(57)【要約】【課題】加工処理された生薬候補の被検植物が基原植物であるか否かを正確に同定し、その生薬候補が目的の生薬であることを鑑別することのできる手段、及びそれを用いた鑑別方法を開発し、提供する。【解決手段】加工処理された被検植物から安定的に塩基配列情報を取得でき、かつ基原植物に特異的な塩基配列を有する基原植物のゲノムDNA又は葉緑体DNAにおける特定領域を増幅可能なプライマーセットを各生薬について設計した。このプライマーセット及びそれを用いた生薬鑑別方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生薬の鑑別用プライマーセットであって、
前記生薬がブクリョウ、ジオウ、エンゴサク、カッコン、ボウフウ、オンジ、ハッカ、マオウ、タイソウ／サンソウニン、カロコン／カロニン、ゴシュユ、ゼンコ、チモ、バクモンドウ、ビャクシ、イレイセン、インチンコウ、ジコッピ、シュクシャ、ニンドウ、センコツ、ソウハクヒ、キョウカツ、ビワヨウ、シコン、及びトチュウからなる群から選択され、
前記プライマーセットは、
ブクリョウのときに配列番号１及び２、又は配列番号３及び４、
ジオウのときに配列番号１７及び１８、
エンゴサクのときに配列番号２６及び２７、
カッコンのときに配列番号３７及び３８、又は配列番号３９及び４０、
ボウフウのときに配列番号５１及び５２、
オンジのときに配列番号６５及び６６、
ハッカのときに配列番号７３及び７４、
マオウのときに配列番号８５及び８６、又は配列番号３８５及び３８６、
タイソウ／サンソウニンのときに配列番号１０１及び１０２、又は配列番号１０３及び１０４、
カロコン／カロニンのときに配列番号１２５及び１２６、又は配列番号１２７及び１２８、
ゴシュユのときに配列番号１４１及び１４２、又は配列番号１４３及び１４４、
ゼンコのときに配列番号１７１及び１７２、又は配列番号４０１及び４０２、
チモのときに配列番号１８６及び１８７、
バクモンドウのときに配列番号１９９及び２００、
ビャクシのときに配列番号２１３及び２１４、又は配列番号４１６及び４１７、
イレイセンのときに配列番号２２７及び２２８、
インチンコウのときに配列番号２４１及び２４２、又は配列番号２４３及び２４４、
ジコッピのときに配列番号２６１及び２６２、
シュクシャのときに配列番号２７５及び２７６、
ニンドウのときに配列番号２８４及び２８５、
センコツのときに配列番号２９８及び２９９、
ソウハクヒのときに配列番号３１２及び３１３、
キョウカツのときに配列番号３２４及び３２５、
ビワヨウのときに配列番号３３２及び３３３、又は配列番号３３４及び３３５、
シコンのときに配列番号３６０及び３６１、及び、
トチュウのときに配列番号３７４及び３７５、
で示す塩基配列からなるポリヌクレオチドである、前記プライマーセット。
【請求項２】
請求項１に記載の生薬の鑑別用プライマーセットからなる群から選択される１以上を含む生薬鑑別キット。
【請求項３】
生薬の基原植物から調製された核酸を鋳型に、その生薬の鑑別用プライマーを用いて核酸増幅反応して得られる増幅産物の塩基配列情報を記載した塩基配列表を含む、請求項２に記載の生薬鑑別キット。
【請求項４】
ブクリョウの鑑別方法であって、
ブクリョウ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号１及び２、又は配列番号３及び４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
配列番号１及び２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１で示す塩基配列と配列番号２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号５で示す塩基配列、又は配列番号３及び４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号３で示す塩基配列と配列番号４で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号１１で示す塩基配列を比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はブクリョウの基原植物であって、前記ブクリョウ候補がブクリョウであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項５】
ジオウの鑑別方法であって、
ジオウ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号１７及び１８で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
増幅産物における配列番号１７で示す塩基配列と配列番号１８で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号１９又は２０で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はジオウの基原植物であって、前記ジオウ候補がジオウであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項６】
エンゴサクの鑑別方法であって、
エンゴサク候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号２６及び２７で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
増幅産物における配列番号２６で示す塩基配列と配列番号２７で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号２８で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はエンゴサクの基原植物であって、前記エンゴサク候補がエンゴサクであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項７】
カッコンの鑑別方法であって、
カッコン候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号３７及び３８、又は配列番号３９及び４０で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
配列番号３７及び３８で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号３７で示す塩基配列と配列番号３８で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号４１で示す塩基配列、又は配列番号３９及び４０で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号３９で示す塩基配列と配列番号４０で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号４６で示す塩基配列を比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はカッコンの基原植物であって、前記カッコン候補がカッコンであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項８】
ボウフウの鑑別方法であって、
ボウフウ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号５１及び５２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
増幅産物における配列番号５１で示す塩基配列と配列番号５２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号５３で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はボウフウの基原植物であって、前記ボウフウ候補がボウフウであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項９】
オンジの鑑別方法であって、
オンジ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号６５及び６６で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのpsbA-trnH領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
増幅産物における配列番号６５で示す塩基配列と配列番号６６で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号６７で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はオンジの基原植物であって、前記オンジ候補がオンジであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項１０】
ハッカの鑑別方法であって、
ハッカ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号７３及び７４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
増幅産物における配列番号７３で示す塩基配列と配列番号７４で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号７５で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はハッカの基原植物であって、前記ハッカ候補がハッカであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項１１】
マオウの鑑別方法であって、
マオウ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号８５及び８６、又は配列番号３８５及び３８６で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのrbcL領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
配列番号８５及び８６で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号８５で示す塩基配列と配列番号８６で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号８７〜８９のいずれかで示す塩基配列、又は配列番号３８５及び３８６で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号３８５で示す塩基配列と配列番号３８６で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号３８７〜３８９のいずれかで示す塩基配列を比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はマオウの基原植物であって、前記マオウ候補がマオウであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項１２】
タイソウ／サンソウニンの鑑別方法であって、
タイソウ／サンソウニン候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号１０１及び１０２、又は配列番号１０３及び１０４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
配列番号１０１及び１０２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１０１で示す塩基配列と配列番号１０２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号１０５で示す塩基配列、又は配列番号１０３及び１０４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１０３で示す塩基配列と配列番号１０４で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号１１５で示す塩基配列を比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はタイソウ／サンソウニンの基原植物であって、前記タイソウ／サンソウニン候補がタイソウ／サンソウニンであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項１３】
カロコン／カロニンの鑑別方法であって、
カロコン／カロニン候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号１２５及び１２６、又は配列番号１２７及び１２８で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのrpl16イントロン領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
配列番号１２５及び１２６で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１２５で示す塩基配列と配列番号１２６で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号１２９〜１３１のいずれかで示す塩基配列、又は配列番号１２７及び１２８で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１２７で示す塩基配列と配列番号１２８で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号１３５〜１３７のいずれかで示す塩基配列を比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はカロコン／カロニンの基原植物であって、前記カロコン／カロニン候補がカロコン／カロニンであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項１４】
ゴシュユの鑑別方法であって、
ゴシュユ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号１４１及び１４２、又は配列番号１４３及び１４４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
配列番号１４１及び１４２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１４１で示す塩基配列と配列番号１４２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号１４５〜１４７のいずれかで示す塩基配列、又は配列番号１４３及び１４４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１４３で示す塩基配列と配列番号１４４で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号１５８〜１６０のいずれかで示す塩基配列を比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はゴシュユの基原植物であって、前記ゴシュユ候補がゴシュユであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項１５】
ゼンコの鑑別方法であって、
ゼンコ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号１７１及び１７２、又は配列番号４０１及び４０２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
配列番号１７１及び１７２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１７１で示す塩基配列と配列番号１７２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号１７３又は１７４で示す塩基配列、又は配列番号４０１及び４０２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号４０１で示す塩基配列と配列番号４０２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号４０３又は４０４で示す塩基配列を比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はゼンコの基原植物であって、前記ゼンコ候補がゼンコであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項１６】
チモの鑑別方法であって、
チモ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号１８６及び１８７で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
増幅産物における配列番号１８６で示す塩基配列と配列番号１８７で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号１８８で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はチモの基原植物であって、前記チモ候補がチモであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項１７】
バクモンドウの鑑別方法であって、
バクモンドウ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号１９９及び２００で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
増幅産物における配列番号１９９で示す塩基配列と配列番号２００で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号２０１で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はバクモンドウの基原植物であって、前記バクモンドウ候補がバクモンドウであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項１８】
ビャクシの鑑別方法であって、
ビャクシ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号２１３及び２１４、又は配列番号４１６及び４１７で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
配列番号２１３及び２１４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号２１３で示す塩基配列と配列番号２１４で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号２１５で示す塩基配列、又は配列番号４１６及び４１７で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号４１６で示す塩基配列と配列番号４１７で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号４１８で示す塩基配列を比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はビャクシの基原植物であって、前記ビャクシ候補がビャクシであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項１９】
イレイセンの鑑別方法であって、
イレイセン候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号２２７及び２２８で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
増幅産物における配列番号２２７で示す塩基配列と配列番号２２８で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号２２９〜２３１のいずれかで示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はイレイセンの基原植物であって、前記イレイセン候補がイレイセンであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項２０】
インチンコウの鑑別方法であって、
インチンコウ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号２４１及び２４２、又は配列番号２４３及び２４４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのpetD-rpoA領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
配列番号２４１及び２４２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号２４１で示す塩基配列と配列番号２４２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号２４５で示す塩基配列、又は配列番号２４３及び２４４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号２４３で示す塩基配列と配列番号２４４で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号２５３で示す塩基配列を比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はインチンコウの基原植物であって、前記インチンコウ候補がインチンコウであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項２１】
ジコッピの鑑別方法であって、
ジコッピ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号２６１及び２６２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのtrnH-psbA領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
増幅産物における配列番号２６１で示す塩基配列と配列番号２６２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号２６３又は２６４で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はジコッピの基原植物であって、前記ジコッピ候補がジコッピであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項２２】
シュクシャの鑑別方法であって、
シュクシャ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号２７５及び２７６で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
増幅産物における配列番号２７５で示す塩基配列と配列番号２７６で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号２７７で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はシュクシャの基原植物であって、前記シュクシャ候補がシュクシャであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項２３】
ニンドウの鑑別方法であって、
ニンドウ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号２８４及び２８５で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのpsbA-trnH領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
増幅産物における配列番号２８４で示す塩基配列と配列番号２８５で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号２８６で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はニンドウの基原植物であって、前記ニンドウ候補がニンドウであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項２４】
センコツの鑑別方法であって、
センコツ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号２９８及び２９９で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
増幅産物における配列番号２９８で示す塩基配列と配列番号２９９で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号３００で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はセンコツの基原植物であって、前記センコツ候補がセンコツであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項２５】
ソウハクヒの鑑別方法であって、
ソウハクヒ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号３１２及び３１３で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
増幅産物における配列番号３１２で示す塩基配列と配列番号３１３で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号３１４で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はソウハクヒの基原植物であって、前記ソウハクヒ候補がソウハクヒであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項２６】
キョウカツの鑑別方法であって、
キョウカツ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号３２４及び３２５で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
増幅産物における配列番号３２４で示す塩基配列と配列番号３２５で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号３２６又は３２７で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はキョウカツの基原植物であって、前記キョウカツ候補がキョウカツであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項２７】
ビワヨウの鑑別方法であって、
ビワヨウ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号３３２及び３３３、又は配列番号３３４及び３３５で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
配列番号３３２及び３３３で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号３３２で示す塩基配列と配列番号３３３で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号３３６で示す塩基配列、又は配列番号３３４及び３３５で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号３３４で示す塩基配列と配列番号３３５で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号３４８で示す塩基配列を比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はビワヨウの基原植物であって、前記ビワヨウ候補がビワヨウであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項２８】
シコンの鑑別方法であって、
シコン候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号３６０及び３６１で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
増幅産物における配列番号３６０で示す塩基配列と配列番号３６１で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号３６２で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はシコンの基原植物であって、前記シコン候補がシコンであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【請求項２９】
トチュウの鑑別方法であって、
トチュウ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、
抽出された核酸を鋳型に、配列番号３７４及び３７５で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのpsbA-trnH領域を増幅する工程、
増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び
増幅産物における配列番号３７４で示す塩基配列と配列番号３７５で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号３７６で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はトチュウの基原植物であって、前記トチュウ候補がトチュウであると鑑別する工程
を含む前記鑑別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、様々な生薬試料が日本薬局方又は局外生規で規定された基原植物であることを確認できる核酸増幅反応プライマーセット、及びそのプライマーセットを用いた生薬鑑別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生薬は、第十七改正日本薬局方又は局外生規2015において、基原植物が規定されている。基原植物とは、ある生薬の原料となる植物（原植物）であり、生薬ごとに種単位で定められている。例えば、生薬「ジオウ」の基原植物は、アカヤジオウRehmannia glutinosa Liboschitz var. purpurea Makino又はRehmannia glutinosa Liboschitz (Scrophulariaceae)であり、それ以外の植物種は、例え同属近縁種であっても、原則として「ジオウ」とは認められていない。しかし、一般に生薬は、基原植物を加熱、乾燥等の様々な加工処理を施した状態で流通している。それ故に、基原植物に外観が類似する植物種（類似種）を原料とした疑似生薬と、基原植物を原料とする生薬とを外見的に区別できない場合も少なくない。疑似生薬の多くは、生薬本来の薬効が期待できない場合が多く、また価格も安価である。したがって、流通する生薬が、本来の基原植物を原料としているか否かを正確に確認することは重要な作業である。通常、生薬候補の植物に含まれる核酸を抽出し、種特異的な領域の塩基配列を決定することで、検査対象である被検植物が対象生薬の基原植物であるか否かを同定することができる（非特許文献１）。しかし、生薬は、前述のように、多くが加工処理されており、また長期にわたる保存によって経時変化を受けることで、試料中のDNAが損傷及び／又は断片化している場合や、カビやキノコ等の菌類由来のDNAの混入している場合が多い。そのため、生薬から採取した核酸の塩基配列決定自体が困難であり、これまで原植物の正確な同定ができなかった。
【０００３】
そこで、加熱等の加工処理がなされた生薬候補の被検植物から、安定的に、かつ正確に塩基配列情報を取得することによって、その被検植物が基原植物であるか否かを正確に同定し、異種植物が混入、又は置換されていない正しい生薬であることを確認する技術が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】丸山卓郎他, 2013年, 特産種苗, 16: 70-76
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、加工処理された生薬候補の被検植物が目的とする生薬の基原植物であるか否かを正確に確認し、その生薬候補が目的の生薬であることを鑑別することのできる手段、及びそれを用いた鑑別方法を開発し、提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、様々な生薬の基原植物におけるゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調べた結果、各生薬の基原植物に特異的な塩基配列が特定領域に存在すること、またその領域は、加工処理された被検植物からも安定的に塩基配列情報を取得できることを見出した。これらの知見に基づき、前記特定領域を増幅することのできるプライマーセットを開発し、それを用いて生薬候補の被検植物が基原植物であるか否かを正確に同定し、生薬候補が目的の生薬であることを鑑別できる方法を開発することに成功した。本明細書では、当該鑑別手段であるプライマーセット及びそれを用いた生薬鑑別方法に基づく以下の発明を提供する。
【０００７】
（１）生薬の鑑別用プライマーセットであって、前記生薬がブクリョウ、ジオウ、エンゴサク、カッコン、ボウフウ、オンジ、ハッカ、マオウ、タイソウ／サンソウニン、カロコン／カロニン、ゴシュユ、ゼンコ、チモ、バクモンドウ、ビャクシ、イレイセン、インチンコウ、ジコッピ、シュクシャ、ニンドウ、センコツ、ソウハクヒ、キョウカツ、ビワヨウ、シコン、及びトチュウからなる群から選択され、前記プライマーセットは、ブクリョウのときに配列番号１及び２、又は配列番号３及び４、ジオウのときに配列番号１７及び１８、エンゴサクのときに配列番号２６及び２７、カッコンのときに配列番号３７及び３８、又は配列番号３９及び４０、ボウフウのときに配列番号５１及び５２、オンジのときに配列番号６５及び６６、ハッカのときに配列番号７３及び７４、マオウのときに配列番号８５及び８６、又は配列番号３８５及び３８６、タイソウ／サンソウニンのときに配列番号１０１及び１０２、又は配列番号１０３及び１０４、カロコン／カロニンのときに配列番号１２５及び１２６、又は配列番号１２７及び１２８、ゴシュユのときに配列番号１４１及び１４２、又は配列番号１４３及び１４４、ゼンコのときに配列番号１７１及び１７２、又は配列番号４０１及び４０２、チモのときに配列番号１８６及び１８７、バクモンドウのときに配列番号１９９及び２００、ビャクシのときに配列番号２１３及び２１４、又は配列番号４１６及び４１７、イレイセンのときに配列番号２２７及び２２８、インチンコウのときに配列番号２４１及び２４２、又は配列番号２４３及び２４４、ジコッピのときに配列番号２６１及び２６２、シュクシャのときに配列番号２７５及び２７６、ニンドウのときに配列番号２８４及び２８５、センコツのときに配列番号２９８及び２９９、ソウハクヒのときに配列番号３１２及び３１３、キョウカツのときに配列番号３２４及び３２５、ビワヨウのときに配列番号３３２及び３３３、又は配列番号３３４及び３３５、シコンのときに配列番号３６０及び３６１、及び、トチュウのときに配列番号３７４及び３７５で示す塩基配列からなるポリヌクレオチドである、前記プライマーセット。
（２）（１）に記載の生薬の鑑別用プライマーセットからなる群から選択される１以上を含む生薬鑑別キット。
（３）生薬の基原植物から調製された核酸を鋳型に、その生薬の鑑別用プライマーを用いて核酸増幅反応して得られる増幅産物の塩基配列情報を記載した塩基配列表を含む、（２）に記載の生薬鑑別キット。
（４）ブクリョウの鑑別方法であって、ブクリョウ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号１及び２、又は配列番号３及び４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び配列番号１及び２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１で示す塩基配列と配列番号２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号５で示す塩基配列、又は配列番号３及び４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号３で示す塩基配列と配列番号４で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号１１で示す塩基配列を比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はブクリョウの基原植物であって、前記ブクリョウ候補がブクリョウであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（５）ジオウの鑑別方法であって、ジオウ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号１７及び１８で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び増幅産物における配列番号１７で示す塩基配列と配列番号１８で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号１９又は２０で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はジオウの基原植物であって、前記ジオウ候補がジオウであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（６）エンゴサクの鑑別方法であって、エンゴサク候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号２６及び２７で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び増幅産物における配列番号２６で示す塩基配列と配列番号２７で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号２８で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はエンゴサクの基原植物であって、前記エンゴサク候補がエンゴサクであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（７）カッコンの鑑別方法であって、カッコン候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号３７及び３８、又は配列番号３９及び４０で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び配列番号３７及び３８で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号３７で示す塩基配列と配列番号３８で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号４１で示す塩基配列、又は配列番号３９及び４０で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号３９で示す塩基配列と配列番号４０で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号４６で示す塩基配列を比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はカッコンの基原植物であって、前記カッコン候補がカッコンであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（８）ボウフウの鑑別方法であって、ボウフウ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号５１及び５２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び増幅産物における配列番号５１で示す塩基配列と配列番号５２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号５３で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はボウフウの基原植物であって、前記ボウフウ候補がボウフウであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（９）オンジの鑑別方法であって、オンジ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号６５及び６６で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのpsbA-trnH領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び増幅産物における配列番号６５で示す塩基配列と配列番号６６で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号６７で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はオンジの基原植物であって、前記オンジ候補がオンジであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（１０）ハッカの鑑別方法であって、ハッカ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号７３及び７４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び増幅産物における配列番号７３で示す塩基配列と配列番号７４で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号７５で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はハッカの基原植物であって、前記ハッカ候補がハッカであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（１１）マオウの鑑別方法であって、マオウ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号８５及び８６、又は配列番号３８５及び３８６で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのrbcL領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び配列番号８５及び８６で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号８５で示す塩基配列と配列番号８６で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号８７〜８９のいずれかで示す塩基配列、又は、配列番号３８５及び３８６で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号３８５で示す塩基配列と配列番号３８６で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号３８７〜３８９のいずれかで示す塩基配列を比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はマオウの基原植物であって、前記マオウ候補がマオウであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（１２）タイソウ／サンソウニンの鑑別方法であって、タイソウ／サンソウニン候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号１０１及び１０２、又は配列番号１０３及び１０４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び配列番号１０１及び１０２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１０１で示す塩基配列と配列番号１０２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号１０５で示す塩基配列、又は配列番号１０３及び１０４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１０３で示す塩基配列と配列番号１０４で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号１１５で示す塩基配列を比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はタイソウ／サンソウニンの基原植物であって、前記タイソウ／サンソウニン候補がタイソウ／サンソウニンであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（１３）カロコン／カロニンの鑑別方法であって、カロコン／カロニン候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号１２５及び１２６、又は配列番号１２７及び１２８で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのrpl16イントロン領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び配列番号１２５及び１２６で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１２５で示す塩基配列と配列番号１２６で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号１２９〜１３１のいずれかで示す塩基配列、又は配列番号１２７及び１２８で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１２７で示す塩基配列と配列番号１２８で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号１３５〜１３７のいずれかで示す塩基配列を比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はカロコン／カロニンの基原植物であって、前記カロコン／カロニン候補がカロコン／カロニンであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（１４）ゴシュユの鑑別方法であって、ゴシュユ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号１４１及び１４２、又は配列番号１４３及び１４４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び配列番号１４１及び１４２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１４１で示す塩基配列と配列番号１４２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号１４５〜１４７のいずれかで示す塩基配列、又は配列番号１４３及び１４４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１４３で示す塩基配列と配列番号１４４で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号１５８〜１６０のいずれかで示す塩基配列を比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はゴシュユの基原植物であって、前記ゴシュユ候補がゴシュユであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（１５）ゼンコの鑑別方法であって、ゼンコ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号１７１及び１７２、又は配列番号４０１及び４０２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び配列番号１７１及び１７２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１７１で示す塩基配列と配列番号１７２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号１７３又は１７４で示す塩基配列、又は配列番号４０１及び４０２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号４０１で示す塩基配列と配列番号４０２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号４０３又は４０４で示す塩基配列を比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はゼンコの基原植物であって、前記ゼンコ候補がゼンコであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（１６）チモの鑑別方法であって、チモ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号１８６及び１８７で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び増幅産物における配列番号１８６で示す塩基配列と配列番号１８７で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号１８８で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はチモの基原植物であって、前記チモ候補がチモであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（１７）バクモンドウの鑑別方法であって、バクモンドウ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号１９９及び２００で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び増幅産物における配列番号１９９で示す塩基配列と配列番号２００で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号２０１で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はバクモンドウの基原植物であって、前記バクモンドウ候補がバクモンドウであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（１８）ビャクシの鑑別方法であって、ビャクシ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号２１３及び２１４、又は配列番号４１６及び４１７で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び配列番号２１３及び２１４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号２１３で示す塩基配列と配列番号２１４で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号２１５で示す塩基配列、又は配列番号４１６及び４１７で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号４１６で示す塩基配列と配列番号４１７で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号４１８で示す塩基配列を比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はビャクシの基原植物であって、前記ビャクシ候補がビャクシであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（１９）イレイセンの鑑別方法であって、イレイセン候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号２２７及び２２８で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び増幅産物における配列番号２２７で示す塩基配列と配列番号２２８で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号２２９〜２３１のいずれかで示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はイレイセンの基原植物であって、前記イレイセン候補がイレイセンであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（２０）インチンコウの鑑別方法であって、インチンコウ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号２４１及び２４２、又は配列番号２４３及び２４４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのpetD-rpoA領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び配列番号２４１及び２４２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号２４１で示す塩基配列と配列番号２４２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号２４５で示す塩基配列、又は配列番号２４３及び２４４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号２４３で示す塩基配列と配列番号２４４で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号２５３で示す塩基配列を比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はインチンコウの基原植物であって、前記インチンコウ候補がインチンコウであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（２１）ジコッピの鑑別方法であって、ジコッピ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号２６１及び２６２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのtrnH-psbA領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び増幅産物における配列番号２６１で示す塩基配列と配列番号２６２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号２６３又は２６４で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はジコッピの基原植物であって、前記ジコッピ候補がジコッピであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（２２）シュクシャの鑑別方法であって、シュクシャ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号２７５及び２７６で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び増幅産物における配列番号２７５で示す塩基配列と配列番号２７６で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号２７７で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はシュクシャの基原植物であって、前記シュクシャ候補がシュクシャであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（２３）ニンドウの鑑別方法であって、ニンドウ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号２８４及び２８５で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのpsbA-trnH領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び増幅産物における配列番号２８４で示す塩基配列と配列番号２８５で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号２８６で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はニンドウの基原植物であって、前記ニンドウ候補がニンドウであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（２４）センコツの鑑別方法であって、センコツ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号２９８及び２９９で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び増幅産物における配列番号２９８で示す塩基配列と配列番号２９９で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号３００で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はセンコツの基原植物であって、前記センコツ候補がセンコツであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（２５）ソウハクヒの鑑別方法であって、ソウハクヒ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号３１２及び３１３で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び増幅産物における配列番号３１２で示す塩基配列と配列番号３１３で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号３１４で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はソウハクヒの基原植物であって、前記ソウハクヒ候補がソウハクヒであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（２６）キョウカツの鑑別方法であって、キョウカツ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号３２４及び３２５で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び増幅産物における配列番号３２４で示す塩基配列と配列番号３２５で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号３２６又は３２７で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はキョウカツの基原植物であって、前記キョウカツ候補がキョウカツであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（２７）ビワヨウの鑑別方法であって、ビワヨウ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号３３２及び３３３、又は配列番号３３４及び３３５で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び配列番号３３２及び３３３で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号３３２で示す塩基配列と配列番号３３３で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号３３６で示す塩基配列、又は配列番号３３４及び３３５で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号３３４で示す塩基配列と配列番号３３５で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号３４８で示す塩基配列を比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はビワヨウの基原植物であって、前記ビワヨウ候補がビワヨウであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（２８）シコンの鑑別方法であって、シコン候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号３６０及び３６１で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び増幅産物における配列番号３６０で示す塩基配列と配列番号３６１で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号３６２で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はシコンの基原植物であって、前記シコン候補がシコンであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
（２９）トチュウの鑑別方法であって、トチュウ候補の被検植物から核酸を抽出する工程、抽出された核酸を鋳型に、配列番号３７４及び３７５で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのpsbA-trnH領域を増幅する工程、増幅産物の塩基配列を決定する工程、及び増幅産物における配列番号３７４で示す塩基配列と配列番号３７５で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列と配列番号３７６で示す塩基配列とを比較し、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はトチュウの基原植物であって、前記トチュウ候補がトチュウであると鑑別する工程を含む前記鑑別方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の生薬鑑別用プライマーセットを用いて、本発明の生薬鑑別方法を行うことで、生薬加工処理された植物であっても、その植物が日本薬局方・局外生規で認められた生薬の基原植物であるか否かを正確に同定することができ、それによって、異種植物の混入等を確実に防止することができる。
【０００９】
本発明の生薬鑑別用キットによれば、本発明の生薬鑑別方法を容易に実施でき、様々な生薬を簡便に鑑別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】標準となるブクリョウの配列と他系統茯苓の相同配列とを比較した図である。
【図２】標準となるブクリョウの配列と他系統茯苓の相同配列とを比較した図である。
【図３】標準となるジオウの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図４−１】標準となるエンゴサクの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図４−２】図４−１の続きである。
【図５】標準となるカッコンの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図６】標準となるカッコンの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図７−１】標準となるボウフウの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図８−１】標準となるオンジの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図８−２】図８−１の続きである。
【図９−１】標準となるハッカの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図９−２】図９−１の続きである。
【図１０−１】標準となるマオウの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図１０−２】図１０−１の続きである。
【図１０−３】図１０−２の続きである。
【図１１−１】標準となるタイソウ・サンソウニンの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図１１−２】図１１−１の続きである。
【図１２−１】標準となるタイソウ・サンソウニンの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図１２−２】図１２−１の続きである。
【図１３】標準となるカロコン・カロニンの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図１４−１】標準となるカロコン・カロニンの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図１４−２】図１４−１の続きである。
【図１５−１】標準となるゴシュユの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図１５−２】図１５−１の続きである。
【図１５−３】図１５−２の続きである。
【図１６−１】標準となるゴシュユの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図１６−２】図１６−１の続きである。
【図１７−１】標準となるゼンコの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図１７−２】図１７−１の続きである。
【図１７−３】図１７−２の続きである。
【図１８−１】標準となるチモの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図１８−２】図１８−１の続きである。
【図１９−１】標準となるバクモンドウの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図１９−２】図１９−１の続きである。
【図２０−１】標準となるビャクシの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図２０−２】図２０−１の続きである。
【図２１−１】標準となるイレイセンの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図２１−２】図２１−１の続きである。
【図２２−１】標準となるインチンコウの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図２２−２】図２２−１の続きである。
【図２２−３】図２２−２の続きである。
【図２３−１】標準となるインチンコウの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図２３−２】図２３−１の続きである。
【図２４−１】標準となるジコッピの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図２４−２】図２４−１の続きである。
【図２５−１】標準となるシュクシャの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図２５−２】図２５−１の続きである。
【図２６−１】標準となるニンドウの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図２６−２】図２６−１の続きである。
【図２７−１】標準となるセンコツの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図２７−２】図２７−１の続きである。
【図２８−１】標準となるソウハクヒの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図２８−２】図２８−１の続きである。
【図２９】標準となるキョウカツの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図３０−１】標準となるビワヨウの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図３０−２】図３０−１の続きである。
【図３０−３】図３０−２の続きである。
【図３１】標準となるビワヨウの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図３２−１】標準となるシコンの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図３２−２】図３２−１の続きである。
【図３３−１】標準となるトチュウの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図３３−２】図３３−１の続きである。
【図３４−１】標準となるマオウの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図３４−２】図３４−１の続きである。
【図３５−１】標準となるゼンコの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図３５−２】図３５−１の続きである。
【図３５−３】図３５−２の続きである。
【図３６】標準となるビャクシの配列と近縁他種の相同配列とを比較した図である。
【図３７−１】生薬の鑑別用プライマーセットにより、生薬と近縁植物由来の生薬だけが増幅され、遠縁のものは増幅されないことを示す電気泳動写真である。
【図３７−２】図３７−１の続きである。
【図３７−３】図３７−２の続きである。
【図３７−４】図３７−３の続きである。
【図３７−５】図３７−４の続きである。
【図３７−６】図３７−５の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．生薬鑑別用プライマーセット
１−１．概要
本発明の第１の態様は、生薬鑑別用プライマーセットである。本態様のプライマーセットは、核酸で構成され、後述する第３態様に記載の生薬鑑別方法において被検植物が目的とする生薬の基原植物であるか否かを同定するための手段として使用される。
【００１２】
１−２．定義
以下で本明細書において頻用する用語について定義する。
【００１３】
本明細書において「生薬」とは、漢方薬の原料となり得る、薬理効果を有する天然物由来の物質をいい、動物、植物、又は菌類の全部又は一部、及び鉱物が含まれる。本明細書においては、特に第十七改正日本薬局方（平成28年3月7日厚生労働省告示第64号）、日本薬局方外生薬規格2015（平成27年12月25日薬生審査発1225第1号厚生労働省医薬・生活衛生局審査管理課長通知）に定める植物及び菌類由来の以下の生薬が該当する。具体的には、ブクリョウ、ジオウ、エンゴサク、カッコン、ボウフウ、オンジ、ハッカ、マオウ、タイソウ、サンソウニン、カロコン、カロニン、ゴシュユ、ゼンコ、チモ、バクモンドウ、ビャクシ、イレイセン、インチンコウ、ジコッピ、シュクシャ、ニンドウ、センコツ、ソウハクヒ、キョウカツ、ビワヨウ、シコン、及びトチュウである。
【００１４】
なお、分類学上、菌類は植物ではないが、本明細書では便宜的に菌類を植物に含める。したがって、特に断りのない限り、本明細書で「植物」と記載した場合、「植物及び／又は菌類」を指すものとする。例えば、本明細書で「基原植物」と記載した場合、「基原植物及び／又は基原菌類」を意味するものとする。
【００１５】
生薬の「基原」とは、生薬の原料となる植物、動物、又は鉱物とその用部、及び加工方法を表す用語である。例えば、ある生薬の原料となる植物の種類、その生薬に用いられる植物の部位、及び生薬にした際の加工方法を含む。このうち、生薬の原料となる植物、すなわち生薬の原植物を「基原植物」という。「原植物」とは、原料となる植物を意味する。基原植物は、原則として生薬ごとに定められている。例えば、上記生薬に関しては、ブクリョウであればマツホドWolfiporia cocos Ryvarden et Gilbertson (Poria cocos Wolf) (Polyporaceae)が、ジオウであればアカヤジオウRehmannia glutinosa Liboschitz var. purpurea Makino又はRehmannia glutinosa Liboschitz (Scrophulariaceae)が、エンゴサクであればCorydalis turtschaninovii Besser forma yanhusuo Y. H. Chou et C. C. Hsu (Papaveraceae)が、カッコンであればクズPueraria lobata Ohwi (Leguminosae)が、ボウフウであればSaposhnikovia divaricata Schischkin (Umbelliferae)が、オンジであればイトヒメハギPolygala tenuifolia Willdenow (Polygalaceae)が、ハッカであればハッカMentha arvensis Linne var. piperascens Malinvaud (Labiatae)が、マオウであればEphedra sinica Stapf、Ephedra intermedia Schrenk et C. A. Meyer又はEphedra equisetina Bunge (Ephedraceae)が、タイソウであればナツメZiziphus jujuba Miller var. inermis Rehder (Rhamnaceae)が、サンソウニンであればサネブトナツメZiziphus jujuba Miller var. spinosa Hu ex H. F. Chou (Rhamnaceae)が、カロコン/カロニンであればTrichosanthes kirilowii Maximowicz、キカラスウリTrichosanthes kirilowii Maximowicz var. japonica Kitamura又はオオカラスウリTrichosanthes bracteata Voigt (Cucurbitaceae)が、ゴシュユであればゴシュユEuodia ruticarpa Hooker filius et Thomson (Evodia rutaecarpa Bentham)、Euodia officinalis Dode (Evodia officinalis Dode)又はEuodia bodinieri Dode (Evodia bodinieri Dode) (Rutaceae)が、ゼンコであればPeucedanum praeruptorum Dunn（白花ゼンコ）又はノダケAngelica decursiva Franchet et Savatier (Peucedanum decursivum Maximowicz) (Umbelliferae)（紫花ゼンコ）が、チモであればハナスゲAnemarrhena asphodeloides Bunge (Liliaceae)が、バクモンドウであればジャノヒゲOphiopogon japonicus Ker-Gawler (Liliaceae)が、ビャクシであればヨロイグサAngelica dahurica Bentham et Hooker filius ex Franchet et Savatier (Umbelliferae)が、イレイセンであればサキシマボタンヅルClematis chinensis Osbeck、Clematis mandshurica Ruprecht又はClematis hexapetala Pallas (Ranunculaceae)が、インチンコウであればカワラヨモギArtemisia capillaris Thunberg (Compositae)が、ジコッピであればクコLycium chinense Miller又はLycium barbarum Linne (Solanaceae)が、シュクシャであればAmomum xanthioides Wallich (Zingiberaceae)が、ニンドウであればスイカズラLonicera japonica Thunberg (Caprifoliaceae)が、センコツであればコウホネNuphar japonicum De Candolle (Nymphaeaceae)が、ソウハクヒであればマグワMorus alba Linne (Moraceae)が、キョウカツであればNotopterygium incisum Ting ex H. T. Chang又はNotopterygium forbesii Boissieu (Umbelliferae)が、ビワヨウであればビワEriobotrya japonica Lindley (Rosaceae)が、シコンであればムラサキLithospermum erythrorhizon Siebold et Zuccarini (Boraginaceae)が、トチュウであればトチュウEucommia ulmoides Oliver (Eucommiaceae)が、それぞれ基原植物となる。各生薬の基原植物は、１種類のみの場合もあれば、同属近縁の数種を含み、そのいずれであってもよい場合もある。
【００１６】
生薬は、その形態に応じて、全形生薬、切断生薬又は粉末生薬に分類される。「全形生薬」は、その薬用とする植物体やその一部を乾燥し、及び／又は簡単な加工をしたものである。ここでいう「簡単な加工」には、切断、（高圧）蒸気処理、加熱、溶液への浸漬等が挙げられる。「切断生薬」は、全形生薬を小片若しくは小塊に切断若しくは破砕したもの、又は粗切、中切若しくは細切したものである。「粉末生薬」は、全形又は切断生薬を粗末、中末、細末又は微末としたものである。本明細書における生薬は、いずれの形態であってもよい。好ましくは全形生薬又は切断生薬である。
【００１７】
前述の基原の定義において述べたように、生薬が植物の一部で構成される場合、それが基原植物のいずれの部分であるか、その薬用とする部分は、生薬ごとに定められている。各生薬の薬用とする部分は、当該分野において周知されており、例えば、第十七改正日本薬局方（既述）に記載されている。
【００１８】
本明細書において「疑似生薬」とは、特定の生薬において、基原植物以外の植物種（例えば、同属近縁種）等を原料として、その特定の生薬と同じ部位を用いて、同様の加工処理を行って得られる産物をいう。疑似生薬は、多くの場合、外見等が生薬に類似するため生薬との識別が困難であることが多い。しかし、前述のように各生薬において、基原植物以外の植物種を原料とした産物は、その植物種がたとえ基原植物の近縁種であったとしても、また、たとえ生薬と同じ薬理作用を有していたとしても、原則として、その生薬とは認められない。
【００１９】
本明細書において「鑑別」とは、生薬候補の被検植物が目的とする生薬の基原植物であるか否かを同定することによって、その生薬候補が真の生薬か疑似生薬かを見分けること、又は生薬における異種植物由来の疑似生薬混入の有無を見分けることをいう。
【００２０】
本明細書において「生薬候補」とは、外観や加工状態が特定の生薬に類似するものの、その原植物が基原植物か否かが明らかでないものをいう。生薬候補は、真の生薬、疑似生薬、又はそれらの混合物を包含し得る。例えば、市場に流通する生薬のうち、その基原植物由来であることが保証されていないものは、本発明の生薬候補に該当する。
【００２１】
本明細書において「被検植物」とは、生薬候補の原植物であって、後述する第３態様に記載の生薬鑑別方法に供される検査対象植物をいう。本明細書では、生薬候補を構成する植物組織が、第３態様に記載の生薬鑑別方法の検査対象となり得る。例えば、葉、茎、芽、葉鞘、葉柄、球芽、地下茎（球茎、鱗茎／球根、根茎、塊茎等を含む）、根（塊根、気根等を含む）、種子、胚軸、実等が挙げられる。
【００２２】
本明細書において「核酸（分子）」とは、原則としてヌクレオチドを構成単位とし、それらがホスホジエステル結合によって連結した生体高分子をいう。通常は、DNA、RNA等の天然核酸で構成される。DNAの場合、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、葉緑体DNA等の細胞内に存在し得るあらゆるDNA分子に加え、mRNAから逆転写反応によって調製されたcDNAを包含する。また、RNAの場合、mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、tmRNA、miRNA等の細胞内に存在し得るあらゆるRNA分子を包含する。その他、本態様の生薬鑑別用プライマーのように、人工的に合成される核酸分子の場合、天然核酸だけでなく、化学修飾核酸や擬似核酸を含んでいてもよい。化学修飾核酸や擬似核酸には、例えば、ペプチド核酸（PNA：Peptide Nucleic Acid）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（PHONA）、架橋化核酸（BNA/LNA：Bridged Nucleic Acid/Locked Nucleic Acid）、モルホリノ核酸等が挙げられる。メチルホスホネート型DNA/RNA、ホスホロチオエート型DNA/RNA、ホスホルアミデート型DNA/RNA、2'-O-メチル型DNA/RNA等が挙げられる。
【００２３】
１−３．構成
本明細書において「生薬鑑別用プライマー」（本明細書では、しばしば「プライマー」と省略して表記する。したがって、特段の断りがない限り、本明細書におけるプライマーとは、生薬鑑別用プライマーを意味する。）とは、後述する生薬鑑別方法で使用される核酸増幅用プライマーであり、19塩基〜25塩基からなる核酸分子（オリゴヌクレオチド）で構成される。天然核酸（DNA及び／又はRNA)で構成されていることが好ましい。安定性が高く、合成が容易で、かつ低廉な点で、DNAで構成されているプライマーが特に好ましい。必要に応じて、プライマーを構成する塩基配列の全部又は一部に化学修飾核酸や擬似核酸を含んでいてもよい。さらに、プライマーは、標識物質及び／又は修飾物質で修飾されていてもよい。標識物質は、特に限定はしない。例えば、蛍光物質及び／又はクエンチャー物質、又は放射性同位元素（例えば、32P、33P、35S）等を利用できる。蛍光物質の具体例として、FITC、DIG、Texas、Cy3、Cy5、Cy7、Cyanine3、Cyanine5、Cyanine7、FAM、HEX、VIC、フルオレサミン及びその誘導体、及びローダミン及びその誘導体等が挙げられる。また、クエンチャー物質の具体例として、TAMRA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、又はBHQ-3等が挙げられる。修飾物質も、特に限定はしない。例えば、ビオチン及びアビジン、ストレプトアビジン若しくはニュートラアビジン、又は磁気ビーズ等が挙げられる標識物質や修飾物質は、各メーカーで販売される市販のものを用いることができる。
【００２４】
プライマー塩基配列上の標識物質や修飾物質の修飾位置は、特に限定しない。使用する標識物質や修飾物質の特性や、目的に応じて適宜定めればよい。標識物質であれば、通常は5’又は3’末端部に修飾されることが多いが、もちろんこれに限られない。また、一つのプライマーを一以上の標識物質や修飾物質で修飾することもできる。標識物質や修飾物質のプライマーへの修飾方法は公知の方法で行えばよい。
【００２５】
本明細書において「生薬鑑別用プライマーセット」とは、フォワードプライマー及びリバースプライマーで構成される生薬鑑別用プライマーの１つの組である。本態様の生薬鑑別用プライマーセットは、表１に示すように、各生薬に対して1組以上が設計される。
【００２６】
【表１】
2020103279.tif 000002
2020103279.tif 000003
【００２７】
具体的には、フォワードプライマー及びリバースプライマーがそれぞれ、ブクリョウであれば配列番号１及び２、又は配列番号３及び４、ジオウであれば配列番号１７及び１８、エンゴサクであれば配列番号２６及び２７、カッコンであれば配列番号３７及び３８、又は配列番号３９及び４０、ボウフウであれば配列番号５１及び５２、オンジであれば配列番号６５及び６６、ハッカであれば配列番号７３及び７４、マオウであれば配列番号８５及び８６、又は配列番号３８５及び３８６、タイソウ／サンソウニンであれば配列番号１０１及び１０２、又は配列番号１０３及び１０４、カロコン／カロニンであれば配列番号１２５及び１２６、又は配列番号１２７及び１２８、ゴシュユであれば配列番号１４１及び１４２、又は配列番号１４３及び１４４、ゼンコであれば配列番号１７１及び１７２、又は配列番号４０１及び４０２、チモであれば配列番号１８６及び１８７、バクモンドウであれば配列番号１９９及び２００、ビャクシであれば配列番号２１３及び２１４、又は配列番号４１６及び４１７、イレイセンであれば配列番号２２７及び２２８、インチンコウであれば配列番号２４１及び２４２、又は配列番号２４３及び２４４、ジコッピであれば配列番号２６１及び２６２、シュクシャであれば配列番号２７５及び２７６、ニンドウであれば配列番号２８４及び２８５、センコツであれば配列番号２９８及び２９９、ソウハクヒであれば配列番号３１２及び３１３、キョウカツであれば配列番号３２４及び３２５、ビワヨウであれば配列番号３３２及び３３３、又は配列番号３３４及び３３５、シコンであれば配列番号３６０及び３６１、及び、トチュウであれば配列番号３７４及び３７５で示す塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００２８】
本態様の生薬鑑別用プライマーセットは、核酸増幅法によって被検植物における特定の核酸領域を増幅することができる。本明細書において「特定の核酸領域」とは、各生薬における基原植物の核酸分子において特異的な塩基配列を有する領域である。特定の核酸領域として選択される領域は、基原植物を構成する原植物種と、基原植物に含まれない近縁種との間で塩基配列が異なる領域でなければならない。しかしながら、一般に近縁種、特に同属近縁種内では、遺伝子の塩基配列における同一性が高い場合が多く、基原植物に特異的な特定の核酸領域は限定される。一方で、基原植物特異性が高く、近縁種との間で塩基配列の差が大き過ぎると、プライマーは基原植物のみにハイブリダイズし得るため、プライマー設計が困難となる。したがって、特定の核酸領域は、基原植物と近縁種間で保存された領域であり、かつ、両者の塩基配列にある程度の差異を有した領域である必要がある。このような特定の核酸領域は、各生薬で定まる。具体的には、ブクリョウ、ジオウ、エンゴサク、カッコン、ボウフウ、ハッカ、タイソウ／サンソウニン、ゴシュユ、ゼンコ、チモ、バクモンドウ、ビャクシ、イレイセン、シュクシャ、センコツ、ソウハクヒ、キョウカツ、ビワヨウ及びシコンであれば、核ゲノム中のリボソームDNAのITS領域が、オンジ、ニンドウ及びトチュウであれば、葉緑体DNAのpsbA-trnH領域が、マオウであれば、葉緑体DNAのrbcL領域が、カロコン／カロニンであれば、葉緑体DNAのrpl16イントロン領域が、インチンコウであれば、葉緑体DNAのpetD-rpoA領域が、そしてジコッピであれば、葉緑体DNAのtrnH-psbA領域が該当する。
【００２９】
「リボソーム(リボゾーム)DNA」（本明細書では、しばしば「rDNA」と表記する）とは、タンパク質合成に関与するリボソームRNA（本明細書では、しばしば「rRNA」と表記する）をコードする遺伝子をいう。真核生物のrRNAは、その種類は問わず、18S rRNA、5.8S rRNA、及び28S rRNAの3種が知られており、それぞれをコードする18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNAというがゲノム上に連続して存在し、数百から数万コピーの反復配列を繰り返している。「ITS（Internal Transcribed Spacer）」とは、18S rDNAと5.8S rDNA間、及び5.8S rDNAと28S rDNA間に存在する配列で、それぞれITS1及びITS2と称する。一般にrDNAの塩基配列は、酵母から高等植物や哺乳動物に至るまで種間で広く保存されているが、ITS1及びITS2はプロセッシングの過程で除去されるため、高度な変異の蓄積が観察される。本明細書においては、上記2つのITSとその間にある5.8s rDNAをまとめて「ITS領域」と称する。
【００３０】
「psbA」とは、光化学系II反応中心であるD1タンパク質をコードする遺伝子で、植物と藻類の葉緑体ゲノムおよびシアノバクテリアゲノムに存在する。植物のpsbA遺伝子は、葉緑体ゲノム中に1コピー存在し、その上流にtrnH遺伝子が隣接する。また、「trnH」とは、アミノ酸の一種であるヒスチジンを運搬する転移RNA（トランスファーRNA）をコードする遺伝子である。近年、DNA配列を用いた生物種の同定に関して、DNAバーコーディングプロジェクトが進められており、植物では葉緑体DNAのtrnH-psbA遺伝子間領域が候補の一つとして提案されている。本明細書において「psbA-trnH領域」及び「trnH-psbA領域」とは、当該のtrnH-psbA遺伝子間領域をいう。
【００３１】
「rbcL」とは、リブロース1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(rbc：ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase)を構成するLサブユニット（Large subunit）である。rbcは、還元的ペントースリン酸回路を有する全ての原核・真核光合成生物および化学合成細菌に存在し、種間で高度に保存されている。「rbcL領域」は、葉緑体DNA上に存在し、rbcLをコードするrbcL遺伝子の部分領域をいう。
【００３２】
「rpl16」とは、リボソームタンパク質の大サブユニット（Large subunit）を構成するタンパク質の1つであるRPL16をコードする遺伝子で、葉緑体DNA上に存在する。「rpl16イントロン領域」とは、rpl16遺伝子のイントロン部分領域をいう。リボソームタンパク質遺伝子の塩基配列は、生物種間で高度に保存されているが、イントロン領域はスプライシングの過程で除去されるため、高度な変異の蓄積が観察される。
【００３３】
「petD」とは、光合成電子伝達系のタンパク質をコードする遺伝子で、photosyntheticelectron transportに由来する。pet遺伝子はシトクロムb6f複合体のサブユニットをコードする遺伝子と、可動性の電子伝達成分である光化学系Iの電子供与体として機能するプラストシアニンおよびシトクロムc553、および光化学系Iの電子受容体であるフェレドキシンとフェレドキシン-NADP+オキシドレダクターゼをコードする遺伝子を含んでいる。petD遺伝子はサブユニットIVをコードする遺伝子である。また、「rpoA」とは、細菌RNAポリメラーゼおよびplastid-encoded plastid RNA polymerase(PEP)の*コア酵素を構成するサブユニット(α2ββ'ωおよびα2ββ'β")の遺伝子である。細菌におけるα、β、β'、およびω遺伝子は、それぞれ、rpoA、rpoB、rpoC、およびrpoZ(rpo:RNA polymerase)と呼ばれる。高等植物において、α、β、β'、およびβ"遺伝子は、すべて色素体ゲノムにコードされており、それぞれ、rpoA、rpoB、rpoC1、およびrpoC2と表記される。本明細書において「petD-rpoA領域」とは、petD-rpoA遺伝子間領域をいう。
【００３４】
各生薬鑑別用プライマーセットで増幅される特定の核酸領域の塩基配列は、生薬の基原植物の核酸分子（ゲノムDNA又は葉緑体DNA）を鋳型にした時の塩基配列がその生薬の「生薬標準配列」となる。プライマー１セットあたりの生薬標準配列数は、生薬ごとに異なる。これは、各生薬において、基原植物の原植物数や特定の核酸領域数が異なるためである。各生薬鑑別用プライマーセットに対応する標準配列の配列番号を表２に示す。なお、本明細書において、各標準配列は、生薬の基原植物の特定の核酸領域の塩基配列において、生薬鑑別用プライマーセットのフォワードプライマーの塩基配列とリバースプライマーの塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まされた塩基配列である。換言すれば、各標準配列は、生薬鑑別用プライマーセットのフォワードプライマーの塩基配列とリバースプライマーの塩基配列に相補的な塩基配列を含まない。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
具体的には、配列番号１及び２で示す塩基配列からなるブクリョウ鑑別用プライマーセットを使用したときのブクリョウ標準配列は配列番号５で示す塩基配列、配列番号３及び４で示す塩基配列からなるブクリョウ鑑別用プライマーセットを使用したときのブクリョウ標準配列は配列番号１１で示す塩基配列、配列番号１７及び１８で示す塩基配列からなるジオウ鑑別用プライマーセットを使用したときのジオウ標準配列は配列番号１９又は２０で示す塩基配列、配列番号２６及び２７で示す塩基配列からなるエンゴサク鑑別用プライマーセットを使用したときのエンゴサク標準配列は配列番号２８で示す塩基配列、配列番号３７及び３８で示す塩基配列からなるカッコン鑑別用プライマーセットを使用したときのカッコン標準配列は配列番号４１で示す塩基配列、配列番号３９及び４０で示す塩基配列からなるカッコン鑑別用プライマーセットを使用したときのカッコン標準配列は配列番号４６で示す塩基配列、配列番号５１及び５２で示す塩基配列からなるボウフウ鑑別用プライマーセットを使用したときのボウフウ標準配列は配列番号５３で示す塩基配列、配列番号６５及び６６で示す塩基配列からなるオンジ鑑別用プライマーセットを使用したときのオンジ標準配列は配列番号６７で示す塩基配列、配列番号７３及び７４で示す塩基配列からなるハッカ鑑別用プライマーセットを使用したときのハッカ標準配列は配列番号７５で示す塩基配列、配列番号８５及び８６で示す塩基配列からなるマオウ鑑別用プライマーセットを使用したときのマオウ標準配列は配列番号８７〜８９のいずれかで示す塩基配列、配列番号３８５及び３８６で示す塩基配列からなるマオウ鑑別用プライマーセットを使用したときのマオウ標準配列は配列番号３８７〜３８９のいずれかで示す塩基配列、配列番号１０１及び１０２で示す塩基配列からなるタイソウ／サンソウニン鑑別用プライマーセットを使用したときのタイソウ／サンソウニン標準配列は配列番号１０５で示す塩基配列、配列番号１０３及び１０４で示す塩基配列からなるタイソウ／サンソウニン鑑別用プライマーセットを使用したときのタイソウ／サンソウニン標準配列は配列番号１１５で示す塩基配列、配列番号１２５及び１２６で示す塩基配列からなるカロコン／カロニン鑑別用プライマーセットを使用したときのカロコン／カロニン標準配列は配列番号１２９〜１３１のいずれかで示す塩基配列、配列番号１２７及び１２８で示す塩基配列からなるカロコン／カロニン鑑別用プライマーセットを使用したときのカロコン／カロニン標準配列は配列番号１３５〜１３７のいずれかで示す塩基配列、配列番号１４１及び１４２で示す塩基配列からなるゴシュユ鑑別用プライマーセットを使用したときのゴシュユ標準配列は配列番号１４５〜１４７のいずれかで示す塩基配列、配列番号１４３及び１４４で示す塩基配列からなるゴシュユ鑑別用プライマーセットを使用したときのゴシュユ標準配列は配列番号１５８〜１６０のいずれかで示す塩基配列、配列番号１７１及び１７２で示す塩基配列からなるゼンコ鑑別用プライマーセットを使用したときのゼンコ標準配列は配列番号１７３又は１７４で示す塩基配列、配列番号４０１及び４０２で示す塩基配列からなるゼンコ鑑別用プライマーセットを使用したときのゼンコ標準配列は配列番号４０３又は４０４で示す塩基配列、配列番号１８６及び１８７で示す塩基配列からなるチモ鑑別用プライマーセットを使用したときのチモ標準配列は配列番号１８８で示す塩基配列、配列番号１９９及び２００で示す塩基配列からなるバクモンドウ鑑別用プライマーセットを使用したときのバクモンドウ標準配列は配列番号２０１で示す塩基配列、配列番号２１３及び２１４で示す塩基配列からなるビャクシ鑑別用プライマーセットを使用したときのビャクシ標準配列は配列番号２１５で示す塩基配列、配列番号４１６及び４１７で示す塩基配列からなるビャクシ鑑別用プライマーセットを使用したときのビャクシ標準配列は配列番号４１８で示す塩基配列、配列番号２２７及び２２８で示す塩基配列からなるイレイセン鑑別用プライマーセットを使用したときのイレイセン標準配列は配列番号２２９〜２３１のいずれかで示す塩基配列、配列番号２４１及び２４２で示す塩基配列からなるインチンコウ鑑別用プライマーセットを使用したときのインチンコウ標準配列は配列番号２４５で示す塩基配列、配列番号２４３及び２４４で示す塩基配列からなるインチンコウ鑑別用プライマーセットを使用したときのインチンコウ標準配列は配列番号２５３で示す塩基配列、配列番号２６１及び２６２で示す塩基配列からなるジコッピ鑑別用プライマーセットを使用したときのジコッピ標準配列は配列番号２６３又は２６４で示す塩基配列、配列番号２７５及び２７６で示す塩基配列からなるシュクシャ鑑別用プライマーセットを使用したときのシュクシャ標準配列は配列番号２７７で示す塩基配列、配列番号２８４及び２８５で示す塩基配列からなるニンドウ鑑別用プライマーセットを使用したときのニンドウ標準配列は配列番号２８６で示す塩基配列、配列番号２９８及び２９９で示す塩基配列からなるセンコツ鑑別用プライマーセットを使用したときのセンコツ標準配列は配列番号３００で示す塩基配列、配列番号３１２及び３１３で示す塩基配列からなるソウハクヒ鑑別用プライマーセットを使用したときのソウハクヒ標準配列は配列番号３１４で示す塩基配列、配列番号３２４及び３２５で示す塩基配列からなるキョウカツ鑑別用プライマーセットを使用したときのキョウカツ標準配列は配列番号３２６又は３２７で示す塩基配列、配列番号３３２及び３３３で示す塩基配列からなるビワヨウ鑑別用プライマーセットを使用したときのビワヨウ標準配列は配列番号３３６で示す塩基配列、配列番号３３４及び３３５で示す塩基配列からなるビワヨウ鑑別用プライマーセットを使用したときのビワヨウ標準配列は配列番号３４８で示す塩基配列、配列番号３６０及び３６１で示す塩基配列からなるシコン鑑別用プライマーセットを使用したときのシコン標準配列は配列番号３６２で示す塩基配列、配列番号３７４及び３７５で示す塩基配列からなるトチュウ鑑別用プライマーセットを使用したときのトチュウ標準配列は配列番号３７６で示す塩基配列となる。
【００３７】
各生薬鑑定用プライマーは、5’末端側に、必要に応じてタグ配列、バーコード配列、アダプター配列等を含んでいてもよい。
【００３８】
プライマーは、化学合成法によって合成することが好ましい。上述の生薬の鑑定用プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列情報に基づいて合成すればよい。合成は、核酸合成受託サービスを利用することもできる。
【００３９】
２．生薬鑑別キット
２−１．概要
本発明の第２の態様は生薬鑑別キットである。本態様の生薬鑑別キットは、被験植物が生薬の基原植物であるか否かを鑑別する第３態様に記載の生薬鑑別方法を実施する上で必要な要素を構成要素として包含する。本態様に生薬鑑別キットを用いることで、簡便に被験植物の生薬鑑別を行うことができる。
【００４０】
２−２．構成
本態様の生薬鑑別キットは、第１態様に記載の生薬鑑別用プライマーセットを必須の構成要素として含む。本態様の生薬鑑別キットにおいて、一の生薬に対する鑑別用プライマーセットは、2組以上含んでいてもよい。また、一つのキットに含まれる生薬の種類は2種以上であってもよい。
【００４１】
生薬鑑別キットは、選択構成要素として、各生薬の標準配列情報を含むことができる。「各生薬の標準配列情報」とは、各生薬の基原植物から調製された核酸を鋳型に、その生薬の鑑別用プライマーを用いて核酸増幅反応して得られる増幅産物の塩基配列情報である。生薬鑑別キットには、包含する生薬鑑別用プライマーセットに対応する標準配列情報を、紙媒体、又はCD-ROM等の電子媒体等の情報伝達媒体に記録した状態で、あるいはインターネットを介して情報提供するURLとして、含むことができる。
【００４２】
その他、生薬鑑別キットは、被験植物から核酸分子を抽出するための試薬（例えば、塩化ベンジル、界面活性剤等）、生薬鑑別用プライマーを用いて核酸増幅反応を行うための試薬（耐熱性DNAポリメラーゼ、dNTP、Mg2+等）、及び／又は使用説明書等を包含することができる。
【００４３】
３．生薬鑑別方法
３−１．概要
本発明の第３の態様は、生薬鑑別方法である。本態様の生薬鑑別方法は、第１態様に記載の生薬鑑別用プライマーセットを用いて生薬候補の被検植物が目的とする生薬の基原植物であるか否かを正確に同定することによって、その生薬候補が目的の生薬であることを鑑別する方法である。本態様の方法を用いることで、簡便かつ正確に生薬を鑑別することが可能となる。
【００４４】
３−２．方法
本態様の生薬鑑別方法は、必須工程として核酸抽出工程、核酸増幅工程、塩基配列決定工程、及び比較鑑別工程を含む。以下、各工程について具体的に説明する。
【００４５】
（１）核酸抽出工程
「核酸抽出工程」とは、生薬候補の被検植物から核酸分子を抽出する工程である。本方法で検査対象となる被検植物は、多くの場合、蒸気処理、加熱、乾燥、溶液浸漬等の加工処理が施されている。したがって、それらの加工処理された被検植物の一部を採取し、当該分野における常法により核酸分子を抽出すればよい。核酸抽出方法は、抽出すべき核酸分子の種類によって好適な方法をもちいればよい。例えば、DNAを抽出する場合、CTAB（Cetyl trimethyl ammonium bromide）法、塩化ベンジル法等を利用することができる。またAGPC（酸性グアニジンチオシアネート・フェノール・クロロホルム）法が挙げられる。これらの具体的な手順等については、当該分野のプロトコルを参照すればよい。プロトコルには、例えば、Green, MR and Sambrook, J, (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkが挙げられる。さらに、植物体から各種核酸分子を抽出するキットが、キアゲン社、タカラバイオ社、TOYOBO社、Thermo Fisher Scientific社、プロメガ社等の各ライフサイエンスメーカーから市販されており、それらを利用することもできる。
【００４６】
（２）核酸増幅工程
「核酸増幅工程」とは、前記核酸抽出工程で得られた被検植物の核酸分子を鋳型に、第１態様に記載の生薬鑑定用プライマーセットを用いて、特定の核酸領域を増幅させる工程である。
【００４７】
本明細書において「核酸増幅法」とは、プライマーを用いて、核酸ポリメラーゼにより標的核酸を増幅させる方法をいう。例えば、PCR法（RT-PCR法を含む）、NASBA（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ICAN（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）（登録商標）法（RT-LAMP法を含む）が挙げられる。本発明で使用する核酸増幅法について限定はしないが、好ましくはPCR法である。また、鋳型として使用する核酸分子が、mRNAの場合(例えばrbcL mRNAの場合)、核酸増幅工程は、NASBA法のようなRNA増幅法を使用するか、RT-PCR法やRT-LAMP法のように、逆転写反応によりmRNAをcDNAに調製した後にDNA増幅法を使用する。
【００４８】
本工程で使用する生薬鑑定用プライマーセットは、生薬候補が鑑別対象とする目的の生薬の基原植物用のプライマーセットである。
【００４９】
各核酸増幅方法については、当該分野で公知であり、各種プロトコルに記載の条件を参考に行えばよい。プロトコル集の例として、前述のGreen, MR and Sambrook, J, (2012)、Domingues L. (2017) PCR: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Humana Press、又はPark DJ, (2010) PCR Protocols, Methods in Molecular Biology, Third Edition, Humana Press等が挙げられる。なお、本工程において、鋳型の相補鎖合成時に、G-C塩基対、又はA-T塩基対以外のエラーが入ると、後述する比較鑑別工程で、標準配列との塩基配列の相違を検証する際に、誤った比較結果をもたらし得るため、鑑別精度が著しく低下する。そこで、核酸増幅反応に使用するポリメラーゼには、相補鎖合成時のエラー率が低いハイフィデリティポリメラーゼ（例えば、Pfu DNA ポリメラーゼ）を使用することが好ましい。
【００５０】
核酸増幅用のキットが前述のような各ライフサイエンスメーカーから市販されており、それらを利用することもできる。その場合、核酸増幅方法の条件等については、添付又は各メーカーが推奨するプロトコルに従えばよい。
【００５１】
（３）塩基配列決定工程
「塩基配列決定工程」とは、前記核酸増幅工程で得られた増幅産物の塩基配列を決定する工程である。
【００５２】
核酸増幅工程後に得られる増幅産物は、被検植物における特定の核酸領域である。この増幅産物の塩基配列を決定する。
【００５３】
増幅産物は、塩基配列決定前に、必要に応じて精製、及び／又はクローニングをすることもできる。増幅産物の精製は、当該分野で公知の各種核酸精製法を利用することができる。例えば、ゲル電気泳動による分離抽出方法、シリカマトリクスやシリカメンブレン等を用いた吸着精製方法等が挙げられる。核酸の精製方法については、各種プロトコル集に記載の方法を参考にしてもよい。例えば、前述のGreen, MR and Sambrook, J, (2012)、Domingues L. (2017)、又はPark DJ, (2010)等が挙げられる。さらに、核酸精製キットは、前述のような各ライフサイエンスメーカーからも多数が市販されており、それらを利用してもよい。その場合、核酸精製方法の具体的な条件等については、添付又は各メーカーが推奨するプロトコルに従えばよい。
【００５４】
増幅産物のクローニングは、得られた増幅産物をプラスミド等に組み込み、大腸菌等の宿主内に導入し、その形質転換体から回収することで達成できる。増幅産物のクローニング法についても当該分野では公知であり、前述のプロトコル集等に記載の方法に従って行えばよい。この増幅産物のクローニングについても各ライフサイエンスメーカーが各種クローニング用キットを市販している。例えば、増幅産物のクローニング用であればMighty TA-cloning Kit（タカラバイオ社）等が挙げられる。それらの市販のキットを利用すると便利である。
【００５５】
増幅産物の塩基配列決定法は、当該分野における公知の塩基配列決定法により実施すればよい。例えば、一般的なサンガー法（ジデオキシ法）の他、パイロシーケンシング法（Roche社）、合成シーケンシング法（Illumina社）、ライゲーションシーケンシング法（Thermo Fisher Scientific社）、イオン半導体シーケンシング法（Thermo Fisher Scientific社）等の次世代シーケンシング法が挙げられる。これらの方法は、当該分野で公知であり、各種プロトコル集の他、各社Webサイトに開示された方法を参考にすることができる。
【００５６】
本工程で決定される増幅産物の塩基配列の正確性は、本発明の主旨から重要である。したがって、サンガー法のような配列読取のエラー率が低い塩基配列決定法が好ましい。
【００５７】
（４）比較鑑別工程
「比較鑑別工程」とは、前記塩基配列決定工程で決定された被検植物における特定の核酸領域の塩基配列を、目的とする生薬の基原植物における標準配列と比較して、両者の塩基配列が一致したときに、その被検植物は、その基原植物であって、前記生薬候補は、目的の生薬であると鑑別する工程である。
【００５８】
基原植物の標準配列は、被検植物と同じ条件で、基原植物に対して核酸抽出工程、核酸増幅工程、及び塩基配列決定工程を行って得られる特定の核酸領域の塩基配列である。この標準配列は、基原植物に特異的な配列を有し、基原植物の同属近縁種や類似種であっても、原則としてその一部塩基が異なる。
【００５９】
なお、上述のように、本明細書において、標準配列は、生薬の基原植物の特定の核酸領域の塩基配列において、生薬鑑別用プライマーセットのフォワードプライマーの塩基配列とリバースプライマーの塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まされた塩基配列である。
【００６０】
したがって、被検植物の増幅産物における生薬鑑別用プライマーセットのフォワードプライマーの塩基配列とリバースプライマーの塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まされた塩基配列と、基原植物の標準配列とを比較して、その配列が完全に一致すれば、被検植物は、基原植物であると正確に同定することができる。被検植物が目的とする生薬の基原植物であれば、その生薬候補は、目的の生薬であると鑑別することができる。一方、当該配列が一致しない場合、被検植物は基原植物ではないか、又は基原植物ではない植物種が混在している、と認定される。それ故に、生薬候補は目的の生薬ではないと鑑別することができる。
【００６１】
以下、それぞれの生薬において、被検植物が目的の生薬の基原植物か否かを正確に同定し、その結果に基づいて生薬を鑑別する具体的な工程について説明する。
【００６２】
（ブクリョウの鑑別方法）
ブクリョウ候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号１及び２、又は配列番号３及び４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、配列番号１及び２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１で示す塩基配列と配列番号２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とブクリョウの標準配列である配列番号５で示す塩基配列、又は配列番号３及び４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号３で示す塩基配列と配列番号４で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とブクリョウの標準配列である配列番号１１で示す塩基配列を比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はブクリョウの基原植物であって、前記ブクリョウ候補がブクリョウであると鑑別する。
【００６３】
（ジオウの鑑別方法）
ジオウ候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号１７及び１８で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、増幅産物における配列番号１７で示す塩基配列と配列番号１８で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とジオウの標準配列である配列番号１９又は２０で示す塩基配列とを比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はジオウの基原植物であって、前記ジオウ候補がジオウであると鑑別する。
【００６４】
（エンゴサクの鑑別方法）
エンゴサク候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号２６及び２７で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、増幅産物における配列番号２６で示す塩基配列と配列番号２７で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とエンゴサクの標準配列である配列番号２８で示す塩基配列とを比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はエンゴサクの基原植物であって、前記エンゴサク候補がエンゴサクであると鑑別する。
【００６５】
（カッコンの鑑別方法）
カッコン候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号３７及び３８、又は配列番号３９及び４０で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、配列番号３７及び３８で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号３７で示す塩基配列と配列番号３８で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とカッコンの標準配列である配列番号４１で示す塩基配列、又は配列番号３９及び４０で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号３９で示す塩基配列と配列番号４０で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とカッコンの標準配列である配列番号４６で示す塩基配列を比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はカッコンの基原植物であって、前記カッコン候補がカッコンであると鑑別する。
【００６６】
（ボウフウの鑑別方法）
ボウフウ候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号５１及び５２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、増幅産物における配列番号５１で示す塩基配列と配列番号５２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とボウフウの標準配列である配列番号５３で示す塩基配列とを比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はボウフウの基原植物であって、前記ボウフウ候補がボウフウであると鑑別する。
【００６７】
（オンジの鑑別方法）
オンジ候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号６５及び６６で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのpsbA-trnH領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、増幅産物における配列番号６５で示す塩基配列と配列番号６６で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とオンジの標準配列である配列番号６７で示す塩基配列とを比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はオンジの基原植物であって、前記オンジ候補がオンジであると鑑別する。
【００６８】
（ハッカの鑑別方法）
ハッカ候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号７３及び７４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、増幅産物における配列番号７３で示す塩基配列と配列番号７４で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とハッカの標準配列である配列番号７５で示す塩基配列とを比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はハッカの基原植物であって、前記ハッカ候補がハッカであると鑑別する。
【００６９】
（マオウの鑑別方法）
マオウ候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号８５及び８６、又は配列番号３８５及び３８６で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのrbcL領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、配列番号８５及び８６で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号８５で示す塩基配列と配列番号８６で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とマオウの標準配列である配列番号８７〜８９のいずれかで示す塩基配列、又は配列番号３８５及び３８６で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号３８５で示す塩基配列と配列番号３８６で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とマオウの標準配列である配列番号３８７〜３８９のいずれかで示す塩基配列を比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はマオウの基原植物であって、前記マオウ候補がマオウであると鑑別する。
【００７０】
（タイソウ／サンソウニンの鑑別方法）
タイソウ／サンソウニン候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号１０１及び１０２、又は配列番号１０３及び１０４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、配列番号１０１及び１０２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１０１で示す塩基配列と配列番号１０２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とタイソウ／サンソウニンの標準配列である配列番号１０５で示す塩基配列、又は配列番号１０３及び１０４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１０３で示す塩基配列と配列番号１０４で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とタイソウ／サンソウニンの標準配列である配列番号１１５で示す塩基配列を比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はタイソウ／サンソウニンの基原植物であって、前記タイソウ／サンソウニン候補がタイソウ／サンソウニンであると鑑別する。
【００７１】
（カロコン／カロニンの鑑別方法）
カロコン／カロニン候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号１２５及び１２６、又は配列番号１２７及び１２８で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのrpl16イントロン領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、配列番号１２５及び１２６で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１２５で示す塩基配列と配列番号１２６で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とカロコン／カロニンの標準配列である配列番号１２９〜１３１のいずれかで示す塩基配列、又は配列番号１２７及び１２８で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１２７で示す塩基配列と配列番号１２８で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とカロコン／カロニンの標準配列である配列番号１３５〜１３７のいずれかで示す塩基配列を比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はカロコン／カロニンの基原植物であって、前記カロコン／カロニン候補がカロコン／カロニンであると鑑別する。
【００７２】
（ゴシュユの鑑別方法）
ゴシュユ候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号１４１及び１４２、又は配列番号１４３及び１４４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、配列番号１４１及び１４２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１４１で示す塩基配列と配列番号１４２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とゴシュユの標準配列である配列番号１４５〜１４７のいずれかで示す塩基配列、又は配列番号１４３及び１４４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１４３で示す塩基配列と配列番号１４４で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とゴシュユの標準配列である配列番号１５８〜１６０のいずれかで示す塩基配列を比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はゴシュユの基原植物であって、前記ゴシュユ候補がゴシュユであると鑑別する。
【００７３】
（ゼンコの鑑別方法）
ゼンコ候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号１７１及び１７２、又は配列番号４０１及び４０２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、配列番号１７１及び１７２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号１７１で示す塩基配列と配列番号１７２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とゼンコの標準配列である配列番号１７３又は１７４で示す塩基配列、又は配列番号４０１及び４０２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号４０１で示す塩基配列と配列番号４０２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とゼンコの標準配列である配列番号４０３又は４０４で示す塩基配列を比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はゼンコの基原植物であって、前記ゼンコ候補がゼンコであると鑑別する。
【００７４】
（チモの鑑別方法）
チモ候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号１８６及び１８７で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、増幅産物における配列番号１８６で示す塩基配列と配列番号１８７で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とチモの標準配列である配列番号１８８で示す塩基配列とを比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はチモの基原植物であって、前記チモ候補がチモであると鑑別する。
【００７５】
（バクモンドウの鑑別方法）
バクモンドウ候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号１９９及び２００で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、増幅産物における配列番号１９９で示す塩基配列と配列番号２００で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とバクモンドウの標準配列である配列番号２０１で示す塩基配列とを比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はバクモンドウの基原植物であって、前記バクモンドウ候補がバクモンドウであると鑑別する。
【００７６】
（ビャクシの鑑別方法）
ビャクシ候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号２１３及び２１４、又は配列番号４１６及び４１７で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、配列番号２１３及び２１４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号２１３で示す塩基配列と配列番号２１４で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とビャクシの標準配列である配列番号２１５で示す塩基配列、又は配列番号４１６及び４１７で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号４１６で示す塩基配列と配列番号４１７で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とビャクシの標準配列である配列番号４１８で示す塩基配列を比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はビャクシの基原植物であって、前記ビャクシ候補がビャクシであると鑑別する。
【００７７】
（イレイセンの鑑別方法）
イレイセン候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号２２７及び２２８で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、増幅産物における配列番号２２７で示す塩基配列と配列番号２２８で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とイレイセンの標準配列である配列番号２２９〜２３１のいずれかで示す塩基配列とを比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はイレイセンの基原植物であって、前記イレイセン候補がイレイセンであると鑑別する。
【００７８】
（インチンコウの鑑別方法）
インチンコウ候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号２４１及び２４２、又は配列番号２４３及び２４４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのpetD-rpoA領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、配列番号２４１及び２４２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号２４１で示す塩基配列と配列番号２４２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とインチンコウの標準配列である配列番号２４５で示す塩基配列、又は配列番号２４３及び２４４で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号２４３で示す塩基配列と配列番号２４４で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とインチンコウの標準配列である配列番号２５３で示す塩基配列を比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はインチンコウの基原植物であって、前記インチンコウ候補がインチンコウであると鑑別する。
【００７９】
（ジコッピの鑑別方法）
ジコッピ候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号２６１及び２６２で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのtrnH-psbA領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、増幅産物における配列番号２６１で示す塩基配列と配列番号２６２で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とジコッピの標準配列である配列番号２６３又は２６４で示す塩基配列とを比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はジコッピの基原植物であって、前記ジコッピ候補がジコッピであると鑑別する。
【００８０】
（シュクシャの鑑別方法）
シュクシャ候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号２７５及び２７６で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、増幅産物における配列番号２７５で示す塩基配列と配列番号２７６で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とシュクシャの標準配列である配列番号２７７で示す塩基配列とを比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はシュクシャの基原植物であって、前記シュクシャ候補がシュクシャであると鑑別する。
【００８１】
（ニンドウの鑑別方法）
ニンドウ候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号２８４及び２８５で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのpsbA-trnH領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、増幅産物における配列番号２８４で示す塩基配列と配列番号２８５で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とニンドウの標準配列である配列番号２８６で示す塩基配列とを比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はニンドウの基原植物であって、前記ニンドウ候補がニンドウであると鑑別する。
【００８２】
（センコツの鑑別方法）
センコツ候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号２９８及び２９９で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、増幅産物における配列番号２９８で示す塩基配列と配列番号２９９で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とセンコツの標準配列である配列番号３００で示す塩基配列とを比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はセンコツの基原植物であって、前記センコツ候補がセンコツであると鑑別する。
【００８３】
（ソウハクヒの鑑別方法）
ソウハクヒ候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号３１２及び３１３で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。増幅産物における配列番号３１２で示す塩基配列と配列番号３１３で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とソウハクヒの標準配列である配列番号３１４で示す塩基配列とを比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はソウハクヒの基原植物であって、前記ソウハクヒ候補がソウハクヒであると鑑別する。
【００８４】
（キョウカツの鑑別方法）
キョウカツ候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号３２４及び３２５で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、増幅産物における配列番号３２４で示す塩基配列と配列番号３２５で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とキョウカツの標準配列である配列番号３２６又は３２７で示す塩基配列とを比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はキョウカツの基原植物であって、前記キョウカツ候補がキョウカツであると鑑別する。
【００８５】
（ビワヨウの鑑別方法）
ビワヨウ候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号３３２及び３３３、又は配列番号３３４及び３３５で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、配列番号３３２及び３３３で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号３３２で示す塩基配列と配列番号３３３で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とビワヨウの標準配列である配列番号３３６で示す塩基配列、又は配列番号３３４及び３３５で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたときの増幅産物における配列番号３３４で示す塩基配列と配列番号３３５で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とビワヨウの標準配列である配列番号３４８で示す塩基配列を比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はビワヨウの基原植物であって、前記ビワヨウ候補がビワヨウであると鑑別する。
【００８６】
（シコンの鑑別方法）
シコン候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号３６０及び３６１で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてリボソームDNAのITS領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、増幅産物における配列番号３６０で示す塩基配列と配列番号３６１で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とシコンの標準配列である配列番号３６２で示す塩基配列とを比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はシコンの基原植物であって、前記シコン候補がシコンであると鑑別する。
【００８７】
（トチュウの鑑別方法）
トチュウ候補の被検植物から核酸を抽出し、その核酸を鋳型に、配列番号３７４及び３７５で示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて葉緑体DNAのpsbA-trnH領域を増幅した後、増幅産物の塩基配列を決定する。その後、増幅産物における配列番号３７４で示す塩基配列と配列番号３７５で示す塩基配列に相補的な塩基配列とに挟まれた塩基配列とトチュウの標準配列である配列番号３７６で示す塩基配列とを比較して、両者の塩基配列が一致したときに前記被検植物はトチュウの基原植物であって、前記トチュウ候補がトチュウであると鑑別する。
【実施例】
【００８８】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００８９】
＜実施例１：ブクリョウの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、ブクリョウの基原植物は、マツホドWolfiporia cocos Ryvarden et Gilbertson (Poria cocos Wolf) (Polyporaceae)と規定されている。しかし同種には多くの種内変異が知られ、市場には日局適合種ではあるものの、塩基配列の異なる複数系統が流通する可能性がある。異なる系統では含有成分が異なる可能性があり、医薬品の品質確保のためには、これら異なる系統の混用を避けることが有効な方法と考えられる。
【００９０】
そこで、本発明者らは、ブクリョウ各系統及びその近縁菌のゲノムDNAを網羅的に調査した。その結果、核リボゾームDNA中のITS領域の配列において、主な市場流通品であるブクリョウは固有の配列を有し、同種内の別系統などと区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はブクリョウ各系統を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【００９１】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【００９２】
そこで、ブクリョウ各系統の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【００９３】
本実施例は、ブクリョウ各系統に対して、系統間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【００９４】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬サンプル（マツホドWolfiporia cocos Ryvarden et Gilbertson (Poria cocos Wolf) (Polyporaceae)の菌核）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【００９５】
同じ基原種内の各系統についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【００９６】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【００９７】
（PCR反応液１）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 19.02μL、10× EX Taq Buffer（タカラバイオ社）2.80μL、dNTP Mix（タカラバイオ社）2.24μL、EX Taq （タカラバイオ社）0.14μL、フォワードプライマー：007-5F（Bukuryou-f1）(GAGCGTCGCGGAACCCTCAAC ;配列番号１; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：007-5R（Bukuryou-r3）(CAATCCGGTCCGGGCTAATG ;配列番号２;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【００９８】
（PCRサイクル条件１）
PCR反応液１を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×30sec, 55℃×30sec, 72℃×1min)×40サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【００９９】
（PCR反応液２）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 17.02μL、10× gene Taq Buffer（ニッポンジーン社）2.80μL、dNTP Mix （ニッポンジーン社）2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq （ニッポンジーン社）0.14μL、フォワードプライマー：007-6F（Bukuryou-f2）(CTCAACTCCGTCCGCCTTTG;配列番号３; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：007-6R（Bukuryou-r3）(CAATCCGGTCCGGGCTAATG ;配列番号４;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０１００】
（PCRサイクル条件２）
PCR反応液２を0.2mlマイクロチューブに入れ、Stepdown法の条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０１０１】
※Stepdown法：94℃, 4 min、(95℃, 30 sec; 70℃, 15 sec; 72℃, 15 sec) × 3 サイクル、(95℃, 30 sec; 66℃, 15 sec; 72℃, 15 sec) × 3 サイクル、(95℃, 30 sec; 62℃, 15 sec; 72℃, 15 sec) × 3 サイクル、(95℃, 30 sec; 58℃, 15 sec; 72℃, 15 sec) × 3 サイクル、(95℃, 30 sec; 54℃, 15 sec; 72℃, 15 sec) × 3 サイクル、(95℃, 30 sec; 48℃, 1.5 min; 72℃, 2.5 min) × 20 サイクル、及び(72℃, 7 min.) × 1 サイクル。
【０１０２】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
PCR後に、ゲル電気泳動法により目的とする特定の核酸領域の増幅産物を確認し、それを単離した。具体的にはPCR後の反応液に2μLのBlue Juiceを添加してサンプル溶液を調製した。total 2% NuSieve+SeaKEM （タカラバイオ社）＋1×TAEのゲルを、Mupid EX-U（ミューピッド社）に充填した1×TAEバッファ中に浸漬し、well中にサンプル溶液を積載した後、100V×約30分間の条件で電気泳動を行った。目標PCR産物のLoading量は、15μL LED 500nmトランスイルミネーターLB-16BG（日本ジェネティクス社）＋ゲル撮影装置Printgraph AE-6931 FXCF（ATTO社）で確認し、画像撮影を行った。
【０１０３】
続いて、目的の増幅産物から予想されるサイズのバンドを使い捨てメスで切り出し、illustra GFX PCR Purification Kit (GEヘルスケア・ジャパン社)を用いて抽出した後、同キット中のType4 buffer 20μLで溶出した。
【０１０４】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
サイクルシーケンス反応の最適化のためにNanodrop 2000C（バイオメディカルサイエンス社）を用いて増幅産物の濃度測定を行い、適正濃度になるようにTEで希釈した。
【０１０５】
BigDyeTerminator v.3.1溶液（Thermo Fisher Scientific社）0.8μL、5× Buffer（Thermo Fisher Scientific社）0.4μL、D.W. 0.8μL、核酸増幅時に使用したプライマー（1pmol/μL）1μL、精製増幅産物1μLを混合し、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）＋200μLを96wellプレートでBigDye Terminator v.3.1マニュアルで指定された条件でサイクルシーケンシングを行った。
【０１０６】
反応後、BigDye Terminator v.3.1マニュアル中で指定されたEDTAエタノール沈殿法により、精製増幅産物を得た。
【０１０７】
ABI PRISM（登録商標）3500xL Genetic Analyzer（Thermo Fisher Scientific社）で、50cmキャピラリー、POP7を用いて同機器のマニュアルに従い、増幅産物の塩基配列を決定した。
【０１０８】
その後、VerctorNTI 9.0 for Windows(Thermo Fisher Scientific社)中のContigExpressにて、PCR反応液１及びPCR反応液２のそれぞれの各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０１０９】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるブクリョウ及び他系統茯苓の相同配列と比較した(表３及び表４並びに図１及び図２）。
【０１１０】
【表３】
2020103279.tif 000005
【０１１１】
【表４】
2020103279.tif 000006
【０１１２】
３．結果
図１、図２で得られた核リボゾームDNA中のITS領域はそれぞれPrimer set 007-5F & 007-5RとPrimer set 007-6F & 007-6RでPCR増幅し、塩基配列決定した部分領域の配列である。フラグメントの長さはそれぞれ153bpと138bpであり(Primerを含む長さ)、通常Primer set 007-5F & 007-5Rを用いてフラグメントの長さが153bpの部分領域を決定できれば、Primer set 007-6F & 007-6Rで試験する必要がない。なお、断片化がひどいサンプルについては、Primer set 007-5F & 007-5RにてPCR増幅が成功しない場合は、より短いフラグメントにも対応可能なPrimer set 007-6F & 007-6Rを用いることによって、138bp(Primerを含む長さ)の塩基配列決定が可能となる。これら２組のPrimer setでは、共通して6サイトの鑑別サイトを示した。
【０１１３】
図１では、まず、27位、32位、83位でCおよび89位でTとなるのはマツホドWolfiporia cocos Ryvarden et Gilbertson (Poria cocos Wolf) (Polyporaceae)の主な系統であり、サンプルはこの系統と一致する。56位、59位では、個々のサイトではマツホドWolfiporia cocos Ryvarden et Gilbertson (Poria cocos Wolf) (Polyporaceae)の主要な系統と同種内の他系統とは区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０１１４】
マツホドWolfiporia cocos Ryvarden et Gilbertson (Poria cocos Wolf) (Polyporaceae)の主要な系統と同種内の他系統を区別するためには、27位、32位、83位もしくは89位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計６サイトの評価をすることが望ましい。
【０１１５】
また、図２では図１と同様、まず、13位、18位、69位でCおよび75位でTとなるのはマツホドWolfiporia cocos Ryvarden et Gilbertson (Poria cocos Wolf) (Polyporaceae)の主な系統であり、サンプルはこの系統と一致する。42位、45位では、個々のサイトではマツホドWolfiporia cocos Ryvarden et Gilbertson (Poria cocos Wolf) (Polyporaceae)の主要な系統と同種内の他系統とは区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０１１６】
マツホドWolfiporia cocos Ryvarden et Gilbertson (Poria cocos Wolf) (Polyporaceae)の主要な系統と同種内の他系統を区別するためには、13位、18位、69位もしくは75位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計６サイトの評価をすることが望ましい。
【０１１７】
＜実施例２：ジオウの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、ジオウの基原植物は、アカヤジオウRehmannia glutinosa Liboschitz var. purpurea Makino又はRehmannia glutinosa Liboschitz (Scrophulariaceae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるRehmannia henryiなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０１１８】
そこで、本発明者らは，ジオウ及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、核リボゾームDNA中のITS領域の配列において、ジオウは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はジオウと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０１１９】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０１２０】
そこで、ジオウと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０１２１】
本実施例は、ジオウ及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０１２２】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（アカヤジオウRehmannia glutinosa Liboschitz var. purpurea Makino又はRehmannia glutinosa Liboschitz (Scrophulariaceae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０１２３】
近縁他種についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０１２４】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０１２５】
（PCR反応液）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 17.02μL、10× gene Taq Buffer（ニッポンジーン社）2.80μL、dNTP Mix （ニッポンジーン社）2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq （ニッポンジーン社）0.14μL、フォワードプライマー：011-1F（Jiou-ITS1-f1）(CAACCTCTCGCCGCGTTCCC;配列番号１７; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：011-1R（Jiou-ITS1-r3）(CGAGAGACATCCTTTCCCCCC;配列番号１８;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０１２６】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、Stepdown法※の条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
※Stepdown法は、実施例１のPCRサイクル条件２と同様である。
【０１２７】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０１２８】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０１２９】
その後、PCR反応液の各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０１３０】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるジオウ及び近縁他種の相同配列と比較した（表５及び図３）。
【０１３１】
【表５】
2020103279.tif 000007
【０１３２】
３．結果
図３で得られた核リボゾームDNA中のITS領域を示し、5サイトの鑑別サイトを示した。8位、17位、75位、92位、97位では、個々のサイトではアカヤジオウRehmannia glutinosa Liboschitz var. purpurea Makino又はRehmannia glutinosa Liboschitz (Scrophulariaceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０１３３】
＜実施例３：エンゴサクの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、エンゴサクの基原植物は、Corydalis turtschaninovii Besser forma yanhusuo Y. H. Chou et C. C. Hsu (Papaveraceae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるCorydalis ambiguaなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０１３４】
そこで、本発明者らは、エンゴサク及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、核リボゾームDNA中のITS領域の配列において、エンゴサクは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はエンゴサクと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０１３５】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０１３６】
そこで、エンゴサクと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０１３７】
本実施例は、エンゴサク及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０１３８】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（Corydalis turtschaninovii Besser forma yanhusuo Y. H. Chou et C. C. Hsu (Papaveraceae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０１３９】
近縁他種のうち、Corydalis boweri、Corydalis saxicola、Corydalis wilsonii、Corydalis adunca、Corydalis ambigua、Corydalis nobilis、Corydalis hamataについてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０１４０】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０１４１】
（PCR反応液）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 19.02μL、10× EX Taq Buffer（タカラバイオ社）2.80μL、dNTP Mix （タカラバイオ社）2.24μL、EX Taq （タカラバイオ社）0.14μL、フォワードプライマー：019-1F（019-T1F）(ACASAGGCCCCGGGAGGCCGRCG;配列番号２６; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：019-1R（019-T1R）(TTCAGCGGGTGGTCCCGCCTGAC;配列番号２７;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０１４２】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×30sec, 55℃×30sec, 72℃×1min)×35サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０１４３】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０１４４】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０１４５】
その後、PCR反応液の各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０１４６】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるエンゴサク及び近縁他種の相同配列と比較した（表６及び図４）。
【０１４７】
【表６】
2020103279.tif 000008
【０１４８】
３．結果
図４で得られた核リボゾームDNA中のITS領域を示し、10サイトの鑑別サイトを示した。まず、68位でAとなるのはCorydalis turtschaninovii Besser forma yanhusuo Y. H. Chou et C. C. Hsu (Papaveraceae)のみであり、サンプルはCorydalis turtschaninovii Besser forma yanhusuo Y. H. Chou et C. C. Hsu (Papaveraceae)と一致する。35位、47位、62位、63位、93位、99位、104位、105位、122位では、個々のサイトではCorydalis turtschaninovii Besser forma yanhusuo Y. H. Chou et C. C. Hsu (Papaveraceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０１４９】
Corydalis turtschaninovii Besser forma yanhusuo Y. H. Chou et C. C. Hsu (Papaveraceae)と近縁他種を区別するためには、68位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計10サイトの評価をすることが望ましい。
【０１５０】
＜実施例４：カッコンの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、カッコンの基原植物は、クズPueraria lobata Ohwi (Leguminosae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるPueraria montana var. thomsoniiなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０１５１】
そこで、本発明者らは、カッコン及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、核リボゾームDNA中のITS領域の配列において、カッコンは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はカッコンと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０１５２】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０１５３】
そこで、カッコンと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０１５４】
本実施例は、カッコン及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０１５５】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（クズPueraria lobata Ohwi (Leguminosae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０１５６】
近縁他種についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０１５７】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０１５８】
（PCR反応液１）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 17.02μL、10× gene Taq Buffer（ニッポンジーン社）2.80μL、dNTP Mix （ニッポンジーン社）2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq （ニッポンジーン社）0.14μL、フォワードプライマー：021-1F（Kakkon-ITS1-f2） (CGGAAGGATCATTGTCGATGC;配列番号３７; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：021-1R（kakkon-ITS1-r1）(GTGTTTGTTGGGGAAGGAGG;配列番号３８;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０１５９】
（PCR反応液２）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 17.02μL、10× gene Taq Buffer（ニッポンジーン社）2.80μL、dNTP Mix （ニッポンジーン社）2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq （ニッポンジーン社）0.14μL、フォワードプライマー：021-2F（Kakkon-ITS2-f1）(GAACGCAAGTTGCGCCCGAAG;配列番号３９; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：021-2R（kakkon-ITS2-r1）(CGAACTCGATTTTCAACCAAC;配列番号４０;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０１６０】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、Stepdown法※の条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
※Stepdown法は、実施例１のPCRサイクル条件２と同様である。
【０１６１】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０１６２】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０１６３】
その後、PCR反応液１及びPCR反応液２のそれぞれの各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０１６４】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるカッコン及び近縁他種の相同配列と比較した（表７及び表８並びに図５及び図６）。
【０１６５】
【表７】
2020103279.tif 000009
【０１６６】
【表８】
2020103279.tif 000010
【０１６７】
３．結果
図５で得られた核リボゾームDNA中のITS1領域を示し、6サイトの鑑別サイトを示した。まず、70位でCとなるのはクズPueraria lobata Ohwi (Leguminosae)のみであり、サンプルはクズPueraria lobata Ohwi (Leguminosae)と一致する。19位、58位、95位、142位、158位では、個々のサイトではクズPueraria lobata Ohwi (Leguminosae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０１６８】
クズPueraria lobata Ohwi (Leguminosae)と近縁他種を区別するためには、70位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計6サイトの評価をすることが望ましい。
【０１６９】
また、図６で得られた核リボゾームDNA中のITS2領域を示し、7サイトの鑑別サイトを示した。まず、60位または89位でGとなるのはクズPueraria lobata Ohwi (Leguminosae)のみであり、サンプルはクズPueraria lobata Ohwi (Leguminosae)と一致する。11位、50位、77位、119位、127位では、個々のサイトではクズPueraria lobata Ohwi (Leguminosae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０１７０】
クズPueraria lobata Ohwi (Leguminosae)と近縁他種を区別するためには、60位または89位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計7サイトの評価をすることが望ましい。
【０１７１】
＜実施例５：ボウフウの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、ボウフウの基原植物は、Saposhnikovia divaricata Schischkin (Umbelliferae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるGlehnia littoralisなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０１７２】
そこで、本発明者らは、ボウフウ及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、核リボゾームDNA中のITS領域の配列において、ボウフウは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はボウフウと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０１７３】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０１７４】
そこで、ボウフウと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０１７５】
本実施例は、ボウフウ及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０１７６】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（Saposhnikovia divaricata Schischkin (Umbelliferae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０１７７】
近縁他種についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０１７８】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０１７９】
（PCR反応液）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 19.02μL、10× EX Taq Buffer（タカラバイオ社）2.80μL、dNTP Mix （タカラバイオ社）2.24μL、EX Taq （タカラバイオ社）0.14μL、フォワードプライマー：031-1F（031-T1F）(GTGAACCTGCGGAAGGATCATTG;配列番号５１; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：031-1R（031-T2R）(GAGATATCCGTTGTCGAGAGTCG;配列番号５２;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０１８０】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×30sec, 55℃×30sec, 72℃×1min)×35サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０１８１】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０１８２】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０１８３】
その後、PCR反応液の各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０１８４】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるボウフウ及び近縁他種の相同配列と比較した（表９及び図７）。
【０１８５】
【表９】
2020103279.tif 000011
2020103279.tif 000012
【０１８６】
３．結果
図７で得られた核リボゾームDNA中のITS領域を示し、20サイトの鑑別サイトを示した。まず、14位、85位でC、123位、210位でT、もしくは164位でAとなるのはSaposhnikovia divaricata Schischkin (Umbelliferae)のみであり，サンプルはSaposhnikovia divaricata Schischkin (Umbelliferae)と一致する。6位、19位、38位、46位、51位、55位、65位、78位、88位、101位、105位、117位、156位、179位、198位では、個々のサイトではSaposhnikovia divaricata Schischkin (Umbelliferae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０１８７】
Saposhnikovia divaricata Schischkin (Umbelliferae)と近縁他種を区別するためには、14位、85位、123位、210位、もしくは164位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計20サイトの評価をすることが望ましい。
【０１８８】
＜実施例６：オンジの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において，オンジの基原植物は、イトヒメハギPolygala tenuifolia Willdenow (Polygalaceae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるPolygala sibiricaなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０１８９】
そこで、本発明者らは、オンジ及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、葉緑体DNA中のpsbA-trnH領域の配列において、オンジは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はオンジと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０１９０】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０１９１】
そこで、オンジと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０１９２】
本実施例は、オンジ及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０１９３】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（イトヒメハギPolygala tenuifolia Willdenow (Polygalaceae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０１９４】
近縁他種についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０１９５】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０１９６】
（PCR反応液）葉緑体DNA中のpsbA-trnH領域増幅用
D.W. 17.02μL、10× gene Taq Buffer（ニッポンジーン社）2.80μL、dNTP Mix （ニッポンジーン社）2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq （ニッポンジーン社）0.14μL、フォワードプライマー：033-2F（onji-psbA-trnH-f1）(CCTAGCTGTTGTAGAAGCTC;配列番号６５; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：033-2R（onji-psbA-trnH-r1）(CCAATTCTTTTTTATTATGAG;配列番号６６;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０１９７】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×30sec, 48℃×30sec, 72℃×1min)×35サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０１９８】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０１９９】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０２００】
その後、PCR反応液の各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０２０１】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるオンジ及び近縁他種の相同配列と比較した（表１０及び図８）。
【０２０２】
【表１０】
2020103279.tif 000013
【０２０３】
３．結果
図８で得られた葉緑体DNA中のpsbA-trnH領域を示し、6サイトの鑑別サイトを示した。まず、159位で１塩基の欠失となるのはイトヒメハギPolygala tenuifolia Willdenow (Polygalaceae)のみであり、サンプルはイトヒメハギPolygala tenuifolia Willdenow (Polygalaceae)と一致する。また、187位〜204位の連続18塩基の欠失となるのはイトヒメハギPolygala tenuifolia Willdenow (Polygalaceae)のみであり、サンプルはイトヒメハギPolygala tenuifolia Willdenow (Polygalaceae)と一致する。23位、83位、127位、144位では、個々のサイトではイトヒメハギPolygala tenuifolia Willdenow (Polygalaceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０２０４】
イトヒメハギPolygala tenuifolia Willdenow (Polygalaceae)と近縁他種を区別するためには、159位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計6サイトの評価をすることが望ましい。
【０２０５】
＜実施例７：ハッカの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、ハッカの基原植物は、ハッカMentha arvensis Linne var. piperascens Malinvaud (Labiatae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるMentha spicataなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０２０６】
そこで、本発明者らは、ハッカ及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、核リボゾームDNA中のITS領域の配列において、ハッカは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はハッカと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０２０７】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０２０８】
そこで、ハッカと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０２０９】
本実施例は、ハッカ及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０２１０】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（ハッカMentha arvensis Linne var. piperascens Malinvaud (Labiatae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０２１１】
近縁他種についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０２１２】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０２１３】
（PCR反応液）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 17.02μL、10× gene Taq Buffer（ニッポンジーン社）2.80μL、dNTP Mix （ニッポンジーン社）2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq （ニッポンジーン社）0.14μL、フォワードプライマー：036-1F（ITS3）＊(GCATCGATGAAGAACGCAGC;配列番号７３;10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：036-1R（Hakka_ITS-R1）(GATTGAGATGTTCAACCACCAC;配列番号７４;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０２１４】
＊ITS3
White et al. 1990.
White T. J., Bruns T., Lee S. and Taylor J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis M. A., Gelfand D. H., Sninsky J. J. and White T. J. (eds.), PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications. pp. 315-322. Academic Press, New York.
【０２１５】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×30sec, 48℃×30sec, 72℃×1min)×35サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０２１６】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０２１７】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０２１８】
その後、PCR反応液の各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０２１９】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるハッカ及び近縁他種の相同配列と比較した（表１１及び図９）。
【０２２０】
【表１１】
2020103279.tif 000014
2020103279.tif 000015
【０２２１】
３．結果
図９で得られた核リボゾームDNA中のITS領域を示し、11サイトの鑑別サイトを示した。まず、93位でY、139位でY、140位でM、148位でR、161位でS、もしくは184位でYとなるのはハッカMentha arvensis Linne var. piperascens Malinvaud (Labiatae)のみであり，サンプルはハッカMentha arvensis Linne var. piperascens Malinvaud (Labiatae)と一致する。77位、83位、136位、169位、216位では、個々のサイトではハッカMentha arvensis Linne var. piperascens Malinvaud (Labiatae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０２２２】
ハッカMentha arvensis Linne var. piperascens Malinvaud (Labiatae)と近縁他種を区別するためには、93位、139位、140位、148位、161位、もしくは184位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計11サイトの評価をすることが望ましい。
【０２２３】
＜実施例８：マオウの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、マオウの基原植物は、Ephedra sinica Stapf、Ephedra intermedia Schrenk et C. A. Meyer又はEphedra equisetina Bunge (Ephedraceae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるEphedra gerardianaなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０２２４】
そこで、本発明者らは、マオウ及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、葉緑体DNA中のrbcL領域の配列において、マオウは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はマオウと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０２２５】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０２２６】
そこで、マオウと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０２２７】
本実施例は、マオウ及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０２２８】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（Ephedra sinica Stapf、Ephedra intermedia Schrenk et C. A. Meyer又はEphedra equisetina Bunge (Ephedraceae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０２２９】
近縁他種についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０２３０】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０２３１】
（PCR反応液１）葉緑体DNA中のrbcL領域増幅用
D.W. 19.02μL、10× EX Taq Buffer（タカラバイオ社）2.80μL、dNTP Mix （タカラバイオ社）2.24μL、EX Taq （タカラバイオ社）0.14μL、フォワードプライマー：037-6F（rbcLEpF0）(GCGTAGGATTTAAAGCTGGTG;配列番号８５; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：037-6R（037-6R）(ATTGTCTTCTCCCGGAACAGG;配列番号８６;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０２３２】
（PCRサイクル条件１）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×30sec, 50℃×30sec, 72℃×1min)×35サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０２３３】
（PCR反応液２）葉緑体DNA中のrbcL領域増幅用
D.W. 19.02μL、10× EX Taq Buffer（タカラバイオ社）2.80μL、dNTP Mix （タカラバイオ社）2.24μL、EX Taq （タカラバイオ社）0.14μL、フォワードプライマー：037-4F（rbcLEpF1）(CTGGTGTTAAAGATTATAGA;配列番号３８５; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：037-4R（rbcLEpR196）(AAGACCATCAGTCCAAACTG;配列番号３８６;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０２３４】
（PCRサイクル条件２）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×1min, 45℃×1min, 72℃×2min)×45サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０２３５】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０２３６】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０２３７】
その後、PCR反応液の各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０２３８】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるマオウ及び近縁他種の相同配列と比較した（表１２並びに図１０及び図３４）。
【０２３９】
【表１２】
2020103279.tif 000016
2020103279.tif 000017
2020103279.tif 000018
2020103279.tif 000019
【０２４０】
３．結果
反応液１、２の違いは増幅断片長の違いであり、一般的に、短いほど増幅成功率が高くなる一方、得られる鑑別サイトの数が少なくなり、オートシーケンサーでの配列決定が困難となる。本方法では反応液１での配列決定を試み、失敗した場合に反応液２を行うといった２段階の試験を設定することにより、コスト低減とサンプルのDNA品質の差への対応を可能とした。
【０２４１】
図１０で得られた葉緑体DNA中のrbcL領域を示し、5サイトの鑑別サイトを示した。48位、55位、89位、99位、108位では、個々のサイトではEphedra sinica Stapf、Ephedra intermedia Schrenk et C. A. Meyer又はEphedra equisetina Bunge (Ephedraceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０２４２】
PCR反応液１で増幅・配列が決定できた場合は上記図１０の情報により、適合種と近縁他種を区別するための必要要件を満たす。
【０２４３】
PCR反応液１で増幅・配列が決定できない場合は、PCR反応液２で増幅・配列決定を行うことで適合種と近縁他種を区別できる。
【０２４４】
図３４で得られた葉緑体DNA中のrbcL領域を示し、5サイトの鑑別サイトを示した。34位、41位、75位、85位、94位では、個々のサイトではEphedra sinica Stapf、Ephedra intermedia Schrenk et C. A. Meyer又はEphedra equisetina Bunge (Ephedraceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０２４５】
＜実施例９：タイソウ／サンソウニンの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、タイソウ・サンソウニンの基原植物は、タイソウ：ナツメZiziphus jujuba Miller var. inermis Rehder (Rhamnaceae)、サンソウニン：サネブトナツメZiziphus jujuba Miller var. spinosa Hu ex H. F. Chou (Rhamnaceae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるZiziphus maireiなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０２４６】
そこで、本発明者らは、タイソウ・サンソウニン及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、核リボゾームDNA中のITS領域の配列において、タイソウ・サンソウニンは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はタイソウ・サンソウニンと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０２４７】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０２４８】
そこで、タイソウ・サンソウニンと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０２４９】
本実施例は、タイソウ・サンソウニン及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０２５０】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（タイソウ：ナツメZiziphus jujuba Miller var. inermis Rehder (Rhamnaceae)、サンソウニン：サネブトナツメZiziphus jujuba Miller var. spinosa Hu ex H. F. Chou (Rhamnaceae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０２５１】
近縁他種のうち、Ziziphus calophylla、Ziziphus mucronata、Ziziphus horsfieldii、Ziziphus spina-christi、Ziziphus glabrata、Ziziphus brunoniana、Ziziphus mairei、Ziziphus xiangchengensis、Ziziphus mauritiana、Ziziphus oenopliaについてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０２５２】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０２５３】
（PCR反応液１）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 17.02μL、10× gene Taq Buffer（ニッポンジーン社）2.80μL、dNTP Mix （ニッポンジーン社）2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq （ニッポンジーン社）0.14μL、フォワードプライマー：039-1F（048-T2F）(GATGCGCGGTTGCAGCCTTC;配列番号１０１; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：039-1R（048-T3R ）(GATATCCGTTGCCGAGAGTCG;配列番号１０２;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０２５４】
（PCR反応液２）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 17.02μL、10× gene Taq Buffer（ニッポンジーン社）2.80μL、dNTP Mix （ニッポンジーン社）2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq （ニッポンジーン社）0.14μL、フォワードプライマー：039-2F（048-T3F）(CTTCCCGGCCGCACAAACG;配列番号１０３; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：039-2R（024-1R＝Ougon-ITS2）(GAGAGCCGAGATATCCGTTGC;配列番号１０４;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０２５５】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、Stepdown法※の条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
※Stepdown法は、実施例１のPCRサイクル条件２と同様である。
【０２５６】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０２５７】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０２５８】
その後、PCR反応液１及びPCR反応液２のそれぞれの各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０２５９】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるタイソウ・サンソウニン及び近縁他種の相同配列と比較した（表１３及び表１４並びに図１１及び図１２）。
【０２６０】
【表１３】
2020103279.tif 000020
【０２６１】
【表１４】
2020103279.tif 000021
【０２６２】
３．結果
図１１、図１２で得られた核リボゾームDNA中のITS領域はそれぞれPrimer set 039-1F & 039-1R（Primer set 048-1F & 048-1R）とPrimer set 039-2F & 039-2R（Primer set 048-2F & 048-2R）でPCR増幅し、塩基配列決定した部分領域の配列である。フラグメントの長さはそれぞれ約170bpと約160bpであり(Primerを含む長さ)、通常Primer set 039-1F & 039-1R（048-1F & 048-1R）を用いてフラグメントの長さが約170bpの部分領域を決定できれば、Primer set 039-2F & 039-2R（048-2F & 048-2R）で試験する必要がない。なお、断片化がひどいサンプルについては、Primer set 039-1F & 039-1RにてPCR増幅が成功しない場合は、より短いフラグメントにも対応可能なPrimer set 039-2F & 039-2Rを用いることによって、約160bp (Primerを含む長さ)の塩基配列決定が可能となる。これら２組のPrimer setでは，決定できる主な鑑別サイトが共通しているが、比較対象である近縁他種の種類によって、鑑別サイトは変わることがあり、図１１と図１２では各々の比較対象との鑑別サイトを示した。
【０２６３】
図１１では、Primer set 039-1F & 039-1R（Primer set 048-1F & 048-1R）で得られた核リボゾームDNA中のITS領域を示し、9サイトの鑑別サイトを示した。まず、１２１位でAとなるのはZiziphus jujuba、つまり、タイソウ：ナツメZiziphus jujuba Miller var. inermis Rehder (Rhamnaceae)、サンソウニン：サネブトナツメZiziphus jujuba Miller var. spinosa Hu ex H. F. Chou (Rhamnaceae)のみであり、サンプルはタイソウ：ナツメZiziphus jujuba Miller var. inermis Rehder (Rhamnaceae)、サンソウニン：サネブトナツメZiziphus jujuba Miller var. spinosa Hu ex H. F. Chou (Rhamnaceae)と一致する。１８位、７０位、７６位、８１位、９２位、１１３位、１１８位、１２２位では、個々のサイトではタイソウ：ナツメZiziphus jujuba Miller var. inermis Rehder (Rhamnaceae)、サンソウニン：サネブトナツメZiziphus jujuba Miller var. spinosa Hu ex H. F. Chou (Rhamnaceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０２６４】
タイソウ：ナツメZiziphus jujuba Miller var. inermis Rehder (Rhamnaceae)、サンソウニン：サネブトナツメZiziphus jujuba Miller var. spinosa Hu ex H. F. Chou (Rhamnaceae)と近縁他種を区別するためには、１２１位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計９サイトの評価をすることが望ましい。
【０２６５】
図１２では、Primer set 039-2F & 039-2R（Primer set 048-2F & 048-2R）で得られた核リボゾームDNA中のITS領域を示し、9サイトの鑑別サイトを示した。まず、１０４位でAとなるのはZiziphus jujuba、つまり、タイソウ：ナツメZiziphus jujuba Miller var. inermis Rehder (Rhamnaceae)、サンソウニン：サネブトナツメZiziphus jujuba Miller var. spinosa Hu ex H. F. Chou (Rhamnaceae)のみであり、サンプルはタイソウ：ナツメZiziphus jujuba Miller var. inermis Rehder (Rhamnaceae)、サンソウニン：サネブトナツメZiziphus jujuba Miller var. spinosa Hu ex H. F. Chou (Rhamnaceae)と一致する。３２位、５４位、６０位、６５位、９６位、１０１位、１０５位、１０６位では、個々のサイトではタイソウ：ナツメZiziphus jujuba Miller var. inermis Rehder (Rhamnaceae)、サンソウニン：サネブトナツメZiziphus jujuba Miller var. spinosa Hu ex H. F. Chou (Rhamnaceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０２６６】
タイソウ：ナツメZiziphus jujuba Miller var. inermis Rehder (Rhamnaceae)、サンソウニン：サネブトナツメZiziphus jujuba Miller var. spinosa Hu ex H. F. Chou (Rhamnaceae)と近縁他種を区別するためには、１０４位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計９サイトの評価をすることが望ましい。
【０２６７】
＜実施例１０：カロコン／カロニンの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、カロコン・カロニンの基原植物は、共にTrichosanthes kirilowii Maximowicz、キカラスウリTrichosanthes kirilowii Maximowicz var. japonica Kitamura又はオオカラスウリTrichosanthes bracteata Voigt (Cucurbitaceae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるTrichosanthes cucmeroidesなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０２６８】
そこで、本発明者らは，カロコン・カロニン及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、葉緑体DNA中のrpl16 intron部分領域の配列において、カロコン・カロニンは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はカロコン・カロニンと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０２６９】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０２７０】
そこで、カロコン・カロニンと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０２７１】
本実施例は、カロコン・カロニン及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０２７２】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（Trichosanthes kirilowii Maximowicz、キカラスウリTrichosanthes kirilowii Maximowicz var. japonica Kitamura又はオオカラスウリTrichosanthes bracteata Voigt (Cucurbitaceae)）およびこれらの近縁植物の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
近縁他種については収集した押葉標本の一部より抽出し相同配列を得た。
【０２７３】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０２７４】
（PCR反応液１）葉緑体DNA中のrpl16 intron部分領域増幅用
D.W. 19.02μL、10× EX Taq Buffer（タカラバイオ社）2.80μL、dNTP Mix （タカラバイオ社）2.24μL、EX Taq （タカラバイオ社）0.14μL、フォワードプライマー：063-1F（rpl16/F）(GTTTCTTCTCATCCAGCTCC; Nishizawa & Watano 2000;配列番号１２５；10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：063-1R（Karokon-rpl16-R1）(CTATAAAGAGTTTAGTTTTCTATC;配列番号１２６;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０２７５】
（PCR反応液２）葉緑体DNA中のrpl16 intron部分領域増幅用
D.W. 19.02μL、10× EX Taq Buffer（タカラバイオ社）2.80μL、dNTP Mix （タカラバイオ社）2.24μL、EX Taq （タカラバイオ社）0.14μL、フォワードプライマー：063-2F（Karokon-rpl16-F2）(GATAGAAAACTAAACTCTTTATAG;配列番号１２７; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：063-2R（rpl16/R）(GAAAGAGTCAATATTCGCCC; Nishizawa & Watano 2000;配列番号１２８；10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０２７６】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×30sec, 48℃×30sec, 72℃×1min)×35サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０２７７】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０２７８】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０２７９】
その後、PCR反応液１及びPCR反応液２のそれぞれの各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０２８０】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるカロコン・カロニン及び近縁他種の相同配列と比較した（表１５及び表１６並びに図１３及び図１４）。
【０２８１】
【表１５】
2020103279.tif 000022
【０２８２】
【表１６】
2020103279.tif 000023
【０２８３】
３．結果
図１３、図１４で得られた葉緑体DNA中のrpl16 intron部分領域はそれぞれPrimer set 063-1F & 063-1R (Primer set 045-1F & 045-1R)とPrimer set 063-2F & 063-2R (Primer set 045-2F & 045-2R)でPCR増幅し、塩基配列決定した領域の配列である。
【０２８４】
図１３ではPrimer set 063-1F & 063-1R (Primer set 045-1F & 045-1R)で得られた葉緑体DNA中のrpl16 intron部分領域を示し、5サイトの鑑別サイトを示した。まず、58位でCとなるのはTrichosanthes kirilowii Maximowicz、キカラスウリTrichosanthes kirilowii Maximowicz var. japonica Kitamura又はオオカラスウリTrichosanthes bracteata Voigt (Cucurbitaceae)と近縁他種のTrichosanthes rosthorniiであり、サンプルはこれらの種と一致する。この領域のみではTrichosanthes kirilowii Maximowiczと近縁他種のTrichosanthes rosthorniiを区別することはできない。
【０２８５】
図１４ではPrimer set 063-2F & 063-2R (Primer set 045-2F & 045-2R)で得られた葉緑体DNA中のrpl16 intron部分領域を示し、4サイトの鑑別サイトを示した。54位、155位、167位、174位では、個々のサイトではTrichosanthes kirilowii Maximowicz、キカラスウリTrichosanthes kirilowii Maximowicz var. japonica Kitamura又はオオカラスウリTrichosanthes bracteata Voigt (Cucurbitaceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０２８６】
Trichosanthes kirilowii Maximowicz、キカラスウリTrichosanthes kirilowii Maximowicz var. japonica Kitamura又はオオカラスウリTrichosanthes bracteata Voigt (Cucurbitaceae)と近縁他種を区別するためには、Primer set 063-2F & 063-2R (Primer set 045-2F & 045-2R)で得られた部分領域（図１４）のみを評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためにはPrimer set 063-1F & 063-1R (Primer set 045-1F & 045-1R)で得られた部分領域（図１３）も評価することが望ましい。
【０２８７】
＜実施例１１：ゴシュユの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、ゴシュユの基原植物は、ゴシュユEuodia ruticarpa Hooker filius et Thomson (Evodia rutaecarpa Bentham)、Euodia officinalis Dode (Evodia officinalis Dode)又はEuodia bodinieri Dode (Evodia bodinieri Dode) (Rutaceae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるTetradium danielliiなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０２８８】
そこで、本発明者らは、ゴシュユ及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、核リボゾームDNA中のITS領域の配列において、ゴシュユは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はゴシュユと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０２８９】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０２９０】
そこで、ゴシュユと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０２９１】
本実施例は、ゴシュユ及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０２９２】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（ゴシュユEuodia ruticarpa  Hooker filius et Thomson (Evodia rutaecarpa Bentham)、Euodia officinalis Dode (Evodia officinalis Dode)又はEuodia bodinieri Dode (Evodia bodinieri Dode) (Rutaceae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０２９３】
近縁他種についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０２９４】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０２９５】
（PCR反応液１）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 17.02μL、10× gene Taq Buffer（ニッポンジーン社）2.80μL、dNTP Mix （ニッポンジーン社）2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq （ニッポンジーン社）0.14μL、フォワードプライマー：042-1F（Goshuyu-ITS1-f1） (CCTGCGGAAGGATCATTGTCG;配列番号１４１; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：042-1R（Goshuyu-ITS1-r1）(GTGAAAGAAGGCGCCGCATCC;配列番号１４２;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０２９６】
（PCR反応液２）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 17.02μL、10× gene Taq Buffer（ニッポンジーン社）2.80μL、dNTP Mix （ニッポンジーン社）2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq （ニッポンジーン社）0.14μL、フォワードプライマー：042-2F（Goshuyu-ITS1-f1）（＝042-1F） (CCTGCGGAAGGATCATTGTCG;配列番号１４３; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：042-2R（Goshuyu-ITS1-r2 ）(GGGAGCGTGCTCTCTCGTTAG;配列番号１４４;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０２９７】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、Stepdown法※の条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
※Stepdown法は、実施例１のPCRサイクル条件２と同様である。
【０２９８】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０２９９】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０３００】
その後、PCR反応液１及びPCR反応液２のそれぞれの各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０３０１】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるゴシュユ及び近縁他種の相同配列と比較した（表１７及び表１８並びに図１５及び図１６）。
【０３０２】
【表１７】
2020103279.tif 000024
2020103279.tif 000025
【０３０３】
【表１８】
2020103279.tif 000026
2020103279.tif 000027
【０３０４】
３．結果
反応液１、２の違いは増幅断片長の違いであり、一般的に、短いほど増幅成功率が高くなる一方、得られる鑑別サイトの数が少なくなり、オートシーケンサーでの配列決定が困難となる。本方法では反応液１での配列決定を試み、失敗した場合に反応液２を行うといった２段階の試験を設定することにより、コスト低減とサンプルのDNA品質の差への対応を可能とした。
【０３０５】
図１５で得られた核リボゾームDNA中のITS領域を示し、14サイトの鑑別サイトを示した。まず、127位もしくは193位でTとなるのはゴシュユEuodia ruticarpa Hooker filius et Thomson (Evodia rutaecarpa Bentham)、Euodia officinalis Dode (Evodia officinalis Dode)又はEuodia bodinieri Dode (Evodia bodinieri Dode) (Rutaceae)のみであり、サンプルはゴシュユEuodia ruticarpa Hooker filius et Thomson (Evodia rutaecarpa Bentham)、Euodia officinalis Dode (Evodia officinalis Dode)又はEuodia bodinieri Dode (Evodia bodinieri Dode) (Rutaceae)と一致する。20位、33位、41位、45位、82位、86位、104位、112位、122位、157位、175位、188位では、個々のサイトではゴシュユEuodia ruticarpa  Hooker filius et Thomson (Evodia rutaecarpa Bentham)、Euodia officinalis Dode (Evodia officinalis Dode)又はEuodia bodinieri Dode (Evodia bodinieri Dode) (Rutaceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０３０６】
ゴシュユEuodia ruticarpa Hooker filius et Thomson (Evodia rutaecarpa Bentham)、Euodia officinalis Dode (Evodia officinalis Dode)又はEuodia bodinieri Dode (Evodia bodinieri Dode) (Rutaceae)と近縁他種を区別するためには、127位もしくは193位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計14サイトの評価をすることが望ましい。
【０３０７】
PCR反応液１で増幅・配列が決定できた場合は上記図１５の情報により、適合種と近縁他種を区別するための必要要件を満たす。
【０３０８】
PCR反応液１で増幅・配列が決定できない場合は、PCR反応液２で増幅・配列決定を行うことで下記図１６の情報で適合種と近縁他種を区別できる。
【０３０９】
図１６で得られた核リボゾームDNA中のITS領域を示し、10サイトの鑑別サイトを示した。まず、127位でTとなるのはゴシュユEuodia ruticarpa  Hooker filius et Thomson (Evodia rutaecarpa Bentham)、Euodia officinalis Dode (Evodia officinalis Dode)又はEuodia bodinieri Dode (Evodia bodinieri Dode) (Rutaceae)のみであり、サンプルはゴシュユEuodia ruticarpa Hooker filius et Thomson (Evodia rutaecarpa Bentham)、Euodia officinalis Dode (Evodia officinalis Dode)又はEuodia bodinieri Dode (Evodia bodinieri Dode) (Rutaceae)と一致する。20位、33位、41位、45位、82位、86位、104位、112位、122位では、個々のサイトではゴシュユEuodia ruticarpa Hooker filius et Thomson (Evodia rutaecarpa Bentham)、Euodia officinalis Dode (Evodia officinalis Dode)又はEuodia bodinieri Dode (Evodia bodinieri Dode) (Rutaceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０３１０】
ゴシュユEuodia ruticarpa  Hooker filius et Thomson (Evodia rutaecarpa Bentham)、Euodia officinalis Dode (Evodia officinalis Dode)又はEuodia bodinieri Dode (Evodia bodinieri Dode) (Rutaceae)と近縁他種を区別するためには、127位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計10サイトの評価をすることが望ましい。
【０３１１】
＜実施例１２：ゼンコの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、ゼンコの基原植物は、1) Peucedanum praeruptorum Dunn（白花ゼンコ）又は2)ノダケAngelica decursiva Franchet et Savatier (Peucedanum decursivum Maximowicz) (Umbelliferae)（紫花ゼンコ）と規定されている。しかし市場には近縁他種であるPeucedanum medicumなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０３１２】
そこで、本発明者らは、ゼンコ及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、核リボゾームDNA中のITS領域の配列において、ゼンコは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はゼンコと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０３１３】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０３１４】
そこで、ゼンコと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０３１５】
本実施例は、ゼンコ及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０３１６】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（ 1) Peucedanum praeruptorum Dunn（白花ゼンコ） 又は2)ノダケAngelica decursiva Franchet et Savatier (Peucedanum decursivum Maximowicz) (Umbelliferae)（紫花ゼンコ））の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０３１７】
近縁他種についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０３１８】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０３１９】
（PCR反応液１）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 19.02μL、10× EX Taq Buffer（タカラバイオ社）2.80μL、dNTP Mix （タカラバイオ社）2.24μL、EX Taq （タカラバイオ社）0.14μL、フォワードプライマー：068-1F（068-T1F）(AAGGATCATTGTCGAATCCTGC;配列番号１７１; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：068-1R（068-T1R）(GAGATATCCGTTGTCGAGAGTC;配列番号１７２;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０３２０】
（PCR反応液２）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 19.02μL、10× EX Taq Buffer（タカラバイオ社）2.80μL、dNTP Mix （タカラバイオ社）2.24μL、EX Taq （タカラバイオ社）0.14μL、フォワードプライマー：068-2F（068-T2F）(TCTGCCTGGGTGTCACGCATC;配列番号４０１; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：068-2R（068-T2R）(TGGGGTCACAGTCGAAGCGCA;配列番号４０２;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０３２１】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×30sec, 52℃×30sec, 72℃×1min)×35サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０３２２】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０３２３】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０３２４】
その後、PCR反応液の各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０３２５】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるゼンコ及び近縁他種の相同配列と比較した（表１９並びに図１７及び図３５）。
【０３２６】
【表１９】
2020103279.tif 000028
2020103279.tif 000029
2020103279.tif 000030
2020103279.tif 000031
【０３２７】
３．結果
図１７で得られた核リボゾームDNA中のITS1領域を示し、18サイトの鑑別サイトを示した。まず、27位でTとなるのはノダケAngelica decursiva Franchet et Savatier (Peucedanum decursivum Maximowicz) (Umbelliferae)（紫花ゼンコ）のみであり、100位でTとなるのはPeucedanum praeruptorum Dunn (Umbelliferae)（白花ゼンコ）のみである。サンプルはPeucedanum praeruptorum Dunn (Umbelliferae)（白花ゼンコ）と一致する。3位、32位、40位、44位、52位、59位、67位、77位、106位、112位、123位、153位、179位、187位、195位、199位では、個々のサイトでは1) Peucedanum praeruptorum Dunn（白花ゼンコ）又は2)ノダケAngelica decursiva Franchet et Savatier (Peucedanum decursivum Maximowicz) (Umbelliferae)（紫花ゼンコ）と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０３２８】
Peucedanum praeruptorum Dunn（白花ゼンコ）又はノダケAngelica decursiva Franchet et Savatier (Peucedanum decursivum Maximowicz) (Umbelliferae)（紫花ゼンコ）と近縁他種を区別するためには、100位または27位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計18サイトの評価をすることが望ましい。
【０３２９】
図３５で得られた核リボゾームDNA中のITS2領域を示し、14サイトの鑑別サイトを示した。まず、39位でA、178位でGとなるのはノダケAngelica decursiva Franchet et Savatier (Peucedanum decursivum Maximowicz) (Umbelliferae)（紫花ゼンコ）のみであり、48位、76位、95位でT、149位、157位でA、170位でG、184位でTとなるのはPeucedanum praeruptorum Dunn (Umbelliferae)（白花ゼンコ）のみである。サンプルはPeucedanum praeruptorum Dunn (Umbelliferae)（白花ゼンコ）と一致する。50位、113位、156位、182位、209位では、個々のサイトでは1) Peucedanum praeruptorum Dunn（白花ゼンコ）又は2)ノダケAngelica decursiva Franchet et Savatier (Peucedanum decursivum Maximowicz) (Umbelliferae)（紫花ゼンコ）と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０３３０】
Peucedanum praeruptorum Dunn（白花ゼンコ）又はノダケAngelica decursiva Franchet et Savatier (Peucedanum decursivum Maximowicz) (Umbelliferae)（紫花ゼンコ）と近縁他種を区別するためには、39位、178位、48位、76位、95位、149位、157位、170位、184位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計14サイトの評価をすることが望ましい。
【０３３１】
＜実施例１３：チモの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、チモの基原植物は、ハナスゲAnemarrhena asphodeloides Bunge (Liliaceae)と規定されている。しかし市場には近縁他種ではないが、外観が類似する生薬が流通する可能性があり、基原の確認によって類似品の誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０３３２】
そこで、本発明者らは、チモ及びそのやや近縁である植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、核リボゾームDNA中のITS領域の配列において、チモは同領域で固有の配列を有し、他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はチモと他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０３３３】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０３３４】
そこで、チモと他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０３３５】
本実施例は、チモ及びその比較的近縁である他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０３３６】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（ハナスゲAnemarrhena asphodeloides Bunge (Liliaceae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０３３７】
近縁他種についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０３３８】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０３３９】
（PCR反応液）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 17.02μL、10× gene Taq Buffer（ニッポンジーン社）2.80μL、dNTP Mix （ニッポンジーン社）2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq （ニッポンジーン社）0.14μL、フォワードプライマー：071-1F（ITS-Chimo-f1）(GAACGCAAGTTGCGCCCGAG;配列番号１８６; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：071-1R（ITS-Chimo-r2）(CTTGGGCCGAGAGCAAGGAC;配列番号１８７;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０３４０】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、Stepdown法※の条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
※Stepdown法は、実施例１のPCRサイクル条件２と同様である。
【０３４１】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０３４２】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０３４３】
その後、PCR反応液の各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０３４４】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるチモ及び近縁他種の相同配列と比較した（表２０及び図１８）。
【０３４５】
【表２０】
2020103279.tif 000032
2020103279.tif 000033
【０３４６】
３．結果
図１８で得られた核リボゾームDNA中のITS領域を示し、10サイトの鑑別サイトを示した。まず、59位、62位、86位、182位でTとなり、180位で欠失となるのはハナスゲAnemarrhena asphodeloides Bunge (Liliaceae)のみであり、サンプルはハナスゲAnemarrhena asphodeloides Bunge (Liliaceae)と一致する。41位、95位、119位、133位、157位では、個々のサイトではハナスゲAnemarrhena asphodeloides Bunge (Liliaceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０３４７】
ハナスゲAnemarrhena asphodeloides Bunge (Liliaceae)と近縁他種を区別するためには、59位、62位、86位、182位もしくは180位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計10サイトの評価をすることが望ましい。
【０３４８】
＜実施例１４：バクモンドウの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、バクモンドウの基原植物は、ジャノヒゲOphiopogon japonicus Ker-Gawler (Liliaceae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるLiriope muscariなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０３４９】
そこで、本発明者らは、バクモンドウ及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、核リボゾームDNA中のITS領域の配列において、バクモンドウは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はバクモンドウと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０３５０】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０３５１】
そこで、バクモンドウと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０３５２】
本実施例は、バクモンドウ及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０３５３】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（ジャノヒゲOphiopogon japonicus Ker-Gawler (Liliaceae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０３５４】
近縁他種についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０３５５】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０３５６】
（PCR反応液）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 19.02μL、10× EX Taq Buffer（タカラバイオ社）2.80μL、dNTP Mix （タカラバイオ社）2.24μL、EX Taq （タカラバイオ社）0.14μL、フォワードプライマー：075-1F（075-T1F）(TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAG;配列番号１９９; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：075-1R（075-T3R）(AGCAYTGTTCCTTGGCGCCC;配列番号２００;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０３５７】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×30sec, 55℃×30sec, 72℃×1min)×35サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０３５８】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０３５９】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０３６０】
その後、PCR反応液の各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０３６１】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるバクモンドウ及び近縁他種の相同配列と比較した（表２１及び図１９）。
【０３６２】
【表２１】
2020103279.tif 000034
2020103279.tif 000035
【０３６３】
３．結果
図１９で得られた核リボゾームDNA中のITS領域を示し、13サイトの鑑別サイトを示した。まず、22位でA、29位でT、90位でT、101位でG、132位でTもしくは169位でAとなるのはジャノヒゲOphiopogon japonicus Ker-Gawler (Liliaceae)のみであり、サンプルはジャノヒゲOphiopogon japonicus Ker-Gawler (Liliaceae)と一致する。36位、79位、92位、97位、110位、116位、126位では、個々のサイトではジャノヒゲOphiopogon japonicus Ker-Gawler (Liliaceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０３６４】
ジャノヒゲOphiopogon japonicus Ker-Gawler (Liliaceae)と近縁他種を区別するためには、22位、29位、90位、101位、132位もしくは169位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計13サイトの評価をすることが望ましい。
【０３６５】
＜実施例１５：ビャクシの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、ビャクシの基原植物は、ヨロイグサAngelica dahurica Bentham et Hooker filius ex Franchet et Savatier (Umbelliferae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるAngelica decursivaなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０３６６】
そこで、本発明者らは、ビャクシ及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、核リボゾームDNA中のITS領域の配列において、ビャクシは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はビャクシと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０３６７】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０３６８】
そこで、ビャクシと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０３６９】
本実施例は、ビャクシ及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０３７０】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（ヨロイグサAngelica dahurica Bentham et Hooker filius ex Franchet et Savatier (Umbelliferae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０３７１】
近縁他種についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０３７２】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０３７３】
（PCR反応液１）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 17.02μL、10× gene Taq Buffer（ニッポンジーン社）2.80μL、dNTP Mix （ニッポンジーン社）2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq （ニッポンジーン社）0.14μL、フォワードプライマー：076-1F（ITS5-Byakushi-2） (GGTGAACCTGCGGAAGGATC;配列番号２１３; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：076-1R（ITS2-Byakushi-1）(CCCGCTAACGGGATACGGACG;配列番号２１４;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０３７４】
（PCR反応液２）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 17.02μL、10× gene Taq Buffer（ニッポンジーン社）2.80μL、dNTP Mix （ニッポンジーン社）2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq （ニッポンジーン社）0.14μL、フォワードプライマー：076-3F（ITS3-Byakushi-1） (GAACGCAAGTTGCGCCCGAAG;配列番号４１６; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：076-3R（ITS4-Byakushi-1）(CACCGATGTCGCGACGTCC;配列番号４１７; 10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０３７５】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、Stepdown法※の条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
※Stepdown法は、実施例１のPCRサイクル条件２と同様である。
【０３７６】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０３７７】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０３７８】
その後、PCR反応液の各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０３７９】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるビャクシ及び近縁他種の相同配列と比較した（表２２並びに図２０及び図３６）。
【０３８０】
【表２２】
2020103279.tif 000036
2020103279.tif 000037
2020103279.tif 000038
【０３８１】
３．結果
図２０で得られた核リボゾームDNA中のITS1領域を示し、12サイトの鑑別サイトを示した。まず、51位でAとなるのはヨロイグサAngelica dahurica Bentham et Hooker filius ex Franchet et Savatier (Umbelliferae)のみであり、サンプルはヨロイグサAngelica dahurica Bentham et Hooker filius ex Franchet et Savatier (Umbelliferae)と一致する。23位、45位、65位、82位、92位、117位、127位、138位、147位、160位、168位では、個々のサイトではヨロイグサAngelica dahurica Bentham et Hooker filius ex Franchet et Savatier (Umbelliferae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０３８２】
ヨロイグサAngelica dahurica Bentham et Hooker filius ex Franchet et Savatier (Umbelliferae)と近縁他種を区別するためには、51位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計12サイトの評価をすることが望ましい。
【０３８３】
図３６で得られた核リボゾームDNA中のITS2領域を示し、6サイトの鑑別サイトを示した。6位、37位、41位、59位、97位、136位では、個々のサイトではヨロイグサAngelica dahurica Bentham et Hooker filius ex Franchet et Savatier (Umbelliferae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０３８４】
＜実施例１６：イレイセンの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、イレイセンの基原植物は、サキシマボタンヅルClematis chinensis Osbeck、Clematis mandshurica Ruprecht又はClematis hexapetala Pallas (Ranunculaceae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるClematis flammulaなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０３８５】
そこで、本発明者らは、イレイセン及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、核リボゾームDNA中のITS領域の配列において、イレイセンは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はイレイセンと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０３８６】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０３８７】
そこで、イレイセンと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０３８８】
本実施例は、イレイセン及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０３８９】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（サキシマボタンヅルClematis chinensis Osbeck、Clematis mandshurica Ruprecht又はClematis hexapetala Pallas (Ranunculaceae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０３９０】
近縁他種のうち、Clematis brachyura、Clematis flammula、Clematis aethusifolia、Clematis vitalba、Clematis delavayi、Clematis lasiandra、Clematis armandii、Clematis uncinataについてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０３９１】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０３９２】
（PCR反応液）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 19.02μL、10× EX Taq Buffer（タカラバイオ社）2.80μL、dNTP Mix （タカラバイオ社）2.24μL、EX Taq （タカラバイオ社）0.14μL、フォワードプライマー：083-1F（Ireisen-ITS-f2）(GGTGAACCTGCGGAAGGATC;配列番号２２７; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：083-1R（Ireisen-ITS-r2）(GCCGAGATATCCGTTGCCGAG;配列番号２２８;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０３９３】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×30sec, 52℃×30sec, 72℃×1min)×35サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０３９４】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０３９５】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０３９６】
その後、PCR反応液の各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０３９７】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるイレイセン及び近縁他種の相同配列と比較した（表２３及び図２１）。
【０３９８】
【表２３】
2020103279.tif 000039
2020103279.tif 000040
【０３９９】
３．結果
図２１で得られた核リボゾームDNA中のITS領域を示し、13サイトの鑑別サイトを示した。16位、57位、61位、62位、63位、66位、74位、95位、140位、147位、156位、175位、178位では、個々のサイトではサキシマボタンヅルClematis chinensis Osbeck、Clematis mandshurica Ruprecht 又はClematis hexapetala Pallas (Ranunculaceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０４００】
＜実施例１７：インチンコウの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、インチンコウの基原植物は、カワラヨモギArtemisia capillaris Thunberg (Compositae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるArtemisia argyiなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０４０１】
そこで、本発明者らは、インチンコウ及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、葉緑体DNA中のpetD-rpoA領域の配列において、インチンコウは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はインチンコウと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０４０２】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０４０３】
そこで、インチンコウと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０４０４】
本実施例は、インチンコウ及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０４０５】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（カワラヨモギArtemisia capillaris Thunberg (Compositae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０４０６】
近縁他種についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０４０７】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０４０８】
（PCR反応液１）葉緑体DNA中のpetD-rpoA領域増幅用
D.W. 17.02μL、10× gene Taq Buffer（ニッポンジーン社）2.80μL、dNTP Mix （ニッポンジーン社）2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq （ニッポンジーン社）0.14μL、フォワードプライマー：085-3F（petD-rpoA-FN）(GGGTATTGGTGCAACATTAC; Nishizawa & Watano 2000より引用，一塩基の修正あり;配列番号２４１； 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：085-3R（petD-rpoA-R）(CAGCCAAGAAGATCTTATGA; Nishizawa & Watano 2000より引用;配列番号２４２；10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０４０９】
＊Nishizawa & Watano 2000
Nishizawa T. and Watano Y. 2000. Primer Pairs Suitable for PCR-SSCP Analysis of Chloroplast DNA in Angiosperms. Journal of Phytogeography and Taxonomy 48: 67-70。
【０４１０】
（PCRサイクル条件１）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×1min, 45℃×1min, 72℃×2min)×45サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０４１１】
（PCR反応液２）葉緑体DNA中のpetD-rpoA領域増幅用
D.W. 17.02μL、10× gene Taq Buffer（ニッポンジーン社）2.80μL、dNTP Mix （ニッポンジーン社）2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq （ニッポンジーン社）0.14μL、フォワードプライマー：085-4F（=085-3F）（petD-rpoA-FN）(GGGTATTGGTGCAACATTAC; Nishizawa & Watano 2000より引用，一塩基の修正あり;配列番号２４３； 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：085-4R（085-T1R）(GGAATCGGCATAGATTCATAATTTA;配列番号２４４;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０４１２】
又は、D.W. 19.02μL、10× EX Taq Buffer（タカラバイオ社）2.80μL、dNTP Mix （タカラバイオ社）2.24μL、EX Taq （タカラバイオ社）0.14μL、フォワードプライマー：085-4F（=085-3F）（petD-rpoA-FN）(GGGTATTGGTGCAACATTAC; Nishizawa & Watano 2000より引用，一塩基の修正あり;配列番号２４３； 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：085-4R（085-T1R）(GGAATCGGCATAGATTCATAATTTA; 配列番号２４４;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０４１３】
（PCRサイクル条件２）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×1min, 45℃×1min, 72℃×2min)×45サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０４１４】
又は、反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×30sec, 48℃×30sec, 72℃×1min)×35サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０４１５】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０４１６】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０４１７】
その後、PCR反応液１及びPCR反応液２のそれぞれの各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０４１８】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるインチンコウ及び近縁他種の相同配列と比較した（表２４及び表２５並びに図２２及び図２３）。
【０４１９】
【表２４】
2020103279.tif 000041
2020103279.tif 000042
【０４２０】
【表２５】
2020103279.tif 000043
【０４２１】
３．結果
反応液１、２の違いは増幅断片長の違いであり、一般的に、短いほど増幅成功率が高くなる一方、得られる鑑別サイトの数が少なくなり、オートシーケンサーでの配列決定が困難となる。本方法では反応液１での配列決定を試み、失敗した場合に反応液２を行うといった２段階の試験を設定することにより、コスト低減とサンプルのDNA品質の差への対応を可能とした。
【０４２２】
図２２は反応液１での配列決定で得られた葉緑体DNA中のpetD-rpoA領域を示し、4サイトの鑑別サイトを示した。まず、118位でGとなるのはカワラヨモギArtemisia capillaris Thunberg (Compositae)のみであり、サンプルはカワラヨモギArtemisia capillaris Thunberg (Compositae)と一致する。87位、224位、230位では、個々のサイトではカワラヨモギArtemisia capillaris Thunberg (Compositae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０４２３】
カワラヨモギArtemisia capillaris Thunberg (Compositae)と近縁他種を区別するためには、118位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計4サイトの評価をすることが望ましい。
【０４２４】
PCR反応液１で増幅・配列が決定できた場合は上記図２２の情報により、適合種と近縁他種を区別するための必要要件を満たす。
【０４２５】
PCR反応液１で増幅・配列が決定できない場合は，PCR反応液２で増幅・配列決定を行うことで適合種と近縁他種を区別できる。
【０４２６】
図２３は反応液2での配列決定で得られた葉緑体DNA中のpetD-rpoA領域を示し、2サイトの鑑別サイトを示した。まず、118位でGとなるのはカワラヨモギArtemisia capillaris Thunberg (Compositae)のみであり、サンプルはカワラヨモギArtemisia capillaris Thunberg (Compositae)と一致する。87位のみではカワラヨモギArtemisia capillaris Thunberg (Compositae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０４２７】
カワラヨモギArtemisia capillaris Thunberg (Compositae)と近縁他種を区別するためには、118位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計2サイトの評価をすることが望ましい。
【０４２８】
＜実施例１８：ジコッピの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、ジコッピの基原植物は、クコLycium chinense Miller又はLycium barbarum Linne (Solanaceae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるLycium ruthenicumなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０４２９】
そこで、本発明者らは、ジコッピ及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、葉緑体DNA中のtrnH-psbA遺伝子間部分領域の配列において、ジコッピは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はジコッピと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０４３０】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０４３１】
そこで、ジコッピと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０４３２】
本実施例は、ジコッピ及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０４３３】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（クコLycium chinense Miller又はLycium barbarum Linne (Solanaceae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０４３４】
近縁他種についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０４３５】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０４３６】
（PCR反応液）葉緑体DNA中のtrnH-psbA遺伝子間部分領域増幅用
D.W. 19.02μL、10× EX Taq Buffer（タカラバイオ社）2.80μL、dNTP Mix （タカラバイオ社）2.24μL、EX Taq （タカラバイオ社）0.14μL、フォワードプライマー：092-2F（f）(ACTGCCTTGATCCACTTGGC; Taberlet et al. 1991.より引用;配列番号２６１； 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：092-2R（092-T2R）(ASAAGGAGAGRGTATTTGCCTGC;配列番号２６２;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０４３７】
＊trnL intron, trnL-F intergenic (a, b, c, d, e, f)
Taberlet et al. 1991.
Taberlet P., Gielly L., Pautou G. and Bouvet J. 1991. Universal Primers For Amplification Of 3 Noncoding Regions Of Chloroplast Dna. Plant Mo. Biol. 17: 1105-1109。
【０４３８】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×30sec, 52℃×30sec, 72℃×1min)×35サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０４３９】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０４４０】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０４４１】
その後、PCR反応液の各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０４４２】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるジコッピ及び近縁他種の相同配列と比較した（表２６及び図２４）。
【０４４３】
【表２６】
2020103279.tif 000044
2020103279.tif 000045
【０４４４】
３．結果
図２４で得られた葉緑体DNA中のtrnH-psbA遺伝子間部分領域を示し、6サイトの鑑別サイトを示した。25-33位、45位、133位、201位、206位、226位では、個々のサイトではクコLycium chinense Miller又はLycium barbarum Linne (Solanaceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０４４５】
＜実施例１９：シュクシャの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、シュクシャの基原植物は、Amomum xanthioides Wallich (Zingiberaceae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０４４６】
そこで、本発明者らは、シュクシャ及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、核リボゾームDNA中のITS領域の配列において、シュクシャは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はシュクシャと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０４４７】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０４４８】
そこで、シュクシャと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０４４９】
本実施例は、シュクシャ及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０４５０】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（Amomum xanthioides Wallich (Zingiberaceae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０４５１】
近縁他種のうち、Amomum microcarpum、Amomum ghaticum、Amomum schmidtii、Amomum quadratolaminare、Amomum aromaticumについてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０４５２】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０４５３】
（PCR反応液）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 17.02μL、10× gene Taq Buffer（ニッポンジーン社）2.80μL、dNTP Mix （ニッポンジーン社）2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq （ニッポンジーン社）0.14μL、フォワードプライマー：103-1F（Amomum-ITS2-F1） (GCAGAATCTCGTGAACCATTG;配列番号２７５; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：103-1R（Amomum-ITS2-R1）(TGACTTGGGGCCACAATCCG;配列番号２７６;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０４５４】
又は、D.W. 19.02μL、10× EX Taq Buffer（タカラバイオ社）2.80μL、dNTP Mix （タカラバイオ社）2.24μL、EX Taq （タカラバイオ社）0.14μL、フォワードプライマー：103-1F（Amomum-ITS2-F1） (GCAGAATCTCGTGAACCATTG;配列番号２７５; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：103-1R（Amomum-ITS2-R1）(TGACTTGGGGCCACAATCCG;配列番号２７６;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０４５５】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×30sec, 52℃×30sec, 72℃×1min)×35サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０４５６】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０４５７】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０４５８】
その後、PCR反応液の各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０４５９】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるシュクシャ及び近縁他種の相同配列と比較した（表２７及び図２５）。
【０４６０】
【表２７】
2020103279.tif 000046
2020103279.tif 000047
【０４６１】
３．結果
図２５で得られた核リボゾームDNA中のITS領域を示し、6サイトの鑑別サイトを示した。まず、236位でT（チミン）となるのはAmomum xanthioides Wallichのみであり、サンプルはこれと一致する。92位、104位、154位、242位、262位では、個々のサイトではAmomum xanthioides Wallichと近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０４６２】
Amomum xanthioides Wallichと近縁他種を区別するためには、236位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計6サイトの評価をすることが望ましい。
【０４６３】
＜実施例２０：ニンドウの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、ニンドウの基原植物は、スイカズラLonicera japonica Thunberg (Caprifoliaceae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるLonicera dasystylaなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０４６４】
そこで、本発明者らは、ニンドウ及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、葉緑体DNA中のpsbA-trnH領域の配列において、ニンドウは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はニンドウと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０４６５】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０４６６】
そこで、ニンドウと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０４６７】
本実施例は、ニンドウ及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０４６８】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（スイカズラLonicera japonica Thunberg (Caprifoliaceae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて，添付のプロトコルに従って抽出した。
【０４６９】
近縁他種についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０４７０】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０４７１】
（PCR反応液）葉緑体DNA中のpsbA-trnH領域増幅用
D.W. 19.02μL、10× EX Taq Buffer（タカラバイオ社）2.80μL、dNTP Mix （タカラバイオ社）2.24μL、EX Taq （タカラバイオ社）0.14μL、フォワードプライマー：127-1F（Nindou-psbA-trnH-f2）(CAAGAGGGCACCATTGCTTC;配列番号２８４; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：127-1R（Nindou-psbA-trnH -r2）(GTACAATTATAGATAAGTCAGC;配列番号２８５;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０４７２】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×30sec, 55℃×30sec, 72℃×1min)×35サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０４７３】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０４７４】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０４７５】
その後、PCR反応液の各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０４７６】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるニンドウ及び近縁他種の相同配列と比較した（表２８及び図２６）。
【０４７７】
【表２８】
2020103279.tif 000048
2020103279.tif 000049
【０４７８】
３．結果
図２６で得られた葉緑体DNA中のpsbA-trnH領域を示し、12サイトの鑑別サイトを示した。まず、90位でA、109位でGとなるのはスイカズラLonicera japonica Thunberg (Caprifoliaceae)のみであり、サンプルはスイカズラLonicera japonica Thunberg (Caprifoliaceae)と一致する。34位、55位、71位、76位、82位、94位、118位、130位、138位、165位では、個々のサイトではスイカズラLonicera japonica Thunberg (Caprifoliaceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０４７９】
スイカズラLonicera japonica Thunberg (Caprifoliaceae)と近縁他種を区別するためには、90位もしくは109位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計12サイトの評価をすることが望ましい。
【０４８０】
＜実施例２１：センコツの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、センコツの基原植物は、コウホネNuphar japonicum De Candolle (Nymphaeaceae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるNuphar shimadaiなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０４８１】
そこで、本発明者らは、センコツ及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、核リボゾームDNA中のITS領域の配列において、センコツは同領域で固有の配列を有し，近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はセンコツと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０４８２】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０４８３】
そこで、センコツと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０４８４】
本実施例は、センコツ及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０４８５】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（コウホネNuphar japonicum De Candolle (Nymphaeaceae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０４８６】
近縁他種についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０４８７】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０４８８】
（PCR反応液）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 19.02μL、10× EX Taq Buffer（タカラバイオ社）2.80μL、dNTP Mix （タカラバイオ社）2.24μL、EX Taq （タカラバイオ社）0.14μL、フォワードプライマー：131-1F（131-T2F）(CCCTTCACTTGTGTTGGAGAATG;配列番号２９８; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：131-1R（131-T1R）(AGTTCCTTGACGCATGCAGCGCC;配列番号２９９;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０４８９】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×30sec, 55℃×30sec, 72℃×1min)×35サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０４９０】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０４９１】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０４９２】
その後、PCR反応液の各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０４９３】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるセンコツ及び近縁他種の相同配列と比較した（表２９及び図２７）。
【０４９４】
【表２９】
2020103279.tif 000050
【０４９５】
３．結果
図２７で得られた核リボゾームDNA中のITS領域を示し、12サイトの鑑別サイトを示した。まず、34位でCとなるのはコウホネNuphar japonicum De Candolle (Nymphaeaceae)のみであり、サンプルはコウホネNuphar japonicum De Candolle (Nymphaeaceae)と一致する。3位、8位、30位、40位、48位、75位、101位、102位、107位、113位、116位では、個々のサイトではコウホネNuphar japonicum De Candolle (Nymphaeaceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０４９６】
コウホネNuphar japonicum De Candolle (Nymphaeaceae)と近縁他種を区別するためには、34位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計12サイトの評価をすることが望ましい。
【０４９７】
＜実施例２２：ソウハクヒの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、ソウハクヒの基原植物は、マグワMorus alba Linne (Moraceae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるMorus notabilisなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０４９８】
そこで、本発明者らは、ソウハクヒ及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、核リボゾームDNA中のITS領域の配列において、ソウハクヒは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はソウハクヒと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０４９９】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０５００】
そこで、ソウハクヒと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０５０１】
本実施例は、ソウハクヒ及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅，配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０５０２】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（マグワMorus alba Linne (Moraceae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０５０３】
近縁他種についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０５０４】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０５０５】
（PCR反応液）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 17.02μL、10× gene Taq Buffer（ニッポンジーン社）2.80μL、dNTP Mix （ニッポンジーン社）2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq （ニッポンジーン社）0.14μL、フォワードプライマー：132-1F（132-T1F）(TGAACCTGCGGAAGGATCATTGTC;配列番号３１２; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：132-1R（132-T1R）(GTTATGATTCCTTGACGCGTTCCG;配列番号３１３;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０５０６】
又は、D.W. 19.02μL、10× EX Taq Buffer（タカラバイオ社）2.80μL、dNTP Mix （タカラバイオ社）2.24μL、EX Taq （タカラバイオ社）0.14μL、フォワードプライマー：132-1F（132-T1F） (TGAACCTGCGGAAGGATCATTGTC;配列番号３１２; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：132-1R（132-T1R）(GTTATGATTCCTTGACGCGTTCCG;配列番号３１３;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０５０７】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、Stepdown法※の条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
※Stepdown法は、実施例１のPCRサイクル条件２と同様である。
【０５０８】
又は、反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×30sec, 55℃×30sec, 72℃×1min)×35サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０５０９】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０５１０】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０５１１】
その後、PCR反応液の各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０５１２】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるソウハクヒ及び近縁他種の相同配列と比較した（表３０及び図２８）。
【０５１３】
【表３０】
2020103279.tif 000051
【０５１４】
３．結果
図２８で得られた核リボゾームDNA中のITS領域を示し、22サイトの鑑別サイトを示した。25位、46位、51位、55位〜67位、79位、85位、96位、102位、116位、132位では、個々のサイトではマグワMorus alba Linne (Moraceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。サンプルはマグワMorus alba Linne (Moraceae)と一致する。
【０５１５】
＜実施例２３：キョウカツの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、キョウカツの基原植物は、Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang又はNotopterygium forbesii Boissieu (Umbelliferae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるVicatia bipinnataなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０５１６】
そこで、本発明者らは、キョウカツ及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、核リボゾームDNA中のITS領域の配列において、キョウカツは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はキョウカツと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０５１７】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０５１８】
そこで、キョウカツと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０５１９】
本実施例は、キョウカツ及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０５２０】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang又はNotopterygium forbesii Boissieu (Umbelliferae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０５２１】
近縁他種についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０５２２】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０５２３】
（PCR反応液）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 19.02μL、10× EX Taq Buffer（タカラバイオ社）2.80μL、dNTP Mix （タカラバイオ社）2.24μL、EX Taq （タカラバイオ社）0.14μL、フォワードプライマー：136-1F（Kyoukatsu-ITS1-f2）(GCRATAGCAGAATGACCCGC;配列番号３２４; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：136-1R（Kyoukatsu-ITS1-r1）(GATATCCGTTGCCGAGAGTCG;配列番号３２５;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０５２４】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×30sec, 50℃×30sec, 72℃×1min)×35サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０５２５】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０５２６】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０５２７】
その後、PCR反応液の各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０５２８】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるキョウカツ及び近縁他種の相同配列と比較した（表３１及び図２９）。
【０５２９】
【表３１】
2020103279.tif 000052
【０５３０】
３．結果
図２９で得られた核リボゾームDNA中のITS領域を示し、20サイトの鑑別サイトを示した。6位、17位、25位、34位、38位、45位、50位、53位、59位、64位、68位、71位、87位、90位、95位、125位、151位、156位、175位、179位では、個々のサイトではNotopterygium incisum Ting ex H. T. Chang又はNotopterygium forbesii Boissieu（＝Hansenia forbesii）(Umbelliferae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０５３１】
＜実施例２４：ビワヨウの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、ビワヨウの基原植物は、ビワEriobotrya japonica Lindley (Rosaceae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるEriobotrya prinoidesなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０５３２】
そこで、本発明者らは、ビワヨウ及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、核リボゾームDNA中のITS領域の配列において、ビワヨウは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はビワヨウと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０５３３】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０５３４】
そこで、ビワヨウと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０５３５】
本実施例は、ビワヨウ及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０５３６】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（ビワEriobotrya japonica Lindley (Rosaceae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０５３７】
近縁他種についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０５３８】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０５３９】
（PCR反応液１）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 17.02μL、10× gene Taq Buffer（ニッポンジーン社）2.80μL、dNTP Mix （ニッポンジーン社）2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq （ニッポンジーン社）0.14μL、フォワードプライマー：142-1F（Biwayo-ITS2-f1） (CTTTGAACGCAAGTTGCGCCC;配列番号３３２; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：142-1R（ITS2）＊(GCTGCGTTCTTCATCGATGC;配列番号３３３； 10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０５４０】
＊ITS2
White et al. 1990.
White T. J., Bruns T., Lee S. and Taylor J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis M. A., Gelfand D. H., Sninsky J. J. and White T. J. (eds.), PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications. pp. 315-322. Academic Press, New York。
【０５４１】
（PCR反応液２）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 17.02μL、10× gene Taq Buffer（ニッポンジーン社）2.80μL、dNTP Mix （ニッポンジーン社）2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq （ニッポンジーン社）0.14μL、フォワードプライマー：142-2F（Biwayo-ITS2-f1） (CTTTGAACGCAAGTTGCGCCC;配列番号３３４; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：142-2R（Biwayo-ITS2-r）(CTCGGCATTTGGGCCAACCG ;配列番号３３５;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０５４２】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、Stepdown法※の条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
※Stepdown法は、実施例１のPCRサイクル条件２と同様である。
【０５４３】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０５４４】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０５４５】
その後、PCR反応液１及びPCR反応液２のそれぞれの各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０５４６】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるビワヨウ及び近縁他種の相同配列と比較した（表３２及び表３３並びに図３０及び図３１）。
【０５４７】
【表３２】
2020103279.tif 000053
2020103279.tif 000054
【０５４８】
【表３３】
2020103279.tif 000055
【０５４９】
３．結果
反応液１、２の違いは増幅断片長の違いであり、一般的に、短いほど増幅成功率が高くなる一方、得られる鑑別サイトの数が少なくなり、オートシーケンサーでの配列決定が困難となる。本方法では反応液１での配列決定を試み、失敗した場合に反応液２を行うといった２段階の試験を設定することにより、コスト低減とサンプルのDNA品質の差への対応を可能とした。
【０５５０】
図３０は反応液１での配列決定で得られた核リボゾームDNA中のITS領域を示し、20サイトの鑑別サイトを示した。まず、9位でT，47位でC、51位でA、108位でC、111位でT、199位でA、もしくは200位でGとなるのはビワEriobotrya japonica Lindley (Rosaceae)のみであり、サンプルはビワEriobotrya japonica Lindley (Rosaceae)と一致する。38位、43位、60位、61位、73位、117位、136位、161位、175位、186位、218位、233位、241位では、個々のサイトではビワEriobotrya japonica Lindley (Rosaceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０５５１】
ビワEriobotrya japonica Lindley (Rosaceae)と近縁他種を区別するためには、9位，47位、51位、108位、111位、199位、もしくは200位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計20サイトの評価をすることが望ましい。
【０５５２】
PCR反応液１で増幅・配列が決定できた場合は上記図３０の情報により、適合種と近縁他種を区別するための必要要件を満たす。
【０５５３】
PCR反応液１で増幅・配列が決定できない場合は、PCR反応液２で増幅・配列決定を行うことで適合種と近縁他種を区別できる。
【０５５４】
図３１は反応液2での配列決定で得られた核リボゾームDNA中のITS領域を示し、10サイトの鑑別サイトを示した。9位でT、47位でC、51位でA、108位でC、もしくは111位でTとなるのはビワEriobotrya japonica Lindley (Rosaceae)のみであり、サンプルはビワEriobotrya japonica Lindley (Rosaceae)と一致する。38位、43位、60位、61位、73位では、個々のサイトではビワEriobotrya japonica Lindley (Rosaceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０５５５】
ビワEriobotrya japonica Lindley (Rosaceae)と近縁他種を区別するためには、9位、47位、51位、108位、もしくは111位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計10サイトの評価をすることが望ましい。
【０５５６】
＜実施例２５：シコンの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、シコンの基原植物は、ムラサキLithospermum erythrorhizon Siebold et Zuccarini (Boraginaceae)と規定されている。しかし市場には近縁他種であるLithospermum officinaleなどが流通する可能性があり、これらの誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０５５７】
そこで、本発明者らは、シコン及びその近縁植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、核リボゾームDNA中のITS領域の配列において、シコンは同領域で固有の配列を有し、近縁他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はシコンと近縁他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０５５８】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０５５９】
そこで、シコンと近縁他種の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０５６０】
本実施例は、シコン及びその近縁他種に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０５６１】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（ムラサキLithospermum erythrorhizon Siebold et Zuccarini (Boraginaceae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０５６２】
近縁他種についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０５６３】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０５６４】
（PCR反応液）核リボゾームDNA中のITS領域増幅用
D.W. 19.02μL、10× EX Taq Buffer（タカラバイオ社）2.80μL、dNTP Mix （タカラバイオ社）2.24μL、EX Taq （タカラバイオ社）0.14μL、フォワードプライマー：144-1F（Shikon-ITS1-f2）(CCTGCATAGCAGAACCACTC;配列番号３６０; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：144-1R（Shikon-ITS1-r1）(CATCTCCAAGCCTCTGTGCC;配列番号３６１;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０５６５】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×30sec, 50℃×30sec, 72℃×1min)×35サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０５６６】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０５６７】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０５６８】
その後、PCR反応液の各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０５６９】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるシコン及び近縁他種の相同配列と比較した（表３４及び図３２）。
【０５７０】
【表３４】
2020103279.tif 000056
2020103279.tif 000057
【０５７１】
３．結果
図３２で得られた核リボゾームDNA中のITS領域を示し、10サイトの鑑別サイトを示した。まず、2位でC、49位でG、98位でA、148位でCとなるのはムラサキLithospermum erythrorhizon Siebold et Zuccarini (Boraginaceae)のみであり、サンプルはムラサキLithospermum erythrorhizon Siebold et Zuccarini (Boraginaceae)と一致する。8位、15位、31位、61位、84位、116位では、個々のサイトではムラサキLithospermum erythrorhizon Siebold et Zuccarini (Boraginaceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０５７２】
ムラサキLithospermum erythrorhizon Siebold et Zuccarini (Boraginaceae)と近縁他種を区別するためには、2位、49位、98位、148位のいずれかを評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計10サイトの評価をすることが望ましい。
【０５７３】
＜実施例２６：トチュウの鑑別方法＞
１．緒言
第十七改正日本薬局方において、トチュウの基原植物は、トチュウEucommia ulmoides Oliver (Eucommiaceae)と規定されている。しかし市場には近縁他種ではないが、外観が類似している生薬などが流通する可能性があり、基原の確認によって類似品の誤用・混用を避けることは医薬品の品質確保のために、重要である。
【０５７４】
そこで、本発明者らは、トチュウ及び比較的近縁である他種植物のゲノムDNA、又は葉緑体DNAを網羅的に調査した。その結果、葉緑体DNA中のpsbA-trnH領域の配列において、トチュウは同領域で固有の配列を有し、他種と区別できることが明らかとなった。したがって、同領域はトチュウと他種を区別するのに有用なDNAマーカーである。
【０５７５】
しかし、生薬からの配列決定は、1) 経時変化、加工等によるDNAの損傷・断片化、2) 菌類由来のDNAの混入により、しばしば困難である。
【０５７６】
そこで、トチュウと比較的近縁である他種植物の配列情報を比較し、これらがPCR増幅可能で、かつ鑑別サイトを含むようにプライマーを設計し、その増幅最適条件を設定することで、従来は配列決定が困難だったサンプルからの配列情報の取得が安定して可能となった。
【０５７７】
本実施例は、トチュウ及び比較的近縁である他種植物に対して、種間の区別が可能なDNA領域を様々なサンプルからPCR増幅、配列決定を可能とするプライマーセットを中心とし、得られた配列中の鑑別サイトを提示するものである。
【０５７８】
２．方法
２−１．核酸抽出方法
鋳型DNAは、生薬又は生薬加工前の基原植物（トチュウEucommia ulmoides Oliver (Eucommiaceae)）の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０５７９】
近縁他種についてはGenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)より相同配列を得た。
【０５８０】
２−２．核酸増幅方法
抽出した鋳型DNAを用いて、PCRにより特定の核酸領域を増幅した。核酸増幅反応条件は以下の通りである。
【０５８１】
（PCR反応液）葉緑体DNA中のpsbA-trnH領域増幅用
D.W. 19.02μL、10× EX Taq Buffer（タカラバイオ社）2.80μL、dNTP Mix （タカラバイオ社）2.24μL、EX Taq （タカラバイオ社）0.14μL、フォワードプライマー：147-1F（Tochuu-psbA-trnH-f3N）(CTCAAGAGGTGGGTATTGCTCC;配列番号３７４; 10pmol/μL) 1μL、リバースプライマー：147-1R（Tochuu-psbA-trnH-r2N）(GATCCACTTGGCTACATCCGCC;配列番号３７５;10pmol/μL) 1μL、鋳型DNA 1μL。
【０５８２】
（PCRサイクル条件）
反応液を0.2mlマイクロチューブに入れ、95℃×5min、(95℃×30sec, 50℃×30sec, 72℃×1min)×35サイクル、72℃×7minの条件で、GeneAmp9700（Thermo Fisher Scientific社）等のサーマルサイクラーを用いて反応させた。
【０５８３】
２−３．ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出
実施例１と同様に、ゲル電気泳動による増幅産物の確認とゲル抽出を行った。
【０５８４】
２−４．増幅産物の塩基配列決定
実施例１と同様に、増幅産物の塩基配列決定を行った。
【０５８５】
その後、PCR反応液の各種増幅産物のフォワード配列及びリバース配列を比較して信頼性の高い配列を決定した。
【０５８６】
BioEdit v7.2.5 for Windows (Tom Hall 2013)を用いて、得られた配列を、標準となるトチュウ及び近縁他種の相同配列と比較した（表３５及び図３３）。
【０５８７】
【表３５】
2020103279.tif 000058
【０５８８】
３．結果
図３３で得られた葉緑体DNA中のpsbA-trnH領域を示し、6サイトの鑑別サイトを示した。まず、91位でT、95位でG、98位でA、もしくは100位で欠失となるのはトチュウEucommia ulmoides Oliver (Eucommiaceae)のみであり、サンプルはトチュウEucommia ulmoides Oliver (Eucommiaceae)と一致する。105位、109位では、個々のサイトではトチュウEucommia ulmoides Oliver (Eucommiaceae)と近縁他種は区別できないが、複数のサイトの組み合わせで区別が可能となる。
【０５８９】
トチュウEucommia ulmoides Oliver (Eucommiaceae)と近縁他種を区別するためには、91位、95位、98位、もしくは100位を評価することが必要要件となるが、より高い確度の鑑別のためには上記の合計6サイトの評価をすることが望ましい。
【０５９０】
＜実施例２７：生薬の鑑別用プライマーセットの品質特異性の確認＞
１．目的
生薬の鑑別用プライマーセットにより、生薬と近縁植物由来の生薬だけが増幅され、遠縁のものは増幅されない事を確認する。
【０５９１】
２．材料
本実施例における生薬(正品)、近縁種及び遠縁種を、以下の表３６に示す。
【０５９２】
【表３６】
2020103279.tif 000059
2020103279.tif 000060
【０５９３】
３．方法
３−１．DNA抽出
対象の生薬(正品)、近縁種及び遠縁種の一部を採取し、市販のDNeasy（登録商標）Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付のプロトコルに従って抽出した。
【０５９４】
３−２．PCR増幅
PCR増幅に使用した生薬の鑑別用プライマーセット、反応液組成、PCRサイクル条件、及びサーマルサイクラーを以下の表３７に示す。また、表３７に、増幅産物に関するゲル電気泳動条件、及びゲル撮影条件を示す。
【０５９５】
【表３７】
2020103279.tif 000061
2020103279.tif 000062
2020103279.tif 000063
【０５９６】
４．結果
PCR増幅の結果として、増幅産物に関するゲル電気泳動の写真を図３７に示す。図３７では、サンプルと同時に泳動した100bp Ladderも示す。Ladderとサンプルの間に不要なレーンがあった場合はそのレーンを削除したが、この場合はLadderとサンプルの間に境界線を入れた。
【０５９７】
５．結論
本実施例で実施した28品目の生薬について、各鑑別用プライマーセットによれば、生薬と近縁植物由来の生薬だけが増幅され、遠縁のものは増幅されないことを確認した。
【図１】
2020103279.tif 000064
【図２】
2020103279.tif 000065
【図３】
2020103279.tif 000066
【図４−１】
2020103279.tif 000067
【図４−２】
2020103279.tif 000068
【図５】
2020103279.tif 000069
【図６】
2020103279.tif 000070
【図７−１】
2020103279.tif 000071
【図７−２】
2020103279.tif 000072
【図８−１】
2020103279.tif 000073
【図８−２】
2020103279.tif 000074
【図９−１】
2020103279.tif 000075
【図９−２】
2020103279.tif 000076
【図１０−１】
2020103279.tif 000077
【図１０−２】
2020103279.tif 000078
【図１０−３】
2020103279.tif 000079
【図１１−１】
2020103279.tif 000080
【図１１−２】
2020103279.tif 000081
【図１２−１】
2020103279.tif 000082
【図１２−２】
2020103279.tif 000083
【図１３】
2020103279.tif 000084
【図１４−１】
2020103279.tif 000085
【図１４−２】
2020103279.tif 000086
【図１５−１】
2020103279.tif 000087
【図１５−２】
2020103279.tif 000088
【図１５−３】
2020103279.tif 000089
【図１６−１】
2020103279.tif 000090
【図１６−２】
2020103279.tif 000091
【図１７−１】
2020103279.tif 000092
【図１７−２】
2020103279.tif 000093
【図１７−３】
2020103279.tif 000094
【図１８−１】
2020103279.tif 000095
【図１８−２】
2020103279.tif 000096
【図１９−１】
2020103279.tif 000097
【図１９−２】
2020103279.tif 000098
【図２０−１】
2020103279.tif 000099
【図２０−２】
2020103279.tif 000100
【図２１−１】
2020103279.tif 000101
【図２１−２】
2020103279.tif 000102
【図２２−１】
2020103279.tif 000103
【図２２−２】
2020103279.tif 000104
【図２２−３】
2020103279.tif 000105
【図２３−１】
2020103279.tif 000106
【図２３−２】
2020103279.tif 000107
【図２４−１】
2020103279.tif 000108
【図２４−２】
2020103279.tif 000109
【図２５−１】
2020103279.tif 000110
【図２５−２】
2020103279.tif 000111
【図２６−１】
2020103279.tif 000112
【図２６−２】
2020103279.tif 000113
【図２７−１】
2020103279.tif 000114
【図２７−２】
2020103279.tif 000115
【図２８−１】
2020103279.tif 000116
【図２８−２】
2020103279.tif 000117
【図２９】
2020103279.tif 000118
【図３０−１】
2020103279.tif 000119
【図３０−２】
2020103279.tif 000120
【図３０−３】
2020103279.tif 000121
【図３１】
2020103279.tif 000122
【図３２−１】
2020103279.tif 000123
【図３２−２】
2020103279.tif 000124
【図３３−１】
2020103279.tif 000125
【図３３−２】
2020103279.tif 000126
【図３４−１】
2020103279.tif 000127
【図３４−２】
2020103279.tif 000128
【図３５−１】
2020103279.tif 000129
【図３５−２】
2020103279.tif 000130
【図３５−３】
2020103279.tif 000131
【図３６】
2020103279.tif 000132
【図３７−１】
2020103279.tif 000133
【図３７−２】
2020103279.tif 000134
【図３７−３】
2020103279.tif 000135
【図３７−４】
2020103279.tif 000136
【図３７−５】
2020103279.tif 000137
【図３７−６】
2020103279.tif 000138
【配列表】
2020103279000001.app