(57)【要約】【課題】本発明は、弁プロテーゼの移植後または、低密度リポタンパク質の上昇に起因して上昇した脂質の存在下でＬｒｐ５／Ｗｎｔ経路を介する疾患を発症している自然弁の弁の狭窄、閉塞または石灰化を抑制するための方法に関する。【解決手段】本発明は、投薬療法の組み合わせを標的炎症および標的細胞の付着に、ならびに第２の薬物を弾性ステント、ゴルテックス移植片または弁膜上の増殖および石灰化を抑制するために投薬することに関与する。組み合わせ療法は、バイオプロテーゼおよび自然弁の石灰化を、ステント、自然弁およびゴルテックスカバーを含む人工材料の寿命の改善を伴って抑制する。弁プロテーゼおよび／またはゴルテックス移植片は、弾性ステントまたはプロテーゼ上に弾性ステントが弁に連結されるように取り付けられる。【選択図】図７
2020103971.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、自然（生来の）心臓弁および心臓弁バイオプロテーゼの狭窄、閉塞または石灰化を抑制するためのデバイスおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
心臓は、律動的に収縮することによって生物の身体全体にわたって血液を循環させる中空で筋肉性の器官である。哺乳動物では、心臓は、右心房および心室が左心房および心室から完全に分離されている４個の部屋を有する。通常、血液は全身の静脈から右心房へ、次いで右心室へ、そこから肺動脈を介して肺へ送られて流れる。肺から戻ると血液は、左心房に入り、次いで左心室へ、そこから全身の動脈に送られて流れる。
【０００３】
４個の主な心臓弁：三尖弁、肺動脈弁、僧帽弁および大動脈弁が、律動的収縮の間に血液のバックフローを防ぐ。三尖弁は右心房と右心室とを分けており、肺動脈弁は右心房と肺動脈とを分けており、僧帽弁は左心房と左心室とを分けており、そして大動脈弁は左心室と大動脈とを分けている。一般に、心臓弁の異常を有する患者は、心臓弁膜症を有するとして特徴付けられる。
【０００４】
心臓弁は、適切に開かなくなること（狭窄）によって、または漏出（逆流）のいずれかによって機能不全になる場合がある。例えば大動脈弁機能不全を有する患者は、大動脈弁狭窄または大動脈弁逆流のいずれかを有するとして診断され得る。いずれの場合でも、外科的手段による弁置換は、可能な処置であり得る。置換弁は、自家移植、同種移植または異種移植および機械弁またはブタもしくはウシなどの他の動物の弁から部分的に作製された弁であってよい。残念ながら、経時的に置換弁自体が変性、血栓症、石灰化および／または閉塞などの問題の影響を受けやすくなる。さらに弁置換の工程は、周囲の組織に穿孔を生じる場合があり、狭窄、変性、血栓症、石灰化および／または閉塞も生じる。
【０００５】
したがって、心臓弁の狭窄、閉塞または石灰化を抑制するための新規方法およびプロテーゼが必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
前述の課題は、両方とも本発明による自然弁および弁プロテーゼの狭窄、閉塞または石灰化を抑制するための方法によって対処される。
【０００７】
本発明の第１の態様では、方法は、心臓弁および／またはプロテーゼの骨および軟骨形成を活性化するベータカテニンを次いで核に放出するノッチ１タンパク質の切断およびグリコーゲン合成酵素キナーゼのリン酸化を介したＷｎｔ経路の活性化を介する、二尖大動脈弁（ＢＡＶ）石灰化、三尖大動脈弁石灰化（ＴＡＶ）、経皮的大動脈弁置換（ＴＡＶＲ）、外科的生体大動脈弁置換（ＳＢＡＶＲ）、僧帽弁粘液腫様変性（ＭＶＭＤ）の進行を遅らせる。
【０００８】
本発明の別の態様では、僧帽弁の狭窄、閉塞、石灰化および／または逆流の進行を遅らせるいくつかの治療薬物療法が提供される。具体的には、脂肪過剰血症の存在下においては、一酸化窒素の減少があり、そしてＷｎｔの分泌のためにＷｎｔ３ａはファルネシル化され、それは次にＬｒｐ５に結合し、さらにノッチ１は、細胞増殖細胞外マトリクスタンパク質合成のＣＢＦＡ１制御が造骨性プログラムの活性化により骨形成を開始するためにスプライスおよび不活性化される。
【０００９】
さらなる態様では、本発明は、次の番号付けした項で詳述される：
項１。  患者に移植された生体弁の狭窄、閉塞または石灰化を抑制するための方法であって、
患者に生体弁を移植して、生来の心臓弁を置き換えること；
移植後に抗高脂血症剤の有効量をＰＣＳＫ９抗体との組み合わせで投与すること；および
生体弁もしくは生来の弁または両方の狭窄、閉塞または石灰化の抑制をもたらすこと
を含む、方法。
項２。  抗高脂血症剤の前記有効量が１０ｍｇから８０ｍｇのアトルバスタチン、１０ｍｇから４０ｍｇのシンバスタチン、５ｍｇから４０ｍｇのロスバスタチン、２０ｍｇから８０ｍｇのプラバスタチン、１ｍｇから４ｍｇのピタバスタチンおよび前述の組み合わせから選択される、項１に記載の方法。
項３。  ＰＣＳＫ９の初回量が０．２５ｍｇ／ｋｇから約０．５ｍｇ／ｋｇである、項３に記載の方法。
項４。  ＰＣＳＫ９の後続用量が約１ｍｇ／ｋｇから約１．５ｍｇ／ｋｇである、項３に記載の方法。
項５。  前記初回量と後続用量との間が約１週間あけられている、項４に記載の方法。
項６。  ファルネシル基転移酵素阻害剤の有効量を投与することをさらに含む、項１に記載の方法。
項７。  前記ファルネシル基転移酵素阻害剤がロナファルニブを含み、前記有効量が１１５ｍｇ／ｍ２から１５０ｍｇ／ｍ２を含む、項６に記載の方法。
項８。  Ｚｅｔｉａを１０ｍｇに等しい量で投与することをさらに含む、項７に記載の方法。
項９。  前記生体弁が大動脈生体弁である、項１に記載の方法。
項１０。  前記生体弁が生体僧帽弁である、項１に記載の方法。
項１１。  前記生体弁が生体肺動脈弁である、項１に記載の方法。
項１２。  前記生体弁が生体三尖弁である、項１に記載の方法。
項１３。  前記生体弁が生物由来の１つまたは複数の弁膜尖を含む、項１に記載の方法。
項１４。  前記１つまたは複数の弁膜尖が、ブタ、ウシまたはヒトである、項１３に記載の方法。
項１５。  一酸化窒素合成酵素をコート（encoating）する核酸を前記１つまたは複数の弁膜尖に導入することをさらに含む、項１３に記載の方法。
項１６。  薬物を導入すること、溶出させること、処理すること、抗増殖および抗石灰化処置で前記１つまたは複数の弁膜尖の両側面をコートすることをさらに含む、項１３に記載の方法。
項１７。  ８０ｍｇ／日に等しい量でアスピリンを投与することをさらに含む、項１に記載の方法。
項１８。  経口Ｐ２Ｙ１２阻害剤の有効量を投与することをさらに含む、項１に記載の方法。
項１９。  前記Ｐ２Ｙ１２阻害剤がクロピドグレル、プラスグレル、チカグレロルおよび前述の組み合わせから選択される、項１８に記載の方法。
項２０。  クロピドグレルの前記有効量が、移植のときに３００ｍｇの負荷量であり、その後７５ｍｇ／日の維持用量である、項１９に記載の方法。
項２１。  プラスグレルの前記有効量が、移植のときに６０ｍｇの負荷量であり、その後１０ｍｇ／日の維持用量である、項１９に記載の方法。
項２２。  チカグレロルの前記有効量が、移植のときに１８０ｍｇの負荷量であり、その後１日２回の９０ｍｇの維持用量である、項１９に記載の方法。
【００１０】
以下の詳細な記載は、例示によって示されるが、本発明を記載の具体的な実施形態だけに限定することを意図しておらず、添付の図と合わせて最良に理解され得る。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
患者に移植された生体弁の狭窄、閉塞または石灰化を抑制するための方法であって、
患者に生体弁を移植して、生来の心臓弁を置き換えること；
移植後に抗高脂血症剤の有効量をＰＣＳＫ９抗体との組み合わせで投与すること；および
生体弁もしくは生来の弁または両方の狭窄、閉塞または石灰化の抑制をもたらすこと
を含む、方法。
（項目２）
抗高脂血症剤の上記有効量が１０ｍｇから８０ｍｇのアトルバスタチン、１０ｍｇから４０ｍｇのシンバスタチン、５ｍｇから４０ｍｇのロスバスタチン、２０ｍｇから８０ｍｇのプラバスタチン、１ｍｇから４ｍｇのピタバスタチンおよび前述の組み合わせから選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
ＰＣＳＫ９の初回量が０．２５ｍｇ／ｋｇから約０．５ｍｇ／ｋｇである、項目３に記載の方法。
（項目４）
ＰＣＳＫ９の後続用量が約１ｍｇ／ｋｇから約１．５ｍｇ／ｋｇである、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記初回量と後続用量との間が約１週間あけられている、項目４に記載の方法。
（項目６）
ファルネシル基転移酵素阻害剤の有効量を投与することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
上記ファルネシル基転移酵素阻害剤がロナファルニブを含み、上記有効量が１１５ｍｇ／ｍ２から１５０ｍｇ／ｍ２を含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
Ｚｅｔｉａを１０ｍｇに等しい量で投与することをさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
上記生体弁が大動脈生体弁である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
上記生体弁が生体僧帽弁である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
上記生体弁が生体肺動脈弁である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
上記生体弁が生体三尖弁である、項目１に記載の方法。
（項目１３）
上記生体弁が生物由来の１つまたは複数の弁膜尖を含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
上記１つまたは複数の弁膜尖が、ブタ、ウシまたはヒトである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
一酸化窒素合成酵素をコートする核酸を上記１つまたは複数の弁膜尖に導入することをさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
薬物を導入すること、溶出させること、処理すること、抗増殖および抗石灰化処置で上記１つまたは複数の弁膜尖の両側面をコートすることをさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
８０ｍｇ／日に等しい量でアスピリンを投与することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
経口Ｐ２Ｙ１２阻害剤の有効量を投与することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
上記Ｐ２Ｙ１２阻害剤がクロピドグレル、プラスグレル、チカグレロルおよび前述の組み合わせから選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
クロピドグレルの上記有効量が、移植のときに３００ｍｇの負荷量であり、その後７５ｍｇ／日の維持用量である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
プラスグレルの上記有効量が、移植のときに６０ｍｇの負荷量であり、その後１０ｍｇ／日の維持用量である、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
チカグレロルの上記有効量が、移植のときに１８０ｍｇの負荷量であり、その後１日２回の９０ｍｇの維持用量である、項目１９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、高脂血症の存在下での弁石灰化のシグナル伝達機構を示す模式図である。
【００１２】
【図２】図２は、コレステロール食、塩化リチウム食の存在下での自然弁アテローム性動脈硬化の予備データおよびＬＤＬ受容体を有さないマウス弁膜でのアトルバスタチンの処置での弁膜の減弱を示す図である。
【００１３】
【図３】図３のパネルＡは、筋線維芽細胞の直接処置のｉｎ  ｖｉｔｒｏデータを示す図であり、塩化リチウムの用量を増加させると細胞増殖が増加した。
【００１４】
図３のパネルＢは、アトルバスタチンでのＤＫＫ１の阻害およびＬｒｐ５の直接阻害を示す図である。
【００１５】
【図４】図４は、組織診断、ＲＴＰＣＲおよび心エコーによって規定されたｅＮＯＳ表現型の特徴付けを示す図である。
【００１６】
図４のパネルＡは、ＢＡＶについての組織診断を示す図である。
【００１７】
図４のパネルＢは、ＢＡＶ  ｅＮＯＳ−／−マウスからの半定量的ＲＴＰＣＲおよび二尖対三尖大動脈弁についての心エコーデータを示す図である。
【００１８】
図４のパネルＣは、さまざまな飼料でのｅＮＯＳヌルマウス由来の心エコーを示す表である。
【００１９】
【図５】図５は、Ｗｎｔの分泌を活性化してＬｒｐ５受容体を作動させ、次いで自然筋線維芽細胞において骨形成を活性化する、脂肪過剰血症の存在下での内皮細胞と筋線維芽細胞との間のシグナル伝達を介して自然弁膜において疾患プロセスを発症する細胞層ならびに疾患の進行を遅らせるさまざまな阻害剤および経口剤を示す模式図である。
【００２０】
【図６】図６は、その中に細胞を含めて自然弁またはバイオプロテーゼの大動脈弁を有する大動脈を示す模式図であり、ステント周囲の大動脈は、大動脈に近接するステントからの傷害後に血管平滑筋細胞増殖および骨形成細胞への分化に続発する狭窄によって、そしてｃ−ｋｉｔ幹細胞もしくはｉｎ  ｖｉｖｏ筋線維芽細胞増殖および炎症に続発する骨形成細胞への分化、ならびに骨形成細胞になるｃ−ｋｉｔ幹細胞のホーミングによって部分的に遮断されていること、ならびにスタチン、プロプロテイン転換酵素サブチリシン・ケキシン９型アンタゴニスト抗体（「ＰＣＳＫ９抗体」）およびファルネシル基転移酵素（「ＦＴＩ」）阻害剤を含む投薬療法の効果を示している。
【００２１】
【図７】図７は、石灰化し、弁膜およびステント破壊を生じる、弁およびステントに付着している間葉系幹細胞の増殖に続発する機能不全生体心臓弁の外科的弁置換のときにヒト患者から外植された弁におけるパンヌス形成および石灰化を示す図である。
【００２２】
【図８】図８は石灰化した心臓弁へのｃｋｉｔ陽性幹細胞付着のＲＮＡ発現を実証するグラフである。
【００２３】
【図９】図９は、生体弁石灰化のウサギモデルで抗炎症薬アトルバスタチン、１日あたり８０ｍｇの検査の結果を示す図であり、対照食はわずかなアテローム性動脈硬化を示し、コレステロール食は重度のアテローム性動脈硬化を実証し、コレステロール食でのアトルバスタチン治療はアテローム性動脈硬化の減弱を実証している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、自然弁、ステント留置された大動脈および弁膜または、それを必要とする患者での弁プロテーゼの移植後の縫合リングを有するか、もしくは有さないバイオプロテーゼの狭窄、閉塞または石灰化を抑制するための方法であって、疾患の初期から後期の証拠を有する心臓弁膜症のための経口薬物療法での、弾性ステント、ゴルテックスカバーリングおよびバイオプロテーゼの配置後すぐの処置を含んでよく、１つまたは複数の治療剤単独または組み合わせでの経口療法は石灰化の抑制の有効性を改善し、ステント、弁およびゴルテックスカバーリングを含む人工材料の寿命を改善し、心臓弁および／またはプロテーゼの骨および軟骨形成を活性化するベータカテニンを次いで核に放出するノッチ１タンパク質の切断およびグリコーゲン合成酵素キナーゼのリン酸化を介したＷｎｔ経路の活性化を介して、二尖大動脈弁（ＢＡＶ）石灰化、三尖大動脈弁石灰化（ＴＡＶ）、経皮的大動脈弁置換（ＴＡＶＲ）、外科的生体大動脈弁置換（ＳＢＡＶＲ）、僧帽弁粘液腫様変性（ＭＶＭＤ）の進行を特異的に遅らせることによって改善する方法を提供し、本発明は僧帽弁の狭窄、閉塞、石灰化および／または逆流の進行を遅らせるためのいくつかの治療薬物療法を含む。
【００２５】
本発明者らは、自然心臓弁および生体弁の狭窄、閉塞または石灰化を、壁を有する血管への前記生体弁の外科移植後に抑制するための方法も開発し、本明細書で開示する。患者は、自然弁が弁膜症を発症した場合および生来の罹患した弁の外科的置換のための生体弁の場合に、一連の医療的処置を単独でまたは組み合わせで提供される。生体弁は、造骨性の潜在能力を有する間葉系幹細胞の付着（最良には図２を参照されたい）、コレステロール食、塩化リチウム食の存在下での自然弁アテローム性動脈硬化の発症、およびＬＤＬ受容体を有さないマウス弁膜でのアトルバスタチン処置での弁膜の減弱の後に、自然弁膜および／または生体弁膜における造骨性および軟骨形成の活性化を介して弾性ステントを含む場合がある。図３は、アトルバスタチンの存在下での筋線維芽細胞への塩化リチウムの直接処置の細胞増殖の活性化およびＤＫＫ１の不活性化への効果を実証している。
【００２６】
脂質レベルを調節するようにＬＤＬ受容体を抑制するＰＣＳＫ９抗体と組み合わせた脂質低下剤スタチンで弁を処置することによってノッチ１受容体のスプライシングを抑制する方法も本明細書で提供されている。ファルネシル基転移酵素（Farsnesyltransferase）（「ＦＴＩ」）阻害剤は、Ｗｎｔのファルネシル化を抑制し、脂肪過剰血症の存在下で造骨経路を介した筋線維芽細胞の分化を調節するＬＲＰ５受容体へのＷｎｔ３ａの結合を抑制する。ＦＴＩ阻害剤は、ファルネシル基転移酵素ＣＡＡＸ結合部位に可逆的に結合する小分子である。ＦＴＩ阻害剤は、図５において実証するとおりＷｎｔ３ａ／ＬＲＰ５／フリズルド複合体の活性化のために必要不可欠であるＷｎｔ３ａのファルネシル化を減少させることによって人工弁膜およびもしくは自然弁細胞増殖およびもしくは骨形成において疾患を形成する細胞付着でのＷｎｔ３ａの活性化を抑制する。
【００２７】
細胞増殖および石灰化を抑制する治療剤は、スタチンおよびＰＣＳＫ９抗体の有効量との組み合わせで脂肪過剰血症の状態での炎症を減少させることによって、細胞付着および／または自然弁細胞増殖および／または骨形成を抑制する。ＰＣＳＫ９は、血漿リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の制御因子である。プロプロテイン転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）タンパク質は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体の活性を制御する。モノクローナル抗体でのＰＣＳＫ９の阻害は、ＬＤＬ受容体の循環の増加およびＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）のクリアランスの増加をもたらす。肝臓において非常に多く発現されるＰＣＳＫ９は、プロドメインの自己触媒的切断後に、図５に示すとおり触媒ドメインと非共有結合によって会合したまま分泌され、スタチン剤との組み合わせでＰＣＳＫ９抗体を介してＬＤＬＲ受容体を抑制する。これらの治療剤は、図５において実証するとおりＷｎｔ３ａ／ＬＲＰ５／フリズルド複合体の活性化のために必要不可欠であるＷｎｔ３ａのファルネシル化を減少させることによって人工弁膜およびもしくは自然弁細胞増殖およびもしくは骨形成において疾患を形成する細胞付着でのＷｎｔ３ａの活性化を抑制するファルネシル基転移酵素阻害剤（ＦＴＩ）の有効量との組み合わせで細胞増殖および石灰化を抑制する。
【００２８】
自然弁疾患および／または外科的もしくは経皮的のいずれかで置き換えた生体弁を有する患者での、本明細書に開示する治療剤との組み合わせでの本明細書で提供される処置および方法は、図６に示すとおり、生体弁の移植後にバイオプロテーゼもしくは生来の弁または両方の石灰化、狭窄、逆流および閉塞の進行を遅らせ、狭窄、閉塞および／または石灰化の進行を抑制するおよび／または遅らせる。
【００２９】
患者において、外科的に除去される場合もされない場合もある生来の弁と弾性ステントが接触するように弾性ステントの患者内の所望の位置で取り付けられている生体の折りたためる弾性弁を固定すること、および任意選択で弁膜の両面、ステントまたは生体弁が固定される縫合リングで石灰化を生じる可能性がある幹細胞の付着を抑制するための薬物療法で処置すること、それによりステント留置された弁プロテーゼの移植もしくはそれを必要とする患者においてまたは自然弁を置き換えるバイオプロテーゼの外科的置換の後にまたは早期から後期の弁膜症プロセスを有する患者において、ステント留置された大動脈の狭窄、閉塞または石灰化を抑制すること。
【００３０】
本明細書において使用される「狭窄」という用語は、心臓からの血流を遮断するまたは遮ることができ、心臓での流れおよび圧力を支持する心臓弁が狭まることを指す。弁狭窄は、これだけに限らないが、リウマチ熱などの疾患による瘢痕；弁膜上での骨形成を介した進行性石灰化；進行性損傷；などを含む種々の原因から生じる場合がある。
【００３１】
本明細書において使用される「弁」という用語は、律動的収縮の際の血液のバックフローを防ぐ４個の主な心臓弁のいずれかを指す。４個の主な心臓弁は、三尖弁、肺動脈弁、僧帽弁および大動脈弁である。三尖弁は右心房と右心室とを分け、肺動脈弁は右心房と肺動脈とを分け、僧帽弁は左心房と左心室とを分け、動脈弁は左心室と大動脈とを分けている。
【００３２】
方法の一実施形態では、生体弁および罹患した弁は、大動脈弁、肺動脈弁、三尖弁または僧帽弁であってよい。
【００３３】
本明細書において使用される「弁プロテーゼ」という用語は、不完全、機能不全または失われた心臓弁を置き換えるまたは補充するために使用されるデバイスを指し得る。弁プロテーゼの例は、これだけに限らないが、ＡＴＳ  ３ｆｓ（登録商標）Ａｏｒｔｉｃ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＥＲＩＭＯＵＮＴ  Ｍａｇｎａ  Ｅａｓｅ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ-Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＥＲＩＭＯＵＮＴ  Ｍａｇｎａ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＥＲＩＭＯＵＮＴ  Ｍａｇｎａ  Ｍｉｔｒａｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＥＲＩＭＯＵＮＴ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＥＲＩＭＯＵＮＴ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｔｒａｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＥＲＩＭＯＵＮＴ  Ｔｈｅｏｎ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＥＲＩＭＯＵＮＴ  Ｔｈｅｏｎ  Ｍｉｔｒａｌ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｄｕｒａｆｌｅｘ  Ｌｏｗ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｍｉｔｒａｌ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｄｕｒａｆｌｅｘ  ｍｉｔｒａｌ  ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ（ブタ（porcine））、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｍｉｔｒａｌ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｓ．Ａ．Ｖ．  Ａｏｒｔｉｃ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｐｒｉｍａ  Ｐｌｕｓ  Ｓｔｅｎｔｌｅｓｓ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｓａｐｉｅｎ  Ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（登録商標）Ａｏｒｔｉｃ  Ｒｏｏｔ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｈａｎｃｏｃｋ（登録商標）ＩＩ  Ｓｔｅｎｔｅｄ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｈａｎｃｏｃｋ  ＩＩ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｍｏｓａｉｃ（登録商標）Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｃ、Ｍｏｓａｉｃ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｂｉｏｃｏｒ、（登録商標）Ｂｉｏｃｏｒ（商標）Ｓｕｐｒａ、Ｂｉｏｃｏｒ（登録商標）Ｐｅｒｉｃａｒｄｉａ、Ｂｉｏｃｏｒ（商標）Ｓｔｅｎｔｌｅｓｓ、Ｅｐｉｃ（商標）、Ｅｐｉｃ  Ｓｕｐｒａ（商標）、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｓｔｅｎｔｌｅｓｓ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｖａｌｖｅ（ＳＰＶ（登録商標））、Ｔｏｒｏｎｔｏ  ＳＰＶ  ＩＩ（登録商標）、Ｔｒｉｆｅｃｔａ、Ｓｏｒｉｎ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｔｒｏｆｌｏｗ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ  Ｖａｌｖｅ（登録商標）、Ｃｒｙｏｌｉｆｅ、Ｃｒｙｏｌｉｆｅ  ａｏｒｔｉｃ  ｖａｌｖｅ（登録商標）Ｃｒｙｏｌｉｆｅ  ｐｕｌｍｏｎｉｃ  ｖａｌｖｅ（登録商標）、Ｃｒｙｏｌｉｆｅ−Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｓｔｅｎｔｌｅｓｓ  ａｏｒ��ｉｃ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｖａｌｖｅ（登録商標）を含む、などのバイオプロテーゼ；機械的プロテーゼを含む。
【００３４】
一般にバイオプロテーゼは、１つまたは複数の弁膜尖（ｃｕｓｐ）を有する弁を含み、弁はその両方とも典型的には弾性であるフレームまたはステントに取り付けられる。本明細書において使用される「弾性」という用語は、デバイスが曲げる、折りたたむ、拡張する、またはこれらの組み合わせができることを意味する。弁の弁膜尖は、一般に、非限定的にブタ（ブタ（porcine））、ウシ（ウシ（bovine））、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サルおよびヒトなどの哺乳動物の組織から作製される。
【００３５】
本発明の方法により弁は、１つまたは複数の弁膜尖を有する折りたためる弾性弁であってよく、折りたためる弾性弁は弾性ステントに取り付けられてよい。
【００３６】
一実施形態では、折りたためる弾性弁は、生物由来の１つまたは複数の弁膜尖を含んでよい。
【００３７】
別の実施形態では、１つまたは複数の弁膜尖は、ブタ（porcine）、ウシ（bovine）またはヒトである。
【００３８】
バイオプロテーゼの例は１つまたは複数の弁膜尖を有する折りたためる弾性弁を含んでよく、折りたためる弾性弁は、これだけに限らないが、Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＳＡＰＩＥＮ経カテーテル心臓弁およびＭｅｄｔｒｏｎｉｃ社製ＣｏｒｅＶａｌｖｅ（登録商標）経カテーテル心臓弁およびＭｅｄｔｒｏｎｉｃ社製Ｐｏｒｔｉｃｏ−Ｍｅｌｏｄｙを含む弾性ステントに取り付けられる。
【００３９】
本発明において使用される弁プロテーゼの弾性ステント部分は、自己拡張型またはバルーンカテーテルの方法によって拡張可能であってよい。弾性ステントは、当業者に公知の任意の生体適合性材料を含んでよい。生体適合性材料の例としては、これだけに限らないがセラミクス；ポリマー；ステンレス鋼；チタン；ニチノールなどのニッケルチタン合金；タンタル；Ｅｌｇｉｌｏｙ（登録商標）およびＰｈｙｎｏｘ（登録商標）などのコバルト含有合金；などが挙げられる。
【００４０】
本発明の方法によれば、高脂血症の存在下で、図１において発症している弁石灰化の発症（一酸化窒素は減少し、Ｗｎｔの分泌のためにＷｎｔ３ａはファルネシル化され、次にＬｒｐ５に結合し、加えてノッチ１は、表Ｉに列挙する細胞増殖の開始とＣＢＦＡ１の活性化を介した細胞増殖の開始と造骨性プログラムの活性化による骨形成の開始のためにスプライスされる）を抑制するための１つまたは複数の治療剤の組み合わせで、患者の経口処置により不活性化される。
【００４１】
弁膜筋線維芽細胞内での骨形成および／または骨形成への幹細胞分化が活性化されると、弁プロテーゼおよび／またはバイオプロテーゼに付着した弾性ステントに付着する。弁プロテーゼの弾性ステント部分は、任意の円柱形であってよい（最終形状は円柱状であり、元は漏斗状であってよく、弁または弁の壁と接触することが必要であり、理論に束縛されることなく、治療剤は弁もしくは弁の壁または大動脈弁を含む大動脈、僧帽弁、三尖弁、大静脈弁から放出され、吸収される。
【００４２】
一実施形態では、弾性ステント部分は、固定の際に弁または弁の壁に接触できるように、実質的に円柱状であってよい。
【００４３】
別の実施形態では、弾性ステント部分の直径は、約１５ｍｍから約４２ｍｍであってよい。
【００４４】
本発明の実施形態により、方法は一酸化窒素合成酵素をコードする核酸を弁プロテーゼの１つまたは複数の弁膜尖に導入することをさらに含む場合がある。一酸化窒素合成酵素をコードする核酸を１つまたは複数の弁膜尖に導入するための方法は、米国特許第６，６６０，２６０号、２００３年１２月９日出願に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４５】
図１に最良に見出されるとおり、いくつかの治療薬物療法は、僧帽弁の狭窄、閉塞、石灰化および／または逆流の進行を遅らせる。脂肪過剰血症の存在下で、一酸化窒素は減少し、Ｗｎｔの分泌のためにＷｎｔ３ａはファルネシル化され、次にＬｒｐ５に結合し、さらにノッチ１は、細胞増殖細胞外マトリクスタンパク質合成のＣＢＦＡ１制御が造骨性プログラムの活性化によって骨形成を開始するため、スプライスおよび不活性化される。
【００４６】
図２において最良に見られるとおり、実験的高コレステロール血症食が低密度リポタンパク質受容体欠損で遺伝的に改変されたマウスに与えられた、図２のパネルＡ１は対照食であり、図２のパネルＡ２はコレステロール食であり、図２のパネルＡ３はアテローム性動脈硬化の改善を有するコレステロール＋アトルバスタチン食であり、図２のパネルＡ４は、コレステロールでの処置に次いで既定食期間の途中でのアトルバスタチン処置を有する退行食（regression  diet）であり、図２のパネルＡ５は塩化リチウム食での処置はコレステロールの欠如で動脈硬化病変を誘発するが、Ｌｒｐ５／ベータカテニン経路を抑制するグリコーゲン合成酵素キナーゼの抑制を伴うと誘発しない。図２のパネルＢ１〜Ｂ５は、図２のパネルＡで定義した対応する既定食での弁膜からのｍｉｃｒｏＣＴデータであり、パネルＢ１の対照食は石灰化の証拠を有さず、図２のパネルＢ２のコレステロール食は石灰化の増加を実証し、図２のパネルＢ３およびＢ４のアトルバスタチン処置は石灰化の証拠を有さず、図２のパネルＢ５の塩化リチウム食は心臓弁での微小石灰化を実証している。図２のパネルＣ１は、コレステロール処置での骨転写因子ＣＢＦＡ１遺伝子発現の増加およびＬｒｐ５遺伝子発現を実証している。Ｌｒｐ５ヌルマウスは心臓での石灰化の証拠を有さない。図２のパネルＥは、核に移行し、Ｌｒｐ５の下流の骨形成を活性化するベータカテニンについての染色の共焦点顕微鏡である。図２のパネルＥ１は、コレステロール食の処置でのベータカテニンの核への陽性移行を実証している。
【００４７】
図３のパネルＡは、筋線維芽細胞の直接処置のｉｎ  ｖｉｔｒｏデータであり、塩化リチウムの用量を増加させると細胞増殖が増加した。
【００４８】
図３のパネルＢは、アトルバスタチンでのＤＫＫ１の阻害およびＬｒｐ５の直接阻害である。
【００４９】
図４は、組織診断、ＲＴＰＣＲおよび心エコーによって明確にされるｅＮＯＳ表現型の特徴付けを実証している。図４のパネルＡはＢＡＶについての組織診断であり、図４のパネルＢはＢＡＶ  ｅＮＯＳ−／−マウス由来の半定量的ＲＴＰＣＲおよび二尖対三尖大動脈弁についての心エコーデータである。図４のパネルＣを参照してＢＡＶ表現型を有するｅＮＯＳ−／−マウスが、Ｌｒｐ５経路活性化を介する三尖大動脈弁よりも早期に加速された速進行性狭窄を発症するかどうかを理解するために、ｅＮＯＳ−／−マウスはコレステロール食と対比するコレステロールおよびアトルバスタチンを与えられた。心エコー血行動態も異なる飼料のｅＮＯＳ−／−マウスの二尖対三尖大動脈弁における狭窄の時期を決定するために実施された。二尖大動脈弁疾患の機構をさらに理解するために、ｅＮＯＳヌルマウスは、（ｎ＝６０）対照食、（ｎ＝６０）コレステロール食および（ｎ＝６０）コレステロール＋アトルバスタチン食で多数のマウスにおいて検査された。屠殺前の二尖大動脈弁の存在および非存在についての心エコー、図４のパネルＣは、さまざまな飼料のｅＮＯＳヌルマウス由来の心エコーである。本発明者らは、タンパク質およびＲＮＡ発現によってノッチ１、Ｗｎｔ３ａおよび古典的Ｗｎｔ経路の下流マーカーを測定した。ノッチ１タンパク質は減少し、ＲＮＡ発現は、対照およびアトルバスタチン処置では存在しなかった、脂質処置と同様のスプライシング変種を実証している。コレステロール食は、古典的Ｗｎｔ経路のメンバーを増加させ、アトルバスタチンはこれらのマーカーを有意に減少させた（ｐ＜０．０５）。
【００５０】
図１〜５に記載のとおり、この疾患プロセスの発症におけるＬｒｐ５  Ｗｎｔ経路の活性化の役割は、ＬＤＬ受容体を欠失している遺伝子マウスにおいて特に示されている。細胞増殖および細胞外マトリクス産生を開始するベータカテニンを活性化する塩化リチウム食の存在下でのアテローム性動脈硬化の発症も示されている。
【００５１】
ここで図５を参照し、自然弁膜において疾患プロセスを発症する細胞層を示している模式図が示されている。脂肪過剰血症の存在下で内皮細胞と筋線維芽細胞との間のシグナル伝達は、Ｗｎｔの分泌を活性化してＬｒｐ５受容体を作動させ、次いで自然筋線維芽細胞において骨形成を活性化する。表Ｉに列挙するさまざまな阻害剤および経口剤は疾患の進行を抑制または遅らせる。
【００５２】
図５は、血漿リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の制御因子として、および冠動脈疾患の危険性低減に有効である薬剤としてのＰＣＳＫ９の役割をさらに示している。プロプロテイン転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）タンパク質は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体の活性を制御する。モノクローナル抗体でのＰＣＳＫ９の阻害は、ＬＤＬ受容体の循環の増加およびＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）のクリアランスの増加をもたらす。肝臓において非常に多く発現されるＰＣＳＫ９は、プロドメインの自己触媒的切断後に触媒ドメインと非共有結合によって会合したまま分泌される。ＰＣＳＫ９の触媒ドメインは低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）の上皮増殖因子様リピートＡ（ＥＧＦ−Ａ）ドメインに結合する。ＰＣＳＫ９の両方の機能は、ライソソーム分解のためのＬＤＬＲ−ＰＣＳＫ９複合体を標的化およびＬＤＬ−Ｃの低下のために必要であり、機能の喪失および機能の獲得１に関連する両ドメイン中の変異と一致している。
【００５３】
本発明は、大動脈弁疾患、僧帽弁逸脱および／または経皮的大動脈弁置換を含む生体弁を有する患者でのＬＤＬ−Ｃ血漿レベルへのスタチン剤について以下の表Ｉに概説するとおり、ＰＣＳＫ９活性およびＰＣＳＫ９の対応する効果をスタチン剤との組み合わせで阻害することによる血液中のＬＤＬ−Ｃレベルの長期にわたる低減のための治療レジメンを提供する。
【００５４】
表Ｉは、心臓弁および／またはプロテーゼの骨および軟骨形成を活性化するベータカテニンを次いで核に放出するノッチ１タンパク質の切断およびグリコーゲン合成酵素キナーゼのリン酸化を介するＷｎｔ経路の活性化を介して、二尖大動脈弁（ＢＡＶ）石灰化、三尖大動脈弁石灰化（ＴＡＶ）、経皮的大動脈弁置換（ＴＡＶＲ）、外科的生体大動脈弁置換（ＳＢＡＶＲ）、僧帽弁粘液腫様変性（ＭＶＭＤ）の進行を遅らせる処置のためのさまざまな経口治療単独および組み合わせを実証しており、本発明は、僧帽弁の狭窄、閉塞、石灰化および／または逆流の進行を遅らせるいくつかの治療薬物療法を含む。抗高脂血症剤は、１０ｍｇから８０ｍｇの範囲のアトルバスタチンの有効量、１０ｍｇから４０ｍｇの範囲のシンバスタチン、ロスバスタチン５ｍｇから４０ｍｇ、プラバスタチン２０ｍｇから８０ｍｇ、ピタバスタチン１ｍｇから４ｍｇの組み合わせを含み、ＰＣＳＫ９抗体初回量は約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇまたは約１．５ｍｇ／ｋｇであってよく、初回量と第１回の後続用量と追加的な後続用量との間が互いに約１週間あけられていてよく、および／または１１５ｍｇ／ｍ２から１５０ｍｇ／ｍ２の範囲を含む１１５ｍｇ／ｍ２用量でのロナファルニブなどのＦＴＩ阻害剤との組み合わせ、１０ｍｇのＺｅｔｉａの有効量との組み合わせであってよい。他の有効なＦＴＩ阻害剤として、ケトメリン酸（Chaetomellic  acid）Ａ、ＦＰＴ阻害剤Ｉ、ＦＰＴ阻害剤ＩＩ、ＦＰＴ阻害剤ＩＩＩ、ＦＴａｓｅ阻害剤Ｉ、ＦＴａｓｅ阻害剤ＩＩ、ＦＴＩ−２７６トリフルオロ酢酸塩、ＦＴＩ−２７７トリフルオロ酢酸塩、ＧＧＴＩ−２９７、ギンゲロール、グリオトキシン、Ｌ−７４４、８３２ジヒドロクロライド、マニュマイシンＡ、チピファルニブ、ａ−ヒドロキシファルネシルホスホン酸が挙げられる。
【表１】
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【００５５】
図２はＬｒｐ５受容体の活性化におけるコレステロールの役割を明確にするデータを実証しており、弁石灰化実験はアテローム性動脈硬化を実証し、石灰化がＬＤＬＲ−／−マウスの大動脈弁において発症している。このデータは、脂質がこれらの組織での骨形成に影響を与えるかどうか、およびスタチンが骨生物学を改善できるかどうかを決定するためにこれらのマウスにおける心臓を特徴付けている。この研究からの結果は、次の５つの処置群からもたらされた：群Ｉ：対照食、群ＩＩ：実験的高コレステロール血症０．２％（ｖ／ｖ）食および群ＩＩＩ：実験的高コレステロール血症０．２％（ｖ／ｖ）食およびアトルバスタチン０．１％（ｖ／ｖ）を１２週間、群ＩＶ：コレステロール食６週間、次いで退縮治療群としてアトルバスタチン０．１％（ｖ／ｖ）のみ６週間、ならびに群Ｖ：塩化リチウム食０．１２％（ｖ／ｖ）のみ、（処置群あたりＮ＝２０）。マッソン・トリクローム染色がアテローム性動脈硬化および初期ミネラル化について評価するために大動脈弁で実施された。
図２は、５つの異なる処置群からの大動脈弁由来のマッソン・トリクローム光学顕微鏡（４０ｘ）とＭｉｃｒｏＣＴデータとの複合である。図２のパネルＡ１は、対照大動脈弁がアテローム性動脈硬化のいかなる証拠も生じなかったことを示している。図２のパネルＡ２は、高コレステロール血症の大動脈弁が石灰化している動脈硬化病変を発症していることを実証している。病変は、大動脈弁の大動脈の表面に沿って発症している。図２のパネルＡ３は、コレステロールに加えてアトルバスタチン処置群由来の大動脈弁であり、弁膜に沿った動脈硬化病変に顕著な改善を示している。図２のパネルＡ４は、群ＩＶ退縮処置大動脈弁が大動脈弁表面に沿ったアテローム性動脈硬化のいかなる証拠も有さないことを示している。図２のパネルＡ５は、塩化リチウム、グリコーゲン合成酵素キナーゼの直接阻害剤の効果を実証している。塩化リチウムでの処置は、細胞内のベータカテニンレベルを増加させ、それによりベータカテニンの核への移行およびＬＥＦ／ＴＣＦ転写因子の活性化を介して骨形成を作動させる。このデータは、塩化リチウム大動脈弁での動脈硬化病変の証拠を実証している。Ａ５の矢印は、動脈硬化病変を指している。石灰化がさまざまな処置群由来の大動脈弁において発生するかどうかを示すためのｅｘ  ｖｉｖｏ  ｍｉｃｒｏＣＴ分析。ＬＤＬＲ−／−マウスは、上に概説のとおりアトルバスタチンを伴っておよび伴わずにコレステロールで処置され、屠殺後にＭｉｃｒｏＣＴスキャナーでｅｘ  ｖｉｖｏスキャンされた。図２のパネルＢは、５つの処置群からのＬＤＬＲ−／−マウス由来の予備ｍｉｃｒｏＣＴデータを示している。各図中の白い領域は弁膜での石灰化の証拠を示す。灰色の領域は各弁膜で石灰化していない領域である。青色の領域はこのデータについてコンピューターがレンダリングしたバックグラウンドである。図２のパネルＢ１は、大動脈弁が石灰化のいかなる証拠も発症しなかった対照食（群Ｉ）である。コレステロール（群ＩＩ）処置マウスは、図２のパネルＢ２に示すＭｉｃｒｏＣＴスキャンに存在する石灰化の２つの白い領域によって示されるとおり初期のミネラル化の領域を発症している。アトルバスタチン（群ＩＩＩ）処置心臓は、図２のパネルＢ３に示すとおりいかなる石灰化も発症しなかった。図２のパネルＢ４は、ミネラル化のいかなる証拠も発症していなかった退縮処置（群ＩＶ）大動脈弁を示している。図２のパネルＣ１は、さまざまな処置群からのＲＴＰＣＲデータを実証している。ＲＴＰＣＲは、コレステロール食（群ＩＩ）でのｃｂｆａ１およびＬｒｐ５受容体遺伝子発現における増加を示し、そしてアトルバスタチン処置は、１２週間のアトルバスタチン処置は（群ＩＩＩ）、大動脈弁におけるＣｂｆａ１およびＬｒｐ５発現の両方を減少させ、さらに６週間のアトルバスタチン退縮処置（群ＩＶ）においてＣｂｆａ１およびＬｒｐ５遺伝子発現をさらに減少させた。最後に、塩化リチウム処置は、いかなるＬｒｐ５発現も伴わずにＣｂｆａ１の増加を実証している。対照食（群Ｉ）は、Ｌｒｐ５発現およびｃｂｆａ１発現を示さなかった。図２のパネルＤ１は、対照Ｌｒｐ５−／−処置マウスである。Ｌｒｐ５−／−マウスでは石灰化の証拠はなかった２、３。
最後に大動脈弁でのベータカテニン発現を検討するための共焦点顕微鏡。図２のパネルＥは、３つの既定食群でのベータカテニン発現の共焦点顕微鏡を実証している。パネルＥ１は、対照弁でのわずかな細胞質性ベータカテニン発現を示している。パネルＥ２は核に位置したベータカテニン発現における増加を示し、パネルＥ３は、ベータカテニンタンパク質発現の減弱を実証している。
【００５６】
図６〜９は、機能不全生体心臓弁の外科的弁置換時のヒト患者由来外植弁におけるパンヌス形成および石灰化工程を示している。対照生体弁と対比するヒト由来の外植生体弁。パネルの（ａ１）対照弁の心室の表面、（ａ２）パンヌスを有する罹患した弁の心室の表面および心臓弁への幹細胞付着を介した石灰化工程。図７は、石灰化した心臓弁に付着するｃｋｉｔ陽性間葉系幹細胞のＲＮＡ発現が、周知の骨転写因子ｃｂｆａ１（コア結合因子ａ１）およびｏｐｎ（オステオポンチン）ならびに細胞外マトリクスタンパク質によって発現される弁上で生じる石灰化工程を引き起こすことを実証する図である。結果は、これらのマーカーすべてについて対照を０とする対照のパーセントとして表される。ＧＡＰＤＨは実験についての対照として使用されるハウスキーピング遺伝子である。図８は、罹患生体弁でのｃＫｉｔ遺伝子発現が対照と比較して増加していることを実証している。
【００５７】
図９  対照動物由来の移植された弁膜は、マッソン・トリクローム染色、図９のパネルＡ１によって実証されるとおり弁膜の表面に沿って中程度の量の細胞浸潤を有するように見える。高拡大倍率は、弁膜と弁膜表面に沿って発症している細胞浸潤との間の境界を実証している。対照生体弁に少量のｃＫｉｔ陽性染色細胞、図９のパネルＢ１、およびオステオポンチンを発現している中程度の量の増殖細胞が、図９のパネルＣ１およびＤ１に示すとおりであった。対照的にコレステロール飼育ウサギ由来の弁組織、図９のパネルＡ２、Ｂ２、Ｃ２、Ｄ２では、マッソン・トリクロームで示される顕著な細胞浸潤があり、組織浸潤はｃＫｉｔ、ＰＣＮＡおよびＯＰＮを発現している。最終的に、外植時の光学顕微鏡下での半定量的視覚分析によって測定されたとおり、コレステロール処置でアテローム性動脈硬化負荷は４倍に増加した。アトルバスタチン処置ウサギの移植弁膜は、アテローム性動脈硬化プラーク負荷、増殖、ｃＫｉｔおよびオステオポンチン発現の量における顕著な減少を実証した、図９のパネルＡ３、Ｂ３、Ｃ３、Ｄ３。
【００５８】
図９は、弁膜での炎症およびパンヌス形成も低減するためのアトルバスタチンの用量について検査するための実験動物からの結果を示している。実験手順は次のとおり、オスニュージーランドホワイトウサギ、体重２．５〜３．０ｋｇは対照（Ｎ＝１０）または０．５％コレステロール飼育群（Ｎ＝１０）またはコレステロール飼育およびアトルバスタチン群（Ｎ＝１０）に割り当てられた。すべての動物は、１２週間自由摂取で飼育された。対照ウサギは標準飼料で飼育された。コレステロール飼育動物は、０．５％（ｗ／ｗ）コレステロール（Ｐｕｒｉｎａ  Ｍｉｌｌｓ、Ｗｏｏｄｍｏｎｔ、ＩＮ）を補充した飼料を受け、コレステロール飼育およびアトルバスタチン群はスタチン処置群のためにアトルバスタチンを毎日３．０ｍｇ／ｋｇ、経口で与えられた。既定食開始前にウサギは、筋肉内ケタミン／キシラジン（４０／５ｍｇ／ｋｇ）を使用してウシ（ｂｏｖｉｎｅ）心膜生体弁組織（Ｐｅｒｉｍｏｕｎｔ、Ｅｄｗａｒｄｓ、Ｉｒｖｉｎｅ  ＣＡ）の外科移植を受けた。１２週間後、ウサギは筋肉内ケタミン／キシラジン（４０／５ｍｇ／ｋｇ）を使用して麻酔され、次いでＢｅｕｔｈａｎａｓｉａ  １ｍｌの心臓内投与で安楽死された。皮下移植部位からの除去直後に生体弁は４％緩衝化ホルマリン中２４時間で固定され、次いでパラフィンに包埋された。パラフィン包埋切片（６μｍ）が切断され、マッソン・トリクローム染色で病理組織学的検査のために染色された。
【００５９】
下の表２は、ヒトへの投薬に相当する抗炎症薬アトルバスタチン、１日あたり８０ｍｇの検査の結果を示し、アトルバスタチンで処置した弁上の幹細胞ＲＮＡ発現の低減パーセントおよび幹細胞媒介パンヌス形成の低減を示している。
【表２】
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【００６０】
表２は、対照、コレステロールおよびコレステロールに加えてアトルバスタチンの実験アッセイについてのＲＮＡ遺伝子発現を実証している。対照およびアトルバスタチン群と比較してコレステロール飼育動物の弁膜においてＳｏｘ９、骨芽細胞転写因子、サイクリンおよびｃＫｉｔが増加していた（ｐ＜０．０５）。表Ｉは、実験モデル由来のＲＴＰＣＲデータである。血清コレステロールレベルは、コレステロール飼育において対照アッセイと比較して有意に高かった（１８４６．０±５２５．３ｍｇ／ｄＬ対１８．０±７ｍｇ／ｄＬ、ｐ＜０．０５）。アトルバスタチン処置実験群は、コレステロール食単独よりも低いコレステロールレベルを明らかに示した（８２４．０±１５２．１ｍｇ／ｄｌ、ｐ＜０．０５）。ｈｓＣＲＰ血清レベルの増加がコレステロール飼育において対照アッセイと比較してあり（１３．６±１９．７対０．２４±０．１、ｐ＜０．０５）、アトルバスタチンによって低減された（７．８±８．７、ｐ＜０．０５）。これらのアッセイは、実験的高コレステロール血症（hypercholestolemia）のウサギモデルで、ヒトに対する１日８０ｍｇに相当する用量のアトルバスタチンを伴っておよび伴わずに検査された。以前の実験は、低用量範囲、１日２０ｍｇおよび１日４０ｍｇのアトルバスタチンを検査するために実施され、低用量範囲では治療上の利益はなかった。
【００６１】
抗炎症剤としてのスタチンおよび抗増殖剤（antiprolifearative）と抗石灰化剤との組み合わせの役割についての作用機序は、石灰化および幹細胞付着の抑制を媒介する。アトルバスタチンは抗増殖剤との組み合わせで、ｃｋｉｔ幹細胞の弁への付着を低減し、弁における内皮一酸化窒素合成酵素を活性化することによって弁のさらなる破壊を低減する。これらの組織での石灰化を抑制する２つのモデルで筋線維芽細胞増殖および細胞外マトリクス産生が９５％低減された、表Ｉに列挙する薬物の組み合わせの使用は、図１〜９に概説のとおり種々のレベルの疾患の活性化を抑制できる。
【００６２】
加えて処置は、アスピリンおよび／または、クロピドグレル、プラスグレル、チカグレロルを含むＰ２Ｙ１２阻害剤などの抗血小板療法との組み合わせで前述の抗高脂血症剤およびＰＣＳＫ９抗体を使用することを含んでよい。プリン作動性シグナル伝達の分野では、Ｐ２Ｙ１２タンパク質は、血小板の表面上に主に、だがここに限らず見出され、血液凝固の重要な制御因子である。Ｐ２Ｙ１２は、Ｇタンパク質共役（ＧＰＣＲ）プリン作動性受容体の群のＧｉクラスに属し、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）の化学受容体である。
【００６３】
自然および／または生体心臓弁石灰化を予防するための処置との組み合わせで使用するために有効である用量は、クロピドグレルでは、移植の時点で３００ｍｇの負荷量であり、その後７５ｍｇ／日の維持用量であり；プラスグレルでは、移植の時点で６０ｍｇの負荷量であり、その後１０ｍｇ／日の維持用量であり；チカグレロルでは、移植の時点で１８０ｍｇの負荷量であり、その後１日２回の９０ｍｇの維持用量である。
【００６４】
本発明による患者の処置は、１つもしくは複数の弁膜尖中の内皮細胞における低密度リポタンパク質受容体；１つもしくは複数の弁膜尖中の筋線維芽細胞中のＬＲＰ５受容体ならびに、または１つもしくは複数の弁膜尖中の内皮細胞での間葉系幹細胞およびＷＮＴ３ａ分泌をさらに抑制する。
【００６５】
本発明は種々の態様および実施形態を参照して記載されているが、当業者は、変更が本発明の精神および範囲から逸脱することなく形態および詳細においてなされてよいことを認識する。
【図１】
2020103971.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【外国語明細書】
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