(57)【要約】      （修正有）【課題】ＬＡＧ−３に特異的に結合し、抗ＬＡＧ−３抗体、例えば抗体２５Ｆ７（ＵＳ２０１１／０１５０８９２Ａ１）と比較して、最適化された機能特性を有する単離されたモノクローナル抗体を提供する。【解決手段】脱アミド部位の減少を含むが、ヒトＬＡＧ−３への高アフィニティー結合、および物理的（すなわち、熱的および化学的）安定性を維持している。本発明の抗体をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞および本発明の抗体を発現するための方法、ならびに該抗体を含む免疫複合体、二重特異性分子および医薬組成物も、提供する。本発明はまた、ＬＡＧ−３を検出するための方法、ならびに本発明の抗ＬＡＧ−３抗体を使用して、免疫応答を刺激して処置するための方法も提供する。抗体を少なくとも１つのさらなる免疫刺激抗体と共投与する併用療法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖および軽鎖可変領域を含む、ヒトＬＡＧ−３に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該重鎖可変領域は、配列番号：１２の重鎖可変領域からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が、それぞれ配列番号：１５、１６および１７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
軽鎖可変領域が、配列番号：１４の軽鎖可変領域からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４】
軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が、それぞれ配列番号：１８、１９および２０のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５】
重鎖可変領域が、配列番号：１２のアミノ酸配列を含む、請求項１または３に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６】
軽鎖可変領域が、配列番号：１４のアミノ酸配列を含む、請求項１から５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７】
それぞれ配列番号：１５、１６、１７、および配列番号：１８、１９および２０のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む、ヒトＬＡＧ−３に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８】
それぞれ配列番号：１２および１４のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む、ヒトＬＡＧ−３に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９】
以下の特性の１つまたは組合せ：
（ａ）サルＬＡＧ−３へ結合する；
（ｂ）マウスＬＡＧ−３へ結合しない；
（ｃ）ＬＡＧ−３の主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子へ結合する；
（ｄ）ＬＡＧ−３の主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子への結合を阻害する；または
（ｅ）免疫応答を刺激する
を示す、請求項１から８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
抗原特異的Ｔ細胞応答においてインターロイキン−２（ＩＬ−２）生産を刺激する、請求項１から９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１１】
抗腫瘍免疫応答を刺激する、請求項１から１０のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１２】
アミノ酸配列ＰＧＨＰＬＡＰＧ（配列番号：２１）を含むヒトＬＡＧ−３のエピトープに結合する、請求項１から１１のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３】
アミノ酸配列ＨＰＡＡＰＳＳＷ（配列番号：２２）またはＰＡＡＰＳＳＷＧ（配列番号：２３）を含むヒトＬＡＧ−３のエピトープに結合する、請求項１から１２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１４】
０．２７ｘ１０−９Ｍ以下のＫＤにてヒトＬＡＧ−３に結合する、請求項１から１３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１５】
ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である、請求項１から１４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１６】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１から１５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１７】
抗体フラグメントまたは一本鎖抗体である、請求項１から１６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分、および第２の抗体またはその抗原結合部分を含む、二重特異性分子。
【請求項１９】
治療剤に連結した、請求項１から１７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分を含む、免疫複合体。
【請求項２０】
治療剤が、細胞毒素または放射性同位体である、請求項１９に記載の免疫複合体。
【請求項２１】
請求項１から１７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分、請求項１８に記載の二重特異性分子、または請求項１９または２０に記載の免疫複合体、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項２２】
抗癌剤をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
該剤が抗体または化学療法剤である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１−８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする単離された核酸。
【請求項２５】
請求項２４に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２６に記載の宿主細胞において抗体を発現させ、宿主細胞から抗体を単離することを含む、抗ＬＡＧ−３抗体を製造するための方法。
【請求項２８】
対象における免疫応答が刺激されるように、請求項１−１７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分、請求項１８に記載の二重特異性分子、または請求項１９または２０に記載の免疫複合体を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法。
【請求項２９】
対象が腫瘍を有する対象であり、腫瘍に対する免疫応答が刺激される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
対象がウイルスを有する対象であり、ウイルスに対する免疫応答が刺激される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるように、免疫応答が抗原特異的Ｔ細胞応答である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
抗原特異的Ｔ細胞によるインターロイキン−２生産が刺激される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
腫瘍の増殖が対象において阻害されるように、請求項１−１７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分、請求項１８に記載の二重特異性分子、または請求項１９または２０に記載の免疫複合体を対象に投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法。
【請求項３４】
ウイルス感染が対象において処置されるように、請求項１−１７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分、請求項１８に記載の二重特異性分子、または請求項１９または２０に記載の免疫複合体を対象に投与することを含む、対象におけるウイルス感染を処置するための方法。
【請求項３５】
少なくとも１つのさらなる免疫刺激抗体の投与をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１つのさらなる免疫刺激抗体が抗ＰＤ−１抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つのさらなる免疫刺激抗体が抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも１つのさらなる免疫刺激抗体が抗−ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
対象における免疫応答、所望により抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するため、または腫瘍細胞の増殖を阻害するため、またはウイルス感染を処置するための、請求項１−１７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分、請求項１８に記載の二重特異性分子、または請求項１９または２０に記載の免疫複合体の使用。
【請求項４０】
対象における免疫応答、所望により抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するため、または腫瘍細胞の増殖を阻害するため、またはウイルス感染を処置するための薬物の製造のための、請求項１−１７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分、請求項１８に記載の二重特異性分子、または請求項１９または２０に記載の免疫複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
治療抗体は、医薬産業の最も急速に成長している分野の一つである。効力（すなわち、活性）を維持するため、および免疫原性を最小限にするために、抗体および他のタンパク質薬物は、製造および保存中に、物理化学的分解から保護されなければならない。実際に、抗体治療薬の開発における主な困難の一つは、対象に投与するときの起こり得る免疫原性応答であり、これは、迅速なクリアランスを引き起こし得るか、またはアナフィラキシーショックを含む生命に関わる副作用を誘発さえし得る。種々の因子、例えば、その生理化学特性（例えば、純度、安定性または溶解性）、臨床的因子（例えば、用量、投与経路、疾患の不均一性、または患者特性）、および他の薬剤との同時処置が、抗体の免疫原性に影響する（Swannら (2008) Curr Opinion Immuol 20:493-499）。
【背景技術】
【０００２】
抗体の免疫原性および／または抗体活性の喪失は、しばしば脱アミドによる。脱アミドは、タンパク質（例えば、抗体）において自発的に起こる化学的分解プロセスである。脱アミドは、アミノ酸残基、例えば、アスパラギンおよびグルタミンからアミド官能基を除去し、したがって、そのアミド含有側鎖を損傷する。これは、順に、タンパク質全体の構造的および生物学的変化を引き起こし、したがって抗体の異種形態を創造する。脱アミドは、組換え的に生産される治療抗体に起こる最も一般的な翻訳後修飾の１つである。
【０００３】
例えば、細胞培養中、脱アミドによるモノクローナル抗体ｈ１Ｂ４（ヒト化抗−ＣＤ１８抗体）の重鎖における不均一性が、Tsaiら (Pharm Res 10(11):1580 (1993))により報告された。加えて、脱アミドによる生物学的活性の減少／喪失は、認識された問題となっている。例えば、Ｋｒｏｏｎらは、治療抗体ＯＫＴ３におけるいくつかの脱アミド部位を特徴付け、ＯＫＴ３生産ロットのサンプル（１４月から３年もの）が７５％活性を下回ったことを報告した（Pharm Res 9(11):1386 (1992)、１３８９頁、第２欄）。加えて、それらのマップにおいて多量の酸化ペプチドを示すＯＫＴ３のサンプルは、抗原結合効力アッセイにおいて有意に減少した活性を有した（１３９０頁、第１欄）。該著者らは、ＯＫＴ３の保存時に起こる化学修飾の特定の部位が、ペプチドマッピングにより同定され、抗体の化学分析および生物学的アッセイにおいて観察される変化と相関していたと結論付けた（１３９２頁、第１欄）。生物学的活性の喪失は、組換えヒトＤＮａｓｅ（Caciaら (1993) J. Chromatogr. 634:229-239）および組換え可溶性ＣＤ４（Teshimaら (1991) Biochemistry 30:3916-3922）を含む種々の他の脱アミド化治療タンパク質についても報告されている。
【０００４】
全般的に、脱アミドは、医薬産業に重要な、予測不可能な問題である。抗体治療薬内の脱アミドにより引き起こされる変動のモニタリングと関連する取り組み、特に、ならびにこの変動と関連するＦＤＡの関心(concerns)は、コストを増大させ、臨床試験を遅延させる。さらに、脱アミド（例えば、部位特異的突然変異誘発）を受けやすいアミノ酸の組換え生産および／または改変と関連するシフト条件（例えば、温度、ｐＨ、および細胞型）を含む、この問題に対処するための修飾は、とりわけ変化が抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に作られるとき、安定性および活性にマイナスに影響し得る。したがって、治療抗体のより安定なバージョンの必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
要約
本発明は、ＬＡＧ−３（例えば、ヒトＬＡＧ−３）に結合し、以前に記載されている抗ＬＡＧ−３抗体と比較して、最適化された物理的安定性を有する単離されたモノクローナル抗体（例えば、ヒトモノクローナル抗体）を提供する。特に、本発明は、修飾されていない抗体と比較して、有意に改善された熱および化学安定性を示す抗体２５Ｆ７（ＵＳ  ２０１１／０１５０８９２  Ａ１）の修飾された形態に関する。具体的には、抗体２５Ｆ７の重鎖ＣＤＲ２ドメインの重要な結合領域を改変することにより、修飾された抗体は、有意に高い物理的および熱安定性、低下した脱アミド、高い熱可逆性、および低い凝集を示すことが示された。同時に、修飾された抗体が、ヒトＬＡＧ−３への修飾されていない抗体と同じ高い結合アフィニティーおよび修飾されていない抗体の機能活性を維持する、例えば、ＬＡＧ−３の主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子への結合を阻害する、および抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する能力を維持することが予想外に観察された。修飾された抗体の結合／生物学的活性の安定性および維持における組み合わせられた実質的な増加は、特に抗体機能に対するＣＤＲ領域の重要性(criticality)を考慮すると、驚くべきことであった。
【０００６】
本発明の抗体は、ＬＡＧ−３タンパク質の検出および腫瘍を有する対象またはウイルスを有する対象における抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激を含む、種々の適用のために使用することができる。
【０００７】
したがって、１つの局面において、本発明は、配列番号：１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する単離されたモノクローナル抗体（例えば、ヒト抗体）またはその抗原結合部分に関する。他の態様において、抗体は、配列番号：１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む。他の態様において、抗体またはその抗原結合部分は、配列番号：１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域（例えば、それぞれ配列番号：１５、１６および１７）を含む。他の態様において、抗体は、配列番号：１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域（例えば、それぞれ配列番号：１８、１９および２０）をさらに含む。
【０００８】
好ましい態様において、抗体は、抗体２５Ｆ７と比較して、増加した物理的特性（すなわち、熱および化学安定性）を示すが、２５Ｆ７と少なくとも同じヒトＬＡＧ−３に対する結合アフィニティーを維持している。例えば、抗体は、抗体２５Ｆ７と比較して、脱アミドによって重鎖ＣＤＲ２領域における減少した配列可変性、例えば、４℃で１２週後、アミノ酸配列の約２．５％以下の修飾（すなわち、本明細書に記載されている「リアルタイム」安定性試験下）、および／または、４０℃で１２週後、アミノ酸配列の約１２．０％以下の修飾（すなわち、本明細書に記載されている加速ストレス条件下）を示すが、少なくとも約１ｘ１０−７Ｍ以下のＫＤ（さらに好ましくは、１ｘ１０−８Ｍ以下のＫＤ、５ｘ１０−９Ｍ以下のＫＤ、または１ｘ１０−９Ｍ以下のＫＤ）のヒトＬＡＧ−３に対する結合アフィニティーを維持している。他の態様において、抗体は、ｐＨ８．０でＰＢＳにおいて少なくとも約４０％の熱可逆性を示す。
【０００９】
他の態様において、抗体は、非修飾抗体（Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71）と比較して、より高い融解温度（インビボにおいてより良い総合安定性を示す）を有する。１つの態様において、抗体は、６０℃以上、例えば、６５℃以上、または７０℃以上のＴＭ１（最初のアンフォールディングの温度）を示す。抗体の融点は、示差走査熱量測定（Chenら (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlandoら (1999) Immunol Lett 68:47-52）または円偏光二色性（Murrayら (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9）を使用して測定することができる。
【００１０】
他の態様において、抗体は迅速な分解に対する耐性により特徴付けられる。抗体の分解は、毛細管電気泳動法（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して測定することができる（Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32）。
【００１１】
他の態様において、抗体は、最小の凝集効果、例えば、２５％以下、例えば、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、または４％以下の凝集を示す。凝集は、望ましくない免疫応答および／または変化した、もしくは好ましくない薬物動態学的特性を引き起こし得る。凝集は、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および光散乱を含むいくつかの技術により測定することができる。
【００１２】
他の態様において、抗体は、少なくとも１つの以下の特性：
（ａ）サルＬＡＧ−３へ結合する；
（ｂ）マウスＬＡＧ−３へ結合しない；
（ｃ）ＬＡＧ−３の主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子への結合を阻害する；および
（ｄ）免疫応答、特に抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する
をさらに示す。
【００１３】
好ましくは、抗体は、特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の少なくとも２つを示す。さらに好ましくは、抗体は、特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の少なくとも３つを示す。よりさらに好ましくは、抗体は、特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の全４つを示す。
【００１４】
他の態様において、抗体は、抗原特異的Ｔ細胞応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答におけるインターロイキン−２（ＩＬ−２）生産を刺激する。他の態様において、抗体は、免疫応答、例えば、抗腫瘍応答（例えば、腫瘍移植片モデルにおいてインビボにて腫瘍増殖の阻害）または自己免疫応答（例えば、ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発症）を刺激する。
【００１５】
他の態様において、抗体は、アミノ酸配列ＰＧＨＰＬＡＰＧ（配列番号：２１）を含むヒトＬＡＧ−３のエピトープに結合する。他の態様において、抗体は、アミノ酸配列ＨＰＡＡＰＳＳＷ（配列番号：２２）またはＰＡＡＰＳＳＷＧ（配列番号：２３）を含むヒトＬＡＧ−３のエピトープに結合する。
【００１６】
他の態様において、抗体は、免疫組織化学により下垂体組織を染色するか、または、免疫組織化学により下垂体組織を染色しない。
【００１７】
本発明の抗体は、重鎖中のジスルフィド架橋不均一性を減少させるか、または破壊するように、所望により重鎖定常領域ヒンジ領域（Angalら (1993) Mol. Immunol. 30:105-108に記載されている位置２４１に対応する位置）にてセリンからプロリンへの変異を有する、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプの全長抗体であり得る。１つの局面において、定常領域アイソタイプは、アミノ酸残基２２８にて変異、例えば、Ｓ２２８Ｐを有するＩｇＧ４である。あるいは、抗体は、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’ またはＦａｂ’２フラグメントまたは一本鎖抗体であり得る。
【００１８】
本発明の別の局面において、抗体（またはその抗原結合部分）は、抗体に連結した治療剤、例えば、細胞毒素または放射性同位体を含む免疫複合体の一部である。他の局面において、抗体は、抗体、またはその抗原結合部分と異なる結合特異性を有する第２の機能性部分（例えば、第２の抗体）を含む二重特異性分子の一部である。
【００１９】
所望により薬学的に許容される担体において製剤化される、本発明の抗体もしくはその抗原結合部分、免疫複合体または二重特異性分子を含む組成物も提供する。
【００２０】
本発明の抗体またはその抗原結合部分（例えば、可変領域および／またはＣＤＲ）をコードする核酸分子ならびにこのような核酸を含む発現ベクターおよびこのような発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。このような発現ベクターを含む宿主細胞を使用して抗ＬＡＧ−３抗体を調製するための方法も提供し、該方法は（ｉ）宿主細胞において抗体を発現させ、そして（ｉｉ）宿主細胞から抗体を単離する工程を含み得る。
【００２１】
他の局面において、本発明は、本発明の抗ＬＡＧ−３抗体を使用して免疫応答を刺激する方法を提供する。１つの態様において、該方法は、抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるように、Ｔ細胞を本発明の抗体と接触させることにより抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激することを含む。好ましい態様において、抗原特異的Ｔ細胞によるインターロイキン−２生産が刺激される。他の態様において、対象は腫瘍を有する対象であり、腫瘍に対する免疫応答が刺激される。他の態様において、対象はウイルスを有する対象であり、ウイルスに対する免疫応答が刺激される。
【００２２】
さらに他の態様において、本発明は、腫瘍の増殖を対象において阻害するように、本発明の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。さらに別の態様において、本発明は、ウイルス感染を対象において処置するように、本発明の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象におけるウイルス感染を処置するための方法を提供する。他の態様において、これらの方法は、本発明の組成物、二重特異性または免疫複合体を投与することを含む。
【００２３】
さらに他の態様において、本発明は、例えば、腫瘍増殖を阻害するか、または抗−ウイルス応答を刺激するために対象における免疫応答を刺激するように、本発明の抗体またはその抗原結合部分および少なくとも１つのさらなる免疫刺激抗体、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗−ＣＴＬＡ−４抗体を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を刺激するための方法を提供する。１つの態様において、さらなる免疫刺激抗体は抗ＰＤ−１抗体である。他の態様において、さらなる免疫刺激剤は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。さらに他の態様において、さらなる免疫刺激剤は抗−ＣＴＬＡ−４抗体である。さらに他の態様において、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２および／またはＩＬ−２１）、または共刺激抗体（例えば、抗−ＣＤ１３７および／または抗−ＧＩＴＲ抗体）と共に投与される。抗体は、例えば、ヒト、キメラまたはヒト化抗体であり得る。
【００２４】
他の局面において、本発明は、前記方法における使用のための、または（例えば、処置のため）前記方法における使用のための医薬の製造のための本発明の抗ＬＡＧ−３抗体および組成物を提供する。
【００２５】
本願の他の特徴および利点は本記載および実施例から明らかであるが、これらに限定すると解釈してはならない。本明細書において引用されているすべての文献、Ｇｅｎｂａｎｋ登録、特許および公開特許出願の内容を出典明示により明確に本明細書に包含させる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１Ａは２５Ｆ７ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：１）およびアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：５）、ＣＤＲ２（配列番号：６）およびＣＤＲ３（配列番号：７）領域が示されており、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系列誘導体が示されている。ＣＤＲ領域はＫａｂａｔシステムを使用して示される（Kabatら (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）。
【００２７】
【図１Ｂ】図１Ｂは２５Ｆ７ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：３）およびアミノ酸配列（配列番号：４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：８）、ＣＤＲ２（配列番号：９）およびＣＤＲ３（配列番号：１０）領域が示されており、ＶおよびＪ生殖細胞系列誘導体が示されている。抗体２５Ｆ７の全長重鎖および軽鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号：３２および３４に示されている。
【００２８】
【図２Ａ】図２ＡはＬＡＧ３．５モノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：１２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：１５）、ＣＤＲ２（配列番号：１６）およびＣＤＲ３（配列番号：１７）領域が示されている。抗体ＬＡＧ３．５の全長重鎖および軽鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号：３５および３７に示されている。
【００２９】
【図２Ｂ】図２ＢはＬＡＧ３．５モノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：１３）およびアミノ酸配列（配列番号：１４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：１８）、ＣＤＲ２（配列番号：１９）およびＣＤＲ３（配列番号：２０）領域が示されている。
【００３０】
【図３】図３は、抗体２５Ｆ７（ＬＡＧ３．１）のＣＤＲ２重鎖可変領域配列のアミノ酸配列（配列番号：４１）および対応するヒト生殖細胞系列配列（配列番号：２７）と比較しての、ＬＡＧ−３変異体ＬＡＧ３．５（配列番号：４２）、ＬＡＧ３．６（配列番号：４３）、ＬＡＧ３．７（配列番号：４４）およびＬＡＧ３．８（配列番号：４５）のＣＤＲ２重鎖可変領域配列のアミノ酸配列を示す。ＬＡＧ３．５のＣＤＲ２重鎖可変領域は、２５Ｆ７のＣＤＲ２重鎖可変領域から、（アスパラギン（Ｎ）に対して）位置５４にてアルギニン（Ｒ）および（アスパラギン（Ｎ）に対して）位置５６にてセリン（Ｓ）で異なる。ＬＡＧ３．５および２５Ｆ７の残りのＣＤＲは同一である。図３は、配列番号：４０も記載している。
【００３１】
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞への抗体ＬＡＧ３．１（２５Ｆ７）、ＬＡＧ３．２、ＬＡＧ３．５、ＬＡＧ３．６、ＬＡＧ３．７およびＬＡＧ３．８の結合活性（それぞれＥＣ５０およびアフィニティー）を示すグラフである。図４Ｂは、配列番号：４１、４２、４５、４４および４３をそれぞれ順に記載している。
【００３２】
【図５−１】図５Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、それぞれ、抗体ＬＡＧ３．１（２５Ｆ７）、ＬＡＧ３．５、ＬＡＧ３．６、ＬＡＧ３．７およびＬＡＧ３．８の熱融解曲線（すなわち、熱安定性）を示すグラフである。
【図５−２】図５Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、それぞれ、抗体ＬＡＧ３．１（２５Ｆ７）、ＬＡＧ３．５、ＬＡＧ３．６、ＬＡＧ３．７およびＬＡＧ３．８の熱融解曲線（すなわち、熱安定性）を示すグラフである。
【００３３】
【図６−１】図６Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、それぞれ、抗体ＬＡＧ３．１（２５Ｆ７）、ＬＡＧ３．５、ＬＡＧ３．６、ＬＡＧ３．７およびＬＡＧ３．８の熱可逆性曲線（すなわち、熱安定性）を示すグラフである。
【図６−２】図６Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、それぞれ、抗体ＬＡＧ３．１（２５Ｆ７）、ＬＡＧ３．５、ＬＡＧ３．６、ＬＡＧ３．７およびＬＡＧ３．８の熱可逆性曲線（すなわち、熱安定性）を示すグラフである。
【００３４】
【図７】図７は、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞および抗原結合（Ｂｉａｃｏｒｅ）への抗体ＬＡＧ３．１（２５Ｆ７）およびＬＡＧ３．５の結合活性を示すグラフである。
【００３５】
【図８】図８は、本明細書に記載されている加速ストレス条件下で５日間インキュベート後に、脱アミドおよび異性化を反映する抗体ＬＡＧ３．１（２５Ｆ７）およびＬＡＧ３．５に対する質量分析（化学修飾／分子安定性）を使用するペプチドマッピングの結果を示す。図８は、配列番号：４６−５２をそれぞれ順に記載している。
【００３６】
【図９】図９は、抗体ＬＡＧ３．１（２５Ｆ７）およびＬＡＧ３．５の親水性プロフィールを比較するグラフである。
【００３７】
【図１０】図１０Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、本明細書に記載されているとおり、４℃および４０℃、すなわち、加速ストレス条件および「リアルタイム」安定性試験の両方での抗体ＬＡＧ３．１およびＬＡＧ３．５のアフィニティーおよび物理的安定性（すなわち、熱および化学安定性）を比較するグラフである。
【００３８】
【図１１】図１１ＡおよびＢは、４℃および４０℃での抗体ＬＡＧ３．１およびＬＡＧ３．５のアミノ酸配列の修飾パーセントを比較するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
発明の詳細な説明
本明細書をさらに容易に理解するために、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は詳細な説明中に記載されている。
【００４０】
「２５Ｆ７」、「抗体２５Ｆ７」、「抗体ＬＡＧ３．１」および「ＬＡＧ３．１」なる用語は、ＵＳ２０１１／０１５０８９２  Ａ１に記載されている抗−ヒトＬＡＧ−３抗体を示す。２５Ｆ７（ＬＡＧ３．１）の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号：１）および対応するアミノ酸配列（配列番号：２）は、図１Ａにおいて示される（それぞれ配列番号：４、５および７と表されるＣＤＲ配列を有する）。２５Ｆ７（ＬＡＧ３．１）の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号：３）および対応するアミノ酸配列（配列番号：４）は、図１Ｂにおいて示される（それぞれ配列番号：８、９および１０と表されるＣＤＲ配列を有する）。
【００４１】
「ＬＡＧ−３」なる用語は、リンパ球活性化遺伝子−３を示す。「ＬＡＧ−３」なる用語は、変異体、アイソフォーム、ホモログ、オルソログおよびパラログを含む。例えば、ヒトＬＡＧ−３タンパク質に対して特異的である抗体は、ある場合において、ヒト以外の種由来のＬＡＧ−３タンパク質と交差反応し得る。他の態様において、ヒトＬＡＧ−３タンパク質に対して特異的である抗体は、ヒトＬＡＧ−３タンパク質に対して完全に特異的であってよく、種または他の型の交差反応性を示さなくてもよく、または、全ての他の種ではなくある特定の他の種由来のＬＡＧ−３と交差反応してよい（例えば、マウスＬＡＧ−３ではなくサルＬＡＧ−３と交差反応する）。「ヒトＬＡＧ−３」なる用語は、ヒト配列ＬＡＧ−３、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ  受入番号  ＮＰ＿００２２７７を有するヒトＬＡＧ−３の完全なアミノ酸配列を示す（配列番号：２９）。「マウスＬＡＧ−３」なる用語は、マウス配列ＬＡＧ−３、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ  受入番号  ＮＰ＿０３２５０５を有するマウスＬＡＧ−３の完全なアミノ酸配列を示す。ＬＡＧ−３はまた、当分野で、例えば、ＣＤ２２３として知られている。ヒトＬＡＧ−３配列は、例えば、保存されている変異または非保存領域における変異を有することにより、Ｇｅｎｂａｎｋ  受入番号  ＮＰ＿００２２７７のヒトＬＡＧ−３と異なっていてよく、ＬＡＧ−３はＧｅｎｂａｎｋ  受入番号  ＮＰ＿００２２７７のヒトＬＡＧ−３と実質的に同じ生物学的機能を有する。例えば、ヒトＬＡＧ−３の生物学的機能は本明細書の抗体によって特異的に結合されるＬＡＧ−３の細胞外ドメインにおけるエピトープを有することであるか、またはヒトＬＡＧ−３の生物学的機能はＭＨＣクラスＩＩ分子へ結合することである。
【００４２】
「サルＬＡＧ−３」なる用語は、旧世界および新世界サルにより発現されるＬＡＧ−３タンパク質を含むことを意図し、カニクイザルＬＡＧ−３およびアカゲザルＬＡＧ−３に限定されない。サルＬＡＧ−３に対する典型的なアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  受入番号  ＸＭ＿００１１０８９２３としても寄託されている、アカゲザルＬＡＧ−３アミノ酸配列である。サルＬＡＧ−３に対する他の典型的なアミノ酸配列は、ＵＳ  ２０１１／０１５０８９２  Ａ１に記載されているクローンｐａ２３−５の別のアカゲザル配列である。この別のアカゲザル配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ−寄託配列と比較して、位置４１９にて単一のアミノ酸の違いを示す。
【００４３】
特定のヒトＬＡＧ−３配列は、一般的に、Ｇｅｎｂａｎｋ  受入番号  ＮＰ＿００２２７７のヒトＬＡＧ−３に対してアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、他の種（例えば、マウス）のＬＡＧ−３アミノ酸配列と比較したとき、ヒトであるアミノ酸配列と同定されるアミノ酸残基を含む。ある場合において、ヒトＬＡＧ−３は、Ｇｅｎｂａｎｋ  受入番号  ＮＰ＿００２２７７のＬＡＧ−３に対してアミノ酸配列において、少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であり得る。１つの態様において、ヒトＬＡＧ−３配列は、受入番号  ＮＰ＿００２２７７のＬＡＧ−３配列と最大１０個のアミノ酸の違いを示し得る。１つの態様において、ヒトＬＡＧ−３は、Ｇｅｎｂａｎｋ  受入番号  ＮＰ＿００２２７７のＬＡＧ−３配列と最大５個、またはさらに最大４、３、２もしくは１個のアミノ酸の違いを示し得る。同一性パーセントは、本明細書に記載されているとおりに決定することができる。
【００４４】
「免疫応答」なる用語は、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または、自己免疫もしくは病的炎症の場合、正常ヒト細胞もしくは組織の人体からの破壊または除去に関する選択的障害を引き起こす、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球および上記細胞または肝臓により生産される可溶性巨大分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の活性を示す。
【００４５】
「抗原特異的Ｔ細胞応答」は、Ｔ細胞に特異的である抗原でのＴ細胞の刺激によって生じるＴ細胞による応答を示す。抗原特異的刺激時のＴ細胞による応答の非限定的な例として、増殖およびサイトカイン生産（例えば、ＩＬ−２生産）を含む。
【００４６】
本明細書において使用される「抗体」なる用語は、全抗体またはその抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部分」）または一本鎖を含む。全抗体はジスルフィド結合により相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。それぞれの重鎖は重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと省略する）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。それぞれの軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと省略する）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域により分断されている相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分類できる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、アミノ−末端からカルボキシ−末端へ次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４にて配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第一の成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への結合を介在し得る。
【００４７】
本明細書において使用される抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）なる用語は、抗原（例えば、ＬＡＧ−３タンパク質）に特異的に結合する能力を維持する抗体の１つ以上のフラグメントを示す。抗体の抗原結合機能は全長抗体のフラグメントにより行うことができることが示されている。抗体の「抗原結合部分」なる用語内に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Wardら, (1989) Nature 341:544-546）；（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；および（ｖｉｉｉ）ナノボディ、単一可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む重鎖可変領域を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされているが、それらは、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製可能とする合成リンカーにより連結することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）としても既知；例えば、Birdら (1988) Science 242:423-426;およびHustonら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883、参照）。このような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含されることを意図する。これらの抗体フラグメントは、当業者に既知の慣用の技術を使用して得られ、これらのフラグメントはインタクトな抗体と同じ手段において有用性についてスクリーニングされる。
【００４８】
本明細書において使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を示すことを意図する（例えば、ＬＡＧ−３タンパク質に特異的に結合する単離された抗体は特異的にＬＡＧ−３タンパク質以外の抗原に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＬＡＧ−３タンパク質に特異的に結合する単離された抗体は、他の種の他の抗原、例えば、ＬＡＧ−３タンパク質に対して交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は実質的に他の細胞物質および／または化学物質を含まなくてもよい。
【００４９】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」なる用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を示す。モノクローナル抗体組成物は特定のエピトープに対して単一の結合特異性およびアフィニティーを示す。
【００５０】
本明細書において使用される「ヒト抗体」なる用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来している可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含むとき、定常領域は、また、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダムまたは部位特異的突然変異またはインビボで体細胞変異により導入された変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において使用される「ヒト抗体」なる用語は、別の哺乳動物種、例えば、マウスの生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むことを意図しない。
【００５１】
「ヒトモノクローナル抗体」なる用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来している可変領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を示す。１つの態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合させたトランスジェニック非ヒト動物、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマにより生産される。
【００５２】
本明細書において使用される「組換えヒト抗体」なる用語は、組換え手段により調製、発現、創造または単離されるすべてのヒト抗体、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子をトランスジェニックまたは染色体導入される動物（例えば、マウス）またはそれから調製されるハイブリドーマから単離される抗体（以下に記載されている）、（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換される宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、創造または単離される抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来している可変領域を有する。しかしながら、１つの態様において、このような組換えヒト抗体をインビトロ変異（または、ヒトＩｇ配列に対して動物トランスジェニックが使用されるとき、インビボ体細胞変異）に付すことができ、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来し、関連するが、天然にインビボにおいてヒト抗体生殖細胞系列のレパートリー内に存在しない可能性のある配列である。
【００５３】
「アイソタイプ」なる用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧｌ）を示す。
【００５４】
「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」なる用語は、「抗原に特異的に結合する抗体」なる用語と互換的に使用される。
【００５５】
「ヒト抗体誘導体」なる用語は、ヒト抗体の修飾された形態、例えば、抗体および別の薬物または抗体の複合体のすべてを示す。
【００５６】
「ヒト化抗体」なる用語は、他の哺乳動物種、例えば、マウスの生殖細胞系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフトされている抗体を示すことを意図する。さらなるフレームワーク領域修飾はヒトフレームワーク配列内に作られ得る。
【００５７】
「キメラ抗体」なる用語は、可変領域配列が１つの種由来であり、定常領域配列が別の種由来である抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体由来であり、定常領域配列がヒト抗体由来である抗体を示すことを意図する。
【００５８】
本明細書において使用される「ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する」抗体は、ヒトＬＡＧ−３タンパク質（あるいは１つ以上の非ヒト種由来のＬＡＧ−３タンパク質）に結合するが、非−ＬＡＧ−３タンパク質に実質的に結合しない抗体を示すことを意図する。好ましくは、抗体は、「高アフィニティー」、すなわち１×１０−７Ｍ以下、さらに好ましくは１×１０−８Ｍ以下、さらに好ましくは５×１０−９Ｍ以下、さらに好ましくは１×１０−９Ｍ以下のＫＤにてヒトＬＡＧ−３タンパク質に結合する。
【００５９】
本明細書において使用されるタンパク質または細胞に「実質的に結合しない」なる用語は、タンパク質または細胞に結合しないか、または高アフィニティーにて結合しない、すなわちタンパク質または細胞に１×１０−６Ｍ以上、さらに好ましくは１×１０−５Ｍ以上、さらに好ましくは１×１０−４Ｍ以上、さらに好ましくは１×１０−３Ｍ以上、より好ましくは１×１０−２Ｍ以上のＫＤにて結合することを意味する。
【００６０】
本明細書において使用される「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」なる用語は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を示すことを意図するが、本明細書において使用される「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」なる用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を示すことを意図する。本明細書において使用される「ＫＤ」なる用語は、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を示すことを意図する。抗体に対するＫＤ値は当分野で確立している方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴、好ましくはバイオセンサーシステム、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを使用することによる。
【００６１】
ＩｇＧ抗体に対する「高アフィニティー」なる用語は、標的抗原に対して１×１０−７Ｍ以下、より好ましくは５×１０−８Ｍ以下、さらに好ましくは１×１０−８Ｍ以下、さらに好ましくは５×１０−９Ｍ以下およびさらに好ましくは１×１０−９Ｍ以下のＫＤを有する抗体を示す。しかしながら、「高アフィニティー」結合は他の抗体アイソタイプに対して変化し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高アフィニティー」結合は、１０−６Ｍ以下、さらに好ましくは１０−７Ｍ以下、さらに好ましくは１０−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を示す。
【００６２】
「脱アミド」なる用語は、タンパク質（例えば、抗体）において自発的に起こる化学的分解プロセスを示す。脱アミドは、アミノ酸残基、例えば、アスパラギンおよびグルタミンからアミド官能基を除去し、したがって、そのアミド含有側鎖を損傷する。具体的には、アスパラギンの側鎖は、隣接ペプチド基を攻撃し、対称スクシンイミド中間体を形成する。中間体の対称性は、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸のいずれかの２つの加水分解産物をもたらす。同様の反応がまた、アスパラギン酸側鎖においても起こり得、イソアスパラギン酸への部分変換を生じる。グルタミンの場合、脱アミドの割合は一般的にアスパラギンの１０倍未満であるが、しかしながら、メカニズムは本質的に同じであり、進行するために水分子のみ必要である。
【００６３】
「対象」なる用語は、ヒトまたは非ヒト動物のすべてを含む。「非ヒト動物」なる用語は、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、鳥類、両生類およびは虫類を含むが、哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシおよびウマが好ましい。
【００６４】
本発明の種々の局面は、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載されている。
【００６５】
増加した安定性および有利な機能特性を有する抗−ＬＡＧ−３抗体
本発明の抗体は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合し、以前に記載されている抗ＬＡＧ−３抗体と比較して、特に抗体２５Ｆ７（ＬＡＧ３．１）と比較して、最適化された安定性を有する。この最適化は、減少した脱アミド（例えば、増加した化学安定性）および増加した熱リフォールディング（例えば、増加した物理的安定性）を含むが、ヒトＬＡＧ−３への高アフィニティー結合を維持している。
【００６６】
脱アミド部位を同定するための方法は、当分野で知られている（例えば、イオン交換、逆相、および疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびタンパク質分解消化物のペプチドマッピング（ＬＣ−ＭＳ）参照）。物理的安定性を測定するための適当なアッセイは、例えば、融点および／または変性後の抗体構造のリフォールディングの分析（例えば、例えば、実施例３、セクション３に記載されている可逆性パーセント）を含む。
【００６７】
１つ以上の技術を使用して評価することができるヒトＬＡＧ−３への結合はまた、当分野で確立している。例えば、抗体は、ヒトＬＡＧ−３を発現する細胞系、例えば、細胞表面上にＬＡＧ−３（例えば、ヒトＬＡＧ−３またはサルＬＡＧ−３（例えば、アカゲザルまたはカニクイザル）またはマウスＬＡＧ−３）を発現するようにトランスフェクトされているＣＨＯ細胞と抗体を反応させるフローサイトメトリーアッセイにより試験することができる。フローサイトメトリーアッセイにおける使用のための他の適当な細胞は、天然のＬＡＧ−３を発現する抗ＣＤ３−刺激ＣＤ４＋活性化Ｔ細胞を含む。さらに、またはあるいは、結合速度（例えば、ＫＤ値）を含む抗体の結合は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて試験することができる。さらに他の適当な結合アッセイは、例えば、組換えＬＡＧ−３タンパク質を使用する、ＥＬＩＳＡアッセイを含む。
【００６８】
好ましくは、本発明の抗体は、１ｘ１０−７Ｍ以下、さらに好ましくは１ｘ１０−８Ｍ以下、５ｘ１０−９Ｍ以下、または１ｘ１０−９Ｍ以下のＫＤにてヒトＬＡＧ−３タンパク質に結合する。
【００６９】
一般的に、抗体は、リンパ球組織、例えば、扁桃腺、脾臓または胸腺におけるＬＡＧ−３に結合し、免疫組織化学により検出することができる。１つの態様において、抗体は、免疫組織化学により測定されるとき、下垂体組織（例えば、下垂体において維持される）を染色する。他の態様において、抗体は、免疫組織化学により測定されるとき、下垂体組織を染色しない（すなわち、下垂体において維持されない）。
【００７０】
さらなる機能特性は、他の種由来のＬＡＧ−３との交差反応性を含む。例えば、抗体は、サルＬＡＧ−３（例えば、カニクイザル、アカゲザル）に結合することができるが、マウス由来のＬＡＧ−３に実質的に結合しない。好ましくは、本発明の抗体は、高アフィニティーでヒトＬＡＧ−３に結合する。
【００７１】
他の機能特性は、免疫応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する抗体の能力を含む。これは、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答におけるインターロイキン−２（ＩＬ−２）生産を刺激する抗体の能力を評価することにより試験することができる。１つの態様において、抗体は、ヒトＬＡＧ−３に結合し、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する。他の態様において、抗体は、ヒトＬＡＧ−３に結合するが、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激しない。免疫応答を刺激する抗体の能力を評価するための他の手段は、腫瘍増殖、例えば、インビボ腫瘍移植片モデル（例えば、実施例６、参照）を阻害する能力または自己免疫応答を刺激する能力、例えば、自己免疫性モデルにおける自己免疫疾患の発症を促進する能力、例えば、ＮＯＤマウスモデルにおける糖尿病の発症を促進する能力を試験することをを含む。
【００７２】
本発明の好ましい抗体はヒトモノクローナル抗体である。さらに、またはあるいは、抗体は、例えば、キメラまたはヒト化モノクローナル抗体であり得る。
【００７３】
モノクローナル抗体ＬＡＧ３．５
本発明の好ましい抗体は、以下および実施例に記載されるように構造的および化学的に特徴付けられるヒトモノクローナル抗体ＬＡＧ３．５である。ＬＡＧ３．５のＶＨアミノ酸配列は、配列番号：１２（図２Ａ）に示される。ＬＡＧ３．５のＶＬアミノ酸配列は、配列番号：１４（図２Ｂ）に示される。
【００７４】
ヒトＬＡＧ−３に結合する他の抗ＬＡＧ−３抗体のＶＨおよびＶＬ配列（またはＣＤＲ配列）は、抗体ＬＡＧ３．５のＶＨおよびＶＬ配列（またはＣＤＲ配列）と「混合および適合させる」ことができる。好ましくは、ＶＨおよびＶＬ鎖（またはかかる鎖内のＣＤＲ）を混合および適合させるとき、特定のＶＨ／ＶＬ対由来のＶＨ配列を構造的に類似のＶＨ配列と置き換える。同様に、好ましくは、特定のＶＨ／ＶＬ対由来のＶＬ配列を構造的に類似のＶＬ配列と置き換える。
【００７５】
したがって、１つの態様において、本発明の抗体またはその抗原結合部分は：
（ａ）アミノ酸配列配列番号：１２を含む重鎖可変領域（すなわち、ＬＡＧ３．５のＶＨ）；および
（ｂ）アミノ酸配列配列番号：１４を含む軽鎖可変領域（すなわち、ＬＡＧ３．５のＶＬ）または別の抗−ＬＡＧ３抗体のＶＬ（すなわち、ＬＡＧ３．５と異なる）；
を含み、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する。
【００７６】
他の態様において、本発明の抗体またはその抗原結合部分は：
（ａ）アミノ酸配列配列番号：１２を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域（すなわち、ＬＡＧ３．５のＣＤＲ配列、それぞれ配列番号：１５、１６および１７）；および
（ｂ）アミノ酸配列配列番号：１４を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域（すなわち、ＬＡＧ３．５のＣＤＲ配列、それぞれ配列番号：１８、１９および２０）または別の抗−ＬＡＧ３抗体のＣＤＲ（すなわち、ＬＡＧ３．５と異なる）；
を含み、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する。
【００７７】
さらに他の態様において、抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＬＡＧ−３に結合する他の抗体のＣＤＲと組み合わせられたＬＡＧ３．５の重鎖可変ＣＤＲ２領域、例えば、異なる抗ＬＡＧ−３抗体の、重鎖可変領域からのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ３、および／または軽鎖可変領域からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含む。
【００７８】
加えて、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメインと独立して、ＣＤＲ３ドメインのみは、同種抗原に対する抗体の結合特異性を決定することができ、多数の抗体が予想通りに、共通のＣＤＲ３配列に基づいて、同じ結合特異性を有して産生することができることが当分野でよく知られている。例えば、Klimkaら, British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000); Beiboerら, J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000); Raderら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998); Barbasら, J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994); Barbasら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995); Ditzelら, J. Immunol. 157:739-749 (1996); Berezovら, BIAjournal 8:Scientific Review 8 (2001); Igarashiら, J. Biochem (Tokyo) 117:452-7 (1995); Bourgeoisら, J. Virol 72:807-10 (1998); Leviら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4374-8 (1993); Polymenis and Stoller, J. Immunol. 152:5218-5329 (1994)およびXu and Davis, Immunity 13:37-45 (2000)、参照。米国特許第６，９５１，６４６；６，９１４，１２８；６，０９０，３８２；６，８１８，２１６；６，１５６，３１３；６，８２７，９２５；５，８３３，９４３；５，７６２，９０５および５，７６０，１８５号も、参照。これらそれぞれの文献を出典明示によりそれらの全体を本明細書に包含させる。
【００７９】
したがって、他の態様において、本発明の抗体は、ＬＡＧ３．５の重鎖可変領域のＣＤＲ２およびＬＡＧ３．５（配列番号：１７および／または２０）の重鎖および／または軽鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３、または別のＬＡＧ−３抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含み、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合することができる。抗体は、好ましくは、（ａ）ＬＡＧ３．５と結合に対して競合し；（ｂ）ＬＡＧ３．５の機能特性を維持し；（ｃ）ＬＡＧ３．５と同じエピトープに結合し；および／または（ｄ）ＬＡＧ３．５と同様の結合アフィニティーを有する。さらに他の態様において、該抗体は、さらに、ＬＡＧ３．５（配列番号：１７および／または２０）の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、または別のＬＡＧ−３抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２を含んでもよく、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合することができる。他の態様において、本発明の抗体は、さらに、ＬＡＧ３．５（配列番号：１７および／または２０）の重鎖および／または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、または別のＬＡＧ−３抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域のＣＤＲ１を含んでもよく、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合することができる。
【００８０】
保存的修飾
他の態様において、本発明の抗体は、１つ以上の保存的修飾により、ＬＡＧ３．５のものと異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列の重鎖および／または軽鎖可変領域配列を含む。好ましい態様において、しかしながら、ＶＨＣＤＲ２の残基５４および５６は、それぞれ、アルギニンおよびセリンとして残る（すなわち、変異されない）。特定の保存的配列修飾は、抗原結合を取り除くことなく作ることができることが、当分野で理解されている。例えば、Brummellら (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildtら (1997) Prot. Eng. 10:835-41; Komissarovら (1997) J. Biol. Chem. 272:26864-26870; Hallら (1992) J. Immunol. 149:1605-12; Kelley and O'Connell (1993) Biochem. 32:6862-35; Adib-Conquyら (1998) Int. Immunol. 10:341-6およびBeersら (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43、参照。したがって、１つの態様において、抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域および／またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み：
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号：１５、および／または位置５４および５６以外でその保存的修飾を含み；そして／または
（ｂ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号：１７、およびその保存的修飾を含み；および／または
（ｃ）軽鎖可変領域ＣＤＲ１、および／またはＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列は、配列番号：１８、および／または、配列番号：１９および／または配列番号：２０、および／またはそれらの保存的修飾を含み；そして
（ｄ）抗体はヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する。
【００８１】
さらに、またはあるいは、抗体は、上記されている以下の１つ以上の機能特性、例えば、ヒトＬＡＧ−３への高アフィニティー結合、サルＬＡＧ−３への結合、マウスＬＡＧ−３への非結合、ＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を阻害する能力および／または抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する能力を有することができる。
【００８２】
種々の態様において、抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【００８３】
本明細書において使用される「保存的配列修飾」なる用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響しないか、または変化させないアミノ酸修飾を示すことを意図する。このような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、当分野で既知の標準技術、例えば、部位特異的突然変異およびＰＣＲ介在突然変異により本発明の抗体に導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族性側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基と置換されていてもよく、改変された抗体を本明細書に記載されている機能アッセイを使用して、維持されている機能（すなわち、上記の機能）に関して試験することができる。
【００８４】
操作および修飾された抗体
本発明の抗体は、修飾された抗体を操作するように、出発物質としてＬＡＧ３．５の１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列を有する抗体を使用して調製することができる。抗体を、１つまたは両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域および／または１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上の残基を修飾することにより操作することができる。さらに、または、あるいは、抗体を、例えば、抗体のエフェクター機能を改変するために、定常領域内の残基を修飾することにより操作することができる。
【００８５】
１つの態様において、ＣＤＲグラフティングは抗体の可変領域を操作するために使用することができる。抗体は、主として６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に存在するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列はＣＤＲ外の配列よりも個々の抗体間でさらに異なっている。ＣＤＲ配列がほとんどの抗体抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体のフレームワーク配列にグラフトされた特定の天然抗体のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmannら (1998) Nature 332:323-327; Jonesら (1986) Nature 321:522-525; Queenら (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; 米国特許第５，２２５，５３９；５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０号、参照）。
【００８６】
したがって、本発明の他の態様は、それぞれ配列番号：１５、１６、１７を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、および／または、それぞれ配列番号：１８、１９、２０を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（すなわち、ＬＡＧ３．５のＣＤＲ）を含む単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分に関する。これらの抗体はモノクローナル抗体ＬＡＧ３．５のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を含むが、異なるフレームワーク配列を含み得る。
【００８７】
このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列の抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは刊行されている文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列のＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列の配列データベース（インターネットwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで利用できる）、ならびにKabatら (1991), cited supra; Tomlinsonら (1992) “The Repertoire of Human Germline VH Sequence Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol. Biol. 227:776-798;およびCoxら (1994) “A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage” Eur. J. Immunol. 24:827-836（これらのそれぞれの内容を出典明示により本明細書に包含させる）において見出すことができる。他の例として、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子に関する生殖細胞系列のＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  データベースにおいて見出すことができる。例えば、ＨＣｏ７  ＨｕＭＡｂ  マウスにおいて見出される以下の重鎖生殖細胞系列配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセッションナンバー：１−６９（ＮＧ＿００１０１０９、ＮＴ＿０２４６３７  ＆  ＢＣ０７０３３３）、３−３３（ＮＧ＿００１０１０９  ＆  ＮＴ＿０２４６３７）および３−７（ＮＧ＿００１０１０９  ＆  ＮＴ＿０２４６３７）において利用することができる。他の例として、ＨＣｏ１２  ＨｕＭＡｂ  マウスにおいて見出される以下の重鎖生殖細胞系列配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセッションナンバー：１−６９（ＮＧ＿００１０１０９、ＮＴ＿０２４６３７  ＆  ＢＣ０７０３３３）、５−５１（ＮＧ＿００１０１０９  ＆  ＮＴ＿０２４６３７）、４−３４（ＮＧ＿００１０１０９  ＆  ＮＴ＿０２４６３７）、３−３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）＆３−２３（ＡＪ４０６６７８）において利用することができる。
【００８８】
抗体タンパク質配列は、当業者によく知られている、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（Altschulら (1997)、上記）と称される配列類似検索法の１つを使用して、コンパイルされたタンパク質配列データベースと比較される。
【００８９】
本発明の抗体における使用に好ましいフレームワーク配列は、本発明の選択された抗体により使用されるフレームワーク配列と構造的に類似のもの、例えば、本発明の好ましいモノクローナル抗体により使用されるＶＨ  ４−３４フレームワーク配列および／またはＶＫ  Ｌ６フレームワーク配列と類似のものである。ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにＶＫのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子において見出されたものと同一の配列を有するフレームワーク領域にグラフトすることができ、またはＣＤＲ配列を生殖細胞系列配列と比較して１つ以上の変異を含むフレームワーク領域にグラフトすることができる。例えば、ある場合において、抗体の抗原結合力を維持または強化するためにフレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが見出されている（例えば、米国特許第５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０号、参照）。
【００９０】
別種の可変領域修飾は、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域のアミノ酸残基の変異であり、それによって興味ある抗体の１つ以上の結合特性（例えば、アフィニティー）を改善する。部位特異的突然変異またはＰＣＲ介在突然変異を変異を導入するために実施することができ、抗体結合の作用または興味ある他の機能特性を本明細書および実施例に記載されているインビトロまたはインビボアッセイにおいて評価することができる。好ましくは保存的修飾（上記）を導入する。変異はアミノ酸の置換、付加または欠失であり得るが、好ましくは置換である。さらに、一般的にＣＤＲ領域内の最大１、２、３、４または５個の残基が改変される。
【００９１】
したがって、他の態様において、本発明は、（ａ）配列番号：１５、または配列番号：１５と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号：１６、または配列番号：１６と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲ２領域（好ましくは、位置５４および５６は、配列番号：１６と同じである）；（ｃ）配列番号：１７、または配列番号：１７と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲ３領域；を含む重鎖可変領域；（ｄ）配列番号：１８、または配列番号：１８と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲ１領域；（ｅ）配列番号：１９、または配列番号：１９と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲ２領域；および（ｆ）配列番号：２０、または配列番号：２０と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲ３領域を含む、単離された抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
【００９２】
本発明の操作された抗体は、修飾が、例えば、抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に行われたものを含む。一般的にこのようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を軽減するために行われる。例えば、１つのアプローチは１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列配列へと「復帰変異(backmutate)」させることである。さらに特に、体細胞変異がおこった抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体のフレームワーク配列と抗体が由来する生殖細胞系列配列を比較することにより同定することができる。
【００９３】
別種のフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的な免疫原性を減少させるために、フレームワーク領域内の、さらには１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基の変異を含む。このアプローチは、また、「脱免疫化(deimmunization)」として称され、米国特許公報第２００３０１５３０４３号においてさらに詳細に記載されている。
【００９４】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加え、または代替で、本発明の抗体は、一般的に１つ以上の抗体の機能特性、例えば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存細胞毒性を改変するために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作することができる。さらに、本発明の抗体は、再び１つ以上の抗体の機能特性を改変するために、化学的に修飾させるか（例えば、１つ以上の化学部分を抗体に結合させることができる）、またはそのグリコシル化を改変するために修飾させることができる。これらそれぞれの態様はさらに以下に詳細に記載されている。Ｆｃ領域における残基の番号付けはＫａｂａｔのＥＵ  ｉｎｄｅｘのものである。
【００９５】
好ましい態様において、抗体は、重鎖定常領域のヒンジ領域における位置２２８に対応する位置にてセリンからプロリンへの変異を含むＩｇＧ４アイソタイプ抗体である（Ｓ２２８Ｐ；ＥＵ  ｉｎｄｅｘ）。この変異は、ヒンジ領域における重鎖中のジスルフィド架橋の不均一性を破壊することが報告されている（Angalら, 上記；位置２４１はＫａｂａｔ番号制に基づく）。
【００９６】
１つの態様において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域のシステイン残基の数が改変、例えば、増加または減少されるように修飾される。このアプローチは、米国特許第５，６７７，４２５号においてさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の組み立てを促進するか、または抗体の安定性を増強または低下させるように改変される。
【００９７】
他の態様において、抗体の生体半減期を短縮するために、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させる。さらに特に、１つ以上のアミノ酸変異は、抗体が天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比較してブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合を損なうように、Ｆｃ−ヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域に導入される。このアプローチは米国特許第６，１６５，７４５号においてさらに詳細に記載されている。
【００９８】
他の態様において、生体半減期を延長するために、抗体を修飾する。種々のアプローチが可能である。例えば、米国特許第６，２７７，３７５号に記載されているとおり、１つ以上の以下の変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆを導入することができる。あるいは、生体半減期を延長するため、抗体は、米国特許第５，８６９，０４６および６，１２１，０２２号に記載されているとおり、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取ったサルベージ受容体結合エピトープを含むように、ＣＨ１またはＣＬ領域内で改変され得る。
【００９９】
さらに他の態様において、抗体のエフェクター機能を改変するために、Ｆｃ領域は、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることにより改変される。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対する改変されたアフィニティーを有するが、親抗体の抗原結合力を維持するように、異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。アフィニティーが改変されているエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは米国特許第５，６２４，８２１および５，６４８，２６０においてさらに詳細に記載されている。
【０１００】
他の態様において、抗体がＣ１ｑ結合を改変され、そして／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を減少または排除するように、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基により置き換えることができる。このアプローチは米国特許第６，１９４，５５１号においてさらに詳細に記載されている。
【０１０１】
他の態様において、アミノ酸位置２３１および２３９内の１つ以上のアミノ酸残基を改変し、それによって抗体が補体を固定する能力を改変する。このアプローチはＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１においてさらに詳細に記載されている。
【０１０２】
さらに他の態様において、Ｆｃ領域は、抗体が抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介在する能力を増強するため、および／または抗体のＦｃγ受容体に対するアフィニティーを増強するために、以下の位置：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９の１つ以上のアミノ酸を修飾することにより修飾される。このアプローチはＰＣＴ公開ＷＯ００／４２０７２においてさらに詳細に記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上のＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対する結合部位がマッピングされており、改良された結合を有する変異体が記載されている（Shieldsら (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604、参照）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９における特異的変異はＦｃγＲＩＩＩへの結合を改良するために示された。さらに、以下の組合せ変異：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４ＡがＦｃγＲＩＩＩ結合を改良することを示された。
【０１０３】
さらに別の態様において、抗体のグリコシル化は修飾される。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、抗体がグリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、抗体の抗原に対するアフィニティーを増強するために改変することができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内でグリコシル化の１つ以上の部位を改変することにより達成することができる。例えば、１つ以上のアミノ酸置換は、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらし、それによってその部位のグリコシル化を排除するように行うことができる。このような非グリコシル化は抗体の抗原に対するアフィニティーを増強し得る。例えば、米国特許第５，７１４，３５０および６，３５０，８６１号、参照。
【０１０４】
さらに、またはあるいは、抗体は、改変された型のグリコシル化を有する抗体、例えば、少ない量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体または増加したバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体を製造することができる。このような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増強することが証明されている。このような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現することにより達成することができる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、当分野で報告されており、本発明の組換え抗体を発現する宿主細胞として使用し、それによって改変されたグリコシル化を有する抗体を生産することができる。例えば、細胞系Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９はフコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８（α（１，６）−フコシルトランスフェラーゼ）を欠いており、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９細胞系において発現された抗体は炭水化物においてフコースを欠いている。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９  ＦＵＴ８−／−細胞系は、２つの置換ベクターを使用して、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的化破壊により創造した（米国特許公開第２００４０１１０７０４号およびYamane-Ohnukiら (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22、参照）。他の例として、ＥＰ１，１７６，１９５は、このような細胞系において発現した抗体がα−１，６結合−関連酵素を減少させるか、または除去することにより低フコシル化を示すような、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を機能的に破壊されている細胞系を記載している。ＥＰ１，１７６，１９５は、また、抗体のＦｃ領域に結合するか、または酵素活性を有さない、フコースのＮ−アセチルグルコサミンへの付加に関して低い酵素活性を有する細胞系、例えば、ラット骨髄腫細胞系ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２）を記載している。ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５は、フコースがＡｓｎ（２９７）連結炭水化物に結合する能力を減少させ、また、宿主細胞において発現された抗体の低フコシル化を引き起こす、変異ＣＨＯ細胞系であるＬｅｃｌ３細胞を記載している（Shieldsら (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照）。修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、また、ＰＣＴ公開ＷＯ０６／０８９２３１に記載されているとおり、ニワトリ卵において生産することができる。あるいは、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、植物細胞、例えば、Ｌｅｍｎａにおいて生産することができる。植物系における抗体の生産のための方法は、２００６年８月１１日に出願されたＡｌｓｔｏｎ  ＆  Ｂｉｒｄ  ＬＬＰ  代理人整理番号０４０９８９／３１４９１１に対応する米国特許出願に記載されている。ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２は、操作された細胞系において発現された抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増強を引き起こすバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞系を記載している（Umanaら (1999) Nat. Biotech. 17:176-180も参照）。あるいは、フコシダーゼ酵素を使用して、抗体のフコース残基を開裂させることができる；例えば、フコシダーゼであるα−Ｌ−フコシダーゼは抗体からフコシル残基を除去する（Tarentinoら (1975) Biochem. 14:5516-23）。
【０１０５】
本発明により考慮される本明細書の抗体のさらなる修飾はペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生体（例えば、血清）半減期を延長するためにペグ化することができる。抗体をペグ化するために、抗体またはそのフラグメントは、一般的にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１つ以上のＰＥＧ部分が抗体または抗体フラグメントに結合するようになる条件下で反応させる。好ましくは、ペグ化は反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）でのアシル化反応またはアルキル化反応により実施される。本明細書において使用される「ポリエチレングリコール」なる用語は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの全ての形態を包含することを意図する。１つの態様において、ペグ化される抗体は非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当分野で既知であり、本発明の抗体に適用することができる。例えば、ＥＰ０１５４３１６およびＥＰ０４０１３８４、参照。
【０１０６】
抗体の物理的特性
本発明の抗体は、異なるクラスを検出および／または区別するために、種々の物理的特性により特徴付けることができる。
【０１０７】
例えば、抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかにおいて１つ以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、抗体の免疫原性の増加または改変された抗原結合による抗体のｐＫの改変をもたらし得る（Marshallら (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallickら (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekhら (1985) Nature 316:452-7; Mimuraら (2000) Mol Immunol 37:697-706）。グリコシル化はＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフにおいて起こることが知られている。場合によっては、可変領域グリコシル化を含まない抗ＬＡＧ−３抗体を有することが好ましい。これは、可変領域においてグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択するか、またはグリコシル化領域内の残基を変異することのいずれかにより達成することができる。
【０１０８】
好ましい態様において、抗体はアスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンの脱アミドは、Ｎ−ＧまたはＤ−Ｇ配列で起こり得、ポリペプチド鎖へねじれを導入し、安定性を減少させる（イソアスパラギン酸効果）イソアスパラギン酸残基の創造をもたらす。
【０１０９】
それぞれの抗体は、特有の等電点（ｐＩ）を有し、一般的に６から９．５のｐＨ範囲内である。ＩｇＧ１抗体におけるｐＩは一般的に７−９．５のｐＨ範囲内であり、ＩｇＧ４抗体におけるｐＩは一般的に６−８のｐＨ範囲内である。正常範囲外のｐＩにて抗体がインビボ条件下においていくつかのアンフォールディングおよび不安定性を有し得ることが推測されている。したがって、正常範囲内であるｐＩ値を含む抗ＬＡＧ−３抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲内のｐＩを有する抗体を選択すること、または荷電表面残基を変異させることのいずれかにより達成することができる。
【０１１０】
本発明の抗体をコードする核酸分子
他の局面において、本発明は、本発明の抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域、またはＣＤＲをコードする核酸分子を提供する。核酸は、完全な細胞で、細胞溶解物で、または部分的に精製された、もしくは実質的に純粋な形態で存在してよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌ結合、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動およびその他当分野で既知の技術を含む標準技術により、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば、他の細胞性核酸またはタンパク質から精製されたとき、「単離された」または「実質的に純粋」である。Ausubelら, ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York、参照。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、イントロン配列を含んでいても含まなくてもよい。好ましい態様において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【０１１１】
本発明の核酸は標準分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに記載しているとおりのヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）により発現された抗体に関して、ハイブリドーマにより作製された抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）得られた抗体に関して、このような抗体をコードする核酸は遺伝子ライブラリーから回収することができる。
【０１１２】
好ましい本発明の核酸分子は、ＬＡＧ３．５モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列（それぞれ配列番号：１２および１４）またはＣＤＲをコードするものを含む。ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたとき、これらのＤＮＡフラグメントは、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準組換えＤＮＡ技術によりさらに操作することができる。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡフラグメントは、他のタンパク質、例えば、抗体定常領域もしくはフレキシブルなリンカーをコードする他のＤＮＡフラグメントに作動可能に連結されている。この文脈において使用されるとき「作動可能に連結」なる用語は、２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がフレーム内に残るように、２つのＤＮＡフラグメントが連結されることを意味することを意図する。
【０１１３】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする他のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で既知であり（例えば、Kabatら (1991)、上記）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であり得るが、より好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子に関して、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする他のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。
【０１１４】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを軽鎖定常領域ＣＬをコードする他のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で既知であり（例えば、Kabatら、上記）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。好ましい態様において、軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域であり得る。
【０１１５】
ｓｃＦｖ遺伝子を創造するため、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡフラグメントは、フレキシブルなリンカーにより連結されたＶＬおよびＶＨ領域を有するＶＨおよびＶＬ配列が連続する一本鎖タンパク質として発現することができるように、フレキシブルリンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号：２８）をコードする他のフラグメントに作動可能に連結される（例えば、Birdら (1988) Science 242:423-426; Hustonら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCaffertyら, (1990) Nature 348:552-554、参照）。
【０１１６】
本発明のモノクローナル抗体の生産
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495の標準体細胞ハイブリダイゼーション（ハイブリドーマ）技術を使用して、生産することができる。モノクローナル抗体を生産するための他の態様は、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換およびファージディスプレイ技術を含む。キメラまたはヒト化抗体も当分野で知られている。例えば、米国特許第４，８１６，５６７；５，２２５，５３９；５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０、参照（これらの内容を出典明示によりその全体を明確に本明細書に包含させる）。
【０１１７】
好ましい態様において、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ヒトＬＡＧ−３に対するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりむしろヒト免疫系の一部を有するトランスジェニックされた、または染色体導入されたマウスを使用して産生することができる。これらのトランスジェニックされた、または染色体導入されたマウスは、本明細書において各々ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）およびＫＭマウス（登録商標）と称されるマウスを含み、本明細書において「ヒトＩｇマウス」と総称される。
【０１１８】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Medarex(登録商標), Inc.）は、内因性μおよびκ鎖座を不活性化する標的変異とともに、非再配置ヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座(miniloci)を含む（例えば、Lonbergら (1994) Nature 368(6474): 856-859、参照）。したがって、マウスはマウスＩｇＭまたはκの発現低下を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子がクラス切り換えと体細胞変異を受け、高アフィニティーヒトＩｇＧκモノクローナルを産生する（Lonbergら (1994)、上記; Lonberg (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93およびHarding and Lonberg (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546）。ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）の調製および使用ならびにこのようなマウスによって運ばれるゲノム修飾は、さらにTaylorら (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chenら (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillonら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choiら (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chenら (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillonら (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylorら (1994) International Immunology 6: 579-591;およびFishwildら (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851に記載されている（これらの全ての内容を出典明示によりその全体を明確に本明細書に包含させる）。さらに、米国特許第５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，７８９，６５０；５，８７７，３９７；５，６６１，０１６；５，８１４，３１８；５，８７４，２９９；５，７７０，４２９；および５，５４５，８０７号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０３９１８；ＷＯ９３／１２２２７；ＷＯ９４／２５５８５；ＷＯ９７／１３８５２；ＷＯ９８／２４８８４；ＷＯ９９／４５９６２およびＷＯ０１／１４４２４（これらの内容を出典明示によりその全体を本明細書に包含させる）。
【０１１９】
他の態様において、本発明のヒト抗体は、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を有するマウス、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を有するマウスを使用して調製することができる。「ＫＭマウス（登録商標）」として本明細書で称されるこのマウスは、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８において詳細に記載されている。内因性ＦｃγＲＩＩＢ受容体遺伝子のホモ接合体の破壊をさらに含むこのマウスの修飾された形態も、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に記載されており、「ＫＭ／ＦＣＧＲ２Ｄマウス（登録商標）」と称されている。加えて、ＨＣｏ７もしくはＨＣｏ１２重鎖導入遺伝子のいずれか、またはその両方を有するマウスを使用することができる。
【０１２０】
さらなるトランスジェニック動物の態様は、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅを含む（Abgenix, Inc.、米国特許第５，９３９，５９８；６，０７５，１８１；６，１１４，５９８；６，１５０，５８４および６，１６２，９６３号）。さらなる態様は、「ＴＣマウス」（Tomizukaら (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727）およびヒト重鎖および軽鎖導入染色体を有するウシ（Kuroiwaら (2002) Nature Biotechnology 20:889-894；ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９２８１２）を含む。これらの特許および刊行物の内容を出典明示によりその全体を明確に本明細書に包含させる。
【０１２１】
１つの態様において、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ方法を使用して調製される。例えば、米国特許第５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５８０，７１７；５，９６９，１０８；６，１７２，１９７；５，８８５，７９３；６，５２１，４０４；６，５４４，７３１；６，５５５，３１３；６，５８２，９１５；および６，５９３，０８１号、参照（これらの内容を出典明示によりその全体を本明細書に包含させる）。
【０１２２】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体応答が免疫化で産生され得るように、ヒト免疫細胞を再構成したＳＣＩＤマウスを使用して調製することもできる。例えば、米国特許第５，４７６，９９６および５，６９８，７６７号、参照（これらの内容を出典明示によりその全体を本明細書に包含させる）。
【０１２３】
他の態様において、ヒト抗ＬＡＧ−３抗体は、ファージがＬＡＧ−３であらかじめ免疫化されたトランスジェニック動物において産生される抗体をコードする核酸を含む、ファージディスプレイを使用して調製される。好ましい態様において、トランスジェニック動物はＨｕＭａｂ、ＫＭまたはＫｉｒｉｎマウスである。例えば、米国特許第６，７９４，１３２号、参照（この内容を出典明示によりその全体を本明細書に包含させる）。
【０１２４】
ヒトＩｇマウスの免疫化
本発明の１つの態様において、ヒトＩｇマウスは、ＬＡＧ−３抗原、組換えＬＡＧ−３タンパク質またはＬＡＧ−３タンパク質を発現する細胞の精製または濃縮された調製物にて免疫化される。例えば、Lonbergら (1994)、上記; Fishwildら (1996)、上記；ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８８４またはＷＯ０１／１４４２４、参照（これらの内容を出典明示によりその全体を本明細書に包含させる）。好ましい態様において、６−１６週齢マウスを５−５０μｇのＬＡＧ−３タンパク質にて免疫化する。あるいは、非−ＬＡＧ−３ポリペプチドに融合したＬＡＧ−３の部分を使用する。
【０１２５】
１つの態様において、トランスジェニックマウスを、完全フロイントアジュバント中のＬＡＧ−３抗原を腹腔内（ＩＰ）または静脈内（ＩＶ）投与により免疫化させ、次に、不完全フロイントアジュバント中の抗原をＩＰまたはＩＶ免疫化させる。他の態様において、フロイント以外のアジュバントまたはアジュバントの非存在下で全細胞を使用する。血漿をＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、十分な力価の抗ＬＡＧ−３ヒト免疫グロブリンを有するマウス由来の細胞を融合のために使用することができる。
【０１２６】
本発明のヒトモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの調製
本発明のヒトモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを調製するため、免疫マウスから脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、適当な不死化細胞系、例えば、マウス骨髄腫細胞系に融合することができる。得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の生成に関してスクリーニングすることができる。ハイブリドーマの作製は当分野で知られている。例えば、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York、参照。
【０１２７】
本発明のモノクローナル抗体を生産するトランスフェクトーマの調製
本発明の抗体はまた、例えば、当分野で既知である組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組合せを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて調製することができる（例えば、Morrison, S. (1985) Science 229:1202）。１つの態様において、標準分子生物学技術により得られる部分的または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写および翻訳調節配列に作動可能に連結されるように、１つ以上の発現ベクターに挿入される。これに関して、「作動可能に連結」なる用語は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳コントロール配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する意図された機能を果たすように、ベクターに結合されることを意味することを意図する。
【０１２８】
「調節配列」なる用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳をコントロールするプロモーター、エンハンサーおよび他の発現コントロールエレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)）に記載されている。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列は、哺乳動物細胞における高レベルタンパク質発現を指示するウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびパピローマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。あるいは、非ウイルス調節配列は、例えば、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターを使用され得る。なおさらに、調節エレメントは、ＳＶ４０初期プロモーターおよびヒト１型Ｔ細胞白血病ウイルスの長い末端反復配列からの配列を含む異なる源からの配列、例えば、ＳＲαプロモーター系を含む（Takebeら (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472）。発現ベクターおよび発現コントロール配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。
【０１２９】
抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、同じ、または異なる発現ベクターに挿入することができる。好ましい態様において、可変領域は、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントと作動可能に連結し、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントと作動可能に連結するように、所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクターに可変領域を挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を創造するために使用される。さらに、またはあるいは、組換え発現ベクターは、宿主細胞から抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドがインフレームにおいて抗体鎖遺伝子のアミノ末端に連結するように、ベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
【０１３０】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製開始点）および選択マーカー遺伝子を有し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが挿入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６；４，６３４，６６５および５，１７９，０１７号、参照）。例えば、一般的に、選択マーカー遺伝子は、ベクターが挿入されている宿主細胞において薬物、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートに対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞中で使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８の選択のため）を含む。
【０１３１】
軽鎖および重鎖の発現のため、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを、標準技術により宿主細胞にトランスフェクトする。「トランスフェクション」なる用語の種々の形態は、外来ＤＮＡを原核生物または真核生物宿主細胞に導入するために一般的に使用されている広範な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを含むことを意図する。原核生物または真核生物宿主細胞のいずれにおいても本発明の抗体を発現させることは理論上可能であるが、真核細胞、特に哺乳動物細胞が、原核細胞よりも適当に折りたたまれた免疫学的に活性な抗体をアッセンブルおよび分泌しやすいため、真核細胞、より好ましくは哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が非常に好ましい。
【０１３２】
本発明の組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621に記載されているようなＤＨＦＲ選択可能マーカーと使用されるUrlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されているｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞の使用に関して、さらなる好ましい発現系はＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８，８４１に記載されているＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入するとき、宿主細胞中で抗体の発現、または、より好ましくは、宿主細胞を増殖させる培養培地中への抗体の分泌を可能にする十分な時間、宿主細胞を培養することにより抗体を生産する。抗体は標準タンパク質精製法を使用して培養培地から回収することができる。
【０１３３】
免疫複合体
本発明の抗体は、免疫複合体、例えば、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するために治療剤とコンジュゲートさせることができる。適当な治療剤は、代謝拮抗剤、アルキル化剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核外輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩもしくはＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質および抗有糸分裂剤を含む。ＡＤＣにおいて、抗体および治療剤は、好ましくは、開裂可能なリンカー、例えば、ペプチジル、ジスルフィドまたはヒドラゾンリンカーを介してコンジュゲートされる。さらに好ましくは、リンカーは、ペプチジルリンカー、例えば、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（配列番号：３９）、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、ＳｅｒまたはＧｌｕである。ＡＤＣは、米国特許第７，０８７，６００；６，９８９，４５２；および７，１２９，２６１号；ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９６９１０；ＷＯ０７／０３８６５８；ＷＯ０７／０５１０８１；ＷＯ０７／０５９４０４；ＷＯ０８／０８３３１２；およびＷＯ０８／１０３６９３；米国特許公開２００６００２４３１７；２００６０００４０８１；および２００６０２４７２９５に記載されているとおりに製造することができる（これらの記載を出典明示により本明細書に包含させる）。
【０１３４】
二重特異性分子
他の局面において、本発明は、少なくとも１つの他の機能分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する他の抗体またはリガンド）と連結している本発明の１つ以上の抗体を含む二重特異性分子を特徴とし、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を産生する。したがって、本明細書において使用される「二重特異性分子」は３つ以上の特異性を有する分子を含む。好ましい態様において、二重特異性分子は、ＬＡＧ−３に対する第１の結合特異性およびＬＡＧ−３を発現する標的細胞を殺すことができる細胞毒性エフェクター細胞を補充するトリガー分子に対する第２の結合特異性を含む。適当なトリガー分子の例はＣＤ６４、ＣＤ８９、ＣＤ１６およびＣＤ３である。例えば、Kuferら, TRENDS in Biotechnology, 22 (5), 238-244 (2004)、参照。
【０１３５】
１つの態様において、二重特異性分子は、抗−Ｆｃ結合特異性および抗−ＬＡＧ−３結合特異性に加えて、第３の特異性を有する。第３の特異性は、抗増強因子(anti-enhancement factor)（ＥＦ）、例えば、細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合し、それにより標的細胞に対する免疫応答を増加させる分子に対してであり得る。例えば、抗増強因子は、細胞毒性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０またはＩＣＡＭ−１を介して）または他の免疫細胞に結合し、標的細胞に対する免疫応答を増加させることができる。
【０１３６】
二重特異性分子は多数の異なる形式およびサイズであり得る。粒径スペクトルの一方において、二重特異性分子は、同一の特異性の２つの結合アームを有する代わりに、それぞれ異なる特異性を有する２つの結合アームを有することを除いては伝統的な抗体形式を維持している。他方において、ペプチド鎖により連結した２つの一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ’ｓ）、いわゆるＢｓ（ｓｃＦｖ）２構築物からなる二重特異性分子である。中間サイズの二重特異性分子は、ペプチジルリンカーにより連結した２つの異なるＦ（ａｂ）フラグメントを含む。これらの二重特異性分子および他の形式は、遺伝子工学、体細胞ハイブリダイゼーションまたは化学的手法により調製することができる。例えば、Kuferら, 上記; Cao and Suresh, Bioconjugate Chemistry, 9 (6), 635-644 (1998);およびvan Sprielら, Immunology Today, 21 (8), 391-397 (2000)、参照（本明細書に記載されている）。
【０１３７】
医薬組成物
他の局面において、本明細書は、製剤化された１つ以上の本発明の抗体を薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物を提供する。該組成物は、所望により１つ以上のさらなる薬学的に活性な成分、例えば、別の抗体または薬物を含んでもよい。本発明の医薬組成物はまた、抗ＬＡＧ−３抗体がワクチンに対する免疫応答を増強するように、例えば、他の免疫刺激剤、抗癌剤、抗ウイルス剤またはワクチンと併用療法において投与することができる。
【０１３８】
医薬組成物はあらゆる賦形剤を含み得る。使用することができる賦形剤は、担体、界面活性剤、増粘剤または乳化剤、固体結合剤、分散もしくは懸濁補助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング剤、崩壊剤、滑剤、甘味剤、防腐剤、等張剤およびそれらの組合せを含む。適当な賦形剤の選択および使用は、Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)（この記載は出典明示により本明細書に包含させる）に教示されている。
【０１３９】
好ましくは、該医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適当である。投与経路に依存して、活性な化合物は、不活性にし得る酸の作用および他の天然条件から保護するために物質に覆われていてもよい。本明細書において使用されるフレーズ「非経口投与」は、経腸および局所投与以外の通常注射による投与方式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含むが、これらに限定されない。あるいは、本発明の抗体は、非経口以外(non-parenteral)の経路、例えば、局所、表皮または粘膜投与経路により、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所的に投与され得る。
【０１４０】
本発明の医薬組成物は薬学的に許容される塩を含み得る。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を維持するが、望ましくない毒性作用を付与しない塩を示す。このような塩の例は酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、無毒性の無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸など、ならびに無毒性の有機酸、例えば、脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などに由来するものを含む。塩基付加塩は、アルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど、ならびに無毒性の有機アミン、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどに由来するものを含む。
【０１４１】
医薬組成物は滅菌水溶液または分散媒の形態であり得る。それらは、また、マイクロエマルジョン、リポソームまたはその他の高濃度の薬物に適した秩序構造において製剤化され得る。
【０１４２】
単一投与形態を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される対象および特定の投与様式に依存して変化し、一般的に治療効果を引き起こす組成物の量である。一般的に、１００％のうち、この量は薬学的に許容される担体と組み合わせて、活性成分の約０．０１％から約９９％、好ましくは約０．１％から約７０％、さらに好ましくは約１％から約３０％の範囲である。
【０１４３】
投与レジメンは所望の最適応答（例えば、治療応答）を提供するために調節される。例えば、単回ボーラスで投与してもよく、経時的に数回の分割投与で投与してもよく、または治療状況の緊急性により指示されるとき、比例的に用量を減少または増加してもよい。とりわけ、投与の容易性および投与量の均一性のため、非経口組成物を投与単位形態で製剤化することが有利である。本明細書において使用される投与単位形態は、処置される対象に対する単位用量として適した物理的に分離した単位を示し；それぞれの単位は必要な医薬担体と一緒に所望の治療効果を引き起こすように計算されたあらかじめ決められた量の活性化合物を含む。あるいは、頻繁な投与があまり必要でない場合、抗体は持続放出製剤として投与することができる。
【０１４４】
抗体の投与に関して、用量は約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、さらに通常、０．０１から５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。例えば、用量は０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重または１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。典型的な処置レジメンは１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１月に１回、３月に１回または３から６月に１回の投与を必要とする。本発明の抗ＬＡＧ−３抗体のための好ましい投与レジメンは、静脈内投与による１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、抗体を下記投与スケジュール：（ｉ）４週間ごとに６回投与、次に３月ごと；（ｉｉ）３週間ごと；（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、次に３週間ごとに１ｍｇ／ｋｇ体重の１つを使用して与える。いくつかの方法において、用量は約１−１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するように調節され、いくつかの方法において約２５−３００μｇ／ｍｌである。
【０１４５】
本発明の抗ＬＡＧ−３抗体の「治療有効量」は、好ましくは疾患症状の重症度の減少、疾患症状の無症状期間の頻度および持続時間の増加、または病気の苦痛に起因する欠陥または障害の阻止をもたらすものである。例えば、腫瘍を有する対象の処置に関して、「治療有効量」は、未処置の対象と比較して、好ましくは腫瘍増殖を少なくとも約２０％、さらに好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％阻害する。治療有効量の治療化合物は、腫瘍サイズを減少させるか、または一般的にヒトもしくは他の哺乳動物である対象における症状を改善することができる。
【０１４６】
医薬組成物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤であり得る。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978、参照。
【０１４７】
治療組成物は、医療デバイス、例えば、（１）無針皮下注射デバイス（例えば、ＵＳ５，３９９，１６３；５，３８３，８５１；５，３１２，３３５；５，０６４，４１３；４，９４１，８８０；４，７９０，８２４；および４，５９６，５５６）；（２）微小注入ポンプ（ＵＳ４，４８７，６０３）；（３）経皮デバイス（ＵＳ４，４８６，１９４）；（４）注入装置（ＵＳ４，４４７，２３３および４，４４７，２２４）；および（５）浸透デバイス（ＵＳ４，４３９，１９６および４，４７５，１９６）；（これらの文献は出典明示により本明細書に包含される）を介して投与することができる。
【０１４８】
１つの態様において、本発明のヒトモノクローナル抗体は、インビボで適切な分布を確実にするため製剤化することができる。例えば、本発明の治療化合物が血液脳関門を通過することを確実にするため、それらはリポソーム中で製剤化することができ、これはさらに特定の細胞または臓器への選択的輸送を増強するための標的分子を含み得る。例えばＵＳ４，５２２，８１１；５，３７４，５４８；５，４１６，０１６；および５，３９９，３３１；V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685; Umezawaら, (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloemanら (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owaisら (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoeら (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreierら (1994) J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; およびKillion and Fidler (1994) Immunomethods 4:273、参照。
【０１４９】
本発明の使用および方法
本発明の抗体（組成物、二重特異性および免疫複合体）は、例えば、ＬＡＧ−３の検出またはＬＡＧ−３の遮断(Blockade)による免疫応答の増強に関する、多数のインビトロおよびインビボにおける有用性を有する。好ましい態様において、抗体はヒト抗体である。このような抗体は、種々の状態における免疫を増強するために、インビトロまたはエキソビボにおいて培養中の細胞、または、例えば、インビボにおいてヒト対象に投与することができる。したがって、１つの局面において、本発明は、対象における免疫応答が修飾されるように、本発明の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を修飾する方法を提供する。好ましくは、応答は増強されるか、刺激されるか、または上方制御される。
【０１５０】
好ましい対象は、免疫応答の増強の必要なヒト患者を含む。方法は、免疫応答（例えば、Ｔ細胞介在免疫応答）を増加させることにより処置することができる障害を有するヒト患者を処置するために特に適当である。特定の態様において、方法はインビボにおける癌の処置に特に適当である。免疫の抗原特異的増強を達成するために、抗ＬＡＧ−３抗体を興味ある抗原と共に投与するか、または抗原がすでに処置される対象（例えば、腫瘍を有するか、またはウイルスを有する対象）に存在する。ＬＡＧ−３に対する抗体を別の薬剤と共に投与するとき、その２つは順にまたは同時にのいずれかで投与することができる。
【０１５１】
本発明は、さらに、抗体またはその部分とヒトＬＡＧ−３の複合体の形成を可能にする条件下で、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分とサンプルおよびコントロールサンプルを接触させることを含む、サンプルにおけるヒトＬＡＧ−３抗原の存在を検出するか、またはヒトＬＡＧ−３抗原の量を測定するための方法を提供する。次に複合体の形成を検出する（コントロールサンプルと比較して、サンプル間の複合体形成の違いがサンプルにおけるヒトＬＡＧ−３抗原の存在を示す）。さらに、本発明の抗ＬＡＧ−３抗体は、イムノアフィニティー精製を介して、ヒトＬＡＧ−３を精製するために使用することができる。
【０１５２】
ＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を阻害し、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する、本発明の抗ＬＡＧ−３抗体の能力を考慮すると、本発明は、また、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するか、増強するか、または上方制御するために、インビトロまたはインビボにて本発明の抗体を使用する方法を提供する。例えば、本発明は、抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるように、該Ｔ細胞を本発明の抗体と接触させることを含む、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法を提供する。抗原特異的Ｔ細胞応答の適当なあらゆる指標が、抗原特異的Ｔ細胞応答を測定するために使用することができる。このような適当な指標の非限定的な例は、抗体の存在下におけるＴ細胞増殖の増加および／または抗体の存在下におけるサイトカイン生産の増加を含む。好ましい態様において、抗原特異的Ｔ細胞によるインターロイキン−２生産が刺激される。
【０１５３】
本発明はまた、対象における免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）が刺激されるように、本発明の抗体を対象に投与することを含む、対象における免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を刺激するための方法を提供する。好ましい態様において、対象は腫瘍を有する対象であり、腫瘍に対する免疫応答が刺激される。他の好ましい態様において、対象はウイルスを有する対象であり、ウイルスに対する免疫応答が刺激される。
【０１５４】
他の態様において、本発明は、腫瘍の増殖を対象において阻害するように、本発明の抗体を対象に投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。さらに他の態様において、本発明は、ウイルス感染を対象において処置するように、本発明の抗体を対象に投与することを含む、対象におけるウイルス感染を処置するための方法を提供する。
【０１５５】
本発明のこれらの方法および他の方法は、以下にさらに詳細に記載されている。
【０１５６】
癌
抗体によるＬＡＧ−３の遮断は、患者における癌細胞に対する免疫応答を増強することができる。１つの局面において、本発明は、癌性腫瘍の増殖が阻害されるように、抗ＬＡＧ−３抗体を使用するインビボにおける対象の処置に関する。抗ＬＡＧ−３抗体は、癌性腫瘍の増殖を阻害するために単独で使用することができる。あるいは、抗ＬＡＧ−３抗体は、以下に記載されているように、他の免疫原、標準癌処置または他の抗体と共に使用することができる。
【０１５７】
したがって、１つの態様において、本発明は、治療有効量の抗ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。好ましくは、抗体はヒト抗ＬＡＧ−３抗体（本明細書に記載されているヒト抗−ヒトＬＡＧ−３抗体のいずれかのような）である。さらに、またはあるいは、抗体はキメラまたはヒト化抗ＬＡＧ−３抗体であり得る。
【０１５８】
本発明の抗体を使用して増殖が阻害され得る好ましい癌は、一般的に免疫療法に応答する癌を含む。処置のために好ましい癌の非限定的な例は、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば、明細胞癌腫）、前立腺癌（例えば、ホルモン抵抗性前立腺癌）、乳癌、大腸癌および肺癌（例えば、非小細胞性肺癌）を含む。さらに、本発明は、本発明の抗体を使用して増殖が阻害され得る難治性または再発性悪性腫瘍を含む。
【０１５９】
本発明の方法を使用して処置することができる他の癌の例は、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸の癌腫、腟の癌腫、外陰の癌腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病を含む慢性または急性白血病、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱の癌、腎臓または尿管の癌、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘導される癌を含む環境的に誘導される癌、および前記癌の組合せを含む。本発明はまた、転移性癌、とりわけＰＤ−Ｌ１を発現する転移性癌の処置に有用である（Iwaiら (2005) Int. Immunol. 17:133-144）。
【０１６０】
所望により、ＬＡＧ−３に対する抗体は、免疫原、例えば、癌細胞、精製された腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む）、細胞および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞（Heら (2004) J. Immunol. 173:4919-28）と組み合わせることができる。使用することができる腫瘍ワクチンの非限定的な例は、黒色腫抗原のペプチド、例えば、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチド、またはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞（以下にさらに記載されている）を含む。
【０１６１】
ヒトにおいて、いくつかの腫瘍、例えば、黒色腫は免疫原性であることが示されている。ＬＡＧ−３遮断によるＴ細胞活性化の閾値を上げることにより、宿主における腫瘍応答を活性化させることができる。
【０１６２】
ＬＡＧ−３遮断は、ワクチンプロトコールと組み合わされたとき、さらに有効である可能性がある。腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験的戦略が考案されている（Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738、参照;Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 in DeVitaら (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Editionも参照。）。これらの戦略の１つにおいて、ワクチンは自己または同種異系の腫瘍細胞を使用して調製される。これらの細胞ワクチンは、ＧＭ−ＣＳＦを発現するように腫瘍細胞に形質導入されるとき、さらに有効であることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種に対する抗原提示の強力な活性化因子であることが示されている（Dranoffら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 90: 3539-43）。
【０１６３】
種々の腫瘍における遺伝子発現および大規模な遺伝子発現パターンの研究により、いわゆる腫瘍特異的抗原が定義された（Rosenberg, SA (1999) Immunity 10: 281-7）。多数の場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍および腫瘍が発生した細胞において発現される分化抗原、例えば、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原およびＴｒｐ−２である。より重要なことには、これらの多数の抗原は、宿主において見られる腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であることを示すことができる。ＬＡＧ−３遮断は、これらのタンパク質に対する免疫応答を発生させるために、腫瘍において発現される組換えタンパク質および／またはペプチドの回収物と共に使用することができる。これらのタンパク質は、通常、免疫系により自己抗原として見られ、したがって、それらに対して寛容性である。腫瘍抗原は、染色体のテロメアの合成のために必要であり、ヒトの癌の８５％以上および非常に限定された体細胞組織において発現される、タンパク質テロメラーゼを含むことができる（Kimら (1994) Science 266: 2011-2013）。（これらの体細胞組織は、種々の手段により免疫攻撃から保護され得る）。腫瘍抗原はまた、タンパク質配列を改変するか、または２つの無関係な配列（すなわち、フィラデルフィア染色体におけるｂｃｒ−ａｂｌ）間の融合タンパク質を創造する体細胞変異による癌細胞において発現される「新(neo)抗原」、またはＢ細胞腫瘍由来のイディオタイプであり得る。
【０１６４】
他の腫瘍ワクチンは、ヒト癌に関与するウイルス、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）およびカポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ）由来のタンパク質を含み得る。ＬＡＧ−３遮断と共に使用され得る腫瘍特異的抗原の他の形態は、腫瘍組織それ自体から単離された精製された熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）である。これらの熱ショックタンパク質は腫瘍細胞由来のタンパク質のフラグメントを含み、これらのＨＳＰは腫瘍免疫を誘発するための抗原提示細胞への送達において非常に効率的である（Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamuraら (1997) Science 278:117-120）。
【０１６５】
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答を起こすために使用され得る強力な抗原提示細胞である。ＤＣを、エキソビボにおいて生産し、種々のタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物で充填することができる（Nestleら (1998) Nature Medicine 4: 328-332）。ＤＣは、また、遺伝的手段により形質導入され、これらの腫瘍抗原を同様に発現することができる。ＤＣは、また、免疫化の目的のために、腫瘍細胞に直接融合されている（Kuglerら (2000) Nature Medicine 6:332-336）。ワクチン接種の方法として、ＤＣ免疫化は、ＬＡＧ−３遮断と有効に組み合わせて、さらに強力な抗腫瘍応答を活性化することができる。
【０１６６】
ＬＡＧ−３遮断はまた、標準癌処置と組み合わせられ得る。ＬＡＧ−３遮断は、化学療法レジメンと有効に組み合わせられ得る。これらの場合、投与される化学療法剤の用量を減少させることができる可能性がある（Mokyrら (1998) Cancer Research 58: 5301-5304）。このような組合せの例は、黒色腫の処置のためにデカルバジンと組み合わせられた抗ＬＡＧ−３抗体である。このような組合せの他の例は、黒色腫の処置のためにインターロイキン−２（ＩＬ−２）と組み合わせられた抗ＬＡＧ−３抗体である。ＬＡＧ−３遮断および化学療法の組合せ使用を支持する科学的論拠は、多数の化学療法化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルの増加をもたらすはずであるというものである。細胞死を介してＬＡＧ−３遮断と相乗効果をもたらし得る他の組合せ治療は、放射線、外科手術およびホルモン遮断である。これらのそれぞれのプロトコールは、宿主における腫瘍抗原の源を創造する。血管形成阻害剤はまた、ＬＡＧ−３遮断と組み合わせられ得る。血管形成の阻害は腫瘍細胞死を誘導し、腫瘍抗原を宿主の抗原提示経路に提供し得る。
【０１６７】
ＬＡＧ−３を遮断する抗体はまた、ＦｃαまたはＦｃγ受容体を発現するエフェクター細胞を腫瘍細胞に標的化する二重特異性抗体と組み合わせて使用することができる（例えば、米国特許第５，９２２，８４５および５，８３７，２４３号、参照）。二重特異性抗体は、２つの別々の抗原を標的化するために使用することができる。例えば、抗−Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）二重特異性抗体は、マクロファージを腫瘍部位に標的化するために使用されている。この標的化は腫瘍特異的応答をさらに有効に活性化し得る。Ｔ細胞群のこれらの応答はＬＡＧ−３遮断の使用により増加し得る。あるいは、抗原は、腫瘍抗原および樹状細胞特異的細胞表面マーカーに結合する二重特異性抗体の使用によりＤＣに直接送達され得る。
【０１６８】
腫瘍は、多種多様のメカニズムにより宿主の免疫監視から逃れる。多数のこれらのメカニズムは、腫瘍により発現され、免疫抑制性であるタンパク質の不活性化により克服され得る。これらは、数ある中でＴＧＦ−β（Kehrlら (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050）、ＩＬ−１０（Howard & O’Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200）およびＦａｓリガンド（Hahneら (1996) Science 274: 1363-1365）を含む。これらの存在物それぞれに対する抗体は、免疫抑制剤の効果を中和し、宿主による腫瘍免疫応答を支持するために、抗−ＬＡＧ−３と組み合わせて使用することができる。
【０１６９】
宿主の免疫応答性を活性化する他の抗体は、抗−ＬＡＧ−３と組み合わせて使用することができる。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する、樹状細胞の表面上の分子を含む。抗−ＣＤ４０抗体は、有効にＴ細胞ヘルパー活性と置き換えることができ（Ridgeら (1998) Nature 393: 474-478）、ＬＡＧ−３抗体と共に使用することができる（Itoら (2000) Immunobiology 201 (5) 527-40）。例えば、ＣＴＬＡ−４（例えば、米国特許第５，８１１，０９７号）、ＯＸ−４０（Weinbergら (2000) Immunol 164: 2160-2169）、４−１ＢＢ（Meleroら (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997)およびＩＣＯＳ（Hutloffら (1999) Nature 397: 262-266）のようなＴ細胞共刺激分子に対する抗体の活性化は、また、Ｔ細胞活性化のレベルを増加させるために提供され得る。
【０１７０】
骨髄移植は、現在、造血起源の種々の腫瘍を処置するために使用されている。移植片対宿主病はこの処置の結果であるが、治療利益は移植片対腫瘍応答から得ることができる。ＬＡＧ−３遮断は、ドナー移植腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を増加させるために使用することができる。
【０１７１】
腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を刺激するために、エキソビボにおける抗原特異的Ｔ細胞の活性化および増殖ならびにこれらの細胞のレシピエントへの適合移植(adoptive transfer)に関連する、いくつかの実験的処置プロトコールもある（Greenberg & Riddell (1999) Science 285: 546-51）。これらの方法はまた、感染因子、例えば、ＣＭＶに対するＴ細胞応答を活性化するために使用することができる。抗ＬＡＧ−３抗体の存在下におけるエキソビボ活性化は、適合移植されたＴ細胞の頻度および活性を増加させることができる。
【０１７２】
感染症
本発明の他の方法は、特定の毒素または病原体に暴露されている患者を処置するために使用される。したがって、本発明の他の局面は、対象が感染病を処置されるように、抗ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む対象における感染病を処置する方法を提供する。好ましくは、抗体はヒト抗−ヒトＬＡＧ−３抗体（本明細書に記載されているヒト抗ＬＡＧ−３抗体のいずれかのような）である。さらに、またはあるいは、抗体はキメラまたはヒト化抗体であり得る。
【０１７３】
上記の腫瘍に対する適用と同様に、抗体介在ＬＡＧ−３遮断は、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答を刺激するために、単独またはアジュバントとして、ワクチンと組み合わせて使用することができる。この治療アプローチが特に有用であり得る病原体の例は、現在、有効であるワクチンがない病原体、または慣用のワクチンが十分に有効でない病原体を含む。これらは、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ＆Ｃ）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌、緑膿菌を含むが、これらに限定されない。ＬＡＧ−３遮断は、感染因子、例えば、感染の経過にわたって改変した抗原が存在するＨＩＶにより確立されている感染に対して特に有用である。これらの新規エピトープは、抗−ヒトＬＡＧ−３投与時に外来物として認識され、したがって、ＬＡＧ−３を介する負のシグナルにより抑制されない強いＴ細胞応答を刺激する。
【０１７４】
本発明の方法により治療可能な感染症を引き起こす病原性ウイルスのいくつかの例は、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、ＢまたはＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩおよびＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コルノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスを含む。
【０１７５】
本発明の方法により治療可能な感染症を引き起こす病原性細菌のいくつかの例は、クラミジア、リケッチア細菌、ミコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌(pneumonococci)、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風菌、ボツリヌス、炭疽菌、ペスト、レプトスピラおよびライム病菌を含む。
【０１７６】
本発明の方法により治療可能な感染症を引き起こす病原性真菌のいくつかの例は、カンジダ（アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカリスなど）、クリプトコックス・ネオフォルマンス、アスペルギルス（フミガーツス、ニガー(niger)など）、ケカビ（ケカビ、アブシディア、クモノスカビ）、スポロトリックス・シェンキー、ブラストマイセス・デルマチチジス、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、コクシジオイデス・イミティスおよびヒストプラスマ・カプスラーツムを含む。
【０１７７】
本発明の方法により治療可能な感染症を引き起こす病原寄生虫のいくつかの例は、赤痢アメーバ、大腸バランチジウム、フォーラーネグレリア、アカントアメーバ属、ランブル鞭毛虫、クリプトスポリジウム属、ニューモシスティス・カリニ、三日熱マラリア原虫、ネズミバベシア、トリパノソーマ・ブルーセイ、クルーズ・トリパノソーマ、ドノバン・リーシュマニア、トキソプラズマ原虫、ニッポストロンギルス・ブラジリエンシス(Nippostrongylus brasiliensis)を含む。
【０１７８】
上記方法のすべてにおいて、ＬＡＧ−３遮断は、免疫療法の他の形態、例えば、サイトカイン処置（例えば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２）、または腫瘍抗原の提示の増強を提供する二重特異性抗体治療と組み合わせることができる（例えば、Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123、参照）。
【０１７９】
自己免疫反応
抗−ＬＡＧ−３抗体は自己免疫応答を誘導および増幅し得る。実際に、腫瘍細胞およびペプチドワクチンを使用する抗腫瘍応答の誘導は、多数の抗腫瘍応答が抗−自己反応性に関連することを示す（van Elsasら (2001) J. Exp. Med. 194:481-489; Overwijkら (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2982-2987; Hurwitz, (2000) supra; Rosenberg & White (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4）。したがって、疾患処置に関するこれらの自己タンパク質に対する免疫応答を効率的に発生させるようにワクチンプロトコールを考案するために、種々の自己タンパク質と共に抗−ＬＡＧ−３遮断を使用することを考えることができる。例えば、アルツハイマー病は脳においてアミロイド沈着におけるＡβペプチドの不適当な蓄積に関する；アミロイドに対する抗体反応は、これらのアミロイド沈着を明らかにすることができる（Schenkら, (1999) Nature 400: 173-177）。
【０１８０】
他の自己タンパク質、例えば、アレルギーおよび喘息の処置に関するＩｇＥならびにリウマチ性関節炎に関するＴＮＦαも、標的として使用することができる。最後に、種々のホルモンに対する抗体反応が、抗ＬＡＧ−３抗体の使用により誘導され得る。生殖ホルモンに関する抗体反応を中和することは、避妊のために使用することができる。特定の腫瘍の増殖のために必要であるホルモンおよび他の可溶性因子に関する抗体反応を中和することも、可能なワクチン標的として考えることができる。
【０１８１】
抗ＬＡＧ−３抗体の使用に関する上記の類似の方法は、他の自己−抗原、例えば、アルツハイマー病におけるＡβを含むアミロイド沈着、サイトカイン、例えば、ＴＮＦαおよびＩｇＥの不適当な蓄積を有する患者を処置するために、治療的自己免疫応答の誘導のために使用することができる。
【０１８２】
ワクチン
抗−ＬＡＧ−３抗体は、抗ＬＡＧ−３抗体と興味ある抗原（例えば、ワクチン）の共投与により、抗原特異的免疫応答を刺激するために使用することができる。したがって、別の局面において、本発明は、対象における抗原に対する免疫応答が増強されるように、（ｉ）抗原；および（ｉｉ）抗ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法を提供する。好ましくは、抗体はヒト抗−ヒトＬＡＧ−３抗体（本明細書に記載されているヒト抗ＬＡＧ−３抗体のいずれかのような）である。さらに、またはあるいは、抗体はキメラまたはヒト化抗体であり得る。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体由来の抗原であり得る。このような抗原の非限定的な例は、上記のセクションにおいて記載されているもの、例えば、上記腫瘍抗原（または腫瘍ワクチン）、または上記ウイルス、細菌もしくは他の病原体由来の抗原を含む。
【０１８３】
インビボおよびインビトロにおいて本発明の抗体組成物（例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子ならびに免疫複合体）を投与する適当な経路は、当分野で既知であり、当業者により選択することができる。例えば、抗体組成物は注射により（例えば、静脈内または皮下に）投与され得る。使用される分子の適当な用量は、対象の年齢および体重ならびに抗体組成物の濃度および／または製剤化に依存している。
【０１８４】
前記のとおり、本発明のヒト抗ＬＡＧ−３抗体は、１つ以上の他の治療剤、例えば、細胞毒性剤、放射毒性物質または免疫抑制剤と共投与することができる。抗体は、薬物と組み合せられてよく（免疫複合体として）、また薬物と別々に投与されてもよい。後者の場合（別々の投与）において、抗体は薬物の前、後もしくは同時に投与されてよく、また、他の既知の治療、例えば、抗癌療法、例えば、放射線療法と共投与されてもよい。このような治療剤は、数ある中の抗腫瘍剤、例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラスチン硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジンおよびシクロホスファミドヒドロキシウレア（これらはそれら自体、患者に対して毒性または準毒性であるレベルでのみ有効である）を含む。シスプラスチンは４週間毎に１回１００ｍｇ／ｍｌ用量として静脈内に投与され、アドリアマイシンは２１日ごとに１回６０−７５ｍｇ／ｍｌ用量として静脈内に投与される。本発明のヒト抗ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントと化学療法剤との共投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞毒性作用をもたらす異なるメカニズムを介して機能する２つの抗癌剤を提供する。このような共投与は、抗体に非反応性にする、薬物耐性の発生または腫瘍細胞の抗原性の変化による問題を解決することができる。
【０１８５】
本発明の抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性もしくは多重特異性分子または免疫複合体）および使用のための指示書を含むキットも本発明の範囲内である。キットは、少なくとも１つのさらなる試薬または１つ以上のさらなる本発明のヒト抗体（例えば、第１のヒト抗体と異なるＬＡＧ−３抗原におけるエピトープに結合する相補的な活性を有するヒト抗体）をさらに含むことができる。キットは、一般的にキットの内容物の意図される使用を指示するラベルを含む。ラベルなる用語は、キット上もしくはキットと共に提供されている、または別な方法でキットに添付されている、あらゆる文書または記録媒体を含む。
【０１８６】
併用療法
他の局面において、本発明は、本発明の抗ＬＡＧ−３抗体（またはその抗原結合部分）を、免疫応答を刺激し、それによりさらに対象における免疫応答を増強、刺激または上方制御するために有効である１つ以上のさらなる抗体と共投与する、併用療法の方法を提供する。１つの態様において、本発明は、例えば、腫瘍増殖を阻害するか、または抗−ウイルス応答を刺激するために、対象における免疫応答を刺激するように、抗ＬＡＧ−３抗体および１つ以上のさらなる免疫刺激抗体、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法を提供する。他の態様において、対象は抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＰＤ−１抗体を投与される。さらに別の態様において、対象は抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与される。さらに他の態様において、対象は抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与される。１つの態様において、抗ＬＡＧ−３抗体はヒト抗体、例えば、本明細書の抗体である。あるいは、抗ＬＡＧ−３抗体は、例えば、キメラまたはヒト化抗体（例えば、マウス抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂから調製される）であり得る。他の態様において、少なくとも１つのさらなる免疫刺激抗体（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体）はヒト抗体である。あるいは、少なくとも１つのさらなる免疫刺激抗体は、例えば、キメラまたはヒト化抗体（例えば、マウス抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体から調製される）であり得る。
【０１８７】
他の態様において、本発明は、ＬＡＧ−３抗体およびＣＴＬＡ−４抗体を対象に投与することを含む、過増殖性疾患（例えば、癌）を処置するための方法を提供する。さらなる態様において、抗ＬＡＧ−３抗体は治療量以下の用量で投与されるか、抗ＣＴＬＡ−４抗体は治療量以下の用量で投与されるか、または両方が治療量以下の用量で投与される。他の態様において、本発明は、抗ＬＡＧ−３抗体および治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ−４抗体を対象に投与することを含む、免疫刺激剤にて過増殖性疾患の処置と関連する有害事象を改変するための方法を提供する。１つの態様において、対象はヒトである。他の態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体はヒト配列モノクローナル抗体１０Ｄ１（ＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４に記載されている）であり、抗ＬＡＧ−３抗体はヒト配列モノクローナル抗体、例えば、本明細書に記載されているＬＡＧ３．５である。本発明の方法に包含される他の抗ＣＴＬＡ−４抗体は、例えば、ＷＯ９８／４２７５２；ＷＯ００／３７５０４；米国特許第６，２０７，１５６号；Hurwitzら (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067-10071; Camachoら (2004) J. Clin. Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (antibody CP-675206);およびMokyrら (1998) Cancer Res. 58:5301-5304に記載されているものを含む。１つの態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、５×１０−８Ｍ以下のＫＤにてヒトＣＴＬＡ−４に結合するか、１×１０−８Ｍ以下のＫＤにてヒトＣＴＬＡ−４に結合するか、５×１０−９Ｍ以下のＫＤにてヒトＣＴＬＡ−４に結合するか、または１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍ以下のＫＤにてヒトＣＴＬＡ−４に結合する。
【０１８８】
他の態様において、本発明は、ＬＡＧ−３抗体およびＰＤ−１抗体を対象に投与することを含む、過増殖性疾患（例えば、癌）を処置するための方法を提供する。さらなる態様において、抗ＬＡＧ−３抗体は治療量以下の用量で投与されるか、抗ＰＤ−１抗体は治療量以下の用量で投与されるか、または両方が治療量以下の用量で投与される。他の態様において、本発明は、抗ＬＡＧ−３抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ−１抗体を対象に投与することを含む、免疫刺激剤にて過増殖性疾患の処置と関連する有害事象を改変するための方法を提供する。１つの態様において、対象はヒトである。１つの態様において、抗ＰＤ−１抗体はヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ＬＡＧ−３抗体はヒト配列モノクローナル抗体、例えば、本明細書に記載されているＬＡＧ３．５である。ヒト配列抗ＰＤ−１抗体の例は、ＰＣＴ公開ＷＯ０６／１２１１６８に記載されている、１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４および４Ａ１１を含む。他の抗ＰＤ−１抗体は、例えば、ラムブロリズマブ（ＷＯ２００８／１５６７１２）、およびＡＭＰ５１４（ＷＯ２０１０／０２７４２３、ＷＯ２０１０／０２７８２７、ＷＯ２０１０／０２７８２８、ＷＯ２０１０／０９８７８８）を含む。１つの態様において、抗ＰＤ−１抗体は、５×１０−８Ｍ以下のＫＤにてヒトＰＤ−１に結合するか、１×１０−８Ｍ以下のＫＤにてヒトＰＤ−１に結合するか、５×１０−９Ｍ以下のＫＤにてヒトＰＤ−１に結合するか、１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍ以下のＫＤにてヒトＰＤ−１に結合する。
【０１８９】
他の態様において、本発明は、ＬＡＧ−３抗体およびＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与することを含む、過増殖性疾患（例えば、癌）を処置するための方法を提供する。さらなる態様において、抗ＬＡＧ−３抗体は治療量以下の用量で投与されるか、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は治療量以下の用量で投与されるか、または両方が治療量以下の用量で投与される。他の態様において、本発明は、抗ＬＡＧ−３抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与することを含む、免疫刺激剤にて過増殖性疾患の処置と関連する有害事象を改変するための方法を提供する。１つの態様において、対象はヒトである。他の態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ＬＡＧ−３抗体はヒト配列モノクローナル抗体、例えば、本明細書に記載されているＬＡＧ３．５である。ヒト配列抗ＰＤ−Ｌ１抗体の例は、ＰＣＴ公開ＷＯ０７／００５８７４に記載されている、３Ｇ１０、１２Ａ４、１０Ａ５、５Ｆ８、１０Ｈ１０、１Ｂ１２、７Ｈ１、１１Ｅ６、１２Ｂ７および１３Ｇ４を含む。他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４６）（ＷＯ２０１０／０７７６３４）、ＭＥＤＩ４７３６（ＷＯ２０１１／０６６３８９）、およびＭＤＸ１１０５（ＷＯ２００７／００５８７４）を含む。１つの態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、５×１０−８Ｍ以下のＫＤにてヒトＰＤ−Ｌ１に結合するか、１×１０−８Ｍ以下のＫＤにてヒトＰＤ−Ｌ１に結合するか、５×１０−９Ｍ以下のＫＤにてヒトＰＤ−Ｌ１に結合するか、または、１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍ以下のＫＤにてヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。
【０１９０】
抗体によるＬＡＧ−３ならびに１つ以上の第２の標的抗原、例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１の遮断は、患者における癌細胞に対する免疫応答を増強することができる。本明細書の抗体を使用して増殖が阻害され得る癌は、一般的に免疫療法に応答する癌を含む。本明細書の併用療法における処置のための典型的な癌の例は、抗ＬＡＧ−３抗体での単剤療法の議論において特に上記されている癌を含む。
【０１９１】
１つの態様において、本明細書に記載されている治療抗体の組合せは、薬学的に許容される担体中で単一の組成物として同時に、または薬学的に許容される担体中でそれぞれの抗体を有する別々の組成物として同時に投与され得る。他の態様において、治療抗体の組合せは連続して投与され得る。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＬＡＧ−３抗体は、連続して投与され得る、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体が第１に、そして抗ＬＡＧ−３抗体が第２に投与されるか、または抗ＬＡＧ−３抗体が第１に、そして抗ＣＴＬＡ−４抗体が第２に投与される。さらに、またはあるいは、抗ＰＤ−１抗体および抗ＬＡＧ−３抗体は、連続して投与され得る、例えば、抗ＰＤ−１抗体が第１に、そして抗ＬＡＧ−３抗体が第２に投与されるか、または抗ＬＡＧ−３抗体が第１に、そして抗ＰＤ−１抗体が第２に投与される。さらに、またはあるいは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＬＡＧ−３抗体は、連続して投与され得る、例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が第１に、そして抗ＬＡＧ−３抗体が第２に投与されるか、または抗ＬＡＧ−３抗体が第１に、そして抗ＰＤ−Ｌ１抗体が第２に投与される。
【０１９２】
さらに、併用療法の２つ以上の投与が連続して投与されるとき、連続投与の順番は投与のそれぞれの時点で順番が逆転もしくは維持されていてよく、連続投与は同時投与と組み合わせられていてよく、またそれらが組み合わされていてよい。例えば、組合せ抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＬＡＧ−３抗体の第１の投与は同時であり、第２の投与は第１に抗ＣＴＬＡ−４および第２に抗−ＬＡＧ−３で連続であり、そして第３の投与は第１に抗−ＬＡＧ−３および第２に抗ＣＴＬＡ−４で連続などであってよい。さらに、またはあるいは、組合せ抗ＰＤ−１抗体および抗ＬＡＧ−３抗体の第１の投与は同時であり、第２の投与は第１に抗ＰＤ−１および第２に抗−ＬＡＧ−３で連続であり、そして第３の投与は第１に抗−ＬＡＧ−３および第２に抗ＰＤ−１で連続などであってよい。さらに、またはあるいは、組合せ抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＬＡＧ−３抗体の第１の投与は同時であり、第２の投与は第１に抗ＰＤ−Ｌ１および第２に抗−ＬＡＧ−３で連続であり、そして第３の投与は第１に抗−ＬＡＧ−３および第２に抗ＰＤ−Ｌ１で連続などであってよい。他の典型的な投与スキームは、第１の投与は第１に抗−ＬＡＧ−３および第２に抗ＣＴＬＡ−４（および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１）で連続であり、そして後の投与は同時であることを含み得る。
【０１９３】
所望により、抗−ＬＡＧ−３ならびに１つ以上のさらなる抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体）の組合せは、さらに免疫原、例えば、癌細胞、精製された腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む）、細胞および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトされた細胞（Heら (2004) J. Immunol. 173:4919-28）と組み合わされ得る。使用することができる腫瘍ワクチンの非限定的な例は、黒色腫抗原のペプチド、例えば、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチド、またはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞（以下でさらに記載されている）を含む。組合せＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断は、さらに、ワクチンプロトコール、例えば、抗ＬＡＧ−３抗体での単剤療法に対して詳細に上記されているあらゆるワクチンプロトコールと組み合わせることができる。
【０１９４】
組合せＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断はまたさらに、標準癌処置と組み合わせられ得る。例えば、組合せＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断は、化学療法レジメンと有効に組み合わせられ得る。こうした場合において、本明細書の組合せにて投与される他の化学療法剤の用量を減少させることができる可能性がある（Mokyrら (1998) Cancer Research 58: 5301-5304）。このような組合せの例は、黒色腫の処置のためにさらにデカルバジンと組み合わせられた抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組合せである。他の例は、黒色腫の処置のためにさらにインターロイキン−２（ＩＬ−２）と組み合わせられた抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組合せである。ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断と化学療法の組合せ使用を支持する科学的論拠は、多数の化学治療化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルの増加をもたらすはずであるというものである。細胞死を介して組合せＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断と相乗効果をもたらし得る他の組合せ治療は、放射線、外科手術およびホルモン遮断である。これらのそれぞれのプロトコールは、宿主における腫瘍抗原の源を創造する。血管形成阻害剤はまた、組合せＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断と組み合わせられ得る。血管形成の阻害は腫瘍細胞死を誘導し、腫瘍抗原を宿主の抗原提示経路に提供し得る。
【０１９５】
ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１を遮断する抗体の組合せはまた、ＦｃαまたはＦｃγ受容体を発現するエフェクター細胞を腫瘍細胞に標的化する二重特異性抗体と組み合わせて使用することができる（例えば、米国特許第５，９２２，８４５および５，８３７，２４３号、参照）。二重特異性抗体は、２つの別々の抗原を標的化するために使用することができる。Ｔ細胞群のこれらの応答は組合せＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断の使用により増加し得る。
【０１９６】
他の例において、抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組合せは、抗−腫瘍性抗体、例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツマブ）、Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）（トシツモマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）（イブリツモマブ）、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）（アレムツズマブ）、Ｌｙｍｐｈｏｃｉｄｅ（登録商標）（エプラツズマブ）、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）およびＴａｒｃｅｖａ（登録商標）（エルロチニブ）などと組み合わせて使用することができる。一例として、理論により束縛されている願望なく、抗癌抗体または毒素とコンジュゲートされた抗癌抗体での処置が、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＬＡＧ−３が介在する免疫応答を増強する、癌細胞（例えば、腫瘍細胞）死を引き起こし得る。典型的な態様において、過増殖性疾患（例えば、癌腫瘍）の処置は、宿主による抗腫瘍免疫応答を増強することができる、同時にもしくは連続してまたはそれらの組合せにおいて、抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせられた抗癌抗体を含むことができる。
【０１９７】
腫瘍は、多種多様のメカニズムにより宿主の免疫監視から逃れる。多数のこれらのメカニズムは、腫瘍により発現され、免疫抑制性であるタンパク質の不活性化により克服され得る。これらは、数ある中でＴＧＦ−β（Kehrlら (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200）およびＦａｓリガンド（Hahneら (1996) Science 274: 1363-1365）を含む。他の態様において、これらの存在物それぞれに対する抗体は、免疫抑制剤の効果を中和し、宿主による腫瘍免疫応答を支持するために、さらに抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組合せと組み合わせて使用することができる。
【０１９８】
宿主の免疫応答性を活性化するために使用することができる他の抗体は、さらに抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組合せと組み合わせて使用することができる。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する、樹状細胞の表面上の分子を含む。抗−ＣＤ４０抗体（Ridgeら, 上記）は、抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１の組合せ（Itoら, 上記）と共に使用することができる。Ｔ細胞共刺激分子に対して活性化する他の抗体（Weinbergら, 上記, Meleroら 上記, Hutloffら, 上記）もまた、Ｔ細胞活性化のレベルを増加させるために提供され得る。
【０１９９】
上記のとおり、骨髄移植は、現在、造血起源の種々の腫瘍を処置するために使用されている。組合せＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断は、ドナー移植腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を増加させるために使用することができる。
【０２００】
腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を刺激するために、エキソビボにおける抗原特異的Ｔ細胞の活性化およびこれらの細胞のレシピエントへの適合移植に関連する、いくつかの実験的処置プロトコールがある（Greenberg & Riddell、上記）。これらの方法はまた、感染因子、例えば、ＣＭＶに対するＴ細胞応答を活性化するために使用することができる。抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の存在下におけるエキソビボ活性化は、適合移植されたＴ細胞の頻度および活性を増加させることが予期され得る。
【０２０１】
１つの態様において、本発明は、抗ＬＡＧ−３抗体ならびに治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与することを含む、免疫刺激剤にて過増殖性疾患（例えば、癌）の処置と関連する有害事象を改変するための方法を提供する。例えば、本発明の方法は、非吸収性ステロイドを患者に投与することにより、免疫刺激治療抗体−誘導大腸炎または下痢の発症を減少させるための方法を提供する。免疫刺激治療抗体を受けるすべての患者がこのような抗体により誘発される大腸炎または下痢を発症する危険性があるため、全患者集団は本発明の方法にしたがう治療が適当である。ステロイドは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置およびＩＢＤの増悪を予防するために投与されているが、それらは、ＩＢＤと診断されていない患者におけるＩＢＤは予防する（発症率を低下させる）ために使用されていない。ステロイド、とりわけ非吸収性ステロイドと関連する有意な副作用は、予防使用を阻止させている。
【０２０２】
さらなる態様において、組合せＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断（すなわち、免疫刺激治療抗体、抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体）は、さらに、何らかの非吸収性ステロイドの使用と組み合わせることができる。本明細書において使用される「非吸収性ステロイド」は、肝臓の代謝後、ステロイドのバイオアベイラビリティが低くなるように、すなわち、約２０％未満であるように、大規模な初回通過代謝を示すグルココルチコイドである。本発明の１つの態様において、非吸収性ステロイドはブデソニドである。ブデソニドは、経口投与後、主に肝臓により大規模に代謝される局所作用性糖質コルチコステロイドである。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ（登録商標）（Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ）は、開発されたブデソニドのｐＨ−および時間−依存性経口製剤であり、回腸および大腸への薬物送達に最適化されている。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ（登録商標）は、回腸および／または上行結腸に関与するクローン病を抑えるための穏やかな処置のために米国において承認されている。クローン病の処置のためのＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ（登録商標）の通常の経口用量は、６から９ｍｇ／日である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ（登録商標）は、腸粘膜において吸収され維持される前に腸に放出される。腸粘膜標的組織を通過すると、ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ（登録商標）は、肝臓におけるシトクロムＰ４５０系によりごくわずかなグルココルチコイド活性を有する代謝産物に大規模に代謝される。したがって、バイオアベイラビリティは低い（約１０％）。ブデソニドの低いバイオアベイラビリティは、大規模な初回通過代謝が小さい他のグルココルチコイドと比較して、改善された治療可能比をもたらす。ブデソニドは、全身作用性コルチコステロイドよりも少ない視床下部−下垂体抑制を含む小さい副作用をもたらす。しかしながら、ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ（登録商標）の慢性投与は、全身性グルココルチコイド作用、例えば、副腎皮質機能亢進症および副腎抑制をもたらし得る。PDR 58th ed. 2004; 608-610、参照。
【０２０３】
さらなる態様において、非吸収性ステロイドと組み合わせられた組合せＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断（すなわち、免疫刺激治療抗体  抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体）は、さらに、サリチル酸塩と組み合わせることができる。サリチル酸塩は５−ＡＳＡ剤、例えば：スルファサラジン（ＡＺＵＬＦＩＤＩＮＥ（登録商標）、Pharmacia & UpJohn）；オルサラジン（ＤＩＰＥＮＴＵＭ（登録商標）、Pharmacia & UpJohn）；バルサラジド（ＣＯＬＡＺＡＬ（登録商標）、Salix Pharmaceuticals, Inc.）；およびメサラミン（ＡＳＡＣＯＬ（登録商標）、Procter & Gamble Pharmaceuticals；ＰＥＮＴＡＳＡ（登録商標）、Shire US；ＣＡＮＡＳＡ（登録商標）、Axcan Scandipharm, Inc.；ＲＯＷＡＳＡ（登録商標）、Solvay）を含む。
【０２０４】
本発明の方法において、抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および非吸収性ステロイドと組み合わせて投与されるサリチル酸塩は、免疫刺激抗体により誘導される大腸炎の発症を減少する目的のために、サリチル酸塩および非吸収性ステロイドの任意の重複もしくは連続投与を含み得る。したがって、例えば、本発明の免疫刺激抗体により誘導される大腸炎の発症を減少させるための方法は、サリチル酸塩および非吸収性のものを同時にまたは連続して（例えば、サリチル酸塩を非吸収性ステロイドの６時間後に投与する）、またはそれらの任意の組合せを投与することを含む。さらに、本発明において、サリチル酸塩および非吸収性ステロイドは、同じ経路（例えば、両方が経口的に投与される）または異なる経路（例えば、サリチル酸塩が経口的に投与され、非吸収性ステロイドが経直腸的に投与される）（抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与するために使用される経路と異なっていてよい）により投与され得る。
【０２０５】
本明細書は、さらに以下の実施例により説明されるが、さらなる限定と解釈してはならない。本出願のすべての図およびすべての文献、本出願において引用されているＧｅｎｂａｎｋ配列、特許および公開された特許出願の内容は、出典明示により明確に本明細書に包含される。特に、ＰＣＴ公開ＷＯ０９／０４５９５７、ＷＯ０９／０７３５３３、ＷＯ０９／０７３５４６およびＷＯ０９／０５４８６３の記載は出典明示により明確に本明細書に包含される。
【実施例】
【０２０６】
実施例１：ＬＡＧ３．１（抗体２５Ｆ７）の変異体の設計
ＬＡＧ３．１と本明細書において称される以前に記載されている抗ＬＡＧ−３抗体である２５Ｆ７抗体変異体を、分解の起こり得る部位に対する抗体のアミノ酸配列を最初に分析することにより、作製した。ＬＡＧ３．１  ＶＨ領域の部位特異的突然変異誘発の発現を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。次に、改変されたＶＨ領域を、ヒトＩｇＧ４−Ｓ２２８Ｐ定常領域を含むＵＣＯＥ（登録商標）（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ベクターにサブクローニングした。種々の重鎖ベクターを、ＣＨＯ−Ｓ細胞にＬＡＧ３．１カッパ鎖を発現するベクターとそれぞれ共トランスフェクトし、安定なプールを発現のために選択した。
【０２０７】
５つの起こり得る脱アミドモチーフを、可変領域重鎖ＣＤＲ２内で同定した。これらの部位は、ＬＡＧ３．１の重鎖可変領域（配列番号：２）の位置５２、５４、５６、５８および６０に位置した（図１Ａ参照）。特に、ＶＨ  ＣＤＲ２（配列番号：６）内の「ＮＧ」配列の脱アミドならびに配列のさらなる異性化を、全ての条件下で観察した。出発物質の脱アミドは約１０％であった。さらに、この「ＮＧ」配列が生殖細胞系列配列に対応しないことを見出した（図３参照）。しかしながら、コンセンサス生殖細胞系列配列は、起こり得るグリコシル化部位であり、したがって、抗体変異体中に含まれなかった。
【０２０８】
図３に示されるとおり、４つの変異体（本明細書においてＬＡＧ３．５、ＬＡＧ３．６、ＬＡＧ３．７およびＬＡＧ３．８と称される）を設計し、起こり得る脱アミドモチーフの２つ（位置５４および５６）に対処した。これらの変異体を、以下の表１において要約される条件に付し、以下の特性：（ａ）化学および熱安定性（物理的安定性）；（ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（凝集）；（ｃ）等電点電気泳動ゲル（ＩＥＦ）（電荷不均一性）；（ｄ）Ｂｉａｃｏｒｅ分析による活性（結合および機能活性）；および（ｅ）質量分析によるペプチドマッピング（化学修飾／分子安定性）を分析した。
【０２０９】
【表１】
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【０２１０】
実施例２：ＬＡＧ−３変異体の特性化
１．活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞結合
抗体変異体が活性化ヒトＴ細胞の表面上で天然ヒトＬＡＧ−３に結合する能力を試験するために、正常健常ドナー末梢血単核細胞を、溶液中でそれぞれ５μｇ／ｍＬおよび３μｇ／ｍＬで存在する抗−ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ  ＃１６−００３７−８５）および抗−ＣＤ２８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ  ＃  ５５５７２５）抗体の組合せで、２ｘ１０ｅ６細胞／ｍＬの密度で１５ｃｍ組織培養プレートにおいて刺激した。刺激の３日後に、細胞を回収し、１ｘＰＦＡＥバッファー（１ｘＰＢＳ＋２％  ＦＢＳ、０．０２％  アジ化ナトリウム、２ｍＭ  Ｎａ  ＥＤＴＡ）で１Ｘ洗浄し、染色のために１ｘＰＦＡＥバッファーに再懸濁した。
【０２１１】
結合反応のために、ＬＡＧ３．１変異体を冷１ｘＰＦＡＥバッファーで連続希釈し、次に、５０μｌの希釈抗体溶液を１ｘＰＦＡＥバッファーにおいて１：１６希釈された５０μｌのＦｉｔｃ−標識化抗−ヒトＣＤ４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ  ＃  ５５５３４６）と混合した。結合反応のために、１００μｌの該希釈抗体混合物を２ｘ１０５細胞に加え、混合物を４℃で３０分間インキュベートした。次に、細胞を、１ｘＰＦＡＥバッファーで２回洗浄した。ＰＥ−標識化ヤギ抗−ヒトＦｃγ−特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ．  ＃  １０９−１１６−１７０）の１：２００希釈物を加え、混合物を４℃で３０分間インキュベートし、次に、冷１ｘＰＦＡＥバッファーで２回洗浄した。最後の洗浄後、１５０μｌの冷１ｘＰＦＡＥをそれぞれの溶液に加え、抗体結合の分析を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用するフローサイトメトリーにより実施した。
【０２１２】
フローサイトメトリー分析の結果は、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞への抗体結合に対するＥＣ５０を示すグラフである図４Ａにおいて要約されている。図４Ｂは、ＢＩＡＣＯＲＥによる可溶性ヒトＬＡＧ−３／Ｆｃ抗原への抗体結合を示すグラフである。示されているとおり、ＬＡＧ３．５およびＬＡＧ３．８の結合アフィニティーは、ＬＡＧ３．１と比較して、わずかに低いが、それらのオフ速度(off-rate)定数は、ＬＡＧ３．１と比較してわずかに高い。
【０２１３】
２．物理的安定性
変異体の熱安定性および熱変性を、Ｍｉｃｒｏｃａｌ  ＶＰ−ＤＳＣを使用して試験した。具体的には、それぞれの変異体をＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ  ＃  ２１−０４０−ＣＶ  ｌｏｔ  ＃  ２１０４０１３９）に希釈した。サンプルの最終濃度は、ＰＢＳへの希釈後に２５０μｇ／ｍＬであった。サンプルを７４℃に合わせ(scanned)、２５℃に冷却し、７４℃に再加熱した。ＰＢＳバッファーをブランクコントロールとして使用した。データをＮｏｎ−２−状態モデルに合わせ、曲線適合をＯｒｉｇｉｎソフトウェアにより実施した。
【０２１４】
表２において要約されており、図５において示されているとおり、ＬＡＧ３．５は、ＬＡＧ３．１よりも高い融解温度ＴＭ２を有し、より良い総合安定性を示した。
【０２１５】
【表２】
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【０２１６】
変性後の抗体リフォールディングは、長期の凝集の可能性の反対の測定である。したがって、ＬＡＧ−３変異体もまた、熱可逆性に関して試験し、比較した。具体的には、抗体を７４℃に加熱し、室温に冷却し、７４℃に再加熱した。第１のサーモグラムに対する第２の曲線下面積の比率は、熱可逆性の推定(estimate)を提供し、これは構造可逆性の直接的尺度である。
【０２１７】
表３において要約されており、図６において示されているとおり、ＬＡＧ３．５は、全ての他の変異体よりも実質的により高い熱可逆性を有した。特に、ＬＡＧ３．５の可逆性パーセント（４７％）は、ＬＡＧ３．１のもの（２０％）の２倍以上であった。熱可逆性は、長期の凝集の可能性と強く相関している。より低い可逆性は、より高い凝集の可能性に対応する。この観察に基づいて、ＬＡＧ３．１は、ＬＡＧ３．５と比較して時間とともに実質的により高い凝集の可能性を示し得る。同様に、全ての他の変異体は、ＬＡＧ３．５と比較して時間とともに実質的により高い凝集の可能性を示し得る。
【０２１８】
【表３】
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【０２１９】
３．凝集
変異体もまた、以下のプロトコールにしたがって、標準サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を使用してタンパク質凝集の尺度として安定性について試験した：抗体試験サンプルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１．０ｍｇ／ｍｌに希釈し、１０ｕＬをＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ、ｍｏｄｅｌ  ２７９５）に適用した。０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．１Ｍ  硫酸ナトリウム、ｐＨ７．２の移動相を使用するゲル濾過カラム（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷｘｌ、７．８ｍｍｘ３００ｍｍ、ｐｒｏｄｕｃｔ  ＃０８５４１）において、分離を成し遂げた。分析物を、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度をモニタリングすることにより検出し、抗体ピーク面積パーセント組成をＥｍｐｏｗｅｒソフトウェアを使用して決定した。表４に示されるとおり、ＬＡＧ３．５は、ＬＡＧ３．１と比較して、実質的に減少した凝集を示した。
【０２２０】
【表４】
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【０２２１】
実施例３：変異体選択
上記試験に基づいて、その修飾されていない形態（ＬＡＧ３．１）と比較して、その有意に改善された物理化学的安定性、特に、構造リフォールディング（熱可逆性）に対するその高い能力を考慮して、抗体変異体ＬＡＧ３．５をさらなる分析のために選択した。この分析は、（ａ）加速ストレス、（ｂ）次に、１２週リアルタイム安定性評価の２工程アプローチを含んだ。具体的には、ＬＡＧ３．５を、４０℃で５日間ｐＨ８．０、５０ｍＭ  重炭酸アンモニウムにおいて１．０ｍｇ／ｍｌでインキュベートした。５日後に、修飾の程度、ならびに活性および安定性に対する効果を分析した。次に、ＬＡＧ３．５変異体を、１２週間ＰＢＳにおけるリアルタイム安定性に付し、次に分析した。これらの試験の結果は、以下に記載される。
【０２２２】
１．抗原結合
図７（および表５）に示されるとおり、抗原結合における変化は、５日後に観察されなかった。図１０ＡおよびＢにおいても示されるとおり、ＬＡＧ３．５は、１２週後に抗原結合または物理的安定性における変化を示さなかった。特に、ＬＡＧ３．５は、４℃および４０℃の両方で全１２週にわたって、ＬＡＧ３．８よりも高いアフィニティーを維持する。
【０２２３】
【表５】
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【０２２４】
２．化学修飾／分子安定性
質量分析によるペプチドマッピングを、ＬＡＧ３．１と比較してのＬＡＧ３．５の化学／分子安定性を分析するために使用した。具体的には、精製された抗体を還元し、アルキル化し、透析し、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｔ．  Ｖ５１１１）およびＧｌｕＣ（Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ．  １１０４７８１７００１）で消化した。消化物を、ナノ−ＬＣ  ＭＳＭＳ質量分析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ）により分析した。
【０２２５】
図８に示されるとおり、ＬＡＧ３．１は、アスパラギン残基が脱アミド化するより高いｐＨで、促進された安定性に付したとき、ＬＡＧ３．５と比較して、ＶＨにおける増加した不均一性を示した（工程１）。異性化による質量の変化は、現在の実験条件下で検出することができなかった。変化パーセントは、親ピークと組み合わせた全ての変化の割合として示される。
【０２２６】
加えて、図１１に示されるとおり、ＬＡＧ３．１は、１２週の長期リアルタイム安定性に付されたとき、４℃および４０℃の両方で、ＬＡＧ３．５と比較して、ＶＨにおける増加した不均一性を示した（工程２）。
【０２２７】
３．物理的安定性
熱可逆性は、ＰＢＳおよびｐＨ８．０で測定した。両方の条件下で、ＬＡＧ３．５は、再び、ＬＡＧ３．１と比較して、約２倍のリフォールディングのレベルを示した。具体的には、表６−８に示されるとおり、ＬＡＧ３．５は、ＰＢＳにおいてＬＡＧ３．１に対する１８％と比較して、４３％のリフォールディングを示した。ＬＡＧ３．５もまた、ｐＨ８．０でＬＡＧ３．１に対する２９％リフォールディングと比較して、４８％リフォールディングを示した。
【０２２８】
【表６】
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【０２２９】
【表７】
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【０２３０】
【表８】
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【０２３１】
４．電荷不均一性
電荷不均一性を評価するために、変異体は、ＬＡＧ３．１と比較して、ｐＩ５．５およびｐＩ１０．０の標準マーカーで等電点分画電気泳動（ＩＥＦ）を使用して分析した。簡潔には、抗体溶液を、ｐＩ３−１０マーカー（ＳＥＲＶＡ、Ｃａｔ＃  ３９２１２）と共に、１ｍｍの厚さのＩＥＦ  ｐＩ３−７の予め作られたゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃  ＥＣ６６４８ＢＯＸ）上に付した。電気泳動法を、ＩＥＦ  ３−７  Ｃａｔｈｏｄｅバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃  ＬＣ５３７０）およびＩＥＦ  Ａｎｏｄｅバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃  ＬＣ５３００）を使用して行い、１時間１００Ｖ定数、１時間２００Ｖ定数、および３０分間５００Ｖ定数の順に電流を加えた。ＩＥＦゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色し、タンパク質バンドを検出し、メタノール−酢酸溶液で脱染色した。次に、ＩＥＦゲルを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬソフトウェアにより分析した。この分析に基づいて（データは示していない）、ＬＡＧ３．５は、ＬＡＧ３．１と比較して、有意に低い不均一性を示した。
【０２３２】
５．ＨＩＣ−ＨＰＬＣ
溶解性を評価するために、変異体は、以下のプロトコールにしたがって標準疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）を使用して分析した：５０ｕＬの２Ｍ  硫酸アンモニウムを１ｍｇ／ｍｌで５０ｕＬの抗体試験サンプルに加えた。次に、８０ｕＬの試験サンプルを、ＨＩＣカラム（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｅｔｈｅｒ−５ＰＷ  ＴＳＫ−ｇｅｌ、７．５ｍｍ  ｘ  ７５ｍｍ、ｐｒｏｄｕｃｔ  ＃０７５７３）に一列に接続されたＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ、ｍｏｄｅｌ  ２７９５）に適用した。５０分にわたって１００％  バッファーＡ（２Ｍ  硫酸アンモニウム、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）から１００％  バッファーＢ（０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）の勾配で１．０ｍｌ／分の流速で、サンプルを溶離した。抗体を２８０ｎｍでのＵＶ吸光度をモニタリングすることにより検出し、データをＥｍｐｏｗｅｒソフトウェアを使用して分析した。図９に示されるとおり、ＬＡＧ３．５の親水性は、硫酸アンモニウムの高い濃度で溶解性を示した。
【０２３３】
実施例４：Ｔ細胞介在免疫応答阻害の逆転
ＬＡＧ３．５の活性を、抗原特異的マウスＴ細胞ハイブリドーマ（３Ａ９）を利用した機能アッセイの手段により決定した。ハイブリドーマ３Ａ９は、ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ４８−６２）からのペプチドに特異的なＴ細胞受容体を発現し、ペプチドパルスＭＨＣ適合抗原提示細胞（ＬＫ３５．２）と共培養したとき、ＩＬ−２を分泌する。ｈｕＬＡＧ−３−ＦｃがＭＨＣクラスＩＩ−ポジティブマウスＢ細胞系に結合することができるため、３Ａ９系におけるｈｕＬＡＧ−３の発現は、マウス提示系上のクラスＩＩとの関与を介して阻害効果を発揮することができた。３Ａ９親のペプチド応答プロフィールとＭＨＣ適合抗原提示細胞と共培養されたヒトＬＡＧ−３−形質導入３Ａ９細胞のものとの比較は、ヒトＬＡＧ−３の発現がコントロール３Ａ９細胞と比較してペプチド応答性を阻害することを証明した。この阻害は、ＬＡＧ３．５を使用するＬＡＧ−３遮断により逆転された。したがって、ＬＡＧ−３介在阻害の遮断は、ＬＡＧ３．５について証明された。
【０２３４】
実施例５：ＬＡＧ３．５によるＴ細胞活性化
初代Ｔ細胞におけるＬＡＧ３．５の機能活性を、スーパー抗原ＳＥＢによって刺激されたヒトＰＢＭＣ培養物を使用して評価した。全ＰＢＭＣを１８人のヒトドナーの血液から単離し、２つのアッセイフォーマット：（ｉ）固定された量の抗体（２０μｇ／ｍＬ）およびＳＥＢの連続希釈物、または（ｉｉ）固定された量のＳＥＢ（８５ｎｇ／ｍＬ）および抗体の連続希釈物のいずれかにおいて７２時間刺激した。分泌されたＩＬ−２を、Ｔ細胞活性の測定のために、ＥＬＩＳＡによりモニタリングした。抗体抗ＰＤ−１抗体およびＩｐｉｌｉｍｕｍａｂをポジティブコントロールとして使用し、抗−ＰＤ−１または抗−ＣＴＬＡ−４と組み合わせてのＬＡＧ３．５の活性もドナーのサブセットに対して評価した。
【０２３５】
増強されたＩＬ−２分泌は、アイソタイプコントロール抗体処理と比較して、ＬＡＧ３．５単独で処理された１８個のドナーの１５個からＳＥＢ濃度の範囲にわたって観察された。ほとんどの場合、刺激は、抗−ＰＤ−１またはＩｐｉｌｉｍｕｍａｂでの処理に対して観察されたもの未満であった。ＬＡＧ３．５について、２つのアッセイフォーマット（上記）の結果は、お互いに一致した。さらに、試験された６つのドナーの５つにおいて、ＬＡＧ３．５と抗−ＰＤ−１またはＩｐｉｌｉｍｕｍａｂとの組合せは、抗−ＰＤ−１またはＩｐｉｌｉｍｕｍａｂと組み合わせたアイソタイプコントロール抗体において観察されたものよりも高いレベルの刺激を引き起こした。これらのデータは、ＬＡＧ３．５が正常ヒトＴ細胞アッセイにおいて機能することができ、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４機能の阻害によって介在される応答をさらに活性化することができることを示した。
【０２３６】
配列表の要約
【表９】
2020103301.tif 000010
【０２３７】
【表１０】
2020103301.tif 000011
【０２３８】
【表１１】
2020103301.tif 000012
【０２３９】
【表１２】
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【０２４０】
【表１３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月26日(2020.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に本明細書に記載され、実施例および図面を参照して説明される発明。