(57)【要約】      （修正有）【課題】滅菌処理物を含有する滅菌システム（例えば、滅菌処理用槽）から流体流を単離することを可能にする単離方法および関連ハードウェアの提供。【解決手段】滅菌処理物を環境および廃流から分離するための単離用槽を利用する単離方法により、滅菌システム（例えば、生物学的製造システム）からの流体流（例えば、廃流、組換え治療用タンパク質を含有する液体）の連続的な抜き取りが可能になり、これにより、滅菌システムの手作業による操作を少なくし、滅菌システムに汚染物質が混入するリスクを低下させることを実現する。【選択図】図１
2020103307.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
滅菌システムの汚染物質混入を阻止する方法であって、
液体を含む、第１の槽を含むシステムを用意する工程、
該第１の槽からの第１の体積の液体を、ある体積の滅菌用ガスを通過させて第２の槽に流し込む工程
を含む前記方法。
【請求項２】
該体積の滅菌用ガスは、第２の槽のヘッドスペース内に配置されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２の槽は、
（ｉ）第２の槽に入る体積の液体が、ヘッドスペースを通過するよう構成されている流体入り口、
（ｉｉ）第２の槽を出る液体が、滅菌用ガスが充填されているヘッドスペースの下から流れるよう構成されている流体出口、
（ｉｉｉ）少なくとも１つのガス入り口；および
（ｉｖ）少なくとも１つのガス出口；
を含み、
該流体入り口が、第１の槽と流体連通している、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第１の槽は、
第２の槽の流体入り口と流体連通している流体出口
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
プロセス中、第２の槽に液体が少なくとも一部充填されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
滅菌用ガスは、第２の槽に散布されるか、または第２の槽のヘッドスペースに直接、導入される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
第１の槽は滅菌されている槽である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
滅菌システムは、生物学的製造システムまたは医薬品生産システムである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第１の槽は、バイオリアクター、クロマトグラフィーシステム、マイクロろ過（ＭＦ）システム、または限外ろ過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）システムである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第１の槽中の液体は、治療用タンパク質を含む細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第１の槽中の液体は、組換え治療用タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
組換えタンパク質は細胞から分泌される、または細胞から分泌されない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
第１の体積の液体は、組換え治療用タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
第１の槽中の液体は、組換え治療用タンパク質を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
第１の体積は組換え治療用タンパク質を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
第１の槽中の液体は発酵副生物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
（ｉ）第２の槽からの第２の体積の液体を第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ１）に流す工程；
（ｉｉ）ＭＣＣＳ１を使用して、液体培養培地中の前記組換え治療用タンパク質を捕捉する工程であって、該組換え治療用タンパク質を含有するＭＣＣＳ１の溶離液が、第２のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ２）に連続的に供給される、前記工程；
（ｉｉｉ）ＭＣＣＳ２を使用して、組換え治療用タンパク質を精製およびポリッシングする工程であって、ＭＣＣＳ２からの溶離液が該組換え治療用タンパク質である、前記工程；
をさらに含み；
プロセスは統合されて、前記第１の槽から、組換え治療用タンパク質であるＭＣＣＳ２からの溶離液まで連続的に行われる、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
組換えタンパク質を精製およびポリッシングするための器具に、第２の槽からの第２の体積の液体を流し入れる工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
第２の体積の液体は、組換えタンパク質を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
組換え治療用タンパク質は、抗体もしくは抗体断片、酵素、操作されたタンパク質、または免疫原性タンパク質もしくはタンパク質断片である、請求項１１〜１３または１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
滅菌用ガスは、オゾン、エチレンオキシド、二酸化窒素または過酸化水素蒸気からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
第１の体積の液体は廃流である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
滅菌処理物流を非滅菌環境から単離するシステムであって、
流体出口を含む第１の槽；ならびに
（ｉ）第１の槽の流体出口と流体連通しており、かつ第２の槽に入る流体が、第２の槽内の滅菌用ガスが充填されているヘッドスペースを通過するよう構成されている流体入り口、
（ｉｉ）第２の槽を出る流体が、第２の槽内の滅菌用ガスが充填されているヘッドスペースの下から抜き取られるよう構成されている流体出口、
（ｉｉｉ）少なくとも１つのガス入り口；および
（ｉｖ）少なくとも１つのガス出口：
を含む、少なくとも１つの第２の槽
を含む前記システム。
【請求項２４】
第１の槽は、生物学的製造システムの構成成分である、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
第１の槽は、流体用導管、バイオリアクター、クロマトグラフィーシステム、マイクロろ過（ＭＦ）システム、または限外ろ過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）システムである、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
バイオリアクターは、生産用バイオリアクターまたは播種用バイオリアクター、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
バイオリアクターは、潅流バイオリアクターまたは流加バイオリアクターである、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２８】
第１の槽と第２の槽との間に配設されている流体用導管をさらに含む、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２９】
第１の槽と第２の槽との間の流体用導管において配設されているフィルターであって、該流体用導管中の流体から粒子物質を除去するよう構成されている前記フィルターをさらに含む、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
流体用導管に配設されているポンプシステムをさらに含む、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３１】
ポンプシステムは、槽の出口からある体積の流体を取り出して、該体積を、第２の槽の流体入り口に流し込むよう構成されているポンプを含む、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】
第２の槽の流体出口と流体連通しているポンプシステムをさらに含む、請求項２３に記載のシステム。
【請求項３３】
第１の槽とポンプとの間の流体用導管に配設されているフィルターであって、該流体用導管中に存在している流体から粒子物質を除去するよう構成されている前記フィルターをさらに含む、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３４】
第１の槽および第２の槽はスキッド上に配設されている、請求項２３に記載のシステム。
【請求項３５】
滅菌用ガスは、オゾン、エチレンオキシド、二酸化窒素または過酸化水素蒸気からなる群から選択される、請求項２３に記載のシステム。
【請求項３６】
少なくとも１つのガス出口は、第２の槽から連続的または周期的にガスを排出するよう構成されている、請求項２３に記載のシステム。
【請求項３７】
少なくとも１つのガス出口はオゾン分解ユニットとガス連通している、請求項２３に記載のシステム。
【請求項３８】
少なくとも１つのガス入り口は、滅菌用ガスを発生もしくは送出するため、または滅菌用ガスを発生および送出するためのシステムとガス連通している、請求項２３に記載のシステム。
【請求項３９】
滅菌用ガスを発生または送出するためのシステムは、オゾン発生もしくは送出システム、またはオゾン発生および送出システムである、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４０】
少なくとも１つのガス入り口は、ガスが第２の槽に放出されることを可能にする１つまたはそれ以上のガス散布要素に接続されている、請求項２３に記載のシステム。
【請求項４１】
ガス散布要素は、フィルター、開放パイプまたはフリットである、請求項４０に記載の
システム。
【請求項４２】
溶存ガスプローブをさらに含む、請求項２３に記載のシステム。
【請求項４３】
第２の槽のヘッドスペース内の滅菌用ガス濃度をモニタリングするためのセンサーをさらに含む、請求項２３に記載のシステム。
【請求項４４】
第２の槽の流体出口は、組換えタンパク質を精製およびポリッシングするための器具と流体連通している、請求項２３に記載のシステム。
【請求項４５】
槽は滅菌されている槽である、請求項２３に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全内容を参照によって本明細書に組み入れる、２０１４年１０月２４日出願の米国仮特許出願第６２／０６８，１８１号への優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、組換えタンパク質の生物工学および生物生産の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳動物細胞は、治療的にまたは商業的に重要なタンパク質を生産するために使用されることが多い。多様性のある製品パイプラインという現在の環境では、バイオテクノロジー企業は、高度に柔軟性があり、コスト効率の高い治療剤の製造に対する革新的な解決策の開発を強いられている（例えば、治療用タンパク質原薬）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
連続的な生物生産法では、滅菌処理用槽からの流体を抜き取ることが必要となることが多い。こうした流体の抜き取りは、連続流、またはある予め定められているトリガーに基づく断続流のどちらか一方とすることができる。この抜き取りは、流体が抜き取られる槽の無菌性を保護するような方法で行う必要がある。これは、流体流が、最終的に滅菌処理用槽に戻って増殖し得る生物の増殖を促進する可能性を有している場合、生物生産における難題となり得る。今日、使用されている主な方法は、第２の滅菌槽に廃流を回収し、この槽が許容量に到達すると、次に、滅菌処理用槽から切り離し、次に、上記の廃流を廃棄する、回分移送法（ｂａｔｃｈ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）である。この方法は回分法（連続ではない）となるので、理想的ではなく、槽の取り扱いおよび滅菌に多くの時間がかかる。これらの操作は、なんらかの工程が失敗する場合、プロセスリスクも起こり得る。あるいは、同一プロセスを予め滅菌されているバッグを用いて行うことが可能であるが、これらのバッグの費用は、連続法の場合、非常に高価となる恐れがあり、バッグの使用では、上記のプロセスリスクはなくならない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、滅菌処理物を含む滅菌システム（例えば、滅菌処理用槽）から、流体流を周期的にまたは連続的に単離（例えば、取り出し）することを可能にする単離方法および関連ハードウェアの開発に一部、基づいている。本単離方法は、滅菌処理物を環境および廃流から分離するための単離用槽を利用する。この単離用槽は一部しか充填されておらず、この槽内にヘッドスペースを維持しており、ヘッドスペースは、滅菌剤を含有している。この滅菌剤（例えば、滅菌用ガス（例えば、オゾン、エチレンオキシド、二酸化窒素または過酸化水素蒸気を含有するガス））は、槽に散布することができるか、または槽のヘッドスペースに直接、導入することができる。滅菌剤は、槽のヘッドスペース内に滅菌雰囲気を維持し、この槽は、入槽する滅菌処理物流と出槽する流体流（例えば、廃流）との間の隔離をもたらす。滅菌剤（例えば、滅菌用ガス）の濃度は、必要な滅菌雰囲気をもたらすよう、槽のヘッドスペース内で制御される。
【０００６】
一態様では、本開示は、滅菌システムの汚染物質混入を阻止する方法であって、液体を含む第１の槽を含むシステムを用意する工程、第１の槽から第１の体積の該液体をある体積の滅菌用ガスに通して、第２の槽に流す工程を含む方法を提供する。本明細書において企図されている滅菌システムは、以下に限定されないが、生物学的製造システムおよび医
薬品製造システムを含む。第１の槽は、滅菌されている槽である。例示的な実施形態では、第１の槽は、生物学的製造システムの構成成分を含む。例えば、第１の槽は（例えば、本明細書に記載されているかまたは当分野で公知の例示的なバイオリアクターのいずれか）、クロマトグラフィーシステムの１つもしくはそれ以上の構成成分（例えば、クロマトグラフィーカラム）、マイクロろ過システムの１つもしくはそれ以上の構成成分、または限外ろ過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）システムの１つもしくはそれ以上の構成成分とすることができる。生物学的製造システムに関すると、第１の槽の液体は、液体培養培地、および／または組換え治療用タンパク質を含む液体とすることができる。一部の実施形態では、第１の槽の液体は、組換え治療用タンパク質を含む細胞を含む。組換え治療用タンパク質は、細胞から分泌されたタンパク質または細胞から分泌されないタンパク質とすることができる。
【０００７】
一部の態様では、滅菌用ガスは、オゾン、エチレンオキシド、二酸化窒素、過酸化水素蒸気（例えば、オゾン含有ガス、エチレンオキシド含有ガス、酸化窒素含有ガスおよび二酸化水素含有ガス）からなる群から選択される。
【０００８】
第１の槽から第２の槽に流された第１の体積の液体は、廃流とすることができる。別の態様では、第１の槽から第２の槽に流された第１の体積の液体は、組換え治療用タンパク質を含む。あるいは、第１の槽から第２の槽に流された第１の体積の液体は、組換え治療用タンパク質を含有しない（すなわち、第１の体積の液体は廃流であるか、または細胞培養を開始する前の培養培地を含む）。第１の体積の液体は、発酵副生物を含んでもよい。
【０００９】
一態様では、本明細書に開示されている方法は、組換えタンパク質を精製およびポリッシングするための器具に、第２の槽からの第２の体積の液体を流す工程をさらに含む。例えば、本明細書において開示されている方法は、第２の槽からの第２の体積の液体を第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ１）に流す工程、ＭＣＣＳ１を使用して液体培養培地中の前記組換え治療用タンパク質を捕捉する工程であって、組換え治療用タンパク質を含有するＭＣＣＳ１の溶離液を第２のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ２）に連続的に供給する工程、ならびにＭＣＣＳ２を使用して組換え治療用タンパク質を精製およびポリッシングする工程であって、ＭＣＣＳ２からの溶離液が組換え治療用タンパク質である工程をさらに含むことができ；このプロセスは、統合されており、かつ第１の槽中の前記液体から組換え治療用タンパク質であるＭＣＣＳ２からの溶離液まで連続的に行われる。一部の実施形態では、第２の体積の液体は、組換えタンパク質を含む。
【００１０】
一態様では、本明細書に開示されている方法は、第２の槽からの第２の体積の液体を、生物学的廃流を廃棄するための貯蔵庫に流す工程をさらに含む。この貯蔵庫は、例えば、廃棄物を廃棄するためのシンク、または該廃液を保管および／もしくは除去するためのビーカーもしくは別の容器とすることができる。
【００１１】
本開示は、非滅菌環境から滅菌処理物流を単離するためのシステムも提供する。一態様では、本システムは、流体出口を含む第１の槽；ならびに第１の槽の流体出口と流体連通しており、かつ第２の槽に入る流体が第２の槽内の滅菌用ガスが充填されているヘッドスペースを通過するよう構成されている流体入り口、第２の槽を出る流体が、第２の槽内の滅菌用ガスが充填されているヘッドスペースより下から抜き取られよう構成されている流体出口、少なくとも１つのガス入り口、および少なくとも１つのガス出口を含む少なくとも１つの第２の槽を含む。一部の例では、第１の槽は、滅菌されている槽である。例示的な実施形態では、第１の槽は、生物学的製造システムの構成成分である。例えば、第１の槽は、流体用導管（例えば、本明細書に記載されているかまたは当分野で公知の例示的なバイオリアクターのいずれか）、クロマトグラフィーシステムの１つもしくはそれ以上の
構成成分（例えば、クロマトグラフィーカラム）、マイクロろ過システムの１つもしくはそれ以上の構成成分、または限外ろ過／ダイアフィルトレーションシステムの１つもしくはそれ以上の構成成分である。バイオリアクターは、例えば、潅流バイオリアクター、流加バイオリアクター、生産用バイオリアクターまたは播種用バイオリアクターである。一部の実施形態では、第２の槽の流体出口は、組換えタンパク質を精製およびポリッシングするための器具と流体連通している。例示的な実施形態では、第１の槽および第２の槽は、スキッド（ｓｋｉｄ）上に配設されている。
【００１２】
一部の態様では、本明細書において開示されているシステムは、第１の槽と第２の槽との間に配設されている流体用導管をさらに含み、場合により、第１の槽と第２の槽との間の流体用導管に配設されているフィルターであって、流体用導管中の流体から粒子物質を除去するよう構成されているフィルターをさらに含む。本明細書において開示されているシステムは、ポンプシステム（例えば、ポンプ）も含むことができ、この場合、このポンプシステムは、流体用導管に配設されている。一部の例では、本明細書において開示されているシステムは、第１の槽の流体出口と流体連通しているポンプ、第２の槽の流体出口と流体連通しているポンプ、またはそれらの両方を含む。一実施形態では、本ポンプシステムは、槽の出口からある体積の流体を抜き取り、その体積が第２の槽の流体入り口に流れるよう構成されている。
【００１３】
一態様では、本明細書において開示されているシステムは、第２の槽内に滅菌用ガスが充填されているヘッドスペースを含む。滅菌用ガスは、例えば、オゾン、エチレンオキシド、二酸化窒素または過酸化水素蒸気からなる群から選択されるガスとすることができる。一部の実施形態では、少なくとも１つのガス入り口は、ガスを第２の槽に放出して、ヘッドスペースに供給するのを可能にする、１つまたはそれ以上のガス散布要素に接続されている。用語「散布要素」とは、流体にガスを通気するための、多孔質要素（例えば、フィルター、開放パイプまたはフリット）を指す。ヘッドスペースに充填するため、第２の槽は、滅菌用ガスを発生もしくは送出するためのシステム、または滅菌用ガスを発生および送出するためのシステムとガス連通している少なくとも１つのガス入り口を含む。一部の実施形態では、滅菌用ガスを発生または送出するためのシステムは、オゾン発生もしくは送出システム、またはオゾン発生および送出システムである。一部の実施形態では、滅菌用ガスを送出するためのシステムは、瓶入りガスである。同様に、一部の実施形態では、第２の槽は、第２の槽から連続的または周期的にガスを排出するよう構成されている少なくとも１つのガス出口を含む。オゾンを使用するシステムの場合、ガス出口は、オゾン分解ユニットとガス連通している。第２の槽に含有する滅菌用ガスの濃度または量を制御するため、本システムは、例えば、第２の槽のヘッドスペース内の滅菌用ガス濃度をモニタリングするための、溶存ガスプローブまたはセンサーを含むことができる。
【００１４】
一態様では、第１の槽は、第２の槽の流体入り口と流体連通している流体出口を含む。例示的な実施形態では、第２の槽は、第２の槽に入る体積の流体がヘッドスペースを通過するよう構成されている流体入り口（例えば、第２の槽の液体レベルより上位に位置している流体入り口）、第２の槽を出る液体が、滅菌用ガスが充填されているヘッドスペースより下から流れるよう構成されている流体出口（例えば、第２の槽の液体レベルより下位に位置している流体出口）、少なくとも１つのガス入り口、および少なくとも１つのガス出口を含み、流体入り口は第１の槽と流体連通している。有利には、その体積の滅菌用ガスは第２の槽のヘッドスペース内に配置されている。ヘッドスペースに充填するには、滅菌用ガスは、第２の槽に散布することができるか、または第２の槽のヘッドスペースに直接、導入することができる。一部の例において、第２の槽は、少なくとも一部が液体で充填されている。
【００１５】
一部の実施形態では、第１の槽中の液体は、組換え治療用タンパク質を含む。
【００１６】
本明細書で使用する場合、名詞の前の単語「ａ」は、特定の名詞が１つまたはそれ以上であることを表す。例えば、句「組換え哺乳動物細胞」は、「１つまたはそれ以上の複数の組換え哺乳動物細胞」を表す。
【００１７】
用語「槽」は、公知技術であり、ある体積の液体またはガスを入れるのに好適な内容積を有する、任意の形状またはサイズの装置（例えば、容器）を意味する。この槽は、開放（すなわち、その外的環境と直接、相互作用する装置）とすることができるか、または閉鎖（すなわち、その外的環境と相互作用しない隔離されている装置）とすることができる。用語「槽」は、例えば、一連の制御されている物理的条件下で、細胞の維持または増殖を可能にする、液体培養培地中の複数の細胞（例えば、組換え哺乳動物細胞）を培養するのに適した内容積を有する装置を含む。槽の非限定例は、流体用導管、バイオリアクター（例えば、本明細書に記載されているかまたは当分野で公知の例示的なバイオリアクターのいずれか）、クロマトグラフィーシステムの１つもしくはそれ以上の構成成分（例えば、クロマトグラフィーカラム）、マイクロろ過システムの１つもしくはそれ以上の構成成分、限外ろ過／ダイアフィルトレーションシステムの１つもしくはそれ以上の構成成分、ビーカー、シンクまたは管である。
【００１８】
用語「滅菌」は公知技術であり、組成物を滅菌にするために使用される有効性が実証されている任意のプロセスであって、例えば、表面に存在している、流体中、医薬中または生物学的培養培地などの化合物中に含まれている、伝染性因子（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  ａｇｅｎｔ）（真菌、細菌、ウイルス、胞子体など）を含めた、すべての生命体を排除（除去）するか、または死滅させるプロセスを指す。滅菌は、熱、化学物質（例えば、ガス）、放射線照射、高圧もしくはろ過、またはそれらの組合せを適用することにより達成することができる。
【００１９】
用語「滅菌用ガス」は、本明細書で使用する場合、組成物を滅菌にすることが可能なガスまたはガス状組成物を指し、この組成物の滅菌は、例えば、表面に存在している、流体中、医薬中または生物学的培養培地などの化合物中に含まれている、伝染性因子（真菌、細菌、ウイルス、胞子体など）を含めた、すべての生命体を排除（除去）するか、または死滅させるプロセスである。
【００２０】
「完全滅菌」または「完全な滅菌の」は、自己複製性の生物学的汚染物質を完全に含まない、組成物またはプロセスを記載するために使用される。例えば、この用語は、ガンマ線を照射した槽、槽の内表面および内容物、ならびに／または緩衝液に適用することができる。完全な滅菌の組成物またはプロセスは、清浄なものとすることができる（その用語が、当分野で公知の通り）。
【００２１】
「滅菌の」または「滅菌」は、約１．０ｘ１０−６以下（例えば、約１．０ｘ１０−７以下、約１．０ｘ１０−８以下、約１．０ｘ１０−９以下、または１ｘ１０−１０）の無菌性保証レベルを有する組成物またはプロセスを記載するために使用される用語である。組成物またはプロセスが滅菌かどうかの決定は、当分野で公知の有効性が実証されているいくつかの生産方法を使用して試験することができる。例えば、滅菌組成物または方法は、自己複製性の生存している生物学的汚染物質（例えば、本明細書に記載されている自己複製性の生物学的汚染物質のいずれか）を完全に不含とすることができる。滅菌組成物または方法はまた、清浄なものとすることができる（その用語が当分野で公知の通り）。滅菌細胞培養物は、汚染物質の混入がない。
【００２２】
用語「無菌性保証レベル」または「ＳＡＬ」は、公知技術であり、処理されるユニットの回分内で完全な滅菌性を実現しているという信頼性のレベルを意味する。その確率は、
バリデーション中に行われる不活性化検討の結果に基づいて通常、計算され、１×１０−ｎの形態で表される。
【００２３】
用語「滅菌されている槽」および「滅菌処理用槽」は互換的であり、滅菌プロセスが施された槽を指す。本明細書で使用する場合、用語「滅菌されている槽」または「滅菌処理用槽」は、例えば、バイオバーデンが制御されている単一培養物（例えば、バイオバーデンが制御されている、組換え哺乳動物細胞の単一培養物）を含有している槽を含む。本明細書で使用する場合、用語「滅菌システム」とは、指定した結果（例えば、液体培養培地からの組換えタンパク質の発現および精製）を実現するために協同して機能する、１つまたはそれ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはそれ超）の滅菌処理用槽の集合体（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を含むシステムを指す。「滅菌システム」とは、合計で２つまたはそれ以上を相互接続した、または切り替え式槽からなるシステムであって、このシステムの少なくとも１つまたはそれ以上の槽が滅菌されている槽である、システムを指す。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「生物学的製造システム」または「生物生産システム」とは、生物薬を生産するためのシステムを指す。用語「医薬品生産システム」とは、低分子薬（例えば、薬物、プロドラッグまたは薬物製品）を生産するためのシステムを指す。本明細書において企図されている生物学的製造システムおよび医薬品システムの構成成分には、例えば、培養の開始および生産向けの１つまたはそれ以上のバイオリアクター、フラスコ、流体用導管、槽、クロマトグラフィーシステムの１つまたはそれ以上の構成成分（例えば、クロマトグラフィーカラム、ポンプ、処理槽）、ろ過システムの１つまたはそれ以上の構成成分（例えば、マイクロろ過システムの１つもしくはそれ以上の構成成分、または限外ろ過／ダイアフィルトレーションシステムの１つもしくはそれ以上の構成成分）、ならびに薬物を単離および精製するために利用される他の装置が含まれる。これらのシステムは、本明細書において定義されている通り、または他には、一般に、当業者により理解される通り、開放、閉鎖、統合または連続であってもよい。
【００２５】
用語「生物薬」とは、本明細書で使用する場合、病理の予防、診断または処置において使用される、生きている生物またはその産生物から作製されるか、または得られる任意の治療物質を指す。したがって、生物薬またはバイオ医薬品は、生物工学を使用して生産される医薬、例えば、治療目的またはインビボでの診断目的で使用されるタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）または核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド）である。
【００２６】
用語「低分子薬」とは、本明細書で使用する場合、病理の予防、診断または処置において使用される、低い分子量を有する治療剤を指す。この治療剤は、有機化学によって、通常、合成されるが、植物、真菌および微生物などの自然源から単離することもできる。
【００２７】
本明細書で使用する場合、第１および第２の槽が装置または導管を介して接続されて、両槽間のガスの流通または連通が可能になる場合、第１の槽は第２の槽に「ガス連通」している。同様に、第１および第２の槽が装置または導管を介して接続されて、両槽間の流体の流通または連通が可能になる場合、第１の槽は第２の槽に「流体連通」している。本発明の教示に一貫して、用語である流体連通およびガス連通は、同義的な用語であることが意図されている。この点において、流体は、液体かガスかに関わりなく、流通するまたはその容器の外形に従う傾向がある物質を含むことが意図される。この点において、ガスは流通して、ガスがその内部に留まる容器の外形に従うことができるので、流体の定義に当てはまるのは液体だけではなく、ガスも当てはまる。
【００２８】
用語「潅流バイオリアクター」は公知技術であり、液体培養培地中の複数の細胞（例え
ば、組換え哺乳動物細胞）を培養する内容積を有するバイオリアクターであって、該バイオリアクター中の液体培養培地を周期的にまたは連続的に抜き取るための手段（例えば、出口、入り口、ポンプまたは他のこうした装置）および該バイオリアクターに実質的に同じ体積の交換用液体培養培地を添加するための手段（例えば、出口、入り口、ポンプまたは他のこうした装置）を有する、バイオリアクターを意味する。交換用液体培養培地の添加は、バイオリアクターからの液体培養培地の抜き取りと実質的に同時に、またはその直後に行うことができる。バイオリアクターから液体培養培地を抜き取るための手段、および交換用液体培養培地を添加するための手段は、単一装置またはシステムとすることができる。
【００２９】
用語「生産用バイオリアクター」は、技術用語であり、大規模バイオリアクター（例えば、５００Ｌ、１，０００Ｌ、５，０００Ｌ、１０，０００Ｌ、２０，０００Ｌ、５０，０００Ｌ、または１００，０００Ｌを超える内部容積を有する）を意味する。例えば、生産用バイオリアクターは、潅流バイオリアクターとすることができる。
【００３０】
用語「流加バイオリアクター」は技術用語であり、第１の液体培養培地中に複数の細胞（例えば、組換え哺乳動物細胞）を含むバイオリアクターであって、細胞培養物から第１の液体培養培地または第２の液体培養培地を十分にもしくは有意に抜き取ることなく、該バイオリアクター中に存在している細胞の培養が、第１の液体培養培地への第２の液体培養培地の周期的または連続的な添加を含む、バイオリアクターを意味する。第２の液体培養培地は、第１の液体培養培地と同じであってもよい。流加培養物の一部の例では、第２の液体培養培地は、第１の液体培養培地の濃縮形態である。流加培養物の一部の例では、第２の液体培養培地は乾燥粉末として添加される。
【００３１】
用語「マルチカラムクロマトグラフィーシステム」または「ＭＣＣＳ」は、合計で２本またはそれ以上を相互接続した、または切り替え式クロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜のシステムを意味する。マルチカラムクロマトグラフィーシステムの非限定例は、合計で２本またはそれ以上を相互接続した、または切り替え式クロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜を含む、周期的な向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣ）である。マルチカラムクロマトグラフィーシステムの追加例は、本明細書に記載されており、当分野で公知である。
【００３２】
用語「哺乳動物細胞」は、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、ハムスター、マウス、ミドリサル、ラット、ブタ、ウシまたはウサギ）に由来する、またはこれらから誘導された、いかなる細胞も意味する。例えば、哺乳動物細胞は、不死化細胞とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は分化細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は非分化細胞である。哺乳動物細胞の非限定例は、本明細書に記載されている。哺乳動物細胞の追加例は、当分野で公知である。
【００３３】
用語「培養する」または「細胞培養する」は、一連の制御されている物理的条件下、哺乳動物細胞（例えば、組換え哺乳動物細胞）の維持または増殖を意味する。
【００３４】
用語「哺乳動物細胞の培養物」または「細胞培養物」は、一連の制御されている物理的条件下で、維持されているかまたは増殖された複数の哺乳動物細胞を含む液体培養培地を意味する。
【００３５】
用語「液体培養培地」または「培養培地」は、細胞（例えば、哺乳動物細胞）がインビトロで成長または増殖することが可能な、十分な栄養素を含む流体を意味する。例えば、液体培養培地は、アミノ酸（例えば、２０種のアミノ酸）、プリン（例えば、ヒポキサンチン）、ピリミジン（例えば、チミジン）、コリン、イノシトール、チアミン、葉酸、ビ
オチン、カルシウム、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チミジン、シアノコバラミン、ピルベート、リポ酸、マグネシウム、グルコース、ナトリウム、カリウム、鉄、銅、亜鉛および炭酸水素ナトリウム：の１つまたはそれ以上を含むことができる。一部の実施形態では、液体培養培地は、哺乳動物に由来する血清を含むことができる。一部の実施形態では、液体培養培地は、哺乳動物に由来する血清または別の抽出物を含まない（規定されている液体培養培地）。一部の実施形態では、液体培養培地は、微量金属、哺乳動物の成長ホルモンおよび／または哺乳動物の成長因子を含むことができる。液体培養培地の別の例は、最少培地（例えば、無機塩、炭素源および水しか含まない培地）である。液体培養培地の非限定例は、本明細書に記載されている。液体培養培地の追加例は、当分野で公知であり、市販されている。液体培養培地は、任意の密度の哺乳動物細胞を含むことができる。例えば、本明細書で使用する場合、生産用バイオリアクターから抜き取られたある体積の液体培養培地は、実質的に哺乳動物細胞を不含とすることができる。
【００３６】
用語「組換え治療用タンパク質」または「組換えタンパク質」は、公知技術であり、組換えＤＮＡ技術によって得られる任意の治療用タンパク質を意味する。本明細書で使用する場合、「組換え治療用タンパク質」には、例えば、抗体もしくは抗体断片、酵素、操作されたタンパク質、または免疫原性タンパク質もしくはタンパク質断片が含まれる。
【００３７】
用語「タンパク質断片」または「ポリペプチド断片」は、長さが、少なくとももしくは約４個のアミノ酸、少なくとももしくは約５個のアミノ酸、少なくとももしくは約６個のアミノ酸、少なくとももしくは約７個のアミノ酸、少なくとももしくは約８個のアミノ酸、少なくとももしくは約９個のアミノ酸、少なくとももしくは約１０個のアミノ酸、少なくとももしくは約１１個のアミノ酸、少なくとももしくは約１２個のアミノ酸、少なくとももしくは約１３個のアミノ酸、少なくとももしくは約１４個のアミノ酸、少なくとももしくは約１５個のアミノ酸、少なくとももしくは約１６個のアミノ酸、少なくとももしくは約１７個のアミノ酸、少なくとももしくは約１８個のアミノ酸、少なくとももしくは約１９個のアミノ酸、もしくは少なくとももしくは約２０個のアミノ酸、または長さが２０個のアミノ酸を超える、ポリペプチド配列の部分を意味する。組換えタンパク質断片は、本明細書に記載されている方法のいずれかを使用して生産することができる。
【００３８】
用語「操作されたタンパク質」は、生物（例えば、哺乳動物）内に存在している内因性核酸によって天然でコードされないポリペプチドを意味する。操作されたタンパク質の例は、酵素（例えば、操作された酵素の安定性および／または触媒活性の増加をもたらす、１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入または追加）、融合タンパク質、抗体（例えば、二価抗体、三価抗体またはダイアボディ）、および少なくとも１つの組換え足場配列を含む抗原−結合タンパク質を含む。
【００３９】
用語「統合法」は、特定の結果（例えば、液体培養培地からの単離組換えタンパク質の産生）を達成するために、協同して機能する構造的要素を使用して行われる方法を意味する。
【００４０】
用語「連続法」は、少なくともシステムの一部により、連続的に流体を供給する方法を意味する。
【００４１】
用語「ろ過」は、液体（例えば、本明細書に記載されているシステムまたは方法のいずれかにおいて存在している液体培養培地または流体）から、望ましくない生物学的汚染物質（例えば、哺乳動物細胞、細菌、酵母細胞、ウイルスまたはマイコバクテリア）および／または粒子物質（例えば、沈殿タンパク質）の少なくとも一部（例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）を除去することを意味する。
【００４２】
用語「潅流培養」は、技術用語であり、槽（例えば、バイオリアクター）中で細胞培養物を培養することを意味し、この場合、該槽中の細胞培養物の培養は、槽中に存在している液体培養培地（例えば、細胞を実質的に含まない液体培養培地）の定期的または連続的な抜き取り、および同時にまたはその直後に、該槽に実質的に同じ体積の交換用液体培養培地を添加することを含む。いくつかの例において、培養期間中に、抜き取られた液体培養培地の体積、および漸増期間（例えば、約２４時間、約１分間〜約２４時間の間の期間、または２４時間を超える期間）にわたり添加された交換用培養培地の体積の増分変化（例えば、増加または減少）が存在する（例えば、毎日の培養培地の再供給速度）。毎日、抜き取られた置き換えられた培地の画分は、培養される特定の細胞、初期播種密度、および特定の時間における細胞密度に応じて、様々となり得る。「ＲＶ」または「リアクター体積」は、培養プロセスの開始時に存在している培養培地の体積（例えば、播種後に存在している培養培地の全体積）を意味する。
【００４３】
用語「流加培養する」は技術用語であり、槽（例えば、生産用バイオリアクター）が液体培養培地中に複数の細胞（例えば、哺乳動物細胞）を含んでいることを意味し、この場合、槽（例えば、生産用バイオリアクター）中に存在している細胞の培養が、培養中に該槽から十分な量または有意な量の液体培養培地の抜き取りなしに、該槽への新しい液体培養培地の周期的または連続的な添加を含む。新しい液体培養培地は、培養の開始時に槽中に存在している液体培養培地と同一とすることができる。流加培養の一部の例では、新しい液体培養培地は、培養の開始時に槽中に存在している、濃縮形態の液体培養培地である。流加培養物の一部の例では、新しい培養培地は乾燥粉末として添加される。
【００４４】
「スキッド」は、技術用語であり、本明細書で使用する場合、本明細書に記載されているシステムのためのプラットフォームまたは支持体として働くことができる三次元の中実構造を指す。スキッドは、移動を可能にする１つまたはそれ以上の構造体（例えば、輪またはローラーなど）を含む場合、システムまたはその一部に可動性を付与することができる。スキッドの非限定例は、本明細書に記載されている。スキッドの追加例は、当分野で公知である。
【００４５】
特に定義されない限り、本明細書において使用される技術的および科学的用語はすべて、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。方法および物質は、本発明において使用するために本明細書に記載されている；当分野において公知の他の適切な方法および物質も使用することができる。これらの物質、方法および例は、単なる例示に過ぎず、限定を意図するものではない。本明細書において言及されているすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリーおよび他の参照物は、それらの全体が参照により組み入れられている。矛盾する場合、定義を含め、本明細書に従う。
【００４６】
本発明の他の特徴および利点は、以下に詳述されている説明および図から、ならびに特許請求の範囲から明白になろう。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明による滅菌処理物流を非滅菌環境から単離するための、例となるシステムを例示している模式図である。
【図２】本発明による滅菌処理物流を非滅菌環境から単離するための、例となるシステムを例示している模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
滅菌処理物を含有する滅菌システム（例えば、滅菌処理用槽）から流体流を単離するこ
とを可能にする単離方法および関連ハードウェアが本明細書において提供される。本明細書において記載されている単離方法は、多くの利点をもたらす。例えば、本単離方法は、滅菌システムからの流体流の周期的または連続的な抜き取りを可能にし、これにより、滅菌システムの手作業による操作を少なくし、滅菌システムに汚染物質が混入するリスクを低下させることを実現する。例えば、本明細書において記載されている単離方法は、バイオリアクターからの液体（例えば、廃流、組換え治療用タンパク質を含有する液体）の周期的または連続的な抜き取りを実現し、ひいては、細胞培養物の手作業による操作を少なくし、細胞培養物に汚染物質が混入するリスクを低下させることを実現する。これらの単離方法の非限定的な態様は、本明細書に記載されており、任意に組み合わせて使用することができる。
【００４９】
本明細書に記載されている方法は、第１の槽から第２の槽に流体体積を流す工程、第３の槽から第４の槽に流体体積を流す工程、または第５の槽から第６の槽に流体体積を流す工程を含む。本技術において理解される通り、重力流など、またはポンプの支援により、第１の槽から第２の槽に液体の体積を流すための方法が多数存在している。したがって、一部の態様では、本明細書において記載されているシステムはまた、１つまたはそれ以上（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のポンプ（例えば、自動ポンプ、例えば自動ペリスタポンプ）も含むことができる。１つまたはそれ以上のポンプは、第１の槽と第２の槽との間に配設されている流体用導管に配設することができる。例えば、本明細書において記載されているシステムはまた、第１の槽の出口からある体積の流体を抜き取り、第２の槽に該体積を流すよう構成されている１つまたはそれ以上のポンプも含むことができる。一部の例では、１つまたはそれ以上のポンプが、滅菌処理用槽の出口からある体積の流体を抜き取り、該体積を本明細書に記載されている単離用槽の流体入り口に流し込むよう構成されている。一部の例では、１つまたはそれ以上のポンプは、単離用槽の少なくとも１つの流体出口と流体連通している。流体は、滅菌処理用槽から抜き取ることができ、ポンプシステムによって抜き取ることができる（例えば、交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）ろ過システムまたはタンジェンシャル流体ろ過（ＴＦＦ））。
【００５０】
一部の例では、本明細書において記載されているシステムは、液体（例えば、本明細書に記載されているシステムまたは方法のいずれかにおいて存在している液体培養培地もしくは流体）から、望ましくない生物学的汚染物質（例えば、哺乳動物細胞、細菌、酵母細胞、ウイルスまたはマイコバクテリア）および／または粒子物質（例えば、沈殿タンパク質）を除去するための１つまたはそれ以上（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のフィルターを含むこともできる。
【００５１】
一部の態様では、本開示は、滅菌システムの汚染物質混入を阻止する方法であって、液体を含む第１の槽を含むシステムを用意する工程、第１の槽から第１の体積の液体をある体積の滅菌用ガスに通して、第２の槽に流す工程を含む方法を提供する。
【００５２】
一部の態様では、本開示は、滅菌システムの汚染物質混入を阻止する方法であって、液体を含む第１の槽を含むシステムを用意する工程、第１の槽から第１の体積の液体をある体積の滅菌用ガスに通して、第２の槽に流す工程を含む方法を提供する。一部の例では、第１の槽は滅菌処理用槽であり、滅菌処理用槽は、第２の槽の流体入り口と流体連通している流体出口を含む。一部の例では、第２の槽は、本明細書に記載されている単離用槽であり、上記体積の滅菌用ガスが、単離用槽のヘッドスペース内に配置されている。
【００５３】
一部の態様では、本開示は、非滅菌環境から滅菌処理物流を単離するためのシステムを提供する。一部の例の場合、本システムは、流体出口を含む滅菌処理用槽（例えば、第１の槽）、ならびに（ｉ）第１の槽の流体出口と流体連通しており、かつ第２の槽に入る流体が第２の槽内の滅菌用ガスが充填されているヘッドスペースを通過するよう構成されて
いる流体入り口、（ｉｉ）第２の槽を出る流体が、第２の槽内の滅菌用ガスが充填されているヘッドスペースより下から抜き取られよう構成されている流体出口、（ｉｉｉ）少なくとも１つのガス入り口；および（ｉｖ）少なくとも１つのガス出口を含む少なくとも１つの単離用槽（例えば、第２の槽）を含む。一部の例では、本明細書において開示されているシステムは、第１の槽と第２の槽との間に配設されている、流体用導管をさらに含む。
【００５４】
本明細書において開示されている単離方法は、滅菌処理物を環境および廃流から分離するための槽（すなわち、「単離用槽」）を利用する。一部の例では、単離用槽は、（ｉ）滅菌処理用槽の流体出口と流体連通しており、かつ単離用槽に入る流体が、単離用槽内の滅菌用ガスが充填されているヘッドスペースを通過するよう構成されている流体入り口、（ｉｉ）単離用槽を出る流体が、単離用槽内の滅菌用ガスが充填されているヘッドスペースより下から抜き取られよう構成されている流体出口、（ｉｉｉ）少なくとも１つのガス入り口；および（ｉｖ）少なくとも１つのガス出口を含む。
【００５５】
本技術において理解される通り、単離用槽は、様々な異なる体積を有することができる。例えば、単離用槽は、約０．２０Ｌ〜約２０Ｌの間（例えば、約０．２０Ｌ〜約１８Ｌの間、約０．２０Ｌ〜約１６Ｌの間、約０．２０Ｌ〜約１４Ｌの間、約０．２０Ｌ〜約１２Ｌの間、約０．２０Ｌ〜約１０Ｌの間、約０．２０Ｌ〜約９．０Ｌの間、約０．２０Ｌ〜約８．０Ｌの間、約０．２０Ｌ〜約７．０Ｌの間、約０．２０Ｌ〜約６．０Ｌの間、約０．２０Ｌ〜約５．０Ｌの間、約０．２０Ｌ〜約４．０Ｌの間、約０．２０Ｌ〜約３．０Ｌの間、約０．２０Ｌ〜約２．０Ｌの間、約０．２０Ｌ〜約１．０Ｌの間、約０．５０Ｌ〜約１８Ｌの間、約０．５０Ｌ〜約１６Ｌの間、約０．５０Ｌ〜約１４Ｌの間、約０．５０Ｌ〜約１２Ｌの間、約０．５０Ｌ〜約１０Ｌの間、約０．５０Ｌ〜約９．０Ｌの間、約０．５０Ｌ〜約８．０Ｌの間、約０．５０Ｌ〜約７．０Ｌの間、約０．５０Ｌ〜約６．０Ｌの間、約０．５０Ｌ〜約５．０Ｌの間、約０．５０Ｌ〜約４．０Ｌの間、約０．５０Ｌ〜約３．０Ｌの間、約０．５０Ｌ〜約２．０Ｌの間、約０．５０Ｌ〜約１．０Ｌの間、約１．０Ｌ〜約２０Ｌの間、約１．０Ｌ〜約１８Ｌの間、約１．０Ｌ〜約１６Ｌの間、約１．０Ｌ〜約１４Ｌの間、約１．０Ｌ〜約１２Ｌの間、約１．０Ｌ〜約１０Ｌの間、約１．０Ｌ〜約９．０Ｌの間、約１．０Ｌ〜約８．０Ｌの間、約１．０Ｌ〜約７．０Ｌの間、約１．０Ｌ〜約６．０Ｌの間、約１．０Ｌ〜約５．０Ｌの間、約１．０Ｌ〜約４．０Ｌの間、約１．０Ｌ〜約３．０Ｌの間、約１．０Ｌ〜約２．０Ｌの間、約１．０Ｌ〜約１．０Ｌの間）、または約０．２０Ｌ、約０．５０Ｌ、約１．０Ｌ、約２．０Ｌ、約３．０Ｌ、約４．０Ｌ、約５．０Ｌ、約６．０Ｌ、約７．０Ｌ、約８．０Ｌ、約９．０Ｌ、約１０．０Ｌ、約１２．０Ｌ、約１４．０Ｌ、約１６．０Ｌ、約１８．０Ｌもしくは約２０．０Ｌの内部容積を有することができる。
【００５６】
この単離用槽は、一部しか充填されておらず、この槽内にヘッドスペースを維持している。ヘッドスペースは、滅菌剤（例えば、滅菌用ガス）を含むことができる。一部の例では、滅菌用ガスが充填された、単離用槽内に含まれているヘッドスペースは、単離用槽の全内容積の約３％〜約９７％の間；単離用槽の全内容積の約５％〜約９５％の間、例えば、単離用槽の全内容積の約１０％〜約９０％の間；単離用槽の全内容積の約１５％〜約８５％の間；単離用槽の全内容積の約２０％〜約８０％の間；単離用槽の全内容積の約２５％〜約７５％の間；単離用槽の全内容積の約３０％〜約７０％の間；単離用槽の全内容積の約３５％〜約６５％の間；単離用槽の全内容積の約４０％〜約６０％の間；単離用槽の全内容積の約４５％〜約５５％の間；または単離用槽の全内容積の約５％；単離用槽の全内容積の約１０％；単離用槽の全内容積の約１５％；単離用槽の全内容積の約２０％；単離用槽の全内容積の約２５％；単離用槽の全内容積の約３０％；単離用槽の全内容積の約３５％；単離用槽の全内容積の約４０％；単離用槽の全内容積の約４５％；単離用槽の全内容積の約５０％；単離用槽の全内容積の約５５％；単離用槽の全内容積の約６０％；単
離用槽の全内容積の約６５％；単離用槽の全内容積の約７５％；単離用槽の全内容積の約８０％；単離用槽の全内容積の約８５％；単離用槽の全内容積の約９０％；もしくは単離用槽の全内容積の約９５％を占める。
【００５７】
本明細書に開示されているシステムおよび方法において使用される例示的な滅菌用ガスには、例えば、オゾンガス、エチレンオキシドガス、二酸化窒素ガスおよび二酸化水素蒸気（例えば、オゾン含有ガス、エチレンオキシド含有ガス、酸化窒素含有ガスおよび二酸化水素含有ガス）、またはこうしたガスの適切な任意の混合物が含まれる。一部の例では、単離用槽のヘッドスペース内に含まれる滅菌用ガスは、例えば、約１５℃〜約７０℃、約２０℃〜約６５℃、約２５℃〜約６０℃、約３０℃〜約５５℃、約３５℃〜約５０℃または約４０℃〜約４５℃の間の温度で維持することができる。
【００５８】
オゾンは、滅菌用ガスとして多数の利点をもたらす。オゾンは、その強力な酸化特性のため、非常に有効な滅菌剤であり、プリオンを含めた、幅広い範囲の病原体を死滅することが可能である。オゾンの高い反応性は、廃棄オゾンは、オゾンを酸素に戻す単一触媒にオゾンを通過させることにより分解することができることを意味する。それは、周期時間が比較的に短いことも意味する。一部の例では、ヘッドスペースはオゾンを、例えば、少なくとも約３０００ｐｐｍ、例えば、少なくとも約４０００ｐｐｍ、少なくとも約５０００ｐｐｍ、少なくとも約６０００ｐｐｍ、少なくとも約７０００ｐｐｍ、少なくとも約８０００ｐｐｍ、少なくとも約９０００ｐｐｍ、少なくとも約１０，０００ｐｐｍ、少なくとも約１５，０００ｐｐｍ、少なくとも約２０，０００ｐｐｍ、少なくとも約５０，０００ｐｐｍ、少なくとも約１００，０００ｐｐｍ、少なくとも約５００，０００ｐｐｍまたは少なくとも約１，０００，０００ｐｐｍのオゾン濃度を有するオゾン含有ガスを含有する。
【００５９】
エチレンオキシドは、殺菌特性を有しており、細菌胞子を含めた、公知のウイルス、細菌および真菌のすべてを死滅することができ、大部分の物質（例えば、生物学的生産方法において使用される滅菌処理用槽）と適合可能である。一部の例では、ヘッドスペースはエチレンオキシド、例えば、少なくとも約５００ｐｐｍ、例えば、少なくとも約８５０ｐｐｍ、少なくとも約１０００ｐｐｍ、少なくとも約２０００ｐｐｍ、少なくとも約３０００ｐｐｍ、少なくとも約４０００ｐｐｍ、少なくとも約５０００ｐｐｍ、少なくとも約６，０００ｐｐｍ、少なくとも約７，０００ｐｐｍ、少なくとも約８，０００ｐｐｍ、少なくとも約９，０００ｐｐｍ、少なくとも約１０，０００ｐｐｍ、少なくとも約１５，０００ｐｐｍ、少なくとも約２０，０００ｐｐｍ、少なくとも約５０，０００ｐｐｍ、少なくとも約１００，０００ｐｐｍ、少なくとも約５００，０００ｐｐｍまたは少なくとも約１，０００，０００ｐｐｍのエチレンオキシド濃度を有するエチレンオキシド含有ガスを含有する。
【００６０】
二酸化窒素（ＮＯ２）ガスは、一般的な細菌、ウイルスおよび胞子を含めた、幅広い範囲の微生物に対する滅菌剤として有効である。一部の例では、ヘッドスペースは二酸化窒素、例えば、少なくとも約５００ｐｐｍ、少なくとも約８５０ｐｐｍ、少なくとも約１０００ｐｐｍ、少なくとも約２０００ｐｐｍ、少なくとも約３０００ｐｐｍ、少なくとも約４０００ｐｐｍ、少なくとも約５０００ｐｐｍ、少なくとも約６，０００ｐｐｍ、少なくとも約７，０００ｐｐｍ、少なくとも約８，０００ｐｐｍ、少なくとも約９，０００ｐｐｍ、少なくとも約１０，０００ｐｐｍ、少なくとも約１５，０００ｐｐｍ、少なくとも約２０，０００ｐｐｍ、少なくとも約５０，０００ｐｐｍ、少なくとも約１００，０００ｐｐｍ、少なくとも約５００，０００ｐｐｍまたは少なくとも約１，０００，０００ｐｐｍの二酸化窒素濃度を有する二酸化窒素含有ガスを含有する。
【００６１】
過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）は、良好な殺菌特性を有しており、水および酸素に分解するこ
とができる。一部の例では、ヘッドスペースは過酸化水素、例えば、少なくとも約５ｐｐｍ、少なくとも約１０ｐｐｍ、少なくとも約５０ｐｐｍ、少なくとも約１００ｐｐｍ、少なくとも約２５０ｐｐｍ、少なくとも約５００ｐｐｍ、少なくとも約８５０ｐｐｍ、少なくとも約１０００ｐｐｍ、少なくとも約２０００ｐｐｍ、少なくとも約３０００ｐｐｍ、少なくとも約４０００ｐｐｍ、少なくとも約５０００ｐｐｍ、少なくとも約６，０００ｐｐｍ、少なくとも約７，０００ｐｐｍ、少なくとも約８，０００ｐｐｍ、少なくとも約９，０００ｐｐｍ、少なくとも約１０，０００ｐｐｍ、少なくとも約１５，０００ｐｐｍ、少なくとも約２０，０００ｐｐｍ、少なくとも約５０，０００ｐｐｍ、少なくとも約１００，０００ｐｐｍ、少なくとも約５００，０００ｐｐｍまたは少なくとも約１，０００，０００ｐｐｍの過酸化水素濃度を有する過酸化水素含有ガスを含有する。
【００６２】
単離用槽は、滅菌雰囲気をモニタリングするために、槽のヘッドスペース内の滅菌剤（例えば、滅菌用ガス）の濃度をモニターするための構成成分をさらに含んでもよい。例えば、単離用槽は、ヘッドスペース内の滅菌用ガスの濃度をモニタリングするためのセンサー、または単離用槽に含有する液体の溶存ガス濃度をモニタリングするためのセンサー（例えば、溶存ガスプローブ）を含むことができる。
【００６３】
一部の例では、単離用槽内の液体により充填されている空間は、単離用槽の全体積の約３％から約９７％の間；単離用槽の全体積の約５％〜約９５％の間；単離用槽の全体積の約１０％〜約９０％の間；単離用槽の全体積の約１５％〜約８５％の間；単離用槽の全体積の約２０％〜約８０％の間；単離用槽の全体積の約２５％〜約７５％の間；単離用槽の全体積の約３０％〜約７０％の間；単離用槽の全体積の約３５％〜約６５％の間；単離用槽の全体積の約４０％〜約６０％の間；単離用槽の全体積の約４５％〜約５５％の間；または単離用槽の全体積の約５％；単離用槽の全体積の約１０％；単離用槽の全体積の約１５％、単離用槽の全体積の約２０％；単離用槽の全体積の約２５％；単離用槽の全体積の約３０％；単離用槽の全体積の約３５％；単離用槽の全体積の約４０％；単離用槽の全体積の約４５％；単離用槽の全体積の約５０％；単離用槽の全体積の約５５％；単離用槽の全体積の約６０％；単離用槽の全体積の約６５％；単離用槽の全体積の約７５％；単離用槽の全体積の約８０％；単離用槽の全体積の約８５％；単離用槽の全体積の約９０％；または単離用槽の全体積の約９５％となる。
【００６４】
単離用槽は、単離用槽のヘッドスペースに滅菌用ガスを導入するための、少なくとも１つのガス入り口を含むことができる。本技術において理解される通り、ガスを槽のヘッドスペースに導入することができる方法が多数存在する。例えば、ガスは、槽に散布してもよく、または槽のヘッドスペースに直接、導入してもよい。したがって、少なくとも１つのガス入り口は、ガスが単離用槽に放出されるのを可能にする、１つまたはそれ以上のガス散布要素に接続することができる。ガス入り口は、滅菌用ガスを発生または送出するため、または滅菌用ガス（例えば、オゾン、エチレンオキシド、二酸化窒素または過酸化水素蒸気）を発生および送出するためのシステムと導管を介してガス連通していてよい。例えば、当分野において周知の通り、ガス入り口は、オゾンを発生するためのシステムとガス連通していてよい。
【００６５】
単離用槽は、単離用槽のヘッドスペースからガスを連続的または周期的に排出するよう構成されている、少なくとも１つのガス出口を含むことができる。本技術において理解される通り、ヘッドスペースのガス圧力が過剰となる場合、ガス出口は、自動的にガスを排出するよう構成することができる。ガス出口は、滅菌用ガスを含有、分解または弱化するよう構成されているユニットとガス連通していてよい。例えば、ガス出口は、オゾン分解ユニットとガス連通していてよい。オゾン分解ユニットは、公知技術であり、触媒的、熱的、熱−触媒的、または活性炭とすることができる。触媒的ユニットは、二酸化マンガン、またはパラジウムによりコーティングされているアルミニウムのどちらか一方を使用す
ることができ、約５０℃の温度でオゾンを分解する。熱分解ユニットは、通常、約１２０℃の温度で操作される。
【００６６】
一部の例では、本明細書に記載されている単離用槽は、滅菌処理用槽の少なくとも１つの流体出口と流体連通しており、かつ単離用槽に入る流体が、単離用槽内の滅菌用ガスが充填されているヘッドスペースを通過するよう構成されている、少なくとも１つの流体入り口を含む。一部の態様では、単離用槽の少なくとも１つの流体入り口は、流体用導管を介して、滅菌処理用槽の少なくとも１つの流体出口と流体連通している。
【００６７】
一部の例では、本明細書に記載されている単離用槽は、少なくとも１つの流体出口を含む。一部の例示的なシステム構成の場合、単離用槽の少なくとも１つの流体出口は、組換えタンパク質を精製およびポリッシングするための器具と流体連通している。したがって、一部の態様では、本明細書に開示されている方法は、単離用槽（例えば、第２の槽）からのある体積の液体を、組換えタンパク質を精製およびポリッシングするための器具に流し込む工程を含む。
【００６８】
用語「精製」は、１つもしくはそれ以上の他の不純物（例えば、バルク不純物）または組換えタンパク質を含む流体中に存在している構成成分（例えば、哺乳動物細胞中に存在しているかまたはそれから分泌される、液体培養培地タンパク質または１つもしくはそれ以上の他の構成成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、他のタンパク質、内毒素、ウイルスなど））から組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を単離するために行われる工程を意味する。例えば、精製は、初期捕捉工程中またはその後に行うことができる。精製は、当分野で公知の任意の方法を使用して、例えば、（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィーまたはモレキュラーシーブクロマトグラフィーの使用により）組換えタンパク質または汚染物質のどちらかに結合する、樹脂、膜または他の任意の固体担体を使用して行うことができる。組換えタンパク質は、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜（例えば、本明細書に記載されているクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜のいずれか）を使用して、組換えタンパク質を含む流体から精製することができる。
【００６９】
用語「ポリッシング」は技術用語であり、所望の最終的な純度に近い、組換え治療用タンパク質を含む流体から、残留している微量もしくは少量の汚染物質または不純物を除去するために行われる工程を意味する。例えば、ポリッシングは、標的組換え治療用タンパク質、または組換え治療用タンパク質を含む流体中に存在している少量の汚染物質もしくは不純物のどちらかに選択的に結合するクロマトグラフィーカラムまたは膜吸収剤に、組換え治療用タンパク質を含む流体を流すことにより行うことができる。こうした例では、クロマトグラフィーカラムまたは膜吸収剤の溶離液／ろ液は、組換え治療用タンパク質を含む。
【００７０】
例えば、本開示は、単離用槽（例えば、第２の槽）からの組換えタンパク質を含むある体積の液体を第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ１）に流す工程、ＭＣＣＳ１を使用して液体培養培地中の前記組換え治療用タンパク質を捕捉する工程であって、組換え治療用タンパク質を含有するＭＣＣＳ１の溶離液を第２のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ２）に連続的に供給する工程；ならびにＭＣＣＳ２を使用して組換え治療用タンパク質を精製およびポリッシングする工程であって、ＭＣＣＳ２からの溶離液が組換え治療用タンパク質である工程を含む方法であって；このプロセスは統合されており、かつ前記第１の槽から、組換え治療用タンパク質であるＭＣＣＳ２からの溶離液まで連続的に行われる、方法を提供する。
【００７１】
用語「マルチカラムクロマトグラフィーシステム」または「ＭＣＣＳ」は、合計で２本またはそれ以上を相互接続した、または切り替え式クロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜のシステムを意味する。マルチカラムクロマトグラフィーシステムの非限定例は、合計で２本またはそれ以上を相互接続した、または切り替え式クロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜を含む、周期的な向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣ）である。マルチカラムクロマトグラフィーシステムの追加例は、本明細書に記載されており、当分野で公知である。
【００７２】
用語「捕捉する」は、液体培養培地または希釈液体培養培地（例えば、培養培地タンパク質、または哺乳動物細胞に存在しているかもしくはそれから分泌される、１つもしくはそれ以上の他の構成成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは他のタンパク質））中に存在している、１つまたはそれ以上の他の構成成分から、組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を部分的に精製するまたは単離する（例えば、少なくとももしくは約５％、例えば、少なくとももしくは約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとももしくは約９５％の重量純度）、濃縮するおよび安定化させるために行われた工程を意味する。通常、捕捉は、組換えタンパク質を結合させる樹脂（例えば、アフィニティークロマトグラフィーの使用による）を使用して行われる。液体培養培地または希釈液体培養培地から組換えタンパク質を捕捉する非限定法は本明細書に記載されており、他のものは、当分野において公知である。組換えタンパク質は、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜（例えば、本明細書に記載されているクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜のいずれか）を使用して、液体培養培地から捕捉することができる。
【００７３】
用語「溶離液／ろ液」は技術用語であり、検出可能な量の組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を含むクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から送り出された流体を意味する。
【００７４】
用語「ろ過」は、液体（例えば、本明細書に記載されているシステムまたは方法のいずれかにおいて存在している液体培養培地または流体）から、望ましくない生物学的汚染物質（例えば、哺乳動物細胞、細菌、酵母細胞、ウイルスまたはマイコバクテリア）および／または粒子物質（例えば、沈殿タンパク質）の少なくとも一部（例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）を除去することを意味する。
【００７５】
用語「分泌されたタンパク質」または「分泌された組換えタンパク質」は、哺乳動物細胞において、それが哺乳動物細胞内で翻訳された際、および少なくとも一部が、分泌シグナル配列の酵素的切断により、少なくとも１つの分泌シグナル配列を元々含んでいるタンパク質（例えば、組換えタンパク質）が、少なくとも部分的に細胞外空間（例えば、液体培養培地）に分泌されることを意味する。熟練専門家であれば、「分泌された」タンパク質は、分泌されたタンパク質と見なされる細胞から、完全に解離している必要がないことを理解するであろう。
【００７６】
一部の例示的なシステム構成の場合、単離用槽の少なくとも１つの流体出口は、廃棄物質を受け入れるおよび／または廃棄するための貯蔵庫（例えば、槽、シンク、または当業者に公知の生物学的処理流体物質を廃棄するためのユニット）と流体連通している。
【００７７】
本単離方法およびシステムにより、滅菌処理物を含有する、滅菌システムの槽（例えば、滅菌処理用槽）から流体流を単離することが可能になる。一部の例では、滅菌処理用槽は、滅菌処理物を含有し、該槽からの流体を抜き取るための少なくとも１つの流体出口を
含む。本明細書に記載されている方法およびシステムの場合、少なくとも１つの流体出口は、単離用槽の少なくとも１つの流体入り口と流体連通しており、この場合、該単離用槽の流体入り口は、単離用槽に入る流体が、単離用槽内の滅菌用ガスが充填されているヘッドスペースを通過するよう構成されている。
【００７８】
本技術において理解される通り、滅菌処理用槽は、様々な異なる体積を有することができる。例えば、工程における滅菌処理用槽は、約０．５０Ｌと約２００Ｌとの間（例えば、約０．５０Ｌと約１８０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約１６０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約１４０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約１２０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約１００Ｌとの間、約０．５０Ｌと約９０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約８０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約７０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約６０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約５０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約４０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約３０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約２０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約１０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約５．０Ｌとの間、約１．０Ｌと約２００Ｌとの間、約１．０Ｌと約１８０Ｌとの間、約１．０Ｌと約１６０Ｌとの間、約１．０Ｌと約１４０Ｌとの間、約１．０Ｌと約１２０Ｌとの間、約１．０Ｌと約１００Ｌとの間、約１．０Ｌと約９０Ｌとの間、約１．０Ｌと約８０Ｌとの間、約１．０Ｌと約７０Ｌとの間、約１．０Ｌと約６０Ｌとの間、約１．０Ｌと約５０Ｌとの間、約１．０Ｌと約４０Ｌとの間、約１．０Ｌと約３０Ｌとの間、約１．０Ｌと約２０Ｌとの間、約１．０Ｌと約１０Ｌとの間、約１．０Ｌと約５．０Ｌとの間、約１．５Ｌと約２００Ｌとの間、約１．５Ｌと約１８０Ｌとの間、約１．５Ｌと約１６０Ｌとの間、約１．５Ｌと約１４０Ｌとの間、約１．５Ｌと約１２０Ｌとの間、約１．５Ｌと約１００Ｌとの間、約１．５Ｌと約９０Ｌとの間、約１．５Ｌと約８０Ｌとの間、約１．５Ｌと約７０Ｌとの間、約１．５Ｌと約６０Ｌとの間、約１．５Ｌと約５０Ｌとの間、約１．５Ｌと約４０Ｌとの間、約１．５Ｌと約３０Ｌとの間、約１．５Ｌと約２０Ｌとの間、約１．５Ｌと約１０Ｌとの間、約１．５Ｌと約５．０Ｌとの間、約２．０Ｌと約２００Ｌとの間、約２．０Ｌと約１８０Ｌとの間、約２．０Ｌと約１６０Ｌとの間、約２．０Ｌと約１４０Ｌとの間、約２．０Ｌと約１２０Ｌとの間、約２．０Ｌと約１００Ｌとの間、約２．０Ｌと約９０Ｌとの間、約２．０Ｌと約８０Ｌとの間、約２．０Ｌと約７０Ｌとの間、約２．０Ｌと約６０Ｌとの間、約２．０Ｌと約５０Ｌとの間、約２．０Ｌと約４０Ｌとの間、約２．０Ｌと約３０Ｌとの間、約２．０Ｌと約２０Ｌとの間、約２．０Ｌと約１０Ｌとの間、約２．０Ｌと約５．０Ｌとの間、約２．５Ｌと約２００Ｌとの間、約２．５Ｌと約１８０Ｌとの間、約２．５Ｌと約１６０Ｌとの間、約２．５Ｌと約１４０Ｌとの間、約２．５Ｌと約１２０Ｌとの間、約２．５Ｌと約１００Ｌとの間、約２．５Ｌと約９０Ｌとの間、約２．５Ｌと約８０Ｌとの間、約２．５Ｌと約７０Ｌとの間、約２．５Ｌと約６０Ｌとの間、約２．５Ｌと約５０Ｌとの間、約２．５Ｌと約５０Ｌとの間、約２．５Ｌと約４０Ｌとの間、約２．５Ｌと約３０Ｌとの間、約２．５Ｌと約２０Ｌとの間、約２．５Ｌと約１０Ｌとの間、約２．５Ｌと約５．０Ｌとの間、約５．０Ｌと約２００Ｌとの間、約５．０Ｌと約１８０Ｌとの間、約５．０Ｌと約１６０Ｌとの間、約５．０Ｌと約１４０Ｌとの間、約５．０Ｌと約１２０Ｌとの間、約５．０Ｌと約１００Ｌとの間、約５．０Ｌと約９０Ｌとの間、約５．０Ｌと約８０Ｌとの間、約５．０Ｌと約７０Ｌとの間、約５．０Ｌと約６０Ｌとの間、約５．０Ｌと約５０Ｌとの間、約５．０Ｌと約４０Ｌとの間、約５．０Ｌと約３０Ｌとの間、約５．０Ｌと約２０Ｌとの間、または約５．０Ｌと約１０Ｌとの間）の内部容積を有することができる。
【００７９】
一部の例では、滅菌処理物を含有する槽は、生物学的製造システムの構成成分である。本明細書において企図されている生物学的製造システムの構成成分には、例えば、フラスコ、流体用導管、バイオリアクター、クロマトグラフィーシステムの１つもしくはそれ以上の構成成分（例えば、クロマトグラフィーカラム）、マイクロろ過システムの１つもしくはそれ以上の構成成分、または限外ろ過／ダイアフィルトレーションシステムの１つもしくはそれ以上の構成成分が含まれる。
【００８０】
一部の実施形態では、バイオリアクターは、潅流バイオリアクター、流加バイオリアクター、または生産用バイオリアクターである。潅流バイオリアクターは、本明細書に記載されているかまたは当分野で公知の例示的な潅流バイオリアクターのいずれかとすることができる。例えば、潅流バイオリアクターは、ステンレス鋼またはプラスチック製（例えば、プラスチック製滅菌バッグ）から作製することができる。潅流バイオリアクターの内表面は、少なくとも１種のコーティング（例えば、ゼラチン、コラーゲン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリスチレンおよびラミニンの少なくとも１種のコーティング）、ならびに当分野で公知の通り、液体培養培地にＯ２、ＣＯ２およびＮ２を吹き込むための１つまたはそれ以上の導入口、ならびに該液体培養培地を撹拌するためのかき混ぜ装置を有することができる。潅流バイオリアクターはまた、バイオリアクターからある体積の流体（例えば、液体培養培地）を抜き取ることができる機械装置、および場合によりバイオリアクターから流体を移すプロセス中に、流体から細胞を抜き取る機械装置内にフィルター（例えば、交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）システム、または米国仮特許出願第６１／８７８，５０２号に記載されているろ過システム）を装備することもできる。バイオリアクターはまた、１つまたはそれ以上のポンプ、ならびに抜き取られた流体を保管するための１つまたはそれ以上の貯蔵器を装備することもできる。
【００８１】
その体積の液体は、例えば、該体積中に存在している哺乳動物細胞を排除する分子量のカットオフを含む滅菌膜に該体積を通して、機械システムを使用する、および／または浸透させるかまたは重力流によって抜き取ることができる。
【００８２】
本技術において理解される通り、滅菌処理を含む槽は、哺乳動物細胞を培養するために当分野において使用される任意の器具（例えば、フラスコ（例えば、スピンフラスコ）、回転管またはバイオリアクター）とすることができる。例えば、滅菌処理物を含有する槽は、組換え哺乳動物細胞を培養するために、当分野で使用されている任意の器具とすることができる。この槽は、撹拌するための内部手段（例えば、インペラ）を含むことができるか、またはこの槽は、外から撹拌（例えば、回転プラットフォームおよび／または傾斜プラットフォームの使用により）することができる。槽は、ステンレス鋼またはプラスチック製（例えば、プラスチック製滅菌バッグ）から作製することができる。一部の実施形態では、この槽は、使い捨て単回使用向けバイオリアクター（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）Ｍｏｂｉｕｓ（登録商標）Ｃｅｌｌｒｅａｄｙという３Ｌの使い捨てバイオリアクター、Ｐｉｅｒｒｅ  Ｇｕｅｒｉｎ  ＡＴＭ１  Ｎｕｃｌｅｏ（商標）という２０Ｌの使い捨てバイオリアクター、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｃｕｌｔｉｂａｇ  ＳＴＲＴＭ５０Ｌの使い捨てバイオリアクター、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｃｕｌｔｉｂａｇ  ＲＭＴＭ  ２０Ｌという使い捨てバイオリアクター、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｃｕｌｔｉｂａｇ  Ｏｒｂｉｔａｌ（商標）５０Ｌ、ＧＥウェーブバイオリアクター２／１０システム５Ｌ、ＧＥウェーブバイオリアクター２０／５０システム２５Ｌ、ＧＥウェーブバイオリアクター２００システム２００ＬまたはＧＥウェーブバイオリアクター５００／１０００システム５００Ｌ）とすることができる。槽の内表面は、少なくとも１種のコーティング（例えば、ゼラチン、コラーゲン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリスチレンおよびラミニンの少なくとも１種のコーティング）、および当分野で公知の通り、第１の液体培養培地にＯ２、ＣＯ２およびＮ２を吹き込むための１つまたはそれ以上の導入口を有することができる。槽は、１つまたはそれ以上のセンサープローブを装備することができる。槽が非剛性プラスチック製材料からなる（例えば、プラスチック製滅菌バッグ）場合、該槽を、槽を囲繞して支持する外部支持体に接続することができる。
【００８３】
組換え哺乳動物細胞は、ヒト、マウス、ハムスターまたはサルの細胞とすることができる。例えば、組換え哺乳動物細胞は、細胞株、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃ
ＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ−Ｋ１ｓ細胞、Ｃ０２．３１クローナル細胞、Ａ１４．１３クローナル細胞、Ｃ０２．５７クローナル細胞、およびＦ０５．４３クローナル細胞）、Ｓｐ２．０、骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ／０）、Ｂ−細胞、ハイブリドーマ細胞、Ｔ−細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ２９３ＥおよびＨＥＫ２９３Ｆ）、アフリカミドリサルの腎臓上皮細胞（Ｖｅｒｏ）またはメイディン−ダービーイヌ（コッカースパニエル）腎臓上皮細胞（ＭＤＣＫ）とすることができる。
【００８４】
組換えタンパク質をコードする核酸は、分子生物学および分子遺伝学において公知の幅広い方法を使用して、組換え哺乳動物細胞を生産するために哺乳動物細胞に導入することができる。非限定例は、トランスフェクション（例えば、リポフェクション）、形質導入（例えば、レンチウイルス、アデノウイルスまたはレトロウイルス感染）および電気穿孔法を含む。一部の例では、組換えタンパク質をコードする核酸は、組換え哺乳動物細胞（一過性トランスフェクション）の染色体に安定的に一体化されない一方、他の組換え哺乳動物細胞では、核酸が一体化される。代替として、または追加的に、組換えタンパク質をコードする核酸は、プラスミドにおいて、および／または哺乳動物の人工染色体（例えば、ヒト人工染色体）において存在することができる。代替として、または追加的に、核酸はウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルスまたはアデノウイルスベクター）を使用して、哺乳動物細胞に導入することができる。核酸は、促進剤の配列（例えば、β−アクチン促進剤およびＣＭＶ促進剤のような強力な促進剤、または誘発性促進剤）に連結させて操作可能となる。核酸を含むベクターはまた、所望の場合、選択可能なマーカー（例えば、ハイグロマイシン、ピューロマイシンまたはネオマイシンに、哺乳動物細胞に対する耐性を付与する遺伝子）も含むことができる。
【００８５】
液体培養培地（培養培地）は、当分野において公知である。液体培養培地は、哺乳動物の血清（例えば、ウシ胎児血清およびウシ血清）、および／または成長ホルモンまたは成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリンおよび上皮成長因子）を補給することができる。本明細書に記載されている液体培養培地のいずれも、動物に由来する構成成分を含まない液体培養培地、血清不含の液体培養培地、血清を含む液体培養培地、化学的に規定されている液体培養培地、およびタンパク質不含の液体培養培地：からなる群から選択することができる。化学的に規定されている液体培養培地、動物に由来する構成成分を含まない液体培養培地、血清不含の液体培養培地、および血清を含む液体培養培地の非限定例は、市販されている。
【００８６】
液体培養培地は、通常、エネルギー源（例えば、グルコースのような炭水化物）、必須アミノ酸（例えば、基礎となる一式の２０種のアミノ酸およびシステイン）、ビタミンおよび／または低濃度で必要とされる他の有機化合物、遊離脂肪酸、および／または微量元素を含む。液体培養培地（例えば、第１および／または第２の液体培養培地）は、所望の場合、例えば、哺乳動物のホルモンまたは成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子）、塩および緩衝剤（例えば、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩の塩）、ヌクレオシドおよび塩基（例えば、アデノシン、チミジンおよびヒポキサンチン）、タンパク質および組織加水分解物、ならびに／またはこれらの添加物の任意の組合せを補給することができる。
【００８７】
本明細書に記載されているいずれの方法のいずれの工程においても、細胞（例えば、哺乳動物細胞）を培養するために使用することができる、幅広い様々な液体培養培地が当分野で公知である。本方法においてやはり有用とすることができる培地の構成成分は、以下に限定されないが、化学的に規定されている（ＣＤ）加水分解物、例えば、ＣＤペプトン、ＣＤポリペプチド（２種またはそれ以上のアミノ酸）およびＣＤ成長因子を含む。液体組織培養培地および培地の構成成分の追加例は、当分野で公知である。
【００８８】
組換え哺乳動物細胞の培養物から得られる液体培養培地は、細胞および／またはウイルスが実質的に不含の液体培養培地を得るためにろ過または浄化することができる。細胞を除去するために液体培養培地をろ過または浄化する方法は、当分野で公知である（例えば、０．２μｍのろ過、交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ（商標））システム、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）システム、または米国仮特許出願第６１／８７８，５０２号に記載されているシステムのいずれかを使用するろ過）。組換え細胞はまた、遠心分離を使用して、実質的に細胞不含である液体培養培地である上澄み液を除去して、または液体培養培地を含む容器（例えば、槽）の重力底部に沈殿させて、沈殿した組換え哺乳動物細胞から離れた液体培養培地（実質的に細胞不含である液体培養培地）を除去することにより液体培養培地から抜き取ることもできる。一部の実施形態では、第１の培養培地、第２の培養培地、第３の培養培地および第４の培養培地の１つまたはそれ以上（例えば、２つ、３つまたはすべて）が同一である。
【００８９】
本明細書に記載されている方法のいずれかにおける工程のいずれかにおいて使用される液体培養培地は、本明細書に記載されているかまたは当分野で公知の液体培養培地のタイプのいずれかとすることができる。本明細書に記載されている組換えタンパク質を単離するための例示的な方法のいずれにおいても、生産細胞培養物から得られた液体培養培地は、第２の流体（例えば、緩衝液）を添加することによって希釈することができる。
【００９０】
実質的に細胞不含である組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を含む液体培養培地は、組換えタンパク質を単離する前に（例えば、第１のＭＣＣＳ（例えば、第１のＰＣＣＳ）に液体培養培地を供給する前に）、少なくとも１日間（例えば、少なくとも約２日間、少なくとも約５日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約２０日間、または少なくとも約３０日間）、貯蔵することができる（例えば、約１５℃未満の温度（例えば、約１０℃未満、約４℃未満、約０℃未満、約−２０℃未満、約−５０℃未満、約−７０℃未満、または約−８０℃未満）で）。あるいは、一部の例において、実質的に細胞不含である組換えタンパク質を含む液体培養培地が、組換えタンパク質を単離するために使用されるシステムに供給される。
【００９１】
組換えタンパク質は、組換え治療用タンパク質とすることができる。本明細書において提供される方法によって生産することができる組換え治療用タンパク質の非限定例は、免疫グロブリン（軽鎖および重鎖免疫グロブリンを含む）、抗体または抗体断片（例えば、本明細書に記載されている抗体断片のいずれか）、酵素（例えば、ガラクトシダーゼ（例えば、アルファ−ガラクトシダーゼ）、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）、またはＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標））、タンパク質（例えば、ヒトエリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）またはインターフェロンアルファまたはベータ）、または免疫原性または抗原性タンパク質またはタンパク質断片（例えば、ワクチンで使用するためのタンパク質）を含む。組換え治療用タンパク質は、少なくとも１つの多機能組換えタンパク質の足場を含む、操作された抗原結合性ポリペプチドとすることができる（例えば、Ｇｅｂａｕｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３巻：２４５〜２５５頁、２００９年に記載されている組換え抗原−結合タンパク質；および米国特許出願公開第２０１２／０１６４０６６号（それらの全体が参照により組み入れられている）を参照されたい）。抗体である組換え治療用タンパク質の非限定例は、以下を含む：パニツムマブ、オマリズマブ、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムバブ、アデカツムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アレムツズマブ、アルイロクマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アチヌマブ、トシリズマブ、バシリジマブ、ベクツモマブ、ベリムバブ、ベバシズマブ、ベシレソマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、カナキヌバム、セルトリズマブ、セツキシマブ、シクスツムマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、デンスマブ、エクリズマ
ブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、フィギツムマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、イゴモマブ、イムガツムマブ、インフリキシマブ、イノリモマブ、イノツズマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ、モキセツモマブ、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、ツコツズマブ、トラスツズマブ、ベルツズマブ、ザルツムマブおよびザツキシマブ。本明細書に記載されている方法によって生産することができる組換え治療用抗体の追加例は、当分野で公知である。本方法によって生産することができる組換え治療用タンパク質のさらなる非限定例は、以下を含む：アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、アバタセプト、ガルスルファーゼ、ルトロピンアルファ、抗血友病因子、アガルシダーゼベータ、インターフェロンベータ−１ａ、ダルベポエチンアルファ、テネクテプラーゼ、エタネルセプト、凝固因子ＩＸ、卵胞刺激ホルモン、インターフェロンベータ−１ａ、イミグルセラーゼ、ドルナーゼアルファ、エポエチンアルファ、インスリンまたはインスリン類似体、メカセルミン、因子ＶＩＩＩ、因子ＶＩＩａ、抗トロンビンＩＩＩ、タンパク質Ｃ、ヒトアルブミン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン−１１、イデュルスルファーゼ、ガルスルファーゼ、α−１−プロテイナーゼ阻害剤、ラクターゼ、アデノシンデアミナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、チロトロピンアルファ（例えば、Ｔｈｙｒｏｇｅｎ（登録商標））およびアルテプラーゼ。本方法によって生産することができる組換えタンパク質の追加例は、酸α−グルコシダーゼ、アルグルコシダーゼアルファ（例えば、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標））、α−Ｌ−イズロニダーゼ（例えば、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（登録商標））、イズロン酸スルファターゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、ガラクトース−６−スルファターゼ、酸β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸リパーゼ、リソソーム酸セラミダーゼ、酸スフィンゴミエリナーゼ、β−グルコシダーゼ（例えば、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）およびＣｅｒｅｄａｓｅ（登録商標））、ガラクトシルセラミダーゼ、α−ガラクトシダーゼ−Ａ（例えば、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標））、酸β−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ノイラミニダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡ、およびヘキソサミニダーゼＢを含む。
【００９２】
分泌され可溶性組換えタンパク質は、細胞（例えば、哺乳動物細胞）から液体培養培地を除去する、または他には物理的に分離することにより、液体培養培地から回収することができる。細胞（例えば、哺乳動物細胞）から液体培養培地を除去するための様々な異なる方法が、例えば、遠心分離、ろ過、ピペット操作および／または吸引を含めて、当分野で公知である。次に、分泌された組換え治療用タンパク質は、様々なタイプのクロマトグラフィー（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、または陰イオン交換クロマトグラフィー）および／またはろ過（例えば、分子量カットオフろ過）を含めた、様々な生化学的技法を使用して、液体培養培地から回収および単離することができる。
【００９３】
流体は、連続的または周期的な抜き取りにより、滅菌処理用槽から抜き取ることができる。一部の例では、滅菌処理用槽から抜き取られた流体は、組換えタンパク質を含む。一部の例では、滅菌処理用槽から抜き取られた流体は、培養培地を含む。一部の例では、滅菌処理用槽から抜き取られた流体は、組換えタンパク質を含まない。
【実施例】
【００９４】
本発明は、以下の実施例においてさらに記載され、この実施例は、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００９５】
図２は、本発明による、滅菌処理物流を非滅菌環境から単離するための、例となるシステムを記載している。本システムは、例えば、生物学的生産処理物の液流の構成成分を含めた、任意の滅菌処理物とすることができる。図２に実証される通り、本システムは、流体出口（１３０）を含む滅菌処理用槽（１１０）（例えば、第１の槽）を含む。生物学的生産処理物の液流の場合、第１の槽は、例えば、液体培地を流すための流体用導管、バイオリアクター（例えば、本明細書に記載されているかまたは当分野で公知の例示的なバイオリアクターのいずれか）、クロマトグラフィーシステムの１つもしくはそれ以上の構成成分（例えば、クロマトグラフィーカラム）、マイクロろ過システムの１つもしくはそれ以上の構成成分、限外ろ過／ダイアフィルトレーションシステムの１つもしくはそれ以上の構成成分とすることができる。図２に記載されているシステムは、第１の槽（１１０）の流体出口（１３０）と流体用導管（２１０）を介して流体連通しており、かつ第２の槽に入る流体が第２の槽（１２０）内の滅菌用ガスが充填されているヘッドスペース（１５０）を通過するよう構成されている流体入り口（１４０）、第２の槽を出る流体が、第２の槽（１２０）内の滅菌用ガスが充填されているヘッドスペース（１５０）より下から抜き取られよう構成されている流体出口（１７０）を含む単離用槽（１２０）（例えば、第２の槽）を含む。第２の槽は、第２の槽のヘッドスペースに充填するため、ガス導管（２２０）を介して、滅菌用ガスを供給するための少なくとも１つのガス入り口（１８０）を含む。第２の槽は、単離物から連続的または周期的にガスを排出するよう構成されている少なくとも１つのガス出口（１６０）も含む。
【００９６】
図１は、本発明による滅菌処理物流を非滅菌環境から単離するための、例示的な実施形態を提示している。図１に記載されているシステムの場合、滅菌処理用槽（例えば、第１の槽、図示せず）からの廃流は、流体が第２の槽の上部から入り、第２の槽内の滅菌用ガスが充填されているヘッドスペースを通過するよう構成されている単離用槽（例えば、第２の槽）と流体連通している。第２の槽は、第２の槽を出る流体が、第２の槽内の滅菌用ガスが充填されているヘッドスペースより下（すなわち、第２の槽の流体が充填されている部分より下）から抜き取られるよう構成されている流体出口をさらに含む。図２は、第２の槽の出口からある体積の流体を抜き取り、生物学的廃流を廃棄するための貯蔵庫に該体積を流すよう構成されているポンプを含むポンプシステムをさらに実証している。第２の槽は、第２の槽のヘッドスペースに充填するため、滅菌用ガスを発生もしくは送出するための、または滅菌用ガスを発生および送出するためのシステム（例えば、オゾン発生システム）とガス連通している少なくとも１つのガス入り口を含む。この実施形態によれば、滅菌用ガスは、第２の槽に散布される。第２の槽は、単離物から連続的または周期的にガスを排出するよう構成されている少なくとも１つのガス出口も含む。
【００９７】
他の実施形態
本発明は、その詳細説明と併せて記載されているが、上述の説明は、例示を意図するものであり、本発明の範囲を限定する意図はなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されることが理解されるべきである。他の態様、利点および修正は、以下の特許請求の範囲内にある。
【図１】
2020103307.tif 000003
【図２】
2020103307.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月31日(2020.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え治療用タンパク質の生産方法であって、
第１の槽および第２の槽を含み、ここで第１の槽は組換え治療用タンパク質を含む液体を含み、第２の槽はある体積の滅菌用ガスを含む、システムを用意する工程；および、
該第１の槽からの第１の体積の液体を、該第２の層のヘッドスペース内に配置させている該体積の滅菌用ガスを通過させて第２の槽に流し込む工程、
を含む方法。
【請求項２】
第２の槽は、
（ｉ）第２の槽に入る体積の液体が、ヘッドスペースを通過するよう構成されている流体入り口；
（ｉｉ）第２の槽を出る液体が、滅菌用ガスが充填されているヘッドスペースの下から流れるよう構成されている流体出口；
（ｉｉｉ）少なくとも１つのガス入り口；および、
（ｉｖ）少なくとも１つのガス出口
をさらに含み、
該流体入り口が、第１の槽と流体連通している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の槽は、第２の槽の流体入り口と流体連通している流体出口を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法の間、第２の槽は液体で少なくとも部分的に満たされている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
滅菌用ガスは、第２の槽に散布される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
滅菌用ガスは、第２の槽のヘッドスペースに直接、導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第１の槽は、滅菌されている槽である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
システムは、生物学的製造システムである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
（ｉ）第２の槽からの第２の体積の流体を第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ１）に流す工程；
（ｉｉ）ＭＣＣＳ１を使用して、第２の体積の流体中の組換え治療用タンパク質を捕捉する工程であって、該組換え治療用タンパク質を含有するＭＣＣＳ１からの溶離液が、第２のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ２）に連続的に供給される、前記工程；および、
（ｉｉｉ）ＭＣＣＳ２を使用して、組換え治療用タンパク質を精製およびポリッシングする工程であって、ＭＣＣＳ２からの溶離液が該組換え治療用タンパク質を含む、前記工程；
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
統合されて、前記第１の槽から、ＭＣＣＳ２からの溶離液まで、連続的に行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＭＣＣＳ１は、第１の周期的な向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ１）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＭＣＣＳ２は、第２の周期的な向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ２）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ＭＣＣＳ１は、第１の周期的な向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ１）であり、ＭＣＣＳ２は、第２の周期的な向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ２）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
組換え治療用タンパク質は、抗体または抗体断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
組換え治療用タンパク質は、酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
酵素は、α−ガラクトシダーゼＡである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
酵素は、β−グルコシダーゼである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
酵素は、アルグルコシダーゼである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
滅菌用ガスは、オゾンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
滅菌用ガスは、エチレンオキシドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
滅菌用ガスは、二酸化窒素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
滅菌用ガスは、過酸化水素蒸気を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
第１の槽は、バイオリアクターである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
バイオリアクターは、潅流バイオリアクターである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
バイオリアクターは、流加バイオリアクターである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
バイオリアクターは、生産用バイオリアクターである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
第１の槽は、クロマトグラフィーシステムである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
第１の槽は、限外ろ過／ダイアフィルトレーションシステムである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の体積の液体は、実質的に哺乳動物細胞を含まない液体培養培地である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【外国語明細書】
2020103307000001.pdf