(57)【要約】【課題】本発明は、ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する方法、に関する。【解決手段】本発明のＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する方法は、（１）ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞を、５位を標識したウリジンまたはシチジンを含む培地で培養し、（２）（１）で得られた培養細胞から、目的のＲＮＡを取得し、（３）目的ＲＮＡの質量分析を行い、そして、（４）（３）の質量分析スペクトルを、ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位が全く生じない場合の質量分析スペクトルと比較することにより、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する、ことを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する方法であって、
（１）ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞を、５位を標識したウリジンまたはシチジンを含む培地で培養し、
（２）（１）で得られた培養細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（３）目的ＲＮＡの質量分析を行い、そして、
（４）（３）の質量分析スペクトルを、ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位が全く生じない場合の質量分析スペクトルと比較することにより、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する、
ことを含む、前記方法
【請求項２】
５位を標識したウリジンまたはシチジンが、５位が重水素で標識されているウリジンまたはシチジンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
５位を標識したウリジンまたはシチジンが、５，６−Ｄ２−ウリジンまたは５，６−Ｄ２−シチジンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＲＮＡが、リボソームＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡおよびトランスファーＲＮＡからなる群から選択される、請求項１−３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＲＮＡが、リボソームＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡまたは核小体低分子ＲＮＡである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
５位の転写後修飾されたウリジンが、以下の：
シュードウリジン、５−メチルウリジン、５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−２’−Ｏ−メチルウリジンメチルエステル、、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオウリジン、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン、５−アミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、５−アミノメチル−２−セレノウリジン、５−アミノメチル−２−チオウリジン、５−アミノメチルウリジン、５−カルバモイルヒドロキシメチルウリジン、５−カルバモイルメチル−２−チオウリジン、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−カルバモイルメチルウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−セレノウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、５−カルボキシメチルウリジン、５−シアノメチルウリジン、５−ヒドロキシウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、５−メチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルジヒドロウリジン、５−タウリノメチル−２−チオウリジン、および５−タウリノメチルウリジン、
からなる群から選択される、請求項１−５に記載の方法。
【請求項７】
５位の転写後修飾されたウリジンが、シュードウリジンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
５位の転写後修飾されたシチジンが、以下の：
５−メチルシチジン、５，２’−ジメチルシチジン、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシシチジンおよび５−ヒドロキシメチルシチジン
からなる群から選択される、請求項１−５に記載の方法。
【請求項９】
ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞が、ウリジンモノリン酸合成酵素が破壊された細胞である、請求項１−８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物細胞が、ヒト由来の細胞である、請求項１−９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物細胞が、ＴＫ６細胞またはＦＭ３Ａ細胞である、請求項１−９に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、
（５）（４）で同定された、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、
ことを含む、請求項１−１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
さらに、
（６−１）健常者から単離された細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（６−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、
ことを含む、請求項１−１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１−１３のいずれか１項に記載の方法に使用するための、ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸のの新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞。
【請求項１５】
ウリジンモノリン酸合成酵素またはシチジンモノリン酸をコードする遺伝子が破壊された細胞である、請求項１４に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１６】
哺乳動物細胞が、ＴＫ６細胞またはＦＭ３Ａ細胞である、請求項１４または１５に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１７】
ＲＮＡ中のウリジンの５位の転写後修飾部位と、疾患の関連性を決定する方法であって、
（Ａ−１）ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞を、５位を標識したウリジンまたはシチジンを含む培地で培養し、
（Ａ−２）（Ａ−１）で得られた培養細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ａ−３）目的ＲＮＡの質量分析を行い、
（Ａ−４）（Ａ−３）の質量分析スペクトルを、ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位が全く生じない場合の質量分析スペクトルと比較することにより、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する、
（Ｂ−２）健常者から単離された細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ｂ−５）（Ｂ−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、
（Ｃ−２）疾患に罹患している対象から単離された細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ｃ−５）（Ｃ−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、そして、
（Ｄ）（Ｂ−５）の転写後修飾率と（Ｃ−５）の転写後修飾率に相違がある場合、当該転写後修飾部位が疾患と関連性がある、と決定する、
と、疾患の関連性を決定する
ことを含む、前記方法。
【請求項１８】
ＲＮＡ中のウリジンの５位の転写後修飾部位と、疾患の関連性を決定する方法であって、
（Ａ−１）ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞を、５位を標識したウリジンまたはシチジンを含む培地で培養し、
（Ａ−２）（Ａ−１）で得られた培養細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ａ−３）目的ＲＮＡの質量分析を行い、
（Ａ−４）（Ａ−３）の質量分析スペクトルを、ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位が全く生じない場合の質量分析スペクトルと比較することにより、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する、
（Ａ−５）（Ａ−４）で同定された、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、
（Ｃ−２）疾患に罹患している対象から単離された細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ｃ−５）（Ｃ−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、そして、
（Ｄ’）（Ａ−５）の転写後修飾率と（Ｃ−５）の転写後修飾率に相違がある場合、当該転写後修飾部位が疾患と関連性がある、と決定する、
と、疾患の関連性を決定する
ことを含む、前記方法。
【請求項１９】
対象が、疾患に罹患している可能性、または、疾患を発症する可能性を検査する方法であって、
（Ａ−１）ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞を、５位を標識したウリジンまたはシチジンを含む培地で培養し、
（Ａ−２）（Ａ−１）で得られた培養細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ａ−３）目的ＲＮＡの質量分析を行い、
（Ａ−４）（Ａ−３）の質量分析スペクトルを、ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位が全く生じない場合の質量分析スペクトルと比較することにより、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する、
（Ｂ−２）健常者から単離された細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ｂ−５）（Ｂ−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、
（Ｃ−２）疾患に罹患している対象から単離された細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ｃ−５）（Ｃ−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、そして、
（Ｄ）（Ｂ−５）の転写後修飾率と（Ｃ−５）の転写後修飾率に相違がある場合、当該転写後修飾部位が疾患と関連性がある、と決定する、
（Ｅ−２）対象から単離された細胞から目的のＲＮＡを取得し、
（Ｅ−５）（Ｄ）で疾患と関連性があると決定された、ウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位について、（Ｅ−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、そして、
（Ｆ）（Ｄ）で疾患と関連性があると決定されたウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位について、（Ｂ−５）の転写後修飾率と（Ｅ−５）の転写後修飾率に相違がある場合、対象が前記疾患に罹患している可能性、または、前記疾患を発症する可能性を有すると決定する、
ことを含む、前記方法。
【請求項２０】
疾患が、先天性角化不全症（ＤＣ）、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、末梢性T 細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、非小細胞性肺がんからなる群から選択される疾患である、請求項１７−１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
疾患が先天性角化不全症（ＤＣ）であり、疾患との関連性が決定されている目的ＲＮＡ中のウリジンの５位の転写後修飾部位が、ヒト２８Ｓ  ｒＲＮＡの４３３１位および４９６６位である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する方法、ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸のの新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞、ＲＮＡ中のウリジンの５位の転写後修飾部位と、疾患の関連性を決定する方法、並びに、対象が、疾患に罹患している可能性、または、疾患を発症する可能性を検査する方法、に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡは、リボヌクレオチドがホスホジエステル結合で結合した核酸であり、生体内でタンパク質合成を行う際に必要なリボソームの活性中心部位を構成している。ＲＮＡは、生体内での挙動により、リボソームＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡおよびトランスファーＲＮＡなど様々な分類がされている。
【０００３】
ＲＮＡは生体内、即ち細胞内でＤＮＡからの転写によって生成された後、メチル化またはアセチル化、あるいは、ウリジンのシュードウリジン（Ψ）への変換などの化学修飾、即ち、転写後修飾（ＰＴＭ）を受ける。ＰＴＭの種類は豊富で、真核生物では１３０種類以上同定されている。ＰＴＭは、ＲＮＡの形態、機能、安定性に重要であることが知られており、局所電荷環境に影響を及ぼす、または水素結合能を増加させる等の影響を及ぼす。
【０００４】
例えば、ＰＴＭは、リボソームとｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、および翻訳因子の相互作用を最適化する。したがって、ＰＴＭのいかなる改変も、翻訳速度および精度の両方に負の影響を及ぼす可能性があり）、そして代謝産物および抗生物質への反応を損なう可能性がある。さらに、特定のＰＴＭは、多様な疾患、例えば癌および感染性疾患における改変された翻訳と関連する。
【０００５】
近年、クライオ電子顕微鏡検査（クライオ−ＥＭ）を用いて、ヒト８０Ｓリボソームの三次元（３Ｄ）構造上で、１３０を超える個々のｒＲＮＡ修飾が視覚化され、そしてこれらのＰＴＭの多くがヒト特異的修飾であると仮定された（Ｎａｔｕｒｅ，５５１，４７２−４７７，２０１７）。しかし、これらのＰＴＭのかなりの部分は、ヒトｒＲＮＡにおける化学基のタイプおよび修飾の部位の両方に関して、従来の報告とも一致せず、不正確、不完全である。
【０００６】
質量分析をスペクトルを用いてＲＮＡを解析する方法が検討されている。また、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法（ｓｔａｂｌｅ  ｉｓｏｔｏｐｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄ：ＳＩＬＮＡＳ）と称される質量分析（ＭＳ）技術に基づく定量的ＲＮＡ分析法を用いて、２つの真核生物、すなわち分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，４３，ｅ１１５，２０１５）および出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，４４，８９５１−８９６１，２０１６）由来の８０ＳリボソームのＰＴＭをマッピングした、ことが報告されている。
【０００７】
しかしながら、より複雑な哺乳動物細胞におけるＰＴＭについて、ＰＴＭの部位、種類を同定し、さらに、修飾率も決定できる方法については報告されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ，５５１，４７２−４７７，２０１７
【非特許文献２】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，４３，ｅ１１５，２０１５
【非特許文献３】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，４４，８９５１−８９６１，２０１６
【非特許文献４】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１３１２，８７−９２，２０１３
【非特許文献５】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３７，ｅ１４０，２００９
【非特許文献６】Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，  ８７，２８８４−２８９１、２０１５
【非特許文献７】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ４４，ｅ５９，２０１６
【非特許文献８】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３７，ｅ４７、２００９
【非特許文献９】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，４４，５０６８−５０８２、２０１６
【非特許文献１０】Ｂｌｏｏｄ，  １０７，  ２６８０−２６８５、２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する方法、ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸のの新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞。ＲＮＡ中のウリジンの５位の転写後修飾部位と、疾患の関連性を決定する方法、並びに、対象が、疾患に罹患している可能性、または、疾患を発症する可能性を検査する方法、を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記問題解決のため、鋭意研究に努めた結果、定量的質量分析により、ヒト８０Ｓリボソームの全てのＲＮＡの完全なＰＴＭを明らかにした。それにより、ヒト８０Ｓリボソームは、２２８箇所の内部部位で、１４の別個のタイプのＰＴＭを持っていることを見出した。具体的には、５．８Ｓ（全長１５７ｎｔ）中に４箇所、１８Ｓ（１８６９ｎｔ）中に９１箇所、および２８Ｓ（５０６４ｎｔ）中に１３３箇所である。これらの大部分は、リボソームの機能領域に位置する。特に、ヒト１８Ｓリボソーム中、Ｃｍ６２１、Ψ８９７、Ψ１０４５、Ψ１１３６、およびΨ１２３２、ならびにヒトリボソーム２８Ｓ中、Ｕｍ１７６０、Ψ１７６８、Ψ２６１９、Ｇｍ３６０６、およびΨ４４６３の合計１０箇所の新規なＰＴＭが見出された。
【００１１】
本発明者らは、特に、ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞を作成し、これを利用することにより、ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾の部位と修飾の種類を同定することに成功した。さらに、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法を用いて修飾率の決定することに成功し、本発明を想到した。
【００１２】
限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する方法であって、
（１）ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞を、５位を標識したウリジンまたはシチジンを含む培地で培養し、
（２）（１）で得られた培養細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（３）目的ＲＮＡの質量分析を行い、そして、
（４）（３）の質量分析スペクトルを、ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位が全く生じない場合の質量分析スペクトルと比較することにより、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する、
ことを含む、前記方法
［態様２］
５位を標識したウリジンまたはシチジンが、５位が重水素で標識されているウリジンまたはシチジンである、態様１に記載の方法。
［態様３］
５位を標識したウリジンまたはシチジンが、５，６−Ｄ２−ウリジンまたは５，６−Ｄ２−シチジンである、態様１に記載の方法。
［態様４］
ＲＮＡが、リボソームＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡおよびトランスファーＲＮＡからなる群から選択される、態様１−３のいずれか１項に記載の方法。
［態様５］
ＲＮＡが、リボソームＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡまたは核小体低分子ＲＮＡである、態様４に記載の方法。
［態様６］
５位の転写後修飾されたウリジンが、以下の：
シュードウリジン、５−メチルウリジン、５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−２’−Ｏ−メチルウリジンメチルエステル、、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオウリジン、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン、５−アミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、５−アミノメチル−２−セレノウリジン、５−アミノメチル−２−チオウリジン、５−アミノメチルウリジン、５−カルバモイルヒドロキシメチルウリジン、５−カルバモイルメチル−２−チオウリジン、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−カルバモイルメチルウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−セレノウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、５−カルボキシメチルウリジン、５−シアノメチルウリジン、５−ヒドロキシウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、５−メチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルジヒドロウリジン、５−タウリノメチル−２−チオウリジン、および５−タウリノメチルウリジン、
からなる群から選択される、態様１−５に記載の方法。
［態様７］
５位の転写後修飾されたウリジンが、シュードウリジンである、態様６に記載の方法。
［態様８］
５位の転写後修飾されたシチジンが、以下の：
５−メチルシチジン、５，２’−ジメチルシチジン、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシシチジンおよび５−ヒドロキシメチルシチジン
からなる群から選択される、態様１−５に記載の方法。
［態様９］
ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞が、ウリジンモノリン酸合成酵素が破壊された細胞である、態様１−８のいずれか１項に記載の方法。
［態様１０］
哺乳動物細胞が、ヒト由来の細胞である、態様１−９のいずれか１項に記載の方法。
［態様１１］
哺乳動物細胞が、ＴＫ６細胞またはＦＭ３Ａ細胞である、態様１−９に記載の方法。
［態様１２］
さらに、
（５）（４）で同定された、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、
ことを含む、態様１−１１のいずれか１項に記載の方法。
［態様１３］
さらに、
（６−１）健常者から単離された細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（６−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、
ことを含む、態様１−１２のいずれか１項に記載の方法。
［態様１４］
態様１−１３のいずれか１項に記載の方法に使用するための、ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸のの新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞。
［態様１５］
ウリジンモノリン酸合成酵素またはシチジンモノリン酸をコードする遺伝子が破壊された細胞である、態様１４に記載の哺乳動物細胞。
［態様１６］
哺乳動物細胞が、ＴＫ６細胞またはＦＭ３Ａ細胞である、態様１４または１５に記載の哺乳動物細胞。
［態様１７］
ＲＮＡ中のウリジンの５位の転写後修飾部位と、疾患の関連性を決定する方法であって、
（Ａ−１）ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞を、５位を標識したウリジンまたはシチジンを含む培地で培養し、
（Ａ−２）（Ａ−１）で得られた培養細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ａ−３）目的ＲＮＡの質量分析を行い、
（Ａ−４）（Ａ−３）の質量分析スペクトルを、ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位が全く生じない場合の質量分析スペクトルと比較することにより、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する、
（Ｂ−２）健常者から単離された細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ｂ−５）（Ｂ−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、
（Ｃ−２）疾患に罹患している対象から単離された細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ｃ−５）（Ｃ−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、そして、
（Ｄ）（Ｂ−５）の転写後修飾率と（Ｃ−５）の転写後修飾率に相違がある場合、当該転写後修飾部位が疾患と関連性がある、と決定する、
と、疾患の関連性を決定する
ことを含む、前記方法。
［態様１８］
ＲＮＡ中のウリジンの５位の転写後修飾部位と、疾患の関連性を決定する方法であって、
（Ａ−１）ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞を、５位を標識したウリジンまたはシチジンを含む培地で培養し、
（Ａ−２）（Ａ−１）で得られた培養細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ａ−３）目的ＲＮＡの質量分析を行い、
（Ａ−４）（Ａ−３）の質量分析スペクトルを、ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位が全く生じない場合の質量分析スペクトルと比較することにより、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する、
（Ａ−５）（Ａ−４）で同定された、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、
（Ｃ−２）疾患に罹患している対象から単離された細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ｃ−５）（Ｃ−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、そして、
（Ｄ’）（Ａ−５）の転写後修飾率と（Ｃ−５）の転写後修飾率に相違がある場合、当該転写後修飾部位が疾患と関連性がある、と決定する、
と、疾患の関連性を決定する
ことを含む、前記方法。
［態様１９］
対象が、疾患に罹患している可能性、または、疾患を発症する可能性を検査する方法であって、
（Ａ−１）ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞を、５位を標識したウリジンまたはシチジンを含む培地で培養し、
（Ａ−２）（Ａ−１）で得られた培養細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ａ−３）目的ＲＮＡの質量分析を行い、
（Ａ−４）（Ａ−３）の質量分析スペクトルを、ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位が全く生じない場合の質量分析スペクトルと比較することにより、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する、
（Ｂ−２）健常者から単離された細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ｂ−５）（Ｂ−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、
（Ｃ−２）疾患に罹患している対象から単離された細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ｃ−５）（Ｃ−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、そして、
（Ｄ）（Ｂ−５）の転写後修飾率と（Ｃ−５）の転写後修飾率に相違がある場合、当該転写後修飾部位が疾患と関連性がある、と決定する、
（Ｅ−２）対象から単離された細胞から目的のＲＮＡを取得し、
（Ｅ−５）（Ｄ）で疾患と関連性があると決定された、ウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位について、（Ｅ−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、そして、
（Ｆ）（Ｄ）で疾患と関連性があると決定されたウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位について、（Ｂ−５）の転写後修飾率と（Ｅ−５）の転写後修飾率に相違がある場合、対象が前記疾患に罹患している可能性、または、前記疾患を発症する可能性を有すると決定する、
ことを含む、前記方法。
［態様２０］
疾患が、先天性角化不全症（ＤＣ）、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、末梢性T 細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、非小細胞性肺がんからなる群から選択される疾患である、態様１７−１９のいずれか１項に記載の方法。
［態様２１］
疾患が先天性角化不全症（ＤＣ）であり、疾患との関連性が決定されている目的ＲＮＡ中のウリジンの５位の転写後修飾部位が、ヒト２８Ｓ  ｒＲＮＡの４３３１位および４９６６位である、態様２０に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞を利用することにより、ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾の部位および種類を、正確に特定することを可能にした。さらに、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法を組み合わせることにより、ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾のランドスケープの作成を可能にした。ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾のランドスケープにより、疾患の関連するＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾の同定、さらに、対象が、疾患に罹患している可能性、または、疾患を発症する可能性を検査することも可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、５，６−Ｄ２−ウリジンを用いて、シュードウリジンを同定する方法の模式図である。
【図２】図２は、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法（Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ−Ｌａｂｅｌｅｄ  ｒｉｂｏＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ；ＳＩＬＮＡＳの概要を示す。
【図３】図３は、ヒトＵＭＰＳ遺伝子の破壊スキームを示す。
【図４】図４は、リジンモノリン酸シンテターゼが欠損したＴＫ６細胞（ＴＫ６ΔＵＭＰＳ）における、ＲＮＡフラグメントＡＵＧｐの質量スペクトルである。上段がＭＳスペクトル、下段が、ＭＳＭＳスペクトルである。上段のＭＳスペクトルにおいて、重水素でラベルされたフラグメントのシグナルは９９９．１４０７５に出ている。ラベルされていないフラグメントのシグナルは９９７．１２付近にある（拡大により判別可能）。両者ののシグナルの高さを計測し、ラベルされているものの比率を計算すると９９％となり、９９％の割合でラベルウリジンが取り込まれたことが理解される。
【図５】図５Ａは、ＵＵＵＵＣＧｐおよびその同族断片の抽出イオンモニタリングの結果を示す。図５Ｂは、Ａｒｉａｄｎｅを用いたヒトｒＲＮＡ配列を通じたデータベース検索によって分析した、ＵΨＵＵＣＧｐ８９６−９０１の同定およびシュードウリジン化の部位を示す。図５Ｃは、ＵΨＵＵＣＧｐ８９６−９０１に関するＭＳ／ＭＳシグナルから同定された解離イオンを示す。
【図６】図６Ａは、ＵＵＣＧｐおよびその同族断片の抽出イオンモニタリングの結果を示す。図６Ｂは、Ａｒｉａｄｎｅを用いたヒトｒＲＮＡ配列を通じたデータベース検索によって分析した、ΨΨＣＧｐ１０４５−１０４８の同定およびシュードウリジン化の部位を示す。図６Ｃは、ΨΨＣＧｐ１０４５−１０４８に関するＭＳ／ＭＳシグナルから同定された解離イオンを示す。
【図７】図７Ａは、ＣＵＵＣＣＧｐおよびその同族断片の抽出イオンモニタリングの結果を示す。図７Ｂは、Ａｒｉａｄｎｅを用いたヒトｒＲＮＡ配列を通じたデータベース検索によって分析した、ＣΨＵＣＣＧｐ１１３５−１１４０の同定およびシュードウリジン化の部位を示す。  図７Ｃは、ＣΨＵＣＣＧｐ１１３５−１１４０に関するＭＳ／ＭＳシグナルから同定された解離イオンを示す。
【図８】図８Ａは、ＣＣＵＧｐおよびその同族断片の抽出イオンモニタリングの結果を示す。図８Ｂは、Ａｒｉａｄｎｅを用いたヒトｒＲＮＡ配列を通じたデータベース検索によって分析した、ＣＣΨＧｐ１２３０−１２３３の同定およびシュードウリジン化の部位を示す。図８Ｃは、ＣＣΨＧｐ１２３０−１２３３に関するＭＳ／ＭＳシグナルから同定された解離イオンを示す。
【図９】図９Ａは、ＡＵＣＵＣＡＡＣＣＵＡＵＵＣＵＣＡＡＡＣＵＵＵＡＡＡＵＧｐおよびその同族断片の抽出イオンモニタリングの結果を示す。図９Ｂは、Ａｒｉａｄｎｅを用いたヒトｒＲＮＡ配列を通じたデータベース検索によって分析した、ＡＵＣＵｍＣＡＡＣＣΨＡΨΨＣＯＨ１７５７−１７７０の同定およびシュードウリジン化の部位を示す。図９Ｃは、ＡＵＣＵｍＣＡＡＣＣΨＡΨΨＣＯＨ１７５７−１７７０に関するＭＳ／ＭＳシグナルから同定された解離イオンを示す。
【図１０】図１０Ａは、ＵＵＣＵＣＵＵＵＵＣＵＵＵＧｐおよびその同族断片の抽出イオンモニタリングの結果を示す。図１０Ｂは、Ａｒｉａｄｎｅを用いたヒトｒＲＮＡ配列を通じたデータベース検索によって分析した、ＵＵＣＵＣＵＵΨＵＣＵＵＵＧｐ２６１２−２６２５の同定およびシュードウリジン化の部位を示す。図１０Ｃは、ＵＵＣＵＣＵＵΨＵＣＵＵＵＧｐ２６１２−２６２５に関するＭＳ／ＭＳシグナルから同定された解離イオンを示す。
【図１１】図１１Ａは、ＵＵＧｐおよびその同族断片の抽出イオンモニタリングの結果を示す。図１１Ｂは、Ａｒｉａｄｎｅを用いたヒトｒＲＮＡ配列を通じたデータベース検索によって分析した、ＵΨＧｍＧｐ４４６２−４４６５の同定およびシュードウリジン化の部位を示す。図１１Ｃは、ＵΨＧｍＧｐ４４６２−４４６５に関するＭＳ／ＭＳシグナルから同定された解離イオンを示す。
【図１２−１】図１２Ａから図１２Ｇは、各ΨガイドｓｎоＲＮＡ並びに１８Ｓ  ｒＲＮＡにおける各シュードウリジンの周囲のｒＲＮＡに対するその塩基対形成を示す。
【図１２−２】図１２Ａから図１２Ｇは、各ΨガイドｓｎоＲＮＡ並びに１８Ｓ  ｒＲＮＡにおける各シュードウリジンの周囲のｒＲＮＡに対するその塩基対形成を示す。
【図１２−３】図１２Ａから図１２Ｇは、各ΨガイドｓｎоＲＮＡ並びに１８Ｓ  ｒＲＮＡにおける各シュードウリジンの周囲のｒＲＮＡに対するその塩基対形成を示す
【図１２−４】図１２Ａから図１２Ｇは、各ΨガイドｓｎоＲＮＡ並びに１８Ｓ  ｒＲＮＡにおける各シュードウリジンの周囲のｒＲＮＡに対するその塩基対形成を示す
【図１３】図１３は、ＤＣ患者細胞由来のＤＫＣ１におけるアミノ酸残基の置換または欠失の位置を示す。
【図１４】図１４は、ＤＣ患者および健康な対照の細胞由来の２８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるＰＴＭの化学量間の相関を示す。
【図１５】図１５は、ＤＣ患者細胞由来の２８Ｓ  ｒＲＮＡにおける４３３１および４９６６位のシュードウリジン化の相違の統計的有意性を示す。
【図１６】図１６は、Ｕ２  ｓｎＲＮＡの部位５３−６３を含む断片のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【図１７】図１７は、Ｕ２  ＲＮＡの２次構造図を示す。
【図１８】図１８は、ＲＵＮ１２の新規シュードウリジンか部位であるΨ３３が同定された、ＭＳスペクトル（上段）およびＭＳ／ＭＳスペクトル（下段）の結果を示す。
【図１９】図１９は、ＳＮＯＲＤ４７の新規シュードウリジンか部位であるΨ５８およびΨ６２が同定された、ＭＳスペクトル（上段）およびＭＳ／ＭＳスペクトル（下段）の結果を示す。
【図２０】図２０は、ＲＵＮ１２の新規シュードウリジンか部位であるΨ６５およびΨ５４が同定された、ＭＳスペクトル（上段）およびＭＳ／ＭＳスペクトル（下段）の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する方法
一態様において、本発明は、ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する方法に関する。同定方法は、
（１）ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞を、５位を標識したウリジンまたはシチジンを含む培地で培養し、
（２）（１）で得られた培養細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（３）目的ＲＮＡの質量分析を行い、そして、
（４）（３）の質量分析スペクトルを、ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位が全く生じない場合の質量分析スペクトルと比較することにより、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する、
ことを含む。
【００１６】
ＲＮＡ中の一部の塩基やリボースは、転写後にメチル化またはアセチル化、あるいは、ウリジンのシュードウリジン（Ψ）への変換などの化学修飾、即ち、転写後修飾（ＰＴＭ）を受ける。ＰＴＭの種類は豊富で、真核生物では１３０種類以上同定されている。ＰＴＭは、ＲＮＡの形態、機能、安定性に重要であることが知られており、局所電荷環境に影響を及ぼす、または水素結合能を増加させる等の影響を及ぼす。
【００１７】
同定の対象となるＲＮＡは、生体内（細胞内）でＰＴＭを受ける可能性のあるＲＮＡであれば、特に限定されない。非限定的に、同定方法の対照となるＲＮＡは、リボソームＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡおよびトランスファーＲＮＡからなる群から選択される。
【００１８】
「リボソームＲＮＡ」は、リボソームを構成するＲＮＡであり、ＲＮＡとしては生体内に最も大量に存在する（７−８割程度）。哺乳動物を含む真核生物のリボソーム粒子は、８０Ｓリボソームであり、６０Ｓ大サブユニット（６０Ｓサブユニット）と小サブユニット（４０Ｓサブユニット）からなる。一般に、大サブユニット（６０Ｓサブユニット）は、２８Ｓと５．８Ｓ、５Ｓ  ｒＲＮＡおよび４７のリボソームタンパク質から構成され、小サブユニット（４０Ｓサブユニット）は、１８Ｓ  ｒＲＮＡおよび３３のリボソームタンパク質で構成されるが、種によってその数字には若干の違いがある。ヒトにおいてはこのうち２８Ｓ、５．８Ｓ、１８Ｓ  ＲＮＡは一つの転写単位に由来する。各サブユニットにおいて、ｒＲＮＡは、翻訳のための触媒コアを形成し、そしてリボソームタンパク質は、リボソーム構造および機能を安定化させそして微調整すると考えられている。
【００１９】
リボソームＲＮＡは種々のＰＴＭを受ける。ＰＴＭは、例えば、リボソームとｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、および翻訳因子の相互作用を最適化する。特定のＰＴＭ、特にリボソームＲＮＡのＰＴＭは、多様な疾患、例えば癌および感染性疾患における改変された翻訳と関連すると考えられている。
【００２０】
「核内低分子ＲＮＡ」（ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＲＮＡ）は、一般には、Ｕ−ＲＮＡとして知られており、真核生物の細胞核中に見出される低分子のＲＮＡである。主な機能としては、細胞核内において、ｍＲＮＡの前駆体の加工に関与する。
【００２１】
「核小体低分子ＲＮＡ」は、核小体に存在するＲＮＡで、ノンコーディングＲＮＡの１つである。リボソームＲＮＡおよびその他のＲＮＡ遺伝子のメチル化やシュードウリジン化など化学修飾を導く小さなＲＮＡ分子の一群である。英語のｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ＲＮＡを略してｓｎｏＲＮＡと呼ばれることも多い。シュドウリジン化に関与するＨ／ＡＣＡ  ｂｏｘ  ｓｎｏＲＮＡと、メチル化に関与するＣ／Ｄ  ｂｏｘ  ｓｎｏＲＮＡの主に２種類のクラスが知られている。
【００２２】
「メッセンジャーＲＮＡ」は、タンパク質の翻訳される塩基配列情報と構造を有するＲＮＡであり、通常ｍＲＮＡと表記される。ＤＮＡからコピーした遺伝情報を担っており、その遺伝情報は、特定のアミノ酸に対応するコドンと呼ばれる３塩基配列という形になっている。
【００２３】
「トランスファーＲＮＡ」は、７０〜１００塩基程度の長さの小さなＲＮＡである。リボソームのタンパク質合成部位でｍＲＮＡ上の塩基配列（コドン）を認識し、対応するアミノ酸を合成中のポリペプチド鎖に転移させるためのアダプター分子である。運搬ＲＮＡ、トランスファーＲＮＡなどとも呼ぶが、通常ｔＲＮＡと略記される。
【００２４】
非限定的に、ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡまたは核小体低分子ＲＮＡである。
前記同定方法において、ウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部を判別することができる。
【００２５】
非限定的に、５位の転写後修飾されたウリジンは、以下の：
シュードウリジン、５−メチルウリジン、５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−２’−Ｏ−メチルウリジンメチルエステル、、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオウリジン、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン、５−アミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、５−アミノメチル−２−セレノウリジン、５−アミノメチル−２−チオウリジン、５−アミノメチルウリジン、５−カルバモイルヒドロキシメチルウリジン、５−カルバモイルメチル−２−チオウリジン、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−カルバモイルメチルウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−セレノウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、５−カルボキシメチルウリジン、５−シアノメチルウリジン、５−ヒドロキシウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、５−メチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルジヒドロウリジン、５−タウリノメチル−２−チオウリジン、および５−タウリノメチルウリジン、
からなる群から選択される。一態様において、５位の転写後修飾されたウリジンは、シュードウリジンである。
【００２６】
非限定的に、５位の転写後修飾されたシチジンは、以下の：
５−メチルシチジン、５，２’−ジメチルシチジン、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシシチジンおよび５−ヒドロキシメチルシチジン
からなる群から選択される。
【００２７】
前記同定方法は、（１）ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞を、５位を標識したウリジンまたはシチジンを含む培地で培養する。
【００２８】
ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞では、ウリジンまたはシチジンを細胞内で新たに合成することができない、または、できにくい。このような細胞を、５位を標識したウリジンまたはシチジンを含む培地で培養すると、ウリジンまたはシチジン（ピリミジン）の新合成の代わりに、サルベージ回路が進行し、添加された５位を標識したウリジンまたはシチジンのみ、または、５位を標識したウリジンまたはシチジンを主に使用して、ＲＮＡの転写が行われる。転写されたＲＮＡは、細胞内でＰＴＭを受ける。サルベージ回路とは、ヌクレオチドの分解経路の中間体から再びヌクレオチドを合成する経路である。
【００２９】
ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞の培地は、５位を標識したウリジンまたはシチジンを含む、という要件を満たす限り、哺乳動物細胞を培養するための公知の培地を用いることができる。
【００３０】
（２）（１）で得られた培養細胞から、目的のＲＮＡを取得し、（３）目的ＲＮＡの質量分析を行う。
５位を標識したウリジンまたはシチジンが取り込まれると、ウリジンまたシチジンの５位へのＰＴＭとその部位が修飾された異性体を識別することが可能になる。よって、（４）（３）の質量分析スペクトルを、ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位が全く生じない場合の質量分析スペクトルと比較することにより、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する。
【００３１】
質量分析スペクトルは、ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ等のタンデムＭＳ等の公知の方法によって得ることができる。ＭＳは、分子をイオン化し、そのｍ／ｚを測定することによって、イオンや分子の質量を測定する分析法である。質量スペクトルは、実測スペクトル、構造式から予測される理論スペクトル、いずれも含み得る。実測スペクトルを、理論スペクトルと比較して、ＰＴＭを予測、同定してもよい。
【００３２】
一態様において、ウリジンまたはシチジンの５位の標識には、例えば、重水素のヌクレオシドの塩基を標識可能な任意の標識を用いることができる。好ましくは、５位を標識したウリジンまたはシチジンは、５位が重水素で標識されているウリジンまたはシチジンである。一態様において、５位を標識したウリジンまたはシチジンが、５，６−Ｄ２−ウリジンまたは５，６−Ｄ２−シチジンである。一例として、５，６−Ｄ２−ウリジンを用いて、シュードウリジンを同定する方法の概要を図１に示す。
【００３３】
５位を標識したウリジンまたはシチジンの一例として、５，６−Ｄ２−ウリジンまたは５，６−Ｄ２−シチジンを添加した培地での培養により標識されたＲＮＡ試料では、ウリジンとシュードウリジン、３−メチルウリジンと５−メチルウリジン、あるいは、３−メチルシチジン／４−メチルシチジンと５−メチルシチジン、の各異性体間を、１Ｄａの質量差として検出することが可能である。
【００３４】
前記同定方法において、ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞を用いる。ウリジンモノリン酸（ＵＭＰ）は、ウラシル、リボースおよび１つのリン酸より構成されており、リン酸とウリジンとの間でリン酸エステルが形成されている。ＵＭＰの新合成には、カルバモイルリン酸シンターゼ、アスパラギン酸カルバモイルトランスフェラーゼ、ジヒドロオロターゼ、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、オロチジンモノリン酸デカルボキシラーゼ（ウリジンモノリン酸合成酵素）の各酵素が関与する。ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞は、これらの酵素の１つまたは２つ以上の酵素の機能を欠失させる、または阻害することによって作成することが可能である。シチジンモノリン酸（ＣＭＰ）は、シチジン、リボースおよび１つのリン酸より構成されており、リン酸とシチジンとの間でリン酸エステルが形成されている。シチジン三リン酸（ＣＴＰ）は、ＣＭＰにさらに２つのリン酸が結合したしたピリミジンヌクレオチドである。ＣＴＰはＵＴＰから合成される。ＵＭＰの新合成に関与する酵素の１つまたは２つ以上の酵素の機能を欠失させる、または阻害することにより、ＣＭＰの合成も欠失または阻害される。
【００３５】
酵素の機能の欠失または阻害は、例えば、遺伝子改変技術を用いて、酵素をコードする遺伝子を改変し、酵素の発現を改変、即ち、酵素の発現を欠失または減少させることによって行ってもよい。遺伝子改変技術は、当業者に公知の手法のいずれかを用いることができる。例えば、標的配列特異的ヌクレアーゼを用いて、意図した通りに標的遺伝子を改変する技術である、ゲノム編集技術を利用してもよい。利用できるヌクレアーゼとしては、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ等のエンドヌクレアーゼが知られている。特に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ／  ＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）は、ＤＮＡ二本鎖を切断し、ゲノム配列の任意の場所を削除、置換、挿入することができる、遺伝子改変技術である。例えば、ゲノム編集技術を用いて、酵素をコードする遺伝子内に、薬剤耐性遺伝子（例えばネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子）を挿入することにより、酵素をコードする遺伝子を破壊する。薬剤耐性を有する細胞を選択することにより酵素をコードする遺伝子が欠失した細胞を得ることができる。
【００３６】
あるいは、酵素の機能の欠失または阻害は、哺乳動物細胞の培養培地に、ＵＭＰの新合成に関与する酵素の１つまたは２つ以上の酵素の機能を欠失させる、または阻害する物質を添加することにより、行ってもよい。物質は、哺乳動物細胞におけるＲＮＡの合成（転写）およびＰＴＭを阻害するものであってはならない。
【００３７】
一態様において、前記同定方法に用いるウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞は、ウリジンモノリン酸合成酵素が破壊された細胞である。、ウリジンモノリン酸合成酵素は、オロチジンモノリン酸（ＯＭＰ）からカルボキシル基を除く酵素であり、オロチジンモノリン酸デカルボキシラーゼ、とも呼称される。
【００３８】
前記同定方法に用いる哺乳動物細胞の種類は特に限定されない。哺乳動物細胞は、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ等を含む哺乳動物に由来する細胞でありうる。哺乳動物細胞は、哺乳動物から採取された細胞を利用しても良いし、樹立された培養細胞であってもよい。一態様において、哺乳動物細胞は、ヒト由来の細胞である。一態様において、哺乳動物細胞は、ＴＫ６細胞またはＦＭ３Ａ細胞である。ＴＫ６細胞は、ヒトの脾臓由来のヒトリンパ芽球細胞に由来する培養細胞で、例えば、ＪＣＲＢ細胞バンク、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）等より入手可能である。ＦＭ３Ａ細胞は、マウスの乳該細胞に由来する培養細胞で、例えば、ＪＣＲＢ細胞バンク、理研バイオリソースセンター等より入手可能である。
【００３９】
２．５位の転写後修飾部位の転写後修飾率の決定
ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する方法において、工程（１）−（４）により、ウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位が同定される。より好ましくは、同定された転写後修飾部位について、さらに転写後修飾率を決定してもよい。具体的には、工程（１）−（４）に加えて、さらに、
（５）（４）で同定された、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、
ことを含んでもよい。
【００４０】
「安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法」（Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ−Ｌａｂｅｌｅｄ  ｒｉｂｏＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ；ＳＩＬＮＡＳ）は、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ４３，  ｅ１１５，２０１５に記載された方法を用いることができる。ＳＩＬＮＡＳは、同位体希釈とＭＳ／ＭＳによるフラグメンテーションという原理により、ＲＮＡのＰＴＭを部位ごとに同定し、定量することができる方法である。ただし、ＳＩＬＮＡＳでは、同質量となるＰＴＭの異性体の種類は判別できない。ＳＩＬＮＡＳの原理を図２に示す。合成ＲＮＡを用いた評価では、数％以上の修飾率であれば、ＳＩＬＮＡＳにより高い定量性を得られることが知られている。
【００４１】
一態様において、前記同定方法により、好ましくは、５位を標識したウリジンまたはシチジンを用いた目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定し、さらに、同定されたＰＴＭ部位のＳＩＬＮＡＳによる修飾率を決定することができる。これにより、ＲＮＡのＰＴＭの部位、種類および修飾率を特定したＲＮＡのＰＴＭのマッピングの作成が可能になる。
【００４２】
一態様において、本発明の同定方法は、さらに、
（６−１）健常者から単離された細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（６−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、
ことを含んでもよい。
【００４３】
本発明者らは、ＴＫ６細胞において検出されるｒＲＮＡ  ＰＴＭが、他のヒト細胞、すなわち我々がｒＲＮＡにおけるすべてのＰＴＭの〜７０％を決定したＨｅＬａ細胞（表１）および人工多能性幹細胞（Ｔａｏｋａら、データ示さず）において同定されるものと、ＰＴＭの種類、部位、および各部位での修飾の化学量に関して有意には異ならないことを見出した。
【００４４】
【表１−１】
2020103258.tif 000002
【００４５】
【表１−２】
2020103258.tif 000003
【００４６】
【表１−３】
2020103258.tif 000004
【００４７】
【表１−４】
2020103258.tif 000005
【００４８】
【表１−５】
2020103258.tif 000006
【００４９】
【表１−６】
2020103258.tif 000007
【００５０】
【表１−７】
2020103258.tif 000008
【００５１】
【表１−８】
2020103258.tif 000009
【００５２】
【表１−９】
2020103258.tif 000010
【００５３】
【表１−１０】
2020103258.tif 000011
【００５４】
ａ．  ヌクレオシドの略語は以下の通りである：Ψ，シュードウリジン；Ａｍ，２’−Ｏ−メチルアデノシン；Ｃｍ，２’−Ｏ−メチルシチジン；Ｇｍ，２’−Ｏ−メチルグオノシン；Ｕｍ，２’−Ｏ−メチルウリジン；Ψｍ，２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；ｍ１Ａ，１−メチルアデノシン；ｍ６２Ａ，Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン；ｍ５Ｃ，５−メチルシチジン；ｍ７Ｇ，７−メチルグアノシン；ｍ３Ｕ，３−メチルウリジン；ｍ６Ａ，Ｎ６−メチルアデノシン；ａｃＣ，Ｎ４−アセチルシチジン；ｍ１ａｃｐ３Ψ，１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン。
【００５５】
ｂ．  ＲＮＡ断片は、Ａｒｉａｄｎｅ  （Ａ）および／またはＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルのマニュアル測定（Ｍ）によって同定した。５６ｄＵ，ｒＲＮＡ、５，６−ｄ２−ウリジンによって標識したｒＲＮＡを用いてシュードウリジンの位置を決定した。ＮＤ，  出せず。
【００５６】
ｃ．  ３つまたはそれ以上の塩基の候補が示された。最終的に決定された位置に下線を示した。  ＮＡ，  特定されず。
ｄ．  Ｇ，  ［１３Ｃ１０］ＧＴＰ  によって標識された内部標準を用いて化学量論的に定量した；  Ｕ／Ｃ，  ［１３Ｃ９］ＵＴＰ  および  ［１３Ｃ９］ＣＴＰ  によって標識された内部標準を用いて化学量論的に定量した；  Ｎ，  化学量論は、同じＲＮＡ骨格を有し同位体標識していないＲＮＡ断片のＬＣ−ＭＳピーク領域の割合（修飾を有する断片の全領域／全ての断片の全領域）によって決定された；  ＳＡ，  Ｔａｏｋａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０１５  Ｏｃｔ  １５；４３（１８）：ｅ１１５に記載、標準的な添加方法によって、化学量論を決定した；  ＮＤ，  検出せず。
【００５７】
ヒトｒＲＮＡが多くの配列変異を含有することにもまた注目すべきである。本明細書の実施例で用いたヒトＴＫ６細胞は、５つの配列変異を含有する。変異には、全配列の〜０．１％領域内の塩基挿入、欠失および置換が含まれるが、そこには、修飾ヌクレオシドは含まれないことが見出されている。したがって、ＴＫ６細胞において、ヒトｒＲＮＡ配列における変異は、前記同定方法に影響をもたらさない、
ただし、上記同定方法は、哺乳動物細胞を、ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害するように処理したものを利用して、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する。生体内における、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の修飾率をより正確に把握するためには、健常者から単離された細胞を用いて、決定することが望ましい。一態様において、前記同定方法は、さらに、
（６−１）健常者から単離された細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（６−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、
ことを含んでもよい。
【００５８】
「健常者から単離された細胞」とは、健康な個体から単離された細胞であって、ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害したするように処理されていない細胞を意味する。
【００５９】
（６−２）において、健常者から単離された細胞から取得した目的のＲＮＡにおいて、５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を決定する場合、一態様において、（５）の（４）で同定された、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を決定する、工程は、行わなくてもよい。
【００６０】
３．哺乳動物細胞
一態様において、本発明は、ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞に関する。
【００６１】
「ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞」の意義、製造方法等は、「１．ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する方法」および「２．５位の転写後修飾部位の転写後修飾率の決定」において上述した通りである。
【００６２】
一態様において、本発明は、本発明の同定方法に使用するための、ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸のの新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞、に関する。
【００６３】
一態様において、本発明は、ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸のの新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞の、本発明の同定方法への使用、に関する。
【００６４】
一態様において、哺乳動物細胞は、ウリジンモノリン酸合成酵素またはシチジンモノリン酸をコードする遺伝子が破壊された細胞である。
哺乳動物細胞の種類は特に限定されない。哺乳動物細胞は、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ブタを含む哺乳動物に由来する細胞でありうる。哺乳動物細胞は、哺乳動物から採取された細胞を利用しても良いし、樹立された培養細胞であってもよい。一態様において、哺乳動物細胞は、ヒト由来の細胞である。一態様において、哺乳動物細胞は、ＴＫ６細胞またはＦＭ３Ａ細胞である。
【００６５】
４．ＲＮＡ中のウリジンの５位の転写後修飾部位と、疾患の関連性を決定する方法
一態様において、本発明は、ＲＮＡ中のウリジンの５位の転写後修飾部位と、疾患の関連性を決定する方法に関する。
【００６６】
一態様において、前記ＲＮＡ中のウリジンの５位の転写後修飾部位と、疾患の関連性を決定する方法は、
（Ａ−１）ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞を、５位を標識したウリジンまたはシチジンを含む培地で培養し、
（Ａ−２）（Ａ−１）で得られた培養細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ａ−３）目的ＲＮＡの質量分析を行い、
（Ａ−４）（Ａ−３）の質量分析スペクトルを、ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位が全く生じない場合の質量分析スペクトルと比較することにより、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する、
（Ｂ−２）健常者から単離された細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ｂ−５）（Ｂ−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、
（Ｃ−２）疾患に罹患している対象から単離された細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ｃ−５）（Ｃ−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、そして、
（Ｄ）（Ｂ−５）の転写後修飾率と（Ｃ−５）の転写後修飾率に相違がある場合、当該転写後修飾部位が疾患と関連性がある、と決定する、
と、疾患の関連性を決定する
ことを含む。
【００６７】
工程（Ａ−１）−（Ａ−４）により、ＲＮＡ中のウリジンの５位のＰＴＭの部位および種類が同定される。（Ａ）の工程により、ＲＮＡの５位のＰＴＭのランドスケープが作成できる。
【００６８】
工程（Ｂ−２）、（Ｂ−５）により健常者の細胞におけるＲＮＡの５位のＰＴＭのランドスケープが作成できる。
工程（Ｃ−２）、（Ｃ−５）により疾患に罹患している対象の細胞におけるＲＮＡの５位のＰＴＭのランドスケープが作成できる。
【００６９】
工程（Ｄ）において、（Ｂ−５）の転写後修飾率と（Ｃ−５）の転写後修飾率を比較し、両者に相違がある場合、当該転写後修飾部位が疾患と関連性がある、と決定する、ことができる。
【００７０】
一態様において、前記ＲＮＡ中のウリジンの５位の転写後修飾部位と、疾患の関連性を決定する方法は、
（Ａ−１）ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞を、５位を標識したウリジンまたはシチジンを含む培地で培養し、
（Ａ−２）（Ａ−１）で得られた培養細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ａ−３）目的ＲＮＡの質量分析を行い、
（Ａ−４）（Ａ−３）の質量分析スペクトルを、ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位が全く生じない場合の質量分析スペクトルと比較することにより、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する、
（Ａ−５）（Ａ−４）で同定された、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、
（Ｃ−２）疾患に罹患している対象から単離された細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ｃ−５）（Ｃ−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、そして、
（Ｄ’）（Ａ−５）の転写後修飾率と（Ｃ−５）の転写後修飾率に相違がある場合、当該転写後修飾部位が疾患と関連性がある、と決定する、
と、疾患の関連性を決定する
ことを含む、前記方法。
【００７１】
工程（Ａ−１）−（Ａ−４）により、ＲＮＡ中のウリジンの５位のＰＴＭの部位および種類が同定される。さらに、（Ａ−５）により各ＰＴＭの修飾率が特定される。（Ａ）の工程により、ＲＮＡの５位のＰＴＭのランドスケープが作成できる。
【００７２】
工程（Ｃ−２）、（Ｃ−５）により疾患に罹患している対象の細胞におけるＲＮＡの５位のＰＴＭのランドスケープが作成できる。
工程（Ｄ’）において、（Ａ−５）の転写後修飾率と（Ｃ−５）の転写後修飾率を比較し、両者に相違がある場合、当該転写後修飾部位が疾患と関連性がある、と決定する、ことができる。
【００７３】
本発明の同定方法により得られた、健常者の細胞におけるＲＮＡの５位のＰＴＭのランドスケープ、あるいは、ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞におけるＲＮＡの５位のＰＴＭのランドスケープと、疾患に罹患している対象の細胞におけるＲＮＡの５位のＰＴＭのランドスケープとを比較することにより、両者に相違がある場合に、その５位のＰＴＭは、特定の疾患と関連していると判断することができる。健常者の細胞におけるＲＮＡの５位のＰＴＭのランドスケープと、ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞におけるＲＮＡの５位のＰＴＭのランドスケープは、実質上同じである可能性が高いと解する。しかしながら、健常者の細胞におけるＲＮＡの５位のＰＴＭのランドスケープを作成する方が、即ち、工程（Ｂ−２）、（Ｂ−５）を行う方が望ましい。
【００７４】
疾患は、ＲＮＡの５位のＰＴＭが関与している、または、関与している可能性がある、と予測される疾患であれば、種類は特に限定されない。疾患は、非限定的に、先天性角化不全症（ＤＣ）、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、末梢性T 細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、非小細胞性肺がんからなる群から選択される疾患である。
【００７５】
本明細書の実施例において、先天性角化不全症（ＤＣ）患者に由来する２８Ｓ  ｒＲＮＡにおいて、４３３１位および４９６６位に、比較的より少ないシュードウリジン化が検出された。一態様において、疾患は、先天性角化不全症（ＤＣ）であり、疾患との関連性が決定されている目的ＲＮＡ中のウリジンの５位の転写後修飾部位が、ヒト２８Ｓ  ｒＲＮＡの４３３１位および４９６６位である。
【００７６】
５．対象が、疾患に罹患している可能性、または、疾患を発症する可能性を検査する方法
本発明の方法により、疾患と関連性のある５位の転写後修飾部位が見出されると、罹患しているか否かが未知の対象について、疾患に罹患している可能性、または、疾患を発症する可能性を検査することが可能になる。一態様において、本発明は、対象が、疾患に罹患している可能性、または、疾患を発症する可能性を検査する方法を提供する。
【００７７】
前記方法は、
（Ａ−１）ウリジンモノリン酸またはシチジンモノリン酸の新合成機能を欠失した、または、阻害した哺乳動物細胞を、５位を標識したウリジンまたはシチジンを含む培地で培養し、
（Ａ−２）（Ａ−１）で得られた培養細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ａ−３）目的ＲＮＡの質量分析を行い、
（Ａ−４）（Ａ−３）の質量分析スペクトルを、ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位が全く生じない場合の質量分析スペクトルと比較することにより、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位を同定する、
（Ｂ−２）健常者から単離された細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ｂ−５）（Ｂ−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、
（Ｃ−２）疾患に罹患している対象から単離された細胞から、目的のＲＮＡを取得し、
（Ｃ−５）（Ｃ−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、そして、
（Ｄ）（Ｂ−５）の転写後修飾率と（Ｃ−５）の転写後修飾率に相違がある場合、当該転写後修飾部位が疾患と関連性がある、と決定する、
（Ｅ−２）対象から単離された細胞から目的のＲＮＡを取得し、
（Ｅ−５）（Ｄ）で疾患と関連性があると決定された、ウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位について、（Ｅ−２）の目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、そして、
（Ｆ）（Ｄ）で疾患と関連性があると決定されたウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位について、（Ｂ−５）の転写後修飾率と（Ｅ−５）の転写後修飾率に相違がある場合、対象が前記疾患に罹患している可能性、または、前記疾患を発症する可能性を有すると決定する、
ことを含む。
【００７８】
工程（Ａ）−（Ｄ）の意義は、「４．ＲＮＡ中のウリジンの５位の転写後修飾部位と、疾患の関連性を決定する方法」に記載の通りである。
工程（Ｅ−２）、（Ｅ−５）により、疾患に罹患している可能性、または、前記疾患を発症する可能性を有するかを調べたい対象の細胞におけるＲＮＡの５位のＰＴＭのランドスケープが作成できる。
【００７９】
工程（Ｆ）において、（Ｂ−５）の転写後修飾率と（Ｅ−５）の転写後修飾率を比較し、両者に相違がある場合、対象が前記疾患に罹患している可能性、または、前記疾患を発症する可能性を有すると決定する、ことができる。
【００８０】
工程（Ｂ−２）、（Ｂ−５）を省略し、代わりに、（Ａ−５）（Ａ−４）で同定された、目的ＲＮＡ中のウリジンまたはシチジンの５位の転写後修飾部位の転写後修飾率を、安定同位体標識したＲＮＡを内部標準として用いる定量ＲＮＡ分析方法によって決定する、ことを行ってもよい。その場合、（Ａ−５）の転写後修飾率と（Ｅ−５）の転写後修飾率を比較し、両者に相違がある場合、対象が前記疾患に罹患している可能性、または、前記疾患を発症する可能性を有すると決定する。
【００８１】
疾患は、ＲＮＡの５位のＰＴＭが関与している、または、関与している可能性がある、と予測される疾患であれば、種類は特に限定されない。疾患は、非限定的に、先天性角化不全症（ＤＣ）、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、末梢性T 細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、非小細胞性肺がんからなる群から選択される疾患である。
【００８２】
一態様において、疾患は、先天性角化不全症（ＤＣ）であり、疾患との関連性が決定されている目的ＲＮＡ中のウリジンの５位の転写後修飾部位が、ヒト２８Ｓ  ｒＲＮＡの４３３１位および４９６６位である。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００８４】
材料および方法
本実施例において、特に明記しない限り、以下の材料および方法を用いた。
試薬
ナトリウムグアノシン−１３Ｃ１０  ５’−三リン酸（９８原子％１３Ｃ）およびＲＮアーゼＡをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより得た。ナトリウムシチジン−１３Ｃ９  ５’−三リン酸およびナトリウムウリジン−１３Ｃ９  ５’−三リン酸（９８原子％１３Ｃ）をＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより購入した。５，６−Ｄ２−ウリジンをＣ／Ｄ／Ｎ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓより得た。ＲＮアーゼＴ１をＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎより購入し、そして使用前に逆相ＬＣによってさらに精製した。酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）をＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈより購入した。
【００８５】
標準的な実験室化学薬品は、和光純薬より得た。
化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを、ＪＢｉｏＳより得た。各オリゴヌクレオチドの塩基配列を、以下の表２に記載する。
【００８６】
【表２】
2020103258.tif 000012
【００８７】
細胞および培養条件
ＴＫ６細胞（脾臓由来のヒトリンパ芽球細胞、エプスタイン−バーウイルス癌化）およびＨｅＬａ細胞（子宮頸部由来のヒト上皮細胞、腺癌）をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより得た。ＴＫ６およびＨｅＬａ細胞を記載されるように３７℃で培養した。
【００８８】
本明細書の実施例で用いた培地を以下の表３に記載する。
【００８９】
【表３】
2020103258.tif 000013
【００９０】
Ｕ／Ｃ−５，６−Ｄ２標識ｒＲＮＡを得るため、ＵＭＰＳ欠損ＴＫ細胞を、天然同位体分布を伴うウリジンの代わりに３３０μＭ  ５，６−Ｄ２−ウリジンを含有するＵ／Ｃ−５，６−Ｄ２標識培地中で培養した。
【００９１】
ＤＣ線維芽細胞、リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）、および対照細胞を、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（ＧＭ０１７７４、ＧＭ０１７８６、ＧＭ０１７８７、ＡＧ０４６４５、ＧＭ０３１９４、ＧＭ０３１９５、ＧＭ０３６５０、およびＡＧ０３７３８、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｏｒｉｅｌｌ．ｏｒｇ／）または医薬基盤・健康・栄養研究所のレポジトリー（ＫＵＲＢ１９８３、ｈｔｔｐ：／／ｃｅｌｌｂａｎｋ．ｎｉｂｉｏｈｎ．ｇｏ．ｊｐ／）から得た。細胞を、２０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭまたは２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０中で維持した。
【００９２】
ＵＭＰＳ欠損ＴＫ６細胞の生成
シュードウリジン化の部位を確認するため、ウリジンモノリン酸シンテターゼが欠損したＴＫ６細胞を生成してウリジンのデノボ合成を遮断し、そしてウリジンの分子量をΨのものから区別するため、５，６−Ｄ２−ウリジンを含有する培地（表３）中で増殖させた。
【００９３】
用いた方法は、ヒトＵＭＰＳ遺伝子（遺伝子ＩＤ：７３７２、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／７３７２）をターゲティングするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術である。具体的には、ＵＭＰＳのエクソン１をターゲティングし、ネオマイシン耐性遺伝子またはピュロマイシン耐性遺伝子を挿入することにより、ＵＭＰＳ遺伝子を破壊した（図３）。そしてゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いたＰＣＲによって、ＵＭＰＳを含む適切な遺伝子ターゲティング事象を確認した。
【００９４】
ＵＭＰＳはＵＭＰ合成酵素である。ＵＭＰＳをノックアウトすることにより、ウリジン新合成経路が阻害され、サルベージ経路のみが進行する。その結果、ラベルウリジンを取り込み、ＲＮＡを生合成する。一例として、作成したウリジンモノリン酸シンテターゼが欠損したＴＫ６細胞（ＴＫ６ΔＵＭＰＳ）は、９９％の割合でラベルウリジンを取り込んだ。（図４、ＭＳスペクトル、ＭＳＭＳスペクトル）。
【００９５】
細胞ＲＮＡの調製
Ｓｅｐａｓｏｌ−ＲＮＡ  Ｉ  Ｓｕｐｅｒ  Ｇ（ナカライテスク、日本・京都）を用いて、１０ｍｌ  ＴＫ６細胞培養（〜１．０ｘ１０６細胞／ｍｌ）から総ＲＮＡ（２０μｇ）を調製した。ＰＬＲＰ−Ｓ  ３００Åカラム（２．１ｘ１００ｍｍ、３μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または４０００Åカラム（４．６ｘ１５０ｍｍ、１０μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上の逆相ＬＣによって、総細胞ＲＮＡ（〜１５μｇ）からｒＲＮＡを精製した（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１３１２，８７−９２，２０１３）。実施例には、９５％純度より高い純度のｒＲＮＡ調製を用いた。
【００９６】
ＲＮＡ断片の直接ナノフローＬＣ−ＭＳおよびタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）分析
核酸分解ＲＮＡ断片を、記載されるような直接ナノフローＬＣ−ＭＳ系（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３７，ｅ１４０，２００９）で分析した。ＬＣ溶出物を、スプレー補助デバイス（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，  ８７，２８８４−２８９１、２０１５）の補助で、−１．３ｋＶでオンライン式に、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に陰イオンモードでスプレーした。
【００９７】
他のセッティングは以下の文献に記載される通りに行った。
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ４４，８９５１−８９６１、２０１６
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ４４，ｅ５９，２０１５
データベース検索およびＭＳ／ＭＳ  ＲＮＡスペクトルの解釈
データベース検索およびＭＳ／ＭＳ  ＲＮＡスペクトルの割り当てには、Ａｒｉａｄｎｅの文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３７，ｅ４７、２００９）を用いた。実施例では、Ａｒｉａｄｎｅの文献と組み合わせるリソースとしてヒトゲノムデータベースを用いた（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，８７，２８８４−２８９１、２０１５）。
【００９８】
Ａｒｉａｄｎｅの以下のデフォルト検索パラメータを用いた：
切断見逃しの最大数、１；可変修飾パラメータ、いかなる残基に関しても、ＲＮＡ断片あたり２メチル化；ＲＮＡ質量許容、±５ｐｐｍ、およびＭＳ／ＭＳ許容、±２０ｐｐｍ。５，６−Ｄ２−ウリジン標識ＲＮＡを用いた、Ψ残基の割り当てに関して、質量表および可変修飾パラメータを、デフォルト値から、それぞれ、「５，６Ｄ＿ＣＵ」および「Ψ」に改変したが、これはＣおよびＵはどちらも培地で標識され、そしてシュードウリジン化反応は、５，６−Ｄ２−ウリジンの５位重水素の溶媒のプロトンへの交換を生じ、ａ−１Ｄａ質量シフトを提供するためであった。ｍ／ｚ  ２０７．０４１および２０８．０４７でのΨに特徴的なシグネチャーイオン（それぞれ、天然および６−Ｄ標識Ψを含有するｒＲＮＡに関する）もまた、Ψの割り当てに用いた（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，４４，ｅ５９，２０１５）。
【００９９】
ＳＩＬＮＡＳ用の内部標準ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写
内部標準ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用のプラスミドを構築するために、ヒト５Ｓ、５．８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡを、ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ用のプライマーは、表２に記載の通りである。ヒト５Ｓおよび５．８Ｓ  ｒＲＮＡをコードする、増幅されたＤＮＡをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した。１８Ｓ  ｒＲＮＡのために、増幅されたＤＮＡをプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）のＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した。２８Ｓ  ｒＲＮＡのために、ＰＣＲ増幅したＤＮＡの５’末端側の半分（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩ消化、〜２．４ｋｂ）と、化学合成したＤＮＡの３’末端側の半分（ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ消化、〜２．７ｋｂ、富士フィルム和光純薬株式会社）とを、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）に結合させた。３’末端側に合成ＤＮＡを使用したのでは、３’末端側の半分のＤＮＡは、非常にＧＣに富む領域を含み、増幅ができなかったたｍである。ｒＲＮＡの末端で産物を終結させるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の前に、プラスミドをＳｐｅＩまたはＸｈｏＩで直線化した。ＲＮＡ合成のたえに、鋳型ＤＮＡ２μｇをインキュベートし、Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ  Ｔ３またはＴ７  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて転写した。ＲＮＡを合成す際に、天然の同位体の分布の炭素を含む５’−３リン酸試薬の代わりに、グアノシン−１３Ｃ１０５’−３リン酸、シチジン−１３Ｃ９５’−３リン酸、またはウリジン−１３Ｃ９５’−３リン酸溶液を用いた。ＲＮＡをエタノール中に沈殿させ、ヌクレアーゼを含まない水中に溶解し、逆相−ＬＣによってさらに精製した。
【０１００】
ＰＴＭの化学量のＳＩＬＮＡＳに基づく定量化
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ４４，８９５１−８９６１、２０１６の記載に基づき、ＰＴＭの化学量のＳＩＬＮＡＳに基づく定量化を行った。
【０１０１】
簡潔には、天然供給源または天然同位体分布を伴うグアノシン中で増殖させた細胞由来のＲＮＡ（〜１００ｆｍоｌ）を、１３Ｃ標識グアノシンとともに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写した等量の合成ＲＮＡと混合した。ＲＮＡが１：１に混合されるように、２６０ｎｍの吸光度の測定に基づいて行い、そしてその後、修飾を含まない既知のヌクレオチド配列を含む〜１０の標識および非標識ＲＮＡ断片対の定量的分析によって実験的に得た修正係数によって、修正した。
【０１０２】
混合物を、１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）中のＲＮアーゼＴ１（〜４ｎｇ／μｌ）で、３７℃で６０分間消化した。１３Ｃ標識シチジンおよびウリジンとともに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写した参照ＲＮＡを用い、同じ方法によって、ＲＮアーゼＡ消化ＲＮＡ断片を産生した。各部位でのＲＮＡ修飾の化学量を、ＳＩＬＮＡＳ用に設計したＡｒｉａｄｎｅプログラムによって概算した。原則として、プログラムはまず、生データからＭＳシグナルの強度を抽出し、ＳＩＬＮＡＳによって産生されたＲＮＡ断片の軽いおよび重いシグナルのすべての対を割り当て、各対のシグナル強度を定量的に比較し、そして軽い（非修飾）および重い（非修飾および修飾の合計）断片間のシグナル強度の相違の、重い同位体で標識した断片のシグナル強度に対する比として修飾の化学量を決定する。計算に際して、Ａｒｉａｄｎｅプログラムは、商業的ｒＮＴＰの同位体不純物（〜２％）を考慮し、そして上述のように、実験的に得た修正係数によって、概算を修正する。最後に、元来のＭＳスペクトルの手動による検査によって結果を確認して、概算が「非混入」ＭＳシグナルに基づいているかどうかを調べた。
【０１０３】
多数のｒＲＮＡ位に由来する冗長配列を除去するため、ユニークなヌクレオチド配列を有する断片を用いて、ＴＫ６  ｒＲＮＡの修飾の化学量を概算した。ユニークなヌクレオチド配列内の修飾ヌクレオシド（単数または複数）を含有するこうした断片を得るため、多くの場合で、全長ｒＲＮＡの体系的なＲＮアーゼＨ切断を設計し、そして実行した。
【０１０４】
ＲＮＡ分析の他の方法
ｒＲＮＡの配列特異的ＲＮアーゼＨ切断を以下の文献：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，４３，ｅ１１５，２０１５およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，４４，８９５１−８９６１，２０１６、に記載されるように行った。切断に用いたすべてのＲＮＡ／ＤＮＡ配列は表２に記載した通りである。
【０１０５】
生じたＲＮアーゼＨ断片を、他のＲＮアーゼでのさらなる消化のため、上述のように、逆相ＬＣによって分離した。ＲＮＡ断片の質量、ならびにａ−、ｃ−、ｗ−、およびｙ−シリーズイオンを、Ａｒｉａｄｎｅによって計算した（ｈｔｔｐ：／／ａｒｉａｄｎｅ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／）。Ｃ／Ｕ−５Ｄ標識断片の計算のため、９８原子％重水素を用いた。ＰＤＢファイルによって定義されるような各ｒＲＮＡの三次構造を、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｄｂ  ｖｉｅｗｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｄｂｖ．ｖｉｔａｌ−ｉｔ．ｃｈ／）で分析した。
【０１０６】
限定されるわけではないが、ＳＩＬＮＡＳ技術は、化学量で〜５％を超えるすべてのＲＮＡ  ＰＴＭの包括的定量的同定を可能にする（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，４３，ｅ１１５，２０１５）。
【０１０７】
実施例１  ヒト１８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるΨ８９７
本実施例において、ヒト１８Ｓ  ｒＲＮＡの８９７位におけるウリジンからシュードウリジンΨ８９７へのＰＴＭを見出した。
【０１０８】
細胞１８Ｓ  ｒＲＮＡおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写参照（１３Ｃ１０−グアノシン標識）１８Ｓ  ｒＲＮＡを逆相ＨＰＬＣによって精製した。生じた「軽い」および「重い」ｒＲＮＡを１：１比で混合し、ＲＮアーゼＴ１で消化し、そしてＬＣ−ＭＳ分析に供した。原則として、ＲＮアーゼＴ１は、細胞および参照１８Ｓ  ｒＲＮＡの各々の配列８９６〜９０１に由来する、３つの断片、すなわちＵＵＵＵＣＧｐ８９６−９０１、ＵＵＵＵＣ＊Ｇｐ８９６−９０１、および修飾ＵＵＵＵＣＧｐ８９６−９０１（ＵΨＵＵＣＧｐ８９６−９０１）を産生するはずである。
【０１０９】
ＵＵＵＵＣＧｐおよびその同族断片の抽出イオンモニタリングの結果を図５Ａに示す。ＵＵＵＵＣＧｐ同族断片を、精製１８Ｓ  ｒＲＮＡのＲＮアーゼＴ１消化によって得た。ＬＣ−ＭＳ分析において、断片ＵＵＵＵＣＧｐ８９６−９０１および対応する重い断片ＵＵＵＵＣ＊Ｇｐ８９６−９０１は同時に溶出した。オリゴヌクレオチドイオン質量を右側に示す。抽出に用いた質量ウインドウは±５ｐｐｍであった。軽いおよび重いＵＵＵＵＣＧｐイオンのＭＳスペクトルのシグナルの高さから、修飾の化学量は２３％と概算された。
【０１１０】
Ａｒｉａｄｎｅを用いたヒトｒＲＮＡ配列を通じたデータベース検索によって分析した、ＵΨＵＵＣＧｐ８９６−９０１の同定およびシュードウリジン化の部位を図５Ｂに示す。ＵΨＵＵＣＧｐ８９６−９０１を、Ｃ／Ｕ−５，６−ｄ２標識１８Ｓ  ｒＲＮＡのＲＮアーゼＴ１消化物から分離した。ＭＳ／ＭＳスペクトルを［ＵΨＵＵＣＧｐ］２−（ｍ／ｚ  ９４９．６２３）に関して衝突誘起解離によって得た。ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚイオンならびにその誘導体を用いて、ＵΨＵＵＣＧｐ８９６−９０１の完全配列カバーを達成した。
【０１１１】
図５Ｃは、ＵΨＵＵＣＧｐ８９６−９０１に関するＭＳ／ＭＳシグナルから同定された解離イオンを示す。
実施例２  ヒト１８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるΨ１０４５
本実施例において、ヒト１８Ｓ  ｒＲＮＡの１０４５位におけるウリジンからシュードウリジンΨ１０４５へのＰＴＭを見出した。
【０１１２】
細胞１８Ｓ  ｒＲＮＡおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写参照（１３Ｃ１０−グアノシン標識）１８Ｓ  ｒＲＮＡを逆相ＨＰＬＣによって精製した。生じた「軽い」および「重い」ｒＲＮＡを１：１比で混合し、ＲＮアーゼＴ１で消化し、そしてＬＣ−ＭＳ分析に供した。原則として、ＲＮアーゼＴ１は、細胞および参照１８Ｓ  ｒＲＮＡの各々の配列４２２〜４２５および１０４５〜１０４８に由来する、５つの断片、すなわちＵＵＣＧｐ４２２−４２５、ＵＵＣＧｐ１０４５−１０４８、ＵＵＣ＊Ｇｐ４２２−４２５、ＵＵＣ＊Ｇｐ１０４５−１０４８および修飾ＵＵＣＧｐ１０４５−１０４８（ΨΨＣＧｐ１０４５−１０４８）を産生するはずである。ＲＮアーゼＴ１で消化したＲＮアーゼＨ断片Ｈ２を用いた以前の分析において、我々は、１８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるＵ４２２はΨを含有しないことを確認した（データ未提示）。
【０１１３】
ＵＵＣＧｐおよびその同族断片の抽出イオンモニタリングの結果を図６Ａに示す。ＵＵＣＧｐ同族断片を、精製１８Ｓ  ｒＲＮＡのＲＮアーゼＴ１消化によって得た。ＬＣ−ＭＳ分析において、断片ＵＵＣＧｐ４２２−４２５およびＵＵＣＧｐ１０４５−１０４８、ならびに対応する重い断片ＵＵＣ＊Ｇｐ４２２−４２５およびＵＵＣ＊Ｇｐ１０４５−１０４８は同時に溶出した。オリゴヌクレオチドイオン質量を右側に示す。抽出に用いた質量ウィンドウは±５ｐｐｍであった。軽いおよび重いＵＵＣＧｐイオンのＭＳスペクトルのシグナルの高さから、修飾の化学量は９２％と概算された。
【０１１４】
Ａｒｉａｄｎｅを用いたヒトｒＲＮＡ配列を通じたデータベース検索によって分析した、ΨΨＣＧｐ１０４５−１０４８の同定およびシュードウリジン化の部位を図６Ｂに示す。ΨΨＣＧｐ１０４５−１０４８を、Ｃ／Ｕ−５，６−ｄ２標識１８Ｓ  ｒＲＮＡのＲＮアーゼＴ１消化物から分離した。ＭＳ／ＭＳスペクトルを［ΨΨＣＧｐ］２−（ｍ／ｚ  ６４１．０８１）に関して衝突誘起解離によって得た。ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚイオンならびにその誘導体を用いて、ΨΨＣＧｐ１０４５−１０４８の完全配列カバーを達成した。
【０１１５】
図６Ｃは、ΨΨＣＧｐ１０４５−１０４８に関するＭＳ／ＭＳシグナルから同定された解離イオンを示す。
実施例３  ヒト１８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるΨ１１３６
本実施例において、ヒト１８Ｓ  ｒＲＮＡの１１３６位におけるウリジンからシュードウリジンΨ１１３６へのＰＴＭを見出した。
【０１１６】
細胞１８Ｓ  ｒＲＮＡおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写参照（１３Ｃ１０−グアノシン標識）１８Ｓ  ｒＲＮＡを逆相ＨＰＬＣによって精製した。生じた「軽い」および「重い」ｒＲＮＡを１：１比で混合し、ＲＮアーゼＴ１で消化し、そしてＬＣ−ＭＳ分析に供した。原則として、ＲＮアーゼＴ１は、細胞および参照１８Ｓ  ｒＲＮＡの各々の配列１１３５〜１１４０に由来する、ＣＵＵＣＣＧｐ１１３５−１１４０、ＣＵＵＣＣ＊Ｇｐ１１３５−１１４０、および修飾ＣＵＵＣＣＧｐ１１３５−１１４０（ＣΨＵＣＣＧｐ１１３５−１１４０）を産生するはずである。
【０１１７】
ＣＵＵＣＣＧｐおよびその同族断片の抽出イオンモニタリングの結果を図７Ａに示す。ＣＵＵＣＣＧｐ同族断片を、精製１８Ｓ  ｒＲＮＡのＲＮアーゼＴ１消化によって得た。ＬＣ−ＭＳ分析において、断片ＣＵＵＣＣＧｐ１１３５−１１４０および対応する重い断片ＣＵＵＣＣ＊Ｇｐ１１３５−１１４０は同時に溶出した。オリゴヌクレオチドイオン質量を右側に示す。抽出に用いた質量ウィンドウは±５ｐｐｍであった。軽いおよび重いＣＵＵＣＣＧｐイオンのＭＳスペクトルのシグナルの高さから、修飾の化学量は７％と概算された。
【０１１８】
Ａｒｉａｄｎｅを用いたヒトｒＲＮＡ配列を通じたデータベース検索によって分析した、ＣΨＵＣＣＧｐ１１３５−１１４０の同定およびシュードウリジン化の部位を図７Ｂに示す。ＣΨＵＣＣＧｐ１１３５−１１４０を、Ｃ／Ｕ−５，６−ｄ２標識１８Ｓ  ｒＲＮＡのＲＮアーゼＴ１消化物から分離した。ＭＳ／ＭＳスペクトルを［ＣΨＵＣＣＧｐ］２−（ｍ／ｚ  ９４８．６３５）に関して衝突誘起解離によって得た。ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚイオンならびにその誘導体を用いて、ＣΨＵＣＣＧｐ１１３５−１１４０の完全配列カバーを達成した。
【０１１９】
図７Ｃは、ＣΨＵＣＣＧｐ１１３５−１１４０に関するＭＳ／ＭＳシグナルから同定された解離イオンを示す。
実施例４  ヒト１８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるΨ１２３２
本実施例において、ヒト１８Ｓ  ｒＲＮＡの１２３２位におけるウリジンからシュードウリジンΨ１２３２へのＰＴＭを見出した。
【０１２０】
細胞１８Ｓ  ｒＲＮＡおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写参照（１３Ｃ１０−グアノシン標識）１８Ｓ  ｒＲＮＡ由来のＲＮアーゼＨ断片Ｈ５を逆相ＨＰＬＣによって精製した。生じた「軽い」および「重い」断片を１：１比で混合し、ＲＮアーゼＴ１で消化し、そしてＬＣ−ＭＳ分析に供した。原則として、ＲＮアーゼＴ１は、細胞および参照１８Ｓ  ｒＲＮＡの各々の配列１２３０〜１２３３に由来する、３つの断片、すなわちＣＣＵＧｐ１２３０−１２３３、ＣＣＵ＊Ｇｐ１２３０−１２３３（＊Ｇ、１３Ｃ１０−グアノシン）、および修飾ＣＣＵＧｐ１２３０−１２３３（ＣＣΨＧｐ１２３０−１２３３）を産生するはずである。
【０１２１】
ＣＣＵＧｐおよびその同族断片の抽出イオンモニタリングの結果を図８Ａに示す。ＣＣＵＧｐ同族断片を、１８Ｓ  ｒＲＮＡの精製ＲＮアーゼＨ１２１１〜１４３５断片のＲＮアーゼＴ１消化によって得た。ＬＣ−ＭＳ分析において、断片ＣＣＵＧｐ１２３０−１２３３および対応する重い断片ＣＣＵ＊Ｇｐ１２３０−１２３３は同時に溶出した。オリゴヌクレオチドイオン質量を右側に示す。軽いおよび重いＣＣＵＧｐイオンのＭＳスペクトルのシグナルの高さから、修飾の化学量は９７％と概算された。
【０１２２】
Ａｒｉａｄｎｅを用いたヒトｒＲＮＡ配列を通じたデータベース検索によって分析した、ＣＣΨＧｐ１２３０−１２３３の同定およびシュードウリジン化の部位を図８Ｂに示す。ＣＣΨＧｐ１２３０−１２３３を、Ｃ／Ｕ−５，６−ｄ２標識１８Ｓ  ｒＲＮＡのＲＮアーゼＴ１消化物から分離した。ＭＳ／ＭＳスペクトルを［ＣＣΨＧｐ］２−（ｍ／ｚ  ６４１．０９３）に関して衝突誘起解離によって得た。ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚイオンならびにその誘導体を用いて、ＣＣΨＧｐ１２３０−１２３３の完全配列カバーを達成した。
【０１２３】
図８Ｃは、ＣＣΨＧｐ１２３０−１２３３に関するＭＳ／ＭＳシグナルから同定された解離イオンを示す。
実施例５  ヒト２８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるΨ１７６８
本実施例において、ヒト２８Ｓ  ｒＲＮＡの１７６８位におけるウリジンからシュードウリジンΨ１７６８へのＰＴＭを見出した。
【０１２４】
細胞２８Ｓ  ｒＲＮＡおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写参照（１３Ｃ１０−グアノシン標識）２８Ｓ  ｒＲＮＡを逆相ＨＰＬＣによって精製した。生じた「軽い」および「重い」断片を１：１比で混合し、ＲＮアーゼＴ１で消化し、そしてＬＣ−ＭＳ分析に供した。
【０１２５】
ＡＵＣＵＣＡＡＣＣＵＡＵＵＣＵＣＡＡＡＣＵＵＵＡＡＡＵＧｐおよびその同族断片の抽出イオンモニタリングの結果を図９Ａに示す。ＬＣ−ＭＳ分析によって、我々は、５つの同族断片、即ち、各々細胞２８Ｓ  ｒＲＮＡおよび参照２８Ｓ  ｒＲＮＡの１７５７−１７８４の配列に由来する、ＡＵＣＵＣＡＡＣＣＵＡＵＵＣＵＣＡＡＡＣＵＵＵＡＡＡＵ＊Ｇｐ１７５７−１７８４、並びに、修飾されたＡＵＣＵＣＡＡＣＣＵＡＵＵＣＵＣＡＡＡＣＵＵＵＡＡＡＵＧｐ１７５７−１７８４（ＡＵＣＵｍＣＡＡＣＣΨＡΨΨＣＵＣＡＡＡＣＵＵΨＡＡＡＵＧｐ１７５７−１７８４、ＡＵＣＵＣＡＡＣＣΨＡΨΨＣＵＣＡＡＡＣＵＵΨＡＡＡＵＧｐ１７５７−１７８４、ＡＵＣＵｍＣＡＡＣＣＵＡΨΨＣＵＣＡＡＡＣＵＵΨＡＡＡＵＧｐ１７５７−１７８４、およびＡＵＣＵＣＡＡＣＣＵＡΨΨＣＵＣＡＡＡＣＵＵΨＡＡＡＵＧｐ１７５７−１７８４）を決定した。ＡＵＣＵＣＡＡＣＣＵＡＵＵＣＵＣＡＡＡＣＵＵＵＡＡＡＵＧｐ１７５７−１７８４の断片は検出されなかった。最も豊富な量のオリゴヌクレオチドはイオンは、右に示されている。
【０１２６】
Ａｒｉａｄｎｅを用いたヒトｒＲＮＡ配列を通じたデータベース検索によって分析した、ＡＵＣＵｍＣＡＡＣＣΨＡΨΨＣＯＨ１７５７−１７７０の同定およびシュードウリジン化の部位を図９Ｂに示す。ＡＵＣＵｍＣＡＡＣＣΨＡΨΨＣＯＨ１７５７−１７７０を、（ｈ２８Ｓ−１７８３−キメラオリゴヌクレオチドを用いて）Ｃ／Ｕ−５，６−ｄ２標識２８Ｓ  ｒＲＮＡのＲＮアーゼＴ１消化物から分離した。ＭＳ／ＭＳスペクトルを［ＡＵＣＵｍＣＡＡＣＣΨＡΨΨＣＯＨ］３-（ｍ／ｚ１４４５．８９８）に関して衝突誘起解離によって得た。ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚイオンならびにその誘導体を用いて、ＡＵＣＵｍＣＡＡＣＣΨＡΨΨＣＯＨ１７５７−１７７０の完全配列カバーを達成した。
【０１２７】
図９Ｃは、ＡＵＣＵｍＣＡＡＣＣΨＡΨΨＣＯＨ１７５７−１７７０に関するＭＳ／ＭＳシグナルから同定された解離イオンを示す。
実施例６  ヒト２８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるΨ２６１９
本実施例において、ヒト２８Ｓ  ｒＲＮＡの２６１９位におけるウリジンからシュードウリジンΨ２６１９へのＰＴＭを見出した。
【０１２８】
細胞２８Ｓ  ｒＲＮＡおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写参照（１３Ｃ１０−グアノシン標識）２８Ｓ  ｒＲＮＡを逆相ＨＰＬＣによって精製した。生じた「軽い」および「重い」断片を１：１比で混合し、ＲＮアーゼＴ１で消化し、そしてＬＣ−ＭＳ分析に供した。原則として、ＲＮアーゼＴ１は、細胞および参照２８Ｓ  ｒＲＮＡの各々の配列２１６２〜２６２５に由来する、３つの断片、すなわちＵＵＣＵＣＵＵＵＵＣＵＵＵＧｐ２６１２−２６２５、ＵＵＣＵＣＵＵＵＵＣＵＵＵ＊Ｇｐ２６１２−２６２５、および修飾ＵＵＣＵＣＵＵＵＵＣＵＵＵＧｐ２６１２−２６２５（ＵＵＣＵＣＵＵΨＵＣＵＵＵＧｐ２６１２−２６２５）を産生するはずである。
【０１２９】
ＵＵＣＵＣＵＵＵＵＣＵＵＵＧｐおよびその同族断片の抽出イオンモニタリングの結果を図１０Ａに示す。ＵＵＣＵＣＵＵＵＵＣＵＵＵＧｐ同族断片を、精製２８Ｓ  ｒＲＮＡのＲＮアーゼＴ１消化によって得た。ＬＣ−ＭＳ分析において、断片ＵＵＣＵＣＵＵＵＵＣＵＵＵＧｐ２６１２−２６２５および対応する重い断片ＵＵＣＵＣＵＵＵＵＣＵＵＵ＊Ｇｐ２６１２−２６２５は同時に溶出した。オリゴヌクレオチドイオン質量を右側に示す。抽出に用いた質量ウィンドウは±５ｐｐｍであった。軽いおよび重いＵＵＣＵＣＵＵＵＵＣＵＵＵＧｐイオンのＭＳスペクトルのシグナルの高さから、修飾の化学量は９０％と概算された。
【０１３０】
Ａｒｉａｄｎｅを用いたヒトｒＲＮＡ配列を通じたデータベース検索によって分析した、ＵＵＣＵＣＵＵΨＵＣＵＵＵＧｐ２６１２−２６２５の同定およびシュードウリジン化の部位を図１０Ｂに示す。ＵＵＣＵＣＵＵΨＵＣＵＵＵＧｐ２６１２−２６２５を、Ｃ／Ｕ−５，６−ｄ２標識２８Ｓ  ｒＲＮＡのＲＮアーゼＴ１消化物から分離した。ＭＳ／ＭＳスペクトルを［ＵＵＣＵＣＵＵΨＵＣＵＵＵＧｐ］３−（ｍ／ｚ  １４５３．５２６）に関して衝突誘起解離によって得た。ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚイオンならびにその誘導体を用いて、ＵＵＣＵＣＵＵΨＵＣＵＵＵＧｐ２６１２−２６２５の完全配列カバーを達成した。
【０１３１】
図１０Ｃは、ＵＵＣＵＣＵＵΨＵＣＵＵＵＧｐ２６１２−２６２５に関するＭＳ／ＭＳシグナルから同定された解離イオンを示す。
実施例７  ヒト２８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるΨ４４６３
本実施例において、ヒト２８Ｓ  ｒＲＮＡの４４６２におけるウリジンからシュードウリジンΨ４４６３へのＰＴＭを見出した。
【０１３２】
細胞２８Ｓ  ｒＲＮＡおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写参照（１３Ｃ１０−グアノシン標識）２８Ｓ  ｒＲＮＡ由来のＲＮアーゼＨ断片Ｈ２７を逆相ＨＰＬＣによって精製した。生じた「軽い」および「重い」断片を１：１比で混合し、ＲＮアーゼＴ１で消化し、そしてＬＣ−ＭＳ分析に供した。原則として、ＲＮアーゼＴ１は、細胞および参照２８Ｓ  ｒＲＮＡの各々の配列４４６２〜４４６４に由来する、５つの断片、すなわちＵＵＧｐ４４６２−４４６４、ＵＵ＊Ｇｐ４４６２−４４６４、および修飾ＵＵＧｐ４４６２−４４６４（ＵΨＧｐ４４６２−４４６４、ＵＵＧｍＧｐ４４６２−４４６５、およびＵΨＧｍＧｐ４４６２−４４６５）を産生するはずである。
【０１３３】
ＵＵＧｐおよびその同族断片の抽出イオンモニタリングの結果を図１１Ａに示す。ＵＵＧｐ同族断片を、２８Ｓ  ｒＲＮＡの精製ＲＮアーゼＨ断片Ｈ２７のＲＮアーゼＴ１消化によって得た。ＬＣ−ＭＳ分析において、断片ＵＵＧｐ４４６２−４４６４および対応する重い断片ＵＵ＊Ｇｐ４４６２−４４６４は同時に溶出した。オリゴヌクレオチドイオン質量を右側に示す。抽出に用いた質量ウィンドウは±５ｐｐｍであった。各断片のＭＳクロマトグラムのピーク面積から、Ψ４４６３での修飾の化学量は１７％と概算された。
【０１３４】
Ａｒｉａｄｎｅを用いたヒトｒＲＮＡ配列を通じたデータベース検索によって分析した、ＵΨＧｍＧｐ４４６２−４４６５の同定およびシュードウリジン化の部位を図１１Ｂに示す。ＵΨＧｍＧｐ４４６２−４４６５を、Ｃ／Ｕ−５，６−ｄ２標識２８Ｓ  ｒＲＮＡのＲＮアーゼＴ１消化物から分離した。ＭＳ／ＭＳスペクトルを［ＵΨＧｍＧｐ］２−（ｍ／ｚ  ６６７．５８９）に関して衝突誘起解離によって得た。ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚイオンならびにその誘導体を用いて、ＵΨＧｍＧｐ４４６２−４４６５の完全配列カバーを達成した。
【０１３５】
図１１Ｃは、ＵΨＧｍＧｐ４４６２−４４６５に関するＭＳ／ＭＳシグナルから同定された解離イオン。
実施例８  候補ガイドｓｎоＲＮＡ、ならびにヒト１８Ｓ／２８Ｓ  ｒＲＮＡにおける７つのシュードウリジン化部位間の潜在的な塩基対形成相互作用
本実施例では、候補ガイドｓｎоＲＮＡ、ならびにヒト１８Ｓ／２８Ｓ  ｒＲＮＡにおける７つのシュードウリジン化部位間の潜在的な塩基対形成相互作用を調べた。
【０１３６】
具体的には、本発明で見出された各シュードウリジン化部位をターゲティングするボックスＡＣＡ  ｓｎоＲＮＡを、ｓｎоＲＮＡ  Ａｔｌａｓデータベース（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，４４，５０６８−５０８２、２０１６）（ｈｔｔｐ：／／ｓｎｏａｔｌａｓ．ｂｉｏｉｎｆ．ｕｎｉ−ｌｅｉｐｚｉｇ．ｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）中にコンパイルされるｓｎоＲＮＡ配列を用いて、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０１６；４４（１８）：８９５１−８９６１に記載のプログラムによって予測されるように。各部位での修飾に関与する候補ガイドｓｎｏＲＮＡを提示した
図１２Ａから図１２Ｇは、各ΨガイドｓｎоＲＮＡ並びに１８Ｓ  ｒＲＮＡにおける各シュードウリジンの周囲のｒＲＮＡに対するその塩基対形成を示す。図１２Ａ  １８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるΨ８９７、図１２Ｂ  １８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるΨ１０４５、図１２Ｃ  １８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるΨ１１３６、および、図１２Ｄ  １８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるΨ１２３２。図１２Ｅ  ２８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるΨ１７６８、図１２Ｆ  ２８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるΨ２６１９、および、図１２Ｇ  ２８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるΨ４４６３（Ｂ７）。ｓｎоＲＮＡおよびｒＲＮＡ配列をそれぞれ、上部および下部鎖に示す。ＨおよびＡＣＡボックスを囲み、そしてヘアピンドメインを実線で図示する。修飾ヌクレオシドをヌクレオシド番号とともに青字で示す。「−」は、通常の水素結合を示し、「・」は、ＧＵ対形成を示す。
【０１３７】
実施例９  家族性先天性角化異常症（ＤＣ）患者由来のヒト８０ＳリボソームのｒＲＮＡのＰＴＭの評価
家族性先天性角化異常症（ＤＣ）は、シュードウリジンシンターゼ遺伝子ＤＫＣ１における点突然変異によって引き起こされる、組織維持不全および癌素因によって特徴付けられる、遺伝性疾患である。しかし、ＤＫＣ１はまた、テロメア維持因子でもあるため、どのＤＫＣ１活性がＤＣの病因形成に主に関与するのかは不明のままである。ＤＣの常染色体優性型は、テロメラーゼＲＮＡ  ＴＥＲＣの突然変異の結果であり、疾患のこの型は、テロメア維持の欠損によって引き起こされることが暗示される一方、ＤＫＣ１の触媒ドメインに見られる突然変異は、ＤＣのより重症型と関連し、疾患のこの型が、ｒＲＮＡシュードウリジンシンターゼ活性の欠損によって引き起こされることが暗示される。
【０１３８】
本実施例では、ＤＫＣ１の突然変異が、ｒＲＮＡのシュードウリジン化に影響を及ぼすかどうかを調べるため、ＤＣ患者由来の８０ＳリボソームのｒＲＮＡにおける、ウリジン→ΨのＰＴＭのＳＩＬＮＡＳに基づく包括的定量化を行うことによって、ｒＲＮＡ  ＰＴＭのランドスケープを、ヒト疾患がどのように改変しうるかを調べた。
【０１３９】
ＤＫＣ１シュードウリジンシンターゼの異なるドメインに位置する、４つの別個の突然変異、すなわちｄｅｌ３７Ｌ、Ａ３５３Ｖ、Ｔ６６Ａ、およびＡ３８６Ｔを宿する、７〜１９歳の５名の患者由来の線維芽細胞およびＢ−リンパ芽球様細胞株を培養した。患者の健常な親戚（４名）に由来する細胞を対照とした。
【０１４０】
【表４】
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【０１４１】
図１３は、ＤＣ患者細胞由来のＤＫＣ１におけるアミノ酸残基の置換または欠失の位置を示す。ＤＫＣ１の核局在化シグナル（Ｎ３Ｌ）およびＴｒｕＢおよびＰＵＡドメインを示す。赤い矢印は、本実施例で分析した患者ｒＲＮＡにおける突然変異を示す。図１３は、Ｖｕｌｌｉａｍｙら（Ｂｌｏｏｄ，  １０７，  ２６８０−２６８５、２００６）（ｈｔｔｐ：／／ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ．ａｓｕ．ｅｄｕ／ｄｉｓｅａｓｅｓ．ｈｔｍｌ）に基づく。
【０１４２】
ＤＣ関連細胞におけるｒＲＮＡ修飾の化学量は、断片の冗長を除去することなく、ＲＮアーゼＴ１断片の分析によってのみ概算された。したがって、冗長ヌクレオチド配列を含む断片の修飾は、より冗長でないかまたはユニークなヌクレオチド配列を含む断片におけるものよりも、より低い化学量で概算された。
【０１４３】
図１４は、ＤＣ患者および健康な対照の細胞由来の２８Ｓ  ｒＲＮＡにおけるＰＴＭの化学量間の相関を示す。５人のＤＣ患者および４人の非罹患親戚の細胞由来のすべてのｒＲＮＡにおけるＰＴＭを、ＳＩＬＮＡＳで評価した（表４）。４つのプロットは、対照株に対する４つのＤＫＣ１突然変異体細胞株（ｄｅｌ３７Ｌ、Ａ３５３Ｖ、Ｔ６６Ａ、Ａ３８６Ｔ）由来の２８Ｓ  ｒＲＮＡにおける修飾の化学量を比較し、そしてΨ４３３１およびΨ４９６６に関して有意な相違が検出された（赤い円）。患者ＫＵＲＢ１９８３およびＡＧ４６４５に関しては、親戚の細胞が入手不能であったため、患者ＫＵＲＢ１９８３およびＡＧ４６４５の対照として、非罹患親戚の平均化学量値を用いた。
【０１４４】
図１５は、ＤＣ患者細胞由来の２８Ｓ  ｒＲＮＡにおける４３３１および４９６６位のシュードウリジン化の相違の統計的有意性を示す。各値は、５人のＤＣ患者および４人の親戚（Ｃｔｒｌ）の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．０００５（片側スチューデントｔ検定）
本実施例において、各部位での修飾の化学量の詳細な比較に基づいて、ＤＣ患者に由来する２８Ｓ  ｒＲＮＡにおいて、４３３１位および４９６６位に、比較的より少ないシュードウリジン化が検出された。各場合の相違（〜４０％）は、統計的に有意であるようであり、そしてＤＫＣ１における突然変異部位に関わりなく、ＤＣ患者において明らかであると解釈される。ＤＣ患者および健常者の、９名の個体由来のＰＴＭは、部位だけでなく、各部位での修飾の化学量に関してもまた、厳密に保存されており、ヒトｒＲＮＡのＰＴＭ多型が少数であることが強調された。
【０１４５】
リボソームの３Ｄ構造によれば、Ψ４３３１およびΨ４９６６はどちらも、内部よりも大サブユニットの末梢に位置し、そしてしたがって、リボソームタンパク質との相互作用を通じて、リボソーム構造を安定化する際に潜在的な役割を有する。これは、Ψ４３３１およびΨ４９６６が内部リボソーム進入部位に依存するＲＮＡ翻訳および翻訳忠実性を改変し、そしてその結果、タンパク質合成における揺らぎが、造血幹細胞の機能を損ない（そしてＤＣ症状を引き起こしうる可能性を提起する。Ψ４３３１およびΨ４９６６は、実際、現在利用可能な指標、例えばテロメア長を補完する、ＤＣの初期診断の新規生化学的マーカーとして働きうる。
【０１４６】
実施例１０  Ｕ２  ｓｎＲＮＡのシュードウリジンの同定
本実施例では、核内低分子であるＵ２  ｓｎＲＮＡのシュードウリジンを同定した。
ＵＭＰＳ欠損ＴＫ６細胞から核ＲＮＡを粗精製し、さらにポリスチレンジビニルベンゼンを担体として逆相ＬＣによって精製することにより核内低分子を入手した。した（Ｊ．Ｃｈｒｏｍｏｔｏｇｒ．Ａ．１３１２，８７−９２，２０１３）。
【０１４７】
精製したＲＮＡをＲＮＡｓｅ  Ｔ１で切断した。実施例１−７と同様の手法により、Ｕ２  ｓｎＲＮＡのシュードウリジンの同定したところ、既知のシュードウリジン化部位１３個と新規シュードウリジン部位Ψ６０が同定された。
【０１４８】
【表５】
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【０１４９】
表５において、Ｙはシュードウリジンである。
図１６は、Ｕ２  ｓｎＲＮＡの部位５３−６３を含む断片のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。先ず、仮にＵ２  ｓｎＲＮＡの部位５３−６３が図１６に示した通りＵΨＵＡＡΨＡΨＣｍＧｐ（Ψ＝シュードウリジン）が正しいとして場合のＭＳ／ＭＳフラグメントの質量値を計算する。これは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ａｒｉａｄｎｅ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｈｔｍｌ／ｍａｓｓ＿ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ．ｈｔｍｌなどに配列を入力して計算させることが出来る。その質量値と実際のスペクトルで見られる質量値を照らし合わせながら、シュードウリジンが存在するか否かを確認する。Ψ６０周辺の実測値が予測通りとなっていればΨ６０が同定できたということになる。
【０１５０】
Ｕ２  ｓｎＲＮＡのＬＣ−ＭＳの結果、Ψ６０を含むＲＮＡｓｅ  Ｔ１断片が、３種類検出された。
【０１５１】
【表６】
2020103258.tif 000016
【０１５２】
表６において、Ｙはシュードウリジンである。
ＳＩＬＮＡＳに基づく定量化の結果、Ｕ２の６０位シュードウリジン化は、部分的な修飾であった。
【０１５３】
【表７】
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【０１５４】
図１７は、Ｕ２  ＲＮＡの２次構造図を示す。Ｕ２の６０位シュードウリジンは、Ｕ２  ｓｎＲＮＡの構想変化に重要な、ＳｔｅｍＩＩに位置している。
実施例１１  ＲＵＮ１２、ＳＮＯＲＤ４７およびＳＮＯＲＡ７３Ｂのシュードウリジン化部位の同定
本実施例では、実施例１０の方法の同様に、核内低分子であるＲＵＮ１２、並びに、核小体低分子であるＳＮＯＲＤ４７およびＳＮＯＲＡ７３Ｂのシュードウリジン化部位を同定した。
【０１５５】
核小体低分子は、ＵＭＰＳ欠損ＴＫ６細胞から核ＲＮＡを粗精製した後、相補的なＤＮＡプローブに対するハイブリダイゼーション法によって精製することによって入手した、
ＲＵＮ１２の新規シュードウリジンか部位であるΨ３３が同定された。ＭＳスペクトルおよびＭＳ／ＭＳスペクトルの結果を図１８に示す。
【０１５６】
ＳＮＯＲＤ４７の新規シュードウリジンか部位であるΨ５８およびΨ６２が同定された。ＭＳスペクトルおよびＭＳ／ＭＳスペクトルの結果を図１９に示す。
ＲＵＮ１２の新規シュードウリジンか部位であるΨ６５およびΨ５４が同定された。ＭＳスペクトルおよびＭＳ／ＭＳスペクトルの結果を図２０に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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