(57)【要約】【課題】虫類から抽出したDNAを用いて、ゴキブリ目昆虫5種（クロゴキブリ、ワモンゴキブリ、コワモンゴキブリ、ヤマトゴキブリ、チャバネゴキブリ）を迅速、簡便かつ高感度に検出可能な系を構築する。【解決手段】ゴキブリ目昆虫5種のそれぞれに特異的に反応するPCRプライマーを開発した。また、本PCRプライマーを用いて、PCR法による特定の増幅産物の検出結果から上記ゴキブリ目昆虫5種を特異的に検出することができる。また、虫類から抽出したDNAを利用してこれらのPCRプライマーを用いた検出結果から上記ゴキブリ目昆虫5種の存在を判断することができる。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号1における塩基番号17〜28の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー及び、配列表の配列番号2における塩基番号19〜30の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるPCRプライマーセット。
【請求項２】
試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１に記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にクロゴキブリが存在しているか否かを検出する工程とを含むクロゴキブリの検出方法。
【請求項３】
配列表の配列番号3における塩基番号14〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩
基のDNAからなるPCRプライマー及び、配列表の配列番号４における塩基番号14〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるPCRプライマーセット。
【請求項４】
試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項３記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にワモンゴキブリが存在しているか否かを検出する工程とを含むワモンゴキブリの検出方法。
【請求項５】
配列表の配列番号５における塩基番号19〜30の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー及び、配列表の配列番号6における塩基番号19〜30の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるPCRプライマーセット。
【請求項６】
試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項5に記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にコワモンゴキブリが存在しているか否かを検出する工程とを含むコワモンゴキブリの検出方法。
【請求項７】
配列表の配列番号7における塩基番号14〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー及び、配列表の配列番号８における塩基番号11〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるPCRプライマーセット。
【請求項８】
試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項7に記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にヤマトゴキブリが存在しているか否かを検出する工程とを含むヤマトゴキブリの検出方法。
【請求項９】
配列表の配列番号9における塩基番号16〜27の塩基配列を３´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー及び、配列表の配列番号10における塩基番号16〜27の塩基配列を３´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるPCRプライマーセット。
【請求項１０】
試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項9に記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にチャバネゴキブリが存在しているか否かを検出する工程とを含むチャバネゴキブリの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虫類を検査対象とした場合において当該虫類がゴキブリ目昆虫であるかを判別できるプライマーに関する発明に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
虫類を検査試料とした場合において、当該虫類がゴキブリ目昆虫であるかを迅速に検査する必要がある場合がある。
ここで、ゴキブリ目昆虫であるかを決定する際、外観観察や得られたDNAより昆虫類に共通の遺伝子配列を利用したプライマーを用いて増幅したDNAを対象としてDNAシークエンシングにより塩基配列を決定してゴキブリ目昆虫であるかを判断する方法がある。
しかし、外観観察は熟練した技術が必要であり、虫体の一部しかない場合は判断が難しい。DNAシークエンシングは煩雑な工程と時間を要するため迅速な判断が困難である。更に、虫類の検査試料によっては、DNAが断片化されているものが多く、DNAシークエンシングでは同定できないことも多い。
そこで、ゴキブリ目昆虫に特異的なプライマーを用いれば、より高感度にDNAを検出可能である。また、微量のサンプル量であっても迅速に検査できる。すなわち、虫類からDNAを抽出し、その遺伝子を鋳型として用いてゴキブリ目昆虫に固有の特定の遺伝子領域を増幅することによって、増幅産物が検出されればゴキブリ目昆虫が存在していたと判断できる。一方、このようなPCR法によるDNA増幅を利用した害虫の検出方法として、以下の特許文献１が公開されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開2016-82971
【０００４】
上記特許文献1の方法によって同定する害虫は、オサゾウムシ科グラナリアコクゾウムシ、カツオブシムシ科ヒメアカカツオ等に限定されており、ゴキブリを対象とするものではない。
このように、ゴキブリ目昆虫をPCR法によりDNA増幅し、検出する方法は特許文献による先行技術には開示されていない状態にある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明者らは、虫類を検査試料とした場合に、当該虫類から抽出したDNAを用いて、ゴキブリ目昆虫であるかを確認できるように、ゴキブリ目昆虫についての特異的遺伝子を高感度で検出することができるプライマー及びその検出方法を開発することを課題とした。
また、特にゴキブリ目昆虫のうち、日本において一般的にみられるゴキブリ目昆虫5種（クロゴキブリ、ワモンゴキブリ、コワモンゴキブリ、ヤマトゴキブリ、チャバネゴキブリ）に限定してこれらのそれぞれに対して特異的に検出できるプライマーセットを開発することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題の解決のために、ゴキブリ目昆虫5種に対して特異的なプライマーを作成し、種々の検討を進めた。本発明者らの種々の検討の結果、対象遺伝子領域としてミトコンドリアDNA中のCOI（cytochrome c oxidase subunit1）領域に着目し、虫類において最も一般的なCOI領域をターゲットとすることで、充実したデータベースを活用可能であることを利用した。さらに、200bp付近の増幅産物が得られるプライマーの設計を試みた。
【０００７】
種々の検討の結果、対象としたゴキブリ目昆虫5種のそれぞれに対して特異的な配列を有するDNA領域を見出した。そして、検出可能な200bp付近の増幅産物が得られるプライマーを設計することができた。
これらのプライマーを利用することでゴキブリ目昆虫5種のそれぞれ検出できるような検出方法を構築することができ、本発明を完成するに至った。
具体的には、本発明は、以下のPCRプライマーセット及びゴキブリ目昆虫5種の検出方法を提供する。
【０００８】
項1．配列表の配列番号１における塩基番号17〜28の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー及び、配列表の配列番号2における塩基番号19〜30の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるPCRプライマーセット。
【０００９】
項2．試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１に記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にクロゴキブリが存在しているか否かを検出する工程とを含むクロゴキブリの検出方法。
【００１０】
項3．配列表の配列番号3における塩基番号14〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー及び、配列表の配列番号4における塩基番号14〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるPCRプライマーセット。
【００１１】
項4．試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項3記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にワモンゴキブリが存在しているか否かを検出する工程とを含むワモンゴキブリの検出方法。
【００１２】
項5．配列表の配列番号5における塩基番号19〜30の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー及び、配列表の配列番号6における塩基番号19〜30の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるPCRプライマーセット。
【００１３】
項6．試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項5に記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にコワモンゴキブリが存在しているか否かを検出する工程とを含むコワモンゴキブリの検出方法。
【００１４】
項7．配列表の配列番号7における塩基番号14〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー及び、配列表の配列番号8における塩基番号11〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるPCRプライマーセット。
【００１５】
項8．試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項７に記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にヤマトゴキブリが存在しているか否かを検出する工程とを含むヤマトゴキブリの検出方法。
【００１６】
項9．配列表の配列番号9における塩基番号16〜27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー及び、配列表の配列番号10における塩基番号16〜27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるPCRプライマーセット。
【００１７】
項10．試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項9に記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にチャバネゴキブリが存在しているか否かを検出する工程とを含むチャバネゴキブリの検出方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のプライマーを用いてPCR検査することによりゴキブリ目昆虫5種（クロゴキブリ、ワモンゴキブリ、コワモンゴキブリ、ヤマトゴキブリ、チャバネゴキブリ）の存在を迅速に判断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の各プイラマーを利用した場合の検出感度を示す電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
ゴキブリ目昆虫検出用プライマー
本発明のPCRプライマーセットは、日本で一般的に見られるゴキブリ目昆虫5種を検出対象としている。尚、当該5種については、公益財団法人文化財中菌害研究所文献（機関紙  文化財の虫菌害62号、2011年12月発行）を参照した。
本発明の対象とするゴキブリ目昆虫5種は、クロゴキブリ（Periplaneta fuliginosa）、ワモンゴキブリ（Periplaneta americana）、コワモンゴキブリ（Periplaneta australasiae）、ヤマトゴキブリ（Periplaneta japonica）、チャバネゴキブリ（Blattella germanica）とした。
【００２２】
本プライマーセットを用いて、PCR法によって上述のゴキブリ目昆虫5種の特定領域を増幅させ、増幅されたDNA断片を、アガロースゲル電気泳動して、その電気泳動のパターンより特定のサイズのDNA断片を検出することで、ゴキブリ目昆虫5種由来のDNAの存在を判断することができる。
また、リアルタイムPCR装置であれば、ゲル電気泳動に加えて、増幅されたDNA断片の融解曲線分析によっても、ゴキブリ目昆虫5種由来のDNAの存在を判断することができる。
【００２３】
さらに、他生物種と交差、且つプライマーダイマーを形成しないようプライマー設計し
た。また、プライマーを併用する場合を考慮し、プライマー使用条件を一律に設定できる
ように設計した。
本発明が提供するプライマーの塩基配列は以下のとおりである。Sはセンスプライマー
を表し、ASはアンチセンスプライマーを表す。尚、各プライマーは5´から3´方向に記載している。
【００２４】
配列番号1（クロゴキブリS）：GTAGTACAAGCTGGAGTAGCAGTCTACC
配列番号2（クロゴキブリAS）：ACTGATAATCGTAATAATGAGGCTGTAATG
配列番号3（ワモンゴキブリS）： AACATTAGTTCGTGCTGAGATCGGG
配列番号4（ワモンクロゴキブリAS）：CTACATCTGGGGCTCCTCATAGTAG
配列番号5（コワモンゴキブリS）：GCAATTTTCTCATTACATCTAGCTGGTGTC
配列番号6（コワモンゴキブリAS）：TTCAAGTTTCGGTCAGTTAATAGTATTGTG
配列番号7（ヤマトゴキブリS）：AGCAATTCTTTCATGACATTTAGCC
配列番号8（ヤマトゴキブリAS）：ATCACCTCCTCCAGCAGGATCG
配列番号9（チャバネゴキブリS）：GACTGTTACCTCCATCTCTATCGCTTC
配列番号10（チャバネゴキブリAS）：CTAGGTCTGATATGAATTGGTGTCATG
【００２５】
また、上記の各プライマーは、その5´末端側には任意の配列が付加されて全体として
最大30塩基のプライマーであってもよい。さらに、それぞれのプライマーについては、3
´端から12塩基が鋳型DNAとマッチしていれば検出が可能である。
そこで、本発明は、まず第１のプライマーとして、配列表の配列番号１における塩基番号17〜28の塩基配列を３´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーを提案する。そして第2のプライマーとして、配列表の配列番号2における塩基番号19〜30の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーを提案する。そして、これらのプライマーをセットで用いることでクロゴキブリを検出することができる。
【００２６】
次に、第3のプライマーとして配列表の配列番号3における塩基番号14〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーを提案する。そして第4のプライマーとして、配列表の配列番号4における塩基番号14〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーを提案する。そして、これらのプライマーをセットで用いることでワモンゴキブリを検出することができる。
【００２７】
次に、第5のプライマーとして配列表の配列番号5における塩基番号19〜30の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーを提案する。そして第6のプライマーとして、配列表の配列番号６における塩基番号19〜30の塩基配列を３´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーを提案する。そしてこれらのプライマーをセットで用いることでコワモンゴキブリを検出することができる。
【００２８】
次に、第7のプライマーとして配列表の配列番号7における塩基番号14〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーを提案する。そして、第8のプライマーとして配列表の配列番号8における塩基番号11〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるPCRプライマーセットを提案する。そしてこれらのプライマーをセットで用いることでヤマトゴキブリを検出することができる。
【００２９】
次に、第9のプライマーとして配列表の配列番号9における塩基番号16〜27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーを提案する。そして第10のプライマーとして配列表の配列番号10における塩基番号16〜27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるPCRプライマーセットを提案する。そしてこれらのプライマーをセットで用いることでチャバネゴキブリを検出することができる。
【００３０】
ゴキブリ目昆虫5種の検出方法
・検査試料
本検出方法における検査試料は虫類を対象としている。具体的には、ゴキブリ目昆虫5種と類似している甲虫類等が挙げられる。また、本発明はPCR法を用いるため微量のDNAが存在すれば検出可能である。従って、由来不明の虫検体一部があれば検出することができる。
【００３１】
・DNAの抽出工程
検査試料からのDNAの抽出については試料の形態については特に限定されない。一般
的な公知のDNA抽出法（厚生労働省医薬局食品保健部長通知、アレルギー物質を含む食品
の検査方法について、平成14年11月06日、食発第1106001号）や市販の各種DNA抽出キット［例えば、DNA Extraction IsoplantII kit（Nippon Gene Co. Ltd., Japan）、DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）等］によって、DNAの回収
が可能な試料であれば、上記の検出法に適用することができる。
【００３２】
・本プライマーセットを用いたPCR工程
本発明のゴキブリ目昆虫5種検出方法は、試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として上記説明した本発明のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にゴキブリ目昆虫5種が存在していたかどうかを確認できる。
PCR反応工程では、抽出されたDNAを鋳型として、ゴキブリ目昆虫5種検出用のプライマーセットを用いてPCRを行う。PCR装置としては、例えば、ブロックタイプ、キャピラリータイプの市販の装置を使用できる。また、リアルタイムPCR装置を用いれば、増幅産物であるDNA断片の増加をリアルタイムでモニタリングすることができるため、ゴキブリ目昆虫5種DNAの存在の有無をより迅速に確認することができる。
【００３３】
・増幅されたDNA断片の検出
PCR増幅産物であるDNA断片の有無の確認は、通常のPCR装置であれば、増幅産物をゲル電気泳動することによって、また、リアルタイムPCR装置であれば、さらに、増幅産物の融解曲線分析を行い、その分析からPCR増幅産物の融解温度（Ｔｍ）値を導くことにより、PCR増幅産物が目的の増幅産物であるかどうかを確認できる。具体的には、本プライマーセットにより、ゴキブリ目昆虫5種のDNAが検出できる。各々の種に対するPCR増幅による理論DNA断片の大きさ及びＴｍは、概ね、以下の表１のようになる。表１に各プライマーセットによる増幅断片長及びTm値を示す。
【００３４】
【表１】
2020145967.tif 000003
【００３５】
上記の配列番号(1)＋(2)、配列番号(3)＋(4)、配列番号(5)＋(6)、配列番号(7)＋(8)、配列番号(9)＋(10)のそれぞれのプライマーセットを用いてPCR工程を行えば、ゴキブリ目昆虫5種をそれぞれ特異的に識別・検出することができる。
【実施例】
【００３６】
以下に本発明の実施例について説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３７】
[試験例1]ゴキブリ目昆虫におけるDNAの増幅
─ゴキブリ目昆虫5種に対するDNA検出用プライマーセットを用いた検出の確認─
ゴキブリ目昆虫5種に対するＰＣＲプライマーの検出を確認するために以下の試験を行った。
【００３８】
・使用した生物種
次の表2に示すゴキブリ目昆虫及び関連昆虫種を用いた。
【００３９】
【表２】
2020145967.tif 000004
【００４０】
・DNA抽出方法
上記のゴキブリ目昆虫及び関連昆虫種は、アース環境サービス株式会社より提供を受けた各ゴキブリ昆虫固体を利用してそのDNAを抽出した。具体的には、各々のゴキブリの組織の一部を70%エタノールで洗浄し、さらに、滅菌水で素早く洗浄後、マルチビーズショッカー（安井器械、大阪）で破砕した試料からDNeasy Blood & Tissue kits（Qiagen GmbH, Germany）を用いて調製したものを使用した。上述したように準備した各ゴキブリ目昆虫のDNA量を測定後、滅菌水を用いて、DNAの濃度を1 ng/μLに調製した。尚、抽出時には、RNA分解酵素によるRNAの除去操作も実施した。
【００４１】
・PCRの反応条件
PCRに供与する2μLのDNA試料液を含む20μL容量の反応液は、タカラバイオ社のTB GreenTM Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)(Takara Bio Inc., Japan)を用いて調製した。反応液は、TB GreenTM Premix Ex TaqTM IIをベースとし、250nMセンスプライマー、250nMアンチセンスプライマーを含む組成として、調製した。PCR反応は、LightCycler(Roche Diagnostics GmbH, Germany)で行い、増幅反応条件は以下の通りである。
【００４２】
95℃で1分間のサイクルを一回実施後、20℃/秒の速度で95℃まで昇温後、5秒間同温度で保温、次に20℃/秒の速度で60℃（アニーリング温度）まで降温後、15秒間同温度で保温、さらに20℃/秒の速度で72℃まで昇温後、30秒間同温度で保温する3つのステップからなる増幅サイクルを35回実施した。
【００４３】
PCR増幅産物は、SYBR Green I依存性の蛍光量として、各々のサイクルの最終ステップに記録した。増幅サイクル終了後、メルティングカーブは、20℃/秒の速度で97℃まで昇温後、次に20℃/秒の速度で60℃まで降温し、10秒間同温度で保温後、さらに0.2℃/秒の速度で97℃に至るまでのゆるやかな昇温中に、0.2秒毎の蛍光強度を記録することによって得た。同PCR装置のソフトウェアによって融解曲線から得られたPCR増幅産物のTm値は、PCRによる特異的な増幅産物の有無を推定するために使用した。さらに、3.0%（wt/vol）アガロースゲル電気泳動によってPCR増幅産物（反応液の5μL）を分離し、分離後のゲルをエチジウムブロマイドで染色後、UV照射下において増幅産物を視覚化することによって、増幅産物の有無を確認した。分子量マーカーとして100bp DNA Ladder（TOYOBO CO., Japan）を使用した。これらのPCRの結果を表3に記載した。表中の+(プラス)は電気泳動により標的サイズの増幅産物が検出されたことを示し、−（マイナス）は当該増幅産物が検出されなかったことを示す。
【００４４】
尚、標的サイズの増幅産物の検出は、ゴキブリ目昆虫5種に対するそれぞれの特異プライマーを使用した場合、表1に示す所定のサイズ（bp）の位置にバンドを確認すれば検出あり（陽性）とみなし、バンドがいずれの位置にも確認されない、もしくはその他の位置にバンドが確認された場合、検出無し（陰性）とみなした。表３に結果を示す。
【００４５】
【表３】
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【００４６】
＜結果及び考察＞
開発したPCRプライマーは、それぞれがゴキブリ目昆虫5種にそれぞれ特異的に反応し、ゴキブリ目昆虫5種のDNA増幅作用を有することが示された。
【００４７】
[試験例2]─ゴキブリ目昆虫5種に対するDNA検出用プライマーセットを用いたPCR分析の検出感度の確認─
それぞれのプライマーセットについて、ゴキブリ目5種に対するＰＣＲプライマーの検出感度を確認するために以下の試験を行った。
【００４８】
・使用したDNA
試験例1で示したDNAの抽出方法によって調製したゴキブリ目昆虫5種のものを利用した（DNAの濃度を1 ng/μLに調製したもの）。当該DNAをPCRに供与する2μLのDNAを利用した。当該DNA溶液を滅菌水で希釈し、約0.1pg/μl、約1pg/μl、約10pg/μl、約100pg/μl、約1ng/μl及び約10ng/μlのDNA溶液希釈液2μl をPCR分析に供試した。その他の試験条件は試験例1に示したものと同様である。結果を表4に示す。
【００４９】
＜PCR条件＞
試験条件は試験例1に示したものと同様である。
【００５０】
【表４】
2020145967.tif 000006
【００５１】
＜結果及び考察＞
表中の+(プラス)は電気泳動により標的サイズの増幅産物が検出されたことを示し、−（マイナス）は当該増幅産物が検出されなかったことを示す。新規PCRプライマーの検出感度は、配列番号(1)＋(2)が2ng/分析、配列番号(3)＋(4)が2ng/分析、配列番号(5)＋(6)が2pg/分析、配列番号(7)＋(8)が2pg/分析、配列番号(9)＋(10)が2ng/分析であった。また、電気泳動の結果を図１に示す。
尚、図1（ａ）は、プライマーが配列番号(1)+(2)でクロゴキブリDNAを検出した場合、
図1（ｂ）は、プライマーが配列番号(3)+(4)でワモンゴキブリDNAを検出した場合、
図1（ｃ）は、プライマーが配列番号(5)+(6)でコワモンゴキブリDNAを検出した場合、
図1（ｄ）は、プライマーが配列番号(7)+(8)でヤマトゴキブリDNAを検出した場合、
図1（ｅ）は、プライマーが配列番号(9)+(10)でチャバネゴキブリDNAを検出した場合、
をそれぞれ示す。
【００５２】
[試験例3]本発明のPCRプライマーの反応特異性の確認
本発明の各PCRプライマーのそれぞれがゴキブリ目昆虫5種それぞれに特異的に反応し、他の生物種（ゴキブリ目昆虫5種以外の他の生物種：他の昆虫、細菌類や植物種）には反応しないことを確認した。
【００５３】
・使用した生物種
次の表5に示す生物種を用いた。
【００５４】
【表５】
2020145967.tif 000007
【００５５】
・使用したDNA
上記各生物種のうち、虫類については、採取品をDNA配列で種を同定した後に使用した。また、精製はQIAGEN社のBlood & Tissueキットを使用した。微生物については、ATCC入手菌、もしくは、食品分離菌をDNA配列で種を同定した後に使用した。さらに、動物、植物類は、市販品を購入し、DNA配列で種を同定した後に使用した。
なお、いずれの精製DNAもRNA分解酵素によるRNAの除去操作を実施してある。その他の試験条件は試験例1に示したものと同様である。結果を表6に示す。
＜PCR条件＞
試験条件は試験例1に示したものと同様である。
【００５６】
【表６】
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＜結果及び考察＞
PCR分析結果、新規PCRプライマーは、ゴキブリ目昆虫5種以外の生物種（他の昆虫、細菌類や植物種）等のDNAとは反応しなかったことから、ゴキブリ目昆虫5種に対する反応特異性を有することが示された。
【図１】
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【配列表】
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