(57)【要約】      （修正有）【課題】抗体依存性細胞傷害活性が向上した抗体を製造する方法の提供。【解決手段】抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する工程と、得られた培養物中に含まれる前記哺乳動物細胞が発現した抗体を回収する工程とを含む、抗体の製造方法において、前記培養工程を０．２ｍＭから４ｍＭのＬ‐グルタミンを添加した培地で行なうことで、抗体依存性細胞傷害活性が向上した抗体を製造する方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する工程と、得られた培養物中に含まれる前記哺乳動物細胞が発現した抗体を回収する工程とを含む、抗体の製造方法において、
前記培養工程を０．２ｍＭから４ｍＭのＬ‐グルタミンを含有する培地で行なうことで、抗体依存性細胞傷害活性が向上した抗体を製造する方法。
【請求項２】
抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する工程を、０．２ｍＭから４ｍＭのＬ‐グルタミンおよび０．３μＭから７μＭのマンガンイオンを含有する培地で行なう、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
抗体がヒトＦｃ領域を含む抗体である、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
請求項３に記載の製造方法で得られた抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性を評価することで、請求項３に記載の製造方法における培養工程をモニタリングする方法。
【請求項５】
請求項３に記載の製造方法で得られた抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性を評価することで、請求項３に記載の製造方法における培地成分を評価する方法。
【請求項６】
請求項３に記載の製造方法で得られた抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性評価を、請求項３に記載の製造方法で得られた抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化分離剤との結合力に基づき行なう、請求項４または５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有した抗体を製造する方法に関する。より詳しくは、抗体を発現可能な宿主を培養する工程を最適化することで、当該宿主が発現する抗体が有するＡＤＣＣ作用を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、組換えタンパク質は幅広い分野で使用されている。近年の抗体医薬品に代表されるバイオ医薬品の成長によりその重要性はさらに高まっている。組換えタンパク質は主に大腸菌、酵母、昆虫細胞、哺乳細胞を宿主として製造されているが、発現させた組換えタンパク質の立体構造や、糖鎖付加といった翻訳後修飾等の理由から哺乳動物細胞を宿主として用いた組換えタンパク質発現系が多く使用されている。哺乳動物細胞の中でも特にチャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞）は多くの組換えタンパク質発現の宿主として用いられている。また組換えＣＨＯ細胞由来の組換えタンパク質は、医薬品として使用できる安全性が確認されていることから、ＣＨＯ細胞は抗体医薬品を製造する際の宿主として最もよく使用される哺乳動物細胞である。
【０００３】
抗体医薬品はモノクローナル抗体を主成分とした医薬品であり、その治療効果として信号伝達阻害、細胞死（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の誘導、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）作用や補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）作用などがある。このうちＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性はエフェクター機能と呼ばれており免疫メカニズムを誘導することで癌等の目的細胞を傷害するため重要である。特にＡＤＣＣ活性は抗体医薬品の細胞傷害作用には重要な活性である。
【０００４】
抗体が有するＡＤＣＣ活性を向上させる方法として、抗体のＦｃ領域にある特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する方法や、抗体のＦｃ領域に付加する糖鎖を改変する方法がある。抗体のＦｃ領域に付加する糖鎖には、特定のアミノ酸配列（例えば、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）（Ｘは任意のアミノ酸残基を示す）のアスパラギン（Ａｓｎ）基の側鎖に付加するＮ型糖鎖と、セリン（Ｓｅｒ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）残基の側鎖に結合するＯ型糖鎖がある。このうちＮ型糖鎖のコアフコースを欠損させることでＡＤＣＣ活性が向上する報告がされている（非特許文献１）。
【０００５】
抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養し、得られた培養物中に含まれる前記哺乳動物細
胞が発現した抗体を回収することで、前記抗体を製造する際、前記哺乳動物細胞の培養条
件を変化させると、前記抗体のＦｃ領域に付加するＮ型糖鎖の構造が変化することが知ら
れている（特許文献１）。しかしながら、実際に抗体のＦｃ領域へ付加する糖鎖は不均一
であり、前記糖鎖の構造とＡＤＣＣ活性との関係を完全に結び付けることは難しい。従っ
て、糖鎖構造を制御してＡＤＣＣ活性の高い抗体を製造する条件、特に前記抗体を発現可
能な哺乳動物細胞を培養する条件の構築は困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１７−５０６５１５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｏｒｉ．Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５５，１０９−１１４（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する工程と、得られた培養物中に含まれる前記哺乳動物細胞が発現した抗体を回収する工程とを含む、抗体の製造方法において、高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する工程において、前記哺乳動物細胞の栄養源であるグルタミン（Ｇｌｎ）を制限した培地で培養することで、得られた培養物中に含まれる前記哺乳動物細胞が発現した抗体の抗体依存性細胞傷害が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下に記載の態様を包含する。
【００１１】
（１）抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する工程と、得られた培養物中に含まれる前記哺乳動物細胞が発現した抗体を回収する工程とを含む、抗体の製造方法において、
前記培養工程を０．２ｍＭから４ｍＭのグルタミンを含有する培地で行なうことで、抗体依存性細胞傷害活性が向上した抗体を製造する方法。
【００１２】
（２）抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する工程を、０．２ｍＭから４ｍＭのグルタミンおよび０．３μＭから７μＭのマンガンイオンを含有する培地で行なう、（１）に記載の製造方法。
【００１３】
（３）抗体がヒトＦｃ領域を含む抗体である、（１）または（２）に記載の製造方法。
【００１４】
（４）（３）に記載の製造方法で得られた抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性を評価することで、（３）に記載の製造方法における培養工程をモニタリングする方法。
【００１５】
（５）（３）に記載の製造方法で得られた抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性を評価することで、（３）に記載の製造方法における培地成分を評価する方法。
【００１６】
（６）（３）に記載の製造方法で得られた抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性評価を、（３）に記載の製造方法で得られた抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化分離剤との結合力に基づき行なう、（４）または（５）に記載の方法。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明の製造方法は、抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する際、培地に添加するＬ‐グルタミンの濃度を、０．２ｍＭから４ｍＭの範囲に制限して培養することを特徴としている。培地中のＬ‐グルタミンが前述した濃度範囲であれば、細胞の増殖性や抗体の生産性が著しく阻害されることはない。Ｌ‐グルタミンの培地への添加は、例えば、高濃度のＬ−グルタミン溶液をフィルター滅菌し、前述した濃度範囲となるよう培地に添加すればよい。またＬ−グルタミンより安定性の高いＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを、本発明において培地に添加するＬ‐グルタミンとして用いてもよい。Ｌ‐グルタミンの培地への添加量は終濃度として前述した濃度範囲となるよう添加すればよく、終濃度０．５ｍＭから３ｍＭとなるよう添加すると好ましく、終濃度０．５ｍＭから２ｍＭとなるよう添加するとより好ましく、終濃度０．５ｍＭから１ｍＭとなるよう添加するとさらにより好ましい。
本発明の製造方法で使用する哺乳動物細胞は、製造対象抗体を発現可能な細胞であれば特に制限はない。一例を示すと、ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ＤＧ４４およびＣＨＯ−ＤＸＢ１１）、マウス骨髄腫由来細胞（ＳＰ２／０、ＮＳ０）、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ細胞）、ヒト白血病細胞由来細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト子宮頸癌由来細胞（ＨｅＬａ細胞）およびアフリカミドリザルの腎細胞由来細胞（ＣＯＳ細胞）があげられる。中でも組換え抗体製造に汎用されるＣＨＯ細胞の使用が好ましい。
【００１９】
本発明の製造方法で使用する培地は、０．２ｍＭから４ｍＭのＬ‐グルタミンを含み、かつ宿主である哺乳動物細胞が生育し抗体を発現可能な培地であれば、特に限定はない。一例を示すと、動物由来の血清が必要な培地（ＲＰＭＩ１６４０、Ｄ−ＭＥＭ等）や化学的に成分が決定されている培地（ＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ［Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製］、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＭｅｄｉｕｍＣＤ［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製］、ＯｐｔｉＣＨＯ［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製］、ＥＸ−ＣＥＬＬ  ＣＤ  ＣＨＯ  Ｆｕｓｉｏｎ、ＥＸ−ＣＥＬＬ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣＨＯ  Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  Ｍｅｄｉｕｍ［Ｍｅｒｃｋ社製］およびＣＨＯｇｒｏ［Ｍｉｒｕｓ社製］）に前述した濃度のＬ‐グルタミンを添加した培地があげられる。さらに前述した培地に、栄養素、ホルモン、成長因子、特定イオン（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等）、ビタミン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、Ｌ‐グルタミン以外のアミノ酸、無機塩（銅、亜鉛、コバルト、ニッケル等）、脂質、グルコースをはじめとする培地構成成分が含まれていてもよい。またＧ４１８、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、カナマイシン、アンピシリンといった、汚染防止や遺伝子組換え細胞の選択に用いる抗生物質をさらに添加してもよい。
【００２０】
本発明の製造方法における培養工程は、宿主として用いる哺乳動物細胞や前記細胞で発現させる抗体に応じて適宜行なえばよい。一例として、
前述した濃度のＬ‐グルタミンを添加した培地を入れたフラスコに、抗体を発現可能な哺乳動物細胞を接種後、当該フラスコを振盪させて培養してもよく、
バイオリアクターで、前述した濃度範囲になるようＬ‐グルタミン濃度を制御しながら、回分培養、半回分培養（流加培養ともいう）、潅流培養またはそれらの組合せにより培養してもよい。
哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞の場合、５％から８％のＣＯ２存在下、温度３０℃から３７℃、ｐＨ６．８から７．４で培養すると好ましい。
【００２１】
なお本発明の製造方法において、前述した濃度範囲のＬ‐グルタミンに加え、０．３μＭから７μＭのマンガンイオンをさらに添加した培地を用いて抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養すると、前記抗体が有するＡＤＣＣ活性がさらに向上するため、好ましい。なお培地中のマンガンイオンが前述した濃度範囲であれば、細胞の増殖性や抗体の生産性が著しく阻害されることはない。マンガンイオンの培地への添加は、水溶液中でマンガンイオンとして存在可能なマンガン化合物を添加すればよい。前記マンガン化合物の例として、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）や硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４）が例示できる。マンガン化合物の添加量は、培地中のマンガンイオンが終濃度として前述した濃度範囲となるよう添加すればよい。
【００２２】
本発明の方法で製造する抗体の一例として、ヒトＦｃ領域を含む抗体があげられる。具体的には、ヒト抗体、ヒト化抗体、ヒトと他の動物（マウスなど）とのキメラ抗体、ヒトＦｃ融合タンパク質などがあげられる。ヒトＦｃ領域を含む抗体がイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）の場合、４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）が知られているが、このうちＩｇＧ１とＩｇＧ３は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性が高い点で、本発明の方法で製造する抗体の好ましい態様といえる。さらにＩｇＧ１はＡＤＣＣ活性が高く、分子の安定性も高いことから本発明の方法で製造する抗体の特に好ましい態様といえる。
【００２３】
本発明の製造方法で使用する、抗体を発現可能な哺乳動物細胞は、前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで、前記哺乳動物細胞を形質転換し作製すればよい。前記発現ベクターには、プロモーターおよび前記抗体をコードするポリヌクレオチドの他に、ポリＡや、組換え抗体の分泌発現に必要な分泌シグナルや、遺伝子増幅マーカー遺伝子や、宿主選択に用いる抗生物質耐性遺伝子や、遺伝子組換えのために用いる哺乳動物細胞以外の宿主での複製開始点等をさらに含んでもよい。
【００２４】
前記ポリＡはターミネーションシグナルを含んでいれば特に制限はなく、一例として、発現させる抗体由来のポリＡ、ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のポリＡ、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼのポリＡ、ウシ成長ホルモン由来のポリＡ、ウサギのβ−グロビン遺伝子由来のポリＡがあげられる。
【００２５】
前記分泌シグナルは発現抗体を分泌すれば特に制限はなく、その一例としては、発現させる組換え抗体由来の分泌シグナル、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）の分泌シグナル、アズロシジン前駆体の分泌シグナル、ヒト血清アルブミンの分泌シグナルがあげられる。
【００２６】
前記遺伝子増幅マーカー遺伝子は、遺伝子増幅させる方法に適した遺伝子を用いればよい。例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）／メトトレキサート（ＭＴＸ）法を用いる場合はｄｈｆｒ遺伝子を、グルタミン合成酵素（ＧＳ）／メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）法を用いる場合はＧＳ遺伝子を、それぞれ用いればよい。
【００２７】
前記抗生物質耐性遺伝子は、宿主選択に用いる抗生物質に対応した耐性遺伝子を選択すればよく、一例として、Ｇ４１８耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、フレオマイシン耐性遺伝子があげられる。
【００２８】
前記複製開始点は、哺乳動物細胞以外の宿主が大腸菌である場合、大腸菌内でのコピー数が高くプラスミドＤＮＡの収量が多い、ＣｏｌＥ１が例示できる。
【００２９】
さらに前記発現ベクターには、プロモーターの働きを強めるためのエンハンサーをさらに含んでもよい。使用するエンハンサーに特に制限はなく、発現させる抗体や哺乳動物細胞を考慮し、適宜選択すればよい。一例としてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のエンハンサーがあげられる。
【００３０】
また哺乳動物に導入した遺伝子（抗体をコードするポリヌクレオチド）が発現しやすくするために、宿主細胞ゲノムの特定領域に選択的に遺伝子導入してもよい。一例として、前記発現ベクターにＬｏｘＰ遺伝子をさらに含ませて、Ｃｒｅリコンビナーゼによる相同組換えを行なうことで、部位特異的に宿主細胞ゲノム中のＬｏｘＰ遺伝子へ組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入できる。また、宿主細胞のゲノムへ部位特異的に組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入する方法としてＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ９などを用いることもできる。
【００３１】
前記発現ベクターで哺乳動物細胞を形質転換するには、エレクトロポレーションやカチオニックリポソームを用いたリポフェクションなど、当業者が通常用いる形質転換法の中から、宿主として使用する哺乳動物細胞に合わせて適宜選択すればよい。
【００３２】
前述した方法で抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養後、得られた培養物中に含まれる前記哺乳動物細胞が発現した抗体を回収することで、ＡＤＣＣ活性が向上した抗体を製造する。抗体の回収方法の一例として、前記得られた培養物から、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーによる精製操作を単独または組み合わせて抗体を回収する方法があげられる。前記方法は抗体を高効率かつ高純度に回収できる点で好ましい。
【００３３】
本発明で製造する抗体が、ヒトＦｃ領域を含む抗体である場合、前記抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性を評価することで、抗体を発現可能な哺乳動物細胞の培養状態（培養工程）をモニタリングできる。ヒトＦｃ領域を含む抗体に付加するＮ型糖鎖を欠損させると前記抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性が著しく低下する。またヒトＦｃ領域を含む抗体が有するＡＤＣＣ活性は、当該Ｆｃ領域と免疫細胞表面上のヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性（結合性）と関連することが知られている（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ．Ｊ，Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３，６，（２０１１））。従って、ヒトＦｃ領域を含む抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性を評価することで、製造する抗体が有するＡＤＣＣ活性をモニタリングでき、抗体を発現可能な哺乳細胞の培養工程をモニタリングできる。一例として、ヒトＦｃ領域を含む抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性が低下した場合、当該抗体が有するＡＤＣＣ活性が低下しているため、当該抗体が有するＡＤＣＣ活性を向上すべく、Ｌ‐グルタミン濃度などの培地成分や培養条件（二酸化炭素濃度、温度、ｐＨ、時間など）を適宜調整する。
【００３４】
ヒトＦｃ領域を含む抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性評価の好ましい態様として、ヒトＦｃ領域を含む抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化分離剤との結合力に基づく評価があげられる。ヒトＦｃγＲＩＩＩａを担体に固定化して得られるヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化分離剤を充填したカラムに、ヒトＦｃ領域を含む抗体をアプライすると、前記抗体が付加した糖鎖構造の違いに基づき分離され（特開２０１５−０８６２１６号公報、ＷＯ２０１８／１５０９７３号）、かつ前記抗体が有するＡＤＣＣ活性の違いに基づき分離される（特開２０１６−０２３１５２号公報、ＷＯ２０１８／１５０９７３号）。従って、前記分離パターンの形状に基づき、本発明における、抗体を発現可能な哺乳動物細胞の培養状態（培養工程）のモニタリングができる。具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化分離剤を充填したカラムを用いてヒトＦｃ領域を含む抗体を分離すると、ＡＤＣＣ活性の高い抗体がＡＤＣＣ活性の低い抗体よりも遅れて溶出される（すなわちＡＤＣＣ活性の高い抗体はヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化分離剤との結合力が強い）。従って、前記分離により得られた溶出パターンのピーク面積またはピーク高さから、ＡＤＣＣ活性が高い抗体が溶出されるピーク（画分）の量および／または割合を算出し、当該量および／または割合が低下した場合、当該抗体が有するＡＤＣＣ活性が低下しているため、当該抗体が有するＡＤＣＣ活性を向上すべく、Ｌ‐グルタミン濃度などの培地成分や培養条件（二酸化炭素濃度、溶存酸素濃度、温度、ｐＨ、時間など）を適宜調整する。
【００３５】
また、培養条件や細胞株を同条件とし培地成分のみを変えて培養して得られたヒトＦｃ領域を含む抗体と、ヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性を評価することで、よりＡＤＣＣ活性が高くなる培地成分の評価も行なえる。一例として、培地成分の異なる培地で培養して得られた抗体を、前述したヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化分離剤を充填したカラムにアプライし、得られた分離パターンの形状やピーク（画分）の量および／または割合に基づき、前記抗体が有するＡＤＣＣ活性を評価し、前記培地成分の違いによるＡＤＣＣ活性を比較することで、培地成分を評価できる。
【００３６】
なお本明細書においてヒトＦｃγＲＩＩＩａとは、
（Ａ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０８６３７）のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含む、Ｆｃ結合性タンパク質、または
（Ｂ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０８６３７）のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、１以上のアミノ酸残基が欠失、他のアミノ酸残基に置換、または付加されたポリペプチドを含む、Ｆｃ結合性タンパク質、のことを意味する。また前記（Ｂ）の好ましい態様として、
特開２０１５−０８６２１６号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１６−１６９１９７号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１７−１１８８７１号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
ＷＯ２０１８／１５０９７３号で開示のＦｃ結合性タンパク質、
があげられる。
【００３７】
また本発明において、ＡＤＣＣ活性が向上した抗体とは、例えば、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化分離剤を充填したカラムを用いた分離により得られた結果（溶出パターン）のうち、ＡＤＣＣ活性の高い抗体が位置するピーク面積またはピーク高さの割合が、Ｌ‐グルタミン濃度を制限しなかったとき（例えば、Ｌ‐グルタミン濃度１０ｍＭの培地）の前記割合と比較し、１％以上、好ましくは２％以上、より好ましくは４％以上向上した抗体のことを意味する。
【発明の効果】
【００３８】
本発明は、抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する工程と得られた培養物中に含まれる前記哺乳動物細胞が発現した抗体を回収する工程とを含む抗体の製造方法において、前記培養工程を０．２ｍＭから４ｍＭのＬ‐グルタミンを添加した培地で行なうことを特徴としている。本発明により、抗癌剤など抗体依存性細胞障害活性を必要とする抗体やＦｃ融合タンパク質を効率的に製造できる。
【００３９】
また本発明で製造する抗体がヒトＦｃ領域を含む抗体の場合、前記抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性を評価することで、本発明の製造方法における培養工程のモニタリングや培地成分の評価が行なえる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】哺乳動物用発現プラスミドｐＥＦｄのプラスミドマップを示している。
【図２】０．１ｍＭから１０ｍＭのＬ‐グルタミンを添加したＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍで抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞をフラスコ培養し得られた抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラム分析の結果を示している。
【図３】０．１ｍＭから１０ｍＭのＬ‐グルタミンを添加したＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍで抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体発現細胞をフラスコ培養し得られた抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラム分析の結果を示している。
【図４】０．５ｍＭから１０ｍＭのＬ‐グルタミンを添加したＣＤ  Ｏｐｔｉ  ＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍで抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞をフラスコ培養し得られた抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラム分析の結果を示している。
【図５】１ｍＭのＬ‐グルタミンを添加したＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍで抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞をジャーファーメンターでバッチ培養し得られた抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラム分析の結果を示している。
【図６】１０ｍＭのＬ‐グルタミンを添加したＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍで抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞をジャーファーメンターでバッチ培養し得られた抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラム分析の結果を示している。
【図７】１ｍＭまたは１０ｍＭのＬ‐グルタミンを添加したＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍで抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞をジャーファーメンターでバッチ培養したときの抗体生産性の推移を示している。図中、ひし形が１ｍＭのＬ‐グルタミン添加時の、正方形が１０ｍＭのＬ‐グルタミン添加時の、それぞれ結果である。
【図８】１ｍＭまたは１０ｍＭのグルタミンを添加したＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍで抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞をジャーファーメンターでバッチ培養したときの生細胞数の推移を示している。図中、ひし形が１ｍＭのＬ‐グルタミン添加時の、正方形が１０ｍＭのＬ‐グルタミン添加時の、それぞれ結果である。
【図９】硫酸マンガン（マンガンイオン）未添加（Ａ）、または硫酸マンガン（マンガンイオン）を１μＭ（Ｂ）、５μＭ（Ｃ）もしくは１０μＭ（Ｄ）添加した培地において、０．５ｍＭ、２ｍＭまたは８ｍＭのＬ‐グルタミンをさらに添加したＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍで抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞をフラスコ培養し得られた抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラム分析の結果を示している。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例を用いて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。
【００４２】
実施例１  抗インターロイキン６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）抗体発現細胞の構築
（１）以下の方法で抗ＩＬ−６Ｒ抗体を哺乳動物細胞で発現可能なベクターを構築した。
（１−１）配列番号１に記載のジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ｄｈｆｒ）およびＳＶ４０のＰｏｌｙＡをコードする遺伝子に制限酵素ＳａｃＩＩ認識配列（ＣＣＧＣＧＧ）を５’末端および３’末端の両方に付加した遺伝子を全合成し（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に委託）プラスミドにクローニングした。
（１−２）（１−１）で作製したプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を培養し、プラスミドを抽出したのち、制限酵素ＳａｃＩＩで消化することで、ｄｈｆｒ−ＳＶ４０ＰｏｌｙＡをコードする遺伝子を調製しｄｈｆｒ−Ｐ１と命名した。
（１−３）ｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型として、配列番号２（５’−ＴＣＣ［ＣＣＧＣＧＧ］ＧＣＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＡＴＧＡＣＣＧ−３’）および配列番号３（５’−ＴＣＣ［ＣＣＧＣＧＧ］ＧＧＴＧＧＣＴＣＴＡＧＣＣＴＴＡＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号２および３中の角かっこは制限酵素ＳａｃＩＩ認識配列を示している）を用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表１に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で３０秒間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、ｐＩＲＥＳベクターのうちネオマイシン耐性遺伝子を除いた領域を増幅した。
【００４３】
【表１】
2020188737.tif 000003
【００４４】
（１−４）（１−３）で作製したＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＳａｃＩＩで消化し、（１−２）で調製したｄｈｆｒ−Ｐ１とライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することでｄｈｆｒ遺伝子を含んだ発現ベクターｐＩＲＥＳ−ｄｈｆｒを得た。
【００４５】
（２）（１）で作製したｐＩＲＥＳ−ｄｈｆｒを鋳型として配列番号４（５’−ＴＴＴＡＡＡＴＣＡ［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＧＣＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＡＡＡＴＡＡＣＣＴＣＴＧ−３’）および配列番号５（５’−ＧＣＡＡＧＴＡＡＡＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＴＡＡＡ［ＣＧＡＴＣＧ］ＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号４中の角かっこは制限酵素ＮｏｔＩ認識配列を、配列番号５中の角かっこは制限酵素ＰｖｕＩ認識配列を、それぞれ示している）を用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で１分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより増幅したＰＣＲ産物（ＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒ、ＳＶ４０のＰｏｌｙＡまでの領域を）をｄｈｆｒ−Ｐ２と命名した。
【００４６】
【表２】
2020188737.tif 000004
【００４７】
（３）ヒト抗体の重鎖定常領域を含んだｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）、ヒト抗体の軽鎖定常領域を含んだｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）および（２）で作製したｄｈｆｒ−Ｐ２をそれぞれ制限酵素ＮｏｔＩおよびＰｖｕＩで消化した後、精製しライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することでＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒ、ＳＶ４０のＰｏｌｙＡを含んだｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１およびｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋを得た。ｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１にＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒおよびＳＶ４０のＰｏｌｙＡを組込んだプラスミドをｐＦＵ−ＣＨＩｇ−ｄｈｆｒと命名し、ｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋにＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒおよびＳＶ４０のＰｏｌｙＡを組込んだプラスミドをｐＦＵ−ＣＬＩｇ−ｄｈｆｒと命名した。
【００４８】
（４）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる抗インターロイキン６レセプター（以下、ＩＬ−６Ｒ）抗体の重鎖可変領域をコードする配列番号７に記載のポリヌクレオチドの５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）とフレームシフト抑制のためのグアニン（Ｇ）を付加し、３’末端に制限酵素ＮｈｅＩ認識配列（ＧＣＴＡＧＣ）を付加した遺伝子を全合成しプラスミドにクローニングした（ＦＡＳＭＡＣ社に委託）。作製したプラスミドをｐＵＣ−ＶＨ６Ｒと命名した。また、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる抗ＩＬ−６Ｒ抗体の軽鎖可変領域をコードする配列番号９に記載のポリヌクレオチドの５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）とフレームシフト抑制のためのグアニン（Ｇ）を付加し、３’末端に制限酵素ＢｓｉＷＩ認識配列（ＣＧＴＡＣＧ）を付加した遺伝子を全合成しプラスミドにクローニングした（ＦＡＳＭＡＣ社に委託）。作製したプラスミドをｐＵＣ−ＶＬ６Ｒと命名した。
【００４９】
（５）（４）で作製したｐＵＣ−ＶＨ６Ｒおよび（３）で作製したｐＦＵ−ＣＨＩｇ−ｄｈｆｒをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｈｅＩで消化後、精製し、ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで、抗ＩＬ−６Ｒ抗体の重鎖（Ｈ鎖）を発現するプラスミドｐＦＵ−６ＲＨ−ｄｈｆｒを得た。また（４）で作製したｐＵＣ−ＶＬ６Ｒおよび（３）で作製したｐＦＵ−ＣＬＩｇ−ｄｈｆｒをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩで消化後、精製し、ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで、抗ＩＬ−６Ｒ抗体の軽鎖（Ｌ鎖）を発現するプラスミドｐＦＵ−６ＲＬ−ｄｈｆｒを得た。
【００５０】
実施例２  抗ＩＬ−６Ｒ抗体高発現細胞の構築
（１）実施例１で作製したｐＦＵ−６ＲＨ−ｄｈｆｒおよびｐＦＵ−６ＲＬ−ｄｈｆｒを、ＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株）にＮｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて遺伝子導入した。その後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、４０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含んだＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で形質転換細胞を培養し抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞を得た。その後、培地に５０ｎｇ／ｍＬのメトトレキサート（ＭＴＸ）を添加することで遺伝子増幅を行なった。
【００５１】
（２）（１）でＭＴＸ処理をした細胞を限外希釈法により単クローン化し、下記に記載のＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）を用いて、抗ＩＬ−６Ｒ抗体を安定的に高生産可能な細胞を選択した。
（２−１）抗ヒトＦａｂ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌで固定化した（４℃で一晩）。固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ  ＭＩＬＫ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）および１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）によりブロッキングした。
（２−２）洗浄緩衝液（０．０５％［ｗ／ｖ］のＴｗｅｅｎ  ２０（商品名）と１５０ｍＭのＮａＣｌとを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、抗体を含んだ培養上清を添加し、抗体と固定化タンパク質とを反応させた（３０℃で１時間）。
（２−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したペルオキシターゼで標識された抗ヒトＦｃ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（２−４）３０℃で１時間反応し、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。その後、１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定し、測定値の高い抗ＩＬ−６Ｒ抗体高生産細胞株を選択した。
【００５２】
（３）ＭＴＸ濃度を段階的（５０ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、４μＭ、８μＭ、１６μＭ、３２μＭ、６４μＭ）に上昇させながら、限外希釈を行ない（２）に記載のＥＬＩＳＡでクローン選択を行なうことを繰り返した。その結果、抗ＩＬ−６Ｒ抗体高生産細胞株を得た。
【００５３】
実施例３  抗ヒトｇｐ１３０受容体（ｇｐ１３０Ｒ）抗体高発現細胞の構築
（１）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなる抗ヒトｇｐ１３０受容体（ｇｐ１３０Ｒ）抗体の重鎖可変領域をコードする配列番号１１に記載のポリヌクレオチドの５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）とフレームシフト抑制のためのグアニン（Ｇ）を付加し、３’末端に制限酵素ＮｈｅＩ認識配列（ＧＣＴＡＧＣ）を付加した遺伝子を全合成しプラスミドにクローニングした（ＦＡＳＭＡＣ社に委託）。作製したプラスミドをｐＵＣ−ＶＨｇｐ１３０と命名した。また、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体の軽鎖可変領域をコードする配列番号１３に記載のポリヌクレオチドの５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）とフレームシフト抑制のためのグアニン（Ｇ）を付加し、３’末端に制限酵素ＢｓｉＷＩ認識配列（ＣＧＴＡＣＧ）を付加した遺伝子を全合成しプラスミドにクローニングした（ＦＡＳＭＡＣ社に委託）。作製したプラスミドをｐＵＣ−ＶＬｇｐ１３０と命名した。
【００５４】
（２）（１）で作製したｐＵＣ−ＶＨｇｐ１３０および実施例１（３）で作製したｐＦＵ−ＣＨＩｇ−ｄｈｆｒをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｈｅＩで消化後、精製し、ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで、抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体の重鎖（Ｈ鎖）を発現するプラスミドｐＦＵ−ｇｐ１３０Ｈ−ｄｈｆｒを得た。また（１）で作製したｐＵＣ−ＶＬｇｐ１３０および実施例１（３）で作製したｐＦＵ−ＣＬＩｇ−ｄｈｆｒをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩで消化後、精製し、ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで、抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体の軽鎖（Ｌ鎖）を発現するプラスミドｐＦＵ−ｇｐ１３０Ｌ−ｄｈｆｒを得た。
【００５５】
（３）（２）で得られたｐＦＵ−ｇｐ１３０Ｌ−ｄｈｆｒを鋳型として、配列番号１４（５’−ＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＧＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣ−３’）および配列番号１５（５’−ＡＡＴ［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＴＡＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣ−３’）（配列番号１５中の角かっこは制限酵素ＮｏｔＩ認識配列を示している）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表３に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体のＬ鎖全長をコードする遺伝子を増幅し、精製後に得られたＰＣＲ産物をｈｇｐ１３０−Ｌ１と命名した。
【００５６】
【表３】
2020188737.tif 000005
【００５７】
（４）（３）で得られたｈｇｐ１３０−Ｌ１を鋳型として、配列番号１６（５’−ＣＴＡ［ＧＡＡＴＴＣ］ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣ−３’）および配列番号１５（配列番号１６中の角かっこは制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列を示している）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるシグナル配列（ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ）を付加するため、配列番号１７に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号１８（５’−ＡＴＧＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＧＣＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣ−３’）に記載のポリヌクレオチドを添加してＰＣＲを行なった。具体的には、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体のＬ鎖全長をコードする遺伝子に配列番号１７に記載のシグナル配列をコードする遺伝子を付加した遺伝子を増幅し、精製後に得られたＰＣＲ産物をｈｇｐ１３０−Ｌ２と命名した。
【００５８】
【表４】
2020188737.tif 000006
【００５９】
（５）（４）で得られたｈｇｐ１３０−Ｌ２および図１に記載の発現ベクターｐＥＦｄをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、精製後ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで哺乳動物細胞において抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体のＬ鎖を発現可能なプラスミドｐＥＦｄ−ｇｐ１３０Ｌを得た。なお、図１に記載のｐＥＦｄベクターは配列番号１９に記載のＥＦ１αプロモーターのうち６２１番目のグアニンから７９８番目のグアニンまでのヌクレオチドが欠損しているプロモーター（ＥＦｄ  ｐｒｏ）を有しており、ＳＶ４０のｐｏｌｙＡおよびｄｈｆｒ遺伝子も有している。
【００６０】
（６）（２）で得られたｐＦＵ−ｇｐ１３０Ｈ−ｄｈｆｒを鋳型として、配列番号２０（５’−ＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＧ−３’）および配列番号２１（５’−ＡＡＴ［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＴＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ−３’）（配列番号２１中の角かっこは制限酵素ＮｏｔＩ認識配列を示している）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表３に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体のＨ鎖全長をコードする遺伝子を増幅し精製後に得られたＰＣＲ産物をｈｇｐ１３０−Ｈ１と命名した。
【００６１】
（７）（６）で得られたｈｇｐ１３０−Ｈ１を鋳型として、配列番号１６および配列番号２１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるシグナル配列を付加するため、配列番号１８に記載のポリヌクレオチドを添加してＰＣＲを行なった。具体的には、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体のＨ鎖全長をコードする遺伝子に配列番号１７に記載のシグナル配列をコードする遺伝子を付加した遺伝子を増幅し、精製後に得られたＰＣＲ産物をｈｇｐ１３０−Ｈ２と命名した。
【００６２】
（８）（７）で得られたｈｇｐ１３０−Ｈ２および図１に記載の発現ベクターｐＥＦｄをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、精製後ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで哺乳動物細胞において抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体のＨ鎖を発現可能なプラスミドｐＥＦｄ−ｇｐ１３０Ｈを得た。
【００６３】
（９）（５）で得られたｐＥＦｄ−ｇｐ１３０Ｌ、（８）で得られたｐＥＦｄ−ｇｐ１３０Ｈを用いた以外は実施例２と同様の方法で高発現細胞の構築を行ない、ＭＴＸ濃度を５０ｎＭ、２５０ｎＭ、１μＭ、２μＭと段階的にあげることで抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体高発現細胞を構築した。
【００６４】
実施例４  フラスコ培養におけるＬ‐グルタミン（Ｇｌｎ）の効果（その１）
（１）実施例２で得られた抗ＩＬ−６Ｒ抗体高発現細胞または実施例３で得られた抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体高発現細胞を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび４０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を入れた１２５ｍＬの三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に接種し、１３０ｒｐｍ、３７℃、８％ＣＯ２の条件下で振盪培養した。
【００６５】
（２）細胞数が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上になったところで、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍで培地交換することで培地に含まれるＧｌｕｔａＭａｘを除き、生細胞数をＣｏｕｎｔｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用して測定した。
【００６６】
（３）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含んだＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍに、生細胞数０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう接種し液量を２０ｍＬとして１２５ｍＬの三角フラスコに加えた。
【００６７】
（４）フィルター滅菌したＬ−グルタミンを終濃度で０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、８ｍＭまたは１０ｍＭとなるように添加し、１３０ｒｐｍ、３７℃、８％ＣＯ２の条件下で９日間、振盪培養した。培養途中で培養液をサンプリングし、生細胞数をＣｏｕｎｔｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用して測定し、抗体生産性はヒトＩｇＧ１（シグマ社製）を標準品とした検量線に基づき、実施例２（２）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定した。
【００６８】
（５）培養終了後の培養液を遠心分離によって細胞および不純物を除去し、上清を得た。
【００６９】
（６）オープンカラムに１．０ｍＬのＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ（ＧＥヘルスケア社製）を詰めて分離カラムを作製し、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化した後、（５）で得られた上清をアプライした。
【００７０】
（７）（６）で平衡化に用いた緩衝液１０ｍＬで（６）で作製した分離カラムを洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）４ｍＬで前記分離カラムに吸着した抗体を溶出した。溶出液に１ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えることでｐＨを中性領域に戻したのち、限外ろ過膜で濃縮しながら５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に緩衝液交換することで、添加したＬ‐グルタミン濃度が異なる条件で培養した、高純度な抗ＩＬ−６Ｒ抗体および抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体を得た。
【００７１】
（８）ヒトＦｃγＲＩＩＩａを固定化した担体（分離剤）を詰めたカラム（ＦｃＲ９＿Ｆカラム、ＷＯ２０１８／１５０９７３号の実施例５に記載）を用いて、下記の方法により（７）で得られた抗ＩＬ−６Ｒ抗体および抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体を分析した。
（８−１）ＦｃＲ９＿Ｆカラムを高速液体クロマトグラフィー装置（島津製作所社製）に接続し、カラムオーブンで前記カラムを２５℃の恒温状態に維持した状態で、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで１０分間流すことにより前記カラムを平衡化した。
（８−２）（７）で得た抗ＩＬ−６Ｒ抗体および抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体を（８−１）で用いた緩衝液で１．０ｍｇ／ｍＬに希釈し、当該希釈抗体溶液を流速１．０ｍＬ／ｍｉｎにて１０μＬ添加した。
（８−３）（８−１）で用いた緩衝液を流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで２分間流した後、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）によるｐＨグラジエント（１８分間で５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）が１００％となるグラジエント）でＦｃＲ９＿Ｆカラムに吸着した抗体を溶出した。
【００７２】
培地中に添加したＬ‐グルタミン濃度の違いによる、抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラムによる分析結果を図２に、抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラムによる分析結果を図３に、それぞれ示した。また、図２に記載の分析結果にある各ピーク（ピーク１、ピーク２およびピーク３）の面積割合ならびに９日間培養時の抗体生産性および生細胞数を表５に、図３に記載の分析結果にある各ピーク（ピーク１、ピーク２およびピーク３）の面積割合ならびに９日間培養時の抗体生産性および生細胞数を表６に、それぞれ示した。
【００７３】
図２および図３ならびに表５および表６より、培地中に含まれるＬ‐グルタミンの濃度が低いほどＦｃＲ９＿Ｆカラムとの結合力が強い（乖離が遅い）ピーク（図表中のピーク３）の割合が増加していることがわかる。ＦｃＲ９＿Ｆカラムに固定化されているＦｃγＲＩＩＩａとの結合性が高いほど抗体のＡＤＣＣ活性は高くなる（特開２０１６−０２３１５２号公報、ＷＯ２０１８／１５０９７３号）。すなわち培地中に含まれるＬ‐グルタミン濃度が低い（Ｌ‐グルタミン量を制限した）条件で培養すると、図２および図３ならびに表５および表６におけるピーク３の示す割合が高くなり、抗体の示すＡＤＣＣ活性が高くなることがわかる。一方、培地中に添加するＬ‐グルタミン量を制限しすぎる（例えば、Ｌ‐グルタミン濃度０．１ｍＭ）と、細胞増殖性が悪化する（表５および表６）。以上の結果より、抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する際、培地に添加するＬ‐グルタミンを終濃度０．２ｍＭから４ｍＭ（好ましくは終濃度０．５ｍＭから２ｍＭ）に制限することで、細胞増殖性を損なうことなくＡＤＣＣ活性が向上した抗体を得られることがわかる。
【００７４】
【表５】
2020188737.tif 000007
【００７５】
【表６】
2020188737.tif 000008
【００７６】
実施例５  フラスコ培養におけるＬ‐グルタミン（Ｇｌｎ）の効果（その２）
細胞を実施例２で得られた抗ＩＬ−６Ｒ抗体高発現細胞とし、培養に用いた培地をＣＤ  Ｏｐｔｉ  ＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）とし、添加するＬ‐グルタミンを終濃度０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、８ｍＭまたは１０ｍＭとし、培養期間を１０日間にした以外は、実施例４と同様の方法で培養および分析を行なった。
【００７７】
培地中に添加したＬ‐グルタミン濃度の違いによる、抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラムによる分析結果を図４に示した。また、図４に記載の分析結果にある各ピーク（ピーク１、ピーク２およびピーク３）の面積割合ならびに１０日間培養時の抗体生産性および生細胞数を表７に示した。使用培地をＣＤ  Ｏｐｔｉ  ＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍに変えたことで、実施例４（図２および図３）では確認できなかった、ＦｃＲ９＿Ｆカラムとの結合がより弱い（乖離が速い、すなわちＡＤＣＣ活性が低い）ピーク（ピーク０）が確認された（図４）。
【００７８】
図４および表７より、培地中に含まれるＬ‐グルタミンの濃度が低いほどＦｃＲ９＿Ｆカラムとの結合力が強い（乖離が遅い）ピーク（図表中のピーク３）の割合が増加していることがわかる。図４および表７におけるピーク３の示す割合が高いほうが抗体の示すＡＤＣＣ活性が高くなることから、培地中に含まれるＬ‐グルタミンの濃度を制限（具体的には、終濃度で０．５ｍＭから４ｍＭ、好ましくは終濃度０．５ｍＭから２ｍＭ）することで、細胞増殖性を損なうことなく、ＡＤＣＣ活性が向上した抗体が得られることがわかる。
【００７９】
【表７】
2020188737.tif 000009
【００８０】
実施例６  バイオリアクターを用いたバッチ培養におけるＬ‐グルタミンの効果
（１）５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、４０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含む１００ｍＬのＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍを入れた５００ｍＬの三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に、実施例２で作製した抗ＩＬ−６Ｒ抗体高発現細胞を接種し、１３０ｒｐｍ、３７℃、８％ＣＯ２の条件下で振盪培養した。
【００８１】
（２）校正したｐＨ計、溶存酸素（ＤＯ）計をセットした２Ｌの滅菌済ジャーファーメンター（バイオット社製）に、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む９００ｍＬのＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍを入れ、通気しながら３７℃、１００ｒｐｍで攪拌し一晩放置した。
【００８２】
（３）一晩放置後、溶存酸素の上限を６．８６とセットし、あらかじめ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含んだＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍで洗浄することでＧｌｕｔａＭＡＸを除いた、（１）で培養した抗ＩＬ−６Ｒ抗体高発現細胞を０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう接種後、終濃度で１ｍＭまたは１０ｍＭとなるようＬ−グルタミンを添加し、全量が１Ｌとなるよう（２）に記載の培地を追加した。
【００８３】
（４）培地および細胞を入れたジャーファーメンターを制御装置（ＢＣＰ：バイオット社製）にセットし、８％ＣＯ２を１００ｍＬ／分で流しながら、３７℃、１００ｒｐｍで９日間バッチ培養した。なお培養中、ｐＨはＣＯ２と０．５Ｍの炭酸水素ナトリウム水溶液を添加することで制御し、ＤＯは３７℃での飽和溶存酸素量の５０％量を保つよう制御した。培養途中で培養液をサンプリングし、生細胞数をＣｏｕｎｔｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用して測定し、抗体生産性を実施例２（２）に記載のＥＬＩＳＡ法（検量線作成のための標準品としてヒトＩｇＧ１（シグマ社製）を使用）にて測定した。また前記サンプリングした培養液から、実施例４（５）から（７）に記載の精製方法を用いて得られた培養液から抗体を精製し、実施例４（８）に記載の方法でＦｃＲ９＿Ｆカラムによる抗体分析を行なった。
【００８４】
１ｍＭのＬ‐グルタミンを添加した培養を９日間行ない得られた抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラムによる分析結果を図５に示した。同様に１０ｍＭのＬ‐グルタミンを添加した培養を９日間行ない得られた抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラムによる分析結果を図６に示した。また図５および図６に記載の分析結果にある各ピーク（ピーク１、ピーク２およびピーク３）の面積割合を表８に示した。さらにＬ‐グルタミン濃度の異なる培養における抗体生産性の推移を図７に、生細胞数の推移を図８に、それぞれ示した。
【００８５】
図５と図６および表８の結果からＬ‐グルタミンを１０ｍＭ添加したときと比較して１ｍＭ添加したときはＦｃＲ９＿Ｆカラムとの結合力が弱いピーク（ピーク１）の割合が低下（１０ｍＭＬ−グルタミン添加：４２．３％、１ｍＭＬ‐グルタミン添加：２５．０％）する一方、結合力が強いピーク（ピーク３）の割合は増加した（１０ｍＭＬ‐グルタミン添加：２２．１％、１ｍＭＬ‐グルタミン添加：３６．０％）。以上の結果から、ジャーファーメンターでのバッチ培養においても、フラスコ培養のときと同様、培地に添加するＬ‐グルタミンを制限することで、抗体を発現可能な哺乳動物細胞が発現した抗体が有するＡＤＣＣ活性が向上することがわかる。さらに表８から、培養終了時の抗体の生産を比較すると１０ｍＭＬ‐グルタミン添加時の３７．０ｍｇ／Ｌに対して１ｍＭＬ‐グルタミン添加時は５２．０ｍｇ／Ｌと抗体生産性も向上していることがわかる。
【００８６】
【表８】
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【００８７】
実施例７  フラスコ培養におけるＬ‐グルタミンとマンガンの効果
細胞を実施例２で得られた抗ＩＬ−６Ｒ抗体高発現細胞とし、添加するＬ‐グルタミンを終濃度で０．５ｍＭ、２ｍＭまたは８ｍＭとし、硫酸マンガンを未添加または終濃度で１μＭ、５μＭもしくは１０μＭとなるよう添加し、培養期間を１０日間にした以外は実施例４と同様の方法で培養および分析を行なった。
【００８８】
培地中に添加したＬ‐グルタミン濃度およびマンガン濃度の違いによる、培養から得られた抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラムによる分析結果を図９に示した。また図９に記載の分析結果にある各ピーク（ピーク１、ピーク２およびピーク３）の面積割合および培養１０日目の抗体生産性、生細胞数を表９に示した。
【００８９】
図９および表９の結果より、培地に１μＭまたは５μＭのマンガンイオンを添加したときに抗体生産性を大きく低下させることなく、ＦｃＲ９＿Ｆカラムとの結合力が弱いピーク（ピーク１）の割合が低下し、結合力が強いピーク（ピーク３）の割合が増大している。さらに前記濃度のマンガン存在下で、Ｌ‐グルタミンの濃度を０．５ｍＭまたは２ｍＭとすると、さらにピーク１の割合が低下し、ピーク３の割合が増大している。
【００９０】
以上の結果から、培地に０．５ｍＭから４ｍＭのＬ‐グルタミンに加え０．３μＭから７μＭのマンガンイオンも添加することで、ＦｃＲ９＿Ｆカラムとの結合が強い、すなわちＡＤＣＣ活性が向上した抗体が得られることがわかる。
【００９１】
【表９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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