(57)【要約】【課題】これまで小仕込み試験後の上槽酒の成分分析により行われてきた、酵母の醸造特性の判定を簡略化する方法を提供する。【解決手段】リンゴ酸低生産株を得るための酵母の醸造特性を判定する方法であって、酵母のゲノムにおける第２染色体の異数性を分析する工程を含む。リンゴ酸低生産株のゲノムの第２染色体の染色体数を第３染色体の染色体数で除した値を（Ａ）とし、リンゴ酸低生産株の親株のゲノムの第２染色体の染色体数を第３染色体の染色体数で除した値を（Ｂ）としたとき、Ａ＞Ｂである場合にリンゴ酸低生産株であると判定する判定工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンゴ酸低生産株を得るための酵母の醸造特性を判定する方法であって、
前記酵母のゲノムにおける第２染色体の異数性を分析する工程を含む酵母の醸造特性を判定する方法。
【請求項２】
前記リンゴ酸低生産株の前記ゲノムの前記第２染色体の染色体数を第３染色体の染色体数で除した値を（Ａ）とし、前記リンゴ酸低生産株の親株のゲノムの第２染色体の染色体数を第３染色体の染色体数で除した値を（Ｂ）としたとき、Ａ＞Ｂである場合にリンゴ酸低生産株であると判定する判定工程を含む請求項１に記載の酵母の醸造特性を判定する方法。
【請求項３】
前記判定工程において、前記Ａ／Ｂの値が１．２８以上である場合にリンゴ酸低生産株であると判定する請求項２に記載の酵母の醸造特性を判定する方法。
【請求項４】
前記酵母として、前記リンゴ酸低生産株によるリンゴ酸生産量が、前記リンゴ酸低生産株の親株によるリンゴ酸生産量の８５％以下であるものが選択される請求項１〜３の何れか一項に記載の酵母の醸造特性を判定する方法。
【請求項５】
前記酵母の親株は、きょうかい酵母９号、又はきょうかい酵母１８０１号である請求項１〜４の何れか一項に記載の酵母の醸造特性を判定する方法。
【請求項６】
リンゴ酸低生産株を得るための酵母の育種方法であって、
（１）培地上に前記酵母を培養する工程と、
（２）前記培地に形成された前記酵母のコロニーごとに第２染色体の異数性を分析する工程と、
（３）前記コロニー間において、前記酵母の第２染色体の異数性を比較する工程と、
（４）前記比較結果に基づいて、前記リンゴ酸低生産株を選択する工程と、
を含む酵母の育種方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンゴ酸低生産株を得るための酵母の醸造特性を判定する方法、及び酵母の育種方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
清酒における消費者の嗜好は、時に大きく変わり、その嗜好に合った清酒を製造するための醸造特性を備える清酒酵母を選択し、育種することが必要である。消費者の嗜好に合った清酒酵母を得るためには、新たな形質を獲得した株をできるだけ多く培養し、その中から、目的の醸造特性を有する酵母を正確かつ簡便に選択し、育種することが望ましい。
【０００３】
また、消費者の嗜好に大きくかかわる清酒の要素としては、酸度、芳香、うま味等が挙げられる。清酒における最近の消費者の嗜好としては、飲み易く、後味のすっきりとした淡麗辛口の味が好まれる傾向にある。
【０００４】
清酒の酸味やうま味は、有機酸の組成や量によって左右される。例えば、有機酸に含まれるリンゴ酸は、爽やかな酸味を与えることが知られている。リンゴ酸は芳香性が高く、清酒では好ましい味となりうるため、リンゴ酸高生産性酵母が醸造業界では広く用いられている。しかしながら、淡麗辛口の清酒においては、酸度を低くする必要があり、清酒中のリンゴ酸含有量が過多になると、酸味が強調され、清酒には好ましくない刺激（突き刺す感じ）が際立ち、清酒の飲みやすさを低下させる虞がある。また、清酒のうま味と香りとのバランスが損なわれる虞もある。したがって、淡麗辛口の酒質でありながら、適度な刺激で飲み易く、すっきりとした味の清酒を製造するには、有機酸、特にリンゴ酸の含有量の少ない清酒を製造する酵母を得ることが望ましい。
【０００５】
消費者の嗜好に合った清酒を製造するための酵母の育種では、従来、二倍体、又は二倍体以上の親株に直接変異処理を行うことが多かった。しかしながら、二倍体株には、各染色体が２本ずつ存在するため、劣性変異株を取得することが困難であった。例えば、特許文献１には、淡麗辛口の清酒を製造するために酸度を低くする酵母を選択する方法として、有機酸低生産性のきょうかい酵母１８０１号が、きょうかい酵母９号ときょうかい酵母１６０１号から一倍体株を単離後、交雑して、育種された株であることが先行技術として記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１４−０１８１０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１の酵母を選択する方法では、劣性変異株の性質を発現させるために、二倍体である親株に変異処理としてＵＶ処理を行い、ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ：Ｌｏｓｓ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）を誘発させてから、ホモ接合体を取得する必要がある。このようなホモ接合体の取得頻度は、２．５×１０−３であり、親株とは異なる性質を有する酵母を多数得ることが困難であった。また、得られた変異株の酒質は、酵母の段階ではわからず、小仕込み後の上槽酒について成分分析をすることにより判明する。そのため、得られた変異株の中から、消費者の嗜好にあった清酒の製造に適した酵母を得るためには、研究・開発者などの現場担当者（以下、担当者と称す）の多量の労力と時間が必要であった。
【０００８】
淡麗辛口の清酒の繊細な味わいを安定的に作り出すためには、日本酒度が高く、酸度が低くなる酵母を厳選し、使用することが望まれる。しかしながら、そのような醸造特性を有する酵母を選択するためには、通常、ある程度の総米量で小仕込み試験を行う必要があるが、一度に１０菌株程度が限界であった。また、小仕込み試験は、担当者の経験や環境条件によって上槽酒（日本国酒税法で定める清酒に相当し、同法は断りがない限り、本発明出願日のものを適用する）の成分が変動することもあり、客観性に欠けることもあった。小仕込み試験前の酵母の段階で、リンゴ酸が低生産となるような酵母を選択することについては、上記特許文献を含めて具体的に明らかにされている技術は殆ど見られない。
【０００９】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、これまで、小仕込み試験後の上槽酒の成分分析により行われてきた、酵母の醸造特性の判定を簡略化することを目的とする。また、リンゴ酸低生産性の酵母を育種することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するための本発明に係る酵母の醸造特性を判定する方法の特徴構成は、
リンゴ酸低生産株を得るための酵母の醸造特性を判定する方法であって、
前記酵母のゲノムにおける第２染色体の異数性を分析する工程を含むことにある。
【００１１】
発明者らは、二倍体株から得られた一倍体株の異数性について検討したところ、第２染色体の染色体数と、リンゴ酸生産性とに相関があることを見い出した。本構成の醸造特性を判定する方法によれば、酵母のゲノムにおける第２染色体の異数性を分析することにより、実際に小仕込み試験をすることなく、リンゴ酸低生産性の判定を簡略化し、酵母を選択することが可能となる。そのため、担当者による多量の試行錯誤を行うことなく、正確かつ容易に目的の酵母を取得することができる。
【００１２】
本発明に係る酵母の醸造特性を判定する方法において、
前記リンゴ酸低生産株の前記ゲノムの前記第２染色体の染色体数を第３染色体の染色体数で除した値を（Ａ）とし、前記リンゴ酸低生産株の親株のゲノムの第２染色体の染色体数を第３染色体の染色体数で除した値を（Ｂ）としたとき、Ａ＞Ｂである場合にリンゴ酸低生産株であると判定する判定工程を含むことが好ましい。
【００１３】
本構成の酵母の醸造特性を判定する方法によれば、リンゴ酸低生産株のゲノムの第２染色体の染色体数を第３染色体の染色体数で除した値を（Ａ）とし、リンゴ酸低生産株の親株のゲノムの第２染色体の染色体数を第３染色体の染色体数で除した値を（Ｂ）としたとき、Ａの値がＢの値よりも大きくなることを指標とすることにより、倍数性が異なる株間であっても、小仕込み試験をすることなく、リンゴ酸低生産性の判定を簡略化し、酵母を選択することができる。また、親株のゲノムの第２染色体の染色体数を第３染色体の染色体数で除した値（Ｂ）を基準として判定するため、より正確な判定を行うことができる。そのため、担当者による多量の試行錯誤を行うことなく、正確かつ容易に目的の酵母を取得することが可能となる。
【００１４】
本発明に係る酵母の醸造特性を判定する方法において、
前記判定工程において、前記Ａ／Ｂの値が１．２８以上である場合にリンゴ酸低生産株であると判定することが好ましい。
【００１５】
本構成の酵母の醸造特性を判定する方法によれば、Ａ／Ｂの値が１．２８以上であることを指標とすることにより、株間で倍数性が異なる場合であっても、小仕込み試験をすることなく、リンゴ酸低生産性の判定を簡略化し、酵母をより確実に選択することができる。また、親株のゲノムの第２染色体の染色体数を第３染色体の染色体数で除した値（Ｂ）を基準として判定するため、より正確な判定を行うことができる。そのため、担当者による多量の試行錯誤を行うことなく、正確かつ容易に目的の醸造特性を有する酵母を取得することが可能となる。
【００１６】
本発明に係る酵母の醸造特性を判定する方法において、
前記酵母として、前記リンゴ酸低生産株によるリンゴ酸生産量が、前記リンゴ酸低生産株の親株によるリンゴ酸生産量の８５％以下であるものが選択されることが好ましい。
【００１７】
本構成の酵母の醸造特性を判定する方法によれば、清酒に含まれるリンゴ酸の含有量を抑えた酸度の低い清酒を製造する酵母を得ることが可能となる。
【００１８】
本発明に係る酵母の醸造特性を判定する方法において、
前記酵母の親株は、きょうかい酵母９号、又はきょうかい酵母１８０１号であることが好ましい。
【００１９】
本構成の酵母の醸造特性を判定する方法によれば、親株として、従来から優れた清酒を醸し出すことが知られるきょうかい酵母９号（Ｋ−９と称す）や、もともとＫ−９等と比較して、リンゴ酸を含めた有機酸生成が少ない高エステル生成酵母であるきょうかい酵母１８０１号（Ｋ−１８０１と称す）を使用することにより、これらの特徴を有した、又は更に向上したリンゴ酸低生産性酵母を得ることが可能となる。その結果、まろやかな味わいや華やかな香りを保持つつ、リンゴ酸低生産性である優良な酵母を取得することが可能となる。
【００２０】
上記課題を解決するための本発明に係る酵母の育種方法の特徴構成は、
リンゴ酸低生産株を得るための酵母の育種方法であって、
（１）培地上に前記酵母を培養する工程と、
（２）前記培地に形成された前記酵母のコロニーごとに第２染色体の異数性を分析する工程と、
（３）前記コロニー間において、前記酵母の第２染色体の異数性を比較する工程と、
（４）前記比較結果に基づいて、前記リンゴ酸低生産株を選択する工程と、
を含むことにある。
【００２１】
本構成の酵母の育種方法によれば、培地に酵母を培養し、形成された酵母のコロニーごとに第２染色体の異数性を分析して、コロニー間において比較し、第２染色体の染色体数が相対的に大きいコロニーを選択することで、多数のコロニーの中から、小仕込み試験をすることなく、リンゴ酸低生産性酵母を取得することができる。その結果、リンゴ酸の含有量を抑えた酸度の低い清酒を製造する酵母を育種することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明者らは、先ず、二倍体株であるＫ−９から一倍体株を取得し、一倍体株の性質を明らかにすることを目的として、次世代シーケンサーによる全ゲノムシーケンス解析を行った。一倍体株について、各染色体の異数性を分析し、比較したところ、第２染色体の染色体数が相対的に大きいグループと、相対的に小さいグループとが存在していた。また、これらの一倍体株について、小仕込み試験を行い、上槽酒の成分分析を行ったところ、第２染色体の染色体数が相対的に大きいグループは、第２染色体の染色体数が相対的に小さいグループと比較して、上槽酒に含まれるリンゴ酸の濃度が低くなる傾向がみられた。また、二倍体株は第３染色体を２本、一倍体株は第３染色体を１本有するが、一倍体株であっても、第２染色体が２本のものや、３本のものが存在することが明らかとなった。この異数性に着目して、酵母の醸造特性の判定を行うことができるとの知見が得られた。
【００２３】
本発明に係る酵母の醸造特性を判定する方法、及び酵母の育種方法に関する実施形態について、以下に具体的に説明する。ただし、本発明は、以下に説明する実施形態に記載されている構成に限定されることを意図しない。
【００２４】
［酵母の醸造特性を判定する方法］
酵母には、第１〜１６染色体が存在することが知られている。本発明に係る酵母の醸造特性を判定する方法は、酵母の第２染色体の異数性を分析、比較することにより、リンゴ酸低生産株であるか否かを判定するものである。当該判定は、菌株間で第２染色体の染色体数を比較することによって行うことができる。具体的には、親株から育種して得られた各コロニー（シングルコロニー；単離したこと、単一種の酵母にしたことを意味する）について、第２染色体の染色体数が、相対的に大きいグループと小さいグループとに分別され、相対的に大きいグループが、リンゴ酸低生産株であると判定される。第２染色体の染色体数は、親株から得られた変異株のコロニー間で比較してもよいが、親株と変異株とで比較してもよい。第２染色体の染色体数が相対的に増加すればリンゴ酸低生産株であると判定されるが、他の染色体（第１、４〜１６染色体）の染色体数が増減してもなんら判定には制限はない。
【００２５】
菌株間で倍数性が異なる場合は、「リンゴ酸低生産株のゲノムの第２染色体の染色体数を第３染色体の染色体数で除した値（Ａ）」が「リンゴ酸低生産株の親株のゲノムの第２染色体の染色体数を第３染色体の染色体数で除した値（Ｂ）」よりも大きいことを指標とすることで、リンゴ酸低生産株であると判定される。第２染色体の染色体数が相対的に増加すればリンゴ酸低生産株であると判定されるが、他の染色体（第１、４〜１６染色体）の染色体数が増減してもなんら判定には制限はない。
【００２６】
判定工程において、Ａ／Ｂの値が１．１０以上、１．２０以上、１．２３以上、１．５０以上であっても良いが、１．２８以上である場合にリンゴ酸低生産株であると判定することが好ましい。また、上限値に限定はないが、３．００以下、２．５０以下、又は２．００以下であっても良いが、１．５０以下が好ましい。
【００２７】
（リンゴ酸低生産株）
リンゴ酸低生産株によるリンゴ酸生産量は、親株によるリンゴ酸生産量と比較して、９５％以下、又は９０％以下であっても良いが、８５％以下であることが好ましい。清酒に含まれるリンゴ酸濃度が低くなると、清酒の酸度が下がり、淡麗辛口や超淡麗辛口の酒質の清酒が得られる。また、下限値に限定はないが、３０％以上、４０％以上、５０％以上、又は６０％以上であっても良いが、７０％以上であることが好ましい。
【００２８】
（育種に用いる親株）
本発明の酵母の育種方法に用いる親株としては、清酒の醸造に使用できる酵母であればよいが、その殆どが出芽酵母のサッカロマイセス  セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。その中でも特に醸造特性の高い株として、公益財団法人日本醸造協会から頒布されている泡あり酵母のきょうかい酵母１号、２号、３号、４号、５号、６号、７号、８号、９号、１０号、１１号、１２号、１３号、１４号、１５号；泡なし酵母のきょうかい酵母６０１号、７０１号、９０１号、１００１号、１４０１号、１５０１号、１６０１号、１７０１号、１８０１号、ＫＴ９０１号；尿素非生産のＫＡｒｇ７号、ＫＡｒｇ９号、ＫＡｒｇ１０号等が挙げられる。これらのうち、親株として、従来から優れた清酒を醸し出すことが知られるきょうかい酵母９号（Ｋ−９）や、もともとＫ−９等と比較してリンゴ酸を含めた有機酸生成が少ない高エステル生成酵母であるきょうかい酵母１８０１号（Ｋ−１８０１）が好ましい。なお、Ｋ−１８０１は、有機酸低生産性酵母であるが、有機酸低生産性の形質を有した優良な清酒酵母が少ないのが現状である。また、他の酵母としては、例えば、株式会社秋田今野商店の取り扱い酵母である、清酒用Ｎｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．４Ａ、Ｎｏ．５、Ｎｏ．９Ａ、Ｎｏ．１２、Ｎｏ．１７、Ｎｏ．２４、Ｎｏ．２５、Ｎｏ．３２、Ｎｏ．３５；各県工業総合研究センターが開発した、まほろば華酵母、吟醸２号、宮城マイ酵母、愛美酵母、泡なし宮城マイ酵母、秋田流・花酵母、秋田純米酵母、こまち酵母、秋田流・雅酵母；学校法人東京農業大学が開発した花酵母等が挙げられる。また、上記酵母を変異導入・交配などの技術で、育種又は改良した酵母でもよい。育種に用いる親株として、上記の市販されている公知の酵母を用いても良いが、公知の株として育種された酵母、又は育種された酵母を更に育種された酵母を用いることが好ましく、醸造特性が開示されている酵母よりも、開示されていない酵母を用いることがより好ましい。
【００２９】
（第２染色体の異数性の分析）
第２染色体の異数性の分析は、次世代シーケンサー（ＮＧＳ：Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）による全ゲノムシーケンス解析の他、核型分析、ＰＣＲ法によって行ってもよく、これらの方法を併用してもよい。例えば、次世代シーケンサーによる全ゲノムシーケンス解析では、リードと呼ばれる各ＤＮＡ断片の塩基配列の単位を参照配列にマッピングした場合に、参照配列に対するリードのカバー率の冗長度（Ｒｅａｄ  Ｄｅｐｔｈ  ｏｆ  Ｃｏｖｅｒａｇｅ、又は単にＤｅｐｔｈ値）が、同じ塩基配列を何回読み出したかを示す数値が得られる。そのため、各染色体でのＤｅｐｔｈ値は、各染色体の染色体数に比例する指標値となり、Ｄｅｐｔｈ値の比較により、間接的に染色体数を比較することができる。また、染色体数が既に知られている生物種の場合には、Ｄｅｐｔｈ値の比により任意の染色体の染色体数の相対的な比率を推定することができるため、実質直接的に染色体数を比較した結果と一致する。例えば、数１０から数千の塩基配列単位で、Ｄｅｐｔｈ値の平均値を計算し、１つの染色体に含まれる塩基配列に該当する全てのＤｅｐｔｈ値をさらに平均したものを、その染色体の染色体数（平均値Ｄｅｐｔｈ値）としてもよく、１つの染色体に含まれる一塩基配列ごとのＤｅｐｔｈ値を平均したものを、その染色体の染色体数（平均値Ｄｅｐｔｈ値）としてもよい。後述する次世代シーケンサーによる全ゲノムシーケンス解析を外部委託した場合、マッピングにより得られたＤｅｐｔｈ値及びＳＮＰｓ（一塩基多型：Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等が情報解析されて納品されるが、これらのデータは、一般的な遺伝子解析ソフトを用いることによって閲覧、更なるデータ抽出が可能であり、染色体の異数性の分析を行うことができる。一般的な遺伝子解析ソフト（ゲノムブラウザー）としては、ＧＥＮＥＴＹＸ（商標登録）（ゼネティックス株式会社製）、ＧｅｎｏｍｅＢｒｏｗｓｅ（商標登録）（フィルジェン株式会社製）等のソフトが挙げられる。
【００３０】
（酵母の染色体、又はゲノム配列）
各菌株のゲノムは、次世代シーケンサーによる全ゲノムシーケンス解析で配列決定される。きょうかい酵母７号のコンセンサス配列（ＤＮＡやＲＮＡの中で、一定の機能に関与している領域に高い頻度で出現する塩基の平均的な配列）を参照配列としてマッピングし、リード毎のＳＮＰｓを得ることができる。参照配列として用いる酵母の染色体、又はゲノム配列は、例えば独立行政法人酒類総合研究所が公開している清酒酵母ゲノムデータベース（ｓａｋｅ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｄａｔａｂａｓｅ：  ＳＹＧＤ、ｈｔｔｐｓ：／／ｎｒｉｂｆ１.ｎｒｉｂ.ｇｏ.ｊｐ／ＳＹＧＤ／、ウェブで公開されているものは断りがない限り、本発明の出願日に検索したものとする）、又は独立行政法人  製品技術評価機構で公開されているもの（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｂｉｏ.ｎｉｔｅ.ｇｏ.ｊｐ／ｄｏｇａｎ／ｐｒｏｊｅｃｔ／ｖｉｅｗ／ＳＣ１）に相当する染色体、又はゲノム配列であればよく、その他ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ.ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ.ｇｏｖ／Ｔａｘｏｎｏｍｙ／Ｂｒｏｗｓｅｒ／ｗｗｗｔａｘ．ｃｇｉ？ｉｄ＝７２１０３２）で公開されている配列でもよい。また、Ｓ２８８Ｃ株のような実験室酵母が公開されているゲノム配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｓｔｒａｉｎ／Ｓ２８８Ｃ）を用いてもよい。
【００３１】
（次世代シーケンサー）
次世代シーケンサーは、キャピラリー電気泳動を用いたサンガー法（第一世代シーケンサー）の原理と基本的に同じであり、ＤＮＡ断片をテンプレートとして、１塩基ごとに再合成する時の蛍光強度を検出し、塩基配列を決定する。従来のサンガー法との違いは、サンガー法では１〜９６のＤＮＡ断片を同時に処理するのに対し、次世代シーケンサーでは数千万から数億のＤＮＡ断片に対して大量並列に処理することが可能である。具体的な次世代シーケンサーとしては、ＭｉＳｅｑ（登録商標）（イルミナ株式会社製）、ＨｉＳｅｑ（登録商標）２０００（イルミナ株式会社製）、Ｒｏｃｈｅ４５４（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）が挙げられる。次世代シーケンサーによる全ゲノムシーケンス解析は、先ず、サンプルからゲノムＤＮＡを抽出し、大量並列シーケンスが精度よく、かつ均一に行われるように断片化し、ライブラリー（鋳型）を作成する。このライブラリーのＤＮＡ断片は次世代シーケンサーによって解読されるが、各ＤＮＡ断片の塩基配列の単位は、上述のとおり、リードと呼ばれる。ゲノム配列が既に解読されている生物種の場合は、このリードを参照配列にマップして比較するシーケンス解析が行われる（ｈｔｔｐｓ：／／ｊｐ.ｉｌｌｕｍｉｎａ.ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄａｍ／ｉｌｌｕｍｉｎａ−ｍａｒｋｅｔｉｎｇ／ａｐａｃ／ｊａｐａｎ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｐｄｆ／ｐｒｉｍｅｒ＿ｉｌｌｕｍｉｎａ＿ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ＿ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ−ｊ.ｐｄｆ）。
【００３２】
［リンゴ酸低生産性の酵母の育種方法］
本発明の酵母の育種方法は、（１）培地上に酵母を培養する工程と、（２）培地に形成された酵母のコロニーごとに第２染色体の異数性を分析する工程と、（３）コロニー間において、酵母の第２染色体の異数性を比較する工程と、（４）比較結果に基づいて、リンゴ酸低生産株を選択する工程と、を含む。（１）の工程では、抗生物質を含有する培地で特定の性質を有する酵母を選択的に培養することができる。例えば、シクロヘキシミド含有培地を用いることで、エチル−α−グルコシドを低減させ、飲み易く、後味のすっきりした清酒を製造する酵母を選択的に培養することができる。また、セルレニン含有培地を用いることで、カプロン酸エチルの生成量を増加させ、吟醸香を有する清酒を製造する酵母を選択的に培養することができる。（２）の工程では、各コロニーを釣菌後、ゲノムＤＮＡを抽出・精製し、第２染色体の染色体数を全ゲノムシーケンス解析、核型分析、ＰＣＲ、又はこれらを併用することによって分析する。（３）の工程では、（２）の工程で得られた第２染色体の染色体数を比較し、染色体数が相対的に大きいグループと、小さいグループとに分別する。（４）の工程では、（３）の工程において、大きいグループに分別された菌株をリンゴ酸低生産株として選択することができる。酵母の育種方法には限定はないが、後述する変異処理工程を含む育種方法であっても良いし、上述のように変異処理工程を含まずに、単に薬剤による選抜工程のみであっても良い。また、二倍体（二倍体以上も含む）株から、例えば胞子形成などを形成させたのちに、一倍体株を得る工程により育種する方法であっても良い。さらには、一倍体（一倍体以上も含む）株を掛け合わせて、二倍体（二倍体以上も含む）株を育種する方法であっても良い。
【００３３】
（シクロヘキシミド耐性株の取得）
シクロヘキシミドは、細菌の一種であるストレプトマイセス  グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）によって生産される抗生物質であり、真核生物のタンパク質合成を選択的に阻害する。シクロヘキシミドはタンパク質合成の転位過程（リボソームに結合する二つのｔＲＮＡ分子とｍＲＮＡの移動）に干渉することでその効果を示し、タンパク質の翻訳を阻害している。このシクロヘキシミドに耐性を有する清酒酵母は、変異処理を行わずに耐性選抜により取得が可能であるが、上述の既存の清酒酵母に対して交配、細胞融合、形質転換、及び変異処理等を行うことにより取得頻度が向上する。この中でも、変異処理によりシクロヘキシミド耐性株を分離することが好ましい。これにより、シクロヘキシミド耐性株を容易に取得することができる。
【００３４】
清酒酵母を変異処理する方法としては、物理的変異処理及び化学的変異処理がある。物理的変異処理としては、紫外線、放射線、イオンビーム等による照射処理が挙げられ、化学的変異処理としては、亜硝酸、ナイトロジェンマスタード、アクリジン系色素、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、メタンスルホン酸エチル（以下、ＥＭＳと称す）等による化学処理が挙げられる。これらの変異処理は、使用する親株の清酒酵母に応じて適宜選択することができるが、好ましくはＥＭＳを用いた化学的変異処理である。これにより、清酒酵母のシクロヘキシミド耐性株を容易に取得することができる。
【００３５】
ＥＭＳを用いて清酒酵母に変異処理を行う方法としては、例えば、先ず、親株である清酒酵母を、ＹＰＤ培地（２％グルコース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス）を用いて、２５℃〜３７℃で、３０〜５０時間浸とう培養し、得られた培養液を遠心分離により集菌する。次いで、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）１０ｍｌに、ＥＭＳの濃度が０．３〜６．０％となるように混合し、当該混合液に上記集菌した菌体を再懸濁して、３０℃で、１５〜６０分間変異処理を行う。このとき、清酒酵母の生存率が０．０１〜９０％、好ましくは１０〜８０％、より好ましくは３０〜６０％となるように変異処理を行う。これにより、シクロヘキシミド耐性株の中から、効率的にエチル−α−グルコシドの生成を低減する清酒酵母を取得することができる。変異処理後、処理溶液に５％チオ硫酸ナトリウム溶液を添加してＥＭＳを中和し、０．２Ｍリン酸緩衝溶液を用いて変異処理菌体を２回洗浄する。洗浄した菌体を、シクロヘキシミド含有寒天培地上に塗布して、２５〜３７℃で、７〜１０日間培養し、増殖したコロニーを釣菌する。得られたシクロヘキシミド耐性株を、レプリカ法等を用いて、さらにシクロヘキシミド含有寒天培地で培養し、シクロヘキシミド耐性を再度確認することが好ましい。これにより、確実にシクロヘキシミド耐性株を取得することができる。使用するシクロヘキシミド含有寒天培地は、清酒酵母を培養できる寒天培地であればよいが、ＹＰＤ寒天培地（２％グルコース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス、２％寒天）が好ましい。シクロヘキシミドの寒天培地への添加量は、０．５〜１．５μｇ／ｍｌであり、好ましくは０．５〜１．０μｇ／ｍｌである。培養条件は、使用する清酒酵母に応じて適宜選択される。
【００３６】
（セルレニン耐性株の取得）
セルレニンは、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ：Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ）を阻害する抗生物質である。このセルレニンに耐性を有する清酒酵母（ＦＡＳ２変異遺伝子：ＦＡＳ１２５０番目のアミノ酸がＧｌｙからＳｅｒに変異したものをコード）は、変異処理を行わずに耐性選抜により取得が可能であるが、上述の既存の清酒酵母に対して交配、細胞融合、形質転換、及び変異処理等を行うことにより取得頻度が向上する。この中でも、変異処理によりセルレニン耐性株を分離することが好ましく、ＥＭＳを用いた化学的変異処理がより好ましい。これにより、セルレニン耐性株を容易に取得することができる。また、野生型と変異型ＦＡＳ２遺伝子とをヘテロで有する二倍体（二倍体以上を含む）株からは、ＬＯＨなどを経由して、変異型ＦＡＳ２遺伝子のみを有する酵母を得ることができる。この場合は変異処理がないことが好ましい
【００３７】
ＥＭＳを用いて清酒酵母に変異処理を行う方法としては、上述のシクロヘキシミド耐性株の取得における方法と同様である。変異処理後、洗浄した菌体を、セルレニン含有寒天培地上に塗布して、２５〜３７℃で、７〜１０日間培養し、増殖したコロニーを釣菌する。得られたセルレニン耐性株を、レプリカ法等を用いて、さらにセルレニン含有寒天培地で培養し、セルレニン耐性を再度確認することが好ましい。これにより、確実にセルレニン耐性株を取得することができる。使用するセルレニン含有寒天培地は、清酒酵母を培養できる寒天培地であればよいが、ＳＤ寒天培地が好ましい。セルレニンの寒天培地への添加量は、４．０〜１０．０μｇ／ｍｌであり、好ましくは４．０〜８．０μｇ／ｍｌである。培養条件は、使用する清酒酵母に応じて適宜選択される。野生型と変異型ＦＡＳ２遺伝子をヘテロで有する二倍体（二倍体以上を含む）株から、より高濃度のセルレニン耐性株（変異型ＦＡＳ２遺伝子をホモで有する）を得る場合は、親株をセルレニンの寒天培地に塗布して上述の培養を行えばよい。
【実施例】
【００３８】
酵母のゲノムの第２染色体の異数性に基づき、リンゴ酸生産性の評価を行った。試験例１は、親株をＫ−９系株とする一倍体株についての評価である。試験例２は、親株をＫ−１８０１とするシクロヘキシミド耐性株についての評価である。試験例３は、親株をＫ−１８０１とするセルレニン耐性株についての評価である。
【００３９】
［試験例１］
（Ｋ−９系株からの一倍体株の取得）
酵母は、通常条件下では、ヘテロ接合型の二倍体株であることが多く、胞子形成する際は一倍体株となることが知られている。清酒酵母の多くは、胞子形成能を殆ど失っており、一倍体株の取得効率が極めて低い。そこで、日本醸造協会誌に記載されている方法（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ.ｊｓｔａｇｅ.ｊｓｔ.ｇｏ.ｊｐ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｊｂｒｅｗｓｏｃｊａｐａｎ１９８８／８４／６／８４＿６＿４０７／＿ａｒｔｉｃｌｅ／−ｃｈａｒ／ｊａ／）に従って、Ｋ−９系株から、ランダム胞子分離法を用いて接合能を示した菌株を１１株取得した（Ｎｏ．１〜１１）。ＰＣＲ法により、接合型を確認したところ、ＭＡＴａのみ存在する６株（Ｎｏ．２、４、５、８、１０、１１）と、ＭＡＴαのみ存在する５株（Ｎｏ．１、３、６、７、９）が得られた。次に、これらの菌株から、タカラバイオ株式会社推奨の方法により、ゲノムＤＮＡを抽出・精製し、タカラバイオ株式会社へ次世代シーケンスによる全ゲノムシーケンス解析を委託した（ｈｔｔｐ：／／ｃａｔａｌｏｇ.ｔａｋａｒａ−ｂｉｏ.ｃｏ.ｊｐ／ｊｕｔａｋｕ／ｂａｓｉｃ＿ｉｎｆｏ.ｐｈｐ？ｕｎｉｔｉｄ＝Ｕ１００００５１６２、サービス名：ＨｉＳｅｑ  ２５００、１リード長１００ｂａｓｅ）。次世代シーケンサーは、ＨｉＳｅｑ（登録商標）２５００（イルミナ株式会社製）を使用し、シーケンス解析は、１００塩基長、ペアエンド法によって行い、ＨｉＳｅｑ２５００のマニュアルに従った。得られた塩基配列のデータを、解析ソフトを用いてゲノム配列にマッピングした。ゲノム配列は、ＮＣＢＩで公開されているきょうかい酵母７号のゲノム配列を用いた（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｋ７  （＝  ＮＢＲＣ  １０１５５７）参考：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ.ｎｉｔｅ.ｇｏ.ｊｐ／ｎｂｒｃ／ｇｅｎｏｍｅ／ｐｒｏｊｅｃｔ／ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ａｎａｌｙｚｅｄ／ｓｃ１.ｈｔｍｌ）。マッピングにより得られた一塩基単位の全てのＤｅｐｔｈ値を平均し、各染色体の染色体数の平均値（平均Ｄｅｐｔｈ値）とした。表１に「第２染色体の染色体数の平均値」、「第３染色体の染色体数の平均値」、及び「第２染色体の染色体数の平均値」／「第３染色体の染色体数の平均値」（Ａ、Ｂ）を示す。定量ＰＣＲ、及び全ゲノムシーケンス解析から得られたＳＮＰｓのデータ等と合わせ、第３染色体の染色体数を算出したところ、親株であるＫ−９系株は２本、得られた１１株は全て１本であると推定された。
【００４０】
（小仕込み試験）
小仕込み試験は、総米２００ｇ、１５℃一定、１５日目に上槽し、アルコール度数とリンゴ酸を含む有機酸とを測定した。発酵経過は親株および一倍体株共にすべて良好であり、アルコール度数は１８．９〜１９．５度であった。リンゴ酸以外の有機酸（クエン酸、ピルビン酸、コハク酸、乳酸、酢酸など）の主要な有機酸については、親株と一倍体株に差異はなかった（データ示さず）。表１に各菌株の小仕込み試験によって得られた上槽酒のリンゴ酸濃度を示す。
【００４１】
【表１】
2020103049.tif 000002
【００４２】
Ｎｏ．１〜１１は、全て一倍体株であったため、第２染色体の染色体数をコロニー間で比較した。Ｎｏ．１〜４は、８６．１〜１２４．８であり、Ｎｏ．５〜１１は、５９．５〜７４．９であることから、Ｎｏ．１〜４を第２染色体の染色体数が相対的に大きいグループ、Ｎｏ．５〜１１を第２染色体の染色体数が相対的に小さいグループに分別した。小仕込み試験によりリンゴ酸生産量について分析したところ、Ｎｏ．１〜４は、親株Ｋ−９系株の生産量の６５〜７５％であった。一方、Ｎｏ．５〜１１は、親株Ｋ−９系株のリンゴ酸生産量の８６〜１００％であった。このことから、第２染色体の染色体数が相対的に大きいグループに属する菌株は、リンゴ酸低生産性であるとの傾向がみられた。従って、育種された同じ倍数性のコロニー間において、第２染色体の比較を行うことによって、リンゴ酸低生産性であるか否かを判定することができることが明らかとなった。
【００４３】
親株と、Ｎｏ．１〜１１との「第２染色体の染色体数の平均値」／「第３染色体の染色体数の平均値」（Ａ、Ｂ）を比較したところ、親株については１．６、Ｎｏ．１〜４については２．７〜３．４、Ｎｏ．５〜１１については１．７〜１．９であった。Ｎｏ.１〜４の上記値は、親株の値の１．６８倍以上であり、Ｎｏ．５〜１１の上記値は、親株の値と同程度であった。このことから、「第２染色体の染色体数の平均値」／「第３染色体の染色体数の平均値」（Ａ）が、親株の「第２染色体の染色体数の平均値」／「第３染色体の染色体数の平均値」（Ｂ）よりも大きい値となる菌株は、リンゴ酸低生産性であると判定することができることが明らかとなった。また、この判定方法により、倍数性の異なる株間での比較を行うことが可能であることも明らかとなった。なお、第２、第３染色体以外の染色体についても比較・分析を行ったが、リンゴ酸生産量との関係性はみられなかった。また、一倍体株については、第３染色体が１本であることから、染色体数の平均値より、第２染色体は、Ｎｏ．１〜４では３本、Ｎｏ．５〜１１では２本であることが推察された。
【００４４】
［試験例２］
（Ｋ−１８０１株からのシクロヘキシミド耐性株の取得）
親株として、有機酸低生産性のＫ−１８０１を使用した。Ｋ−１８０１を、ＹＰＤ培地（２％グルコース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス）を用いて、３０℃で、２４時間培養後、ＥＭＳで変異処理を行った。変異処理条件としては、ＹＰＤ培地で培養した菌体を遠心分離にて集菌（１×１０８細胞／ｍｌ）し、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに懸濁し、３％となるようにＥＭＳを添加して、３０℃で、４５分間変異処理を行った。５％チオ硫酸ナトリウム溶液でＥＭＳを中和し、遠心分離にて集菌（１×１０８細胞／ｍｌ）し、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で菌体を２回洗浄した。次いで、シクロヘキシミド含有ＹＰＤ寒天培地（１ｍｇ／Ｌシクロヘキシミド、２％グルコース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス、２％寒天）１０枚に、洗浄した菌体（計１×１０８細胞）を塗布して、３０℃で、１０日間培養した。シクロヘキシミド含有ＹＰＤ寒天培地上で増殖したコロニーを同じシクロヘキシミド含有ＹＰＤ寒天培地にレプリカして、３０℃で、１０日間培養し、各菌株のシクロヘキシミド耐性を再度確認した。この工程では、シングルコロニー（単一クローン）化も同時に行った。本試験では、ＥＭＳ変異処理後、耐性選抜を行い、シクロヘキシミド耐性株を、計２株取得した（Ｎｏ．１２、１３）。次に、試験例１と同様に、これらの菌株から、タカラバイオ株式会社推奨の方法により、ゲノムＤＮＡを抽出・精製し、タカラバイオ株式会社へ次世代シーケンスによる全ゲノムシーケンス解析を委託した。マッピングにより得られた一塩基単位の全てのＤｅｐｔｈ値を平均し、各染色体の染色体数の平均値（平均Ｄｅｐｔｈ値）とした。表２に「第２染色体の染色体数の平均値」、「第３染色体の染色体数の平均値」、及び「第２染色体の染色体数の平均値」／「第３染色体の染色体数の平均値」（Ａ、Ｂ）を示す。
【００４５】
（小仕込み試験）
小仕込み試験は、総米５０ｇ、１５℃一定、１４日目に上槽し、アルコール度数とリンゴ酸を含む有機酸とを測定した。発酵経過は親株およびシクロヘキシミド耐性２株共にすべて良好であり、アルコール度数は，いずれも１８．０度程度であった。リンゴ酸以外の有機酸（クエン酸、ピルビン酸、コハク酸、乳酸、酢酸など）の主要な有機酸については、親株と変異株とに差異はなかった（データ示さず）。表２に各菌株の小仕込み試験によって得られた上槽酒のリンゴ酸濃度を示す。
【００４６】
【表２】
2020103049.tif 000003
【００４７】
親株Ｋ−１８０１株は、三倍体株であることが知られている。Ｎｏ．１２、Ｎｏ．１３は、第３染色体の染色体数の平均値から、いずれも親株と同じ三倍体株であると推定される。Ｎｏ．１２とＮｏ．１３とのコロニー間で、第２染色体の染色体数を比較したところ、Ｎｏ．１２が相対的に大きく、Ｎｏ．１３が相対的に小さいことが明らかであった。また、リンゴ酸生産量については、Ｎｏ．１２は、親株の生産量の６３％であった。一方、Ｎｏ．１３は、親株の生産量とほぼ同じ生産量であった。このことから、本試験例においても、第２染色体の染色体数が相対的に大きいと、リンゴ酸低生産の傾向がみられた。
【００４８】
親株Ｋ−１８０１株と、Ｎｏ．１２及び１３との「第２染色体の染色体数の平均値」／「第３染色体の染色体数の平均値」（Ａ、Ｂ）を比較したところ、親株は１．０１、Ｎｏ．１２は１．３０、Ｎｏ．１３は１．０２であった。Ｎｏ．１２における上記値は、親株の値の１．２８７倍であったが、親株とＮｏ．１３における上記値は、ほぼ同じであった。また、リンゴ酸生産量については、Ｎｏ．１２は、親株の６３％であった。一方、Ｎｏ．１３は、親株のリンゴ酸生産量とほぼ同じであった。このことから、「第２染色体の染色体数の平均値」／「第３染色体の染色体数の平均値」（Ａ）が、親株の「第２染色体の染色体数の平均値」／「第３染色体の染色体数の平均値」（Ｂ）より大きいと、リンゴ酸低生産の傾向がみられた。なお、第２、第３染色体以外の染色体についても比較・分析を行ったが、リンゴ酸生産量との関係性はみられなかった。三倍体株は、第３染色体が３本であることから、染色体数の平均値（８０．９／６２．０≒１．３）より、Ｎｏ．１２の第２染色体は３本から４本へ育種により増加したことが推察された。また、Ｋ−１８０１はＫ−９よりもリンゴ酸生産性がもともと低いが、Ｋ−１８０１を親株にしても、効率よくリンゴ酸低生産株を判定・選抜することができた。
【００４９】
［試験例３］
（Ｋ−１８０１株からのセルレニン耐性株の取得）
親株として、有機酸低生産性のＫ−１８０１を使用した。Ｋ−１８０１は野生型と変異型ＦＡＳ２遺伝子をヘテロ接合型で有していることが知られている。Ｋ−１８０１を、ＹＰＤ培地（２％グルコース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス）を用いて、３０℃で、２４時間培養後、次いで、６μｇ／ｍＬのセルレニンを含む前記ＳＤ寒天培地に、洗浄した菌体を１×１０６細胞／プレートになるように塗布し、３０℃で静置培養した。このプレートから生育の良いコロニーを採取し、全ゲノムシーケンス解析により変異型ＦＡＳ２遺伝子（１２５０番目のアミノ酸がセリンである変異型ＦＡＳ２タンパク質をコードしている遺伝子）をホモ接合型で有することを確認した。この工程では、シングルコロニー（単一クローン）化も同時に行った。最終的にこの変異株を６株得た（Ｎｏ．１４〜１９）。次に、試験例１及び２と同様に、これらの菌株から、タカラバイオ株式会社推奨の方法により、ゲノムＤＮＡを抽出・精製し、タカラバイオ株式会社へ次世代シーケンスによる全ゲノムシーケンス解析を委託した。マッピングにより得られた一塩基単位の全てのＤｅｐｔｈ値を平均し、各染色体の染色体数の平均値（平均Ｄｅｐｔｈ値）とした。表３に「第２染色体の染色体数の平均値」、「第３染色体の染色体数の平均値」、及び「第２染色体の染色体数の平均値」／「第３染色体の染色体数の平均値」（Ａ、Ｂ）を示す。
【００５０】
（小仕込み試験）
親株および変異株を試験例２と同様に、小仕込み試験を行った。発酵経過は親株およびセルレニン耐性６株共にすべて良好であり、上槽後のアルコール度数は、１７．０〜１８．０度となった。リンゴ酸以外の有機酸（クエン酸、ピルビン酸、コハク酸、乳酸、酢酸など）の主要な有機酸については、親株と変異株に差異はなかった（データ示さず）。表３に各菌株の小仕込み試験によって得られた上槽酒のリンゴ酸濃度を示す。
【００５１】
【表３】
2020103049.tif 000004
【００５２】
親株Ｋ−１８０１株は、三倍体株であることが知られている。Ｎｏ．１４〜１９は、第３染色体の染色体数の平均値から、いずれも親株と同じ三倍体株であると推定される。Ｎｏ．１４〜１９のコロニー間で、第２染色体の染色体数を比較したところ、Ｎｏ．１４は１００．２、Ｎｏ．１５〜１９は６１．４〜８１．６であり、Ｎｏ．１４が相対的に大きく、Ｎｏ．１５〜１９が相対的小さいことが明らかであった。また、リンゴ酸生産量については、Ｎｏ．１４は、親株の生産量の８３％であった。一方、Ｎｏ．１５〜１９のリンゴ酸生産量は、親株のリンゴ酸生産量よりも増加していた。このことから、本試験例においても、第２染色体の染色体数が相対的に大きいと、リンゴ酸低生産の傾向がみられた。
【００５３】
親株Ｋ−１８０１株と、Ｎｏ．１４〜１９との「第２染色体の染色体数の平均値」／「第３染色体の染色体数の平均値」（Ａ、Ｂ）を比較したところ、親株は１．０１、Ｎｏ．１４は１．３０、Ｎｏ．１５〜１９は０．９１〜１．０１であった。Ｎｏ．１４における上記値は、親株における上記値の１．２８７倍であったが、親株とＮｏ．１５〜１９における上記値は、同程度であった。また、リンゴ酸生産量については、Ｎｏ．１４は、親株の８３％であった。一方、Ｎｏ．１５〜１９は、親株のリンゴ酸生産量よりも増加していた。このことから、「第２染色体の染色体数の平均値」／「第３染色体の染色体数の平均値」（Ａ）が、親株の「第２染色体の染色体数の平均値」／「第３染色体の染色体数の平均値」（Ｂ）より大きいと、リンゴ酸低生産の傾向がみられた。なお、第２、第３染色体以外の染色体についても比較・分析を行ったが、リンゴ酸生産量との関係性はみられなかった。三倍体株の第３染色体は３本であることから、染色体数の平均値（１００．２／７７．３≒１．３）より、Ｎｏ．１４の第２染色体は３本から４本へ育種により増加したことが推察された。また、Ｎｏ．１４のカプロン酸エチルの濃度は、親株と比較して３０％程度向上しており、有用な形質が更に向上していた（データ示さず）。
【００５４】
倍数性が同じ株間であれば、第２染色体の異数性を分析し、株間で比較することにより、リンゴ酸低生産性酵母であるか否かを判定し、育種することが可能となることが明らかとなった。また、倍数性が異なる株間の場合は、第２染色体の染色体数の平均値を第３染色体の染色体数の平均値で除した値を親株や株間とで比較することにより、リンゴ低生産性酵母であるか否かを判定し、育種することが可能となることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明に係る酵母の醸造特性を判定する方法、及び酵母の育種方法は、本醸造、吟醸酒、大吟醸酒、純米酒、純米大吟醸などの特定名称酒、糖質濃度が０．５重量％以下の糖質オフや糖質ゼロと称する清酒の製造に用いるリンゴ酸低生産性酵母を取得するために利用することができる。