(57)【要約】【課題】対象又は生体試料におけるプロテアーゼ活性を、活性化可能抗体を用いて検出するための組成物及び方法、並びに、種々の診断適用におけるこれらの組成物及び方法を提供する。【解決手段】標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）と、非切断状態にある活性化可能抗体のＡＢの標的への結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）と、ＡＢに連結された切断可能部分（ＣＭ）とを含む活性化可能抗体を用いる。【選択図】図１
2020098195.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持マトリックスに結合された生体試料中の共局在する切断剤及び標的の存在又は不在を検出するインビトロの方法であって、
（ａ）支持マトリックスに結合された生体試料を、活性化可能抗体と接触させ、ここで活性化可能抗体は、標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）と、非切断状態にある活性化可能抗体のＡＢの標的への結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）と、ＡＢに連結された切断可能部分（ＣＭ）とを含み、ここでＣＭはプロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであり、ここで前記切断剤はプロテアーゼであり、前記切断剤によって前記活性化可能抗体のＣＭが切断されると、前記活性化可能抗体が活性化され、
（ｂ）生体試料中の活性化された活性化可能抗体のレベルをインサイチュ（in situ）で測定する
ことを含み、
ここで、生体試料中に活性化された活性化可能抗体が検出可能なレベルで存在すれば、生体試料中に切断剤及び標的が存在し、且つ共局在していることを示し、生体試料中に活性化された活性化可能抗体が検出可能なレベルで存在しなければ、生体試料中に切断剤、標的、又は切断剤及び標的の双方が不在であるか、又は検出可能なレベルで存在せず、若しくは共局在していないことを示す、方法。
【請求項２】
活性化可能抗体が、検出可能な標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料中の活性化可能抗体のレベルの測定が、活性化された抗体に特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、前記二次試薬が、検出可能な標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
検出可能な標識が、造影剤、コントラスト剤、酵素、蛍光標識、発色団、染料、放射性同位体、一又は二以上の金属イオン、又はリガンド系標識を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
非切断状態の活性化可能抗体がＮ末端からＣ末端に向かって以下の構造的配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標的が表１に列記された標的の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＡＢが表２に列記された抗体の群から選択される抗体であり、或いは当該抗体から誘導される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
抗体の抗原結合断片が、Fab断片、F（ab'）2断片、scFv、及びscAbからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＭＭのＡＢに対する結合の平衡解離定数が、ＡＢの標的に対する結合の平衡解離定数よりも大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＭＭが、切断状態の活性化可能抗体のＡＢの標的に対する結合と干渉又は競合しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＭＭがアミノ酸長４０以下のポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＭＭのポリペプチド配列が、標的のポリペプチド配列とは異なると共に、ＡＢの天然結合パートナーの何れとも５０％超の同一性を有さない、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＭＭが標的に対して２５％超のアミノ酸配列同一性を有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＭＭが標的に対して１０％超のアミノ酸配列同一性を有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＭが、表３に列記のプロテアーゼの群から選択されるプロテアーゼの基質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＣＭが、アミノ酸長１５以下のポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
活性化可能抗体が、ＭＭとＣＭとの連結ペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
活性化可能抗体が、ＣＭとＡＢとの連結ペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
活性化可能抗体が第一の連結ペプチド（ＬＰ１）及び第二の連結ペプチド（ＬＰ２）を含むと共に、非切断状態の活性化可能抗体が、Ｎ末端からＣ末端に向かって下記：ＭＭ−ＬＰ１−ＣＭ−ＬＰ２−ＡＢ又はＡＢ−ＬＰ２−ＣＭ−ＬＰ１−ＭＭという構造的配置を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記二つの連結ペプチドが必ずしも互いに同一ではない、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも一方が、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３）、及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３４）からなる群より選択されるアミノ酸配列（ここでｎは１以上の整数である）を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも一方が、ＧＧＳＧ（配列番号３５）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３６）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３７）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３８）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３９）、及びＧＳＳＳＧ（配列番号４０）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
非切断状態の活性化可能抗体がスペーサーを含み、ここでスペーサーはＭＭに直接連結されると共に、スペーサーのＮ末端からＣ末端に向かって−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢという構造的配置を有する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮特許出願第61／749,220号（2013年1月4日出願）、米国仮特許出願第61／749,212号（2013年1月4日出願）米国仮特許出願第61／749,529号（2013年1月7日出願）、米国仮特許出願第61／749,486号（2013年1月7日出願）、米国仮特許出願第61／755,810号（2013年1月23日出願）、米国仮特許出願第61／763,237号（2013年2月11日出願）、米国仮特許出願第61／830,940号（2013年6月4日出願）、及び米国仮特許出願第61／897,659号（2013年10月30日出願）に基づく優先権の利益を主張する。これらの出願は各々その全体が援用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は概して、対象又は生体試料におけるプロテアーゼ活性を、活性化可能抗体を用いて検出するための組成物及び方法、並びに、種々の診断適用におけるこれらの組成物及び方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
異常なプロテアーゼ活性が種々の障害に関与することが指摘されている。従って、生体試料の比プロテアーゼ活性を容易に検出しうる方法が求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、生体試料の比プロテアーゼ活性を、活性化可能抗体を用いて検出するための方法及び組成物を提供する。これらの組成物及び方法は、種々の診断適用に、例えばインビボ（in vivo）で、インビトロ（in vitro）で、インサイチュ（in situ）で、又はエクスビボ（ex vivo）で使用できる。
【０００５】
本明細書に記載の組成物及び方法は、プロテアーゼ活性化抗体技術の使用を通じて、対象又は生体試料中の、例えば細胞又は組織試料中の比プロテアーゼ活性の検出を可能とする、新規の有効な技術を提供する。活性化可能抗体の画像化により、対象及び生体試料中のプロテアーゼ活性を特定する独自のアプローチが提供される。この技術により、活性化可能抗体のタンパク質分解による活性化、並びに、活性化可能抗体を切断しうるプロテアーゼを発現する細胞及び組織中の標的に対する活性化抗体の結合について、検証が可能となる。その結果により、細胞又は組織の有するプロテアーゼ活性の特異性及び濃度が、その細胞又は組織中の所望の標的に結合する活性化可能抗体を活性化するのに十分であるか否かを決定することが可能となる。
【０００６】
本願発明の活性化可能抗体は、抗体の抗原結合部位を遮断するマスキング部分を含む。このマスキング部分は、抗体に対してプロテアーゼ基質含有リンカーを介して連結される。このリンカーを本明細書では切断可能部分（切断可能な moiety：ＣＭ）と呼ぶ。（一又は二以上の）特異的なプロテアーゼにより切断されるＣＭの選択を通じて、特異性の異なる複数のプロテアーゼの活性をスクリーニングするための活性化可能抗体のポートフォリオが開発された。本明細書に開示の組成物及び方法を、異種移植腫瘍担持マウスのインビボ（in vivo）及びエクスビボ（ex vivo）でのスクリーニング、並びに、ヒト患者の腫瘍組織のインサイチュ（in situ）でのスクリーニングに適用することにより、タンパク質分解活性の存在も解明されてきた。プロテアーゼ阻害剤は腫瘍組織中の斯かる活性を阻害した。本明細書に開示の組成物及び方法は、異常なプロテアーゼ活性、通常は亢進されたプロテアーゼ活性を特徴とする疾患の治療における、活性化可能抗体の治療剤としての使用を支持する。また、本明細書に開示の組成物及び方法は、本発明の活性化可能抗体での処置に適した患者群の同定、或いはその他の形態での精製（例えば階層化等）にも有用である。ある態様によれば、ある対象は、活性化抗体と結合する標的、及び、試験される活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）で基質を切断するプロテアーゼの双方に陽性を示す。斯かる患者は、斯かるＣＭを含む活性化可能抗体での処置に適した候補として同定される。なぜなら、標的とプロテアーゼとが組織内で一緒に局在化し、抗体の活性化及び抗体との結合を可能とするからである。ある態様によれば、標的と斯かる活性化可能抗体を用いたプロテアーゼとの双方に陽性を示す対象に対して、斯かる活性化可能抗体が治療剤として投与される。
【０００７】
本発明は、標的に結合する活性化可能抗体を、種々の診断及び／又は予防適用に使用する方法、並びに、これらの方法に使用されるキットを提供する。標的の例としては、表１に列記する標的の何れか、或いはこれらの組み合わせが挙げられる。例えば、本発明は、対象又は試料中の切断剤及び標的の存在又は不在を検出する方法であって、（ｉ）対象又は生体試料を活性化可能抗体と接触させ、（ii）対象又は生体試料中の活性化された活性化可能抗体のレベルを測定することによると共に、ここで、対象又は生体試料中に活性化された活性化可能抗体が検出可能なレベルで存在すれば、対象又は生体試料中に切断剤及び標的が存在することを示し、ここで、対象又は生体試料中における活性化された活性化可能抗体の検出可能なレベルで存在しなければ、対象又は生体試料中に切断剤、標的、又は切断剤及び標的の双方が不在であるか、又は検出可能なレベルで存在しないことを示す、方法を提供する。ある態様によれば、生体試料は二以上の組織型を含む。ある態様によれば、生体試料は組織マイクロアレイである。ある態様によれば、生体試料は凍結組織マイクロアレイである。
【０００８】
斯かる活性化可能抗体は、マスキング部分（masking moiety：ＭＭ）と、切断剤によって切断される切断可能部分（ＣＭ）と、標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（antigen binding fragment：ＡＢ）とを含む。ある態様によれば、非切断（即ち非活性化）状態の活性化可能抗体は、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の構造的配置を有する。ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ、又は、ＡＢ−ＣＭ−ＭＭ。ある態様によれば、ＭＭは、ＡＢの標的に対する結合を阻害するペプチドである。ここでＭＭは、ＡＢの天然の結合パートナーのアミノ酸配列を有さない。ある態様によれば、非切断状態の活性化可能抗体のＭＭは、ＡＢの標的に対する特異的結合と干渉する。ここで切断（即ち活性化）状態の活性化可能抗体のＭＭは、ＡＢの標的に対する特異的結合と干渉又は競合しない。ある態様によれば、活性化可能抗体はコンジュゲートされた活性化可能抗体である、即ち、活性化可能抗体は他の剤にコンジュゲートされてなる。ある態様によれば、活性化可能抗体は他の剤にコンジュゲートされていない。ある態様によれば、活性化可能抗体は検出可能な標識を含む。ある態様によれば、検出可能な標識はＡＢ上に位置する。ある態様によれば、対象又は試料中の活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に特異的に結合する二次試薬を用いて達成される。ここで当該試薬は、検出可能な標識を含む。ある態様によれば、二次試薬は、検出可能な標識を含む抗体である。
【０００９】
また、本発明は、対象又は試料中の関心対象の切断剤及び標的の存在又は不在を検出する方法に使用されるキットであって、当該キットは、少なくとも本明細書に記載の対象又は生体試料に接触させるための活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体と、対象又は生体試料中の活性化された活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体のレベルを検出する手段とを含み、ここで、対象又は生体試料中に活性化された活性化可能抗体が検出可能なレベルで存在すれば、対象又は生体試料中に切断剤及び標的が存在することを示し、対象又は生体試料中に活性化された活性化可能抗体が検出可能なレベルで存在しなければ、対象又は生体試料中に切断剤、標的、又は切断剤及び標的の双方が不在であるか、又は検出可能なレベルで存在しないことを示す、キットも提供する。ある態様によれば、生体試料は二以上の組織型を含む。ある態様によれば、生体試料は組織マイクロアレイである。ある態様によれば、生体試料は凍結組織マイクロアレイである。
【００１０】
また、本発明は、対象又は試料中の切断剤の存在又は不在を検出する方法であって、（ｉ）対象又は生体試料を標的の存在下で活性化可能抗体と接触させ、（ii）対象又は生体試料中の活性化された活性化可能抗体のレベルを測定することによると共に、ここで、対象又は生体試料中に活性化された活性化可能抗体が検出可能なレベルで存在すれば、対象又は生体試料中に切断剤及び標的が存在することを示し、対象又は生体試料中に活性化された活性化可能抗体が検出可能なレベルで存在しなければ、対象又は生体試料中に切断剤、標的、又は切断剤及び標的の双方が不在であるか、又は検出可能なレベルで存在しないことを示す、方法を提供する。斯かる活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）と、切断剤によって切断される切断可能部分（ＣＭ）と、標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）とを含む。ある態様によれば、非切断（即ち非活性化）状態の活性化可能抗体は、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の構造的配置を含む。ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭ。ある態様によれば、ＭＭはＡＢの標的に対する結合を阻害するペプチドである。ここで、ＭＭはＡＢの天然の結合パートナーのアミノ酸配列を有さない。ある態様によれば、非切断状態の活性化可能抗体のＭＭは、ＡＢの標的に対する特異的結合と干渉する。ここで、切断（即ち活性化）状態の活性化可能抗体のＭＭは、ＡＢの標的に対する特異的結合と干渉又は競合しない。ある態様によれば、活性化可能抗体は、コンジュゲート化活性化可能抗体である。ある態様によれば、活性化可能抗体は、他の剤にコンジュゲートされていない。ある態様によれば、検出可能な標識が、マスキング部分に結合されてなる。ある態様によれば、検出可能な標識が、切断可能部分に対し、プロテアーゼ切断部位のＮ末端側に連結されてなる。ある態様によれば、ＡＢの単一の抗原結合部位がマスクされてなる。ある態様によれば、ここで本発明の抗体は少なくとも２つの抗原結合部位を有し、少なくとも１つの抗原結合部位はマスクされており、少なくとも１つの抗原結合部位はマスクされていない。ある態様によれば、全ての抗原結合部位がマスクされてなる。ある態様によれば、測定工程は、検出可能な標識を含む二次試薬の使用を含む。ある態様によれば、生体試料は二以上の組織型を含む。ある態様によれば、生体試料は組織マイクロアレイである。ある態様によれば、生体試料は凍結組織マイクロアレイである。
【００１１】
また、本発明は、対象又は試料中の切断剤の存在又は不在を検出する方法に使用されるキットであって、少なくとも対象又は生体試料への接触に使用される本明細書に記載の活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体と、対象又は生体試料中の活性化された活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体のレベルを検出する手段とを含み、ここで活性化可能抗体は、活性化可能抗体の一部に存在し、ＣＭの切断に伴い放出される、検出可能な標識を含み、ここで、対象又は生体試料中に活性化された活性化可能抗体が検出可能なレベルで存在すれば、対象又は生体試料中に切断剤及び標的が存在することを示し、対象又は生体試料中に活性化された活性化可能抗体が検出可能なレベルで存在しなければ、対象又は生体試料中に切断剤、標的、又は切断剤及び標的の双方が不在であるか、又は検出可能なレベルで存在しないことを示す、キットを提供する。ある態様によれば、生体試料は二以上の組織型を含む。ある態様によれば、生体試料は組織マイクロアレイである。ある態様によれば、生体試料は凍結組織マイクロアレイである。
【００１２】
本発明は、対象又は試料中の切断剤及び標的の存在又は不在を検出する方法であって、（ｉ）対象又は生体試料を活性化可能抗体と接触させ、ここで 活性化可能抗体が、活性化可能抗体の一部に存在し、ＣＭの切断に伴い放出される、検出可能な標識を含み、（ii）対象又は生体試料中の活性化された活性化可能抗体のレベルを測定することによると共に、ここで、対象又は生体試料中に活性化された活性化可能抗体が検出可能なレベルで存在しなければ、対象又は生体試料中に切断剤、標的、又は切断剤及び標的の双方が不在であるか、又は検出可能なレベルで存在しないことを示し、対象又は生体試料中における活性化された活性化可能抗体の検出可能なレベルが低下していれば、対象又は生体試料中に切断剤及び標的が存在することを示す、方法を提供する。検出可能な標識のレベルの低下は、例えば約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、及び／又は、約100％の低下である。斯かる活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）と、切断剤によって切断される切断可能部分（ＣＭ）と、標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）とを含む。ある態様によれば、非切断（即ち非活性化）状態の活性化可能抗体は、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の構造的配置を含む。ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭ。ある態様によれば、ＭＭはＡＢの標的に対する結合を阻害するペプチドである。ここで、ＭＭはＡＢの天然の結合パートナーのアミノ酸配列を有さない。ある態様によれば、非切断状態の活性化可能抗体のＭＭは、ＡＢの標的に対する特異的結合と干渉する。ここで、切断（即ち活性化）状態の活性化可能抗体のＭＭは、ＡＢの標的に対する特異的結合と干渉又は競合しない。ある態様によれば、活性化可能抗体は、コンジュゲート化活性化可能抗体である。ある態様によれば、活性化可能抗体は、他の剤にコンジュゲートされていない。ある態様によれば、活性化可能抗体は、検出可能な標識を含む。ある態様によれば、検出可能な標識は、ＡＢ上に位置する。ある態様によれば、対象又は試料中の活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に特異的に結合する二次試薬を用いて達成される。ここで、試薬は検出可能な標識を含む。ある態様によれば、二次試薬は検出可能な標識を含む抗体である。ある態様によれば、生体試料は二以上の組織型を含む。ある態様によれば、生体試料は組織マイクロアレイである。ある態様によれば、生体試料は凍結組織マイクロアレイである。
【００１３】
また、本発明は、対象又は試料中の関心対象の切断剤及び標的の存在又は不在を検出する方法に使用されるキットであって、少なくとも対象又は生体試料への接触に使用される本明細書に記載の活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体と、対象又は生体試料中の活性化された活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体のレベルを検出する手段とを含むと共に、ここで、対象又は生体試料中に活性化された活性化可能抗体が検出可能なレベルで存在すれば、対象又は生体試料中に切断剤、標的、又は切断剤及び標的の双方が不在であるか、又は検出可能なレベルで存在しないことを示し、対象又は生体試料中における活性化された活性化可能抗体の検出可能なレベルが低下していれば、対象又は生体試料中に切断剤及び標的が存在することを示す、キットを提供する。検出可能な標識のレベルの低下は、例えば約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、及び／又は、約100％の低下である。
【００１４】
また、本発明は、対象又は試料中の切断剤の存在又は不在を検出する方法であって、（ｉ）対象又は生体試料を活性化可能抗体と接触させ、ここで 活性化可能抗体が、活性化可能抗体の一部に存在し、ＣＭの切断に伴い放出される、検出可能な標識を含み、（ii）対象又は生体試料中の検出可能な標識のレベルを測定することによると共に、ここで、対象又は生体試料中に検出可能なレベルで検出可能な標識が存在すれば、対象又は生体試料中に切断剤が不在であるか、又は検出可能なレベルで存在しないことを示し、対象又は生体試料中の検出可能な標識の検出可能なレベルが低下していれば、対象又は生体試料中に切断剤が存在することを示す、方法を提供する。検出可能な標識のレベルの低下は、例えば、約 5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、及び／又は、約100％の低下である。斯かる活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）と、切断剤によって切断される切断可能部分（ＣＭ）と、標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）とを含む。ある態様によれば、非切断（即ち非活性化）状態の活性化可能抗体は、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の構造的配置を含む。ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭ。ある態様によれば、ＭＭはＡＢの標的に対する結合を阻害するペプチドである。ここで、ＭＭはＡＢの天然の結合パートナーのアミノ酸配列を有さない。ある態様によれば、非切断状態の活性化可能抗体のＭＭは、ＡＢの標的に対する特異的結合と干渉する。ここで、切断（即ち活性化）状態の活性化可能抗体のＭＭは、ＡＢの標的に対する特異的結合と干渉又は競合しない。ある態様によれば、活性化可能抗体は、コンジュゲート化活性化可能抗体である。ある態様によれば、活性化可能抗体は、他の剤にコンジュゲートされていない。ある態様によれば、活性化可能抗体は、検出可能な標識を含む。ある態様によれば、検出可能な標識は、ＡＢ上に位置する。ある態様によれば、対象又は試料中の活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に特異的に結合する二次試薬を用いて達成される。ここで、試薬は検出可能な標識を含む。ある態様によれば、二次試薬は検出可能な標識を含む抗体である。ある態様によれば、生体試料は二以上の組織型を含む。ある態様によれば、生体試料は組織マイクロアレイである。ある態様によれば、生体試料は凍結組織マイクロアレイである。
【００１５】
また、本発明は、対象又は試料中の関心対象の切断剤の存在又は不在を検出する方法に使用されるキットであって、少なくとも対象又は生体試料への接触に使用される本明細書に記載の活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体と、対象又は生体試料中の活性化された活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体のレベルを検出する手段とを含み、ここで、活性化可能抗体が、活性化可能抗体の一部に存在し、ＣＭの切断に伴い放出される、検出可能な標識を含み、ここで、対象又は生体試料中に検出可能な標識が検出可能なレベルで存在すれば、対象又は生体試料中に切断剤、標的、又は切断剤及び標的の双方が不在であるか、及び／又は、検出可能なレベルでは存在しないことを示す、キットを提供する。ここで、対象又は生体試料中の検出可能な標識の検出可能なレベルの低下は、対象又は生体試料中に切断剤及び標的が存在することを示す。検出可能な標識のレベルの低下は、例えば約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、及び／又は、約100％の低下である。ある態様によれば、生体試料は二以上の組織型を含む。ある態様によれば、生体試料は組織マイクロアレイである。ある態様によれば、生体試料は凍結組織マイクロアレイである。
【００１６】
これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、標的は、表１に列記される標的の群から選択される。ある態様によれば、ＡＢは、表２に列記される抗体の群から選択される抗体であるか、斯かる抗体から誘導される。ある態様によれば、その抗原結合断片は、Fab断片、F（ab'）2断片、scFv、及びscAbからなる群より選択される。ある態様によれば、ＡＢは、標的への結合に関して、100ｎＭ未満の平衡解離定数を有する。ある態様によれば、ＭＭのＡＢに対する結合の平衡解離定数は、ＡＢの標的に対する平衡解離定数よりも大きい。ある態様によれば、ＭＭは、標的に対する結合に関して、切断状態の活性化可能抗体のＡＢと干渉又は競合しない。ある態様によれば、ＭＭは40アミノ酸長以下のポリペプチドである。ある態様によれば、ＭＭのポリペプチド配列は標的のポリペプチド配列とは異なり、ＭＭのポリペプチド配列は、ＡＢの天然結合パートナーの何れとも50％超の同一性を有しない。ある態様によれば、ＭＭは、標的に対して25％超のアミノ酸配列同一性を含まない。ある態様によれば、ＭＭは、標的に対して10％超のアミノ酸配列同一性を含まない。ある態様によれば、ＣＭは、表３に列記のプロテアーゼの群から選択されるプロテアーゼの基質である。ある態様によれば、ＣＭはアミノ酸長15以下のポリペプチドである。ある態様によれば、プロテアーゼは組織内で標的と共局在化すると共に、活性化可能抗体がプロテアーゼに露出されると、プロテアーゼが活性化可能抗体中のＣＭを切断する。ある態様によれば、活性化可能抗体はＭＭとＣＭとの間に連結ペプチドを含む。ある態様によれば、活性化可能抗体はＣＭとＡＢとの間に連結ペプチドを含む。ある態様によれば、活性化可能抗体は第一の連結ペプチド（ＬＰ１）と第二の連結ペプチド（ＬＰ２）とを含むと共に、非切断状態の活性化可能抗体はＮ末端からＣ末端に向かって以下の構造的配置を有する。ＭＭ−ＬＰ１−ＣＭ−ＬＰ２−ＡＢ又はＡＢ−ＬＰ２−ＣＭ−ＬＰ１−ＭＭ。ある態様によれば、これら２つの連結ペプチドは互いに同一である必要はない。ある態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２のうち少なくとも一方が、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号33）、及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号34）（ここでｎは１以上の整数である）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２のうち少なくとも一方が、GGSG（配列番号35）、GGSGG（配列番号36）、GSGSG（配列番号37）、GSGGG（配列番号38）、GGGSG（配列番号39）、及びGSSSG（配列番号40）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある態様によれば、非切断状態の活性化可能抗体はスペーサーを含み、ここで、スペーサーはＭＭに直接連結されると共に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、スペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢという構造的配置を有する。ある態様によれば、非切断状態の活性化可能抗体はスペーサーを含み、ここで、スペーサーはＭＭに直接連結されると共に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＡＢ−ＣＭ−ＭＭ−スペーサーという構造的配置を有する。
【００１７】
これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、生体試料は二以上の組織型を含む。これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、生体試料は組織マイクロアレイである。これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、生体試料は凍結組織マイクロアレイである。
【００１８】
これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、活性化可能抗体は、検出可能な標識を含む。これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、検出可能な標識は、造影剤、コントラスト剤、酵素、蛍光標識、発色団、染料、一又は二以上の金属イオン、又はリガンド系標識を含む。これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、造影剤は放射性同位体を含む。これらの方法のある態様によれば、放射性同位体は、インジウム又はテクネチウムである。これらの方法のある態様によれば、放射性同位体はヨウ素であるか、ヨウ素から誘導される。これらの方法のある態様によれば、放射性同位体は125I又は133Iである。これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、コントラスト剤は、ヨウ素、ガドリニウム又は酸化鉄を含む。これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はβ−ガラクトシダーゼを含む。これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、蛍光標識は、黄色蛍光タンパク質（yellow fluorescent protein：ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（cyan fluorescent protein：ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein：ＧＦＰ）、修正赤色蛍光タンパク質（modified red fluorescent protein：ｍＲＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）tdimer2、ＨＣＲＥＤ、又はユーロピウム誘導体を含む。これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、発光標識は、Ｎ−メチルアクリジニウム誘導体を含む。これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、標識はAlexa Fluor（登録商標）標識、例えばAlex Fluor（登録商標）680又はAlexa Fluor（登録商標）750等を含む。これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、リガンド系標識は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、或いは一又は二以上のハプテンを含む。これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、検出可能な標識は生物発光標識である。これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、生物発光標識はＤ−ルシフェリンである。これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、生物発光標識は、遊離可能なリンカーを介して活性化可能抗体にコンジュゲートされてなる。これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、遊離可能なリンカーはジスルフィド結合である。
【００１９】
これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、検出可能な標識は、活性化可能抗体の少なくとも一部にコンジュゲートされてなる。例えば、これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、検出可能な標識は、ＡＢにコンジュゲートされてなる。これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、検出可能な標識が少なくともＭＭにコンジュゲートされてなる。検出可能な標識が少なくともＭＭにコンジュゲートされてなるこれらの方法及び／又はキットの一態様によれば、ＭＭにコンジュゲートされた検出可能な標識はビオチンである。斯かるコンストラクトは種々の画像化技術に有用である。非限定的な例を挙げると、磁気共鳴（magnetic resonance：ＭＲ）画像化が挙げられる。これらの態様によれば、ＭＲ画像化に先立って、ビオチン化ＭＭを有する活性化可能抗体が、アビジン及び／又はストレプトアビジン被覆磁性ナノ粒子と一緒に、対象に投与される。ある態様によれば、磁性ナノ粒子は、抗ビオチン抗体で被覆される。これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、ビオチン化ＭＭを有する活性化可能抗体と、被覆磁性ナノ粒子とが、同時に投与される。これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、ビオチン化ＭＭを有する活性化可能抗体と、被覆磁性ナノ粒子とが、連続的に投与される。これらのキット及び方法は、活性化可能抗体の活性化を観察するのに有用である。
【００２０】
これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、対象は哺乳類である。これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、対象はヒトである。ある態様によれば、対象はヒト以外の哺乳類、例えばヒト以外の霊長類、伴侶動物（例えば猫、犬、馬等）、農用家畜、労働用動物又は動物園飼育動物である。ある態様によれば、対象は齧歯類である。
【００２１】
これらの方法のある態様によれば、当該方法はインビボ（in vivo）の方法である。これらの方法のある態様によれば、当該方法はインサイチュ（in situ）の方法である。これらの方法のある態様によれば、当該方法はエクスビボ（ex vivo）の方法である。これらの方法のある態様によれば、当該方法はインビトロ（in vitro）の方法である。
【００２２】
当該方法及び／又はキットのある態様によれば、当該方法及び／又はキットは、本発明の活性化可能抗体での処置に適した患者群の同定又は他の形態での精製（例えば階層化等）に用いられる。例えば、本明細書にて提供される方法の何れかによれば、これらの方法において試験される標的と、活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）内の基質を切断するプロテアーゼとの双方に陽性を示す患者は、斯かるＣＭを含む活性化可能抗体での処置に適した候補として同定される。同様に、本明細書にて提供される方法の何れかにおいて、これらの方法において試験される標的と活性化可能抗体中のＣＭ内の基質を切断するプロテアーゼとの一方又は両方に対して陰性を示す患者は、別形態の治療に適した候補として同定されうる。ある態様によれば、斯かる患者は、処置に適した活性化可能抗体（例えば患者により疾患部位で切断されるＣＭを含む活性化可能抗体）が同定されるまで、他の活性化可能抗体を用いて試験される。
【００２３】
また、本発明は、患者群を同定又は他の形態で精製する方法に使用されるキットであって、少なくとも（ｉ）対象又は生体試料への接触に使用される本明細書に記載の活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体と、（ii）対象又は生体試料中の活性化された活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体のレベルを検出する手段とを含み、ここで試料中に活性化された活性化可能抗体が検出可能なレベルで存在すれば、当該試料が標的と、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）中の基質を切断する切断剤との存在に対して陽性であることを示し、更に（iii）前記の標的及び切断剤の存在に陽性を示す一又は二以上の対象を同定及び選択することにより、患者群を同定又は精製する手段とを含むキットを提供する。ある態様によれば、当該キットは、斯かる本明細書に記載の活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の治療有効量を、前記の標的及び切断剤の存在について陽性を示す患者群中の一又は二以上の対象に対して投与するためのインストラクションを含む。ある態様によれば、当該キットは、斯かる本明細書に記載の活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の治療有効量を、前記の標的及び切断剤の両方の存在について陽性を示さない患者群の一又は二以上の対象に対して投与するためのインストラクションも含む。ある態様によれば、当該キットは、本明細書に記載の別の抗標的治療剤の治療有効量を、前記の標的及び切断剤の両方の存在について陽性を示さない患者群の一又は二以上の対象に対して投与するためのインストラクションを含む。ある態様によれば、活性化可能抗体は、検出可能な標識を含む。ある態様によれば、検出可能な標識は、造影剤、コントラスト剤、酵素、蛍光標識、発色団、染料、放射性同位体、一又は二以上の金属イオン、又はリガンド系標識を含む。ある態様によれば、障害は癌である。ある態様によれば、障害は自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患である。ある態様によれば、生体試料は二以上の組織型を含む。ある態様によれば、生体試料は組織マイクロアレイである。ある態様によれば、生体試料は凍結組織マイクロアレイである。
【００２４】
これらの方法のある態様によれば、標的は、表１に列記される標的の群から選択される。ある態様によれば、ＡＢは、表２に列記される抗体の群から選択される抗体であるか、斯かる抗体から誘導される。ある態様によれば、その抗原結合断片は、Fab断片、F（ab'）2断片、scFv、及びscAbからなる群より選択される。ある態様によれば、ＡＢは、標的への結合に関して、100ｎＭ未満の平衡解離定数を有する。ある態様によれば、ＭＭのＡＢに対する結合の平衡解離定数は、ＡＢの標的に対する平衡解離定数よりも大きい。ある態様によれば、ＭＭは、標的に対する結合に関して、切断状態の活性化可能抗体のＡＢと干渉又は競合しない。ある態様によれば、ＭＭは40アミノ酸長以下のポリペプチドである。ある態様によれば、ＭＭのポリペプチド配列は標的のポリペプチド配列とは異なると共に、ＭＭのポリペプチド配列は、ＡＢの天然結合パートナーの何れとも50％超の同一性を有しない。ある態様によれば、ＭＭは、標的に対して25％超のアミノ酸配列同一性を含まない。ある態様によれば、ＭＭは、標的に対して10％超のアミノ酸配列同一性を含まない。ある態様によれば、ＣＭは、表３に列記のプロテアーゼの群から選択されるプロテアーゼの基質である。ある態様によれば、ＣＭはアミノ酸長15以下のポリペプチドである。ある態様によれば、プロテアーゼは組織内で標的と共局在化すると共に、活性化可能抗体がプロテアーゼに露出されると、プロテアーゼが活性化可能抗体中のＣＭを切断する。ある態様によれば、活性化可能抗体はＭＭとＣＭとの間に連結ペプチドを含む。ある態様によれば、活性化可能抗体はＣＭとＡＢとの間に連結ペプチドを含む。ある態様によれば、活性化可能抗体は第一の連結ペプチド（ＬＰ１）と第二の連結ペプチド（ＬＰ２）とを含むと共に、非切断状態の活性化可能抗体はＮ末端からＣ末端に向かって、以下の構造的配置を有する。ＭＭ−ＬＰ１−ＣＭ−ＬＰ２−ＡＢ又はＡＢ−ＬＰ２−ＣＭ−ＬＰ１−ＭＭ。ある態様によれば、これら２つの連結ペプチドは互いに同一である必要はない。ある態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２のうち少なくとも一方が、（GS）n、（GGS）n、（GSGGS）n（配列番号33）、及び（GGGS）n（配列番号34）、（ここでｎは１以上の整数である）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２のうち少なくとも一方が、GGSG（配列番号35）、GGSGG（配列番号36）、GSGSG（配列番号37）、GSGGG（配列番号38）、GGGSG（配列番号39）、及びGSSSG（配列番号40）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある態様によれば、非切断状態の活性化可能抗体はスペーサーを含み、ここで、スペーサーはＭＭに直接連結されると共に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、スペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢという構造的配置を有する。ある態様によれば、非切断状態の活性化可能抗体はスペーサーを含み、ここで、スペーサーはＭＭに直接連結されると共に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＡＢ−ＣＭ−ＭＭ−スペーサーという構造的配置を有する。
【００２５】
これらの方法のある態様によれば、切断剤は、対象又は生体試料中で標的と共局在化するプロテアーゼであると共に、ＣＭは、前記プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであり、ここで、活性化可能抗体がプロテアーゼに露出されると、プロテアーゼが活性化可能抗体中のＣＭを切断する。ある態様によれば、ＣＭは、表３に列記のプロテアーゼの群から選択されるプロテアーゼの基質である。これらの方法のある態様によれば、ＣＭはアミノ酸長15以下のポリペプチドである。これらの方法のある態様によれば、ＣＭは、ＡＢのＮ末端に連結される。これらの方法のある態様によれば、ＣＭは、ＡＢのＣ末端に連結される。これらの方法のある態様によれば、ＣＭは、ＡＢの可変軽（variable 軽：ＶＬ）鎖のＮ末端に連結される。これらの方法のある態様によれば、ＣＭは、ＡＢの可変重（variable 重：ＶＨ）鎖のＮ末端に連結される。
【００２６】
これらの方法のある態様によれば、切断剤は酵素である。これらの方法のある態様によれば、切断剤は還元剤である。これらの方法のある態様によれば、切断剤は光分解である。
【００２７】
これらの方法のある態様によれば、切断剤は酵素であり、ＣＭは斯かる酵素の基質である。これらの方法のある態様によれば、酵素は本明細書に記載のプロテアーゼである。これらの方法のある態様によれば、プロテアーゼは、本明細書に記載のプロテアーゼ農地の一つである。これらの方法のある態様によれば、プロテアーゼは、uPA、レグマイン（legumain）、MT-SP1、ADAM17、BMP-1、TMPRSS3、TMPRSS4、MMP-9、MMP-12、MMP-13、及びMMP-14からなる群より選択される。ある態様によれば、当該酵素はuPAを含む。ある態様によれば、当該酵素はレグマイン（legumain）を含む。ある態様によれば、当該酵素は MT-SP1を含む。ある態様によれば、当該酵素はマトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinase：MMP）を含む。ある態様によれば、MMPは、MMP-9、MMP-12、MMP-13、及びMMP-14からなる群より選択される。ある態様によれば、当該プロテアーゼは、標的を発現しない組織では活性でないか、活性が有意に低い。ある態様によれば、当該プロテアーゼは、健常組織、例えば非罹患組織では活性でないか、活性が有意に低い。
【００２８】
また、本発明は、コンジュゲート化活性化可能抗体（本明細書では活性化可能抗体コンジュゲートともいう）を種々の診断適用に使用する方法を提供する。例えば、本発明は、対象又は試料中の関心対象の切断剤及び標的の存在又は不在を検出する方法であって、（ｉ）対象又は生体試料を活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体と接触させ、（ii）対象又は生体試料中の抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体のレベルを測定することによると共に、ここで、対象又は生体試料中に活性化された抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体が検出可能なレベルで存在すれば、対象又は生体試料中に切断剤及び標的が存在することを示し、対象又は生体試料中に活性化された抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体が検出可能なレベルで存在しなければ、対象又は生体試料中に切断剤、標的、又は前記の切断剤及び標的の双方が不在であるか、及び／又は、検出可能なレベルで存在しないことを示す、方法を提供する。ある態様によれば、生体試料は二以上の組織型を含む。ある態様によれば、生体試料は組織マイクロアレイである。ある態様によれば、生体試料は凍結組織マイクロアレイである。
【００２９】
また、本発明は、対象又は試料中の切断剤の存在又は不在を検出する方法であって、（ｉ）対象又は生体試料を標的の存在下で、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体と接触させ、（ii）対象又は生体試料中の活性化された抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体のレベルを測定することによると共に、ここで、対象又は生体試料中に活性化された抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体が検出可能なレベルで存在すれば、対象又は生体試料中に切断剤が存在することを示し、対象又は生体試料中に抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体が検出可能なレベルで存在しなければ、対象又は生体試料中に切断剤が不在であるか、又は検出可能なレベルで存在しないことを示す、方法を提供する。ある態様によれば、生体試料は二以上の組織型を含む。ある態様によれば、生体試料は組織マイクロアレイである。ある態様によれば、生体試料は凍結組織マイクロアレイである。
【００３０】
また、本発明は、対象又は試料中の切断剤の存在又は不在を検出する方法であって、（ｉ）対象又は生体試料を活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体と接触させ、（ii）対象又は生体試料中の検出可能な標識のレベルを測定することによると共に、ここで、対象又は生体試料中に検出可能なレベルで検出可能な標識が存在すれば、対象又は生体試料中に切断剤が不在であるか、又は検出可能なレベルで存在しないことを示す、方法を提供する。ここで、no 対象又は生体試料中に検出可能な標識が検出可能なレベルで存在しなければ、対象又は生体試料中に切断剤が存在することを示す。ある態様によれば、生体試料は二以上の組織型を含む。ある態様によれば、生体試料は組織マイクロアレイである。ある態様によれば、生体試料は凍結組織マイクロアレイである。
【００３１】
また、本発明は、対象又は試料中の切断剤及び標的の存在又は不在を検出する方法であって、（ｉ）対象又は生体試料を活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体と接触させ、（ii）対象又は生体試料中の検出可能な標識のレベルを測定することによると共に、ここで、対象又は生体試料中に検出可能な標識が検出可能なレベルで存在すれば、対象又は生体試料中に切断剤及び／又は標的が不在であるか、及び／又は、検出可能なレベルで存在しないことを示す、方法を提供する。ここで、対象又は生体試料中の検出可能な標識の検出可能なレベルの低下は、前記の切断剤及び標的が対象又は生体試料中に存在することを示す。検出可能な標識のレベルの低下は、例えば、約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、及び／又は、約100％の低下である。ある態様によれば、生体試料は二以上の組織型を含む。ある態様によれば、生体試料は組織マイクロアレイである。ある態様によれば、生体試料は凍結組織マイクロアレイである。
【００３２】
これらの方法のある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、造影剤、コントラスト剤、酵素、蛍光標識、発色団、染料、一又は二以上の金属イオン、及びリガンド系標識からなる群より選択される検出可能な標識を含む。これらの方法のある態様によれば、造影剤は放射性同位体を含む。これらの方法のある態様によれば、放射性同位体は、インジウム又はテクネチウムである。これらの方法のある態様によれば、コントラスト剤は、ヨウ素、ガドリニウム又は酸化鉄を含む。これらの方法のある態様によれば、酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はβ−ガラクトシダーゼを含む。これらの方法のある態様によれば、蛍光標識は、を含む 黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、修飾赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）tdimer2、ＨＣＲＥＤ、又はユーロピウム誘導体。これらの方法のある態様によれば、発光標識はＮ−メチルアクリジニウム誘導体を含む。これらの方法のある態様によれば、標識はAlexa Fluor（登録商標）標識、例えばAlex Fluor（登録商標）680又はAlexa Fluor（登録商標）750を含む。これらの方法のある態様によれば、リガンド系標識は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン又は一又は二以上のハプテンを含む。
【００３３】
これらの方法のある態様によれば、対象は哺乳類である。これらの方法のある態様によれば、対象はヒトである。ある態様によれば、対象はヒト以外の哺乳類、例えばヒト以外の霊長類、伴侶動物（例えば猫、犬、馬等）、農用家畜、労働用動物、又は動物園飼育動物である。ある態様によれば、対象は齧歯類である。
【００３４】
これらの方法のある態様によれば、当該方法はインビボ（in vivo）の方法である。これらの方法のある態様によれば、当該方法はインサイチュ（in situ）の方法である。これらの方法のある態様によれば、当該方法はエクスビボ（ex vivo）の方法である。これらの方法のある態様によれば、当該方法はインビトロ（in vitro）の方法である。
【００３５】
これらの方法のある態様によれば、本方法は、本発明の活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体による処置に適した患者群を、同定或いは他の形態で精製するのに使用される。例えば、これらの方法において試験される標的と、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）の基質を切断するプロテアーゼとの双方に陽性を示す患者が、斯かるＣＭを含む抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体での処置に適した候補として同定される。同様に、これらの方法において試験される標的及び活性化可能抗体中のＣＭ内の基質を切断するプロテアーゼの一方又は両方に陰性を示す患者を、別形態の治療に適した候補として同定してもよい。ある態様によれば、処置に適した抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体が同定されるまで、斯かる患者を他の抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体（例えば、患者により疾患の部位で切断されるＣＭを含む活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体）で試験してもよい。
【００３６】
ある態様によれば、活性化可能抗体は、活性化状態で標的に結合すると共に、（ｉ）標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）と、（ii）ＡＢに連結された切断可能部分（ＣＭ）とを含み、ここでＣＭは、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであると共に、更に活性化可能抗体は、（iii）非切断状態にある活性化可能抗体のＡＢの標的に対する結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）を含み、ここでＭＭは、ＣＭを介してＡＢに連結される。
【００３７】
ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、非切断状態でＮ末端からＣ末端に向かって以下の構造的配置を有する。ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭ。
【００３８】
ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭとの間に連結ペプチドを含む。
【００３９】
ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、ＣＭとＡＢとの間に連結ペプチドを含む。
【００４０】
ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、第一の連結ペプチド（ＬＰ１）及び第二の連結ペプチド（ＬＰ２）を含む。ここで、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、非切断状態で、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の構造的配置を有する。ＭＭ−ＬＰ１−ＣＭ−ＬＰ２−ＡＢ又はＡＢ−ＬＰ２−ＣＭ−ＬＰ１−ＭＭ。ある態様によれば、これら２つの連結ペプチドは互いに同一である必要はない。
【００４１】
ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。ある態様によれば、標的に結合する抗体又はその免疫学的に活性な断片は、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖、Fab断片、F（ab'）2断片、scFv、scAb、dAb、単一ドメイン重鎖抗体、及び、単一ドメイン軽鎖抗体である。ある態様によれば、斯かる標的に結合する抗体又はその免疫学的に活性な断片は、マウス、キメラ、ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００４２】
ある態様によれば、抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）は、表１に示す標的から選択される標的に特異的に結合する。
【００４３】
ある態様によれば、抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）は、表２に示される抗体から選択される抗体であるか、或いは斯かる抗体から誘導される。
【００４４】
ある態様によれば、ＡＢは、標的への結合に関して、100ｎＭ未満の平衡解離定数を有する。
【００４５】
ある態様によれば、ＭＭのＡＢに対する結合の平衡解離定数は、ＡＢの標的に対する平衡解離定数よりも大きい。ある態様によれば、ＭＭのＡＢに対する結合の平衡解離定数は、ＡＢの標的に対する平衡解離定数以下である。ある態様によれば、ＭＭは、標的に対する結合に関して、切断状態の活性化可能抗体のＡＢと干渉又は競合しない。
【００４６】
ある態様によれば、ＭＭはアミノ酸長約2〜40、例えばアミノ酸長40未満のポリペプチドである。
【００４７】
ある態様によれば、ＭＭのポリペプチド配列は標的のポリペプチド配列とは異なると共に、ＭＭのポリペプチド配列は、ＡＢの天然結合パートナーの何れとも50％超の同一性を有しない。
【００４８】
ある態様によれば、ＭＭは、標的に対して25％超のアミノ酸配列同一性を含まない。ある態様によれば、ＭＭは、標的に対して10％超のアミノ酸配列同一性を含まない。
【００４９】
ある態様によれば、ＭＭは、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体内に位置し、これにより、非切断状態における活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の標的への結合が、非修飾ＡＢの標的に対する結合の平衡解離定数の少なくとも20倍以上の平衡解離定数で生じるように低減され、ここで切断状態における活性化可能抗体のＡＢが、標的に結合する。
【００５０】
ある態様によれば、ＭＭは、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体内に位置し、これにより、非切断状態における活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の標的への結合が、非修飾ＡＢの標的に対する結合の平衡解離定数の少なくとも40倍以上の平衡解離定数で生じるように低減され、ここで切断状態における活性化可能抗体のＡＢが、標的に結合する。
【００５１】
ある態様によれば、ＭＭは、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体内に位置し、これにより、非切断状態における活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の標的への結合が、非修飾ＡＢの標的に対する結合の平衡解離定数の少なくとも50倍以上の平衡解離定数で生じるように低減され、ここで切断状態における活性化可能抗体のＡＢが、標的に結合する。
【００５２】
ある態様によれば、ＭＭは、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体内に位置し、これにより、非切断状態における活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の標的への結合が、非修飾ＡＢの標的に対する結合の平衡解離定数の少なくとも100倍以上の平衡解離定数で生じるように低減され、ここで切断状態における活性化可能抗体のＡＢが、標的に結合する。
【００５３】
ある態様によれば、ＭＭは、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体内に位置し、これにより、非切断状態における活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の標的への結合が、非修飾ＡＢの標的に対する結合の平衡解離定数の少なくとも200倍以上の平衡解離定数で生じるように低減され、ここで切断状態における活性化可能抗体のＡＢが、標的に結合する。
【００５４】
ある態様によれば、ＭＭの連結が、ＡＢの標的に結合する能力を低減し、これにより、ＭＭに連結している状態のＡＢの標的に対する解離定数（Ｋｄ）が、ＭＭに連結していない状態のＡＢの標的に対する解離定数（Ｋｄ）の少なくとも20倍以上である。ある態様によれば、ＭＭの連結が、ＡＢの標的に結合する能力を低減し、これにより、ＭＭに連結している状態のＡＢの標的に対する解離定数（Ｋｄ）が、ＭＭに連結していない状態のＡＢの標的に対する解離定数（Ｋｄ）の少なくとも40倍以上である。ある態様によれば、ＭＭの連結が、ＡＢの標的に結合する能力を低減し、これにより、ＭＭに連結している状態のＡＢの標的に対する解離定数（Ｋｄ）が、ＭＭに連結していない状態のＡＢの標的に対する解離定数（Ｋｄ）の少なくとも50倍以上である。ある態様によれば、ＭＭの連結が、ＡＢの標的に結合する能力を低減し、これにより、ＭＭに連結している状態のＡＢの標的に対するＫｄが、ＭＭに連結していない状態のＡＢの標的に対する解離定数（Ｋｄ）の少なくとも100倍以上である。ある態様によれば、ＭＭの連結が、ＡＢの標的に結合する能力を低減し、これにより、ＭＭに連結している状態のＡＢの標的に対するＫｄが、ＭＭに連結していない状態のＡＢの標的に対する解離定数（Ｋｄ）の少なくとも1000倍以上である。ある態様によれば、ＭＭの連結が、ＡＢの標的に結合する能力を低減し、これにより、ＭＭに連結している状態のＡＢの標的に対するＫｄが、ＭＭに連結していない状態のＡＢの標的に対する解離定数（Ｋｄ）の少なくとも10,000倍以上である。
【００５５】
ある態様によれば、ＭＭは、アミノ酸配列CISPRGCPDGPYVMY（配列番号12）を含む。
【００５６】
ある態様によれば、例えばPCT公報番号WO2009／025846号及びWO2010／081173号に記載のアッセイ等の標的置換アッセイ（target displacement assay）を用いて、インビトロ（in vitro）でアッセイした場合に、標的の存在下において、ＭＭは、ＣＭが非切断状態の場合に、ＣＭが切断状態の場合と比べて、ＡＢの標的に結合する能力を、少なくとも90％低減する。
【００５７】
ある態様によれば、プロテアーゼは組織内で標的と共局在化すると共に、活性化可能抗体がプロテアーゼに露出されると、プロテアーゼが活性化可能抗体中のＣＭを切断する。ある態様によれば、標的を顕著に発現しない組織において、プロテアーゼは活性でないか、或いは活性が有意に低下する。ある態様によれば、健全組織、例えば非罹患組織において、プロテアーゼは活性でないか、或いは活性が有意に低下する。
【００５８】
ある態様によれば、ＣＭはアミノ酸長15以下のポリペプチドである。
【００５９】
ある態様によれば、ＣＭは、表３に示すプロテアーゼからなる群より選択されるプロテアーゼの基質である。ある態様によれば、ＣＭは、uPA（ウロキナーゼプラスミノーゲンアクティベータ）、レグマイン（legumain）、及びMT−SP1（マトリプターゼ：matriptase）からなる群より選択されるプロテアーゼの基質である。ある態様によれば、当該プロテアーゼはuPAを含む。ある態様によれば、当該プロテアーゼはレグマイン（legumain）を含む。ある態様によれば、当該プロテアーゼはMT−SP1を含む。
【００６０】
ある態様によれば、ＣＭは、少なくとも2種のプロテアーゼの基質である。ある態様によれば、各プロテアーゼは、表３に示すプロテアーゼからなる群より選択される。ある態様によれば、ＣＭは、少なくとも2種のプロテアーゼの基質であり、ここで当該プロテアーゼの一方は、uPA、レグマイン（legumain）、及びMT−SP1からなる群より選択され、他方のプロテアーゼは、表３に示すプロテアーゼからなる群より選択される。ある態様によれば、ＣＭは、uPA、レグマイン（legumain）、及びMT−SP1からなる群より選択される少なくとも2種のプロテアーゼの基質である。
【００６１】
ある態様によれば、ＣＭはアミノ酸配列LSGRSDNH（配列番号14）を含む。
【００６２】
ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、少なくとも第一のＣＭ及び第二のＣＭを含む。ある態様によれば、第一のＣＭ及び第二のＣＭのうち少なくとも一方は、uPA、レグマイン（legumain）、及びMT−SP1からなる群より選択されるプロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである。ある態様によれば、第一のＣＭ及び第二のＣＭのうち少なくとも一方が、アミノ酸配列LSGRSDNH（配列番号14）を含む。ある態様によれば、第一のＣＭは標的組織において、uPA、レグマイン（legumain）、及びMT−SP1からなる群より選択される第一の切断剤によって切断され、第二のＣＭは標的組織において、第二の切断剤によって切断される。ある態様によれば、第一の切断剤及び第二の切断剤は、uPA、レグマイン（legumain）、及びMT−SP1からなる群より選択される同一の酵素であると共に、第一のＣＭ及び第二のＣＭは、斯かる酵素に対する異なる基質である。ある態様によれば、第一の切断剤及び第二の切断剤は異なる酵素である。ある態様によれば、第一の切断剤及び第二の切断剤は標的組織に共局在化する。ある態様によれば、第一のＣＭ及び第二のＣＭは標的組織において、少なくとも１つの切断剤によって切断される。
【００６３】
ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、少なくとも第一のＣＭ及び第二のＣＭを含む。ある態様によれば、第一のＣＭ及び第二のＣＭのうち少なくとも一方は、uPA、レグマイン（legumain）、及びMT−SP1からなる群より選択されるプロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである。ある態様によれば、第一のＣＭ及び第二のＣＭのうち少なくとも一方が、アミノ酸配列LSGRSDNH（配列番号14）を含む。ある態様によれば、第一のＣＭは標的組織において、uPA、レグマイン（legumain）、及びMT−SP1からなる群より選択される第一の切断剤によって切断され、第二のＣＭは標的組織において、第二の切断剤によって切断される。ある態様によれば、第一の切断剤及び第二の切断剤は、uPA、レグマイン（legumain）、及びMT−SP1からなる群より選択される同一の酵素であると共に、第一のＣＭ及び第二のＣＭは、斯かる酵素に対する異なる基質である。ある態様によれば、第一の切断剤及び第二の切断剤は異なる酵素である。ある態様によれば、第一の切断剤及び第二の切断剤は標的組織に共局在化する。ある態様によれば、第一のＣＭ及び第二のＣＭは標的組織において、少なくとも１つの切断剤によって切断される。
【００６４】
ある態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２のうち少なくとも一方が、（GS）n、（GGS）n、（GSGGS）n（配列番号33）、及び（GGGS）n（配列番号34）、（ここでｎは１以上の整数である）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２のうち少なくとも一方が、GGSG（配列番号35）、GGSGG（配列番号36）、GSGSG（配列番号37）、GSGGG（配列番号38）、GGGSG（配列番号39）、及びGSSSG（配列番号40）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある態様によれば、ＬＰ１はアミノ酸配列GSSGGSGGSGGSG（配列番号13）を含む。ある態様によれば、ＬＰ２はアミノ酸配列GSSGT（配列番号15）又はGSSG（配列番号41）を含む。
【００６５】
ある態様によれば、活性化可能抗体は、ＡＢにコンジュゲートされてなる剤も含む。ある態様によれば、斯かる剤は治療剤である。ある態様によれば、斯かる剤は抗新生物剤である。ある態様によれば、斯かる剤は毒素又はその断片である。ある態様によれば、斯かる剤は、表４に列記される群より選択される剤である。ある態様によれば、斯かる剤はドラスタチン（dolastatin）である。ある態様によれば、斯かる剤はオーリスタチン（auristatin）又はその誘導体である。ある態様によれば、斯かる剤はオーリスタチン（auristatin） E又はその誘導体である。ある態様によれば、斯かる剤はモノメチルオーリスタチン（auristatin）Ｅ（ＭＭＡＥ）である。ある態様によれば、斯かる剤はメイタンシノイド（maytansinoid）又はメイタンシノイド（maytansinoid）誘導体である。ある態様によれば、斯かる剤はDM1又はDM4である。ある態様によれば、斯かる剤はデュオカルマイシン（duocarmycin）又はその誘導体である。ある態様によれば、斯かる剤はカリケアマイシン（calicheamicin）又はその誘導体である。
【００６６】
ある態様によれば、斯かる剤はリンカーを介してＡＢにコンジュゲートされてなる。ある態様によれば、当該リンカーは切断可能なリンカーである。ある態様によれば、斯かるリンカーは、表５及び６に示すリンカーからなる群より選択される。
【００６７】
ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、シグナルペプチドも含む。ある態様によれば、シグナルペプチドは、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体に、スペーサーを介してにコンジュゲートされてなる。ある態様によれば、斯かるスペーサーは、シグナルペプチドの不在下で、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体にコンジュゲートされてなる。ある態様によれば、スペーサーは、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体のＭＭに直接連結される。ある態様によれば、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号11）を含む。ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、本明細書に記載のＭＭ配列に直接連結された配列QGQSGQ（配列番号11）のスペーサーを含み、Ｎ末端からＣ末端に向かってスペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢという構造的配置を有する。ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、本明細書に記載のＭＭ配列に直接連結されたスペーサーを含み、Ｎ末端からＣ末端に向かってスペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢという構造的配置を有する。ある態様によれば、非切断状態の活性化可能抗体はスペーサーを含み、ここで、スペーサーはＭＭに直接連結されると共に、Ｎ末端からＣ末端に向かってＡＢ−ＣＭ−ＭＭ−スペーサーという構造的配置を有する。
【００６８】
ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、単一特異的である。ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、多重特異的であり、例えば、非限定的な例を挙げると、二重特異的又は三官能性である。ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、二重特異性T細胞誘導（bispecific T-cell engager：ＢＩＴＥ）前駆体分子の一部として設計される。ある態様によれば、活性化可能抗体は、キメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor：ＣＡＲ）修飾Ｔ細胞又は他の改変受容体の前駆体として設計される。
【００６９】
ある態様によれば、標的は、表１に列記される標的の群から選択される。ある態様によれば、ＡＢは、表２に列記される抗体の群から選択される抗体であるか、斯かる抗体から誘導される。ある態様によれば、その抗原結合断片は、Fab断片、F（ab'）2断片、scFv、及びscAbからなる群より選択される。ある態様によれば、ＡＢは、標的への結合に関して、100ｎＭ未満の平衡解離定数を有する。ある態様によれば、ＭＭのＡＢに対する結合の平衡解離定数は、ＡＢの標的に対する平衡解離定数よりも大きい。ある態様によれば、ＭＭは、標的に対する結合に関して、切断状態の活性化可能抗体のＡＢと干渉又は競合しない。ある態様によれば、ＭＭは40アミノ酸長以下のポリペプチドである。ある態様によれば、ＭＭのポリペプチド配列は標的のポリペプチド配列とは異なり、ここで、ＭＭのポリペプチド配列は、ＡＢの天然結合パートナーの何れとも50％超の同一性を有しない。ある態様によれば、ＭＭは、標的に対して25％超のアミノ酸配列同一性を含まない。ある態様によれば、ＭＭは、標的に対して10％超のアミノ酸配列同一性を含まない。ある態様によれば、ＣＭは、表３に列記のプロテアーゼの群から選択されるプロテアーゼの基質である。ある態様によれば、ＣＭはアミノ酸長15以下のポリペプチドである。ある態様によれば、プロテアーゼは組織内で標的と共局在化する。ここで、活性化可能抗体がプロテアーゼに露出されると、プロテアーゼが活性化可能抗体中のＣＭを切断する。ある態様によれば、活性化可能抗体はＭＭとＣＭとの間に連結ペプチドを含む。ある態様によれば、活性化可能抗体はＣＭとＡＢとの間に連結ペプチドを含む。ある態様によれば、活性化可能抗体は第一の連結ペプチド（ＬＰ１）と第二の連結ペプチド（ＬＰ２）とを含む。ここで、非切断状態の活性化可能抗体はＮ末端からＣ末端に向かって以下の構造的配置を有する。ＭＭ−ＬＰ１−ＣＭ−ＬＰ２−ＡＢ又はＡＢ−ＬＰ２−ＣＭ−ＬＰ１−ＭＭ。ある態様によれば、これら２つの連結ペプチドは互いに同一である必要はない。ある態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２のうち少なくとも一方が、（GS）n、（GGS）n、（GSGGS）n（配列番号33）、及び（GGGS）n（配列番号34）、（ここでｎは１以上の整数である）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２のうち少なくとも一方が、GGSG（配列番号35）、GGSGG（配列番号36）、GSGSG（配列番号37）、GSGGG（配列番号38）、GGGSG（配列番号39）、及びGSSSG（配列番号40）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある態様によれば、非切断状態の活性化可能抗体はスペーサーを含み、ここで、スペーサーはＭＭに直接連結されると共に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、スペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢという構造的配置を有する。ある態様によれば、非切断状態の活性化可能抗体はスペーサーを含み、ここで、スペーサーはＭＭに直接連結されると共に、Ｎ末端からＣ末端に向かってＡＢ−ＣＭ−ＭＭ−スペーサーという構造的配置を有する。
【００７０】
ある態様によれば、方法又はキットは、本発明の活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体による処置に適した患者群を、同定或いは他の形態で精製した後、斯かる活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体を、それを必要とする対象に投与する処置に使用される。例えば、これらの方法において試験される標的と、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）の基質を切断するプロテアーゼとの双方に陽性を示す患者が、斯かるＣＭを含む抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体での処置に適した候補として同定されると共に、斯かる患者にその後、試験された活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の治療有効量が投与される。同様に、これらの方法において試験される標的及び活性化可能抗体中のＣＭ内の基質を切断するプロテアーゼの一方又は両方に陰性を示す患者を、別形態の治療に適した候補として同定してもよい。ある態様によれば、処置に適した抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体が同定されるまで、斯かる患者を他の抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体（例えば、患者により疾患の部位で切断されるＣＭを含む活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体等）で試験してもよい。ある態様によれば、患者が陽性を示した活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の治療有効量を、その後に患者に投与する。
【００７１】
ある態様によれば、活性化可能抗体は、活性化状態で標的に結合すると共に、（ｉ）標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）と、（ii）ＡＢに連結された切断可能部分（ＣＭ）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるＣＭと、（iii）非切断状態にある活性化可能抗体のＡＢの標的への結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）であって、ＣＭを介してＡＢに連結されたＭＭとを含む。
【００７２】
ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、非切断状態において、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の構造的配置を有する：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭ。
【００７３】
ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭとの間に連結ペプチドを含む。
【００７４】
ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、ＣＭとＡＢとの間に連結ペプチドを含む。
【００７５】
ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、第一の連結ペプチド（ＬＰ１）及び第二の連結ペプチド（ＬＰ２）を含む。ここで、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、非切断状態において、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の構造的配置を有する：ＭＭ−ＬＰ１−ＣＭ−ＬＰ２−ＡＢ又はＡＢ−ＬＰ２−ＣＭ−ＬＰ１−ＭＭ。ある態様によれば、これら２つの連結ペプチドは互いに同一である必要はない。
【００７６】
ある態様によれば、抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）は、表１に示す標的から選択される標的に特異的に結合する。
【００７７】
ある態様によれば、抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）は、表２に示される抗体から選択される抗体であるか、或いは斯かる抗体から誘導される。
【００７８】
ある態様によれば、ＡＢは、標的への結合に関して、100ｎＭ未満の平衡解離定数を有する。
【００７９】
ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。ある態様によれば、標的に結合する抗体又はその免疫学的に活性な断片は、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖、Fab断片、F（ab'）2断片、scFv、scAb、dAb、単一ドメイン重鎖抗体、及び単一ドメイン軽鎖抗体である。ある態様によれば、斯かる標的に結合する抗体又はその免疫学的に活性な断片は、マウス、キメラ、ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００８０】
ある態様によれば、ＭＭのＡＢに対する結合の平衡解離定数は、ＡＢの標的に対する平衡解離定数よりも大きい。ある態様によれば、ＭＭのＡＢに対する結合の平衡解離定数は、ＡＢの標的に対する平衡解離定数を超えない。ある態様によれば、ＭＭは、標的に対する結合に関して、切断状態の活性化可能抗体のＡＢと干渉又は競合しない。
【００８１】
ある態様によれば、ＭＭは、アミノ酸長約2〜40、例えばアミノ酸長40未満のポリペプチドである。
【００８２】
ある態様によれば、ＭＭのポリペプチド配列は標的のポリペプチド配列とは異なると共に、ＭＭのポリペプチド配列は、ＡＢの天然結合パートナーの何れとも50％超の同一性を有しない。
【００８３】
ある態様によれば、ＭＭは、標的に対して25％超のアミノ酸配列同一性を含まない。ある態様によれば、ＭＭは、標的に対して10％超のアミノ酸配列同一性を含まない。
【００８４】
ある態様によれば、ＭＭは、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体内に位置し、これにより、非切断状態における活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の標的への結合が、非修飾ＡＢの標的に対する結合の平衡解離定数の少なくとも20倍以上の平衡解離定数で生じるように低減され、ここで切断状態における活性化可能抗体のＡＢが、標的に結合する。
【００８５】
ある態様によれば、ＭＭは、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体内に位置し、これにより、非切断状態における活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の標的への結合が、非修飾ＡＢの標的に対する結合の平衡解離定数の少なくとも40倍以上の平衡解離定数で生じるように低減され、ここで切断状態における活性化可能抗体のＡＢが、標的に結合する。
【００８６】
ある態様によれば、ＭＭは、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体内に位置し、これにより、非切断状態における活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の標的への結合が、非修飾ＡＢの標的に対する結合の平衡解離定数の少なくとも50倍以上の平衡解離定数で生じるように低減され、ここで切断状態における活性化可能抗体のＡＢが、標的に結合する。
【００８７】
ある態様によれば、ＭＭは、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体内に位置し、これにより、非切断状態における活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の標的への結合が、非修飾ＡＢの標的に対する結合の平衡解離定数の少なくとも100倍以上の平衡解離定数で生じるように低減され、ここで切断状態における活性化可能抗体のＡＢが、標的に結合する。
【００８８】
ある態様によれば、ＭＭは、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体内に位置し、これにより、非切断状態における活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の標的への結合が、非修飾ＡＢの標的に対する結合の平衡解離定数の少なくとも200倍以上の平衡解離定数で生じるように低減され、ここで切断状態における活性化可能抗体のＡＢが、標的に結合する。
【００８９】
ある態様によれば、ＭＭの連結が、ＡＢの標的に結合する能力を低減し、これにより、ＭＭに連結している状態のＡＢの標的に対する解離定数（Ｋｄ）が、ＭＭに連結していない状態のＡＢの標的に対する解離定数（Ｋｄ）の少なくとも20倍以上である。ある態様によれば、ＭＭの連結が、ＡＢの標的に結合する能力を低減し、これにより、ＭＭに連結している状態のＡＢの標的に対する解離定数（Ｋｄ）が、ＭＭに連結していない状態のＡＢの標的に対する解離定数（Ｋｄ）の少なくとも40倍以上である。ある態様によれば、ＭＭの連結が、ＡＢの標的に結合する能力を低減し、これにより、ＭＭに連結している状態のＡＢの標的に対する解離定数（Ｋｄ）が、ＭＭに連結していない状態のＡＢの標的に対する解離定数（Ｋｄ）の少なくとも50倍以上である。ある態様によれば、ＭＭの連結が、ＡＢの標的に結合する能力を低減し、これにより、ＭＭに連結している状態のＡＢの標的に対するＫｄが、ＭＭに連結していない状態のＡＢの標的に対する解離定数（Ｋｄ）の少なくとも100倍以上である。ある態様によれば、ＭＭの連結が、ＡＢの標的に結合する能力を低減し、これにより、ＭＭに連結している状態のＡＢの標的に対するＫｄが、ＭＭに連結していない状態のＡＢの標的に対する解離定数（Ｋｄ）の少なくとも1000倍以上である。ある態様によれば、ＭＭの連結が、ＡＢの標的に結合する能力を低減し、これにより、ＭＭに連結している状態のＡＢの標的に対するＫｄが、ＭＭに連結していない状態のＡＢの標的に対する解離定数（Ｋｄ）の少なくとも10,000倍以上である。
【００９０】
ある態様によれば、例えばPCT公報番号WO2009／025846号及びWO2010／081173号に記載のアッセイ等の標的置換アッセイ（target displacement assay）を用いて、インビトロ（in vitro）でアッセイした場合に、標的の存在下において、ＭＭは、ＣＭが非切断状態の場合に、ＣＭが切断状態の場合と比べて、ＡＢの標的に結合する能力を、少なくとも90％低減する。
【００９１】
ある態様によれば、プロテアーゼは組織内で標的と共局在化すると共に、活性化可能抗体がプロテアーゼに露出されると、プロテアーゼが活性化可能抗体中のＣＭを切断する。ある態様によれば、標的を顕著に発現しない組織において、プロテアーゼは活性でないか、或いは活性が有意に低下する。ある態様によれば、健全組織、例えば非罹患組織において、プロテアーゼは活性でないか、或いは活性が有意に低下する。
【００９２】
ある態様によれば、ＣＭはアミノ酸長15以下のポリペプチドである。
【００９３】
ある態様によれば、ＣＭは、表３に示すプロテアーゼからなる群より選択されるプロテアーゼの基質である。ある態様によれば、ＣＭは、uPA（ウロキナーゼプラスミノーゲンアクティベータ）、レグマイン（legumain）、及びMT−SP1（マトリプターゼ：matriptase）からなる群より選択されるプロテアーゼの基質である。ある態様によれば、当該プロテアーゼはuPAを含む。ある態様によれば、当該プロテアーゼはレグマイン（legumain）を含む。ある態様によれば、当該プロテアーゼはMT−SP1を含む。
【００９４】
ある態様によれば、ＣＭは、少なくとも2種のプロテアーゼの基質である。ある態様によれば、各プロテアーゼは、表３に示すプロテアーゼからなる群より選択される。ある態様によれば、ＣＭは、少なくとも2種のプロテアーゼの基質であり、ここで当該プロテアーゼの一方は、uPA、レグマイン（legumain）、及びMT−SP1からなる群より選択され、他方のプロテアーゼは、表３に示すプロテアーゼからなる群より選択される。ある態様によれば、ＣＭは、uPA、レグマイン（legumain）、及びMT−SP1からなる群より選択される少なくとも2種のプロテアーゼの基質である。
【００９５】
ある態様によれば、ＣＭはアミノ酸配列LSGRSDNH（配列番号14）を含む。
【００９６】
ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、少なくとも第一のＣＭ及び第二のＣＭを含む。ある態様によれば、第一のＣＭ及び第二のＣＭのうち少なくとも一方は、uPA、レグマイン（legumain）、及びMT−SP1からなる群より選択されるプロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである。ある態様によれば、第一のＣＭ及び第二のＣＭのうち少なくとも一方が、アミノ酸配列LSGRSDNH（配列番号14）を含む。ある態様によれば、第一のＣＭは標的組織において、uPA、レグマイン（legumain）、及びMT−SP1からなる群より選択される第一の切断剤によって切断され、第二のＣＭは標的組織において、第二の切断剤によって切断される。ある態様によれば、第一の切断剤及び第二の切断剤は、uPA、レグマイン（legumain）、及びMT−SP1からなる群より選択される同一の酵素であると共に、第一のＣＭ及び第二のＣＭは、斯かる酵素に対する異なる基質である。ある態様によれば、第一の切断剤及び第二の切断剤は異なる酵素である。ある態様によれば、第一の切断剤及び第二の切断剤は標的組織に共局在化する。ある態様によれば、第一のＣＭ及び第二のＣＭは標的組織において、少なくとも１つの切断剤によって切断される。
【００９７】
ある態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２のうち少なくとも一方が、（GS）n、（GGS）n、（GSGGS）n（配列番号33）、及び（GGGS）n（配列番号34）、（ここでｎは１以上の整数である）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２のうち少なくとも一方が、GGSG（配列番号35）、GGSGG（配列番号36）、GSGSG（配列番号37）、GSGGG（配列番号38）、GGGSG（配列番号39）、及びGSSSG（配列番号40）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある態様によれば、ＬＰ１はアミノ酸配列GSSGGSGGSGGSG（配列番号13）を含む。ある態様によれば、ＬＰ２はアミノ酸配列GSSGT（配列番号15）又はGSSG（配列番号41）を含む。
【００９８】
ある態様によれば、活性化可能抗体は、ＡＢにコンジュゲートされてなる剤も含む。ある態様によれば、斯かる剤は治療剤である。ある態様によれば、斯かる剤は抗新生物剤である。ある態様によれば、斯かる剤は毒素又はその断片である。ある態様によれば、斯かる剤は、表４に列記される群より選択される剤である。ある態様によれば、斯かる剤はドラスタチン（dolastatin）である。ある態様によれば、斯かる剤はオーリスタチン（auristatin）又はその誘導体である。ある態様によれば、斯かる剤はオーリスタチン（auristatin） E又はその誘導体である。ある態様によれば、斯かる剤はモノメチルオーリスタチン（auristatin）Ｅ（ＭＭＡＥ）である。ある態様によれば、斯かる剤はメイタンシノイド（maytansinoid）又はメイタンシノイド（maytansinoid）誘導体である。ある態様によれば、斯かる剤はDM1又はDM4である。ある態様によれば、斯かる剤はデュオカルマイシン（duocarmycin）又はその誘導体である。ある態様によれば、斯かる剤はカリケアマイシン（calicheamicin）又はその誘導体である。
【００９９】
ある態様によれば、斯かる剤はリンカーを介してＡＢにコンジュゲートされてなる。ある態様によれば、当該リンカーは切断可能なリンカーである。ある態様によれば、斯かるリンカーは、表５及び６に示すリンカーからなる群より選択される。
【０１００】
ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、シグナルペプチドも含む。ある態様によれば、シグナルペプチドは、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体に、スペーサーを介してにコンジュゲートされてなる。ある態様によれば、斯かるスペーサーは、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体に、シグナルペプチドの不在下でコンジュゲートされてなる。ある態様によれば、スペーサーは、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体のＭＭに直接連結される。ある態様によれば、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列QGQSGQ（配列番号11）を含む。ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、本明細書に記載のＭＭ配列に直接連結された配列QGQSGQ（配列番号11）のスペーサーを含み、Ｎ末端からＣ末端に向かってスペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢという構造的配置を有する。ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、本明細書に記載のＭＭ配列に直接連結されたスペーサーを含み、Ｎ末端からＣ末端に向かってスペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢという構造的配置を有する。ある態様によれば、非切断状態の活性化可能抗体はスペーサーを含み、ここで、スペーサーはＭＭに直接連結されると共に、Ｎ末端からＣ末端に向かってＡＢ−ＣＭ−ＭＭ−スペーサーという構造的配置を有する。
【０１０１】
ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、単一特異的である。ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、多重特異的であり、例えば、非限定的な例を挙げると、二重特異的又は三官能性である。ある態様によれば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、二重特異性T細胞誘導（bispecific T-cell engager：ＢＩＴＥ）前駆体分子の一部として設計される。ある態様によれば、活性化可能抗体は、キメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor：ＣＡＲ）修飾Ｔ細胞又は他の改変受容体の前駆体として設計される。
【０１０２】
ある態様によれば、標的は、表１に列記される標的の群から選択される。ある態様によれば、ＡＢは、表２に列記される抗体の群から選択される抗体であるか、斯かる抗体から誘導される。ある態様によれば、その抗原結合断片は、Fab断片、F（ab'）2断片、scFv、及びscAbからなる群より選択される。ある態様によれば、ＡＢは、標的への結合に関して、100ｎＭ未満の平衡解離定数を有する。ある態様によれば、ＭＭのＡＢに対する結合の平衡解離定数は、ＡＢの標的に対する平衡解離定数よりも大きい。ある態様によれば、ＭＭは、標的に対する結合に関して、切断状態の活性化可能抗体のＡＢと干渉又は競合しない。ある態様によれば、ＭＭは40アミノ酸長以下のポリペプチドである。ある態様によれば、ＭＭのポリペプチド配列は標的のポリペプチド配列とは異なり、ここで、ＭＭのポリペプチド配列は、ＡＢの天然結合パートナーの何れとも50％超の同一性を有しない。ある態様によれば、ＭＭは、標的に対して25％超のアミノ酸配列同一性を含まない。ある態様によれば、ＭＭは、標的に対して10％超のアミノ酸配列同一性を含まない。ある態様によれば、ＣＭはアミノ酸長15以下のポリペプチドである。ある態様によれば、プロテアーゼは組織内で標的と共局在化する。ここで、活性化可能抗体がプロテアーゼに露出されると、プロテアーゼが活性化可能抗体中のＣＭを切断する。ある態様によれば、活性化可能抗体はＭＭとＣＭとの間に連結ペプチドを含む。ある態様によれば、活性化可能抗体はＣＭとＡＢとの間に連結ペプチドを含む。ある態様によれば、活性化可能抗体は第一の連結ペプチド（ＬＰ１）と第二の連結ペプチド（ＬＰ２）とを含む。ここで、非切断状態の活性化可能抗体はＮ末端からＣ末端に向かって以下の構造的配置を有する。ＭＭ−ＬＰ１−ＣＭ−ＬＰ２−ＡＢ又はＡＢ−ＬＰ２−ＣＭ−ＬＰ１−ＭＭ。ある態様によれば、これら２つの連結ペプチドは互いに同一である必要はない。ある態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２のうち少なくとも一方が、（GS）n、（GGS）n、（GSGGS）n（配列番号33）、及び（GGGS）n（配列番号34）、（ここでｎは１以上の整数である）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある態様によれば、ＬＰ１又はＬＰ２のうち少なくとも一方が、GGSG（配列番号35）、GGSGG（配列番号36）、GSGSG（配列番号37）、GSGGG（配列番号38）、GGGSG（配列番号39）、及びGSSSG（配列番号40）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある態様によれば、非切断状態の活性化可能抗体はスペーサーを含み、ここで、スペーサーはＭＭに直接連結されると共に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、スペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢという構造的配置を有する。ある態様によれば、非切断状態の活性化可能抗体はスペーサーを含み、ここで、スペーサーはＭＭに直接連結されると共に、Ｎ末端からＣ末端に向かってＡＢ−ＣＭ−ＭＭ−スペーサーという構造的配置を有する。
【０１０３】
また、本発明は、活性化可能抗体の活性化、及び、活性化された活性化可能抗体の所期の標的への結合を、「半活性化可能抗体（hemi-activatable antibody）」と称するコンストラクトを用いて検出するためのキット及び／又は方法を提供する。斯かるコンストラクトにおいて、活性化可能抗体は第一の抗原結合ドメイン及び第二の抗原結合ドメインを含み、第一の抗原結合ドメインはマスクされておらず、第二の抗原結合ドメインはマスクされると共に、プロテアーゼ切断可能配列を含む標識されたリンカーを有する。これらの半活性化可能抗体（hemi-activatable antibody）によれば、非マスク化アームが組織標的に、例えば組織受容体に結合することにより、半活性化可能抗体（hemi-activatable antibody）を組織に係留する。プロテアーゼが組織内に存在して標識化リンカーを切断すると、マスク及び／又は標識が半活性化可能抗体（hemi-activatable antibody）から脱着し、標識シグナル（例えば蛍光等）が減少する。一方、プロテアーゼが組織内に検出可能なレベルで存在しない場合には、標識シグナル（例えば蛍光等）のレベルは変化しないか、或いは相対的に変化が少ないことになる。
【０１０４】
ある態様によれば、半活性化可能抗体（hemi-activatable antibody）は標識されており、斯かる標識は組織における結合された物質の量を表す二重の指標（co−register）として用いられる。
【０１０５】
ある態様によれば、標識化又は非標識化半活性化可能抗体（hemi-activatable antibody）が使用され、ここで第一の抗原結合ドメインはマスクされておらず、第二の抗原結合ドメインはマスクされると共に、フルオロフォア・クエンチャー対に包含されたプロテアーゼ切断可能配列を含むリンカーを有する。これらの半活性化可能抗体（hemi-activatable antibody）によれば、非マスク化アームが組織標的に、例えば組織受容体に結合することにより、半活性化可能抗体（hemi-activatable antibody）を組織に係留する。プロテアーゼが組織内に存在して標識化リンカーを切断すると、クエンチャー及び／又は標識が脱着し、標識シグナル（例えば蛍光等）が増加する。一方、プロテアーゼが組織内に検出可能なレベルで存在しない場合には、標識シグナル（例えば蛍光等）のレベルは変化しないか、或いは相対的に変化が少ないことになる。
【０１０６】
また、本発明は、活性化可能抗体の活性化を観察し、活性化可能抗体の分布を観察し、及び／又は、対象における活性化可能抗体の蓄積を観察するためのキット及び／又は方法を提供する。これらの方法によれば、活性化可能抗体は種々の検出可能なマーカーの何れかにコンジュゲートされ、斯かるマーカーが対応する機器又は他の分析手段を用いて検出される。これらの方法及び／又はキットのある態様によれば、活性化可能抗体が標識にコンジュゲートされてなる。標識の非限定的な例としては、ビオチン、蛍光標識、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴトレーサー、光音響試薬、及び／又はＭＲＩ造影剤が挙げられる。斯かる標識の適切な例としては、本明細書に記載のものが挙げられる。続いて、これらの標識は、種々の方法の何れかを用いて検出される。斯かる方法の非限定的な例としては、ウエスタンブロット分析、組織学、免疫蛍光（immunofluorescence：ＩＦ）、免疫組織化学（immunohistochemistry：ＩＨＣ）、及び／又は、インビボ（in vivo）及び／又は術中画像化法が挙げられる。
【０１０７】
また、本発明は、腫瘍モデルにおける活性化可能抗体の活性化、及び、活性化された活性化可能抗体の結合を、インビボ（in vivo）で「コールド」（"cold"）前処理工程によって画像化し、評価するためのキット及び／又は方法を提供する。これらの方法の利点は、（ｉ）腫瘍又は罹患組織におけるプロテアーゼ活性、（ii）基質の切断可能性及び特異性、（iii）活性化可能抗体の活性化及び結合、並びに（iv）標識化の影響を受けない複数の異なる基質の比較を、インビボ（in vivo）で評価できる点にある。
【０１０８】
これらのキット及び／又は方法によれば、活性化可能抗体の活性化及び結合の間接的な測定は、マウスを「コールド」（"cold"）非標識化活性化可能抗体で処置し、次いで標識化抗体を投与することにより行われる。標識化抗体のみで処理された（即ち「コールド」（"cold"）前処置されていない）マウスと、「コールド」（"cold"）活性化可能抗体で処理されたマウスとの間における、蛍光強度又は他の何れかの画像化評価手段（例えばＰＥＴ、ＭＲＩ等）の差が、活性化された活性化可能抗体により占有された受容体の量を示す。本明細書では斯かる量を占有受容体レベルとも呼ぶ。斯かるシグナルのベースラインは、マウス等の腫瘍モデルを「コールド」（"cold"）抗体で前処置し、受容体の完全占有を生じさせることによって設定される。更に、この対照によって、トラップされた可能性のある標識化物質のシグナルを、透過性及び滞留亢進（Enhanced Permeability and Retention：ＥＰＲ）作用により示すことが可能となる。
【０１０９】
また、本発明は、多発性骨髄腫患者由来の骨髄生検試料等の組織試料を切片化する（sectioning）方法を提供する。ある態様によれば、組織試料は、支持マトリックスに結合する任意の凍結組織である。ある態様によれば、組織試料脂肪又は軟組織、例えば乳癌又はリンパ節試料である。ある態様によれば、組織は固体腫瘍由来である。ある態様によれば、組織試料は多発性骨髄腫試料である。ある態様によれば、組織試料は、多発性骨髄腫患者由来の骨髄生検である。ある態様によれば、患者由来の組織試料の切片化に続いて、染色が行われる。ある態様によれば、多発性骨髄腫患者由来の組織試料の切片化に続いて、染色が行われる。ある態様によれば、多発性骨髄腫患者由来の骨髄生検試料の切片化に続いて、染色が行われる。これらの方法によれば、組織試料は凍結されてなり、ある態様によれば、少なくとも−30℃に凍結される。ある態様によれば、凍結組織試料は続いてチャック（chuck）に固定される。チャックをチャックホルダーに固定した後、凍結切片と混和しうる支持マトリックス、例えば可塑性又は接着性材料、例えば接着テープを、ブロック表面に接着する。ある態様によれば、続いて支持マトリックスを、例えばプラスチックローラー又は他の同様の機器を用いて操作し、均等に接着されるように調整する。支持マトリックスの端を所定位置に固定しつつ、ブロックをゆっくりと刃に対して下げ、切片を取得する。組織切片は任意の厚さとすることができるが、例えば1ミクロン（μｍ）、1ミクロン、2ミクロン、3ミクロン、4ミクロン、5ミクロン、6ミクロン、7ミクロン、8ミクロン、9ミクロン、10ミクロン、或いは10ミクロン超とすることができる。ある態様によれば、組織の切片化はタングステンカーバイドナイフ、例えば16ｃｍのタングステンカーバイドナイフを用いて行われる。組織切片を支持マトリックス状に固定して凍結を維持する。ある態様によれば、支持マトリックスに接着された組織切片を、支持マトリックス上で直接染色する。これにより、組織を移送する手間が省け、予期せぬ損傷を避けることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、本開示の方法、すなわち本開示の活性化可能抗体のインサイチュイメージング（in situ imaging）の概略図である：１．組織切片がスライド上に置かれる。２．スライドが、標識された活性化可能抗体を含む溶液で被覆され、インキュベートされる。３．広範な洗浄後、活性化可能抗体の結合が可視化される。
【０１１１】
【図２Ａ】図２Ａ及び２Ｂは、非小細胞肺癌Ｈ２９２異種移植腫瘍組織を用いた、活性化可能抗体のインサイチュイメージングのための原理証明を示す一連の画像である。これらの図は、抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５を活性化し、これに結合する、非小細胞肺癌Ｈ２９２異種移植腫瘍組織の能力を示す。このような活性化は、プロテイナーゼ阻害剤により又は過剰の非標識（すなわち「コールド」）抗体により阻害される。予想されるように、切断可能部分の代わりにＧＳに富むリンカーを有するマスクされた抗体３９５４−ＮＳＵＢ−Ｃ２２５ｖ５は、ＮＳＣＬＣ組織試料によって活性化されなかった。
【図２Ｂ】同上。
【０１１２】
【図３】図３は、本開示のインサイチュイメージング法を用いた、抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５が、活性化され、凍結ヒトガン組織に結合する能力を示す一連の画像である。上段の左側のパネルで組織画像は、抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５が、抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体の組織由来のタンパク質分解切断によって活性化されて、組織中のＥＧＦＲ標的に結合するＣ２２５ｖ５抗体を与えることを示す。上段の中央のパネルに示されるように、市販の抗ＥＧＦＲ抗体を組織へ暴露することにより、組織染色の同一のパターンが検出された。上段の右側のパネルの画像は、広域スペクトル阻害剤カクテルセットＩＩＩ及び５０ｍＭ  ＥＤＴＡの１：１００希釈による組織の前処理により、左側のパネルに示した蛍光シグナルが阻害されたことを示す。下段は、ＤＡＰＩ核染色を表す。
【０１１３】
【図４】図４は、三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）の腫瘍組織により、活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５（中央のパネル）及び３９５４−ＬＳ９−Ｃ２２５ｖ５（右パネル）の活性化を示す一連の画像である。ＣＭ１２０４（アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＮＨ、配列番号１４）は、ＭＴ−ＳＰ１、ｕＰＡ、及びレグマイン（legumain）の基質である：公知の切断可能部分は、本明細書においてＣＭ  ＬＳ９（アミノ酸配列ＳＬＡＰＬＧＬＱＲＲ、配列番号２５１）と呼ばれ、これはＭＭＰ−１４の基質である。プロテアーゼ活性は、セツキシマブ染色効率（左のパネル）と比較した、活性化可能抗体の活性化と組織結合の割合として定量される。
【０１１４】
【図５】図５は、組織切片による、活性化可能抗体活性化のｐＨ依存性を示す一連の画像である。Ｈ２９２異種移植腫瘍組織上のｐＨ６．５の緩衝液（細胞内プロテアーゼであるカテプシンＢに最適なｐＨ）中の活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５及び３９５４ーＬＳ４ーＣ２２５ｖ５［ＣＭ  ＬＳ４（アミノ酸配列ＲＲＡＬＡＬ、配列番号２５２）はカテプシンＢの基質である］のインキュベーションは、３９５４−ＬＳ４−Ｃ２２５ｖ５を活性化した（下右のパネル）が、３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５（下左のパネル）の有意な活性化はなかった。これに対して、生理学的ｐＨ（ｐＨ７．４）でのこれらの活性化可能抗体のインキュベーションは、３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５（上左のパネル）を活性化したが、３９５４−ＬＳ４−Ｃ２２５ｖ５の有意な活性化はなかった。
【０１１５】
【図６】図６は、３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５が広範囲のヒト腫瘍試料で活性化可能であることを示す一連の表である。列２は、種々のヒトガン組織試料について、市販の抗ＥＧＦＲ抗体により検出されるＥＧＦＲ受容体の発レベルを示す。列３は、種々のヒトガン組織試料中で、抗体Ａ１１により検出される、活性マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）の量を示す。列４と５は、セツキシマブ（Cetux）組織染色（列４）と比較したＥＧＦＲ活性化可能抗体（列５）のインサイチュ活性化と結合の評価を示す。ＥＧＦＲの量と組織試料へのＡ１１抗体の結合とを測定するＩＨＣ染色を、−から３＋までスコア化した：−、染色無し；１＋（すなわち「＋」）、弱い染色；２＋（すなわち「＋＋」）、中程度の染色；及び、３＋（すなわち「＋＋＋」）、強い染色。インサイチュイメージング染色のスコア化は、セツキシマブ（親）抗体染色との比較に基づき、以下のように定義される：＋（すなわち「＋」）、親抗体と比較して弱い染色；２＋（すなわち「＋＋」）、親抗体と比較して中程度の染色；及び、３＋（すなわち「＋＋＋」）、親抗体と同程度の染色。
【０１１６】
【図７】図７は、ヒト結腸直腸癌の肝転移組織試料中のＥＧＦＲとＡ１１の共局在を示す図である。
【０１１７】
【図８】図８は、抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体を活性化しこれに結合する、ヒト結腸直腸癌の肝転移組織の能力を示す図である。
【０１１８】
【図９】図９は、インサイチュイメージング、ＥＧＦＲ  ＩＨＣ、及びＡ１１  ＩＨＣの三重染色を示す一連の画像である。上段の画像は、単一の組織切片について行われた染色を示し、（左から右へ）：インサイチュイメージング条件下での、ＥＧＦＲ発現、マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）の活性、及びセツキシマブの結合を示す。下段の画像は、単一の組織切片について行われた染色を示し、（左から右へ）：ＥＧＦＲ発現、マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）の活性、及び抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５のインサイチュイメージングを示す。図９中の右の列の画像は、インサイチュイメージング条件下での、セツキシマブの結合（上の画像）を、組織由来のタンパク質分解切断により活性化される抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体の結合（下の画像）と比較する。市販の抗ＥＧＦＲ抗体を組織に曝露することにより、図９の左の列の画像により示されるように、同様の組織染色パターンが検出された。図９の中央の列の画像は、マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）活性とＥＧＦＲ発現の共局在を示す。
【０１１９】
【図１０】図１０は、インサイチュイメージング法を使用して証明されるように、活性化され、ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍組織に結合する、本明細書において５３４２−１２０４−４Ｄ１１及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１と呼ばれる抗Jagged活性化可能抗体の能力を示す一連の画像である：ＣＭ  ＰＬＧＬ（アミノ酸配列ＰＬＧＬ、配列番号２１４）は、ｐａｎ−ＭＭＰ基質である。活性化可能抗体はAlexa Fluor（登録商標）680で標識されて、標識された活性化可能抗５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０を産生した。また、標識抗Jagged親抗体４Ｄ１１−ＡＦ６８０も試験した。４Ｄ１１−ＡＦ６８０（パネルＡ）、５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０（パネルＢ）、及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０（パネルＣ）のそれぞれは、凍結ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍組織試料とインキュベートされた。パネルＤ、Ｅ、及びＦは、４Ｄ１１−ＡＦ６８０、５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０、及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０を、広域スペクトルプロテアーゼ阻害剤カクテルで前処理した凍結ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍組織とインキュベートした後に得られた蛍光画像である。
【０１２０】
【図１１】図１１は、ヒト膵臓癌組織のインサイチュイメージングにより証明されるように、抗Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１の活性化を示す一連の画像である。４Ｄ１１−ＡＦ６８０（４Ｄ１１）（列１、行１）、５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０（１２０４）（列１、行２）、及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０（ＰＬＧＬ）（列１、行３）のそれぞれを、ヒト膵臓癌患者から単離した凍結組織試料とインキュベートした。列２、３、及び４のパネルはそれぞれ、４Ｄ１１−ＡＦ６８０、５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０、及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０を、凍結膵臓癌患者組織前処理抗体Ａ１１（ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼの活性部位に特異的に結合する抗体、マトリプターゼとしても知られている）と：（列２）；ＭＭＰ阻害剤（図１１、列３）と；又は、広域スペクトルプロテアーゼ阻害剤カクテル（列４）と、インキュベートした後に得られた蛍光画像である。
【０１２１】
【図１２】図１２は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び結腸癌（ＣＲＣ）ヒト組織試料についての、抗体Ｃ２２５ｖ５のインサイチュイメージングと活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５の活性化を示す一連の画像である。
【０１２２】
【図１３Ａ】図１３Ａと１３Ｂは、本明細書においてマスクされた抗体３９５４−ＮＳＵＢ−Ｃ２２５ｖ４と呼ばれるマスクされた抗ＥＧＦＲ抗体構築物、本明細書において３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４と呼ばれる活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体構築物、又はセツキシマブ（すなわち、非修飾セツキシマブ）を腹腔内注入されたＨ２９２異種移植腫瘍担持マウスの光学的イメージングを示す一連の写真である。マウスは、IVIS Spectrum/CTイメージングシステム（Caliper LifeSciences）を使用してイメージングした（図１３Ａ）。エクスビボ生体分布（図１３Ｂ）を評価するために、剖検を使用した。これらの写真は、３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４活性化可能抗体が、Ｈ２９２異種移植マウスモデルにおいて、腫瘍部位に局在化することを証明している。
【図１３Ｂ】同上。
【０１２３】
【図１４】図１４は、非標識（すなわち、標識されていない）活性化可能抗体と、検出可能な標識を含み、活性化可能抗体のＡＢに特異的に結合する二次試薬とを使用して、インサイチュイメージングを行う実現可能性を示す一連の画像である。
【０１２４】
【図１５】図１５は、活性化可能抗体がプロテアーゼにより活性化され、活性化された活性化可能抗体が標的に結合しインターナライズし、次にイメージング剤が細胞内で活性化されるように、イメージング試薬に結合した活性化可能抗体を使用する、典型的なインターナリゼーションイメージング手法を示す図であり。
【０１２５】
【図１６】図１６は、イメージング試薬に結合した抗体を使用する、インターナリゼーションイメージング手法を示す図であり、ここで、抗体は標的に結合しインターナライズされ、次にイメージング剤が細胞内で活性化される。
【０１２６】
【図１７】図１７は、磁気共鳴イメージング法で、結合した活性化可能抗体を使用する典型的方法を示す図である。
【０１２７】
【図１８】図１８は、活性化可能抗体分布、蓄積、及び／又は活性化を追跡するための種々のイメージング法において、活性化可能抗体及び結合した活性化可能抗体を使用する種々の実施態様を示す図である。
【０１２８】
【図１９】図１９は、本明細書で提供される半活性化可能抗体の概略図を提供する一連の図である。図１９Ａ及び１９Ｃは、活性化可能抗体の１つのアームが標識リンカーを含み、別のアームが親抗体（又は、普遍的に発現された標的に対する抗体）の抗原結合部位である半活性化可能抗体の設計を示す。図１９Ｂは、活性化可能抗体のリンカーが、抗体の抗原結合部位をマスクする標識試薬を含有する半活性化可能抗体の設計を示す。図１９Ｄは、活性化可能抗体の１つのアームが標識リンカーとクエンチされたプローブ（Ｑ）を含有し、別のアームが親抗体の抗原結合部位である半活性化可能抗体設計を示す。
【０１２９】
【図２０】図２０は、図１の標準的活性化可能抗体インサイチュイメージング法を、本明細書において「逆」インサイチュイメージング法と呼ばれるインサイチュイメージング法と比較する図である。
【０１３０】
【図２１】図２１は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）からの組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）試料と乳癌（ＢＣ）患者腫瘍試料で観察される活性化速度のレベルを示すグラフである。インサイチュイメージング染色のスコア化は、４Ｄ１１（親）抗体染色との比較に基づき、以下のように定義される：−、染色無し；１＋（すなわち「＋」）、親抗体と比較して弱い染色；２＋（すなわち「＋＋」）、親抗体と比較して中程度の染色；及び３＋（すなわち「＋＋＋」）、親抗体と同程度の染色。
【０１３１】
【図２２】図２２と２３は、広域スペクトルプロテアーゼ阻害剤（ＢＳＰＩ）の存在下で、標識親抗ＥＧＦＲ抗体（セツキシマブ−ＡＦ６８０）、標識抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＡＦ６８０）、又は標識抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＡＦ６８０）に接触させた微細針吸引物（ＦＮＡ）中の染色を示す図である。２人の対象からの結果は、それぞれ図２２と２３に示される。
【図２３】同上。
【０１３２】
【図２４Ａ】図２４Ａ、２４Ｂ、及び２４Ｃは、受容体占有率のインビボ及びエクスビボイメージングを使用して検出される、活性化可能抗Jagged抗体（５３４２−１２０４−４Ｄ１１）蓄積のレベル間の相関を示す一連の写真とグラフである。
【図２４Ｂ−Ｃ】同上。
【０１３３】
【図２５】図２５は、受容体占有率のイメージングを使用する、抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５の推定される活性化を示すグラフである。
【０１３４】
【図２６】図２６は、多発性骨髄腫骨髄生検の患者試料（ＭＭ０００１５）中の悪性多発性骨髄腫の形質細胞マーカーであるＣＤ１３８による、抗Jagged抗体４Ｄ１１の共局在を示す写真である。
【０１３５】
【図２７】図２７は、２つの多発性骨髄腫骨髄生検の患者試料（ＭＭ０００１５及びＭＭ００１０２）中の、抗Jagged抗体４Ｄ１１の免疫組織化学分析、及び活性化可能抗Jagged抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１のインサイチュイメージング分析、の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【０１３６】
本発明は、活性化可能抗体を使用して、生体試料中の特異的プロテアーゼ活性を検出するための方法と組成物とを提供する。これらの組成物と方法は、種々の診断適用、例えばインビボ、インビトロ、インサイチュ、又はエクスビボで使用することができる。
【０１３７】
本明細書に提供される方法は、細胞培養物又は組織切片などの生体試料中のタンパク質分解活性の検出を可能にする。本明細書に記載の方法を使用して、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）の存在に基づいて、タンパク質分解活性を定量することが可能である。これらの方法は、疾患部位（例えば腫瘍組織）又は健常組織から誘導される任意の凍結細胞又は組織で有用である。
【０１３８】
プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解的切断を触媒する酵素であり、その触媒機構に基づいて５つの異なるクラスに分けることができる：セリン、システイン、アスパラギン酸、メタロ又はスレオニンプロテアーゼ（C. Lopez-Otin, Nature Reviews 2007）。プロテアーゼは、タンパク質の代謝回転、血液凝固、創傷治癒、消化、受精、細胞分化及び増殖、細胞シグナル伝達、免疫応答、及びアポトーシスを含む多くの重要な生理学的プロセスに関与している。しかしプロテアーゼは、厳密に制御されていない場合は非常に有害であり得る。例えば、不適切なタンパク質分解は、癌だけでなく、心血管系、炎症、神経変性、細菌及びウイルスや寄生虫疾患において、大きな役割を有することができる。過剰なタンパク質分解は適切なプロテアーゼの阻害によって防ぐことができるため、プロテアーゼは、適切な治療のための標的であると考えられている（B. Turk, Nature Rev Drug Disc）。注目すべきは、プロテアーゼの活性が、生合成の調節、不活性なプロテアーゼ前駆体（プロ酵素又はチモーゲンとしても知られている）の活性化、及び阻害剤及び補助因子の結合を含む基本的な機構を介して緊密に制御されている。
【０１３９】
細胞や組織中のプロテアーゼを同定し性状解析するために、いくつかの分子的技術が利用できる。これらの技術のほとんどは、プロテアーゼのｍＲＮＡ又はタンパク質発現の検出に焦点を当てている。しかし、プロテアーゼがチモーゲン形態であり、又はその活性を抑制するプロテアーゼ阻害剤との複合体である確率のために、これらの技術はプロテアーゼの活性に関する情報を提供しない。従って、生体系、特に患者試料におけるプロテアーゼ活性の検出可能な試薬の開発は、ホメオスタシスと疾患の発症にプロテアーゼが関与している機構をさらに理解し、並びに臨床用途のためのより良い治療戦略を設計することを助けるために、重要である。
【０１４０】
ザイモグラフィーは、基質分解の視覚化を提供する試薬の使用によって、機能的プロテアーゼの検出を可能にする技術である。プロテアーゼ活性のエキソビボ可視化のために、数種類のザイモグラフィー技術が開発されており、これらは２つの範疇［ゲルザイモグラフィー及びインサイチュザイモグラフィー（Vandooren et al., 2013による総説）］に細分化できるであろう。ゲルザイモグラフィーにおける組織ホモジネートの使用は、組織上の酵素活性の局在化を無くし、無傷の細胞又は組織の異なる区画に局在化されていた可能性のあるプロテアーゼ又は阻害剤の相互作用から生じる、プロテアーゼ活性の修飾につながるかもしれない（Hrabec, et al., J Cancer Res Clin Oncol 128:197-204, 2002）。これに対して、インサイチュザイモグラフィー技術は、これらの局在化との組み合わせた様々なプロテアーゼ活性の評価に基づく（Yan and Blomme, 2003）。しかし、プロテアーゼが分子量により同定できるゲルザイモグラフィーと比較して、インサイチュザイモグラフィーでは、データの解釈は基質の特異性と選択性に依存する。インサイチュザイモグラフィーで現在使用されているほとんどの試薬（例えば、ＤＱ−コラーゲン又はＤＱ−カゼイン）は、データの解釈を非常に推論的にする多くのプロテアーゼにより切断できるであろう基質に基づく。
【０１４１】
本明細書に記載の方法は、プロテアーゼ活性化抗体技術（本明細書において、活性化可能抗体イメージングと呼ばれる）の使用により、生体試料、例えば組織試料中の特異的プロテアーゼ活性の選択的検出を可能にする、新規で強力な技術を提供する。ある実施態様においてこの方法は、活性化可能抗体インビボイメージングである。ある実施態様においてこの方法は、活性化可能抗体エクスビボイメージングである。ある実施態様においてこの方法は、活性化可能抗体インサイチュイメージングである。ある実施態様においてこの方法は、活性化可能抗体インビトロイメージングである。これらの方法は、組織切片中で特異的プロテアーゼ活性を検出し局在化するために、異なるプロテアーゼ特異的基質を取り込むように設計された活性化可能抗体を使用する。
【０１４２】
一般に、本明細書に提供される組成物と方法は、標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）を含む活性化可能抗体を含み、ここで、ＡＢは、抗体又はその抗原結合断片が標的に結合する能力を低下させるように、マスキング部分（ＭＭ）に結合している。ある実施態様において、ＭＭは、プロテアーゼ、例えば対象の治療部位で標的に共局在しているプロテアーゼの基質を含む切断可能部分（ＣＭ）を介して、ＡＢに結合している。多くの研究が、固形腫瘍において、異常なプロテアーゼレベル、例えばｕＰＡ、レグマイン、ＭＴ−ＳＰ１、マトリックス金属プロテアーゼ（ＭＭＰ）の相関を証明している（例えば、urthy RV, et al. “Legumain expression in relation to clinicopathologic and biological variables in colorectal cancer.” Clin Cancer Res. 11 (2005): 2293-2299; Nielsen BS, et al. “Urokinase plasminogen activator is localized in stromal cells in ductal breast cancer.” Lab Invest 81 (2001): 1485-1501; Mook OR, et al. “In situ localization of gelatinolytic activity in the extracellular matrix of metastases of colon cancer in rat liver using quenched fluorogenic DQ-gelatin.” J Histochem Cytochem. 51 (2003): 821-829を参照）。
【０１４３】
本明細書に提供される活性化可能抗体は、プロテアーゼの基質を含み、これは、治療部位及び／又は診断部位における標的化抗体活性化のために、腫瘍細胞中のプロテアーゼ活性にレバレッジ効果を与えるのに有用である。基質選択プロセスは、多くの好適な特徴を有する基質を同定するのに使用される。例えば選択される基質は、全身性に安定（すなわち、対象の全身循環において安定）であり、一般的に循環プロテアーゼ（例えば、プラスミン、トロンビン、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ））による切断に対して感受性ではなく、非毒性であり、一般に皮膚などの毒性の可能性のある部位での、プロテアーゼ（例えば、ＡＤＡＭ  ９、ＡＤＡＭ  １０、ＡＤＡＭ  １７、及び／又はカリクレイン、例えばＫＬＫ−５及びＫＬＫ−７）による切断に対して感受性ではなく、目的の治療部位及び／又は診断部位において活性である。ある実施態様において、同定される基質は、目的の治療部位及び／又は診断部位において過剰発現されているが、正常で健常な又は非疾患組織もしくは非損傷組織で典型的には活性ではないプロテアーゼについて選択され、次に選択された基質は、正常な、例えば非疾患組織中で発現されるプロテアーゼに対して逆スクリーニングされる。
【０１４４】
非限定例として、ＡＢは表１に列記された標的の結合パートナーである。
【表１】
2020098195.tif 000003
【０１４５】
非限定例として、ＡＢは表２に列記された抗体であるか、又は抗体から誘導される。
【表２−１】
2020098195.tif 000004
【表２−２】
2020098195.tif 000005
【０１４６】
ある実施態様において、ＡＢは、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する。ある実施態様において、ＥＧＦＲに結合するＡＢは、以下に示される重鎖及び／又は軽鎖の一又は二以上を含む。
Ｃ２２５ｖ５ＡＢ重鎖アミノ酸配列：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*（配列番号２）
Ｃ２２５ｖ５抗体軽鎖アミノ酸配列：
QILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*（配列番号１６）
Ｃ２２５ｖ４抗体重鎖アミノ酸配列：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*（配列番号２４４）
Ｃ２２５ｖ６抗体重鎖アミノ酸配列：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*（配列番号２５３）
【０１４７】
ある実施態様において、ＡＢは、インターロイキン６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に結合する。ある実施態様において、ＩＬ−６Ｒに結合するＡＢは、以下に示される重鎖及び／又は軽鎖の一又は二以上を含む。
Ａｖ１抗体重鎖アミノ酸配列:
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYSGITTYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２５４）
Ａｖ１抗体軽鎖アミノ酸配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSＦＮＲＧＥＣ（配列番号２５５）
【０１４８】
ある実施態様において、ＡＢは、Jagged標的、例えばJagged 1、Jagged 2、Jagged 1とJagged 2の両方に結合する。ある実施態様において、Jagged標的に結合するＡＢは、以下に示される重鎖及び／又は軽鎖の一又は二以上を含む。
４Ｄ１１軽鎖配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号２６）
４Ｄ１１重鎖配列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGRQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２８）
４Ｄ１１ｖ２重鎖配列
EVHLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGRQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２５６）
４Ｄ１１ｖ２軽鎖配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLXKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号２５７）
【０１４９】
ある実施態様において、Jagged標的に結合するＡＢは、以下に示される可変重鎖及び／又は可変軽鎖配列の一又は二以上を含む。
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ４
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号２５８）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ４
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２５９）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ５
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号２６０）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ５
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPYHGQFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２６１）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ７
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号２６２）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ７
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２６３）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ８
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号２６４）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ８
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHIGRTNPFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２６５）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ１３
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号２６６）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ１３
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２６７）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ１６
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号２６８）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ１６
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPYYGQFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２６９）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ１９
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号２７０）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ１９
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２７１）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ２１
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号２７２）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ２１
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２７３）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ２４
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号２７４）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ２４
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEEMGWQTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２７５）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ２６
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号２７６）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ２６
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２７７）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ２７
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号２７８）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ２７
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFYGQFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２７９）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ２８
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号２８０）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ２８
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２８１）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ３０
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号２８２）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ３０
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEEMGWQTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２８３）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ３１
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号２８４）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ３１
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２８５）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ３２
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号２８６）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ３２
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２８７）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ３７
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号２８８）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ３７
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPHNGQFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２８９）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ３９
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号２９０）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ３９
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２９１）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ４０
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号２９２）
重鎖アミノ配列Ｈｃ４０
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２９３）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ４７
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号２９４）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ４７
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDEMGWQTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２９５）
可変４Ｂ２軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTLDAPPQFGQGTKVEIKR（配列番号２９６）
可変４Ｂ２重鎖
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２９７）
可変４Ｄ１１軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKR（配列番号２２）
可変４Ｄ１１重鎖
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGRQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２４）
可変４Ｅ７軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号２９８）
可変４Ｅ７重鎖
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEEMGWQTKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２９９）
可変４Ｅ１１軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALDAPLMFGQGTKVEIKR（配列番号３００）
可変４Ｅ１１重鎖
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEPMGQLTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号３０１）
可変６Ｂ７軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号３０２）
可変６Ｂ７重鎖
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDEMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号３０３）
可変６Ｆ８軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALVAPLTFGQGTKVEIKR（配列番号３０４）
可変６Ｆ８重鎖
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDEMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号３０５）
【０１５０】
非限定例として、ＣＭは、表３に列記された以下の酵素又はプロテアーゼの一又は二以上により切断される基質であるか、又は基質から誘導されるアミノ酸配列を含む。
【表３】
2020098195.tif 000006
【０１５１】
本明細書に提供される活性化可能抗体は、マスキング部分を含む。ある実施態様において、マスキング部分は、活性化可能抗体に連結しているか又は結合しているアミノ酸配列であり、マスキング部分は、抗体が標的に特異的に結合する能力を低下させるように、活性化可能抗体構築物内に位置している。適切なマスキング部分は、種々の公知の方法のいずれかを使用して同定される。例えば、ペプチドマスキング部分は、米国特許出願公開第８，２９３，６８５号（Daugherty et al.）（その内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載された方法を使用して同定される。
【０１５２】
ある実施態様において、マスキング部分は、特異的抗体又は抗体断片で使用するために選択される。例えば、ＥＧＦＲに結合する抗体で使用するために適したマスキング部分は、配列CISPRG（配列番号４３）を含むＭＭを含む。非限定例として、ＭＭは、CISPRGCG（配列番号４４）；CISPRGCPDGPYVMY（配列番号１２）；CISPRGCPDGPYVM（配列番号４５）, CISPRGCEPGTYVPT（配列番号４６）、及び CISPRGCPGQIWHPP（配列番号４７）などの配列を含むことができる。他の適切なマスキング部分は、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１０／０８１１７３に開示された任意のＥＧＦＲ特異的マスク、例えば非限定例として、GSHCLIPINMGAPSC（配列番号４８）；CISPRGCGGSSASQSGQGSHCLIPINMGAPSC（配列番号４９）；CNHHYFYTCGCISPRGCPG（配列番号50); ADHVFWGSYGCISPRGCPG（配列番号５１）；CHHVYWGHCGCISPRGCPG（配列番号52); CPHFTTTSCGCISPRGCPG（配列番号５３）；CNHHYHYYCGCISPRGCPG（配列番号54); CPHVSFGSCGCISPRGCPG（配列番号５５）；CPYYTLSYCGCISPRGCPG（配列番号５６）；CNHVYFGTCGCISPRGCPG（配列番号５７）；CNHFTLTTCGCISPRGCPG（配列番号５８）；CHHFTLTTCGCISPRGCPG（配列番号５９）；YNPCATPMCCISPRGCPG（配列番号６０）；CNHHYFYTCGCISPRGCG（配列番号６１）；CNHHYHYYCGCISPRGCG（配列番号６２）；CNHVYFGTCGCISPRGCG（配列番号６３）；CHHVYWGHCGCISPRGCG（配列番号６４）；CPHFTTTSCGCISPRGCG（配列番号６５）；CNHFTLTTCGCISPRGCG（配列番号６６）；CHHFTLTTCGCISPRGCG（配列番号６７）；CPYYTLSYCGCISPRGCG（配列番号６８）；CPHVSFGSCGCISPRGCG（配列番号６９）；ADHVFWGSYGCISPRGCG（配列番号７０）；YNPCATPMCCISPRGCG（配列番号７１）；CHHVYWGHCGCISPRGCG（配列番号７２）；C(N/P)H(H/V/F)(Y/T)(F/W/T/L)(Y/G/T/S)(T/S/Y/H)CGCISPRGCG（配列番号７３）；CISPRGCGQPIPSVK（配列番号７４）；CISPRGCTQPYHVSR（配列番号７５）；及び／又はCISPRGCNAVSGLGS（配列番号７６）を含む。
【０１５３】
Jagged標的、例えばJagged 1及び／又はJagged 2に結合する抗体で使用するために適したマスキング部分は、非限定例として、QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNG（配列番号７７）；PWCMQRQDFLRCPQP（配列番号７８）；QLGLPAYMCTFECLR（配列番号７９）；CNLWVSGGDCGGLQG（配列番号８０）；SCSLWTSGSCLPHSP（配列番号８１）；YCLQLPHYMQAMCGR（配列番号８２）；CFLYSCTDVSYWNNT（配列番号8３）；PWCMQRQDYLRCPQP（配列番号８４）；CNLWISGGDCRGLAG（配列番号８５）；CNLWVSGGDCRGVQG（配列番号８６）；NLWVSGGDCRGLRG（配列番号８７）；CNLWISGGDCRGLPG（配列番号８８）；CNLWVSGGDCRDAPW（配列番号８９）；CNLWVSGGDCRDLLG（配列番号９０）；CNLWVSGGDCRGLQG（配列番号９１）；CNLWLHGGDCRGWQG（配列番号９２）；CNIWLVGGDCRGWQG（配列番号９３）；CTTWFCGGDCGVMRG（配列番号９４）；CNIWGPSVDCGALLG（配列番号９５）；CNIWVNGGDCRSFEG（配列番号９６）；YCLNLPRYMQDMCWA（配列番号９７）；YCLALPHYMQADCAR（配列番号９８）；CFLYSCGDVSYWGSA（配列番号９９）；CYLYSCTDSAFWNNR（配列番号１００）；CYLYSCNDVSYWSNT（配列番号１０１）；FLYSCTDVSYW（配列番号１０２）；CFLYSCTDVAYWNSA（配列番号１０３）；FLYSCTDVSYWGDT（配列番号１０４）；CFLYSCTDVSYWGNS（配列番号１０５）；CFLYSCTDVAYWNNT（配列番号１０６）；CFLYSCGDVSYWGNPGLS（配列番号１０７）；CFLYSCTDVAYWSGL（配列番号１０８）；CYLYSCTDGSYWNST（配列番号１０９）；CFLYSCSDVSYWGNI（配列番号１１０）；CFLYSCTDVAYW（配列番号１１１）；CFLYSCTDVSYWGST（配列番号１１２）；CFLYSCTDVAYWGDT（配列番号１１３）；GCNIWLNGGDCRGWVDPLQG（配列番号１１４）；GCNIWLVGGDCRGWIGDTNG（配列番号１１５）；GCNIWLVGGDCRGWIEDSNG（配列番号１１６）；GCNIWANGGDCRGWIDNIDG（配列番号１１７）；GCNIWLVGGDCRGWLGEAVG（配列番号１１８）；GCNIWLVGGDCRGWLEEAVG（配列番号１１９）；GGPALCNIWLNGGDCRGWSG（配列番号１２０）；GAPVFCNIWLNGGDCRGWMG（配列番号１２１）；GQQQWCNIWINGGDCRGWNG（配列番号１２２）；GKSEFCNIWLNGGDCRGWIG（配列番号１２３）；GTPGGCNIWANGGDCRGWEG（配列番号１２４）；GASQYCNLWINGGDCRGWRG（配列番号１２５）；GCNIWLVGGDCRPWVEGG（配列番号１２６）；GCNIWAVGGDCRPFVDGG（配列番号１２７）；GCNIWLNGGDCRAWVDTG（配列番号１２８）；GCNIWIVGGDCRPFINDG（配列番号１２９）；GCNIWLNGGDCRPVVFGG（配列番号１３０）；GCNIWLSGGDCRMFMNEG（配列番号１３１）；GCNIWVNGGDCRSFVYSG（配列番号１３２）；GCNIWLNGGDCRGWEASG（配列番号１３３）；GCNIWAHGGDCRGFIEPG（配列番号１３４）；GCNIWLNGGDCRTFVASG（配列番号１３５）；GCNIWAHGGDCRGFIEPG（配列番号１３６）；GFLENCNIWLNGGDCRTG（配列番号１３７）；GIYENCNIWLNGGDCRMG（配列番号１３８）；及び／又は、GIPDNCNIWINGGDCRYG（配列番号１３９）などの配列を含むマスキング部分を含む。
【０１５４】
インターロイキン６標的、例えばインターロイキン６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に結合する抗体で使用するために適したマスキング部分は、非限定例として、QGQSGQYGSCSWNYVHIFMDC（配列番号１４０）；QGQSGQGDFDIPFPAHWVPIT（配列番号１４１）；QGQSGQMGVPAGCVWNYAHIFMDC（配列番号１４２）；YRSCNWNYVSIFLDC（配列番号１４３）； PGAFDIPFPAHWVPNT（配列番号１４４）；ESSCVWNYVHIYMDC（配列番号１４５）；YPGCKWNYDRIFLDC（配列番号１４６）；YRTCSWNYVGIFLDC（配列番号１４７）；YGSCSWNYVHIFMDC（配列番号１４８）；YGSCSWNYVHIFLDC（配列番号１４９）；YGSCNWNYVHIFLDC（配列番号１５０）；YTSCNWNYVHIFMDC（配列番号１５１）；YPGCKWNYDRIFLDC（配列番号１５２）；WRSCNWNYAHIFLDC（配列番号１５３）；WSNCHWNYVHIFLDC（配列番号１５４）；DRSCTWNYVRISYDC（配列番号１５５）；SGSCKWDYVHIFLDC（配列番号１５６）；SRSCIWNYAHIHLDC（配列番号１５７）；SMSCYWQYERIFLDC（配列番号１５８）；YRSCNWNYVSIFLDC（配列番号１５９）；YGSCSWNYVHIFMDC（配列番号１６０）；SGSCKWDYVHIFLDC（配列番号１６１）；YKSCHWDYVHIFLDC（配列番号１６２）；YGSCTWNYVHIFMEC（配列番号１６３）；FSSCNWNYVHIFLDC（配列番号１６４）；WRSCNWNYAHIFLDC（配列番号１６５）；YGSCQWNYVHIFLDC（配列番号１６６）；YRSCNWNYVHIFLDC（配列番号１６７）；NMSCHWDYVHIFLDC（配列番号１６８）；FGPCTWNYARISWDC（配列番号１６９）；XXsCXWXYvhIfXdC（配列番号１７０）；MGVPAGCVWNYAHIFMDC（配列番号１７１）；RDTGGQCRWDYVHIFMDC（配列番号１７２）；AGVPAGCTWNYVHIFMEC（配列番号１７３）；VGVPNGCVWNYAHIFMEC（配列番号１７４）；DGGPAGCSWNYVHIFMEC（配列番号１７５）；AVGPAGCWWNYVHIFMEC（配列番号１７６）；CTWNYVHIFMDCGEGEGP（配列番号１７７）；GGVPEGCTWNYAHIFMEC（配列番号１７８）；AEVPAGCWWNYVHIFMEC（配列番号１７９）；AGVPAGCTWNYVHIFMEC（配列番号１８０）；SGASGGCKWNYVHIFMDC（配列番号１８１）；MGVPAGCVWNYAHIFMDC（配列番号１８２）；TPGCRWNYVHIFMECEAL（配列番号１８３）；VGVPNGCVWNYAHIFMEC（配列番号１８４）；PGAFDIPFPAHWVPNT（配列番号１８５）；RGACDIPFPAHWIPNT（配列番号１８６）；QGDFDIPFPAHWVPIT（配列番号１８７）；XGafDIPFPAHWvPnT（配列番号１８８）；RGDGNDSDIPFPAHWVPRT（配列番号１８９）；SGVGRDRDIPFPAHWVPRT（配列番号１９０）；WAGGNDCDIPFPAHWIPNT（配列番号１９１）；WGDGMDVDIPFPAHWVPVT（配列番号１９２）；AGSGNDSDIPFPAHWVPRT（配列番号１９３）；ESRSGYADIPFPAHWVPRT（配列番号１９４）；及び／又はRECGRCGDIPFPAHWVPRT（配列番号１９５）などの配列を含むマスキング部分を含む。
【０１５５】
ある実施態様において、マスキング部分は、抗体又は抗体断片で使用するために選択される。例えば、ある実施態様において、マスキング部分は、非結合立体部分（ＮＢ）又は非結合立体部分の結合パートナー（ＢＰ）であり、ここで、ＢＰは、ＮＢを活性化可能抗体に動員するか又は誘引する。例えば、ある実施態様において、ＮＢは、可溶性の球状タンパク質である。ある実施態様において、ＮＢは、血流中を循環するタンパク質である。ある実施態様において、ＮＢは、アルブミン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ヘモグロビン、トランスフェリン、免疫グロブリンドメイン、及び他の血清タンパク質からなる群から選択される。ある実施態様において、ＢＰは、アルブミン結合ペプチド、フィブリノゲン結合ペプチド、フィブロネクチン結合ペプチド、ヘモグロビン結合ペプチド、トランスフェリン結合ペプチド、免疫グロブリンドメイン結合ペプチド、及び他の血清タンパク質結合ペプチドから成る群から選択される。ある実施態様において、活性化可能抗体は、非切断状態では、以下のようにＮ末端からＣ末端へ向かってＮＢ−ＣＭ−ＡＢ、ＡＢ−ＣＭ−ＮＢ、ＢＰ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＢＰという構造的配置を有する。活性化可能抗体がＢＰを含み、活性化可能抗体が対応するＮＢの存在下にある実施態様において、活性化可能抗体は、非切断状態では、以下のようにＮ末端からＣ末端へ向かってＢ：ＢＰ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＢＰ：ＮＢという構造的配置を有し、ここで、「：」は、ＮＢとＢＰとの間の相互作用、例えば結合である。ある実施態様において、活性化可能抗体は、非切断状態では、以下のようにＮ末端からＣ末端へ向かってＮＢ−ＬＰ１−ＣＭ−ＬＰ２−ＡＢ、ＡＢ−ＬＰ２−ＣＭ−ＬＰ１−ＮＢ、ＢＰ−ＬＰ１−ＣＭ−ＬＰ２−ＡＢ、又はＡＢ−ＬＰ２−ＣＭ−ＬＰ１−ＢＰという構造的配置を有する。活性化可能抗体がＢＰを含み、活性化可能抗体が対応するＮＢの存在下にある実施態様において、活性化可能抗体は、非切断状態では、以下のようにＮ末端からＣ末端へ向かってＮＢ：ＢＰ−ＬＰ１−ＣＭ−ＬＰ２−ＡＢ、又はＡＢ−ＬＰ２−ＣＭ−ＬＰ１−ＢＰ：ＮＢという構造的配置を有し、ここで、「：」は、ＮＢとＢＰとの間の相互作用、例えば結合である。
【０１５６】
本明細書に提供される活性化可能抗体は、切断可能部分を含む。ある実施態様において、切断可能部分は、プロテアーゼ、通常細胞外プロテアーゼの基質であるアミノ酸配列を含む。適切な基質は、種々の公知の方法のいずれかを使用して同定される。例えば、ペプチド基質は、米国特許第７，６６６，８１７号（Daugherty et al.）（その内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載された方法を使用して同定される（また、Boulware et al. “Evolutionary optimization of peptide substrates for proteases that exhibit rapid hydrolysis kinetics.” Biotechnol Bioeng. 106.3 (2010): 339-46も参照）。
【０１５７】
ある実施態様において、ＣＭは、特異的プロテアーゼで使用するために選択される。ある実施態様において、ＣＭは、ＡＤＡＭ  １７、ＢＭＰ−１、システインプロテアーゼ、例えばカテプシン、ＨＴＲＡ１、レグマイン、マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、好中球エラスターゼ、例えばＴＭＰＲＳＳ、例えばＴＭＰＲＳＳ３又はＴＭＰＲＳＳ４、トロンビン、及びｕ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡはまたウロキナーゼとも呼ばれる）からなる群から選択される少なくとも一つのプロテアーゼに対する基質である。
【０１５８】
ある実施態様において、ＣＭはＡＤＡＭ１７の基質である。いくつかの実施態様において、ＣＭはＢＭＰ−１の基質である。いくつかの実施態様において、ＣＭはカテプシンの基質である。いくつかの実施態様において、ＣＭはシステインプロテアーゼの基質である。いくつかの実施態様において、ＣＭはＨＴＲＡ１の基質である。いくつかの実施態様において、ＣＭはレグマインの基質である。いくつかの実施態様において、ＣＭはＭＴ−ＳＰ１の基質である。いくつかの実施態様において、ＣＭはＭＭＰの基質である。いくつかの実施態様において、ＣＭは好中球エラスターゼの基質である。いくつかの実施態様において、ＣＭはトロンビンの基質である。いくつかの実施態様において、ＣＭはＴＭＰＲＳＳの基質である。いくつかの実施態様において、ＣＭはＴＭＰＲＳＳ３の基質である。いくつかの実施態様において、ＣＭはＴＭＰＲＳＳ４の基質である。いくつかの実施態様において、ＣＭはｕＰＡの基質である。
【０１５９】
ある実施態様において、切断可能部分は、特異的プロテアーゼ、例えば活性化可能抗体の標的と共局在されることが公知のプロテアーゼで使用するために選択される。例えば、本開示の活性化可能抗体で使用するのに適した切断可能部分は、ウロキナーゼ、レグマイン、少なくとも一つのマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）、及び/又はMT-SP1（マトリプターゼ）などの少なくとも１つのプロテアーゼにより切断され、配列 TGRGPSWV（配列番号１９６）；SARGPSRW（配列番号１９７）；TARGPSFK（配列番号１９８）；LSGRSDNH（配列番号１４）；GGWHTGRN（配列番号１９９）；HTGRSGAL（配列番号２００）；PLTGRSGG（配列番号２０１）；AARGPAIH（配列番号２０２）；RGPAFNPM（配列番号２０３）；SSRGPAYL（配列番号２０４）；RGPATPIM（配列番号２０５）；RGPA（配列番号２０６）；GGQPSGMWGW（配列番号２０７）；FPRPLGITGL（配列番号２０８）；VHMPLGFLGP（配列番号２０９）；SPLTGRSG（配列番号２１０）；SAGFSLPA（配列番号２１１）；LAPLGLQRR（配列番号２１２）；SGGPLGVR（配列番号２１３);及び／又はPLGL（配列番号２１４)を含む。
【０１６０】
ある実施態様において、ＣＭは少なくとも一つのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の基質である。ＭＭＰの例は、ＭＭＰ１；ＭＭＰ２；ＭＭＰ３；ＭＭＰ７；ＭＭＰ８；ＭＭＰ９；ＭＭＰ１０；ＭＭＰ１１；ＭＭＰ１２；ＭＭＰ１３；ＭＭＰ１４；ＭＭＰ１５；ＭＭＰ１６；ＭＭＰ１７；ＭＭＰ１９；ＭＭＰ２０；ＭＭＰ２３；ＭＭＰ２４；ＭＭＰ２６；及びＭＭＰ２７を含む。ある実施態様において、ＣＭは、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１１、及びＭＭＰ１９の基質である。ある実施態様において、ＣＭはＭＭＰ９の基質である。ある実施態様において、ＣＭはＭＭＰ１４の基質である。ある実施態様において、ＣＭは二以上のＭＭＰの基質である。ある実施態様において、ＣＭは少なくともＭＭＰ９及びＭＭＰ１４の基質である。ある実施態様において、ＣＭは同じＭＭＰのための二以上の基質を含む。ある実施態様において、ＣＭは少なくとも二以上のＭＭＰ９基質を含む。ある実施態様において、ＣＭは少なくとも二以上のＭＭＰ１４基質を含む。
【０１６１】
ある実施態様において、ＣＭはＭＭＰの基質であり、配列 ISSGLLSS（配列番号３０６）；QNQALRMA（配列番号３０７）；AQNLLGMV（配列番号３０８）；STFPFGMF（配列番号３０９）；PVGYTSSL（配列番号３１０）；DWLYWPGI（配列番号３１１）；MIAPVAYR（配列番号３１２）；RPSPMWAY（配列番号３１３）；WATPRPMR（配列番号３１４）；FRLLDWQW（配列番号３１５）；LKAAPRWA（配列番号３１６）；GPSHLVLT（配列番号３１７）；LPGGLSPW（配列番号３１８）；MGLFSEAG（配列番号３１９）；SPLPLRVP（配列番号３２０）；RMHLRSLG（配列番号３２１）；LAAPLGLL（配列番号３２２）；AVGLLAPP（配列番号３２３）；LLAPSHRA（配列番号３２４）；PAGLWLDP（配列番号３２５)；及び／又はISSGLSS（配列番号３２６)を含む。
【０１６２】
ある実施態様において、本開示の活性化可能抗体に使用するための活性化可能抗体は、真核生物又は原核生物種において組換えＤＮＡ技術及び発現を使用して生合成してもよい。マスキング部分、リンカー配列（切断可能部分（ＣＭ）及び抗体鎖（重鎖又は軽鎖）を含む）、及び抗体鎖（重鎖又は軽鎖）をコードするｃＤＮＡは、５’から３’（翻訳産物でＮ末端からＣ末端）方向に連結して核酸構築物を作成することができ、これは、通常の抗体発現プロセス後に、活性化可能抗体タンパク質として発現される。ある実施態様において活性化可能抗体は、ＣＭ抗体を発現し、次にマスクをタンパク質のＮ末端又はその近くに化学的に連結することによって半合成的に製造することができるであろう。ある実施態様において活性化可能抗体は、抗体を発現し、次に、未切断状態の活性化可能抗体が、Ｎ末端からＣ末端へ向かってＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭという構造的配置を有するように、タンパク質のＮ末端又はその近くに、化学的にマスクとＣＭを結合させることによって製造することができるであろう。
【０１６３】
本明細書に記載の活性化可能抗体はまた、活性化可能抗体に結合した薬剤を含むことができる。ある実施態様において、コンジュゲート化された薬剤は、新生物などの治療剤である。このような実施態様において、薬剤は、活性化可能抗体の炭水化物部分にコンジュゲート化され、例えば、炭水化物部分は、抗体の抗原結合領域の外、又は活性化可能抗体中の抗原結合断片の外で配置される。ある実施態様において、薬剤は、抗体のスルフヒドリル基又は活性化可能抗体中の抗原結合断片にコンジュゲート化される。ある実施態様において、薬剤は、抗体のアミノ基又は活性化可能抗体の抗原結合断片にコンジュゲート化される。ある実施態様において、薬剤は、抗体のカルボン酸基又は活性化可能抗体の抗原結合断片にコンジュゲート化される。ある実施態様において、薬剤はチオール含有薬剤である。ある実施態様において、薬剤は一つ以上のチオール基を含むように遺伝子操作される。
【０１６４】
ある実施態様において、薬剤は、細胞傷害剤、例えば毒素（例えば、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素的に活性な毒素、又はその断片）、又は放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）である。適当な細胞障害剤は、例えば表４に列記されたいずれかを含む。
【０１６５】
ある実施態様において、細胞障害剤はチオール含有薬剤である。ある実施態様において、細胞障害剤は、一又は二以上のチオール基を含むように遺伝子操作される。ある実施態様において、細胞障害剤はドラスタチン又はその誘導体（例えば、アウリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＤＭＡＦ、ＤＭＡＥ）である。例えば、細胞傷害剤はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。ある実施態様において、細胞障害剤はメイタンシノイド又はメイタンシノイド誘導体である。ある実施態様において、薬剤はＤＭ１又はＤＭ４である。ある実施態様において、薬剤はデュオカルマイシン又はその誘導体である。ある実施態様において、薬剤はカリケアマイシン又はその誘導体である。
【０１６６】
ある実施態様において、本明細書で提供される組成物及び方法に加えて、コンジュゲート化活性化可能抗体はまた、活性化可能抗体配列中に挿入されたか又は含まれた修飾アミノ酸配列を介して、部位特異的コンジュゲート化のために修飾することもできる。これらの修飾アミノ酸配列は、コンジュゲート化された活性化可能抗体内のコンジュゲート化薬剤の、制御された配置及び／又は投与を可能にするように設計される。例えば、活性化可能抗体は、反応性チオール基を提供し、タンパク質の折りたたみ及び組み立てに負の影響を与えず、また抗原結合も変化させない軽鎖及び重鎖上の位置に、システイン置換を含むように遺伝子操作することができる。ある実施態様において、活性化可能抗体は、コンジュゲート化に適した部位を提供するために、活性化可能抗体内に一又は二以上の非天然アミノ酸残基を含むか又はそうでなければ導入するように遺伝子操作することができる。ある実施態様において、活性化可能抗体は、酵素的に活性なペプチド配列を活性化可能抗体配列内に含むか又は導入するように遺伝子操作することができる。
【０１６７】
ある実施態様において、薬剤は、例えば標識又は他のマーカーなどの検出可能部分である。例えば薬剤は、放射能標識アミノ酸、マークされた抗ビオチン抗体又はアビジン（例えば、光学的又は熱量分析法によって検出することができる蛍光マーカー又は酵素活性を含む抗ビオチン抗体又はストレプトアビジン）により検出できる一又は二以上のビオチン部分、一又は二以上の放射性同位体又は放射性核種、一又は二以上の蛍光標識、一又は二以上の酵素標識、及び／又は一又は二以上の化学発光剤であるか、又はこれを含むことができる。ある実施態様において、検出可能部分は、スペーサー分子によって結合される。
【０１６８】
使用可能な酵素的に活性な毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、アメリカヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンを含む。ラジオコンジュゲート化抗体を産生するために、種々の放射性核種を利用することができる。例には、212Ｂｉ、131Ｉ、131Ｉｎ、90Ｙ、及び186Ｒｅが挙げられる。
【０１６９】
抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、N−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオル）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチル塩酸塩など）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの種々の二官能性タンパク質結合剤を用いて作製される。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)に記載されるように調製することができる。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種を抗体にコンジュゲートするための典型的なキレート剤である。（Ｗ０９４／１１０２６を参照されたい）。
【０１７０】
当業者は、非常に多様な可能性がある部分を、本発明の得られた抗体に結合させることができると認識するであろう（例えば、"Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)を参照されたい、この全内容は参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【０１７１】
表４は、ここに記載した本発明で使用できる典型的な薬剤のいくつかを列記するが、これは決して網羅的なリストであることを意味しない。
【表４−１】
2020098195.tif 000007
【表４−２】
2020098195.tif 000008
【０１７２】
ある実施態様において、本明細書で提供される組成物及び方法に加えて、活性化可能抗体はまた、抗体及び他の部分がそれぞれの活性を保持する限り、２つの分子を結合させ任意の化学反応を使用して結合することができる。この結合は、多くの化学的機序、例えば共有結合、アフィニティ結合、インターカレーション、配位結合、及び錯体形成を含みうる。しかし、好ましい結合は共有結合である。共有結合は、既存の側鎖を直接縮合することによって、又は外部架橋分子を組み入れることのいずれかによって行われうる。多くの二価又は多価結合剤が、本発明の抗体などのタンパク質分子を他の分子に結合させるために有用である。例えば、代表的な結合剤は、チオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン、及びヘキサメチレンジアミンなどの有機化合物を含みうる。この一覧は、当技術分野において公知の様々なクラスの結合剤を網羅したものではなく、むしろより一般的な結合剤の例であると意図される（Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133: 1335-2549 (1984); Jansen et al, Immunological Reviews 62: 185-216 (1982); and Vitetta et al, Science 238: 1098 (1987)を参照されたい）。
【０１７３】
好ましいリンカーは、文献に記載されている。（例えば、ＭＢＳ（Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用を記載する、Ramakrishnan, S. et al, Cancer Res. 44:201-208 (1984)を参照されたい）。同様に、オリゴペプチドリンカーによって抗体に結合させたハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用を記載する米国特許第５，０３０，７１９号も参照されたい。好ましいリンカーは、（ｉ）ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）−トルエン）（Pierce Chem. Co., Cat. (21558G)）；（ｉｉ）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Pierce Chem. Co., Cat #21651G）；及び（ｉｉｉ）スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド]ヘキサノエート（Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G）を含む。
【０１７４】
上記のリンカーは、異なる属性を有する成分を含み、このため、異なる物理化学特性を有するコンジュゲートが得られる。例えば、リンカーＳＭＰＴは、立体的に妨害されるジスルフィド結合を含み、安定性が増加したコンジュゲートを形成することができる。ジスルフィド結合はインビトロで切断されることから、ジスルフィド結合は一般的に、他の結合より安定性が低く、そのためコンジュゲートはより利用できにくくなる。
【０１７５】
試薬ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩は、カルボン酸と第一級又は第二級アミンとで開始してカルボキサミドを作成するのに有用である。すなわちＥＤＣは、抗体中のリジン残基をリンカー又は毒素中のカルボン酸と連結、又は抗体中のアスパラギン酸又はグルタミン酸残基をリンカー又は毒素中のアミンと連結するのに使用してもよい。ＥＤＣを利用するこのようなコンジュゲート化反応は、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）もしくはスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−３−オキシスルホニルスクシンイミド）の添加によって強化することができる。このような結合反応へのＮＨＳ又はスルホ−ＮＨＳの添加は、コンジュゲート化反応の速度、完全性、選択性、及び／又は再現性を高めることができる。
【０１７６】
ある実施態様において、リンカーは切断可能である。ある実施態様において、リンカーは、非切断可能である。ある実施態様において、二以上のリンカーが存在する。二以上のリンカーは、例えば全て同じで、切断可能又は非切断可能であるか、又は二以上のリンカーは、例えば異なっていて、少なくとも１つが切断可能で少なくとも一つが非切断可能である。
【０１７７】
ある態様において、本明細書で提供される組成物及び方法に加えて、活性化可能抗体は、薬剤をＡＢに結合させるためのいくつかの方法のいずれかを使用してコンジュゲート化することができる：（ａ）ＡＢの炭水化物部分への結合、又は（ｂ）ＡＢのスルフヒドリル基への結合、又は（ｃ）ＡＢのアミノ基への結合、又は（ｄ）ＡＢのカルボキシレート基への結合。本発明によれば、ＡＢは、少なくとも２つの反応性基（１つはＡＢと反応し、１つは薬剤と反応する）を有する中間リンカーを介して薬剤に共有結合される。任意の適合性のある有機化合物を含んでよいリンカーは、ＡＢ（又は薬剤）との反応がＡＢの反応性と選択性に悪影響を与えないように選択することができる。さらに、薬剤へのリンカーの結合は、薬剤の活性を破壊してはならない。酸化された抗体又は酸化された抗体断片との反応に適したリンカーは、一級アミン、二級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、フェニルヒドラジン、セミカルバジド、及びチオセミカルバジド基からなる群から選択されるアミンを含有するものを含む。このような反応性官能基は、リンカーの構造の一部として存在してもよく、又はこのような反応性基を含まないリンカーの適切な化学修飾により導入してもよい。
【０１７８】
還元されたＡＢへの結合に適したリンカーは、還元された抗体又は断片スルフヒドリル基と反応できるある反応性基を有するものを含む。このような反応性基は、特に限定されるものではないが、反応性ハロアルキル基（例えば、ハロアセチル基を含む）、安息香酸ｐ-第二水銀基、及びマイケル方式付加反応の可能な基（例えば、マレイミド及びMitra and Lawton，1979，J．Amer．Chem．Soc．101:3097-3110 に記載されている種類の基を含む）を含む。
【０１７９】
酸化も還元もされていないＡＢへの結合に適したリンカーは、ＡＢ中の非修飾リジン残基中に存在する一級アミノ基と反応できるある反応性基を有するものを含む。このような反応性基は、特に限定されるものではないが、ＮＨＳカルボン酸又は炭酸エステル、スルホＮＨＳカルボン酸又は炭酸エステル、４−ニトロフェニルカルボン酸又は炭酸エステル、ペンタフルオロフェニルカルボン酸又は炭酸エステル、アシルイミダゾール、イソシアネート、及びイソチオシアネートを含む。
【０１８０】
酸化も還元もされていないＡＢへの結合に適したリンカーは、ＡＢ中のアスパラギン酸又はグルタミン酸残基中に存在するカルボン酸基と反応できるある反応性基を有するものを含み、これは適切な試薬で活性化されている。適切な活性化試薬は、ＮＨＳ又はスルホ−ＮＨＳの有無にかかわらず、ＥＤＣ、及びカルボキサミド形成のために利用される他の脱水剤を含む。これらの例では、適当なリンカー中に存在する官能基は、一級及び二級アミン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、及びヒドラジドを含むであろう。
【０１８１】
リンカーがＡＢに結合される前又は後に、薬剤をリンカーに結合させることができる。ある用途では、まずリンカーが、結合された薬剤を含まないＡＢ−リンカー中間体を生成することが望ましい場合がある。特定の用途に応じて、具体的な薬剤をリンカーに共有結合させることができる。別の実施態様において、ＡＢはまず、ＭＭ、ＣＭ、及び関連するリンカーに結合され、その後コンジュゲート化のためにリンカーに結合される。
【０１８２】
分岐鎖状リンカー：具体的な実施態様において、薬剤への結合のための複数の部位を有するリンカーが使用される。複数部位のリンカーについて、ＡＢへの単一の共有結合は、いくつかの部位で薬剤を結合できるＡＢ−リンカー中間体をもたらす。この部位は、アルデヒド又はスルフヒドリル基、又は薬剤が結合可能な任意の化学的部位であってもよい。
【０１８３】
あるいは、ＡＢ上の複数の部位での単一部位リンカーの結合により、より高い比活性（又は薬剤対ＡＢのより高い比）を達成することができる。この複数の部位は、２つの方法のいずれかによってＡＢに導入することができる。第一に、同じＡＢ内で、複数のアルデヒド基及び／又はスルフヒドリル基を生成することができる。第二に、リンカーへの以後の結合のための複数の官能性部位を有する「分岐鎖状リンカー」を、ＡＢのアルデヒド又はスルフヒドリルに結合することができる。分岐鎖状リンカー又は複数部位リンカーの官能性部位は、アルデヒド又はスルフヒドリル基であり得るか、又はリンカーが結合することができる任意の化学部位であり得る。これらの２つの手法を組合せることにより、すなわちＡＢ上のいくつかの部位で複数部位リンカーを結合させることにより、さらに高い特異的活性を得ることができる。
【０１８４】
切断可能リンカー：補体系の酵素（例えば、特に限定されるものではないが、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、トリプシン、プラスミン、又はタンパク質分解活性を有する別の酵素）による切断を受けやすいペプチドリンカーを、本発明のある実施態様において使用することができる。本発明の１つの方法によれば、薬剤は、補体による切断に感受性のリンカーを介して結合している。抗体は、補体を活性化することができるクラスから選択される。従って、抗体−薬剤コンジュゲートは、補体カスケードを活性化し、標的部位で薬剤を放出する。本発明の別の方法によれば、薬剤は、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミン、又はトリプシンなどのタンパク質分解活性を有する酵素による切断に感受性のリンカーを介して結合している。これらの切断可能なリンカーは、細胞外毒素、例えば非限定例として、表４に示す外毒素のいずれかの細胞外毒素、を含むコンジュゲート化活性化可能抗体で有用である。
【０１８５】
切断可能リンカー配列の非限定例は、表５に提供されている。
【表５】
2020098195.tif 000009
【０１８６】
さらに、薬剤は、ジスルフィド結合（例えば、システイン分子上のジスルフィド結合）を介してＡＢに結合していてもよい。多くの腫瘍が自然に高レベルのグルタチオン（還元剤）を放出するため、これは、送達部位での以後の薬剤放出により、ジスルフィド結合を還元することができる。ある特定の実施態様において、ＣＭを修飾することになる還元剤はまた、コンジュゲート化活性化可能抗体のリンカーも修飾するであろう。
【０１８７】
スペーサー要素と切断可能な要素：さらに別の実施態様において、薬剤と抗体のＡＢ間の間隔を最適化するような方法で、リンカーを構築する必要があるかもしれない。これは、一般的な構造のリンカーを使用することによって達成することができる：
Ｗ−（ＣＨ2）ｎ−でＱ
ここで、
Ｗは、−−ＮＨ−−ＣＨ2−−又は−−ＣＨ2−−である；
Ｑは、アミノ酸、ペプチドである；及び
ｎは、０〜２０の整数である。
【０１８８】
さらに別の実施態様において、リンカーは、スペーサー要素と切断可能な要素とを含むことができる。スペーサー要素は、切断要素が切断に関与する酵素に、よりアクセス可能であるように、ＡＢのコアから離れて切断可能な要素を配置するのに機能する。前述の分岐したリンカーの一部は、スペーサー要素として機能することができる。
【０１８９】
この議論を通して、薬剤へのリンカーの（又は、切断可能な要素へのスペーサー要素の、又は薬剤への切断可能な要素の）結合は、特定の様式の結合又は反応によって行われる必要はないことを理解すべきである。適切な安定性及び生物学的適合性のある生成物を提供する任意の反応が、許容可能である。
【０１９０】
血清補体とリンカーの選択：本発明の１つの方法によれば、薬剤の放出が所望される時、補体を活性化することができるクラスの抗体であるＡＢが使用される。得られたコンジュゲートは、抗原に結合する能力と補体カスケードを活性化する能力の両方を保持している。従って、本発明のこの実施態様によれば、薬剤は、切断可能なリンカー又は切断可能な要素の一端に接合され、リンカー基の他端は、ＡＢ上の特異的部位に結合される。例えば薬剤が、ヒドロキシ基又はアミノ基を有する場合、これは、それぞれエステル又はアミド結合を介して、ペプチド、アミノ酸、又は他の適切に選択されたリンカーのカルボキシ末端に結合してもよい。例えば、このような薬剤は、カルボジイミド反応を介してリンカーペプチドに結合させることができる。薬剤は、リンカーへの結合を妨げる官能基が含まれている場合、これらの干渉性官能基は、結合の前にブロックすることができ、生成物コンジュゲート又は中間体が作られると、脱ブロックされる。次に、リンカーの反対側又はアミノ末端は、直接使用されるか、又は補体を活性化することができるＡＢに結合するために、さらなる修飾後に使用される。
【０１９１】
リンカー（又はリンカーのスペーサー要素）は、任意の所望の長さでもよく、その一端は、共有結合で活性化可能抗体のＡＢ上の特定の部位に結合することができる。リンカー又はスペーサー要素の他端は、アミノ酸又はペプチドリンカーに結合させることができる。
【０１９２】
これらのコンジュゲートが補体の存在下で抗原に結合する時、薬剤をリンカーに結合させるアミド又はエステル結合が切断されるであろう。これらのコンジュゲートは、対象に投与された場合、標的部位への薬剤の送達及び放出を達成し、特に限定されないが、表４に示された薬剤、抗生物質、代謝拮抗剤、抗増殖剤などのインビボ送達のために特に有効であろう。
【０１９３】
補体活性化の無い放出のためのリンカー：標的化送達のさらに別の用途では、補体カスケードの活性化は、最終的に標的細胞を溶解させるため、補体活性化の無い薬剤の放出が望ましい。すなわちこの手法は、標的細胞を死滅させることなく薬剤の送達及び放出を達成するべき場合に有用である。標的細胞へのホルモン、酵素、コルチコステロイド、神経伝達物質、遺伝子、又は酵素のような細胞メディエーターの送達が望まれる場合、これが目標となる。血清プロテアーゼによる切断に軽度に感受性であるリンカーを介して補体を活性化することができないＡＢに薬剤を結合させることによって、これらのコンジュゲートを調製することができる。このコンジュゲートは個体に投与されると、抗原−抗体複合体が急速に形成され、一方、薬剤の切断はゆっくり発生し、こうして、標的部位での化合物の放出をもたらす。
【０１９４】
生化学的架橋剤：別の実施態様において、活性化可能抗体は、特定の生化学的架橋剤を使用して、一又は二以上の治療剤及び／又は診断薬にコンジュゲート化することができる。架橋試薬は、２つの異なる分子の官能基を結ぶ分子架橋を形成する。２つの異なるタンパク質を段階的に連結するために、望ましくないホモポリマー形成を排除するヘテロ二官能性架橋剤を使用することができる。
【０１９５】
リソソームプロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカー、例えばVａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ａｌａ、又は他のジペプチド、もまた有用である、さらに、リソソームの低ｐＨ環境で開裂可能な酸に不安定なリンカー、例えばビス−シアリルエーテルを使用することができる。他の適切なリンカーは、カテプシンに不安定な基質、特に酸性ｐＨで最適な機能を示すものが挙げられる。
【０１９６】
代表的なヘテロ二官能性架橋剤は、表６に参照される。
【表６】
2020098195.tif 000010
【０１９７】
非切断可能リンカー又は直接結合：本発明のさらに別の実施態様において、コンジュゲートは、薬剤が標的に送達されるが放出されないように設計されてもよい。これは、直接又は非切断可能リンカーを介して、ＡＢに薬剤を結合させることによって達成することができる。
【０１９８】
これらの非切断可能リンカーは、アミノ酸、ペプチド、Ｄ−アミノ酸、又は本明細書に記載の方法によりＡＢに結合させて利用することができる官能基、を含むように修飾することができる他の有機化合物を含むことができる。このような有機リンカーの一般式は次のようになるであろう：
Ｗ−（ＣＨ2）ｎ−Ｑ
ここで、
Ｗは、−−ＮＨ−−ＣＨ2−−又は−−ＣＨ2−−であり；
Ｑは、アミノ酸、ペプチドであり；及び
ｎは、０〜２０の整数である。
【０１９９】
非切断可能コンジュゲート：あるいは化合物は、補体を活性化しないＡＢに結合することができる。補体を活性化することができないのＡＢを使用する場合、この結合は、活性化された補体による切断を受けやすいリンカーを使用するか、又は活性化された補体による切断を受けにくいリンカーを使用することによって達成することができる。
【０２００】
定義：
他に定義しない限り、本発明に関連して使用される科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質及びオリゴ又はポリヌクレオチド化学、及びハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法、及び技術は、当技術分野で公知であり一般的に使用されている。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために、標準的な技術が使用される。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様に従って行われるか、又は当技術分野で一般的なように又は本明細書に記載のように達成される。前述の技術及び手順は、一般的に当技術分野で公知の従来法により行われるか、又は本明細書を通して引用され考察されている様々な一般的文献やより具体的な文献に記載されているように行われる。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))を参照されたい。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医薬及び製薬化学、に関連して使用される命名法、及びこれらの実験手順や技術は、当該分野で周知で一般的に使用されているものである。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化、及び送達、ならびに患者の治療のために、標準的な技術が使用される。
【０２０１】
本開示に従って使用されるように、以下の用語は、特に断りのない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。
【０２０２】
本明細書で使用される用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に特異的に結合（免疫反応）する抗原結合部位を含む分子を指す。「特異的に結合する」、「と免疫反応する」、又は「と免疫特異的に結合する」は、その抗体が所望の抗原の一又は二以上の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドと反応しないか、又ははるかに低い親和性（Ｋｄ＞１０-6で結合することを意味する。抗体としては、特に限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、及びＦａｂ発現ライブラリーを含む。
【０２０３】
基本的な抗体の構造単位は、テトラマーを含むことが知られている。各テトラマーは、各対が一つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成される。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。一般に、ヒトから得られる抗体分子は、分子中に存在する重鎖の性質により互いに異なるクラスである、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤのいずれかに関連する。特定のクラスには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２などのサブクラスを有する。さらに、ヒトにおいて、軽鎖はカッパ鎖又はラムダ鎖であり得る。
【０２０４】
本明細書において用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）又は「モノクローナル抗体組成物」は、１つのみの軽鎖遺伝子産物と１つのみの重鎖遺伝子産物とからなる抗体分子の１つのみの分子種を含有する抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、集団のすべての分子で同一である。ＭＡｂは、抗原に対するユニークな結合親和性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含有する。
【０２０５】
用語「抗原結合部位」又は「結合部分」は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）と軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変領域（「Ｖ」）のアミノ酸残基により形成される。重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチ（「超可変領域」）は、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」として知られている、より保存されたフランキングストレッチの間に挿入される。すなわち用語「ＦＲ」は、免疫グロブリン中の超可変領域の間に、及び隣接している、天然に存在するアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間内で互いに対して配置されて、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面に対して相補的であり、重鎖及び軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))、又はChothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)の定義に従う。
【０２０６】
本明細書において用語「エピトープ」は、免疫グロブリン、ｓｃＦｖ、又はＴ細胞受容体に特異的に結合できる任意のタンパク質決定基を含む。用語「エピトープ」は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体に特異的に結合できる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学活性表面群からなり、通常３次元構造特性ならびに特異的電荷特性を有する。例えば、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端ペプチドに対して、抗体を作成してもよい。解離定数が≦１μMの時は、抗体は抗原に特異的に結合すると言われる。ある実施態様において、解離定数は≦１００ｎＭであり、ある実施態様において、解離定数は≦１０ｎＭである。
【０２０７】
本明細書において用語「特異的結合」、「免疫学的結合」、及び「免疫学的結合特性」とは、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である抗原との間で起こるタイプの非共有相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度又は親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）で表すことができ、ここで、より小さなＫｄはより大きな親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野で周知の方法を用いて定量することができる。このような方法の一つは、抗原結合部位／抗原複合体形成及び解離の速度を測定することを伴い、ここで、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、及び両方向の速度に等しく影響を与える幾何学的パラメータに依存する。このように、「速度定数」（Ｋｏｎ）及び「オフ速度定数」（Ｋｏｆｆ）の両方とも、濃度、及び会合及び解離の実際の速度を計算することによって決定することができる。（Nature 361:186-87 (1993)参照）。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比率は、親和性に関連しないすべてのパラメータの解除を可能にし、解離定数Ｋｄに等しい。（一般的には、Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473を参照）。本発明の抗体は、放射性リガンド結合アッセイ又は当業者に公知の類似のアッセイなどのアッセイによって測定して、解離定数（Ｋｄ）が≦１μＭである時は、標的に特異的に結合すると言われる。ある実施態様において、Ｋｄは≦１００ｎＭである。ある実施態様において、Ｋｄは≦１０ｎＭである。ある実施態様において、Ｋｄは≦１ｎＭである。ある実施態様において、Ｋｄは≦１００ｐＭ〜約１ｐＭである。
【０２０８】
本明細書で提供される組成物と方法は、活性化可能抗体の活性（例えば、マスキング、活性化、又は結合活性）を犠牲にすることなく、ＡＢ中の一又は二以上のシステイン残基への、一又は二以上の薬剤の結合を可能にする。
【０２０９】
本明細書において用語「単離されたポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、又は合成起源のポリヌクレオチド、又はこれらの一部の組合せを意味するものであり、その起源により、「単離されたポリヌクレオチド」は、（１）ポリヌクレオチドのすべて又は一部に結合しておらず、「単離されたポリヌクレオチド」は天然に存在しない、（２）ポリヌクレオチドに機能的に結合しているが、これは天然には結合していない、又は（３）より大きな配列の一部として天然には存在しない。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の重鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子、及び本明細書に記載の軽鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を含む。
【０２１０】
本明細書で参照される用語「単離されたタンパク質」は、ｃＤＮＡ又は組換えＲＮＡから発現されるタンパク質、又は合成起源タンパク質、又はこれらの一部の組合せを意味するものであり、その起源又は由来により、「単離されたタンパク質」は、（１）天然に存在するタンパク質と結合していない、（２）同じ起源の他のタンパク質を含まない、（３）異なる種からの細胞により発現される、又は（４）天然には存在しない。
【０２１１】
本明細書において用語「ポリペプチド」は、ポリペプチド配列の未変性のタンパク質、断片、又は類似体を指す一般用語として本明細書で使用される。従って、天然のタンパク質、断片、及び類似体は、ポリペプチド属の種である。本発明のポリペプチドは、本明細書に示される重鎖免疫グロブリン分子、本明細書に示される軽鎖免疫グロブリン分子、ならびに重鎖免疫グロブリン分子と軽鎖免疫グロブリン分子（例えば、カッパ軽鎖免疫グロブリン分子）、及びその逆、とを含む組合せにより形成される抗体分子、その断片、及び類似体を含む。
【０２１２】
本明細書で使用される対象に適用される「天然に存在する」という用語は、その対象が天然に見出され得るという事実を指す。例えば、天然の起源から単離することができ、実験室などでヒトにより意図的に修飾されていない、ある生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【０２１３】
本明細書において用語「機能的に結合している」という用語は、そのように記載された成分の位置が、それらの意図された方法で機能することを可能にする関係にあることを指す。コード配列に「機能的に結合している」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるように連結されている。
【０２１４】
本明細書において用語「制御配列」は、これらが連結されるコード配列の発現及びプロセシングをもたらすのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。このような制御配列の性質は宿主生物によって異なる。原核生物と真核生物では、このような制御配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、及び転写停止配列を含む。用語「制御配列」は、その存在が発現及びプロセシングに必須であり、また、その存在が有利である付加的な構成要素、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列を含むことができるすべての構成要素を、最低限含むことが意図される。本明細書で言及される「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０塩基長のヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドのいずれか）、又はヌクレオチドのいずれかのタイプの修飾された形態を意味する。この用語は、ＤＮＡの一本鎖及び二本鎖形態を含む。
【０２１５】
本明細書において用語オリゴヌクレオチドは、天然に存在する、及び天然に存在しないオリゴヌクレオチド結合により一緒に連結された、天然に存在する修飾されたヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般的に２００塩基以下の長さを含むポリヌクレオチドサブセットである。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは長さが１０〜６０塩基である。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０〜４０塩基である。オリゴヌクレオチドは、例えばプローブ用に、通常１本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、例えば遺伝子変異体の作製で使用するために、２本鎖でもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０２１６】
本明細書で参照される用語「天然に存在するヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含む。本明細書で参照される用語「修飾ヌクレオチド」は、修飾されたか又は置換された糖基などを有するヌクレオチドを含む。本明細書で参照される用語「オリゴヌクレオチド結合」は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレルロエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、ホスホロンミデートなどのオリゴヌクレオチド結合を含む。例えば、LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. U.S. Patent No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)を参照されたい。所望であれば、オリゴヌクレオチドは、検出用の標識を含むことができる。
【０２１７】
本明細書において、２０個の慣用アミノ酸及びその略語は、以下の使用法に従う。Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991))を参照されたい。２０個の慣用アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えばα−，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の非通常アミノ酸もまた、本発明のポリペプチドに適した成分であり得る。非慣用アミノ酸の例には、４ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、α−Ｎ−メチルアルギニン、及び類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）がある。本明細書で使用されるポリペプチド表記では、標準用法及び慣例に従って、左手方向がアミノ末端方向で、右手方向はカルボキシ末端方向である。
【０２１８】
同様に、特に明記しない場合は、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は５’方向と言われる。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’方向への付加は、転写方向と呼ばれる。ＲＮＡと同じ配列を有し、そのＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は「上流配列」と呼ばれる。ＲＮＡと同じ配列を有し、そのＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は「下流配列」と呼ばれる。
【０２１９】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的同一性」は、例えば、デフォルトギャップ重み付けを使用して、プログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴにより、最適に整列された２つのペプチド配列が、少なくとも８０％の配列同一性を共有することを意味する。いくつかの実施態様において、２つのペプチド配列は少なくとも９０％の配列同一性を共有する。いくつかの実施態様において、２つのペプチド配列は少なくとも９５％の配列同一性を共有する。いくつかの実施態様において、２つのペプチド配列は少なくとも９９％の配列同一性を共有する。
【０２２０】
いくつかの実施態様において、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
【０２２１】
本明細書において考察されるように、抗体又は免疫グロブリン分子のアミノ酸配列における小さな変化は、本発明に包含されるものとして意図され、アミノ酸配列のこの変化が、参照配列に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を維持することを提供している（例えば、野生型配列）。いくつかの実施態様において、アミノ酸配列の変化は、参照配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸同一性を維持する。特に、保存的アミノ酸置換が意図される。保存的置換は、その側鎖が関連しているアミノ酸ファミリー内で起こるものである。遺伝的にコードされるアミノ酸は、一般的にファミリーに分類される：（１）酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸であり、（２）塩基性アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジンであり、（３）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、（４）非荷電極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、及びスレオニンを含む。疎水性アミノ酸は、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、及びバリンを含む。アミノ酸の他のファミリーは、（Ｉ）脂肪族−ヒドロキシファミリーである、セリン及びスレオニン、（ｉｉ）アミド含有ファミリーである、アスパラギン及びグルタミン、（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーである、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン；及び（ｉｖ）芳香族ファミリーである、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンを含む。例えば、イソロイシン又はバリンによるロイシンの孤立置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の孤立置換、セリンによるスレオニンの孤立置換、又は構造的に関連したアミノ酸によるアミノ酸の類似の置換が、例えば、置換が、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は他の可変領域内のアミノ酸を含まない場合に、生じる分子の結合性又は他の特性に大きな影響を与えないと予測するのは妥当である。アミノ酸の変化が機能性ペプチドを発生させるかどうかは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。アッセイは、本明細書に詳細に記載されている。抗体又は免疫グロブリン分子の断片又は類似体は、当業者によって容易に調製することができる。いくつかの実施態様において、断片又は類似体のアミノ末端及びカルボキシ末端は、機能ドメインの境界近くに存在する。構造ドメイン及び機能ドメインは、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データを、公的又は独自の配列データベースと比較することによって同定することができる。いくつかの実施態様において、配列モチーフ又は既知の構造及び／又は機能の他のタンパク質において生じる予測されるタンパク質コンフォメーションドメインを同定するために、コンピュータ化された比較法が使用される。既知の三次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を同定するための方法が知られている。Bowie et al. Science 253:164 (1991)。こうして前述の例は、当業者が、本発明に従った構造的及び機能的ドメインを定義するために使用することができる配列モチーフと構造的コンホメーションを認識できることを証明する。
【０２２２】
いくつかの実施態様において、アミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を減少させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる、（４）このような類似体の他の物理化学的又は機能的特性を付与するか又は変化させる、ものである。類似体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々なムテインを含むことができる。例えば、単一又は複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を、天然に存在する配列中（例えば、分子間接触を形成するドメインの外側のポリペプチドの部分）に作成することができる。保存的アミノ酸置換は、実質的に親配列の構造的特徴を変化させてはならない（例えば、置換アミノ酸は、親配列中に存在するらせんを破壊する傾向があっても、又は親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊してもならない）。当技術分野で認識されているポリペプチドの二次及び三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H.  Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J.  Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); and Thornton et at. Nature 354:105 (1991)に記載されている。
【０２２３】
本明細書において用語「ポリペプチド断片」は、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失、及び／又は１つ以上の内部欠失（複数可）を有するが、残りのアミノ酸配列は、例えば完全長ｃＤＮＡ配列からの、推定される天然に存在する配列中の対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。断片は典型的には、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０アミノ酸の長さである。いくつかの実施態様において、断片は少なくとも１４アミノ酸長である抗体断片である。いくつかの実施態様において、断片は少なくとも２０アミノ酸長であるＡＢの断片である。いくつかの実施態様において、断片は少なくとも５０アミノ酸長であるＡＢの断片である。いくつかの実施態様において、断片は少なくとも７０アミノ酸長であるＡＢの断片である。本明細書において用語「類似体」は、推定アミノ酸配列の一部と実質的な同一性を有し、かつ適切な結合条件下で標的への特異的結合を有する、少なくとも２５アミノ酸のセグメントから構成されているポリペプチドを指す。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然に存在する配列に関して保存的アミノ酸置換（又は付加もしくは欠失）を含む。類似体は典型的には、少なくとも２０アミノ酸長であり、いくつかの実施態様において、少なくとも５０アミノ酸長又はそれ以上であり、しばしば完全長の天然に存在するポリペプチドと同じ長さでもよい。
【０２２４】
本明細書において用語「薬剤」は、化合物、化合物の混合物、生体高分子、又は生体物質から作製された抽出物を示すために使用される。
【０２２５】
本明細書において用語「標識」又は「標識された」は、例えばマークされた抗ビオチン抗体又はアビジン（例えば、光学的又は熱量分析法によって検出できる蛍光マーカー又は酵素活性を含有する抗ビオチン抗体又はストレプタビジン）によって検出できるビオチニル部分のポリペプチドへの、放射能標識アミノ酸の組み込み又は結合による、検出可能なマーカーの組み込みを指す。特定の状況では、標識又はマーカーは、治療的となることができる。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で公知であり、使用されてもよい。ポリペプチドの標識の例には、特に限定されないが、以下を含む：放射性同位体又は放射性核種（例えば、3Ｈ、14Ｃ、15Ｎ、35Ｓ、90Ｙ、99Ｔｃ、111Ｉｎ、125Ｉ、131Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）、化学発光物、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施態様において、標識は、潜在的な立体障害を減少させるために、様々な長さのスペーサーアームによって結合される。本明細書において用語「薬剤又は薬物」は、患者に適切に投与された場合に所望の治療効果を誘導することができる、化合物又は組成物を指す。
【０２２６】
本明細書において用語「薬剤」は、例えば医薬品、治療薬、又は薬理学的化合物を含む、元素、化合物、薬剤、又は分子実体を意味する。薬剤は、天然又は合成又はこれらの組み合わせであることができる。「治療薬」は、単独で又は別の薬剤（プロドラッグと組合せたプロドラッグ変換酵素）との組み合わせのいずれかで、癌細胞又は免疫細胞（活性化免疫細胞）に対して、治療（例えば、有益な）効果を発揮する薬剤である。典型的には、本明細書に記載される方法及び組成物の有用な治療薬は、細胞毒性、細胞増殖抑制又は免疫抑制効果を発揮するものである。いくつかの実施態様において、薬剤は、放射性要素ではない。薬物は、チオール含有薬剤であることができ、及び／又は薬剤は、一又は二以上のチオール基を含むように遺伝子操作することができる。
【０２２７】
「細胞毒性剤」は、細胞に対する薬剤の効果に関連して、細胞を死滅させることを意味する。「細胞増殖抑制剤」は、細胞増殖の阻害を意味する。
【０２２８】
抗体の文脈における用語「鎖間ジスルフィド結合」は、２つの重鎖間又は重鎖と軽鎖間とのジスルフィド結合を指す。
【０２２９】
用語「鎖間チオール」は、鎖間ジスルフィド結合の形成に関与することができる抗体の重鎖又は軽鎖のチオール基を指す。
【０２３０】
特定の種類及び／又は類似の反応性の全てのコンジュゲート化の点が薬剤に結合して、タンパク質−薬剤コンジュゲートの均質な集団を生じる時、タンパク質は「完全にロードされている」と言われる。特定の種類及び／又は類似の反応性の、可能なコンジュゲート化の点の一部のみが薬剤に結合して、タンパク質−薬剤コンジュゲートのいくつかの異性体を生じる時、タンパク質は「部分的にロードされている」と言われる。
【０２３１】
本明細書において他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))によって例示されるように、当分野で慣用の用法に従って使用されている。
【０２３２】
本明細書において「実質的に純粋な」は、対象種が存在する主な種（すなわち、モル基準で、組成物中の他の個々の種よりも豊富である）であることを意味し、そしていくつかの実施態様において、実質的に精製された画分は、対象種が存在する全ての高分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を含む組成物である。
【０２３３】
一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の約８０％超を含み、いくつかの実施態様において、約８５％、９０％、９５％、９９％超を含むであろう。いくつかの実施態様において、対象種は基本的に均質に精製され（従来の検出方法によって、組成物中に汚染物質種が検出できない）、ここで組成物は本質的に単一の高分子種からなる。
【０２３４】
患者という用語は、ヒト及び動物の対象を含む。これは、対象及び患者という用語が本明細書において交換可能に使用されることを、理解するべきである。
【０２３５】
活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の使用
キット、及び／又は本開示の方法で用いられる活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、生体試料中の少なくとも１つの標的に特異的である。生体試料は、例えば、新鮮な細胞試料、凍結細胞試料、新鮮な組織試料、及び／又は凍結組織試料である。いくつかの実施態様において、試料は、癌又は他の腫瘍性状態に罹患しているか、罹患しているリスクがあるか、又は罹患していると疑われる患者からのものである。いくつかの実施態様において、試料は、炎症性疾患に罹患しているか、罹患しているリスクがあるか、又は罹患していると疑われる患者からのものである。いくつかの実施態様において、試料は、自己免疫疾患に罹患しているか、罹患しているリスクがあるか、又は罹患していると疑われる患者からのものである。いくつかの実施態様において、試料は、線維性疾患に罹患しているか、罹患しているリスクがあるか、又は罹患していると疑われる患者からのものである。いくつかの実施態様において、試料は、難聴に罹患しているか、罹患しているリスクがあるか、又は罹患していると疑われる患者からのものである。
【０２３６】
試料が、あるか、又は癌に罹患しているか、罹患しているリスクがあるか、又は罹患していると疑われる患者からのものである場合、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して特異的な活性化可能抗体、及び／又はＥＧＦＲに対して特異的なコンジュゲート化活性化可能抗体は、方法及び／又はキットに有用である。いくつかの実施態様において、癌は乳癌であり、例えば非限定例として、乳癌は三重陰性乳癌である。いくつかの実施態様において、癌は三重陰性乳癌である。いくつかの実施態様において、癌は結腸直腸癌である。いくつかの実施態様において、癌は胃癌である。いくつかの実施態様において、癌は神経膠芽腫である。いくつかの実施態様において、癌は頭頸部癌、例えば非限定例として、食道癌である。いくつかの実施態様において、癌は食道癌である。いくつかの実施態様において、癌は肺癌であり、例えば非限定例として、非小細胞肺癌を介して、例えば、肺癌であり、例えば非限定例として、非小細胞肺癌である。いくつかの実施態様において、癌は非小細胞肺癌である。いくつかの実施態様において、癌は卵巣／子宮内膜癌である。いくつかの実施態様において、癌は卵巣癌である。いくつかの実施態様において、癌は子宮内膜癌である。いくつかの実施態様において、癌は膵臓癌である。いくつかの実施態様において、癌は前立腺癌である。いくつかの実施態様において、癌は腎臓癌である。いくつかの実施態様において、癌は肉腫であり、例えば非限定例として、骨肉腫である。いくつかの実施態様において、癌は骨肉腫である。いくつかの実施態様において、癌は皮膚癌であり、例えば非限定例として、扁平上皮癌、基底細胞癌、及び／又は黒色腫である。いくつかの実施態様において、癌は扁平上皮癌である。いくつかの実施態様において、癌は基底細胞癌である。いくつかの実施態様において、癌は黒色腫である。
【０２３７】
試料が、あるか、又は炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患に罹患しているか、罹患しているリスクがあるか、又は罹患していると疑われる患者からのものである場合、ＥＧＦＲに対して特異的な活性化可能抗体、及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、方法及び／又はキットに有用である。いくつかの実施態様において、炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患は乾癬である。
【０２３８】
試料が、あるか、又は癌に罹患しているか、罹患しているリスクがあるか、又は罹患していると疑われる患者からのものである場合、Jagged標的、例えばJagged 1及び／又はJagged 2に対して特異的な活性化可能抗体、及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、方法及び／又はキットに有用である。いくつかの実施態様において、癌は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含む白血病、多発性骨髄腫を含むリンパ芽球性疾患、及び肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌を含む固形腫瘍、及び三重陰性乳癌を含む乳癌である。
【０２３９】
いくつかの実施態様において、癌は乳癌であり、非限定例として、ＥＲ／ＰＲ＋乳癌、ＨＥＲ２＋乳癌、三重陰性乳癌を含む。いくつかの実施態様において、癌は、結腸直腸癌である。いくつかの実施態様において、癌は胃癌である。いくつかの実施態様において、癌は神経膠芽腫である。いくつかの実施態様において、癌は頭頸部癌である。いくつかの実施態様において、癌は肺癌であり、例えば非限定例として、非小細胞肺癌を含む。いくつかの実施態様において、癌は多発性骨髄腫である。いくつかの実施態様において、癌は卵巣癌である。いくつかの実施態様において、癌は膵臓癌である。いくつかの実施態様において、癌は前立腺癌である。いくつかの実施態様において、癌は肉腫である。いくつかの実施態様において、癌は腎臓癌であり、例えば非限定例として、腎細胞癌である。いくつかの実施態様において、癌は皮膚癌であり、例えば非限定例として、扁平上皮癌、基底細胞癌、黒色腫を含む。
【０２４０】
試料が、あるか、又は、原発性腫瘍起源に関係なく癌の骨疾患又は転移に罹患しているか、罹患しているリスクがあるか、又は罹患していると疑われる患者からのものである場合、Jagged標的、例えばJagged 1及び／又はJagged 2に対して特異的な活性化可能抗体、及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、方法及び／又はキットに有用である。
【０２４１】
試料が、あるか、又は繊維性疾患に罹患しているか、罹患しているリスクがあるか、又は罹患していると疑われる患者からのものである場合、Jagged標的、例えばJagged 1及び／又はJagged 2に対して特異的な活性化可能抗体、及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、方法及び／又はキットに有用である。いくつかの実施態様において、線維性疾患は、腎臓、肝臓、肺、及び皮膚の線維性疾患である。いくつかの実施態様において、線維性疾患は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）などの線維性障害である。いくつかの実施態様において、線維性疾患は腎臓線維症である。いくつかの実施態様において、線維性疾患は肝線維症である。いくつかの実施態様において、線維性疾患は、腹膜透析誘発性線維症である。いくつかの実施態様において、線維性疾患は強皮症である。
【０２４２】
試料が、あるか、又は難聴に罹患しているか、罹患しているリスクがあるか、又は罹患していると疑われる患者からのものである場合、Jagged標的、例えばJagged 1及び／又はJagged 2に対して特異的な活性化可能抗体、及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、方法及び／又はキットに有用である。
【０２４３】
試料が、あるか、又は癌に罹患しているか、罹患しているリスクがあるか、又は罹患していると疑われる患者からのものである場合、インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に対して特異的な活性化可能抗体、及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、方法及び／又はキットに有用である。いくつかの実施態様において、癌は乳癌であり、特に限定されないが、三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）を含む。いくつかの実施態様において、癌はキャッスルマン病である。いくつかの実施態様において、癌は肝細胞癌である。いくつかの実施態様において、癌は肺癌である。いくつかの実施態様において、癌は多発性骨髄腫である。いくつかの実施態様において、癌は卵巣癌である。いくつかの実施態様において、癌は前立腺癌である。
【０２４４】
試料が、あるか、又は炎症及び／又は炎症性疾患に罹患しているか、罹患しているリスクがあるか、又は罹患していると疑われる患者からのものである場合、ＩＬ−６Ｒに対して特異的な活性化可能抗体、及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、方法及び／又はキットに有用である。いくつかの実施態様において、疾患又は障害は自己免疫疾患である。
【０２４５】
また、本発明の活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の使用は、適切な担体、賦形剤、及び改善された輸送、送達、耐性などを提供するために製剤に組み込まれている他の薬剤と共に、行われるであろうことが理解されよう。適切な製剤の多くは、すべての製薬化学者に知られている公定書であるRemington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975))の、特にChapter 87 by Blaug, Seymourで見つけることができる。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油及び油中水エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカーボワックスを含む半固体混合物が含まれる。任意の上記混合物は、本発明の処置、治療及び／又は診断に適切であり得るが、ただし、製剤中の活性成分が製剤によって不活性化されておらず、製剤が生理学的に適合し、投与経路に許容されることを条件とする。また、製薬化学者に知られている製剤、賦形剤及び担体に関連する追加情報については、Baldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.” Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.” Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.” J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)、及びその中の引用を参照されたい。
【０２４６】
コンジュゲート化活性化可能抗体を含む本発明の製剤は、標的の異常な発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害を、診断、ステージ分類、又は分析するために使用される。例えば、本発明の製剤は、癌又は他の新生物症状を検出又は分析するために使用される。
【０２４７】
いくつかの実施態様において、製剤は、ＥＧＦＲの異常な発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害を、検出するか又は他の方法で分析するために使用される。いくつかの実施態様において、製剤は、Jagged標的、例えばJagged 1及び／又はJaggedの異常な発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害を、検出するか又は分析するために使用される。いくつかの実施態様において、製剤は、ＩＬ−６Ｒの異常な発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害を、検出するか又は分析するために使用される。
【０２４８】
診断、ステージ分類及び／又は他の分析は、異常な標的の発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害を診断又は治療するための任意の公知の方法に関連して決定される。
【０２４９】
活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、医薬組成物を含む組成物の形態で、開示の方法及び／又はキットに使用することができる。このような組成物の調製における原理及び考慮点、ならびに成分の選択における指針は、例えばRemington : The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; and Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New Yorkに提供されている。
【０２５０】
活性化可能抗体断片の一実施態様は、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の断片である。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、ペプチド分子は、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するように設計することができる。このようなペプチドは、化学的に合成し、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。［例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)参照］。また製剤は、検出されるか又は分析される特定の徴候に必要な一又は二以上の活性化合物、例えば互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するもの、を含有することもできる。あるいは又はさらに、組成物は、その機能を増強する薬剤を含むことができる。このような分子は、意図する目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
【０２５１】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術により又は界面重合、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース、又はゼラチン−マイクロカプセル、及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルにより、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）により調製されるマイクロエマルジョン中に、又はマクロエマルジョン中に捕捉されうる。
【０２５２】
インビボ投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
【０２５３】
いくつかの実施態様において、活性化可能抗体は、検出可能な標識を含む。無傷の抗体又はその断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、又はＦ（ａｂ）２）が使用される。プローブ又は抗体に関して「標識された」という用語は、プローブ又は抗体に検出可能な物質を結合（すなわち、物理的に連結）させることによる、プローブ又は抗体の直接標識、ならびに、直接標識される別の試薬との反応性による、プローブ又は抗体の間接標識、を包含することを意図している。間接標識の例には、蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるように、蛍光標識二次抗体及びビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識を使用する一次抗体の検出を含む。用語「生体試料」は、対象から単離された組織、細胞、及び対象から単離された生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞及び体液を含むことが意図される。従って用語「生体試料」の使用の範囲内に含まるのは、血液、及び血清、血漿、又はリンパ液を含む血液の画分又は成分である。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロならびにインビボで、生体試料中のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを検出するのに使用することができる。例えば、分析物タンパク質の検出のためのインビトロ技術は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降、免疫染色、及び免疫蛍光が含まれる。免疫測定法を実施するための方法は、例えばELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology”, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; “Immunoassay”, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996;及び “Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載されている。さらに分析物タンパク質の検出のためのインビボ技術は、対象への標識された抗分析物タンパク質抗体の導入が挙げられる。例えば、抗体は、対象におけるその存在及び位置が標準イメージング技術により検出することができる放射性マーカーで標識することができる。
【０２５４】
診断適応症
活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、患者試料中の標的の検出に有用であり、従って診断薬として有用である。例えば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、患者試料中の標的のレベルを検出するためのインビトロアッセイ、例えばＥＬＩＳＡで使用される。いくつかの実施態様において、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、患者試料、例えば組織中の標的レベルを検出するために、インサイチュアッセイ、例えば本明細書に開示されるインサイチュイメージングで使用される。いくつかの実施態様において、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、患者又は患者の試料、例えば器官又は組織中の標的レベルを検出するために、本明細書に開示されるものなどのエクスビボアッセイで使用される。本明細書に開示されるいくつかの実施態様において、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、患者中の標的レベルを検出するために、インビボアッセイ、例えばインビボイメージングで使用される。これらの実施態様のいずれにおいても、対象は、例えば表１に列記したもの、又はそれらの任意の組み合わせからの標的である。
【０２５５】
ある実施態様において、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、固体支持体（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）上に固定化される。固定化された活性化可能抗体及び／又は固定化されたコンジュゲート化活性化可能抗体は、試験試料中に存在し得る任意の標的に対する捕捉抗体としての役割を果たす。固定化した抗体を患者試料に接触させる前に、固体支持体は洗浄され、分析物の非特異的吸着を防止するために、乳タンパク質又はアルブミンなどのブロッキング剤で処理される。
【０２５６】
次に、ウェルは、抗原を含有する疑いのある試験試料で、又は抗原の標準量を含有する溶液で処理される。このような試料は、例えば病状の診断と見なされる抗原の循環レベルを有することが疑われる対象からの血清試料である。試験試料又は標準物質を洗い流した後、固体支持体は、検出可能に標識された二次抗体で処理される。標識された二次抗体は検出抗体として機能する。検出可能な標識のレベルが測定され、試験試料中の標的の濃度が、標準試料から作成した標準曲線との比較によって決定される。
【０２５７】
インビトロ診断アッセイにおいて活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体を用いて得られた結果を基準にして、標的の発現レベルに基づいて、対象の疾患をステージ分類することが可能であることが理解されよう。所定の疾患のために、疾患の進行の様々な段階にあるか、及び／又は疾患の治療的処置における様々な時点にあると診断された対象から、生体試料が採取される。進行又は治療の各段階について統計的に有意な結果を提供する試料の集団を用いて、各段階の特徴と見なすことができる抗原の濃度範囲が指定される。
【０２５８】
活性化可能抗体及び／又は結合活性化可能抗体はまた、診断及び／又はイメージング法で使用することができる。いくつかの実施態様において、このような方法はインビトロ法である。いくつかの実施態様において、このような方法はインビボ法である。いくつかの実施態様において、このような方法はインサイチュ法である。いくつかの実施態様において、このような方法はエクスビボ法である。例えば、酵素的に切断可能なＣＭを有する活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、ＣＭを切断できる酵素の存在又は非存在を検出するために使用することができる。このような活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、宿主生物の所定の細胞又は組織中の活性化抗体（すなわち、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の切断から試薬抗体）測定の蓄積を介する、酵素活性（又は、いくつかの実施態様において、ジスルフィド結合の還元を提供することができる上昇した還元可能性の環境）のインビボ検出（例えば、定性的又は定量的）を含むことができる診断薬に使用することができる。活性化された抗体のこのような蓄積は、組織が、酵素活性（ＣＭの性質に応じて上昇した還元可能性）を発現することを示しているだけでなく、組織が、活性化抗体が結合する標的を発現することも示す。
【０２５９】
例えばＣＭは、腫瘍の部位に、生物学的に閉じ込められた部位のウイルス又は細菌感染の部位（例えば、膿瘍、臓器などの部位）に存在するプロテアーゼに対するプロテアーゼ基質として選択することができる。ＡＢは、標的抗原に結合するものであることができる。当業者に周知の方法を用いて、検出可能な標識（例えば、蛍光標識又は放射能標識又は放射性トレーサー）を、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体のＡＢ又は他の領域に結合することができる。適切な検出可能な標識は、上記のスクリーニング方法の文脈で説明されており、付加的な具体例は以下に提供される。疾患状態のタンパク質又はペプチドに特異的なＡＢを、目的の疾患組織においてその活性が上昇しているプロテアーゼと共に用いると、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、ＣＭ特異的酵素が、検出可能なレベルで存在しないか、又は疾患組織より低いレベルで存在するか、又は不活性（例えば、チモーゲン方又は阻害剤との複合体で）である組織と比較して、疾患組織への結合率の上昇を示すであろう。小タンパク質及びペプチドは、急速に腎臓濾過システムによって血液から除去されるため、及びＣＭに特異的な酵素は、検出可能なレベルで存在していないため（又は、非疾患組織においてより低いレベルで存在するか、又は不活性なコンフォメーションで存在するため）、疾患組織における活性化抗体の蓄積は、非疾患組織に比較して強化されている。
【０２６０】
別の例では、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、試料中の切断剤の存在又は非存在を検出するのに使用することができる。例えば、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体が、酵素により切断されやすいＣＭを含む場合、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、試料中酵素の存在を検出（定性的又は定量的のいずれか）するために使用することができる。別の例では、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体が、還元剤により切断されやすいＣＭを含有する場合、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、試料中の還元条件を検出（定性的又は定量的のいずれか）するために使用することができる。これらの方法で分析を容易にするために、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、検出可能になるように標識することができ、支持体（例えば、スライド又はビーズなどの固体支持体）に結合することができる。検出可能な標識は、切断後に放出されない活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の一部の上に配置することができ、例えば、検出可能な標識は、切断が起こるまで検出できないクエンチ蛍光標識又は他の標識であってもよい。アッセイは、例えば、固定化された検出可能に標識された活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体に、酵素及び／又は還元剤を含むことが疑われる試料を、切断が発生するために十分な時間接触させ、次に過剰な試料及び汚染物質を洗浄して除去することにより行うことができる。次に、試料中の切断剤（例えば、酵素又は還元剤）の存在又は非存在は、試料と接触する前の活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の検出可能なシグナルの変化により、例えば、試料中の切断剤による活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体の切断による検出可能なシグナルの存在及び／又は上昇により、評価される。
【０２６１】
このような検出方法はまた、切断された時に活性化可能抗体のＡＢを結合することができる標的の存在又は非存在の検出を提供するように適合させることもできる。すなわちアッセイは、切断剤の存在又は非存在を及び目的の標的の存在又は非存在を評価するために適合させることができる。切断剤の存在又は非存在は、上記のように活性化可能抗体の検出可能な標識の存在及び／又は増加によって検出することができ、標的の存在又は非存在は、検出可能に標識された抗標的抗体の使用により、標的−ＡＢ複合体を検出することによって検出することができる。
【０２６２】
活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、例えばプロテアーゼ切断による、及び特定の標的への結合による、活性化可能抗体の活性化の検証のためのインサイチュイメージングにおいても有用である。インサイチュイメージングは、細胞培養物又は組織切片などの生体試料中のタンパク質分解活性と標的の局在化を可能にする技術である。この技術を使用して、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）の存在に基づいて、指定された標的への結合及びタンパク質分解活性の両方を確認することができる。
【０２６３】
これらの技術は、疾患部位（例えば、腫瘍組織）又は健常組織に由来する任意の凍結細胞や組織に有用である。これらの技術はまた、新鮮な細胞又は組織試料で有用である。
【０２６４】
これらの技術では、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体は、検出可能な標識で標識される。検出可能な標識は、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Alexa Fluor（登録商標）色素、ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、近赤外（ＮＩＲ）色素（例えば、Qdot（登録商標）ナノクリスタル）、コロイド金属、ハプテン、放射性マーカー、ビオチンとストレプトアビジンなどの増幅試薬、又は酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリ性ホスファターゼ）でもよい。
【０２６５】
いくつかの実施態様において、検出可能な標識は生物発光標識である。生物発光標識は、放出可能なリンカーを介して、活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施態様において、放出可能リンカーは、切断可能なリンカーである。いくつかの実施態様において、放出可能リンカーは、非切断可能なリンカーである。適切な切断可能リンカーは、本明細書に記載の切断可能リンカー及び当業者に公知の他のリンカーのいずれかを含む。適切な非切断可能リンカーは、本明細書に記載の切断可能リンカー及び当業者に公知の他のリンカーのいずれかを含む。いくつかの実施態様において、放出可能リンカーは、ジスルフィド結合である。
【０２６６】
いくつかの実施態様において、検出可能な標識は、Ｄ−ルシフェリン基質である。Ｄ−ルシフェリンは、ルシフェラーゼによって触媒されるＡＴＰ依存性生物発光反応において基質として作用する。すなわち、Ｄ−ルシフェリンは、活性化可能抗体に結合することができ、活性化可能抗体の活性化、受容体への結合、及びインターナリゼーション後にのみ、生物発光を生成する。すなわち、コンジュゲート化活性化可能抗体のこれらの実施態様は、消光剤分子の使用を必要としない。
【０２６７】
Ｄ−ルシフェリンは、放出可能なリンカーを介して活性化可能抗体にコンジュゲート化される。いくつかの実施態様において、放出可能リンカーは切断可能なリンカーである。適切な切断可能なリンカーは、本明細書に記載の切断可能なリンカーのいずれかを含む。いくつかの実施態様において、放出可能リンカーはジスルフィド結合である。
【０２６８】
いくつかの実施態様において、検出可能な標識はルシフェラーゼである。すなわち、反応は、Ｄ−ルシフェリン基質の注入時に発生する。この反応は内因性のルシフェラーゼの存在を必要としないため、この手法は有利である。さらに、反応はより強いシグナルになり、ルシフェラーゼは何百ものＤ−ルシフェリン分子を活性化できるであろうが、１つのルシフェリン分子が１つの反応のみをもたらす。
【０２６９】
ルシフェラーゼは、放出可能なリンカーを介して、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体にコンジュゲート化される。いくつかの実施態様において、放出可能リンカーは切断可能なリンカーである。適切な切断可能なリンカーは、本明細書に記載の切断可能なリンカーのいずれかを含む。いくつかの実施態様において、放出可能リンカーはジスルフィド結合である。
【０２７０】
標識された活性化可能抗体とインキュベートされた試料中の標識の検出は、試料が標的を含有し、活性化可能抗体及び／又はコンジュゲート化活性化可能抗体のＣＭに特異的なプロテアーゼを含有することを示す。いくつかの実施態様において、プロテアーゼの存在は、本明細書に記載のもののような広域スペクトルプロテアーゼ阻害剤を使用して、及び／又はプロテアーゼに特異的な薬剤、例えばプロテアーゼマトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）に特異的であり、ＭＴ−ＳＰ１のタンパク質分解活性を阻害するＡ１１のような抗体を使用して、確認することができる。例えば国際公開番号ＷＯ２０１０／１２９６０９号（２０１０年１１月１１公開）パンフレットを参照。本明細書に記載のものなどの広域スペクトルプロテアーゼ阻害剤を使用する、及び／又はより選択的な阻害剤を使用する同じ手法は、活性化可能抗体のＣＭに特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼ群を同定するために使用することができる。いくつかの実施態様において、標的の存在は、標的に特異的な薬剤、例えば別の抗体を用いて確認することができ、又は検出可能な標識は、非標識標的と競合することができる。いくつかの実施態様において、標識されていない活性化可能抗体は、標識された二次抗体又はより複雑な検出システムによる検出とともに、使用することができるであろう。
【０２７１】
コンジュゲート化活性化可能抗体が生物発光標識を含む実施態様において、これらのコンジュゲート化活性化可能抗体は、コンジュゲート化活性化可能抗体の活性化を追跡するインビボ方法のために有用である。これらのインビボイメージング方法の例示的な実施態様は、図１５に示されている、これらの方法において、活性化可能抗体は、放出可能な、例えば切断可能なリンカーを介して、一又は二以上のイメージング試薬とコンジュゲート化される。コンジュゲート化活性化可能抗体の活性化、受容体結合、及びインターナリゼーションの後、イメージング試薬は放出される。エントリ後に放出されるイメージング剤の各分子は、インビボで活性化可能抗体の活性化のリアルタイム定量を可能にする測定可能な信号を生成する。このように、イメージング試薬コンジュゲート化活性化可能抗体は、活性化部位への活性化可能抗体の標的化送達のためのマーカーとして有用である。
【０２７２】
いくつかの実施態様において、活性化可能抗体にコンジュゲート化されるイメージング試薬は、Ｄ−ルシフェリンである。これらの方法において、活性化可能抗体は、解放可能、例えば切断可能なリンカーを介してＤ−ルシフェリン基質とコンジュゲート化され、ルシフェラーゼで安定にトランスフェクトされた細胞に曝露される。例えば、Ｄ−ルシフェリンコンジュゲート化活性化可能抗体は、ルシフェラーゼトランスジェニックマウス、又はルシフェラーゼでトランスフェクトされた細胞株を接種された異種移植マウスモデルに投与される。コンジュゲート活性化可能抗体の活性化、受容体結合、及びインターナリゼーション後、Ｄ−ルシフェリンが放出される。エントリー後に放出されるルシフェリンの各分子は、インビボでの活性化可能抗体の活性化のリアルタイム定量化を可能にする測定可能な光子を生成する。すなわち、Ｄ−ルシフェリンコンジュゲート化活性化可能抗体は、活性化部位への活性化可能抗体の標的化送達のためのマーカーとして有用である。
【０２７３】
同様の技術はまた、インビボイメージングのために有用であり、ここで、対象、例えばヒト、を含む哺乳動物中の蛍光シグナルの検出は、疾患部位が標的を含み、活性化可能抗体のＣＭに特異的であるプロテアーゼを含むことを示す。このような技術の例は、実施例９及び図１３Ａに示されている。
【０２７４】
これらの技術はまた、活性化可能抗体中のプロテアーゼ特異的ＣＭに基づき、種々の細胞、組織、及び組織中のプロテアーゼ活性の検出、同定、又は性状解析のためのキット及び／又は試薬で有用である。
【０２７５】
いくつかの実施態様において、インサイチュイメージング及び／又はインビボイメージングは、治療すべき患者を同定するための方法において有用である。例えば、インサイチュイメージングにおいて、活性化可能抗体は、適切な場所、例えば腫瘍部位に適切なプロテアーゼと標的を有する患者を同定するために患者試料をスクリーニングするために使用される。
【０２７６】
いくつかの実施態様において、本開示の活性化可能抗体を用いた治療に適した患者集団を同定又は絞り込むために、インサイチュイメージングが使用される。例えば、標的と、試験されている活性化可能抗体（例えば、疾患部位の蓄積活性化可能抗体）の切断部分（ＣＭ）中の物質を切断するプロテアーゼとの、両方が陽性である患者は、そのようなＣＭを含むそのような活性化可能抗体による治療の適切な候補として同定される。同様に、標的と、これらの方法を使用して試験されている活性化可能抗体中のＣＭ中の基質を切断するプロテアーゼとの、いずれか又は両方が陰性である患者は、治療の別の形態のための適切な候補として同定される可能性がある。いくつかの実施態様において、第一の活性化可能抗体について陰性である患者は、治療に適した活性化可能抗体が同定されるまで、異なるＣＭを含む他の活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者によって切断されるＣＭを含む活性化可能抗体）を用いて試験することができる。
【０２７７】
いくつかの実施態様において、本開示の活性化可能抗体を用いた治療に適した患者集団を同定又は絞り込むために、インビボイメージングが使用される。例えば、標的と、試験されている活性化可能抗体（例えば、疾患部位の蓄積活性化可能抗体）の切断部分（ＣＭ）中の物質を切断するプロテアーゼとの、両方が陽性である患者は、そのようなＣＭを含むそのような活性化可能抗体による治療の適切な候補として同定される。同様に、陰性である患者は、治療の別の形態のための適切な候補として同定される可能性がある。いくつかの実施態様において、第一の活性化可能抗体について陰性である患者は、治療に適した活性化可能抗体が同定されるまで、異なるＣＭを含む他の活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者によって切断されるＣＭを含む活性化可能抗体）を用いて試験することができる。
【０２７８】
いくつかの実施態様において、コンジュゲート化活性化可能抗体の活性化を追跡するために、インビボイメージング使用される。例えば、コンジュゲート化活性化可能抗体の活性化は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を用いてインビボで追跡される。
【０２７９】
磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）は、異なる緩和時間に基づいて、組織の鑑別を可能にする診断方法である。造影剤は緩和時間を変化させ、患者の解剖学的構造及び生理機能に相関する特性の可視化を増強するために使用される。患者の解剖学的構造及び生理機能に相関する特性の可視化を増強するために、２種類のＭＲ造影剤（近隣の陽子のスピン−格子緩和時間を短縮するＴ１造影剤、及び、メディア含有構造の信号を減少させるためのスピン−スピン緩和を強化するＴ２造影剤）が使用される。
【０２８０】
現在、最も有名なＴ２造影剤は、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）ナノ粒子に基づき、これは、Ｔ１造影剤とは対照的に、より長い時間、血管内にとどまり、より長いイメージング採取時間ウィンドウを可能にする。さらに、ＳＰＩＯナノ粒子は、診断用途のための臨床現場でＭＲＩのために広く使用されている（例えば、Feridex IV（登録商標）及びEndorem（登録商標））。
【０２８１】
ナノ粒子のコントラスト強調は、そのサイズ、表面特性、及び凝集の程度に依存することが知られている。ナノ粒子によって形成されたクラスターのより大きな流体力学的直径を用いるＴ２緩和能の増強は、超常磁性ナノ粒子の独特の特徴である（例えば、Ai et al., 2005. Magnetite-Loaded Polymeric Micelles as Ultrasensitive Magnetic-Resonance Probes Adv Mater 17(16):1949-1952; Atanasijevic et al., “Calcium-sensitive MRI contrast agents based on superparamagnetic iron oxide nanoparticles and calmodulin.” Proc Natl Acad Sci U S A. 103.40(2006):14707-12; Mikhaylov, G., et al. Ferri-liposomes as an MRI-visible drug-delivery system for targeting tumours and their microenvironment. Nat Nanotechnol 6, 594-602 (2011); Zhao M, Josephson L, Tang Y, Weissleder R. Magnetic sensors for protease assays. Angew Chem Int Ed Engl 2003;42(12):1375-8を参照）。この概念の証明は、ミセルの疎水性コア内の単分散ＳＰＩＯ粒子のクラスタリング時のＭＲＩの緩和度がかなり増加することにより証明され、従って、高いＳＰＩＯローディングが得られ、１．５Ｔの臨床ＭＲＩスキャナ上の超高感度ＭＲＩ検出が可能になった（Ai et al., 2005)。
【０２８２】
さらに、この原理は、劇的なＴ２のコントラストの変化を生成する安定なナノ集合体に、分散された磁性粒子の可逆的な自己集合の分子間相互作用を検出するための磁気緩和スイッチとして作用する、ＳＰＩＯベースのＭＲＩセンサーの開発に使用することができるであろう（Perez et al., 2002 Magnetic relaxation switches capable of sensing molecular interactions. Nat. Biotechnol. 20, 816-820; Atanasijevic et al., “Calcium-sensitive MRI contrast agents based on superparamagnetic iron oxide nanoparticles and calmodulin.” Proc Natl Acad Sci U S A. 103.40(2006):14707-12; Zhao M, Josephson L, Tang Y, Weissleder R. Magnetic sensors for protease assays. Angew Chem Int Ed Engl 2003;42(12):1375-8）。同様に、カルシウム依存性のタンパク質−タンパク質相互作用に基づいて、インビボでの機能的ＭＲＩ研究のためのカルシウム指示薬のファミリーが、Atanasijevic et al.により開発されている(Atanasijevic et al., 2006)。Zhao et al.の研究では逆の手法が使用され、ここでは、開発されたアッセイは、プロテアーゼ切断可能な基質を採用し、これは、アビジン磁性ナノ粒子と相互作用し、こうして高いＴ２緩和能でクラスタ化された状態を誘発する、各端末上のビオチン化残基によりフランキングされている(Zhao et al., 2003)。すなわち、プロテアーゼの存在下で、基質配列は２つのビオチン間で切断されて、凝集を誘発することなく、アビジン磁性ナノ粒子と相互作用するモノビオチン化フラグメントを与える。
【０２８３】
すなわちいくつかの実施態様において、インビボでの磁気共鳴（ＭＲ）イメージング法は、クラスターの流体力学直径の増加時のＳＰＩＯナノ粒子のＴ２緩和能の増強効果を利用する。これらのインビボＭＲイメージング不の例示的態様は、図１７に示される。図１７に示すように、これらの方法では、活性化可能抗体のマスキング部分（ＭＭ）はビオチン化されて、ビオチン化ＭＭを有するコンジュゲート化活性化可能抗体（コンジュゲート活性化可能抗体に基づく磁気センサーとも呼ばれる）が生成される。次に、ビオチン化ＭＭを有するコンジュゲート化活性化可能抗体は、対象に投与され、アビジン被覆磁性ナノ粒子及び／又はストレプトアビジン被覆磁性ナノ粒子もまた、ＭＲイメージング前のある時点で対象に注入される。いくつかの実施態様において、磁性ナノ粒子は、標識することができる抗ビオチンで被覆されている。いくつかの実施態様において、ビオチン化ＭＭ及び被覆磁性ナノ粒子を有するコンジュゲート化活性化可能抗体が同時に投与される。例えば、ビオチン化されたＭＭ及び被覆磁性ナノ粒子を有するコンジュゲート化活性化可能抗体は、単一の組成物中に処方され得るか、又は二以上の別々の組成物として投与することができる。いくつかの実施態様において、ビオチン化ＭＭ及び被覆磁性ナノ粒子を有するコンジュゲート化活性化可能抗体は、連続的に投与される。
【０２８４】
これらのインビボＭＲイメージング方法では、ビオチン化ＭＭを有するコンジュゲート化活性化可能抗体の投与後の即時ＭＲイメージングは、高いＭＲ造影画像（高緩和能）を提供し、これは、ビオチン化ＭＭを有するコンジュゲート化活性化可能抗体の活性化に際して減少し、低ＭＲＩコントラストをもたらす。すなわち、これらのインビボＭＲイメージング法は、ビオチン化ＭＭを有するコンジュゲート化活性化可能抗体の活性化をインビボで追跡するための非侵襲的な手段を提供する。
【０２８５】
いくつかの実施態様において、コンジュゲート化活性化可能抗体の種々の特性、例えば非限定例として、コンジュゲート化活性化可能抗体の分布、蓄積、及び／又は活性化の、インビボモニタリングのための方法で使用される。これらの方法のいくつかの例示的態様が図１８に示される。
【０２８６】
図１８に示される実施態様においては、「標識された」活性化可能抗体（本明細書においてコンジュゲート化活性化可能抗体とも呼ばれる）は、活性化可能抗体に対する及び／又は活性化可能抗体の一部に対する抗体、例えば抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）に結合する抗体、マスキング部分（ＭＭ）に結合する抗体、及び／又は切断可能成分（ＣＭ）に結合する抗体、を使用して検出することができる。
【０２８７】
図１８に示された実施態様において、標識された活性化可能抗体は、イメージング剤、例えば蛍光マーカー、近赤外（ＮＩＲ）標識、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴトレーサー、ＭＲＩ造影剤、を用いて標識又はコンジュゲート化される活性化可能抗体であり、従って、そのようなものとして、標識された活性化可能抗体は、対応する計測器又は検出のための他の当該分野で認識された手段を用いて検出することができる。いくつかの実施態様において、活性化可能抗体又はその一部、例えばＭＭ、ＣＭ、ＡＢ、及び／又はそれらの組み合わせ、は、ビオチン化され、これは、標識された活性化可能抗体が生体試料から捕捉されることを可能にするであろう。いくつかの実施態様において、ビオチン化された活性化可能抗体は、組織学的染色又はウェスタンブロットのような検出方法のためのアビジン及び／又はストレプトアビジンによる標識として使用される。
【０２８８】
いくつかの実施態様において、活性化可能抗体は、第一の抗原結合ドメイン及び第二の抗原結合ドメインを含み、ここで、図１９に示されるように、第一の抗原結合ドメインはマスクされておらず、第二の抗原結合ドメインはマスクされて、標識されたリンカーを含む。効率的なヘテロ二量体形成を促進するために、マスキングペプチド、及びリンカー、プローブ、検出可能な標識を含む他の部分は重鎖に融合される。半活性化可能抗体は、生体試料中の、活性化可能抗体の活性化と、活性化抗体による標的への結合の確認を、検証するための方法において有用である。このような方法は、本明細書において、「逆」インサイチュイメージング技術と称され、ここで、標準すなわち非逆インサイチュイメージングは図１に示される。これらの逆インサイチュイメージング技術の概略は、図２０に示される。これらの方法は、病変組織のスクリーニングのために、及び与えられた活性化可能抗体を用いた治療に応答する患者集団の絞り込みのために、有用である。これらの方法はまた、生体試料及びシステムにおけるプロテアーゼ活性のプロフィール化のための方法において有用である。
【０２８９】
本明細書で提供される逆インサイチュイメージング法は、標識リンカー切断を検出することにより、プロテアーゼの性状解析と、同じ組織切片上での標的発現を可能にする。このように、半活性化可能抗体の非マスク化抗体のアームは組織受容体に結合し、こうして、半活性化可能抗体構築物を組織を固定する。基質切断の場合には、マスク及び／又は標識を有するリンカーは抗原結合部位から解離して、標識（例えば、蛍光）シグナルの低下を引き起こす。基質切断可能なプロテアーゼ活性が存在しない場合には、検出信号（例えば、蛍光）の差は記録されないであろう。親抗体の結合は、標識抗体構築物又は二次試薬（例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体）を使用して、半活性化可能抗体を検出することにより評価される。
【０２９０】
半活性化可能抗体は、本明細書に提供されるか又は当技術分野で知られている任意の方法を使用して作製することができる。
【０２９１】
いくつかの実施態様において、これらのインサイチュイメージング法は、以下の工程のうちの一又は二以上を含む。まず、凍結切片がスライドグラス上に配置される。標識された活性化可能抗体リンカー（例えば、蛍光タグ）を有する半活性化可能抗体を含む溶液が組織に適用され、インキュベートされる。インキュベーション（時間、濃度及び緩衝液は変えることができる：例えば、１時間、室温）後、組織は広範に洗浄されて非結合物質が除去され、残存標識のシグナルが各方法により検証される。蛍光標識された物質の場合、活性化可能抗体リンカーのタンパク質分解切断は、蛍光顕微鏡により、蛍光の低下として検出することができる。この方法は、免疫組織化学と組合せることができ、抗体結合の同時検出を可能にし、同じ組織片上の親抗体へのシグナルの標準化を可能にする。図１に示した技術と比較したこれらのインサイチュイメージング法の比較は、図２０に示される。
【０２９２】
さらに、これらの方法は、細胞培養物又は新鮮な組織のインキュベーションでの使用に適合させることができる。あるいは、これらの方法は、選択的プロテアーゼ阻害剤の存在下で行うことができるであろう。例えば、活性化可能抗体を活性化するプロテアーゼの同定を行うことができるであろう。後者の方法の変更は、様々な基質配列の特異性及び選択性のインサイチュ性状解析を可能にするであろう。
【０２９３】
これらの方法は、非限例として、同じ組織試料／切片中の親抗体の結合及び活性化可能抗体の活性化を検出する能力を含む多くの利点を提供し、これは、活性化可能抗体の活性化の定量を改善することができる。
【０２９４】
本発明はさらに以下の実施例において説明されるが、これらは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０２９５】
活性化可能抗体インサイチュイメージングの開発と性状解析
【０２９６】
本明細書に提供される実施例は、本明細書で活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５と呼ばれる抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（本明細書において、３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５活性化可能抗体、又は３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５とも呼ばれる）を使用し、これは、ＥＧＦＲ結合配列、マスキング部分（ＭＭ）、及びプロテアーゼの基質である切断可能部分（ＣＭ）を含む。これらの例はまた、本明細書において、ＭＭとＥＧＦＲ結合配列との間に位置する非切断部分を含む、マスクされた抗体３９５４−ＮＳＵＢ−Ｃ２２５ｖ５と呼ばれるマスクされた抗ＥＧＦＲ抗体構築物（また３９５４−ＮＳＵＢ−Ｃ２２５ｖ５マスク化抗体、又は３９５４−ＮＳＵＢ−Ｃ２２５ｖ５とも呼ばれる）を使用する。本明細書において提供される例は、これらの抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体構築物を使用するが、これらの方法は、任意の活性化可能抗体に適用可能であることを理解すべきである。
【０２９７】
抗ＥＧＦＲの活性化可能抗体構築物：３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体構築物は、以下の重鎖及び軽鎖配列を含む：
３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５活性化可能抗体の重鎖ヌクレオチド配列：
［Ｃ２２５ｖ５（配列番号１）］
[caggtgcagctgaaacagagcggcccgggcctggtgcagccgagccagagcctgagcattacctgcaccgtgagcggctttagcctgaccaactatggcgtgcattgggtgcgccagagcccgggcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggagcggcggcaacaccgattataacaccccgtttaccagccgcctgagcattaacaaagataacagcaaaagccaggtgttttttaaaatgaacagcctgcaaagccaggataccgcgatttattattgcgcgcgcgcgctgacctattatgattatgaatttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgcggctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgaactgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga]（配列番号１）
３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５活性化可能抗体重鎖アミノ酸配列：
［Ｃ２２５ｖ５（配列番号２）］
[QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*]（配列番号２）
３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５活性化可能抗体軽鎖ヌクレオチド配列：
［スペーサー（配列番号５）］［マスク（配列番号６）］［リンカー１（配列番号７）］［１２０４  基質（配列番号８）］［リンカー２（配列番号９）］［Ｃ２２５（配列番号１０）］
[caaggccagtctggccag][tgcatctcacctcgtggttgtccggacggcccatacgtcatgtac][ggctcgagcggtggcagcggtggctctggtggatccggt][ctgagcggccgttccgataatcat][ggcagtagcggtacc][cagatcttgctgacccagagcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgtgtgagctttagctgccgcgcgagccagagcattggcaccaacattcattggtatcagcagcgcaccaacggcagcccgcgcctgctgattaaatatgcgagcgaaagcattagcggcattccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgagcattaacagcgtggaaagcgaagatattgcggattattattgccagcagaacaacaactggccgaccacctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag]（配列番号３）
３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５活性化可能抗体軽鎖アミノ酸配列：
［スペーサー（配列番号１１）］［マスク（配列番号１２）］［リンカー１（配列番号１３）］［１２０４  基質（配列番号１４）］［リンカー２（配列番号１５）］［Ｃ２２５（配列番号１６）］
[QGQSGQ][CISPRGCPDGPYVMY][GSSGGSGGSGGSG][LSGRSDNH][GSSGT][QILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*]（配列番号4)
【０２９８】
３９５４−ＮＳＵＢ−Ｃ２２５ｖ５マスク化抗ＥＧＦＲ抗体構築物は、同じ重鎖として、上記に示した３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５活性化可能な抗ＥＧＦＲ抗体を含む。３９５４−ＮＳＵＢ−Ｃ２２５ｖ５マスク化抗ＥＧＦＲ抗体構築物は、以下の軽鎖配列を含む。
３９５４−ＮＳＵＢ−Ｃ２２５ｖ５マスク化抗体軽鎖ヌクレオチド配列：
［スペーサー（配列番号５）］［マスク（配列番号６）］［リンカー１−非切断可能基質リンカー２（配列番号１９）］［Ｃ２２５（配列番号１０）］
[caaggccagtctggccag][tgcatctcacctcgtggttgtccggacggcccatacgtcatgtac][ggctcgagcggtggcagcggtggctctggtggctcaggtggaggctcgggcggtgggagcggcggttct][cagatcttgctgacccagagcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgtgtgagctttagctgccgcgcgagccagagcattggcaccaacattcattggtatcagcagcgcaccaacggcagcccgcgcctgctgattaaatatgcgagcgaaagcattagcggcattccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgagcattaacagcgtggaaagcgaagatattgcggattattattgccagcagaacaacaactggccgaccacctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag]（配列番号１７）
３９５４−ＮＳＵＢ−Ｃ２２５ｖ５仮面抗体軽鎖アミノ酸配列：
［スペーサー（配列番号１１）］［マスク（配列番号１２）］［リンカー１−非切断可能基質リンカー２（配列番号２０）］［Ｃ２２５（配列番号１６）］
[QGQSGQ][CISPRGCPDGPYVMY][GSSGGSGGSGGSGGGSGGGSGGS][QILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*]（配列番号１８）
【０２９９】
３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ５活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体に使用される切断可能部分（ＣＭ）は、種々のヒト癌でアップレギュレートされることが知られている２つのセリンプロテアーゼ［ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、及び膜型セリンプロテアーゼ１（ＭＴ−ＳＰ１／マトリプターゼ）］によって切断することができる；このＣＭはまた、レグマインによって切断することができる。３９５４−ＮＳＵＢ−ｃ２２５ｖ５マスク化抗ＥＧＦＲ抗体は、プロテアーゼ耐性活性化可能抗体をもたらす、非切断可能基質配列を含有するため、陰性対照として使用された。
【０３００】
選択されたプロテアーゼによる活性化後に標的細胞受容体に排他的に結合する活性化可能抗体のユニークな特徴は、生物系でのプロテアーゼ活性の検出を可能にする新規かつ強力な技術の創出につながり、これは、本明細書において、活性化可能抗体のインサイチュイメージングと呼ばれる。この技術は、プロテアーゼ活性の部位で選択的に蓄積することができる標識された活性化可能抗体の使用に基づく。様々な組織切片におけるプロテアーゼ活性のイメージング方法にこの技術を適用するために、単純なプロトコルが開発された。このプロトコルは、三つの主要な工程を含む：（１）凍結（又は新鮮な）組織切片をスライドグラス上に置き、ＰＢＳで簡単にすすぐ、（２）標識された活性化可能抗体（蛍光色素のAlexa Fluor（登録商標）680を用いて）を含む溶液が、暗所で組織切片上でインキュベートされる。（３）組織試料はＰＢＳ又は他の適切な緩衝液で広範に洗浄され、活性化された（すなわち、切断された）活性化可能抗体の結合が、蛍光顕微鏡によって可視化される（図１）。いくつかの実施態様において、工程（１）は、ＰＢＳ−ツイーン（ＰＢＳ−Ｔ）によるさらなるすすぎを含む。いくつかの実施態様において、工程（３）は、ＰＢＳ−Ｔ、次にＰＢＳによる洗浄を含む。いくつかの実施態様において、工程（１）は、ＰＢＳ−Ｔによるさらなるすすぎを含み、工程（３）は、ＰＢＳ−Ｔ、次にＰＢＳによる洗浄を含む。
【実施例２】
【０３０１】
Ｈ２９２異種移植腫瘍組織中のプロテアーゼ活性の性状解析
【０３０２】
ＥＧＦＲは、Ｈ２９２ヒト非小細胞肺癌細胞で高度に発現され、そしてこの異種移植腫瘍モデルにおけるセツキシマブの有効性は、複数の研究によって決定されている（例えば、Doody et al., Mol Cancer Ther October 2007 6; 2642; Chen et al., BMC Medicine 2012, 10:28を参照）。すなわち、活性化可能抗体のインサイチュイメージング手法で活性化可能抗体を検証するために、Ｈ２９２腫瘍組織試料が選択された。この研究（その結果は図２Ａ及び図２Ｂに示されている）は、３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ５活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体を、陽性対照及び陰性対照としてのそれぞれ親抗体（セツキシマブ）及び３９５４−ＮＳＵＢ−ｃ２２５ｖ５（すなわち、非切断可能マスク化抗体）とともに使用した。Ｈ２９２異種移植凍結腫瘍組織切片をスライドグラス上に置き、ＰＢＳ−Ｔ、続いてＰＢＳで２回洗浄し、次に、広域スペクトルプロテアーゼ阻害剤カクテル又は緩衝液のみを用いて組織の３０分間の前処理を行なった。Alexa Fluor-680（登録商標）標識された３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ５及びAlexa Fluor-680（登録商標）標識された３９５４−ＮＳＵＢ−ｃ２２５ｖ５を組織に適用し、暗所で１時間インキュベートした（蛍光の退色を防止するために）。インキュベーション後、１μｇ／ｍｌのインキュベートした腫瘍切片をＰＢＳ−Ｔ、次にＰＢＳで３回洗浄し、核マーカーＤＡＰＩを用いて１分間対比染色した。蛍光顕微鏡分析は、プロテアーゼ阻害剤による組織切片の前処理によって消失した３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ５の陽性染色を示し、これは、組織試料への３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ５の結合がタンパク質分解事象の結果であることを示した。３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ５の陽性染色はまた、組織を過剰の非標識（「コールド」）セツキシマブで前処理した時にも消失した。さらに、Ｈ２９２組織のインキュベーションは、プロテアーゼ阻害剤を用いた組織の前処理によって影響を受けなかったセツキシマブ抗体についての陽性染色を明らかにしたが、組織を非標識セツキシマブで前処理した時に、これは消失した。予想されたように、プロテアーゼ阻害剤又は非標識セツキシマブで前処理したか又はしなかった組織では、非切断可能３９５４−ＮＳＵＢ−ｃ２２５ｖ５について何の信号も検出されなかった。
【実施例３】
【０３０３】
活性化可能抗体インサイチュイメージングを使用する患者の腫瘍試料のスクリーニング
【０３０４】
実施例２で上記した方法で、凍結した結腸直腸癌患者の腫瘍試料を使用して、ヒト組織に対するプロテアーゼ活性を検証するための活性化可能抗体インサイチュイメージングの適用性を評価した。まず、３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ５インサイチュイメージングとＥＧＦＲ免疫組織染色（ＩＨＣ）の二重染色を行って、蛍光シグナルの共局在を確認した（図３）。さらに、腫瘍組織を広域スペクトルプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）で前処理すると、３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ５の結合が完全に消失し（図３）、３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ５の活性化に必要であるプロテアーゼ活性の阻害の成功を示した。
【０３０５】
次に、異なる腫瘍組織間のプロテアーゼ活性の不均一性を調べた。これらの研究は、ｕＰＡ（３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ５）及びＭＭＰ−１４（３９５４−ＬＳ９−Ｃ２２５ｖ５）による活性化が可能な活性化可能抗体を用いて、二つの三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）患者腫瘍試料をスクリーニングした。図４に示されるように、顕著には、ｕＰＡ、Ｍｔ−ＳＰ１、及びレグマインにより切断される基質を含有する試料中で、３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５活性の速度差が検出されたのに対し、高レベルのＭＭＰ活性が両方の腫瘍について証明された。抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体を活性化しこれに結合するヒト三重陰性乳癌患者の組織試料の能力に関する結果は、表７に要約される。
【表７】
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【０３０６】
このようなインサイチュイメージング技術は、細胞培養物又は組織切片などの生体試料中のタンパク質分解活性の検出を可能にする。この技術を使用して、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）の存在に基づいて、タンパク質分解活性を定量することが可能である。これらの技術は、疾患部位（例えば、腫瘍組織）又は健常組織に由来する任意の凍結細胞や組織にも有用である。これらの技術はまた、新鮮な細胞及び組織でも有用である。
【実施例４】
【０３０７】
抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体のインサイチュイメージング
【０３０８】
本実施例は、本開示の抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体の活性化と結合のインサイチュイメージングの使用を記載する。結果は、本開示の抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体が、組織によって発現されるプロテアーゼによって活性化され、その組織上のＥＧＦＲ標的に結合することができることを示している。
【０３０９】
活性化可能抗体のインサイチュイメージングは、細胞及び組織中のプロテアーゼ活性を性状解析するためのユニークな手法である。この技術は、活性化可能抗体の活性化と、活性化可能抗体を切断することができるプロテアーゼを発現する細胞と組織の組織切片中の標的への結合との、検証を可能にする。このようなインサイチュ手法の概略は、図１に示される。
【０３１０】
活性化された抗体により認識される標的と共局在された部位において、活性化可能抗体を切断することができる細胞又は組織による抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体の活性化と結合のインサイチュイメージング（本明細書においてインサイチュイメージングとも呼ばれる）は、以下のように行われた：凍結組織切片をスライドグラス上に置いた。標識された（例えば、蛍光タグで標識された）抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体を含む溶液を、組織上に適用し、室温（約２２〜２４℃）で１時間、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００μＭのＺｎＣｌ2、５ｍＭのＣａＣｌ2、及び０．０５％のツイーン２０、約１μｇ／ｍｌ濃度の活性化可能抗体を含む）中でインキュベートした。このようなインキュベーションの条件は、例えば、溶液のｐＨ（例えば、約ｐＨ７〜約ｐＨ８．５の範囲内）、インキュベーションの温度（例えば、約２０℃〜約４０℃の範囲内、例えば室温又は３７℃）、インキュベーション時間（例えば、約１５分〜約１５０分の範囲内）、及び／又は活性化可能抗体濃度（例えば、約０．０５μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの範囲内）を変化させることにより、組織切片中の切断剤を助長するように調整することができる。次に、組織を広範囲に洗浄して、非結合物質を除去し、検出可能な標識を測定した。例えば、蛍光タグを使用した時、組織を蛍光顕微鏡に供した。組織上の活性化抗体の検出は、組織が、活性化可能抗体を切断したプロテアーゼを発現し、活性化された抗体が結合したＥＧＦＲ標的も発現したことを示した。
【０３１１】
図６は、３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ５が、広範囲のヒト腫瘍試料で活性化可能であることを示している。列２は、様々なヒト癌組織試料について、ＥＧＦＲ抗体（モノクローナルウサギ抗ＥＧＦＲ抗体、Cell Signaling）によって検出されるＥＧＦＲ受容体の発現レベルを示す。列３は、様々なヒト癌組織試料について、抗体Ａ１１によって検出される活性マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）の量を示す。列４及び５は、セツキシマブ（Cetux）組織染色（列４）と比較した、ＥＧＦＲの活性化可能抗体（列５）のインサイチュ活性化と結合の評価を示す。組織試料へのＥＧＦＲ、Ａ１１、及びセツキシマブ抗体の結合量を測定する染色を、−から３＋にスコア化した：染色なし；１＋（すなわち「＋」）、弱い染色；２＋（すなわち「＋＋」）、中程度の染色；及び３＋（すなわち「＋＋＋」）、強い染色。活性化可能抗体のインサイチュイメージング染色のスコア化は、セツキシマブ抗体染色との比較に基づいており、以下のように定義される：−、染色なし；１＋（すなわち「＋」）、親抗体と比較して弱い染色；２＋（すなわち「＋＋」）、親抗体と比較して中程度の染色；及び３＋（すなわち「＋＋＋」）、親抗体と同様の染色。図６に示されるように、高レベルの活性マトリプターゼが、結腸直腸癌（ＣＲＣ）の９試料のうちの８で観察され、高レベルの活性マトリプターゼが、１０の肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍のうちの５の試料で観察されている。隣接する健康な肺組織からの試料では、活性マトリプターゼは観察されなかった。
【０３１２】
これらのデータは、本開示の抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体、例えば活性化可能抗体３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ５を用いた治療に適した患者集団を、有効かつ効率的に同定又は絞り込むための方法における、インサイチュイメージングの有用性を示唆する。例えば、標的（例えばＥＧＦＲ）と、抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（例えば、ＭＴ−ＳＰ１）の切断部分（ＣＭ）中の基質を切断するプロテアーゼとの両方が、これらのインサイチュイメージング技術を使用して陽性となる患者は、試験されている抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体による治療の適切な候補として同定できるであろう。同様に、標的と、ＣＭ（例えば、ＭＴ−ＳＰ１）中の基質を切断するプロテアーゼとのいずれか又は両方が、これらのインサイチュイメージング技術を使用して陰性となる患者は、治療の別の形態のための適切な候補として同定される可能性がある。いくつかの実施態様において、このような患者は、治療に適した抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体が同定されるまで、他の抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体を用いて試験することができる（例えば、疾患の部位で患者によって切断されるＣＭを含む抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体）。
【実施例５】
【０３１３】
抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体のインサイチュイメージング
【０３１４】
本実施例は、抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体の活性化と結合のための、患者の組織試料をスクリーニングするためのインサイチュイメージング手法の使用を記載する。結果は、本開示の抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体が、癌患者の組織によって発現されるプロテアーゼによって活性化され、その組織上のＥＧＦＲ受容体に結合することができることを示している。
【０３１５】
国立癌研究所（National Cancer Institute）によって資金を供給されている協同ヒト組織ネットワーク（Cooperative Human Tissue Network）によって提供されたヒト結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、及び肝臓転移組織試料が、１μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌ濃度の標識ＥＧＦＲ及びＡ１１抗体を用いて、凍結組織をそれぞれ１時間処理することにより、ＥＧＦＲ及びＭT−ＳＰ１発現についてプロフィール化された（図７及び表８〜１１）。さらに、抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−ｃ２２５Ｖ５が、活性化され、ヒト腫瘍又は肝転移組織に結合する能力が、インサイチュイメージングを使用して評価された（図７及び表８〜１１）。上記したように、活性化可能抗体は、Alexa Fluor-680（登録商標）（Invitrogen）で標識された。得られた活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５Ｖ５−ＡＦ６８０（１２０４−Ｃ２２５ｖ５又は１２０４−Ｃ２２５とも呼ばれる）は、本明細書に記載のインサイチュイメージングのプロトコルに従って、凍結された患者組織試料とともにインキュベートされた。図８は、抗ＥＧＦＲの活性化可能抗体を活性化し、これに結合する、大腸癌肝転移組織の能力を示している。図１２は、抗ＥＧＦＲの活性化可能抗体活性化し、これに結合する、結腸直腸癌及びＮＳＣＬＣ組織の能力を示している。抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体活性化し、これに結合する、癌患者の組織試料の能力に関する結果は、表８〜１１に要約される。組織試料へのＥＧＦＲ及びＡ１１抗体の結合量を測定するＩＨＣ染色を、−から３＋にスコア化した：−、染色なし；１＋（すなわち「＋」）、弱い染色；２＋（すなわち「＋＋」）、中程度の染色；及び３＋（すなわち「＋＋＋」）、強い染色。インサイチュイメージング染色のスコア化は、セツキシマブ抗体染色との比較に基づき、以下のように定義される：−、染色なし；１＋（すなわち「＋」）、弱い染色；２＋（すなわち「＋＋」）、中程度の染色；及び３＋（すなわち「＋＋＋」）、強い染色。インサイチュイメージング染色のスコア化は、セツキシマブ抗体染色との比較に基づいており、以下のように定義される：−、染色なし；１＋（すなわち「＋」）、親抗体と比較して弱い染色；２＋（すなわち「＋＋」）、親抗体と比較して、中程度の染色；及び３＋（すなわち「＋＋＋」）、親抗体と同程度の染色。
【表８】
2020098195.tif 000012
【表９】
2020098195.tif 000013
【表１０−１】
2020098195.tif 000014
【表１０−２】
2020098195.tif 000015
【表１１】
2020098195.tif 000016
【実施例６】
【０３１６】
抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体のインサイチュイメージングの定量
【０３１７】
本実施例は、抗ＥＧＦＲ抗体ＩＨＣ及びＡ１１抗体ＩＨＣと組合せた、抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体の活性化と、エクスビボでのその生体組織への結合のインサイチュイメージングの使用を記載する。市販の抗ＥＧＦＲ抗体ＩＨＣの使用は、組織中のＥＧＦＲ発現の量に、親抗体（例えばセツキシマブ）及び抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体の染色を標準化することを可能にする。ＥＧＦＲ抗体との共染色はまた、ＥＧＦＲ発現に標準化されセツキシマブ染色に対して、抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体のインサイチュイメージングの定性的定量化を可能にする。蛍光シグナルの定量は、例えばMetaMorphなどの研究イメージングのためのバイオ分析ソフトウェアを用いて行うことができる。ＭＴ−ＳＰ１（抗体Ａ１１）の活性部位を特異的に認識する抗体による組織の染色はまた、ＭT−ＳＰ１（活性化可能抗体３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ４、３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ５、及び３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ６の基質をタンパク質分解的に切断する酵素）の活性を追跡するために行うことができる。
【０３１８】
ＥＧＦＲ  ＩＨＣと組み合わせて実施される細胞又は組織による、抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体の切断のインサイチュイメージングの定量は、以下のように行われた：凍結組織切片をスライドグラス上に置き、ＰＢＳで、次にＰＢＳ−Ｔですすいだ。標識された抗ＥＧＦＲ活性化抗体（例えば、蛍光タグで標識）を含む溶液を組織に適用し、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００μＭのＺｎＣｌ2、５ｍＭのＣａＣｌ2、及び０．０５％のツイーン２０、約１μｇ／ｍｌ濃度の活性化可能抗体を含む）のインキュベーション緩衝液中で、室温で１時間インキュベートした。次に、組織を、非結合物質を除去するためにＰＢＳ−Ｔですすぎ、そして内因性ＩｇＧを３％ＢＳＡでブロックした。切片を、市販の抗ウサギ抗ＥＧＦＲ抗体及び標識Ａ１１抗体（例えば、蛍光タグで標識）で、室温で１時間インキュベートした。すすいだ、蛍光タグで標識された二次抗体抗ウサギＩｇＧを適用し、切片上で５μｇ／ｍｌの濃度で、例えば室温で３０分間インキュベートして一次抗体を増幅した。切片をＰＢＳ、続いてＰＢＳ−Ｔですすぎ、ＤＡＰＩで対比染色し、検出可能な標識を測定した。例えば、蛍光タグを用いた場合、組織を蛍光顕微鏡検査に供した。活性化され、インサイチュで受容体に結合する抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体の能力を、以下の式により定量した。
【数１】
2020098195.tif 000017
これは、以下のようにも書くことができる：
【数２】
2020098195.tif 000018
ここで、
ＰＢＡ＝親抗体（例えば、セツキシマブ）と比較した抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体の活性化と結合の％、
Ａｂ  ＥＧＦＲ＝セツキシマブ結合を用いた切片上のＥＧＦＲ  ＩＨＣの染色強度、
Ｐｂ  ＥＧＦＲ＝抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体インサイチュイメージングを用いた切片上のＥＧＦＲ  ＩＨＣの染色強度、
Ａｂインサイチュイメージング＝セツキシマブ結合の強度、
Ｐｂインサイチュイメージング＝抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体の結合強度。
【０３１９】
ヒト食道癌及び膵臓癌組織試料を、ＥＧＦＲ及びＭＴ−ＳＰ１発現についてプロファイル化した：抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５が、活性化され、ヒト腫瘍に結合する能力を、インサイチュイメージングを使用して評価した。上記したように、活性化可能抗体をAlexa Fluor-680（登録商標）で標識した。生じた活性化可能抗体３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ５−ＡＦ６８０を、本明細書に記載のインサイチュイメージングのプロトコルに従って、凍結患者組織試料とインキュベートした。さらに、ＥＧＦＲ及びAlexa Fluor（登録商標）-750標識したＡ１１抗体を１μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌの濃度で用いて、凍結組織をそれぞれ１時間処理することにより使用した。図９は、抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体を活性化し、これに結合する食道癌組織の能力を示している。抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体を活性化し、これに結合する、食堂及び膵臓癌患者の組織試料の能力に関する結果は、表１２に要約される。組織試料へのセツキシマブ、ＥＧＦＲ、及びＡ１１抗体の結合量を測定するＩＨＣ染色を、−から３＋にスコア化した：−、染色なし；１＋（すなわち「＋」）、弱い染色；２＋（すなわち「＋＋」）、中程度の染色；及び３＋（すなわち「＋＋＋」）、強い染色。抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体のインサイチュイメージングを、ＥＧＦＲ染色に対して標準化したセツキシマブ抗体染色との比較に基づいて定量し、上記した式により計算した。
【表１２】
2020098195.tif 000019
【０３２０】
図９は、インサイチュイメージング、ＥＧＦＲ  ＩＨＣ、及びＡ１１  ＩＨＣの三重染色を示す一連の画像である。画像の上段は、インサイチュイメージング条件下で単一の組織切片について行なった染色を示し、（左から右へ）ＥＧＦＲ発現、マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）の活性、及びインサイチュイメージング条件下でのセツキシマブの結合を示している。画像の下段は、単一の組織切片上で行なった染色を示し、（左から右へ）ＥＧＦＲ発現、マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）の活性、及び抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ５（１２０４）のインサイチュイメージングを示している。図９の画像の右側の欄は、インサイチュイメージング条件下で組織由来タンパク質分解切断（下の画像）によって活性化されたセツキシマブ（上の画像）の結合と、抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体の結合を比較する。図９の画像の左側の欄に示すように、市販の抗ＥＧＦＲ抗体を組織に暴露することにより、組織染色の同一のパターンが検出された。図９の画像の中央の欄は、マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）活性とＥＧＦＲ発現の共局在を示す。本明細書において用語「共局在」は、ＥＧＦＲ及び／又はＡ１１染色の任意のオーバーレイ又は他の重複を意味することを意図するものではなく、用語「共局在」は、ＥＧＦＲ発現患者の組織中ＭT−ＳＰ１活性の存在を示すために使用される。全体としてこれらのデータは、ヒト食道癌組織試料による抗ＥＧＦＲ抗体３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ５の約９０％の活性化を証明する。
【実施例７】
【０３２１】
抗Jagged活性化可能抗体のインサイチュイメージング
【０３２２】
本実施例は、本開示の抗Jagged活性化可能抗体の活性化と結合のインサイチュイメージングの使用を記載する。
【０３２３】
本明細書に提供される実施例は、Jagged 1とJagged 2の両方、マスキング部分（ＭＭ）、及びプロテアーゼの基質である切断可能部分（ＣＭ）に特異的に結合する、抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）を含む、本明細書において活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１（また５３４２−１２０４−４Ｄ１１活性化抗体、又は５３４２−１２０４−４Ｄ１１とも呼ばれる）と呼ばれる抗Jagged活性化可能抗体を使用する。本明細書に提供される実施例は、Jagged 1とJagged 2の両方、マスキング部分（ＭＭ）、及びプロテアーゼの基質である切断可能部分（ＣＭ）に特異的に結合する、抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）を含み、配列ＰＬＧＬを含む、本明細書において活性化可能抗体５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１（また５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１活性化抗体、又は５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１とも呼ばれる）と呼ばれる抗Jagged活性化可能抗体を使用する。本明細書に提供される実施例は、Jagged 1とJagged 2の両方に特異的に結合するＡＢ又はその抗原結合断片（ＡＢ）を含む、４Ｄ１１と呼ばれる抗Jagged抗体を使用する。本明細書に提供される実施例はこれらの抗Jagged活性化可能抗体構築物を使用するが、これらの方法は任意の活性化可能抗体に適用可能であることを、理解すべきである。
抗Jagged抗体構築物及び抗Jagged活性化可能抗体構築物：
【０３２４】
４Ｄ１１抗Jagged抗体は、以下の重鎖及び軽鎖配列を含む：
４Ｄ１１軽鎖可変領域ヌクレオチド配列
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGT（配列番号２１）
４Ｄ１１軽鎖可変領域アミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKR（配列番号２２）
４Ｄ１１重鎖可変領域ヌクレオチド配列
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCAAGTATTGACCCGGAAGGTCGGCAGACATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGACATCGGCGGCAGGTCGGCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA（配列番号２３）
４Ｄ１１重鎖可変領域アミノ酸配列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGRQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号２４）
４Ｄ１１軽鎖ヌクレオチド配列
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT（配列番号２５）
４Ｄ１１軽鎖アミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号２６）
４Ｄ１１重鎖ヌクレオチド配列
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCAAGTATTGAAGAGATGGGTTGGCAGACAAAGTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCGGCTGCTGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA（配列番号２７）
４Ｄ１１重鎖アミノ酸配列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGRQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２８）
【０３２５】
５３４２−１２０４−４Ｄ１１活性化可能抗Jagged抗体構築物は、配列番号２８で上記した４Ｄ１１抗体の重鎖配列と以下の軽鎖配列とを含む：
５３４２−１２０４−４Ｄ１１軽鎖ヌクレオチド配列
CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTGGCAGGGGGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGTCTGAGCGGCCGTTCCGATAATCATGGCGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT（配列番号２９）
５３４２−１２０４−４Ｄ１１軽鎖アミノ酸配列
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGGSGGLSGRSDNHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEXFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号３０）
【０３２６】
５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１活性化可能抗Jagged抗体構築物は、上記した４Ｄ１１の重鎖配列と以下の軽鎖配列とを含む：
５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１軽鎖ヌクレオチド配列
CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTGGCAGGGGGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCAGGTGGAGGCTCGCCACTGGGCCTGGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT（配列番号３１）
５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１軽鎖アミノ酸配列
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGGSGGSGGGSPLGLGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号３２）
【０３２７】
活性化可能抗体のインサイチュイメージングは、細胞及び組織中のプロテアーゼ活性を性状解析するためのユニークな手法である。この技術は、活性化可能抗体の活性化と、活性化可能抗体を切断することができるプロテアーゼを発現する細胞と組織の組織切片中の標的への結合との、検証を可能にする。このようなインサイチュ手法の概略は、図１に示される。
【０３２８】
活性化された抗体により認識される標的と共局在された部位において、活性化可能抗体を切断することができる細胞又は組織による抗Jagged活性化可能抗体の活性化と結合のインサイチュイメージング（本明細書においてインサイチュイメージングとも呼ばれる）は、以下のように行われた：凍結組織切片をスライドグラス上に置いた。標識された（例えば、蛍光タグで標識された）抗Jagged活性化可能抗体を含む溶液を、組織上に適用し、室温（約２２〜２４℃）で１時間、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００μＭのＺｎＣｌ2、５ｍＭのＣａＣｌ2、及び０．０５％のツイーン２０、約１μｇ／ｍｌ濃度の活性化可能抗体を含む）中でインキュベートした。次に、組織を広範囲に洗浄して、非結合物質を除去し、検出可能な標識を測定した。例えば、蛍光タグを使用した時、組織を蛍光顕微鏡に供した。組織上の活性化抗体の検出は、組織が、活性化可能抗体を切断したプロテアーゼを発現し、活性化された抗体が結合したJagged標的も発現したことを示した。
【０３２９】
抗Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１が、活性化され、ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍組織に結合する能力を、インサイチュイメージングを使用して評価した。活性化可能抗体をAlexa Fluor-680（Invitrogen）で標識して、それぞれ、標識された活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０（本明細書において、１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０及びＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０とも呼ばれる）を生成する。また、標識された抗Jagged親抗体４Ｄ１１−ＡＦ６８０も試験した。上記したように、４Ｄ１１−ＡＦ６８０、１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０、及びＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０のそれぞれを、凍結ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍組織試料とインキュベートした。結果は、それぞれ図１０のパネルＡ、Ｂ、及びＣに示される。赤色の蛍光組織画像は、それぞれ４Ｄ１１抗体と、活性化可能抗体の組織由来のタンパク質分解切断によって活性化される４Ｄ１１抗体の、Jaggedへ結合を示す。パネルＤ、Ｅ、及びＦは、広域スペクトルプロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ（カタログ番号５３９１３４、EMD Millipoe）と５０マイクロモル（μＭ）ガラルジン（Galardin）（カタログ番号３６４２０５、Calbiochem Millipore）の１：１００希釈物で前処理した凍結ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍組織と、４Ｄ１１−ＡＦ６８０、１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０、及びＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０とをインキュベーション後に得られた蛍光画像を示す。パネルＥ及びＦ中の減少した赤色蛍光は、パネルＢとＣ中で見られる活性化可能抗体１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０及びＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０の結合が、組織由来プロテアーゼによる活性化可能抗体の切断により行われたことを示す：プロテアーゼ阻害剤カクテルは、このようなタンパク質分解を阻害した。青い染色は、ＤＡＰＩ核染色を示す。抗Jagged親抗体４Ｄ１１又は抗Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１の、凍結ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍組織への結合は、このような組織を、非標識抗Jagged親抗体４Ｄ１１で前処理することにより、又はこのような組織を、Jagged 1、Jagged 2、又はこれらの組合せで前処理することにより、阻害された。
【０３３０】
抗Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１の活性化もまた、ヒト膵臓癌組織のインサイチュイメージングにより評価した。４Ｄ１１−ＡＦ６８０−４Ｄ１１、１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０（１２０４）、及びＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０（ＰＬＧＬ）のそれぞれを、膵臓癌を有するヒト患者から分離された凍結組織試料とインキュベートした。結果は、それぞれ図１１の列１、行１、２、及び３中のパネルに示される。列２、３、及び４のパネルは、１０μｇ／ｍｌの抗体Ａ１１（Ａ１１は、マトリプターゼとしても知られているＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼの活性部位に特異的に結合する抗体である）（図１１、列２）で、５０μＭの広域スペクトルＭＭＰ阻害剤ガラルジン（Calbiochem, Millipore）（図１１、列３）で、又は広域スペクトルプロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ（カタログ番号５３９１３４、EMD Millipore）と５０μMガラルジンの１：１００希釈物（図１１、列４）で、前処理した凍結膵臓癌患者の組織を用いて、４Ｄ１１−ＡＦ６８０、１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０、及びＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０をインキュベーション後に得られた蛍光画像を示す。青い染色は、ＤＡＰＩ核染色を示す。結果は、膵臓組織試料が、その存在が各活性化可能抗体切断可能部分の切断を行う活性マトリプターゼ及びメタロプロテアーゼを産生し、それによりマスキング部分を解放し、組織上のJagged標的への活性化された抗体の安定な結合を可能にすることを示唆する。
【実施例８】
【０３３１】
抗Jagged活性化可能抗体のインサイチュイメージング
【０３３２】
本実施例は、抗Jagged活性化可能抗体の活性化と結合のために、膵臓癌の異種移植腫瘍組織及びヒト膵臓癌組織をスクリーニングするための、インサイチュイメージングの使用を記載する。結果は、本開示の抗Jagged活性化可能抗体が、そのような組織により発現されるプロテアーゼにより活性化されることができ、そのような組織上のJagged標的に結合することを示す。
【０３３３】
ＢｘＰＣ３腫瘍試料及びヒト膵臓癌組織試料を、１μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌ濃度の標識したそれぞれ抗Jagged抗体４Ｄ１１及び抗マトリプターゼＡ１１抗体を用いて、凍結組織の１時間の処理により、JaggedとＭＴ−ＳＰ１の発現についてプロフィール化した。結果は、それぞれ表１３の列２及び３に示される。
【０３３４】
さらに、抗Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１が、活性化され、ＢｘＰＣ３異種移植組織及びヒト膵臓癌組織に結合する能力を、インサイチュイメージングを使用して評価した。上記したように、活性化可能抗体をAlexa Fluor-680（Invitrogen）で標識した（実施例７）。これらの標識抗体、すなわち５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０（本明細書において１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０とも呼ばれる）、及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０（本明細書においてＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０とも呼ばれる）を、本明細書に記載のインサイチュイメージングのプロトコルに従って、凍結ＢｘＰＣ３異種移植組織と、又は４人の患者から分離されたヒト膵臓癌組織試料と、インキュベートした（実施例７）。表１３は、抗Jagged活性化可能抗体を活性化し、活性化された抗Jagged活性化可能抗体に結合する、ＢｘＰＣ３腫瘍及び膵臓癌患者の組織試料の能力を示している。表１３では、抗Jagged抗体４Ｄ１１又は抗マトリプターゼ抗体Ａ１１の組織試料への結合量（列２と３）を測定するＩＨＣ染色を、−から３＋にスコア化した：−、染色なし；１＋、弱い染色；２＋、中程度の染色；及び３＋、強い染色。インサイチュイメージング染色（列４と５）のスコア化は、４Ｄ１１抗体染色との比較に基づき、以下のように定義される：−、染色なし；１＋、親抗体と比較して弱い染色；２＋、親抗体と比較して中程度の染色；及び３＋、親抗体と比較して同程度の染色。ＢｘＰＣ３の結果も図１０に示される。
【表１３】
2020098195.tif 000020
【実施例９】
【０３３５】
抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体のインビボ及びエクスビボイメージング
【０３３６】
本明細書に提供される実施例は、本明細書において活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４と呼ばれる抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（本明細書において、３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４活性化可能抗体、又は３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４とも呼ばれる）を使用し、これは、ＥＧＦＲ結合配列、マスキング部分（ＭＭ）、及びプロテアーゼの基質である切断可能部分（ＣＭ）を含む。これらの例はまた、本明細書において、ＭＭとＥＧＦＲ結合配列との間に位置する非切断可能部分を含む、マスクされた抗体３９５４−ＮＳＵＢ−Ｃ２２５ｖ４と呼ばれるマスク化抗ＥＧＦＲ抗体構築物（また３９５４−ＮＳＵＢ−Ｃ２２５ｖ４マスク化抗体、又は３９５４−ＮＳＵＢ−Ｃ２２５ｖ４とも呼ばれる）を使用する。本明細書において提供される例は、これらの抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体構築物を使用するが、これらの方法は、任意の活性化可能抗体に適用可能であることを理解すべきである。
【０３３７】
３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体構築物は、以下の重鎖及び軽鎖配列を含む：
３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４活性化可能抗体重鎖ヌクレオチド配列：
［Ｃ２２５ｖ４（配列番号２４３）］
[caggtgcagctgaaacagagcggcccgggcctggtgcagccgagccagagcctgagcattacctgcaccgtgagcggctttagcctgaccaactatggcgtgcattgggtgcgccagagcccgggcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggagcggcggcaacaccgattataacaccccgtttaccagccgcctgagcattaacaaagataacagcaaaagccaggtgttttttaaaatgaacagcctgcaaagcaacgataccgcgatttattattgcgcgcgcgcgctgacctattatgattatgaatttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgcggctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgaactgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga]（配列番号２４３）
３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４活性化可能抗体重鎖アミノ酸配列：
［Ｃ２２５ｖ４（配列番号２４４）］
[QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*]（配列番号２４４）
３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４活性化可能抗体軽鎖ヌクレオチド配列：
［スペーサー（配列番号５）］［マスク（配列番号６）］［リンカー１（配列番号７）］［１２０４基質（配列番号８）］［リンカー２（配列番号９）］［Ｃ２２５ｖ４（配列番号２４７）］
[caaggccagtctggccag][tgcatctcacctcgtggttgtccggacggcccatacgtcatgtac][ggctcgagcggtggcagcggtggctctggtggatccggt][ctgagcggccgttccgataatcat][ggcagtagcggtacc][cagatcttgctgacccagagcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgtgtgagctttagctgccgcgcgagccagagcattggcaccaacattcattggtatcagcagcgcaccaacggcagcccgcgcctgctgattaaatatgcgagcgaaagcattagcggcattccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgagcattaacagcgtggaaagcgaagatattgcggattattattgccagcagaacaacaactggccgaccacctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag]（配列番号２４５）
３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４活性化可能抗体軽鎖アミノ酸配列：
［スペーサー（配列番号１１）］［マスク（配列番号１２）］［リンカー１（配列番号１３）］［１２０４基質（配列番号１４）］［リンカー２（配列番号１５）］［Ｃ２２５ｖ４（配列番号２４８）］
[QGQSGQ][CISPRGCPDGPYVMY][GSSGGSGGSGGSG][LSGRSDNH][GSSGT][QILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*]（配列番号２４６）
【０３３８】
３９５４−ＮＳＵＢ−Ｃ２２５ｖ４マスク化抗ＥＧＦＲ抗体構築物は、上記した３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ４活性化可能な抗ＥＧＦＲ抗体と同じ重鎖を含む。３９５４−ＮＳＵＢ−Ｃ２２５ｖ４マスク化抗ＥＧＦＲ抗体構築物は、以下の軽鎖配列を含む：
３９５４−ＮＳＵＢ−Ｃ２２５ｖ４マスク化抗体軽鎖ヌクレオチド配列：
［スペーサー（配列番号５）］［マスク（配列番号６）］［リンカー１−非切断可能基質−リンカー２（配列番号１９）］［Ｃ２２５（配列番号２４７）］
[caaggccagtctggccag][tgcatctcacctcgtggttgtccggacggcccatacgtcatgtac][ggctcgagcggtggcagcggtggctctggtggctcaggtggaggctcgggcggtgggagcggcggttct][cagatcttgctgacccagagcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgtgtgagctttagctgccgcgcgagccagagcattggcaccaacattcattggtatcagcagcgcaccaacggcagcccgcgcctgctgattaaatatgcgagcgaaagcattagcggcattccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgagcattaacagcgtggaaagcgaagatattgcggattattattgccagcagaacaacaactggccgaccacctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag]（配列番号２４９）
３９５４−ＮＳＵＢ−Ｃ２２５ｖ４マスク化抗体軽鎖アミノ酸配列：
［スペーサー（配列番号１１）］［マスク（配列番号１２）］［リンカー１−非切断可能基質−リンカー２（配列番号２０）］［Ｃ２２５ｖ４（配列番号２４８）］
[QGQSGQ][CISPRGCPDGPYVMY][GSSGGSGGSGGSGGGSGGGSGGS][QILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*]（配列番号２５０）
【０３３９】
３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ４活性化抗ＥＧＦＲ抗体に使用されるマスキング部分（ＭＭ）は、種々のヒト癌でアップレギュレートされることが知られている２つのセリンプロテアーゼ［ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、及び膜型セリンプロテアーゼ１（ＭＴ−ＳＰ１／マトリプターゼ）］により切断することができる。３９５４−ＮＳＵＢ−ｃ２２５ｖ４マスク化抗ＥＧＦＲ抗体は、非切断可能基質配列を含有し、プロテアーゼ耐性活性化可能抗体を与えるため、陰性対照として使用した。
【０３４０】
光学イメージングによるインビボの活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体分布の評価
ＨＴ２９異種移植腫瘍担持マウスに、１２．５ｍｇ／ｋｇのAlexa Fluor 750コンジュゲート化活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体を腹腔内注射した。イメージングの１時間前に、マウスに、クエンチしたＰＥＧ化Ｃｙ５．５基質プローブ（２ｎｍｏｌ）を静脈内注射した。活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体の注射の２４時間後、IVIS Spectrum/CT imaging system (Caliper LifeSciences)を使用して、マウスをイメージングした。この処置中、マウスを３７℃で気体麻酔（５％イソフルラン）下で維持した。７５０ｎｍでの標識活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体構築物の分布は、抗体活性化とＥＧＦＲ受容体結合の指標であるため、この波長でのイメージングを使用して、活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ４と非切断可能マスク化抗ＥＧＦＲ抗体３９５４−ＮＳＵＢ−ｃ２２５ｖ４との蓄積レベルを評価した。腫瘍組織内のプローブの活性化動態を追跡することにより、基質切断のレベルを評価するために、６８０ｎｍでのイメージングを使用した．最後に、剖検を使用して、エクスビボで生体内分布を評価した。結果は、図１３Ａ及び１３Ｂに示される。
【実施例１０】
【０３４１】
非標識抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体のインサイチュイメージング
【０３４２】
本実施例は、単一のプロテアーゼによって切断される基質を含む非標識抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体のインサイチュイメージングの使用を記載する。切断は、活性化可能抗体のＡＢ部分に特異的に結合する二次抗体を用いて検出された。結果は、非標識活性化可能抗体の活性化と結合を評価する能力を示す。
【０３４３】
Ｈ２９２異種移植腫瘍組織上の、基質１２０３（アミノ酸配列ＴＧＲＧＰＳＷＶ、配列番号１９６；ｕＰＡにより切断可能）を含有する非標識抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ５の活性化と結合のインサイチュイメージングは、以下のように行われた：凍結組織切片をスライドグラス上に置いた。非標識の抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体を含む溶液を、組織上に適用し、室温（約２２〜２４℃）で１時間、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００μＭのＺｎＣｌ2、５ｍＭのＣａＣｌ2、及び０．０５％のツイーン２０、約１μｇ／ｍｌ濃度の活性化可能抗体を含む）中でインキュベートした。このようなインキュベーションの条件は、例えば、溶液のｐＨ（例えば、約ｐＨ７〜約ｐＨ８．５の範囲内）、インキュベーションの温度（例えば、約２０℃〜約４０℃の範囲内、例えば室温又は３７℃）、インキュベーション時間（例えば、約１５分〜約１５０分の範囲内）、及び／又は活性化可能抗体濃度（例えば、約０．０５μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの範囲内）を変化させることにより、組織切片中の切断剤を助長するように調整することができる。次に、組織を広範囲に洗浄して、非結合物質を除去した。組織上の活性化抗体の存在は、ＦＩＴＣで標識された二次ヒトＩｇＧ抗体を使用して検出された。この検出の条件は、検出試薬と検出方法（例えば、蛍光標識）に調整することができる。例えば、蛍光タグを使用した時、組織を蛍光顕微鏡に供した。図１４に示されるように、抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０３−ｃ２２５ｖ５は、非標識セツキシマブ対照と比較して、標識された抗ヒトＩｇＧを使用して検出不可能な染色を示し、Ｈ２９２異種移植腫瘍試料が、あるとしても、非常に低レベルのｕＰＡを発現したことを示唆した。これに対して、活性化可能抗体３９５４−１２１０３−ｃ２２５ｖ５のインサイチュイメージング操作中の、組織への組換えｕＰＡの添加は、セツキシマブと同様の陽性染色を示し、非標識活性化可能抗体と、活性化可能抗体に特異的に結合する二次試薬、例えば標識抗体、とを用いるインサイチュイメージングを実施することが可能であることを示した。
【実施例１１】
【０３４４】
組織マイクロアレイを用いたインサイチュイメージング
【０３４５】
本例は、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）中での発現及び／又は活性化を検出するための、活性化可能抗体の使用を説明する。抗Jagged抗体４Ｄ１１を、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）ＴＭＡ及び乳癌（ＢＣ）ＴＭＡとともに使用した。ＮＳＣＬＣ及びＢＣ患者の腫瘍試料のほとんどは、Jagged発現が陽性であった。同じＮＳＣＬＣ及びＢＣのＴＭＡを、本明細書において５３４２−１２０４−４Ｄ１１と呼ぶ活性化可能抗Jagged抗体と接触させた。ＮＳＣＬＣの９７％とＢＣ患者の腫瘍試料の１００％は、５３４２−１２０４−４Ｄ１１活性化可能抗Jagged抗体の結合と活性化が陽性であった。さらに図２１に示されるように、ＢＣ患者腫瘍試料の８０％超は、高活性化率（＋＋又は＋＋＋）と解析された。同じＮＳＣＬＣとＢＣのＴＭＡを、プロテアーゼＭＴ−ＳＰ１に結合するＡ１１抗体と接触させた。ＮＳＣＬＣの７７％とＢＣ患者の腫瘍試料の９８％がＭＴ−ＳＰ１活性が陽性であった。８個のＮＳＣＬＣ腫瘍は、ＭＴ−ＳＰ１活性が欠如していたが、５３４２−１２０４−４Ｄ１１活性化可能な抗Jagged抗体の結合と活性化を示し、これは、５３４２−１２０４−４Ｄ１１活性化可能な抗Jagged抗体の活性化におけるプロテアーゼの関与を示唆している。
【実施例１２】
【０３４６】
細針吸引試料のインサイチュイメージング
【０３４７】
本実施例は、Ｈ２９２異種移植研究からの細針吸引試料にインサイチュイメージングを使用する方法について記載する。簡単に説明すると、以下の吸引方法が使用された：結節をピンセットで採取後に固定化した。クリニックで使用されるゲージ（例えば２２〜２５）に最も近い２３ゲージ針を、前後運動で約２０秒間僅かに吸引して使用した。針は小さなバイアル中に空にして、直ちにドライアイスで凍結した。異種移植片は、吸引処置後に採取し、吸引試料と一致するように標識し、抽出後すぐに凍結した。
【０３４８】
次に、細針吸引（ＦＮＡ）試料を、標識された親抗ＥＧＦＲ抗体（セツキシマブ−ＡＦ６８０）、標識され抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＡＦ６８０）、又は標識された抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体（３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＡＦ６８０）に、広域スペクトルプロテアーゼ阻害剤（ＢＳＰＩ）（Broad Spectrum Protease Inhibitor Set III, EDTA Free, Catalog No. 539134, Calbiochem, Millipore, Billerica, MA）及び５０ｍＭの広域スペクトルＭＭＰ阻害剤ガラルジン（カタログ番号３６４２０５、Calbiochem, Millipore）の存在下で、接触させた。２つの対象からの結果は、図２２と２３に示される。親抗体と活性化可能抗体の染色が、すべての３つの試料で見られた。
【０３４９】
すなわち、これらの結果は、十分な数の細胞を含むＦＮＡ試料において、本明細書で提供されるインサイチュイメージング技術が、本明細書に記載の任意の診断方法において有用であることを示す。
【実施例１３】
【０３５０】
癌細胞株におけるコールド競合を用いる抗Jagged抗体及び活性化可能抗Jagged抗体のインビボイメージング
【０３５１】
本明細書に提供される研究は、抗Jagged抗体４Ｄ１１と活性化可能な抗Jagged抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１を使用する。抗Jagged抗体及び活性化可能な抗Jagged抗体は、ヒト原発性膵臓腺癌細胞株であるＢｘＰＣ３細胞を用いて試験した。
【０３５２】
本明細書に記載の研究は、「コールド」４Ｄ１１前処理対照を用いたインビボイメージングによるＢｘＰＣ３異種移植腫瘍における、抗Jagged抗体４Ｄ１１と抗Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１の蓄積を評価するために設計された。研究の最初のセットで使用される群の概要は、以下の表１４に示される：
【表１４】
2020098195.tif 000021
【０３５３】
抗Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１の活性化を、受容体占有率のイメージング（図２４Ａ）によって推定した。
【０３５４】
図２４Ａ及び図２４Ｂに見られるように、インビボイメージング結果（図２４Ｂ）は、エクスビボイメージング結果（図２４Ｃ）と相関した。
【実施例１４】
【０３５５】
癌細胞株におけるコールド競合を用いる活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体のインビボイメージング
【０３５６】
本明細書に提供される試験は、活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ５を使用する。活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体は、ヒト非小細胞肺癌細胞株であるＨ２９２細胞を用いて試験した。
【０３５７】
本明細書に記載の試験は、「コールド」Ｃ２２５ｖ５前処理対照を用いたインビボイメージングによる、Ｈ２９２異種移植腫瘍における、活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ５の蓄積を評価するために設計された。研究の最初のセットで使用される群の概要は、以下の表１５に示される：
【表１５】
2020098195.tif 000022
【０３５８】
抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５の活性化は、受容体占有率（図２５）のイメージングによって評価された。
【０３５９】
ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍モデルにおいて、「コールド」競合を用いる、抗Jagged抗体４Ｄ１１と活性化可能抗Jagged抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１のインビボイメージング、及びＨ２９２異種移植腫瘍モデルにおいて、「コールド」競合を用いる、活性化可能抗ＥＧＦＲ抗体３９５４−１２０４−ｃ２２５ｖ５のインビボイメージングは、これらの方法が、抗体結合の検出のための実行可能な方法であることを示した。このように、これらの方法は、インビボ腫瘍モデルにおいて基質の切断性をスクリーニングするのに有用である。
【実施例１５】
【０３６０】
ヒト多発性骨髄腫の骨髄生検薄片化手順
【０３６１】
取り扱いが困難な骨髄や他の組織を薄片化し染色する方法を開発するために、適切なプロトコルを確立する前に、いくつかの手順を試験した。最初に、使い捨て刃 を使用するルーチン薄片化手順を試みた。次に、硬い試料で使用される時、より大きな安定性と少ない振動を有するため、１６ｃｍの炭化タングステンナイフを評価した。次に、以下のように粘着テープの使用を試みた：組織を粘着テープの上に置き、次に薄片化した；組織が直接スライドに接触するように、粘着テープに接着した組織をスライド上に置いた；テープの除去と組織切片への移動のための様々な方法を試みたが、成功しなかった；そのような方法は、スライドへの組織切片の接着のために許可される温度と時間の効果を評価することを含んだ。これらの失敗が、染色操作中に試料をスライドに移動させることを試みず、組織切片を粘着テープ上に残すことの評価につながり、その結果、後述の成功したプロトコルが得られた。以下のプロトコルは、骨髄組織の薄片化と染色を記載するが、この方法はまた、他の困難な組織の薄片化と染色にも使用することができることを理解されたい。
【０３６２】
多発性骨髄腫の患者から分離された骨髄生検組織を、−３０℃に設定したクライオスタットに入れ、その温度に達した後、薄片化した。組織をチャックに接着し、チャックをチャックホルダーに挿入した後、粘着テープ片をブロックの表面に塗布した。接着テープをプラスチック製のローラーで圧延して、接着を促進させた。テープの下端を鉗子で固定しながら、ブロックをゆっくりと刃に降ろし、薄片を取った。１６ｃｍの炭化タングステンナイフを使用して組織を７ミクロン（μｍ）で薄片化し、組織切片を−３０℃で粘着テープ上に置き、−８０℃で長期間保存した。
【０３６３】
後述するように、得られた組織切片を、各免疫蛍光染色プロトコルを用いて、直接接着テープ上で染色した。標準的ＩＨＣプロトコルを含む任意の適切なＩＨＣプロトコルを、これらの方法で使用することができる。本明細書に記載の試験では、以下の免疫蛍光染色プロトコルが使用された。
【０３６４】
抗Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１が、活性化され、多発性骨髄腫腫瘍組織に結合する能力を、インサイチュイメージングを使用して評価した。活性化可能抗体を、Alexa Fluor（登録商標）488（Invitrogen）で標識して、標識された活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ４８８（本明細書において１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ４８８とも呼ばれる）を作製した。標識された抗Jagged 親抗体４Ｄ１１−ＡＦ４８８も試験した。抗Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ４８８陽性多発性骨髄腫細胞を同定するために、悪性多発性骨髄腫（ＭＭ）形質細胞マーカーであるＣＤ１３８（eBiosciences）を同時に染色した。抗Jagged抗体４Ｄ１１−ＡＦ４８８、抗Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ４８８、及び抗Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ４８８のそれぞれを、広域スペクトルプロテアーゼ阻害剤（ＢＰＳＩ）の存在下で、ＣＤ１３８とのカクテル中で凍結多発性骨髄腫腫瘍組織試料とともに、室温（約２２〜２４℃）で１時間、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００μＭのＺｎＣｌ2、５ｍＭのＣａＣｌ2、１％のＢＳＡ、及び０．０５％のツイーン２０、約２μｇ／ｍｌ濃度の活性化可能抗体；５μｇ／ｍｌ濃度のＣＤ１３８を含む）中でインキュベートした。次に、組織を広範囲に洗浄して、非結合物質を除去した。４Ｄ１１−ＡＦ４８８と１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ４８８のシグナルを、ウサギ抗ＡＦ４８８で増幅した。ウサギ抗ＡＦ４８８は、３％ＢＳＡ中５μｇ／ｍｌの濃度で、室温で３０分間インキュベートした。次に、組織を広範囲に洗浄して、非結合物質を除去した。４Ｄ１１−ＡＦ４８８と１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ４８８の検出は、３％ＢＳＡ中５μｇ／ｍｌのマウス抗ウサギＡＦ６４７を用いて行なった。ＣＤ１３８の検出は、３％ＢＳＡ中５μｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＧ  ＡＦ４８８を用いて行なった。抗ウサギＩｇＧ  ＡＦ６４７と抗マウスＩｇＧ  ＡＦ４８８はカクテルとして適用し、室温で３０分間インキュベートした。
【０３６５】
結果は図２６と２７に示される。図２６は、多発性骨髄腫の骨髄生検組織が、Jagged（抗Jagged抗体４Ｄ１１による染色によって示される）及びＣＤ１３８（抗ＣＤ１３８抗体による染色によって示される）を発現することを示す。図２７は、抗Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１が、多発性骨髄腫の骨髄生検組織により活性化され、そのような活性化が広域スペクトルプロテアーゼ阻害剤の存在下で阻害されることを示す。
【０３６６】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明に則して記載したが、以上の記載は本発明の範囲を例示することを意図するものであり、これを限定することを意図するものではない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定められる。他の側面、利点、及び変形例も、添付の特許請求の範囲内に含まれる。
【図１】
2020098195.tif 000023
【図２Ａ】
2020098195.tif 000024
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020098195.tif 000030
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ−Ｃ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月15日(2019.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の活性化可能抗体を用いて、第２の活性化可能抗体による治療対象の患者を選択するインビトロの方法であって、
前記第１の活性化可能抗体は、非切断状態において、
（ｉ）標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）と、
（ii）前記ＡＢに連結された、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである切断可能部分（ＣＭ）と、
（iii）前記ＣＭを介して前記ＡＢに連結されたマスキング部分（ＭＭ）と
を含み、
ここで、前記第１の活性化可能抗体が前記ＣＭにおいて切断されると、前記第１の活性化可能抗体が活性化されると共に、前記第１の活性化可能抗体が非切断状態にある場合には、前記ＭＭが前記標的に対する前記ＡＢの特異的結合と干渉することにより、前記標的に対する前記ＡＢの結合が阻害されるように構成され、
前記第２の活性化可能抗体は、非切断状態において、
（ｉ）前記第１の活性化可能抗体と同一の標的に特異的に結合するＡＢと、 
（ii）前記第１の活性化可能抗体と同一のプロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるＣＭと、
（iii）前記ＣＭを介して前記ＡＢに連結されたＭＭと
を含み、
ここで、前記第２の活性化可能抗体が非切断状態にある場合には、前記ＭＭが前記標的に対する前記ＡＢの特異的結合と干渉するように構成され、
前記方法は、
Ｉ．前記患者から採取され、支持マトリックスに結合された組織試料内における、共局在化する切断剤及び標的の存在又は不在を検出する工程
を含むと共に、前記工程Ｉにおける検出は、
（ａ）前記第１の活性化可能抗体を非切断状態で前記組織試料と接触させ、
（ｂ）前記組織試料を前記支持マトリックスに結合されたまま洗浄し、
（ｃ）前記組織試料内に活性化状態の前記第１の活性化可能抗体が検出可能なレベルで存在するか否かを原位置（in situ）で測定する
ことを含み、
ここで、前記組織試料内に活性化状態の前記第１の活性化可能抗体が検出可能なレベルで存在する場合には、前記患者は前記標的及び前記プロテアーゼの両方の存在について陽性であると共に、前記組織試料内に活性化状態の前記第１の活性化可能抗体が検出可能なレベルで存在しない場合には、前記患者は前記標的及び前記プロテアーゼの両方の存在について陰性であり、
ここで、前記工程Ｉにおいて前記患者が前記標的及び前記プロテアーゼの両方の存在について陽性であると判断された場合、前記患者が、非切断状態にある前記第２の活性化可能抗体の治療有効量による治療対象として選択される、方法。
【請求項２】
前記組織試料内に活性化状態の前記第１の活性化可能抗体が検出可能なレベルで存在するか否かの原位置での測定が、検出可能な標識に連結された前記第１の活性化可能抗体を用いて、或いは、活性化状態の前記第１の活性化可能抗体に特異的に結合する、検出可能な標識を含む二次試薬を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の活性化可能抗体と前記第２の活性化可能抗体とが同一である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の活性化可能抗体と前記第２の活性化可能抗体とが異なる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記組織試料が凍結組織試料である、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記組織試料が腫瘍組織試料である、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記患者が、癌に罹患している患者、癌に罹患する虞がある患者、又は癌に罹患していると疑われる患者である、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記患者が、炎症性疾患に罹患している患者、炎症性疾患に罹患する虞がある患者、又は炎症性疾患に罹患していると疑われる患者である、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＡＢが、ベバシズマブ、ラニビズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、ナタリズマブ、バシリキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、チウキセタン、リツキシマブ、オセルリズマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、ダクリズマブ、ブレンツキシマブベドチン、ゲムツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、アレムツズマブ、アブシキシマブ、オマリズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、パリビズマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、Ｈｕ５ｃ８、ペルツズマブ、エルツマキソマブ、アバタセプト、タネズマブ、バビツキシマブ、ザルツムマブ、マプタムマブ、マツズマブ、ニモツズマブ、ＩＣＲ６２、ｍＡｂ５２８、ＣＨ８０６、ＭＤＸ−４４７、エドレコロマブ、ＲＡＶ１２、ｈｕＪ５９１、エタネルセプト、アレファセプト、アナキンラ、ＧＣ１００８、アデカツムマブ、フィギツムマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、及びデノスマブからなる群から選択される抗体、又は、前記群から選択される抗体の抗原結合断片である、請求項１〜８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＡＢが、１−９２−ＬＦＡ−３、抗ルイス−Ｙ、アペリンＪ受容体、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＳ補体、Ｃ−２４２、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤＩ１７、ＣＤ１３２、（ＩＬ−２ＲＧ）、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤＩ７２Ａ、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ６（ＮＣＡ−９０）、ＣＬＡＵＤＩＮ−３、ＣＬＡＵＤＩＮ−４、ｃＭｅｔ、コラーゲン、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＳＦＲ、ＣＳＦＲ−１、ＣＴＬＡ−４、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬＩ０、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲＩ、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＹＲ６１、ＤＬ４４、ＤＬＬ４、ＤＰＰ−４、ＥＧＦＲ、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）、ＥｐＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＲＢＢ３、ＲＳＶのＦタンパク質、ＦＡＰ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ８、ＦＧＦＲＩ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、葉酸受容体、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦＲ、ＧＬＵＴＩ、ＧＬＵＴ４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＧＰ IIｂ／IIIａ受容体ｓ、Ｇｐｌ３０、ＧＰIIＢ／IIIＡ、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ｈＧＨ、ヒアルロニダーゼ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体（ＦｃｅＲＩ）、ＩＧＦ、ＩＧＦＩＲ、ＩＬＩＢ、ＩＬＩＲ、ＩＬ２、ＩＬＩ１、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１２Ｒｂｅｔａｌ、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１５、ＩＬＩ７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２３、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７／ＩＬ２７Ｒ（ｗｓｘｌ）、ＩＬ２９、ＩＬ−３ＩＲ、ＩＬ３ｌ／ＩＬ３１Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、インシュリン受容体、Ｊａｇｇｅｄリガンド、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、ＬＩＦ−Ｒ、ＭＲＰ４、ＭＵＣＩ、ムチン−１６、Ｎａ／Ｋ ＡＴＰａｓｅ、好中球エラスターゼ、ＮＧＦ、ニカストリン、Ｎｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、ＮＯＶ、ＯＳＭ−Ｒ、ＰＡＲ２、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＰＤ−Ｉ、ＰＤ−ＬＩ、ＰＤ−Ｌ２、ホスファチジル−セリン、ＰＩＧＦ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＡＧ１２、ＲＡＧＥ、ＳＬＣ４４Ａ４、スフィンゴシンＩリン酸、ＴＧＦβ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＩＬ−ＲＩ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、ＴＲＫ−Ａ、ＴＲＫ−Ｂ、ｕＰＡＲ、ＶＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＲＩ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＷＩＳＰ−Ｉ、ＷＩＳＰ−２、ＷＩＳＰ−３、α−４インテグリン、α−Ｖインテグリン、及びα４βｌインテグリンからなる群より選択される標的に結合する抗体、又は、前記群から選択される標的に結合する抗体の抗原結合断片である、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、検出可能な標識に連結された前記第１の活性化可能抗体を用いて実施される、請求項１〜１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、活性化状態の前記第１の活性化可能抗体に特異的に結合する、検出可能な標識を含む二次試薬を用いて実施される、請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出可能な標識が、造影剤、コントラスト剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、放射性同位体、１若しくは２以上の金属イオン、又はリガンドに基づく標識である、請求項１〜１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出可能な標識が蛍光色素である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
非切断状態の前記の第１及び／又は第２の活性化可能抗体が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭの構造を有する、請求項１〜１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体の抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、及びｓｃＡｂからなる群より選択される、請求項１〜１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＭＭの前記ＡＢに対する結合の平衡解離定数が、前記ＡＢの前記標的に対する平衡解離定数よりも大きい、請求項１〜１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＭＭが、前記標的への結合について、切断状態の前記ＡＢと干渉又は競合しない、請求項１〜１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＭＭが、４０アミノ酸長以下のポリペプチドである、請求項１〜１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＭＭのポリペプチドのアミノ酸配列が、前記標的のアミノ酸配列と異なると共に、前記ＡＢの天然結合パートナーの何れに対しても、５０％以上のアミノ酸配列同一性を有さない、請求項１〜１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＭＭが、前記標的に対して２５％を超えるアミノ酸配列同一性を有さない、請求項１〜２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＭＭが、前記標的に対して１０％を超えるアミノ酸配列同一性を有さない、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣＭが、ＡＤＡＭＳ、ＡＤＡＭＴＳ、アスパラギン酸プロテアーゼ、アスパラギン酸カテプシン、カスパーゼ、システインカテプシン、システインプロテイナーゼ、ＫＬＫ、メタロプロテイナーゼ、ＭＭＰ、セリンプロテアーゼ、凝固因子プロテアーゼ、及びII型膜貫通セリンプロテアーゼからなる群より選択されるプロテアーゼの基質である、請求項１〜２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＭが、ＡＤＡＭＳ、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭＩ０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭＩＳ、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭＤＥＣＩ、ＡＤＡＭＴＳＩ、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＢＡＣＥ、Ｒｅｎｉｎ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１４、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＶ／Ｌ２、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、クルジパイン、レグメイン、オトゥバイン−２、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫＩ０、ＫＬＫＩ１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、メプリン、ネプリライシン、ＰＳＭＡ、ＢＭＰ−１、ＭＭＰＩ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２３、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、活性化タンパク質Ｃ、カテプシンＡ、カテプシンＧ、キマーゼ、ＦＶＩｌａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩａ、エラスターゼ、グランザイムＢ、ＢＧグアニジノベンゾアターゼ、ＨｔｒＡｌ、ヒト好中球エラスターゼ、ラクトフェリン、マラプシン、ＮＳ３／４Ａ、ＰＡＣＥ４、プラスミン、ＰＳＡ、ｔＰＡ、トロンビン、トリプターゼ、ｕＰＡ、ＤＥＳＣＩ、ＤＰＰ−４、ＦＡＰ、ヘプシン、マトリプターゼ−２、ＭＴ−ＳＰＩ／マトリプターゼ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、及びＴＭＰＲＳＳ４からなる群より選択されるプロテアーゼの基質である、請求項１〜２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＭが、１５アミノ酸長以内のポリペプチドである、請求項１〜２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記の第１及び／又は第２の活性化可能抗体が、前記ＭＭと前記ＣＭとの間に連結ペプチドを含む、請求項１〜２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記の第１及び／又は第２の活性化可能抗体が、前記ＣＭと前記ＡＢとの間に連結ペプチドを含む、請求項１〜２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記の第１及び／又は第２の活性化可能抗体が、第１の連結ペプチド（ＬＰ１）及び第２の連結ペプチド（ＬＰ２）を含むと共に、非切断状態における前記の第１及び／又は第２の活性化可能抗体が、Ｎ末端からＣ末端に向かってＭＭ−ＬＰ１−ＣＭ−ＬＰ２−ＡＢ又はＡＢ−ＬＰ２−ＣＭ−ＬＰ１−ＭＭの配置を有する、請求項１〜２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記２つの連結ペプチドが必ずしも互いに同一ではない、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＬＰ１及びＬＰ２のうち少なくとも一方が、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３）、及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３４）からなる群（ここでｎは１以上の整数を表す。）より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ＬＰ１及びＬＰ２のうち少なくとも一方が、ＧＧＳＧ（配列番号３５）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３６）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３７）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３８）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３９）、及びＧＳＳＳＧ（配列番号４０）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
非切断状態における前記の第１及び／又は第２の活性化可能抗体がスペーサーを含むと共に、前記スペーサーが前記ＭＭに直接連結され、Ｎ末端からＣ末端に向かってスペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢの配置を有する、請求項１〜３１の何れか一項に記載の方法。
【請求項３３】
非切断状態における前記の第１及び／又は第２の活性化可能抗体がスペーサーを含むと共に、前記スペーサーが前記ＭＭに直接連結され、Ｎ末端からＣ末端に向かってＡＢ−ＣＭ−ＭＭ−スペーサーの配置を有する、請求項１〜３１の何れか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記支持マトリックスがスライドである、請求項１〜３３の何れか一項に記載の方法。