(57)【要約】【課題】５種のマラリア原虫を種特異的に検出する方法を提供すること。【解決手段】試料中に存在する、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、及びサルマラリア原虫からなる群より選択される１種以上の検出方法は、（１）５種類のプライマーからなるプライマーセットを用いて、核酸を増幅する工程、及び  （２）工程（１）で増幅された核酸に基づいて、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、及びサルマラリア原虫からなる群より選択される１種以上を検出する工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に存在する、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、及びサルマラリア原虫からなる群より選択される１種以上の検出方法であって、
（１）下記の（ａ）〜（ｅ）の５種類のプライマーセットを用いて、核酸を増幅する工程、及び
（２）工程（１）で増幅された核酸に基づいて、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、及びサルマラリア原虫からなる群より選択される１種以上を検出する工程を含む方法。
（ａ）配列番号１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ熱帯熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号２の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ熱帯熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット、
（ｂ）配列番号３の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号３の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号４の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号４の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット、
（ｃ）配列番号５の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号５の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ四日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号６の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ四日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット、
（ｄ）配列番号７の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号７の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ卵形マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号８の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ卵形マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット、及び
（ｅ）配列番号９の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号９の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号１０の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１０の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット
【請求項２】
工程（１）において、
（ｆ）配列番号１１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１１の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつプラスモジウム属のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号１２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１２の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつプラスモジウム属のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと
からなるプライマーセットを用いて、プラスモジウム属の核酸を属特異的に増幅し、
工程（２）において、工程（１）で増幅された核酸に基づいてプラスモジウム属を検出することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（１）の前に、
配列番号１３の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと配列番号１４の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットを用いて、前記検体から取得したＤＮＡを鋳型として、１次増幅産物を得る工程を含み、
前記工程（２）は、前記（ａ）〜（ｅ）、又は（ｆ）が存在する場合には（ａ）〜（ｆ）であるプライマーセットを用いて、前記１次増幅産物を鋳型として、２次増幅産物を得る工程を含む
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
配列番号１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットを用いた熱帯熱マラリア原虫の検出方法。
【請求項５】
配列番号３の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号３の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号４の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号４の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットを用いた三日熱マラリア原虫の検出方法。
【請求項６】
配列番号５の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットを用いた四日熱マラリア原虫の検出方法。
【請求項７】
配列番号７の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットを用いた卵形マラリア原虫の検出方法。
【請求項８】
配列番号９の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号９の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号１０の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１０の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットを用いたサルマラリア原虫の検出方法。
【請求項９】
配列番号１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなる熱帯熱マラリア原虫検出用プライマーセット。
【請求項１０】
配列番号３の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号３の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号４の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号４の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなる三日熱マラリア原虫検出用プライマーセット。
【請求項１１】
配列番号５の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなる四日熱マラリア原虫検出用プライマーセット。
【請求項１２】
配列番号７の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなる卵形マラリア原虫検出用プライマーセット。
【請求項１３】
配列番号９の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号９の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号１０の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１０の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるサルマラリア原虫検出用プライマーセット。
【請求項１４】
一方のオリゴヌクレオチドにタグ配列が取り付けられ、他方のオリゴヌクレオチドに標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられている請求項９〜１３のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項１５】
下記（ａ）〜（ｅ）の５種類のプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ、及びｄＮＴＰを含む、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、及びサルマラリア原虫からなる群より選択される１種以上の検出用キット。
（ａ）配列番号１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１の塩基配列において１個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ熱帯熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号２の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ熱帯熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット、
（ｂ）配列番号３の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号３の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号４の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号４の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット、
（ｃ）配列番号５の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号５の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ四日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号６の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ四日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット、
（ｄ）配列番号７の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号７の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ卵形マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号８の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ卵形マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット、及び
（ｅ）配列番号９の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号９の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号１０の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１０の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット。
【請求項１６】
（ｆ）配列番号１１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１１の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつプラスモジウム属のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号１２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１２の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつプラスモジウム属のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと
からなるプライマーセットをさらに含む請求項１５に記載の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、5種のマラリア原虫の検出方法、マラリア原虫検出用プライマーセット、マラリア原虫検出用キット、及び核酸検出用デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、マラリアは世界で年間およそ2億1200万人の患者が罹患し、死亡者数は42万9000人と報告されている。死亡患者の70%は5歳児未満であり、マラリアと貧困が相互に因果関係となる負のサイクルは、アフリカ等の熱帯地域における社会経済開発を妨げる大きな要因とされる。ヒトに感染する代表的なマラリア原虫には、熱帯熱マラリア(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア（Plasmodium  vivax）、卵形マラリア（Plasmodium ovale）、四日熱マラリア（Plasmodium malariae）及びサルマラリア（Plasmodium knowlesi）の5種類が知られている。マラリア感染の診断の遅れは、治療の遅れに繋がり、重症化の後に死亡する例も少なくない。したがって、マラリア流行地で実施可能な、簡便、迅速、高感度かつ種特異的なマラリア診断法の開発が国際的に喫緊の課題となっている。
【０００３】
マラリア原虫の検査は、血液塗抹標本をギムザ染色して光学顕微鏡で観察する方法がゴールドスタンダードである。この顕微鏡法は、熟練者によって確定診断あるいは否定が可能であるが、原虫密度が少ない場合は、長い検査時間と高度な技術が要求され、結果的に治療が遅れる可能性が高い。そのため、イムノクロマトグラフィーを利用したマラリア迅速診断法（Rapid Diagnostic Test; RDT）が開発されている。しかしながら、マラリア種を区別する特異性は低く、感染回復後の偽陽性が問題となっている。
【０００４】
そこで最近では、ＰＣＲ法を利用したマラリア診断法が開発されている。ＰＣＲ法は顕微鏡法やRDTに比較して感度が高く、混合感染に対しても特異性良く診断できる。しかしながら、最終的なＤＮＡ増幅物の検出をするためには、高額な蛍光検出器の使用や煩雑なゲル電気泳動を行う必要があり、一般病院やマラリア流行地域の現場診療所におけるルーチンな診断には適していない。
【０００５】
非特許文献１には、マラリア原虫のミトコンドリアチトクロームｃオキシダーゼIII(ｃｏｘ３)をターゲットとしたＰＣＲによる、熱帯熱マラリア、三日熱マラリア、卵形マラリア、及び四日熱マラリアの4種類のマラリア原虫のＰＣＲによる検出方法が記載されている。しかしながら、この文献ではサルマラリアの検出が含まれていない。
【０００６】
従来、三日熱マラリア原虫とサルマラリア原虫のミトコンドリアＤＮＡの相同性は９７％程度と極めて高いことが知られており、一般病院やマラリア流行地域の現場診療で２つの原虫への感染を簡便かつ迅速に識別することは困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Parasitology International 64 (2015)304-308
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、熱帯熱マラリア(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア（Plasmodium vivax）、卵形マラリア（Plasmodium ovale)、四日熱マラリア（Plasmodium malariae）及びサルマラリア（Plasmodium knowlesi）の5種類のマラリア原虫の簡便かつ迅速な検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、かかる課題を解決すべく、マラリア原虫のミトコンドリアチトクロームｃオキシダーゼIII(ｃｏｘ３)の塩基配列に基づいて、熱帯熱マラリア、三日熱マラリア、卵形マラリア、四日熱マラリア及びサルマラリアの5種のマラリア原虫の各々を特異的に識別できる２種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーを作成し、かかるプライマーからなるプライマーセットにより5種のマラリア原虫に特徴的なＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅し、それらのＰＣＲ産物を、当該ＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡが取り付けられた核酸検出用デバイスに適用することで、検出されたバンドの位置からマラリア感染の有無及び感染マラリアの原虫種を目視で検出、識別、又は診断できることを見出した。
【００１０】
本発明の以下の態様が提供される。
【００１１】
項１．試料中に存在する、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、及びサルマラリア原虫からなる群より選択される１種以上の検出方法であって、
（１）下記の（ａ）〜（ｅ）の５種類のプライマーセットを用いて、核酸を増幅する工程、及び
（２）工程（１）で増幅された核酸に基づいて、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、及びサルマラリア原虫からなる群より選択される１種以上を検出する工程を含む方法。
【００１２】
（ａ）配列番号１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ熱帯熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号２の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ熱帯熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット、
（ｂ）配列番号３の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号３の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号４の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号４の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット、
（ｃ）配列番号５の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号５の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ四日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号６の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ四日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット、
（ｄ）配列番号７の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号７の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ卵形マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号８の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ卵形マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット、及び
（ｅ）配列番号９の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号９の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号１０の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１０の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット
項２．工程（１）において、
（ｆ）配列番号１１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１１の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつプラスモジウム属のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号１２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１２の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつプラスモジウム属のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと
からなるプライマーセットを用いて、プラスモジウム属の核酸を属特異的に増幅し、
工程（２）において、工程（１）で増幅された核酸に基づいてプラスモジウム属を検出することをさらに含む項１に記載の方法。
【００１３】
項３．工程（１）の前に、
配列番号１３の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと配列番号１４の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットを用いて、前記検体から取得したＤＮＡを鋳型として、１次増幅産物を得る工程を含み、
前記工程（２）は、前記（ａ）〜（ｅ）、又は（ｆ）が存在する場合には（ａ）〜（ｆ）であるプライマーセットを用いて、前記１次増幅産物を鋳型として、２次増幅産物を得る工程を含む
項１又は２に記載の方法。
【００１４】
項４．配列番号１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットを用いた熱帯熱マラリア原虫の検出方法。
【００１５】
項５．配列番号３の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号３の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号４の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号４の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットを用いた三日熱マラリア原虫の検出方法。
【００１６】
項６．配列番号５の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットを用いた四日熱マラリア原虫の検出方法。
【００１７】
項７．配列番号７の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットを用いた卵形マラリア原虫の検出方法。
【００１８】
項８．配列番号９の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号９の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号１０の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１０の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットを用いたサルマラリア原虫の検出方法。
【００１９】
項９．配列番号１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなる熱帯熱マラリア原虫検出用プライマーセット。
【００２０】
項１０．配列番号３の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号３の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号４の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号４の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなる三日熱マラリア原虫検出用プライマーセット。
【００２１】
項１１．配列番号５の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなる四日熱マラリア原虫検出用プライマーセット。
【００２２】
項１２．配列番号７の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなる卵形マラリア原虫検出用プライマーセット。
【００２３】
項１３．配列番号９の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号９の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号１０の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１０の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるサルマラリア原虫検出用プライマーセット。
【００２４】
項１４．一方のオリゴヌクレオチドにタグ配列が取り付けられ、他方のオリゴヌクレオチドに標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられている項９〜１３のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【００２５】
項１５．下記（ａ）〜（ｅ）の５種類のプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ、及びｄＮＴＰを含む、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、及びサルマラリア原虫からなる群より選択される１種以上の検出用キット。
【００２６】
（ａ）配列番号１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１の塩基配列において１個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ熱帯熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号２の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ熱帯熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット、
（ｂ）配列番号３の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号３の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号４の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号４の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット、
（ｃ）配列番号５の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号５の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ四日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号６の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ四日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット、
（ｄ）配列番号７の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号７の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ卵形マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号８の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ卵形マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット、及び
（ｅ）配列番号９の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号９の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号１０の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１０の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット。
【００２７】
項１６．（ｆ）配列番号１１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１１の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつプラスモジウム属のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号１２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１２の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつプラスモジウム属のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと
からなるプライマーセットをさらに含む項１５に記載の検出用キット。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、配列番号１〜１０の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又はその１個又は２個の塩基が修飾された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを使用して、熱帯熱マラリア原虫ｃｏｘ３遺伝子、三日熱マラリア原虫ｃｏｘ３遺伝子、四日熱マラリア原虫ｃｏｘ３遺伝子、卵形マラリア原虫ｃｏｘ３遺伝子、及びサルマラリア原虫ｃｏｘ３遺伝子の５種のヒトマラリア原虫の有無及び種別を簡便かつ迅速に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】（Ａ）核酸検出用デバイスの一実施形態の平面図、（Ｂ）側面図。
【図２】図１の核酸検出用デバイスを試験溶液に浸漬した状態を示す略図。
【図３】核酸検出用デバイスを透明な外装体により被覆した状態を示す略図。
【図４】プライマーセットを用いたマラリア種特異的ＰＣＲの略図。
【図５】核酸クロマトグラフィーによるマラリア検出を説明するための概略図。
【図６】核酸クロマトグラフィーによる室温でのＰＣＲ産物の展開10分後のストリップにおけるバンドの検出を示す写真。丸印は検出されたバンドの位置を指す。ＮＣはマラリア非感染のヒトＤＮＡを鋳型にＰＣＲ増幅した産物を用いた陰性対照を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明の好ましい実施形態について説明する。
【００３１】
本発明の検出方法は、試料中に存在する、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、及びサルマラリア原虫からなる群より選択される１種以上の検出方法であって、（１）下記の（ａ）〜（ｅ）の５種類のプライマーセットを用いて、核酸を増幅する工程、及び（２）工程（１）で増幅された核酸に基づいて、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、及びサルマラリア原虫からなる群より選択される１種以上を検出する工程を含む。
【００３２】
（ａ）配列番号１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ熱帯熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号２の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ熱帯熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット
（ｂ）配列番号３の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号３の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号４の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号４の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット
（ｃ）配列番号５の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号５の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ四日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号６の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ四日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット
（ｄ）配列番号７の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号７の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ卵形マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号８の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ卵形マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット
（ｅ）配列番号９の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号９の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号１０の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１０の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット
なお、本明細書で使用する「試料」とは、マラリア原虫種である熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、及びサルマラリア原虫特定の５種を含む可能性があり、本発明の検出方法の対象となるヒトから採取した試料であり、特には血液試料、血液試料から精製したＤＮＡ含有試料等を指す。
【００３３】
上記の本発明の検出方法で使用する上記の（ａ）〜（ｅ）のプライマーセットにおける各オリゴヌクレオチドは、マラリア原虫のミトコンドリアＤＮＡのチトクロームｃオキシダーゼ３遺伝子（ｃｏｘ３）をターゲットとしている。このため、従来、マラリア原虫のＤＮＡのＰＣＲ検出において長い間標準と考えられてきた１８ｒＤＮＡの配列に基づくＰＣＲに比べて、高感度かつ高効率に５種類のマラリア原虫を現出することができる。
【００３４】
また、上記の（ａ）〜（ｅ）のオリゴヌクレオチドは、５種類のマラリア原虫の一つを各々特異的に検出できるよう、かつクロスリアクションが起こらないように設計されているため、ＰＣＲに用いるプライマーセットをすべて一つの反応液中に混合してマルチプレックスで増幅及び検出することができ、１時間以内で迅速にマラリア感染の有無及び感染種の特定又は診断を行うことができる。
【００３５】
従来技術では５種類のマラリア原虫をマルチプレックス検出するために２回のＰＣＲ反応を必要としたが、本発明では反応温度条件を工夫することで１回のＰＣＲ反応で５種類のマラリア原虫を区別して検出できるため、操作が簡便である。
【００３６】
また、ＰＣＲに用いるプライマーセットをすべて一つの反応液中に混合してＰＣＲを行い、増幅産物をストリップ上に展開することで、１本のストリップ上で５種類のマラリア原虫の感染の有無を目視で特定することができる。
【００３７】
核酸クロマトグラフィーストリップを用いた方法は、常温でも行えるため、従来法のようにアガロースゲルの用時調製や低温保存する必要がない。また、高額な蛍光検出器付きサーマルサイクラーも必要ないため、簡便かつ低コストで5種のマラリア原虫を一度に検出できる。
【００３８】
上記の本発明の検出方法で使用する上記の（ａ）〜（ｅ）のプライマーセットにおける各オリゴヌクレオチドには、配列番号１〜１０の各塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドに加えて、配列番号１〜１０の各塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドも包含される。配列番号１〜１０の各塩基配列が、増幅産物を得るためプライマーとして機能する限りにおいて、１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換していてもよい。例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２の５’端から１番目の塩基が欠失していても、欠失していない場合と比較して感度は劣るものの、各マラリア原虫の属特異的検出は可能であることが判明している。また、１塩基の置換では通常塩基配列とその相補的な配列との対合にほぼ影響がないことも当該技術分野では良く知られている。
【００３９】
一実施形態では、上記工程（１）において、
（ｆ）配列番号１１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１１の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつプラスモジウム属のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号１２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１２の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつプラスモジウム属のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット
を用いて、プラスモジウム属の核酸を属特異的に増幅し、
上記工程（２）において、工程（１）で増幅された核酸に基づいてプラスモジウム属を検出することをさらに含む。
【００４０】
この場合、（ｆ）のプライマーセットを（ａ）〜（ｅ）のプライマーセットと同じ反応溶液に入れることで、５種類のマラリア原虫の種特異的な検出と同時に、プラスモジウム属の属特異的な検出も同時に行うことができる。
【００４１】
上記の（ａ）〜（ｅ）及び（ｆ）のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う場合、  上記の（ａ）〜（ｆ）の各プライマーセットにおける対となる２つのオリゴヌクレオチドの一方の５’端には、スペーサーを介して又は介さずに、タグ配列を取り付けてもよい。例えば、（ａ）の配列番号１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又はその修飾配列、（ｂ）配列番号３の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又はその修飾配列、（ｃ）の配列番号５の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又はその修飾配列、（ｄ）の配列番号７の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又はその修飾配列、（ｅ）の配列番号９の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又はその修飾配列、及び（ｆ）の配列番号１１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又はその修飾配列の各々の５’端にタグ配列が取り付けられてもよい。
【００４２】
タグ配列を設けることで、複数の核酸配列を同時に検出するときのクロスリアクションがより効果的に防止される。タグ配列とは、５種のマラリア成虫の標的核酸の配列であるとは無関係にタグ間のクロスリアクションを排除した設計がなされた配列であり、好ましくは、１５塩基以上５０塩基以下、より好ましくは、２０塩基以上２５塩基以下である。そのようなスペーサー及びタグ配列は核酸検出の分野において周知である。タグ配列の導入の詳細については、例えばＷＯ２０１３／０３９２２８号を参照されたい。
【００４３】
スペーサーは、プライマーとタグ配列の間に挿入される、ポリメラーゼ反応阻害領域からなる遺伝子非発現部分である。スペーサーとしては、核酸誘導体を含むこともできるし、非核酸誘導体を含むこともできる。核酸誘導体としては、Ｌ型核酸、３-ｄｅｏｘｙ-２-ｈｙｄｒｏｘｙ-ｄＮ、修飾塩基核酸、損傷塩基核酸、リン酸結合部位修飾核酸、ＲＮＡ、２’-ＯＭｅ-Ｎ、及び、それらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。非核酸誘導体としては、炭素鎖（Ｃｎ）、ペグ鎖（（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）、ジスルフィド含有鎖（ＣｎＳＳＣｎ）、及びジチオールフォスフォロアミダイトからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。
【００４４】
また、上記の（ａ）〜（ｅ）及び（ｆ）のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う場合、ＰＣＲでの標的核酸の増幅後の検出を容易にするために、上記の（ａ）〜（ｆ）の各プライマーセットにおける対となる２つのオリゴヌクレオチドの他方、又は２つのオリゴヌクレオチドの両方に、肉眼で観察できる標識物質、又は標識物質導入材料で標識してもよい。例えば、（ａ）の配列番号２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又はその修飾配列、（ｂ）配列番号４の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又はその修飾配列、（ｃ）の配列番号６の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又はその修飾配列、（ｄ）の配列番号８の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又はその修飾配列、（ｅ）の配列番号１０の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又はその修飾配列、及び（ｆ）の配列番号１２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又はその修飾配列の各々の５’端に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられてもよい。標識物質導入材料は、標識物質と結合するための材料であり、例えば、アビジンコートした標識物質と結合するためのビオチンを含み、標識物質の標的核酸への導入を可能にする。
【００４５】
標識物質は、目視（肉眼で）で検出可能な発光又は発色を提示する発光物質又は発色物質であることが好ましい。このような標識物質としては、各種染料、各種顔料、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム化合物、オレフィン、エノールエーテル、エナミン、アリールビニルエーテル、ジオキセン、アリールイミダゾール、ルシゲニン、ルシフェリン及びエクリオンを包含する化学発光物質が挙げられる。さらに、金コロイド若しくはゾル又は銀コロイド若しくはゾルを包含するコロイド若しくはゾル、金属粒子、無機粒子等が挙げられる。
【００４６】
標識物質は、その一部にラテックス粒子等の粒子を有していてもよい。標識物質の一部を構成するラテックス粒子などの粒子の平均粒子径は、特に限定しないが、例えば、２０ｎｍ以上２０μｍ以下、好ましくは０．１μｍ以上１０μｍ以下、特に好ましくは０．１μｍ以上５μｍ以下、さらに好ましくは０．１５μｍ以上２μｍ以下である。また、固相担体の孔径によって適宜調整される。
【００４７】
好ましくは、粒子は水溶液に懸濁でき、そして水不溶性ポリマー材料からなる粒子である。例えばポリエチレン、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリル酸ポリマー、メタクリル酸ポリマー、アクリロニトリルポリマー、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン、ポリビニルアセテート−アクリレート、ポリビニルピロリドン又は塩化ビニル−アクリレートが挙げられる。それらの表面上に活性基、例えばカルボキシル、アミノ又はアルデヒド基を有するラテックス粒子も挙げられる。
【００４８】
標識物質導入材料としては、抗原抗体反応における抗体や、アビジン（ストレプトアビジン）−ビオチンシステムにおけるビオチン、抗ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）システムにおけるジゴキシゲニン、又は抗ＦＩＴＣ−ＦＩＴＣシステムにおけるＦＩＴＣ等に代表されるハプテン類などが挙げられる。検出に用いられる標識物質は、上記標識物質導入材料と相互作用する他方の分子又は物質（例えば、抗原、すなわち、ストレプトアビジン、抗ＦＩＴＣなど）であり、オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション工程において、あるいはこの工程に先立って、あるいはこの工程後に、増幅産物に取り付けられた標識物質導入材料と、標識物質導入材料と結合する部位を備える標識物質と結合して、増幅産物の検出を可能にする。
【００４９】
本発明の検出方法の別の実施形態では、上記工程（１）の前に、配列番号１３の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド及び配列番号１４の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて、前記検体から取得したＤＮＡを鋳型として、１次増幅産物を得る工程を含み、上記工程（２）は、前記（ａ）〜（ｅ）、又は（ｆ）が存在する場合には（ａ）〜（ｆ）であるプライマーセットを用いて、前記１次増幅産物を鋳型として、２次増幅産物を得る工程を含む。
【００５０】
このように、反応条件をそれぞれで変更した１次増幅と２次増幅を行うことで、２回のＰＣＲ反応を行わなくても、１回のＰＣＲ反応で５種類のマラリア原虫を区別して検出できる。
【００５１】
本発明におけるＰＣＲ条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されず、例えば、ＰＣＲ反応に用いる鋳型としての２本鎖ＤＮＡ量は０ ．１ｎｇ以上が好ましく、１〜５０ｎｇがより好ましい。また、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９２〜９８℃で１０〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５５〜７０℃で１０〜６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を７１〜７５℃で５〜１２０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを２０〜４０サイクル行う。サイクル反応の前に初期変性反応を行うことが好ましい。ＰＣＲにおける初期変性反応条件について、変性温度は９２〜９８℃が好ましく、変性時間は３０秒〜１０分が好ましい。１次増幅と２次増幅を行う場合、１次増幅は、熱変性反応を９２〜９８℃で１０〜６０秒間行い、アニーリング反応を６５〜７０℃で１０〜６０秒間行い、伸長反応を７１〜７５℃で１０〜６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを１０〜３０サイクル行うことが好ましく、２次増幅は、熱変性反応を９２〜９８℃で１０〜６０秒間行い、アニーリング反応を１次反応のアニーリング温度よりも低い温度、例えば５５〜６５℃で１０〜６０秒間行い、伸長反応を７１〜７５℃で１０〜６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを２０〜４０サイクル行うことが好ましい。
【００５２】
本発明は、配列番号１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットを用いた熱帯熱マラリア原虫の検出方法を包含する。
【００５３】
この方法によれば、熱帯熱マラリア原虫を種特異的に検出することができる。
【００５４】
本発明は、配列番号３の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号３の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号４の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号４の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットを用いた三日熱マラリア原虫の検出方法を包含する。
【００５５】
この方法によれば、三日熱マラリア原虫を種特異的に検出することができる。
【００５６】
本発明は、配列番号５の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットを用いた四日熱マラリア原虫の検出方法を包含する。
【００５７】
この方法によれば、四日熱マラリア原虫を種特異的に検出することができる。
【００５８】
本発明は、配列番号７の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットを用いた卵形マラリア原虫の検出方法を包含する。
【００５９】
この方法によれば、卵形マラリア原虫を種特異的に検出することができる。
【００６０】
本発明は、配列番号９の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号９の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号１０の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１０の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットを用いたサルマラリア原虫の検出方法を包含する。
【００６１】
この方法によれば、サルマラリア原虫を種特異的に検出することができる。
【００６２】
本発明は、配列番号１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなる熱帯熱マラリア原虫検出用プライマーセットを包含する。
【００６３】
かかるプライマーセットは熱帯熱マラリア原虫検出用の特異的プライマーセットとして使用することができる。
【００６４】
本発明は、配列番号１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなる熱帯熱マラリア原虫検出用プライマーセットを包含する。
【００６５】
本発明は、配列番号３の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号３の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号４の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号４の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなる三日熱マラリア原虫検出用プライマーセットを包含する。
【００６６】
かかるプライマーセットは三日熱マラリア原虫検出用の特異的プライマーセットとして使用することができる。
【００６７】
本発明は、配列番号５の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなる四日熱マラリア原虫検出用プライマーセットを包含する。
【００６８】
かかるプライマーセットは四日熱マラリア原虫検出用の特異的プライマーセットとして使用することができる。
【００６９】
本発明は、配列番号７の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとからなる卵形マラリア原虫検出用プライマーセットを包含する。
【００７０】
かかるプライマーセットは卵形マラリア原虫検出用の特異的プライマーセットとして使用することができる。
【００７１】
本発明は、配列番号９の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号９の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号１０の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１０の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるサルマラリア原虫検出用プライマーセットを包含する。
【００７２】
かかるプライマーセットはサルマラリア原虫検出用の特異的プライマーセットとして使用することができる。
【００７３】
さらに、配列番号３の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号３の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号４の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号４の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなる第１のプライマーセットと、配列番号９の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号９の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号１０の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１０の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなる第２プライマーセットとを用いた三日熱マラリア原虫とサルマラリア原虫の識別方法を包含する。
【００７４】
上記のプライマーセットは、ＰＣＲ法に用いてもよいし、一定温度等温で核酸を増幅する遺伝子増幅法であるＬＡＭＰ法や、ＳＤＡ法、ＩＣＡＮ法、ＲＣＡ法に用いてもよい。
【００７５】
本発明はさらに、下記（ａ）〜（ｅ）の５種類のプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及び反応緩衝液を含む、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、及びサルマラリア原虫からなる群より選択される１種以上の検出用キットを包含する。
【００７６】
（ａ）配列番号１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１の塩基配列において１個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ熱帯熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号２の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ熱帯熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット
（ｂ）配列番号３の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号３の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号４の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号４の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ三日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット
（ｃ）配列番号５の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号５の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ四日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号６の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ四日熱マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット
（ｄ）配列番号７の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号７の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ卵形マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号８の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつ卵形マラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット
（ｅ）配列番号９の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号９の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号１０の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１０の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつサルマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセット
ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であればいずれでもよい。当該ポリメラーゼとしては、Bst DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Bca(exo-)DN Aポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Vent (Exo-)DNAポリ メラーゼ（Vent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、DeepVent (Exo-)DNAポリメラーゼ（DeepVent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、KOD DNAポリメラーゼなどが挙げられる。
【００７７】
ｄＮＴＰとしては、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰが挙げられる。
【００７８】
反応緩衝液としては、トリス緩衝液、ＥＤＴＡ緩衝液、及びトリス−ＥＤＴＡ緩衝液等が挙げられる。
【００７９】
一実施形態において、上記検出用キットは、（ｆ）配列番号１１の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１１の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつプラスモジウム属のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドと、配列番号１２の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド又は配列番号１２の塩基配列において１個又は２個の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドであってかつプラスモジウム属のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域の増幅産物を得るためのオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットをさらに含む。
【００８０】
この場合、一つのキットで５種類のマラリア原虫の種特異的な検出と同時に、プラスモジウム属の属特異的な検出も同時に行うことができる。
【００８１】
５種類のマラリア原虫の標的核酸配列は、上記の（ａ）〜（ｆ）の各プライマーセットにおける対となる２つのオリゴヌクレオチドの一方に取り付けられたタグ配列とハイブリダイズし得る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを保持する固相担体を備えた核酸検出用デバイスにより、検出することができる。
【００８２】
図１（Ａ）は核酸検出用デバイスの一実施形態の平面図であり、図１（Ｂ）は同核酸検出用デバイスの側面図である。
【００８３】
一実施形態の核酸検出用デバイス１は、固相担体１０を備えている。固相担体１０は、検出対象であるマラリア原虫の標的核酸の検出用のオリゴヌクレオチドプローブを保持する多孔質材料を有する。
【００８４】
「オリゴヌクレオチドプローブ」は、検出対象であるマラリア原虫の標的核酸の増幅用の上述のオリゴヌクレオチドプライマーに取り付けられたＤＮＡタグにハイブリダイズし得る、該ＤＮＡタグの配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドとすることもできるし、マラリア原虫の標的核酸と特異的にハイブリダイズしうる配列を有するように設計されたオリゴヌクレオチドとすることもできる。オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチド配列の長さは、特に限定されないが、ハイブリダイズする核酸に対する特異性とハイブリダイゼーション効率を確保するため、１５塩基以上５０塩基以下であることが好ましい。
【００８５】
多孔質材料は当該分野で周知であり、例えば、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン等が挙げられる。固相担体１０はストリップ状又はシート状に通常形成される。オリゴヌクレオチドプローブの配列の長さは、特に限定されないが、各標的核酸に対する特異性とハイブリダイゼーション効率を確保するため、１５塩基以上５０塩基以下であることが好ましい。
【００８６】
任意選択で、核酸検出用デバイス１は固相担体１０を支持するバッキング部材１２を備えてもよい。さらに任意選択で、核酸検出用デバイス１は、固相担体１０と外部環境との間の気体の流通を妨げ、オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション反応環境の気密性を維持する被覆部材１４を備えてもよい。被覆部材１４は固相担体の表面を被覆する透明フィルムであり、透明フィルムを構成する素材は、固相担体表面の気密性を維持し、展開液の蒸発を妨げるものであればとくに限定されないが、例えば、ポリエチレンテレフタレートを挙げることができる。被覆部材１４を設けることにより、核酸クロマトグラフィーにおける非特異的シグナル（非特異的ハイブリダイゼーション）の発生を簡便に抑制でき、標的核酸をより高感度に検出することができる。
【００８７】
図１（Ａ），（Ｂ）において、オリゴヌクレオチド固定領域１６ａ，１６ｂ，１６ｃ，１６ｄ，１６ｅ，１６ｆは、固相担体１０におけるオリゴヌクレオチドプローブの固定位置であり、固相担体１０の先端部から一定程度離れた位置に、対応する標的核酸ごとにライン状に互いに平行に固定される。
【００８８】
オリゴヌクレオチドプローブの固相担体１０への固定化方法は特に限定されず、その３’末端で固相担体１０に結合されていてもよいし、５’末端で結合されていてもよい。例えば、ニトロセルロース等を固相担体１０に使用する場合、プローブを固相担体１０にインクジェット方式でプリントした後、ＵＶ照射などにより固着性を高める。この方法の場合、プローブはＵＶの届く固相担体１０表面のみに固定化される。
【００８９】
固相担体１０上には標的核酸に対応するプローブ領域を容易に特定できるように、１つ又は複数の位置マーカー１８ａ，１８ｂ，１８ｃを配置してもよい。位置マーカー１８ａ，１８ｂ，１８ｃの存在により、目視検出の場合であっても、簡便に標的核酸の存在又は不存在を検出することができる。
【００９０】
ここで、ＰＣＲで増幅した試料を用いた核酸検出用デバイス１での核酸検出を例として説明する。核酸検出用デバイス１でのマラリア原虫の標的核酸の検出に先立ち、試料中のＤＮＡからマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域を、かかる標的核酸を含む試料を第１プライマー及び第２プライマーからなる増幅用プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅する。
【００９１】
第１プライマーは、標的核酸に相補的な配列とタグ配列とを有するが、タグ配列と第１の識別配列とは直接連結されず、その間にＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を有することが好ましい。この連結部位は、天然塩基又は天然塩基と対合する天然塩基の誘導体（天然塩基等）を含まず、例えば、人工オリゴヌクレオチドから構成され、それゆえＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止させる。これにより、一本鎖領域を有する核酸が増幅され、熱変性なしにオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションが可能となる。
【００９２】
第１プライマーとＰＣＲにおいて対となる第２プライマーは、標的核酸に相補的な配列に加えて、増幅された標的核酸がオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズしたときに目視確認可能な標識物質、又は標識物質導入材料を含む。標識物質及び標識物質導入材料については上述した通りである。
【００９３】
試料中のＤＮＡからマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列の特定領域を増幅させた後の増幅産物を含む試験溶液（展開液）を、固相担体１０の先端に適用する。適用された試験溶液は、固相担体１０を構成する多孔質材料内にキャピラリー現象によって展開される。
【００９４】
図２に示すように、固相担体１０の先端を、エッペンドルフチューブ等の容器２０内に入れた増幅された標的核酸を含む試験溶液２２に浸漬させることで固相担体１０に展開することができる。
【００９５】
代わりに、図３に示すように、固相担体１０の全体を被覆し、少なくとも一部が透明な外装部材３０の先端部３２付近に固相担体１０の先端を配置し、外装部材３０の先端部３２の先端に設けられたサンプルポート３４を介して容器２０中の試験溶液２２を外装部材３０内に入れて、固相担体１０の先端を浸漬させることでも固相担体１０に展開され得る。外装部材３０は、標的核酸を目視検出できるように、少なくとも一部は透明でなければならない。
【００９６】
試験溶液は、固相担体１０中での標的核酸の展開を容易にするように、「展開媒体」を含むことが好ましい。展開媒体は、特に限定されないが、例えば、水、水と相溶する有機溶媒、又は水と１種又は２種以上の前記有機溶媒の混液が挙げられる。水と相溶する有機溶媒としては、例えば、炭素数１〜４程度の低級アルコール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、アセトン等が挙げられる。展開媒体は、好ましくは水を主体とする。
【００９７】
展開媒体は、ｐＨを調整するための緩衝成分を含むことができる。緩衝成分は、意図するｐＨにもよるが、通常は６．０以上８．０以下の範囲である。より好ましくは、７．０以上８．０以下である。こうしたｐＨを得るための成分は、例えば、酢酸と酢酸ナトリウム（酢酸緩衝液）、クエン酸とクエン酸ナトリウム（クエン酸緩衝液）、リン酸とリン酸ナトリウム（リン酸緩衝液）等である。さらに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等が挙げられる。なお、展開媒体として、増幅反応液をそのまま採用してもよい。また、増幅反応液に対して、界面活性剤や適当な塩等の追加の成分や溶媒を加えたりすることで、組成や濃度の調整をして展開媒体として使用してもよい。展開時間は特に限定されず、固相担体１０の形態や形状、展開媒体の性質に応じて適宜設定される。
【００９８】
固相担体１０に保持されたオリゴヌクレオチドプローブが、第１プライマーに取り付けられたＤＮＡタグにハイブリダイズし得る該ＤＮＡタグの配列に相補的な配列を有するため、第１プライマーとハイブリダイズし、第１プライマーは標識物質又は標識物質導入材料を含む第２プライマーとハイブリダイズするため、オリゴヌクレオチドプローブを固定化したラインの発色により、複数の標的核酸を種特異的に及び／属特異的に目視で識別して検出することができる。
【００９９】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【０１００】
１．試料の収集
大阪市立大学大学院医学研究科の金子明教授のグループが、2015年にマラリア原虫ミトコンドリアDNAのcox3遺伝子をターゲットとして、種特異的検出する方法を報告しており（Isozumi, R., et al., Parasitol Int, 2015）、同法を参考にしてPCR条件を検討した。標準DNAとして、5種のマラリアに単独感染したケニア人及びヴァヌアツ人から採取した血液由来の精製済みDNA（大阪市立大学より提供）を使用した。
２．マルチプレックスＰＣＲ
表１に、５種マラリア原虫マルチプレックス検出のためのマルチプレックスＰＣＲで用いたオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列を示す。
【０１０１】
プラスモジウム属の属特異的なプライマーを、Plasmodium のｃｏｘ３遺伝子配列に基づいてParasitology International 64 (2015)304-308を参照して設計した。MtPuni_F及びMtPuni_Rがそれぞれ属特異的の順方向プライマー及び逆方向プライマーである。また、熱帯熱マラリア、三日熱マラリア、卵形マラリア、四日熱マラリア及びサルマラリアの5種の種特異的なプライマーを、各々のマラリア原虫のｃｏｘ３遺伝子配列に基づいて設計した。MtPf_F （配列番号１）及びMtPf_R（配列番号２）がそれぞれ熱帯熱マラリアに特異的な順方向プライマー及び逆方向プライマーであり、MtPv_F（配列番号３）及びMtPv_ R（配列番号４）がそれぞれ三日熱マラリアに特異的な順方向プライマー及び逆方向プライマーであり、MtPm_F（配列番号５）及びMtPm_ R（配列番号６）がそれぞれ四日熱マラリアに特異的な順方向プライマー及び逆方向プライマーであり、MtPo_F（配列番号７）及びMtPo_ R（配列番号８）がそれぞれ卵形マラリアに特異的な順方向プライマー及び逆方向プライマーであり、MtPk_F（配列番号９）及びMtPk_ R（配列番号１０）がそれぞれサルマラリアに特異的な順方向プライマー及び逆方向プライマーである。
【０１０２】
各PCRプライマーは、各マラリア種に特徴的なcox3遺伝子配列に続き、スペーサー（3つのカーボン連結）、DNAタグ配列を連結する。図４に示すように、配列番号１，３，５，７，９，１１の塩基配列からなる順方向プライマーの５’末端にはそれぞれＤＮＡタグ１，２，４，３，７，８を付け、それらの各々と対をなす配列番号２，４，６，８，１０，１２の塩基配列からなる逆方向プライマーの５’末端にはビオチンを付加した。
【０１０３】
DNAタグ付きプライマー及びビオチン付加プライマーはTBA株式会社で合成した。
【０１０４】
また、一次増幅用の順方向プライマーMtU_F及び逆方向プライマーMtU_Rも設計した。  1次増幅用の順方向プライマーMtU_F及び逆方向プライマーMtU_RはFASMAC社で合成した。
【０１０５】
【表１】
2020096533.tif 000002
【０１０６】
表２に、ＰＣＲに使用した試薬及びプライマーの量を示す。試薬及びプライマーを混合し、PCR 0.2 ml チューブバンド  セパレート8連  ナチュラル（Greiner Bio-One）に入れ、ＰＣＲに供した。
【０１０７】
【表２】
2020096533.tif 000003
【０１０８】
表３に、ＰＣＲ条件を示す。T100  サーマルサイクラー（Bio-Rad）を使用した。ステップ１として、95°C、3分の変性を1回行い、ステップ２として、一時増幅用のプライマーMtU_F 及びMtU_Rによる一次増幅を行った。変性95℃，15秒、アニーリング 70°C，30秒、伸長72℃，30秒を10サイクル行った。次に、属特異的プライマーMtPuni_F及びMtPuni_R及び５種のマラリア原虫特異的プライマーMtPf_F、MtPf_R、MtPv_F、MtPv_R、MtPm_F、MtPm_R、MtPo_F、MtPo_R、MtPk_F、及びMtPk_Rによる二次増幅を行った。変性95℃，15秒、アニーリング 60°C，30秒、伸長72℃，30秒を30サイクル行った。
【０１０９】
【表３】
2020096533.tif 000004
【０１１０】
３．核酸検出デバイスを用いた核酸クロマトグラフィー
図５に示すように、核酸クロマトグラフィーストリップには、ＤＮＡタグ１，２，３，４，７，８に相補的なＤＮＡ鎖（タグ１相補鎖、タグ２相補鎖、タグ３相補鎖、タグ４相補鎖、タグ７相補鎖、タグ８相補鎖）を、ストリップの長手方向に対して交差する方向に略直線状にプリントしておいた。このような構成にすることで、例えば配列番号１の塩基配列からなる順方向プライマーMtPf_Fと配列番号２の塩基配列からなる逆方向プライマーMtPf_Rにより増幅されたＤＮＡがある場合には、ＤＮＡタグ１に相補的なＤＮＡが取り付けられたラインがナノラテックスにより青色に呈色して観察される。
【０１１１】
上記のマルチプレックスＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を、核酸クロマトグラフィー用の展開液に加えてハイブリダイズ用溶液を調製し（表４）、核酸クロマトグラフィーストリップ（C-PAS8 (2 mm)（TBA株式会社）の下端を当該溶液に浸漬し、ＰＣＲ産物を室温にて核酸クロマトグラフィーストリップに展開した。
【０１１２】
図６に、展開10分後のストリップにおけるＰＣＲ産物の様子を示す。丸印は検出されたバンドの位置を指し、陰性対照以外の５つのレーンのすべてにおいて属特異的なバンドが観察され(マラリア共通、Pos)、５つのレーンのそれぞれでサルマラリアに特異的なバンド（Pk）、四日熱マラリアに特異的なバンド（Pm）、熱帯熱マラリアに特異的なバンド（Pf）、三日熱マラリアに特異的なバンド（Pv）、卵形マラリアに特異的なバンド（Po）が観察された。
【０１１３】
【表４】
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【０１１４】
本実施例では、５種のマラリア原虫を特異的にＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物を核酸クロマトグラフィーストリップに展開することで、検出されたバンドの位置からマラリア感染の有無及び感染マラリアの原虫種を特定できる検出又は診断デバイスを開発した。本検出法では、nested PCRとマルチプレックスＰＣＲを組み合わせることにより操作の簡便化と検出の高感度化が可能となった。また、核酸クロマトグラフィーにより、ＰＣＲ後の検出を約１０分とする迅速化が可能となった。加えて、結果がストリップ上で青色ラインとして可視化されるため、バンドの位置を肉眼で容易に識別又は診断することが可能となった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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