(57)【要約】【課題】治療の有益な効果の一部またはすべてを保持しながら、細胞治療において使用されるドナー細胞の考えられる負の効果を迅速に除去するための、治療用細胞のコントロールされた排除を提供する。【解決手段】本発明は一部、治療用細胞、例えば、キメラ抗原レセプターを発現する細胞の排除をコントロールするための方法に関する。本発明はさらに、有害事象後に患者において治療用細胞の破壊をコントロールするための２工程方法に関する。この２工程システムは、ラパマイシンまたはラパマイシンアナログベースのコントロールレベル、および第２のリミズシドのコントロールレベルを含み得る。本発明はまた、誘導性カスパーゼポリペプチドおよびラパマイシン感受性ポリペプチドを発現する細胞を使用する細胞治療のための方法に関し、ここでアポトーシスによって排除される治療用細胞の割合は、投与されるリガンドの選択および量に関連する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
２０１４年１２月１５日に出願された「Methods  for  Controlled  Elimination  of  Therapeutic  Cells」とのタイトルの米国仮特許出願第62/092,149号に対する優先権を主張する。この出願はすべて、その全体が参照され、その参照により援用される。
【０００２】
（分野）
本技術は一部、治療用細胞、例えば、キメラ抗原レセプターを発現する細胞の排除をコントロールするための方法に関する。本技術はさらに、有害事象後に患者において治療用細胞の破壊をコントロールするための２工程方法に関する。この２工程システムは、ラパマイシンまたはラパマイシンアナログベースのコントロールレベル、および第２のリミズシドのコントロールレベルを含み得る。本技術はまた、一部、誘導性カスパーゼポリペプチドおよびラパマイシン感受性ポリペプチドを発現する細胞を使用する細胞治療のための方法に関し、ここでアポトーシスによって排除される治療用細胞の割合は、投与されるリガンドの選択および量に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
Ｔ細胞活性化は、病原性微生物（例えば、ウイルス、細菌、および寄生生物）、外来タンパク質、および環境中の有害化学物質に対する防御免疫において、ならびにがんおよび他の過剰増殖性疾患に対する免疫としても、重要な工程である。Ｔ細胞は、細胞の表面上に呈示される抗原を認識するレセプター（すなわち、Ｔ細胞レセプター）をそれらの表面上で発現する。通常の免疫応答の間に、上記Ｔ細胞レセプターへのこれら抗原の結合は、ＭＨＣ抗原提示の状況では、Ｔ細胞活性化をもたらす細胞内変化を開始する。
【０００４】
改変されたまたは改変されていない細胞（例えば、Ｔ細胞）が患者に投与される細胞治療の使用がますます増加しつつある。いくつかの例では、細胞は、異種遺伝子を発現するように遺伝子操作され、次いで、患者へと投与される。異種遺伝子は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現させるために使用され得る。このキメラ抗原レセプターは、ＭＨＣ抗原提示の必要なくＴ細胞に抗原特異性を伝えるためにデザインされた人工レセプターである。それらは、Ｔ細胞を活性化し、特異免疫をもたらすように選択された、抗原特異的構成成分、膜貫通構成成分および細胞内構成成分を含む。キメラ抗原レセプター発現Ｔ細胞は、がん治療をはじめとした様々な治療において使用され得る。これら処置は、例えば、腫瘍を排除のために標的化するために、ならびにがんおよび血液障害を処置するために使用されるが、これら治療は、負の副作用を有し得る。治療用細胞誘発性有害事象のいくつかの場合には、治療用細胞の迅速かつほぼ完全な排除の必要性がある。過度のオンターゲット効果（例えば、大きな腫瘍塊に対して指向されるもの）は、腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはマクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）と関連するサイトカインストームをもたらし得る。結果として、それらが重大有害事象（ＳＡＥ）を引き起こす事象において移入されたＴ細胞または幹細胞を排除し得るか、または処置後にもはや用いられなくなり得る安定な、信頼性のある「自殺遺伝子」の開発は非常に重要である。なお場合によっては、治療の必要性は残り得、十分な治療レベを維持しながら、負の効果を減少するための方法が存在し得る。
【０００５】
従って、治療の有益な効果のうちの一部またはすべてを保持しながら、細胞治療において使用されるドナー細胞の考えられる負の効果を迅速に除去するために、治療用細胞のコントロールされた排除の必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して指向されるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現する自家Ｔ細胞は、９０％に近づく客観的奏効（ＯＲ）率を伴って、ある種のタイプの白血病（「液性腫瘍」）およびリンパ腫の処置に関する初期の臨床試験において形質転換効果を有していた。それらの臨床的有望性が大きいことにも関わらず、この成功は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）に代表的なその観察される高レベルのオンターゲット、オフ腫瘍有害事象（high  level  of  on-target,  off-tumor  adverse  event）によって抑えられる。リスクを最小にしながらこれらの画期的な処置の利益を維持するために、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の活性レベルをコントロールするために整調可能な安全スイッチが開発された。誘導性共刺激キメラポリペプチドは、細胞において共発現されるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の持続的で調節されたコントロールを可能にする。リガンド誘導物質は、誘導性キメラシグナル伝達分子を多量体化することによってＣＡＲ発現細胞を活性化し、これは翻って、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路および他の細胞内シグナル伝達経路を誘導し、標的細胞、例えば、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫ−Ｔ）細胞の活性化をもたらす。リガンド誘導物質の非存在下では、Ｔ細胞は、静止状態であるか、または基底レベルの活性を有する。
【０００７】
小分子での二量体化の化学的誘導（ＣＩＤ）は、タンパク質機能のスイッチを生成して、細胞生理を変化させるために使用される有効な技術である。高い特異性の効率的二量体化剤は、リミズシド（ＡＰ１９０３）であり、これは、テールトゥーテール（ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ）に配置された２個の同一のタンパク質結合表面を有し、各々は、ＦＫＢＰ１２の変異体：ＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ）（ＦＫＢＰ１２ｖ３６、ＦＶ３６またはＦｖ）に対して高い親和性および特異性を有する。ホモ二量体化に通常は依拠する１個またはこれより多くの細胞シグナル伝達分子上への１個またはこれより多くのＦＶドメインの結合は、そのタンパク質をリミズシドコントロールへと変換し得る。リミズシドでのホモ二量体化は、誘導性カスパーゼ安全スイッチの状況で使用される。別個の二量体化剤リガンドによってコントロールされるこの分子スイッチは、ヘテロ二量体化小分子、ラパマイシン、またはラパマイシンアナログ（「ラパログ」）に基づいた。ラパマイシンは、ＦＫＢＰ１２およびそのバリアントに結合し、ＦＫＢＰ１２およびｍＴＯＲのＦＫＢＰ−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインを含むポリペプチドの両方に結合することによって、ＦＫＢＰ１２に融合されるシグナル伝達ドメインのヘテロ二量体化を誘導し得る。本出願のいくつかの実施形態において提供されるのは、治療適用のための薬剤として、ラパマイシン、ラパログおよびリミズシドの使用を大いに増大させる分子スイッチである。
【０００８】
二重スイッチ技術の一実施形態において、ホモ二量体化剤（例えば、ＡＰ１９０３（リミズシド））は、ＦＫＢＰ１２多量体化領域を含むキメラカスパーゼポリペプチド（これは、改変された細胞において発現される）の二量体化または多量体化を直接誘導し、アポトーシスをもたらす。他の実施形態において、ＦＫＢＰ１２多量体化を含むキメラカスパーゼポリペプチドは、多量体化されるか、またはヘテロ二量体化剤（例えば、ラパマイシンまたはラパログ）に結合することによって凝集される。このヘテロ二量体化剤はまた、例えば、キメラ抗原レセプターなどの、上記改変された細胞においても発現されるキメラポリペプチド上のＦＲＢまたはＦＲＢバリアント多量体化領域にも結合する。両方のキメラポリペプチドへのこの結合は、改変された細胞のアポトーシスを引き起こす。
【０００９】
ラパマイシンは、高親和性（＜１ｎＭ）でＦＫＢＰ１２に結合する天然生成物マクロライドであり、ｍＴＯＲのＦＫＢＰ−ラパマイシン結合（ＦＫＢＰ−Ｒａｐａｍｙｃｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ（ＦＲＢ））ドメインとの高親和性の阻害性相互作用を一緒に開始する。ＦＲＢは、小さく（８９アミノ酸）、それによって、多くのタンパク質に付加される場合に、タンパク質「タグ」または「ハンドル」として使用され得る。ＦＲＢ融合タンパク質と第２のＦＫＢＰ１２融合タンパク質との共発現は、それらの近似をラパマイシン誘導性にする（１２−１６）。これおよび続く実施例は、ＦＲＢ結合カスパーゼ−９とＦＫＢＰ結合カスパーゼ−９（ｉＣ９）との発現はまたアポトーシスを指向し得るかどうかを試験し、経口的に利用可能なリガンド、ラパマイシン、または低い治療用量でｍＴＯＲを阻害しないが、代わりに、選択されたカスパーゼ−９融合変異体ＦＲＢドメインと結合するラパマイシンの誘導体（ラパログ）によって制御される細胞安全スイッチの基本として働くようにデザインされた実験および結果を提供する（Ｓａｂａｔｉｎｉ  ＤＭ，ら，  Ｃｅｌｌ．  １９９４；７８（１）：３５−４３；Ｂｒｏｗｎ  ＥＪ，ら．，  Ｎａｔｕｒｅ．  １９９４；３６９（６４８３）：７５６−８；  Ｃｈｅｎ  Ｊ，ら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９５；９２（１１）：４９４７−５１；およびＣｈｏｉ  Ｊ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９６；２７３（５２７２）：２３９−４２を参照のこと）。
【００１０】
一例では、２つのコントロールレベルが、治療用細胞において提供される。この例では、その第１のコントロールレベルは、「整調可能」であり得る。すなわち、上記治療用細胞の除去レベルは、上記治療用細胞の部分的除去を生じるようにコントロールされ得る。いくつかの例では、キメラ抗原ポリペプチドは、ラパマイシン、またはラパマイシンアナログの結合部位を含む；自殺遺伝子（例えば、カスパーゼポリペプチドをコードするものなど）は、上記治療用細胞にも存在する。このコントロール可能な第１のレベルを使用して、継続した治療の必要性は、負の副作用を排除またはそのレベルを減少させる必要性とバランスがとられ得る。いくつかの実施形態において、ラパマイシンアナログ、ラパログは、患者に投与され、次いで、それは、カスパーゼポリペプチドおよびキメラ抗原レセプターの両方に結合し、従って、カスパーゼポリペプチドをＣＡＲの場所へと動員し、カスパーゼポリペプチドを凝集させる。凝集の際に、カスパーゼポリペプチドは、アポトーシスを誘導する。患者に投与されるラパマイシンまたはラパマイシンアナログの量は、変動し得る；アポトーシスによるより低い細胞レベルの除去が、副作用を減少させ、ＣＡＲ治療を継続するために望ましい場合、より低いレベルのラパマイシンまたはラパマイシン（rapamycin  or  rapamycin）が、患者に投与され得る。この例では、第２のコントロールレベルは、細胞排除の最大レベルを達成するために設計され得る。この第２のレベルは、例えば、リミズシド、またはＡＰ１９０３の使用に基づき得る。上記治療用細胞の１００％までを迅速に排除する必要性がある場合、上記ＡＰ１９０３は、患者に投与され得る。多量体ＡＰ１９０３は、カスパーゼポリペプチドに結合し、カスパーゼポリペプチドの多量体化およびアポトーシスをもたらす。ある種の例では、第２のレベルはまた、上記被験体に投与されるＡＰ１９０３のレベルによって整調可能であり得るかまたはコントロールされ得る。
【００１１】
上記第２の治療用細胞排除レベルでは、選択的アポトーシスは、リミズシド（ＡＰ１９０３）を投与することによって、二量体リガンド結合ポリペプチド（例えば、ＡＰ１９０３結合ポリペプチドＦＫＢＰ１２ｖ３６など）に融合されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドを発現する細胞において誘導され得る。いくつの例では、上記カスパーゼ−９ポリペプチドは、誘導性キメラポリペプチドの一部として、野生型カスパーゼ−９ポリペプチドより低い基底アポトーシス活性レベルを生じるアミノ酸置換を含む。
【００１２】
従って、いくつかの実施形態において、第１のキメラポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで上記第１のキメラポリペプチドは、膜会合ポリペプチド領域および第１の多量体化領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに第２のキメラポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで上記第２のキメラポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域および第２の多量体化領域を含み、ここで上記第２の多量体化領域は、上記第１の多量体化領域とは異なるアミノ酸配列を有する、第２のポリヌクレオチドを含む改変された細胞であって；ここで上記第１の多量体化領域および第２の多量体化領域は、第１の多量体リガンドに結合する、細胞が提供される。いくつかの実施形態において、上記第２の多量体化領域は、第１の多量体リガンドに結合し、前記第１の多量体化領域に有意に結合しない第２の多量体リガンドに結合する。いくつかの実施形態において、上記第１のリガンドは、第１の部分を含み、上記第１の多量体化領域は、上記第１の部分に結合し、上記第２の多量体化領域は、上記第１の部分に有意に結合しない。いくつかの実施形態において、上記第１の多量体化領域は、上記第２の多量体リガンドに結合できない。いくつかの実施形態において、上記第１の多量体化領域および第２の多量体化領域は、ラパマイシンまたはラパログに結合する。
【００１３】
第１のキメラポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで上記第１のキメラポリペプチドは、膜会合ポリペプチド領域および第１の多量体化領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに第２のキメラポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで上記第２のキメラポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域および第２の多量体化領域を含み、ここで上記第２の多量体化領域は、上記第１の多量体化領域とは異なるアミノ酸配列を有する、第２のポリヌクレオチドに作用的に連結されたプロモーターを含む核酸もまた、いくつかの実施形態において提供され、ここで上記第１の多量体化領域および第２の多量体化領域は、第１の多量体リガンドに結合する。いくつかの実施形態において、キメラ抗原レセプターをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで上記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、（ｉｉｉ）抗原認識部分、および（ｉｖ）ＦＲＢ領域またはＦＲＢバリアント領域を含む第１のポリヌクレオチド；ならびにキメラカスパーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで上記キメラカスパーゼポリペプチドは、（ｉ）ＦＫＢＰ１２領域またはＦＫＢＰ１２バリアント領域、および（ｉｉ）カスパーゼポリペプチドを含む、第２のポリヌクレオチドを含む核酸もまた、提供される。
【００１４】
被験体において移植された改変された細胞の生存をコントロールするための方法もまた、いくつかの実施形態において提供され、上記方法は、本出願の改変された細胞を上記被験体に移植すること；およびｂ）  （ａ）の後に、上記被験体に、ラパマイシンまたはラパログを、上記アポトーシス促進ポリペプチド領域を含む第２のキメラポリペプチドを発現する改変された細胞のうちの３０％まで、または少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％を殺滅するために有効な量で投与することを包含する。いくつかの実施形態において、上記第２の多量体化領域は、ＦＫＢＰ１２領域またはＦＫＢＰ１２バリアント領域であり、上記アポトーシス促進ポリペプチド領域を含む第２のキメラポリペプチド上のＦＫＢＰ１２領域またはＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを、上記第２のキメラポリペプチドを発現する改変された細胞のうちの少なくとも９０％を殺滅するために有効な量で投与することをさらに包含する。
【００１５】
被験体において移植された改変された細胞の生存をコントロールする方法もまた、いくつかの実施形態において提供され、上記方法は、ａ）本出願の改変された細胞を上記被験体に移植すること；およびｂ）  （ａ）の後に、上記被験体に、上記アポトーシス促進ポリペプチド領域を含む第２のキメラポリペプチド上のＦＫＢＰ１２領域またはＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを、上記第２のキメラポリペプチドを発現する改変された細胞のうちの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を殺滅するために有効な量で投与することを包含する。いくつかの実施形態において、同種反応性の改変された細胞は、上記被験体に存在し、同種反応性の改変された細胞の数は、ラパマイシン、ラパログの投与後に、少なくとも９０％減少する。
【００１６】
標的細胞によって発現される標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法もまた、いくつかの実施形態において提供され、上記方法は、（ａ）上記被験体に、有効量の本出願の改変された細胞を投与することであって、ここで上記改変された細胞は、上記標的抗原に結合するキメラ抗原レセプターまたはＴ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む、投与すること；および（ｂ）  ａ）の後に、有効量のラパマイシンまたはラパログを投与することを包含する。いくつかの実施形態において、被験体において移植された改変された細胞の生存をコントロールするための方法であって、ここで本出願の改変された細胞は、上記被験体に移植されている方法が提供され、上記方法は、上記改変された細胞を上記被験体から除去することを要する上記被験体における状態の有無を同定すること、および上記患者において同定された状態の有無に基づいて、ラパマイシンもしくはラパログ、または上記ＦＫＢＰ１２領域もしくはＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与するか、上記患者へのその後の投与量を維持するか、またはその後の投与量を調整することを包含する。
【００１７】
本出願のいくつかの実施形態において、上記第１の多量体化領域は、ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）領域またはＦＲＢバリアント領域を含む。いくつかの実施形態において、上記第１の多量体化領域は、ＦＲＢＬを含む。いくつかの実施形態において、上記第１の多量体化領域は、少なくとも２個のＦＲＢ領域またはＦＲＢバリアント領域を含む。いくつかの実施形態において、上記第２の多量体化領域は、ＦＫＢＰ１２領域またはＦＫＢＰ１２バリアント領域を含む。いくつかの実施形態において、上記第２の多量体化領域は、ＦＫＢＰｖ３６領域を含む。いくつかの実施形態において、上記第２のリガンドは、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、およびＡＰ１５１０からなる群より選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、上記膜会合ポリペプチドは、Ｔ細胞レセプターを含む。いくつかの実施形態において、上記膜会合ポリペプチドは、キメラ抗原レセプターを含む。いくつかの実施形態において、上記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ−９ポリペプチドである。
【００１９】
いくつかの実施形態において、第１のキメラポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで上記第１のキメラポリペプチドは、膜会合ポリペプチド領域および第１のリガンド結合領域を含む、第1のポリヌクレオチド；ならびに第２のキメラポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで上記第２のキメラポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域および第２のリガンド結合領域を含み、ここで上記第２のリガンド結合領域は、上記第１のリガンド結合領域とは異なるアミノ酸配列を有する、第２のポリヌクレオチドを含む改変された細胞であって；ここで上記第１のリガンド結合領域および第２のリガンド結合領域は、第１の多量体リガンドに結合できる、細胞が提供される。
【００２０】
ある種の実施形態において、キメラ抗原レセプターをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで上記キメラ抗原レセプターは、ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびにキメラカスパーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで上記キメラカスパーゼポリペプチドは、（ｉ）ＦＫＢＰ１２多量体化領域および（ｉｉ）カスパーゼポリペプチドを含む、第２のポリヌクレオチドを含む改変された細胞が提供される。キメラ抗原レセプターをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで上記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、（ｉｉｉ）抗原認識部分、および（ｉｖ）ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびにキメラカスパーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで上記キメラカスパーゼポリペプチドは、（ｉ）ＦＫＢＰ１２多量体化領域および（ｉｉ）カスパーゼポリペプチドを含む、第２のポリヌクレオチドを含む改変された細胞がまた、提供される。キメラ抗原レセプターをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで上記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、（ｖ）抗原認識部分、およびＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびにキメラカスパーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで上記キメラカスパーゼポリペプチドは、（ｉ）ＦＫＢＰ１２多量体化領域および（ｉｉ）カスパーゼポリペプチドを含む、第２のポリヌクレオチドを含む改変された細胞もまた、提供される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、上記キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、最適化したコドンを含む。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ヒト細胞である。本出願の細胞は、真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、またはヒトの細胞の任意のタイプであり得る。いくつかの実施形態において、上記細胞は、前駆体細胞である。いくつかの実施形態において、上記細胞は、造血前駆体細胞である。いくつかの実施形態において、上記細胞は、間葉系ストローマ細胞、胚性幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、上記細胞は、骨髄から得られるかまたは骨髄から調製される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、臍帯血から得られるかまたは臍帯血から調製される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、末梢血単核球から得られるかまたは末梢血単核球から調製される。
【００２２】
いくつかの局面において、上記キメラポリペプチドまたは改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、発生的に制御され、上記カスパーゼ−９ポリペプチドは、発生的に分化した細胞において発現される。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、組織特異的であり、上記カスパーゼ−９ポリペプチドは、特異的組織において発現される。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、活性化Ｔ細胞において活性化される。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、５’ＬＴＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、上記キメラタンパク質は、マーカーポリペプチド（例えば、ΔＣＤ１９ポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない）をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記カスパーゼ−９ポリペプチドは、短縮型カスパーゼ−９ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、上記カスパーゼ−９ポリペプチドは、カスパーゼ動員ドメインを欠いている。
【００２３】
いくつかの実施形態において、上記多量体化領域は、ＦＫＢＰ１２、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、フレキシブルリンカードメインによって隔てられた重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをタンデムで含む一本鎖抗体、およびこれらの変異された配列からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記多量体化領域は、ＦＫＢＰ１２領域である。いくつかの実施形態において、上記ＦＫＢ１２領域は、ＦＫＢ１２ｖ３６領域である。いくつかの実施形態において、上記多量体化領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである。いくつかの実施形態において、上記多量体化領域は、ＦＫ５０６二量体および二量体ＦＫ５０６アナログリガンドからなる群より選択されるリガンドを結合する。いくつかの実施形態において、上記リガンドは、ＡＰ１９０３であり、他の実施形態において、上記リガンドは、ＡＰ２０１８７である。いくつかの実施形態において、上記多量体化領域は、配列番号２９のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する。いくつかの実施形態において、上記多量体化領域は、配列番号３０のヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントによってコードされる。いくつかの実施形態において、上記多量体化領域は、配列番号３２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその機能的フラグメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記多量体化領域は、配列番号３１のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記多量体化領域は、配列番号３２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその機能的フラグメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記多量体化領域は、配列番号３１のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記多量体化領域は、配列番号２９もしくは配列番号３２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその機能的フラグメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記多量体化領域は、配列番号３０もしくは配列番号３１のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、またはその機能的フラグメントをさらに含む。
【００２４】
本出願のいくつかの局面において、上記細胞は、ウイルスベクターで形質導入またはトランスフェクトされる。上記ウイルスベクターは、例えば、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルスベクターが挙げられるが、これに限定されない）；ＳＦＧベクター；およびアデノウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターであり得るが、これらに限定されない。
【００２５】
いくつかの実施形態において、上記細胞は、単離される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ヒト被験体の中にある。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ヒト被験体において移植される。
【００２６】
いくつかの実施形態において、個別化された処置が提供され、ここで上記疾患または状態のステージまたはレベルは、上記多量体リガンドを投与する前に、上記多量体リガンドのさらなる用量を投与する前に、または上記多量体リガンド投与に関与する方法および投与量を決定するにあたって、決定される。これら方法は、本出願の疾患または状態のうちのいずれかに対する上記方法のうちのいずれかにおいて使用され得る。上記リガンドを投与する前に上記患者を評価するためのこれらの方法が、移植片対宿主病の状況において論じられる場合、これらの方法が、他の状態および疾患の処置にも同様に適用され得ることは、理解される。従って、例えば、本出願のいくつかの実施形態において、上記方法は、治療用細胞を患者に投与することを包含し、そしてトランスフェクトまたは形質導入された治療用細胞を上記患者から除去することを要する該患者における状態の有無を同定すること；および上記患者において同定された状態の有無に基づいて、上記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、上記患者に対する上記多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または上記多量体リガンドのその後の投与量を調整することをさらに包含する。そして、例えば、本出願の他の実施形態において、上記方法は、上記患者における移植片対宿主病の症状の出現に基づいて、上記多量体リガンドのさらなる単一用量またはさらなる複数用量を上記患者に投与するかどうかを決定することをさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記患者において移植片対宿主病の有無またはステージを同定すること、および上記患者において同定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、上記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、上記患者に対する上記多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または上記多量体リガンドのその後の投与量を調整することをさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記患者において移植片対宿主病の有無またはステージを同定すること、および上記患者において同定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、上記多量体化領域に結合する多量体リガンドが上記患者に投与されるべきか、または上記患者にその後投与される上記多量体リガンドの投与量が、または調整されるかを決定することをさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記患者において移植片対宿主病の有無またはステージを含む情報を受け取ること；および上記患者において同定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、上記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、上記患者への上記多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または多量体リガンドのその後の投与量を調整することをさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記患者において移植片対宿主病の有無またはステージを同定すること、および上記被験体において同定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて上記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、上記患者に投与される上記多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または上記多量体リガンドのその後の投与量を調整する意思決定者に、上記移植片対宿主病の有無またはステージを伝達することをさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記患者において移植片対宿主病の有無またはステージを同定すること、ならびに上記被験体において同定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、上記多量体結合領域に結合する多量体リガンドを投与するか、上記患者に投与される上記多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または上記多量体リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝達することをさらに包含する。
【００２７】
ドナーＴ細胞をヒト患者に投与するための方法もまた提供され、上記方法は、本出願の形質導入またはトランスフェクトされたＴ細胞をヒト患者に投与することを包含し、ここで上記細胞は、非同種枯渇（non-allodepleted）ヒトドナーＴ細胞である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、上記治療用細胞は、非悪性障害を有する被験体に投与され、またはここで上記被験体は、例えば、原発性免疫不全障害（例えば、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＫ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全などが挙げられるが、これらに限定されない）、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）または他の血球貪食障害、遺伝性骨髄不全障害（Inherited  Marrow  Failure  Disorder）（例えば、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンドブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症などが挙げられるが、これらに限定されない）、ヘモグロビン異常症（例えば、鎌状赤血球症、サラセミアなどが挙げられるが、これらに限定されない）、代謝障害（例えば、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスなどが挙げられるが、これらに限定されない）、または破骨細胞障害（例えば、大理石骨病が挙げられるが、これらに限定されない）などの非悪性障害と診断されている。
【００２９】
上記治療用細胞は、例えば、所望の治療結果のために患者に投与される任意の細胞であり得る。上記細胞は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、末梢血細胞、造血前駆体細胞、骨髄細胞、または腫瘍細胞であり得る。上記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドはまた、腫瘍細胞を直接殺滅するために使用され得る。１つの適用において、上記誘導性の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、腫瘍へと注射され、１０〜２４時間後に（タンパク質発現を可能にするために）、上記リガンド誘導物質（例えば、ＡＰ１９０３など）は、アポトーシスを引き起こすために投与され、腫瘍抗原の微小環境への放出を引き起こす。腫瘍微小環境をさらに改善してより免疫原性にするために、処置は、１種またはこれより多くのアジュバント（例えば、ＩＬ−１２、ＴＬＲ、ＩＤＯ阻害剤など）と組み合わされ得る。いくつかの実施形態において、上記細胞は、固形腫瘍を処置するために送達され得る（例えば、腫瘍床への上記細胞の送達など）。いくつかの実施形態において、上記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ワクチンの一部として、または腫瘍床への直接送達によって投与され得、上記腫瘍細胞におけるキメラカスパーゼ−９ポリペプチドの発現を生じ、続いて、上記リガンド誘導物質の投与後に腫瘍細胞のアポトーシスが生じる。従って、いくつかの実施形態において、核酸ワクチン（例えば、ＤＮＡワクチン）もまた提供され、ここで上記ワクチンは、本出願の誘導性、または改変された誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む。上記ワクチンは、被験体へと投与され得、それによって標的細胞をインビボで形質転換または形質導入し得る。上記リガンド誘導物質は、次いで、本出願の方法に従って投与され得る。
【００３０】
いくつかの実施形態において、上記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、短縮型の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、上記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、カスパーゼ動員ドメインを欠いている。いくつかの実施形態において、上記カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含むか、または配列番号８のヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントによってコードされる。
【００３１】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与することをさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、フレキシブルリンカードメインによって隔てられた、タンデムの重鎖可変領域と重鎖可変領域とからなる一本鎖抗体、およびこれらの変異した配列からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域である。いくつかの実施形態において、上記多量体リガンドは、ＦＫ５０６二量体または二量体ＦＫ５０６様アナログリガンドである。いくつかの実施形態において、上記多量体リガンドは、ＡＰ１９０３である。いくつかの実施形態において、治療用細胞の数は、上記多量体リガンドの投与後に約６０％〜９９％、約７０％〜９５％、８０％〜９０％または約９０％もしくはこれ超低減する。いくつかの実施形態において、上記多量体リガンドの投与後に、ドナーＴ細胞は、上記患者の中で生存し、拡大することができかつウイルスおよび真菌に反応性である。いくつかの実施形態において、上記多量体リガンドの投与後に、ドナーＴ細胞は、上記患者の中で生存し、拡大することができかつ上記患者において腫瘍細胞に反応性である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、上記第２のレベルのコントロールにおいて使用される自殺遺伝子は、カスパーゼポリペプチド、例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、またはカスパーゼ１４である。ある種の実施形態において、上記カスパーゼポリペプチドは、カスパーゼ−９ポリペプチドである。ある種の実施形態において、上記カスパーゼ−９ポリペプチドは、本明細書中の表５または表６の中に提供される触媒として活性な（触媒として死んでいない）カスパーゼバリアントポリペプチドのアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、上記カスパーゼ−９ポリペプチドは、本明細書中の表５または表６の中に提供される触媒として活性な（触媒として死んでいない）カスパーゼバリアントポリペプチドのアミノ酸配列からなる。他の実施形態において、上記リガンド誘導物質の非存在下でより低い基底活性を有するカスパーゼポリペプチドが、使用され得る。例えば、誘導性キメラカスパーゼポリペプチドの一部として含まれる場合、ある種の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、キメラ構築物の中の野生型カスパーゼ−９と比較して、より低い基底活性を有し得る。例えば、上記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号９と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、少なくとも１個のアミノ酸置換を含み得る。
【００３３】
ある特定の実施形態は、以下の説明、実施例、請求項および図面においてさらに論じられる。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ａ）第１のキメラポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該第１のキメラポリペプチドは、膜会合ポリペプチド領域および第１の多量体化領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）第２のキメラポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該第２のキメラポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域および第２の多量体化領域を含み、ここで該第２の多量体化領域は、該第１の多量体化領域とは異なるアミノ酸配列を有する、第２のポリヌクレオチド；
を含む改変された細胞であって、
ここで該第１の多量体化領域および第２の多量体化領域は、第１の多量体リガンドに結合する、
改変された細胞。
（項目２）
前記第２の多量体化領域は、前記第１の多量体リガンドに結合し、前記第１の多量体化領域に有意に結合しない第２の多量体リガンドに結合する、項目１に記載の改変された細胞。
（項目３）
前記第１のリガンドは、第１の部分を含み、
前記第１の多量体化領域は、該第１の部分に結合し、そして
前記第２の多量体化領域は、該第１の部分に有意に結合しない、
項目１または項目２に記載の改変された細胞。
（項目４）
前記第１のリガンドは、第１の単量体を含み、
前記第１の多量体化領域は、該第１の単量体に結合し、そして
前記第２の多量体化領域は、該第１の単量体に有意に結合しない、
項目１または項目２に記載の改変された細胞。
（項目５）
前記第１の多量体化領域は、前記第２の多量体リガンドに結合できない、項目１〜３のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目６）
前記第１の多量体化領域および第２の多量体化領域は、ラパマイシンまたはラパログに結合する、項目１〜４のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目７）
前記ラパログは、Ｓ−ｏ，ｐ−ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）−ラパマイシン、Ｒ−イソプロポキシラパマイシン、およびＳ−ブタンスルホンアミドラプからなる群より選択される、項目６に記載の改変された細胞。
（項目８）
前記第１の多量体化領域は、ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）領域またはＦＲＢバリアント領域を含む、項目１〜７のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目９）
前記第１の多量体化領域は、ＫＬＷ（Ｔ２０９８Ｌ）、ＫＴＦ（Ｗ２１０１Ｆ）、およびＫＬＦ（Ｔ２０９８Ｌ、Ｗ２１０１Ｆ）からなる群より選択されるＦＲＢバリアント領域を含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１０）
前記第１の多量体化領域は、ＦＲＢＬを含む、項目１〜９のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１１）
前記第１の多量体化領域は、少なくとも２個のＦＲＢ領域またはＦＲＢバリアント領域を含む、項目１〜１０のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１２）
前記第１の多量体化領域は、少なくとも３個のＦＲＢ領域またはＦＲＢバリアント領域を含む、項目１〜１０のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１３）
前記第２の多量体化領域は、ＦＫＢＰ１２領域またはＦＫＢＰ１２バリアント領域を含む、項目１〜１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１４）
前記第２の多量体化領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される３６位でのアミノ酸置換を有するＦＫＢＰ１２バリアント領域である、項目１〜１３のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１５）
前記第２の多量体化領域は、ＦＫＢＰｖ３６領域を含む、項目１３に記載の改変された細胞。
（項目１６）
前記第２のリガンドは、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、およびＡＰ１５１０からなる群より選択される、項目１〜１５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１７）
前記膜会合ポリペプチドは、抗原認識部分を含む、項目１〜１６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１８）
前記膜会合ポリペプチドは、Ｔ細胞レセプターを含む、項目１〜１６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１９）
前記膜会合ポリペプチドは、キメラ抗原レセプターを含む、項目１〜１６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２０）
前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、項目１９に記載の改変された細胞。
（項目２１）
前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域および（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、ならびに（ｖ）抗原認識部分を含む、項目１９に記載の改変された細胞。
（項目２２）
前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）４−１ＢＢ、ＯＸ４０、およびＣＤ２８からなる群より選択される共刺激ポリペプチド、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、ならびに（ｉｖ）抗原認識部分を含む、項目１９に記載の改変された細胞。
（項目２３）
前記膜会合ポリペプチド領域は、膜貫通ポリペプチドまたは膜標的化領域である、項目１〜２２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２４）
前記膜標的化領域は、ミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域、ＮＫＧ２Ｄレセプター、およびレセプターの膜貫通配列からなる群より選択される、項目２３に記載の改変された細胞。
（項目２５）
前記第１のリガンドは、Ｓ−ｏ，ｐ−ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）−ラパマイシン、Ｒ−イソプロポキシラパマイシン、およびＳ−ブタンスルホンアミドラプからなる群より選択されるラパログである、項目１〜２４のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２６）
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、またはカスパーゼ１４、ＦＡＤＤ（ＤＥＤ）、ＡＰＡＦ１（ＣＡＲＤ）、ＣＲＡＤＤ／ＲＡＩＤＤ  ＣＡＲＤ）、ＡＳＣ（ＣＡＲＤ）、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、ＲＩＰＫ３、およびＲＩＰＫ１−ＲＨＩＭからなる群より選択される、項目１〜２５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２７）
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼポリペプチドである、項目１〜２６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２８）
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ−９ポリペプチドである、項目２７に記載の改変された細胞。
（項目２９）
前記カスパーゼポリペプチドは、配列番号３００のアミノ酸配列を含む、項目２８に記載の改変された細胞。
（項目３０）
前記カスパーゼポリペプチドは、表５または表６中の触媒として活性なカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、項目２８に記載の改変された細胞。
（項目３１）
前記カスパーゼポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、およびＮ４０５Ｑからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、項目２８に記載の改変された細胞。
（項目３２）
ａ）キメラ抗原レセプターをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、（ｉｉｉ）抗原認識部分、および（ｉｖ）ＦＲＢ領域またはＦＲＢバリアント領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）キメラカスパーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラカスパーゼポリペプチドは、（ｉ）ＦＫＢＰ１２領域またはＦＫＢＰ１２バリアント領域および（ｉｉ）カスパーゼポリペプチドを含む、第２のポリヌクレオチド、を含む改変された細胞。
（項目３３）
前記キメラ抗原レセプターは、共刺激ポリペプチドをさらに含む、項目３２に記載の改変された細胞。
（項目３４）
前記共刺激ポリペプチドは、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４−１ＢＢからなる群より選択される、項目３３に記載の改変された細胞。
（項目３５）
ａ）キメラ抗原レセプターをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、（ｖ）抗原認識部分、および（ｖｉ）ＦＲＢ領域またはＦＲＢバリアント領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）キメラカスパーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラカスパーゼポリペプチドは、（ｉ）ＦＫＢＰ１２領域またはＦＫＢＰ１２バリアント領域および（ｉｉ）カスパーゼポリペプチドを含む、第２のポリヌクレオチド、を含む改変された細胞。
（項目３６）
ＦＲＢ領域またはＦＲＢバリアント領域は、ＫＬＷ（Ｔ２０９８Ｌ）、ＫＴＦ（Ｗ２１０１Ｆ）、およびＫＬＦ（Ｔ２０９８Ｌ、Ｗ２１０１Ｆ）からなる群より選択される、項目３２〜３５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目３７）
前記ＦＲＢバリアント領域は、ＦＲＢＬである、項目３２〜３５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目３８）
前記第１の多量体化領域は、ＦＲＢＬであり、前記第２の多量体化領域は、ＦＫＢＰｖ３６である、項目１〜３７のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目３９）
前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドからなる群より選択される、項目２０、または３２〜３８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目４０）
ａ）第１のキメラポリペプチドであって、ここで該第１のキメラポリペプチドは、膜会合ポリペプチド領域および第１の多量体化領域を含む、第１のキメラポリペプチド；ならびに
ｂ）第２のキメラポリペプチドであって、ここで該第２のキメラポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域および第２の多量体化領域を含み、ここで該第２の多量体化領域は、該第１の多量体化領域とは異なるアミノ酸配列を有する、第２のキメラポリペプチド；
を含む改変された細胞であって、
ここで該第１の多量体化領域および第２の多量体化領域は、第１の多量体リガンドに結合する、
改変された細胞。
（項目４１）
前記第１のキメラポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、項目４０に記載の改変された細胞。
（項目４２）
ａ）キメラ抗原レセプターをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、（ｉｉｉ）抗原認識部分、（ｉｖ）ＦＲＢＬ領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）キメラカスパーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラカスパーゼポリペプチドは、（ｉ）ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域および（ｉｉ）ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ−９ポリペプチドを含む、第２のポリヌクレオチド、を含む改変された細胞。
（項目４３）
ａ）キメラ抗原レセプターをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、（ｖ）抗原認識部分、（ｖ）ＦＲＢＬ領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）キメラカスパーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラカスパーゼポリペプチドは、（ｉ）ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域および（ｉｉ）ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ−９ポリペプチドを含む、第２のポリヌクレオチド、を含む改変された細胞。
（項目４４）
前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍｕｃ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ４４ｖ６からなる群より選択される抗原に結合する、項目１７、２０〜２２、３２〜３９、または４２〜４３のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目４５）
前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、項目１７、２０〜２２、３２〜３９、または４２〜４４のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目４６）
前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である、項目２０〜２２、２３、３２〜３９、または４２〜４５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目４７）
ａ）少なくとも１個のＦＲＢ領域またはＦＲＢバリアント領域を含むキメラＴ細胞レセプターをコードする第１のポリヌクレオチド；および
ｂ）キメラカスパーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラカスパーゼポリペプチドは、（ｉ）ＦＫＢＰ１２領域またはＦＫＢＰ１２バリアント領域、および（ｉｉ）カスパーゼポリペプチドを含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む改変された細胞。
（項目４８）
前記Ｔ細胞レセプターは、ＰＲＡＭＥ、Ｂｏｂ−１、およびＮＹ−ＥＳＯ−１からなる群より選択される抗原性ポリペプチドに結合する、項目１８または４７のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目４９）
前記短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２１４のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目２１、３５〜３９、または４６〜４７のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目５０）
前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、配列番号２１６のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目２１、３５〜３９、または４６〜４９のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目５１）
前記膜会合ポリペプチドは、ＮＫＧ２Ｄレセプターである、項目１〜１６、２５〜３９、または４２〜５０のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目５２）
前記細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、項目１〜５１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目５３）
前記細胞は、Ｔ細胞である、項目１〜５１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目５４）
前記細胞は、初代Ｔ細胞である、項目１〜５１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目５５）
前記細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である、項目１〜５１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目５６）
前記細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非リンパ球性造血細胞、非造血細胞、マクロファージ、ケラチノサイト、線維芽細胞、メラノーマ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはＴ細胞からなる群より選択される、項目１〜５１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目５７）
前記Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞である、項目１〜５１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目５８）
前記細胞は、骨髄から得られるかまたは骨髄から調製される、項目１〜５１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目５９）
前記細胞は、臍帯血から得られるかまたは臍帯血から調製される、項目１〜５８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目６０）
前記細胞は、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される、項目１〜５８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目６１）
前記細胞は、末梢血単核細胞から得られるかまたは末梢血単核細胞から調製される、項目１〜５８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目６２）
前記細胞は、ヒト細胞である、項目１〜６１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目６３）
前記改変された細胞は、インビボで形質導入またはトランスフェクトされる、項目１〜６２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目６４）
前記細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子での遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスからなる群より選択される方法を使用して、核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される、項目１〜６３のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目６５）
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドを含む、項目１〜６４のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目６６）
第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む核酸を含むキットまたは組成物であって、ここで
ａ）該第１のポリヌクレオチドは、第１のキメラポリペプチドをコードし、ここで該第１のキメラポリペプチドは、膜会合ポリペプチド領域および第１の多量体化領域を含み；そして
ｂ）該第２のポリヌクレオチドは、第２のキメラポリペプチドをコードし、ここで該第２のキメラポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域および第２の多量体化領域を含み、ここで該第２の多量体化領域は、該第１の多量体化領域とは異なるアミノ酸配列を有し；
ここで該第１の多量体化領域および第２の多量体化領域は、第１の多量体リガンドに結合する、キットまたは組成物。
（項目６７）
前記第２の多量体化領域は、前記第１の多量体リガンドに結合し、前記第１の多量体化領域に有意に結合しない第２の多量体リガンドに結合する、項目６６に記載のキットまたは組成物。
（項目６８）
前記第１のリガンドは、第１の部分を含み、
前記第１の多量体化領域は、該第１の部分に結合し、そして
前記第２の多量体化領域は、該第１の部分に有意に結合しない、
項目６６または６７のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
（項目６９）
前記第１のリガンドは、第１の単量体を含み、
前記第１の多量体化領域は、該第１の単量体に結合し、そして
前記第２の多量体化領域は、該第１の単量体に有意に結合しない、
項目６６または６７のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
（項目７０）
前記第１の多量体化領域は、前記第２の多量体リガンドに結合できない、項目６６〜６９のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
（項目７１）
前記第１の多量体化領域および第２の多量体化領域は、ラパマイシンまたはラパログに結合する、項目６６〜７０のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
（項目７２）
前記核酸は、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドを含む、項目６６〜７１のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
（項目７３）
前記第１のポリヌクレオチドを含む第１の核酸種および前記第２のポリヌクレオチドを含む第２の核酸種を含む、項目６６〜７２のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
（項目７４）
キメラ膜会合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸であって、ここで該キメラ膜会合ポリペプチドは、
ａ）膜会合ポリペプチド；および
ｂ）１個またはこれより多くの多量体化領域、
を含み、ここで
該多量体化領域は、第１の部分および第２の部分を含む多量体リガンドに結合し、
該多量体化領域は、該多量体リガンドの該第１の部分に結合するが、該多量体リガンドの該第２の部分に結合しない、
核酸。
（項目７５）
前記膜会合ポリペプチドは、キメラ抗原レセプターまたはキメラＴ細胞レセプターである、項目７４に記載の核酸。
（項目７６）
前記多量体化領域は、ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントである、項目７４または７５のいずれか１項に記載の核酸。
（項目７７）
前記多量体リガンドは、ラパマイシンまたはラパログである、項目７４〜７６のいずれか１項に記載の核酸。
（項目７８）
少なくとも２個の多量体化領域を含む、項目７４〜７７のいずれか１項に記載の核酸。
（項目７９）
ａ）第１のキメラポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該第１のキメラポリペプチドは、膜会合ポリペプチド領域および第１の多量体化領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）第２のキメラポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該第２のキメラポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域および第２の多量体化領域を含み、ここで該第２の多量体化領域は、該第１の多量体化領域とは異なるアミノ酸配列を有する、第２のポリヌクレオチド；
に作用的に連結されたプロモーターを含む核酸であって、
ここで該第１の多量体化領域および第２の多量体化領域は、第１の多量体リガンドに結合する、
核酸。
（項目８０）
前記第２の多量体化領域は、前記第１の多量体リガンドに結合し、該第１の多量体化領域に有意に結合しない第２の多量体リガンドに結合する、項目７９に記載の核酸。
（項目８１）
前記第１のリガンドは、第１の部分を含み、
前記第１の多量体化領域は、該第１の部分に結合し、そして
前記第２の多量体化領域は、該第１の部分に有意に結合しない、
項目７９または８０に記載の核酸。
（項目８２）
前記第１のリガンドは、第１の単量体を含み、
前記第１の多量体化領域は、該第１の単量体に結合し、そして
前記第２の多量体化領域は、該第１の単量体に有意に結合しない、
項目７９または項目８０に記載の核酸。
（項目８３）
前記第１の多量体化領域は、前記第２の多量体リガンドに結合できない、項目７９〜８２のいずれか１項に記載の核酸。
（項目８４）
前記第１の多量体化領域および第２の多量体化領域は、ラパマイシンまたはラパログに結合する、項目７９〜８３のいずれか１項に記載の核酸。
（項目８５）
前記ラパログは、Ｓ−ｏ，ｐ−ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）−ラパマイシン、Ｒ−イソプロポキシラパマイシン、およびＳ−ブタンスルホンアミドラプからなる群より選択される、項目８４に記載の核酸。
（項目８６）
前記第１の多量体化領域は、ＦＲＢ領域またはＦＲＢバリアント領域を含む、項目７９〜８５のいずれか１項に記載の核酸。
（項目８７）
前記第１の多量体化領域は、ＫＬＷ（Ｔ２０９８Ｌ）、ＫＴＦ（Ｗ２１０１Ｆ）、およびＫＬＦ（Ｔ２０９８Ｌ、Ｗ２１０１Ｆ）からなる群より選択されるＦＲＢバリアント領域である、項目７９〜８６のいずれか１項に記載の核酸。
（項目８８）
前記第１の多量体化領域は、ＦＲＢＬを含む、項目７９〜８７のいずれか１項に記載の核酸。
（項目８９）
前記第１の多量体化領域は、少なくとも２個のＦＲＢ領域またはＦＲＢバリアント領域を含む、項目８６〜８８のいずれか１項に記載の核酸。
（項目９０）
前記第２の多量体化領域は、ＦＫＢＰ１２領域を含む、項目７９〜８９のいずれか１項に記載の核酸。
（項目９１）
前記第２の多量体化領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される３６位でのアミノ酸置換を有するＦＫＢＰ１２バリアント領域である、項目７９〜９０のいずれか１項に記載の核酸。
（項目９２）
前記第２の多量体化領域は、ＦＫＢＰｖ３６多量体化領域を含む、項目９１に記載の核酸。
（項目９３）
前記第２のリガンドは、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、およびＡＰ１５１０からなる群より選択される、項目７９〜９２のいずれか１項に記載の核酸。
（項目９４）
前記膜会合ポリペプチドは、抗原認識部分をさらに含む、項目７９〜９３のいずれか１項に記載の核酸。
（項目９５）
前記膜会合ポリペプチドは、Ｔ細胞レセプターを含む、項目７９〜９４のいずれか１項に記載の核酸。
（項目９６）
前記膜会合ポリペプチドは、ＮＫＧ２Ｄレセプターを含む、項目７９〜９４のいずれか１項に記載の核酸。
（項目９７）
前記膜会合ポリペプチドは、キメラ抗原レセプターを含む、項目７９〜９４のいずれか１項に記載の核酸。
（項目９８）
前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、項目９７に記載の核酸。
（項目９９）
前記キメラ抗原レセプターは、膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｖ）抗原認識部分を含む、項目９８に記載の核酸。
（項目１００）
前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）４−１ＢＢ、ＯＸ４０、およびＣＤ２８からなる群より選択される共刺激ポリペプチド、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、ならびに（ｉｖ）抗原認識部分を含む、項目９７に記載の核酸。
（項目１０１）
前記膜会合領域は、膜貫通領域である、項目７９〜９４のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１０２）
前記膜会合領域は、膜標的化領域である、項目７９〜９４のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１０３）
前記膜標的化領域は、ミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域、ＮＫＧ２Ｄレセプター、およびレセプターの膜貫通配列からなる群より選択される、項目１０２に記載の核酸。
（項目１０４）
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、またはカスパーゼ１４、ＦＡＤＤ（ＤＥＤ）、ＡＰＡＦ１（ＣＡＲＤ）、ＣＲＡＤＤ／ＲＡＩＤＤ  ＣＡＲＤ）、ＡＳＣ（ＣＡＲＤ）、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、ＲＩＰＫ３、およびＲＩＰＫ１−ＲＨＩＭからなる群より選択される、項目７９〜１０３のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１０５）
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼポリペプチドである、項目７９〜１０３のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１０６）
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ−９ポリペプチドである、項目１０５に記載の核酸。
（項目１０７）
前記カスパーゼポリペプチドは、配列番号３００のアミノ酸配列を含む、項目１０６に記載の核酸。
（項目１０８）
前記カスパーゼポリペプチドは、表５または表６中の触媒として活性なカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、項目１０６に記載の核酸。
（項目１０９）
前記カスパーゼポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、およびＮ４０５Ｑからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、項目１０６に記載の核酸。
（項目１１０）
ａ）キメラ抗原レセプターをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、（ｉｉｉ）抗原認識部分、および（ｉｖ）ＦＲＢ領域またはＦＲＢバリアント領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）キメラカスパーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラカスパーゼポリペプチドは、（ｉ）ＦＫＢＰ１２領域またはＦＫＢＰ１２バリアント領域、および（ｉｉ）カスパーゼポリペプチドを含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む核酸。
（項目１１１）
前記キメラ抗原レセプターは、共刺激ポリペプチドをさらに含む、項目１１０に記載の核酸。
（項目１１２）
前記共刺激ポリペプチドは、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４−１ＢＢからなる群より選択される、項目１１１に記載の核酸。
（項目１１３）
ａ）キメラ抗原レセプターをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、（ｖ）抗原認識部分、および（ｖｉ）ＦＲＢＬ領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）キメラカスパーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラカスパーゼポリペプチドは、（ｉ）ＦＫＢＰ１２領域またはＦＫＢＰ１２バリアント領域および（ｉｉ）カスパーゼポリペプチドを含む、第２のポリヌクレオチド、を含む核酸。
（項目１１４）
前記ＦＲＢ領域またはＦＲＢバリアント領域は、ＫＬＷ（Ｔ２０９８Ｌ）、ＫＴＦ（Ｗ２１０１Ｆ）、およびＫＬＦ（Ｔ２０９８Ｌ、Ｗ２１０１Ｆ）からなる群より選択される、項目１１０〜１１３のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１１５）
前記ＦＲＢバリアント領域は、ＦＲＢＬである、項目１１４に記載の核酸。
（項目１１６）
前記第１の多量体化領域は、ＦＲＢＬであり、前記第２の多量体化領域は、ＦＫＢＰｖ３６である、項目７９〜１１５のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１１７）
ａ）キメラ抗原レセプターをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、（ｉｉｉ）抗原認識部分、（ｉｖ）ＦＲＢＬ領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）キメラカスパーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラカスパーゼポリペプチドは、（ｉ）ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域および（ｉｉ）ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ−９ポリペプチドを含む、第２のポリヌクレオチド、を含む改変された細胞。
（項目１１８）
ａ）キメラ抗原レセプターをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、（ｖ）抗原認識部分、（ｖｉ）ＦＲＢＬ領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）キメラカスパーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラカスパーゼポリペプチドは、（ｉ）ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域および（ｉｉ）ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ−９ポリペプチドを含む、第２のポリヌクレオチド、を含む改変された細胞。
（項目１１９）
前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドからなる群より選択される、項目９８〜１１８のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１２０）
前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍｕｃ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ４４ｖ６からなる群より選択される抗原に結合する、項目９８〜１１９のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１２１）
前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、項目９８〜１２０のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１２２）
前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である、項目９８〜１２０のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１２３）
前記短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２１４のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目９９または１０１〜１２２のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１２４）
前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、配列番号２１６のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目９９〜１０１〜１２２のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１２５）
前記ＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号１６１のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目１１９〜１２４のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１２６）
前記膜貫通領域のポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを含む、項目９８〜１２５のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１２７）
前記核酸は、ウイルスベクター内に含まれる、項目７９〜１２６のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１２８）
前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである、項目１２７に記載の核酸。
（項目１２９）
前記ウイルスベクターは、マウス白血病ウイルスベクター、ＳＦＧベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群より選択される、項目１２７に記載の核酸。
（項目１３０）
前記核酸は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、もしくはバイオリスティックのために調製されるかまたはそのためにデザインされたベクターの中に存在するか、あるいは化学的脂質、ポリマー、無機ナノ粒子、もしくはポリプレックスに結合されるかまたはその中に組み込まれる、項目７９〜１２６のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１３１）
前記核酸は、プラスミド内に含まれる、項目７９〜１２６のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１３２）
少なくとも２個のプロモーターを含む、項目７９〜１３１のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１３３）
１個のプロモーターは、前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの両方に作動可能に連結される、項目７９〜１３２のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１３４）
前記第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、項目７９〜１３２に記載の核酸。
（項目１３５）
前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、項目１３４に記載の核酸。
（項目１３６）
前記核酸は、キメラ抗原レセプター、２Ａポリペプチド、およびカスパーゼポリペプチドを含むポリペプチドをコードする、項目１３５に記載の核酸。
（項目１３７）
前記第１のポリヌクレオチドは、第１のプロモーターに作動可能に連結され、前記第２のポリヌクレオチドは、第２のプロモーターに作動可能に連結される、項目１３２に記載の核酸。
（項目１３８）
表７に提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで該ポリペプチドは、ＦＫＢＰ１２ｖ３６、ｄカスパーゼ９、Ｔ２Ａ、シグナルペプチド、ＦＭＣ６３−ＶＬ、ＦＭＣ６３−ＶＨ、ＣＤ３４エピトープ、ＣＤ８ａストーク、ＣＤ８ｔｍ、ＭｙＤ８８、ｄＣＤ４０、ＣＤ３ｚ、ＦＲＢＩ＾＾、ＦＲＢＩ、およびリンカーポリペプチドを含む、項目７９〜１３７のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１３９）
項目７９〜１３８のいずれか１項に記載の核酸でトランスフェクトされた、改変された細胞。
（項目１４０）
前記細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、項目１３９に記載の改変された細胞。
（項目１４１）
前記細胞は、Ｔ細胞である、項目１３９に記載の改変された細胞。
（項目１４２）
前記細胞は、初代Ｔ細胞である、項目１３９に記載の改変された細胞。
（項目１４３）
前記細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である、項目１３９に記載の改変された細胞。
（項目１４４）
前記細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非リンパ球性造血細胞、非造血細胞、マクロファージ、ケラチノサイト、線維芽細胞、メラノーマ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはＴ細胞からなる群より選択される、項目１３９に記載の改変された細胞。
（項目１４５）
前記Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞である、項目１３９に記載の改変された細胞。
（項目１４６）
前記細胞は、骨髄から得られるかまたは骨髄から調製される、項目１３９〜１４５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１４７）
前記細胞は、臍帯血から得られるかまたは臍帯血から調製される、項目１３９〜１４５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１４８）
前記細胞は、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される、項目１３９〜１４５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１４９）
前記細胞は、末梢血単核細胞から得られるかまたは末梢血単核細胞から調製される、項目１３９〜１４５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１５０）
前記細胞は、ヒト細胞である、項目１３９〜１４９のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１５１）
前記改変された細胞は、インビボで形質導入またはトランスフェクトされる、項目１３９〜１５０のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１５２）
前記細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子での遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスからなる群より選択される方法を使用して、核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される、項目１３９〜１５１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１５３）
膜会合ポリペプチド領域と第１の多量体化領域とを含む第１のキメラポリペプチドおよびアポトーシス促進ポリペプチド領域と第２の多量体化領域とを含む第２のキメラポリペプチドであって、ここで該第２の多量体化領域は、該第１の多量体化領域とは異なるアミノ酸配列を有し；ここで該第１の多量体化領域および第２の多量体化領域は、第１の多量体リガンドに結合し、そして該第１の多量体化領域は、第２の多量体リガンドに結合できない、第１のキメラポリペプチドおよび第２のキメラポリペプチドを発現させるための方法であって、該方法は、項目７９〜１３８のいずれか１項に記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させることを含み、それによって、該細胞は、該第１のキメラポリペプチドおよび第２のキメラポリペプチドを該組み込まれた核酸から発現する、方法。
（項目１５４）
少なくとも２個のＦＲＢ領域またはＦＲＢバリアント領域を含むキメラ抗原レセプターを含む第１のキメラポリペプチド、およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域またはＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域とカスパーゼポリペプチド領域とを含む第２のキメラポリペプチドを発現させるための方法であって、該方法は、項目７９〜１３８のいずれか１項に記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させることを含み、それによって該細胞は、該第１のキメラポリペプチドおよび第２のキメラポリペプチドを該組み込まれた核酸から発現する、方法。
（項目１５５）
ＦＲＢＬ領域およびキメラ抗原レセプターを含むキメラポリペプチドを発現させるための方法であって、該方法は、項目７９〜１３８のいずれか１項に記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させることを含み、それによって該細胞は、該キメラポリペプチドを該組み込まれた核酸から発現する、方法。
（項目１５６）
前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、項目１５３〜１５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５７）
前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、項目１５３〜１５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５８）
被験体において移植された改変された細胞の生存をコントロールするための方法であって、該方法は、
ａ）項目１〜６５または１３９〜１５２のいずれか１項に記載の改変された細胞を、該被験体に移植すること；および
ｂ）  （ａ）の後に、該被験体に、前記アポトーシス促進ポリペプチド領域を含む前記第２のキメラポリペプチドを発現する該改変された細胞のうちの３０％未満を殺滅するために有効な量のラパマイシンまたはラパログを投与すること
を包含する、方法。
（項目１５９）
ラパマイシンまたはラパログを、改変された細胞を使用する細胞治療を受けたことがあるヒト被験体に投与するための方法であって、該方法は、ラパマイシンまたはラパログを該ヒト被験体に投与することを包含し、ここで該改変された細胞は、項目１〜６５または１３９〜１５２のいずれか１項に記載の核酸を含み、ここで該ラパマイシンまたはラパログは、ＦＲＢ領域またはＦＲＢバリアント領域に結合する、方法。
（項目１６０）
前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラカスパーゼポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの４０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目１５８〜１５９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６１）
前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラカスパーゼポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの５０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目１５８〜１５９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６２）
前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラカスパーゼポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの６０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目１５８〜１５９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６３）
前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラカスパーゼポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの７０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目１５８〜１５９に記載の方法。
（項目１６４）
前記第１のリガンドは、前記第２のキメラポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの９０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目１５８〜１５９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６５）
前記第１のリガンドは、前記第２のキメラポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目１５８〜１５９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６６）
前記第１のリガンドは、前記第２のキメラポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９５％を殺滅するために有効な量で投与される、項目１５８〜１５９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６７）
１より多くの用量の前記第１のリガンドは、前記被験体に投与される、項目１５８〜１６６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６８）
１より多くの用量のラパマイシンまたは前記ラパログは、投与される、項目１５８〜１６６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６９）
前記第２の多量体化領域は、ＦＫＢＰ１２領域またはＦＫＢＰ１２バリアント領域であり、前記アポトーシス促進ポリペプチド領域を含む前記第２のキメラポリペプチド上の該ＦＫＢＰ１２領域またはＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを、該第２のキメラポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９０％を殺滅するために有効な量で投与することをさらに包含する、項目１５８〜１６８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７０）
リガンドを、改変された細胞を使用する細胞治療を受けたことがあるヒト被験体に投与するための方法であって、該方法は、該リガンドを該ヒト被験体に投与することを包含し、ここで該改変された細胞は、項目１〜６５または１３９〜１５２のいずれか１項に記載の改変された細胞を含み、ここで該リガンドは、ＦＫＢＰ１２領域またはＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合する、方法。
（項目１７１）
被験体において移植された改変された細胞の生存をコントロールするための方法であって、該方法は、
ａ）項目１〜６５または１３９〜１５２のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に移植すること；および
ｂ）  （ａ）の後に、該被験体に、前記アポトーシス促進ポリペプチド領域を含む前記第２のキメラポリペプチド上の前記ＦＫＢＰ１２領域またはＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを、該第２のキメラポリペプチドを発現する該改変された細胞のうちの少なくとも９０％を殺滅するために有効な量で投与すること、
を包含する、方法。
（項目１７２）
１より多くの用量の前記リガンド、ラパマイシン、または前記ラパログは、投与される、項目１７１に記載の方法。
（項目１７３）
トランスフェクトまたは形質導入された改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の有無を同定すること；ならびに
該被験体において同定された該状態の有無に基づいて、ラパマイシンもしくはラパログ、または前記ＦＫＢＰ１２領域もしくはＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体へのその後の投与量を維持するか、あるいはその後の投与量を調整すること
をさらに包含する、項目１５８〜１７２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７４）
トランスフェクトまたは形質導入された治療用細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の有無を同定すること；ならびに
該被験体において同定された該状態の有無に基づいて、前記ＦＫＢＰ１２領域もしくはＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンド、またはラパマイシンもしくはラパログが、該被験体に投与されるべきどうか、あるいは該被験体にその後投与される該リガンドの投与量が調整されるかを決定すること、
をさらに包含する、項目１５８〜１７２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７５）
トランスフェクトまたは形質導入された改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の有無を含む情報を受け取ること；および
該被験体において同定された該状態の有無に基づいて、ラパマイシンもしくはラパログ、または前記ＦＫＢＰ１２領域もしくはＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体へのその後の投与量を維持するか、あるいはその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、項目１５８〜１７４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７６）
トランスフェクトまたは形質導入された改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の有無を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の有無またはステージを、該被験体において同定された該状態の有無またはステージに基づいて、ラパマイシン、ラパログまたは前記ＦＫＢＰ１２領域もしくはＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体に投与されるその後の投与量を維持するか、あるいはその後の投与量を調整する意思決定者に伝達すること、
をさらに包含する、項目１５８〜１７４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７７）
トランスフェクトまたは形質導入された改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の有無を同定すること；ならびに
該被験体において同定された該状態の有無またはステージに基づいて、ラパマイシン、ラパログ、または前記ＦＫＢＰ１２領域もしくはＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体に投与されるその後の投与量を維持するか、あるいはその後の投与量を調整する指示を伝達すること、
をさらに包含する、項目１５８〜１７４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７８）
同種反応性の改変された細胞は、前記被験体に存在し、同種反応性の改変された細胞の数は、ラパマイシン、前記ラパログ、または前記リガンドの投与後に少なくとも９０％減少する、項目１５８〜１７４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７９）
少なくとも１×１０６個の形質導入またはトランスフェクトされた改変された細胞が、前記被験体に投与される、項目１５８〜１７８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８０）
少なくとも１×１０７個の形質導入またはトランスフェクトされた改変された細胞が、前記被験体に投与される、項目１５８〜１７８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８１）
少なくとも１×１０８個の形質導入またはトランスフェクトされた改変された細胞が、前記被験体に投与される、項目１５８〜１７８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８２）
前記被験体における移植片対宿主病の有無またはステージを同定すること、および
該被験体において同定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、ラパマイシン、ラパログ、または前記ＦＫＢＰ１２領域もしくはＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体へのその後の投与量を維持するか、またはその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、項目１５８〜１７８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８３）
改変された細胞を使用する細胞治療を受けたことがあるヒト被験体にリガンドを投与するための方法であって、該方法は、該リガンドを該ヒト被験体に投与することを包含し、ここで該改変された細胞は、項目１〜６５または１３９〜１５２のいずれか１項に記載の改変された細胞を含み、ここで該リガンドは、ＦＫＢＰ１２領域またはＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合する、方法。
（項目１８４）
ラパマイシンまたはラパログを、改変された細胞を使用する細胞治療を受けたことがあるヒト被験体に投与するための方法であって、該方法は、ラパマイシンまたはラパログを該ヒト被験体に投与することを包含し、ここで該改変された細胞は、項目１〜６５または１３９〜１５２のいずれか１項に記載の改変された細胞を含み、ここで該ラパマイシンまたはラパログは、ＦＲＢ領域またはＦＲＢバリアント領域に結合する、方法。
（項目１８５）
改変された細胞は、ＦＫＢＰ１２領域またはＦＫＢＰ１２バリアント領域を含むキメラポリペプチドを含み、該ＦＫＢＰ１２領域またはＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合する前記リガンドは、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、およびＡＰ１５１０からなる群より選択される、項目１８４に記載の方法。
（項目１８６）
標的細胞によって発現される標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、（ａ）該被験体に、有効量の項目１〜６５または１３９〜１５２のいずれか１項に記載の改変された細胞を投与することであって、ここで該改変された細胞は、該標的抗原に結合するキメラ抗原レセプターまたはＴ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む投与すること；ならびに（ｂ）  ａ）の後に、有効量のリガンド、ラパマイシン、またはラパログを投与すること、を包含する方法。
（項目１８７）
前記標的抗原は、腫瘍抗原である、項目１８６に記載の方法。
（項目１８８）
前記被験体はがんを有する、項目１５８〜１８７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８９）
前記改変された細胞は、腫瘍床に送達される、項目１５８〜１８７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９０）
前記がんは、前記被験体の血液または骨髄に存在する、項目１８９に記載の方法。
（項目１９１）
前記被験体は、血液または骨髄の疾患を有する、項目１５８〜１９０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９２）
前記被験体は、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、項目１５８〜１９０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９３）
前記被験体は、原発性免疫不全状態、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）または他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、ヘモグロビン異常症、代謝状態、および破骨細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、項目１５８〜１９０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９４）
前記被験体は、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコーニ貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、および大理石骨病からなる群より選択される疾患または状態と診断されている、項目１５８〜１９０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９５）
項目１〜６５または１３９〜１５２のいずれか１項に記載の改変された細胞が被験体へと移植されている、該被験体において移植された改変された細胞の生存をコントロールするための方法であって、該方法は、
該改変された細胞を該被験体から除去することを要する該被験体における状態の有無を同定すること；ならびに
該被験体において同定された該状態の有無に基づいて、ラパマイシン、もしくはラパログ、または前記ＦＫＢＰ１２領域もしくはＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与するか、該被験へのその後の投与量を維持するか、あるいはその後の投与量を調整すること、
を包含する、方法。
【００３４】
図面は、本技術の実施形態を図示するものであって、限定するものではない。図示を明確にするためおよび容易にするために、図面は、一定の割合で拡大縮小して作成されておらず、場合によっては、特定の実施形態の理解を容易にするために、様々な態様が、誇張または拡大されて示されていることがある。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】図１Ａは、本明細書で論じられるとおりの種々のｉＣａｓｐ９発現ベクターを図示する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａに示される発現ベクターによって生成される全長および短縮型のカスパーゼ−９タンパク質の代表的ウェスタンブロットを図示する。
【図２】図２は、アポトーシスを引き起こすための自殺遺伝子生成物およびＣＩＤの相互作用の模式図である。
【図３】図３は、アポトーシスの二段構造の制御を示す模式図である。左の部分は、ＦＲＢＩ改変ＣＡＲへの誘導性カスパーゼポリペプチドのラパログ媒介性動員を示す。右の部分は、リミズシド（ＡＰ１９０３）媒介性誘導性カスパーゼポリペプチドを示す。
【図４】図４は、ＦＲＢＬ改変ＣＤ１９−ＭＣ−ＣＡＲおよび誘導性カスパーゼ−９をコードするベクターのプラスミドマップである。ｐＳＦＧ−ｉＣａｓｐ９−２Ａ−ＣＤ１９−Ｑ−ＣＤ２８ｓｔｍ−ＭＣｚ−ＦＲＢＬ２。
【図５】図５は、ＦＲＢＬ改変Ｈｅｒ２−ＭＣ−ＣＡＲおよび誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドをコードするベクターのプラスミドマップである。ｐＳＦＧ−ｉＣａｓｐ９−２Ａ−ａＨｅｒ２−Ｑ＿ＣＤ２８ｓｔｍ−ｍＭＣｚ−ＦＲＢＬ２。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、アポトーシスの二段構造の活性化のアッセイの結果を提供する。図６Ａｌは、ラパマイシンでの誘導性カスパーゼ−９ポリペプチド（ｉＣ９）の動員を示し、より段階的なアポトーシス漸増（apoptosis  titration）をもたらす。図６Ｂは、リミズシド（ＡＰ１９０３）を使用する完全なアポトーシスを示す。
【図７】図７は、ｐＢＰ０５４５ベクター、ｐＢＰ０５４５．ｐＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ＭＣ−ゼータ．のプラスミドマップである。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
（詳細な説明）
外部環境からの情報を細胞の内部へと移すための機構として、制御されるタンパク質−タンパク質相互作用は、大部分の（全てではないものの）シグナル伝達経路をコントロールするように進化した。シグナル伝達は、酵素プロセス（例えば、アミノ酸側鎖リン酸化、アセチル化、または固有の特異性を欠くタンパク質分解性切断）によって左右される。さらに、多くのタンパク質または因子は、十分な基質／生成物関係の自発的な生成を排除してシグナル伝達を活性化もしくは伝播する細胞濃度でまたは細胞下位置で、存在する。活性化されたシグナル伝達の重要な構成成分は、適切な上流シグナルを介して経路を効率的に伝達する（または弱める）シグナル伝達「ノード」または空間的シグナル伝達センターへのこれら構成成分の動員である。
【００３７】
個々のタンパク質−タンパク質相互作用および従って、個々のシグナル伝達タンパク質を人工的に単離および操作するためのツールとして、化学的に誘導される二量体化（ＣＩＤ）技術を開発して、標的タンパク質に対するホモタイプまたはヘテロタイプの相互作用を課して、天然の生物学的制御を再現した。その最も単純な形態では、単一のタンパク質を、１またはこれより多くの構造的に同一なリガンド結合ドメインを含むように改変する。次いで、これは、コグネイトホモ二量体リガンドの存在下で、それぞれ、ホモ二量体化またはオリゴマー化の基本となる（Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＤＭら  （９３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２，  １０１９−２４）。この概念のわずかにより複雑なバージョンは、１またはこれより多くの別個のリガンド結合ドメインを２個の異なるタンパク質に配置して、小分子、両方の別個のドメインに同時に結合するヘテロ二量体リガンドを使用してこれらシグナル伝達分子のヘテロ二量体化を可能にすることを包含する（Ｈｏ  ＳＮら  （９６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３８２，  ８２２−６）。この薬物媒介性二量体化は、それらの誘導性のまたは自発的なアセンブリおよび制御を可能にするために［十分なリガンド結合ドメインタグ化構成成分の非常に高い局所濃度を生じる。
【００３８】
本明細書中で使用されるとき、請求項および／または明細書において用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに使用されるときの単語「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つの」を意味し得るが、「１つ以上の」、「少なくとも１つの」および「１つもしくは１つより多くの」の意味とも一致する。なおもさらに、用語「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、相互交換可能であり、当業者は、これらの用語がオープンエンドな（ｏｐｅｎ  ｅｎｄｅｄ）用語であると認識している。
【００３９】
本明細書中で使用される用語「同種異系」は、抗原的に異なるＨＬＡ遺伝子座またはＭＨＣ遺伝子座のことを指す。
【００４０】
したがって、同じ種から移植される細胞または組織は、抗原的に異なり得る。同系マウスは、１つ以上の遺伝子座が異なり得（コンジェニック）、同種異系マウスは、同じバックグラウンドを有し得る。
【００４１】
用語「抗原」は、本明細書で使用される場合、免疫応答を引き起こす分子として定義される。この免疫応答は、抗体産生、または特異的な免疫学的に能力のある細胞の活性化のいずれか、または両方に関与し得る。
【００４２】
「抗原認識部分」は、抗原に結合する任意のポリペプチドまたはそのフラグメント、例えば、天然に由来するかまたは合成の抗体フラグメント可変ドメインなどであり得る。抗原認識部分の例としては、抗体に由来するポリペプチド、例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；Ｔ細胞レセプターに由来するポリペプチド、例えば、ＴＣＲ可変ドメインなど；ならびに細胞外の同種タンパク質に結合する任意のリガンドまたはレセプターフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書中で使用される用語「がん」は、そのユニークな特質である正常なコントロールの喪失が、制御されない成長、分化の欠如、局所的な組織浸潤および転移をもたらす、細胞の過剰増殖として定義される。例としては、メラノーマ、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺がん、肝細胞癌、白血病、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、歯肉がん、舌がん、神経芽細胞腫、頭部がん、頚部がん、乳がん、膵がん、前立腺がん、腎がん、骨がん、精巣がん、卵巣がん、中皮腫、子宮頸がん、消化器がん、リンパ腫、脳がん、結腸がん、肉腫または膀胱がんが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
ドナー：用語「ドナー」は、患者レシピエントではない哺乳動物（例えば、ヒト）を指す。上記ドナーは、例えば、上記レシピエントとＨＬＡ同一性を有し得るか、または上記レシピエントと部分的またはより大きなＨＬＡ不一致を有し得る。
【００４５】
ハプロタイプ一致：用語「ハプロタイプ一致」は、細胞を参照して使用される場合、本明細書での細胞タイプおよび／または細胞系統は、ハプロタイプを共有する細胞または１つの染色体上に密接に連鎖した遺伝子のセットにおいて実質的に同じ対立遺伝子を有する細胞を指す。ハプロタイプ一致ドナーは、上記レシピエントと完全なＨＬＡ同一性は有さず、部分的ＨＬＡ不一致が存在する。
【００４６】
血液疾患：本明細書中で使用される用語「血液疾患」、「血液疾患」および／または「血液の疾患」は、血液およびその成分（血液細胞、ヘモグロビン、血液タンパク質を含むが、これらに限定されない）の産生、凝固のメカニズム、血液の産生、血液タンパク質の産生などおよびそれらの組み合わせに影響する状態のことを指す。血液疾患の非限定的な例としては、貧血、白血病、リンパ腫、血液学的新生物、アルブミン血症（ａｌｂｕｍｉｎｅｍｉａｓ）、血友病などが挙げられる。
【００４７】
骨髄疾患：本明細書中で使用される用語「骨髄疾患」は、血液細胞および血小板の産生の減少をもたらす状態のことを指す。いくつかの骨髄疾患では、正常な骨髄の構造が、感染症（例えば、結核）または悪性疾患によって取って代わられ得、その後、血液細胞および血小板の産生の減少に至り得る。骨髄疾患の非限定的な例としては、白血病、細菌感染症（例えば、結核）、放射線宿酔または放射線中毒、汎血球減少症（ａｐｎｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）、貧血、多発性骨髄腫などが挙げられる。
【００４８】
Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞（これがＣＤ３＋細胞を意味するものを包含する）：Ｔ細胞（Ｔリンパ球とも称される）は、リンパ球と称される白血球の一群に属する。リンパ球は、一般に、細胞性免疫に関わる。「Ｔ細胞」における「Ｔ」とは、胸腺に由来する細胞またはその成熟が胸腺に影響される細胞のことを指す。Ｔ細胞は、Ｔ細胞レセプターとして知られる細胞表面タンパク質の存在によって、他のリンパ球のタイプ（例えば、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）と区別され得る。本明細書中で使用される用語「活性化Ｔ細胞」は、クラスＩＩ主要組織適合性（ＭＨＣ）マーカーにおいて提示された抗原決定基の認識によって免疫応答（例えば、活性化Ｔ細胞のクローン性増殖）をもたらすように刺激されたＴ細胞のことを指す。Ｔ細胞は、抗原決定基、サイトカインおよび／またはリンフォカインならびに分化クラスター細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８などおよびそれらの組み合わせ）の存在によって活性化される。差次的なタンパク質のクラスターを発現する細胞は、しばしば、Ｔ細胞表面上のそのタンパク質の発現について「陽性」であると言われる（例えば、ＣＤ３またはＣＤ４の発現について陽性の細胞は、ＣＤ３＋またはＣＤ４＋と称される）。ＣＤ３およびＣＤ４タンパク質は、Ｔ細胞におけるシグナル伝達に直接的および／または間接的に関わり得る細胞表面レセプターまたはコレセプターである。
【００４９】
末梢血：本明細書中で使用される用語「末梢血」は、血液の循環プールから得られるかまたは調製され、リンパ系、脾臓、肝臓もしくは骨髄内に隔絶されない、血液の細胞成分（例えば、赤血球、白血球および血小板）のことを指す。
【００５０】
臍帯血：臍帯血は、末梢血、およびリンパ系、脾臓、肝臓または骨髄内に隔絶された血液とは異なる。交換可能に使用され得る用語「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｂｌｏｏｄ）」、「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｂｌｏｏｄ）」または「臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）」は、胎盤および出産後のつながったままの臍帯に残存する血液のことを指す。臍帯血は、造血細胞をはじめとした幹細胞を含むことが多い。
【００５１】
「細胞質ＣＤ４０」または「ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０」とは、ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０ポリペプチドを意味する。いくつかの例では、この用語はまた、ＣＤ４０細胞外ドメインおよびＣＤ４０膜貫通ドメインのうちの一部または全ての両方を欠いているＣＤ４０ポリペプチドを指す。
【００５２】
例えば、細胞の場合におけるような「得られるかまたは調製される」は、細胞または細胞培養物が、その供給源から単離されること、精製されることまたは部分的に精製されることを意味し、ここで、その供給源は、例えば、臍帯血、骨髄または末梢血であり得る。これらの用語は、元の供給源または細胞培養物が培養され、細胞が複製される場合、および子孫細胞がその元の供給源に由来する場合にも適用され得る。
【００５３】
あるパーセントの細胞が殺傷される場合におけるような「殺滅する（ｋｉｌｌ）」または「殺滅する（ｋｉｌｌｉｎｇ）」は、アポトーシスを計測するための公知の任意の方法を使用して、および例えば、本明細書で論じられるアッセイ（例えば、本明細書で論じられるＳＥＡＰアッセイまたはＴ細胞アッセイなど）を使用して計測されるときの、アポトーシスによる細胞の死を意味する。この用語はまた、細胞除去を指し得る。
【００５４】
同種枯渇：用語「同種枯渇」とは、本明細書で使用される場合、同種反応性Ｔ細胞の選択的枯渇を指す。用語「同種反応性Ｔ細胞」とは、本明細書で使用される場合、外来細胞（例えば、移植された同種移植片におけるものなど）への曝露に対する反応において、免疫応答を生じるように活性化されたＴ細胞を指す。選択的枯渇は、一般に、免疫磁力を使用する除去、免疫毒素、フローソーティング、アポトーシスの誘導、光枯渇技術などまたはこれらの組み合わせのために、種々の細胞表面で発現されるマーカーまたはタンパク質（例えば、ときおり、分化クラスタータンパク質（ＣＤタンパク質）、ＣＤ１９など）を標的化することに関与する。本方法において、上記細胞は、同種枯渇の前または後に、キメラタンパク質コードベクターで形質導入またはトランスフェクトされ得る。また、上記細胞は、同種枯渇工程なしで、キメラタンパク質コードベクターで形質導入またはトランスフェクトされ得、非同種枯渇細胞は、患者に投与され得る。付加された「安全スイッチ」が原因で、例えば、非同種枯渇（または部分的にのみ同種枯渇された）Ｔ細胞を投与することは可能である。なぜなら有害事象、例えば、移植片対宿主病などは、上記多量体リガンドの投与の際に緩和され得るからである。
【００５５】
移植片対宿主病：用語「移植片対宿主病」または「ＧｖＨＤ」とは、同種骨髄移植としばしば関連し、そしてときおり、免疫不全患者への非照射血液の輸血と関連する合併症を指す。移植片対宿主病はときおり、移植された骨髄中の機能的免疫細胞が、レシピエントを「外来」として認識し、免疫応答を上昇させる場合に起こり得る。ＧｖＨＤは、急性形態および慢性形態へと分けられ得る。急性ＧＶＨＤ（ａＧＶＨＤ）はしばしば、移植または輸血後の最初の１００日以内に観察され、肝臓、皮膚、粘膜、免疫系（例えば、造血系、骨髄、胸腺など）、肺および消化管に影響を及ぼし得る。慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）はしばしば、移植または輸血後１００日またはそれより後に始まり、急性ＧｖＨＤと同じ器官を攻撃し得るが、結合組織および外分泌腺にも影響を及ぼし得る。皮膚の急性ＧｖＨＤは、びまん性斑丘疹状皮疹を、ときおり、レース模様で生じ得る。
【００５６】
ドナーＴ細胞：ここで使用される用語「ドナーＴ細胞」は、同種異系の幹細胞移植の後に抗ウイルス免疫および／または抗腫瘍免疫をもたらすためにレシピエントにしばしば投与されるＴ細胞のことを指す。ドナーＴ細胞は、骨髄移植片拒絶反応を阻害するためおよび同種異系生着（ａｌｌｏｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）の成功を増加させるために利用されることが多いが、しかしながら、同じドナーＴ細胞は、宿主抗原に対する同種異系攻撃反応（ａｌｌｏａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を引き起こし得、それはその後、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）をもたらし得る。ある特定の活性化ドナーＴ細胞は、他の活性化Ｔ細胞よりも高いまたは低いＧｖＨＤ反応を引き起こし得る。ドナーＴ細胞は、レシピエントの腫瘍細胞に対しても反応性であり得、有益な移植片対腫瘍効果を引き起こす。
【００５７】
間葉系ストローマ細胞：本明細書中で使用される用語「間葉系ストローマ細胞」または「骨髄由来間葉系ストローマ細胞」は、エキソビボ、インビトロおよびインビボにおいて脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨芽細胞に分化し得、標準的な培養条件においてプラスチック培養皿に接着する単核骨髄細胞の一部としてさらに定義され得る、多分化能幹細胞のことを指し、造血系マーカーが陰性であり、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５が陽性である。
【００５８】
胚性幹細胞：本明細書中で使用される用語「胚性幹細胞」は、５０〜１５０個の細胞の初期胚である、胚盤胞の内部細胞塊に由来する、多能性幹細胞のことを指す。胚性幹細胞は、それ自体を無限に再生する能力、ならびに３つの一次胚葉である外胚葉、内胚葉および中胚葉のすべての誘導体に分化する能力を特徴とする。多能性細胞は、すべての細胞型を生み出せるが、多分化能細胞（例えば、成体幹細胞）は、限られた数の細胞型しか生み出せないという点で、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）は、多分化能（ｍｕｔｉｐｏｔｅｎｔ）と区別される。
【００５９】
誘導性多能性幹細胞：本明細書中で使用される用語「誘導性多能性幹細胞」または「人工多能性幹細胞」は、胚性幹細胞などの、すべての細胞型ではないが多くの細胞型に分化できる細胞を作製するように、遺伝的操作（例えば、後に多能性を活性化する遺伝子の発現）、生物学的操作（例えば、ウイルスまたはレトロウイルスによる処理）および／または化学的操作（例えば、小分子、ペプチドなど）によって「再プログラムされた」または誘導された、成体の細胞または分化細胞のことを指す。誘導性多能性幹細胞は、それらが、中間に分化したまたは最終分化した状況（例えば、皮膚細胞、骨細胞、線維芽細胞など）を達成し、次いで、脱分化するように誘導され、それにより、多分化能細胞または多能性細胞を作製する能力の一部または全部を回復するという点で胚性幹細胞と区別される。
【００６０】
ＣＤ３４＋細胞：本明細書中で使用される用語「ＣＤ３４＋細胞」は、その細胞表面上にＣＤ３４タンパク質を発現している細胞のことを指す。本明細書中で使用される「ＣＤ３４」は、細胞間接着因子としてしばしば働き、リンパ節にＴ細胞が入ることに関与し、「分化クラスター」遺伝子ファミリーのメンバーである、細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）のことを指す。ＣＤ３４は、骨髄、細胞外マトリックスに、またはストローマ細胞に直接、幹細胞が付着することも媒介し得る。ＣＤ３４＋細胞は、臍帯および骨髄において造血細胞として、間葉系幹細胞のサブセット、内皮前駆体細胞、リンパ管（胸膜のリンパ管を除く）ではなく血管の内皮細胞、マスト細胞、皮膚の真皮の間質におよび付属器周辺における樹状細胞の部分集団（ＸＩＩＩａ因子が陰性である）、ならびにある特定の軟部組織の腫瘍（例えば、胞状軟部肉腫、プレＢ急性リンパ芽球性白血病（Ｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ＡＭＬ−Ｍ７、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、巨細胞線維芽腫、顆粒球性肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、髄膜（ｍｅｎｇｉｎｇｅａｌ）血管周囲細胞腫、髄膜腫、神経線維腫、神経鞘腫および甲状腺乳頭癌）における細胞に見られることが多い。
【００６１】
遺伝子発現ベクター：本文書全体を通じて交換可能に使用され得る、本明細書中で使用される用語「遺伝子発現ベクター」、「核酸発現ベクター」または「発現ベクター」は、宿主細胞内で複製され得、単数または複数の遺伝子を宿主細胞に導入するために利用され得る、核酸分子（例えば、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、人工染色体、酵母人工染色体（例えば、ＹＡＣ））のことを広く指す。発現ベクター上に導入された遺伝子は、内在性遺伝子（例えば、宿主細胞または宿主生物に通常見られる遺伝子）または異種遺伝子（例えば、ゲノムに通常見られない遺伝子または宿主細胞もしくは宿主生物の染色体外核酸上の遺伝子）であり得る。発現ベクターによって細胞に導入される遺伝子は、天然の遺伝子、または改変されたもしくは操作された遺伝子であり得る。遺伝子発現ベクターは、発現ベクター上に保有された単数または複数の遺伝子の効率的な転写を促進し得るかまたは増強し得る、エンハンサー配列、プロモーター領域および／またはターミネーター配列として時折、機能し得る、５’および３’非翻訳制御配列を含むようにも操作され得る。遺伝子発現ベクターは時折、特定の細胞型、細胞位置または組織タイプにおける複製および／または発現の機能性（例えば、転写および翻訳）について操作される。発現ベクターは時折、宿主細胞またはレシピエント細胞においてベクターを維持するための選択マーカーを含む。
【００６２】
発生的に制御されるプロモーター：本明細書中で使用される用語「発生的に制御されるプロモーター」は、発生のプログラムまたは経路によってコントロールされるか、開始されるか、または影響されるある特定の条件下で発現される遺伝子を転写するＲＮＡポリメラーゼに対する最初の結合部位として作用するプロモーターのことを指す。発生的に制御されるプロモーターは、発生のプログラムまたは経路の一部である遺伝子の転写に影響し得る転写のアクチベーターまたはリプレッサーに結合するためのさらなる調節領域をプロモーター領域にまたはプロモーター領域付近に有することが多い。発生的に制御されるプロモーターは、時折、遺伝子産物が細胞の発生分化に影響する遺伝子の転写に関与する。
【００６３】
発生的に分化した細胞：本明細書中で使用される用語「発生的に分化した細胞」は、発生的に制御される特定の遺伝子の発現を伴うことが多く、特定の機能を果たすために、その細胞がそれほど特殊化されていない形態からより特殊化された形態に発展するプロセスを経た細胞のことを指す。発生的に分化した細胞の非限定的な例は、肝臓細胞、肺細胞、皮膚細胞、神経細胞、血液細胞などである。発生分化の変化は、通常、遺伝子発現の変化（例えば、遺伝子発現のパターンの変化）、遺伝子の再編成（例えば、サイレンシングされるかまたは発現される遺伝子をそれぞれ隠すかまたは曝すリモデリングまたはクロマチン）を含み、時々、ＤＮＡ配列の変化（例えば、免疫多様性の分化）を含む。発生中の細胞分化は、遺伝子制御ネットワークの結果として理解され得る。制御遺伝子およびそのシス制御のモジュールは、インプット（例えば、発生の経路またはプログラムの上流で発現されるタンパク質）を受け取り、そのネットワークの別の箇所でアウトプットをもたらす、遺伝子制御ネットワークにおける分岐点（ｎｏｄｅ）である（例えば、発現された遺伝子産物は、その発生の経路またはプログラムの下流の他の遺伝子に対して作用する）。
【００６４】
本明細書中で使用される用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、交換可能に使用され得る。これらの用語のすべてには、任意およびすべてのその後の世代のそれらの子孫も含まれる。故意または偶然の変異に起因して、すべての子孫が同一でない可能性があることが理解される。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「ラパログ」または「ラパマイシンアナログ」とは、天然の抗生物質ラパマイシンのアナログを意味する。本実施形態におけるある種のラパログは、血清中での安定性、野生型ＦＲＢ（および従って、親タンパク質ｍＴＯＲ）に対する不十分な親和性（ｍＴＯＲへのラパマイシンの結合によって通常引き起こされる免疫抑制を回避する）、および変異体ＦＲＢドメインに対する比較的高い親和性などの特性を有する。商業目的で、ある種の実施形態において、上記ラパログは、有用なメモリおよび生成特性を有する。ラパログの例としては、Ｓ−ｏ，ｐ−ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）−ラパマイシン：ＥＣ５０（ｗｔ  ＦＲＢ（Ｋ２０９５  Ｔ２０９８  Ｗ２１０１）  約１０００ｎＭ）、ＥＣ５０（ＦＲＢ−ＫＬＷ  約５ｎＭ）  Ｌｕｅｎｇｏ  ＪＩ  （９５）  Ｃｈｅｍ  ＆  Ｂｉｏｌ  ２：４７１−８１；  Ｌｕｅｎｇｏ  ＪＩ  （９４）  Ｊ．  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ５９：６５１２−６５１３；米国特許第６１８７７５７号；Ｒ−イソプロポキシラパマイシン：ＥＣ５０（ｗｔ  ＦＲＢ（Ｋ２０９５  Ｔ２０９８  Ｗ２１０１）  約３００ｎＭ）、ＥＣ５０（ＦＲＢ−ＰＬＦ  約８．５ｎＭ）；Ｌｉｂｅｒｌｅｓ  Ｓ  （９７）  ＰＮＡＳ  ９４：  ７８２５−３０；およびＳ−ブタンスルホンアミドラプ（S-Butanesulfonamidorap）（ＡＰ２３０５０）：  ＥＣ５０（ｗｔ  ＦＲＢ（Ｋ２０９５  Ｔ２０９８  Ｗ２１０１）  約２．７ｎＭ），  ＥＣ５０（ＦＲＢ−ＫＴＦ  約＞２００ｎＭ）  Ｂａｙｌｅ  （０６）  Ｃｈｅｍ  ＆  Ｂｉｏ．  １３：  ９９−１０７が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
用語「ＦＲＢ」とは、ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメイン（ｍＴＯＲ内にコードされる残基２０１５〜２１１４）およびそのアナログを指す。ある種の実施形態において、ＦＲＢバリアントが提供される。ＦＲＢバリアントの特性は、安定性（いくつかのバリアントは、他のものより不安定である）および種々のラパログに結合する能力である。ラパマイシンに結合体化した結晶構造に基づいて、最も分析された３個の重要なラパマイシン相互作用残基が存在する（Ｋ２０９５、Ｔ２０９８、およびＷ２１０１）。全３個の変異は、ラパマイシンまたはいくつかのラパログの存在下で安定化され得る不安定なタンパク質をもたらす。この特徴は、いくつかの適用において、シグナル：ノイズ比をさらに増大させるために使用され得る。変異体の例としては、Ｂａｙｌｅら  （０６）  Ｃｈｅｍ  ＆  Ｂｉｏ  １３：  ９９−１０７；  Ｓｔａｎｋｕｎａｓら  （０７）  Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  ８：１１６２−１１６９；  および  Ｌｉｂｅｒｌｅｓ  Ｓ  （９７）  ＰＮＡＳ  ９４：７８２５−３０）において論じられる。本実施形態のＦＲＢ領域の例としては、ＫＬＷ（Ｌ２０９８を有する）；ＫＴＦ（Ｆ２１０１を有する）；およびＫＬＦ（Ｌ２０９８、Ｆ２１０１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
各リガンドは、２個またはこれより多くの部分（例えば、定義された部分、別個の部分）を含み得、およびときおり、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはこれより多くの部分を含む。上記第１のリガンドおよび第２のリガンドは各々独立して、２個の部分（すなわち、二量体）からなり得るか、３個の部分（すなわち、三量体）からなり得るか、または４個の部分（すなわち、四量体）からなり得る。上記第１のリガンドはときおり、第１の部分および第２の部分を含み、上記第２のリガンドはときおり、第３の部分および第４の部分を含む。上記第１の部分および上記第２の部分はしばしば、異なり（すなわち、異種（例えば、ヘテロ二量体））、上記第１の部分および上記第３の部分はときおり異なり、そしてときおり同じであり、上記第３の部分および上記第４の部分はしばしば同じである（すなわち、同種（homogeneous）（例えば、ホモ二量体））。異なる部分はときおり、異なる機能を有する（例えば、上記第１の多量体化領域に結合する、上記第２の多量体化領域に結合する、上記第１の多量体化領域に有意に結合しない、上記第２の多量体化領域に有意に結合しない（例えば、上記第１の部分は、上記第１の多量体化領域に結合するが、上記第２の多量体化領域に有意に結合しない））、そしてときおり、異なる化学構造を有する。異なる部分はときおり、異なる化学構造を有するが、同じ多量体化領域に結合し得る（例えば、上記第２の部分および上記第３の部分は、上記第２の多量体化領域に結合し得るが、異なる構造を有し得る）。上記第１の部分はときおり、上記第１の多量体化領域に結合し、ときおり上記第２の多量体化領域に有意に結合しない。各部分はときおり、「単量体」（例えば、上記第１の部分、第２の部分、第３の部分および第４の部分、それぞれを追跡する（track）第１の単量体、第２の単量体、第３の単量体および第４の単量体）といわれる。各部分はときおり、「側面」といわれる。リガンドの側面はときおり、互いに隣接し得、ときおり、リガンド上の反対側の位置に位置し得る。
【００６８】
「結合できる」とは、多量体化領域またはリガンド結合領域に結合する多量体リガンドまたはヘテロ二量体リガンドの例におけるように、上記リガンドが上記リガンド結合領域に結合し、例えば、上記リガンドの単数または複数の部分は、上記多量体化領域に結合すること、およびこの結合は、アッセイ方法（生物学的アッセイ、化学的アッセイ、または物理的検出手段（例えば、ｘ線結晶学など）が挙げられるが、これらに限定されない）によって検出され得ることが意味される。さらに、リガンドが「有意に結合しない」と考えられる場合は、上記リガンド結合領域へのリガンドの結合のわずかな検出があり得るが、この結合量または結合の安定性は、有意に検出可能ではないこと、および本実施形態の細胞において起こる場合、上記改変された細胞を活性化しないかまたはアポトーシスを引き起こさないことを意味する。ある種の例では、上記リガンドが上記リガンドの投与の際に「有意に結合」しない場合、アポトーシスを受ける細胞の量は、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満である。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「ｉカスパーゼ−９」分子、ポリペプチド、またはタンパク質は、誘導性カスパーゼ−９として定義される。用語「ｉカスパーゼ−９」は、ｉカスパーゼ−９核酸、ｉカスパーゼ−９ポリペプチドおよび／またはｉカスパーゼ−９発現ベクターを包含する。この用語はまた、天然のｉカスパーゼ−９ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列、またはＣＡＲＤドメインを欠いている短縮型配列のいずれかを包含する。
【００７０】
本明細書で使用される場合、用語「ｉカスパーゼ１分子」、「ｉカスパーゼ３分子」、または「ｉカスパーゼ８分子」は、それぞれ、誘導性カスパーゼ１、３、または８として定義される。用語ｉカスパーゼ１、ｉカスパーゼ３、またはｉカスパーゼ８は、それぞれ、ｉカスパーゼ１、３、もしくは８核酸、ｉカスパーゼ１、３、もしくは８ポリペプチドおよび／またはｉカスパーゼ１、３、もしくは８発現ベクターを包含する。この用語はまた、それぞれ、天然のカスパーゼｉカスパーゼ−１、−３、もしくは−８ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、またはＣＡＲＤドメインを欠いている短縮型配列のいずれかを包含する。本明細書で提供される実験詳細の状況において「野生型」カスパーゼ−９は、ＣＡＲＤドメインを欠いているカスパーゼ−９分子を意味する。
【００７１】
改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラポリペプチドにおいて、基底活性またはＩＣ５０に影響を及ぼす少なくとも１個のアミノ酸置換を含む。基底活性およびＩＣ５０を試験するための方法は、本明細書で論じられる。非改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、このタイプのアミノ酸置換を含まない。改変されたおよび非改変カスパーゼ−９ポリペプチドの両方は、例えば、ＣＡＲＤドメインを除去するために、切断され得る。
【００７２】
「機能保存的バリアント」は、タンパク質または酵素の全体的な立体構造および機能を変化させずに所与のアミノ酸残基が変更されたタンパク質または酵素であり、それには、あるアミノ酸を、極性または非極性の性質、サイズ、形状および電荷を含む類似の特性を有するアミノ酸で置き換えたものが含まれるが、これらに限定されない。一般に公知の遺伝的にコードされないアミノ酸の多くに対する保存的アミノ酸置換は、当該分野で周知である。他のコードされないアミノ酸に対する保存的置換は、遺伝的にコードされるアミノ酸の特性と比べたときの物理的特性に基づいて決定され得る。
【００７３】
保存アミノ酸と示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素において異なり得、機能が類似した任意の２つのタンパク質の間のタンパク質配列またはアミノ酸配列の類似性のパーセントは、変動し得、アラインメントスキームに従って決定されるとき、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％であり得る。本明細書中で言及されるとき、「配列類似性」は、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列が関係する程度を意味する。２つの配列間の類似性の程度は、配列同一性および／または保存のパーセントに基づき得る。本明細書中の「配列同一性」は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が不変である程度を意味する。「配列アラインメント」は、類似性の程度を評価する目的のために最大の同一性（およびアミノ酸配列の場合、保存）レベルを達成するように２つ以上の配列を並べるプロセスを意味する。配列をアラインメントするためおよび類似性／同一性を評価するための数多くの方法（例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくＣｌｕｓｔｅｒ法ならびにＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡなど）が、当該分野で公知である。これらのプログラムのうちのいずれかを使用するとき、好ましい設定は、最も高い配列類似性をもたらすものである。
【００７４】
本明細書で言及されるアミノ酸残基番号は、非短縮型および非改変カスパーゼ−９ポリペプチド（例えば、配列番号９のもの）におけるアミノ酸位置を反映する。配列番号９は、短縮型カスパーゼ−９ポリペプチドのアミノ酸配列を提供し、これは、ＣＡＲＤドメインを含まない。従って、配列番号９は、全長カスパーゼ−９アミノ酸配列を参照して、アミノ酸残基番号１３５において始まり、アミノ酸残基番号４１６で終わる。当業者は、配列をカスパーゼ−９ポリペプチドの他の配列と整列させて、望ましい場合には、アミノ酸残基番号を、例えば、本明細書で論じられる配列アラインメント法を使用して相関させ得る。
【００７５】
本明細書中で使用されるとき、用語「ｃＤＮＡ」は、鋳型としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を使用して調製されたＤＮＡのことを指すと意図されている。ゲノムＤＮＡ、またはゲノムＲＮＡ鋳型、プロセシングされていないＲＮＡ鋳型もしくは部分的にプロセシングされたＲＮＡ鋳型から重合されたＤＮＡに対立するものとしてｃＤＮＡを使用することの利点は、ｃＤＮＡが、主に、対応するタンパク質のコード配列を含む点である。完全または部分的なゲノム配列が使用されるときがあり、例えば、最適な発現のために非コード領域を必要とする場合、またはイントロンなどの非コード領域がアンチセンスストラテジーにおいて標的化される場合が存在する。
【００７６】
本明細書中で使用されるとき、用語「発現構築物」または「導入遺伝子」は、遺伝子産物をコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝的構築物として定義され、ここで、核酸コード配列の一部または全部が転写されることが可能であり、該構築物は、ベクターに挿入され得る。転写産物は、タンパク質に翻訳されるが、必ずしも翻訳されるわけではない。ある特定の実施形態において、発現は、遺伝子の転写とｍＲＮＡから遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の実施形態において、発現は、目的の遺伝子をコードする核酸の転写だけを含む。用語「治療的な構築物」は、発現構築物または導入遺伝子のことを指すためにも使用され得る。発現構築物または導入遺伝子は、例えば、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害（例えば、がん）を処置する治療として、使用され得、ゆえに、発現構築物または導入遺伝子は、治療的な構築物または予防的な構築物である。
【００７７】
本明細書中で使用されるとき、用語「発現ベクター」は、転写されることが可能な遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターのことを指す。場合によっては、ＲＮＡ分子は、その後、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。他の場合、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの生成では、これらの配列は、翻訳されない。発現ベクターは、種々の調節配列を含み得、それらの調節配列は、特定の宿主生物において、作動可能に連結されたコード配列を転写するためおよびおそらく翻訳するために必要な核酸配列のことを指す。ベクターおよび発現ベクターは、転写および翻訳を支配する調節配列に加えて、同様に他の機能を果たす核酸配列を含み得、それらは、下で論じられる。
【００７８】
本明細書中で使用されるとき、用語「エキソビボ」は、身体の「外側」のことを指す。用語「エキソビボ」および「インビトロ」は、本明細書中で交換可能に使用され得る。
【００７９】
本明細書で使用される場合、用語「機能的に等価な」とは、カスパーゼ−９または短縮型カスパーゼ−９に関する場合、例えば、カスパーゼ−９核酸フラグメント、バリアント、またはアナログを指し、カスパーゼ−９ポリペプチド、またはアポトーシス応答を刺激するカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする核酸を指す。「機能的に等価な」とは、例えば、ＣＡＲＤドメインを欠くが、アポトーシス細胞応答を誘導できるカスパーゼ−９ポリペプチドを指す。用語「機能的に等価な」が、他の核酸またはポリペプチド（例えば、ＣＤ１９、５’ＬＴＲ、多量体リガンド結合領域、またはＣＤ３など）に適用される場合、それは、本明細書中の方法の参照ポリペプチドと同じまたは類似の活性を有するフラグメント、バリアントなどを指す。
【００８０】
本明細書中で使用されるとき、用語「遺伝子」は、機能的なタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする単位として定義される。理解されるように、この機能的な用語には、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質および変異体を発現するかまたは発現するように適合された、より小さい操作された遺伝子セグメントが含まれる。
【００８１】
用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖に起因する疾患として定義される。例示的な過剰増殖性疾患としては、がんまたは自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。他の過剰増殖性疾患としては、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症または炎症性腸疾患が挙げられ得る。
【００８２】
用語「免疫原性組成物」または「免疫原」は、免疫応答を引き起こすことができる物質のことを指す。免疫原の例としては、例えば、抗原、自己免疫疾患の誘導において役割を果たす自己抗原、およびがん細胞上に発現された腫瘍関連抗原が挙げられる。
【００８３】
本明細書中で使用される用語「免疫無防備状態」は、免疫系が衰えているかまたは弱くなっている被験体として定義される。免疫無防備状態の状態は、免疫系の欠損もしくは機能不全または感染および／もしくは疾患への感受性を高める他の要因に起因し得る。そのような分類は、評価に対して概念的基礎を与えるが、免疫無防備状態の個体は、一方の群または他方の群に完全に当てはまらないことが多い。身体の防御機構における２つ以上の欠損が、影響され得る。例えば、ＨＩＶによって引き起こされる特定のＴリンパ球欠損を有する個体は、抗ウイルス治療のために使用される薬物によって引き起こされる好中球減少症も有し得るか、または皮膚および粘膜の完全性が破られたために免疫無防備状態であり得る。免疫無防備状態の状況は、留置中心ライン（ｉｎｄｗｅｌｌｉｎｇ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｌｉｎｅｓ）もしくは静脈内薬物乱用に起因する他のタイプの機能障害に起因し得るか；または続発性悪性疾患、栄養失調によって引き起こされ得るか、または他の感染病原体（例えば、結核）もしくは性行為感染症、例えば、梅毒もしくは肝炎に感染していることに起因し得る。
【００８４】
本明細書中で使用されるとき、用語「薬学的または薬理学的に許容され得る」は、動物またはヒトに投与されたとき、有害（ａｄｖｅｒｓｅ）反応、アレルギー反応または他の有害（ｕｎｔｏｗａｒｄ）反応をもたらさない分子実体および組成物のことを指す。
【００８５】
本明細書中で使用されるとき、「薬学的に許容され得るキャリア」は、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質および作用物質の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒質または作用物質が、本明細書中に提示されるベクターまたは細胞と不適合性である場合を除いては、治療的な組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分もまた、その組成物に組み込まれ得る。
【００８６】
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書中で使用される核酸およびポリヌクレオチドは、相互交換可能である。核酸は、モノマーの「ヌクレオチド」に加水分解され得るポリヌクレオチドである。モノマーのヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書中で使用されるとき、ポリヌクレオチドには、当該分野において利用可能な任意の手段によって得られるすべての核酸配列が含まれるが、これらに限定されず、そのような手段としては、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術およびＰＣＲＴＭなどを使用する組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング、ならびに合成手段が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの変異を含み、当該分野で周知の方法によるヌクレオチドまたはヌクレオシドの変異を含むが、これらに限定されない。核酸は、１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。
【００８７】
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、通常、規定の配列を有する、アミノ酸残基の鎖として定義される。本明細書中で使用されるとき、ポリペプチドという用語は、「ペプチド」および「タンパク質」という用語と相互交換可能である。
【００８８】
本明細書中で使用されるとき、用語「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列として定義される。
【００８９】
用語「トランスフェクション」および「形質導入」は、相互交換可能であり、外来性ＤＮＡ配列が真核生物宿主細胞に導入されるプロセスのことを指す。トランスフェクション（または形質導入）は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃送達、レトロウイルス感染、リポフェクション、スーパーフェクション（ｓｕｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ）などを含むいくつかの手段のうちのいずれか１つによって達成され得る。
【００９０】
本明細書中で使用されるとき、用語「同系」とは、同一の遺伝子型、または組織移植が可能であるのに十分密接な関係がある遺伝子型、または免疫学的に適合性の遺伝子型を有する細胞、組織または動物のことを指す。例えば、同じ近交系の一卵性双生児または動物。同系および同遺伝子系は、交換可能に使用され得る。
【００９１】
用語「患者」または「被験体」は、相互交換可能であり、本明細書中で使用されるとき、生物または動物；哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジまたは他の非ヒト哺乳動物を含む）；非哺乳動物（例えば、非哺乳動物の脊椎動物、例えば、鳥類（例えば、ニワトリまたはアヒル）または魚類、および非哺乳動物の無脊椎動物を含む）を含むが、これらに限定されない。
【００９２】
「Ｔ細胞活性化分子」とは、キメラ抗原レセプターを発現するＴ細胞へと組み込まれる場合、Ｔ細胞の活性化を高めるポリペプチドを意味する。例としては、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子（例えば、ＣＤ３ζポリペプチドなど）、およびＦｃレセプターガンマ（例えば、Ｆｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットなど）（Ｈａｙｎｅｓ，  Ｎ．Ｍ．ら  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６：１８２−７（２００１））．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
本明細書中で使用されるとき、用語「転写支配下」または「作動可能に連結された」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現をコントロールする核酸に対して正しい位置および方向で存在することとして定義される。
【００９４】
本明細書中で使用されるとき、用語「処置」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置される」または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、予防法および／または治療のことを指す。
【００９５】
本明細書中で使用されるとき、用語「ワクチン」とは、動物に投与することができる形態で存在する、本明細書中に提示される組成物を含む製剤のことを指す。代表的には、ワクチンは、組成物が懸濁されるかまたは溶解される従来の食塩水または緩衝水溶液媒質を含む。この形態において、組成物は、ある状態を予防するか、回復させるか、または別途処置するために都合よく使用され得る。ワクチンは、被験体に導入されたとき、抗体、サイトカインおよび／または他の細胞応答の産生を含むがこれらに限定されない免疫応答を引き起こすことができる。
【００９６】
いくつかの実施形態において、核酸は、ウイルスベクター内に含まれている。ある特定の実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。ある特定の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、エキソビボにおいてウイルスベクターと接触され、いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、インビボにおいてウイルスベクターと接触されることが理解される。
【００９７】
造血幹細胞および細胞治療
造血幹細胞としては、造血前駆体細胞、成熟した血球タイプへと分化し得る未成熟の多分化能細胞が挙げられる。これら幹細胞および前駆体細胞は、骨髄および臍帯血から、およびいくつかの場合では、末梢血から単離され得る。他の幹細胞および前駆体細胞としては、例えば、間葉系ストローマ細胞、胚性幹細胞、および人工多能性幹細胞が挙げられる。
【００９８】
骨髄由来間葉系ストローマ細胞（ＭＳＣ）は、標準的培養条件においてプラスチック培養ディッシュに接着し、造血系統マーカーに関して陰性であり、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５に関して陽性であり、そして脂肪細胞、骨芽細胞、および軟骨芽細胞へとインビトロで分化し得る単核骨髄細胞の画分として定義されている。１つの生理学的役割が、造血の支持であると推定される一方で、ＭＳＣが活発な成長の領域（例えば、瘢痕性組織および新生物組織）に組み込まれ得、おそらく増殖し得る、およびそれらの天然の微小環境にホーミングし得、病的細胞の機能を置き換え得るといういくつかの報告もまた、確立された。それらの分化潜在能およびホーミング能力は、それらの天然の形態での再生医療への適用（regenerative  application）のための、または特定の微小環境（例えば、病的な骨髄または転移性の沈着物）への活性な生物学的因子の送達のためのそれらの遺伝子改変を通じてかのいずれかで、ＭＳＣを細胞治療のための魅力的なビヒクルにする。さらに、ＭＳＣは、強力な本質的免疫抑制活性を有し、今日までに、移植片対宿主病および自己免疫障害の実験的処置においてそれらの最も頻繁な適用が見出されている（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，  Ｍ．  Ｆ．ら  （１９９９）．    Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：  １４３−１４７；  Ｄｏｍｉｎｉｃｉ，  Ｍ．ら  （２００６）．    Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ８：  ３１５−３１７；  Ｐｒｏｃｋｏｐ，  Ｄ．  Ｊ．  （１９９７）．    Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：  ７１−７４；  Ｌｅｅ，  Ｒ．  Ｈ．ら  （２００６）．    Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０３：  １７４３８−１７４４３；  Ｓｔｕｄｅｎｙ，  Ｍ．ら，  （２００２）．    Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２：  ３６０３−３６０８；  Ｓｔｕｄｅｎｙ，  Ｍ．ら  （２００４）．  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ９６：  １５９３−１６０３；  Ｈｏｒｗｉｔｚ，  Ｅ．  Ｍ．ら  （１９９９）．    Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ５：  ３０９−３１３；  Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，  Ｇ．ら，  （２００７）．    Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５：  ２７３９−２７４９；  Ｐｈｉｎｎｅｙ，  Ｄ．  Ｇ．，  および  Ｐｒｏｃｋｏｐ，  Ｄ．  Ｊ．  （２００７）．    Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５：  ２８９６−２９０２；  Ｈｏｒｗｉｔｚ，  Ｅ．  Ｍ．ら  （２００２）．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９：  ８９３２−８９３７；  Ｈａｌｌ，  Ｂ．ら，  （２００７）．    Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ８６：  ８−１６；  Ｎａｕｔａ，  Ａ．  Ｊ．，  および  Ｆｉｂｂｅ，  Ｗ．  Ｅ．  （２００７）．    Ｂｌｏｏｄ  １１０：  ３４９９−３５０６；  Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ，  Ｋ．ら  （２００８）．  Ｌａｎｃｅｔ  ３７１：  １５７９−１５８６；  Ｔｙｎｄａｌｌ，  Ａ．，  および  Ｕｃｃｅｌｌｉ，  Ａ．  （２００９）．    Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）。
【００９９】
ＭＳＣは、最小の報告された副作用を伴って、数百名の患者において注入された。しかし、追跡調査は限定的であって、長期間の副作用は未知であり、ＭＳＣのインビボ分化（例えば、軟骨もしくは骨への）を誘導する、またはＭＳＣの機能性を高めるためにＭＳＣを遺伝子改変することは今後の取り組みと関連するという帰結については、ほとんど未知である。いくつかの動物モデルは、安全性の懸念を引き起こした。例えば、培養物中の自発的な骨肉腫形成は、マウス由来ＭＳＣにおいて観察された。さらに、心筋梗塞のマウスモデルおよびラットモデルにおける、ＭＳＣの局所注射後の異所性骨化および石灰化病変が論じられており、それらの催不整脈潜在性はまた、新生仔ラットの心室の筋細胞との共培養実験において明らかであった。さらに、両側性のびまん性肺骨形成は、イヌにおける骨髄移植後に観察されており、それはおそらく移植されたストローマ構成成分に起因している（Ｈｏｒｗｉｔｚ，  Ｅ．  Ｍ．ら，  （２００７）．    Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １３：  ５３−５７；  Ｔｏｌａｒ，  Ｊ．ら  （２００７）．    Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５：  ３７１−３７９；  Ｙｏｏｎ，  Ｙ．−Ｓ．ら，  （２００４）．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０９：  ３１５４−３１５７；  Ｂｒｅｉｔｂａｃｈ，  Ｍ．ら  （２００７）．  Ｂｌｏｏｄ  １１０：  １３６２−１３６９；Ｃｈａｎｇ，  Ｍ．  Ｇ．ら  （２００６）．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１３：  １８３２−１８４１；  Ｓａｌｅ，  Ｇ．  Ｅ．，  および  Ｓｔｏｒｂ，  Ｒ．  （１９８３）．    Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １１：  ９６１−９６６）。
【０１００】
細胞治療の別の例では、キメラ抗原レセプターをコードする核酸で形質導入されたＴ細胞は、がんを処置するために患者に投与されてきた（Ｚｈｏｎｇ，  Ｘ．−Ｓ．，  （２０１０）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８：４１３−４２０）。キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、ＭＨＣ抗原提示を必要とすることなしに、Ｔ細胞に抗原特異性を伝達するようにデザインされた人工レセプターである。それらは、抗原特異的構成成分、膜貫通構成成分、およびＴ細胞を活性化しかつ特異的免疫を提供するために選択される細胞内構成成分を含む。キメラ抗原レセプター発現Ｔ細胞は、種々の治療（がん治療を含む）において使用され得る。共刺激ポリペプチドは、標的抗原に対するＣＡＲ発現Ｔ細胞の活性化、増殖または持続性（persistance）を高めるために、従って、養子免疫療法の効能を増大するために使用され得る。
【０１０１】
例えば、ヒト化モノクローナル抗体トラスツズマブ（ハーセプチン）に基づくキメラ抗原レセプターを発現するＴ細胞は、がん患者を処置するために使用されてきた。有害事象は考えられるが、少なくとも１つの報告された症例では、この治療は、患者にとって致命的結果になった（Ｍｏｒｇａｎ，  Ｒ．Ａ．ら，  （２０１０）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８：８４３−８５１）。細胞を、本明細書で示されるとおりのキメラカスパーゼ−９ベースの安全スイッチで形質導入すると、有害事象が進行することを停止させ得る安全スイッチが提供される。従って、いくつかの実施形態において、その改変されたＴ細胞がまた誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する、核酸、細胞、および方法が提供される。例えば、キメラ抗原レセプター改変Ｔ細胞の数を減少する必要性がある場合、誘導性リガンドが上記患者に投与され得、それによって、その改変されたＴ細胞のアポトーシスを誘導し得る。
【０１０２】
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）分子の効力を高めるためにＣＡＲ分子にさらなるシグナル伝達ドメインを組み込んだとき、ＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞による免疫療法の抗腫瘍の効能は、着実に改善した。腫瘍細胞は、完全なＴ細胞活性化にとって必要な必須の共刺激分子を欠くことが多いので、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達分子だけを含む第１世代ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞は、養子移入後にインビボにおいて不良な存続および増殖（expansion）を明らかに示した（Ｔｉｌｌ  ＢＧ，Ｊｅｎｓｅｎ  ＭＣ，Ｗａｎｇ  Ｊら：ＣＤ２０−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｂｏｔｈ  ＣＤ２８  ａｎｄ  ４−１ＢＢ  ｄｏｍａｉｎｓ：ｐｉｌｏｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｂｌｏｏｄ  １１９：３９４０−５０，２０１２；Ｐｕｌｅ  ＭＡ，Ｓａｖｏｌｄｏ  Ｂ，Ｍｙｅｒｓ  ＧＤら：Ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｏ  ｃｏｅｘｐｒｅｓｓ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １４：１２６４−７０，２００８；Ｋｅｒｓｈａｗ  ＭＨ，Ｗｅｓｔｗｏｏｄ  ＪＡ，Ｐａｒｋｅｒ  ＬＬら：Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２：６１０６−１５，２００６）。第２世代ＣＡＲ  Ｔ細胞は、それらの細胞の増殖（proliferation）および生存を改善するようにデザインされた。ＣＤ２８または４−１ＢＢ由来の細胞内の共刺激ドメインを組み込んでいる第２世代ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ  Ｃ，Ｍｉｌｏｎｅ  ＭＣ，Ｈａｓｓａｎ  Ｒら：Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＣＤ２８  ａｎｄ  ＣＤ１３７  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６：３３６０−５，２００９；Ｓｏｎｇ  ＤＧ，Ｙｅ  Ｑ，Ｐｏｕｓｓｉｎ  Ｍら：ＣＤ２７  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｂｌｏｏｄ  １１９：６９６−７０６，２０１２）は、養子移入後に、改善された生存およびインビボでの増殖を示し、これらの共刺激分子を含む、抗ＣＤ１９  ＣＡＲによって改変されたＴ細胞を用いたより最近の臨床試験では、ＣＤ１９＋白血病の処置に対して顕著な効能が示された（Ｋａｌｏｓ  Ｍ，Ｌｅｖｉｎｅ  ＢＬ，Ｐｏｒｔｅｒ  ＤＬら：Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｈａｖｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｃａｎ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ３：９５ｒａ７３，２０１１；Ｐｏｒｔｅｒ  ＤＬ，Ｌｅｖｉｎｅ  ＢＬ，Ｋａｌｏｓ  Ｍら：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６５：７２５−３３，２０１１；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ＲＪ，Ｄａｖｉｌａ  ＭＬ，Ｒｉｖｉｅｒｅ  Ｉら：ＣＤ１９−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒａｐｉｄｌｙ  ｉｎｄｕｃｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ５：１７７ｒａ３８，２０１３）。
【０１０３】
他の研究者らは、「第３世代」ＣＡＲ  Ｔ細胞と呼ばれる、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリータンパク質（例えば、ＯＸ４０および４−１ＢＢ）由来のさらなるシグナル伝達分子を探索した（Ｆｉｎｎｅｙ  ＨＭ，Ａｋｂａｒ  ＡＮ，Ｌａｗｓｏｎ  ＡＤ：Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ＣＤ２８，ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ，ＣＤ１３４，ａｎｄ  ＣＤ１３７  ｉｎ  ｓｅｒｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＴＣＲ  ｚｅｔａ  ｃｈａｉｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：１０４−１３，２００４；Ｇｕｅｄａｎ  Ｓ，Ｃｈｅｎ  Ｘ，Ｍａｄａｒ  Ａら：ＩＣＯＳ−ｂａｓｅｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｂｉｐｏｌａｒ  ＴＨ１７／ＴＨ１  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ，２０１４）が、活性化Ｔ細胞のＣＤ３ζ核因子（ＮＦＡＴ）経路と異なるＴ細胞シグナル伝達を誘導する他の分子が、Ｔ細胞の生存および増殖に必要な共刺激を提供する可能性があり、おそらく、従来の共刺激分子によって供給されない、価値のあるさらなる機能をＣＡＲ  Ｔ細胞に与える。いくつかの第２および第３世代ＣＡＲ  Ｔ細胞は、高度に活性化されたＴ細胞によって引き起こされるサイトカインストームおよび腫瘍崩壊症候群に起因する患者の死に関係していた。
【０１０４】
「キメラ抗原レセプター」または「ＣＡＲ」は、例えば、Ｔ細胞を活性化し、特異免疫をもたらすように選択された、膜貫通ポリペプチドおよび細胞内ドメインポリペプチドに連結された、標的抗原を認識するポリペプチド配列（抗原認識ドメイン）を含むキメラポリペプチドのことを意味する。その抗原認識ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）であり得るか、または例えば、他の分子（例えば、Ｔ細胞レセプターまたはパターン認識レセプターなど）に由来し得る。細胞内ドメインは、Ｔ細胞の活性化を引き起こす少なくとも１つのポリペプチド（例えば、例えば、ＣＤ３ゼータであるがこれに限定されない、および、例えば、共刺激分子、例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４−１ＢＢであるがこれらに限定されない）を含む。用語「キメラ抗原レセプター」とは、抗体に由来するのではなくキメラＴ細胞レセプターに由来するキメラレセプターのことも指すことがある。これらのキメラＴ細胞レセプターは、標的抗原を認識するポリペプチド配列を含み得、ここで、その認識配列は、例えば、Ｔ細胞レセプターまたはｓｃＦｖに由来する認識配列であり得るがこれらに限定されない。細胞内ドメインポリペプチドは、Ｔ細胞を活性化するように作用するポリペプチドである。キメラＴ細胞レセプターは、例えば、Ｇｒｏｓｓ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｅｓｈａｒ，Ｚ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：３３７０−３３７８（１９９２）およびＺｈａｎｇ，Ｙ．ら、ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ６：１−１３（２０１０）において論じられている。
【０１０５】
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の１タイプにおいて、腫瘍特異的モノクローナル抗体の可変重（ＶＨ）鎖および軽（ＶＬ）鎖は、Ｔ細胞複合体に由来するＣＤ３ゼータ鎖（ζ）とインフレームで融合される。そのＶＨおよびＶＬは、通常、グリシン−セリンフレキシブルリンカーを使用して互いに接続され、次いで、スペーサー（ＣＨ２ＣＨ３）によって膜貫通ドメインに結合されることにより、腫瘍抗原と相互作用できるようにｓｃＦｖが細胞表面から離れて伸長する。形質導入の後、Ｔ細胞は、この時点で、その表面上にＣＡＲを発現し、腫瘍抗原と接触し、ライゲーションすると、ＣＤ３ゼータ鎖を介してシグナル伝達し、細胞傷害および細胞活性化を誘導する。
【０１０６】
研究者らは、ＣＤ３ゼータを介したＴ細胞の活性化が、腫瘍特異的殺滅を誘導するのに十分であるが、Ｔ細胞の増殖および生存を誘導するには不十分であることを述べている。ゼータ鎖のみを発現している第１世代ＣＡＲによって改変されたＴ細胞を使用した初期の臨床試験は、遺伝子が改変されたＴ細胞が、インビボにおいて不良な生存および増殖を示すことを示した。
【０１０７】
Ｂ７軸を介した共刺激が、完全なＴ細胞活性化にとって必要であるので、研究者らは、共刺激ポリペプチドＣＤ２８シグナル伝達ドメインをＣＡＲ構築物に付加した。この領域は、通常、膜貫通領域（ＣＤ３ゼータバージョンの代わりに）、ならびにＰＩ３ＫおよびＬｃｋに結合するためのＹＭＮＭモチーフを含む。ゼータだけを有するＣＡＲまたはゼータとＣＤ２８の両方を有するＣＡＲを発現しているＴ細胞の間のインビボでの比較から、活性化後のＩＬ−２産生の増加に部分的に起因して、ＣＤ２８がインビボにおいて増殖を促進することが実証された。ＣＤ２８を含んでいるものは、第２世代ＣＡＲと呼ばれる。最もよく使用される共刺激分子としては、ＣＤ２８および４−１ＢＢが挙げられ、これらは、腫瘍認識後に、ＮＦ−κＢの活性化をもたらすシグナル伝達カスケードを惹起し得、Ｔ細胞の増殖と細胞生存の両方を促進する。
【０１０８】
ＣＡＲのデザインにおいて共刺激ポリペプチド４−１ＢＢまたはＯＸ４０を使用することにより、Ｔ細胞の生存および効力がさらに改善された。４−１ＢＢは、特に、Ｔ細胞の増殖および生存を大幅に増強するとみられる。この第３世代のデザイン（３つのシグナル伝達ドメインを有する）は、ＰＳＭＡ  ＣＡＲ（Ｚｈｏｎｇ  ＸＳら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１０  Ｆｅｂ；１８（２）：４１３−２０）およびＣＤ１９  ＣＡＲにおいて、最も著しくはＣＬＬの処置のために、使用されている（Ｍｉｌｏｎｅ，Ｍ．Ｃ．ら（２００９）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１４５３−１４６４；Ｋａｌｏｓ，Ｍ．ら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．（２０１１）３：９５ｒａ７３；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．ら（２０１１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：７２５−５３３）。これらの細胞は、インビボにおいて１０００倍超増殖して、３人の患者において目覚ましい機能を示し、３人の患者すべてにおいて持続的な緩解をもたらした。
【０１０９】
「由来する」が、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、分子の配列に由来し得ることを意味することは、理解される。細胞内ドメインは、Ｔ細胞の活性化を引き起こす少なくとも１種のポリペプチド（例えば、ＣＤ３ゼータなどが挙げられるが、これらに限定されない）および例えば、共刺激分子（例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４−１ＢＢが挙げられるが、これらに限定されない）を含む。
【０１１０】
Ｔ細胞レセプターは、Ｔ細胞の表面に存在する２種の異なるポリペプチドから構成される分子である。それらは、主要組織適合遺伝子複合体分子に結合した抗原を認識する；上記抗原での認識の際に、上記Ｔ細胞は活性化される。「認識する」は、例えば、Ｔ細胞レセプターまたはそのフラグメント（単数または複数）、例えば、ＴＣＲαポリペプチドおよびＴＣＲβが一緒に、上記抗原と接触し、これを標的として同定することができることを意味する。ＴＣＲは、αおよびβポリペプチド、または鎖を含み得る。このαポリペプチドおよびβポリペプチドは、２つの細胞外ドメイン、可変ドメインおよび定常ドメインを含む。このαおよびβポリペプチドの可変ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する；ＣＤＲ３は、エピトープの認識を担う主要なＣＤＲであると考えられる。そのαポリペプチドは、ＶＪ組換えによって生成される、Ｖ領域およびＪ領域を含み、そのβポリペプチドは、ＶＤＪ組換えによって生成される、Ｖ領域、Ｄ領域、およびＪ領域を含む。ＶＪ領域およびＶＤＪ領域の交差は、ＣＤＲ３領域に相当する。ＴＣＲはしばしば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  （ＩＭＧＴ）  ＴＣＲ命名を使用して命名される（ＩＭＧＴデータベース、ｗｗｗ．ＩＭＧＴ．ｏｒｇ；  Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ，  Ｖ．ら，ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ−ＤＢ、免疫グロブリンおよびＴ細胞レセプターヌクレオチド配列のＩＭＧＴ（登録商標）包括的データベース、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３４，  Ｄ７８１−Ｄ７８４  （２００６）．  ＰＭＩＤ：  １６３８１９７９；Ｔ細胞レセプター  Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ，  ＬｅＦｒａｎｃ  ａｎｄ  ＬｅＦｒａｎｃ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ＩＳＢＮ    ０−１２−４４１３５２−８）。
【０１１１】
キメラＴ細胞レセプターは、例えば、抗原性ポリペプチド（例えば、Ｂｏｂ−１、ＰＲＡＭＥ、およびＮＹ−ＥＳＯ−１）に結合し得る（米国特許出願第１４／９３０，５７２号（２０１５年１１月２日出願、標題「Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｂｏｂ１  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」、および米国仮特許出願第６２／１３０，８８４号（２０１５年３月１０日出願、標題「Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」）（これらの各々は、その全体において本明細書に参考として援用される）。
【０１１２】
細胞治療の別の例では、Ｔ細胞は、非機能的ＴＧＦ−βレセプターを発現し、それらをＴＧＦ−βに対して耐性にするように改変される。これは、その改変されたＴ細胞がＴＧＦ−βによって引き起こされる細胞毒性を回避することを可能にし、上記細胞が細胞治療において使用されることを可能にする（Ｂｏｌｌａｒｄ，  Ｃ．Ｊ．ら，  （２００２）  Ｂｌｏｏｄ  ９９：３１７９−３１８７；  Ｂｏｌｌａｒｄ，  Ｃ．Ｍ．ら，  （２００４）  Ｊ．  Ｅｘｐｔｌ．  Ｍｅｄ．  ２００：１６２３−１６３３）。しかし、それはまた、Ｔ細胞リンパ腫または他の有害作用を生じ得る。なぜなら上記改変されたＴ細胞は、いまや正常な細胞コントロールの一部を欠いているからである；これら治療用Ｔ細胞は、それら自体が悪性になり得る。これら改変されたＴ細胞を、本明細書で示されるとおりのキメラカスパーゼ−９ベースの安全スイッチで形質導入すると、この結果を回避し得る安全スイッチが提供される。
【０１１３】
他の例では、ナチュラルキラー細胞は、膜会合ポリペプチドを発現するように改変される。キメラ抗原レセプターの代わりに、ある種の実施形態において、異種膜結合ポリペプチドは、ＮＫＧ２Ｄレセプターである。ＮＫＧ２Ｄレセプターは、腫瘍細胞上のストレスタンパク質（例えば、ＭＩＣＡ／Ｂ）に結合し得、それによってＮＫ細胞を活性化し得る。細胞外結合ドメインはまた、シグナル伝達ドメインに融合され得る（Ｂａｒｂｅｒ，  Ａ．ら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７；６７：  ５００３−８；  Ｂａｒｂｅｒ  Ａら，  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２００８；  ３６：１３１８−２８；  Ｚｈａｎｇ  Ｔ．ら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００７；  ６７：１１０２９−３６．）、そしてこれは、翻って、ＦＲＢ連結（linkered）ＣＡＲに類似のＦＲＢドメインに連結され得る。さらに、他の細胞表面レセプター（例えば、ＶＥＧＦ−Ｒ）は、多くの腫瘍内で、高レベルで見出される、低酸素症誘発性ＶＥＧＦの存在下で腫瘍依存性クラスター化を高めるために、ＦＲＢドメインのドッキング部位として使用され得る。
【０１１４】
異種遺伝子（例えば、改変されたレセプター、またはキメラレセプター）を発現する、細胞治療において使用される細胞は、細胞が異種遺伝子で形質導入される前に、それの後に、またはそれと同時にキメラカスパーゼ−９ベースの安全スイッチをコードする核酸で形質導入され得る。
【０１１５】
（ハプロタイプ一致幹細胞移植）
幹細胞移植は、造血幹細胞およびそれらの子孫が関わる広く種々の疾患を処置する有効な手段と判明した一方で、組織適合性ドナーの不足は、このアプローチの最も広い適用に対する主な障害であると判明した。血縁のない幹細胞ドナーおよび／または臍帯血バンクの大きな一団の導入は、その問題を緩和する一助となったが、多くの患者は、いずれの供給源とも適合しないままである。マッチしたドナーが見出され得る場合ですら、検索の開始と幹細胞の収集との間に経過した時間は、通常、最も必要な患者のうちの多くを運命付け得る遅れである３ヶ月を超える。従って、ＨＬＡハプロタイプ一致の家族ドナーを利用するにあたっては、かなりの重要性が存在している。かかるドナーは、親、同胞（sibling）、もしくは第２度近親者であり得る。移植拒絶という問題は、幹細胞の適切な馴化および大きな用量の組み合わせによって克服され得る一方で、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）は、ドナー移植片の広範なＴ細胞枯渇によって防止され得る。このような手順の即座の結果は、移植後免疫抑制の非存在下ですら、成人および小児の両方に関して生着率＞９０％および重症ＧｖＨＤ率＜１０％ゆえに満足させるものである。不運なことに、広範なＴ細胞枯渇およびドナーとレシピエントとの間のＨＬＡミスマッチと結びつけられた移植手順の十分な免疫抑制は、極めて高率の移植後感染性合併症をもたらし、疾患再発の高い発生率に寄与する。
【０１１６】
ドナーＴ細胞注入は、同種幹細胞移植後の抗ウイルス免疫および抗腫瘍免疫を付与するための有効なストラテジーである。しかし、ハプロタイプ一致移植後に患者にＴ細胞を単純に追加戻し（addback）しても、機能させられない；同種反応性Ｔ細胞の頻度は、例えば、ウイルス特異的Ｔリンパ球の頻度より数桁高い。同種反応性細胞を最初に枯渇させたドナーＴ細胞を投与することによって、免疫再形成を促進するための方法が開発されつつある。これを達成するための１つの方法は、ドナーＴ細胞をレシピエントのＥＢＶで形質転換したＢリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）で刺激することである。同種反応性Ｔ細胞は、ＣＤ２５発現をアップレギュレートし、ＣＤ２５  Ｍａｂ免疫毒素結合体、ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡによって排除される。この化合物は、化学的に脱グリコシル化されたリシンＡ鎖（ｄｇＡ）へとヘテロ二官能性架橋剤［Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−ｄ−（２−ピリジルチオ）トルエン］を介して結合体化したマウスＩｇＧ１抗ＣＤ２５（ＩＬ−２レセプターα鎖）からなる。
【０１１７】
ＬＣＬ刺激後のＣＤ２５免疫毒素での処置は、同種反応性細胞のうちの＞９０％を枯渇させる。フェーズＩ臨床研究において、ＣＤ２５免疫毒素を使用して同種反応性リンパ球を枯渇させ、同種枯渇させた後の免疫再形成ドナーＴ細胞を２用量レベルで、Ｔ細胞枯渇ハプロタイプ一致ＳＣＴのレシピエントへと注入した。８名の患者を、１０４細胞／ｋｇ／用量で処置し、８名の患者に、１０５  細胞／ｋｇ／用量を与えた。１０５細胞／ｋｇ／用量を受ける患者は、１０４  細胞／ｋｇ／用量を受ける患者と比較して、ＳＣＴ後の３ヶ月、４ヶ月、および５ヶ月で、有意に改善されたＴ細胞回復を示した（Ｐ＜０．０５）。促進されたＴ細胞回復は、エフェクター記憶（ＣＤ４５ＲＡ（−）ＣＣＲ−７（−））集団の拡大の結果として起こった（Ｐ＜０．０５）。このことは、防御Ｔ細胞応答が長く生存するようであることを示唆する。Ｔ細胞レセプターシグナルジョイント除去サークル（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｊｏｉｎｔ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｃｉｒｃｌｅ）（ＴＲＥＣ）は、用量レベル２の患者においてＴ細胞の再構築において検出されなかった。このことは、それらがその注入された同種枯渇した細胞に由来するようであることを示す。４ヶ月でのＴ細胞のスペクトルタイピング（ｓｐｅｃｔｒａｔｙｐｉｎｇ）は、ポリクローナルＶβレパートリーを示した。四量体および酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイを使用すると、用量レベル２では６名の評価可能な患者のうちの４名において、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）特異的応答が移植後２〜４ヶ月程度の早さで観察されたが、このような応答は、用量レベル１の患者において６〜１２ヶ月まで観察されなかった。有意な急性の移植片対宿主病（１６名のうちの２名）および慢性の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ；１５名のうちの２名）の発生率は、低かった。これらのデータは、同種枯渇したドナーＴ細胞が、ハプロタイプ一致ＳＣＴ後にＴ細胞回復を改善するために安全に使用され得ることを示す。注入される細胞の量を、その後、ＧｖＨＤの証拠なしに１０６  細胞／ｋｇへと上昇させた。
【０１１８】
このアプローチは、抗ウイルス免疫を再構築したが、再発は主要な問題のままであり、６名の患者は、高リスクの白血病再発のために移植し疾患で死亡した。従って、より高いＴ細胞用量は、抗腫瘍免疫を再構築するために、および待ち望まれた抗腫瘍効果を提供するために有用である。なぜなら腫瘍反応性前駆体のその推測される頻度は、ウイルス反応性前駆体の頻度より１〜２対数低いからである。しかし、いくらかの患者では、細胞のこれら用量は、同種枯渇の後ですらＧｖＨＤを引き起こすために十分である（Ｈｕｒｌｅｙ  ＣＫら，  Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２００３；９：６１０−６１５；  Ｄｅｙ  ＢＲら，  Ｂｒ．Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  ２００６；１３５：４２３−４３７；  Ａｖｅｒｓａ  Ｆら，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９９８；３３９：１１８６−１１９３；  Ａｖｅｒｓａ  Ｆら，  Ｊ  Ｃ  ｌｉｎ．Ｏｎ  ｃｏｌ．  ２００５；２３：３４４７−３４５４；Ｌａｎｇ  Ｐ，  Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．  ２００４；３３：２８１−２８７；  Ｋｏｌｂ  ＨＪら，  Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０３：７６７−７７６；  Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ  Ｓら，  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ  ２００５；５６：２９−４４；  Ｂｌｅａｋｌｅｙ  Ｍら，  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００４；４：３７１−３８０；  Ａｎｄｒｅ−Ｓｃｈｍｕｔｚ  Ｉら，  Ｌａｎｃｅｔ  ２００２；３６０：１３０−１３７；  Ｓｏｌｏｍｏｎ  ＳＲら，  Ｂｌｏｏｄ  ２００５；１０６：１１２３−１１２９；  Ａｍｒｏｌｉａ  ＰＪら，  Ｂｌｏｏｄ  ２００６；１０８：１７９７−１８０８；  Ａｍｒｏｌｉａ  ＰＪら，  Ｂｌｏｏｄ  ２００３；  Ｇｈｅｔｉｅ  Ｖら，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９１；１４２：２２３−２３０；  Ｍｏｌｌｄｒｅｍ  ＪＪら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９；５９：２６７５−２６８１；  Ｒｅｚｖａｎｉ  Ｋら，  ＣＩｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００５；１  １：８７９９−８８０７；  Ｒｅｚｖａｎｉ  Ｋら，  Ｂｌｏｏｄ  ２００３；１０２：２８９２−２９００）。
【０１１９】
（移植片対宿主病（ＧｖＨＤ））
移植片対宿主病は、ドナーの免疫担当細胞（例えば、Ｔ細胞）をレシピエントへと移植した後にときおり起こる状態である。上記移植した細胞は、そのレシピエントの細胞を外来物質として認識し、それらを攻撃および破壊する。この状態は、Ｔ細胞移植の、特に、ハプロタイプ一致幹細胞移植と関連する場合に、危険な効果であり得る。十分なＴ細胞が、有益な効果（例えば、免疫系の再形成および移植片の抗腫瘍効果など）を提供するために注入されるべきである。しかし、移植され得るＴ細胞の数は、移植が重症の移植片対宿主病を生じるという懸念によって制限され得る。
【０１２０】
移植片対宿主病は、以下の表に示されるように病期分類され得る：
【表１０】
2020096640.tif 000002
【０１２１】
急性ＧｖＨＤグレード判定は、コンセンサス会議基準によって行われ得る（Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ  Ｄら．，  １９９４  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｃｕｔｅ  ＧＶＨＤ  Ｇｒａｄｉｎｇ．  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １９９５；１５：８２５−８２８）。
【０１２２】
【表１１】
2020096640.tif 000003
【０１２３】
（細胞治療および遺伝子操作された細胞移植の「安全スイッチ」としての誘導性カスパーゼ−９）
移植片対宿主病の作用を低減するとは、例えば、患者がより低いレベルのステージに割り当てられ得るように、ＧｖＨＤの症状における減少、または例えば、移植片対宿主病の症状を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％減少させることを意味する。移植片対宿主病の効果の減少はまた、ＧｖＨＤ反応に関与する活性化Ｔ細胞の減少（例えば、マーカータンパク質（例えば、ＣＤ１９）を発現し、そしてＣＤ３を発現する細胞（例えば、ＣＤ３＋ＣＤ１９＋細胞）の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％減少など）の検出によって測定され得る。
【０１２４】
本明細書で提供されるのは、二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）を結合するために最適化されるＦＫＢＰバリアントと融合されるヒトアポトーシス促進分子に基づく代替の自殺遺伝子ストラテジーである。バリアントとしては、例えば、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される３６位でのアミノ酸置換を有するＦＫＢＰ領域を含み得る（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  Ｔら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９８，  ９５：１０４３７−１０４４２）。ＡＰ１９０３は、健常志願者において安全であると判明している合成分子である（Ｉｕｌｉｕｃｃｉ  ＪＤら，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２００１，  ４１：８７０−８７９）。この小分子の投与は、アポトーシス促進標的分子の架橋および活性化を生じる。ヒトＴリンパ球におけるこの誘導性システムの適用を、Ｆａｓまたはアポトーシス促進分子としてのＦａｓ関連デスドメイン含有タンパク質（ＦＡＤＤ）のデスエフェクタードメイン（ＤＥＤ）を使用して探索した。これら誘導性死分子で形質導入されたＴ細胞の９０％までが、ＣＩＤの投与後にアポトーシスを受けた（Ｔｈｏｍｉｓ  ＤＣら，  Ｂｌｏｏｄ．  ２００１，  ９７：１２４９−１２５７；  Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＤＭら，  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．  １９９６，  ６：  ８３９−８４７；  Ｆａｎ  Ｌら，  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １９９９，  １０：  ２２７３−２２８５；  Ｂｅｒｇｅｒ  Ｃら，  Ｂｌｏｏｄ．  ２００４，  １０３：１２６１−１２６９；  Ｊｕｎｋｅｒ  Ｋら，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００３，  １０：１１８９−  １９７）。この自殺遺伝子ストラテジーは、細胞治療のために使用される任意の適切な細胞（例えば、造血幹細胞、および他の前駆体細胞（例えば、間葉系ストローマ細胞、胚性幹細胞、および人工多能性幹細胞が挙げられる）が挙げられる）において使用され得る。ＡＰ２０１８７およびＡＰ１９５０（ＡＰ１９０３の合成バージョン）はまた、リガンド誘導物質として使用され得る（Ａｍａｒａ  ＪＦ  （９７）  ＰＮＡＳ  ９４：１０６１８−２３；  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ−Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）。
【０１２５】
従って、この安全スイッチ（カスパーゼ−９によって触媒される）は、トランスフェクトまたは形質導入された治療用細胞の除去を要する細胞治療患者における状態が存在する場合に使用され得る。上記細胞が除去される必要があり得る状態としては、例えば、ＧｖＨＤ、上記細胞が誤った組織または細胞タイプのより成熟した細胞へ不適切に分化すること、および他の毒性が挙げられる。不適切な分化の場合にカスパーゼ−９スイッチを活性化するために、組織特異的プロモーターを使用することは可能である。例えば、前駆体細胞が骨および脂肪細胞へと分化する、および脂肪細胞が望ましくない場合、上記前駆体細胞をトランスフェクトまたは形質導入するために使用されるベクターは、カスパーゼ−９ヌクレオチド配列に作動可能に連結された脂肪細胞特異的プロモーターを有し得る。このように、多量体リガンドの投与の際に、上記細胞が脂肪細胞へと分化するのであれば、その不適切に分化した脂肪細胞のアポトーシスが生じるはずである。
【０１２６】
上記方法は、例えば、細胞治療によって緩和され得る任意の障害（がん、血液または骨髄におけるがん、他の血液または骨髄由来の疾患（例えば、鎌状赤血球貧血および異染性白質ジストロフィー（ｍｅｔａｃｈｒｏｍｉｃ  ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ））、および幹細胞移植によって緩和され得る任意の障害（例えば、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィー（ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｌ  ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）などの血液または骨髄障害）が挙げられる）のために使用され得る。
【０１２７】
養子免疫療法の効力は、治療用Ｔ細胞を腫瘍細胞によって使用される免疫回避ストラテジーに耐性にすることによって高められ得る。インビトロ研究は、これがドミナントネガティブレセプターまたは免疫調節性サイトカインでの形質導入によって達成され得ることを示した（Ｂｏｌｌａｒｄ  ＣＭら，  Ｂｌｏｏｄ．  ２００２，  ９９：３１７９−３１８７：  Ｗａｇｎｅｒ  ＨＪら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００４，  １１：８１−９１）。さらに、抗原特異的Ｔ細胞レセプターの移入は、Ｔ細胞治療をより広い範囲の腫瘍へと適用することを可能にする（Ｐｕｌｅ  Ｍら，  Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．  ２００３，  ５：２１１−２２６；  Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ＴＮ，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００２，  ２：５１２−５１９）。操作されたヒトＴ細胞の自殺システムを、臨床研究における該Ｔ細胞のその後の使用を可能にするために開発および試験した。カスパーゼ−９を改変したところ、ヒトＴリンパ球において、それらの機能的および表現型特性を損なうことなく、アップレギュレートされた抗アポトーシス分子を有するＴ細胞ですら、ＣＩＤへの感受性を示す一方で安定して発現されることが示された（Ｓｔｒａａｔｈｏｆ，  Ｋ．Ｃ．ら，  ２００５，  Ｂｌｏｏｄ  １０５：４２４８−５４）。
【０１２８】
遺伝子治療のために使用される遺伝子改変された細胞において、その遺伝子は、その遺伝子を発現するために使用される細胞以外の供給源に由来する異種ポリヌクレオチド配列であり得る。上記遺伝子は、細菌、ウイルス、酵母、寄生生物、植物、またはさらには動物などの原核生物または真核生物供給源に由来する。この異種ＤＮＡはまた、１つより多くの供給源に由来する（すなわち、マルチ遺伝子構築物または融合タンパク質）。この異種ＤＮＡはまた、１つの供給源に由来する制御配列および異なる供給源に由来する遺伝子を含み得る。または、この異種ＤＮＡは、細胞内因性遺伝子の通常の発現を変更させるために使用される制御配列を含み得る。
【０１２９】
（他のカスパーゼ分子）
最新技術のキメラポリペプチド（polypeotide）によってコードされ得るカスパーゼ−９以外のカスパーゼポリペプチドとしては、例えば、カスパーゼ−１、カスパーゼ−３、およびカスパーゼ−８が挙げられる。これらカスパーゼポリペプチドの考察は、例えば、ＭａｃＣｏｒｋｌｅ，  Ｒ．Ａ．ら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  （１９９８）  ９５：３６５５−３６６０；  および  Ｆａｎ，  Ｌ．ら  （１９９９）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：２２７３−２２８５）に見出され得る。
【０１３０】
（発現構築物の操作）
発現構築物は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチド、またはある種の実施形態では、多量体リガンド結合領域およびマーカーポリペプチドに連結されたカスパーゼ−９ポリペプチド（全て作用的に連結される）をコードする。一般に、用語「作動可能に連結される」とは、プロモーター配列が第２の配列に機能的に連結される（ここで例えば、上記プロモーター配列は、上記第２の配列に相当するＤＮＡの転写を開始および媒介する）ことを示すことを意味する。このカスパーゼ−９ポリペプチドは、全長であってもよいし、短縮型であってもよい。ある種の実施形態において、上記マーカーポリペプチドは、上記カスパーゼ−９ポリペプチドに連結される。例えば、上記マーカーポリペプチドは、ポリペプチド配列（例えば、切断可能な２Ａ様配列など）を介して上記カスパーゼ−９ポリペプチドに連結され得る。上記マーカーポリペプチドは、例えば、ＣＤ１９であり得るか、または例えば、異種タンパク質であり得、キメラカスパーゼポリペプチドの活性に影響を及ぼさないように選択され得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、カスパーゼ−９ポリペプチドおよび異種タンパク質（これは、例えば、マーカーポリペプチドであり得、例えば、キメラ抗原レセプターであり得る）をコードし得る。上記異種ポリペプチド、例えば、上記キメラ抗原レセプターは、ポリペプチド配列（例えば、切断可能な２Ａ様配列など）を介して上記カスパーゼ−９ポリペプチドに連結され得る。
【０１３２】
ある種の例では、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む核酸は、第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同じベクター（例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターなど）の中に含まれる。この第２のポリペプチドは、例えば、カスパーゼポリペプチド（本明細書で論じられるとおり）またはマーカーポリペプチドであり得る。これらの例では、上記構築物は、切断可能な２Ａポリペプチドによって連結される上記２種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸に作動可能に連結された１個のプロモーターとともにデザインされ得る。この例では、上記第１のおよび第２のポリペプチドは、翻訳の間に分断され、キメラ抗原レセプターポリペプチド、および上記第２のポリペプチドを生じる。他の例では、上記２種のポリペプチドは、同じベクターから別個に発現され得、ここで上記ポリペプチドのうちの一方をコードするポリヌクレオチドを含む各核酸が、別個のプロモーターに作動可能に連結される。なお他の例では、１個のプロモーターは、上記２個の核酸に作動可能に連結され得、２個の別個のＲＮＡ転写物、従って２種のポリペプチドの生成を指向し得る。従って、本明細書で論じられる発現構築物は、少なくとも１個、または少なくとも２個のプロモーターを含み得る。
【０１３３】
２Ａ様配列、または「切断可能な」２Ａ配列は、例えば、多くの異なるウイルス（例えば、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａが挙げられる）に由来する。これらの配列はときおり、「ペプチドスキッピング配列（peptide  skipping  sequence）」としても公知である。このタイプの配列は、分断されることが意図される２個のペプチドの間でシストロン内に配置される場合、リボソームは、ペプチド結合をスキップするようであり、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ配列の場合、Ｇｌｙアミノ酸とＰｒｏアミノ酸との間の結合は省かれる。これは、２種のポリペプチド、この場合には、上記カスパーゼ−９ポリペプチドおよび上記マーカーポリペプチドを残す。この配列が使用される場合、２Ａ配列の５’側にコードされるペプチドは、カルボキシ末端におけるさらなるアミノ酸（Ｇｌｙ残基が挙げられる）および２Ａ配列における任意の上流で終わり得る。２Ａ配列の３’側にコードされる上記ペプチドは、アミノ末端におけるさらなるアミノ酸（Ｐｒｏ残基が挙げられる）および２Ａ配列における任意の下流で終わり得る。「２Ａ」または「２Ａ様」配列は、ペプチド結合スキッピングを引き起こし得るペプチドの大きなファミリーの一部である。種々の２Ａ配列が特徴付けられており（例えば、Ｆ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ）、本出願のポリペプチドにおいて使用され得る２Ａ様配列の例である。
【０１３４】
発現構築物は、ベクター（例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドベクター）へと挿入され得る。提供される方法のことは、任意の適切な方法を使用して行われ得る；これら方法としては、抗原提示細胞（本明細書で示される）へと核酸を形質導入、形質転換、またはさもなければ提供するための方法が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、短縮型カスパーゼ−９ポリペプチドは、ＤＮＡリンカーありもしくはなしで、配列番号８、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７のヌクレオチド配列、もしくはこれらの機能的に等価なフラグメントによってコードされるか、あるいは配列番号９、配列番号２４、配列番号２６、もしくは配列番号２８のアミノ酸配列またはこれらの機能的に等価なフラグメントを有する。いくつかの実施形態において、ＣＤ１９ポリペプチドは、ＤＮＡリンカーありもしくはなしで、配列番号１４のヌクレオチド配列もしくはその機能的に等価なフラグメントによってコードされるか、または配列番号１５のアミノ酸配列もしくはその機能的に等価なフラグメントを有する。カスパーゼ−９ポリペプチドの機能的に等価なフラグメントは、配列番号９のポリペプチドと実質的に同じアポトーシスを誘導する能力を有し、配列番号９のポリペプチドの能力のうちの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を有する。ＣＤ１９ポリペプチドの機能的に等価なフラグメントは、標準的検出技術を使用して、配列番号１５のポリペプチドと比較される場合、形質導入またはトランスフェクトされた細胞を同定および選択するために使用されるべきマーカーとして作用する、検出されているマーカーポリペプチドのうちの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を有して、配列番号１５のポリペプチドと実質的に同じ能力を有する。
【０１３５】
より詳細には、１個より多くのリガンド結合ドメインまたは多量体化領域は、発現構築物の中で使用され得る。なおさらには、上記発現構築物は、膜標的化配列を含む。適切な発現構築物は、上記のＦＫＢＰ１２多量体化領域のいずれかの側に、共刺激ポリペプチドエレメントを含み得る。
【０１３６】
ある種の例では、誘導性カスパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドと同じベクター（例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターなど）の中に含まれる。これらの例では、上記構築物は、切断可能な２Ａポリペプチドによって連結される２種のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸に作動可能に連結された１個のプロモーターでデザインされ得る。この例では、上記第１のおよび第２のポリペプチドは、発現後に切断され、キメラ抗原レセプターポリペプチドおよび誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドを生じる。他の例では、上記２種のポリペプチドは、同じベクターから別個に発現され得、ここで上記ポリペプチドのうちの一方をコードするヌクレオチド配列を含む各核酸が、別個のプロモーターに作動可能に連結される。なお他の例では、１個のプロモーターは、２個の核酸に作動可能に連結され得、２個の別個のＲＮＡ転写物、従って、２種のポリペプチドの生成を指向し得る。従って、本明細書で論じられる発現構築物は、少なくとも１個、または少なくとも２個のプロモーターを含み得る。
【０１３７】
なお他の例では、２種のポリペプチドは、２個の別個のベクターを使用して、細胞において発現され得る。上記細胞は、上記ベクターで共トランスフェクトまたは共形質転換され得るか、または上記ベクターは、種々の時間で上記細胞へと導入され得る。
【０１３８】
（リガンド結合領域）
発現構築物のリガンド結合（「二量体化」）ドメインまたは多量体化領域は、天然または非天然のリガンド、例えば、非天然の合成リガンドを使用して誘導を可能にし得る任意の好都合なドメインであり得る。多量体化領域は、構築物の性質およびリガンドの選択に応じて、細胞膜に対して内側または外側であり得る。上に示された細胞質領域と会合されるリガンド結合タンパク質を含むレセプターをはじめとした多種多様のリガンド結合タンパク質が公知である。本明細書中で使用されるとき、用語「リガンド結合ドメイン」は、用語「レセプター」と相互交換可能であり得る。リガンド（例えば、小さい有機リガンド）が公知であるかまたは容易に生成され得るリガンド結合タンパク質が、特に興味深い。これらのリガンド結合ドメインまたはレセプターには、ＦＫＢＰおよびシクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、上に示された他のレセプターなど、ならびに抗体から得ることができる「非天然の」レセプター、特に、重鎖または軽鎖サブユニット、その変異された配列、確率論的手順、コンビナトリアル合成などによって得られるランダムアミノ酸配列が含まれる。ある特定の実施形態において、リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２多量体化領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域、ステロイドレセプターリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域およびテトラサイクリンレセプターリガンド結合領域からなる群より選択される。しばしば、リガンド結合領域は、ＦｖＦｖｌｓ配列を含む。時折、Ｆｖ’Ｆｖｌｓ配列は、さらなるＦｖ’配列をさらに含む。例としては、例えば、Ｋｏｐｙｔｅｋ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：３１３−３２１（２０００）およびＧｅｓｔｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍ．＆  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  １０：６６７−６７５（２００７）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  Ｔ（２００６）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  ６７：４４０−２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，ｓ．ら、ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ，２００７））において論じられているものが挙げられる。
【０１３９】
おおむね、リガンド結合ドメインまたはレセプタードメインは、天然のドメインまたはその切断された活性な一部として、少なくとも約５０アミノ酸、および約３５０アミノ酸未満、通常、２００アミノ酸未満であり得る。結合ドメインは、例えば、低分子（ウイルスベクターでの効率的なトランスフェクションを可能にする＜２５ｋＤａ）であり得、モノマーであり得、非免疫原性であり得、二量体化のために形成され得る、合成的に入手可能な細胞透過性の無毒性リガンドを有し得る。
【０１４０】
レセプタードメインは、発現構築物のデザインおよび適切なリガンドの利用可能性に応じて、細胞内または細胞外であり得る。疎水性リガンドの場合、結合ドメインは、膜のいずれの側であってもよいが、親水性リガンド、特に、タンパク質リガンドの場合、リガンドを結合にとって利用可能な形態で内部移行させるための輸送系が存在しない場合、結合ドメインは、通常、細胞膜に対して外側であり得る。細胞内レセプターの場合、構築物は、レセプタードメイン配列の５’または３’においてシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインをコードし得るか、またはレセプタードメイン配列の５’に脂質付着シグナル配列を有し得る。レセプタードメインが、シグナルペプチドと膜貫通ドメインとの間に存在する場合、レセプタードメインは、細胞外であり得る。
【０１４１】
レセプターをコードする発現構築物の一部は、種々の理由のために変異誘発に供され得る。変異誘発されたタンパク質は、より高い結合親和性を提供し得、天然に存在するレセプターと変異誘発されたレセプターとのリガンドによる区別を可能にし得、レセプター−リガンド対などをデザインする機会を提供し得る。レセプターの変更は、結合部位におけるコンビナトリアル法を使用したランダム変異誘発と知られているアミノ酸の変更を含み得、ここで、結合部位に関連するアミノ酸または立体構造変化に関連する他のアミノ酸に対するコドンが、特定のアミノ酸に対するコドン（複数可）を公知の変化によってまたはランダムに変更し、得られるタンパク質を適切な原核生物宿主において発現し、次いで、得られたタンパク質を結合についてスクリーニングすることによって、変異誘発に供され得る。
【０１４２】
抗体および抗体サブユニット、例えば、重鎖もしくは軽鎖、特にフラグメント、より詳細には、可変領域の全部もしくは一部、または高親和性結合をもたらす重鎖と軽鎖との融合物が、結合ドメインとして使用され得る。企図される抗体には、免疫応答を引き起こさず、一般に末梢（すなわち、ＣＮＳ／脳領域の外側）では発現されない細胞外ドメインなどの異所的に発現されたヒト生成物であるものが含まれる。そのような例としては、低親和性神経成長因子レセプター（ＬＮＧＦＲ）および胚表面タンパク質（すなわち、癌胎児抗原）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
なおもさらに、抗体は、生理的に許容され得るハプテン分子、および結合親和性についてスクリーニングされる個別の抗体サブユニットに対して調製され得る。そのサブユニットをコードするｃＤＮＡは、単離され、定常領域、可変領域の一部の欠失、可変領域の変異誘発などによって改変されることにより、リガンドに対して適切な親和性を有する結合タンパク質ドメインを得ることができる。このように、ほとんどの生理的に許容され得る任意のハプテン化合物が、リガンドとして使用され得るか、またはリガンドに対するエピトープを提供するために使用され得る。抗体単位の代わりに、結合ドメインが公知であって、結合のための有用なリガンドが存在する、天然のレセプターが使用され得る。
【０１４４】
（オリゴマー化）
形質導入されるシグナルは、通常、キメラタンパク質分子のリガンド媒介性のオリゴマー化によって、すなわち、リガンドが結合した後のオリゴマー化の結果として、生じ得るが、他の結合事象、例えば、アロステリックな活性化が、シグナルを惹起するために使用され得る。キメラタンパク質の構築物は、様々なドメインの順序および個々のドメインの反復の数に関して、変動し得る。
【０１４５】
レセプターを多量体化する場合、キメラ表面膜タンパク質のリガンド結合ドメイン／レセプタードメインに対するリガンドは、通常、少なくとも２つの結合部位を有し、それらの結合部位の各々がリガンドレセプタードメインに結合することができるという意味において、多量体であり得る。「多量体リガンド結合領域」または「多量体化領域」とは、多量体リガンドに結合するリガンド結合領域のことを意味する。用語「多量体リガンド」には、二量体のリガンドが含まれる。二量体のリガンドは、リガンドレセプタードメインに結合することができる２つの結合部位を有し得る。望ましくは、対象のリガンドは、二量体またはそれより高次のオリゴマー、通常、約四量体以下の、小さい合成有機分子であり得、個々の分子は、代表的には、少なくとも約１５０Ｄａおよび約５ｋＤａ未満、通常、約３ｋＤａ未満であり得る。合成リガンドとレセプターとの種々の対が、使用され得る。例えば、天然のレセプターを含む実施形態において、二量体のＦＫ５０６は、ＦＫＢＰ１２レセプターとともに使用され得、二量体化されたシクロスポリンＡは、シクロフィリンレセプターとともに使用され得、二量体化されたエストロゲンは、エストロゲンレセプターとともに使用され得、二量体化された糖質コルチコイドは、糖質コルチコイドレセプターとともに使用され得、二量体化されたテトラサイクリンは、テトラサイクリンレセプターとともに使用され得、二量体化されたビタミンＤは、ビタミンＤレセプターとともに使用され得るなど。あるいは、それより高次のリガンド、例えば、三量体が、使用され得る。非天然のレセプター、例えば、抗体サブユニット、改変された抗体サブユニット、フレキシブルリンカードメインによって分断された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタンデムで含む一本鎖抗体、または改変されたレセプターならびにその変異された配列などを含む実施形態の場合、多種多様な化合物のうちのいずれかが使用され得る。これらのリガンド単位の有意な特色は、各結合部位が、高親和性でレセプターに結合することができる点、およびそれらのリガンド単位が、化学的に二量体化されることができる点である。また、リガンドが、機能的なレベルで血清に溶解することができ、なおもほとんどの用途のために原形質膜を横断して拡散することができるように、それらのリガンドの疎水性／親水性のバランスをとる方法も利用可能である。
【０１４６】
ある特定の実施形態において、本方法は、条件的にコントロールされるタンパク質またはポリペプチドを生成するために、化学的に誘導される二量体化（ＣＩＤ）の手法を利用する。この手法は、誘導可能であることに加えて、不安定な二量体化剤の分解またはモノマーの競合的阻害剤の投与に起因して、可逆的である。
【０１４７】
ＣＩＤシステムは、合成二価リガンドを使用して、リガンド結合ドメインに融合されたシグナル伝達分子を迅速に架橋する。このシステムは、細胞表面タンパク質（Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３．２６２：ｐ．１０１９−１０２４；Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｄ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １９９６，６：８３９−８４７；Ｂｌａｕ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９７，９４：３０７６−３０８１）またはサイトゾルタンパク質（Ｌｕｏ，Ｚ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３８３：１８１−１８５；ＭａｃＣｏｒｋｌｅ，Ｒ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９８，９５：３６５５−３６６０）のオリゴマー化および活性化、転写を調節するＤＮＡエレメントへの転写因子のリクルートメント（Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３８２：８２２−８２６；Ｒｉｖｅｒａ，Ｖ．Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９６，２：１０２８−１０３２）またはシグナル伝達を刺激する原形質膜へのシグナル伝達分子のリクルートメント（Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｄ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９５，９２：９８０５−９８０９；Ｈｏｌｓｉｎｇｅｒ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９５，９５：９８１０−９８１４）を引き起こすために使用されている。
【０１４８】
ＣＩＤシステムは、表面レセプターの凝集が、下流のシグナル伝達カスケードを効率的に活性化するという概念に基づく。最も単純な実施形態において、ＣＩＤシステムは、脂質透過性免疫抑制薬ＦＫ５０６の二量体アナログを使用し、その二量体アナログは、その正常な生物活性を失っているが、ＦＫ５０６結合タンパク質であるＦＫＢＰ１２に遺伝的に融合された分子を架橋する能力を獲得している。１つ以上のＦＫＢＰ１２を、カスパーゼ−９に融合することによって、二量体化薬物に依存的であるがリガンドおよび外部ドメインに非依存的な様式でカスパーゼ−９活性を刺激することができる。これにより、時間的なコントロール、モノマー薬物アナログを使用して可逆性、および高い特異性を備えたシステムが提供される。第３世代のＡＰ２０１８７／ＡＰ１９０３  ＣＩＤの、それらの結合ドメインであるＦＫＢＰ１２に対する高親和性は、インビボにおいて、内在性のＦＫＢＰ１２による非特異的な副作用を誘導することなく、組換えレセプターの特異的な活性化を可能にする。二量体化薬物に結合する、アミノ酸の置換および欠失を有するＦＫＢＰ１２バリアント（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６）もまた使用され得る。ＦＫＢＰ１２バリアントとしては、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびアラニンからなる群より選択される３６位でアミノ酸置換を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、合成リガンドは、プロテアーゼ分解に対して抵抗性であり、それにより、インビボにおけるレセプターの活性化において、送達されるほとんどのタンパク質剤よりも効率的になる。
【０１４９】
使用されるリガンドは、リガンド結合ドメインの２つ以上に結合することができる。キメラタンパク質は、２つ以上のリガンド結合ドメインを含むとき、２つ以上のリガンドに結合することができる場合がある。そのリガンドは、代表的には、非タンパク質または化学物質である。例示的なリガンドとしては、ＦＫ５０６（例えば、ＦＫ１０１２）が挙げられるが、これに限定されない。
【０１５０】
他のリガンド結合領域は、例えば、二量体の領域、またはゆらぎ置換によって改変されたリガンド結合領域、例えば、ＦＫＢＰ１２（Ｖ３６）などであり得る：Ｆ３６がＶに置換されたヒト１２ｋＤａ  ＦＫ５０６結合タンパク質、完全に成熟したコード配列（アミノ酸１〜１０７）は、合成二量体化薬物ＡＰ１９０３に対する結合部位を提供する（Ｊｅｍａｌ，Ａ．ら、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃ．５８，７１−９６（２００８）；Ｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｉ．ａｎｄ  Ｋｅｌｌｙ，Ｗ．Ｋ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １１，１５６６−７２（１９９３））。上記タンパク質の２つのタンデムなコピーは、より高次のオリゴマーが、ＡＰ１９０３による架橋の際に誘導されるようにその構築物においても使用され得る。
【０１５１】
上記多量体化領域（例えば、上記ＦＲＢ多量体化領域またはＦＫＢＰ１２多量体化領域）は、上記アポトーシス促進ポリペプチドに対してアミノ末端に位置してもよいし、上記アポトーシス促進ポリペプチドに対してカルボキシル末端に位置してもよい。さらなるポリペプチド（例えば、リンカーポリペプチド、ステムポリペプチド、スペーサーポリペプチド、またはいくつかの例では、マーカーポリペプチドなど）は、上記多量体化領域と上記アポトーシス促進ポリペプチドとの間に位置してもよい。
【０１５２】
「領域」または「ドメイン」は、それが本出願のキメラポリペプチドに関する場合、上記ポリペプチドの機能を維持するポリペプチドまたはそのフラグメントを意味する。すなわち、例えば、ＦＫＢＰ１２結合ドメイン、ＦＫＢＰ１２ドメイン、ＦＫＢＰ１２領域、ＦＫＢＰ１２多量体化領域などとは、キメラポリペプチドの二量体化または多量体化を引き起こすかまたはそれを可能にするための、ＣＩＤリガンド（例えば、リミズシドまたはラパマイシンなど）に結合するＦＫＢＰ１２ポリペプチドを指す。アポトーシス促進ポリペプチド、例えば、本出願のカスパーゼ−９ポリペプチドまたは短縮型カスパーゼ−９ポリペプチドの「領域」または「ドメイン」は、上記キメラポリペプチド、またはキメラアポトーシス促進ポリペプチドの一部としてのカスパーゼ−９領域の二量体化または多量体化の際に、その二量体化または多量体化したキメラポリペプチドは、カスパーゼカスケードに関与し得、アポトーシスを可能にし得るかまたは引き起こし得ることを意味する。
【０１５３】
ＦＫＢＰ１２バリアントはまた、上記ＦＫＢＰ１２多量体化領域またはＦＲＢ多量体化領域において使用され得る。ＦＫＢＰ１２バリアントの例は、多くの種（例えば、酵母が挙げられる）からのものが挙げられる。一実施形態において、上記ＦＫＢＰ１２バリアントは、ＦＫＢＰ１２．６（ｃａｌｓｔａｂｌｉｎ）である。
【０１５４】
他のヘテロ二量体は、本出願において企図されている。一実施形態において、カルシニューリンＡポリペプチドまたは領域は、ＦＲＢ多量体化領域の代わりに使用され得る。これら実施形態において、上記第１のリガンドは、例えば、シクロスポリンを含む。
【０１５５】
Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰ：Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、Ｆ３６Ｖ−ＦＫＢＰ１２のコドンゆらぎバージョンである。それは、Ｆ３６Ｖ−ＦＫＰＢと同一のポリペプチド配列をコードするが、ヌクレオチドレベルでは６２％の相同性しか有しない。Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、レトロウイルスベクターにおける組換えを減少させるようにデザインされた（Ｓｃｈｅｌｌｈａｍｍｅｒ，Ｐ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５７，１７３１−５（１９９７））。Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、ＰＣＲアセンブリ手順によって構築された。その導入遺伝子は、１コピーのＦ３６Ｖ−ＦＫＢＰに直接連結された１コピーのＦ３６Ｖ’−ＦＫＢＰ１２を含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、リガンドは、小分子である。選択されたリガンド結合領域に対する適切なリガンドが、選択され得る。しばしば、リガンドは、二量体であり、時折、リガンドは、二量体のＦＫ５０６または二量体のＦＫ５０６様アナログである。ある特定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ１９０３（ＣＡＳ索引名：２−ピペリジンカルボン酸、１−［（２Ｓ）−１−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ブチル］−、１，２−エタンジイルビス［イミノ（２−オキソ−２，１−エタンジイル）オキシ−３，１−フェニレン［（１Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピリデン］］エステル、［２Ｓ−［１（Ｒ＊），２Ｒ＊［Ｓ＊［Ｓ＊［１（Ｒ＊），２Ｒ＊］］］］］−（９ＣＩ）  ＣＡＳ登録番号：１９５５１４−６３−７；分子式：Ｃ７８Ｈ９８Ｎ４Ｏ２０  分子量：１４１１．６５）である。ある特定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ２０１８７である。
【０１５７】
ある特定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ２０１８７アナログ、例えば、ＡＰ１５１０などである。いくつかの実施形態において、ある特定のアナログは、ＦＫＢＰ１２に対して適切であり得、ある特定のアナログは、ＦＫＢＰ１２のゆらぎバージョンに対して適切であり得る。ある特定の実施形態において、１つのリガンド結合領域が、キメラタンパク質に含められる。他の実施形態において、２つ以上のリガンド結合領域が、含められる。例えば、リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２である場合、これらの領域の２つが含められる場合、一方は、例えば、ゆらぎバージョンであり得る。
【０１５８】
企図される他の二量体化システムは、クーママイシン／ＤＮＡジャイレースＢシステムを含む。クーママイシン誘導性二量体化は、改変されたＲａｆタンパク質を活性化し、ＭＡＰキナーゼカスケードを刺激する。Ｆａｒｒａｒ，  Ｍ．  Ａ．，ら，  （１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３８３，１７８−１８１を参照のこと。他の実施形態において、ＧＲ  Ｃｒａｂｔｒｅｅおよび共同研究者らによって開発されたアブシシン酸（ＡＢＡ）システム（Ｌｉａｎｇ  ＦＳら，  Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ．  ２０１１  Ｍａｒ  １５；４（１６４）：ｒｓ２）が使用され得るが、ＤＮＡジャイレースＢのように、これは、免疫原性である外来タンパク質に依拠する。
【０１５９】
ＡＰ１９０３  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ
ＡＰ１９０３  ＡＰＩは、Ａｌｐｈｏｒａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．によって製造されており、ＡＰ１９０３  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは、Ｆｏｒｍａｔｅｃｈ  Ｉｎｃによって作製されている。それは、非イオン性可溶化剤Ｓｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５（２５０ｍｇ／ｍＬ，ＢＡＳＦ）の２５％溶液中のＡＰ１９０３の５ｍｇ／ｍＬ溶液として製剤化されている。室温において、この製剤は、わずかに黄色の透明の溶液である。冷蔵されると、この製剤は、可逆的な相転移を起こし、乳白色の溶液になる。この相転移は、室温に再度温めると、元に戻る。１本分（the  fill）は、３ｍＬのガラスバイアルにおける２．３３ｍＬである（バイアル１本あたり合計約１０ｍｇのＡＰ１９０３  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。
【０１６０】
ＡＰ１９０３は、患者に投与する前の夜に冷蔵庫から取り出され、およそ２１℃の温度で一晩保管され、その結果、その溶液は、希釈前に透明になる。その溶液は、注入開始の３０分以内にガラスボトルもしくはポリエチレンボトルまたは非ＤＥＨＰバッグにおいて調製され、投与するまでおよそ２１℃で保管される。
【０１６１】
すべての試験薬が、２℃〜８℃の温度で維持され、過剰な光および熱から保護され、アクセスが制限された鍵が掛かった区域で保管される。
【０１６２】
ＡＰ１９０３を投与し、誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドを誘導する必要性を決定する際に、患者は、例えば、非ＤＥＨＰ、非エチレンオキシド滅菌注入セットを使用して２時間にわたるＩＶ注入を介して単一の固定された用量の注射用ＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を投与され得る。ＡＰ１９０３の用量は、全ての患者のために個々に計算され、体重が≧１０％変動しなければ、再計算されるべきではない。その計算された用量は、注入前に０．９％ノーマルセーライン１００ｍＬ中に希釈される。
【０１６３】
ＡＰ１９０３の以前の第Ｉ相研究では、２４人の健常志願者を、２時間にわたって、ＩＶ注入される０．０１、０．０５、０．１、０．５および１．０ｍｇ／ｋｇという用量レベルにおいて、単一用量のＡＰ１９０３  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎで処置した。ＡＰ１９０３血漿レベルは、用量に正比例し、平均Ｃｍａｘ値は、０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量の範囲にわたって、およそ１０〜１２７５ｎｇ／ｍＬの範囲だった。最初の注入期間の後、血中濃度は、急速な分布相を示し、血漿レベルは、投与の０．５、２および１０時間後にそれぞれ最高濃度のおよそ１８、７および１％に減少した。ＡＰ１９０３  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは、すべての用量レベルにおいて安全であり、耐容性がよいことが示され、好ましい薬物動態プロファイルを示した。Ｉｕｌｉｕｃｃｉ  ＪＤら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：８７０−９，２００１。
【０１６４】
使用されるＡＰ１９０３  ｆｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎの固定された用量は、例えば、２時間にわたって静脈内に注入される０．４ｍｇ／ｋｇであり得る。細胞の有効なシグナル伝達にインビトロで必要とされるＡＰ１９０３の量は、１０〜１００ｎＭ（１６００Ｄａ  ＭＷ）である。これは、１６〜１６０μｇ／Ｌまたは約０．０１６〜１．６ｍｇ／ｋｇ（１．６〜１６０μｇ／ｋｇ）に等しい。１ｍｇ／ｋｇまでの用量は、上記で論じられるＡＰ１９０３のフェーズＩ研究において十分に許容された。従って、０．４ｍｇ／ｋｇは、治療用細胞と組み合わせた、このフェーズＩ研究のための安全かつ有効なＡＰ１９０３の用量であり得る。
【０１６５】
（選択マーカー）
ある特定の実施形態において、発現構築物は、その発現構築物にマーカーを含めることによってその発現がインビトロまたはインビボにおいて識別される核酸構築物を含む。そのようなマーカーは、その発現構築物を含む細胞の容易な識別を可能にする識別可能な変化を細胞にもたらし得る。通常、薬物選択マーカーを含めることが、クローニングおよび形質転換体の選択に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する抵抗性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルス−Ｉのチミジンキナーゼ（ｔｋ）などの酵素が使用される。免疫学的表面マーカーを含む細胞外の非シグナル伝達ドメインまたは様々なタンパク質（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＬＮＧＦＲ）もまた使用され得、それにより、磁性抗体または蛍光抗体によって媒介される選別のための直接的方法が可能になる。使用される選択マーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、重要であると考えられない。選択マーカーのさらなる例としては、例えば、レポーター（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ベータ−ｇａｌまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））が挙げられる。ある特定の実施形態において、マーカータンパク質、例えば、ＣＤ１９などは、例えば、免疫磁気選択などにおいて、移入するための細胞の選択のために使用される。本明細書中で論じられるように、ＣＤ１９マーカーは、抗ＣＤ１９抗体、すなわち、例えば、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ、ＴＣＲまたは他の抗原認識部分と区別される。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、細胞をソートする一助とするために、発現ベクターの中に含まれ得る。例えば、ＣＤ３４最小エピトープは、ベクターの中に組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるキメラ抗原レセプターまたはキメラ刺激分子を発現させるために使用される発現ベクターは、１６アミノ酸のＣＤ３４最小エピトープをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。本明細書中の例において提供されるある特定の実施形態などのいくつかの実施形態において、ＣＤ３４最小エピトープは、ＣＤ８ストークのアミノ末端位置において組み込まれる。
【０１６７】
（膜会合ポリペプチド領域）
膜会合ポリペプチドは、例えば、細胞膜と会合するポリペプチドまたはそのフラグメントを含み得る。膜会合ポリペプチドの例としては、細胞レセプター、キメラ抗原レセプター、およびキメラＴ細胞レセプターが挙げられるが、これらに限定されない。膜会合ポリペプチド領域は、例えば、膜貫通領域、または膜標的化領域であり得る。
【０１６８】
（膜標的化）
膜標的化配列または膜標的化領域は、細胞表面膜へのキメラタンパク質の輸送を提供し、ここで、同じ配列または他の配列が、細胞表面膜へのキメラタンパク質の結合をコードし得る。細胞膜と会合した分子は、膜会合を容易にするある特定の領域を含み、そのような領域は、キメラタンパク質分子に組み込まれることにより、膜標的化分子をもたらし得る。例えば、いくつかのタンパク質は、アシル化される配列をＮ末端またはＣ末端に含み、これらのアシル部分は、膜会合を容易にする。そのような配列は、アシルトランスフェラーゼによって認識され、特定の配列モチーフに一致することが多い。ある特定のアシル化モチーフは、単一のアシル部分（その後に、陰イオン性脂質頭部基との会合を改善するいくつかの正に帯電した残基（例えば、ヒトｃ−Ｓｒｃ：Ｍ−Ｇ−Ｓ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ）が続くことが多い）によって修飾されることができ、他のものは、複数のアシル部分によって修飾されることができる。例えば、タンパク質チロシンキナーゼＳｒｃのＮ末端配列は、単一のミリストイル部分を含み得る。二重アシル化領域は、ある特定のタンパク質キナーゼ（例えば、Ｓｒｃファミリーメンバーのサブセット（例えば、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ）およびＧタンパク質アルファサブユニット）のＮ末端領域内に配置されている。そのような二重アシル化領域は、そのようなタンパク質の最初の１８アミノ酸の中に配置されることが多く、それは、配列モチーフＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｃｙｓに一致し、ここで、Ｍｅｔは、切断され、Ｇｌｙは、Ｎ−アシル化され、Ｃｙｓ残基のうちの１つは、Ｓ−アシル化される。Ｇｌｙは、ミリストイル化されることが多く、Ｃｙｓは、パルミトイル化され得る。配列モチーフＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ（いわゆる「ＣＡＡＸボックス」）に一致するアシル化領域は、Ｇタンパク質ガンマサブユニットのＣ末端由来のＣ１５またはＣ１０イソプレニル部分によって修飾され得、他のタンパク質（例えば、ワールドワイドウェブアドレスｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ＤｉｓｐｌａｙＩｐｒｏＥｎｔｒｙ？ａｃ＝ＩＰＲ００１２３０）もまた使用され得る。これらのおよび他のアシル化モチーフとしては、例えば、Ｇａｕｔｈｉｅｒ−Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  １５：２２０５−２２１７（２００４）；Ｇｌａｂａｔｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０３：６９７−７００（１９９４）およびＺｌａｋｉｎｅら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１０：６７３−６７９（１９９７）において論じられているものが挙げられ、そのモチーフは、膜局在化を誘導するためにキメラ分子に組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、アシル化モチーフを含むタンパク質由来の天然の配列が、キメラタンパク質に組み込まれる。例えば、いくつかの実施形態において、Ｌｃｋ、ＦｙｎもしくはＹｅｓまたはＧタンパク質アルファサブユニットのＮ末端部分（例えば、そのようなタンパク質由来の最初の２５個のＮ末端アミノ酸またはそれより少ないアミノ酸（例えば、随意の変異を有する、その天然の配列の約５〜約２０アミノ酸、約１０〜約１９アミノ酸または約���５〜約１９アミノ酸））が、キメラタンパク質のＮ末端の中に組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、ＣＡＡＸボックスモチーフ配列を含むＧタンパク質ガンマサブユニット由来の約２５アミノ酸以下のＣ末端配列（例えば、随意の変異を有する、天然の配列の約５〜約２０アミノ酸、約１０〜約１８アミノ酸または約１５〜約１８アミノ酸）が、キメラタンパク質のＣ末端に連結され得る。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、アシル部分は、＋１から＋６というｌｏｇ  ｐ値を有し、時折、＋３から＋４．５というｌｏｇ  ｐ値を有する。Ｌｏｇ  ｐ値は、疎水性の尺度であり、オクタノール／水の分配研究に由来することが多く、ここで、より高い疎水性を有する分子は、より高い頻度でオクタノールに分配し、より高いｌｏｇ  ｐ値を有すると特徴付けられる。Ｌｏｇ  ｐ値は、いくつかの親油性分子に対して公表されており、ｌｏｇ  ｐ値は、公知の分配プロセスを使用して計算され得る（例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．７１，Ｉｓｓｕｅ  ６，ｐａｇｅ  ５９９、エントリー４４９３は、４．２というｌｏｇ  ｐ値を有するラウリン酸を示している）。任意のアシル部分が、上で論じられたペプチド組成物に連結され得、公知の方法および本明細書中以後に論じられる方法を用いて抗菌活性について試験され得る。アシル部分は、時折、例えば、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ４−Ｃ１２シクロアルキルアルキル（ｃｙｃｌａｌｋｙｌａｌｋｙｌ）、アリール、置換アリールまたはアリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキルである。任意のアシル含有部分は、時折、脂肪酸であり、脂肪酸部分の例は、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）、オクチル（Ｃ８）、ノニル（Ｃ９）、デシル（Ｃ１０）、ウンデシル（Ｃ１１）、ラウリル（Ｃ１２）、ミリスチル（Ｃ１４）、パルミチル（Ｃ１６）、ステアリル（Ｃ１８）、アラキジル（Ｃ２０）、ベヘニル（Ｃ２２）およびリグノセリル部分（Ｃ２４）であり、各部分は、０、１、２、３、４、５、６、７または８つの不飽和（すなわち、二重結合）を含み得る。アシル部分は、時折、脂質分子（例えば、ホスファチジル脂質（例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴミエリン（ｓｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）、スフィンゴシン、セラミド、ガングリオシド、セレブロシド））またはそれらの改変バージョンである。ある特定の実施形態において、１、２、３、４もしくは５個またはそれより多くのアシル部分が、膜会合領域に連結される。
【０１７０】
本明細書中のキメラタンパク質はまた、一回貫通型（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｓｓ）または複数回貫通型（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐａｓｓ）の膜貫通配列を含み得る（例えば、キメラタンパク質のＮ末端またはＣ末端に）。一回貫通型膜貫通領域は、ある特定のＣＤ分子、チロシンキナーゼレセプター、セリン／トレオニンキナーゼレセプター、ＴＧＦベータ、ＢＭＰ、アクチビンおよびホスファターゼに見出される。一回貫通型膜貫通領域は、シグナルペプチド領域および約２０〜約２５アミノ酸（それらの多くは、疎水性アミノ酸であり、アルファヘリックスを形成し得る）の膜貫通領域を含むことが多い。短いトラックの正に帯電したアミノ酸が、タンパク質を膜に繋ぎ止めるために膜貫通の範囲の後に続くことが多い。複数回貫通型タンパク質には、イオンポンプ、イオンチャネルおよびトランスポーターが含まれ、膜を複数回またぐ２つまたはそれを超えるらせんを含む。複数回貫通型タンパク質のすべてまたは実質的にすべてが、時折、キメラタンパク質に組み込まれる。一回貫通型および複数回貫通型膜貫通領域に対する配列は、公知であり、キメラタンパク質分子に組み込むために選択され得る。
【０１７１】
宿主において機能性であり、キメラタンパク質の他のドメインのうちの１つと会合されていることもあるし会合されていないこともある、任意の膜標的化配列が、使用され得る。いくつかの実施形態において、そのような配列としては、ミリストイル化標的化配列、パルミトイル化標的化配列、プレニル化配列（すなわち、ファルネシル化、ゲラニル−ゲラニル化、ＣＡＡＸボックス）、タンパク質間相互作用モチーフ、またはレセプター由来の膜貫通配列（シグナルペプチドを利用する）が挙げられるが、これらに限定されない。例としては、例えば、ｔｅｎ  Ｋｌｏｏｓｔｅｒ  ＪＰら、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ（２００７）９９，１−１２，Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１：９３６−４０，１０９８（２００３）において論じられているものが挙げられる。
【０１７２】
様々な膜におけるタンパク質の保持を高め得るさらなるタンパク質ドメインが存在する。例えば、約１２０アミノ酸のプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインが、代表的には細胞内のシグナル伝達に関与する２００個を超えるヒトタンパク質において見られる。ＰＨドメインは、膜内の様々なホスファチジルイノシトール（ＰＩ）脂質（例えば、ＰＩ（３，４，５）−Ｐ３、ＰＩ（３，４）−Ｐ２、ＰＩ（４，５）−Ｐ２）に結合し得るので、種々の膜コンパートメントまたは細胞内コンパートメントにタンパク質をリクルートする際に重要な役割を果たし得る。しばしば、ＰＩ脂質のリン酸化状態は、例えば、ＰＩ−３キナーゼまたはＰＴＥＮによって制御されるので、膜とＰＨドメインとの相互作用は、アシル脂質による相互作用ほど安定でない。
【０１７３】
（膜貫通領域）
本明細書中のキメラ抗原レセプターは、一回貫通型（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｓｓ）または複数回貫通型（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐａｓｓ）の膜貫通配列を含み得る（例えば、キメラタンパク質のＮ末端またはＣ末端に）。一回貫通型膜貫通領域は、ある特定のＣＤ分子、チロシンキナーゼレセプター、セリン／トレオニンキナーゼレセプター、ＴＧＦβ、ＢＭＰ、アクチビンおよびホスファターゼに見出される。一回貫通型膜貫通領域は、シグナルペプチド領域および約２０〜約２５アミノ酸（それらの多くは、疎水性アミノ酸であり、アルファヘリックスを形成し得る）の膜貫通領域を含むことが多い。短いトラックの正に帯電したアミノ酸が、タンパク質を膜に繋ぎ止めるために膜貫通の範囲の後に続くことが多い。複数回貫通型タンパク質には、イオンポンプ、イオンチャネルおよびトランスポーターが含まれ、膜を複数回またぐ２つまたはそれを超えるらせんを含む。複数回貫通型タンパク質のすべてまたは実質的にすべてが、時折、キメラタンパク質に組み込まれる。一回貫通型および複数回貫通型膜貫通領域に対する配列は、公知であり、キメラタンパク質分子に組み込むために選択され得る。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合される。１つの実施形態において、ＣＡＲにおけるドメインのうちの１つと天然に会合する膜貫通ドメインが使用される。他の実施形態において、ＣＡＲにおけるドメインのうちの１つと天然に会合しない膜貫通ドメインが使用される。場合によっては、そのレセプター複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインにそのようなドメインが結合するのを回避するために膜貫通ドメインは、選択され得るか、またはアミノ酸置換によって改変され得る（例えば、代表的には、疎水性残基に変更される（ｃｈａｒｇｅｄ））。
【０１７５】
膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞レセプターのアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ３−ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７またはＣＤ１５４に由来し得る。または、いくつかの例では、主に疎水性残基、例えば、ロイシンおよびバリンなどを含む膜貫通ドメインが、新規に合成され得る。ある特定の実施形態において、短いポリペプチドリンカーは、キメラ抗原レセプターの膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間に結合を形成し得る。それらのキメラ抗原レセプターは、ストーク、すなわち、細胞外領域のアミノ酸を細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間にさらに含み得る。例えば、そのストークは、選択された膜貫通ドメインに天然に会合するアミノ酸の配列であり得る。いくつかの実施形態において、キメラ抗原レセプターは、ＣＤ８膜貫通ドメインを含み、ある特定の実施形態において、キメラ抗原レセプターは、ＣＤ８膜貫通ドメインおよびその膜貫通ドメインの細胞外部分におけるさらなるアミノ酸を含み、ある特定の実施形態において、キメラ抗原レセプターは、ＣＤ８膜貫通ドメインおよびＣＤ８ストークを含む。キメラ抗原レセプターは、膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの間にアミノ酸の領域をさらに含み得、それらのアミノ酸は、その膜貫通ドメインが由来するポリペプチドと天然に会合するものである。
【０１７６】
（調節領域）
（１．プロモーター）
目的のポリヌクレオチド配列の発現をコントロールするために使用される特定のプロモーターは、標的化された細胞においてそのポリヌクレオチドの発現を指示することができる限り、重要であると考えられない。したがって、ヒト細胞が標的化される場合、ポリヌクレオチド配列コード領域は、例えば、ヒト細胞において発現されることができるプロモーターに隣接しておよびそのプロモーターの支配下に配置され得る。一般的に言えば、そのようなプロモーターは、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターを含み得る。
【０１７７】
様々な実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列、β−アクチン、ラットインスリンプロモーターおよびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素が、目的のコード配列の高レベル発現を得るために使用され得る。発現レベルが所与の目的にとって十分であるならば、目的のコード配列の発現を達成すると当該分野で周知である他のウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターの使用も同様に企図される。周知の特性を有するプロモーターを使用することによって、トランスフェクション後または形質転換後の目的のタンパク質の発現のレベルおよびパターンが、最適化され得る。
【０１７８】
特異的な生理学的シグナルまたは合成シグナルに応答して制御されるプロモーターの選択は、遺伝子産物の誘導性発現を可能にし得る。例えば、１つの導入遺伝子の発現、またはマルチシストロニックなベクターが使用されるときは複数の導入遺伝子の発現が、ベクターが生成される細胞にとって有毒である場合、それらの導入遺伝子のうちの１つ以上の発現を妨げるかまたは減少させることが望ましい。産生細胞株にとって有毒である導入遺伝子の例は、アポトーシス促進遺伝子およびサイトカイン遺伝子である。いくつかの誘導性プロモーターシステムが、導入遺伝子産物が有毒である場合のウイルスベクターの作製に利用可能である（より誘導性のプロモーターを付加する）。
【０１７９】
エクジソンシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）は、１つのそのようなシステムである。このシステムは、哺乳動物細胞において目的の遺伝子の制御された発現を可能にするようにデザインされる。そのシステムは、導入遺伝子の基底レベルの発現ではなく２００倍超の誘導能を実質的に可能にする厳しく制御された発現機構からなる。そのシステムは、ショウジョウバエのヘテロ二量体エクジソンレセプターに基づき、エクジソンまたはムリステロンＡなどのアナログが、そのレセプターに結合すると、そのレセプターは、プロモーターを活性化して、下流の導入遺伝子の発現をオンにし、高レベルのｍＲＮＡ転写産物がもたらされる。このシステムでは、ヘテロ二量体レセプターの両方のモノマーが、１つのベクターから構成的に発現されるのに対し、目的の遺伝子の発現を駆動するエクジソン応答性プロモーターは、別のプラスミド上に存在する。ゆえに、このタイプのシステムを目的の遺伝子トランスファーベクターに遺伝子操作して導入することが、有用であり得る。次いで、産生細胞株において目的の遺伝子を含むプラスミドとレセプターモノマーを含むプラスミドとをコトランスフェクションすることにより、潜在的に有毒な導入遺伝子を発現させずに、遺伝子トランスファーベクターの作製が可能になり得る。適切な時点において、導入遺伝子の発現が、エクジソンまたはムリステロンＡによって活性化され得る。
【０１８０】
有用であり得る別の誘導性システムは、もともとはＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄによって開発された（Ｇｏｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１，１９９２；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９，１９９５）、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭまたはＴｅｔ−ＯｎＴＭシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）である。このシステムもまた、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体（例えば、ドキシサイクリン）に応答して高レベルの遺伝子発現を制御することが可能である。Ｔｅｔ−ＯｎＴＭシステムでは、ドキシサイクリンの存在下において遺伝子発現がオンになるのに対し、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭシステムでは、ドキシサイクリンの非存在下において遺伝子発現がオンになる。これらのシステムは、大腸菌のテトラサイクリン抵抗性オペロンに由来する２つの制御エレメント（テトラサイクリンリプレッサーが結合するテトラサイクリンオペレーター配列、およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質）に基づく。目的の遺伝子は、プラスミドの中に存在するテトラサイクリン応答性エレメントを有するプロモーターの後ろでプラスミド中にクローニングされる。第２のプラスミドは、テトラサイクリンによってコントロールされるトランス活性化因子と呼ばれる制御エレメントを含み、その制御エレメントは、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭシステムでは、単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６ドメインおよび野生型テトラサイクリン（ｔｅｒｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）リプレッサーから構成される。したがって、ドキシサイクリンの非存在下において、転写は、恒常的にオンである。Ｔｅｔ−ＯｎＴＭシステムでは、テトラサイクリンリプレッサーは、野生型でなく、ドキシサイクリンの存在下において転写を活性化する。遺伝子治療ベクターを作製する場合、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在下において産生細胞が生育され得、潜在的に有毒な導入遺伝子の発現を妨げ得るように、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭシステムが使用され得るが、そのベクターが患者に導入されると、遺伝子発現は恒常的にオンになり得る。
【０１８１】
いくつかの状況において、遺伝子治療ベクターにおける導入遺伝子の発現を制御することが望ましい。例えば、様々な活性強度を有する種々のウイルスプロモーターが、所望の発現レベルに応じて使用される。哺乳動物細胞では、ＣＭＶ前初期プロモーターが、強力な転写活性化をもたらすために使用されることが多い。ＣＭＶプロモーターは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ら、１９９７．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−４８において概説されている。導入遺伝子の低い発現レベルが望まれるとき、それほど強力でないＣＭＶプロモーターの改変バージョンもまた、使用されている。造血細胞における導入遺伝子の発現が望まれるとき、ＭＬＶまたはＭＭＴＶ由来のＬＴＲなどのレトロウイルスプロモーターが使用されることが多い。所望の効果に応じて使用される他のウイルスプロモーターとしては、ＳＶ４０、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２  ＬＴＲ、アデノウイルスプロモーター（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ２ＡまたはＭＬＰ領域由来のもの）、ＡＡＶ  ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫおよびトリ肉腫ウイルスが挙げられる。
【０１８２】
他の例では、特定の分化した細胞において発生的に制御されかつ活性であるプロモーターが、選択され得る。従って、例えば、プロモーターは、多能性幹細胞において活性でなくてもよいが、例えば、多能性幹細胞がより成熟した細胞へと分化する場合、上記プロモーターは、次いで、活性化され得る。
【０１８３】
同様に、組織特異的プロモーターは、標的化されていない組織に対する潜在的な毒性または望ましくない効果を減少させるように、特定の組織または細胞において転写をもたらすために使用される。これらのプロモーターは、ＣＭＶプロモーターなどのより強力なプロモーターと比べて低い発現をもたらし得るが、より限定された発現および免疫原性ももたらし得る（Ｂｏｊａｋ，Ａ．ら、２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１９７５−７９；Ｃａｚｅａｕｘ．，Ｎ．ら、２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：３３２２−３１）。例えば、組織特異的プロモーター（例えば、ＰＳＡ関連プロモーター）または前立腺特異的腺性カリクレインまたは筋肉クレアチンキナーゼ遺伝子が、適切な場合に使用され得る。
【０１８４】
組織特異的プロモーターまたは分化特異的プロモーターの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｂ２９（Ｂ細胞）；ＣＤ１４（単球性細胞）；ＣＤ４３（白血球および血小板）；ＣＤ４５（造血細胞）；ＣＤ６８（マクロファージ）；デスミン（筋肉）；エラスターゼ−１（膵腺房細胞）；エンドグリン（内皮細胞）；フィブロネクチン（分化中の細胞、治癒中の組織）；およびＦｌｔ−１（内皮細胞）；ＧＦＡＰ（アストロサイト）。
【０１８５】
ある特定の適応症では、遺伝子治療ベクターを投与した後の特定の時点において転写を活性化することが望ましい。これは、ホルモンまたはサイトカインによって制御可能であるようなプロモーターを用いて行われる。使用され得るサイトカイン応答性プロモーターおよび炎症性タンパク質応答性プロモーターとしては、ＫキニノーゲンおよびＴキニノーゲン（Ｋａｇｅｙａｍａら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，２３４５−２３５１）、ｃ−ｆｏｓ、ＴＮＦ−アルファ、Ｃ反応性タンパク質（Ａｒｃｏｎｅら（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６（８），３１９５−３２０７）、ハプトグロビン（Ｏｌｉｖｉｅｒｏら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．，６，１９０５−１９１２）、血清アミロイドＡ２、Ｃ／ＥＢＰアルファ、ＩＬ−１、ＩＬ−６（Ｐｏｌｉ  ａｎｄ  Ｃｏｒｔｅｓｅ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２０２−８２０６）、補体Ｃ３（Ｗｉｌｓｏｎら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６１８１−６１９１）、ＩＬ−８、アルファ−１酸性糖タンパク質（Ｐｒｏｗｓｅ  ａｎｄ  Ｂａｕｍａｎｎ，（１９８８）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，８，４２−５１）、アルファ−１抗トリプシン、リポタンパク質リパーゼ（Ｚｅｃｈｎｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２３９４−２４０１，１９８８）、アンジオテンシノーゲン（Ｒｏｎら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２８８７−２８９５）、フィブリノゲン、ｃ−ｊｕｎ（ホルボールエステル、ＴＮＦ−アルファ、ＵＶ照射、レチノイン酸および過酸化水素によって誘導可能）、コラゲナーゼ（ホルボールエステルおよびレチノイン酸によって誘導される）、メタロチオネイン（重金属および糖質コルチコイド誘導性）、ストロメライシン（ホルボールエステル、インターロイキン−１およびＥＧＦによって誘導可能）、アルファ−２マクログロブリンおよびアルファ−１抗キモトリプシンが挙げられる。他のプロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、ヒト免疫不全ウイルス（ＭＶ）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、エプスタイン・バーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビンおよびクレアチンが挙げられる。
【０１８６】
上記プロモーターのいずれか単独または別のプロモーターとの併用が、所望の作用に応じて有用であり得ることが想定される。プロモーターおよび他の制御エレメントは、それらが所望の細胞または組織において機能的であるように選択される。さらに、このプロモーターのリストは、網羅的または限定的であると解釈されるべきでなく；他のプロモーターが、本明細書中に開示されるプロモーターおよび方法とともに使用される。
【０１８７】
（２．エンハンサー）
エンハンサーは、同じＤＮＡ分子上の離れた位置に配置されたプロモーターからの転写を増加させる遺伝的エレメントである。初期の例としては、コード配列に隣接し、かついくつかのイントロンの中に存在する、免疫グロブリンおよびＴ細胞レセプターに関連するエンハンサーが挙げられる。多くのウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０およびレトロウイルスＬＴＲ）は、エンハンサーの活性と密接に関連し、単一エレメントのように扱われることが多い。エンハンサーは、ほぼプロモーターのように組織化される。すなわち、エンハンサーは、多くの個々のエレメントから構成され、その各々が、１つ以上の転写性タンパク質に結合する。エンハンサーとプロモーターとの基本的な区別は、操作上のものである。エンハンサー領域は概して、少し離れて、しばしば向きに関係なく、転写を刺激する；これは、プロモーター領域またはその成分エレメントには必ずしも当てはまらない。他方で、プロモーターは、特定の部位において特定の向きでＲＮＡ合成の開始を指示する１つ以上のエレメントを有するのに対し、エンハンサーは、これらの特異性を欠く。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば重複し、近接することから、しばしば非常によく似たモジュール構成を有するようである。エンハンサーのサブセットは、転写活性を増加させ得るだけでなく、ゲノムにインテグレートされたとき、隣接する配列から転写性エレメントを（インスレーターエレメントとともに）隔離するのを助け得る、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）である。
【０１８８】
任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ  ＥＰＤＢのように）が、遺伝子の発現を駆動するために使用され得るが、多くは、特定の組織タイプまたは組織のサブセットに発現を限定し得る（例えば、Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９：７７６−８８に概説されている）。例としては、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビン、筋肉クレアチンキナーゼ由来のエンハンサー、ならびにウイルスＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶ由来の配列が挙げられるが、これらに限定されない。適切なエンハンサーが、特定の用途に対して選択され得る。適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部としてまたは追加の遺伝的発現構築物として提供される場合、真核細胞は、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質内転写を支持し得る。
【０１８９】
（３．ポリアデニル化シグナル）
ｃＤＮＡインサートが使用される場合、遺伝子転写産物の適切なポリアデニル化をもたらすためにポリアデニル化シグナルを含めることが通常望ましい。ポリアデニル化シグナルの性質は、本方法の実施の成功にとって重大であるとは考えられておらず、任意のそのような配列（例えば、ヒトまたはウシの成長ホルモンおよびＳＶ４０のポリアデニル化シグナルならびにＬＴＲポリアデニル化シグナル）が、使用される。１つの非限定的な例は、ｐＣＥＰ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に存在するＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。ターミネーターもまた、発現カセットのエレメントとして企図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを高めるため、およびそのカセットから他の配列への読み過ごしを最小限にするために役立ち得る。終止シグナル配列またはポリ（Ａ）シグナル配列は、例えば、ｍＲＮＡの３’末端における保存配列（ＡＡＵＡＡＡ）から約１１〜３０ヌクレオチド下流に位置し得る（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．ら、１９９３．ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：７７７−８３；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８）。
【０１９０】
（４．開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位）
特定の開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳に必要とされることがある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接する配列を含む。ＡＴＧ開始コドンをはじめとした外来性翻訳調節シグナルが、提供される必要があり得る。開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列の読み枠とインフレームで配置される。外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然または合成であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって上昇し得る。
【０１９１】
ある特定の実施形態において、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用は、多重遺伝子すなわちポリシストロニックなメッセージを作製するために使用される。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回することができ、内部部位において翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：３２０−３２５，１９８８）。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメントが、論じられており（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）、ならびに哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳも論じられている（Ｍａｃｅｊａｋ  ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９０−９４，１９９１）。ＩＲＥＳエレメントは、異種のオープンリーディングフレームに連結され得る。各々がＩＲＥＳによって分断されている複数のオープンリーディングフレームが、共に転写され得、ポリシストロニックなメッセージを作製する。ＩＲＥＳエレメントのおかげで、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。複数の遺伝子が、単一のメッセージを転写するために単一のプロモーター／エンハンサーを使用して効率的に発現され得る（米国特許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８１９号（各々が参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）。
【０１９２】
（配列の最適化）
タンパク質産生は、導入遺伝子におけるコドンを最適化することによっても増加され得る。タンパク質産生を増加させるために、種特異的コドンの変更が用いられ得る。また、コドンが最適化されることにより、最適化されたＲＮＡが生成され得、それにより、より効率的な翻訳がもたらされ得る。ＲＮＡに組み込まれるコドンを最適化することによって、不安定性を引き起こす二次構造をもたらすエレメント、例えばリボソーム結合を阻害し得るｍＲＮＡ二次構造、またはｍＲＮＡの核外輸送を阻害し得るクリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）配列などのエレメントが、除去され得る（Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８；Ｙａｎ，Ｊ．ら、２００７．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：４１１−２１；Ｃｈｅｕｎｇ，Ｙ．Ｋ．ら、２００４．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：６２９−３８；Ｎａｒｕｍ．，Ｄ．Ｌ．ら、２００１．６９：７２５０−５５；Ｙａｄａｖａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｏｃｋｅｎｈｏｕｓｅ，Ｃ．Ｆ．，２００３．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：４９６２−６９；Ｓｍｉｔｈ．，Ｊ．Ｍ．ら、２００４．ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ２０：１３３５−４７；Ｚｈｏｕ，Ｗ．ら、２００２．Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８８：１２７−５１；Ｗｕ，Ｘ．ら、２００４．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１３：８９−９６；Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ら、２００６．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４９：６９−７８；Ｄｅｍｌ，Ｌ．Ａ．ら、２００１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１０９９−１１００１；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｒ．Ｍ．ら、１９９７．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４８９２−４９０３；Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｄ．ら、２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：４５３１−４０；ｚｕｒ  Ｍｅｇｅｄｅ，Ｊ．ら、２０００．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２６２８−２６３５）。例えば、ＦＢＰ１２、カスパーゼポリペプチド、およびＣＤ１９配列が、コドンの変更によって最適化され得る。
【０１９３】
（リーダー配列）
リーダー配列は、ｍＲＮＡの安定性を高めるためおよびより効率的な翻訳をもたらすために付加され得る。リーダー配列は、通常、ｍＲＮＡを小胞体に標的化することに関与する。例としては、自身の切断を遅延させる、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）に対するシグナル配列、およびＩｇＥ遺伝子リーダー配列が挙げられる（Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８；Ｌｉ，Ｖ．ら、２０００．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７２：４１７−２８；Ｘｕ，Ｚ．Ｌ．ら、２００１．Ｇｅｎｅ  ２７２：１４９−５６；Ｍａｌｉｎ，Ａ．Ｓ．ら、２０００．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．２：１６７７−８５；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．ら、２００５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：１１２−１２５；Ｙａｎｇ．，Ｊ．Ｓ．ら、２００２．Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：１３７９−８４；Ｋｕｍａｒ．，Ｓ．ら、２００６．ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２５：３８３−９２；Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：４５３１−４０）。ＩｇＥリーダーは、小胞体への挿入を高めるために使用され得る（Ｔｅｐｌｅｒ，Ｉら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５９１２）。
【０１９４】
導入遺伝子の発現は、発現を最適化するための適切な方法を選択することによって、最適化され得るおよび／またはコントロールされ得る。これらの方法は、例えば、プロモーター、送達方法および遺伝子配列を最適化することを含む（例えば、Ｌａｄｄｙ，Ｄ．Ｊ．ら、２００８．ＰＬｏＳ．ＯＮＥ  ３  ｅ２５１７；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８に提示されているような）。
【０１９５】
（核酸）
本明細書中で使用される「核酸」は、一般に、核酸塩基を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその誘導体もしくはアナログの分子（１本、２本またはそれより多くの鎖）のことを指す。核酸塩基には、例えば、ＤＮＡ（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」またはシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」またはＣ）に見られる天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基が含まれる。用語「核酸」は、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を包含し、その各々は、用語「核酸」の亜属として包含される。核酸は、少なくとも、多くとも、または約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０もしくは１０００ヌクレオチド長、またはこの中の導き出せる任意の範囲の長さであり得る。
【０１９６】
本明細書中に提供される核酸は、別の核酸に対して同一または相補的である領域を有し得る。その相補的または同一である領域は、少なくとも５つ連続した残基であり得ることが企図されるが、その領域は、少なくとも、多くとも、または約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０または１０００個連続したヌクレオチドであることが特に企図される。
【０１９７】
本明細書中で使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズすることができる」は、二本鎖分子もしくは三本鎖分子、または部分的な二本鎖もしくは三本鎖の性質を有する分子を形成することを意味すると理解される。本明細書中で使用される用語「アニールする」は、「ハイブリダイズする」と同義である。用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズすることができる」は、用語「ストリンジェントな条件（複数可）」または「高ストリンジェンシー」および用語「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件（複数可）」を包含する。
【０１９８】
本明細書中で使用されるとき、「ストリンジェントな条件（複数可）」または「高ストリンジェンシー」は、相補的な配列（複数可）を含む１つ以上の核酸鎖の間のまたはその１つ以上の核酸鎖内のハイブリダイゼーションを可能にするが、ランダム配列のハイブリダイゼーションを妨げる条件である。ストリンジェントな条件は、核酸と標的鎖との間のミスマッチを、たとえあったにしてもほとんど許容しない。そのような条件は、公知であり、高選択性が要求される用途のために使用されることが多い。非限定的な用途としては、核酸（例えば、遺伝子またはその核酸セグメント）の単離、または少なくとも１つの特異的なｍＲＮＡ転写産物もしくはその核酸セグメントの検出などが挙げられる。
【０１９９】
ストリンジェントな条件は、約４２℃〜約７０℃の温度における約０．０２Ｍ〜約０．５Ｍ  ＮａＣｌによって提供されるような、低塩および／または高温の条件を含み得る。所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、特定の核酸（複数可）の長さ、標的配列（複数可）の長さおよび核酸塩基含有量、核酸（複数可）の電荷組成、ならびにハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたは他の溶媒（複数可）の存在または濃度によって部分的に決定されることが理解される。
【０２００】
ハイブリダイゼーションのためのこれらの範囲、組成および条件は、単なる非限定的な例という目的で言及されていること、特定のハイブリダイゼーション反応に対する所望のストリンジェンシーは、１つ以上のポジティブコントロールまたはネガティブコントロールとの比較によって経験的に決定されることが多いことが理解される。想定される用途に応じて、標的配列に対する様々な程度の核酸選択性を達成するために、様々なハイブリダイゼーション条件が使用され得る。非限定的な例では、ストリンジェントな条件下において核酸にハイブリダイズしない関係する標的核酸の同定または単離は、低温および／または高イオン強度におけるハイブリダイゼーションによって達成され得る。そのような条件は、「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」と呼ばれ、低ストリンジェンシーの非限定的な例としては、約２０℃〜約５０℃の温度範囲における約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍ  ＮａＣｌで行われるハイブリダイゼーションが挙げられる。低または高ストリンジェンシー条件は、特定の用途に適合させるためにさらに改変され得る。
【０２０１】
（核酸修飾）
下記で論じられる修飾のいずれかが、核酸に適用され得る。修飾の例としては、ＲＮＡもしくはＤＮＡの骨格、糖または塩基、およびそれらの様々な組み合わせに対する変更が挙げられる。核酸における任意の好適な数の骨格結合、糖および／または塩基が、修飾され得る（例えば、独立して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、最大１００％）。修飾されていないヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素に結合された塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシルのうちのいずれか１つである。
【０２０２】
修飾塩基は、１’位におけるアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基である。修飾塩基の非限定的な例としては、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピンなどが挙げられる。修飾塩基の他の非限定的な例としては、ニトロピロリル（例えば、３−ニトロピロリル）、ニトロインドリル（例えば、４−、５−、６−ニトロインドリル）、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｙｌ）、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニルなどが挙げられる。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、例えば、核酸は、リン酸骨格修飾を有する修飾された核酸分子を含み得る。骨格修飾の非限定的な例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタールおよび／またはアルキルシリル修飾が挙げられる。ある特定の場合において、ヌクレオシドに天然に存在するリボース糖部分は、ヘキソース糖、多環式ヘテロアルキル環またはシクロヘキセニル基で置き換えられる。ある特定の場合において、ヘキソース糖は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースまたはそれらの誘導体である。ヘキソースは、Ｄ−ヘキソース、グルコースまたはマンノースであり得る。ある特定の場合において、多環式ヘテロアルキル基は、環内に１つの酸素原子を含む二環式環であり得る。ある特定の場合において、多環式ヘテロアルキル基は、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［３．２．１］オクタンまたはビシクロ［３．３．１］ノナンである。
【０２０４】
ニトロピロリル核酸塩基およびニトロインドリル核酸塩基は、ユニバーサル塩基として公知の化合物のクラスのメンバーである。ユニバーサル塩基は、オリゴヌクレオチド二重鎖の融解挙動または活性に実質的に影響せずに４つの天然に存在する塩基のいずれかを置き換え得る化合物である。天然に存在する核酸塩基に関連する安定化する水素結合相互作用とは対照的に、３−ニトロピロリル核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド二重鎖は、スタッキング相互作用によって単独で安定化され得る。ニトロピロリル核酸塩基との有意な水素結合相互作用が無いことにより、特定の相補性塩基に対する特異性は不必要になる。さらに、４−、５−および６−ニトロインドリルは、４つの天然塩基に対して非常に低い特異性しか示さない。１−（２’−Ｏ−メチル−ベータ−Ｄ−リボフラノシル）−５−ニトロインドールを調製するための手順は、Ｇａｕｂｅｒｔ，Ｇ．；Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００４，４５，５６２９に論じられている。他のユニバーサル塩基としては、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニルおよびそれらの構造的誘導体が挙げられる。
【０２０５】
ジフルオロトリルは、ユニバーサル塩基として機能する非天然の核酸塩基である。ジフルオロトリルは、天然の核酸塩基チミンの同配体である。しかしながら、チミンとは異なり、ジフルオロトリルは、天然塩基のいずれに対しても、顕著な選択性を示さない。ユニバーサル塩基として機能する他の芳香族化合物は、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾールおよび４−メチルベンゾイミダゾールである。さらに、比較的疎水性のイソカルボスチリリル誘導体である３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリルおよび３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリルは、天然塩基だけを含むオリゴヌクレオチド配列と比べてオリゴヌクレオチド二重鎖の不安定化をわずかにしか引き起こさないユニバーサル塩基である。他の非天然の核酸塩基としては、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニルおよびそれらの構造的誘導体が挙げられる。ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾールおよび上で言及された他の非天然塩基の合成手順を含むより詳細な考察については、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９：７２３８−７２４２（１９９４）を参照のこと。
さらに、化学的置換基、例えば、架橋剤が、反応物に対して安定性または不可逆性をさらに付加するために使用され得る。架橋剤の非限定的な例としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル（ジスクシンイミジルエステル、例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）を含む）、二官能性マレイミド（例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの作用物質が挙げられる。
【０２０６】
ヌクレオチドアナログは、「ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）」核酸も含み得る。ある特定の組成物は、内因性の核酸を特定の構造に本質的に「繋ぎ止める」または「ロックする」ために使用され得る。配列を繋ぎ止めることは、核酸複合体の解離を防ぐために役立ち、ゆえに、複製を防ぎ得るだけでなく、内在性（endogeneous）配列の標識、修飾および／またはクローニングも可能にし得る。ロックされた構造は、遺伝子発現を制御し得る（すなわち、転写または複製を阻害し得るかまたは増強し得る）か、または内在性の核酸配列を標識するためもしくはその他の方法で修飾するために使用され得る安定した構造として使用され得るか、またはその内在性配列を単離するために、すなわちクローニングのために使用され得る。
【０２０７】
核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡだけを含む分子に必ずしも限定されず、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含する。非ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのパーセントは、１％〜１００％（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５％）であり得る。
【０２０８】
（核酸調製物）
いくつかの実施形態において、例えば、アッセイにおけるコントロールまたは標準物質として、または治療薬として使用するための核酸が、提供される。核酸は、当該分野で公知の任意の手法（例えば、化学合成、酵素的生成または生物学的生成など）によって作製され得る。核酸は、生物学的サンプルから回収され得るかまたは単離され得る。核酸は、組換えであり得るか、または天然であり得るかもしくは細胞にとって内因性であり得る（細胞のゲノムから産生され得る）。生物学的サンプルは、小さい核酸分子の回収率を高めるような方法で処理され得ることが企図される。一般に、方法は、グアニジニウムおよび界面活性剤を有する溶液で細胞を溶解することを含み得る。
【０２０９】
核酸合成はまた、標準的な方法に従って行われ得る。合成核酸（例えば、合成オリゴヌクレオチド）の非限定的な例としては、ホスホトリエステル、ホスファイトもしくはホスホルアミダイト化学を使用するインビトロ化学合成および固相法によってまたはデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体を介して作製された核酸が挙げられる。様々な異なるオリゴヌクレオチド合成機構が、他の箇所に開示されている。
【０２１０】
核酸は、公知の手法を用いて単離され得る。特定の実施形態において、小さい核酸分子を単離するためおよび／またはＲＮＡ分子を単離するための方法が、使用され得る。クロマトグラフィーは、タンパク質または他の核酸から核酸を分離するためまたは単離するために使用されるプロセスである。そのような方法は、ゲルマトリックスを用いる電気泳動、フィルターカラム、アルコール沈殿および／または他のクロマトグラフィーを含み得る。細胞からの核酸が、使用されるかまたは評価される場合、方法は、一般に、特定のＲＮＡ集団を単離するためのプロセスを実行する前に、細胞をカオトロピック（例えば、グアニジニウムイソチオシアネート）および／または界面活性剤（例えば、Ｎ−ラウロイルサルコシン）で溶解することを含む。
【０２１１】
方法は、核酸を単離するための有機溶媒および／またはアルコールの使用を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞溶解産物に加えられるアルコールの量は、約５５％〜６０％というアルコール濃度に達する。種々のアルコールを使用できるが、エタノールがうまく機能する。固体支持体は、任意の構造であってよく、それには、電気陰性基を有する無機物またはポリマー支持体を含み得る、ビーズ、フィルターおよびカラムが含まれる。ガラス繊維のフィルターまたはカラムは、そのような単離手順にとって有効である。
【０２１２】
核酸単離プロセスは、時折、ａ）サンプル中の細胞を、グアニジニウムを含む溶解液で溶解すること（ここで、少なくとも約１Ｍグアニジニウムの濃度を有する溶解産物が生成される）；ｂ）その溶解産物から核酸分子を、フェノールを含む抽出液を用いて抽出すること；ｃ）その溶解産物にアルコール溶液を加えることにより、溶解産物／アルコール混合物を形成すること（ここで、その混合物中のアルコールの濃度は、約３５％〜約７０％である）；ｄ）その溶解産物／アルコール混合物を固体支持体に適用すること；ｅ）イオン性溶液を用いてその固体支持体から核酸分子を溶出すること；およびｆ）その核酸分子を捕捉することを含み得る。サンプルは、乾燥され得、その後の操作にとって適切な液体および体積で再懸濁され得る。
【０２１３】
本明細書で提供されるのは、本出願のポリヌクレオチドを含む核酸を含む組成物またはキットである。従って、組成物またはキットは、例えば、上記第１のおよび第２のキメラポリペプチドをコードする上記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの両方を含み得る。上記核酸は、１個より多くの核酸種を含み得、すなわち、例えば、上記第１の核酸種は、上記第１のポリヌクレオチドを含み、上記第２の核酸種は、上記第２のポリヌクレオチドを含む。他の例では、上記核酸は、上記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの両方を含み得る。上記キットは、さらに、上記第１のもしくは第２のリガンド、または両方を含み得る。
【０２１４】
（遺伝子移入の方法）
細胞内での導入遺伝子発現の効果を媒介するために、発現構築物を細胞に移行させる必要があり得る。そのような移行は、ウイルスによる遺伝子移入方法またはウイルスによらない遺伝子移入方法を使用し得る。この項では、遺伝子移入の方法および組成物の考察が提供される。
【０２１５】
発現ベクターを含む形質転換された細胞は、その細胞に発現ベクターを導入することによって作製される。本方法とともに使用するための細胞小器官、細胞、組織または生物の形質転換のためのポリヌクレオチド送達に適した方法は、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を細胞小器官、細胞、組織または生物に導入し得る実質的に任意の方法を含む。
【０２１６】
宿主細胞は、ベクターに対するレシピエントとして使用され得るし、使用されてきた。宿主細胞は、所望の結果が、ベクターの複製であるかまたはベクターによってコードされるポリヌクレオチド配列の一部もしくは全部の発現であるかに応じて、原核生物または真核生物に由来し得る。数多くの細胞株および細胞培養物が、宿主細胞として使用するために利用可能であり、それらは、生存している培養物および遺伝物質に対する保管所としての機能を果たす組織であるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）を通じて入手することができる。
【０２１７】
適切な宿主は、決定され得る。一般に、これは、ベクターの骨格および所望の結果に基づく。例えば、プラスミドまたはコスミドは、多くのベクターの複製のために、原核生物宿主細胞に導入され得る。ベクターの複製および／または発現のための宿主細胞として使用される細菌細胞としては、ＤＨ５アルファ、ＪＭ１０９およびＫＣ８、ならびにいくつかの商業的に入手可能な細菌宿主（例えば、ＳＵＲＥ（登録商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ＣｅｌｌｓおよびＳＯＬＯＰＡＣＫ  Ｇｏｌｄ  Ｃｅｌｌｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標），Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））が挙げられる。あるいは、大腸菌ＬＥ３９２などの細菌細胞が、ファージウイルスに対する宿主細胞として使用され得る。宿主細胞として使用され得る真核細胞としては、酵母、昆虫および哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの複製および／または発現のための哺乳動物真核生物宿主細胞の例としては、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＳａｏｓおよびＰＣ１２が挙げられるが、これらに限定されない。酵母株の例としては、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１８】
核酸ワクチンは、例えば、非ウイルスＤＮＡベクター、「裸の」ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにウイルスベクターを含み得る。細胞をこれらのワクチンで形質転換する方法およびこれらのワクチンに含まれる遺伝子の発現を最適化するための方法は公知であり、それらの方法も本明細書中で論じられる。
【０２１９】
（核酸またはウイルスベクターを移入する方法の例）
細胞をトランスフェクトするためもしくは形質転換するため、または本方法のヌクレオチド配列もしくは組成物を投与するために、任意の適切な方法が使用され得る。ある特定の例が、本明細書中に提示され、それらの例としてはさらに、カチオン性ポリマー、脂質様分子およびある特定の市販品、例えば、ＩＮ−ＶＩＶＯ−ＪＥＴ  ＰＥＩなどを使用した送達などの方法が挙げられる。
【０２２０】
（１．エキソビボ形質転換）
生物から取り出された血管細胞および血管組織をエキソビボの環境においてトランスフェクトするために、様々な方法が利用可能である。例えば、イヌ内皮細胞は、インビトロにおけるレトロウイルス遺伝子移入によって遺伝的に変更され、イヌに移植された（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４４−１３４６，１９８９）。別の例では、ユカタンミニブタ内皮細胞を、インビトロにおいてレトロウイルスでトランスフェクトし、ダブルバルーンカテーテルを使用して動脈に移植した（Ｎａｂｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４（４９１０）：１３４２−１３４４，１９８９）。したがって、細胞または組織が、取り出され、本明細書中に提示されるポリヌクレオチドを使用してエキソビボにおいてトランスフェクトされ得ることが企図される。特定の態様において、移植された細胞または組織は、生物の中に配置され得る。
【０２２１】
（２．注射）
ある特定の実施形態において、抗原提示細胞または核酸ベクターもしくはウイルスベクターは、１つ以上の注射（すなわち、針による注射）、例えば、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、前立腺内（ｉｎｔｒａｐｒｏｔａｔｉｃ）、腫瘍内、腹腔内などを介して、細胞小器官、細胞、組織または生物に送達され得る。注射の方法としては、例えば、食塩水溶液を含む組成物の注射が挙げられる。さらなる実施形態は、直接マイクロインジェクションによるポリヌクレオチドの導入を含む。使用される発現ベクターの量は、抗原の性質、ならびに使用される細胞小器官、細胞、組織または生物に応じて変動し得る。
【０２２２】
皮内注射、結節内注射またはリンパ管内注射は、ＤＣ投与のより一般的に使用される方法の一部である。皮内注射は、血流への吸収が低速度であるがリンパ系への取り込みが迅速であることを特徴とする。真皮に多数のランゲルハンス樹状細胞が存在することにより、インタクトな抗原ならびにプロセシングされた抗原が流入領域リンパ節に輸送され得る。これを正しく行うためには、適切な部位の準備が必要である（すなわち、適切な針の留置を観察するために、毛を刈り込む）。結節内注射は、リンパ系組織への抗原の直接的な送達を可能にする。リンパ管内注射は、ＤＣの直接投与を可能にする。
【０２２３】
（３．エレクトロポレーション）
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションを介して細胞小器官、細胞、組織または生物に導入される。エレクトロポレーションは、細胞およびＤＮＡの懸濁液を高圧放電に曝露することを含む。この方法のいくつかの変法では、ある特定の細胞壁分解酵素（例えば、ペクチン分解酵素）を使用して、標的レシピエント細胞を、未処理の細胞よりもエレクトロポレーションによる形質転換に対してより感受性にする（参照により本明細書中に援用される米国特許第５，３８４，２５３号）。
【０２２４】
エレクトロポレーションを使用した真核細胞のトランスフェクションは、かなり成功している。この様式で、マウスプレＢリンパ球がヒトカッパ免疫グロブリン遺伝子でトランスフェクトされ（Ｐｏｔｔｅｒら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，７１６１−７１６５）、ラット肝細胞がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされた（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６，７１６−７１８）。
【０２２５】
インビボにおけるワクチン用エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）、すなわちｅＶａｃは、単純な注射法を介して臨床で実行されている。ポリペプチドをコードするＤＮＡベクターが、患者の皮内に注射される。次いで、電極によって皮内の空間に電気的パルスが適用されることにより、そこに局在化している細胞、特に、常在の皮膚樹状細胞が、ＤＮＡベクターを取り込み、コードされるポリペプチドを発現するようになる。次いで、局所炎症によって活性化された、これらのポリペプチドを発現している細胞が、例えば、リンパ節に遊走し、抗原を提示し得る。核酸が、エレクトロポレーションによって細胞に送達され得る場合、その核酸は、例えば、限定されないが、核酸の注射または他の任意の投与手段の後で、エレクトロポレーションを使用して投与されるとき、電気穿孔的に（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒｅｔｉｃａｌｌｙ）投与される。
【０２２６】
エレクトロポレーションの方法は、例えば、Ｓａｒｄｅｓａｉ，Ｎ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２３：４２１−９（２０１１）およびＦｅｒｒａｒｏ，Ｂ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ７：１２０−１２７（２０１１）（これらの全体が本明細書中で参照により援用される）に論じられている。
【０２２７】
（４．リン酸カルシウム）
他の実施形態では、リン酸カルシウム沈殿を用いて、ポリヌクレオチドが細胞に導入される。この手法を用いて、ヒトＫＢ細胞が、アデノウイルス５ＤＮＡでトランスフェクトされた（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４６７）。また、この様式において、マウスＬ（Ａ９）、マウスＣ１２７、ＣＨＯ、ＣＶ−１、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａ細胞が、ネオマイシンマーカー遺伝子でトランスフェクトされ（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７（８）：２７４５−２７５２，１９８７）、ラット肝細胞が、種々のマーカー遺伝子でトランスフェクトされた（Ｒｉｐｐｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０：６８９−６９５，１９９０）。
【０２２８】
（５．ＤＥＡＥ−デキストラン）
別の実施形態では、ＤＥＡＥ−デキストランの後にポリエチレングリコールを使用して、ポリヌクレオチドが細胞に送達される。この様式において、レポータープラスミドが、マウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞に導入された（Ｇｏｐａｌ，Ｔ．Ｖ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８５  Ｍａｙ；５（５）：１１８８−９０）。
【０２２９】
（６．音波処理負荷（Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｌｏａｄｉｎｇ））
さらなる実施形態は、直接音波負荷（ｄｉｒｅｃｔ  ｓｏｎｉｃ  ｌｏａｄｉｎｇ）によるポリヌクレオチドの導入を含む。ＬＴＫ線維芽細胞が、音波処理負荷によってチミジンキナーゼ遺伝子でトランスフェクトされた（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，８４６３−８４６７）。
【０２３０】
（７．リポソーム媒介性トランスフェクション）
さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、脂質複合体、例えば、リポソームなどの中に閉じ込められ得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内側の水性媒質を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒質によって隔てられた複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると、自発的に形成する。それらの脂質成分は、自己再配列を起こした後、閉鎖構造を形成し、水および溶解した溶質を脂質二重層の間に閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ｂａｃｈｈａｗａｔ，（１９９１）Ｉｎ：Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ．ｐｐ．８７−１０４）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体化されたポリヌクレオチドも企図される。
【０２３１】
（８．レセプター媒介性トランスフェクション）
なおもさらに、ポリヌクレオチドは、レセプター媒介性送達ビヒクルを介して標的細胞に送達され得る。これらは、標的細胞において生じているレセプター媒介性エンドサイトーシスによる高分子の選択的取り込みを利用する。様々なレセプターの細胞型特異的分布に照らして、この送達方法は、別の特異性の程度を付加する。
【０２３２】
ある特定のレセプター媒介性遺伝子標的化ビヒクルは、細胞レセプター特異的リガンドおよびポリヌクレオチド結合剤を含む。他のものは、送達されるべきポリヌクレオチドに作動可能に付着された細胞レセプター特異的リガンドを含む。いくつかのリガンドは、レセプター媒介性遺伝子移入のために使用され（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，４４２９−４４３２；Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７（９）：３４１０−３４１４，１９９０；Ｐｅｒａｌｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４０８６−４０９０，１９９４；Ｍｙｅｒｓ，ＥＰＯ  ０２７３０８５）、これにより、この手法の実施可能性が確立される。別の哺乳動物細胞型における特異的送達も論じられている（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，１２：１５９−１６７，１９９３；参照により本明細書中に援用される）。ある特定の態様では、標的細胞の集団上に特異的に発現されるレセプターに対応するリガンドが、選択される。
【０２３３】
他の実施形態において、細胞特異的ポリヌクレオチド標的化ビヒクルのポリヌクレオチド送達ビヒクル成分は、リポソームとともに特異的結合リガンドを含み得る。送達されるべきポリヌクレオチド（複数可）は、そのリポソーム内に収容され、特異的結合リガンドは、リポソーム膜に機能的に組み込まれる。このようにして、そのリポソームは、標的細胞のレセプター（複数可）に特異的に結合し、細胞にその内容物を送達し得る。そのようなシステムは、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）が、ＥＧＦレセプターのアップレギュレーションを示す細胞へのポリヌクレオチドのレセプター媒介性送達において使用されるシステムを使用して機能的であると示された。
【０２３４】
なおもさらなる実施形態において、標的化された送達ビヒクルのポリヌクレオチド送達ビヒクル成分は、リポソーム自体であり得、そのリポソームは、例えば、細胞特異的結合を指示する１つ以上の脂質または糖タンパク質を含み得る。例えば、ガラクトース末端のアシアロガングリオシドであるラクトシル−セラミドが、リポソームに組み込まれ、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増加が観察された（Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９，１５７−１７６）。組織特異的な形質転換構築物が、類似の様式で標的細胞に特異的に送達され得ることが企図される。
【０２３５】
（微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ））
微粒子銃法は、ポリヌクレオチドを少なくとも１つの細胞小器官、細胞、組織または生物に導入するために使用され得る（米国特許第５，５５０，３１８号；米国特許第５，５３８，８８０号；米国特許第５，６１０，０４２号；およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９６９９；これらの各々は、参照により本明細書中に援用される）。この方法は、ＤＮＡでコーティングされた微小発射体が高速度に加速して、それらが細胞膜を貫通し、細胞を殺滅せずにそれらの細胞に入ることを可能にする能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３）。当該分野で公知の多種多様の微粒子銃法が存在し、それらの多くは、本方法に適用可能である。
【０２３６】
この微粒子銃では、１つ以上の粒子が、少なくとも１つのポリヌクレオチドでコーティングされ、推進力によって細胞に送達され得る。小粒子を加速するためのいくつかのデバイスが、開発された。１つのそのようなデバイスは、電流を発生させ、その後その電流が輸送力を提供する高圧放電に依存する（Ｙａｎｇら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，９５６８−９５７２）。使用される微小発射体は、生物学的に不活性な物質（例えば、タングステンまたは金の粒子またはビーズ）からなった。例示的な粒子としては、タングステン、白金、およびある特定の例では、金から構成された粒子（例えば、ナノ粒子を含む）が挙げられる。場合によっては、金属粒子上へのＤＮＡ沈殿が、微粒子銃を使用したレシピエント細胞へのＤＮＡ送達に必要としないことが企図される。しかしながら、粒子は、ＤＮＡでコーティングされるのではなく、ＤＮＡを含み得ることが企図される。ＤＮＡでコーティングされた粒子は、粒子銃を介したＤＮＡ送達のレベルを上昇させ得るが、本質的に必要ない。
【０２３７】
（ウイルスベクター媒介性移入方法の例）
被験体内の単数または複数の細胞がヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子を発現し得るようにそのヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列を含む組成物をその細胞またはその被験体に投与するのに適した任意のウイルスベクターが、本方法において使用され得る。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、細胞への遺伝子移入を媒介するウイルス粒子に組み込まれる。代表的には、そのウイルスは、単純に、適切な宿主細胞に生理学的条件下で曝露されることにより、ウイルスの取り込みが可能になり得る。本方法は、下記で論じられるように、種々のウイルスベクターを使用して都合よく使用される。
【０２３８】
（１．アデノウイルス）
アデノウイルスは、その中程度のサイズのＤＮＡゲノム、操作の容易性、高力価、広範囲な標的細胞および高感染力を理由に、遺伝子トランスファーベクターとして使用するのに特に適している。およそ３６ｋｂのウイルスゲノムは、ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに必要なシス作用性エレメントを含む１００〜２００塩基対（ｂｐ）の末端逆位配列（ＩＴＲ）が境を接している。異なる転写単位を含む、ゲノムの初期（Ｅ）領域および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分割される。
【０２３９】
Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転写の制御に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現により、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質が合成される。これらのタンパク質は、ＤＮＡの複製、後期遺伝子の発現および宿主細胞の切り離しに関与する（Ｒｅｎａｎ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ  Ｏｎｃｏｌ．，１９，１９７−２１８）。ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５）の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によってもたらされる単一の一次転写産物の有意なプロセシングの後にだけ、発現される。ＭＬＰ（１６．８マップ単位に位置する）は、感染の後期において特に有効であり、このプロモーターからもたらされたすべてのｍＲＮＡは、それらを翻訳にとって有用にする５’トリパータイトリーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｌｅａｄｅｒ）（ＴＬ）配列を有する。
【０２４０】
アデノウイルスが遺伝子治療に対して最適化されるために、大きなＤＮＡセグメントを含むことができるように運搬能を最大にする必要がある。ある特定のアデノウイルス産物に関連する毒性および免疫学的反応を減少させることも非常に望ましい。これらの２つの目標は、アデノウイルス遺伝子の除去が両方の目的にかなうという点で、ある程度重なり合っている。本方法の実施によって、治療的な構築物を比較的容易にマニピュレートする能力を保持しつつ、これらの両方の目標を達成することができる。
【０２４１】
ウイルスＤＮＡの複製に必要とされるシスエレメントがすべて、直鎖状のウイルスゲノムのいずれかの末端の末端逆位反復配列（ＩＴＲ）（１００〜２００ｂｐ）に局在化するので、ＤＮＡの大きな置き換えが可能である。ＩＴＲを含むプラスミドは、非欠陥アデノウイルスの存在下において複製し得る（Ｈａｙ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９８４  Ｊｕｎ  ５；１７５（４）：４９３−５１０）。ゆえに、これらのエレメントをアデノウイルスベクターに含めることにより、複製が可能になり得る。
【０２４２】
さらに、ウイルス封入のためのパッケージングシグナルは、ウイルスゲノムの左端の１９４〜３８５ｂｐ（０．５〜１．１マップ単位）に局在する（Ｈｅａｒｉｎｇら、Ｊ．（１９８７）Ｖｉｒｏｌ．，６７，２５５５−２５５８）。このシグナルは、左端に近いが付着末端配列の外側の特異的配列が、頭部構造へのＤＮＡの挿入に必要とされるタンパク質への結合を媒介する、バクテリオファージラムダＤＮＡにおけるタンパク質認識部位を模倣している。ＡｄのＥ１置換ベクターは、ウイルスゲノムの左端の４５０ｂｐ（０〜１．２５マップ単位）フラグメントが２９３細胞においてパッケージングを指示し得ることを実証した（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ，１０１：１９５−２０２，１９９１）。
【０２４３】
以前に、アデノウイルスゲノムのある特定の領域が、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、コードされている遺伝子が発現され得ることが示された。これらの細胞株は、その細胞株によってコードされる、アデノウイルス機能を欠いたアデノウイルスベクターの複製を支持することができる。「補助」ベクター、例えば、野生型ウイルスまたは条件欠陥性変異体による複製欠損性アデノウイルスベクターの補完の報告も存在する。
【０２４４】
複製欠損性アデノウイルスベクターは、ヘルパーウイルスによってトランスで補完され得る。しかしながら、複製機能を提供するのに必要なヘルパーウイルスが存在するせいで、いずれの調製物も汚染され得るので、この知見だけでは、複製欠損性ベクターの単離が可能にならない。したがって、複製欠損性ベクターの複製および／またはパッケージングに特異性を付加し得るさらなるエレメントが必要だった。そのエレメントは、アデノウイルスのパッケージング機能に由来する。
【０２４５】
アデノウイルスに対するパッケージングシグナルは、従来のアデノウイルスマップの左端に存在することが示されている（Ｔｉｂｂｅｔｔｓら（１９７７）Ｃｅｌｌ，１２，２４３−２４９）。後の研究から、ゲノムのＥ１Ａ（１９４〜３５８ｂｐ）領域に欠失を有する変異体が、初期（Ｅ１Ａ）機能を補完した細胞株においてさえ不十分にしか成長しないことが示された（Ｈｅａｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６７，８０９−８２２）。代償的な（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｎｇ）アデノウイルスＤＮＡ（０〜３５３ｂｐ）が、その変異体の右端に組み換えられたとき、そのウイルスは、正常にパッケージングされた。さらなる変異解析から、Ａｄ５ゲノムの左端に、短い反復性の位置依存性エレメントが同定された。その反復は、ゲノムのいずれかの末端に存在する場合、効率的なパッケージングには１コピーで十分であるが、Ａｄ５  ＤＮＡ分子の内側に向かって移動した場合は、そうではないことが見出された（Ｈｅａｒｉｎｇら、Ｊ．（１９８７）Ｖｉｒｏｌ．，６７，２５５５−２５５８）。
【０２４６】
パッケージングシグナルの変異バージョンを使用することによって、様々な効率でパッケージングされるヘルパーウイルスを作製することが可能である。代表的には、変異は、点変異または欠失である。パッケージングが低効率であるヘルパーウイルスをヘルパー細胞内で生育させるとき、そのウイルスは、野生型ウイルスと比べて低い速度であったとしてもパッケージングされ、それにより、ヘルパーの繁殖が可能となる。しかしながら、これらのヘルパーウイルスを、野生型パッケージングシグナルを含むウイルスとともに細胞内で生育させるとき、その野生型パッケージングシグナルは、変異バージョンよりも優先的に認識される。パッケージング因子の量が限られていることを考慮すると、野生型シグナルを含むウイルスは、ヘルパーと比べて選択的にパッケージングされる。優先性が十分大きい場合、均質に近い系統（stock）が達成され得る。
【０２４７】
特定の組織または種に対するＡＤＶ構築物の向性を改善するために、レセプター結合ファイバー配列は、しばしばアデノウイルス分離株の間で置換され得る。例えば、アデノウイルス５において見出されたコクサッキー−アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）リガンドは、アデノウイルス３５由来のＣＤ４６結合ファイバー配列の代わりに用いられ、ヒト造血細胞に対する結合親和性が大幅に改善されたウイルスが作製され得る。得られた「シュードタイプ化された」ウイルスであるＡｄ５ｆ３５は、いくつかの臨床的に開発されたウイルス分離株の基礎となった。さらに、標的細胞に対してウイルスを再標的化することを可能にするファイバーを改変する様々な生化学的方法が存在する。方法は、二機能性抗体（一方の末端はＣＡＲリガンドに結合し、もう一方の末端は標的配列に結合する）の使用、およびカスタマイズされたアビジンベースのキメラリガンドとの会合を可能にするファイバーの代謝性のビオチン化を含む。あるいは、リガンド（例えば、抗ＣＤ２０５）をヘテロ二機能性リンカー（例えば、ＰＥＧ含有）によってアデノウイルス粒子に付着することができる。
【０２４８】
（２．レトロウイルス）
レトロウイルスは、そのＲＮＡを逆転写のプロセスによって感染細胞において二本鎖ＤＮＡに変換する能力を特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ，（１９９０）Ｉｎ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｅｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４３７−１５００）。次いで、得られたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞染色体内に安定に組み込み、ウイルスタンパク質の合成を指示する。その組み込みにより、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、３つの遺伝子、それぞれキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含む。ｐｓｉと呼ばれる、ｇａｇ遺伝子から上流に見られる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルとして機能する。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列が、ウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムへの組み込みにも必要である（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。したがって、例えば、本技術は、例えば、細胞を形質導入するために使用されるポリヌクレオチドがその細胞のゲノムに組み込まれた細胞を含む。
【０２４９】
レトロウイルスベクターを構築するために、プロモーターをコードする核酸を、ウイルスゲノム内のある特定のウイルス配列の位置に挿入することにより、複製欠損であるウイルスが作製される。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含むがＬＴＲおよびｐｓｉ成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎら（１９８３）Ｃｅｌｌ，３３，１５３−１５９）。レトロウイルスのＬＴＲ配列およびｐｓｉ配列とともにヒトｃＤＮＡを含む組換えプラスミドをこの細胞株に導入するとき（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、そのｐｓｉ配列は、その組換えプラスミドのＲＮＡ転写産物をウイルス粒子内にパッケージングさせ、次いでそれを培養培地中に分泌させる（Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｊ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．Ｒ．，（１９８８）Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．）．Ｎｉｃｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ；Ｔｅｍｉｎら（１９８６）Ｉｎ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（ｅｄ．），  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４９−１８８；Ｍａｎｎら、１９８３）。組換えレトロウイルスを含む培地を捕集し、必要に応じて濃縮し、遺伝子移入のために使用する。レトロウイルスベクターは、幅広い種類の細胞型に感染することができる。しかしながら、多くのタイプのレトロウイルスの組み込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら（１９７５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７，２４２−２４８）。
【０２５０】
レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするようにデザインされたアプローチは、ウイルスエンベロープへのガラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づいて最近開発された。アシアロ糖タンパク質レセプターを介した肝細胞などの細胞の特異的感染を可能にし得るこの修飾が望まれる場合がある。
【０２５１】
組換えレトロウイルスの標的化に対する異なるアプローチがデザインされており、そのアプローチは、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体および特異的な細胞レセプターに対するビオチン化抗体を使用した。それらの抗体は、ストレプトアビジンを使用することによってビオチン成分を介して結合された（Ｒｏｕｘら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９０７９−９０８３）。主要組織適合遺伝子複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を使用して、それらの表面抗原を有する種々のヒト細胞がインビトロにおいてエコトロピックウイルスに感染することが実証された（Ｒｏｕｘら、１９８９）。
【０２５２】
（３．アデノ随伴ウイルス）
ＡＡＶは、約４７００塩基対の直鎖状の一本鎖ＤＮＡを使用する。末端逆位反復配列は、ゲノムに隣接している。２つの遺伝子が、ゲノム内に存在し、いくつかの異なる遺伝子産物を生じる。第１に、ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ−１、ＶＰ−２およびＶＰ−３と命名された３つの異なるビリオンタンパク質（ＶＰ）を生成する。第２に、ｒｅｐ遺伝子は、４つの非構造タンパク質（ＮＳ）をコードする。これらのｒｅｐ遺伝子産物の１つ以上は、ＡＡＶ転写のトランス活性化に関与する。
【０２５３】
ＡＡＶにおける３つのプロモーターは、ゲノム内のそれらの位置によって、マップ単位で命名されている。これらは、左から右へ、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０である。転写によって、６つの転写産物が生じ、２つは、３つの各プロモーターにおいて開始され、各対の一方がスプライシングされる。マップ単位４２〜４６に由来するスプライス部位は、各転写産物にとって同じである。４つの非構造タンパク質は、より長い転写産物に由来するとみられ、３つのビリオンタンパク質のすべてが、最も小さい転写産物から生じる。
【０２５４】
ＡＡＶは、ヒトにおけるいかなる病的状態にも関連しない。興味深いことに、効率的な複製のために、ＡＡＶは、単純ヘルペスウイルスＩおよびＩＩ、サイトメガロウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ならびに当然のことながらアデノウイルスなどのウイルスからの「補助」機能を必要とする。それらのヘルパーのうち最も特徴付けられたものは、アデノウイルスであり、このウイルスに対する多くの「初期」機能は、ＡＡＶの複製を支援すると示された。ＡＡＶ構造発現を抑制すると考えられているＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質の低レベルの発現、およびヘルパーウイルス感染は、この阻止を取り消すと考えられている。
【０２５５】
ＡＡＶベクターの末端反復配列は、ＡＡＶまたは改変されたＡＡＶゲノムを含むｐ２０１などのプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化によって（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１：３０９６−３１０１（１９８７））またはＡＡＶの公開配列に基づく末端反復配列の化学的合成もしくは酵素的合成を含むがこれらに限定されない他の方法によって得ることができる。それは、例えば、機能、すなわち安定した部位特異的な組み込みを可能にするために必要とされるＡＡＶ  ＩＴＲの最小の配列または一部を、欠失分析によって決定することができる。また、安定した部位特異的な組み込みを指示する末端反復配列の能力を維持しつつ、配列のどの軽微な改変が許容され得るかを決定することもできる。
【０２５６】
ＡＡＶベースのベクターは、インビトロにおいて遺伝子送達するための安全で有効なビヒクルであることが証明されており、これらのベクターは、開発されており、エキソビボとインビボの両方における潜在的な遺伝子治療において広範囲に適用するために前臨床段階および臨床段階において試験されている（Ｃａｒｔｅｒ  ａｎｄ  Ｆｌｏｔｔｅ，（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７０；７９−９０；Ｃｈａｔｔｅｉｊｅｅら（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７０，７９−９０；Ｆｅｒｒａｒｉら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，３２２７−３２３４；Ｆｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，５２０−５３２；Ｆｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０６１３−１０６１７，（１９９３）；Ｇｏｏｄｍａｎら（１９９４），Ｂｌｏｏｄ，８４，１４９２−１５００；Ｋａｐｌｉｔｔら（１９９４）Ｎａｔ’ｌ  Ｇｅｎｅｔ．，８，１４８−１５３；Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．１９９６  Ｄｅｃ；６２（６）：１６６９−７６；Ｋｅｓｓｌｅｒら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１４０８２−１４０８７；Ｋｏｅｂｅｒｌら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１４２６−１４３１；Ｍｉｚｕｋａｍｉら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１７，１２４−１３０）。
【０２５７】
肺におけるＡＡＶ媒介性の効率的な遺伝子移入および遺伝子発現は、嚢胞性線維症の処置のための臨床試験に至っている（Ｃａｒｔｅｒ  ａｎｄ  Ｆｌｏｔｔｅ，１９９５；Ｆｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０６１３−１０６１７，（１９９３））。同様に、骨格筋へのジストロフィン遺伝子のＡＡＶ媒介性の遺伝子送達による筋ジストロフィーの処置、脳へのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子送達によるパーキンソン病の処置、肝臓への第ＩＸ因子遺伝子送達による血友病Ｂの処置、および潜在的に、心臓への血管内皮成長因子遺伝子による心筋梗塞の処置の見込みは、これらの器官におけるＡＡＶ媒介性の導入遺伝子発現が高度に効率的であると最近示されたので、有望であるとみられる（Ｆｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，５２０−５３２；Ｆｌｏｔｔｅら、１９９３；Ｋａｐｌｉｔｔら、１９９４；１９９６；Ｋｏｅｂｅｒｌら、１９９７；ＭｃＣｏｗｎら（１９９６）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，７１３，９９−１０７；Ｐｉｎｇら（１９９６）Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，３，２２５−２２８；Ｘｉａｏら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，８０９８−８１０８）。
【０２５８】
（４．他のウイルスベクター）
他のウイルスベクターも、本発明の方法および組成物において発現構築物として用いられる。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，（１９８８）Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，ｐｐ．４６７−４９２；Ｂａｉｃｈｗａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，（１９８６）Ｉｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｐｐ．１１７−１４８；Ｃｏｕｐａｒら、Ｇｅｎｅ，６８：１−１０，１９８８）カナリアポックスウイルスおよびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターが使用される。これらのウイルスは、様々な哺乳動物細胞への遺伝子移入において使用するためのいくつかの特徴を提供する。
【０２５９】
いったん、構築物が細胞内に送達されたら、導入遺伝子をコードする核酸は、種々の部位に位置づけられ、発現される。ある実施形態おいて、導入遺伝子をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定に組み込まれる。この組み込みは、相同組換えを介して同種の（ｃｏｇｎａｔｅ）位置および向きである（遺伝子置換）かまたはランダムで非特異的な位置に組み込まれる（遺伝子増強）。なおもさらなる実施形態において、核酸は、ＤＮＡの別個のエピソームセグメントとして細胞において安定に維持される。そのような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期と無関係のまたはそれと同期した維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物がどのように細胞に送達され、その核酸が細胞のどこにとどまるかは、使用される発現構築物のタイプに依存する。
【０２６０】
（疾患を処置するための方法）
本方法は、疾患を処置するかまたは予防する方法も包含し、ここで、例えば注入による細胞の投与が、有益であり得る。
【０２６１】
細胞、例えば、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、または前駆体細胞など、例えば、造血幹細胞、間葉系ストローマ細胞、幹細胞、多能性幹細胞および胚性幹細胞などが、細胞治療のために使用され得る。それらの細胞は、ドナーに由来し得るか、または患者から得られた細胞であり得る。それらの細胞は、例えば、病的な細胞の機能を置き換えるための、例えば、再生において使用され得る。それらの細胞は、生物学的作用物質が、特定の微小環境、例えば、病的な骨髄または転移性の沈着物（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｄｅｐｏｓｉｔ）などに送達され得るように、異種遺伝子を発現するようにも改変され得る。間葉系ストローマ細胞は、例えば、免疫抑制活性を提供するためにも使用されており、移植片対宿主病および自己免疫障害の処置において使用され得る。本願において提供される細胞は、細胞治療後に治療用細胞の活性が増加されるか、または減少される必要がある状況において価値のあるものであり得る安全スイッチを含む。例えば、キメラ抗原レセプターを発現するＴ細胞が患者に提供される場合、場合によっては、またはオフターゲット毒性などの有害事象が存在し得る。リガンドの投与を終了すると、治療用Ｔ細胞は非活性化状態に戻り、無毒性の低い発現レベルで残存し得る。または、例えば、その治療用細胞は、腫瘍細胞または腫瘍サイズを減少させるように働き得、もはや必要とされなくなることがある。この状況では、リガンドの投与は、終了してもよく、治療用細胞は、もはや活性化されない。最初の治療後に腫瘍細胞が再発する（ｒｅｔｕｒｎ）かまたは腫瘍サイズが増加する場合、キメラ抗原レセプターを発現しているＴ細胞を活性化させ、患者を再処置するために、リガンドが再度投与され得る。
【０２６２】
「治療用細胞」とは、細胞治療のために使用される細胞、すなわち、状態または疾患を処置するためまたは予防するために被験体に投与される細胞のことを意味する。上記細胞が負の効果を有するこのような場合、本方法は、選択的アポトーシスを介して上記治療用細胞を除去するために使用され得る。
【０２６３】
他の例では、Ｔ細胞は、種々の疾患および状態を処置するために、ならびに幹細胞移植の一部として使用される。ハプロタイプ一致Ｔ細胞移植後に起こり得る有害事象は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である。ＧｖＨＤが起こる可能性は、移植されるＴ細胞の数が増大するとともに増大する。これは、注入され得るＴ細胞の数を制限する。患者におけるＧｖＨＤの事象において、その注入されたＴ細胞を選択的に除去する能力を有することによって、より多数のＴ細胞が注入され得、その数を１０６より多い、１０７より多い、１０８より多い、または１０９より多い細胞へと、増大させ得る。投与され得る１ｋｇ  体重あたりのＴ細胞の数は、例えば、約１×１０４  Ｔ細胞／ｋｇ  体重〜約９×１０７  Ｔ細胞／ｋｇ  体重、例えば、約１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、もしくは９×１０４；約１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、もしくは９×１０５；約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、もしくは９×１０６；または約１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、もしくは９×１０７  Ｔ細胞／ｋｇ  体重であり得る。他の例では、Ｔ細胞以外の治療用細胞が使用され得る。投与され得る１ｋｇ  体重あたりの治療用細胞の数は、例えば、約１×１０４  Ｔ細胞／ｋｇ  体重〜約９×１０７  Ｔ細胞／ｋｇ  体重、例えば、約１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、もしくは９×１０４；約１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、もしくは９×１０５；約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、もしくは９×１０６；または約１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、もしくは９×１０７  治療用細胞／ｋｇ  体重であり得る。
【０２６４】
用語「単位用量」は、それが接種材料に関するとき、哺乳動物に対する単位投与量として好適な物理的に分離した単位のことを指し、各単位は、必要とされる希釈剤と共同して、所望の免疫原性効果をもたらすと計算された所定の量の薬学的組成物を含む。接種材料の単位用量についての規格（specification）は、薬学的組成物のユニークな特色および達成されるべき特定の免疫学的効果によって規定され、その特色に依存する。
【０２６５】
本明細書で示される多量体リガンドなどの薬学的組成物の有効量は、カスパーゼ−９ベクターを含む細胞を選択的に除去するというこの選択された結果を達成する量である。その結果、カスパーゼ−９発現細胞のうちの６０％超、７０％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、または９７％超が殺滅される。用語は、「十分な量」とも同義である。
【０２６６】
任意の特定の用途に対する有効量は、処置されている疾患もしくは状態、投与される特定の組成物、被験体のサイズおよび／または疾患もしくは状態の重症度などの因子に応じて変動し得る。本明細書中に提示される特定の組成物の有効量は、過度の実験を必要とせずに、経験的に決定され得る。
【０２６７】
用語「接触される」および「曝露される」は、細胞、組織または生物に適用されるとき、薬学的組成物および／もしくは別の作用物質、例えば、化学療法剤または放射線治療薬などが標的細胞、組織もしくは生物に送達されるプロセスを論ずるために本明細書中で使用されるか、または標的細胞、組織もしくは生物のすぐ近位に配置されるプロセスを考察するために本明細書中で使用される。細胞の殺滅または静止を達成するために、薬学的組成物および／またはさらなる作用物質（複数可）が、細胞（複数可）を殺滅するのに有効または細胞の分裂を防ぐのに有効な合計量で１つ以上の細胞に送達される。
【０２６８】
薬学的組成物の投与は、数分から数週間の範囲の間隔だけ、他の作用物質（複数可）より先に行われ得る、他の作用物質（複数可）と並行して（co-current）であり得る、および／または他の作用物質（複数可）の後に行われ得る。薬学的組成物および他の作用物質（複数可）が別々に細胞、組織または生物に適用される実施形態では、その薬学的組成物および作用物質（複数可）がなおも、都合よく組み合わされた効果をその細胞、組織または生物に対して発揮することができ得るように、各送達の時点の間に有効時間が満了しないことが通常、保証され得る。例えば、そういった場合には、２、３、４つまたはそれより多くの様式を用いて、細胞、組織または生物を実質的に同時に（すなわち、約１分未満以内に）薬学的組成物と接触させ得ることが企図される。他の態様において、１つ以上の作用物質が、発現ベクターを投与する前および／または投与した後に、実質的に同時、約１分以内から、約２４時間、約７日間、約１〜約８週間またはそれより長くまで、およびそれらの中の任意の導き出せる範囲で投与され得る。なおもさらに、本明細書中に提示される薬学的組成物と１つ以上の作用物質との様々な併用レジメンが、使用され得る。
【０２６９】
（最適化されたおよび個別化された治療的処置）
二量体の投与後のアポトーシスの誘導は、移植片対宿主病のステージ、または患者の中に残っている望ましくない治療用細胞の数を決定することによって最適化され得る。
【０２７０】
例えば、患者がＧｖＨＤを有すること、およびそのＧｖＨＤのステージを決定することは、多量体リガンドを投与することによって、カスパーゼ−９関連アポトーシスを誘導することは必要であり得るという臨床医への指示を提供する。別の例では、患者が多量体リガンドでの処置後にＧｖＨＤのレベルの低下を有することの決定は、さらなる用量の多量体リガンドが必要とされないことを臨床医に示し得る。同様に、多量体リガンドでの処置後に、上記患者がＧｖＨＤ症状を示し続けるか、またはＧｖＨＤの再発に苦しむことの決定は、多量体リガンドの少なくともさらなる１用量を投与することが必要であり得ることを臨床医に示し得る。用語「投与量」は、投薬量および投与頻度（例えば、次の用量のタイミングなど）の両方を含むことを意味する。
【０２７１】
他の実施形態において、改変された細胞またはインビボで改変された細胞の数を減少することが必要な事象において、誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドに加えて、キメラ抗原レセプターを発現する治療用細胞のような治療用細胞の投与後に、多量体リガンドは、上記患者に投与され得る。これら実施形態において、上記方法は、有害な症状または状態（例えば、移植片対宿主病、またはオフターゲット毒性）の有無を決定すること、および上記多量体リガンドのある用量を投与することを包含する。上記方法は、上記症状または状態をモニターすること、および上記症状もしくは状態が持続する事象において、さらなる用量の上記多量体リガンドを投与することをさらに包含し得る。このモニタリングおよび処置スケジュールは、キメラ抗原レセプターまたはキメラシグナル伝達分子を発現する治療用細胞が上記患者の中に残っている間は継続し得る。
【０２７２】
その後の薬物の用量、例えば、例えば、その後の多量体リガンドの用量、および／またはその後の薬物投与量を調整するまたは維持する指示は、任意の好都合な様式で提供され得る。指示は、いくつかの実施形態において、表形式で（例えば、物理的媒体または電子媒体において）提供され得る。例えば、観察される移植片対宿主病の症状が、表として提供され得、臨床医は、疾患のステージのリストまたは表とその症状を比較し得る。次いで、その臨床医は、その表から、その後の薬物用量に対する指示を確認し得る。ある特定の実施形態において、指示は、それらの症状またはＧｖＨＤステージがコンピュータに提供された後（例えば、コンピュータ上のメモリに入れられた後）、コンピュータによって提示され得る（例えば、表示され得る）。例えば、この情報は、コンピュータに提供され得（例えば、ユーザーによってコンピュータメモリに入れられ得るか、またはコンピュータネットワーク内のリモートデバイスを介してコンピュータに送信され得）、コンピュータ内のソフトウェアが、その後の薬物用量を調整するかもしくは維持することについての指示を生成し得、および／またはその後の薬物用量の量を提供し得る。
【０２７３】
その後の用量が、指示に基づいて決定されたら、臨床医は、決定されたその後の用量を投与し得るか、または別の人もしくは実体に対してその用量を調整する指示を提供し得る。本明細書中で使用される用語「臨床医」は、意思決定者のことを指し、ある特定の実施形態において、臨床医は、医療専門家である。意思決定者は、いくつかの実施形態において、コンピュータまたは表示されたコンピュータプログラムのアウトプットであり得、そのコンピュータによって表示される指示またはその後の薬物用量に基づいて、保健サービス提供者が行動し得る。意思決定者は、その後の用量を直接投与し得る（例えば、その後の用量を被験体に注入し得る）か、または遠隔的に投与し得る（例えば、ポンプパラメータが、意思決定者によって遠隔的に変更され得る）。
【０２７４】
いくつかの例では、上記リガンドの１用量または複数用量は、ＧｖＨＤ、または他の症状（例えば、ＣＲＳ症状）の臨床的出現が明らかになる前に投与され得る。この例では、細胞治療は、負の症状の出現の前に終了される。例えば、遺伝的疾患の処置のための造血細胞移植などの他の実施形態において、上記治療は、移植片が生着に向かって進行した後であるが、しかし臨床的に観察可能なＧｖＨＤまたは他の負の症状が起こり得る前に、終了され得る。他の例では、上記リガンドは、オンターゲット／オフ腫瘍細胞（例えば、Ｂ細胞関連標的抗原を共発現する健康なＢ細胞など）を排除するための、改変された細胞を排除するために投与され得る。
【０２７５】
本明細書で示されるとおりの方法は、限定なしに、活性化された細胞、核酸またはこれをコードする発現構築物の有効量の送達を含む。薬学的組成物の「有効量」は、一般に、検出可能にかつ反復して、述べられる所望の結果を達成するために、例えば、上記疾患またはその症候を回復するか、減少するか、最小にするか、またはその程度を制限するために、十分な量として定義される。疾患の排除、根絶または治癒を含む他のより厳密な定義が、適用されることもある。いくつかの実施形態において、処置の有効性を評価するためおよび毒性をコントロールするためにバイオマーカーをモニターすることが存在してもよい。
【０２７６】
（患者に投与するための製剤および経路）
臨床適用が企図される場合、薬学的組成物（発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、トランスフェクトまたは形質導入された細胞）を、意図される用途にとって適切な形態で調製する必要があり得る。一般に、これは、発熱物質ならびにヒトまたは動物にとって有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴い得る。
【０２７７】
多量体リガンド、例えば、ＡＰ１９０３（ＩＮＮリミズシド）などは、例えば、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．２〜４ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．３〜３ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．３〜２ｍｇ／ｋｇ被験体体重または約０．３〜１ｍｇ／ｋｇ被験体体重、例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９もしくは１０ｍｇ／ｋｇ被験体体重の用量で送達され得る。いくつかの実施形態において、リガンドは、１用量あたり０．４ｍｇ／ｋｇ、例えば、５ｍｇ／ｍＬの濃度で提供される。リガンドを、例えば、バイアル１本あたり約０．２５ｍｌ〜約１０ｍｌ、例えば、約０．２５、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０ｍｌ、例えば、約２ｍｌの体積で含むバイアルまたは他の容器が提供され得る。
【０２７８】
送達ベクターを安定にするためおよび標的細胞による取り込みを可能にするために適切な塩および緩衝剤を使用することが一般に望ましい場合がある。緩衝剤は、組換え細胞が患者に導入されるときにも使用され得る。水性組成物は、薬学的に許容され得るキャリアまたは水性媒質に溶解されたまたは分散された、細胞に対して有効量のベクターを含む。そのような組成物は、接種材料とも称される。薬学的に許容され得るキャリアは、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質および作用物質の使用は、公知である。任意の従来の媒質または作用物質が、ベクターまたは細胞と不適合性である場合を除いては、治療的な組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分もまた、その組成物に組み込まれ得る。
【０２７９】
活性な組成物は、従来の医薬品を含み得る。これらの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の通常の経路を介し得る。これには、例えば、経口、経鼻、頬側、直腸、膣または局所的が含まれる。あるいは、投与は、同所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射による投与であり得る。そのような組成物は、通常、本明細書中で論じられる薬学的に許容され得る組成物として投与され得る。
【０２８０】
注射可能な使用に適した薬学的な形態としては、滅菌された水溶液または分散液、および滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時調製用の滅菌された粉末が挙げられる。すべての場合において、その形態は、滅菌されており、容易に注射できる程度に流動性である。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護される。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用すること、分散液の場合、必要とされる粒径を維持すること、および界面活性物質を使用することによって、維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。ある特定の例では、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムが、含められ得る。注射可能な組成物の持続性の吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物において使用することによってもたらされ得る。
【０２８１】
経口投与の場合、組成物は、賦形剤とともに組み込まれ得、摂取不可能なうがい薬および歯磨剤の形態で使用され得る。必要とされる量で活性成分をホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）などの適切な溶媒に組み込んでいるうがい薬が、調製され得る。あるいは、活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含む殺菌洗浄液に組み込まれ得る。活性成分は、例えば、ゲル、ペースト、粉末およびスラリーを含む、歯磨剤にも分散され得る。活性成分は、例えば、水、結合剤、研磨剤、香味料、起泡剤および湿潤剤を含み得るペースト歯磨剤に治療有効量で加えられ得る。
【０２８２】
組成物は、中性または塩の形態で製剤化され得る。薬学的に許容され得る塩としては、例えば、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸など、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸とともに形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基とともに形成される塩は、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄など、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基からも得ることができる。
【０２８３】
製剤化されると、溶液は、投与製剤（ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）に適合した様式で、および治療的に有効であるような量で、投与され得る。それらの製剤は、種々の剤形（例えば、注射可能な液剤、薬物放出カプセル剤など）で容易に投与される。例えば、水性液剤での非経口投与の場合、その液剤は、必要であれば適切に緩衝され得、最初に、液体希釈剤が、十分な食塩水またはグルコースで等張性にされ得る。これらの特定の水性液剤は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。この文脈では、滅菌された水性媒質が使用され得る。例えば、１投与量が、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、１０００ｍｌの皮下注入液に加えられ得るか、または提案される注入部位に注射され得る（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１０３５−１０３８および１５７０−１５８０頁を参照のこと）。処置されている被験体の状態に応じて、投与量のいくつかのバリエーションが必然的に生じる。いずれにしても、投与に関与する者が、個々の被験体に対する適切な用量を決定し得る。さらに、ヒトに投与する場合、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓの基準が要求するような、無菌性、発熱性ならびに一般的な安全性および純度の基準を満たし得る。
【０２８４】
治療は、ＣＡＲ−Ｔ細胞または他の治療用細胞の数を減少させ、ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化レベルを低下させ得る、ラパマイシンもしくはラパログ、またはＡＰ１９０３を投与することによってモジュレートされ得る。ＣＡＲ−Ｔ細胞治療を中止するために、安全スイッチ−キメラカスパーゼ−９ポリペプチドは、適切なリガンド：ＡＰ１９０３、ラパマイシン、またはラパログを投与することによって活性化され得る。上記リガンドの量および投与スケジュールは、必要とされるＣＡＲ−Ｔ細胞治療のレベルに基づいて決定され得る。安全スイッチとして、上記リガンドの用量は、投与された改変された細胞のうちの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％を除去するために有効な量である。他の例では、上記用量は、ＣＡＲ−Ｔ細胞治療のレベルを減少させるが、上記治療を完全には中止しない必要性がある場合、上記キメラカスパーゼポリペプチドを発現する細胞のうちの３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０、９５％、または１００％までを除去するために有効な量である。これは、例えば、安全スイッチを誘導する前に、上記リガンドを投与する前に被験体からサンプルを得、そして上記リガンドを投与した後に、投与後例えば、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、または１日、２日、３日、４日、５日でサンプルを得、そして例えば、利用可能な任意の方法（例えば、マーカーの存在を検出することを含む）によって、上記２個のサンプル間のキメラカスパーゼ発現細胞の数または濃度を比較することによって、測定され得る。
【実施例】
【０２８５】
以下で示される実施例は、ある種の実施形態を例証し、本技術を限定しない。
【０２８６】
ドナー細胞を選択的に除去するための機構を、細胞治療のための安全スイッチとして研究してきたが、合併症があった。今日までの安全スイッチ遺伝子でのいくつかの経験は、Ｔリンパ球におけるものであった。なぜならこれら細胞での免疫療法は、ウイルス感染症および悪性腫瘍の処置として有効であると判明したからである（Ｗａｌｔｅｒ，  Ｅ．Ａ．ら，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  １９９５，  ３３３：１０３８−４４；  Ｒｏｏｎｅｙ，  Ｃ．Ｍ．ら，  Ｂｌｏｏｄ．  １９９８，  ９２：１５４９−５５；  Ｄｕｄｌｅｙ，  Ｍ．Ｅ．ら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，  ２９８：８５０−５４；  Ｍａｒｊｉｔ，  Ｗ．Ａ．ら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ    ２００３，  １００：２７４２−４７）。単純ヘルペスウイルスＩ由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）遺伝子を、造血幹細胞移植後の再発性悪性腫瘍およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）リンパ増殖を処置するために、ドナーＴ細胞注入におけるインビボ自殺スイッチとして使用されてきた（Ｂｏｎｉｎｉ  Ｃら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９７，  ２７６：１７１９−１７２４；  Ｔｉｂｅｒｇｈｉｅｎ  Ｐら，  Ｂｌｏｏｄ．  ２００１，  ９７：６３−７２）。しかし、移植片対宿主病を引き起こすＴ細胞の破壊は不完全であり、ＨＳＶ−ＴＫを活性化するためのプロドラッグとしてのガンシクロビル（またはアナログ）の使用は、サイトメガロウイルス感染症のための抗ウイルス薬としてのガンシクロビルの投与を排除する。この作用機構はまた、細胞分裂に依拠してＤＮＡ合成の干渉を要し、その結果、細胞殺滅は、数日間にわたって長引かされ得、不完全であり得、臨床上の利益に長い遅れを生じ得る（Ｃｉｃｅｒｉ，  Ｆ．ら，  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００９，  ２６２：１０１９−２４）。さらに、ＨＳＶ−ＴＫ誘導免疫応答は、免疫抑制されたヒト免疫不全ウイルスおよび骨髄移植患者においてすら、ＨＳＶ−ＴＫ形質導入細胞の排除を生じ、持続性、および従ってその注入されたＴ細胞の有効性を損なった。ＨＳＶ−ＴＫはまたウイルス由来であり、従って、潜在的に免疫原性である（Ｂｏｎｉｎｉ  Ｃら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９７，  ２７６：１７１９−１７２４；  Ｒｉｄｄｅｌｌ  ＳＲら，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  １９９６，  ２：２１６−  ２３）。Ｅ  ｃｏｌｉ由来シトシンデアミナーゼ遺伝子はまた、臨床上は使用されてきた（Ｆｒｅｙｔａｇ  ＳＯら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００２，  ６２：４９６８−４９７６）が、異種抗原としてそれは免疫原性であり得、従って、長期間の持続性を要するＴ細胞ベースの治療とは不適合であり得る。トランスジェニックヒトＣＤ２０は、モノクローナルキメラ抗ＣＤ２０抗体によって活性化され得、非免疫原性安全システムとして提唱されている（Ｉｎｔｒｏｎａ  Ｍら，  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０００，  １１：  ６１１−６２０）。
【０２８７】
以下の節は、カスパーゼ−９キメラタンパク質を使用して、細胞治療のために使用される細胞において安全スイッチを提供するための方法の例を提供する。
【０２８８】
（実施例１：カスパーゼ−９自殺スイッチ発現ベクターの構築および評価）
（ベクター構築および発現の確認）
ヒトＴ細胞において安定してかつ効率的に発現され得る安全スイッチは、本明細書で示される。上記システムは、改変された遺伝子を発現する形質導入されたＴ細胞の選択的排除を引き起こすことができる小分子二量体化薬物と相互作用するように改変された潜在的に低い免疫原性を有するヒト遺伝子生成物を含む。さらに、上記誘導性カスパーゼ−９は、抗アポトーシス分子を過剰発現するＴ細胞において機能を維持する。
【０２８９】
ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６などの）に融合された改変されたヒトカスパーゼ−９活性を含む、治療剤としての使用に適した発現ベクターを構築した。このカスパーゼ−９／ＦＫ５０６ハイブリッド活性は、小分子医薬を使用して二量体化され得る。カスパーゼ−９活性の全長、短縮型、および改変されたバージョンを、リガンド結合ドメイン、または多量体化する（multimerizing）領域に融合し、蛍光マーカーＧＦＰの発現も可能にするレトロウイルスベクターＭＳＣＶ．ＩＲＥＳ．ＧＲＰへと挿入した。図１Ａは、アポトーシスの誘導のための自殺スイッチとして構築および評価される全長、短縮型および改変されたカスパーゼ−９発現ベクターを図示する。
【０２９０】
全長誘導性カスパーゼ−９分子（Ｆ’−Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９）は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーで、カスパーゼ分子の小および大サブユニットへと連結される２個、３個、またはこれより多くのＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ−例えば、ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰバリアントまたはＦＫＢＰ１２ｖ３６）を含む（図１Ａを参照のこと）。全長誘導性カスパーゼ−９（Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９．Ｉ．ＧＦＰ）は、全長カスパーゼ−９を有し、Ｆ３６Ｖ変異を含む２個の１２ｋＤａヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＨ００２  ８１８）に連結されたカスパーゼリクルートメントドメイン（ＣＡＲＤ；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００１  ２２９）をも含む（図１Ａ）。ＦＫＢＰ（Ｆ’）のうちの１種もしくは複数種のアミノ酸配列は、レトロウイルスにおいて発現される場合、相同組換えを防止するために、コドンゆらぎにした（codon-wobbled）（例えば、各アミノ酸コドンの３番目のヌクレオチドを、本来コードされたアミノ酸を維持するサイレント変異によって変化させた）。Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９Ｃ３Ｓは、その活性部位を破壊する２８７位でのシステインからセリンへの変異を含む。構築物Ｆ’Ｆ−Ｃａｓｐ９、Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９、およびＦ’−Ｃａｓｐ９において、カスパーゼ活性化ドメイン（ＣＡＲＤ）、１個のＦＫＢＰ１２、またはその両方のいずれかを、それぞれ欠失させた。全ての構築物を、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントとしてＭＳＣＶ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰへとクローニングした。
【０２９１】
２９３Ｔ細胞を、これら構築物の各々でトランスフェクトし、形質導入の４８時間後、そのマーカー遺伝子ＧＦＰの発現を、フローサイトメトリーによって分析した。さらに、トランスフェクションの２４時間後、２９３Ｔ細胞を、１００ｎＭ  ＣＩＤとともに一晩インキュベートし、その後、アポトーシスマーカーアネキシンＶで染色した。４回の別個の実験からの、二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）への曝露前および後の導入遺伝子発現レベル（平均ＧＦＰ）の平均および標準偏差ならびにアポトーシス細胞の数（ＧＦＰ〜細胞内の％アネキシンＶ）を、図１Ａ中の表の第２列〜第５列において示す。ＧＦＰ発現のレベルおよびアネキシンＶに関する染色に加えて、全長、短縮型および改変されたカスパーゼ−９の発現された遺伝子生成物をまた、カスパーゼ−９遺伝子が発現されて、その発現された生成物が予測されたサイズであったことを確認するためにウェスタンブロットによって分析した。ウェスタンブロットの結果を、図１Ｂに示す。
【０２９２】
トランスフェクトした２９３Ｔ細胞における予測されるサイズの誘導性カスパーゼ−９構築物とマーカー遺伝子ＧＦＰとの共発現を、全長および短縮型両方のカスパーゼ分子に存在するアミノ酸残基２９９〜３１８に特異的なカスパーゼ−９抗体、ならびにＧＦＰ特異的抗体を使用して、ウェスタンブロットによって実証した。ウェスタンブロットを、本明細書で示されるとおりに行った。
【０２９３】
トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、溶解緩衝液（アプロチニン、ロイペプチン、およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を０．５％で含む５０％  Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙ、１０％  ドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］、４％  β−メルカプトエタノール、１０％  グリセロール、１２％  水、４％  ブロモフェノールブルー）中で再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。３０分間遠心分離した後、上清を採取した；Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）と１：２で混合し、煮沸し、１０％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに負荷した。その膜を、ウサギ抗カスパーゼ−９（アミノ酸残基２９９〜３１８）免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ；  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ，  Ｇｏｌｄｅｎ，  ＣＯ；  １：５００希釈）でおよびマウス抗ＧＦＰ  ＩｇＧ（Ｃｏｖａｎｃｅ，  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，  ＣＡ；  １：２５，０００希釈）でプローブした。次いで、ブロットを、適切なペルオキシダーゼ結合二次抗体に曝し、タンパク質発現を、増強化学発光（ＥＣＬ；  Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ）で検出した。次いで、上記膜を小片にし、ヤギポリクローナル抗アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；  １：５００希釈）で再プローブして、負荷の品質をチェックした。
【０２９４】
さらにより小さなサイズのバンド（図１Ｂに見られる）は、分解生成物を表すようである。Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９およびＦ’Ｆ−Ｃａｓｐ９構築物の分解生成物は、これらの構築物のより低い発現レベルに起因して、それらの基底活性の結果として検出されない可能性がある。各サンプルの等しいローディングを、ウェスタンブロットの各レーンの下に示されるアクチンの実質的に等しい量によって確認したところ、タンパク質の実質的に類似の量が各レーンにおいて負荷されたことが示された。
【０２９５】
改変された細胞において発現され得るキメラポリペプチドの例は、本明細書で提供される。この例では、単一のポリペプチドが、核酸ベクターによってコードされる。誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドは、ペプチド結合のスキッピングに起因して、翻訳中にＣＡＲポリペプチドから分離される（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，  ＭＬ  ２００１，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８２：１０１３−２５）。
【０２９６】
（カスパーゼ−９自殺スイッチ発現構築物の評価）
（細胞株）
Ｂ  ９５−８  ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株（ＬＣＬ）、Ｊｕｒｋａｔ、およびＭＴ−２細胞（Ｄｒ  Ｓ．  Ｍａｒｒｉｏｔｔ（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｈｏｕｓｔｏｎ，  ＴＸ）による贈呈）を、１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ；  Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＲＰＭＩ  １６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ，  Ｌｏｇａｎ，  ＵＴ）中で培養した。ポリクローナルＥＢＶ特異的Ｔ細胞株を、４５％  ＲＰＭＩ／４５％  Ｃｌｉｃｋｓ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，  ＣＡ）／１０％  ＦＢＳ中で培養し、以前報告されたように生成した。簡潔には、末梢血単核細胞（２４ウェルプレートのウェルあたり２×１０６個）を、レスポンダー−対−刺激物質（stimulator）（Ｒ／Ｓ）比４０：１において、４０００ラドで照射した自家ＬＣＬで刺激した。９〜１２日後、生細胞を、Ｒ／Ｓ比４：１で、照射したＬＣＬで再刺激した。その後、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を、４０Ｕ／ｍＬ〜１００Ｕ／ｍＬ  組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈＩＬ−２；  Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；  Ｃｈｉｒｏｎ，  Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，  ＣＡ）の存在下で、ＬＣＬで毎週再刺激することによって拡大した。
【０２９７】
（レトロウイルス形質導入）
レトロウイルスの一過性の生成のために、２９３Ｔ細胞を、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅトランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を使用して、ｇａｇ−ｐｏｌおよびＲＤ  １１４エンベロープをコードするプラスミドとともにｉＣａｓｐ９／ｉＦａｓ構築物でトランスフェクトした。ウイルスを、トランスフェクションの４８〜７２時間後に採取し、急速凍結し、使用するまで−８０℃で貯蔵した。安定なＦＬＹＲＤ  １８由来のレトロウイルスプロデューサー株を、ＶＳＶ−Ｇ偽型一過性レトロウイルス上清での多重形質導入によって生成した。最高の導入遺伝子発現を有するＦＬＹＲＤ１８細胞を、単一細胞ソートし、最高のウイルス力価を生じたクローンを拡大し、リンパ球を形質導入するためのウイルスを生成するために使用した。このクローンの導入遺伝子発現、機能、およびレトロウイルス力価を、８週間超にわたる連続培養の間に維持した。ヒトリンパ球の形質導入のために、非組織培養処理した２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）を、組換えフィブロネクチンフラグメント（ＦＮ  ＣＨ−２９６；レトロネクチン；  Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ，  Ｏｔｓｕ，  Ｊａｐａｎ；  ＰＢＳ中４μｇ／ｍＬ、４℃で一晩）でコーティングし、３７℃において３０分間にわたって、０．５ｍＬ  レトロウイルス/ウェルで２回インキュベートした。その後、３×１０５〜５×１０５  Ｔ細胞/ウェルを、１ｍＬ  ウイルス/ウェルを使用して、１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２の存在下で４８〜７２時間にわたって形質導入した。形質導入効率を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で、共発現されたマーカー遺伝子緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現の分析によって決定した。機能研究のために、形質導入したＣＴＬを、示されるようにＭｏＦｌｏサイトメーター（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，  Ｆｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  ＣＯ）を使用して、選択しないか、または低い、中間、もしくは高いＧＦＰ発現を有する集団へと分離するかのいずれかであった。
【０２９８】
（アポトーシスの誘導および分析）
示された濃度のＣＩＤ（ＡＰ２０１８７；  ＡＲＩＡＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞または形質導入したＣＴＬへと添加した。接着細胞および非接着細胞を採取し、アネキシン結合緩衝液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）で洗浄した。細胞を、製造業者の指示（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に従って、アネキシンＶおよび７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で１５分間染色した。染色後１時間以内に、細胞を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してフローサイトメトリーによって分析した。
【０２９９】
（細胞傷害アッセイ）
各ＣＴＬ株の細胞傷害活性を、以前に示されたように、標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイにおいて評価した。標的細胞は、自家ＬＣＬ、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ−ミスマッチＬＣＬおよびリン補カイン活性化キラー細胞感受性Ｔ細胞リンパ腫株ＨＳＢ−２を含んだ。完全培地または１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）中でインキュベートした標的細胞を、それぞれ、自発的および最大５１Ｃｒ放出を決定するために使用した。三連のウェルの特異的溶解の平均パーセンテージを、１００×（実験放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）として計算した。
【０３００】
（表現型決定）
細胞表面表現型を、以下のモノクローナル抗体を使用して調査した：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＣＤ５６ならびにＴＣＲ−α／β（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，  Ｍｉａｍｉ，  ＦＬ）。ΔＮＧＦＲ−ｉＦａｓを、抗ＮＧＦＲ抗体（Ｃｈｒｏｍａｐｒｏｂｅ，  Ａｐｔｏｓ，  ＣＡ）を使用して検出した。適切なマッチしたアイソタイプコントロール（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、各実験において使用した。細胞を、ＦＡＣＳｓｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。
【０３０１】
（サイトカイン生成の分析）
ＣＴＬ培養上清中のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）の濃度を、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインサイトメトリックビーズアッセイ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して測定し、培養上清中のＩＬ−１２の濃度を、製造業者の指示に従って、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ；  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ）によって測定した。
【０３０２】
（インビボ実験）
非肥満糖尿病重症複合免疫不全症（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウス（６〜８週齢）を、照射し（２５０ラド）、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中に再懸濁された１０×１０６〜１５×１０６  ＬＣＬを右側腹部の皮下に注射した。２週間後、直径約０．５ｃｍの腫瘍を有するマウスに、非形質導入ＥＢＶ  ＣＴＬおよびｉＣａｓｐ９．Ｉ．ＧＦＰｈｉｇｈ形質導入ＥＢＶ  ＣＴＬの１：１混合物（合計１５×１０６個）を尾静脈へと注射した。ＣＴＬ注入の４〜６時間前および３日後に、マウスに、組換えｈＩＬ−２（２０００Ｕ；  Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；  Ｃｈｉｒｏｎ）を腹腔内注射した。４日目に、上記マウスを、２群に無作為に分離した：１群は、ＣＩＤ（５０μｇ  ＡＰ２０１８７、腹腔内）を受け、１群は、キャリアのみ（１６．７％  プロパンジオール、２２．５％  ＰＥＧ４００、および１．２５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、腹腔内）を受けた。７日目に、全てのマウスを殺滅した。腫瘍をホモジナイズし、抗ヒトＣＤ３（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。ＦＡＣＳ分析によって、ゲーティングしたＣＤ３＋集団内のＧＦＰ＋細胞の数を、評価した。非形質導入ＣＴＬのみ（合計１５×１０６個）を受けたマウスのコントロール群の腫瘍を、ＣＤ３＋／ＧＦＰ＋  細胞の分析において陰性コントロールとして使用した。
【０３０３】
（誘導性カスパーゼ−９の発現および機能の最適化）
カスパーゼ３、７、および９を、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞および形質導入ヒトＴ細胞の両方において、誘導性安全スイッチ分子としてのそれらの適切性についてスクリーニングした。誘導性カスパーゼ−９（ｉＣａｓｐ９）のみが、選択したＣＩＤ（例えば、二量体化の化学的誘導物質）に対する感受性を付与するために十分なレベルで発現された。最初の検査では、全長ｉＣａｓｐ９が、おそらく形質導入された細胞が導入遺伝子の基底活性によって排除されていることに起因して、Ｔ細胞において安定して高レベルで維持できないことが示された。ＣＡＲＤドメインは、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子１（Ａｐａｆ−１）とのシトクロムＣおよびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）駆動の相互作用によって、カスパーゼ−９分子の生理学的な二量体化に関与する。二量体化および自殺スイッチの活性化を誘導するためにＣＩＤを使用することが原因で、ＣＡＲＤドメインの機能は、この状況では不必要であり、ＣＡＲＤドメインの除去を、基底活性を減少するための方法として調査した。カスパーゼ−９の活性化のために、多量体化よりむしろ二量体化のみが必要とされることを考慮すると、単一のＦＫＢＰ１２ｖ３６ドメインをまた、活性化をもたらすための方法として調査した。
【０３０４】
カスパーゼ−９の得られる短縮型および／または改変された形態（例えば、ＣＡＲＤドメイン、または２個のＦＫＢＰ１２ドメインのうちの一方、または両方が除去される）の活性を比較した。破壊された活性化部位を有する構築物Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９Ｃ−＞Ｓは、非機能的コントロールを提供した（図１Ａを参照のこと）。全ての構築物を、レトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）が導入遺伝子発現を誘導し、増強ＧＦＰが内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の使用によって同じｍＲＮＡから共発現されるレトロウイルスベクターＭＳＣＶ２６  へとクローニングした。トランスフェクトした２９３Ｔ細胞において、予測されたサイズでの全ての誘導性カスパーゼ−９構築物の発現、ならびにＧＦＰの共発現は、ウェスタンブロットによって示された（図１Ｂを参照のこと）。タンパク質発現（ＧＦＰの平均蛍光によって予測し、ウェスタンブロットで可視化される）は、非機能的構築物Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９Ｃ−＞Ｓにおいて最高であり、全長構築物Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９において大きく減少した。ＣＡＲＤ（Ｆ’Ｆ−Ｃａｓｐ９）、１個のＦＫＢＰ１２（Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９）、または両方（Ｆ−Ｃａｓｐ９）の除去は、誘導性カスパーゼ−９およびＧＦＰの両方の次第により高い発現を生じ、対応してＣＩＤに対する感受性を高めた（図１Ａを参照のこと）。これらの結果に基づいて、Ｆ−Ｃａｓｐ９構築物（以降、ｉＣａｓｐ９Ｍといわれる）を、ヒトＴリンパ球におけるさらなる研究のために使用した。
【０３０５】
（ヒトＴリンパ球におけるｉＣａｓｐ９Ｍの安定な発現）
自殺遺伝子発現の長期の安定性は、最も重要である。なぜなら自殺遺伝子は、遺伝子操作された細胞が存続する限りにおいて、発現されなければならないからである。Ｔ細胞形質導入に関しては、高力価ＲＤ１１４偽型ウイルスを生成するＦＬＹＲＤ１８由来レトロウイルスプロデューサークローンを、Ｔ細胞の形質導入を促進するために生成した。ＥＢＶ特異的ＣＴＬ株（ＥＢＶ−ＣＴＬ）におけるｉＣａｓｐ９Ｍ発現を評価した。なぜならＥＢＶ特異的ＣＴＬ株は、十分に特徴付けられた機能および特異性を有し、ＥＢＶ関連悪性腫瘍の防止および処置のためのインビボ治療として既に使用されつつあるからである。７０％より高いＥＢＶ−ＣＴＬの一貫した形質導入効率（５名の異なるドナーにおいて平均７５．３％；範囲、７１．４％〜８３．０％）を、レトロウイルスでの単一の形質導入後に得た。ＥＢＶ−ＣＴＬにおけるｉＣａｓｐ９Ｍの発現は、導入遺伝子機能の選択または喪失なしに、形質導入後の少なくとも４週間にわたって安定であった。
【０３０６】
（ｉＣａｓｐ９Ｍは、形質導入したＴ細胞特性を変化させない）
ｉＣａｓｐ９Ｍの発現がＴ細胞特性を変化させないことを確実にするために、非形質導入または非機能的ｉＣａｓｐ９Ｃ−＞Ｓ形質導入ＥＢＶ−ＣＴＬの表現型、抗原特異性、増殖潜在性、および機能を、ｉＣａｓｐ９Ｍ形質導入ＥＢＶ−ＣＴＬのものと比較した。４名の別個のドナーにおいて、形質導入したおよび非形質導入ＣＴＬは、等数のＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ５６＋、およびＴＣＲα／β＋  細胞からなった。同様に、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−２を含むサイトカインの生成は、ｉＣａｓｐ９Ｍ発現によって変化しなかった。ｉＣａｓｐ９Ｍ形質導入ＥＢＶ−ＣＴＬは、非形質導入ＣＴＬおよびコントロールの形質導入したＣＴＬに匹敵する自家ＬＣＬを特異的に溶解した。ｉＣａｓｐ９Ｍの発現は、指数関数的に増殖するＣＴＬの成長特性に影響を及ぼさず、重要なことには、抗原に対する独立性および増殖のためのＩＬ−２を保った。形質導入後２１日目に、自家ＬＣＬおよびＩＬ−２での通常の毎週の抗原性の刺激は、継続したかまたは中止した。抗原刺激の中止は、Ｔ細胞の一様の下降を生じた。
【０３０７】
（インビトロでの高い導入遺伝子発現のために選択されたＴリンパ球のうちの９９％超の排除）
ＣＴＬにおいて誘導性ｉＣａｓｐ９Ｍ能力（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ）を、ＣＩＤの投与後のＧＦＰ発現細胞の喪失をモニターすることによって試験した；ＧＦＰ＋  細胞の９１．３％（範囲、５名の異なるドナーにおいて８９．５％〜９２．６％）を、単一の１０ｎＭ用量のＣＩＤ後に排除した。ＣＩＤへの曝露時間に拘わらず、同様の結果を得た（範囲、１時間継続）。全ての実験において、ＣＩＤ処置を生き残ったＣＴＬは、ＣＩＤ後のＧＦＰの平均蛍光強度において７０％（範囲、５５％〜８２％）減少とともに、低い導入遺伝子発現を有した。生存しているＧＦＰ＋Ｔ細胞のさらなる排除は、抗原刺激、続いて第２の１０ｎＭ  用量のＣＩＤによって得られなかった。従って、上記非応答ＣＴＬは、ＣＩＤによる機能的活性化に関して、不十分なｉＣａｓｐ９Ｍを発現する可能性が最も高かった。低レベルの発現とＣＩＤに対するＣＴＬ非応答との間の相関関係を調査するために、ＣＴＬを、連結したマーカー遺伝子ＧＦＰの低、中、および高発現に関してソートし、同じドナーに由来する非形質導入ＣＴＬと１：１で混合して、ＣＩＤ誘導アポトーシスに応答する形質導入したＴ細胞の数の正確な定量を可能にした。
【０３０８】
排除された形質導入したＴ細胞の数は、ＧＦＰ導入遺伝子発現のレベルとともに増大した（図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃを参照のこと）。導入遺伝子発現とｉＣａｓｐ９Ｍの機能との間の相関関係を決定するために、ｉＣａｓｐ９Ｍ  ＩＲＥＳ．ＧＦＰ形質導入ＥＢＶ−ＣＴＬを、低ＧＦＰ発現（平均２１）、中ＧＦＰ発現（平均８０）および高ＧＦＰ発現（平均１８９）について選択した。選択したＴ細胞を１０ｎＭ  ＣＩＤとともに一晩インキュベートし、その後、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤで染色した。アネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ−およびアネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ＋  Ｔ−のパーセンテージが示される。選択されたＴ細胞を、非形質導入Ｔ細胞と１：１で混合し、抗原刺激後に１０ｎＭ  ＣＩＤとともにインキュベートした。７日目の残余ＧＦＰ陽性Ｔ細胞のパーセンテージが示される。
【０３０９】
ＧＦＰｈｉｇｈ選択細胞に関しては、１０ｎＭ  ＣＩＤは、形質導入した細胞のうちの９９．１％（範囲、９８．７％〜９９．４％）の枯渇をもたらした。抗原刺激の日に、Ｆ−Ｃａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰ形質導入ＣＴＬを、処理しなかったか、または１０ｎＭ  ＣＩＤで処理したかのいずれかであった。７日後に、ＣＩＤへの応答を、ＧＦＰに関するフローサイトメトリーによって測定した。形質導入したＴ細胞のパーセンテージを５０％に調整して、ＣＩＤ処理後の残余ＧＦＰ＋  細胞の正確な測定を可能にした。選択していないＣＴＬ（上の行）およびＧＦＰｈｉｇｈ選択ＣＴＬ（下の行）におけるＣＩＤへの応答を比較した。残余ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示す。
【０３１０】
ＧＦＰｈｉｇｈ選択細胞におけるアポトーシスの迅速な誘導は、ＣＩＤ投与の１４日以内に、細胞収縮およびフラグメント化などのアポトーシス特性によって示される（参照）。１０ｎＭ  ＣＩＤとの一晩のインキュベーション後に、Ｆ−Ｃａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰｈｉｇｈ形質導入Ｔ細胞を、顕微的評価によって、細胞収縮およびフラグメント化などのアポトーシス特性を有した。高い発現について選択されたＴ細胞のうち、６４％（範囲、５９％〜６９％）はアポトーシス（アネキシン−Ｖ＋＋／７−ＡＡＤ−）表現型を有し、３０％（範囲、２６％〜３２％）は、壊死（アネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ＋）表現型を有した。アポトーシスのマーカーで染色すると、Ｔ細胞のうちの６４％がアポトーシス表現型（アネキシンＶ＋、７−ＡＡＤ−、右下象限）を有し、３２％が壊死表現型（アネキシンＶ＋、７−ＡＡＤ＋、右上象限）を有することが示された。３回の別個の実験の代表例を示す。
【０３１１】
対照的に、アポトーシスの誘導は、中間または低いＧＦＰ発現に関して選択したＴ細胞では有意に低かった（図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃを参照のこと）。従って、臨床適用のために、高コピー数、高レベルの発現、または抗コピー数および高レベルの発現の両方の選択を可能にする選択マーカーを有する発現構築物のバージョンは、望ましいものであり得る。ＣＩＤ誘導アポトーシスを、汎カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋ（ＣＩＤを添加する前に１時間にわたって１００μＭ）によって阻害した。ＣＩＤの力価は、１ｎＭ  ＣＩＤが最大欠失効果を得るために十分であることが示された。示される量のＣＩＤ（ＡＰ２０１８７）を使用する用量応答曲線は、ＣＩＤに対するＦ−Ｃａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰｈｉｇｈの感受性を示す。ＧＦＰ＋細胞の生存を、示される量のＣＩＤの投与後７日目に測定する。各点の平均および標準偏差を与える。別の二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）であるＡＰ１９０３を使用しても同様の結果を得た。上記誘導物質は、健常志願者に投与される場合、有害作用を実質的に有しないことが臨床的に示された。その用量応答は、形質導入後少なくとも４週間にわたって変化しないままであった。
【０３１２】
（ｉＣａｓｐ９Ｍは抗アポトーシス分子を発現する悪性細胞において機能する）
カスパーゼ−９を、以前に示されたｉＦａｓおよびｉＦＡＤＤよりむしろ臨床使用のために誘導性アポトーシス促進分子として選択した。なぜならカスパーゼ−９は、アポトーシスシグナル伝達において比較的遅く作用し、従って、アポトーシス阻害剤による阻害に余り感受性でないと予測されるからである。従って、自殺機能は、抗アポトーシス分子を発現する悪性の形質転換されたＴ細胞株においてのみならず、記憶細胞の長期保存を確実にするために、上記プロセスの一部として上昇した抗アポトーシス分子を発現する通常のＴ細胞の亜集団においても保存されるべきである。この仮説をさらに調査するために、ｉＣａｓｐ９ＭおよびｉＦａｓの機能を、ＥＢＶ−ＣＴＬにおいてまず比較した。任意の潜在的ベクターベースの差異を排除するために、誘導性Ｆａｓはまた、ｉＣａｓｐ９のように、ＭＳＣＶ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰベクターにおいて発現された。これらの実験のために、ΔＮＧＦＲ．ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰおよびｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰ形質導入ＣＴＬの両方を、ＧＦＰｈｉｇｈ発現についてソートし、非形質導入ＣＴＬと１：１比で混合して、等しい割合でかつ類似のレベルでｉＦａｓまたはｉＣａｓｐ９Ｍのいずれかを発現する細胞集団を得た。上記ＥＢＶ−ＣＴＬを、高いＧＦＰ発現についてソートし、示されるとおりに非形質導入ＣＴＬと１：１で混合した。ΔＮＧＦＲ＋／ＧＦＰ＋およびＧＦＰ＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。
【０３１３】
１０ｎＭ  ＣＩＤの投与後のＧＦＰ＋細胞の排除は、ｉＦａｓ形質導入ＣＴＬにおいてよりｉＣａｓｐ９Ｍにおいて、より迅速かつより効率的であった（ＣＩＤ後の７日目において、ｉＣａｓｐ９Ｍ形質導入細胞の９９．２％±０．１４％をｉＦａｓ形質導入細胞の８９．３％±４．９％と比較した；Ｐ＜０．０５）。ＬＣＬ刺激の日に、１０ｎＭ  ＣＩＤを投与し、示される時点でＧＦＰを測定して、ＣＩＤへの応答を決定した。黒菱形は、ΔＮＧＦＲ−ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰについてのデータを示し；黒四角は、ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰについてのデータを示す。３回の実験の平均および標準偏差を示す。
【０３１４】
ｃ−ＦＬＩＰおよびｂｃｌ−ｘＬ発現に起因する、ｉＣａｓｐ９ＭおよびｉＦａｓの機能もまた２種の悪性Ｔ細胞株：Ｊｕｒｋａｔ（アポトーシス感受性Ｔ細胞白血病株）およびＭＴ−２（アポトーシス耐性Ｔ細胞株）において比較した。Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＭＴ−２細胞を、類似の効率（Ｊｕｒｋａｔでは９２％  対  ８４％、ＭＴ−２では７６％  対  ７０％）で、ｉＦａｓおよびｉＣａｓｐ９Ｍで形質転換し、１０ｎＭ  ＣＩＤの存在下で８時間培養した。アネキシンＶ染色は、ｉＦａｓおよびｉＣａｓｐ９Ｍが等数のＪｕｒｋａｔ細胞においてアポトーシスを誘導した（それぞれ、５６．４％±１５．６％および５７．２％±１８．９％）が、ｉＣａｓｐ９Ｍの活性化のみがＭＴ−２細胞のアポトーシスを生じた（ｉＦａｓおよびｉＣａｓｐ９Ｍに関して、それぞれ１９．３％±８．４％および５７．９％±１１．９％）ことを示した。
【０３１５】
ヒトＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ（左）およびＭＴ−２（右）を、ΔＮＧＦＲ−ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰまたはｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰで形質導入した。Ｔ細胞の等しいパーセンテージを、自殺遺伝子の各々で形質導入した：Ｊｕｒｋａｔでは、ΔＮＧＦＲ−ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰに関して９２％  対  ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰに関して８４％、およびＭＴ−２では、ΔＮＧＦＲ−ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰに関しては７６％  対  ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰに関しては７０％。Ｔ細胞は、非処理であったかまたは１０ｎＭ  ＣＩＤとともにインキュベートしたかのいずれかであった。ＣＩＤへの曝露の８時間後、アポトーシスを、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤに関して染色することによって測定した。３回の実験の代表例を示す。ＰＥは、フィコエリトリンを示す。これら結果は、アポトーシス阻害分子を過剰発現するＴ細胞において、ｉＦａｓの機能がブロックされ得る一方で、ｉＣａｓｐ９Ｍがアポトーシスをなお効率的に誘導し得ることを示す。
【０３１６】
（免疫調節性導入遺伝子を発現するＴ細胞のｉＣａｓｐ９Ｍ媒介性排除）
ｉＣａｓｐ９Ｍが活性な導入遺伝子生成物を発現するように遺伝子改変された細胞を効率的に破壊し得るかどうかを決定するために、ＩＬ−１２を安定して発現するＥＢＶ−ＣＴＬを排除するｉＣａｓｐ９Ｍの能力を測定した。ＩＬ−１２が、非形質導入ＣＴＬおよびｉＣａｓｐ９Ｍ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ形質導入ＣＴＬの上清中で検出不能であった一方で、ｉＣａｓｐ９Ｍ．ＩＲＥＳ．ＩＬ−１２形質導入細胞の上清は、３２４ｐｇ／ｍＬ〜７６２ｐｇ／ｍＬ  ＩＬ−１２を含んだ。しかし、１０ｎＭ  ＣＩＤの投与後に、上記上清中のＩＬ−１２は、検出不能なレベルに低下した（＜７．８ｐｇ／ｍＬ）。従って、高い導入遺伝子発現細胞に関する事前のソートなしですら、ｉＣａｓｐ９Ｍの活性化は、ＩＬ−１２の生物学的に関連するレベルを生成する全てのＴ細胞を完全に排除するために十分である。ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰ構築物中のマーカー遺伝子ＧＦＰを、ヒトＩＬ−１２のｐ４０およびｐ３５サブユニットをコードするｆｌｅｘｉ  ＩＬ−１２によって置き換えた。ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰ形質導入ＥＢＶ−ＣＴＬおよびｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＩＬ−１２形質導入ＥＢＶ−ＣＴＬを、ＬＣＬで刺激し、次いで、未処置のままにするかまたは１０ｎＭ  ＣＩＤに曝露した。第２の抗原性刺激の３日後に、培養上清中のＩＬ−１２のレベルは、ＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡによって測定した（このアッセイの検出限界は、７．８ｐｇ／ｍＬである）。三連のウェルの平均および標準偏差を、示す。２名の異なるドナーのＣＴＬでの２回の実験のうちの１回の結果を示す。
【０３１７】
（インビボでの高い導入遺伝子発現について選択したＴ細胞のうちの９９％超の排除）
ｉＣａｓｐ９Ｍの機能をまた、インビボで形質導入されたＥＢＶ−ＣＴＬにおいて評価した。ＳＣＩＤマウス−ヒト異種移植モデルを、養子免疫療法のために使用した。自家ＬＣＬ異種移植片を有するＳＣＩＤマウスへの、非形質導入ＣＴＬおよびｉＣａｓｐ９Ｍ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰｈｉｇｈ形質導入ＣＴＬの１：１混合物の静脈内注入後に、マウスを、単一用量のＣＩＤまたはキャリアのみのいずれかで処置した。ＣＩＤ／キャリア投与の３日後に、腫瘍を、ヒトＣＤ３＋／ＧＦＰ＋  細胞について分析した。ヒト抗ＣＤ３抗体を使用する上記注入生成物のうちの非形質導入構成成分の検出から、ＣＩＤを受けたマウスにおける尾静脈注入の成功を確認した。ＣＩＤで処置したマウスにおいて、キャリアのみで処置した注入したマウスと比較して、ヒトＣＤ３＋／ＧＦＰ＋  Ｔ細胞の数が９９％超減少した。これは、インビボおよびインビトロで、ｉＣａｓｐ９Ｍ形質導入Ｔ細胞の等しく高い感受性を示す。
【０３１８】
インビボでのｉＣａｓｐ９Ｍの機能をアッセイした。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを照射し、１０×１０６〜１５×１０６  ＬＣＬを皮下注射した。１４日後、直径０．５ｃｍの腫瘍を有するマウスに、合計１５×１０６  ＥＢＶ−ＣＴＬを与えた（これら細胞のうちの５０％は非形質導入であり、５０％はｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰで形質導入され、高ＧＦＰ発現に関してソートした）。ＣＴＬ投与後の３日目に、マウスに、ＣＩＤ（５０μｇ  ＡＰ２０１８７；（黒菱形、ｎ＝６）またはキャリアのみ（黒四角、ｎ＝５）のいずれかを与え、６日目に、腫瘍中のヒトＣＤ３＋／ＧＦＰ＋Ｔ細胞の存在を分析した。非形質導入ＣＴＬ（１５×１０６  ＣＴＬ；ｎ＝４）のみを与えたマウスのコントロール群の腫瘍から単離したヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を、腫瘍内のＣＤ３＋／ＧＦＰ＋  Ｔ細胞の分析のための陰性コントロールとして使用した。
【０３１９】
（考察）
いくつかの実施形態において、遺伝子改変されたＴ細胞をインビボで排除するために適した自殺遺伝子を発現する発現ベクターが、本明細書で示される。本明細書で示される自殺遺伝子発現ベクターは、細胞死、低い基底活性、高比活性、および内因性抗アポトーシス分子に対する最小の感受性を惹起するために十分高いレベルでの発現である、改変している遺伝子を有する全ての細胞において安定した共発現を含む、ある種非限定的な有利な特性を有する。本明細書で示されるのは、ある種の実施形態において、誘導性カスパーゼ−９、ｉＣａｓｐ９Ｍ（これは低い基底活性を有する）であり、ヒトＴ細胞において４週間超にわたって安定な発現を可能にする。小分子の二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）の単一の１０ｎＭ  用量は、インビトロおよびインビボの両方で、高い導入遺伝子発現について選択されたｉＣａｓｐ９Ｍ形質導入細胞のうちの９９％超を殺滅するために十分である。さらに、Ｔｈ１サイトカインＩＬ−１２と共発現される場合、ｉＣａｓｐ９Ｍの活性化は、高い導入遺伝子発現に関する選択なしですら、全ての検出可能なＩＬ−１２生成細胞を排除した。カスパーゼ−９は、大部分の抗アポトーシス分子の下流で作用し、従って、ＣＩＤへの高感受性は、ｂｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシス分子の増大したレベルの存在に拘わらず保存される。従って、ｉＣａｓｐ９Ｍはまた、アポトーシスに比較的耐性である形質転換されたＴ細胞および記憶Ｔ細胞すらも破壊を誘導するために有用であると判明し得る。
【０３２０】
他のカスパーゼ分子とは異なり、タンパク質分解は、カスパーゼ−９の活性化に十分でないようである。結晶学データおよび機能データは、不活性カスパーゼ−９単量体の二量体化は、コンホメーション変化誘導活性化をもたらすことを示す。プロカスパーゼ−９の濃度は、生理学的状況において、二量体化のために必要とされる閾値を十分下回る約２０ｎＭの範囲にある。
【０３２１】
理論によって限定されることなく、二量体化へのエネルギー的障壁は、シトクロムＣおよびＡＴＰによって駆動される、Ａｐａｆ−１のＣＡＲＤドメインとカスパーゼ−９との間の同種親和性相互作用（ｈｏｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）によって克服され得ると考えられる。２個のＦＫＢＰ１２に結合されるカスパーゼ−９の過剰発現は、自発的二量体化が起こることを可能にし得、最初の全長カスパーゼ−９構築物の観察された毒性を説明し得る。毒性の減少および遺伝子発現の増大が１個のＦＫＢＰ１２の除去後に観察された、それは、自発的二量体化と関連する毒性の減少に起因する可能性が最も高い。多量体化はしばしば、表面死レセプターの活性化に関与する一方で、カスパーゼ−９の二量体化は、活性化を媒介するために十分であるはずである。本明細書で示されるデータは、単一のＦＫＢＰ１２を有するｉＣａｓｐ９構築物が、２個のＦＫＢＰ１２を有するものと同程度に効率的に機能することを示す。ＣＡＲＤドメインの除去によるＣＩＤへの増大した感受性は、ＣＩＤ結合の際に、二量体化のエネルギー的閾値の減少を表し得る。
【０３２２】
ウイルス由来または細菌由来の致死遺伝子（例えば、ＨＳＶ−ＴＫおよびシトシンデアミナーゼ）の持続性および機能は、ウイルス由来または細菌由来の致死遺伝子を発現する細胞に対する望ましくない免疫応答によって損なわれ得る。ｉＣａｓｐ９Ｍの構成成分を形成するＦＫＢＰ１２およびアポトーシス促進分子は、ヒト由来分子であり、従って、免疫応答を誘導する可能性は低い。ＦＫＢＰ１２とカスパーゼ−９との間のリンカーおよびＦＫＢＰ１２ドメイン中の単一の点変異は、新規アミノ酸配列をもたらすが、その配列は、ｉＦａｓ形質導入Ｔ細胞のマカクレシピエントによって免疫学的に認識されなかった。さらに、ｉＣａｓｐ９Ｍの構成成分はヒト由来分子であるので、接合部配列に特異的な記憶Ｔ細胞は、ウイルス由来タンパク質（例えば、ＨＳＶ−ＴＫ）とは異なり、レシピエントに存在するべきではなく、それによって、ｉＣａｓｐ９Ｍ形質導入Ｔ細胞の免疫応答媒介性排除のリスクを減少させる。
【０３２３】
誘導性ＦａｓまたはＦａｓ関連死ドメインタンパク質（ＦＡＤＤ）の死エフェクタードメイン（ＤＥＤ）を使用する以前の研究は、形質導入された細胞のうちのおよそ１０％が、破壊性遺伝子の活性化に非応答性であることを示した。ここで示される実験において観察されるように、ＣＩＤへの非応答性の考えられる説明は、導入遺伝子の低い発現である。ＣＩＤ投与後に生き残った、本発明者らの研究におけるｉＣａｓｐ９Ｍ形質導入Ｔ細胞および他者による研究におけるｉＦａｓ形質導入Ｔ細胞は、低レベルの導入遺伝子発現を有した。認められるレトロウイルス「位置効果（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔ）」を克服する試みにおいて、導入遺伝子の均質な発現の増大したレベルは、レトロウイルス組み込み体とニワトリβ−グロビンクロマチンインスレーター（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）とを隣接させることによって達成された。このクロマチンインスレーターの付加は、形質導入された２９３Ｔ細胞における発現の均質さを劇的に増大させたが、形質導入された初代Ｔ細胞において有意な効果を有しなかった。高発現レベルを有するＴ細胞の選択は、二量体化剤への応答の変動性を最小限にした。高ＧＦＰ発現に関してソートされた形質導入されたＴ細胞のうちの９９％超は、単一の１０ｎＭ  ＣＩＤ用量後に排除された。この実証は、高レベルの自殺遺伝子を発現する細胞が選択マーカーを使用して単離され得るという仮説を裏付ける。
【０３２４】
非常に少数の耐性残余細胞は、毒性の再起を引き起こし得る。２  ｌｏｇまでの欠失効率は、この可能性を有意に減少させる。臨床使用のために、非免疫原性選択マーカー（例えば、短縮型ヒトＮＧＦＲ、ＣＤ２０、またはＣＤ３４（例えば、ＧＦＰの代わりに））との共発現は、高い導入遺伝子発現Ｔ細胞の選択を可能にする。自殺スイッチ（例えば、ｉＣＡＳＰ９Ｍ）および適切な選択マーカー（例えば、短縮型ヒトＮＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３４などおよびこれらの組み合わせ）の共発現は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）または自己切断配列（例えば、２Ａ）を含む融合タンパク質の翻訳後修飾のいずれかを使用して得られ得る。対照的に、唯一の安全性の懸念が導入遺伝子媒介性毒性（例えば、人工Ｔ細胞レセプター、サイトカインなどまたはこれらの組み合わせ）である状況では、この選択工程は不必要であり得る。なぜならｉＣａｓｐ９Ｍと導入遺伝子発現との間の厳密な連鎖は、治療用導入遺伝子の生物学的に関連するレベルを発現する実質的に全ての細胞の排除を可能にするからである。これは、ｉＣａｓｐ９ＭとＩＬ−１２とを共発現することによって示された。ｉＣａｓｐ９Ｍの活性化は、任意の測定可能なＩＬ−１２生成を実質的に排除した。導入遺伝子発現の成功および「自殺スイッチ」のその後の活性化は、導入遺伝子の機能および活性に依存し得る。
【０３２５】
ＣＩＤへの非応答性の別の考えられる説明は、高レベルのアポトーシス阻害剤がＣＩＤ媒介性アポトーシスを減弱し得ることである。アポトーシス阻害剤の例としては、ｃ−ＦＬＩＰ、ｂｃｌ−２ファミリーメンバーおよびアポトーシスタンパク質の阻害剤（ＩＡＰ）が挙げられ、これらは、通常、アポトーシスと生存との間のバランスを制御する。例えば、ｃ−ＦＬＩＰおよびｂｃｌ−２のアップレギュレーションは、記憶プールを確立するように運命付けられたＴ細胞の亜集団を、コグネイト標的または抗原提示細胞に応じて活性化誘導細胞死に対して耐性にする。いくつかのＴリンパ系腫瘍では、アポトーシスと生存との間の生理学的バランスは、細胞生存の利益となるように破壊される。自殺遺伝子は、記憶細胞および悪性に形質転換された細胞を含む実質的に全ての形質導入されたＴ細胞を欠失させるはずである。従って、その選択された誘導性自殺遺伝子は、抗アポトーシス分子の増大したレベルの存在下でその活性の実質的に全てではないにしても有意な部分を保持するはずである。
【０３２６】
アポトーシスシグナル伝達経路におけるｉＦａｓ（またはｉＦＡＤＤ）の頂端位置は、このｉＦａｓ（またはｉＦＡＤＤ）をアポトーシスの阻害剤に対して特に脆弱なままにさせ得、従って、これら分子をアポトーシス安全スイッチの重要な構成成分であることに、あまりよく適さないものにし得る。カスパーゼ３または７は、終末エフェクター（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ）分子として十分に適しているようである；しかし、初代ヒトＴ細胞において機能レベルで発現され得ない。従って、カスパーゼ−９はアポトーシス経路において十分遅く機能し、ｃ−ＦＬＩＰおよび抗アポトーシスｂｃｌ−２ファミリーメンバーの阻害効果を回避するので、カスパーゼ−９を自殺遺伝子として選択した。そしてカスパーゼ−９をまた、機能レベルで安定して発現できた。アポトーシスのＸ連鎖阻害剤（ＸＩＡＰ）は、理論では、自発的カスパーゼ−９活性化を減少できたが、ＦＫＢＰ１２Ｖ３６に対するＡＰ２０１８７（またはＡＰ１９０３）の高親和性は、この非共有結合的に会合したＸＩＡＰを置き換え得る。ｉＦａｓとは対照的に、ｉＣａｓｐ９Ｍは、ｂｃｌ−ｘＬを含む抗アポトーシス分子を過剰発現する形質転換されたＴ細胞株において機能的なままであった。
【０３２７】
ヒトＴ細胞によってオンコレトロウイルスベクターからの発現に対して特異的にデザインされた誘導性安全スイッチが、本明細書で示される。ｉＣａｓｐ９Ｍは、最適な欠失効果に関する必要用量において安全であると判明した小さな、二量体化の化学的誘導物質であるＡＰ１９０３（またはアナログ）によって活性化され得、ガンシクロビルまたはリツキシマブとは異なり、インビボで他の生物学的効果を有しない。従って、養子移入のためのＴ細胞におけるこの自殺遺伝子の発現は、安全性を増大させ得、また、臨床適用の範囲を拡げ得る。
【０３２８】
（実施例２）
（半合致（Ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ）幹細胞移植後の同種枯渇Ｔ細胞（Ａｌｌｏｄｅｐｌｅｔｅｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌ）の安全性を改善するためのｉＣａｓｐ９自殺遺伝子の使用）
この例では、発現構築物を使用して、半合致幹細胞移植後に同種枯渇Ｔ細胞の安全性を改善するための発現構築物および該発現構築物を使用する方法が示される。ｉＣａｓｐ９および選択マーカー（短縮型ＣＤ１９）をコードするレトロウイルスベクターを、ドナーＴ細胞のための安全スイッチとして生成した。（抗ＣＤ２５免疫毒素を使用する）同種枯渇の後ですら、ドナーＴ細胞は、効率的に形質導入でき、増殖でき、およびその後にＣＤ１９免疫磁性選択によって＞９０％純度へと富化できた。その操作された細胞は、抗ウイルス特異性および機能性を保持し、調節性の表現型および機能を有するサブセットを含んだ。ｉＣａｓｐ９を小分子二量体化剤（small-molecule  dimerizer）で活性化すると、＞９０％アポトーシスが迅速に生じた。導入遺伝子発現は、静止しているＴ細胞においてダウンレギュレートされたが、ｉＣａｓｐ９は、活性化（同種反応性）Ｔ細胞において迅速に発現がアップレギュレートされたので、効率的な自殺遺伝子を保持した。
【０３２９】
（材料および方法）
（同種枯渇Ｔ細胞の生成）
同種枯渇細胞を、以前に示されたように、健常志願者から生成した。簡潔には、健常ドナーに由来する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、無血清培地（ＡＩＭ  Ｖ；  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）中で４０：１のレスポンダー  対  刺激物質比で、照射レシピエントエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）とともに共培養した。７２時間後、ＣＤ２５を発現する活性化Ｔ細胞は、ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ免疫毒素中での一晩のインキュベーションによる共培養物から枯渇された。同種枯渇を、残っているＣＤ３＋ＣＤ２５＋集団が＜１％であり、３Ｈ−チミジン取り込みによる残りの増殖が＜１０％であった場合に適切であるとみなした。
【０３３０】
（プラスミドおよびレトロウイルス）
ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９は、切断可能な２Ａ様配列を介して短縮型ヒトＣＤ１９へと連結された誘導性カスパーゼ−９（ｉＣａｓｐ９）からなる。ｉＣａｓｐ９は、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介してヒトカスパーゼ−９（ＣＡＳＰ９；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１２２９）へと接続された、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＨ００２  ８１８）からなる。このＦ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３へのＦＫＢＰ１２の結合親和性を増大させる。カスパーゼリクルートメントドメイン（ＣＡＲＤ）を、ヒトカスパーゼ−９配列から欠失させた。なぜならその生理学的機能は、ＦＫＢＰ１２によって置き換えられており、その除去は、導入遺伝子の発現および機能を増大させるからである。この２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の２０アミノ酸のペプチドをコードし、このペプチドは、グリシンと末端プロリン残基との間で＞９９％切断を媒介し、ｉＣａｓｐ９のＣ末端において１９個の余分なアミノ酸およびＣＤ１９のＮ末端において１個の余分なプロリン残基を生じる。ＣＤ１９は、アミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）で短縮された全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７７０）からなり、これは、細胞質内ドメインを２４２から１９アミノ酸に短縮し、リン酸化の潜在的部位である全ての保存されたチロシン残基を除去する。
【０３３１】
テナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ−Ｖ）偽型レトロウイルスを生成する安定なＰＧ１３クローンを、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ製品＃ＳＤ３４４４；  ＡＴＣＣ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）をＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９で一過性にトランスフェクトすることによって作製した。これは、Ｅｃｏ偽型レトロウイルスを生成した。ＰＧ１３パッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）を、Ｅｃｏ偽型もしくはレトロウイルスで３回形質導入して、１細胞あたり複数のＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９プロウイルス組み込み体を含むプロデューサー株を生成した。単一細胞クローニングを行い、最高力価を生じたＰＧ１３クローンを増殖させ、ベクター生成のために使用した。
【０３３２】
（レトロウイルス形質導入）
Ｔ細胞活性化および増殖のための培養培地は、４５％  ＲＰＭＩ  １６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ，  Ｌｏｇａｎ，  ＵＴ）、４５％  クリック（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，  ＣＡ）および１０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；  Ｈｙｃｌｏｎｅ）からなった。同種枯渇細胞を、固定化抗ＣＤ３（ＯＫＴ３；  Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，  ＮＪ）によって４８時間にわたって活性化し、その後、レトロウイルスベクター選択的同種枯渇での形質導入を、ドナーＰＢＭＣとレシピエントＥＢＶ−ＬＣＬとを共培養することによって行って、同種反応性細胞を活性化した：活性化した細胞は、ＣＤ２５を発現し、その後、抗ＣＤ２５免疫毒素によって排除した。この同種枯渇細胞を、ＯＫＴ３によって活性化し、レトロウイルスベクターで４８時間後に形質導入した。免疫磁性選択を、形質導入の４日目に行った；陽性画分を、さらに４日間増殖させ、凍結保存した。
【０３３３】
小規模実験では、非組織培養処理２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）を、ＯＫＴ３  １ｇ／ｍｌで２〜４時間、３７℃においてコーティングした。同種枯渇細胞を、１×１０６  細胞／ウェルで添加した。２４時間において、１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；  Ｃｈｉｒｏｎ，  Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，  ＣＡ）を添加した。レトロウイルス形質導入を、活性化の４８時間後に行った。非組織培養処理２４ウェルプレートを、３．５ｇ／ｃｍ２  組換えフィブロネクチンフラグメント（ＣＨ−２９６；  Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ；  Ｔａｋａｒａ  Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）でコーティングし、そのウェルに、０．５ｍｌ／ウェルのレトロウイルスベクター含有上清を、３０分間、３７℃において２回負荷した。その後、ＯＫＴ３活性化細胞を、３：１の比の新鮮なレトロウイルスベクター含有上清およびＴ細胞培養培地（１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を補充）中に、５×１０５  細胞／ウェル蒔いた。細胞を２〜３日後に採取し、５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下で増殖させた。
【０３３４】
（遺伝子改変同種枯渇細胞のスケールアップ生成）
臨床適用のための形質導入プロセスのスケールアップは、非組織培養処理Ｔ７５フラスコ（Ｎｕｎｃ，  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，  ＮＹ）を使用し、これを、一晩４℃において、１０ｍｌのＯＫＴ３  １μｇ／ｍｌまたは１０ｍｌのフィブロネクチン  ７μｇ／ｍｌでコーティングした。増大した細胞接着のためのコロナ放電処理したフッ化エチレンプロピレンバッグ（２ＰＦ−００７２ＡＣ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）も使用した。同種枯渇細胞を、１×１０６  細胞／ｍｌで、ＯＫＴ３でコーティングしたフラスコの中に播種した。１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を翌日添加した。レトロウイルス形質導入のために、レトロネクチンでコーティングしたフラスコまたはバッグに、１０ｍｌのレトロウイルス含有上清を２〜３時間にわたって１回負荷した。ＯＫＴ３活性化Ｔ細胞を、３：１の比の新鮮なレトロウイルスベクター含有培地およびＴ細胞培養培地（１００  Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を補充）の中で、１×１０６  細胞／ｍｌで播種した。翌朝に細胞を採取し、約５×１０５  細胞／ｍｌ〜８×１０５  細胞／ｍｌの播種密度で、組織培養処理Ｔ７５またはＴ１７５フラスコ中の、ＩＬ−２  約５０〜１００Ｕ／ｍｌを補充した培養培地中で増殖させた。
【０３３５】
（ＣＤ１９免疫磁性選択）
ＣＤ１９に関する免疫磁性選択を、形質導入の４日後に行った。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体に結合体化した常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ａｕｂｕｒｎ，  ＣＡ）で標識し、小規模実験ではＭＳもしくはＬＳカラム上で、および大規模実験ではＣｌｉｎｉＭａｃｓ  Ｐｌｕｓ自動化選択デバイスで選択した。ＣＤ１９選択細胞を、さらに４日間増殖させ、形質導入後の８日目に凍結保存した。それらの細胞を、「遺伝子改変同種枯渇細胞」と呼んだ。
【０３３６】
（免疫表現型決定およびペンタマー分析）
フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア；  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、以下の抗体を使用して行った：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６およびＣＤ６２Ｌ。ＣＤ１９−ＰＥ（Ｃｌｏｎｅ  ４Ｇ７；  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）は、最適な染色を与えることが見出されたので、その後の全ての実験において使用した。非形質導入コントロールを使用して、ＣＤ１９に関する陰性ゲートを設定した。ＨＬＡ−ペンタマー、ＨＬＡ−Ｂ８−ＲＡＫＦＫＱＬＬ（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ，  Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，  ＶＡ）を使用して、ＥＢＶ溶解抗原（ＢＺＬＦ１）のエピトープを認識するＴ細胞を検出した。ＨＬＡ−Ａ２−ＮＬＶＰＭＶＡＴＶペンタマーを使用して、ＣＭＶ−ｐｐ６５抗原のエピトープを認識するＴ細胞を検出した。
【０３３７】
（抗ウイルス応答に関するインターフェロン−ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ）
ＥＢＶ、ＣＭＶおよびアデノウイルス抗原への応答の評価に関するインターフェロン−ＥＬＩＳｐｏｔを、公知の方法を使用して行った。形質導入後８日間の低温貯蔵した遺伝子改変された同種枯渇させた細胞を解凍し、レスポンダー細胞として使用する前に、ＩＬ−２なしの完全培地中で一晩静置した。同じドナーに由来する低温貯蔵したＰＢＭＣを、比較物質（comparator）として使用した。レスポンダー細胞を、１ウェルあたり２×１０５、１×１０５、５×１０４および２．５×１０４  細胞の連続希釈物として二連または三連でプレーティングした。刺激物質細胞を、１×１０５/ウェルでプレーティングした。ＥＢＶへの応答に関しては、４０Ｇｙで照射したドナー由来ＥＢＶ−ＬＣＬを、刺激物質として使用した。アデノウイルスへの応答に関しては、Ａｄ５ｆ３５アデノウイルスに感染させたドナー由来活性化単球を使用した。
【０３３８】
簡潔には、ドナーＰＢＭＣを、２４ウェルプレートにおいて一晩、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５（Ｃａｍｂｒｅｘ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）中にプレーティングし、翌朝採取し、Ａｄ５ｆ３５を多重感染度（ＭＯＩ）２００で２時間感染させ、洗浄し、３０Ｇｙで照射し、刺激物質として使用した。抗ＣＭＶ応答に関しては、ＭＯＩ  ５０００でＣＭＶ  ｐｐ６５導入遺伝子をコードするＡｄ５ｆ３５アデノウイルス（Ａｄ５ｆ３５−ｐｐ６５）を使用する類似のプロセスを使用した。特異的スポット形成単位（ＳＦＵ）を、試験ウェルのレスポンダーのみおよび刺激物質のみのウェルからＳＦＵを差し引くことによって計算した。ＣＭＶへの応答は、Ａｄ５ｆ３５−ｐｐ６５ウェルとＡｄ５ｆ３５ウェルとの間でのＳＦＵの差異であった。
【０３３９】
（ＥＢＶ特異的細胞傷害）
遺伝子改変された同種枯渇した細胞を、レスポンダー：刺激物質比  ４０：１において、４０Ｇｙ照射ドナー由来ＥＢＶ−ＬＣＬで刺激した。９日後、その培養物を、レスポンダー：刺激物質比  ４：１において再刺激した。再刺激を、示されるとおり毎週行った。２ラウンドまたは３ラウンドの刺激後に、細胞傷害を、標的細胞としてドナーＥＢＶ−ＬＣＬを、および自家コントロールとしてドナーＯＫＴ３芽細胞（ｂｌａｓｔ）を使用して、４時間５１Ｃｒ−放出アッセイにおいて測定した。ＮＫ活性を、３０倍過剰の非放射能のＫ５６２細胞を添加することによって阻害した。
【０３４０】
（二量体化の化学的誘導物質、ＡＰ２０１８７でのアポトーシスの誘導）
自殺遺伝子機能性を、小分子合成ホモ二量体化剤、ＡＰ２０１８７（Ａｒｉａｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）をＣＤ１９免疫磁性選択の翌日に１０ｎＭ  終濃度で添加することによって評価した。細胞を、２４時間においてアネキシンＶおよび７−アミノアクチノマイシン（７−ＡＡＤ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。アネキシンＶおよび７−ＡＡＤの両方に関して陰性の細胞を、生存しているとみなし、アネキシンＶ陽性の細胞をアポトーシスとみなし、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤの両方が陽性の細胞を壊死とみなした。二量体化によって誘導される殺滅率を、以下のとおり、基底生存率に関して較正した：殺滅率＝１００％−（ＡＰ２０１８７処理細胞の％生存率÷非処理細胞の％生存率）。
【０３４１】
（長期培養および再活性化後の導入遺伝子発現の評価）
細胞を、形質導入の２２日後まで、５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を含むＴ細胞培地中で維持した。細胞の一部を、１ｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３および１μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ２８（Ｃｌｏｎｅ  ＣＤ２８．２，  ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）で４８〜７２時間コーティングした２４ウェルプレート上で再活性化した。再活性化細胞および非再活性化細胞の両方でのＣＤ１９発現および自殺遺伝子機能を、形質導入後の２４日目または２５日目に測定した。
【０３４２】
いくつかの実験では、細胞をまた、形質導入後３週間培養し、１：１のレスポンダー：刺激物質比において、３０Ｇ照射同種異系ＰＢＭＣで刺激した。共培養の４日後、細胞の一部を、１０ｎＭ  ＡＰ２０１８７で処理した。殺滅を、２４時間においてアネキシンＶ／７−ＡＡＤ染色によって測定し、バイスタンダーウイルス特異的Ｔ細胞に対する二量体化剤の効果を、ＡＰ２０１８７処理細胞および未処理細胞に対するペンタマー分析によって評価した。
【０３４３】
（制御Ｔ細胞）
ＣＤ４、ＣＤ２５およびＦｏｘｐ３の発現を、フローサイトメトリーを使用して、遺伝子改変された同種枯渇された細胞において分析した。ヒトＦｏｘｐ３染色に関して、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）染色セットを、適切なラットＩｇＧ２ａアイソタイプコントロールとともに使用した。これら細胞を、表面ＣＤ２５−ＦＩＴＣおよびＣＤ４−ＰＥで共染色した。機能分析を、同種枯渇および遺伝子改変後に選択されたＣＤ４＋２５＋細胞と、カルボキシフルオレセインジアセテートＮ−スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識自家ＰＢＭＣとを共培養することによって行った。ＣＤ４＋２５＋選択を、抗ＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ａｕｂｕｒｎ，  ＣＡ）を使用してＣＤ８＋細胞をまず枯渇させ、続いて、抗ＣＤ２５マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ａｕｂｕｒｎ，  ＣＡ）を使用して陽性選択を行った。ＣＦＳＥ標識を、１．５μＭ  ＣＦＳＥを含むリン酸緩衝食塩水中２×１０７／ｍｌの自家ＰＢＭＣを１０分間インキュベートすることによって行った。上記反応を、等容積のＦＢＳを添加し、１０分間、３７℃でインキュベートすることによって停止した。細胞を、使用前に２回洗浄した。ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを、ＯＫＴ３  ５００ｎｇ／ｍｌおよび４０Ｇ照射同種ＰＢＭＣフィーダーで、ＰＢＭＣ：同種フィーダー比  ５：１において刺激した。次いで、細胞を、等数の自家ＣＤ４＋２５＋遺伝子改変された同種枯渇された細胞ありまたはなしで培養した。培養の５日後に、細胞分裂を、フローサイトメトリーによって分析した；ＣＤ１９を使用して、非ＣＦＳＥ標識のＣＤ４＋ＣＤ２５＋  遺伝子改変されたＴ細胞をゲートアウトした。
【０３４４】
（統計分析）
対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して、サンプル間の統計的有意差を決定した。全てのデータを、平均±１標準偏差として表す。
【０３４５】
（結果）
選択的に同種枯渇したＴ細胞を、ｉＣａｓｐ９で効率的に形質導入し、拡大し得る。
選択的同種枯渇を、臨床プロトコル手順に従って行った。簡潔には、３／６〜５／６のＨＬＡミスマッチＰＢＭＣおよびリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）を共培養した。ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ免疫毒素を、７２時間の共培養後に適用し、＜１０％  残余増殖（平均４．５±２．８％；範囲０．７４〜９．１％；１０回の実験）を有し、＜１％  残余ＣＤ３＋ＣＤ２５＋細胞（平均０．２３±０．２０％；範囲０．０６〜０．７３％；１０回の実験）を含む同種枯渇細胞を確実に生成した。それによって、選択的同種枯渇のための放出基準を満たしかつその後の操作のための出発材料として働いた。
【０３４６】
固定化ＯＫＴ３上で４８時間にわたって活性化した同種枯渇された細胞は、ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９をコードするＧａｌ−Ｖ偽型レトロウイルスベクターで効率的に形質導入できた。形質導入の２〜４日後にＣＤ１９発現に関してＦＡＣＳ分析によって評価した形質導入効率は、約５３％±８％であり、小規模（２４ウェルプレート）および大規模（Ｔ７５フラスコ）での形質導入についての結果（それぞれ、６回および４回の実験において約５５±８％  対  約５０％±１０％）と匹敵していた。細胞数は、ＯＫＴ３活性化後の最初の２日間において縮小し、その結果、同種枯渇された細胞のうちのわずか約６１％±１２％（約４５％〜８０％の範囲）が、形質導入の日に回収された（図９を参照のこと）。同種枯渇された細胞が形質導入後に成功裡に拡大し得るかどうかを決定するために行った実験のグラフ結果を図９に図示する。黒菱形は、フラスコおよびバッグの中で行った大規模実験を示す。白丸は、２４ウェルプレートの中で行った小規模実験を示す。その後、上記細胞は、その後の８日間にわたって約９４±４６倍の範囲（約４０〜約１５３の範囲）の平均拡大で有意な拡大を示し、正味５８±３３倍の拡大を生じた。細胞拡大は、小規模および大規模実験の両方において、５回の小規模実験において正味の拡大約４５±２９倍（約２５〜約９０の範囲）および３回の大規模実験において約７９±３４倍（約５０〜約１１６の範囲）と類似していた。
【０３４７】
（ΔＣＤ１９は、免疫磁性カラム上で、形質導入された細胞の効率的かつ選択的富化を可能にする）
自殺遺伝子活性化の効率は、ときおり、自殺遺伝子自体の機能性に依存し、ときおり、遺伝子改変された細胞を富化するために使用される選択システムに依存する。選択マーカーとしてのＣＤ１９の使用を、ＣＤ１９選択が十分な純度および収量で遺伝子改変された細胞の選択を可能にするかどうか、および選択がその後の細胞成長に対して任意の有害作用を有するかどうかを決定するために調査した。小規模選択を、製造業者の指示に従って行った；しかし、大規模選択は、１０リットルのＣＤ１９マイクロビーズを１．３×１０７  細胞につき使用する場合に最適であることが判明した。ＦＡＣＳ分析を、免疫磁性選択の２４時間後に行って、抗ＣＤ１９マイクロビーズからの干渉を最小にした。免疫磁性選択後の細胞の純度は、一貫して９０％より高かった：ＣＤ１９＋  細胞の平均パーセンテージは、小規模選択で約９８．３％±０．５％（ｎ＝５）の範囲にあり、大規模ＣｌｉｎｉＭａｃｓ選択で約９７．４％±０．９％（ｎ＝３）の範囲にあった。
【０３４８】
小規模および大規模での選択の絶対収量は、形質導入効率の較正後に；それぞれ、約３１％±１１％および約２８％±６％であった。形質導入された細胞の平均回収率は、小規模選択で約５４％±１４％および大規模選択で約７２％±１８％であった。選択プロセスは、その後の細胞拡大に対して何ら識別可能な有害作用を有しなかった。４回の実験においで、ＣＤ１９免疫磁性選択後３日間にわたる平均細胞拡大は、ＣＤ１９陽性画分に関して約３．５倍  対  選択されていない形質導入された細胞に関して約４．１倍（ｐ＝０．３４）および非形質導入細胞に関して約３．７倍（ｐ＝０．７５）であった。
【０３４９】
（遺伝子改変された同種枯渇された細胞の免疫表現型）
最終細胞生成物（形質導入の８日後に低温貯蔵された、遺伝子改変された同種枯渇された細胞）を、免疫表現型決定したところ、ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞の両方を含むことが見出され、以下の表で示されるとおり、６２％±１１％  ＣＤ８＋  対  ２３％±８％  ＣＤ４＋でＣＤ８細胞が優勢であった。ＮＳ＝有意でない、ＳＤ＝標準偏差。
【０３５０】
【表１】
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【０３５１】
細胞の大部分は、ＣＤ４５ＲＯ＋であり、エフェクター記憶Ｔ細胞の表面免疫表現型を有した。記憶マーカー（ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７およびＣＤ２８を含む）の発現は、不均一であった。細胞のうちのおよそ２４％は、ＣＤ６２Ｌ（中枢記憶細胞上で主に発現されるリンパ節ホーミング分子）を発現した。
【０３５２】
（遺伝子改変された同種枯渇された細胞は、抗ウイルスレパートリーおよび機能を保持した）
最終生成物の細胞が抗ウイルス免疫を媒介する能力を、インターフェロン−ＥＬＩＳｐｏｔ、細胞傷害アッセイ、およびペンタマー分析によって評価した。低温貯蔵された遺伝子改変された同種枯渇された細胞を、全ての分析において使用した。なぜならそれらは、臨床試験における使用のために現在評価されている生成物の代表であったからである。ドナー細胞によって提示されるアデノウイルス抗原、ＣＭＶ抗原またはＥＢＶ抗原に応答したインターフェロン−γ分泌は保存されたが、非操作ＰＢＭＣに対して遺伝子改変された同種枯渇された細胞において抗ＥＢＶ応答は低下する傾向にあった。ウイルス抗原に対する応答は、４対の非操作ＰＢＭＣおよび遺伝子改変された同種枯渇された細胞（ＧＭＡＣ）においてＥＬＩＳｐｏｔによって評価した。アデノウイルス抗原およびＣＭＶ抗原は、それぞれ、Ａｄ５ｆ３５ヌルベクターおよびＡｄ５ｆ３５−ｐｐ６５ベクターでの感染を通じて、ドナー由来活性化単球によって提示された。ＥＢＶ抗原は、ドナーＥＢＶ−ＬＣＬによって提示された。スポット形成単位（ＳＦＵ）の数字を、刺激物質のみのウェルおよびレスポンダーのみのウェルに対して較正した。４名のドナーのうちの３名のみが、ＣＭＶ応答について評価可能であり、１名のセロネガティブドナーを除外した。
【０３５３】
細胞傷害を、ドナー由来ＥＢＶ−ＬＣＬを標的として使用して評価した。ドナー由来ＥＢＶ−ＬＣＬで２ラウンドまたは３ラウンドの刺激を受けた、遺伝子改変された同種枯渇された細胞は、ウイルス感染した自家標的細胞を効率的に溶解できた。遺伝子改変された同種枯渇された細胞を、ドナーＥＢＶ−ＬＣＬで２サイクルまたは３サイクルにわたって刺激した。５１Ｃｒ放出アッセイを、ドナー由来ＥＢＶ−ＬＣＬおよびドナーＯＫＴ３芽細胞を標的として使用して行った。ＮＫ活性を、３０倍過剰の非放射能Ｋ５６２でブロックした。左パネルは、全体的にまたは部分的にミスマッチのドナー−レシピエント対を使用する５回の独立した実験からの結果を示す。右のパネルは、血縁のないＨＬＡハプロタイプ一致ドナー−レシピエント対を使用する３回の実験からの結果を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。
【０３５４】
ＥＢＶ−ＬＣＬを、選択的同種枯渇の間の抗原提示細胞として使用した。従って、ドナーおよびレシピエントがハプロタイプ一致である場合に、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞が有意に枯渇され得ることは可能であった。この仮説を調査するために、血縁のないＨＬＡハプロタイプ一致のドナー−レシピエント対を使用する３回の実験が含められ、その結果は、ドナー由来ＥＢＶ−ＬＣＬに対する細胞傷害性が保持されることを示した。その結果は、ＨＬＡ−Ｂ８陰性ハプロタイプ一致レシピエントに対する同種枯渇後の２名の有益なドナーにおいて、ＨＬＡ−Ｂ８−ＲＡＫＦＫＱＬＬ（ＥＢＶ溶解抗原（ＢＺＬＦ１）エピトープ）を認識するＴ細胞に関するペンタマー分析によって実証された。非操作ＰＢＭＣを、比較物質として使用した。このＲＡＫ−ペンタマー陽性集団は、遺伝子改変された同種枯渇された細胞において保持され、ドナー由来ＥＢＶ−ＬＣＬでの数ラウンドのインビトロ刺激後に拡大できた。まとめると、これら結果は、遺伝子改変された同種枯渇された細胞が有意な抗ウイルス機能性を保持したことを示す。
【０３５５】
（遺伝子改変された同種枯渇された細胞集団における制御Ｔ細胞）
フローサイトメトリーおよび機能分析を使用して、制御性Ｔ細胞が、本発明者らの同種枯渇された、遺伝子改変されたＴ細胞生成物において保持されるかどうかを決定した。Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋２５＋集団を見出した。免疫磁性分離後に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋富化された画分は、ＣＦＳＥ標識自家ＰＢＭＣとともにＯＫＴ３および同種フィーダーの存在下で共培養した場合に、サプレッサー機能を示した。１２Ｂ）。ドナー由来ＰＢＭＣをＣＦＳＥで標識し、ＯＫＴ３および同種フィーダーで刺激した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を、遺伝子改変された細胞集団から免疫磁性選択し、１：１比で試験ウェルに添加した。フローサイトメトリーを５日後に行った。遺伝子改変されたＴ細胞を、ＣＤ１９発現によってゲートアウトした。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋遺伝子改変された細胞の添加（下のパネル）は、細胞増殖を有意に減少させた。従って、同種枯渇されたＴ細胞は、ＣＤ２５枯渇免疫毒素への曝露後にすら、制御性の表現型を再獲得し得る。
【０３５６】
（遺伝子改変された同種枯渇された細胞は、二量体化の化学的誘導物質の添加によって効率的にかつ迅速に排除された）
免疫磁性選択の翌日に、１０ｎＭの二量体化の化学的誘導物質であるＡＰ２０１８７を添加して、アポトーシスを誘導した。アポトーシスは、２４時間以内に出現した。２４時間においてアネキシンＶおよび７−ＡＡＤ染色によるＦＡＣＳ分析は、ＡＰ２０１８７処理細胞のうちの約５．５％±２．５％のみが生存可能なままであるのに対して、非処理細胞のうちの約８１．０％±９．０％が生存可能であることを示した（以下を参照のこと：ベースラインの生存率に対する較正後の殺滅効率は、約９２．９％±３．８％であった。大規模ＣＤ１９選択は、小規模選択と類似の効率で殺滅された細胞を生じた：大規模および小規模において、ＡＰ２０１８７ありおよびなしの平均生存率、ならびにパーセンテージ殺滅は、それぞれ、約３．９％、約８４．０％、約９５．４％（ｎ＝３）ならびに約６．６％、約７９．３％、約９１．４％（ｎ＝５）であった。ＡＰ２０１８７は、非形質導入細胞に対して非毒性であった：ＡＰ２０１８７ありおよびなしでの生存率は、それぞれ、約８６％±９％および８７％±８％（ｎ＝６）であった。
【０３５７】
（導入遺伝子発現および機能は、長期の培養とともに減少したが、細胞再活性化の際に回復した）
導入遺伝子発現および機能の安定性を評価するために、細胞を、形質導入後２４日まで、Ｔ細胞培養培地および低用量ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）中で維持した。次いで、細胞の一部を、ＯＫＴ３／抗ＣＤ２８で再活性化した。ＣＤ１９発現を、４８〜７２時間後にフローサイトメトリーによって分析し、自殺遺伝子機能を、１０ｎＭ  ＡＰ２０１８７での処理によって評価した。４８〜７２時間の活性化ありまたはなし（５回の実験）で、形質導入後５日目（すなわち、ＣＤ１９選択の１日後）および形質導入後２４日目の細胞を得る。２回の実験では、ＣＤ２５選択を、ＯＫＴ３／ａＣＤ２８活性化後に行って、活性化した細胞をさらに富化した。エラーバーは、標準偏差を表す。＊は、形質導入後５日目の細胞と比較した場合に、ｐ＜０．０５を示す。２４日目までに、表面ＣＤ１９発現は、７９３±１２８から４７８±１０７への平均蛍光強度（ＭＦＩ）の並行した低下（ｐ＜０．０５）とともに、約９８％±１％から約８８％±４％へと低下した（ｐ＜０．０５）（図１３Ｂを参照のこと）。同様に、自殺遺伝子機能は有意に減少した：残余生存率は、ＡＰ２０１８７での処理後に１９．６±５．６％であった；ベースラインの生存率５４．８±２０．９％に対する較正後に、これは、わずか６３．１±６．２％という殺滅効率に等しかった。
【０３５８】
導入遺伝子発現における経時的減少がＴ細胞静止後の低下した転写にまたは形質導入した細胞の排除に起因したかどうかを決定するために、細胞の一部を、ＯＫＴ３および抗ＣＤ２８抗体での形質導入後２２日目に再活性化した。４８〜７２時間で（形質導入後２４日目または２５日目）において、ＯＫＴ３／ａＣＤ２８再活性化した細胞は、非再活性化細胞より有意に高い導入遺伝子発現を有した。ＣＤ１９発現は、約８８％±４％から約９３％±４％へと増大し（ｐ＜０．０１）、ＣＤ１９  ＭＦＩは、４７８±１０７から６４３±１７４へと増大した（ｐ＜０．０１）。さらに、自殺遺伝子機能はまた、約６３．１％±６．２％殺滅効率から約８４．６％±８．０％（ｐ＜０．０１）殺滅効率へと有意に増大した。さらに、殺滅効率は、細胞が活性化マーカーＣＤ２５に関して免疫磁性的にソートされた場合に完全に回復した：ＣＤ２５陽性細胞の殺滅効率は、約９３．２％±１．２％，であった。これは、形質導入後５日目の殺滅効率（９３．１±３．５％）と同じであった。ＣＤ２５陰性画分の殺滅は、７８．６±９．１％であった。
【０３５９】
注意すべき観察は、二量体化剤が、非特異的マイトジェン刺激によるよりむしろ、同種ＰＢＭＣで再活性化された遺伝子改変された細胞を枯渇させるために使用された場合、多くのウイルス特異的Ｔ細胞が残された（ｓｐａｒｅ）ことであった。同種細胞での４日間の再活性化後に、図１４Ａおよび１４Ｂに示されるように、ＡＰ２０１８７での処理は、ＥＢＶおよびＣＭＶに由来するペプチドに対して特異的なＨＬＡペンタマーと反応性のＴ細胞の割合によって測定される場合、ウイルス反応性亜集団を残す（およびそれによって富化する）。遺伝子改変された同種枯渇された細胞を、形質導入後３週間にわたって培養物中で維持して、導入遺伝子ダウンモジュレーションを可能にした。細胞を、同種ＰＢＭＣで４日間刺激し、その後、一部を１０ｎＭ  ＡＰ２０１８７で処理した。ＥＢＶ特異的Ｔ細胞およびＣＭＶ特異的Ｔ細胞の頻度は、同種刺激前に、同種刺激後に、および二量体化剤での同種刺激細胞の処理後に、ペンタマー分析によって定量した。ウイルス特異的Ｔ細胞のパーセンテージは、同種刺激後に減少した。二量体化剤での処理後に、ウイルス特異的Ｔ細胞は、部分的におよび優先的に保持された。
【０３６０】
（考察）
同種Ｔ細胞を２種の別個の安全機構、選択的同種枯渇および自殺遺伝子改変で操作するという実施可能性は、本明細書で示されてきた。組み合わせると、これら改変は、ハプロタイプ一致移植後ですら、抗ウイルス活性および抗腫瘍活性を有する実質的な数のＴ細胞の追加戻しを高め得るおよび／または可能にし得る。本明細書で示されるデータは、自殺遺伝子ｉＣａｓｐ９が効率的に機能すること（二量体化剤での処置後に＞９０％  アポトーシス）および同種反応性Ｔ細胞がそれらの標的と遭遇した場合に起こるように、経時的に起こる導入遺伝子発現のダウンモジュレーションがＴ細胞活性化の際に迅速に逆にされたことを示す。本明細書で示されるデータはまた、ＣＤ１９が、形質導入された細胞の＞９０％  純度への効率的かつ選択的富化を可能にした適切な選択マーカーであることを示す。さらに、本明細書で示されるデータは、これら操作が、抗ウイルス活性の保持を伴うその操作されたＴ細胞の免疫学的能力に対する認識できる効果、およびＴｒｅｇ活性を有するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋集団の再生を有しなかったことを示す。
【０３６１】
自殺遺伝子の全体的な機能性が、自殺遺伝子自体および形質導入された細胞を選択するために使用されるマーカーの両方に依存するならば、臨床的使用への変換は、両方の構成成分の最適化、および２種の遺伝子の発現を結びつけるために使用される方法の最適化を必要とする。この２種の最も広く（現在では臨床診療において）使用される選択マーカーは、各々欠点を有する。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）は、潜在的に免疫原性の外来タンパク質をコードし、選択培地中での７日間の培養を要し、これは、系の複雑さを増大させるのみならず、ウイルス特異的Ｔ細胞に対して潜在的に損傷をも与える。広く使用される表面選択マーカーＬＮＧＦＲは、その明らかな臨床的安全性にもかかわらず、マウスモデルでは、その腫瘍形成潜在能および白血病との潜在的な相関性に関して近年懸念が高まっている。さらに、ＬＮＧＦＲ選択は、広く利用可能ではない。なぜならそれは、遺伝子治療においてほぼ独占的に使用されるからである。多くの代替の選択マーカーが示唆されている。ＣＤ３４は、インビトロで十分に研究されているが、希な造血前駆体の選択のために主に構成された系を最適化するために必要とされる工程、およびより重大なことには、変化したインビボでのＴ細胞ホーミングの潜在性は、ＣＤ３４を、自殺スイッチ発現構築物に関する選択マーカーとしての使用に対して最適以下にする。ＣＤ１９は、代替の選択マーカーとして選択された。なぜなら臨床グレードのＣＤ１９選択は、幹細胞自己移植のＢ細胞枯渇のための方法として容易に利用可能であるからである。本明細書で示される結果は、ＣＤ１９富化が高純度かつ高収量で行われ得、さらに、選択プロセスがその後の細胞成長および機能性に対して認識できる効果を有しないことを示した。
【０３６２】
ＣＤ１９選択ｉＣａｓｐ９細胞における自殺遺伝子活性化の有効性は、ＨＳＶｔｋ遺伝子を発現するように形質導入したｎｅｏ選択細胞またはＬＮＧＦＲ選択細胞の活性化に対して非常に都合良く比較した。ＨＳＶｔｋ構築物のより前の世代は、３Ｈ−チミジン取り込みの８０〜９０％抑制を提供し、長期のインビトロ培養の際に殺滅効率において同様の減少を示したが、それでもなお臨床的に有効であった。急性および慢性両方のＧＶＨＤの完全な消散は、循環する遺伝子改変された細胞におけるインビボでの減少が僅か８０％であると報告された。これらデータは、インビトロで見られる導入遺伝子ダウンモジュレーションが問題となりそうにないという仮説を支持する。なぜならＧＶＨＤの原因である活性化Ｔ細胞が、自殺遺伝子発現をアップレギュレートし、従って、インビボで選択的に排除されるからである。この効果が、インビボでのウイルス特異的Ｔ細胞および白血病特異的Ｔ細胞の保持を可能にするために十分であるかどうかは、臨床状況で試験される。自殺遺伝子改変前にインビトロ選択的同種枯渇を組み合わせることによって、自殺遺伝子機構を活性化する必要性は、有意に減少し得、それによって、追加戻しＴ細胞ベースの治療の利益を最大化し得る。
【０３６３】
インビトロで見られるｉＣａｓｐ９媒介性自殺の高効率は、インビボでも繰り返された。ＳＣＩＤマウス−ヒト異種移植モデルにおいて、ｉＣａｓｐ９改変Ｔ細胞のうちの９９％超が、二量体化剤の単一用量後に排除された。ＡＰ１９０３（これは、ＡＰ２０１８７に極めて近い機能的かつ化学的等価性を有し、臨床適用における使用が現在提唱されている）は、健常ヒト志願者に対して安全性が試験され、安全であると示された。約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１２７５ｎｇ／ｍｌ  ＡＰ１９０３（約７ｎＭ〜約８９２ｎＭの間で等価）との間の最大血漿レベルは、２時間の静脈内注入として投与される、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ用量範囲にわたって達した。実質的に有意な有害作用はなかった。迅速な血漿再分布を可能にした後、インビトロで使用される二量体化剤の濃度は、インビボで容易に達成可能なままである。
【０３６４】
自殺遺伝子改変Ｔ細胞の免疫学的能力を維持するために最適な培養条件を、安全スイッチ、選択マーカーおよび細胞タイプの各組み合わせに関して決定して定義しなければならない。なぜなら表現型、レパートリーおよび機能性は、全て、ポリクローナルＴ細胞活性化のために使用される刺激、形質導入細胞の選択のための方法、および培養の継続時間によって影響を及ぼされ得るからである。ＣＤ２８共刺激の付加およびＣＤ４：ＣＤ８比に関して非操作ＰＢＭＣにより密接に似ている遺伝子改変された細胞を生成するための細胞サイズの常磁性ビーズの使用、ならびにリンパ節ホーミング分子ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７を含む記憶サブセットマーカーの発現は、遺伝子改変されたＴ細胞のインビボ機能性を改善し得る。ＣＤ２８共刺激はまた、レトロウイルス形質導入および拡大の効率を増大し得る。しかし、興味深いことには、ＣＤ２８共刺激の付加は、同種枯渇された細胞の形質導入に何ら影響を有しないことが見出され、示された細胞拡大の程度は、他の研究において抗ＣＤ３単独アームと比較した場合に、より高かった。さらに、ｉＣａｓｐ９改変同種枯渇された細胞は、有意な抗ウイルス機能性を保持し、およそ１／４は、ＣＤ６２Ｌ発現を保持した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の再生もまた、見られた。Ｔ細胞活性化および形質導入のための出発材料として使用される同種枯渇された細胞は、共刺激としての抗ＣＤ２８抗体の添加にあまり感受性を有しない可能性がある。ＣＤ２５枯渇されたＰＢＭＣ／ＥＢＶ−ＬＣＬ共培養物は、非操作ＰＢＭＣより有意に高いレベルでＣＤ８６を既に発現しかつ共刺激を提供し得るＴ細胞およびＢ細胞を含んだ。抗ＣＤ３でのポリクローナルＴ細胞活性化の前にＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を枯渇させると、最終Ｔ細胞生成物の免疫学的能力を高めることが報告された。機能的能力に対するインビトロ培養および拡大の効果を最小にするために、本明細書で示されるいくつかの実験では、比較的短時間の培養期間を使用した。それによって細胞は、４日目に行われるＣＤ１９選択を伴う形質導入後合計８日間にわたって拡大された。
【０３６５】
最後に、スケールアップした生成が示され、その結果、十分な細胞生成物が、１０７  細胞／ｋｇまでの用量で成人患者を処置するために生成され得る：同種枯渇された細胞は、４×１０７細胞／フラスコで活性化および形質転換され得、ＣＤ１９選択された最終細胞生成物の最小で８倍の回復が、元のフラスコ１個あたり少なくとも３×１０８  同種枯渇された遺伝子改変された細胞を生成するために、形質導入後８日目に得られ得る。増大した培養容積は、さらなるフラスコまたはバッグに容易に収容され得る。
【０３６６】
本明細書で示される同種枯渇およびｉＣａｓｐ９改変は、特にハプロタイプ一致幹細胞同種移植後に、Ｔ細胞を添加し戻す安全性を有意に改善し得る。これは、翻って、抗白血病効果を生じるというより高い見込みとともに、より大きな用量漸増を可能にするはずである。
【０３６７】
（実施例３）
（ＣＡＳＰＡＬＬＯ  -  ハプロタイプ一致幹細胞移植後の誘導性カスパーゼ−９自殺遺伝子で形質導入した同種枯渇Ｔ細胞のフェーズＩ臨床試験）
この例は、図２において例示した代替の自殺遺伝子ストラテジーを使用するフェーズ１臨床試験の結果を示す。簡潔には、ドナー末梢血単核球を、レシピエントの照射ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞とともに（４０：１）７２時間共培養し、ＣＤ２５免疫毒素で同種枯渇させ、次いで、ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子および選択マーカー（ΔＣＤ１９）を有するレトロウイルス上清で形質導入した；ΔＣＤ１９は、免疫磁性選択を介して＞９０％純度への富化を可能にした。
【０３６８】
細胞治療製品の生成のためのプロトコルの一例を、本明細書で提供する。
【０３６９】
（原材料）
末梢血の２４０ｍｌまで（２回の収集にて）を、確立されたプロトコルに従って移植ドナーから得た。場合によっては、ドナーおよびレシピエントのサイズに依存して、白血球除去を行って、十分なＴ細胞を単離した。１０ｃｃ〜３０ｃｃの血液をまた、レシピエントから採血し、それを使用して刺激細胞（stimulator  cell）として使用されるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球様細胞株を生成した。場合によっては、医療履歴および／またはＢ細胞数が低いという表示に依存して、ＬＣＬを、適切な第１度近親者（例えば、親、きょうだい、もしくは子孫）の末梢血単核球を使用して生成した。
【０３７０】
（同種枯渇細胞の生成）
同種枯渇細胞を、本明細書で示されるように移植ドナーから生成した。健常ドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、無血清培地（ＡＩＭ  Ｖ；  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）中４０：１のレスポンダー対刺激物質比において、照射したレシピエントのエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）とともに共培養した。７２時間後、ＣＤ２５を発現する活性化Ｔ細胞を、ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ免疫毒素中での一晩のインキュベーションによって、共培養物から枯渇させた。同種枯渇を、その残りのＣＤ３＋ＣＤ２５＋集団が＜１％であり、３Ｈ−チミジン取り込みによる残りの増殖が＜１０％であった場合に、適切であるとみなす。
【０３７１】
（レトロウイルス生成）
【０３７２】
レトロウイルスプロデューサー株クローンを、ｉＣａｓｐ９−ＣＤ１９構築物のために生成した。このプロデューサーのマスター細胞バンクもまた、生成した。このマスター細胞バンクの試験を行って、複製能のあるレトロウイルスの生成およびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶなどによる感染を除外した。このプロデューサー株を、コンフルエントになるまで成長させ、上清を採取し、濾過し、アリコートに分け、急速凍結し、−８０℃で貯蔵した。さらなる試験を、レトロウイルス上清の全てのバッチに対して行って、プロトコルに従って、複製能のあるレトロウイルス（ＲＣＲ）を除外し、分析証明書を発行した。
【０３７３】
（同種枯渇細胞の形質導入）
同種枯渇Ｔリンパ球を、フィブロネクチンを使用して形質導入した。プレートまたはバッグを、組換えフィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６（ＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎＴＭ，  Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ，  Ｏｔｓｕ，  Ｊａｐａｎ）でコーティングした。ウイルスを、コーティングしたプレートまたはバッグ中でプロデューサー上清をインキュベートすることによってレトロネクチンに結合させた。次いで、細胞を、ウイルスコーティングしたプレートまたはバッグに移した。形質導入後、同種枯渇Ｔ細胞を、プロトコルに従って、これらにＩＬ−２を１週間に２回供給して増殖させて十分な細胞数に到達させた。
【０３７４】
（ＣＤ１９免疫磁性選択）
ＣＤ１９に関する免疫磁性選択を、形質導入の４日後に行った。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体に結合体化した常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ａｕｂｕｒｎ，  ＣＡ）で標識し、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ  Ｐｌｕｓ自動化選択デバイスで選択する。臨床での注入に必要とされる細胞数に依存して、細胞を、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ選択後に凍結保存するか、またはＩＬ−２でさらに増殖させて形質導入後の６日目または８日目に凍結保存するかのいずれかを行った。
【０３７５】
（凍結）
細胞のアリコートを、ＦＤＡによる最終リリース試験のために必要とされるとおりの形質導入効率、同一性、表現型および微生物学的培養を試験するために取り出した。この細胞を、プロトコルに従って投与する前に、凍結保存した。
【０３７６】
（研究薬）
（ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ）
ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡは、ヘテロ−−二官能性架橋剤［Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル−アルファ−メチル−ｄ−（２−ピリジルチオ）トルエン］（ＳＭＰＴ）を介して化学的に脱グリコシル化したリシンＡ鎖（ｄｇＡ）に結合体化したマウスＩｇＧ１  抗ＣＤ２５（ＩＬ−２レセプターアルファ鎖）である。ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡを、０．５ｍｇ／ｍｌの滅菌溶液として製剤化する。
【０３７７】
（合成ホモ二量体化剤ＡＰ１９０３）
作用機構：ＡＰ１９０３誘導性細胞死は、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）由来の薬物結合ドメインに融合されたヒト（カスパーゼ−９プロテイン）レセプター（これは、アポトーシス細胞死をシグナル伝達する）の細胞内部分を含むキメラタンパク質を発現させることによって達成される。このキメラタンパク質は、ＦＫＢＰドメインを架橋し、カスパーゼシグナル伝達およびアポトーシスを開始するＡＰ１９０３の投与まで細胞内で静止状態のままである。
【０３７８】
毒物学：ＡＰ１９０３は、ＦＤＡによって臨床試験用の新医薬品（ＩＮＤ）として評価されており、フェーズＩ臨床安全性研究を成功裡に終えた。ＡＰＩ９０３を０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ  用量範囲にわたって投与した場合に、有意な有害作用は注記されなかった。
【０３７９】
薬理学／薬物動態：患者に、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を、２時間注入として（０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ用量範囲にわたって１０ｎｇ／ｍＬ〜１２７５ｎｇ／ｍＬの血漿濃度を示し、血漿レベルは、投与後０．５時間および２時間で最大から１８％および７％へと低下するという、公開されたＰｋデータに基づいて）与えた。
【０３８０】
ヒトにおける副作用プロファイル：志願者でのフェーズ１研究の間には、重篤な有害事象は起こらなかった。有害事象の発生率は、各処置後に非常に低く、全ての有害事象は、重症度が軽度であった。唯一の有害事象は、おそらくＡＰＩ９０３に関連していると考えられた。これは、１．０ｍｇ／ｋｇ  ＡＰＩ９０３投与量で１名の志願者について「顔面紅潮」として示された血管拡張というエピソードであった。この事象は、注入の開始後３分で起こり、３２分の継続後に消散した（resolved）。この研究の間に報告された全ての他の有害事象は、研究者によって研究薬には関連しないかまたは関連性がありそうもない（improbable）と考えられた。これらの事象は、胸痛、インフルエンザ症候群、口臭、頭痛、注射部位疼痛、血管拡張、咳の増加、鼻炎、発疹、歯肉出血、および斑状出血を含んだ。
【０３８１】
グレード１  ＧＶＨＤを発症している患者を、２時間注入として、０．４ｍｇ／ｋｇ  ＡＰＩ９０３で処置した。患者グレード１  ＧＶＨＤへのＡＰ１９０３の投与プロトコルを、以下のとおり確立した。同種枯渇Ｔ細胞の注入後にＧｖＨＤを発症している患者を生検して診断を確定し、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を２時間の注入として与える。グレードＩ  ＧＶＨＤを有する患者は、他の治療を最初に何も受けなかったが、彼らがＧｖＨＤの進行を示した場合、従来のＧｖＨＤ治療を、施設のガイドラインに従って投与した。グレード２〜４  ＧＶＨＤを発症している患者に、施設のガイドラインに従って、ＡＰ１９０３二量体化薬物に加えて、標準的な全身免疫抑制治療を施した。
【０３８２】
調製および注入の指示：注射用ＡＰ１９０３を、３ｍｌ  バイアル中、５ｍｇ／ｍｌの濃度で２．３３ｍｌの濃縮溶液（すなわち、１０．６６ｍｇ／バイアル）として得る。投与前に、その計算した用量を、注入用０．９％  生理食塩水中で１００ｍＬへと希釈した。１００ｍｌ容積中の注射用ＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を、非ＤＥＨＰ、非エチレンオキシド滅菌注入セットおよび注入ポンプを使用して、２時間かけてＩＶ注入を介して投与した。
【０３８３】
ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子発現構築物（例えば、ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＡＣＤ１９）は、切断可能な２Ａ様配列を介して短縮型ヒトＣＤ１９（ＡＣＤ１９）へと連結した誘導性カスパーゼ−９（ｉＣａｓｐ９）からなる。ｉＣａｓｐ９は、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーを介してヒトカスパーゼ−９（ＣＡＳＰ９；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１２２９）へと接続された、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＨ００２  ８１８）を含む。このＦ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７またはＡＰＩ９０３に対するＦＫＢＰ１２の結合親和性を増大させ得る。カスパーゼリクルートメントドメイン（ＣＡＲＤ）は、ヒトカスパーゼ−９配列から欠失されており、その生理学的機能は、ＦＫＢＰ１２によって置き換えられている。ＣＡＲＤをＦＫＢＰ１２で置き換えると、導入遺伝子発現および機能が増大する。上記２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ  Ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の１８アミノ酸のペプチドをコードし、それはグリシンと末端プロリン残基との間で＞９９％切断を媒介し、ｉＣａｓｐ９のＣ末端において１７個の余分なアミノ酸およびＣＤ１９のＮ末端において１個の余分なプロリン残基を生じる。ΔＣＤ１９は、アミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）で短縮された全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７７０）からなり、これは、細胞質内ドメインを２４２から１９アミノ酸に短縮し、リン酸化の潜在的部位である全ての保存されたチロシン残基を除去する。
【０３８４】
（インビボ研究）
３名の患者に、ハプロ−ＣＤ３４＋幹細胞移植（ＳＣＴ）後に、約１×１０６  細胞／ｋｇ〜約３×１０６  細胞／ｋｇの間の用量レベルでｉＣａｓｐ９＋  Ｔ細胞を与えた。
【０３８５】
【表２】
2020096640.tif 000005
【０３８６】
注入したＴ細胞を、図２７、２８および２９において図示したように、注入後７日目の早さで、フローサイトメトリー（ＣＤ３＋  ΔＣＤ１９＋）またはｑＰＣＲによってインビボで検出し、最大倍数増殖は１７０±５（注入後２９±９日目）であった。２名の患者は、グレードＩ／ＩＩ  ａＧＶＨＤを発症し（図３１〜３２を参照のこと）、ＡＰ１９０３投与は、注入の３０分以内に、ＣＤ３＋  ΔＣＤ１９＋細胞の＞９０％除去（図３０、３３および３４を参照のこと）（２４時間以内にさらなる対数減少を伴う）、および２４時間以内の皮膚および肝臓のａＧｖＨＤの消散を引き起こし、ｉＣａｓｐ９導入遺伝子がインビボで機能することを示した。患者２に関しては、処置後２４時間以内での皮膚発疹の消失が観察された。
【０３８７】
【表３】
2020096640.tif 000006
【０３８８】
エキソビボ実験は、このデータを確認した。さらに、残っている同種枯渇Ｔ細胞は、増殖でき、ウイルス（ＣＭＶ）および真菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に対して反応性であった（ＩＦＮ−γ生成）。これらのインビボ研究は、二量体化薬物の単一用量が、ＧｖＨＤを引き起こすＴ細胞の部分集団を減少または排除し得るが、ウイルス特異的ＣＴＬ（これは、次いで、再増殖し得る）を残し得ることを見出した。
【０３８９】
（免疫再形成）
患者細胞および試薬の利用可能性に依存して、免疫再形成研究（免疫表現型決定、Ｔ細胞およびＢ細胞機能）は、移植後一連の間隔で得られ得る。ｉカスパーゼ形質導入同種枯渇Ｔ細胞から生じる免疫再形成を測定するいくつかのパラメータを分析する。この分析は、全リンパ球カウント、Ｔ細胞およびＣＤ１９  Ｂ細胞の数の反復測定、ならびにＴ細胞サブセット（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ５６、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、アルファ／ベータおよびガンマ／デルタＴ細胞レセプター）のＦＡＣＳ分析を含む。患者Ｔ細胞の利用可能性に依存して、調節性Ｔ細胞マーカー（例えば、ＣＤ４１ＣＤ２５１ＦｏｘＰ３）もまた分析する。可能な場合には、注入の４時間後、１ヶ月の間週に１回、月に１回×９ヶ月間、および次に１年でおよび２年で、およそ１０〜６０ｍｌの患者血液を採取する。採取される血液量は、レシピエントのサイズに依存し、いずれの１回の採血時にも（臨床上のケアおよび研究評価のために血液採取は可能である）合計で１〜２ｃｃ／ｋｇを超えない。
【０３９０】
（形質導入された同種枯渇されたＴ細胞の持続性および安全性）
以下の分析もまた末梢血サンプルに対して行って、研究予定表に示された時点で形質導入されたＴ細胞の機能、持続性および安全性をモニターした：
・トランスジェニック細胞の存在を検出するための表現型決定。
・ＰＣＲによるＲＣＲ試験。
・レトロウイルス組み込み体を検出するための定量的リアルタイムＰＣＲ。
【０３９１】
ＰＣＲによるＲＣＲ試験は、研究前、３ヶ月、６ヶ月、および１２ヶ月で行われ、その後、合計１５年間にわたって毎年行われる。組織、細胞および血清サンプルを、ＦＤＡによって要求されるように、ＲＣＲの将来的な研究における使用のために保管する。
【０３９２】
（統計分析および停止規則）
ＭＴＤを、適格な症例のうちの多くても２５％においてグレードＩＩＩ／ＩＶの急性ＧＶＨＤを引き起こす用量であると定義する。その決定は、サイズ２のコホートを有するロジスティックモデルを使用する改変連続再評価法（ＣＲＭ）に基づく。３つの用量群（すなわち、１×１０６、３×１０６、１×１０７）が評価され、毒性の事前確率が、それぞれ、１０％、１５％、および３０％と予測されている。提唱されるＣＲＭデザインは、各コホートにおいて１名より多くの被験体を集め、用量漸増を１用量レベル以下にまで制限し、非形質導入細胞に関して安全であると示された最低用量レベルで患者登録を開始することによって、元のＣＲＭに対する改変を使用する。最低用量コホートでの毒性転帰は、用量−毒性曲線を更新するために使用される。次の患者コホートを、２５％という目標確率に最も近い毒性の関連する確率（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）を有する用量レベルへと割り当てる。このプロセスは、少なくとも１０名の患者がこの用量漸増研究へと集められるまで継続する。患者の利用可能性に依存して、１８名以下の患者がフェーズＩ治験へと登録され得るか、または６名の患者が最新ＭＴＤにおいて処理されるまで登録され得る。最終ＭＴＤは、これら終結点において目標毒性率に最も近い確率を有する用量である。
【０３９３】
シミュレーションを行って、その提唱されるデザインの操作特性を決定し、これと、標準的な３＋３用量漸増デザインとを比較した。提唱されるデザインは、ＭＴＤとして適切な用量レベルを宣言するより高い確率に基づいてＭＴＤのよりよい推定値（estimate）を提供し、より低いかつおそらく無効な用量レベルで集められたより少数の患者を提供し、治験に必要とされる患者平均総数がより低く維持された。低い用量−毒性曲線（shallow  dose-toxicity  curve）は、本明細書で提唱される用量の範囲にわたって予測され、従って、促進される用量漸増は、患者の安全を含むことなく行われ得る。行われるシミュレーションは、改変ＣＲＭデザインが、標準的デザインと比較した場合に、総毒性のより大きな平均数を招かないことを示す（総毒性は、それぞれ、１．９および２．１に等しい）。
【０３９４】
同種枯渇されたＴ細胞の最初の注入後の４５日以内に起こるグレードＩＩＩ／ＩＶ  ＧＶＨＤは、その後のコホートに関して推奨される用量を決定するために、ＣＲＭ計算へと考慮される。患者の毒性転帰のリアルタイムモニタリングを、用量−毒性曲線の推定を実行し、予め指定された用量レベルのうちの１つを使用して次の患者コホートのための用量レベルを決定するために研究の間に行う。
【０３９５】
処置を制限する毒性としては以下が挙げられる：
ａ）注入に関連するグレード４の反応、
ｂ）ＴＣ−Ｔの注入後３０日以内に起こる移植不全（少なくとも１４日間にわたって持続する成長因子治療に不応性の、異なる日での３回連続測定に関して＜５００１ｍｍ３へのＡＮＣのその後の減少として定義される）、
ｃ）注入後３０日以内に起こるグレード４非造血および非感染性の有害事象、
ｄ）ＴＣ−Ｔの注入後４５日までのグレード３〜４の急性ＧＶＨＤ、
ｅ）注入後３０日以内に起こる処置関連死。
【０３９６】
ＧＶＨＤ率を、安全性および毒性の他の尺度とともに、記述統計を使用してまとめる。同様に、記述統計を、グレード１より大きいＧＶＨＤに起因してＡＰ１９０３を受ける患者における臨床的応答および生物学的応答をまとめるために計算する。
【０３９７】
ｉカスパーゼ形質導入同種枯渇Ｔ細胞から生じる免疫再形成を測定するいくつかのパラメーターを、分析する。これらは、全リンパ球数、ＴおよびＣＤ１９  Ｂ細胞数の反復測定、ならびにＴ細胞サブセット（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ５６、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、α／βおよびγ／δＴ細胞レセプター）のＦＡＣＳ分析を含む。十分なＴ細胞が分析用に残っている場合、Ｔ制御性細胞マーカー（例えば、ＣＤ４／ＣＤ２５／ＦｏｘＰ３）もまた分析する。各被験体を、上記で示されるように注入前および注入後の複数の時点で測定する。
【０３９８】
患者群全体における、および用量群による、ならびに測定時間によるこれらパラメーターの記述要約を示す。患者内の経時的な測定を表す成長曲線を作成して、免疫再形成の一般的パターンを可視化する。ｉＣａｓｐ９陽性細胞の割合もまた、各時点でまとめる。注入前と比較して経時的なこれらエンドポイントでの変化のペアワイズ比較を、対応のあるｔ検定またはウィルコクソンの符合順位検定を使用して行う。
【０３９９】
ランダム係数モデルを使用する各反復測定した免疫再形成パラメーターの縦断的分析を行う。縦断的分析は、患者１名あたりの免疫再形成のモデルパターンの構築を可能にしながら、患者内の種々の切片および傾きを可能にする。上記患者が受ける異なる用量レベルを説明するためにモデルにおいて独立変数としての用量レベルもまた、使用する。免疫機能において経時的に有意な改善があるかどうかの検定、および傾きの推定値およびその標準誤差に基づくこれら改善の大きさの推定は、本明細書で示されるモデルを使用して可能である。ＣＴＬの異なる用量レベルにわたる免疫再形成の率における差異の任意の指標の評価はまた、行われる。同一性リンクを有する正規分布は、これらモデルにおいて利用され、ＳＡＳ  ＭＩＸＥＤ手順を使用して実装される。免疫再形成パラメーターの正規性の仮定を評価し、正規性を達成するために必要であれば、変換（例えば、対数、平方根）を行い得る。
【０４００】
上記に示されるものに類似のストラテジーを使用して、Ｔ細胞生存、拡大および持続性の速度論を評価することができる。絶対Ｔ細胞数とマーカー遺伝子陽性細胞数との比を決定し、縦断的に経時的にモデル化する。その傾きの正の推定値は、免疫回復のためのＴ細胞の寄与が増大していることを示す。ｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞のウイルス特異的免疫を、縦断的モデルを使用してエキソビボ刺激ウイルス特異的ＣＴＬに基づいて、ＩＦＮγを放出するＴ細胞数の分析によって評価する。ＥＢＶ、ＣＭＶおよびアデノウイルスの免疫評価の分析のために別個のモデルを作成する。
【０４０１】
最後に、患者コホート全体において、全体的および疾患なしの生存を、カプラン・マイヤーの積・極限法（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｐｒｏｄｕｃｔ−ｌｉｍｉｔ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用してまとめる。移植後１００日間および１年間で生存しかつ疾患のない患者の割合を、カプラン・マイヤー曲線から概算し得る。
【０４０２】
結論として、ハプロＣＤ３４＋  ＳＣＴ後のｉＣａｓｐ９＋  同種枯渇Ｔ細胞の追加戻しは、機能的ドナーリンパ球のインビボでの有意な拡大およびａＧｖＨＤの消散とともに同種反応性Ｔ細胞の迅速なクリアランスを可能にする。
【０４０３】
（実施例４：インビボでのＴ細胞同種枯渇）
実施例１〜３において提供されるプロトコルはまた、インビボでのＴ細胞同種枯渇を提供するために改変され得る。このアプローチを急性（actute）ＧｖＨＤなしの免疫再形成から利益を受け得る被験体のより大きな群へと拡げるために、Ｔ細胞枯渇のインビボ方法を提供することによってこのプロトコルを単純化し得る。処置前の同種枯渇方法では、本明細書で論じられるように、ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞株を、レシピエントからまず調製する。次いで、これは、同種抗原提示細胞として作用する。この手順は８週間かかり得、広範囲に前処置した悪性腫瘍を有する被験体では、特に、彼らの最初の治療の構成成分としてリツジシマブを彼らが受けた場合には、失敗する可能性がある。その後、ドナーＴ細胞を、レシピエントＥＢＶ−ＬＣＬと共培養し、その同種反応性Ｔ細胞（これは活性化抗原ＣＤ２５を発現する）を、その後、ＣＤ２５−リシン結合体化モノクローナル抗体で処理する。この手順は、各被験体に関する実験室作業にさらに多くの日数がかかり得る。
【０４０４】
上記プロセスは、同種枯渇のインビボ方法を使用し、二量体化薬物による同種反応性Ｔ細胞の観察された迅速なインビボ枯渇を利用し、非刺激であるが、ウイルス／真菌反応性Ｔ細胞を残しておくことによって、単純化され得る。
【０４０５】
グレードＩまたはこれより高い急性ＧｖＨＤの発生がある場合、単一用量の二量体化薬物が投与される（例えば、２時間の静脈内注入として０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３という用量で）。急性ＧｖＨＤが持続する場合、さらに３用量までの二量体化薬物が４８時間の間隔で投与され得る。グレードＩＩまたはこれより高い急性ＧｖＨＤを有する被験体では、これらのさらなる用量の二量体化薬物がステロイドと組み合わされ得る。二量体化剤に対してグレードＩＩＩまたはＩＶの反応に起因して二量体化剤のさらなる用量を受けることができない持続性のＧＶＨＤを有する患者に関しては、この患者は、０または１用量いずれかの二量体化剤の後に、ステロイドのみで処置され得る。
【０４０６】
（治療用Ｔ細胞の生成）
２４０ｍｌ（２回の収集で）までの末梢血を、獲得した同意に従って移植ドナーから得る。必要であれば、白血球除去療法（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）を使用して、十分なＴ細胞を得る；（幹細胞動員前または最後のＧ−ＣＳＦ投与の７日後のいずれかに）。１０〜３０ｍｌの余分の血液をまた集めて、肝炎およびＨＩＶなどの感染性疾患について試験し得る。
【０４０７】
末梢血単核細胞を、抗ヒトＣＤ３抗体（例えば、ＯｒｔｈｏｔｅｃｈまたはＭｉｌｔｅｎｙｉ製）を使用して０日目に活性化し、２日目に組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈＩＬ−２）の存在下で拡大する。ＣＤ３抗体活性化Ｔ細胞を、組換えフィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６（ＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎＴＭ，  Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ，  Ｏｔｓｕ，  Ｊａｐａｎ）でコーティングしたフラスコまたはプレートでｉカスパーゼ−９レトロウイルスベクターによって形質導入する。ウイルスを、レトロネクチンコーティングしたプレートまたはフラスコ中でプロデューサー上清をインキュベートすることによって、レトロネクチンへと結合させる。次いで、細胞を、ウイルスコーティングした組織培養デバイスへと移す。形質導入後、Ｔ細胞を、プロトコルに従って、これらにｒｈＩＬ−２を１週間に２回供給することによって拡大して十分数の細胞に到達させる。
【０４０８】
注入されたＴ細胞の大部分が自殺遺伝子を有することを確実にするために、選択マーカー、短縮型ヒトＣＤ１９（ΔＣＤ１９）および市販の選択デバイスを使用して、その形質導入された細胞を＞９０％純度になるように選択し得る。ＣＤ１９に関する免疫磁性選択を、形質導入の４日後に行い得る。細胞を、モノクローナルマウス抗−ヒトＣＤ１９抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ａｕｂｕｒｎ，  ＣＡ）に結合体化した常磁性マイクロビーズで標識し、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ  Ｐｌｕｓ自動化選択デバイスで選択する。臨床的注入に必要とされる細胞数に依存して、細胞は、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ選択後に低温貯蔵されるかまたはＩＬ−２でさらに拡大されて十分な細胞が拡大されたらすぐに低温貯蔵される（生成物開始から１４日目まで）かのいずれかであり得る。
【０４０９】
細胞のアリコートを、ＦＤＡによる最終リリース試験のために必要とされる場合、形質導入効率、同一性、表現型、自律的成長および微生物学的検査の試験のために取り出し得る。上記細胞を、投与前に低温貯蔵する。
【０４１０】
（Ｔ細胞の投与）
形質導入されたＴ細胞を、幹細胞移植後から、例えば、３０日〜１２０日の間に患者に投与する。上記低温貯蔵したＴ細胞を解凍し、ノーマルセーラインを用いカテーテルラインを通して注入する。小児に関しては、体重によっては前投薬の薬が投与される。細胞の用量は、例えば、約１×１０４  細胞／ｋｇ〜１×１０８  細胞／ｋｇ、例えば、約１×１０５  細胞／ｋｇ〜１×１０７  細胞／ｋｇ、約１×１０６  細胞／ｋｇ〜５×１０６  細胞／ｋｇ、約１×１０４  細胞／ｋｇ〜５×１０６  細胞／ｋｇ、例えば、約１×１０４、約１×１０５、約２×１０５、約３×１０５、約５×１０５、６×１０５、約７×１０５、約８×１０５、約９×１０５、約１×１０６、約２×１０６、約３×１０６、約４×１０６、または約５×１０６  細胞／ｋｇの範囲に及び得る。
【０４１１】
（ＧｖＨＤの処置）
グレード≧１の急性ＧＶＨＤを発生させる患者を、２時間の注入として０．４ｍｇ／ｋｇ  ＡＰ１９０３で処置する。注入用ＡＰ１９０３は、例えば、３ｍｌバイアル中２．３３ｍｌの濃縮溶液として、５ｍｇ／ｍｌの濃度（すなわち、１０．６６ｍｇ／バイアル）で提供され得る。投与前に、計算された用量を、注入用の０．９％  ノーマルセーラインで１００ｍＬへと希釈する。１００ｍｌ体積での注入用ＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を、非ＤＥＨＰ、非エチレンオキシド滅菌注入セットおよび注入ポンプを使用して、２時間にわたるＩＶ注入を介して投与し得る。
【０４１２】
【表４】
2020096640.tif 000007
【０４１３】
他の方法は、例えば、本明細書中の実施例１〜３において提供されるとおりの臨床的治療および評価に従い得る。
【０４１４】
（実施例５：ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子を使用して、間葉系ストローマ細胞治療の安全性を改善する）
間葉系ストローマ細胞（ＭＳＣ）は、数百名の患者に注入され、今日まで報告された有害副作用は最小限である。ＭＳＣは、疾患の処置において使用されてきたために、追跡調査が限定されたものであり比較的短期間であることに起因して、長期間の副作用は知られていない。なぜならＭＳＣは、疾患の処置において使用されてきたからである。いくつかの動物モデルは、副作用が潜在的に存在し、従って、使用されるＭＳＣの成長および生存にわたってコントロールを可能にするシステムが治療上望ましいことを示した。本明細書で示される誘導性カスパーゼ−９自殺スイッチ発現ベクター構築物を、インビボおよびインビトロでＭＳＣを排除するための方法として調査した。
【０４１５】
（材料および方法）
（ＭＳＣ単離）
ＭＳＣを、健常ドナーから単離した。簡潔には、注入後廃棄される健常ドナー骨髄収集バッグおよびフィルターを、ＲＰＭＩ  １６４０（ＨｙＣｌｏｎｅ，  Ｌｏｇａｎ，  ＵＴ）で洗浄し、１０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  アラニル−グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ユニット／ｍＬ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）が入った組織培養フラスコにプレーティングした。４８時間後、その上清を廃棄し、その細胞を、完全培養培地（ＣＣＭ）：１６．５％  ＦＢＳ、２ｍＭ  アラニル−グルタミン、１００ユニット／ｍＬ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを有するα−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。細胞を、８０％  コンフルエント未満になるように成長させ、適切であれば低密度で再プレーティングした。
【０４１６】
（免疫表現型決定）
フィコエリトリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合体化ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１３３モノクローナル抗体を使用して、ＭＳＣを染色した。全ての抗体は、示されたものを除いてＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）製であった。適切なアイソタイプ適合抗体で標識したコントロールサンプルを、各実験に含めた。細胞を、４種の蛍光シグナルについて設定されたフィルタを備えた蛍光活性化セルソーティングＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。
【０４１７】
（インビトロでの分化研究）
脂肪細胞分化。  ＭＳＣ（７．５×１０４  細胞）を、ＮＨ  ＡｄｉｐｏＤｉｆｆ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ａｕｂｕｒｎ，  ＣＡ）が入った、６ウェルプレートのウェルにプレーティングした。培地を、２１日間にわたって３日毎に交換した。細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中４％  ホルムアルデヒドで固定した後にＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ溶液（３：２比のイソプロパノールと水とで０．５％  ｗ／ｖ  Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏを希釈することによって得た）で染色した。
【０４１８】
骨形成分化。  ＭＳＣ（４．５×１０４  細胞）を、ＮＨ  ＯｓｔｅｏＤｉｆｆ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）が入った、６ウェルプレートにプレーティングした。培地を、１０日間にわたって３日毎に交換した。細胞を、冷メタノールでの固定後に、製造業者の指示に従って、Ｓｉｇｍａ  Ｆａｓｔ  ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を使用してアルカリホスファターゼ活性に関して染色した。
【０４１９】
軟骨芽細胞分化。  ２．５×１０５〜５×１０５  細胞を含むＭＳＣペレットを、１５ｍＬまたは１．５ｍＬ  ポリプロピレンコニカルチューブの中で遠心分離することによって得、ＮＨ  ＣｈｏｎｄｒｏＤｉｆｆ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中で培養した。培地を、合計２４日間にわたって３日毎に交換した。細胞ペレットを、ＰＢＳ中の４％  ホルマリン中で固定し、慣用的パラフィン切片化のために処理した。切片をアルシアンブルーで、またはペプシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｆｒｅｍｏｎｔ，  ＣＡ）での抗原回復後にＩＩ型コラーゲンに関する間接免疫蛍光（マウス抗ＩＩ型コラーゲンモノクローナル抗体ＭＡＢ８８８７，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）を使用して染色した。
【０４２０】
（ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９レトロウイルス生成およびＭＳＣの形質導入）
ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ΔＣＤ１９（ｉＣａｓｐ−ΔＣＤ１９）レトロウイルスは、切断可能な２Ａ様配列を介して、短縮型ヒトＣＤ１９（ΔＣＤ１９）に連結されたｉＣａｓｐ９からなる。上記のように、ｉＣａｓｐ９は、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーを介してヒトカスパーゼ−９（その動員ドメイン（ＣＡＲＤ）は欠失されており、その機能は、ＦＫＢＰ１２によって置き換わっている）に接続されたＦ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）（その変異は、合成ホモ二量体化剤（ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３）に対するそのタンパク質の結合親和性を増大させる）である。
【０４２１】
２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ  Ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の２０アミノ酸ペプチドをコードし、グリシンと末端プロリン残基との間で９９％超の切断を媒介して、翻訳の際のｉＣａｓｐ９とΔＣＤ１９との間の分離を確実にする。ΔＣＤ１９は、アミノ酸３３３で短縮され、リン酸化のための潜在的部位である全ての保存された細胞質内チロシン残基を除去したヒトＣＤ１９からなる。テナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ−Ｖ）偽型レトロウイルスを生成する安定なＰＧ１３クローンを、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ製品  ＃ＳＤ３４４４；  ＡＴＣＣ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）をＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ΔＣＤ１９で一過性にトランスフェクトすることによって作製し、これによってＥｃｏ偽型レトロウイルスを得た。このＰＧ１３パッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）を、Ｅｃｏ偽型レトロウイルスで３回形質導入して、１細胞あたり複数のＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ΔＣＤ１９プロウイルス組み込み体を含むプロデューサー株を生成した。単一細胞クローニングを行い、最高力価を生成するＰＧ１３クローンを拡大し、ベクター生成のために使用した。レトロウイルス上清を、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  アラニル−グルタミン、１００ユニット／ｍＬ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを有するＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、プロデューサー細胞株の培養を介して得た。レトロウイルスを含む上清を、最初の培養の４８時間後および７２時間後に集めた。形質導入のために、およそ２×１０４  ＭＳＣ／ｃｍ２を、６ウェルプレート、Ｔ７５またはＴ１７５フラスコの中のＣＭ中にプレーティングした。２４時間後、培地を、ポリブレン（最終濃度５μｇ／ｍＬ）と一緒に１０倍希釈したウイルス上清に置き換え、その細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２中で４８時間にわたってインキュベートし、その後、細胞を完全培地中で維持した。
【０４２２】
（細胞富化）
インビトロ実験のための誘導性ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９陽性ＭＳＣ選択のために、レトロウイルスで形質導入したＭＳＣを、製造業者の指示に従って、抗ＣＤ１９（クローン４Ｇ７）で結合体化した磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＣＤ１９陽性細胞について富化した。細胞サンプルを、ＰＥ結合体化またはＡＰＣ結合体化ＣＤ１９（クローンＳＪ２５Ｃ１）抗体で染色して、細胞画分の純度を評価した。
【０４２３】
（インビトロでのアポトーシス研究）
未分化ＭＳＣ。  二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）（ＡＰ２０１８７；  ＡＲＩＡＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）を、完全培地中のｉＣａｓｐ９形質導入ＭＳＣ培養物へと５０ｎＭで添加した。アポトーシスを、細胞採取ならびにアネキシンＶ結合緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）中でのアネキシンＶ−ＰＥおよび７−ＡＡＤでの染色後に、ＦＡＣＳ分析によって２４時間後に評価した。コントロールｉＣａｓｐ９形質導入ＭＳＣを、ＣＩＤへの曝露なしで、培養物中で維持した。
【０４２４】
分化ＭＳＣ。  形質導入したＭＳＣを、上記で示されるように分化させた。分化期間の最後に、ＣＩＤを、５０ｎＭで分化培地へと添加した。細胞を、上記で示されるように、研究されている組織に対して適切に染色し、対比染色（メチレンアズールまたはメチレンブルー）を使用して、核および細胞質形態を評価した。並行して、組織を、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイのために、製造業者の指示に従って処理した（Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）。各時点について、４つの無作為の視野を、最終倍率４０×で撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアバージョン１．４３ｏ（ＮＩＨ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）で画像を分析した。細胞密度を、表面積の単位（ｍｍ２）あたりの核の数（ＤＡＰＩ陽性）として計算した。アポトーシス細胞のパーセンテージを、陽性ＴＵＮＥＬシグナル（ＦＩＴＣ陽性）を有する核の数  対  核の総数の比として決定した。コントロールを、ＣＩＤなしの培養物中で維持した。
【０４２５】
（マウスモデルでのインビボ殺滅研究）
全てのマウス実験を、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ動物飼養ガイドラインに従って行った。改変ＭＳＣのインビボでの持続性を評価するために、ＳＣＩＤマウスモデルを、インビボ画像化システムとともに使用した。ＭＳＣを、高感度緑色蛍光タンパク質−ホタルルシフェラーゼ（ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ）遺伝子のみをまたはｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９遺伝子と一緒にコードするレトロウイルスで形質導入した。細胞を、ＭｏＦｌｏフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，  ＣＡ）を使用する蛍光活性化セルソーティングによって、ｅＧＦＰ陽性に関してソートした。二重形質導入細胞もまた、ＰＥ結合体化抗ＣＤ１９で染色し、ＰＥ陽性に関してソートした。ＳＣＩＤマウス（８〜１０週齢）に、反対側の側腹部にｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９ありおよびなしで、５×１０５  ＭＳＣを皮下注射した。マウスに、１週間後に開始して、２４時間間隔を空けて、５０μｇのＣＩＤの２回の腹腔内注射を与えた。ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃを発現するＭＳＣのインビボ画像化のために、マウスに、Ｄ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、Ｘｅｎｏｇｅｎ−ＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して分析した。各時点での総ルミネッセンス（沈着した総標識ＭＳＣに比例した測定値）を、ＭＳＣ移植部位にわたる関心領域（ＲＯＩ）を自動的に定義することによって計算した。これらＲＯＩは、バックグラウンドを少なくとも５％上回るルミネッセンスシグナルを有する全ての領域を含んだ。総光子数を各ＲＯＩに関して積分し、平均値を計算した。結果を、時間ゼロが１００％シグナルに相当するように正規化した。
【０４２６】
第２の実験セットにおいて、２．５×１０６  ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ標識ＭＳＣおよび２．５×１０６  ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ標識ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９形質導入ＭＳＣの混合物を、右側腹部に皮下注射し、そのマウスに、７日後に開始して２４時間空けて５０μｇのＣＩＤの２回の腹腔内注射を与えた。ＣＩＤ注射後のいくつかの時点で、ＭＳＣの皮下ペレットを、組織ルミネッセンスを使用して採取し、全ヒト標本を同定し、収集し、マウス組織の夾雑を最小にした。次いで、ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡｍｐ（登録商標）  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を使用して単離した。１００ｎｇのＤＮＡのアリコートを、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）において使用して、特異的プライマーおよびプローブ（ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ構築物に関して：順方向プライマー  ５’−ＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣ−３’、逆方向、５’−ＡＣＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴ−３’、プローブ  ５’  ＦＡＭ，６−カルボキシフルオレセイン−ＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣ−３’  ＭＧＢＮＦＱ、副溝結合非蛍光クエンチャー；ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９：順方向  ５’−ＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴ−３’、逆方向  ５’−ＣＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴ−３’、プローブ５’  ＦＡＭ−ＣＧＧＡＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＴ−３’  ＭＧＢＮＦＱ）を使用して、各導入遺伝子のコピー数を決定した。各導入遺伝子の単一コピーを含む既知数のプラスミドを使用して、標準曲線を確立した。単一ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ形質導入ＭＳＣまたは二重ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ形質導入ＭＳＣおよびｉＣａｓｐ９形質導入ＭＳＣの「純粋」集団から単離されたおよそ１００ｎｇのＤＮＡは、それぞれ、類似した数のｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ遺伝子コピー（およそ３．０×１０４）、ならびにゼロおよび１．７×１０３のｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９遺伝子コピーを有すると決定された。
【０４２７】
非形質導入ヒト細胞およびマウス組織は、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ中でいずれの遺伝子のコピーもゼロであった。ｅＧＦＰ遺伝子のコピー数は、ＭＳＣのいずれの集団（ｉＣａｓｐ９陰性または陽性）から単離された同一量のＤＮＡに対しても同じであるので。細胞の任意の混合物から単離されたＤＮＡ中のこの遺伝子のコピー数は、ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ陽性細胞の総数（ｉＣａｓｐ９陽性＋陰性ＭＳＣ）に比例する。さらに、ｉＣａｓｐ９陰性組織は、ｉＣａｓｐ９コピー数に寄与しないので、任意のＤＮＡサンプル中のｉＣａｓｐ９遺伝子のコピー数は、ｉＣａｓｐ９陽性細胞の総数に比例する。従って、任意のＤＮＡサンプルに関して、ＧがＧＦＰ陽性およびｉＣａｓｐ９陰性細胞の総数であり、ＣがＧＦＰ陽性およびｉＣａｓｐ９陽性細胞の総数である場合、ＮｅＧＦＰ＝ｇ・（Ｃ＋Ｇ）およびＮｉＣａｓｐ９＝ｋ・Ｃである（ここでＮは、遺伝子コピー数を表し、ｇおよびｋは、それぞれ、ｅＧＦＰ遺伝子およびｉＣａｓｐ９遺伝子についてのコピー数および細胞数に関する定数である）。従って、ＮｉＣａｓｐ９／ＮｅＧＦＰ＝（ｋ／ｇ）・［Ｃ／（Ｃ＋Ｇ）］、すなわち、ｉＣａｓｐ９コピー数とｅＧＦＰコピー数との間の比は、全てのｅＧＦＰ陽性細胞の中での二重形質導入（ｉＣａｓｐ９陽性）細胞の画分に比例する。ＮｉＣａｓｐ９およびＮｅＧＦＰの絶対値は、各ＭＳＣ外植片中のマウス細胞による汚染の増大とともに減少するが、各時点に関して、含まれるマウス組織の量に拘わらずその比は一定である。なぜならヒト細胞の両方のタイプが物理的に混合されるからである。（インビトロ培養によって示されるように）両方の集団における自発的アポトーシスの類似の比を想定すると、任意の時点におけるＮｉＣａｓｐ９／ＮｅＧＦＰと時間ゼロでのそれとの間の商は、ＣＩＤへの曝露後に生存しているｉＣａｓｐ９陽性細胞のパーセンテージを表す。全てのコピー数決定を、三連で行った。
【０４２８】
（統計分析）
対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して、サンプル間の統計的有意差を決定した。全ての数値データを、平均±１標準偏差として表す。
【０４２９】
（結果）
（ＭＳＣは、ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９で容易に形質導入され、それらの基本表現型を維持する）
３名の健常ドナー由来のＭＳＣのフローサイトメトリー分析は、それらが一様に、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５に関して陽性であり、造血マーカーＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１３３およびＣＤ３４に関して陰性であることを示した。骨髄から単離された単核性接着画分は均質に（homogenously）、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５に関して陽性であり、造血マーカーに関して陰性であった。単離されたＭＳＣの、脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨芽細胞への分化潜在能を特異的アッセイにおいて確認したところ、これら細胞が真正のＭＳＣであることが示された。
【０４３０】
早期継代のＭＳＣを、カスパーゼ−９の誘導性形態をコードするｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９レトロウイルスベクターで形質導入した。最適なシグナル伝達条件（single  transduction  condition）下で、この細胞のうちの４７±６％がＣＤ１９（その短縮型形態は、ｉＣａｓｐ９とともにシスで転写される）を発現し、成功裡の形質導入のための代用物として働き、形質導入された細胞の選択を可能にする。ＣＤ１９に関して陽性の細胞のパーセンテージは、培養物中で２週間より長く安定であり、ＭＳＣに対してその構築物の有害な作用も成長に有利な効果も示唆しなかった。ＣＤ１９陽性細胞（ｉＣａｓｐ９での成功裡の形質導入の代用物）のパーセンテージは、２週間より長く一定なままである。その構築物の安定性にさらに対処するために、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）によって精製したｉＣａｓｐ９陽性細胞の集団を、培養物中で維持した：ＣＤ１９陽性細胞のパーセンテージの有意差は、６週間を超えても観察されなかった（ベースラインで９６．５±１．１％  対  ４３日後に９７．４±０．８％、Ｐ＝０．４６）。ｉＣａｓｐ９−ＣＤ１９陽性細胞の表現型は、非形質導入細胞の表現型と他の点では実質的に同一であった（実質的に全ての細胞がＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５に関して陽性、造血マーカーに関して陰性）。これは、ＭＳＣの遺伝子操作がそれらの基本特性を改変しないことを確認した。
【０４３１】
（ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９形質導入ＭＳＣは、インビトロでのＣＩＤへの曝露後に選択的アポトーシスを受ける）
アポトーシス促進遺伝子生成物ｉＣａｓｐ９は、小さな二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）、ＡＰ２０１８７（ｉＣａｓｐ９生成物に存在するＦＫ５０６−結合ドメインに結合するタクロリムスのアナログ）によって活性化され得る。非形質導入ＭＳＣは、ベースラインにおいてｉＣａｓｐ９陽性細胞が有する（１５±６％、Ｐ＝０．４７）ように、およそ１８％（±７％）という培養物中での自発的アポトーシス率を有する。ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９での形質導入後のＭＳＣ培養物へのＣＩＤ（５０ｎＭ）の添加は、２４時間以内にｉＣａｓｐ９陽性細胞の９０％超（９３±１％、Ｐ＜０．０００１）のアポトーシス死を生じる一方で、ｉＣａｓｐ９陰性細胞は、非形質導入コントロールに類似のアポトーシス指数を保持する（２０±７％、ＣＩＤありまたはなしでの非形質導入コントロールに対してそれぞれＰ＝０．９９およびＰ＝０．６９）（図１７Ａおよび７０Ｂを参照のこと）。ｉＣａｓｐ９でのＭＳＣの形質導入後、その二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）を、５０ｎＭで完全培地中の培養物に添加した。アポトーシスを、細胞採取ならびにアネキシンＶ−ＰＥおよび７−ＡＡＤでの染色後に、ＦＡＣＳ分析によって２４時間後に評価した。同じ化合物に曝露された非形質導入コントロールＭＳＣ（コントロール／ＣＩＤ、１５％）およびＣＩＤに曝露されなかったｉＣａｓｐ９−ＣＤ１９陽性細胞（ｉＣａｓｐ陽性／ＣＩＤなし、１３％）に匹敵し、非形質導入ＭＳＣのベースラインアポトーシス率（コントロール／ＣＩＤなし、１６％）に類似した割合である、陰性集団（ｉＣａｓｐ陰性／ＣＩＤ）のわずか１９％に対して、ｉＣａｓｐ９−ＣＤ１９陽性細胞（ｉＣａｓｐ陽性／ＣＩＤ）のうちの９３％がアネキシン陽性になった。ｉＣａｐ９−ＣＤ１９陽性細胞の磁性免疫選択は、高純度に到達させ得る。その選択された細胞のうちの９５％超が、ＣＩＤへの曝露後にアポトーシス性になる。
【０４３２】
ＣＩＤへの単一曝露後の後の時点での高度に精製されたｉＣａｓｐ９陽性集団の分析は、ｉＣａｓｐ９陰性細胞の小さな画分が拡大し、ｉＣａｓｐ９陽性細胞の集団が残存するが、ｉＣａｓｐ９陽性細胞の集団はＣＩＤへの再曝露によって殺滅され得ることを示す。従って、ＣＩＤによるさらなる殺滅に耐性のｉＣａｓｐ９陽性集団は検出されなかった。ｉＣａｓｐ９−ＣＤ１９陰性ＭＳＣの集団は、ＣＩＤ導入後２４時間程度の速さで出現する。ｉＣａｓｐ９−ＣＤ１９陰性ＭＳＣの集団が予測される。なぜなら１００％純度を有する集団の達成は非現実的であり、かつそのＭＳＣは、それらのインビトロでの迅速な拡大に有利な条件において培養されている最中であるからである。ｉＣａｓｐ９−ＣＤ１９陽性集団の画分は、殺滅が１００％効率ではないという事実によって推測されるように、持続する（例えば、９９％純粋集団の９９％殺滅を仮定すると、得られる集団は、４９．７％  ｉＣａｓｐ９陽性細胞および５０．３％  ｉＣａｓｐ９陰性細胞を有する）。しかし、生存している細胞は、ＣＩＤへの再曝露によって後の時点で殺滅され得る。
【０４３３】
（ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９形質導入ＭＳＣは、非改変ＭＳＣの分化潜在能を維持し、それらの子孫は、ＣＩＤへの曝露によって殺滅される）
上記ＣＩＤが、ｉＣａｓｐ９陽性ＭＳＣの分化した子孫を選択的に殺滅し得るかどうかを決定するために、ＣＤ１９に関する免疫磁性選択を使用して、改変された集団の純度を増大させた（１ラウンドの選択後に＞９０％）。このようにして選択されたｉＣａｓｐ９陽性細胞は、インビボで、研究した全ての結合組織系統へと分化できた（図１９Ａ〜１９Ｑを参照のこと）。ヒトＭＳＣをＣＤ１９（従って、ｉＣａｓｐ９）発現に関して免疫磁性選択したところ、純度は９１％より高かった。特異的分化培地中での培養後に、ｉＣａｓｐ９陽性細胞は、脂肪細胞系統（Ａ、オイルレッドおよびメチレンアズール）、骨芽細胞系統（Ｂ、アルカリホスファターゼ−ＢＣＩＰ／ＮＢＴおよびメチレンブルー）および軟骨芽細胞系統（Ｃ、アルシアンブルーおよびヌクレアレッド）を生じることができた。これらの分化した組織は、５０ｎＭ  ＣＩＤへの曝露によってアポトーシスへと駆動される（Ｄ〜Ｎ）。未処理ｉＣａｓｐ９形質導入コントロールに見られるものとは対照的に、多くのアポトーシス小体（矢印）、細胞質膜ブレブ形成（挿入図）および細胞構造の喪失（ＤおよびＥ）；軟骨細胞小結節（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｉｃ  ｎｏｄｕｌｅ）（Ｆ〜Ｈ）、および脂肪生成培養物（Ｉ〜Ｋ）および骨形成培養物（Ｌ〜Ｎ）における広範囲のＴＵＮＥＬ陽性に注意のこと（脂肪生成条件が示される、Ｏ〜Ｑ）（Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｏ、ＤＡＰＩ；  Ｇ、Ｊ、Ｍ、Ｐ，ＴＵＮＥＬ−ＦＩＴＣ；  Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、重ね合わせ）。
【０４３４】
５０ｎＭのＣＩＤへの曝露の２４時間後、アポトーシスの顕微鏡での証拠を、脂肪生成培養物および骨形成培養物全体にわたる膜ブレブ形成、細胞収縮および剥離、ならびにアポトーシス小体の存在とともに観察した。ＴＵＮＥＬアッセイは、脂肪生成培養物および骨形成培養物ならびに軟骨小結節において広範囲に陽性を示し（図１９Ａ〜１９Ｑを参照のこと）、これは経時的に増大した。脂肪細胞分化培地中での培養後に、ｉＣａｓｐ９陽性細胞は、脂肪細胞を生じた。５０ｎＭ  ＣＩＤへの曝露後に、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の増大しつつある割合によって証明されるように、進行性のアポトーシスが観察された。２４時間後、細胞密度の有意な減少が存在した（５８４  細胞／ｍｍ２から＜１４  細胞／ｍｍ２へ）。ほぼ全てのアポトーシス細胞が、スライドから剥がれてしまい、アポトーシス細胞の割合のさらに信頼に足る計算が妨げられた。従って、ｉＣａｓｐ９は、ＭＳＣ分化後にすら機能的なままであった。その活性化は、分化した子孫の死滅を生じる。
【０４３５】
（ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９形質導入ＭＳＣは、ＣＩＤへのインビボでの曝露後に選択的アポトーシスを受ける）
静脈内注射したＭＳＣは、短いインビボ生存時間を既に有するようであるが、局所注射した細胞は、より長く生存し得、相当してより多くの顕著な有害作用を生じ得る。このような状況でのｉＣａｓｐ９自殺システムのインビボ機能性を評価するために、ＳＣＩＤマウスに、ＭＳＣを皮下注射した。ＭＳＣを、ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ遺伝子（先に示された）およびｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９遺伝子で二重形質導入した。ＭＳＣをまた、ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃで単一に形質導入した。このｅＧＦＰ陽性（および適用可能である場合には、ＣＤ１９陽性）画分を、純度＞９５％で蛍光活性化セルソーティングによって単離した。各動物に、ｉＣａｓｐ９陽性ＭＳＣおよびコントロールＭＳＣ（ともにｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ陽性）を反対側の側腹部に皮下注射した。ＭＳＣの局在を、Ｘｅｎｏｇｅｎ−ＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して評価した。別の実験セットでは、単一形質導入および二重形質導入されたＭＳＣの１：１混合物を、右側腹部に皮下注射し、上記のようにマウスにＣＩＤを与えた。ＭＳＣの皮下ペレットを、種々の時点で採取し、ゲノムＤＮＡを単離し、ｑＰＣＲを使用して、上記ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ遺伝子およびｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９遺伝子のコピー数を決定した。これら条件下では、ｉＣａｓｐ９  対  ｅＧＦＰの遺伝子コピー数の比は、全ヒト細胞の間でのｉＣａｓｐ９陽性細胞の画分に比例する（詳細については上記の方法を参照のこと）。その比を、時間ゼロがｉＣａｓｐ９陽性細胞の１００％に相当するように正規化した。ＭＳＣの皮下接種後（ＣＩＤ注射前）の一連の動物実験は、両方の細胞集団において自発的アポトーシスの証拠を示す（ベースラインの約２０％への全体的なルミネッセンスシグナルにおける低下によって示されるとおり）。これは以前から、異種モデル（xenogeneic  model）におけるＭＳＣの全身送達および局所送達後に観察された。
【０４３６】
ルミネッセンスデータは、ＣＩＤの投与前ですら、  ＭＳＣの局所送達後最初の９６時間にわたってヒトＭＳＣの実質的喪失を示し、１週間後には、およそ２０％  細胞のみが生存していた。しかし、その時点から進むと、二量体化薬物ありとなしとのｉｃａｓｐ９陽性ＭＳＣの生存の間には、有意差があった。ＭＳＣ移植の７日後に、動物に、２４時間空けて、５０μｇのＣＩＤの２回の注射を与えた。ｉＣａｓｐ９で形質導入したＭＳＣを、それらのルミネッセンスシグナルの消失によって示されるように、上記薬物によって迅速に殺滅した。ｉＣａｓｐ９に関して陰性の細胞は、上記薬物によって影響を受けなかった。上記薬物を注射しなかった動物は、ＭＳＣ移植後１ヶ月まで両方の集団においてシグナルの持続を示した。細胞殺滅をさらに定量するために、ｑＰＣＲアッセイを開発して、ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ遺伝子およびｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９遺伝子のコピー数を測定した。マウスに、二重形質導入ＭＳＣおよび単一形質導入ＭＳＣの１：１混合物を皮下注射し、ＭＳＣ移植の１週間後に上記のようにＣＩＤを投与した。ＭＳＣ外植片を、いくつかの時点で集め、ゲノムＤＮＡをそのサンプルから単離し、実質的に同一量のＤＮＡに対してｑＰＣＲアッセイを行った。これらの条件下で（方法を参照のこと）、任意の時点で、ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９  対  ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃのコピー数の比は、生存能力のあるｉＣａｓｐ９陽性細胞の画分に比例する。ｉＣａｓｐ９陽性細胞の連続的な殺滅が観察され（＞９９％）、その結果、生存しているｉＣａｓｐ９陽性細胞の割合は、１週間後に、元の集団の０．７％へと減少した。従って、ｉＣａｓｐ９で形質導入されたＭＳＣは、ＣＩＤへの曝露後にインビボで選択的に殺滅され得るが、さもなければ持続する。
【０４３７】
（考察）
誘導性自殺タンパク質を使用して安全機構を発現するようにヒトＭＳＣを操作する実施可能性は、本明細書で示される。本明細書で示される日付（date）は、ＭＳＣが、選択可能な表面マーカーＣＤ１９にカップルした自殺遺伝子ｉＣａｓｐ９で容易に形質導入され得ることを示す。共形質導入された遺伝子の発現は、ＭＳＣおよびそれらの分化した子孫の両方において安定であり、それらの表現型も分化潜在能も明らかには変化させない。これらの形質導入された細胞は、ｉＣａｓｐ９に結合する、適切な二量体化の小分子化学的誘導物質に曝される場合に、インビトロおよびインビボで殺滅され得る。
【０４３８】
細胞ベースの治療が成功するためには、移植された細胞は、それらの採取とそれらの最終的なインビボ臨床適用の間の期間を生き延びなければならない。さらに、安全な細胞ベースの治療はまた、成功裡に移植された細胞の望ましくない成長および活性をコントロールする能力を含むべきである。ＭＳＣは、顕著な副作用なしに多くの患者に投与されてきたが、近年の報告によれば、移植されたＭＳＣがそれらの機能性を高めるように、ならびに骨および軟骨を含む系統へと分化するように遺伝的にかつ後成的に改変される潜在性は、さらに調査および利用されるにつれて、さらなる保護（例えば、本明細書で示される安全スイッチ）が、細胞ベースの治療にわたるさらなるコントロール方法を提供し得ることが示される。生物学的に活性なタンパク質を放出するように遺伝子改変されたＭＳＣを受ける被験体は、自殺遺伝子によって提供される付加された安全性から特に利益を受け得る。
【０４３９】
本明細書で示される自殺システムは、他の公知の自殺システムを超えるいくつかの潜在的利点を提供する。ヌクレオシドアナログが関わるストラテジー（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）とガンシクロビル（ＧＣＶ）とを、および細菌もしくは酵母シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）と５−フルオロ−シトシン（５−ＦＣ）とを組み合わせるもの）は、細胞周期依存性であり、再生医療へのＭＳＣの適用の間に形成され得る有糸分裂後組織において有効でである見込みはない。さらに、増殖しつつある組織においてすら、有糸分裂画分は、全ての細胞を含む訳ではなく、移植片の有意な部分は、生存しかつ機能不全のままであり得る。ある場合には、自殺に必要とされるプロドラッグそれ自体が治療用途を有し得、従って、これらは、非標的器官によるそれらの代謝の結果として（例えば、多くのシトクロムＰ４５０基質）、または標的細胞による活性化後の隣接する組織への拡散に起因して（例えば、ＣＢ１９５４、細菌ニトロレダクターゼの基質）のいずれかで、排除される（例えば、ＧＣＶ）か、または毒性であり得る（例えば、５−ＦＣ）。
【０４４０】
対照的に、本明細書で示される二量体化の小分子化学的誘導物質は、ｉＣａｓｐ９を活性化するために必要とされるものより１０倍高い用量ですら、毒性の証拠を示さなかった。さらに、非ヒト酵素システム（例えば、ＨＳＶ−ｔｋおよびＤＣ）は、形質導入された細胞に対して破壊的な免疫応答という高いリスクを有する。ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子および選択マーカーＣＤ１９は両方ともヒト起源のものであり、従って、望ましくない免疫応答を導入する可能性はより低いはずである。選択マーカーの発現を、非ヒト起源の２Ａ様切断可能ペプチドによって自殺遺伝子へ連結すること（linkage）は問題を提起し得るが、この２Ａ様リンカーは、２０アミノ酸長であり、非ヒトタンパク質より免疫原性が低いようである。最後に、ｉＣａｓｐ９陽性細胞における自殺遺伝子活性化の有効性を、有利なことには、他の自殺システムを発現する細胞の殺滅と比較すると、ｉＣａｓｐ９改変Ｔ細胞のうちの９０％またはこれより多くが、臨床上おそらく有効であるレベルである、単一用量の二量体化剤の後に排除される。
【０４４１】
本明細書で示されるｉＣａｓｐ９システムはまた、他の細胞ベースのおよび／または自殺スイッチベースの治療で見られるさらなる制限を回避し得る。形質導入された構築物のサイレンシングに起因する発現の喪失は、哺乳動物細胞のレトロウイルス形質導入後に頻繁に観察される。本明細書で示される発現構築物は、このような効果の証拠を示さなかった。培養物中で１ヶ月後ですら、発現または誘導死の減少は明らかではなかった。
【０４４２】
他の細胞ベースのおよび／または自殺スイッチベースの治療においてときおり観察される別の潜在的問題は、制御されない抗アポトーシス遺伝子を有する細胞における耐性の発生である。この効果は、プログラム細胞死経路の異なるエレメント（例えば、Ｆａｓ）が関わる他の自殺システムにおいて観察されてきた。ｉＣａｓｐ９は、この制限を有する可能性がより低いことから、本明細書で示される発現構築物のための自殺遺伝子として選択された。アポトーシスカスケードの他のメンバーと比較すると、カスパーゼ−９の活性化は、アポトーシス経路において後期で起こり、従って、多くの（全てではないにしても）抗アポトーシス制御因子（例えば、ｃ−ＦＬＩＰおよびｂｃｌ−２ファミリーメンバー）の影響を回避するはずである。
【０４４３】
本明細書で示されるシステムに特異的な潜在的制限は、ｉＣａｓｐ９の自発的二量体化であり得る。これは翻って、望ましくない細胞死および不十分な持続性を引き起こし得る。この効果は、Ｆａｓを利用するある種の他の誘導性システムにおいて観察されてきた。形質導入された細胞における低い自発的死の率およびトランスジェニック細胞のインビボでの長期の持続性という観察は、この可能性が、ｉＣａｓｐ９ベースの発現構築物を使用する場合に重大な考慮事項ではないことを示す。
【０４４４】
ＭＳＣのレトロウイルス形質導入に由来する組み込み事象は、特に、レトロウイルスベクターの複数の挿入がある場合に、有害な変異誘発を潜在的に駆動し得、望ましくないコピー数効果および／または他の望ましくない効果を引き起こす。これら望ましくない効果は、レトロウイルス形質導入自殺システムの利益を相殺し得る。これら効果はしばしば、Ｔリンパ球を形質導入するために、安定なプロデューサー細胞株および類似の培養条件から得られる臨床グレードのレトロウイルス上清を使用して最小化され得る。本明細書で形質導入されかつ評価されたＴ細胞は、約１〜３の範囲の組み込み体を含む（その上清は、約１×１０６  ウイルス粒子／ｍＬの範囲で含む）。レトロウイルスベクターの代わりにレンチウイルスベクターを使用すると、特に、高い自己再生および分化潜在能を有する細胞では、遺伝毒性のリスクがさらに減少し得る。
【０４４５】
少ない割合のｉＣａｓｐ９陽性ＭＳＣが、ＣＩＤへの単一の曝露後に持続する一方で、これらの生き残っている細胞は、その後、ＣＩＤへの再曝露後に殺滅され得る。インビボでは、２用量で＞９９％が枯渇されるが、ＣＩＤの反復用量は、臨床状況では最大の枯渇のために必要とされるようである。誘導性自殺スイッチシステムを使用する場合に特別な安全性を提供するためのさらなる非限定的方法としては、投与される細胞集団の純度をさらに増大させるためのさらなるラウンドのセルソーティングおよび殺滅の効率を高めるための１より多くの自殺遺伝子システムの使用が挙げられる。
【０４４６】
上記ＣＤ１９分子（これは、Ｂリンパ球によって生理学的に発現される）を、他の利用可能な選択系（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）および短縮型低親和性神経成長因子レセプター（ΔＬＮＧＦＲ））を超えるその潜在的利点から、形質導入細胞の選択マーカーとして選択した。「ｎｅｏ」は、潜在的に免疫原性の外来タンパク質をコードし、選択培地中での７日間の培養を要し、システムの複雑さを増大させ、その選択された細胞に潜在的に損傷を与える。ΔＬＮＧＦＲ発現は、他の表面マーカーに類似の単離ストラテジーを可能にするはずであるが、これらは、臨床用途に広く利用可能ではなく、ΔＬＮＧＦＲの腫瘍形成潜在能に関するなかなか消えない懸念が残る。対照的に、臨床グレードのデバイスを使用してＣＤ１９発現によってｉＣａｓｐ９陽性細胞を磁性選択することは、容易に利用可能であり、その後の細胞成長または分化に対して顕著な影響を示していない。
【０４４７】
カスパーゼ−９安全スイッチを含む間葉系ストローマ細胞の調製および投与のために使用される手順は、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞の調製のためにも使用され得る。従って、本実施例において概説される手順に関しては、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞のいずれかが、この実施例で提供される間葉系ストローマ細胞の代わりに使用され得る。これら細胞では、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは、例えば、ＣＭＶプロモーターまたはロニン（ｒｏｎｉｎ）プロモーターとともに使用され得る。
【０４４８】
（実施例６）
（より低い基底活性およびリガンドＩＣ５０の最小の損失を有する改変カスパーゼ−９ポリペプチド）
基底シグナル伝達（アゴニストまたは活性化剤の非存在下でのシグナル伝達）は、多くの生体分子で一般的である。例えば、複数のサブファミリーに由来する６０を超える野生型Ｇプロテイン共役レセプター（ＧＰＣＲ）［１］、キナーゼ（例えば、ＥＲＫおよびａｂｌ）［２］、表面免疫グロブリン［３］、およびプロテアーゼにおいて観察されている。基底シグナル伝達は、胚性幹細胞多能性の維持、Ｂ細胞発生および分化［４〜６］、Ｔ細胞分化［２，  ７］、胸腺細胞発生［８］、エンドサイトーシスおよび薬物耐容性［９］、自己免疫［１０］から、植物生長および発生［１１］まで、非常に種々の生物学的事象に寄与すると仮定されている。その生物学的重要性は常に完全に理解されているわけでも明らかでもないが、欠陥のある基底シグナル伝達は、重大な帰結をもたらし得る。欠陥のある基底Ｇｓプロテインシグナル伝達は、網膜色素変性、色盲、腎性尿崩症、家族性ＡＣＴＨ抵抗性（ｆａｍｉｌｉａｌ  ＡＣＴＨ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、および家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症［１２，  １３］）などの疾患をもたらした。
【０４４９】
野生型イニシエーターカスパーゼ−９のホモ二量体化がエネルギー的にたとえ不利であり、野生型イニシエーターカスパーゼ−９を溶液中で大部分をモノマーにしても［１４〜１６］、プロセシングされていないカスパーゼ−９の低レベルの生来の基底活性［１５，１７］は、Ａｐａｆ−１ベースの「アポプトソーム」（その天然のアロステリック調節因子［６］）の存在下で増強される。さらに、超生理学的発現レベルおよび／または共局在は、近位にあることで駆動される二量体化（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ−ｄｒｉｖｅｎ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）をもたらし得、さらには、基底活性化を増強し得る。
【０４５０】
キメラ非改変カスパーゼ−９ポリペプチドでは、本質的なカスパーゼ−９基底活性は、カスパーゼ動員プロドメイン（Ｃａｓｐａｓｅ−Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｐｒｏ−Ｄｏｍａｉｎ）（ＣＡＲＤ）［１８］を除去し、これをコグネイト高親和性ＡＰ１９０３−結合ドメイン、ＦＫＢＰ１２−Ｆ３６Ｖで置き換えることによって有意に減少した。細胞治療のためのアポトーシス促進性「安全スイッチ」としてのその有用性は、複数の研究において十分に示されてきた［１８〜２０］。上記安全スイッチの高い特異的かつ低い基底活性は、これを細胞治療において強力なツールにした一方で、Ｇプロテイン共役レセプターとは対照的に、基底シグナル伝達を排除するための「逆作動薬」は現在存在しない［２１］。これは、製造には、およびいくつかの適用においては望ましいことであり得る。マスター細胞バンクを準備することは、キメラポリペプチドの低レベル基底活性の高い増幅に起因して、困難であることは判明している。さらに、いくつかの細胞は、カスパーゼ−９の低レベル基底活性に対して他のものより感受性が高く、形質導入された細胞の意図しないアポトーシスをもたらす［１８］。
【０４５１】
キメラカスパーゼ−９ポリペプチドの基底活性を改変するために、「妥当なデザイン」ベースの方法を、ランダムに生成される変異体に対する選択圧として複数サイクルのスクリーニングを使用する「定向進化」［２２］よりむしろ、ホモ二量体化、ＸＩＡＰ媒介性阻害、またはリン酸化（以下の表）において決定的な役割を果たすことが公知の残基に基づいて７５ｉ  Ｃａｓｐ９変異体を操作するために使用した。カスパーゼ−９の二量体化駆動活性化は、イニシエーターカスパーゼ活性化の優性モデルを熟考した［１５、２３、２４］。自発的二量体化を減少させるために、部位特異的変異誘発を、ホモ二量体化、および従って、基底カスパーゼ−９シグナル伝達にとって決定的な残基で行った。β６鎖（カスパーゼ−９の重要な二量体化界面）における５個の重要な残基（Ｇ４０２−Ｃ−Ｆ−Ｎ−Ｆ４０６）の、構成的二量体エフェクターカスパーゼ−３のそれ（Ｃ２６４−Ｉ−Ｖ−Ｓ−Ｍ２６８）での置き換えは、カスパーゼ−９を、有意な構造的再配列（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）なしに、Ａｐａｆ−１活性化に非応答性の構成的二量体タンパク質に変換した［２５］。自発的ホモ二量体化を改変するために、上記５個の残基の体系的変異誘発を、アミノ酸化学に基づいて、ならびに溶液中で主に単量体として存在するイニシエーターカスパーゼ−２、−８、−９、および−１０の相当する残基に対して行った［１４、１５］。分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）ベースの代用物殺滅アッセイ（surrogate  killing  assay）（表、下記）によって２８種のｉＣａｓｐ９変異体を作製および試験した後、Ｎ４０５Ｑ変異が、ＡＰ１９０３に対するより高いＩＣ５０を適度な（＜１０倍）コストで、基底シグナル伝達を下げることが判明した。
【０４５２】
タンパク質分解（代表的には、カスパーゼ活性化のために必要とされる）は、カスパーゼ−９活性化のために絶対的に必要とされるわけではない［２６］ので、熱力学的な「ハードル」を、自己タンパク質分解を阻害するために増大させた。さらに、ＸＩＡＰ媒介性カスパーゼ−９結合は、単量体状態においてカスパーゼ−９を捕捉して、その触媒活性および基底活性を減弱する［１４］ので、ＸＩＡＰとの相互作用にとって重要なテトラペプチド（Ａ３１６−Ｔ−Ｐ−Ｆ３１９、Ｄ３３０−Ａ−Ｉ−Ｓ−Ｓ３３４）を変異誘発することによって、ＸＩＡＰとカスパーゼ−９との間の相互作用を強化しようと試みた。これらｉＣａｓｐ−９変異体のうちの１７種から、Ｄ３３０Ａ変異が、最小（＜５倍）のＡＰ１９０３  ＩＣ５０コストで基底シグナル伝達を低下させると決定した。
【０４５３】
第３のアプローチは、カスパーゼ−９が、ＰＫＣ−ζによるＳ１４４［２７］、プロテインキナーゼＡによるＳ１８３［２８］、Ａｋｔ１によるＳ１９６［２９］のリン酸化の際にキナーゼによって阻害される、およびｃ−ａｂｌによるＹ１５３のリン酸化の際に活性化される［３０］という以前に報告された知見に基づいた。これらの「ブレーキ」は、ＩＣ５０を改善し得るか、またはリン酸化摸倣（「ホスホ摸倣（ｐｈｏｓｐｈｏｍｉｍｅｔｉｃ）」）残基での置換は、これらの「ブレーキ」を増やして、基底活性を低下させ得る。しかし、これら残基に基づく１５個の単一残基変異体のうちのいずれも、ＡＰ１９０３に対するＩＣ５０を成功裡に低下させなかった。
【０４５４】
例えば、実施例１〜５においておよび本出願全体を通じて論じられる方法などの方法は、適切な改変とともに、必要であれば、改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドに、および種々の治療用細胞に対して適用され得る。
【０４５５】
（実施例７：材料および方法）
カスパーゼ−９のＰＣＲ部位特異的変異誘発：
カスパーゼ−９の基底シグナル伝達を改変するために、ＰＣＲベースの部位特異的変異誘発［３１］を、変異含有オリゴおよびＫａｐａ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｗｏｂｕｒｎ，  ＭＡ）で行った。１８サイクルの増幅後、親プラスミドを、ＰＣＲ生成物を無傷なままにするメチル化依存性ＤｐｎＩ制限酵素で除去した。得られた反応物のうちの２μｌを、ＸＬ１−ｂｌｕｅまたはＤＨ５αを化学的に形質転換するために使用した。陽性変異体を、配列決定（ＳｅｑＷｒｉｇｈｔ，  Ｈｏｕｓｔｏｎ，  ＴＸ）を介してその後に同定した。
【０４５６】
細胞株維持およびトランスフェクション：
早期継代ＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞（ＡＴＣＣ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）を、加湿した３７℃、５％  ＣＯ２／９５％  空気雰囲気中でのトランスフェクションまで、１０％  ＦＢＳ、１００  Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、および１００  Ｕ／ｍＬ  ストレプトマイシンを補充したＩＭＤＭ、ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）中で維持した。対数増殖期にある細胞を、１５ｍＬコニカルチューブ中で１００万個の細胞あたり、ｉＣａｓｐ９変異体をコードする発現プラスミドの８００ｎｇ〜２μｇおよびＳＲαプロモーター駆動性ＳＥＡＰをコードする発現プラスミド５００ｎｇで一過性にトランスフェクトした。触媒として不活性なカスパーゼ−９（Ｃ２８５Ａ）（ＦＫＢＰドメインなし）または「空の」発現プラスミド（「ｐＳＨ１ヌル）を使用して、トランスフェクション間の全プラスミドレベルを一定に維持した。３μｌ／μｇのプラスミドＤＮＡの比のＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ（登録商標）  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用して、抗生物質の非存在下でＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション混合物のうちの１００μｌまたは２ｍＬを、それぞれ、９６ウェルプレートまたは６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ＳＥＡＰアッセイのために、トランスフェクション後の最短３時間のインキュベーション後に、ＡＰ１９０３の対数希釈物を添加した。ウェスタンブロットのために、細胞を、採取する前にＡＰ１９０３（１０ｎＭ）とともに２０分間インキュベートした。
【０４５７】
分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）アッセイ：
ＡＰ１９０３処理の２４〜４８時間後に、約１００μｌの上清を９６ウェルプレートに採取し、ＳＥＡＰ活性についてアッセイした［１９、３２］。簡潔には、熱に感受性の内因性（および血清由来）アルカリホスファターゼによって引き起こされるバックグラウンドを減少させるために、４５分間の６５℃熱変性の後に、５μｌの上清を９５μｌのＰＢＳに添加し、２Ｍ  ジエタノールアミン中に再懸濁した１μｌの１００ｍＭ  ４−メチルウンベリフェリルホスフェート（４−ＭＵＰ；  Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を含む１００μｌの基質緩衝液に添加した。ＳＥＡＰによる４−ＭＵＰの加水分解は、励起／発光（３５５／４６０ｎｍ）を有する蛍光基質を生成し、この蛍光基質は容易に測定され得る。黒色不透明９６ウェルプレートの中でアッセイを行って、ウェル間の蛍光漏出を最小にした。基底シグナル伝達およびＡＰ１９０３誘導活性の両方を試験するために、１０６  早期継代ＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞を、種々の量の野生型カスパーゼおよびＳＲαプロモーターを使用してＳＥＡＰ（細胞生存性のマーカー）を駆動する５００ｎｇの発現プラスミドで共トランスフェクトした。製造業者の示唆に従って、抗生物質なしの１ｍＬのＩＭＤＭ＋１０％  ＦＢＳを、各混合物に添加した。上記混合物のうちの１０００μｌを、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。１００μｌのＡＰ１９０３を、トランスフェクションの少なくとも３時間後に添加した。少なくとも２４時間にわたるＡＰ１９０３の添加後に、１００μｌの上清を、９６ウェルプレートに移し、６８℃で３０分間熱変性させて、内因性アルカリホスファターゼを不活化した。このアッセイのために、４−メチルウンベリフェリルホスフェート基質を、ＳＥＡＰによって４−メチルウンベリフェロン（３６４ｎｍで励起され得、４４８ｎｍの発光フィルタで検出され得る代謝産物）へと加水分解した。ＳＥＡＰは、細胞生存性のマーカーとして使用されるので、還元型ＳＥＡＰ読み取りは、増大したｉカスパーゼ−９活性と一致する。従って、ＡＰ１９０３の非存在下でのより高いＳＥＡＰ読み取りは、より低い基底活性を示す。望ましいカスパーゼ変異体は、低下した基底シグナル伝達とともにＡＰ１９０３に対する増大した感受性（すなわち、より低いＩＣ５０）を有する。この研究の目的は、ＩＣ５０を有意に損なうことなく基底シグナル伝達を低下させることである。
【０４５８】
ウェスタンブロット分析：
２μｇのプラスミドで４８〜７２時間にわたって一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞を、３７℃でＡＰ１９０３で７．５〜２０分間処理し（示されるとおり）、その後、ＨａｌｔＴＭ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌを含む５００μｌのＲＩＰＡ緩衝液（０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０／１４０ｍＭ  ＮａＣｌ／１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド／１％  デオキシコール酸ナトリウム／０．１％  ＳＤＳ）中で溶解した。この溶解物を集め、氷上で３０分間溶解した。細胞デブリをペレット化した後、重層する上清に由来するタンパク質濃度を、製造業者によって推奨されるように、ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙを用いて、９６ウェルプレート中で測定した。３０μｇのタンパク質を、２．５％  ２−メルカプトエタノールを含むＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）中で５分間、９５℃で煮沸し、その後、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  １０％  Ｔｒｉｓ／グリシンタンパク質ゲルによって分離した。膜を、１／１０００  ウサギ抗ヒトカスパーゼ−９ポリクローナル抗体、続いて、１／１０，０００  ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２二次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でプローブした。タンパク質バンドを、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏケミルミネッセント基質を使用して検出した。等しいサンプル負荷を確実にするために、ブロットを、Ｒｅｓｔｏｒｅ  ＰＬＵＳ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで６５℃で１時間にわたってストリッピングし、その後、１／１０，０００  ウサギ抗アクチンポリクローナル抗体で標識した。別段述べられなければ、全ての試薬を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。
【０４５９】
実施例１〜５においておよび本明細書全体を通じて論じられる方法および構築物は、改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドをアッセイおよび使用するためにも使用され得る。
【０４６０】
（実施例８：改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドの評価および活性）
基底活性およびＡＰ１９０３誘導活性の比較： 
改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドの基底活性およびＡＰ１９０３誘導活性の両方を試験するために、ＳＥＡＰおよび種々の量のｉＣａｓｐ９変異体で共トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞のＳＥＡＰ活性を試験した。ｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５Ｑ、およびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑは、１μｇ  ｉＣａｓｐ９／１００万個細胞（相対的ＳＥＡＰ活性単位  １４８９２８、１７９０８１、２０５７７２  対  １１４５１８）または２μｇ  ｉＣａｓｐ９／１００万個細胞（１３６８６３、１７５５２９、１７４３６６  対  ９８８８９）のいずれかでトランスフェクトした細胞に関して、非改変ｉＣａｓｐ９より有意に低い基底活性を示した。２μｇ／１００万個細胞でトランスフェクトした場合に、全３種の改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドの基底シグナル伝達は、有意に高かった（ｐ値＜０．０５）。ｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５Ｑ、およびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑはまた、ＡＰ１９０３に関する増大した推定ＩＣ５０を示したが、それらは全て、ＷＴに関して１ｐＭと比較して６ｐＭよりさらに低く（ＳＥＡＰアッセイに基づいて）、それらを潜在的に有用なアポトーシススイッチにする。
【０４６１】
タンパク質発現レベルおよびタンパク質分解の評価：
改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドの基底活性における観察された減少が、低下したタンパク質安定性またはトランスフェクション効率の変動に起因するという可能性を排除するために、およびｉＣａｓｐ９の自己タンパク質分解を試験するために、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞におけるカスパーゼ−９バリアントのタンパク質発現レベルをアッセイした。非改変キメラカスパーゼ−９ポリペプチド、ｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ、およびｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑのタンパク質レベルは全て、この研究で使用されるトランスフェクション条件下で類似のタンパク質レベルを示した。対照的に、ｉＣａｓｐ９  Ｎ４０５Ｑバンドは、特に２μｇの発現プラスミドを使用した場合に、他のものより濃いようであった。自己タンパク質分解は、上記使用したトランスフェクション条件では、おそらく生細胞のみが集められたことが原因で容易に検出可能でなかった。抗アクチンタンパク質再ブロッティングは、匹敵する溶解物量が、各レーンへと負荷されることを確認した。これらの結果は、ＳＥＡＰアッセイによって観察される、ｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５Ｑ、およびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ変異体における観察されたより低い基底シグナル伝達を支持する。
【０４６２】
考察：
ＳＥＡＰスクリーニングアッセイに基づいて、これら３種の改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドは、ｉＣａｓｐ９  ＷＴトランスフェクト体と比較して、より高いＡＰ１９０３非依存性ＳＥＡＰ活性、従って、より低い基底シグナル伝達を示した。しかし、二重変異（Ｄ３３０−Ｎ４０５Ｑ）は、単一アミノ酸変異体に対して、基底活性もＩＣ５０（０．０５ｎＭ）もいずれもさらに低下させなかった。観察された差異は、タンパク質不安定性にもトランスフェクションの間に使用されるプラスミドの異なる量（differential  amount）にも起因しないようであった。
【０４６３】
（実施例９：改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドの評価および活性）
誘導性カスパーゼ−９は、ＡＰ１９０３依存性様式において、迅速な細胞周期非依存性の細胞自律性の殺滅を提供する。この誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドの特性の改善は、さらにより広い適用性を可能にする。タンパク質のリガンド非依存性細胞傷害を減少させ、低い発現レベルでその殺滅を増大させることは、望ましい。リガンド非依存性細胞傷害は、比較的低い発現レベルでは懸念ではないが、発現のレベルが、ベクター生成の間などの、初代標的細胞におけるよりも１桁以上高いレベルに達し得る場合には、実質的な影響を有し得る。また、細胞は、ＸＩＡＰおよびＢｃｌ−２のような、細胞が発現するアポトーシスインヒビターのレベルに起因して、低いカスパーゼ発現レベルに差次的に感受性（differentially  sensitive）であり得る。従って、より低い基底活性およびＡＰ１９０３リガンドに対しておそらくより高い感受性を有するようにカスパーゼポリペプチドを再操作するために、４つの変異誘発ストラテジーを考案した。
【０４６４】
二量体化ドメイン：  カスパーゼ−９は、生理学的レベルでは溶液中で単量体であるが、アポトーシス促進Ａｐａｆ駆動性「アポプトソーム」において起こるような高い発現レベルでは、カスパーゼ−９は、二量体化し得、Ｄ３１５での自己タンパク質分解および触媒活性の大きな増大をもたらす。Ｃ２８５は活性部位の一部であるので、変異Ｃ２８５Ａは、触媒としては不活性であり、陰性コントロール構築物として使用される。二量体化は、特に５個の残基、すなわち、Ｇ４０２、Ｃ４０３、Ｆ４０４、Ｎ４０５、およびＦ４０６の非常に密な相互作用を要する。各残基に関して、アミノ酸の異なるクラス（例えば、疎水性、極性など）を表す種々のアミノ酸置換を構築した。興味深いことに、Ｇ４０２での全ての変異体（すなわち、Ｇ４０２Ａ、Ｇ４０２Ｉ、Ｇ４０２Ｑ、Ｇ４０２Ｙ）およびＣ４０３Ｐは、触媒として不活性なカスパーゼポリペプチドをもたらした。さらなるＣ４０３変異（すなわち、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、およびＣ４０３Ｔ）は、野生型カスパーゼに類似であったので、さらに追求しなかった。Ｆ４０４での変異は全て、基底活性を減少させたが、それはまた、約１  ｌｏｇから測定不能までの、ＩＣ５０に対する感受性の低下を反映した。効力の順序では、それらは、以下のとおりである：Ｆ４０４Ｙ＞Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ＞＞Ｆ４０４Ａ、Ｆ４０４Ｓ。Ｎ４０５での変異は、それぞれ、Ｎ４０５Ａの場合のように何ら効果を有さないか、Ｎ４０５Ｔにおけるように増大した基底活性を有するか、またはＮ４０５ＱおよびＮ４０５Ｆの場合のようにＩＣ５０に対して小さな（約５倍）またはより大きな有害作用に付随して低下した基底活性を有するかのいずれかであった。最後に、Ｆ４０４のように、Ｆ４０６での変異は全て基底活性を低下させ、それは、約１  ｌｏｇから測定不能までの、ＩＣ５０に対する感受性の低下を反映した。効力の順序では、それらは以下のとおりである：Ｆ４０６Ａ  Ｆ４０６Ｗ、Ｆ４０６Ｙ＞Ｆ４０６Ｔ＞＞Ｆ４０６Ｌ。
【０４６５】
溶液中で単量体（例えば、カスパーゼ−２、−８、−１０）または二量体（例えば、カスパーゼ−３）であることが公知の他のカスパーゼに由来する類似の５残基を置換することを除いて、二量体化ドメイン内で複合変異（compound  mutation）を有するいくつかのポリペプチドを構築し、試験した。ＡＡＡＡＡアラニン置換とともに、カスパーゼ−２、−３、および−８から５残基の変化を含むカスパーゼ−９ポリペプチドは全て、触媒として不活性であった一方で、カスパーゼ−１０由来の等価な残基（ＩＳＡＱＴ）は、ＩＣ５０がより高いことを除いて低下した基底活性をもたらした。
【０４６６】
全体としては、一貫してより低い基底活性の組み合わせに基づいて、ＩＣ５０に関してごく軽度の影響と組み合わせて、Ｎ４０５Ｑをさらなる実験のために選択した。効力を改善するために、Ｎ４０５Ｑ置換を有する改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドのコドン最適化したバージョン（Ｎ４０５Ｑｃｏと称する）を試験した。このポリペプチドは、野生型Ｎ４０５Ｑ置換されたカスパーゼ−９ポリペプチドよりＡＰ１９０３に対して感受性が僅かに高いようであった。
【０４６７】
切断部位変異体：    アポプトソーム内でのまたはＡＰ１９０３強制ホモ二量体化を介するカスパーゼ−９の凝集後に、Ｄ３１５での自己タンパク質分解が起こる。これは、Ａ３１６において、少なくとも一過性に、新たなアミノ末端を作り出す。興味深いことに、新たに現れたテトラペプチドである３１６ＡＴＰＦ３１９は、カスパーゼ−９阻害剤、ＸＩＡＰ（これは、二量体化について、カスパーゼ−９自体と、その二量体化モチーフＧＣＦＮＦ（上記で論じられる）において競合する）に結合する。従って、Ｄ３１５切断の最初の結果は、ＸＩＡＰ結合であり、さらなるカスパーゼ−９活性化を減弱する。しかし、第２のカスパーゼ切断部位は、Ｄ３３０に存在し、この部位は、下流のエフェクターカスパーゼであるカスパーゼ−３の標的である。アポトーシス促進圧（pro-apoptotic  pressure）が増えるにつれて、Ｄ３３０はますます切断され、残基３１６〜３３０内のＸＩＡＰ結合小ペプチドを放出し、従って、この軽減するカスパーゼ−９阻害剤（mitigating  Caspase-9  inhibitor）を取り除く。Ｄ３３０Ａ変異体を構築した。この変異体は、基底活性を低下させたが、Ｎ４０５Ｑほど低くはなかった。高コピー数でのＳＥＡＰアッセイによって、ＩＣ５０において僅かな増大が明らかになったが、初代Ｔ細胞での低コピー数では、実際には、標的細胞の改善された殺滅とともに、ＩＣ５０のわずかな増大があった。自己タンパク質分解部位Ｄ３１５での変異はまた、基底活性を低下させたが、これは、ＩＣ５０において大きな増大をもたらした。なぜならおそらくＤ３３０切断は、次にカスパーゼ活性化のために必要であったからである。Ｄ３１５ＡおよびＤ３３０Ａでの二重変異は、正確にはプロセシングされ得ない不活性な「ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）」カスパーゼ−９をもたらした。
【０４６８】
他のＤ３３０変異体を作った（Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、およびＤ３３０Ｖを含む）。Ｄ３２７での変異はまた、コンセンサスカスパーゼ−３切断部位がＤｘｘＤであるので、Ｄ３３０での切断を妨げたが、いくつかのＤ３２７変異（すなわち、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、およびＤ３２７Ｒ）は、Ｆ３２６Ｋ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｋ、Ｌ３２９Ｇ、およびＡ３３１Ｋとともに（Ｄ３３０変異とは異なって）、基底活性を低下させなかったのでさらに追求しなかった。
【０４６９】
ＸＩＡＰ結合変異体：  上記で論じられるように、Ｄ３１５での自己タンパク質分解は、ＸＩＡＰ結合テトラペプチドである３１６ＡＴＰＦ３１９を明らかにし、これは、ＸＩＡＰをカスパーゼ−９複合体へと「誘い出す」。ＡＴＰＦを、ミトコンドリア由来抗ＸＩＡＰインヒビターであるＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯからの類似のＸＩＡＰ結合テトラペプチドＡＶＰＩで置換すると、ＸＩＡＰへとより密に結合し得、基底活性を低下させ得る。しかし、この４残基置換は、効果を有しなかった。ＡＴＰＦモチーフ内での他の置換は、効果なし（すなわち、Ｔ３１７Ｃ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ）から、ＩＣ５０において非常に軽度（すなわち、Ｔ３１７Ｓ）、軽度（すなわち、Ｔ３１７Ａ）、大きい（すなわち、Ａ３１６Ｇ、Ｆ３１９Ｗ）増大までのいずれかの、低い基底活性までの範囲に及んだ。全体としては、ＸＩＡＰ結合テトラペプチドを変化させるという効果は、軽度であった；にもかかわらず、Ｔ３１７Ｓを二重変異において試験するために選択した（下記で論じられる）。なぜならＩＣ５０に対する効果は、この群の中で最も軽度であったからである。
【０４７０】
リン酸化変異体：  少数のカスパーゼ−９残基が、リン酸化の阻害性（例えば、Ｓ１４４、Ｓ１８３、Ｓ１９５、Ｓ１９６、Ｓ３０７、Ｔ３１７）または活性化（すなわち、Ｙ１５３）のいずれかの標的であると報告された。従って、酸性残基（例えば、Ａｓｐ）での置換によってリン酸化を摸倣する（「ホスホ摸倣物」）かまたはリン酸化を排除するかのいずれかの変異を試験した。一般に、大部分の変異は、ホスホ摸倣物が試行されたか否かに拘わらず、基底活性を低下させた。低い基底活性を有する変異体の中で、Ｓ１４４での変異（すなわち、Ｓ１４４ＡおよびＳ１４４Ｄ）およびＳ１４９６Ｄは、ＩＣ５０に対して識別できる効果を有さず、変異体Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、およびＳ１９６Ａは、ＩＣ５０を軽度に増大させ、変異体Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ａ、およびＳ３０７Ａは、ＩＣ５０に対して大きな有害作用を有した。低い基底活性および最小の（あるとすれば）ＩＣ５０に対する効果の組み合わせに起因して、Ｓ１４４Ａを、二重変異のために選択した（以下で論じられる）。
【０４７１】
二重変異体：  Ｄ３３０Ａバリアントの僅かに改善した効力と、基底活性をさらに低下させ得る考えられる残基とを組み合わせるために、多くのＤ３３０Ａ二重変異体を構築および試験した。代表的には、それらは、ＩＣ５０においてごく僅かな増大はあったが低い基底活性を維持した（Ｎ４０５Ｑ、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１８３Ａ、およびＳ１９６Ａにおける第２の変異を含む）。二重変異体Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｔは、より高い基底活性を有し、Ｄ３３０Ａと、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、およびＴ３１７Ｅとでの二重変異体は、触媒として不活性であった。効力を改善するかまたはＩＣ５０を減少させることが意図された低い基底活性を有する一連の二重変異体Ｎ４０５Ｑを、試験した。これらの全ては、ＣａｓｐａＣＩＤｅ−１．０に対して低い基底活性および僅かに増大したＩＣ５０の観点から、Ｎ４０５Ｑに類似であるようであり、Ｎ４０５Ｑと、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１９６Ｄ、およびＴ３１７Ｓとを含んだ。
【０４７２】
ＳＥＡＰアッセイを行って、二量体化ドメイン変異体のうちのいくつかの基底活性およびＣＩＤ感受性を研究した。Ｎ４０５Ｑは、ＡＰ１９０３独立性シグナル伝達の上方のシフトによって決定されるように、ＷＴカスパーゼ−９より低い基底活性を有する試験した変異体の中で最もＡＰ１９０３感受性であった。Ｆ４０６Ｔは、この群からの最も低いＣＩＤ感受性であった。
【０４７３】
変異体カスパーゼポリペプチドＤ３３０ＡおよびＮ４０５Ｑの二量体非依存性ＳＥＡＰ活性を、二重変異体Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑとともにアッセイした。複数のトランスフェクションの結果（Ｎ＝７〜１３）は、Ｎ４０５ＱがＤ３３０Ａより低い基底活性を有し、この二重変異体は中間であることを見出した。
【０４７４】
変異体カスパーゼポリペプチドＤ３３０ＡおよびＮ４０５Ｑの平均（＋標準偏差、ｎ＝５）ＩＣ５０を、二重変異体Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑとともに得ると、一過性のトランスフェクション活性において、Ｄ３３０Ａは、Ｎ４０５Ｑ変異体よりＡＰ１９０３に対して幾分感受性が高いが、ＷＴ  カスパーゼ−９より約２倍感受性が低いことが示される。
【０４７５】
ＳＥＡＰアッセイを、野生型（ＷＴ）カスパーゼ−９、Ｎ４０５Ｑ、不活性Ｃ２８５Ａ、およびＸＩＡＰ結合ドメイン内のいくつかのＴ３１７変異体を使用して行った。その結果は、Ｔ３１７ＳおよびＴ３１７Ａが、ＡＰｆ１９０３に対してＩＣ５０の大きなシフトなしに、基底活性を減少し得ることを示す。従って、Ｔ３１７Ｓを、Ｎ４０５Ｑとの二重変異体を作製するために選択した。
【０４７６】
上記のＳＥＡＰアッセイからのＩＣ５０は、Ｔ３１７ＡおよびＴ３１７Ｓが、より低い基底活性を有するにも拘わらず、野生型カスパーゼ−９ポリペプチドに類似のＩＣ５０を有することを示した。
【０４７７】
いくつかのＤ３３０変異体に由来する二量体非依存性ＳＥＡＰ活性は、試験したことクラスの全てのメンバー（Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｖ、Ｄ３３０Ｇ、およびＤ３３０Ｓを含む）が、野生型カスパーゼ−９より低い基底活性を有することを示した。Ｄ３３０Ａバリアントの基底およびＡＰ１９０３誘導活性化をアッセイした。１００万個のＨＥＫ２９３細胞あたり１または２μｇの変異体カスパーゼポリペプチドおよび０．５μｇのｐＳＨ１−ｋＳＥＡＰで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３／１６細胞のＳＥＡＰアッセイを、トランスフェクションの７２時間後に行った。２μｇの各発現プラスミド（ＷＴを含む）に基づいて正規化したデータを、１μｇベースのトランスフェクションからの正規化したデータと混合した。ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ａ、−Ｄ３３０Ｅ、および−Ｄ３３０Ｓは、野生型カスパーゼ−９より統計的に低い基底シグナル伝達を示した。
【０４７８】
ウェスタンブロットの結果は、Ｄ３３０変異が、Ｄ３３０での切断をブロックし、僅かに大きく（より遅く移動する）小さなバンド（＜２０ｋＤａマーカー）をもたらすことを示した。他のブロットは、Ｄ３２７変異がまた、切断をブロックすることを示す。
【０４７９】
示されたカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするレトロウイルスで５回形質導入されたＰＧ１３の複数のクローンの平均蛍光強度を、測定した。基底活性が低いほど、代表的には、遺伝子連結されたレポーターＣＤ１９とともに、カスパーゼ−９遺伝子のより高い発現レベルへと変換される。その結果は、平均して、Ｎ４０５Ｑ変異体を発現するクローンが、より高いレベルのＣＤ１９を発現し、Ｄ３３０変異体またはＷＴカスパーゼ−９を超えて、Ｎ４０５Ｑのより低い基底活性を反映することを示す。ＶＳＶ−Ｇエンベロープベースのレトロウイルス上清で交差形質導入した（ｃｒｏｓｓ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）ＰＧ１３パッケージング細胞から得られるウイルス力価に対する種々のカスパーゼ変異の効果をアッセイした。レトロウイルスマスター細胞株生成に対するＣａｓｐａＣＩＤｅ由来基底シグナル伝達の効果を試験するために、レトロウイルスパッケージング細胞株ＰＧ１３を、４μｇ／ｍｌ  トランスフェクション増強因子ポリブレンの存在下で、ＶＳＶ−Ｇベースのレトロウイルス上清で５回交差形質導入した。ＣａｓｐａＣＩＤｅ形質導入ＰＧ１３細胞をその後、形質導入の指標としてＰＥ結合体化抗ヒトＣＤ１９抗体で染色した。ＣａｓｐａＣＩＤｅ−Ｄ３３０Ａ、−Ｄ３３０Ｅ、および−Ｎ４０５Ｑ形質導入ＰＧ１３細胞は、増強されたＣＤ１９平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。これは、より高いレトロウイルスコピー数を示し、より低い基底活性を意味した。ＰＧ１３形質導入体のウイルス力価をより直接的に試験するために、ＨＴ１０８０細胞を、ウイルス上清および８μｇ／ｍｌ  ポリブレンで処理した。ＰＧ１３細胞において、ＷＴ  ｉＣａｓｐ９に対してｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ａ、−Ｎ４０５Ｑ、および−Ｄ３３０Ｅ形質導入体の増強されたＣＤ１９  ＭＦＩは、ＨＴ１０８０細胞において観察されるように、より高いウイルス力価と正に相関する。最初に低いウイルス力価（およそ１Ｅ５形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌ）に起因して、ウイルス力価における差異は、ウイルス収量を増大させるためのＨＡＴ処理の非存在下で観察されなかった。ＨＡＴ培地処理の際に、ＣａｓｐａＣＩＤｅ−Ｄ３３０Ａ、−Ｎ４０５Ｑ、または−Ｄ３３０Ｅで形質導入したＰＧ１３細胞は、より高いウイルス力価を示した。ウイルス力価（形質導入単位）を、以下の式で計算する：ウイルス力価＝（形質導入の日の細胞数）＊（％  ＣＤ１９＋）／上清の容積（ｍｌ）。より低い基底活性を有するＣａｓｐａＣＩＤｅ変異体の効果をさらに調査するために、ＣａｓｐａＣＩＤｅ形質導入ＰＧ１３細胞の個々のクローン（コロニー）を、選択および拡大した。他のコホートより高いＣＤ１９  ＭＦＩを有するＣａｓｐａＣＩＤｅ−Ｎ４０５Ｑクローンを、観察した。
【０４８０】
初代Ｔ細胞において主に単一コピーでの種々のカスパーゼポリペプチドの効果を、アッセイした。これは、これら自殺遺伝子が治療上どのように使用されるかをより正確に反映し得る。驚くべきことに、そのデータは、Ｄ３３０Ａ変異体が、低力価でＡＰ１９０３に対して実際にはより感受性が高く、２４時間アッセイで試験した場合にＷＴカスパーゼ−９と少なくとも同程度に殺滅することを示す。このＮ４０５Ｑ変異体は、ＡＰ１９０３に対して感受性がより低く、２４時間以内にそれほど効率的に標的細胞を殺滅できない。
【０４８１】
別個の健常ドナーに由来する６種の非独立性のＴ細胞サンプルを形質導入した結果は、Ｄ３３０Ａ変異体（ｍｕｔ）が、野生型カスパーゼ−９ポリペプチドよりＡＰ１９０３に対して感受性がより高いことを示した。
【０４８２】
ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ａ変異体は、形質導入されたＴ細胞において改善されたＡＰ１９０３依存性細胞傷害を示した。健常ドナー（ｎ＝６）由来の初代Ｔ細胞を、変異または野生型ｉＣａｓｐ９またはｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ａ、およびΔＣＤ１９細胞表面マーカーをコードするレトロウイルスで形質導入した。形質導入後、ｉＣａｓｐ９形質導入Ｔ細胞を、ＣＤ１９マイクロビーズおよび磁性カラムを使用して精製した。次いで、Ｔ細胞をＡＰ１９０３（０〜１００ｎＭ）に曝し、ＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞に関して、フローサイトメトリーによって２４時間後に測定した。ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０ＡのＩＣ５０は、野生型ｉＣａｓｐ９より有意に低かった（ｐ＝０．００２）。
【０４８３】
いくつかのＤ３３０変異体の結果は、試験した全６種のＤ３３０変異体（Ｄ３３０Ａ、Ｅ、Ｎ、Ｖ、Ｇ、およびＳ）が、野生型カスパーゼ−９ポリペプチドよりＡＰ１９０３に対して感受性が高いことを明らかにした。
【０４８４】
Ｎ４０５Ｑ変異体は、他の二量体化ドメイン変異体（Ｎ４０４ＹおよびＮ４０６Ｙを含む）とともに、１０日以内に野生型カスパーゼ−９ポリペプチドまたはＤ３３０Ａとは区別できない、標的Ｔ細胞を殺滅し得る。０日目にＡＰ１９０３を受けた細胞に、４日目に第２の用量のＡＰ１９０３を与えた。このデータは、制御される効力スイッチの一部としてＮ４０５Ｑのように、低下した感受性カスパーゼ−９変異体の使用を支持する。
【０４８５】
Ｎ４０５Ｑカスパーゼポリペプチドのコドン最適化（「Ｎ４０５Ｑｃｏ」といわれる）の結果は、コドン最適化が、おそらく発現においてのみ増大をもたらし、誘導性カスパーゼ機能に対して非常に僅かな効果を有することを明らかにした。これは、元のカスパーゼ−９遺伝子における共通コドンの使用を反映するようである。
【０４８６】
カスパーゼ−９ポリペプチドは、インビボで用量応答曲線を有し、これは、カスパーゼ−９ポリペプチドを発現するＴ細胞の種々の画分を排除するために使用され得る。このデータはまた、０．５ｍｇ／ｋｇ  ＡＰ１９０３の用量が、大部分の改変されたＴ細胞をインビボで排除するために十分であることを示す。
【０４８７】
Ｄ３３０Ｅ  ｉＣａｓｐ９で形質導入したＴ細胞のインビボでのＡＰ１９０３用量依存性排除をアッセイした。Ｔ細胞を、ＳＦＧ−ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ｅ−２Ａ−ΔＣＤ１９レトロウイルスで形質導入し、免疫不全マウス（ＮＳＧ）へとｉ．ｖ．注射した。２４時間後に、マウスに、ＡＰ１９０３  （０〜５ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．注射した。さらに２４時間後、マウスを屠殺し、脾臓由来のリンパ球（Ａ）を単離し、ヒトＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞の頻度に関してフローサイトメトリーによって分析した。これは、ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ｅが、ＡＰ１９０３に応答して野生型ｉＣａｓｐ９と類似のインビボ細胞傷害プロフィールを示すことを示す
【０４８８】
結論：  論じられるように、これまでのところ７８個の変異体のこの分析から、単一の変異体の変異（single  mutant  mutations）のうち、Ｄ３３０変異は、幾分改善された効力と僅かに減少した基底活性とを合わせもつ。Ｎ４０５Ｑ変異体は魅力的でもある。なぜならそれらは、非常に低い基底活性と、ＩＣ５０において４〜５倍の増大を反映するごく僅かに減少した効力とを有するからである。初代Ｔ細胞での実験は、Ｎ４０５Ｑ変異体が、標的細胞を効率的に、しかしＤ３３０変異体より幾分遅い動力学で殺滅し得るということを示した。これは、Ｎ４０５Ｑ変異体を、ＡＰ１９０３の最初の投与後に部分的に殺滅し、ＡＰ１９０３の２回目の投与で完全な殺滅まで達成され得る段階的自殺スイッチとして潜在的に非常に有用にする。
【０４８９】
以下の表は、本明細書で論じられる方法に従って調製およびアッセイされた種々の改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドに関する基底活性およびＩＣ５０のまとめを提供する。この結果は、一度試験したサブセット（すなわち、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ｅ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ａ３３１Ｋ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、および以下の二重変異体：Ｄ３３０ＡとＳ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、またはＳ１８３Ａ；およびＮ４０５ＱとＳ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１９６Ｄ、またはＴ３１７Ｓ）を除いて、最低２回の独立したＳＥＡＰアッセイに基づく。４回の多面的アプローチを採用して、試験される改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドを生成した。「機能しない（ｄｅａｄ）」改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、もはやＡＰ１９０３に応答しなかった。二重変異体は、ハイフンによって示される。例えば、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑは、３３０位での置換および４０５位での置換を有する改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを示す。
【０４９０】
【表５−１】
2020096640.tif 000008
【表５−２】
2020096640.tif 000009
【表５−３】
2020096640.tif 000010
【０４９１】
実施例６〜９において引用された参考文献
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【０４９２】
キメラカスパーゼポリペプチドは、アミノ酸置換（より低い基底活性を有するカスパーゼポリペプチドを生じるアミノ酸置換を含む）を含み得る。これらは、例えば、ｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ、ｉＣａｓｐ９  Ｎ４０５Ｑ、およびｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ  Ｎ４０５Ｑを含み得、ＳＥＡＰレポーターベースの代用物殺滅アッセイにおいてそれらのＡＰ１９０３  ＩＣ５０に対して最小の有害な作用とともに、それぞれ、低いから検出不能までの基底活性を示した。
【０４９３】
（実施例１０：特定の核酸配列およびアミノ酸配列の例）
以下は、キメラタンパク質およびＣＤ１９マーカーの発現のために使用され得る構築物の例を提供するヌクレオチド配列である。この図は、ＳＦＧ．ｉＣ９．２Ａ．２ＣＤ１９．ｇｃｓ構築物を示す。
【０４９４】
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【０４９５】
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表６−７】
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【表６−８】
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【表６−９】
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【表６−１０】
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【表６−１１】
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【表６−１２】
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【表６−１３】
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【表６−１４】
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【表６−１５】
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【表６−１６】
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【表６−１７】
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【表６−１８】
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【表６−１９】
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【表６−２０】
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【表６−２１】
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【表６−２２】
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【表６−２３】
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【表６−２４】
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【表６−２５】
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【表６−２６】
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【表６−２７】
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【表６−２８】
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【表６−２９】
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【表６−３０】
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【表６−３１】
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【表６−３２】
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【表６−３３】
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【表６−３４】
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【表６−３５】
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【表６−３６】
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【表６−３７】
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【表６−３８】
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【表６−３９】
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【表６−４０】
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【表６−４１】
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【表６−４２】
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【表６−４３】
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【表６−４４】
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【表６−４５】
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【表６−４６】
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【０４９６】
ポリペプチドをコードするプラスミド挿入物の部分的配列は、２Ａリンカーによって隔てられた、誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドおよびＣＤ１９に結合するキメラ抗原レセプターをコードする（ここでこの２つのカスパーゼ−９ポリペプチドおよびキメラ抗原レセプターは翻訳の間に分断される）。本明細書で提供されるキメラ抗原レセプターの例は、共刺激ポリペプチド（例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢおよびＯＸ４０などが挙げられるが、これらに限定されない）を含めることによってさらに改変され得る。本明細書で提供される誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドは、誘導性改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド（例えば、本明細書で提供されるものなど）によって置換され得る。
【０４９７】
【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【０４９８】
（ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターおよびキメラ刺激分子の発現）
以下の実施例は、本願において提供されるように、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターおよびキメラ刺激分子に関する組成物および方法を論じる。カスパーゼ−９ベースの安全スイッチ、およびＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターまたはキメラ刺激分子を発現する細胞におけるその使用に関する組成物および方法もまた、含まれる。
【０４９９】
（実施例１１：ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターのデザインおよび活性）
（ＭＣ−ＣＡＲ構築物のデザイン）
誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０実験からの活性化データに基づいて、従来の内部ドメイン（例えば、ＣＤ２８および４−１ＢＢ）の代わりに、ＣＡＲ分子におけるＭＣシグナル伝達の潜在性を試験した。ＭＣ（ＡＰ１９０３結合ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域なし）を、ＰＳＣＡ．ζの中にサブクローニングして、ＣＤ２８内部ドメインの位置を模倣した。レトロウイルスを、３つの構築物の各々に関して生成し、ヒトＴ細胞を形質導入し、その後、形質導入効率を測定して、ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζが発現され得ることを実証した。これらＣＡＲ構築物の各々を有するＴ細胞が、ＰＳＣＡ＋腫瘍細胞を認識するそれらの能力を保持することを確認するために、６時間の細胞傷害アッセイを行った。これは、Ｃａｐａｎ−１標的細胞の溶解を示した。従って、ＣＡＲ分子の細胞質領域へのＭＣの付加は、ＣＡＲ発現または標的細胞上の抗原の認識に影響を及ぼさない。
【０５００】
ＭＣ共刺激は、ＣＡＲ改変Ｔ細胞におけるＴ細胞殺滅、増殖および生存を増強する。短期間細胞傷害アッセイにおいて実証されるように、上記３種のＣＡＲデザインの各々は、Ｃａｐａｎ−１腫瘍細胞を認識および溶解する能力を示した。エフェクターＴ細胞における細胞溶解エフェクター機能は、腫瘍認識後に予め形成されたグランザイムおよびパーフォリンの放出によって媒介され、ＣＤ３ζを介する活性化は、共刺激の必要性なしにこのプロセスを誘導するために十分である。第１世代ＣＡＲ  Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３ζ細胞質領域のみで構築されたＣＡＲ）は、腫瘍細胞を溶解し得る；しかし、生存および増殖は、共刺激の欠如に起因して損なわれる。よって、ＣＤ２８もしくは４−１ＢＢ共刺激ドメイン構築物の付加は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の生存および増殖の能力を有意に改善した。
【０５０１】
ＭＣが生存および増殖に影響を及ぼす共刺激シグナルを同様に提供し得るかどうかを試験するために、共培養アッセイを、高い腫瘍：Ｔ細胞比（１：１、１：５、１：１０  Ｔ細胞  対  腫瘍細胞）の下で、ＰＳＣＡ＋  Ｃａｐａｎ−１腫瘍細胞で行った。Ｔ細胞および腫瘍細胞の数が等しかった（１：１）場合、非形質導入コントロールＴ細胞と比べて全３種の構築物からＣａｐａｎ−１−ＧＦＰ細胞の効率的な殺滅が存在した。しかし、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、多数の腫瘍細胞（１：１０）でチャレンジした場合、ＣＡＲ分子がＭＣもしくはＣＤ２８のいずれかを含んだ場合のみ、Ｃａｐａｎ−１−ＧＦＰ腫瘍細胞の有意な減少が存在した。
【０５０２】
これら２種のＣＡＲによる共刺激の機構をさらに試験するために、細胞の生存率および増殖をアッセイした。ＭＣもしくはＣＤ２８を含むＰＳＣＡ  ＣＡＲは、非形質導入Ｔ細胞およびＣＤ３ζのみＣＡＲと比べて改善された生存率を示し、ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζおよびＰＳＣＡ．２８．ζによるＴ細胞増殖は、有意に増強された。他の群は、共刺激シグナル伝達領域を含むＣＡＲがＴ細胞の重要な生存および成長分子であるＩＬ−２（４）を生成することを示したので、ＥＬＩＳＡを、Ｃａｐａｎ−１腫瘍細胞でチャレンジしたＣＡＲ  Ｔ細胞に由来する上清に対して行った。ＰＳＣＡ．２８．ζは、高レベルのＩＬ−２を生成したが、ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζシグナル伝達はまた、有意なレベルのＩＬ−２（これは、これらアッセイにおいて観察されたＴ細胞生存および増殖に寄与するようである）を生成した。さらに、ＣＡＲ改変Ｔ細胞によるＩＬ−６生成を試験した。なぜならＩＬ−６は、ＣＡＲ改変Ｔ細胞の効力および有効性において重要なサイトカインとして関与している（１５）からである。ＩＬ−２とは対照的に、ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζは、初代Ｔ細胞におけるｉＭＣ活性化がＩＬ−６を誘導するという観察と一致して、ＰＳＣＡ．２８．ζと比べてより高レベルのＩＬ−６を生成した。まとめると、これらデータは、ＭＣを介する共刺激が、ＣＤ２８のものに類似の効果を生じ、それによって、腫瘍細胞認識後に、ＣＡＲ改変Ｔ細胞がＩＬ−２およびＩＬ−６を生成する（これは、Ｔ細胞生存を増強する）ことを示唆する。
【０５０３】
ＣＡＲ改変Ｔ細胞を使用する免疫療法は、種々の悪性腫瘍の処置に関して大いに有望である。ＣＡＲは、最初に単一のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）を用いてデザインされた（１６〜１９）一方で、ＣＡＲ免疫療法の実施可能性を評価する臨床試験は、限られた臨床上の利益を示した（１，２，２０，２１）。これは、腫瘍認識後にＴ細胞の不完全な活性化（これは、インビボで制限された持続性および増殖をもたらす）に主に起因した（２２）。この欠陥に対処するために、ＣＡＲを、別の刺激ドメイン（しばしば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳおよびＤＡＰ１０を含むＴ細胞共刺激分子の細胞質部分に由来した）（４，２３〜３０）を含むように操作した。これは、ＣＡＲ  Ｔ細胞が、標的抗原の結合の際に適切な共刺激を受けることを可能にする。実際に、難治性急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の処置ための、ＣＤ２８または４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを有する抗ＣＤ１９  ＣＡＲで行った臨床試験は、養子移入の後に、印象的なＴ細胞持続性、増殖および一連の腫瘍殺滅を実証した（６〜８）。
【０５０４】
ＣＤ２８共刺激は、ＣＤ１９＋リンパ腫の処置に関して明確な臨床上の利点を提供する。Ｓａｖｏｌｄｏおよび共同研究者らは、第１世代ＣＡＲ（ＣＤ１９．ζ）および第２世代ＣＡＲ（ＣＤ１９．２８．ζ）を比較するＣＡＲ−Ｔ細胞臨床試験を行ったところ、養子移入後にＣＤ２８がＴ細胞持続性および増殖を増強することを見出した（３１）。第２世代ＣＡＲの主な機能のうちの１つは、ＣＤ３ζによるＮＦＡＴ転写因子の活性化（シグナル１）、およびＣＤ２８または４−１ＢＢによるＮＦ−κＢの活性化（シグナル２）を介してＴ細胞の生存および成長を支持するＩＬ−２を生成する能力である（３２）。これは、ＮＦ−κＢを同様に活性化した他の分子が、ＣＡＲ分子内のＣＤ３ζ鎖と対になり得ることを示唆した。本発明者らのアプローチは、樹状細胞（ＤＣ）ワクチンのアジュバントとして本来は開発されたＴ細胞共刺激分子を使用した（１２，３３）。ＤＣの完全な活性化またはライセンス供与のために、ＴＬＲシグナル伝達は、ＴＮＦファミリーメンバー、ＣＤ４０（これは、抗原でプライミングされたＣＤ４＋  Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌと相互作用する）のアップレギュレーションに通常は関与する。ｉＭＣは、ＤＣにおいてＮＦ−κＢの強力なアクチベーターであったので、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０を組み込んだＣＡＲでのＴ細胞の形質導入は、Ｔ細胞への必要とされた共刺激（シグナル２）を提供し得、それらの生存および増殖を増強し得る。
【０５０５】
一連の実験を行って、ＭｙＤ８８、ＣＤ４０または両方の成分が、ｉＭＣ分子を使用する最適なＴ細胞刺激に必要とされるかどうかを試験した。顕著なことには、ＭｙＤ８８もＣＤ４０も、サイトカイン生成（ＩＬ−２およびＩＬ−６）によって測定される場合にはＴ細胞活性化を十分に誘導できないが、単一の融合タンパク質として組み合わされた場合には、強力なＴ細胞活性化を誘導し得ることが見出された。ＭＣを組み込むＰＳＣＡ  ＣＡＲを構築し、その後、第１世代（ＰＳＣＡ．ζ）ＣＡＲおよび第２世代（ＰＳＣＡ．２８．ζ）ＣＡＲに対してその機能を比較した。ここでＭＣは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の生存および増殖を、ＣＤ２８内部ドメインと匹敵するレベルへと増強することが見出された。このことは、共刺激が十分であったことを示唆した。ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζ  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、ＰＳＣＡ．２８．ζより低レベルのＩＬ−２を生成した一方で、分泌レベルは、非形質導入Ｔ細胞およびＰＳＣＡ．ζ  ＣＡＲで形質導入したＴ細胞より有意に高かった。他方で、ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζ  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、ＰＳＣＡ．２８．ζ形質導入Ｔ細胞より有意に高いレベルのＩＬ−６（Ｔ細胞活性化と関連する重要なサイトカイン）を分泌した。このことは、ＭＣが、インビボで改善された腫瘍細胞殺滅へと翻訳され得るＣＡＲ機能に特有の特性を付与することを示した。関連するシグナル伝達経路の分子分析がなお行われる必要はある一方で、これら実験は、ＭＣが、細胞外ＣＡＲドメインによる抗原認識後にＮＦ−κＢ（シグナル２）を活性化し得ることを示す。
【０５０６】
ＭＣ−ＣＡＲのデザインおよび機能検証。ＣＤ３ζのみ、またはＣＤ２８とともにもしくはＭＣ内部ドメインとともに組み込む３種のＰＳＣＡ  ＣＡＲ構築物をデザインした。形質導入効率（パーセンテージ）を、抗ＣＡＲ−ＡＰＣ（ＩｇＧ１  ＣＨ２ＣＨ３ドメインを認識する）によって測定した。Ｃ）ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζ  ＣＡＲでのＴ細胞の高い形質導入効率を実証するフローサイトメトリー分析。Ｄ）１：１  Ｔ細胞  対  腫瘍細胞の比での６時間のＬＤＨ放出アッセイにおける、ＣＡＲ改変Ｔ細胞によるＰＳＣＡ＋  Ｃａｐａｎ−１腫瘍細胞の特異的溶解の分析。＊は０．０５未満のｐ値を示す。
【０５０７】
ＭＣ−ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、長期間共培養アッセイにおいてＣａｐａｎ−１腫瘍細胞を殺滅する。１：１比において培養して７日後の、Ｃａｐａｎ−１−ＧＦＰ腫瘍細胞とともに培養したＣＡＲ改変Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。１：１および１：１０のＴ細胞  対  腫瘍細胞比での共培養アッセイにおけるフローサイトメトリーによる生存性ＧＦＰ＋細胞の定量。
【０５０８】
ＭＣおよびＣＤ２８共刺激は、Ｔ細胞生存、増殖およびサイトカイン生成を高める。１：１０のＴ細胞  対  腫瘍細胞共培養アッセイから単離されたＴ細胞を、細胞生存率および細胞数に関してアッセイして、腫瘍細胞曝露に応じた生存および増殖を評価した。共培養アッセイからの上清を、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２およびＩＬ−６生成に関してその後測定した。
【０５０９】
誘導性共刺激分子のデザインおよびＴ細胞活性化に対する効果。ＦＫＢＰｖ３６  ＡＰ１９０３−結合ドメイン（Ｆｖ’．Ｆｖ）のみ、またはＭｙＤ８８、ＣＤ４０もしくはＭｙＤ８８／ＣＤ４０融合タンパク質とともに組み込む４種のベクターを、デザインした。ＣＤ３＋ＣＤ１９＋フローサイトメトリー分析を使用する初代活性化Ｔ細胞の形質導入効率。１０ｎＭ  ＡＰ１９０３ありおよびなしでの活性化後の改変されたＴ細胞のＩＦＮ−γ生成の分析。１０ｎＭ  ＡＰ１９０３ありおよびなしでの活性化後の改変されたＴ細胞のＩＬ−６生成の分析。＊は０．０５未満のｐ値を示す。
【０５１０】
生存および成長の利点とは別に、ＭＣ誘導共刺激はまた、ＣＡＲ改変Ｔ細胞にさらなる機能を提供し得る。Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖおよび共同研究者らは近年、ＭｙＤ８８シグナル伝達が、Ｔｈ１およびＴｈ１７の両方の応答にとって必須であり、それがＩＬ−１を介して作用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞を調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）駆動阻害に対して不応性にすることを実証した（３４）。ｉＭＣでの実験は、ＩＬ−１αおよびβが、ＡＰ１９０３活性化後に分泌されることを示す。さらに、Ｍａｒｔｉｎらは、Ｒａｓ、ＰＩ３ＫおよびプロテインキナーゼＣを介するＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＣＤ４０シグナル伝達が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇ細胞を溶解する細胞傷害性メディエーターであるグランザイムおよびパーフォリンのＮＦ−κＢ依存性誘導を生じることを実証した（３５）。従って、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０共活性化は、ＣＡＲ−Ｔ細胞をＴｒｅｇ細胞の免疫抑制効果（固形腫瘍および他のタイプのがんの処置において決定的に重要であり得る機能）に抵抗性にし得る。
【０５１１】
まとめると、ＭＣは、ＣＡＲ分子へと組み込まれ得、レトロウイルスで形質導入された初代Ｔ細胞は、明確な毒性またはＣＡＲ安定性の問題なしに、ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζを発現し得る。さらに、ＭＣは、類似の共刺激をＣＤ２８の共刺激に提供するようである。ここで形質導入されたＴ細胞は、第１世代ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞と比べて改善された生存率、増殖および腫瘍殺滅を示す。  ＭＣが、ＣＡＲにさらなる利益（例えば、Ｔｒｅｇ細胞の阻害性効果に対する耐性）を付加するかどうかを決定するためのさらなる実験は、考慮され得る。
【０５１２】
（実施例１２：参考文献）
以下の参考文献は、例えば、実施例１１におけるものを含め、引用されるか、または関連し得るさらなる情報を提供する。
【０５１３】
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【０５１４】
（実施例１３：ＭＣ共刺激は、ＣＤ１９  ＣＡＲの機能および増殖を増強する）
ＣＤ１９抗原を認識する抗原認識部分を使用する、本明細書で論じられるものに類似の実験が提供される。本明細書で提供されるベクターは、ＣＤ１９＋腫瘍細胞を標的化するＭｙＤ８８／ＣＤ４０  ＣＡＲ構築物（これは、誘導性カスパーゼ−９安全スイッチも組み込む）を構築するために改変され得ることは、理解される。
【０５１５】
ＭＣ共刺激が、他の抗原を標的化するＣＡＲにおいて機能するかどうかを試験するために、Ｔ細胞を、ＣＤ１９．ζまたはＣＤ１９．ＭＣ．ζのいずれかで改変した。改変された細胞のＣＤ１９＋  バーキットリンパ腫細胞株（ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ）に対する細胞傷害、活性化および生存をアッセイした。共培養アッセイにおいて、いずれかのＣＡＲで形質導入したＴ細胞は、１：１程度の低さのエフェクター  対  標的比でＣＤ１９＋  Ｒａｊｉ細胞の殺滅を示した。しかし、共培養アッセイからのサイトカイン生成の分析は、ＣＤ１９．ＭＣ．ζ形質導入Ｔ細胞が、ＣＤ１９．ζと比べてより高レベルのＩＬ−２およびＩＬ−６を生成することを示した。これは、ｉＭＣおよびＭＣシグナル伝達ドメインを含むＰＳＣＡ  ＣＡＲで観察された共刺激効果と一致する。さらに、ＣＤ１９．ＭＣ．ζで形質導入したＴ細胞は、Ｒａｊｉ腫瘍細胞による活性化後に増強された増殖を示した。これらデータは、ＣＡＲ分子におけるＭＣシグナル伝達が、腫瘍細胞上で発現される標的抗原へのライゲーション後に、Ｔ細胞活性化、生存および増殖を改善することを実証する先の実験を裏付ける。
【０５１６】
ｐＢＰ０５２６−ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９ｗｔ．２Ａ．ＣＤ１９ｓｃＦｖ．ＣＤ３４ｅ．ＣＤ８ｓｔｍ．ＭＣ．ゼータ
【化２３】
2020096640.tif 000079
【化２４】
2020096640.tif 000080
【化２５】
2020096640.tif 000081
【化２６】
2020096640.tif 000082
【化２７】
2020096640.tif 000083
【化２８】
2020096640.tif 000084
【０５１７】
（実施例１４：ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターおよび誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドを共発現するＴ細胞のサイトカイン生成）
種々のキメラ抗原レセプター構築物を作製して、抗原への曝露後の形質導入Ｔ細胞のサイトカイン生成を比較した。上記キメラ抗原レセプター構築物は全て、ＣＤ１９に結合される抗原認識領域を有した。本明細書で提供されるベクターが、誘導性カスパーゼ−９安全スイッチをも組み込むＣＡＲ構築物を構築するために改変され得ることは、理解される。このＣＡＲ構築物がＦＲＢドメインをさらに含み得ることは、さらに理解される。
【０５１８】
（実施例１５：Ｈｅｒ２＋腫瘍細胞を標的化するためのＭｙＤ８８／ＣＤ４０  ＣＡＲ構築物の例）
本明細書で提供されるベクターがＨｅｒ２＋腫瘍細胞を標的とするＭｙＤ８８／ＣＤ４０  ＣＡＲ構築物（これは、誘導性カスパーゼ−９安全スイッチをも組み込む）を構築するために改変され得ることは、理解される。上記ＣＡＲ構築物がＦＲＢドメインをさらに含み得ることは、さらに理解される。
SFG-Her2scFv.CD34e.CD8stm.MC.ゼータ配列
【化２９】
2020096640.tif 000085
【化３０】
2020096640.tif 000086
【化３１】
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【化３２】
2020096640.tif 000088
【０５１９】
（さらなる配列）
【化３３】
2020096640.tif 000089
【化３４】
2020096640.tif 000090
【化３５】
2020096640.tif 000091
【化３６】
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【化３７】
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【化３８】
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【化３９】
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【化４０】
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【化４１】
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【化４２】
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【化４３】
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【化４４】
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【化４５】
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【化４６】
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【化４７】
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【化４８】
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【０５２０】
（実施例１６：改善された治療用細胞二量体スイッチの開発）
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して指向されるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現する自家Ｔ細胞を使用する治療は、客観的奏効（ＯＲ）率が９０％に達するある種のタイプの白血病（「液性腫瘍」）およびリンパ腫の処置に対して形質転換効果を有する。それらが臨床上大いに有望であることおよびそれに伴う強い関心が予測できるにも関わらず、この成功は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）に典型的な、観察される高レベルのオンターゲット、オフ腫瘍有害事象によって抑えられる。これらの革命的な処置のリスクを最小にしながら、その利益を維持するために、キメラカスパーゼポリペプチドベースの自殺遺伝子システムは開発された（これは、リガンド結合ドメイン（ＦＫＢＰ１２ｖ３６と称される）に融合された、改変されたカスパーゼ−９タンパク質の合成リガンド媒介性二量体化に基づく）。ＦＫＢＰ１２ｖ３６に結合する小分子二量体化剤であるリミズシド（ＡＰ１９０３）の存在下で、カスパーゼ−９は活性化され、標的細胞の迅速なアポトーシスがもたらされる。低減したレベルのリミズシドの添加は、抑えられた殺滅率をもたらし得、Ｔ細胞排除の量が、キメラカスパーゼ改変Ｔ細胞のほぼなしからほぼ完全な排除まで制御されることを可能にし得る。この「二量体」スイッチの利用性を最大にするために、用量応答曲線の傾きは、可能な限りゆるやかであるべきである；さもなければ、正確な用量の投与は、困難である。最新の、第１世代の、臨床的ｉカスパーゼ−９構築物を用いると、約１．５〜２  ｌｏｇを網羅する用量応答曲線が観察された。
【０５２１】
治療用細胞二量体機能に対して改善するために、第２のレベルのコントロールは、カスパーゼ−９凝集物に添加され得、ラパマイシン駆動性の低い凝集レベルを、リミズシド駆動性の高い二量体化レベルから分離する。第１のコントロールレベルにおいて、キメラカスパーゼポリペプチドは、ラパマイシン／シロリムス（または非免疫抑制アナログ）によって、そのカルボキシ末端に８９−アミノ酸ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメイン（ｍＴＯＲ内にコードされる）の１またはこれより多くのコピーを含むように改変されるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）へと動員される（図３、左パネル）。ｉカスパーゼ−９のリミズシド駆動性ホモ二量体化に対して、リミズシド結合したＦＫＢＰ１２ｖ３６（約０．１ｎＭ）に対して、ＦＲＢに対するラパマイシン結合したＦＫＢＰ１２ｖ３６の相対的親和性（Ｋｄ  約４ｎＭ）および架橋されたタンパク質の「千鳥状（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）」の幾何的配置の両方に起因して、カスパーゼ−９オリゴマー化のレベルは減少されると推定される。「微調整（ｆｉｎｅ−ｔｕｎｉｎｇ）のさらなるレベルが、各ＣＡＲに融合されるＦＲＢドメインの数を変化させることによってＣＡＲドッキング部位において提供され得る。それに対して、標的依存の特異性は、通常の標的駆動性ＣＡＲクラスター化によって提供され、これは翻って、ラパマイシンの存在下でキメラカスパーゼポリペプチドクラスター化に変換されるべきである。最大の細胞排除レベルが必要とされる場合、リミズシドはまた、最新のプロトコル（すなわち、現在は、０．４  ｍｇ／ｋｇの２時間の注入で）の下で投与され得る（図３、右パネル）。
【０５２２】
方法：
ラパログ制御されるキメラカスパーゼポリペプチドのベクター：  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ研究室は、ｍＴＯＲ／ＦＲＡＰから最小ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメイン（残基２０２５〜２１１４）を最初に同定し、それをラパマイシン解離定数（Ｋｄ）  約４ｎＭを有すると決定した（Ｃｈｅｎ  Ｊら  （９５）  ＰＮＡＳ  ９２，  ４９４７−５１）。その後の研究から、非免疫抑制性「隆起した（ｂｕｍｐｅｄ）」ラパマイシンアナログ（「ラパログ」）に対して比較的高い親和性で結合するＦＲＢの直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）変異体（例えば、ＦＲＢｌ（Ｌ２０９８）が同定された（Ｌｉｂｅｒｌｅｓ  ＳＤ  （９７）  ＰＮＡＳ  ９４，  ７８２５−３０；  Ｂａｙｌｅ  ＪＨ  （０６）  Ｃｈｅｍ  ＆  Ｂｉｏｌ  １３，  ９９−１０７）。ＣａｓｐａＣＩＤｅを動員し得る改変されたＭＣ−ＣＡＲを開発するために、カルボキシ末端ＣＤ３ζドメイン（ｐＢＰ０５２６由来）および（ｐＢＰ０５４５、図７）を、１または２個のタンデムＦＲＢIドメインに、ＭｙＤ８８、ＣＤ４０、およびＣＤ３ζドメインを含む市販の合成ＳａｌＩ−ＭｌｕＩフラグメントを使用して融合して、それぞれ、ベクターｐＢＰ０６１２およびｐＢＰ０６１１を得る（図４および５、ならび表７および８）。このアプローチはまた、標準の「非ＭｙＤ８８／ＣＤ４０」構築物（例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０、および／または４−１ＢＢ、ならびにＣＤ３ζを含む構築物）を含むいかなるＣＡＲ構築物にも適用可能であるはずである。
【０５２３】
結果：
２個のタンデムＦＲＢｌドメインを、第１世代Ｈｅｒ２−ＣＡＲまたは誘導性ｉカスパーゼ−９を共発現する第１世代ＣＤ１９−ＣＡＲのいずれかに融合した。２９３細胞を、構成的レポータープラスミド、ＳＲα−ＳＥＡＰで、Ｈｅｒ２−ＣＡＲ−ＦＲＢｌ２、ｉカスパーゼ−９、Ｈｅｒ２−ＣＡＲ−ＦＲＢｌ２＋ｉＣａｓｐ９、ｉＣ９−ＣＡＲ（１９）．ＦＲＢｌ２（ＣＤ１９−ＣＡＲ−ＦＲＢｌ２およびｉカスパーゼ９の両方を共発現する）をコードする正規化したレベルの発現プラスミド、またはコントロールベクターとともに一過性にトランスフェクトした。２４時間後に、細胞を洗浄し、ラパマイシンまたはリミズシドの半対数希釈物とともに二連のウェルへと分けた。薬物とともに一晩インキュベーションした後、ＳＥＡＰ活性を決定した。興味深いことに、ラパマイシン添加は、約５０％減少までのＳＥＡＰ活性の広い減少をもたらした（図６）。この用量依存性減少は、ＦＲＢタグ化ＣＡＲおよびＦＫＢＰ１２タグ化カスパーゼ−９の両方の存在を必要とした。対照的に、ＡＰ１９０３は、遙かに低い薬物レベルで、ＳＥＡＰ活性を正常レベルの約２０％（以前の経験に匹敵）へと減少させた。細胞生存性をラパマイシンで減少させ、必要であればインビボでより効率的な殺滅のためにリミズシドへと切り替えることは可能であるようである。さらに、オンターゲットまたはオフターゲット媒介性ＣＡＲクラスター化は、主にｓｃＦｖ結合の部位において殺滅の感受性を増大させるはずである。
【０５２４】
ヘテロスイッチのさらなる入れ替え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）：
誘導性カスパーゼ−９は、開発した中で最速かつ最もＣＩＤ感受性の自殺遺伝子であることが分かったが、アポトーシス（または関連する壊死、細胞死の手段としての炎症および壊死の誘発）をもたらす多くの他のタンパク質またはタンパク質ドメインは、このアプローチを使用してホモ二量体またはヘテロ二量体ベースの殺滅に適合させ得る。
【０５２５】
ラパマイシン（またはラパログ）媒介性膜動員によって活性化され得るタンパク質の部分的リストとしては、以下が挙げられる：
・他のカスパーゼ（すなわち、カスパーゼ１〜１４、これは、哺乳動物において同定されている）
・天然のカスパーゼ二量体化剤として機能する他のカスパーゼ関連アダプター分子（例えば、ＦＡＤＤ（ＤＥＤ）、ＡＰＡＦ１（ＣＡＲＤ）、ＣＲＡＤＤ／ＲＡＩＤＤ（ＣＡＲＤ）、およびＡＳＣ（ＣＡＲＤ）（括弧の中は二量体化ドメイン）。
・アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー（例えば、ＢａｘおよびＢａｋ、これは、ミトコンドリア脱分極（またはＢｃｌ−ｘＬまたはＢｃｌ−２などの抗アポトー阻止促進ファミリーメンバーの誤った局在化）を引き起こし得る）。
・ＭＬＫＬ媒介性膜溶解に起因して、炎症促進性細胞死（壊死と称される）の関連形態を引き起こし得るＲＩＰＫ３またはＲＩＰＫ１−ＲＨＩＭドメイン。
【０５２６】
その標的依存性凝集レベルに起因して、ＣＡＲレセプターは、アポトーシス促進分子のラパマイシン媒介性動員のための理想的なドッキング部位を提供するはずである。にもかかわらず、共発現された誘導性キメラカスパーゼ様分子の存在下でラパログ媒介性細胞死を潜在的に提供し得るＦＲＢドメインを含む多価のドッキング部位の多くの例が存在する。
【０５２７】
【表７−１】
2020096640.tif 000105
【表７−２】
2020096640.tif 000106
【０５２８】
【表８−１】
2020096640.tif 000107
【表８−２】
2020096640.tif 000108
【表８−３】
2020096640.tif 000109
【０５２９】
【表９−１】
2020096640.tif 000110
【表９−２】
2020096640.tif 000111
【表９−３】
2020096640.tif 000112
【０５３０】
（材料および方法）
以下のセットの材料および方法は、本出願のある種の実施形態を整えるまたはアッセイするために参照され得る。
【０５３１】
レトロウイルスの生成および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の形質導入
ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞（１．５×１０５）を、１０ｍＬ  ＤＭＥＭ４５００）（グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％  ウシ胎仔血清を補充）の入った、１００ｍｍ組織培養ディッシュに播種する。１６〜３０時間のインキュベーション後、細胞を、Ｎｏｖａｇｅｎ’ｓ  ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）プロトコルを使用してトランスフェクトする。簡潔には、各トランスフェクションに関して、０．５ｍＬ  ＯｐｔｉＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１．５ｍＬ微量遠心チューブの中へとピペットで入れ、３０μｌ  ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ試薬を添加し、続いて５秒間ボルテックスする。サンプルを５分間静置して、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ懸濁物を沈殿させる。ＤＮＡ（合計１５μｇ）を各チューブに添加し、ピペットで４回上下させることによって混合する。サンプルを、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ−ＤＮＡ複合体形成のために５分間静置させ、懸濁物を、２９３Ｔ細胞の１つのディッシュに滴下する。代表的なトランスフェクションは、複製不能性レトロウイルスを生成するために、これらプラスミドを含んだ：３．７５μｇの、ｇａｇ−ｐｏｌを含むプラスミド（ｐＥＱ−ＰＡＭ３（−Ｅ））、２．５μｇの、ウイルスエンベロープ（例えば、ＲＤ１１４）を含むプラスミド、目的の遺伝子を含むレトロウイルス＝３＝３．７５μｇ。
【０５３２】
ＰＢＭＣを、組織培養プレートのウェルに予めコーティングされた抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で刺激する。プレーティングして２４時間後、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を上記培養物に添加する。２日目または３日目に、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞に由来するレトロウイルスを含む上清を、０．４５μｍで濾過し、レトロネクチン（１ｃｍ２表面あたり、１ｍｌのＰＢＳ中１０μｌ／ウェル）で予め被覆した非ＴＣ処理プレート上で遠心分離する。プレートを、２０００ｇで２時間、室温で遠心分離する。ＣＤ３／ＣＤ２８芽細胞を、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を補充した完全培地中で２．５×１０５  細胞／ｍｌで再懸濁し、１０００×ｇで１０分間、室温で、プレート上で遠心分離する。３〜４日間のインキュベーション後、細胞を計数し、形質導入効率を、フローサイトメトリーによって、適切なマーカー抗体（代表的には、ＣＤ３４またはＣＤ１９）を使用して測定する。細胞を、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を補充した完全培地中で維持し、細胞に、２〜３日ごとに新鮮培地およびＩＬ−２を再供給し、細胞を必要に応じて分けて、拡大する。
【０５３３】
培養細胞におけるＴ細胞カスパーゼアッセイ
適切なレトロウイルスでの形質導入の後、５０，０００個のＴを、ＩＬ−２なしのＣＴＬ培地中、自殺薬物（リミズシドまたはラパマイシン）の存在下または非存在下で、９６ウェルプレートの１ウェルあたりに播種する。ＩｎｃｕＣｙｔｅ機器を使用するアポトーシスの検出を可能にするために、２μＭのＩｎｃｕＣｙｔｅＴＭ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｃａｓｐａｓｅ−３／７  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ試薬（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ４４４０）を各ウェルに添加して、総容積２００μｌにする。そのプレートを、５分間、４００×ｇで遠心分離し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４４５９）の中に入れ、緑色蛍光を２〜３時間ごとに合計４８時間にわたって１０×対物レンズでモニターする。画像分析を、「ＴＣｅｌｌｓ＿ｃａｓｐｒｅａｇｅｎｔ＿ｐｈａｓｅ＿ｇｒｅｅｎ＿１０ｘ＿ＭＬＤ」処理定義を使用して行う。「Ｔｏｔａｌ  Ｇｒｅｅｎ  Ｏｂｊｅｃｔ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ」測定法を使用して、カスパーゼ活性化を定量する。各条件を二連で行い、各ウェルを４個の異なる位置で画像化する。
【０５３４】
Ｔ細胞抗腫瘍アッセイ
ＨＰＡＣ  ＰＳＣＡ＋腫瘍細胞を、ＮｕｃＬｉｇｈｔＴＭ  Ｒｅｄ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ４６２５）を使用して、核局在化ＲＦＰタンパク質で安定して標識する。共培養を設定するために、４０００  ＨＰＡＣ−ＲＦＰ細胞を、１００μｌのＩＬ−２なしのＣＴＬ培地中、少なくとも４時間にわたって９６ウェルプレートの各ウェルに播種して、腫瘍細胞を接着させる。適切なレトロウイルスで形質導入し、培養物中で少なくとも７日間静置させた後、Ｔを、種々のＥ：Ｔ比に従って、ＨＰＡＣ−ＲＦＰ含有９６ウェルプレートへと播種する。リミズシドもまた上記培養物に添加して、３００μｌ総容積／ウェルにする。各プレートを二連で、一方のプレートをＩｎｃｕＣｙｔｅでモニターするため、一方のプレートを２日目にＥＬＩＳＡアッセイ用に上清収集するために設定する。プレートを５分間、４００×ｇで遠心分離し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４４５９）の中に入れて、赤色蛍光（およびＴ細胞がＧＦＰ−Ｆｆｌｕｃで標識される場合には緑色蛍光）を２〜３時間ごとに合計７日間にわっって１０×対物レンズでモニターする。画像分析を、「ＨＰＡＣ−ＲＦＰ＿ＴｃｅｌｌｓＧＦＰ＿１０ｘ＿ＭＬＤ」処理定義を使用して行う。７日目に、ＨＰＡＣ−ＲＦＰ細胞を、「Ｒｅｄ  Ｏｂｊｅｃｔ  Ｃｏｕｎｔ（１／ウェル）」測定法を使用して分析する。また、７日目に、０ｎＭまたは１０ｎＭの自殺薬物を共培養物の各ウェルに添加し、ＩｎｃｕＣｙｔｅの中に戻して、Ｔ細胞排除をモニターする。８日目に、Ｔ細胞−ＧＦＰ細胞を、「Ｔｏｔａｌ  Ｇｒｅｅｎ  Ｏｂｊｅｃｔ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ」測定法を使用して分析する。各条件を、少なくとも２連で行い、各ウェルを４個の異なる位置で画像化する。
【０５３５】
Ｒａｊｉ細胞抗腫瘍活性を測定するために、細胞集団を、ｉｎｃｕｃｙｔｅよりむしろフローサイトメトリーによって決定する。なぜならこの細胞はプレートに接着しないからである。緑色蛍光タンパク質の安定な発現によって標識したＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ）（Ｒａｊｉ−ＧＦＰ）は、その細胞表面上にＣＤ１９を発現しかつ抗ＣＤ１９  ＣＡＲにとっての標的である、バーキットリンパ腫細胞株である。５００００  Ｒａｊｉ−ＧＦＰ細胞を、１００００  ＣＡＲ−Ｔ細胞を有する２４ウェルプレートに播種する（１：５  Ｅ：Ｔ比）。培地上清を、活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞によるサイトカイン放出を決定するために、４８時間で採取する。腫瘍殺滅の程度を、７日および１４日で、ＧＦＰ標識腫瘍細胞およびＣＤ３標識Ｔ細胞の割合によってフローサイトメトリー（Ｇａｌｅｏｓ，  Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって決定する。
【０５３６】
ＩＶＩＳ画像化
標識されたＴ細胞を有するＮＳＧマウスをイソフルランで麻酔し、１００μｌ  Ｄ−ルシフェリン（ＰＢＳ中１５ｍｇ／ｍｌ  ストック溶液）を下腹部の腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によって注射する。１０分後、その動物を、麻酔チャンバからＩＶＩＳプラットフォームへと移す。ＩＶＩＳイメージャー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で背側および腹側から画像を得、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（ＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でＢＬＩを定量および記録する。
【０５３７】
ウェスタンブロット
適切なレトロウイルスでの形質導入後、６，０００，０００  Ｔ細胞を、３ｍｌ  ＣＴＬ培地中、６ウェルプレートの１ウェルあたりに播種する。２４時間後、細胞を収集し、冷ＰＢＳ中で洗浄し、プレートの中で（ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｌａｔｅｄ）１×Ｈａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ，  ８７７８６）を含むＲＩＰＡ  Ｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ，  ８９９０１）中、氷上で３０分間溶解する。その溶解物を、１６，０００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離し、その上清を新しいエッペンドルフチューブに移す。タンパク質アッセイを、製造業者の推奨に従って、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ，  ２３２２７）を使用して行う。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルを調製するために、５０μｇの溶解物を４×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Ｂｉｏ  Ｒａｄ，  １６１０７４７）と混合し、９５℃で１０分間加熱する。その間に、１０％  ＳＤＳゲルを、Ｂｉｏ  Ｒａｄキャスティング装置および３０％  アクリルアミド／ビス溶液（Ｂｉｏ  Ｒａｄ，  １６０１５８）を使用して調製する。上記サンプルを、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ，  １６１０３７４）とともに負荷し、１×Ｔｒｉｓ／グリシン泳動緩衝液（Ｂｉｏ  Ｒａｄ，  １６１０７７１）中、１４０Ｖで９０分間泳動する（ran）。タンパク質分離後、そのゲルを、ｉＢｌｏｔ  ２デバイス（Ｔｈｅｒｍｏ，  ＩＢ２１００１）においてプログラム０を使用してＰＶＤＦ膜に転写する（合計７分）。その膜を、ｉＢｉｎｄ  Ｆｌｅｘ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ，  ＳＬＦ２０００）を使用して、製造業者の推奨に従って一次抗体および二次抗体でプローブする。抗ＭｙＤ８８抗体（Ｓｉｇｍａ，  ＳＡＢ１４０６１５４）を、１：２００希釈で使用し、二次ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ，  Ａ１６０７２）を、１：５００希釈で使用する。カスパーゼ−９抗体（Ｔｈｅｒｍｏ，  ＰＡ１−１２５０６）を、１：２００希釈で使用し、二次ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ，  Ａ１６１０４）を、１：５００希釈で使用する。β−アクチン抗体（Ｔｈｅｒｍｏ，  ＰＡ１−１６８８９）を、１：１０００希釈で使用し、二次ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ，  Ａ１６１０４）を、１：１０００希釈で使用する。その膜を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ，  ３４０９６）で発色させ、ＧｅｌＬｏｇｉｃ  ６０００  ＰｒｏカメラおよびＣａｒｅＳｔｒｅａｍ  ＭＩソフトウェア（ｖ．５．３．１．１６３６９）を使用して画像化する。
【０５３８】
レポーターアッセイのための細胞のトランスフェクション
ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞（１．５×１０５）を、１０ｍＬ  ＤＭＥＭ４５００（グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％  ウシ胎仔血清を補充）が入った、１００ｍｍ組織培養ディッシュに播種する。１６〜３０時間インキュベーション後、細胞を、Ｎｏｖａｇｅｎ’ｓ  ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）プロトコルを使用してトランスフェクトする。簡潔には、各トランスフェクションについて、０．５ｍＬ  ＯｐｔｉＭＥＭを、１．５ｍＬ微量遠心チューブにピペットで入れ、１５μｌ  ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ試薬を添加し、続いて５秒間ボルテックスする。サンプルを５分間静置して、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ懸濁物を沈殿させる。ＤＮＡ（合計５μｇ）を各チューブに添加し、ピペットで４回上下させることによって混合する。サンプルを、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ−ＤＮＡ複合体形成のために５分間静置させ、その懸濁液を、２９３Ｔ細胞の１つのディッシュに滴下する。代表的なトランスフェクションは、１μｇ  ＮＦｋＢ−ＳＥＡＰ（５）、４μｇ  Ｇｏ−ＣＡＲ（ｐＢＰ０７７４）または４μｇ  ＭＣ−Ｒａｐ−ＣＡＲ（ｐＢＰ１４４０）（１）を含む。
【０５３９】
二量体化薬物での細胞の刺激
トランスフェクションの２４時間後（４．１）、２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートへと分け、二量体化薬物の希釈物と共にインキュベートする。簡潔には、１００μｌ  培地を、９６ウェル平底プレートの各ウェルに添加する。薬物を、プレート上に置かれるべき濃度勾配の最高濃度の４倍の濃度へとチューブ中で希釈する。１００μｌの二量体化リガンド（リミズシド、ラパマイシン、イソプロポキシルラパマイシン）を、プレートの最も右側にある３個のウェルの各々に添加する（アッセイは、それによって三連で行われる）。次いで、各薬物含有ウェルからの１００μｌを、隣のウェルへと移し、そのサイクルを１０回反復して、連続２倍段階勾配を生成する。最後のウェルは未処理にし、基底レポーター活性のコントロールとして働く。次いで、トランスフェクトした２９３細胞を、トリプシン処理し、完全培地で洗浄し、培地中に懸濁し、薬物を含む（または薬物なし）各ウェルへと１００μｌをアリコートする。細胞を２４時間インキュベートする。
【０５４０】
レポーター活性のアッセイ
ＳＲαプロモーターは、ＳＶ４０初期領域（これは、Ｔ抗原転写を駆動する）およびヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ−１）の長末端反復（ＬＴＲ）の一部（ＲおよびＵ５）を含むハイブリッド転写エレメントである。このプロモーターは、高い構成的なレベルの分泌型アルカリホスファターゼ（ＳｅＡＰ）レポーター遺伝子を駆動する。二量体化によるカスパーゼ−９の活性化は、細胞死を迅速にもたらし、細胞が死んでいるの割合は、薬物の量の増大と共に増大する。細胞が死ぬ場合、レポーターの転写および翻訳は停止するが、既に分泌されたレポータータンパク質は培地の中に残る。構成的ＳｅＡＰ活性の喪失は、それによって、細胞死の薬物依存性活性化の有効な代用である。
【０５４１】
薬物刺激の２４時間後に、９６ウェルプレートを包んで蒸発を妨げ、６５℃で２時間インキュベートして、内因性および血清ホスファターゼを不活化するが、その一方で、熱安定性ＳｅＡＰレポーターは残る（３、１２、１４）。各ウェルからの１００μｌ  サンプルを、側面が黒い９６ウェルアッセイプレートの個々のウェルへと負荷する。サンプルを、４〜１６時間にわたって０．５Ｍ  ジエタノールアミン（ｐＨ１０．０）中の０．５ｍＭ  ４−メチルウンベリフェリルホスフェート（４−ＭＵＰ）とともにインキュベートする。ホスファターゼ活性を、３５５ｎｍでの励起および４６０ｎｍでの発光を有する蛍光によって測定する。データを、表作成のためにＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌのスプレッドシートに移し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍでグラフ化する。
【０５４２】
イソプロピルオキシラパマイシンの生成
Ｌｕｅｎｇｏらの方法（（Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ  ５９：６５１２，（１９９４）），（１７，  １８））を使用する。簡潔には、２０ｍｇのラパマイシンを、３ｍＬ  イソプロパノール中に溶解し、２２．１ｍｇのｐ−トルエンスルホン酸を添加し、室温で４〜１２時間撹拌しながらインキュベートする。終了時に、５ｍＬ  酢酸エチルを添加し、生成物を、飽和炭酸水素ナトリウムで５回、ブライン（飽和塩化ナトリウム）で３回抽出する。その有機相を乾燥させ、酢酸エチル：ヘキサン（３：１）中に再溶解する。立体異性体および微量の生成物を、３〜４  ＫＰａ圧下で、３：１  酢酸エチル：ヘキサンを用いる１０〜１５ｍＬ  シリカゲルカラムでのＦＬＡＳＨクロマトグラフィーによって分離し、画分を乾燥させる。画分を、２３７ｎＭ、２６７ｎＭ、２７８ｎＭおよび２９０ｎＭでの分光測光法によってアッセイし、ＦＲＢ対立遺伝子特異的転写スイッチにおける結合特異性に関して試験する。
【０５４３】
本明細書で論じられる方法（ベクターを構築するための方法、患者への投与、細胞をトランスフェクトまたは形質転換する、アッセイ、および患者をモニターするための方法が挙げられるが、これらに限定されない）はまた、以下の特許および特許出願において見出され得、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
【０５４４】
米国特許出願第１４／２１０，０３４号（標題ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＣＯＮＴＲＯＬＬＩＮＧ  Ｔ  ＣＥＬＬ  ＰＲＯＬＩＦＥＲＡＴＩＯＮ、２０１４年３月１３日出願）；米国特許出願第１３／１１２，７３９号（２０１１年５月２０日出願、米国特許第９，０８９，５２０号として２０１５年７月２８日発行、および標題ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＩＮＤＵＣＩＮＧ  ＳＥＬＥＣＴＩＶＥ  ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ）；米国特許出願第１４／６２２，０１８号（２０１４年２月１３日出願、標題ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＡＣＴＩＶＡＴＩＮＧ  Ｔ  ＣＥＬＬＳ  ＵＳＩＮＧ  ＡＮ  ＩＮＤＵＣＩＢＬＥ  ＣＨＩＭＥＲＩＣ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥ）；米国特許出願第１３／１１２，７３９号（２０１１年５月２０日出願、標題ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＩＮＤＵＣＩＮＧ  ＳＥＬＥＣＴＩＶＥ  ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ）；米国特許出願第１３／７９２，１３５号（２０１３年３月１０日出願、標題ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＣＡＳＰＡＳＥ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ）；米国特許出願第１４／２９６，４０４号（２０１４年６月４日出願、標題ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＩＮＤＵＣＩＮＧ  ＰＡＲＴＩＡＬ  ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ  ＵＳＩＮＧ  ＣＡＳＰＡＳＥ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ）；米国仮特許出願第６２／０４４，８８５号（２０１４年９月２日出願）、および米国特許出願第１４／８４２，７１０号（２０１５年９月１日出願、各々は標題ＣＯＳＴＩＭＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＣＨＩＭＥＲＩＣ  ＡＮＴＩＧＥＮ  ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ  ＢＹ  ＭｙＤ８８  ＡＮＤ  ＣＤ４０  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ）；米国特許出願第１４／６４０，５５４号（２０１５年３月６日出願、標題ＣＡＳＰＡＳＥ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＨＡＶＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ）；米国特許第７，４０４，９５０号（Ｓｐｅｎｃｅｒ，  Ｄ．らへ２００８年６月２９日発行）、Ｓｐｅｎｃｅｒ，  Ｄ．らによる米国特許出願第１２／４４５，９３９号（２０１０年１０月２６日出願）；Ｓｐｅｎｃｅｒ，  Ｄ．らによる米国特許出願第１２／５６３，９９１号（２００９年９月２１日出願）；Ｓｌａｗｉｎ，  Ｋ．らによる米国特許出願第１３／０８７，３２９号（２０１１年４月１４日出願）；Ｓｐｅｎｃｅｒ，  Ｄ．らによる米国特許出願第１３／７６３，５９１号（２０１３年２月８日出願）；ならびに国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２２００４（２０１４年３月７日出願、２０１４年１０月９日にＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２２００４として公開、標題ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＣＡＳＰＡＳＥ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ）。
【０５４５】
（実施例１７：代表的実施形態）
以降で提供されるのは、本技術のある種の実施形態の例である。
【０５４６】
実施形態Ａ１．
ａ）第１のキメラポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該第１のキメラポリペプチドは、膜会合ポリペプチド領域および第１のリガンド結合領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）第２のキメラポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該第２のキメラポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域および第２のリガンド結合領域を含み、ここで該第２のリガンド結合領域は、該第１のリガンド結合領域とは異なるアミノ酸配列を有する、第２のポリヌクレオチド；
を含む改変された細胞であって、ここで該第１のリガンド結合領域および第２のリガンド結合領域は、第１の多量体リガンドに結合できる、改変された細胞。
【０５４７】
実施形態Ａ１．１．前記第２のリガンド結合領域は、前記第１の多量体リガンドに結合でき、前記第１のリガンド結合領域に有意に結合しない第２の多量体リガンドに結合できる、実施形態Ａ１に記載の改変された細胞。
【０５４８】
実施形態Ａ１．２  前記第１のリガンド結合領域は、前記第２の多量体リガンドに結合できない、実施形態Ａ１〜Ａ１．１のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５４９】
実施形態Ａ２．  前記膜会合ポリペプチドは、抗原認識部分をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ１．２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５５０】
実施形態Ａ３．  前記膜会合ポリペプチドは、Ｔ細胞レセプターを含む、実施形態Ａ１〜Ａ１．２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５５１】
実施形態Ａ４．  前記膜会合ポリペプチドは、キメラ抗原レセプターを含む、実施形態Ａ１〜Ａ１．２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５５２】
実施形態Ａ５．  前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、実施形態Ａ４に記載の改変された細胞。
【０５５３】
実施形態Ａ６．  前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域および（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、（ｖ）抗原認識部分を含む、実施形態Ａ４に記載の改変された細胞。
【０５５４】
実施形態Ａ７〜Ａ８．  留保。
【０５５５】
実施形態Ａ９．  前記第１のリガンド結合領域および第２のリガンド結合領域は、ラパログに結合する、実施形態Ａ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５５６】
実施形態Ａ９．１．  前記ラパログは、Ｓ−ｏ，ｐ−ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）−ラパマイシン、Ｒ−イソプロポキシラパマイシン、およびＳ−ブタンスルホンアミドラプからなる群より選択される、実施形態Ａ９に記載の改変された細胞。
【０５５７】
実施形態Ａ１０．  前記第１のリガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合ドメインＦＲＢＬを含む、実施形態Ａ１〜Ａ９．１のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５５８】
実施形態Ａ１０．１．  前記第１のリガンド結合領域は、少なくとも２個のＦＲＢＬドメインを含む、実施形態Ａ１０に記載の改変された細胞。
【０５５９】
実施形態Ａ１０．２．  前記第１のリガンド結合領域は、少なくとも３個のＦＲＢＬドメインを含む、実施形態Ａ１０に記載の改変された細胞。
【０５６０】
実施形態Ａ１０．３．  前記第１のリガンド結合領域は、  ＫＬＷ（Ｔ２０９８Ｌ）、ＫＴＦ（Ｗ２１０１Ｆ）、およびＫＬＦ（Ｔ２０９８Ｌ、Ｗ２１０１Ｆ）からなる群より選択されるＦＲＢドメインである、実施形態Ａ１〜Ａ１０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５６１】
実施形態Ａ１１．  前記第２のリガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２多量体化領域を含む、実施形態Ａ１〜Ａ１０．３のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５６２】
実施形態Ａ１１．１．  前記第２のリガンド結合領域は、ＦＫＢＰｖ３６リガンド結合領域を含む、実施形態Ａ１１に記載の改変された細胞。
【０５６３】
実施形態Ａ１２．  前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、またはカスパーゼ１４、ＦＡＤＤ（ＤＥＤ）、ＡＰＡＦ１（ＣＡＲＤ）、ＣＲＡＤＤ／ＲＡＩＤＤ  ＣＡＲＤ）、ＡＳＣ（ＣＡＲＤ）、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、ＲＩＰＫ３、およびＲＩＰＫ１−ＲＨＩＭからなる群より選択される、実施形態Ａ１〜Ａ１１のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５６４】
実施形態Ａ１３．  前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼポリペプチドである、実施形態Ａ１〜Ａ１１のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５６５】
実施形態Ａ１４．  前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ａ１〜Ａ１２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５６６】
実施形態Ａ１５．
ａ）キメラ抗原レセプターをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、（ｉｉｉ）抗原認識部分、および（ｉｖ）ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢＬ）を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）キメラカスパーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラカスパーゼポリペプチドは、（ｉ）ＦＫＢＰ多量体化領域および（ｉｉ）カスパーゼポリペプチドを含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む改変された細胞。
【０５６７】
実施形態Ａ１６．
ａ）キメラ抗原レセプターをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、（ｖ）抗原認識部分、およびＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢＬ）を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）キメラカスパーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラカスパーゼポリペプチドは、（ｉ）ＦＫＢＰ多量体化領域および（ｉｉ）カスパーゼポリペプチドを含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む改変された細胞。
【０５６８】
実施形態Ａ１７．  前記第１のリガンド結合領域は、ＦＲＢＬであり、前記第２のリガンド結合領域は、ＦＫＢＰｖ３６である、実施形態Ａ１〜Ａ６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５６９】
実施形態Ａ１８．  前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子である、実施形態Ａ１５〜Ａ１７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５７０】
実施形態Ａ１９．  前記Ｔ細胞活性化分子は、ＣＤ３ζポリペプチドである、実施形態Ａ１５〜Ａ１７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５７１】
実施形態Ａ２０．  前記Ｔ細胞活性化分子は、Ｆｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドである、実施形態Ａ１５〜Ａ１７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５７２】
実施形態Ａ２１．  前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原に結合する、実施形態Ａ２〜Ａ２０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５７３】
実施形態Ａ２２．  前記抗原認識部分は、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、実施形態Ａ２〜Ａ２０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５７４】
実施形態Ａ２３．  前記抗原認識部分は、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６、およびＨｅｒ２／Ｎｅｕからなる群より選択される抗原に結合する、実施形態Ａ２〜Ａ２０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５７５】
実施形態Ａ２４．  前記抗原認識部分は、ウイルス抗原または細菌抗原に結合する、実施形態Ａ２〜Ａ２０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５７６】
実施形態Ａ２５．  前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ａ２〜Ａ２０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５７７】
実施形態Ａ２６．  前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である、実施形態Ａ５〜Ａ２５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５７８】
実施形態Ａ２７．  前記カスパーゼポリペプチドは、カスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ａ１３〜Ａ２６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５７９】
実施形態Ａ２８．  前記カスパーゼポリペプチドは、配列番号３００のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１３〜Ａ２６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５８０】
実施形態Ａ２９．  前記カスパーゼポリペプチドは、表５または表６中のカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ａ１３〜Ａ２６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５８１】
実施形態Ａ３０．  前記カスパーゼポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、およびＮ４０５Ｑからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ａ３〜Ａ２６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５８２】
実施形態Ａ３１．  前記短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２１４のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ａ６〜Ａ３０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５８３】
実施形態Ａ３２．  前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、配列番号２１６のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ａ６〜Ａ３１のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５８４】
実施形態Ａ３３．  前記抗原認識部分は、ＣＤ１９に結合する一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ａ２〜Ａ３３のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５８５】
実施形態Ａ３４．  前記抗原認識部分は、ＰＳＣＡに結合する一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ａ２〜Ａ３２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５８６】
実施形態Ａ３５．  前記抗原認識部分は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結合する一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ａ２〜Ａ３２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５８７】
実施形態Ａ３６．  前記細胞は、Ｔ細胞である、実施形態Ａ１〜Ａ３５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５８８】
実施形態Ａ３７．  前記細胞は、ナチュラルキラー細胞である、実施形態Ａ１〜Ａ３５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０５８９】
実施形態Ａ３８．  前記膜結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄレセプターである、実施形態Ａ３７に記載の改変された細胞。
【０５９０】
実施形態B１．
ａ）第１のキメラポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該第１のキメラポリペプチドは、膜会合ポリペプチド領域および第１のリガンド結合領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）第２のキメラポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該第２のキメラポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域および第２のリガンド結合領域を含み、ここで該第２のリガンド結合領域は、該第１のリガンド結合領域とは異なるアミノ酸配列を有する、第２のポリヌクレオチド；
を含む核酸であって、ここで該第１のリガンド結合領域および第２のリガンド結合領域は、第１の多量体リガンドに結合できる、核酸。
【０５９１】
実施形態B１．１．  前記第２のリガンド結合領域は、前記第１の多量体リガンドに結合でき、前記第１のリガンド結合領域に有意に結合しない第２の多量体リガンドに結合できる、実施形態Ｂ１に記載の核酸。
【０５９２】
実施形態B１．２  前記第１のリガンド結合領域は、前記第２の多量体リガンドに結合できない、実施形態Ｂ１〜Ｂ１．１のいずれか１つに記載の核酸。
【０５９３】
実施形態B２．  前記膜会合ポリペプチドは、抗原認識部分をさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１．２のいずれか１つに記載の核酸。
【０５９４】
実施形態B３．  前記膜会合ポリペプチドは、Ｔ細胞レセプターを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１．２のいずれか１つに記載の核酸。
【０５９５】
実施形態B３．１．  前記膜会合ポリペプチドは、ＮＫＧ２Ｄレセプターを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１．２のいずれか１つに記載の核酸。
【０５９６】
実施形態B４．  前記膜会合ポリペプチドは、キメラ抗原レセプターを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１．２のいずれか１つに記載の核酸。
【０５９７】
実施形態B４．１．  前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、実施形態Ｂ４に記載の核酸。
【０５９８】
実施形態B４．２．  前記キメラ抗原は、膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｖ）抗原認識部分を含む、実施形態Ｂ４に記載の核酸。
【０５９９】
実施形態B４．３〜４．４．  留保。
【０６００】
実施形態B４．５．  前記第１のリガンド結合領域および第２のリガンド結合領域は、ラパログに結合する、実施形態Ｂ１〜Ｂ４．４のいずれか１つに記載の核酸。
【０６０１】
実施形態B４．６．  前記ラパログは、Ｓ−ｏ，ｐ−ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）−ラパマイシン、Ｒ−イソプロポキシラパマイシン、およびＳ−ブタンスルホンアミドラプからなる群より選択される、実施形態Ｂ４．５に記載の核酸。
【０６０２】
実施形態B４．７．  前記第１のリガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合ドメインＦＲＢＬを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ４．６のいずれか１つに記載の核酸。
【０６０３】
実施形態B４．８．  前記第１のリガンド結合領域は、少なくとも２個のＦＲＢＬドメインを含む、実施形態Ｂ４．７に記載の核酸。
【０６０４】
実施形態B４．９．  前記第１のリガンド結合領域は、少なくとも３個のＦＲＢＬドメインを含む、実施形態Ｂ４．７に記載の核酸。
【０６０５】
実施形態B４．１０．  前記第１のリガンド結合領域は、  ＫＬＷ（Ｔ２０９８Ｌ）、ＫＴＦ（Ｗ２１０１Ｆ）、およびＫＬＦ（Ｔ２０９８Ｌ、Ｗ２１０１Ｆ）からなる群より選択されるＦＲＢドメインである、実施形態Ｂ１〜Ｂ４．９のいずれか１つに記載の核酸。
【０６０６】
実施形態B４．１１．  前記第２のリガンド結合領域は、ＦＫＢＰ多量体化領域を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ４．１０のいずれか１つに記載の核酸。
【０６０７】
実施形態B４．１２．  前記第２のリガンド結合領域は、ＦＫＢＰｖ３６リガンド結合領域を含む、実施形態Ｂ４．１１に記載の核酸。
【０６０８】
実施形態B４．１３．  前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、またはカスパーゼ１４、ＦＡＤＤ（ＤＥＤ）、ＡＰＡＦ１（ＣＡＲＤ）、ＣＲＡＤＤ／ＲＡＩＤＤ  ＣＡＲＤ）、ＡＳＣ（ＣＡＲＤ）、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、ＲＩＰＫ３、およびＲＩＰＫ１−ＲＨＩＭからなる群より選択される、実施形態Ｂ１〜Ｂ４．１２のいずれか１つに記載の核酸。
【０６０９】
実施形態B４．１４．  前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼポリペプチドである、実施形態Ｂ１〜Ｂ４．１３のいずれか１つに記載の核酸。
【０６１０】
実施形態B４．１５．  前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ｂ１〜Ｂ４．１４のいずれか１つに記載の核酸。
【０６１１】
実施形態B４．１６．
ａ）キメラ抗原レセプターをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、（ｉｉｉ）抗原認識部分、および（ｉｖ）ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢＬ）を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）キメラカスパーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラカスパーゼポリペプチドは、（ｉ）ＦＫＢＰ多量体化領域および（ｉｉ）カスパーゼポリペプチドを含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む核酸。
【０６１２】
実施形態B４．１７．  
ａ）キメラ抗原レセプターをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、（ｖ）抗原認識部分、およびＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢＬ）を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）キメラカスパーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラカスパーゼポリペプチドは、（ｉ）ＦＫＢＰ多量体化領域および（ｉｉ）カスパーゼポリペプチドを含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む核酸。
【０６１３】
実施形態B４．１８．  前記第１のリガンド結合領域は、ＦＲＢＬであり、前記第２のリガンド結合領域は、ＦＫＢＰｖ３６である、実施形態Ｂ１〜Ｂ４．１７のいずれか１つに記載の核酸。
【０６１４】
実施形態B５．  前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子である、実施形態Ｂ４．１〜Ｂ４．１８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６１５】
実施形態B６．  前記Ｔ細胞活性化分子は、ＣＤ３ζポリペプチドである、実施形態Ｂ４．１〜Ｂ４．１８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６１６】
実施形態B７．  前記Ｔ細胞活性化分子は、Ｆｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドである、実施形態Ｂ４．１〜Ｂ４．１８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６１７】
実施形態B８．  前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｂ２〜Ｂ７のいずれか１つに記載の核酸。
【０６１８】
実施形態B９．  前記抗原認識部分は、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｂ２〜Ｂ７のいずれか１つに記載の核酸。
【０６１９】
実施形態B１０．  前記抗原認識部分は、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６、およびＨｅｒ２／Ｎｅｕからなる群より選択される抗原に結合する、実施形態Ｂ２〜Ｂ７のいずれか１つに記載の核酸。
【０６２０】
実施形態B１１．  前記抗原認識部分は、ＰＳＣＡに結合する、実施形態Ｂ２〜Ｂ７のいずれか１つに記載の核酸。
【０６２１】
実施形態B１２．  前記抗原認識部分は、ＣＤ１９に結合する、実施形態Ｂ２〜Ｂ７のいずれか１つに記載の核酸。
【０６２２】
実施形態B１３．  前記抗原認識部分は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結合する、実施形態Ｂ２〜Ｂ７のいずれか１つに記載の核酸。
【０６２３】
実施形態B１４．  前記抗原認識部分は、ウイルス抗原または細菌抗原に結合する、実施形態Ｂ２〜Ｂ７のいずれか１つに記載の核酸。
【０６２４】
実施形態B１５．  前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ｂ２〜Ｂ１４のいずれか１項に記載の核酸。
【０６２５】
実施形態B１６．  前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である、実施形態Ｂ２〜Ｂ１５のいずれか１つに記載の核酸。
【０６２６】
実施形態B１７．  前記短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２１４のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｂ４．２〜Ｂ１６のいずれかつに記載の核酸。
【０６２７】
実施形態B１８．  前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、配列番号２１６のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｂ４．２〜Ｂ１７のいずれか１つに記載の核酸。
【０６２８】
実施形態B１９．  留保。
【０６２９】
実施形態B２０．  前記ＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号１６１のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｂ６〜Ｂ１８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６３０】
実施形態B２１．  前記膜貫通領域のポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｂ４．１〜Ｂ２０のいずれか１つに記載の核酸。
【０６３１】
実施形態B２１．１．  前記カスパーゼポリペプチドは、カスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ｂ４．１４〜Ｂ２１のいずれか１つに記載の核酸。
【０６３２】
実施形態B２１．２．  前記カスパーゼポリペプチドは、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０ＡまたはＮ４０５Ｑを含む、実施形態Ｂ４．１４〜Ｂ２１のいずれか１つに記載の核酸。
【０６３３】
実施形態B２１．３．  前記カスパーゼポリペプチドは、表５または表６中のカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ｂ４．１４〜Ｂ２１のいずれか１つに記載の核酸。
【０６３４】
実施形態B２１．４．  前記カスパーゼポリペプチドは、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ａ、およびＮ４０５Ｑからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ｂ４．１４〜Ｂ２１のいずれか１つに記載の核酸。
【０６３５】
実施形態B２２．  前記核酸は、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター配列を含む、実施形態Ｂ１４〜Ｂ２１．４のいずれか１つに記載の核酸。
【０６３６】
実施形態B２３．  前記核酸は、ウイルスベクター内に含まれる、実施形態Ｂ１〜Ｂ２２のいずれか１つに記載の核酸。
【０６３７】
実施形態B２４．  前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである、実施形態Ｂ２３に記載の核酸。
【０６３８】
実施形態B２５．  前記レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルスベクターである、実施形態Ｂ２４に記載の核酸。
【０６３９】
実施形態B２６．  前記レトロウイルスベクターは、ＳＦＧベクターである、実施形態Ｂ２４に記載の核酸。
【０６４０】
実施形態B２７．  前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである、実施形態Ｂ２３に記載の核酸。
【０６４１】
実施形態B２８．  前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである、実施形態Ｂ２３に記載の核酸。
【０６４２】
実施形態B２９．  前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群より選択される、実施形態Ｂ２３に記載の核酸。
【０６４３】
実施形態B３０．  前記核酸は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、もしくはバイオリスティックのために調製されるかまたはそのためにデザインされたベクターの中に存在するか、あるいは化学的脂質、ポリマー、無機ナノ粒子、もしくはポリプレックスに結合されるかまたはその中に組み込まれる、実施形態Ｂ１〜Ｂ２９のいずれか１つに記載の核酸。
【０６４４】
実施形態B３１．  前記核酸は、プラスミド内に含まれる、実施形態Ｂ１〜Ｂ２２またはＢ３０のいずれか１つに記載の核酸。
【０６４５】
実施形態B３２．  少なくとも２個のプロモーターを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３１のいずれか１つに記載の核酸。
【０６４６】
実施形態B３３．  １個のプロモーターは、前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの両方に作動可能に連結される、実施形態Ｂ１〜Ｂ３１のいずれか１つに記載の核酸。
【０６４７】
実施形態B３４．  前記第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、実施形態Ｂ３３に記載の核酸。
【０６４８】
実施形態B３５．  前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、実施形態Ｂ３４に記載の核酸。
【０６４９】
実施形態B３６．  前記核酸は、キメラ抗原レセプター、２Ａポリペプチド、およびカスパーゼポリペプチドを含むポリペプチドをコードする、実施形態Ｂ３５に記載の核酸。
【０６５０】
実施形態B３７．  前記第１のポリヌクレオチドは、第１のプロモーターに作動可能に連結され、前記第２のポリヌクレオチドは、第２のプロモーターに作動可能に連結される、実施形態Ｂ３２に記載の核酸。
【０６５１】
実施形態B３８．  前記２個のＲＮＡ転写物は、前記２個のポリヌクレオチドに相補的に生成される、実施形態Ｂ３７に記載の核酸。
【０６５２】
実施形態B３９．  表７に提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで該ポリペプチドは、ＦＫＢＰ１２ｖ３６、ｄカスパーゼ９、Ｔ２Ａ、シグナルペプチド、ＦＭＣ６３−ＶＬ、ＦＭＣ６３−ＶＨ、ＣＤ３４エピトープ、ＣＤ８ａストーク、ＣＤ８ｔｍ、ＭｙＤ８８、ｄＣＤ４０、ＣＤ３ｚ、ＦＲＢＩ＾＾、ＦＲＢＩ、およびリンカーポリペプチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３のいずれか１つに記載の核酸。
【０６５３】
実施形態B４０．  前記ポリヌクレオチドは、表７の中に提供されるヌクレオチド配列を有する、実施形態Ｂ３９に記載の核酸。
【０６５４】
実施形態B４１．  表７の中に提供されるＦＫＢＰ１２ｖ３６アミノ酸配列をコードする、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６５５】
実施形態B４２．  表７の中に提供されるＦＫＢＰ１２ｖ３６ヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６５６】
実施形態B４３．  表７の中に提供されるｄカスパーゼ９アミノ酸配列をコードする、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６５７】
実施形態B４４．  表７の中に提供されるｄカスパーゼ９ヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６５８】
実施形態B４５．  表７の中に提供されるＴ２Ａアミノ酸配列をコードする、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６５９】
実施形態B４６．  表７の中に提供されるＴ２Ａヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６６０】
実施形態B４７．  表７の中に提供されるシグナルペプチドアミノ酸配列をコードする、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６６１】
実施形態B４８．  表７の中に提供されるシグナルペプチドヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６６２】
実施形態B４９．  表７の中に提供されるＦＭＣ６３−ＶＬアミノ酸配列をコードする、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６６３】
実施形態B５０．  表７の中に提供されるＦＭＣ６３−ＶＬヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６６４】
実施形態B５１．  表７の中に提供されるＦＭＣ６３−ＶＨアミノ酸配列をコードする、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６６５】
実施形態B５２．  表７の中に提供されるＦＭＣ６３−ＶＨヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６６６】
実施形態B５３．  表７の中に提供されるＣＤ３４エピトープアミノ酸配列をコードする、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６６７】
実施形態B５４．  表７の中に提供されるＣＤ３４エピトープヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６６８】
実施形態B５５．  表７の中に提供されるＣＤ８ａストークアミノ酸配列をコードする、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６６９】
実施形態B５６．  表７の中に提供されるＣＤ８ａストークヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６７０】
実施形態B５７．  表７の中に提供されるＣＤ８膜貫通ヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６７１】
実施形態B５８．  表７の中に提供されるＣＤ８膜貫通アミノ酸配列をコードする、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６７２】
実施形態B５９．  表７の中に提供されるＭｙＤ８８ヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６７３】
実施形態B６０．  表７の中に提供されるＭｙＤ８８アミノ酸配列をコードする、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６７４】
実施形態B６１．  表７の中に提供されるｄＣＤ４０ヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６７５】
実施形態B６２．  表７の中に提供されるｄＣＤ４０アミノ酸配列をコードする、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６７６】
実施形態B６３．  表７の中に提供されるＣＤ３ｚヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６７７】
実施形態B６４．表７の中に提供されるＣＤ３ｚアミノ酸配列をコードする、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６７８】
実施形態B６５．  表７の中に提供されるＦＲＢＩ＾＾ヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６７９】
実施形態B６６．  表７の中に提供されるＦＲＢＩ＾＾アミノ酸配列をコードする、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６８０】
実施形態B６７．  表７の中に提供されるＦＲＢＩヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６８１】
実施形態B６８．  表７の中に提供されるＦＲＢＩアミノ酸配列をコードする、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６８２】
実施形態B６９．  表８の中に提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで該ポリペプチドは、ＦＫＢＰ１２ｖ３６、ｄカスパーゼ９、Ｔ２Ａ、シグナルペプチド、ＦＲＰ５−ＶＨＬ、ＦＲＰ％ＶＬ、ＣＤ３４エピトープ、ＣＤ８ａストーク、ＣＤ８ｔｍ、ＭｙＤ８８、ｄＣＤ４０、ＣＤ３ｚ、ＦＲＢＩ＾＾、ＦＲＢＩ、およびリンカーポリペプチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３のいずれか１つに記載の核酸。
【０６８３】
実施形態B７０．  前記ポリヌクレオチドは、表８の中に提供されるヌクレオチド配列を有する、実施形態Ｂ６９に記載の核酸。
【０６８４】
実施形態B７１．  表８の中に提供されるＦＲＰ５−ＶＨアミノ酸配列をコードする、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６８５】
実施形態B７２．  表８の中に提供されるＦＲＰ５−ＶＨヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６８６】
実施形態B７３．  表８の中に提供されるＦＲＰ５ＶＬアミノ酸配列をコードする、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６８７】
実施形態B７４．  表８の中に提供されるＦＲＰ５ＶＬヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６８８】
実施形態B７５．  表９の中に提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３のいずれか１つに記載の核酸。
【０６８９】
実施形態B７６．  前記ポリヌクレオチドは、表９の中に提供されるヌクレオチド配列を有する、実施形態Ｂ７５に記載の核酸。
【０６９０】
実施形態B７７．  表９の中に提供されるＦＲＰ５−ＶＨアミノ酸配列をコードする、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６９１】
実施形態B７８．  表９の中に提供されるＦＲＰ５−ＶＨヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６９２】
実施形態B７９．  表９の中に提供されるＦＲＰ５ＶＬアミノ酸配列をコードする、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６９３】
実施形態B８０．  表９の中に提供されるＦＲＰ５ＶＬヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０６９４】
実施形態C１．  実施形態Ｂ１〜Ｂ８０のいずれか１つに記載の核酸でトランスフェクトされた、改変された細胞。
【０６９５】
実施形態C２．  前記細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、実施形態Ａ１〜Ａ１７またはＣ１のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０６９６】
実施形態C３．  前記細胞は、Ｔ細胞である、実施形態Ａ１〜Ａ１７またはＣ１のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０６９７】
実施形態C４．  前記細胞は、初代Ｔ細胞である、実施形態Ａ１〜Ａ１７またはＣ１のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０６９８】
実施形態C５．  前記細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である、実施形態Ａ１〜Ａ１７またはＣ１のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０６９９】
実施形態C６．  前記細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非リンパ球性造血細胞、非造血細胞、マクロファージ、ケラチノサイト、線維芽細胞、メラノーマ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはＴ細胞からなる群より選択される、実施形態Ａ１〜Ａ１７またはＣ１のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７００】
実施形態C７．  前記Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞である、実施形態Ａ１〜Ａ１７またはＣ１のいずれか１つに記載の方法。
【０７０１】
実施形態C８．  前記細胞は、骨髄から得られるかまたは骨髄から調製される、実施形態Ｃ１〜Ｃ７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７０２】
実施形態C９．  前記細胞は、臍帯血から得られるかまたは臍帯血から調製される、実施形態Ｃ１〜Ｃ７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７０３】
実施形態C１０．  前記細胞は、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される、実施形態Ｃ１〜Ｃ７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７０４】
実施形態C１１．  前記細胞は、末梢血単核細胞から得られるかまたは末梢血単核細胞から調製される、実施形態Ｃ１〜Ｃ７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７０５】
実施形態C１２．  前記細胞は、ヒト細胞である、実施形態Ｃ１〜Ｃ７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７０６】
実施形態C１２．１．  前記改変された細胞は、インビボで形質導入またはトランスフェクトされる、実施形態Ｃ１〜Ｃ１２のいずれか１つに記載の方法。
【０７０７】
実施形態C１３．  前記細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子での遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスからなる群より選択される方法を使用して、核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質転換される、実施形態Ｃ１〜Ｃ７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７０８】
実施形態D１．  被験体において移植された改変された細胞の生存をコントロールするための方法であって、該方法は、
ａ）実施形態Ａ１〜Ａ３８またはＣ１〜Ｃ１３のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に移植すること；および
ｂ）  （ａ）の後に、該被験体に、前記キメラカスパーゼポリペプチドを発現する該改変された細胞のうちの３０％未満を殺滅するために有効な量でラパログを投与すること、を包含する、方法。
【０７０９】
実施形態D２．  前記ラパマイシンまたはラパマイシンアナログは、前記キメラカスパーゼポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの４０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態Ｄ１に記載の方法。
【０７１０】
実施形態D３．  前記ラパマイシンまたはラパマイシンアナログは、前記キメラカスパーゼポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの５０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態Ｄ１に記載の方法。
【０７１１】
実施形態D４．  前記ラパマイシンまたはラパマイシンアナログは、前記キメラカスパーゼポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの６０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態Ｄ１に記載の方法。
【０７１２】
実施形態D５．  前記ラパマイシンまたはラパマイシンアナログは、前記キメラカスパーゼポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの７０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態Ｄ１に記載の方法。
【０７１３】
実施形態D６．  前記キメラカスパーゼポリペプチド上の前記ＦＫＢＰ多量体化領域に結合する多量体リガンドを、前記ラパマイシンまたはラパマイシンアナログの投与後に残っている、該キメラカスパーゼポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９０％を殺滅するために有効な量で投与することをさらに包含する、実施形態Ｄ１〜Ｄ５のいずれか１つに記載の方法。
【０７１４】
実施形態D７．  前記キメラカスパーゼポリペプチド上の前記ＦＫＢＰ多量体化領域に結合する多量体リガンドを、前記ラパマイシンまたはラパマイシンアナログの投与後に残っている、該キメラカスパーゼポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９５％を殺滅するために有効な量で投与することをさらに包含する、実施形態Ｄ１〜Ｄ５のいずれか１つに記載の方法。
【０７１５】
実施形態D８．  前記多量体リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｄ６またはＤ７のいずれか１つに記載の方法。
【０７１６】
実施形態D９．  被験体において移植された改変された細胞の生存をコントロールするための方法であって、該方法は、
ａ）実施形態Ａ１〜Ａ１７またはＣ１〜Ｃ１３のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に移植すること；および
ｂ）  （ａ）の後に、該被験体において該移植された改変された細胞から生じる状態の有無またはステージを含む情報を受け取ること、および
ｃ）該被験体において同定された該状態の有無またはステージに基づいて、ラパマイシンもしくはラパマイシンアナログを投与するか、該ラパマイシンもしくはラパマイシンリガンドの該被験体へのその後の投与量を維持するか、または該ラパマイシンまたはラパマイシンアナログのその後の投与量を調整すること、
を包含する、方法。
【０７１７】
実施形態D１０．  被験体において移植された改変された細胞の生存をコントロールするための方法であって、該方法は、
ａ）実施形態Ａ１〜Ａ１７またはＣ１〜Ｃ１３のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に移植すること；
ｂ）  （ａ）の後に、該被験体において該移植された改変された細胞から生じる状態の有無またはステージを含む情報を受け取ること；および
ｃ）該被験体において同定された該状態の有無またはステージに基づいて、前記キメラカスパーゼポリペプチド上のＦＫＢＰ１２ｖ３６多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、該被験体への該多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または該多量体リガンドのその後の投与量を調整すること、
を包含する、方法。
【０７１８】
実施形態D１１．  （ｃ）の後に、前記被験体において同定された前記状態の有無またはステージに基づいて、前記キメラカスパーゼポリペプチド上のＦＫＢＰ１２ｖ３６多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、該被験体への該多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または該多量体リガンドのその後の投与量を調製することをさらに包含する、実施形態Ｄ９に記載の方法。
【０７１９】
実施形態D１２．  被験体において移植された改変された細胞の生存をコントロールするための方法であって、該方法は、
ａ）実施形態Ａ１〜Ａ１７またはＣ１〜Ｃ１３のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に移植すること；
ｂ）該被験体において該移植された改変された細胞から生じる状態の有無またはステージを同定すること、および
ｃ）該被験体において同定された該状態の有無またはステージに基づいて、
（ｉ）ラパマイシンまたはラパマイシンアナログを投与するか、該被験体に投与される該ラパマイシンまたはラパマイシンアナログのその後の投与量を維持するか、または該ラパマイシンまたはラパマイシンアナログのその後の投与量を調整するか；あるいは
（ｉｉ）前記キメラカスパーゼポリペプチド上のＦＫＢＰ１２ｖ３６多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、該被験体への該多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または該多量体リガンドのその後の投与量を調整する
意思決定者に、該状態の有無またはステージを伝達すること、
を包含する、方法。
【０７２０】
実施形態D１３．  被験体において移植された改変された細胞の生存をコントロールするための方法であって、該方法は、
ａ）実施形態Ａ１〜Ａ１７またはＣ１〜Ｃ１３のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に移植すること；
ｂ）該被験体において該移植された治療用細胞から生じる状態の有無またはステージを同定すること、および
ｃ）該被験体において同定された該状態の有無またはステージに基づいて、
（ｉ）ラパマイシンまたはラパマイシンアナログを投与するか、該被験体に投与される該ラパマイシンまたはラパマイシンアナログのその後の投与量を維持するか、または該ラパマイシンまたはラパマイシンアナログのその後の投与量を調整するか；あるいは
（ｉｉ）前記キメラカスパーゼポリペプチド上のＦＫＢＰ１２ｖ３６多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、該被験体への該多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または該多量体リガンドのその後の投与量を調整する
指示を伝達すること、
を包含する、方法。
【０７２１】
実施形態D１４．  前記状態は、移植片対宿主病、オンターゲットオフ腫瘍反応性、またはサイトカイン放出症候群である、実施形態Ｄ１〜Ｄ１３のいずれか１つに記載の方法。
【０７２２】
実施形態E１．  標的細胞によって発現される標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、有効量の、実施形態Ａ１〜Ａ３８、またはＣ１〜Ｃ１３のいずれか１つに記載の改変された細胞を投与することを包含する、方法。
【０７２３】
実施形態E２．  前記標的抗原は、腫瘍抗原である、実施形態Ｅ１に記載の方法。
【０７２４】
実施形態E３．  被験体において腫瘍のサイズを減少させるための方法であって、該方法は、実施形態Ａ１〜Ａ１７、またはＣ１〜Ｃ１３のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に投与することを包含し、ここでその抗原認識部分は、該腫瘍上の抗原に結合する、方法。
【０７２５】
実施形態E４．  前記被験体は、腫瘍を有すると診断されている、実施形態Ｅ１〜Ｅ３のいずれか１つに記載の方法。
【０７２６】
実施形態E５．  前記被験体はがんを有する、実施形態Ｅ１〜Ｅ４のいずれか１つに記載の方法。
【０７２７】
実施形態E６．  前記被験体は固形腫瘍を有する、実施形態Ｅ１〜Ｅ５のいずれか１つに記載の方法。
【０７２８】
実施形態E７．  前記改変された細胞は、腫瘍床に送達される、実施形態Ｅ１〜Ｅ６のいずれか１つに記載の方法。
【０７２９】
実施形態E８．  前記がんは、前記被験体の血液または骨髄に存在する、実施形態Ｅ５に記載の方法。
【０７３０】
実施形態E９．  前記被験体は、血液または骨髄の疾患を有する、実施形態Ｅ１〜Ｅ３のいずれか１つに記載の方法。
【０７３１】
実施形態E１０．  前記被験体は、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、実施形態Ｅ１〜Ｅ２のいずれか１つに記載の方法。
【０７３２】
実施形態E１１．  前記患者は、原発性免疫不全状態、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）または他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、ヘモグロビン異常症、代謝状態、および破骨細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、実施形態Ｅ１〜Ｅ２のいずれか１つに記載の方法。
【０７３３】
実施形態E１２．  前記疾患または状態は、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコーニ貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、および大理石骨病からなる群より選択される、実施形態Ｅ１〜Ｅ２のいずれか１つに記載の方法。
【０７３４】
実施形態E１３．  前記標的細胞は、腫瘍細胞である、実施形態Ｅ１〜Ｅ１２のいずれか１つに記載の方法。
【０７３５】
実施形態E１４．  前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記改変された細胞の投与後に減少する、実施形態Ｅ１〜Ｅ１３のいずれか１つに記載の方法。
【０７３６】
実施形態E１５．  前記改変された細胞の投与前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、該改変された細胞の投与後に該被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数  濃度を測定すること、および該第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比較して、該第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増大または減少を決定することを包含する、実施形態Ｅ１〜Ｅ１４のいずれか１つに記載の方法。
【０７３７】
実施形態E１６．  前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して減少している、実施形態Ｅ１５に記載の方法。
【０７３８】
実施形態E１７．  前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して増大している、実施形態Ｅ１５に記載の方法。
【０７３９】
実施形態Ｆ１．  細胞においてキメラ抗原レセプターを発現させるための方法であって、該方法は、実施形態Ｂ１〜Ｂ８０のいずれか１つに記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させることを含み、それによって、該細胞は、前記キメラ抗原レセプターおよび該キメラカスパーゼポリペプチドを該組み込まれた核酸から発現する、方法。
【０７４０】
実施形態Ｆ２．  前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、実施形態Ｆ１に記載の方法。
【０７４１】
実施形態Ｆ３．  前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、実施形態Ｆ１に記載の方法。
【０７４２】
本技術は、１またはこれより多くの具体的実施形態を参照しながら実質的に詳細に論じられてきたものの、当業者は、本出願において具体的に開示される実施形態に変更がなされ得るが、これらの改変および改善が本技術の範囲および趣旨内にあることを認識する。
【０７４３】
例証として論じられる本技術またはその一部は、特許請求される本技術の範囲内で種々の改変が可能である。
【０７４４】
（実施例２５：さらなる代表的実施形態）
以降で提供されるのは、本技術のある種の実施形態の例である。
実施形態Ａ１．  
ａ）第１のキメラポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該第１のキメラポリペプチドは、少なくとも２個の第１のリガンド結合領域を含む足場領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）第２のキメラポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該第２のキメラポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域および第２のリガンド結合領域を含む、第２のポリヌクレオチド；
を含む改変された細胞であって、
ここで該第２のリガンド結合領域は、該第１のリガンド結合領域とは異なるアミノ酸配列を有し、
ここで該第１のリガンド結合領域および第２のリガンド結合領域は、第１のリガンドに結合できる、
改変された細胞。
【０７４５】
実施形態Ａ２．  前記第２のリガンド結合領域は、前記第１のリガンドに結合でき、かつ第２のリガンドに結合できる、実施形態Ａ１に記載の改変された細胞。
【０７４６】
実施形態Ａ３．  前記第２のリガンドは、前記第１のリガンド結合領域に有意に結合しない、実施形態Ａ２に記載の改変された細胞。
【０７４７】
実施形態Ａ４．  前記第１のリガンド結合領域は、前記第２のリガンドに結合できない、実施形態Ａ１〜Ａ２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７４８】
実施形態Ａ５．  前記第１のリガンド結合領域は、前記第１のリガンドに結合でき、かつ第２のリガンドに結合できる、実施形態Ａ１に記載の改変された細胞。
【０７４９】
実施形態Ａ６．  前記第２のリガンドは、前記第２のリガンド結合領域に有意に結合しない、実施形態Ａ５に記載の改変された細胞。
【０７５０】
実施形態Ａ７．  前記第２のリガンド結合領域は、前記第２のリガンドに結合できない、実施形態Ａ５に記載の改変された細胞。
【０７５１】
実施形態Ａ８．  前記第１のキメラポリペプチドは、膜標的化ポリペプチド領域をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７５２】
実施形態Ａ９．  前記第１のキメラポリペプチドは、抗原認識部分をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７５３】
実施形態Ａ１０．  前記第１のキメラポリペプチドは、マーカーポリペプチドをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ９のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７５４】
実施形態Ａ１１．  前記第１のキメラポリペプチドは、Ｔ細胞レセプターをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ９のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７５５】
実施形態Ａ１２．  前記第１のキメラポリペプチドは、キメラ抗原レセプターをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ９のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７５６】
実施形態Ａ１３．  前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、実施形態Ａ１２に記載の改変された細胞。
【０７５７】
実施形態Ａ１４．  前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域および（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、（ｖ）抗原認識部分を含む、実施形態Ａ１２に記載の改変された細胞。
【０７５８】
実施形態Ａ１５．  前記第１のキメラポリペプチドは、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド、および（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ９のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７５９】
実施形態Ａ１６．  前記第１のキメラポリペプチドは、ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ９のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７６０】
実施形態Ａ１７．  前記第１のキメラポリペプチドは、ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ９のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７６１】
実施形態Ａ１８．  前記第１のリガンドは、ラパマイシンまたはラパログである、実施形態Ａ１〜Ａ１７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７６２】
実施形態Ａ１９．  前記第２のリガンドは、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、およびＡＰ１５１０からなる群より選択される、実施形態Ａ１〜Ａ１８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７６３】
実施形態Ａ２０．  前記第１のリガンド結合領域は、ＦＲＢ領域である、実施形態Ａ１〜Ａ４またはＡ８〜Ａ１９のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７６４】
実施形態Ａ２１．  前記第２のリガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ａ１〜Ａ４またはＡ８〜Ａ２０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７６５】
実施形態Ａ２２．  前記第１のリガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ａ５〜Ａ１９のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７６６】
実施形態Ａ２３．  前記第２のリガンド結合領域は、ＦＲＢ領域である、実施形態Ａ５〜Ａ１９またはＡ２２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７６７】
実施形態Ａ２４．  前記細胞は、キメラ抗原レセプターをコードする核酸をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ１３またはＡ１５〜Ａ２３のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７６８】
実施形態Ａ２５．  前記足場領域は、少なくとも３個の第１のリガンド結合領域を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２４のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７６９】
実施形態Ａ２６．  前記足場領域は、少なくとも４個の第１のリガンド結合領域を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２４のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７７０】
実施形態Ａ２７．  前記足場領域は、少なくとも５個の第１のリガンド結合領域を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２４のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７７１】
実施形態Ａ２８．  前記足場領域は、少なくとも６〜１０個の第１のリガンド結合領域を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２４のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７７２】
実施形態Ａ２９．  前記ラパログは、Ｓ−ｏ，ｐ−ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）−ラパマイシン、Ｒ−イソプロポキシラパマイシン、およびＳ−ブタンスルホンアミドラプからなる群より選択される、実施形態Ａ１８〜Ａ２８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７７３】
実施形態Ａ３０．  前記足場は、少なくとも２個のＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢＬ）を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２０、またはＡ２４〜Ａ２９のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７７４】
実施形態Ａ３１．  前記足場は、少なくとも３個のＦＲＢＬドメインを含む、実施形態Ａ３０に記載の改変された細胞。
【０７７５】
実施形態Ａ３２．  前記第１のリガンド結合領域は、少なくとも４個のＦＲＢＬドメインを含む、実施形態Ａ３０に記載の改変された細胞。
【０７７６】
実施形態Ａ３３．  前記ＦＲＢ領域は、ＫＬＷ（Ｔ２０９８Ｌ）、ＫＴＦ（Ｗ２１０１Ｆ）、およびＫＬＦ（Ｔ２０９８Ｌ、Ｗ２１０１Ｆ）からなる群より選択される、実施形態Ａ２０〜Ａ３２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７７７】
実施形態Ａ３４．  前記ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰｖ３６リガンド結合領域を含む、実施形態Ａ２１〜Ａ３３のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７７８】
実施形態Ａ３５．  前記ＦＫＢＰ１２領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される３６位でのアミノ酸置換を有する、実施形態Ａ２１〜Ａ３３のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７７９】
実施形態Ａ３６．  前記細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞、ＴＣＲ発現細胞、またはＮＫ細胞である、実施形態Ａ１〜Ａ３５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７８０】
実施形態Ａ３７．  前記細胞は、骨髄から得られるかまたは骨髄から調製される、実施形態Ａ１〜Ａ３６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７８１】
実施形態Ａ３８．  前記細胞は、臍帯血から得られるかまたは臍帯血から調製される、実施形態Ａ１〜Ａ３６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７８２】
実施形態Ａ３９．  前記細胞は、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される、実施形態Ａ１〜Ａ３６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７８３】
実施形態Ａ４０．  前記細胞は、末梢血単核細胞から得られるかまたは末梢血単核細胞から調製される、実施形態Ａ１〜Ａ３６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７８４】
実施形態Ａ４１．  前記細胞は、前記第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ３６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７８５】
実施形態Ａ４２．  前記プロモーターは、前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結される、実施形態Ａ４１に記載の改変された細胞。
【０７８６】
実施形態Ａ４３．  前記プロモーターは、発生的に制御され、前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、発生的に分化した細胞において発現される、実施形態Ａ４１〜Ａ４２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７８７】
実施形態Ａ４４．  前記プロモーターは、組織特異的であり、前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、特異的組織において発現される、実施形態Ａ４１〜Ａ４２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７８８】
実施形態Ａ４５．  前記プロモーターは、活性化Ｔ細胞において活性化される、実施形態Ａ４１〜Ａ４２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７８９】
実施形態Ａ４６．  前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、またはカスパーゼ１４、ＦＡＤＤ（ＤＥＤ）、ＡＰＡＦ１（ＣＡＲＤ）、ＣＲＡＤＤ／ＲＡＩＤＤ  ＣＡＲＤ）、ＡＳＣ（ＣＡＲＤ）、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、ＲＩＰＫ３、およびＲＩＰＫ１−ＲＨＩＭからなる群より選択される、実施形態Ａ１〜Ａ４５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７９０】
実施形態Ａ４７．  前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼポリペプチドである、実施形態Ａ１〜Ａ４５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７９１】
実施形態Ａ４８．  前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ａ１〜Ａ４５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７９２】
実施形態Ａ４９．  前記カスパーゼポリペプチドは、配列番号３００のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ４７〜Ａ４８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７９３】
実施形態Ａ５０．  前記カスパーゼポリペプチドは、表５または表６中のカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ａ４７〜Ａ４８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７９４】
実施形態Ａ５１．  前記カスパーゼポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、およびＮ４０５Ｑからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ａ４７〜Ａ４８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７９５】
実施形態Ａ５２．  前記短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２１４のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ａ１４〜Ａ５０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７９６】
実施形態Ａ５３．  前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、配列番号２１６のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ａ１４〜Ａ５２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７９７】
実施形態Ａ５４．  前記抗原認識部分は、ＣＤ１９に結合する一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ａ９〜Ａ５２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７９８】
実施形態Ａ５５．  前記抗原認識部分は、ＰＳＣＡに結合する一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ａ９〜Ａ５２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０７９９】
実施形態Ａ５６．  前記抗原認識部分は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結合する一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ａ９〜Ａ５２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０８００】
実施形態Ａ５７．  前記細胞は、Ｔ細胞である、実施形態Ａ１〜Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０８０１】
実施形態Ａ５８．  前記細胞は、ナチュラルキラー細胞である、実施形態Ａ１〜Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０８０２】
実施形態Ａ５９．  膜会合ポリペプチド領域は、ＮＫＧ２Ｄレセプターである、実施形態Ａ８〜Ａ５８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０８０３】
実施形態Ａ６０．  前記膜標的化ポリペプチド領域は、ミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域、およびレセプターの膜貫通配列からなる群より選択される、実施形態Ａ８〜Ａ５８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０８０４】
実施形態Ａ６１．  前記膜標的化ポリペプチド領域は、ミリストイル化領域である、実施形態Ａ８〜Ａ５８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０８０５】
実施形態Ａ６２．  前記ミリストイル化領域は、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ａ６１に記載の改変された細胞。
【０８０６】
実施形態Ａ６３．  前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子である、実施形態Ａ１３〜Ａ６２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０８０７】
実施形態Ａ６４．  前記Ｔ細胞活性化分子は、ＣＤ３ζポリペプチドである、実施形態Ａ１３〜Ａ６２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０８０８】
実施形態Ａ６５．  前記Ｔ細胞活性化分子は、Ｆｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドである、実施形態Ａ１３〜Ａ６２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０８０９】
実施形態Ａ６６．  前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原に結合する、実施形態Ａ９〜Ａ６５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０８１０】
実施形態Ａ６７．  前記抗原認識部分は、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、実施形態Ａ９〜Ａ６５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０８１１】
実施形態Ａ６８．  前記抗原認識部分は、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６、およびＨｅｒ２／Ｎｅｕからなる群より選択される抗原に結合する、実施形態Ａ９〜Ａ６５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０８１２】
実施形態Ａ６９．  前記抗原認識部分は、ウイルス抗原または細菌抗原に結合する、実施形態Ａ９〜Ａ６５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０８１３】
実施形態Ａ７０．  前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ａ９〜Ａ６５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０８１４】
実施形態Ａ７１．  前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である、実施形態Ａ１３〜Ａ７０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０８１５】
実施形態B１．  第１のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、ここで該第１のキメラポリペプチドは、少なくとも２個の第１のリガンド結合領域を含む足場領域を含む、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸。
【０８１６】
実施形態B２．  第２のキメラポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該第２のキメラポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域および第２のリガンド結合領域を含む、第２のポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ｂ１に記載の核酸であって、ここで該第２のリガンド結合領域は、該第１のリガンド結合領域とは異なるアミノ酸配列を有し、ここで該第１のリガンド結合領域および第２のリガンド結合領域は、第１のリガンドに結合できる、核酸。
【０８１７】
実施形態B３．  前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、実施形態Ｂ２に記載の核酸。
【０８１８】
実施形態B４．  前記プロモーターは、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結される、実施形態Ｂ２に記載の核酸。
【０８１９】
実施形態B８．  前記第２のリガンドは、前記第１のリガンド結合領域に有意に結合しない、実施形態Ｂ７に記載の核酸。
【０８２０】
実施形態B９．  前記第１のリガンド結合領域は、前記第２のリガンドに結合できない、実施形態Ｂ２〜Ｂ７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０８２１】
実施形態B１０．  前記第１のリガンド結合領域は、前記第１のリガンドに結合でき、かつ第２のリガンドに結合できる、実施形態Ｂ２〜Ｂ６のいずれか１つに記載の核酸。
【０８２２】
実施形態B１１．  前記第２のリガンドは、前記第２のリガンド結合領域に有意に結合しない、実施形態Ｂ１０に記載の核酸。
【０８２３】
実施形態B１２．  前記第２のリガンド結合領域は、前記第２のリガンドに結合できない、実施形態Ｂ１０に記載の核酸。
【０８２４】
実施形態B１３．  前記第１のキメラポリペプチドは、膜標的化ポリペプチド領域をさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１２のいずれか１つに記載の核酸。
【０８２５】
実施形態B１４．  前記第１のキメラポリペプチドは、抗原認識部分をさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１４のいずれか１つに記載の核酸。
【０８２６】
実施形態B１５．  前記第１のキメラポリペプチドは、マーカーポリペプチドをさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１４のいずれか１つに記載の核酸。
【０８２７】
実施形態B１６．  前記第１のキメラポリペプチドは、Ｔ細胞レセプターをさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１４のいずれか１つに記載の核酸。
【０８２８】
実施形態B１７．  前記第１のキメラポリペプチドは、キメラ抗原レセプターをさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１４のいずれか１つに記載の核酸。
【０８２９】
実施形態B１８．  前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、実施形態Ｂ１７に記載の核酸。
【０８３０】
実施形態B１９．  前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域および（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子、（ｖ）抗原認識部分を含む、実施形態Ｂ１７に記載の核酸。
【０８３１】
実施形態B２０．  前記第１のキメラポリペプチドは、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド、および（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域をさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１４のいずれか１つに記載の核酸。
【０８３２】
実施形態B２１．  前記第１のキメラポリペプチドは、ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドをさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１４のいずれか１つに記載の核酸。
【０８３３】
実施形態B２２．  前記第１のキメラポリペプチドは、ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域をさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１４のいずれか１つに記載の核酸。
【０８３４】
実施形態B２３．  前記第１のリガンドは、ラパマイシンまたはラパログである、実施形態Ｂ１〜Ｂ２２のいずれか１つに記載の核酸。
【０８３５】
実施形態B２４．  前記第２のリガンドは、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、およびＡＰ１５１０からなる群より選択される、実施形態Ｂ１〜Ｂ２３のいずれか１つに記載の核酸。
【０８３６】
実施形態B２５．  前記第１のリガンド結合領域は、ＦＲＢ領域である、実施形態Ｂ１〜Ｂ９またはＢ１３〜Ｂ２４のいずれか１つに記載の核酸。
【０８３７】
実施形態B２６．  前記第２のリガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ｂ１〜Ｂ９またはＢ１３〜Ｂ２４のいずれか１つに記載の核酸。
【０８３８】
実施形態B２７．  前記第１のリガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ｂ１０〜Ｂ２４のいずれか１つに記載の核酸。
【０８３９】
実施形態B２８．  前記第２のリガンド結合領域は、ＦＲＢ領域である、実施形態Ｂ１０〜Ｂ２４またはＢ２７のいずれか１つに記載の核酸。
【０８４０】
実施形態B２９．  前記足場領域は、少なくとも３個の第１のリガンド結合領域を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２８のいずれか１つに記載の核酸。
【０８４１】
実施形態B３０．  前記足場領域は、少なくとも４個の第１のリガンド結合領域を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２８のいずれか１つに記載の核酸。
【０８４２】
実施形態B３１．  前記足場領域は、少なくとも５個の第１のリガンド結合領域を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２４のいずれか１つに記載の核酸。
【０８４３】
実施形態B３２．  前記足場領域は、少なくとも６〜１０個の第１のリガンド結合領域を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２４のいずれか１つに記載の核酸。
【０８４４】
実施形態B３３．  前記ラパログは、Ｓ−ｏ，ｐ−ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）−ラパマイシン、Ｒ−イソプロポキシラパマイシン、およびＳ−ブタンスルホンアミドラプからなる群より選択される、実施形態Ｂ２３〜Ｂ３２のいずれか１つに記載の核酸。
【０８４５】
実施形態B３４．  前記足場は、少なくとも２個のＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢＬ）を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３３のいずれか１つに記載の核酸。
【０８４６】
実施形態B３５．  前記足場は、少なくとも３個のＦＲＢＬドメインを含む、実施形態Ｂ３４に記載の核酸。
【０８４７】
実施形態B３６．  前記第１のリガンド結合領域は、少なくとも４個のＦＲＢＬドメインを含む、実施形態Ｂ３４に記載の核酸。
【０８４８】
実施形態B３７．  前記ＦＲＢ領域は、ＫＬＷ（Ｔ２０９８Ｌ）、ＫＴＦ（Ｗ２１０１Ｆ）、およびＫＬＦ（Ｔ２０９８Ｌ、Ｗ２１０１Ｆ）からなる群より選択される、実施形態Ｂ２５〜Ｂ３６のいずれか１つに記載の核酸。
【０８４９】
実施形態B３８．  前記ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰｖ３６リガンド結合領域を含む、実施形態Ｂ２６〜Ｂ３７のいずれか１つに記載の核酸。
【０８５０】
実施形態B３９．  前記プロモーターは、発生的に制御され、前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、発生的に分化した細胞において発現される、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０８５１】
実施形態B４０．  前記プロモーターは、組織特異的であり、前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、特異的組織において発現される、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０８５２】
実施形態B４１．  前記プロモーターは、活性化Ｔ細胞において活性化される、実施形態Ｂ１〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の核酸。
【０８５３】
実施形態B４２．  前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、またはカスパーゼ１４、ＦＡＤＤ（ＤＥＤ）、ＡＰＡＦ１（ＣＡＲＤ）、ＣＲＡＤＤ／ＲＡＩＤＤ  ＣＡＲＤ）、ＡＳＣ（ＣＡＲＤ）、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、ＲＩＰＫ３、およびＲＩＰＫ１−ＲＨＩＭからなる群より選択される、実施形態Ｂ２〜Ｂ４１のいずれか１つに記載の核酸。
【０８５４】
実施形態B４３．  前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼポリペプチドである、実施形態Ｂ１〜Ｂ４２のいずれか１つに記載の核酸。
【０８５５】
実施形態B４４．  前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ｂ１〜Ｂ４３のいずれか１つに記載の核酸。
【０８５６】
実施形態B４５．  前記カスパーゼポリペプチドは、配列番号３００のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｂ４３〜Ｂ４４のいずれか１つに記載の核酸。
【０８５７】
実施形態B４６．  前記カスパーゼポリペプチドは、表５または表６中のカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ｂ４３〜Ｂ４４のいずれか１つに記載の核酸。
【０８５８】
実施形態B４７．  前記カスパーゼポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、およびＮ４０５Ｑからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ｂ４３〜Ｂ４４のいずれか１つに記載の核酸。
【０８５９】
実施形態B４８．  前記短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２１４のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｂ１９〜Ｂ４７のいずれか１つに記載の核酸。
【０８６０】
実施形態B４９．  前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、配列番号２１６のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｂ１９〜Ｂ４８のいずれか１つに記載の核酸。
【０８６１】
実施形態B５０．  前記抗原認識部分は、ＣＤ１９に結合する一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ｂ１４〜Ｂ４９のいずれか１つに記載の核酸。
【０８６２】
実施形態B５１．  前記抗原認識部分は、ＰＳＣＡに結合する一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ｂ１４〜Ｂ４９のいずれか１つに記載の核酸。
【０８６３】
実施形態B５２．  前記抗原認識部分は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結合する一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ｂ１４〜Ｂ４９のいずれか１つに記載の核酸。
【０８６４】
実施形態B５３．  前記細胞は、Ｔ細胞である、実施形態Ｂ１〜Ｂ５６のいずれか１つに記載の核酸。
【０８６５】
実施形態B５４．  前記細胞は、ナチュラルキラー細胞である、実施形態Ｂ１〜Ｂ５６のいずれか１つに記載の核酸。
【０８６６】
実施形態B５５．  膜標的化ポリペプチド領域は、ＮＫＧ２Ｄレセプターである、実施形態Ｂ１３〜Ｂ５４のいずれか１つに記載の核酸。
【０８６７】
実施形態B５６．  前記膜標的化ポリペプチド領域は、ミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域、およびレセプターの膜貫通配列からなる群より選択される、実施形態Ｂ１３〜Ｂ５４のいずれか１つに記載の核酸。
【０８６８】
実施形態B５７．  前記膜標的化ポリペプチド領域は、ミリストイル化領域である、実施形態Ｂ１３〜Ｂ５４のいずれか１つに記載の核酸。
【０８６９】
実施形態B５８．  前記ミリストイル化領域は、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｂ５７に記載の核酸。
【０８７０】
実施形態B５９．  前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子である、実施形態Ｂ１８〜Ｂ５８のいずれか１つに記載の核酸。
【０８７１】
実施形態B６０．  前記Ｔ細胞活性化分子は、ＣＤ３ζポリペプチドである、実施形態Ｂ１８〜Ｂ５８のいずれか１つに記載の核酸。
【０８７２】
実施形態B６１．  前記Ｔ細胞活性化分子は、Ｆｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドである、実施形態Ｂ１８〜Ｂ５８のいずれか１つに記載の核酸。
【０８７３】
実施形態B６２．  前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｂ１４〜Ｂ５９のいずれか１つに記載の核酸。
【０８７４】
実施形態B６３．  前記抗原認識部分は、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｂ１４〜Ｂ５９のいずれか１つに記載の核酸。
【０８７５】
実施形態B６４．  前記抗原認識部分は、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６、およびＨｅｒ２／Ｎｅｕからなる群より選択される抗原に結合する、実施形態Ｂ１４〜Ｂ５９のいずれか１つに記載の核酸。
【０８７６】
実施形態B６５．  前記抗原認識部分は、ウイルス抗原または細菌抗原に結合する、実施形態Ｂ１４〜Ｂ５９のいずれか１つに記載の核酸。
【０８７７】
実施形態B６６．  前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ｂ１４〜Ｂ５９のいずれか１つに記載の核酸。
【０８７８】
実施形態B６７．  前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である、実施形態Ｂ１８〜Ｂ７０のいずれか１つに記載の核酸。
【０８７９】
実施形態B６８．  前記核酸は、ウイルスベクター内に含まれる、実施形態Ｂ１〜Ｂ６７のいずれか１つに記載の核酸。
【０８８０】
実施形態B６９．  前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである、実施形態Ｂ６８に記載の核酸。
【０８８１】
実施形態B７０．  前記レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルスベクターである、実施形態Ｂ６９に記載の核酸。
【０８８２】
実施形態B７１．  前記レトロウイルスベクターは、ＳＦＧベクターである、実施形態Ｂ６９に記載の核酸。
【０８８３】
実施形態B７２．  前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである、実施形態Ｂ６８に記載の核酸。
【０８８４】
実施形態B７３．  前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである、実施形態Ｂ６８に記載の核酸。
【０８８５】
実施形態B７４．  前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群より選択される、実施形態Ｂ６８に記載の核酸。
【０８８６】
実施形態B７５．  前記核酸は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、もしくはバイオリスティックのために調製されるかまたはそのためにデザインされたベクターの中に存在するか、あるいは化学的脂質（chemical  lipid）、ポリマー、無機ナノ粒子、もしくはポリプレックスに結合されるかまたはその中に組み込まれる、実施形態Ｂ１〜Ｂ７４のいずれか１項に記載の核酸。
【０８８７】
実施形態B７６．  前記核酸は、プラスミド内に含まれる、実施形態Ｂ１〜Ｂ６６、またはＢ７５のいずれか１つに記載の核酸。
【０８８８】
実施形態B７７．  実施例１６の表の中に提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ７６のいずれか１つに記載の核酸。
【０８８９】
実施形態B７８．  ＦＫＢＰｖ３６、ＦｐＫ’、ＦｐＫ、Ｆｖ、Ｆｖ’、ＦＫＢＰｐＫ’、ＦＫＢＰｐＫ’’、およびＦＫＢＰｐＫ’’’からなる群より選択される、実施例１６の表の中に提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ７６のいずれか１つに記載の核酸。
【０８９０】
実施形態B７９．  ＦＫＢＰｖ３６、ＦｐＫ’、ＦｐＫ、Ｆｖ、Ｆｖ’、ＦＫＢＰｐＫ’、ＦＫＢＰｐＫ’’、およびＦＫＢＰｐＫ’’’からなる群より選択される、実施例１６の表の中に提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ７６のいずれか１つに記載の核酸。
【０８９１】
実施形態B８０．  ＦＫＢＰｖ３６、ＦｐＫ’、ＦｐＫ、Ｆｖ、Ｆｖ’、ＦＫＢＰｐＫ’、ＦＫＢＰｐＫ’’、およびＦＫＢＰｐＫ’’’からなる群より選択される、実施例１６の表の中に提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ７６のいずれか１つに記載の核酸。
【０８９２】
実施形態B８１．  ＦＲＰ５−ＶＬ、ＦＲＰ５−ＶＨ、ＦＭＣ６３−ＶＬ、およびＦＭＣ６３−ＶＨからなる群より選択される、実施例１６の表の中に提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ８０のいずれか１つに記載の核酸。
【０８９３】
実施形態B８２．  ＦＲＰ５−ＶＬおよびＦＲＰ５−ＶＨをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ８１に記載の核酸。
【０８９４】
実施形態B８３．  ＦＭＣ６３−ＶＬおよびＦＭＣ６３−ＶＨをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ８１に記載の核酸。
【０８９５】
実施形態B８４．  ＭｙＤ８８ＬおよびＭｙＤ８８からなる群より選択される、実施例１６の表の中に提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ８３のいずれか１つに記載の核酸。
【０８９６】
実施形態B８５．  実施例１６の表の中に提供されるΔカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ８４のいずれか１つに記載の核酸。
【０８９７】
実施形態B８６．  実施例１６の表の中に提供されるΔＣＤ１９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ８５のいずれか１つに記載の核酸。
【０８９８】
実施形態B８７．  実施例１６の表の中に提供されるｈＣＤ４０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ８６のいずれか１つに記載の核酸。
【０８９９】
実施形態B８８．  実施例１６の表の中に提供されるＣＤ３ζポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ８７のいずれか１つに記載の核酸。
【０９００】
実施形態C１．  実施形態Ｂ１〜Ｂ８８のいずれか１つに記載の核酸でトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
【０９０１】
実施形態C２．  前記細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、実施形態Ａ１〜Ａ７１、またはＣ１のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０９０２】
実施形態C３．  前記細胞は、Ｔ細胞である、実施形態Ａ１〜Ａ７１またはＣ１のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０９０３】
実施形態C４．  前記細胞は、初代Ｔ細胞である、実施形態Ａ１〜Ａ７１、またはＣ１のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０９０４】
実施形態C５．  前記細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である、実施形態Ａ１〜Ａ７１、またはＣ１のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０９０５】
実施形態C６．  前記細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（  inducible  pluripotent  stem  cell；ｉＰＳＣ）、非リンパ球性造血細胞、非造血細胞、マクロファージ、ケラチノサイト、線維芽細胞、メラノーマ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはＴ細胞からなる群より選択される、実施形態Ａ１〜Ａ７１、またはＣ１のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０９０６】
実施形態C７．  前記Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞である、実施形態Ａ１〜Ａ７１、またはＣ１のいずれか一つに記載の方法。
【０９０７】
実施形態C８．  前記細胞は、骨髄から得られるかまたは骨髄から調製される、実施形態Ｃ１〜Ｃ７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０９０８】
実施形態C９．  前記細胞は、臍帯血から得られるかまたは臍帯血から調製される、実施形態Ｃ１〜Ｃ７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０９０９】
実施形態C１０．  前記細胞は、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される、実施形態Ｃ１〜Ｃ７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０９１０】
実施形態C１１．  前記細胞は、末梢血単核細胞から得られるかまたは末梢血単核細胞から調製される、実施形態Ｃ１〜Ｃ７のいずれか１項に記載の改変された細胞。
【０９１１】
実施形態C１２．  前記細胞は、ヒト細胞である、実施形態Ｃ１〜Ｃ７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０９１２】
実施形態C１３．  前記改変された細胞は、インビボで形質導入またはトランスフェクトされる、実施形態Ｃ１〜Ｃ１２のいずれか１つに記載の方法。
【０９１３】
実施形態C１４．  前記細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子での遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスからなる群より選択される方法を使用して、核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される、実施形態Ｃ１〜Ｃ７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
【０９１４】
実施形態D１．  被験体において移植された改変された細胞の生存をコントロールするための方法であって、該方法は、
ａ）実施形態Ａ１〜Ａ７１、またはＣ１〜Ｃ１４のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に移植すること；および
ｂ）  （ａ）の後に、該被験体にラパマイシンまたはラパログを、前記アポトーシス促進ポリペプチド領域を含む前記第２のキメラポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの３０％未満を殺滅するために有効な量で投与すること、
を包含する方法。
【０９１５】
実施形態D１．１．  ラパマイシンまたはラパログを、改変された細胞を使用する細胞治療を受けたことがあるヒト被験体に投与するための方法であって、該方法は、ラパマイシンまたはラパログを、該ヒト被験体に投与することを包含し、ここで該改変された細胞は、実施形態Ｂ１〜Ｂ８８のいずれか１つに記載の核酸を含み、ここで該ラパマイシンまたはラパログは、ＦＲＢ領域に結合する、方法。
【０９１６】
実施形態D２．  前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラカスパーゼポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの４０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態Ｄ１またはＤ１．１のいずれか１つに記載の方法。
【０９１７】
実施形態D３．  前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラカスパーゼポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの５０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態Ｄ１またはＤ１．１のいずれか１つに記載の方法。
【０９１８】
実施形態D４．  前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラカスパーゼポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの６０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態Ｄ１またはＤ１．１のいずれか１つに記載の方法。
【０９１９】
実施形態D５．  前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラカスパーゼポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの７０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態Ｄ１またはＤ１．１に記載の方法。
【０９２０】
実施形態D６．  第２のリガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域であり、前記アポトーシス促進ポリペプチド領域を含む前記第２のキメラポリペプチド上の該ＦＫＢＰ１２領域に結合するリガンドを、該第２のキメラポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９０％を殺滅するために有効な量で投与することをさらに包含する、実施形態Ｄ１〜Ｄ５のいずれか１つに記載の方法。
【０９２１】
実施形態D７．  被験体において移植された改変された細胞の生存をコントロールするための方法であって、該方法は、
ａ）実施形態Ａ１〜Ａ７１またはＣ１〜Ｃ１４のいずれか１つに記載の改変された細胞を、該被験体に移植すること；および
ｂ）  （ａ）の後に、該被験体に、前記アポトーシス促進ポリペプチド領域を含む前記第２のキメラポリペプチド上の前記ＦＫＢＰ１２領域に結合するリガンドを、該第２のキメラポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９０％を殺滅するために有効な量で投与すること
を包含する方法。
【０９２２】
実施形態D８．  前記リガンド、ラパマイシン、または前記ラパログの１より多くの用量が投与される、実施形態Ｄ１〜Ｄ７のいずれか１つに記載の方法。
【０９２３】
実施形態D９．  トランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の有無を同定すること；ならびに
該被験体において同定された該状態の有無に基づいて、ラパマイシンもしくはラパログ、または前記ＦＫＢＰ１２領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体へのその後の投与量を維持するか、あるいはその後の投与量を調整すること
をさらに包含する、実施形態Ｄ１〜Ｄ８のいずれか１つに記載の方法。
【０９２４】
実施形態D１０．  トランスフェクトまたは形質導入された治療用細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の有無を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の有無に基づいて、前記ＦＫＢＰ１２領域に結合するリガンド、またはラパマイシンもしくはラパログが、該被験体に投与されるべきどうか、あるいは該被験体にその後投与される該リガンドの投与量が調整されることを決定すること、
をさらに包含する、実施形態Ｄ１〜Ｄ９のいずれか１つに記載の方法。
【０９２５】
実施形態D１１．  トランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の有無を含む情報を受け取ること；および
該被験体において同定された該状態の有無に基づいて、ラパマイシンもしくはラパログ、または前記ＦＫＢＰ１２領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体へのその後の投与量を維持するか、あるいはその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、実施形態Ｄ１〜Ｄ９のいずれか１つに記載の方法。
【０９２６】
実施形態D１２．  トランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の有無を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の有無またはステージを、該被験体において同定された該状態の有無またはステージに基づいて、ラパマイシン、ラパログまたは前記ＦＫＢＰ１２領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体に投与されるその後の投与量を維持するか、あるいはその後の投与量を調整する意思決定者に伝達すること、
をさらに包含する、実施形態Ｄ１〜Ｄ９のいずれか１つに記載の方法。
【０９２７】
実施形態D１３．  トランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞を該被験体から除去することを要する該被験体における状態の有無を同定すること；ならびに
該被験体において同定された該状態の有無またはステージに基づいて、ラパマイシン、ラパログ、または前記ＦＫＢＰ１２領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体に投与されるその後の投与量を維持するか、あるいはその後の投与量を調整する指示を伝達すること、
をさらに包含する、実施形態Ｄ１〜Ｄ９のいずれか１つに記載の方法。
【０９２８】
実施形態D１４．  前記リガンドの投与後に、前記被験体細胞において移植片対宿主病またはサイトカイン放出症候群を引き起こす改変された細胞の数は、減少する、実施形態Ｄ１３に記載の方法。
【０９２９】
実施形態D１５．  前記改変された細胞は、トランスフェクションまたは形質導入前に同種枯渇される、実施形態Ｄ１〜Ｄ１４のいずれか１つに記載の方法。
【０９３０】
実施形態D１６．  前記改変された細胞は、トランスフェクションまたは形質導入前に同種枯渇されない、実施形態Ｄ１〜Ｄ１４のいずれか１つに記載の方法。
【０９３１】
実施形態D１７．  前記改変された細胞は、前記被験体に対して同種である、実施形態Ｄ１〜Ｄ１６のいずれか１つに記載の方法。
【０９３２】
実施形態D１８．  前記改変された細胞は、前記被験体に対して自家である、実施形態Ｄ１〜Ｄ１６のいずれか１つに記載の方法。
【０９３３】
実施形態D１９．  前記形質導入またはトランスフェクトされた改変された細胞は、前記被験体への投与前に、ＩＬ−２の存在下で培養される、実施形態Ｄ１〜Ｄ１８のいずれか１つに記載の方法。
【０９３４】
実施形態D２０．  同種反応性の改変された細胞は、前記被験体に存在し、同種反応性の改変された細胞の数は、ラパマイシン、前記ラパログ、または前記リガンドの投与後に少なくとも９０％減少する、実施形態Ｄ１９に記載の方法。
【０９３５】
実施形態D２１．  ラパマイシン、前記ラパログ、または前記リガンドの投与後に、改変された細胞は、前記被験体の中で生き残り、拡大できかつウイルスおよび真菌に対して反応性である、実施形態Ｄ７〜Ｄ２０のいずれか１つに記載の方法。
【０９３６】
実施形態D２２．  ラパマイシン、前記ラパログ、または前記リガンドの投与後に、改変された細胞は、前記被験体の中で生き残り、拡大できかつ該被験体中の腫瘍細胞に対して反応性である、実施形態Ｄ７〜Ｄ２０のいずれか１つに記載の方法。
【０９３７】
実施形態D２３．  前記被験体は、前記改変された細胞の投与前または投与と同時に幹細胞移植を受けたことがある、実施形態Ｄ７〜Ｄ２０のいずれか１つに記載の方法。
【０９３８】
実施形態D２４．  前記被験体における移植片対宿主病症状の出現に基づいて、該被験体へのラパマイシン、前記ラパログ、または前記リガンドのさらなる単一用量またはさらなる複数用量を投与するかどうかを決定することをさらに包含する、実施形態Ｄ７〜Ｄ２０のいずれか１つに記載の方法。
【０９３９】
実施形態D２５．  少なくとも１×１０６個の形質導入またはトランスフェクトされた改変された細胞が、前記被験体に投与される、実施形態Ｄ１〜Ｄ２４のいずれか１つに記載の方法。
【０９４０】
実施形態D２６．  少なくとも１×１０７個の形質導入またはトランスフェクトされた改変された細胞が、前記被験体に投与される、実施形態Ｄ１〜Ｄ２４のいずれか１つに記載の方法。
【０９４１】
実施形態D２７．  少なくとも１×１０８個の形質導入またはトランスフェクトされた改変された細胞が、前記被験体に投与される、実施形態Ｄ１〜Ｄ２４のいずれか１つに記載の方法。
【０９４２】
実施形態D２８．  前記被験体における移植片対宿主病の有無またはステージを同定すること、および
該被験体において同定された該移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、ラパマイシン、ラパログ、もしくは前記ＦＫＢＰ１２領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体へのその後の投与量を維持するか、またはその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、実施形態Ｄ１〜Ｄ２５のいずれか１つに記載の方法。
【０９４３】
実施形態E１．  細胞においてキメラ抗原レセプターを発現させるための方法であって、該方法は、実施形態Ａ１〜Ａ７１のいずれか１つに記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞へと組み込まれる条件下で接触させ、それによって該細胞は、該キメラ抗原レセプターおよびキメラカスパーゼポリペプチドを該組み込まれた核酸から発現することを包含する、方法。
【０９４４】
実施形態E２．  前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、実施形態Ｅ１に記載の方法。
【０９４５】
実施形態E３．  前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、実施形態Ｅ１に記載の方法。
*      *        *
【０９４６】
本明細書中で参照された特許、特許出願、刊行物および文書の各々の全体が、参照により本明細書によって援用される。上記特許、特許出願、刊行物および文書の引用は、前述のいずれかが、関連する従来技術であることを自認するものでもないし、これらの刊行物または文書の内容または日付に関して何ら自認するものでもない。
【０９４７】
本技術の基本的な態様から逸脱することなく、前述のものに対して改変が行われ得る。本技術は、１つ以上の特定の実施形態に照らして実質的に詳細に説明されてきたが、当業者は、本願において具体的に開示された実施形態に対して変更が行われ得るが、これらの改変および改善が本技術の範囲内および精神内であることを認識する。
【０９４８】
本明細書中に例証的に記載された技術は、本明細書中に具体的に開示されていない任意のエレメント（複数可）の非存在下において、適切に実施され得る。したがって、例えば、本明細書中の各場合において、用語「〜を含む」、「〜から本質的になる」および「〜からなる」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと置き換えられてもよい。使用されてきた用語および表現は、限定の用語ではなく説明の用語として使用され、そのような用語および表現の使用は、示されたおよび記載された特徴またはそれらの一部のいかなる等価物も排除せず、特許請求される本技術の範囲内で様々な改変が可能である。エレメントのうちの１つまたはエレメントのうちの２つ以上が記載されていることが文脈から明らかでない限り、用語「ａ」または「ａｎ」は、それが修飾するエレメントのうちの１つまたは複数のことを指し得る（例えば、「試薬（ａ  ｒｅａｇｅｎｔ）」は、１つ以上の試薬を意味し得る）。本明細書中で使用される用語「約」は、基となるパラメータの１０％以内の値（すなわち、プラスまたはマイナス１０％）のことを指し、一続きの値の始めに用語「約」を使用することにより、それらの値の各々が修飾される（すなわち、「約１、２および３」は、約１、約２および約３のことを指す）。例えば、「約１００グラム」という重量は、９０グラム〜１１０グラムの重量を含み得る。さらに、値のリストが、本明細書中に記載されるとき（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６％）、そのリストには、それらのすべての中間値および分数値（例えば、５４％、８５．４％）が含まれる。したがって、本技術は、代表的な実施形態および随意の特徴によって具体的に開示されてきたが、本明細書中に開示された概念の改変およびバリエーションが、当業者によって用いられることがあり、そのような改変およびバリエーションは、本技術の範囲内であるとみなされると理解されるべきである。
【０９４９】
この技術のある特定の実施形態は、以下に続く特許請求の範囲に示される。
【図１Ａ】
2020096640.tif 000113
【図１Ｂ】
2020096640.tif 000114
【図２】
2020096640.tif 000115
【図３】
2020096640.tif 000116
【図４】
2020096640.tif 000117
【図５】
2020096640.tif 000118
【図６】
2020096640.tif 000119
【図７】
2020096640.tif 000120
【配列表】
2020096640000001.app
【外国語明細書】
2020096640000001.pdf