(57)【要約】      （修正有）【課題】骨形成不全症（ＯＩ）を効果的に処置する方法の提供。【解決手段】それを必要とする対象における骨形成不全症（ＯＩ）を処置する方法であって、該対象に、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）に特異的に結合する治療有効量の抗体またはその抗原結合性断片を投与することを含む前記方法。【選択図】図１
2020109110.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象における骨形成不全症（ＯＩ）を処置する方法であって、該対象に、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）に特異的に結合する治療有効量の抗体またはその抗原結合性断片を投与することを含む前記方法。
【請求項２】
抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４、５および６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域と、配列番号７、８および９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＩｇＧ４定常領域をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトκ軽鎖定常領域をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ヒトκ軽鎖定常領域は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＩｇＧ４定常領域とヒトκ軽鎖定常領域とをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ヒトκ軽鎖定常領域は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３を中和する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
抗体またはその抗原結合性断片は、骨体積密度（ＢＶ／ＴＶ）、全骨表面積（ＢＳ）、骨面密度（ＢＳ／ＢＶ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）、骨梁間隔（Ｔｂ．Ｓｐ）および全体積（Ｄｅｎｓ  ＴＶ）からなる群から選択される骨パラメータを改善
させる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
抗体またはその抗原結合性断片は、骨吸収を阻害する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
抗体またはその抗原結合性断片は、尿中ヒドロキシプロリン、尿中総ピリジノリン（ＰＹＤ）、尿中遊離デオキシピリジノリン（ＤＰＤ）、尿中コラーゲンＩ型架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）、尿中または血清コラーゲンＩ型架橋Ｃ−テロペプチド（ＣＴＸ）、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）および酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ）からなる群から選択される骨吸収の血清バイオマーカーを低下させる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
抗体またはその抗原結合性断片は、総アルカリホスファターゼ、骨特異的アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、およびＩ型プロコラーゲン（Ｃ末端／Ｎ末端）からなる群から選択される骨沈着の血清バイオマーカーを増加させる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
抗体またはその抗原結合性断片は、骨吸収を阻害する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
抗体またはその抗原結合性断片は、骨沈着を促進する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
抗体またはその抗原結合性断片は、聴覚機能、肺機能および腎機能からなる群から選択される、ＯＩによって影響を受けた非骨格器官の機能を改善する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
それを必要とする対象における骨形成不全症（ＯＩ）を処置する方法であって、該対象に、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）に結合する治療有効量の抗体またはその抗原結合性断片を投与することを含み、該抗体が、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、前記方法。
【請求項２３】
それを必要とする対象における骨形成不全症（ＯＩ）を処置する方法であって、該対象に、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）に結合する治療有効量の抗体またはその抗原結合性断片と、少なくとも１つの治療薬剤とを組み合わせて投与することを含む前記方法。
【請求項２４】
薬剤はビスホスホネートである、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１３年３月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／８０３，６４７号、２０１３年９月９日に出願された米国仮特許出願第６１／８７５，３９９号、および２０１３年１０月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／８８３，１５１号と関連し、これらの仮特許出願の内容は参照によって全体としてそれぞれ本明細書に組み入れる。
【０００２】
政府資金調達
本発明は、米国国立衛生研究所より付与された第Ｐ０１  ＨＤ０７０３９４号、第Ｐ０１  ＨＤ２２６５７号および第Ｒ０１  ＤＥ０１７７１号の下で政府支援を受けてなされたものである。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は骨形成不全症（ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ、ＯＩ）を処置する方法に関する。より詳細には、本発明は、ヒトトランスフォーミング成長因子ベータ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ、ＴＧＦβ）またはそのアイソフォームに特異的に結合する結合タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合性断片を使用して、ＯＩを処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
骨形成不全症（ＯＩ）は、「脆骨病」またはＬｏｂｓｔｅｉｎ症候群としても知られる、衰弱をもたらす希少性の先天性骨疾患であり、１５，０００人に約１人が罹患する。ＯＩの種類によって表現型は様々であるが、共通の症状として、骨格と歯の不完全骨化、骨量減少、脆弱骨、および病的骨折が挙げられる。ＯＩにおけるこれらの共通の症状は遺伝子変異によって引き起こされると考えられており、その遺伝子変異により骨マトリックスの沈着またはホメオスタシスに関与するＩ型コラーゲンまたは他のタンパク質の欠乏が引き起こされる。これらの症状ならびに致死性の骨折および合併症の性向の結果、ＯＩ患者の寿命は、一般人集団の寿命より短い。したがって、該技術分野でＯＩの有効な処置方法を開発する早急な必要性があることは明白である。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１Ａ（ウェスタンブロット）および図１Ｂ〜１Ｆ（グラフ）は、ＴＧＦβシグナル伝達が、野生型対照と比較して、Ｃｒｔａｐ−／−マウスの骨で上昇していることを示す。
【図２】図２Ａ（発光画像）および図２Ｂ〜２Ｃ（グラフ）は、ＴＧＦβリポーターマウスと交配したＣｒｔａｐ−／−マウスが、野生型対照と比較して、より高いＴＧＦβ活性を有することを示す。
【図３】図３は、マウス汎特異的（ｐａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗ＴＧＦβ抗体１Ｄ１１で処置したＣｒｔａｐ−／−マウス由来の脊椎のμＣＴ画像である。
【図４】図４は、マウス汎特異的抗ＴＧＦβ抗体１Ｄ１１で処置したＣｒｔａｐ−／−マウス由来の脊椎の定量的測定値を含むグラフである。
【図５Ａ】図５は、マウス汎特異的抗ＴＧＦβ抗体１Ｄ１１で処置したＣｒｔａｐ−／−マウス由来の脊椎の組織学的解析結果である。
【図５Ｂ】図５は、マウス汎特異的抗ＴＧＦβ抗体１Ｄ１１で処置したＣｒｔａｐ−／−マウス由来の脊椎の組織学的解析結果である。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、３点曲げ試験によって測定するときの、マウス汎特異的抗ＴＧＦβ抗体１Ｄ１１で処置したＣｒｔａｐ−／−マウス由来の大腿骨の生体力学的特性（図６Ａ−最大荷重、図６Ｂ−剛性））を示すグラフである。
【図７】図７Ａおよび７Ｂ（顕微鏡画像）および７Ｃ（グラフ）は、マウス汎特異的抗ＴＧＦβ抗体１Ｄ１１で処置したＣｒｔａｐ−／−マウスの肺表現型を示す。
【図８】図８は、抗デコリン抗体で染色したＣｒｔａｐ−／−およびＷＴ肺の顕微鏡画像である。
【図９】図９は、デコリン結合アッセイを図示するグラフである。
【図１０】図１０は、Ｃｒｔａｐ−／−マウスにおけるＴＧＦβシグナル伝達の増加を示す一群のグラフ、写真および画像である。図１０Ａは、ＴＧＦβ標的遺伝子ｐ２１、ＰＡＩ−１およびＣｏｌ１α１の定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す一連の３つのグラフである。グラフは、Ｐ３ＷＴおよびＣｒｔａｐ−／−マウスの頭蓋骨における増加したＴＧＦβシグナル伝達を示す。結果は、ＷＴ群の平均倍数変化±ＳＤ、１群あたりｎ＝５、＊ｐ＜０．０５として示す。図１０Ｂは、Ｐ３頭蓋タンパク質抽出物のウェスタンブロット分析の写真であり、ＷＴマウスと比較してＣｒｔａｐ−／−マウスでは全Ｓｍａｄ２タンパク質に対する活性化Ｓｍａｄ２（ｐＳｍａｄ２）の量が増加していることを示し、ＴＧＦβ−シグナル伝達が増加していることを示唆する；１群あたりｎ＝３。図１０Ｃは、図１０Ｂで示したウェスタンブロットを定量化して示すグラフである。結果は、ＷＴ群の平均倍数変化±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５として示す。図１０Ｄは、ＴＧＦβ−リポーターマウス（ＳＢＥ−Ｌｕｃマウス）と相互交配したＣｒｔａｐ−／−マウスとＷＴマウスにおいてＣｒｔａｐ−／−マウスの方が骨格構造と重複する領域の生物発光が増加していることを示す画像である。Ｐ１０の３同腹仔の代表画像を示している。３同腹仔において、Ｃｒｔａｐ−／−マウスは頭／頭蓋冠でＷＴマウスと比較して平均２．８６倍（ＳＤ±０．３４）の生物発光シグナルを示す（スケールバー＝１ｃｍ）。図１０Ｅは、ＴＧＦβリポーター細胞株を使用して、骨形成条件下で３日間培養したＷＴおよびＣｒｔａｐ−／−骨髄間質細胞由来の調整培地で評価したＴＧＦβ活性を示すグラフであり、ＴＧＦβ活性がＷＴ細胞由来の培地と比較してより高いことが実証される。結果は、ＷＴ群の平均倍数変化±ＳＤ、１群あたりｎ＝５、＊ｐ＜０．０５として示す。図１０Ｆは、ｐＳｍａｄ２についての肺（Ｐ１０）の免疫染色を示す２つの画像であり、ＷＴおよびＣｒｔａｐ−／−マウスにおける細胞内染色の増加が示される（４０倍拡大）。１群あたりマウスｎ＝３の代表的画像を示す（スケールバー＝２０μｍ）。
【図１１】図１１は、ＴＧＦβ中和抗体１Ｄ１１処置後のＣｒｔａｐ−／−マウスの表現型補正を示す一群の写真とグラフである。図１１Ａは、１６週齢の野生型（ＷＴ）マウス、対照抗体処置Ｃｒｔａｐ−／−マウスおよび１Ｄ１１処置Ｃｒｔａｐ−／−マウスにおける処置後８週間のＬ４椎体の一連の３つのマイクロＣＴ画像である。図１１Ｂは、Ｌ４椎体のマイクロＣＴの結果を示す一群の３つのグラフを示しており、それらの図はＷＴ、対照Ｃｒｔａｐ−／−および１Ｄ１１処置Ｃｒｔａｐ−／−マウスにおいて、骨体積／全体積（ＢＶ／ＴＶ）、骨梁数（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｎｕｍｂｅｒ）（Ｔｂ．Ｎ）、および骨梁幅（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）（Ｔｂ．Ｔｈ）が増加していることを実証する。結果は、平均±ＳＤ、１群あたりｎ＝８、＊Ｃｒｔａｐ−／−１Ｄ１１対Ｃｒｔａｐ−／−対照についてｐ＜０．０５、＋Ｃｒｔａｐ−／−対ＷＴについてｐ＜０．０５として示す。図１１Ｃは、Ｌ４脊椎の組織形態計測（ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ）分析の結果を示す一群の３つのグラフを示しており、それらの図はＷＴと比較してＣｒｔａｐ−／−マウスにおいて骨表面あたりの破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）数（Ｎ．Ｏｃ／ＢＳ）および骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）数（Ｎ．Ｏｂ／ＢＳ）が増加していることを示す。１Ｄ１１処置後の骨芽細胞数および破骨細胞数の低下は、Ｃｒｔａｐ−／−マウスの骨再形成加速化が効果的に抑制されたことを示す。Ｃｒｔａｐ−／−マウスにおける骨面積あたりの骨細胞数（Ｎ．Ｏｔ／Ｂ．Ａｒ）の増加は、１Ｄ１１処置後にＷＴレベルまで減少する。結果は、平均±ＳＤ、１群あたりｎ＝６、＊Ｃｒｔａｐ−／−１Ｄ１１対Ｃｒｔａｐ−／−対照についてｐ＜０．０５、＋Ｃｒｔａｐ−／−対ＷＴについてｐ＜０．０５として示す。図１１Ｄは、１６週齢の野生型（ＷＴ）マウス、対照Ｃｒｔａｐ−／−マウス、および１Ｄ１１処置Ｃｒｔａｐ−／−マウスにおける処置後８週間での膨張肺のヘマトキシリン／エオシン染色を示す一連の３つの画像である。Ｃｒｔａｐ−／−対照マウスは、ＷＴマウスと比較して遠位気道空間の増加を示す。１Ｄ１１を用いて処置した後、対照Ｃｒｔａｐ−／−マウスと比較して、遠位気道直径の縮小がある。１群あたりｎ＝８マウスの代表的画像を示している（スケールバー＝１００μｍ）。図１１Ｅは、平均肺胞径（ｍｅａｎ  ｌｉｎｅａｒ  ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ、ＭＬＩ）法による肺胞構造間の距離を定量化して示すグラフであり、対照抗体処置Ｃｒｔａｐ−／−およびＷＴマウスと比較して１Ｄ１１処置Ｃｒｔａｐ−／−マウスにおける遠位気道空間が顕著に減少していることが実証される。結果は、平均±ＳＤ、１群あたりマウスｎ＝８、１マウスあたり１０解析画像、＊Ｃｒｔａｐ−／−１Ｄ１１対Ｃｒｔａｐ−／−対照に対してｐ＜０．０５、＋Ｃｒｔａｐ−／−対ＷＴに対してｐ＜０．０５として示す。
【図１２】図１２は、デコリンのＩ型コラーゲンへの結合が、Ｐ９８６  ３Ｈｙｐ部位で重複し、Ｃｒｔａｐ−／−マウスのＩ型コラーゲンで減少していることを示す一連のグラフである。図１２Ａは、Ｐ３マウスの頭蓋骨の定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す一群の３つのグラフであり、ＷＴに対してＣｒｔａｐ−／−マウスの頭蓋骨における小ロイシンリッチプロテオグリカンデコリン（Ｄｃｎ）、バイグリカン（Ｂｇｎ）、およびアスポリン（Ａｓｐｎ）のＲＮＡ発現に差異がないことを示している。結果は、ＷＴ群の平均倍数変化±ＳＤ、１群あたりｎ＝５として示す。図１２Ｂは、表面プラズモン共鳴分析を示すグラフであり、Ｃｒｔａｐ−／−マウスのＩ型コラーゲンに対する組み換えデコリンコアタンパク質に対する結合が、ＷＴのＩ型コラーゲンと比較しておよそ４５％少ないことを示している。３μＭ、５μＭおよび１２μＭのデコリンを使用して３つの独立した実験を行った。チップ上に固定されたＩ型コラーゲンに対して標準化された結合デコリン総量の応答単位（ＲＵ）を示す。Ｃｒｔａｐ−／−Ｉ型コラーゲンに結合するデコリンの低下平均は４４．６±７．９％である。
【図１３】図１３は、増加したＴＧＦβシグナル伝達の阻害によりＣｏｌ１α２遺伝子（Ｃｏｌ１α２ｔｍ１．１Ｍｃｂｒ）のＧ６１０Ｃ変異に起因する優性ＯＩモデルマウスの骨表現型が改善することを示す一連のグラフおよび写真である。図１３Ａは、ＴＧＦβ標的遺伝子ｐ２１およびＰＡＩ−１の定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す２つのグラフであり、これらはＰ３  ＷＴおよびＣｏｌ１α２ｔｍ１．１Ｍｃｂｒマウスの頭蓋骨におけるＴＧＦβシグナル伝達の増加を示している。結果は、ＷＴ群の平均倍数変化±ＳＤ、１群あたりｎ＝３、＊ｐ＜０．０５として示す。図１３Ｂはウェスタンブロット分析の結果を示す写真であり、この結果から、ＷＴと比較して、ＷＴおよびＣｏｌ１α２ｔｍ１．１ＭｃｂｒマウスのＰ３頭蓋冠におけるＳｍａｄ２タンパク質の全レベルに対する活性化Ｓｍａｄ２（ｐＳｍａｄ２）のレベル増加が示され、ＴＧＦβ−シグナル伝達の増加が示唆される；１群あたりｎ＝３。図１３Ｃは、図１３Ｂで示したウェスタンブロットを定量化して示したグラフである。結果は、ＷＴ群の平均倍数変化±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５として示す。図１３Ｄは、１６週齢の野生型（ＷＴ）マウス、対照抗体処置Ｃｏｌ１α２ｔｍ１．１Ｍｃｂｒマウス、および１Ｄ１１処置後Ｃｏｌ１α２ｔｍ１．１Ｍｃｂｒマウスの処置後８週間のＬ４椎体の一連のマイクロＣＴ画像の写真である。図１３Ｅは、Ｌ４椎体のマイクロＣＴからのデータの一連のグラフであり、これらは１Ｄ１１処置後のＣｏｌ１α２ｔｍ１．１Ｍｃｂｒマウスにおいて骨体積／全体積（ＢＶ／ＴＶ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）、および骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）が増加していることを示す。結果は、平均±ＳＤ、１群あたりｎ＝６、＊Ｃｏｌ１α２ｔｍ１．１Ｍｃｂｒ１Ｄ１１対Ｃｏｌ１α２ｔｍ１．１Ｍｃｂｒ対照についてｐ＜０．０５、＋Ｃｏｌ１α２ｔｍ１．１Ｍｃｂｒ対ＷＴについてｐ＜０．０５として示す。
【図１４】図１４は、体重曲線のグラフであり、試験期間中におけるＷＴと比較したＣｒｔａｐ−／−マウスの体重減少を示す（全ての時間点についてｐ＜０．０５、平均±ＳＥを示している）。１Ｄ１１処置Ｃｒｔａｐ−／−マウスでは、Ｃｒｔａｐ−／−対照マウスと比較して統計的に有意な体重の差は観察されなかった。
【図１５】図１５は、Ｃｒｔａｐ−／−マウスにおける異常なＩ型コラーゲン翻訳後修飾に対してＴＧＦβ阻害の効果がないことを示す一連のグラフおよび表である。図１５Ａは、ＷＴマウス、対照Ｃｒｔａｐ−／−マウス、および１Ｄ１１処置Ｃｒｔａｐ−／−マウス（１６週齢マウス、処置後８週間）の脛骨由来の抽出されたＩ型コラーゲンのタンデム質量スペクトルを示す一連の３つのグラフである。上のグラフ中の配列は配列番号１９であり、中央のグラフの配列は配列番号２０であり、下のグラフの配列は配列番号２１である。図１５Ｂは、タンデム質量スペクトル分析の概要を示す表である。１Ｄ１１処置は、骨試料におけるコラーゲン残基Ｐｒｏ９８６  α１（Ｉ）の３−ヒドロキシル化状態に有意な影響を与えなかった。３−ヒドロキシル化された残基の平均パーセンテージ（％）（±ＳＤ）を示している、１群あたりｎ＝５。図１５Ｃは、対照Ｃｒｔａｐ−／−および１Ｄ１１−処置Ｃｒｔａｐ−／−マウスにおける骨Ｉ型コラーゲンが、ＷＴマウスと比較して、ヒドロキシリシルピリジノリン（ＨＰ）およびリシルピリジノリン架橋（ＬＰ）レベルの変化とＨＰ／ＬＰ比率の増加を表すことを示す一連の３つのグラフである。Ｃｒｔａｐ−／−マウスにおける１Ｄ１１処置は、対照Ｃｒｔａｐ−／−マウスと比較してこれらのパラメータに有意な影響を与えなかった。結果は、平均±ＳＤ、１群あたりｎ＝４マウス、＋Ｃｒｔａｐ−／−対ＷＴについてｐ＜０．０５として示す。
【図１６】図１６は、処置研究の開始時（図１６Ａ＝８週齢）および終了時（図１６Ｂ＝１６週齢）における血清骨代謝回転マーカー・オステオカルシン（ＯＣＮ）および骨コラーゲンのＣ末端架橋テロペプチド（ＣＴＸ）を示す一連のグラフである。図１６Ａは、試験開始時のＷＴマウスと比較した８週齢Ｃｒｔａｐ−／−における増加したＯＣＮおよびＣＴＸ血清レベルの増加が、Ｃｒｔａｐ−／−マウスにおける増加した骨代謝回転を表すことを示す２つのグラフである。結果は、平均±ＳＤ、ＷＴについてｎ＝８、Ｃｒｔａｐ−／−マウスについてｎ＝１４、＋Ｃｒｔａｐ−／−対ＷＴについてｐ＜０．０５として示す。図１６Ｂは、１６週齢１Ｄ１１処置Ｃｒｔａｐ−／−マウスが、対照Ｃｒｔａｐ−／−マウスと比較して、血清ＯＣＮの低下とＣＴＸ血清レベルの顕著な低下の傾向を示すことを示す２つのグラフであり、ＴＧＦβの阻害により増加した骨代謝回転が抑制されることを示している。結果は、平均±ＳＤ、ＷＴについてｎ＝８、Ｃｒｔａｐ−／−の１群あたりｎ＝７、＊Ｃｒｔａｐ−／−１Ｄ１１対Ｃｒｔａｐ−／−対照についてｐ＜０．０５、＋Ｃｒｔａｐ−／−対ＷＴについてｐ＜０．０５として示す。
【図１７】図１７は、ＷＴ、対照Ｃｒｔａｐ−／−、および１Ｄ１１処置Ｃｒｔａｐ−／−マウス（１６週齢、処置後８週間）の椎体Ｌ４のマイクロＣＴ分析の結果を示す表である。平均±ＳＤは、骨体積／組織体積（ＢＶ／ＴＶ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）、骨梁間隔（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）（Ｔｂ．Ｓｐ）および骨体積に対する骨塩量（ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）（ＢＭＤ  ＢＶ）；１群あたりｎ＝８を示しており、＋は等分散試験が不合格になった場合のクラスカル＝ウォリスの順位に基づく一元配置分散分析を示す。ｎ．ｓ．＝統計的に有意でない。
【図１８】図１８は、ＷＴ、対照Ｃｒｔａｐ−／−、および１Ｄ１１処置Ｃｒｔａｐ−／−マウス（１６週齢、処置後８週間）についての大腿骨近位部における骨梁骨のマイクロＣＴ分析の結果を示す表である。平均±ＳＤは、骨体積／組織体積（ＢＶ／ＴＶ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）、骨梁間隔（Ｔｂ．Ｓｐ）および骨体積に対する骨塩量（ＢＭＤ  ＢＶ）；１群あたりｎ＝８について示す。＋は等分散試験が不合格になった場合のクラスカル＝ウォリスの順位に基づく一元配置分散分析を示す。ｎ．ｓ．＝統計的に有意でない。
【図１９】図１９は、ＷＴ、対照Ｃｒｔａｐ−／−、および１Ｄ１１処置Ｃｒｔａｐ−／−マウス（１６週齢、処置後８週間）についての大腿骨中軸での皮質骨のマイクロＣＴ分析の結果を示す表である。平均±ＳＤは、皮質の厚さ、骨体積に対する骨塩量（ＢＭＤ  ＢＶ）、前後（ａ．ｐ．）径、横断面積（ＣＳＡ）、および内外（ｍ．ｌ．）および前後（ａ．ｐ．）軸に対する横断面慣性モーメント（ＣＳＭＩ）；１群あたりｎ＝８を示す。ｎ．ｓ．＝統計的に有意でない。
【図２０】図２０は、３点曲げ試験による大腿骨（１６週齢マウス、処置後８週間）の生体力学試験の結果を示す表である。ＷＴマウスと比較して、対照Ｃｒｔａｐ−／−マウスは、弾性率および弾性変位を除く生体力学パラメータの有意な低下を示す。１Ｄ１１を用いた抗ＴＧＦβ処置は、Ｃｒｔａｐ−／−大腿骨における最大荷重および極限強度の著しい改善に至り、全ての骨および組織強度の増加を示している。しかしながら、降伏後変位の有意な変化は観察されず、１Ｄ１１がＯＩ骨の脆弱性増加に影響しなかったことを示す。ＷＴについてｎ＝６、対照Ｃｒｔａｐ−／−についてｎ＝４、１Ｄ１１処置Ｃｒｔａｐ−／−マウスについてｎ＝３。ｎ．ｓ．＝統計的に有意でない。
【図２１】図２１は、ＷＴ、対照Ｃｒｔａｐ−／−、および１Ｄ１１処置Ｃｒｔａｐ−／−マウス（１６週齢、処置後８週間）におけるＬ４椎体の組織形態計測分析の結果を示す表である。平均±ＳＤは、骨体積／組織体積（ＢＶ／ＴＶ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）、骨梁間隔（Ｔｂ．Ｓｐ）、破骨細胞数／骨表面積（Ｎ．Ｏｃ／ＢＳ）、破骨細胞表面積／骨表面積（Ｏｃ．Ｓ／ＢＳ）、骨芽細胞数／骨表面積（Ｎ．Ｏｂ／ＢＳ）、骨芽細胞表面積／骨表面積（Ｏｃ．Ｓ／ＢＳ）、骨細胞数／骨面積（Ｎ．Ｏｔ／Ｂ．Ａｒ）；１群あたりｎ＝６について示す。＋は等分散試験が不合格になった場合のクラスカル＝ウォリスの順位に基づく一元配置分散分析を示す。ｎ．ｓ．＝統計的に有意でない。
【図２２】図２２は、ＷＴ、対照Ｃｏｌ１α２ｔｍ１．１Ｍｃｂｒ、および１Ｄ１１処置Ｃｏｌ１α２ｔｍ１．１Ｍｃｂｒマウス（１６週齢、処置後８週間）における椎体Ｌ４のマイクロＣＴ分析の結果を示す表である。平均±ＳＤは、骨体積／組織体積（ＢＶ／ＴＶ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）、骨梁間隔（Ｔｂ．Ｓｐ）および骨体積に対する骨塩量（ＢＭＤ  ＢＶ）；１群あたりｎ＝６について示す。ｎ．ｓ．＝統計的に有意でない。
【図２３】図２３は、ＷＴおよびＣｒｔａｐ−／−マウスにおける組み換えデコリンコアタンパク質のＩ型コラーゲンに対する結合を測定した表面プラズモン共鳴分析を示すグラフである。デコリンの示された濃度それぞれにおける３つの技術的複製物は、２つの独立した生物学的複製物から実施した（◆複製物１、▲複製物２）。結果は、ＷＴの平均に対するパーセンテージで示す（バーは１群あたりの平均を示す）。
【図２４】図２４（顕微鏡画像）は、ＷＴおよびＣｒｔａｐ−／−マウスの遠位部大腿骨骨端におけるデコリンの免疫染色を２０倍拡大、遺伝子型あたりｎ＝３、スケールバー＝１００μｍ（図２４Ａ〜２４Ｃ）および４０倍拡大、遺伝子型あたりｎ＝３、スケールバー＝５０μｍ（図２４Ｄ〜２４Ｆ）で実証する。対照大腿骨は二次抗体のみとインキュベートした。
【図２５】図２５（顕微鏡画像）は、ＷＴおよびＣｒｔａｐ−／−マウスの遠位部大腿骨骨端におけるＴＧＦβ１の免疫染色を、２０倍、遺伝子型あたりｎ＝３、スケールバー＝１００μｍ（図２５Ａ〜２５Ｃ）、および４０倍拡大、遺伝子型あたりｎ＝３、スケールバー＝５０μｍ（図２５Ｄ〜２５Ｆ）で実証する。対照大腿骨は二次抗体のみとインキュベートした。
【図２６】図２６（顕微鏡画像）は、ＷＴおよびＣｏｌ１α２ｔｍ１．１Ｍｃｂｒマウスについての遠位部大腿骨骨端におけるＴＧＦβ１の免疫染色を、２０倍、遺伝子型あたりｎ＝３、スケールバー＝１００μｍ（図２６Ａ〜２６Ｃ）、および４０倍拡大、遺伝子型あたりｎ＝３、スケールバー＝５０μｍ（図２６Ｄ〜２６Ｆ）で実証する。対照大腿骨は二次抗体のみとインキュベートした。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明は骨形成不全症（ＯＩ）を効果的に処置する方法に関する。より詳細には、本発明は、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）またはそのアイソフォームに特異的に結合する結合タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合性断片を使用して、ＯＩを処置する方法に関する。好ましくは、結合タンパク質は「汎特異的」であり、ヒトＴＧ
Ｆβの３つのアイソフォーム、つまりＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の全てに結合する。より好ましくは、結合タンパク質は、ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に特異的に結合し、中和する。一態様において、本発明は、それを必要とする対象におけるＯＩを処置する方法であって、該対象に、ＴＧＦβに特異的に結合する治療有効量の抗体またはその抗原結合性断片を投与することを含む前記方法を提供する。
【０００７】
一実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４、５および６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域と、配列番号７、８および９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む。
【０００８】
別の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０００９】
一実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片は、さらにヒトＩｇＧ４定常領域を含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片は、さらにヒトκ軽鎖定常領域を含む。別の実施形態において、ヒトκ軽鎖定常領域は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片は、さらにヒトＩｇＧ４定常領域とヒトκ軽鎖定常領域を含む。
【００１０】
別の実施形態において、ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ヒトκ軽鎖定常領域は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。
【００１１】
別の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合する。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３を中和する。
【００１２】
別の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片は、骨体積密度（ＢＶ／ＴＶ）、全骨表面積（ＢＳ）、骨面密度（ＢＳ／ＢＶ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）、骨梁間隔（Ｔｂ．Ｓｐ）および全体積（Ｄｅｎｓ  ＴＶ）からなる群から選択される骨パラメータを改善させる。
【００１３】
別の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片は、骨吸収を阻害する。
【００１４】
別の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片は、尿中ヒドロキシプロリン、尿中総ピリジノリン（ＰＹＤ）、尿中遊離デオキシピリジノリン（ＤＰＤ）、尿中コラーゲンＩ型架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）、尿中または血清コラーゲンＩ型架橋Ｃ−テロペプチド（ＣＴＸ）、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）および酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）５ｂ（ＴＲＡＰ）からなる群から選択される骨吸収の血清バイオマーカーを低下させる。
【００１５】
別の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片は、総アルカリホスファターゼ、骨特異的アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、およびＩ型プロコラーゲン（Ｃ末端／Ｎ末端）からなる群から選択される骨沈着の血清バイオマーカーを増加させる。
【００１６】
別の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片は、骨吸収を阻害する。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片は、骨沈着を促進する。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片は、聴覚機能、肺機能および腎機能からなる群から選択される、ＯＩによって影響を受けた非骨格器官の機能を改善する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、それを必要とする対象におけるＯＩを処置する方法であって、該対象に、ＴＧＦβに結合する治療有効量の抗体またはその抗原結合性断片を投与することを含み、該抗体が、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、前記方法を提供する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、それを必要とする対象におけるＯＩを処置する方法であって、該対象に、ＴＧＦβに結合する治療有効量の抗体またはその抗原結合性断片と少なくとも１つの治療薬剤とを組み合わせて投与することを含む前記方法を提供する。別の実施形態において、前記薬剤はビスホスホネートである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
Ａ．定義
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。
【００２０】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に明記のない限り、複数の参照物も含むことに留意されたい。
【００２１】
用語「約」または「およそ」は、所与の値または範囲の１０％以内、より好ましくは５％以内（または１％以下）を意味する。
【００２２】
用語「投与する」または「投与」は、注入または他の方法で、体外に存在する物質（例えば抗体）を物理的に患者に送達する行為、例えば、粘膜、皮内、静脈内、皮下、もしくは筋肉内送達により、および／または本明細書に記載もしくは当該分野で公知の任意の他の物理的送達方法により投与する行為を指す。疾患またはその症状を処置するとき、物質の投与は、典型的には、その疾患または症状の発症後に行う。疾患またはその症状を予防するとき、物質の投与は、典型的には、その疾患または症状の発症前に行う。
【００２３】
ＴＧＦβの「拮抗剤」または「阻害剤」は、阻害または他の方法で、ＴＧＦβの１つまたはそれ以上の生物活性を、例えばＴＧＦβを発現する細胞内で、またはＴＧＦβリガンドを発現する細胞内で、またはＴＧＦβ受容体を発現する細胞内で、低下させることができる分子を指す。特定の例示的実施形態において、本発明の抗体は、ＴＧＦβの活性を、細胞表面発現ＴＧＦβ受容体（例えば、ＴＧＦβ受容体１、２または３）を有する細胞内で、前記抗体が前記細胞に接触するとき、阻害または他の方法で低下させる拮抗剤抗体である。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβの拮抗剤（例えば本発明の抗体）は、例えばＴＧＦβ受容体を発現する細胞の活性および／または細胞シグナル伝達経路を阻害または他の方法で低下させ、それにより拮抗剤不在下のＴＧＦβ媒介生物活性と比較して細胞のＴＧＦβ媒介生物学的活性を阻害することにより作用することができる。本発明の特定の実施形態において、抗ＴＧＦβ抗体は、拮抗性抗ＴＧＦβ抗体、好ましくは、全ヒトモノクローナル拮抗性抗ＴＧＦβ抗体である。
【００２４】
用語「抗体」、「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」は、本明細書中で交換可能に使用することができる。抗体という用語には、これらに限定されないが、合成抗体、モノクローナル抗体、組み換え産生抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒ
ト化抗体、キメラ抗体、イントラボディ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）（例えば、単一特異性、二重特異性など）、ラクダ化抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体およびこれらの任意のエピトープ結合断片を含む。特に、抗体は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、つまり抗原結合ドメイン、またはＴＧＦβ抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子（例えば、抗ＴＧＦβ抗体の１つまたはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ））を含む。抗ＴＧＦβ抗体は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、任意のクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または任意の下位クラス（例えばＩｇＧ２ａとＩｇＧ２ｂ）の抗体であってもよい。特定の実施形態において、抗ＴＧＦβ抗体は、ヒト化抗体、例えばヒト化モノクローナル抗ＴＧＦβ抗体である。別の実施形態において、抗ＴＧＦβ抗体は、完全ヒト抗体、例えば完全ヒトモノクローナル抗ＴＧＦβ抗体である。好ましい実施形態において、抗ＴＧＦβ抗体は、ＩｇＧ抗体、例えばＩｇＧ４抗体である。
【００２５】
用語「組成物」および「製剤」は、特定の成分（例えば抗ＴＧＦβ抗体）を場合により特定の量で含有する生成物、および特定の成分を場合により特定の量で組み合わせることで直接的または間接的に得られる任意の生成物を包含することを意図する。
【００２６】
用語「定常領域」または「定常ドメイン」は、抗体の抗原への結合に直接的には関与しないが、様々な有効機能、例えばＦｃ受容体との相互作用を示す、軽鎖または重鎖のカルボキシ末端部分を指す。当該用語は、抗原結合部位を含んでいる可変ドメインである免疫グロブリンの他の部分と比較してより保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の一部を指す。定常ドメインは重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインと軽鎖のＣＨＬドメインとを含む。
【００２７】
用語「エピトープ」は、抗原の表面の局所的領域、例えば、ＴＧＦβポリペプチドまたはＴＧＦβポリペプチド断片、つまり、抗体の１つまたはそれ以上の抗原結合領域に結合することが可能であり、動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトにおいて抗原活性または免疫原活性を有する、すなわち免疫反応を誘発する能力を有する領域を指す。免疫原活性を有するエピトープは、動物における抗体反応を誘発するポリペプチドの一部である。抗原活性を有するエピトープは、当技術分野において周知の任意の技術、例えば免疫アッセイによって測定するとき、抗体が特異的に結合するポリペプチドの一部である。抗原エピトープは必ずしも免疫原である必要はない。エピトープは、通常、分子の化学的に活性な表面群からなり、例えばアミノ酸または糖側鎖であり、特定の三次元構造特性と特別な電荷特性とを有している。エピトープに寄与するポリペプチドの領域は、ポリペプチドの連続するアミノ酸であってもよく、またはエピトープは、ポリペプチドの２つもしくはそれ以上の非連続的領域を一緒にして成るものでもよい。エピトープは抗原の三次元表面特徴であってもなくてもよい。特定の実施形態において、ＴＧＦβエピトープは、ＴＧＦβポリペプチド（例えば、ＴＧＦβポリペプチドの三量体形態）の三次元表面特徴である。別の実施形態において、ＴＧＦβエピトープは、ＴＧＦβポリペプチドの線形特徴（例えばＴＧＦβポリペプチドの二量体形態または単量体形態）である。抗ＴＧＦβ抗体は、特にＴＧＦβの単量体形態のエピトープ、ＴＧＦβの二量体形態のエピトープ、またはＴＧＦβの単量体形態および二量体形態の両方に、特異的に結合することができる。
【００２８】
用語「賦形剤」は、薬物用の希釈剤、ビヒクル、保存剤、結合剤、安定剤などとして一般に使用される不活性な物質を指し、例えば、これらに限定されないが、タンパク質（例えば血清アルブミンなど）、アミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、グリシン、ヒスチジンなど）、脂肪酸およびリン脂質（例えばアルキルスルホネート、カプリレートなど）、界面活性剤（例えばＳＤＳ、ポリソルベート、非イオン
界面活性剤など）、ショ糖エステル（例えばショ糖、マルトース、トレハロースなど）および多価アルコール（例えばマンニトール、ソルビトールなど）が挙げられる。参照によって全体として本明細書に組み入れるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．も参照のこと。
【００２９】
ペプチドまたはポリペプチドの文脈において、用語「断片」は、完全長より短いアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。そのような断片は、例えば、アミノ末端の切断、カルボキシ末端での切断、および／またはアミノ酸配列からの内部残基の欠失によって生じ得る。断片は、例えば、選択的ＲＮＡスプライシング、または生体内プロテアーゼ活性から生ずる場合もある。ある実施形態において、ＴＧＦβ断片としては、ＴＧＦβポリペプチドの少なくとも５０、１００アミノ酸残基、少なくとも１２５の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５の連続するアミノ酸残基、少なくとも２００の連続するアミノ酸残基あるいは少なくとも２５０の連続するアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、ＴＧＦβ抗原に特異的に結合するＴＧＦβポリペプチドまたはその抗体断片は、完全長ポリペプチドまたは抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つの機能を維持している。
【００３０】
用語「完全ヒト抗体」または「ヒト抗体」は、本明細書で交換可能に使用され、ヒト可変領域を含み、最も好ましくはヒト定常領域も含む抗体を指す。特定の実施形態において、当該用語は、ヒト起源の可変領域と定常領域とを含む抗体を指す。「完全ヒト」抗ＴＧＦβ抗体は、特定の実施形態において、ＴＧＦβポリペプチドに結合し、ヒト生殖細胞免疫グロブリン核酸配列の天然体性変異型である核酸配列によってコードされる抗体も包含することができる。特定の実施形態において、抗ＴＧＦβ抗体は完全ヒト抗体である。用語「完全ヒト抗体」には、Ｋａｂａｔらによって記載されるような、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列に対応する可変領域および定常領域を有する抗体が含まれる（Ｋａｂａ，Ｅ．  Ａ．ら（１９９１）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１〜３２４２を参照）。完全ヒト化抗体を産生する方法は、当該技術分野において公知である。
【００３１】
語句「組み換えヒト抗体」は、組み換え手段によって製造されたか、発現されたか、作製されたか、または単離されたヒト抗体を含み、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら（１９９２）、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０：６２８７〜６２９５頁参照）にトランスジェニックおよび／もしくは染色体交換された動物（例えばマウスもしくはウシ）から単離された抗体、または他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段によって製造されたか、発現されたか、作製されたか、または単離された抗体を含む。そのような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列由来の定常領域および可変領域を有してもよい（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１〜３２４２参照）。しかしながら、特定の実施形態では、そのような組み換えヒト抗体はインビトロ変異生成（またはヒトのＩｇ配列に動物の遺伝子組み換え体が使用されるときはインビボでの体性変異）にかけられ、したがってその組み換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ配列に由来
および関連する一方、インビボのヒト抗体生殖細胞系レパートリーには天然に存在しない可能性もある配列である。
【００３２】
用語「重鎖」は、抗体について使用するとき、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、アルファ（α）、デルタ（Δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と呼ばれる５つの別個の種類を指す。重鎖のこれらの個別の種類は、当該技術分野において周知であり、抗体に５つのクラス、それぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、さらにＩｇＧについては４つの下位クラス、つまりＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４を生じさせる。好ましくは、重鎖は、ヒト重鎖である。
【００３３】
「単離された」または「精製された」抗体は、抗体が由来する細胞もしくは組織に由来する、細胞物質もしくは他の混入タンパク質を実質的に含まず、または化学的に合成された場合は化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。語句「細胞性物質を実質的に含まない」は、抗体が単離されたまたは組み換え産生された細胞の細胞成分と分離されている抗体の調製物を含む。したがって胞性物質を実質的に含まない抗体には、異種性タンパク質（本明細書において「混入タンパク質」とも称される）が、約３０％未満、２０％未満、１０％未満または５％未満（乾燥重量による）である抗体の調製物を含む。抗体が組み換え産生される場合、抗体は好ましくは培地を実質的に含まない、つまり、培地がタンパク質調製物の体積の約２０％未満、１０％未満または５％未満を示す。抗体が化学合成によって製造されるとき、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まないことが好ましく、つまりタンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されている。したがって、そのような抗体調製物は、対象の抗体以外に約３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満（乾燥重量による）の化学前駆物質または化合物を有する。好ましい実施形態において、抗ＴＧＦβ抗体は単離または精製されている。
【００３４】
用語「Ｋａｂａｔナンバリング」および同様の用語は、当該技術分野において認識されており、抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基よりも可変性が高い（つまり、超可変性の）アミノ酸残基に番号を付けるシステムを指す（Ｋａｂａｔら（１９７１）  Ａｎｎ．  ＮＹ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １９０：３８２−３９１およびＫａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２）。重鎖可変領域に関しては、超可変領域は、典型的に、ＣＤＲ１についてアミノ酸３１〜３５位、ＣＤＲ２についてアミノ酸５０〜６５位、ＣＤＲ３についてアミノ酸９５〜１０２位の範囲である。軽鎖可変領域に関しては、超可変領域は、典型的に、ＣＤＲ１についてアミノ酸２４〜３４位、ＣＤＲ２についてアミノ酸５０〜５６位、ＣＤＲ３についてアミノ酸８９〜９７位の範囲である。
【００３５】
用語「軽鎖」は、抗体について使用するとき、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）またはラムダ（λ）と呼ばれる２つの別個の種類を指す。軽鎖アミノ酸配列は当該技術分野において周知である。好ましい実施形態において、軽鎖はヒト軽鎖である。
【００３６】
用語「制御する」、「制御すること」および「制御」は、対象が、疾患または障害の治癒をもたらさない治療剤（例えば予防剤または治療薬剤）から得る、有益な効果を指す。特定の実施形態において、対象は、ＴＧＦβ媒介疾患（例えばＯＩ）またはその１つまたはそれ以上の症状を「制御」して疾患の進行または悪化を予防するために、１つまたはそれ以上の治療剤（例えば予防剤または治療薬剤）を投与される。
【００３７】
用語「モノクローナル抗体」は、均質または本質的に均質の抗体集団から得られた抗体を指し、各モノクローナル抗体は典型的にはそれぞれ抗原上の単一エピトープを認識する。好ましい実施形態において、「モノクローナル抗体」は、単一のハイブリドーマまたは他の細胞によって生産される抗体である。用語「モノクローナル」は、抗体を作製するためのどの特定の方法にも限定されない。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら；Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）に記載されるようなハイブリドーマ方法によって作製してもよく、またはファージライブラリから単離してもよい。クローン細胞株およびそれより発現されたモノクローナル抗体の製造のための他の方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（２００２）第５版；  Ａｕｓｕｂｅｌら編著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにおける第１１章参照）。
【００３８】
用語「薬学的に許容される」とは、連邦政府もしくは州政府の管理当局によって承認されているか、または米国薬局方、欧州薬局方もしくは他の一般的に認識されている薬局方において、動物、特にヒトで使用するために収載されていることを意味する。
【００３９】
用語「薬学的に許容される賦形剤」は、活性分子、例えばモノクローナル抗体と、適合可能なまたは都合の良い投薬形態を製造するために組み合わされる任意の不活性分子を意味する。「薬学的に許容される賦形剤」は、使用された投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、モノクローナル抗体を含む製剤の他の成分と適合可能な賦形剤である。
【００４０】
用語「予防する」、「予防すること」、および「予防」は、本明細書に記載する一治療剤または治療剤の組み合わせ（例えば、予防または治療薬剤の組み合わせ）の投与により、ＴＧＦβ媒介疾患および／またはそれに関連する症状の発症、再発、発生または拡大を全体的にまたは部分的に阻害することを指す。
【００４１】
用語「ＴＧＦβ抗原」は、抗体が特異的に結合するＴＧＦβポリペプチドの一部を指す。ＴＧＦβ抗原は、抗体が特異的に結合するＴＧＦβポリペプチドまたはその断片のアナログまたは誘導体を指す。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβ抗原は単量体ＴＧＦβ抗原または二量体ＴＧＦβ抗原である。エピトープに寄与するＴＧＦβポリペプチドの領域は、ポリペプチドの連続するアミノ酸であってもよく、またはエピトープは、ポリペプチドの２つまたはそれ以上の非連続的領域を一緒にして成るものでもよい。エピトープは抗原の三次元表面特徴であってもなくてもよい。免疫反応を誘発可能なＴＧＦβ抗原の表面上に局在化された領域は、ＴＧＦβエピトープである。エピトープは抗原の三次元表面特徴であってもなくてもよい。本明細書で使用するとき、ＴＧＦβ抗原の「アナログ」は、ＴＧＦβポリペプチド、ＴＧＦβポリペプチドの断片または本明細書に記載のＴＧＦβエピトープと類似または同一の機能を有するポリペプチドを指す。例えば、アナログは、本明細書に記載のＴＧＦβポリペプチド（例えば、配列番号１、２もしくは３）、ＴＧＦβポリペプチドの断片、ＴＧＦβエピトープまたは本明細書に記載の抗ＴＧＦβ抗体の断片のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一の配列を含み得る。追加的にまたは代替的に、ポリペプチドは、本明細書に記載のＴＧＦβポリペプチド、ＴＧＦβポリペプチドの断片またはＴＧＦβエピトープをコードするヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる。
【００４２】
用語「ヒトＴＧＦβ」、「ｈＴＧＦβ」または「ｈＴＧＦβポリペプチド」および同様の用語は、配列番号１、２または３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において相互に交換可能に使用）、ならびにそのＳＮＰ変異体を含む関連ポリペプチドを指す。関連ポリペプチドとしては、好ましくはＴＧＦβ活性を保持するかおよび／または抗ＴＧＦβ免疫反応を生成するため
に十分な、対立形質変異体（例えば、ＳＮＰ変異体）、スプライス変異体、断片；誘導体；置換、欠失、および挿入変異体；融合ポリペプチド；ならびに異種間ホモログが挙げられる。さらに、抗ＴＧＦβ免疫反応を生成するために十分なＴＧＦβの可溶形態も包含される。当業者であれば認識するように、抗ＴＧＦβ抗体は、ＴＧＦβポリペプチド、ポリペプチド断片、抗原および／または、エピトープがより大きなポリペプチド断片の一部、さらにはより大きなポリペプチドの一部である大きな抗原の一部であるとき、エピトープに結合することができる。ｈＴＧＦβは二量体形態または単量体形態で存在することもできる。
【００４３】
用語「ＴＧＦβ媒介疾患」および「ＴＧＦβ媒介障害」は、相互に交換可能に使用される語であり、ＴＧＦβ、例えばｈＴＧＦβによって完全にまたは部分的に引き起こされるまたは起因する任意の疾患または障害を指す。特定の実施形態において、ＴＧＦβは異常発現している。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβは、特定の細胞型において異常に上方調節されている。別の実施形態において、正常、異常、または過剰な細胞シグナル伝達が、ＴＧＦβ受容体へのＴＧＦβの結合により引き起こされる。特定の実施形態において、ＴＧＦβ受容体（例えば、ＴＧＦβ受容体１、２または３）は、細胞、例えば骨芽細胞、破骨細胞または骨髄間質細胞の細胞表面で発現する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβ媒介疾患は、退行性骨疾患、例えば骨形成不全症である。
【００４４】
用語「特異的に結合する」または「特異的結合」は１つの抗原またはその断片（例えばＴＧＦβ）に特異的に結合し、他の抗原には特異的に結合しないことを指す。抗原に特異的に結合する抗体は、例えば放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＢＩＡＣＯＲＥ、または当該分野で公知の他のアッセイによって測定するとき、他のペプチドまたはポリペプチドに対して低い親和性で結合してもよい。ある実施形態において、本発明の抗ＴＧＦβ抗体は、異なる非ＴＧＦβ抗原の２倍を超える親和性でＴＧＦβ（例えばｈＴＧＦβ）に特異的に結合しうる。抗原に特異的に結合する抗体またはその変異体もしくは断片は、関連する抗原と交差反応してもよい。例えば、ある実施形態において、抗ＴＧＦβ抗体は、ｈＴＧＦβおよび別のＴＧＦβ抗原（例えば齧歯動物または非ヒト霊長類ＴＧＦβ抗体）と交差反応することができる。好ましくは、抗原に特異的に結合する抗体またはその変異体もしくは断片は、他の非ＴＧＦβ抗原と交差反応しない。ＴＧＦβ抗原に特異的に結合する抗体またはその変異体もしくは断片は、例えば免疫アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅまたは当業者に既知の他の技術によって同定することができる。典型的には、特異的または選択的反応は、少なくとも２倍のバックグラウンドシグナル、バックグラウンドノイズ、またはより典型的には１０倍を超えるバックグラウンドでありうる。いくつかの実施形態において、結合タンパク質または抗体は、その抗原、例えばＴＧＦβに、１×１０−６Ｍ〜１×１０−７の解離定数で結合する。別の実施形態において、解離定数は、１×１０−６Ｍ〜１×１０−８である。抗体の特異性に関する考察については、例えば、Ｐａｕｌ編著、１９８９、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３３２〜３３６頁を参照のこと。
【００４５】
用語「対象」および「患者」は、相互に交換可能に使用される。本明細書で使用するとき、対象は、好ましくは哺乳動物、例えば非霊長動物（例えばウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）、または霊長動物（例えばサル、ヒト）、最も好ましくはヒトである。１つの実施形態において、対象は、ＴＧＦβ媒介疾患を有する哺乳動物、好ましくはヒトである。別の実施形態において、対象は、ＴＧＦβ媒介疾患の発症リスクを有する哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００４６】
用語「治療薬剤」は、ＴＧＦβ媒介疾患および／またはそれに関連する症状の処置、制御、または緩和に使用することができる任意の薬剤を指す。ある実施形態において、用語
「治療薬剤」は、ＴＧＦβ抗体を指す。ある別の実施形態において、用語「治療薬剤」は、ＴＧＦβ抗体以外の薬剤を指す。好ましくは、治療薬剤は、ＴＧＦβ媒介疾患またはその１つもしくはそれ以上の症状の処置、制御または緩和に有用であることが公知であるか、またはこれまで使用されたもしくは現在使用されている薬剤である。
【００４７】
用語「治療」は、ＴＧＦβ媒介疾患（例えば、ＯＩ）の予防、制御、処置および／または緩和に使用することができる任意のプロトコル、方法および／または薬剤を指す。特定の実施形態において、用語「治療（複数）」および「治療」は、当業者、例えば医療従事者に知られているＴＧＦβ媒介疾患の生物学的治療法、支持療法、ならびに／またはＴＧＦβ媒介疾患の予防、制御、処置および／もしくは緩和に有用な他の治療法を指す。
【００４８】
用語「処置する」、「処置」および「処置すること」は、１つまたそれ以上の治療（例えば、これらに限定されないが、１つまたはそれ以上の予防薬剤または治療薬剤の投与）の結果として、ＴＧＦβ媒介疾患（例えば、ＯＩ）の進行、重症度、および／または持続期間を低減または改善することを指す。特定の実施形態において、そのような用語は、ＴＧＦβのＴＧＦβ受容体への結合の低下または阻害、対象のＴＧＦβ受容体を発現する細胞からのＴＧＦβの産生もしくは分泌の低下もしくは阻害、対象のＴＧＦβを発現しない細胞からのＴＧＦβの産生もしくは阻害の低下もしくは阻害、および／またはＴＧＦβ媒介関連疾患、例えばＯＩの１つまたはそれ以上の症状の阻害または低下を指す。
【００４９】
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、軽鎖および重鎖の一部分であって、典型的には重鎖のアミノ末端１２０〜１３０アミノ酸および軽鎖の約１００〜１１０アミノ酸であり、抗体間で著しく配列が異なっており、特定の抗体それぞれの特定の抗原に対する結合性および特異性に利用される一部分を指す。配列の可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域に集約され、一方で、可変ドメインのより高度に保存された領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。軽鎖と重鎖のＣＤＲは、抗原と抗体の相互作用で主たる役割を担う。アミノ酸位置のナンバリングは、Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ
Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．）第５版（「Ｋａｂａｔら」）に記載されているようなＥＵインデックスに従う。好ましい実施形態において、可変領域はヒト可変領域である。
【００５０】
Ｂ．骨形成不全症（ＯＩ）
ＯＩは、骨マトリックス沈着またはホメオスタシスに関与する１つまたはそれ以上のタンパク質の欠損によって特徴付けられる一群の先天性骨障害を包含する。特定の遺伝子変異、生じるタンパク質の欠損、または罹患個体の表現型によって定義される８つの種類のＯＩがある。ＯＩの種類によって表現型は様々であるが、共通の症状として、骨格と歯の不完全骨化、骨量減少、脆弱骨、および病的骨折が挙げられる。
【００５１】
Ｉ型コラーゲンは、石灰化組織および非石灰化組織の両方において最も豊富な結合組織タンパク質の１つである。Ｉ型コラーゲンの正確な合成、翻訳後修飾および分泌は、適切な組織発達、維持および修復に必要である。ＯＩを有する個体で特定されるほとんどの変異がＩ型コラーゲンの合成低下、またはＩ型コラーゲンの不正確な合成および／もしくはプロセシングを引き起こす。
【００５２】
Ｉ型コラーゲン遺伝子の変異に加えて、コラーゲンの細胞内トラフィッキングおよびプロセシングに関与する遺伝子の他の変異が、ＯＩ罹患個体において特定される。これらの遺伝子としては、分子シャペロン、例えばＦＫ５０６結合タンパク質１０（ＦＫＢＰ１０）および熱ショックタンパク質４７（ＨＳＰ４７）（Ａｌａｎａｙら、２０１０；Ｃｈｒ
ｉｓｔｉａｎｓｅｎら、２０１０；Ｋｅｌｌｅｙら、２０１１）が挙げられる。さらなる変異が、分子間コラーゲン架橋遺伝子、例えば、プロコラーゲン−リジン、２−オキソグルタレート５−ジオキシゲナーゼ２（ＰＬＯＤ２）において、コラーゲンプロリルヒドロキシラーゼ遺伝子ファミリーのメンバー、例えばロイシンプロリン−高プロテオグリカン（レプレカン（ｌｅｐｒｅｃａｎ））（ＬＥＰＲＥ１）、ペプチジルプロリルイソメラーゼＢ（シクロフィリンＢ）（ＣＹＰＢ）において、および軟骨関連タンパク質（ＣＲＴＡＰ）において特定されている（Ｍｏｒｅｌｌｏら、２００６；Ｃａｂｒａｌら、２００７；Ｂａｌｄｒｉｄｇｅら、２００８；ｖａｎ  Ｄｉｊｋら、２００９；Ｃｈｏｉら、２００９；Ｂａｒｎｅｓら、２０１０；Ｐｙｏｔｔら、２０１１）。変異に加えて、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）ならびにそれぞれの受容体などのタンパク質が様々なＯＩ表現型に関与していると考えられるが、それらの作用の正確なメカニズムはわかっていない（Ｇｅｂｋｅｎら、２０００）。
【００５３】
一実施形態において、ＴＧＦβ発現は、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲンに結合する分子によって制御される。ある実施形態において、小ロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）はＴＧＦβ発現を制御する。特定の実施形態において、デコリンはＴＧＦβ合成を制御する。ある実施形態において、デコリンは、３−ヒドロキシプロリン部位がＩ型および／またはＩＩ型コラーゲン分子の９８６位に存在していないＩ型またはＩＩ型コラーゲンには結合しない。
【００５４】
Ｃ．骨生物学
脊椎動物の骨格は、骨で構成されており、骨は、構造、土台、保護、およびイオン輸送を制御する無機物質源である生きた石灰化組織である。骨は細胞および非細胞成分で構成される特別な結合組織である。非細胞性細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、コラーゲンタンパク質および非コラーゲンタンパク質を含んでおり、それらの両方が石灰化プロセスに関与している。正確に分泌され整列したＥＣＭが、適切な骨形成にとって重要である。骨形成不全症で証拠づけられるように、いずれかのＥＣＭタンパク質の欠失、奇形または誤配列により、病理が発生する。
【００５５】
用語「皮質骨」または「緻密骨」は、濃密で、硬く、頑丈な骨の外層を指す。用語「骨梁骨」または「海綿質骨」は、皮質骨より軽く、皮質骨ほど濃密でない骨の吸収性中間層である。用語「骨梁」は、棒状形状のコラーゲンで構成された海綿状骨の微視的構造単位である。
【００５６】
骨は不断の再構築が行われる動的組織である。用語「骨芽細胞」は、類骨を沈着する終末分化骨形成細胞を指す。用語「類骨」は、主としてＩ型コラーゲンで構成される未成熟の未石灰化骨を指す。用語「前骨芽細胞」は、完全に分化していない増殖能を有する未成熟骨芽細胞を指す。用語「骨前駆細胞」は、骨芽細胞を含むいくつかの種類の間質細胞を生じさせることが可能な多能性細胞を指す。骨前駆細胞は一般に「間質幹細胞」と呼ばれ、骨髄の中で発生し、循環血液から少数を単離することができる。用語「破骨細胞」は、骨髄単球から分化した終末分化骨再吸収細胞を指す。破骨細胞は、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の発現によって識別することができる。
【００５７】
正常なホメオスタシス条件下において、骨芽細胞と破骨細胞は骨統合を維持するために協同して働く。骨沈着および骨吸収が共役しないとき、病理が生じる。例えば、大理石骨病は、破骨細胞が吸収できない結果として、骨が過剰に濃密で硬くなることを特徴とする骨疾患であり、一方で骨粗鬆症は、破骨細胞の活性増加に起因しうる脆い多孔性の骨を特徴とする骨障害である。破骨細胞の活性が骨形成不全症で増加している可能性があることを提示する証拠があり、これらの種類の細胞が治療介入の有望な標的となりうることが示唆される。本開示は、ＴＧＦβ抗体を用いて破骨細胞を阻害する方法を含む。
【００５８】
骨の構造、密度および性質を測定し、特徴付けるためにいくつかの方法を使用することができ、例えば、組織学および組織形態計測、原子間力顕微鏡、共焦点ラマン顕微鏡検査、ナノインデンテーション、３点曲げ試験、Ｘ線イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影（μ−ＣＴ）が挙げられる。例示的な実施形態において、骨格はこれらの方法の少なくとも１つによって測定され、特徴付けられる。
【００５９】
用語「骨体積密度」は、石灰化された物質（骨体積またはＢＶ）で構成される骨の所与の体積（全体積またはＴＶ）に対する割合を指す。したがって、骨体積密度はＢＶ／ＴＶとして計算され、パーセンテージで記述される。用語「骨比表面積」は所与の骨体積あたりの全骨表面積（ＢＳ）を指す。したがって、特定の骨表面積はＢＳ／ＴＶとして計算される。他の共通の骨測定値としては、骨面積（Ｂ．Ａｒ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）、骨梁間隔（Ｔｂ．Ｓｐ）；Ｎ．Ｏｃ（破骨細胞数）；Ｏｃ．Ｓ（破骨細胞表面積）；Ｏｃ．Ｓ／ＢＳ；骨芽細胞数（Ｎ．Ｏｂ）、骨芽細胞表面積（Ｏｂ．Ｓ）、骨芽細胞全周（Ｏｂ．Ｐｍ）および前記測定値のいずれかの導関数が挙げられる。Ｏｃ．Ｓ／ＢＳが大きいことは、破骨細胞による骨吸収が増加していることの指標である。
【００６０】
Ｄ．トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）
ＴＧＦβは、細胞の増殖および分化、胚発生、細胞外マトリックス形成、骨発達、創傷治癒、造血、ならびに免疫および炎症反応に関与する多機能サイトカインである（Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９８１；Ｂｏｒｄｅｒら、１９９５ａ）。分泌ＴＧＦβタンパク質は、潜在関連ペプチド（ｌａｔｅｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ＬＡＰ）および成熟ＴＧＦβペプチドへと切断され、潜在型および活性型で見出される。成熟したＴＧＦβペプチドは、ホモ二量体、および他のＴＧＦβファミリーとのヘテロ二量体の両方を形成する。ＴＧＦβは、任意の天然源から精製することができ、または合成的に（例えば組み換えＤＮＡ技術の使用によって）製造することもできる。ＴＧＦβ分子は、「ｈＴＧＦ」として知られるヒト由来の分子であることが好ましい。
【００６１】
３つのヒトＴＧＦβのアイソフォーム：ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３（それぞれＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０１１３７、Ｐ０８１１２およびＰ１０６００）があり、それらは生物学的に活性な状態で鎖間ジスルフィド架橋によって連結された２つの１１２アミノ酸モノマーを含む２５ｋＤａのホモ二量体である。ＴＧＦβ１は、ＴＧＦβ２とは２７個で、ＴＧＦβ３とは２２個で、主に保存的なアミノ酸が変化していることによる差異がある。これらの差異は、Ｘ線結晶学（Ｓｃｈｌｕｎｅｇｇｅｒら、１９９２；Ｐｅｅｒら、１９９６）によって測定されるＴＧＦβの３Ｄ構造で位置づけされ、受容体結合領域が定義される（Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、１９９６；Ｑｉａｎら、１９９６）。
【００６２】
ｈＴＧＦβ１（配列番号１）
ＭＰＰＳＧＬＲＬＬＬ  ＬＬＬＰＬＬＷＬＬＶ  ＬＴＰＧＲＰＡＡＧＬ  ＳＴＣＫＴＩＤＭＥＬ  ＶＫＲＫＲＩＥＡＩＲ  ＧＱＩＬＳＫＬＲＬＡ  ６０
ＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰ  ＧＰＬＰＥＡＶＬＡＬ  ＹＮＳＴＲＤＲＶＡＧ  ＥＳＡＥＰＥＰＥＰＥ  ＡＤＹＹＡＫＥＶＴＲ  ＶＬＭＶＥＴＨＮＥＩ  １２０
ＹＤＫＦＫＱＳＴＨＳ  ＩＹＭＦＦＮＴＳＥＬ  ＲＥＡＶＰＥＰＶＬＬ  ＳＲＡＥＬＲＬＬＲＬ  ＫＬＫＶＥＱＨＶＥＬ  ＹＱＫＹＳＮＮＳＷＲ  １８０
ＹＬＳＮＲＬＬＡＰＳ  ＤＳＰＥＷＬＳＦＤＶ  ＴＧＶＶＲＱＷＬＳＲ  ＧＧＥＩＥＧＦＲＬＳ  ＡＨＣＳＣＤＳＲＤＮ  ＴＬＱＶＤＩＮＧＦＴ  ２４０
ＴＧＲＲＧＤＬＡＴＩ  ＨＧＭＮＲＰＦＬＬＬ  ＭＡＴＰＬＥＲＡＱＨ  ＬＱＳＳＲＨＲＲＡＬ  ＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥ  ＫＮＣＣＶＲＱＬＹＩ  ３００
ＤＦＲＫＤＬＧＷＫＷ  ＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮ  ＦＣＬＧＰＣＰＹＩＷ  ＳＬＤＴＱＹＳＫＶＬ  ＡＬＹＮＱＨＮＰＧＡ  ＳＡＡＰＣＣＶＰＱＡ  ３６０
ＬＥＰＬＰＩＶＹＹＶ  ＧＲＫＰＫＶＥＱＬＳ  ＮＭＩＶＲＳＣＫＣＳ  ３９０（配列番号１）
【００６３】
ｈＴＧＦβ２（配列番号２）
ＭＨＹＣＶＬＳＡＦＬ  ＩＬＨＬＶＴＶＡＬＳ  ＬＳＴＣＳＴＬＤＭＤ  ＱＦＭＲＫＲＩＥＡＩ  ＲＧＱＩＬＳＫＬＫＬ  ＴＳＰＰＥＤＹＰＥＰ  ６０
ＥＥＶＰＰＥＶＩＳＩ  ＹＮＳＴＲＤＬＬＱＥ  ＫＡＳＲＲＡＡＡＣＥ  ＲＥＲＳＤＥＥＹＹＡ  ＫＥＶＹＫＩＤＭＰＰ  ＦＦＰＳＥＮＡＩＰＰ  １２０
ＴＦＹＲＰＹＦＲＩＶ  ＲＦＤＶＳＡＭＥＫＮ  ＡＳＮＬＶＫＡＥＦＲ  ＶＦＲＬＱＮＰＫＡＲ  ＶＰＥＱＲＩＥＬＹＱ  ＩＬＫＳＫＤＬＴＳＰ  １８０
ＴＱＲＹＩＤＳＫＶＶ  ＫＴＲＡＥＧＥＷＬＳ  ＦＤＶＴＤＡＶＨＥＷ  ＬＨＨＫＤＲＮＬＧＦ  ＫＩＳＬＨＣＰＣＣＴ  ＦＶＰＳＮＮＹＩＩＰ  ２４０
ＮＫＳＥＥＬＥＡＲＦ  ＡＧＩＤＧＴＳＴＹＴ  ＳＧＤＱＫＴＩＫＳＴ  ＲＫＫＮＳＧＫＴＰＨ  ＬＬＬＭＬＬＰＳＹＲ  ＬＥＳＱＱＴＮＲＲＫ  ３００
ＫＲＡＬＤＡＡＹＣＦ  ＲＮＶＱＤＮＣＣＬＲ  ＰＬＹＩＤＦＫＲＤＬ  ＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧ  ＹＮＡＮＦＣＡＧＡＣ  ＰＹＬＷＳＳＤＴＱＨ  ３６０
ＳＲＶＬＳＬＹＮＴＩ  ＮＰＥＡＳＡＳＰＣＣ  ＶＳＱＤＬＥＰＬＴＩ  ＬＹＹＩＧＫＴＰＫＩ  ＥＱＬＳＮＭＩＶＫＳ  ＣＫＣＳ  ４１４（配列番号２）
【００６４】
ｈＴＧＦβ３（配列番号３）
ＭＫＭＨＬＱＲＡＬＶ  ＶＬＡＬＬＮＦＡＴＶ  ＳＬＳＬＳＴＣＴＴＬ  ＤＦＧＨＩＫＫＫＲＶ  ＥＡＩＲＧＱＩＬＳＫ  ＬＲＬＴＳＰＰＥＰＴ  ６０
ＶＭＴＨＶＰＹＱＶＬ  ＡＬＹＮＳＴＲＥＬＬ  ＥＥＭＨＧＥＲＥＥＧ  ＣＴＱＥＮＴＥＳＥＹ  ＹＡＫＥＩＨＫＦＤＭ  ＩＱＧＬＡＥＨＮＥＬ  １２０
ＡＶＣＰＫＧＩＴＳＫ  ＶＦＲＦＮＶＳＳＶＥ  ＫＮＲＴＮＬＦＲＡＥ  ＦＲＶＬＲＶＰＮＰＳ  ＳＫＲＮＥＱＲＩＥＬ  ＦＱＩＬＲＰＤＥＨＩ  １８０
ＡＫＱＲＹＩＧＧＫＮ  ＬＰＴＲＧＴＡＥＷＬ  ＳＦＤＶＴＤＴＶＲＥ  ＷＬＬＲＲＥＳＮＬＧ  ＬＥＩＳＩＨＣＰＣＨ  ＴＦＱＰＮＧＤＩＬＥ  ２４０
ＮＩＨＥＶＭＥＩＫＦ  ＫＧＶＤＮＥＤＤＨＧ  ＲＧＤＬＧＲＬＫＫＱ  ＫＤＨＨＮＰＨＬＩＬ  ＭＭＩＰＰＨＲＬＤＮ  ＰＧＱＧＧＱＲＫＫＲ  ３００
ＡＬＤＴＮＹＣＦＲＮ  ＬＥＥＮＣＣＶＲＰＬ  ＹＩＤＦＲＱＤＬＧＷ  ＫＷＶＨＥＰＫＧＹＹ  ＡＮＦＣＳＧＰＣＰＹ  ＬＲＳＡＤＴＴＨＳＴ  ３６０
ＶＬＧＬＹＮＴＬＮＰ  ＥＡＳＡＳＰＣＣＶＰ  ＱＤＬＥＰＬＴＩＬＹ  ＹＶＧＲＴＰＫＶＥＱ  ＬＳＮＭＶＶＫＳＣＫ  ＣＳ  ４１２（配列番号３）
【００６５】
ヒトにはＴＧＦβ受容体１、２、および３の３つのＴＧＦβ受容体があり、それらは構造的特性および機能的特性、例えばＴＧＦβタンパク質ファミリーメンバーに対する親和性によって識別することができる。ＴＧＦβタンパク質のホモ二量体またはヘテロ二量体ＴＧＦβ膜貫通受容体複合体への結合は、細胞内ＳＭＡＤタンパク質によって媒介される標準的ＴＧＦβシグナル伝達経路を活性化する。
【００６６】
ＴＧＦβの脱調節は、複数の病理学的プロセスに結びつき、ヒトにおいて、様々な病態、例えば先天的欠損症、癌、慢性炎症、自己免疫疾患および線維性疾患との関係が指摘されてきた（Ｂｏｒｄｅｒら、１９９４；Ｂｏｒｄｅｒら、１９９５ｂ）。
【００６７】
ヒトＴＧＦβはマウスＴＧＦβに非常に類似しており、ヒトＴＧＦβ１はマウスＴＧＦβ１と１つしかアミノ酸の違いがなく、ヒトＴＧＦβ２はマウスＴＧＦβ２と３つのアミノ酸の差があるだけであり、ヒトＴＧＦβ３はマウスＴＧＦβ３と同一である。
【００６８】
Ｅ．トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）と結合する分子
本発明は、ＴＧＦβと結合する分子を対象に投与することを含む方法を含む。ＴＧＦβ結合剤は、任意の結合性の分子、例えば抗体、融合タンパク質（例えば免疫アドヘシン）、ｓｉＲＮＡ、核酸、アプタマー、タンパク質または小分子有機化合物であり得る。
【００６９】
ある実施形態において、本発明は、ＴＧＦβに結合する抗体（抗ＴＧＦβ抗体）またはその変異体もしくはその抗原結合性断片を含む。抗ＴＧＦβ抗体は、特にＴＧＦβタンパク質、ポリペプチド断片またはエピトープに結合する。ＴＧＦβと結合する分子は任意の種由来であり得る。
【００７０】
ある典型的な実施形態において、ＴＧＦβに結合する抗体は、ヒト化抗体、完全ヒト抗体またはその変異体もしくはその抗原結合性断片である。好ましい抗ＴＧＦβ抗体は、ＴＧＦβとその受容体との結合を抑制し、ＴＧＦβ生物活性（例えば、ＴＧＦβ受容体媒介細胞内ＳＭＡＤシグナル伝達およびその結果としての細胞活性）を阻害する。
【００７１】
ある実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片は、Ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ（ＣＡＴ−１５２）、Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ（ＣＡＴ−１９２）、Ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ（ＧＣ−１００８）、ＬＹ２３８２７７０、ＳＴＸ−１００あるいはＩＭＣ−ＴＲ１である。
【００７２】
ある特定の実施形態において、ＴＧＦβに結合する抗体は、次の相補性決定領域（ＣＤＲ）のいずれか１つまたはそれ以上のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む：ＨＣＤＲ１−ＳＮＶＩＳ（配列番号４）、
ＨＣＤＲ２−ＧＶＩＰＩＶＤＩＡＮＹＡＱＲＦＫＧ（配列番号５）、または
ＨＣＤＲ３−ＴＬＧＬＶＬＤＡＭＤＹ（配列番号６）。
【００７３】
他の特定の実施形態において、ＴＧＦβに結合する抗体は、次の相補性決定領域（ＣＤＲ）のいずれか１つまたはそれ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む：ＬＣＤＲ１−ＲＡＳＱＳＬＧＳＳＹＬＡ（配列番号７）、
ＬＣＤＲ２−ＧＡＳＳＲＡＰ（配列番号８）、または
ＬＣＤＲ３−ＱＱＹＡＤＳＰＩＴ（配列番号９）。
【００７４】
特定の実施形態において、ＴＧＦβに結合する抗体は、配列番号４、５および６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００７５】
別の実施形態において、ＴＧＦβに結合する抗体は、配列番号７、８および９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００７６】
より特定の実施形態において、ＴＧＦβに結合する抗体は、配列番号４、５および６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７、８および９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００７７】
特定の実施形態において、ＴＧＦβに結合する抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥ  ＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶ  ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳ  ＳＮＶＩＳＷＶＲＱＡ  ＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧ  ＶＩＰＩＶＤＩＡＮＹ  ＡＱＲＦＫＧＲＶＴＩ  ＴＡＤＥＳＴＳＴＴＹ  ＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＳＴＬ  ＧＬＶＬＤＡＭＤＹＷ
ＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１０）。
【００７８】
別の実施形態において、ＴＧＦβに結合する抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む：
ＥＴＶＬＴＱＳＰＧＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＡＳＱＳＬＧ  ＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫ  ＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ  ＧＡＳＳＲＡＰＧＩＰ  ＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴ  ＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥ  ＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱ  ＱＹＡＤＳＰＩＴＦＧ  ＱＧＴＲＬＥＩＫ（配列番号１１）。
【００７９】
より特定の実施形態において、ＴＧＦβに結合する抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβに結合する抗体は、定常領域、例えばヒトＩｇＧ定常領域を含む。いくつかの実施形態において、定常領域はヒトＩｇＧ４定常領域である。さらなる実施形態において、定常領域は改変ヒトＩｇＧ４定常領域である。好ましくは、ＩｇＧ４定常領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥ  ＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴ  ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳ  ＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ
ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶ  ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ  ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ  ＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤ  ＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤ  ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ  ＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹ  ＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ  ＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ  ＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳ  ＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ  ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ  ＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫ  ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ  ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ  ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ  ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ  ＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬ  ＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧ  ＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ  ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ  ＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１２）。
【００８１】
別の実施形態において、定常領域はヒトＣκ定常領域である。好ましくは、Ｃκ定常領域は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む：
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩ  ＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳ  ＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮ  ＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱ  ＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧ  ＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤ  ＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳ  ＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥ  ＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴ  ＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ  ＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１３）。
【００８２】
特定の実施形態において、ＴＧＦβに結合する抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥ  ＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶ  ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳ  ＳＮＶＩＳＷＶＲＱＡ  ＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧ  ＶＩＰＩＶＤＩＡＮＹ  ＡＱＲＦＫＧＲＶＴＩ  ＴＡＤＥＳＴＳＴＴＹ  ＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＳＴＬ  ＧＬＶＬＤＡＭＤＹＷ
ＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ  ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥ  ＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴ  ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳ  ＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ  ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶ  ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ  ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ  ＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤ  ＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤ  ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ  ＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹ  ＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ  ＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ  ＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳ  ＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ  ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ  ＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫ  ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ  ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ  ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ  ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ  ＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬ  ＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧ  ＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ  ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ  ＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１４）。
位置１−１２０：重鎖（ＶＨ）の可変領域。ＣＤＲ（相補性決定領域、Ｋａｂａｔの定義による）に下線を付している。
位置１２１−４４７：ヒトＩｇＧ４の定常領域（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＩＧＨＧ４＿ＨＵＭＡＮ）。
【００８３】
他の特定の実施形態において、ＴＧＦβに結合する抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む：
ＥＴＶＬＴＱＳＰＧＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＡＳＱＳＬＧ  ＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫ  ＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ  ＧＡＳＳＲＡＰＧＩＰ  ＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴ  ＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥ  ＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱ  ＱＹＡＤＳＰＩＴＦＧ  ＱＧＴＲＬＥＩＫＲＴ
ＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰ  ＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴ  ＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦ  ＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫ  ＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳ  ＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫ  ＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬ  ＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨ  ＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱ  ＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦ  ＮＲＧＥＣ（配列番号１５）。
位置１−１０８：軽鎖（ＶＬ）の可変領域。ＣＤＲ（相補性決定領域、Ｋａｂａｔの定義による）に下線を付している。
位置１０９−２１５：ヒトＣκの定常領域。
【００８４】
さらなる実施形態において、ＴＧＦβに結合する抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。
【００８５】
いくつかの実施形態において、ＴＧＦβに結合する抗体は、リーダー配列を含む宿主細胞によって発現される。リーダー配列は、好ましくは長さが１−３０のアミノ酸、より好ましくは２５−２５のアミノ酸、最も好ましくは１９アミノ酸のアミノ酸配列を含む。重鎖、軽鎖、または重鎖および軽鎖の両方が、リーダー配列を含んでもよい。
【００８６】
例えば、軽鎖または重鎖リーダー配列は、配列番号１６のアミノ酸配列を含んでもよい：ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬ  ＶＡＴＡＴＧＶＨＳ（配列番号１６）。したがって、プロセシングされていない重鎖を発現する宿主細胞は、配列番号１７のアミノ酸を含んでもよい：ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬ  ＶＡＴＡＴＧＶＨＳＱ  ＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶ  ＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳ  ＣＫＡＳＧＹＴＦＳＳ  ５０
ＮＶＩＳＷＶＲＱＡＰ  ＧＱＧＬＥＷＭＧＧＶ  ＩＰＩＶＤＩＡＮＹＡ  ＱＲＦＫＧＲＶＴＩＴ  ＡＤＥＳＴＳＴＴＹＭ  １００
ＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴ  ＡＶＹＹＣＡＳＴＬＧ  ＬＶＬＤＡＭＤＹＷＧ  ＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡ  ＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬ  １５０
ＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳ  ＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ  ＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷ  ＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨ  ＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧ  ２００
ＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶ  ＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹ  ＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮ  ＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫ  ＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡ  ２５０
ＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦ  ＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬ  ＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣ  ＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰ  ＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧ  ３００
ＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰ  ＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲ  ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱ  ＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣ  ＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳ  ３５０
ＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧ  ＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬ  ＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮ  ＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧ  ＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷ  ４００
ＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹ  ＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤ  ＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴ  ＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮ  ＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡ  ４５０
ＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬ  ＳＬＳＬＧＫ  ４６６（配列番号１７）。
ここで、
位置１〜１９：リーダー配列
位置２０〜１３９：重鎖（ＶＨ）の可変領域。ＣＤＲ（相補性決定領域、Ｋａｂａｔの定義による）に下線を付している。
位置１４０〜４６６：ヒトＩｇＧ４の定常領域（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＩＧＨＧ４＿ＨＵＭＡＮ）。
【００８７】
他の例示的実施形態において、プロセシングされていない軽鎖を発現する宿主細胞は、配列番号１８のアミノ酸を含んでもよい：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬ  ＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥ  ＴＶＬＴＱＳＰＧＴＬ  ＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬ  ＳＣＲＡＳＱＳＬＧＳ  ５０
ＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰ  ＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧ  ＡＳＳＲＡＰＧＩＰＤ  ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ  ＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰ  １００
ＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱ  ＹＡＤＳＰＩＴＦＧＱ  ＧＴＲＬＥＩＫＲＴＶ  ＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ  ＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡ  １５０
ＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹ  ＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶ  ＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱ  ＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤ  ＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴ  ２００
ＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫ  ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧ  ＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮ  ＲＧＥＣ  ２３４（配列番号１８）。
ここで、
位置１〜１９：リーダー配列
位置２０〜１２７：軽鎖（ＶＬ）の可変領域。ＣＤＲ（相補性決定領域、Ｋａｂａｔの定義による）に下線を付している。
位置１２８〜２３４：ヒトＣκの定常領域。
【００８８】
本発明の例示的実施形態において、ＴＧＦβに結合する抗体はヒト化抗体または完全ヒト抗体である。ヒト化抗体アイソタイプおよび完全ヒト抗体アイソタイプの例としては、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが挙げられる。好ましくは、抗ＴＧＦβ抗体はＩｇＧ抗体である。ＩｇＧには４つの形態がある。好ましくは、抗ＴＧＦβ抗体はＩｇＧ４抗体である。本発明の１つの実施形態において、抗ＴＧＦβ抗体はヒト化ＩｇＧ４抗体である。本発明の別の実施形態において、抗ＴＧＦβ抗体は完全ヒトＩｇＧ４抗体である。
【００８９】
最も好ましい本発明の実施形態において、抗ＴＧＦβ抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むＩｇＧ４抗ＴＧＦβ抗体である。本発明の代替的な最も好ましい実施形態において、抗ＴＧＦβ抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むＩｇＧ４抗ＴＧＦβ抗体であり、重鎖可変領域は配列番号４、５および６のアミノ酸配列を含む３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、軽鎖重鎖可変領域は、配列番号７、８および９のアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを含む抗体である。配列番号１４を含む重鎖アミノ酸配列、および配列番号１５を含む軽鎖アミノ酸配列、および配列番号４〜９に一致するＣＤＲ配列を含む抗ＴＧＦβ抗体の特定、単離、調製および特性決定は、米国特許第７，７２３，４８６号および米国特許第８，３８３，７８０号に詳細に記載されており、それらの文献は各々全体として参照によって本明細書に組み入れる。
【００９０】
好ましくは、抗体またはその抗原結合性断片は「汎特異的」であり、ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合する。より好ましくは、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合し、拮抗剤として作用する。最も好ましくは、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合し、ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３を中和する。本発明の方法で使用するために適している典型的な汎特異的抗ＴＧＦβモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の例としては、米国特許第７，７２３，４７６号および米国特許第８，３８３，７８０号に記載されており、それらは各々全体として参照によって本明細書に組み入れる。
【００９１】
１Ｄ１１．１６は、多様なインビトロアッセイにおいてヒトおよびマウスＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３を中和する典型的なマウス汎特異的抗ＴＧＦβ抗体であり（Ｄａｓｃｈら、１９８９；Ｄａｓｃｈら、１９９６、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｐｒｏｄｕ
ｃｔ  ｓｈｅｅｔ  ｆｏｒ  ＭＡＢ１８３５、これらは参照によって全体としてそれぞれ本明細書に組み入れる）、線維症モデル動物における原理究明研究においても有用である（Ｌｉｎｇら、２００３；Ｍｉｙａｊｉｍａら、２０００；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９９；Ｋｈａｎｎａら、１９９９；Ｓｈｅｎｋａｒら、１９９４）。しかしながら、１Ｄ１１．１６は、マウスモノクローナル抗体であるので（Ｄａｓｃｈら、１９８９；Ｄａｓｃｈら、１９９６）、ヒトでの治療的使用には好ましくない。したがって、特定の実施形態では、１Ｄ１１．１６抗体の変異体または誘導体が本発明の方法で用いられる。
【００９２】
上述のように、本発明の特定の実施形態は、抗ＴＧＦβ抗体の変異体または誘導体を含む。詳細には、本発明は、抗ＴＧＦβ抗体が、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むＩｇＧ４抗ＴＧＦβ抗体である、抗ＴＧＦβ抗体の変異体を含みうる。別の実施形態において、本発明は、１Ｄ１１．１６抗体の変異体または誘導体を含む。抗ＴＧＦβ抗体の変異体は、それらの高い類似性に基づいて同様の物理化学的特性を有し得、したがって、本発明の範囲内に含まれる。変異体は、本明細書に記載の抗ＴＧＦβ抗体に少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％または９９％相同であるアミノ酸配列を有し、ＴＧＦβポリペプチド、ＴＧＦβポリペプチド断片またはＴＧＦβエピトープに対する結合に競合可能な抗体と定義される。好ましくは、変異体は、ＴＧＦβとその受容体との結合およびＴＧＦβ生物活性（例えば、ＴＧＦβ受容体媒介細胞内ＳＭＡＤシグナル伝達およびその結果としての細胞活性）を緩和、中和、または他の方法で阻害する。標的に対する結合の競合の決定は、当該技術分野で公知の常法にしたがって実施することができる。好ましくは、変異体はヒト化抗体であり、好ましくはＩｇＧ４分子である。好ましい実施形態において、変異体は、抗ＴＧＦβ抗体が、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むＩｇＧ４抗ＴＧＦβ抗体と、アミノ酸配列において少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。用語「変異体」は、抗ＴＧＦβ抗体のアミノ酸配列と比較して、１つまたはそれ以上のアミノ酸によって改変されたアミノ酸配列を含む抗体を指す。変異体は、アミノ酸の置換、修飾、付加および欠失を含む保存的配列改変を含み得る。
【００９３】
改変の例としては、例えばこれらに限定されないが、糖鎖形成、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮蔽基による誘導体化、タンパク質分解、ならびに細胞リガンドおよび他のタンパク質への連結が挙げられる。アミノ酸改変は、当該分野で公知の標準的技術によって、例えば抗体をコードする核酸における部位特異的変異生成、分子クローニング、オリゴヌクレオチド特異的変異生成およびランダムＰＣＲ媒介変異生成によって導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の構造または化学的性質を有するアミノ酸残基と置換されている置換を含む。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において定義されている。これらのファミリーには、例えば、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族性側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）が挙げられる。上記で使用した以外の他のアミノ酸残基の分類を利用し得ることも当業者にとって明確である。さらに変異体は、非保存性アミノ酸置換（例えば、アミノ酸を、異なる構造または化学的性質を有するアミノ酸残基とする置換）を有してもよい。同様の些細な変形は、アミノ酸の欠失、挿入またはその両方を含んでもよい。免疫学的活性を失うことなく、置換、修飾、挿入または欠失しうるアミノ酸残基を決定する指針は、当該技術分野で周知のコンピュータ・プログラムを使用して見出することができる。コンピュータ・
アルゴリズム、例えば、特にＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔは、当業者に良く知られており、比較されるアミノ酸配列を最適に整列させて、アミノ酸残基の類似性または同一性を定義するために使用することができる。変異体は、抗ＴＧＦβ抗体と比較して、同じまたは異なる、より高いまたはより低い結合親和力を有し、なおＴＧＦβに結合することができ、より高いまたはより低いが抗ＴＧＦβ抗体と同じ生物学的活性を有する。
【００９４】
本発明の実施形態には、抗ＴＧＦβ抗体の抗原結合断片も含まれる。用語「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、「抗原結合断片」および同様の語句は、抗原と相互作用するアミノ酸残基を含み、抗原に対するその特異性と親和性を結合剤に付与する抗体の一部分（例えば相補性決定領域（ＣＤＲ））を指す。抗原結合領域は、齧歯動物（例えば、ウサギ、ラット、またはハムスター）およびヒトに由来することができる。好ましくは、抗原結合領域はヒト起源である。抗原結合断片の非限定的な例としては、以下が挙げられる：Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、ｄＡｂ断片、および抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位。
【００９５】
Ｆ．治療的投与
本明細書に記載の方法は、ＴＧＦβに結合する治療有効量の抗体を対象に投与することを含む。本明細書で使用するとき、語句「治療有効量」は、ＯＩに関連する１つまたはそれ以上の症状の検知可能な改善をもたらす、または骨形成不全症の病態もしくは症状を生じさせる根本的な病理学的メカニズムに相関する生物学的効果（例えば特別のバイオマーカーのレベルの低下）を生じさせる、ＴＧＦβに結合する抗体の用量を意味する。例えば、骨塩量を増加させ、骨量および／もしくは骨強度を増加させ、骨折および／もしくは歯損を低下させ、ならびに／またはＯＩの任意の診断測定値を改善するＴＧＦβに結合する抗体の用量は、治療有効量と考えられる。
【００９６】
一実施形態において、骨塩量、骨量および／または骨強度は、ＴＧＦβに結合する抗体を用いた処置後に、約５％〜約２００％増加する。特定の実施形態において、骨塩量、骨量および／または骨強度は、ＴＧＦβに結合する抗体を用いた処置後に、約５％〜約１０％、１０％〜約１５％、１５％〜約２０％、２０％〜約２５％、２５％〜約３０％、３０％〜約３５％、３５％〜約４０％、４０％〜約４５％、４５％〜約５０％、５０％〜約５５％、５５％〜約６０％、６０％〜約６５％、６５％〜約７０％、７０％〜約７５％、７５％〜約８０％、８０％〜約８５％、８５％〜約９０％、９０％〜約９５％、９５％〜約１００％、１００％〜約１０５％、１０５％〜約１１０％、１１０％〜約１１５％、１１５％〜約１２０％、１２０％〜約１２５％、１２５％〜約１３０％、１３０％〜約１３５％、１３５％〜約１４０％、１４０％〜約１４５％、１４５％〜約１５０％、１５０％〜約１５５％、１５５％〜約１６０％、１６０％〜約１６５％、１６５％〜約１７０％、１７０％〜約１７５％、１７５％〜約１８０％、１８０％〜約１８５％、１８５％〜約１９０％、１９０％〜約１９５％、または１９５％〜約２００％増加する。
【００９７】
ある実施形態において、骨吸収の血清バイオマーカー、例えば尿中ヒドロキシプロリン、尿中総ピリジノリン（ＰＹＤ）、尿中遊離デオキシピリジノリン（ＤＰＤ）、尿中コラーゲンＩ型架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）、尿中または血清コラーゲンＩ型架橋Ｃ−テロペプチド（ＣＴＸ）、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）および酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ）を低下させる抗体の用量は、治療有効量と考えられる。一実施形態では、骨吸収の血清バイオマーカーは、ＴＧＦβに結合する抗体の処置後に、約５％〜約２００％低下する。
【００９８】
一実施形態において、骨吸収の血清バイオマーカー、例えば尿中ヒドロキシプロリン、尿中総ピリジノリン（ＰＹＤ）、尿中遊離デオキシピリジノリン（ＤＰＤ）、尿中コラーゲンＩ型架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）、尿中または血清コラーゲンＩ型架橋Ｃ−テロ
ペプチド（ＣＴＸ）、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）および酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ）は、ＴＧＦβに結合する抗体を用いた処置後に、約５％〜約１０％、１０％〜約１５％、１５％〜約２０％、２０％〜約２５％、２５％〜約３０％、３０％〜約３５％、３５％〜約４０％、４０％〜約４５％、４５％〜約５０％、５０％〜約５５％、５５％〜約６０％、６０％〜約６５％、６５％〜約７０％、７０％〜約７５％、７５％〜約８０％、８０％〜約８５％、８５％〜約９０％、９０％〜約９５％、９５％〜約１００％、１００％〜約１０５％、１０５％〜約１１０％、１１０％〜約１１５％、１１５％〜約１２０％、１２０％〜約１２５％、１２５％〜約１３０％、１３０％〜約１３５％、１３５％〜約１４０％、１４０％〜約１４５％、１４５％〜約１５０％、１５０％〜約１５５％、１５５％〜約１６０％、１６０％〜約１６５％、１６５％〜約１７０％、１７０％〜約１７５％、１７５％〜約１８０％、１８０％〜約１８５％、１８５％〜約１９０％、１９０％〜約１９５％、または１９５％〜約２００％低下する。
【００９９】
ある実施形態において、骨沈着の血清バイオマーカー、例えば総アルカリホスファターゼ、骨特異的アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、およびＩ型プロコラーゲン（Ｃ末端／Ｎ末端）を増加させる抗体の用量が、治療有効量と考えられる。実施形態では、骨沈着の血清バイオマーカーは、ＴＧＦβに結合する抗体を用いた処置後に約５％〜約２００％増加する。
【０１００】
一実施形態において、骨沈着の血清バイオマーカー、例えば総アルカリホスファターゼ、骨特異的アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、およびＩ型プロコラーゲン（Ｃ末端／Ｎ−末端）が、ＴＧＦβに結合する抗体を用いた処置後に、約５％〜約１０％、１０％〜約１５％、１５％〜約２０％、２０％〜約２５％、２５％〜約３０％、３０％〜約３５％、３５％〜約４０％、４０％〜約４５％、４５％〜約５０％、５０％〜約５５％、５５％〜約６０％、６０％〜約６５％、６５％〜約７０％、７０％〜約７５％、７５％〜約８０％、８０％〜約８５％、８５％〜約９０％、９０％〜約９５％、９５％〜約１００％、１００％〜約１０５％、１０５％〜約１１０％、１１０％〜約１１５％、１１５％〜約１２０％、１２０％〜約１２５％、１２５％〜約１３０％、１３０％〜約１３５％、１３５％〜約１４０％、１４０％〜約１４５％、１４５％〜約１５０％、１５０％〜約１５５％、１５５％〜約１６０％、１６０％〜約１６５％、１６５％〜約１７０％、１７０％〜約１７５％、１７５％〜約１８０％、１８０％〜約１８５％、１８５％〜約１９０％、１９０％〜約１９５％、または１９５％〜約２００％増加する。
【０１０１】
別の実施形態は、ＯＩによって影響を受けた非骨格器官の機能を改善する治療有効量の抗体を投与することを含む。例えば、聴覚、肺および／または腎機能を改善するＴＧＦβに結合する抗体の用量は、治療有効量と考えられる。
【０１０２】
本発明の方法によれば、対象に投与されるＴＧＦβに結合する抗体の治療有効量は、対象の年齢およびサイズ（例えば、体重または体表面積）、ならびに投与経路および当業者に周知の他の投与経路に依存して変化する。
【０１０３】
特定の例示的実施形態において、抗ＴＧＦβ抗体は対象に皮下投与で投与される。他の例示的な投与様式としては、これらに限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられる。組成物は、任意の都合のよい経路で投与することができ、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜（例えば口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通じた吸収によって、ならびに他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は、全身性でも局所性でもよい。ＴＧＦβ抗体は、非経口的にまたは皮下に投与することができる。
【０１０４】
様々な送達システムが知られており、医薬組成物を送達させるために使用することができ、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル内の被包化、受容体媒介エンドサイトーシスなどが挙げられる（例えば、Ｗｕら（１９８７）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、第２６２巻、４４２９〜４４３２頁参照）。治療用組成物は、適切な担体、賦形剤、および改善された移行性、送達性、耐用性などを製剤に付与するために組み入れられる他の薬剤を用いて投与される。多くの適切な製剤を、全ての薬剤師に公知の処方集で見つけることができる：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ろう、油、脂質、ベシクル含有脂質（カチオン性またはアニオン性）（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）、ＤＮＡ結合体、無水吸収性ペースト、水中油型および油中水型エマルジョン、エマルジョンカルボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカルボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌら、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ
ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」、ＰＤＡ（１９９８）、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ、第５２巻、２３８〜３１１頁も参照のこと。
【０１０５】
医薬組成物は、活性成分の用量に適合する単位用量での投薬形態で製造することができる。そのような単位用量の投薬形態としては、例えば、錠剤、丸薬、カプセル剤、輸注剤（アンプル）、坐剤などが挙げられる。
【０１０６】
医薬組成物は、任意の許容される装置または機構を使用して対象に投与することもできる。例えば、投与は、注射器と針を使用して、または再使用可能なペン型および／もしくは自動注射送達装置を用いて実施することができる。本発明の方法は、複数の再使用可能なペン型および／または自動輸注装置を使用してＴＧＦβ結合剤（または結合剤を含む医薬製剤）を投与することを含む。そのような装置の例としては、いくつか示すと、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｒｇｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ  ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。医薬組成物の皮下投与に適用される使い捨てのペン型および／または自動注射器配達装置の例としては、いくつか示すと、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫＴＭ  Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴＴＭ（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）、およびＨＵＭＩＲＡＴＭ  Ｐｅｎ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
対象にＴＧＦβ結合剤（または結合剤を含む医薬製剤）を送達するマイクロインフューザの使用も本明細書で企図される。本明細書で使用するとき、用語「マイクロインフューザ」は、長期間（例えば約１０、１５、２０、２５、３０分またはそれ以上）にわたる多
量（例えば約２．５ｍＬまたはそれ以上まで）の治療用製剤をゆっくり投与するように設計された皮下送達装置を意味する。例えば、米国特許第６，６２９，９４９号；米国特許第６，６５９，９８２号；およびＭｅｅｈａｎら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、第４６巻、１０７〜１１６頁（１９９６）参照。マイクロインフューザは、高濃度（例えば、約１００、１２５、１５０、１７５、２００ｍｇ／ｍＬもしくはそれ以上）および／または粘性の溶液内に含まれた大量の治療用タンパク質を送達させるために特に有用である。
【０１０８】
Ｇ．併用療法
ある態様において、本発明は、そのような処置を必要とする対象に、ＴＧＦβに結合する抗体を、少なくとも１つのさらなる治療薬剤と組み合わせて投与することを含むＯＩを処置する方法を包含する。本発明の方法の実施においてＴＧＦβに結合する抗体と組み合わせて投与され得るさらなる治療薬剤の例としては、これらに限定されないが、ビスホスホネート、カルシトニン、テリパラチド、および対象の骨形成不全症を処置、予防または緩和することが知られている任意の他の化合物が挙げられる。本発明の方法において、さらなる治療薬剤は、ＴＧＦβに結合する抗体と同時にまたは連続的に投与することができる。例えば、同時投与に関して、ＴＧＦβに結合する抗体と少なくとも１つのさらなる治療薬剤との両方を含む医薬製剤を作製することができる。一実施形態において、ＴＧＦβに結合する抗体は、ビスホスホネート製剤（例えばエチドロネート、クロドロネート、チルドロネート、パミドロネート、ネドリネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、ゾレンドロネート、およびリセドロネート）と組み合わせて投与される。別の実施形態において、ＴＧＦβに結合する抗体は、骨形成を刺激する薬物、例えば副甲状腺ホルモンアナログおよびカルシトニンと組み合わせて投与される。さらに別の実施形態において、ＴＧＦβに結合する抗体は、選択的エストロゲン受容体調節因子（ＳＥＲＭ）と組み合わせて投与される。本発明の方法の実施において、ＴＧＦβに結合する抗体と組み合わせて投与されるさらなる治療薬剤の量は、既知の方法および当該分野で容易に利用可能な常法にしたがって簡便に決定することができる。
【実施例】
【０１０９】
ＯＩは、全身性結合組織疾患であり、罹患した個体は、Ｉ型コラーゲンのα１またはα２鎖の一次配列の変異によるＩ型コラーゲン原線維の形成における異常、ならびにＩ型コラーゲンの翻訳後修飾およびＩ型コラーゲン原線維に結合するタンパク質における異常を示す。ＣＲＴＡＰは、プロリル−３−ヒドロキシル化複合体の１メンバーであり、その機能がＩ型コラーゲンの適切な折り畳み、翻訳後修飾および分泌を支援する軟骨関連タンパク質と呼ばれるタンパク質をコードする。ＣＲＴＡＰへの変異は、ＶＩＩ型骨形成不全症の原因である。Ｃｒｔａｐ遺伝子（Ｃｒｔａｐ−／−）を欠くマウスは、骨形成不全症を模倣する表現型を表し、この疾患のモデルとして使用される（Ｍｏｒｅｌｌｏら、２００６）。Ｃｒｔａｐ−／−マウスおよび年齢一致野生型（ＷＴ）同腹子対照を次の実施例で使用した。
【０１１０】
材料および方法
動物、抗ＴＧＦβ処置および組織回収
Ｃｒｔａｐ−／−マウスを生成し、混合Ｃ５７Ｂｌａｃｋ／６Ｊ／１２９Ｓｖ遺伝的バックグラウンドを維持した。Ｃｏｌ１α２遺伝子（Ｃｏｌ１α２ｔｍ１．１Ｍｃｂｒ）におけるＧ６１０Ｃ変異を保有するマウスを得て、野生型Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスに交配させた。Ｃｏｌ１α２ｔｍ１．１Ｍｃｂｒ対立遺伝子に対してヘテロ接合性のマウスも実験に使用した。Ｓｍａｄ２／３依存のＴＧＦβシグナル伝達経路に応答してルシフェラーゼを発現するＴＧＦβ−リポーターマウス（ＳＢＥ−Ｌｕｃマウス）を取得し、Ｃｒｔａｐ＋／−マウスと２世代交配してリポーター導入遺伝子を発現するＣｒｔａｐ−／−マウスおよび野生型同腹子を生成した。マウスは全て小動物施設に収容し、実験は動物実験委員
会（ＩＡＣＵＣ）の承認プロトコルにしたがって実施した。
【０１１１】
タンパク質とＲＮＡの分析について、Ｐ３マウスの頭蓋冠を分離し、骨格外組織を取り除き、液体窒素で急速凍結した。Ｃｒｔａｐ−／−Ｐ１０マウス肺の免疫染色については、各マウスの肺を、屠殺後すぐに４％パラホルムアルデヒドを用いた２５ｃｍのＨ２Ｏの定圧での引力により等しく膨張させ、次いで縫合により気管で閉じた。その後、肺を、胸部から穏やかに切除し、４％パラホルムアルデヒド中に一晩固定した。
【０１１２】
８週齢の雌Ｃｒｔａｐ−／−およびＣｏｌ１α２ｔｍ１．１Ｍｃｂｒマウスを、汎ＴＧＦβ中和抗体１Ｄ１１で８週間（１０ｍｇ／ｋｇ体重、Ｉ．Ｐ．注射、各週３回）処置した。対照Ｃｒｔａｐ−／−、Ｃｏｌ１α２ｔｍ１．１Ｍｃｂｒ、およびＷＴマウスは、同じＩｇＧ１アイソタイプの対照抗体（１３Ｃ４）を受けた。処置後、マウスを屠殺し、腰椎および大腿骨を回収し、マイクロＣＴおよび骨組織形態計測のために１０％ホルマリン中に固定した。Ｃｒｔａｐ−／−マウスの対側性大腿骨は、生体力学試験が行われるまで、生理食塩水で湿らせたガーゼで包んで−２０℃で保存した。これらのＣｒｔａｐ−／−マウスの肺を、Ｐ１０マウスについて記載したように、等しく膨張させ、回収し、固定した。１Ｄ１１または対照抗体は群割付けによって注入したため、処置の間は盲検が行われなかった。全ての後の分析では、調査者は遺伝子型と処置群を知らされなかった。
【０１１３】
免疫ブロッティング
急速凍結したＰ３頭蓋冠試料からタンパク質を抽出し、３００μｌの溶解バッファー（０．０６２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２％ＳＤＳ、５ｍＭ  ＮａＦ、２ｍＭ
Ｎａ３ＶＯ４およびロシュコンプリートプロテイナーゼ阻害剤）に移して、１分間ホモジナイズし、９５℃で４０分間インキュベートした。上清を遠心濾過ユニット／Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ３Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、遠心分離してタンパク質を濃縮した。溶解物の全タンパク濃度を、製造業者の指示にしたがってＭｉｃｒｏ  ＢＣＡ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して測定した。４０μｇの頭蓋冠タンパク質抽出物を、５％のβ−メルカプトエタノールを含有するレムリ（ｌａｅｍｍｅｌｉ）緩衝剤に懸濁し、Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＴＧＸ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（勾配４〜２０％；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分離し、ウェスタンブロット分析用のＰＶＤＦ膜上に移した。ＰＶＤＦ膜を、ｐＳｍａｄ２モノクローナル抗体とインキュベートし（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃３１０８、５％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴ中１：７５０、一晩）、次いで二次ＨＲＰ結合抗ウサギ抗体とインキュベートし（ＧＥ、５％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴ中１：５０００、２時間）、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ）を用いて処置して、Ｘ線フィルムに曝露させた。続いて、抗体を、ＲｅＢｌｏｔ  Ｐｌｕｓ試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して膜から剥がし、Ｓｍａｄ２モノクローナル抗体とインキュベートし（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃５３３９、５％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴ中１：２０００、一晩）、その後、同様に二次抗体とインキュベートし、ＥＣＬを媒介させて可視化した。Ｘ線フィルムをスキャンし、各バンドの密度をＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を使用して定量した。
【０１１４】
定量リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して急速凍結Ｐ３マウス頭蓋冠から抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者のプロトコルに従い、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。定量ＲＴ−ＰＣＲを、遺伝子特異的プライマーおよびＳＹＢＲグリーンＩ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ．ｖ１．５（Ｒｏｃｈｅ）で実施した。β２−マイクログロブリンをｓ遺伝子として使用してｃＤＮＡ濃度を標準化した。
【０１１５】
インビボ生物発光イメージング
ＴＧＦβリポーター導入遺伝子を発現するＰ１０Ｃｔｒａｐ−／−マウスおよび野生型同腹子（ＳＢＥ−Ｌｕｃマウス）に、Ｄ−ルシフェリン（Ｇｏｌｄｂｉｏ、１５０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）を注入し、イソフルランで麻酔をかけ、生物発光画像システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して、注入後１０分間画像処理した。
【０１１６】
一次骨芽細胞培養物、ＴＧＦβ−リポーター細胞
骨髄細胞をおよそ２か月齢のＣｒｔａｐ−／−および野生型マウスの脛骨および大腿骨から分離し、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足したα−ＭＥＭで培養した。培地は２日に１回ごとに代え、非接着細胞は廃棄した。７日後に、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）と定義される接着細胞を、２４ウェルプレートに、１ｃｍ２あたり２．５×１０４細胞で再播種し、骨形成培地（α−ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５００μＭアスコルビン酸および１０ｍＭ  β−グリセロホスフェート）中で３日間培養した。調整培地を回収し、ＰＡＩルシフェラーゼ・リポーター・ミンク肺上皮細胞と共にインキュベートした。２４時間後、細胞溶解物をルシフェラーゼ活性アッセイのために回収し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。結果は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して定量した全タンパク質に対して標準化した。
【０１１７】
マイクロＣＴ、骨組織形態計測
腰部脊椎と大腿骨は、Ｓｃａｎｃｏ  μＣＴ−４０マイクロＣＴを使用してスキャンし、骨梁および皮質骨パラメータを定量した。脊椎および大腿部の骨梁骨パラメータを、手動で椎体Ｌ４の骨梁ならびに大腿骨の遠位骨端セクションの輪郭をとることにより、Ｓｃａｎｃｏ分析ソフトウェアを使用して分析した。大腿部の中軸中心にある皮質骨パラメータは、ソフトウェアに含まれた自動閾値アルゴリズムを使用して定量した。
【０１１８】
スキャンされた脱灰されていないＣｒｔａｐ−／−マウス背骨試料を、切開のため、プラスチックに包埋した。トルイジンブルー染色およびＴＲＡＰ染色を、ＯｂおよびＯｃの可視化および定量のために、それぞれＢｉｏｑｕａｎｔ  Ｏｓｔｅｏ画像解析システムを使用して、標準プロトコルにしたがって実施した。
【０１１９】
免疫染色および組織学
免疫組織化学については、Ｐ５マウスの後足を回収し、４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、パラフィンに包埋した。脱パラフィンおよび再水和後、熱誘導抗原回収（Ｄａｋｏ、Ｓ１７００）を実施し、次いでヒアルロニダーゼを用いて３０分間処置した（２ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）。内因性ペルオキシダーゼを、３％過酸化水素を使用して１０分間ブロックした。ブロッキング溶液（３％標準ヤギ血清、０．１％ＢＳＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＰＢＳ中）でインキュベートした後、切片を、ＴＧＦβ１に対する抗体（Ｇ１２２１、Ｐｒｏｍｅｇａ）、およびデコリン（ＬＦ−１１３、Ｌａｒｒｙ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡより好意で提供）で、６０分間３７℃でインキュベート（それぞれＰＢＳで１：２５希釈、対照試料はＰＢＳのみでインキュベート）し、次いで二次抗体と共にインキュベートした（ＳｕｐｅｒＰｉｃＴｕｒｅ  Ｐｌｏｙｍｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ＤＡＢ基質を製造業者の推奨にしたがって添加し、試料を脱水して、Ｃｙｔｏｓｅａｌ  ＸＹＬキシレンをベースとするマウント培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してマウントした。ＷＴと変異同腹子の切片は、同時に処置した。ＷＴと変異体同腹子について、骨梁骨の画像を、同一の露光時間を使用して、光学顕微鏡（Ａｘｉｏｐｌａｎ２、ツァイス）を用いて得た。
【０１２０】
Ｐ１０および１６週齢Ｃｒｔａｐ−／−マウスの肺を、組織回収しながら等しく膨張させ、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン包埋した。Ｐ１０Ｃｒｔａｐ−／−および野生型マウスの肺を、ｐＳｍａｄ２の免疫染色のために使用した。簡潔には、パラフィン切片をキシレンで処置し、再水和し、抗原回収のために２０分間加熱した（ｐＨ６；Ｄａｋｏ）。切片を、次いでブロッキング溶液（３％標準ロバ血清、０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）とインキュベートし、次いで、ウサギ抗ｐＳｍａｄ２抗体（１：５００）（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃３１０８）、Ａｌｅｘａ  ｆｌｏｕｒ５９４結合ロバ抗ウサギ第２抗体（１：６００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートし、ＤＡＰＩ含有Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ抗褪色試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でマウントした。これらの切片からの蛍光画像を、同一露光時間を使用して、ツァイス顕微鏡（Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して得た。
【０１２１】
１６週齢マウスの肺組織学および形態測定については、傍矢状切片を、ヘマトキシリン・エオシン染色を標準プロトコルで使用して染色した。平均肺胞径（ＭＬＩ）法を使用して肺胞構造間の距離を定量した。簡潔には、光学顕微鏡（Ａｘｉｏｐｌａｎ２、ツァイス）を使用して、両方の肺の全ての肺葉から、１マウスあたり１０の組織学的領域を２０倍拡大で得た。ＭＬＩは、改変ＩｍａｇｅＪソフトウェア（国立衛生試験所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、Ｐａｕｌ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎによって改変）を使用して測定した。手動で血管、大きな気道および他の非肺胞構造を除去した後、各画像の胞状組織についてソフトウェアを自動的に開始し、画像全体にわたり各ラインを２１ピクセルで測定しながら１，３５３ラインで構成されたライン・グリッドを重ね合せた。肺胞構造を遮るラインの数を使用してＭＬＩを計算した。
【０１２２】
３点曲げによる生体力学的試験
Ｃｒｔａｐ−／−およびＷＴの大腿骨を、３点曲げ試験によって、Ｉｎｓｔｒｏｎ５８４８装置（Ｉｎｓｔｒｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｗｏｏｄ  ＭＡ）で６ｍｍのスパンを用いて試験した。大腿骨は全て室温で、湿らせて試験した。これらを０．０５Ｎ／秒の速度で５秒間、１Ｎで予荷重した。予荷重に続き、大腿骨を破壊されるまで０．１ｍｍ／秒の速度で荷重した。荷重と変位のデータはＢＬＵＥＨＩＬＬソフトウェア（Ｉｎｓｔｒｏｎ５８４８）を使用して４０Ｈｚの速度で得た。
【０１２３】
降伏点を決定するために、荷重−変位曲線において、予荷重前と最大荷重後の領域を特定した。この領域を５つの区分に分け、最大傾斜を有する区分の適合線を得た。次いで、この線に０．０１２ｍｍのオフセットを実施した。オフセット線と荷重−変位曲線との間の交点を、０．０１２オフセット降伏点とした。この降伏点は、一般に文献で選択されている０．２％オフセットひずみに、より厳密に一致した。弾性領域は、予荷重の完成から降伏点までの領域として特定した。降伏後領域は、降伏点から、荷重の変化が−１Ｎを超過し、破断を示す点までの領域として特定した。弾性変位は、試験片が弾性領域に残る間の変位とした。降伏後変位は、試験片が降伏後領域に残る間の変位とした。全変位は、弾性変位および降伏後変位の合計として計算した。台形の数値積分法を使用して、破断までのエネルギーを、荷重−変位曲線下面積として計算した。最大荷重は、試験片が破断する前に、ＢＬＵＥＨＩＬＬによって記録された最高荷重値を見出すことにより決定した。剛性を計算するために、最小二乗適合法を、荷重−変位曲線の弾性領域の最大傾斜区分に適用した。剛性は最小二乗適合線の傾斜とした。大腿部の中軸のマイクロＣＴ分析から得た幾何学的なデータ（直径および慣性モーメント）を利用して固有の材料特性、つまり極限強度、破断までの靱性、および弾性率を計算した。
【０１２４】
血清骨代謝回転（ｂｏｎｅ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ）マーカー
血清オステオカルシン（ＯＣＮ）は、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．からのマウス・オステオカルシンＥＩＡキットを使用して定量した。骨コラ
ーゲン（ＣＴＸ）のＣ末端架橋テロペプチドは、Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ．からのＲａｔＬａｐｓ（商標）ＥＩＡキットを使用して定量した。両方の分析は、製造業者のプロトコルにしたがって実施した。
【０１２５】
コラーゲンＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析および架橋分析
質量分析については、Ｉ型コラーゲンを、Ｃｒｔａｐ−／−および野生型脛骨から製造した。骨を、クロロホルム／メタノール（３：１  ｖ／ｖ）で脱脂し、０．５ＭのＥＤＴＡ、０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で脱塩し、これらの脱塩工程は全て４℃で実施した。骨を細かく刻み、コラーゲンをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファー中での熱変性（９０℃）によって可溶化した。コラーゲンα鎖をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切断し、インゲル・トリプシン消化にかけた。Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ＭＳを、トリプシンペプチドについて、Ｃ８キャピラリーカラム（３００μｍ×１５０ｍｍ；Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ２０８  ＭＳ５．３１５）を使用したインライン液体クロマトグラフィー（ＬＣ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）を装備したＬＣＱ  Ｄｅｃａ  ＸＰイオントラップ質量分析計を使用して、４．５μｌ分で溶出して実施した。Ｓｅｑｕｅｓｔ検索ソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）を使用して、ＮＣＢＩタンパク質データベースを使用してペプチド同定を行った。
【０１２６】
６Ｎ  ＨＣｌを使用して脱塩された骨を加水分解した後にＨＰＬＣによってピリジノリン架橋（ＨＰおよびＬＰ）を定量した。
【０１２７】
表面プラズモン共鳴分析
表面プラズモン共鳴実験はＢＩＡＣｏｒｅ  Ｘ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．）を使用して実施した。野生型およびＣｒｔａｐ−／−マウス由来の精製された天然マウス腱Ｉ型コラーゲンを、ＣＭ５センサー・チップ上で、それぞれ約０．０５ナノグラム／ｍｍ２（５００ＲＵ）および０．０８ナノグラム／ｍｍ２（８００ＲＵ）の濃度でのアミドカップリングによって固定化した。実験は、１０μｌ／分の流速にて２０℃でＨＢＳＰバッファー（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．００５％界面活性剤Ｐ２０を含有）中で実施した。組み換えヒトデコリンコアタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を両方のＩ型ＣＭ５チップ上に注射した。ヒトデコリン原液の濃度はアミノ酸分析によって決定した。デコリンの野生型およびＣｒｔａｐ−／−マウスＩ型コラーゲンに対する結合応答は、ＣＭ５センサー・チップ上の固定化Ｉ型コラーゲンの量によって標準化した。３つのデコリン濃度（３、５および１２μＭ）を使用して、各濃度について分析を３回繰り返した。この実験は、各時間の異なるマウスから単離したコラーゲンで２回実施した。
【０１２８】
統計的手法
２群間の比較は、不対両側スチューデントｔ検定を使用して行った。３群間の比較については、群の等分散が確認された場合には一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施し、次いでＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法を使用して全ペアワイズ多重比較を行った。等分散試験が不合格となった場合は、クラスカル＝ウォリスの順位に基づく一元配置分散分析を実施し、次いでＴｕｋｅｙテストを使用して、全ペアワイズ多重比較を行った。０．０５未満のＰ値を、スチューデントｔ検定、ＡＮＯＶＡ、およびクラスカル＝ウォリスの順位に基づく一元配置ＡＮＯＶＡで統計的に有意であるとみなした。事後ペアワイズ多重比較については、各Ｐ値について、Ｐ値の順位および比較総数に依存する臨界レベルと比較し、群間の差異が有意であるかを測定した。Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ  Ｖ１１．０（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を統計分析に使用した。
【０１２９】
ＯＩマウスの骨および肺に対する１Ｄ１１の効果は、試験開始時点では不明であった。マウスについて初期試料の群あたりのサイズを決定するために、サイズを計算して１Ｄ１
１と対照処置ＯＩマウスとの間の９０％出力でのマイクロＣＴによる骨量（ＢＶ／ＴＶ）の最小差異２０％を検出した。１群のサイズは８匹のマウスを必要とした。
【実施例１】
【０１３０】
Ｃｒｔａｐ−／−頭蓋冠における改変されたＴＧＦβシグナル伝達
Ｃｒｔａｐ−／−マウスおよび年齢一致野生型（ＷＴ）同腹子対照を、活性化ｐＳｍａｄ２、ＴＧＦβシグナル伝達経路のメンバー、およびＴＧＦβの下流の他の標的の発現について分析した。頭蓋骨を切除し、ＲＮＡおよびタンパク質を、リアルタイム−ＰＣＲおよびウェスタンブロットによってそれぞれ抽出し、分析した。図１Ａおよび１Ｂにおいて見出し得るように、Ｃｒｔａｐ−／−マウスは、ウェスタンブロットで測定し、デンシトメトリで定量化するとき、ＷＴマウスと比較して全Ｓｍａｄ２に対する活性化ｐＳｍａｄ２の比率が１００％高く、ＴＧＦβシグナル伝達がＣｒｔａｐ−／−マウス中で上昇していることが示された。ＴＧＦβの転写標的、例えばＣｏｌ１α１およびｐ２１は、ＲＴ−ＰＣＲによって測定するとき、図１Ｃおよび図１Ｄで実証されるように、ＷＴ対照と比較して、それぞれ上昇していた。線維化促進性ＥＣＭタンパク質結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）を測定すると、ＲＴ−ＰＣＲによって測定するように、および図１Ｅで実証されるように、ＷＴ対照と比較してＣｒｔａｐ−／−マウスでは約５０％高いことがわかった。図１Ｆにおいて示されるように、ＲＴ−ＰＣＲ分析は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤ｐ２７の発現が、Ｃｒｔａｐ−／−マウスまたはＷＴマウスにおいて変わらないことが明らかになった。
【実施例２】
【０１３１】
インビボでのＣｒｔａｐ−／−マウスおよびＣｒｔａｐ−／−骨芽細胞の増加したＴＧＦｂ活性
Ｃｒｔａｐ−／−マウスを、ＴＧＦβシグナル伝達の活性化に応じてルシフェラーゼを発現するＴＧＦβリポーターマウスと交配させた（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＢＥ／ＴＫ−ｌｕｃ）７Ｔｗｃ／Ｊ）。Ｐ９マウスに、基質Ｄ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）を注入し、１０分後にイメージングした（Ｘｅｎｏｇｅｎ；ＩＶＩＳカメラシステム）。図２Ａで実証されるように、Ｃｒｔａｐ−／−マウスは、ＷＴ対照と比較して、尾骨、長骨および頭蓋冠において発光がかなり高く、ｃｒｔａｐ−／−マウスにおいてＴＧＦｂ活性が増加していることを示していた。図２Ｂは、頭蓋冠でのルシフェラーゼ活性を定量したものである。
【０１３２】
骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）をＣｒｔａｐ−／−マウスおよびＷＴマウスから単離し、骨形成条件の下でエキソビボ培養し、調整培地で、ＴＧＦβシグナル伝達の活性化に応答するルシフェラーゼ発現細胞株を使用して、ＴＧＦβ活性について分析した。図２Ｃに示されるように、Ｃｒｔａｐ−／−ＢＭＳＣからの調整培地は、ＷＴマウスのＢＭＳＣと比較して、リポーター細胞株のルシフェラーゼ活動がほぼ２倍に大きくなった。まとめると、これらのデータは、Ｃｒｔａｐ−／−マウスの骨および骨芽細胞についてＴＧＦβ分泌および活性が上昇していることを示している。
【実施例３】
【０１３３】
Ｃｒｔａｐ−／−脊椎のμＣＴ分析
８週齢成体Ｃｒｔａｐ−／−マウス（１群あたりＮ＝６）に、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、ＴＧＦβに結合する汎特異的抗体のマウス代替物である１Ｄ１１（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｉ．Ｐ．，３回／週、全８週）を投与した。無関係の１３Ｃ４抗体を、Ｃｒｔａｐ−／−マウスと対照としてのＷＴマウス（Ｎ＝６）の個別群に投与した。１６週齢マウス（週８〜１６から処置）のＬ４椎体を、μ−ＣＴで画像化した。ＴＧＦβ中和抗体１Ｄ１１（Ｇｅｎｚｙｍｅ；１０ｍｇ／ｋｇ、Ｉ．Ｐ．，３回／週）で８週間処置した８週齢Ｃｒｔａｐ−／−マウス（１群
あたりｎ＝６）ならびに対照抗体（１３Ｃ４プラセボ）で処置した野生型（ＷＴ）および対照Ｃｒｔａｐ−／−マウスからの椎体Ｌ４のマイクロＣＴデータを図３に示した。図３に示されるように、Ｃｒｔａｐ−／−脊椎は、ＷＴ対照脊椎と比較して海綿状であった。しかしながら、１Ｄ１１処置により、ＷＴ状態と同様の骨格表現型に帰着した。
【０１３４】
図３からのデータを図４で定量化した。汎特異的抗ＴＧＦβ抗体を用いた処置によってＣｒｔａｐ−／−マウスの骨格表現型がレスキューされた。被処置Ｃｒｔａｐ−／−マウスの脊椎骨は、骨体積密度（ＢＶ／ＴＶ）、全骨表面積（ＢＳ）、骨面密度（ＢＳ／ＢＶ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）、骨梁間隔（Ｔｂ．Ｓｐ）および全体積（Ｄｅｎｓ  ＴＶ）を含む測定されたパラメータにおいて、ＷＴ対照マウスと統計的に類似していた。
【実施例４】
【０１３５】
抗ＴＧＦβ処置したＣｒｔａｐ−／−脊椎における組織形態計測
μ−ＣＴに加えて、抗体処置マウス、プラセボ処置マウスおよびＷＴマウスの脊椎骨を、組織形態計測によって分析した。図５Ａおよび５Ｂに示されるように、μ−ＣＴの結果を組織形態計測により確認した。さらに、組織切片を、破骨細胞マーカーＴＲＡＰの発現について染色した。分析で明らかにされるように、Ｃｒｔａｐ−／−マウスの骨表面では、ＷＴ対照と比較して、より多くの破骨細胞が被覆され（Ｎ．Ｏｃ／ＢＳおよびＯｃ．Ｓ／ＢＳ）、破骨細胞活性が増加していることが示された。１Ｄ１１抗ＴＧＦβを用いた処置により、全ての破骨細胞特異的パラメータがＷＴ数未満に減少した。したがって、破骨細胞は、ＴＧＦβ抗体、より詳細には、汎特異的抗ＴＧＦβ抗体に対する有望な標的として同定された。
【実施例５】
【０１３６】
抗ＴＧＦβ処置Ｃｒｔａｐ−／−大腿骨の３点曲げ試験
生体力学試験は、インストロン５８４８装置（Ｉｎｓｔｒｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｗｏｏｄ  ＭＡ）を用いた標準３点曲げ試験を使用して、６ｍｍのスパンで、１Ｎ／秒の速度で５秒間１Ｎを予荷重して、１６週齢マウス（処置後８〜１６週目）の切除した大腿骨に実施した。予荷重に続き、大腿骨を破壊されるまで０．１ｍｍ／秒の速度で圧縮した。荷重と変位のデータはＢＬＵＥＨＩＬＬソフトウェア（Ｉｎｓｔｒｏｎ５８４８）を使用して４０Ｈｚの速度で得た。
【０１３７】
図６に実証されるように、Ｃｒｔａｐ−／−マウスの大腿骨は、ＷＴ対照マウスよりも堅さが少なく、はるかに小さい最大荷重を耐える能力があった。１Ｄ１１処置Ｃｒｔａｐ−／−マウスの大腿骨は、顕著な最大荷重の改善と、対照Ｃｒｔａｐ−／−マウスと比較した剛性の増加傾向を示した。
【０１３８】
したがって、１Ｄ１１汎特異的抗ＴＧＦβ抗体を用いた処置は、定量的に、定性的に、および生物力学的に、Ｃｒｔａｐ−／−マウスの骨格筋表現型を回復した。
【実施例６】
【０１３９】
１Ｄ１１によるＴＧＦβシグナル伝達の阻害は肺の表現型を改善する
Ｃｒｔａｐ−／−マウスは、低い骨量、糸球体硬化症および肺形成障害によって現れる全身性結合組織疾患を有した（Ｂａｌｄｒｉｄｇｅら；  ＰＬｏＳｏｎｅ  ５（５）：ｅ１０５６０（２０１０））。ＴＧＦβ発現の増加が、ｐＳｍａｄ２の免疫染色陽性により証拠づけられ、図７Ａで実証されるように、Ｃｒｔａｐ−／−マウスの肺で見られた。組織学的に、Ｃｒｔａｐ−／−マウスは、図７Ｂに示されるように、ＷＴマウスと比較して、遠位気道空間が増加していることが示された。図７Ａおよび図７Ｂで実証され、図７Ｃで定量化されるように（＊Ｐ＜０．０５対対照Ｃｒｔａｐ−／−；１マウスあたり１０画
像解析、１群あたりｎ＝８マウス）、１Ｄ１１処置（１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、３ｘ／週を８週間）により、Ｃｒｔａｐ−／−マウスにおけるｐＳｍａｄ２発現が減少し、遠位気道空間が減少し、肺表現型が改善した。
【実施例７】
【０１４０】
Ｃｒｔａｐ−／−肺中でのデコリン発現
Ｃｒｔａｐ−／−マウスの骨および肺における調節不全ＴＧＦβシグナル伝達の基礎を理解するためにＴＧＦβ発現の転写制御因子を調べた。ＥＣＭにおいてＴＧＦβを制御可能な細胞外タンパク質の主なクラスとしては、小ロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）、例えばデコリンが挙げられる。図８に示されるように、免疫染色により、ＷＴ対照肺と比較して、Ｃｒｔａｐ−／−肺におけるデコリンの発現が増加していることが明らかになった。
【０１４１】
デコリンは成熟ＴＧＦβの制御因子であるので、この知見から、コラーゲンの翻訳後修飾の変化は、ＯＩで起こると、ＳＬＲＰを含めたＥＣＭタンパク質の相互作用を変化させることが示唆された。デコリンは、例えばＩ型およびＩＩ型コラーゲンのアミノ酸残基３９６位に存在しているヒドロキシプロリン部位に結合するが、これらのコラーゲンはＣｒｔａｐ−／−マウスには存在しない。デコリン結合がＯＩにおいて変化しているか、ならびにその変化がＣｒｔａｐ−／−骨およびマウスにおいて観察される表現型に少なくとも部分的に関与しているかを測定するために、デコリン結合アッセイを行った。図９に示されるように、３−ヒドロキシル化コラーゲンペプチド（Ｉ型およびＩＩ型コラーゲンなど）に結合するデコリン結合は、３−ヒドロキシル化を有しないコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型コラーゲンなど）より多かった。
【実施例８】
【０１４２】
ＴＧＦβシグナル伝達の増加は、骨形成不全症における共通のメカニズムである
ＯＩは、脆弱骨、低骨量、骨変形および骨折を特徴とする。さらに、肺異常を含む骨外性の症状発現は実質的に病的状態および死を導く。ＯＩの症例の多くは、Ｉ型コラーゲンをコードする遺伝子の常染色体優性突然変異（ＣＯＬ１Ａ１とＣＯＬ１Ａ２）によって引き起こされる。近年、コラーゲンの翻訳後修飾に関与するタンパク質をコードするさらなる遺伝子の突然変異がＯＩの退行形態を引き起こすものとして同定された。記述された第１番目の変異は、Ｉ型コラーゲンのプロリン残基９８６α１（Ｉ）の３−ヒドロキシル化に関わるプロリル−３−ヒドロキシラーゼ複合体の一員である軟骨関連タンパク質（ＣＲＴＡＰ）にあった。低形質ＣＲＴＡＰ変異は、原線維性コラーゲンにおける３−ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ）の部分的損失および他の残基の過剰修飾を導き、優性形態の重度ＯＩと臨床的に重複する退行性ＯＩ  ＶＩＩ型に帰着した。３Ｈｙｐの生理学的作用は、完全には理解されていないが、生化学的研究によって、コラーゲンの安定性に否定的に影響するよりもむしろコラーゲン−タンパク質相互作用に関係していることが示唆された。
【０１４３】
ＥＣＭは、シグナル伝達分子およびそれらの制御因子の重要な貯蔵所である。骨において、ＴＧＦβは、骨再吸収破骨細胞と骨形成骨芽細胞の局所的な活性を連結させることにより骨再構築の中心的調整因子として作用する。ＴＧＦβは、骨芽細胞によって豊富に産生され、主に不活性の潜在的形態で分泌され、骨マトリックス内へ配置される。ここで、破骨細胞による骨吸収の間に放出および活性化が行われ得る。さらなる制御レベルとして、活性なＴＧＦβがプロテオグリカンによって結合され、これによりコラーゲン原線維に関連する生物活性が調節され得る。Ｉ型コラーゲンは骨におけるＥＣＭの最も豊富な成分であるため、ＯＩの中で観察されるコラーゲン構造の変化が、骨脆弱性の増加だけでなく、骨マトリックスのシグナル貯蔵機能にも影響しているという興味を引く仮説が掲示された。興味深いことに、Ｃｒｔａｐ−／−マウスは、ＴＧＦβシグナル伝達が増加したモデル動物と表現型が重複していた。例えば、ＴＧＦβ過剰発現により、低骨量が引き起こさ
れた。さらに、Ｃｒｔａｐ−／−マウスは肺において肺胞気道空間の拡大を示すが、これはマルファン症候群モデルマウスで観察される状態と類似しており、ＴＧＦβシグナル伝達の増加が、肺病理の主な要因であることが示された。したがって、ＯＩ退行の場合のＴＧＦβシグナル伝達の状態をＣｒｔａｐ−／−モデルマウスにおいて調べた。
【０１４４】
骨におけるＴＧＦβシグナル伝達の状態を評価するために、Ｃｒｔａｐ−／−マウスの頭蓋骨でのＴＧＦβ標的遺伝子の発現レベルを評価した。野生型（ＷＴ）試料と比較して、Ｃｒｔａｐ−／−骨は、ＴＧＦβ活性の上昇と一致して、ＴＧＦβ下流標的ｐ２１（サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１）、ＰＡＩ−１（プラスミノゲン活性化阻害因子−１）およびＣｏｌ１α１の発現増加を示した（図１０Ａ）。細胞内のＴＧＦβシグナル経路の活性増加を確認するために、細胞内第２メッセンジャータンパク質でありＴＧＦβ受容体の活性化後にリン酸化されるＳｍａｄ２の状態を評価した。標的遺伝子発現と一致して、免疫ブロット分析により、Ｃｒｔａｐ−／−マウスの骨試料において全Ｓｍａｄ２に対するリン酸化Ｓｍａｄ２（ｐＳｍａｄ２）のより高い比率が実証され、このことはＴＧＦβシグナル伝達が増加していることを示していた（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。
【０１４５】
これらの静的測定値が、インビボにおけるＴＧＦβ活性をの増加反映しているかを確かめるために、Ｃｒｔａｐ−／−マウスを、ＴＧＦβ応答Ｓｍａｄ結合因子の制御下でルシフェラーゼを発現するＴＧＦβリポーターマウス（ＳＢＥ−Ｌｕｃマウス）と相互交配させた。ＷＴ／ＳＢＥ−Ｌｕｃ同腹子と比較して、Ｃｒｔａｐ−／ＳＢＥ−Ｌｕｃマウスは、骨格構造における生物発光領域が増加しており、インビボにおけるＴＧＦβ活性の増加が示された（図１０Ｄ）。３同腹仔において、Ｃｒｔａｐ−／−マウスは、ＷＴマウスと比較して、頭／頭蓋冠において平均２．８６倍（ＳＤ±０．３４）の生物発光シグナルを示している。さらに、Ｃｒｔａｐの損失と関連した増加したＴＧＦβ／Ｓｍａｄシグナル伝達が骨に固有、つまり組織自律的なものかを試験するために、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）を、インビトロで骨芽細胞に対して分化させた。ＴＧＦβリポーター細胞株の使用により、Ｃｒｔａｐ−／−ＢＭＳＣ由来の調整培地は、ＷＴ  ＢＭＳＣ由来の培地と比較して、より高いＴＧＦβ活性を示すことがわかった（図１０Ｅ）。まとめると、これらの知見から、Ｃｒｔａｐの損失が、組織自律的形式で骨におけるＴＧＦβシグナル伝達を増強することが示された。
【０１４６】
重度のＯＩを有する患者はさらに固有の肺異常を示すこともあり、呼吸不全はこれらの個体の主要な死因の１つである。興味深いことに、Ｃｒｔａｐ−／−マウスは、他の発症モデルにおけるＴＧＦβシグナル伝達の増加に関連した特徴である、肺胞気道空間のびまん性増加を示した。これにしたがって、Ｃｒｔａｐ−／−マウスの肺は、肺胞細胞のｐＳｍａｄ２に対する細胞内染色の増加を示し、ＴＧＦβ活性の増加が骨外性組織にも現れていることが示された（図１０Ｆ）。
【０１４７】
ＴＧＦβシグナル伝達の増加がＣｒｔａｐ−／−マウスにおける骨と肺の表現型に関与する主要メカニズムを表すものであるかを理解するために、レスキュー実験を、汎ＴＧＦβ中和抗体（１Ｄ１１）を用いて実施した。８週齢Ｃｒｔａｐ−／−マウスを１Ｄ１１で８週間処置した；対照Ｃｒｔａｐ−／−およびＷＴマウスには非特異性対照抗体（１３Ｃ４）を投与した。１Ｄ１１は、処置したＣｒｔａｐ−／−マウスの体重を顕著に変化させず、ＴＧＦβの阻害が一般的な栄養状態に影響しなかったことを示した（図１４）。さらに質量分析および架橋分析により、１Ｄ１１がＣｒｔａｐ−／−マウスにおけるＩ型コラーゲンのＰ９８６  ３−ヒドロキシル化またはコラーゲン架橋の状態に顕著な変化を与えなかったことが示され、ＴＧＦβシグナル伝達の調節異常が、変化した分子コラーゲン構造の結果であり、細胞内コラーゲンプロセシングまたは細胞外原線維集合体に直接的に関与しないことが示唆された（図１５）。Ｃｒｔａｐ−／−マウスは、骨量の低下と異常な骨梁骨パラメータを示した（図１１Ａおよび１１Ｂ）。脊椎のマイクロＣＴ画像分析は、
対照Ｃｒｔａｐ−／−マウスと比較して、ＴＧＦβ阻害が、骨体積／全体積、骨梁数、骨梁幅を含む骨梁骨パラメータを、ＷＴレベルの近くまで顕著に改善したことを示した（図１１Ａおよび１１Ｂ、および図１７）。同様の有益な効果が、Ｃｒｔａｐ−／−マウスの大腿部の骨梁骨で観察され、ＴＧＦβ阻害により骨梁骨パラメータが顕著に改善された（図１８）。１Ｄ１１を用いた骨格におけるＴＧＦβ阻害の効果は、ＷＴマウスと、正常ＴＧＦβ成熟の機能不全によりＴＧＦβ活性が増加したモデルであるＥｓｌ−１−／−マウスとにおいて、以前に報告されている。１Ｄ１１はＷＴマウスの背骨で骨梁ＢＶ／ＴＶを３３％、穏やかに増加させたが、Ｅｓｌ−１−／−マウスでは、ＢＶ／ＴＶの１０６％増加が示された。このことは、骨格中で増加している病態生理学状況でＴＧＦβを標的とすることで、相対的により明白な肯定的な結果に結びつきうることを示唆した。本研究において、１Ｄ１１は、Ｃｒｔａｐ−／−マウスの背骨で骨梁ＢＶ／ＴＶを２３５％増加させ、ＴＧＦβシグナル伝達の調節異常がＣｒｔａｐ−／−マウスにおける低い骨量の重要な要因であることを支持した。大腿骨中軸では、Ｃｔｒａｐ−／−マウスにおいて、皮質の幅、直径、横断面積および横断面の慣性モーメントを含む皮質のアーキテクチャーのパラメータが、ＷＴマウスと比較して顕著に低下していた。１Ｄ１１処置後、これらのパラメータは、もはやＷＴマウスと有意な差異はなかった（図１９）。皮質および骨梁骨におけるこれらの変化が、骨強度の改善に転換されるどうかを試験するために、３点曲げ試験による大腿骨の生体力学試験を実施した。ＴＧＦβ阻害により、処置されたＣｒｔａｐ−／−マウスにおいて最大荷重と極限強度が増加されたことがわかり、全体の骨および組織強度の向上と骨折に対する耐性の改善が示された。しかしながら、１Ｄ１１処置は、対照および１Ｄ１１処置Ｃｒｔａｐ−／−マウスの両方で降伏後変位の低下が示されるように（図２０）、ＯＩ骨の脆性増加には影響を与えなかった。これはおそらく、変化したコラーゲン構造に関連した固有の異常なミネラル化を反映していると考えられた。まとめると、これらの知見から、ＴＧＦβシグナル伝達の増加が、Ｃｒｔａｐ欠損に起因する退行性ＯＩの骨表現型の主要な要因であり、ＴＧＦβシグナル伝達調節異常の阻害により、骨量、微細構造パラメータが回復し、全骨強度が改善することが示された。
【０１４８】
Ｃｒｔａｐ−／−マウスにおける細胞レベルでのＴＧＦβ阻害の効果を理解するために、処置されたマウスの組織形態計測分析を実施した。この試験における椎体の切片で、対照Ｃｒｔａｐ−／−の骨表面あたりの破骨細胞数（Ｏｃ）および骨芽細胞数（Ｏｂ）が、ＷＴマウスと比較して増加していることがわかり、背骨における骨再構築の増加が示された（図１１Ｃおよび図２１）。一貫して、骨コラーゲン（ＣＴＸ）の血清骨代謝回転マーカー・オステオカルシン（ＯＣＮ）およびＣ末端架橋テロペプチドは、８週齢（ＯＣＮおよびＣＴＸ）と１６週齢（ＣＴＸのみ）の対照Ｃｒｔａｐ−／−マウスにおいて向上していた（図１９）。骨の細胞組成における同様の変化が、優性ＯＩおよび退行性ＯＩを有する患者について記述され、骨代謝回転の増加と一致してＯｃ数およびＯｂ数の増加が示された。興味深いことに、ＴＧＦβシグナル伝達が増加したモデルマウスは、破骨細胞の骨吸収および異常な骨構築の増加を伴う低い骨量をも示した。ＴＧＦβが骨細胞に影響を与えるという報告の多くは、ＴＧＦβが骨修復部位でＯｃ前駆体およびＯｂ前駆体の動員および初期分化を刺激することができ、次いでインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）が媒介するＯｂ分化が起こるというモデルと一致する。しかしながら、引き続く高用量で、ＴＧＦβは、分化因子ＲＵＮＸ２の抑制によりＯｂ分化を阻害することができた。Ｏｃ／Ｏｂ相互作用に対する重大な影響を考慮すると、ＴＧＦβ利用可能性の微調整が、骨再構築の間の形成を伴う骨吸収の局所結合のための重要な因子であり、その不均衡が重大な骨病理に結びつく可能性がある。
【０１４９】
対照Ｃｒｔａｐ−／−マウスにおける知見とは対照的に、１Ｄ１１で処置されたＣｒｔａｐ−／−マウスの骨切片は、Ｏｃ数およびＯｂ数を低下させた。この数はＷＴマウスで測定された値よりも低く、この実験中で使用された１Ｄ１１の用量でのＴＧＦβ抑制の結果として骨再構築の調節異常が超生理学的に抑制されたことが示された（図１１Ｃ）。初
期の報告と一致して、ＷＴレベルより低いＯｃ数およびＯｂ数が観察されたことでも、骨再構築プロセスの間の通常のＯｃ数およびＯｂ数を調整するためにＴＧＦβの局所的量の生理学的必要性が強調された。我々の知見は、ＷＴマウスについての１Ｄ１１処置によりＯｃ数が低下し、Ｏｂ数が増加したという従来の研究とは異なった。これは、ＷＴマウスの正常骨と比較して、増加したＴＧＦβシグナル伝達および増加した骨再構築を伴う病態生理学的状況におけるＴＧＦβ阻害の明白な細胞効果を反映している可能性がある。ＴＧＦβは骨芽細胞前駆細胞の分化を阻害することが示されており、ＴＧＦβシグナル伝達の増加により、未熟な骨芽細胞系細胞の割合が高くなる可能性がある。他方、骨表面における未熟Ｏｂの増加または高比率により、これらの細胞による分泌ＴＧＦβの量の増加が引き起こされ得る。１Ｄ１１を用いたＴＧＦβ阻害により、Ｃｒｔａｐ−／−マウスにおいて増加したＯｂ数が著しく低下するという知見は、ＴＧＦβシグナル伝達の増加が、骨芽細胞系細胞の増加に必然的に関与することを示唆している。
【０１５０】
Ｏｃ数およびＯｂ数に関する知見に加えて、対照Ｃｒｔａｐ−／−マウスでは、骨面積あたりの骨細胞（Ｏｔ）数の増大が観察されたが、１Ｄ１１で処置したＣｒｔａｐ−／−マウスではＷＴマウスの数と匹敵するレベルまで低下していた（図１１Ｃおよび図２１）。ＯＩ患者では、疾患のより重度な形態の個体でＯｔ密度の増加が観察され、ＯＩ骨における生理学的成熟不全に基づく未熟な主要骨の存在を反映していると思われた。増加したＴＧＦβシグナル伝達がＯＩにおける骨病理の要因となるという私たちの仮説と一致して、ＷＴマウスにおけるＴＧＦβの過剰発現は、同様にＯｔ密度の増加に帰着した。考えられる説明として、ＴＧＦβは、Ｏｂの、Ｏｔへの移行中のＯｂアポトーシスを阻害し、それによりＯｔ密度の増加を引き起こす。集約すると、これらの知見から、増加したＴＧＦβシグナル伝達が、Ｃｒｔａｐ−／−マウスにおける高い骨代謝回転状態と骨の成熟不全の要因となり、ＴＧＦβシグナル伝達調節異常の阻害により、これらの細胞変化が逆行することが示された。
【０１５１】
Ｏｃ／Ｏｂ相互作用に対するこれらの重大な影響を考慮することにより、ＴＧＦβ利用可能性の微調整が、骨再構築の間の骨形成を伴う骨吸収の局所結合のための重要な因子であり、その不均衡が重大な骨病理に結びつくことが考えられた。私たちの知見は、Ｃｒｔａｐ−／−マウスにおけるＴＧＦβシグナル伝達異常の阻害により、骨量および微構造パラメータが回復し、全体の骨強度が改善され、Ｃｒｔａｐ−／−マウスで観察される細胞変化が逆行することを示した。したがって、ＴＧＦβシグナル伝達の調節異常は、この退行性ＯＩモデルマウスの骨表現型の重要な要因である。
【０１５２】
さらに私たちは、ＴＧＦβの阻害が、Ｃｒｔａｐ−／−マウスの肺表現型に影響するかどうかについても関心を持った。Ｃｒｔａｐ−／−マウスの肺は、ＷＴマウスと比較して、遠位気道空間の増加を示した（図１１Ｄ）。興味深いことに、ＴＧＦβ中和抗体で処置されたＣｒｔａｐ−／−マウスの肺は、肺胞構造間の距離の６０％改善を示した（図１１Ｄおよび１１Ｅ）。この知見から、過度のＴＧＦβシグナル伝達が、Ｃｒｔａｐ−／−マウスで示される肺異常の重要な病理学的要因でもあることも示された。増加したＴＧＦβシグナル伝達は、肺の発生異常だけでなく、成熟した肺における疾患にも関与していた。例えば、肺におけるＴＧＦβ過剰発現は、拡大した気道空間領域を伴う肺発達不全に至り、ＴＧＦβシグナル伝達の増加は、マルファン症候群ならびに肺気腫および気管支喘息の発症における肺異常の病理機構に関与していた。私たちの結果は、過度のＴＧＦβシグナル伝達が、Ｃｒｔａｐ−／−マウスで示される肺異常の重要な病理学的要因であることを示した。Ｃｒｔａｐ−／−マウスにおける１Ｄ１１を備えた肺表現型の部分的なレスキューを考慮すると、調節異常ＴＧＦβシグナル伝達は、解剖学的構造が確立されたときに肺組織発達に影響し、さらにＴＧＦβ阻害が表現型を改善することができるときには後の工程で肺組織の維持に影響を与えることが考えられた。
【０１５３】
次の問題は、Ｃｒｔａｐの喪失に基づくコラーゲンの変化（コラーゲンのＰ９８６での３Ｈｙｐの損失をもたらし、翻訳後改変をもたらす）が、どのように調節異常ＴＧＦβシグナル伝達に帰着するかであった。生化学的分析は、コラーゲンのプロリル−３−ヒドロキシル化は、コラーゲン分子の安定性に根本的な影響を及ぼさないが、コラーゲン−タンパク質の相互作用に影響しうることを示した。興味深い仮説として、３Ｈｙｐの損失がコラーゲンの小ロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）との相互作用に影響を与えている可能性があった。ＳＬＲＰは、Ｉ型コラーゲンと同様にＴＧＦβ、それらの両方に結合し、ＴＧＦβの活性も調節することが知られている。例えば、ＳＬＲＰデコリンは、骨肉腫細胞におけるＴＧＦβの明確な作用を阻害することができ、一方で、前骨芽細胞におけるＴＧＦβ活動を増強する。Ｉ型コラーゲンに対するデコリンの結合領域は、３重らせんドメインの９６１／９６２残基に集中することが示唆されており、この位置はＣｒｔａｐ欠損症におけるＯＩでヒドロキシル化されていないＰ９８６残基のすぐ近くである。したがって、Ｐ９８６  ３Ｈｙｐ位置がデコリンのＩ型コラーゲンへの相互作用部位を示し、成熟ＴＧＦβのコラーゲンに対する隔離を媒介している可能性がある。
【０１５４】
それゆえ、コラーゲンに結合するデコリンがＴＧＦβ制御にとって重要であり、この結合が、変化したコラーゲンの構造を変化させ、例えば退行性ＯＩの場合にはＩ型コラーゲンのα１鎖のＰ９８６の翻訳後３−プロリル−ヒドロキシル化性修飾の損失によって破壊するとの仮説を立てた。Ｃｒｔａｐの損失は頭蓋骨におけるデコリンおよび他のＳＬＲＰのＲＮＡ発現を変化させず（図１２Ａ）、骨梁におけるデコリンの定性的量も変化させなかったが（図２４）、ＷＴマウスに対してＣｒｔａｐ−／−マウスに由来するＩ型コラーゲンへの組み換えデコリンコアタンパク質の結合が減少していた（図１２Ｂ）ことが示された。ＷＴおよびＣｒｔａｐ−／−マウスの組み換えデコリンコアタンパク質のＩ型コラーゲンに対する結合の表面プラズモン共鳴分析測定結果は、試験した３つの濃度において、Ｃｒｔａｐ−／−マウスでの結合が低下していることを実証した（図２３）。デコリンの示された濃度それぞれでの３つの技術的複製物は、２つの独立した生物学的複製から実施した（◆複製物１、▲複製物２）。結果は、ＷＴの平均に対するパーセンテージで示した（バーは１群あたりの平均）。Ｃｒｔａｐ−／−Ｉ型コラーゲンに結合するデコリンの低下の平均値は、３１２μＭ、５１２μＭおよび１２μＭのデコリンで、それぞれ２８．５％、３３．５％および３８．１％であった。
【０１５５】
この知見は、コラーゲン−プロテオグリカン相互作用の変化が、ＯＩの骨および他のコラーゲンが豊富な組織におけるＴＧＦβシグナル伝達の調節異常の一因である可能性を示唆した。デコリンがＴＧＦβ生物活性を効果的に縮小するためにデコリン−コラーゲン結合が必要であることの報告に基づくと、ＯＩコラーゲンにおける欠陥が、デコリンの結合を導いている可能性があり、マトリックス中のＴＧＦβを隔離し、ＴＧＦβ機能を改変している可能性があった。したがって、絶対的なＴＧＦβレベルに大きな変化がない場合でも（図２４および図２５）、変化したプロテオグリカン−コラーゲン相互作用が、ＯＩにおける骨および他のコラーゲン豊富な組織における調節異常ＴＧＦβシグナル伝達に関与している可能性があった。この概念は、特定の領域においてプロテオグリカンに結合することが知られている重度の高い形態の優性ＯＩクラスターにおけるＣＯＬ１Ａ１とＣＯＬ１Ａ２の変異の発見により支持され、さらに、正常な骨ホメオスタシスに対するプロテオグリカン−コラーゲン相互作用の生理学的関連性が支持された。このことから、さらにデコリンとコラーゲン結合部位に対して競合する他のプロテオグリカンが、調節異常ＴＧＦβ活性に関与し、さらなるシグナル伝達経路を変化させることが示唆された。
【０１５６】
コラーゲン線維の不完全な構造が脆弱骨および骨外性顕示に結びつくＯＩの複数の退行性および優性形態には臨床的な重複があることから、ＴＧＦβシグナル伝達の調節異常が共通の病態生理学的疾患メカニズムである可能性がある。この仮説に取り組むために、優性ＯＩモデルマウスにおけるＴＧＦβシグナル伝達の状態を調べた。Ｃｏｌ１α２遺伝子
のＧ６１０Ｃ変異（Ｃｏｌ１α２ｔｍ１．１Ｍｃｂｒ）を保有するノックイン・マウスは、アーミッシュ系集団で最初に同定された優性遺伝される軽度ＯＩ型の表現型模写体である。Ｃｏｌ１α２ｔｍ１．１Ｍｃｂｒマウスの骨試料において、ＴＧＦβ目標遺伝子ｐ２１およびＰＡＩ−１の発現増加が確認され、ＴＧＦβシグナル伝達が上方調節されていることが示唆された（図１３Ａ）。一貫して、Ｃｏｌ１α２ｔｍ１．１Ｍｃｂｒマウス由来の骨抽出物の免疫ブロット分析においても、活性化ｐＳｍａｄ２／全Ｓｍａｄ２の比率増加が示され、Ｃｒｔａｐ−／−マウスにおける我々の観察と類似していた（図１３Ｂおよび１３Ｃ）。
【０１５７】
この優性ＯＩモデルにおける増加したＴＧＦβシグナル伝達が通常のメカニズムでも現れるかを試験するために、８週齢のＣｏｌ１α２ｔｍ１．１Ｍｃｂｒマウスを、ＴＧＦβ中和抗体１Ｄ１１で８週間処置し、対照Ｃｏｌ１α２ｔｍ１．１ＭｃｂｒおよびＷＴマウスを対照抗体１３Ｃ４で処置した。Ｃｒｔａｐ−／−マウスにおける知見と類似して、１Ｄ１１処置は背骨でＷＴレベルまで骨梁パラメータを回復させた（図１３Ｄ、１３Ｅおよび２２）。まとめると、これらの知見から、調節異常ＴＧＦβシグナル伝達が、優性ＯＩ形態の病理の重大な要因でもあり、抗ＴＧＦβ療法が優性ＯＩにおける骨表現型を改善することが示された。
【０１５８】
臨床的な転換の観点からすると、ＯＩ患者における全身的なＴＧＦβ阻害は、負の効果があり得ることを考慮しなければならない。一方、ＴＧＦ−β１−／−マウスは生後第１週において重篤な多病巣性炎症性疾患および免疫系調節異常を発症したが、１Ｄ１１で処置したＣｒｔａｐ−／−マウスおよびＣｏｌ１α２ｔｍ１．１Ｍｃｂｒマウスは両方とも全体的な健康、挙動または成長に顕著に有害な作用は観察されず、成体マウスにおけるＴＧＦβリガンドの部分的な薬理学的阻害の効果は発達中にＴＧＦβ１を完全に損失している場合と異なることが示唆された。ヒトにおいて、ＴＧＦβの３つのアイソフォームへの親和性と特異性の点で１Ｄ１１と似ているＦｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ（ＧＣ１００８、Ｇｅｎｚｙｍｅ）が、処置耐性原発性巣状糸球体硬化症、特発性肺線維症、悪性黒色腫および腎細胞癌を有する患者に対する第１相試験で使用された。これらの研究において、Ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂは、一般に十分な耐用性があり、用量依存性の起こり得る副作用としては、皮膚発疹または病斑、鼻血、歯肉出血および疲労があった。
【０１５９】
ＯＩの分子のメカニズムは完全には理解されていない。その結果、ＯＩを有する患者に対する現在の処置選択肢は、主に骨粗鬆症の処置で使用されているような、抗再吸収治療薬剤に限定されている。興味深いことに、最近の、ＯＩを有する成人における同化剤ｔｅｒｉｐａｒａｔｉｄｅの無作為プラセボ対照試験において、重度のＯＩ型ＩＩＩ／ＩＶを有する成人が、軽度のＯＩ型Ｉを有する成人と異なった応答をすることが示された（Ｏｒｗｏｌｌら、２０１４年）。これは、細胞シグナル伝達の変化を標的とする療法に対応して、遺伝子型の差異があったことを示唆しており、ＴＧＦβ標的処置が、コラーゲンおよびコラーゲンの翻訳後修飾遺伝子突然変異に基づいて重度ＯＩをさらに研究するための有望な選択肢となりうることを示唆した。全体として、私たちのデータは、骨脆弱疾患の様々な遺伝的に継承された形態の病理におけるメカニズムとしてマトリックス細胞シグナル伝達調節異常に基づく概念を支持するものであり、骨格および骨格外組織の過剰ＴＧＦβ活性の中和によるＯＩの処置のための疾患特異的メカニズムに基づく手順を指摘するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月26日(2020.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、前記抗体がレルデリムマブ（Lerdelimumab、ＣＡＴ−１５２）またはメテリムマブ（Metelimumab、ＣＡＴ−１９２）、またはその抗原結合フラグメントである、ヒト対象における骨形成不全症（ＯＩ）の治療用の医薬組成物。
【請求項２】
抗体がヒトＩｇＧ４定常領域を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記抗体が、少なくとも１つの治療薬と組み合わせて使用される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記薬剤が、ビスホスホネート、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモンアナログ、カルシトニン、および選択的エストロゲン受容体調節因子からなる群から選択される、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抗体がアレンドロネート、パミドロネート、ゾレドロネートまたはリセドロネートと組み合わせて使用される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
抗体がテリパラチドと組み合わせて使用される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
対象がI型OIである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）に結合する抗体または抗原結合断片を含む、ヒト対象の骨形成不全症（ＯＩ）の治療用の医薬組成物であって、
ヒト対象は、Ｉ型またはＩＩ型コラーゲン、ロイシンプロリン−高プロテオグリカン（レプレカン）、または軟骨関連タンパク質（ＣＲＴＡＰ）の変異遺伝子を持っていると特定され、
前記抗体または抗原結合断片は、配列番号４、５および６のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１−３、および配列番号７、８および９のアミノ酸配列をそれぞれ有する軽鎖ＣＤＲ１−３を含む、
前記医薬組成物。
【請求項９】
前記抗体が、それぞれ配列番号１０および１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記抗体が、ヒトＩｇＧ４定常領域およびヒトκ軽鎖定常領域を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ヒトＩｇＧ４定常領域が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ヒトκ軽鎖定常領域が配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記抗体が、それぞれ配列番号１４および１５のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記対象がＩ型ＯＩである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記抗体が少なくとも１つの治療薬と組み合わせて使用される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記薬剤が、ビスホスホネート、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモンアナログ、カルシトニン、および選択的エストロゲン受容体調節因子からなる群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ヒト対象における骨形成不全症（ＯＩ）を治療する方法において使用するための医薬組成物であって、
トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）に結合する抗体またはその抗原結合断片を対象に投与することを含み、
前記抗体または抗原結合断片は、それぞれ配列番号４、５、および６のアミノ酸配列をそれぞれ有する相補性決定領域を有する重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１−３および配列番号７、８、および９のアミノ酸配列をそれぞれ有する軽鎖ＣＤＲ１−３を含み、そして（1）１型プロコラーゲン（Ｃ末端／Ｎ末端）、オステオカルシン、総アルカリホスファターゼ、および骨特異的アルカリホスファターゼから選択される骨沈着の１つ以上のバイオマーカー、または
（2）尿中ヒドロキシプロリン、尿中総ピリジノリン、尿中遊離デオキシピリジノリン、尿中コラーゲンＩ型架橋N-テロペプチド、尿中または血清コレーゲンＩ型架橋Ｃ−テロペプチド、骨シアロタンパク質、オステオポンチンおよび酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５ｂから選択される骨吸収の１つ以上のバイオマーカー
のレベルを測定することを含む、
前記医薬組成物。
【請求項１７】
前記抗体が、それぞれ配列番号１０および１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記抗体が、ヒトＩｇＧ４定常領域およびヒトκ軽鎖定常領域を含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記抗体が、それぞれ配列番号１４および１５のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を
含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記対象がＩ型ＯＩである、請求項１６に記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
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