(57)【要約】【課題】本発明の目的は、細胞内の抗酸化機能を亢進する新規成分を提供することである。【解決手段】ヒノキチオールを含有する細胞内の抗酸化機能亢進剤は、チオレドキシン還元酵素、チオレドキシン、及びスルフィレドキシンからなる群より選択される少なくともいずれかを発現促進することでチオレドキシンシステムを活性化し、細胞の抗酸化機能を亢進する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒノキチオールを含有する細胞内の抗酸化機能亢進剤。
【請求項２】
チオレドキシンシステム活性化剤である、請求項１に記載の抗酸化機能亢進剤。
【請求項３】
チオレドキシン還元酵素発現促進剤、チオレドキシン発現促進剤、及びスルフィレドキシン発現促進剤からなる群より選択される少なくともいずれかである、請求項１又は２に記載の抗酸化機能亢進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内の抗酸化機能を亢進する新規成分に関する。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素種によって細胞が傷害を受けると、酸素が関与する有害な反応が起こり、これによってＤＮＡが損傷すると正常な細胞分裂を阻害し、老化や病気が引き起こされると考えられている。一方、細胞には、過剰に発生した活性酸素種に対抗する抗酸化システムも備わっており、この抗酸化システムが正常に機能することで、活性酸素種によるダメージの修復等が行われる。抗酸化システムの代表例としては、Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｕｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ）、Ｇｕｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＧＰｘ）等の抗酸化酵素がそれぞれ関与するシステムが挙げられる。
【０００３】
抗酸化剤は、活性酸素種が関与する有害な反応を減弱もしくは除去する物質であり、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＢ２、カテキン、ポリフェノール、ＣｏＱ１０などが知られている。例えばビタミンＢ２はＧＰｘの補酵素として作用することが知られており、りんごのポリフェノールはＳＯＤ様活性を有することが報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
一方、病原体が宿主に感染すると、宿主に望まれざる反応（感染症）を引き起こす。抗菌剤は、病原体を死滅又は増殖抑制させる物質であり、ペニシリン系、セフェム系、カルバペネム系、モノバクタム系、アミノグリコシド系、テトラサイクリン系、マクロライド系、リンコマイシン系、グリコペプチド系の抗菌剤が知られている。
【０００５】
ヒバなどに含まれる不飽和七員環の単環式モノテルペンであるヒノキチオールも、患者における細菌又はカビに起因する感染症の治療に有用であること（特許文献１）が知られており、比較的広範な抗菌スペクトルを有する殺菌剤として用いられている。ヒノキチオールは、バンコマイシン耐性腸球菌に対しても有用であること（特許文献２）も報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Proanthocyanidins: Food Sources, Antioxidant Properties and Health Benefits. Nova Science, p.p. 139-159 (2015)
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第９３／１７５５９号
【特許文献２】特開２００１−１３１０６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
抗酸化剤は、近年の健康志向と相まって様々なサプリメントなどとして利用されることに加え、医薬品としての有用性も提唱されている。新たな抗酸化剤が見いだされれば、その利用可能性において更なる広がりが期待できる。
【０００９】
そこで、本発明は、細胞内の抗酸化機能を亢進する新規成分を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意検討を行ったところ、これまで抗酸化剤として知られていなかったヒノキチオールに、チオレドキシンシステム活性化による細胞内の抗酸化機能亢進作用があることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
【００１１】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  ヒノキチオールを含有する細胞内の抗酸化機能亢進剤。
項２．  チオレドキシンシステム活性化剤である、項１に記載の抗酸化機能亢進剤。
項３．  チオレドキシン還元酵素発現促進剤、チオレドキシン発現促進剤、及びスルフィレドキシン発現促進剤からなる群より選択される少なくともいずれかである、項１又は２に記載の抗酸化機能亢進剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、細胞内の抗酸化機能を亢進する新規成分が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】試験例１の細胞生存率試験で得られた結果（比較例１、実施例１、参考例３及び参考例４）を示す。
【図２】試験例１の細胞生存率試験で得られた結果（参考例１及び参考例２）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の細胞内の抗酸化機能亢進剤は、ヒノキチオールを含有することを特徴とする。以下、本発明の細胞内の抗酸化機能亢進剤について詳述する。
【００１５】
ヒノキチオール
ヒノキチオールは、天然物に由来する不飽和七員環の単環式モノテルペンである。ヒノキチオールは、低毒性で幅広い抗菌スペクトルを示す殺菌作用を有することが知られている公知の成分である。本発明の細胞内の抗酸化機能亢進剤においては、ヒノキチオールは、細胞内の抗酸化機能を亢進する新たな用途で用いられる。本発明において、ヒノキチオールは、植物から取得された天然物であってもよいし、化学合成品であってもよい。
【００１６】
ヒノキチオールの天然物の原料植物としては、例えばアスナロ（Thujopsis dolabrata）、タイワンヒノキ（Chamaecyparis taiwanensis）等が挙げられる。植物は、栽培により生産されたものであっても天然より採取されたものであってもよい。本発明の細胞内の抗酸化機能亢進剤は、天然物からのヒノキチオールの単離精製物の態様で含んでいてもよいし、天然物からのヒノキチオールの粗精製物の態様で含んでいてもよい。粗精製物の例としては、天然物の加工処理物が挙げられ、好ましくはヒバ油等のヒノキチオール含有精油、ヒノキチオール含有精油の溶媒抽出物、溶媒抽出物のヒノキチオール画分等が挙げられる。前記精油としてはヒバ油が好ましい。原料植物からのヒノキチオールの抽出及び単離精製は公知の方法により行うことができる。
【００１７】
また、ヒノキチオールの化学合成品も公知の方法により得ることができる。具体的には、ジシクロペンタジエンから合成する方法が知られている。
【００１８】
本発明の抗酸化機能亢進剤におけるヒノキチオールの配合量については、当該細胞内の抗酸化機能亢進剤の製剤形態や用途等に応じて適宜設定されるが、通常０．０００１〜０．５量％が挙げられる。細胞内の抗酸化機能亢進効果をより高める観点から、抗酸化機能亢進剤におけるヒノキチオールの配合量としては、好ましくは０．０００３〜０．５重量％、より好ましくは０．０００３〜０．３重量％、更に好ましくは０．０００３〜０．２重量％が挙げられる。
【００１９】
その他の成分
本発明の細胞内の抗酸化機能亢進剤は、ヒノキチオール以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、適用形態に応じて他の成分を含有していてもよい。このような成分としては、例えば、防腐剤、殺菌剤、抗菌剤、消炎剤、抗ヒスタミン剤、局所麻酔剤、血行促進剤、増粘剤、湿潤剤、賦形剤、香料、甘味剤、清涼化剤、色素、消臭剤、界面活性剤、溶剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。
【００２０】
製剤形態
本発明の細胞内の抗酸化機能亢進剤は、上述のヒノキチオールを含む限り、その形態及び性状は特に限定されない。本発明の細胞内の抗酸化機能亢進剤の形態については、外用剤及び内服剤のいずれの形態であってもよく、また、医薬品（医薬部外品を含む）、化粧品、食品（機能性食品、健康保健用食品、病者用食品等を含む）、等のいずれの形態であってもよい。さらに、本発明の細胞内の抗酸化機能亢進剤の性状についても特に制限されず、液状、固形状、半固形状（ゲル状、軟膏状、ペースト状）等のいずれであってもよい。
【００２１】
本発明の細胞内の抗酸化機能亢進剤の製剤形態の具体例としては、ローション剤、乳液剤、軟膏剤、クリーム剤、点鼻剤、経皮吸収剤、坐剤、口腔衛生剤等の外用剤；注射剤、点滴剤等の注入剤；液剤、飲料剤、乳剤、懸濁剤、酒精剤、シロップ剤、エリキシル剤、錠剤、丸剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の内服剤が挙げられる。
【００２２】
製造方法
本発明細胞内の抗酸化機能亢進剤の製造方法は、上記のヒノキチオールと、必要に応じて配合されるその他の成分とを用いて、各種形態及び性状、並びに使用目的に応じ、従来公知の通常の製剤手順に従えばよい。
【００２３】
用途
本発明の細胞内の抗酸化機能亢進剤は、投与によって、細胞が有している抗酸化システムにアプローチして抗酸化システム自体を賦活化する。これによって、活性酸素種による酸化ストレスに対する細胞防御機能を向上させることができる。
【００２４】
本発明の細胞内の抗酸化機能亢進剤は、細胞が有するチオレドキシンシステムを活性化することができる。つまり、本発明の細胞内の抗酸化機能亢進剤は、チオレドキシンシステム活性化剤として用いることができる。
【００２５】
チオレドキシンシステムは、チオレドキシン還元酵素、チオレドキシン、スルフィレドキシン、ペルオキシレドキシン等によって構築される細胞内抗酸化機構の一つである。チオレドキシン還元酵素はチオレドキシンを還元型（活性型）に変換し、チオレドキシンは酸化したタンパク質やペルオキシレドキシンを還元型に変換し、スルフィレドキシンは酸化型ペルオキシレドキシンを還元型に変換する。還元型ペルオキシレドキシンは活性酸素種である過酸化水素を水に変換する。
【００２６】
本発明の細胞内の抗酸化機能亢進剤は、チオレドキシンシステムに関与するチオレドキシン還元酵素、チオレドキシン、及びスルフィレドキシンの発現を促進することで、チオレドキシンシステムを活性化することができる。つまり、本発明の細胞内の抗酸化機能亢進剤は、チオレドキシン発現促進剤、チオレドキシン還元酵素発現促進剤、及びスルフィレドキシン発現促進剤からなる群より選択される少なくともいずれかとして用いることができる。
【００２７】
本発明の細胞内の抗酸化機能亢進剤の適応となる細胞が晒される酸化ストレスとしては、日常活動のあらゆる場面で生じる酸化ストレスが含まれ、一時的に生じる酸化ストレスと慢性的に生じる酸化ストレスとのいずれも含まれる。本発明の細胞内の抗酸化機能亢進剤の適用場所についても、酸化ストレスに晒される細胞が存在する場所であれば特に限定されず、例えば、皮膚、粘膜、臓器等が含まれる。
【００２８】
具体的には、本発明の細胞内の抗酸化機能亢進剤は、酸化ストレスによる病態の予防又は治療のために用いることができる。より具体的には、本発明の細胞内の抗酸化機能亢進剤は、生活習慣病の予防又は治療、老化の予防において酸化ストレスをコントロールするために用いることができる。
【００２９】
本発明の細胞内の抗酸化機能亢進剤の用量としては、製剤形態及び適用する症状の程度等に応じて適宜設定すればよい。例えば、外用剤の場合、１日数回、皮膚又は粘膜に適用することができる。具体的には、１回当たり、ヒノキチオールが０．００２〜２ｍｇとなる量で、１日１〜数回程度の頻度で適用することができる。
【実施例】
【００３０】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３１】
試験例１：細胞生存率試験
試験細胞として、歯肉繊維芽細胞ＨＧＦ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用い、富士フイルム和光純薬株式会社製ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地にＣｏｒｎｉｎｇ製ウシ胎児血清を１０重量％加えた培地でコラーゲンコートされた９６穴プレートに細胞数１万個／穴、培地量１００μＬ／穴で播種を行った。３７℃、５％ＣＯ2でサブコンフルエント状態まで培養後、表１の培養液に交換し６時間培養した後に、ウシ胎児血清を１０％含むＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地に交換し、さらに４８時間培養を行った。培養完了後、培地を、ウシ胎児血清を１０％含むＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地に更にアラマーブルー１０％を加えた培地に交換した。２時間後にプレートリーダーで６００ｎｍの吸光度（リファレンス）と５７０ｎｍの吸光度を測定し、表１の参考例１の培地のみの条件を１００％として細胞生存率を算出した。なお、ヒノキチオールとしては高砂香料工業株式会社製ヒノキチオールを用い、培地中２０μＭのヒノキチオールは、培地中０．０００３重量％ヒノキチオールに相当する。オーラノフィンは、富士フイルム和光純薬株式会社製オーラノフィンを用いた。オーラノフィンは、チオレドキシン還元酵素を阻害することで、チオレドキシンシステムの機能を低下又は停止させる。チオレドキシン還元酵素は、細胞内の抗酸化システムの１つであるチオレドキシンシステムを構築する成分である。
【００３２】
【表１】
2020103100.tif 000002
【００３３】
結果を図１及び図２に示す。図中、縦軸は細胞生存率を表し、統計解析はTukeyの検定にて実施した。比較例１に示すように過酸化水素に晒されることによって細胞がほとんど死滅した一方で、実施例１に示すように、細胞暴露環境において過酸化水素と共にヒノキチオールを共存させることによって、細胞生存率が顕著に向上した。また、参考例３及び４に示すように、細胞暴露環境において過酸化水素及びヒノキチオールと共にチオレドキシン還元酵素阻害剤を共存させると、再び細胞の生存率が顕著に減少し、その程度は、チオレドキシン還元酵素阻害剤の濃度に依存した。これは、チオレドキシン還元酵素が阻害されることでヒノキチオールによる抗酸化作用が働かなくなることを意味する。なお、参考例２に示すように、過酸化水素が存在しない細胞暴露環境にオーラノフィンを共存させても、コントロール（参考例１）と同様の細胞生存率であった。つまり、オーラノフィン自体は、過酸化水素が存在しない環境では細胞生存率に影響を与えなかった。これらのことから、ヒノキチオールがチオレドキシンシステムを活性化することによって細胞生存率を向上させたことが示された。
【００３４】
試験例２：ＲＮＡ-Ｓｅｑ遺伝子発現量試験
試験細胞として、歯肉繊維芽細胞ＨＧＦ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用い、富士フイルム和光純薬株式会社製ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地にＣｏｒｎｉｎｇ製ウシ胎児血清を１０重量％加えた培地で５ｃｍシャーレに細胞数２００万個、培地量３．５ｍＬで播種を行った。３７℃、５％ＣＯ２でサブコンフルエント状態まで培養後、表２に示す培養液に交換し２４時間培養した。培養完了後、Ｖｉｏｇｅｎｅ製Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍを用いて細胞からトータルＲＮＡを回収し、ｉｌｌｕｍｉｎａ製ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いてライブラリを作製した。作製されたライブラリについてｉｌｌｕｍｉｎａ製ＨｉＳｅｑ２５００シーケンサーを用いて５０−ｂａｓｅ ｓｉｎｇｌｅ ｒｅａｄシーケンシングを実施した。得られたリードを、ＳＴＡＲを用いてヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８）にマッピングしたのち、マップされたリード数を遺伝子ごとにカウントし、ＤＥＳｅｑ２により２群間発現比較統計解析を行った。具体的には、比較例２を基準に実施例２の遺伝子発現量を比較し、表３に示す抗酸化システムのマーカー遺伝子（Ｓｙｍｂｏｌ）の倍率変化（Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ）を解析した結果を表３に示した。
【００３５】
【表２】
2020103100.tif 000003
【００３６】
【表３】
2020103100.tif 000004
【００３７】
表３に示すように、チオレドキシンを還元型（活性型）に変換するチオレドキシン還元酵素ＴＸＮＲＤ１、酸化したタンパク質やペルオキシレドキシンを還元型に変換するチオレドキシンＴＸＮ、及び酸化型ペルオキシレドキシンを還元型に変換するスルフィレドキシンＳＲＸＮ１がそれぞれ１．９倍、１．２倍、２．５倍に発現促進されたことを確認した。一方、ＳＯＤ、ＧＰＸ、ＣＡＴ等の他の抗酸化システムを構築する酵素については０．８〜１．１倍の発現変化であり、明らかな促進作用が認められなかった。つまり、ヒノキチオールが、チオレドキシン還元酵素、チオレドキシン、及び／又はスルフィレドキシンの発現を促進することが示された。
【図１】
2020103100.tif 000005
【図２】
2020103100.tif 000006