(57)【要約】【課題】網膜の外側血液網膜関門の培養モデルを作製するための２層式流路デバイス、網膜の外側血液網膜関門の培養モデル及びその作製方法の提供【解決手段】両端に開口部を有する複数のチャネルを有し、血管内皮細胞を培養するための第１の細胞用チャネルと線維芽細胞を培養するための第２の細胞用チャネルが培養液を流通させるための培養液チャネルを介して存在し、それぞれのチャネル間には細胞の通過を阻止するための隔離材が存在する下層用マイクロ流路チップ、両端に開口部を有する接着性細胞を培養するための１つの細胞用チャネルを有する上層用マイクロ流路チップ、並びに多孔性のポーラス膜を有する、２層式マイクロ流路デバイスであって、下層用マイクロ流路チップと上層用マイクロ流路チップをポーラス膜を隔てて積層したときに、下層用マイクロ流路チップの第１の細胞用チャネルと上層用マイクロ流路チップの細胞用チャネルがポーラス膜を隔てて部分的に重なる２層式流路デバイス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
両端に開口部を有する複数のチャネルを有し、血管内皮細胞を培養するための第１の細胞用チャネルと線維芽細胞を培養するための第２の細胞用チャネルが培養液を流通させるための培養液チャネルを介して存在し、それぞれのチャネル間には液体を添加したときに液体の流出を阻止するための隔離材が存在する下層用マイクロ流路チップ、
両端に開口部を有する接着性細胞を培養するための１つの細胞用チャネルを有する上層用マイクロ流路チップ、並びに
多孔性のポーラス膜を有する、２層式マイクロ流路デバイスであって、
下層用マイクロ流路チップと上層用マイクロ流路チップをポーラス膜を隔てて積層したときに、下層用マイクロ流路チップの第１の細胞用チャネルと上層用マイクロ流路チップの細胞用チャネルがポーラス膜を隔てて部分的に重なる２層式流路デバイス。
【請求項２】
下層用マイクロ流路デバイスが５つのチャネルを有し、中央部に血管内皮細胞を培養するための第１の細胞用チャネルを１つ有し、第１の細胞用チャネルの両脇に培養液を流通させるための培養液チャネルを２つ有し、さらに培養液チャネルの外側に線維芽細胞を培養するための第２の細胞用チャネルを２つ有する、請求項１記載の２層式流路デバイス。
【請求項３】
下層用マイクロ流路チップのチャネル間の細胞の通過を阻止するための隔離材が間隔をあけて配置された複数のマイクロポストである、請求項１又は２に記載の２層式流路デバイス。
【請求項４】
上層用マイクロ流路チップに、下層用マイクロ流路チップと上層用マイクロ流路チップをポーラス膜を隔てて積層したときに、下層用マイクロ流路チップの開口部の両端に存在する開口部に重なる穴が存在し、該穴を通して下層用マイクロ流路チップのチャネルの端に存在する開口部に細胞及び細胞培養用試薬を添加することができる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の２層式流路デバイス。
【請求項５】
下層用マイクロ流路チップと上層用マイクロ流路チップがポーラス膜を隔てて積層されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の２層式流路デバイス。
【請求項６】
上層用マイクロ流路チップの細胞用チャネルが網膜色素細胞を培養するための細胞用チャネルである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の２層式流路デバイス。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の２層式流路デバイスを用いて、３次元培養モデルを作製する方法であって、
以下の(i)〜(iii)の工程を行うことにより下層用マイクロ流路チップで血管内皮細胞と線維芽細胞を共培養し：
(i)  下層用マイクロ流路チップの血管内皮細胞を培養するための第１の細胞用チャネルに血管内皮細胞を添加する；
(ii)  下層用マイクロ流路チップの培養液チャネルに培養液を満たす；及び
(iii)  下層用マイクロ流路チップの線維芽細胞を培養するための第２の細胞用チャネルに線維芽細胞を添加する、
次いで、上層用マイクロ流路チップに接着性細胞を添加し、下層用マイクロ流路チップの細胞と上層用マイクロ流路チップの細胞を共培養し、
下層用マイクロ流路チップで血管系を形成させ、上層用マイクロ流路チップで接着性細胞を培養することを含む、３次元培養モデルを作製する方法。
【請求項８】
上層用マイクロ流路チップに添加する接着性細胞が網膜色素上皮細胞である外側血液網膜関門モデルである、請求項７記載の３次元培養モデルを作製する方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の２層式流路デバイスの下層用マイクロ流路チップにおいて血管系が形成されており、上層用マイクロ流路チップにおいて接着性細胞層が形成されている、３次元培養モデル。
【請求項１０】
下層用マイクロ流路チップにおいて形成された血管系が、血管内皮細胞及び線維芽細胞の相互作用により形成された血管系である、請求項９記載の３次元培養モデル。
【請求項１１】
上層用マイクロ流路チップにおいて形成されている接着性細胞層が網膜色素上皮細胞層である外側血液網膜関門モデルである、請求項９又は１０に記載の３次元培養モデル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の組織の３次元培養モデルに関し、特に網膜の外側血液網膜関門の培養モデルに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、医薬品の開発や病気の研究の現場では、主に動物モデルや培養細胞を用いて実験が進められている。動物モデルは薬等の全身応答が解析可能である点などが利点として挙げられるが、実験にかかるコストや倫理面の問題から減らそうとする動きにある。
【０００３】
一方で、培養細胞を用いた実験は分子レベルでの解析や周辺環境の制御が容易であるが、シャーレ上に平面的に培養するため、生体の3次元構造を模擬できていない。そこで、培養モデルに生態環境を再現することが必要と考えられた。
【０００４】
このような背景から、臓器チップと呼ばれる技術が生まれた。これはマイクロ流路チップという液体を流せるチャネルを持つ実験デバイス内に、臓器の細胞を培養することで生体の組織や臓器の構造を再現し、それを用いた病態の再現や薬剤の評価を行おうとする技術である。これまでに、肺、肝臓、腸、心臓など主要な臓器のチップが開発されてきたが、眼など特殊な感覚器官のモデルはほとんどなかった。
【０００５】
網膜は血液網膜関門という血管と網膜間にバリアが存在し、その恒常性を維持している。網膜内側には内側血液網膜関門が存在し、外側には外側血液網膜関門が存在する。
【０００６】
外側の網膜組織は白目の内側に微小血管系である脈絡膜、ブルッフ膜を挟んで網膜色素上皮細胞の単層から形成される。
【０００７】
この網膜色素上皮細胞のバリアによって、脈絡膜からの物質輸送を制御している。つまり、この網膜関門に異常が起きることによって、様々な網膜疾患が発生するという原理になっている。網膜疾患の例として加齢黄斑変性が挙げられる。この病気は、網膜中心部の黄斑と呼ばれる部位に発症し、欧米において失明原因の1位にもなっている病気である。これは、先ほどの外側網膜において、脈絡膜からの異常な新生血管が網色素上皮細胞の層を障害することによって発症する。加齢黄斑変性は有効な治療法が確立されていないことから、難治性網膜疾患に位置付けられている。
【０００８】
加齢黄斑変性等の網膜疾患の病態メカニズムを解明するために培養モデルが開発された。これまでの外側血液網膜関門の培養モデルは、カルチャーインサートという底面にポーラス膜がはってある容器のそれぞれに網膜色素上皮細胞、血管内皮細胞を培養することで網膜構造を再現したもの（静置培養系モデル：図１）や、２層のマイクロ流路を用いることで生体の流れを再現した培養モデルが開発されていた（潅流培養系モデル：図１、非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】L. J. Chen et al., Sci. Rep., vol. 7, no. 1, pp. 1-9, 2017.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、種々の組織の３次元培養モデルを作製するための２層式流路デバイス、３次元培養モデル及びその作製方法の提供を目的とする。特に、網膜の外側血液網膜関門の培養モデルを作製するための２層式流路デバイス、網膜の外側血液網膜関門の培養モデル及びその作製方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、眼の網膜組織に着目した。網膜は眼に入ってくる光を受け取り、信号に変換する組織であり、様々な細胞による多層構造によって形成されている。網膜内の血管系は単位当たりの血流が多く、全身の影響を受けやすい組織であり、血管の状態を外から直接観察でき、動脈硬化や糖尿病の診断も可能にする非常に重要な組織であるので、本発明者らは網膜チップの開発に取組んだ。
【００１２】
これまでの外側血液網膜関門の培養モデルとしては、カルチャーインサートという底面にポーラス膜がはってある容器のそれぞれに網膜色素上皮細胞、血管内皮細胞を培養することで網膜構造を再現したもの（静置培養系モデル）や、２層のマイクロ流路を用いることで生体の流れを再現した培養モデル（潅流培養系モデル）が開発されていた。
【００１３】
しかし、これらの培養モデルはあくまで細胞を平面的に培養したものであり、実際の組織に見られるような３次元的な血管構造を再現できていなかった。
【００１４】
そこで、本発明者らは、マイクロ流路内に３次元血管系を構築し、網膜色素上皮細胞と共培養することによって、血管の３次元構造を再現し、血管動態が観察可能な、より生体に近い外側血液網膜関門モデル等の３次元培養モデルの開発を目指し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  両端に開口部を有する複数のチャネルを有し、血管内皮細胞を培養するための第１の細胞用チャネルと線維芽細胞を培養するための第２の細胞用チャネルが培養液を流通させるための培養液チャネルを介して存在し、それぞれのチャネル間には液体を添加したときに液体の流出を阻止するための隔離材が存在する下層用マイクロ流路チップ、
両端に開口部を有する接着性細胞を培養するための１つの細胞用チャネルを有する上層用マイクロ流路チップ、並びに
多孔性のポーラス膜を有する、２層式マイクロ流路デバイスであって、
下層用マイクロ流路チップと上層用マイクロ流路チップをポーラス膜を隔てて積層したときに、下層用マイクロ流路チップの第１の細胞用チャネルと上層用マイクロ流路チップの細胞用チャネルがポーラス膜を隔てて部分的に重なる２層式流路デバイス。
[２]  下層用マイクロ流路デバイスが５つのチャネルを有し、中央部に血管内皮細胞を培養するための第１の細胞用チャネルを1つ有し、第１の細胞用チャネルの両脇に培養液を流通させるための培養液チャネルを２つ有し、さらに培養液チャネルの外側に線維芽細胞を培養するための第２の細胞用チャネルを２つ有する、[１]の２層式流路デバイス。
[３]  下層用マイクロ流路チップのチャネル間の細胞の通過を阻止するための隔離材が間隔をあけて配置された複数のマイクロポストである、[１]又は[２]の２層式流路デバイス。
[４]  上層用マイクロ流路チップに、下層用マイクロ流路チップと上層用マイクロ流路チップをポーラス膜を隔てて積層したときに、下層用マイクロ流路チップの開口部の両端に存在する開口部に重なる穴が存在し、該穴を通して下層用マイクロ流路チップのチャネルの端に存在する開口部に細胞及び細胞培養用試薬を添加することができる、[１]〜[３]のいずれかの２層式流路デバイス。
[５]  下層用マイクロ流路チップと上層用マイクロ流路チップがポーラス膜を隔てて積層されている、[１]〜[４]のいずれかの２層式流路デバイス。
[６]  上層用マイクロ流路チップの細胞用チャネルが網膜色素細胞を培養するための細胞用チャネルである、[１]〜[５]のいずれかの２層式流路デバイス。
[７]  [１]〜[６]のいずれかの２層式流路デバイスを用いて、３次元培養モデルを作製する方法であって、
以下の(i)〜(iii)の工程を行うことにより下層用マイクロ流路チップで血管内皮細胞と線維芽細胞を共培養し：
(i)  下層用マイクロ流路チップの血管内皮細胞を培養するための第１の細胞用チャネルに血管内皮細胞を添加する；
(ii)  下層用マイクロ流路チップの培養液チャネルに培養液を満たす；及び
(iii)  下層用マイクロ流路チップの線維芽細胞を培養するための第２の細胞用チャネルに線維芽細胞を添加する、
次いで、上層用マイクロ流路チップに接着性細胞を添加し、下層用マイクロ流路チップの細胞と上層用マイクロ流路チップの細胞を共培養し、
下層用マイクロ流路チップで血管系を形成させ、上層用マイクロ流路チップで接着性細胞を培養することを含む、３次元培養モデルを作製する方法。
[８]  上層用マイクロ流路チップに添加する接着性細胞が網膜色素上皮細胞である外側血液網膜関門モデルである、[７]の３次元培養モデルを作製する方法。
[９]  [１]〜[６]のいずれかの２層式流路デバイスの下層用マイクロ流路チップにおいて血管系が形成されており、上層用マイクロ流路チップにおいて接着性細胞層が形成されている、３次元培養モデル。
[１０]  下層用マイクロ流路チップにおいて形成された血管系が、血管内皮細胞及び線維芽細胞の相互作用により形成された血管系である、[９]の３次元培養モデル。
[１１]  上層用マイクロ流路チップにおいて形成されている接着性細胞層が網膜色素上皮細胞層である外側血液網膜関門モデルである、[９]又は[１０]の３次元培養モデル。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の外側血液網膜関門モデル等の３次元培養モデルは、血管の３次元構造を再現し、血管動態が観察可能な、より生体に近い３次元培養モデルである。外側血液網膜関門モデルは、網膜疾患の病態を解析したり、予防又は治療薬をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】従来の静置培養系モデルを示す図である。
【図２】従来の潅流培養系モデルを示す図である。
【図３】マイクロ流路チップ作製法の概要を示す図である。
【図４−１】マイクロ流路チップの構造を示す図である。
【図４−２】マイクロ流路チップのチャネル内部の拡大図である。
【図４−３】マイクロ流路チップの流路のデザインを示す図である。
【図５】HUVEC単独培養のときの流路への細胞導入の方法を示す図である。
【図６】HUVECとLFの共培養の方法を示す図である。
【図７】HUVEC単独培養（Ａ）及びHUVECとLFの共培養（Ｂ）による血管形成を示す図である。
【図８】マイクロ流路チップに形成された血管の共焦点顕微鏡像を示す図である。
【図９】マイクロ流路チップに形成された血管に蛍光ビーズを流したときの様子を示す図である。
【図１０】マイクロ流路チップに形成された血管に蛍光デキストランを流したときの様子を示す図である。
【図１１−１】２層構造の流路デバイスの作製方法及び構造を示す図である。
【図１１−２】２層流路デバイスの作製に使用したフォトマスクのデザインを示す図である。
【図１２】２層構造の流路デバイスの上面からの写真（Ａ）及び断面写真（Ｂ）を示す図である。
【図１３】実際の外側網膜関門を模式的に示す図である。
【図１４】２層構造の流路デバイスの上層の流路にRPE細胞を播種した状態の模式図を示す図である。
【図１５】播種30分後のRPE細胞の状態を示す写真（Ａ）、及び播種２日後のRPE細胞の状態を示す写真（Ｂ）を示す図である。
【図１６】RPE細胞が結合している状態を模式的に示す図である。
【図１７】RPE細胞がZO1により結合している状態を示す図である。
【図１８】RPE細胞層のバリア機能の評価方法の概要を示す図である。
【図１９】RPE細胞のバリア機能の評価の結果を示す図である。
【図２０】RPE細胞のバリア機能の評価において、低酸素状態と正常時の細胞を示す図である。
【図２１】RPE細胞がVEGFを異常分泌した異常時と正常時の眼底組織の状態を模式的に示す図である。
【図２２】RPE細胞のVEGF分泌の評価の結果を示す図である。
【図２３】脈絡膜モデルに対する血管新生の再現の評価方法の概要を示す図である。
【図２４】脈絡膜モデルに対する血管新生の再現実験の結果を示す図である。
【図２５】脈絡膜モデルに対する血管新生の再現実験の結果（z軸が同じ位置でxy断面を観察）を示す図である。
【図２６】網膜関門モデルの作製方法の概要を示す図である。
【図２７】作製した網膜関門モデルのRPE細胞層（上層）（Ａ）、血管層（下層）（Ｂ）及び両者の合成画像（Ｃ）を示す図である。
【図２８】作製した網膜関門モデルの共焦点顕微鏡観察像を示す図である。
【図２９】網膜関門モデルを模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明はマイクロ流路チップを用いて作製した２層式流路デバイス及び該２層式流路デバイスで細胞を培養することにより作製した３次元培養モデルである。２層式流路デバイスの上層に、網膜色素上皮細胞（RPE: retinal pigment epithelium）層を形成させた場合、３次元培養モデルは外側血液網膜関門モデルとなる。ここで、血液網膜関門（BRB: Blood-Retinal-Barrier)とは、循環血液と網膜組織の間に存在する関門であり、バリア機能を有し、恒常性を維持する働きをする。外側血液網膜関門は、強膜の上に存在し、ブルッフ膜を隔てて脈絡膜と網膜色素上皮細胞が存在する。脈絡膜は微小血管系が形成され、網膜色素上皮細胞は、脈絡膜からの物質輸送の制御を行っている。
【００２０】
１．２層式流路デバイス
本発明の２層式流路デバイスは、２つのマイクロ流路チップをポーラス膜（多孔性膜）を隔てて積層し２層とした構造を有する。２つのマイクロ流路チップは、下層用のマイクロ流路チップと上層用のマイクロ流路チップである。下層用のマイクロ流路チップは、複数のチャネル（流路）を有するマイクロ流路チップであり、血管内皮細胞を培養するための第１の細胞用チャネル、線維芽細胞を培養するための第２の細胞用チャネル及び培養液を流通させるための培養液チャネルの３種類のチャネルを有する。血管内皮細胞を培養するための第１の細胞用チャネルと線維芽細胞を培養するための第２の細胞用チャネルが培養液を流通させるための培養液チャネルを介して存在する。血管内皮細胞を培養するための第１の細胞用チャネルを血管チャネルと呼び、線維芽細胞を培養するための第２の細胞用チャネルを線維芽細胞チャネルと呼ぶことができる。好ましくは、下層用マイクロ流路チップは５つのチャネルを有し、中央部に血管内皮細胞を培養するための第１の細胞用チャネルを１つ有し、第１の細胞用チャネルの両脇に培養液を流通させるための培養液チャネルを２つ有し、さらに培養液チャネルの外側に線維芽細胞を培養するための第２の細胞用チャネルを２つ有する。
【００２１】
本発明の２層式流路デバイスの上層用マイクロ流路チップ及び下層用マイクロ流路チップの材質は限定されず、細胞培養容器に用いることができる材質を用いることができ、ポリジメチルシロキサン（PDMS)、ポリメチルメタクリレート（PMMA)、ガラス等が挙げられるが、好ましくはポリジメチルシロキサン（PDMS)でできている。大きさは、限定されないが、例えば、タテが10mm〜50mm、ヨコが10mm〜50mmである。
【００２２】
マイクロ流路チップ内のチャネルの形状は直線状でもよく、途中で折れ曲がっていても、湾曲していてもよい。チャネルを有するマイクロ流路チップの作製及び細胞や培養液の添加の容易性を考慮すると直線形のチャネルと途中で折れ曲がったチャネルを組合せたものが好ましい。上層用マイクロ流路チップ及び下層用マイクロ流路チップのチャネルの構造の例を図４−３及び図１１−２に示す。図４−３及び図１１−２Ａが下層用マイクロ流路チップを示し、図１１−２Ｂが上層用マイクロ流路チップを示す。各チャネルの長さは限定されないが、数mm〜数十mmが好ましい。また、チャネルの幅もチャネルの種類により変更することができるが、数百μm〜千数百μm、好ましくは500μm〜1500μm、さらに好ましくは600μm〜1100μmである。例えば、血管内皮細胞を培養するための第１の細胞用チャネルの幅を800μm〜1200μm、好ましくは1000μmとし、線維芽細胞を培養するための第２の細胞用チャネル及び培養液を流通させるための培養液チャネルの幅を600μm〜800μm、好ましくは700μmとすればよい。チャネルの高さ（深さ）は、数百μm、好ましくは50μm〜300μm、さらに好ましくは100μm〜200μmとすればよい。
【００２３】
それぞれのチャネルの両端には、細胞や培養液等の培養用試薬を添加し、又は除去するための開口部を有する。培養液等を添加するための開口部をインレット（注入口）と呼び、培養液等を除去するための開口部をアウトレット（排出口）と呼ぶこともできる。チャネル内で細胞を培養するためには定期的に培養液を交換することが好ましく、この際に開口部を有する。開口部をチャンバーと呼ぶこともできる。
【００２４】
それぞれのチャネル間にはチャネル内の液体が漏れるのを阻止するための隔離材が存在する。該隔離材により、細胞を目的のチャネルにパターニングすることができる。隔離材としては、細胞を通過させない培養液等を通過させる隔離膜や間隔をあけて配置された複数のマイクロポストを用いることができる。マイクロポストを用いる場合、チャネル内は疎水性であるため、マイクロポスト間に液体の表面張力が発生し、チャネル内に液体を流した場合でも、隣接する流路に液体がない場合、液体がチャネルの外に流出することはない。すなわち、チャネル間は膜又はマイクロポストにより仕切られており、液体を添加した時に、液体がチャネルから流出することがない。隔離膜は、数μm、好ましくは５μm〜10μm、さらに好ましくは７μm〜９μmのポアサイズを有する多孔性膜を用いることができる。隔離膜の材質として、ポリエチレンテレフタレート（PET）、ナイロン、ニトロセルロース等が挙げられる。マイクロポストは、多角形の柱状の凸部である。マイクロポストは、マイクロ流路チップを作製する際に、一体成型することができる。従って、マイクロポストも好ましくはポリジメチルシロキサン（PDMS)でできている。マイクロポストを仕切材と呼ぶこともある。マイクロポストの大きさは、タテが10μm〜100μm、ヨコが10μm〜100μm、高さはチャネルの高さ（深さ）と同一である。
【００２５】
下層用のマイクロ流路チップは、チャネルの間にマイクロポストがあるため、マイクロポストアレイ流路チップ又はマイクロポストアレイ流路デバイスとも呼ぶ。
【００２６】
上層用のマイクロ流路チップは、網膜色素上皮細胞等の接着性細胞を培養するための１つの細胞用チャネルを有する。上層用のマイクロ流路チップの細胞用チャネルも、下層用マイクロ流路チップと同様に両端に開口部を有する。
【００２７】
本発明の２層式流路デバイスは、上記の下層用マイクロ流路チップ及び上層用マイクロ流路チップ、並びにポーラス膜（多孔性膜）を有し、下層用マイクロ流路チップ及び上層用マイクロ流路チップがポーラス膜を隔てて重なった構造を有する。下層用マイクロ流路チップと上層用マイクロ流路チップをポーラス膜を隔てて積層したときに、下層用マイクロ流路チップの第１の細胞用チャネルと上層用マイクロ流路チップの細胞用チャネルがポーラス膜を隔てて部分的に同じ位置に重なる。すなわち、下層用マイクロ流路チップの第１の細胞用チャネルの１部と上層用マイクロ流路チップの細胞用チャネルの１部がポーラス膜を隔てて同じ位置に重なる。例えば、図１１−２において、Ｂの上層用マイクロ流路チップのチャネルの中央部分の直線部分が、Ａの下層用マイクロ流路チップの中央のチャネルと部分的に重なっている。上層用マイクロ流路チップの細胞用チャネルのサイズは、幅が、数百μm〜千数百μm、好ましくは800μm〜1200μm、さらに好ましくは1000μmとすればよい。また、チャネルの高さ（深さ）は、数百μm、好ましくは50μm〜300μm、さらに好ましくは100μm〜200μmとすればよい。
【００２８】
下層用マイクロ流路チップの第１の細胞用チャネルと上層用マイクロ流路チップの細胞用チャネルがポーラス膜を隔てて部分的に同じ位置に重なるため、下層用マイクロ流路チップの第１の細胞用チャネル中で培養している細胞と上層用マイクロ流路チップの細胞用チャネル中で培養している細胞が培養液を介して相互作用し得る。
【００２９】
ポーラス膜は、細胞を通過させないサイズのポアを有し、そのサイズは数μm〜十数μm、好ましくは３μm〜15μm、さらに好ましくは５μm〜10μm、さらに好ましくは７μm〜９μmである。ポーラス膜の材質として、ポリエチレンテレフタレート（PET）、ナイロン、ニトロセルロース、ポリジメチルシロキサン（PDMS)、コラーゲンビトリゲル等が挙げられる。例えば、Falcon(登録商標）Cell Culture Insertsに含まれるポーラス膜を用いることができる。
【００３０】
上層用マイクロ流路チップに、下層用マイクロ流路チップと上層用マイクロ流路チップをポーラス膜を隔てて積層したときに、下層用マイクロ流路チップの開口部の両端に存在する開口部に重なる穴が存在し、該穴を通して下層用マイクロ流路チップのチャネルの端に存在する開口部に細胞及び細胞培養用試薬を添加することができる。例えば、図１１−２において、上層用マイクロ流路チップには、下層用マイクロ流路チップ（Ａ）の各チャネルの両端の開口部と重なる位置に円状の穴が存在する。
【００３１】
２．２層式流路デバイスの作製
特定のチャネル構造を有するマイクロ流路チップの作製は、フォトリソグラフィ法、ソフトリソグラフィ法、マイクロコンタクトプリンティング法、マイクロフルイディスク法、ステンシル法等の種々の方法を用いて作製することができる。この中でもフォトリソグラフィ法が好ましい。フォトリソグラフィ法においては、フォトレジストと呼ばれる感光性有機物を基板にコートし、フォトリソグラフィック・マスクを介して紫外線などを照射することでマスクに描かれた幾何学パターンを基板表面へと転写する。そこへシランなどの自己組織化膜を形成した後に、フォトレジストを除去することでタンパク質などの吸着領域を作ることができる。この方法は，非常に細かい形状まで制御できる。
【００３２】
フォトリソグラフィ法による作製は以下の工程で行えばよい。
【００３３】
最初にシリコン基板上にフォトリソグラフィ法によって流路のモールドを作製する。次いで、モールドにPDMS（ポリジメチルシロキサン）プレポリマーを流し込むことによりキャスティングし、オーブンで固めた後、モールドから剥がし、ガラス基板と接着させることにより作製することができる。
【００３４】
上層用マイクロ流路チップも下層用マイクロ流路チップもフォトリソグラフィ法により作製することができ、ポーラス膜を介して上層用マイクロ流路チップと下層用マイクロ流路チップを重ね合せ、シランカップリングにより接着することができる。この際、マイクロ流路チップ及びポーラス膜を疎水性にするために、マイクロ流路チップ及びポーラス膜をプラズマ処理することが好ましい。
【００３５】
３．３次元培養モデル（外側血液網膜関門モデル）
本発明の２層式流路デバイスの下層用マイクロ流路デバイスで血管内皮細胞（VEC：Vascular endothelial cells)及び線維芽細胞（Fibroblasts)を共培養し、かつ上層用マイクロ流路デバイスで接着性細胞を培養し、下層用マイクロ流路デバイスの細胞と上層用マイクロ流路デバイスの細胞を共培養することにより種々の組織の３次元培養モデルを作製することができる。
【００３６】
例えば、接着細胞として肺胞上皮細胞を用いた場合、肺の３次元培養モデルを作製することができ、ヒト腸上皮細胞を用いた場合、腸の３次元培養モデルを作製することができ、心筋細胞を用いた場合、心臓の３次元培養モデルを作製することができ、腎尿細管細胞を用いた場合、腎臓の３次元培養モデルを作製することができ、肝細胞を用いた場合、肝臓の３次元培養モデルを作製することができ、脳微小血管内皮細胞を用いた場合、血液脳関門モデルを作製することがでる。
【００３７】
この３次元培養モデルにおいては、下層用マイクロ流路デバイスにて血管系が形成され、上層用マイクロ流路デバイスにて接着性細胞の層が形成され、血管系とその上層の細胞層を有する組織の３次元培養モデルとなる。
【００３８】
例えば、上層用マイクロ流路デバイスで網膜色素上皮細胞（RPE：Retinal pigment epithelial cells)を培養し、下層用マイクロ流路デバイスの細胞と上層用マイクロ流路デバイスの細胞を共培養することにより外側血液網膜関門（oBRB: Outer blood-retinal barrier)モデルを作製することができる。以下、外側血液網膜関門モデルについて説明する。
【００３９】
下層用マイクロ流路チップにおいては、管腔構造を有する３次元の微小血管系が再現される。この血管系は、脈絡膜の微小血管系を再現したものであり、下層用マイクロ流路チップは脈絡膜のモデルとなる。また、上層用マイクロ流路チップにおいては、網膜色素上皮細胞層(RPE層）が形成される。２層式流路デバイスのポーラス膜は、外側血液網膜関門のブルッフ膜を模擬している。すなわち、本発明の外側血液網膜関門モデルは、下層の血管系と上層の網膜上皮細胞の共培養系のモデルである。
【００４０】
本発明の外側血液関門モデルは以下の工程で作製することができる。
【００４１】
下層用マイクロ流路チップにおける血管系は、以下の(i)〜(iii)の工程により形成される。
(i)  下層用マイクロ流路チップの血管内皮細胞を培養するための第１の細胞用チャネルに血管内皮細胞を添加する。
(ii)  下層用マイクロ流路チップの培養液チャネルに培養液を満たす。
(iii)  下層用マイクロ流路チップの線維芽細胞を培養するための第２の細胞用チャネルに線維芽細胞を添加する。
【００４２】
(i)〜(iii)の工程は、順不同に行ってもよいが、この順番で行うことが好ましい。細胞懸濁液や培養液のチャネルへの添加は、チャネルの端の開口部（インレット）から行えばよい。
【００４３】
次いで、上層用マイクロ流路チップに網膜色素上皮細胞を添加し培養する。上層用マイクロ流路チップへの網膜色素上皮細胞の添加は、好ましくは下層用マイクロ流路チップにおいて血管系が形成された後に行う。この結果、下層用マイクロ流路チップの細胞と上層用マイクロ流路チップの細胞を共培養することになる。
【００４４】
本発明の外側血液網膜関門モデルにおいては、下層用マイクロ流路チップで血管系を形成させ、上層用マイクロ流路チップで網膜色素上皮細胞を培養する。
【００４５】
下層用マイクロ流路チップの第１の細胞用チャネルにおいて血管内皮細胞を培養するとき及び第２の細胞用チャネルにおいて線維芽細胞を培養するとき、細胞をフィブリンゲルに包埋した状態で培養することが好ましい。細胞をフィブリンゲルで包埋するには、細胞用チャネルにフィブリノーゲン溶液と細胞懸濁液を混合して添加し、さらにトロンビンを添加すればよい。細胞懸濁液の細胞密度は、限定されないが、2.0×106cells/ml〜5.0×107cells/ml、好ましくは5.0×106cells/ml〜2.0×107cells/ml、さらに好ましくは1.0×107cells/mlである。フィブリノーゲン溶液は１mg/ml〜50mg/ml、好ましくは5mg/ml〜15mg/ml、さらに好ましくは10mg/mlの濃度で用い、フィブリノーゲン溶液と細胞懸濁液を１：１〜１：10、好ましくは１：２〜１：５、さらに好ましくは１：３で混合すればよい。トロンビンは、10U/ml〜100U/ml、好ましくは25U/ml〜75U/ml、さらに好ましくは50U/mlの濃度のものを終濃度0.5U/ml〜３U/ml、好ましくは0.75U/ml〜1.25U/ml、さらに好ましくは１U/mlとなるように添加すればよい。細胞懸濁液の混合液をチャネルに1μl〜10μl添加すればよい。
【００４６】
血管内皮細胞は、あらかじめEBM（Endothelial Cell Basal Medium）等の内皮細胞用培養液で培養し、線維芽細胞は、あらかじめFBM（Fibroblast Cell Basal Medium）等の線維芽細胞用培養液で培養すればよい。
【００４７】
下層用マイクロ流路チップの培養液チャネルに添加する培養液は細胞培養に用い得る培養液を用いることができる。このような培養液として、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM：Dulbecco's Modified Eagle Medium）、RPMI-1640培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM:Iscove's Modified Dulbecco's Medium）等が挙げられる。好ましくは、EBM（Endothelial Cell Basal Medium）等の内皮細胞用培養液を用いる。培養液は、適宜抗生物質、FBS（ウシ胎児血清）、アミノ酸等のサプリメントを添加して用いる。
【００４８】
上層用マイクロ流路チップで網膜色素上皮細胞を培養するときは、好ましくは細胞チャネルをフィブロネクチンでコーティングする。フィブロネクチンは大きな繊維状の細胞接着性糖タンパク質であり、それぞれ約2500個のアミノ酸残基からなる2つのサブユニットが、カルボキシル末端近くでS-S結合（ジスルフィド結合）で繋がった二量体で、球状領域と柔軟な線状領域とが交互に繰り返す構造をしている。主に繊維芽細胞、肝細胞、神経細胞などの接着を促進する。細胞膜表面の受容体タンパク質であるインテグリンを介し、細胞接着のほか、細胞移動、増殖の促進、さらに組織修復に関わっている。
【００４９】
上層用マイクロ流路チップで網膜色素上皮細胞を培養するときには、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM：Dulbecco's Modified Eagle Medium）、RPMI-1640培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM:Iscove's Modified Dulbecco's Medium）等を用いればよい。培養液は、適宜抗生物質、FBS（ウシ胎児血清）、アミノ酸等のサプリメントを添加して用いる。
【００５０】
本発明においては、培養液、フィブリノーゲン溶液、トロンビン等の細胞培養時に用いる物質を培養用試薬と呼ぶ。
【００５１】
下層用マイクロ流路チップにおいては、血管内皮細胞と線維芽細胞が培養液チャネルを介して共培養され、線維芽細胞から分泌される線維芽細胞成長因子（bFGF：basic Fibroblast Growth Factor)や血管内皮増殖因子（VEGF：Vascular Endothelial Growth Factor）等のサイトカインが培養液チャネルを通って、血管内皮細胞の第１の細胞チャネルに到達し、血管内皮細胞が結合し、ネットワークを形成して、血管系が形成される。すなわち、血管系は血管内皮細胞及び線維芽細胞の相互作用により形成される。この際、細胞間には、タイトジャンクションが形成され、タイトジャンクションを構成するXZO-1タンパク質が発現している。
【００５２】
上層用マイクロ流路チップにおいては、網膜色素上皮細胞層が形成される。細胞間には、タイトジャンクションが形成され、タイトジャンクションを構成するXZO-1タンパク質が発現している。また、網膜色素上皮細胞層はバリア機能を有している。さらに、培養液として、低グルコース濃度（1.0g/L）の培養液を用いた場合、VEGFの分泌が促進される。これはRPE細胞が異常を検知し、VEGFを異常分泌するという生体内の挙動と一致する。
【００５３】
４．外側血液網膜関門モデルの利用
脈絡膜（Choroid）は、強膜と網膜のあいだに位置する厚さ0.1mm〜0.3mmの血管と色素に富んだ褐色の膜状組織である。外側は強膜、内側は網膜に接する。脈絡膜の機能として網膜の栄養のほかに、眼内温度及び眼圧の調整作用、遮光などがあるとされている。組織的には網膜側から、ブルッフ膜、脈絡毛細血管版、血管層、脈絡上板の４層に分けられる。ブルッフ膜は脈絡膜の構成成分の１つで、最も網膜側に位置し2μm程度の膜でRPEに接している。この膜は網膜と脈絡膜の間の接着、物質代謝などに関与している。ブルッフ膜は脈絡毛細血管板とRPE層との間にあり、網膜視細胞の機能維持として複合体(RPE-CC complex)を担う。網膜側から、RPEの基底膜、内側膠原線維層、弾性線維層、外側膠原線維層、脈絡毛細血管の基底膜の５層から構成される。１０層から成る網膜は、硝子体内側の９層から成る感覚網膜と脈絡膜側のRPE層に大別され、その恒常性を厳密に維持するために、血液網膜関門（BRB）が存在し、全身循環・網膜間の物質移動の他、脈絡膜と網膜間の物質移動を制限している。眼底の微小循環は、主に網膜毛細血管と脈絡膜毛細血管に分類され、BRBは網膜毛細血管細胞を実体とする内側血液網膜関門（inner BRB）、およびRPE細胞を実体とする外側血液網膜関門（outer BRB）の構造的に異なる２つの関門によって構成されており、いずれのBRBの障害も視力に悪影響を及ぼす重大な慢性網膜疾患に繋がる。
【００５４】
網膜毛細血管内皮細胞の周囲はペリサイトで、さらにその外側が網膜の主要なグリア細胞であるミュラー細胞で覆われており、これらの細胞が相互作用することで、inner BRBの恒常性を維持している。毛細血管における内皮細胞に対するペリサイトが１対１の割合で存在している。inner BRBの障害は、網膜に無血流領域を出現させ、これらの領域に血液を供給するために新生血管を発生させる。この病的な新生血管は脆弱で破綻しやすいため、血液成分の血管外への漏出や出血を引き起こして網膜機能が障害される。Outer BRBは、神経網膜と脈絡膜の間に存在するRPE細胞やコラーゲン繊維などから成るブルッフ膜によって構成されており、透過性が高い脈絡膜毛細血管から血液成分が神経網膜に侵入するのを制限している。RPE細胞の機能が低下すると、RPE細胞の基底膜であるブルッフ膜との間に沈着物（ドルーゼン）が溜まったり、脈絡膜からの新生血管の侵入により、網膜機能が障害される。これまでバリア機能の低下は、RPE細胞そのものに原因があると考えられていたが、最近では、脈絡膜毛細血管の循環障害もouter BRBの恒常性を破綻させる大きな要因であると推測されている。また、脈絡膜新生血管の約１０％は骨髄細胞由来であるということも明らかになってきている。
【００５５】
本発明の外側血液網膜関門モデルは、網膜の外側血液網膜関門を単純化した培養モデルであり、血管の３次元構造が再現されており、血管動態の観察が可能であり、網膜疾患の病態メカニズムの研究等に用いることができる。また、本発明の外側血液網膜関門モデルを用いて、網膜疾患の予防又は治療薬をスクリーニングすることができる。
【００５６】
ここで、本発明の外側血液網膜関門モデルを用いて解明し得る網膜疾患として、加齢黄斑変性、緑内障、糖尿病網膜症、網膜色素変性症、脈絡膜新生血管等の網膜疾患が挙げられる。
【実施例】
【００５７】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５８】
[実施例１]  マイクロ流路チップにおける脈絡膜（血管）モデルの形成
１．マイクロ流路チップの作製
最初に、血管形成に使用したマイクロ流路チップに関して説明する。
マイクロ流路チップの作製方法の概要を図３に示す。最初にシリコン基板上にフォトリソグラフィによって流路のモールドを作製した（図３左）。フォトリソグラフィ法、半導体加工プロセスに利用されている方法である。フォトレジストと呼ばれる感光性有機物を基板にコートし、フォトリソグラフィック・マスクを介して紫外線などを照射することでマスクに描かれた幾何学パターンを基板表面へと転写する。そこへシランなどの自己組織化膜を形成した後に、フォトレジストを除去することでタンパク質などの吸着領域を作ることができる。
【００５９】
そしてモールドにPDMS（ポリジメチルシロキサン）プレポリマーを流し込むことによりキャスティングし(図３中央）、オーブンで固めた後、モールドから剥がし、ガラス基板と接着させることによって（図３右）、作製した。PDMSプレポリマーは、PDMSと硬化剤を10:1の割合で混合し作製した。
【００６０】
以下に具体的な流路の作製手順を示す。
(1)  シリコン基板にSU-8 3050を500rpm、10秒間の後、1200rpmで30秒間スピンコートし、95℃、45分間ホットプレートで加熱した。その後、室温で15分間置いた。
(2)  流路状にパターニングしたフォトマスクを基板に貼り付け21秒間露光した。
(3)  65℃、1分間で加熱した後、95℃、5分間ホットプレートで加熱した。現像液に浸した後、エタノールIPで洗浄し、95℃、30分間でハードベークした。
(4)  PDMSと硬化剤を10 : 1の割合で混合したPDMSプレポリマーを作製したモールドに流し込み70℃、3時間で硬化させた。
(5)  ディスポメスとピンセットを用いてマイクロ流路構造を取り外した。
(6)  生検トレパンを用いてマイクロ流路構造に液体注入用の穴を開け、プラズマ処理した後、ガラス基板と接着した。
【００６１】
実際に作製したマイクロ流路チップの構造を図４−１に示す。マイクロ流路チップのサイズは３cm×３cmであった。図４−１Ａはマイクロ流路チップの写真であり、図４−１Ａに示すように、流路は末端に開口部を有する5本のチャネルを有する。図４−１Ｂはマイクロ流路チップに色水を導入したときの顕微鏡上面写真を示す。図４−１Ｂに示すように、チャネル間には、台形状の形状を有する微小なポスト（マイクロポスト）が並んでいる構造になっている。図４−１Ｃはマイクロ流路チップのインレットから液体を導入している様子を示す。中央のチャネルを血管チャネルと呼び（図４−２の１）、その外側のチャネルを培養液チャネルと呼び（図４−２の３）、その外側のチャネルをLFチャネルと呼ぶ（図４−２の２）。血管チャネルは1000μm、培養液チャネル及びLFチャネルはそれぞれ700μmの幅を持ち、チャネル間を図のような多角形状のマイクロポストが仕切る構造とした。また、チャネルの高さはフォトレジストの膜厚を制御することによって、150μmに設定した。チャネル内部は疎水性であるため、ポスト間には液体の表面張力が発生し、液体を流してもチャネル外に漏れ出ていかない構造になっている。このため、このマイクロ流路によって細胞をそれぞれのチャネルにパターニング(配置）することができる。さらに、図４−２にマイクロ流路チップのチャネル内部の拡大図を示す。黒で表された部分はマイクロポストを示す。図４−３は、マイクロ流路チップの流路のデザインを示す。
【００６２】
２．血管形成モデルの作成
次に血管形成の手順を紹介する。上記のように、マイクロ流路チップは5本のチャネルを有する（図４−２）。まず、中央の１チャネル（図４−２の１）に血管内皮細胞とフィブリノーゲンの懸濁液を導入した。次に、線維芽細胞も同様にフィブリノーゲンと懸濁して、一番外側の２本のチャネル（図４−２の２）に導入した。次いで、37℃のインキュベータでこのフィブリノーゲンをゲル化させた後に、細胞を導入したチャネルの間のチャネル（図４−２の３）に培養液を導入した。その後、デバイスをインキュベータで培養することによって、血管を形成させた。
【００６３】
ここで、血管内皮細胞とともに培養している線維芽細胞は、生体内の組織を構成する細胞であり、傷や炎症を治す因子を分泌し、HUVECの成長を促進させ、血管の形成を促進させる目的で共培養した。
【００６４】
血管内皮細胞及び線維芽細胞としては、緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescent Protein；GFP)を恒常的に発現させたヒト臍帯静脈内皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells；HUVEC)とヒト肺線維芽細胞(Normal Human Lung Fibroblast；NHLF（単にLFと呼ぶこともある）)を使用した。どちらも足場依存性細胞であるため、細胞培養フラスコを用いて培養を行った。培養はインキュベータ(ミニCO2インキュベータ4020型、朝日ライフサイエンス)内において，CO2濃度5%、湿潤な環境下で培地はそれぞれ以下のものを使用した．HUVEC及びNHLFの培養に用いた培地は以下のとおりであった。
GFP-HUVEC（フナコシ株式会社）：
EBM(hEGF 0.5ml, VEGF 0.5ml, R3-IGF-1 0.5ml, Ascorbic acid 0.5ml, Hydrocortisone 0.2ml, hFGF-β 2.0ml, Heparin 0.2ml, FBS 10ml, GA 0.5ml 含有)に、Antibiotic-Antimycotic 1%を添加した培地
NHLF：
FBM (Insulin 0.5ml, hFGF-β 0.5ml, GA 0.5ml, FBS 10ml 含有)に、Antibiotic-Antimycotic 1%を添加した培地 
【００６５】
細胞の生死判定は、Calcein-AM又はPI（Propidium Iodie)で染色することにより行った。細胞の免疫染色は、細胞間結合（タイトジャンクション）を構成するタンパク質の１つである。ZO-1の染色は抗ZO-1抗体を用いて行い、細胞核の染色はDAPIを用いて行った。
【００６６】
以下に、HUVECの単独培養とHUVECとNHLFの共培養の具体的な手順を示す。
【００６７】
HUVEC単独培養
（１）  デバイスを70℃のオーブンで24時間放置し、流路作製時にプラズマ処理によって親水性に変化したチャネル内部を疎水性に戻した。その後、デバイスにUV滅菌（20分間）を施した。
（２）  D-PBS(-)で10mg/mlに希釈したフィブリノーゲンをSartorius syringe filterで滅菌した。
（３）  培養フラスコからトリプシン処理し剥がしたGFP-HUVECをEBMで懸濁し、1.0×107 cells/mlで用意した。
（４）  フィブリノーゲン溶液と細胞懸濁液を1 : 3の割合で混合した。
（５）  （４）作製した混合溶液にトロンビン(50U/ml)を1U/mlになるよう加え、デバイスの中央のチャネルに注入した。
（６）  5分間インキュベートし、フィブリンゲルを固めた後、両脇のチャネルを培養液(EBM)で満たし、インキュベータで培養した。
【００６８】
図５にHUVEC単独培養のときの流路への細胞導入の方法を示す。
なお、培地交換は2日に1回の頻度で行った。
【００６９】
HUVECとNHFLの共培養
HUVECの血管形成を促進させるために流路内でHUVECとNHLFを共培養した。上述した培地チャネルのさらに両脇のチャネルにNHLFをフィブリンゲルに包埋し、培養した（図６）。
（１）  HUVEC単独培養時の手順（５）と同様の操作を行った。
（２）  5分間インキュベートし、フィブリンゲルを固めた。
（３）  培養フラスコからトリプシン処理し剥がしたNHLFをEBMで懸濁し、1.0×107 cells/mlで用意した。
（４）  フィブリノーゲン溶液とNHLF懸濁液を1:3の割合で混合した。
（５）  （４）で作製した混合溶液にトロンビン(50U/ml)を1U/mlになるよう加え、デバイスの両脇(繊維芽細胞)チャネルに注入した。
（６）  5分間インキュベートし、フィブリンゲルを固めた後、培地チャネルを培養液(EBM)で満たし、インキュベータで培養した。
【００７０】
図６にHUVECとLFの共培養の方法を示す。
【００７１】
潅流試験 
作製した血管系に生体と同様の潅流能力があるかを調査した。血管チャネルで血管形成を確認後、培地チャネルに蛍光ビーズ(Fluoresbrite（登録商標） YG Carboxylate Microsperes, φ3.0μm, Polysciences)及び蛍光デキストラン(FITC-dextran 70kDa, Invitrogen )を導入し、血管の潅流性を観察した。
【００７２】
血管形成の実験結果を図７に示す。
【００７３】
図７ＡはHUVECのみで培養した場合の結果を示し、図７ＢはHUVECとLFとを共培養した場合の結果を示す。図７の左のパネルは、デバイスを上から見た時の模式図を示し、中央のパネルは、細胞とゲルを注入直後の顕微鏡写真を示し、右のパネルは、培養３日後の顕微鏡写真を示す。HUVECのみで培養した場合は、播種直後は細胞は丸い形をしており、ゲル内部で接着していなかったが、培養3日目にはゲル内部で細胞が接着し伸長や細胞同士の結合が観察された。しかしながら、血管は形成されなかった（図７Ａ）。一方、HUVECとLFとを共培養したものは培養3日目で、HUVEC同士がネットワークを形成し、マイクロ流路チップの流路内で血管網の形成が観察された（図７Ｂ）。形成された血管系は最長で21日間培養した。
【００７４】
播種直後は単独培養同様、HUVECは粒形状をしていたが、時間が経過するとともに、多くの細胞が結合し、ネットワークを形成することが観察された。単独培養のものと比較すると、明らかに共培養時の方がHUVECの増殖や結合を多く観察できた。これはNHLFから分泌されるサイトカイン（bFGF, VEGFなど）が隣接する培地を通って、血管チャネルまで到達し、HUVECに作用したからであると考えられる。
【００７５】
形成された血管を共焦点レーザー顕微鏡（LSM700、Carl Zeiss）を用いて、断面を撮影した。ZO1と呼ばれる細胞間結合のタンパク質を赤、HUVECの細胞質を緑、細胞核をDAPIにより青色に染めて観察した。図８に結果を示す。図８に示すように、このように断面を切ってみると、HUVECによって中空の管腔構造が観察された。また、細胞間結合を示すタイトジャンクションの染色色（赤色）が血管系に確認されたことから、血管系のバリア機能が発現したこと示唆された。
【００７６】
また、デバイスの培養液のチャネルから直径２μmの蛍光ビーズを流して潅流試験を行ったところ、血管内部を通って、片方のチャネルに流れ出ていく様子も観察できたが、血管外への漏出は確認されなかった。断面を撮影してみても、図９に示すように、黄色の蛍光ビーズが緑色の血管内部に留まっていた。
【００７７】
一方で、デバイスの培養液のチャネルから70kDaの蛍光デキストランを流してみたところ、図１０に示すように、流した直後は、血管の中だけを通っていたが、30分後には血管から拡散していく様子が観察された。このことは、作製した血管は生体内の血管と同様に潅流可能で、かつ物質透過性があることを示唆している。
【００７８】
[実施例２]  ２層構造の流路デバイス（２層流路デバイス）の作製
実施例１で、外側網膜でいう脈絡膜の部分を作製した。本実施例では、脈絡膜と網膜色素上皮細胞（RPE: retinal pigment epithelium）層を共培養可能なマイクロ流路デバイスを作製した。
【００７９】
これは、血管形成のための流路とポーラス膜、RPE細胞培養用の流路を重ねて組み合わせた２層構造の流路デバイス（２層流路デバイス）となる。ポーラス膜は、ブルッフ膜を模擬している。図１１−１に２層流路デバイスの作製方法の概要及び構造を示す。また、図１１−２に２層流路デバイスの作製に使用したフォトマスクのデザインを示す。Ａが下層のマイクロ流路チップのデザインであり、Ｂが上層のデザインである。図１１−２に示すように、下層用マイクロ流路チップと上層用マイクロ流路チップを積層したときに、下層用マイクロ流路チップの開口部の両端に存在する開口部に重なる穴が存在し、該穴を通して下層用マイクロ流路チップのチャネルの端に存在する開口部に細胞及び細胞培養用試薬を添加することができる。
【００８０】
本実施例では、緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescent Protein, GFP)を恒常的に発現させたヒト臍帯静脈内皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)とヒト肺線維芽細胞(Normal Human Lung Fibroblast, NHLF)、ヒト網膜色素上皮細胞(Retinal Pigment Epithelial Cells, RPE)を使用した。いずれも足場依存性細胞であるため、細胞培養フラスコを用いて培養を行った。培養はインキュベータ(ミニCO2インキュベータ4020型、朝日ライフサイエンス)内において、CO2濃度5%、湿潤な環境下で行い、培地はそれぞれ以下のものを使用した。
【００８１】
GFP-HUVEC：
EBM(hEGF 0.5ml, VEGF 0.5ml, R3-IGF-1 0.5ml, Ascorbic acid 0.5ml, Hydrocortisone 0.2ml, hFGF-β2.0ml, Heparin 0.2ml, FBS 10ml, GA 0.5ml 含有)に、Antibiotic-Antimycotic 1%を添加した培地 
NHLF：
FBM (Insulin 0.5ml, hFGF-β 0.5ml, GA 0.5ml, FBS 10ml 含有)に、Antibiotic-Antimycotic 1%を添加した培地 
RPE：
DMEM (D-glucose 4.5g/L, Phenol Red 15mg/L, Sodium Pyruvate 110mg/L 含有)に、Antibiotic-Antimycotic 1%，FBS(Fetal Bovine Serum)10%を添加した培地 
RPE(コンフルエント時)：
DMEM (D-glucose 4.5g/L, Phenol Red 15mg/L, Sodium Pyruvate 110mg/L 含有)に、Antibiotic-Antimycotic 1%，FBS1%を添加した培地 
RPE(コンディショニング時)：
DMEM (D-glucose 1.0g/L, Phenol Red 15mg/L, Sodium Pyruvate 110mg/L 含有)に、Antibiotic-Antimycotic 1%，B-27 Supplement(Gibco)を添加した培地
【００８２】
本実施例の２層構造の流路デバイス（２層流路デバイス）は実施例１で使用したマイクロ流路チップと市販のセルカルチャーインサート(Falcon（登録商標） Cell Culture Inserts，ポアサイズ : 8.0μm、353093)のポーラス膜、直線形状のチャネルを持つマイクロ流路デバイスを組み合わせることにより作製した。ポーラス膜を2つのマイクロ流路デバイスで挟み込むことによって、下層には血管系、ポーラス膜を隔てて、上層にはRPE細胞単層という構造を有する。
【００８３】
フォトリソグラフィ法を用いて2つのマイクロ流路デバイスを作製し、それぞれを組み合わせることによって2層式マイクロ流路デバイスを作製した。以下に作製手順を示す。
（１）  実施例１におけるマイクロポストアレイ流路デバイスの作製手順と同様にして、上層、下層それぞれのマイクロ流路デバイスをフォトリソグラフィ法によって作製した。
（２）  セルカルチャーインサート底面のポーラス膜をディスポメスで取り外し、流路のサイズに合うように加工した。
（３）  （２）で加工したポーラス膜にプラズマ処理を施し、80℃のアミノプロピルメトキシシラン：APMS（sigma）5 %溶液に30分間浸けた。
（４）  （１）で作製したそれぞれのマイクロ流路デバイスも同様にプラズマ処理を施し、脱イオン水で洗浄した（３）のポーラス膜を流路で挟み込むことで接着させた。なお、上層チャネルが下層マイクロ流路デバイスの中央のチャネルに重なるようにアセンブリは顕微鏡下で行った。
（５）  プラズマ処理によって失われた疎水性を取り戻し、接着をより強固にするために、作製した2層マイクロ流路デバイスを80℃オーブン内で3時間放置した。
【００８４】
図１２Ａに実際に作製した２層流路デバイスの上面からの写真を示し、図１２Ｂに断面写真を示す。図１２Ｂに示すように、断面から観察した場合、脈絡膜用の流路の上部にポーラス膜で隔てた新たなチャネルが追加されており、２層構造の流路が形成されているのがわかる。加えて、本実験におけるこの２層構造においても、下層流路は隣り合うチャネルやポーラス膜のポアから漏れなく液体を注入することができた。
【００８５】
作製した２層構造の流路デバイスを用いることで、目的である外側網膜関門を模擬した、血管系とRPE細胞の共培養が可能となる。図１３に実際の外側網膜関門の模式図を示す。図１３に示すように、脈絡膜の上にブルッフ膜を隔てて網膜色素上皮細胞（RPE）層が存在する。作製した２層構造の流路の上層にRPEを培養したものは、実際の外側網膜関門を模擬した構造を有する。
【００８６】
[実施例３]  共培養系の構築と評価
本実施例では、作製した２層式マイクロ流路デバイス内での細胞培養に取組んだ。上層でRPE細胞を培養し、各種刺激を与えることにより、細胞層のバリア機能を評価した。さらに、下層にて血管を形成させた後、上層にRPE細胞を播種して共培養系を構築した。
【００８７】
１．共培養系の構築
実施例２で作製した２層構造の流路の上層にRPE細胞を培養して評価を行った。上層流路にフィブロネクチンをコーティングし、細胞懸濁液を導入することで細胞を播種した。以下にその方法を示す。
（１）  下層流路の血管チャネルと線維芽チャネルをフィブリノーゲンで満たし、ゲル化させた。
（２）  ゲル化後、下層の培養液チャネルをDMEMで満たした。
（３）  上層流路にフィブロネクチン(10μg/ml)（和光純薬）を導入し、2時間静置した。 
（４）  流路内部をPBSで洗浄後、培養フラスコからトリプシン処理によって剥がし、DMEMで懸濁したRPE細胞(1.0×107cells/ml)10μlを上層流路内部に導入した。
（５）  30分間静置後、インレットから培養液(DMEM)を導入し、インキュベータで培養した。
【００８８】
図１４に２層構造の流路デバイスの上層の流路にRPE細胞を播種した状態の模式図を示す。播種したRPE細胞は30分程度でメンブレン上に接着し、培養２日後には上層の流路上で増殖してコンフルエントになった。図１５に播種30分後のRPE細胞の状態を示す写真（Ａ）、及び播種２日後のRPE細胞の状態（Ｂ）を示す写真を示す。播種したRPE細胞は上層のみに導入され、下層には細胞が観察されなかった。これは、上層からポーラス膜のポアを通り抜け、下層側に入る細胞がなかったことを示している。また、導入した細胞は播種後30分間程度でチャネル上に接着し、その後増殖していく様子が観察された。2日後には細胞がコンフルエントの状態になり、免疫染色により細胞間のタイトジャンクションを示すZO-1の発現も確認された。
【００８９】
２．RPE細胞の結合の評価
また、RPE細胞は細胞同士が結合することで、バリア機能を発揮し、血液網膜関門を担い、物質輸送の制御を行っている。図１６にRPE細胞が結合している模式図を示す。そこで、流路上のRPE細胞においても細胞同士の結合が認められるかを調べるために、RPE細胞に対して、細胞間の結合タンパクであるZO1をAlexa-Flour 546で修飾した抗ZO1抗体を用いて赤く染色し、細胞核をDAPIを用いて青色に染めた。結果を図１７に示す。図１７において、細胞核が青く染まっており（モノクロでは、グレーに見える）、細胞と細胞の間が赤く染まっている。すなわち、図１７は、細胞のまわりに赤色のZO1が発現していることを示している。この結果は、PRE細胞同士が結合していることを示す。
【００９０】
３．RPE細胞のバリア機能の評価
次に、RPE細胞層のバリア機能を定量的に評価した。生体内ではRPE細胞の単層が神経網膜と脈絡膜間に存在し、血液網膜関門（oBRB）を担い、バリア機能を発揮している。RPE細胞を含む上皮細胞は体内の物質を外へ漏らさない。体外の物質を不必要に入れないという生体防御機能を有している。バクテリアのような比較的大きなものの侵入を防ぐことから、水のような小さな分子の漏洩を防ぐことまで、バリア機能を果たすために細胞同士が密に接着している。マイクロ流路内におけるRPE細胞単層のバリア機能を評価するために、単層を形成させた後、RPE細胞が存在する上層流路に蛍光デキストラン(FITC-dextran 70kDa, Invitrogen)を流し、24時間後下層にどのくらいのデキストランが透過しているかを蛍光マイクロプレートリーダー(Gemini EM，Molecular Device)にて測定することにより評価した。この際、上層にRPE細胞層を形成したもの(正常時)、培養液にCoCl2(150μM)を加え疑似的低酸素状態にしたもの、RPE細胞を培養していないデバイスの３種類を比較した。また密着結合(タイトジャンクション)の有無を確認するため、ZO-1を免疫染色した。方法の概要を図１８に示す。
【００９１】
流路にRPE細胞を培養していないもの、RPE細胞をただ培養したもの、RPE細胞を低酸素状態で培養したものの３種類について評価を行った。低酸素状態は、好気反応が機能しない状態であり、生体内では継続するとがんや血管の病気になる病的な状態を示します。本実施例では、疑似的に低酸素状態を作り出すことのできる塩化コバルト（CoCl2）を150μMの濃度で培養液に添加することによって低酸素状態とした。
【００９２】
図１９に結果を示す。図１９は、下層に投下した蛍光デキストランの割合（％）を示す。図１９の割合は、100×（下層の蛍光強度）／（上層の蛍光強度＋下層の蛍光強度）で表される式により算出した。図１９に示すように、RPE細胞を培養していない場合に、ある程度下層に蛍光デキストランが透過しているのに対し、RPE細胞を培養した場合は、ほとんど透過していなかった。この結果は、RPE細胞は流路内でバリア機能を持つことを示している。一方で、疑似的低酸素状態にしたものに関して、正常時のものと差異がないことから、24時間の低酸素刺激ではRPE単層のバリア機能に影響を及ぼさないことが示唆された。カルチャーインサートでの培養におけるTEER測定においても正常時、低酸素時では変化が確認されなかった．また，図２０に示した低酸素状態下の顕微鏡写真（Ｂ）においてもコントロール（Ａ）と比較して細胞形状に変化は特に観察されなかった。
【００９３】
４．RPE細胞のVEGF分泌の評価
RPE細胞は血管内皮増殖因子（VEGF）を分泌し、脈絡膜の恒常性を維持している。しかしながら、加齢黄斑変性などの網膜疾患においてはこのRPE細胞に異常が発生し、VEGFを異常分泌する。そのVEGFによって以上に新生血管が起こるという病態がある。図２１にRPE細胞がVEGFを異常分泌した異常時（Ｂ）と正常時（Ａ）の眼底組織の状態を模式的に示す。
【００９４】
そこで、培養したRPE細胞が分泌するVEGF濃度をELISA法を用いて測定した。ELISAは市販されているHuman VEGF ELISA kit(R&D Systems)を使用した。RPE細胞が上層でコンフルエントになった後、導入していた培養液(DMEM glucose:5mM)を低酸素培養液（DMEM glucose:5mM + CoCl2:150μM）、高血糖培養液（DMEM glucose:30mM）に代えて、培養を行った。細胞の播種密度は1.0×107cells/mlであった。RPE細胞をただ培養した場合をcontrolとして、低酸素状態にした場合、及びグルコース濃度の高い、高血糖状態を模擬した場合について測定した。
【００９５】
図２２に結果を示す。図２２Ａに示すように、低酸素状態では、培養24時間でVEGF濃度が増加する傾向が見られ、図２２Ｂに示すように、高グルコース状態では、24時間では微量だった増加が、48時間後には大きく増加した。
【００９６】
この結果と実施例３の３のバリア機能の評価から、与えた病的条件ではバリア機能の破壊までは作用しないものの、細胞の分泌するVEGFの量が増加するという遺伝子レベルでの変化が発生していることが分かった。
【００９７】
５．脈絡膜モデルに対する血管新生の再現の評価
４の結果を踏まえ、作製した脈絡膜モデルに対して、血管新生を再現できるか実験を行った。実施例２で作製した２層構造の流路デバイスの下層にて血管を形成させた後、上層の培養液にVEGFを添加し、VEGF濃度100ng/mlとした。方法の概要を図２３に示す。24時間後に共焦点顕微鏡を用いて観察した。
【００９８】
図２４に結果を示す。図２４ＡにVEGF添加前の染色像を、図２４ＢにVEGF添加４日後の染色像を示す。上のパネルはモデルを上から見たxy平面の画像を示し、下のパネルがxy断面図の点線の部分で切った断面図を示す。図２４に示すように、VEGF添加前は血管が微小に管を形成していたが、4日後には血管から上に向かってHUVECが伸びている様子が観察された。VEGFへの反応が4日目以降に見られたのは、添加直後はVEGFが血管系の成熟に用いられ、十分に成熟した後に血管新生への因子として用いられたためであると考えられる。
【００９９】
延びているHUVECの高さ方向の同じ位置（z軸が同じ）のxy断面を観察した。結果を図２５に示す。図２５に示すように、時間の経過とともに添加前は小さかったHUVECが増殖して血管を形成しながら伸びている様子が観察された。なお、HUVECを単層で培養した場合は、細胞１つが遊走するのみであった。
この結果は、作製した血管系がVEGFに反応して血管新生を引き起こすことを示している。
【０１００】
６．網膜関門モデルの作製
最後に目的である網膜関門モデル（共培養系）を作製した。
実施例２で作製した２層構造の流路デバイスの下層で血管を形成させた後に、上層にRPE細胞を播種し、培養した。具体的には以下の手順で行った。
（１）  実施例２と同様の方法で下層流路に血管系を作製した。
（２）  上層流路にフィブロネクチン(10μg/ml)を導入し、2時間静置した。
（３）  上層流路内部をPBSで洗浄し、DMEMで懸濁したRPE細胞(3.0×107cells/ml)を導入した。
（４）  30分間静置後、インレットから培養液(EBM)を導入し、インキュベータで培養した。
【０１０１】
RPE細胞はCellTracker Redで染色した。
共培養系の概要を図２６に示す。
【０１０２】
作製した網膜関門モデルの蛍光顕微鏡観察像を図２７に示す。図２７Ａは作製した網膜関門モデルのRPE細胞層、図２７Ｂは血管層（下層）、図２７Ｃは両者の合成画像を示す。図２７が示すように、上層にはRPE細胞の単層、下層には血管系をそれぞれ形成させることに成功した。図２７Ｃは生体の構造と同様に血管構造の上部にRPE細胞の単層が形成されていることを示す。
【０１０３】
作製した網膜関門モデルの共焦点顕微鏡観察像を図２８に示す。図２８Ａは、共焦点顕微鏡観察像を示し、図２８Ｂは共焦点顕微鏡による断面観察像を示す。図２８Ｂに示すように、網膜関門モデルの上層には赤く染めたRPE細胞層が形成され、下層には緑色の血管系が形成された。本実施例により、血管層の上部にRPE細胞の層を形成することができ、目標としていた網膜のRPE細胞と3次元血管系の共培養モデルの構築に成功した。図２９に網膜関門モデルを模式的に示す。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明の外側血液網膜関門モデルを用いて網膜疾患の病態を解析したり、予防又は治療薬をスクリーニングすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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