(57)【要約】      （修正有）【課題】生殖医療分野における胚の品質を決定するための三次元再構成の方法を提供する。【解決手段】方法は、三次元再構成における胚の形態、フラグメンテーションの再区分、割球の分裂軸及び／又は細胞の再区分を決定する工程と、決定した三次元再構成における胚の形態、フラグメンテーションの再区分、割球の分裂軸及び／又は細胞の再区分をコントロールと比較する工程と、決定した三次元再構成における胚の形態、フラグメンテーションの再区分、割球の分裂軸及び／又は細胞の再区分が、コンピテントな胚の同基準と同一である場合、該胚がコンピテントであると結論し、決定した三次元再構成における胚の形態、フラグメンテーションの再区分、割球の分裂軸及び／又は細胞の再区分が、非コンピテントな胚の同基準と同一である場合、該胚が非コンピテントであると結論する工程と、を含む。【選択図】図５Ａ
2020109673.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚の品質を決定するためのin vitro非侵襲的方法であって、
ｉ）ヒト胚の連続断面画像を提供する工程、
ｉｉ）ヒト胚の三次元再構成を実施する工程、並びに
ｉｉｉ）前記三次元再構成における胚の形態、フラグメンテーションの再区分、割球の分裂軸及び／又は細胞の再区分を決定する工程
を含む、in vitro非侵襲的方法。
【請求項２】
ｉ）前記三次元再構成における胚の形態、フラグメンテーションの再区分、割球の分裂軸及び／又は細胞の再区分を決定する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で決定した前記三次元再構成における胚の形態、フラグメンテーションの再区分、割球の分裂軸及び／又は細胞の再区分をコントロールと比較する工程、並びに
ｉｉｉ）工程ｉ）で決定した前記三次元再構成における胚の形態、フラグメンテーションの再区分、割球の分裂軸及び／又は細胞の再区分が、コンピテントな胚の同基準と同一である場合、該胚がコンピテントであると結論し、工程ｉ）で決定した前記三次元再構成における胚の形態、フラグメンテーションの再区分、割球の分裂軸及び／又は細胞の再区分が、非コンピテントな胚の同基準と同一である場合、該胚が非コンピテントであると結論する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
胚の品質を決定するための請求項１に記載の方法であって、
ｉ）前記胚の連続断面画像を提供する工程、
ｉｉ）前記胚の三次元再構成を実施する工程、並びに
ｉｉｉ）割球の数、割球の規則性及びフラグメンテーション率を決定することによって、胚の形態を決定する工程、
ｉｖ）並びに、６〜８割球、レギュラーサイズの割球及び低いフラグメンテーション率（２５％以下）を有する場合、該胚がコンピテントであると結論し、より少ない割球（３日目で６細胞未満）、イレギュラーサイズの割球及び高いフラグメンテーション率（２５％超）を有する場合、該胚が非コンピテントであると結論する工程
を含む、方法。
【請求項４】
患者の妊娠転帰を向上させるための方法であって、ｉ）複数の胚を提供する工程、ｉｉ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法を実施することによって、該胚の品質を決定する工程、ｉｉｉ）最もコンピテントな胚を選択する工程、及びｉｖ）工程ｉｉｉ）で選択した胚を前記患者の子宮に移植する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は一般に、生殖医療の分野に関する。より具体的には、本発明は、胚の品質を決定するための方法及びデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
現在のところ、生殖介助術（ＡＲＴ）では、移植のための胚の選択は、光学顕微鏡法による形態学的基準評価に依拠している。胚の選択に伝統的に関与するパラメータは、ｉ）生成された胚を有する卵母細胞の形態及び受精、ｉｉ）割球の数及びサイズ、ｉｉｉ）割球の細胞質の外観、ｉｖ）フラグメンテーション率及びｖ）多核の存在である。この形態学的アプローチは、胚の形態の主観的な観察結果に専ら基づくものであり、操作者に依存するので、ＡＲＴにおいて妊娠の成功を予測するには限界がある（Guerif et al., 2007）。実際、現在のところ、in vitroで得られ、形態学的基準で移植用に選択された胚の８５％は、移植の失敗につながる。この結果は全く期待外れであり、光学顕微鏡法によるヒト卵母細胞及び胚の限定的な２Ｄ視覚化が正確性を欠くことを示唆している。したがって、ＡＲＴでは、早期着床前発生中のヒト卵母細胞及び胚の観察を改善して、ＡＲＴの成功を高める必要性が確実にある。
【０００３】
最近、このような選択を支援するための胚の形態動態学的データを取得するために、タイムラプスイメージングに基づく新たな方法が開発されている（Meseguer et al., 2011; Herrero and Meseguer, 2013）。それにもかかわらず、個々のウェルに含まれる胚は、７つの焦点面でしか観察されないので、タイムラプスシステムは、光学顕微鏡法と比較して、胚の形態評価を改善しない。実際、これらのシステムの主な限界は、球形の卵母細胞及び胚を回転又は転動させることができないことであり、特に、高いフラグメンテーション率又は胚盤胞期の場合には、形態を評価することが困難である。また、定期取得の画像は、明るい胚を必要とする。これらのシステムでは、光が比較的短い場合であっても、可能な限り長い波長を伴う可能な限り短い露光時間が好ましいはずである。
【０００４】
ヒト卵母細胞及び初期胚を研究のための、並びにその後に日常作業におけるＡＲＴの不成功をより良く理解するための新たな有益なツールを開発するために、３Ｄ技術の使用は、ＡＲＴにおける革新的で魅力的な方法である。実際、ヒト卵母細胞及び胚などの球形の生物学的構造を２Ｄ平面だけで詳細に分析することは非常に困難であると思われる。光学顕微鏡法の制約は、ヒト卵母細胞及び胚の観察を制限し、３Ｄイメージング方法は、マウスモデルのような高度な形態評価を可能とし得る（Nieman et al., 2011）。３Ｄ技術を用いて、卵母細胞の３Ｄの前核の位置、胚の３Ｄのフラグメンテーションの再区分、３Ｄの割球の分裂軸又は３Ｄの細胞の再区分などの他の多数の形態学的パラメータを研究し得る。３Ｄ技術によるヒト卵母細胞及び胚の観察の改善の主な目的は、ＡＲＴの成功の改善である。
【０００５】
過去数年間において、胚の解剖学的組織を研究し、マウスの形態学的表現型を特性評価するために、マウス胚の３Ｄ再構成では、切開して一連の組織学的切片及び固定切片を得る必要があった（Kaufman et al., 1997; Wong et al., 2012; Wong et al., 2014）。今日、光学イメージングの課題の１つは、その発展の追求のために、適合条件で生物学的構造及び有機物を３Ｄで観察することである。したがって、最近、いくつかの種において生存可能な胚の切片化を実施し、これらの胚の非侵襲的３Ｄ再構成を可能にするために、光学イメージング分野の新たな技術が開発されている。
【０００６】
これらの新たな光学イメージングシステムの中で、光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）は、マイクロメートルスケールの分解能を用いた生物媒体のための非侵襲的新興技術であり、眼科で主に使用される。フルフィールドＯＣＴと称される新たな独自のＯＣＴアプローチが、研究チームによって最近提案されており、白色光干渉顕微鏡法に基づくものである。フルフィールドＯＣＴは、ＣＣＤカメラなどの検出器アレイによって記録された干渉画像の組み合わせによって、断層写真を得ることを可能にする。従来のＯＣＴと比較して、フルフィールドＯＣＴは、簡便なハロゲンランプを使用して、超高分解能（約１μm）で横断方向の断層画像を取得する。興味深いことに、発生学及び発生生物学では、ex vivo標本の３Ｄイメージングのために、この技術の実施が使用されている。実際、マウス胚の３Ｄ再構成は、同じ分解能を用いて、標準的な組織学的方法よりも容易に実施される。また、組織学的切片と比較して、画像取得は高速であり、サンプルの調製及び固定後の薄切片の解剖を必要としない。
【０００７】
選択的平面照明顕微鏡法（ＳＰＩＭ）を含む光シート顕微鏡法もまた、サンプル中の照明面のみをイメージングする新たな技術であり、バックグラウンドシグナルを実質的に排除し、サンプルの検査に必要な光量を劇的に減少させる。実際、この技術は、生サンプル中の光毒性効果を減少させ、生きている状態で、リアルタイムで、それらに対する有害な効果及び損傷を伴わずに、生物学的構造を３Ｄで見ることを可能にする（Huisken et al., 2004, Huisken, 2012）。この概念は、焦点面でわずかな光によってサンプルのみを照明することに基づくものであり、フォトブリーチングが最小限に減少する。したがって、光シート顕微鏡法は、脆弱なサンプル又は生存可能なサンプルの非破壊的イメージングのための理想的なツールを構成する。発生学及び発生生物学の適用に関して、光シート顕微鏡法（ＳＰＩＭを含む）は、高分解能及び速い取得速度で胚を３Ｄイメージングするための魅力的なツールであると思われる一方、低侵襲性である。３Ｄ初期ゼブラフィッシュ胚及びdrosophila melanogaster胚発生の３Ｄ再構成は、発生生物学におけるＳＰＩＭ技術の可能性を示す（Huisken et al., 2004; Keller et al., 2008; Huisken and Stainier, 2009; Weber and Huisken, 2011; Kaufmann et al., 2012; Krzic et al., 2012, Huisken , 2012）。
【０００８】
したがって、光学顕微鏡法は、いくつかの焦点面からのマウス又はヒト胚の３Ｄ再構成及びプリンティングを実施することを可能にする。また、ＯＣＴ及び光シート顕微鏡法（ＳＰＩＭを含む）は、３Ｄ再構成及びプリンティングのためのヒト卵母細胞及び胚の非侵襲的画像取得を開発するための最も魅力的な技術革新である。ヒト発生学では、in vitroで得られた球形の卵母細胞及び胚の高度な観察について、これらの新たな光学イメージング方法の適用はまだ試験されていない。
【０００９】
さらに、いくつかの研究チームが、磁気共鳴イメージングを使用したマウス胚の３Ｄ再構成を含む図譜を提案しているが、ほとんどの場合において、初期胚を研究していなかった。マイクロ磁気共鳴イメージング（μＭＲＩ）をヒト卵母細胞及び胚の３Ｄ再構成に使用することはまた、卵母細胞及び胚の形態評価の魅力的な方法であり得るが、今日では、高磁場であっても（９．４Ｔであっても）、画像の空間分解能が十分ではない。
【００１０】
最近、人間医学では、３Ｄプリンティングの出現及びその適用が拡大している（Rengier et al., 2010; Hespel et al., 2014）。実際、これらの最近の技術的進歩は、３Ｄプリンタを使用して、ヒト軟骨組織、心臓弁、骨モデル又は頭蓋形成インプラントなどの複雑な構造を作製することを可能にする（Kim et al., 2012; Visser et al., 2013; Cui et al., 2014; Nakayama et al.,2014; Unger et al., 2014. Hochman et al., 2014; Tan et al., 2014）。外科手術と同様に、最近の研究では、３Ｄプリンタを使用したゼブラフィッシュ胚及び幼虫モデルの再現が報告されている（Masselinket al., 2014）。したがって、ヒト卵母細胞及び胚の３Ｄプリンティングは、現実の卵母細胞及び胚の発生に相当するより現実的な性質のいくつかのモデルの作製を可能にし得る。また、これらのヒト卵母細胞及び胚モデルは、発生学者のスタッフ、患者及び学生のための有益な教育上のトレーニング及びアップデートツールであり得る。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は一般に、生殖医療の分野に関する。より具体的には、本発明は、胚の品質を決定するための方法及びデバイスに関する。より具体的には、本発明は、胚の品質を決定するための三次元再構成の使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、in vitroにおける様々な発生段階の形態評価を改善するために、連続断面画像からヒト卵母細胞及び胚の３Ｄ再構成及び３Ｄプリンティングを可能にする方法に関する。本発明者らは、最良の胚の選択を支援するために、３Ｄ再構成及び３Ｄプリンティングが、ＡＲＴにおける非侵襲的技術革新であることを実証する。また、本発明者らは、ヒト又はマウス胚の３Ｄ再構成及びプリンティングが、標準的な光学顕微鏡切片から実施され得ることを実証する。ＯＣＴ又は光シート顕微鏡法（例えば、ＳＰＩＭ）のような新たな３Ｄ技術は、生存可能なヒト卵母細胞及び胚の３Ｄ再構成のための高品質な非侵襲的画像取得を可能にし得る。高空間分解能マイクロ磁気共鳴イメージングもまた、ヒト卵母細胞及び胚の形態を調査するための魅力的な方法である。胚の選択のための３Ｄ技術の使用は、ＡＲＴの成功を増加させると同時に、技術及び医薬形成のための教育的アプローチ、並びにＡＲＴ手術を受けている患者のための有益なツールである。
【００１３】
したがって、本発明は、胚の品質を決定するためのin vitro非侵襲的方法であって、
ｉ）前記胚の連続断面画像を提供する工程、
ｉｉ）前記胚の三次元再構成を実施する工程、並びに
ｉｉｉ）前記三次元再構成における胚の形態、フラグメンテーションの再区分、割球の分裂軸及び／又は細胞の再区分を決定する工程
を含むin vitro非侵襲的方法に関する。
【００１４】
いくつかの実施態様では、本発明は、卵母細胞の品質を決定するためのin vitro非侵襲的方法であって、
ｉ）前記卵母細胞の連続断面画像を提供する工程、
ｉｉ）前記卵母細胞の三次元再構成を実施する工程、及び
ｉｉｉ）前記三次元再構成における卵母細胞の前核の位置を決定する工程
を含むin vitro非侵襲的方法に関する。
【００１５】
一実施態様では、本発明は、本発明の胚又は卵母細胞の品質を決定するためのin vitro非侵襲的方法であって、情報科学自動セグメント化ツールを使用して、工程ｉｉｉ）を実施するin vitro非侵襲的方法に関する。
【００１６】
本明細書で使用される「胚」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、受精卵母細胞又は接合体を指す。「胚」という用語はまた、受精卵母細胞又は接合体から最大５又は６日の全ての発生段階（胚盤胞期）の細胞を指す。前記受精は、一般体外受精（ｃＩＶＦ）条件下で、又は卵細胞内精子注入法（ＩＣＳＩ）手順下で起こり得る。本発明の方法によって評価され得る胚の例としては、１細胞胚（接合体とも称される）、２細胞胚、３細胞胚、４細胞胚、５細胞胚、６細胞胚、８細胞胚など（典型的には、最大１６細胞胚を含む）が挙げられ、これらはいずれも、例えば、in vivoで成熟した卵母細胞から、又はin vitroで成熟した卵母細胞から、任意の便利な方法によって誘導され得る。本明細書で使用される「胚盤胞」という用語は、桑実胚の形成後に、哺乳動物の初期胚発生において形成される構造を指す。それは、内細胞塊（ＩＣＭ）又は胚結節（これは、その後に胚を形成する）及び外側の細胞層又はトロホブラスト（これは、その後に胎盤を形成する）を有する。トロホブラストは、内細胞塊と、液体で満たされた胚盤胞腔（胞胚腔として公知である）とを取り囲む。ヒト胚盤胞は、７０〜１００個の細胞を含む。ヒトでは、胚盤胞形成は、受精後５／６日目に始まる。
【００１７】
本発明によれば、卵母細胞は、自然周期、改変自然周期、又はｃＩＶＦ若しくはＩＣＳＩでは刺激周期から生じ得る。「自然周期」という用語は、雌又は女性が卵母細胞を産生する自然周期を指す。「改変自然周期」という用語は、リコンビナントＦＳＨ又はｈＭＧに関連するＧｎＲＨアンタゴニストによる軽度の卵巣刺激下で、雌又は女性が１つ又は２つの卵母細胞を産生するプロセスを指す。「刺激周期」という用語は、リコンビナントＦＳＨ又はｈＭＧに関連するＧｎＲＨアゴニスト又はアンタゴニストによる刺激下で、雌又は女性が１つ以上の卵母細胞を産生するプロセスを指す。
【００１８】
「一般体外受精」又は「ｃＩＶＦ」という用語は、体外（すなわち、in vitro）で、卵母細胞が精子によって受精するプロセスを指す。ＩＶＦは、体内受精が失敗した場合の主な不妊処置である。「卵細胞内精子注入法」又は「ＩＣＳＩ」という用語は、シングルの精子を卵母細胞に直接注入する体外受精法を指す。この手法は、男性の不妊要因を克服するために最も一般的に使用されるが、精子が卵母細胞に容易に侵入不可能である場合にも、及び時には特に精子供与に関連する体外受精方法としても使用され得る。
【００１９】
「卵母細胞又は胚の品質の決定」は、本発明の方法が、卵母細胞又は胚が体外受精との関連でコンピテントであるかを決定することを目的とすることを意味する。本発明の方法は、高い妊娠率を付与し、及び／又は健康者をもたらすという観点の一方又は両方から、卵母細胞又は胚が正常に機能する能力を評価することを可能にする。したがって、本発明の方法は、妊娠をもたらすことができる低いフラグメンテーション率の胚の選択を可能にする。
【００２０】
「コンピテントな卵母細胞」という用語は、受精した場合に、妊娠につながる高い着床率を有する生存可能な胚を産生する雌性配偶子又は卵を指す。
【００２１】
「コンピテントな胚」という用語は、妊娠につながる高い着床率を有する胚を指す。「高い着床率」という用語は、子宮に移植した場合に、胚が子宮環境に着床して生存可能な胎児が生じ、次に、前記妊娠を終了させる手術又は事象がなければ、生存可能な子孫に発達する可能性を意味する。
【００２２】
本発明の方法は、好ましくは女性に適用可能であるが、他の哺乳動物（例えば、霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、マウスなど）に適用可能であり得る。
【００２３】
「三次元再構成」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、卵母細胞又は胚を三次元で再構成することに関する。
【００２４】
当業者であれば、連続断面画像を提供するために、当技術分野で周知の任意の方法を使用し得る。例えば、実施例に記載されている方法が使用され得る。連続断面画像の提供は、標準的な光学顕微鏡法又は光シート顕微鏡法（例えば、選択的平面照明顕微鏡法（ＳＰＩＭ））又は光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）又は磁気共鳴マイクロイメージング（μＭＲＩ）から実施され得る。
【００２５】
当業者であれば、３Ｄ再構成を実施するために、当技術分野で周知の任意の方法を使用し得る。例えば、実施例に記載されている方法が使用され得る。断面画像からの３Ｄ再構成の実施は、様々なイメージングモダリティ（古典的な顕微鏡法、光シート顕微鏡法（例えば、ＳＰＩＭ）、ＯＣＴ、マイクロＭＲＩ）から大量の画像をインポートすることができるソフトウェアを使用して実施され得る。このソフトウェアは、多面再構成（ＭＰＲ）、ボリュームレンダリング（ＶＲ）、目的のオブジェクトのセグメンテーション（手動セグメンテーション又は半自動若しくは自動インフォマティクスセグメンテーション）、容積測定による割球及びフラグメントの自動識別、３Ｄ面の抽出、並びに３Ｄプリンティング用のエクスポートを実施し得る。
【００２６】
特定の実施態様では、本発明の方法は、
ｉ）前記３Ｄ再構成における卵母細胞の前核の位置を決定し、胚の形態、フラグメンテーションの再区分、割球の分裂軸及び／又は細胞の再区分を決定する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で決定した前記３Ｄ再構成における卵母細胞の前核の位置、胚の形態、フラグメンテーションの再区分、割球の分裂軸及び／又は細胞の再区分をコントロールと比較する工程、並びに
ｉｉｉ）工程ｉ）で決定した前記３Ｄ再構成における卵母細胞の前核の位置、胚の形態、フラグメンテーションの再区分、割球の分裂軸及び／又は細胞の再区分が、コンピテントな卵母細胞又はコンピテントな胚の同基準と同一である場合、該卵母細胞又は該胚がコンピテントであると結論し、工程ｉ）で決定した前記３Ｄ再構成における卵母細胞の前核の位置、胚の形態、フラグメンテーションの再区分、割球の分裂軸及び／又は細胞の再区分が、非コンピテントな卵母細胞又は非コンピテントな胚の同基準と同一である場合、該卵母細胞又は該胚が非コンピテントであると結論する工程
を含む。
【００２７】
一実施態様では、コントロールは、コンピテントな卵母細胞又はコンピテントな胚である。別の実施態様では、コントロールは、非コンピテントな卵母細胞又は非コンピテントな胚である。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は、胚の品質を決定するためのin vitro非侵襲的方法であって、
ｉ）前記胚の連続断面画像を提供する工程、
ｉｉ）前記胚の三次元再構成を実施する工程、並びに
ｉｉｉ）割球の数、割球の規則性及びフラグメンテーション率を決定することによって、胚の形態を決定する工程、
ｉｖ）並びに、６〜８割球、レギュラーサイズの割球及び低いフラグメンテーション率を有する場合、該胚がコンピテントであると結論し、より少ない割球（３日目で６細胞未満）、イレギュラーサイズの割球及び高いフラグメンテーション率（２５％超）を有する場合、該胚が非コンピテントであると結論する工程
を含むin vitro非侵襲的方法に関する。
【００２９】
本発明の方法は、臨床決定を下すのに特に適切である。本明細書で使用される「臨床決定」という用語は、胚の健康又は生存に影響を与える転帰を有する行動をとるか否かの決定を指す。特に、本発明との関連では、臨床決定は、胚を患者の子宮に移植するか否かの決定を指す。特に、上記方法は、発生学者が、妊娠転帰の可能性が低い胚の子宮への移植を回避するのに役立つ。上記方法はまた、着床及び妊娠をもたらすことができるコンピテントな卵母細胞及びコンピテントな胚を選択することによって、多胎妊娠を回避するのに特に適切であるので、各サイクルで移植可能な胚が少なく、多胎妊娠の発生率が減少する。
【００３０】
さらなる態様では、本発明は、患者の妊娠転帰を向上させるための方法であって、ｉ）複数の胚を提供すること、ｉｉ）本発明の方法を実施することによって、該胚の品質を決定すること、ｉｉｉ）最もコンピテントな胚を選択すること、及びｉｖ）工程ｉｉｉ）で選択した胚を前記患者の子宮に移植することからなる工程を含む方法に関する。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は、体外受精を受けている患者にコンピテントな胚を移植する方法であって、
ａ）前記患者から卵母細胞を採取する工程；
ｂ）前記卵母細胞を体外受精することによって、前記卵母細胞から胚を作製する工程；
ｃ）本発明の方法を実施することによって、該胚の品質を決定する工程；及び
ｄ）コンピテントである可能性が高い胚を前記患者に移植する工程
を含む方法に関する。
【００３２】
本発明はまた、本発明の方法を実行するためのデバイスであって、
−工程ｉ）の連続断面画像を提供するための手段、
−工程ｉｉ）の三次元構成を実施するための手段、及び
−工程ｉ）で決定した前記三次元再構成における卵母細胞の前核の位置、胚の形態、フラグメンテーションの再区分、割球の分裂軸及び／又は細胞の再区分を決定するための手段
を含むデバイスに関する。
【００３３】
本発明はまた、卵母細胞又は胚を生産又はプリンティングする方法であって、
ｉ）前記卵母細胞又は胚の連続断面画像を提供する工程、
ｉｉ）前記卵母細胞又は胚の三次元再構成を実施する工程、
ｉｉｉ）前記三次元再構成における卵母細胞の前核の位置、胚の形態、フラグメンテーションの再区分、割球の分裂軸及び／又は細胞の再区分を決定する工程、並びに
ｉｖ）前記卵母細胞又は前記胚を三次元プリンティングする工程
を含む方法に関する。
【００３４】
本発明はまた、本発明の方法によって実施された、人工的に生産又は３Ｄプリンティングされた卵母細胞又は胚に関する。
【００３５】
当業者であれば、三次元プリンティングのために、当技術分野で周知の任意の方法を使用し得る。例えば、実施例に記載されている方法が使用され得る。
【００３６】
以下の図面及び実施例によって、本発明をさらに説明する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定すると決して解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】光学顕微鏡法の固定組織断面画像からのマウス胚の３Ｄ再構成及び視覚化。
【図２】ＩＶＦ研究所における光学顕微鏡法の断面画像からの生存可能なヒト胚の非侵襲的３Ｄ再構成及び視覚化。
【図３】ＩＶＦ研究所における標準的な光学顕微鏡法の２０個の断面から実施した３日目の生存可能なヒト胚の非侵襲的３Ｄ再構成。
【図４】ＳＰＩＭベースのライクシート（like sheet）を使用した顕微鏡の例。
【図５Ａ】ヒト胚の３Ｄ再構成及びプリンティング。
【図５Ｂ】ヒト胚の３Ｄ再構成及びプリンティング。
【図５Ｃ】ヒト胚の３Ｄ再構成及びプリンティング。
【図５Ｄ】ヒト胚の３Ｄ再構成及びプリンティング。
【図５Ｅ】ヒト胚の３Ｄ再構成及びプリンティング。
【図５Ｆ】ヒト胚の３Ｄ再構成及びプリンティング。
【図５Ｇ】ヒト胚の３Ｄ再構成及びプリンティング。
【図５Ｈ】ヒト胚の３Ｄ再構成及びプリンティング。
【図５Ｉ】ヒト胚の３Ｄ再構成及びプリンティング。
【図６Ａ】光学顕微鏡法による従来の胚の観察の限界、並びに着床率及び妊娠率を予測するための形態観察の不適当性。
【図６Ｂ】光学顕微鏡法並びに３Ｄ再構成及びプリンティング。
【図６Ｃ】２種の光学顕微鏡法、すなわち光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）及び光シート顕微鏡法（選択的平面照明顕微鏡法（ＳＰＩＭ）を含む）。
【図６Ｄ】従来のＩＶＦ顕微鏡法の適合光学系。
【図６Ｅ】胚スキャンを使用することの生物学的利益。
【実施例】
【００３８】
実施例１：
胚スキャン。
本発明は、ヒト卵母細胞及び胚の三次元（３Ｄ）再構成及び３Ｄプリンティングのための方法に関する。より正確には、それは、in vitroにおける着床前発生中に卵母細胞及び胚の形態評価を改善するための新たな革新的ツールとしての３Ｄ技術の使用に関する。
【００３９】
本発明は、ヒト卵母細胞及び胚の３Ｄ再構成及び３Ｄプリンティングに基づくものである。これらの３Ｄ技術は、ＡＲＴの成功を増加させるために、胚の形態を評価し、胚の選択を改善するのに使用され得る。また、３Ｄ技術は、発生学者のスタッフのトレーニング、アップデートのための、及びＡＲＴ手術を受けている患者のための有益なツールである。
【００４０】
本発明は、
ｉ）標準的な光学顕微鏡法又は光シート顕微鏡法（例えば、ＳＰＩＭ）又は光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）又は磁気共鳴マイクロイメージング（μＭＲＩ）から、ヒト卵母細胞及び胚の連続断面画像を提供すること。
ｉｉ）様々なイメージングモダリティ（古典的な顕微鏡法、光シート顕微鏡法（例えば、ＳＰＩＭ）、ＯＣＴ、マイクロＭＲＩ）から大量の画像をインポートすることができるソフトウェアを使用して断面画像から、ヒト卵母細胞及び胚の３Ｄ再構成を実施すること。このソフトウェアは、多面再構成（ＭＰＲ）、ボリュームレンダリング（ＶＲ）、目的のオブジェクトのセグメンテーション（手動セグメンテーション又は半自動若しくは自動インフォマティクスセグメンテーション）、容積測定による割球及びフラグメントの自動識別、３Ｄ面の抽出、並びに３Ｄプリンティング用のエクスポートを実施し得る。
ｉｉｉ）３Ｄ再構成における卵母細胞及び胚の形態を分析すること。
ｉｉｉｉ）ヒト卵母細胞及び胚の３Ｄ再構成から３Ｄプリンティングを実施すること。
ｉｉｉｉｉ）情報、トレーニング及び医薬形成のために３Ｄプリンティングモデルを使用すること
からなる工程を含む。
【００４１】
光学顕微鏡法の固定組織断面画像からのマウス胚の３Ｄ再構成及び視覚化。古典的な光学顕微鏡法でマウス胚（ＴＳ７）から得られた大量の５７個のＴＩＦＦ画像を使用して、多面再構成（ＭＰＲ）及び３Ｄボリュームレンダリングを行うことが可能である。ボリュームレンダリングは、ＣＴスキャン及びＭＲＩの結果を強調するための放射線医学で周知の３Ｄ視覚化技術である。ボリュームレンダリングは、標本の３Ｄ情報を得るために、ＤＩＣＯＭ（ＴＩＦＦ又はＪＰＥＧ画像を含む）以外の画像サンプルに適用され得る（例えば、核をより良く見るために透明度を改変し得る）（図１）。
【００４２】
ＩＶＦ研究所における光学顕微鏡法の断面画像からの生存可能なヒト胚の非侵襲的３Ｄ再構成及び視覚化（図２）。
【００４３】
ＩＶＦ研究所における標準的な光学顕微鏡法の２０個の断面から、３日目の生存可能なヒト胚の非侵襲的３Ｄ再構成を実施した。フォーカスを修正することによって、多面再構成及びボリュームレンダリングを実施するために３Ｄ視覚化ソフトウェアにインポートし得る大量の画像を得ることが可能である（図３）。
【００４４】
本発明者らはまた、
生存可能なヒト胚の３Ｄ再構成から得られた３Ｄプリンティングモデル。
ヒト卵母細胞及び胚の３Ｄ再構成及びプリンティング：研究所における技術トレーニング及び形成のための教育上の有益なツール。
ヒト卵母細胞及び胚の３Ｄ再構成及びプリンティング：ＩＶＦプログラムを受けている患者のための有益なツール。
ヒト卵母細胞及び胚の３Ｄプリンティングモデル及びデリバティブマーケット。
ヒト胚及び卵母細胞の３Ｄ再構成によるウェブデータベースの作成
を実施した。
【００４５】
ヒト胚の３Ｄ再構成及びプリンティングを図５Ａ−Ｉに示す。
【００４６】
本発明者らは、光学顕微鏡法による従来の胚の観察の限界、並びに着床率及び妊娠率を予測するための形態観察の不適当性を図６Ａに示す。本発明者らは、光学顕微鏡法並びに３Ｄ再構成及びプリンティングを図６Ｂに示し、２種の光学顕微鏡法、すなわち光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）及び光シート顕微鏡法（選択的平面照明顕微鏡法（ＳＰＩＭ）を含む）を図６Ｃに示し、従来のＩＶＦ顕微鏡法の適合光学系を図６Ｄに示し、本発明（胚スキャン）の生物学的利益を図６Ｅに示す。
【００４７】
本発明は、
最良の形態評価による胚の選択
着床率及び妊娠率
ＩＶＦの費用対効果
を改善することによって、重要な臨床的及び経済的影響を与える。
【００４８】
結論：
ヒト卵母細胞及び胚の３Ｄ再構成及び３Ｄプリンティングは、ＡＲＴにおける卵母細胞及び胚の形態評価を改善するための新たな技術革新である。これらの革新的な３Ｄ技術は、ＡＲＴの成功を増加させるために、生存可能な胚の選択の補足的で貴重な支援を提供し得る。
【００４９】
実施例２：
ＳＰＩＭベースのライクシート（like sheet）を使用した顕微鏡の例。光学デバイス（１）は、光シート（２）を生成して、対象（４）の単一面を照明する。光シートビームに対して９０°に配置された２つの対物レンズ（３）は、ＣＣＤカメラにそれぞれ接続されている。コンピュータは、２つのカメラから画像を受信し、モーター駆動のｘｙｚステージ（５）の移動を自動操縦して、ＳＰＩＭによって交互に照射された胚の異なる面の大量の写真を作る。最終的に、写真は、視覚化ソフトウェアに送信される：それは、２つのカメラの写真をミックスし、多面再構成（ＭＰＲ）及び３Ｄ（ＶＲ）で結果を示す（図４）。
【００５０】
実施例３：
体外受精、胚の品質分類及びＩＶＦの転帰。
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（Ovitrelle; Merck Serono）２５０μgの単回注射によって、排卵を誘導する。注射の３６時間後に経膣超音波誘導吸入によって卵母細胞の回収を実施し、フラッシュせずに各排卵前卵胞を個々に吸引する。
【００５１】
従来のＩＶＦ又はＩＣＳＩ手順のために、卵丘−卵母細胞複合体を単離する。ＩＣＳＩのマイクロインジェクションの前に、卵母細胞の成熟度を剥離後に評価する。６％ＣＯ２及び加湿雰囲気の３７℃の油の下、培養培地（Vitrolife）の微小液滴３０μl中で、卵母細胞を個別に培養する。マイクロインジェクション又は受精の１８〜２０時間後に、２つの前核及び２つの極体の存在によって、正常な受精を確認する。それぞれマイクロインジェクション又は受精の２５時間又は２７時間後に、初期卵割を観察する。
【００５２】
卵母細胞の回収の３日後に、以下の形態学的基準にしたがって、胚の品質を１〜４に等級分けする：（ａ）割球の数、（ｂ）割球の規則性、及び（ｃ）フラグメンテーション率（表Ｉ）。フラグメンテーションが２５％未満でレギュラーサイズの６〜８割球が観察された場合（フラグメンテーション率が低い胚）、胚を最高品質（グレード１及び２）とみなした。最高品質の胚は、３日目に移植又は凍結したのに対して、グレード３及び４の胚は廃棄した。
【００５３】
移植の４週間後に、少なくとも１つの胎嚢の存在、及び超音波検査による胎児の心臓活動の視覚化によって、臨床妊娠を確認する。
【００５４】
したがって、最高品質の胚又はコンピテントな胚は、フラグメンテーション率が低く（２５％以下）、レギュラーサイズの６〜８割球を有するグレード１〜２の胚である。
【００５５】
したがって、低品質の胚又は非コンピテントな胚は、フラグメンテーション率が高く（２５％超）、レギュラーサイズ又はイレギュラーサイズの少ない割球（３日目で６細胞未満）を有するグレード３〜４の胚である。
【００５６】
表Ｉ：３日目における胚の品質分類。以下の形態学的基準（ｉ）割球の数、（ｉｉ）割球の規則性、及び（ｉｉｉ）フラグメンテーション率に基づいて、胚の品質を１〜４に等級分けした（１〜２：最高品質の胚；３〜４：低品質の胚）。
【表１】
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【００５７】
参考文献：
本出願を通して、様々な参考文献が、本発明が関係する技術水準を説明している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月19日(2020.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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