(57)【要約】      （修正有）【課題】微生物検出ツールとして、生物学的廃水処理プロセスにおいて重要な反応を担う亜硝酸酸化細菌を標的とした機能性核酸分子の提供。【解決手段】（ａ）〜（ｄ）の少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、亜硝酸酸化細菌に特異的に結合する核酸分子。（ａ）特定の塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、亜硝酸酸化細菌に結合するポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）と異なる特定の塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ｄ）前記（ｃ）のいずれかの塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、亜硝酸酸化細菌に結合するポリヌクレオチド。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）又は（ｂ）の少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、
亜硝酸酸化細菌に特異的に結合することを特徴とする核酸分子。
（ａ）配列番号１〜１８のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、亜硝酸酸化細菌に結合するポリヌクレオチド
【請求項２】
下記（ｃ）又は（ｄ）の少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、
亜硝酸酸化細菌に特異的に結合することを特徴とする核酸分子。
（ｃ）配列番号１９〜３６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ｃ）のいずれかの塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、亜硝酸酸化細菌に結合するポリヌクレオチド
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、Nitrobacter属の亜硝酸酸化細菌に結合するポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、Nitrobacter hamburgensis、Nitrobacter vulgaris、及び／又はNitrobacter winogradskyiに結合するポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の核酸分子と亜硝酸酸化細菌とを接触させる接触工程を含み、その接触工程において前記核酸分子と亜硝酸酸化細菌とを結合させることにより、亜硝酸酸化細菌を検出することを特徴とする亜硝酸酸化細菌の検出方法。
【請求項６】
請求項３又は４に記載の核酸分子と亜硝酸酸化細菌とを接触させる接触工程を含み、その接触工程において前記核酸分子と亜硝酸酸化細菌とを結合させることにより、亜硝酸酸化細菌を検出することを特徴とする亜硝酸酸化細菌の検出方法。
【請求項７】
前記接触工程は、前記核酸分子が固定化された担体を用いて、前記核酸分子と亜硝酸酸化細菌を接触させ、前記核酸分子と亜硝酸酸化細菌とを結合させるものであることを特徴とする請求項５又は６に記載の亜硝酸酸化細菌の検出方法。
【請求項８】
前記核酸分子は標識物質で標識されており、前記接触工程において、標識された前記核酸分子と亜硝酸酸化細菌を接触させ、前記核酸分子と亜硝酸酸化細菌とを結合させるものであることを特徴とする請求項５又は６に記載の亜硝酸酸化細菌の検出方法。
【請求項９】
前記核酸分子は、ポリヌクレオチドと金コロイド粒子とが結合した金コロイド標識核酸分子であり、
前記接触工程は、当該金コロイド標識核酸分子を亜硝酸酸化細菌と接触、結合させることを特徴とする請求項５から８のいずれかに記載の亜硝酸酸化細菌の検出方法。
【請求項１０】
前記核酸分子は、ポリヌクレオチドとビオチン分子が結合したビオチン標識核酸分子であり、
前記接触工程は、当該ビオチン標識核酸分子を亜硝酸酸化細菌と接触、結合させ、さらにストレプトアビジンに基質を活性化する酵素を結合した分子を接触、結合させ、さらにストレプトアビジンに結合した酵素で基質を活性化することにより発色させることを特徴とする請求項５から８のいずれかに記載の亜硝酸酸化細菌の検出方法。
【請求項１１】
検出対象の亜硝酸酸化細菌が、Nitrobater属であることを特徴とする請求項５から１０のいずれかに記載の亜硝酸酸化細菌の検出方法。
【請求項１２】
検出対象の亜硝酸酸化細菌が、Nitrobacter hamburgensis、Nitrobacter vulgaris、及び／又はNitrobacter winogradskyiであることを特徴とする請求項５から１０のいずれかに記載の亜硝酸酸化細菌の検出方法。
【請求項１３】
亜硝酸酸化細菌の検出に用いられる検査キットであって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子が固定化された担体を備えており、その担体を亜硝酸酸化細菌に接触させることで、検出する亜硝酸酸化細菌を前記核酸分子に結合させることを特徴とする亜硝酸酸化細菌の検出キット。
【請求項１４】
前記核酸分子は、ポリヌクレオチドに金コロイド粒子が結合した金コロイド標識核酸分子であることを特徴とする請求項１３に記載の亜硝酸酸化細菌の検出キット。
【請求項１５】
前記核酸分子は、ポリヌクレオチドにビオチンが結合したビオチン標識核酸分子であることを特徴とする請求項１３に記載の亜硝酸酸化細菌の検出キット。
【請求項１６】
亜硝酸酸化細菌の検出に用いられる検出試薬であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子が標識物質で標識された標識核酸分子を含んでおり、前記標識核酸分子を亜硝酸酸化細菌に接触させることで、亜硝酸酸化細菌を前記標識核酸分子に結合させることを特徴とする亜硝酸酸化細菌の検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、亜硝酸酸化細菌に結合する核酸分子（ＤＮＡアプタマーともいう）及びその用途に関し、具体的には、亜硝酸酸化細菌に結合する核酸分子、核酸分子を用いた亜硝酸酸化細菌の検出方法、検出キット及び検出試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的廃水処理プロセスの運転及びその管理は、pHや温度などの物理化学的指標に基づいて行われている。処理環境に応じて変化する廃水処理プロセス内の微生物に関しては、その増減を始めとし微生物の状態把握が困難であり、現場では半ばブラックボックスとして扱われている。このため、プロセス運転において、処理水質の低下や処理効率の低下などが突発的に生じた場合、廃水処理プロセス内の微生物の状況が分からないことに起因し、経験的な対処方法によって試行錯誤を重ねなければならず、プロセスを回復させるためには多大な労力が要求される。
【０００３】
ここで、亜硝酸酸化細菌は、排水処理の上流プロセスである硝化に関与する重要な微生物（硝化細菌）である。プロセスを破綻させず効率的な処理を持続的に行うには、亜硝酸酸化細菌の生育状態を把握し、制御することが重要な因子である。微生物状態を把握するためには、蛍光in situ ハイブリダイゼーション法、定量的リアルタイムPCR法、16S rＲＮＡ遺伝子クローニング解析や16S rＲＮＡ遺伝子アンプリコン解析が知られている。即ち、蛍光in situ ハイブリダイゼーション法、定量的リアルタイムPCR法、16S rＲＮＡ遺伝子クローニング解析や16S rＲＮＡ遺伝子アンプリコン解析により、亜硝酸酸化細菌を調べることで廃水処理プロセスの管理を行うことが考えられる。
【０００４】
しかしながら、蛍光in situ ハイブリダイゼーション法、定量的リアルタイムPCR法、16S rＲＮＡ遺伝子クローニング解析や16S rＲＮＡ遺伝子アンプリコン解析は高度な技術が必要な上、高コストであり、更に検出結果が得られるまで長時間を要するという問題点があった。このため、生物学的廃水処理プロセスの適切な運転や管理には、水質指標だけでなく、微生物指標も取り入れた管理指標が必要であるにも関わらず、現実的に微生物指標を利用することは困難となっていた。また、一旦破綻したプロセスを回復させるには、現場にて作業者がいち早く微生物状態を把握し、これに応じた対策を処方することが望ましいが、検出結果を得るまでに長時間を要すると、得られた結果に基づいて対策を取ることに遅延が生じてしまう。また、検出結果と現実の微生物状態との間に差異が生じて対策の有効性が低下するなど、プロセスの迅速な復旧を図ることが現実には難しいという問題点があった。すなわち簡便かつ迅速に廃水処理プロセス内の微生物状態を把握する技術が希求されていた。
【０００５】
特に、廃水処理で重要となる屎尿等、下水等に含まれるアンモニア態窒素から、アンモニア酸化細菌によって酸化された後に生じる亜硝酸の処理を担う亜硝酸酸化細菌を、廃水処理の現場において簡便かつ迅速に測定する技術は、これまで提案されておらず、全く手の付けられていない課題として存在したままとなっていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ge, S. et al., Chemosphere、140、85-98（2015）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１に示された方法では、高度な技術が必要な上、高コストであり、更に検出結果が得られるまで長時間を要するという問題点があった。このため、生物学的廃水処理プロセスの適切な運転や管理には、水質指標だけでなく、微生物指標も取り入れた管理指標が必要であるにも関わらず、現実的に微生物指標を利用することは困難となっていた。また、一旦破綻したプロセスを回復させるには、現場にて作業者がいち早く微生物状態を把握し、これに応じた対策を処方することが望ましいが、検出結果を得るまでに長時間を要すると、得られた結果に基づいて対策を取ることに遅延が生じてしまう。また、検出結果と現実の微生物状態との間に差異が生じて対策の有効性が低下するなど、プロセスの迅速な復旧を図ることが現実には難しいという問題点があった。すなわち簡便かつ迅速に廃水処理プロセス内の微生物状態を把握する技術が希求されていた。
【０００８】
特に、廃水処理で重要となる屎尿等、下水等に含まれるアンモニア態窒素の処理を担う亜硝酸酸化細菌を、廃水処理の現場において簡便かつ迅速に測定する技術は、これまで提案されておらず、全く手の付けられていない課題として存在したままとなっていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この目的を達成するために、核酸分子に係る第１の発明は、下記（ａ）又は（ｂ）の少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、亜硝酸酸化細菌に特異的に結合するものである。
（ａ）配列番号１〜１８のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、亜硝酸酸化細菌に結合するポリヌクレオチド
【００１０】
核酸分子に係る第２の発明は、下記（ｃ）又は（ｄ）の少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、亜硝酸酸化細菌に特異的に結合するものである。
（ｃ）配列番号１９〜３６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ｃ）のいずれかの塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、亜硝酸酸化細菌に結合するポリヌクレオチド
【００１１】
核酸分子に係る第３の発明は、第１又は第２の発明に記載の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドが、Nitrobacter属の亜硝酸酸化細菌に結合するポリヌクレオチドである。
【００１２】
核酸分子に係る第４の発明は、第１又は第２に記載の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドが、Nitrobacter hamburgensis、Nitrobacter vulgaris、及び／又はNitrobacter winogradskyiに結合するポリヌクレオチドである。
【００１３】
亜硝酸酸化細菌の検出方法に係る第１の発明は、前記核酸分子に係る第１又は第２の発明に記載の核酸分子と亜硝酸酸化細菌とを接触させる接触工程を含み、その接触工程において前記核酸分子と亜硝酸酸化細菌とを結合させることにより、亜硝酸酸化細菌を検出するものである。
【００１４】
亜硝酸酸化細菌の検出方法に係る第２の発明は、前記核酸分子に係る第３又は第４の発明に記載の核酸分子と亜硝酸酸化細菌とを接触させる接触工程を含み、その接触工程において前記核酸分子と亜硝酸酸化細菌とを結合させることにより、亜硝酸酸化細菌を検出するものである。
【００１５】
亜硝酸酸化細菌の検出方法に係る第３の発明は、第１又は第２の発明に記載の亜硝酸酸化細菌の検出方法において、前記接触工程は、前記核酸分子が固定化された担体を用いて、前記核酸分子と亜硝酸酸化細菌を接触させ、前記核酸分子と亜硝酸酸化細菌とを結合させるものである。
【００１６】
亜硝酸酸化細菌の検出方法に係る第４の発明は、第１又は第２の発明に記載の亜硝酸酸化細菌の検出方法において、前記核酸分子は標識物質で標識されており、前記接触工程において、標識された前記核酸分子と亜硝酸酸化細菌を接触させ、前記核酸分子と亜硝酸酸化細菌とを結合させるものである。
【００１７】
亜硝酸酸化細菌の検出方法に係る第５の発明は、第１から第４の発明のいずれかに記載の亜硝酸酸化細菌の検出方法において、前記核酸分子は、ポリヌクレオチドと金コロイド粒子とが結合した金コロイド標識核酸分子であり、前記接触工程は、当該金コロイド標識核酸分子を亜硝酸酸化細菌と接触させるものである。
【００１８】
亜硝酸酸化細菌の検出方法に係る第６の発明は、第１から第４の発明のいずれかに記載の亜硝酸酸化細菌の検出方法において、前記核酸分子は、ポリヌクレオチドとビオチン分子が結合したビオチン標識核酸分子であり、前記接触工程は、当該ビオチン標識核酸分子を亜硝酸酸化細菌と接触、結合させ、さらにストレプトアビジンに結合した酵素で基質を活性化することにより発色させるものである。
【００１９】
亜硝酸酸化細菌の検出方法に係る第７の発明は、第１から第６の発明のいずれかに記載の亜硝酸酸化細菌の検出方法において、検出対象の亜硝酸酸化細菌がNitrobacter属である。
【００２０】
亜硝酸酸化細菌の検出方法に係る第８の発明は、第１から第６の発明のいずれかに記載の亜硝酸酸化細菌の検出方法において、検出対象の亜硝酸酸化細菌が、Nitrobacter hamburgensis、Nitrobacter vulgaris、及び／又はNitrobacter winogradskyiである。
【００２１】
亜硝酸酸化細菌の検出キットに係る第１の発明は、亜硝酸酸化細菌の検出に用いられる検査キットであって、前記核酸分子に係る第１から第４の発明のいずれかに記載の核酸分子が固定化された担体を備えており、その担体を亜硝酸酸化細菌に接触させることで、検出する亜硝酸酸化細菌を前記核酸分子に結合させるものである。
【００２２】
亜硝酸酸化細菌の検出キットに係る第２の発明は、第１の発明に記載の亜硝酸酸化細菌の検出キットにおいて、前記核酸分子が、ポリヌクレオチドに金コロイド粒子が結合した金コロイド標識核酸分子である。
【００２３】
亜硝酸酸化細菌の検出キットに係る第３の発明は、第１の発明に記載の亜硝酸酸化細菌の検出キットにおいて、前記核酸分子が、ポリヌクレオチドにビオチンが結合したビオチン標識核酸分子である。
【００２４】
亜硝酸酸化細菌の検出試薬に係る発明は、前記核酸分子に係る第１から第４の発明のいずれかに記載の核酸分子が標識物質で標識された標識核酸分子を含んでおり、前記標識核酸分子を亜硝酸酸化細菌に接触させることで、亜硝酸酸化細菌を前記標識核酸分子に結合させるものである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の核酸分子によれば、亜硝酸酸化細菌に特異的に結合するという効果を奏する。また、本発明の亜硝酸酸化細菌の検出方法によれば、亜硝酸酸化細菌を特異的に検出することができるという効果を奏する。さらに前記核酸分子と亜硝酸酸化細菌との結合の有無を、本発明の亜硝酸酸化細菌の検出試薬及び検出キットにより亜硝酸酸化細菌を特異的に検出できるという効果を奏する。さらに検出試薬及び検出キットは、例えば、水環境中や土壌中に存在する亜硝酸酸化細菌の検出に、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】亜硝酸酸化細菌に特異的に結合するＤＮＡアプタマーの選別過程の概略図である。
【図２】Cell-SELEX6回目、12回目及び18回目を実施した後に得られたssＤＮＡ配列の母集団におけるＮＢap1〜ＮＢap8の存在比の変化を示した図である。
【図３】亜硝酸酸化細菌（ＮＯＢ）に特異的に結合する8種類 (ＮＢap1〜ＮＢap8) のＤＮＡアプタマーの二次構造を示した図である。
【図４】Cell-SELEX18回目、24回目及び30回目を実施した後に得られたssＤＮＡ配列の母集団におけるＮＢap9〜ＮＢap18の存在比の変化を示した図である。
【図５】亜硝酸酸化細菌（ＮＯＢ）に特異的に結合する10種類 (ＮＢap9〜ＮＢap18) のＤＮＡアプタマーの二次構造を示した図である。
【図６】ＤＮＡアプタマーと金コロイド粒子による亜硝酸酸化細菌（ＮＯＢ）測定技術の概略を説明する図である。
【図７】ＤＮＡアプタマーとストレプトアビジンとビオチン系を用いた亜硝酸酸化細菌（ＮＯＢ）測定技術の概略を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の下記（ａ）〜（ｄ）の少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、
亜硝酸酸化細菌に特異的に結合する核酸分子。
（ａ）配列番号１〜８のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、同一性を有する塩基配列からなり、亜硝酸酸化細菌に結合するポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号９〜１６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ｃ）のいずれかの塩基配列に対して、同一性を有する塩基配列からなり、亜硝酸酸化細菌に結合するポリヌクレオチド
【００２８】
本発明において、「ＮＯＢに結合する」とは、例えば、亜硝酸酸化細菌（Nitrite Oxidizing Bacteria：以下、「ＮＯＢ」と略称する場合がある。）に対する結合能を有している、又は、ＮＯＢに対する結合活性を有していることを意味する。前記核酸分子とＮＯＢとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分析法等により測定できる。
【００２９】
ＮＯＢの種類は、例えば、Nitrobacter hamburgensis、Nitrobacter vulgaris、Nitrobacter winogradskyiであるがこれに限られるものではない。前記核酸分子は、これらＮＯＢの生菌又は死菌に結合する。
【００３０】
前記核酸分子は、ＮＯＢ以外の細菌と比較して、ＮＯＢに対して特異的に結合するものである。前記ＮＯＢ以外の細菌は、Escherichia coli、Blastomonas natatoria 、Nitrosomonas europaea又はPseudomonas aeruginosa等である。前記核酸分子は、ＮＯＢ以外の細菌と比較して、ＮＯＢに対して優れた結合力を示す。
【００３１】
前記核酸分子において、前記（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基及びリボヌクレオチド残基があげられる。前記ポリヌクレオチドは、後述するように、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチド残基及びリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡであり、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。
【００３２】
前記核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。なお、後者の場合、リボヌクレオチド残基の数は、「１もしくは数個」に制限されるものではなく、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜７６個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１又は２個である。
【００３３】
前記核酸分子は、１もしくは数個の修飾化ヌクレオチド残基を含んでもよい。なお、修飾化ヌクレオチド残基の含有数は「１もしくは数個」に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドであれば、１〜７６個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１又は２個である。
【００３４】
前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、修飾化デオキシリボヌクレオチド残基及び修飾化リボヌクレオチド残基があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチド残基における糖残基が修飾されたものがあげられる。前記糖残基は、例えば、デオキシリボース残基又はリボース残基があげられる。前記ヌクレオチド残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位及び／又は４’位があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、塩基としてピリミジン塩基（ピリミジン核）を有するヌクレオチド残基が修飾されたもの、又は、塩基としてプリン塩基（プリン核）を有するヌクレオチド残基が修飾されたものがあげられ、好ましくは前者である。以下、ピリミジン塩基を有するヌクレオチド残基をピリミジンヌクレオチド残基といい、修飾されたピリミジンヌクレオチド残基を修飾化ピリミジンヌクレオチド残基といい、プリン塩基を有するヌクレオチド残基をプリンヌクレオチド残基といい、修飾されたプリンヌクレオチド残基を修飾化プリンヌクレオチド残基という。前記ピリミジンヌクレオチド残基は、例えば、ウラシルを有するウラシルヌクレオチド残基、シトシンを有するシトシンヌクレオチド残基、チミンを有するチミンヌクレオチド残基等があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位及び／又は４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、リボース残基の２’位が修飾された、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。
【００３５】
前記ヌクレオチド残基における塩基は、例えば、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、チミン（ｔ）及びウラシル（ｕ）の天然塩基（非人工塩基）でもよいし、非天然塩基（人工塩基）でもよい。前記人工塩基は、例えば、修飾塩基及び改変塩基等があげられ、前記天然塩基（ａ、ｃ、ｇ、ｔ又はｕ）と同様の機能を有することが好ましい。前記同様の機能を有する人工塩基は、例えば、グアニン（ｇ）に代えて、シトシン（ｃ）に結合可能な人工塩基、シトシン（ｃ）に代えて、グアニン（ｇ）に結合可能な人工塩基、アデニン（ａ）に代えて、チミン（ｔ）又はウラシル（ｕ）に結合可能な人工塩基、チミン（ｔ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基、ウラシル（ｕ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基等があげられる。前記修飾塩基は、例えば、メチル化塩基、フルオロ化塩基、アミノ化塩基、チオ化塩基等があげられる。前記修飾塩基の具体例としては、例えば、２’−メチルウラシル、２’−メチルシトシン、２’−フルオロウラシル、２’−フルオロシトシン、２’−アミノウラシル、２’−アミノシトシン、２−チオウラシル、２−チオシトシン等があげられる。本発明において、例えば、ａ、ｇ、ｃ、ｔ及びｕで表わされる塩基は、前記天然塩基の他に、前記天然塩基のそれぞれと同様の機能を有する前記人工塩基の意味も含む。
【００３６】
前記核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜７６個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１又は２個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。
【００３７】
前記核酸分子は、例えば、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。後者の場合、前記核酸分子は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを２つ以上含んでもよい。その数は特に制限されるものではなく、例えば、２以上であり、好ましくは２〜２０であり、より好ましくは２〜１０であり、さらに好ましくは、２又は３である。かかる２つ以上のポリヌクレオチドは、同じ配列でもよいし、異なる配列でもよい。また、これら複数のポリヌクレオチドは、例えば、それぞれが直接的に連結してもよい。
【００３８】
加えて上述のポリヌクレオチドが２つ以上含まれる場合は、例えば、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。また、かかる複数のポリヌクレオチドは、例えば、リンカー又は付加配列等のいずれかまたは双方を有してもよい。
【００３９】
前記リンカーの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基及びリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記リンカーの具体例として、例えば、例えば、ポリデオキシチミン（ポリｄＴ）、ポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）、ＡとＴの繰り返し配列であるポリｄＡｄＴ等があげられ、好ましくはポリｄＴ、ポリｄＡｄＴである。
【００４０】
前記リンカー数は、前記核酸分子に含まれる複数のポリヌクレオチド数によるが、特に制限されない。さらに前記リンカーの塩基数も、特に制限されない。例えば、前記リンカーの塩基数は、１〜２００塩基であり、好ましくは１〜２０塩基であり、より好ましくは１〜１０塩基であり、さらに好ましくは１〜５塩基である。
【００４１】
前記（ａ）のポリヌクレオチドは、配列番号１〜１８のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００４２】
ＮＢap1（配列番号１）
CGTACGGAATTCGCTAGCTAGAAAGAAATAGTATAAAACAAGTACAATATTATGTATAGGATCCGAGCTCCACGTG
ＮＢap2（配列番号２）
CGTACGGAATTCGCTAGCAGGTATGATAAAGTAAGAAGATAGAAATATAATATTTTTAGGATCCGAGCTCCACGTG
ＮＢap3（配列番号３）
CGTACGGAATTCGCTAGCAATATATTAAATAAATGAGTAAAGAAACATAGTAAATCTGGGATCCGAGCTCCACGTG
ＮＢap4（配列番号４）
CGTACGGAATTCGCTAGCATATAATATAGAAAGAAAAAATGTCAAGTATCATAATAATGGATCCGAGCTCCACGTG
ＮＢap5（配列番号５）
CGTACGGAATTCGCTAGCTATAAATTGTCAATTAGTAATAAATAGAAGTAAGTAAAAAGGATCCGAGCTCCACGTG
ＮＢap6（配列番号６）
CGTACGGAATTCGCTAGCCTAAAGATAATAGAAATAAAATAAAGAACATGTAAAAGAAGGATCCGAGCTCCACGTG
ＮＢap7（配列番号７）
CGTACGGAATTCGCTAGCAATGAATATTATCATAAGGAAGGAAATAAAATAACAATTAGGATCCGAGCTCCACGTG
ＮＢap8（配列番号８）
CGTACGGAATTCGCTAGCAACATAATAAAATAACAATACAAGAACATTTATATAAATTGGATCCGAGCTCCACGTG
ＮＢap9（配列番号９）
CGTACGGAATTCGCTAGCTATATAATGGAATAAAAGGTTAATAAAAAATATAGTTCTTGGATCCGAGCTCCACGTG
ＮＢap10（配列番号１０）
CGTACGGAATTCGCTAGCGTATATATATATTATTAGTTTATGTAATTTGATTGATTTGGGATCCGAGCTCCACGTG
ＮＢap11（配列番号１１）
CGTACGGAATTCGCTAGCTATATAAATAGAAACAAAATAGTAATTAGAAGACTTAAAGGGATCCGAGCTCCACGTG
ＮＢap12（配列番号１２）
CGTACGGAATTCGCTAGCTAATAGATATAAGGTTGTAAAAATATTAAAGTATAAATCAGGATCCGAGCTCCACGTG
ＮＢap13（配列番号１３）
CGTACGGAATTCGCTAGCAGAAAGAGATTAAAAAACACATATTTTATATAAATAGTTAGGATCCGAGCTCCACGTG
ＮＢap14（配列番号１４）
CGTACGGAATTCGCTAGCAAAGTATAAGAATAAAAAGCAAAGTATAAATTTATATATCGGATCCGAGCTCCACGTG
ＮＢap15（配列番号１５）
CGTACGGAATTCGCTAGCATAGTAGTAATAGTTGTATAATAGAAAAACATAAGAATTAGGATCCGAGCTCCACGTG
ＮＢap16（配列番号１６）
CGTACGGAATTCGCTAGCATAATAATAGAAAAGAAATATTGTGTTGTAATAGTTAATTGGATCCGAGCTCCACGTG
ＮＢap17（配列番号１７）
CGTACGGAATTCGCTAGCTAAGAAAATTTCAAATAATAATAGATAAACTGTTGTATTAGGATCCGAGCTCCACGTG
ＮＢap18（配列番号１８）
CGTACGGAATTCGCTAGCTTAGTTGTTATCTTCATAGATTTATTATTTGATTATTTTAGGATCCGAGCTCCACGTG
【００４３】
前記（ｂ）において、「同一性」を有する塩基配列とは、ＮＯＢに結合する能力を消失しない範囲で改変された塩基配列をいう。例えば、前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなるものである。
【００４４】
また、「同一性」を有する塩基配列とは、例えば、前記（ｃ）のいずれかの塩基配列において、８０％以上、８５％以上であり、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上、非常に好ましくは１００％の塩基配列が同一である塩基配列をいう。この同一性は、例えば、解析ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ（商標）等を用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる。
【００４５】
前記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドは、例えば、Escherichia coli、Blastomonas natatoria、 Nitrosomonas europaea又はPseudomonas aeruginosa等に実質的に結合しない。「実質的に結合しない」とは、例えば、前記核酸分子とEscherichia coli、Blastomonas natatoria、 Nitrosomonas europaea又はPseudomonas aeruginosa等との結合を検出した際に、検出限界以下であることも含む。
【００４６】
また（ｃ）のポリヌクレオチドは、（ａ）のポリヌクレオチドの配列からフォワードプライマー（CGTACGGAATTCGCTAGC）とリバースプライマー（GGATCCGAGCTCCACGTG）の配列を除いた配列番号１９〜３６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００４７】
ＮＢap1-40（配列番号１９）
TAGAAAGAAATAGTATAAAACAAGTACAATATTATGTATA
ＮＢap2-40（配列番号２０）
AGGTATGATAAAGTAAGAAGATAGAAATATAATATTTTTA
ＮＢap3-40（配列番号２１）
AATATATTAAATAAATGAGTAAAGAAACATAGTAAATCTG
ＮＢap4-40（配列番号２２）
ATATAATATAGAAAGAAAAAATGTCAAGTATCATAATAAT
ＮＢap5-40（配列番号２３）
TATAAATTGTCAATTAGTAATAAATAGAAGTAAGTAAAAA
ＮＢap6-40（配列番号２４）
CTAAAGATAATAGAAATAAAATAAAGAACATGTAAAAGAA
ＮＢap7-40（配列番号２５）
AATGAATATTATCATAAGGAAGGAAATAAAATAACAATTA
ＮＢap8-40（配列番号２６）
AACATAATAAAATAACAATACAAGAACATTTATATAAATT
ＮＢap9-40（配列番号２７）
TATATAATGGAATAAAAGGTTAATAAAAAATATAGTTCTT
ＮＢap10-40（配列番号２８）
GTATATATATATTATTAGTTTATGTAATTTGATTGATTTG
ＮＢap11-40（配列番号２９）
TATATAAATAGAAACAAAATAGTAATTAGAAGACTTAAAG
ＮＢap12-40（配列番号３０）
TAATAGATATAAGGTTGTAAAAATATTAAAGTATAAATCA
ＮＢap13-40（配列番号３１）
AGAAAGAGATTAAAAAACACATATTTTATATAAATAGTTA
ＮＢap14-40（配列番号３２）
AAAGTATAAGAATAAAAAGCAAAGTATAAATTTATATATC
ＮＢap15-40（配列番号３３）
ATAGTAGTAATAGTTGTATAATAGAAAAACATAAGAATTA
ＮＢap16-40（配列番号３４）
ATAATAATAGAAAAGAAATATTGTGTTGTAATAGTTAATT
ＮＢap17-40（配列番号３５）
TAAGAAAATTTCAAATAATAATAGATAAACTGTTGTATTA
ＮＢap18-40（配列番号３６）
TTAGTTGTTATCTTCATAGATTTATTATTTGATTATTTTA
【００４８】
前記（ｄ）において、「同一性」を有する塩基配列とは、ＮＯＢに結合する能力を消失しない範囲で改変された塩基配列をいう。例えば、前記（ｃ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなるものである。
【００４９】
また、「同一性」を有する塩基配列とは、例えば、前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、８０％以上、８５％以上であり、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上、非常に好ましくは１００％の塩基配列が同一である塩基配列をいう。前記同一性は、例えば、解析ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ（商標）等を用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる。
【００５０】
前記核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造及びループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造及び／又はバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
【００５１】
前記核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含み、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドがあげられる。前記核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造及びループ構造を形成していることが好ましい。
【００５２】
本発明において、「ステム構造及びループ構造を形成している」とは、例えば、実際にステム構造及びループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造及びループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造及びループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造及びループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、及び、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
【００５３】
前記核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。前記核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾化ヌクレオチド残基及び／又は前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。前記核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端又は３’末端に、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）又はデオキシチミジン等が結合してもよい。
【００５４】
前記核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端及び３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長であり、好ましくは１〜５０塩基長であり、より好ましくは１〜２５塩基長、さらに好ましくは１８〜２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基及びリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。
【００５５】
前記核酸分子は、例えば、さらに標識物質を有してもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体、酵素等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、ＦＡＭ色素、ローダミン色素、テキサスレッド色素、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ＨＥＸ、ＴＹＥ等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ６４７等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記標識物質は、前記核酸分子に結合していればよく、結合箇所の制限はない。結合箇所は、好ましくは、５’末端及び３’末端の少なくとも一方に結合していればよく、より好ましくは５’末端に結合している。
【００５６】
前記標識物質は、例えば、前記核酸分子に直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、間接的に連結してもよい。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、前述の例示を援用できる。
【００５７】
前記核酸分子及びそれを修飾した核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法等、遺伝子工学的手法、公知の方法により合成できる。
【００５８】
前記検出方法は、前述のように、ＮＯＢの検出方法であって、試料と前記核酸分子とを接触させ、前記試料中のＮＯＢと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のＮＯＢを検出する検出工程を含むことを特徴とする。前記検出方法は、前記核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程及び条件等は、特に制限されない。
【００５９】
本発明によれば、前記核酸分子が、ＮＯＢに特異的に結合することから、例えば、ＮＯＢと前記核酸分子との結合を検出することによって、試料中のＮＯＢを特異的に検出可能である。具体的には、例えば、試料中のＮＯＢの有無又はＮＯＢの量を分析可能であることから、定性又は定量も可能である。本発明によれば、ＮＯＢの中でも、例えば、Nitrobacter hamburgensis、Nitrobacter vulgaris、Nitrobacter winogradskyiを特異的に検出できる。
【００６０】
前記検出工程は、例えば、前記試料と前記核酸分子とを接触させて、前記試料中ＮＯＢと前記核酸分子とを結合させる接触工程と、ＮＯＢと前記核酸分子との結合を検出する結合検出工程とを含む。また、前記検出工程は、例えば、さらに、前記結合検出工程の結果に基づいて、前記試料中のＮＯＢの有無又は量を分析する工程を含む。
【００６１】
前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４〜３７℃であり、好ましくは１８〜２５℃であり、接触時間は、例えば、１０〜１２０分であり、好ましくは３０〜６０分である。
【００６２】
前記接触工程において、前記核酸分子は、未固定の遊離した核酸分子でもよい。その場合、例えば、容器内で、前記試料と接触させることができる。前記核酸分子が、例えば、前記標識物質を有していれば、ＮＯＢに付着した前記核酸分子を介して、ＮＯＢの検出が可能となる。
【００６３】
前記接触工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子でもよい。なお、前記核酸分子は、取扱性に優れることから、前記固定化核酸分子が好ましい。前記担体は、特に制限されず、例えば、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。
【００６４】
前記核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用する場合、前記核酸分子の５’末端及び３’末端のいずれかを固定化することが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、例えば、前記付加配列を介して固定化することが好ましい。
【００６５】
前記結合検出工程は、前述のように、前記試料中のＮＯＢと前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記試料中のＮＯＢの有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記試料中のＮＯＢの量を分析（定量）できる。
【００６６】
ＮＯＢと前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記試料中にＮＯＢは存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記試料中にＮＯＢが存在すると判断できる。また、予め、ＮＯＢの細菌数と、結合量との相関関係を求めておき、前記相関関係に基づいて、前記結合量から、前記試料中のＮＯＢの細菌数を計測することもできる。
【００６７】
ＮＯＢと前記核酸分子との結合の検出方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、表面プラズモン共鳴分析法、蛍光偏光法等があげられる。
【００６８】
例えば、表面プラズモン共鳴分析法では、前記核酸分子と、金コロイドを結合して金コロイド標識核酸分子を得る金コロイド標識ステップと、当該金コロイド標識核酸分子をＮＯＢと結合させる金コロイド標識核酸分子結合ステップを有することにより、ＮＯＢを検出できる。
【００６９】
具体的には、以下の通りである（図６）。
１）金ナノ粒子で修飾した前記核酸分子により、ＮＯＢのみを選択的に識別する。
２）選択的に識別された金ナノ粒子が凝集し、表面プラズモン共鳴が生じる。
３）表面プラズモン共鳴に起因する可視光領域での色調変化が起こる。
４）色調変化を吸光度として定量測定する。
【００７０】
［検出試薬］
前記接触工程において、前記核酸分子が未固定の遊離した核酸分子である場合、容器等の中で混合することで、前記試料と接触させることができる。前記核酸分子が、前記標識物質を有している場合、ＮＯＢに結合した前記標識物質に基づき、前記標識物質量を光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、吸光度計等を用いて観測、測定することでＮＯＢを検出できる。本検出試薬は、前記核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。前記標識物質は、前記核酸分子に結合していればよく、結合箇所の制限はない。結合箇所は、好ましくは、５’末端及び３’末端の少なくとも一方に結合していればよく、より好ましくは５’末端に結合している。
【００７１】
例えば、サンドイッチ型検出法では、チオール修飾した前記核酸分子と、ビオチン修飾した前記核酸分子とＮＯＢを結合させるステップと、Horseradish peroxidase (HRP)ーストレプトアビジン結合体とテトラメチルベンジジンまたはo-フェニレンジアミン二塩酸塩による反応ステップを有することにより、ＮＯＢを検出できる。なお、チオール修飾した前記核酸分子は、あらかじめガラスキャピラリーに固定化する。
【００７２】
具体的には、以下の通りである（図７）。
１）ガラスキャピラリーに固定化した前記核酸分子によって、ＮＯＢのみを選択的に識別する。
２）１)で補足されたＮＯＢに対して、ビオチン修飾した前記核酸分子を結合させる。
３）Horseradish peroxidase (HRP)ーストレプトアビジン結合体を前記核酸分子に修飾されたビオチンに結合させる。
４）テトラメチルベンジジンまたはo-フェニレンジアミン二塩酸塩を添加することによって、可視光領域での色調変化が起こる。
５）色調変化をもとにＮＯＢを定量測定する。
【００７３】
［検出キット］
また、ＮＯＢの検出するために、前記核酸分子を用いた検出手段をキット化してもよい。検出キットは、前記核酸分子を含むことを特徴とする。前記検出キットは、前記核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。
【００７４】
前記検査キットは、前記核酸分子が固定化された担体を備えており、その担体をＮＯＢに接触させることで、検出するＮＯＢを前記核酸分子に結合させるものである。前記検出キットを使用すれば、ＮＯＢの検出を容易に行うことができる。
【００７５】
前記核酸分子は、例えば、ポリヌクレオチドに金コロイド粒子が結合した金コロイド標識核酸分子であることを特徴とするＮＯＢの検出キットである。
【００７６】
前記核酸分子は、例えば、チオール修飾したポリヌクレオチドと、ビオチン修飾したポリヌクレオチドであることを特徴とするＮＯＢの検出キットである。
【００７７】
［検出デバイス］
ＮＯＢの検出デバイスとしてもよい。前記検出デバイスは、前記核酸分子を含むことを特徴とする。前記検出デバイスは、前記核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。前記検出デバイスを使用すれば、前述のように、例えば、ＮＯＢの検出等を行うことができる。
【００７８】
前記検出デバイスは、例えば、さらに担体を有し、前記担体に前記核酸分子が配置されている。前記核酸分子は、前記担体に固定化されていることが好ましい。前記担体の種類及び前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。前記検出デバイスの使用方法は、特に制限されず、前記核酸分子及び前記検出方法を援用できる。
【００７９】
前記核酸分子は、前述のように、ＮＯＢ結合性を示す。このため、前記核酸分子の用途は、ＮＯＢへの結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。
【００８０】
本発明において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、地下水、河川水、海水、生活排水、土壌等があげられる。
【００８１】
前記試料は、例えば、採取したものを、そのまま前記検出方法に使用してもよいし、前記採取物を種として培地で培養を行い、得られた培養物を本発明の検出方法に試料として使用してもよい。
【実施例】
【００８２】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。
［実施例１］
【００８３】
亜硝酸酸化細菌を網羅的に識別できるＤＮＡアプタマーの選別を行った。
【００８４】
1.5mL容プラスチックチューブを用い、調製したRandom library nucleotides (5'-CGTACGGAATTCGCTAGC-N40-GGATCCGAGCTCCACGTG-3' [100 pmol・マイクロL-1] ) 15マイクロLに、Selection buffer（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na2HPO4・7H2O、1.5 mM KH2PO4、1.4 mM MgCl2）135マイクロLを添加し混合した。Random library nucleotidesのプライマー配列は、Song, M.らの配列を用いた（Sci. Rep.、7、43641、2017)。
【００８５】
Random library nucleotidesとSelection bufferを入れた1.5mL容プラスチックチューブをヒートブロックにて９５ ℃で５分間加温した後、氷浴で１５分間静置した。
【００８６】
３種の亜硝酸酸化細菌 (ＮＯＢ) のうち、107cells・ml-1に調整した１種のＮＯＢの生菌液850マイクロLをRandom library nucleotidesとSelection bufferを加えた1.5mL容プラスチックチューブに添加した。
【００８７】
前記の３種のＮＯＢとは、Nitrobacter winogradskyi（DSM10237T株）、Nitrobacter hamburgensis（DSM10229T株）、Nitrobacter vulgaris（DSM10236T株）を指す。
【００８８】
1.5mL容プラスチックチューブ内のRandom library nucleotidesとＮＯＢ生菌を、振盪器を用いて撹拌 (220 rpm) しながら、室温で４５分間反応させた。
【００８９】
遠心分離装置 (16,000 g×5分、25 ℃) を用いて、反応液を遠心分離した後、上清をのみを捨てることで、ＮＯＢ生菌体に結合したRandom library nucleotidesを回収した。
【００９０】
Random library nucleotides結合したＮＯＢ生菌体を、1mLのSelection bufferを用いて、２回洗浄した。
【００９１】
ＮＯＢ生菌体に結合したRandom library nucleotidesを水層に抽出するために、ＮＯＢ生菌体に結合したRandom library nucleotides の入った容器にNuclease-waterを100 マイクロL添加し、９５℃で５分間温めた。
【００９２】
その溶液を遠心分離(16,000 g×5分、25 ℃)し、水層に抽出したRandom library nucleotidesを1.5mL容プラスチックチューブに回収した。
【００９３】
0.2mL容プラスチックチューブを用いて、Promega社製GoTaq Green Master Mix (10 マイクロL)、10マイクロM のフォワードプライマー (5’-CGTACGGAATTCGCTAGC-3’) (4 マイクロL)、0.6マイクロMのリバースプライマー (5’-CACGTGGAGCTCGGATCC-3’) (2 マイクロL) 及びMQ (2 マイクロL) を含む溶液に、前記のRandom library nucleotidesを2マイクロL添加した。以下、この溶液をＲＬＮ反応液という。なお、フォワードプライマーとリバースプライマーの配列は、Song, M.らの配列を用いた（Sci. Rep.、7、43641、2017)。
【００９４】
Cell-systematic evolution of ligands by exponential enrichment法 (以下、Cell-SELEX法)の１回の操作において、前記ＲＬＮ反応液を添加した0.2 mL容プラスチックチューブを８本用意した。その後、前記0.2mL容プラスチックチューブ８本をバイオラッド社製T100サーマルサイクラーにセットし、変性反応 (95℃、30 秒)、 アニーリング反応 (56.3 ℃、30秒)、 伸長反応(72 ℃、10秒) のステップを６〜１６回の範囲で繰り返すアシンメトリックPCRを行った。理論上、アシンメトリックPCR増幅産物には、フォワードプライマーにて増幅されたsingle strand ＤＮＡ (ssＤＮＡという) が多く含まれる。
【００９５】
アシンメトリックPCR反応後の溶液は、1.5mL容プラスチックチューブに全て回収した後、アシンメトリックPCR増幅産物は、１０% (%T) アクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。
【００９６】
その後、ZYMO RESEARCH社製 ssＤＮＡ/RNA Clean & Concentratorキットを用いて、アシンメトリックPCR増幅産物内のssＤＮＡのみを精製・濃縮した。
【００９７】
先に用いたＮＯＢと異なる種のＮＯＢを107 cells・ml-1に調整し、生菌液として850 マイクロLをssＤＮＡとSelection bufferの入った1.5mL容プラスチックチューブに添加し、上記の操作を繰り返した（図１）。
【００９８】
濃縮されたssＤＮＡは、再び、別のＮＯＢ種へ結合させた。図１に示すように、Cell-SELEX法による操作を３種のＮＯＢに対してそれぞれ３回ずつ (合計９回)行った。ただし、はじめの９回はNitrobacter winogradskyiのみに結合させ、合計１８回のCell-SELEXを実施した。
【００９９】
さらに、６回目、１１回目及び１４回目のCell-SELEX法終了時において、非標的微生物であるEscherichia coli（Top10株）、Blastomonas natatoria（NBRC15649T株）およびNitrosomonas europaea（NBRC14298株）をそれぞれ用いたカウンターセレクションを行った。
【０１００】
＜カウンターセレクション＞
カウンターセレクションは、以下のとおり行った（図１）。
【０１０１】
1.5mL容プラスチックチューブ内で、15マイクロLの前記ssＤＮＡと135マイクロLのSelection bufferを混合した。
【０１０２】
ssＤＮＡとSelection bufferを入れた1.5mL容プラスチックチューブをヒートブロックにて９５℃で５分間加温した後、氷浴で１５分間静置した。
【０１０３】
107 cells・ml-1に調製したEscherichia coli、Blastomonas natatoria又はNitrosomonas europaeaの生菌液850マイクロLをssＤＮＡとSelection bufferが入った 1.5mL容プラスチックチューブに添加した。
【０１０４】
1.5mL容プラスチックチューブ内のssＤＮＡとEscherichia coli、Blastomonas natatoria又はNitrosomonas europaeaの生菌を、振盪器を用いて撹拌 (220 rpm) しながら、室温で４５分間反応させた。
【０１０５】
遠心分離装置 (16,000 g×5分, 25℃) を用いて、反応液と菌体を分離した後、図１に示すとおり、Escherichia coli、Blastomonas natatoria又はNitrosomonas europaeaの生菌に結合したssＤＮＡを除くため、上清のみを回収した。
【０１０６】
上清に含まれるssＤＮＡをエタノール沈殿させた後、沈殿したssＤＮＡをNuclease-water (100マイクロL) に溶解しssＤＮＡ溶解液とした。
【０１０７】
0.2 mL容プラスチックチューブを用い、Promega社製GoTaq Green Master Mix (10 マイクロL)、10マイクロM のフォワードプライマー (5’-CGTACGGAATTCGCTAGC-3’) (4 マイクロL)、0.6マイクロMのリバースプライマー(5’-CACGTGGAGCTCGGATCC-3’) (2 マイクロL) 及びMQ (2 マイクロL) を含む溶液に、前記ssＤＮＡ溶解液を2マイクロL添加した。以下、この溶液を上清溶液という。0.2mL容プラスチックチューブは、Cell-SELEX法の1回の操作において、８本用意した。
【０１０８】
上清溶液の入った0.2mL容プラスチックチューブ5本をバイオラッド社製T100サーマルサイクラーにセットし、変性反応 (95 ℃、30 秒)、 アニーリング反応 (56.3 ℃、30秒)、 伸長反応 (72 ℃、10秒) のステップを６〜１６回の範囲で繰り返すアシンメトリックPCRを行った。
【０１０９】
アシンメトリックPCR反応後の溶液は、1.5mL容プラスチックチューブに全て回収した後、アシンメトリックPCR増幅産物は、１０% (%T) アクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。
【０１１０】
その後、ZYMO RESEARCH社製 ssＤＮＡ/RNA Clean & Concentratorキットを用いて、アシンメトリックPCR増幅産物内のssＤＮＡのみを精製・濃縮した。
【０１１１】
Cell-SELEX６回目、１２回目及び１８回目を実施した後に得られたssＤＮＡ配列は、ZYMO RESEARCH社製Select-A-size DNA Clean & Concentratorキットを用いて、５０塩基以上の配列のみを精製・濃縮した。
【０１１２】
精製・濃縮したssＤＮＡ配列は、次世代シーケンサー、イルミナ社製Miseqによって解析した。次世代シーケンサーで得られたssＤＮＡ配列の母集団は、それぞれ約４０万〜５０万リードから構成される。
【０１１３】
USEARCH v9.0.2132プログラム(https://www.drive5.com/usearch/) によって、各母集団における配列相同性１００%のssＤＮＡ塩基配列の特定と母集団における存在比を得た。
【０１１４】
表１には、８種のssＤＮＡ配列(以下、ＮＢap1〜ＮＢap8) は、Cell-SELEX １８回目の母集団における存在比が３．３%以上を示し、ＮＯＢを網羅的に (少なくても３種のＮＯＢ) に識別できるＤＮＡアプタマーの塩基配列、長さ及びG+C含量を示した。
【０１１５】
以上の操作を３種類のＮＯＢに対し、１種類ずつ行い、３種類のＮＯＢに結合するＤＮＡアプタマーを得た（表１）。
【０１１６】
【表１】
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【０１１７】
図２には、Cell-SELEX法の過程において、前記８種のＤＮＡアプタマーの濃縮過程を示す存在比を示した。
【０１１８】
図３に温度２５℃、反応液中に含まれる[Na+]濃  度137 mM及び [Mg2+] 濃度1.4 mMの条件における、前記８種のＤＮＡアプタマーの二次構造を示す。図３の作成に当たっては、mfold software（http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/download-mfold）を用いた。
【０１１９】
［実施例２］
実施例２は、基本的に前述の実施例１と同じ方法とし、前掲のCell-SELEX法の回数のみを増加させることにより、前掲とは異なる他のＤＮＡアプタマーを選別した。具体的には、実施例１の１８回目のCell-SELEXで得られたssＤＮＡを用いて、Cell-SELEX法による操作を前掲３種のＮＯＢに対してさらに４回ずつ（前掲と合わせて合計３０回）行い、前掲と合わせて２４回目および３０回目の母集団における配列相同性１００％のssＤＮＡ塩基配列の特定と母集団における存在比を得た。なお、この場合のカウンターセレクションは、６回目、１１回目、１４回目に続き、２２回目のCell-SELEX法終了時において、非標的微生物であるEscherichia coli（Top10株）、Blastomonas natatoria（NBRC15649T株）、Nitrosomonas europaea（NBRC14298株）およびPseudomonas aeruginosa(NBRC12689T) をそれぞれ用いて行った。具体的には、前掲の各回におけるCell-SELEX法終了時ごとに異なる非標的微生物を用いたカウンターセレクションを行うものであり、６回目のCell-SELEX法終了時にEscherichia coli、１１回目にBlastomonas natatoria、１４回目のCell-SELEX法終了時にNitrosomonas europaea、２２回目のCell-SELEX法終了時にPseudomonas aeruginosaを用いた。
【０１２０】
前掲の８種を含む合計１８種のssＤＮＡ配列(以下、ＮＢap1〜ＮＢap18) は、Cell-SELEX３０回目の母集団における存在比が1.8%以上を示し、ＮＯＢを網羅的に (少なくても3種のＮＯＢ) に識別できるＤＮＡアプタマーの塩基配列、長さ及びG+C含量を示した。
【０１２１】
以上の操作を３種類のＮＯＢに対し、１種類ずつ行い、３種類のＮＯＢに結合するＤＮＡアプタマーをさらに得ることができた。前掲の８種を除く他の１０種のＤＮＡアプタマーを表２に示す。
【０１２２】
【表２】
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【０１２３】
図４には、Cell-SELEX法の過程において、前掲８種を含む合計１８種のＤＮＡアプタマーの濃縮過程を示す存在比を示した。図中の番号は、それぞれNBap1〜NBap18からなる１８種のＤＮＡアプタマーを表している。
【０１２４】
図５に温度２５℃、反応液中に含まれる[Na+]濃  度137 mM及び [Mg2+] 濃度1.4 mMの条件における、前掲の８種を除く他の１０種のＤＮＡアプタマーの二次構造を示す。なお、図５の作成に当たっては、前掲のmfold softwareを用いた。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明の核酸分子は、ＮＯＢに結合可能である。このため、前記核酸分子によれば、例えば、ＮＯＢとの結合によって、ＮＯＢを検出できる。このため、前記核酸分子は、例えば、に水処理関連、土壌関連の分野におけるＮＯＢの検出に、極めて有用なツールとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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