(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトの身体に対して負の効果および潜在的に致死的な効果を誘発せずに疾患の進行を妨げ、または遅らせるＡβ結合タンパク質などの生物学的製剤の提供。【解決手段】アミロイド−ベータ（Ａｓ）結合タンパク質に関する。該結合タンパク質である抗体は、Ａｓ（２０−４２）グロブロマーまたはグロブロマーエピトープを含むいずれのＡｆ型に対しても高親和性を有する。また、該抗体を作成する方法および用いる方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２または配列番号３に少なくとも９０％同一である第１のアミノ酸配列、および配列番号１に少なくとも９０％同一である第２のアミノ酸配列
を含む、結合タンパク質。
【請求項２】
第１のアミノ酸配列が、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一である、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項３】
第２のアミノ酸配列が、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一である、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項４】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一である第１のアミノ酸配列、ならびに
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一である第２のアミノ酸配列
を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項５】
免疫グロブリン分子、ジスルフィド連結したＦｖ、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ダイアボディ、ヒト化抗体、多特異的抗体、Ｆａｂ、二重特異的抗体、ＤＶＤ、Ｆａｂ’、二特異的抗体、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖからなる群から選択される、請求項１から４に記載の結合タンパク質。
【請求項６】
配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖定常領域をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項７】
免疫接着分子、造影剤、および治療薬からなる群から選択される薬剤をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項８】
ヒトグリコシル化パターンを持つ、請求項１から７のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の結合タンパク質をコードしている、単離された核酸。
【請求項１０】
請求項９の単離された核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
結合を生成するのに十分な条件下、請求項１０の宿主細胞を培養培地中で培養することを含む、結合タンパク質を生成する方法。
【請求項１３】
請求項１１の方法にしたがって生成される結合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１から８または１４のいずれか一項の結合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
少なくとも１つのさらなる治療薬をさらに含む、請求項１４のいずれか一項の医薬組成物。
【請求項１６】
（ａ）結晶化されている、請求項１から８のいずれか一項の結合タンパク質、および成分を含む製剤、ならびに
（ｂ）少なくとも１つのポリマー担体
を含む、結合タンパク質を放出するための組成物。
【請求項１７】
処置が実現するように請求項１から２３または４０のいずれか一項の結合タンパク質を対象に投与することによる、アルファ１アンチトリプシン欠損症、Ｃ１インヒビター欠損性血管性浮腫、アンチトロンビン欠乏血栓塞栓症、クールー、クロイツフェルトヤコブ病／スクレイピー、ウシ海綿状脳症、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病、致死性家族性不眠症、ハンチントン病、脊髄小脳失調、マシャド−ジョセフ萎縮、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、前頭側頭型認知症、鎌状赤血球貧血、不安定ヘモグロビン封入体溶血、薬物誘導性封入体溶血、パーキンソン病、全身性ＡＬアミロイドーシス、結節性ＡＬアミロイドーシス、全身性ＡＡアミロイドーシス、前立腺アミロイドーシス、血液透析アミロイドーシス、遺伝性（アイスランド）脳性血管障害、ハンチントン病、家族性内臓アミロイドーシス、家族性内臓多発神経障害、家族性内臓アミロイドーシス、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイド神経障害、家族性心アミロイドーシス、アルツハイマー病、ダウン症候群、甲状腺髄様癌、および２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）からなる群から選択される疾患または障害に対して対象を処置するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイドベータ（Ａβ）結合タンパク質、前記タンパク質をコードする核酸、前記タンパク質を生成する方法、前記タンパク質を含む組成物、ならびにアミロイドーシス（例えば、アルツハイマー病）などの状態の診断、処置、および防止における前記タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知能力の進行性の喪失、ならびに脳のいくつかの領域における、アミロイドベータ（Ａβ）ペプチドの沈着、神経原線維変化、およびニューロンの喪失を含めた特徴的な神経病理学的特色によって特徴付けられる神経変性疾患である（ＨａｒｄｙおよびＳｅｌｋｏｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７巻、３５３頁、２００２年；Ｍａｔｔｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、４３１巻、７００４頁、２００４年）。アルツハイマー病において観察されるものに非常に類似する脳のアミロイド沈着および認知障害は、ダウン症候群（トリソミー２１）の特質でもあり、ダウン症候群は出生８００件中約１件の頻度で生じる。
【０００３】
Ａβペプチドは、タンパク質分解性のプロセシングによってアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から生じる。このプロセシングは、α−、β−、およびγ−セクレターゼと命名されるいくつかのプロテアーゼの協同的な活性によって引き起こされ、様々な長さの特異的な断片の数々をもたらす。アミロイド沈着物は殆ど、アミノ酸４０個または４２個の長さのペプチドからなる（Ａβ４０、Ａβ４２）。これはさらに、ヒトバリアントに加えて、ヒト以外の生物体、とりわけ他の哺乳動物、特にラットにおいて存在するアミロイドβ（１−４２）タンパク質のアイソフォームを含む。このタンパク質は水性環境中で重合する傾向があり、非常に様々な分子形態において存在し得る。不溶性タンパク質の沈着と、例えばアルツハイマー病などの認知症の発生または進行との単純な相関については、疑わしいことが証明されている（Ｔｅｒｒｙら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、３０巻、５７２−５８０頁、１９９１年；Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ、１６巻、２８５−２９８頁、１９９５年）。これとは対照的に、シナプスおよび認知的知覚の喪失は、可溶型のＡβ（１−４２）と、より良好に相関すると思われる（Ｌｕｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１５５巻、８５３−８６２頁、１９９９年；ＭｃＬｅａｎら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４６巻、８６０−８６６頁、１９９９年）。
【０００４】
過去にモノマーのＡβ（１−４２）に対して産生されているポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のどれも、動物および／またはヒトにやはり深刻な副作用を引き起こさずには望ましい治療効果を生成しないことが証明されている。例えば、Ｎ−末端配向抗Ａβ（１−４２）抗体を週１回５ヶ月間投与した非常に高齢のＡＰＰ２３マウスにおける前臨床試験からの受動免疫の結果は、治療上関連する副作用があることを指摘している。特に、これらのマウスは、食塩水で処置したマウスに比べて微小出血の数および重症度における増大を示した（Ｐｆｅｉｆｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９８巻、１３７９頁、２００２年）。出血における同様の増大が、非常に高齢の（＞２４月齢）Ｔｇ２５７６およびＰＤＡＰＰマウスにも記載されていた（Ｗｉｌｃｏｃｋら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２３巻、３７４５−５１頁、２００３年；Ｒａｃｋｅら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２５巻、６２９−６３６頁、２００５年）。両方の系統において、抗Ａβ（１−４２）の注射は、微小出血の著しい増大をもたらした。
【０００５】
国際公開第２００４／０６７５６１号は、Ａβ（１−４２）ペプチドの球状のオリゴマー（グロブロマー）およびこれらを調製するためのプロセスに関する。国際公開第２００６／０９４７２４号は、非拡散性の球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーに関し、Ｘは１．．２４の数からなる群から選択される。国際公開第２００４／０６７５６１号および国際公開第２００６／０９４７２４号は、グロブロマーの限定されたタンパク質分解により、Ａβ（２０−４２）またはＡβ（１２−４２）グロブロマーなど、前記グロブロマーの切断されたバージョンが生じることをさらに記載している。国際公開第２００７／０６４９１７号は、組換え型のアミロイドβペプチド（以降Ｎ−Ｍｅｔ  Ａβ（１−４２）と呼ぶ）およびこのグロブロマー型の、クローニング、発現、および単離を記載している。データは、アミロイド原繊維のＡβフォールディングの独立の経路、および１つまたは複数の独特のエピトープ（本明細書以降、グロブロマーエピトープと呼ぶ）を表すＡβオリゴマーへの集合の存在を示唆している。グロブロマーエピトープがＡＤ患者およびＡＰＰトランスジェニックマウスの脳において検出され、グロブロマーがニューロンに特異的に結合しＬＴＰを阻止することから、グロブロマーは病理学的に関連のあるＡβ配座異性体を表している。可溶性Ａβグロブロマーは、本質的にＰ／Ｑ型のシナプス前カルシウムチャネルとの相互作用によってその有害な作用を発揮し、したがってこの相互作用の阻害物質は、アルツハイマー病などのアミロイドーシスの処置に有用であることが見出されている（国際公開第２００８／１０４３８５号）。
【０００６】
このようなグロブロマー状形態のＡβに選択的に結合する抗体は、国際公開第２００７／０６４９７２号、国際公開第２００７／０６２８５２号、国際公開第２００８０６７４６４号、国際公開第２００８／１５０９４６号、および国際公開第２００８／１５０９４９号において記載されている。例えば、国際公開第２００７／０６２８５２号および国際公開第２００８／１５０９４９号から知られているいくつかのモノクローナル抗体は、Ａβ（２０−４２）グロブロマーを特異的に認識する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００４／０６７５６１号
【特許文献２】国際公開第２００６／０９４７２４号
【特許文献３】国際公開第２００７／０６４９１７号
【特許文献４】国際公開第２００８／１０４３８５号
【特許文献５】国際公開第２００７／０６４９７２号
【特許文献６】国際公開第２００７／０６２８５２号
【特許文献７】国際公開第２００８／０６７４６４号
【特許文献８】国際公開第２００８／１５０９４６号
【特許文献９】国際公開第２００８／１５０９４９号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＨａｒｄｙおよびＳｅｌｋｏｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７巻、３５３頁、２００２年
【非特許文献２】Ｍａｔｔｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、４３１巻、７００４頁、２００４年
【非特許文献３】Ｔｅｒｒｙら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、３０巻、５７２−５８０頁、１９９１年
【非特許文献４】Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ、１６巻、２８５−２９８頁、１９９５年
【非特許文献５】Ｌｕｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１５５巻、８５３−８６２頁、１９９９年
【非特許文献６】ＭｃＬｅａｎら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４６巻、８６０−８６６頁、１９９９年
【非特許文献７】Ｐｆｅｉｆｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９８巻、１３７９頁、２００２年
【非特許文献８】Ｗｉｌｃｏｃｋら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２３巻、３７４５−５１頁、２００３年
【非特許文献９】Ｒａｃｋｅら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２５巻、６２９−６３６頁、２００５年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ヒトの身体に対して負の効果および潜在的に致死的な効果を誘発せずに疾患の進行を妨げ、または遅らせるＡβ結合タンパク質などの生物学的製剤の開発には、極めて大きな、満たされていない治療上の必要性が存在する。一般集団の寿命が延びることに鑑みて、またこの延命とともにアルツハイマー病または関連の障害と診断される患者数がそれに伴い年々上昇することから、このような必要性はとりわけ歴然としている。さらに、このようなＡβ結合タンパク質により、アルツハイマー病の症状を経験する患者において、現在剖検時にのみ確認することができる、アルツハイマー病の適切な診断が可能になる。加えて、Ａβ結合タンパク質は、この消耗性の疾患の原因となるタンパク質の生物学的性質および他の生物学的要因の解明を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、可溶性Ａβグロブロマー、例えば、本明細書に記載するＡβ（２０−４２）グロブロマーに結合することができる、Ａβ結合タンパク質（または、単に「結合タンパク質」）、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト化抗体、およびこれらの断片の新規なファミリーを提供する。本発明の結合タンパク質は、本明細書に記載するＡβグロブロマー以外のＡβ型と反応性であり得る（すなわち、結合する）ことが注目され、このようなＡβ型は、アルツハイマー病などのアミロイドーシスを有する患者の脳に存在することがある。これらのＡβ型は、オリゴマー状またはグロブロマー状であってよく、またはそうでなくてもよい。それに対して本発明の結合タンパク質が結合するＡβ型は、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）モノクローナル抗体ｍ４Ｄ１０（本明細書以降「ｍ４Ｄ１０」と呼ぶ）が反応性であるグロブロマーエピトープを含む任意のＡβ型を含む。ｍ４Ｄ１０およびその性質は、本明細書に参照により組み込む、ＷＯ２００７／０６２８５２に記載されている。このようなＡβ型は、本明細書以降「標的Ａβ型」と呼ばれる。さらに、本発明はまた、前記標的Ａβ型の活性を阻害する治療手段を提供し、前記標的Ａβ型に関連する疾患、とりわけアルツハイマー病などのアミロイドーシスを処置するための組成物および方法を提供する。
【００１１】
一態様では、本発明は、
配列番号２：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＸ１２ＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＸ２４ＳＧＦＴＸ２９ＳＳＹＧＶＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＸ４８Ｘ４９ＶＩＷＲＧＧＲＩＤＹＮＡＡＦＭＳＲＸ６７ＴＩＳＸ７１ＤＮＳＫＸ７６ＴＸ７８ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＳＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
［配列中、Ｘ１２はＩもしくはＶであり、Ｘ２４はＡもしくはＶであり、Ｘ２９はＶもしくはＬであり、Ｘ４８はＶもしくはＬであり、Ｘ４９はＳもしくはＧであり、Ｘ６７はＦもしくはＬであり、Ｘ７１はＲもしくはＫであり、Ｘ７６はＮもしくはＳであり、Ｘ７８はＬもしくはＶである］；または
配列番号３：
Ｘ１ＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＸ２７ＳＸ２９ＳＳＹＧＶＨＷＸ３７ＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＸ４８ＧＶＩＷＲＧＧＲＩＤＹＮＡＡＦＭＳＲＸ６７ＴＩＳＸ７１ＤＴＳＫＸ７６ＱＸ７８ＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＳＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
［配列中、Ｘ１はＱもしくはＥであり、Ｘ２７はＧもしくはＦであり、Ｘ２９はＩもしくはＬであり、Ｘ３７はＩもしくはＶであり、Ｘ４８はＩもしくはＬであり、Ｘ６７はＶもしくはＬであり、Ｘ７１はＶもしくはＫであり、Ｘ７６はＮもしくはＳであり、Ｘ７８はＦもしくはＶである］
に少なくとも９０％同一である第１のアミノ酸配列、および
配列番号１：
ＤＶＶＭＴＱＸ７ＰＬＳＬＰＶＴＸ１５ＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＩＤＧＫＴＹＬＮＷＸ４１Ｘ４２ＱＸ４４ＰＧＱＳＰＸ５０ＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ
［配列中、Ｘ７はＳもしくはＴであり、Ｘ１５はＬもしくはＰであり、Ｘ４１はＦもしくはＬであり、Ｘ４２はＱもしくはＬであり、Ｘ４４はＲもしくはＫであり、Ｘ５０はＲもしくはＱである］
に少なくとも９０％同一である第２のアミノ酸配列
を含む結合タンパク質を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる一態様では、上記に記載する結合タンパク質は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である第１のアミノ酸配列を含む。本発明のなおさらなる一態様では、上記に記載する結合タンパク質は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１からなる群から選択される第１のアミノ酸配列を含む。
【００１３】
本発明の別の態様では、上記に記載する結合タンパク質は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である第２のアミノ酸配列を含む。本発明のなお別の態様では、上記に記載する結合タンパク質は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択される第２のアミノ酸配列を含む。
【００１４】
本発明の一態様では、上記に記載する結合タンパク質は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である第１のアミノ酸配列、および配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である第２のアミノ酸配列を含む。本発明のさらなる一態様では、上記に記載する結合タンパク質は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１からなる群から選択される第１のアミノ酸配列、および配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択される第２のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
本発明の特定の一態様では、上記に記載する結合タンパク質は、配列番号６に記載するアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である第１のアミノ酸配列、および配列番号１４に記載するアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である第２のアミノ酸配列を含む。本発明のさらなる特定の一態様では、上記に記載する結合タンパク質は、配列番号６に記載する第１のアミノ酸配列、および配列番号１４に記載する第２のアミノ酸配列を含む。
【００１６】
本発明の特定の一態様では、上記に記載する結合タンパク質は、配列番号１０に記載するアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である第１のアミノ酸配列、および配列番号１４に記載するアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である第２のアミノ酸配列を含む。本発明のさらなる特定の一態様では、上記に記載する結合タンパク質は、配列番号１０に記載する第１のアミノ酸配列、および配列番号１４に記載する第２のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
一態様では、本明細書に記載する結合タンパク質は抗体である。この抗体は、例えば、免疫グロブリン分子、ジスルフィド連結したＦｖ、モノクローナル抗体（ｍａｂ）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ダイアボディ、ヒト化抗体、多特異的抗体、Ｆａｂ、二重特異的抗体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）結合分子、Ｆａｂ’、二特異的抗体、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦｖであってよい。
【００１８】
本明細書に記載する結合タンパク質が抗体である場合、これは上記に規定した第１のアミノ酸配列に対応する少なくとも１個の可変重鎖、および上記に規定した第２のアミノ酸配列に対応する少なくとも１個の可変軽鎖を含む。例えば、本発明の抗体は、（ｉ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１個の可変重鎖、ならびに（ｉｉ）配列番号１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１個の可変軽鎖を含む。本発明の特定の一態様では、本発明の抗体は、（ｉ）配列番号６または配列番号１０に記載するアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１個の可変重鎖、ならびに（ｉｉ）配列番号１４に記載するアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１個の可変軽鎖を含む。
【００１９】
本明細書に記載する結合タンパク質は、別のアミノ酸配列または他の化学的部分であってよい別の部分をさらに（第１および第２のアミノ酸配列に加えて）含んでもよい。例えば、本発明の抗体は重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含んでもよい。前記重鎖免疫グロブリン定常ドメインは、ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、およびヒトＩｇＡ定常ドメインからなる群から選択されてよい。別の態様では、本発明の結合タンパク質は、配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、さらに配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域をさらに含む。本発明の特定の一態様では、本明細書に記載する結合タンパク質は、配列番号６または配列番号１０に記載するアミノ酸配列を含む可変重鎖、配列番号１４に記載するアミノ酸配列を含む可変軽鎖、配列番号２５に記載するアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、および配列番号２７に記載するアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含む。本発明のさらなる特定の一態様では、本明細書に記載する結合タンパク質は、配列番号４６または配列番号４７に記載する第１のアミノ酸配列、および配列番号４８に記載する第２の第１のアミノ酸配列を含む。
【００２０】
本明細書に記載する、抗体などの結合タンパク質は、治療薬、造影剤、免疫接着分子の形成を促進することができる残基、および／または別の機能的分子（例えば、別のペプチドもしくはタンパク質）をさらに含むことができる。造影剤は、それだけには限定されないが、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、および１５３Ｓｍを含めた放射標識；酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、またはビオチンであってよい。
【００２１】
本発明の結合タンパク質はグリコシル化されていてよい。本発明の一態様によると、グリコシル化パターンはヒトグリコシル化パターンである。
【００２２】
本発明の一態様では、上記に記載した結合タンパク質は、マウスモノクローナル抗体ｍ４Ｄ１０が反応性であるグロブロマーエピトープを含むＡβ型に結合する（すなわち、標的Ａβ型）。特に、上記に記載する結合タンパク質は、本明細書に記載するアミロイド−ベータ（２０−４２）グロブロマーに結合する。
【００２３】
本発明の一態様では、本明細書に記載する結合タンパク質はＡβ（２０−４２）グロブロマーの生物学的機能を変調することができる。本発明のさらなる一態様では、本明細書に記載する結合タンパク質は、Ａβ（２０−４２）グロブロマー活性を中和することができる。
【００２４】
本発明の結合タンパク質は、結晶として存在することができる。一態様では、結晶は、無担体の製薬上の放出制御結晶である。別の態様では、結晶化した結合タンパク質は、可溶化型のその対応物よりもｉｎ  ｖｉｖｏのより大きな半減期を有する。さらに別の態様では、結晶化した結合タンパク質は結晶化後に生物学的活性を保持している。
【００２５】
本発明は、本明細書に開示する結合タンパク質のいずれか１つをコードする単離された核酸も提供する。さらなる一実施形態は、前記核酸を含むベクターを提供する。前記ベクターは、ｐｃＤＮＡ、ｐＴＴ（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３０巻（２）、２００２年）、ｐＴＴ３（さらなる多重クローニング部位を有するｐＴＴ）、ｐＥＦＢＯＳ（ＭｉｚｕｓｈｉｍａおよびＮａｇａｔａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８巻（１７）、１９９０年）、ｐＢＶ、ｐＪＶ、およびｐＢＪからなる群から選択することができる。
【００２６】
本発明の別の態様では、宿主細胞は、上記に開示したベクターで形質転換される。一実施形態によると、宿主細胞は、それだけには限定されないが、Ｅ．コリを含めた原核細胞である。関連の一実施形態では、宿主細胞は、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、および真菌細胞を含む群から選択される真核細胞である。動物細胞は、哺乳動物細胞、トリ細胞、および昆虫細胞からなる群から選択されてよい。本発明の一態様によると、前記哺乳動物細胞は、ＣＨＯおよびＣＯＳを含む群から選択され、前記真菌細胞はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母細胞であり、前記昆虫細胞は昆虫Ｓｆ９細胞である。
【００２７】
さらに、本発明は、本明細書に開示する任意の１つの宿主細胞を、前記結合タンパク質を生成するのに適する条件下および時間、培養培地中で培養することを含む、本明細書に開示する結合タンパク質を生成する方法を提供する。別の実施形態は、本明細書に開示する方法にしたがって生成される本発明の結合タンパク質を提供する。別の実施形態では、本発明は、上記に開示した方法にしたがって生成される結合タンパク質を提供する。
【００２８】
本発明は、本明細書に開示する抗体などの結合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
【００２９】
本発明の一実施形態は、本明細書に記載する結合タンパク質を放出するための組成物を提供し、組成物は、次に、上記に開示した通り、結晶化した抗体などの結晶化した結合タンパク質、および成分、ならびに少なくとも１つのポリマー性担体を含む製剤を含む。一態様では、ポリマー性担体は、ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、ポリ（ラクチック−コ−グリコール酸（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ））すなわちＰＬＧＡ、ポリ（β−ヒドロキシブチレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）、ポリ（（オルガノ）ホスファゼン）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギネート、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン（ｇｌｙｃａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ）、硫酸化多糖、これらのブレンドおよびコポリマーからなる群の１つまたは複数から選択されるポリマーである。別の態様では、成分は、アルブミン、ショ糖、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール、およびポリエチレングリコールからなる群から選択される。
【００３０】
本発明は、前記標的Ａβ型の活性が阻害される（すなわち低減される）ように、前記標的Ａβ型を本発明の結合タンパク質（複数可）と接触させることを含む、Ａβ（２０−４２）グロブロマー（または任意の他の標的Ａβ型）の活性を阻害する（すなわち低減する）方法にも関する。特定の一実施形態では、前記活性はｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害される。この方法は、試料中のＡβ型の活性を阻害する（すなわち低減する）ために、本発明の結合タンパク質を、対象に由来する試料などの試料（例えば、全血、脳脊髄液、血清、組織など）、または標的Ａβ型を含み、もしくは含むと疑われる細胞培養物に加えることを含むことができる。あるいは、前記標的Ａβ型の活性は、対象においてｉｎ  ｖｉｖｏで阻害（すなわち低減）されてよい。このように、本発明は、Ａβ型の活性が阻害される（すなわち低減される）ように、前記Ａβ型を本発明の結合タンパク質（複数可）と接触させることを含む、対象における標的Ａβ型の活性の阻害（すなわち低減）において用いるための、本明細書に記載する結合タンパク質にさらに関する。
【００３１】
関連の一態様では、本発明は、前記Ａβ型の活性が有害である疾患または障害に罹患している対象における、標的Ａβ型の活性を阻害する（すなわち低減する）ための方法を提供する。一実施形態では、前記方法は、対象における標的Ａβ型の活性が阻害される（すなわち低減される）ように、本明細書に開示する結合タンパク質の少なくとも１つが対象に投与されることを含む。このように、本発明は、対象における前記Ａβ型の活性が阻害される（すなわち低減される）ように、本明細書に開示する結合タンパク質の少なくとも１つを対象に投与する、本明細書に記載する疾患または障害に罹患している対象における標的Ａβ型の阻害（すなわち低減）において用いるための、本明細書に記載するＡβ結合タンパク質を提供する。
【００３２】
関連の一態様では、本発明は、アルファ１アンチトリプシン欠損症、Ｃ１インヒビター欠損性血管性浮腫、アンチトロンビン欠乏血栓塞栓症、クールー、クロイツフェルトヤコブ病／スクレイピー、ウシ海綿状脳症、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病、致死性家族性不眠症、ハンチントン病、脊髄小脳失調、マシャド−ジョセフ萎縮、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、前頭側頭型認知症、鎌状赤血球貧血、不安定ヘモグロビン封入体溶血、薬物誘導性封入体溶血、パーキンソン病、全身性ＡＬアミロイドーシス、結節性ＡＬアミロイドーシス、全身性ＡＡアミロイドーシス、前立腺アミロイドーシス、血液透析アミロイドーシス、遺伝性（アイスランド）脳性血管障害、ハンチントン病、家族性内臓アミロイドーシス、家族性内臓多発神経障害、家族性内臓アミロイドーシス、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドニューロパチー、家族性心アミロイドーシス、アルツハイマー病、ダウン症候群、甲状腺髄様癌、および２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）からなる群から選択される疾患または障害を処置し（例えば、その発症を治療、抑止、軽減、遅延、もしくは防止し、またはその反回もしくは再発を防止し）、あるいは防止するための方法を提供する。特定の一実施形態では、前記疾患または障害は、アルツハイマー病またはダウン症候群などのアミロイドーシスである。一実施形態では、前記方法は、処置が達成されるように、本明細書に開示するＡβ結合タンパク質のいずれか１つを投与するステップを含む。別の実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるＡβ結合タンパク質の任意の１つを、１つまたは複数のさらなる治療薬（複数可）の投与と同時に、または投与の後に投与するステップを含む、本明細書に開示される疾患または障害に罹患している対象を処置する方法を提供する。このように、本発明は、本明細書に開示される結合タンパク質の任意の１つを、１つまたは複数のさらなる治療薬（複数可）の投与と同時に、または投与の後に投与するステップを含む、本明細書に開示する疾患または障害に罹患している対象の処置において用いるための本明細書に開示するＡβ結合タンパク質を提供する。例えば、さらなる治療薬は、本明細書に列挙される治療薬の群から選択される。
【００３３】
本明細書に開示する結合タンパク質および前記結合タンパク質を含む医薬組成物は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、側脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻腔内、および経皮から選択される少なくとも１つの様式によって対象に投与される。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、（ｉ）前記試料を本発明の結合タンパク質（複数可）と接触させ、（ｉｉ）前記結合タンパク質（複数可）と前記試料のエレメントとの間の複合体の形成を検出することを含む、試料中の標的Ａβ型を検出するための方法を提供し、対照試料に比べた試料中の複合体の形成または形成の増大は試料中の前記Ａβ型の存在を示す。試料は、本明細書に開示する疾患もしくは障害を有すると疑われる対象から得た生物学的試料（例えば、全血、脳脊髄液、血清、組織など）であってよく、または前記Ａβ型を含み、もしくは含むことが疑われる細胞培養物であってよい。対照試料は前記Ａβ型を含んでおらず、または上記に記載した疾患を有さない患者から得られる。前記結合タンパク質（複数可）と、アルツハイマー病を有することが疑われる患者から得られた試料のエレメントとの間の複合体の存在は、前記患者におけるこの疾患の診断を指摘するものである。
【００３５】
代替の一実施形態では、標的Ａβ型の検出は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば、対象におけるｉｎ  ｖｉｖｏ画像化によって行われてよい。この目的のために、本発明の結合タンパク質（複数可）は、前記タンパク質（複数可）を標的Ａβ型に結合させ、前記結合タンパク質（複数可）と前記Ａβ型との間の複合体の形成を検出する条件下で、対象または対照の対象に投与されてよく、対照の対象に比べた対象における複合体の形成または形成の増大は、対象における前記Ａβ型の存在を指摘するものである。対象は、標的Ａβ型の活性が有害である障害または疾患に罹患していることが知られている、または疑われる対象であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】Ｊκ２およびＶκＡ１７／２−３０フレームワーク領域を含むヒト化４Ｄ１０抗体の可変軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。ＣＤＲ領域全てに下線が付されている。
【図２】ヒトＪＨ６（ｈＪＨ６）およびＶＨ３＿５３フレームワーク領域を含むヒト化４Ｄ１０抗体の可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。ＣＤＲ領域全てに下線が付されている。
【図３】ヒトＪＨ６およびＶＨ４＿５９フレームワーク領域を含むヒト化４Ｄ１０抗体の可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。ＣＤＲ領域全てに下線が付されている。
【図４】ヒトＪＨ６（ｈＪＨ６）およびＶＨ３＿５３フレームワーク領域を含むヒト化４Ｄ１０抗体の可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。ＣＤＲ領域全てに下線が付されている。
【図５】ＶＨ３コンセンサス変化Ｉ１２Ｖを有する、ヒトＪＨ６およびＶＨ３＿５３フレームワーク領域を含むヒト化４Ｄ１０抗体の可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号５）を示す図である。ＣＤＲ領域全てに下線が付されている。
【図６】ＶＨ３コンセンサス変化Ｉ１２Ｖ、ならびにフレームワーク復帰突然変異Ａ２４Ｖ、Ｖ２９Ｌ、Ｖ４８Ｌ、Ｓ４９Ｇ、Ｆ６７Ｌ、Ｒ７１Ｋ、Ｎ７６Ｓ、およびＬ７８Ｖを有する、ヒトＪＨ６およびＶＨ３＿５３フレームワーク領域を含むヒト化４Ｄ１０抗体の可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号６）を示す図である。ＣＤＲ領域全てに下線が付されている。
【図７】フレームワーク復帰突然変異Ｖ２９ＬおよびＲ７１Ｋを有する、ヒトＪＨ６およびＶＨ３＿５３フレームワーク領域を含むヒト化４Ｄ１０抗体の可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号７）を示す図である。ＣＤＲ領域全てに下線が付されている。
【図８】ヒトＪＨ６およびＶＨ４＿５９フレームワーク領域を含むヒト化４Ｄ１０抗体の可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号８）を示す図である。ＣＤＲ領域全てに下線が付されている。
【図９】Ｎ末端ピログルタメート形成を防ぐためのＱ１Ｅ変化を有する、ヒトＪＨ６およびＶＨ４＿５９フレームワーク領域を含む、ヒト化４Ｄ１０抗体の可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号９）を示す図である。ＣＤＲ領域全てに下線が付されている。
【図１０】Ｎ末端ピログルタメート形成を防ぐためのＱ１Ｅ変化、ならびにフレームワーク復帰突然変異Ｇ２７Ｆ、Ｉ２９Ｌ、Ｉ３７Ｖ、Ｉ４８Ｌ、Ｖ６７Ｌ、Ｖ７１Ｋ、Ｎ７６Ｓ、およびＦ７８Ｖを有する、ヒトＪＨ６およびＶＨ４＿５９フレームワーク領域を含む、ヒト化４Ｄ１０抗体の可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す図である。ＣＤＲ領域全てに下線が付されている。
【図１１】Ｎ末端ピログルタメート形成を防ぐためのＱ１Ｅ変化、ならびにフレームワーク復帰突然変異Ｇ２７Ｆ、Ｉ２９Ｌ、およびＶ７１Ｋを有する、ヒトＪＨ６およびＶＨ４＿５９フレームワーク領域を含む、ヒト化４Ｄ１０抗体の可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号１１）を示す図である。ＣＤＲ領域全てに下線が付されている。
【図１２】Ｊκ２およびＶκＡ１７／２−３０フレームワーク領域を含む、ヒト化４Ｄ１０抗体の可変軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す図である。ＣＤＲ領域全てに下線が付されている。
【図１３】Ｖκ２コンセンサス変化Ｓ７Ｔ、Ｌ１５Ｐ、Ｑ３７Ｌ、Ｒ３９Ｋ、およびＲ４５Ｑを有する、Ｊκ２およびＶκＡ１７／２−３０フレームワーク領域を含む、ヒト化４Ｄ１０抗体の可変軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１３）を示す図である。ＣＤＲ領域全てに下線が付されている。
【図１４】Ｖκ２コンセンサス変化Ｓ７Ｔ、Ｌ１５Ｐ、Ｑ３７Ｌ、Ｒ３９Ｋ、およびＲ４５Ｑ、ならびにフレームワーク復帰突然変異Ｆ３６Ｌを有するＪκ２およびＶκＡ１７／２−３０フレームワーク領域を含むヒト化４Ｄ１０抗体の可変軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す図である。ＣＤＲ領域全てに下線が付されている。
【図１５】Ｖκ２コンセンサス変化Ｓ７ＴおよびＱ３７Ｌを有するＪκ２およびＶκＡ１７／２−３０フレームワーク領域を含むヒト化４Ｄ１０抗体の可変軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１５）を示す図である。ＣＤＲ領域全てに下線が付されている。
【図１６】Ｖκ２コンセンサス変化Ｓ７Ｔ、Ｑ３７Ｌ、およびＲ３９Ｋを有するＪκ２およびＶκＡ１７／２−３０フレームワーク領域を含むヒト化４Ｄ１０抗体の可変軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１６）を示す図である。ＣＤＲ領域全てに下線が付されている。
【図１７】ヒトＪＨ６（ｈＪＨ６）およびＶＨ３＿５３フレームワーク領域を含む、マウスモノクローナル抗体４Ｄ１０（ｍ４Ｄ１９）およびヒト化４Ｄ１０抗体（４Ｄ１０ｈｕｍ）の可変重鎖のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。ＣＤＲ領域全てが太字で印刷されている。１２位上のＸはＩまたはＶであり、２４位上のＸはＡまたはＶであり、２９位上のＸはＶまたはＬであり、４８位上のＸはＶまたはＬであり、４９位上のＸはＳまたはＧであり、６７位上のＸはＦまたはＬであり、７１位上のＸはＲまたはＫであり、７６位上のＸはＮまたはＳであり、７８位上のＸはＬまたはＶである。
【図１８】ヒトＪＨ６およびＶＨ４＿５９フレームワーク領域を含む、マウスモノクローナル抗体４Ｄ１０（ｍ４Ｄ１９）およびヒト化４Ｄ１０抗体（４Ｄ１０ｈｕｍ）の可変重鎖のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。ＣＤＲ領域全てが太字で印刷されている。１位上のＸはＱまたはＥであり、２７位上のＸはＧまたはＦであり、２９位上のＸはＩまたはＬであり、３７位上のＸはＩまたはＶであり、４８位上のＸはＩまたはＬであり、６７位上のＸはＶまたはＬであり、７１位上のＸはＶまたはＫであり、７６位上のＸはＮまたはＳであり、７８位上のＸはＦまたはＶである。
【図１９】Ｊκ２およびＶκＡ１７／２−３０フレームワーク領域を含む、マウスモノクローナル抗体４Ｄ１０（ｍ４Ｄ１９）およびヒト化４Ｄ１０抗体（４Ｄ１０ｈｕｍ）の可変軽鎖のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。ＣＤＲ領域全てが太字で印刷されている。７位上のＸはＳまたはＴであり、１５位上のＸはＬまたはＰであり、４１位上のＸはＦまたはＬであり、４２位上のＸはＱまたはＬであり、４４位上のＸはＲまたはＫであり、５０位上のＸはＲまたはＱである。
【図２０】サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定した、（Ａ）カニクイザル血漿および（Ｂ）ヒト血漿中の、ヒト化モノクローナル抗体４Ｄ１０ｈｕｍ＃１および４Ｄ１０ｈｕｍ＃２、ヒト／マウスキメラ抗体ｈ１Ｇ５（陽性対照）およびヒトポリクローナル抗体ｈＩｇＧ１（陰性対照）の血小板因子４（ＰＦ−４）の交差反応を示す図である。ＰＦ−４の固定化した抗体に対する結合が検出された。
【図２１】整列サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定した、（Ａ）カニクイザル血漿および（Ｂ）ヒト血漿中の、ヒト化モノクローナル抗体４Ｄ１０ｈｕｍ＃１および４Ｄ１０ｈｕｍ＃２、ヒト／マウスキメラ抗体ｈ１Ｇ５（陽性対照）およびヒトポリクローナル抗体ｈＩｇＧ１（陰性対照）の血小板因子４（ＰＦ−４）の交差反応を示す図である。抗体は、固定化した抗マウスＩｇＧによってプレート上に捕獲された。ＰＦ−４の捕獲抗体に対する結合が検出された。
【図２２】サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定した、（Ａ）カニクイザル血漿中および（Ｂ）ヒト血漿中の、マウスモノクローナル抗体ｍ４Ｄ１０およびｍ１Ｇ５、抗ヒトＰＦ−４抗体（陽性対照）、およびＩｇＧ２ａ（陰性対照）の血小板因子４（ＰＦ−４）の交差反応を示す図である。ＰＦ−４の固定化した抗体に対する結合が検出された。
【図２３】整列サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定した、（Ａ）カニクイザル血漿中および（Ｂ）ヒト血漿中の、マウスモノクローナル抗体ｍ４Ｄ１０およびｍ１Ｇ５、抗ヒトＰＦ−４抗体（陽性対照）、およびＩｇＧ２ａ（陰性対照）の血小板因子４（ＰＦ−４）の交差反応を示す図である。抗体は、固定化した抗マウスＩｇＧによってプレート上に捕獲された。ＰＦ−４の捕獲抗体に対する結合が検出された。
【図２４】ＶＨ３コンセンサス変化Ｉ１２Ｖならびにフレームワーク復帰突然変異Ａ２４Ｖ、Ｖ２９Ｌ、Ｖ４８Ｌ、Ｓ４９Ｇ、Ｆ６７Ｌ、Ｒ７１Ｋ、Ｎ７６Ｓ、およびＬ７８Ｖを有するヒトＪＨ６およびＶＨ３＿５３フレームワーク領域；ならびにＩｇガンマ−１定常領域を含むヒト化４Ｄ１０抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号４６）を示す図である。ＣＤＲ領域全てに下線が付されている。
【図２５】Ｎ末端ピログルタメート形成を防ぐためのＱ１Ｅ変化、ならびにフレームワーク復帰突然変異Ｇ２７Ｆ、Ｉ２９Ｌ、Ｉ３７Ｖ、Ｉ４８Ｌ、Ｖ６７Ｌ、Ｖ７１Ｋ、Ｎ７６Ｓ、およびＦ７８Ｖを有するヒトＪＨ６およびＶＨ４＿５９フレームワーク領域；ならびにＩｇガンマ−１定常領域を含むヒト化４Ｄ１０抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号４７）を示す図である。ＣＤＲ領域全てに下線が付されている。
【図２６】Ｖκ２コンセンサス変化Ｓ７Ｔ、Ｌ１５Ｐ、Ｑ３７Ｌ、Ｒ３９Ｋ、およびＲ４５Ｑ、ならびにフレームワーク復帰突然変異Ｆ３６Ｌを有するＪκ２およびＶκＡ１７／２−３０フレームワーク領域；ならびにＩｇカッパ定常領域を含むヒト化４Ｄ１０抗体の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４８）を示す図である。ＣＤＲ領域全てに下線が付されている。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本明細書において別段の規定がなければ、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。用語の意味および範囲は明らかでなければならないが、潜在的になんらかの曖昧さがある場合、本明細書に提供される定義が、いかなる辞書上の、または非本質的な定義にも優先する。さらに、文脈によってその他の方法が必要とされなければ、単数形の用語は複数形を含み、複数形の語は単数形を含む。本出願において「または」の使用は、別段の記載がなければ「および／または」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の語の使用は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態同様、限定的なものではない。また、「エレメント」または「成分」などの語は、特に別段の記載がなければ１つを超えるサブユニットを含む１つの単位およびエレメントおよび成分を含むエレメントおよび成分の両方を包含する。
【００３８】
一般的に、本明細書に記載する細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションとの関連において用いられる命名法、ならびにこれらの技術は、当技術分野においてよく知られており、通例用いられているものである。本発明の方法および技術は、当技術分野においてよく知られており、別段の指摘がなければ本明細書を通して引用され、論じられる、様々な一般的でより詳しい参考文献において記載されている従来の方法にしたがって一般的に行われる。酵素反応および精製技術は、当技術分野において一般的に達成され、または本明細書に記載する製造元の規格にしたがって行われる。本明細書に記載する分析化学、有機合成化学、ならびに医薬品化学および製薬化学に関連して用いられる命名法、ならびにこれらの検査技術および技術は、当技術分野においてよく知られており、一般的に用いられているものである。標準的な技術が、化学合成、化学分析、薬剤調製、製剤、および送達、ならびに患者の処置に用いられる。
【００３９】
本発明は、Ａβ結合タンパク質、特に、抗Ａβ抗体またはそのＡβ結合ポーション、特にＡβ（２０−４２）グロブロマーに結合するものに関する。これらのＡβ結合タンパク質は、Ａβペプチドの他の形態、特にモノマーおよび原繊維だけでなく、Ａβグロブロマーの非切断型も識別することができる。このように、本発明は、Ａβ（１−４２）グロブロマーに対するこのＡβ結合タンパク質の結合親和性よりも大きい、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性を有するＡβ結合タンパク質に関する。
【００４０】
本明細書で用いられる「Ａβ（Ｘ−Ｙ）」の語は、ＸおよびＹの両方を含むヒトアミロイドベータ（Ａβ）タンパク質のアミノ酸Ｘ位からアミノ酸Ｙ位までのアミノ酸配列を意味する。特に、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ  ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ  ＩＡＴ（配列番号２９）（アミノ酸１位から４３位に対応する）のアミノ酸Ｘ位からアミノ酸Ｙ位までのアミノ酸配列、または任意の天然に存在するそのバリアント、特に、Ａ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「Ｆｌｅｍｉｓｈ」）、Ｅ２２Ｇ（「Ａｒｃｔｉｃ」）、Ｅ２２Ｑ（「Ｄｕｔｃｈ」）、Ｅ２２Ｋ（「Ｉｔａｌｉａｎ」）、Ｄ２３Ｎ（「Ｉｏｗａ」）、Ａ４２Ｔ、およびＡ４２Ｖからなる群から選択される（数字はＡβペプチドの開始に対するものであり、Ｘ位およびＹ位の両方、またはどれもがグロブロマー形成を妨げ得ない最高３個のさらなるアミノ酸置換を有する配列を含む）少なくとも１つの変異を有するものである。一態様によると、アミノ酸１２またはＸの数字の大きいほうからアミノ酸４２またはＹの数字の小さいほうまでのポーションにおいてさらなるアミノ酸置換は存在しない。別の態様によると、アミノ酸２０またはＸの数字の大きいほうからアミノ酸４２またはＹの数字の小さいほうまでのポーションにおいてさらなるアミノ酸置換は存在しない。別の態様によると、アミノ酸２０またはＸの数字の大きいほうからアミノ酸４０またはＹの数字の小さいほうまでのポーションにおいてさらなるアミノ酸置換は存在しない。本明細書における「さらなる」アミノ酸置換は、天然において見出されない基準の配列からの任意の逸脱である。
【００４１】
より詳しくは、本明細書で用いられる「Ａβ（１−４２）」の語は、１および４２の両方を含むヒトＡβタンパク質のアミノ酸１位からアミノ酸４２位までのアミノ酸配列を意味し、特に、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ  ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ  ＩＡ（配列番号３０）またはあらゆる天然に存在するそのバリアント、特に、Ａ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「Ｆｌｅｍｉｓｈ」）、Ｅ２２Ｇ（「Ａｒｃｔｉｃ」）、Ｅ２２Ｑ（「Ｄｕｔｃｈ」）、Ｅ２２Ｋ（「Ｉｔａｌｉａｎ」）、Ｄ２３Ｎ（「Ｉｏｗａ」）、Ａ４２Ｔ、およびＡ４２Ｖからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するものを意味する（数字はＡβペプチドの開始に対するものであり、１位および４２位の両方、またはどれもがグロブロマー形成を妨げ得ない最高３個のさらなるアミノ酸置換を有する配列を含む）。一態様によると、アミノ酸２０からアミノ酸４２までのポーションにおいてさらなるアミノ酸置換は存在しない。同様に、本明細書で用いられる「Ａβ（１−４０）」の語は、１および４０の両方を含むヒトＡβタンパク質のアミノ酸１位からアミノ酸４０位までのアミノ酸配列、特に、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ  ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号３１）またはあらゆる天然に存在するそのバリアントを意味し、特に、Ａ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「Ｆｌｅｍｉｓｈ」）、Ｅ２２Ｇ（「Ａｒｃｔｉｃ」）、Ｅ２２Ｑ（「Ｄｕｔｃｈ」）、Ｅ２２Ｋ（「Ｉｔａｌｉａｎ」）、およびＤ２３Ｎ（「Ｉｏｗａ」）からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するものを意味する（数字はＡβペプチドの開始に対するものであり、１および４０の両方、またはどれもがグロブロマー形成を妨げ得ない最高３個のさらなるアミノ酸置換を有する配列を含む）。一態様によると、アミノ酸２０からアミノ酸４０までのポーションにおいてさらなるアミノ酸置換は存在しない。
【００４２】
より詳しくは、本明細書で用いられる「Ａβ（１２−４２）」の語は、１２および４２の両方を含むヒトＡβタンパク質のアミノ酸１２位からアミノ酸４２位までのアミノ酸配列を意味し、特に、アミノ酸配列ＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ  ＩＡ（配列番号３２）または任意の天然に存在するそのバリアント、特に、Ａ２１Ｇ（「Ｆｌｅｍｉｓｈ」）、Ｅ２２Ｇ（「Ａｒｃｔｉｃ」）、Ｅ２２Ｑ（「Ｄｕｔｃｈ」）、Ｅ２２Ｋ（「Ｉｔａｌｉａｎ」）、Ｄ２３Ｎ（「Ｉｏｗａ」）、Ａ４２Ｔ、およびＡ４２Ｖからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するものを意味する（数字はＡβペプチドの開始に対するものであり、１２位および４２位の両方、またはどれもがグロブロマー形成を妨げ得ない最高３個のさらなるアミノ酸置換を有する配列を含む）。一態様によると、アミノ酸２０からアミノ酸４２までのポーションにおいてさらなるアミノ酸置換は存在しない。同様に、本明細書で用いられる「Ａβ（２０−４２）」の語は、２０および４２の両方を含むヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸２０位からアミノ酸４２位までのアミノ酸配列、特に、アミノ酸配列Ｆ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ  ＩＡ（配列番号３３）または任意の天然に存在するそのバリアントを意味し、特に、Ａ２１Ｇ（「Ｆｌｅｍｉｓｈ」）、Ｅ２２Ｇ（「Ａｒｃｔｉｃ」）、Ｅ２２Ｑ（「Ｄｕｔｃｈ」）、Ｅ２２Ｋ（「Ｉｔａｌｉａｎ」）、Ｄ２３Ｎ（「Ｉｏｗａ」）、Ａ４２Ｔ、およびＡ４２Ｖからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するものを意味する（数字はＡβペプチドの開始に対するものであり、２０および４０の両方、またはどれもがグロブロマー形成を妨げ得ない最高３個のさらなるアミノ酸置換を有する配列を含む）。一態様にしたがって、さらなる任意のアミノ酸置換が存在する。
【００４３】
本明細書で用いられる「Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー」（Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状オリゴマー）の語は、上記で規定した通り、均一性および明確な物理的性質を有する、可溶性の、球状の、非共有性のＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの会合を意味する。一態様によると、Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーは、陰イオン性界面活性剤とのインキュベートによって得られる、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの、安定な、非原繊維の（ｎｏｎｆｉｂｒｉｌｌａｒ）、オリゴマーの集合である。モノマーおよび原繊維と対照的に、これらグロブロマーは、規定されるサブユニットの集合数によって特徴付けられる（例えば、ＷＯ２００４／０６７５６１に記載される、サブユニット４−６個の初期集合型である「オリゴマーＡ」、およびサブユニット１２−１４個の後期集合型である「オリゴマーＢ」）。グロブロマーは３次元の球状型構造を有する（「モルテングロビュール」、Ｂａｒｇｈｏｒｎら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、９５巻、８３４−８４７頁、２００５年を参照されたい）。これは、以下の１つまたは複数の特徴によってさらに特徴付けられてよい：
−切断型のグロブロマーを生じる、乱交雑のプロテアーゼ（例えば、サーモリシンまたはエンドプロテアーゼＧｌｕＣ）でのＮ末端アミノ酸Ｘ−２３の開裂性
−乱交雑のプロテアーゼおよび抗体でのＣ末端アミノ酸２４−Ｙの非接近性（ｎｏｎ−ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）
−グロブロマー立体配置におけるコアエピトープＡβ（２０−Ｙ）のより良好な接近性を有する前記グロブロマーの３次元コア構造を維持するこれらグロブロマーの切断型。
【００４４】
本発明にしたがって、特に、本発明のＡβ結合タンパク質の結合親和性を評価する目的で、「Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー」の語は、本明細書において、特に、参照により本明細書に組み込む、ＷＯ２００４／０６７５６１に記載されているプロセスによって得ることができる生成物を意味する。前記プロセスは、天然の、組換えの、または合成のＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドまたはその誘導体をアンフォールディングし、少なくとも部分的にアンフォールディングされたＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドまたはその誘導体を界面活性剤に曝露し、界面活性剤の作用を低減し、インキュベートを続けることを含む。
【００４５】
ペプチドのアンフォールディングの目的では、例えば、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）などの水素結合破壊剤をタンパク質に対して作用させることができる。作用温度が約２０℃から５０℃、特に約３５℃から４０℃である場合、数分、例えば約１０分から６０分の作用時間が十分である。水性バッファーと混和性である適切な有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））中、濃縮型などにおいて蒸発乾燥させた残渣を引き続き溶解すると、少なくとも部分的にアンフォールディングされたペプチドまたはその誘導体の懸濁液がもたらされ、これを引き続き用いることができる。所望により、保存懸濁液を、約２０℃などの低温でしばらく貯蔵することができる。あるいは、ペプチドまたはその誘導体を、わずかに酸性の水溶液（例えば、約１０ｍＭのＨＣｌ水溶液）など中に取り込んでもよい。通常数分のインキュベート時間の後、不溶成分を遠心分離によって除去する。１００００ｇで数分が好都合である。これらの方法のステップは、室温、すなわち２０℃から３０℃の範囲の温度で行うことができる。遠心分離後に得られた上清はＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドまたはその誘導体を含有し、約−２０℃などの低温でしばらく貯蔵することができる。引き続き界面活性剤に曝露することは、中間型のオリゴマーをもたらすための、ペプチドまたはその誘導体のオリゴマー化に関連する（ＷＯ２００４／０６７５６１においてオリゴマーＡと呼ばれる）。この目的のために、界面活性剤は、十分な中間体のオリゴマーが生成されるまで少なくとも部分的にアンフォールディングされたペプチドまたはその誘導体に対して作用させられる。イオン性界面活性剤、特に陰イオン性界面活性剤を用いるのが好ましい。
【００４６】
特定の一実施形態によると、式（Ｉ）：
Ｒ−Ｘ
の界面活性剤が用いられ、式中、Ｒ基は、炭素原子６個から２０個、例えば１０個から１４個を有する非分枝もしくは分枝のアルキル、または炭素原子６個から２０個、例えば１０個から１４個を有する非分枝もしくは分枝のアルケニルであり、Ｘ基は、Ｘが、例えば、−ＣＯＯ−Ｍ＋、−ＳＯ３−Ｍ＋、特に、−ＯＳＯ３−Ｍ＋の中から選択される酸性基またはこれらの塩であり、Ｍ＋は水素陽イオン、または例えば、アルカリ金属陽イオンおよびアルカリ土類金属陽イオンならびにアンモニウム陽イオンから選択される無機もしくは有機の陽イオンである。Ｒが非分枝のアルキルである式（Ｉ）の界面活性剤が有利であり、その中でもアルク−１−イル基が特に言及されなければならない。例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリン酸、界面活性剤ラウロイルサルコシンのナトリウム塩（サルコシルＮＬ−３０もしくはＧａｒｄｏｌ（登録商標）としても知られている）、およびオレイン酸が有利に用いられ得る。界面活性剤の作用の時間は特に、オリゴマー化に曝されるペプチドまたはその誘導体がアンフォールディングされているか否か（そうであれば、どの程度か）に依存する。アンフォールディングのステップにより、ペプチドまたはその誘導体が、水素結合破壊剤で、すなわち特にヘキサフルオロイソプロパノールで前もって処理される場合、作用温度が約２０℃から５０℃、特に約３５℃から４０℃である場合、数時間の、有利には約１時間から２０時間の、特に約２時間から１０時間の範囲の作用時間が十分である。あまりアンフォールディングされていない、または本質的にアンフォールディングされていないペプチドまたはその誘導体が出発点である場合、それに対応してより長い作用時間が好都合である。例えば、ＨＦＩＰ処理の代替として上記に記載する手順にしたがってペプチドもしくはその誘導体が前処理されている場合、または前記ペプチドもしくはその誘導体が直接オリゴマー化にかけられる場合、作用温度が約２０℃から５０℃、特に約３５℃から４０℃である場合、約５時間から３０時間の、特に約１０時間から２０時間の範囲の作用時間が十分である。インキュベート後、不溶性の成分が遠心分離によって除去されるのが有利である。１００００ｇで数分が好都合である。選択される界面活性剤の濃度は、用いられる界面活性剤による。ＳＤＳが用いられる場合、０．０１重量％から１重量％の範囲における濃度、例えば、０．０５重量％から０．５重量％、例えば、約０．２重量％が好都合であることが判明している。ラウリン酸またはオレイン酸が用いられる場合、幾分高い濃度、例えば、０．０５重量％から２重量％の範囲、例えば、０．１重量％から０．５重量％、例えば、約０．５重量％が好都合である。界面活性剤の作用は、およそ生理学的範囲における塩濃度で行わなければならない。このように、特に、５０ｍＭから５００ｍＭの範囲、例えば、１００ｍＭから２００ｍＭ、または約１４０ｍＭのＮａＣｌ濃度が好都合である。界面活性剤の作用を引き続き減少させ、インキュベートを続けることは、本発明のＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー（ＷＯ２００４／０６７５６１においてオリゴマーＢと呼ぶ）をもたらすためのさらなるオリゴマー化に関連する。前述���ステップから得られた組成物は一様に、界面活性剤および生理学的範囲の塩濃度を含有するので、次いで、界面活性剤の作用および塩濃度も低減することが好都合である。これは、例えば、好都合には水または塩濃度の低いバッファー、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．３で希釈することにより、界面活性剤および塩の濃度を低減することによって行われてよい。約２から１０の範囲の、有利には約３から８の範囲の、特に約４の希釈係数が適切であることが判明している。界面活性剤の作用を低減することは、前記界面活性剤の作用を中和することができる物質を加えることによっても実現され得る。これらの例は、精製および抽出の措置の過程において細胞を安定化することができる物質など、界面活性剤と複合体を形成することができる物質、例えば、特定のＥＯ／ＰＯブロックコポリマー、特に商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８のブロックコポリマーを含む。特定の臨界ミセル濃度周辺またはそれを超える濃度範囲の、アルコキシル化、特にエトキシ化したアルキルフェノール、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘシリーズのエトキシ化されているｔ−オクチルフェノール、特に、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００、３−（３−コラミドプロピルジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ（登録商標））、またはアルコキシル化、特にエトキシ化されているソルビタン脂肪エステル、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）シリーズ、特にＴｗｅｅｎ（登録商標）２０のエトキシ化されているソルビタン脂肪エステルが等しく用いられてよい。引き続き、十分な本発明のＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーが生成するまで溶液をインキュベートする。作用温度が約２０℃から５０℃、特に約３５℃から４０℃である場合、数時間、例えば、約１０時間から３０時間の範囲の、または約１５時間から２５時間の範囲の作用時間が十分である。次いで、溶液を濃縮し、可能な残渣を遠心分離によって除去することができる。ここでも、１００００ｇで数分が好都合であることが判明している。遠心分離後に得られた上清は、本発明のＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーを含む。本発明のＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーは、それ自体知られているやり方において、例えば、限外ろ過、透析、沈殿、または遠心分離において最終的に回収され得る。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるなど、変性の条件下、Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーの電気泳動分離は、二重バンド（例えば、Ａβ（１−４２）に対して見かけの分子量３８／４８ｋＤａを有する）を生成することがあり、分離前にグロブロマーをグルタールジアルデヒド処理するとこの２本のバンドが１本に合体し得る。グロブロマーのサイズ排除クロマトグラフィーは、１本のピークをもたらし得る（例えば、それぞれ、Ａβ（１−４２）グロブロマーに対しておよそ１００ｋＤａの分子量に相当し、またはグルタールアルデヒドで架橋されたＡβ（１−４２）グロブロマーに対しておよそ６０ｋＤａに対応する）。Ａβ（１−４２）ペプチド、Ａβ（１２−４２）ペプチド、およびＡβ（２０−４２）ペプチドから出発して、前記プロセスは、Ａβ（１−４２）グロブロマー、Ａβ（１２−４２）グロブロマー、およびＡβ（２０−４２）グロブロマーを得るのに特に��している。
【００４７】
本発明の特定の一実施形態では、Ｘが２．．２４の数からなる群から選択され、Ｙが上記で規定した通りであるＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーは、Ｘが２．．２４の数からなる群から選択され、例えば、Ｘは２０または１２であり、Ｙが上記で規定した通りであるＡβ（１−Ｙ）グロブロマーをより短い形態に切断することによって得られるものであり、これは好適なプロテアーゼで処理することによって実現され得る。例えば、Ａβ（２０−４２）グロブロマーは、Ａβ（１−４２）グロブロマーをサーモリシンのタンパク質分解にかけることによって得られてよく、Ａβ（１２−４２）グロブロマーは、Ａβ（１−４２）グロブロマーを、エンドプロテアーゼＧｌｕＣタンパク質分解にかけることによって得られてよい。望ましい程度のタンパク質分解に到達したら、プロテアーゼは一般的に知られているやり方で不活性化される。次いで、得られたグロブロマーは、本明細書にすでに記載した手順にしたがって単離されてよく、所望により、さらなる検査および精製ステップによってさらに処理加工されてよい。前記プロセスの詳しい記載は、参照により本明細書に組み込む、ＷＯ２００４／０６７５６１に開示されている。
【００４８】
本発明の目的では、Ａβ（１−４２）グロブロマーは特に以下の実施例１ａに記載されるＡβ（１−４２）グロブロマーであり、Ａβ（２０−４２）グロブロマーは特に以下の実施例１ｂに記載されるＡβ（２０−４２）グロブロマーであり、Ａβ（１２−４２）グロブロマーは特に以下の実施例１ｃに記載されるＡβ（１２−４２）グロブロマーである。本発明の一態様によると、グロブロマーは神経細胞に対して親和性を示し、および／または神経調節作用を示す。
【００４９】
本発明の別の態様によると、グロブロマーは１１個から１６個の、例えば１２個から１４個のＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドからなる。本発明の別の態様によると、本明細書における「Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー」の語は、Ａβ（Ｘ−Ｙ）サブユニットから本質的になるグロブロマーを意味し、例えば、１２個のサブユニットのうち平均して少なくとも１１個のサブユニットがＡβ（Ｘ−Ｙ）型であり、または１０％未満のグロブロマーが任意の非Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドを含み、または非Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの含量は検出閾値未満である。より詳しくは、本明細書における「Ａβ（１−４２）グロブロマー」の語は、上記に規定するＡβ（１−４２）単位から本質的になるグロブロマーを意味し、本明細書における「Ａβ（１２−４２）グロブロマー」の語は、上記に規定するＡβ（１２−４２）単位から本質的になるグロブロマーを意味し、本明細書における「Ａβ（２０−４２）グロブロマー」の語は、上記に規定するＡβ（２０−４２）単位から本質的になるグロブロマーを意味する。
【００５０】
本明細書における「架橋結合しているＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー」の語は、上記に記載される通り、グロブロマーの構成単位の架橋結合によって、例えば、化学的架橋結合、アルデヒド架橋結合、グルタールジアルデヒド架橋結合によって、Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーから得ることができる分子を意味する。本発明の別の態様では、架橋結合しているグロブロマーは、本質的に非共有性の相互作用のみによって一緒に保持されているというよりむしろ、単位が共有結合によって少なくとも部分的に繋がれているグロブロマーである。本発明の目的では、架橋結合しているＡβ（１−４２）グロブロマーは、特に、以下の実施例１ｄに記載される架橋結合しているＡβ（１−４２）オリゴマーである。
【００５１】
本明細書における「Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー誘導体」の語は、特に、検出を促進する基に共有性に連結することによって標識されるグロブロマーを、例えば、フルオロフォア、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリスリン、エクオリアビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）蛍光タンパク質、ディクチオソーマ（Ｄｉｃｔｙｏｓｏｍａ）蛍光タンパク質、またはこれらの任意の組合せ、もしくは蛍光活性誘導体；発色団；化学発光団、例えば、ルシフェラーゼ、特にホティヌスピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）のルシフェラーゼ、ビブリオフィッシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）ルシフェラーゼ、または任意の組合せ、またはこれらの化学発光活性誘導体、；酵素的に活性な基、例えば、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビのペルオキシダーゼ）、またはこれらの任意の酵素的に活性な誘導体；高電子密度基、例えば、重金属含有基（例えば、金含有基）；ハプテン、例えば、フェノール由来のハプテン；抗原性の強い構造、例えば、抗原性であると予想されるペプチド配列（例えば、ＫｏｌａｓｋａｒおよびＴｏｎｇａｏｎｋａｒのアルゴリズムによって抗原性であると予測されるもの）；別の分子に対するアプタマー；キレート基、例えば、ヘキサヒスチジニル；さらなる特定のタンパク質−タンパク質相互作用を媒介する天然の、または天然由来のタンパク質構造、例えば、ｆｏｓ／ｊｕｎ対のメンバー；磁性の基、例えば、強磁性の基；または放射性の基、例えば、１Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉ、またはこれらの任意の組合せを含む基を意味し；あるいは不活性化、隔離、分解、および／または沈殿を促進する基に対して共有性に、または非共有性の高親和性相互作用によって連結することによってフラグ付けされているグロブロマーを意味し（例えば、ユビキチンなどのｉｎ  ｖｉｖｏの分解を促進する基でフラグ付けされ、このフラグ付けされたオリゴマーが、例えばｉｎ  ｖｉｖｏで集合している）；あるいは上記の任意の組合せによって修飾されているグロブロマーを意味する。このような標識化の、およびフラグ化性の基およびこれらをタンパク質に付着させるための方法は、当技術分野において知られている。標識化および／またはフラグ化はグロブロマー化の前、間、または後に行われてよい。本発明の別の態様では、グロブロマー誘導体は、標識化および／またはフラグ化反応によってグロブロマーから得ることができる分子である。これに対応して、本明細書における「Ａβ（Ｘ−Ｙ）モノマー誘導体」の語は、特に、グロブロマーに対して記載される通り、標識化またはフラグ化されているＡβモノマーを意味する。
【００５２】
本発明のさらなる一態様では、本明細書に記載する結合タンパク質は、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに高い親和性で、例えば、多くて約１０−６Ｍの、多くて約１０−７Ｍの、多くて約１０−８Ｍの、多くて約１０−９Ｍの、多くて約１０−１０Ｍの、多くて約１０−１１Ｍの、多くて約１０−１２Ｍの、多くて１０−１３Ｍの解離定数（ＫＤ）で結合する。一態様では、本明細書に記載する結合タンパク質のＡβ（２０−４２）グロブロマーに対する会合速度定数（ｋｏｎ）は、表面プラズモン共鳴によって測定して、少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１、および少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１からなる群から選択される。別の態様では、結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴によって測定して、多くて約１０−３ｓ−１、多くて約１０−４ｓ−１、多くて約１０−５ｓ−１、多くて約１０−６ｓ−１からなる群から選択されるＡβ（２０−４２）グロブロマーに対する解離速度定数（ｋｏｆｆ）を有する。本発明の特定の一態様では、本明細書に記載する結合タンパク質は、１×１０−９Ｍから１×１０−１０Ｍの解離定数でＡβ（２０−４２）グロブロマーに結合する。本発明のさらに特定の一態様では、本明細書に記載する結合タンパク質のＡβ（２０−４２）グロブロマーに対する会合速度定数（ｋｏｎ）は、１×１０５Ｍ−１ｓ−１から１×１０６Ｍ−１ｓ−１である。本発明のさらに特定の一態様では、本明細書に記載する結合タンパク質は、８×１０−５ｓ−１から８×１０−４ｓ−１の、Ａβ（２０−４２）に対する解離速度定数（ｋｏｆｆ）を有する。
【００５３】
本発明の別の態様では、本明細書に記載する結合タンパク質のＡβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性は、Ａβ（１−４２）グロブロマーに対する結合親和性よりも大きい。
【００５４】
本明細書における「より大きな親和性」の語は、非結合のＡβ結合タンパク質と、一方で非結合のＡβグロブロマーと、他方でＡβ結合タンパク質−グロブロマー複合体と、の間の平衡が、Ａβ結合タンパク質−グロブロマー複合体により有利である、相互作用の度合いを意味する。同様に、本明細書における「より小さな親和性」の語は、非結合のＡβ結合タンパク質と、一方で非結合のＡβグロブロマーと、他方でＡβ結合タンパク質−グロブロマー複合体と、の間の平衡が、非結合のＡβ結合タンパク質と非結合のＡβグロブロマーにさらに有利である相互作用の度合いを意味する。「より大きな親和性」の語は「より高い親和性」の語と同義であり、「より小さな親和性」の語は「より低い親和性」の語と同義である。
【００５５】
本発明の関連の一態様では、本明細書に記載する結合タンパク質のＡβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性は、結合タンパク質のＡβ（１−４２）グロブロマーに対する結合親和性よりも、少なくとも２倍（例えば、少なくとも３倍もしくは少なくとも５倍）、少なくとも１０倍（例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、もしくは少なくとも５０倍）、少なくとも１００倍（例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、もしくは少なくとも５００倍）、および少なくとも１０００倍（例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍、もしくは少なくとも５０００倍）、少なくとも１００００倍（例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍、もしくは少なくとも５００００倍）、または少なくとも１０００００倍大きい。
【００５６】
本発明のなおさらなる一態様では、本明細書に記載する結合タンパク質は、比較的高い親和性で、例えば、多くて約１０−６Ｍの、多くて約１０−７Ｍの、多くて約１０−８Ｍの、多くて約１０−９Ｍの、多くて約１０−１０Ｍの、多くて約１０−１１Ｍの、多くて約１０−１２Ｍの、多くて１０−１３Ｍの解離定数（ＫＤ）でＡβ（１２−４２）グロブロマーに結合する。一態様では、本明細書に記載する結合タンパク質のＡβ（１２−４２）グロブロマーに対する会合速度定数（ｋｏｎ）は、表面プラズモン共鳴によって測定して、少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１からなる群から選択される。別の態様では、結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴によって測定して、多くて約１０−３ｓ−１、多くて約１０−４ｓ−１、多くて約１０−５ｓ−１、多くて約１０−６ｓ−１からなる群から選択される、Ａβ（１２−４２）グロブロマーに対する解離速度定数（ｋｏｆｆ）を有する。
【００５７】
本発明の関連の一態様では、本明細書に記載する結合タンパク質のＡβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性は、結合タンパク質のＡβ（１２−４２）グロブロマーに対する結合親和性よりも約１．１倍から３倍大きい。
【００５８】
一態様によると、本発明のＡβ結合タンパク質は、上記に規定した通り、少なくとも１つのＡβグロブロマーに結合し、少なくとも１つの非グロブロマー型のＡβに対して比較的小さな親和性を有する。少なくとも１つのＡβグロブロマーよりも少なくとも１つの非グロブロマー型のＡβに対して比較的小さい親和性を有する本発明のＡβ結合タンパク質は、Ａβ（１−４２）モノマーよりも大きいＡβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性を有するＡβ結合タンパク質を含む。本発明の代替の、またはさらなる態様によると、Ａβ結合タンパク質のＡβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性は、Ａβ（１−４０）モノマーに対するよりも大きい。特に、Ａβ結合タンパク質のＡβ（２０−４２）グロブロマーに対する親和性は、Ａβ（１−４０）モノマーおよびＡβ（１−４２）モノマーの両方に対するＡβ結合タンパク質の親和性よりも大きい。
【００５９】
本明細書で用いられる「Ａβ（Ｘ−Ｙ）モノマー」の語は、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの単離型、特に、他のＡβペプチドとの本質的に非共有性の相互作用に従事していないＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの一形態を意味する。特に、Ａβ（Ｘ−Ｙ）モノマーは、通常、水溶液の形態において提供される。本発明の特定の一実施形態では、モノマー水溶液は、０．０５％から０．２％、例えば、約０．１％のＮＨ４ＯＨを含む。本発明の別の特定の実施形態では、モノマー水溶液は、０．０５％から０．２％、例えば、約０．１％のＮａＯＨを含む。使用する場合（例えば、本発明のＡβ結合タンパク質の結合親和性を決定するために）、前記溶液を好適なやり方で希釈するのが好ましいことがある。さらに、前記溶液を、それを調製した後、２時間以内、特に１時間以内、とりわけ３０分以内に用いるのが通常好ましい。
【００６０】
より詳しくは、本明細書における「Ａβ（１−４０）モノマー」の語は、本明細書に記載するＡβ（１−４０）モノマー調製物を意味し、本明細書における「Ａβ（１−４２）モノマー」の語は、本明細書に記載するＡβ（１−４２）調製物を意味する。
【００６１】
好ましくは、本発明のＡβ結合タンパク質は、低い親和性で、例えば、１×１０−８Ｍ以下の親和性のＫＤで（例えば、３×１０−８Ｍ以下の親和性のＫＤで）、１×１０−７Ｍ以下の親和性のＫＤで（例えば、３×１０−７Ｍ以下の親和性のＫＤで）、または１×１０−６Ｍ以下の親和性のＫＤで（例えば、３×１０−５Ｍ以下の親和性のＫＤで）、または１×１０−５Ｍ以下の親和性のＫＤで１つまたは両方のモノマーに結合する。
【００６２】
本発明の一態様によると、本発明のＡβ結合タンパク質のＡβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性は、Ａβ結合タンパク質の１つまたは両方のモノマーに対する結合親和性よりも、少なくとも２倍（例えば、少なくとも３倍もしくは少なくとも５倍）、少なくとも１０倍（例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、もしくは少なくとも５０倍）、少なくとも１００倍（例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、もしくは少なくとも５００倍）、少なくとも１０００倍（例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍、もしくは少なくとも５０００倍）、少なくとも１００００倍（例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍、もしくは少なくとも５００００倍）、または少なくとも１０００００倍大きい。
【００６３】
少なくとも１つのＡβグロブロマーに対するよりも少なくとも１つの非グロブロマー型のＡβに対して比較的小さい親和性を有する本発明のＡβ結合タンパク質は、Ａβ（１−４２）原線維に対するよりも大きい、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性を有するＡβ結合タンパク質をさらに含む。本発明の代替の、またはさらなる態様によると、Ａβ結合タンパク質のＡβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性は、Ａβ（１−４０）原線維に対するよりも大きい。特定の一実施形態によると、本発明は、Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）原線維両方に対する結合親和性よりも大きい、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性を有するＡβ結合タンパク質に関する。
【００６４】
本明細書における「原線維」の語は、非共有性に会合している、個々のＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの集合を含む分子構造を意味し、この分子構造は電子顕微鏡において原繊維構造を示し、コンゴーレッドに結合し、次いで偏光下で複屈折を示し、このＸ線回折パターンはクロス−β構造である。本発明の別の態様では、原線維は、界面活性剤の非存在下（例えば、０．１ＭＨＣｌ中）、２４単位を超え、または１００単位を超える凝集物の形成をもたらす、適切なＡβペプチドの自己誘導性のポリマー性凝集を含むプロセスによって得られる分子構造である。このプロセスは当技術分野においてよく知られている。Ａβ（Ｘ−Ｙ）原線維が水溶液の形態において用いられるのが好ましい。本発明の特定の一実施形態では、原線維水溶液は、Ａβペプチドを０．１％ＮＨ４ＯＨ中に溶解し、それを２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で１：４に希釈し、その後ｐＨを７．４に再調整し、溶液を３７℃で２０時間インキュベートし、その後１００００ｇで１０分間遠心分離し、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中再懸濁することによって作成される。本明細書における「Ａβ（Ｘ−Ｙ）原線維」の語はまた、Ａβ（Ｘ−Ｙ）サブユニットを含む原線維を意味し、例えば、平均して少なくとも９０％のサブユニットがＡβ（Ｘ−Ｙ）型であり、少なくとも９８％のサブユニットがＡβ（Ｘ−Ｙ）型であり、または非Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの含量は検出閾値未満である。より詳しくは、本明細書における「Ａβ（１−４２）原線維」の語は、実施例３に記載するＡβ（１−４２）原線維調製物を意味する。
【００６５】
好ましくは、本発明のＡβ結合タンパク質は、低い親和性で、例えば、１×１０−８Ｍ以下の親和性のＫＤで（例えば、３×１０−８Ｍ以下の親和性のＫＤで）、１×１０−７Ｍ以下の親和性のＫＤで（例えば、３×１０−７Ｍ以下の親和性のＫＤで）、または１×１０−６Ｍ以下の親和性のＫＤで（例えば、３×１０−５Ｍ以下の親和性のＫＤで）、または１×１０−５Ｍ以下の親和性のＫＤで１つまたは両方の原線維に結合する。
【００６６】
本発明の一態様によると、本発明のＡβ結合タンパク質のＡβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性は、Ａβ結合タンパク質の１つまたは両方の原線維に対する結合親和性よりも、少なくとも２倍（例えば、少なくとも３倍もしくは少なくとも５倍）、少なくとも１０倍（例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、もしくは少なくとも５０倍）、少なくとも１００倍（例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、もしくは少なくとも５００倍）、少なくとも１０００倍（例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍、もしくは少なくとも５０００倍）、少なくとも１００００倍（例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍、もしくは少なくとも５００００倍）、または少なくとも１０００００倍大きい。
【００６７】
特定の一実施形態によると、本発明は、少なくとも１つのＡβグロブロマー、特にＡβ（２０−４２）グロブロマーに対するよりも、Ａβのモノマー型および原線維型両方に対して比較的小さな親和性を有するＡβ結合タンパク質に関する。これらのＡβ結合タンパク質は、ときに、グロブロマー特異的Ａβ結合タンパク質と呼ばれる。
【００６８】
本発明の結合タンパク質、例えば、ヒト化抗体４Ｄ１０（４Ｄ１０ｈｕｍ）は、ｍ２６６および３Ｄ６などの競合抗体とは対照的に、主にＡβ（２０−４２）グロブロマー型を認識し、Ａβ（１−４０）モノマー、Ａβ（１−４２）モノマー、Ａβ原線維、またはｓＡＰＰ（すなわち、可溶性Ａβ前駆体）の標準的調製物を認識しない、グロブロマー特異的結合タンパク質を含む。グロブロマーに対するこのような特異性は重要である、というのは、ヒト化４Ｄ１０でグロブロマー型のＡβを特異的に標的化することは、１）不溶性のアミロイド沈着物を標的とするのを避け（沈着物に対する結合は不溶性のＡβでの免疫化の間に観察される炎症性の副作用の説明となり得る）；２）予知的な生理機能があると報告されているＡβモノマーおよびＡＰＰを残しておき（Ｐｌａｎら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２３巻、５５３１−５５３５頁、２００３年）；３）抗体のバイオアベイラビリティを増大する（抗体は不溶性沈着物に対する広範囲の結合によって隠されず、または到達できなくならないので）。
【００６９】
ＰＦ−４はＣＸＣケモカインファミリーに属し、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド４（ＣＸＣＬ４）としても知られている、小型の、アミノ酸７０個のサイトカインである。ＰＦ−４は、血小板凝集の間に活性化された血小板のアルファ顆粒から放出され、ヘパリン様分子の効果を緩和することによって血液凝固を促進する。ＰＦ−４は、これらの機能のため、創傷修復および炎症に関与すると予想される（Ｅｉｓｍａｎｎら、Ｂｌｏｏｄ、７６巻（２）、３３６−４４頁、１９９０年）。ＰＦ−４は通常、プロテオグリカンとの複合体中に見出され、血栓症の薬理学的処置として用いられている抗凝固薬のヘパリンと複合体を形成することができる。これは抗凝固薬のヘパリンの投与に対する特異体質性の自己免疫反応である、ヘパリン誘導性血小板減少症（ＨＩＴ）における病理機能をよく表しており（Ｗａｒｋｅｎｔｉｎ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３５６巻（９）、８９１−３頁、２００７年）、この場合ヘパリン：ＰＦ４複合体が抗原である。ＰＦ４自己抗体は、血栓症およびＨＩＴに類似する特徴を有するが以前にヘパリンを投与されていない患者においてやはり見出されている（Ｗａｒｋｅｎｔｉｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．、１２１巻（７）、６３２−６頁、２００８年）。ヘパリン誘導性血小板減少症は血小板減少症（血小板低値）の発症によって特徴付けられ、さらにＨＩＴにより血栓症にかかりやすくなる。ＰＦ−４のこれらの機能および病理プロセスにおける関与に鑑みて、対象中に存在するＰＦ−４に対する結合（例えば、交差反応性）を示す結合タンパク質（例えば、抗体）の投与は、前記ＰＦ−４に影響を及ぼすことがあり、したがって有害（副）作用をもたらし得ると結論付けることができる。このような有害作用の程度および性質は、ＰＦ−４上のエピトープの位置およびサイズ、それぞれの結合タンパク質の結合強度および性質などのパラメータに応じて変化し得る。
【００７０】
本発明の一態様によると、本発明の結合タンパク質は、血小板因子４（ＰＦ−４）に対して結合性を示さず、または低い結合性を示す。ＰＦ−４に対する前記交差反応は、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット、またはＢＩＡｃｏｒｅ分析などの標準化されたｉｎ  ｖｉｔｒｏの免疫アッセイを用いて評価され得る。
【００７１】
特定の一実施形態によると、本明細書において規定される結合タンパク質のＰＦ−４に対する交差反応は、（ｉ）約１：３．１６から約１：３１６０（最終血漿希釈）のヒトまたはカニクイザルの血漿を約１：３段階希釈してサンドイッチ−ＥＬＩＳＡを行い（例えば、実施例３．１および３．２に記載する通り）、（ｉｉ）検出されたシグナル（ｙ軸）を対数変換した血漿希釈（ｘ軸）に対してプロットし、（ｉｉｉ）測定範囲（約１：３．１６から約１：３１６０の最終血漿希釈）におけるこれら非曲線適合したデータから曲線下面積（ＡＵＣ、すなわち全ピーク面積）を決定することによって得られた前記結合タンパク質およびリファレンスの抗ＰＦ−４抗体に対する値の比率を意味する。本発明の特定の一実施形態によると、サンドイッチ−ＥＬＩＳＡによるＰＦ−４に対する交差反応の決定は以下を含む：ある量の調査中の結合タンパク質もしくはリファレンスの抗ＰＦ−４抗体、または好ましくはこれらの好適な希釈、例えば、炭酸水素ナトリウム１００ｍＭ、ｐＨ９．６中１０μｇ／ｍｌの結合タンパク質もしくは抗体溶液の１００μｌを、タンパク質吸着性マイクロタイタープレートのウェルをコーティングするのに用い、次いでプレートを洗浄し、ブロックし、再び洗浄し、次いで約１：３段階希釈のカニクイザルもしくはヒトの血漿（例えば、約１：３．１６から約１：３１６０（最終血漿希釈）のヒトＰＦ−４でスパイクしたヒト血漿）と接触させ、引き続き各ウェルに結合したＰＦ−４を、例えば、ＰＦ−４特異的一次抗体、酵素コンジュゲートした二次抗体、および比色反応によって検出する。
【００７２】
本明細書において用いられる「基準の抗ＰＦ−４抗体」は、ＰＦ−４、特にヒト（ＨＰＦ４）と特異的に反応性である抗体、特にモノクローナル抗体である。このような抗体は、ヒトＰＦ−４、特にアミノ酸配列
ＥＡＥＥＤＧＤＬＱＣＬＣＶＫＴＴＳＱＶＲＰＲＨＩＴＳＬＥＶＩＫＡＧＰＨＣＰＴＡＱＬＩＡＴＬＫＮＧＲＫＩＣＬＤＬＱＡＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ（配列番号７０）
を有するヒトＰＦ−４を含む抗原を提供し、抗体レパートリーを前記抗原に曝露し、前記抗原レパートリーからヒトＰＦ−４に対して特異的に結合する抗体を選択することによって得られる。抗体は、任意選択によって、免疫原（ヒトＰＦ−４）を用いて親和性精製されてよい。このようなリファレンスの抗ＰＦ−４抗体は、モノクローナル抗ＨＰＦ４抗体、Ａｂｃａｍカタログ番号：ａｂ４９７３５など、市販されている。
【００７３】
別の特定の実施形態によると、本明細書において規定される結合タンパク質のＰＦ−４に対する交差反応は、前記結合タンパク質、ならびに（ｉ）ヒトまたはカニクイザル血漿および約１：３段階希釈の結合タンパク質および約１０ｎｇ／ｍｌから約１０００ｎｇ／ｍｌ（最終濃度）のリファレンスの抗ＰＦ−４抗体で整列サンドイッチ−ＥＬＩＳＡを行い（例えば、実施例３．３および３．４に記載する通り）、（ｉｉ）検出されたシグナル（ｙ軸）対結合タンパク質またはリファレンスの抗ＰＦ−４抗体の対数変換した濃度（ｘ軸）をプロットし、（ｉｉｉ）測定範囲（結合タンパク質またはリファレンスの抗体の濃度約１０ｎｇ／ｍｌから約１００００ｎｇ／ｍｌ）における非曲線適合したデータからの曲線下面積（ＡＵＣ、すなわち合計ピーク面積）を決定することによって得られたリファレンスの抗ＰＦ−４抗体に対するＡＵＣ値の比率を意味する。本発明の特定の一実施形態によると、整列サンドイッチ−ＥＬＩＳＡによるＰＦ−４に対する交差反応の決定は以下を含む：タンパク質吸着性のマイクロタイタープレートのウェルを、調査中の結合タンパク質およびリファレンスの抗ＰＦ−４抗体を捕獲するのに適するある量の整列抗体でコーティングし（例えば、炭酸水素ナトリウム１００ｍＭ、ｐＨ９．６中５０μｇ／ｍｌのＦｃ特異的抗マウスＩｇＧ、Ｓｉｇｍａカタログ番号：Ｍ３５３４）、次いでプレートを洗浄し、ブロックし、再び洗浄し、次いで約１：３段階希釈の約１０ｎｇ／ｍｌから約１００００ｎｇ／ｍｌ（最終濃度）の調査中の結合タンパク質またはリファレンスの抗ＰＦ−４抗体と接触させ、さらなる洗浄ステップの後、プレートを、例えば、１：１０希釈の、ヒトまたはカニクイザル血漿（例えば、ヒトＰＦ−４をスパイクしたヒト血漿）と接触させ、引き続きプレートに結合したＰＦ−４を、例えば、ＰＦ−４特異的一次抗体、酵素コンジュゲートした二次抗体、および比色反応により検出する。
【００７４】
本発明の一態様によると、本発明のＡβ結合タンパク質のＰＦ−４に対する交差反応は、本明細書に記載するカニクイザル血漿とのサンドイッチ−ＥＬＩＳＡによって分析した場合、リファレンスの抗ＰＦ−４抗体の対応する交差反応よりも小さく、例えば、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、もしくは少なくとも３０倍少なく、および／または本明細書に記載するヒト血漿とサンドイッチ−ＥＬＩＳＡによって分析した場合、リファレンスの抗ＰＦ−４抗体の対応する交差反応よりも、例えば、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、もしくは少なくとも２０倍小さい。
【００７５】
本発明の別の態様によると、本発明のＡβ結合タンパク質のＰＦ−４に対する交差反応は、本明細書に記載するカニクイザル血漿との整列サンドイッチ−ＥＬＩＳＡによって分析した場合、リファレンスの抗ＰＦ−４抗体の対応する交差反応よりも、例えば、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも８０倍、もしくは少なくとも１１５倍少なく、および／または本明細書に記載するヒト血漿と整列サンドイッチ−ＥＬＩＳＡによって分析した場合、リファレンスの抗ＰＦ−４抗体の対応する交差反応よりも小さく、例えば、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍小さい。
【００７６】
本発明の別の態様によると、本発明のＡβ結合タンパク質のＰＦ−４に対する交差反応は、本明細書に記載するカニクイザル血漿とのサンドイッチ−ＥＬＩＳＡおよび整列サンドイッチ−ＥＬＩＳＡによって分析した場合、リファレンスの抗ＰＦ−４抗体の対応する交差反応よりも小さく、例えば、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも３０倍小さい。
【００７７】
本発明の別の態様によると、本発明のＡβ結合タンパク質のＰＦ−４に対する交差反応は、本明細書に記載するヒト血漿とのサンドイッチ−ＥＬＩＳＡおよび整列サンドイッチ−ＥＬＩＳＡによって分析した場合、リファレンスの抗ＰＦ−４抗体の対応する交差反応よりも小さく、例えば、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも３０倍小さい。
【００７８】
本発明の別の態様によると、本発明のＡβ結合タンパク質のＰＦ−４に対する交差反応は、本明細書に記載するカニクイザル血漿およびヒト血漿とのサンドイッチ−ＥＬＩＳＡおよび整列サンドイッチ−ＥＬＩＳＡによって分析した場合、リファレンスの抗ＰＦ−４抗体の対応する交差反応よりも小さく、例えば、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも３０倍小さい。
【００７９】
本明細書で用いられる「ポリペプチド」の語は、アミノ酸の任意のポリマー鎖を意味する。「ペプチド」および「タンパク質」の語はポリペプチドの語と交換可能に用いられ、アミノ酸のポリマー鎖をやはり意味する。「ポリペプチド」の語は、天然もしくは人工のタンパク質、タンパク質断片、またはタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドはモノマー性でも、またはポリマー性でもよい。
【００８０】
「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」の語は、その起源または由来となる源のためにその天然状態においてそれに伴う天然関連成分と関連のないタンパク質またはポリペプチドであり、同じ種からの他のタンパク質が実質的になく、異なる種からの細胞によって発現され、または天然に存在しない。このように、化学合成され、またはそれから天然に発生した細胞と異なる細胞系において合成されたポリペプチドは、天然に関連する成分から「単離されている」。タンパク質は、当技術分野においてよく知られているタンパク質精製技術を用いて、単離によって天然に関連する成分を実質的になくすことができる。
【００８１】
本明細書において用いられる「回収する」の語は、ポリペプチドなどの化学種を、当技術分野においてよく知られているタンパク質精製技術を用いるなど、単離によって天然に関連する成分を実質的になくすプロセスを意味する。
【００８２】
抗体、タンパク質、またはペプチドの、第２の化学種との相互作用に関して、本明細書で用いられる「特異的な結合」または「特異的に結合する」の語は、抗体が一般的にタンパク質に対するよりもむしろ特定のタンパク質構造を認識し結合するなど、相互作用が化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基もしくはエピトープ）の存在に依存することを意味する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、エピトープＡ（またはフリーの、非標識のＡ）を含む分子の存在は、標識された「Ａ」および抗体を含む反応において、抗体に結合している標識されたＡの量を低減する。
【００８３】
本明細書で用いられる「抗体」の語は、Ｉｇ分子の本質的なエピトープ結合性の特徴を保持している、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖である４本のポリペプチド鎖、またはこれらの任意の機能的な断片、変異体、バリアント、もしくは誘導体からなる任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を広く意味する。このような機能的な断片、変異体、バリアント、または誘導体の抗体の型式は当技術分野において知られている。これらの非限定的な実施形態を以下で論じる。本明細書で用いられる「全長の抗体」は、２本の重鎖および２本の軽鎖である４本のポリペプチド鎖を含むＩｇ分子を意味する。鎖は通常、ジスルフィド結合によって相互に連結されている。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において「可変重鎖」とも呼び、または本明細書においてＨＣＶＲもしくはＶＨと略す）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３である３つのドメインからなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において「可変軽鎖」とも呼び、または本明細書においてＬＣＶＲもしくはＶＬと略される）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬの領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域によって割り込まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分割され得る。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順番でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列される３個のＣＤＲおよび４個のＦＲから構成され：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。免疫グロブリン分子は任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスであってよい。
【００８４】
本明細書で用いられる、抗体の「抗原結合ポーション」（または単に「抗体のポーション」）、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体の部分」）の語は、抗原（例えば、Ａβ（２０−４２）グロブロマー）に特異的に結合する能力を保持している抗体の１つまたは複数の断片を意味し、すなわち抗体の機能的断片である。抗体の抗原結合性機能は、全長の抗体の１つまたは複数の断片によって遂行され得ることが示されている。このような抗体の実施形態は、二特異的、二重特異的、または多特異的であってもよく、２つ以上の異なる抗原に対して特異的に結合する。抗体の「抗原結合ポーション」の語の範囲内に包含される結合断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結されている２個のＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の１本のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂ断片（参照により本明細書に組み込む、Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４−５４６頁、１９８９年；Ｗｉｎｔｅｒら、ＷＯ９０／０５１４４  Ａ１）、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、ＶＬ領域およびＶＨ領域は、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対になって１価の分子を形成する単一のタンパク質鎖として作成されるのを可能にする合成リンカーによって、組換え方法を用いて連結され得る（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている、例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻、４２３−４２６頁、１９８８年；およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻、５８７９−５８８３頁、１９８８年を参照されたい）。このような単一鎖の抗体も、抗体の「抗原結合ポーション」の語の範囲内に包含される。ダイアボディなどの単一鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現される二価の、二特異的な抗体であるが、非常に短いため同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成ができないリンカーを用いており、それによってドメインに、別の鎖の相補的なドメインと対形成を強い、２つの抗原結合部位を作り出している（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、６４４４−６４４８頁、１９９３年；Ｐｏｌｊａｋら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２巻、１１２１−１１２３頁、１９９４年）。このような抗体結合ポーションは当技術分野において知られている（ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ編集、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．、７９０頁、２００１年、ＩＳＢＮ  ３−５４０−４１３５４−５）。
【００８５】
本明細書で用いられる「抗体」の語は抗体構築物も含む。本明細書で用いられる「抗体構築物」の語は、リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常ドメインに連結している本発明の抗原結合ポーションを１つまたは複数含むポリペプチドを意味する。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合によって連結されている２つ以上のアミノ酸残基を含み、１つまたは複数の抗原結合ポーションに連結するように用いられる。このようなリンカーポリペプチドは当技術分野においてよく知られている（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、６４４４−６４４８頁、１９９３年；Ｐｏｌｊａｋら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２巻、１１２１−１１２３頁、１９９４年を参照されたい）。
【００８６】
免疫グロブリン定常ドメインは、重鎖または軽鎖の定常ドメインを意味する。ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖の定常ドメインのアミノ酸配列は当技術分野において知られており、表１に示される。
【００８７】
【表１】
2020103288.tif 000002
2020103288.tif 000003
【００８８】
なおさらに、本発明の結合タンパク質（例えば、抗体）は、本発明の結合タンパク質の、１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有性または非共有性の会合によって形成される、大型の免疫接着分子の部分であってよい。このような免疫接着分子の例は、四量体のｓｃＦｖ分子を作成するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、６巻、９３−１０１頁、１９９５年）、ならびに二価およびビオチン化されたｓｃＦｖ分子を作成するための、システイン残基、マーカーペプチド、およびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用を含む（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１巻、１０４７−１０５８頁、１９９４年）。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片などの抗体のポーションは、抗体全体の、それぞれパパイン消化またはペプシン消化などの従来の技術を用いて抗体全体から調製されてよい。さらに、抗体、抗体のポーション、および免疫接着分子は、本明細書に記載する標準の組換えＤＮＡ技術を用いて得られてよい。
【００８９】
本明細書で用いられる「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体を意味することが理解される。しかし、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに特異的に結合する単離された抗体は、Ａβグロブロマー、例えば、Ａβ（１２−４２）グロブロマー、または他のＡβ型などの他の抗原に対する交差反応性を有する。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料および／もしくは化学物質、ならびに／またはいかなる他の標的Ａβ型も実質的に含まないものであり得る。
【００９０】
本明細書で用いられる「ヒト抗体」の語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲにおける、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によって、またはｉｎ  ｖｉｖｏの体細胞変異によって導入される変異）を含むことができる。しかし、本明細書で用いられる「ヒト抗体」の語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフティングされている抗体を含まないことが意図される。
【００９１】
本明細書で用いられる「組換えヒト抗体」の語は、宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現される抗体（以下のセクションＢにおいてさらに記載する）、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ．、１５巻、６２−７０頁、１９９７年；ＡｚｚａｚｙおよびＨｉｇｈｓｍｉｔｈ、Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３５巻、４２５−４４５頁、２００２年；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  Ｊ．Ｖ．およびＬａｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｗ．（２００２年）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２９巻、１２８−１４５頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．およびＣｈａｍｅｓ  Ｐ．（２０００年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、２１巻、３７１−３７８頁）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離される抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら、（１９９２年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０巻、６２８７−６２９５頁；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  Ｓ−Ａ．およびＧｒｅｅｎ  Ｌ．Ｌ．（２００２年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３巻、５９３−５９７頁；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｍ．ら（２０００年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、２１巻、３６４−３７０頁を参照されたい）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを伴う任意の他の手段によって調製され、発現され、作り出され、もしくは単離された抗体など、組換えの手段によって調製され、発現され、作り出され、または単離されたヒト抗体全てを含むことが意図される。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかし、ある実施形態では、このような組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列にトランスジェニックである動物が用いられる場合、ｉｎ  ｖｉｖｏの体細胞変異誘発）に曝され、したがって組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、関連するが、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト抗体生殖系列レパートリーの範囲内に天然に存在しないことがある配列である。
【００９２】
「キメラ抗体」の語は、１つの種からの重鎖および軽鎖可変領域配列、ならびに別の種からの定常領域配列を含む抗体、例えば、ヒト定常領域に連結しているマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体を意味する。
【００９３】
「ＣＤＲグラフト化抗体」の語は、一つの種からの重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬの１つまたは複数のＣＤＲ領域の配列が別の種のＣＤＲ配列で置換されている抗体、例えば、１つまたは複数のマウス可変重鎖および軽鎖領域がヒト可変重鎖および軽鎖配列で置換されているマウスＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）を有する抗体を意味する。
【００９４】
「Ｋａｂａｔナンバリング」、「Ｋａｂａｔ定義」および「Ｋａｂａｔラベリング」の語は本明細書において交換可能に用いられる。これらの語は、当技術分野において認められており、抗体の重鎖および軽鎖可変領域、またはその抗原結合ポーションにおける他のアミノ酸残基よりも可変性である（すなわち、高頻度可変性である）アミノ酸残基に番号付けするシステムを意味する（Ｋａｂａｔら（１９７１年）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．、１９０巻、３８２−３９１頁、およびＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、第９１−３２４２）。重鎖可変領域に対して、高頻度可変性領域は、ＣＤＲ１に対してアミノ酸３１位から３５位、ＣＤＲ２に対してアミノ酸５０位から６５位、ＣＤＲ３に対してアミノ酸９５位から１０２位の範囲である。軽鎖可変領域に対して、高頻度可変性領域は、ＣＤＲ１に対してアミノ酸２４位から３４位、ＣＤＲ２に対してアミノ酸５０位から５６位、ＣＤＲ３に対してアミノ酸８９位から９７位の範囲である。
【００９５】
本明細書で用いられる「アクセプター」および「アクセプター抗体」の語は、１つまたは複数のフレームワーク領域のアミノ酸の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％を提供し、またはコードする抗体または核酸配列を意味する。いくつかの実施形態では、「アクセプター」の語は、定常領域（複数可）を提供し、またはコードする、抗体のアミノ酸配列または核酸配列を意味する。さらに別の実施形態では、「アクセプター」の語は、１つまたは複数のフレームワーク領域および定常領域（複数可）を提供し、またはコードする抗体のアミノ酸配列または核酸配列を意味する。特定の一実施形態では、「アクセプター」の語は、１つまたは複数のフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％を提供し、またはコードするヒト抗体のアミノ酸配列または核酸配列を意味する。この実施形態によると、アクセプターは、ヒト抗体の１つまたは複数の特定の位置に生じないアミノ酸残基を、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも１０個含有してよい。アクセプターフレームワーク領域および／またはアクセプター定常領域（複数可）は、例えば、生殖系列の抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能的抗体（例えば、当技術分野においてよく知られている抗体、開発中の抗体、もしくは市販の抗体）に由来し、または得られるものであってよい。
【００９６】
本明細書で用いられる「ＣＤＲ」の語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を意味する。重鎖および軽鎖の各々の可変領域には３個のＣＤＲが存在し、これらは各々の可変領域に対してＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる。本明細書で用いられる「ＣＤＲセット」の語は、抗原に結合することができる単一の可変領域において生じる３個のＣＤＲの群を意味する。これらＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムにしたがって異なって規定されている。Ｋａｂａｔによって記載されたシステムは（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７年）および（１９９１年））、抗体の任意の可変領域に適用できる、明白な残基の番号付けシステムを提供するだけでなく、３個のＣＤＲを規定する正確な残基の境界も提供するものである。これらのＣＤＲはＫａｂａｔのＣＤＲとも呼ばれることがある。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同研究者は（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６巻、９０１−９１７頁（１９８７年）、ならびにＣｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻、８７７−８８３頁（１９８９年））、ＫａｂａｔのＣＤＲ内のあるサブポーションが、アミノ酸配列のレベルで大いなる多様性を有するのにかかわらず、ほぼ同一のペプチドのバックボーンの立体配置を採用していることを見出した。これらのサブポーションはＬ１、Ｌ２、およびＬ３、またはＨ１、Ｈ２、およびＨ３と呼ばれたが、「Ｌ」および「Ｈ」はそれぞれ軽鎖および重鎖の領域を呼ぶ。これらの領域はＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲと呼ばれることがあり、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複する境界を有する。ＣＤＲのＫａｂａｔのＣＤＲとの重複を規定する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、９巻、１３３−１３９頁（１９９５年））およびＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２６２巻（５）、７３２−４５頁（１９９６年））によって記載されている。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、特定の残基または残基の群または全体のＣＤＲさえも抗原の結合に著しく影響を及ぼさないという予測または実験上の知見を考慮して、これらは短くも、または長くもなり得るが、上記のシステムの１つに厳密にしたがわなくてよく、しかしそれにもかかわらずＫａｂａｔのＣＤＲと重複する。本明細書において用いられる方法は、任意のこれらのシステムにしたがって規定されるＣＤＲを利用することができ、特定の実施形態はＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａが規定するＣＤＲを用いるものである。
【００９７】
本明細書で用いられる「基準の」残基の語は、Ｃｈｏｔｈｉａら（両方とも参照により本明細書に組み込む、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６巻、９０１−９０７頁（１９８７年）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７巻、７９９頁（１９９２年））によって規定される特定の基準のＣＤＲ構造を規定するＣＤＲまたはフレームワークにおける残基を意味する。Ｃｈｏｔｈｉａらによると、多くの抗体のＣＤＲの決定的なポーションは、アミノ酸配列のレベルの大いなる多様性にかかわらずほぼ同一のペプチドバックボーン立体配置を有する。各々の基準の構造は、ループを形成するアミノ酸残基の連続したセグメントに対する、主に１セットのペプチドバックボーンのねじれ角を特定する。
【００９８】
本明細書で用いられる「ドナー」および「ドナー抗体」の語は、１つまたは複数のＣＤＲを提供する抗体を意味する。一実施形態では、ドナー抗体は、フレームワーク領域がそれから得られ、またはそれに由来する抗体と異なる種からの抗体である。ヒト化抗体の文脈において、「ドナー抗体」の語は、１つまたは複数のＣＤＲを提供する非ヒト抗体を意味する。
【００９９】
本明細書で用いられる「フレームワーク」または「フレームワーク配列」の語は、可変領域からＣＤＲを差し引いた残りの配列を意味する。ＣＤＲ配列の正確な定義は様々なシステムによって決定され得るので、フレームワーク配列の意味は、それに対応して様々な解釈にあてられる。６個のＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２、および−Ｌ３、ならびに重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２、および−Ｈ３）はまた、各鎖上の軽鎖および重鎖上のフレームワーク領域を４つのサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）に分割し、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２との間に、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３との間に、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４との間に位置する。特定のサブ領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４と特定せずに、フレームワーク領域は、他によって言及される通り、単一の、天然に存在する免疫グロブリン鎖の可変領域内のＦＲの組合せを表す。本明細書で用いられるＦＲは４つのサブ領域の１つを表し、ＦＲはフレームワーク領域を構成する４つのサブ領域の２つ以上を表す。
【０１００】
ヒト重鎖および軽鎖のアクセプター配列は当技術分野において知られている。本発明の一実施形態では、ヒト重鎖および軽鎖のアクセプター配列は、表２および表３に記載する配列から選択される。別の実施形態では、ヒト重鎖および軽鎖のアクセプター配列は、表２および表３に記載する配列に、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列から選択される。
【０１０１】
【表２】
2020103288.tif 000004
【０１０２】
【表３】
2020103288.tif 000005
【０１０３】
本明細書で用いられる「生殖系列抗体遺伝子」または「遺伝子断片」の語は、特定の免疫グロブリンを発現するための遺伝子の再編成および変異をもたらす成熟プロセスを受けていない、非リンパ系細胞によってコードされる免疫グロブリン配列を意味する（例えば、Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２巻（３）、１８３−２００頁（２００２年）；Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓら、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．、４８４巻、１３−３０頁（２００１年）を参照されたい）。本発明の様々な実施形態によって提供される利点の１つは、生殖系列の抗体の遺伝子は、成熟した抗体の遺伝子よりも、種において個体に特有である本質的なアミノ酸配列構造を保存している可能性があり、したがってその種において治療的に用いられる場合、外来の源からとして認識される可能性が低いという認識からくるものである。
【０１０４】
本明細書で用いられる「主要な」残基の語は、抗体、特にヒト化抗体の結合特異性および／または結合親和性に対してより影響を有する可変領域内のある残基を意味する。主要な残基は、それだけには限定されないが、以下：ＣＤＲに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位（Ｎ−グリコシル化部位またはＯ−グリコシル化部位のいずれかであってよい）、希な残基、抗原と相互作用することができる残基、ＣＤＲと相互作用することができる残基、基準の残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の接触する残基、バーニア（Ｖｅｒｎｉｅｒ）ゾーン内の残基、ならびにＣｈｏｔｈｉａ定義の可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔ定義の第１の重鎖フレームワークとの間に重複する領域における残基の１つまたは複数を含む。
【０１０５】
本明細書で用いられる「ヒト化抗体」の語は、対象の抗原に免疫特異的に結合しており、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク（ＦＲ）領域および非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体、またはバリアント、誘導体、アナログ、もしくはこれらのポーションである。本明細書で用いられる、ＣＤＲの文脈における「実質的に」の語は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを意味する。ヒト化抗体は、全ての、または実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のＣＤＲに相当し、全ての、または実質的に全てのフレームワーク領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＣＤＲである、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）を実質的に全て含む。一態様によると、ヒト化抗体は、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域である、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）を少なくとも１ポーション含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、軽鎖および少なくとも重鎖の可変ドメインの両方を含む。抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４領域を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖だけを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖だけを含む。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、軽鎖および／または重鎖のヒト化可変ドメインだけを含む。
【０１０６】
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含めた任意のクラスの免疫グロブリン、および、制限なくＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択されてよい。ヒト化抗体は、１つを超えるクラスまたはアイソタイプからの配列を含むことができ、特定の定常ドメインは、当技術分野においてよく知られている技術を用いて所望のエフェクター機能を最適化するように選択されてよい。
【０１０７】
ヒト化抗体のフレームワーク領域およびＣＤＲ領域は、親の配列に正確に対応する必要はなく、例えば、ドナー抗体ＣＤＲまたはコンセンサスのフレームワークは少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、挿入、および／または欠失によって変異されていてよく、その結果その部位のＣＤＲまたはフレームワーク残基はドナー抗体またはコンセンサスフレームワークのいずれにも対応しない。しかし、一実施形態では、このような変異は広範囲ではない。通常、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のヒト化抗体の残基が、親のＦＲおよびＣＤＲ配列の残基に対応する。本明細書で用いられる「コンセンサスフレームワーク」の語は、コンセンサス免疫グロブリン配列におけるフレームワーク領域を意味する。本明細書で用いられる「コンセンサス免疫グロブリン配列」の語は、関連の免疫グロブリン配列のファミリーにおいて最も頻繁に生じるアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列を意味する（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ、１９８７年）を参照されたい）。免疫グロブリンの一ファミリーにおいて、コンセンサス配列における各位置は、ファミリーにおいてその位置に最も頻繁に生じるアミノ酸によって占められる。２個のアミノ酸が等しく頻繁に生じる場合、いずれもコンセンサス配列に含まれてよい。
【０１０８】
本明細書で用いられる「バーニア」ゾーンは、ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ（参照により本明細書に組み込む、１９９２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２４巻、４８７−４９９頁）によって記載される通り、抗原に対してＣＤＲ構造を調整し、適合を微調整することができるサブセットのフレームワーク残基を意味する。バーニアゾーン残基は、ＣＤＲの根底となる層を形成し、ＣＤＲの構造および抗体の親和性に対して影響を及ぼし得る。
【０１０９】
本明細書で用いられる「抗体」の語は、多価結合タンパク質も含む。「多価結合タンパク質」の語は、本明細書において用いられて、２つ以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質を意味する。多価結合タンパク質は、３つ以上の抗原結合部位を有するように操作されており、一般的に、天然に存在する抗体ではない。「多特異的結合タンパク質」の語は、２つ以上の関連の、または非関連の標的に結合することができる結合タンパク質を意味する。本明細書で用いられる二重可変ドメイン（ＤＶＤ）結合タンパク質は、２つ以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質であり、４価または多価の結合タンパク質である。このようなＤＶＤは単一特異的（すなわち１つの抗原に結合することができる）であってよく、または多特異的（すなわち２つ以上の抗原に結合することができる）であってよい。２つの重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび２つの軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含むＤＶＤ結合タンパク質は、ＤＶＤ  Ｉｇと呼ばれる。ＤＶＤ  Ｉｇの各半分は、重鎖ＤＶＤポリペプチド、および軽鎖ＤＶＤポリペプチド、ならびに２つの抗原結合部位を含む。各結合部位は重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、抗原結合部位１つあたり合計６個のＣＤＲが抗原の結合に関与する。ＤＶＤ結合タンパク質およびＤＶＤ結合タンパク質を作成する方法は、米国特許出願第１１／５０７，０５０号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１０】
「エピトープ」の語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に対して特異的に結合することができる任意のポリペプチド決定因子を含む。ある実施形態では、エピトープ決定因子は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面グルーピング（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）を含み、ある実施形態では、特異的な３次元構造の特徴、および／または特異的な電荷の特徴を有することができる。エピトープは、結合タンパク質によって、特に抗体によって結合される抗原の一領域である。ある実施形態では、結合タンパク質または抗体は、タンパク質および／または巨大分子の複合混合物中でその標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合すると言われる。
【０１１１】
本発明の抗体の結合親和性は、標準化されたｉｎ  ｖｉｔｒｏの免疫アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット、またはＢＩＡｃｏｒｅ分析（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いることによって評価され得る。さらなる記述には、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．ら（１９９３年）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．、５１巻、１９−２６頁；Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．ら、（１９９１年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１１巻、６２０−６２７頁；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．ら（１９９５年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．、８巻、１２５−１３１頁；およびＪｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．ら、（１９９１年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８巻、２６８−２７７頁を参照されたい。
【０１１２】
特定の一実施形態によると、本明細書において規定される親和性は、ドットブロットを行い、それを濃度測定によって評価することによって得られる値を意味する。本発明の特定の一実施形態にしたがって、ドットブロットによる結合親和性の決定は以下を含む：ある量の抗原（例えば、上記で定義したＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー、Ａβ（Ｘ−Ｙ）モノマー、もしくはＡβ（Ｘ−Ｙ）原線維）、または好ましくは、例えば、１００ｐｍｏｌ／μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌ、１ｐｍｏｌ／μｌ、０．１ｐｍｏｌ／μｌ、および０．０１ｐｍｏｌ／μｌの濃度の抗原に対して２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中、これらの好適な希釈をニトロセルロースメンブレン上に点在させ、次いでメンブレンをミルクでブロックして非特異的な結合を防ぎ、洗浄し、次いで対象の抗体と接触させ、引き続き後者を酵素コンジュゲートした二次抗体および比色反応によって検出し、規定された抗体濃度では結合した抗体の量により親和性の決定が可能になる。このように、２つの異なる抗体の１つの標的に対する、または１つの抗体の２つの異なる標的に対する相対的な親和性は、その他の点では同一であるドットブロットの条件下、２つの抗体−標的組合せで観察される標的−結合抗体のそれぞれの量の関係とここで規定される。ウエスタンブロットをベースとする同様の取組みと異なり、ドットブロットの取組みは、後者の天然の立体配置における所与の標的に対する抗体の親和性を決定するものであり、ＥＬＩＳＡの取組みと異なり、ドットブロットの取組みは、異なる標的とマトリクスとの間の親和性における違いに悩むことはなく、それによって異なる標的間のより正確な比較が可能になる。
【０１１３】
本明細書で用いられる「表面プラズモン共鳴」の語は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用い、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度における変化を検出することによってリアルタイムの生体分子特異的な相互作用の分析を可能にする光学的現象を意味する。さらなる記述には、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ら（１９９３年）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．、５１巻、１９−２６頁；Ｊｏｎｓｓｏｎら（１９９１年）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１１巻、６２０−６２７頁；Ｊｏｈｎｓｓｏｎら、（１９９５年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．、８巻、１２５−１３１頁；およびＪｏｈｎｎｓｏｎら（１９９１年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８巻、２６８−２７７頁を参照されたい。
【０１１４】
本明細書で用いられる「ｋｏｎ」（「Ｋｏｎ」、「ｋｏｎ」、「Ｋｏｎ」とも）の語は、会合複合体、例えば、当技術分野において知られている抗体／抗原複合体を形成するための、抗原に対する結合タンパク質（例えば、抗体）の会合に対する会合速度定数を意味することが意図される。「ｋｏｎ」は、本明細書において交換可能に用いられる「会合速度定数（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）」または「ｋａ」の語によっても知られている。この値は、以下の等式によって示される通り、結合タンパク質（例えば、抗体）のその標的抗原に対する結合速度、または結合タンパク質（例えば、抗体）と抗原との間の複合体形成の速度を示す：
抗体（「Ａｂ」）＋抗原（「Ａｇ」）→Ａｂ−Ａｇ
【０１１５】
本明細書で用いられる「ｋｏｆｆ」（「Ｋｏｆｆ」、「ｋｏｆｆ」、「Ｋｏｆｆ」とも）の語は、当技術分野において知られている、結合タンパク質（例えば、抗体）の会合複合体（例えば、抗体／抗原複合体）からの解離のための解離速度定数、または「解離速度定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）」を意味することが意図される。この値は、以下の等式によって示される通り、結合タンパク質（例えば、抗体）のその標的抗原からの解離速度、またはＡｂ−Ａｇ複合体の経時的な遊離の抗体と抗原との分離を示す：
Ａｂ＋Ａｇ←Ａｂ−Ａｇ
【０１１６】
本明細書で用いられる「ＫＤ」（「Ｋｄ」または「ＫＤ」とも）の語は、「平衡解離定数」を意味し、平衡時に滴定測定において、または解離速度定数（ｋｏｆｆ）を会合速度定数（ｋｏｎ）によって除すことによって得られる値を意味することが意図される。会合速度定数（ｋｏｎ）、解離速度定数（ｋｏｆｆ）および平衡解離定数（ＫＤ）は、結合タンパク質（例えば、抗体）の抗原に対する結合親和性を表すのに用いられる。会合速度定数および解離速度定数を決定するための方法は、当技術分野においてよく知られている。蛍光ベースの技術の使用は、平衡時の生理学的バッファー中の試料を調べるための高感度および能力を提供する。他の実験的取組みおよび機器（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（生体分子相互作用分析）アッセイ）が用いられてよい（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎから入手できる機器）。さらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ、Ｉｄａｈｏ）から入手できるＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）アッセイも用いられてよい。
【０１１７】
本明細書で用いられる「標識された結合タンパク質」の語は、結合タンパク質の同定を提供する組み入れられた標識を有する結合タンパク質を意味する。同様に、本明細書で用いられる「標識された抗体」の語は、抗体の同定を提供する組み入れられた標識を有する抗体を意味する。一態様では、標識は、検出可能なマーカー、例えば、放射標識されたアミノ酸の取込み、またはマーク付けされたアビジンによって検出され得るビオチニル部分のポリペプチドに対する付着である（例えば、光学的方法または比色法によって検出され得る蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）。ポリペプチドに対する標識の例は、それだけには限定されないが、以下を含む：放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、もしくは１５３Ｓｍ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学ルミネセントマーカー、ビオチニル基（ｂｉｏｔｉｎｙｌ  ｇｒｏｕｐｓ）、二次レポーターによって認識される予め決定されたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、および磁性薬剤、例えば、ガドリニウムキレート。
【０１１８】
本明細書で用いられる「抗体」の語は抗体コンジュゲートも含む。「抗体コンジュゲート」の語は、第２の化学的部分（例えば、治療薬）に化学的に連結している、抗体などの結合タンパク質を意味する。
【０１１９】
「治療薬」の語は本明細書において、損なわれたヒトの脳の認知能力（すなわち、思考、学習、および記憶）を改善する薬物である、「認知促進薬」である生物学的材料から作られる化合物、化合物の混合物、生物学的巨大分子、または抽出物を意味するために用いられる。認知促進薬は、酸素供給を改善することによって、神経成長を刺激することによって、または神経損傷を阻害することによって、神経化学物質（例えば、神経伝達物質、酵素、およびホルモン）の利用能を変化させることによって働く。認知促進薬の例は、それだけには限定されないが、アセチルコリン受容体アゴニスト（例えば、ニコチン性α−７受容体アゴニストもしくはアロステリックモジュレーター、α４β２ニコチン性受容体アゴニストもしくはアロステリックモジュレーター）、アセチルコリンエステラーゼ阻害物質（例えば、ドネペジル、リバスチグミン、およびガランタミン）、ブチリルコリンエステラーゼ阻害物質、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニスト（例えば、メマンチン）、活性依存性神経保護タンパク質（ＡＤＮＰ）アゴニスト、セロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体アゴニスト（例えば、キサリプロデン）、５−ＨＴ４受容体アゴニスト、５−ＨＴ６受容体アンタゴニスト、セロトニン１Ａ受容体アンタゴニスト、ヒスタミンＨ３受容体アンタゴニスト、カルパイン阻害物質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）タンパク質もしくはアゴニスト、栄養成長因子、抗アポトーシス性化合物、ＡＭＰＡ型グルタメート受容体活性化物質、Ｌ型もしくはＮ型カルシウムチャネルブロッカーもしくはモジュレーター、カリウムチャネルブロッカー、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）活性化物質、ＨＩＦプロリル４−ヒドロキシラーゼ阻害物質、抗炎症薬、アミロイドＡβペプチドもしくはアミロイドプラークの阻害物質、タウ過剰リン酸化の阻害物質、ホスホジエステラーゼ５阻害物質（例えば、タダラフィル、シルデナフィル）、ホスホジエステラーゼ４阻害物質、モノアミンオキシダーゼ阻害物質、またはこれらの薬学的に許容される塩など、アセチルコリンの活性を増大する化合物を含む。このような認知促進薬の特定の例は、それだけには限定されないが、ドネペジル（Ａｒｉｃｅｐｔ（登録商標））、リバスチグミン（Ｅｘｅｌｏｎ（登録商標））、ガランタミン（Ｒｅｍｉｎｙｌ（登録商標））、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸アンタゴニスト、例えばメマンチン（Ｎａｍｅｎｄａ（登録商標））などのコリンエステラーゼ阻害物質を含む。
【０１２０】
本明細書で用いられる「結晶」および「結晶化（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｅｄ）」の語は、結晶の形態において存在する結合タンパク質（例えば、抗体、またはその抗原結合ポーション）を意味する。結晶は、非結晶質の固体状態または液体の結晶性状態などの他の形態とは異なる、物質の固体状態の一形態である。結晶は、規則的な、繰り返しの、３次元の、原子、イオン、分子（例えば、抗体などのタンパク質）、または分子集合体（例えば、抗原／抗体複合体）のアレイから構成される。これら３次元のアレイは、当技術分野において十分に理解されている特定の数学的関係にしたがって配列されている。結晶において繰り返される、基礎単位、または構成単位は非対称ユニットと呼ばれる。所与の、十分に規定される結晶学的対称性に一致する配列における非対称ユニットの繰返しが、結晶の「単位格子」を提供する。全ての３次元における規則的な平行移動による単位格子の繰返しが結晶をもたらす。Ｇｉｅｇｅ，Ｒ．およびＤｕｃｒｕｉｘ，Ａ．、Ｂａｒｒｅｔｔ、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版、２０頁１−１６、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９９９年）を参照されたい。
【０１２１】
本明細書で用いられる「中和性の」の語は、結合タンパク質が前記Ａβ型に特異的に結合する場合、標的Ａβ型の生物学的活性の中和を意味する。例えば、中和性の結合タンパク質は、グロブロマー（および／または任意の他の標的Ａβ型）のＡβ（２０−４２）アミノ酸領域に対する結合がグロブロマーの生物学的活性の阻害をもたらす中和性の抗体である。本発明の一態様によると、中和性の結合タンパク質は、グロブロマー（および／または任意の他の標的Ａβ型）のＡβ（２０−４２）領域に対して結合し、標的Ａβ型の生物学的活性を、少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％、またはそれを超えて低減する。中和性の結合タンパク質による標的Ａβ型の生物学的活性の阻害は、当技術分野においてよく知られている標的Ａβ型の生物学的活性の１つまたは複数の指標、例えば、標的Ａβ型のＰ／Ｑ型の電圧依存性シナプス前のカルシウムチャネルに対する相互作用（例えば、結合）、Ｐ／Ｑ型の電圧依存性シナプス前のカルシウムチャネル活性の阻害、Ｐ／Ｑ型の電圧依存性シナプス前カルシウムチャネルによるＣａ＋＋流入、局所（例えば、細胞内）Ｃａ＋＋濃度、シナプス活性を測定することによって評価され得る。
【０１２２】
「活性」の語は、結合タンパク質、特に抗体の、抗原に対する結合特異性／親和性などの活性、例えば、Ａβ（２０−４２）グロブロマー（および任意の他の標的Ａβ型）、ならびに／または抗体の中和性の効力、例えば、標的Ａβ型に対する結合が標的Ａβ型の生物学的活性を阻害する抗体を含む。標的Ａβ型の前記生物学的活性は、前記カルシウムチャネルの活性の阻害をもたらす、Ｐ／Ｑ型の電圧依存性シナプス前カルシウムチャネルに対するＡβ型の相互作用を含む。
【０１２３】
本発明は、本発明の結合タンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列も提供する。本発明はまた、これらのコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、もしくは７９％）、少なくとも約８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、もしくは８９％）、または少なくとも約９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）の同一性を含み、対応し、同一であり、ハイブリダイズでき、または相補的である配列を有するこれらのヌクレオチド配列（もしくはその断片）も提供する。（７０％から１００％の間の（７０％、１００％を含む）全ての整数（およびそのポーション）はパーセント同一性に関して本発明の範囲内であるとみなされる。）これらの配列は任意の供給源に由来していてよい（例えば、天然の供給源から単離されるか、半合成の経路によって生成されるか、または新たに合成されるかのいずれか）。特に、このような配列は、実施例において記載される以外の供給源（例えば、細菌、真菌、藻類、マウス、もしくはヒト）から単離され、または由来していてよい。
【０１２４】
本発明の目的で、ヌクレオチド配列の「断片」は、指定されるヌクレオチド配列の領域に対応する、およそ少なくとも６個、例えば、少なくとも約８個、少なくとも約１０個のヌクレオチド、または少なくとも約１５個のヌクレオチドの連続した配列と規定される。
【０１２５】
「同一性」の語は、特定の比較ウインドウまたはセグメントにわたって、ヌクレオチド毎のベースの２つの配列の関連性を意味する。このように、同一性は、２つのＤＮＡセグメント（もしくは２個のアミノ酸配列）の同じ鎖（センスもしくはアンチセンスのいずれか）間の、同じであること、相似、または同等性の度合いと規定される。「配列同一性のパーセント値」は、２つの最適にアラインされた配列を、特定の領域にわたって比較し、マッチする位置の数を得るために両方の配列において同一の塩基またはアミノ酸が生じる位置の数を決定し、このような位置の数を比較されるセグメントにおける位置の合計数によって除し、結果に１００をかけることによって計算される。配列の最適のアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２巻、４８２頁、１９８１年のアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８巻、４４３頁、１９７０年のアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８５巻、２４４４頁、１９８８年の方法によって、および関連のアルゴリズムを実行するコンピュータプログラムによって（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｍａｃａｗ  Ｐｉｌｅｕｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃｈｅｍ２１８／１１Ｍｕｌｔｉｐｌｅ．ｐｄｆ；  Ｈｉｇｇｉｎｓら、ＣＡＢＩＯＳ．、５Ｌ１５１−１５３、１９８９年）、ＦＡＳＴＤＢ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２５巻、３３８９−３４０２頁、１９９７年）、ＰＩＬＥＵＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）またはＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））によって行われ得る（米国特許第５，９１２，１２０号を参照されたい）。
【０１２６】
本発明の目的で、「相補性」は、２つのＤＮＡセグメント間の関連性の度合いと規定される。これは１つのＤＮＡセグメントのセンス鎖が、二重らせんを形成するために、好適な条件下で、他のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖とハイブリダイズする能力を測定することによって決定される。「補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」は、基準の塩基対ルールに基づいて所与の配列に対して対形成する配列と規定される。例えば、一ヌクレオチド鎖におけるＡ−Ｇ−Ｔ配列は、他の鎖におけるＴ−Ｃ−Ａに対して「相補的」である。二重らせんにおいて、アデニンが一つの鎖において出現し、チミンが他方の鎖において出現する。同様に、グアニンが一つの鎖において見出される場合はいつでも、シトシンが他方において見出される。２つのＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列間の関連性が大きいほど、２つのＤＮＡセグメントの鎖間にハイブリッドの二本鎖を形成する能力は大きい。
【０１２７】
２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、両方の配列における、一連の同一の、および保存されているアミノ酸残基の存在と定義される。２つのアミノ酸配列間の類似性の度合いが高いほど、２つの配列の相似、同じであること、または同等性が高い。（２つのアミノ酸配列間の同一性は、両方の配列において、一連の正確に同様の、または不変のアミノ酸残基が存在することと定義される。）「相補性」、「同一性」、および「類似性」の定義は、当業者にはよく知られている。
【０１２８】
「によってコードされる」はポリペプチド配列をコードする核酸配列を意味し、ポリペプチド配列またはそのポーションは、核酸配列によってコードされるポリペプチドからの少なくとも３個のアミノ酸、例えば、少なくとも８個のアミノ酸、または少なくとも１５個のアミノ酸のアミノ酸配列を含む。
【０１２９】
本明細書で言及する「ポリヌクレオチド」の語は、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチド、またはいずれのタイプのヌクレオチドの修飾型いずれかである、２つ以上のヌクレオチドのポリマー型を意味する。この語は一重鎖および二重鎖型のＤＮＡを含むが、好ましくは二重鎖ＤＮＡである。
【０１３０】
本明細書で用いられる「単離されたポリヌクレオチド」の語は、その起源によって、「単離されたポリヌクレオチド」が；「単離されたポリヌクレオチド」が天然において見出されるポリヌクレオチドの全てまたはポーションに随伴せず、天然において連結していないポリヌクレオチドに作動可能に連結しており、またはより大型の配列の部分として天然に存在しない、ポリヌクレオチド（例えば、ゲノムの、ｃＤＮＡの、もしくは合成起源の、またはこれらのいくつかの組合せの）を意味する。
【０１３１】
本明細書で用いられる「ベクター」の語は、それに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味することが意図される。ベクターの１タイプは「プラスミド」であり、「プラスミド」は、その中にさらなるＤＮＡセグメントがライゲートされていることがある環状二重鎖ＤＮＡループを意味する。ベクターの別のタイプはウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲートされていてよい。ある種のベクターは、それが導入された宿主細胞において自立的に複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌のベクター、およびエピソームの哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソームの哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中に導入されると宿主細胞のゲノム中に組み入れられ得、それによって宿主のゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、ベクターが作動可能に連結している遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用である発現ベクターは、プラスミドの形態におけることが多い。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いられてよい、というのは、プラスミドは、ベクターの最も一般的に用いられている形態であるからである。しかし、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）など、このような他の形態の発現ベクターも含むことが意図される。
【０１３２】
「作動可能に連結している」の語は近位を意味し、記載される成分が意図されるやり方で機能するのを可能にする関係にある。コード配列に「作動可能に連結している」制御配列は、制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が実現されるような方法でライゲートされている。「作動可能に連結している」配列は、対象の遺伝子、およびトランスにおいて、または対象の遺伝子を制御する距離で作用する発現制御配列と連続している両方の発現制御配列を含む。本明細書で用いられる「発現制御配列」の語は、これらがライゲートしているコード配列の発現およびプロセシングを実行する必要があるポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、好適な転写開始、転写終結、プロモーター、およびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質のｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；および所望により、タンパク質の分泌を増強する配列を含む。このような制御配列の性質は、宿主生物体に応じて異なり、原核生物において、このような制御配列は一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み、真核生物において、一般的にこのような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。「制御配列」の語は、その存在が発現およびプロセシングに不可欠である成分を含むことが意図され、その存在が、有利であるさらなる成分、例えばリーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。
【０１３３】
本明細書において規定される「形質転換」は、それによって外来のＤＮＡが宿主細胞に入る任意のプロセスを意味する。形質転換は、当技術分野においてよく知られている様々な方法を用いて、天然の、または人工的な条件下で起こり得る。形質転換は、外来の核酸配列を、原核生物または真核生物の宿主細胞中に挿入するための任意の知られている方法に頼ることができる。方法は、形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、それだけには限定されないが、ウイルス感染、電気穿孔、リポフェクション、および微粒子銃を含むことができる。このような「形質転換された」細胞は、挿入されたＤＮＡが、自立的に複製するプラスミドまたは宿主の染色体の部分のいずれかとして複製することができる、安定に形質転換されている細胞を含む。これらはまた、限定された期間、挿入されたＤＮＡまたはＲＮＡを一過性に発現する細胞も含む。
【０１３４】
本明細書で用いられる「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）の語は、その中に外来のＤＮＡが導入されている細胞を意味することが意図される。このような語は、特定の対象の細胞にだけでなく、このような細胞の子孫にも言及することが意図されることを理解されたい。ある種の修飾は、変異または環境の影響のいずれかにより連続する世代において起こり得るため、このような子孫は実際、親細胞と同一でないことがあるが、本明細書で用いられる「宿主細胞」の語の範囲内に依然として含まれる。一態様では、宿主細胞は、生命のいずれかの界から選択される原核細胞および真核細胞を含む。真核細胞は、原生生物、真菌、植物、および動物の細胞を含む。別の態様では、宿主細胞は、それだけには限定されないが、原核細胞系のＥ．コリ、哺乳動物細胞系のＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、およびＣＯＳ；昆虫細胞系Ｓｆ９、ならびに真菌細胞サッカロマイセス・セレビシエを含む。
【０１３５】
標準的な技術が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換に用いられてよい（例えば、電気穿孔、リポフェクション）。酵素反応および精製技術は、製造元の仕様書にしたがって、または当技術分野において一般的に行われており、もしくは本明細書に記載する通りに行われてよい。前述の技術および手順は、一般に、当技術分野においてよく知られている従来の方法にしたがって、および本明細書を通して引用され、論じられる様々な一般的でより詳しい参考文献に記載される通りに行われてよい。例えば、任意の目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））を参照されたい。
【０１３６】
当技術分野において知られており、本明細書で用いられる「トランスジェニック生物体」は、導入遺伝子を含む細胞を有する生物体を意味し、生物体（または生物体の祖先）中に導入された導入遺伝子は生物体において天然に発現されないポリペプチドを発現する。「導入遺伝子」は、トランスジェニック生物体がそれから発生する細胞のゲノム中に、安定に、作動可能に組み入れられ、トランスジェニック生物体の１つまたは複数の細胞型または組織においてコードされた遺伝子生成物の発現を指示するＤＮＡ構築物である。
【０１３７】
「調節する」および「変調する」の語は交換可能に用いられ、本明細書で用いられる通り、対象の分子の活性（例えば、標的Ａβ型の生物学的活性）における変化または変更を意味する。変調は、対象の分子のある種の活性または機能の規模における増大または低減であってよい。分子の例示の活性および機能は、それだけには限定されないが、結合の特徴、酵素活性、細胞受容体の活性化、およびシグナル伝達を含む。
【０１３８】
同様に、本明細書で用いられる「モジュレーター」の語は、対象の分子の活性または機能（例えば、標的Ａβ型の生物学的活性）を変化または変更することができる化合物である。例えば、モジュレーターは、モジュレーターの非存在下で観察される活性または機能の規模に比べて、分子のある活性または機能の規模における増大または低減を引き起こすことができる。ある実施形態では、モジュレーターは、分子の少なくとも１つの活性または機能の規模を低減する阻害物質である。
【０１３９】
本明細書で用いられる「アゴニスト」の語は、対象の分子と接触させた場合、アゴニストの非存在下で観察される活性または機能の規模に比べて、分子のある活性または機能の規模における増大を引き起こすモジュレーターを意味する。
【０１４０】
本明細書で用いられる「アンタゴニスト」または「阻害物質」の語は、対象の分子と接触させた場合、アンタゴニストの非存在下で観察される活性または機能の規模に比べて、分子のある活性または機能の規模における低減を引き起こすモジュレーターを意味する。対象の特定のアンタゴニストは、標的Ａβ型の生物学的活性を阻止または変調するものを含む。標的Ａβ型のアンタゴニストおよび阻害物質は、それだけには限定されないが、Ａβ（２０−４２）グロブロマーおよび任意の他の標的Ａβ型に結合する本発明の結合タンパク質を含むことができる。標的Ａβ型のアンタゴニストまたは阻害物質は、例えば、Ｐ／Ｑ型の電圧依存性のシナプス前のカルシウムチャネルの活性に対する前記Ａβ型の阻害効果を低減し得る。
【０１４１】
本明細書で用いられる「効果的な量」の語は、障害または１つもしくは複数のその症状の重症度および／または期間を低減または回復させ、障害の進行を妨げ、障害の退行を引き起こし、障害に伴う１つまたは複数の症状の再発、発症、開始、または進行を防ぎ、障害を検出し、あるいは別の治療法（例えば、予防薬もしくは治療薬）の予防効果または治療効果（複数可）を増強または改善するのに十分である治療の量を意味する。
【０１４２】
本明細書で用いられる「試料」の語は、その最も広範な意味において用いられる。本明細書で用いられる「生物学的試料」は、それだけには限定されないが、生存しているものまたは以前に生存していたものからの任意の量の物質を含む。このような生存しているものは、それだけには限定されないが、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギ、および他の動物を含む。このような物質は、それだけには限定されないが、血液、血清、尿、滑液、細胞、器官、組織、骨髄、リンパ節、および脾臓を含む。
【０１４３】
Ｉ．本発明の抗体
本発明の第１の特定の態様は、Ａβ（２０−４２）グロブロマーおよび／または任意の他の標的Ａβ型に結合するＣＤＲグラフト化抗体、またはその抗原結合ポーションを提供する。本発明の第２の特定の態様は、Ａβ（２０−４２）グロブロマーおよび／または任意の他の標的Ａβ型に結合するヒト化抗体、またはその抗原結合ポーションを提供する。特定の一態様によると、抗体またはそのポーションは、単離されている抗体である。さらなる特定の一態様によると、本発明の抗体はＡβ（２０−４０）グロブロマーおよび／または任意の他の標的Ａβ型の活性を中和する。
【０１４４】
Ａ．抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体を作成する方法
本発明の抗体は、当技術分野において知られている任意の数々の技術によって作成され得る。
【０１４５】
１．ハイブリドーマ技術を用いた抗Ａβ（２０−４２）グロブロマーモノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはこれらの組合せの使用を含めた、当技術分野において知られている広範囲の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８年）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、５６３−６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１年）（前記参考文献はその全文が参照により組み込まれる）など、当技術分野において知られており、教示される技術を含めたハイブリドーマ技術を用いて生成され得る。本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」の語は、ハイブリドーマ技術によって生成される抗体に制限されない。「モノクローナル抗体」の語は、これが生成される方法ではなく、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含めた単一のクローンに由来する抗体を意味する。
【０１４６】
ハイブリドーマ技術を用いて特定の抗体を生成し、スクリーニングするための方法はルーチンであり、当技術分野においてよく知られている。一実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体を産生する方法、および本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含む方法によって生成される抗体を提供し、例えば、ハイブリドーマは、本発明の抗原で免疫化したマウスから単離された脾細胞をミエローマ細胞と融合し、次いで本発明のポリペプチドと結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンに対する融合に起因するハイブリドーマをスクリーニングすることによって産生される。簡潔に述べると、マウスはＡβ（２０−４２）グロブロマー抗原で免疫化され得る。特定の一実施形態では、抗原は、免疫応答を刺激するためのアジュバントと一緒に投与される。このようなアジュバントはフロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）、またはＩＳＣＯＭ（免疫賦活複合体）を含む。このようなアジュバントは、局所堆積中でポリペプチドを捕捉することによって急速な分散からポリペプチドを保護し、またはマクロファージおよび免疫系の他の構成成分に対して化学走性である因子を分泌するように宿主を刺激する物質を含むことがある。好ましくは、ポリペプチドが投与される場合、免疫化スケジュールは、数週間にわたって広がる、ポリペプチドの２つ以上の投与を伴う。
【０１４７】
動物をＡβ（２０−４２）グロブロマー抗原で免疫化した後、抗体および／または抗体生成細胞が動物から得られてよい。抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体含有血清は、動物を出血させ、または屠殺することによって動物から得られる。血清は、それが動物から得られたままで用いられてよく、免疫グロブリン分画は血清から得られてよく、または抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体は血清から精製されてよい。このやり方で得られた血清または免疫グロブリンはポリクローナルであり、したがって不均質なアレイの性質を有する。
【０１４８】
免疫応答が検出された後、例えば、抗原Ａβ（２０−４２）グロブロマーに特異的な抗体がマウス血清中に検出された後、マウスの脾臓を回収し、脾細胞を単離する。次いで、脾細胞をよく知られている技術によって任意の適切なミエローマ細胞、例えば、ＡＴＣＣから入手できる細胞系ＳＰ２０からの細胞に対して融合する。ハイブリドーマが選択され、限外希釈によってクローニングされる。次いで、ハイブリドーマクローンを、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに結合することができる抗体を分泌する細胞に対して当技術分野において知られている方法によってアッセイする。一般に高レベルの抗体を含む腹水は、ポジティブハイブリドーマクローンでマウスを免疫化することによって産生され得る。
【０１４９】
別の実施形態では、抗体生成性の不死化ハイブリドーマが免疫化した動物から調製され得る。免疫化後、動物を屠殺し、当技術分野においてよく知られている通り、脾臓Ｂ細胞を、不死化したミエローマ細胞に融合させる（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上述を参照されたい）。特定の一実施形態では、ミエローマ細胞は免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌性細胞系）。融合および抗生物質の選択後、Ａβ（２０−４２）グロブロマーもしくはそのポーション、またはＡβ（２０−４２）グロブロマーを発現する細胞を用いてハイブリドーマがスクリーニングされる。特定の一実施形態では、最初のスクリーニングは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いて行われる。ＥＬＩＳＡスクリーニングの一例は、本明細書に参照により組み込むＷＯ００／３７５０４に提供されている。
【０１５０】
抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体産生性ハイブリドーマは、以下にさらに詳しく論じる通り、頑強なハイブリドーマ増殖、抗体の高い生成、および望ましい抗体の特徴を含めた望ましい特徴に対して選択され、クローニングされ、さらにスクリーニングされる。ハイブリドーマは同系の動物において、免疫系を欠く動物において、例えば、ヌードマウスにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養において、培養され、拡大されてよい。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、拡大する方法は当業者にはよく知られている。
【０１５１】
特定の一実施形態では、ハイブリドーマは、上記に記載した通り、マウスのハイブリドーマである。別の特定の実施形態では、ハイブリドーマは、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマなどの、非ヒトの、非マウスの種において生成される。別の実施形態では、ハイブリドーマはヒトハイブリドーマであり、ヒト非分泌性ミエローマは、抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体を発現するヒト細胞と融合される。
【０１５２】
特異的なエピトープを認識する抗体断片は、知られている技術によって産生され得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を生成するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を生成するため）などの酵素を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解性の切断によって生成され得る。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０１５３】
２．ＳＬＡＭを用いた抗Ａβ（２０−４２）グロブロマーモノクローナル抗体
本発明の別の態様では、組換え抗体は、米国特許第５，６２７，０５２号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０２５５１号、およびＢａｂｃｏｃｋ，Ｊ．Ｓ．ら（１９９６年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻、７８４３−７８４８頁において記載される通り、選択リンパ球抗体法（ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｔｈｏｄ）（ＳＬＡＭ）として当技術分野において呼ばれている手順を用いて、単一の、単離されたリンパ球から産生される。この方法において、対象の抗体を分泌する単一の細胞、例えば、セクション１に記載される任意の１つの免疫化した動物に由来するリンパ球が、抗原特異的溶血プラークアッセイを用いてスクリーニングされ、抗原Ａβ（２０−４２）グロブロマーまたはそのサブユニットは、ビオチンなどのリンカーを用いてヒツジ赤血球に連結され、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに特異性を有する抗体を分泌する単一の細胞を同定するのに用いられる。対象の抗体分泌細胞を同定した後、重鎖および軽鎖可変領域のｃＤＮＡが逆転写ＰＣＲによって細胞から救出され、次いで、これら可変領域は好適な免疫グロブリン定常領域（例えば、ヒト定常領域）の状況において、ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞において発現されてよい。ｉｎ  ｖｉｖｏで選択されたリンパ球に由来する、増幅された免疫グロブリン配列でトランスフェクトされた宿主細胞は、次いで、例えば、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する抗体を発現する細胞を単離するためにトランスフェクトされた細胞をパニングすることによって、さらなる分析およびｉｎ  ｖｉｔｒｏの選択を受けることができる。増幅された免疫グロブリン配列は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９７／２９１３１号およびＰＣＴ公開第ＷＯ００／５６７７２号において記載されているものなど、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの親和性成熟法などによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでさらに操作され得る。
【０１５４】
３．トランスジェニック動物を用いた抗Ａβ（２０−４２）グロブロマーモノクローナル抗体
本発明の別の実施形態では、抗体は、Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗原を有するヒト免疫グロブリン遺伝子座のいくつか、または全てを含む非ヒト動物を免疫化することによって生成される。特定の一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の大型断片を含み、マウス抗体生成が欠損している操作されたマウス系統である、ゼノマウス（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ）トランスジェニックマウスである。例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７巻、１３−２１頁（１９９４年）、ならびに米国特許第５，９１６，７７１号、第５，９３９，５９８号、第５，９８５，６１５号、第５，９９８，２０９号、第６，０７５，１８１号、第６，０９１，００１号、第６，１１４，５９８号、および第６，１３０，３６４号を参照されたい。１９９１年７月２５日公開のＷＯ９１／１０７４１、１９９４年２月３日公開のＷＯ９４／０２６０２、両方とも１９９６年１０月３１日公開のＷＯ９６／３４０９６およびＷＯ９６／３３７３５、１９９８年４月２３日公開のＷＯ９８／１６６５４、１９９８年６月１１日公開のＷＯ９８／２４８９３、１９９８年１１月１２日公開のＷＯ９８／５０４３３、１９９９年９月１０日公開のＷＯ９９／４５０３１、１９９９年１０月２１日公開のＷＯ９９／５３０４９、２０００年２月２４日公開のＷＯ００  ０９５６０、および２０００年６月２９日公開のＷＯ００／０３７５０４も参照されたい。ゼノマウストランスジェニックマウスは、完全なヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを生成し、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を産生する。ゼノマウストランスジェニックマウスは、メガベースサイズの、生殖系列立体配置のヒト重鎖遺伝子座のＹＡＣ断片およびｘ軽鎖遺伝子座の導入によってヒト抗体レパートリーのおよそ８０％を含む。その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５巻、１４６−１５６頁（１９９７年）、ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８８巻、４８３−４９５頁（１９９８年）を参照されたい。
【０１５５】
４．組換え抗体ライブラリーを用いた抗Ａβ（２０−４２）グロブロマーモノクローナル抗体
本発明の抗体を作成するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法がやはり用いられてよく、抗体ライブラリーが、所望の結合特異性を有する抗体を同定するためにスクリーニングされる。組換え抗体ライブラリーのこのようなスクリーニングのための方法は当技術分野においてよく知られており、例えば、その各々の内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１８６１９号；Ｄｏｗｅｒら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１７２７１号；Ｗｉｎｔｅｒら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２０７９１号；Ｍａｒｋｌａｎｄら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１５６７９号；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／０１２８８号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号；Ｇａｒｒａｒｄら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０９６９０号；Ｆｕｃｈｓら（１９９１年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻、１３７０−１３７２頁；Ｈａｙら（１９９２年）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、３巻、８１−８５頁；Ｈｕｓｅら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻、１２７５−１２８１頁；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０年）３４８巻、５５２−５５４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３年）ＥＭＢＯ  Ｊ、１２巻、７２５−７３４頁；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２２６巻、８８９−８９６頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻、６２４−６２８頁；Ｇｒａｍら（１９９２年）ＰＮＡＳ、８９巻、３５７６−３５８０頁；Ｇａｒｒａｄら（１９９１年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻、１３７３−１３７７頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１年）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ、１９巻、４１３３−４１３７頁；およびＢａｒｂａｓら（１９９１年）ＰＮＡＳ、８８巻、７９７８−７９８２頁、米国特許出願公開第２００３０１８６３７４号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ９７／２９１３１号に記載されている方法を含む。
【０１５６】
組換え抗体ライブラリーは、Ａβ（２０−４２）グロブロマー、またはＡβ（２０−４２）グロブロマーのポーションで免疫化された対象からであってよい。あるいは、組換え抗体ライブラリーは、ナイーブ対象、すなわち、ヒトＡβ（２０から４２）グロブロマーで免疫化されていないヒト対象からのヒト抗体ライブラリーなど、Ａβ（２０−４２）グロブロマーで免疫化されていないヒトからであってよい。本発明の抗体は、組換え抗体ライブラリーをヒトＡβ（２０−４２）グロブロマーを含むペプチドでスクリーニングし、それによってＡβ（２０−４２）グロブロマーを認識し、Ａβ（１−４２）グロブロマー、Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）モノマー、Ａβ原線維、およびｓＡＰＰαを識別する抗体を選択することによって選択される。このようなスクリーニングおよび選択を行うための方法は、先の段落における参考文献に記載されているものなど、当技術分野においてよく知られている。特定のｋｏｆｆ速度定数でヒトＡβ（２０−４２）グロブロマーから解離するものなど、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する特定の結合親和性を有し、Ａβ（１−４２）グロブロマー、Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）モノマー、Ａβ原線維、およびｓＡＰＰαを識別する本発明の抗体を選択するために、当技術分野において知られているドットブロットの方法を用いて、所望のｋｏｆｆ速度定数を有する抗体を選択することができる。Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する特定の中和活性を有し、Ａβ（１−４２）グロブロマー、Ａβ（１−４０）、およびＡβ（１−４２）モノマー、Ａβ原線維、およびｓＡＰＰαを識別する本発明の抗体を選択するために、Ａβ（２０−４２）グロブロマー活性の阻害を評価するための当技術分野において知られている特定のＩＣ５０標準方法を有するものなどが用いられてよい。
【０１５７】
一態様では、本発明は、ヒトＡβ（２０−４２）に結合し、Ａβ（１−４２）グロブロマー、Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）モノマー、Ａβ原線維、およびｓＡＰＰαを識別する、単離された抗体、またはその抗原結合ポーションに関する。一態様によると、抗体は中和抗体である。様々な実施形態では、抗体は組換え抗体またはモノクローナル抗体である。
【０１５８】
例えば、本発明の抗体はまた、当技術分野において知られている様々なファージディスプレイ方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ方法において、それをコードするポリヌクレオチド配列を保有する機能的な抗体ドメインがファージ粒子の表面上にディスプレイされる。特定的には、このようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインをディスプレイするように利用され得る。対象の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば、標識された抗原、または固体表面もしくはビーズに結合されもしくは捕獲されている抗原を用いて、選択され、または抗原で同定され得る。これらの方法において用いられるファージは、典型的に、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えで融合している、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはジスルフィド安定化されているＦｖ抗体ドメインを有するファージから発現されるｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む繊維状ファージである。本発明の抗体を作成するのに用いられ得るファージディスプレイ方法の例は、各々がその全体において参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８２巻、４１−５０頁（１９９５年）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８４巻、１７７−１８６頁（１９９５年）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４巻、９５２−９５８頁（１９９４年）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ、１８７巻、９−１８頁（１９９７年）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５７巻、１９１−２８０頁（１９９４年）；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０２８０９号、第ＷＯ９１／１０７３７号、第ＷＯ９２／０１０４７号、第ＷＯ９２／１８６１９号、第ＷＯ９３／１１２３６号、第ＷＯ９５／１５９８２号、第ＷＯ９５／２０４０１号、ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０、２２５号、第５，６５８，７２７号、第５，７３３，７４３号、および第５，９６９，１０８号において開示されているものを含む。
【０１５９】
上記の参考文献に記載される通り、ファージ選択後、ファージからの抗体コード領域は、ヒト抗体または任意の他の所望の抗原結合断片を含む全体の抗体を産生するために単離され、用いられてよく、例えば、以下に詳しく記載するものなど、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含めた任意の所望の宿主において発現されてよい。例えば、組換えでＦａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片を生成するための技術は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２２３２４号；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１２巻（６）、８６４−８６９頁（１９９２年）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ、３４巻、２６−３４頁（１９９５年）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０巻、１０４１−１０４３頁（１９８８年）（前記参考文献は、その全体が参照により組み込まれる）において開示されているものなど、当技術分野において知られている方法を用いてやはり使用されてよい。単鎖Ｆｖｓおよび抗体を生成するために用いられ得る技術の例は、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０３巻、４６−８８頁（１９９１年）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ、９０巻、７９９５−７９９９頁（１９９３年）；Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０巻、１０３８−１０４０頁（１９８８年）において記載されているものを含む。
【０１６０】
ファージディスプレイによって組換え抗体ライブラリーをスクリーニングする代わりに、大型のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするために当技術分野において知られている他の方法が、本発明の二重特異的抗体の同定に適用され得る。代替の発現系の１タイプは、ＳｚｏｓｔａｋおよびＲｏｂｅｒｔｓによるＰＣＴ公開第ＷＯ９８／３１７００号、ならびにＲｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．およびＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９７年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻、１２２９７−１２３０２頁において記載される通り、組換え抗体ライブラリーがＲＮＡ−タンパク質融合物として発現されるものである。この系において、共有結合性の融合が、ｍＲＮＡと、その３’末端にペプチジルアクセプター抗生物質のピューロマイシンを保有する合成ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によってコードするペプチドまたはタンパク質との間に作り出される。このように、特異的なｍＲＮＡは、コードされたペプチドもしくはタンパク質、例えば、抗体もしくはこれらのポーションの性質（例えば、二重特異的抗原に対する抗体もしくはそのポーションの結合）に基づいて、ｍＲＮＡの複合混合物（例えば、コンビナトリアルライブラリー）から濃縮されてよい。このようなライブラリーのスクリーニングから回収された、抗体をコードする核酸配列またはそのポーションは、上記に記載した通り、組換えの手段によって（例えば、哺乳動物宿主細胞において）発現されてよく、さらに、上記に記載した通り、もともと選択された配列（複数可）中に変異が導入されているｍＲＮＡ−ペプチド融合物のスクリーニングのさらなるラウンドによって、または組換え抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏの親和性成熟のための他の方法のいずれかによって、さらなる親和性成熟に曝されてよい。
【０１６１】
別の取組みにおいて、本発明の抗体は、当技術分野において知られている酵母ディスプレイ方法を用いて産生されてもよい。酵母ディスプレイ法において、酵母細胞壁に抗体ドメインを繋留し、これらを酵母の表面上にディスプレイするのに遺伝子の方法が用いられる。特に、このような酵母はレパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインをディスプレイするのに利用されてよい。本発明の抗体を作成するのに用いられ得る酵母ディスプレイ法の例は、参照により本明細書に組み込む、Ｗｉｔｔｒｕｐら、米国特許第６，６９９，６５８号に開示されているものを含む。
【０１６２】
Ｂ．組換えＡβ（２０−４２）グロブロマー抗体の生成
本発明の抗体は、当技術分野において知られている任意の数々の技術によって生成されてよい。例えば、宿主細胞からの発現であり、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）が標準の技術によって宿主細胞中にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」の語の様々な形態が、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなど、外来のＤＮＡを原核生物または真核生物の宿主細胞中に導入するのに通常用いられる広範囲の技術を包含することが意図される。本発明の抗体を、原核生物または真核生物いずれかの宿主細胞において発現させることが可能である。本発明の特定の一態様によると、抗体の発現は、哺乳動物宿主細胞などの真核細胞を用いて行われる、というのはこのような真核細胞（特に哺乳動物細胞）は、原核細胞よりも集合し、適切にフォールディングされ、免疫学的に活性な抗体を分泌する可能性が高いからである。
【０１６３】
一態様によると、本発明の組換え抗体を発現するための哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｒ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２年）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５９巻、６０１−６２１頁に記載されている通り、ＤＨＦＲ選択マーカーと一緒に用いられる、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、（１９８０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻、４２１６−４２２０頁において記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０ミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳＰ２細胞を含む。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞中の抗体の発現を可能にし、または宿主細胞が培養されている培養培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって抗体が生成される。抗体は、標準のタンパク質精製方法を用いて培養培地から回収されてよい。
【０１６４】
宿主細胞はまた、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ分子などの機能的な抗体断片を生成するのに用いられてよい。上記の手順に対する変形は本発明の範囲内であることが理解されよう。例えば、宿主細胞に、本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖のいずれかの機能的な断片をコードするＤＮＡをトランスフェクトするのが望ましいことがある。対象の抗原の結合に必要ではない軽鎖および重鎖のいずれかまたは両方をコードするＤＮＡのいくつか、または全てを除去するのに、組換えＤＮＡ技術がやはり用いられてよい。このような切断されたＤＮＡ分子から発現される分子も、本発明の抗体によって包含される。さらに、標準の化学的架橋連結方法によって本発明の抗体を第２の抗体に架橋連結することによって、１本の重鎖および１本の軽鎖が本発明の抗体であり、他の重鎖および軽鎖が対象の抗原以外の抗原に特異的である二機能性抗体が生成されてよい。
【０１６５】
本発明の抗体、またはその抗原結合ポーションの組換え発現のための特定の一システムにおいて、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターが、リン酸カルシウムが媒介するトランスフェクションによってｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞中に導入される。組換え発現ベクターの範囲内で、抗体重鎖および軽鎖の遺伝子は各々、遺伝子の高レベルの転写を駆動するために、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター制御エレメントに作動可能に連結されている。組換え発現ベクターはＤＨＦＲ遺伝子も保有しているが、ＤＨＦＲ遺伝子は、メトトレキセート選択／増幅を用いてベクターをトランスフェクトされているＣＨＯ細胞の選択を可能にする。選択された形質転換体の宿主細胞は、抗体重鎖および軽鎖の発現を可能にするように培養され、インタクトな抗体が培養培地から回収される。組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体に対して選択し、宿主細胞を培養し、培養培地から抗体を回収するのに、標準の分子生物学技術が用いられる。なおさらに、本発明は、本発明の組換え抗体が合成されるまで適切な培養培地中で本発明の宿主細胞を培養することによって、本発明の組換え抗体を合成する方法を提供する。本方法は、培養培地から組換え抗体を単離するステップをさらに含むことができる。
【０１６６】
１．抗Ａβ（２０−４２）グロブロマーマウス抗体
表４は、マウス４Ｄ１０のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列のリストである。
【０１６７】
【表４】
2020103288.tif 000006
【０１６８】
２．抗Ａβ（２０−４２）グロブロマーキメラ抗体
キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体など、抗体の異なるポーションが異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を生成するための方法は、当技術分野において知られており、本明細書において詳しく論じられる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻、１２０２頁（１９８５年）；Ｏｉら、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４巻、２１４頁（１９８６年）；Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９８９年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２５巻、１９１−２０２頁；米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、および第４，８１６，３９７号を参照されたい。さらに、「キメラ抗体」生成用に開発された技術が、好適な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒に、好適な抗原特異性のマウス抗体分子から遺伝子をスプライシングすることによって、用いられてよい（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１巻、８５１−８５５頁；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４年、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻、６０４−６０８頁；Ｔａｋｅｄａら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻、４５２−４５４頁）。
【０１６９】
一実施形態では、本発明のキメラ抗体は、ＷＯ２００７／０６２８５２に記載されるマウスモノクローナル抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体４Ｄ１０の重鎖定常領域を、ヒトＩｇＧ定常領域で置換することによって生成される。
【０１７０】
３．抗Ａβ（２０−４２）グロブロマーＣＤＲグラフト化抗体
本発明のＣＤＲグラフト化抗体はヒト抗体からの重鎖および軽鎖可変領域配列を含み、ＶＨおよび／またはＶＬの１つまたは複数のＣＤＲ領域は、本発明のマウス抗体のＣＤＲ配列で置換されている。任意のヒト抗体からのフレームワーク配列が、ＣＤＲグラフト化に対する鋳型として働き得る。しかし、このようなフレームワーク上への直鎖の置換は、しばしば抗原に対する結合親和性のいくらかの喪失をまねく。ヒト抗体がオリジナルのマウス抗体に対して相同であるほど、マウスＣＤＲをヒトフレームワークと組み合わせることで、親和性を低減し得るＣＤＲにおけるゆがみを導入する可能性は低くなる。したがって、ＣＤＲは別としてマウス可変フレームワークを置換するように選択されたヒト化変フレームワークは、例えば、マウス抗体可変領域フレームワークと少なくとも６５％の配列同一性を有する。ヒトおよびマウス可変領域は、ＣＤＲは別として、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％の配列同一性、または少なくとも８０％の配列同一性を有する。キメラ抗体を生成するための方法は当技術分野において知られており、本明細書において詳しく論じられる（ＥＰ  ２３９，４００；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、および第５，５８５，０８９号も参照されたい）、ベニアリングまたはリサーフェシング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｒ  ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ  ５９２，１０６；ＥＰ  ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２８巻（４／５）、４８９−４９８頁（１９９１年）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７巻（６）、８０５−８１４頁（１９９４年）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ、９１巻、９６９−９７３頁（１９９４年））、およびチェーンシャッフリング（米国特許第５，５６５，３５２号）。
【０１７１】
以下の表５は、本発明のＣＤＲグラフト化抗体（４Ｄ１０ｈｕｍ抗体）およびそれに含まれるＣＤＲの配列を示す。
【０１７２】
【表５】
2020103288.tif 000007
2020103288.tif 000008
【０１７３】
４．抗Ａβ（２０−４２）グロブロマーヒト化抗体
ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する、非ヒト種抗体からの抗体分子である。
【０１７４】
知られているヒトＩｇ配列は、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ−／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／、ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／、ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｍｇｅｎ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＳＤ／ＩＴ／ＩＴ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ−０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ、ｗｗｗ．ｌｉｂｒａｒｙ．ｔｈｉｎｋｑｕｅｓｔ．ｏｒｇ／１２４２９／Ｉｍｍｕｎｅ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ／、ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｍ−ｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／、ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏ−ｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ．ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ／、ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．−ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｌ／、ｗｗｗ．ｐｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐａ／３４０９１３／３４０９１３．ｈｔｍｌ−、ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／、ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃｊｐ／．ａｂｏｕｔ．ｙａｓｕｈｉｔｏ−／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／ｔａｂｌｅ．ａｓｐ、ｗｗｗ．ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／ａｘｐ／ｆａｃｓ／ｄａｖｉｅｓ／ｌｉｎ−ｋｓ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｆｃｃｌ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ＿ｇｅｏ．ｈｔｍｌ、ａｘｉｍｔｌ．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／．ａｂｏｕｔ．ｒｅｋ／ＡＥＰ−Ｓｔａｒｔ．ｈｔｍｌ、ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／．ａｂｏｕｔ．ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓｌ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／、ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕ−ｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ、ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／、ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍａｒｔｉｎ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ、ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ／、ａｂｇｅｎ．ｃｖｍ．ｔａｍｕ．ｅｄｕ／ｌａｂ／ｗｗｗａｂｇｅｎ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／．ａｂｏｕｔ．ｈｏｎｅｇｇｅｒ／ＡＨＯｓｅｍ−ｉｎａｒ／Ｓｌｉｄｅ０１．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｕｂｃｇ０７ｓ／、ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍ、ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｈ−ｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｉｏｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏ−ｕｔ．ｆｍｏｌｉｎａ／Ｗｅｂ−ｐａｇｅｓ／Ｐｅｐｔ／ｓｐｏｔｔｅｃｈ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ／ｆｒｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍ、ｗｗｗ．ｐａｔｅｎｔｓ．ｉｂｍ．ｃｏｍ／ｉｂｍ．ｈｔｍｌ．、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３年）に開示されている。このような移入された配列は、当技術分野において知られている通り、免疫原性を低減し、または結合親和性、会合速度、解離速度、アビディティー、特異性、半減期、または任意の他の適切な特徴を低減し、増強し、または修飾するために用いられてよい。
【０１７５】
ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合性を変更し、好ましくは改善するように、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換されてよい。これらのフレームワーク置換は、特定の位置の普通でないフレームワーク残基を同定するための抗原結合性および配列比較に重要なフレームワーク残基を同定するためにＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用を形作るなど、当技術分野においてよく知られている方法によって同定される（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、３２３頁（１９８８年）を参照されたい）。３次元免疫グロブリンモデルは通例入手可能であり、当業者には馴染み深い。選択された候補の免疫グロブリン配列の可能な３次元立体配置構造を図示し、表示するコンピュータプログラムは入手可能である。これらの表示を詳細に調べることで、候補の免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割を分析することができ、すなわち、候補の免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基を分析することができる。この方法で、標的抗原（複数可）に対する親和性の増大など、所望の抗体の特徴が実現されるように、ＦＲ残基が、コンセンサスおよび移入配列から選択され、組み合わされてよい。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接的に、および最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼすことにおいて関与する。抗体は、それだけには限定されないが、各々全体が参照により本明細書に組み込まれ、これらに引用される参考文献も含まれる、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻、５２２頁（１９８６年）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻、１５３４頁（１９８８年）、Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻、２２９６頁（１９９３年）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６巻、９０１頁（１９８７年）、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９巻、４２８５頁（１９９２年）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１巻、２６２３頁（１９９３年）、Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２８（４／５）巻、４８９−４９８頁（１９９１年）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７巻（６）、８０５−８１４頁（１９９４年）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ、９１巻、９６９−９７３頁（１９９４年）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０９９６７号、ＰＣＴ／：ＵＳ９８／１６２８０、ＵＳ９６／１８９７８、ＵＳ９１／０９６３０、ＵＳ９１／０５９３９、ＵＳ９４／０１２３４、ＧＢ８９／０１３３４、ＧＢ９１／０１１３４、ＧＢ９２／０１７５５；ＷＯ９０／１４４４３、ＷＯ９０／１４４２４、ＷＯ９０／１４４３０、ＥＰ２２９２４６、ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６、ＥＰ２３９，４００、米国特許第５，５６５，３３２号、第５，７２３，３２３号、第５，９７６，８６２号、第５，８２４，５１４号、第５，８１７，４８３、第５８１４４７６号、第５７６３１９２号、第５７２３３２３号、第５，７６６８８６号、第５，７１４，３５２号、第６，２０４，０��３号、第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，２２５，５３９号、第４，８１６，５６７号において記載されている、当技術分野において知られている様々な技術を用いてヒト化され得る。
【０１７６】
以下の表６は、本発明のヒト化抗体（４Ｄ１０ｈｕｍ抗体）およびそれに含まれるＣＤＲの配列を示すものである。
【０１７７】
【表６】
2020103288.tif 000009
2020103288.tif 000010
2020103288.tif 000011
【０１７８】
Ｃ．抗体および抗体産生細胞系
一態様に従って，本発明の抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー（ｇｌｏｂｕｌｏｍｅｒ）抗体または任意の他の標的Ａβ型に対する抗体は、Ａβ（２０−４２）グロブロマー（および／または任意の他の標的Ａβ型）の活性を低減または中和する高い能力を示す。
【０１７９】
特定の実施形態において、抗体は、重鎖定常領域、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤの定常領域などを含む。一態様に従って、重鎖定常領域はＩｇＧ１重鎖定常領域またはＩｇＧ４重鎖定常領域である。さらなる態様に従って、抗体は、軽鎖定常領域、カッパ軽鎖定常領域またはラムダ軽鎖定常領域のいずれかを含む。一態様に従って、抗体はカッパ軽鎖定常領域を含む。抗体ポーションは、例えば、Ｆａｂ断片または一本鎖Ｆｖ断片であってもよい。
【０１８０】
抗体のエフェクター機能を改変するためのＦｃポーションにおけるアミノ酸残基の置換は、当技術分野において公知である（Ｗｉｎｔｅｒら、ＵＳ特許第５，６４８，２６０号および同第５，６２４，８２１号）。抗体のＦｃポーションは、いくつかの重要なエフェクター機能、例えば、サイトカインの誘導、ＡＤＣＣ、食作用、補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）ならびに抗体および抗原−抗体複合体の半減期／クリアランス速度を仲介する。ある場合には、これらのエフェクター機能は治療用抗体にとって望ましいが、他の場合には、治療対象によって、不必要または有害でさえあり得る。特定のヒトＩｇＧアイソタイプ、具体的にはＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、それぞれ、ＦｃγＲｓおよび補体Ｃ１ｑとの結合を介してＡＤＣＣおよびＣＤＣを仲介する。新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、抗体の循環半減期を決定する必須成分である。その上別の実施形態において、抗体の定常領域、例えば、抗体のＦｃ領域における少なくとも１個のアミノ酸残基が、抗体のエフェクター機能が改変されるように置換される。
【０１８１】
一実施形態は、本発明の抗体が、別の機能性分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に誘導体化または連結された標識抗体を提供する。例えば、本発明の標識抗体は、本発明の抗体と１種または複数種の他の分子種、例えば、別の抗体（例えば、二重特異性抗体またはダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ））、検出可能な薬剤、医薬品および／または抗体と別の分子（ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグなど）との会合を仲介できるタンパク質またはペプチドなどとの（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合などによる）機能的連結により得ることができる。
【０１８２】
本発明の抗体を誘導体化できる有用な検出可能な薬剤は、蛍光化合物を含む。例示的な蛍光性検出可能薬剤は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリンなどを含む。抗体はまた、検出可能な酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどを用いて誘導体化できる。抗体を、検出可能な酵素を用いて誘導体化する場合、抗体は、検出可能な反応生成物を生成するために酵素が使用する追加の試薬を加えることによって検出される。例えば、検出可能な薬剤のホースラディッシュペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加により、検出可能である着色された反応生成物をもたらす。抗体はまた、ビオチンを用いて誘導体化でき、アビジンまたはストレプトアビジンの結合の間接的測定を介して検出できる。
【０１８３】
本発明の別の実施形態は結晶化抗体を提供する。一態様に従って、本発明は、本明細書に開示した全抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体およびそれらの断片の結晶ならびにこのような結晶を含む製剤および組成物に関する。さらなる態様に従って、結晶化抗体は抗体の可溶性対応物よりｉｎ  ｖｉｖｏで長い半減期を有する。さらなる態様に従って、抗体は結晶化後も生物学的活性を保有する。
【０１８４】
本発明の結晶化抗体は、参照により本明細書に組み込まれたＷＯ０２／０７２６３６に開示のように当技術分野において公知の方法に従って作製され得る。
【０１８５】
本発明の別の実施形態は、抗体が１つまたは複数の炭水化物残基を含むグリコシル化抗体を提供する。新生ｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質の産生は、翻訳後修飾として公知のさらなるプロセシングを受けることがある。具体的には、糖（グリコシル）残基を酵素的に加えることができる、グリコシル化として公知の方法である。共有結合したオリゴ糖側鎖を有する得られたタンパク質は、グリコシル化タンパク質または糖タンパク質として公知である。
【０１８６】
抗体は、Ｆｃドメインおよび可変ドメインに１つまたは複数の炭水化物残基を含む糖タンパク質である。Ｆｃドメイン中の炭水化物残基は、Ｆｃドメインのエフェクター機能に対する重要な効果を有し、抗体の抗原結合または半減期に対して最小効果（Ｒ．Ｊｅｆｆｅｒｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２１（２００５年）、１１−１６頁）を有する。対照的に、可変ドメインのグリコシル化は、抗体の抗原結合活性について効果を有し得る。可変ドメインにおけるグリコシル化は、おそらく立体障害のために抗体結合親和性についての負の効果を有し得る（Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３年）３０：１３６１−１３６７頁）または抗原に対する親和性の増加をもたらす（Ｗａｌｌｉｃｋ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８８年）１６８：１０９９−１１０９頁；Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９１年）１０：２７１７  ２７２３頁）．
本発明の一態様は、抗体のＯ結合型またはＮ結合型グリコシル化部位が突然変異した、グリコシル化部位突然変異体の作製に関する。当業者は、標準的な周知の技術を使用して、このような突然変異体を作製できる。生物学的活性を保有するが、結合活性が増大または低減したグリコシル化部位突然変異体の創造は、本発明の別の目的である。
【０１８７】
その上別の実施形態において、本発明の抗体のグリコシル化は修正されている。例えば、非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｌａｔｅｄ）抗体を作ることができる（すなわち、抗体がグリコシル化を欠いている。）。グリコシル化を改変することができ、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加することができる。このような炭水化物の修飾は、抗体配列内のグリコシル化の１つまたは複数の部位を改変することによって達成できる。例えば、１つまたは複数の可変領域グリコシル化部位の除去をもたらし、その結果その部位のグリコシル化を取り除く、１個または複数個のアミノ酸置換を行うことができる。このような非グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加し得る。このような試みは、国際出願公開番号ＷＯ０３／０１６４６６Ａ２および米国特許第５，７１４，３５０号および同第６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載され、これらはそれぞれその全体を、参照により本明細書に組み込む。
【０１８８】
追加的または代替的に、フコシル残基量の減少を有する低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体またはバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）ＧｌｃＮＡｃ構造の増加を有する抗体などのグリコシル化の改変型を有する、本発明の修飾抗体を作ることができる。このような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力の増加が実証されている。このような炭水化物修飾は、例えば、宿主細胞において、改変されたグリコシル化機構を有する抗体を発現させることによって達成できる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、当技術分野において記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、その結果改変されたグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら（２００２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０頁；Ｕｍａｎａら（１９９９年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１および欧州特許第ＥＰ１，１７６，１９５号；国際出願公開番号ＷＯ０３／０３５８３５およびＷＯ９９／５４３４２  ８０を参照されたく、これらはそれぞれその全体を、参照により本明細書に組み込む。
【０１８９】
タンパク質のグリコシル化は、対象となるタンパク質のアミノ酸配列およびタンパク質を発現させる宿主細胞に依存する。さまざまな生物がさまざまなグリコシル化酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ）を産生し、さまざまな利用可能な基質（ヌクレオチド糖）を有し得る。このような要因のために、タンパク質のグリコシル化パターンおよびグリコシル残基の組成は、特定のタンパク質が発現される宿主系によって異なると思われる。本発明において有用なグリコシル残基は、限定するものではないが、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、ｎ−アセチルグルコサミンおよびシアル酸を含み得る。一態様に従って、グリコシル化抗体は、グリコシル化パターンがヒトであるようにグリコシル残基を含む。
【０１９０】
異なるタンパク質のグリコシル化が、異なるタンパク質の特徴をもたらし得ることは当業者には公知である。例えば、酵母などの微生物宿主において産生され、酵母の内因性経路を利用してグリコシル化された治療用タンパク質の有効性は、ＣＨＯ細胞系などの哺乳動物細胞において発現された同じタンパク質の有効性と比較して減少し得る。このような糖タンパク質もまた、ヒトにおいて免疫原性であり得、投与後ｉｎ  ｖｉｖｏで半減期の減少を示す。ヒトおよび他の動物における特異的受容体は、特異的グリコシル残基を認識でき、タンパク質の血流からの急速なクリアランスを促進する。他の悪影響は、タンパク質のフォールディング、溶解度、プロテアーゼに対する感受性、トラフィッキング、輸送、コンパートメント化、分泌、他のタンパク質もしくは因子による認識、抗原性またはアレルゲン性における変化を含み得る。したがって、医師は、グリコシル化の特異的な組成およびパターン、例えば、ヒト細胞において産生された、または意図する対象動物の種特異的細胞において産生されたものと同一もしくは少なくとも同様のグリコシル化の組成およびパターンを有する治療用タンパク質の方を選ぶことができる。
【０１９１】
宿主細胞のグリコシル化タンパク質と異なるグリコシル化タンパク質の発現は、異種グリコシル化酵素を発現するように遺伝子組換えすることによって達成できる。当技術分野において公知の技術を使用して、医師は、ヒトタンパク質グリコシル化を示す抗体を作製できる。例えば、酵母菌株は、これらの酵母菌株において産生されたグリコシル化タンパク質（糖タンパク質）が、動物細胞、特にヒト細胞のタンパク質のグリコシル化と同一のタンパク質のグリコシル化を示すような、非天然のグリコシル化酵素を発現するように遺伝子組換えされたことがある（Ｕ．Ｓ特許出願第２００４００１８５９０号および同第２００２０１３７１３４号ならびにＷＯ０５／１００５８４）。
【０１９２】
別の実施形態は、本発明のような抗体に特異的な抗イディオタイプの（抗Ｉｄ）抗体に関する。抗Ｉｄ抗体は、別の抗体の抗原結合領域に一般的に伴う固有の決定基を認識する抗体である。抗Ｉｄは、抗体またはそれらのＣＤＲ含有領域を用いて動物を免疫化することによって調製できる。免疫化された動物は、免疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識し、応答し、抗Ｉｄ抗体を産生すると思われる。抗Ｉｄ抗体はまた「免疫原」として使用でき、さらに別の動物において免疫応答を誘導し、いわゆる抗抗Ｉｄ抗体を産生させることができる。
【０１９３】
さらに、対象となるタンパク質は、ライブラリーのメンバーの宿主細胞が変異体グリコシル化パターンを有する対象となるタンパク質を産生するように、さまざまなグリコシル化酵素を発現するように遺伝子操作された宿主細胞のライブラリーを使用して発現させることができることは、当業者には理解されるであろう。その後、医師は、特定の新規なグリコシル化パターンを有する対象となるタンパク質を選択し、単離することができる。さらなる態様に従って、個別に選択された新規なグリコシル化パターンを有するタンパク質は、生物学的特性の修正または改変を示す。
【０１９４】
Ｄ．抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体の使用
Ａβ（２０−４２）グロブロマーに結合するそれらの能力を考えると、本発明の抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体または任意の他の標的Ａβ型に対する抗体は、Ａβ（２０−４２）グロブロマーおよび／または任意の他の標的Ａβ型（例えば、血清、ＣＳＦ、脳組織また血漿などの生物学的試料）を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）または組織免疫組織化学などの従来の免疫測定法を使用して検出するために使用できる。本発明は、生物学的試料と本発明の抗体とを接触させるステップならびにＡβ（２０−４２）グロブロマー（および／またはおよび／または任意の他の標的Ａβ型）に結合した抗体または未結合の抗体のいずれかを検出し、その結果、生物学的試料中のＡβ（２０−４２）グロブロマーおよび／または任意の他の標的Ａβ型を検出するステップを含む、生物学的試料中のＡβ（２０−４２）グロブロマーおよび／または任意の他の標的Ａβ型を検出する方法を提供する。抗体は、直接または間接的に検出可能な物質を用いて標識され、結合抗体または未結合抗体の検出を容易にされる。適切な検出可能物質は、さまざまな酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料および放射性物質を含む。適切な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含み；適切な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン；適切な蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを含み；発光材料の例はルミノールを含み、；適切な放射性物質の例は、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏまたは１５３Ｓｍを含む。
【０１９５】
抗体を標識する代わりに、Ａβ（２０−４２）グロブロマーおよび／または任意の他の標的Ａβ型は、検出可能な物質を用いて標識されたＡβ（２０−４２）グロブロマー標準および非標識の抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体を利用する競合免疫測定法によって、生体液中でアッセイできる。このアッセイにおいて、生物学的試料、標識Ａβ（２０−４２）グロブロマー標準および抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体を組み合わせ、非標識抗体に結合した標識Ａβ（２０−４２）グロブロマー標準の量を決定する。生物学的試料中のＡβ（２０−４２）グロブロマーおよび／または任意の他の標的Ａβ型の量は、抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体に結合した標識Ａβ（２０−４２）グロブロマー標準の量に反比例する。
【０１９６】
本発明の一態様に従って、本発明の抗体は、Ａβ（２０−４２）グロブロマー活性および／または任意の他の標的Ａβ型の活性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で中和できる。したがって、本発明のこのような抗体は、例えば、Ａβ（２０−４２）グロブロマーおよび／または本発明の抗体と交差反応する任意の他の標的Ａβ型を有するヒト対象または他の哺乳動物対象において、Ａβ（２０−４２）グロブロマーおよび／または任意の他の標的Ａβ型を含有する細胞培養液において、Ａβ（２０−４２）グロブロマー活性および／または任意の他の標的Ａβ型の活性を阻害する（すなわち低減する）ために使用できる。一実施形態において、本発明は、Ａβ（２０−４２）グロブロマーおよび／または任意の他の標的Ａβ型と、本発明の抗体とを、Ａβ（２０−４２）グロブロマー活性および／または任意の他の標的Ａβ型の活性が阻害される（すなわち低減される）ように接触させるステップを含む、Ａβ（２０−４２）グロブロマー活性および／または任意の他の標的Ａβ型の活性を阻害する（すなわち低減する）方法を提供する。例えば、Ａβ（２０−４２）グロブロマーおよび／または任意の他の標的Ａβ型を含有する、または含有すると疑われる細胞培養液において、本発明の抗体を培養培地に加え、Ａβ（２０−４２）グロブロマー活性および／または任意の他の標的Ａβ型の活性を培養液において阻害（すなわち低減する）ことができる。
【０１９７】
別の実施形態において、本発明は、前記Ａβ型の活性が有害である疾患もしくは障害またはアルファ１アンチトリプシン欠損症、Ｃ１インヒビター欠損性血管性浮腫、アンチトロンビン欠乏血栓塞栓症、クールー、クロイツフェルトヤコブ病／スクレイピー、ウシ海綿状脳症、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病、致死性家族性不眠症、ハンチントン病、脊髄小脳失調、マシャド−ジョセフ萎縮、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、前頭側頭型認知症、鎌状赤血球貧血、不安定ヘモグロビン封入体溶血、薬物誘導性封入体溶血、パーキンソン病、全身性ＡＬアミロイドーシス、結節性ＡＬアミロイドーシス、全身性ＡＡアミロイドーシス、前立腺アミロイドーシス、血液透析アミロイドーシス、遺伝性（アイスランド）脳性血管障害、ハンチントン病、家族性内臓アミロイドーシス、家族性内臓多発神経障害、家族性内臓アミロイドーシス、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドニューロパチー、家族性心アミロイドーシス、アルツハイマー病、ダウン症候群、甲状腺髄様癌、および２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）からなる群から選択される疾患もしくは障害を患う対象において有利に、対象において標的Ａβ型の活性を阻害する（すなわち低減する）方法を提供する。
【０１９８】
本発明は、このような疾患または障害を患う対象において、標的Ａβ型の活性を阻害する（すなわち低減する）方法を提供し、この方法は、本発明の抗体を、対象において前記Ａβ型の活性が阻害される（すなわち減少する）ように、対象に投与するステップを含む。本発明の一態様において、前記標的Ａβ型はヒトＡβ型であり、対象はヒト対象である。代替的には、対象は、ＡＰＰまたは任意のＡβ型を発現し、本発明の抗体が結合できる標的Ａβ型の発生をもたらす非ヒト哺乳動物であってもよい。さらに、対象は、（例えば、標的Ａβ型の投与によって、またはＡＰＰもしくは標的Ａβ型の発生をもたらす任意の他のＡβ型の発現によって）標的Ａβ型が導入されている非ヒト哺乳動物であってよい。本発明の抗体は、ヒト対象に治療目的のために投与できる。さらに、本発明の抗体は、ＡＰＰもしくは任意のＡβ型の発現が、抗体が結合できる標的Ａβ型の発生をもたらす非ヒト哺乳動物に、獣医学的目的のため、またはヒト疾患の動物モデルとして投与できる。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体の治療有効性を評価するために有用であり得る（例えば、投薬量および投与の時間経過の試験）。
【０１９９】
別の実施形態は、アルツハイマー病またはダウン症候群などのアミロイドーシスを患う対象において、標的Ａβ型の活性を阻害する（すなわち低減する）ための方法である。
【０２００】
標的Ａβ型の活性が有害である障害は、障害を患う対象において標的Ａβ型の存在が、障害の病態生理学または障害の悪化に寄与する因子のいずれかの原因であることが示されている、または疑いがある疾患および他の障害を含む。したがって、標的Ａβ型の活性が有害である障害は、前記Ａβ型の活性の阻害（すなわち減少）が、障害の症状および／または進行の一部またはすべてを緩和することが期待される障害である。このような障害は、例えば、障害を患う対象の生体液における標的Ａβ型の濃度の増加（例えば、対象の血清、脳組織、血漿、脳脊髄液などにおける標的Ａβ型の濃度の増加）によって証明でき、このことは、例えば、抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体および／または上記のような任意の他の標的Ａβ型に対する抗体または本発明の抗体が反応性であるグロブロマーエピトープを含む任意のＡβ型に対する任意の抗体を使用して検出できる。本発明の抗体を用いて治療できる障害の限定されない例は、本明細書に開示された障害および本発明の抗体の医薬組成物に関連する下記の項に述べられる障害を含む。
【０２０１】
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の疾患の病態の進行（例えば悪化）を予防するための方法に関する。本方法は、それらの治療を必要とする対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に、治療有効量の、本明細書に記載の任意の結合タンパク質または抗体を投与するステップを含む。代替的には、本方法は、治療有効量の本明細書に記載の任意のタンパク質を、治療有効量の少なくとも１種の治療薬と組み合わせて、対象に投与するステップを含む。
【０２０２】
本明細書に記載の障害の発症または進行を予防するための上記の方法において、当業者に公知の１種または複数種のバイオマーカー、診断検査またはバイオマーカーおよび診断検査の組み合わせは、（１）対象が、本明細書に記載の１種または複数種の障害の発症の危険性があるかどうか、または（２）１種または複数種の前述の障害があると以前に診断された対象において、本明細書に記載の障害が進行（すなわち悪化）しているかどうかを決定するために使用できる。
【０２０３】
当技術分野において公知の１種または複数種のバイオマーカー、診断検査またはバイオマーカーおよび診断検査の組み合わせは、本明細書に記載の障害の発症の危険性がある対象を特定するために使用できる。同様に、当技術分野において公知の１種または複数種のバイオマーカー、診断検査またはバイオマーカーおよび診断検査の組み合わせは、本明細書に記載の障害を患うことが特定されている対象の疾患または病態の進行を決定するために使用できる。例えば、１種または複数種の生物学的マーカー、神経画像マーカーまたは生物学的マーカーもしくは神経画像マーカー（例えばＭＲＩなど）の組み合わせは、アルツハイマー病の発症の危険性がある対象、アルツハイマー病を患っていることが特定されたそれら対象に関しては疾患の進行を特定するために使用できる。検査できる生物学的マーカーは、限定するものではないがベータアミロイド１−４２、タウ、リン酸化タウ（ｐタウ）、血漿Ａβ抗体、α−抗キモトリプシン、アミロイド前駆体タンパク質、血小板中のＡＰＰアイソフォーム比率、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥとしても公知）、ＣＤ５９、８−ヒドロキシ−デオキシグアニン（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｉｎｅ）、グルタミンシンセターゼ、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ＧＦＡＰに対する抗体、インターロイキン−６−受容体複合体、カリクレイン、メラノトランスフェリン、ニューロフィラメントタンパク質、ニトロチロシン、オキシステロール、スルファチド、シナプスマーカー、Ｓ１００β、ＮＰＳ、血漿シグナル伝達タンパク質などまたはそれらの任意の組み合わせを含む（Ｓｈａｗ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ２００７年、６、２９５−３０３頁。Ｂｏｒｒｏｎｉ，Ｂ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００７年、１４、１１７１−１１７８頁。Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００６年、５  ４６３−４６９頁。Ｂｏｕｗｍａｎ，Ｆ．Ｈ．ら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２００７年、６９、１００６−１０１１頁；Ｒａｙ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００７年、１３（１１）、１３５９−１３６２頁。Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｊ．ら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２００７年、６９、１６２２−１６３４頁。を参照されたい。）。
【０２０４】
Ｅ．医薬組成物
本発明は、本発明の抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。本発明の抗体を含む医薬組成物は、限定するものではないが、障害の診断、検出またはモニタリング、障害またはそれらの１種もしくは複数種の症状の予防、治療、管理または改善および／または調査に使用される。特定の実施形態において、組成物は本発明の１種または複数種の抗体を含む。別の実施形態において、本医薬組成物は、１種または複数種の本発明の抗体および標的Ａβ型の活性が有害である障害を治療するための本発明の抗体以外の１種または複数種の予防薬または治療薬を含む。さらなる実施形態において、予防薬または治療薬は、障害またはそれらの１種もしくは複数種の症状の予防、治療、管理または改善に有用であることが公知である、または使用されたことがある、または現在使用されている。これらの実施形態に従って、本組成物は、担体、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。
【０２０５】
本発明の抗体は、対象への投与に適切な医薬組成物内に組み込むことができる。通常、本医薬組成物は、本発明の抗体および薬学的に許容される担体を含む。本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性の、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される担体の例は、１種または複数種の水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組み合わせを含む。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコールまたは塩化ナトリウムを含むことが好ましい。薬学的に許容される担体は、少量の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、保存料またはバッファーをさらに含むことができ、これらは、抗体の貯蔵期間または有効性を強化する。
【０２０６】
さらなる実施形態において、本医薬組成物は、本明細書に開示された障害の治療のための、少なくとも１種の追加の治療薬を含む。
【０２０７】
さまざまな送達系は公知であり、本発明の１種または複数種の抗体または本発明の１種または複数種の抗体と、障害またはそれらの１種もしくは複数種の症状を予防、管理、治療または改善するために有用な予防薬または治療薬との組み合わせを投与するために使用でき、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル中へのカプセル化、抗体または抗体断片を発現できる組換え細胞、受容体介在性エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２頁（１９８７年）を参照されたい）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築体などが公知である。本発明の予防薬または治療薬を投与する方法は、限定するものではないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与および粘膜投与（例えば、鼻腔内および経口経路）を含む。加えて、経肺投与が、例えば、吸入器または噴霧器およびエアゾール剤を含む製剤の使用によって用いることができる。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号、第５，９８５，３２０号、第５，９８５，３０９号、第５，９３４，２７２号、第５，８７４，０６４号、第５，８５５，９１３号、第５，２９０，５４０号および第４，８８０，０７８号；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６およびＷＯ９９／６６９０３を参照されたく、これらそれぞれは、参照によりそれら全体を本明細書に組み込む。一実施形態において、本発明の抗体、併用療法または本発明の組成物は、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ（登録商標）経肺薬剤送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）を使用して投与される。特定の実施形態において、本発明の予防薬または治療薬は、筋肉内、静脈内、腫瘍内、経口、鼻腔内、経肺または皮下に投与される。予防薬または治療薬は、任意の簡便な経路によって、例えば、点滴またはボーラス注射によって、上皮内膜または皮膚粘膜内膜を介する吸収によって（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）投与され、他の生物学的活性薬剤と一緒に投与されてもよい。投与は、全身であっても、または局所であってもよい。
【０２０８】
特定の実施形態において、本発明の抗体は治療を必要とされる範囲に局所的に投与されることが望ましく、これは、限定するものではないが、例えば、局所注入、注射による局所注入またはインプラントを用いた局所注入によって達成でき、前記インプラントは、シラスティック膜、ポリマー、線維性マトリクス（例えばＴｉｓｓｕｅｌ（登録商標））またはコラーゲンマトリクスなどの膜およびマトリクスを含む、多孔質材料または非多孔質材料である。一実施形態において、１種または複数種の本発明の抗体の有効量は対象の患部範囲に局所投与され、障害またはそれらの症状を予防、治療、管理および／または改善する。別の実施形態において、１種または複数種の本発明の抗体の有効量は、本発明の抗体以外の有効量の１種または複数種の療法（例えば、１種または複数種の予防薬または治療薬）を組み合わせて対象の患部範囲に局所投与され、障害またはそれらの１種もしくは複数種の症状を予防、治療、管理および／または改善する。
【０２０９】
別の実施形態において、抗体は、制御放出系または持続放出系において送達され得る。一実施形態において、ポンプを使用して制御放出または持続放出を達成できる（Ｌａｎｇｅｒ、上記；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７年、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０年、Ｓｕｒｇｅｒｙ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９年、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１巻：５７４頁を参照されたい。）。別の実施形態において、ポリマー材料を使用して、本発明の療法の制御放出または持続放出を達成できる（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｌａｎｇｅｒ  および  Ｗｉｓｅ（編）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９７４年）；  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４年）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ、１９８３年、Ｊ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照されたい；さらにＬｅｖｙら、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１９０頁；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９年、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７  １：１０５）；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／１５１５４；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／２０２５３を参照されたい。持続放出製剤に使用されるポリマーの例は、限定するものではないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）およびポリオルトエステルを含む。特別な実施形態において、持続放出製剤に使用されるポリマーは、不活性で、溶脱可能な不純物を含んでおらず、保存、滅菌および生分解性において安定である。さらに別の実施形態において、制御放出系または持続放出系は予防標的または治療標的に近接して配置でき、したがって、全身用量の一部だけを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、上記２巻、１１５−１３８頁（１９８４年）を参照されたい。）。
【０２１０】
制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３頁）による総説において考察されている。当業者に公知の任意の技術を使用して、１種または複数種の本発明の抗体を含む持続放出製剤を作製できる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０５５４８、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２０６９８、Ｎｉｎｇら、１９９６年、「Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｇｅｌ」Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ３９：１７９−１８９頁、Ｓｏｎｇら、１９９５年、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ−  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ」ＰＤＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５０：３７２−３９７頁、Ｃｌｅｅｋら、１９９７年、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ａ  ｂＦＧＦ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３−８５４頁およびＬａｍら、１９９７年、「Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｌｏｃａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：７５９−７６０頁を参照されたく、これらはそれぞれ、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０２１１】
本発明の組成物が、抗体をコードする核酸である特定の実施形態において、核酸はｉｎ  ｖｉｖｏで投与され、例えば、レトロウイルスベクターの使用により適切な核酸発現ベクターの一部として核酸を構築し、核酸が細胞内になるように投与することによって（米国特許第４，９８０，２８６号を参照されたい。）、または直接注射によって、または微粒子銃（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤を用いたコーティングの使用により、または核に進入することが公知のホメオボックス様ペプチドと連結させてそれを投与することによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１８６４−１８６８頁を参照されたい。）、そのコードされた抗体の発現を促進できる。代替的には、核酸を細胞内に導入し、相同的組換えによる発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【０２１２】
本発明の医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例は、限定するものではないが、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口、鼻腔内（例えば吸入）、経皮的な（例えば局所）、経粘膜的および直腸への投与を含む。特定の実施形態において、組成物は、人間への静脈内、皮下の、筋肉内、経口、鼻腔内または局所投与に適した医薬組成物として日常の手順に従って製剤化される。通常、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性バッファー中の溶液である。必要に応じて、本組成物は、可溶化剤および注射部位の痛みを軽減するための、リグノカイン（ｌｉｇｎｏｃａｍｎｅ）などの局所麻酔薬をさらに含むことができる。
【０２１３】
本発明の組成物が局所投与される場合、組成物は、軟膏、クリーム、経皮的なパッチ、ローション、ジェル、シャンプー、スプレー、エアゾール、溶液、エマルジョンの形態または当業者に周知の他の形態に製剤化され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９９５年）を参照されたい。非スプレー可能局所剤形に関して、局所適用に適合した担体または１種または複数種の賦形剤を含み、水より高い動的粘度を有する粘性の半固形または固形が通常用いられる。適切な製剤は、限定するものではないが、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、粉末、塗布薬、膏薬などを含み、所望であれば、これらは滅菌され、例えば浸透圧などのさまざまな特性への影響のため、助剤（例えば、保存料、安定剤、湿潤剤、バッファーまたは塩）と混合される。他の適切な局所剤形は、有効成分が、例えば、固体または液体の不活性な担体と組み合わせて、加圧された揮発性物質（例えばフレオンなどの高圧ガス）との混合物中に、またはスクイーズボトル中に包装された、スプレー可能なエアゾール製剤を含む。モイスチャライザーまたは保湿剤もまた、所望であれば、医薬組成物および剤形に加えることができる。このような追加の原料の例は、当技術分野において周知である。
【０２１４】
本発明の方法が、組成物の鼻腔内投与を含む場合、組成物は、エアゾール型、スプレー、ミストまたは液滴の形態に製剤化され得る。具体的には、本発明に従った使用のための予防薬または治療薬は、加圧包装または噴霧器から適切な高圧ガス（例えば、ジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス）を使用して提示される、エアゾールスプレーの形態で都合よく送達され得る。加圧されたエアゾールの場合、投薬単位は、測られた量を送達するためのバルブを提供することによって決定できる。吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）または吸入器（ｉｎｕｆｆｌａｔｏｒ）に使用するためのカプセルおよびカートリッジ（例えばゼラチンで構成された）は、本発明の化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含有するように製剤化できる。
【０２１５】
本発明の方法が、経口投与を含む場合、組成物は、錠剤、カプセル、カシェ剤、ジェルキャップ、溶液、懸濁液などの形態で経口的に製剤化できる。錠剤またはカプセルは、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用いて従来の手段により調製できる。錠剤は、当技術分野において周知の方法によってコーティングできる。経口投与用液体製剤は、限定するものではないが、溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとることができ、またはそれらは使用前に水もしくは他の適切なビヒクルにより構成される乾燥製品として提示されてもよい。このような液体製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油状エステル、エチルアルコールまたは分画植物油（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｏｉｌｓ））；および保存料（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）などの薬学的に許容される添加剤を用いて従来の手段によって調製できる。この製剤は、バッファー塩、香味料、着色料および甘味料を必要に応じてさらに含有することができる。経口投与用製剤は、予防薬または治療薬（複数可）の除放性、制御放出または持続放出のために適切に製剤化できる。
【０２１６】
本発明の方法は、例えば、吸入器または噴霧器の使用によるエアゾール化剤を用いて製剤化された組成物の経肺投与を含み得る。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号、第５，９８５，３２０号、第５，９８５，３０９号、第５，９３４，２７２号、第５，８７４，０６４号、第５，８５５，９１３号、第５，２９０，５４０号および第４，８８０，０７８号；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６およびＷＯ９９／６６９０３を参照されたく、これらはそれぞれ、その全体を参照により本明細書に組み込む。特定の実施形態において、本発明の抗体、併用療法および／または本発明の組成物は、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ（登録商標）経肺薬剤送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）を使用して投与される。
【０２１７】
本発明の方法は、注射（例えば、ボーラス注射または持続注射）による非経口投与用に製剤化された組成物の投与を含むことができる。注射用製剤は、単位剤形（例えば、アンプル中または複数回投与容器中）に保存料を添加して提示することができる。本組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態をとることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含有することができる。代替的には、有効成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、滅菌発熱因子非含有水）を用いて構成するための粉末形態であってもよい。本発明の方法は、デポー製剤として製剤化された組成物の投与をさらに含むことができる。このような長期作用製剤は、体内埋め込みによって（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、本組成物は、適切なポリマー材料または疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョン）もしくはイオン交換樹脂を用いて製剤化でき、または難溶性誘導体として（例えば難溶性塩として）製剤化できる。
【０２１８】
本発明の方法は、中性形態または塩形態として製剤化された組成物の投与を包含する。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩などの陰イオンを用いて形成された塩およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩などの陽イオンを用いて形成された塩を含む。
【０２１９】
概して、組成物の原料は、別々に供給されるまたは単位剤形中に混合して供給されるかのいずれかであり、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたは小袋（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの密閉された容器中の凍結乾燥された粉末または無水濃縮物として供給される。投与様式が点滴である場合、組成物は、滅菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する点滴ボトルに分注することができる。投与様式が注射による場合、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルは、投与前に原料を混合できるように提供することができる。
【０２２０】
具体的には、本発明はまた、本発明の１種または複数種の抗体または医薬組成物を、抗体の量を示すアンプルまたは小袋などの密閉容器中に包装して提供する。一実施形態において、本発明の１種または複数種の抗体または医薬組成物は、密閉容器中の滅菌された凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給され、（例えば、水または生理食塩水を用いて）対象に投与するために適切な濃度に再構成され得る。一実施形態において、本発明の１種または複数種の抗体または医薬組成物は、少なくとも５ｍｇ、例えば、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇまたは少なくとも１００ｍｇの単位投薬量で、密閉容器中の滅菌された凍結乾燥粉末として供給される。凍結乾燥された、本発明の抗体または医薬組成物は、２℃と８℃との間でその元の容器において保存されなければならず、本発明の抗体または医薬組成物は、再構成された後、１週間以内、例えば、５日以内、７２時間以内、４８時間以内、２４時間以内、１２時間以内、６時間以内、５時間以内、３時間以内または１時間以内に投与されなければならない。代替的実施形態において、１種または複数種の本発明の抗体または医薬組成物は、抗体の量および濃度を示す密閉容器中に液体形態で供給される。さらなる実施形態において、液体形態の投与される組成物は、少なくとも０．２５ｍｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも１００ｍｇ／ｍｌで、密閉容器中で供給される。液体形態は、２℃と８℃との間でその元の容器において保存されなければならない。
【０２２１】
本発明の抗体は、非経口投与に適切な医薬組成物内に組み込むことができる。一態様において、抗体は、０．１−２５０ｍｇ／ｍｌの抗体を含有する注射溶液として調製されるものとする。注射溶液は、フリントバイアルもしくはアンバーバイアル、アンプルまたは薬剤充填済み注射器中の、液体剤形または凍結乾燥剤形のいずれかで構成され得る。バッファーは、Ｌ−ヒスチジン（１−５０ｍＭ）であってよく、最適には５−１０ｍＭ、ｐＨ５．０から７．０（最適にはｐＨ６．０）であってよい。他の適切なバッファーは、限定するものではないが、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムを含む。塩化ナトリウムは、０−３００ｍＭ（液体剤形のためには最適には１５０ｍＭ）の濃度において溶液の毒性を修正するために使用できる。抗凍結剤は、凍結乾燥剤形に主に０−１０％のスクロース（最適には０．５−１．０％）が含まれてよい。他の適切な抗凍結剤は、トレハロースおよびラクトースを含む。増量剤は、凍結乾燥剤形に、主に１−１０％のマンニトール（最適には２−４％）が含まれてよい。安定剤は、液体剤形および凍結乾燥剤形の両方に、主に１−５０ｍＭのＬ−メチオニン（最適には５−１０ｍＭ）を使用できる。他の適切な増量剤はグリシン、アルギニンを含み、０−０．０５％のポリソルベート−８０（最適には０．００５−０．０１％）として含まれてよい。追加の界面活性剤は、限定するものではないが、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤を含む。非経口投与のための注射溶液として調製された、本発明の抗体を含む医薬組成物は、抗体の吸収または分散を増加するために使用される薬剤などのアジュバントとして有用な薬剤をさらに含むことができる。特に有用なアジュバントは、Ｈｙｌｅｎｅｘ（登録商標）（組換えヒトヒアルロニダーゼ）などのヒアルロニダーゼである。注射溶液へのヒアルロニダーゼの添加は、非経口投与、特に皮下投与後のヒト生物学的利用能を改良する。ヒアルロニダーゼはまた、注射部位体積が大きくても（すなわち、１ｍｌを超える）痛みおよび不快感を少なくし、注射部位の反応の発生を最小にすることができる（国際出願公開番号ＷＯ０４／０７８１４０および米国特許出願公開第ＵＳ２００６１０４９６８号を参照されたく、参照により本明細書に組み込む。）。
【０２２２】
本発明の組成物は、さまざまな形態であってよい。これらは、例えば、溶液（例えば、注射溶液および点滴溶液）、分散液または懸濁液などの液体剤形、錠剤、丸薬、粉末、リポソームおよび座薬などの、半固形および固形剤形を含む。好ましい形態は、意図する投与様式および治療用途に依存する。組成物は、他の抗体を用いたヒトの受動免疫化に使用される組成物と同様の組成物などの、注射溶液または点滴溶液の形態であってよい。一実施形態において、抗体は、静脈内への点滴または注射により投与される。別の実施形態において、抗体は、筋肉内注射または皮下注射により投与される。
【０２２３】
治療用組成物は、通常滅菌され、製造および保存の条件下で安定でなければならない。この組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソームまたは高濃度薬剤に適切な他の秩序構造として製剤化できる。滅菌注射溶液は、活性化合物（すなわち、結合タンパク質、例えば本発明の抗体）を、適切な溶媒中の必要量で上に列挙した原料の１種または組み合わせに組み込み、必要に応じ、次いでフィルター滅菌することによって調製できる。一般的に、分散液は、活性化合物を基本分散媒および上に列挙した原料から必要な他の原料を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製できる。滅菌注射溶液の調製のための滅菌凍結乾燥粉末の場合、調製方法は、あらかじめフィルター滅菌されたそれらの溶液から、有効成分＋任意の所望の追加原料の粉末を生じる、真空乾燥およびスプレー乾燥を含む。溶液の固有の流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持できる。注射組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアレート塩およびゼラチンを組成物に含むことによってもたらすことができる。
【０２２４】
本発明の抗体は、当技術分野において公知のさまざまな方法によって投与できる。多くの治療用途に関して、投与の経路／様式は、皮下注射、静脈内注射または点滴であってよい。技術者に理解されるように、投与の経路／様式は、所望の結果によって変化する。特定の実施形態において、活性化合物は、体内埋め込み、経皮的パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などの急速放出から化合物を保護する担体と一緒に調製できる。生分解性の、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が使用できる。このような製剤の調製方法の多くは、特許権を有するまたは通常、当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８年を参照されたい。
【０２２５】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、例えば、不活性な希釈剤または同化できる食用の担体を用いて経口投与できる。抗体（および所望であれば他の原料）はまた、ハードシェルゼラチンカプセルまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入でき、錠剤に圧縮でき、または対象の食事に直接組み込むことができる。経口治療的投与に関して、抗体は、賦形剤に組み込まれ、摂取可能な錠剤、口腔錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハーなどの形態で使用できる。非経口投与以外によって本発明の抗体を投与するために、その不活性化を防ぐための材料を用いて抗体をコーティングする、またはその不活性化を防ぐための材料とともに抗体を同時投与する必要があると思われる。
【０２２６】
補足活性化合物もまた、組成物に組み込むことができる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、本明細書に記載の障害または疾患の治療に有用な１種または複数種の追加の治療薬と同時製剤化および／または同時投与される。例えば、本発明の抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体は、他の標的と結合する１種または複数種の追加の抗体（例えば、他の可溶性抗原と結合する抗体または細胞表面分子と結合する抗体）と同時製剤化および／または同時投与される。さらに、本発明の１種または複数種の抗体は、２種以上の前述の治療薬と組み合わせて使用できる。このような併用療法は、投与する治療薬のより少ない投薬量を有利に利用でき、したがって、さまざまな単独療法に伴う毒性および合併症の可能性を避けることができる。
【０２２７】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、当技術分野において公知の半減期延長ビヒクルと結びついている。このようなビヒクルは、限定するものではないが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコールおよびデキストランを含む。このようなビヒクルは、例えば、Ｕ．Ｓ．出願第０９／４２８，０８２号および公開されたＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９９／２５０４４に記載されており、これらをいかなる目的に対しても、参照により本明細書に組み込む。
【０２２８】
特定の実施形態において、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を投与し、障害またはこれらの１種または複数種の症状を遺伝子療法を用いて、治療、予防、管理または改良する。遺伝子療法は、発現された核酸または発現可能な核酸を対象に投与することにより実施される療法を指す。本発明のこの実施形態において、核酸は、予防効果または治療効果を仲介する、それらによりコードされる本発明の抗体を産生する。
【０２２９】
当技術分野において利用可能な遺伝子療法のための方法はいずれも、本発明に従って使用できる。遺伝子療法の方法の一般総説に関して、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、１９９３年、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５頁；ＷｕおよびＷｕ、１９９１年、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５頁；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、１９９３年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６頁；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２頁（１９９３年）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９３年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７頁；１９９３年５月、ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５頁を参照されたい。組換えＤＮＡ技術の当技術分野において一般に知られている使用可能な方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３年）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０年）に記載されている。遺伝子療法のさまざまな方法の詳細な記載は、ＵＳ２００５００４２６６４Ａ１に開示されており、これを参照により本明細書に組み込む。
【０２３０】
本発明の抗体は、アルツハイマー病、ダウン症候群、認知症、パーキンソン病などの疾患または脳内におけるアミロイドベータタンパク質の構築に伴う任意の他の疾患もしくは病態を治療するために、単独または組み合わせて使用できる。本発明の抗体は、「コンフォメーション病」の治療のために使用できる。このような疾患は、構成タンパク質内の二次構造から三次構造の変化、続く改変されたタンパク質の凝集により起こる（Ｈａｙｄｅｎら、ＪＯＰ．Ｊ  Ｐａｎｃｒｅａｓ  ２００５年；６（４）：２８７−３０２頁）。具体的には、本発明の抗体は、１種または複数種の下記のコンフォメーション病：アルファ１アンチトリプシン欠損症、Ｃ１インヒビター欠損性血管性浮腫、アンチトロンビン欠乏血栓塞栓症、クールー、クロイツフェルトヤコブ病／スクレイピー、ウシ海綿状脳症、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病、致死性家族性不眠症、ハンチントン病、脊髄小脳失調、マシャド−ジョセフ萎縮、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、前頭側頭型認知症、鎌状赤血球貧血、不安定ヘモグロビン封入体溶血、薬物誘導性封入体溶血、パーキンソン病、全身性ＡＬアミロイドーシス、結節性ＡＬアミロイドーシス、全身性ＡＡアミロイドーシス、前立腺アミロイドーシス、血液透析アミロイドーシス、遺伝性（アイスランド）脳性血管障害、ハンチントン病、家族性内臓アミロイドーシス、家族性内臓多発神経障害、家族性内臓アミロイドーシス、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドニューロパチー、家族性心アミロイドーシス、アルツハイマー病、ダウン症候群、甲状腺髄様癌、および２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）を治療するために使用できる。好ましくは、本発明の抗体は、アミロイドーシス、例えば、アルツハイマー病およびダウン症候群を治療するために利用できる。
【０２３１】
本発明の抗体は、単独または１種または複数種の追加薬剤、例えば治療薬（例えば、小分子または生物学的分子）と組み合わせて使用でき、前記追加薬剤は、その目的に合わせて技術者により選択されることを理解すべきである。例えば、追加の治療薬は、ヒトの脳の認識能力障害を向上させる薬剤である「認知強化薬」（すなわち、思考、学習および記憶）であってよい。認知強化薬は、神経化学物質（例えば、神経伝達物質、酵素およびホルモン）の利用能を改変することによって、酸素供給を向上させることによって、神経成長を刺激することによって、または神経の損傷を阻害することによって作用する。認知強化薬の例は、アセチルコリンの活性を増大する化合物、例えば、限定するものではないが、アセチルコリン受容体アゴニスト（例えば、ニコチン性α−７受容体アゴニストまたはアロステリック調節因子、α４β２ニコチン性受容体アゴニストまたはアロステリック調節因子）、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（例えば、ドネペジル、リバスティグミンおよびガランタミン）、ブチリルコリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニスト（例えば、メマンチン）、活性依存性神経保護タンパク質（ＡＤＮＰ）アゴニスト、セロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体アゴニスト（例えば、キサリプロデン）、５−ＨＴ４受容体アゴニスト、５−ＨＴ６受容体アンタゴニスト、セロトニン１Ａ受容体アンタゴニスト、ヒスタミンＨ３受容体アンタゴニスト、カルパイン阻害剤、血管内皮の成長因子（ＶＥＧＦ）タンパク質またはアゴニスト、栄養成長因子、抗アポトーシス化合物、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体活性化因子、Ｌ型またはＮ型カルシウムチャネル遮断薬または調節因子、カリウムチャネル遮断薬、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）活性化因子、ＨＩＦプロリル４−ヒドロキシラーゼ阻害剤、抗炎症剤、アミロイドＡβペプチドまたはアミロイドプラークの阻害剤、タウ過剰リン酸化の阻害剤、ホスホジエステラーゼ５阻害剤（例えば、タダラフィル、シルデナフィル）、ホスホジエステラーゼ４阻害剤、モノアミンオキシダーゼ阻害剤またはそれらの薬学的に許容される塩を含む。このような認知強化薬の具体例は、限定するものではないが、ドネペジル（Ａｒｉｃｅｐｔ（登録商標））、リバスティグミン（Ｅｘｅｌｏｎ（登録商標））、ガランタミン（Ｒｅｍｉｎｙｌ（登録商標））などのコリンエステラーゼ阻害剤、メマンチン（Ｎａｍｅｎｄａ（登録商標））などのＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸アンタゴニストを含む。本発明の抗体により治療される疾患または病態の治療に有用であることが現在認識されている、または将来認識される薬剤を含む、少なくとも１種の認知強化薬は、本発明の抗体と同時に投与でき、本発明の抗体と（任意の順序で）連続して投与できる。さらに、上記の治療に使用した場合、本明細書に記載の組み合わせは、相加効果または相乗効果を有し得ると考えられる。追加薬剤はまた、治療用組成物に対して有利な属性をもたらす薬剤、例えば、組成物の粘度に影響を及ぼす薬剤であり得る。
【０２３２】
本発明内に含まれる組み合わせは、それらの意図する目的にとって有用な組み合わせであることをさらに理解すべきである。上で説明した薬剤は、目的の例示であり、限定する意図のものではない。本発明の一部であるこの組み合わせは、本発明の抗体と、下記のリストから選択される少なくとも１種の追加薬剤を含むことができる。この組み合わせが、形成された組成物がその意図する機能を果たすことができるような場合、この組み合わせは、複数の追加薬剤、例えば、２種または３種の追加薬剤をさらに含むことができる。
【０２３３】
本発明の医薬組成物は、「治療有効量」または「予防有効量」の本発明の抗体を含むことができる。「治療有効量」は、必要な投薬量および期間で、所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。抗体の治療有効量は、当業者により決定され得、個人の疾患状態、年齢、性別および体重などの因子ならびに個人において所望の応答を引き出す抗体の能力に従って変動し得る。治療有効量は、抗体の任意の毒性効果または有害効果より、治療的に有益な効果が上回る量でもある。「予防有効量」は、必要な投薬量および期間で、所望の予防結果を達成するために有効な量を指す。通常、予防用量は、疾患の前または疾患の早期に対象に使用されるので、予防有効量は、治療有効量より少ないと思われる。
【０２３４】
投薬量レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答または予防応答）を提供するように調整されてよい。例えば、単回ボーラスを投与しても、数回に分割した用量を、時間をかけて投与しても、または治療状況の緊急性により、用量を表示のように比例的に減少させても、または増加させてもよい。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形に製剤化することは特に有利である。本明細書において使用する場合、単位剤形は、治療される哺乳動物対象にとって単一の投薬量として適した、物理的に個別の単位を指し、各単位は必要とされる医薬担体に伴う所望の治療効果を生み出すために計算された、所定量の活性化合物を含有する。本発明単位剤形に関する仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴および達成されるべき特定の治療効果または予防効果、ならびに（ｂ）個人の感受性の治療のための、活性化合物などの調合の当技術分野において固有の限界により必然的に決定され、直接依存する。
【０２３５】
本発明の抗体の治療有効量または予防有効量の例示的、非限定範囲は、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ、例えば１−１０ｍｇ／ｋｇである。投薬量の値は、緩和される病態の型および重症度により変動し得ることに留意すべきである。任意の特定の対象に関して、具体的な投薬量レジメンは、個人の必要性および組成物を投与する人物または組成物の投与を監視する人物の専門的判断に従って、時間とともに調整されるべきであり、本明細書において説明した投薬量範囲は単なる例示であり、特許請求する組成物の範囲または実践を制限する意図のものではないことをさらに理解すべきである。
【０２３６】
本明細書に記載の本発明の方法の他の適切な改良および適合は、明らかであり、本明細書において開示した本発明の範囲または実施形態から逸脱することなく、適切な等価物を使用して行うことができることは当業者には容易に理解されるであろう。これまで本発明を詳細に記載したが、本発明は、下記の実施例を参照することによってより明快に理解されると思われるが、下記の実施例は単なる例示目的のために含まれており、本発明を限定する意図のものではない。
【実施例】
【０２３７】
実施例１：グロブロマーの調製
ａ）Ａβ（１−４２）グロブロマー：
Ａβ（１−４２）合成ペプチド（Ｈ−１３６８、Ｂａｃｈｅｍ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、１００％の１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）に６ｍｇ／ｍｌで懸濁し、振とう下で３７℃において１．５時間、完全可溶化のためにインキュベートした。ＨＦＩＰは水素結合崩壊剤として作用し、Ａβペプチド中の既存の構造不均一性を除外するために使用する。ＨＦＩＰを、ＳｐｅｅｄＶａｃにおいて蒸発により除去し、Ａβ（１−４２）を、５ｍＭの濃度でジメチルスルホキシド中に再懸濁し、２０秒間超音波処理した。ＨＦＩＰにより予備処理したＡβ（１−４２）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中４００μＭに希釈し、１／１０体積の２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（Ｈ２Ｏ中）を加えた（最終濃度は０．２％ＳＤＳ）。３７℃において６時間のインキュベーションにより、１６／２０−ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマー（球形のオリゴマーの短縮形）中間体がもたらされた。３８／４８−ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマーは、３体積のＨ２Ｏを用いたさらなる希釈および３７℃において１８時間のインキュベーションにより作製された。３０００ｇ、２０分の遠心分離後、試料を、限外ろ過（カットオフ３０−ｋＤａ）により濃縮し、５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対して透析し、１０，０００ｇ、１０分で遠心分離機にかけ、３８／４８−ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマーを含む上清を回収した。透析の代替として、３８／４８−ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマーは、９倍過剰（ｖ／ｖ）の氷冷メタノール／酢酸溶液（３３％のメタノール、４％の酢酸）、１時間、４℃により、沈殿させることもできる。その後、３８／４８−ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマーをペレット化し（１０分で１６２００ｇ）、５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に再懸濁し、ｐＨ７．４に調製した。
【０２３８】
ｂ）Ａβ（２０−４２）グロブロマー：
実施例１ａに従って調製した１．５９ｍｌのＡβ（１−４２）グロブロマー製剤を、３８ｍｌのバッファー（５０ｍＭのＭＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．４）および２００μｌの水中１ｍｇ／ｍｌのサーモリシン溶液（Ｒｏｃｈｅ）と混合した。反応混合物を、ＲＴにおいて２０時間撹拌した。その後、８０μｌの水中１００ｍＭのＥＤＴＡ溶液、ｐＨ７．４を加え、混合物を、４００μｌの１％濃度ＳＤＳ溶液を用いてＳＤＳ含有量０．０１％にさらに調整した。反応混合物を、１５ｍｌの３０ｋＤａのＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐチューブを介しておよそ１ｍｌに濃縮した。濃縮物を、９ｍｌのバッファー（５０ｍＭのＭＥＳ／ＮａＯＨ、０．０２％のＳＤＳ、ｐＨ７．４）と混合し、再度１ｍｌに濃縮した。濃縮物を、６℃において１ｌのバッファー（５ｍＭのリン酸ナトリウム、３５ｍＭのＮａＣｌ）に対して透析チューブにおいて１６時間透析した。透析物を、水中２％濃度のＳＤＳ溶液を用いてＳＤＳ含有量０．１％に調製した。試料を、１０，０００ｇにおいて１０分間遠心分離機にかけ、Ａβ（２０−４２）グロブロマー上清を回収した。
【０２３９】
ｃ）Ａβ（１２−４２）グロブロマー：
実施例１ａに従って調製した２ｍｌのＡβ（１−４２）グロブロマー製剤を、３８ｍｌのバッファー（５ｍＭのリン酸ナトリウム，３５ｍＭの塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）および１５０μｌの水中１ｍｇ／ｍｌのＧｌｕＣエンドプロテイナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）と混合した。反応混合物をＲＴにおいて６時間撹拌し、さらに、１５０μｌの水中１ｍｇ／ｍｌのＧｌｕＣエンドプロテイナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を続けて加えた。反応混合物を、ＲＴにおいてさらに１６時間撹拌し、次いで８μｌの５ＭのＤＩＦＰ溶液を加えた。反応混合物を、１５ｍｌの３０ｋＤａのＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐチューブを介しておよそ１ｍｌに濃縮した。濃縮物を、９ｍｌのバッファー（５ｍＭのリン酸ナトリウム、３５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）と混合し、再度１ｍｌに濃縮した。濃縮物を、６℃において１ｌのバッファー（５ｍＭのリン酸ナトリウム、３５ｍＭのＮａＣｌ）に対して透析チューブにおいて１６時間透析した。透析物を、水中１％濃度のＳＤＳ溶液を用いてＳＤＳ含有量０．１％に調製した。試料を、１０，０００ｇにおいて１０分間遠心分離機にかけ、Ａβ（１２−４２）グロブロマー上清を回収した。
【０２４０】
ｄ）架橋したＡβ（１−４２）グロブロマー：
Ａβ（１−４２）合成ペプチド（Ｈ−１３６８、Ｂａｃｈｅｍ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、１００％の１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）に６ｍｇ／ｍｌで懸濁し、振とう下で３７℃において１．５時間、完全可溶化のためにインキュベートした。ＨＦＩＰは水素結合崩壊剤として作用し、Ａβペプチド中の既存の構造不均一性を除外するために使用した。ＨＦＩＰを、ＳｐｅｅｄＶａｃにおいて蒸発により除去し、Ａβ（１２−４２）グロブロマーＡβ（１−４２）を、５ｍＭの濃度でジメチルスルホキシド中に再懸濁し、２０秒間超音波処理した。ＨＦＩＰにより予備処理したＡβ（１−４２）を、ＰＢＳ（２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中４００μＭに希釈し、１／１０体積の２％ＳＤＳ（水中）を加えた（最終濃度は０．２％ＳＤＳ）。３７℃において６時間のインキュベーションにより、１６／２０−ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマー（グロブロマーオリゴマーの短縮形）中間体がもたらされた。３８／４８−ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマーは、３体積の水を用いたさらなる希釈および３７℃において１８時間インキュベーションにより作製された。ここで、３８／４８−ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマーの架橋を、１ｍＭのグルタルアルデヒドとともに２時間２１℃の室温におけるインキュベーション、次いで室温における３０分間のエタノールアミン（５ｍＭ）処理治療により実施した。
【０２４１】
実施例２：ヒト化抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体の作製、単離および特徴付け
実施例２．１：ヒト抗体フレームワークの選択
ヒト抗体フレームワークの選択は、ヒト抗体の標準構造の類似性およびアミノ酸配列相同性に基づいた。さらに、適切なアクセプターＶＬおよびＶＨのフレームワーク配列の特定が、ヒトＶＨおよびＶκ生殖細胞系列配列のアミノ酸配列相同性に基づく場合、ループ構造およびＶＨ／ＶＬインターフェイスを支持するアミノ酸残基の保有ならびにバーニアゾーン（Ｖｅｒｎｉｅｒ  ｚｏｎｅ）のアミノ酸残基の保有を考慮した。さらに、４Ｄ１０  ＣＤＲを潜在的に適切なアクセプターＶＬおよびＶＨのフレームワーク配列にグラフトすることにより得られるＶＨおよびＶＬ配列の免疫原性を、さまざまなＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に対する重複ペプチドの予測される親和性に基づいて、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで評価した。ＶＨおよびＶＬを、個々のＶＨまたはＶＬファミリーのコンセンサスに適合させ、潜在的免疫原性をさらに最小化した。マウスアミノ酸残基への選択された復帰突然変異を実施し、ループ構造およびＶＨ／ＶＬインターフェイスを支持するアミノ酸を保有した。個々のＶＨまたはＶＬ生殖細胞系列遺伝子を有する天然のヒトＶＨ配列またはＶＬ配列の対応するプールにおけるこれらの復帰突然変異の頻度は、アミノ酸配列アライメントにより決定した。上記の判断によりもたらされたＶＨ配列およびＶＬ配列は、潜在的Ｎ結合型グリコシル化部位（ＮＸＳまたはＮＸＴ、ＸはＰ以外の任意のアミノ酸）と合致した。
【０２４２】
実施例２．２：マウス抗ＡΒ（２０−４２）グロブロマー抗体のヒト化
４Ｄ１０ｈｕｍ＿ＶＨ．１ｚ（配列番号４）：表４に記載のマウス抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体４Ｄ１０由来の重鎖ＣＤＲ配列を、ヒトＶＨ３−５３のアクセプターフレームワークおよびＪＨ６配列にグラフトした。
【０２４３】
４Ｄ１０ｈｕｍ＿ＶＨ．１（配列番号５）：表４に記載のマウス抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体４Ｄ１０由来の重鎖ＣＤＲ配列を、ＶＨ３コンセンサス変化Ｉ１２Ｖを含む、ヒトＶＨ３−５３およびＪＨ６配列のアクセプターフレームワークにグラフトした。
【０２４４】
４Ｄ１０ｈｕｍ＿ＶＨ．１ａ（配列番号６）：表４に記載のマウス抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体４Ｄ１０由来の重鎖ＣＤＲ配列を、ＶＨ３コンセンサス変化Ｉ１２Ｖならびにフレームワーク復帰突然変異Ａ２４Ｖ、Ｖ２９Ｌ、Ｖ４８Ｌ、Ｓ４９Ｇ、Ｆ６７Ｌ、Ｒ７１Ｋ、Ｎ７６ＳおよびＬ７８Ｖを含む、ヒトＶＨ３−５３およびＪＨ６配列のアクセプターフレームワークにグラフトした。
【０２４５】
４Ｄ１０ｈｕｍ＿ＶＨ．１ｂ（配列番号７）：表４に記載のマウス抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体４Ｄ１０由来の重鎖ＣＤＲ配列を、復帰突然変異Ｖ２９ＬおよびＲ７１Ｋを含む、ヒトＶＨ３−５３およびＪＨ６配列のアクセプターフレームワークにグラフトした。
【０２４６】
４Ｄ１０ｈｕｍ＿ＶＨ．２ｚ（配列番号８）：表４に記載のマウス抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体４Ｄ１０由来の重鎖ＣＤＲ配列を、ヒトＶＨ４−５９およびＪＨ６配列のアクセプターフレームワークにグラフトした。
【０２４７】
４Ｄ１０ｈｕｍ＿ＶＨ．２（配列番号９）：表４に記載のマウス抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体４Ｄ１０由来の重鎖ＣＤＲ配列を、Ｎ末端ピログルタミン酸の形成を防ぐためにＱ１Ｅ変化を含む、ヒトＶＨ４−５９およびＪＨ６配列のアクセプターフレームワークにグラフトした。
【０２４８】
４Ｄ１０ｈｕｍ＿ＶＨ．２ａ（配列番号１０）：表４に記載のマウス抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体４Ｄ１０由来の重鎖ＣＤＲ配列を、Ｎ末端ピログルタミン酸の形成を防ぐためのＱ１Ｅ変化ならびにフレームワーク復帰突然変異Ｇ２７Ｆ、Ｉ２９Ｌ、Ｉ３７Ｖ、Ｉ４８Ｌ、Ｖ６７Ｌ、Ｖ７１Ｋ、Ｎ７６ＳおよびＦ７８Ｖを含む、ヒトＶＨ４−５９およびＪＨ６配列のアクセプターフレームワークにグラフトした。
【０２４９】
４Ｄ１０ｈｕｍ＿ＶＨ．２ｂ（配列番号１１）：表４に記載のマウス抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体４Ｄ１０由来の重鎖ＣＤＲ配列を、Ｎ末端ピログルタミン酸の形成を防ぐためにＱ１Ｅ変化ならびにフレームワーク復帰突然変異Ｇ２７Ｆ、Ｉ２９ＬおよびＶ７１Ｋを含む、ヒトＶＨ４−５９およびＪＨ６配列のアクセプターフレームワークにグラフトした。
【０２５０】
４Ｄ１０ｈｕｍ＿Ｖκ．１ｚ（配列番号１２）：表４に記載のマウス抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体４Ｄ１０由来の軽鎖ＣＤＲ配列を、ヒトＶκＡ１７／２−３０およびＪκ２配列のアクセプターフレームワークにグラフトした。
【０２５１】
４Ｄ１０ｈｕｍ＿Ｖκ．１（配列番号１３）：表４に記載のマウス抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体４Ｄ１０由来の軽鎖ＣＤＲ配列を、Ｖκ２コンセンサス変化Ｓ７Ｔ、Ｌ１５Ｐ、Ｑ３７Ｌ、Ｒ３９ＫおよびＲ４５Ｑを含む、ヒトＶκＡ１７／２−３０およびＪκ２配列のアクセプターフレームワークにグラフトした。
【０２５２】
４Ｄ１０ｈｕｍ＿Ｖκ．１ａ（配列番号１４）：表４に記載のマウス抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体４Ｄ１０由来の軽鎖ＣＤＲ配列を、Ｖκ２コンセンサス変化Ｓ７Ｔ、Ｌ１５Ｐ、Ｑ３７Ｌ、Ｒ３９ＫおよびＲ４５ＱならびにＶＬ／ＶＨインターフェイスに影響を及ぼすフレームワーク復帰突然変異Ｆ３６Ｌを含む、ヒトＶκＡ１７／２−３０およびＪκ２配列のアクセプターフレームワークにグラフトした。
【０２５３】
４Ｄ１０ｈｕｍ＿Ｖκ．１ｂ（配列番号１５）：表４に記載のマウス抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体４Ｄ１０由来の軽鎖ＣＤＲ配列を、Ｖκ２コンセンサス変化Ｓ７ＴおよびＱ３７Ｌを含む、ヒトＶκＡ１７／２−３０およびＪκ２配列のアクセプターフレームワークにグラフトした。
【０２５４】
４Ｄ１０ｈｕｍ＿Ｖκ．１ｃ（配列番号１６）：表４に記載のマウス抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体４Ｄ１０由来の軽鎖ＣＤＲ配列を、Ｖκ２コンセンサス変化Ｓ７Ｔ、Ｑ３７ＬおよびＲ３９Ｋを含む、ヒトＶκＡ１７／２−３０およびＪκ２配列のアクセプターフレームワークにグラフトした。
【０２５５】
４Ｄ１０ｈｕｍ＿ＶＨ．２、４Ｄ１０ｈｕｍ＿ＶＨ．２ａまたは４Ｄ１０ｈｕｍ＿ＶＨ．２ｂにおける前記ＶＨおよびＶκ復帰突然変異、コンセンサス変化またはＱ１Ｅ突然変異のいくつかは、その後の親和性成熟の間に除去できる。
【０２５６】
実施例２．３：ヒト化抗体の構築
上記のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで構築されたヒト化抗体は、オリゴヌクレオチドを使用して新たに構築される。各可変領域ｃＤＮＡに関して、６０−８０  ヌクレオチドの６オリゴヌクレオチドは、各オリゴヌクレオチドの５’末端および／または３’末端において互いに２０ヌクレオチドが重複するように設計されている。アニーリング反応において、６オリゴはすべて結合され、ボイルされ、ｄＮＴＰの存在下でアニーリングされる。その後ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＃Ｍ０２１０、Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、ＭＡ．）を加え、重複オリゴヌクレオチド間のおよそ４０ｂｐのギャップを埋める。その後ＰＣＲを実施し、改良されたｐＢＯＳベクター中のマルチクローニング部位に相補的なオーバーハンギング配列を含有する、２種の最外部のプライマーを使用して、全可変領域遺伝子を増幅する（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．およびＮａｇａｔａ，Ｓ．、（１９９０年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８、Ｎｏ．１７））。各ｃＤＮＡアセンブリに由来するＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離し、予測される可変領域のｃＤＮＡサイズに対応するバンドを切り取り、精製した。可変重鎖領域を、ヒトＩｇＧ１定常領域をコードし、２つのヒンジ−領域アミノ酸突然変異を含有するｃＤＮＡ断片に、相同組換えにより細菌中においてインフレームで挿入する。これらの突然変異は、２３４位（ＥＵ番号付け）におけるロイシンからアラニンへの変化および２３５位におけるロイシンからアラニンへの変化である（Ｌｕｎｄら、１９９１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：２６５７）。可変軽鎖領域を、ヒトカッパ定常領域に相同組換えによりインフレームで挿入する。細菌コロニーを単離し、プラスミドＤＮＡを抽出し、ｃＤＮＡインサートをその全体について配列決定する。各抗体に対応する正しいヒト化重鎖および軽鎖を、一時的に完全長ヒト化抗Ａβグロブロマー抗体を産生させるために、ＣＯＳ細胞に共トランスフェクトする。組換えキメラ抗体を含有する細胞上清を、タンパク質Ａセファロースクロマトグラフィーにより精製し、結合した抗体を、酸性バッファーを加えることによって抽出する。抗体を中和し、ＰＢＳに対して透析する。（Ｄｉｅｄｅｒ  Ｍｏｅｃｈａｒｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：６４８３−６４９２頁（１９９９年）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第４版、１９９９年）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ．（ＩＳＢＮ  ０−４７１−３２９３８−Ｘ）；ＬｕおよびＷｅｉｎｅｒ編、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（２００１年）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｐｒｅｓｓ．Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ．２９８頁（ＩＳＢＮ  １−８８１２９９−２１−Ｘ）；ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１年）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．７９０頁（ＩＳＢＮ  ３−５４０−４１３５４−５）；Ｏｌｄ，Ｒ．Ｗ．＆Ｓ．Ｂ．Ｐｒｉｍｒｏｓｅ、Ｐ���ｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（第３版、１９８５年）Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｂｏｓｔｏｎ．Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；２：４０９頁（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０１３１８−４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ．１−３巻．（ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６）；Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．  Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  Ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｏ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８７年）ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ＮＹ（Ｈｏｒｓｔ  Ｉｂｅｌｇａｕｆｔｓ訳）６３４頁（ＩＳＢＮ  ０−８９５７３−６１４−４）；これらすべては参照によりそれら全体を本明細書に組み込む。）。
【０２５７】
多数の実施形態および特徴を上に記載してきたが、記載の実施形態および特徴の改良および変形が、添付の特許請求の範囲において定義された本開示および本発明から逸脱することなく実施可能であることは当業者に理解されると思われる。
【０２５８】
実施例２：４：ＨＥＫ２９３細胞におけるヒト化抗体の発現および精製
配列番号４６で示した抗体重鎖；配列番号４７で示した抗体重鎖をコードするＤＮＡ構築体および配列番号４８で示したポリペプチドをコードする抗体軽鎖構築体を、実施例２．３に記載のように調製した。配列決定によるＤＮＡの確認後、すべての重鎖および軽鎖ＤＮＡ構築体を、Ｅ．コリにおいて拡大し、ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏ  Ｆｒｅｅ  Ｐｌａｓｉｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｐｒｅｐを使用して（カタログ番号１２３６２、ＱＩＡＧＥＮ）製造業者のプロトコルに従って精製した。
【０２５９】
モノクローナル抗体４Ｄ１０ｈｕｍ＃１の発現のために、ＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞に、配列番号４６で示した重鎖および配列番号４８で示した軽鎖をコードするプラスミドを、一時的に共トランスフェクトした。モノクローナル抗体４Ｄ１０ｈｕｍ＃２の発現のために、ＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞に、配列番号４７で示した重鎖および配列番号４８で示した軽鎖をコードするプラスミドを、一時的に共トランスフェクトした。トランスフェクション前に、ＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）において、培養フラスコ（２ＬＣｏｒｎｉｎｇ  カタログ番号４３１１９８）中０．５ｌ規模で振とうしながらＣＯ２インキュベーター（８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ、３７℃）において繁殖させた。細胞培養液が１×１０６細胞／ｍｌの密度に達した時、トランスフェクション複合体を加えることによって、細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトション複合体は、第１に、軽鎖をコードする１５０μｇのプラスミド、重鎖をコードする１００μｇのプラスミドおよび２５ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地を混合し、次いで、５００μｌのＰＥＩ溶液（１ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ７．０）線形２５ｋＤａのポリエチレンイミン、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  カタログ番号２３９６６）を加えることによって調製した。トランスフェクション複合体を、反転により混合し、細胞培養液に加える前に室温で１５分間インキュベートした。トランスフェクション後、培養液をＣＯ２インキュベーター（８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ、３７℃）において成長させ続けた。トランスフェクション２４時間後、培養培地に、５０ｍｌの５％Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｎ１溶液（Ｏｒｇａｎｏ  Ｔｅｃｈｎｉｅ、Ｌａ  Ｃｏｕｒｎｅｕｖｅ  Ｆｒａｎｃｅ  カタログ番号１９５５３）を補足した。トランスフェクション６日後、細胞を、遠心分離（１６，０００ｇ、３０分）によりペレット化し、発現された抗体を含有する上清をフィルター滅菌（０．２μｍＰＥＳフィルター）し、精製ステップの開始まで４℃に配置した。発現された抗体を、タンパク質Ａセファロース親和性クロマトグラフィーにより、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  試薬およびプロトコルを使用して、製造業者の取扱説明書に従って上清から精製した。タンパク質溶出液を、ＰＢＳ（ｐＨ７）に対して透析した。精製された４Ｄ１０ｈｕｍ抗体を、分光光度法で２８０ｎｍにおいて定量化し、質量分析およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析した。
【０２６０】
実施例２：５：ヒト化抗体の親和性分析
精製されたヒト化抗体４Ｄ１０ｈｕｍ＃１および４Ｄ１０ｈｕｍ＃２のＡβ（２０−４２）グロブロマーに対する相互作用を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によりＢＩＡｃｏｒｅ装置を使用して評価した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（１０，０００ＲＵ）を、ＣＭ５センサーチップにおいてアミンカップリング手順により製造業者の取扱説明書（ＢＩＡｃｏｒｅ）に従って直接固定した。個々の４Ｄ１０ｈｕｍ抗体を、５．０μｌの１μｇ／ｍｌの４Ｄ１０ｈｕｍ抗体溶液を流速１０−１５μｌ／分で注入することによって、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃによりコーティングされたチップ表面に捕捉した。センサーチップにおける可溶性Ａβ（２０−４２）グロブロマーと４Ｄ１０ｈｕｍ抗体との相互作用を、グロブロマー溶液（濃度範囲：２０−０．３１２５ｎＭ）を流速５０μｌ／分で注入することによって検査した。会合速度を５．０分モニターし、解離速度を１０分間モニターした。得られたセンサーグラムから、会合速度定数（ｋｏｎ）、解離速度定数（ｋｏｆｆ）および平衡解離定数（ＫＤ）を、製造業者のソフトウェアおよび取扱説明書を使用して決定した。４Ｄ１０ｈｕｍ＃１の３種の異なる製剤および４Ｄ１０ｈｕｍ＃２の２種の異なる製剤に関して決定された動態および平衡定数を、表７に要約した。表７は、キメラおよびヒト化鎖を有する抗体＃３、＃４および＃５の親和性データをさらに示す。抗体＃４および＃５の重鎖は、４Ｄ１０ｈｕｍ＃１または＃２のものであり、軽鎖はｍ４Ｄ１０  ＶＬ（配列番号２４）およびヒトＩｇカッパ定常領域（配列番号２７）のキメラである。抗体＃３の軽鎖は、４Ｄ１０ｈｕｍ＃１および＃２のものであり、重鎖は、ｍ４Ｄ１０  ＶＨ（配列番号２３）およびヒトＩｇガンマ−１定常領域（配列番号２５）のキメラである。
【０２６１】
【表７】
2020103288.tif 000012
2020103288.tif 000013
【０２６２】
実施例２．６：ドットブロットを介した抗体選択性の分析
モノクローナル抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体の選択性を特徴付けるために、それらを、さまざまなＡβ型に対する結合に関して試験した。この目的のために、０．２ｍｇ／ｍｌＢＳＡを補足したＰＢＳ中１００ｐｍｏｌ／μｌから０．００００１ｐｍｏｌ／μｌまでの範囲の個々のＡβ（１−４２）型の段階希釈液を調製した。１μｌの各希釈液を、ニトロセルロース膜上にブロットした。検出を、対応する抗体（０．２μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートし、次いでペルオキシダーゼにコンジュゲートされた抗ヒト−ＩｇＧおよび染色試薬ＢＭ  Ｂｌｕｅ  ＰＯＤ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して免疫染色することによって実施した。
【０２６３】
ドットブロット用Ａβ−標準：
１．Ａβ（１−４２）グロブロマー
Ａβ（１−４２）グロブロマーを、実施例１ａに記載のように調製した（透析によるバッファー交換）。
【０２６４】
２．Ａβ（２０−４２）グロブロマー
Ａβ（２０−４２）グロブロマーを、実施例１ｂに記載のように調製した。
【０２６５】
３．Ａβ（１−４０）モノマー、０．１％のＮａＯＨ
２．５ｍｇのＡβ（１−４０）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｈ−１３６８）を、０．５ｍｌのＨ２Ｏ中０．１％のＮａＯＨ（新たに調製した）に溶解し（＝５ｍｇ／ｍｌ）、速やかに３０秒間室温において振とうし、透明な溶液を得た。試料を、−２０℃において使用まで保存した。
【０２６６】
４．Ａβ（１−４２）モノマー、０．１％のＮａＯＨ
２．５ｍｇのＡβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｈ−１３６８）を、０．５ｍｌのＨ２Ｏ中０．１％のＮａＯＨ（新たに調製した）に溶解し（＝５ｍｇ／ｍｌ）、速やかに３０秒間室温において振とうし、透明な溶液を得た。試料を、−２０℃において使用まで保存した。
【０２６７】
５．Ａβ（１−４２）線維
１ｍｇのＡβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｈ−１３６８）を、５００μｌの水性の０．１％のＮＨ４ＯＨ（エッペンドルフチューブ）に溶解し、１分間室温において撹拌した。１００μｌのこの新たに調製したＡβ（１−４２）溶液を、３００μｌの２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４を用いて中和した。ｐＨを、１％のＨＣｌを用いてｐＨ７．４に調製した。試料を、２４時間３７℃においてインキュベートし、遠心分離機にかけた（１０分、１００００ｇ）。上清を廃棄し、線維性ペレットを、４００μｌの２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４に、ボルテックスにより１分間再懸濁した。
【０２６８】
６．ｓＡＰＰα
Ｓｉｇｍａにより供給される（カタログ番号Ｓ９５６４；２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭのＮａＣｌ中２５μｇ；ｐＨ７．４）。ｓＡＰＰαを、２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを用いて０．１ｍｇ／ｍｌ（＝１ｐｍｏｌ／μｌ）に希釈した。
【０２６９】
７．Ａβ（１２−４２）グロブロマー
Ａβ（１２−４２）グロブロマーを、実施例１ｃに記載のように調製した。
【０２７０】
ドットブロットの材料：
２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４＋０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ中のＡβ−標準の段階希釈液（上記の１から７を参照されたい。）、１００ｐｍｏｌ／μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌ、１ｐｍｏｌ／μｌ、０．１ｐｍｏｌ／μｌ、０．０１ｐｍｏｌ／μｌ、０．００１ｐｍｏｌ／μｌ、０．０００１ｐｍｏｌ／μｌおよび０．００００１ｐｍｏｌ／μｌの濃度を得た。
【０２７１】
ニトロセルロース：Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｄｉｕｍ、Ｐｕｒｅ  Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（０．２μｍ）；ＢＩＯ−ＲＡＤ
抗ヒト−ＰＯＤ：カタログ番号１０９−０３５−００３（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
検出試薬：ＢＭ  Ｂｌｕｅ  ＰＯＤ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、沈殿性、カタログ番号：１１４４２０６６００１（Ｒｏｃｈｅ）
ウシ血清アルブミン、（ＢＳＡ）：カタログ番号：１１９２６（Ｓｅｒｖａ）
ブロッキング試薬：ＴＢＳ中５％低脂肪乳
バッファー溶液：
ＴＢＳ：２５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌバッファー  ｐＨ７．５＋１５０ｍＭのＮａＣｌ
ＴＴＢＳ：２５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ−バッファーｐＨ７．５＋１５０ｍＭのＮａＣｌ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０
ＰＢＳ＋０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ：２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４バッファー  ｐＨ７．４＋１４０ｍＭのＮａＣｌ＋０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ
抗体溶液Ｉ：２０ｍｌのＴＢＳ中１％低脂肪乳中０．２μｇ／ｍｌ抗体
【０２７２】
抗体：ヒト化モノクローナル抗Ａβ抗体４Ｄ１０ｈｕｍ＃１；４．７ｍｇ／ｍｌ  ＯＤ２８０ｎｍ；−８０℃において保存
【０２７３】
抗体溶液ＩＩ：ＴＢＳ中１％低脂肪乳中１：５０００希釈の抗ヒト−ＰＯＤ
【０２７４】
ドットブロットの手順：
１）（段階希釈により得た）さまざまなＡβ−標準の８種の濃度のそれぞれ１μｌを、互いにおよそ１ｃｍの距離でニトロセルロース膜にドットを打った。
２）Ａβ−標準のドットを、ニトロセルロース膜上で、少なくとも１０分間、室温（ＲＴ）において風乾させた（＝ドットブロット）。
３）ブロッキング：
ドットブロットを、３０ｍｌのＴＢＳ中５％低脂肪乳とともに１．５時間、ＲＴにおいてインキュベートした。
４）洗浄：
ブロッキング溶液を廃棄し、ドットブロットを、振とう下で２０ｍｌのＴＴＢＳとともに１０分間、ＲＴにおいてインキュベートした。
５）抗体溶液Ｉ：
洗浄バッファーを廃棄し、ドットブロットを、抗体溶液Ｉとともに２時間、ＲＴにおいてインキュベートした。
６）洗浄：
抗体溶液Ｉを廃棄し、ドットブロットを、振とう下で２０ｍｌのＴＴＢＳとともに１０分間、ＲＴにおいてインキュベートした。洗浄溶液を廃棄し、ドットブロットを、振とう下で２０ｍｌのＴＴＢＳとともに１０分間、ＲＴにおいてインキュベートした。洗浄溶液を廃棄し、ドットブロットを、振とう下で２０ｍｌのＴＢＳとともに１０分間、ＲＴにおいてインキュベートした。
７）抗体溶液ＩＩ：
洗浄バッファーを廃棄し、ドットブロットを、抗体溶液ＩＩとともに１時間、ＲＴにおいてインキュベートした
８）洗浄：
抗体溶液ＩＩを廃棄し、ドットブロットを、振とう下で２０ｍｌのＴＴＢＳとともに１０分間、ＲＴにおいてインキュベートした。洗浄溶液を廃棄し、ドットブロットを、振とう下で２０ｍｌのＴＴＢＳとともに１０分間、ＲＴにおいてインキュベートした。洗浄溶液を廃棄し、ドットブロットを、振とう下で２０ｍｌのＴＢＳとともに１０分間、ＲＴにおいてインキュベートした。
９）発色：
洗浄溶液を廃棄した。ドットブロットを、７．５ｍｌのＢＭ  Ｂｌｕｅ  ＰＯＤ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを用いて１０分間発色させた。発色を、ドットブロットをＨ２Ｏ用いて激しく洗浄することによって停止させた。定量的評価を、ドット強度のデンシトメトリー分析（ＧＳ８００密度計（ＢｉｏＲａｄ）およびソフトウェアパッケージＱｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．５．０（ＢｉｏＲａｄ））に基づいて実施した。Ａβ（２０−４２）グロブロマーの最新の光学的に明確に特定されたドットの相対密度の２０％を超える相対密度を有するドットのみを評価した。この閾値を、各ドットブロットに関して、独立して決定した。計算値は、Ａβ（２０−４２）グロブロマーの認識および所与の抗体の個別のＡβ型の間の関係を示す。
【０２７５】
ドットブロット分析を、ヒト化モノクローナル抗Ａβ抗体  ４Ｄ１０ｈｕｍ＃１を用いて実施した。個々のＡβ型を段階希釈に適用し、免疫反応のためにそれぞれの抗体とともにインキュベートした（１＝Ａβ（１−４２）グロブロマー；２＝Ａβ（２０−４２）グロブロマー；３＝Ａβ（１−４０）モノマー、０．１％のＮａＯＨ；４＝Ａβ（１−４２）モノマー、０．１％のＮａＯＨ；５＝Ａβ（１−４２）線維製剤；６＝ｓＡＰＰα（Ｓｉｇｍａ）；（第１ドット：１ｐｍｏｌ））。結果を表８に要約する。
【０２７６】
【表８】
2020103288.tif 000014
【０２７７】
実施例３：血小板因子４の交差反応の決定
実施例  ３．１：サンドイッチＥＬＩＳＡを介したカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  Ｍｏｎｋｅｙ）血漿中の血小板因子４との交差反応の決定
試薬リスト：
Ｆ９６  Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＮＵＮＣ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ  カタログ番号４３９４５４
実験Ｅ１中の結合抗体：
−ヒト化モノクローナル抗Ａβ抗体  ４Ｄ１０ｈｕｍ＃１；２．３６ｍｇ／ｍｌ  ＯＤ２８０ｎｍ；−８０℃において保存
−ヒト化モノクローナル抗Ａβ抗体  ４Ｄ１０ｈｕｍ＃２；１．７４ｍｇ／ｍｌ  ＯＤ２８０ｎｍ；−８０℃において保存
−ヒト／マウスキメラ抗Ａβモノクローナル抗体  クローンｈ１Ｇ５野生型Ｆｃ−フレーム（ｃｈｉｍ  ｈ１Ｇ５  ｗｔ）；０．９９ｍｇ／ｍｌ  ＯＤ２８０ｎｍ；−８０℃において保存（陽性対照として使用）
−親和性精製ヒトポリクローナル抗体  ｈＩｇＧ１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、カタログ番号ＡＧ５０２）；１．００ｍｇ／ｍｌ  ＯＤ２８０ｎｍ；−８０℃において保存（陰性対照として使用）
参照実験Ｒ１中の結合抗体：
−抗ＨＰＦ４モノクローナル抗体；４．２ｍｇ／ｍｌ  ＯＤ２８０ｎｍ；Ａｂｃａｍ  カタログ番号ａｂ４９７３５；−３０℃において保存（陽性対照として使用）
−抗Ａβモノクローナル抗体  クローンｍ１Ｇ５；１．７０ｍｇ／ｍｌ  ＯＤ２８０ｎｍ；−８０℃において保存
−抗Ａβモノクローナル抗体  クローンｍ４Ｄ１０；８．６０ｍｇ／ｍｌ  ＯＤ２８０ｎｍ；−８０℃において保存
−モノクローナル抗体  クローンｍＩｇＧ２ａ；７．８９ｍｇ／ｍｌ  ＯＤ２８０ｎｍ；−８０℃において保存（陰性対照として使用）
コーティングバッファー：１００ｍＭの炭酸水素ナトリウム；ｐＨ９．６
ＥＬＩＳＡ用ブロッキング試薬；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ  カタログ番号：１１１２５８９
ＰＢＳＴバッファー：２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭのＮａＣｌ；０．０５％のＴｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．４
ＰＢＳＴ＋０．５％のＢＳＡバッファー：２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭのＮａＣｌ；０．０５％のＴｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．４＋０．５％ＢＳＡ；Ｓｅｒｖａカタログ番号１１９２６
カニクイザル血漿：１３例の異なるドナー由来のカニクイザルＥＤＴＡ血漿プール；−３０℃において保存
トリプシン阻害剤：Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ７９０２
一次抗体：ｐＲＡｂ−ＨＰＦ４；０．５ｍｇ／ｍｌ；Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ９５６１
標識試薬：抗ウサギＰＯＤコンジュゲート；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｔｄ．カタログ番号：１１１−０３６−０４５
染色液：ＤＭＳＯ中４２ｍＭのＴＭＢ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨカタログ番号：９２８１７０６０）；水中３％のＨ２Ｏ２；１００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．９
停止液：２Ｍのスルホン酸
【０２７８】
試薬の調製に使用した方法：
結合抗体：
結合抗体を、コーティングバッファー中１０μｇ／ｍｌに希釈した。
【０２７９】
ブロッキング溶液：
ブロッキング試薬を１００ｍｌの水に溶解し、ブロッキングストック溶液を調製し、１０ｍｌのアリコートを−２０℃において保存した。３ｍｌのブロッキングストック溶液を、各プレートをブロックするために２７ｍｌの水で希釈した。
【０２８０】
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）血漿ストック溶液の調製：
２ｍｌのカニクイザル血漿プールを、１０分間、１０，０００ｇで遠心分離機にかけた。１．５８ｍｌの上清を取り出し、３．４２ｍｌのＰＢＳＴ＋０．５％のＢＳＡバッファーを用いて希釈した（＝１：３．１６希釈）。その後、５０μｌのＨ２Ｏ中１０ｍｇ／ｍｌのトリプシン阻害剤を加えた。室温における１０分間のインキュベーション後、試料を０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＳＬＧＳ０２５０Ｓ）を通してろ過した。
【０２８１】
【表９】
2020103288.tif 000015
【０２８２】
一次抗体溶液：
一次抗体を、ＰＢＳＴ＋０．５％のＢＳＡバッファー中１μｇ／ｍｌに希釈した。希釈係数は１：５００であった。抗体溶液は速やかに使用した。
【０２８３】
標識試薬：
抗ウサギ−ＰＯＤコンジュゲート凍結乾燥物を、０．５ｍｌの水で再構成した。５００μｌのグリセロールを加え、１００μｌのアリコートをさらなる使用のため−２０℃において保存した。濃縮された標識試薬を、ＰＢＳＴバッファーで希釈した。希釈係数は１：１００００であった。試薬は速やかに使用した。
【０２８４】
ＴＭＢ溶液：
２０ｍｌの１００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．９を、２００μｌのＴＭＢストック溶液および２９．５μｌの３％の過酸化水素溶液を混合した。溶液は速やかに使用した。
【０２８５】
【表１０】
2020103288.tif 000016
【０２８６】
使用した手順：
１．１００μｌの結合抗体溶液／ウェルを適用し、一晩、４℃においてインキュベートした。
２．抗体溶液を廃棄し、ウェルを、２５０μｌのＰＢＳＴバッファーで３回洗浄した。
３．２６５μｌのブロッキング溶液／ウェルを加え、１．５時間、室温においてインキュベートした。
４．ブロッキング溶液を廃棄し、ウェルを、２５０μｌのＰＢＳＴバッファーで３回洗浄した。
５．カニクイザル血漿段階希釈液の調製後、１００μｌ／ウェルのこれらの希釈液をプレートに適用した。プレートを、２時間、室温においてインキュベートした。
６．カニクイザル血漿希釈液を廃棄し、ウェルを、２５０μｌのＰＢＳＴバッファーで３回洗浄した。
７．１００μｌの一次抗体溶液／ウェルを加え、１時間、室温においてインキュベートした。
８．一次抗体溶液を廃棄し、ウェルを、２５０μｌのＰＢＳＴバッファーで３回洗浄した。
９．２００μｌの標識溶液／ウェルを加え、１時間、室温においてインキュベートした。
１０．標識溶液を廃棄し、ウェルを、２５０μｌのＰＢＳＴバッファーで３回洗浄した。
１１．１００μｌのＴＭＢ溶液を各ウェルに加えた。
１２．プレートの色を、発色の間モニターし（５−１５分、周囲温度において）、適切な色に発色した時に、５０μｌ／ウェルの停止溶液を加えることによって反応を終了させた。
１３．吸光度を、４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０２８７】
データ分析：
血漿希釈因子（Ｘ−値）を、式：Ｘ＝ｌｏｇ（Ｘ）を使用して対数変換した。データを、対数変換したＸ−値を使用して、血漿の希釈（１：Ｘ）を表すＸ軸にプロットした。Ｈ列の個々のＰＢＳＴブランクのＯＤ４５０ｎｍ値を、Ａ−Ｇ列の各カラムの血漿段階希釈液の値から差し引いた。得られたバックグラウンドを補正したＯＤ４５０ｎｍ値をＹ軸にプロットした。希釈効果曲線を、これらのデータ点から、非線形回帰の「４パラメータロジスティック方程式」および「最小二乗法（通常）」フィッティング法（フィッティング方法「Ｓ字型用量−応答（可変スロープ）」と同じである。）を使用するカーブフィッティングにより、データ分析ソフトウェアパッケージＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ  （Ｖｅｒｓｉｏｎ５．０３；ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用して計算した。カーブフィッティングは、唯一の目的であるデータの可視化のために実施したが、任意のさらなる計算、すなわち、曲線下面積の計算に基づくものではない。曲線下面積（ＡＵＣまたは全ピーク面積）は、非曲線あてはめデータ、対数変換されたＸ−値および測定範囲内のＯＤ４５０ｎｍ値（最終血漿希釈は１：３．１６から１：３１６０）に基づいて決定した。下記の計算設定を、データ分析ソフトウェアパッケージ  ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ  （Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０３；ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）に使用した：
−ベースラインはＹ＝０．０に設定した。
−最小ピークの高さ：最小のＹから最大のＹまでの距離の１０％未満であるピークは無視した。
−ピークの方向：定義により、すべてのピークがベースラインより上へ向かっていなければならない。
各個別の抗体に関して、ＰＦ４濃縮係数を、市販の抗ＨＰＦ４抗体（Ａｂｃａｍカタログ番号：ａｂ４９７３５）を、ＰＦ４認識の参照抗体として使用して計算し、
【０２８８】
【数１】
2020103288.tif 000017
注：ＰＦ４濃縮係数は、ヒト型の抗ＨＰＦ４が存在しない参照実験において得られた抗ＨＰＦ４抗体ＡＵＣに基づいて計算した。
【０２８９】
実験Ｅ１および参照実験Ｒ１の結果を、図２０Ａおよび２２Ａならびに表９Ａおよび９Ｂに示す。
【０２９０】
実施例３．２：サンドイッチＥＬＩＳＡを介したヒト血漿中の血小板因子４との交差反応の決定
下記を除いて、試薬調製のために、実施例３．１と同じ試薬および手順を使用した：
ヒトＰＦ４（７．３ｍｇ／ｍｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  カタログ番号ＨＰＦ４；−３０℃において保存）をスパイクしたヒト血漿（４例の異なるドナー由来のヒトＥＤＴＡ血漿プール；−３０℃において保存）を、カニクイザル血漿の代わりに使用した。ＨＰＦ４−スパイクヒト血漿ストック溶液は、下記のように調製した。
【０２９１】
Ａ）ヒト血漿希釈液の調製：
２ｍｌのヒト血漿プールを、１０分間、１００００ｇにおいて遠心分離機にかけた。１．５８ｍｌの上清を取り出し、３．４２ｍｌのＰＢＳＴ＋０．５％のＢＳＡを用いて希釈した（＝１：３．１６希釈）。その後５０μｌのＨ２Ｏ中１０ｍｇ／ｍｌトリプシン阻害剤を加えた。１０分間の室温におけるインキュベーション後、試料を、０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  カタログ番号ＳＬＧＳ０２５０Ｓ）を通してろ過した。
【０２９２】
Ｂ）ＨＰＦ４ストック溶液の調製：
１μｌのＨＰＦ４を、９９μｌのＰＢＳＴ＋０．５％のＢＳＡバッファーに加えた＝７３μｇ／ｍｌ。
【０２９３】
Ｃ）１０ｎｇ／ｍｌのＨＰＦ４をスパイクしたヒト血漿ストック溶液の調製：
０．６９μｌの７３μｇ／ｍｌのＨＰＦ４ストック溶液を、５ｍｌの１：３．１６希釈したヒト血漿に加え、１０ｎｇ／ｍｌのＨＰＦ４をスパイクしたヒト血漿ストック希釈を得た。
【０２９４】
ＨＰＦ４をスパイクしたヒト血漿を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡに関する段階希釈液の調製、標準プレートの設定、実験手順およびデータ分析は、実施例３．１のカニクイザル血漿を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡに関して記載したものと同様であった。
【０２９５】
実験Ｅ２中の結合抗体：実施例３．１の実験Ｅ１において使用したものと同じであった。
【０２９６】
参照実験Ｒ２中の結合抗体：実施例３．１の参照実験Ｒ１において使用したものと同じであった。
【０２９７】
実験Ｅ２および参照実験Ｒ２の結果を、図２０Ｂおよび２２Ｂならびに表９Ａおよび９Ｂに示す。
【０２９８】
【表１１】
2020103288.tif 000018
【０２９９】
【表１２】
2020103288.tif 000019
【０３００】
実施例３．３：整列サンドイッチＥＬＩＳＡを介したカニクイザル血漿中の血小板因子４との交差反応の決定
実施例３．１に記載の試薬および整列抗体の抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的；ヤギにおいて産生される；Ｓｉｇｍａカタログ番号：Ｍ３５３４；２．３ｍｇ／ｍｌ；参照実験Ｒ３中のマウス結合抗体に関しては−２０℃において保存）および抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的；ヤギにおいて産生される；Ｓｉｇｍａ  カタログ番号：Ｉ２１３６；２．２ｍｇ／ｍｌ；実験Ｅ３のヒト、ヒト化およびヒト／マウスキメラの結合抗体に関しては−２０℃において保存）を使用した。
【０３０１】
試薬の調製に使用した方法：
ブロッキング溶液、一次抗体およびＴＭＢ溶液は、実施例３．１に記載のように調製した。
【０３０２】
各整列抗体は、コーティングバッファー中１０μｇ／ｍｌに希釈した。
【０３０３】
実験Ｅ３中の結合抗体：実施例３．１の実験Ｅ１において使用したものと同じであった。
【０３０４】
参照実験Ｒ３中の結合抗体：実施例３．１の参照実験Ｒ１において使用したものと同じであった。
【０３０５】
各結合抗体は、ＰＢＳＴ＋０．５％のＢＳＡバッファーを用いて１０μｇ／ｍｌ（ストック溶液）に希釈し、段階希釈液を、下記のように調製した：
【０３０６】
【表１３】
2020103288.tif 000020
【０３０７】
カニクイザル血漿：
４００μｌのカニクイザル血漿プールを、１０分間、１００００ｇにおいて遠心分離機にかけた。１．５８μｌの上清を取り出し、６８４μｌのＰＢＳＴ＋０．５％のＢＳＡを用いて希釈した（＝１：３．１６希釈）。その後１０μｌのＨ２Ｏ中１０ｍｇ／ｍｌのトリプシン阻害剤を加えた。１０分間の室温におけるインキュベーション後、試料を、０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＳＬＧＳ０２５０Ｓ）を通してろ過した。その後、５００μｌのこの１：３．１６希釈した血漿試料を、１５．３ｍｌのＰＢＳＴ＋０．５％のＢＳＡバッファーを用いて１：３１．６に再度希釈し、１：１００の合計希釈液を得た。
【０３０８】
標識試薬：
凍結乾燥された抗ウサギ−ＰＯＤコンジュゲートを、０．５ｍｌの水で再構成した。５００μｌのグリセロールを加え、アリコートの１００μｌを、さらなる使用のために−２０℃において保存した。濃縮された標識試薬を、ＰＢＳＴバッファーで希釈した。希釈係数は１：５０００であった。試薬は速やかに使用した。
【０３０９】
【表１４】
2020103288.tif 000021
【０３１０】
【表１５】
2020103288.tif 000022
【０３１１】
使用した手順：
１．１００μｌの個々の整列抗体溶液（実験Ｅ３のために抗ヒトＩｇＧ；参照実験Ｒ３のために抗マウスＩｇＧ）／ウェルを適用し、一晩、４℃においてインキュベートした。
２．抗体溶液を廃棄し、ウェルを、２５０μｌのＰＢＳＴ−バッファーを用いて３回洗浄した。
３．２６５μｌのブロッキング溶液／ウェルを加え、２時間、室温においてインキュベートした。
４．ブロッキング溶液を廃棄し、ウェルを、２５０μｌのＰＢＳＴ−バッファーを用いて３回洗浄した。
５．各結合抗体の段階希釈液の調製後、１００μｌ／ウェルのこれらの抗体希釈液をプレートに適用した。プレートを、２時間室温においてインキュベートした。
６．抗体溶液を廃棄し、ウェルを、２５０μｌのＰＢＳＴ−バッファーを用いて３回洗浄した。
７．１００μｌのカニクイザル血漿の１：１００希釈液／ウェルを加え、２時間、室温においてインキュベートした。
８．血漿溶液を廃棄し、ウェルを、２５０μｌのＰＢＳＴ−バッファーを用いて３回洗浄した。
９．１００μｌの一次抗体溶液／ウェルを加え、１時間、室温においてインキュベートした。
１０．一次抗体溶液を廃棄し、ウェルを、２５０μｌのＰＢＳＴ−バッファーを用いて３回洗浄した。
１１．２００μｌの標識試薬／ウェルを加え、１時間、室温においてインキュベートした。
１２．標識試薬を廃棄し、ウェルを、２５０μｌのＰＢＳＴ−バッファーを用いて３回洗浄した。
１３．１００μｌのＴＭＢ溶液を各ウェルに加えた。
１４．プレートの色を、発色の間モニターし（５−１５分、周囲温度において）、適切な色に発色した時に、５０μｌ／ウェルの停止溶液を加えることによって反応を終了させた。
１５．吸光度を、４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０３１２】
データ分析を、血漿希釈係数ではなく抗体の量（ｎｇ／ｍｌで表される）をＸ値として使用したことを除き、実施例３．１においてカニクイザル血漿を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡに関して記載したように実施し、このようにして濃度効果曲線を計算した。したがって、曲線下面積は、非曲線あてはめデータ、対数変換されたＸ−値および測定範囲内のＯＤ４５０ｎｍ値（最終抗体濃度は１０ｎｇ／ｍｌから１００００ｎｇ／ｍｌまで）に基づいて決定した。
【０３１３】
実験Ｅ３および参照実験Ｒ３の結果を、図２１Ａおよび２３Ａならびに表１０Ａおよび１０Ｂに示す。
【０３１４】
実施例３．４：整列サンドイッチＥＬＩＳＡを介した、ヒト血漿中の血小板因子４との交差反応の決定
下記を除いて、試薬調製のために、実施例３．３に関する同じ試薬および手順を使用した：
実験Ｅ４に使用した各整列抗体を、コーティングバッファー中１０μｇ／ｍｌに希釈し、実験Ｒ４に使用した各整列抗体を、コーティングバッファー中５０μｇ／ｍｌに希釈した。
【０３１５】
ヒトＰＦ４（７．３ｍｇ／ｍｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎカタログ番号ＨＰＦ４；−３０℃において保存）をスパイクしたヒト血漿（４例の異なるドナー由来のヒトＥＤＴＡ血漿プール；−３０℃において保存）を、カニクイザル血漿の代わりに使用した。ＨＰＦ４−スパイクヒト血漿ストック溶液は、下記のように調製した。
【０３１６】
Ａ）ヒト血漿希釈液の調製：
４ｍｌのヒト血漿プールを、１０分間、１００００ｇにおいて遠心分離機にかけた。３．１６ｍｌの上清を取り出し、６．８４ｍｌのＰＢＳＴ＋０．５％のＢＳＡを用いて希釈した（＝１：３．１６希釈）。その後１００μｌのＨ２Ｏ中１０ｍｇ／ｍｌのトリプシン阻害剤を加えた。１０分間の室温におけるインキュベーション後、試料を、０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  カタログ番号ＳＬＧＳ０２５０Ｓ）を通してろ過した。その後、５ｍｌのこの１：３．１６希釈した血漿試料を、１０．８ｍｌのＰＢＳＴ＋０．５％のＢＳＡバッファーを用いて１：３．１６に再度希釈し、１：１０の合計希釈液を得た。
【０３１７】
Ｂ）ＨＰＦ４ストック溶液の調製：
１μｌのＨＰＦ４を、９９μｌのＰＢＳＴ＋０．５％のＢＳＡバッファーに加えた＝７３μｇ／ｍｌ。
【０３１８】
Ｃ）１０ｎｇ／ｍｌのＨＰＦ４をスパイクしたヒト血漿ストック溶液の調製：
１．６４μｌの７３μｇ／ｍｌのＨＰＦ４ストック溶液を１２ｍｌの１：１０希釈したヒト血漿に加え、１０ｎｇ／ｍｌのＨＰＦ４スパイクヒト血漿ストック希釈液を得た。
【０３１９】
結合抗体の段階希釈液の調製；結合抗体プレートの設定、ブロッキング溶液の調製、一次抗体、試薬およびＴＭＢ溶液は、実施例３．３と同じものであった。
【０３２０】
実験Ｅ４の整列抗体および結合抗体：実施例３．３の実験Ｅ３において使用したものと同じであった。
【０３２１】
参照実験Ｒ４の整列抗体および結合抗体：実施例３．３の参照実験Ｒ４において使用したものと同じであった。
【０３２２】
ＨＰＦ４をスパイクしたヒト血漿を用いた整列サンドイッチＥＬＩＳＡに関する実験手順（ステップ７において、１：１０希釈したヒト血漿を使用する。）およびデータ分析は、実施例３．３のカニクイザル血漿を用いた整列サンドイッチＥＬＩＳＡに関して記載したものと同様であった。
【０３２３】
実験Ｅ４および参照実験Ｒ４の結果を、図２１Ｂおよび２３Ｂならびに表１０Ａおよび１０Ｂに示す。
【０３２４】
【表１６】
2020103288.tif 000023
【０３２５】
【表１７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月28日(2020.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６または配列番号１０のアミノ酸配列である可変重鎖アミノ酸配列、および配列番号１４のアミノ酸配列である可変軽鎖アミノ酸配列を含む、抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体。
【外国語明細書】
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