(57)【要約】【課題】  本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、観察試料を加熱又は冷却する温度可変部の温度不均一による影響を受けづらい溶融温度分析装置を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明は、観察試料を加熱又は冷却する温度可変部と、観察試料の蛍光輝度を計測する蛍光計測部と、温度可変部の温度分布を赤外線で計測する分布計測部と、温度可変部の実測温度を計測する実測計測部と、を有し、所定の時刻における、蛍光輝度のデータと温度分布のデータと実測温度のデータを取得する、ことを特徴とする。【選択図】  図１
2020103095.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察試料を加熱又は冷却する温度可変部と、
前記観察試料の蛍光輝度を計測する蛍光計測部と、
前記観察試料の温度分布を赤外線で計測する分布計測部と、
前記温度可変部の実測温度を計測する実測計測部と、を有し、
所定の時刻における、前記蛍光輝度のデータと前記温度分布のデータと前記実測温度のデータを取得する、ことを特徴とする融解温度分析装置。
【請求項２】
複数の前記所定の時刻における、前記蛍光輝度のデータと前記温度分布のデータと前記実測温度のデータを取得する、ことを特徴とする請求項１に記載の融解温度分析装置。
【請求項３】
前記蛍光輝度のデータと前記温度分布のデータと前記実測温度のデータを、時刻のデータと共に取得し、
取得された、前記蛍光輝度のデータと前記温度分布のデータと前記実測温度のデータと前記時刻のデータから、前記所定の時刻における、前記蛍光輝度のデータと前記温度分布のデータと前記実測温度のデータを取得する、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の融解温度分析装置。
【請求項４】
前記蛍光計測部と前記分布計測部と前記実測計測部を同期制御することによって、前記所定の時刻における、前記蛍光輝度のデータと前記温度分布のデータと前記実測温度のデータを取得する、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の融解温度分析装置。
【請求項５】
前記所定の時刻の前記温度分布のデータと前記実測温度のデータの差分により、融解曲線の温度補正をする、ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の融解温度分析装置。
【請求項６】
前記蛍光計測部は、前記蛍光輝度を可視光線で計測する、ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の融解温度分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の標的核酸を定量分析する融解温度分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、種々の核酸が混在するサンプルから、特定の塩基配列を含む核酸（標的核酸）の濃度を定量分析する方法として、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ；ｄｉｇｉｔａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が提案されている。
【０００３】
デジタルＰＣＲでは、標的核酸を含むサンプルに、標的核酸を増幅するための増幅試薬、標的核酸を検出するための蛍光試薬などと混合して希釈したものを試料とし（図５（ａ））、試料を物理的に独立した複数の微小区画に分割する（図５（ｂ））。そして、複数の微小区画のそれぞれにおいて独立にＰＣＲを生じさせ、標的核酸を増幅して検出可能にする（図５（ｃ））。
【０００４】
増幅後に蛍光シグナルが検出された微小区画の数（陽性区画数）および／または増幅後に蛍光シグナルが検出されなかった微小区画の数（陰性区画数）を計数する。計数結果をポアソン（Ｐｏｉｓｓｏｎ）分布などの所定の確率分布に基づいて統計処理することでサンプル中の標的核酸の濃度を定量することができる（図５）。
【０００５】
デジタルＰＣＲにおいて反応液を複数の微小区画に分割する方法として、反応液の液滴をオイル中に形成する方法がある。すなわち、油中水型エマルジョン（Ｗ／Ｏエマルジョン）を形成する方法（特許文献１）や、基板上に複数の微小区画を設けたチップを使って反応液を分割する方法（特許文献２）などがある。
【０００６】
標的核酸の濃度定量は計数した微小区画を統計的なポアソン分布により処理するため、微小区画のそれぞれに標的核酸が入る確率にばらつきが無いことが好ましい。そのため微小区画としては、より単分散に近い分割方法を用いることが好ましい。
【０００７】
一方、高分解能融解曲線（Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｉｎｇ：ＨＲＭ）解析は、ＰＣＲによる標的核酸の増幅後に、複数種の標的核酸の融解変異を検出する方法である。ＨＲＭ解析は従来の融解曲線法と比較してより感度の高い方法で、二本鎖の核酸が一本鎖の核酸に解離する温度をモニターする。この温度は、増幅産物の融解温度（Ｔｍ）として知られている。
【０００８】
ＨＲＭ解析でのＴｍ検出方法は、約８０〜２５０塩基対の遺伝子フラグメントを高機能な二本鎖核酸結合色素を含む反応液内でＰＣＲにより増幅する。増幅産物をアニールさせ蛍光輝度が最も高い状態にスタンバイさせ、ゆっくりと温度を上昇させると同時にアンプリコンからの蛍光データを記録する。ＰＣＲ産物が変性（または融解）し始めると、蛍光色素が放出されるにつれて増幅産物の蛍光はそのＴｍに近づくまでゆっくりと低下する。Ｔｍに最も近くなると、試料が二本鎖核酸から一本鎖核酸へと変化するのにあわせて蛍光の急激な低下が観察される（図６）。
【０００９】
微小区画の温度測定法としては、既知の温度情報を持った標準蛍光色素を使用する方法がある。温度が上昇すると蛍光強度が量子収率の低下のために減少することを利用して、各微小区画に標準蛍光色素を分注して蛍光強度を測定することにより、温度分布のデータとして利用する方法である（特許文献３）。
【００１０】
また、非接触で温度をイメージングする方法の代表的なものとして赤外線サーモグラフィが挙げられる。赤外線サーモグラフィとは、物体が放射する赤外線を検出して、物体表面の温度分布を二次元的に表示し、可視化する方法である。熱放射を利用する利点は、非接触で測定可能であり、測定対象に影響を及ぼさず、応答性に優れ、速い温度変化が測定できる等の点が挙げられる（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２０１２−５０３７７３号公報
【特許文献２】特表２０１５−５１６８０２号公報
【特許文献３】特許第５７０３３７７号公報
【特許文献４】特開平１０−２８０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＨＲＭ解析を用いたＴｍ検出方法では、複数種の標的核酸の融解温度Ｔｍにおいて、わずかな差異を検出するために温度可変部には、非常に高い温度精度が要求される。そこで加熱・冷却の正確な温度制御のためにペルチェ素子を使用した温度可変部が用いられている。しかし、温度センサの計測誤差が生じていた。また、ペルチェ素子自体、及び微小区画が設けられた試料観察部（観察試料）と温度可変部との取り付け部分において、接触抵抗に起因する温度の不均一が生じていた。
【００１３】
これらの変動要因により、微小区画内の最も熱い位置と最も冷たい位置で観察温度の誤差が発生することがあり、微小区画の試料に対する観察温度として、わずかな融解温度Ｔｍの差を識別する際に問題があった。そのため各微小区画の試料の観察温度は、時間単位ですべての区画を測定する必要が生じていた。
【００１４】
しかしながら、上記特許文献３に記載の従来例である標準蛍光色素を用いた温度可変部の温度キャリブレーションを行う方法は、リアルタイムＰＣＲ装置の精度管理のために用いられている方法のひとつである。この方法では、微小区画が設けられた観察試料と温度可変部との取り付け部分に起因する温度の不均一には対応することができないという問題があった。
【００１５】
すなわち、温度可変部に対する観察試料の取り付け部分は面接触による温度伝達構造となっているため、取り付けの状態によって熱抵抗が変化し観察試料への温度伝達に不均一性をもたらしていた。
【００１６】
一方、上記特許文献４に記載の従来例は、観察試料に対して赤外線カメラによる温度分布の画像と可視光線カメラによる光学画像を同時に得られる光学装置であるが、試料を加熱・冷却させながら連続して計測する温度可変機能を持っていない。したがって、温度の不均一は問題とならなかった。
【００１７】
しかしながら、赤外線カメラは外気温度の影響を受けやすく、対象物の温度測定時の誤差となっていた。通常はメカニカルシャッタを使った温度補正が行われ、シャッタを閉じてその時の外気温度による影響を読み出し、画像処理により減算して補正を行なっていた。シャッタ補正直後の計測値は正確な値となるが、連続して温度計測を繰り返す場合には実際の試料温度との間で誤差が生じてしまった。
【００１８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、観察試料を加熱又は冷却する温度可変部の温度不均一による影響を受けづらい溶融温度分析装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、観察試料を加熱又は冷却する温度可変部と、前記観察試料の蛍光輝度を計測する蛍光計測部と、前記温度可変部の温度分布を赤外線で計測する分布計測部と、前記温度可変部の実測温度を計測する実測計測部と、を有し、所定の時刻における、前記蛍光輝度のデータと前記温度分布のデータと前記実測温度のデータを取得する、ことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
観察試料を加熱又は冷却する温度可変部の温度不均一による影響を受けづらい溶融温度分析装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の実施例に係る装置（融解温度分析装置）の構造を説明する図である。
【図２】本発明の実施例に係る装置（融解温度分析装置）の動作フローを示す図である。
【図３】本発明の実施例に係る装置（融解温度分析装置）のブロック図である。
【図４】試料観察部（観察試料）と温度可変部の斜視図を示す図である。
【図５】標的核酸の定量化原理を示した図である。
【図６】標的核酸の融解曲線の特性を示した図である。
【図７】融解曲線の温度補正方法を示した図である。
【図８】各計測データと計測時刻について説明する図である。
【図９】基準点の温度値と計測時刻の関係を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
〔実施例１〕
図１は、本発明に係る装置（融解温度分析装置）の特徴を最もよく表す図面である。
【００２３】
同図において、１は、試料の蛍光輝度を計測する蛍光カメラ（蛍光計測部）１である。２は、励起光の波長を減衰させて試料の蛍光のみを通過させる光学ロングパスフィルタの蛍光フィルタ２である。３は、試料に照射する励起光を生成する励起用光源３である。４は、励起に必要な波長のみを通過させる光学ショートパスフィルタの励起用フィルタ４である。
【００２４】
５は、赤外線を検出して試料表面の温度分布を可視化する赤外線サーモグラフィ（分布計測部）５である。６は、励起光を反射し蛍光を透過させるダイクロイックミラー６である。７は、長波長の赤外線を反射して可視光線のみ透過させるホットミラー７である。８は、試料を複数の微小区画に分割した試料観察部（観察試料）８である。
【００２５】
９は、観察試料８に熱伝達して加熱や冷却（少なくとも加熱及び冷却のいずれか一方）をおこなうプレート９である。１０は、プレート９の基準点に対しての実測温度を計測する接触式の温度センサ（実測計測部）１０である。１１は、プレート９に対しての加熱や冷却を実行する熱伝素子であるペルチェ素子１１である。１２は、ペルチェ素子１１の放熱側の熱を放出するヒートシンク１２である。１３は、ヒートシンク１２の熱を強制放出するファン１３である。
【００２６】
９〜１３の温度制御に関するユニットをまとめた部分は、温度可変部１４としてまとめられる。
【００２７】
図２は、本発明に係る装置（融解温度分析装置）の動作フローを示した図である。
【００２８】
ステップＳ１では、励起用光源３の出力をオンにして、励起フィルタ４を通過した波長の励起光がダイクロイックミラー６で反射して観察試料８に照射される。ステップＳ２では、励起光により微小区画に分割された試料から放射された蛍光を、ホットミラー７とダイクロイックミラー６を通過し、蛍光フィルタ２で励起光の波長を除去した蛍光画像として、蛍光計測部１で計測される。ステップＳ３では、試料から放射された赤外線をホットミラー７で反射して、分布計測部５で温度分布の画像として計測される。
【００２９】
ステップＳ４では、プレート９に実装された実測計測部１０により基準点の接触温度が計測される。ステップＳ５では、温度可変部１４の制御により試料の温度を＋ｎ℃上昇させる。ステップＳ６では、温度可変部１４はＨＲＭ解析で必要となる温度範囲６５〜９５℃の間で加熱の制御を行うため、９５℃に達成するまでＳ２からＳ５までのステップを繰り返す。ステップＳ７では、温度可変部１４によるランプ速度を調整するため、ｍ秒の待ち時間を設定する。ステップＳ６の分岐で、９５℃に達したところでステップＳ８の励起光源オフを実行し、動作を終了させる。
【００３０】
同図において、ステップＳ２〜Ｓ４では計測時の時刻データを同時に取得することにより、相互で時系列のデータとして扱うことが可能である。
【００３１】
試料の退色が問題になる場合には、励起光源のオン・オフを蛍光計測部による計測を実施する時間にだけ限っても構わない。ステップＳ２の前後に励起光源オン・オフのステップを挿入することで、必要最小限の励起光照射に制限することができる。
【００３２】
また、蛍光計測部と分布計測部の計測タイミングは、図２のようなステップＳ２とステップＳ３の順番で計測しなくても構わない。各々計測したタイミングの時刻（所定の時刻）が管理されていれば、非同期制御であっても、同期制御であっても問題はない。ステップＳ４の温度計測についても、計測タイミングの時刻（所定の時刻）が管理されていれば同様である。
【００３３】
図３は、本発明に係る装置（融解温度分析装置）のブロック図である。
【００３４】
同図において、装置全体の主制御を司るのがメインコントローラ１５であり、蛍光計測部１と分布計測部５による計測時間の管理と画像取得と、励起用光源３のオン・オフ制御を行う。温度可変部１４の中で試料の温度制御を司るのが温度制御コントローラ１６であり、実測計測部１０で検出した温度と、ペルチェ素子１１の電流を切り替えて加熱と冷却のＰＩＤ制御を行い、ヒートシンク１２の放熱のためファン１３のオン・オフ制御を行う。
【００３５】
主制御のメインコントローラ１５からは、温度可変部１４の温度制御コントローラ１６に対して設定温度を指示することで、試料の温度制御が実行される。また、基準点の温度データについては、メインコントローラ１５から温度制御コントローラ１６への要求に応じて計測され、計測温度と時刻データを合わせて提供する。
【００３６】
図４は、温度可変部１４と観察試料８の斜視図である。
【００３７】
同図において、観察試料８はガラスや樹脂のような透過部材であり、試料を微細孔やドロップレット等を使って複数の微小区画に分割するもので、温度可変部１４の上部のプレート９に固定される。
【００３８】
プレート９には実測計測部１０が埋め込まれ、接触式の白金センサや熱電対等を使って温度を計測する。プレート９の実測計測部１０近傍に基準点１７となる黒色領域を設ける。
【００３９】
基準点１７は、観察試料８をプレート９に固定した際にも、分布計測部５からは直接観察できる構造とする。そして、実測計測部１０による実際の温度と、分布計測部５で基準点１７の黒色領域を計測した温度との差分を、時刻が管理された実測温度データとして保持しておく。
【００４０】
基準点１７の位置は実測計測部１０の近傍にあればよく、観察試料８の範囲外となるプレート９の四隅に設けたり、基準点と実測計測部を複数ペアで設けたりすることも可能である。
【００４１】
プレート９の下には、グリスやシリコンシートのような熱伝導率の高い部材を間に挟んで、ペルチェ素子１１やヒートシンク１２が重ねられている。ペルチェ素子１１には２本の電極が接続され、直流電流の極性を切り替えることで、加熱と冷却を切り替えて温度制御を実行することができる。
【００４２】
温度可変部１４は、ＨＲＭ解析で必要となる温度範囲６５〜９５℃の間で加熱の制御を行う。図２に示した動作フローに沿って説明をすると、１秒毎（ｍ＝１）に＋１℃（ｎ＝１）のランプ速度（１℃／秒）で試料を計測した場合には、観察時間を３０秒で完了させることが可能である。しかしながら、上記のようなランプ速度ではペルチェ素子に発生する温度の不均一が顕著に発生してしまい、微小区画の試料温度に誤差が発生してしまう。
【００４３】
試料温度の誤差を低減するために、温度上昇のランプ速度を低下させることで誤差要因を低減させる方法もとられている。しかし、ランプ速度を１／１０倍の０．１℃／秒で温度上昇させた場合には観察時間は１０倍の５分が必要となってしまい、ＨＲＭ解析のスループットが悪化してしまう。
【００４４】
そこで、蛍光輝度を計測する蛍光計測部と、温度分布を計測する分布計測部で各々計測した時刻を記録することで、観察試料８の蛍光輝度データと温度分布データを同じ時系列として計測することが可能となる。同時に、温度可変部１４のプレート９に実測計測部１０を埋め込んだ基準点１７の実測温度データも同じ時系列で取得することにより、同じ時刻に分布計測部で計測した基準点１７の温度との差分を温度補正値とする。
【００４５】
図７は、融解曲線の温度補正方法を示した図である。図７（ａ）は縦軸に蛍光の輝度、横軸に温度をとった融解曲線で、微小区画毎の融解曲線を重ねていくと輝度や温度に大きなバラツキがあることが解る。図７（ｂ）は縦軸の輝度を正規化して０〜１００％に変換した融解曲線であるが、輝度のバラツキが抑えられたことで横軸の温度のバラツキが残っている。図７（ｃ）は実測温度データを加味した温度補正値を使って横軸の温度を補正した融解曲線となる。結果として、縦軸、および横軸の双方で微小区画毎のバラツキが抑えられ、同じ試料であれば微小区画の場所によらず同じ融解曲線を得ることが可能である。すなわち、複数種の標的核酸の融解温度Ｔｍを正確に読み出すことが可能となる。
【００４６】
図８と図９は、温度補正値の算出方法について説明する図である。
【００４７】
図８は、以下の内容を表している。蛍光計測部による蛍光輝度データＥｍｉｔ０１〜Ｅｍｉｔ０７と計測した時刻ｔｉｍｅを表している。また、分布計測部による温度分布データＴｈｅｒｍ０１〜Ｔｈｅｒｍ０７と計測した時刻ｔｉｍｅを表している。また、実測計測部の実測温度Ｔｅｍｐ０１〜Ｔｅｍｐ０７と計測した時刻ｔｉｍｅを表している。同じ時間軸の中で各々が計測したデータのタイミング（所定の時刻）を確認することができる。
【００４８】
蛍光輝度データと温度分布データは２次元の画像データ（ＲａｗデータやＢｉｔｍａｐデータ等）となっているので、画像データから観察試料の微小区画毎に分けられた領域について、各々の蛍光輝度値と温度値を抽出して融解曲線は生成される。但し、同一時刻における蛍光輝度値と温度値を抽出しなくてはならないので、非同期で取得した温度値については時間補正が必要となるが、同期制御で計測を行った系では時間補正の必要は無くなる。
【００４９】
図９は、分布計測部５から読み出した基準点の温度値１８と、接触温度計による基準点の実測温度値１９を縦軸にして、各々のデータを取得した計測時刻（ｔｉｍｅ）を横軸にしたグラフである。時刻ｔ１では温度差がΔＴｅｍｐ１となるので、その時刻の赤外線カメラ画像による計測温度は、全体に−ΔＴｅｍｐ１の補正を行う。同様に、時刻ｔ２では温度差がΔＴｅｍｐ２となるので、その時刻の赤外線カメラ画像による計測温度は、全体に−ΔＴｅｍｐ２の補正を行う。
【００５０】
このように、計測時刻ごとの温度補正値を算出しておくことで、蛍光輝度データの計測タイミング（所定の時刻）に合わせた、微小区画毎の実測温度を知ることができるので、正しい融解曲線を出力することが可能となる。
【００５１】
したがって、ＨＲＭ解析を用いたＴｍ検出方法において、加熱のランプ速度を速めて観察部の温度不均一が発生した場合にも、同じ時系列で計測した温度補正値により温度分布データを補正することで、実測温度に適合した融解温度Ｔｍを算出することができる。
【符号の説明】
【００５２】
１  蛍光カメラ（蛍光計測部）
５  赤外線サーモグラフィ（分布計測部）
１０  温度センサ（実測計測部）
１４  温度可変部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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