(57)【要約】      （修正有）【課題】キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを含むflu血球凝集素ポリペプチド、並びに修飾されたグリコシル化部位及び非天然のグリコシル化部位を含むflu血球凝集素ポリペプチド、それらを含む組成物、それらを含むワクチン、並びにそれらの使用方法を提供する。【解決手段】HAステムドメイン及びHA球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドであって、該HA球状ヘッドドメインが、該HAステムドメインと異種である、前記ポリペプチド。それらを含む組成物、それらを含む免疫原性組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
HAステムドメイン及びHA球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血球
凝集素(HA)ポリペプチドであって、該HA球状ヘッドドメインが、該HAステムドメインと異
種である、前記ポリペプチド。
【請求項２】
季節性インフルエンザウイルス株のHAステムドメイン及び異種インフルエンザウイルス
株のHA球状ヘッドドメインを含む、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペ
プチド。
【請求項３】
前記HAステムドメインが、図1でAp及びAqと表記されたシステイン残基を維持している
、請求項1又は2記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項４】
前記HAステムドメインが、亜型H1のインフルエンザウイルスのHAステムドメインである
、請求項1又は2記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項５】
前記HAステムドメインが、亜型H3のインフルエンザウイルスのHAステムドメインである
、請求項1又は2記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項６】
前記HA球状ヘッドドメインが、亜型H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H1
4、H15、H16、又はH17のインフルエンザウイルスのHA球状ヘッドドメインである、請求項
4記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項７】
前記HA球状ヘッドドメインが、亜型H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H1
4、H15、H16、又はH17のインフルエンザウイルスのHA球状ヘッドドメインである、請求項
5記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項８】
前記HA球状ヘッドドメインが、亜型H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、又はH16のインフ
ルエンザウイルスのHA球状ヘッドドメインである、請求項6記載のキメラインフルエンザ
ウイルスHAポリペプチド。
【請求項９】
前記HA球状ヘッドドメインが、亜型H4、H7、H10、H14、又はH15のインフルエンザウイ
ルスのHA球状ヘッドドメインである、請求項7記載のキメラインフルエンザウイルスHAポ
リペプチド。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１１】
請求項10記載の核酸を発現する細胞。
【請求項１２】
請求項10記載の核酸を発現するように改変されたゲノムを含むウイルス。
【請求項１３】
請求項1〜9のいずれか一項記載のポリペプチドを含むウイルス。
【請求項１４】
インフルエンザウイルスである、請求項12記載のウイルス。
【請求項１５】
インフルエンザウイルスである、請求項13記載のウイルス。
【請求項１６】
不活化されているか又は分割されている、請求項14記載のウイルス。
【請求項１７】
不活化されているか又は分割されている、請求項15記載のウイルス。
【請求項１８】
請求項1〜9のいずれか一項記載のポリペプチドを含むウイルス様粒子。
【請求項１９】
請求項1〜9のいずれか一項記載のポリペプチドを含む免疫原性組成物。
【請求項２０】
請求項12記載のウイルスを含む免疫原性組成物。
【請求項２１】
請求項13記載のウイルスを含む免疫原性組成物。
【請求項２２】
請求項14記載のウイルスを含む免疫原性組成物。
【請求項２３】
請求項15記載のウイルスを含む免疫原性組成物。
【請求項２４】
請求項18記載のウイルス様粒子を含む免疫原性組成物。
【請求項２５】
対象を免疫する方法であって、該対象に請求項19記載の免疫原性組成物の有効量を投与
することを含む、前記方法。
【請求項２６】
対象を免疫する方法であって、該対象に請求項20記載の免疫原性組成物の有効量を投与
することを含む、前記方法。
【請求項２７】
対象を免疫する方法であって、該対象に請求項21記載の免疫原性組成物の有効量を投与
することを含む、前記方法。
【請求項２８】
対象を免疫する方法であって、該対象に請求項22記載の免疫原性組成物の有効量を投与
することを含む、前記方法。
【請求項２９】
対象を免疫する方法であって、該対象に請求項23記載の免疫原性組成物の有効量を投与
することを含む、前記方法。
【請求項３０】
対象を免疫する方法であって、該対象に請求項24記載の免疫原性組成物の有効量を投与
することを含む、前記方法。
【請求項３１】
前記対象がヒトである、請求項25記載の方法。
【請求項３２】
前記対象がヒトである、請求項26記載の方法。
【請求項３３】
前記対象がヒトである、請求項27記載の方法。
【請求項３４】
前記対象がヒトである、請求項28記載の方法。
【請求項３５】
前記対象がヒトである、請求項29記載の方法。
【請求項３６】
前記対象がヒトである、請求項30記載の方法。
【請求項３７】
前記免疫原性組成物が、前記対象に筋肉内又は鼻腔内投与される、請求項25記載の方法
。
【請求項３８】
インフルエンザウイルス疾患を予防する方法であって、対象に請求項25記載の免疫原性
組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項３９】
インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス疾患を治療する方法であって
、対象に請求項25記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項４０】
インフルエンザウイルス疾患を予防する方法であって、対象に請求項25記載の免疫原性
組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項４１】
インフルエンザウイルス疾患を予防する方法であって、対象に請求項25記載の免疫原性
組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項４２】
前記免疫原性組成物が、前記対象に筋肉内又は鼻腔内投与される、請求項26記載の方法
。
【請求項４３】
インフルエンザウイルス疾患を予防する方法であって、対象に請求項26記載の免疫原性
組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項４４】
インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス疾患を治療する方法であって
、対象に請求項26記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項４５】
インフルエンザウイルス疾患を予防する方法であって、対象に請求項26記載の免疫原性
組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項４６】
インフルエンザウイルス疾患を予防する方法であって、対象に請求項26記載の免疫原性
組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項４７】
対象のインフルエンザウイルス疾患又は感染を予防する方法であって、該対象に、該対
象が感作されていないインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを投与することを
含む、前記方法。
【請求項４８】
前記インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドが、亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8
、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、及び/又はH17のインフルエンザウイルス由
来のものである、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
前記対象に、該対象が感作されていない第2のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリ
ペプチドを投与することを含み、ここで、該第2のインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドが、亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16
、及び/又はH17のインフルエンザウイルス由来のものであり、かつ第1及び第2の投与のイ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドが、異なるインフルエンザウイルス亜型由
来のものである、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
該対象に、該対象が感作されていない第3のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペ
プチドを投与することを含み、ここで、該第3のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリ
ペプチドが、亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、
及び/又はH17のインフルエンザウイルス由来のものであり、かつ第1、第2、及び第3の投
与のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドが、異なるインフルエンザウイルス
亜型由来のものである、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
対象のインフルエンザウイルス疾患又は感染を予防する方法であって、該対象にインフ
ルエンザウイルスを投与することを含み、ここで、該インフルエンザウイルスが、該対象
が感作されていない血球凝集素ポリペプチドを含む、前記方法。
【請求項５２】
前記インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドが、亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8
、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、及び/又はH17のインフルエンザウイルス由
来のものである、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
前記対象に第2のインフルエンザウイルスを投与することを含み、ここで、該第2のイン
フルエンザウイルスが、該対象が感作されていない血球凝集素ポリペプチドを含み;該第2
のインフルエンザウイルスの血球凝集素ポリペプチドが、亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、
H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、及び/又はH17のインフルエンザウイルス由来
のものであり;かつ第1及び第2の投与のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド
が、異なるインフルエンザウイルス亜型由来のものである、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
前記対象に第3のインフルエンザウイルスを投与することを含み、ここで、該第3のイン
フルエンザウイルスが、該対象が感作されていない血球凝集素ポリペプチドを含み;該第3
のインフルエンザウイルスの血球凝集素ポリペプチドが、亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、
H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、及び/又はH17のインフルエンザウイルス由来
のものであり;かつ第1、第2、及び第3の投与のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペ
プチドが、異なるインフルエンザウイルス亜型由来のものである、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
HAステムドメイン及びHA球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血球
凝集素(HA)ポリペプチドであって、該HA球状ヘッドドメインが、該HAステムドメインと異
種であり、ここで、該HAステムドメインが、少なくとも1つの修飾されたグリコシル化部
位を含み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位が、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cy
sを有する天然のグリコシル化部位の修飾を含み、ここで、該修飾が、該修飾されたグリ
コシル化部位に結合するグリカンの能力を破壊し、ここで、Xaaが任意のアミノ酸である
、前記ポリペプチド。
【請求項５６】
前記修飾が、前記天然のグリコシル化部位の1以上のアミノ酸置換を含む、請求項55記
載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項５７】
前記修飾されたグリコシル化部位が、H3付番体系に従って、アミノ酸位置20-22、21-23
、33-35、46-48、289-291、290-292、296-298、及び481-483からなる群から選択されるア
ミノ酸位置に位置しており、前記HAステムドメインが、亜型H1、H2、H5、H6、H8、H9、H1
1、H12、H13、及びH16のインフルエンザウイルス由来のHAステムドメインである、請求項
55記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項５８】
前記修飾されたグリコシル化部位が、H3付番体系に従って、アミノ酸位置8-10、22-24
、38-40、46-48、296-298、410-412、及び481-483からなる群から選択されるアミノ酸位
置に位置しており、前記HAステムドメインが、亜型H3、H4、H7、H10、H14、又はH15のイ
ンフルエンザウイルス由来のHAステムドメインである、請求項55記載のキメラインフルエ
ンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項５９】
前記HA球状ヘッドドメインが、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する1以上の非天
然のグリコシル化部位をさらに含み、ここで、Xaaが任意のアミノ酸である、請求項55〜5
8のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項６０】
前記HA球状ヘッドドメインが、インフルエンザウイルスH1亜型のHA球状ヘッドドメイン
であり、かつ前記非天然のグリコシル化部位が、Sa、Sb、Ca、もしくはCb抗原性部位に位
置しているか;又は前記HA球状ヘッドドメインが、インフルエンザウイルスH3亜型であり
、かつ前記非天然のグリコシル化部位が、A、B、C、もしくはD抗原性部位に位置している
、請求項59記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド。
【請求項６１】
前記非天然のグリコシル化部位が、H3付番に従って、血球凝集素アミノ酸位置59-61、1
29-131、158-160、又は165-167にある、請求項59記載のキメラインフルエンザウイルス血
球凝集素(HA)ポリペプチド。
【請求項６２】
HAステムドメイン及びHA球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血球
凝集素(HA)ポリペプチドであって、該HA球状ヘッドドメインが、該HAステムドメインと異
種であり、かつ該HA球状ヘッドドメインが、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する1
以上の非天然のグリコシル化部位を含み、ここで、Xaaが任意のアミノ酸である、前記ポ
リペプチド。
【請求項６３】
HAステムドメイン及びHA球状ヘッドドメインを含む非キメラインフルエンザウイルス血
球凝集素(HA)ポリペプチドであって、該HA球状ヘッドドメインが、該HAステムドメインと
同種であり、ここで、該HAステムドメインが、1以上の修飾されたグリコシル化部位を含
み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位が、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有
する天然のグリコシル化部位の修飾を含み、ここで、該修飾が、該修飾されたグリコシル
化部位に結合するグリカンの能力を破壊し、ここで、Xaaが任意のアミノ酸である、前記
ポリペプチド。
【請求項６４】
前記HA球状ヘッドドメインが、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する1以上の非天
然のグリコシル化部位をさらに含み、ここで、Xaaが任意のアミノ酸である、請求項63記
載の非キメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項６５】
前記HA球状ヘッドドメインが、インフルエンザウイルスH1亜型のHA球状ヘッドドメイン
であり、かつ前記非天然のグリコシル化部位が、Sa、Sb、Ca、又はCb抗原性部位に位置し
ているか;又は前記HA球状ヘッドドメインが、インフルエンザウイルスH3亜型であり、か
つ前記非天然のグリコシル化部位が、A、B、C、又はD抗原性部位に位置している、請求項
64記載の非キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド。
【請求項６６】
前記非天然のグリコシル化部位が、H3付番に従って、血球凝集素アミノ酸位置59-61、8
1-83、129-131、143-145、158-160、及び/又は165-167、170-172、187-189、193-195、19
7-199、208-210にある、請求項64又は65記載の非キメラインフルエンザウイルス血球凝集
素(HA)ポリペプチド。
【請求項６７】
インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ステムドメインポリペプチドであって:
a.HA1のN末端ステムセグメントが1〜50の異種残基のリンカーに共有結合し、それがさ
らにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合したものを含むインフルエンザ血球凝
集素HA1ドメイン
を含み;該HA1ドメインが、
b.インフルエンザ血球凝集素HA2ドメイン
と三次結合又は四次結合しており、
ここで、該インフルエンザウイルスHAステムドメインポリペプチドドメインが、1以上
の修飾されたグリコシル化部位をさらに含み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位が
、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する天然のグリコシル化部位の修飾を含み、こ
こで、該修飾が、該修飾されたグリコシル化部位に結合するグリカンの能力を破壊し、こ
こで、Xaaが任意のアミノ酸である、前記ポリペプチド。
【請求項６８】
インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ステムドメインポリペプチドであって:
a.HA1のN末端の長いステムセグメントが1〜50の異種残基のリンカーに共有結合し、そ
れがさらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合したものを含むインフルエンザ
血球凝集素HA1ドメイン
を含み;該HA1ドメインが、
b.インフルエンザ血球凝集素HA2ドメイン
と三次結合又は四次結合しており、
ここで、該インフルエンザウイルスHAステムドメインポリペプチドドメインが、1以上
の修飾されたグリコシル化部位をさらに含み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位が
、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する天然のグリコシル化部位の修飾を含み、こ
こで、該修飾が、該修飾されたグリコシル化部位に結合するグリカンの能力を破壊し、こ
こで、Xaaが任意のアミノ酸である、前記ポリペプチド。
【請求項６９】
インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ステムドメインポリペプチドであって:
a.HA1のN末端ステムセグメントが1〜50の異種残基のリンカーに共有結合し、それがさ
らにHA1のC末端ステムセグメントに共有結合したものを含むインフルエンザ血球凝集素HA
1ドメイン
を含み;該HA1ドメインが、
b.インフルエンザ血球凝集素HA2ドメイン
と三次結合又は四次結合しており、
ここで、該インフルエンザウイルスHAステムドメインポリペプチドドメインが、1以上
の修飾されたグリコシル化部位をさらに含み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位が
、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する天然のグリコシル化部位の修飾を含み、こ
こで、該修飾が、該修飾されたグリコシル化部位に結合するグリカンの能力を破壊し、こ
こで、Xaaが任意のアミノ酸である、前記ポリペプチド。
【請求項７０】
インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ステムドメインポリペプチドであって:
a.以下の順序で連結された:HA1のN末端ステムセグメント、1〜50の異種残基の第1のリ
ンカー、HA1の中間ステムセグメント、1〜50の異種残基の第2のリンカー、及びHA1のC末
端ステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素HA1ドメイン
を含み;該HA1ドメインが、
b.インフルエンザ血球凝集素HA2ドメイン
と三次結合又は四次結合しており、
ここで、該インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ステムドメインポリペプチドドメイ
ンが、1以上の修飾されたグリコシル化部位をさらに含み、ここで、該修飾されたグリコ
シル化部位が、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する天然のグリコシル化部位の修
飾を含み、ここで、該修飾が、該修飾されたグリコシル化部位に結合するグリカンの能力
を破壊し、ここで、Xaaが任意のアミノ酸である、前記ポリペプチド。
【請求項７１】
前記修飾されたグリコシル化部位が、H3付番体系に従って、アミノ酸位置20-22、21-23
、33-35、46-48、289-291、290-292、296-298、及び481-483からなる群から選択されるア
ミノ酸位置に位置しており、前記HAステムドメインが、亜型H1、H2、H5、H6、H8、H9、H1
1、H12、H13、及びH16のインフルエンザウイルス由来のHAステムドメインである、請求項
68〜71のいずれか一項記載のインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ステムドメインポリ
ペプチド。
【請求項７２】
前記修飾されたグリコシル化部位が、H3付番体系に従って、アミノ酸位置8-10、22-24
、38-40、46-48、296-298、410-412、及び481-483からなる群から選択されるアミノ酸位
置に位置しており、前記HAステムドメインが、亜型H3、H4、H7、H10、H14、H15のインフ
ルエンザウイルス由来のHAステムドメインである、請求項68〜71のいずれか一項記載のイ
ンフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ステムドメインポリペプチド。
【請求項７３】
可溶性である、請求項1〜9又は55〜72のいずれか一項記載のHAポリペプチド。
【請求項７４】
請求項55〜62のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項７５】
請求項63〜66のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項７６】
請求項74記載の核酸を発現する細胞。
【請求項７７】
請求項75記載の核酸を発現する細胞。
【請求項７８】
請求項55〜62のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリ
ペプチドを含むウイルス。
【請求項７９】
請求項63〜66のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリ
ペプチドを含むウイルス。
【請求項８０】
請求項55〜62のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリ
ペプチドを含む免疫原性組成物。
【請求項８１】
請求項63〜66のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリ
ペプチドを含む免疫原性組成物。
【請求項８２】
対象を免疫する方法であって、該対象に請求項80記載の免疫原性組成物の有効量を投与
することを含む、前記方法。
【請求項８３】
対象を免疫する方法であって、該対象に請求項81記載の免疫原性組成物の有効量を投与
することを含む、前記方法。
【請求項８４】
前記対象がヒトである、請求項82記載の方法。
【請求項８５】
前記対象がヒトである、請求項83記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれている、2011年9月20日に出
願された米国仮出願第61/536,924号、2011年12月1日に出願された米国仮出願第61/565,89
9号、2012年3月6日に出願された米国仮出願第61/607,526号、2012年5月17日に出願された
米国仮出願第61/648,525号、2012年7月10日に出願された米国仮出願第61/670,108号、及
び2012年8月17日に出願された米国仮出願第61/684,481号の優先権の恩典を主張する。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)によって授与された
助成番号AI070469、AI086061、及びHHSN266200700010Cの下で米国政府による支援を受け
て行なわれた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
(1.序論)
本明細書に提供されるのは、flu血球凝集素ポリペプチド、例えば、キメラインフルエ
ンザウイルス血球凝集素ポリペプチド、それを含む組成物、それを含むワクチン、及びそ
れらの使用方法である。
【背景技術】
【０００４】
(2.背景)
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)のファミリー
に属するエンベロープ型のRNAウイルスである(Palese及びShawの文献(2007, オルトミク
ソウイルス科:ウイルス及びその複製(Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replic
ation), 第5版.フィールズのウイルス学(Fields' Virology), B.N. Fields, D. M. Knipe
、及びP.M. Howley編. Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins, Philad
elphia, USA, p1647-1689))。A型インフルエンザウイルスの自然宿主は主に鳥類であるが
、A型インフルエンザウイルス(鳥類起源のものを含む)は、ヒト及び他の動物宿主(コウモ
リ、イヌ、ブタ、ウマ、海洋哺乳動物、及びイタチ類)に感染し、疾病を引き起こすこと
もできる。例えば、アジアで広がっているH5N1 A型鳥インフルエンザウイルスは、中国及
びインドネシアのブタで発見されており、その宿主範囲を広げて、A型インフルエンザに
感染しやすいと一般に考えられていなかったネコ、ヒョウ、及びトラを含むようになって
もいる(CIDRAP-鳥インフルエンザ:農業及び野生生物での注意事項(Avian Influenza: Agr
icultural and Wildlife Considerations))。動物におけるインフルエンザウイルス感染
の出現は、ヒトパンデミックインフルエンザ株を発生させる可能性がある。
【０００５】
A型及びB型インフルエンザウイルスは、主要なヒト病原体であり、不顕性感染から死を
もたらすこともある原発性ウイルス肺炎まで重症度が異なる呼吸器疾患を引き起こす。感
染の臨床的効果は、インフルエンザ株の病原性、並びに宿主の曝露、病歴、年齢、及び免
疫状態によって様々である。季節性インフルエンザに起因する累積罹患率及び死亡率は、
比較的高い発病率のためにかなり高い。通常の季節では、インフルエンザは、全世界で30
0万〜500万症例の重症疾患及び最大500,000人の死亡を引き起こすことができる(世界保健
機構(2003)インフルエンザ:概説(Influenza: Overview);2003年3月)。米国では、インフ
ルエンザウイルスは、人口のおよそ10〜15％に感染し(Glezen及びCouch RBの文献(1978)1
974〜76年のヒューストン地区のパンデミック間期インフルエンザ(Interpandemic influe
nza in the Houston area, 1974-76.)(N Engl J Med 298:587-592);Foxらの文献(1982) 1
975〜1979年のシアトルの家族におけるインフルエンザウイルス感染。II.病気に侵された
家庭における感染パターン、並びに年齢及び事前抗体と感染及び関連疾病の発生との関係
(Influenza virus infections in Seattle families, 1975-1979. II. Pattern of infec
tion in invaded households and relation of age and prior antibody to occurrence 
of infection and related illness.)(Am J Epidemiol 116:228-242)、毎年約30,000人の
死亡と関連する(Thompson WWらの文献(2003)米国におけるインフルエンザ及び呼吸器合胞
体ウイルスと関連する死亡(Mortality Associated with Influenza and Respiratory Syn
cytial Virus in the United States.)(JAMA 289:179-186);Belshe(2007)ワクチンに関す
るトランスレーショナルリサーチ:インフルエンザを一例として(Translational research
on vaccines: influenza as an example.)(Clin Pharmacol Ther 82:745-749)。
【０００６】
毎年の流行に加え、インフルエンザウイルスは、たまに起こるパンデミックの原因であ
る。例えば、A型インフルエンザウイルスは、1918年、1957年、1968年、及び2009年に発
生したようなパンデミックを引き起こすことができる。主要なウイルス抗原である血球凝
集素(HA)に対する予め形成された免疫がないために、パンデミックインフルエンザは、単
年で人口の50％よりも多くに影響を及ぼすことができ、しばしば流行性インフルエンザよ
りも重い疾患を引き起こす。明確な例は、およそ5000万人〜1億人が死亡した、1918年の
パンデミックである(Johnson及びMuellerの文献(2002)説明の更新:1918〜1920年の「スペ
イン風邪(Spanish)」による全世界の死亡者数(Updating the Accounts: Global Mortalit
y of the 1918-1920 "Spanish")(Influenza Pandemic Bulletin of the History of Medi
cine 76:105-115)。1990年代後半の高病原性鳥H5N1インフルエンザウイルス(Claasらの文
献(1998)高病原性鳥インフルエンザウイルスと関連するヒトA型インフルエンザH5N1ウイ
ルス(Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza
virus.)(Lancet 351:472-7)の出現以降、それが次のパンデミックウイルスとなるかも知
れないという懸念がある。さらに、H7及びH9株は、これらの株が時折ヒトに感染するので
、新たなパンデミックの候補である。
【０００７】
インフルエンザウイルス感染を防御する有効な方法は、ワクチン接種によるものである
;しかしながら、現在のワクチン接種手法は、循環している株とワクチン製剤に含まれる
分離株との間で良好な一致が得られることを当てにしている。そのような一致は、因子の
組合せのために得るのが困難であることが多い。第1に、インフルエンザウイルスは絶え
ず変化を遂げている:3〜5年ごとに、A型インフルエンザウイルスの優勢株は、既存の抗体
応答を避けるのに十分な抗原連続変異(antigenic drift)を経た変異体に取って代わられ
る。そのため、ワクチン製剤に含まれるべき分離株は、世界保健機関(WHO)の共同研究セ
ンターの集中的な監視努力に基づいて、毎年選択されなければならない。第2に、ワクチ
ンの製造及び流通に十分な時間を与えるために、株は、インフルエンザシーズンの開始の
約6カ月前に選択されなければならない。ワクチン株選択委員会の予測が不正確で、ワク
チン接種の有効性が大幅に低下することもある。
【０００８】
A型インフルエンザウイルスの新規亜型がヒト集団に侵入する可能性も、現在のワクチ
ン接種戦略にとって大きな課題となっている。インフルエンザウイルスのどの亜型及び株
が次のパンデミックをもたらすかを予測することは不可能なので、現在の株特異的手法を
用いて、パンデミックインフルエンザワクチンを調製することはできない。
【発明の概要】
【０００９】
(3.概要)
本明細書に提供されるのは、インフルエンザウイルスの保存されたHAステムドメイン(
本明細書で「ストーク」ドメインと呼ばれることもある)に対する交差防御免疫応答を誘
導するflu血球凝集素(HA)ポリペプチドである。一態様において、本発明は、安定なHAス
トークを有するキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド(すなわち、本明
細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)の設計及び構築に
関するものであり、該安定なHAストークは、該ストークと異種の球状HAヘッドを提示する
。ワクチン接種用に設計されるHA免疫原はHAストーク領域を共有するが、その球状ヘッド
が極めて異なっている。そのような構築物は、保存されたHAストークに対する極めて強力
でかつ広域中和性の抗体を誘発する、生インフルエンザウイルス、死滅インフルエンザウ
イルス、ウイルス/ウイルス様粒子(「VLP」)、サブユニットワクチン、スプリットワクチ
ンなどのワクチン製剤へと改変される。そのような「普遍的な」ワクチンを用いて、イン
フルエンザウイルス亜型にわたる交差防御免疫応答を誘導し及び/又は増進させることが
できる。
【００１０】
背景として、インフルエンザウイルスに対する中和抗体は、HA糖タンパク質を標的とし
、ウイルス侵入に関与する結合段階又は融合段階のいずれかを妨げる。2つの基本的サブ
セットの中和抗体:株特異的球状ヘッド(インフルエンザウイルスの様々な株及び亜型にわ
たって保存されてないドメイン)に対する抗体、及びHA糖タンパク質の高度に保存された
ステムに対する抗体は、インフルエンザウイルスへの曝露によって誘発される。保存され
ていないHA球状ヘッドは、免疫優性エピトープを担持する。理論に束縛されるものではな
いが、株特異的抗球状ヘッド抗体は、抗ステム抗体よりも強力であり、したがって、現在
のワクチンの感染によって付与される主として株特異的な免疫を説明するものであると考
えられる。
【００１１】
本発明は、HAステムに対する極めて強力でかつ広域中和性の抗体を誘発するインフルエ
ンザウイルスワクチンに対する本発明者らの合理的設計戦略に一部基づいている。これに
関して、キメラHA免疫原は、過去の曝露/ワクチン接種からの比較的よく保存されたスト
ークドメインを共有するが、異種HA球状ヘッド-好ましくは、意図されるワクチン被接種
者(vaccinate)が感作されていないものを含むように設計される。この構築物への曝露は
、主に、保存されたHAステムに対する抗体を増加させるはずである。保存されたHAステム
による免疫の繰返し及び球状ヘッドの変更は、HAの共通のステム領域に対する強力な交差
中和抗体を誘導するはずである。
【００１２】
キメラHA構築物を設計する場合、得られるタンパク質の安定性を維持するように注意を
払うべきである。これに関して、図1でAp及びAqとして特定されているシステイン残基を
維持することが推奨されるが、それは、それらが、下記の第5.1節でより詳細に論じられ
ているようにHAストークの安定性に寄与するからである。最良の安定性を得るために、HA
球状ドメインを全体として(図1に示すように、Apシステイン残基とAqシステイン残基の間
で)「交換する」ことが好ましいが、それは、得られる立体構造が、天然の構造に最も近
いからである。言い換えると、第5.1.2節で言及される「リンカー」は、異種HAの球状ヘ
ッドドメイン全体であることができる。
【００１３】
HAストークの天然の球状ヘッドを「完全に交換する」代わりに、HA球状ヘッドエピトー
プに寄与するループを改変することにより、該球状ヘッドを保存されたストークと異種の
ものにすることができる。この手法は、とりわけ、集団が曝露されているHAを使用すると
きには、改変される球状ヘッドを天然の球状HAヘッドと大きく異なるように設計しない限
り、保存されたストークに対する所望の免疫応答を生じさせるのに同様には有効でない場
合がある。それにもかかわらず、そのような改変は、例えば、HA球状ヘッドエピトープに
寄与する5つのループの大部分を改変することによって達成することができる。1つの有用
な手法において、5つ全てのループを改変することができる。或いは、又はさらに、5つの
ループ中のエピトープを、グリコシル化部位を球状ヘッドドメインに導入することによっ
てマスクすることができる。
【００１４】
ワクチン接種に使用される構築物を、ワクチン接種されるべき特定の対象/集団用に有
利に設計することができる。現在生きているヒトが曝露されている3つのインフルエンザ
亜型:亜型H1、H2、及びH3が存在する。H2亜型のインフルエンザウイルスは、1968年に該
集団から消失したが、H1及びH3亜型のインフルエンザウイルスは、今日まで該集団内に存
続している。結果として、1968年以前に生まれた現在生きている成人は、H1、H2、及びH3
亜型の各々に曝露されている可能性が高い。対照的に、1968年以後に生まれた現在生きて
いる成人は、H1及びH3亜型にしか曝露されていない可能性が高い。
【００１５】
したがって、成人のワクチン接種のための好ましい実施態様において、キメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドは、亜型H1、H2、又はH3のインフルエンザウイルスのHA由
来の球状ヘッドドメインを保持するのではなく、これら3つの亜型のうちの1つのHA由来の
ステムドメインを保有する。異種球状ヘッドは、任意の非H1、非H2、又は非H3亜型のHAか
ら選択することができる。また、一方ではH1/H2ステム、他方ではH3ステムを用いて作製
される別々のキメラ構築物をワクチン接種プログラムで有益に使用することができ--H1及
びH2亜型は、保存されたストークドメインを共有するグループ1 HA亜型であり;一方、H3
は、グループ1のストークとは構造的に異なるストークドメインを有するグループ2亜型で
ある。H1及びH3構築物の使用は、各々のステムドメインに対する免疫応答の生成/増進を
保証する。そのようなキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドによる成人対象の免
疫は、該対象の記憶免疫応答を増進させ、該対象におけるインフルエンザウイルスに対す
る長期持続性免疫をもたらす交差反応性、広域中和性の抗ステムドメイン抗体の大規模産
生をもたらす。
【００１６】
曝露されたことがない乳児は、当然ながら、全てのインフルエンザウイルス亜型に感作
されていない。結果として、多種多様なHAステム/球状ヘッド組合せを乳児用のワクチン
で使用するために構築することができる。好ましい実施態様において、未感作の乳児に、
グループ1(H1もしくはH2)又はグループ2(H3)株のHAストーク、並びに異種株;すなわち、
非H1、非H2、及び/又は非H3株由来の球状ヘッドを用いて作製される構築物をワクチン接
種することができる。各々のHAストークについての3つの異なるキメラHA構築物を3回の順
次ワクチン接種で有利に用いて、交差防御応答を誘導することができる。
【００１７】
ワクチン接種に使用されるキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを有利に設計
して、これらのポリペプチドへのグリコシル化部位の付加又は修飾により、対象において
HAステムドメインに対する極めて強力でかつ広域中和性の抗体を効果的に誘発することも
できる。HA球状ヘッド及びステムドメインのグリコシル化は、抗原性部位をマスクするこ
とができ、それにより、インフルエンザウイルスが対象内の免疫応答を回避することを可
能にすると考えられる。しかしながら、インフルエンザウイルスHAポリペプチドとの関連
において、キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメイン内でのグリコ
シル化は、グリコシル化によって遮蔽されるこのドメイン内の抗原性領域に対する所望の
免疫応答を妨害又は防止することがある。したがって、ある好ましい実施態様において、
キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、ステムドメインへのグリカンの結合を
破壊し、それにより、該ステムドメインに免疫応答をより誘発させる、1以上の修飾され
たグリコシル化部位を含む。ステムドメインの免疫原性をさらに増大させるために、構築
物は、グリコシル化されたときに、球状ヘッドドメイン中に見出される免疫優性抗原性領
域を免疫応答の誘発から保護する球状ヘッドドメイン中の非天然のグリコシル化部位をさ
らに含むことができる。非天然のグリコシル化部位の1つの例は、ある亜型のインフルエ
ンザウイルスHAの球状ヘッドドメインへのグリコシル化部位の付加であり、ここで、該グ
リコシル化部位は、別の亜型のインフルエンザウイルスHA球状ヘッドドメイン中に天然に
見出される。非天然のグリコシル化部位の別の例は、ある株由来のインフルエンザウイル
スHAの球状ヘッドドメインへのグリコシル化部位の付加であり、ここで、該グリコシル化
部位は、インフルエンザウイルスの別の株由来のHAの球状ヘッド中に天然に見出される。
非天然のグリコシル化部位のまた別の例は、ある株由来のHAの球状ヘッドへのグリコシル
化部位の付加であり、ここで、該グリコシル化部位は、インフルエンザウイルスの別の亜
型又は株由来のHAの球状ヘッド中に天然には見出されない。任意の特定の動作理論に束縛
されるものではないが、球状ヘッドドメインにおけるさらなるグリコシル化は、保存され
たステムドメインに対する免疫応答を増大させる一方で、球状ヘッドドメインに対する免
疫応答を低下させると考えられる。
【００１８】
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの使用は有利であるこ
とが理解されるべきである。なぜなら、(i)該ポリペプチドは、(無傷の球状ヘッドドメイ
ンを保有するために)極めて安定であり、及び(ii)該ポリペプチドが投与される対象の免
疫系は、過去にキメラインフルエンザ血球凝集素の球状ヘッドドメインに曝露されたこと
はないが、キメラインフルエンザ血球凝集素のステムドメインの保存されたエピトープに
曝露されたことがあるからである。
【００１９】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、ステムドメインへのグリカンの結合を
破壊する1以上の修飾されたグリコシル化部位を含むステムドメインを含むflu HAポリペ
プチド(例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド及び非
キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)である。
【００２０】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、1以上の非天然のグリコシル化部位を
含む球状ヘッドドメインを含むflu HAポリペプチド(例えば、インフルエンザウイルス血
球凝集素ステムドメインポリペプチド及び非キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチド)である。
【００２１】
また別の態様において、本明細書に提供されるのは、(1)ステムドメインへのグリカン
の結合を破壊する1以上の修飾されたグリコシル化部位を含むステムドメイン;及び(2)1以
上の非天然のグリコシル化部位を含む球状ヘッドドメインを含むflu HAポリペプチド(例
えば、インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド及び非キメライン
フルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)である。
【００２２】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、HAステムドメイン及びHA球状
ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドであり
、ここで:(1)該HA球状ヘッドドメインは、該HAステムドメインと異種であり;及び(2)該HA
ステムドメインは、1以上の修飾されたグリコシル化部位を含み、ここで、該修飾された
グリコシル化部位は、該ステムドメイン中のグリコシル化部位へのグリカンの結合を破壊
/妨害するグリコシル化部位に対する修飾を含む。具体的な実施態様において、該修飾さ
れたグリコシル化部位は、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する天然のグリコシル
化部位の修飾を含み、ここで、Xaaは任意のアミノ酸である。ある実施態様において、該H
A球状ヘッドドメインは、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する1以上の非天然のグ
リコシル化部位をさらに含み、ここで、Xaaは任意のアミノ酸である。
【００２３】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、HAステムドメイン及びHA球状ヘッ
ドドメインを含む非キメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドであり、
ここで:(1)該HA球状ヘッドドメインは、該HAステムドメインと同種であり、及び(2)該HA
ステムドメインは、1以上の修飾されたグリコシル化部位を含み、ここで、該修飾された
グリコシル化部位は、該ステムドメイン中のグリコシル化部位へのグリカンの結合を破壊
/妨害するグリコシル化部位に対する修飾を含む。具体的な実施態様において、該修飾さ
れたグリコシル化部位は、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する天然のグリコシル
化部位の修飾を含み、ここで、該修飾は、該修飾されたグリコシル化部位に結合するグリ
カンの能力を破壊し、ここで、Xaaは任意のアミノ酸である。
【００２４】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、インフルエンザウイルス血球凝集
素(HA)ステムドメインポリペプチドであって:HA1のN末端ステムセグメントが1〜50の異種
残基のリンカーに共有結合し、それがさらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結
合したものを含むインフルエンザ血球凝集素HA1ドメインを含み;該HA1ドメインが、イン
フルエンザ血球凝集素HA2ドメインと三次結合又は四次結合しており、ここで、該インフ
ルエンザウイルスHAステムドメインポリペプチドドメインが、1以上の修飾されたグリコ
シル化部位をさらに含み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位が、該ステムドメイン
中のグリコシル化部位へのグリカンの結合を破壊/妨害するグリコシル化部位に対する修
飾を含む、ポリペプチドである。具体的な実施態様において、該修飾されたグリコシル化
部位は、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する天然のグリコシル化部位の修飾を含
み、ここで、該修飾は、該修飾されたグリコシル化部位に結合するグリカンの能力を破壊
し、ここで、Xaaは任意のアミノ酸である。
【００２５】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、インフルエンザウイルス血球凝集
素(HA)ステムドメインポリペプチドであって:HA1のN末端の長いステムセグメントが1〜50
の異種残基のリンカーに共有結合し、それがさらにHA1のC末端の長いステムセグメントに
共有結合したものを含むインフルエンザ血球凝集素HA1ドメインを含み;該HA1ドメインが
、インフルエンザ血球凝集素HA2ドメインと三次結合又は四次結合しており、ここで、該
インフルエンザウイルスHAステムドメインポリペプチドドメインが、1以上の修飾された
グリコシル化部位をさらに含み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位が、該ステムド
メイン中のグリコシル化部位へのグリカンの結合を破壊/妨害するグリコシル化部位に対
する修飾を含む、ポリペプチドである。具体的な実施態様において、該修飾されたグリコ
シル化部位は、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する天然のグリコシル化部位の修
飾を含み、ここで、該修飾は、該修飾されたグリコシル化部位に結合するグリカンの能力
を破壊し、ここで、Xaaは任意のアミノ酸である。
【００２６】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、インフルエンザウイルス血球凝集
素(HA)ステムドメインポリペプチドであって:HA1のN末端ステムセグメントが1〜50の異種
残基のリンカーに共有結合し、それがさらにHA1のC末端ステムセグメントに共有結合した
ものを含むインフルエンザ血球凝集素HA1ドメインを含み;該HA1ドメインが、インフルエ
ンザ血球凝集素HA2ドメインと三次結合又は四次結合しており、ここで、該インフルエン
ザウイルスHAステムドメインポリペプチドドメインが、1以上の修飾されたグリコシル化
部位をさらに含み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位が、該ステムドメイン中のグ
リコシル化部位へのグリカンの結合を破壊/妨害するグリコシル化部位に対する修飾を含
む、ポリペプチドである。具体的な実施態様において、該修飾されたグリコシル化部位は
、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する天然のグリコシル化部位の修飾を含み、こ
こで、該修飾は、該修飾されたグリコシル化部位に結合するグリカンの能力を破壊し、こ
こで、Xaaは任意のアミノ酸である。
【００２７】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、インフルエンザウイルス血球凝集
素(HA)ステムドメインポリペプチドであって:以下の順序で連結された:HA1のN末端ステム
セグメント、1〜50の異種残基の第1のリンカー、HA1の中間ステムセグメント、1〜50の異
種残基の第2のリンカー、及びHA1のC末端ステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝
集素HA1ドメインを含み;該HA1ドメインが、インフルエンザ血球凝集素HA2ドメインと三次
結合又は四次結合しており、ここで、該インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ステムド
メインポリペプチドドメインが、1以上の修飾されたグリコシル化部位をさらに含み、こ
こで、該修飾されたグリコシル化部位が、該ステムドメイン中のグリコシル化部位へのグ
リカンの結合を破壊/妨害するグリコシル化部位に対する修飾を含む、ポリペプチドであ
る。具体的な実施態様において、該修飾されたグリコシル化部位は、アミノ酸配列Asn-Xa
a-Ser/Thr/Cysを有する天然のグリコシル化部位の修飾を含み、ここで、該修飾は、該修
飾されたグリコシル化部位に結合するグリカンの能力を破壊し、ここで、Xaaは任意のア
ミノ酸である。
【００２８】
本発明は、とりわけ、HAステムを含み、かつ異種HAヘッドを提示するキメラインフルエ
ンザHAポリペプチドの構築、及びステムドメインとヘッドドメインの両方に対する抗体と
交差反応するこのポリペプチドからの安定なキメラHAタンパク質の産生を示す作業実施例
(例えば、第6節、実施例)によって示される。該作業実施例は、インフルエンザウイルス
の多数の異なる株及び亜型に対する対象の防御的免疫応答の生成におけるそのような構築
物の使用も示し、すなわち、該実施例は、本明細書に記載のキメラインフルエンザHAポリ
ペプチドを普遍的なインフルエンザワクチンとして使用することができることを示す。さ
らに、該作業実施例(例えば、第6.11節、実施例11)は、1以上の修飾されたグリコシル化
部位を有するHAステムドメイン及び/又は1以上の非天然のグリコシル化部位を有するHA球
状ヘッドドメインを含むflu HAポリペプチドの構築を示し、ここで、該修飾されたグリコ
シル化部位は、グリコシル化部位に結合するグリカンの能力を破壊する1以上の天然のグ
リコシル化部位に対する修飾である。該作業実施例(第6.11節、実施例11参照)は、インフ
ルエンザウイルスの保存されたストークドメインに対する増大した免疫応答を誘発するこ
れらのインフルエンザHAポリペプチドの能力も示す。
【００２９】
(3.1  用語)
アミノ酸位置に関して使用されるときの、「約(about)」又は「約(approximately)」と
いう用語は、配列中の特定のアミノ酸位置、又はそのアミノ酸位置からN末端方向もしく
はC末端方向に、5、4、3、2、もしくは1残基以内にある任意のアミノ酸を指す。
【００３０】
本明細書で使用されるように、数字と一緒に使用される場合、「約(about)」又は「約(
approximately)」という用語は、言及された数字の1、5、又は10％以内の任意の数字を指
す。ある実施態様において、「約(about)」という用語は、記載された正確な数を包含す
る。
【００３１】
「アミノ酸配列同一性」という用語は、1対の整列されたアミノ酸配列間の、通常パー
センテージとして表される同一性又は類似性の程度を指す。同一性パーセントは、配列を
整列させ、かつ最大の配列相同性パーセントを達成するために、必要に応じてギャップを
導入した後の、ペプチド中の対応するアミノ酸残基と同一である(すなわち、アラインメ
ント中の所与の位置のアミノ酸残基が同じ残基である)か、又は類似する(すなわち、アラ
インメント中の所与の位置のアミノ酸置換が、以下で論じるような、保存的な置換である
)候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージである。配列の同一性及び類似性のパーセ
ンテージを含む配列相同性は、周知の配列アラインメント技術、好ましくは、この目的の
ために設計されたコンピュータアルゴリズムを用いて、該コンピュータアルゴリズムのデ
フォルトパラメータ、又はそれを含むソフトウェアパッケージを用いて決定することがで
きる。コンピュータアルゴリズム及びそのようなアルゴリズムを組み込んでいるソフトウ
ェアパッケージの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる。BLASTファミリーの
プログラムは、2つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの特定の非限定的な例
を例示する(例えば、Karlin及びAltschulの文献(1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
2264-2268)(Karlin及びAltschulの文献(1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-587
7)のように修正されている)、Altschulらの文献(1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)(NBL
AST及びXBLASTを記載している)、Altschulらの文献(1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-
3402)(Gapped BLAST及びPSI-Blastを記載している)。別の特定の例は、Myers及びMiller
の文献(1988 CABIOS 4:11-17)のアルゴリズムであり、これは、ALIGNプログラム(バージ
ョン2.0)に組み込まれ、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部として入
手可能である。また、Wisconsin Sequence Analysis Packageの一部として入手可能な、F
ASTAプログラム(Pearson W.R.及びLipman D.J.の文献(Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:2
444-2448, 1988))も特別である。さらなる例としては、以下のものが挙げられる。BESTFI
T、これは、Smith及びWatermanの文献(Advances in Applied Mathematics, 2:482-489, 1
981)の「局所相同性」アルゴリズムを用いて、2つの配列間で最良の単一の類似性領域を
見出すものであり、比較されている2つの配列の長さが異なる場合に好ましい;並びにGAP
、これは、Neddleman及びWunschの文献(J. Mol. Biol. 48:443-354, 1970)のアルゴリズ
ムに従って「最大類似性」を見出すことによって2つの配列を整列させるものであり、2つ
の配列がおよそ同じ長さであり、アラインメントが全長にわたって予想される場合に好ま
しい。
【００３２】
「保存的置換」は、あるクラスのアミノ酸の同じクラスの別のアミノ酸との交換を指す
。特定の実施態様において、保存的置換は、ポリペプチドの構造もしくは機能、又は両方
を変化させない。保存的置換の目的のためのアミノ酸のクラスには、疎水性のもの(Met、
Ala、Val、Leu、Ile)、中性で親水性のもの(Cys、Ser、Thr)、酸性のもの(Asp、Glu)、塩
基性のもの(Asn、Gln、His、Lys、Arg)、立体構造を破壊するもの(conformation disrupt
ers)(Gly、Pro)、及び芳香族のもの(Trp、Tyr、Phe)が含まれる。
【００３３】
本明細書で使用されるように、核酸配列との関連における「断片」という用語は、親配
列由来の連続するヌクレオチドの一部を含むヌクレオチド配列を指す。具体的な実施態様
において、該用語は、親配列由来の5〜15、5〜25、10〜30、15〜30、10〜60、25〜100、1
50〜300個、又はそれより多くの連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を指す。別の
実施態様において、該用語は、親配列の少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45
、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、150、175、200、250、275
、300、325、350、375、400、425、450、又は475個の連続するヌクレオチドのヌクレオチ
ド配列を指す。
【００３４】
本明細書で使用されるように、アミノ酸配列との関連における「断片」という用語は、
親配列由来の連続するアミノ酸残基の一部を含むアミノ酸配列を指す。具体的な実施態様
において、該用語は、親配列由来の2〜30、5〜30、10〜60、25〜100、150〜300個、又は
それより多くの連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を指す。別の実施態様において、該
用語は、親配列の少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70
、75、80、85、90、95、100、110、125、150、175、又は200個の連続するアミノ酸残基の
アミノ酸配列を指す。
【００３５】
本明細書で使用されるように、「疾患」及び「障害」という用語は、互換的に使用され
、対象の状態を指す。いくつかの実施態様において、状態はウイルス感染である。具体的
な実施態様において、「疾患」という用語は、細胞もしくは対象におけるウイルスの存在
に起因するか、又はウイルスによる細胞もしくは対象への侵入による病理学的状態を指す
。ある実施態様において、状態は対象での疾患であり、その重症度は、免疫原性組成物の
投与によって対象の免疫応答を誘導することによって低減される。
【００３６】
本明細書で使用されるように、対象への療法の投与との関連における「有効量」という
用語は、予防及び/又は治療効果(複数可)を有する療法の量を指す。ある実施態様におい
て、対象への療法の投与との関連における「有効量」は、以下の効果のうちの1つ、2つ、
3つ、4つ、又はそれより多くを達成するのに十分である療法の量を指す:(i)インフルエン
ザウイルス感染、それと関連する疾患もしくは症状の重症度を軽減もしくは改善する;ii)
インフルエンザウイルス感染、それと関連する疾患もしくは症状の持続期間を短縮する;(
iii)インフルエンザウイルス感染、それと関連する疾患もしくは症状の進行を予防する;(
iv)インフルエンザウイルス感染、それと関連する疾患もしくは症状の退行をもたらす;(v
)インフルエンザウイルス感染、それと関連する疾患もしくは症状の発症もしくは開始を
予防する;(vi)インフルエンザウイルス感染、それと関連する疾患もしくは症状の再発を
予防する;(vii)1つの細胞から別の細胞、1つの組織から別の組織、もしくは1つの器官か
ら別の器官へのインフルエンザウイルスの伝播を低減もしくは予防する;(ix)1つの対象か
ら別の対象へのインフルエンザウイルスの伝播を予防もしくは低減する;(x)インフルエン
ザウイルス感染と関連する器官不全を低減する;(xi)対象の入院を減少させる;(xii)入院
期間を短縮する;(xiii)インフルエンザウイルス感染もしくはそれと関連する疾患を有す
る対象の生存を増加させる;(xiv)インフルエンザウイルス感染もしくはそれと関連する疾
患を消失させる;(xv)インフルエンザウイルスの複製を阻害もしくは低減する;(xvi)宿主
細胞(複数可)へのインフルエンザウイルスの侵入を阻害もしくは低減する;(xviii)インフ
ルエンザウイルスゲノムの複製を阻害もしくは低減する;(xix)インフルエンザウイルスタ
ンパク質の合成を阻害もしくは低減する;(xx)インフルエンザウイルス粒子の会合を阻害
もしくは低減する;(xxi)宿主細胞(複数可)からのインフルエンザウイルス粒子の放出を阻
害もしくは低減する;(xxii)インフルエンザウイルス力価を低下させる;及び/又は(xxiii)
別の療法の予防もしくは治療効果(複数可)を増強もしくは改善する。
【００３７】
ある実施態様において、有効量はインフルエンザウイルス疾患からの完全な防御をもた
らすのではなく、未処置の対象と比較してより低い力価又は少ない数のインフルエンザウ
イルスをもたらす。ある実施態様において、有効量は、未処置の対象と比べて、0.5倍、1
倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍
、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍、もしくは1,000倍、又はそれより大きい
インフルエンザウイルスの力価の低下をもたらす。いくつかの実施態様において、有効量
は、未処置の対象と比べて、約1log以上、約2log以上、約3log以上、約4log以上、約5log
以上、約6log以上、約7log以上、約8log以上、約9log以上、約10log以上、1〜3log、1〜5
log、1〜8log、1〜9log、2〜10log、2〜5log、2〜7log、2〜8log、2〜9log、2〜10log、3
〜5log、3〜7log、3〜8log、3〜9log、4〜6log、4〜8log、4〜9log、5〜6log、5〜7log、
5〜8log、5〜9log、6〜7log、6〜8log、6〜9log、7〜8log、7〜9log、又は8〜9logのイン
フルエンザウイルスの力価の低下をもたらす。インフルエンザウイルスの力価、数、又は
総負荷量の低下の利点としては、重症度がより低い感染症状、より少ない感染症状、及び
感染と関連する疾患の長さの短縮が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書で使用されるように、「flu血球凝集素ポリペプチド」及び「flu HAポリペプ
チド」という用語は、(i)本明細書に開示されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチド;並びに(ii)インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメイン及び/もしくは
インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメイン又はこれらの断片を含む本明細書に開
示されるポリペプチドのいずれかを指し、ここで、該インフルエンザウイルス血球凝集素
ステムドメインは、1以上の修飾されたグリコシル化部位を含むか;該インフルエンザウイ
ルス血球凝集素ヘッドドメインは、1以上の非天然のグリコシル化部位を含むか;又は両方
であるかのいずれかである。flu HAポリペプチドとしては、キメラインフルエンザウイル
ス血球凝集素ポリペプチド、非キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド、
インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチド、及びインフルエンザウ
イルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
具体的な実施態様において、flu HAポリペプチドは、ステムドメインへのグリカン結合を
破壊するインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメイン中の1以上の修飾されたグリ
コシル化部位;1以上の非天然のグリコシル化部位を含むインフルエンザウイルス血球凝集
素球状ヘッドドメイン;又は両方のいずれかを含むキメラインフルエンザウイルス血球凝
集素ポリペプチドである。別の実施態様において、flu HAポリペプチドは、ステムドメイ
ンへのグリカン結合を破壊するインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメイン中の1
以上の修飾されたグリコシル化部位、1以上の非天然のグリコシル化部位を含むインフル
エンザウイルス血球凝集素球状ヘッドドメイン;又は両方を含むインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチド(任意の株、亜型、もしくは型のインフルエンザウイルスのもの又はそれ
らに由来するもの)である。例えば、そのようなfluポリペプチドについては、下記の実施
例11を参照されたい。
【００３９】
「血球凝集素」及び「HA」は、当業者に公知の任意の血球凝集素を指す。ある実施態様
において、血球凝集素は、インフルエンザ血球凝集素、例えば、A型インフルエンザ血球
凝集素、B型インフルエンザ血球凝集素、又はC型インフルエンザ血球凝集素である。典型
的な血球凝集素は、シグナルペプチド(本明細書では任意)、ステムドメイン、球状ヘッド
ドメイン、内腔ドメイン(本明細書では任意)、膜貫通ドメイン(本明細書では任意)、及び
細胞質ドメイン(本明細書では任意)を含む、当業者に公知のドメインを含む。ある実施態
様において、血球凝集素は、単一のポリペプチド鎖、例えば、HA0からなる。ある実施態
様において、血球凝集素は、四次結合した2以上のポリペプチド鎖、例えば、HA1及びHA2
からなる。当業者は、未成熟なHA0が切断されてシグナルペプチド(約20アミノ酸)を放出
し、成熟した血球凝集素HA0を生じさせることができることを認識しているであろう。血
球凝集素HA0は、別の部位で切断されて、HA1ポリペプチド(約320アミノ酸、球状ヘッドド
メインとステムドメインの一部とを含む)及びHA2ポリペプチド(約220アミノ酸、ステムド
メインの残り、内腔ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを含む)を生じさせ
ることができる。ある実施態様において、血球凝集素は、シグナルペプチド、膜貫通ドメ
イン、及び細胞質ドメインを含む。ある実施態様において、血球凝集素は、シグナルペプ
チドを欠く、すなわち、血球凝集素は成熟した血球凝集素である。ある実施態様において
、血球凝集素は、膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメイン、又は両方を欠く。本明細書で
使用されるように、「血球凝集素」及び「HA」という用語は、翻訳後プロセシング、例え
ば、シグナルペプチド切断、ジスルフィド結合形成、グリコシル化(例えば、N結合型グリ
コシル化)、プロテアーゼ切断、及び脂質修飾(例えば、S-パルミトイル化)によって修飾
される血球凝集素ポリペプチドを包含する。
【００４０】
本明細書で使用されるように、「キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチ
ド」、「キメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド」、「キメラ血球凝集素ポリペプ
チド」、及び「キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド」という用語は、インフル
エンザウイルス血球凝集素ステムドメイン及びインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッド
ドメインを含むインフルエンザ血球凝集素を指し、ここで、該インフルエンザウイルス血
球凝集素ヘッドドメインは、該インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインと異種
である。ある実施態様において、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド
のインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインは、インフルエンザウイルス血球凝
集素ステムドメインとは異なる株又は亜型のインフルエンザウイルス由来のものである。
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリ
ペプチドとの関連において、異種インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインは、
相同ヘッド(すなわち、通常、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの
ステムドメインと関連しているヘッドドメイン)と少なくとも5％、少なくとも10％、少な
くとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも5〜10％、少なくとも10〜15
％、少なくとも10〜20％、少なくとも15〜20％、又は少なくとも20〜25％異なるインフル
エンザウイルス血球凝集素ヘッドを指す。当業者は、そのような相違を、当技術分野で公
知及び本明細書に記載の手法を用いて、例えば、ヘッドドメインの配列同一性又は配列相
同性を比較して測定することができることを認識しているであろう。ある実施態様におい
て、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドとの関連に
おいて、異種インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインは、血球凝集素阻害アッ
セイにおいて、相同ヘッド(すなわち、通常、該キメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドのステムドメインと関連しているヘッドドメイン)に対して惹起される抗
血清の血球凝集素阻害力価と比べて、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、
少なくとも5倍、又は少なくとも6倍小さい血球凝集素阻害力価を有する抗血清を生じさせ
るインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドを指す。当業者は、そのような相違を、当技
術分野で公知及び本明細書に記載の手法を用いて測定することができることを認識してい
るであろう(例えば、下記の第5.14節参照)。
【００４１】
「HA1のN末端ステムセグメント」は、インフルエンザ血球凝集素HA1ポリペプチドのス
テムドメインのアミノ末端部分に対応するポリペプチドセグメントを指す。ある実施態様
において、HA1のN末端ステムセグメントは、HA1ドメインのアミノ酸HA1N-termからApまで
にほぼ対応するアミノ酸残基からなる。HA1N-termは、当業者によって認識されているよ
うなHA1のN末端アミノ酸である。Apは、HA1のC末端ステムセグメント中のシステイン残基
とジスルフィド結合を形成するか、又はそれを形成することができる、HA1のN末端ステム
セグメント中のシステイン残基である。残基Apは、図1のA型インフルエンザ血球凝集素ポ
リペプチド中で特定されている。例示的なHA1のN末端ステムセグメントが本明細書に記載
されている。ある実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、H3血球凝集素由来
のHA1のアミノ酸1〜52にほぼ対応するアミノ酸残基からなる。この付番体系では、1は、
シグナルペプチドが除去されている成熟したHA0タンパク質のN末端アミノ酸を指すことに
留意されたい。当業者は、他のインフルエンザHAポリペプチドのHA1のN末端ステムセグメ
ントに対応するアミノ酸残基、例えば、H1血球凝集素由来のHA1のHA1のN末端ステムセグ
メントに対応するアミノ酸残基を容易に認識することができるであろう(例えば、図1参照
)。
【００４２】
「HA1のC末端ステムセグメント」は、インフルエンザ血球凝集素HA1ポリペプチドのス
テムドメインのカルボキシ末端部分に対応するポリペプチドセグメントを指す。ある実施
態様において、HA1のC末端ステムセグメントは、HA1ドメインのアミノ酸AqからHA1C-term
までにほぼ対応するアミノ酸残基からなる。HA1C-termは、当業者によって認識されてい
るようなHA1ドメインのC末端アミノ酸である。残基Aqは、図1のA型インフルエンザ血球凝
集素ポリペプチド中で特定されている。例示的なHA1のC末端ステムセグメントが本明細書
に記載されている。ある実施態様において、HA1のC末端ステムセグメントは、H3血球凝集
素由来のHA1のアミノ酸277〜346にほぼ対応するアミノ酸残基からなる。この付番体系で
は、1は、シグナルペプチドが除去されている成熟したHA0タンパク質のN末端アミノ酸を
指すことに留意されたい。当業者は、他のインフルエンザHAポリペプチドのHA1のC末端ス
テムセグメントに対応するアミノ酸残基、例えば、H1血球凝集素由来のHA1のHA1のC末端
ステムセグメントに対応するアミノ酸残基を容易に認識することができるであろう(例え
ば、図1参照)。
【００４３】
「HA1のC末端の短いステムセグメント」は、インフルエンザ血球凝集素HA1ポリペプチ
ドのステムドメインのカルボキシル末端部分に対応するポリペプチドセグメントを指す。
ある実施態様において、HA1のC末端の短いステムセグメントは、HA1ドメインのアミノ酸B
qからHA1C-termまでにほぼ対応するアミノ酸残基からなる。残基Bqは、図1のA型インフル
エンザ血球凝集素ポリペプチド中で特定されている。例示的なHA1のC末端の短いステムセ
グメントが本明細書に記載されている。ある実施態様において、HA1のC末端の短いステム
セグメントは、H3血球凝集素由来のHA1のアミノ酸305〜346にほぼ対応するアミノ酸残基
からなる。この付番体系では、1は、シグナルペプチドが除去されている成熟したHA0タン
パク質のN末端アミノ酸を指すことに留意されたい。
【００４４】
「HA1のN末端の長いステムセグメント」は、インフルエンザ血球凝集素HA1ポリペプチ
ドのステムドメインのアミノ末端部分に対応するポリペプチドセグメントを指す。ある実
施態様において、HA1のN末端の長いステムセグメントは、HA1ドメインのアミノ酸HA1N-te
rmからCpまでにほぼ対応するアミノ酸残基からなる。Cpは、HA1のC末端の長いステムセグ
メント中のアラニン残基に連結しているか、又はそれに連結することができるHA1のN末端
の長いステムセグメント中のシステイン残基である。残基Cpは、図1のA型インフルエンザ
血球凝集素ポリペプチド中で特定されている。例示的なHA1のN末端の長いステムセグメン
トが本明細書に記載されている。ある実施態様において、HA1のN末端の長いステムセグメ
ントは、H3血球凝集素由来のHA1のアミノ酸1〜97にほぼ対応するアミノ酸残基からなる。
この付番体系では、1は、シグナルペプチドが除去されている成熟したHA0タンパク質のN
末端アミノ酸を指すことに留意されたい。
【００４５】
「HA1のC末端の長いステムセグメント」は、インフルエンザ血球凝集素HA1ポリペプチ
ドのステムドメインのカルボキシル末端部分に対応するポリペプチドセグメントを指す。
ある実施態様において、HA1のC末端の長いステムセグメントは、HA1ドメインのアミノ酸C
qからHA1C-termまでにほぼ対応するアミノ酸残基からなる。Cqは、HA1のN末端の長いステ
ムセグメント中のシステイン残基に連結しているか、又はそれに連結することができるHA
1のC末端の長いステムセグメント中のアラニン残基である。残基Cqは、図1のA型インフル
エンザ血球凝集素ポリペプチド中で特定されている。例示的なHA1のC末端の長いステムセ
グメントが本明細書に記載されている。ある実施態様において、HA1のC末端の長いステム
セグメントは、H3血球凝集素由来のHA1のアミノ酸252〜346にほぼ対応するアミノ酸残基
からなる。この付番体系では、1は、シグナルペプチドが除去されている成熟したHA0タン
パク質のN末端アミノ酸を指すことに留意されたい。
【００４６】
「HA2」は、当業者に公知のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのHA2ドメインに対
応するポリペプチドドメインを指す。ある実施態様において、HA2は、ステムドメイン、
内腔ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインからなる(例えば、Scheiffleらの文
献(2007, EMBO J. 16(18):5501-5508)を参照されたく、その内容は、引用によりその全体
が組み込まれる)。ある実施態様において、HA2は、ステムドメイン、内腔ドメイン、及び
膜貫通ドメインからなる。ある実施態様において、HA2は、ステムドメイン及び内腔ドメ
インからなり;そのような実施態様において、HA2は可溶性であることができる。ある実施
態様において、HA2はステムドメインからなり;そのような実施態様において、HA2は可溶
性であることができる。
【００４７】
本明細書で使用されるように、ポリペプチド、核酸、又はウイルスとの関連における「
異種」という用語は、通常天然で見られないか、又は通常天然で関心対象のポリペプチド
、核酸、もしくはウイルスと関連していないポリペプチド、核酸、又はウイルスをそれぞ
れ指す。例えば、「異種ポリペプチド」は、異なるウイルス、例えば、異なるインフルエ
ンザ株もしくは亜型、又は無関係なウイルスもしくは異なる種に由来するポリペプチドを
指すことができる。具体的な実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ
ウイルス血球凝集素の球状ヘッドドメインとの関連において使用される場合、異種という
用語は、それが、通常、関連しているのが見られない(例えば、HAのヘッド及びステムド
メインが、天然では、一緒に見られない)インフルエンザHAステムドメインと関連してい
るインフルエンザHA球状ヘッドドメインを指す。上記のように、ある実施態様において、
本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素の異種インフルエンザHA球状
ヘッドドメインは、血球凝集素の相同ヘッド(すなわち、通常、キメラインフルエンザウ
イルス血球凝集素ポリペプチドのステムドメインと関連しているヘッドドメイン)と少な
くとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少な
くとも5〜10％、少なくとも10〜15％、少なくとも10〜20％、少なくとも15〜20％、又は
少なくとも20〜25％異なる。
【００４８】
本明細書で使用されるように、対象への2以上の療法の投与との関連における「併用」
という用語は、2以上の療法(例えば、2以上の予防剤及び/又は治療剤)の使用を指す。「
併用」という用語の使用は、療法が対象に投与される順序を制限しない。例えば、第1の
療法(例えば、第1の予防剤又は治療剤)は、対象への第2の療法の投与の前に(例えば、5分
、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、16時間、24時間、48時間、
72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、もしくは12週間
前に)、それと同時に、又はその後に(例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4
時間、6時間、12時間、16時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間
、4週間、5週間、6週間、8週間、もしくは12週間後に)投与することができる。
【００４９】
本明細書で使用されるように、「感染」という用語は、細胞又は対象におけるウイルス
の侵入、その増殖、及び/又は存在を意味する。一実施態様において、感染は、「活動性
」感染、すなわち、ウイルスが細胞又は対象で複製している感染である。そのような感染
は、ウイルスが最初に感染した細胞、組織、及び/又は器官から、他の細胞、組織、及び/
又は器官へのウイルスの伝播を特徴とする。感染はまた、潜伏性の感染、すなわち、ウイ
ルスが複製していない感染であってもよい。ある実施態様において、感染は、細胞もしく
は対象におけるウイルスの存在に起因するか、又は細胞もしくは対象へのウイルスの侵入
による病理学的状態を指す。
【００５０】
本明細書で使用されるように、「インフルエンザウイルス疾患」という用語は、細胞又
は対象におけるインフルエンザ(例えば、A型もしくはB型インフルエンザウイルス)ウイル
スの存在、又は細胞もしくは対象へのインフルエンザウイルスの侵入に起因する病理学的
状態を指す。具体的な実施態様において、この用語は、インフルエンザウイルスによって
引き起こされる呼吸器疾患を指す。
【００５１】
本明細書で使用されるように、「IFN欠損システム」又は「IFN欠損基体」という語句は
、IFNを産生しないか、又は低レベルのIFNを産生する(すなわち、同じ条件下のIFNコンピ
テントなシステムと比較して、5〜10％、10〜20％、20〜30％、30〜40％、40〜50％、50
〜60％、60〜70％、70〜80％、80〜90％、もしくはそれより大きいIFN発現の低下)か、IF
Nに応答しないか、もしくはそれにあまり効率的には応答せず、及び/又はIFNによって誘
導される1以上の抗ウイルス遺伝子の活性が欠損している、システム、例えば、細胞、細
胞株、及び動物、例えば、ブタ、マウス、ニワトリ、七面鳥、ウサギ、ラットなどを指す
。
【００５２】
本明細書で使用されるように、「log」という数値用語は、log10を指す。
【００５３】
本明細書で使用されるように、「修飾されたグリコシル化部位」という用語は、1以上
のアミノ酸の付加、置換、又は欠失によって修飾されているインフルエンザウイルス血球
凝集素ポリペプチド中の天然のグリコシル化部位を指す。ある実施態様において、修飾さ
れたグリコシル化部位は、グリカンに結合することができない。ある実施態様において、
修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル化を破壊
又は妨害する。ある実施態様において、修飾されたグリコシル化部位は、本明細書に記載
のflu HAポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド)の適切な
フォールディングを妨害しない。ある実施態様において、修飾されたグリコシル化部位は
、アミノ酸モチーフAsn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する天然のグリコシル化部位の修飾を含み
、ここで、Xaaは任意のアミノ酸である。特定の実施態様において、修飾されたグリコシ
ル化部位は、アミノ酸モチーフAsn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する天然のグリコシル化部位に1
以上のアミノ酸置換を含み、ここで、Xaaは任意のアミノ酸である。
【００５４】
本明細書で使用されるように、「感染多重度」又は「MOI」という語句は、感染細胞当
たりの感染性ウイルス粒子の平均数である。MOIは、添加した感染性ウイルス粒子の数(添
加したml×PFU/ml)を、添加した細胞の数(添加したml×細胞/ml)で割ることによって決定
される。
【００５５】
本明細書で使用されるように、「非キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプ
チド」という用語は、同じ亜型又は株由来のHAステムドメイン及びHAヘッドドメインを含
むインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを指し、ここで、該ポリペプチドは、
下記の第5.4.2節で論じられているような1以上の非天然のグリコシル化部位、及び/又は
下記の第5.4.1節で論じられているような1以上の修飾されたグリコシル化部位を含む。あ
る実施態様において、非キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、同じ
インフルエンザウイルス亜型由来のHAステムドメイン及びHA球状ヘッドドメインを含む。
具体的な実施態様において、該インフルエンザウイルス亜型は、H1、H2、H3、H4、H5、H6
、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、又はH17亜型である。ある実施態様
において、非キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、同じインフルエ
ンザウイルス株由来のHAステムドメイン及びHA球状ヘッドドメインを含む。ある実施態様
において、該インフルエンザウイルス株は、A/ネーデルラント/602/2009である。
【００５６】
本明細書で使用されるように、「非天然のグリコシル化部位」という用語は、天然のグ
リコシル化部位が特定のHA亜型又は株に関して見られない特定の球状ヘッドドメイン内の
任意のアミノ酸位置にあるグリコシル化部位を指す。非天然のグリコシル化部位の1つの
例は、ある亜型のインフルエンザウイルス血球凝集素の球状ヘッドドメインへのグリコシ
ル化部位の付加であり、ここで、該グリコシル化は、別の亜型のインフルエンザウイルス
由来の血球凝集素の球状ヘッドドメイン中に天然に見出される。非天然のグリコシル化の
別の例は、ある株由来のインフルエンザウイルス血球凝集素の球状ヘッドドメインへのグ
リコシル化部位の付加であり、ここで、該グリコシル化部位は、別のインフルエンザウイ
ルス株由来の血球凝集素の球状ヘッド中に天然に見出される。非天然のグリコシル化部位
のまた別の例は、ある株由来のインフルエンザウイルス血球凝集素の球状ヘッドドメイン
へのグリコシル化部位の付加であり、ここで、該グリコシル化部位は、インフルエンザウ
イルスの別の亜型又は株由来の血球凝集素の球状ヘッド中に天然には見出されない。好ま
しい実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、アミノ酸モチーフAsn-Xaa-Ser/Th
r/Cysを有し、ここで、Xaaは任意のアミノ酸であり、又はある実施態様において、XaaはP
roを除く任意のアミノ酸である。
【００５７】
本明細書で使用されるように、「核酸」という用語は、DNA分子(例えば、cDNA又はゲノ
ムDNA)及びRNA分子(例えば、mRNA)及びヌクレオチド類似体を用いて作製されたDNA又はRN
Aの類似体を含むことが意図される。核酸は、一本鎖又は二本鎖であることができる。
【００５８】
当業者に公知であるように、「ポリペプチド」は、アミド結合によって連結されたアミ
ノ酸のポリマーを指す。本明細書で使用されるように、この用語は、共有アミド結合で連
結された単一のポリペプチド鎖を指すことができる。この用語は、非共有結合的相互作用
、例えば、イオン接触、水素結合、ファンデルワールス接触、及び疎水性接触によって会
合する複数のポリペプチド鎖を指すこともできる。当業者は、この用語が、例えば、翻訳
後プロセシング、例えば、シグナルペプチド切断、ジスルフィド結合形成、グリコシル化
(例えば、N結合型グリコシル化)、プロテアーゼ切断、及び脂質修飾(例えば、S-パルミト
イル化)によって修飾されているポリペプチドを含むことを認識しているであろう。
【００５９】
本明細書で使用されるように、インフルエンザウイルス疾患を予防するための対象への
療法(複数可)の投与との関連における「予防する」、「予防すること」、及び「予防」と
いう用語は、療法又は療法の組合せの投与から得られる予防的な/有益な効果のうちの1つ
又は複数を指す。具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス疾患を予防するた
めの対象への療法(複数可)の投与との関連における「予防する」、「予防すること」、及
び「予防」という用語は、療法又は療法の組合せの投与から得られる以下の効果のうちの
1つ又は複数を指す:(i)インフルエンザウイルス疾患又はその症状の発症又は開始の阻害;
(ii)インフルエンザウイルス疾患又はそれと関連する症状の再発の阻害;並びに(iii)イン
フルエンザウイルスの感染及び/又は複製の低減又は阻害。
【００６０】
本明細書で使用されるように、天然源、例えば、細胞から得られるポリペプチド(抗体
を含む)との関連で使用される場合の「精製された」及び「単離された」という用語は、
天然源由来の夾雑物質、例えば、土壌粒子、鉱物、環境由来の化学物質、並びに/又は天
然源由来の細胞性物質、例えば、限定されないが、細胞破片、細胞壁物質、膜、オルガネ
ラ、細胞内に存在する核酸、炭水化物、タンパク質、及び/もしくは脂質の大部分を実質
的に含まないポリペプチドを指す。したがって、単離されたポリペプチドには、細胞性物
質及び/又は夾雑物質の(乾燥重量で)約30％、20％、10％、5％、2％又は1％未満を有する
ポリペプチド調製物が含まれる。本明細書で使用されるように、化学合成されるポリペプ
チド(抗体を含む)との関連で使用される場合の「精製された」及び「単離された」という
用語は、ポリペプチドの合成に関与する化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まな
いポリペプチドを指す。具体的な実施態様において、flu HAポリペプチド(例えば、イン
フルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、インフルエンザ血球凝集素ヘッドド
メインポリペプチド、キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド、及び/又は非キメ
ラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド)は、化学合成される。別の具体的な実施態様
において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、インフルエンザ血球
凝集素ヘッドドメインポリペプチド、及び/又はキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドは、単離される。
【００６１】
本明細書で使用されるように、ウイルスとの関連における「複製」、「ウイルスの複製
」、及び「ウイルス複製」という用語は、ウイルスの増殖をもたらすウイルスの生活環の
段階のうちの1つもしくは複数、又は全てを指す。ウイルスの生活環の段階には、宿主細
胞表面へのウイルス付着、宿主細胞への貫入又は侵入(例えば、受容体介在性エンドサイ
トーシス又は膜融合によるもの)、脱外被(ウイルスカプシドがウイルス酵素又は宿主酵素
によって除去及び分解され、それにより、ウイルスゲノム核酸が放出される過程)、ゲノ
ム複製、ウイルスメッセンジャーRNA(mRNA)の合成、ウイルスタンパク質合成、並びにゲ
ノム複製のためのウイルスリボ核タンパク複合体の会合、ウイルス粒子の会合、ウイルス
タンパク質の翻訳後修飾、及び溶解又は出芽による宿主細胞からの遊離、及び埋め込まれ
たウイルス糖タンパク質を含むリン脂質エンベロープの獲得が含まれるが、これらに限定
されない。いくつかの実施態様において、「複製」、「ウイルスの複製」、及び「ウイル
ス複製」という用語は、ウイルスゲノムの複製を指す。他の実施態様において、「複製」
、「ウイルスの複製」、及び「ウイルス複製」という用語は、ウイルスタンパク質の合成
を指す。
【００６２】
本明細書で使用されるように、「ステムドメインポリペプチド」及び「インフルエンザ
ウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド」という用語は、血球凝集素のステムド
メインを構成する1以上のポリペプチド鎖を含む血球凝集素ポリペプチドの誘導体、例え
ば、改変された誘導体を指す。ステムドメインポリペプチドは、単一のポリペプチド鎖、
2つのポリペプチド鎖、又はより多くのポリペプチド鎖であり得る。通常、ステムドメイ
ンポリペプチドは、単一のポリペプチド鎖(すなわち、血球凝集素HA0ポリペプチドのステ
ムドメインに対応する)又は2つのポリペプチド鎖(すなわち、血球凝集素HA2ポリペプチド
と関連している血球凝集素HA1ポリペプチドのステムドメインに対応する)である。ある実
施態様において、ステムドメインポリペプチドは、インフルエンザ血球凝集素に由来する
。具体的な実施態様において、ステムドメインポリペプチドは、H1又はH3インフルエンザ
ウイルス血球凝集素に由来する。改変されたステムドメインポリペプチドは、下記のよう
な1以上のリンカーを含むことができる。
【００６３】
本明細書で使用されるように、「インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポ
リペプチド」、「インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメイン」、「HA球状ヘッド
ドメイン」、及び「HAヘッドドメイン」という用語は、インフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドの球状ヘッドドメインを指す。インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメイン
ポリペプチド又はインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインは、既知の(例えば
、野生型の)インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインを含むことができる、も
しくはそれからなることができるか、又は既知の(例えば、野生型)インフルエンザウイル
ス血球凝集素ヘッドドメインの派生物、例えば、改変された派生物を含むことができる、
もしくはそれからなることができる。
【００６４】
本明細書で使用されるように、「対象」又は「患者」という用語は、互換的に使用され
、動物(例えば、鳥、爬虫類、及び哺乳動物)を指す。具体的な実施態様において、対象は
鳥である。別の実施態様において、対象は、非霊長類(例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ
、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス)並びに霊長類(例
えば、サル、チンパンジー、及びヒト)を含む哺乳動物である。ある実施態様において、
対象は非ヒト動物である。いくつかの実施態様において、対象は家畜又はペットである。
別の実施態様において、対象はヒトである。別の実施態様において、対象はヒト乳児であ
る。別の実施態様において、対象はヒト小児である。別の実施態様において、対象はヒト
成人である。別の実施態様において、対象はヒト高齢者である。別の実施態様において、
対象はヒト早産児である。
【００６５】
本明細書で使用されるように、「ヒト早産児」という用語は、妊娠37週未満で生まれる
ヒト乳児を指す。
【００６６】
本明細書で使用されるように、「ヒト乳児」という用語は、新生児から1歳までのヒト
を指す。
【００６７】
本明細書で使用されるように、「ヒト小児」という用語は、1歳から18歳までのヒトを
指す。
【００６８】
本明細書で使用されるように、「ヒト成人」という用語は、18歳以上のヒトを指す。
【００６９】
本明細書で使用されるように、「ヒト高齢者」という用語は、65歳以上のヒトを指す。
【００７０】
「三次構造」及び「四次構造」という用語は、当業者によって理解される意味を有する
。三次構造は、単一のポリペプチド鎖の三次元構造を指す。四次構造は、複数のポリペプ
チド鎖を有するポリペプチドの三次元構造を指す。
【００７１】
本明細書で使用されるように、「季節性インフルエンザウイルス株」という用語は、対
象集団が季節ごとに曝露されるインフルエンザウイルスの株を指す。具体的な実施態様に
おいて、季節性インフルエンザウイルス株という用語は、A型インフルエンザウイルスの
株を指す。具体的な実施態様において、季節性インフルエンザウイルス株という用語は、
H1又はH3亜型、すなわち、現在、ヒト対象集団内に存続している2つの亜型に属するイン
フルエンザウイルスの株を指す。他の実施態様において、季節性インフルエンザウイルス
株という用語は、B型インフルエンザウイルスの株を指す。
【００７２】
本明細書で使用されるように、「療法(複数)」及び「療法」という用語は、ウイルス感
染又はそれと関連する疾患もしくは症状の予防又は治療において使用することができる任
意のプロトコル(複数可)、方法(複数可)、化合物(複数可)、組成物(複数可)、製剤(複数
可)、及び/又は薬剤(複数可)を指すことができる。ある実施態様において、「療法(複数)
」及び「療法」という用語は、当業者に公知のウイルス感染又はそれと関連する疾患もし
くは症状の予防又は治療において有用な生物学的療法、支持療法、及び/又は他の療法を
指す。いくつかの実施態様において、「療法」という用語は、(i)flu HAポリペプチド(例
えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)をコードする核酸、(ii)f
lu HAポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)、
又は(iii)flu HAポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペ
プチド)をコードする核酸を含むかもしくはflu HAポリペプチドを含むベクターもしくは
組成物を指す。いくつかの実施態様において、「療法」という用語は、キメラインフルエ
ンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに特異的に結合する抗体を指す。
【００７３】
本明細書で使用されるように、「治療する」、「治療」、及び「治療すること」という
用語は、対象への療法(複数可)の投与との関連において、療法又は療法の組合せの有益な
又は治療的な効果を得るためにインフルエンザウイルス疾患又は感染を治療することを指
す。具体的な実施態様において、そのような用語は、療法又は療法の組合せの投与から得
られる以下の効果のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又はそれより多くを指す:(i)イン
フルエンザウイルス感染、又はそれと関連する疾患もしくは症状の重症度の軽減又は改善
;(ii)インフルエンザウイルス感染、又はそれと関連する疾患もしくは症状の持続時間の
短縮;(iii)インフルエンザウイルス感染又はそれと関連する疾患もしくは症状の退行;(iv
)インフルエンザウイルスの力価の低減;(v)インフルエンザウイルス感染又はそれと関連
する疾患と関連する器官不全の低減;(vi)対象の入院の減少;(vii)入院期間の短縮;(viii)
対象の生存の増加;(ix)インフルエンザウイルス感染、又はそれと関連する疾患もしくは
症状の消失;(x)インフルエンザウイルス感染又はそれと関連する疾患もしくは症状の進行
の阻害;(xi)細胞、組織、器官、又は対象から別の細胞、組織、器官、又は対象へのイン
フルエンザウイルスの伝播の予防;(xii)宿主細胞(複数可)へのインフルエンザウイルスの
侵入の阻害又は低減;(xiii)インフルエンザウイルスゲノムの複製の阻害又は低減;(xiv)
インフルエンザウイルスタンパク質の合成の阻害又は低減;(xv)宿主細胞(複数可)からの
インフルエンザウイルス粒子の放出の阻害又は低減;並びに/或いは(xvi)別の療法の治療
効果の増強又は改善。
【００７４】
本明細書で使用されるように、いくつかの実施態様において、ウイルスとの関連におけ
る「野生型」という語句は、一般的であり、自然に循環しており、かつ疾患の典型的な発
生をもたらすウイルスの型を指す。他の実施態様において、ウイルスとの関連における「
野生型」という用語は、親ウイルスを指す。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
(4.図面の簡単な説明)
【図１】A型インフルエンザウイルス血球凝集素の16の亜型の代表的な配列(それぞれ、配列番号1〜16)のCLUSTALWによる配列アラインメントを示す。Apと表記された残基は、Aqと表記された残基(HA1のC末端ステムセグメント中のシステイン残基)とジスルフィド結合を形成するか、又はそれを形成することができるHA1のN末端ステムセグメント中のシステイン残基である。Bqと表記された残基は、本明細書に記載のHA1のC末端の短いステムセグメントのおおよそのN末端アミノ酸を表す。Cqと表記された残基は、本明細書に記載のHA1のC末端の長いステムセグメントのおおよそのN末端アミノ酸を表す。Cpと表記された残基は、本明細書に記載のHA1のN末端の長いステムセグメントのおおよそのC末端アミノ酸を表す。
【００７６】
【図２】A型インフルエンザHK68-H3N2血球凝集素(配列番号3)及びPR8-H1N1血球凝集素(配列番号1)と整列させたB型インフルエンザウイルス血球凝集素(配列番号558)の代表的な配列のCLUSTALWによる配列アラインメントを示す。
【００７７】
【図３】本明細書に記載の様々なN末端及びC末端ステムセグメント並びに中間ステムセグメントの境界を成すアミノ酸を記載した、B型インフルエンザウイルス血球凝集素(配列番号17)の配列表を示す。
【００７８】
【図４】HK68-H3N2血球凝集素タンパク質に基づくA型インフルエンザHAステムドメインポリペプチドの推定上の構造を提供する。図4Aは、HK68-H3N2血球凝集素タンパク質、HA1のN末端ステムセグメント配列番号36、及びC末端ステムセグメント配列番号52に基づくA型インフルエンザHAステムドメインポリペプチドの推定上の構造を提供する。図4Bは、HK68-H3N2血球凝集素タンパク質、HA1のN末端ステムセグメント配列番号36、及びC末端の短いステムセグメント配列番号352に基づくA型インフルエンザHAの短いステムドメインポリペプチドの推定上の構造を提供する。図4Cは、HK68-H3N2血球凝集素タンパク質、HA1のN末端の長いステムセグメント配列番号417、及びC末端の長いステムセグメント配列番号433に基づくA型インフルエンザHAの長いステムドメインポリペプチドの推定上の構造を提供する。
【００７９】
【図５】PR8-H1N1血球凝集素タンパク質に基づくA型インフルエンザHAステムドメインポリペプチドの推定上の構造を提供する。図5Aは、PR8-H1N1血球凝集素タンパク質、HA1のN末端ステムセグメント配列番号18、及びC末端ステムセグメント配列番号34に基づくA型インフルエンザHAステムドメインポリペプチドの推定上の構造を提供する。図5Bは、A型インフルエンザHAの短いステムドメインポリペプチド、HA1のN末端ステムセグメント配列番号18、及びC末端の短いステムセグメント配列番号350の推定上の構造を提供する。図5Cは、PR8-H1N1血球凝集素タンパク質、HA1のN末端の長いステムセグメント配列番号414、及びC末端の長いステムセグメント配列番号430に基づくA型インフルエンザHAの長いステムドメインポリペプチドの推定上の構造を提供する。
【００８０】
【図６】B型インフルエンザHAステムドメインポリペプチドの推定上の構造を提供する。図6Aは、B/香港/8/73血球凝集素タンパク質に基づく部分的にヘッドのないHA分子を提供する。この分子中では、HAのHA1ドメインの最初の94アミノ酸が保持されており(配列番号550)、かつCys94が、リンカー架橋によって、HA1ドメインのCys143に直連結されている(配列番号553)。図6Bは、B/香港/8/73血球凝集素タンパク質に基づく部分的にヘッドのないHA分子を示す。この分子中では、HAのHA1ドメインの最初の178アミノ酸が保持されており(配列番号551)、かつCys178が、リンカー架橋によって、HA1ドメインのCys272に直連結されている(配列番号554)。図6Cは、B/香港/8/73血球凝集素タンパク質に基づくヘッドのないHA分子を示す。この分子中では、HAのHA1ドメインの最初の94アミノ酸が保持されており(配列番号555)、かつCys94が、リンカー架橋によって、HA1ドメインのCys143に直連結されている。HA1ドメインのアミノ酸143〜178がさらに保持されており(配列番号556)、かつCys178が、リンカー架橋によって、HA1ドメインのCys272に直連結されている(配列番号557)。図6Dは、B/香港/8/73血球凝集素タンパク質に基づくヘッドのないHA分子を示す。この分子中では、HAのHA1ドメインの最初の54アミノ酸が保持されており(配列番号552)、かつCys54が、リンカー架橋によって、HA1ドメインのCys272に直連結されている(配列番号554)。
【００８１】
【図７】保存されたH1ストークドメイン及び異なる亜型HA由来の様々な球状ヘッドドメインを有するキメラHAの概略図を示す。
【００８２】
【図８】抗体及び反応性血清を誘導し、解析するための新規のインフルエンザワクチン及び診断ツールプラットフォームを示す。A)キメラHAの発現。A/PR8/34 HAのストークドメイン及びA/カリフォルニア/4/09の球状ヘッドドメインからなるキメラHA(キメラHA)並びに野生型HA(PR8-HA及びCAL09-HA)並びにGFP対照を293T細胞で発現させた。上のウェスタンブロットはPR8特異的抗体(PY102)でプロービングしたのに対し、下側のブロットはCal09に特異的な抗体(39C2)でプロービングした。B)Aで発現されたHA構築物の模式図。キメラHAは、A/PR/8/34 HAストークドメイン及び2009 A/カリフォルニア/04/09球状ヘッドドメインから構成される。
【００８３】
【図９】キメラHAの概略図を示す。A)キメラHAの基本構造。球状ヘッドは、ジスルフィド結合Cys 52-Cys 277で好都合に交換することができる。B)完全に保存されたストークドメイン及び様々な球状ヘッドドメインからなるキメラHAの順次投与による初回免疫-追加免疫体制。
【００８４】
【図１０】H1 HAのストーク及びH3 HAの球状ヘッドを有するキメラHAの作製を記載している。A/PR8/34 HAのストークドメイン及びHK/68の球状ヘッドドメインからなるキメラHA(キメラH3)並びに野生型HA(PR8-HA及びHK68 HA)を293T細胞で発現させた。上のウェスタンブロットはPR8特異的抗体でプロービングしたのに対し、下側のブロットはH3に特異的な抗体でプロービングした。
【００８５】
【図１１】A/香港/1/1968(H3)、A/パース/16/2009(H3)、A/PR/8/34(H1)、A/Cal/4/09(H1)、A/ベトナム/1203/04(H5)、及びA/マガモ/アルバータ/24/01(H7)の血球凝集素タンパク質配列の配列比較を示す。Cys52及びCys272アミノ酸残基が(H3付番に基づいて)指定されている。黒の陰影部は、保存されたアミノ酸を示す。黒の波線は、HAの球状ヘッド領域を表す。HA1及びHA2の始点が示されている。
【００８６】
【図１２】キメラ血球凝集素の概略図を示す。(A)キメラPR8-cH1 HAの構築図。キメラHAを、A/PR/8/34(H1) HAのCys52とCys277の間に位置する球状ヘッドドメインと、A/カリフォルニア/4/09(H1) HAの球状ヘッドドメインとを交換することにより構築した。得られたキメラHAは、A/PR8/34(H1) HAのストーク領域をA/カリフォルニア/4/09(H1) HAの球状ヘッドドメインとともに有しており、PR8-cH1と表記されている。(B)様々な野生型HA及びキメラHA、例えば、(左から右に)野生型PR8 HA、キメラPR8-cH1 HA、キメラPR8-cH5 HA、野生型パースHA、及びキメラパース-cH7 HAのフォールディングされた構造の概略図。全長HA構造は、タンパク質データベース(PDB)からダウンロードした: PR8 HA(PDB ID 1RU7)及びパースHA(HK68 HA、PDB ID 1MQNで表される)。最終的な画像は、PyMol(Delano Scientific)で作成した。
【００８７】
【図１３】キメラHA構築物の表面発現及び機能解析を示す。(A)キメラHA構築物の表面発現を一過性にトランスフェクトした細胞で評価した。トランスフェクションの24時間後、293T細胞をトリプシン処理し、キメラHAタンパク質の細胞表面発現をフローサイトメトリーで解析した。上のパネルで、模擬トランスフェクトした細胞(左の陰影領域)が、PR8 HAをトランスフェクトした細胞(右)又はPR8-cH1をトランスフェクトした細胞(右)又はPR8-cH5をトランスフェクトした細胞(右)と比較されている。下のパネルで、模擬トランスフェクトした細胞(左の陰影領域)が、パースをトランスフェクトした細胞及びパース-cH7構築物(右)をトランスフェクトした細胞と比較されている。(B)キメラHAを発現するルシフェラーゼコード偽粒子を用いて、MDCK細胞を感染させた。ルシフェラーゼアッセイで生成された相対光単位(RLU)は、キメラHAを発現する偽粒子が細胞に侵入することができたことを示す。
【００８８】
【図１４】キメラ血球凝集素を有する組換えウイルスの作製を記載している。(A)組換えウイルスのウェスタンブロット解析。模擬感染させた又は表示されたウイルス(16hpi)を2のMOIで感染させたMDCK細胞由来の抽出物を調製し、抗体:抗A/PR8/HA(H1)(PY102)、抗A/Cal/09/HA(H1)(29C1)、抗A/VN/HA(H5)(M08)、抗H3/HA(12D1)、抗H7(NR-3125)、抗A/NP(HT103)、及び内部ローディング対照としての抗GAPDHでプロービングした。(B)抗体:抗A/NP(HT103)、抗A/H1 HA(6F12)、抗A/PR8/HA(PY102)、抗A/Cal/09/HA(29C1)、抗A/VN/HA(M08)、抗H3/HA(12D1)、及び抗A/H7ウイルス(NR-3152)を用いた、組換えウイルスに感染させたMDCK細胞の免疫蛍光解析。
【００８９】
【図１５】組換えウイルスの成長動態及びプラーク表現型を記載している。(A)10日齢の発育鶏卵を、卵1個当たり100pfuの野生型ウイルス又は組換えウイルスに感染させ、ウイルス成長を感染後72時間モニタリングした。(B)組換えウイルスのプラーク表現型をプラークアッセイにより評価した。MDCK細胞を、野生型ウイルス又は組換えウイルスのいずれかに感染させ、感染48時間後に免疫染色して、A/NP(HT103)に対する抗体を用いてプラーク表現型を明らかにした。
【００９０】
【図１６】キメラH6血球凝集素をトランスフェクトした細胞の免疫蛍光解析を示す。293T細胞に、キメラH6血球凝集素を発現する1μgのpCAGGSプラスミドをトランスフェクトした。DNA(A)、Cal/09感染(B)、DNA及びCal/09感染(C)、又はCal/09スプリットワクチン(D)を受容した動物由来の血清をトランスフェクト細胞に添加し、Alexa Fluor 594コンジュゲート抗マウスIgGとともにインキュベートした後、蛍光顕微鏡法で可視化した。
【００９１】
【図１７】DNA初回免疫及びキメラウイルス追加免疫が、致死的インフルエンザウイルス感染により感染させた動物に防御を付与することを示す。動物を、DNAのみ、キメラH9ウイルスのみ、DNA初回免疫及びキメラH9ウイルス追加免疫、又は不活化PR8ウイルスのいずれかで処理した。その後、マウスを、鼻腔内に注入される5×104PFUのPR8ウイルスに感染させ、動物の重量を14日間モニタリングした。
【００９２】
【図１８】ELISAにより決定したときのcH6タンパク質に対するストーク特異的抗体の反応性を示す。
【００９３】
【図１９】ステムドメイン及び球状ヘッドドメインを有するA/PR/8/34 H1血球凝集素三量体の構造を示す。血球凝集素三量体は、グリカンなしで(A)、グリカン構造を伴って、野生型形態で(B)、及びグリカン構造がストークドメインから除去され、球状ヘッドドメインに付加されている突然変異体形態(C)で示されている。
【００９４】
【図２０】A/PR/8/34(PR8)及びA/HK/1/68(HK68)血球凝集素(HA)の配列を示す。ステムドメインを形成するアミノ酸が囲まれている。ストークドメインと球状ヘッドドメインの境界を形成するシステイン(「C」)は、ステムドメインを形成するアミノ酸の第1の囲みの後ろ及びステムドメインを形成するアミノ酸の第2の囲みの前に示されているシステインである。残りのアミノ酸(ステムドメインを形成するアミノ酸の第1の囲みの後ろ及びステムドメインを形成するアミノ酸の第2の囲みの前に存在するシステインを含まない、囲まれていないアミノ酸)は、球状ヘッドドメインを形成するアミノ酸である。天然のグリコシル化部位は、球状ヘッドドメインに対応するアミノ酸の部分に濃い(darkened)文字で示されている。膜貫通及び細胞外ドメインは、各々の配列の末端の強調された一連のアミノ酸で表されている。ステムドメインへのグリカンの結合を破壊するために突然変異させることができるグリコシル化部位が示されており;これらは、以下の配列:(HA PR8中の)NNST、NVT、NSS、NGT、及び(HA HK68中の)NST、NGT、NAT、NGS、NGTを含む。
【００９５】
【図２１】インフルエンザ血球凝集素(H1)の単量体の球状ヘッドドメイン上の免疫優性抗原性部位の模式図を示す(A)。非天然のグリコシル化部位をA/Pr/8/34 H1血球凝集素の抗原性部位に導入する例示的な突然変異(B)。これらの非天然のグリコシル化部位は、アミノ酸モチーフN-Xaa-S/T(ここで、Xaaは、任意のアミノ酸であることができる)で示されている。
【００９６】
【図２２】ヒトH1亜型(2009 H1N1ウイルスまで(2009 H1N1ウイルスも含む)、及び他の2009インフルエンザウイルス)のHAにおけるグリコシル化部位の経時的な獲得を示す。1918年以降及び2009 H1N1パンデミックウイルスの出現以前にヒトで循環していた季節性H1N1株のHA1中の抗原性部位のアミノ酸アラインメント(A)。簡単にするために、アラインメントは、インフルエンザ研究データベース(Influenza Research Database)及びインフルエンザウイルス資源データベース(Influenza Virus Resource Database)から入手した原型的参照株及びワクチン株を用いて行なった(受託番号は方法に記載されている)。年が表示されていないのは、その年の分離株配列がないことか、又は配列がわずかしか入手できないために原型配列が不明であることかのいずれかに対応する。陰影領域は、上部に記載されている既知の抗原性部位を示す。1、2、及び3と表記された領域中の囲まれた文字は、保存されたグリコシル化を表し;4、5、6、及び7と表記された領域中の囲まれた文字は、時間が経つと現われるグリコシル化を表す。時間ストークは、HAタンパク質の球状ヘッドにおけるグリコシル化の獲得の年を示す(B)。数字は、下部に示す特定の年に出現するグリコシル化部位のアミノ酸位置を示す。矢印は、時間経過に伴うグリコシル化部位の持続を示し、丸は、特定のグリコシル化部位の消失を表す。不連続線は、H1N1がヒトで循環しなかった期間を示す。1918年から2009 pH1N1ウイルスの出現まで経時的に出現するのと同じ各々のグリコシル化の特定の位置の構造的表示(C)。HAは、HA三量体分子を形成するリボンとして表されている。位置は、H1命名体系を指す(71、142、144、172、及び177は、それぞれ、H3付番の58、128、130、158、及び163に対応する)。
【００９７】
【図２３】HAグリコシル化突然変異体2009 pH1N1ウイルスの表現型特徴を示す。MDCK細胞におけるレスキューされたA/ネーデルラント/602/2009 HAグリコシル化突然変異体ウイルスのプラークサイズ表現型(A)。5のMOIで12時間感染させたMDCK細胞から得られた全細胞ライセートのウェスタンブロット解析(B)。ライセートを非還元条件下で泳動し、ブロットを、H1を欠くPR8ウイルスに対して惹起されたウサギポリクローナル抗体3851で検出した。該H1は、酸及びDTT処理で除去されていた。0.001のMOIで感染させた分化したヒト気管気管支(tracheobrochial)上皮細胞におけるレスキューされたウイルスの成長動態(C)。ウイルス力価測定を、示された各々の時点について、MDCK細胞での標準的なプラークアッセイにより実施した。
【００９８】
【図２４】HA中に追加のグリコシル化を有する2009 pH1N1ウイルスがマウス及びフェレットで弱毒化されることを示す。(A〜E)Neth/09グリコシル化突然変異体ウイルスによる9週齢C57B/6雌マウスの感染。組換えウイルス当たりn＝5匹のマウスの群に、表示されたウイルス用量で鼻腔内(i.n.)感染させた。体重は、各群の平均値を表し、エラーバーは、各時点での標準偏差(s.d.)を示す。(F)1×103pfuの各々の突然変異体ウイルスに感染させたマウス由来の肺の力価を、示したように感染後(p.i.)2日目(丸)、3日目(四角)、及び7日目(三角)に得た。黒棒は、rNeth/09 WTウイルスと比較したときの、各時点での群当たり2匹(矢印)又は3匹のマウスについての平均ウイルス力価を表す。(G)表示されたウイルスに感染させたフェレット(群当たりn＝3)の体重変化。重量は平均値として示され、エラーバーは、各時点のs.d.を示す。(H)(G)に示すフェレットから1日おきに得られた鼻洗浄液中のウイルス力価。(I)表示されたウイルスによる感染後(p.i.)3日でのフェレット(n＝3)由来の組織中のウイルス量。値は、(F)と同様に表されている。フェレットの体重の統計的有意差をウィルコクソンの順位和検定で推定した(G)。
【００９９】
【図２５】Tx/91のHA中にグリコシル化欠失を含むウイルスがマウスで増大した病原性を示し、2009 pH1N1株に対して交差防御することを示す。野生型HA又はグリコシル化欠失突然変異体A/テキサス/36/1991 HAのいずれか及びPR8由来の残りの7つの遺伝子を担持する組換えA型インフルエンザウイルスの表現型特徴(ウイルスは、rPR8 7:1 Tx/91 HAである)。(A)それぞれのグリコシル化欠失突然変異体ウイルスに5のMOIで12時間感染させたMDCK細胞から得られたライセートのウェスタンブロット解析。ライセートを還元条件下で泳動し、ブロットをポリクローナル3951抗体で検出した。(B)示された1×104pfuの各ウイルスに感染させた8週齢C57B/6雌マウス。群当たりn＝5匹のマウスの平均体重。エラーバーは、各時点についてのs.d.を示す。(C)(B)の感染させたマウスを27日間血清転換させておき、27日の時点で、これらのマウスを100 LD50のNeth/09に感染させた。体重は、各群の平均値をそれぞれのs.d.とともに表す。(D)生存率は、(C)のマウスについて示されている。スチューデントt-検定を用いて、体重減少の有意性を決定し、ログランク検定を用いて、生存転帰の有意性(*P＜0.05)を評価した。
【０１００】
【図２６】キメラHA(cHA)タンパク質(A)及びMDCK細胞でのcHA発現(B)の模式的表示を示す。キメラHA(cHA)タンパク質及び組換えキメラウイルス。(A)cHAの模式的表示。球状ヘッドドメインは、残基C52とC277(H3付番)の間の介在アミノ酸配列として定義される。このジスルフィド結合をヘッドとストークの境界として用いて、外来のHAヘッドを異種ストークの上に導入した。ストークドメインは、HA1及びHA2サブユニットの残りの部分として定義される。CT、細胞質尾部;SP、シグナルペプチド;TM、膜貫通ドメイン。全長HA構造は、タンパク質データベース(PDB)からダウンロードした:PR8(H1) HA(PDB ID 1RU7)及びA/ホロホロチョウ/香港/WF10/99 HA[A/ブタ/香港/9/98(H9; PDB ID 1JSD)で表される]。最終的な画像は、PyMol(Delano Scientific)で作成した。H6 HAの構造は公開されていないので、PR8 HAのヘッドフォールディングの画像がcH6/1構築物のために使用されている。(B)cHAの発現を確認するための免疫蛍光。MDCK細胞を、WT PR8ウイルスもしくはcH9/1 N3ウイルスのいずれかに感染させるか、又は模擬感染させた。PR8ウイルスのヘッド及びストークに特異的な抗体並びにH9反応性を有する抗体を用いて、cHA発現を確認した。(倍率バー:40×)。
【０１０１】
【図２７】パンデミックH1N1ウイルスに感染した成人患者がHAストークに反応する高力価の中和抗体を有することを示す。pH1N1感染成人(n＝9)、pH1N1に感染していない小児(n＝5)、及びpH1N1ウイルスに感染していない成人(n＝11)の血清と、cH6/1タンパク質(A)、cH9/1タンパク質;(B)HA2タンパク質のLAH(抗LAH抗体を陽性対照として使用した);(C)H5 HAタンパク質(H5 HAに対して惹起されたマウスポリクローナル血清を陽性対照として使用し、汎H3抗体12D1を陰性対照として使用した);(D)(13)又はH3 HAタンパク質(12D1を陽性対照として使用し、H5 HAに対して惹起されたマウスポリクローナル血清を陰性対照として使用した);(E)全てELISAにより評価した;データ点は、プール試料のSE付き平均力価又は反応性を表す。
【０１０２】
【図２８】パンデミックH1N1ウイルスに感染した成人患者がHAストークに特異的である高力価の中和抗体を有することを示す(A及びB)。pH1N1感染者(n＝14)及びpH1N1に感染していない成人(n＝5)由来の血清を別々にプールし、両方のプール由来の全IgGを精製した。ストーク抗体の中和能力を、cH9/1 N3ウイルスを用いたプラーク減少アッセイにより評価した。データ点は、2回の実験の平均及びSEを表す。プラークを抗H9抗体G1-26で免疫染色した。(B)は、上部に沿って示した血清の4つの希釈液のプラーク減少を示す。(C)シュードタイプ粒子中和アッセイは、ヒト精製IgG調製物(pH1N1感染成人及びpH1N1に感染していない成人由来の血清)の中和抗体活性を測定する。全IgG濃度は、50、10、及び2μg/mLであった。陽性対照として、ストーク特異的モノクローナル抗体6F12を使用した。
【０１０３】
【図２９】cH6/1及びcH9/1タンパク質の発現及び機能を示す。A)2μgのcH6/1及びcH9/1タンパク質のクマシーゲル。M、マーカータンパク質。(B)バキュロウイルス発現cHAタンパク質のウェスタンブロット解析。レーン1、cH6/1タンパク質;レーン2、cH9/1タンパク質;レーン3、WT PR8 HA;レーン4、WT H3 HA。ブロットを、PR8ウイルスのストークと反応することが知られている抗体(ウサギポリクローナル抗HA2)又はH3ウイルスのストークと反応することが知られている抗体(マウスmAb 12D1)及びH6の球状ヘッドと反応することが知られている抗体(ヤギポリクローナル抗H6)又はH9ウイルスの球状ヘッドと反応することが知られている抗体(マウスmAb G1-26)でプロービングして、バキュロウイルス発現cHAのアイデンティティを確認した。mAb 12D1は、HA0とHA2の両方と反応する(H3タンパク質調製物は切断されて、2つの異なるバンドを生じる)。(C)cH9/1 N3再集合体ウイルスのプラークアッセイ。再集合体cH9/1 N3ウイルスのプラーク表現型は、WT PR8ウイルスによって作られるプラークと同様である。プラークをPY102及び抗H9抗体G1-26で免疫染色した。
【０１０４】
【図３０】インフルエンザウイルスHAのストークに対するモノクローナル抗体がcHAに結合し、それを中和することを示す。(A)ストーク抗体C179を用いて、cH6/1バキュロウイルス発現タンパク質に対する反応性をELISAにより試験した。C179はcH9/1と用量依存的な形で反応した。(B)ストーク抗体C179を用いて、cH9/1バキュロウイルス発現タンパク質に対する反応性をELISAにより試験した。C179はcH9/1と用量依存的な形で反応した(C及びD)。抗体6F12は、cH9/1 N3ウイルス複製を中和する。6F12を用いて、cH9/1 N3ウイルスを中和するストーク特異的モノクローナル抗体の能力をプラーク減少アッセイにより評価した。Dは、mAb 6F12の5つの希釈液(100、20、4、0.8、及び0.16μg/mL)を用いたcH9/1 N3ウイルスのプラーク減少を示す。プラークを抗H9抗体G1-26で免疫染色した。
【０１０５】
【図３１】キメラ血球凝集素の概略図を示す。図31Aは、野生型及びcH1/1ウイルスの図を示す。キメラHAを、PR8(H1) HAのCys52とCys277の間に位置する球状ヘッドドメインと、A/カリフォルニア/4/09(H1) HAの球状ヘッドドメインとを交換することにより構築した。得られるキメラHAは、A/PR8/34(H1) HAのストーク領域をA/カリフォルニア/4/09(H1) HAの球状ヘッドドメインとともに有しており、cH1/1と表記されている。図31Bは、様々な野生型及びキメラHAのフォールディングされた構造の理論的概略図を示す。左から右に:野生型PR8 HA、キメラcH1/1 HA、キメラcH5/1 HA、野生型パースHA、キメラcH7/3 HA、及びキメラcH5/3 HA。
【０１０６】
【図３２】本研究で使用されるH1 HAとH3 HAとH5 HAとH7 HAのアミノ酸同一性を比較した表を示す。アミノ酸同一性パーセントは、ClustalWを用いて計算した(シグナルペプチドを除く)。アミノ酸同一性パーセントは、全長HA、並びに球状ヘッドドメイン及びストークドメインについて比較されている。灰色の棒は、100％同一性を示す。
【０１０７】
【図３３】キメラHA構築物の表面発現を示す。キメラHA構築物の表面発現を一過性にトランスフェクトした又は一過性に感染させた細胞で評価した。トランスフェクションの48時間後、293T細胞をトリプシン処理し、キメラHAタンパク質の細胞表面発現をフローサイトメトリーで解析した。上のパネルでは、模擬トランスフェクトした細胞(灰色)が、PR8 HAをトランスフェクトした細胞(黒線)又はcH1/1をトランスフェクトした細胞(黒線)又はcH5/1をトランスフェクトした細胞(黒線)と比較されている。真ん中のパネルでは、模擬トランスフェクトした細胞(灰色)が、パース/09をトランスフェクトした細胞、cH7/3をトランスフェクトした細胞(黒線)、及びcH5/3構築物をトランスフェクトした細胞(黒線)と比較されている。下のパネルでは、MDCK細胞を、パース/09、cH7/3、及びcH5/3を発現する組換えウイルスに感染させた。感染の12時間後、様々なHAの細胞表面発現を、フローサイトメトリーを用いて解析した。
【０１０８】
【図３４】MDCK細胞に侵入するキメラHAの能力を示す。キメラHAを発現するルシフェラーゼコード偽粒子を用いて、MDCK細胞に形質導入した。ルシフェラーゼアッセイで生成される相対光単位(RLU)は、キメラHAを発現する偽粒子が細胞に侵入することができることを示す。
【０１０９】
【図３５】組換えcHA発現ウイルスに感染させた細胞のウェスタンブロット解析を示す。模擬感染させた又は表示されたウイルスを2のMOIで感染させたMDCK細胞由来の抽出物を調製し、16hpiで、抗体:抗A/PR8/HA(H1)(PY102)、抗A/Cal/09/HA(H1)(29E3)、抗A/VN/HA(H5)(mAb #8)、抗H3/HA(12D1)、抗H7(NR-3152)、抗A/NP(HT103)、及びローディング対照としての抗GAPDHでプロービングした。
【０１１０】
【図３６】抗体:抗A/NP(HT103)、抗A/H1 HA(6F12)、抗A/PR8/HA(PY102)、抗A/Cal/09/HA(29E3)、抗A/VN/HA(mAb #8)、抗H3/HA(12D1)、及び抗A/H7ウイルス(NR-3152)を用いた、組換えウイルスに感染させたMDCK細胞の免疫蛍光解析を示す。
【０１１１】
【図３７】野生型ウイルス及び組換えウイルスの成長動態及びプラーク表現型を示す。(A)10日齢の発育鶏卵を、卵1個当たり100pfuの野生型ウイルス又は組換えウイルスに感染させ、ウイルス成長を感染後72時間モニタリングした。データ点は、実験複製の平均値及び標準偏差を表す。(B)組換えウイルスのプラーク表現型をプラークアッセイにより評価した。MDCK細胞を野生型ウイルス又は組換えウイルスのいずれかに感染させた。感染48時間後、細胞を固定し、免疫染色し、A/NP(HT103)に対する抗体を用いてプラーク表現型を明らかにした。
【０１１２】
【図３８】ストーク特異的モノクローナル抗体がcHA発現ウイルス及びシュードタイプ粒子を中和することを示す。cHA発現ウイルス又はシュードタイプ粒子を中和するmAb(KB2)の能力をプラーク減少アッセイ又はシュードタイプ粒子阻害アッセイにより評価した。MDCK細胞を、表示された量(ug/mL)のmAbの存在下で、又は抗体なしで、cHA発現ウイルスもしくはシュードタイプ粒子に感染させるか、又はこれらで形質導入した。プラーク形成又はルシフェラーゼ活性を読出しとして用いて、mAbによる阻害の程度を決定した。該mAbは、cH1/1(黒い四角)及びcH5/1(黒い三角)ウイルス複製を用量依存的な形で中和し、100ug/mLを超える濃度で100％阻害する。データ点は、実験複製の平均値及び標準偏差を表す。(B)該mAbは、cH1/1(黒い四角)及びcH5/1(黒い三角)シュードタイプ粒子の侵入も用量依存的な形で阻害し、4ug/mL超で完全に阻害する。データ点は、実験複製の平均値及び標準偏差を表す。シュードタイプ阻害アッセイは独立に処理された。
【０１１３】
【図３９】NJ/76ワクチンレシピエントが、Cal/09ワクチン接種前に、高い抗HAストーク抗体を有していたことを示す。NJ/76ワクチン被接種者(n＝20)又は年齢を一致させた対照対象(n＝15)由来の血清の連続希釈液を、A)cH6/1 HA又はB)NC/99 HAに対するその反応性についてELISAにより試験し、IgG終点力価を計算した。入手可能な血清の量が限られているため、Cal/09ワクチン接種前IgG終点力価も、C)cH6/1及びD)NC/99に対して、プールされたNJ/76ワクチン被接種者(N＝5)及び対照対象(n＝7)について決定した。各々のプールは、Cal/09ワクチン接種前の試料とCal/09ワクチン接種後の試料が入手可能である各々の群由来の全個体からなっていた。対応のないスチューデントT検定を実施し、＜0.05の両側p値を統計的有意とみなした。N.D.＝検出されず。N.S＝有意でない。*統計的に有意である。
【０１１４】
【図４０】NJ/76ワクチンレシピエントが、Cal/09ワクチン接種前に、Cal/09に対する高いHAI力価を有していたことを示す。A)HAI力価を、NJ/76ワクチン被接種者(n＝5)及び対照対象(n＝7)由来のCal/09ワクチン接種前のプール血清試料について、Cal/09及びフランス/76に対して、cRBCを用いて決定した。B)プールされた結果が全体として群を代表するものであることを保証するために、各々のプール内からの個々の対象に対応する血清試料を用いて、Cal/09に対するHAIアッセイも実施した。対応のないスチューデントT検定を実施し、＜0.05の両側p値を統計的有意とみなした。N.D.＝検出されず。N.S＝有意でない。*統計的に有意である。
【０１１５】
【図４１】NJ/76及びCal/09ワクチンが広域中和抗体を増加させたことを示す。マイクロ中和アッセイを、MDCKで、A)cH5/1 N3及びB)Cal/09ウイルスに対して、Cal/09ワクチン接種の前及び後にNJ/76ワクチン被接種者(n＝5)及び対照対象(n＝7)から回収したTPCK-トリプシン処理したプール血清試料を用いて実施した。感染後、細胞を抗NP抗体及びHRPコンジュゲート二次抗体で染色した。中和力価を、特定のシグナルの少なくとも50％の低下をもたらす最小血清希釈と定義した。
【０１１６】
【図４２】cHA構築物の順次ワクチン接種がHAストーク特異的抗体を誘発し、致死的感染からの防御をもたらすことを示す。マウスを、アジュバントとともに鼻腔内及び腹腔内投与される20μgのcH9/1タンパク質で初回免疫した。3週間後、マウスを、アジュバントとともに鼻腔内及び腹腔内投与される20μgのcH6/1タンパク質で追加免疫した。対照として、マウスを、BSAを用いて同様の様式で初回免疫及び追加免疫するか、又はマウスに不活化FM1ウイルスを筋肉内投与した。動物から採血し、最後のワクチン接種の3週間後に、5LD50のA/フォートモンマス/1/1947(FM1)ウイルスに感染させた。(A)ワクチン接種によって誘発されるストーク反応性の程度を評価するために、ELISAプレートにcH5/1 N1ウイルスをコーティングした。(B)感染からの防御を評価するために、マウスを14日間毎日計量した。(C)感染後の生存率を示すカプランマイヤー曲線。cH9/1＋cH6/1ワクチン接種マウスは、BSA対照と比べて統計的により高い生存率を有していた(p＝.0003)。
【０１１７】
【図４３】cH6/1のワクチン接種がcH9/1 N1ウイルス感染からの防御を媒介するストーク特異的免疫を誘発することを示す。インフルエンザウイルスの感染又はインフルエンザウイルスのワクチン接種の前に刺激するために、動物にYAM-HAウイルスを接種した。3週間後、動物に、cH6/1又はBSAのワクチンを、アジュバントとともに、鼻腔内及び腹腔内接種した。対照動物に野生型B/山形/16/1988を接種し、同様の様式でBSAワクチン接種するか、又は不活化cH9/1 N1ウイルスを筋肉内投与した。動物から採血し、ワクチン接種の3週間後に、250LD50のcH9/1 N1ウイルスに感染させた。(A)感染からの防御を評価するために、マウスを8日間毎日計量した。3〜5日目に、YAM-HA＋cH6/1動物は、YAM-HA＋BSAコホートと比べて統計的により小さい重量減少を示した(p＜.05)。(B)生存を示すカプランマイヤー曲線。YAM-HA＋BSAコホート(p＝.038)、並びに未感作動物及びWT YAM＋BSA動物(p＜.0001)と比べて統計的に異なる生存率がYAM-HA＋cH6/1群で見られた。YAM-HA＋BSAコホートの生存率は、WT-YAM＋BSAコホートの生存率と統計的に異なってはいなかった(p＝0.058)。(C)ワクチン接種によって誘発されるストーク反応性の程度を評価するために、ELISAプレートにcH5/1 N1ウイルスをコーティングした。(D)cH5/1ウイルスを用いたプラーク減少アッセイの結果が示されている。(E)動物にワクチンを接種し、採血し、全IgGをH5に基づく偽粒子侵入阻害アッセイのために回収した。阻害パーセントを、対照と比べたルシフェラーゼ発現の減少として評価した。
【０１１８】
【図４４】cH6/1のワクチン接種がマウスを致死的H5インフルエンザウイルス感染から防御することを示す。インフルエンザウイルスの感染又はインフルエンザウイルスのワクチン接種の前に刺激するために、動物にYAM-HAウイルスを接種した。3週間後、動物に、cH6/1又はBSAのワクチンを、アジュバントとともに、鼻腔内及び腹腔内接種した。対照動物に野生型B/山形/16/1988を接種し、同様の様式でBSAをワクチン接種するか、又は不活化cH9/1 N1ウイルスを筋肉内投与した。動物から採血し、PR8バックグラウンドで10LD50の2:6 H5再集合体に感染させた(例えば、Steelらの文献(2009, J Virol 83:1742-1753)参照)。(A)生存を示すカプランマイヤー曲線。YAM-HA+cH6/1群をYAM-HA+BSAコホートと比較したとき、生存率の差が統計的有意性に達した(p＝.06)。(B)生存の長さは、平均して、BSAをワクチン接種した動物(p＝0.037)、並びに未感作対照及びWT YAM/BSA対照(p＜0.001)よりもYAM-HAを接種した動物及びcH6/1をワクチン接種した動物で長かった。(C)ワクチン接種によって誘発されるストーク反応性の程度を評価するために、ELISAプレートにcH5/1 N1ウイルスをコーティングした。1:50血清希釈を％最大重量減少に対してプロットした。1つの値は外れ値であることが明らかになり、解析から除外された。線形回帰については、R2＝0.56及びp＝.02であった。
【０１１９】
【図４５】cHAのワクチン接種がH1N1ウイルス感染からの防御を媒介するストーク特異的免疫を誘発することを示す。(A〜F)動物を、cH9/1をコードするDNAで初回免疫し、その後、cH6/1をワクチン接種し、cH5/1可溶性タンパク質(n＝10)又はBSA(n＝5)で追加免疫し、一方、陽性対照マウスは、不活化ウイルスを筋肉内に受容した(n＝5)。(A)動物をワクチン接種し、FM1ウイルスに感染させ;マウスを毎日計量した。経時的な重量減少が初期重量のパーセンテージの変化として示されている。(B)(A)の感染マウスの生存を示すグラフ。(C)動物をワクチン接種し、pH1N1ウイルスに感染させ;マウスを毎日計量した。経時的な重量減少が初期重量のパーセンテージの変化として示されている。(D)(C)の感染マウスの生存を示すグラフ。(E)動物をワクチン接種し、PR8ウイルスに感染させ;マウスを毎日計量した。経時的な重量減少が初期重量のパーセンテージの変化として示されている。(F)(E)の感染マウスの生存を示すグラフ。(G)上でA〜Fに及び下でH〜Iに記載したようにワクチン接種し、5 LD50のA/FM/1/1947(A、B)、10 LD50のA/ネーデルラント/602/2009(C、D)、又は5 LD50のA/PR/8/1934(E、F、H、I)に感染させた動物由来の血清のH1 HAに対する反応性。(H)動物は、上でA〜Fに記載したようにワクチン接種を受け(四角、n＝4)、又は動物は未感作であったが(三角、n＝3)、陽性対照マウスは、不活化PR8ウイルスを筋肉内に受容した(X印、n＝5)。PR8ウイルスの感染前に、CD8 T細胞を除去した。マウスを毎日計量した。経時的な重量減少が初期重量のパーセンテージの変化として示されている。(I)(H)の感染マウスの生存を示すグラフ。(J)動物に、A〜Fについて記載したようにワクチンを接種した。全IgGを、H2に基づく偽粒子侵入阻害アッセイで使用するために精製した。阻害パーセントを、対照と比べたルシフェラーゼ発現の減少として評価した。Fab断片CR6261を陽性対照として使用した。
【０１２０】
【図４６】血球凝集素ストーク抗体が複製感染後に産生されることを示す。動物を、104PFUのA/カリフォルニア/04/09(Cal09)、A/ニューカレドニア/20/99(NC99)、又はA/ソロモン諸島/3/06(SI06)ウイルスに感染させた。感染4週間後に、血清をマウスから回収し、血球凝集素ストーク特異的抗体を、cH6/1タンパク質を用いたELISAによりアッセイした。
【０１２１】
【図４７】血球凝集素ストーク抗体が2回目のインフルエンザウイルスへの曝露の後に増加することを示す。動物を104PFUのNC99に感染させ、次いで4週間後、105もしくは106PFUのSI06ウイルス又は103もしくは104PFUのCal09ウイルスで追加免疫した。血清を、2回目の感染の4週間後にマウスから回収し、血球凝集素ストーク特異的抗体を、cH6/1タンパク質を用いたELISAによりアッセイした。比較としての役割を果たすために、1回のNC99ウイルスの接種しか受けていない動物について図46に示された値を含めた。
【０１２２】
【図４８】順次感染させたマウス由来の血清が未感染動物を致死的H5ウイルス感染から防御することを示す。動物を104PFUのNC99に感染させ、次いで4週間後、106PFUのSI06又は104PFUのCal09ウイルスで追加免疫した。これらの動物から回収された血清を未感作動物の腹腔内に移し、該未感作動物を致死用量の組換えH5ウイルスに感染させた。1回のNC99感染しか経験していない動物由来の血清を受容した動物は感染から防御されず、対照と同様の動態で死亡した。NC99及びSI06ウイルスに曝露された動物由来の血清は感染動物の60％を防御し、一方、NC99及びCal09ウイルスに感染させた動物由来の血清は感染マウスの80％を死から防御した。NC99-SI06群とNC99-Cal09群の生存率は同様であったのに対し(p＝0.575)、NC99のみの群と比べた生存率の差は統計的に有意であった(NC99-SI06対NC99 p＝0.018、NC99-Cal09対NC99 p＝0.0023)。
【０１２３】
【図４９】インフルエンザウイルスグリコシル化突然変異体が発現され、適切にグリコシル化されることを示す。293 T細胞に、野生型A/PR/8/34 HAウイルス(PR8)、又はグリコシル化部位がPR8ヘッドドメインに導入されている及び/もしくはグリコシル化部位が突然変異によってPR8ストークドメインから除去されているPR8構築物をトランスフェクトした。ウェスタンブロット解析を、NR-4539抗A型インフルエンザウイルスHA2抗体を用いて実施し、抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体で可視化した。グリコシル化部位が導入された突然変異体ウイルスタンパク質は、野生型PR8よりも高い分子量に移動し;グリコシル化部位が除去されたものは、野生型PR8よりも低い分子量に移動した。突然変異体ウイルスタンパク質は全て予想された分子量に移動し、グリカンが関連グリコシル化部位においてインビトロで首尾よく付加又は除去されていたことを示している。導入されたグリコシル化部位の部位が、突然変異体42-1、42-4、及び42-5について示されている。
【０１２４】
【図５０】PR8におけるグリコシル化部位の付加及びグリコシル化部位の除去が、ウイルスタンパク質の発現にも、適切な立体構造にフォールディングするその能力にも影響がないことを示す。293 T細胞に、野生型PR8又はPR8のグリコシル化突然変異体又はcH5/1の血球凝集素をトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、細胞を固定し、適当な抗ヘッドドメイン(PY102)又は抗ストークドメイン(KB2、C179、及び6F12)抗体で染色し、蛍光ロバ抗マウス抗体とともにインキュベートした。蛍光反応性を、倒立蛍光顕微鏡を用いて可視化した。(A)PR8のヘッドドメインへのグリコシル化部位の導入は、ウイルスタンパク質発現にも、ストーク抗体(6F12)結合にも影響を及ぼさなかった。(B)グリコシル化部位がヘッドドメインに導入されているウイルスタンパク質の免疫蛍光染色は、抗ヘッド抗体結合を低下させ、ヘッドドメインの過剰グリコシル化が抗体結合部位をマスクしたことを示している。ストークドメインの立体構造エピトープに結合する抗ストークドメイン抗体の結合には変化がなく、ウイルス突然変異体が適切にフォールディングされたことを示している。(C)抗ヘッド及び抗ストーク特異的抗体を用いた、グリコシル化部位がヘッドドメインに導入されているPR8ウイルス突然変異体及びグリコシル化部位がストークドメインから除去されているPR8ウイルス突然変異体の免疫蛍光は、該タンパク質が発現され、適切にフォールディングされることを示した。野生型PR8と比べて、グリコシル化部位がヘッドドメインに導入されている突然変異体構築物(42-1、42-4、及び42-5)並びにグリコシル化部位がストークドメインから除去されている突然変異体構築物(Δ33/289)のストークドメインに結合する抗ストーク抗体の能力に差がないことが観察された。
【０１２５】
【図５１】シアリル化受容体に結合することができるウイルスグリコシル化突然変異体及びレスキューされた生存可能な突然変異体ウイルスを示す。トランスフェクト細胞をノイラミニダーゼ(シアリダーゼ)とともに37℃で1時間、その後、2％のニワトリ赤血球懸濁液とともにインキュベートした。付着した赤血球を溶解させ、ライセートの吸光度を540nmで測定した。A型インフルエンザ突然変異体ウイルスをレスキューするために、293T細胞に、1μgの8つのpDZ PR8レスキュープラスミドをコトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、ウイルスを含む上清を8日齢の発育鶏卵中に接種した。37℃で2日間のインキュベーションの後、尿膜腔液を回収し、ニワトリ赤血球の血球凝集により、及びMDCK細胞でのプラーク形成により、ウイルスの存在についてアッセイした。A型インフルエンザストークウイルス突然変異体Δ289、Δ483、及びΔ33/289は、ニワトリ赤血球に結合し、レスキューされることができた。
【０１２６】
【図５２】野生型HA及び発現構築物の概略図。(A)未切断の全長インフルエンザウイルス血球凝集素。シグナルペプチドは左端の成分であり、HA細胞外ドメインは真ん中の成分であり、膜貫通及び細胞内ドメインは右端の成分である。(B)三量体化ドメインを有する発現構築物。膜貫通及び細胞内ドメインを、位置V503(H3付番)で、トロンビン切断部位(左から3番目の成分)、T4三量体化ドメイン(左から4番目の成分)、及びヘキサヒスチジンタグ(6×hisタグ、左から5番目の成分)と交換した。(C)三量体化ドメインを有さない発現構築物。膜貫通及び細胞内ドメインを、それぞれ、アミノ酸位置509(H1、H2、及びH5)又は508(H3)(H3付番)で、ヘキサヒスチジンタグ(6×hisタグ、右端の成分)と交換した。
【０１２７】
【図５３】三量体化ドメインの導入は、組換えHAにおけるオリゴマーの安定性及び形成に影響を及ぼす。(A)還元性、変性SDS-PAGEによる三量体化ドメインを有する又は三量体化ドメインを有さない組換えHAの解析。三量体化ドメインあり(+)で発現された組換えHAは、なし(-)で発現されたHAよりも高い安定性を示す。未切断のHA(HA0)及び切断産物(HA1/分解産物;HA2)が矢印で示されている。(B)架橋されたHAの還元性、変性SDS-PAGE解析。様々なHA種がブロット中に示されている。高分子多量体はHで示され、三量体はTで示され、二量体はDで示され、単量体はMで示されている。(C)左パネル(囲み1〜4):抗ヘキサヒスチジンタグ抗体でプロービングされたB由来の還元され、変性し、かつ架橋されたグループ1 HAのウェスタンブロット解析。右パネル(右端の囲み):SDS-PAGEで解析されたBS3を有する架橋対照(IgG)。様々な種(完全抗体、重鎖、軽鎖)が矢印で示されている。マーカーバンドの分子量が各々のパネルの左側に示されている。
【０１２８】
【図５４】組換えPR8(H1)及びCal09(H1) HAに対するストーク反応性抗体の結合。(A)三量体化ドメインを有さない(T4三量体ドメインなし、黒線)又は三量体化ドメインを有する(T4三量体ドメインあり、赤線)組換え可溶性PR8 HAに対するストーク反応性抗体C179、CR6261、及び6F12並びにヘッド反応性抗体PY102及びPR8抗血清の結合。(B)三量体化ドメインを有さない(T4三量体ドメインなし、黒線)又は三量体化ドメインを有する(T4三量体ドメインあり、赤線)組換え可溶性Cal09 HAに対するストーク反応性抗体C179、CR6261、及び6F12並びにヘッド反応性抗体7B2及びCal09抗血清の結合。
【０１２９】
【図５５】組換えJAP57(H2)及びVN04(H5) HAに対するストーク反応性抗体の結合。(A)三量体化ドメインを有さない(T4三量体ドメインなし、黒線)又は三量体化ドメインを有する(T4三量体ドメインあり、赤線)組換え可溶性JAP57 HAに対するストーク反応性抗体C179及びCR6261並びにヘッド反応性抗体8F8及びH2抗血清の結合。(B)三量体化ドメインを有さない(T4三量体ドメインなし、黒線)又は三量体化ドメインを有する(T4三量体ドメインあり、赤線)組換え可溶性VN04 HAに対するストーク反応性抗体C179及びCR6261並びにヘッド反応性抗体mAb#8及びH5抗血清の結合。
【０１３０】
【図５６】グループ2 HAに対するストーク反応性抗体の結合。(A)三量体化ドメインを有さない(T4三量体ドメインなし、黒線)又は三量体化ドメインを有する(T4三量体ドメインあり、赤線)組換え可溶性HK68 HAに対するストーク反応性抗体12D1及びCR8020並びにヘッド反応性抗体XY102及びH3抗血清の結合。(B)三量体化ドメインを有さない(T4三量体ドメインなし、黒線)又は三量体化ドメインを有する(T4三量体ドメインあり、赤線)組換え可溶性Wisc05 HAに対するストーク反応性抗体12D1及びCR8020並びにH3抗血清の結合。
【発明を実施するための形態】
【０１３１】
(5.詳細な説明)
本発明は、インフルエンザウイルスの保存されたHAステムドメイン(本明細書で「スト
ーク」ドメインと呼ばれることもある)に対する交差防御免疫応答を誘導するインフルエ
ンザ血球凝集素(HA)ウイルス免疫原(すなわち、flu HAポリペプチド)に関する。
【０１３２】
一態様において、本明細書に提供されるのは、キメラインフルエンザウイルス血球凝集
素(HA)ポリペプチドである。そのようなキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポ
リペプチドは、ステムドメインと異種の球状HAヘッドドメインを提示するHAステムドメイ
ンを含む。ワクチン接種用に設計されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペ
プチドは、HAの同じステムドメインを共有するが、その球状ヘッドが極めて異なっている
。そのような構築物は、保存されたHAステムに対する極めて強力でかつ広域中和性の抗体
を誘発する、生インフルエンザウイルス、死滅インフルエンザウイルス、ウイルス/ウイ
ルス様粒子(「VLP」)、サブユニットワクチン、スプリットワクチンなどのワクチン製剤
へと改変される。そのような「普遍的な」ワクチンを用いて、インフルエンザウイルス亜
型にわたる交差防御免疫応答を誘導し及び/又は増進させることができる。
【０１３３】
背景として、インフルエンザウイルスに対する中和抗体は、HA糖タンパク質を標的とし
、ウイルス侵入に関与する結合段階又は融合段階のいずれかを妨げる。2つの基本的サブ
セットの中和抗体:株特異的球状ヘッド(インフルエンザウイルスの様々な株及び亜型にわ
たって保存されてないドメイン)に対する抗体、及びHA糖タンパク質の高度に保存された
ステムに対する抗体は、インフルエンザウイルスへの曝露によって誘発される。保存され
ていないHA球状ヘッドは、免疫優性エピトープを担持し-株特異的抗球状ヘッド抗体は、
抗ステム抗体特異性よりも強力であると考えられ、したがって、現在のワクチンの感染に
よって付与される主として株特異的な免疫を説明するものである。
【０１３４】
本明細書に開示されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドは、
HAステムに対する極めて強力でかつ広域中和性の抗体を誘発するインフルエンザウイルス
ワクチンに対する本発明者らの合理的設計戦略に一部基づいている。これに関して、キメ
ラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドは、過去の曝露/ワクチン接種か
らの比較的よく保存されたストークドメインを共有するが、異種HA球状ヘッドドメイン-
好ましくは、意図されるワクチン被接種者(vaccinate)が感作されていないものを含むよ
うに設計される。この構築物への曝露は、主に、保存されたHAステムに対する抗体を増加
させるはずである。保存されたHAステムによる免疫の繰返し及び球状ヘッドの変更は、HA
の共通のステム領域に対する強力な交差中和抗体を誘導するはずである。
【０１３５】
キメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドを設計する場合、得られる
タンパク質の安定性を維持するように注意を払うべきである。これに関して、図1でAp及
びAqとして特定されているシステイン残基を維持することが推奨されるが、それは、それ
らが、下記の第5.1節でより詳細に論じられているようにHAストークの安定性に寄与する
からである。最良の安定性を得るために、HA球状ドメインを全体として(図1に示すように
、Apシステイン残基とAqシステイン残基の間で)「交換する」ことが好ましいが、それは
、得られる立体構造が、天然の構造に最も近いからである。言い換えると、第5.1.2節で
言及される「リンカー」は、異種HAの球状ヘッドドメイン全体であることができる。
【０１３６】
HAストークの天然の球状ヘッドを「完全に交換する」代わりに、HA球状ヘッドエピトー
プに寄与するループを改変することにより、該球状ヘッドを保存されたストークと異種の
ものにすることができる。この手法は、とりわけ、集団が曝露されているHAを使用すると
きには、改変される球状ヘッドを天然の球状HAヘッドと大きく異なるように設計しない限
り、保存されたストークに対する所望の免疫応答を生じさせるのに同様には有効でない場
合がある。それにもかかわらず、そのような改変は、例えば、HA球状ヘッドエピトープに
寄与する5つのループの大部分を改変することによって達成することができる。1つの有用
な手法において、5つ全てのループを改変することができる。
【０１３７】
ワクチン接種に使用される構築物を、ワクチン接種されるべき特定の対象/集団用に有
利に設計することができる。現在生きているヒトが曝露されている3つのインフルエンザ
亜型:亜型H1、H2、及びH3が存在する。H2亜型のインフルエンザウイルスは、1968年に該
集団から消失したが、H1及びH3亜型のインフルエンザウイルスは、今日まで該集団内に存
続している。結果として、1968年以前に生まれた現在生きている成人は、H1、H2、及びH3
亜型の各々に曝露されている可能性が高い。対照的に、1968年以後に生まれた現在生きて
いる成人は、H1及びH3亜型にしか曝露されていない可能性が高い。
【０１３８】
したがって、成人のワクチン接種のための好ましい実施態様において、キメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドは、亜型H1、H2、又はH3のインフルエンザウイルスのHA由
来の球状ヘッドドメインを保持するのではなく、これら3つの亜型のうちの1つのHA由来の
ステムドメインを保有する。異種球状ヘッドは、任意の非H1、非H2、又は非H3亜型のHAか
ら選択することができる。また、一方ではH1/H2ステム、他方ではH3ステムを用いて作製
される別々のキメラ構築物をワクチン接種プログラムで有益に使用することができ--H1及
びH2亜型は、保存されたストークドメインを共有するグループ1 HA亜型であり;一方、H3
は、グループ1のストークとは構造的に異なるストークドメインを有するグループ2亜型で
ある。H1及びH3構築物の使用は、各々のステムドメインに対する免疫応答の生成/増進を
保証する。そのようなキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドによる成人対象の免
疫は、該対象の記憶免疫応答を増進させ、該対象におけるインフルエンザウイルスに対す
る長期持続性免疫をもたらす交差反応性、広域中和性の抗ステムドメイン抗体の大規模産
生をもたらす。
【０１３９】
曝露されたことがない乳児は、当然ながら、全てのインフルエンザウイルス亜型に感作
されていない。結果として、多種多様なHAステム/球状ヘッド組合せを乳児用のワクチン
で使用するために構築することができる。好ましい実施態様において、未感作の乳児に、
グループ1(H1もしくはH2)又はグループ2(H3)株のHAストーク、並びに異種株;すなわち、
非H1、非H2、及び/又は非H3株由来の球状ヘッドを用いて作製される構築物をワクチン接
種することができる。各々のHAストークについての3つの異なるキメラHA構築物を3回の順
次ワクチン接種で有利に用いて、交差防御応答を誘導することができる。
【０１４０】
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの使用は有利であるこ
とが理解されるべきである。なぜなら、(i)該ポリペプチドは、(無傷の球状ヘッドドメイ
ンを保有するために)極めて安定であり、及び(ii)該ポリペプチドが投与される対象の免
疫系は、過去にキメラインフルエンザ血球凝集素の球状ヘッドドメインに曝露されたこと
はないが、キメラインフルエンザ血球凝集素のステムドメインの保存されたエピトープに
曝露されたことがあるからである。
【０１４１】
キメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドは、HAステムを含み、かつ
異種HAヘッドを提示するキメラインフルエンザHAポリペプチドの構築、及びステムドメイ
ンとヘッドドメインの両方に対する抗体と交差反応するこのポリペプチドからの安定なキ
メラHAタンパク質の産生を示す作業実施例(例えば、第6.2節)によって示される。
【０１４２】
一態様において、本明細書に提供されるのは、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッ
ドドメインポリペプチド及びインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプ
チドを含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドであり、ここで、該イ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイ
ルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種である(例えば、該インフルエンザウ
イルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチド及び該インフルエンザウイルス血球凝集素
ステムドメインポリペプチドは、異なるインフルエンザウイルス血球凝集素亜型に由来す
る)。本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、
インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチド(第5.2節参照)とインフ
ルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド(第5.3節)とを組み合わせるこ
とによって作製することができる。すなわち、本発明の原理を用いて、本明細書に記載の
インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチド(下記の第5.1.1節参照)
及び本明細書に記載のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド(
下記の5.1.2節参照)を混合し、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを
作製するように適合させることができる。
【０１４３】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、1以上の修飾されたグリコシル化部位
及び/又は1以上の非天然のグリコシル化部位を含むflu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例え
ば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド、インフルエンザウイル
ス血球凝集素(HA)ステムドメインポリペプチド)である。図20A及びBに示すように、野生
型血球凝集素のグリコシル化は、球状ヘッドドメインとステムドメインの両方で生じる。
これらのドメインで内のグリコシル化は抗原性領域をマスクし、それにより、インフルエ
ンザウイルスが宿主免疫系応答を回避するのを可能にすることができると考えられる。例
えば、季節性インフルエンザウイルス株(例えば、H1N1及びH3N2)は、時間とともに球状ヘ
ッドドメインの免疫優性抗原性領域中にさらなるグリコシル化部位を獲得することが知ら
れている。しかしながら、本明細書に記載のインフルエンザウイルスHAポリペプチドとの
関連において、ポリペプチドのステムドメイン内でのグリコシル化は、このドメインに見
出される保存された抗原性領域に対する所望の免疫応答を妨害又は防止することができる
。図19Cを参照されたい。一実施態様において、本明細書に提供されるのは、少なくとも1
つの修飾されたグリコシル化部位を有するステムドメインを含むflu HAポリペプチドであ
り、ここで、該修飾されたグリコシル化部位、ここで、該修飾は、該修飾されたグリコシ
ル化部位に結合するグリカンの能力を破壊する。別の実施態様において、本明細書に提供
されるのは、HA球状ヘッドドメインを含むflu HAポリペプチドであり、ここで、該HA球状
ヘッドドメインは、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する少なくとも1つの非天然の
グリコシル化部位を含み、ここで、Xaaは任意のアミノ酸である。別の実施態様において
、該flu HAポリペプチドは、(1)1以上の修飾されたグリコシル化部位を含むステムドメイ
ン(ここで、該修飾されたグリコシル化部位は、天然のグリコシル化部位の修飾を含み、
該修飾は、該修飾されたグリコシル化部位に結合するグリカンの能力を破壊する);及び(2
)アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する1以上の非天然のグリコシル化部位を含むHA
球状ヘッドドメイン(ここで、Xaaは任意のアミノ酸である)を含む。具体的な実施態様に
おいて、該flu HAポリペプチドのステムドメイン中の修飾されたグリコシル化部位は、ア
ミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する天然のグリコシル化部位の修飾を含み、ここで
、Xaaは任意のアミノ酸である。
【０１４４】
任意の特定の動作理論に束縛されるものではないが、本明細書に提供されるインフルエ
ンザウイルスHAポリペプチドのステムドメイン内の保存された抗原性領域に対する免疫応
答は、ステムドメイン内の1以上のグリコシル化部位を、該部位でのグリコシル化(すなわ
ち、グリカンの結合)を破壊する形で修飾することによって増大させることができると考
えられる。さらに、これらの免疫優性領域への1以上の非天然のグリコシル化部位の付加
によるHA球状ヘッドドメインの免疫優性抗原性領域のマスキングもまた、ステムドメイン
内の保存された亜免疫優性抗原性領域の免疫原性を増大させることができると考えられる
。
【０１４５】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、対象のインフルエンザウイルス疾患及
び/もしくは感染の予防及び/もしくは治療、並びに/又は該疾患及び/もしくは感染に対す
る免疫において本明細書に記載のflu HAポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウ
イルス血球凝集素ポリペプチド)を使用する方法であり、すなわち、該flu HAポリペプチ
ドを用いて、対象にインフルエンザウイルス疾患もしくは感染に対するワクチンを接種す
るか、又はインフルエンザウイルス疾患もしくは感染に罹患している対象を治療すること
ができる。一実施態様において、該flu HAポリペプチドを使用する方法は、対象にflu HA
ポリペプチドの有効量を投与することを含む、対象のインフルエンザウイルス疾患の予防
のためのものである。別の実施態様において、flu HAポリペプチドを使用する方法は、対
象にflu HAポリペプチドの有効量を投与することを含む、対象のインフルエンザウイルス
疾患の治療のためのものである。また別の実施態様において、flu HAポリペプチドを使用
する方法は、対象のインフルエンザウイルス疾患及び/又は感染に対する免疫のためのも
のである。
【０１４６】
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のflu HAポリペプチ
ド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)のうちの1つ又複数
を発現するように改変されたインフルエンザウイルスである。そのようなウイルスを、イ
ンフルエンザウイルスに対するワクチンとして利用することができ、例えば、本明細書に
おけるflu HAポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリ
ペプチド)のうちの1つ又は複数を発現する本明細書に提供されるインフルエンザウイルス
を、サブユニットワクチン、スプリットワクチン、不活化ワクチン、及び/又は弱毒化さ
れた生ウイルスワクチンとして利用することができる。
【０１４７】
ある実施態様において、本明細書に記載のflu HAポリペプチド(例えば、キメラインフ
ルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド)のうちの1つ又複数を発現するように改変
されたインフルエンザウイルスは、flu HAポリペプチドのインフルエンザウイルス血球凝
集素ヘッドドメインポリペプチドが由来する源と同じ源(例えば、インフルエンザウイル
ス株又は亜型)に由来するノイラミニダーゼ(NA)、又はその断片を含む。ある実施態様に
おいて、flu HAポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポ
リペプチド)のうちの1つ又複数を発現するように改変されたインフルエンザウイルスは、
flu HAポリペプチドの球状ヘッドドメイン及び/又はステムドメインとは異なる株のイン
フルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼを含む。ある実施態様において、flu HAポリ
ペプチドのうちの1つ又複数を発現するように改変されたインフルエンザウイルスは、flu
HAポリペプチドのうちの1つ又複数を発現するように改変されたインフルエンザウイルス
によってコードされる他のタンパク質と比べて異なるインフルエンザウイルス由来のノイ
ラミニダーゼを含む。
【０１４８】
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のflu HAポリペプチ
ド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)をコードする核酸で
ある(例えば、下記の第5.5節参照)。
【０１４９】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のflu HAポリペプ
チドをコードする核酸を含む、ベクター、例えば、発現ベクターである(例えば、下記の
第5.6節参照)。具体的な実施態様において、該ベクターは、プラスミドベクターである。
別の具体的な実施態様において、該ベクターは、ウイルスベクター(例えば、下記の第5.7
節及び第5.8節参照)であり、例えば、本明細書の記載のflu HAポリペプチド(例えば、キ
メラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド)がビリオンに組み込まれてい
るインフルエンザウイルスベクター、又はキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリ
ペプチドを発現するように改変されたゲノムを含むインフルエンザウイルスベクターであ
る。別の具体的な実施態様において、該ベクターは、細菌ベクターである(例えば、下記
の第5.10節参照)。別の具体的な実施態様において、該ベクターは、バキュロウイルスで
ある。本明細書に提供されるベクターを、原核細胞(例えば、細菌)又は真核細胞(例えば
、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、藻類、及び哺乳動物細胞)を用いたキメラインフルエ
ンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの発現のために設計することができる。したがって
、同じく本明細書に提供されるのは、本明細書に提供されるベクターを含み、かつ本明細
書に記載の1以上のflu HAポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチド)を産生することができる細胞(すなわち、原核及び真核細胞)である。
【０１５０】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のflu HAポリペプ
チド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)が組み込まれてい
るウイルス様粒子(VLP)及びウイロソームである(下記の第5.9節参照)。
【０１５１】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のflu HAポリペプ
チド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)のうちの1つもし
くは複数、及び/又は本明細書に記載の核酸、ベクター、VLP、細菌、もしくはウイロソー
ムのうちの1つもしくは複数を含む組成物である(例えば、第5.14節参照)。具体的な実施
態様において、本明細書に提供される組成物は、本明細書に記載のflu HAポリペプチド(
例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)を含む。別の具体的な
実施態様において、本明細書に提供される組成物は、本明細書に記載のflu HAポリペプチ
ド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)をコードする核酸を
含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供される組成物は、本明細書に記載
のflu HAポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)
をコードする核酸を含む発現ベクターを含む。別の具体的な実施態様において、本明細書
に提供される組成物は、本明細書に記載のflu HAポリペプチド(例えば、キメラインフル
エンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)を発現するように改変されたゲノムを有するイ
ンフルエンザウイルス又は非インフルエンザウイルスを含む。
【０１５２】
ある実施態様において、本明細書に記載の1以上のflu HAポリペプチド(例えば、キメラ
インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド、下記の第5.1節参照)もしくはその組成
物、及び/又は本明細書に記載の核酸、ベクター、VLP、もしくはウイロソームのうちの1
つ又複数を対象に投与して、該対象をインフルエンザウイルスの多数の株又は亜型に対し
て免疫する。具体的な実施態様において、該投与は、いずれか1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、又は17種の公知のA型インフルエンザ血球凝集素亜型又
は後に同定されるA型インフルエンザ血球凝集素亜型に対する該個体の宿主免疫応答を生
じさせるのに十分である。別の具体的な実施態様において、該投与は、現在公知の又は後
に同定されるいずれかのB型インフルエンザ血球凝集素亜型に対する該個体の宿主免疫応
答を生じさせるのに十分である。
【０１５３】
ある実施態様において、本明細書に記載の1以上のflu HAポリペプチド(例えば、キメラ
インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド、下記の第5.1節参照)もしくはその組成
物及び/又は本明細書に記載の核酸、ベクター、VLP、もしくはウイロソームのうちの1つ
又複数を単一用量として一度に対象に投与する。具体的な実施態様において、対象はヒト
小児である。別の具体的な実施態様において、対象はヒト成人である。別の具体的な実施
態様において、対象はヒト高齢者である。ある実施態様において、本明細書に記載の第1
のflu HAポリペプチド、又は本明細書に記載の組成核酸、ベクター、VLP、もしくはウイ
ロソームを単一用量として対象に投与し、次いで3〜6週間後に、本明細書に記載の第2のf
lu HAポリペプチド、又は本明細書に記載の組成核酸、ベクター、VLP、もしくはウイロソ
ームを投与する。
【０１５４】
ある実施態様において、本明細書に記載の1以上のflu HAポリペプチド(例えば、キメラ
インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)もしくはその組成物及び/又は本明細書
に記載の核酸、ベクター、VLP、もしくはウイロソームのうちの1つ又複数を単一用量とし
て対象に投与し、次いで3〜6週間後に、第2の用量を投与し、ここで、第1の用量で使用さ
れるflu HAポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチ
ド)のインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインは、第2の用量で使用されるflu 
HAポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)とは異
なるインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメイン株又は亜型由来のものである。あ
る実施態様において、追加免疫接種は、2回目の接種の後6〜12カ月の間隔で対象に投与す
ることができる。ある実施態様において、追加免疫で使用されるflu HAポリペプチドのイ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインは、第1及び第2の用量で使用されるflu 
HAポリペプチドのインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインとは異なる株又は亜
型由来のものである。具体的な実施態様において、対象はヒト小児である。別の具体的な
実施態様において、対象はヒト成人である。別の具体的な実施態様において、対象はヒト
高齢者である。
【０１５５】
具体的な実施態様において、ヒト乳児への投与のために、2用量の本明細書に記載のflu
HAポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)(例え
ば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド、下記の第5.1節参照)もしく
はその組成物、及び/又は本明細書に記載の核酸、ベクター、VLP、もしくはウイロソーム
のうちの1つ又複数を乳児に投与し、ここで、第1の用量で使用されるflu HAポリペプチド
のインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインは、第2の用量で使用されるflu HA
ポリペプチドのインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインとは異なる株又は亜型
由来のものである。
【０１５６】
具体的な実施態様において、ヒト乳児への投与のために、3用量のflu HAポリペプチド(
例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド、下記の第5.1節参照)も
しくはその組成物、及び/又は本明細書に記載の核酸、ベクター、VLP、もしくはウイロソ
ームのうちの1つ又複数を乳児に投与し、ここで、第1、第2、及び第3の用量で使用される
flu HAポリペプチドのインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインは、異なるイン
フルエンザウイルスの株又は亜型由来のものである。
【０１５７】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、対象をインフルエンザウイルス疾患又
は感染に対して免疫する方法であって、該対象を、該対象が感作されていないインフルエ
ンザウイルスの血球凝集素に曝露させることを含む、方法であり、すなわち、該対象は、
過去に該インフルエンザウイルス及び/又はインフルエンザウイルスの血球凝集素に曝露
されたことがない。具体的な実施態様において、該血球凝集素は、本明細書に記載のflu 
HAポリペプチドである。具体的な実施態様において、該血球凝集素は、キメラインフルエ
ンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドである。
【０１５８】
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象をインフルエンザウイルス疾患
又は感染に対して免疫する方法であって、該対象に1以上のインフルエンザウイルスを投
与することを含む、方法であり、ここで、該1以上のインフルエンザウイルスの各々は、
該対象が感作されていない血球凝集素ポリペプチドを含み、すなわち、該対象は、過去に
該1以上のインフルエンザウイルスに曝露されたことがない。具体的な実施態様において
、該1以上のインフルエンザウイルスは、亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H
12、H13、H14、H15、H16、及び/又はH17のインフルエンザウイルスである。別の具体的な
実施態様において、該方法は、(i)亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H1
3、H14、H15、H16、又はH17のインフルエンザウイルスの第1の投与、及び(ii)亜型H2、H4
、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、又はH17のインフルエンザ
ウイルスの第2の投与を含み、ここで、第1の投与のインフルエンザウイルスは、第2の投
与のインフルエンザウイルスとは異なる亜型のものである。別の具体的な実施態様におい
て、該方法は、(i)亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H
16、又はH17のインフルエンザウイルスの第1の投与;(ii)亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H
9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、又はH17のインフルエンザウイルスの第2の投与
;及び(iii)亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、又
はH17のインフルエンザウイルスの第3の投与を含み、ここで、第1、第2、及び第3の投与
のインフルエンザウイルスは異なる亜型のものである。
【０１５９】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象をインフルエンザウイルス疾
患又は感染に対して免疫する方法であって、該対象に、該対象が感作されていない1以上
のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを投与することを含み、すなわち、該
対象は、過去に該1以上のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに曝露された
ことがない。ある実施態様において、該対象が感作されていない該1以上のインフルエン
ザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、組成物(例えば、ワクチンを含む組成物)中にある
。ある実施態様において、該対象が感作されていない1以上のインフルエンザウイルス血
球凝集素ポリペプチドは、ベクター、例えば、インフルエンザウイルスベクター中にある
。ある実施態様において、該対象が感作されていない1以上のインフルエンザウイルス血
球凝集素ポリペプチドは、VLP中にある。ある実施態様において、該対象が感作されてい
ない1以上のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、ウイロソーム中にある
。具体的な実施態様において、該1以上のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチ
ドは、亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、及び/又
はH17のインフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド
である。別の具体的な実施態様において、該方法は、(i)亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H
9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、又はH17のインフルエンザウイルス血球凝集素
ポリペプチドの第1の投与、及び(ii)亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、
H13、H14、H15、H16、又はH17のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの第2の
投与を含み、ここで、第1の投与のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、
第2の投与のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドとは異なる亜型のものであ
る。別の具体的な実施態様において、該方法は、(i)亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H
10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、又はH17のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリ
ペプチドの第1の投与;(ii)亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14
、H15、H16、又はH17のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの第2の投与;及
び(iii)亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、又はH1
7のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの第3の投与を含み、ここで、第1、
第2、及び第3の投与のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、異なるインフ
ルエンザウイルス亜型由来のものである。
【０１６０】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象をインフルエンザウイルス疾
患又は感染に対して免疫する方法であって、(i)該対象に、インフルエンザ亜型(例えば、
H1血球凝集素)由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド(又は該血球凝集素
ポリペプチドをコードする核酸、該血球凝集素ポリペプチドを発現するウイルス、該血球
凝集素ポリペプチドを発現するVLPなど)を投与することによって、該対象を初回免疫する
こと、及びある期間の後、(ii)該対象を、本明細書に記載のflu HAポリペプチド(例えば
、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)(又は該flu HAポリペプチドを
コードする核酸、該flu HAポリペプチドを発現するウイルス、該flu HAポリペプチドを発
現するVLPなど)で追加免疫することを含む、方法である。具体的な実施態様において、該
flu HAポリペプチドは、対象が感作されていないインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッ
ドドメインポリペプチド(又はその部分)、及び工程(i)の初回免疫で使用される血球凝集
素ポリペプチド中のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドと同
じ又は同様である(例えば、同じインフルエンザウイルス株又は亜型由来である)インフル
エンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド(又はその部分)を含むキメライン
フルエンザウイルス血球凝集素HAポリペプチドである。ある実施態様において、対象に、
同じ又は異なる本明細書に記載のflu HAポリペプチド(又は該flu HAポリペプチドをコー
ドする核酸、該flu HAポリペプチドを発現するウイルス、該flu HAポリペプチドを発現す
るVLPなど)の第2の投与を含む、2回目の追加免疫を投与することができる。ある実施態様
において、対象に、同じ又は異なる本明細書に記載のflu HAポリペプチド(又は該flu HA
ポリペプチドをコードする核酸、該flu HAポリペプチドを発現するウイルス、該flu HAポ
リペプチドを発現するVLPなど)の第3の投与を含む、3回目の追加免疫を投与することがで
きる。ある実施態様において、該対象の初回免疫と追加免疫の間の期間、又は2回以上の
追加免疫を投与する場合、追加免疫と追加免疫の間の期間は、例えば、1週間、2週間、3
週間、4週間、1カ月、2カ月、3カ月、又はそれより長い期間であることができる。ある実
施態様において、該対象の初回免疫と追加免疫の間の(又は1回目の追加免疫と2回目の追
加免疫の間の)期間は、例えば、3〜5日、7〜10日、7〜14日、14〜21日、14〜28日、21〜2
8日、21日〜1カ月、1カ月〜2カ月、1カ月〜3カ月、2カ月〜3カ月、2カ月〜4カ月、又は4
カ月〜6カ月の範囲であることができる。
【０１６１】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象をインフルエンザウイルス疾
患又は感染に対して免疫する方法であって、(i)該対象に、ヘッドのないインフルエンザ
ウイルス血球凝集素ポリペプチド(すなわち、インフルエンザウイルス血球凝集素ステム
ドメインポリペプチド、又は該血球凝集素ポリペプチドをコードする核酸、該血球凝集素
ポリペプチドを発現するウイルス、該血球凝集素ポリペプチドを発現するVLPなど)、例え
ば、インフルエンザ亜型(例えば、H1血球凝集素)由来の本明細書に記載されているものを
投与することによって、該対象を初回免疫すること、及びある期間の後に、(ii)該対象を
、本明細書に記載のflu HAポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝
集素ポリペプチド)(又は該flu HAポリペプチドをコードする核酸、該flu HAポリペプチド
を発現するウイルス、該flu HAポリペプチドを発現するVLPなど)で追加免疫することを含
む、方法である。具体的な実施態様において、該flu HAポリペプチドは、該対象が感作さ
れていないインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチド(又はその部
分)、及び工程(i)の初回免疫で使用されるヘッドのない血球凝集素ポリペプチド中のイン
フルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド(すなわち、インフルエンザ
ウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド)と同じ又は同様である(例えば、同じイ
ンフルエンザウイルス株又は亜型由来である)インフルエンザウイルス血球凝集素ステム
ドメインポリペプチド(又はその部分)を含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドである。ある実施態様において、対象に、同じ又は異なる本明細書に記載のfl
u HAポリペプチド(又は該flu HAポリペプチドをコードする核酸、該flu HAポリペプチド
を発現するウイルス、該flu HAポリペプチドを発現するVLPなど)の第2の投与を含む、2回
目の追加免疫を投与することができる。ある実施態様において、対象に、同じ又は異なる
本明細書に記載のflu HAポリペプチド(又は該flu HAポリペプチドをコードする核酸、該f
lu HAポリペプチドを発現するウイルス、該flu HAポリペプチドを発現するVLPなど)の第3
の投与を含む、3回目の追加免疫を投与することができる。具体的な実施態様において、2
回目及び/又は3回目の追加免疫で使用されるflu HAポリペプチド(これは、具体的な実施
態様において、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドである)は、ヘッ
ドのないHAのインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドと同じであ
るか、又は該ポリペプチドと同様であるインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメイ
ンポリペプチドを含み、異なるヘッドを含んでいても、含んでいなくてもよい。ある実施
態様において、該対象の初回免疫と追加免疫の間の期間、又は2回以上の追加免疫を投与
する場合、追加免疫と追加免疫の間の期間は、例えば、1週間、2週間、3週間、4週間、1
カ月、2カ月、3カ月、又はそれより長い期間であることができる。ある実施態様において
、該対象の初回免疫と追加免疫の間の(又は1回目の追加免疫と2回目の追加免疫の間の)期
間は、例えば、3〜5日、7〜10日、7〜14日、14〜21日、14〜28日、21〜28日、21日〜1カ
月、1カ月〜2カ月、1カ月〜3カ月、2カ月〜3カ月、2カ月〜4カ月、又は4カ月〜6カ月の範
囲であることができる。
【０１６２】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象をインフルエンザウイルス疾
患又は感染に対して免疫する方法であって、(i)該対象に、本明細書に記載の第1のflu HA
ポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)(又は該f
lu HAポリペプチドをコードする核酸、該flu HAポリペプチドを発現するウイルス、該flu
HAポリペプチドを発現するVLPなど)を投与することによって、該対象を初回免疫するこ
と、及びある期間の後に、(ii)該対象を、本明細書に記載の第2のflu HAポリペプチド(例
えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)(又は該flu HAポリペプチ
ドをコードする核酸、該flu HAポリペプチドを発現するウイルス、該flu HAポリペプチド
を発現するVLPなど)で追加免疫することを含む、方法である。具体的な実施態様において
、該第2のflu HAポリペプチドは、該対象が感作されていないインフルエンザウイルス血
球凝集素ヘッドドメインポリペプチド(又はその部分)、及び工程(i)の初回免疫で使用さ
れる第1のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのインフルエンザウイ
ルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドと同じ又は同様である(例えば、同じインフ
ルエンザウイルス株又は亜型由来である)インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメ
インポリペプチド(又はその部分)を含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペ
プチドである。ある実施態様において、対象に、第1もしくは第2のflu HAポリペプチド(
例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)、又は異なる本明細書
に記載のflu HAポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペ
プチド)(もしくは該flu HAポリペプチドをコードする核酸、該flu HAポリペプチドを発現
するウイルス、該flu HAポリペプチドを発現するVLPなど)の第2の投与を含む、2回目の追
加免疫を投与することができる。ある実施態様において、対象に、過去に投与された同じ
flu HAポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)又
は異なる本明細書に記載のflu HAポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス
血球凝集素ポリペプチド)(もしくは該flu HAポリペプチドをコードする核酸、該flu HAポ
リペプチドを発現するウイルス、該flu HAポリペプチドを発現するVLPなど)のうちの1つ
の投与を含む、3回目の追加免疫を投与することができる。具体的な実施態様において、2
回目及び/又は3回目の追加免疫で使用されるflu HAポリペプチドは、第1のflu HAポリペ
プチド(これは、具体的な実施態様において、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素
ポリペプチドである)のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド
と同じであるか、又は該ポリペプチドと同様であるインフルエンザウイルス血球凝集素ス
テムドメインポリペプチドを含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド
であり、異なるヘッドを含んでいても、含んでいなくてもよい。ある実施態様において、
該対象の初回免疫と追加免疫の間の期間、又は2回以上の追加免疫を投与する場合、追加
免疫と追加免疫の間の期間は、例えば、1週間、2週間、3週間、4週間、1カ月、2カ月、3
カ月、又はそれより長い期間であることができる。ある実施態様において、該対象の初回
免疫と追加免疫の間の(又は1回目の追加免疫と2回目の追加免疫の間の)期間は、例えば、
3〜5日、7〜10日、7〜14日、14〜21日、14〜28日、21〜28日、21日〜1カ月、1カ月〜2カ
月、1カ月〜3カ月、2カ月〜3カ月、2カ月〜4カ月、又は4カ月〜6カ月の範囲であることが
できる。
【０１６３】
(5.1  キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)
本明細書に提供されるのは、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペ
プチド及びインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含むか、又
はこれらのポリペプチドからなるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド
であり、ここで、該インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、
該インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種である(例えば
、該インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチド及び該インフルエン
ザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、異なるインフルエンザウイルス血
球凝集素亜型に由来する)。インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプ
チドは、下記の第5.2節に記載されている。安定な、ヘッドのないステムドメインを形成
することができるインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、下
記の第5.3節に記載されている。
【０１６４】
全長インフルエンザ血球凝集素は、通常、HA1ドメイン及びHA2ドメインを含む。ステム
ドメインは、HA1ドメインの2つのセグメント及びHA2ドメインの大部分又は全てによって
形成される。該HA1ドメインの2つのセグメントは、一次配列中で、球状ヘッドドメイン(
例えば、図1でAp及びAqとして表記されている残基間のアミノ酸残基参照)によって隔てら
れている。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球
凝集素ポリペプチドは、そのような構造を維持している。すなわち、ある実施態様におい
て、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、HA1ド
メイン及びHA2ドメインから構成される安定なステム構造、並びに(一次配列中で)HA1ドメ
インの2つのセグメントを隔てる球状ヘッドドメインを含み、ここで、該球状ヘッドドメ
インは、HA1ドメイン及びHA2ドメインの他のセグメントによって形成されるステムドメイ
ンと異種である。
【０１６５】
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドは、(i)本明細書に記載のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメイン
ポリペプチド(例えば、下記の第5.1.2節参照)もしくは任意の既知の株もしくは亜型のイ
ンフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプ
チド(例えば、任意の野生型インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプ
チド、例えば、下記の第5.4節に記載のインフルエンザウイルスの血球凝集素のステムド
メイン)、及び(ii)本明細書に記載のインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメイン
ポリペプチド(例えば、下記の第5.2節及び第5.4.2節参照)もしくは任意の既知の株もしく
は亜型のインフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメイ
ンポリペプチド(例えば、任意の野生型インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメイ
ンポリペプチド)を含むか、又はこれらのポリペプチドからなり、ここで、該インフルエ
ンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイルス血球
凝集素ステムドメインポリペプチドと異種であり、及びここで、該インフルエンザウイル
ス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、A型インフルエンザウイルス亜型H1のイン
フルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドでも、A型インフルエンザウ
イルス亜型H3のインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドでもない
。
【０１６６】
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドは、(i)本明細書に記載のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメイン
ポリペプチド(例えば、下記の第5.3節及び第5.4.1節参照)もしくは任意の既知の株もしく
は亜型のインフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメイ
ンポリペプチド(例えば、任意の野生型インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメイ
ンポリペプチド)、及び(ii)本明細書に記載のインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッド
ドメインポリペプチド(例えば、下記の第5.2節及び第5.4.2節参照)もしくは任意の既知の
株もしくは亜型のインフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッ
ドドメインポリペプチド(例えば、任意の野生型インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッ
ドドメインポリペプチド)を含むか、又はこれらのポリペプチドからなり、ここで、該イ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイ
ルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種であり、及びここで、該インフルエン
ザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、A型インフルエンザウイルス亜型H
2のインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドではない。
【０１６７】
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドは、(i)本明細書に記載のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメイン
ポリペプチド(例えば、下記の第5.3節及び第5.4.1節参照)もしくは任意の既知の株もしく
は亜型のインフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメイ
ンポリペプチド(例えば、任意の野生型インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメイ
ンポリペプチド)、及び(ii)本明細書に記載のインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッド
ドメインポリペプチド(例えば、下記の第5.2節及び第5.4.2節参照)もしくは任意の既知の
株もしくは亜型のインフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッ
ドドメインポリペプチド(例えば、任意の野生型インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッ
ドドメインポリペプチド)を含むか、又はこれらのポリペプチドからなり、ここで、該イ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイ
ルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種であり、及びここで、該インフルエン
ザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、A型インフルエンザウイルス亜型H
5のインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドではない。
【０１６８】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)本明細書に記載のインフ
ルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド(例えば、下記の第5.3節及び第
5.4.1節参照)もしくは任意の既知の株もしくは亜型のインフルエンザウイルス由来のイン
フルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド(例えば、任意の野生型イン
フルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド)、及び(ii)A型インフルエン
ザウイルス亜型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、
H16、もしくはH17由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチド
を含むか、又はこれらのポリペプチドからなるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素
ポリペプチドであり、ここで、該インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリ
ペプチドは、該インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種で
ある。
【０１６９】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)本明細書に記載のイ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド(例えば、下記の第5.3節及
び第5.4.1節参照)もしくは任意の既知の株もしくは亜型のインフルエンザウイルス由来の
インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド(例えば、任意の野生型
インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド)、及び(ii)A型インフル
エンザウイルス亜型H4、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、もしく
はH17由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドを含むか、
又はこれらのポリペプチドからなるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチ
ドであり、ここで、該インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは
、該インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種である。
【０１７０】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)本明細書に記載のイ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド(例えば、下記の第5.3節及
び第5.4.1節参照)もしくは任意の既知の株もしくは亜型のインフルエンザウイルス由来の
インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド(例えば、任意の野生型
インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド)、及び(ii)鳥インフル
エンザウイルス亜型H1、H2、もしくはH3由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッド
ドメインポリペプチドを含むか、又はこれらのポリペプチドからなるキメラインフルエン
ザウイルス血球凝集素ポリペプチドであり、ここで、該インフルエンザウイルス血球凝集
素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメイン
ポリペプチドと異種である。
【０１７１】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)本明細書に記載のイ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド(例えば、下記の第5.3節及
び第5.4.1節参照)もしくは任意の既知の株もしくは亜型のインフルエンザウイルス由来の
インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド(例えば、任意の野生型
インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド)、及び(ii)ウマインフ
ルエンザウイルス亜型H3由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペ
プチドを含むか、又はこれらのポリペプチドからなるキメラインフルエンザウイルス血球
凝集素ポリペプチドであり、ここで、該インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメイ
ンポリペプチドは、該インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドと
異種である。
【０１７２】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)亜型H1のA型インフル
エンザウイルス由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド、
及び(ii)亜型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H1
6、もしくはH17のA型インフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス血球凝集素
ヘッドドメインポリペプチドを含むか、又はこれらのポリペプチドからなるキメラインフ
ルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドであり、ここで、該インフルエンザウイルス血
球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイルス血球凝集素ステムド
メインポリペプチドと異種である具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血
球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、又
はH17のA型インフルエンザウイルス由来のものである。別の具体的な実施態様において、
インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H1のA型インフ
ルエンザウイルス由来のものでも、亜型H2のA型インフルエンザウイルス由来のものでも
、亜型H3のA型インフルエンザウイルス由来のものでもない。別の具体的な実施態様にお
いて、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H5のA型
インフルエンザウイルス由来のものではない。
【０１７３】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)亜型H3のA型インフル
エンザウイルス由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド、
及び(ii)亜型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H1
6、もしくはH17のA型インフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス血球凝集素
ヘッドドメインポリペプチドを含むか、又はこれらのポリペプチドからなるキメラインフ
ルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドであり、ここで、該インフルエンザウイルス血
球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイルス血球凝集素ステムド
メインポリペプチドと異種である。具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス
血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H4、H7、H10、H14、又はH15のA型インフ
ルエンザウイルス由来のものである。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウ
イルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H1のA型インフルエンザウイルス
由来のものでも、亜型H2のA型インフルエンザウイルス由来のものでも、亜型H3のA型イン
フルエンザウイルス由来のものでもない。別の具体的な実施態様において、インフルエン
ザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H5のA型インフルエンザウイ
ルス由来のものではない。
【０１７４】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)亜型H2のA型インフル
エンザウイルス由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド、
及び(ii)亜型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H1
6、もしくはH17のA型インフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス血球凝集素
ヘッドドメインポリペプチドを含むか、又はこれらのポリペプチドからなるキメラインフ
ルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドであり、ここで、該インフルエンザウイルス血
球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイルス血球凝集素ステムド
メインポリペプチドと異種である。具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス
血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H1のA型インフルエンザウイルス由来の
ものでも、亜型H2のA型インフルエンザウイルス由来のものでも、亜型H3のA型インフルエ
ンザウイルス由来のものでもない。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイ
ルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H5のA型インフルエンザウイルス由
来のものではない。
【０１７５】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)亜型H1、H2、H3、H4
、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、もしくはH17のA型インフ
ルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド
、及び(ii)B型インフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッド
ドメインポリペプチドを含むか、又はこれらのポリペプチドからなるキメラインフルエン
ザウイルス血球凝集素ポリペプチドであり、ここで、該インフルエンザウイルス血球凝集
素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメイン
ポリペプチドと異種である。
【０１７６】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)B型インフルエンザウ
イルス由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド、及び(ii)
亜型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、もし
くはH17のA型インフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドド
メインポリペプチドを含むか、又はこれらのポリペプチドからなるキメラインフルエンザ
ウイルス血球凝集素ポリペプチドであり、ここで、該インフルエンザウイルス血球凝集素
ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポ
リペプチドと異種である。具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集
素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、
H14、H15、H16、又はH17のA型インフルエンザウイルス由来のものである。別の具体的な
実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、
亜型H1のA型インフルエンザウイルス由来のものでも、亜型H2のA型インフルエンザウイル
ス由来のものでも、亜型H3のA型インフルエンザウイルス由来のものでもない。別の具体
的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチド
は、亜型H5のA型インフルエンザウイルス由来のものではない。
【０１７７】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)B型インフルエンザウ
イルス由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド、及び(ii)
B型インフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポ
リペプチドを含むか、又はこれらのポリペプチドからなるキメラインフルエンザウイルス
血球凝集素ポリペプチドであり、ここで、該インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドド
メインポリペプチドは、該インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチ
ドと異種である。
【０１７８】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)A型インフルエンザウ
イルスA/カリフォルニア/7/2009(H1)由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムド
メインポリペプチド、及び(ii)亜型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H1
2、H13、H14、H15、H16、もしくはH17のA型インフルエンザウイルス由来のインフルエン
ザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドを含むか、又はこれらのポリペプチド
からなるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドであり、ここで、該イン
フルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイル
ス血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種である。具体的な実施態様において、イ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H5、H6、H8、H9、
H11、H12、H13、又はH16のA型インフルエンザウイルス由来のものである。別の具体的な
実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、
亜型H1のA型インフルエンザウイルス由来のものではない。別の具体的な実施態様におい
て、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H2のA型イ
ンフルエンザウイルス由来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエ
ンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H3のA型インフルエンザウ
イルス由来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血
球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H5のA型インフルエンザウイルス由来のも
のではない。
【０１７９】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)A型インフルエンザウ
イルスA/カリフォルニア/7/2009(H1)由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムド
メインポリペプチド、及び(ii)亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、
H14、H15、H16、もしくはH17のA型インフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイル
ス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドを含むか、又はこれらのポリペプチドからなる
キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドである。具体的な実施態様におい
て、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H4のA型イ
ンフルエンザウイルス由来のものである。具体的な実施態様において、インフルエンザウ
イルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H5のA型インフルエンザウイルス
由来のものである。具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッ
ドドメインポリペプチドは、亜型H6のA型インフルエンザウイルス由来のものである。具
体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチ
ドは、亜型H7のA型インフルエンザウイルス由来のものである。具体的な実施態様におい
て、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H8のA型イ
ンフルエンザウイルス由来のものである。具体的な実施態様において、インフルエンザウ
イルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H9のA型インフルエンザウイルス
由来のものである。具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッ
ドドメインポリペプチドは、亜型H10のA型インフルエンザウイルス由来のものである。具
体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチ
ドは、亜型H11のA型インフルエンザウイルス由来のものである。具体的な実施態様におい
て、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H12のA型イ
ンフルエンザウイルス由来のものである。具体的な実施態様において、インフルエンザウ
イルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H13のA型インフルエンザウイルス
由来のものである。具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッ
ドドメインポリペプチドは、亜型H14のA型インフルエンザウイルス由来のものである。具
体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチ
ドは、亜型H15のA型インフルエンザウイルス由来のものである。具体的な実施態様におい
て、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H16のA型イ
ンフルエンザウイルス由来のものである。
【０１８０】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)A型インフルエンザウ
イルスA/ブリスベン/59/2007様(H1)由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメ
インポリペプチド、及び(ii)亜型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12
、H13、H14、H15、H16、もしくはH17のA型インフルエンザウイルス由来のインフルエンザ
ウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドを含むか、又はこれらのポリペプチドか
らなるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドであり、ここで、該インフ
ルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイルス
血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種である。具体的な実施態様において、イン
フルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H5、H6、H8、H9、H1
1、H12、H13、又はH16のA型インフルエンザウイルス由来のものである。別の具体的な実
施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜
型H1のA型インフルエンザウイルス由来のものではない。別の具体的な実施態様において
、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H2のA型イン
フルエンザウイルス由来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエン
ザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H3のA型インフルエンザウイ
ルス由来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球
凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H5のA型インフルエンザウイルス由来のもの
ではない。
【０１８１】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)A型インフルエンザウ
イルスA/サウスカロライナ/1918(H1)由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムド
メインポリペプチド、及び(ii)亜型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H1
2、H13、H14、H15、H16、もしくはH17のA型インフルエンザウイルス由来のインフルエン
ザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドを含むか、又はこれらのポリペプチド
からなるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドであり、ここで、該イン
フルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイル
ス血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種である。具体的な実施態様において、イ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H5、H6、H8、H9、
H11、H12、H13、又はH16のA型インフルエンザウイルス由来のものである。別の具体的な
実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、
亜型H1のA型インフルエンザウイルス由来のものではない。別の具体的な実施態様におい
て、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H2のA型イ
ンフルエンザウイルス由来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエ
ンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H3のA型インフルエンザウ
イルス由来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血
球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H5のA型インフルエンザウイルス由来のも
のではない。
【０１８２】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)A型インフルエンザウ
イルスA/USSR/92/1977(H1)由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリ
ペプチド、及び(ii)亜型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H1
4、H15、H16、もしくはH17のA型インフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス
血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドを含むか、又はこれらのポリペプチドからなるキ
メラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドであり、ここで、該インフルエンザ
ウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイルス血球凝集
素ステムドメインポリペプチドと異種である。具体的な実施態様において、インフルエン
ザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H5、H6、H8、H9、H11、H12、
H13、又はH16のA型インフルエンザウイルス由来のものである。別の具体的な実施態様に
おいて、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H1のA
型インフルエンザウイルス由来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフ
ルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H2のA型インフルエン
ザウイルス由来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイル
ス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H3のA型インフルエンザウイルス由来
のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘ
ッドドメインポリペプチドは、亜型H5のA型インフルエンザウイルス由来のものではない
。
【０１８３】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)A型インフルエンザウ
イルスA/カリフォルニア/04/2009(H1)由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムド
メインポリペプチド、及び(ii)亜型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H1
2、H13、H14、H15、H16、もしくはH17のA型インフルエンザウイルス由来のインフルエン
ザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドを含むか、又はこれらのポリペプチド
からなるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドであり、ここで、該イン
フルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイル
ス血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種である。具体的な実施態様において、イ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H5、H6、H8、H9、
H11、H12、H13、又はH16のA型インフルエンザウイルス由来のものである。別の具体的な
実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、
亜型H1のA型インフルエンザウイルス由来のものではない。別の具体的な実施態様におい
て、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H2のA型イ
ンフルエンザウイルス由来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエ
ンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H3のA型インフルエンザウ
イルス由来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血
球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H5のA型インフルエンザウイルス由来のも
のではない。
【０１８４】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)A型インフルエンザウ
イルスA/パース/16/2009(H3)由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポ
リペプチド、及び(ii)亜型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、
H14、H15、H16、もしくはH17のA型インフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイル
ス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドを含むか、又はこれらのポリペプチドからなる
キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドであり、ここで、該インフルエン
ザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイルス血球凝
集素ステムドメインポリペプチドと異種である。具体的な実施態様において、インフルエ
ンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H4、H7、H10、H14、又はH1
5のA型インフルエンザウイルス由来のものである。別の具体的な実施態様において、イン
フルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H5のA型インフルエ
ンザウイルス由来のものである。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイル
ス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、A/ベトナム/1203/04(H5)由来のものである
。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポ
リペプチドは、亜型H7のA型インフルエンザウイルス由来のものである。別の具体的な実
施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、A/
アルバータ/24/01(H7)由来のものである。別の具体的な実施態様において、インフルエン
ザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H1のA型インフルエンザウイ
ルス由来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球
凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H2のA型インフルエンザウイルス由来のもの
ではない。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドド
メインポリペプチドは、亜型H3のA型インフルエンザウイルス由来のものではない。別の
具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプ
チドは、亜型H5のA型インフルエンザウイルス由来のものではない。
【０１８５】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)A型インフルエンザウ
イルスA/ブリスベン/10/2007様(H3)由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメ
インポリペプチド、及び(ii)亜型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12
、H13、H14、H15、H16、もしくはH17のA型インフルエンザウイルス由来のインフルエンザ
ウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドを含むか、又はこれらのポリペプチドか
らなるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドであり、ここで、該インフ
ルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイルス
血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種である。具体的な実施態様において、イン
フルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H4、H7、H10、H14、
又はH15のA型インフルエンザウイルス由来のものである。別の具体的な実施態様において
、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H1のA型イン
フルエンザウイルス由来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエン
ザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H2のA型インフルエンザウイ
ルス由来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球
凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H3のA型インフルエンザウイルス由来のもの
ではない。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドド
メインポリペプチドは、亜型H5のA型インフルエンザウイルス由来のものではない。
【０１８６】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)A型インフルエンザウ
イルスA/香港/1/1968(H3)由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリ
ペプチド、及び(ii)亜型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H1
4、H15、H16、もしくはH17のA型インフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス
血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドを含むか、又はこれらのポリペプチドからなるキ
メラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドであり、ここで、該インフルエンザ
ウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイルス血球凝集
素ステムドメインポリペプチドと異種である。具体的な実施態様において、インフルエン
ザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H4、H7、H10、H14、又はH15
のA型インフルエンザウイルス由来のものである。別の具体的な実施態様において、イン
フルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H1のA型インフルエ
ンザウイルス由来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイ
ルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H2のA型インフルエンザウイルス由
来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素
ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H3のA型インフルエンザウイルス由来のものではな
い。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメイン
ポリペプチドは、亜型H5のA型インフルエンザウイルス由来のものではない。
【０１８７】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)A型インフルエンザウ
イルスA/カリフォルニア/1/1988(H3)由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムド
メインポリペプチド、及び(ii)亜型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H1
2、H13、H14、H15、H16、もしくはH17のA型インフルエンザウイルス由来のインフルエン
ザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドを含むか、又はこれらのポリペプチド
からなるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドであり、ここで、該イン
フルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイル
ス血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種である。具体的な実施態様において、イ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H4、H7、H10、H14
、又はH15のA型インフルエンザウイルス由来のものである。別の具体的な実施態様におい
て、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H1のA型イ
ンフルエンザウイルス由来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエ
ンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H2のA型インフルエンザウ
イルス由来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血
球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H3のA型インフルエンザウイルス由来のも
のではない。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッド
ドメインポリペプチドは、亜型H5のA型インフルエンザウイルス由来のものではない。
【０１８８】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)A型インフルエンザウ
イルスA/アンアーバー/6/60(H2)由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメイ
ンポリペプチド、及び(ii)亜型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H
13、H14、H15、H16、もしくはH17のA型インフルエンザウイルス由来のインフルエンザウ
イルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドを含むか、又はこれらのポリペプチドから
なるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドであり、ここで、該インフル
エンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイルス血
球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種である。具体的な実施態様において、インフ
ルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H4、H7、H10、H14、又
はH15のA型インフルエンザウイルス由来のものである。別の具体的な実施態様において、
インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H1のA型インフ
ルエンザウイルス由来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエンザ
ウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H2のA型インフルエンザウイル
ス由来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝
集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H3のA型インフルエンザウイルス由来のもので
はない。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメ
インポリペプチドは、亜型H5のA型インフルエンザウイルス由来のものではない。
【０１８９】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(i)A型インフルエンザウ
イルスA/プエルトリコ/8/1934(H1)由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメ
インポリペプチド、及び(ii)亜型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12
、H13、H14、H15、H16、もしくはH17のA型インフルエンザウイルス由来のインフルエンザ
ウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドを含むか、又はこれらのポリペプチドか
らなるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドであり、ここで、該インフ
ルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイルス
血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種である。具体的な実施態様において、イン
フルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H1、H2、H4、H5、H6
、H7、H9、H10、H14、又はH15のA型インフルエンザウイルス由来のものである。別の具体
的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチド
は、亜型H1、H2、H5、H6、又はH9のA型インフルエンザウイルス由来のものである。別の
具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプ
チドは、亜型H1のA型インフルエンザウイルス由来のものではない。別の具体的な実施態
様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H2
のA型インフルエンザウイルス由来のものではない。別の具体的な実施態様において、イ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H3のA型インフル
エンザウイルス由来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウ
イルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H5のA型インフルエンザウイルス
由来のものではない。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集
素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H5のA型インフルエンザウイルス由来のものであ
る。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメイン
ポリペプチドは、A/ベトナム/1203/04(H5)由来のものである。別の具体的な実施態様にお
いて、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H6のA型
インフルエンザウイルス由来のものである。別の具体的な実施態様において、インフルエ
ンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、A/マガモ/スウェーデン/81/02(
H6)由来のものである。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝
集素ヘッドドメインポリペプチドは、亜型H9のA型インフルエンザウイルス由来のもので
ある。別の具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメイ
ンポリペプチドは、A/ホロホロチョウ/香港/WF10/99(H9)由来のものである。
【０１９０】
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドは、インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド及び
インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドを含み、ここで、該イン
フルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエンザウイル
ス血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種であり、及びここで、該キメラインフル
エンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、以下の順序で:HA1のN末端ステムセグメント
、インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチド、HA1のC末端ステムセ
グメント、及びHA2の一次構造を有する。本明細書に提供されるキメラインフルエンザウ
イルス血球凝集素ポリペプチドの一次配列は、単一のポリペプチドによって形成されるこ
とができ、又はそれは、多数のポリペプチドによって形成されることができる。通常、単
一のポリペプチドは、当業者によって好適であると考えられる任意の技術によって発現さ
れる。
【０１９１】
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドは単量体である。ある実施態様において、本明細書に提供されるキメライ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは多量体である。ある実施態様において、
本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは三量体で
ある。
【０１９２】
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。通常、シグナルペプチドは、ポリペプチド
発現及び翻訳の間又はその後に切断されて、成熟キメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドを生じる。ある実施態様において、同じく本明細書に提供されるのは、シ
グナルペプチドを欠く成熟キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドである
。本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドがシグナ
ルペプチドを含む実施態様において、シグナルペプチドは、当業者に公知の任意のインフ
ルエンザウイルスシグナルペプチドに基づくことができる。ある実施態様において、シグ
ナルペプチドは、A型インフルエンザシグナルペプチドに基づく。ある実施態様において
、シグナルペプチドは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H1
4、H15、H16、及びH17からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素のシグナ
ルペプチドに基づく。ある実施態様において、シグナルペプチドは、当業者に有用である
と考えられる任意のシグナルペプチドであることができる。ある実施態様において、シグ
ナルペプチドは、配列番号18〜33から選択される。
【０１９３】
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドは、内腔ドメインを含む。本明細書に提供されるキメラインフルエンザウ
イルス血球凝集素ポリペプチドが内腔ドメインを含む実施態様において、内腔ドメインは
、当業者に公知の任意のインフルエンザ内腔ドメインに基づくことができる。ある実施態
様において、内腔ドメインは、A型インフルエンザ内腔ドメインに基づく。ある実施態様
において、内腔ドメインは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13
、H14、H15、H16、及びH17からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素の内
腔ドメインに基づく。ある実施態様において、内腔ドメインは、当業者に有用であると考
えられる任意の内腔ドメインであることができる。ある実施態様において、内腔ドメイン
は、配列番号98〜113から選択される。ある実施態様において、内腔ドメインは、ステム
ドメインと同じ血球凝集素由来のものである。ある実施態様において、内腔ドメインは、
ステムドメインHA2サブユニットのようなインフルエンザウイルス株又は亜型由来のもの
である。
【０１９４】
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドは、膜貫通ドメインを含む。本明細書に提供されるキメラインフルエンザ
ウイルス血球凝集素ポリペプチドが膜貫通ドメインを含む実施態様において、膜貫通ドメ
インは、当業者に公知の任意のインフルエンザ膜貫通ドメインに基づくことができる。あ
る実施態様において、膜貫通ドメインは、A型インフルエンザ膜貫通ドメインに基づく。
ある実施態様において、膜貫通ドメインは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10
、H11、H12、H13、H14、H15、H16、及びH17からなる群から選択されるA型インフルエンザ
血球凝集素の膜貫通ドメインに基づく。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、当業
者に有用であると考えられる任意の膜貫通ドメインであることができる。ある実施態様に
おいて、膜貫通ドメインは、配列番号114〜129から選択される。ある実施態様において、
膜貫通ドメインは、ステムドメインと同じ血球凝集素由来のものである。ある実施態様に
おいて、膜貫通ドメインは、ステムドメインHA2サブユニットのようなインフルエンザウ
イルス株又は亜型由来のものである。
【０１９５】
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドは、細胞質ドメインを含む。本明細書に提供されるキメラインフルエンザ
ウイルス血球凝集素ポリペプチドが細胞質ドメインを含む実施態様において、細胞質ドメ
インは、当業者に公知の任意のインフルエンザ細胞質ドメインに基づくことができる。あ
る実施態様において、細胞質ドメインは、A型インフルエンザ細胞質ドメインに基づく。
ある実施態様において、細胞質ドメインは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10
、H11、H12、H13、H14、H15、H16、及びH17からなる群から選択されるA型インフルエンザ
血球凝集素の細胞質ドメインに基づく。ある実施態様において、細胞質ドメインは、当業
者に有用であると考えられる任意の細胞質ドメインであることができる。ある実施態様に
おいて、細胞質ドメインは、配列番号130〜145から選択される。ある実施態様において、
細胞質ドメインは、ステムドメインと同じ血球凝集素由来のものである。ある実施態様に
おいて、細胞質ドメインは、ステムドメインHA2サブユニットのようなインフルエンザウ
イルス株又は亜型由来のものである。
【０１９６】
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチド中のグリコシル化部位のうちの1つ又は複数を(例えば、アミノ酸の付加、
欠失、又は置換によって)修飾する。具体的な実施態様において、1以上のグリコシル化部
位を、これらの部位でのグリコシル化がポリペプチドのプロセシング及び成熟の間に生じ
ないように修飾する。当業者は、インフルエンザHAが、通常、1以上のグリコシル化部位(
例えば、Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys、ここで、Xaaは、任意のアミノ酸もしくはAsn-Xaa-Ser/Th
r/Cysであり、又はある実施態様において、XaaはPro以外の任意のアミノ酸である)を含む
ことを認識しているであろう。ある実施態様において、修飾されたグリコシル化部位は、
キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのステムドメイン中に位置する。
ある実施態様において、グリコシル化部位中の1以上のアミノ酸残基を、グリコシル化部
位を分断するアミノ酸残基と保存的に置換する。ある実施態様において、グリコシル化部
位中の1以上のアミノ酸残基を、グリコシル化部位を分断する任意のアミノ酸残基と置換
する。ある実施態様において、グリコシル化部位中の1以上のアスパラギン残基をアラニ
ンと置換する。特定の実施態様において、H3血球凝集素の位置38のアスパラギン位置をア
ラニンに変化させる。ある実施態様において、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素
ポリペプチドは、その球状ヘッドドメイン中に1以上の非天然のグリコシル化部位を含む
。ある実施態様において、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、下
記の第5.4節に論じられているような1以上の修飾されたグリコシル化部位及び/又は非天
然のグリコシル化部位を含む。
【０１９７】
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドは、天然のインフルエンザ血球凝集素の三次元構造と類似している三次元
構造を形成することができる。構造類似性は、当業者によって好適であると考えられる任
意の技術に基づいて評価することができる。例えば、キメラインフルエンザウイルス血球
凝集素ポリペプチドと、天然のインフルエンザ血球凝集素を認識する中和抗体又は抗血清
との、例えば、非変性条件下での反応は、構造類似性を示すことができる。有用な中和抗
体又は抗血清は、例えば、Suiらの文献(2009, Nat. Struct. Mol. Biol. 16(3):265-273)
、Ekiertらの文献(February 26, 2009, Science [DOI: 10.1126/science.1171491])、及
びKashyapらの文献(2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(16):5986-5991)に記載され
ており、これらの内容は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている。ある実
施態様において、抗体又は抗血清は、血球凝集素の三次構造又は四次構造によって形成さ
れる非隣接(すなわち、一次配列で隣接していない)エピトープと反応する抗体又は抗血清
である。
【０１９８】
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドは、1以上のポリペプチドドメインをさらに含む。有用なポリペプチドド
メインは、ポリペプチドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメイ
ンを含む。例えば、Hisタグ
【化１】
2020096604.tif 000002
、FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書に提供されるキメラインフルエンザウ
イルス血球凝集素ポリペプチドの精製を容易にすることができる。いくつかの実施態様に
おいて、Hisタグは、配列(His)nを有し、ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11
、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれより大きい。バクテリオファージT4フ
ィブリチン由来のフォルドンドメイン、又は三量体化ドメインは、本明細書に提供される
ポリペプチドの三量体化を容易にすることができる。いくつかの実施態様において、三量
体化ドメインは、三量体又は四量体コイルドコイルの形成を可能にする野生型GCN4pII三
量体化ヘプタッド反復又は修飾されたGCN4pII三量体化ヘプタッド反復を含む。例えば、W
eldonらの文献(2010, PLoSONE 5(9): e12466)を参照されたい。フォルドンドメインは、
当業者に公知の任意のフォルドン配列を有することができる(例えば、Papanikolopoulou
らの文献(2004, J. Biol. Chem. 279(10):8991-8998)を参照されたく、その内容は、引用
によりその全体が本明細書中に組み込まれる)。例としては、
【化２】
2020096604.tif 000003
が挙げられる。フォルドンドメインは、本明細書に提供される可溶性ポリペプチドの三量
体化を容易にするのに有用であることができる。切断部位を用いて、ポリペプチドの一部
の切断、例えば、精製タグもしくはフォルドンドメイン又は両方の切断を容易にすること
ができる。有用な切断部位としては、トロンビン切断部位、例えば、配列
【化３】
2020096604.tif 000004
を有するものが挙げられる。ある実施態様において、切断部位は、タバコエッチ病ウイル
ス(TEV)プロテアーゼによって認識される切断部位(例えば、アミノ酸配列Glu-Asn-Leu-Ty
r-Phe-Gln-(Gly/Ser))である。
【０１９９】
ある実施態様において、キメラインフルエンザ血球凝集素血球凝集素ポリペプチドは、
可溶性ポリペプチド、例えば、下記の実施例6及び9に記載されているものである。
【０２００】
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドのインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、図1でAp及びAq
としてインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド中で特定されているシステイン残基を維持
している、すなわち、図1でAp及びAqとしてインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド中で
特定されているシステイン残基は、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球
凝集素ポリペプチド中で維持されている。したがって、ある実施態様において、本明細書
に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの一次配列中:(i)インフ
ルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドのN末端セグメントは、図1でApとして特
定されているシステイン残基で終わり、(ii)インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポ
リペプチドのC末端セグメントは、図1でAqとして特定されているシステイン残基から始ま
り;及び(iii)インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチド(これは、インフル
エンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種である)は、インフルエンザ血球凝
集素ステムドメインポリペプチドのN末端セグメントとC末端セグメントの間にある。イン
フルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、下記の第5.1.2節で詳細に記載さ
れている。
【０２０１】
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドのHA1のN末端ステムセグメントは、Ap(例えば、H3血球凝集素由来のHA1サブユ
ニットのCys52)で正確に終わるのではなく、配列上及び構造上Apに近い残基で終わる。例
えば、ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドのHA1のN末端ステムセグメントは、Ap-1、Ap-2、Ap-3、Ap-4、Ap-5、Ap-6
、Ap-7、Ap-8、Ap-9、Ap-10、Ap-11、Ap-12、Ap-13、Ap-14、Ap-15、Ap-16、Ap-17、Ap-1
8、Ap-19、Ap-20、Ap-21、Ap-22、Ap-23、Ap-23、Ap-24、Ap-25、Ap-26、Ap-27、Ap-28、
Ap-29、Ap-30で終わる。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ
ウイルス血球凝集素ポリペプチドのHA1のN末端ステムセグメントは、Ap-1〜Ap-3、Ap-3〜
Ap-5、Ap-5〜Ap-8、Ap-8〜Ap-10、Ap-10〜Ap-15、Ap-15〜Ap-20、Ap-20〜Ap-30、Ap-30〜
Ap-40の範囲で終わる。例えば、Ap-10で終わるHA1のN末端ステムセグメントは、H3血球凝
集素のLys42で終わる。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ
ウイルス血球凝集素ポリペプチドのHA1のN末端ステムセグメントは、Ap+1、Ap+2、Ap+3、
Ap+4、Ap+5、Ap+6、Ap+7、Ap+8、Ap+9、Ap+10、Ap+11、Ap+12、Ap+13、Ap+14、Ap+15、Ap
+16、Ap+17、Ap+18、Ap+19、Ap+20、Ap+21、Ap+22、Ap+23、Ap+24、Ap+25、Ap+26、Ap+27
、Ap+28、Ap+29、Ap+30、Ap+31、Ap+32、Ap+33、Ap+34、Ap+35、Ap+36、Ap+37、Ap+38、A
p+39、Ap+40で終わる。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ
ウイルス血球凝集素ポリペプチドのHA1のN末端ステムセグメントは、Ap+1〜Ap+5、Ap+5〜
Ap+10、Ap+10〜Ap+15、Ap+15〜Ap+20、Ap+20〜Ap+25、Ap+25〜Ap+30、Ap+30〜Ap+35、Ap+
35〜Ap+40、又はAp+40〜Ap+50の範囲で終わる。例えば、Ap+38で終わるHA1のN末端ステム
セグメントは、H3血球凝集素のArg90で終わる。HA1のN末端ステムセグメントの終点は、
得られるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドが、野生型インフルエン
ザ血球凝集素と類似した三次元構造を形成することができるように、HA1のC末端ステムセ
グメント及びインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドの終点との関連で選
択されるべきである。そのような実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ヘッドド
メインポリペプチド(これは、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドと
異種である)は、一次配列中、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドのN
末端セグメントとC末端セグメントの間に位置する。
【０２０２】
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドのHA1のC末端ステムセグメントは、Aq(例えば、H3血球凝集素由来のHA1サブユ
ニットのCys277)から始まるのではなく、配列上及び構造上Aqに近い残基から始まる。例
えば、ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドのHA1のC末端ステムセグメントは、Aq-1、Aq-2、Aq-3、Aq-4、Aq-5、Aq-6
、Aq-7、Aq-8、Aq-9、Aq-10、Aq-11、Aq-12、Aq-13、Aq-14、Aq-15、Aq-20、Aq-25、Aq-3
0、Aq-35、Aq-40、Aq-45、Aq-50、Aq-55、Aq-60、Aq-65、Aq-70、Aq-75、又はAq-80周辺
から始まる。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血
球凝集素ポリペプチドのHA1のC末端ステムセグメントは、Aq-1〜Aq-5、Aq-5〜Aq-10、Aq-
10〜Aq-15、Aq-15〜Aq-20、Aq-20〜Aq-25、Aq-25〜Aq-30、Aq-30〜Aq-35、Aq-35〜Aq-40
、Aq-40〜Aq-45、Aq-45〜Aq-50、Aq-50〜Aq-55、Aq-55〜Aq-60、Aq-60〜Aq-65、Aq-65〜A
q-70、Aq-75〜Aq-80の範囲から始まる。例えば、Aq-77で終わるHA1のC末端ステムセグメ
ントは、H3血球凝集素のGly200から始まり;Aq-10で終わるHA1のC末端ステムセグメントは
、H3血球凝集素のイソロイシン262から始まる。ある実施態様において、本明細書に記載
のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのHA1のC末端ステムセグメント
は、Aq+1、Aq+2、Aq+3、Aq+4、Aq+5、Aq+6、Aq+7、Aq+8、Aq+9、Aq+10、Aq+11、Aq+12、A
q+13、Aq+14、Aq+15、Aq+16、Aq+17、Aq+18、Aq+19、Aq+20、Aq+21、Aq+22、Aq+23、Aq+2
4、Aq+25、Aq+26、Aq+27、Aq+28、Aq+29、Aq+30から始まる。ある実施態様において、本
明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのHA1のC末端ステ
ムセグメントは、Aq+1〜Aq+3、Aq+3〜Aq+5、Aq+5〜Aq+8、Aq+8〜Aq+10、Aq+10〜Aq+15、
又はAq+15〜Aq+20の範囲から始まる。HA1のN末端ステムセグメントの終点は、得られるキ
メラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドが、野生型インフルエンザ血球凝集
素と類似した三次元構造を形成することができるように、HA1のC末端ステムセグメント及
びインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドの始点との関連で選択されるべ
きである。そのような実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリ
ペプチド(これは、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種である)
は、一次配列中、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドのN末端セグメ
ントとC末端セグメントの間に位置する。
【０２０３】
一例において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチ
ドのHA1のN末端ステムセグメントは、血球凝集素アミノ酸位置45-48(H3付番を使用)のう
ちのいずれか1つで終わることができ、該キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリ
ペプチドのHA1のC末端ステムセグメントは、血球凝集素アミノ酸位置285-290(H3付番を使
用)うちのいずれか1つから始まることができ;及び異種ヘッドドメインは、アミノ酸位置4
6-49のうちのいずれか1つから始まり、かつアミノ酸位置284-289(H3付番を使用)のうちの
いずれか1つで終わることができる。別の例において、本明細書に記載のキメラインフル
エンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのHA1のN末端ステムセグメントは、血球凝集素ア
ミノ酸位置90(H3付番を使用)で終わり、該キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリ
ペプチドのHA1のC末端ステムセグメントは、血球凝集素アミノ酸位置200(H3付番を使用)
から始まり;及び異種ヘッドドメインは、アミノ酸位置91から始まり、かつアミノ酸位置1
99(H3付番を使用)で終わる。
【０２０４】
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドのN末端ステムセグメントの終点はAp-1であり、本明細書に記載のキメライン
フルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのC末端ステムセグメントの始点はAq-1であ
る。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素
ポリペプチドのN末端ステムセグメントの終点はAp-2であり、本明細書に記載のキメライ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのC末端ステムセグメントの始点はAq-2で
ある。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドのN末端ステムセグメントの終点はAp-3であり、本明細書に記載のキメラ
インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのC末端ステムセグメントの始点はAq-3
である。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝
集素ポリペプチドのN末端ステムセグメントの終点はAp-4であり、本明細書に記載のキメ
ラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのC末端ステムセグメントの始点はAq-
4である。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球
凝集素ポリペプチドのN末端ステムセグメントの終点はAp-5であり、本明細書に記載のキ
メラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのC末端ステムセグメントの始点はA
q-5である。そのような実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポ
リペプチド(これは、該インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種で
ある)は、一次配列中、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドのN末端セ
グメントとC末端セグメントの間に位置する。
【０２０５】
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドのN末端ステムセグメントの終点はAp+1であり、本明細書に記載のキメライン
フルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのC末端ステムセグメントの始点はAq+1であ
る。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素
ポリペプチドのN末端ステムセグメントの終点はAp+2であり、本明細書に記載のキメライ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのC末端ステムセグメントの始点はAq+2で
ある。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドのN末端ステムセグメントの終点はAp+3であり、本明細書に記載のキメラ
インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのC末端ステムセグメントの始点はAq+3
である。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝
集素ポリペプチドのN末端ステムセグメントの終点はAp+4であり、本明細書に記載のキメ
ラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのC末端ステムセグメントの始点はAq+
4である。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球
凝集素ポリペプチドのN末端ステムセグメントの終点はAp+5であり、本明細書に記載のキ
メラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのC末端ステムセグメントの始点はA
q+5である。そのような実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポ
リペプチド(これは、該インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種で
ある)は、一次配列中、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドのN末端セ
グメントとC末端セグメントの間に位置する。
【０２０６】
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドのN末端ステムセグメントの終点はAp-1であり、本明細書に記載のキメライン
フルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのC末端ステムセグメントの始点はAq+1であ
る。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素
ポリペプチドのN末端ステムセグメントの終点はAp-2であり、本明細書に記載のキメライ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのC末端ステムセグメントの始点はAq+2で
ある。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドのN末端ステムセグメントの終点はAp-3であり、本明細書に記載のキメラ
インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのC末端ステムセグメントの始点はAq+3
である。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝
集素ポリペプチドのN末端ステムセグメントの終点はAp-4であり、本明細書に記載のキメ
ラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのC末端ステムセグメントの始点はAq+
4である。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球
凝集素ポリペプチドのN末端ステムセグメントの終点はAp-5であり、本明細書に記載のキ
メラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのC末端ステムセグメントの始点はA
q+5である。そのような実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポ
リペプチド(これは、該インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種で
ある)は、一次配列中、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドのN末端セ
グメントとC末端セグメントの間に位置する。
【０２０７】
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドのN末端ステムセグメントの終点はAp+1であり、本明細書に記載のキメライン
フルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのC末端ステムセグメントの始点はAq-1であ
る。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素
ポリペプチドのN末端ステムセグメントの終点はAp+2であり、本明細書に記載のキメライ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのC末端ステムセグメントの始点はAq-2で
ある。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドのN末端ステムセグメントの終点はAp+3であり、本明細書に記載のキメラ
インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのC末端ステムセグメントの始点はAq-3
である。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝
集素ポリペプチドのN末端ステムセグメントの終点はAp+4であり、本明細書に記載のキメ
ラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのC末端ステムセグメントの始点はAq-
4である。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球
凝集素ポリペプチドのN末端ステムセグメントの終点はAp+5であり、本明細書に記載のキ
メラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのC末端ステムセグメントの始点はA
q-5である。そのような実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポ
リペプチド(これは、該インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種で
ある)は、一次配列中、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドのN末端セ
グメントとC末端セグメントの間に位置する。
【０２０８】
同じく本明細書に提供されるのは、HA2サブユニット及びキメラHA1サブユニットを含む
キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドである。ある実施態様において、キメラHA
1サブユニットは、第1のインフルエンザウイルス株又は亜型のHA1サブユニットの1、2、3
、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、
45、46、47、48、49、60、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、
65、66、67、68、69、70、71、72、73、75、75、76、77、78、79、又は80個のアミノ酸を
含み、キメラHA1サブユニットのアミノ酸の残りの部分は、第2のインフルエンザウイルス
株又は亜型由来のものである。ある実施態様において、キメラHA1サブユニットは、第1の
インフルエンザウイルス株又は亜型のHA1サブユニットの1〜10、10〜20、20〜30、30〜40
、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、又は90〜100個のアミノ酸を含み、キメラH
A1サブユニットのアミノ酸の残りの部分は、第2のインフルエンザウイルス株又は亜型由
来のものである。ある実施態様において、第1のインフルエンザウイルス株又は亜型由来
のアミノ酸は連続的であることができ、又はキメラHA1ドメインのN末端及び/もしくはC末
端の部分を表すことができる。具体的な実施態様において、キメラHA1サブユニットは、2
以上の異なる亜型又は株のインフルエンザウイルスのアミノ酸を含むインフルエンザウイ
ルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドを含む。具体的な実施態様において、キメラ
HA1サブユニットは、2以上の異なる亜型又は株のインフルエンザウイルスのアミノ酸を有
する球状ヘッドを含む。
【０２０９】
本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、本明
細書に記載の技術を含む、当業者により知られる及び当業者に好適と考えられる任意の技
術に従って調製することができることが当業者によって理解されるであろう。ある実施態
様において、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは単離される。
【０２１０】
(5.2  インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチド)
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の、キメラインフルエンザウイルス血球凝
集素ポリペプチドを含む、flu HAポリペプチドの作製において使用するためのインフルエ
ンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドである。
【０２１１】
一般に、本明細書に提供されるインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチド
は、インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインを含むか、又はそれか
ら本質的になるポリペプチドである。インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのヘッドド
メインは、当業者によって一般に認識されるヘッドドメインである。
【０２１２】
ある実施態様において、本明細書に提供されるインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメイ
ンポリペプチドは、当業者に公知のインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインとの少なく
とも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、98％、又は99％のアミノ酸配列同一性
を有するインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインを含む。
【０２１３】
同じく本明細書に提供されるのは、2以上の株又は亜型のインフルエンザウイルス由来
のアミノ酸を含むインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドである。ある実
施態様において、キメラHA1サブユニットは、第1のインフルエンザウイルス株又は亜型の
HA1サブユニットの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、
39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、60、51、52、53、54、55、56、57、58、
59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、75、75、76、77、78、
79、又は80個のアミノ酸を含み、キメラHA1サブユニットのアミノ酸の残りの部分は、第2
のインフルエンザウイルス株又は亜型由来のものである。ある実施態様において、キメラ
HA1サブユニットは、第1のインフルエンザウイルス株又は亜型のHA1サブユニットの1〜10
、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、又は90〜100個
のアミノ酸を含み、キメラHA1サブユニットのアミノ酸の残りの部分は、第2のインフルエ
ンザウイルス株又は亜型由来のものである。ある実施態様において、第1のインフルエン
ザウイルス株又は亜型由来のアミノ酸は連続的であることができ、及び/又はキメラHA1ド
メインのN末端及び/もしくはC末端の部分を表すことができる。
【０２１４】
同じく本明細書に提供されるのは、欠失型の公知のインフルエンザ血球凝集素ヘッドド
メインを含むインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドであり、ここで、最
大約150、145、140、135、130、125、120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、7
0、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1
個のアミノ酸残基がヘッドドメインから欠失している。同じく本明細書に提供されるのは
、欠失型の公知のインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインを含むインフルエンザ血球凝
集素ヘッドドメインポリペプチドであり、ここで、約1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、4
0〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、13
0〜140、又は140〜150個のアミノ酸残基がヘッドドメインから欠失している。さらに本明
細書に提供されるのは、改変型の公知のインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインを含む
インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドであり、ここで、該ヘッドドメイ
ンの最大約80、75、70  65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6
、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基が他のアミノ酸と置換されている(例えば、保存的
に置換されている)。同じく本明細書に提供されるのは、改変型の公知のインフルエンザ
血球凝集素ヘッドドメインを含むインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチド
であり、ここで、該ヘッドドメインの最大約1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、5
0〜60、60〜70、70〜80、80〜90、又は90〜100個のアミノ酸残基が他のアミノ酸と置換さ
れている(例えば、保存的に置換されている)。ある実施態様において、最大50個、60個、
又はそれより多くのアミノ酸が、インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインのN末端(一次
アミノ酸配列から見た場合)から欠失しており、最大70個、80個、又はそれより多くのア
ミノ酸が、インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインのC末端(一次アミノ酸配列から見た
場合)から欠失している。
【０２１５】
同じく本明細書に提供されるのは、インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメイン(例えば
、抗原性部位A、B、C、及びD(ここで、該ヘッドドメインは亜型H3由来のものである)又は
抗原性部位Sa、Sb、Ca、及びCb(ここで、該ヘッドドメインは亜型H1由来のものである)と
関連する抗原性領域(例えば、エピトープを含む又はエピトープからなることが知られて
いるヘッドドメインの領域)のうちの1つ又は複数の欠失を含むインフルエンザ血球凝集素
ヘッドドメインポリペプチドである。具体的な実施態様において、本明細書に提供される
のは、1つの抗原性領域(例えば、エピトープを含む又はエピトープからなることが知られ
ているヘッドドメインの領域)の欠失を含むインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポ
リペプチドである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、2つの
抗原性領域(例えば、エピトープを含む又はエピトープからなることが知られているヘッ
ドドメインの2つの領域)の欠失を含むインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプ
チドである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、3つの抗原性
領域(例えば、エピトープを含む又はエピトープからなることが知られているヘッドドメ
インの3つの領域)の欠失を含むインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドで
ある。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、4つの抗原性領域(例
えば、エピトープを含む又はエピトープからなることが知られているヘッドドメインの4
つの領域)の欠失を含むインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、5つの抗原性領域(例えば、
エピトープを含む又はエピトープからなることが知られているヘッドドメインの5つの領
域)の欠失を含むインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドである。当業者
は、当技術分野で公知であるか、又は当業者に公知でありかつ本明細書に記載されている
技術を用いて後に同定されるインフルエンザヘッドドメインの抗原性領域(例えば、エピ
トープ)を容易に決定することができる。
【０２１６】
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドのインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、(i)ステムドメ
インと相同である(すなわち、同じインフルエンザウイルス株又は亜型に由来する)インフ
ルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチド由来の1つ、2つ、3つ、又はそれより多
くの抗原性領域、及び(ii)ステムドメインと異種である(すなわち、異なるインフルエン
ザウイルス株又は亜型に由来する)インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチ
ド由来の1つ、2つ、3つ、又はそれより多くの抗原性領域を含む。具体的な実施態様にお
いて、該ヘッドドメインのC抗原性部位/領域は、ステムドメインと相同である(すなわち
、同じインフルエンザウイルス株又は亜型に由来する)。別の具体的な実施態様において
、該ヘッドドメインのD抗原性部位/領域は、ステムドメインと相同である(すなわち、同
じインフルエンザウイルス株又は亜型に由来する)。別の具体的な実施態様において、該
ヘッドドメインのC及びD抗原性部位/領域は、ステムドメインと相同である(すなわち、同
じインフルエンザウイルス株又は亜型に由来する)。また別の具体的な実施態様において
、該ヘッドドメインのCa及び/又はCb抗原性部位/領域は、ステムドメインと相同である(
すなわち、同じインフルエンザウイルス株又は亜型に由来する)。
【０２１７】
同じく本明細書に提供されるのは、インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインと関連す
る抗原性領域(例えば、エピトープを含む又はエピトープからなることが知られているヘ
ッドドメインの領域)のうちの1つ又複数と、非抗原性ポリペプチド配列(例えば、免疫応
答を誘導しないことが知られているか、又はインフルエンザに特異的ではない免疫応答を
生じさせることが知られているポリペプチド配列)との置換を含むインフルエンザ血球凝
集素ヘッドドメインポリペプチドである。具体的な実施態様において、本明細書に提供さ
れるのは、1つの抗原性領域(例えば、エピトープを含む又はエピトープからなることが知
られているヘッドドメインの領域)と、非抗原性ポリペプチド配列(例えば、免疫応答を誘
導しないことが知られているか、又はインフルエンザに特異的ではない免疫応答を生じさ
せることが知られているポリペプチド配列)との置換を含むインフルエンザ血球凝集素ヘ
ッドドメインポリペプチドである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供され
るのは、2つの抗原性領域(例えば、エピトープを含む又はエピトープからなることが知ら
れているヘッドドメインの2つの領域)と、非抗原性ポリペプチド配列(例えば、免疫応答
を誘導しないことが知られているか又はインフルエンザに特異的ではない免疫応答を生じ
させることが知られているポリペプチド配列)との置換を含むインフルエンザ血球凝集素
ヘッドドメインポリペプチドである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供さ
れるのは、3つの抗原性領域(エピトープを含む又はエピトープからなることが知られてい
るヘッドドメインの3つの領域)と、非抗原性ポリペプチド配列(例えば、免疫応答を誘導
しないことが知られているか又はインフルエンザに特異的ではない免疫応答を生じさせる
ことが知られているポリペプチド配列)との置換を含むインフルエンザ血球凝集素ヘッド
ドメインポリペプチドである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるの
は、4つの抗原性領域(エピトープを含む又はエピトープからなることが知られているヘッ
ドドメインの4つの領域)と、非抗原性ポリペプチド配列(例えば、免疫応答を誘導しない
ことが知られているか又はインフルエンザに特異的ではない免疫応答を生じさせることが
知られているポリペプチド配列)との置換を含むインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメイ
ンポリペプチドである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、5
つの抗原性領域(エピトープを含む又はエピトープからなることが知られているヘッドド
メインの5つの領域)と、非抗原性ポリペプチド配列(例えば、免疫応答を誘導しないこと
が知られているか又はインフルエンザに特異的ではない免疫応答を生じさせることが知ら
れているポリペプチド配列)との置換を含むインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポ
リペプチドである。当業者は、当技術分野で公知であるか、又は当業者に公知でありかつ
本明細書に記載されている技術を用いて後に同定されるインフルエンザヘッドドメインの
抗原性領域(例えば、エピトープ)を容易に決定することができる。
【０２１８】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、1つ、2つ、3つ、又はそ
れより多くの異種抗原性領域、すなわち、異なるインフルエンザウイルス株又は亜型(例
えば、集団の全体又は一部が感作されていないインフルエンザウイルス株又は亜型)の血
球凝集素由来の1つ、2つ、3つ、又はそれより多くの抗原性領域を含むインフルエンザ血
球凝集素ヘッドドメインポリペプチドである。別の具体的な実施態様において、インフル
エンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドの異種抗原性領域は、下記の第5.4.2節に
論じられているような1以上の非天然のグリコシル化部位を含む。任意の特定の動作理論
に束縛されるものではないが、ステムドメイン内の保存された亜免疫優性抗原性領域の免
疫原性は、インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメイン中のこれらの免疫優性領域への1以
上の非天然のグリコシル化部位の付加によって増大させることができると考えられる。具
体的な実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、1
つ、2つ、3つ、又はそれより多くの異種抗原性領域を含み、ここで、該異種抗原性領域は
、1以上の非天然のグリコシル化部位を含む。
【０２１９】
本明細書に提供されるインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、当業
者に公知の又は後に発見される任意のインフルエンザ血球凝集素のヘッドドメインに基づ
くことができる(すなわち、該ヘッドドメインとの配列同一性を有することができる)。あ
る実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、A型イ
ンフルエンザ血球凝集素のヘッドドメイン(例えば、下記の第5.4節に記載のA型インフル
エンザウイルスの血球凝集素のヘッドドメイン)に基づく。ある実施態様において、イン
フルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8
、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、及びH17からなる群から選択されるA型イン
フルエンザ血球凝集素のヘッドドメインに基づく。ある実施態様において、インフルエン
ザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、B型インフルエンザ血球凝集素のヘッドド
メイン(例えば、下記の第5.4節に記載のB型インフルエンザウイルスの血球凝集素のヘッ
ドドメイン)に基づく。いくつかの実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ヘッド
ドメインポリペプチドは、B/アザラシ/ネーデルラント/1/99のヘッドドメインに基づく。
具体的な実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、
H5、H6、及び/又はH9群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素のヘッドドメインに
基づく。別の具体的な実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリ
ペプチドは、H5、H7、及び/又はH9群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素のヘッ
ドドメインに基づく。
【０２２０】
(5.3  インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド)
本明細書に提供されるのは、flu血球凝集素ポリペプチド(例えば、キメラインフルエン
ザウイルス血球凝集素ポリペプチド)の作製において使用するためのインフルエンザ血球
凝集素ステムドメインポリペプチドである。任意の特定の動作理論に束縛されることを意
図するものではないが、本明細書に提供されるflu血球凝集素ポリペプチド(例えば、キメ
ラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)との関連において、インフルエンザ
血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、複数のインフルエンザ株と交差反応が可能で
ある免疫応答を生じさせるために、宿主免疫系に1以上の比較的保存された抗原性領域を
提示するのに有用であると考えられている。該1以上の抗原性領域はインフルエンザ血球
凝集素亜型にわたってよく保存されているので、そのような免疫応答は、全長インフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドのいくつかの亜型と交差反応することができる。
【０２２１】
一般に、本明細書に提供されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド
は、インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインを含むか又はそれから本質
的になるポリペプチドである。インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメイン
は、当業者によって一般に認識されるステムドメインである。
【０２２２】
ある実施態様において、本明細書に提供されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメイ
ンポリペプチドは、インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインをほと
んど又は全く含まない。ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメイ
ンポリペプチドは、当業者によって好適であると考えられる任意の技術によってその球状
ヘッドドメインが欠失させられているインフルエンザ血球凝集素である。
【０２２３】
ある実施態様において、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポ
リペプチドは、図1でAp及びAqとしてインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド中で特定さ
れているシステイン残基を維持している。ある実施態様において、本明細書に記載のイン
フルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、野生型インフルエンザウイルスの
血球凝集素よりも低いpH(例えば、5.2未満、5.1未満、5.0未満、又は4.9未満、例えば、4
.8、4.7、4.6、4.5、4.4.、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8などのpH)でより高い安定性を
有する。特定の実施態様において、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムド
メインポリペプチドは、野生型インフルエンザウイルスの血球凝集素よりも低いpHで、融
合前立体構造から融合立体構造への立体構造変化を経る。いくつかの実施態様において、
本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、低いpH(例
えば、4.9〜5.2、4.5〜3.5、3.5〜2.5、2.5〜1.5、1.5〜0.5のpH)でポリペプチドの安定
性を増大させる1以上のアミノ酸置換、例えば、HA1 H17Y(H3付番)を含む。インフルエン
ザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの安定性は、例えば、Thoennesらの文献(2008,
Virology 370: 403-414)に記載されているような、トリプシン消化に対する血球凝集素
分子の感受性などの、当技術分野で公知の技術を用いて評価することができる。
【０２２４】
インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、下記の技術を含む、当業者
に好適であると考えられる任意の技術に従って調製することができる。ある実施態様にお
いて、ステムドメインポリペプチドは単離される。
【０２２５】
いくつかの実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド
の一次構造は、以下の順序で:HA1のN末端ステムセグメント、リンカー、HA1のC末端ステ
ムセグメント、及びHA2を含む。いくつかの実施態様において、インフルエンザ血球凝集
素ステムドメインポリペプチドの一次構造は、以下の順序で:HA1のN末端ステムセグメン
ト、リンカー、HA1のC末端の短いステムセグメント、及びHA2を含む。いくつかの実施態
様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの一次構造は、以下
の順序で:HA1のN末端の長いステムセグメント、リンカー、HA1のC末端の長いステムセグ
メント、及びHA2を含む。いくつかの実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステ
ムドメインポリペプチドは、以下の順序で:HA1のN末端ステムセグメント、リンカー、HA1
の中間ステムセグメント、第2のリンカー、HA1のC末端ステムセグメント、及びHA2を含む
。
【０２２６】
一次配列は、単一のポリペプチドによって形成されることができるか、又はそれは、複
数のポリペプチドによって形成されることができる。通常、単一のポリペプチドは、当業
者によって好適であると考えられる任意の技術によって発現される。単一のポリペプチド
の実施態様において、HA1セグメントとHA2は三次結合している。当業者に公知であるよう
に、単一のHAポリペプチドは、例えば、プロテアーゼによって、適当な発現条件下で切断
され、四次結合した2つのポリペプチドを生じさせることができる。切断は、通常、HA1の
C末端ステムセグメントとHA2の間である。ある実施態様において、本明細書に提供される
のは、複数のポリペプチド、例えば、2つのポリペプチドのインフルエンザ血球凝集素ス
テムドメインである。複数のポリペプチドの実施態様において、HA1セグメントとHA2は四
次結合している。
【０２２７】
ある実施態様において、本明細書に提供されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメイ
ンポリペプチドは単量体である。ある実施態様において、本明細書に提供されるインフル
エンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは多量体である。ある実施態様において、
本明細書に提供されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは三量体で
ある。当業者は、天然のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドがインビボで三量体化す
ることができること、及び本明細書に提供される特定のインフルエンザ血球凝集素ステム
ドメインポリペプチドが三量体化することができることを認識しているであろう。下記の
特定の実施態様において、本明細書に提供されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメイ
ンポリペプチドは、三量体化を容易にする三量体化ドメインを含む。
【０２２８】
ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、シ
グナルペプチドを含む。通常、シグナルペプチドは、ポリペプチドの発現及び翻訳時又は
その後に切断され、成熟したインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドを生
じさせる。シグナルペプチドは、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド
の発現に有利であることができる。ある実施態様において、また本明細書に提供される、
シグナルペプチドを欠く成熟インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドであ
る。
【０２２９】
インフルエンザ血球凝集素HA2は、通常、ステムドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞
質ドメインを含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA2ステムドメ
イン、HA2内腔ドメイン、HA2膜貫通ドメイン、及びHA2細胞質ドメインを含むインフルエ
ンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドである。そのようなインフルエンザ血球凝集
素ステムドメインポリペプチドは、膜結合型抗原として発現されることができる。ある実
施態様において、本明細書に提供されるのは、HA2ステムドメイン、HA2内腔ドメイン、及
びHA2膜貫通ドメインを含むが、典型的な細胞質ドメインの一部又は全てを欠くインフル
エンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドである。そのようなインフルエンザ血球凝
集素ステムドメインポリペプチドは、膜結合型抗原として発現されることができる。ある
実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA2ステムドメイン及びHA2内腔ドメイン
を含むが、HA2膜貫通ドメインとHA2細胞質ドメインの両方を欠くインフルエンザ血球凝集
素ステムドメインポリペプチドである。そのようなインフルエンザ血球凝集素ステムドメ
インポリペプチドは、可溶性ポリペプチドとして有利に発現されることができる。ある実
施態様において、本明細書に提供されるのは、HA2ステムドメインを含むが、HA2内腔ドメ
イン、HA2膜貫通ドメイン、及びHA2細胞質ドメインを欠くインフルエンザ血球凝集素ステ
ムドメインポリペプチドである。そのようなインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポ
リペプチドは、可溶性ポリペプチドとして有利に発現されることができる。ある実施態様
において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、当業者に公知のイ
ンフルエンザHA2ステムドメインとの少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、9
6％、又は98％のアミノ酸配列同一性を有するHA2ステムドメインを含む。公知のA型イン
フルエンザ及びB型インフルエンザ血球凝集素由来の例示的な公知のHA2ステムドメインは
、下の表に提供されている。
【０２３０】
同じく本明細書に提供されるのは、最大100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、5
0、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基
がHA2ステムドメインの一方又は両方の末端から欠失している欠失型のHA2ステムドメイン
を含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドである。さらに本明細書に
提供されるのは、最大100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30
、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基が他のアミノ酸と
保存的に置換されている改変型のHA2ステムドメインを含むインフルエンザ血球凝集素ス
テムドメインポリペプチドである。さらに提供されるのは、欠失した及び改変されたHA2
ステムドメインを含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドである。あ
る実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、1以上
の修飾されたグリコシル化部位を含むHA2ステムドメインを含み、ここで、該修飾された
グリコシル化部位は、下記の第5.4.1節に記載されているような、該修飾されたグリコシ
ル化部位に結合するグリカンの能力を破壊する天然のグリコシル化部位の修飾を含む。任
意の特定の動作理論に束縛されるものではないが、ステムドメイン内の免疫原性及び接近
可能性抗原性領域は、該部位でのグリコシル化(すなわち、グリカンの結合)を破壊する形
でステムドメイン内の1以上のグリコシル化部位を修飾することによって増加させること
ができると考えられる。
【０２３１】
いくつかの実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド
の一次構造は、以下の順序で:HA1のN末端ステムセグメント、リンカー、HA1のC末端ステ
ムセグメント、及びHA2を含む。HA1のN末端ステムセグメントは、本明細書に提供される
定義に基づいて当業者により認識される任意のHA1のN末端ステムセグメントであることが
できる。通常、HA1のN末端ステムセグメントは、成熟したHA1(すなわち、シグナルペプチ
ドを欠くHA1)のN末端アミノ酸からHA1の約52番目の残基の配列に位置するシステイン残基
までからなるポリペプチドに対応する。本明細書でApと称される、このシステイン残基は
、通常、HA1のC末端ステムセグメント中のシステイン残基とジスルフィド架橋を形成する
ことができる。16個の代表的なA型インフルエンザ血球凝集素の配列が図1に示されており
、残基Apが各々で特定されている。
【０２３２】
ある実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、Ap(例えば、H3血球凝集素由
来のHA1サブユニットのCys52)で正確に終わるのではなく、配列上及び構造上Apに近い残
基で終わる。例えば、ある実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、Ap-1、Ap
-2、Ap-3、Ap-4、Ap-5、Ap-6、Ap-7、Ap-8、Ap-9、Ap-10、Ap-11、Ap-12、Ap-13、Ap-14
、Ap-15、Ap-16、Ap-17、Ap-18、Ap-19、Ap-20、Ap-21、Ap-22、Ap-23、Ap-23、Ap-24、A
p-25、Ap-26、Ap-27、Ap-28、Ap-29、Ap-30で終わる。ある実施態様において、本明細書
に記載のflu血球凝集素ポリペプチドのHA1のN末端ステムセグメントは、Ap-1〜Ap-3、Ap-
3〜Ap-5、Ap-5〜Ap-8、Ap-8〜Ap-10、Ap-10〜Ap-15、Ap-15〜Ap-20、Ap-20〜Ap-30、Ap-3
0〜Ap-40の範囲で終わる。他の実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、Ap+1
、Ap+2、Ap+3、Ap+4、Ap+5、Ap+6、Ap+7、Ap+8、Ap+9、Ap+10、Ap+11、Ap+12、Ap+13、Ap
+14、Ap+15、Ap+16、Ap+17、Ap+18、Ap+19、Ap+20、Ap+21、Ap+22、Ap+23、Ap+24、Ap+25
、Ap+26、Ap+27、Ap+28、Ap+29、Ap+30、Ap+31、Ap+32、Ap+33、Ap+34、Ap+35、Ap+36、A
p+37、Ap+38、Ap+39、Ap+40で終わる。ある実施態様において、本明細書に記載のflu血球
凝集素ポリペプチドのHA1のN末端ステムセグメントは、Ap+1〜Ap+5、Ap+5〜Ap+10、Ap+10
〜Ap+15、Ap+15〜Ap+20、Ap+20〜Ap+25、Ap+25〜Ap+30、Ap+30〜Ap+35、Ap+35〜Ap+40、
又はAp+40〜Ap+50の範囲で終わる。HA1のN末端ステムセグメントの終点は、得られる連結
されたHA1ステムドメインが、下記のように、インフルエンザ血球凝集素ステムドメイン
と類似した三次元構造を形成することができるように、HA1のC末端ステムセグメント及び
リンカーの終点との関連で選択されるべきである。
【０２３３】
ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、当
業者に公知のインフルエンザHA1のN末端ステムセグメントとの少なくとも70％、75％、80
％、85％、90％、95％、96％、又は98％のアミノ酸配列同一性を有するHA1のN末端ステム
セグメントを含む。例示的な公知のHA1のN末端ステムセグメントは、下の表に提供されて
いる。
【０２３４】
同じく本明細書に提供されるのは、最大100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、5
0、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基
がHA1のN末端ステムセグメントの一方又は両方の末端から欠失している欠失型のHA1のN末
端ステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドである
。同じく本明細書に提供されるのは、約1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100個のアミノ酸残基が該ステムドメインから欠失して
いる欠失型の公知のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインを含むインフルエンザ血球
凝集素ステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供され
るのは、ある実施態様において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、又はそれより多く
の残基が、HA1のN末端ステムセグメントのC末端に付加されており;これらの付加された残
基が、HA1のN末端ステムセグメントに隣接する球状ヘッドドメインのアミノ酸配列に由来
し得る、伸張型のHA1のN末端ステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素ステムド
メインポリペプチドである。さらに本明細書に提供されるのは、最大80、75、70  65、60
、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミ
ノ酸残基が他のアミノ酸と保存的に置換されている改変型のHA1のN末端ステムセグメント
を含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドである。同じく本明細書に
提供されるのは、ステムドメインの最大約1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50
〜60、60〜70、70〜80、80〜90、又は90〜100個のアミノ酸残基が他のアミノ酸と置換さ
れている(例えば、保存的に置換されている)改変型の公知のインフルエンザ血球凝集素ス
テムドメインを含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドである。さら
に提供されるのは、欠失した及び改変されたHA1のN末端ステムセグメントを含むインフル
エンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、最大50個
、60個、又はそれより多くのアミノ酸が、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインのN
末端(一次アミノ酸配列から見た場合)から欠失しており、最大70個、80個、又はそれより
多くのアミノ酸が、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインのC末端(一次アミノ酸配列
から見た場合)から欠失している。
【０２３５】
HA1のC末端ステムセグメントは、本明細書に提供される定義に基づいて当業者により認
識される任意のHA1のC末端ステムセグメントであり得る。通常、HA1のC末端ステムセグメ
ントは、HA1の約277番目の残基(H3付番を使用)の配列に位置するシステイン残基からHA1
のC末端アミノ酸までからなるポリペプチドに対応する。本明細書でAqと称される、この
システイン残基は、通常、HA1のN末端ステムセグメント中のシステイン残基Apとジスルフ
ィド架橋を形成することができる。17個の代表的なA型インフルエンザ血球凝集素の配列
が図1に示されており、残基Aqが各々で特定されている。
【０２３６】
ある実施態様において、ある実施態様において、HA1のC末端ステムセグメントは、Aq(
例えば、H3血球凝集素由来のHA1サブユニットのCys277)から始まるのではなく、配列上及
び構造上Aqに近い残基から始まる。例えば、ある実施態様において、HA1のC末端ステムセ
グメントは、Aq-1、Aq-2、Aq-3、Aq-4、Aq-5、Aq-6、Aq-7、Aq-8、Aq-9、Aq-10、Aq-11、
Aq-12、Aq-13、Aq-14、Aq-15、Aq-20、Aq-25、Aq-30、Aq-35、Aq-40、Aq-45、Aq-50、Aq-
55、Aq-60、Aq-65、Aq-70、Aq-75、又はAq-80周辺から始まる。ある実施態様において、H
A1のC末端ステムセグメントは、Aq-1〜Aq-5、Aq-5〜Aq-10、Aq-10〜Aq-15、Aq-15〜Aq-20
、Aq-20〜Aq-25、Aq-25〜Aq-30、Aq-30〜Aq-35、Aq-35〜Aq-40、Aq-40〜Aq-45、Aq-45〜A
q-50、Aq-50〜Aq-55、Aq-55〜Aq-60、Aq-60〜Aq-65、Aq-65〜Aq-70、Aq-75〜Aq-80から始
まる。他の実施態様において、HA1のC末端ステムセグメントは、Aq+1、Aq+2、Aq+3、Aq+4
、Aq+5、Aq+6、Aq+7、Aq+8、Aq+9、又はAq+10から始まる。ある実施態様において、本明
細書に記載のflu血球凝集素ポリペプチドのHA1のC末端ステムセグメントは、Aq+1〜Aq+3
、Aq+3〜Aq+5、Aq+5〜Aq+8、Aq+8〜Aq+10、Aq+10〜Aq+15、又はAq+15〜Aq+20の範囲から
始まる。HA1のN末端ステムセグメントの終点は、得られるHA1ステムドメインが、下記の
ように、インフルエンザ血球凝集素と類似した三次元構造を形成することができるように
、HA1のC末端ステムセグメント及びリンカーの始点との関連で選択されるべきである。
【０２３７】
ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、当
業者に公知のインフルエンザHA1のC末端ステムセグメントとの少なくとも70％、75％、80
％、85％、90％、95％、96％、又は98％のアミノ酸配列同一性を有するHA1のC末端ステム
セグメントを含む。例示的な公知のHA1のC末端ステムセグメントは、下の表に提供されて
いる。
【０２３８】
ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp-1であり、C末端ステムセグ
メントの始点はAq-1である。ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp-
2であり、C末端ステムセグメントの始点はAq-2である。ある実施態様において、N末端ス
テムセグメントの終点はAp-3であり、C末端ステムセグメントの始点はAq-3である。ある
実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp-4であり、C末端ステムセグメント
の始点はAq-4である。ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp-5であ
り、C末端ステムセグメントの始点はAq-5である。
【０２３９】
ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp+1であり、C末端ステムセグ
メントの始点はAq+1である。ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp+
2であり、C末端ステムセグメントの始点はAq+2である。ある実施態様において、N末端ス
テムセグメントの終点はAp+3であり、C末端ステムセグメントの始点はAq+3である。ある
実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp+4であり、C末端ステムセグメント
の始点はAq+4である。ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp+5であ
り、C末端ステムセグメントの始点はAq+5である。
【０２４０】
ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp-1であり、C末端ステムセグ
メントの始点はAq+1である。ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp-
2であり、C末端ステムセグメントの始点はAq+2である。ある実施態様において、N末端ス
テムセグメントの終点はAp-3であり、C末端ステムセグメントの始点はAq+3である。ある
実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp-4であり、C末端ステムセグメント
の始点はAq+4である。ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp-5であ
り、C末端ステムセグメントの始点はAq+5である。
【０２４１】
ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp+1であり、C末端ステムセグ
メントの始点はAq-1である。ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp+
2であり、C末端ステムセグメントの始点はAq-2である。ある実施態様において、N末端ス
テムセグメントの終点はAp+3であり、C末端ステムセグメントの始点はAq-3である。ある
実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp+4であり、C末端ステムセグメント
の始点はAq-4である。ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp+5であ
り、C末端ステムセグメントの始点はAq-5である。
【０２４２】
同じく本明細書に提供されるのは、最大100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、5
0、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基
がHA1のC末端ステムセグメントの一方又は両方の末端から欠失している欠失型のHA1のC末
端ステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドである
。同じく本明細書に提供されるのは、約1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜6
0、60〜70、70〜80、80〜90、又は90〜100個のアミノ酸残基がステムドメインから欠失し
ている欠失型の公知のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインを含むインフルエンザ血
球凝集素ステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供さ
れるのは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、又はそれより多くの残基が、HA1のC末端
ステムセグメントのN末端に付加されており;これらの付加された残基が、HA1のC末端ステ
ムセグメントに隣接する球状ヘッドドメインのアミノ酸配列に由来し得る、伸張型のHA1
のC末端ステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド
である。特定の実施態様において、1つの残基がC末端ステムセグメントに付加される場合
、1つの残基がN末端ステムセグメントに付加され;2つの残基がC末端ステムセグメントに
付加される場合、2つの残基がN末端ステムセグメントに付加され;3つの残基がC末端ステ
ムセグメントに付加される場合、3つの残基がN末端ステムセグメントに付加される。さら
に本明細書に提供されるのは、最大約80、75、70  65、60、55、50、45、40、35、30、25
、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基が他のアミノ酸と保存
的に置換されている改変型のHA1のC末端ステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集
素ステムドメインポリペプチドである。同じく本明細書に提供されるのは、HA1のC末端ス
テムセグメントの最大約1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70
〜80、80〜90、又は90〜100個のアミノ酸残基が他のアミノ酸と置換されている(例えば、
保存的に置換されている)改変型のHA1のC末端ステムセグメントを含むインフルエンザ血
球凝集素ステムドメインポリペプチドである。さらに提供されるのは、欠失した及び改変
されたHA1のC末端ステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリ
ペプチドである。ある実施態様において、該C末端ステムセグメントは、1以上の修飾され
たグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、該N末端ステムセグメントは、1以上
の修飾されたグリコシル化部位を含む。他の実施態様において、該C末端ステムセグメン
ト及びN末端ステムセグメントは、1以上の修飾されたグリコシル化部位を含む。
【０２４３】
ある実施態様において、本明細書に提供されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメイ
ンポリペプチドは、HA1サブユニットのステムドメインのキメラ/ハイブリッドを含む。HA
1サブユニットのステムドメインのキメラは、第1のインフルエンザウイルス株又は亜型の
HA1サブユニットのステムドメインの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、
35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、60、51、52、53、54、
55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、75、
75、76、77、78、79、又は80個のアミノ酸を含むことができ、HA1サブユニットのステム
ドメインのキメラのアミノ酸の残りの部分は、第2のインフルエンザウイルス株又は亜型
由来のものであることができる。ある実施態様において、HA1サブユニットのステムドメ
インのキメラは、第1のインフルエンザウイルス株又は亜型のHA1サブユニットのステムド
メイン1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、又
は90〜100個のアミノ酸を含み、HA1サブユニットのステムドメインのキメラのアミノ酸の
残りの部分は、第2のインフルエンザウイルス株又は亜型由来のものである。ある実施態
様において、本明細書に提供されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチ
ドは、HA2サブユニットとHA1サブユニットのステムドメインのキメラとを含む。ある実施
態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、HA1サブユニ
ットのステムドメインのキメラ/ハイブリッドを含み、ここで、1以上の天然のグリコシル
化部位は、修飾が、下記の第5.4.1節に記載されているように、修飾されたグリコシル化
部位に結合するグリカンの能力を破壊するように修飾されている。任意の特定の動作理論
に束縛されるものではないが、ステムドメイン内の免疫原性及び接近可能性抗原性領域は
、該部位でのグリコシル化(すなわち、グリカンの結合)を破壊する形でステムドメイン内
の1以上のグリコシル化部位を修飾することによって増加させることができると考えられ
る。
【０２４４】
インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、当業者に公知であるか又は
後に発見される任意のインフルエンザ血球凝集素に基づくことができる(すなわち、上記
のように、配列同一性を有することができる)。ある実施態様において、インフルエンザ
血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、A型インフルエンザ血球凝集素に基づく。あ
る実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、H1、H2
、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、及びH17からなる
群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様において、イン
フルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、以下で詳細に記載されるように、
B型インフルエンザ血球凝集素に基づく。
【０２４５】
HA1のN末端ステムセグメントは、当業者に公知であるか又は後に発見される任意のHA1
のN末端ステムセグメントに基づくことができる(すなわち、上記のように、配列同一性を
有することができる)。ある実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、A型イン
フルエンザHA1のN末端ステムセグメントに基づく。ある実施態様において、HA1のN末端ス
テムセグメントは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H
15、H16、及びH17からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。あ
る実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、配列番号34〜49から選択される。
ある実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、各々1つのアミノ酸がそのC末端
から欠失している、配列番号34〜49から選択される。ある実施態様において、HA1のN末端
ステムセグメントは、各々2つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号34〜49
から選択される。ある実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、各々3つのア
ミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号34〜49から選択される。ある実施態様に
おいて、HA1のN末端ステムセグメントは、各々4つのアミノ酸がそのC末端から欠失してい
る、配列番号34〜49から選択される。ある実施態様において、HA1のN末端ステムセグメン
トは、各々5つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号34〜49から選択される
。ある実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、配列番号177〜224から選択さ
れる。ある実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、アンアーバー/6/60、A/
プエルトリコ/8/34、もしくはA/パース/16/2009インフルエンザウイルスのHA-1のN末端ス
テムセグメントであるか又はこれらに基づく。
【０２４６】
HA1のC末端ステムセグメントは、当業者に公知であるか又は後に発見される任意のHA1
のC末端ステムセグメントに基づくことができる(すなわち、上記のように、配列同一性を
有することができる)。ある実施態様において、HA1のC末端ステムセグメントは、A型イン
フルエンザHA1のC末端ステムセグメントに基づく。ある実施態様において、HA1のC末端ス
テムセグメントは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H
15、H16、及びH17からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。あ
る実施態様において、HA1のC末端ステムセグメントは、配列番号50〜65から選択される。
ある実施態様において、HA1のC末端ステムセグメントは、各々1つのアミノ酸がそのN末端
から欠失している、配列番号50〜65から選択される。ある実施態様において、HA1のC末端
ステムセグメントは、各々2つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号50〜65
から選択される。ある実施態様において、HA1のC末端ステムセグメントは、各々3つのア
ミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号50〜65から選択される。ある実施態様に
おいて、HA1のC末端ステムセグメントは、各々4つのアミノ酸がそのN末端から欠失してい
る、配列番号50〜65から選択される。ある実施態様において、HA1のC末端ステムセグメン
トは、各々5つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号50〜65から選択される
。ある実施態様において、HA1のC末端ステムセグメントは、配列番号226〜273から選択さ
れる。ある実施態様において、HA1のC末端ステムセグメントは、アンアーバー/6/60、A/
プエルトリコ/8/34、又はA/パース/16/2009インフルエンザウイルスのHA-1のN末端ステム
セグメントであるか又はこれらに基づく。
【０２４７】
HA2ステムドメインは、当業者に公知であるか又は後に発見される任意のHA2ステムドメ
インに基づくことができる(すなわち、上記のように、配列同一性を有することができる)
。ある実施態様において、HA2ステムドメインは、A型インフルエンザHA2ステムドメイン
に基づく。ある実施態様において、HA2ステムドメインは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7
、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、及びH17からなる群から選択されるA型
インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様において、HA2ステムドメインは、A/
アンアーバー/6/60様、A/プエルトリコ/8/1934様、A/パース/16/2009様、A/カリフォルニ
ア/07/2009様、A/ブリスベン/59/07様、A/ニューカレドニア/20/1999様、又はA/ビクトリ
ア/361/201様インフルエンザウイルスのHA2ステムドメインであるか又はこれらに基づく
。ある実施態様において、HA2ステムドメインは、後に発見されるHA2ステムドメインであ
るか又はこれに基づく。
【０２４８】
ある実施態様において、HA2ステムドメインは、HA1サブユニットのステムドメインと同
じインフルエンザウイルス株又は亜型由来のものである。
【０２４９】
シグナルペプチドを含む実施態様において、シグナルペプチドは、当業者に公知の任意
のインフルエンザウイルスシグナルペプチドに基づくことができる。ある実施態様におい
て、シグナルペプチドは、A型インフルエンザシグナルペプチドに基づく。ある実施態様
において、シグナルペプチドは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12
、H13、H14、H15、及びH16からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基
づく。ある実施態様において、シグナルペプチドは、当業者に有用であると考えられる任
意のシグナルペプチドであることができる。ある実施態様において、シグナルペプチドは
、配列番号18〜33から選択される。
【０２５０】
内腔ドメインを含む実施態様において、内腔ドメインは当業者に公知の任意のインフル
エンザ内腔ドメインに基づくことができる。ある実施態様において、内腔ドメインは、A
型インフルエンザ内腔ドメインに基づく。ある実施態様において、HA2内腔ドメインは、H
1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、及びH17か
らなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様において
、内腔ドメインは、当業者に有用であると考えられる任意の内腔ドメインであることがで
きる。ある実施態様において、内腔ドメインは、配列番号98〜113から選択される。ある
実施態様において、内腔ドメインは、HA1サブユニットのステムドメインと同じインフル
エンザウイルス株又は亜型由来のものである。
【０２５１】
ある実施態様において、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、及び内腔ドメインは、HA2
サブユニットのステムドメインと同じインフルエンザウイルス株又は亜型由来のものであ
る。他の実施態様において、細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインは、HA2サブユニットの
ステムドメインと同じインフルエンザウイルス株又は亜型由来のものである。ある実施態
様において、細胞質ドメイン及び内腔ドメインは、HA2サブユニットのステムドメインと
同じインフルエンザウイルス株又は亜型由来のものである。
【０２５２】
膜貫通ドメインを含む実施態様において、膜貫通ドメインは当業者に公知の任意のイン
フルエンザ膜貫通ドメインに基づくことができる。ある実施態様において、膜貫通ドメイ
ンは、A型インフルエンザ膜貫通ドメインに基づく。ある実施態様において、HA2膜貫通ド
メインは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16
、及びH17からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態
様において、膜貫通ドメインは、当業者に有用であると考えられる任意の膜貫通ドメイン
であることができる。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、配列番号114〜129から
選択される。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、HA2サブユニットのステムドメ
インと同じインフルエンザウイルス株又は亜型由来のものである。
【０２５３】
細胞質ドメインを含む実施態様において、細胞質ドメインは当業者に公知の任意のイン
フルエンザ細胞質ドメインに基づくことができる。ある実施態様において、細胞質ドメイ
ンは、A型インフルエンザ細胞質ドメインに基づく。ある実施態様において、HA2細胞質ド
メインは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16
、及びH17からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態
様において、細胞質ドメインは、当業者に有用であると考えられる任意の細胞質ドメイン
であることができる。ある実施態様において、細胞質ドメインは、配列番号130〜145から
選択される。ある実施態様において、細胞質ドメインは、HA2サブユニットのステムドメ
インと同じインフルエンザウイルス株又は亜型由来のものである。
【０２５４】
ある実施態様において、血球凝集素ステムドメイン中のグリコシル化部位の1つ又は複
数を、これらの部位でのグリコシル化がポリペプチドのプロセシング及び成熟の間に生じ
ないように(例えば、アミノ酸の付加、欠失、又は置換によって)修飾する。当業者は、イ
ンフルエンザHAが、通常、1以上のグリコシル化部位(例えば、Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys、こ
こで、Xaaは任意のアミノ酸であり、又はある実施態様において、XaaはPro以外の任意の
アミノ酸である)を含むことを認識しているであろう。ある実施態様において、グリコシ
ル化部位中の1以上のアミノ酸残基を、グリコシル化部位を分断するアミノ酸残基と保存
的に置換する。ある実施態様において、グリコシル化配列中の1以上のアミノ酸残基を、
グリコシル化部位を分断する任意のアミノ酸残基と置換する。ある実施態様において、グ
リコシル化部位中の1以上のアスパラギン残基をアラニンと置換する。特定の実施態様に
おいて、H3血球凝集素の位置38のアスパラギンをアラニンに変化させる。ある実施態様に
おいて、血球凝集素ステムドメインは、下記の第5.4.1節で論じられているような1以上の
修飾されたグリコシル化部位を含む。
【０２５５】
下の表1は、A型インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのシグナルペプチド、HA1のN末
端ステムセグメント、HA1のC末端ステムセグメント、及びHA2ドメインを特定している。
これらのシグナルペプチド、ステムセグメント、及びドメインは、本明細書に記載のポリ
ペプチド及び方法において有用である。
表1.例示的なA型インフルエンザ血球凝集素配列
【表１】
2020096604.tif 000005
2020096604.tif 000006
2020096604.tif 000007
2020096604.tif 000008
2020096604.tif 000009
2020096604.tif 000010
2020096604.tif 000011
2020096604.tif 000012
2020096604.tif 000013
【０２５６】
下の表1Aは、本明細書に記載のポリペプチド及び方法のための有用なHA1のN末端ステム
セグメント及びHA1のC末端ステムセグメントを特定している。
表1A.例示的なA型インフルエンザ血球凝集素配列
【表２】
2020096604.tif 000014
2020096604.tif 000015
2020096604.tif 000016
2020096604.tif 000017
2020096604.tif 000018
2020096604.tif 000019
2020096604.tif 000020
2020096604.tif 000021
2020096604.tif 000022
2020096604.tif 000023
【０２５７】
下の表2は、HA2ポリペプチドの推定上のステムドメイン、内腔ドメイン、膜貫通ドメイ
ン、及び細胞質ドメインを特定している。
表2.例示的なA型インフルエンザ血球凝集素配列
【表３】
2020096604.tif 000024
2020096604.tif 000025
2020096604.tif 000026
2020096604.tif 000027
2020096604.tif 000028
2020096604.tif 000029
【０２５８】
ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、イ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの三次構造又は四次構造中に1以上の免疫原性エピ
トープを含む。
【０２５９】
ある実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、アミノ酸配列
【化４】
2020096604.tif 000030
を含み、ここで、
A17は、Y又はHであり;
A18は、H、L、又はQであり;
(Xaa)nは、18〜20アミノ酸残基の配列を表し;かつ
A38は、H、S、Q、T、又はNである。
【０２６０】
ある実施態様において、HA1のC末端ステムセグメントは、アミノ酸配列
【化５】
2020096604.tif 000031
を含み、ここで、
A291は、T、S、N、D、P、又はKであり;かつ
A292は、L、M、K、又はRである。
【０２６１】
ある実施態様において、HA2ドメインは、アミノ酸配列
【化６】
2020096604.tif 000032
を含み、ここで、
A18は、V又はIであり;
A19は、D、N、又はAであり;
A20は、Gであり、かつ
A21は、Wである。
【０２６２】
ある実施態様において、HA2ドメインは、アミノ酸配列
【化７】
2020096604.tif 000033
を含み、ここで、
A38は、K、Q、R、L、又はYであり;
A39は、任意のアミノ酸残基であり;
A40は、任意のアミノ酸残基であり;
A41は、Tであり;
A42は、Qであり;
A43は、任意のアミノ酸残基であり;
A44は、Aであり;
A45は、Iであり;
A46は、Dであり;
A47は、任意のアミノ酸残基であり;
A48は、I、V、又はMであり;
A49は、T、Q、又はNであり;
A50は、任意のアミノ酸残基であり;
A51は、Kであり;
A52は、V又はLであり;
A53は、Nであり;
A54は、任意のアミノ酸残基であり;
A55は、V、I、又はLであり;かつ
A56は、V又はIである。
【０２６３】
ある実施態様において、インフルエンザステムドメインポリペプチドは、配列番号146
〜149から選択される2つのアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、インフルエンザ
ステムドメインポリペプチドは、配列番号146〜149から選択される3つのアミノ酸配列を
含む。ある実施態様において、インフルエンザステムドメインポリペプチドは、配列番号
146〜149から選択される4つのアミノ酸配列を含む。
【０２６４】
ある実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、B型インフルエンザ血球凝集
素に基づく。ある実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、下の表3に示す配
列番号154〜157から選択される。
【０２６５】
ある実施態様において、HA1のC末端ステムセグメントは、B型インフルエンザ血球凝集
素に基づく。ある実施態様において、HA1のC末端ステムセグメントは、下の表3に示す配
列番号158〜159及び553〜554から選択される。
【０２６６】
ある実施態様において、HA2ステムドメインは、B型インフルエンザ血球凝集素に基づく
。B型インフルエンザ血球凝集素のN末端ステムセグメントの終点及びC末端ステムセグメ
ントの終点の例示的な残基を図2に示す。ある実施態様において、HA2ステムドメインは、
下の表3及び4に示す配列番号160によるものである。
【０２６７】
特定の実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメントとB
型インフルエンザウイルスHA1のC末端セグメントの境界は、6対のアミノ酸残基:Arg50及
びSer277;Ala66及びTrp271;Lys80及びSer277;Cys94及びCys143;Cys178及びCys272、並び
にCys54及びCys272に関して定義される。これら6対の残基の位置は図3でも強調されてい
る。残基番号は、タンパク質データバンク受託番号3BT6に記載のB型インフルエンザウイ
ルス由来のB-HAの付番に基づく。タンパク質データバンク受託番号3BT6のB-HAタンパク質
のX線結晶構造に対応するアミノ酸配列を代表的なH1及びH3アミノ酸配列と整列させ、そ
れを図2に示す。
【０２６８】
ある実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメントは、
残基1(PDBファイル3BT6と同様に、B型インフルエンザウイルスHA1サブユニットの付番に
基づく)から始まり、Arg50で終わる。ある実施態様において、B型インフルエンザウイル
スHA1のN末端ステムセグメントは、残基1から始まり、Ala66で終わる。いくつかの実施態
様において、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメントは、残基1から始ま
り、Lys80で終わる。いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスN末端ス
テムセグメントは、残基1から始まり、Arg80で終わる。いくつかの実施態様において、B
型インフルエンザウイルスN末端ステムセグメントは、残基1から始まり、Cys54で終わる
。いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスN末端ステムセグメントは、
残基1から始まり、Cys94で終わる。いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウ
イルスN末端ステムセグメントは、残基1から始まり、Cys178で終わる。
【０２６９】
いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメン
トは、表3に示すような、配列番号154〜157及び550〜552のいずれか1つによるアミノ酸配
列を有する。いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステ
ムセグメントは、配列番号154〜157又は550〜552のいずれか1つのアミノ酸配列のいずれ
か1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるア
ミノ酸配列を有する。
【０２７０】
いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメン
トは、B型インフルエンザウイルスHA1の残基1〜50に対応するアミノ酸配列配列番号154と
少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配
列を有する。
【０２７１】
いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメン
トは、B型インフルエンザウイルスHA1の残基1〜66に対応するアミノ酸配列配列番号155と
少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配
列を有する。
【０２７２】
いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメン
トは、B型インフルエンザウイルスHA1の残基1〜80に対応するアミノ酸配列配列番号156と
少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配
列を有する。
【０２７３】
いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメン
トは、位置80のリジンがアルギニンに置き換えられているB型インフルエンザウイルスHA1
の残基1〜80に対応するアミノ酸配列配列番号157と少なくとも70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０２７４】
いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメン
トは、B型インフルエンザウイルスHA1の残基1〜94に対応するアミノ酸配列配列番号550と
少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配
列を有する。
【０２７５】
いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメン
トは、B型インフルエンザウイルスHA1の残基1〜178に対応するアミノ酸配列配列番号551
と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸
配列を有する。
【０２７６】
いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA1のN末端ステムセグメン
トは、B型インフルエンザウイルスHA1の残基1〜54に対応するアミノ酸配列配列番号552と
少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配
列を有する。
【０２７７】
いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端ステムセグメン
トは、Ser277、Trp271、Cys143、Cys272、又は他のB型インフルエンザウイルスHA亜型の
対応する残基から始まるアミノ酸配列を有する。
【０２７８】
いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端ステムセグメン
トは、表3に示すような、配列番号158〜159又は553〜554のいずれか1つによるアミノ酸配
列を有する。いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端ステ
ムセグメントは、B型インフルエンザウイルスHA1の残基277〜344に対応する配列番号158
と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸
配列を有する。いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端ス
テムセグメントは、B型インフルエンザウイルスHA1の残基271〜344に対応する配列番号15
9と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ
酸配列を有する。いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端
ステムセグメントは、B型インフルエンザウイルスHA1の残基137〜344に対応する配列番号
553と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミ
ノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA1のC末
端ステムセグメントは、B型インフルエンザウイルスHA1の残基272〜344に対応する配列番
号554と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるア
ミノ酸配列を有する。
【０２７９】
いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端ステムセグメン
トは、残基276、残基275、残基274、残基273、又は残基272から始まる。他の実施態様に
おいて、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端ステムセグメントは、残基278、残基279
、残基280、残基281、又は残基282から始まる。
【０２８０】
ある実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA2ドメインは、B型インフルエン
ザウイルスHA1のN末端セグメント、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端セグメント、
又は両方を通して、B型インフルエンザウイルスHA1ドメインと三次結合又は四次結合して
いる。
【０２８１】
いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端セグメントとB型
インフルエンザウイルスHA2サブユニットは、共有結合している。例えば、そのC末端で(
例えば、第2の配列の末端残基で)、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端セグメントは
、そのような実施態様のB型インフルエンザウイルスHA2ドメインに共有結合している。い
くつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA1のC末端セグメントとB型イン
フルエンザウイルスHA2ドメインは、連続ポリペプチド鎖を形成する。
【０２８２】
いくつかの実施態様において、B型インフルエンザウイルスHA2ドメインは、表3又は4に
示すような、配列番号160又は161のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において
、HA2ドメインのアミノ酸配列は、配列番号160〜161のいずれか1つと少なくとも70％、75
％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一である。
【０２８３】
ある実施態様において、B型インフルエンザステムドメインポリペプチドは、シグナル
ペプチドを含む。シグナルペプチドは、本明細書に記載の任意のシグナルペプチドを含む
、当業者に好適であると考えられる任意のシグナルペプチドであることができる。ある実
施態様において、シグナルペプチドは、配列番号150〜153のいずれかと少なくとも70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一である。ある実施態様において、シ
グナルペプチドは、配列番号150〜153のいずれかによるものである。
【０２８４】
ある実施態様において、B型インフルエンザステムドメインポリペプチドは、内腔ドメ
インを含む。内腔ドメインは、本明細書に記載の任意の内腔ドメインを含む、当業者に好
適であると考えられる任意の内腔ドメインであることができる。ある実施態様において、
内腔は、配列番号162と少なくとも60％又は80％同一である。ある実施態様において、内
腔ドメインは、配列番号162によるものである。
【０２８５】
ある実施態様において、B型インフルエンザステムドメインポリペプチドは、膜貫通ド
メインを含む。膜貫通ドメインは、本明細書に記載の任意の膜貫通ドメインを含む、当業
者に好適であると考えられる任意の膜貫通ドメインであることができる。ある実施態様に
おいて、膜貫通ドメインは、配列番号163と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、9
5％、96％、又は98％同一である。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、配列番号1
63によるものである。
【０２８６】
ある実施態様において、B型インフルエンザステムドメインポリペプチドは、細胞質ド
メインを含む。細胞質ドメインは、本明細書に記載の任意の細胞質ドメインを含む、当業
者に好適であると考えられる任意の細胞質ドメインであることができる。ある実施態様に
おいて、細胞質ドメインは、配列番号164と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、9
5％、96％、又は98％同一である。ある実施態様において、細胞質ドメインは、配列番号1
64によるものである。
表3:例示的なB型インフルエンザ血球凝集素配列
【表４】
2020096604.tif 000034
2020096604.tif 000035
2020096604.tif 000036
2020096604.tif 000037
【０２８７】
表4は、B型インフルエンザ由来のHAの推定上のステムドメイン、内腔ドメイン、膜貫通
ドメイン、及び細胞質ドメインを提供する。
表4:例示的なB型インフルエンザ血球凝集素配列
【表５】
2020096604.tif 000038
【０２８８】
図1及び2に示すように、HA1のN末端ステムセグメントは、A型インフルエンザとB型イン
フルエンザの間で、さらにA型インフルエンザ亜型にわたって配列同一性を共有する。同
様に、HA1のC末端ステムセグメントも、A型インフルエンザとB型インフルエンザの間で、
さらにA型インフルエンザ亜型にわたって配列同一性を共有する。さらに、HA2ドメインも
、A型インフルエンザとB型インフルエンザの間で、さらにA型インフルエンザ亜型にわた
って配列同一性を共有する。
【０２８９】
いくつかの実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド
は、以下の順序で:HA1のN末端ステムセグメント、リンカー、HA1の中間ステムセグメント
、第2のリンカー、HA1のC末端ステムセグメント、及びHA2を含む。いくつかの実施態様に
おいて、HA1のN末端ステムセグメントは、表5に示すような、配列番号555と少なくとも70
％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配列を有する。
配列番号555は、B型インフルエンザウイルスHA1の残基1〜94に対応する。いくつかの実施
態様において、HA1のC末端ステムセグメントは、表5に示すような、配列番号557と少なく
とも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配列を有
する。配列番号557は、B型インフルエンザウイルスHA1の残基272〜344に対応する。いく
つかの実施態様において、HA1の中間セグメントは、表5に示すような、配列番号556と少
なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ酸配列
を有する。配列番号556は、B型インフルエンザウイルスHA1の残基143〜178に対応する。
いくつかの実施態様において、HA2ドメインは、本明細書に記載されるような、配列番号1
60と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％同一であるアミノ
酸配列を有する。いくつかの実施態様において、第1及び第2のリンカーは、本明細書に記
載のリンカーを含むが、これに限定されない、当業者に公知の任意のリンカーであること
ができる。
表5.例示的なB型インフルエンザ血球凝集素配列
【表６】
2020096604.tif 000039
【０２９０】
いくつかの実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド
は、複数のインフルエンザ株又は亜型由来のセグメント及び/又はドメインを含むか又は
それらから本質的になるハイブリッドポリペプチドである。例えば、インフルエンザ血球
凝集素ステムドメインポリペプチドは、異なるA型インフルエンザウイルスHA亜型由来のH
A1のN末端ステムセグメント及びHA1のC末端ステムセグメントを含むことができる。いく
つかの実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、A型インフルエンザウイルス
由来のものであるが、HA1のC末端ステムセグメントは、B型インフルエンザウイルス由来
のものである。同様に、HA2は、A型インフルエンザウイルス由来のものでもあり得るが、
HA1のN末端ステムセグメント及び/又はC末端ステムセグメントは、B型インフルエンザウ
イルス由来のものである。
【０２９１】
表1〜4に記載の配列エレメント又はその変異体の任意の組合せを用いて、本発明の血球
凝集素HAステムドメインポリペプチドを形成させることができることが理解されるであろ
う。
【０２９２】
本明細書に提供されるインフルエンザステムドメインポリペプチドにおいて、リンカー
は、HA1のN末端ステムセグメントをHA1のC末端ステムセグメントに共有結合で連結させる
。ある実施態様において、リンカーは直接結合である。ある実施態様において、リンカー
は、インフルエンザステムドメインと異種のインフルエンザウイルス由来の球状ヘッド、
又はその断片である。ある実施態様において、リンカーは、キメラインフルエンザウイル
ス血球凝集素のHA2サブユニットのステムドメインと異種のインフルエンザウイルス由来
の球状ヘッド、又はその断片である。ある実施態様において、リンカーは、キメラインフ
ルエンザウイルス血球凝集素のHA1及び/又はHA2サブユニットのステムドメインと異種の
インフルエンザウイルス由来の球状ヘッド、又はその断片である。ある実施態様において
、リンカーは、抗体Fab領域又はその断片である。他の実施態様において、リンカーは、
非インフルエンザウイルス糖タンパク質又はその断片である。ある実施態様において、リ
ンカーは、1つのアミノ酸残基、2以下のアミノ酸残基、3以下のアミノ酸残基、4以下のア
ミノ酸残基、5以下のアミノ酸残基、10以下のアミノ酸残基、15以下のアミノ酸残基、20
以下のアミノ酸残基、30以下のアミノ酸残基、40以下のアミノ酸残基、又は50以下のアミ
ノ酸残基を含むペプチドである。ある実施態様において、リンカーペプチドは、50以上の
アミノ酸残基を含む。ある実施態様において、リンカーは、球状ヘッドドメインを実質的
に欠く。つまり、リンカーは、インフルエンザ球状ヘッドドメインのアミノ酸配列由来の
、10、9、8、7、6、5、又は4以下の隣接する連続したアミノ酸残基を含む。ある実施態様
において、リンカーは、
【化８】
2020096604.tif 000040
以外である。ある実施態様において、リンカーは、
【化９】
2020096604.tif 000041
以外である。ある実施態様において、リンカーは、
【化１０】
2020096604.tif 000042
以外である。
【０２９３】
ある実施態様において、リンカーは、一方の末端で、HA1のN末端ステムセグメントのC
末端に共有結合で連結されている。リンカーペプチドはまた、もう一方の末端で、HA1のC
末端ステムセグメントのN末端に共有結合で連結されている。ある実施態様において、共
有結合のうちの1つはアミド結合である。ある実施態様において、両方の共有結合がアミ
ド結合である。
【０２９４】
リンカーは、当業者によって好適であると考えられる任意のリンカーであることができ
る。ある実施態様において、リンカーは、HA1のN末端ステムセグメント及びHA1のC末端ス
テムセグメントに基づいて選択される。これらの実施態様において、リンカーは、両方と
もAccelrys製のInsightII及びQuantaなどの分子モデリングプログラムを用いて選択され
得る。ある実施態様において、リンカーは、当業者によって認識される血球凝集素ステム
ドメインの構造と一致する、HA1のN末端ステムセグメント及びHA1のC末端ステムセグメン
トの構造アラインメントを可能にする構造モチーフである。ある実施態様において、リン
カーは、候補リンカーのライブラリーから選択される。ある実施態様において、ライブラ
リーは、欧州分子生物学研究所(European Molecular Biology Laboratory)(EMBL)又は欧
州バイオインフォマティクス研究所(European Bioinformatics Institute)(EBI)のタンパ
ク質データバンク(PDB)又は巨大分子構造データベースなどの公開データベース中の三次
元ポリペプチド構造を含む。ある実施態様において、ライブラリーは、両方ともAccelrys
製のInsightII及びQuantaなどの市販プログラムに付随する独占所有権のある三次元ポリ
ペプチド構造を含む。さらに、タンパク質構造又は構造エレメントの任意のデータベース
又はコレクションを用いて、リンカーを選択することができる。タンパク質構造エレメン
トの例示的なデータベース又はコレクションとしては、タンパク質の構造分類(Structura
l Classification of Proteins)(SCOP、Cambridge Universityによって維持され、提供さ
れる);タンパク質ファミリーのデータベース(database of protein families)(Pfam、Wel
lcome Trust Sanger Instituteによって維持され、提供される);汎用タンパク質資源(Uni
versal Protein Resource)(UniProt、UniProt Consortiumによって維持され、提供される
);タンパク質ファミリーの総合資源(Integrated resource for protein families)(Inter
Pro;EMBL-EBIによって維持され、提供される);クラス構造トポロジー相同スーパーファミ
リー(Class Architecture Topology Homologous superfamily)(CATH、University Colleg
e LondonのInstitute of Structural and Molecular Biologyによって維持され、提供さ
れる);及び構造的に類似したタンパク質のファミリー(families of structurally simila
r proteins)(FSSP、EBIによって維持され、提供される)が挙げられるが、これらに限定さ
れない。限定するものではないが、SCOP、CATH、及びFSSPによって使用されるものを含む
、当業者によって好適であると考えられる任意のアルゴリズムを用いて、リンカーを選択
することができる。有用な例としては、Pymol(Delano Scientific LLC)、InsightII及びQ
uanta(両方ともAccelrys製)、MIDAS(University of California, San Francisco)、Swiss
PDB viewer(Swiss Institute of Bioinformatics)、TOPOFIT(Northeastern University)
、CBSU LOOPP(Cornell University)、並びにSuperPose(University of Alberta, Edmonto
n)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９５】
ある実施態様において、リンカーは直接結合である。ある実施態様において、リンカー
は、Gly、Gly-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly、及びGly-Gly-Gly-Gly-Glyからなる
群から選択される。ある実施態様において、リンカーは、Gly-Pro及びPro-Glyからなる群
から選択される。ある実施態様において、リンカーは、例えば、配列
【化１１】
2020096604.tif 000043
を有する281ターンループである。
【０２９６】
ある実施態様において、リンカーは、グリコシル化配列を含む。ある実施態様において
、リンカーは、Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysによるアミノ酸配列を含み、ここで、Xaaは任意のア
ミノ酸であり、又はある実施態様において、Xaaはプロリン以外の任意のアミノ酸であり
、Ser/Thr/Cysはセリン、トレオニン、又はシステインである。ある実施態様において、
リンカーは、アミノ酸配列Asn-Ala-Serを含む。ある実施態様において、リンカーは、グ
リコシル化配列である。ある実施態様において、リンカーは、Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysによ
るアミノ酸配列であり、ここで、Xaaは任意のアミノ酸であり、又はある実施態様におい
て、Xaaはプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ser/Thr/Cysはセリン、トレオニン、又
はシステインである。ある実施態様において、リンカーは、アミノ酸配列Asn-Ala-Serで
ある。
【０２９７】
ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、天
然のインフルエンザ血球凝集素のステムドメインの三次元構造と類似している三次元構造
を形成することができる。構造類似性は、当業者によって好適であると考えられる任意の
技術に基づいて評価することができる。例えば、インフルエンザ血球凝集素ステムドメイ
ンポリペプチドと、天然のインフルエンザ血球凝集素を認識する中和抗体又は抗血清との
、例えば、非変性条件下での反応は、構造類似性を示すことができる。有用な中和抗体又
は抗血清は、例えば、Suiらの文献(2009, Nat. Struct. Mol. Biol. 16(3):265-273)、Ek
iertらの文献(2009年2月26日、Science[DOI: 10.1126/science. 1171491])、及びKashyap
らの文献(2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(16):5986-5991)に記載されており、そ
の内容は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる。ある実施態様において、抗
体又は抗血清は、血球凝集素の三次構造又は四次構造によって形成される非隣接(すなわ
ち、一次配列で隣接していない)エピトープと反応する抗体又は抗血清である。
【０２９８】
ある実施態様において、構造類似性は、分光技術、例えば、円二色性、ラマン分光法、
NMR、3D NMR、及びX線結晶学によって評価することができる。X線結晶学で決定された公
知のインフルエンザ血球凝集素構造は、限定されないが、1HGJ(HA H3N2株)及び1RUZ(HA H
1N1株)を含む、タンパク質データバンクファイルの構造座標に記載されている。
【０２９９】
ある実施態様において、構造類似性は、2つの構造の対応する重畳部分間のRMS偏差によ
って評価される。意味のある重畳を生じさせるために、ある実施態様において、少なくと
も20個の対応する原子、25個の対応する原子、30個の対応する原子、40個の対応する原子
、50個の対応する原子、60個の対応する原子、70個の対応する原子、80個の対応する原子
、90個の対応する原子、100個の対応する原子、120個の対応する原子、150個の対応する
原子、200個の対応する原子、又は250個の対応する原子の座標を用いて、RMS偏差を計算
する。
【０３００】
ある実施態様において、アミノ酸骨格中の全ての対応する原子の座標を用いて、RMS偏
差を計算する。ある実施態様において、アミノ酸骨格中の全ての対応するアルファ炭素原
子の座標を用いて、RMS偏差を計算する。ある実施態様において、側鎖を含む全ての対応
する同一残基の座標を用いて、RMS偏差を計算する。
【０３０１】
ある実施態様において、HA1のN末端セグメント中の対応する原子の全て又は一部の座標
を用いて、RMS偏差を計算する。ある実施態様において、HA1のC末端セグメント中の対応
する原子の全て又は一部の座標を用いて、RMS偏差を計算する。ある実施態様において、H
A1のN末端セグメントとC末端セグメントの両方における対応する原子の全て又は一部の座
標を用いて、RMS偏差を計算する。ある実施態様において、HA2ドメイン中の対応する原子
の全て又は一部の座標を用いて、RMS偏差を計算する。
【０３０２】
ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドと公知
のA型インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメイン(例えば、1HGJ又は1RUZ由来)の
対応する部分の構造間のRMS偏差は、5Å以下、4Å以下、3Å以下、2.5Å以下、2Å以下、
1.5Å以下、1Å以下、0.75Å以下、0.5Å以下、0.3Å以下、0.2Å以下、又は0.1Å以下で
ある。市販又はオープンソースのソフトウェアを用いて、構造的重畳及び/又はRMS偏差の
計算を実施してもよい。有用な例としては、Pymol(Delano Scientific LLC)、InsightII
及びQuanta(両方ともAccelrys製)、MIDAS(University of California, San Francisco)、
SwissPDB viewer(Swiss Institute of Bioinformatics)、TOPOFIT(Northeastern Univers
ity)、CBSU LOOPP(Cornell University)、及びSuperPose(University of Alberta, Edmon
ton)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０３】
ある実施態様において、本明細書に提供される任意のインフルエンザ血球凝集素ステム
ドメインポリペプチドは、当業者に好適であると考えられる1以上のポリペプチドドメイ
ンをさらに含むことができる。有用なポリペプチドドメインとしては、ポリペプチドの部
分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインが挙げられる。例えば、Hi
sタグ
【化１２】
2020096604.tif 000044
FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書に提供されるポリペプチドの精製を容易
にすることができる。いくつかの実施態様において、Hisタグは、配列(His)nを有し、こ
こで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、
又はそれより大きい。バクテリオファージT4フィブリチン由来のフォルドンドメイン、又
は三量体化ドメインは、本明細書に提供されるポリペプチドの三量体化を容易にすること
ができる。いくつかの実施態様において、三量体化ドメインは、三量体又は四量体コイル
ドコイルの形成を可能にする野生型GCN4pII三量体化ヘプタッド反復又は修飾されたGCN4p
II三量体化ヘプタッド反復を含む。例えば、Weldonらの文献(2010, PLoSONE 5(9): e1246
6)を参照されたい。フォルドンドメインは、当業者に公知の任意のフォルドン配列を有す
ることができる(例えば、Papanikolopoulouらの文献(2004, J. Biol. Chem. 279(10):899
1-8998)を参照されたく、その内容は引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる)。
例としては、
【化１３】
2020096604.tif 000045
が挙げられる。フォルドンドメインは、本明細書に提供される可溶性ポリペプチドの三量
体化を容易にするのに有用であることができる。切断部位を用いて、ポリペプチドの一部
の切断、例えば、精製タグもしくはフォルドンドメイン又は両方の切断を容易にすること
ができる。有用な切断部位としては、トロンビン切断部位、例えば、配列
【化１４】
2020096604.tif 000046
を有するものが挙げられる。ある実施態様において、切断部位は、タバコエッチ病ウイル
ス(TEV)プロテアーゼによって認識される切断部位(例えば、アミノ酸配列Glu-Asn-Leu-Ty
r-Phe-Gln-(Gly/Ser))である。
【０３０４】
ある実施態様において、提供されるのは、エラスターゼ切断部位を含むインフルエンザ
血球凝集素ステムドメインポリペプチドである。当業者は、血球凝集素配列中のHA1-HA2
切断部位のアルギニン又はリジンの代わりにバリンを使用することによって、HA1とHA2の
連結部のトリプシン切断部位をエラスターゼ切断部位に突然変異させることができること
を認識しているであろう(例えば、Stechらの文献(2005, Nature Med. 11(6):683-689)を
参照されたい)。したがって、本明細書に提供されるのは、C末端ステムセグメントのC末
端(すなわち、HA1ドメインのC末端)にバリン置換を有するインフルエンザ血球凝集素ステ
ムドメインポリペプチドである。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、
配列番号50〜65又は158〜159のいずれかを含むインフルエンザ血球凝集素ステムドメイン
ポリペプチドであり、ここで、配列番号50〜65又は158〜159のC末端アミノ酸残基、例え
ば、アルギニン又はリジンは、バリン残基と置換されている。
【０３０５】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1とHA2の接合部でのプロテアー
ゼ切断に対して抵抗性があると予測されるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリ
ペプチドである。当業者は、HA1とHA2にまたがるArg-Gly配列がトリプシンの認識部位で
あり、かつ通常、血球凝集素活性化のために切断されることを認識すべきである。本明細
書に記載のステムドメインポリペプチドは活性化される必要がないので、本明細書に提供
されるのは、プロテアーゼ切断に対して抵抗性があると予測されるインフルエンザ血球凝
集素ステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供される
のは、HA1とHA2にまたがるプロテアーゼ部位をプロテアーゼ切断に対して抵抗性がある配
列に突然変異させている、本明細書に記載の任意のインフルエンザ血球凝集素ステムドメ
インポリペプチドである。ある実施態様において、提供されるのは、HA1のC末端ステムセ
グメントのC末端残基がLys又はArg以外の任意の残基である、本明細書に記載の任意のイ
ンフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、提
供されるのは、HA2ドメインのN末端残基がプロリンである、本明細書に記載の任意のイン
フルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、提供
されるのは、HA1のC末端ステムセグメントのC末端残基がAlaであり、HA2ドメインのN末端
残基もAlaである、本明細書に記載の任意のインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポ
リペプチドである。
【０３０６】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端ステムセグメントがリ
ンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端ステムセグ
メントに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチ
ドである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端ステムセグメ
ントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、さらに
HA2ステムドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメイ
ンポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、シグナルペ
プチドがHA1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1
のC末端ステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合したものか
らなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドである。
【０３０７】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端ステムセグメントがリ
ンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端ステムセグ
メントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合したものからなるインフルエン
ザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提
供されるのは、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端
ステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔
ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプ
チドである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、シグナルペプチドがHA
1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端ステ
ムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメ
インに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド
である。
【０３０８】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端ステムセグメントがリ
ンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端ステムセグ
メントに共有結合し、それがプロテアーゼ切断部位、三量体化ドメイン、及び精製タグに
順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドで
ある。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端ステムセグメント
がリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、さらにHA2
ステムドメインに共有結合し、それが切断部位、三量体化ドメイン、及び精製タグに順に
共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドである
。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、シグナルペプチドがHA1のN末端ス
テムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端ステムセグメン
トに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがプロテアーゼ切断部位
、三量体化ドメイン、及び精製タグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球
凝集素ステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、プロテアーゼ切断部
位は、トロンビン切断部位である。ある実施態様において、切断部位は、アミノ酸配列
【化１５】
2020096604.tif 000047
を有する。ある実施態様において、切断部位は、タバコエッチ病ウイルス(TEV)プロテア
ーゼによって認識される切断部位(例えば、アミノ酸配列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/
Ser))である。ある実施態様において、三量体化ドメインは、フォルドンドメインである
。いくつかの実施態様において、三量体化ドメインは、三量体又は四量体コイルドコイル
の形成を可能にする野生型GCN4pII三量体化ヘプタッド反復又は修飾されたGCN4pII三量体
化ヘプタッド反復を含む。例えば、Weldonらの文献(2010, PLoSONE 5(9): e12466)を参照
されたい。いくつかの実施態様において、精製タグは、配列(His)nを有するHisタグであ
り、ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19
、20、又はそれより大きい。
【０３０９】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端ステムセグメントがリ
ンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端ステムセグ
メントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それが切断部位、三量体化
ドメイン、及び精製タグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステ
ムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA
1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端ステムセグメント
に共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結
合し、それが切断部位、三量体化ドメイン、及び精製タグに順に共有結合したものからな
るインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において
、本明細書に提供されるのは、シグナルペプチドがHA1のN末端ステムセグメントに共有結
合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、さらに
HA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それが切断部位
、三量体化ドメイン、及び精製タグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球
凝集素ステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、プロテアーゼ切断部
位は、トロンビン切断部位である。ある実施態様において、切断部位は、アミノ酸配列
【化１６】
2020096604.tif 000048
を有する。ある実施態様において、切断部位は、タバコエッチ病ウイルス(TEV)プロテア
ーゼによって認識される切断部位(例えば、アミノ酸配列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/
Ser))である。ある実施態様において、三量体化ドメインは、フォルドンドメインである
。いくつかの実施態様において、三量体化ドメインは、三量体又は四量体コイルドコイル
の形成を可能にする野生型GCN4pII三量体化ヘプタッド反復又は修飾されたGCN4pII三量体
化ヘプタッド反復を含む。例えば、Weldonらの文献(2010, PLoSONE 5(9): e12466)を参照
されたい。いくつかの実施態様において、精製タグは、配列(His)nを有するHisタグであ
り、ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19
、20、又はそれより大きい。
【０３１０】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端ステムセグメントがリ
ンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端ステムセグ
メントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメ
インに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド
である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端ステムセグメン
トがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、さらにHA
2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2
膜貫通ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポ
リペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、シグナルペプチ
ドがHA1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末
端ステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内
腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合したものからなる
インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドである。
【０３１１】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端ステムセグメントがリ
ンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端ステムセグ
メントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメ
インに共有結合し、それがさらにHA2細胞質ドメインに共有結合したものからなるインフ
ルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、本明細
書に提供されるのは、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1
のC末端ステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それが
HA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合し、それがさ
らにHA2細胞質ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステムド
メインポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、シグナ
ルペプチドがHA1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらに
HA1のC末端ステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、そ
れがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合し、それ
がさらにHA2細胞質ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素ステ
ムドメインポリペプチドである。
【０３１２】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号34)-LL-(配列番号50)-(配列番号66)、
(配列番号35)-LL-(配列番号51)-(配列番号67)、
(配列番号36)-LL-(配列番号52)-(配列番号68)、
(配列番号37)-LL-(配列番号53)-(配列番号69)、
(配列番号38)-LL-(配列番号54)-(配列番号70)、
(配列番号39)-LL-(配列番号55)-(配列番号71)、
(配列番号40)-LL-(配列番号56)-(配列番号72)、
(配列番号41)-LL-(配列番号57)-(配列番号73)、
(配列番号42)-LL-(配列番号58)-(配列番号74)、
(配列番号43)-LL-(配列番号59)-(配列番号75)、
(配列番号44)-LL-(配列番号60)-(配列番号76)、
(配列番号45)-LL-(配列番号61)-(配列番号77)、
(配列番号46)-LL-(配列番号62)-(配列番号78)、
(配列番号47)-LL-(配列番号63)-(配列番号79)、
(配列番号48)-LL-(配列番号64)-(配列番号80)、及び
(配列番号49)-LL-(配列番号65)-(配列番号81)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドであり、
ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは
本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有
結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様において、LLは、直接結合
、Gly、Gly-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly、(Gly)n(ここで、nは、ペプチドリンカ
ーに柔軟性がある限り、任意の数のグリシン残基を示し;ある実施態様において、nは、2
つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又は7つのグリシン残基である)、Gly-Pro、
【化１７】
2020096604.tif 000049
からなる群から選択される。
【０３１３】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号34)-LL-(配列番号50)-(配列番号82)、
(配列番号35)-LL-(配列番号51)-(配列番号83)、
(配列番号36)-LL-(配列番号52)-(配列番号84)、
(配列番号37)-LL-(配列番号53)-(配列番号85)、
(配列番号38)-LL-(配列番号54)-(配列番号86)、
(配列番号39)-LL-(配列番号55)-(配列番号87)、
(配列番号40)-LL-(配列番号56)-(配列番号88)、
(配列番号41)-LL-(配列番号57)-(配列番号89)、
(配列番号42)-LL-(配列番号58)-(配列番号90)、
(配列番号43)-LL-(配列番号59)-(配列番号91)、
(配列番号44)-LL-(配列番号60)-(配列番号92)、
(配列番号45)-LL-(配列番号61)-(配列番号93)、
(配列番号46)-LL-(配列番号62)-(配列番号94)、
(配列番号47)-LL-(配列番号63)-(配列番号95)、
(配列番号48)-LL-(配列番号64)-(配列番号96)、及び
(配列番号49)-LL-(配列番号65)-(配列番号97)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドであり、
ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは
本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有
結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様において、LLは、直接結合
、
【化１８】
2020096604.tif 000050
からなる群から選択される。
【０３１４】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号34)-LL-(配列番号50)-(配列番号82)-(配列番号98)、
(配列番号35)-LL-(配列番号51)-(配列番号83)-(配列番号99)、
(配列番号36)-LL-(配列番号52)-(配列番号84)-(配列番号100)、
(配列番号37)-LL-(配列番号53)-(配列番号85)-(配列番号101)、
(配列番号38)-LL-(配列番号54)-(配列番号86)-(配列番号102)、
(配列番号39)-LL-(配列番号55)-(配列番号87)-(配列番号103)、
(配列番号40)-LL-(配列番号56)-(配列番号88)-(配列番号104)、
(配列番号41)-LL-(配列番号57)-(配列番号89)-(配列番号105)、
(配列番号42)-LL-(配列番号58)-(配列番号90)-(配列番号106)、
(配列番号43)-LL-(配列番号59)-(配列番号91)-(配列番号107)、
(配列番号44)-LL-(配列番号60)-(配列番号92)-(配列番号108)、
(配列番号45)-LL-(配列番号61)-(配列番号93)-(配列番号109)、
(配列番号46)-LL-(配列番号62)-(配列番号94)-(配列番号110)、
(配列番号47)-LL-(配列番号63)-(配列番号95)-(配列番号111)、
(配列番号48)-LL-(配列番号64)-(配列番号96)-(配列番号112)、及び
(配列番号49)-LL-(配列番号65)-(配列番号97)-(配列番号113)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドであり、
ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは
本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有
結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様において、LLは、直接結合
、
【化１９】
2020096604.tif 000051
からなる群から選択される。
【０３１５】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号34)-LL-(配列番号50)-(配列番号82)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号1
66)、
(配列番号35)-LL-(配列番号51)-(配列番号83)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号1
66)、
(配列番号36)-LL-(配列番号52)-(配列番号84)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号1
66)、
(配列番号37)-LL-(配列番号53)-(配列番号85)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号1
66)、
(配列番号38)-LL-(配列番号54)-(配列番号86)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号1
66)、
(配列番号39)-LL-(配列番号55)-(配列番号87)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号1
66)、
(配列番号40)-LL-(配列番号56)-(配列番号88)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号1
66)、
(配列番号41)-LL-(配列番号57)-(配列番号89)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号1
66)、
(配列番号42)-LL-(配列番号58)-(配列番号90)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号1
66)、
(配列番号43)-LL-(配列番号59)-(配列番号91)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号1
66)、
(配列番号44)-LL-(配列番号60)-(配列番号92)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号1
66)、
(配列番号45)-LL-(配列番号61)-(配列番号93)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号1
66)、
(配列番号46)-LL-(配列番号62)-(配列番号94)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号1
66)、
(配列番号47)-LL-(配列番号63)-(配列番号95)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号1
66)、
(配列番号48)-LL-(配列番号64)-(配列番号96)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号1
66)、及び
(配列番号49)-LL-(配列番号65)-(配列番号97)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号1
66)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドであり、
ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは
本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有
結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様において、LLは、直接結合
、  
【化２０】
2020096604.tif 000052
からなる群から選択される。
【０３１６】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号34)-LL-(配列番号50)-(配列番号82)-(配列番号98)-(配列番号168)-(配列番号16
7)-(配列番号166)、
(配列番号35)-LL-(配列番号51)-(配列番号83)-(配列番号99)-(配列番号168)-(配列番号16
7)-(配列番号166)、
(配列番号36)-LL-(配列番号52)-(配列番号84)-(配列番号100)-(配列番号168)-(配列番号1
67)-(配列番号166)、
(配列番号37)-LL-(配列番号53)-(配列番号85)-(配列番号101)-(配列番号168)-(配列番号1
67)-(配列番号166)、
(配列番号38)-LL-(配列番号54)-(配列番号86)-(配列番号102)-(配列番号168)-(配列番号1
67)-(配列番号166)、
(配列番号39)-LL-(配列番号55)-(配列番号87)-(配列番号103)-(配列番号168)-(配列番号1
67)-(配列番号166)、
(配列番号40)-LL-(配列番号56)-(配列番号88)-(配列番号104)-(配列番号168)-(配列番号1
67)-(配列番号166)、
(配列番号41)-LL-(配列番号57)-(配列番号89)-(配列番号105)-(配列番号168)-(配列番号1
67)-(配列番号166)、
(配列番号42)-LL-(配列番号58)-(配列番号90)-(配列番号106)-(配列番号168)-(配列番号1
67)-(配列番号166)、
(配列番号43)-LL-(配列番号59)-(配列番号91)-(配列番号107)-(配列番号168)-(配列番号1
67)-(配列番号166)、
(配列番号44)-LL-(配列番号60)-(配列番号92)-(配列番号108)-(配列番号168)-(配列番号1
67)-(配列番号166)、
(配列番号45)-LL-(配列番号61)-(配列番号93)-(配列番号109)-(配列番号168)-(配列番号1
67)-(配列番号166)、
(配列番号46)-LL-(配列番号62)-(配列番号94)-(配列番号110)-(配列番号168)-(配列番号1
67)-(配列番号166)、
(配列番号47)-LL-(配列番号63)-(配列番号95)-(配列番号111)-(配列番号168)-(配列番号1
67)-(配列番号166)、
(配列番号48)-LL-(配列番号64)-(配列番号96)-(配列番号112)-(配列番号168)-(配列番号1
67)-(配列番号166)、及び
(配列番号49)-LL-(配列番号65)-(配列番号97)-(配列番号113)-(配列番号168)-(配列番号1
67)-(配列番号166)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドであり、
ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは
本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有
結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様において、LLは、直接結合
、  
【化２１】
2020096604.tif 000053
からなる群から選択される。
【０３１７】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号177)-LL-(配列番号226)-(配列番号66)、
(配列番号178)-LL-(配列番号227)-(配列番号66)、
(配列番号179)-LL-(配列番号228)-(配列番号66)、
(配列番号180)-LL-(配列番号229)-(配列番号67)、
(配列番号181)-LL-(配列番号230)-(配列番号67)、
(配列番号182)-LL-(配列番号231)-(配列番号67)、
(配列番号183)-LL-(配列番号232)-(配列番号68)、
(配列番号184)-LL-(配列番号233)-(配列番号68)、
(配列番号185)-LL-(配列番号234)-(配列番号68)、
(配列番号186)-LL-(配列番号235)-(配列番号69)、
(配列番号187)-LL-(配列番号236)-(配列番号69)、
(配列番号188)-LL-(配列番号237)-(配列番号69)、
(配列番号189)-LL-(配列番号238)-(配列番号70)、
(配列番号190)-LL-(配列番号239)-(配列番号70)、
(配列番号191)-LL-(配列番号240)-(配列番号70)、
(配列番号192)-LL-(配列番号241)-(配列番号71)、
(配列番号193)-LL-(配列番号242)-(配列番号71)、
(配列番号194)-LL-(配列番号243)-(配列番号71)、
(配列番号195)-LL-(配列番号244)-(配列番号72)、
(配列番号196)-LL-(配列番号245)-(配列番号72)、
(配列番号197)-LL-(配列番号246)-(配列番号72)、
(配列番号198)-LL-(配列番号247)-(配列番号73)、
(配列番号199)-LL-(配列番号248)-(配列番号73)、
(配列番号200)-LL-(配列番号249)-(配列番号73)、
(配列番号201)-LL-(配列番号250)-(配列番号74)、
(配列番号202)-LL-(配列番号251)-(配列番号74)、
(配列番号203)-LL-(配列番号252)-(配列番号74)、
(配列番号204)-LL-(配列番号253)-(配列番号75)、
(配列番号205)-LL-(配列番号254)-(配列番号75)、
(配列番号206)-LL-(配列番号255)-(配列番号75)、
(配列番号207)-LL-(配列番号256)-(配列番号76)、
(配列番号208)-LL-(配列番号257)-(配列番号76)、
(配列番号209)-LL-(配列番号258)-(配列番号76)、
(配列番号210)-LL-(配列番号259)-(配列番号77)、
(配列番号211)-LL-(配列番号260)-(配列番号77)、
(配列番号212)-LL-(配列番号261)-(配列番号77)、
(配列番号213)-LL-(配列番号262)-(配列番号78)、
(配列番号214)-LL-(配列番号263)-(配列番号78)、
(配列番号215)-LL-(配列番号264)-(配列番号78)、
(配列番号216)-LL-(配列番号265)-(配列番号79)、
(配列番号217)-LL-(配列番号266)-(配列番号79)、
(配列番号218)-LL-(配列番号267)-(配列番号79)、
(配列番号219)-LL-(配列番号268)-(配列番号80)、
(配列番号220)-LL-(配列番号269)-(配列番号80)、
(配列番号221)-LL-(配列番号270)-(配列番号80)、
(配列番号222)-LL-(配列番号271)-(配列番号81)、
(配列番号223)-LL-(配列番号272)-(配列番号81)、
(配列番号224)-LL-(配列番号273)-(配列番号81)、
(配列番号312)-LL-(配列番号313)-(配列番号66)、
(配列番号34)-LL-(配列番号314)-(配列番号66)、
(配列番号315)-LL-(配列番号316)-(配列番号66)、
(配列番号308)-LL-(配列番号52)-(配列番号68)、
(配列番号36)-LL-(配列番号309)-(配列番号68)、及び
(配列番号310)-LL-(配列番号311)-(配列番号68)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドであり、
ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは
本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有
結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様において、LLは、直接結合
、  
【化２２】
2020096604.tif 000054
からなる群から選択される。
【０３１８】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号154)-LL-(配列番号158)-(配列番号160)、
(配列番号155)-LL-(配列番号159)-(配列番号160)、
(配列番号156)-LL-(配列番号158)-(配列番号160)、
(配列番号157)-LL-(配列番号158)-(配列番号160)、
(配列番号550)-LL-(配列番号553)-(配列番号160)、
(配列番号551)-LL-(配列番号554)-(配列番号160)、及び
(配列番号552)-LL-(配列番号555)-(配列番号160)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドであり、
ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは
本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有
結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様において、LLは、直接結合
、  
【化２３】
2020096604.tif 000055
からなる群から選択される。
【０３１９】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号154)-LL-(配列番号158)-(配列番号161)、
(配列番号155)-LL-(配列番号159)-(配列番号161)、
(配列番号156)-LL-(配列番号158)-(配列番号161)、
(配列番号157)-LL-(配列番号158)-(配列番号161)、
(配列番号550)-LL-(配列番号553)-(配列番号161)、
(配列番号551)-LL-(配列番号554)-(配列番号161)、
(配列番号552)-LL-(配列番号555)-(配列番号161)、及び
(配列番号555)-LL-(配列番号556)-LL-(配列番号557)-(配列番号161)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドであり、
ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは
本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有
結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様において、LLは、直接結合
、  
【化２４】
2020096604.tif 000056
からなる群から選択される。
【０３２０】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号154)-LL-(配列番号158)-(配列番号161)-(配列番号162)、
(配列番号155)-LL-(配列番号159)-(配列番号161)-(配列番号162)、
(配列番号156)-LL-(配列番号158)-(配列番号161)-(配列番号162)、
(配列番号157)-LL-(配列番号158)-(配列番号161)-(配列番号162)、
(配列番号550)-LL-(配列番号553)-(配列番号161)-(配列番号162)、
(配列番号551)-LL-(配列番号554)-(配列番号161)-(配列番号162)、
(配列番号552)-LL-(配列番号555)-(配列番号161)-(配列番号162)、及び
(配列番号555)-LL-(配列番号556)-LL-(配列番号557)-(配列番号161)-(配列番号162)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドであり、
ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは
本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有
結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様において、LLは、直接結合
、  
【化２５】
2020096604.tif 000057
からなる群から選択される。
【０３２１】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号154)-LL-(配列番号158)-(配列番号161)-(配列番号168)-(配列番号167)-配列番
号166)、
(配列番号155)-LL-(配列番号159)-(配列番号161)-(配列番号168)-(配列番号167)-配列番
号166)、
(配列番号156)-LL-(配列番号158)-(配列番号161)-(配列番号168)-(配列番号167)-配列番
号166)、
(配列番号157)-LL-(配列番号159)-(配列番号161)-(配列番号168)-(配列番号167)-配列番
号166)、
(配列番号550)-LL-(配列番号553)- )-(配列番号161)-(配列番号168)-(配列番号167)-配列
番号166)、
(配列番号551)-LL-(配列番号554)-(配列番号161)-(配列番号168)-(配列番号167)-配列番
号166)、
(配列番号552)-LL-(配列番号555)-(配列番号161)-(配列番号168)-(配列番号167)-配列番
号166)、及び
(配列番号555)-LL-(配列番号556)-LL-(配列番号557)-(配列番号161)-(配列番号168)-(配
列番号167)-配列番号166)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドであり、
ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは
本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有
結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様において、LLは、直接結合
、  
【化２６】
2020096604.tif 000058
からなる群から選択される。
【０３２２】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号154)-LL-(配列番号158)-(配列番号161)-(配列番号162)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)、
(配列番号155)-LL-(配列番号159)-(配列番号161)-(配列番号162)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)、
(配列番号156)-LL-(配列番号158)-(配列番号161)-(配列番号162)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)、及び
(配列番号157)-LL-(配列番号159)-(配列番号161)-(配列番号162)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)、
(配列番号550)-LL-(配列番号553)-(配列番号161)-(配列番号162)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)、
(配列番号551)-LL-(配列番号554)-(配列番号161)-(配列番号162)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)、
(配列番号552)-LL-(配列番号555)-(配列番号161)-(配列番号162)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)、及び
(配列番号555)-LL-(配列番号556)-LL-(配列番号557)-(配列番号161)-(配列番号162)-(配
列番号168)-(配列番号167)-(配列番号166)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドであり、
ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつここで、LLは
本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ドメインに共有
結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様において、LLは、直接結合
、  
【化２７】
2020096604.tif 000059
からなる群から選択される。
【０３２３】
ある実施態様において、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、
【化２８】
2020096604.tif 000060
のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含まない。ある実施態様において、本
明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、
【化２９】
2020096604.tif 000061
のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含まない。ある実施態様において、本明細書に記
載のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、
【化３０】
2020096604.tif 000062
のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含まない。ある実施態様において、本
明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、
【化３１】
2020096604.tif 000063
のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含まない。ある実施態様において、本明細書に記
載のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、
【化３２】
2020096604.tif 000064
のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含まない。ある実施態様において、本
明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、
【化３３】
2020096604.tif 000065
のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含まない。
【０３２４】
ある実施態様において、本明細書に記載のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、
抗体CR6261、CR6325、CR6329、CR6307、CR6323、2A、D7、D8、F10、G17、H40、A66、D80
、E88、E90、H98、C179(ハイブリドーマFERM BP-4517により産生される;Takara Bio社(Ot
su, Shiga, Japan)により販売されているクローン)、AI3C(FERM BP-4516)、Ekiert DCら
の文献(2009)、高度に保存されたインフルエンザウイルスエピトープの抗体認識(Antibod
y Recognition of a Highly Conserved Influenza Virus Epitope.) Science(2009年2月2
6日のScience Expressで発表された); Kashyapらの文献(2008)に記載の任意の他の抗体、
又は任意の他の同様の抗体によって認識されない。
【０３２５】
(5.3.1  インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチド)
ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、イ
ンフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドである。本明細書に提供され
るインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドの典型的な一次構造は、
以下の順序で:HA1のN末端ステムセグメント、リンカー、HA1のC末端の短いステムセグメ
ント、及びHA2を含む。一次配列は、単一のポリペプチドによって形成されることができ
るか、又はそれは、複数のポリペプチドによって形成されることができる。通常、単一の
ポリペプチドは、当業者に好適であると考えられる任意の技術によって発現される。単一
のポリペプチドの実施態様において、HA1セグメントとHA2は三次結合している。当業者に
公知であるように、単一のHAポリペプチドは、例えば、プロテアーゼによって、適当な発
現条件下で切断され、四次結合した2つのポリペプチドを生じさせることができる。切断
は、通常、HA1のC末端の短いステムセグメントとHA2の間である。ある実施態様において
、本明細書に提供されるのは、複数のポリペプチドである。複数のポリペプチドの実施態
様において、HA1セグメントとHA2は四次結合している。
【０３２６】
ある実施態様において、本明細書に提供されるインフルエンザ血球凝集素の短いステム
ドメインポリペプチドは単量体である。ある実施態様において、本明細書に提供されるイ
ンフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは多量体である。ある実施態
様において、本明細書に提供されるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリ
ペプチドは三量体である。当業者は、天然のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドがイ
ンビボで三量体化することができること、及び本明細書に提供される特定のインフルエン
ザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドが三量体化することができることを認識
しているであろう。下記の特定の実施態様において、本明細書に提供されるインフルエン
ザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは、三量体化を容易にする三量体化ドメ
インを含む。
【０３２７】
ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチド
は、シグナルペプチドを含む。通常、シグナルペプチドは、ポリペプチド発現及び翻訳時
又はその後に切断され、成熟したインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペ
プチドを生じさせる。シグナルペプチドは、インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメ
インポリペプチドの発現に有利であることができる。ある実施態様において、同じく本明
細書に提供されるのは、シグナルペプチドを欠く成熟したインフルエンザ血球凝集素の短
いステムドメインポリペプチドである。
【０３２８】
インフルエンザ血球凝集素HA2は、通常、ステムドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞
質ドメインを含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA2ステムドメ
イン、HA2内腔ドメイン、HA2膜貫通ドメイン、及びHA2細胞質ドメインを含むインフルエ
ンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、本明
細書に提供されるのは、HA2ステムドメイン、HA2内腔ドメイン、及びHA2膜貫通ドメイン
を含むが、典型的な細胞質ドメインの一部又は全てを欠くインフルエンザ血球凝集素の短
いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供されるの
は、HA2ステムドメイン及びHA2内腔ドメインを含むが、HA2膜貫通ドメインとHA2細胞質ド
メインの両方を欠くインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドである
。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA2ステムドメインを含むが、HA2
内腔ドメイン、HA2膜貫通ドメイン、及びHA2細胞質ドメインを欠くインフルエンザ血球凝
集素の短いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、インフルエンザ
血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは、当業者に公知のインフルエンザHA2ス
テムドメインとの少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％のア
ミノ酸配列同一性を有するHA2ステムドメインを含む。公知のA型インフルエンザ及びB型
インフルエンザ血球凝集素由来の例示的な公知のHA2ステムドメインは、上の表に提供さ
れている。
【０３２９】
同じく本明細書に提供されるのは、最大100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、5
0、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基
がHA2ステムドメインの一方又は両方の末端から欠失している欠失型のHA2ステムドメイン
を含むインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドである。さらに本明
細書に提供されるのは、最大100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、3
5、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基が他のアミノ
酸と保存的に置換されている改変型のHA2ステムドメインを含むインフルエンザ血球凝集
素の短いステムドメインポリペプチドである。さらに提供されるのは、欠失した及び改変
されたHA2ステムドメインを含むインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペ
プチドである。
【０３３０】
HA1のN末端ステムセグメントは、本明細書に提供される任意のHA1のN末端ステムである
ことができる。例示的な公知のHA1のN末端ステムセグメントは、下の表に提供されている
。
【０３３１】
HA1のC末端の短いステムセグメントは、本明細書に提供される定義に基づいて当業者に
より認識される任意のHA1のC末端の短いステムセグメントであることができる。通常、HA
1のC末端の短いステムセグメントは、HA1の約305番目の残基(H3付番を使用)の配列に位置
するシステイン残基からHA1のC末端アミノ酸までからなるポリペプチドに対応する。本明
細書でBqと称される、このシステイン残基は、HA1のN末端ステムセグメント中のシステイ
ン残基Apに連結されることができる。17個の代表的なA型インフルエンザ血球凝集素の配
列が図1に示されており、残基Bqが各々で特定されている。
【０３３２】
ある実施態様において、HA1のC末端の短いステムセグメントは、Bq(例えば、H3血球凝
集素由来のHA1サブユニットのCys305)から始まるのではなく、配列上及び構造上Bqに近い
残基から始まる。例えば、ある実施態様において、HA1のC末端の短いステムセグメントは
、Bq-1、Bq-2、Bq-3、Bq-4、Bq-5、Bq-6、Bq-7、Bq-8、Bq-9、Bq-10、Bq-11、Bq-12、Bq-
13、Bq-14、Bq-15、Bq-20、Bq-25、Bq-30、Bq-35、Bq-40、Bq-45、Bq-50、Bq-55、Bq-60
、Bq-65、Bq-70、Bq-75、又はBq-80から始まる。他の実施態様において、HA1のC末端の短
いステムセグメントは、Bq+1、Bq+2、Bq+3、Bq+4、Bq+5、Bq+6、Bq+7、Bq+8、Bq+9、又は
Bq+10から始まる。HA1のN末端ステムセグメントの終点は、得られるHA1ステムドメインが
、下記のように、インフルエンザ血球凝集素と類似した三次元構造を形成することができ
るように、HA1のC末端の短いステムセグメント及びリンカーの始点との関連で選択される
べきである。
【０３３３】
ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチド
は、当業者に公知のインフルエンザHA1のC末端の短いステムセグメントとの少なくとも70
％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％のアミノ酸配列同一性を有するHA1
のC末端の短いステムセグメントを含む。例示的な公知のHA1のC末端の短いステムセグメ
ントは、下の表に提供されている。
【０３３４】
ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp-1であり、C末端の短いステ
ムセグメントの始点はBq-1である。ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終
点はAp-2であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq-2である。ある実施態様にお
いて、N末端ステムセグメントの終点はAp-3であり、C末端の短いステムセグメントの始点
はBq-3である。ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp-4であり、C末
端の短いステムセグメントの始点はBq-4である。ある実施態様において、N末端ステムセ
グメントの終点はAp-5であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq-5である。
【０３３５】
ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp+1であり、C末端の短いステ
ムセグメントの始点はBq+1である。ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終
点はAp+2であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq+2である。ある実施態様にお
いて、N末端ステムセグメントの終点はAp+3であり、C末端の短いステムセグメントの始点
はBq+3である。ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp+4であり、C末
端の短いステムセグメントの始点はBq+4である。ある実施態様において、N末端ステムセ
グメントの終点はAp+5であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq+5である。
【０３３６】
ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp-1であり、C末端の短いステ
ムセグメントの始点はBq+1である。ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終
点はAp-2であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq+2である。ある実施態様にお
いて、N末端ステムセグメントの終点はAp-3であり、C末端の短いステムセグメントの始点
はBq+3である。ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp-4であり、C末
端の短いステムセグメントの始点はBq+4である。ある実施態様において、N末端ステムセ
グメントの終点はAp-5であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq+5である。
【０３３７】
ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はApであり(すなわち、N末端ス
テムセグメントの終点はシステインであり)、C末端ステムセグメントの始点はAqである(
すなわち、C末端ステムセグメントの始点はシステインである)。ある実施態様において、
N末端ステムセグメントの終点はAp+1であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq-1
である。ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp+2であり、C末端の短
いステムセグメントの始点はBq-2である。ある実施態様において、N末端ステムセグメン
トの終点はAp+3であり、C末端の短いステムセグメントの始点はBq-3である。ある実施態
様において、N末端ステムセグメントの終点はAp+4であり、C末端の短いステムセグメント
の始点はBq-4である。ある実施態様において、N末端ステムセグメントの終点はAp+5であ
り、C末端の短いステムセグメントの始点はBq-5である。
【０３３８】
同じく本明細書に提供されるのは、最大100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、5
0、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基
がHA1のC末端の短いステムセグメントの一方又は両方の末端から欠失している欠失型のHA
1のC末端の短いステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメイン
ポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10個、又はそれより多くの残基が、HA1のC末端の短いステムセグメント
のN末端に付加されている伸張型のHA1のC末端の短いステムセグメントを含むインフルエ
ンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドである。特定の実施態様において、1
つの残基がC末端の短いステムセグメントに付加される場合、1つの残基がN末端ステムセ
グメントに付加され;2つの残基がC末端の短いステムセグメントに付加される場合、2つの
残基がN末端ステムセグメントに付加され;3つの残基がC末端の短いステムセグメントに付
加される場合、3つの残基がN末端ステムセグメントに付加される。さらに本明細書に提供
されるのは、最大100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25
、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基が他のアミノ酸と保存
的に置換されている改変型のHA1のC末端の短いステムセグメントを含むインフルエンザ血
球凝集素の短いステムドメインポリペプチドである。さらに提供されるのは、欠失した及
び改変されたHA1のC末端の短いステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素の短い
ステムドメインポリペプチドである。
【０３３９】
インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは、当業者に公知である
か又は後に発見される任意のインフルエンザ血球凝集素に基づくことができる(すなわち
、上記のように、配列同一性を有することができる)。ある実施態様において、インフル
エンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは、A型インフルエンザ血球凝集素
に基づく。ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリ
ペプチドは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H1
6、及びH17からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施
態様において、インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは、以下で
詳細に記載するように、B型インフルエンザ血球凝集素に基づく。
【０３４０】
HA1のN末端ステムセグメントは、当業者に公知であるか又は後に発見される任意のHA1
のN末端ステムセグメントに基づくことができる(すなわち、上記のように、配列同一性を
有することができる)。ある実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、A型イン
フルエンザHA1のN末端ステムセグメントに基づく。ある実施態様において、HA1のN末端ス
テムセグメントは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H
15、H16、及びH17からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。あ
る実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、配列番号34〜49から選択される。
ある実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、各々1つのアミノ酸がそのC末端
から欠失している、配列番号34〜49から選択される。ある実施態様において、HA1のN末端
ステムセグメントは、各々2つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号34〜49
から選択される。ある実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、各々3つのア
ミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号34〜49から選択される。ある実施態様に
おいて、HA1のN末端ステムセグメントは、各々4つのアミノ酸がそのC末端から欠失してい
る、配列番号34〜49から選択される。ある実施態様において、HA1のN末端ステムセグメン
トは、各々5つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号34〜49から選択される
。ある実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、配列番号177〜224から選択さ
れる。
【０３４１】
HA1のC末端の短いステムセグメントは、当業者に公知であるか又は後に発見される任意
のHA1のC末端の短いステムセグメントに基づくことができる(すなわち、上記のように、
配列同一性を有することができる)。ある実施態様において、HA1のC末端の短いステムセ
グメントは、A型インフルエンザHA1のC末端の短いステムセグメントに基づく。ある実施
態様において、HA1のC末端の短いステムセグメントは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8
、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、及びH17からなる群から選択されるA型イン
フルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様において、HA1のC末端の短いステムセグメ
ントは、配列番号350〜365から選択される。ある実施態様において、HA1のC末端の短いス
テムセグメントは、各々1つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号350〜365
から選択される。ある実施態様において、HA1のC末端の短いステムセグメントは、各々2
つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号350〜365から選択される。ある実
施態様において、HA1のC末端の短いステムセグメントは、各々3つのアミノ酸がそのN末端
から欠失している、配列番号350〜365から選択される。ある実施態様において、HA1のC末
端の短いステムセグメントは、各々4つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番
号350〜365から選択される。ある実施態様において、HA1のC末端の短いステムセグメント
は、各々5つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号350〜365から選択される
。ある実施態様において、HA1のC末端の短いステムセグメントは、配列番号366〜413から
選択される。
【０３４２】
HA2ステムドメインは、当業者に公知であるか、後に発見されるか、又は本明細書に記
載されている任意のHA2ステムドメインに基づくことができる(すなわち、上記のように、
配列同一性を有することができる)。ある実施態様において、HA2ステムドメインは、A型
インフルエンザHA2ステムドメインに基づく。ある実施態様において、HA2ステムドメイン
は、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、及びH
17からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様にお
いて、HA2ステムドメインは、配列番号66〜97から選択される。
【０３４３】
シグナルペプチドを含む実施態様において、シグナルペプチドは、当業者に公知である
か又は本明細書に記載されている任意のインフルエンザシグナルペプチドに基づくことが
できる。ある実施態様において、シグナルペプチドは、A型インフルエンザシグナルペプ
チドに基づく。
【０３４４】
内腔ドメインを含む実施態様において、内腔ドメインは、当業者に公知であるか又は本
明細書に記載されている任意のインフルエンザ内腔ドメインに基づくことができる。
【０３４５】
膜貫通ドメインを含む実施態様において、膜貫通ドメインは、当業者に公知であるか又
は本明細書に記載されている任意のインフルエンザ膜貫通ドメインに基づくことができる
。
【０３４６】
細胞質ドメインを含む実施態様において、細胞質ドメインは、当業者に公知であるか又
は本明細書に記載されている任意のインフルエンザ細胞質ドメインに基づくことができる
。
【０３４７】
ある実施態様において、血球凝集素の短いステムドメイン中のグリコシル化部位の1つ
又は複数を、これらの部位でのグリコシル化がポリペプチドのプロセシング及び成熟の間
に生じないように(例えば、アミノ酸の付加、欠失、又は置換によって)修飾する。当業者
は、インフルエンザHAが、通常、1以上のグリコシル化部位(例えば、Ser/Thr/Cys、ここ
で、Xaaは任意のアミノ酸であり、又はある実施態様において、XaaはProではない)を含む
ことを認識しているであろう。ある実施態様において、グリコシル化配列中の1以上のア
ミノ酸残基を、グリコシル化部位を分断するアミノ酸残基と保存的に置換する。ある実施
態様において、グリコシル化配列中の1以上のアミノ酸残基を、グリコシル化部位を分断
する任意のアミノ酸残基と置換する。ある実施態様において、グリコシル化配列中の1以
上のアスパラギン残基をアラニンと置換する。特定の実施態様において、H3血球凝集素の
位置38のアスパラギンをアラニンに変化させる。ある実施態様において、血球凝集素の短
いステムドメインは、下記の第5.4.1節で論じられているような1以上の修飾されたグリコ
シル化部位を含む。
【０３４８】
下の表6は、A型インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのシグナルペプチド、HA1の末
端ステムセグメント、HA1のC末端の短いステムセグメント、及びHA2ドメインを特定して
いる。これらのシグナルペプチド、ステムセグメント、及びドメインは、本明細書に記載
のポリペプチド及び方法において有用である。
表6.例示的なA型インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインペプチド配列
【表７】
2020096604.tif 000066
2020096604.tif 000067
2020096604.tif 000068
2020096604.tif 000069
2020096604.tif 000070
2020096604.tif 000071
2020096604.tif 000072
2020096604.tif 000073
2020096604.tif 000074
【０３４９】
下の表6Aは、本明細書に記載のポリペプチド及び方法のための有用なHA1のN末端ステム
セグメント及びHA1のC末端の短いステムセグメントを特定している。
表6A.例示的なA型インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインペプチド配列
【表８】
2020096604.tif 000075
2020096604.tif 000076
2020096604.tif 000077
2020096604.tif 000078
2020096604.tif 000079
2020096604.tif 000080
2020096604.tif 000081
2020096604.tif 000082
【０３５０】
ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチド
は、インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの三次構造又は四次構造中に1以上の免疫原
性エピトープを含む。
【０３５１】
ある実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、アミノ酸配列
【化３４】
2020096604.tif 000083
を含み、ここで、
A17は、Y又はHであり;
A18は、H、L、又はQであり;
(Xaa)nは、18〜20アミノ酸残基の配列を表し;かつ
A38は、H、S、Q、T、又はNである。
【０３５２】
ある実施態様において、HA2ドメインは、アミノ酸配列
【化３５】
2020096604.tif 000084
を含み、ここで、
A18は、V又はIであり;
A19は、D、N、又はAであり;
A20は、Gであり、かつ
A21は、Wである。
【０３５３】
ある実施態様において、HA2ドメインは、アミノ酸配列
【化３６】
2020096604.tif 000085
を含み、ここで、
A38は、K、Q、R、L、又はYであり;
A39は、任意のアミノ酸残基であり;
A40は、任意のアミノ酸残基であり;
A41は、Tであり;
A42は、Qであり;
A43は、任意のアミノ酸残基であり;
A44は、Aであり;
A45は、Iであり;
A46は、Dであり;
A47は、任意のアミノ酸残基であり;
A48は、I、V、又はMであり;
A49は、T、Q、又はNであり;
A50は、任意のアミノ酸残基であり;
A51は、Kであり;
A52は、V又はLであり;
A53は、Nであり;
A54は、任意のアミノ酸残基であり;
A55は、V、I、又はLであり;かつ
A56は、V又はIである。
【０３５４】
図1及び2に示すように、HA1のN末端ステムセグメントは、A型インフルエンザとB型イン
フルエンザの間で、さらにA型インフルエンザ亜型にわたって配列同一性を共有する。同
様に、HA1のC末端の短いステムセグメントも、A型インフルエンザとB型インフルエンザの
間で、さらにA型インフルエンザ亜型にわたって配列同一性を共有する。さらに、HA2ドメ
インも、A型インフルエンザとB型インフルエンザの間で、さらにA型インフルエンザ亜型
にわたって配列同一性を共有する。
【０３５５】
いくつかの実施態様において、インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペ
プチドは、複数のインフルエンザ株又は亜型由来のセグメント及び/もしくはドメインを
含むか又はそれらから本質的になるハイブリッドポリペプチドである。例えば、インフル
エンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドは、異なるA型インフルエンザウイ
ルスHA亜型由来のHA1のN末端ステムセグメント及びHA1のC末端の短いステムセグメントを
含むことができる。いくつかの実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、B型
インフルエンザウイルス由来のものであるが、HA1のC末端の短いステムセグメントは、A
型インフルエンザウイルス由来のものである。同様に、HA2及びHA1のC末端の短いステム
セグメントは、A型インフルエンザウイルス由来のものでもあり得るが、HA1のN末端は、B
型インフルエンザウイルス由来のものである。
【０３５６】
表2、4、5に記載の配列エレメント、並びに表3の「シグナルペプチド」、「HA1のN末端
ステムセグメント」、及び「HA2ドメイン」の欄に記載の配列又はそれらの変異体の任意
の組合せを用いて、本発明の血球凝集素HAステムドメインポリペプチドを形成させること
ができることが理解されるであろう。
【０３５７】
本明細書に提供されるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドに
おいて、リンカーは、HA1のN末端ステムセグメントをHA1のC末端の短いステムセグメント
と共有結合で連結させる。リンカーは、本明細書に記載のリンカーを含むが、これに限定
されない、当業者によって好適であると考えられる任意のリンカーであることができる。
ある実施態様において、リンカーは、インフルエンザステムドメインと異種のインフルエ
ンザウイルス由来の球状ヘッド、又はその断片である。
【０３５８】
ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチド
は、天然のインフルエンザ血球凝集素のステムドメインの三次元構造と類似している三次
元構造を形成することができる。構造類似性は、本明細書に記載の技術を含むが、これに
限定されない、当業者によって好適であると考えられる任意の技術に基づいて評価するこ
とができる。
【０３５９】
ある実施態様において、本明細書に提供される任意のインフルエンザ血球凝集素の短い
ステムドメインポリペプチドは、当業者に好適であると考えられる1以上のポリペプチド
ドメインをさらに含むことができる。有用なポリペプチドドメインとしては、ポリペプチ
ドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインが挙げられる。例え
ば、Hisタグ
【化３７】
2020096604.tif 000086
、FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書に提供されるポリペプチドの精製を容
易にすることができる。いくつかの実施態様において、精製タグは、配列(His)nを有する
Hisタグであり、ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20、又はそれより大きい。
バクテリオファージT4フィブリチン由来のフォルドンを含む、任意の三量体化ドメイン
は、本明細書に提供されるポリペプチドの三量体化を容易にすることができる。いくつか
の実施態様において、三量体化ドメインは、三量体又は四量体コイルドコイルの形成を可
能にする野生型GCN4pII三量体化ヘプタッド反復又は修飾されたGCN4pII三量体化ヘプタッ
ド反復を含む。例えば、Weldonらの文献(2010, PLoSONE 5(9): e12466)を参照されたい。
フォルドンドメインは、当業者に公知の任意のフォルドン配列を有することができる(例
えば、Papanikolopoulouらの文献(2004, J. Biol. Chem. 279(10):8991-8998)を参照され
たく、その内容は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる)。例としては、
【化３８】
2020096604.tif 000087
が挙げられる。フォルドンドメインは、本明細書に提供される可溶性ポリペプチドの三量
体化を容易にするのに有用であることができる。切断部位を用いて、ポリペプチドの一部
の切断、例えば、精製タグもしくはフォルドンドメイン又は両方の切断を容易にすること
ができる。有用な切断部位としては、トロンビン切断部位、例えば、配列
【化３９】
2020096604.tif 000088
を有するものが挙げられる。ある実施態様において、切断部位は、タバコエッチ病ウイル
ス(TEV)プロテアーゼによって認識される切断部位(例えば、アミノ酸配列Glu-Asn-Leu-Ty
r-Phe-Gln-(Gly/Ser))である。
【０３６０】
ある実施態様において、提供されるのは、本明細書に記載のエラスターゼ切断部位を含
むインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドである。特定の実施態様
において、本明細書に提供されるのは、配列番号350〜365のいずれかを含むインフルエン
ザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドであり、ここで、配列番号350〜365のC
末端アミノ酸残基、例えば、アルギニン又はリジンは、バリン残基と置換されている。
【０３６１】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1とHA2の接合部でのプロテアー
ゼ切断に対して抵抗性があると予測されるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメイ
ンポリペプチドである。ある実施態様において、提供されるのは、HA1とHA2にまたがるプ
ロテアーゼ部位を、プロテアーゼ切断に対して抵抗性がある配列に突然変異させている、
本明細書に記載の任意のインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドで
ある。ある実施態様において、提供されるのは、HA1のC末端の短いステムセグメントのC
末端残基が、Lys又はArg以外の任意の残基である、本明細書に記載の任意のインフルエン
ザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、提供さ
れるのは、HA2ドメインのN末端残基がプロリンである、本明細書に記載の任意のインフル
エンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、提
供されるのは、HA1のC末端の短いステムセグメントのC末端残基がAlaであり、かつHA2ド
メインのN末端残基もAlaである、本明細書に記載の任意のインフルエンザ血球凝集素の短
いステムドメインポリペプチドである。
【０３６２】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端ステムセグメントがリ
ンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の短いステ
ムセグメントに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメイ
ンポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端
ステムセグメントリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共
有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝
集素の短いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供
されるのは、シグナルペプチドがHA1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リンカーに
共有結合し、さらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステム
ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポ
リペプチドである。
【０３６３】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端ステムセグメントがリ
ンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の短いステ
ムセグメントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合したものからなるインフ
ルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、
本明細書に提供されるのは、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さら
にHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結
合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の
短いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供される
のは、シグナルペプチドがHA1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結
合し、さらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメイ
ンに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血
球凝集素の短いステムドメインポリペプチドである。
【０３６４】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端ステムセグメントがリ
ンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の短いステ
ムセグメントに共有結合し、それが切断部位、三量体化ドメイン、及び精製タグに順に共
有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドで
ある。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端ステムセグメント
がリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、さら
にHA2ステムドメインに共有結合し、それが切断部位、三量体化ドメイン、及び精製タグ
に順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペ
プチドである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、シグナルペプチドが
HA1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の
短いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それが切
断部位、三量体化ドメイン、及び精製タグに順に共有結合したものからなるインフルエン
ザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、プロテ
アーゼ切断部位は、トロンビン切断部位である。ある実施態様において、切断部位は、ア
ミノ酸配列
【化４０】
2020096604.tif 000089
を有する。ある実施態様において、切断部位は、タバコエッチ病ウイルス(TEV)プロテア
ーゼによって認識される切断部位(例えば、アミノ酸配列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/
Ser))である。ある実施態様において、三量体化ドメインは、フォルドンドメインである
。いくつかの実施態様において、三量体化ドメインは、三量体又は四量体コイルドコイル
の形成を可能にする野生型GCN4pII三量体化ヘプタッド反復又は修飾されたGCN4pII三量体
化ヘプタッド反復を含む。例えば、Weldonらの文献(2010, PLoSONE 5(9): e12466)を参照
されたい。いくつかの実施態様において、精製タグは、配列(His)nを有するHisタグであ
り、ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19
、20、又はそれより大きい。
【０３６５】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端ステムセグメントがリ
ンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の短いステ
ムセグメントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それが切断部位、三
量体化ドメイン、及び精製タグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集
素の短いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供さ
れるのは、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の短
いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内
腔ドメインに共有結合し、それが切断部位、三量体化ドメイン、及び精製タグに順に共有
結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドであ
る。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、シグナルペプチドがHA1のN末端
ステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の短いステム
セグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメイ
ンに共有結合し、それが切断部位、三量体化ドメイン、及び精製タグに順に共有結合した
ものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドである。ある
実施態様において、プロテアーゼ切断部位は、トロンビン切断部位である。ある実施態様
において、切断部位は、アミノ酸配列
【化４１】
2020096604.tif 000090
を有する。ある実施態様において、切断部位は、タバコエッチ病ウイルス(TEV)プロテア
ーゼによって認識される切断部位(例えば、アミノ酸配列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/
Ser))である。ある実施態様において、三量体化ドメインは、フォルドンドメインである
。いくつかの実施態様において、三量体化ドメインは、三量体又は四量体コイルドコイル
の形成を可能にする野生型GCN4pII三量体化ヘプタッド反復又は修飾されたGCN4pII三量体
化ヘプタッド反復を含む。例えば、Weldonらの文献(2010, PLoSONE 5(9): e12466)を参照
されたい。いくつかの実施態様において、精製タグは、配列(His)nを有するHisタグであ
り、ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19
、20、又はそれより大きい。
【０３６６】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端ステムセグメントがリ
ンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の短いステ
ムセグメントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫
通ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメイン
ポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端ス
テムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共
有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し
、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集
素の短いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供さ
れるのは、シグナルペプチドがHA1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リンカーに共
有結合し、さらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムド
メインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメ
インに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペ
プチドである。
【０３６７】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端ステムセグメントがリ
ンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の短いステ
ムセグメントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫
通ドメインに共有結合し、それがさらにHA2細胞質ドメインに共有結合したものからなる
インフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様にお
いて、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端ステムセグメントがリンカーに共有結合し
、さらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに
共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共
有結合し、それがさらにHA2細胞質ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ
血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書
に提供されるのは、シグナルペプチドがHA1のN末端ステムセグメントに共有結合し、リン
カーに共有結合し、さらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2
ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜
貫通ドメインに共有結合し、それがさらにHA2細胞質ドメインに共有結合したものからな
るインフルエンザ血球凝集素の短いステムドメインポリペプチドである。
【０３６８】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号34)-LL-(配列番号350)-(配列番号66)、
(配列番号35)-LL-(配列番号351)-(配列番号67)、
(配列番号36)-LL-(配列番号352)-(配列番号68)、
(配列番号37)-LL-(配列番号353)-(配列番号69)、
(配列番号38)-LL-(配列番号354)-(配列番号70)、
(配列番号39)-LL-(配列番号355)-(配列番号71)、
(配列番号40)-LL-(配列番号356)-(配列番号72)、
(配列番号41)-LL-(配列番号357)-(配列番号73)、
(配列番号42)-LL-(配列番号358)-(配列番号74)、
(配列番号43)-LL-(配列番号359)-(配列番号75)、
(配列番号44)-LL-(配列番号360)-(配列番号76)、
(配列番号45)-LL-(配列番号361)-(配列番号77)、
(配列番号46)-LL-(配列番号362)-(配列番号78)、
(配列番号47)-LL-(配列番号363)-(配列番号79)、
(配列番号48)-LL-(配列番号364)-(配列番号80)、及び
(配列番号49)-LL-(配列番号365)-(配列番号81)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の短いステムポリペプ
チドであり、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつ
ここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ド
メインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様において、LL
は、直接結合、Gly、Gly-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly、(Gly)n(ここで、nは、ペ
プチドリンカーに柔軟性がある限り、任意の数のグリシン残基であり;ある実施態様にお
いて、nは、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又は7つのグリシン残基である)、
【化４２】
2020096604.tif 000091
からなる群から選択される。
【０３６９】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号34)-LL-(配列番号350)-(配列番号82)、
(配列番号35)-LL-(配列番号351)-(配列番号83)、
(配列番号36)-LL-(配列番号352)-(配列番号84)、
(配列番号37)-LL-(配列番号353)-(配列番号85)、
(配列番号38)-LL-(配列番号354)-(配列番号86)、
(配列番号39)-LL-(配列番号355)-(配列番号87)、
(配列番号40)-LL-(配列番号356)-(配列番号88)、
(配列番号41)-LL-(配列番号357)-(配列番号89)、
(配列番号42)-LL-(配列番号358)-(配列番号90)、
(配列番号43)-LL-(配列番号359)-(配列番号91)、
(配列番号44)-LL-(配列番号360)-(配列番号92)、
(配列番号45)-LL-(配列番号361)-(配列番号93)、
(配列番号46)-LL-(配列番号362)-(配列番号94)、
(配列番号47)-LL-(配列番号363)-(配列番号95)、
(配列番号48)-LL-(配列番号364)-(配列番号96)、及び
(配列番号49)-LL-(配列番号365)-(配列番号97)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の短いステムポリペプ
チドであり、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつ
ここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端セグメントは、HA2ド
メインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様において、LL
は、直接結合、  
【化４３】
2020096604.tif 000092
からなる群から選択される。
【０３７０】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号34)-LL-(配列番号350)-(配列番号82)-(配列番号98)、
(配列番号35)-LL-(配列番号351)-(配列番号83)-(配列番号99)、
(配列番号36)-LL-(配列番号352)-(配列番号84)-(配列番号100)、
(配列番号37)-LL-(配列番号353)-(配列番号85)-(配列番号101)、
(配列番号38)-LL-(配列番号354)-(配列番号86)-(配列番号102)、
(配列番号39)-LL-(配列番号355)-(配列番号87)-(配列番号103)、
(配列番号40)-LL-(配列番号356)-(配列番号88)-(配列番号104)、
(配列番号41)-LL-(配列番号357)-(配列番号89)-(配列番号105)、
(配列番号42)-LL-(配列番号358)-(配列番号90)-(配列番号106)、
(配列番号43)-LL-(配列番号359)-(配列番号91)-(配列番号107)、
(配列番号44)-LL-(配列番号360)-(配列番号92)-(配列番号108)、
(配列番号45)-LL-(配列番号361)-(配列番号93)-(配列番号109)、
(配列番号46)-LL-(配列番号362)-(配列番号94)-(配列番号110)、
(配列番号47)-LL-(配列番号363)-(配列番号95)-(配列番号111)、
(配列番号48)-LL-(配列番号364)-(配列番号96)-(配列番号112)、及び
(配列番号49)-LL-(配列番号365)-(配列番号97)-(配列番号113)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の短いステムポリペプ
チドであり、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつ
ここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端の短いステムセグメン
トは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様
において、LLは、直接結合、  
【化４４】
2020096604.tif 000093
からなる群から選択される。
【０３７１】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号34)-LL-(配列番号350)-(配列番号82)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号
166)、
(配列番号35)-LL-(配列番号351)-(配列番号83)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号
166)、
(配列番号36)-LL-(配列番号352)-(配列番号84)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号
166)、
(配列番号37)-LL-(配列番号353)-(配列番号85)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号
166)、
(配列番号38)-LL-(配列番号354)-(配列番号86)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号
166)、
(配列番号39)-LL-(配列番号355)-(配列番号87)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号
166)、
(配列番号40)-LL-(配列番号356)-(配列番号88)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号
166)、
(配列番号41)-LL-(配列番号357)-(配列番号89)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号
166)、
(配列番号42)-LL-(配列番号358)-(配列番号90)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号
166)、
(配列番号43)-LL-(配列番号359)-(配列番号91)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号
166)、
(配列番号44)-LL-(配列番号360)-(配列番号92)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号
166)、
(配列番号45)-LL-(配列番号361)-(配列番号93)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号
166)、
(配列番号46)-LL-(配列番号362)-(配列番号94)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号
166)、
(配列番号47)-LL-(配列番号363)-(配列番号95)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号
166)、
(配列番号48)-LL-(配列番号364)-(配列番号96)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号
166)、及び
(配列番号49)-LL-(配列番号365)-(配列番号97)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番号
166)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の短いステムポリペプ
チドであり、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつ
ここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端の短いステムセグメン
トは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様
において、LLは、直接結合、  
【化４５】
2020096604.tif 000094
からなる群から選択される。
【０３７２】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号34)-LL-(配列番号350)-(配列番号82)-(配列番号98)-(配列番号168)-(配列番号1
67)-(配列番号166)、
(配列番号35)-LL-(配列番号351)-(配列番号83)-(配列番号99)-(配列番号168)-(配列番号1
67)-(配列番号166)、
(配列番号36)-LL-(配列番号352)-(配列番号84)-(配列番号100)-(配列番号168)-(配列番号
167)-(配列番号166)、
(配列番号37)-LL-(配列番号353)-(配列番号85)-(配列番号101)-(配列番号168)-(配列番号
167)-(配列番号166)、
(配列番号38)-LL-(配列番号354)-(配列番号86)-(配列番号102)-(配列番号168)-(配列番号
167)-(配列番号166)、
(配列番号39)-LL-(配列番号355)-(配列番号87)-(配列番号103)-(配列番号168)-(配列番号
167)-(配列番号166)、
(配列番号40)-LL-(配列番号356)-(配列番号88)-(配列番号104)-(配列番号168)-(配列番号
167)-(配列番号166)、
(配列番号41)-LL-(配列番号357)-(配列番号89)-(配列番号105)-(配列番号168)-(配列番号
167)-(配列番号166)、
(配列番号42)-LL-(配列番号358)-(配列番号90)-(配列番号106)-(配列番号168)-(配列番号
167)-(配列番号166)、
(配列番号43)-LL-(配列番号359)-(配列番号91)-(配列番号107)-(配列番号168)-(配列番号
167)-(配列番号166)、
(配列番号44)-LL-(配列番号360)-(配列番号92)-(配列番号108)-(配列番号168)-(配列番号
167)-(配列番号166)、
(配列番号45)-LL-(配列番号361)-(配列番号93)-(配列番号109)-(配列番号168)-(配列番号
167)-(配列番号166)、
(配列番号46)-LL-(配列番号362)-(配列番号94)-(配列番号110)-(配列番号168)-(配列番号
167)-(配列番号166)、
(配列番号47)-LL-(配列番号363)-(配列番号95)-(配列番号111)-(配列番号168)-(配列番号
167)-(配列番号166)、
(配列番号48)-LL-(配列番号364)-(配列番号96)-(配列番号112)-(配列番号168)-(配列番号
167)-(配列番号166)、及び
(配列番号49)-LL-(配列番号365)-(配列番号97)-(配列番号113)-(配列番号168)-(配列番号
167)-(配列番号166)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の短いステムポリペプ
チドであり、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつ
ここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端の短いステムセグメン
トは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様
において、LLは、直接結合、  
【化４６】
2020096604.tif 000095
からなる群から選択される。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号177)-LL-(配列番号366)-(配列番号66)、
(配列番号178)-LL-(配列番号367)-(配列番号66)、
(配列番号179)-LL-(配列番号368)-(配列番号66)、
(配列番号180)-LL-(配列番号369)-(配列番号67)、
(配列番号181)-LL-(配列番号370)-(配列番号67)、
(配列番号182)-LL-(配列番号371)-(配列番号67)、
(配列番号183)-LL-(配列番号372)-(配列番号68)、
(配列番号184)-LL-(配列番号373)-(配列番号68)、
(配列番号185)-LL-(配列番号374)-(配列番号68)、
(配列番号186)-LL-(配列番号375)-(配列番号69)、
(配列番号187)-LL-(配列番号376)-(配列番号69)、
(配列番号188)-LL-(配列番号377)-(配列番号69)、
(配列番号189)-LL-(配列番号378)-(配列番号70)、
(配列番号190)-LL-(配列番号379)-(配列番号70)、
(配列番号191)-LL-(配列番号380)-(配列番号70)、
(配列番号192)-LL-(配列番号381)-(配列番号71)、
(配列番号193)-LL-(配列番号382)-(配列番号71)、
(配列番号194)-LL-(配列番号383)-(配列番号71)、
(配列番号195)-LL-(配列番号384)-(配列番号72)、
(配列番号196)-LL-(配列番号385)-(配列番号72)、
(配列番号197)-LL-(配列番号386)-(配列番号72)、
(配列番号198)-LL-(配列番号387)-(配列番号73)、
(配列番号199)-LL-(配列番号388)-(配列番号73)、
(配列番号200)-LL-(配列番号389)-(配列番号73)、
(配列番号201)-LL-(配列番号390)-(配列番号74)、
(配列番号202)-LL-(配列番号391)-(配列番号74)、
(配列番号203)-LL-(配列番号392)-(配列番号74)、
(配列番号204)-LL-(配列番号393)-(配列番号75)、
(配列番号205)-LL-(配列番号394)-(配列番号75)、
(配列番号206)-LL-(配列番号395)-(配列番号75)、
(配列番号207)-LL-(配列番号396)-(配列番号76)、
(配列番号208)-LL-(配列番号397)-(配列番号76)、
(配列番号209)-LL-(配列番号398)-(配列番号76)、
(配列番号210)-LL-(配列番号399)-(配列番号77)、
(配列番号211)-LL-(配列番号400)-(配列番号77)、
(配列番号212)-LL-(配列番号401)-(配列番号77)、
(配列番号213)-LL-(配列番号402)-(配列番号78)、
(配列番号214)-LL-(配列番号403)-(配列番号78)、
(配列番号215)-LL-(配列番号404)-(配列番号78)、
(配列番号216)-LL-(配列番号405)-(配列番号79)、
(配列番号217)-LL-(配列番号406)-(配列番号79)、
(配列番号218)-LL-(配列番号407)-(配列番号79)、
(配列番号219)-LL-(配列番号408)-(配列番号80)、
(配列番号220)-LL-(配列番号409)-(配列番号80)、
(配列番号221)-LL-(配列番号410)-(配列番号80)、
(配列番号222)-LL-(配列番号411)-(配列番号81)
(配列番号223)-LL-(配列番号412)-(配列番号81)、及び
(配列番号224)-LL-(配列番号413)-(配列番号81)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の短いステムポリペプ
チドであり、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつ
ここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端の短いステムセグメン
トは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様
において、LLは、直接結合、  
【化４７】
2020096604.tif 000096
からなる群から選択される。
【０３７３】
(5.3.2  インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチド)
ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、イ
ンフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。本明細書に提供され
るインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドの典型的な一次構造は、
以下の順序で:HA1のN末端の長いステムセグメント、リンカー、HA1のC末端の長いステム
セグメント、及びHA2を含む。一次配列は、単一のポリペプチドによって形成されること
ができるか、又はそれは、複数のポリペプチドによって形成されることができる。通常、
単一のポリペプチドは、当業者に好適であると考えられる任意の技術によって発現される
。単一のポリペプチドの実施態様において、HA1セグメントとHA2は三次結合している。当
業者に公知であるように、単一のHAポリペプチドは、例えば、プロテアーゼによって、適
当な発現条件下で切断され、四次結合した2つのポリペプチドを生じさせることができる
。切断は、通常、HA1のC末端の短いステムセグメントとHA2の間である。ある実施態様に
おいて、本明細書に提供されるのは、複数のポリペプチドである。複数のポリペプチドの
実施態様において、HA1セグメントとHA2は四次結合している。
【０３７４】
ある実施態様において、本明細書に提供されるインフルエンザ血球凝集素の長いステム
ドメインポリペプチドは単量体である。ある実施態様において、本明細書に提供されるイ
ンフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは多量体である。ある実施態
様において、本明細書に提供されるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリ
ペプチドは三量体である。当業者は、天然のインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメ
インポリペプチドがインビボで三量体化することができること、及び本明細書に提供され
る特定のインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが三量体化するこ
とができることを認識しているであろう。下記の特定の実施態様において、本明細書に提
供されるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは、三量体化を容
易にする三量体化ドメインを含む。
【０３７５】
ある実施態様において、同じく本明細書に提供されるのは、インフルエンザ血球凝集素
の長いステムドメインポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。ある実施態様において
、シグナルペプチドを欠く成熟したインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリ
ペプチドである。
【０３７６】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA2ステムドメイン、HA2内腔ドメ
イン、HA2膜貫通ドメイン、及びHA2細胞質ドメインを含むインフルエンザ血球凝集素の長
いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供されるの
は、HA2ステムドメイン、HA2内腔ドメイン、及びHA2膜貫通ドメインを含むが、典型的な
細胞質ドメインの一部又は全てを欠くインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポ
リペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA2ステムドメ
イン及びHA2内腔ドメインを含むが、HA2膜貫通ドメインとHA2細胞質ドメインの両方を欠
くインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様に
おいて、本明細書に提供されるのは、HA2ステムドメインを含むが、HA2内腔ドメイン、HA
2膜貫通ドメイン、及びHA2細胞質ドメインを欠くインフルエンザ血球凝集素の長いステム
ドメインポリペプチドである。ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素の長い
ステムドメインポリペプチドは、当業者に公知のインフルエンザHA2ステムドメインとの
少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％のアミノ酸配列同一性
を有するHA2ステムドメインを含む。公知のA型インフルエンザ血球凝集素由来の例示的な
公知のHA2ステムドメインは、下の表に提供されている。
【０３７７】
同じく本明細書に提供されるのは、最大100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、5
0、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基
がHA2ステムドメインの一方又は両方の末端から欠失している欠失型のHA2ステムドメイン
を含むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。さらに本明
細書に提供されるのは、最大100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、3
5、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基が他のアミノ
酸と保存的に置換されている改変型のHA2ステムドメインを含むインフルエンザ血球凝集
素の長いステムドメインポリペプチドである。さらに提供されるのは、欠失した及び改変
されたHA2ステムドメインを含むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペ
プチドである。
【０３７８】
HA1のN末端の長いステムセグメントは、本明細書に提供される定義に基づいて当業者に
より認識される任意のHA1のN末端の長いステムセグメントであることができる。通常、HA
1のN末端の長いステムセグメントは、成熟したHA1のN末端アミノ酸(すなわち、シグナル
ペプチドを欠くHA1)からHA1の約97番目の残基(H3付番を使用)の配列に位置するシステイ
ン残基までからなるポリペプチドに対応する。本明細書でCpと称される、このシステイン
残基は、通常、HA1のC末端の長いステムセグメント中のシステイン残基Cqに連結されるこ
とができる。17個の代表的なA型インフルエンザ血球凝集素の配列が図1に示されており、
残基Cpが各々で特定されている。
【０３７９】
ある実施態様において、HA1のN末端の長いステムセグメントは、Cp(例えば、H3血球凝
集素由来のHA1サブユニットのCys97)で正確に終わるのではなく、配列上及び構造上Cpに
近い残基で終わる。例えば、ある実施態様において、HA1のN末端の長いステムセグメント
は、Cp-1、Cp-2、Cp-3、又はCp-4で終わる。他の実施態様において、HA1のN末端の長いス
テムセグメントは、Cp+1、Cp+2、Cp+3、Cp+4、又はCp+5で終わる。HA1のN末端の長いステ
ムセグメントの終点は、得られる連結されたHA1ステムドメインが、下記のように、イン
フルエンザ血球凝集素ステムドメインと類似した三次元構造を形成することができるよう
に、HA1のC末端の長いステムセグメント及びリンカーの終点との関連で選択されるべきで
ある。
【０３８０】
ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチド
は、当業者に公知のインフルエンザHA1のN末端の長いステムセグメントとの少なくとも70
％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％のアミノ酸配列同一性を有するHA1
のN末端の長いステムセグメントを含む。例示的な公知のHA1のN末端の長いステムセグメ
ントは、下の表に提供されている。
【０３８１】
同じく本明細書に提供されるのは、最大100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、5
0、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基
がHA1のN末端の長いステムセグメントの一方又は両方の末端から欠失している欠失型のHA
1のN末端の長いステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメイン
ポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、1つ、2つ、又
は3つの残基が、HA1のN末端の長いステムセグメントのC末端に付加されており;これらの
付加された残基が、HA1のN末端の長いステムセグメントに隣接する球状ヘッドドメインの
アミノ酸配列に由来することができる、伸張型のHA1のN末端の長いステムセグメントを含
むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。さらに本明細書
に提供されるのは、最大100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、3
0、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基が他のアミノ酸と
保存的に置換されている改変型のHA1のN末端の長いステムセグメントを含むインフルエン
ザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。さらに提供されるのは、欠失し
た及び改変されたHA1のN末端の長いステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素の
長いステムドメインポリペプチドである。
【０３８２】
HA1のC末端の長いステムセグメントは、本明細書に提供される定義に基づいて当業者に
より認識される任意のHA1のC末端の長いステムセグメントであることができる。通常、HA
1のC末端の長いステムセグメントは、HA1の約252番目の残基(H3付番を使用)の配列に位置
するアラニン残基からHA1のC末端アミノ酸までからなるポリペプチドに対応する。本明細
書でCqと称される、このアラニン残基は、通常、HA1のN末端の長いステムセグメント中の
システイン残基Cpに連結されることができる。16個の代表的なA型インフルエンザ血球凝
集素の配列が図1に示されており、残基Cqが各々で特定されている。
【０３８３】
ある実施態様において、HA1のC末端の長いステムセグメントは、Cq(例えば、H3血球凝
集素由来のHA1サブユニットのAla252)から始まるのではなく、配列上及び構造上Cqに近い
残基から始まる。例えば、ある実施態様において、HA1のC末端の長いステムセグメントは
、Cq-1、Cq-2、Cq-3、又はCq-4から始まる。他の実施態様において、HA1のC末端の長いス
テムセグメントは、Cq+1、Cq+2、Cq+3、Cq+4、又はCq+5から始まる。HA1のN末端の長いス
テムセグメントの終点は、得られるHA1ステムドメインが、下記のように、インフルエン
ザ血球凝集素と類似した三次元構造を形成することができるように、HA1のC末端の長いス
テムセグメント及びリンカーの始点との関連で選択されるべきである。
【０３８４】
ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチド
は、当業者に公知のインフルエンザHA1のC末端の長いステムセグメントとの少なくとも70
％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、又は98％のアミノ酸配列同一性を有するHA1
のC末端の長いステムセグメントを含む。例示的な公知のHA1のC末端の長いステムセグメ
ントは、下の表に提供されている。
【０３８５】
ある実施態様において、N末端の長いステムセグメントの終点はCp-1であり、C末端の長
いステムセグメントの始点はCq-1である。ある実施態様において、N末端の長いステムセ
グメントの終点はAp-2であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq-2である。ある
実施態様において、N末端の長いステムセグメントの終点はCp-3であり、C末端の長いステ
ムセグメントの始点はCq-3である。ある実施態様において、N末端の長いステムセグメン
トの終点はCp-4であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq-4である。ある実施態
様において、N末端の長いステムセグメントの終点はCp-5であり、C末端の長いステムセグ
メントの始点はCq-5である。
【０３８６】
ある実施態様において、N末端の長いステムセグメントの終点はCp+1であり、C末端の長
いステムセグメントの始点はCq+1である。ある実施態様において、N末端の長いステムセ
グメントの終点はCp+2であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq+2である。ある
実施態様において、N末端の長いステムセグメントの終点はCp+3であり、C末端の長いステ
ムセグメントの始点はCq+3である。ある実施態様において、N末端の長いステムセグメン
トの終点はCp+4であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq+4である。ある実施態
様において、N末端の長いステムセグメントの終点はCp+5であり、C末端の長いステムセグ
メントの始点はCq+5である。
【０３８７】
ある実施態様において、N末端の長いステムセグメントの終点はCp-1であり、C末端の長
いステムセグメントの始点はCq+1である。ある実施態様において、N末端の長いステムセ
グメントの終点はCp-2であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq+2である。ある
実施態様において、N末端の長いステムセグメントの終点はCp-3であり、C末端の長いステ
ムセグメントの始点はCq+3である。ある実施態様において、N末端の長いステムセグメン
トの終点はCp-4であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq+4である。ある実施態
様において、N末端の長いステムセグメントの終点はCp-5であり、C末端の長いステムセグ
メントの始点はCq+5である。
【０３８８】
ある実施態様において、N末端の長いステムセグメントの終点はCp+1であり、C末端の長
いステムセグメントの始点はCq-1である。ある実施態様において、N末端の長いステムセ
グメントの終点はCp+2であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq-2である。ある
実施態様において、N末端の長いステムセグメントの終点はCp+3であり、C末端の長いステ
ムセグメントの始点はCq-3である。ある実施態様において、N末端の長いステムセグメン
トの終点はCp+4であり、C末端の長いステムセグメントの始点はCq-4である。ある実施態
様において、N末端の長いステムセグメントの終点はCp+5であり、C末端の長いステムセグ
メントの始点はCq-5である。
【０３８９】
同じく本明細書に提供されるのは、最大100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、5
0、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基
がHA1のC末端の長いステムセグメントの一方又は両方の末端から欠失している欠失型のHA
1のC末端の長いステムセグメントを含むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメイン
ポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、1つ、2つ、又
は3つの残基が、HA1のC末端の長いステムセグメントのN末端に付加されており;これらの
付加された残基が、HA1のC末端の長いステムセグメントに隣接する球状ヘッドドメインの
アミノ酸配列に由来することができる、伸張型のHA1のC末端の長いステムセグメントを含
むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。特定の実施態様
において、1つの残基がC末端の長いステムセグメントに付加される場合、1つの残基がN末
端の長いステムセグメントに付加され;2つの残基がC末端の長いステムセグメントに付加
される場合、2つの残基がN末端の長いステムセグメントに付加され;3つの残基がC末端の
長いステムセグメントに付加される場合、3つの残基がN末端の長いステムセグメントに付
加される。さらに本明細書に提供されるのは、最大100、95、90、85、80、75、70、65、6
0、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミ
ノ酸残基が他のアミノ酸と保存的に置換されている改変型のHA1のC末端の長いステムセグ
メントを含むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。さら
に提供されるのは、欠失した及び改変されたHA1のC末端の長いステムセグメントを含むイ
ンフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。
【０３９０】
インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは、当業者に公知である
か又は後に発見される任意のインフルエンザ血球凝集素に基づくことができる(すなわち
、上記のように、配列同一性を有することができる)。ある実施態様において、インフル
エンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは、A型インフルエンザ血球凝集素
に基づく。ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリ
ペプチドは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H1
6、及びH17からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施
態様において、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは、以下で
詳細に記載するように、B型インフルエンザ血球凝集素に基づく。
【０３９１】
HA1のN末端の長いステムセグメントは、当業者に公知であるか又は後に発見される任意
のHA1のN末端の長いステムセグメントに基づくことができる(すなわち、上記のように、
配列同一性を有することができる)。ある実施態様において、HA1のN末端の長いステムセ
グメントは、A型インフルエンザHA1のN末端の長いステムセグメントに基づく。ある実施
態様において、HA1のN末端の長いステムセグメントは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8
、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、及びH17からなる群から選択されるA型イン
フルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様において、HA1のN末端の長いステムセグメ
ントは、配列番号414〜429から選択される。ある実施態様において、HA1のN末端の長いス
テムセグメントは、各々1つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号414〜429
から選択される。ある実施態様において、HA1のN末端の長いステムセグメントは、各々2
つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号414〜429から選択される。ある実
施態様において、HA1のN末端の長いステムセグメントは、各々3つのアミノ酸がそのC末端
から欠失している、配列番号414〜429から選択される。ある実施態様において、HA1のN末
端の長いステムセグメントは、各々4つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番
号414〜429から選択される。ある実施態様において、HA1のN末端の長いステムセグメント
は、各々5つのアミノ酸がそのC末端から欠失している、配列番号414〜429から選択される
。ある実施態様において、HA1のN末端の長いステムセグメントは、配列番号446〜493から
選択される。
【０３９２】
HA1のC末端の長いステムセグメントは、当業者に公知であるか又は後に発見される任意
のHA1のC末端の長いステムセグメントに基づくことができる(すなわち、上記のように、
配列同一性を有することができる)。ある実施態様において、HA1のC末端の長いステムセ
グメントは、A型インフルエンザHA1のC末端の長いステムセグメントに基づく。ある実施
態様において、HA1のC末端の長いステムセグメントは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8
、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、及びH17からなる群から選択されるA型イン
フルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様において、HA1のC末端の長いステムセグメ
ントは、配列番号430〜445から選択される。ある実施態様において、HA1のC末端の長いス
テムセグメントは、各々1つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号430〜445
から選択される。ある実施態様において、HA1のC末端の長いステムセグメントは、各々2
つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号430〜445から選択される。ある実
施態様において、HA1のC末端の長いステムセグメントは、各々3つのアミノ酸がそのN末端
から欠失している、配列番号430〜445から選択される。ある実施態様において、HA1のC末
端の長いステムセグメントは、各々4つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番
号430〜445から選択される。ある実施態様において、HA1のC末端の長いステムセグメント
は、各々5つのアミノ酸がそのN末端から欠失している、配列番号430〜445から選択される
。ある実施態様において、HA1のC末端の長いステムセグメントは、配列番号494〜541から
選択される。
【０３９３】
HA2ステムドメインは、当業者に公知であるか、後に発見されるか、又は本明細書に記
載されている任意のHA2ステムドメインに基づくことができる(すなわち、上記のように、
配列同一性を有することができる)。ある実施態様において、HA2ステムドメインは、A型
インフルエンザHA2ステムドメインに基づく。ある実施態様において、HA2ステムドメイン
は、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、及びH
17からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素に基づく。ある実施態様にお
いて、HA2ステムドメインは、配列番号66〜97から選択される。
【０３９４】
シグナルペプチドを含む実施態様において、シグナルペプチドは、当業者に公知である
か又は本明細書に記載されている任意のインフルエンザシグナルペプチドに基づくことが
できる。ある実施態様において、シグナルペプチドは、配列番号18〜33から選択される。
【０３９５】
内腔ドメインを含む実施態様において、内腔ドメインは、当業者に公知であるか又は本
明細書に記載されている任意のインフルエンザ内腔ドメインに基づくことができる。ある
実施態様において、内腔ドメインは、配列番号98〜113から選択される。
【０３９６】
膜貫通ドメインを含む実施態様において、膜貫通ドメインは、当業者に公知であるか又
は本明細書に記載されている任意のインフルエンザ膜貫通ドメインに基づくことができる
。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、配列番号114〜129から選択される。
【０３９７】
細胞質ドメインを含む実施態様において、細胞質ドメインは、当業者に公知であるか又
は本明細書に記載されている任意のインフルエンザ細胞質ドメインに基づくことができる
。ある実施態様において、細胞質ドメインは、配列番号130〜145から選択される。
【０３９８】
ある実施態様において、血球凝集素ステムドメイン中のグリコシル化部位の1つ又は複
数を、これらの部位でのグリコシル化がポリペプチドのプロセシング及び成熟の間に生じ
ないように(例えば、アミノ酸の付加、欠失、又は置換によって)修飾する。当業者は、イ
ンフルエンザHAが、通常、1以上のグリコシル化部位(例えば、Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys、こ
こで、Xaaは任意の他のアミノ酸であり、又はある実施態様において、XaaはPro以外の任
意のアミノ酸である)を含むことを認識しているであろう。ある実施態様において、グリ
コシル化配列中の1以上のアミノ酸残基を、グリコシル化部位を分断するアミノ酸残基と
保存的に置換する。ある実施態様において、グリコシル化配列中の1以上のアミノ酸残基
を、グリコシル化部位を分断する任意のアミノ酸残基と置換する。ある実施態様において
、グリコシル化配列中の1以上のアスパラギン残基をアラニンと置換する。特定の実施態
様において、H3血球凝集素の位置38のアスパラギンをアラニンに変化させる。ある実施態
様において、血球凝集素ステムドメインは、下記の第5.4.1節で論じられているような1以
上の修飾されたグリコシル化部位を含む。
【０３９９】
下の表7は、A型インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのシグナルペプチド、HA1のN末
端の長いステムセグメント、HA1のC末端の長いステムセグメント、及びHA2ドメインを特
定している。これらのシグナルペプチド、ステムセグメント、及びドメインは、本明細書
に記載のポリペプチド及び方法において有用である。
表7.例示的なA型インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインペプチド配列
【表９】
2020096604.tif 000097
2020096604.tif 000098
2020096604.tif 000099
2020096604.tif 000100
2020096604.tif 000101
2020096604.tif 000102
2020096604.tif 000103
2020096604.tif 000104
2020096604.tif 000105
【０４００】
下の表7Aは、本明細書に記載のポリペプチド及び方法のための有用なHA1のN末端の長い
ステムセグメント及びHA1のC末端の長いステムセグメントを特定している。
表7A.例示的なA型インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメイン配列
【表１０】
2020096604.tif 000106
2020096604.tif 000107
2020096604.tif 000108
2020096604.tif 000109
2020096604.tif 000110
2020096604.tif 000111
2020096604.tif 000112
2020096604.tif 000113
2020096604.tif 000114
2020096604.tif 000115
2020096604.tif 000116
【０４０１】
ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチド
は、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドの三次構造又は四次構
造中に1以上の免疫原性エピトープを含む。
【０４０２】
ある実施態様において、HA1のN末端の長いステムセグメントは、アミノ酸配列
【化４８】
2020096604.tif 000117
を含み、ここで、
A17は、Y又はHであり;
A18は、H、L、又はQであり;
(Xaa)nは、18〜20アミノ酸残基の配列を表し;かつ
A38は、H、S、Q、T、又はNである。
【０４０３】
ある実施態様において、HA1のC末端の長いステムセグメントは、アミノ酸配列
【化４９】
2020096604.tif 000118
を含み、ここで、
A291は、T、S、N、D、P、又はKであり;かつ
A292は、L、M、K、又はRである。
【０４０４】
ある実施態様において、HA2ドメインは、アミノ酸配列
【化５０】
2020096604.tif 000119
を含み、ここで、
A18は、V又はIであり;
A19は、D、N、又はAであり;
A20は、Gであり、かつ
A21は、Wである。
【０４０５】
ある実施態様において、HA2ドメインは、アミノ酸配列
【化５１】
2020096604.tif 000120
を含み、ここで、
A38は、K、Q、R、L、又はYであり;
A39は、任意のアミノ酸残基であり;
A40は、任意のアミノ酸残基であり;
A41は、Tであり;
A42は、Qであり;
A43は、任意のアミノ酸残基であり;
A44は、Aであり;
A45は、Iであり;
A46は、Dであり;
A47は、任意のアミノ酸残基であり;
A48は、I、V、又はMであり;
A49は、T、Q、又はNであり;
A50は、任意のアミノ酸残基であり;
A51は、Kであり;
A52は、V又はLであり;
A53は、Nであり;
A54は、任意のアミノ酸残基であり;
A55は、V、I、又はLであり;かつ
A56は、V又はIである。
【０４０６】
ある実施態様において、インフルエンザステムドメインポリペプチドは、配列番号146
〜149から選択される2つのアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、インフルエンザ
ステムドメインポリペプチドは、配列番号146〜149から選択される3つのアミノ酸配列を
含む。ある実施態様において、インフルエンザステムドメインポリペプチドは、配列番号
146〜149から選択される4つのアミノ酸配列を含む。
【０４０７】
図1及び2に示すように、HA1のN末端の長いステムセグメントは、A型インフルエンザとB
型インフルエンザの間で、さらにA型インフルエンザ亜型にわたって配列同一性を共有す
る。同様に、HA1のC末端の長いステムセグメントも、A型インフルエンザとB型インフルエ
ンザの間で、さらにA型インフルエンザ亜型にわたって配列同一性を共有する。さらに、H
A2ドメインも、A型インフルエンザとB型インフルエンザの間で、さらにA型インフルエン
ザ亜型にわたって配列同一性を共有する。
【０４０８】
いくつかの実施態様において、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペ
プチドは、複数のインフルエンザ株又は亜型由来のセグメント及び/もしくはドメインを
含むか又はそれらから本質的になるハイブリッドポリペプチドである。例えば、インフル
エンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドは、異なるA型インフルエンザウイ
ルスHA亜型由来のHA1のN末端の長いステムセグメント及びHA1のC末端の長いステムセグメ
ントを含むことができる。いくつかの実施態様において、HA1のN末端の長いステムセグメ
ントは、A型インフルエンザウイルス由来のものであるが、HA1のC末端の長いステムセグ
メントは、B型インフルエンザウイルス由来のものである。同様に、HA2は、A型インフル
エンザウイルス由来のものでもあり得るが、HA1のN末端の長いステムセグメント及び/又
はC末端の長いステムセグメントは、B型インフルエンザウイルス由来のものである。
【０４０９】
表2〜4、6、6aに記載の配列エレメント、又はその変異体の任意の組合せを用いて、本
発明の血球凝集素HAの長いステムドメインポリペプチドを形成させることができることが
理解されるであろう。
【０４１０】
本明細書に提供されるインフルエンザステムドメインポリペプチドにおいて、リンカー
は、HA1のN末端の長いステムセグメントをHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合
で連結させる。リンカーは、本明細書に記載のリンカーを含むが、これに限定されない、
当業者によって好適であると考えられる任意のリンカーであることができる。
【０４１１】
ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチド
は、天然のインフルエンザ血球凝集素のステムドメインの三次元構造と類似している三次
元構造を形成することができる。構造類似性は、本明細書に記載の技術を含むが、これに
限定されない、当業者によって好適であると考えられる任意の技術に基づいて評価するこ
とができる。
【０４１２】
ある実施態様において、本明細書に提供される任意のインフルエンザ血球凝集素の長い
ステムドメインポリペプチドは、当業者に好適であると考えられる1以上のポリペプチド
ドメインをさらに含むことができる。有用なポリペプチドドメインとしては、ポリペプチ
ドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインが挙げられる。例え
ば、Hisタグ
【化５２】
2020096604.tif 000121
FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書に提供されるポリペプチドの精製を容易
にすることができる。いくつかの実施態様において、精製タグは、配列(His)nを有するHi
sタグであり、ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17
、18、19、20、又はそれより大きい。
バクテリオファージT4フィブリチン由来のフォルドンを含む、任意の三量体化ドメイン
は、本明細書に提供されるポリペプチドの三量体化を容易にすることができる。いくつか
の実施態様において、三量体化ドメインは、三量体又は四量体コイルドコイルの形成を可
能にする野生型GCN4pII三量体化ヘプタッド反復又は修飾されたGCN4pII三量体化ヘプタッ
ド反復を含む。例えば、Weldonらの文献(2010, PLoSONE 5(9): e12466)を参照されたい。
フォルドンドメインは、当業者に公知の任意のフォルドン配列を有することができる(例
えば、Papanikolopoulouらの文献(2004, J. Biol. Chem. 279(10):8991-8998)を参照され
たく、その内容は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる)。例としては、
【化５３】
2020096604.tif 000122
が挙げられる。フォルドンドメインは、本明細書に提供される可溶性ポリペプチドの三量
体化を容易にするのに有用であることができる。切断部位を用いて、ポリペプチドの一部
の切断、例えば、精製タグもしくはフォルドンドメイン又は両方の切断を容易にすること
ができる。有用な切断部位としては、トロンビン切断部位、例えば、配列
【化５４】
2020096604.tif 000123
を有するものが挙げられる。ある実施態様において、切断部位は、タバコエッチ病ウイル
ス(TEV)プロテアーゼによって認識される切断部位(例えば、アミノ酸配列Glu-Asn-Leu-Ty
r-Phe-Gln-(Gly/Ser))である。
【０４１３】
ある実施態様において、提供されるのは、本明細書に記載のエラスターゼ切断部位を含
むインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。特定の実施態様
において、本明細書で提供されるのは、配列番号430〜445のいずれかを含むインフルエン
ザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドであり、ここで、配列番号430〜445のC
末端アミノ酸残基、例えば、アルギニン又はリジンは、バリン残基と置換されている。
【０４１４】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1とHA2の接合部でのプロテアー
ゼ切断に対して抵抗性があると予測されるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメイ
ンポリペプチドである。当業者は、HA1とHA2にまたがるArg-Gly配列がトリプシンの認識
部位であり、通常、血球凝集素活性化のために切断されることを認識すべきである。本明
細書に記載のステムドメインポリペプチドは活性化される必要がないので、本明細書に提
供されるのは、プロテアーゼ切断に抵抗性があると予測されるインフルエンザ血球凝集素
の長いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、提供されるのは、HA
1とHA2にまたがるプロテアーゼ部位を、プロテアーゼ切断に対して抵抗性がある配列に突
然変異させている、本明細書に記載の任意のインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメ
インポリペプチドである。ある実施態様において、HA1のC末端の長いステムセグメントの
C末端残基が、Lys又はArg以外の任意の残基である、本明細書に記載の任意のインフルエ
ンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドが提供される。ある実施態様において
、提供されるのは、HA2ドメインのN末端残基がプロリンである、本明細書に記載の任意の
インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様にお
いて、提供されるのは、HA1のC末端の長いステムセグメントのC末端残基がAlaであり、か
つHA2ドメインのN末端残基もAlaである、本明細書に記載の任意のインフルエンザ血球凝
集素の長いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、提供されるのは
、HA2ドメインのN末端残基がグリシン以外の任意の残基である、本明細書に記載の任意の
インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。
【０４１５】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端の長いステムセグメン
トがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の長
いステムセグメントに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステム
ドメインポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1
のN末端の長いステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の長いステ
ムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合したものからなるイン
フルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において
、本明細書に提供されるのは、シグナルペプチドがHA1のN末端の長いステムセグメントに
共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結
合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素
の長いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、リンカーは、インフ
ルエンザステムドメインと異種のインフルエンザウイルス由来の球状ヘッド、又はその断
片である。ある実施態様において、リンカーは、キメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドのHA2サブユニットのステムドメインと異種のインフルエンザウイルス由
来の球状ヘッド、又はその断片である。ある実施態様において、リンカーは、キメライン
フルエンザウイルス血球凝集素のHA1及び/又はHA2サブユニットのステムドメインと異種
のインフルエンザウイルス由来の球状ヘッド、又はその断片である。
【０４１６】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端の長いステムセグメン
トがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の長
いステムセグメントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合したものからなる
インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様にお
いて、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端の長いステムセグメントがリンカーに共有
結合し、さらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメ
インに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ
血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書
に提供されるのは、シグナルペプチドがHA1のN末端の長いステムセグメントに共有結合し
、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、さら
にHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合したものからなる
インフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様にお
いて、リンカーは、インフルエンザステムドメインと異種のインフルエンザウイルス由来
の球状ヘッド、又はその断片である。ある実施態様において、リンカーは、血球凝集素の
HA2サブユニットのステムドメインと異種のインフルエンザウイルス由来の球状ヘッド、
又はその断片である。ある実施態様において、リンカーは、血球凝集素のHA1及び/又はHA
2サブユニットのステムドメインと異種のインフルエンザウイルス由来の球状ヘッド、又
はその断片である。
【０４１７】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端の長いステムセグメン
トがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の長
いステムセグメントに共有結合し、それが切断部位、三量体化ドメイン、及び精製タグに
順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプ
チドである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端の長いステ
ムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有
結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それが切断部位、三量体化ドメイン、
及び精製タグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムド
メインポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、シグナ
ルペプチドがHA1のN末端の長いステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、
さらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共
有結合し、それが切断部位、三量体化ドメイン、及び精製タグに順に共有結合したものか
らなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。ある実施態
様において、プロテアーゼ切断部位は、トロンビン切断部位である。ある実施態様におい
て、切断部位は、アミノ酸配列
【化５５】
2020096604.tif 000124
を有する。ある実施態様において、切断部位は、タバコエッチ病ウイルス(TEV)プロテア
ーゼによって認識される切断部位(例えば、アミノ酸配列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/
Ser))である。ある実施態様において、三量体化ドメインは、フォルドンドメインである
。いくつかの実施態様において、三量体化ドメインは、三量体又は四量体コイルドコイル
の形成を可能にする野生型GCN4pII三量体化ヘプタッド反復又は修飾されたGCN4pII三量体
化ヘプタッド反復を含む。例えば、Weldonらの文献(2010, PLoSONE 5(9): e12466)を参照
されたい。いくつかの実施態様において、精製タグは、配列(His)nを有するHisタグであ
り、ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19
、20、又はそれより大きい。
【０４１８】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端の長いステムセグメン
トがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の長
いステムセグメントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それが切断部
位、三量体化ドメイン、及び精製タグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血
球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に
提供されるのは、HA1のN末端の長いステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA
1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し
、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それが切断部位、三量体化ドメイン、及び精製
タグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポ
リペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、シグナルペプチ
ドがHA1のN末端の長いステムセグメントに共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA
1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し
、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それが切断部位、三量体化ドメイン、及び精製
タグに順に共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポ
リペプチドである。ある実施態様において、プロテアーゼ切断部位は、トロンビン切断部
位である。ある実施態様において、切断部位は、アミノ酸配列
【化５６】
2020096604.tif 000125
を有する。ある実施態様において、切断部位は、タバコエッチ病ウイルス(TEV)プロテア
ーゼによって認識される切断部位(例えば、アミノ酸配列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/
Ser))である。ある実施態様において、三量体化ドメインは、フォルドンドメインである
。いくつかの実施態様において、三量体化ドメインは、三量体又は四量体コイルドコイル
の形成を可能にする野生型GCN4pII三量体化ヘプタッド反復又は修飾されたGCN4pII三量体
化ヘプタッド反復を含む。例えば、Weldonらの文献(2010, PLoSONE 5(9): e12466)を参照
されたい。いくつかの実施態様において、精製タグは、配列(His)nを有するHisタグであ
り、ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19
、20、又はそれより大きい。
【０４１９】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端の長いステムセグメン
トがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の長
いステムセグメントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにH
A2膜貫通ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムド
メインポリペプチドである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN
末端の長いステムセグメントがリンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の長いステムセ
グメントに共有結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメイン
に共有結合し、それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合したものからなるインフルエ
ンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様において、本明
細書に提供されるのは、シグナルペプチドがHA1のN末端の長いステムセグメントに共有結
合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、
さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさ
らにHA2膜貫通ドメインに共有結合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いス
テムドメインポリペプチドである。
【０４２０】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端の長いステムセグメン
トがリンカーに共有結合し、さらにHA2ステムドメインと結合関係にあるHA1のC末端の長
いステムセグメントに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにH
A2膜貫通ドメインに共有結合し、それがさらにHA2細胞質ドメインに共有結合したものか
らなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。ある実施態
様において、本明細書に提供されるのは、HA1のN末端の長いステムセグメントがリンカー
に共有結合し、さらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有結合し、さらにHA2ステ
ムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、それがさらにHA2膜貫通
ドメインに共有結合し、それがさらにHA2細胞質ドメインに共有結合したものからなるイ
ンフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである。ある実施態様におい
て、本明細書に提供されるのは、シグナルペプチドがHA1のN末端の長いステムセグメント
に共有結合し、リンカーに共有結合し、さらにHA1のC末端の長いステムセグメントに共有
結合し、さらにHA2ステムドメインに共有結合し、それがHA2内腔ドメインに共有結合し、
それがさらにHA2膜貫通ドメインに共有結合し、それがさらにHA2細胞質ドメインに共有結
合したものからなるインフルエンザ血球凝集素の長いステムドメインポリペプチドである
。
【０４２１】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号414)-LL-(配列番号430)-(配列番号66)、
(配列番号415)-LL-(配列番号431)-(配列番号67)、
(配列番号416)-LL-(配列番号432)-(配列番号68)、
(配列番号417)-LL-(配列番号433)-(配列番号69)、
(配列番号418)-LL-(配列番号434)-(配列番号70)、
(配列番号419)-LL-(配列番号435)-(配列番号71)、
(配列番号420)-LL-(配列番号436)-(配列番号72)、
(配列番号421)-LL-(配列番号437)-(配列番号73)、
(配列番号422)-LL-(配列番号438)-(配列番号74)、
(配列番号423)-LL-(配列番号439)-(配列番号75)、
(配列番号424)-LL-(配列番号440)-(配列番号76)、
(配列番号425)-LL-(配列番号441)-(配列番号77)、
(配列番号426)-LL-(配列番号442)-(配列番号78)、
(配列番号427)-LL-(配列番号443)-(配列番号79)、
(配列番号428)-LL-(配列番号444)-(配列番号80)、及び
(配列番号429)-LL-(配列番号445)-(配列番号81)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の長いステムポリペプ
チドであり、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつ
ここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端の長いステムセグメン
トは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様
において、LLは、直接結合、Gly、Gly-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly、(Gly)n(こ
こで、nは、ペプチドリンカーに柔軟性がある限り、任意の数のグリシン残基であり;ある
実施態様において、nは、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又は7つのグリシン残基である)、  
【化５７】
2020096604.tif 000126
からなる群から選択される。
【０４２２】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号414)-LL-(配列番号430)-(配列番号82)、
(配列番号415)-LL-(配列番号431)-(配列番号83)、
(配列番号416)-LL-(配列番号432)-(配列番号84)、
(配列番号417)-LL-(配列番号433)-(配列番号85)、
(配列番号418)-LL-(配列番号434)-(配列番号86)、
(配列番号419)-LL-(配列番号435)-(配列番号87)、
(配列番号420)-LL-(配列番号436)-(配列番号88)、
(配列番号421)-LL-(配列番号437)-(配列番号89)、
(配列番号422)-LL-(配列番号438)-(配列番号90)、
(配列番号423)-LL-(配列番号439)-(配列番号91)、
(配列番号424)-LL-(配列番号440)-(配列番号92)、
(配列番号425)-LL-(配列番号441)-(配列番号93)、
(配列番号426)-LL-(配列番号442)-(配列番号94)、
(配列番号427)-LL-(配列番号443)-(配列番号95)、
(配列番号428)-LL-(配列番号444)-(配列番号96)、及び
(配列番号429)-LL-(配列番号445)-(配列番号97)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の長いステムポリペプ
チドであり、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつ
ここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端の長いステムセグメン
トは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様
において、LLは、直接結合、  
【化５８】
2020096604.tif 000127
からなる群から選択される。
【０４２３】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号414)-LL-(配列番号430)-(配列番号82)-(配列番号98)、
(配列番号415)-LL-(配列番号431)-(配列番号83)-(配列番号99)、
(配列番号416)-LL-(配列番号432)-(配列番号84)-(配列番号100)、
(配列番号417)-LL-(配列番号433)-(配列番号85)-(配列番号101)、
(配列番号418)-LL-(配列番号434)-(配列番号86)-(配列番号102)、
(配列番号419)-LL-(配列番号435)-(配列番号87)-(配列番号103)、
(配列番号420)-LL-(配列番号436)-(配列番号88)-(配列番号104)、
(配列番号421)-LL-(配列番号437)-(配列番号89)-(配列番号105)、
(配列番号422)-LL-(配列番号438)-(配列番号90)-(配列番号106)、
(配列番号423)-LL-(配列番号439)-(配列番号91)-(配列番号107)、
(配列番号424)-LL-(配列番号440)-(配列番号92)-(配列番号108)、
(配列番号425)-LL-(配列番号441)-(配列番号93)-(配列番号109)、
(配列番号426)-LL-(配列番号442)-(配列番号94)-(配列番号110)、
(配列番号427)-LL-(配列番号443)-(配列番号95)-(配列番号111)、
(配列番号428)-LL-(配列番号444)-(配列番号96)-(配列番号112)、及び
(配列番号429)-LL-(配列番号445)-(配列番号97)-(配列番号113)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の長いステムポリペプ
チドであり、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつ
ここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端の長いステムセグメン
トは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様
において、LLは、直接結合、  
【化５９】
2020096604.tif 000128
からなる群から選択される。
【０４２４】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号414)-LL-(配列番号430)-(配列番号82)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番
号166)、
(配列番号415)-LL-(配列番号431)-(配列番号83)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番
号166)、
(配列番号416)-LL-(配列番号432)-(配列番号84)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番
号166)、
(配列番号417)-LL-(配列番号433)-(配列番号85)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番
号166)、
(配列番号418)-LL-(配列番号434)-(配列番号86)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番
号166)、
(配列番号419)-LL-(配列番号435)-(配列番号87)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番
号166)、
(配列番号420)-LL-(配列番号436)-(配列番号88)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番
号166)、
(配列番号421)-LL-(配列番号437)-(配列番号89)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番
号166)、
(配列番号422)-LL-(配列番号438)-(配列番号90)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番
号166)、
(配列番号423)-LL-(配列番号439)-(配列番号91)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番
号166)、
(配列番号424)-LL-(配列番号440)-(配列番号92)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番
号166)、
(配列番号425)-LL-(配列番号441)-(配列番号93)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番
号166)、
(配列番号426)-LL-(配列番号442)-(配列番号94)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番
号166)、
(配列番号427)-LL-(配列番号443)-(配列番号95)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番
号166)、
(配列番号428)-LL-(配列番号444)-(配列番号96)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番
号166)、及び
(配列番号429)-LL-(配列番号445)-(配列番号97)-(配列番号168)-(配列番号167)-(配列番
号166)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の長いステムポリペプ
チドであり、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつ
ここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端の長いステムセグメン
トは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様
において、LLは、直接結合、  
【化６０】
2020096604.tif 000129
からなる群から選択される。
【０４２５】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号414)-LL-(配列番号430)-(配列番号82)-(配列番号98)-(配列番号168)-(配列番号
167)-(配列番号166)、
(配列番号415)-LL-(配列番号431)-(配列番号83)-(配列番号99)-(配列番号168)-(配列番号
167)-(配列番号166)、
(配列番号416)-LL-(配列番号432)-(配列番号84)-(配列番号100)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)、
(配列番号417)-LL-(配列番号433)-(配列番号85)-(配列番号101)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)、
(配列番号418)-LL-(配列番号434)-(配列番号86)-(配列番号102)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)、
(配列番号419)-LL-(配列番号435)-(配列番号87)-(配列番号103)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)、
(配列番号420)-LL-(配列番号436)-(配列番号88)-(配列番号104)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)、
(配列番号421)-LL-(配列番号437)-(配列番号89)-(配列番号105)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)、
(配列番号422)-LL-(配列番号438)-(配列番号90)-(配列番号106)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)、
(配列番号423)-LL-(配列番号439)-(配列番号91)-(配列番号107)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)、
(配列番号424)-LL-(配列番号440)-(配列番号92)-(配列番号108)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)、
(配列番号425)-LL-(配列番号441)-(配列番号93)-(配列番号109)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)、
(配列番号426)-LL-(配列番号442)-(配列番号94)-(配列番号110)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)、
(配列番号427)-LL-(配列番号443)-(配列番号95)-(配列番号111)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)、
(配列番号428)-LL-(配列番号444)-(配列番号96)-(配列番号112)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)、及び
(配列番号429)-LL-(配列番号445)-(配列番号97)-(配列番号113)-(配列番号168)-(配列番
号167)-(配列番号166)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の長いステムポリペプ
チドであり、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつ
ここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端の長いステムセグメン
トは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様
において、LLは、直接結合、  
【化６１】
2020096604.tif 000130
からなる群から選択される。
【０４２６】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、以下のもの:
(配列番号446)-LL-(配列番号494)-(配列番号66)、
(配列番号447)-LL-(配列番号495)-(配列番号66)、
(配列番号448)-LL-(配列番号496)-(配列番号66)、
(配列番号449)-LL-(配列番号497)-(配列番号67)、
(配列番号450)-LL-(配列番号498)-(配列番号67)、
(配列番号451)-LL-(配列番号499)-(配列番号67)、
(配列番号452)-LL-(配列番号500)-(配列番号68)、
(配列番号453)-LL-(配列番号501)-(配列番号68)、
(配列番号454)-LL-(配列番号502)-(配列番号68)、
(配列番号455)-LL-(配列番号503)-(配列番号69)、
(配列番号456)-LL-(配列番号504)-(配列番号69)、
(配列番号457)-LL-(配列番号505)-(配列番号69)、
(配列番号458)-LL-(配列番号506)-(配列番号70)、
(配列番号459)-LL-(配列番号507)-(配列番号70)、
(配列番号460)-LL-(配列番号508)-(配列番号70)、
(配列番号461)-LL-(配列番号509)-(配列番号71)、
(配列番号462)-LL-(配列番号510)-(配列番号71)、
(配列番号463)-LL-(配列番号511)-(配列番号71)、
(配列番号464)-LL-(配列番号512)-(配列番号72)、
(配列番号465)-LL-(配列番号513)-(配列番号72)、
(配列番号466)-LL-(配列番号514)-(配列番号72)、
(配列番号467)-LL-(配列番号515)-(配列番号73)、
(配列番号468)-LL-(配列番号516)-(配列番号73)、
(配列番号469)-LL-(配列番号517)-(配列番号73)、
(配列番号470)-LL-(配列番号518)-(配列番号74)、
(配列番号471)-LL-(配列番号519)-(配列番号74)、
(配列番号472)-LL-(配列番号520)-(配列番号74)、
(配列番号473)-LL-(配列番号521)-(配列番号75)、
(配列番号474)-LL-(配列番号522)-(配列番号75)、
(配列番号475)-LL-(配列番号523)-(配列番号75)、
(配列番号476)-LL-(配列番号524)-(配列番号76)、
(配列番号477)-LL-(配列番号525)-(配列番号76)、
(配列番号478)-LL-(配列番号526)-(配列番号76)、
(配列番号479)-LL-(配列番号527)-(配列番号77)、
(配列番号480)-LL-(配列番号528)-(配列番号77)、
(配列番号481)-LL-(配列番号529)-(配列番号77)、
(配列番号482)-LL-(配列番号530)-(配列番号78)、
(配列番号483)-LL-(配列番号531)-(配列番号78)、
(配列番号484)-LL-(配列番号532)-(配列番号78)、
(配列番号485)-LL-(配列番号533)-(配列番号79)、
(配列番号486)-LL-(配列番号534)-(配列番号79)、
(配列番号487)-LL-(配列番号535)-(配列番号79)、
(配列番号488)-LL-(配列番号536)-(配列番号80)、
(配列番号489)-LL-(配列番号537)-(配列番号80)、
(配列番号490)-LL-(配列番号538)-(配列番号80)、
(配列番号491)-LL-(配列番号539)-(配列番号81)、
(配列番号492)-LL-(配列番号540)-(配列番号81)、及び
(配列番号493)-LL-(配列番号541)-(配列番号81)
からなる群から選択される配列を有するインフルエンザ血球凝集素の長いステムポリペプ
チドであり、ここで、上の各配列は、本明細書に記載の隣接配列に連結されており、かつ
ここで、LLは本明細書に記載のリンカーである。特に、HA1のC末端の長いステムセグメン
トは、HA2ドメインに共有結合又は非共有結合で連結されることができる。ある実施態様
において、LLは、直接結合、  
【化６２】
2020096604.tif 000131
からなる群から選択される。
【０４２７】
(5.4  グリコシル化変異体)
別の態様において、本明細書に提供されるのは、1以上の修飾されたグリコシル化部位
及び/又は1以上の非天然のグリコシル化部位を含むflu血球凝集素(HA)ポリペプチドであ
る。具体的な実施態様において、flu HAポリペプチドは、1以上の修飾されたグリコシル
化部位及び/又は1以上の非天然のグリコシル化部位を含むキメラインフルエンザウイルス
血球凝集素ポリペプチドである。図19C及びBに示すように、野生型血球凝集素のグリコシ
ル化は、球状ヘッドとステムドメインの両方で生じる。これらのドメイン内でのグリコシ
ル化は、抗原性領域をマスクし、それにより、インフルエンザウイルスが宿主免疫系応答
を回避するのを可能にすることができると考えられる。例えば、季節性インフルエンザウ
イルス株(例えば、H1N1及びH3N2)は、時間とともに球状ヘッドドメインの免疫優性抗原性
領域中にさらなるグリコシル化部位を獲得することが知られている。しかしながら、本明
細書に記載のインフルエンザウイルスHAポリペプチドとの関連において、該ポリペプチド
のステムドメイン内でのグリコシル化は、このドメインに見出される保存された抗原性領
域に対する所望の免疫応答を妨害又は防止することができる。
【０４２８】
任意の特定の動作理論に束縛されるものではないが、本明細書に提供されるインフルエ
ンザウイルスHAポリペプチドのステムドメイン内の保存された抗原性領域に対する免疫応
答は、該部位でのグリコシル化(すなわち、グリカンの結合)を破壊する形でステムドメイ
ン内での1以上のグリコシル化部位を修飾することにより増大させることができると考え
られる。さらに、これらの免疫優性領域における1以上の非天然のグリコシル化部位の付
加によるHA球状ヘッドドメインの免疫優性抗原性領域のマスキングも、ステムドメイン内
の保存された亜免疫優性抗原性領域の免疫原性を増大させることができると考えられる。
図19Cを参照されたい。
【０４２９】
1以上の修飾されたグリコシル化部位及び/又は1以上の非天然のグリコシル化部位を含
むflu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、本明細書に記載のワクチン接種の方法に従って使
用することができ、すなわち、そのような突然変異体HAポリペプチドは、対象においてイ
ンフルエンザウイルスストーク/ステムドメイン特異的抗体を誘発するように、対象に投
与することができる。そのようなストークに対する抗体を誘発する突然変異体HAポリペプ
チドの能力を評価するために、対象(例えば、マウス)を、本明細書に記載の突然変異体HA
ポリペプチド、又は本明細書に記載の突然変異体HAポリペプチドを発現するウイルス(例
えば、インフルエンザウイルス)で免疫し、ステム/ストークドメイン特異的抗体の産生を
誘発するそのような突然変異体HAポリペプチド又はそのような突然変異体HAポリペプチド
を発現するウイルスの能力を評価し、対象においてステム/ストークドメイン特異的抗体
の産生を誘発する対応物の野生型HA又は野生型ウイルスの能力と比較することができる。
例えば、ストークに対する抗体を誘発する突然変異体HAポリペプチドの能力を評価するた
めに、マウスを、野生型インフルエンザウイルスの株又は亜型、グリコシル化部位がヘッ
ドドメインに付加されているHA突然変異体を発現するインフルエンザウイルス、及びグリ
コシル化部位がストークドメインから除去されているHA突然変異体を発現するインフルエ
ンザウイルス、並びにこれらの組合せで免疫することができる。その後、そのようなマウ
スを、インフルエンザウイルスDNAで初回免疫するか、又はウイルスタンパク質を接種す
ることができる。3週間後、そのようなマウスをウイルスタンパク質で追加免疫すること
ができる。ウイルスタンパク質で追加免疫してから3週間後、マウスを様々なインフルエ
ンザウイルス株に感染させて、重量減少及び生存についてモニタリングすることができる
。感染マウスの抗ヘッド抗体及び抗ストーク抗体の血清力価を下記のようにELISAにより
評価することができる。
【０４３０】
(5.4.1  ステムドメイン中の修飾されたグリコシル化部位)
一実施態様において、本明細書に提供されるflu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、少な
くとも1つの修飾されたグリコシル化部位を含むHAステムドメインを含み、ここで、該修
飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位に結合するグリカンの能力
を破壊する天然のグリコシル化部位の修飾を含む。任意の特定の動作理論に束縛されるも
のではないが、flu HAポリペプチドのステムドメイン内の保存された抗原性領域は、これ
らの抗原性領域に結合するグリカンにより、対象の免疫系(例えば、抗体応答)から遮断さ
れると考えられる。したがって、ステムドメイン内の免疫原性及び接近可能性抗原性領域
は、該部位でのグリコシル化(すなわち、グリカンの結合)を破壊する形でステムドメイン
内の1以上のグリコシル化部位を修飾することによって増大させることができると考えら
れる。
【０４３１】
天然のグリコシル化部位が修飾されたグリコシル化部位に結合するグリカンの能力を破
壊する形で修飾される修飾されたグリコシル化部位は、当業者に明らかな任意の技術によ
って作製されることができ、該技術には、例えば、下記の実施例5に論じられている部位
特異的突然変異生成技術を含む、本明細書に記載の方法が含まれる。
【０４３２】
ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、少なくとも1つ、2つ、3つ
、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、15、もしくは20、又はそれより
多くの修飾されたグリコシル化部位を含むHAステムドメインを含み、ここで、該修飾され
たグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位に結合するグリカンの能力を破壊
する天然のグリコシル化部位の修飾を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)
ポリペプチドのHAステムドメインは、1〜3、4〜6、7〜9、10〜12、13〜15、16〜18、19〜
21の修飾されたグリコシル化部位を含む。他の実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポ
リペプチドのHAステムドメインは、1〜5、6〜10、11〜15、16〜20、21〜25の修飾された
グリコシル化部位を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドのHA
ステムドメインは、1つの修飾されたグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、f
lu血球凝集素(HA)ポリペプチドのHAステムドメインは、2つの修飾されたグリコシル化部
位を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドのHAステムドメイン
は、3つの修飾されたグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(H
A)ポリペプチドのHAステムドメインは、4つの修飾されたグリコシル化部位を含む。ある
実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドのHAステムドメインは、5つの修飾さ
れたグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド
のHAステムドメインは、6つの修飾されたグリコシル化部位を含む。ある実施態様におい
て、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドのHAステムドメインは、7つの修飾されたグリコシル
化部位を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドのHAステムドメ
インは、8つの修飾されたグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、flu血球凝集
素(HA)ポリペプチドのHAステムドメインは、9つの修飾されたグリコシル化部位を含む。
ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドのHAステムドメインは、10の修
飾されたグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプ
チドのHAステムドメインは、11の修飾されたグリコシル化部位を含む。ある実施態様にお
いて、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドのHAステムドメインは、12の修飾されたグリコシ
ル化部位を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドのHAステムド
メインは、13の修飾されたグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、flu血球凝
集素(HA)ポリペプチドのHAステムドメインは、14の修飾されたグリコシル化部位を含む。
ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドのHAステムドメインは、15の修
飾されたグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプ
チドのHAステムドメインは、16の修飾されたグリコシル化部位を含む。ある実施態様にお
いて、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドのHAステムドメインは、17の修飾されたグリコシ
ル化部位を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドのHAステムド
メインは、18の修飾されたグリコシル化部位を含む。ある実施態様において、flu血球凝
集素(HA)ポリペプチドのHAステムドメインは、19の修飾されたグリコシル化部位を含む。
ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドのHAステムドメインは、20又は
それより多くの修飾されたグリコシル化部位を含む。
【０４３３】
修飾されたグリコシル化部位としては、N結合型及びO結合型グリコシル化部位が挙げら
れるが、これらに限定されない。ある実施態様において、修飾されたグリコシル化部位は
、N結合型グリコシル化部位である。他の実施態様において、修飾されたグリコシル化部
位は、O結合型グリコシル化部位である。いくつかの実施態様において、修飾されたグリ
コシル化部位は、アミノ酸モチーフAsn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する修飾されたN結合型グリ
コシル化部位であり、ここで、Xaaは任意のアミノ酸であり、又はある実施態様において
、XaaはPro以外の任意のアミノ酸である。
【０４３４】
修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位に結合するグリカンの
能力を破壊することができる任意の修飾を含むことができる。好ましい実施態様において
、該修飾は、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドの適切なフォールディング及び/又は対象の
免疫応答を誘発するflu血球凝集素(HA)ポリペプチドの能力を妨害しない。ある実施態様
において、該修飾は、天然のグリコシル化部位における1以上のアミノ酸残基の欠失を含
む。他の実施態様において、該修飾は、天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換
を含む。
【０４３５】
ある実施態様において、修飾されたグリコシル化部位は、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Th
r/Cysを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含み、ここで、Xaaは任意
のアミノ酸であり、又はある実施態様において、XaaはPro以外の任意のアミノ酸であり、
及びここで、該修飾は、該修飾されたグリコシル化部位に結合するグリカンの能力を破壊
する。該修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位に結合するグリ
カンの能力を破壊することができる当業者に公知の任意のアミノ酸置換を含むことができ
る。好ましい実施態様において、該1以上のアミノ酸置換は、適切にフォールディングす
るか、又は対象の免疫応答を誘発するflu血球凝集素(HA)ポリペプチドの能力を妨害しな
い。ある実施態様において、天然のグリコシル化部位の1以上のアミノ酸を、Asn(N)、Ser
(S)、Thr(T)、又はAsp(D)アミノ酸残基について置換される。例示的なアミノ酸置換とし
ては、Asn(N)のLys(K)アミノ酸残基への置換;Ser(S)のAsn(N)残基への置換;及びThr(T)の
Asp(D)残基への置換が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において
、修飾されたグリコシル化部位は、天然のグリコシル化部位のAsn(N)残基のLys(K)残基へ
の置換を含む。他の実施態様において、修飾されたグリコシル化部位は、天然のグリコシ
ル化部位のSer(S)残基のAsn(N)アミノ酸残基への置換を含む。また他の実施態様において
、修飾されたグリコシル化部位は、天然のグリコシル化部位のThr(T)残基のAsp(D)アミノ
酸残基への置換を含む。
【０４３６】
ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Ala-Serを含む天然のグリコシル化
部位に1以上のアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-A
sp-Serを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態
様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Arg-Serを含む天然のグリコシル化部位に1以上の
アミノ酸置換を含む。他の実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Asn-Serを含む
天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は
、アミノ酸配列Asn-Cys-Serを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む
。ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Glu-Serを含む天然のグリコシル化
部位に1以上のアミノ酸置換を含む。他の実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-G
ln-Serを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態
様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Gly-Serを含む天然のグリコシル化部位に1以上の
アミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-His-Serを含む
天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。他の実施態様において、修飾は
、アミノ酸配列Asn-Ile-Serを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む
。いくつかの実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Lys-Serを含む天然のグリコ
シル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配
列Asn-Leu-Serを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。他の実施態
様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Met-Serを含む天然のグリコシル化部位に1以上の
アミノ酸置換を含む。他の実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Phe-Serを含む
天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は
、アミノ酸配列Asn-Pro-Serを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む
。いくつかの実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Ser-Serを含む天然のグリコ
シル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配
列Asn-Thr-Serを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。他の実施態
様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Trp-Serを含む天然のグリコシル化部位に1以上の
アミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Tyr-Serを含む
天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は
、アミノ酸配列Asn-Val-Serを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む
。
【０４３７】
ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Ala-Thrを含む天然のグリコシル化
部位に1以上のアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-A
sp-Thrを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態
様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Arg-Thrを含む天然のグリコシル化部位に1以上の
アミノ酸置換を含む。他の実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Asn-Thrを含む
天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は
、アミノ酸配列Asn-Cys-Thrを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む
。ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Glu-Thrを含む天然のグリコシル化
部位に1以上のアミノ酸置換を含む。他の実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-G
ln-Thrを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態
様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Gly-Thrを含む天然のグリコシル化部位に1以上の
アミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-His-Thrを含む
天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。他の実施態様において、修飾は
、アミノ酸配列Asn-Ile-Thrを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む
。いくつかの実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Lys-Thrを含む天然のグリコ
シル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配
列Asn-Leu-Thrを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。他の実施態
様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Met-Thrを含む天然のグリコシル化部位に1以上の
アミノ酸置換を含む。他の実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Phe-Thrを含む
天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は
、アミノ酸配列Asn-Pro-Thrを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む
。いくつかの実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Ser-Thrを含む天然のグリコ
シル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配
列Asn-Thr-Thrを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。他の実施態
様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Trp-Thrを含む天然のグリコシル化部位に1以上の
アミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Tyr-Thrを含む
天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は
、アミノ酸配列Asn-Val-Thrを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む
。
【０４３８】
ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Ala-Cysを含む天然のグリコシル化
部位に1以上のアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-A
sp-Cysを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態
様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Arg-Cysを含む天然のグリコシル化部位に1以上の
アミノ酸置換を含む。他の実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Asn-Cysを含む
天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は
、アミノ酸配列Asn-Cys-Cysを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む
。ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Glu-Cysを含む天然のグリコシル化
部位に1以上のアミノ酸置換を含む。他の実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-G
ln-Cysを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態
様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Gly-Cysを含む天然のグリコシル化部位に1以上の
アミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-His-Cysを含む
天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。他の実施態様において、修飾は
、アミノ酸配列Asn-Ile-Cysを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む
。いくつかの実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Lys-Cysを含む天然のグリコ
シル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配
列Asn-Leu-Cysを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。他の実施態
様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Met-Cysを含む天然のグリコシル化部位に1以上の
アミノ酸置換を含む。他の実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Phe-Cysを含む
天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は
、アミノ酸配列Asn-Pro-Cysを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む
。いくつかの実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Ser-Cysを含む天然のグリコ
シル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配
列Asn-Thr-Cysを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。他の実施態
様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Trp-Cysを含む天然のグリコシル化部位に1以上の
アミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は、アミノ酸配列Asn-Tyr-Cysを含む
天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、修飾は
、アミノ酸配列Asn-Val-Cysを含む天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含む
。
【０４３９】
HAステムドメイン中の保存された天然のグリコシル化部位としては、図20に示されてい
るものが挙げられる。グループ1血球凝集素(H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、
及びH16)中の例示的な天然のN-グリコシル化部位は、限定されないが、アミノ酸位置20-2
2(H9中で欠落)、21-23、33-35(H8、H9、H12、H13、H16中で欠落)、46-48(H1、H2、H5、H6
、H8、H9、H11、H12中で欠落)、289-291(H6、H11、H13、H16中で欠落)、290-292(H1、H2
、H5、H8、H9、H12中で欠落)、296-298(H1、H2、H5、H11、H13、H16中で欠落)、及び481-
483に見出すことができ、ここで、該アミノ酸位置はH3付番によるものである。ある実施
態様において、血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3付番に従って、アミノ酸位置20-22に
修飾されたグリコシル化部位を含み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位は、該修飾
されたグリコシル化部位でのグリコシル化を破壊する修飾を含む。ある実施態様において
、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3付番に従って、アミノ酸位置21-23に修飾された
グリコシル化部位を含み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリ
コシル化部位でのグリコシル化を破壊する修飾を含む。ある実施態様において、flu血球
凝集素(HA)ポリペプチドは、H3付番に従って、アミノ酸位置33-35に修飾されたグリコシ
ル化部位を含み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化
部位でのグリコシル化を破壊する修飾を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA
)ポリペプチドは、H3付番に従って、アミノ酸位置46-48に修飾されたグリコシル化部位を
含み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位でのグ
リコシル化を破壊する修飾を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプ
チドは、H3付番に従って、アミノ酸位置289-291に修飾されたグリコシル化部位を含み、
ここで、該修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位でのグリコシ
ル化を破壊する修飾を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは
、H3付番に従って、アミノ酸位置290-292に修飾されたグリコシル化部位を含み、ここで
、該修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル化を
破壊する修飾を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3付
番に従って、アミノ酸位置296-298に修飾されたグリコシル化部位を含み、ここで、該修
飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル化を破壊す
る修飾を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3付番に従
って、アミノ酸位置481-483に修飾されたグリコシル化部位を含み、ここで、該修飾され
たグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル化を破壊する修飾
を含む。
【０４４０】
ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3付番に従って、アミノ
酸位置20-22、21-23、33-35、46-48、289-291、290-292、296-298、及び481-483からなる
群から選択されるアミノ酸位置に2つの修飾されたグリコシル化部位を含み、ここで、各
々の修飾されたグリコシル化部位は、修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル化を破
壊する修飾を含む。他の実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3付番
に従って、アミノ酸位置20-22、21-23、33-35、46-48、289-291、290-292、296-298、及
び481-483からなる群から選択されるアミノ酸位置に3つの修飾されたグリコシル化部位を
含み、ここで、各々の修飾されたグリコシル化部位は、修飾されたグリコシル化部位での
グリコシル化を破壊する修飾を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペ
プチドは、H3付番に従って、アミノ酸位置20-22、21-23、33-35、46-48、289-291、290-2
92、296-298、及び481-483からなる群から選択されるアミノ酸位置に4つの修飾されたグ
リコシル化部位を含み、ここで、各々の修飾されたグリコシル化部位は、修飾されたグリ
コシル化部位でのグリコシル化を破壊する修飾を含む。いくつかの実施態様において、fl
u血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3付番に従って、アミノ酸位置20-22、21-23、33-35、
46-48、289-291、290-292、296-298、及び481-483からなる群から選択されるアミノ酸位
置に5つの修飾されたグリコシル化部位を含み、ここで、各々の修飾されたグリコシル化
部位は、修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル化を破壊する修飾を含む。ある実施
態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3付番に従って、アミノ酸位置20-22
、21-23、33-35、46-48、289-291、290-292、296-298、及び481-483からなる群から選択
されるアミノ酸位置に6つの修飾されたグリコシル化部位を含み、ここで、各々の修飾さ
れたグリコシル化部位は、修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル化を破壊する修飾
を含む。他の実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3付番に従って、
アミノ酸位置20-22、21-23、33-35、46-48、289-291、290-292、296-298、及び481-483か
らなる群から選択されるアミノ酸位置に7つの修飾されたグリコシル化部位を含み、ここ
で、各々の修飾されたグリコシル化部位は、修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル
化を破壊する修飾を含む。また他の実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド
は、H3付番に従って、アミノ酸位置20-22、21-23、33-35、46-48、289-291、290-292、29
6-298、及び481-483に修飾されたグリコシル化部位を含み、ここで、各々の修飾されたグ
リコシル化部位は、修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル化を破壊する修飾を含む
。
【０４４１】
グループ2血球凝集素(H3、H4、H7、H10、H14、H15)中の例示的な保存されたN-グリコシ
ル化部位は、限定されないが、アミノ酸位置8-10、22-24、38-40(H4、H14中で欠落)、46-
48(H3、H4、H7、H10、H14中で欠落)  285-287(H4、H7、H10、H14、H15中で欠落)、296-29
8(H3、H7、H15中で欠落)、410-412(H3、H4、H14中で欠落)、及び481-483に見出すことが
でき、こで、該アミノ酸位置は、H3付番によるものである。ある実施態様において、flu
血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3付番に従って、アミノ酸位置8-10に修飾されたグリコ
シル化部位を含み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル
化部位でのグリコシル化を破壊する修飾を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(
HA)ポリペプチドは、H3付番に従って、アミノ酸位置22-24に修飾されたグリコシル化部位
を含み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位での
グリコシル化を破壊する修飾を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペ
プチドは、H3付番に従って、アミノ酸位置38-40に修飾されたグリコシル化部位を含み、
ここで、該修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位でのグリコシ
ル化を破壊する修飾を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは
、H3付番に従って、アミノ酸位置46-48に修飾されたグリコシル化部位を含み、ここで、
該修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル化を破
壊する修飾を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3付番
に従って、アミノ酸位置285-287に修飾されたグリコシル化部位を含み、ここで、該修飾
されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル化を破壊する
修飾を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3付番に従っ
て、アミノ酸位置296-298に修飾されたグリコシル化部位を含み、ここで、該修飾された
グリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル化を破壊する修飾を
含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3付番に従って、ア
ミノ酸位置410-412に修飾されたグリコシル化部位を含み、ここで、該修飾されたグリコ
シル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル化を破壊する修飾を含む。
ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3付番に従って、アミノ酸
位置481-483に修飾されたグリコシル化部位を含み、ここで、該修飾されたグリコシル化
部位は、該修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル化を破壊する修飾を含む。
【０４４２】
ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3付番に従って、アミノ
酸位置8-10、22-24、38-40、46-48、285-287、296-298、410-412、及び481-483からなる
群から選択されるアミノ酸位置に2つの修飾されたグリコシル化部位を含み、ここで、該
修飾されたグリコシル化部位の各々は、該修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル化
を破壊する修飾を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3
付番に従って、アミノ酸位置8-10、22-24、38-40、46-48、285-287、296-298、410-412、
及び481-483からなる群から選択されるアミノ酸位置に3つの修飾されたグリコシル化部位
を含み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位の各々は、該修飾されたグリコシル化部
位でのグリコシル化を破壊する修飾を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)
ポリペプチドは、H3付番に従って、アミノ酸位置8-10、22-24、38-40、46-48、285-287、
296-298、410-412、及び481-483からなる群から選択されるアミノ酸位置に4つの修飾され
たグリコシル化部位を含み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位の各々は、該修飾さ
れたグリコシル化部位でのグリコシル化を破壊する修飾を含む。ある実施態様において、
flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3付番に従って、アミノ酸位置8-10、22-24、38-40
、46-48、285-287、296-298、410-412、及び481-483からなる群から選択されるアミノ酸
位置に5つの修飾されたグリコシル化部位を含み、ここで、該修飾されたグリコシル化部
位の各々は、該修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル化を破壊する修飾を含む。あ
る実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3付番に従って、アミノ酸位
置8-10、22-24、38-40、46-48、285-287、296-298、410-412、及び481-483からなる群か
ら選択されるアミノ酸位置に6つの修飾されたグリコシル化部位を含み、ここで、該修飾
されたグリコシル化部位の各々は、該修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル化を破
壊する修飾を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3付番
に従って、アミノ酸位置8-10、22-24、38-40、46-48、285-287、296-298、410-412、及び
481-483からなる群から選択されるアミノ酸位置に7つの修飾されたグリコシル化部位を含
み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位の各々は、該修飾されたグリコシル化部位で
のグリコシル化を破壊する修飾を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリ
ペプチドは、H3付番に従って、アミノ酸位置8-10、22-24、38-40、46-48、285-287、296-
298、410-412、及び481-483における修飾されたグリコシル化部位を含み、ここで、該修
飾されたグリコシル化部位の各々は、該修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル化を
破壊する修飾を含む。
【０４４３】
ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3付番に従って、アミノ
酸残基20-23、33-35、289-291、及び483-485に1つ、2つ、又は3つの修飾されたグリコシ
ル化部位を含み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化
部位でのグリコシル化を破壊する修飾を含む。他の実施態様において、flu血球凝集素(HA
)ポリペプチドは、H3付番に従って、アミノ酸残基33-35及び289-291に2つの修飾されたグ
リコシル化部位を含み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコ
シル化部位でのグリコシル化を破壊する修飾を含む。
【０４４４】
少なくとも1つの修飾されたグリコシル化部位を含むHAステムドメインを含むflu血球凝
集素ポリペプチドは、限定されないが、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペ
プチド、非キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド(すなわち、同じ亜型
又は株由来のHAステムドメイン及びHAヘッドドメインを含むインフルエンザウイルス血球
凝集素ポリペプチド)、及びインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプ
チドを含む、本明細書に記載のHAステムドメインを含む任意のflu血球凝集素(HA)ポリペ
プチドであることができる。
【０４４５】
ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、キメラインフルエンザウ
イルス血球凝集素ポリペプチドである。具体的な実施態様において、キメラインフルエン
ザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドは、HAステムドメイン及びHA球状ヘッドドメイン
を含み、ここで、該HA球状ヘッドドメインは、該HAステムドメインと異種であり、及びこ
こで、該HAステムドメインは、少なくとも1つの修飾されたグリコシル化部位を含み、こ
こで、該修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位に結合するグリ
カンの能力を破壊する天然のグリコシル化部位の修飾を含む。具体的な実施態様において
、該修飾は、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する天然のグリコシル化部位に1以上
のアミノ酸置換を含み、ここで、Xaaは任意のアミノ酸であり、又はある実施態様におい
て、XaaはPro以外の任意のアミノ酸である。
【０４４６】
ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、非キメラインフルエンザ
ウイルス血球凝集素ポリペプチドである。具体的な実施態様において、非キメラインフル
エンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、HAステムドメイン及びHA球状ヘッドドメイン
を含み、ここで、該HA球状ヘッドドメインは、該HAステムドメインと相同であり(すなわ
ち、該球状ヘッドドメイン及びステムドメインは、同じインフルエンザウイルス株又は亜
型由来のものであり)、及びここで、該HAステムドメインは、少なくとも1つの修飾された
グリコシル化部位を含み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリ
コシル化部位に結合するグリカンの能力を破壊する天然のグリコシル化部位の修飾を含む
。具体的な実施態様において、該修飾は、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する天
然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含み、ここで、Xaaは任意のアミノ酸であ
り、又はある実施態様において、XaaはPro以外の任意のアミノ酸である。ある実施態様に
おいて、非キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、同じインフルエン
ザウイルス亜型由来のHAステムドメイン及びHA球状ヘッドドメインを含む。具体的な実施
態様において、インフルエンザウイルス亜型は、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、
H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、又はH17亜型である。具体的な実施態様において、
非キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、同じインフルエンザウイル
ス株由来のHAステムドメイン及びHA球状ヘッドドメインを含む。ある実施態様において、
インフルエンザウイルス株は、A/ネーデルラント/602/2009である。
【０４４７】
ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、インフルエンザウイルス
血球凝集素ステムドメインポリペプチドである。例示的なインフルエンザウイルス血球凝
集素ステムドメインポリペプチドは、上記の第5.2節に開示されている。
【０４４８】
具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペ
プチドは:(a)HA1のN末端ステムセグメントが1〜50の異種残基のリンカーに共有結合し、
それがさらにHA1のC末端の短いステムセグメントに共有結合したものを含むインフルエン
ザ血球凝集素HA1ドメインを含み;該HA1ドメインは(b)インフルエンザ血球凝集素HA2ドメ
インと三次結合又は四次結合しており、ここで、該インフルエンザウイルス血球凝集素ス
テムドメインポリペプチドは、少なくとも1つの修飾されたグリコシル化部位をさらに含
み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位に結合す
るグリカンの能力を破壊する天然のグリコシル化部位の修飾を含む。具体的な実施態様に
おいて、該修飾は、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する天然のグリコシル化部位
に1以上のアミノ酸置換を含み、ここで、Xaaは任意のアミノ酸であり、又はある実施態様
において、XaaはPro以外の任意のアミノ酸である。別の実施態様において、インフルエン
ザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドは:(a)HA1のN末端の長いステムセグメ
ントが1〜50の異種残基のリンカーに共有結合し、それがさらにHA1のC末端の長いステム
セグメントに共有結合したものを含むインフルエンザ血球凝集素HA1ドメインを含み;該HA
1ドメインは(b)インフルエンザ血球凝集素HA2ドメインと三次結合又は四次結合しており
、ここで、該インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、少なく
とも1つの修飾されたグリコシル化部位をさらに含み、ここで、該修飾されたグリコシル
化部位は、該修飾されたグリコシル化部位に結合するグリカンの能力を破壊する天然のグ
リコシル化部位の修飾を含む。別の実施態様において、該修飾は、アミノ酸配列Asn-Xaa-
Ser/Thr/Cysを有する天然のグリコシル化部位に1以上のアミノ酸置換を含み、ここで、Xa
aは任意のアミノ酸であり、又はある実施態様において、XaaはPro以外の任意のアミノ酸
である。別の実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリ
ペプチドは:(a)HA1のN末端ステムセグメントが1〜50の異種残基のリンカーに共有結合し
、それがさらにHA1のC末端ステムセグメントに共有結合したものを含むインフルエンザ血
球凝集素HA1ドメインを含み;該HA1ドメインは(b)インフルエンザ血球凝集素HA2ドメイン
と三次結合又は四次結合しており、ここで、該インフルエンザウイルス血球凝集素ステム
ドメインポリペプチドは、少なくとも1つの修飾されたグリコシル化部位をさらに含み、
ここで、該修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位に結合するグ
リカンの能力を破壊する天然のグリコシル化部位の修飾を含む。具体的な実施態様におい
て、該修飾は、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する天然のグリコシル化部位に1以
上のアミノ酸置換を含み、ここで、Xaaは任意のアミノ酸であり、又はある実施態様にお
いて、XaaはPro以外の任意のアミノ酸である。別の実施態様において、インフルエンザウ
イルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドは:(a)以下の順序で連結された:HA1のN末
端ステムセグメント、1〜50の異種残基の第1のリンカー、HA1の中間ステムセグメント、1
〜50の異種残基の第2のリンカー、及びHA1のC末端ステムセグメントを含むインフルエン
ザ血球凝集素HA1ドメインを含み;該HA1ドメインは(b)インフルエンザ血球凝集素HA2ドメ
インと三次結合又は四次結合しており、ここで、該インフルエンザウイルス血球凝集素ス
テムドメインポリペプチドは、少なくとも1つの修飾されたグリコシル化部位をさらに含
み、ここで、該修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位に結合す
るグリカンの能力を破壊する天然のグリコシル化部位の修飾を含む。具体的な実施態様に
おいて、該修飾は、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する天然のグリコシル化部位
に1以上のアミノ酸置換を含み、ここで、Xaaは任意のアミノ酸であり、又はある実施態様
において、XaaはPro以外の任意のアミノ酸である。
【０４４９】
(5.4.2  球状ヘッドドメイン中の非天然のグリコシル化部位)
別の実施態様において、本明細書に提供されるflu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、少
なくとも1つの非天然のグリコシル化部位を含むHA球状ヘッドドメインを含む。任意の特
定の動作理論に束縛されるものではないが、これらの免疫優性領域における1以上の非天
然のグリコシル化部位の付加による該HA球状ヘッドドメインの免疫優性抗原性領域のマス
キングは、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドのステムドメイン中の保存された亜免疫優性
抗原性領域に対する免疫原性を増大させることもできると考えられる。
【０４５０】
非天然のグリコシル化部位は、例えば、下記の実施例5に記載の部位特異的突然変異生
成技術を含む、当業者に知られている任意の公知の技術を用いて、本明細書に記載のflu
血球凝集素(HA)ポリペプチドのHA球状ヘッドドメインに付加することができる。好ましい
/具体的な実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、flu血球凝集素(HA)ポリペプ
チドの適切なフォールディングを妨害せず、及び/又は対象の免疫応答(例えば、抗体応答
)を誘発するflu血球凝集素(HA)ポリペプチドのステムドメインの能力を妨害しない。
【０４５１】
ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位を、A型インフルエンザ血球凝集素
のヘッドドメインに基づくHA球状ヘッドドメインに付加することができる。ある実施態様
において、HA球状ヘッドドメインは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、
H12、H13、H14、H15、H16、及びH17からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝
集素のヘッドドメインに基づく。ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位を、
B型インフルエンザ血球凝集素のヘッドドメインに基づくHA球状ヘッドドメインに付加す
ることができる。いくつかの実施態様において、HA球状ヘッドドメインは、B/アザラシ/
ネーデルラント/1/99のヘッドドメインに基づく。
【０４５２】
ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/
Cysを含み、ここで、Xaaは任意のアミノ酸であり、又はある実施態様において、XaaはPro
以外の任意のアミノ酸である。ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、ア
ミノ酸配列Asn-Ala-Serを含む。ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、A
sn-Asp-Serを含む。いくつかの実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Ar
g-Serを含む。他の実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Asn-Serを含む
。ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Cys-Serを含む。ある実施
態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Glu-Serを含む。他の実施態様におい
て、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Gln-Serを含む。いくつかの実施態様において、
非天然のグリコシル化部位は、Asn-Gly-Serを含む。ある実施態様において、非天然のグ
リコシル化部位は、Asn-His-Serを含む。他の実施態様において、非天然のグリコシル化
部位は、Asn-Ile-Serを含む。いくつかの実施態様において、非天然のグリコシル化部位
は、Asn-Lys-Serを含む。ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Leu
-Serを含む。他の実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Met-Serを含む
。他の実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Phe-Serを含む。ある実施
態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Pro-Serを含む。いくつかの実施態様
において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Ser-Serを含む。ある実施態様において、
非天然のグリコシル化部位は、Asn-Thr-Serを含む。他の実施態様において、非天然のグ
リコシル化部位は、Asn-Trp-Serを含む。ある実施態様において、非天然のグリコシル化
部位は、Asn-Tyr-Serを含む。ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn
-Val-Serを含む。
【０４５３】
ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、アミノ酸配列Asn-Ala-Thrを含
む。ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Asp-Thrを含む。いくつ
かの実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Arg-Thrを含む。他の実施態
様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Asn-Thrを含む。ある実施態様において
、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Cys-Thrを含む。ある実施態様において、非天然の
グリコシル化部位は、Asn-Glu-Thrを含む。他の実施態様において、非天然のグリコシル
化部位は、Asn-Gln-Thrを含む。いくつかの実施態様において、非天然のグリコシル化部
位は、Asn-Gly-Thrを含む。ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-H
is-Thrを含む。他の実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Ile-Thrを含
む。いくつかの実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Lys-Thrを含む。
ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Leu-Thrを含む。他の実施態
様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Met-Thrを含む。他の実施態様において
、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Phe-Thrを含む。ある実施態様において、非天然の
グリコシル化部位は、Asn-Pro-Thrを含む。いくつかの実施態様において、非天然のグリ
コシル化部位は、Asn-Ser-Thrを含む。ある実施態様において、非天然のグリコシル化部
位は、Asn-Thr-Thrを含む。他の実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-T
rp-Thrを含む。ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Tyr-Thrを含
む。ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Val-Thrを含む。
【０４５４】
ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、アミノ酸配列Asn-Ala-Cysを含
む。ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Asp-Cysを含む。いくつ
かの実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Arg-Cysを含む。他の実施態
様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Asn-Cysを含む。ある実施態様において
、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Cys-Cysを含む。ある実施態様において、非天然の
グリコシル化部位は、Asn-Glu-Cysを含む。他の実施態様において、非天然のグリコシル
化部位は、Asn-Gln-Cysを含む。いくつかの実施態様において、非天然のグリコシル化部
位は、Asn-Gly-Cysを含む。ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-H
is-Cysを含む。他の実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Ile-Cysを含
む。いくつかの実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Lys-Cysを含む。
ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Leu-Cysを含む。他の実施態
様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Met-Cysを含む。他の実施態様において
、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Phe-Cysを含む。ある実施態様において、非天然の
グリコシル化部位は、Asn-Pro-Cysを含む。いくつかの実施態様において、非天然のグリ
コシル化部位は、Asn-Ser-Cysを含む。ある実施態様において、非天然のグリコシル化部
位は、Asn-Thr-Cysを含む。他の実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-T
rp-Cysを含む。ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Tyr-Cysを含
む。ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、Asn-Val-Cysを含む。
【０４５５】
flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20、又はそれより多くの非天然のグ
リコシル化部位を有するHA球状ヘッドドメインを含むことができる。いくつかの実施態様
において、flu HAポリペプチドは、2〜5、4〜6、5〜10、又は10〜15の非天然のグリコシ
ル化部位を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、1つの非天
然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘッドドメインを含む。他の実施態様において、fl
u血球凝集素(HA)ポリペプチドは、2つの非天然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘッド
ドメインを含む。具体的な実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、3つの
非天然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘッドドメインを含む。他の実施態様において
、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、4つの非天然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘ
ッドドメインを含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、5つの
非天然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘッドドメインを含む。他の実施態様において
、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、6つの非天然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘ
ッドドメインを含む。他の実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、7つの
非天然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘッドドメインを含む。他の実施態様において
、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、8つの非天然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘ
ッドドメインを含む。他の実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、9つの
非天然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘッドドメインを含む。他の実施態様において
、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、10の非天然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘ
ッドドメインを含む。他の実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、11の
非天然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘッドドメインを含む。他の実施態様において
、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、12の非天然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘ
ッドドメインを含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、13の
非天然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘッドドメインを含む。ある実施態様において
、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、14の非天然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘ
ッドドメインを含む。他の実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、15の
非天然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘッドドメインを含む。他の実施態様において
、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、16の非天然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘ
ッドドメインを含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、17の
非天然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘッドドメインを含む。他の実施態様において
、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、18の非天然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘ
ッドドメインを含む。他の実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、19の
非天然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘッドドメインを含む。他の実施態様において
、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、20又はそれより多くの非天然のグリコシル化部位
を有するHA球状ヘッドドメインを含む。
【０４５６】
1以上の非天然のグリコシル化部位は、天然のグリコシル化部位が特定のインフルエン
ザウイルス亜型又は株に関して見られない球状ヘッドドメイン内の任意のアミノ酸位置に
位置することができる。非天然のグリコシル化部位を球状ヘッドドメインに導入する例示
的な突然変異を図21Bに示す。ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、H3
付番体系に従って、アミノ酸位置59-61、128-130、130-132、158-160、及び/又は163-165
にある。ある実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、H3付番体系に従って、ア
ミノ酸位置59-61、81-83、129-131、143-145、158-160、165-167、170-172、187-189、19
3-195、197-199、及び/又は208-210にある。いくつかの実施態様において、非天然のグリ
コシル化部位は、H3付番に従って、アミノ酸位置59-61にある。他の実施態様において、
非天然のグリコシル化部位は、H3付番に従って、アミノ酸位置129-131にある。他の実施
態様において、非天然のグリコシル化部位は、H3付番に従って、アミノ酸位置129-131及
び158-160にある。いくつかの実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、H3付番
に従って、アミノ酸位置59-61、129-131及び165-167にある。いくつかの実施態様におい
て、非天然のグリコシル化部位は、H3付番に従って、アミノ酸位置59-61、129-131、158-
160、及び165-167にある。いくつかの実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、
H3付番に従って、アミノ酸位置81-83、129-131、158-160、165-167、170-172、187-189、
及び208-210にある。他の実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、H3付番に従
って、アミノ酸位置81-83、129-131、158-160、170-172、187-189、及び208-210にある。
さらに他の実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、H3付番に従って、アミノ酸
位置129-131、158-160、165-167、170-172、187-189、及び208-210にある。
【０４５７】
好ましい実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、球状ヘッドドメイン中の抗
原性領域に位置し、それにより、抗原性領域が免疫応答を誘発するのを遮断する。球状ド
メイン中の例示的な抗原性領域としては、H1亜型のSa、Sb、Ca、及びCb抗原性部位(図21A
)、並びにH3亜型のA、B、C、D抗原性領域が挙げられるが、これらに限定されない。いく
つかの実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H1亜型球状ヘッドドメイ
ンのSa抗原性領域中に位置する非天然のグリコシル化部位を含む。ある実施態様において
、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H1亜型球状ヘッドドメインのSb抗原性領域中に位
置する非天然のグリコシル化部位を含む。他の実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポ
リペプチドは、H1亜型球状ヘッドドメインのCa抗原性領域中に位置する非天然のグリコシ
ル化部位を含む。また他の実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H1亜
型球状ヘッドドメインのCb抗原性領域中に位置する非天然のグリコシル化部位を含む。別
の実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H1亜型球状ヘッドドメインのS
a及びSb抗原性領域中に位置する非天然のグリコシル化部位を含む。別の実施態様におい
て、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H1亜型球状ヘッドドメインのSa及びCa抗原性領
域中に位置する非天然のグリコシル化部位を含む。別の実施態様において、flu血球凝集
素(HA)ポリペプチドは、H1亜型球状ヘッドドメインのSa及びCb抗原性領域中に位置する非
天然のグリコシル化部位を含む。別の実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチ
ドは、H1亜型球状ヘッドドメインのSb及びCa抗原性領域中に位置する非天然のグリコシル
化部位を含む。別の実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H1亜型球状
ヘッドドメインのSb及びCb抗原性領域中に位置する非天然のグリコシル化部位を含む。別
の実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H1亜型球状ヘッドドメインのC
a及びCb抗原性領域中に位置する非天然のグリコシル化部位を含む。別の実施態様におい
て、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H1亜型球状ヘッドドメインのSa、Sb、及びCa抗
原性領域中に位置する非天然のグリコシル化部位を含む。別の実施態様において、flu血
球凝集素(HA)ポリペプチドは、H1亜型球状ヘッドドメインのSb、Ca、及びCb抗原性領域中
に位置する非天然のグリコシル化部位を含む。別の実施態様において、flu血球凝集素(HA
)ポリペプチドは、H1亜型球状ヘッドドメインのSa、Sb、Ca、及びCb抗原性領域中に位置
する非天然のグリコシル化部位を含む。
【０４５８】
いくつかの実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、H3亜型球状ヘッドドメイ
ンのA抗原性領域中にある。いくつかの実施態様において、非天然のグリコシル化部位は
、H3亜型球状ヘッドドメインのB抗原性領域中にある。いくつかの実施態様において、非
天然のグリコシル化部位は、H3亜型球状ヘッドドメインのC抗原性領域中にある。いくつ
かの実施態様において、非天然のグリコシル化部位は、H3亜型球状ヘッドドメインのD抗
原性領域中にある。別の実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3亜型
球状ヘッドドメインのA及びB抗原性領域中に位置する非天然のグリコシル化部位を含む。
別の実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3亜型球状ヘッドドメイン
のA及びC抗原性領域中に位置する非天然のグリコシル化部位を含む。別の実施態様におい
て、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3亜型球状ヘッドドメインのA及びD抗原性領域
中に位置する非天然のグリコシル化部位を含む。別の実施態様において、flu血球凝集素(
HA)ポリペプチドは、H3亜型球状ヘッドドメインのB及びC抗原性領域中に位置する非天然
のグリコシル化部位を含む。別の実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは
、H3亜型球状ヘッドドメインのB及びD抗原性領域中に位置する非天然のグリコシル化部位
を含む。別の実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3亜型球状ヘッド
ドメインのC及びD抗原性領域中に位置する非天然のグリコシル化部位を含む。別の実施態
様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3亜型球状ヘッドドメインのA、B、及
びC抗原性領域中に位置する非天然のグリコシル化部位を含む。別の実施態様において、f
lu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3亜型球状ヘッドドメインのB、C、及びD抗原性領域
中に位置する非天然のグリコシル化部位を含む。別の実施態様において、flu血球凝集素(
HA)ポリペプチドは、H3亜型球状ヘッドドメインのA、B、C、及びD抗原性領域中に位置す
る非天然のグリコシル化部位を含む。
【０４５９】
他の実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H1、H2、H3、H4、H5、H6
、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、又はH17球状ヘッドドメインの1以
上の抗原性領域に1以上の非天然のグリコシル化部位を含む。
【０４６０】
ある実施態様において、1以上の非天然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘッドドメ
インを含むflu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、キメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドである。ある実施態様において、1以上の非天然のグリコシル化部位を有
するHA球状ヘッドドメインを含むflu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、非キメラインフル
エンザウイルス血球凝集素ポリペプチドである。
【０４６１】
(5.4.3  球状ヘッドドメイン中の非天然のグリコシル化部位及びステムドメイン中の修飾
されたグリコシル化部位)
別の実施態様において、本明細書に提供されるflu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、1つ
、2つ、又はそれより多くの修飾されたグリコシル化部位を有するHAステムドメイン、及
び1つ、2つ、又はそれより多くの非天然のグリコシル化部位を有するHA球状ヘッドを含み
、ここで、該修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位に結合する
グリカンの能力を破壊する天然のグリコシル化部位の修飾を含む。修飾されたグリコシル
化部位及び非天然のグリコシル化部位は、当技術分野で公知であり及び/又は本明細書に
記載されている技術を用いて生じさせることができる。具体的な実施態様において、修飾
されたグリコシル化部位(複数可)及び非天然のグリコシル化部位(複数可)は、flu HAポリ
ペプチドの適切なフォールディングを妨害せず、及び/又は対象の免疫応答(例えば、抗体
応答)を誘発するflu HAポリペプチドのステムドメインの能力を妨害しない。修飾された
グリコシル化部位及び非天然のグリコシル化部位の説明については、上記の第5.4.1節及
び第5.4.2節を参照されたい。上記の第5.4.1節及び第5.4.2節に記載の修飾されたグリコ
シル化部位と非天然のグリコシル化部位は両方とも、flu HAポリペプチドに組み込むこと
ができる。
【０４６２】
ある実施態様において、本明細書に提供されるflu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、H3
付番に従って、位置33-35及び289-291に修飾されたグリコシル化部位を有するHAステムド
メイン;及びH3付番に従って、以下の位置:129-131、158-160、165-167、170-172、187-18
9、及び208-210のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又は7つに非天然のグリコシル
化部位を含むHA球状ヘッドドメインを含む。
【０４６３】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、球状ヘッドドメイン中の1以
上の非天然のグリコシル化部位及びステムドメイン中の1以上の修飾されたグリコシル化
部位を含むキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドであり、ここで、該ステムドメ
イン中の修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル
化を破壊する修飾を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、
球状ヘッドドメイン中の1以上の非天然のグリコシル化部位及びステムドメイン中の1以上
の修飾されたグリコシル化部位を含むキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドであ
り、ここで、該ステムドメイン中の修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコ
シル化部位でのグリコシル化を破壊する修飾を含み、及びここで、(i)該非天然のグリコ
シル化部位は、H3付番に従って、アミノ酸位置81-83、129-131、158-160、165-167、170-
172、187-189、及び208-210のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、又はそれより
多くにあり、並びに(ii)該修飾されたグリコシル化部位は、H3付番に従って、アミノ酸位
置20-23、33-35、271-273、289-291、及び/又は483-485のうちの1つ、2つ、3つ、又はそ
れより多くにある。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、球状ヘ
ッドドメイン中の1以上の非天然のグリコシル化部位を含み、かつステムドメイン中の1以
上の修飾されたグリコシル化部位を含むキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドで
あり、ここで、該ステムドメイン中の修飾されたグリコシル化部位は、該修飾されたグリ
コシル化部位でのグリコシル化を破壊する修飾を含み、及びここで、(i)該非天然のグリ
コシル化部位は、H3付番に従って、アミノ酸位置81-83、129-131、158-160、170-172、18
7-189、及び208-210にあり、及び(ii)該修飾されたグリコシル化部位は、H3付番に従って
、アミノ酸位置33-35及び289-291にある。別の具体的な実施態様において、本明細書に提
供されるのは、ステムドメイン中の1以上の修飾されたグリコシル化部位を含む球状ヘッ
ドドメイン中の1以上の非天然のグリコシル化部位を含むキメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドを含み、ここで、該ステムドメイン中の修飾されたグリコシル化部位は、
該修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル化を破壊する修飾を含み、及びここで、(i
)該非天然のグリコシル化部位は、H3付番に従って、アミノ酸位置81-83、129-131、158-1
60、165-167、170-172、187-189、及び208-210にあり、及び(ii)該修飾されたグリコシル
化部位は、H3付番に従って、アミノ酸位置33-35及び289-291にある。別の具体的な実施態
様において、本明細書に提供されるのは、ステムドメイン中の1以上の修飾されたグリコ
シル化部位を含む球状ヘッドドメイン中の1以上の非天然のグリコシル化部位を含むキメ
ラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含み、ここで、該ステムドメイン中の修飾さ
れたグリコシル化部位は、該修飾されたグリコシル化部位でのグリコシル化を破壊する修
飾を含み、及びここで、(i)該非天然のグリコシル化部位は、H3付番に従って、アミノ酸
位置129-131、158-160、165-167、170-172、187-189、及び208-210にあり、及び(ii)該修
飾されたグリコシル化部位は、H3付番に従って、アミノ酸位置33-35及び289-291にある。
修飾されたグリコシル化部位を含む例示的なキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドは、第6.11節(実施例11)に記載されている。
【０４６４】
(5.5  flu血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする核酸)
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば
、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)をコードする核酸である。遺
伝暗号の縮重のために、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする
任意の核酸が本明細書に包含される。ある実施態様において、HA1のN末端ステムセグメン
ト、HA1のC末端ステムセグメント、HA2ドメイン、内腔ドメイン、膜貫通ドメイン、及び/
又は細胞質ドメインをコードする天然のインフルエンザウイルス核酸に対応する核酸を用
いて、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチド)を産生する。
【０４６５】
同じく本明細書に提供されるのは、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、キメライ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)をコードする核酸にハイブリダイスする
ことができる核酸である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、flu血球
凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチ
ド)をコードする核酸の断片にハイブリダイスすることができる核酸である。他の実施態
様において、本明細書に提供されるのは、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、キメ
ラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)をコードする核酸の全長にハイブリ
ダイスすることができる核酸である。核酸のハイブリダイゼーション条件の一般的なパラ
メータは、Sambrookらの文献、分子クローニング-実験マニュアル(Molecular Cloning - 
A Laboratory Manual)(第2版, 1〜3巻, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring H
arbor, New York(1989))、及びAusubelらの文献、分子生物学の最新プロトコル(Current 
Protocols in Molecular Biology)(2巻, Current Protocols Publishing, New York(1994
))に記載されている。ハイブリダイゼーションは、高いストリンジェンシー条件、中間の
ストリンジェンシー条件、又は低いストリンジェンシー条件の下で実施することができる
。当業者は、低いストリンジェンシー条件、中間のストリンジェンシー条件、及び高いス
トリンジェンシー条件は、その全てが相互作用する複数の因子に左右され、また、当該核
酸によっても決まることを理解するであろう。例えば、高いストリンジェンシー条件は、
核酸(複数可)の融点の5℃以内の温度、低い塩濃度(例えば、250mM未満)、及び高い共溶媒
濃度(例えば、1〜20％の共溶媒、例えば、DMSO)を含むことができる。他方、低いストリ
ンジェンシー条件は、核酸(複数可)の融点より10℃を超えて低い温度、高い塩濃度(例え
ば、1000mM超)、及び共溶媒の欠如を含むことができる。
【０４６６】
いくつかの実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、キメラインフ
ルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)をコードする核酸が単離される。ある実施態
様において、「単離された」核酸は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離
されている核酸分子を指す。つまり、単離された核酸は、天然ではそれに関連していない
異種核酸を含むことができる。他の実施態様において、「単離された」核酸、例えば、cD
NA分子は、組換え技術によって産生されたとき、他の細胞物質もしくは培養培地を実質的
に含まないものであるか、又は化学合成されたとき、化学物質前駆体もしくは他の化学物
質を実質的に含まないものであることができる。「細胞物質を実質的に含まない」という
用語には、それが単離されるか又は組換えで産生される細胞の細胞成分から核酸が分離さ
れている核酸調製物が含まれる。したがって、細胞物質を実質的に含まない核酸には、(
乾燥重量で)約30％、20％、10％、又は5％未満の他の核酸を有する核酸調製物が含まれる
。「培養培地を実質的に含まない」という用語には、培養培地が調製物の容量の約50％、
20％、10％、又は5％未満である核酸調製物が含まれる。「化学物質前駆体又は他の化学
物質を実質的に含まない」という用語には、核酸の合成に関与する化学物質前駆体又は他
の化学物質から核酸が分離されている調製物が含まれる。具体的な実施態様において、そ
のような核酸調製物は、(乾燥重量で)約50％、30％、20％、10％、5％未満の化学物質前
駆体又は関心対象の核酸以外の化合物を有する。
【０４６７】
さらに、本明細書に提供されるのは、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペ
プチドの個々の成分をコードする核酸である。具体的な実施態様において、HA1のN末端ス
テムセグメント、HA1のC末端ステムセグメント、及び/又はHA2ドメインをコードする核酸
が提供される。インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドの成分をコードす
る核酸は、当業者に公知の標準的な分子生物学の技術を用いてアセンブルすることができ
る。
【０４６８】
(5.6  flu血球凝集素(HA)ポリペプチドの発現)
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば
、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)をコードする核酸を含む、発
現ベクターを含む、ベクターである。具体的な実施態様において、該ベクターは、flu血
球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプ
チド)をコードする核酸の発現を導くことができる発現ベクターである。発現ベクターの
非限定的な例としては、プラスミド及びウイルスベクター、例えば、複製欠損レトロウイ
ルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びバキュロウイルスが挙げられるが、こ
れら限定されない。発現ベクターとしては、限定されないが、トランスジェニック動物及
び非哺乳動物細胞/生物体、例えば、哺乳動物のN結合型グリコシル化を行なうように改変
されている哺乳動物細胞/生物体を挙げることもできる。
【０４６９】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、flu血球凝集素(HA)ポリペ
プチド(例えば、ステムドメイン及びヘッドドメイン、又はどちらかのドメインの部分)の
成分をコードする発現ベクターである。そのようなベクターを用いて、1以上の宿主細胞
で該成分を発現させることができ、該成分を、当業者に公知の技術を用いて、単離し、リ
ンカーとコンジュゲートさせることができる。
【０４７０】
発現ベクターは、宿主細胞内での核酸の発現に好適な形態の本明細書に記載のflu血球
凝集素(HA)ポリペプチドをコードする核酸を含む。具体的な実施態様において、発現ベク
ターは、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される、発現させる核酸に機能的に連
結された1以上の調節配列を含む。発現ベクターにおいて、「機能的に連結された」とは
、関心対象の核酸が、(例えば、インビトロ転写/翻訳系での、又はベクターが宿主細胞に
導入される場合は宿主細胞での)核酸の発現を可能にする様式で調節配列(複数可)に連結
されていることを意味するものとする。調節配列には、プロモーター、エンハンサー、及
び他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)が含まれる。調節配列には
、多くのタイプの宿主細胞で核酸の構成的発現を導くもの、特定の宿主細胞でのみ核酸の
発現を導くもの(例えば、組織特異的調節配列)、及び特定の薬剤による刺激によって核酸
の発現を導くもの(例えば、誘導可能な調節配列)が含まれる。発現ベクターの設計は、形
質転換される宿主細胞の選択、タンパク質の所望の発現レベルのような因子によって決ま
り得ることが当業者には理解されるであろう。「宿主細胞」という用語は、核酸で形質転
換又はトランスフェクトされる特定の対象細胞、及びそのような細胞の子孫又は可能性の
ある子孫を含むものとする。そのような細胞の子孫は、後続の世代で起こり得る突然変異
もしくは環境の影響又は宿主細胞ゲノムへの核酸の組込みのために、核酸で形質転換又は
トランスフェクトされる親細胞と同一でなくてもよい。
【０４７１】
発現ベクターは、原核生物細胞(例えば、大腸菌(E. coli))又は真核生物細胞(例えば、
昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを使用、例えば、引用によりその全体が本明細
書中に組み込まれている、Treanorらの文献(2007, JAMA, 297(14):1577-1582)参照)、酵
母細胞、植物細胞、藻類、もしくは哺乳動物細胞)を用いて、本明細書に記載のflu血球凝
集素(HA)ポリペプチドの発現のために設計することができる。酵母宿主細胞の例としては
、分裂酵母(S. pombe)及び出芽酵母(S. cerevisiae)並びに下記の実施例が挙げられるが
、これらに限定されない。哺乳動物宿主細胞の例としては、Crucell Per.C6細胞、Vero細
胞、CHO細胞、VERY細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞、MDCK細胞、293細胞、3T3細胞、
又はWI38細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施態様において、宿主細胞
は、骨髄腫細胞、例えば、NS0細胞、45.6 TG1.7細胞、AF-2クローン9B5細胞、AF-2クロー
ン9B5細胞、J558L細胞、MOPC 315細胞、MPC-11細胞、NCI-H929細胞、NP細胞、NS0/1細胞
、P3 NS1 Ag4細胞、P3/NS1/1-Ag4-1細胞、P3U1細胞、P3X63Ag8細胞、P3X63Ag8.653細胞、
P3X63Ag8U.1細胞、RPMI 8226細胞、Sp20-Ag14細胞、U266B1細胞、X63AG8.653細胞、Y3.Ag
.1.2.3細胞、及びYO細胞である。昆虫細胞の非限定的な例としては、Sf9、Sf21、キンウ
ワバ(Trichoplusia ni)、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)、及びカイコガ(Bombyx mori
)が挙げられる。特定の実施態様において、哺乳動物細胞培養系(例えば、チャイニーズハ
ムスター卵巣又はベビーハムスター腎臓細胞)が、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドの発現
に使用される。別の実施態様において、植物細胞培養系が、flu血球凝集素(HA)ポリペプ
チドの発現に使用される。植物細胞培養系を利用するタンパク質の産生のための植物細胞
及び方法については、例えば、米国特許第7,504,560号;第6,770,799号;第6,551,820号;第
6,136,320号;第6,034,298号;第5,914,935号;第5,612,487号;及び第5,484,719号、並びに
米国特許出願公開第2009/0208477号、第2009/0082548号、第2009/0053762号、第2008/003
8232号、第2007/0275014号、及び第2006/0204487号を参照されたい。具体的な実施態様に
おいて、植物細胞培養系は、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドの発現に使用されない。本
明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス
血球凝集素ポリペプチド)をコードする核酸を含む宿主細胞を単離することができ、すな
わち、細胞は、対象の体外にある。ある実施態様において、該細胞は、本明細書に記載の
flu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリ
ペプチド)をコードする核酸を発現するように改変される。
【０４７２】
発現ベクターは、従来の形質転換又はトランスフェクション技術によって宿主細胞に導
入することができる。そのような技術としては、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共
沈、DEAE-デキストランによるトランスフェクション、リポフェクション、及びエレクト
ロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞を形質転換又はトラン
スフェクトするための好適な方法は、Sambrookらの文献(1989, 分子クローニング-実験マ
ニュアル(Molecular Cloning - A Laboratory Manual), 第2版, Cold Spring Harbor Pre
ss, New York)、及び他の実験マニュアルに見出すことができる。ある実施態様において
、宿主細胞は、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターで
一過性にトランスフェクトされる。他の実施態様において、宿主細胞は、flu血球凝集素(
HA)ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターで安定にトランスフェクトされる
。
【０４７３】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについて、使用される発現ベクター及びト
ランスフェクション技術によっては、細胞のごく一部だけが外来性DNAをそのゲノムに組
み込むことができることが知られている。これらの組込み体を同定及び選択するために、
(例えば、抗生物質耐性のための)選択マーカーをコードする核酸が、通常、関心対象の核
酸と一緒に宿主細胞に導入される。選択マーカーの例としては、薬剤、例えば、G418、ハ
イグロマイシン、及びメトトレキセートに対する耐性を付与するものが挙げられる。導入
された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択によって同定することがで
きる(例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する)
。
【０４７４】
宿主細胞を用いたflu血球凝集素(HA)ポリペプチドの組換え発現の代替法として、flu血
球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを、例えば、T7プロモー
ター調節配列及びT7ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写及び翻訳することができる
。具体的な実施態様において、共役転写/翻訳系、例えば、Promega TNT(登録商標)、又は
転写及び翻訳に必要な成分を含む細胞溶解物もしくは細胞抽出物を用いて、flu血球凝集
素(HA)ポリペプチドを産生することができる。
【０４７５】
flu血球凝集素(HA)ポリペプチドが産生されると、それは、タンパク質の単離又は精製
のための当技術分野で公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン
交換、親和性、特に、特定の抗原に対する親和性、プロテインAによるもの、及びサイジ
ングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、示差溶解性、又はタンパク質の単離もしく
は精製のための任意の他の標準的な技術によって単離又は精製することができる。ある実
施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、熱ショックタンパク質(例えば、Hs
p10、Hsp20、Hsp30、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90、又はHsp100)とともに又はそれなしで
、異種タンパク質、例えば、主要組織適合性複合体(MHC)とコンジュゲートさせることが
できる。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、免疫調節分子、例
えば、免疫細胞、例えば、B細胞(例えば、C3d)又はT細胞にflu血球凝集素(HA)ポリペプチ
ドをターゲッティングするタンパク質とコンジュゲートさせることができる。ある実施態
様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、自然免疫系を刺激するタンパク質、例
えば、インターフェロン1型、アルファ、ベータ、もしくはガンマインターフェロン、コ
ロニー刺激因子、例えば、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インター
ロイキン(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23
、腫瘍壊死因子(TNF)-β、TNFα、B7.1、B7.2、4-1BB、CD40リガンド(CD40L)、及び薬剤
誘導性CD40(iCD40)とコンジュゲートさせることができる。
【０４７６】
したがって、本明細書に提供されるのは、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、キ
メラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド)を産生する方法である。一実
施態様において、本方法は、ポリペプチドが産生されるように、ポリペプチドをコードす
る核酸を含む宿主細胞を好適な培地中で培養することを含む。いくつかの実施態様におい
て、本方法は、ポリペプチドを培地又は宿主細胞から単離することをさらに含む。
【０４７７】
(5.7  インフルエンザウイルスベクター)
一態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポ
リペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド)を含む
インフルエンザウイルスである。具体的な実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペ
プチドをインフルエンザウイルスのビリオンに組み込む。インフルエンザウイルスを、免
疫細胞などの特定の細胞型にウイルスをターゲッティングする部分にコンジュゲートさせ
もよい。いくつかの実施態様において、インフルエンザウイルスのビリオンは、flu血球
凝集素(HA)ポリペプチドに加えて、異種ポリペプチドをそれらに組み込んでいるか、又は
それを発現する。異種ポリペプチドは、免疫増強活性を有するか、又は特定の細胞型にイ
ンフルエンザウイルスをターゲッティングするポリペプチド、例えば、特定の細胞型の表
面の抗原に結合する抗体、又は特定の細胞型の表面の特異的受容体に結合するリガンドで
あってもよい。
【０４７８】
flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むインフルエンザウイルスは、当業者に公知の技
術、例えば、リバースジェネティクス及びヘルパーフリープラスミドレスキューを用いて
、ビリオンの産生の間にトランスでflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを供給することによ
って産生することができる。或いは、血球凝集素機能がトランスで提供されているウイル
スに感染しやすい細胞でflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現するように改変されたゲ
ノムを含む親インフルエンザウイルスの複製は、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む
子孫インフルエンザウイルスを産生する。
【０４７９】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを発
現するように改変されたゲノムを含むインフルエンザウイルスである。具体的な実施態様
において、親インフルエンザウイルスのゲノムは、子孫インフルエンザウイルスによって
発現されるflu血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードするように改変される。別の具体的
な実施態様において、親インフルエンザウイルスのゲノムは、発現されて、子孫インフル
エンザウイルスのビリオンに組み込まれるflu血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする
ように改変される。したがって、親インフルエンザウイルスの複製によって生じる子孫イ
ンフルエンザウイルスは、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む。親インフルエンザウ
イルスのビリオンは、同じ又は異なる型、亜型、又は株のインフルエンザウイルスに由来
するステム又はヘッドドメインを含むflu血球凝集素(HA)ポリペプチドをそれらに組み込
んでいてもよい。或いは、親インフルエンザウイルスのビリオンは、機能的に、インフル
エンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの活性(例えば、インフルエンザウイルス血球凝
集素の受容体結合及び/又は融合活性)のうちの1つ又は複数を置換することができる部分
をそれらに組み込んでいてもよい。ある実施態様において、インフルエンザウイルス血球
凝集素ポリペプチドの活性のうちの1つ又は複数は、(i)インフルエンザウイルスと異種の
ポリペプチドの細胞外ドメインが(ii)インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの
膜貫通ドメイン、又は膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに融合したものを含む融合タン
パク質によって提供される。具体的な実施態様において、親インフルエンザウイルスのビ
リオンは、(i)インフルエンザウイルス以外の感染性病原体の受容体結合性/融合原性ポリ
ペプチドの細胞外ドメインが(ii)インフルエンザウイルス血球凝集素の膜貫通ドメイン、
又は膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに融合したものを含む融合タンパク質をそれらに
組み込んでいてもよい。インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの1以上の活性
を提供する融合タンパク質、及びそのような融合タンパク質を発現するように改変された
インフルエンザウイルスの産生方法の説明については、例えば、2007年6月7日に公開され
た国際特許出願公開WO 2007/064802号及び2006年12月1日に出願された米国特許出願第11/
633,130号を参照されたく;これらは各々、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれ
ている。
【０４８０】
ある実施態様において、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドのうちの1つ
又複数を発現するように改変されたインフルエンザウイルスは、flu血球凝集素(HA)ポリ
ペプチドの球状ヘッドが由来する源と同じ源(例えば、インフルエンザウイルス株又は亜
型)に由来するものである、ノイラミニダーゼ(NA)、又はその断片を含む。ある実施態様
において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのう
ちの1つ又複数を発現するように改変されたインフルエンザウイルスは、キメラインフル
エンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドが由来する源と同じ源(例えば、イ
ンフルエンザウイルス株又は亜型)に由来するものである、ノイラミニダーゼ(NA)、又は
その断片を含み、ここで、該球状ヘッドは、該キメラインフルエンザウイルス血球凝集素
ポリペプチドのHA1及び/又はHA2サブユニットのステムドメインと異種である。
【０４８１】
いくつかの実施態様において、親インフルエンザウイルスのビリオンは、異種ポリペプ
チドをそれらに組み込んでいる。ある実施態様において、親インフルエンザウイルスのゲ
ノムは、子孫インフルエンザウイルスによって発現される異種ポリペプチド及びflu血球
凝集素(HA)ポリペプチドをコードするように改変される。具体的な実施態様において、fl
u血球凝集素(HA)ポリペプチド、異種ポリペプチド、又は両方は、子孫インフルエンザウ
イルスのビリオンに組み込まれる。
【０４８２】
異種ポリペプチドは、特定の細胞型にインフルエンザウイルスをターゲッティングする
ポリペプチド、例えば、特定の細胞型の表面の抗原を認識する抗体、又は特定の細胞型の
表面の特異的受容体に結合するリガンドであってもよい。いくつかの実施態様において、
ターゲッティングポリペプチドは、ウイルスの標的細胞認識機能を代替する。具体的な実
施態様において、異種ポリペプチドは、インフルエンザウイルスが天然で感染するのと同
じ細胞型にインフルエンザウイルスをターゲッティングする。他の具体的な実施態様にお
いて、異種ポリペプチドは、免疫細胞、例えば、B細胞、T細胞、マクロファージ、又は樹
状細胞に子孫インフルエンザウイルスをターゲッティングする。いくつかの実施態様にお
いて、異種ポリペプチドは、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞の細胞特異的マーカー(例
えば、CD44など)を認識して、それに結合する。一実施態様において、異種ポリペプチド
は、樹状細胞にウイルスをターゲッティングするDC-SIGNである。別の実施態様において
、異種ポリペプチドは、免疫細胞にウイルスをターゲッティングする抗体(例えば、単鎖
抗体)であり、この抗体は、それがインフルエンザウイルスビリオンに組み込まれるよう
に、別のポリペプチド由来の膜貫通ドメインと融合されていてもよい。いくつかの実施態
様において、抗体は、CD20抗体、CD34抗体、又はDEC-205に対する抗体である。ターゲッ
ティング機能のあるポリペプチドを発現するようにウイルスを改変する技術は当技術分野
で公知である。例えば、Yangらの文献(2006, PNAS103:11479-11484)及び2008年1月24日に
公開された米国特許出願公開第20080019998号及び2007年1月25日に公開された第20070020
238号を参照されたく、その各々の内容は、引用によりその全体が本明細書中に組み込ま
れる。
【０４８３】
別の実施態様において、異種ポリペプチドは、ウイルス付着タンパク質である。その付
着タンパク質(複数可)をこの態様で使用することができるウイルスの非限定的な例は、以
下の群から選択されるウイルスである:ラッサ熱ウイルス、B型肝炎ウイルス、狂犬病ウイ
ルス、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイル
ス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス
、アルファウイルス、例えば、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、及びアウラ
ウイルス(E1、E2、及びE3などの表面糖タンパク質を含む)、ボルナ病ウイルス、ハンター
ンウイルス、フォーミーウイルス、並びにSARS-CoVウイルス。
【０４８４】
一実施態様において、フラビウイルス表面糖タンパク質、例えば、デングウイルス(DV)
Eタンパク質を使用することができる。いくつかの実施態様において、アルファウイルス
ファミリー由来のシンドビスウイルス糖タンパク質が使用される(K. S. Wang, R. J. Kuh
n, E. G. Strauss, S. Ou, J. H. Straussの文献(J. Virol. 66, 4992(1992))。ある実施
態様において、異種ポリペプチドは、NDV HNもしくはFタンパク質;ヒト免疫不全ウイルス
(HIV)gp160(又はその産物、例えば、gp41もしくはgp120);B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsA
g);ヘルペスウイルスの糖タンパク質(例えば、gD、gE);或いはポリオウイルスのVP1に由
来する。
【０４８５】
別の実施態様において、異種ポリペプチドは、当技術分野で公知の任意の非ウイルスタ
ーゲッティング系に由来する。ある実施態様において、非ウイルス病原体、例えば、細胞
内細菌又は細胞内原虫のタンパク質が使用される。いくつかの実施態様において、細菌ポ
リペプチドは、例えば、クラミジア(Chlamydia)、リケッチア(Rikettsia)、コクセリア(C
oxelia)、リステリア(Listeria)、ブルセラ(Brucella)、又はレジオネラ(Legionella)に
よって提供される。いくつかの実施態様において、原虫のポリペプチドは、例えば、マラ
リア原虫(Plasmodia)種、リューシマニア属(Leishmania)種、トキソプラズマ原虫(Toxopl
asma gondii)、又はクルーズトリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)によって提供される。
他の例示的なターゲッティング系は、その全体が本明細書中に組み込まれている、Waehle
rらの文献(2007、「遺伝子治療のための標的ウイルスベクターの改変(Engineering targe
ted viral vectors for gene therapy)」, Nature Reviews Genetics 8:573-587)に記載
されている。
【０４８６】
ある実施態様において、インフルエンザウイルスによって発現される異種ポリペプチド
は、免疫増強(免疫賦活)活性を有する。免疫増強ポリペプチドの非限定的な例としては、
刺激分子、サイトカイン、ケモカイン、抗体、及び他の作用物質、例えば、Flt-3リガン
ドが挙げられるが、これらに限定されない。免疫増強活性のあるポリペプチドの具体的な
例としては、以下が挙げられる:インターフェロン1型、アルファ、ベータ、もしくはガン
マインターフェロン、コロニー刺激因子、例えば、顆粒球-マクロファージコロニー刺激
因子(GM-CSF)、インターロイキン(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15
、IL-18、IL-21、IL-23、腫瘍壊死因子(TNF)-β、TNFα、B7.1、B7.2、4-1BB、CD40リガ
ンド(CD40L)及び薬剤誘導性CD40(iCD40)(例えば、引用によりその全体が本明細書中に組
み込まれている、Hanks, B. A.らの文献(2005. Nat Med 11:130-137)を参照されたい)。
【０４８７】
A型及びB型インフルエンザウイルスのゲノムは8本(8)の一本鎖のマイナスセンスセグメ
ントからなる(C型インフルエンザウイルスは7本(7)の一本鎖のマイナスセンスセグメント
からなる)ので、親インフルエンザウイルスのゲノムは、組換えセグメント、並びに当業
者に公知の技術、例えば、リバースジェネティクス及びヘルパーフリープラスミドレスキ
ューを用いて、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド(及び任意の他のポリペプチド、例えば、
異種ポリペプチド)を発現するように改変することができる。一実施態様において、組換
えセグメントは、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド、並びにvRNAの適切な複製、転写、及
びパッケージングに必要とされる3'及び5'組込みシグナルをコードする核酸を含む(Fujii
らの文献(2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2002-2007);Zhengらの文献(1996, Vir
ology 217:242-251)、これらは両方とも、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれ
る)。具体的な実施態様において、組換えセグメントは、親インフルエンザウイルスと異
なる又は同じ型、亜型、又は株に由来するインフルエンザウイルスのセグメントの3'及び
5'非コード及び/又は非翻訳配列を使用する。いくつかの実施態様において、組換えセグ
メントは、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの3'非コード領域、インフル
エンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの非翻訳領域、及びインフルエンザウイルス血球
凝集素ポリペプチドの5'非コード領域を含む。具体的な実施態様において、組換えセグメ
ントは、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドのHA1のN末端ステムセグメント、HA1のC末端ス
テムセグメント、球状ヘッドドメイン、及び/又はHA2として、インフルエンザウイルス型
と同じ型、亜型、又は株であるインフルエンザウイルスのHAセグメントの3'及び5'非コー
ド並びに/又は非翻訳配列を含む。ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチ
ドをコードする組換えセグメントは、親インフルエンザウイルスのHAセグメントを代替す
ることができる。いくつかの実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドをコー
ドする組換えセグメントは、親インフルエンザウイルスのNS1遺伝子を代替することがで
きる。いくつかの実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする組換
えセグメントは、親インフルエンザウイルスのNA遺伝子を代替することができる。flu血
球凝集素(HA)ポリペプチドを発現させるために使用することができる例示的なインフルエ
ンザウイルス株としては、アンアーバー/1/50、A/アンアーバー/6/60、A/プエルトリコ/8
/34、A/サウスダコタ/6/2007、A/ウルグアイ/716/2007、A/カリフォルニア/07/2009、A/
パース/16/2009、A/ブリスベン/59/2007、A/ブリスベン/10/2007、及びB/ブリスベン/60/
2008が挙げられる。
【０４８８】
いくつかの実施態様において、flu血球凝集素遺伝子セグメントは、flu血球凝集素(HA)
ポリペプチドをコードする。具体的な実施態様において、flu血球凝集素(HA)遺伝子セグ
メント及び少なくとも1つの他のインフルエンザウイルス遺伝子セグメントは、該flu血球
凝集素(HA)遺伝子セグメント及び該少なくとも1つの他の遺伝子セグメントを組換えイン
フルエンザウイルスの複製時に一緒に分離することを可能にするパッケージングシグナル
を含む(Gao及びPaleseの文献(2009, PNAS 106:15891-15896);及び国際出願公開WO11/0146
45号参照)。
【０４８９】
いくつかの実施態様において、親インフルエンザウイルスのゲノムは、二シストロン性
である組換えセグメントを用いて、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現するように改
変することができる。二シストロン性技術は、内部リボソーム侵入部位(IRES)配列の使用
により、複数のタンパク質のコード配列の単一mRNAへの改変を可能にする。IRES配列は、
RNA分子へのリボソームの内部動員を導き、キャップ非依存的に下流の翻訳を可能にする
。簡潔に述べると、1つのタンパク質のコード領域が、第2のタンパク質のオープンリーデ
ィングフレーム(ORF)に挿入される。挿入は、IRES並びに適切な発現及び/又は機能に必要
な任意の非翻訳シグナル配列に連なる。挿入は、第2のタンパク質のORF、ポリアデニル化
、又は転写プロモーターを妨害してはならない(例えば、Garcia-Sastreらの文献(1994, J
. Virol. 68:6254-6261)及びGarcia-Sastreらの文献(1994 Dev. Biol. Stand. 82:237-24
6)を参照されたく、その各々は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている)
。例えば、米国特許第6,887,699号、米国特許第6,001,634号、米国特許第5,854,037号、
及び米国特許第5,820,871号も参照されたく、その各々は、引用によりその全体が本明細
書中に組み込まれる。当技術分野で公知又は本明細書に記載の任意のIRESを本発明に従っ
て使用することができる(例えば、BiP遺伝子のIRES、GenBankデータベースエントリーHUM
GRP78のヌクレオチド372〜592;又は脳心筋炎ウイルス(EMCV)のIRES、GenBankデータベー
スエントリーCQ867238のヌクレオチド1430-2115)。したがって、ある実施態様において、
親インフルエンザウイルスは、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドと、別のポリペプチド、
例えば、親インフルエンザウイルスによって発現される遺伝子とを発現する二シストロン
性RNAセグメントを含むように改変される。いくつかの実施態様において、親インフルエ
ンザウイルス遺伝子は、HA遺伝子である。いくつかの実施態様において、親インフルエン
ザウイルス遺伝子は、NA遺伝子である。いくつかの実施態様において、親インフルエンザ
ウイルス遺伝子は、NS1遺伝子である。
【０４９０】
当業者に公知の技術を用いて、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むインフルエンザ
ウイルス、及びflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現するように改変されたゲノムを含
むインフルエンザウイルスを産生することができる。例えば、リバースジェネティクス技
術を用いて、そのようなインフルエンザウイルスを産生することができる。簡潔に述べる
と、リバースジェネティクス技術は、一般に、ウイルスポリメラーゼによる認識及び成熟
ビリオンの生成に必要なパッケージングシグナルに必須である、マイナス鎖ウイルスRNA
の非コード領域を含む合成組換えウイルスRNAの調製を含む。組換えRNAは、組換えDNA鋳
型から合成され、精製されたウイルスポリメラーゼ複合体によってインビトロで再構成さ
れて、細胞をトランスフェクトするために使用することができる組換えリボ核タンパク質
(RNP)を形成する。インビトロ又はインビボでの合成RNAの転写の間にウイルスポリメラー
ゼタンパク質が存在する場合、より効率的なトランスフェクションが達成される。合成組
換えRNPは、感染性ウイルス粒子中にレスキューすることができる。前述の技術は、1992
年11月24日に出願された米国特許第5,166,057号;1998年12月29日に出願された米国特許第
5,854,037号;1996年2月20日に公開された欧州特許公開EP 0702085A1号;米国特許出願第09
/152,845号;1997年4月3日に公開された国際特許公開PCT WO 97/12032号;1996年11月7日に
公開されたWO 96/34625号;欧州特許公開EP A780475号;1999年1月21日に公開されたWO 99/
02657号;1998年11月26日に公開されたWO 98/53078号;1998年1月22日に公開されたWO 98/0
2530号;1999年4月1日に公開されたWO 99/15672号;1998年4月2日に公開されたWO 98/13501
号;1997年2月20日に公開されたWO 97/06270号;及び1997年6月25日に公開されたEPO 780 4
75A1号に記載されており、その各々は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる
。
【０４９１】
或いは、ヘルパーフリープラスミド技術を用いて、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを
含むインフルエンザウイルス、及びflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現するように改
変されたゲノムを含むインフルエンザウイルスを産生することができる。簡潔に述べると
、プラスミドベクターへのPCR産物の挿入を可能にする独特の制限部位を含むプライマー
によるPCRを用いて、ウイルスセグメントの全長cDNAを増幅させる(Flandorferらの文献(2
003, J. Virol. 77:9116-9123;Nakayaらの文献(2001, J. Virol. 75:11868-11873;これら
は両方とも、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている)。プラスミドベクタ
ーは、正確なマイナスの(vRNAセンス)転写物が発現されるように設計される。例えば、正
確なマイナスの(vRNAセンス)転写物がポリメラーゼIプロモーターから産生されるように
、プラスミドベクターは、切断されたヒトRNAポリメラーゼIプロモーターとデルタ型肝炎
ウイルスリボザイム配列の間にPCR産物を配置するように設計することができる。各ウイ
ルスセグメントを含む別個のプラスミドベクター並びに必要なウイルスタンパク質を含む
発現ベクターを細胞にトランスフェクトして、組換えウイルス粒子の産生をもたらすこと
ができる。別の実施例では、必要なウイルスタンパク質をコードするウイルスのゲノムRN
AとmRNAの両方が発現されるプラスミドベクターを使用することができる。ヘルパーフリ
ープラスミド技術の詳細な説明については、例えば、引用によりその全体が本明細書中に
組み込まれている、国際公開WO 01/04333号;米国特許第6,951,754号、第7,384,774号、第
6,649,372号、及び第7,312,064号;Fodorらの文献(1999, J. Virol. 73:9679-9682);Quinl
ivanらの文献(2005, J. Virol. 79:8431-8439);Hoffmannらの文献(2000, Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 97:6108-6113);並びにNeumannらの文献(1999, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 96:9345-9350)を参照されたい。
【０４９２】
本明細書に記載のインフルエンザウイルスは、本明細書に記載の方法に従うその使用を
可能にする力価までウイルスを成長させる任意の基体中で増殖させることができる。一実
施態様において、基体は、対応する野生株ウイルスについて測定される力価と同等の力価
までウイルスを成長させる。ある実施態様において、基体は、インフルエンザウイルスに
とって、又はHA機能が由来するウイルスにとって生物学的に適するものである。具体的な
実施態様において、例えば、NS1遺伝子中の突然変異による弱毒化インフルエンザウイル
スは、IFN欠損基体中で増殖させることができる。例えば、好適なIFN欠損基体は、インタ
ーフェロンを産生するか、もしくはそれに応答するその能力に欠陥がある基体であっても
よく、又はIFN欠損基体をインターフェロン欠損成長環境を必要とし得る任意の数のウイ
ルスの成長のために使用することができる基体である。例えば、2003年6月3日に出願され
た米国特許第6,573,079号、2005年2月8日に出願された第6,852,522号、及び2009年2月24
日に出願された第7,494,808号を参照されたく、これらの文献の各々の内容全体は、引用
によりその全体が本明細書中に組み込まれる。具体的な実施態様において、ウイルスを発
育卵(例えば、鶏卵)中で増殖させる。具体的な実施態様において、ウイルスを8日齢、9日
齢、8〜10日齢、10日齢、11日齢、10〜12日齢、又は12日齢の発育卵(例えば、鶏卵)中で
増殖させる。ある実施態様において、ウイルスをMDCK細胞、Vero細胞、293T細胞、又は当
技術分野で公知の他の細胞株で増殖させる。ある実施態様において、ウイルスを発育卵に
由来する細胞で増殖させる。
【０４９３】
本明細書に記載のインフルエンザウイルスは、当業者に公知の任意の方法によって単離
及び精製することができる。一実施態様において、ウイルスは、一般に、周知の清澄化手
順、例えば、密度勾配遠心分離及びカラムクロマトグラフィーによって細胞培養物から取
り出され、細胞成分から分離され、望ましい場合、当業者に周知の手順、例えば、プラー
クアッセイを用いて、さらに精製することができる。
【０４９４】
ある実施態様において、本明細書に記載されているように使用されるインフルエンザウ
イルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメント
は、A型インフルエンザウイルスから得られるか、又はそれに由来する。ある実施態様に
おいて、本明細書に記載されているように使用されるインフルエンザウイルス、又はイン
フルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは、単一のA型イ
ンフルエンザウイルスの亜型もしくは株から得られるか、又はそれらに由来する。他の実
施態様において、本明細書に記載されているように使用されるインフルエンザウイルス、
又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは、2以
上のA型インフルエンザウイルスの亜型もしくは株から得られるか、又はそれらに由来す
る。ある実施態様において、本明細書に記載されているように使用されるインフルエンザ
ウイルスは、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド及
びノイラミニダーゼ(NA)、又はそれらの断片を含み、ここで、該NAは、該キメラインフル
エンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドが由来する源と同じ源(例えば、イ
ンフルエンザウイルス株又は亜型)由来のものである。ある実施態様において、本明細書
に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのうちの1つ又は複数を
発現するように改変されたインフルエンザウイルスは、該キメラインフルエンザウイルス
血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドが由来する源と同じ源(例えば、インフルエンザウ
イルス株又は亜型)由来のものである、ノイラミニダーゼ(NA)、又はその断片を含み、こ
こで、該球状ヘッドは、該キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのHA1
及び/又はHA2サブユニットのステムドメインと異種である。
【０４９５】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されているように使用されるインフルエ
ンザウイルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグ
メントは、B型インフルエンザウイルスから得られるか、又はそれに由来する。ある実施
態様において、本明細書に記載されているように使用されるインフルエンザウイルス、又
はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは、単一の
B型インフルエンザウイルスの亜型もしくは株から得られるか、又はそれらに由来する。
他の実施態様において、本明細書に記載されているように使用されるインフルエンザウイ
ルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは
、2以上のB型インフルエンザウイルスの亜型もしくは株から得られるか、又はそれらに由
来する。他の実施態様において、本明細書に記載されているように使用されるインフルエ
ンザウイルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグ
メントは、A型インフルエンザウイルスの亜型又は株とB型インフルエンザウイルスの亜型
又は株の組合せから得られるか、又はそれに由来する。
【０４９６】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されているように使用されるインフルエ
ンザウイルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグ
メントは、C型インフルエンザウイルスから得られるか、又はそれに由来する。ある実施
態様において、本明細書に記載されているように使用されるインフルエンザウイルス、又
はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは、単一の
C型インフルエンザウイルスの亜型もしくは株から得られるか、又はそれらに由来する。
他の実施態様において、本明細書に記載されているように使用されるインフルエンザウイ
ルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは
、2以上のC型インフルエンザウイルスの亜型もしくは株から得られるか、又はそれらに由
来する。他の実施態様において、本明細書に記載されているように使用されるインフルエ
ンザウイルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグ
メントは、C型インフルエンザウイルスの亜型又は株とA型インフルエンザウイルスの亜型
もしくは株及び/又はB型インフルエンザウイルスの亜型もしくは株の組合せから得られる
か、或いはそれらに由来する。
【０４９７】
A型インフルエンザウイルスの非限定的な例としては、亜型H10N4、亜型H10N5、亜型H10
N7、亜型H10N8、亜型H10N9、亜型H11N1、亜型H11N13、亜型H11N2、亜型H11N4、亜型H11N6
、亜型H11N8、亜型H11N9、亜型H12N1、亜型H12N4、亜型H12N5、亜型H12N8、亜型H13N2、
亜型H13N3、亜型H13N6、亜型H13N7、亜型H14N5、亜型H14N6、亜型H15N8、亜型H15N9、亜
型H16N3、亜型H1N1、亜型H1N2、亜型H1N3、亜型H1N6、亜型H1N9、亜型H2N1、亜型H2N2、
亜型H2N3、亜型H2N5、亜型H2N7、亜型H2N8、亜型H2N9、亜型H3N1、亜型H3N2、亜型H3N3、
亜型H3N4、亜型H3N5、亜型H3N6、亜型H3N8、亜型H3N9、亜型H4N1、亜型H4N2、亜型H4N3、
亜型H4N4、亜型H4N5、亜型H4N6、亜型H4N8、亜型H4N9、亜型H5N1、亜型H5N2、亜型H5N3、
亜型H5N4、亜型H5N6、亜型H5N7、亜型H5N8、亜型H5N9、亜型H6N1、亜型H6N2、亜型H6N3、
亜型H6N4、亜型H6N5、亜型H6N6、亜型H6N7、亜型H6N8、亜型H6N9、亜型H7N1、亜型H7N2、
亜型H7N3、亜型H7N4、亜型H7N5、亜型H7N7、亜型H7N8、亜型H7N9、亜型H8N4、亜型H8N5、
亜型H9N1、亜型H9N2、亜型H9N3、亜型H9N5、亜型H9N6、亜型H9N7、亜型H9N8、及び亜型H9
N9が挙げられる。
【０４９８】
A型インフルエンザウイルスの株の具体的な例としては、A/ビクトリア/361/2011(H3N2)
;A/カリフォルニア/4/2009(H1N1);A/カリフォルニア/7/2009(H1N1);A/パース/16/2009(H3
N2);A/ブリスベン/59/2007(H1N1);A/ブリスベン/10/2007((H3N2);A/sw/アイオワ/15/30(H
1N1);A/WSN/33(H1N1);A/eq/プラハ/1/56(H7N7);A/PR/8/34;A/マガモ/ポツダム/178-4/83(
H2N2);A/セグロカモメ/DE/712/88(H16N3);A/sw/香港/168/1993(H1N1);A/マガモ/アルバー
タ/211/98(H1N1);A/水鳥/デラウェア/168/06(H16N3);A/sw/ネーデルラント/25/80(H1N1);
A/sw/ドイツ/2/81(H1N1);A/sw/ハノーバー/1/81(H1N1);A/sw/ポツダム/1/81(H1N1);A/sw/
ポツダム/15/81(H1N1);A/sw/ポツダム/268/81(H1N1);A/sw/フィニステール/2899/82(H1N1
);A/sw/ポツダム/35/82(H3N2);A/sw/コートダルモール/3633/84(H3N2);A/sw/ヘント/1/84
(H3N2);A/sw/ネーデルラント/12/85(H1N1);A/sw/カレンツァイ(Karrenzien)/2/87(H3N2);
A/sw/シュウェリン/103/89(H1N1);A/七面鳥/ドイツ/3/91(H1N1);A/sw/ドイツ/8533/91(H1
N1);A/sw/ベルギー/220/92(H3N2);A/sw/ヘント/V230/92(H1N1);A/sw/ライプチヒ/145/92(
H3N2);A/sw/Re220/92hp(H3N2);A/sw/バークム/909/93(H3N2);A/sw/シュレースヴィヒ−ホ
ルシュタイン/1/93(H1N1);A/sw/スコットランド/419440/94(H1N2);A/sw/バークム/5/95(H
1N1);A/sw/ベスト(Best)/5C/96(H1N1);A/sw/イングランド/17394/96(H1N2);A/sw/イエナ/
5/96(H3N2);A/sw/ウーデンローデ/7C/96(H3N2);A/sw/ローネ/1/97(H3N2);A/sw/コートダ
ルモール/790/97(H1N2);A/sw/バークム/1362/98(H3N2);A/sw/イタリア/1521/98(H1N2);A/
sw/イタリア/1553-2/98(H3N2);A/sw/イタリア/1566/98(H1N1);A/sw/イタリア/1589/98(H1
N1);A/sw/バークム/8602/99(H3N2);A/sw/コートダルモール/604/99(H1N2);A/sw/コートダ
ルモール/1482/99(H1N1);A/sw/ヘント/7625/99(H1N2);A/香港/1774/99(H3N2);A/sw/香港/
5190/99(H3N2);A/sw/香港/5200/99(H3N2);A/sw/香港/5212/99(H3N2);A/sw/イル・エ・ヴ
ィレーヌ/1455/99(H1N1);A/sw/イタリア/1654-1/99(H1N2);A/sw/イタリア/2034/99(H1N1)
;A/sw/イタリア/2064/99(H1N2);A/sw/ベルリン/1578/00(H3N2);A/sw/バークム/1832/00(H
1N2);A/sw/バークム/1833/00(H1N2);A/sw/コートダルモール/800/00(H1N2);A/sw/香港/79
82/00(H3N2);A/sw/イタリア/1081/00(H1N2);A/sw/ベルチヒ/2/01(H1N1);A/sw/ベルチヒ/5
4/01(H3N2);A/sw/香港/9296/01(H3N2);A/sw/香港/9745/01(H3N2);A/sw/スペイン/33601/0
1(H3N2);A/sw/香港/1144/02(H3N2);A/sw/香港/1197/02(H3N2);A/sw/スペイン/39139/02(H
3N2);A/sw/スペイン/42386/02(H3N2);A/スイス/8808/2002(H1N1);A/sw/バークム/1769/03
(H3N2);A/sw/ビッセンドルフ/IDT1864/03(H3N2);A/sw/エーレン(Ehren)/IDT2570/03(H1N2
);A/sw/ゲッシャー/IDT2702/03(H1N2);A/sw/ハーゼリュンネ/2617/03hp(H1N1);A/sw/レー
ニンゲン/IDT2530/03(H1N2);A/sw/IVD/IDT2674/03(H1N2);A/sw/ノルドキルヒェン/IDT199
3/03(H3N2);A/sw/ノルドヴァルデ/IDT2197/03(H1N2);A/sw/ノルデン/IDT2308/03(H1N2);A
/sw/スペイン/50047/03(H1N1);A/sw/スペイン/51915/03(H1N1);A/sw/フェヒタ/2623/03(H
1N1);A/sw/ヴィズベク/IDT2869/03(H1N2);A/sw/ヴァルタースドルフ/IDT2527/03(H1N2);A
/sw/ダム(Damme)/IDT2890/04(H3N2);A/sw/ゲルダーン/IDT2888/04(H1N1);A/sw/グランス
テット(Granstedt)/IDT3475/04(H1N2);A/sw/グレーフェン/IDT2889/04(H1N1);A/sw/グー
テンスベルク/IDT2930/04(H1N2);A/sw/グーテンスベルク/IDT2931/04(H1N2);A/sw/ローネ
/IDT3357/04(H3N2);A/sw/ノルトルップ/IDT3685/04(H1N2);A/sw/ゼーセン/IDT3055/04(H3
N2);A/sw/スペイン/53207/04(H1N1);A/sw/スペイン/54008/04(H3N2);A/sw/シュトルツェ
ナウ/IDT3296/04(H1N2);A/sw/ヴェーデル/IDT2965/04(H1N1);A/sw/バートグリースバッハ
/IDT4191/05(H3N2);A/sw/クロッペンブルク/IDT4777/05(H1N2);A/sw/デートリンゲン/IDT
3780/05(H1N2);A/sw/デートリンゲン/IDT4735/05(H1N2);A/sw/エックルハム/IDT5250/05(
H3N2);A/sw/ハーケンブレック(Harkenblek)/IDT4097/05(H3N2);A/sw/ヘルツェン(Hertzen
)/IDT4317/05(H3N2);A/sw/クローゲル(Krogel)/IDT4192/05(H1N1);A/sw/ラエル/IDT3893/
05(H1N1);A/sw/ラエル/IDT4126/05(H3N2);A/sw/メルツェン/IDT4114/05(H3N2);A/sw/ミュ
スラリンゲン(Muesleringen)-S./IDT4263/05(H3N2);A/sw/オスターホーフェン/IDT4004/0
5(H3N2);A/sw/シュプレンゲ(Sprenge)/IDT3805/05(H1N2);A/sw/シュタットローン/IDT385
3/05(H1N2);A/sw/フォーグラルン(Voglarn)/IDT4096/05(H1N1);A/sw/ヴォーラーシュト(W
ohlerst)/IDT4093/05(H1N1);A/sw/バートグリースバッハ/IDT5604/06(H1N1);A/sw/ヘルツ
ラケ/IDT5335/06(H3N2);A/sw/ヘルツラケ/IDT5336/06(H3N2);A/sw/ヘルツラケ/IDT5337/0
6(H3N2);及びA/イノシシ/ドイツ/R169/2006(H3N2)が挙げられるが、これらに限定されな
い。
【０４９９】
A型インフルエンザウイルスの株の他の具体的な例としては、A/トロント/3141/2009(H1
N1);A/レーゲンスブルク/D6/2009(H1N1);A/バイエルン/62/2009(H1N1);A/バイエルン/62/
2009(H1N1);A/ブランデンブルク/19/2009(H1N1);A/ブランデンブルク/20/2009(H1N1);A/
連邦直轄区(Distrito Federal)/2611/2009(H1N1);A/マトグロッソ/2329/2009(H1N1);A/サ
ンパウロ/1454/2009(H1N1);A/サンパウロ/2233/2009(H1N1);A/ストックホルム/37/2009(H
1N1);A/ストックホルム/41/2009(H1N1);A/ストックホルム/45/2009(H1N1);A/ブタ/アルバ
ータ/OTH-33-1/2009(H1N1);A/ブタ/アルバータ/OTH-33-14/2009(H1N1);A/ブタ/アルバー
タ/OTH-33-2/2009(H1N1);A/ブタ/アルバータ/OTH-33-21/2009(H1N1);A/ブタ/アルバータ/
OTH-33-22/2009(H1N1);A/ブタ/アルバータ/OTH-33-23/2009(H1N1);A/ブタ/アルバータ/OT
H-33-24/2009(H1N1);A/ブタ/アルバータ/OTH-33-25/2009(H1N1);A/ブタ/アルバータ/OTH-
33-3/2009(H1N1);A/ブタ/アルバータ/OTH-33-7/2009(H1N1);A/北京/502/2009(H1N1);A/フ
ィレンツェ/10/2009(H1N1);A/香港/2369/2009(H1N1);A/イタリア/85/2009(H1N1);A/サン
トドミンゴ/572N/2009(H1N1);A/カタロニア/385/2009(H1N1);A/カタロニア/386/2009(H1N
1);A/カタロニア/387/2009(H1N1);A/カタロニア/390/2009(H1N1);A/カタロニア/394/2009
(H1N1);A/カタロニア/397/2009(H1N1);A/カタロニア/398/2009(H1N1);A/カタロニア/399/
2009(H1N1);A/サンパウロ/2303/2009(H1N1);A/秋田/1/2009(H1N1);A/カストロ/JXP/2009(
H1N1);A/福島/1/2009(H1N1);A/イスラエル/276/2009(H1N1);A/イスラエル/277/2009(H1N1
);A/イスラエル/70/2009(H1N1);A/岩手/1/2009(H1N1);A/岩手/2/2009(H1N1);A/鹿児島/1/
2009(H1N1);A/大阪/180/2009(H1N1);A/プエルトモント/Bio87/2009(H1N1);A/サンパウロ/
2303/2009(H1N1);A/札幌/1/2009(H1N1);A/ストックホルム/30/2009(H1N1);A/ストックホ
ルム/31/2009(H1N1);A/ストックホルム/32/2009(H1N1);A/ストックホルム/33/2009(H1N1)
;A/ストックホルム/34/2009(H1N1);A/ストックホルム/35/2009(H1N1);A/ストックホルム/
36/2009(H1N1);A/ストックホルム/38/2009(H1N1);A/ストックホルム/39/2009(H1N1);A/ス
トックホルム/40/2009(H1N1;)A/ストックホルム/42/2009(H1N1);A/ストックホルム/43/20
09(H1N1);A/ストックホルム/44/2009(H1N1);A/宇都宮/2/2009(H1N1);A/WRAIR/0573N/2009
(H1N1);及びA/浙江/DTID-ZJU01/2009(H1N1)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５００】
B型インフルエンザウイルスの非限定的な例としては、愛知/5/88株、B/ブリスベン/60/
2008株;秋田/27/2001、秋田/5/2001株、アラスカ/16/2000株、アラスカ/1777/2005株、ア
ルゼンチン/69/2001株、アリゾナ/146/2005株、アリゾナ/148/2005株、バンコク/163/90
株、バンコク/34/99株、バンコク/460/03株、バンコク/54/99株、バルセロナ/215/03株、
北京/15/84株、北京/184/93株、北京/243/97株、北京/43/75株、北京/5/76株、北京/76/9
8株、ベルギー/WV106/2002株、ベルギー/WV107/2002株、ベルギー/WV109/2002株、ベルギ
ー/WV114/2002株、ベルギー/WV122/2002株、ボン/43株、ブラジル/952/2001株、ブカレス
ト/795/03株、ブエノスアイレス/161/00株)、ブエノスアイレス/9/95株、ブエノスアイレ
ス/SW16/97株、ブエノスアイレス/VL518/99株、カナダ/464/2001株、カナダ/464/2002株
、チャコ/366/00株、チャコ/R113/00株、済州/303/03株、千葉/447/98株、重慶/3/2000株
、SA1タイ/2002臨床分離株、SA10タイ/2002臨床分離株、SA100フィリピン/2002臨床分離
株、SA101フィリピン/2002臨床分離株、SA110フィリピン/2002臨床分離株)、SA112フィリ
ピン/2002臨床分離株、SA113フィリピン/2002臨床分離株、SA114フィリピン/2002臨床分
離株、SA2タイ/2002臨床分離株、SA20タイ/2002臨床分離株、SA38フィリピン/2002臨床分
離株、SA39タイ/2002臨床分離株、SA99フィリピン/2002臨床分離株、CNIC/27/2001株、コ
ロラド/2597/2004株、コルドバ/VA418/99株、チェコスロバキア/16/89株、チェコスロバ
キア/69/90株、ダエク/10/97株、ダエク/45/97株、ダエク/47/97株、ダエク/9/97株、B/D
u/4/78株、B/ダーバン/39/98株、ダーバン/43/98株、ダーバン/44/98株、B/ダーバン/52/
98株、ダーバン/55/98株、ダーバン/56/98株、イングランド/1716/2005株、イングランド
/2054/2005株)、イングランド/23/04株、フィンランド/154/2002株、フィンランド/159/2
002株、フィンランド/160/2002株、フィンランド/161/2002株、フィンランド/162/03株、
フィンランド/162/2002株、フィンランド/162/91株、フィンランド/164/2003株、フィン
ランド/172/91株、フィンランド/173/2003株、フィンランド/176/2003株、フィンランド/
184/91株、フィンランド/188/2003株、フィンランド/190/2003株、フィンランド/220/200
3株、フィンランド/WV5/2002株、福建/36/82株、ジュネーブ/5079/03株、ジェノバ/11/02
株、ジェノバ/2/02株、ジェノバ/21/02株、ジェノバ/54/02株、ジェノバ/55/02株、広東/
05/94株、広東/08/93株、広東/5/94株、広東/55/89株、広東/8/93株、広州/7/97株、広州
/86/92株、広州/87/92株、京幾/592/2005株、ハノーバー/2/90株、ハルビン/07/94株、ハ
ワイ/10/2001株、ハワイ/1990/2004株、ハワイ/38/2001株、ハワイ/9/2001株、河北/19/9
4株、河北/3/94株)、河南/22/97株、広島/23/2001株、香港/110/99株、香港/1115/2002株
、香港/112/2001株、香港/123/2001株、香港/1351/2002株、香港/1434/2002株、香港/147
/99株、香港/156/99株、香港/157/99株、香港/22/2001株、香港/22/89株、香港/336/2001
株、香港/666/2001株、香港/9/89株、ヒューストン/1/91株、ヒューストン/1/96株、ヒュ
ーストン/2/96株、湖南/4/72株、茨城/2/85株、仁川(ncheon)/297/2005株、インド/3/89
株、インド/77276/2001株、イスラエル/95/03株、イスラエル/WV187/2002株、日本/1224/
2005株、江蘇/10/03株、ヨハネスブルク/1/99株、ヨハネスブルク/96/01株、門真/1076/9
9株、門真/122/99株、鹿児島/15/94株、カンザス/22992/99株、ハズコフ(Khazkov)/224/9
1株、神戸/1/2002株、高知/193/99株、ラツィオ/1/02株、リー/40株、レニングラード/12
9/91株、リスボン/2/90株)、ロサンゼルス/1/02株、ルサカ/270/99株、リヨン/1271/96株
、マレーシア/83077/2001株、マプト/1/99株、マルデルプラタ/595/99株、メリーランド/
1/01株、メンフィス/1/01株、メンフィス/12/97-MA株、ミシガン/22572/99株、三重/1/93
株、ミラノ/1/01株、ミンスク/318/90株、モスクワ/3/03株、名古屋/20/99株、南昌/1/00
株、ナッシュビル/107/93株、ナッシュビル/45/91株、ネブラスカ/2/01株、ネーデルラン
ト/801/90株、ネーデルラント/429/98株、ニューヨーク/1/2002株、NIB/48/90株、寧夏/4
5/83株、ノルウェー/1/84株、オマーン/16299/2001株、大阪/1059/97株、大阪/983/97-V2
株、オスロ/1329/2002株、オスロ/1846/2002株、パナマ/45/90株、パリ/329/90株、パル
マ/23/02株、パース/211/2001株、ペルー/1364/2004株、フィリピン/5072/2001株、釜山/
270/99株、ケベック/173/98株、ケベック/465/98株、ケベック/7/01株、ローマ/1/03株、
佐賀/S172/99株、ソウル/13/95株、ソウル/37/91株、山東/7/97株、上海/361/2002株)、
滋賀/T30/98株、四川/379/99株、シンガポール/222/79株、スペイン/WV27/2002株、スト
ックホルム/10/90株、スイス/5441/90株、台湾/0409/00株、台湾/0722/02株、台湾/97271
/2001株、テヘラン/80/02株、東京/6/98株、トリエステ/28/02株、ウランウデ/4/02株、
イギリス/34304/99株、USSR/100/83株、ビクトリア/103/89株、ウィーン/1/99株、武漢/3
56/2000株、WV194/2002株、玄武/23/82株、山形/1311/2003株、山形/K500/2001株、アラ
スカ/12/96株、GA/86株、長崎/1/87株、東京/942/96株、B/ウィスコンシン/1/2010株;及
びロチェスター/02/2001株が挙げられる。
【０５０１】
C型インフルエンザウイルスの非限定的な例としては、愛知/1/81株、アンアーバー/1/5
0株、青森/74株、カリフォルニア/78株、イングランド/83株、ギリシア/79株、広島/246/
2000株、広島/252/2000株、兵庫/1/83株、ヨハネスブルク/66株、神奈川/1/76株、京都/1
/79株、ミシシッピー/80株、宮城/1/97株、宮城/5/2000株、宮城/9/96株、奈良/2/85株、
ニュージャージー/76株、ブタ/北京/115/81株、埼玉/3/2000株)、静岡/79株、山形/2/98
株、山形/6/2000株、山形/9/96株、ベルリン/1/85株、イングランド/892/8株、五大湖/11
67/54株、JJ/50株、ブタ/北京/10/81株、ブタ/北京/439/82)株、テーラー(TAYLOR)/1233/
47株、及びC/山形/10/81株が挙げられる。
【０５０２】
ある実施態様において、本明細書に提供されるインフルエンザウイルスは、弱毒化表現
型を有する。具体的な実施態様において、弱毒化インフルエンザウイルスは、A型インフ
ルエンザウイルスに基づく。他の実施態様において、弱毒化インフルエンザウイルスは、
B型インフルエンザウイルスに基づく。さらに他の実施態様において、弱毒化インフルエ
ンザウイルスは、C型インフルエンザウイルスに基づく。他の実施態様において、弱毒化
インフルエンザウイルスは、A型インフルエンザ、B型インフルエンザ及び/又はC型インフ
ルエンザウイルスの1以上の株又は亜型由来の遺伝子又はゲノムセグメントを含むことが
できる。いくつかの実施態様において、弱毒化骨格ウイルスは、A型インフルエンザウイ
ルス及びB型インフルエンザウイルス由来の遺伝子を含む。
【０５０３】
具体的な実施態様において、ウイルスが少なくとも部分的に感染性を保持し、インビボ
で複製することができるが、非病原性である不顕性レベルの感染をもたらす低い力価を生
じさせることしかできないような、インフルエンザウイルスの弱毒化が望ましい。そのよ
うな弱毒化ウイルスは、ウイルス又はその免疫原性組成物が免疫応答を誘発するために対
象に投与される、本明細書に記載の実施態様に特に好適である。インフルエンザウイルス
の弱毒化は、例えば、化学的突然変異誘発によって作製されるウイルス突然変異体を選択
すること、遺伝子操作によるゲノムの突然変異、弱毒化された機能を有するセグメントを
含む再集合体ウイルスを選択すること、又は条件的ウイルス突然変異体(例えば、低温適
応ウイルス)の選択などの、当技術分野で公知の任意の方法によって達成することができ
る。或いは、天然に存在する弱毒化インフルエンザウイルスを、インフルエンザウイルス
ベクターのためのインフルエンザウイルス骨格として使用することができる。
【０５０４】
一実施態様において、インフルエンザウイルスは、親インフルエンザウイルスのHA遺伝
子を本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドと置換することによって、少なく
とも部分的に弱毒化することができる。いくつかの実施態様において、インフルエンザウ
イルスは、細胞のインターフェロン(IFN)応答に拮抗するウイルスの能力を損なわせる突
然変異したNS1遺伝子を発現するようにインフルエンザウイルスを改変することによって
、少なくとも部分的に弱毒化することができる。インフルエンザウイルスNS1遺伝子に導
入することができる突然変異の種類の例としては、欠失、置換、挿入、及びそれらの組合
せが挙げられる。NS1遺伝子全体のどこにでも(例えば、N末端、C末端、もしくはその間の
どこか)、及び/又はNS1遺伝子の調節エレメントに、1以上の突然変異を導入することがで
きる。一実施態様において、弱毒化インフルエンザウイルスは、NS1のC末端から5個、好
ましくは10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、75、80、85、90、95、99、
100、105、110、115、120、125、126、130、135、140、145、150、155、160、165、170、
もしくは175個のアミノ酸残基からなる欠失、又はC末端から5〜170、25〜170、50〜170、
100〜170、100〜160、もしくは105〜160個のアミノ酸残基の欠失をもたらすインフルエン
ザウイルスNS1遺伝子の突然変異を有するゲノムを含む。別の実施態様において、弱毒化
インフルエンザウイルスは、それがアミノ酸残基1〜130、アミノ酸残基1〜126、アミノ酸
残基1〜120、アミノ酸残基1〜115、アミノ酸残基1〜110、アミノ酸残基1〜100、アミノ酸
残基1〜99、アミノ酸残基1〜95、アミノ酸残基1〜85、アミノ酸残基1〜83、アミノ酸残基
1〜80、アミノ酸残基1〜75、アミノ酸残基1〜73、アミノ酸残基1〜70、アミノ酸残基1〜6
5、又はアミノ酸残基1〜60のNS1タンパク質をコードするように、インフルエンザウイル
スNS1遺伝子の突然変異を有するゲノムを含み、ここで、N末端アミノ酸は、1番である。N
S1突然変異及び突然変異したNS1を含むインフルエンザウイルスの例については、例えば
、米国特許第6,468,544号及び第6,669,943号;並びにLiらの文献(1999, J. Infect. Dis. 
179:1132-1138)を参照されたく、その各々は、引用によりその全体が本明細書中に組み込
まれる。
【０５０５】
(5.8  非インフルエンザウイルスベクター)
一態様において、本明細書に提供されるのは、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば
、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素(emagglutinin)(HA)ポリペプチド)を含む非
インフルエンザウイルスである。具体的な実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペ
プチドは、非インフルエンザウイルスのビリオンに組み込まれる。具体的な実施態様にお
いて、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチド)は、精製された(例えば、プラーク精製された)又は単離されたウイルス
に含まれる/該ウイルスによって発現される。非インフルエンザウイルスを、特定の細胞
型、例えば、免疫細胞にウイルスをターゲッティングする部分に結合させもよい。いくつ
かの実施態様において、インフルエンザウイルスのビリオンは、flu血球凝集素(HA)ポリ
ペプチドに加えて、異種ポリペプチドをそれらに組み込んでいるか、又はそれを発現する
。異種ポリペプチドは、免疫増強活性を有するか、又は特定の細胞型に非インフルエンザ
ウイルスをターゲッティングするポリペプチド、例えば、特定の細胞型の表面の抗原に結
合する抗体、もしくは特定の細胞型の表面の特異的受容体に結合するリガンドであっても
よい。そのような異種ポリペプチドの例については、上の第5.4節を参照されたい。
【０５０６】
flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む/発現する非インフルエンザウイルスは、当業者
に公知の技術を用いて産生することができる。flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む非
インフルエンザウイルスは、ビリオンの産生の間にトランスでflu血球凝集素(HA)ポリペ
プチドを供給することによって産生することができる。或いは、血球凝集素機能がトラン
スで提供されているウイルスに感染しやすい細胞でflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを発
現するように改変されたゲノムを含む親の非インフルエンザウイルスの複製は、flu血球
凝集素(HA)ポリペプチドを含む子孫ウイルスを産生する。
【０５０７】
限定するものではないが、天然に存在する株、変異体、もしくは突然変異体、突然変異
させたウイルス、再集合体、及び/又は遺伝子改変ウイルスを含む、任意のウイルス型、
亜型、又は株を、非インフルエンザウイルスベクターとして使用することができる。具体
的な実施態様において、親の非インフルエンザウイルスは、天然に存在するウイルスでは
ない。別の具体的な実施態様において、親の非インフルエンザウイルスは、遺伝子改変ウ
イルスである。ある実施態様において、エンベロープ型ウイルスが、本明細書に記載の膜
結合型flu血球凝集素(HA)ポリペプチドの発現に好ましい。
【０５０８】
例示的な実施態様において、非インフルエンザウイルスベクターは、ニューカッスル病
ウイルス(NDV)である。別の実施態様において、非インフルエンザウイルスベクターは、
ワクシニアウイルスである。他の例示的で、非限定的な実施態様において、非インフルエ
ンザウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、B型肝炎ウイルス
、レトロウイルス(例えば、ガンマレトロウイルス、例えば、マウス幹細胞ウイルス(MSCV
)ゲノムもしくはマウス白血病ウイルス(MLV)、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、
腫瘍レトロウイルス、もしくはレンチウイルス)、アルファウイルス(例えば、ベネズエラ
ウマ脳炎ウイルス)、ラブドウイルス、例えば、水疱性口内炎ウイルスもしくはパピロー
マウイルス、ポックスウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、MVA-T7ベクター、もしく
は鶏痘)、メタニューモウイルス、麻疹ウイルス、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘル
ペスウイルス、又はフォーミーウイルスである。例えば、Lawrie及びTuminの文献(1993, 
Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109)(レトロウイルスベクター);Bettらの文献(1993
, J. Virol. 67, 5911)(アデノウイルスベクター);Zhouらの文献(1994, J. Exp. Med. 17
9, 1867)(アデノ随伴ウイルスベクター);Dubenskyらの文献(1996, J. Virol. 70, 508-51
9)(ワクシニアウイルス及び鶏痘ウイルスを含むポックスファミリー由来のウイルスベク
ター並びにアルファウイルス属由来のウイルスベクター、例えば、シンドビスウイルス及
びセムリキ森林ウイルスに由来するもの);米国特許第5,643,576号(ベネズエラウマ脳炎ウ
イルス);WO 96/34625号(VSV);Oheらの文献(1995, Human Gene Therapy 6, 325-333);Woo
らの文献(WO 94/12629号);Xiao及びBrandsmaの文献(1996, Nucleic Acids. Res. 24、263
0-2622)(パピローマウイルス);並びにBukreyev及びCollinsの文献(2008, Curr Opin Mol 
Ther. 10:46-55)(NDV)を参照されたく、その各々は、引用によりその全体が本明細書中に
組み込まれる。
【０５０９】
具体的な実施態様において、非インフルエンザウイルスベクターは、NDVである。任意
のNDV型、亜型、又は株は、限定されないが、天然に存在する株、変異体、もしくは突然
変異体、突然変異させたウイルス、再集合体及び/又は遺伝子改変ウイルスを含む、flu血
球凝集素(HA)ポリペプチドを発現するように改変される骨格の役割を果たすことができる
。具体的な実施態様において、遺伝子操作のための骨格の役割を果たすNDVは、天然に存
在する株である。ある実施態様において、遺伝子操作のための骨格の役割を果たすNDVは
、溶解性株である。他の実施態様において、遺伝子操作のための骨格の役割を果たすNDV
は、非溶解性株である。ある実施態様において、遺伝子操作のための骨格の役割を果たす
NDVは、長潜伏期性株である。いくつかの実施態様において、遺伝子操作のための骨格の
役割を果たすNDVは、亜病原性株である。他の実施態様において、遺伝子操作のための骨
格の役割を果たすNDVは、短潜伏期性株である。NDV株の具体的な例としては、73-T株、ア
ルスター株、MTH-68株、イタリアン(Italien)株、ヒックマン(Hickman)株、PV701株、ヒ
ッチナー(Hitchner)B1株、ラソタ(La Sota)株、YG97株、MET95株、及びF48E9株が挙げら
れるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において、遺伝子操作のための骨格の
役割を果たすNDVは、ヒッチナーB1株である。別の具体的な実施態様において、遺伝子操
作のための骨格の役割を果たすNDVは、ラソタ株である。
【０５１０】
一実施態様において、非インフルエンザウイルスベクターのための骨格として使用され
るNDVは、修飾Fタンパク質を発現するように改変されており、この修飾Fタンパク質中で
は、該Fタンパク質の切断部位が1つ又は2つの追加のアルギニン残基を含む部位に置き換
えられ、この突然変異切断部位がフリンファミリーのユビキタスに発現されるプロテアー
ゼによって活性化されるようになる。そのような修飾Fタンパク質を発現するNDVの具体的
な例としては、rNDV/F2aa及びrNDV/F3aaが挙げられるが、これらに限定されない。突然変
異した切断部位を有する修飾Fタンパク質を産生するためにNDVのFタンパク質に導入され
る突然変異の説明については、例えば、Parkらの文献(2006、「二重特異性を有する改変
されたウイルスワクチン構築物:鳥インフルエンザ及びニューカッスル病(Engineered vir
al vaccine constructs with dual specificity: Avian influenza and Newcastle disea
se)」PNAS USA 103:8203-2808))を参照されたい。
【０５１１】
一実施態様において、非インフルエンザウイルスベクターは、ポックスウイルスである
。ポックスウイルスベクターは、ワクチンベクターに好適な配列を提供するポックスウイ
ルス科の任意のメンバー、特に、ワクシニアウイルス又はアビポックスウイルス(例えば
、カナリア痘ウイルス、鶏痘など)に基づくことができる。具体的な実施態様において、
ポックスウイルスベクターは、ワクシニアウイルスベクターである。好適なワクシニアウ
イルスとしては、コペンハーゲン(VC-2)株(Goebelらの文献(Virol 179:247-266, 1990);J
ohnsonらの文献(Virol. 196:381-401、1993)、改変コペンハーゲン株(NYVAC)(米国特許第
6,265,189号)、WYETH株、及び改変アンカラ(MVA)株(Antoineらの文献(Virol. 244:365-39
6、1998))が挙げられるが、これらに限定されない。他の好適なポックスウイルスとして
は、望ましい特性を提供し、高度に弱毒化されているALVAC及びTROVACベクターなどの鶏
痘株が挙げられる(例えば、米国特許第6,265,189号;AIDS研究レビュー(AIDS Research Re
views)中のTartagliaらの文献(Koffら編, 3巻, Marcel Dekker, N. Y., 1993);及びTarta
gliaらの文献(1990, Reviews in Immunology 10:13-30、1990)を参照されたい)。
【０５１２】
flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現させるために非インフルエンザウイルスを改変
する方法は、そのようなウイルスを弱毒化させ、増殖させ、かつ単離及び精製する方法と
同様に当技術分野で周知である。NDVベクターに関するそのような技術については、国際
公開WO 01/04333号;米国特許第7,442,379号、第6,146,642号、第6,649,372号、第6,544,7
85号、及び第7,384,774号;Swayneらの文献(2003)(Avian Dis. 47:1047-1050);及びSwayne
文献(2001)(J. Virol. 11868-11873)を参照されたく、その各々は、引用によりその全体
が本明細書中に組み込まれる。ポックスウイルスに関するそのような技術については、例
えば、Picciniらの文献(Methods of Enzymology 153:545-563, 1987);国際公開WO 96/112
79号;米国特許第4,769,330号;米国特許第4,722,848号;米国特許第4,769,330号;米国特許
第4,603,112号;米国特許第5,110,587号;米国特許第5,174,993号;EP 83 286号;EP 206 920
号;Mayrらの文献(Infection 3:6-14, 1975);並びにSutter及びMossの文献(Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 89:10847-10851, 1992)を参照されたい。ある実施態様において、非イン
フルエンザウイルスは弱毒化されている。
【０５１３】
特に、対象への投与のための組成物中で使用するための、非インフルエンザウイルスベ
クターの選択のための例示的な検討事項は、安全性、低毒性、安定性、細胞型特異性、及
び免疫原性、特に、非インフルエンザウイルスベクターによって発現されるflu血球凝集
素(HA)ポリペプチドの抗原性である。
【０５１４】
(5.9  ウイルス様粒子及びウイロソーム)
本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイ
ルス血球凝集素ポリペプチド)は、ウイルス様粒子(VLP)ベクター、例えば、精製された/
単離されたVLPに組み込むことができる。VLPは、通常、ウイルスの構造タンパク質(複数
可)に一般的に由来するウイルスポリペプチド(複数可)を含む。いくつかの実施態様にお
いて、VLPは複製することができない。ある実施態様において、VLPはウイルスの完全なゲ
ノムを欠いていてもよく、又はウイルスのゲノムの一部を含んでいてもよい。いくつかの
実施態様において、VLPは細胞に感染することができない。いくつかの実施態様において
、VLPは、当業者に公知であるか又は本明細書に記載されている1以上のウイルス性標的部
分(例えば、ウイルス表面糖タンパク質)又は非ウイルス性標的部分(例えば、抗体もしく
はタンパク質)をその表面に発現する。いくつかの実施態様において、VLPは、flu血球凝
集素(HA)ポリペプチド及びウイルス構造タンパク質、例えば、HIV gagを含む。具体的な
実施態様において、VLPは、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド及びHIV gagポリペプチドを
含む。
【０５１５】
組換えで産生されるVLPを産生して特徴付けるための方法は、インフルエンザウイルス(
Brightらの文献(2007, Vaccine. 25:3871))、ヒトパピローマウイルス1型(Hagneseeらの
文献(1991, J. Virol. 67:315))、ヒトパピローマウイルス16型(Kirnbauerらの文献(Proc
. Natl. Acad. Sci.(1992)89:12180))、HIV-1(Hafferらの文献(1990, J. Virol. 64:2653
))、及びA型肝炎(Winokurの文献(1991, 65:5029))を含む、いくつかのウイルスに基づい
て記載されており、その各々は、その全体が本明細書中に組み込まれている。NDVタンパ
ク質を含むVLPを発現させる方法は、Pantuaらの文献(2006, J. Virol. 80:11062-11073)
、及び2009年3月12日に公開された米国特許出願公開第20090068221号で提供されており、
その各々は、その全体が本明細書中に組み込まれている。具体的な実施態様において、本
明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むVLPを、下の実施例の節に記載され
ているように、バキュロウイルスを用いて生成させる。他の実施態様において、本明細書
に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むVLPを、下の実施例の節に記載されている
ように、293T細胞を用いて生成させる。
【０５１６】
具体的な実施態様において、VLP、例えば、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むVLP
を、細胞(例えば、293T細胞)で発現させる。ある実施態様において、VLPを、シアル酸を
含む表面糖タンパク質を発現する細胞で発現させる。そのような実施態様に従って、細胞
をノイラミニダーゼ(例えば、ウイルス又は細菌のノイラミニダーゼ)の存在下で培養する
。ある実施態様において、VLP、例えば、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むVLPを、
シアル酸を含む表面糖タンパク質を発現しない細胞で発現させる。
【０５１７】
具体的な実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、ウイロソームに組み
込むことができる。flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むウイロソームは、当業者に公
知の技術を用いて産生することができる。例えば、ウイロソームは、精製されたウイルス
を破壊し、ゲノムを抽出し、ウイルスタンパク質(例えば、flu血球凝集素(HA)ポリペプチ
ド)及び脂質で粒子を再び組み立てて、ウイルスタンパク質を含む脂質粒子を形成させる
ことによって産生することができる。
【０５１８】
(5.10  細菌ベクター)
具体的な実施態様において、細菌は、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチ
ド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)を発現するように改
変することができる。flu血球凝集素(HA)ポリペプチドの発現のために好適な細菌として
は、リステリア、サルモネラ(Salmonella)、赤痢菌(Shigella)種、ヒト結核菌(Mycobacte
rium tuberculosis)、大腸菌、髄膜炎菌(Neisseria meningitides)、ウシ流産菌(Brucell
a abortus)、マルタ熱菌(Brucella melitensis)、ライム病ボレリア(Borrelia burgdorfe
ri)、乳酸菌(Lactobacillus)、カンピロバクター(Campylobacter)、ラクトコッカス(Lact
ococcus)、ビフィズス菌(Bifidobacterium)、及び野兎病菌(Francisella tularensis)が
挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において、flu血球凝集素(HA)
ポリペプチドを発現するように改変された細菌は、弱毒化されている。異種ポリペプチド
を発現するように改変された細菌の産生技術は当技術分野で公知であり、flu血球凝集素(
HA)ポリペプチドの発現に適用することができる。例えば、2008年10月9日に公開された米
国特許出願公開第20080248066号及び2007年9月6日に公開された米国特許出願公開第20070
207171号を参照されたく、その各々は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる
。ある実施態様において、本明細書で使用される細菌ベクターは、N結合型グリコシル化
を行なう能力を保有し、例えば、そのような細菌は、N-グリコシル化機構を天然に保有す
るか(例えば、カンピロバクター)、又はN-グリコシル化機構を保有するように遺伝子改変
されている。
【０５１９】
(5.11  植物及び藻類ベクター)
ある実施態様において、植物(例えば、タバコ属の植物)を、本明細書に記載のflu血球
凝集素(HA)ポリペプチドを発現するように改変することができる。具体的な実施態様にお
いて、当技術分野で公知の方法を用いたアグロインフィルトレーションによって、植物を
本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイル
ス血球凝集素ポリペプチド)を発現するように改変することができる。例えば、関心対象
の遺伝子、例えば、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする遺伝
子をコードする核酸を、アグロバクテリウムの株に導入する。その後、この株を液体培地
中で増殖させ、得られる細菌を洗浄し、緩衝溶液に懸濁する。その後、アグロバクテリウ
ムが関心対象の遺伝子を植物細胞の一部に形質転換するように、植物を(例えば、注射又
は浸漬によって)本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする核酸を含
むアグロバクテリウムに曝露させる。その後、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを該植物
によって一過性に発現させ、当技術分野で公知かつ本明細書に記載の方法を用いて単離す
ることができる(具体的な例については、Shojiらの文献(2008, Vaccine, 26(23):2930-29
34);及びD’Aoustらの文献(2008, J. Plant Biotechnology, 6(9):930-940))を参照され
たい。具体的な実施態様において、植物は、タバコ植物(すなわち、タバコ(Nicotiana ta
bacum))である。別の具体的な実施態様において、植物は、タバコ植物の近縁種(例えば、
ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana))である。別の具体的な実施態様において、
本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを大豆種で発現させる。別の具体的な
実施態様において、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドをトウモロコシ種
で発現させる。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポ
リペプチドをコメ種で発現させる。
【０５２０】
他の実施態様において、藻類(例えば、コナミドリムシ(Chlamydomonas reinhardtii))
を改変して、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現させることができ
る(例えば、Rasalaらの文献(2010, Plant Biotechnology Journal)(2010年3月7日にオン
ラインで発表され、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている)を参照された
い)。
【０５２１】
ある実施態様において、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現させ
るために使用される植物は、N-グリコシル化系(例えば、細菌又は哺乳動物N-グリコシル
化系)の成分を発現するように改変されている、すなわち、該植物は、N-グリコシル化を
行なうことができる。
【０５２２】
flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現させるために使用することができる植物細胞、
及び植物細胞培養系を利用するタンパク質の産生方法は、例えば、米国特許第5,929,304
号;第7,504,560号;第6,770,799号;第6,551,820号;第6,136,320号;第6,034,298号;第5,914
,935号;第5,612,487号;及び第5,484,719号、米国特許出願公開第2009/0208477号、第2009
/0082548号、第2009/0053762号、第2008/0038232号、第2007/0275014号、及び第2006/020
4487号、並びにShojiらの文献(2008, Vaccine, 26(23):2930-2934)、及びD’Aoustらの文
献(2008, J. Plant Biotechnology, 6(9):930-940)に記載されている(これらは、引用に
よりその全体が本明細書中に組み込まれている)。
【０５２３】
(5.12  flu血球凝集素(HA)ポリペプチドに対する抗体の作製)
本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコード
する核酸、又はそのような核酸もしくはポリペプチドを含むベクターを用いて、インフル
エンザに対する、例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのストーク領
域に対する中和抗体を誘発することができる。具体的な実施態様において、本明細書に記
載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、又は
そのような核酸もしくはポリペプチドを含むベクターを非ヒト対象(例えば、マウス、ウ
サギ、ラット、モルモットなど)に投与して、抗体の産生を含む免疫応答を誘導すること
ができ、この抗体は、当業者に公知の技術(例えば、免疫親和性クロマトグラフィー、遠
心分離、沈殿など)を用いて単離することができる。
【０５２４】
或いは、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを用いて、抗体ライブラリ
ーから抗体をスクリーニングすることができる。例えば、単離されたflu血球凝集素(HA)
ポリペプチドを固体支持体(例えば、シリカゲル、樹脂、誘導体化プラスチックフィルム
、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、ポリスチレンビーズ、アルミナゲル、又は多
糖、磁気ビーズ)に固定し、抗体への結合についてスクリーニングすることができる。代
替法として、抗体を固体支持体に固定し、単離されたflu血球凝集素(HA)ポリペプチドへ
の結合についてスクリーニングすることができる。任意のスクリーニングアッセイ、例え
ば、パニングアッセイ、ELISA、表面プラズモン共鳴、又は当技術分野で公知の他の抗体
スクリーニングアッセイを用いて、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドに結合する抗体につ
いてスクリーニングすることができる。スクリーニングされる抗体ライブラリーは、市販
の抗体ライブラリー、インビトロで作製されたライブラリー、又はインフルエンザに感染
した個体から抗体を同定及びクローニング又は単離することによって得られたライブラリ
ーであることができる。特定の実施態様において、抗体ライブラリーは、インフルエンザ
ウイルス大発生の生存者から作製される。抗体ライブラリーは、当技術分野で公知の方法
に従って作製することができる。特定の実施態様において、抗体ライブラリーは、抗体を
クローニングし、それをファージディスプレイライブラリー又はファージミドディスプレ
イライブラリーで用いることによって作製される。
【０５２５】
本明細書に記載の方法で同定される抗体は、当技術分野で公知又は本明細書に記載の生
物学的アッセイを用いて、中和活性及び自己反応性の欠如について試験することができる
。一実施態様において、非ヒト動物又は抗体ライブラリーから単離された抗体は、2以上
のインフルエンザ亜型由来の血球凝集素ポリペプチドを中和する。いくつかの実施態様に
おいて、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、
又はそのような核酸もしくはポリペプチドをコードするベクターを用いて誘発又は同定さ
れる抗体は、インフルエンザH3ウイルスを中和する。いくつかの実施態様において、flu
血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、又はそのよう
な核酸もしくはポリペプチドを含むベクターを用いて誘発又は同定される抗体は、1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、もしくは16種、又はそれより多くのイ
ンフルエンザウイルスの亜型又は株を中和する。一実施態様において、中和抗体は1以上
のA型インフルエンザウイルス及び1以上のB型インフルエンザウイルスを中和する。特定
の実施態様において、中和抗体は、CR6261、CR6325、CR6329、CR6307、CR6323、2A、D7、
D8、F10、G17、H40、A66、D80、E88、E90、H98、C179(ハイブリドーマFERM BP-4517によ
り産生される;Takara Bio社により販売されているクローン(Otsu, Shiga, Japan))、及び
/又はAI3C(FERM BP-4516);もしくはEkiert DCらの文献(2009)高度に保存されたインフル
エンザウイルスエピトープの抗体認識(Antibody Recognition of a Highly Conserved In
fluenza Virus Epitope)(Science(2009年2月26日にScience Expressで発表された)); Kas
hyapらの文献(2008)トルコH5N1鳥インフルエンザ大発生の生存者由来のコンビナトリアル
抗体ライブラリーは、ウイルス中和戦略を明らかにする(Combinatorial antibody librar
ies from survivors of the Turkish H5N1 avian influenza outbreak revealウイルス n
eutralization strategies.)(Proc Natl Acad Sci U S A 105: 5986-5991);Suiらの文献(
2009)鳥及びヒトA型インフルエンザウイルスの広域スペクトル中和のための構造及び機能
的基礎(Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avia
n and human influenza A virus.)(Nat Struct Mol Biol 16: 265-273);米国特許第5,589
,174号、第5,631,350号、第6,337,070号、及び第6,720,409号;国際公開WO 2007/134237と
して公開された国際出願PCT/US2007/068983号;国際公開WO 2009/036157号として公開され
た国際出願PCT/US2008/075998号;国際公開WO 2008/028946号として公開された国際出願PC
T/EP2007/059356号;及び国際公開WO 2009/079259号として公開された国際出願PCT/US2008
/085876号に記載されている任意の他の抗体ではないか、又はそれらと同じエピトープに
結合しない。他の実施態様において、中和抗体は、Wangらの文献(2010)「異なる血球凝集
素による連続免疫後のH3インフルエンザウイルスに対する広域防御性モノクローナル抗体
(Broadly Protective Monoclonal Antibodies against H3 Influenza Viruses following
Sequential Immunization with Different Hemagglutinins)」(PLOS Pathogens 6(2):1-
9)に記載されている抗体ではない。特定の実施態様において、中和抗体は、Ig VH1-69セ
グメントを使用していない。いくつかの実施態様において、中和抗体と抗原との相互作用
は、重鎖によってのみ仲介されるものではない。
【０５２６】
flu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、又はそ
のような核酸もしくはポリペプチドを含むベクターを用いて同定又は誘発される抗体には
、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫活性部分、すなわち、血球凝集素ポ
リペプチドに特異的に結合する抗原結合部位を含む分子が含まれる。免疫グロブリン分子
は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及びIgY)、
クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)、又はサブクラスであること
ができる。抗体には、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キ
メラ抗体、単鎖Fv(scFv)、単鎖抗体、Fab断片、F(ab')断片、ジスルフィド結合Fv(sdFv)
、及び抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本明細書に記載の方法を用いて誘発又は同
定される抗体に対する抗Id抗体を含む)、並びに上記のいずれかのエピトープ結合性断片
が含まれるが、これらに限定されない。
【０５２７】
flu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、又はそ
のような核酸もしくはポリペプチドを含むベクターを用いて誘発又は同定される抗体は、
診断的イムノアッセイ、受動免疫療法、及び抗イディオタイプ抗体の作製で使用すること
ができる。受動免疫療法で使用される前の抗体を修飾することができ、例えば、抗体をキ
メラ化又はヒト化することができる。キメラ抗体及びヒト化抗体の作製に関する概説につ
いては、例えば、米国特許第4,444,887号及び第4,716,111号;並びに国際公開WO 98/46645
号、WO 98/50433号、WO 98/24893号、WO 98/16654号、WO 96/34096号、WO 96/33735号、
及びWO 91/10741号を参照されたく、その各々は、引用によりその全体が本明細書中に組
み込まれる。さらに、血球凝集素ポリペプチドを中和する抗体の能力及び該ポリペプチド
に対する抗体の特異性を、受動免疫療法で抗体を使用する前に試験することができる。イ
ンフルエンザウイルス感染に起因する疾患の予防又は治療のための中和抗体の使用に関す
る議論については、下記の第5.11節を参照されたい。
【０５２８】
flu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、又はそ
のような核酸もしくはポリペプチドを含むベクターを用いて誘発又は同定される抗体を用
いて、療法の効果及び/又は疾患の進行をモニタリングすることができる。この目的のた
めに、限定されないが、少し例を挙げれば、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫
吸着アッセイ)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫
拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセ
イ、プロテインAイムノアッセイ、及び免疫電気泳動アッセイなどの技術を用いた、競合
的及び非競合的アッセイ系を含む、当技術分野で公知の任意のイムノアッセイ系を使用す
ることができる。
【０５２９】
flu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、又はそ
のような核酸もしくはポリペプチドを含むベクターを用いて誘発又は同定される抗体は、
抗イディオタイプ抗体の作製で使用することができる。その後、今度は、この抗イディオ
タイプ抗体を、インフルエンザの特定の抗原、例えば、血球凝集素ポリペプチドの中和エ
ピトープに結合する抗体の亜集団を産生するために、免疫に使用することができる(引用
によりその全体が本明細書中に組み込まれている、Jerneの文献(1974, Ann. Immunol.(Pa
ris)125c:373);Jerneらの文献(1982, EMBO J. 1:234))。
【０５３０】
(5.13  flu血球凝集素(HA)ポリペプチドによる細胞の刺激)
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)
ポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)によって
エクスビボで細胞を刺激する方法である。そのような細胞、例えば、樹状細胞を、flu血
球凝集素(HA)ポリペプチドに対する抗体を作製するためにインビトロで使用することがで
きるか、又はそれ自体を、例えば、当技術分野で公知の養子移入技術によって対象に投与
することができる。養子移入技術の説明については、例えば、引用によりその全体が本明
細書中に組み込まれている、2008年1月24日に公開された米国特許出願公開第20080019998
号を参照されたい。ある実施態様において、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペ
プチドによってエクスビボで刺激された細胞を対象に投与する場合、該細胞は、哺乳動物
細胞(例えば、CB-1細胞)ではない。
【０５３１】
1つの非限定的な例では、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現する
ように改変されたベクター、例えば、インフルエンザウイルスベクターを用いて、flu血
球凝集素(HA)ポリペプチドを発現させ、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド
に対する免疫刺激特性を提示する樹状細胞(DC)を作製することができる。そのようなDCは
、メモリーT細胞を拡大するために使用されることができ、flu血球凝集素(HA)ポリペプチ
ドに特異的な細胞傷害性Tリンパ球クローンを含む、T細胞の強力なスティミュレーターで
ある。引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、Strobelらの文献(2000, Hu
man Gene Therapy 11:2207-2218)を参照されたい。
【０５３２】
本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、該ポリペプチドを標的細胞、例
えば、DCと接触させ、該ポリペプチドを標的細胞に送達する任意の方法で標的細胞に送達
することができる。ある実施態様において、本明細書に記載されているように、flu血球
凝集素(HA)ポリペプチドを対象に送達する。いくつかのそのような実施態様において、ポ
リペプチドと接触させた細胞を単離し、増殖させることができる。
【０５３３】
ある実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドをインビトロで標的細胞に送
達する。当業者に公知の技術を用いて、標的細胞にポリペプチドを送達することができる
。例えば、標的細胞を、組織培養プレート、チューブ、又は他の容器中のポリペプチドと
接触させることができる。ポリペプチドを培地に懸濁し、培養プレートのウェル、チュー
ブ、又は他の容器に添加することができる。ポリペプチドを含む培地を、細胞のプレーテ
ィングの前に、又は細胞をプレーティングした後に添加することができる。標的細胞は、
ポリペプチドを細胞と接触させるのに十分な量の時間、ポリペプチドとともにインキュベ
ートすることが好ましい。ある実施態様において、細胞を、ポリペプチドとともに、約1
時間以上、約5時間以上、約10時間以上、約12時間以上、約16時間以上、約24時間以上、
約48時間以上、約1時間〜約12時間、約3時間〜約6時間、約6時間〜約12時間、約12時間〜
約24時間、又は約24時間〜約48時間インキュベートする。flu血球凝集素(HA)ポリペプチ
ドがウイルス中にある、ある実施態様において、標的細胞を接触させることは、細胞をウ
イルスに感染させることを含む。
【０５３４】
標的細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びモルモットを含む、任意の
種由来のものであることができる。いくつかの実施態様において、標的細胞は、健康な対
象又は治療を必要とする対象から得られるDCである。ある実施態様において、標的細胞は
、ポリペプチドに対する免疫応答を刺激することが望ましい対象から得られるDCである。
対象から細胞を得る方法は、当技術分野で周知である。
【０５３５】
(5.14  組成物)
本明細書に記載の核酸、ベクター、ポリペプチド、細菌、抗体、又は細胞(本明細書で
は「活性化合物」と呼ばれることもある)を組成物に組み込むことができる。具体的な実
施態様において、組成物は、医薬組成物、例えば、免疫原性組成物(例えば、ワクチン製
剤)である。本明細書に提供される医薬組成物は、組成物を対象に投与することができる
任意の形態であることができる。具体的な実施態様において、医薬組成物は、獣医学的投
与及び/又はヒトへの投与に好適である。組成物は、インフルエンザウイルス疾患を予防
又は治療する方法で使用することができる。
【０５３６】
一実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、flu
血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペ
プチド)を含む。別の実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との
混合物中に、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする核酸を含む
。別の実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、fl
u血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを含む。別の実施態
様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、flu血球凝集素(
HA)ポリペプチドを含むインフルエンザウイルス又は非インフルエンザウイルスを含む。
別の実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、flu
血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現するように改変されたゲノムを有するインフルエンザ
ウイルス又は非インフルエンザウイルスを含む。別の実施態様において、医薬組成物は、
医薬として許容し得る担体との混合物中に、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むウイ
ルス様粒子又はウイロソームを含む。別の実施態様において、医薬組成物は、医薬として
許容し得る担体との混合物中に、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現するか、又はそ
れを発現するように改変された細菌を含む。別の実施態様において、医薬組成物は、医薬
として許容し得る担体との混合物中に、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドで刺激された細
胞を含む。
【０５３７】
いくつかの実施態様において、医薬組成物は、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポ
リペプチドを利用する療法に加えて1以上の他の療法を含むことができる。
【０５３８】
本明細書で使用されるように、「医薬として許容し得る」という用語は、動物、より具
体的にはヒトでの使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局に承認されているか
、又は米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する
。「担体」という用語は、医薬組成物がそれとともに投与される、希釈剤、アジュバント
、賦形剤、又は媒体を指す。食塩水溶液及び水性デキストロース溶液及びグリセロール溶
液を、特に注射用溶液のための液体担体として利用することもできる。好適な賦形剤とし
ては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、
チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タル
ク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、
エタノールなどが挙げられる。好適な医薬担体の例は、E. W. Martin著「レミントンの薬
学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」に記載されている。製剤は、投与様式に適
するべきである。
【０５３９】
具体的な実施態様において、医薬組成物は、対象への意図された投与経路に好適である
ように製剤化される。例えば、医薬組成物は、非経口、経口、皮内、経皮、結腸直腸、腹
腔内、及び直腸投与に適するように製剤化することができる。具体的な実施態様において
、医薬組成物は、静脈内、経口、腹腔内、鼻腔内、気管内、皮下、筋肉内、局所、皮内、
経皮、又は肺投与用に製剤化することができる。
【０５４０】
ある実施態様において、生体分解性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水
物、ポリエチレングリコール(PEG化)、ポリメタクリル酸メチルポリマー、ポリラクチド
、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル
、及びポリ乳酸を担体として使用することができる。いくつかの実施態様において、活性
化合物は、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤のように、身
体からの速やかな消失からの化合物の保護を増大させる担体を用いて調製される。そのよ
うな製剤の調製方法は当業者には明らかであろう。リポソーム又はミセルを医薬として許
容し得る担体として使用することもできる。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号
に記載されているような、当業者に公知の方法によって調製することができる。ある実施
態様において、医薬組成物は、1以上のアジュバントを含む。
【０５４１】
具体的な実施態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、一価製剤である。他
の実施態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、多価製剤である。一例におい
て、多価製剤は、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現する2以上のベクターを含む。あ
る実施態様において、多価製剤は、単一のベクターを用いて発現される1以上の異なるflu
血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むことができる。
【０５４２】
ある実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、防腐剤、例えば、水銀誘導体
のチメロサールをさらに含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物
は、0.001％〜0.01％のチメロサールを含む。他の実施態様において、本明細書に記載の
医薬組成物は、防腐剤を含まない。具体的な実施態様において、チメロサールは、本明細
書に記載の医薬組成物の製造時に使用され、チメロサールは、医薬組成物の生産後の精製
工程を通して除去される、すなわち、医薬組成物は、微量のチメロサールを含む(精製後
に、1用量当たり＜0.3μgの水銀;そのような医薬組成物は、チメロサール不含製品とみな
される)。
【０５４３】
ある実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、卵タンパク質(例えば、オボ
アルブミン又は他の卵タンパク質)をさらに含む。本明細書に記載の医薬組成物中の卵タ
ンパク質の量は、1mlの医薬組成物に対して、約0.0005〜約1.2μgの卵タンパク質である
ことができる。他の実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、卵タンパク質を
含まない。
【０５４４】
ある実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、限定されないが、ゲンタマイ
シン、ネオマイシン、ポリミキシン(例えば、ポリミキシンB)及びカナマイシン、ストレ
プトマイシンを含む、1以上の抗微生物剤(例えば、抗生物質)をさらに含む。他の実施態
様において、本明細書に記載の医薬組成物は、いかなる抗生物質も含まない。
【０５４５】
ある実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、ウイルスを不活化するために
使用される1以上の成分、例えば、ホルマリンもしくはホルムアルデヒド、又は界面活性
剤、例えば、デオキシコール酸ナトリウム、オクトキシノール9(TritonX-100)、及びオク
トキシノール10をさらに含む。他の実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、
ウイルスを不活化するために使用されるいかなる成分も含まない。
【０５４６】
ある実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、ゼラチンをさらに含む。他の
実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、ゼラチンを含まない。
【０５４７】
ある実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、1以上の緩衝剤、例えば、リ
ン酸緩衝剤及びスクロースホスフェートグルタメート緩衝剤をさらに含む。他の実施態様
において、本明細書に記載の医薬組成物は、緩衝剤を含まない。
【０５４８】
ある実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、1以上の塩、例えば、塩化ナ
トリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、グルタミン酸一ナトリウム、及びアルミ
ニウム塩(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン(硫酸アルミニ
ウムカリウム)、又はそのようなアルミニウム塩の混合物)をさらに含む。他の実施態様に
おいて、本明細書に記載の医薬組成物は、塩を含まない。
【０５４９】
具体的な実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、低添加剤インフルエンザ
ウイルスワクチンである、すなわち、該医薬組成物は、インフルエンザウイルスワクチン
中に一般に見られる1以上の添加剤を含まない。低添加剤インフルエンザワクチンは記載
されている(例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、国際公開WO 
09/001217号として公開された国際出願PCT/IB2008/002238号を参照されたい)。
【０５５０】
本明細書に記載の医薬組成物は、投与のための説明書と一緒に、容器、パック、又はデ
ィスペンサーに含めることができる。
【０５５１】
本明細書に記載の医薬組成物は、使用前に保存することができ、例えば、該医薬組成物
は、冷凍して(例えば、約-20℃もしくは約-70℃で)保存するか;冷蔵条件で(例えば、約4
℃で)保存するか;又は室温で保存することができる(インフルエンザワクチンを含む組成
物を冷蔵しないで保存する方法については、引用によりその全体が本明細書中に組み込ま
れている、国際公開WO 07/110776号として公開された国際出願PCT/IB2007/001149号を参
照されたい)。
【０５５２】
ある実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物中の活性化合物が、flu血球凝集
素(HA)ポリペプチドを発現するように改変された細胞である場合、該医薬組成物中の細胞
は、哺乳動物細胞(例えば、CB-1細胞)ではない。
【０５５３】
(5.14.1  サブユニットワクチン)
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のflu血球凝
集素(HA)ポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)
を含むサブユニットワクチンである。いくつかの実施態様において、サブユニットワクチ
ンは、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド、及び1以上の表面糖タンパク質(例えば、インフ
ルエンザウイルスノイラミニダーゼ)、他のターゲッティング部分、又はアジュバントを
含む。具体的な実施態様において、サブユニットワクチンは、単一のflu血球凝集素(HA)
ポリペプチドを含む。他の実施態様において、サブユニットワクチンは、2つ、3つ、4つ
、又はそれより多くのflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む。具体的な実施態様におい
て、サブユニットワクチンで使用されるflu血球凝集素(HA)ポリペプチド(複数可)は、膜
結合型でない、すなわち、それは可溶性である。
【０５５４】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、1用量当たり、約10μg〜約60μg
の本明細書に記載の1以上のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、約0.001％〜0.01％のチメ
ロサール、約0.1μg〜約1.0μgの鶏卵タンパク質、約1.0μg〜約5.0μgのポリミキシン、
約1.0μg〜約5.0μgのネオマイシン、約0.1μg〜約0.5μgのベータプロピオラクトン、及
び約0.001〜約0.05w/v％のノニルフェノールエトキシレートを含むサブユニットワクチン
である。
【０５５５】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるサブユニットワクチンは、45μgの
本明細書に提供されるflu血球凝集素(HA)ポリペプチド(複数可)、1.0μg以下の水銀(チメ
ロサール由来)、1.0μg以下の鶏卵タンパク質(すなわち、オボアルブミン)、3.75μg以下
のポリミキシン、及び2.5μg以下のネオマイシンを含む0.5ml用量を含むか又はそれから
なる。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるサブユニットワクチンは、1
用量当たり、0.5μg以下のベータプロピオラクトン及び0.015w/v％以下のノニルフェノー
ルエトキシレートをさらに含むか、又はそれらからなる。いくつかの実施態様において、
0.5ml用量のサブユニットワクチンは、充填済み注射器にパックされる。
【０５５６】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるサブユニットワクチンは、45μgの
本明細書に提供されるflu血球凝集素(HA)ポリペプチド(複数可)、25.0μgの水銀(チメロ
サール由来)、1.0μg以下の鶏卵タンパク質(すなわち、オボアルブミン)、3.75μg以下の
ポリミキシン、及び2.5μg以下のネオマイシンを含む5.0mlの多用量バイアル(1用量当た
り、0.5ml)からなる。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるサブユニット
ワクチンは、1用量当たり、0.5μg以下のベータプロピオラクトン及び0.015w/v％以下の
ノニルフェノールエトキシレートをさらに含むか、又はそれらからなる。
【０５５７】
具体的な実施態様において、サブユニットワクチンは、発育鶏卵で増殖させたインフル
エンザウイルスを用いて調製される(すなわち、サブユニットワクチンの成分(例えば、fl
u血球凝集素(HA)ポリペプチド)は、発育鶏卵で増殖させたウイルスから単離される)。別
の具体的な実施態様において、サブユニットワクチンは、発育鶏卵で増殖させなかったイ
ンフルエンザウイルスを用いて調製される(すなわち、サブユニットワクチンの成分(例え
ば、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド)は、発育鶏卵で増殖させなかったウイルスから単離
される)。別の具体的な実施態様において、サブユニットワクチンは、哺乳動物細胞、例
えば、不死化ヒト細胞(例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、
国際公開WO 07/045674号として公開された国際出願PCT/EP2006/067566号を参照されたい)
、又はイヌ腎臓細胞、例えば、MDCK細胞(例えば、引用によりその全体が本明細書中に組
み込まれている、国際公開WO 08/032219号として公開された国際出願PCT/IB2007/003536
号を参照されたい)で増殖させたインフルエンザウイルスを用いて調製される(すなわち、
サブユニットワクチンの成分(例えば、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド)は、哺乳動物細
胞で増殖させたウイルスから単離される)。別の具体的な実施態様において、サブユニッ
トワクチン中の血球凝集素ステムドメインポリペプチド(複数可)は、発現ベクター、例え
ば、ウイルスベクター、植物ベクター、又は細菌ベクターを用いて調製される(すなわち
、サブユニットワクチン中のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド(複数可)は、発現ベクター
から得られる/単離される)。
【０５５８】
(5.14.2  生ウイルスワクチン)
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例
えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)を含む生ウイルスを含む
免疫原性組成物(例えば、ワクチン)である。別の実施態様において、本明細書に提供され
るのは、組成物を投与される対象で産生される子孫ウイルスによって発現されるflu血球
凝集素(HA)ポリペプチドをコードするように改変されている生ウイルスを含む免疫原性組
成物(例えば、ワクチン)である。具体的な実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペ
プチドは、膜結合型である。他の具体的な実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペ
プチドは膜結合型ではない、すなわち、可溶性である。特定の実施態様において、生ウイ
ルスは、上の第5.7節に記載されているような、インフルエンザウイルスである。他の実
施態様において、生ウイルスは、上の第5.8節に記載されているような、非インフルエン
ザウイルスである。いくつかの実施態様において、生ウイルスは弱毒化されている。いく
つかの実施態様において、免疫原性組成物は、2つ、3つ、4つ、もしくはそれより多くの
異なるflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むか、又はそれらを発現するように改変され
ている、2つ、3つ、4つ、又はそれより多くの生ウイルスを含む。
【０５５９】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、1用量当たり、本明細書に記載の1
以上のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む約105〜約1010蛍光焦点単位(FFU)の弱毒化
生インフルエンザウイルス、約0.1〜約0.5mgのグルタミン酸一ナトリウム、約1.0〜約5.0
mgの加水分解ブタ(procine)ゼラチン、約1.0〜約5.0mgのアルギニン、約10〜約15mgのス
クロース、約1.0〜約5.0mgの二塩基性リン酸カリウム、約0.5〜約2.0mgのリン酸二水素カ
リウム、及び約0.001〜約0.05μg/mlの硫酸ゲンタマイシンを含む免疫原性組成物(例えば
、ワクチン)である。いくつかの実施態様において、免疫原性組成物(例えば、ワクチン)
は、単一の0.2ml用量を含む充填済み噴霧器としてパックされる。
【０５６０】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、1用量当たり、本明細書に記
載の1以上のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む106.5〜107.5FFUの弱毒化生インフル
エンザウイルス、0.188mgのグルタミン酸一ナトリウム、2.0mgの加水分解ブタゼラチン、
2.42mgのアルギニン、13.68mgのスクロース、2.26mgの二塩基性リン酸カリウム、0.96mg
のリン酸二水素カリウム、及び0.015μg/ml未満の硫酸ゲンタマイシンを含む免疫原性組
成物(例えば、ワクチン)である。いくつかの実施態様において、免疫原性組成物(例えば
、ワクチン)は、単一の0.2ml用量を含む充填済み噴霧器としてパックされる。
【０５６１】
具体的な実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む生ウイルスを、本
明細書に記載の免疫原性組成物中でのその使用の前に、発育鶏卵で増殖させる。別の具体
的な実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む生ウイルスを、本明細書
に記載の免疫原性組成物中でのその使用の前に、発育鶏卵で増殖させない。別の具体的な
実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む生ウイルスを、本明細書に記
載の免疫原性組成物中でのその使用の前に、哺乳動物細胞、例えば、不死化ヒト細胞(例
えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、国際公開WO 07/045674号と
して公開された国際出願PCT/EP2006/067566号を参照されたい)、又はイヌ腎臓細胞、例え
ば、MDCK細胞(例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、国際公開W
O 08/032219号として公開された国際出願PCT/IB2007/003536号を参照されたい)で増殖さ
せる。
【０５６２】
対象でのウイルスの増殖は、自然感染で起こるものと同様の種類及び程度の長期刺激を
もたらし、そのため、かなりの長期持続性免疫を付与することができるので、対象への投
与用の生ウイルスを含む免疫原性組成物が好ましい場合がある。
【０５６３】
(5.14.3  不活化ウイルスワクチン)
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例
えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)を含む不活化ウイルスを
含む免疫原性組成物(例えば、ワクチン)である。具体的な実施態様において、flu血球凝
集素(HA)ポリペプチドは膜結合型である。特定の実施態様において、不活化ウイルスは、
上の第5.7節に記載されているような、インフルエンザウイルスである。他の実施態様に
おいて、不活化ウイルスは、上の第5.8節に記載されているような、非インフルエンザウ
イルスである。いくつかの実施態様において、免疫原性組成物は、2つ、3つ、4つ、又は
それより多くの異なるflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む、2つ、3つ、4つ、又はそれ
より多くの不活化ウイルスを含む。ある実施態様において、不活化ウイルス免疫原性組成
物は、1以上のアジュバントを含む。
【０５６４】
当業者に公知の技術を用いて、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むウイルスを不活
化することができる。一般的な方法は、不活化のためにホルマリン、熱、又は界面活性剤
を使用する。例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、米国特許第
6,635,246号を参照されたい。他の方法としては、引用によりその全体が本明細書中に組
み込まれている、米国特許第5,891,705号;第5,106,619号及び第4,693,981号に記載されて
いるものが挙げられる。
【０５６５】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、免疫原性組成物の各用量が、約15
〜約60μgの本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、約1.0〜約5.0mgの塩化ナ
トリウム、約20〜約100μgの一塩基リン酸ナトリウム、約100〜約500μgのリン酸水素ナ
トリウム、約5〜約30μgのリン酸二水素カリウム、約5〜約30μgの塩化カリウム、及び約
0.5〜約3.0μgの塩化カルシウムを含むような、不活化インフルエンザウイルスを含む免
疫原性組成物(例えば、ワクチン)である。いくつかの実施態様において、免疫原性組成物
(例えば、ワクチン)は、単一の0.25ml又は単一の0.5mlの用量としてパックされる。他の
実施態様において、免疫原性組成物(例えば、ワクチン)は、多用量製剤としてパックされ
る。
【０５６６】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、免疫原性組成物の各用量が、1用
量当たり、約15〜約60μgの本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、約0.001
％〜0.01％のチメロサール、約1.0〜約5.0mgの塩化ナトリウム、約20〜約100μgの一塩基
リン酸ナトリウム、約100〜約500μgのリン酸水素ナトリウム、約5〜約30μgのリン酸二
水素カリウム、約5〜約30μgの塩化カリウム、及び約0.5〜約3.0μgの塩化カルシウムを
含むような、不活化インフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物(例えば、ワクチン)で
ある。いくつかの実施態様において、免疫原性組成物(例えば、ワクチン)は、単一の0.25
ml又は単一の0.5mlの用量としてパックされる。他の実施態様において、免疫原性組成物(
例えば、ワクチン)は、多用量製剤としてパックされる。
【０５６７】
具体的な実施態様において、本明細書に提供される免疫原性組成物(例えば、ワクチン)
は、単一の0.25ml用量としてパックされ、1用量当たり、22.5μgの本明細書に記載のflu
血球凝集素(HA)ポリペプチド、2.05mgの塩化ナトリウム、40μgの一塩基リン酸ナトリウ
ム、150μgのリン酸水素ナトリウム、10μgのリン酸二水素カリウム、10μgの塩化カリウ
ム、及び0.75μgの塩化カルシウムを含む。
【０５６８】
具体的な実施態様において、本明細書に提供される免疫原性組成物(例えば、ワクチン)
は、単一の0.5ml用量としてパックされ、1用量当たり、45μgの本明細書に記載のflu血球
凝集素(HA)ポリペプチド、4.1mgの塩化ナトリウム、80μgの一塩基リン酸ナトリウム、30
0μgのリン酸水素ナトリウム、20μgのリン酸二水素カリウム、20μgの塩化カリウム、及
び1.5μgの塩化カルシウムを含む。
【０５６９】
具体的な実施態様において、免疫原性組成物(例えば、ワクチン)は、5.0mlのワクチン(
1用量当たり、0.5ml)を含むか又はそれからなる多用量製剤としてパックされ、1用量当た
り、24.5μgの水銀(チメロサール由来)、45μgの本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポ
リペプチド、4.1mgの塩化ナトリウム、80μgの一塩基リン酸ナトリウム、300μgのリン酸
水素ナトリウム、20μgのリン酸二水素カリウム、20μgの塩化カリウム、及び1.5μgの塩
化カルシウムを含む。
【０５７０】
具体的な実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む不活化ウイルスを
、その不活化及びその後の本明細書に記載の免疫原性組成物中での使用の前に、発育鶏卵
で増殖させた。別の具体的な実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む
不活化ウイルスを、その不活化及びその後の本明細書に記載の免疫原性組成物中での使用
の前に、発育鶏卵で増殖させなかった。別の具体的な実施態様において、flu血球凝集素(
HA)ポリペプチドを含む不活化ウイルスを、その不活化及びその後の本明細書に記載の免
疫原性組成物中での使用の前に、哺乳動物細胞、例えば、不死化ヒト細胞(例えば、引用
によりその全体が本明細書中に組み込まれている、国際公開WO 07/045674号として公開さ
れた国際出願PCT/EP2006/067566号を参照されたい)、又はイヌ腎臓細胞、例えば、MDCK細
胞(例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、国際公開WO 08/03221
9号として公開された国際出願PCT/IB2007/003536号を参照されたい)で増殖させた。
【０５７１】
(5.14.4  スプリットウイルスワクチン)
一実施態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザ
ウイルス血球凝集素ポリペプチド)を含む免疫原性組成物は、スプリットウイルスワクチ
ンである。いくつかの実施態様において、スプリットウイルスワクチンは、2つ、3つ、4
つ、又はそれより多くの異なるflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む。ある実施態様に
おいて、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、膜結合型である/あった。ある実施態様にお
いて、スプリットウイルスワクチンは、1以上のアジュバントを含む。
【０５７２】
スプリットウイルスワクチンの産生技術は当業者に公知である。非限定的な例として、
インフルエンザウイルススプリットワクチンは、界面活性剤で破壊された不活化粒子を用
いて調製することができる。本明細書に記載の方法による使用に適合させることができる
スプリットウイルスワクチンの一例は、筋肉内使用のためのfluzone(登録商標)インフル
エンザウイルスワクチン(ゾーン精製、サブビリオン)であり、それを、発育鶏卵で増殖さ
せたインフルエンザウイルスから調製される滅菌懸濁剤として製剤化する。ウイルス含有
液を回収し、ホルムアルデヒドで不活化する。インフルエンザウイルスを、連続フロー遠
心分離機を用いて、線形ショ糖密度勾配溶液中で濃縮し、精製する。次に、ウイルスを、
非イオン性界面活性剤、オクトキシノール-9(Triton(登録商標)X-100-Union Carbide社の
登録商標)を用いて化学的に破壊し、「スプリットウイルス」を生じさせる。次に、この
スプリットウイルスを、化学手段によってさらに精製し、リン酸ナトリウム緩衝生理食塩
液に懸濁する。
【０５７３】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、約10μg〜約60μgの本明細書に記
載の1以上のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、約0.01〜約1.0mgのオクトキシノール-10(T
RITON X-100(登録商標))、約0.5〜0.5mgのα-トコフェリルハイドロジェンスクシネート
、約0.1〜1.0mgのポリソルベート80(Tween 80)、約0.001〜約0.003μgのヒドロコルチゾ
ン、約0.05〜約0.3μgの硫酸ゲンタマイシン(gentamcin)、約0.5〜約2.0μgの鶏卵タンパ
ク質(オボアルブミン)、約25〜75μgのホルムアルデヒド、及び約25〜75μgのデオキシコ
ール酸ナトリウムを含むスプリットウイルスワクチンである。
【０５７４】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるスプリットウイルスワクチンは、45
μgの本明細書に提供されるflu血球凝集素(HA)ポリペプチド(複数可)、0.085mg以下のオ
クトキシノール-10(TRITON X-100(登録商標))、0.1mg以下のα-トコフェリルハイドロジ
ェンスクシネート、0.415mg以下のポリソルベート80(Tween 80)、0.0016μg以下のヒドロ
コルチゾン、0.15μg以下の硫酸ゲンタマイシン、1.0以下の鶏卵タンパク質(オボアルブ
ミン)、50μg以下のホルムアルデヒド、及び50μg以下のデオキシコール酸ナトリウムを
含む0.5ml用量を含むか又はそれからなる。いくつかの実施態様において、0.5ml用量のサ
ブユニットワクチンは、充填済み注射器にパックされる。
【０５７５】
具体的な実施態様において、スプリットウイルスワクチンは、発育鶏卵で増殖させたイ
ンフルエンザウイルスを用いて調製される。別の具体的な実施態様において、スプリット
ウイルスワクチンは、発育鶏卵で増殖させなかったインフルエンザウイルスを用いて調製
される。別の具体的な実施態様において、スプリットウイルスワクチンは、哺乳動物細胞
、例えば、不死化ヒト細胞(例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれてい
る、WO 07/045674号として公開された国際出願PCT/EP2006/067566号を参照されたい)、又
はイヌ腎臓細胞、例えば、MDCK細胞(例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込
まれている、WO 08/032219号として公開された国際出願PCT/IB2007/003536号を参照され
たい)で増殖させたインフルエンザウイルスを用いて調製される。
【０５７６】
(5.14.5  アジュバント)
ある実施態様において、本明細書に記載の組成物は、アジュバントを含むか、又はそれ
と併用投与される。本明細書に記載の組成物との併用投与のためのアジュバントは、該組
成物の投与前、それと同時、又はその後に投与されてもよい。いくつかの実施態様におい
て、「アジュバント」という用語は、本明細書に記載の組成物とともに又はその一部とし
て投与した場合、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイル
ス血球凝集素ポリペプチド)に対する免疫応答を強化し、増強し、及び/又は増進させるが
、その化合物を単独で投与した場合、ポリペプチドに対する免疫応答を生じさせない化合
物を指す。いくつかの実施態様において、アジュバントは、ポリペプチドに対する免疫応
答を生じさせ、アレルギー又は他の有害反応を生じさせない。アジュバントは、例えば、
リンパ球動員、B及び/又はT細胞の刺激、並びにマクロファージの刺激を含むいくつかの
機構によって、免疫応答を増強することができる。
【０５７７】
ある実施態様において、アジュバントは、応答の定性的形態に影響を及ぼすポリペプチ
ドの立体構造変化を引き起こすことなく、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドに対する固有
の応答を強化する。アジュバントの具体的な例としては、アルミニウム塩(ミョウバン)(
例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及び硫酸アルミニウム)、3デ-O-ア
シル化モノホスホリル脂質A(MPL)(GB 2220211号参照)、MF59(Novartis)、AS03(GlaxoSmit
hKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、ポリソルベート80(Tween 80;ICL Americas社)、イミ
ダゾピリジン化合物(国際公開WO 2007/109812号として公開された国際出願PCT/US2007/06
4857号参照)、イミダゾキノキサリン化合物(国際公開WO 2007/109813号として公開された
国際出願PCT/US2007/064858号参照)、及びサポニン、例えば、QS21(Kensilらの文献、ワ
クチンの設計:サブユニット及びアジュバント手法(Vaccine Design: The Subunit and Ad
juvant Approach)(Powell及びNewman編, Plenum Press, NY, 1995);米国特許第5,057,540
号参照)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、アジュ
バントは、フロイントアジュバント(完全又は不完全)である。他のアジュバントは、任意
に免疫賦活剤、例えば、モノホスホリル脂質Aと組み合わせた、水中油エマルジョン(例え
ば、スクアレン又は落花生油)である(Stouteらの文献(N. Engl. J. Med. 336, 86-91(199
7))参照)。別のアジュバントは、CpGである(Bioworld Today, 1998年11月15日)。そのよ
うなアジュバントは、他の特異的免疫刺激剤、例えば、MPLもしくは3-DMP、QS21、重合体
もしくは単量体のアミノ酸、例えば、ポリグルタミン酸もしくはポリリジン、又は上の第
5.4節に記載されている他の免疫増強剤とともに、又はそれらなしで使用することができ
る。flu血球凝集素(HA)ポリペプチドの異なる製剤が、異なるアジュバントを含み得るか
、又は同じアジュバントを含み得ることを理解すべきである。
【０５７８】
(5.15  予防的及び治療的使用)
一態様において、本明細書に提供されるのは、活性化合物(すなわち、本明細書に記載
のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのよ
うなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしく
は細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は本明細書に記載の組成物を利用
して、対象の免疫応答を誘導する方法である。具体的な実施態様において、対象のインフ
ルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必
要とする対象に、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド又はその免疫原性組
成物の有効量を投与することを含む。別の実施態様において、対象のインフルエンザウイ
ルス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象
に、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする核酸又はその免疫原
性組成物の有効量を投与することを含む。別の実施態様において、対象のインフルエンザ
ウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする
対象に、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むかもしくは発現するウ
イルスベクター、又はその免疫原性組成物の有効量を投与することを含む。さらに別の実
施態様において、対象のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応
答を誘導する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポ
リペプチド又はその医薬組成物の有効量で刺激された細胞を投与することを含む。ある実
施態様において、本方法で使用される本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド
は、哺乳動物細胞、植物細胞、又は昆虫細胞に由来する本明細書に記載の精製されたflu
血球凝集素(HA)ポリペプチドである。
【０５７９】
具体的な実施態様において、対象のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに
対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のサブユニ
ットワクチンを投与することを含む。別の実施態様において、対象のインフルエンザウイ
ルス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象
に、本明細書に記載の生ウイルスワクチンを投与することを含む。特定の実施態様におい
て、生ウイルスワクチンは、弱毒化ウイルスを含む。別の実施態様において、対象のイン
フルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを
必要とする対象に、本明細書に記載の不活化ウイルスワクチンを投与することを含む。別
の実施態様において、対象のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する免
疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のスプリットウイル
スワクチンを投与することを含む。別の実施態様において、対象のインフルエンザウイル
ス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象に
、本明細書に記載のウイルス様粒子ワクチンを投与することを含む。別の実施態様におい
て、インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを
必要とする対象に、本明細書に記載のウイロソームを投与することを含む。別の実施態様
において、インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、
それを必要とする対象に、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現する
かもしくは発現するように改変された細菌又はその組成物を投与することを含む。ある実
施態様において、本方法で使用される本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド
は、哺乳動物細胞、植物細胞、又は昆虫細胞に由来する本明細書に記載の精製されたflu
血球凝集素(HA)ポリペプチドである。
【０５８０】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書に記
載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、その
ようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもし
くは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物によって誘導される免
疫応答は、インフルエンザウイルスの任意の亜型又は株によって引き起こされるインフル
エンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効である。ある実施態様において、
本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、一方のHAグルー
プ(例えば、H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、及びH16を含むグループ1)に属し
、もう一方のHAグループ(例えば、H3、H4、H7、H10、H14、及びH15を含むグループ2)に属
さないインフルエンザウイルスの亜型によって引き起こされるインフルエンザウイルス感
染を予防及び/又は治療するのに有効である。例えば、誘導される免疫応答は、H11、H13
、H16、H9、H8、H12、H6、H1、H5、及びH2からなるHAグループに属するインフルエンザウ
イルスによって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するの
に有効であり得る。或いは、誘導される免疫応答は、H3、H4、H14、H10、H15、及びH7か
らなるHAグループに属するインフルエンザウイルスによって引き起こされるインフルエン
ザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効であり得る。いくつかの実施態様にお
いて、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、インフル
エンザウイルスの1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つの亜型によって引き起こされるインフル
エンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効である。ある実施態様において、
本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、インフルエンザ
ウイルスの6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、又は15の亜型によって引き起こさ
れるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効である。いくつかの
実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答
は、インフルエンザウイルスの同じ亜型内の1以上の変異体によって引き起こされるイン
フルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効である。
【０５８１】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書に記
載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、その
ようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもし
くは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物によって誘導される免
疫応答は、H1N1とH2N2の両方の亜型によって引き起こされるインフルエンザウイルス感染
を予防及び/又は治療するのに有効である。他の実施態様において、本明細書に記載の活
性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、H1N1とH2N2の両方の亜型によって引
き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効でない。い
くつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される
免疫応答は、H1N1、H2N2、及びH3N2の亜型によって引き起こされるインフルエンザウイル
ス感染を予防及び/又は治療するのに有効である。いくつかの実施態様において、本明細
書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、H3N2亜型によって引き
起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効である。他の
実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答
は、H3N2亜型によって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療
するのに有効でない。
【０５８２】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書に記
載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、その
ようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもし
くは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物によって誘導される免
疫応答は、インフルエンザウイルスの任意の亜型又は株によって引き起こされるインフル
エンザウイルス疾患を予防及び/又は治療するのに有効である。ある実施態様において、
本明細書に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、一方のHAグルー
プに属し、もう一方のHAグループに属さないインフルエンザウイルスの亜型によって引き
起こされるインフルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治療するのに有効である。例え
ば、誘導される免疫応答は、H11、H13、H16、H9、H8、H12、H6、H1、H5、及びH2からなる
HAグループに属するインフルエンザウイルスによって引き起こされるインフルエンザウイ
ルス疾患を予防及び/又は治療するのに有効であり得る。或いは、誘導される免疫応答は
、H3、H4、H14、H10、H15、及びH7からなるHAグループに属するインフルエンザウイルス
によって引き起こされるインフルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治療するのに有効
であり得る。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物によ
って誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルスの1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つの
亜型のいずれかによって引き起こされるインフルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治
療するのに有効である。ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物
によって誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルスの6つ、7つ、8つ、9つ、10、11
、12、13、14、又は15の亜型のいずれかによって引き起こされるインフルエンザウイルス
疾患を予防及び/又は治療するのに有効である。いくつかの実施態様において、本明細書
に記載の活性化合物又は組成物によって誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルス
の同じ亜型内の1以上の変異体によって引き起こされるインフルエンザウイルス疾患を予
防及び/又は治療するのに有効である。
【０５８３】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書に記
載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、その
ようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもし
くは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物によって誘導される免
疫応答は、インフルエンザウイルス疾患/感染に起因する症状を軽減するのに有効である
。インフルエンザウイルス疾患/感染の症状としては、体の痛み(特に、関節及び咽喉)、
発熱、吐き気、頭痛、ひりひり痛む目、疲労、咽喉炎、赤くなった目又は皮膚、並びに腹
痛が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５８４】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書に記
載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、その
ようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもし
くは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物によって誘導される免
疫応答は、インフルエンザウイルス疾患/感染に罹患している対象の入院を減少させるの
に有効である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物に
よって誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルス疾患/感染に罹患している対象の
入院期間を短縮するのに有効である。
【０５８５】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の活性化合物(すなわ
ち、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコー
ドする核酸、そのようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイ
ルスベクターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物を利
用して、対象のインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療する方法である。一実
施態様において、対象のインフルエンザウイルス感染を予防又は治療する方法は、それを
必要とする対象に、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコード
する核酸、そのようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター、又は上記のいず
れか1つの組成物を投与することを含む。具体的な実施態様において、対象のインフルエ
ンザウイルス感染を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、サブユニットワ
クチン、生ウイルスワクチン、不活化ウイルスワクチン、スプリットウイルスワクチン、
又はウイルス様粒子ワクチンを投与することを含む。
【０５８６】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)
ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含
むかもしくは発現するベクター、又はそのようなポリペプチドで刺激された細胞を利用し
て、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治療する方法である。具体的な
実施態様において、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法は、それ
を必要とする対象に、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド又はその免疫原性組成物の有効量
を投与することを含む。別の実施態様において、対象のインフルエンザウイルス疾患を予
防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドをコ
ードする核酸又はその免疫原性組成物の有効量を投与することを含む。別の実施態様にお
いて、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法は、それを必要とする
対象に、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むかもしくは発現するウイルスベクター、
又はその免疫原性組成物の有効量を投与することを含む。さらに別の実施態様において、
対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に
、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドで刺激された細胞又はその医薬組成物の有効量を投与
することを含む。
【０５８７】
具体的な実施態様において、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方
法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載されるサブユニットワクチンを投与する
ことを含む。別の実施態様において、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療
する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の生ウイルスワクチンを投与する
ことを含む。特定の実施態様において、生ウイルスワクチンは、弱毒化ウイルスを含む。
別の実施態様において、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法は、
それを必要とする対象に、本明細書に記載の不活化ウイルスワクチンを投与することを含
む。別の実施態様において、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法
は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のスプリットウイルスワクチンを投与する
ことを含む。別の実施態様において、インフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方
法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のウイルス様粒子ワクチンを投与するこ
とを含む。別の実施態様において、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療す
る方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のウイロソームを投与することを含
む。別の実施態様において、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法
は、それを必要とする対象に、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現するかもしくは発
現するように改変された細菌又はその組成物を投与することを含む。
【０５８８】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、対象をインフルエンザウイルス疾患又
は感染に対して免疫する方法であって、該対象が感作されていないインフルエンザウイル
スの血球凝集素を曝露させることを含む、方法であり、すなわち、該対象は、過去にイン
フルエンザウイルス及び/又はインフルエンザウイルスの血球凝集素に曝露されたことが
ない。
【０５８９】
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象をインフルエンザウイルス疾患
又は感染に対して免疫する方法であって、該対象に1以上のインフルエンザウイルスを投
与することを含む、方法であり、ここで、該1以上のインフルエンザウイルスの各々は、
該対象が感作されていない血球凝集素ポリペプチドを含み、すなわち、該対象は、過去に
該1以上のインフルエンザウイルスに曝露されたことがない。具体的な実施態様において
、該1以上のインフルエンザウイルスは、亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H
12、H13、H14、H15、H16、及び/又はH17のインフルエンザウイルスである。別の具体的な
実施態様において、該方法は、(i)亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H1
3、H14、H15、H16、又はH17のインフルエンザウイルスの第1の投与、及び(ii)亜型H2、H4
、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、又はH17のインフルエンザ
ウイルスの第2の投与を含み、ここで、第1の投与のインフルエンザウイルスは、第2の投
与のインフルエンザウイルスとは異なる亜型のものである。該第1及び第2の投与は、少な
くとも1日、2日、3日、5日、10日、15日、30日、45日、2カ月、75日、3カ月、又は少なく
とも6カ月隔てることができる。別の具体的な実施態様において、該方法は、(i)亜型H2、
H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、又はH17のインフルエン
ザウイルスの第1の投与;(ii)亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H1
4、H15、H16、又はH17インフルエンザウイルスの第2の投与;及び(iii)亜型H2、H4、H5、H
6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、又はH17のインフルエンザウイル
スの第3の投与を含み、ここで、該第1、第2、及び第3の投与のインフルエンザウイルスは
、異なる亜型のものである。該第1、第2、及び第3の投与は、少なくとも1日、2日、3日、
5日、10日、15日、30日、45日、2カ月、75日、3カ月、又は少なくとも6カ月隔てることが
できる。
【０５９０】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象をインフルエンザウイルス疾
患又は感染に対して免疫する方法であって、該対象に該対象が感作されていない1以上の
インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを投与することを含む、方法であり、す
なわち、該対象は、過去に該1以上のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに
曝露されたことがない。ある実施態様において、該対象が感作されていない1以上のイン
フルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、組成物(例えば、ワクチンを含む組成物)
中にある。ある実施態様において、該対象が感作されていない1以上のインフルエンザウ
イルス血球凝集素ポリペプチドは、ベクター、例えば、インフルエンザウイルスベクター
中にある。ある実施態様において、該対象が感作されていない1以上のインフルエンザウ
イルス血球凝集素ポリペプチドは、VLP中にある。ある実施態様において、該対象が感作
されていない1以上のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、ウイロソーム
中にある。具体的な実施態様において、該1以上のインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドは、亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16
、及び/又はH17のインフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリ
ペプチドである。別の具体的な実施態様において、該方法は、(i)亜型H2、H4、H5、H6、H
7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、又はH17のインフルエンザウイルス血
球凝集素ポリペプチドの第1の投与及び(ii)亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11
、H12、H13、H14、H15、H16、又はH17のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド
の第2の投与を含み、ここで、第1の投与のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチ
ドは、第2の投与のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドとは異なる亜型のも
のである。該第1及び第2の投与は、少なくとも1日、2日、3日、5日、10日、15日、30日、
45日、2カ月、75日、3カ月、又は少なくとも6カ月隔てることができる。別の具体的な実
施態様において、該方法は、(i)亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13
、H14、H15、H16、又はH17のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの第1の投
与;(ii)亜型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、又はH1
7のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの第2の投与;及び(iii)亜型H2、H4、
H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、又はH17のインフルエンザウ
イルス血球凝集素ポリペプチドの第3の投与を含み、ここで、該第1、第2、及び第3の投与
のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、異なるインフルエンザウイルス亜
型由来のものである。該第1、第2、及び第3の投与は、少なくとも1日、2日、3日、5日、1
0日、15日、30日、45日、2カ月、75日、3カ月、又は少なくとも6カ月隔てることができる
。
【０５９１】
別の実施態様において、該方法は、(i)本明細書に記載の第1のflu HAポリペプチド(例
えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)、そのようなポリペプチ
ドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含むか又は発現するベクターの第1の投
与;及び(ii)本明細書に記載の第2のflu HAポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザ
ウイルス血球凝集素ポリペプチド)の第2の投与を含み、ここで、該第1及び第2のflu HAポ
リペプチドは、同じステムドメインを有する。ある実施態様において、該第1及び第2のfl
u HAポリペプチドの球状ヘッドドメインは異なる。ある実施態様において、該第1及び第2
のflu HAポリペプチドの球状ヘッドドメインは同じ株由来のものである。該第1及び第2の
投与は、少なくとも1日、2日、3日、5日、10日、15日、30日、45日、2カ月、75日、3カ月
、又は少なくとも6カ月隔てることができる。ある実施態様において、追加免疫接種を対
象に6〜12カ月の間隔で投与し、次いで、2回目の接種を行なうことができる。
【０５９２】
別の実施態様において、該方法は、(i)インフルエンザウイルスの第1の投与;及び(ii)
本明細書に記載のflu HAポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチド)の第2の投与を含み、ここで、該インフルエンザウイルス及び該flu HAポ
リペプチドは、同じステムドメインを有する。ある実施態様において、該インフルエンザ
ウイルス及び該flu HAポリペプチドの球状ヘッドドメインは異なる。該第1及び第2の投与
は、少なくとも1日、2日、3日、5日、10日、15日、30日、45日、2カ月、75日、3カ月、又
は少なくとも6カ月隔てることができる。ある実施態様において、追加免疫接種を対象に6
〜12カ月の間隔で投与し、次いで、2回目の接種を行なうことができる。
【０５９３】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の中和抗体を投与する
ことによって、対象でインフルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治療する方法である
。具体的な実施態様において、対象でインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方
法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の中和抗体、又はその医薬組成物の有効
量を投与することを含む。特定の実施態様において、中和抗体はモノクローナル抗体であ
る。ある実施態様において、中和抗体は、CR6261、CR6325、CR6329、CR6307、CR6323、2A
、D7、D8、F10、G17、H40、A66、D80、E88、E90、H98、C179(FERM BP-4517)、AI3C(FERM 
BP-4516)、又はEkiert DCらの文献(2009)高度に保存されたインフルエンザウイルスエピ
トープの抗体認識(Antibody Recognition of a Highly Conserved Influenza Virus Epit
ope)(Science(2009年2月26日にScience Expressで発表された); Kashyapらの文献(2008)
トルコH5N1鳥インフルエンザ大発生の生存者由来のコンビナトリアル抗体ライブラリーは
、ウイルス中和戦略を明らかにする(Combinatorial antibody libraries from survivors
of the Turkish H5N1 avian influenza outbreak reveal virus neutralization strate
gies.)(Proc Natl Acad Sci U S A 105: 5986-5991);Suiらの文献(2009)鳥及びヒトA型イ
ンフルエンザウイルスの広域スペクトル中和のための構造及び機能的基礎(Structural an
d functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenz
a A virus.)(Nat Struct Mol Biol 16: 265-273);米国特許第5,589,174号、第5,631,350
号、第6,337,070号、及び第6,720,409号;国際公開WO 2007/134237として公開された国際
出願PCT/US2007/068983号;国際公開WO 2009/036157号として公開された国際出願PCT/US20
08/075998号;国際公開WO 2008/028946号として公開された国際出願PCT/EP2007/059356号;
及び国際公開WO 2009/079259号として公開された国際出願PCT/US2008/085876号に記載さ
れている任意の他の抗体ではない。他の実施態様において、中和抗体は、Wangらの文献(2
010)「異なる血球凝集素による連続免疫後のH3インフルエンザウイルスに対する広域防御
性モノクローナル抗体(Broadly Protective Monoclonal Antibodies against H3 Influen
za Viruses following Sequential Immunization with Different Hemagglutinins)」(PL
OS Pathogens 6(2):1-9)に記載されている抗体ではない。
【０５９４】
ある実施態様において、本明細書に提供される、対象(例えば、ヒト又は非ヒト動物)の
インフルエンザウイルス疾患又は感染を予防又は治療する方法は、当業者に公知及び本明
細書に記載のインビボ及びインビトロアッセイにより測定したとき、対象でのインフルエ
ンザウイルスの複製の低減をもたらす。いくつかの実施態様において、インフルエンザウ
イルスの複製は、約1log以上、約2log以上、約3log以上、約4log以上、約5log以上、約6l
og以上、約7log以上、約8log以上、約9log以上、約10log以上、1〜3log、1〜5log、1〜8l
og、1〜9log、2〜10log、2〜5log、2〜7log、2log〜8log、2〜9log、2〜10log、3〜5log
、3〜7log、3〜8log、3〜9log、4〜6log、4〜8log、4〜9log、5〜6log、5〜7log、5〜8lo
g、5〜9log、6〜7log、6〜8log、6〜9log、7〜8log、7〜9log、又は8〜9log低減される。
【０５９５】
下の実施例9は、キメラインフルエンザウイルスHAポリペプチドを用いて、どのように
して対象にインフルエンザウイルス感染に対するワクチンを接種することができるかとい
うことを示している。
【０５９６】
(5.15.1  併用療法)
様々な態様において、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、キメ
ラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)、そのようなポリペプチドをコード
する核酸、そのようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイル
スベクターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞、又は中和抗体は
、1以上の他の療法(例えば、抗ウイルス療法、抗細菌療法、もしくは免疫調節療法)との
併用で対象に投与することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の医
薬組成物(例えば、免疫原性組成物)は、1以上の療法との併用で対象に投与することがで
きる。1以上の他の療法は、インフルエンザウイルス疾患の治療もしくは予防に有益であ
ることができるか、又はインフルエンザウイルス疾患と関連する症状もしくは状態を改善
することができる。いくつかの実施態様において、1以上の他の療法は、鎮痛剤、解熱薬
、又は呼吸を楽にするかもしくは助ける療法である。ある実施態様において、療法は、5
分未満の間隔、30分未満の間隔、1時間の間隔、約1時間の間隔、約1〜約2時間の間隔、約
2時間〜約3時間の間隔、約3時間〜約4時間の間隔、約4時間〜約5時間の間隔、約5時間〜
約6時間の間隔、約6時間〜約7時間の間隔、約7時間〜約8時間の間隔、約8時間〜約9時間
の間隔、約9時間〜約10時間の間隔、約10時間〜約11時間の間隔、約11時間〜約12時間の
間隔、約12時間〜18時間の間隔、18時間〜24時間の間隔、24時間〜36時間の間隔、36時間
〜48時間の間隔、48時間〜52時間の間隔、52時間〜60時間の間隔、60時間〜72時間の間隔
、72時間〜84時間の間隔、84時間〜96時間の間隔、又は96時間〜120時間の間隔で投与さ
れる。具体的な実施態様において、2種以上の療法が、同じ患者(patent)診察時に投与さ
れる。
【０５９７】
当業者に周知の任意の抗ウイルス剤を、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明
細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核
酸、そのようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベク
ターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は医薬組成物と併用す
ることができる。抗ウイルス剤の非限定的な例としては、その受容体へのウイルスの付着
、細胞内へのウイルスの内在化、ウイルスの複製、又は細胞からのウイルスの放出を阻害
及び/又は低減する、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質抗体、核酸
分子、有機分子、無機分子、及び小分子が挙げられる。特に、抗ウイルス剤としては、ヌ
クレオシド類似体(例えば、ジドブジン、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、
イドクスウリジン、トリフルリジン、及びリバビリン)、フォスカーネット、アマンタジ
ン、ペラミビル、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、リトナビル、α-インター
フェロン及び他のインターフェロン、AZT、ザナミビル(Relenza(登録商標))、並びにオセ
ルタミビル(Tamiflu(登録商標))が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗ウイル
ス剤としては、インフルエンザウイルスワクチン、例えば、Fluarix(登録商標)(GlaxoSmi
thKline)、FluMist(登録商標)(MedImmune Vaccines)、Fluvirin(登録商標)(Chiron社)、F
lulaval(登録商標)(GlaxoSmithKline)、Afluria(登録商標)(CSL Biotherapies社)、Agrif
lu(登録商標)(Novartis)、又はFluzone(登録商標)(Aventis Pasteur)が挙げられる。
【０５９８】
具体的な実施態様において、抗ウイルス剤は、ウイルス抗原に特異的である免疫調節剤
である。特定の実施態様において、ウイルス抗原は、血球凝集素ポリペプチド以外のイン
フルエンザウイルスポリペプチドである。他の実施態様において、ウイルス抗原は、イン
フルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドである。
【０５９９】
当業者に公知の任意の抗細菌剤を、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書
に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、
そのようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクター
もしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は医薬組成物と併用するこ
とができる。抗細菌剤の非限定的な例としては、アミカシン、アモキシシリン、アモキシ
シリン-クラブラン酸、アンホテリシンB、アンピシリン、アンピシリン(Ampicllin)-スル
バクタム、アプラマイシン、アジスロマイシン、アズトレオナム、バシトラシン、ベンジ
ルペニシリン、カスポファンギン、セファクロル、セファドロキシル、セファレキシン、
セファロチン、セファゾリン、セフジニル、セフェピム、セフィキシム、セフメノキシム
、セフォペラゾン、セフォペラゾン-スルバクタム、セフォタキシム、セフォキシチン、
セフピロム、セフポドキシム、セフポドキシム-クラブラン酸、セフポドキシム-スルバク
タム、セフプロジル、セフキノム、セフタジジム、セフチブテン(Ceftibutin)、セフチオ
フル、セフトビプロール、セフトリアキソン、セフロキシム、クロラムフェニコール、フ
ロルフェニコール、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリナフロキサシン、ク
リンダマイシン、クロキサシリン、コリスチン、コトリモキサゾール(トリムトプリム/ス
ルファメトキサゾール)、ダルババンシン、ダルフォプリスチン/キノプリスチン、ダプト
マイシン、ジベカシン、ジクロキサシリン、ドリペネム、ドキシサイクリン、エンロフロ
キサシン、エルタペネム、エリスロマイシン、フルクロキサシリン、フルコナゾール、フ
ルシトシン、ホスホマイシン、フシジン酸、ガレノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフ
ロキサシン、ゲンタマイシン、イミペネム、イトラコナゾール、カナマイシン、ケトコナ
ゾール、レボフロキサシン、リンコマイシン、リネゾリド、ロラカルベフ、メシルナム(
アムジノシリン)、メロペネム、メトロニダゾール、メジオシリン、メズロシリン-スルバ
クタム、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ムピロシン、ナリジキシン酸、ネオマイ
シン、ネチルマイシン、ニトロフラントイン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキ
サシリン、ペフロキサシン、ペニシリンV、ピペラシリン、ピペラシリン-スルバクタム、
ピペラシリン-タゾバクタム、リファンピシン、ロキシスロマイシン、スパルフロキサシ
ン、スペクチノマイシン、スピラマイシン、ストレプトマイシン、スルバクタム、スルフ
ァメトキサゾール、テイコプラニン、テラバンシン、テリスロマイシン、テモシリン、テ
トラサイクリン、チカルシリン、チカルシリン-クラブラン酸、チゲサイクリン、トブラ
マイシン、トリメトプリム、トロバフロキサシン、タイロシン、バンコマイシン、バージ
ニアマイシン及びボリコナゾールが挙げられる。
【０６００】
いくつかの実施態様において、併用療法は、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリ
ペプチド、又は第5.2〜5.7節に記載の1以上のベクターによる能動免疫、及び第5.9節に記
載の1以上の中和抗体による受動免疫を含む。いくつかの実施態様において、併用療法は
、第5.2〜5.7節に記載の1以上のベクターによる免疫、及び第5.9節に記載の細胞の投与(
例えば、養子移入による)を含む。
【０６０１】
いくつかの実施態様において、併用療法は、第5.2〜5.7節に記載の2以上の異なるベク
ターの投与を含む。
【０６０２】
いくつかの実施態様において、併用療法は、もう一方のHAグループ(例えば、グループ2
)の1つ、2つ、3つ、又はそれより多くのHA亜型に対する免疫応答を誘導する活性化合物(
すなわち、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチド
をコードする核酸、そのようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば
、ウイルスベクターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)と併用し
た、一方のHAグループ(例えば、グループ1)の1つ、2つ、3つ、又はそれより多くのHA亜型
に対する免疫応答を誘導する活性化合物(すなわち、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)
ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含
むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、そのようなポ
リペプチドで刺激された細胞)による能動免疫を含む。
【０６０３】
いくつかの実施態様において、併用療法は、本明細書に記載の2以上のflu血球凝集素(H
A)ポリペプチドによる能動免疫を含む。
【０６０４】
(5.15.2  患者集団)
ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書に記載のflu
血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポ
リペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)
、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物は、未感作の対象、すなわち、
インフルエンザウイルス感染に起因する疾患を有していないか、又はインフルエンザウイ
ルス感染症に感染したことがなく、かつ現在それに感染していない対象に投与することが
できる。一実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、インフルエン
ザウイルス感染を獲得する危険のある未感作の対象に投与される。一実施態様において、
本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドが免疫応答
を誘導する、特定のインフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患を有していない
か、又は特定のインフルエンザウイルスに感染したことがなく、かつそれに感染していな
い対象に投与される。本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、flu血球凝集素(HA)ポ
リペプチドが免疫応答を誘導する、インフルエンザウイルス、又はインフルエンザウイル
スの別の型、亜型、もしくは株に感染している対象、及び/或いはそれらに感染したこと
がある対象に投与することができる。
【０６０５】
ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書に記載のflu
血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポ
リペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)
、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物は、インフルエンザウイルス感
染と診断された患者に投与される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性
化合物又は組成物は、症状が現われるか又は症状が重くなる前に(例えば、患者が入院を
必要とする前に)、インフルエンザウイルス感染患者に投与される。いくつかの実施態様
において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、その活性化合物又は組成物のflu
血球凝集素(HA)ポリペプチドのヘッドドメインが由来したインフルエンザウイルスの型と
異なる型のインフルエンザウイルスに感染しているか、又はそう診断された患者に投与さ
れる。
【０６０６】
ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書に記載のflu
血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポ
リペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)
、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物は、flu血球凝集素(HA)ポリペプ
チドのヘッドドメインのHAグループと同じHAグループに属するインフルエンザウイルスに
感染している可能性があるか、又はそれに感染している患者に投与される。ある実施態様
において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド
のヘッドドメインの亜型と同じ亜型のインフルエンザウイルスに感染している可能性があ
るか、又はそれに感染している患者に投与される。
【０６０７】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書に記
載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、その
ようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもし
くは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物が投与されるべき対象
は、動物である。ある実施態様において、動物は鳥である。ある実施態様において、動物
はイヌである。ある実施態様において、動物はネコである。ある実施態様において、動物
はウマである。ある実施態様において、動物はウシである。ある実施態様において、動物
は哺乳動物、例えば、ウマ、ブタ、マウス、又は霊長類、好ましくはヒトである。
【０６０８】
ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書に記載のflu
血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポ
リペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)
、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物が投与されるべき対象は、ヒト
成人である。ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与され
るべき対象は、50歳を超えるヒト成人である。ある実施態様において、本明細書に記載の
活性化合物又は組成物が投与されるべき対象は、高齢のヒト対象である。
【０６０９】
ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書に記載のflu
血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポ
リペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)
、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物が投与されるべき対象は、ヒト
小児である。ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与され
るべき対象は、ヒト乳児である。ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又
は組成物が投与される対象は、月齢6カ月未満の乳児ではない。具体的な実施態様におい
て、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべき対象は、2歳以下である。
【０６１０】
具体的な実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書に記載
のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのよ
うなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしく
は細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物が投与されるべき対象は
、月齢6カ月を超える任意の乳児又は小児、及び50歳を超える任意の成人である。他の実
施態様において、対象は妊娠個体である。別の実施態様において、対象は、インフルエン
ザシーズン(例えば、11月から4月)中に妊娠の可能性又はその予定がある個体である。具
体的な実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべき対象
は、1、2、3、4、5、6、7、又は8週間前に出産した女性である。
【０６１１】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書に記
載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、その
ようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもし
くは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物が投与されるべきヒト
対象は、インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染に起因する疾患の
危険が高い任意の個体(例えば、免疫障害又は免疫不全個体)である。いくつかの実施態様
において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべきヒト対象は、インフ
ルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染に起因する疾患の危険が高い個体
(例えば、免疫障害又は免疫抑制個体)と密接に接触する任意の個体である。
【０６１２】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書に記
載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、その
ようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもし
くは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物が投与されるべきヒト
対象は、インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染に起因する合併症
もしくは疾患に対する感受性を高める任意の病気に罹患した個体である。他の実施態様に
おいて、本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、インフルエンザウイルス感染によっ
て、個体が罹患するか、又は個体が危険に曝される別の病気の合併症が増加する可能性を
有する対象に投与される。特定の実施態様において、インフルエンザウイルス合併症に対
する感受性を高める病気、又はインフルエンザウイルスによってその病気と関連する合併
症が増加する病気は、例えば、肺を侵す病気、例えば、嚢胞性線維症、気腫、喘息、又は
細菌感染症(例えば、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、肺炎連鎖球菌(Strept
ococcus pneumoniae)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、及びト
ラコーマ病原体(Chlamydia trachomatus)によって引き起こされる感染症);心血管疾患(例
えば、先天性心臓疾患、鬱血性心不全、及び冠動脈疾患);内分泌障害(例えば、糖尿病)、
神経学的障害及びニューロン発達障害(例えば、脳、脊髄、末梢神経、及び筋肉の障害(例
えば、脳性麻痺、癲癇(発作性疾患)、脳卒中、知的障害(例えば、精神遅滞)、筋ジストロ
フィー、及び脊髄損傷))である。
【０６１３】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書に記
載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、その
ようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもし
くは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物が投与されるべきヒト
対象は、グループホーム、例えば、老人ホームに在住する個体である。いくつかの実施態
様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべきヒト対象は、グル
ープホーム、例えば、老人ホームで勤務するか、又はそこでかなりの時間を過ごす。いく
つかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべきヒト
対象は、医療従事者(例えば、医師又は看護士)である。いくつかの実施態様において、本
明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべきヒト対象は、喫煙者である。具体
的な実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべきヒト対
象は、免疫障害又は免疫抑制を起こしている。
【０６１４】
さらに、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)
ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含
むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、そのようなポ
リペプチドで刺激された細胞)又は組成物を投与することができる、インフルエンザの合
併症を発症する危険が高い対象には、以下の者が含まれる:合併症の危険が高い者にイン
フルエンザウイルスを伝染させることができる個体、例えば、6カ月未満の乳児を含むこ
とになる家族を含む、高リスク個体がいる家族の構成員、6カ月未満の乳児と接触する個
体、又は老人ホームもしくは他の長期介護施設に住む個体と接触する個体;長期にわたる
肺、心臓、又は循環障害を有する個体;代謝性疾患(例えば、糖尿病)を有する個体;腎臓障
害を有する個体;血液障害(貧血又は鎌状赤血球症を含む)を有する個体;弱くなった免疫系
(医薬品、悪性腫瘍、例えば、癌、臓器移植、又はHIV感染に起因する免疫抑制を含む)を
有する個体;長期アスピリン療法を受けている(そのため、インフルエンザに感染した場合
、ライ症候群を起こす可能性が高い)小児。
【０６１５】
他の実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書に記載のflu
血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポ
リペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)
、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物の投与の対象には、以下の、生
後6カ月以上の健康な個体が含まれる:4月から9月にかけて、例えば、熱帯地方及び南半球
などの、インフルエンザの大発生が起こり得る外国及び地域に旅行する予定のある者;イ
ンフルエンザウイルスが循環している世界の地域から来た者を含む可能性がある大きな組
織的観光団の一員として旅行する者;学校もしくは大学に通い、寄宿舎に住むか、もしく
は施設環境に住む者;又は自分がインフルエンザで病気になる危険を減らしたい者。
【０６１６】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書に記
載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、その
ようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもし
くは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物の投与が禁忌である対
象には、インフルエンザワクチン接種が禁忌である以下の任意の個体が含まれる:生後6カ
月未満の乳児;及び免疫原性製剤の生産で使用される卵、卵製品、又は他の成分に対して
アナフィラキシー反応(ショックが続発することが多い呼吸困難を引き起こすアレルギー
反応)を経験したことがある個体。ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物
又は組成物の投与が、免疫原性製剤の生産で使用される1以上の成分のために(例えば、卵
又は卵製品の存在のために)禁忌である場合、該活性化合物又は組成物を、活性化合物又
は組成物の投与を禁忌にする成分を含まない方法で生産することができる(例えば、該活
性化合物又は組成物を、卵又は卵製品を使用しないで生産することができる)。
【０６１７】
いくつかの実施態様において、以下の患者集団の1つ又は複数に生ウイルスワクチンを
投与しないことが望ましい場合がある:高齢者;生後6カ月未満の乳児;妊娠個体;1歳未満の
乳児;2歳未満の小児;3歳未満の小児;4歳未満の小児;5歳未満の小児;20歳未満の成人;25歳
未満の成人;30歳未満の成人;35歳未満の成人;40歳未満の成人;45歳未満の成人;50歳未満
の成人;70歳を超える高齢者;75歳を超える高齢者;80歳を超える高齢者;85歳を超える高齢
者;90歳を超える高齢者;95歳を超える高齢者;その年齢層でのアスピリン及び野生型イン
フルエンザウイルス感染と関連する合併症が理由で、アスピリンもしくはアスピリン含有
医薬品を服用している小児及び若者(2〜17歳);喘息又は他の反応性気道疾患の病歴がある
個体;重度のインフルエンザ感染の素因となり得る慢性の医学的基礎疾患を有する個体;ギ
ランバレー症候群の病歴がある個体;発熱を伴う急性の重篤な疾患を有する個体;又は中程
度もしくは重度の病気である個体。そのような個体については、本明細書に記載の不活化
ウイルスワクチン、スプリットウイルスワクチン、サブユニットワクチン、ウイロソーム
、ウイルス様粒子、又は非ウイルスベクターの投与が好ましい場合がある。ある実施態様
において、生ウイルスワクチンを投与することが好ましい対象には、2〜17歳の健康な小
児及び若者、並びに18〜49歳の健康な成人が含まれ得る。
【０６１８】
ある実施態様において、生ウイルスベクターを含む免疫原性製剤は、他の生ウイルスワ
クチンと同時に投与されない。
【０６１９】
(5.16  投与様式)
(5.16.1  送達経路)
本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプ
チド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含むかもし
くは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、そのようなポリペプチ
ドで刺激された細胞)又は組成物は、種々の経路によって対象に送達することができる。
これらには、鼻腔内、気管内、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、経皮、静脈内、結膜内、及
び皮下経路が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、組成物
は、局所投与用に、例えば、皮膚への塗布用に製剤化される。具体的な実施態様において
、投与経路は、例えば、鼻スプレーの一部として、鼻腔内へのものである。ある実施態様
において、組成物は、筋肉内投与用に製剤化される。いくつかの実施態様において、組成
物は、皮下投与用に製剤化される。ある実施態様において、組成物は、注射による投与用
には製剤化されない。生ウイルスワクチンのための具体的な実施態様において、ワクチン
は、注射以外の経路による投与用に製剤化される。
【０６２０】
例えば、抗原がウイルスベクター、ウイルス様粒子ベクター、又は細菌ベクターである
場合、ベクターが由来する骨格ウイルス又は細菌の天然の感染経路から免疫原性組成物を
導入することが好ましいと考えられる。或いは、ポリペプチドが由来するインフルエンザ
ウイルスの天然の感染経路からflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを導入することが好まし
い場合がある。激しい分泌性及び細胞性免疫応答を誘導する抗原、特に、ウイルスベクタ
ーの能力を有利に使用することができる。例えば、ウイルスベクターによる気道の感染は
、インフルエンザウイルスからの防御を同時に伴って、例えば、泌尿器系での強い分泌性
免疫応答を誘導することができる。さらに、好ましい実施態様において、任意の好適な経
路によって医薬組成物を肺に導入することが望ましい場合がある。肺投与は、例えば、吸
入器又はネブライザー、及び噴霧剤として使用するためのエアゾール化剤を含む製剤の使
用によって利用することもできる。
【０６２１】
具体的な実施態様において、サブユニットワクチンは、筋肉内投与される。別の実施態
様において、生インフルエンザウイルスワクチンは、鼻腔内投与される。別の実施態様に
おいて、不活化インフルエンザウイルスワクチン、又はスプリットインフルエンザウイル
スワクチンは、筋肉内投与される。別の実施態様において、ウイルス様粒子又はその組成
物は、筋肉内投与される。
【０６２２】
いくつかの実施態様において、インビトロで本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリ
ペプチドで刺激された細胞は、当業者に公知の技術を用いて対象に導入(又は再導入)する
ことができる。いくつかの実施態様において、該細胞は、真皮内に、真皮下に、又は末梢
血流中に導入することができる。いくつかの実施態様において、対象に導入される細胞は
、有害な免疫応答を回避するために、その対象に由来する細胞であることが好ましい。他
の実施態様において、同様の免疫バックグラウンドを有するドナー宿主に由来する細胞を
使用することもできる。有害な免疫原性応答を回避するように設計されたものを含む、他
の細胞を使用することもできる。
【０６２３】
(5.16.2  投薬量及び投与頻度)
インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス疾患の治療及び/又は予防で
有効である活性化合物(すなわち、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そ
のようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含むかもしくは発現
するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激
された細胞)又は組成物の量は疾患の性質によって決まり、標準的な臨床技術で決定する
ことができる。
【０６２４】
製剤で使用すべき正確な用量は、投与経路、及び感染又はそれに起因する疾患の重篤度
によっても決まり、臨床医の判断及び各対象の状況に従って決定されるべきである。例え
ば、有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態(年齢、体重、健康を含む)、患
者がヒトであるか動物であるかということ、投与される他の医薬品、及び治療が予防的で
あるか治療的であるかということによって異なってもよい。通常、患者はヒトであるが、
トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物を治療することもできる。治療投薬量
は、安全性及び有効性を最適化するために最適に調節される。
【０６２５】
ある実施態様において、最適な投薬量範囲の特定を助けるために、インビトロアッセイ
が使用される。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られる、用量応答曲
線から推定することができる。
【０６２６】
flu血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする核酸の例示的な用量の範囲は、患者1人当
たり、約10ng〜1g、100ng〜100mg、1μg〜10mg、又は30〜300μgの核酸、例えば、DNAで
ある。
【０６２７】
ある実施態様において、(例えば、スプリットウイルスワクチン及びサブユニットワク
チン中に提供される)flu血球凝集素(HA)ポリペプチドの例示的な用量の範囲は、患者1キ
ログラム当たり、約5μg〜約100mg、15μg〜50mg、15μg〜25mg、15μg〜10mg、15μg〜5
mg、15μg〜1mg、15μg〜100μg、15μg〜75μg、5μg〜50μg、10μg〜50μg、15μg〜4
5μg、20μg〜40μg、又は25〜35μgである。他の実施態様において、flu血球凝集素(HA)
ポリペプチドの例示的な用量の範囲は、1用量当たり、約1μg〜約50mg、約5μg〜約50mg
、約1μg〜約100mg、約5μg〜約100mg、約15μg〜約50mg、約15μg〜約25mg、約15μg〜
約10mg、約15μg〜約5mg、約15μg〜約1mg、約15μg〜約100μg、約15μg〜約75μg、約5
μg〜約50μg、約10μg〜約50μg、約15μg〜約45μg、約20μg〜約40μg、約又は25〜約
35μgのflu血球凝集素(HA)ポリペプチドであり、必要とされるだけの間隔で、1回、2回、
3回、又はそれより多くの回数、対象に投与することができる。
【０６２８】
感染性ウイルスベクターの用量は、1用量当たり、ビリオン数が10〜100個、又はそれよ
り多くまで様々であることができる。いくつかの実施態様において、ウイルスベクターの
好適な投薬量は、102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106
、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、
又は1012pfuであり、必要とされるだけの間隔で、1回、2回、3回、又はそれより多くの回
数、対象に投与することができる。
【０６２９】
ある実施態様において、VLPの例示的な用量の範囲は、患者1kg当たり、約0.01μg〜約1
00mg、約0.1μg〜約100mg、約5μg〜約100mg、約15μg〜約50mg、約15μg〜約25mg、約15
μg〜約10mg、約15μg〜約5mg、約15μg〜約1mg、約15μg〜約100μg、約15μg〜約75μg
、約5μg〜約50μg、約10μg〜約50μg、約15μg〜約45μg、約20μg〜約40μg、又は約2
5〜約35μgである。
【０６３０】
一実施態様において、不活化ワクチンは、それが約5μg〜約50μg、約10μg〜約50μg
、約15μg〜約100μg、約15μg〜約75μg、約15μg〜約50μg、約15μg〜約30μg、約20
μg〜約50μg、約25μg〜約40μg、約25μg〜約35μgのflu血球凝集素(HA)ポリペプチド
を含むように製剤化される。
【０６３１】
ある実施態様において、活性化合物、すなわち、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)
ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含
むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、そのようなポ
リペプチドで刺激された細胞、又は組成物は、単一用量として1回、対象に投与される。
【０６３２】
ある実施態様において、活性化合物又は組成物は、単一用量として、次いで3〜6週間後
に第2の用量として、対象に投与される。ある実施態様において、活性化合物又は組成物
は、単一用量として、次いで3〜6週間後に第2の用量として、対象に投与され、次いで3〜
6週間後に、第3の用量が投与される。ある実施態様において、第2及び/又は第3の投与は
、異なる活性化合物又は組成物を利用することができる。これらの実施態様に従って、2
回目の接種の後に6〜12カ月間隔で、追加免疫接種を対象に投与することができる。ある
実施態様において、追加免疫接種は、異なる活性化合物又は組成物を利用することができ
る。ある実施態様において、第1の(初回免疫)投与は、全長血球凝集素もしくはその断片(
又はそれらをコードする核酸)を含み、第2の(追加免疫)投与は、本明細書に記載のflu血
球凝集素(HA)ポリペプチド(又はそれをコードする核酸、それを含むVLP、もしくはそれを
発現するウイルスもしくは細菌)の投与を含む。いくつかの実施態様において、同じ活性
化合物又は組成物の投与を繰り返すことができ、投与は、少なくとも1日、2日、3日、5日
、10日、15日、30日、45日、2カ月、75日、3カ月、又は少なくとも6カ月の間隔を空ける
ことができる。ある実施態様において、活性化合物又は組成物は、単一用量として1年に1
回、対象に投与される。
【０６３３】
小児への投与のための具体的な実施態様において、少なくとも1カ月間隔で与えられる
、活性化合物(すなわち、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのような
ポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含むかもしくは発現するベク
ター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細
胞)又は組成物の2用量が小児に投与される。成人への投与のための具体的な実施態様にお
いて、単一用量が与えられる。別の実施態様において、少なくとも1カ月間隔で与えられ
る、活性化合物又は組成物の2用量が成人に投与される。別の実施態様において、若年小
児(6カ月〜9歳)には、1カ月間隔で与えられる2用量の活性化合物又は組成物を初めて投与
することができる。特定の実施態様において、その最初のワクチン接種の年に1用量だけ
投与された小児には、その翌年に2用量が投与されるべきである。いくつかの実施態様に
おいて、インフルエンザワクチン、例えば、本明細書に記載の免疫原性製剤を初めて投与
される2〜8歳の小児には、4週間の間隔で投与される2用量が好ましい。ある実施態様にお
いて、3歳を超える対象に好ましい可能性がある0.5mlとは対照的に、生後6〜35カ月の小
児には、半用量(0.25ml)が好ましい場合がある。
【０６３４】
具体的な実施態様において、ヒト乳児への投与のために、2用量の本明細書に記載のflu
血球凝集素(HA)ポリペプチド(下記の第5.1節参照)もしくはその組成物、及び/又は本明細
書に記載の核酸、ベクター、VLP、もしくはウイロソームのうちの1つもしくは複数を乳児
に投与し、ここで、第1の用量で使用されるflu血球凝集素(HA)ポリペプチドのインフルエ
ンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインは、第2の用量で使用されるflu血球凝集素(HA)ポ
リペプチドのインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインとは異なる株又は亜型由
来のものである。第1及び第2の投与は、少なくとも1日、2日、3日、5日、10日、15日、30
日、45日、2カ月、75日、3カ月、又は少なくとも6カ月隔てることができる。
【０６３５】
具体的な実施態様において、ヒト乳児への投与のために、第3の用量の本明細書に記載
のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド(下記の第5.1節参照)もしくはその組成物、及び/又は
本明細書に記載の核酸、ベクター、VLP、もしくはウイロソームのうちの1つもしくは複数
を乳児に投与し、ここで、第1、第2、及び第3の用量で使用されるflu血球凝集素(HA)ポリ
ペプチドのインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインは、異なるインフルエンザ
ウイルスの株又は亜型由来のものである。第1、第2、及び第3の投与は、少なくとも1日、
2日、3日、5日、10日、15日、30日、45日、2カ月、75日、3カ月、又は少なくとも6カ月隔
てることができる。
【０６３６】
特定の実施態様において、活性化合物(すなわち、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)
ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含
むかもしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、そのようなポ
リペプチドで刺激された細胞)又は組成物は、秋又は冬に、すなわち、各半球のインフル
エンザシーズンの前又はその期間中に、対象に投与される。一実施態様において、第2の
用量をインフルエンザシーズンのピークの前に与えることができるように、小児には、該
シーズンの初め、例えば、北半球で9月下旬又は10月初旬に第1の用量が投与される。
【０６３７】
抗体による受動免疫について、投薬量の範囲は、患者の体重1kg当たり、約0.0001〜100
mg、より一般的には0.01〜5mgである。例えば、投薬量は、体重1kg当たり、1mgもしくは1
0mg、又は1〜10mgの範囲、つまり、70kgの患者の場合、それぞれ、70mgもしくは700mg、
又は70〜700mgの範囲であることができる。例示的な治療レジメンは、1年もしくは数年の
間、又は数年間隔で、2週間毎に1回、又は月に1回、又は3〜6カ月毎に1回の投与を必要と
する。いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する2種以上のモノクローナル抗体が
同時に投与され、その場合、投与される各抗体の投薬量は示された範囲に含まれる。抗体
は、通常、複数の機会に投与される。単一の投薬の間隔は、毎週、毎月、又は毎年である
ことができる。間隔は、患者でflu血球凝集素(HA)ポリペプチドに対する抗体の血液レベ
ルを測定することにより示されるように、不規則であることができる。
【０６３８】
(5.17  生物学的アッセイ)
(5.17.1  キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの活性を試験するため
のアッセイ)
本明細書に開示されるベクターでflu血球凝集素(HA)ポリペプチドの発現を試験するた
めのアッセイは、当技術分野で公知の任意のアッセイを用いて実施することができる。例
えば、ウイルスベクターへの組込みについてのアッセイは、この節又は第5.4節もしくは
第5.5節に記載されているように、ウイルスを成長させること、ショ糖クッションに通す
遠心分離によってウイルス粒子を精製すること、及び当技術分野で周知の方法を用いたイ
ムノアッセイ、例えば、ウェスタンブロットによるflu血球凝集素(HA)ポリペプチド発現
についてのその後の解析を含む。血球凝集素ポリペプチドがキメラであるかどうかを判定
する方法は、当業者に公知であり、かつ本明細書に記載されている(例えば、下の実施例3
及び4参照)。
【０６３９】
一実施態様において、本明細書に開示されるflu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、当技
術分野で公知の抗体抗原相互作用についての任意のアッセイを用いて、インフルエンザウ
イルス血球凝集素ポリペプチド、例えば、該ポリペプチドのストーク領域に対する中和抗
体に特異的に結合するその能力を試験することにより、適切なフォールディング及び機能
性についてアッセイされる。そのようなアッセイで使用される中和抗体には、例えば、Ek
iertらの文献(2009, Science Express, 2009年2月26日);Kashyapらの文献(2008, Proc Na
tl Acad Sci USA 105: 5986-5991);Suiらの文献(2009, Nature Structural and Molecula
r Biology, 16:265-273);Wangらの文献(2010, PLOS Pathogens 6(2): 1-9);米国特許第5,
589,174号、第5,631,350号、第6,337,070号、及び第6,720,409号;国際公開WO 2007/13423
7号として公開された国際出願PCT/US2007/068983号;国際公開WO 2009/036157号として公
開された国際出願PCT/US2008/075998号;国際公開WO 2008/028946号として公開された国際
出願PCT/EP2007/059356号;及び国際公開WO 2009/079259号として公開された国際出願PCT/
US2008/085876号に記載されている中和抗体が含まれる。これらの抗体には、とりわけ、C
R6261、CR6325、CR6329、CR6307、CR6323、2A、D7、D8、F10、G17、H40、A66、D80、E88
、E90、H98、C179(FERM BP-4517)、AI3C(FERM BP-4516)が含まれる。
【０６４０】
別の実施態様において、本明細書に開示されるflu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、例
えば、NMR、X線結晶学的方法、又は二次構造予測法、例えば、円二色性などの、当技術分
野で公知の任意の方法を用いたflu血球凝集素(HA)ポリペプチドの構造又は立体構造の決
定により、適切なフォールディングについてアッセイされる。
【０６４１】
(5.17.2  キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを用いて作製された抗
体の活性を試験するためのアッセイ)
本明細書に記載の抗体は、当業者に公知の種々の方法(例えば、ELISA、表面プラズモン
共鳴ディスプレイ(BIAcore)、ウェスタンブロット、免疫蛍光、免疫染色、及び/又は微量
中和アッセイ)で特徴付けることができる。いくつかの実施態様において、抗体は、flu血
球凝集素(HA)ポリペプチド、又は該ポリペプチドを含むベクターに特異的に結合する能力
についてアッセイされる。そのようなアッセイは、溶液中で(例えば、Houghtenの文献(19
92, Bio/Techniques 13:412 421))、ビーズ表面で(Lamの文献(1991, Nature 354:82 84))
、チップ表面で(Fodorの文献(1993, Nature 364:555 556))、細菌を用いて(米国特許第5,
223,409号)、胞子を用いて(米国特許第5,571,698号;第5,403,484号;及び第5,223,409号)
、プラスミドを用いて(Cullらの文献(1992, Proc Natl. Acad. Sci. USA 89:1865 1869))
、又はファージを用いて(Scott及びSmithの文献(1990, Science 249:386 390);Cwirlaら
の文献(1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378 6382);及びFeliciの文献(1991, J. 
Mol. Biol. 222:301 310))実施することができる(その各々は、引用によりその全体が本
明細書中に組み込まれている)。
【０６４２】
flu血球凝集素(HA)ポリペプチドに対する抗体の特異的結合及び他の抗原との交差反応
性は、当技術分野で公知の任意の方法により評価することができる。特異的結合及び交差
反応性を解析するために使用することができるイムノアッセイには、少し例を挙げれば、
ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サ
ンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡
散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイ
、プロテインAイムノアッセイなどの技術を用いた、競合的及び非競合的アッセイ系が含
まれるが、これらに限定されない。そのようなアッセイはルーチンであり、かつ当技術分
野で周知である(例えば、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれている、Ausubel
ら編の文献(1994,分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biolog
y), 1巻, John Wiley & Sons社, New York)を参照されたい)。
【０６４３】
flu血球凝集素(HA)ポリペプチドに対する抗体の結合親和性及び抗体抗原相互作用の解
離速度は、競合的結合アッセイによって測定することができる。競合的結合アッセイの一
例は、漸増する量の非標識抗原の存在下での標識抗原(例えば、3H又は125I)と関心対象の
抗体とのインキュベーション、及び標識抗原に結合した抗体の検出を含むラジオイムノア
ッセイである。flu血球凝集素(HA)ポリペプチドに対する抗体の親和性及び結合解離速度
は、スキャッチャードプロット解析によるデータから測定することができる。二次抗体と
の競合もラジオイムノアッセイを用いて測定することができる。この場合、flu血球凝集
素(HA)ポリペプチドは、漸増する量の非標識二次抗体の存在下で、標識化合物(例えば、3
H又は125I)と結合させた試験抗体とともにインキュベートされる。
【０６４４】
ある実施態様において、抗体結合親和性及び速度定数は、KinExA 3000システム(Sapidy
ne Instruments、Boise、ID)を用いて測定される。いくつかの実施態様において、インフ
ルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する抗体の結合及び解離速度を測定するた
めに、表面プラズモン共鳴(例えば、BIAcore動態)解析を使用する。BIAcore動態解析は、
その表面にflu血球凝集素(HA)ポリペプチドに対する抗体が固定されたチップからのflu血
球凝集素(HA)ポリペプチドの結合及び解離を解析することを含む。典型的なBIAcore動態
試験は、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドが固定されているセンサーチップ表面への、0.0
05％のTween20を含むHBS緩衝液中の様々な濃度の250μLの抗体試薬(mAb、Fab)の注入を含
む。流速は、75μL/分で一定に保たれる。解離データは、必要に応じて15分間又はそれよ
り長く回収される。各注入/解離サイクルの後、結合抗体は、希酸、通常、10〜100mM HCl
の短い1分間の投入を用いて、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド表面から
除去されるが、状況が許せば、他の再生剤を使用する。より具体的には、結合速度kon及
び解離速度koffの測定のために、ポリペプチドを、標準的なアミンカップリング化学、す
なわち、EDC/NHS法(EDC＝N-ジエチルアミノプロピル)-カルボジイミド)を用いて、センサ
ーチップ表面に直接固定する。簡潔に述べると、pH4又はpH5の10mM NaOAc中のポリペプチ
ドの5〜100nM溶液を調製し、約30〜50RU相当のポリペプチドが固定されるまで、EDC/NHS
活性化表面に流す。この後、1MのEt-NH2を注入して、未反応の活性エステルの「キャップ
」を外す。参照目的のために、同一の固定条件下で、ポリペプチドを含まないブランク表
面を調製する。適当な表面が調製されたら、抗体試薬のそれぞれの好適な希釈系列をHBS/
Tween-20中に調製し、直列につながれたポリペプチドセル表面と参照セル表面の両方に流
す。調製される抗体濃度の範囲は、平衡結合定数KDの推定値によって異なる。上記のよう
に、結合した抗体は、適当な再生剤を用いて、各注入/解離サイクル後に除去される。
【０６４５】
抗体の中和活性は、当業者に公知の任意のアッセイを用いて決定することができる。本
明細書に記載の抗体は、当業者に公知の技術を用いて、その宿主細胞受容体(すなわち、
シアル酸)へのインフルエンザウイルス、又はflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む任意
の他の組成物(例えば、VLP、リポソーム、もしくは洗剤抽出物)の結合を阻害するその能
力についてアッセイすることができる。例えば、インフルエンザウイルス受容体を発現す
る細胞は、抗体の存在下又は非存在下でflu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む組成物と
接触させることができ、抗原の結合を阻害する抗体の能力は、例えば、フローサイトメト
リー又はシンチレーションアッセイにより測定することができる。flu血球凝集素(HA)ポ
リペプチドを含む組成物、又は抗体は、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む組成物と
細胞受容体との間の相互作用の検出を可能にするために、検出可能な化合物、例えば、放
射性標識(例えば、32P、35S、及び125I)又は蛍光標識(例えば、フルオレセインイソチオ
シアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-
フタルデヒド、及びフルオレサミン)で標識することができる。或いは、flu血球凝集素(H
A)ポリペプチドがその受容体に結合するのを阻害する抗体の能力は、無細胞アッセイで決
定することができる。例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを含む組
成物を抗体と接触させることができ、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む組成物が細
胞受容体に結合するのを阻害する抗体の能力を決定することができる。具体的な実施態様
において、抗体を固体支持体上に固定し、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチ
ドを含む組成物を検出可能な化合物で標識する。或いは、flu血球凝集素(HA)ポリペプチ
ドを含む組成物を固体支持体上に固定し、抗体を検出可能な化合物で標識する。ある実施
態様において、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドが細胞受容体に結合するのを阻害する抗
体の能力は、対照(例えば、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドが細胞受容体に結合するのを
阻害することが知られている抗体)と比べた、抗体の結合阻害率を評価することによって
決定される。
【０６４６】
他の実施態様において、本明細書に記載の方法で使用するのに好適な抗体は、インフル
エンザウイルスの受容体結合を阻害しないが、それでもなお本明細書に記載のアッセイで
中和することが分かっている。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法に従
って使用するのに好適な抗体は、当技術分野で公知又は本明細書に記載のアッセイでウイ
ルスと宿主膜との融合を低減又は阻害する。
【０６４７】
一実施態様において、ウイルスと宿主膜との融合は、レポーターを含むインフルエンザ
ウイルスと、ウイルスに感染することができる宿主細胞とを用いたインビトロアッセイで
アッセイされる。レポーター活性が、陰性対照(例えば、対照抗体の存在下又は抗体の非
存在下でのレポーター活性)と比較して阻害されるか又は低減する場合、抗体は融合を阻
害する。
【０６４８】
一実施態様において、ウイルスと宿主膜との融合は、細胞融合のモデル系を用いて検出
される。例示的な細胞融合アッセイでは、細胞(例えば、HeLa細胞)を、flu血球凝集素(HA
)ポリペプチドをコードするプラスミドでトランスフェクトし、抗体の存在下でflu血球凝
集素(HA)ポリペプチド融合機能を可能にする緩衝液(例えば、pH5.0緩衝液)に接触及び曝
露させる。抗体は、それが陰性対照(例えば、対照抗体の存在下又は抗体の非存在下での
シンシチウム形成)と比較してシンシチウム形成を低減又は阻害する場合、中和性である
。
【０６４９】
他の実施態様において、ウイルスと宿主膜との融合は、インビトロでのリポソームに基
づくアッセイを用いてアッセイされる。例示的なアッセイでは、宿主細胞受容体は、レポ
ーターの半分を含むリポソームへと再構築される。flu血球凝集素(HA)ポリペプチドは、
レポーターのもう半分を含む別の組のリポソームへと再構築される。2つのリポソーム集
団を一緒に混合すると、融合は、レポーターの再構築、例えば、比色定量的に検出するこ
とができる酵素反応によって検出される。レポーター活性が、抗体の非存在下又は対照抗
体の存在下で行われるアッセイでのレポーター活性と比較して低減するか又は阻害される
場合、抗体は融合を阻害する。ある実施態様において、融合を阻害する抗体の能力は、対
照の存在下での融合率と比べた、抗体の存在下での融合率を評価することによって決定さ
れる。
【０６５０】
(5.17.3  刺激された細胞の活性を試験するためのアッセイ)
本明細書に記載の方法に従って刺激された細胞は、例えば、関心対象のポリヌクレオチ
ド又は遺伝子(複数可)の組込み、転写、及び/又は発現、組み込まれた遺伝子のコピー数
、並びに組込みの位置について解析することができる。そのような解析は、いつでも実施
することができ、かつ当技術分野で公知の任意の方法によって実施することができる。他
の実施態様において、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチドによる標的細胞
の良好な刺激は、当技術分野で公知又は本明細書に記載の方法を用いて、flu血球凝集素(
HA)ポリペプチドに対する中和抗体の産生を検出することにより決定される。
【０６５１】
ある実施態様において、刺激された細胞、例えば、DCが投与される対象を、細胞の位置
、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする、ベクターによって送達されるポリヌク
レオチドもしくは遺伝子の発現、免疫応答の刺激(例えば、flu血球凝集素(HA)ポリペプチ
ドに対する中和抗体の産生)について解析し、及び/又は当技術分野で公知もしくは本明細
書に記載の任意の方法によって、インフルエンザウイルス感染もしくはそれと関連する疾
患と関連する症状についてモニタリングすることができる。
【０６５２】
レポーターアッセイを用いて、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドのターゲッティングの
特異性を決定することができる。例えば、骨髄細胞の混合集団を対象から得て、インビト
ロで培養することができる。flu血球凝集素(HA)ポリペプチドを骨髄細胞の混合集団に投
与することができ、flu血球凝集素(HA)ポリペプチドと関連するレポーター遺伝子の発現
を培養細胞でアッセイすることができる。いくつかの実施態様において、混合細胞集団中
の刺激された細胞の少なくとも約50％、より好ましくは、少なくとも約60％、70％、80％
、又は90％、さらにより好ましくは、少なくとも約95％は、樹状細胞である。
【０６５３】
(5.17.4  抗ウイルス活性アッセイ)
本明細書に記載の抗体又はその組成物は、抗ウイルス活性についてインビトロで評価す
ることができる。一実施態様において、抗体又はその組成物は、インフルエンザウイルス
の増殖に対するその効果についてインビトロで試験される。インフルエンザウイルスの増
殖は、当技術分野で公知又は本明細書に記載の任意の方法により(例えば、細胞培養で)評
価することができる。具体的な実施態様において、細胞は、0.0005及び0.001、0.001及び
0.01、0.01及び0.1、0.1及び1、もしくは1及び10のMOI、又は0.0005、0.001、0.005、0.0
1、0.05、0.1、0.5、1、5、もしくは10のMOIで感染させられ、補充された無血清培地とと
もにインキュベートされる。ウイルス力価は、血球凝集素プラーク又は本明細書に記載の
任意の他のウイルスアッセイにより上清中で測定される。ウイルス力価を評価することが
できる細胞としては、EFK-2細胞、Vero細胞、MDCK細胞、初代ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)
、H292ヒト上皮細胞株、及びHeLa細胞が挙げられるが、これらに限定されない。インビト
ロアッセイには、当技術分野で周知又は本明細書に記載の方法を用いて、インビトロで、
培養細胞におけるウイルス複製の変化(例えば、プラーク形成により測定される)、或いは
ウイルスタンパク質の産生(例えば、ウェスタンブロット解析により測定される)又はウイ
ルスRNAの産生(例えば、RT-PCRもしくはノーザンブロット解析により測定される)を測定
するものが含まれる。
【０６５４】
非限定的な例では、標的哺乳動物細胞株の単層を様々な量(例えば、3プラーク形成単位
(pfu)又は5pfuの多重度)のウイルス(例えば、インフルエンザ)に感染させ、その後、様々
な希釈の抗体(例えば、0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、又は10μg/ml)の存在下又は非存
在下で培養する。感染した培養物を感染から48時間後又は72時間後に回収し、適当な標的
細胞株(例えば、Vero細胞)に対する当技術分野で公知の標準的なプラークアッセイにより
力価を測定する。
【０６５５】
血球凝集アッセイの非限定的な例では、細胞を抗体と接触させ、同時に又はその後(例
えば、1のMOIで)ウイルスに感染させ、ウイルス複製を可能にする条件下で(例えば、20〜
24時間)ウイルスをインキュベートする。抗体は、感染の全過程で存在することが好まし
い。次に、ウイルスの複製及びウイルス粒子の放出を、0.5％のニワトリ赤血球を用いた
血球凝集アッセイにより決定する。例えば、Kashyapらの文献(PNAS USA 105:5986-5991)
を参照されたい。いくつかの実施態様において、化合物は、それが、ウイルス力価の約75
％低下に相当する少なくとも2ウェルのHAだけウイルスの複製を低減させる場合、ウイル
ス複製の阻害剤とみなされる。具体的な実施態様において、阻害剤は、このアッセイで、
ウイルス力価を50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以
上、85％以上、90％以上、又は95％以上低下させる。他の具体的な実施態様において、阻
害剤は、対象において、インフルエンザウイルス力価の約1log以上、約2log以上、約3log
以上、約4log以上、約5log以上、約6log以上、約7log以上、約8log以上、約9log以上、約
10log以上、1〜3log、1〜5log、1〜8log、1〜9log、2〜10log、2〜5log、2〜7log、2log
〜8log、2〜9log、2〜10log、3〜5log、3〜7log、3〜8log、3〜9log、4〜6log、4〜8log
、4〜9log、5〜6log、5〜7log、5〜8log、5〜9log、6〜7log、6〜8log、6〜9log、7〜8lo
g、7〜9log、又は8〜9logの低下をもたらす。インフルエンザウイルス力価のlog低下は、
陰性対照と比較したもの、別の治療と比較したもの、又は抗体投与前の患者における力価
と比較したものであることができる。
【０６５６】
(5.17.5  細胞傷害性アッセイ)
当技術分野で周知の多くのアッセイを用いて、活性化合物又はその組成物への曝露後の
細胞(感染もしくは未感染)又は細胞株の生存率を評価し、それにより、該化合物又は組成
物の細胞傷害性を決定することができる。例えば、細胞増殖は、ブロモデオキシウリジン
(BrdU)の取込み(例えば、Hoshinoらの文献(1986, Int. J. Cancer 38, 369);Campanaらの
文献(1988, J. Immunol. Meth. 107:79)を参照されたい)、(3H)チミジンの取込み(例えば
、Chen, J.の文献(1996, Oncogene 13:1395-403);Jeoung, J.の文献(1995, J. Biol. Che
m. 270:18367 73)を参照されたい)を測定することによるか、直接的な細胞カウントによ
るか、又は既知の遺伝子、例えば、癌原遺伝子(例えば、fos、myc)もしくは細胞周期マー
カー(Rb、cdc2、サイクリンA、D1、D2、D3、Eなど)の転写、翻訳、もしくは活性の変化を
検出することによりアッセイすることができる。そのようなタンパク質及びmRNA及び活性
のレベルは、当技術分野で公知の任意の方法で測定することができる。例えば、市販の抗
体を含む抗体を用いた公知の免疫診断方法、例えば、ELISA、ウェスタンブロッティング
、又は免疫沈降により、タンパク質を定量することができる。当技術分野で周知かつルー
チンの方法を用いて、例えば、ノーザン解析、RNアーゼ保護、又は逆転写と関連したポリ
メラーゼ連鎖反応を用いて、mRNAを定量することができる。細胞生存率は、トリパンブル
ー染色又は当技術分野で公知の他の細胞生死マーカーを用いて評価することができる。具
体的な実施態様において、細胞のATPレベルを測定して、細胞生存率を決定する。
【０６５７】
具体的な実施態様において、細胞生存率は、細胞内ATPレベルを測定する、当技術分野
で標準的なアッセイ、例えば、CellTiter-Gloアッセイキット(Promega)を用いて、3日及
び7日の期間で測定される。細胞ATPの低下は細胞傷害効果を示す。別の具体的な実施態様
において、細胞生存率は、ニュートラルレッド取込みアッセイで測定することができる。
他の実施態様において、形態変化の目視観察には、肥大、粒状度、ギザギザの縁を有する
細胞、薄膜状の外観、円形化、ウェル表面からの剥離、又は他の変化が含まれ得る。こう
した変化には、観察された細胞傷害性の程度に従って、T(100％毒性)、PVH(部分的毒性-
非常に強い-80％)、PH(部分的毒性-強い-60％)、P(部分的毒性-40％)、Ps(部分的毒性-わ
ずか-20％)、又は0(毒性なし-0％)という呼称が与えられる。50％細胞阻害(細胞傷害)濃
度(IC50)は、これらのデータの回帰分析により決定される。
【０６５８】
具体的な実施態様において、細胞傷害性アッセイで使用される細胞は、初代細胞及び細
胞株を含む動物細胞である。いくつかの実施態様において、細胞はヒト細胞である。ある
実施態様において、細胞傷害性は、以下の細胞株のうちの1つ又は複数で評価される:U937
、ヒト単球細胞株;初代末梢血単核細胞(PBMC);Huh7、ヒト肝芽細胞腫細胞株;293T、ヒト
胚性腎細胞株;及びTHP-1、単球細胞。ある実施態様において、細胞傷害性は、以下の細胞
株のうちの1つ又は複数で評価される:MDCK、MEF、Huh 7.5、Detroit、又はヒト気管気管
支上皮(HTBE)細胞。
【０６５９】
活性化合物又はその組成物は、動物モデルでインビボ毒性について試験することができ
る。例えば、活性化合物の活性を試験するために使用される、本明細書に記載の動物モデ
ル及び/又は当技術分野で公知の他のものを用いて、これらの化合物のインビボ毒性を測
定することもできる。例えば、動物に様々な濃度の活性化合物を投与する。その後、この
動物を、致死率、体重減少もしくは体重増加失敗、及び/又は組織損傷を示し得る血清マ
ーカーのレベル(例えば、全般的な組織障害の指標としてのクレアチンホスホキナーゼレ
ベル、肝障害の可能性の指標としてのグルタミン酸シュウ酸トランスアミナーゼ又はピル
ビン酸トランスアミナーゼのレベル)について経時的にモニタリングする。これらのイン
ビボアッセイは、投薬量の他に、様々な投与様式及び/又はレジメンの毒性を試験するよ
うに適合させることができる。
【０６６０】
活性化合物の毒性及び/又は効力は、例えば、LD50(集団の50％に致死的な用量)及びED5
0(集団の50％で治療的に有効な用量)を決定するための、細胞培養又は実験動物における
標準的な薬学的手順により決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治
療指数であり、それは、比LD50/ED50と表すことができる。大きい治療指数を示す活性化
合物が好ましい。毒性のある副作用を示す活性化合物を使用してもよいが、感染していな
い細胞に対する潜在的な障害を最小限に抑え、それにより、副作用を低下させるために、
そのような薬剤を罹患組織の部位にターゲッティングする送達系を設計するよう、注意を
払うべきである。
【０６６１】
細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトで使用するための活性化合
物の投薬量の範囲を定める際に使用することができる。そのような薬剤の投薬量は、循環
濃度の範囲内にあることが好ましく、この範囲には、ほとんど又は全く毒性のないED50が
含まれる。投薬量は、利用される剤形及び利用される投与経路によって、この範囲内で異
なり得る。本明細書に記載の方法で使用されるどの活性化合物についても、有効用量は、
最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量を動物モデルで定めて、循環血
漿濃度範囲を得ることができ、この循環血漿濃度範囲には、細胞培養で測定されるIC50(
すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度)が含まれる。そのような情報
を用いて、ヒトでの有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、
例えば、高速液体クロマトグラフィーで測定することができる。投薬量の決定に関するさ
らなる情報が本明細書に提供される。
【０６６２】
さらに、当業者に公知の任意のアッセイを用いて、例えば、ウイルス感染又はそれと関
連する状態もしくは症状を測定することにより、本明細書に記載の活性化合物及び組成物
の予防的及び/又は治療的有用性を評価することができる。
【０６６３】
(5.17.6  インビボでの抗ウイルス活性)
活性化合物及びその組成物は、ヒトで使用する前に所望の治療的又は予防的活性につい
てインビボでアッセイすることが好ましい。例えば、インビボアッセイを用いて、活性化
合物又はその組成物及び/又は別の療法を投与することが好ましいかどうかを決定するこ
とができる。例えば、インフルエンザウイルス疾患を予防するための活性化合物又はその
組成物の使用を評価するために、動物をインフルエンザウイルスに感染させる前に組成物
を投与することができる。或いは、又はさらに、動物をインフルエンザウイルスに感染さ
せるのと同時に、活性化合物又はその組成物を動物に投与することができる。インフルエ
ンザウイルス感染又はそれと関連する疾患を治療するための活性化合物又はその組成物の
使用を評価するために、動物をインフルエンザウイルスに感染させた後に化合物又は組成
物を投与することができる。具体的な実施態様において、活性化合物又はその組成物は、
動物に2回以上投与される。
【０６６４】
活性化合物及びその組成物は、限定されないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サ
ル、ブタ、フェレット、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ウサギ、モルモットなどを含む動物モデル
系で、抗ウイルス活性について試験することができる。具体的な実施態様において、活性
化合物及びその組成物は、マウスモデル系で試験される。そのようなモデル系は広く使用
されており、かつ当業者に周知である。具体的な実施態様において、活性化合物及びその
組成物は、マウスモデル系で試験される。インフルエンザウイルスのための動物モデルの
非限定的な例がこの節で提供される。
【０６６５】
一般に、動物をインフルエンザウイルスに感染させ、同時に又はその後に、活性化合物
もしくはその組成物、又はプラセボで処置する。或いは、動物を、活性化合物もしくはそ
の組成物、又はプラセボで処置し、その後、インフルエンザウイルスに感染させる。これ
らの動物から得られる試料(例えば、血清、尿、痰、精液、唾液、血漿、又は組織試料)は
、当技術分野で周知の方法、例えば、ウイルス力価の変化(例えば、プラーク形成により
測定される)、ウイルスタンパク質の産生(例えば、ウェスタンブロット、ELISA、もしく
はフローサイトメトリー解析により測定される)、又はウイルス核酸の産生(例えば、RT-P
CRもしくはノーザンブロット解析により測定される)を測定する方法により、ウイルス複
製について試験することができる。組織試料中のウイルスの定量のために、組織試料を、
リン酸緩衝食塩水(PBS)中でホモジナイズし、透明になったホモジネートの希釈物を、細
胞(例えば、Vero、CEF、又はMDCK細胞)の単層上へ37℃で1時間吸着させる。他のアッセイ
では、組織病理学的評価、好ましくは、ウイルスが感染の標的にすることが知られている
器官(複数可)の評価を感染後に実施する。ウイルス特異的モノクローナル抗体を用いて、
ウイルス免疫組織化学検査を実施することができる。
【０６６６】
活性化合物もしくはその組成物が投与される感染対象におけるウイルスの力価、活性化
合物もしくはその組成物が投与される感染対象の生存期間、活性化合物もしくはその組成
物が投与される感染対象における免疫応答、活性化合物もしくはその組成物が投与される
感染対象における症状の数、持続時間、及び/もしくは重症度、並びに/又は活性化合物も
しくはその組成物が投与される感染対象における1以上の症状の開始までの時間が評価さ
れるインビボアッセイを用いて、ウイルスの病原性に対する活性化合物又はその組成物の
効果を決定することもできる。当業者に公知の技術を用いて、そのような効果を測定する
ことができる。ある実施態様において、活性化合物又はその組成物は、未処置の対象と比
べて、0.5倍、1倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍
、125倍、150倍、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍、もしくは1,000倍、又は
それより大きいインフルエンザウイルスの力価の低下をもたらす。いくつかの実施態様に
おいて、活性化合物又はその組成物は、未処置の対象と比べて、約1log以上、約2log以上
、約3log以上、約4log以上、約5log以上、約6log以上、約7log以上、約8log以上、約9log
以上、約10log以上、1〜3log、1〜5log、1〜8log、1〜9log、2〜10log、2〜5log、2〜7lo
g、2log〜8log、2〜9log、2〜10log、3〜5log、3〜7log、3〜8log、3〜9log、4〜6log、4
〜8log、4〜9log、5〜6log、5〜7log、5〜8log、5〜9log、6〜7log、6〜8log、6〜9log、
7〜8log、7〜9log、又は8〜9logのインフルエンザウイルスの力価の低下をもたらす。
【０６６７】
インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス剤の試験用に開発された、インフルエンザ
ウイルス動物モデル、例えば、フェレット、マウス、モルモット、リスザル、マカク、及
びニワトリが記載されている。例えば、Sidwellらの文献(Antiviral Res., 2000, 48:1-1
6);Lowen A.C.らの文献(PNAS., 2006, 103:9988-92);及びMcCauleyらの文献(Antiviral R
es., 1995, 27:179-186)及びRimmelzwannらの文献(Avian Diseases, 2003, 47:931-933)
を参照されたい。インフルエンザのマウスモデルについて、インフルエンザ感染マウスに
投与される活性化合物の抗ウイルス活性をアッセイするために使用することができるパラ
メータの非限定的な例としては、肺炎関連死、血清α1酸糖タンパク増加、動物体重、血
球凝集素によりアッセイされる肺ウイルス、プラークアッセイによりアッセイされる肺ウ
イルス、及び肺の組織病理学的変化が挙げられる。統計解析を実施して、有意性(例えば
、0.05以下のP値)を計算する。
【０６６８】
他のアッセイでは、動物モデル対象の感染後に、組織病理学的評価を行なう。鼻甲介及
び気管を、上皮変化及び上皮下炎症について調べることができる。肺を、細気管支上皮の
変化、及び大、中、小、又は末端細気管支における細気管支周囲炎症について調べること
ができる。肺胞を、炎症性変化についても評価する。中細気管支は、以下のように、0〜3
+のスコアで等級付けられる:0(正常:繊毛性頂端境界及び基底偽重層核を有する中位から
高い円柱状の上皮細胞により裏打ちされている;最小限の炎症);1+(輪郭が円柱状かつ均一
で増殖がわずかに増加した上皮層;繊毛がなおも多くの細胞に見られる);2+(減弱から顕著
な増殖までの範囲の上皮層における顕著な変化;破壊された細胞及び管腔境界での不規則
な層輪郭);3+(著しく破壊され、無秩序になった上皮層、内腔には壊死細胞が見られる;減
弱した細気管支もあれば、反応性増殖が顕著な細気管支もある)。
【０６６９】
気管は、以下のように、0〜2.5+のスコアで等級付けられる:0(正常:繊毛性頂端境界、
基底偽重層核を有する中位から高い円柱状の上皮細胞により裏打ちされている。頂端境界
と核との間に明らかな細胞質。時折見られる扁平上皮細胞の小さな増殖巣);1+(上皮層の
限局的扁平上皮化生);2+(上皮層の大部分の広範囲の扁平上皮化生、繊毛は限局的に明白
な場合がある);2.5+(明白な繊毛が極めて少ない広範囲の扁平上皮化生)。
【０６７０】
ウイルス免疫組織化学は、ウイルス特異的モノクローナル抗体(例えば、NP-、N-、又は
HN-特異的モノクローナル抗体)を用いて行なわれる。染色は、以下のように、0〜3+に等
級付けられる:0(感染細胞なし);0.5+(ほとんど感染細胞なし);1+(ほとんど感染細胞なし
、広く離れた個々の細胞として);1.5+(ほとんど感染細胞なし、広く離れた単体として、
及び小クラスターで);2+(通常、上皮層が裏打ちする細気管支の一部の、又は肺胞内の小
さな小葉下病巣(sublobular foci)の、隣接細胞のクラスターを侵す、適度な数の感染細
胞);3+(細気管支の上皮層の大部分を侵すか、又は肺胞内の大きな小葉下病巣に広がる、
多数の感染細胞)。
【０６７１】
一例では、ウイルス感染の動物モデルで肺病変を誘導し、感染を引き起こす能力を、野
生株ウイルス及び模擬ウイルスを用いて比較する。肺病変は、目視検査で健康である肺葉
の割合として評価することができる。ペントバルビタールの静脈内投与により感染5日後
に動物を安楽死させ、その肺全体を取り出す。肉眼的病変に侵された各肺葉の表面の割合
を目視で見積もる。割合を平均化して、各動物の7つの肺葉についての平均値を得る。他
のアッセイでは、鼻スワブを検査して、ウイルス負荷量又は力価を測定することができる
。検死時に鼻スワブを採取して、感染後のウイルス負荷量を測定することができる。
【０６７２】
一実施態様において、ウイルスを組織試料中で定量する。例えば、組織試料をリン酸緩
衝食塩水(PBS)中でホモジナイズし、透明になったホモジネートの希釈物を、細胞(例えば
、MDCK細胞)の単層上へ37℃で1時間吸着させる。次に、感染させた単層に、0.1％ウシ血
清アルブミン(BSA)、0.01％DEAE-デキストラン、0.1％NaHCO3、及び1％寒天を含む最小必
須培地の溶液を重層する。プラークを可視化することができるまで、プレートを2〜3日イ
ンキュベートする。PR8感染試料由来のウイルスの力価を測定する(titrate)ための組織培
養感染量(TCID)アッセイを以下のように実施する。96ウェルプレート中の細胞(例えば、M
DCK細胞)のコンフルエントな単層を、培地中の透明になった組織ホモジネートの対数希釈
物とともにインキュベートする。接種の2〜3日後に、血球凝集アッセイ(HAアッセイ)で、
各ウェルからの0.05mlのアリコートをウイルス増殖について評価する。
【０６７３】
(5.17.6.1.1  ヒトでのアッセイ)
一実施態様において、インフルエンザウイルスの複製を調節する活性化合物又はその組
成物を感染ヒト対象で評価する。この実施態様に従って、活性化合物又はその組成物をヒ
ト対象に投与し、ウイルスの複製に対する活性化合物又は組成物の効果を、例えば、生物
学的試料(例えば、血清又は血漿)中のウイルス又はウイルス核酸のレベルを解析すること
により決定する。ウイルス複製を変化させる活性化合物又はその組成物は、対照で処置し
た対象又は対象群におけるウイルス複製のレベルを、活性化合物又はその組成物で処置し
た対象又は対象群におけるウイルス複製のレベルと比較することにより同定することがで
きる。或いは、ウイルスの複製の変化は、活性化合物又はその組成物の投与の前後で対象
又は対象群におけるウイルス複製のレベルを比較することにより同定することができる。
当業者に公知の技術を用いて、生物学的試料を得て、mRNA又はタンパク質の発現を解析す
ることができる。
【０６７４】
別の実施態様において、インフルエンザウイルス感染/疾患と関連する1以上の症状の重
症度に対する活性化合物又はその組成物の効果を感染対象で評価する。この実施態様に従
って、活性化合物もしくはその組成物又は対照をインフルエンザウイルス感染に罹患して
いるヒト対象に投与し、ウイルス感染の1以上の症状に対する活性化合物又は組成物の効
果を決定する。1以上の症状を軽減する活性化合物又はその組成物は、対照で処置した対
象を活性化合物又は組成物で処置した対象と比較することにより同定することができる。
具体的な実施態様において、活性化合物(すなわち、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)
ポリペプチド)又はその組成物の投与は、インフルエンザウイルス疾患又は感染に起因す
るヒト又はヒト集団の入院期間の短縮をもたらす。別の具体的な実施態様において、活性
化合物(すなわち、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド)又はその組成物の
投与は、インフルエンザウイルス疾患又は感染を有するヒト又はヒト集団における呼吸(r
espiratory)/呼吸(breathing)補助の必要性を低下させる。別の具体的な実施態様におい
て、活性化合物(すなわち、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド)又はその
組成物の投与は、インフルエンザウイルス疾患又は感染を有するヒト又はヒト集団の罹患
期間の低減をもたらす。別の具体的な実施態様において、活性化合物(すなわち、本明細
書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド)又はその組成物の投与は、例えば、全身又は
肺プレチスモグラフィーにより評価される肺容量の改善(例えば、増加)をもたらす。別の
実施態様において、活性化合物又はその組成物を健康なヒト対象に投与し、ワクチンとし
ての効力についてモニタリングする(例えば、対象を、インフルエンザウイルス感染の症
状の開始;対象に感染するインフルエンザウイルスの能力;並びに/又はインフルエンザウ
イルス感染と関連する1以上の症状の軽減/不在についてモニタリングする)。感染性疾患
を熟知している医師に公知の技術を用いて、活性化合物又はその組成物がインフルエンザ
ウイルス疾患と関連する1以上の症状を軽減するかどうか決定することができる。
【０６７５】
(5.18  対象における抗体の評価)
別の態様において、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、キメラ
インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)、又は本明細書に記載のflu血球凝集素
(HA)ポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)を発
現するウイルスを用いて、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド(例えば、flu
HAポリペプチド、例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)に対
する対象(例えば、未感作の対象もしくは免疫/ワクチン接種された対象)又は対象集団の
抗体応答を評価することができる(例えば、下の実施例8参照)。具体的な実施態様におい
て、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド又はキメラインフルエンザウ
イルス血球凝集素ポリペプチドを発現するウイルスを用いて、対象又は対象集団における
ステム特異的抗体の存在を評価することができる。具体的な実施態様において、キメライ
ンフルエンザウイルスHAポリペプチドは、HAステムドメイン中の1以上の修飾されたグリ
コシル化部位及び/又は球状ヘッドドメイン中の1以上の非天然のグリコシル化部位を含む
【０６７６】
具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド(例えば
、本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド(複数可)、例えば、キメラインフル
エンザウイルス血球凝集素ポリペプチド、又は本明細書に記載のflu血球凝集素(HA)ポリ
ペプチド、例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを発現するウ
イルス)で免疫/ワクチン接種されたことがある対象又は対象集団の抗体応答を評価して、
対象又は対象集団におけるストーク特異的抗体の種類を同定する。そのような評価は、本
明細書に記載のインフルエンザウイルスHAポリペプチドポリペプチド(複数可)(例えば、f
lu HAポリペプチド、例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)、
又は本明細書に記載のインフルエンザウイルスHAポリペプチドポリペプチド(複数可)(例
えば、flu HAポリペプチド、例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプ
チド)を発現するウイルスの投与に対する臨床応答を決定する際に重要な代用マーカー/エ
ンドポイントの同定を可能にすることができる。そのような手法において、対象又は対象
集団由来の生体試料、例えば、血液を単離し、抗体の存在について直接試験することがで
きるか、又は(例えば、血清を得るために)処理し、その後、抗体の存在について試験する
ことができる
【０６７７】
別の具体的な実施態様において、未感作の対象(すなわち、インフルエンザウイルスHA
ポリペプチドポリペプチド(複数可)(例えば、flu HAポリペプチド、例えば、本明細書に
記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)、もしくはインフルエン
ザウイルスHAポリペプチドポリペプチド(複数可)(例えば、flu HAポリペプチド、例えば
、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)を発現するウイルスで免疫/ワ
クチン接種されたことがない対象)、又は未感作の対象集団の抗体プロファイルを評価し
て、該対象又は対象集団が、様々なインフルエンザウイルス株又は亜型に対する球状ヘッ
ド特異的及び/又はステム特異的抗体を保有するかどうかを決定する。そのような評価は
、該対象又は対象集団への投与に好適である、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、
キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)又はflu血球凝集素(HA)ポリペプ
チド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)を発現するウイル
ス、例えば、該対象又は対象集団が感作されていない(それに対する抗体を有さない)ヘッ
ドドメインを含む、flu血球凝集素(HA)ポリペプチド、例えば、キメラインフルエンザウ
イルス血球凝集素ポリペプチドの作製を可能にすることができる。そのような評価は、患
者のための免疫戦略を決定することができる。
【０６７８】
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、特定のインフルエンザウ
イルス株又は亜型のステムドメインに特異的である対象中の抗体の存在を評価/検出する
方法であって、該対象由来の生体試料(例えば、血液、血清)を、本明細書に記載のキメラ
インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドとインビトロで接触させることを含み、
ここで、該キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドが関心対象の株又は亜
型由来のステムドメインを含む、方法である。特定のインフルエンザウイルス株又は亜型
のステムドメインに特異的な抗体の存在を評価/検出する方法については、下記の実施例6
〜8を参照されたい。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、特定
のインフルエンザウイルス株又は亜型のステムドメインに特異的である対象中の抗体の存
在を評価/検出する方法であって、該対象由来の生体試料(例えば、血液、血清)を、本明
細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを発現する/含むウ
イルスとインビトロで接触させることを含み、ここで、該キメラインフルエンザウイルス
血球凝集素ポリペプチドが関心対象の株又は亜型由来のステムドメインを含む、方法であ
る。
【０６７９】
(5.19  キット)
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の医薬/免疫原性組成物の1以上の成分、例
えば、本明細書に提供される1以上の活性化合物を充填した1以上の容器を含む医薬パック
又はキットである。医薬又は生物学的製品の製造、使用、又は販売を規制する行政機関に
より規定された形式での通知を、そのような容器(複数可)に任意で関連付けることができ
、その通知は、この機関による、ヒト投与のための製造、使用、又は販売の承認を示して
いる。
【０６８０】
本明細書に包含されるキットは、本明細書に記載の方法に従って使用することができる
。一実施態様において、キットは、1以上の容器中に、本明細書に記載の活性化合物、好
ましくは1以上のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、1以上のキメラインフルエンザ
ウイルス血球凝集素ポリペプチド)を含む。ある実施態様において、キットは、本明細書
に記載のワクチン、例えば、スプリットウイルスワクチン、サブユニットワクチン、不活
化インフルエンザウイルスワクチン、又はインフルエンザ生ウイルスワクチンを含み、こ
こで、該ワクチンは、本明細書に記載の1以上のflu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば
、1以上のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)を含む。具体的な実施
態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイ
ルス血球凝集素ポリペプチド及び該キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチ
ドを用いて対象中に存在する抗体を評価するための説明書を含むキットである。別の具体
的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、試料中のHAステムドメイン特異的抗
体の存在をアッセイする方法で使用するための本明細書に記載のキメラインフルエンザウ
イルス血球凝集素ポリペプチドを含むキットである。
【実施例】
【０６８１】
(6.実施例)
(6.1  実施例1:インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド)
表8.構築物のまとめ
【表１１】
2020096604.tif 000132
2020096604.tif 000133
本実施例は、本明細書に記載の方法に従って調製することができる表8の有用なポリペ
プチドを提供する。
【０６８２】
(6.2  実施例2:キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)
この実施例は、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド、及び該キメラ
インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの投与を含む、対象において高レベルの
交差中和性HAストーク抗体を誘導する方法を記載するものである。この実施例に記載され
ているように、インフルエンザウイルスによって、及びキメラインフルエンザウイルス血
球凝集素を発現するように改変された細胞によってうまく発現されるキメラインフルエン
ザウイルス血球凝集素を作製した。キメラインフルエンザウイルス血球凝集素のステムド
メインとヘッドドメインの両方の抗体認識から明らかなように、該キメラインフルエンザ
ウイルス血球凝集素を、その適切な立体構造で回収することに成功した。
【０６８３】
図7は、インフルエンザウイルスのH1亜型のステム/ストークドメイン及び他のインフル
エンザウイルス亜型(H2、H3、及びH5)の異種球状ヘッドドメインを含む、キメラインフル
エンザウイルス血球凝集素(HA)を示す。図7の戦略概要に従って、H1N1(PR8-H1N1)インフ
ルエンザウイルスに由来するステムドメイン及び2009パンデミックH1 HA(Cal/09)の球状
ヘッドドメインから構成されるキメラHAを含むインフルエンザウイルスを作製した。2つ
のウイルスのHAの球状ヘッドドメインが非常に異なっているのに対し(〜70％アミノ酸同
一性)、ステムドメインは極めて保存されているが、それでも異なっている(〜89％アミノ
酸同一性)。図8に示すように、同じステムドメインを有するが、同じ亜型内の非常に異な
るHAヘッドを有するキメラHAを発現させた。
【０６８４】
さらに、A/PR8/34 HAのストークドメイン及びHK/68の球状ヘッドドメインからなるキメ
ラHA(キメラH3)、並びに野生型HA(PR8-HA及びHK68 HA)を293T細胞で発現させた。図10は
、(H1亜型HAに由来する)同じステムドメインを有し、かつ異なる亜型(H3)由来の球状ヘッ
ドを有する安定なキメラHAを発現させることも可能であることを示す。
【０６８５】
このように、HAステムドメインを完全に共有するが、その球状ヘッドが極めて異なって
いるHA免疫原を設計した。これらの構築物による免疫の繰返しは、HAの共通のステムドメ
インに対する高レベルの交差中和抗体を生じさせるはずである。したがって、改善された
ワクチン戦略は、不変のステム/ストークドメイン及び変化する球状ヘッドを有するキメ
ラHAを用いて、強力な交差中和性抗ステムドメイン抗体を誘導する。例えば、A/PR/8/34
由来のH1 HAの不変のステムドメインを異なるグループ1 HA(H1、H2、H5、H9)由来の球状
ヘッドと一緒に用いて、組換え不活化ウイルス、組換え弱毒化ウイルス、又は組換えHAの
いずれかのパネルを作製することができる(図9)。例えば、X31ウイルスのH3 HAのステム
ドメインに基づくグループ2 HAについての同様のパネルは、H3、H4、及びH7球状ヘッドと
組み合わせて、グループ2 HAの普遍的なワクチンの基礎を提供することができる。組換え
ウイルスを、PR/8又は低温適応インフルエンザウイルスなどの、インフルエンザウイルス
ワクチン骨格上にレスキューし、標準的な技術により成長させ、不活化又は弱毒化ワクチ
ンとして使用することができる。組換えHAを、哺乳動物様のグリコシル化を行なうことが
できる昆虫細胞(MIMIC Sf9)において、又は例えば、293 TもしくはVero細胞の一過性トラ
ンスフェクションにより発現させることができ、その後、C末端hisタグを援用したNi-キ
レートクロマトグラフィーにより精製することができる。他の戦略としては、キメラHAを
発現するDNAワクチン、又はキメラHAを発現する他のベクター、例えば、アデノウイルス
ベクターの使用を挙げることができる。
【０６８６】
(6.3  実施例3:キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを発現するウイル
ス)
この実施例は、異なる血球凝集素亜型由来の種々の球状ヘッド及びストーク組合せを包
含するいくつかの機能的キメラインフルエンザウイルス血球凝集素、並びにこれらのキメ
ラ血球凝集素を発現し、野生型インフルエンザウイルスの成長特性と同様の成長特性を有
していた組換えインフルエンザウイルスを記載するものである。
【０６８７】
(6.3.1  材料及び方法)
(6.3.1.1  細胞及びウイルス)
293T及びMDCK細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクチョン(American Type C
ulture Collection)(ATCC, Manassas, VA)から入手し、10％胎仔ウシ血清(HyClone; Ther
mo Scientific)及びペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco, Invitrogen)を補充したダル
ベッコの最小必須培地(DMEM)中又はMEM(Gibco, Invitrogen)中で維持した。
【０６８８】
全てのA/PR/8/34組換えウイルスを、10日齢の発育鶏卵中、37℃で2日間成長させた。
【０６８９】
(6.3.1.2  プラスミドの構築)
異なるキメラ血球凝集素をコードするプラスミドを、以前に記載されているような組換
えウイルスを作製するためのリバースジェネティックスプラスミドの構築を基に改変した
同様の戦略により構築した(例えば、Fodorらの文献(1999, J Virol 73:9679-9682);及びH
aiらの文献(2008, J Virol 82:10580-10590)参照)。簡潔に述べると、キメラHAの様々な
セグメントを、SapI部位を含むプライマーでPCRにより増幅させ、SapIで消化し、ヒトRNA
ポリメラーゼIプロモーター及びマウスRNAポリメラーゼIターミネーターを含むpDZベクタ
ー(例えば、Quinlivanらの文献(2005, J Virol 79:8431-8439)参照)のSapI部位に、多重
セグメントライゲーションによりクローニングした。
【０６９０】
(6.3.1.3  フローサイトメーター解析)
細胞表面における血球凝集素タンパク質のレベルを評価するために、293T細胞に、製造
業者の指示に従ってLipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて、1μgの適当なプラスミド
をトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、細胞をトリプシン処理し、
2％FBSを含むPBSに懸濁させた後、それらを、1/1000希釈のH1 HAに対するモノクローナル
抗体(mAb) 6F12、又は1/400希釈のH3 HAに対するmAb 12D1(Wangらの文献(2010, PLoS Pat
hog 6:e1000796)参照)で染色した。染色された細胞をBeckman Coulter Cytomics FC 500
フローサイトメーターで計数し、結果を、FlowJoソフトウェアを用いて解析した。
【０６９１】
(6.3.1.4  偽粒子生成及び侵入アッセイ)
偽粒子産生のための手順を以前の研究を基に改変した(例えば、Evansらの文献(2007, N
ature 446:801-805);及びSuiらの文献(2011, Clin Infect Dis 52:1003-1009)参照)。簡
潔に述べると、293-T細胞に、(i)所望のレポーターを含むプロウイルス(V1-GLuc)、(ii)H
IV Gag-Pol、(iii)異なるキメラ血球凝集素タンパク質、及び(iv)A型インフルエンザPR8
ノイラミニダーゼ(NA)をコードする4つのプラスミドをコトランスフェクトした。トラン
スフェクションの72時間後、上清を回収し、その後、濾過した(0.45μm孔径)。偽粒子を
用いた形質導入及び感染アッセイは全て、1μg/mlのポリブレン(Sigma, St. Louis, MO)
の存在下で実施した(Suiらの文献(2011, Clin Infect Dis 52:1003-1009)参照)。
【０６９２】
侵入アッセイは、MDCK細胞を、異なるキメラ血球凝集素を有し、G-Lucレポーターを含
む偽粒子に感染させることにより実施した。感染の24時間後、細胞を新鮮な培地で3回洗
浄して、偽粒子接種材料中に存在するG-Lucタンパク質を除去した。感染の48時間後、ル
シフェラーゼアッセイを実施した(Evansらの文献(2007, Nature 446:801-805)参照)。
【０６９３】
(6.3.1.5  組換えキメラA型インフルエンザウイルスのレスキュー)
プラスミドDNAからのA型インフルエンザウイルスのレスキューを、以前に記載されてい
る通りに実施した(例えば、Fodorらの文献(1999, J Virol 73:9679-9682);及びHaiらの文
献(2008, J Virol 82:10580-10590)参照)。組換え野生型(rWT)PR8ウイルスを作製するた
めに、293T細胞に、Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、1μgの8
つのpDZ PR8レスキュープラスミドの各々をコトランスフェクトした。異なるキメラHAを
発現するウイルスを同じ方法で作製したが、HAプラスミドを対応するキメラプラスミドに
置き換えて、対応するキメラウイルスを回収した。感染の6時間後、培地を、0.3％ウシ血
清アルブミン(BSA)、10mM HEPES、及び1.5μg/ml TPCK(L-1-トシルアミド-2-フェニルエ
チルクロロメチルケトン)処理トリプシンを含むDMEMと交換した。トランスフェクション
の24時間後、ウイルス含有上清を8日齢の発育鶏卵中に接種した。37℃で2日間のインキュ
ベーションの後、尿膜腔液を回収し、ウイルスの存在について、ニワトリ赤血球の血球凝
集により、及びMDCK細胞におけるプラーク形成によりアッセイした。
【０６９４】
(6.3.1.6  ウイルス成長動態アッセイ)
組換えウイルスの複製特徴を解析するために、10日齢の発育鶏卵に100pfuの各々それぞ
れのウイルスを接種した。尿膜腔液を回収し、その後、0、9、24、48、及び72感染後時間
(hpi)でのウイルス成長についてアッセイした。尿膜腔液中に存在するウイルスの力価をM
DCK細胞でのプラークアッセイにより決定した。
【０６９５】
(6.3.1.7  プラークの免疫染色)
プラークを、A型インフルエンザNPタンパク質に対するmAb(HT103)による免疫染色によ
り可視化した。
【０６９６】
(6.3.1.8  ウェスタンブロット及び間接免疫蛍光解析)
12ウェルディッシュのうちの1つのウェルのコンフルエントなMDCK細胞を、37℃で1時間
、表示された組換えインフルエンザウイルスに感染させるか(2の感染多重度[MOI])、又は
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に模擬感染させた。12感染後時間(hpi)で、細胞を、以前に記
載されている通りに1×タンパク質ローディングバッファー中で溶解させた(例えば、Hai
らの文献(2008, J Virol 82:10580-10590)参照)。還元された細胞ライセートを、A/NPに
対するmAb(HT103)、A/PR8/HAに対するmAb(PY102)、A/Cal/09/HAに対するmAb(29C1)、A/VN
/HAに対するmAb(M08)(20)、A/H3/HAに対するmAb(12D1)を使用することによって、ウェス
タンブロット解析により解析した。パース-cH7の検出は、BEI Resourcesから入手されるA
/FPV/オランダ/27(H7)ウイルスに対するヤギポリクローナル血清、NR-3152を使用した。m
Ab抗 グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)ローディング対照抗体はAbca
m製であった。関心対象のタンパク質は全て、増強化学発光タンパク質検出系(PerkinElme
r Life Sciences, Boston, MA)を用いて可視化した。
【０６９７】
免疫蛍光解析のために、15-mmカバースリップ上のコンフルエントなMDCK細胞の単層に
、組換えウイルスを2のMOIで感染させた。15hpiで、細胞を固定し、-20℃で20分間、メタ
ノール-アセトン(比率、1:1)で透過処理した。0.1％Tween 20を含むPBS中の1％ウシ血清
アルブミンでブロッキングした後、細胞を、上記のように、A/NPに対する抗体(HT103)、A
/H1/HAに対する抗体(6F12)、A/PR8/HAに対する抗体(PY102)、A/Cal/09/HAに対する抗体(2
9C1)、A/VN/HAに対する抗体(M08)(20)、A/H3/HAに対する抗体(12D1)、及びA/H7ウイルス
に対する抗体(NR-3152)とともに1時間インキュベートした。0.1％Tween 20を含むPBSで3
回洗浄した後、細胞を、Alexa Fluor 594コンジュゲート抗マウス免疫グロブリンG(IgG; 
Invitrogen, Carlsbad, CA)又はAlexa Fluor 594コンジュゲート抗ヤギ免疫グロブリンG(
IgG, Invitrogen, Carlsbad, CA)とともに1時間インキュベートした。最後に3回洗浄した
後、感染細胞を、Olympus IX70顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡法により解析した。
【０６９８】
(6.3.2  結果)
(6.3.2.1  キメラ血球凝集素の作製)
Cys52-Cys277ジスルフィド結合を形成するシステイン残基の保存に関する情報を得るた
めに、H1、H3、H5、及びH7亜型のA型インフルエンザウイルスHA配列のアラインメントを
作成した(図11参照)。免疫優性抗原性部位が球状ヘッドドメイン上に存在することが主な
原因で、HA1サブユニットの配列は、HA2サブユニットの配列よりも保存されていない。よ
り保存されたHA2鎖は、HA分子をウイルスエンベロープに固定するストーク領域を含む。
このアラインメントは、Cys52及びCys277並びに両方の末端に向かうアミノ酸が選択され
た亜型にわたって保存されていることを示している。これ以降、Cys52に対してN末端及び
Cys277に対してC末端の血球凝集素配列をストークドメインと定義する(図11)。介在配列
は、この実施例において、ヘッドドメインであるとみなされる。
【０６９９】
パンデミックH1 Cal/09 HA球状ヘッドドメインをPR8(H1) HA由来のストーク領域ととも
に含むキメラ血球凝集素構築物(PR8-cH1)を最初に作製した(図12A)。VN1203(H5) HA由来
の球状ヘッドをPR8(H1) HA由来のストークとともに含むキメラHA(PR8-cH5)も作製した(図
12B)。インフルエンザHAの全16種の亜型は2つの系統発生学的なグループ(グループ1及び2
)に分類され(例えば、Suiらの文献(2009, Nat Struct Mol Biol 16:265-273)参照)、H1 H
AとH5 HAは両方ともグループ1に属するので、A/アルバータ/24/01(H7)ヘッドドメインをA
/パース/16/2009(H3) HA(パース-cH7)由来のストーク領域とともに有するキメラHAを作製
するための同様の戦略(図12B)を適用した。H7とH3は両方とも、グループ2の系統発生学的
グループ由来のメンバーである(例えば、Suiらの文献(2009, Nat Struct Mol Biol 16:26
5-273)参照)。
【０７００】
次に、様々なキメラHA構築物が発現されて細胞表面に輸送されているかどうかを検討し
た。それぞれ、PR8及びH3ストークドメイン特異的抗体で表面染色した後、一過性にトラ
ンスフェクトした293T細胞の蛍光活性化セルソーター(FACS)解析を実施した(図13A)。図1
3Aに示すように、3つ全てのキメラ構築物の発現を検出した。この検出により、ゴルジ複
合体から細胞表面へのキメラHAの輸送が分断されないことが示される。
【０７０１】
次に、様々なキメラHAの侵入特徴を、MDCK細胞を、キメラHA、野生型A型インフルエン
ザPR8 NA、及びHIVベースのルシフェラーゼを含むレトロウイルスHAシュードタイプ化粒
子に感染させることにより調べた。キメラHAタンパク質によって媒介される侵入効率は、
ルシフェラーゼの読出しにより検出した。同程度のレベルのシュードタイプ化粒子媒介性
ルシフェラーゼ送達が、PR8-cH5及びパース-cH7キメラHA及び対応する野生型タンパク質
について観察された(図13B)。PR8-cH1 HAは、他のHA構築物と比べてより低いルシフェラ
ーゼレベルを示した。
【０７０２】
(6.3.3  キメラ血球凝集素を有するインフルエンザウイルスの作製)
上の結果を考慮して、キメラHAが、ウイルス粒子全体との関連でかつ最終的に機能的で
あるかどうかということが、キメラHAのみを発現する組換えA型インフルエンザウイルス
のレスキューを可能にすることを確かめた。以前に発表されたプロトコル(例えば、Fodor
らの文献(1999, J Virol 73:9679-9682);及びHaiらの文献(2008, J Virol 82:10580-1059
0))を用いて、異なるキメラHAの全てを含むウイルスを作製するのに成功した。得られた
ウイルスをプラーク精製し、10日齢の胚性卵中で増幅させ、キメラセグメントをRT-PCRに
より解析し、シークエンシングした。全ての場合において、ウイルスは、予想されたキメ
ラHAセグメントを有し、他のHAセグメントを有さないことが分かった。
【０７０３】
キメラウイルスのアイデンティティを感染細胞のウェスタンブロッティング及び間接免
疫蛍光によりさらに示した(図14A及び14B)。MDCK細胞を、rWT A/PR8、野生型A/パース、P
R8-cH1、PR8-cH5、及びパース-cH7ウイルスに感染させた(図14A及び14B)。PR8-cH1及びPR
8-cH5キメラHAタンパク質を、ぞれぞれ、Cal/09 HAに対する抗体(29C1)又はVN/04 HAに対
する抗体(M08)のいずれかを用いて、対応する試料中で検出した(Steelらの文献(2009, J 
Virol 83:1742-1753)参照)(図14A)。汎H3ストークmAbである12D1(Wangらの文献(2010, PL
oS Pathog 6:e1000796)参照)を用いて、パースcH7-HAと野生型パースHAの間での同程度の
発現レベルが観察された。抗H7抗体(NR-3152)を使用したとき、陽性バンドは、パース-cH
7感染試料でしか検出されなかった。
【０７０４】
免疫蛍光研究について、感染条件は、ウェスタン解析の感染条件と同様であった。感染
細胞を、図14Bに示すように、対応する抗体で染色した。感染細胞は全て、予想されたHA
発現及び予想されたA/NPタンパク質発現を示した(図14B)。
【０７０５】
(6.3.4  組換えウイルスの複製特徴)
ウイルスの成長特性を、10日齢の発育鶏卵中、37℃で評価した(図15A)。キメラHAを発
現する組換えウイルスの成長動態との比較のために、rWT PR8ウイルスを含めた。PR8-cH5
ウイルスに関して、PR8ウイルスと比べて同様の複製パターンが観察された。パース-cH7
ウイルスに関して、rWT PR8ウイルスと比べて、9hpiでウイルス力価が2倍低下した。それ
にもかかわらず、それは、48hpiで、野生型ウイルスと同様のピーク力価(1×109 PFU/ml)
に達した。全ての時点を通した力価の低下によって示されるように、rWT PR8ウイルスと
比べると、PR8-cH1ウイルスは弱毒化されていた。それにもかかわらず、このキメラウイ
ルスですら、約108 PFU/mlというかなりのピーク力価に達した。キメラウイルスの各々の
プラーク表現型もMDCK細胞で評価した。図15Bに示すように、全てのウイルスが同程度の
サイズのプラークを形成した。これらの結果から、キメラHA構築物がインビボで正しくフ
ォールディングし、生物学的に機能的であることが確認される。
【０７０６】
(6.3.5  結論)
ヘッドドメインとストークドメインの境界を定める保存されたジスルフィド結合Cys52-
Cys277を利用することにより、異なるHA球状ヘッドドメインを有するキメラHAタンパク質
を有するインフルエンザウイルスを作製するための新しい戦略を開発した。したがって、
もとのヘッドドメインを別のHAのヘッドドメインと置換することにより、同じストークを
有するが、異なる球状ヘッドを有するキメラHAのパネルを作製した。この設計を、PR8ス
トークドメインをCal/09及びVN H5球状ヘッドとともに含む、多数の亜型にわたって検討
した。さらに、H7球状ヘッドをH3ストークドメイン上に配置した。これらの構築物は、両
方の系統発生学的グループのインフルエンザHAタンパク質を網羅する。各々の構築物は細
胞表面に発現し、図12に示すように融合活性を保持した。キメラHAを有する組換えウイル
スの作製は、HAが正しくフォールディングし、生物学的機能を保持することをさらに立証
した。
【０７０７】
(6.4  実施例4:キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの診断的適用及び
キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドによるマウスのワクチン接種)
この実施例は、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを診断目的で利
用することができること、及びキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを
発現するウイルスをワクチンで利用することができることを示す。
【０７０８】
(6.4.1  材料及び方法)
(6.4.1.1  細胞及びプラスミド)
293T細胞及びMDCK細胞をATCCから入手し、それぞれ、各々10％胎仔ウシ血清(HyClone)
、及び100ユニット/mlのペニシリン-100μg/mlのストレプトマイシン(Pen/Strep, Gibco)
を補充したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)及び最小必須培地(両方ともGibco製)中
で維持した。10％胎仔ウシ血清を補充したTNM-FH(Sigma-Aldrich)とHyclone SFX昆虫培地
(ThermoScientific)とを、Sf9及びBTI-TN5B1-4(High Five)細胞培養に使用した。
【０７０９】
A/マガモ/スウェーデン/81/02(「cH6」)ウイルス又はA/ホロホロチョウ/香港/WF10/99(
「cH9」)ウイルスのいずれかに由来する球状ヘッドドメインを含むA/プエルトリコ/8/193
4(PR8)のストークを有するキメラ血球凝集素構築物を同様の技術を用いて作製した。キメ
ラH6構築物については、様々な成分をPCRにより増幅させ、以前に記載されたクローニン
グ戦略を用いてpDZプラスミドにクローニングした(例えば、Fodorらの文献(1999, J Viro
l 73:9679-82);及びHaiらの文献(2008, Journal of Virology 82:10580-90)参照)。簡潔
に述べると、キメラ血球凝集素(cHA)の様々な成分を、Sap I部位を含むプライマーでPCR
により増幅させ、Sap Iで消化し、pDZプラスミドのSap I部位にクローニングした。バキ
ュロ転移プラスミドの作製のために、cH6をPCRにより増幅させ、BamHI及びNotIで切断し
、C末端T4ファージフォルドン及び6-hisタグを有する修飾されたpBacPAK8(Gentech)バキ
ュロ転移ベクターにインフレームでクローニングした(Meierらの文献(2004, J Mol Biol 
344:1051-69)参照)。全てのプラスミドの配列をサンガーシークエンシングにより確認し
た。
【０７１０】
(6.4.1.2  組換えcH9ウイルスのレスキュー)
組換えワクチンウイルスをレスキューするために、PR8由来の7つの野生型ウイルスセグ
メントのvRNA及びmRNAをコードする8つのリバースジェネティックスプラスミドと、cH9と
を、以前に記載されている通りに使用した(Fodorらの文献(1999, J Virol 73:9679-82);
及びPleschkaらの文献(1996, J Virol 70:4188-92))。簡潔に述べると、293T細胞に、Lip
ofectamine 2000(Invitrogen)を用いて、1μgの8つのプラスミドの各々をトランスフェク
トした。トランスフェクションの12時間後、培地を、0.3％ウシ血清アルブミン、10mM HE
PES、及び1.5μgのTPCK(l-1-トシルアミド-2-フェニルエチルクロロメチルケトン)処理ト
リプシン/mLを含むDMEMと交換した。トランスフェクションの2日後、ウイルス含有上清を
10日齢の発育鶏卵中に接種した。37℃で2日間のインキュベーションの後、尿膜腔液を回
収し、ニワトリ赤血球の血球凝集により、ウイルスの存在についてアッセイした。その後
、レスキューされたcH9ウイルスを10日齢の卵中で増殖させ、次いで、37℃で48時間イン
キュベートした。ウイルスストックの力価を、以前に記載されている通りにプラークアッ
セイにより測定した(例えば、Steelらの文献(2009, Journal of Virology 83:1742-53)参
照)。cH9の配列を逆転写PCR産物のシークエンシングにより確認した。
【０７１１】
(6.4.1.3  組換えバキュロウイルス作製、タンパク質発現、及び精製)
cH6を担持する組換えバキュロウイルス(rBV)を作製するために、プラスミド及びBaculo
gold DNA(BDBioschiences)を、製造業者の指示に従ってCellfectin II(Invitrogen)を用
いて、Sf9細胞にコトランスフェクトした。組換えバキュロウイルスを、TNM-FH培地(Gemi
ni Bioproducts, West Sacramento, CA)中で成長させたSf9細胞で増幅させ、力価を、以
前に記載されている通りにプラークアッセイにより決定した(例えば、Steelらの文献(200
9, Journal of Virology 83:1742-53)参照)。
【０７１２】
HyClone SFX昆虫細胞培地(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)中で成長させたHi
gh Five細胞(Krammerらの文献(2010, Mol Biotechnol 45:226-34)参照)を、500mlの振盪
フラスコ中、10の感染多重度(MOI)及び1×106細胞/mlの細胞密度で、cH6を発現するrBVに
感染させた。感染96時間後、細胞を回収し、室温で2000×gで10分間の低速遠心分離によ
り、上清から分離した。cH6タンパク質の精製のために、上清を回収し、Ni-NTA樹脂(Qiag
en)とともに4℃で2時間インキュベートした。スラリーをカラムに充填し、洗浄バッファ
ー(50mM Na2HCO3、300mM NaCl, 20mMイミダゾール、pH 8)で3回洗浄した。タンパク質を
溶出バッファー(50mM Na2HCO3、300mM NaCl、250mMイミダゾール、pH 8)で0.5mlずつ溶出
させ、ブラッドフォード試薬でタンパク質含量について試験し、タンパク質を含む画分を
プールした。タンパク質の純度及びアイデンティティを、SDS-PAGE、クマシー染色、及び
ウェスタンブロットにより試験した。タンパク質濃度をブラッドフォード試薬で決定した
。
【０７１３】
(6.4.1.4  マウス実験)
全ての処置のために、マウスを0.1mLのケタミン/キシラジン混合物(1.5mgケタミン及び
0.3mgキシラジン)の腹腔内注射で麻酔した。
【０７１４】
マウス50％致死用量(LD50)を、4匹のマウスの群をインフルエンザウイルスの10倍連続
希釈液に感染させることにより、BALB/cマウス(Charles River Laboratories)で決定した
。体重を2週間にわたってモニタリングした。その体重の25％超を失ったマウスを実験的
エンドポイントに達したものとみなし、安楽死させた。LD50値をReed及びMeunchの方法に
より計算した(Reed及びMeunchの文献(1938, Am. J. Hyg. 27:493-497)参照)。
【０７１５】
A/カリフォルニア/04/09(Cal/09)ウイルス感染後に産生されるステム抗体を評価する実
験のために、以前に記載されているような電気刺激の適用(TriGrid送達系、Ichor Medica
l Systems)(例えば、Luxembourgらの文献(2007, Expert Opinion on Biological Therapy
7:1647-64)参照)に加えて、雌の8〜10週齢BALB/cマウスをPR8ウイルス由来の全長HAをコ
ードする80μgの発現プラスミドの筋肉内投与で最初に初回免疫した。3週間後、マウスを
、50μl容量中の致死未満用量の104PFU Cal/09で鼻腔内に追加免疫した。対照動物は、DN
Aのみ又はCal/09ウイルスのみ又は2009-2010ワクチン(Cal/09スプリットワクチン)の筋肉
内注射のいずれかを受容した。追加免疫の3週間後、又は対照動物について同等の時点で
、マウスから採血し、血清を回収して、cH6に対する反応性を下記のような免疫蛍光によ
り試験した。
【０７１６】
ワクチン構築物としてのcH9ウイルスの効力を試験する実験のために、PR8全長DNAを上
記の通りに投与した。初回免疫の3週間後、マウスに、鼻腔内に注入される103PFUのcH9ウ
イルスを接種した。対照動物は、DNAのみ又はCal/09ウイルスのみ又は精製不活化PR8ウイ
ルスのいずれかを筋肉内に受容した。追加免疫の3週間後、又は対照動物について同等の
時点で、マウスを5×104 LD50のPR8ウイルスの鼻腔内接種で感染させた。マウスを、感染
後14日間計量した。その初期体重の27.5％超を失ったマウスを安楽死させ、死亡と記録し
た。
【０７１７】
(6.4.1.5  キメラ血球凝集素の発現を確認するための免疫蛍光)
293T細胞のコンフルエントな単層に、1μgのpDZ cH6プラスミドをトランスフェクトし
た。トランスフェクションの48時間後、細胞を固定し、0.1％Tween 20を含むPBS中の1％
ウシ血清アルブミンでブロッキングした。その後、細胞を、上記の4つの実験群(PR8 DNA
のみ、Cal/09のみ、PR8 DNA及びCal/09感染、又はCal/09スプリットワクチンのみ)の各々
の動物からプールされた血清とともにインキュベートした。0.1％Tween 20を含むPBSで3
回洗浄した後、細胞をAlexa Fluor 488コンジュゲート抗マウスIgG(Invitrogen)とともに
1時間インキュベートした。感染細胞を、Olympus IX70顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡法によ
り解析した。
【０７１８】
(6.4.1.6  ELISA)
96ウェルELISAプレート(Nunc, MaxiSorp)に、50mlのバキュロウイルス発現cH6をコーテ
ィングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートを3％ミルク/PBSでブロッキングし、
その後、PBS/0.1％Tween(PBST)で洗浄した。ワクチン接種マウス由来の血清をPBSに連続
希釈し、プレートに添加し、次いで、37℃で1時間インキュベートした。その後、プレー
トをPBSTで洗浄し、1:2500希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG(GE Healt
hcare)とともにインキュベートした。PBSTでさらに洗浄した後、SigmafastOPD基質(Sigma
)を添加した。反応を3M H2SO4で停止させ、光学密度測定を490nmで行なった。
【０７１９】
(6.4.2  結果)
(6.4.2.1  キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、診断的適用に使用
することができる)
免疫マウスによるH6ステムドメインに対する抗体の産生をアッセイする解析ツールとし
ての役割を果たすH6インフルエンザウイルス亜型の血球凝集素由来の球状ヘッドドメイン
及びPR8ウイルスの血球凝集素由来のステム/ストークドメインを含むキメラ血球凝集素構
築物を作製した。免疫マウスはH1ウイルスの球状ヘッドにのみ曝露されたので、実験動物
で生成される抗体は、それらがそのH1ステムに対するものであった場合、キメラH6血球凝
集素(cH6)に対してのみ反応することとなった。
【０７２０】
図16A及び16Dに示すように、DNAのみ又はパンデミックスプリットワクチンによる処置
は、ワクチン接種マウスにおいてステム反応性抗体を誘発しなかった。逆に、Cal/09のみ
の感染は、ステム反応性抗体を生成させたが(図16B)、DNAエレクトロポレーション及び感
染によって誘発されるほどではなかった(図16C)。交差反応性H1ステム抗体であるC179を
トランスフェクションの対照として使用した(図16E)。予想された通り、PR8の球状ヘッド
に対する抗体であるPY102は、トランスフェクトされたcH6 HAに反応しなかった(図16F)。
【０７２１】
図18に示すように、ステム抗体結合を検出するツールとしてのcH6キメラインフルエン
ザウイルス血球凝集素ポリペプチドの有用性をELISAにより確認した。
【０７２２】
(6.4.2.2  キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、ワクチンで使用す
ることができる)
図17に示すように、不活化PR8ウイルスをワクチン接種した動物は致死感染から防御さ
れたが、DNAのみを受容した動物は、感染後5日までに、感染のために完全に死亡した。cH
9ウイルスのみを受容した動物も感染から防御されず、生存率はわずか25％であった。対
照的に、最初にDNAで初回免疫し、その後、cH9ウイルスで追加免疫した動物は、感染から
防御され、生存率は、不活化ウイルス調製物をワクチン接種した動物と統計的に同じであ
った。
【０７２３】
(6.5  実施例5:インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメイン中
のグリコシル化は、インフルエンザウイルスの病原性及び抗原性特性を調節する)
この実施例は、インフルエンザウイルスの病原性及び抗原性交差反応性に対するインフ
ルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインのグリコシル化の効果を
示す。
【０７２４】
(6.5.1  材料及び方法)
(6.5.1.1  H1N1 HAウイルス配列及びアラインメント)
インフルエンザ研究データベース(Influenza Research Database)(www.fludb.org)から
入手可能な全てのH1N1ヒトウイルス由来のHA配列をダウンロードし、ClustalWを用いて整
列させ、BioEdit Sequence Alignment Editorソフトウェアを用いて手作業で編集した。1
年につき少なくとも2つのもとの分離株に基づく代表的なグリコシル化パターンを含むHA1
配列をさらなる解析のために選択した。図22Aに示されたHAのGenBank受託番号は、以下の
通りである:
【化６３】
2020096604.tif 000134
これらのグリコシル化部位は、モチーフN-X-S/Tにより予測された。
【０７２５】
(6.5.1.2  細胞株及びウイルス)
ヒト胎児腎臓(293T)細胞を、10％FBS及び1000U/mlペニシリン/ストレプトマイシンを補
充したDMEM中で維持した。Madin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞を、10％FBS及びペニシリン/
ストレプトマイシンを補充したMEM中で維持した。細胞培養用の試薬をGibco Life Techno
logiesから購入した。ウイルス株A/テキサス/36/1991 H1N1(テキサス/91)、A/ブリスベン
/59/2007 H1N1(Bris/59)、及びA/ブリスベン/10/2007 H3N2(Bris/10)を10日齢の発育鶏卵
中で成長させた。A/カリフォルニア/04/2009(Cal/09)及びA/ネーデルラント/602/2009(Ne
th/09)分離株、並びに全ての組換えウイルスストックをMDCK細胞で成長させた。
【０７２６】
(6.5.1.3  組換えウイルスの作製)
(6.5.1.3.1  A/ネーデルラント/602/2009分離株レスキュープラスミド)
配列解析から、PB2、PB1、M、及びNSタンパク質をコードするセグメントが、A/カリフ
ォルニア/04/2009分離株とA/ネーデルラント/602/2009分離株の間で同一であることが示
された。したがって、以前に記載されたA/カリフォルニア/04/2009株(Haiらの文献(2010,
Journal of Virology 84: 4442-4450); Quinlivanらの文献(2005, Journal of Virology
79, 8431-8439))のプラスミドpDZ-PB1、pDZ-PB2、pDZ-M、及びpDZ-NSを使用した。QIAam
pウイルスRNAミニキット(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて、A/ネーデルラント/602/20
09ウイルス分離株に感染したMDCK細胞から得られた上清からウイルスRNAを単離すること
により、残りのセグメントをクローニングし、SapI制限部位を含むセグメント特異的プラ
イマーを用いて、NP、HA、及びNAを、以前に記載されている通りにpPolIプラスミドにク
ローニングした(Quinlivanらの文献(2005, Journal of Virology 79, 8431-8439))。PAに
ついては、A/カリフォルニア/04/2009 pPolI-PAプラスミドを鋳型として用いて部位特異
的突然変異生成を実施し、3ntを突然変異させて、WT Neth/09 PA遺伝子を得た。次に、セ
グメントPA及びNPを、SapI制限部位を用いて、ベクターpPolIから二方向性ベクターpDZに
サブクローニングした。グリコシル化突然変異体をコードする構築物を、Quick Change部
位特異的突然変異生成キット(Stratagene, La Jolla, CA)を用いたWT Neth/09 pPol-HAの
部位特異的突然変異生成により作製した。グリコシル化部位を付加するために各々の場合
に行なわれるアミノ酸変化は、以下の通りである:部位71の場合、K71N及びN73S、部位142
の場合、D144T、部位144の場合、D144N及びN146T、部位172の場合、G172S、及び部位177
の場合、K177N。
【０７２７】
(6.5.1.3.2  WT A/ネーデルラント/602/2009及びそれぞれのグリコシル化突然変異体ウイ
ルスのレスキュー)
Neth/09に基づく組換えA型インフルエンザウイルスを、製造業者の指示に従ってLipofe
ctamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、293T細胞に0.5μgの10種のプラスミ
ドの各々をトランスフェクトすることにより作製した。プラスミド混合物は、PB2、PB1、
PA、NP、M、及びNS遺伝子をコードする6つのpDZベクター、並びにHA及びNA遺伝子をコー
ドする2つのpPolIベクターを含んでいた。レスキュー効率を高めるために、A/WSN/33発現
プラスミドpCAGGS-HA及びpCAGGS-NAを含めた。トランスフェクションの16〜20時間後、MD
CK細胞を293T細胞に添加し、培地を、ペニシリン/ストレプトマイシン、0.3％ウシアルブ
ミン、及び1ug/ml TPCK処理トリプシン(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を含むDMEMに交
換した。MDCK細胞を添加してから24〜36時間後、上清を回収した。レスキューされたウイ
ルスをプラーク精製し、MDCK細胞で48時間再成長させて、継代数1のストックを作製し、
これを、示される全ての実験に使用した。ウイルスストックの力価を、MDCK細胞でのプラ
ークアッセイにより、3つ1組で決定した。各々の組換えウイルスの正確な配列を、ゲノム
全体をシークエンシングすることにより確認した。
【０７２８】
(6.5.1.3.3  A/PR8/34 7:1 Tx/91 HAグリコシル化欠失ウイルスの作製及びレスキュー)
融合PCRを行なって、Tx/91 HAのグリコシル化突然変異体を含むpDZ-HAプラスミドを作
製し、この現代の季節性H1N1 HAの球状ヘッド中にある1つ、2つ、又は3つのグリコシル化
部位を欠失させた。以下のアミノ酸変化:部位71を欠失させるN71K及びS73N、部位142を欠
失させるT144D、並びに部位177を欠失させるN177Kを行なって、各々のグリコシル化部位
を欠失させ、Neth/09分離株中に見られる残基と一致させた。A/PR8/34(PR/34)の残りの7
つの遺伝子をpDZプラスミドにクローニングして、上記の通りに、PR/34 7:1 TX/91 HA野
生型及び突然変異体組換えウイルスをレスキューした。
【０７２９】
(6.5.1.4  プラーク表現型及びインビトロウイルス成長解析)
MDCK細胞を、〜100pfuの示されたような各々の組換えウイルスに感染させた後、プラー
クアッセイを実施することにより、プラークサイズ表現型を評価した。感染の48時間後、
細胞を4％ホルムアルデヒドで固定し、プラークを、M1タンパク質とM2タンパク質に共通
であるアミノ末端ペプチドを認識するマウスモノクローナル抗体E10で免疫染色すること
により可視化した。成長曲線を分化した初代ヒト気管気管支上皮(HTBE)細胞(Lonza, MD)
で実施した。約1×105個のHTBE細胞を、12ウェルプレート(Corning. MA)中のコラーゲン
コーティングした12-mm透過膜トランスウェルインサート(0.4μm)に播種した。細胞を、
コンフルエンスに達するまで、BEGM気管支上皮細胞成長培地(Lonza, MD)中に4日間浸漬さ
せて成長させ、その後、培地を頂端表面から除去し、さらに細胞をこの大気-液体界面で4
週間培養することにより、分化を確立させた。この間に、基底外側の培地を2日毎に交換
した。ウイルス感染の前に、細胞単層をPBSで徹底的に洗浄して、細胞の頂端側に蓄積し
た粘液を除去した。3連のウェルに、示された各々のウイルスを0.001pfu/細胞の感染多重
度(MOI)で接種した。100μlのPBSを各々のウェルに37℃で30分間添加することにより、ウ
イルスを表示された時点で回収した。ウイルス力価を、MDCK細胞を用いた標準的なプラー
クアッセイにより実施した。
【０７３０】
(6.5.1.5  ウェスタンブロットアッセイ)
表示されたウイルスに5のMOIで12時間感染させたMDCK細胞を、コンプリートミニプロテ
アーゼ阻害剤(Roche, IN)を含むNP-40溶解バッファー(50nM Tris、150nM NaCl、5mM EDTA
、30mM NaF、40mM β-グリセロホスフェート、10％グリセロール、及び0.25％NP-40)中で
溶解させた。清澄化したライセートを5分間煮沸し、タンパク質を、NuPAGE 4-12％Bis-Tr
is勾配ゲル(Invitrogen, CA)上で、WT及び突然変異体Neth/09ウイルスについては非還元
条件下で、又はTx/91 WT及びそれぞれのグリコシル化欠失突然変異体ウイルスについては
還元条件下で分離した。ウェスタンブロットを実施して、H1を欠くPR8ウイルスに対して
惹起されたウサギポリクローナル抗体3951とともにインキュベートすることにより、PVDF
膜に転写されたタンパク質を検出した。該H1は、酸及びDTT処理(Steelらの文献(2010, mB
io 1))により除去されていた。
【０７３１】
(6.5.1.6  マウス実験)
(6.5.1.6.1  感染、体重減少、及び生存)
マウス実験は全て、施設内動物管理使用委員会(institutional Animal Care and Use C
ommittee)(IACUC)ガイドラインに準拠して実施され、マウントサイナイ医科大学(Mount S
inai School of Medicine)のIACUCによって承認された。7〜9週齢のC57BL/6雌マウス(Jac
kson Laboratories, ME)を、ケタミン-キシラキシンの腹腔内注射により麻酔し、表示さ
れたウイルスを50μlのPBSに希釈した1×102、1×103、1×104、1×105、1×106pfuのウ
イルスの用量で腹腔内感染させた。体重及び生存を14日間毎日モニタリングした。25％超
の体重減少を示すマウスを実験的エンドポイントに達したものとみなし、人道的に安楽死
させた。
【０７３２】
(6.5.1.6.2  肺ウイルス力価)
感染マウスの肺を、表示された感染後日数で無菌的に切除し、さらに処理するまで-80
℃で保存した。力価測定のために、組織を、機械的ホモジナイザー(MP Biochemicals, OH
)を用いて1mlのPBS中でホモジナイズした。清澄化した上清ホモジネート中のウイルス力
価をMDCK細胞での標準的なプラークアッセイにより定量した。
【０７３３】
(6.5.1.6.3  Neth/09感染)
8週齢のマウスを、表示されたrTx/91ウイルスに感染させた。マウスを27日間血清転換
させ、27日の時点で、それらを、50％致死用量(LD50％)の100倍のA/ネーデルラント/602/
2009に感染させた。生存及び体重減少を感染後13日間モニタリングした。
【０７３４】
(6.5.1.7  フェレット実験)
動物研究を、国際実験動物管理公認協会(Association for Assessment and Accreditat
ion of Laboratory Animal Care International)公認施設の国立疾病管理予防センター施
設内動物管理使用委員会(Centers for Disease Control and Prevention's Institutiona
l Animal Care and Use Committee)のガイドラインの下で実施した。
【０７３５】
(6.5.1.7.1  感染、体重減少、及び鼻洗浄液力価)
現在循環している季節性H3N2、過去に循環していた季節性H1N1、及びパンデミック2009
H1N1 A型インフルエンザウイルスの血球凝集素阻害により血清学的に陰性である8〜12カ
月齢の雄のFitchフェレット(Triple F Farms, PA)を用いて、表示されたウイルスの病原
性を評価した。1群当たり3匹のフェレットを、塩酸ケタミン(24mg/kg)-キシラジン(2mg/k
g)-アトロピン(0.05mg/kg)カクテルの筋肉内注射で麻酔し、WT Neth/09 HA又はHA 144-17
2グリコシル化突然変異体ウイルスのいずれかを、500μlの最終容量のPBS中、106pfuで鼻
腔内感染させた。体重を12日間毎日測定した。これは、初期重量と比べたパーセント重量
として表されている。フェレットの鼻腔を、1日目から7日目まで1日おきに、1mlのPBSで
洗浄した。鼻洗浄液中のウイルス力価をMDCK細胞での標準的なプラークアッセイにより決
定した。
【０７３６】
(6.5.1.7.2  組織ウイルス力価)
表示された1群当たり3匹のフェレットを、106pfuの上記のような各々のウイルスに感染
させた。感染後3日目に、フェレットを安楽死させ、肺、気管、鼻甲介、及び嗅球を無菌
的に回収した。組織標本をドライアイス上で即時凍結させ、それらを処理するまで-70℃
で保存した。凍結組織標本を解凍し、計量し、その後、使い捨ての滅菌済み組織粉砕機(K
endall, MA)を用いて、冷PBS中でホモジナイズした。組織ホモジネートを清澄化し、透明
な上清中のウイルス力価をMDCK細胞での標準的なプラークアッセイにより決定した。
【０７３７】
(6.5.1.8  ヒト標本)
ヒト血清標本の使用を伴う研究は、セントルイス医科大学(Saint Louis University Sc
hool of Medicine)とマウントサイナイ医科大学(Mount Sinai School of Medicine)の両
方の施設内審査委員会により審査され、承認された。臨床試験に登録されている18歳以上
(成人)である対象及び1〜17歳(小児)の個体から得られたワクチン接種前及びワクチン接
種後の血清試料を用いて、セントルイス大学の国立アレルギー感染症研究所ワクチン治療
評価部門(National Institute of Allergy and Infectious Disease Vaccine and Treatm
ent Evaluation Unit at Saint Louis University)で行なわれる不活化2009 H1N1インフ
ルエンザワクチン株の安全性及び免疫原性を試験した。季節性H3N2、H1N1、2009 H1N1、
及びグリコシル化突然変異体HAに対するこれらのヒト血清の反応性を評価するために行な
われる実験は盲検で実施された。
【０７３８】
(6.5.1.9  マウス及びヒト血清の血球凝集素阻害(HAI)アッセイ)
マウス血清を、感染後28日目に、表示されたウイルスに感染した動物から得た。マウス
血清を用いて実施される実験を、相同ウイルスに対する少なくとも160HI単位を含むよう
に選択されたウイルス当たり3匹の感染動物からプールされた血清を用いて実施した。HAI
アッセイを本質的に以前に記載されている通りに行なった(Manicassamyらの文献(2010, P
LoS Pathog 6, e1000745);Medinaらの文献(2010, Nat Commun 1, doi: 10.1038))。簡潔
に述べると、トリプシン-熱-過ヨウ素酸処理を用いて、0.1Mリン酸バッファー、pH 8.2中
の半容量のトリプシン8mg/ml(Sigma-Aldrich)を1容量の血清と混合することにより、マウ
ス、フェレット、及びヒト血清を不活化し、試料を56℃で30分間インキュベートした。試
料をRTに冷却し、3容量の0.11Mメタ過ヨウ素酸カリウムと混合し、RTで15分間、さらにイ
ンキュベートした。その後、試料を3容量の1％グリセロール生理食塩水と混合し、RTで15
分間インキュベートした。最後に、試料を混合し、2.5容量の85％生理食塩水とともにイ
ンキュベートして、試料を1:10の濃度に希釈した。血清のHAIアッセイを標準的なプロト
コルに従って実施した(Yuらの文献(2008, Nature 455, 532-536))。簡潔に述べると、マ
ウス又はヒト血清の2倍希釈液を混合し、96ウェルプレート中で、1ウェル当たり8HA単位
のウイルスとともに4℃で30分間プレインキュベートした。七面鳥(Bris/10及びNeth/09の
場合)又はニワトリ(Bris/59の場合)の赤血球を0.25％の最終濃度で添加し、プレートを4
℃で30分間インキュベートした。HAI力価を血球凝集活性を示す最大希釈として決定した
。
【０７３９】
(6.5.1.10  統計解析)
マウス研究のために、体重減少の統計的有意差(P＜0.05)を、両側の対応のないスチュ
ーデントt検定を用いて評価し、生存曲線についての統計的な差を確定するために、本発
明者らは、ログランク検定を利用した。フェレット実験のために、経時的な体重減少の統
計的有意性(P＜0.05)を、ウィルコクソンの順位和検定を用いて時間の関数としての動物
群(n＝3)の全体的体重減少として解釈される面積下曲線(AUC)の解析により実施した。
【０７４０】
(6.5.2  序論)
A型インフルエンザウイルス感染は、公衆衛生に大きな負担をもたらす主要な関心事で
あり続けている(Molinariらの文献(2007, Vaccine 25, 5086-5096))。2009パンデミックH
1N1(pH1N1)ウイルスの出現は、ヒト集団の大部分がこの新しい株の血球凝集素(HA)に感作
されていないことが原因で、過去に循環していた亜型が、十分な時間が与えられれば、新
規のパンデミックを引き起こし得るという最初の直接的な証拠を提供した(Medina & Garc
ia-Sastre(2011, Nature Reviews 9, 590-603))。したがって、交差防御HA抗体のレベル
及び質は、新規のA型インフルエンザウイルス株のパンデミック能力を決定する際に重要
な役割を果たす。
【０７４１】
2009 pH1N1株のHAは、1918ウイルス(Kashらの文献(2010, Influenza and other respir
atory viruses 4, 121-127); Manicassamyらの文献(2010, PLoS Pathog 6, e1000745); S
kountzouらの文献(2010))、具体的には、抗原性部位Saの周辺(Krauseらの文献(2010, J V
irol 84, 3127-3130); Manicassamyらの文献(2010, PLoS Pathog 6, e1000745); Xuらの
文献(2010))に対する大きな相同性を含め、1950年以前に循環していたヒトH1N1ウイルス
のHAに対する抗原性類似性を共有することが以前に示された。対照的に、現代の季節性H1
N1株のワクチン接種(Manicassamyらの文献(2010, PLoS Pathog 6, e1000745))又は感染(K
ashらの文献(2010, Influenza and other respiratory virus 4, 121-127))は、2009 pH1
N1ウイルスに対する交差反応性をほとんど又は全く誘導しなかった(Manicassamyらの文献
(2010, PLoS Pathog 6, e1000745))。このことは、HAの球状ヘッド中に位置する既知の抗
原性部位又はその付近に見られる、アミノ酸レベルでのより大きな相違と相互に関連があ
る。
【０７４２】
ヒトに循環していた過去の季節性H1N1及びH3N2インフルエンザウイルスは、免疫選択圧
による抗原連続変異(HA抗原性部位又はその周辺におけるアミノ酸変化の経時的な段階的
蓄積)を受けたことが示されている。これらの残基変化の一部は、HAにおけるグリコシル
化部位の獲得をもたらし、その中には維持されるものもあるが、時間が経つと置換される
もの又は消失するものもあり、HAグリコシル化がヒトA型インフルエンザウイルスにおい
て重要な進化的役割を果たすことを示唆している(Dasらの文献(2010, PLoS Pathog 6, e1
001211); Igarashiらの文献(2008, Virology 376, 323-329); Sunらの文献(2011, PloS o
ne 6, e22844))。最近の研究により、HAグリコシル化が、このウイルスタンパク質の抗原
性特性及び受容体結合特性(Wangらの文献(2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106, 18137-
18142))、並びにインフルエンザウイルスの病原性に影響を及ぼすことが示されている(Ta
teらの文献(2011a, J Immunol 187, 1884-1894); Tateらの文献(2011b, Virology 413, 8
4-92))。興味深いことに、HAの球状ヘッド上のいくつかのグリコシル化部位は、時間的に
は1918年〜2009年に、季節性H1N1ウイルスによって獲得されており、これらの大半は、抗
原性部位Sa又はその周辺にある(Dasらの文献、2010,(Dasらの文献(2010, PLoS Pathog 6,
e1001211); Igarashiらの文献(2008, Virology 376, 323-329); Sunらの文献(2011, Plo
S one 6, e22844))。対照的に、2009 pH1N1ウイルスは、これらの追加のグリコシル化を
欠き、かつ1918 H1N1パンデミックウイルスと同じグリコシル化状態を共有している。
【０７４３】
H1グリコシル化部位の各々が2009 pH1N1の病原性及び抗原性特性において有する具体的
な役割には焦点が当てられていない。
【０７４４】
2009 pH1N1株は、北米でのそのもとの発生以来、世界中に広まり、それは、現在、北半
球及び南半球で季節的に循環しており、過去のH1N1ウイルスに取って代わっている。その
結果、pH1N1ウイルスが、免疫選択圧によって引き起こされる抗原性連続変異を受け始め
ている可能性が高い。グリコシル化の獲得は、H1N1連続変異変異体の出現の一因となり得
る。この実施例では、H1N1ウイルスの病原性及び抗原性特性に対するH1N1 HAの球状ヘッ
ドにおけるグリコシル化の獲得の具体的な効果を調べた。結果は、HAグリコシル化が発病
と既存の免疫からの回避の両方において、並びに交差反応性ポリクローナル抗体応答の誘
導において重要な役割を果たすことを示している。
【０７４５】
(6.5.3  結果)
(6.5.3.1  H1N1ヒトウイルスは、HAタンパク質の球状ヘッド中でグリコシル化部位を経時
的に獲得した)
1918及び2009 H1N1パンデミックウイルスのアミノ酸配列の全体的解析から、これらの
ウイルスのHA1が同じ部位でグリコシル化されることが明らかになった。パンデミックの
直前に循環している季節性H1N1ウイルス株と比べて、2009 H1N1 HAタンパク質の異なる抗
原性特性の原因となり得る相違をより良く理解するために、既知の抗原性部位の周辺のア
ミノ酸配列に特に注意を払った。配列アラインメントから、1918年のヒトへのH1N1ウイル
スの導入以来、モチーフN-X-S/Tによって予測されるいくつかのグリコシル化部位が、HA
球状ヘッド中に経時的に獲得されていることが明らかになった(図22A及び22B)。興味深い
ことに、これらのグリコシル化部位は、主に、抗原性部位Sa又はその近くに現われた(図2
2A)。1918年〜1933年のヒトインフルエンザウイルスの配列は入手可能でなく、初期のH1N
1ウイルス由来の配列の大半は、卵中で広く継代されている株由来のものであるという注
意付きではあるが、1935年〜1957年の間に、3つの異なるHAグリコシル化が(アミノ酸残基
144、172、及び177[それぞれ、H3付番130、158、及び163]に)順次獲得され、ヒト分離株
に一貫して見られるように思われた。1957年のH2N2パンデミックインフルエンザウイルス
の出現はH1N1ウイルスに取って代わり、このH1N1ウイルスは、ヒトでの流行から消失した
。H1N1ウイルス株は1977年にヒトで再出現し、1950年代に循環していたH1N1ウイルスと同
じグリコシル化部位を含んでいた。1986年に、グリコシル化部位144は、位置142(H3付番:
128;これらのグリコシル化部位は非適合性である)でのグリコシル化に置き換えられ、部
位71(H3付番:59)における追加のグリコシル化がほぼ同時に獲得された。しかしながら、1
987年に、グリコシル化部位172は失われ、それ以来、2009 pH1N1の出現の直前に循環して
いた季節性ウイルスを含む、当時のH1N1ウイルスは、HAの球状ヘッド中にグリコシル化部
位71、142、及び177を含んでいた(図22B及び22C)。2009 pH1N1のグリコシル化状態は、19
18 H1N1パンデミックウイルスのグリコシル化状態と同じであるので、2009 pH1N1ウイル
スは、免疫選択圧の結果として、同じ又は同様のグリコシル化を経時的に獲得し得る(Wei
らの文献(2010, Sci Transl Med 2, 24ra21))。そこで、2009 pH1N1ウイルスの病原性及
び抗原性特性に対する追加のグリコシル化の具体的な効果を評価した。
【０７４６】
(6.5.3.2  HAの球状ヘッド中での追加のグリコシル化は、インビトロではなく、インビボ
でpH1N1ウイルスを弱毒化する)
HAグリコシル化の順次付加だけが異なる、2009 pH1N1(Neth/09株)組換えウイルスを作
製して、季節性H1N1におけるこれらの部位の一過性の出現を模倣した。何度か試みたにも
かかわらず、Neth/09バックグラウンドでHAグリコシル化部位144、172、及び177を含むウ
イルスのレスキューは不可能であり、これらの特定のグリコシル化の組合せが、さらなる
代償的突然変異を必要とし得ることが示唆された。それにもかかわらず、他の全ての突然
変異体ウイルスのレスキューに成功した。これらの組換えウイルスのインビトロ表現型解
析により、4つの追加のグリコシル化(Neth/09 HA 71-142-172-177)を含むウイルスだけが
、MDKCでより小さいプラークの表現型を有することが示された(図23A)。HAグリコシル化
部位の付加は、これらの部位の使用と一致する、SDS-PAGEでのHAの移動度の低下をもたら
した(図23B)。成長動態を実施して、初代分化ヒト気管気管支上皮細胞(HTBE)で複製する
ウイルスの能力に対するグリコシル化の効果を評価した。ウイルスは全て、もとのWT Net
h/09分離株ウイルスのレベルと同様の高いレベル(＞107pfu/ml)で複製し(図23C)、これら
の追加のグリコシル化がヒト細胞の感染に影響を及ぼさないことが示された。次に、組換
えグリコシル化ウイルスの病原性能力をC57BL/6マウスで評価した。この実施例から、体
重減少により評価される、マウスにおけるウイルスの病原性のグリコシル化依存的弱毒化
(すなわち、HA中のグリコシル化部位が多いほど、病原性は小さい)(図24A〜E)が見出され
た。グリコシル化部位144を含むウイルスだけが、WT Neth/09ウイルスに感染したマウス
で見られるのと同様の体重減少パターンを示した(図24B)。2以上の追加のグリコシル化部
位を有するウイルスは全て、大幅に弱毒化された(図24C〜E)。罹患率は、感染してから最
初の7日間のマウスにおける肺ウイルス力価と相関した。144-172、71-142-177、及び71-1
42-172-177に感染した動物は、WT Neth/09と比べて有意により低い力価を有していた。こ
れが異なる動物モデルでも正しいかどうかを明らかにするために、インフルエンザウイル
スの発症を研究するための最も優れた動物モデルの1つとして広く認められているフェレ
ットで、WTウイルスと比べた144-172グリコシル化ウイルスの病原性を評価した。全体的
な体重減少の統計的に有意な減少が144-172ウイルスに感染した動物で見られた(図24G)。
興味深いことに、両方の群から7日目に至るまで得られた鼻洗浄液力価、及び3日目の鼻甲
介の力価は、差を示さなかった(図24H及びI)。しかしながら、3日目のフェレットの気管
及び肺は、WT Neth/09と比べて、144-172ウイルスの感染の低下を示した(図24I)。これは
、グリコシル化H1N1ウイルスが(鼻の)上気道では同様のレベルまで複製することができる
一方、それらが下気道(気管及び肺)ではあまり感染及び複製することができないことを示
唆している。
【０７４７】
(6.5.3.3  HAグリコシル化部位144は、WT HAに対するポリクローナル抗体応答を回避する
一方、マウスでより幅広いポリクローナル応答を誘導する)
H1N1ウイルスの抗原性特性に対するグリコシル化の効果についての洞察を得るために、
各々のグリコシル化突然変異体ウイルスに感染したマウスから得られた血清の互いに対す
るHAI活性(表9、下記)を試験した。マウスへのrWTウイルス又は71-142-177もしくは71-14
2-172-177グリコシル化ウイルスの感染は、グリコシル化ウイルス144及び144-172に対す
るほとんど又は全く検出できない血清HAIをもたらしたが、他のウイルスに対して一定レ
ベルの交差反応性が残存した。驚くべきことに、144又は144-172グリコシル化を含むウイ
ルスの感染は、全てのHAグリコシル化突然変異体ウイルス及びWT Neth/09ウイルスに交差
反応することができる抗体応答を誘発した。総合すると、これは、144グリコシル化部位
を含むものを除き、ウイルスによって誘導されるポリクローナルHAI活性の大部分が、144
グリコシル化によって効率的にマスクされる部位、おそらくは、Saに対するものであるこ
とを示している。対照的に、位置144におけるグリコシル化は、ポリクローナル抗体応答
の誘導のパターンを変化させ、この応答は、HA中の多数の抗原性領域に対するものである
ように思われ、単一のグリコシル化事象によっても、複数回のグリコシル化事象によって
マスクされない。対照的に、位置71-142-177又は71-142-172-177におけるグリコシル化を
含むウイルスの感染は、より狭い交差反応性パターンを誘導し、ポリクローナル液性応答
がわずかに変化するが、おそらくは部位Sa周辺に集中し続けていることを示唆している。
表9.2009 pH1N1グリコシル化突然変異体の感染後のマウス血清のHAI力価
【表１２】
2020096604.tif 000135
aマウスを、表示されたHAセグメントを含むNeth/99組換えウイルスに感染させた。
bHAI力価は、血球凝集阻害活性を示す最大希釈を表す。
c相同な力価は太字で示されている。
【０７４８】
(6.5.3.4  HAグリコシル化部位144は、ヒトでのpH1N1不活化ワクチンに対するポリクロー
ナル抗体応答を回避する)
次に、ヒトで抗体応答を誘発する2009 pH1N1不活化ワクチンの能力を、グリコシル化Ha
を有する2009 H1N1ウイルスに対する阻害活性とともに試験した。2009 pH1N1一価ワクチ
ンを受けたほとんどの成人個体は、全てのグリコシル化突然変異体ウイルスに対する検出
可能な抗体応答を有することが分かった(表10、下記)。それにもかかわらず、最も低い交
差反応性が144(及び144-172)グリコシル化部位を含むウイルスで見られ、これら2つのウ
イルスに対して試験したとき、1つの個体は、検出不可能なHAI活性レベルを示した。これ
は、マウス血清検査の結果と密接に一致し、部位144におけるグリコシル化のマスキング
効果を強調するものである。予想された通り、過去に循環した季節性H1N1ウイルスを含む
2009年の三価の季節性ワクチンは、そのグリコシル化レベルとは関係なく、pH1N1ウイル
スに対する顕著なHAI力価を誘導しなかった(表10、下記)。ヒトにおける過去のインフル
エンザウイルスへの曝露のレベルは、そのポリクローナル抗体応答に影響を及ぼし得るの
で、一価p2009 H1N1不活化ワクチンで免疫されたあまり感作されていない集団(＜18歳の
小児)における血清HAI力価についても評価を行なった。これらの個体の血清活性は、成人
のものと同様の交差反応性パターンを有しており、144及び144-172グリコシル化突然変異
体ウイルスに対するより低いHAI活性を示した(表11、下記)。対照的に、小児及び成人血
清の中には、71-142-177及び71-142-172-177グリコシル化ウイルスに対するかなりの活性
を示すものもあった(表10及び11、下記)。
表10.2009 pH1N1不活化ワクチンによるワクチン接種後の成人ヒト血清のHAI力価
【表１３】
2020096604.tif 000136
2020096604.tif 000137
a太線の囲みは、各々の個体についての最低の交差反応性力価を示す。
bそれぞれ、ワクチン接種後0日目(前)及び21日目(後)に得られたヒト血清試料。
cそれぞれ、ワクチン接種後0日目(前)及び63日目(後)に得られたヒト血清試料。
d 2009 TIV: A/ブリスベン/57/2007(H1N1)株、A/ブリスベン/10/2007(H3N2)株、及びB/ブ
リスベン/60/2008株を含んでいた三価不活化インフルエンザウイルスワクチン。
表11.2009 pH1N1不活化ワクチンによるワクチン接種後の小児ヒト血清のHAI力価。
【表１４】
2020096604.tif 000138
aそれぞれ、ワクチン接種後0日目(前)及び42日目(後)に得られたヒト血清試料。
b太線の囲みは、各々の個体についての最低の交差反応性力価を強調している。
c 2009 H1N1不活化ワクチンを0日目及び21日目に投与した。
d 2009 TIV: A/ブリスベン/57/2007(H1N1)株、A/ブリスベン/10/2007(H3N2)株、及びB/ブ
リスベン/60/2008株を含む三価不活化インフルエンザウイルスワクチンを0日目に投与し
、2009 H1N1ワクチンを21日目に投与した。
【０７４９】
(6.5.3.5  最近の季節性H1N1ウイルスにおけるグリコシル化欠失は、そのインビボ病原性
を増大させ、pH1N1 2009ウイルス感染に対する交差防御を誘発する)
H1N1ウイルスの病原性及び抗原性特性におけるHAグリコシル化の役割をさらに解明する
ために、そのHA中、部位71、142、及び177に、3つの追加のグリコシル化部位を含む当時
のTx/91季節性株に基づく、1組のグリコシル化欠失ウイルスを作製した。HAグリコシル化
部位の除去は、予想された通り、SDS-PAGEでのより速いHA移動をもたらした(図25A)。し
かしながら、致死未満用量のWT Tx/91ウイルス(1×103pfu)の感染は、マウスの罹患をも
たらさなかった;2つ又は3つのグリコシル化の欠失を含むウイルス(Δ71-177及びΔ71-142
-177)の感染は、rWTウイルスと比べて顕著なレベルの体重減少をもたらした(図25B)。最
も高い罹患率は、Δ71-142-177ウイルスで観察された。Δ71-142-177ウイルスは、それが
HAの球状ヘッド中にグリコシル化部位を有さないという点で2009 pH1N1とよく似ているウ
イルスである。これにより、HAのグリコシル化がH1N1ウイルスのインビボ病原性能力に負
の影響を及ぼすことが再び確認された。これらのグリコシル化欠失ウイルスの感染が、抗
原性が極めて多様なWT 2009 H1N1ウイルスに対する交差防御的液性応答を誘発することが
できるかどうかを調べるために、これらの動物を、感染後27日目に、50％致死用量(LD50)
の100倍のWT Neth/09ウイルスに感染させた。過去にrWT Tx/91に感染したマウスは全て、
Neth/09感染のために死亡し、部位71に1つの欠失したグリコシル化を含むウイルス(Δ71)
に感染したマウスは、大幅な体重減少及びわずか20％の生存率を示した(図25C及びD)。対
照的に、部位71-177におけるグリコシル化欠失を有するウイルス(Δ71-177)及び71-142-1
77におけるグリコシル化欠失を有するウイルス(Δ71-142-177)に感染した動物は、大幅な
体重減少(最大〜20％)を示したが、それらは全て、Neth/09の致死感染から生き残り(図25
D)、Δ71-142-177に感染した動物は、全体的により低い罹患レベルを示した(図25C)。こ
れらのデータは、HAグリコシル化が、抗原性部位をマスキングする際に、及び抗原性が多
様なH1N1インフルエンザウイルス株に対する防御的免疫応答を誘発する際に重要な役割を
果たすことを示している。
【０７５０】
(6.5.4  考察)
この実施例では、現在の2009 pH1N1株との関連での病原性及び抗原性交差反応性に対す
るHAタンパク質におけるグリコシル化の効果を評価した。過去に季節性H1N1ウイルスにつ
いて観察されたもののような、HAタンパク質における一過性のグリコシル化の獲得を模倣
するように改変された1組の組換え2009 pH1N1ウイルスを利用して、グリコシル化が、こ
れらのウイルスの発症機序及び抗原性特性を調節する際に重要な役割を果たすことが示さ
れた。
【０７５１】
2009 pH1N1ウイルスの最初の配列解析から、発生時に世界中で循環していた季節性H1N1
ウイルス(Bris/59様)と比べた劇的な違いが明らかになった(Dawoodらの文献(2009, N Eng
l J Med 360, 2605-2615); Gartenらの文献(2009, Science 325, 197-201); Smithらの文
献、2009(Nature 459, 1122-1125))。HAタンパク質のクローン解析、並びに本発明者ら及
び他の研究者らの実験的研究(Kashらの文献(2010, Influenza and other respiratory vi
rus 4, 121-127); Manicassamyらの文献(2010, PLoS Pathog 6, e1000745); Skountzouら
の文献(2010, J. Immunol. 1895(3), 1642-1649))から、2009パンデミックウイルスは、1
950年代以前にヒトで循環したより古いH1N1ウイルスとより密接に関連することが示され
た。H1N1季節性ウイルスのHAは、ヒトにおけるその進化の間に、おそらくは免疫選択圧の
結果として、グリコシル化部位を獲得した。興味深いことに、いくつかのグリコシル化が
出現したが、最終的には消失し、一部はやがて固定された(図22)。これは、ウイルス進化
の間に、これらのグリコシル化の中に、ウイルスにとって有害なものとなり得るものがあ
る一方、ヒトにおける連続変異変異体の出現に対する適応及び/又は免疫回避優位性を提
供し得るものもあることを示唆している。2009 pH1N1パンデミックウイルスと1918 H1N1
パンデミックウイルスはHA1中に同じグリコシル化パターンを有するので、2009 pH1N1株
が同様の進化パターンを経て、時間とともに、過去に季節性H1N1で観察されたものと同様
のHAにおけるグリコシル化を獲得した可能性がある(図22)。したがって、2009 pH1N1ウイ
ルスを、1918年のその出現以来ヒトH1N1ウイルスで天然に生じる追加のグリコシル化モチ
ーフを有するように改変した。これにより、2009 pH1N1ワクチンによってヒトで誘発され
る防御的抗体応答との関連におけるそのような突然変異の潜在的意義の研究も可能になっ
た。
【０７５２】
HA中に追加のグリコシル化部位を含む組換えNeth/09ウイルスは、マウス及びフェレッ
トで弱毒化された(図24)。それにもかかわらず、MDCK及び初代HTBE細胞におけるグリコシ
ル化ウイルスの感染及び複製能力は顕著には影響を受けなかった(図23)。WTウイルスと14
4-172ウイルスの間で、144-172感染動物の肺及び気管ではウイルス量に違いが観察された
が、鼻甲介では違いが観察されなかった。これらの動物モデルにおけるグリコシル化pH1N
1ウイルスの感染は、概して、H1N1季節性ウイルスの感染を連想させる。このH1N1季節性
ウイルスは、マウスモデルでは、通常、疾患を引き起こさず(Bouvier & Lowenの文献(201
0, Viruses 2, 1530-1563); Picaらの文献(2011, Journal of Virology 85(23), 12825-9
))、フェレットでは、上気道で高力価になるまで複製するが、下気道では複製しない(Mai
nesらの文献(2009, Science 325, 484-487); Munsterらの文献(2009, Science 325, 481-
483))。pH1N1ウイルス中にグリコシル化部位を付加することによって病原性が低下しただ
けでなく、Tx/91 H1N1ウイルスとの関連でグリコシル化を欠失させることによって病原性
が増大した。したがって、HA中のグリコシル化の獲得は、H1N1ウイルスの病原性を軽減す
るように思われる。
【０７５３】
Neth/09グリコシル化突然変異体ウイルスの抗原性特徴により、HA中の部位Saが、マウ
ス、フェレット(データは示さない)、及びヒトについての主要な抗原性領域であることが
示唆されたが、それは、この部位周辺(例えば、部位144及び144-172)の残基への1つ又は2
つのグリコシル化の付加が、WTの非グリコシル化ウイルスによって誘発されるポリクロー
ナル応答のHAI活性を顕著に低下させるのに十分であったからである。HAIの劇的な低下は
71-142-172-177ウイルスでは見られないので、これら2つの部位のうち、144がこの効果の
原因となるものであると思われる。部位144におけるグリコシル化はHAI反応性を回避する
際に最も効率的であったので、現在の不活化2009 pH1N1ワクチン株によるヒトの免疫は、
pH1N1で免疫したマウス及びフェレットにおける免疫応答を連想させる全体的なポリクロ
ーナル抗体免疫応答を誘導した(表10、上記)。同様に、解析された小児のワクチン接種後
血清は、71-142-177及び71-142-172-177ウイルスに対してかなりの活性を示すが、144及
び144-172ウイルスに対してはあまり活性を示さない。全般的に、これは、ヒトH1N1ウイ
ルスのグリコシル化がその抗原性特性に大きく影響を及ぼすことを示している。2009 pH1
N1株は、季節的に世界中で循環し続けるので、免疫媒介性の抗原圧の結果として、HAの新
たな変化が進化し、その抗原性特性を調節する2009 pH1N1株における新規のグリコシル化
部位の出現を促進することもあり得る。もしこれが正しければ、病原性及び抗原性におけ
るその影響を解析することが興味深いことであろう。
【０７５４】
重要なことに、グリコシル化部位144及び144-172を有するウイルスの感染は、作製され
た全てのWT及びNeth/09グリコシル化ウイルスと交差反応することができるより幅広いポ
リクローナル応答を誘導した(表9、上記)。ポリクローナル応答の兆しの増大は、他のエ
ピトープに対する液性応答を変更する抗原性中心の変化をもたらす、免疫優性部位Saの遮
蔽によるものである可能性が高い。注目すべきことに、致死未満用量のTx/91欠失突然変
異体Δ71-177及びΔ71-142-177に感染したマウスで観察されるWT Neth/09ウイルスに対す
る交差防御は、液性応答の「阻止」又は変更におけるグリコシル化の重要性を強調するも
のである。これらの結果は、部位Sa周辺でのグリコシル化の出現の重要な進化的役割を示
すものでもあるが、それは、この領域の又はその近くでのグリコシル化の欠失は交差反応
性における重大な影響を有するためである。まとめると、これらの知見は、HAの抗原性特
性における特定のグリコシル化の免疫調節効果、及び同じく、感染及びワクチン接種に対
する免疫応答の兆しに対するグリコシル化の効果を強調するものである。
【０７５５】
(6.6  実施例6:2009パンデミックH1N1インフルエンザウイルスの感染によって誘発される
血球凝集素ストーク抗体)
この実施例は、ステムドメイン特異的抗体を研究するために使用されたキメラインフル
エンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを記載している。これらのポリペプチドを用いて
、2009パンデミックH1N1ウイルスの感染が、血球凝集素ステムに対するウイルス中和抗体
の力価の増加を誘発することが明らかにされた。キメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドに加えて、従来の血球凝集阻害アッセイで検出されないインフルエンザウ
イルス中和抗体を測定するために使用することができるアッセイも記載されている。
【０７５６】
(6.6.1  材料及び方法)
(6.6.1.1  細胞及びプラスミド)
293T及びMDCK細胞をATCCから入手し、それぞれ、各々10％胎仔ウシ血清(HyClone)及び1
00ユニット/mlのペニシリン-100μg/mlのストレプトマイシン(Pen/Strep, Gibco)を補充
したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)及び最小必須培地(両方ともGibco製)中で維持
した。10％胎仔ウシ血清を補充したTNM-FH培地(Gemini Bioproducts)と、Hyclone SFX昆
虫培養培地(ThermoScientific)とを、Sf9及びBTI-TN5B1-4(High Five)細胞培養に使用し
た。
【０７５７】
A/マガモ/スウェーデン/81/02(cH6/1)ウイルス又はA/ホロホロチョウ/香港/WF10/99(cH
9/1)ウイルスのいずれかに由来する球状ヘッドドメインを含むA/プエルトリコ/8/1934(PR
8)のストークを有するキメラ血球凝集素(cHA)構築物を、以前に記載された方法を用いて
作製した(Haiらの文献(2008, J Virol 82, 10580); Fodorらの文献(1999, J Virol 73, 9
679))。簡潔に述べると、キメラ血球凝集素(cHA)の様々な成分を、Sap I部位を含むプラ
イマーでPCRにより増幅させ、Sap Iで消化し、pDZプラスミド(Quinlivanらの文献(2005, 
J Virol 79, 8431))のSap I部位にクローニングした。バキュロ転移プラスミドの作製の
ために、cH6/1及びcH9/1をPCRにより増幅させ、BamHI及びNotIで切断し、C末端T4ファー
ジフォルドン及び6-hisタグを有する修飾されたpFastBac(Invitrogen)バキュロ転移ベク
ターにインフレームでクローニングした(Meierらの文献(2004, J Mol Biol 344, 1051))
。全てのプラスミドの配列をサンガーシークエンシングにより確認した。
【０７５８】
(6.6.1.2  組換えバキュロウイルス作製、タンパク質発現、及び精製)
組換えcH6/1及びcH9/1タンパク質を作製するために、バキュロ転移ベクターを、製造業
者の指示に従って、大腸菌株DH10Bac(Invitrogen)中に形質転換した。正しい表現型を示
すDH10Bacコロニーを採取し、成長させ、バクミドをPlasmid Midi Kit(Qiagen)を用いて
調製した。
【０７５９】
cH6/1又はcH9/1遺伝子を担持するバクミドを、製造業者の指示に従ってCellfectin II(
Invitrogen)を用いて、Sf9細胞にトランスフェクトした。組換えバキュロウイルスを、TN
M-FH培地(Gemini Bioproducts, West Sacramento, CA)中で成長させたSf9細胞で増幅させ
、力価をプラークアッセイにより決定した(Kingらの文献(2007, Methods Mol Biol 388, 
77))。
【０７６０】
HyClone SFX昆虫細胞培地(Thermo Fisher Scientific)中で成長させたHigh Five細胞を
、500mlの振盪フラスコ中、10の感染多重度(MOI)及び1×106細胞/mlの細胞密度で、cH6/1
又はcH9/1を発現する組換えバキュロウイルスに感染させた(Krammerらの文献(2010, Mol 
Biotechnol 45, 226))。感染96時間後、細胞を回収し、2000×g及び室温で10分間の低速
遠心分離により、上清から分離した。cHAタンパク質の精製のために、上清を回収し、Ni-
NTA樹脂(Qiagen)とともに4℃で2時間インキュベートした。スラリーをカラムに充填し、
洗浄バッファー(50mM Na2HCO3、300mM NaCl, 20mMイミダゾール、pH 8)で3回洗浄した。
タンパク質を溶出バッファー(50mM Na2HCO3、300mM NaCl、250mMイミダゾール、pH 8)で0
.5mlずつ溶出させ、ブラッドフォード試薬でタンパク質含量について試験し、タンパク質
を含む画分をプールした。プール画分をPBS中でバッファー交換し、10kD分子量カットオ
フを有するAmicon Ultra遠心分離フィルターユニット(Millipore)を用いて、スイング式
バケットローター中で濃縮した。タンパク質の純度及びアイデンティティをSDS-PAGE、ク
マシー染色、及びウェスタンブロットにより試験した。以下の抗体:抗H6ヤギ抗血清(BEI,
#NR-663)、G1-26(抗H9、マウス; BEI# NR-9485)、3951(ウサギ、抗HA2 PR8)(Gravesらの
文献(1983, Virology 126, 106))、PY102(抗PR8ヘッド、マウス)、及び12D1(抗H3ストー
ク、マウス)(Wangらの文献(2010, PLoS Pathog 6, e1000796))を用いて、cHAの発現を確
認した。最終的なタンパク質濃度をブラッドフォード試薬で決定した。
【０７６１】
(6.6.1.3  組換えcHA発現ウイルスのレスキュー)
cH9/1を発現する組換えウイルスをレスキューするために、PR8由来の6つの野生型ウイ
ルスセグメントのvRNA及びmRNAをコードするリバースジェネティックスプラスミド、並び
にA/マガモ/アルバータ/24/01ウイルス及びcH9/1由来のN3 NAをコードするプラスミドを
、以前に記載されている通りに使用した(Haiらの文献(2008, J Virol 82, 10580); Fodor
らの文献(1999, J Virol 73, 9679, 27))。簡潔に述べると、293T細胞に、製造業者の指
示に従ってLipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて、1μgの8つのプラスミドの各々を
トランスフェクトした。トランスフェクションの12時間後、培地を、0.3％ウシ血清アル
ブミン、10mM HEPES、及び1.5μgのTPCK(l-1-トシルアミド-2-フェニルエチルクロロメチ
ルケトン)処理トリプシン/mL(Sigma T1426)を含むDMEMと交換した。トランスフェクショ
ンの2日後、ウイルス含有上清を10日齢の発育鶏卵中に接種した。37℃で2日間のインキュ
ベーションの後、尿膜腔液を回収し、ニワトリ赤血球の血球凝集により、ウイルスの存在
についてアッセイした。その後、レスキューされたcH9/1ウイルスを10日齢卵中で増殖さ
せ、次いで、37℃で48時間インキュベートした。ウイルスストックの力価を、TPCKトリプ
シンの存在下、以前に記載されているMDCK細胞でのプラークアッセイにより測定した(Ste
elらの文献(2009, J Virol 83, 1742))。cH9/1 RNAの配列を逆転写PCR産物のシークエン
シングにより確認した。
【０７６２】
(6.6.1.4  キメラ血球凝集素の発現を確認するための免疫蛍光)
MDCK細胞のコンフルエントな単層を、2のMOIでcH9/1N3ウイルスに感染させた。感染の4
8時間後、細胞を固定し、0.1％Tween 20を含むPBS中の1％ウシ血清アルブミンでブロッキ
ングした。その後、細胞をマウスmAb:抗NP抗体HT103、PY102、抗H9(BEI NR#9485)、又は
汎H1ストーク特異的抗体(6F12)とともにインキュベートした。0.1％Tween 20を含むPBSで
3回洗浄した後、細胞をAlexa Fluor 488コンジュゲート抗マウスIgG(Invitrogen)ととも
に1時間インキュベートした。感染細胞をOlympus IX70顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡法によ
り解析した。
【０７６３】
(6.6.1.5  ヒト血清試料)
ヒト血清試料を回収し、施設内プロトコルに準拠して使用した。血清を3つの患者コホ
ート:pH1N1に感染していない成人、pH1N1に感染していない小児、及びpH1N1ウイルスに感
染した成人から回収した。血清をpH1N1に感染した患者から症候性感染の最初の3週間以内
に回収した。プール血清を用いる実験については、等容量の各々の試料を混合して、プー
ルを作製した。感染の確認は、Wrammertらによって、RT-PCR及び血清学的アッセイにより
実施された(Wrammertらの文献(2011, J Exp Med 208, 181-193))。
【０７６４】
(6.6.1.6  血球凝集素阻害アッセイ)
回収された血清を、血球凝集の非特異的阻害因子を除去するために、トリプシン-熱-過
ヨウ素酸処理によって、又はRDE処理によって最初に不活化した(Coleman, Dowdleの文献(
1969, Bull World Health Organ 41, 415(1969))。血球凝集阻害(HI)アッセイを実施して
、以前に記載されている通りに、cH9/1N3及びA/アヒル/フランス/MB42/76(H6 HA)(Dessel
bergerらの文献(1978, Proc Natl Acad Sci U S A 75, 3341(Jul, 1978))ウイルスとの反
応性を試験した(Lowenらの文献(2009,. J Virol 83, 2803))。HI活性が1:10希釈の血清で
見られない場合、試料を陰性とみなす。
【０７６５】
(6.6.1.7  ELISA)
96ウェルELISAプレート(Qiagen HisSorb又はNunc Immulon 2)に、PBSに希釈した50ulの
バキュロウイルス発現cH6/1、cH9/1、もしくは全長血球凝集素(H5 HA、BEI NR#660; H3 H
A、BEI NR#15171)タンパク質、又はH1配列(PR8)の長いαヘリックス(LAH)(Wangらの文献(
2010, Proc Natl Acad Sci U S A 107, 18979))をコーティングし、4℃で一晩インキュベ
ートした。プレートを0.5％ミルク/2％ヤギ血清/PBSでブロッキングし、その後、PBS/0.1
％Tween(PBST)で3回洗浄した。モノクローナル抗体、ヒト対象由来血清、及び対照として
使用されるマウス血清をPBS又はブロッキングバッファーに連続希釈し、その後、プレー
トに添加し、次いで、室温で1時間インキュベートした。その後、プレートをPBSTで3回洗
浄し、アルカリホスファターゼ(AP)(Meridian Life Science)又は抗マウスAP(Invitrogen
)に結合させたヤギ抗ヒトIgG[Fc]の1:5000希釈液とともにさらに1時間インキュベートし
た。PBSTで3回洗浄した後、p-ニトロフェニルホスフェート基質(Sigma)を添加した。10分
後、反応をNaOHで停止させ、光学密度測定を405nmで行なった。
【０７６６】
(6.6.1.8  プラーク減少アッセイ)
感染した成人及び未感作(pH1N1ウイルスに感染していない)患者由来血清を最初にプー
ルし、IgGタンパク質の精製のために、プロテインGセファロース(GE Healthcare)を含む
重力流カラムに充填した。カラムをPBSで洗浄した。ポリクローナル抗体を0.1Mグリシン
バッファー(pH 2.7)で溶出させた。2M Tris-HClバッファー(pH 10)を1:10の比率ですぐに
添加して、pHをもとに戻した。溶出液をPBS中でバッファー交換し、50kD MWカットオフを
有するAmicon Ultra-15遠心分離フィルターユニット(Millipore)を用いて、スイング式バ
ケットローター中で濃縮した。タンパク質濃度を、A280法を用いてNanoDrop 2000分光光
度計で測定した。非特異的血清阻害因子の除去を、多数のウイルス株を用いて、精製IgG
調製物中にHI活性が存在しないことを示すHI試験で確認した(データは示さない)。ストー
ク反応性抗体の中和能力を、以前に記載されている通りに評価した(Wangらの文献(2010, 
PLoS Pathog 6, e1000796))。ウイルスを、1ウェル当たり100プラーク形成単位を生じさ
せる濃度にまで最初に希釈した。その後、プール血清由来の様々な濃度のIgGをウイルス
とともに室温で1時間共インキュベートした。MDCK細胞を播種した6ウェルプレートをPBS
で洗浄し、その後、200ulのウイルス-IgG混合物に感染させた。37℃で45分間のインキュ
ベーションの後、ウイルス及びIgGを細胞から吸引し、適切な抗体濃度及びTPCKトリプシ
ンを含む寒天オーバーレイを各々のウェルに添加した。プレートを37℃で2日間インキュ
ベートした。プラークを、抗H9抗体G1-26を用いた免疫染色により可視化した(Bouvierら
の文献(2008, J Virol 82, 10052))。
【０７６７】
(6.6.1.9  シュードタイプ粒子中和アッセイ)
シュードタイプ粒子産生の手順を以前の研究を基に改変した(Evansらの文献(2007, Nat
ure 446, 801))。簡潔に述べると、293-T細胞に、(i)所望のレポーターを含むプロウイル
ス(V1-GLuc)、(ii)HIV Gag-Pol、(iii)キメラcH9/1血球凝集素タンパク質、及び(iv)B型
インフルエンザ/山形/16/88ノイラミニダーゼ(NA)をコードする4つのプラスミドをコトラ
ンスフェクトした(Tscherneらの文献(2010, J Virol Methods 163, 336))。V1-GLucプラ
スミドは、細胞から分泌され、細胞上清中で検出することができるルシフェラーゼタンパ
ク質をコードしている。トランスフェクションの48時間後、上清を回収し、その後、cH9/
1粒子調製物を精製するために濾過した(0.45μm孔径)。その後、粒子を(感染後に線形範
囲内のルシフェラーゼ活性を与えることが判明している量で)様々な濃度(50μg/ml、10μ
g/ml、及び2μg/ml)の精製ヒトIgGとともにインキュベートし、MDCK細胞に添加した。感
染が6時間進行した後、細胞を洗浄し、新鮮な上清を細胞の上に配置した。シュードタイ
プ粒子を用いる感染は全て、1μg/mlポリブレン(Sigma, St. Louis, MO)の存在下で実施
した(Tscherneらの文献(2010,  J Virol Methods 163, 336))。感染の48時間後、ルシフ
ェラーゼアッセイを実施した。
【０７６８】
(6.6.2  結果)
(6.6.2.1  キメラ血球凝集素に基づく試薬の開発)
解析ツールとしての役割を果たすキメラ血球凝集素(cHA)構築物を作製して、ヒト血清
中のストーク抗体の存在を評価した。C52とC277の間に存在し、かつHAストークとヘッド
の境界の線引きをするジスルフィド結合を利用することにより、PR8ウイルスのHA由来の
ストークドメインの上にH6又はH9血球凝集素の球状ヘッドドメインをコードする発現プラ
スミドを人為的に作製した(図26A)。ストーク抗体を含むヒト血清試料は、H6又はH9ウイ
ルスに対する血球凝集素阻害(HI)活性について陰性である可能性が高い(これらのウイル
ス亜型に対して事前に曝露されていないことによる)が、H1血球凝集素ストークに対して
事前に曝露されているためにcH6/1又はcH9/1構築物と反応するであろうと仮定した。これ
らのツール、組換え発現cHAタンパク質、及びcHAを発現するウイルスを用いて、ヒト血清
試料中のストーク抗体の相対量を評価し、該ストーク特異的抗体によって媒介される中和
活性を測定することができた。
【０７６９】
解析的アッセイ用のcH6/1及びcH9/1タンパク質を生成させるために、キメラHAをコード
するプラスミドを作製し、バキュロウイルス発現系で可溶性タンパク質として発現させた
。2μgの全タンパク質のクマシー染色から、これらの調製物における高い純度が示唆され
ている(図29A)。cH9/1のわずかな移動の遅れは、cH9/1ヘッド上での占められたグリコシ
ル化部位の数の増加の結果であると考えられる。cHAタンパク質を、HAの様々な部分と反
応する抗体を用いたウェスタンブロット解析によりさらに特徴付けた。図29Bに示すよう
に、cH6/1、cH9/1、及びPR8由来の全長HAのみが、PR8ストークに特異的なウサギポリクロ
ーナル抗血清と反応した。H6、H9、及びPR8のヘッドドメインに対するモノクローナル抗
体により、キメラ構築物がPR8ストークの上に外来のヘッドを発現することが確認された
。H3タンパク質は、陰性対照として使用され、汎H3抗体12D1を使用した場合にのみ検出さ
れた(Wangらの文献(2010, PLoS Pathog 6, e1000796))。
【０７７０】
中和ストーク抗体を検出する目的で、キメラ分子を発現する組換えウイルスもレスキュ
ーした。過去1世紀にわたるヒトインフルエンザウイルスは全て、N1又はN2亜型のNAをコ
ードしているので、cH9/1N3再集合体ウイルスのレスキューにより、どの(N1又はN2)ノイ
ラミニダーゼ抗体活性も測定することなく、ストーク特異的抗体の中和能力の評価が可能
になると推論された。cH9/1N3ウイルス(H9球状ヘッドHAと、N3亜型ノイラミニダーゼとと
もに、H1ストークを発現する)を、リバースジェネティックスを用いてレスキューし、高
力価になるまで発育鶏卵中で成長させた。このウイルスのプラークアッセイ表現型は、PR
8野生型ウイルスのプラークアッセイ表現型と同様であった(図26C)。ウイルス継代後のH9
ヘッドの存在を確認するために、細胞をcH9/1N3ウイルスに感染させた。その後、感染細
胞を、H9亜型血球凝集素タンパク質に特異的な抗体であるマウスmAb G1-26でプロービン
グした。汎H1ストーク特異的抗体6F12を用いて、野生型PR8ウイルス感染細胞とcH9/1N3ウ
イルス感染細胞の両方を検出した(図26B)。
【０７７１】
(6.6.2.2  ストーク特異的抗体はcHAに結合し、それを中和する)
cH6/1及びcH9/1タンパク質をツールとして用いて、ステム抗体を検出することができる
ことを確認するために、これらのcHAの使用を、HAストークと反応することが知られてい
る抗体で最初に検証した。実際、H1 HAのストークと反応する抗体であるマウスmAb C179(
Okunoらの文献(1993, J Virol 67, 2552))は、ELISAにより、用量依存的な形でバキュロ
ウイルス発現cH6/1及びcH9/1タンパク質に結合した(図30A及びB)。
【０７７２】
次に、cH9/1N3ウイルスの複製がモノクローナル抗体6F12によって阻害され得るかどう
かを確認した。このモノクローナル抗体は、H1インフルエンザウイルスに対する中和活性
を有する(データは示さない)。抗体6F12は、プラーク減少アッセイにおいて、用量依存的
な形でcH9/1N3ウイルスに結合して、それを中和することができ(図30C及びD)、4μg/mlを
超える濃度で100％阻害が見られた。これらの結果は、キメラタンパク質及び組換えcH9/1
N3ウイルスを用いて、中和活性を有するストーク抗体を検出することができるという仮説
を立証した。
【０７７３】
(6.6.2.3  pH1N1に感染した患者は、cHAに結合し、それを中和する高力価の抗体を有する
)
cH6/1及びcH9/1可溶性タンパク質を用いて患者血液試料中のストーク反応性抗体を定量
する前に、HI活性用の血清を、これら2つのHA亜型を発現するウイルスに対して試験した
。A/アヒル/フランス/MB42/76(H6)及びcH9/1N3ウイルスを用いて、回収された成人及び小
児血清試料の全てがHI陰性であることが確認された(結果は示さない)。
【０７７４】
次に、血清とcH6/1及びcH9/1タンパク質との反応性をELISAにより試験した。pH1N1ウイ
ルスに感染していない成人及び小児対象から回収された血清は、どちらのタンパク質とも
ほとんど反応性を示さなかった。しかしながら、pH1N1インフルエンザウイルスに感染し
た患者から回収された血清は、両方のcHA構築物に対する結合の増強を示し、pH1N1感染者
由来の血清プールと未感染の成人及び小児の血清プールと比較したとき、IgG反応性の違
いは、(同等の光学密度測定値を生じる希釈液と比べて)30倍を超えて大きかった(図27A及
びB)。したがって、陰性のHIデータを考慮することにより、cHAタンパク質との反応性が
ストークドメイン中で生じると推論された。
【０７７５】
ヒト血清のプール試料を用いて、HAステムの一部である、長いαヘリックス(LAH)に対
するIgG結合も試験した。これらのIgGは、マウスにおける防御的免疫を媒介することが以
前に示されていた(Wangらの文献(2010, Proc Natl Acad Sci U S A 107, 18979))。pH1N1
に感染した患者由来の血清は、H1 LAHと反応する抗体を含んでいたが、パンデミックウイ
ルスに曝露されていない患者は、最小限のLAH特異的血清抗体を有していた(図27C)。
【０７７６】
H5血球凝集素亜型は、H1 HAと同じ系統発生学的グループにあり、極めてよく似たスト
ーク構造を共有する(Ekiertらの文献(2009, Science 324, 246))。興味深いことに、pH1N
1に曝露された患者では、H5タンパク質と反応する血清抗体特異性が増大したが(図27D)、
相同H5亜型ウイルスに対する血清HI活性が全くなかった(データは示さない)。この結果は
、pH1N1ウイルスへの曝露によって、ストーク特異的抗体により媒介されるある程度の抗H
5免疫が付与された可能性があることを示唆した。
【０７７７】
重要なことに、pH1N1に感染した患者では、H3血球凝集素タンパク質に特異的な血清抗
体が増加しなかった(H3は、H1及びH5 HAとは別の系統発生学的グループにある)(図27E)。
この結果は、pH1N1感染患者由来の血清中のストーク特異的抗体の力価の増強は、通常の
免疫刺激の機能ではなく;むしろ、H1ストーク抗体特異性は、パンデミックウイルス株の
感染によって選択的に増大したことを示している。
【０７７８】
次に、これらのヒト試料中に見られるこれらのストーク反応性抗体が中和能力を有する
かどうかを評価した。感染した成人及び未感染の成人由来の血清試料をプールし、血球凝
集素ヘッドに結合する非特異的阻害因子(例えば:シアル酸含有分子及びレクチン)を除去
するために、全IgGを精製した。これらの純粋なIgG調製物を用いて、55.5μg/mL全血清Ig
Gを超える抗体濃度での完全阻害プラーク形成(図28A及びB)が達成された。ELISAデータに
よると、pH1N1感染者由来の血清を未感染の成人の血清と比較したとき、中和活性の約30
倍の違いが観察された。mAb 6F12を標準として用いて、6F12によって媒介される中和活性
とポリクローナルヒトIgG調製物によって媒介される中和活性との比較を行なうことがで
きた。cHAウイルスの100％中和をもたらした6F12の濃度とヒトIgGの濃度を比較すること
により、最後の30日間にpH1N1に感染した患者由来の全ヒトIgGの7％が中和ストーク抗体
を含むと推測された。
【０７７９】
最後に、ストーク反応性抗体の中和能力を、シュードタイプ粒子感染アッセイを用いて
評価した。このアッセイは、宿主細胞へのウイルス侵入時に生成されるルシフェラーゼ活
性の読出しを有する。cH9/1タンパク質を発現するシュードタイプ化粒子を精製ヒトIgGと
ともにインキュベートし、中和活性を、細胞上清中のルシフェラーゼ酵素活性の欠如をも
たらす粒子侵入の阻害により測定した(方法参照)。プラーク減少アッセイと一致して、シ
ュードタイプ化粒子アッセイも、10μg/mlを超える全IgG濃度で粒子の100％中和を示した
(図28C)。
【０７８０】
(6.6.3  結論)
血球凝集素タンパク質の球状ヘッドに結合する抗体も含む調製物中でのストーク特異的
抗体の選択的検出を可能にする、キメラ血球凝集素タンパク質及び該キメラタンパク質を
発現するウイルスの形態の、新規の解析ツールを開発した。これらの新規の血球凝集素構
築物は、不変のH1亜型ストークを異なる血球凝集素亜型由来の球状ヘッドドメインととも
に(例えば:H1ストークをH6ヘッドとともに)有している。これを、血球凝集素タンパク質(
19)のシステイン52と277の間に存在するジスルフィド結合を利用することによって達成し
、介在配列と異なるHA亜型の配列とを交換した。
【０７８１】
これらのキメラ血球凝集素(cHA)構築物を用いて、pH1N1ウイルス感染が確認されたヒト
の小コホートが、未感染の成人及びpH1N1ウイルスに感染していない小児対照と比べて高
い力価のストーク特異的な中和抗体を生成させることが示された。これらの知見は、血球
凝集素(hemagglutintin)ストークと反応する抗体が、pH1N1感染に応答して生成し、2009
年のインフルエンザパンデミック以前に循環していた季節性H1N1ウイルスの絶滅の一因と
なった可能性が高いという仮説を支持する。
【０７８２】
(6.7  実施例7:キメラ血球凝集素:異なる亜型及び系統発生学的グループに由来する球状
ヘッド及びストークドメインを発現するインフルエンザウイルス)
この実施例は、異なる血球凝集素亜型及び異なる系統発生学的グループの種々の球状ヘ
ッド及びストーク組合せを包含するいくつかの機能的キメラインフルエンザウイルス血球
凝集素、並びにこれらのキメラ血球凝集素を発現し、野生型インフルエンザウイルスの成
長特性と同様の成長特性を有する組換えインフルエンザウイルスを記載している。これら
のキメラ組換えウイルスは、野生型インフルエンザウイルスの成長特性と同様の成長特性
を保有しており、ウイルス学的及び免疫学的アッセイでドメイン特異的抗体を測定するた
めの試薬として使用することができる。
【０７８３】
(6.7.1  材料及び方法)
(6.7.1.1  細胞及びウイルス)
293T及びMDCK細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type C
ulture Collection)(ATCC)から入手し、10％胎仔ウシ血清(HyClone; Thermo Scientific)
及びペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco, Invitrogen)を補充したダルベッコの最小必
須培地(DMEM)又はMEM(Gibco, Invitrogen)のいずれかの中で維持した。A/プエルトリコ/8
/1934(PR8)及びA/パース/16/2009(パース/09)野生型(Alexander Klimov, CDCにより親切
に提供されたもの)及び組換えウイルスを、特定病原菌を含まない10日齢の発育鶏卵(Char
les River)中、37℃で2日間成長させた。
【０７８４】
(6.7.1.2  プラスミドの構築)
様々なキメラ血球凝集素をコードするプラスミドを、以前に記載されているものと同様
の戦略を用いて構築した(例えば、Fodorらの文献(1999, J Virol 73:9679-9682);及びHai
らの文献(2008, J Virol 82:10580-10590参照))。簡潔に述べると、キメラHAの様々なセ
グメントを、SapI部位を含むプライマーでPCRにより増幅させ、SapIで消化し、アンビセ
ンス発現ベクターであるpDZベクターのSapI部位に、多重セグメントライゲーションによ
りクローニングした。このベクターでは、vRNA転写が、ヒトRNAポリメラーゼIプロモータ
ー及びマウスRNAポリメラーゼIターミネーターによって制御され、mRNA/cRNA転写が、ニ
ワトリβアクチンポリメラーゼIIプロモーターによって制御される(例えば、Quinlivanら
の文献(2005, J Virol 79:8431-8439)参照)。本発明者らは、Daniel Perez(メリーランド
大学)に対して、H7 HAプラスミド(Genbank ID: DQ017504)のことで深く感謝している。A/
プエルトリコ/8/1934(PR8)遺伝子をコードするプラスミドを以前に記載されている通りに
使用した(Haiらの文献(2008, J Virol 82:10580-10590))。
【０７８５】
(6.7.1.3  ヌクレオチド配列受託番号)
本研究で使用される構築されたcHA遺伝子は全て、受託番号IRD-RG-684014、IRD-RG-684
022、IRD-RG-684030、及びIRD-RG-684038の下、インフルエンザ研究データベース(Influe
nza Research Database)に寄託されている。キメラcH1/1、cH5/1、cH7/3、及びcH5/3は、
それぞれ、A/プエルトリコ/8-RGcH1-1/34、A/プエルトリコ/8-RGcH5-1/34、A/パース/16-
RGcH7-3/09、及びA/パース/16-RGcH5-3/09として記載されている。
【０７８６】
(6.7.1.4  フローサイトメトリー解析)
細胞表面での血球凝集素タンパク質発現のレベルを評価するために、293T細胞に、製造
業者の指示に従ってLipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて、1μgの適当なプラスミド
をトランスフェクトするか、又はMDCK細胞をcHA発現組換えウイルスに感染させた。トラ
ンスフェクションの48時間後、293T細胞をトリプシン処理し、2％FBSを含むPBSに再懸濁
させ、その後、モノクローナル抗体(mAb) 6F12(これは、本発明者らの実験室で作製され
た、グループ1 HAのストークドメインに広く反応するmAbである(データは示さない))(5μ
g/ml)で、又はH3 HAに対するmAb 12D1(5μg/mL)で染色した(Wangらの文献(2010, PLoS Pa
thog 6:e1000796)参照)。感染の12時間後、MDCK細胞をトリプシン処理により再懸濁させ
、mAb 12D1で染色した。染色された細胞をBeckman Coulter Cytomics FC 500フローサイ
トメーターで解析し、結果を、FlowJoソフトウェアを用いて解析した。
【０７８７】
(6.7.1.5  偽粒子生成及び侵入アッセイ)
偽粒子産生のための手順を以前の研究を基に改変した(例えば、Evansらの文献(2007, N
ature 446:801-805)及びTscherneらの文献(2010, J Virol Methods 163:336-43)参照)。
簡潔に述べると、本発明者らは、293T細胞に、(i)所望のレポーターを含むプロウイルス(
V1-Gaussiaルシフェラーゼ)(Evansらの文献(2007, Nature 446:801-805))、(ii)HIV Gag-
Pol(Evansらの文献(2007, Nature 446:801-805))、(iii)キメラ血球凝集素タンパク質、
及び(iv)B/山形/16/88ウイルスノイラミニダーゼ(NA)をコードする4つのプラスミドをコ
トランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、上清を回収し、その後、濾過
した(0.45μm孔径)。シュードタイプウイルス様粒子(VLP)の存在を血球凝集アッセイによ
り評価した。異なるVLP調製物を同じ4血球凝集単位に調整した後、MDCK細胞に接種した。
形質導入の効率を増大させるために、偽粒子を用いた以下のアッセイは全て、1μg/mLポ
リブレン(Sigma)の存在下で実施した(例えば、Evansらの文献(2007, Nature 446:801-805
)及びTscherneらの文献(2010, J Virol Methods 163:336-43)参照)。
【０７８８】
侵入アッセイは、異なるキメラ血球凝集素を発現し、Gaussiaルシフェラーゼレポータ
ーを含む偽粒子をMDCK細胞に形質導入することにより実施した。形質導入の24時間後、細
胞を新鮮な培地で3回洗浄して、接種材料中に存在する残留Gaussiaルシフェラーゼタンパ
ク質を除去した。形質導入の48時間後、ルシフェラーゼアッセイを実施した(Evansらの文
献(2007, Nature 446:801-805))。
【０７８９】
(6.7.1.6  組換えキメラインフルエンザAウイルスのレスキュー)
プラスミドDNAからのA型インフルエンザウイルスのレスキューを以前に記載されている
通りに実施した(例えば、Fodorらの文献(1999, J Virol 73:9679-9682);及びHaiらの文献
(2008, J Virol 82:10580-10590)参照)。組換え野生型(rWT)PR8ウイルスを作製するため
に、293T細胞に、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて、1μgの8つのpDZ PR8レスキ
ュープラスミドをコトランスフェクトした。cHA発現組換えウイルスを作製するために、
野生型HAプラスミドを、所望のキメラHAをコードするプラスミドと置き換えた。トランス
フェクションの6時間後、培地を、0.3％ウシ血清アルブミン(BSA)、10mM HEPES、及び1.5
μg/ml TPCK(L-1-トシルアミド-2-フェニルエチルクロロメチルケトン)処理トリプシン(S
igma)を含むDMEMと交換した。トランスフェクションの24時間後、8日齢の発育鶏卵にウイ
ルス含有上清を接種した。37℃で2日間のインキュベーションの後、尿膜腔液を回収し、
ニワトリ赤血球の血球凝集により、ウイルスの存在についてアッセイした。ウイルススト
ックの力価を、以前に記載されている通りに、MDCK細胞でのプラークアッセイにより測定
した(Fodorらの文献(1999, J Virol 73:9679-9682)、Haiらの文献(2008, J Virol 82:105
80-10590))。
【０７９０】
(6.7.1.7  ウイルス成長動態アッセイ)
組換えウイルスの複製特徴を解析するために、10日齢の発育鶏卵に、100プラーク形成
単位(pfu)の野生型又はcHA発現組換えウイルスを接種した。尿膜腔液を回収し、その後、
0、9、24、48、及び72感染後時間(hpi)で、ウイルス成長についてアッセイした。尿膜腔
液中に存在するウイルスの力価を、上で言及されている通りに、MDCK細胞でのプラークア
ッセイにより決定した。
【０７９１】
(6.7.1.8  プラークの免疫染色)
プラークを、以前に記載されているプロトコルを用いて、A型インフルエンザ核タンパ
ク質(NP)に対するmAb HT103で免疫染色することにより可視化した(Bouvierらの文献(2008
, Journal of Virology 82:10052-8);及びSteelらの文献(2009, J Virol 83:1742-53))。
【０７９２】
(6.7.1.9  ウェスタンブロット及び間接免疫蛍光解析)
コンフルエントなMDCK細胞を、表示された組換えインフルエンザウイルスに感染させる
か(2の感染多重度[MOI])、又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を37℃で1時間模擬感染させた
。12hpiで、細胞を、以前に記載されている通りに、1×SDSローディングバッファー中で
溶解させた(例えば、Haiらの文献(2008, J Virol 82:10580-10590)参照)。還元された細
胞ライセートを、A型インフルエンザウイルス核タンパク質(NP)に対するモノクローナル
抗体(mAb)(HT103)、PR8 HAヘッドドメインに対するモノクローナル抗体(PY102)、Cal/09 
HAヘッドドメインに対するモノクローナル抗体(29E3)、VN/04 HAヘッドドメインに対する
モノクローナル抗体(mAb #8)、及びHAストークに対して反応する汎H3抗体である12D1を用
いたウェスタンブロット解析により解析した。H7ヘッドドメインを検出するために、ポリ
クローナルヤギ血清NR-3152(A/FPV/オランダ/27(H7)ウイルスに対して惹起されたもの、B
EI Resources)を使用した。抗グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)抗体
(Abcam)をローディング対照に使用した。増強化学発光タンパク質検出系(PerkinElmer Li
fe Sciences)を用いて、タンパク質を可視化した。
【０７９３】
免疫蛍光解析のために、15-mmカバースリップ上のMDCK細胞のコンフルエントな単層を
、2のMOIで組換えウイルスに感染させた。15hpiで、細胞を固定し、メタノール-アセトン
(比率、1:1)で、-20℃で20分間透過処理した。0.1％Tween 20を含むPBS中の1％ウシ血清
アルブミンでブロッキングした後、細胞を、上記の抗体、及びmAb 6F12とともに1時間イ
ンキュベートした。0.1％Tween 20を含むPBSで3回洗浄した後、細胞を、Alexa Fluor 594
コンジュゲート抗マウスIgG(Invitrogen)又はAlexa Fluor 594コンジュゲート抗ヤギIgG(
Invitrogen)とともに1時間インキュベートした。最後の3回の洗浄の後、感染細胞を、Oly
mpus IX70顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡法により解析した。
【０７９４】
(6.7.1.10  プラーク減少アッセイ)
プラーク減少アッセイを以前に記載されている通りに実施した(Wangらの文献(2010, PL
oS Pathog 6:e1000796)参照)。PR8ストークの上のCal/09又はVN/04球状ヘッドドメインか
ら構成されたcHAを発現する約60〜80pfuの組換えウイルスを、様々な濃度(100、20、4、0
.8、0.16、及び0.032ug/ml)のmAb KB2(これは、本発明者らの実験室で作製された広域中
和性抗HAストーク抗体である(データは示さない))とともに、又はそれらなしで、240uLの
全容量中、室温で60分間インキュベートした。6ウェルプレート中のMDCK細胞のコンフル
エントな層をPBSで2回洗浄し、その後、抗体-ウイルス複合体とともに37℃で40分間イン
キュベートした。その後、接種材料を吸引除去した後に、上記の濃度の抗体を補充した又
は抗体を補充していないTPCK-トリプシン寒天オーバーレイを各々のウェルに添加した。
プレートを37℃で2日間インキュベートした。その後、プラークを、抗A型インフルエンザ
NP抗体HT103を用いた免疫染色により可視化した(Bouvierらの文献(2008, Journal of Vir
ology 82:10052-8);及びSteelらの文献(2009, J Virol 83:1742-53))。
【０７９５】
(6.7.1.11  シュードタイプ粒子中和アッセイ)
シュードタイプ粒子産生の手順は上記のものと同じであり、VN/04(H5)ヘッド又はCal/0
9(H1)ヘッドのいずれか及びPR8(H1)ストークから構成されるcHA構築物をB型インフルエン
ザ/山形/16/88ウイルスNAとともに使用した。その後、粒子を、100μg/mLから0.032μg/m
Lまでの5倍希釈の様々な濃度のmAb KB2とともにインキュベートした。その後、これらの
混合物をMDCK細胞に添加した。形質導入が6時間進行した後、細胞を洗浄し、新鮮な培地
を細胞の上に配置した。シュードタイプ粒子を用いる形質導入は全て、1μg/mLポリブレ
ン(Sigma, St. Louis, MO)の存在下で実施した(Tscherneらの文献(2010, J Virol Method
s 163:336-43))。形質導入の48時間後、侵入がmAb KB2によって遮断された程度をアッセ
イするために、ルシフェラーゼアッセイを実施した。
【０７９６】
(6.7.2  結果:)
(6.7.2.1  キメラ血球凝集素の作製)
Cys52-Cys277ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が保存されているかどうかを
確かめるために、H1、H3、H5、及びH7亜型のA型インフルエンザウイルスHA配列のアライ
ンメントを本研究で使用した。これらのシステイン残基は、HA亜型にわたって極めて保存
されているので、グループ1 HAとグループ2 HAの両方について、Cys52-Cys277ジスルフィ
ド結合を、ヘッドドメインとストークドメインの間を線引きする点として使用した。Cys5
2とCys277の間の配列をヘッド領域と定義し、分子の残りの部分をストークと定義するこ
とにより、種々のHA亜型由来の新規のヘッド及びストーク組合せをコードする構築物を作
製することができることが理論的に説明された(図31A及びB)。
【０７９７】
ヘッドドメインの交換が可能となり得る、血球凝集素亜型のストーク領域とストーク領
域の間に存在するアミノ酸同一性度のために、本発明者らはさらに促された。ヘッドドメ
インと比べて、より高いパーセンテージのアミノ酸同一性が、全ての亜型にわたってスト
ークドメイン中に見られた(図32)。
【０７９８】
インフルエンザHAの16種の亜型は全て、2つの系統発生学的グループに分類される(Pale
se及びShawの文献(2006, オルトミクソウイルス:ウイルス及びその複製(Orthomyxovirida
e: the virus and their replication), Fields virology, 第5版, 1647-1690)。より高
いパーセンテージのアミノ酸同一性が特定のグループのストーク領域内で観察されたので
(図32)、及びグループ1ウイルス由来のヘッドドメイン及びストークドメインを含む1つの
cHAウイルスの作製に成功していたので(Picaらの文献(2012, PNAS 109:2573-8))、グルー
プ内cHAを作製する試みが行なわれた。グループ1については、パンデミックH1 Cal/09 HA
又はVN/04球状ヘッドドメインのいずれかをPR8(H1)HA由来のストーク領域とともにコード
する2つのキメラ血球凝集素構築物(それぞれ、cH1/1及びcH5/1)を作製した(図31B)。同様
の戦略を適用して、異なるグループ2インフルエンザ株由来のヘッドドメイン及びストー
クドメイン:Alb/01(H7、グループ2)由来のヘッド及びパース/09(H3、グループ2)HA由来の
ストーク領域を発現するキメラHA(cH7/3)を作製した(図1B)。最後に、ヘッドドメイン及
びストークドメインを交換して、パース/09 HA(H3、グループ2)ストークの上にVN/05 HA(
H5、グループ1)のヘッドドメインを含むグループ間キメラHA(cH5/3)を作製することがで
きるかどうかを評価した(図31B)。
【０７９９】
これらのプラスミドの構築後、様々なキメラHA構築物が発現され、野生型HAのように細
胞表面に輸送されることができるかどうかを明らかにするために、実験を実施した。それ
ぞれ、H1及びH3ストークドメイン特異的抗体で表面染色した後、一過性にトランスフェク
トされた293T細胞の蛍光活性化セルソーター(FACS)解析を実施した。この方法を用いて、
4つ全てのキメラ構築物の細胞表面発現を検出した(図33)。しかしながら、野生型PR8 HA
と比べて、より少ない表面タンパク質発現がcH1/1構築物について検出され、これは、こ
のキメラDNA構築物についてのCal/09 HAのヘッドドメインと関連する固有の性格又はより
低いトランスフェクション効率に起因する可能性があった。さらに、cH7/3構築物とcH5/3
構築物の細胞表面発現パターンに違いがあったことは注目すべきことである。この「二重
ピーク」発現パターンは、トランスフェクション条件でのみ観察され、再現性があった。
それは、cH7/3発現組換えウイルスの感染によっても、cH5/3発現組換えウイルスの感染に
よっても検出されなかった(図33)。したがって、これらのデータは、cHAがゴルジ複合体
から細胞表面へと輸送されることができることを示している。
【０８００】
次に、MDCK細胞の形質導入による様々なcHAの侵入特徴を、ルシフェラーゼレポーター
構築物を含み、粒子表面にcHA及び野生型B/山形/16/88ウイルスNAを発現するレトロウイ
ルスシュードタイプ粒子を用いて調べた。cHAタンパク質によって媒介される侵入効率を
ルシフェラーゼの読出しにより検出した。同程度のレベルのシュードタイプ粒子媒介性ル
シフェラーゼ発現が、cH5/1、cH7/3、及びcH5/3キメラHA、並びに対応する野生型タンパ
ク質について観察された(図34)。cH1/1 HAをコードする粒子は、他のHA構築物と比べてよ
り低いルシフェラーゼレベルを発現し、これは、プロデューサー細胞株におけるcH1/1発
現がより低く、したがって、粒子1つ当たりのHA三量体がより少ないことか、又はcH1/1 H
Aの侵入特性の効率がより低いことかのいずれかによるものである可能性があった。シュ
ードタイプ粒子を4血球凝集素単位に正規化したとき、赤血球に対する結合の違いのため
に、シュードタイプ粒子の実際の量が変化し得るということもあり得る。
【０８０１】
(6.7.2.2  キメラ血球凝集素を有する組換えインフルエンザウイルスの作製)
本発明者らのcHA構築物は効率的に発現し、細胞表面に輸送されることが明らかにされ
ていたので、cHAをコードする組換えインフルエンザウイルスをレスキューすることがで
きるかどうかを評価するための研究を実施した。以前に発表されたプロトコルを用いて、
様々なcHAを含むウイルスを作製するのに成功した(例えば、Fodorらの文献(1999, J Viro
l 73:9679-9682);及びHaiらの文献(2008, J Virol 82:10580-10590)参照)。得られたウイ
ルスをプラーク精製し、10日齢の発育卵中で増幅させ、キメラセグメントをRT-PCRにより
解析し、シークエンシングした。どの場合も、ウイルスは、予想されたキメラHAセグメン
トを有し、他のHAセグメントを有さないことが分かった(データは示さない)。
【０８０２】
レスキューされたウイルスにおけるcHAの存在を感染細胞のウェスタンブロット及び間
接免疫蛍光によりさらに確認した(図3A及びB)。MDCK細胞を、rWT PR8、野生型パース/09
、cH1/1、cH5/1、cH7/3、及びcH5/3ウイルスに感染させた(図3A及び3B)。cH1/1及びcH5/1
キメラHAタンパク質を、それぞれ、Cal/09(H1) HAのヘッドドメインに対して反応する抗
体(29E3)(Medinaらの文献(2010, Nature Communications 1:28))又はVN/04(H5) HAのヘッ
ドドメインに対して反応する抗体(mAb #8)(Steelらの文献(2009, J Virol 83:1742-53))
を用いて、対応する試料中で検出した(図3A)。汎H3抗ストークmAbである12D1を用いて、c
H7/3とcH5/3と野生型パースHAの間で同程度の発現レベル(Wangらの文献(2010, PLoS Path
og 6:e1000796)参照)。野生型パースHAは、ゲル上でのより遅い移動を示し、これは、球
状ヘッドドメイン中のグリコシル化部位の数がより多いためである可能性が高い。cH7/3
又はcH5/3感染試料に対して、それぞれ、抗H7ポリクローナル抗体(NR-3152)又は抗H5モノ
クローナル抗体(mAb #8)を使用することにより、正確なHAヘッドドメインがH3ストークの
上に発現することが確認された。陽性バンドは、どちらの場合にも検出された。
【０８０３】
免疫蛍光研究について、感染条件は、ウェスタンブロット解析に使用した条件と同様で
あった。感染細胞を、図35で使用されているような対応する抗体で染色した。感染細胞は
全て、キメラ及び野生型HA、並びにA型インフルエンザウイルスNPの予想される発現を示
した(図36)。
【０８０４】
(6.7.2.3  組換えウイルスの複製特徴)
野生型及び組換えウイルスの成長特性を、10日齢の発育鶏卵中、37℃で評価した(図37A
)。キメラHAを発現する組換えウイルスの成長動態の比較のために、rWT PR8ウイルスを含
めた。cH5/1及びcH5/3ウイルスは、rWT PR8ウイルスの複製動態と同程度の複製動態を示
した。cH7/3ウイルスは、48hpiで、rWT PR8と同様のピーク力価(1×109PFU/mL)にまで成
長したが、9hpiで、rWT PR8ウイルスと比べてウイルス力価が2log低下した。全ての時点
でのウイルス力価の低下によって示されるように、cH1/1ウイルスは、rWT PR8ウイルスと
比べて弱毒化された。それにもかかわらず、cH1/1ウイルスは、約108PFU/mLというかなり
のピーク力価に達した。パース/09野生型ウイルスは、発育卵中で同程度のピーク力価に
まで成長する(データは示さない)。
【０８０５】
キメラウイルスの各々のプラーク表現型もMDCK細胞で評価した。図37Bに示すように、
全てのウイルスが同程度の大きさのプラークを形成した。これらのデータを合わせて、キ
メラHA構築物が正確にフォールディングし、生物学的に機能的であることが確認される。
【０８０６】
(6.7.2.4  ストーク特異的抗体は、cHA発現ウイルス及び偽粒子を中和することができる)
最後に、ストーク特異的抗体を、本発明者らが新たに作製した、cHAを発現する組換え
ウイルスを中和する能力について試験した。プラーク減少アッセイを、広範なグループ1
反応性を有するHAストーク特異的抗体であるmAb KB2の存在下で、又は抗体なしで実施し
た。mAb KB2が、同様の効率でかつ用量依存的な形で、全てのcHA発現ウイルスを中和する
ことが示された。100ug/mLで、mAb KB2は、cH1/1及びcH5/1ウイルスを、100％の効率で完
全に中和することができ、4ug/mLもの低い濃度でもいくらかの中和活性があった(図38A)
。
【０８０７】
これらの結果を確認するために、シュードタイプ粒子阻害アッセイをmAb KB2を用いて
実施した。cH1/1又はcH5/1及びB型インフルエンザウイルスNAを発現するシュードタイプ
粒子を、mAb KB2の存在下で又は抗体なしで、MDCK細胞に添加した。形質導入の48時間後
、上清を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。予想された通り、mAb KB2は、cH1/1及
びcH5/1シュードタイプ粒子の侵入を、4ug/mLを超える濃度で、用量依存的な形で阻止し
た。シュードタイプ粒子の侵入を阻害するには、プラーク減少アッセイで使用される濃度
と比べてより低い濃度のmAb KB2で十分であったが、シュードタイプ粒子の表面でのHA三
量体の組込みがより少ないと想定されていたので、これは予想された結果であった(Corti
らの文献(2010, The Journal of Clinical Investigation 120:1663-73))。全ウイルスを
シュードタイプ粒子と対比させて含むアッセイにおいて、mAbの中和能力が異なるという
この現象は、他の研究で認められている(Cortiらの文献(2010, The Journal of Clinical
Investigation 120:1663-7321); Suiらの文献(2009, Nature Structural & Molecular B
iology 16:265-73))。
【０８０８】
(6.7.3  結論)
ヘッドドメインとストークドメインの境界を定める保存されたジスルフィド結合Cys52-
Cys277を利用することにより、異なるHA球状ヘッドドメインを有するキメラHAタンパク質
を有するインフルエンザウイルスを作製するための新しい戦略を開発した。したがって、
もとのヘッドドメインを別のHAのヘッドドメインと置換することにより、同じストークを
有するが、異なる球状ヘッドを有するキメラHAのパネルを作製した。この設計を、PR8ス
トークドメインをCal/09及びVN H5球状ヘッドとともに含む、多数の亜型にわたって検討
した。さらに、H7球状ヘッドをH3ストークドメイン上に配置した。これらの構築物は、両
方の系統発生学的グループのインフルエンザHAタンパク質を網羅する。各々の構築物は細
胞表面に発現し、図12に示すような融合活性を保持した。キメラHAを有する組換えウイル
スの作製は、HAが正しくフォールディングし、生物学的機能を保持することをさらに立証
した。
【０８０９】
(6.8  実施例8:1976及び2009 H1N1インフルエンザウイルスワクチンは、ヒトで抗血球凝
集素ストーク抗体を強化する)
この実施例は、A/ニュージャージー/1976インフルエンザウイルスワクチンを受けてい
た個体が、年齢を一致させた対照と比べて、血球凝集素ストーク抗体の力価の上昇を示し
たことを示す。これらの対照対象が、A/カリフォルニア/04/09ワクチンを受けた後に、抗
血球凝集素ストーク抗体の増加を経験したのに対し、A/ニュージャージー/1976ワクチン
を受けた個体は、それを経験しなかった。これは、血清中の抗ステム/ストーク抗体の存
在を検出するためのキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの有用性を示
している。
【０８１０】
(6.8.1  材料及び方法)
(6.8.1.1  ヒト血清試料)
2009年10月に、ヒト血清を、NJ/76ワクチンを受けていた対象(n＝20、平均年齢＝62)及
び年齢を一致させた対照(n＝15、平均年齢＝57)から回収した。研究開始前の4カ月以内に
インフルエンザ様疾患を経験していた対象は除外した。2009年10月から2010年1月の間に
、全ての対象に一価Cal/09様ワクチンを投与した。Cal/09ワクチンを受けてから6〜8カ月
後、対象は、ワクチン接種後の採血をしてもらうために戻ってきた(20人のNJ/76ワクチン
被接種者のうち5人;15人の対照対象のうち7人)。入手可能な血清の量が限られているので
、等容量のCal/09ワクチン接種前血清及びCal/09ワクチン接種後血清を、両方の試料が入
手可能である個体からプールし(NJ/76ワクチン被接種者＝5人;対照対象＝7人)、その後、
これらのプールを複数のアッセイで試験した。
【０８１１】
(6.8.1.2  細胞及びウイルス)
Madin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞をATCCから入手し、10％胎仔ウシ血清(FCS, Hyclone)
及び100U/mlペニシリン及びストレプトマイシン(Gibco)を補充したダルベッコの改変イー
グル培地(DMEM, Gibco)中で維持した。Cal/09を、1μg/mlのl-1-トシルアミド-2-フェニ
ルエチルクロロメチルケトン処理(TPCK)-トリプシン(Sigma-Aldrich)を含むDMEM中、MDCK
細胞で増殖させた。A/アヒル/フランス/MB42/1976(フランス/76)ウイルスを10日齢の発育
鶏卵中で増殖させた。cH5/1 N3ウイルスを、以前に記載されているリバースジェネティッ
クス系を用いて作製した(例えば、Fodorらの文献(J Virol 1999; 73:9679-82); Neumann
らの文献(Proc Natl Acad Sci U S A 1999; 96:9345-50)参照)。vRNA及びmRNAをコードす
るリバースジェネティックスプラスミドは、A/プエルトリコ/8/34(PR8)由来の6つの呗苣㲦牢ਾ苣ꮃ苣뮂苣ꆃ菣袃胣ꚸ臣ꮁ䡣⼵‱䅈迥뎁⽁菣뾂龃苣벃菣⾪㈴㘹㈴⼴㘰苣ꒂ菣릂䴨獩⽳㘰㰩牢ਾ铧ꖝ臣亮″䅎苣뎂菣覃臣讂菣ꦃ苣龃菣銂郥肂胣掂㕈ㄯ迥뎁㍎删䅎臣超裥꾁胣劁ⵔ䍐ꎔ觧꺁苣㲷牢ਾ菣꾂苣뎃苣뎃苣ꮁ苣誂ꋧ趪臣龁胣龄鿦꾁藥ꚁ胣ㆁ볎⽧汭吠䍐ⵋ菣ꪃ菣랂菣銂ꏨ薅臣龁䵄䵅㰨牢ਾ蓦鎟鿥난銂铧蒁臣龮雦鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶⸸⸱″蒵迦袁苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣뾂菣醃苣ꪳ臣몙迧誏臣뺲ꏨ⦽戼㹲 倠㡒胣䆁讃菣벃苣것菣讃苣⾢〲㤯⠹䍎㤯⤹苣ꒂ菣릂胣誏臣掳㙈ㄯ铧ꖝ臣䢮꺁ꮜꯧ내菨隤菣㲉牢ਾ菣ꒂ菣꺁苣벃菣超裥⢗뻤袁臣膀楐慣苣꺁雦꺌倨潲⁣慎汴䄠慣⁤捓⁩⁕⁓⁁〲㈱※〱㨹㔲㌷㰭牢ਾ〸芏藧⦧胣䢂銂胣䎁鳦꾫菣궂苣銃苣膃苣뎃뾂苣誏臣咳覸蟩鎽賥覃菣ꒂ菣銂鳦馁苣꺿ꏩ閁苣㲌牢ਾ臣炟慆瑳慂馃苣뾂菣⢼湉楶牴杯湥ꮁ苣뎃菣것菣ꂃ臣꾂菣벃菣뎃苣鞁臣芀뗧鮏臣邃苣ꖃ菣Ꚃ戼㹲ꒂ菣릂爨噂銂ꏨꂀꗦ薀臣ꢥ苣ꮁ뻥ꎁ臣鲽ꏨ鞁臣芀祈汃湯⁥䙓蚘駨내菨릟鳥⢰桔牥潭䘠獩㱨牢ਾ牥匠楣湥楴楦⥣룤ꞁ裦랕臣鮁臣䊟䥔吭㕎ㅂ㐭䠨杩⁨楆敶⠩牋浡敭覂臣螖賧⢮潍⁬楂瑯捥湨㱯牢ਾ⁬〲〱※㔴㈺㘲㌭⤴내菨銂胣㖁〰汭賦ꪛ菣ꦃ苣뎂룤膀〱臣龄鿦骤蟩ꚺ䴨䥏誏臣ㆳ韃〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾⼼畳㹰듧㲰牢ਾ菨⾞汭臣내菨蚯뫥ꞁ胣䢁銂駧뺏臣讂䉲ꮁ蓦鎟臣鮁臣芀蓦鎟臣㞮鲀㘹駦鎖뻥膀듧麃苣麛迥鞁戼㹲膀껥ꦸ刨⥔臣㊧〰쌰林臣ㆧ蚈雩꺁뷤龀臩莿裥ꊛ臣袂苣誸룦讁苣蚈鯩鞁臣芀룤薸㈨〵汭銂鯥㲞牢ਾ迥鞁胣㎁汭臣亮⵩呎릨蓨⢂楑条湥ꢁ臣节臣㒫蓢ꞁ芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣릂菣ꪃ菣銂苣㲫牢ਾ菣ꂃ臣薅ꇥ鞁胣鞴뗦邃菣閃苣벃㔨洰⁍慎䠲佃膀〳洰⁍慎汃胣㊁洰ꒂ菣肃苣벃菣膀䡰㠠ꞁ戼㹲㌊鯥鞴뗦鞁臣芀苣뎃菣꾂돨銂뫦몇菣莃菣ꆂ菣⢼〵䵭丠㉡䍈㍏胣㎁〰䵭丠䍡膀〳洰ꒂ菣肃苣㲾牢ਾ菣ꮃ胣炁⁈⤸臣ェ㔮汭臣ꒁ뫦몇臣鮁胣隃菣莃菣閃苣벃菣ꚩ雨ꞁ苣뎃菣꾂돨ꮐ蟩ꮁ臣蒁臣ꚩ꣩㲓牢ਾ臣龁胣뾂菣醃苣ꪳ苣ꮐ苣뮔裥銂菣벃菣鞁胣㎁欰慄臣ꮂ菣袃苣閃苣覜臣讂流捩湯唠瑬慲散汬㰨牢ਾ楍汬灩牯⥥臩莿裥ꊛ菣讃菣袃苣ꢔ臣ꚁ뿦꺸臣膀菣莃菣ꆂ菣銂䡰㜠㐮臣ꪃ菣뢅럧鶡铧蚐ꏩꦡ戼㹲뒰倨卂ꮁ뫤鮏臣龁胣뾂菣醃苣ꪳ臣钴뫥誏臣ꊂ苣螃菣蚃苣蚃苣銂胣厁卄倭䝁膀苣麃苣벃鿦㲓牢ਾ觨膀迥뎁苣Ꞃ苣뾂菣隃菣莃菣ꮁ苣誂ꧨ鎨臣龁胣뾂菣醃苣ꪳ뿦ꚺ苣隃菣莃菣閃苣벃菣ꚩ雨ꞁ戼㹲몱껥鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶⸸⸱‴超雧낂菣隃菣뎃⡇杉⥇뗧릂諥ꆾ臣몱껥⦚戼㹲 䤠䝧뗧릂諥ꆾ苣떅듧邵郥超雧뢐鷧ꊂ菣뮂苣⢤䱅卉⥁臣袂苣��껥鞁臣芀냧钽臣낿臣讂臣膀㘹戼㹲Ꚃ苣ꮃ菣것菣袃䤨浭汵湯㈠※畎据ꮁ胣궂藩ꦡ趇苧뢅ꇥ邃菣閃苣벃胣炁⁈궸臣㊮볎⽧汭臣㲮牢ਾ닧붣뗧鮏臣䢈袏臣Ꚃ苣股룦ꊂ菣隃菣뎃䈨䅓銂胣㒁蓢ꞁ룤ꦙ苣벃菣ꎂ菣낂臣龁胣鞃菣벃菣銂戼㹲膀呒臣ㆧ駦鎖胣㖁볯ꆄ蓨ꪂ매ꞁ菣궃菣궂菣낂臣膀䉐⽓⸰㈰薼睔敥⵮〲倨卂吭ꞁ麛듦蒵臣㲗牢ਾ臣芀ꇨ薸苣㖒볯ꆄ蓨ꪂ매ꮁ胩骶룥袇臣膀苣Ꞃ菣ꮁ럦ꂊ臣龁胣鞃菣벃菣銂呒臣ㆧ駦鎖苣뎃苣ꖃ戼㹲馃菣袃臣膀芙雩貾胣鶁苣覂苣傒卂吭臣㎧鯥鞴뗦鞁臣芀菣꺂諦銃菣䦈䝧뾥듦꾃苣鎃菣ꮃ苣궂戼㹲랂菣벃苣⢼剈⥐䴨牥摩慩⁮楌敦匠楣湥散ꓧ⦾뫤ꆬ諦鎽苣㖒볯ꆄ蓨ꪂ매ꮁ㨱〵〰臣貸蟩鞁臣貾戼㹲膀苣Ꞃ菣ꮁ럦ꂊ臣膀呒臣ㆧ駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀菣것菣袃苣傒卂吭臣㎧鯥趆臣鞴뗦鞁胣㲁牢ਾ臣꺁뻥膀菣ꮃ苣궂苣肃菣벂鿥ꪳ匨杩慭䅆呓传䑐‬楓浧ⵡ汁牤捩⥨苣뮷諥鞁臣芀鿥ꪳ臣꺁苣㲤牢ਾ菣궂菣馃菣랂菣뎃苣劒ꞁ蚈雩財臣ꎁ臣貾胣㎁⁍䍈꺁럦ꂊ臣袂苣膀迥鲿苣鲁귦閁臣龁胣覅戼㹲ꚭ꿥ꚺ룦骮苣㒒〹浮臣財臣ꎁ臣芀䅈臣뺯臣ꚁ鯥躏臣貂臣覅귥蚯뫥銂胣蒐胣꺁胥薀臣股룦貸戼㹲袇臣ꒁ臣ꚁ卂ꮁ꿥鞁臣겸껥閁苣龁藥ꚭ꿥ꚺ臣覂룦鞮臣膀鷩릉闧蒚苣낂菣ꮃ臣뺯臣ꚁ귦辦戼㹲隌臣龁胣邃菣꾂苣ꦃ苣뎃菣랂苣誃菣銂胣貺곦鞊뷤꺁臣꺁迥鲿胦ꮁ鿥ꖁ臣ꚁ胣蒐胣꺁觧骮臣㲮牢ਾ諦龎臣ꒁ臣ꚁ꣨鞮臣龁胣芵苧鮊뻤銂胣麝觧낕髧⢄卂⥁苣낂菣ꮃ臣鮸껧貾臣邃菣꾂苣ꦃ苣뎃戼㹲覃苣誸鯥讂냥ꪁ臣ꢁ苣㎂꣦隺臥꺷臣覅귥蚯뫥銂鳦馁苣节臣ꢁ臣ꚁ껥ꦾ臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯钼胣㲑䐯噉ਾ㘨㠮ㄮ㔮†ꇨ莐蟥蚛飩뎮䠨䥁ꊂ菣뮂苣⦤戼㹲 股룦銂胣㖁莄臣㎧蚈雩膀⸰릮蟩꺁洸⽧汭吠䍐ⵋ菣ꪃ菣랂菣⢳楓浧ⵡ汁牤捩⥨臣ꚇ郧馁苣㲋牢ਾ臣ꢁ臣袂苣膀ꇨ莐蟥蚛臣麝觧낕髧뮘껥ꂛ귥銂駩뮎臣龁胣鶁臣貾胣ꚩ雦銂呒臣랆跥鞁胣鶁臣㲮牢ਾ뻥膀릮蟩꺁ㄱ䵭臩ꢃ苣ꂴ藩ꮂ菣Ꚃ菣뚺뛦⢲楓浧ⵡ汁牤捩⥨苣뮷諥鞁臣芀ꧨ首苣躁菣Ꚃ듧뢅戼㹲ꮂ菣Ꚃ菣ꢁ臣节臣劫ꞁ㔱裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣貾胣㎁껥辇臣ㆮ볯낂菣뮂菣벃菣龔郧龣ꇥ뒰戼㹲뚺뛦銂ꧨ首臣뮷諥鞁胣鎁苣銂蛥뎁胣劁ꞁ㔱裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀鳦貾臣膀⸱릮蟩꺁㰰牢ਾ㠮薼铧蚐ꏩꦡ냦銂ꧨ首臣뮷諥鞁胣鶁臣貾胣뾽铧鞁臣芀껥辇臣ꢅ臣膀ꇨ薸臣몇駧릮蟩ꮁ雩㲢牢ਾ胩鞁臣节臣ꞁ臣讂胣股郧鶇鯩ꊂ菣뮂苣銂胣め㔮볯讃菣袃菣꒵ꇨ莐挨䉒ⱃ䰠浡楰敲䈠潩潬楧㱣牢ਾ污䰠扡牯瑡牯敩⥳苣ꢔ臣ꚁ閺㘹苣Ꞃ菣鞃菣벃菣⢈畎据궸臣肜裥ꮁ껥붖臣ꚁ胣㎁苣Ꞃ菣蚈臣㲮牢ਾꇨ莐蟥蚛苣节臣覂臣Ꚃ苣ꮃ苣꺁룥��苣몱껥鞁臣芀苣ꒂ菣릂迥뎁諦鎽苣랷郥鞁胣劁ꞁ〳裥鎖戼㹲ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣鶁臣貾胣掁䉒銂苣Ꞃ菣ꮁ럦ꂊ臣膀菣것菣袃苣랰룤ꞁ듧㎄蚈雩ꒂ菣궂戼㹲ꖃ菣벃菣鞁臣貾胣궪臣随臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ㘨㠮ㄮ㘮†菣ꒂ苣궃룤貒苣莃苣ꒂ㰩牢ਾ†냧钽臣낿臣讂臣膀〵볯蒵맧릟ꓩ龄鿦ꢔ蟩⢏䍔䑉〵銂胣掁㕈ㄯ丠誏臣䎳污〯Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ臣㲤牢ਾ臣ꚁ胣䶁䍄내菨ꞁ臣ꎀ뛧貸蟩ꮁ苣誂뇦骮臣龁胣龄鿦貾胣내菨銂胣㎁莄胣㖁볯䎅㉏臣膀〲駦鎖戼㹲ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣내菨銂〸볯ꊂ苣袃菣ꞁ鯥骮臣膀薼臩뢅賥뒰듧誏臣㖳볯ꆄ蓨ꪂ매ꞁ菣㲖牢ਾ菣莃苣뎃苣鞁臣芀듧麃苣膀㨱〲〰룥袇臣鎃苣膃菣뎂菣뢂菣늂菣袃菣Ꚃ苣鞊偎䴨汩楬潰敲㰩牢ਾ胣ꆬ臣ꞁ胣ㆁ㔺〰貸蟩꺁뫤ꆬ剈뎂菣뢂菣늂菣袃苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣⢳楍汬灩牯⥥臣鞃菣벃戼㹲鎃菣낂臣龁胣骃菣ꪂ苣랂菣벃苣몟돨⢪楓浧䙡十ⱔ匠杩慭䄭摬楲档銂苣Ꞃ菣ꮁ呒臣㊧蚈雩뮷戼㹲ꂊ臣龁뻥膀迥鲿苣㎒⁍䍈ꞁ臥ꊭ臣鮁臣芀菣ꒂ苣궃룤貒苣莃苣ꒂ臣龁苣ꮁ胣㊁〰吠䥃㱄畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〵⼼畳㹢ㄯ〰戼㹲츊沼苣膀藥ꮁ꣨覼臣龁苣蚁臣咫䍐ⵋ菣ꪃ菣랂菣ꞁ뫤趉蟥蚐臣ꚁ臣蒁臣ꎀ뛧貸蟩股룦⢅蓦鎟鿥㲹牢ਾ鳥궸꺁苣Ꞃ菣ꮁ럦ꂊ臣龁胣股룦誏臣Ꚃ苣ꮃ苣⢹䡣⼵‱㍎迥꾁慃⽬㤰銂㜳蓢ꞁ芙雩ꒂ菣궂戼㹲ꖃ菣벃菣鞁臣芀ꇨ薸Ꚃ苣ꮃ苣랷郥ꦉ苣뎂菣閃菣ꢂ菣袃臣䶪䍄내菨꺁㘹苣Ꞃ菣鞃菣벃菣ꮁ戼㹲뮧臣膀臣貂苣膀郥肝臣鮁苣龁苣ꮁ胣㎁莄胣㖁볯䎅㱏畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵ꞁ芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣鞃菣벃菣㲈牢ਾ苣傒卂臣㊧鯥鞴뗦鞁胣覭뿦ꚺ臣貸蟩股룦銂郥肂蓦鎟鿥난臣ꢁ苣ꮁ〲駦鎖蛥ꒂ菣궂菣馃菣袃臣㲗牢ਾ臣芀鯥骮迥뎁諦鎽蟥蚐臣膀䍔䑉猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾㰰猯扵몱껥芙臣뾽铧鞁臣节臣꺁郥肸臣芁臣龁胣궸鋥鮊뻤銂胣龄戼㹲鎟胦꺁냥ꪁ臣ꢁ苣㖂薼飩뎮苣节臣覂臣股룦꺁룥袇臣鞁臣骮뻧鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶⸸′邵黦⦜戼㹲⠊⸶⸸⸲‱丠⽊㘷菣꾂菣뎃ꋨꖎ꣧薀臣膀慃⽬㤰菣꾂菣뎃軦꺨觥ꮁ룤螘臣龁諥ꆾ臣䢮릂菣벃戼㹲꾂諦鎽苣覜臣ꚁ臣龁㰩牢ਾ†䅈苣袃菣꾂諦鎽臣膀菣莃菣覃菣ꒂ菣貁臩뮎臣鶛鳩ꢁ臣龮돨蒚臣낕臣ꎁ臣蒁苣貁胣릂菣벃戼㹲꾂菣ꆃ苣뎃臣ꪁ臣节뿤颭臣貂臣蒁苣䢋ꮁ胥鎽臣鶛鳩閁苣ꚁ臣讂蓦鎟臣뚊돦ꮁ臣蒁臣膀鳦节戼㹲릊軧蒚臣鞢諥馁苣ꢁ胨袁苣貂苣⢋뻤袁臣膀慐敬敳迥뎁慗杮臣螖賧⢮䉍潩㈠㄰㬱㈠芏藧⦧胣䆂㰯牢ਾ菣ꦂ菣袃菣벃菣뎃ㄯ㔯⠰坆㔯膀귥肯胦⦧胣亁⽊㘷隃苣략뫦⦐胣亁⽃㤹ꎭ꿧Ꞁ膀迥뎁慃⽬㤰戼㹲⠊菣��뗨邺놔鷦꺁䅈꺁苣龃菣뢅藩鞈꿦莼臣覂胣鎁臣릂臣몤臣貂苣⢋ꇨㆨ⤲胣䎂污〯誏臣亳⽊戼㹲㜊꺁䅈臣膀귥肯胦ꪠ䍎㤯꺁䅈臣钯볨鞁臣ꢁ臣膀藥鎽臣鶁苣麁苣㞌⸹薼迥뎁㈸㔮볯꺁苣龃戼㹲躃藩超裥貐룤Ꞁ苣놅鳦馁苣芀郥颧臣膀䩎㜯ꢁ믤趉臣覂뻥낒臣ꚁ臣讂귥肯胦ꪠ坆㔯ꢁ臣鎖戼㹲꺁郥肸胦ꚺ臣㢯⸳薼臣芁臣龁胣鞁臣鞁臣貁苣膀臣覂臣ꎧ黦馁苣ꢁ胣鎁苣覂臣뾂菣醃苣ꪳ雩㲓牢ਾ臣肜ꓥ꺁郥肸胦ꚺ臣膀䅈苣袃菣꾂菣ꆃ苣뎃룤ꮁ귥ꢜ臣⢗慃ぬ뺯䍎㤯鶼㠸㤮볯貐룤Ꞁ主⽊㰷牢ਾ뺯䍎㤯鶼ㄹ㘮볯貐룤Ꞁ主⽊㘷꿥䚾⽗〵볯㦝⸰薼郥肸胦⦧胣肸雦膀菣뾂뗨邺臣䢮꺁菣莃菣覃戼㹲ꆃ苣뎃臣膀귥肯胦䢧꺁菣莃菣覃菣ꒂ菣ꢁ臣龮돨蒚臣낕臣讂䌨污〯뺯䍎㤯鶼㜶ㄮ볯貐룤Ꞁ戼㹲㬊䩎㜯뺯䍎㤯鶼㤶㜮볯貐룤Ꞁ主⽊㘷꿥䚾⽗〵볯㚝⸹薼郥肸胦⦧臣ꢁ臣躘苣讁臣ꪁ苣芀菣袃戼㹲ꞁ臣鶁臣몇迧ꮁ〳맥銂뛨袁苣钚臣誂臣芁苣ꮁ苣讁臣辂苣骁胣隃苣략뫦꺁ㅈ臣膀귥肯胦䢧ꮁ戼㹲뺯臣ꚁ苣誂苣銺臣ꮁ꿥鞁臣꾁苣讁臣颫臣貐룤Ꞁ뫥銂ꓧ馁ꢅ䅈鶼ㄹ〮볯貐룤Ꞁ颃菣覃菣㲉牢ਾ菣ꒂ菣鶼㔸㤮볯貐룤Ꞁ릂菣벃苣覃菣ꒂ菣鶼㐹㘮볯貐룤Ꞁ芀臣龁臣ꎁ臣膀慃⽬㤰蓦鎟设戼㹲袁臣膀楐慣苣꺁雦꺌倨潲⁣慎汴䄠慣⁤捓⁩⁕⁓⁁〲㈱※〱㨹㔲㌷㠭芏藧⦧臣麡볤鞁臣ꊽ臣㲧牢ਾ胣亁⽊㘷菣꾂菣뎃臣것苣钃苣뎃菣꾁胣䎁污〯鶛鳩趉臣䢫릂菣벃苣鞊뷤꺁ꋥꂊ苣貵꣩鞁臣꾏戼㹲붃胦貁臣讂胣㲂牢ਾꇨㆨ㨲戼㹲䌊污〯ꪠ胣亁⽊㘷ꃦ膀䍎㤯ꪠ胣誏臣䚳⽗〵ꃦ꺁ꇨ莐蟥蚛듧ꊂ菣躃藩超裥钯볨㲃牢ਾ䐼噉邀ꇨ醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㌱㰹愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖 丠⽊㘷䠠ꢁ慃⽬㤰䠠ꢁ臣麡볤Ꞁ誏臣亳⽊㘷䠠ꢁ坆㔯‰䅈臣鎖臣뢛臩ꚺ銂胨꺅臣ꚁ胣䎁戼㹲愊⽬㤰臣꾃苣膃菣ꖎ꣧趉臣膀䩎㜯꾃苣膃菣銂迥醁臣뺯뇨貁ꧨ꾃苣膃菣銂迥醁臣蒁臣蒁꿥ꆱ戼㹲袂苣节ꯩ蒁諥ꆾ臣릂菣벃苣趏뿥Ꞁ諦鎽苣覜臣讂臣ꦁ臣讁苣躘苣讁臣鞁臣芀㤱㘷菣꾂菣뎃苣㲒牢ਾ迥醁臣讀뷤⢓鶼〲놔鷦꺁ꇨ薸苣膀ꧨ꾃苣膃菣銂迥醁臣蒁臣蒁맥ꊽ苣肸蟨閁臣龁胥鎽渨볯㆝戼㹲㔊놔鷦꺁ꇨ薸臣钯볨鞁臣芀䡣⼶誏臣亳⽃㤹臣뺯臣讂뗧릂杉鮊뻤銂䱅卉ꮁ苣誂뇦骮臣龁胣㲂牢ਾ䡣⼶‱䅈苣뎃菣꾂돨꾁胣䢁릂菣벃苣銂郥肂臣膀㙈菣莃菣銂郥뺁臣蒁胣銃菣꺁㙈䤠噁臣꺁鯦㲝牢ਾ鳩꺁迥붃胦꾁뷤蒁臣ꞁ胣鎁臣뾂菣醃苣ꪳ臣膀鳦醿ꓧ閁苣龁苣蚁臣膀苣ꮃ菣鞃‱䅈苣袃菣꾂戼㹲邵郥鞊뷤꺁ꓦ몇臣龁苣꺁鳦ꢔ臣蒃菣ꮃ臣鞁臣꺁뷥늉苣鲞臣馁设臣낁胣傁捩覂臣螖賧⢮牐捯戼㹲 慎汴䄠慣⁤捓⁩⁕⁓⁁〲㈱※〱㨹㔲㌷㠭芏藧⦧��閡釨ꪁ臣ꢁ臣膀䩎㜯꾃苣膃菣ꮢ軦꺨胨㲅牢ਾ臣膀䡣⼶‱䅈臣뺯臣ꚁ꿥ꞅ꿥ꆱ臣钯臣ꚁ鳦辄臣誸飦鞁臣䦟䝧뗧릂諥ꆾ苣覜臣ꚁ臣龁뎛㤳⥁戼㹲芀꒾雩ꞁ귥肯胦产⽃㤹䠠ꮁ꿥馁苣䦋䝧뗧릂諥ꆾ臣覜蓦꺷臣颭鳥鮁臣膀臣꺁迧ꆱ臣䢌릂菣벃戼㹲꾂諦鎽臣릉闧蒚臣芁苣鎁臣貁ꓧ閁苣龁뎛㤳⥂胣ꖅ触꾏菨ꪁꧨ首臣貸냥ꞁ臣讂臣膂胣䎁污〯戼㹲㤊菣꾂菣뎃軦꺨觥誏臣䎳污〯꾃苣膃菣ꖎ꣧貾ꇨ薸菣벃菣銂胣ꆸ雦꺁ꧨ首臣ꖅ触꾏菨ꞁ臣讂戼㹲ꆸ雦꺁뻧꺁藥ꚁ臣ꎂ胨⢅䩎㜯꾃苣膃菣ꮢ軦꺨胨鶼⼵〲뺯藧뺯뇨鶼⼷㔱讁苣鲽ꏨ鞁臣芀臣㲝牢ਾ臣貾胣蒐胣꺁뻧놔鷦꺁慃⽬㤰菣꾂菣뎃軦꺨觥鞃菣ꮃ臣覂臣䦮䝧뗧릂諥ꆾ苣排㙈ㄯ迥뎁䍎㤯‹戼㹲䠊ꮁ꿥鞁臣몱껥鞁胣鶁苣覂臣膀胥薀臣ꎂ胨讁苣麛迥閁苣龁菣벃苣銂귦몢臣趏飦鞁뎛㤳誏戼㹲뎁㤳⥂胣鞁臣貁臣ꚁ胣许뗦꺁铧钀臣뾽铧閁苣鞾苣鎁臣銂뿤벨臣龁胣龮髩膀䩎㜯꾃苣膃菣㲳牢ਾꋨꖎ꣧薀菣벃菣꾁胣뺯藧鞃菣ꮃ臣钯臣ꚁ臣ꪁ苣誸飦鞁臣掟㙈ㄯ䠠ꮁ꿥馁苣芵苧鮊뻤銂ꓧ鞁戼㹲龁뎛㤳⥃胣鞁臣鞁臣貁苣膀臣꺁꒾雩ꞁ䍎㤯‹䅈臣뺯臣讂杉芵苧鮊뻤ꮁ럥꾁귥ꢜ臣ꪁ臣㲋牢ਾ臣龁뎛㤳⥄胣鎁苣覂臣螃菣뾂臣膀䩎㜯꾃苣膃菣ꮢ軦꺨胨貁胣䎁污〯꾃苣膃菣銂迥醁苣趉戼㹲ꮁ胣誸飦鞁臣鮊뻤꺁諦䢗릂菣벃苣鞊뷤銂鳦鞁臣蒁臣鎁臣銂ꓧ鞁臣蒁苣芀㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶⸸⸲′丠⽊㘷菣꾂菣뎃ꋨꖎ꣧薀臣膀慃⽬㤰菣꾂菣뎃軦꺨觥ꮁ胣䎁污〯ꮁ꿥馁苣늘뻥蒚㱈牢ਾ䥁諥ꆾ苣覜臣ꚁ臣龁㰩牢ਾ†䩎㜯꾃苣膃菣것苣钃苣뎃菣ꂁ臣貁慃⽬㤰臣뺯臣讂飩ꆾ髧䢄䥁諥ꆾ苣覜臣ꚁ臣龁룤릖胣꾃戼㹲꾂菣뎃軦꺨臣貂臣蒁臣蒁꿥ꆱ臣鶁苣銂鳦鞁臣蒁臣讁臣龁뎛〴⥁胣鞃菣ꮃ臣貂臣䢟䥁뗧鲞臣㲮牢ਾ뿤베胦銂蛥뎁뿤벨臣讂臣膂臣膀ꧨ鞃菣ꮃ臣ꮐ臣貂苣蒐胣꺁胥鎽铧ꖝ臣股룦銂铧蒁臣膀慃⽬戼㹲《ꮁ꿥鞁臣䢦䥁苣莃苣ꒂ苣龮雦鞁臣芀뗧릂諥ꆾ臣貐꟦膀뗧鲞臣膀룤ꮲ胦貁臣誂胣讁臣覜蓦㲏牢ਾ臣芁苣膀菣벃菣股룦貁鯩ꎛ苣ꎭꋧꮁꇨ馁苣꺁臣芁苣鎁臣銂ꓧ鞁臣蒁苣⢋鯥㒳䈰芀臣ꆁ苣꺁戼㹲ꚩ雦ꮁ苣閃菣뎃苣⾹㘷苣ꒂ菣릂䠨丶⤴臣뺯臣讂䅈뮴胦꾁ꛨ龯臣貂臣膀臣꺁꿥ꆱ苣膀臩뮎臣㲫牢ਾ㙈苣ꒂ菣릂臣鶛鳩閁苣ꚁ臣ꪁ臣鎁臣貁ꋧ趪臣貂臣⢟鯥㒳䄰芀臣ꢁ苣讂臣膀臣貂苣꺁뗧鲞臣㲋牢ਾ苣膀䩎㜯꾃苣膃菣ꮢ軦꺨胨貁胣䎁污〯꾃苣膃菣ꖎ꣧趉臣膀慃⽬㤰䠠꺁郧뚊菣莃菣ꮁ뗧袐戼㹲馁苣䢋䥁諦鎽臣鞢諥銂뗧鎨臣龁臣ꢁ臣몢ꫨ閁苣讂胣ં䐼噉邀볯颼볯馼胣㲑䐯噉ਾ㘨㠮㈮㌮†諦䢗릂菣벃苣鞊뷤鮊뻤꾁胣䎁污��꾃苣膃菣ꖎ꣧貾臣膀꿥ꞅ꿥ꆱ臣鞢諥鞁臣⦟戼㹲 丠⽊㘷菣꾂菣뎃臣超雧鞁臣讀뷤ꢁ郥颧胣炁〲㤰䤠噁臣龄鿦鞁臣讀뷤貁胣誸飦鞁臣鮊뻤꺁諦㲗牢ਾ䅈苣袃菣꾂諦鎽苣覜臣讂臣蒁臣뎦꿥⢟뻤袁臣膀楐慣苣꺁雦꺌倨潲⁣慎汴䄠慣⁤捓⁩⁕⁓⁁㰲牢ਾ㄰㬲ㄠ㤰㈺㜵ⴳ⤸迥ꞅꮁ苣ꎁ臣膀慃⽬㤰臣꾃苣膃菣ꖎ꣧节諦䢗릂菣벃苣鞊뷤鮊뻤銂ꋥꂊ戼㹲閁臣讂臣ꦁ臣讁苣뾪臣讂臣ꢁ臣ꪁ臣龁胣鎁臣꺛髧꺁臣膂臣膀꿥ꞅ꿥ꆱ臣亨⽊㘷菣꾂菣뎃ꋨ㲫牢ਾ軦꺨胨꺁룤릖臣膀〲㤰맥ㆴ袜臣覂〲〱맥ㆴ鳦뺁臣꺁雩膀룤ꆾ慃⽬㤰菣꾂菣뎃苣閊룤鞁臣芀㰶牢ਾ胣㢜苣袜뻥膀꿥ꆱ臣膀臣꺁菣꾂菣뎃軦꺨뻥꺁軦股苣鞁臣节苣蚁臣膂臣뮈臣ꚁ臣龁胣亂⽃㤹䠠戼㹲䄊迥뎁䡣⼶‱䅈臣뺯臣讂뗧릂杉鮊뻤銂胣ꆸ雦꺁뻧놔鷦꺁菣꾂菣뎃軦꺨뻥鞃菣ꮃꇨ薸臣ꒁ臣㲄牢ਾ臣膀䱅卉ꮁ苣誂뇦骮臣龁胣䎂污〯꾃苣膃菣ꖎ꣧貾臣蒐胣꺁䅈苣뎃菣꾂돨ꮁ꿥馁苣䦋䝧諥ꆾ戼㹲꺁ꓥ隌胥螎苣袨껧馁苣龁苣ꮁ胣鎁苣覂苣膀鯥㎳䈹迥뎁㤳ꞁ뇦骮臣貂臣蒁苣꾃苣膃菣ꖎ꣧趉戼㹲꺁胥ꢁ꿦莼臣龁ꢡ㌱芀꿥ꞅ꿥ꆱ臣芵苧䦹䝧諥ꆾ臣膀䡣⼶ꮁ꿥鞁臣㊦胥袂苣节ꓥ趁臣誸飦㲇牢ਾ臣龁臣膀䩎㜯꾃苣膃菣ꮢ軦꺨胨꺁杉芵苧鮊뻤꾁ꋥꂊ臣ꪁ臣ꎁ臣芀뫤뎃臣貂臣袂臣ꮁ胣ꦁ戼㹲ꆁ苣꺁뻧ꞁ苣膀䍎㤯‹䅈臣뺯臣ꚁꋥꂊ臣뎦꿥閁苣ꪁ臣ꎁ臣芀臣貂苣꺁菣벃苣꾁胣䎁污〯꾃戼㹲꾂菣뎃軦꺨苣뺁臣膀諦䢗릂菣벃苣鞊뷤꺁諥ꆾ苣鞢諥閁臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂臣膀臩뮎臣享⽊㘷戼㹲ꮁ鯦늜臣貂臣鎁臣貁臣蒁胥鎽臣꺁臣鞢諥閁臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂胣㲂牢ਾꇨㆨ㨳戼㹲上⽃㤹䠠誏臣掳㙈ㄯ䠠ꮁ꿥馁苣䎋污〯꾃苣膃菣ꖎ꣧貾杉芵苧鮊뻤꺁ꓥ隌戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰〴⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯邼胣㲑䐯噉ਾ㘨㠮㈮㐮†䩎㜯袏臣䎯污〯꺁菣꾂菣뎃軦꺨臣膀鯧貐䅈苣袃菣꾂迥뎁闧꺨䅈菣莃菣銂郥肂戼㹲Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ꿥馁苣궸鋥鞊뷤銂ꋥꂊ臣鮁臣⦟戼㹲 ꆬ臣膀䩎㜯袏臣䎯污〯꾃苣膃菣ꖎ꣧貾臣貵꣩閁苣讂諦䢗릂菣벃苣鞊뷤꺁ꋥꂊ臣膀鯧貐㱈牢ਾ릂菣벃苣誏臣낕꣧鲺黥⢋敨整潲畳瑢灹捩䠩颃菣覃菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ꿥馁苣궸鋥㲌牢ਾ諥ꆾ臣鞢볥ꮁ꿥鲿臣讂臣ꦁ臣讁苣躘苣讁臣鞁臣芀臣貂苣鲤꣨馁苣龁苣ꮁ胣鞃菣ꮃꇨ薸苣ꢔ戼㹲蒁臣膀䡣⼵‱㍎苣ꒂ菣릂臣뺯臣ꚁ菣ꒂ苣궃룤貒苣莃苣ꒂ苣龮雦鞁臣芀䡣⼵‱㍎苣ꒂ菣릂臣㲯牢ਾ胣䢁‵䅈菣莃菣覃菣ꒂ菣膀剐‸䅈苣袃菣꾂胣誏臣䶳獩⽳㘰铧ꖝ臣亮銂郥肂臣ꞁ胣늩苣ꒂ菣릂戼㹲銂铧蒁臣膀䅈苣袃菣꾂룤貒諦鎽臣��鳥銂ꓦ몇臣龁胣掂㙈ㄯ臣뺯臣讂杉芵苧鮊뻤螃菣뾂臣肸戼㹲뒇臣ꚁ胣亁⽊㘷菣꾂菣뎃ꋨꖎ꣧薀铧ꖝ臣股룦节臣龁胣䎁污〯꺁菣꾂菣뎃軦꺨觥꺁꿥ꞅ꿥ꆱ戼㹲袂苣节ꇩ鞑臣랼諥ꪁ䡣⼵‱㍎臣뺯臣讂룤貒諥ꆾ苣몤臣龁㈨㌴뺯〹芀臣讁臣ꪁ臣覂胣뺯藧㲧牢ਾ꿥ꆱ臣讁胣꾃苣膃菣ꖎ꣧貾臣궸鋥鞊뷤꺁ꋥꂊ㠨〱胣㦁讁苣誸飦⦇苣貵꣩鞁臣讁臣龁뎛ㄴ⥁戼㹲芀䩎㜯꾃苣膃菣ꮢ軦꺨胨꾁胣䎁污〯꾃苣膃菣ꖎ꣧趉臣뺯藧뺯뇨袂苣节趀볥鮊臣芁苣䎋污㰯牢ਾ㤰臣뺯臣讂룤貒諥ꆾ苣覜臣ꚁ臣龁㤨뺯〳芀臣ꆁ苣꺁뻧节胣䎁污〯꾃苣膃菣ꖎ꣧貾臣䎮污㰯牢ਾ㤰臣뺯臣讂룤貒諦鎽諥ꆾ臣鞢諥銂뗧鎨臣龁뎛ㄴ⥂胣뺁臣膂苣ꢁ胣鎁苣覂臣螃菣뾂臣膀㤱㰷牢ਾ誏臣㊳〰‹ㅈㅎ苣ꒂ菣릂臣꾃苣膃菣ꖎ꣧ꮁ苣ꎁ臣鞢諥鞁臣鞊䅈苣袃菣꾂諦鎽臣膀鯧貐䅈苣㲹牢ਾ菣벃苣誏臣낕꣧鲺黥䢋颃菣覃菣ꆃ苣뎃苣覜臣讂苣ꒂ菣릂苣궸鋥馁苣붃諥꺁ꋥ랼臣뺯뿥馁苣㲋牢ਾ臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂胣ં䐼噉邀볯颼볯醼胣㲑䐯噉ਾ㘨㠮㌮†뗧隫㰩牢ਾ†臣꺁껥붖뻤꾁胣ꦁ臣覂苣꒏藥蒚菣뾂ㅈ䠠銂郥肂㤱㘷迥뎁〲㤰䠠丱‱菣꾂菣뎃臣膀䅈苣㲹牢ਾ菣벃苣鞊뷤꺁諥ꆾ苣鞢諥閁臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂臣ꢁ苣몤臣芀臣覂臣膀菣꾂菣뎃軦꺨臣袂臣ꚁ戼㹲颪駧閁苣讂諦䢗릂菣벃苣鞊뷤꾁胣뾯釥貁闩蒁苣蚁臣鶀苣貂胣骤꟦ꪁ䅉ꪠ臣뺯臣讂菩蚈髧㲄牢ਾ飩ꆾ苣邏뻤馁苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶‹龮雦设㨹駦趁髧ꪁ苣뎃菣ꮃ苣뎃苣꾃苣膃菣ꢁ臣ꚁ臣궂菣ꦃꇨ莐蟥蚛듧讧꿧ꦉ㰩牢ਾ†臣꺁껥붖뻤꾁胣겋觧ꪁꇨ莐蟥蚛듧颃菣覃迥뎁苣袃菣꾂뗧袐臣銂郥肂苣뎃菣꾂돨ꞁ臣讂胣㲁牢ਾ苣ꆃ菣股郧鶇鯩ꂴ挨䅈讧꿧ꦉ臣꾃苣膃菣ꖎ꣧ꮁ苣誂ꫨ몙臣貂苣鎁臣貁臣趁苣릂菣벃苣릉戼㹲낕髧超雧鲿귧꺁飩ꆾ諥鮊苣몤臣芀㰊䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶⸹‱邝雦誏臣릖돦⦕戼㹲⠊⸶⸹⸱‱내菨誏臣Ꚃ苣ꮃ苣⦹戼㹲 ㈠㌹誏臣䶳䍄내菨銂呁䍃臣覂藥讉臣膀菣ꮃ菣莃苣꺁铦覤苣벃苣ꮃ鿥난䐨䕍⥍迥뎁鳦辰뿥㲅牢ਾꃩ릟鳥⢰룤릖臣节楇换붣궸臣궶賦鞁臣芀郥薀臣膀〱볯躃믤Ꚃ苣股룦⢅祈汃湯⥥胣誏臣ㆳ〰戼㹲ꚃ菣莃菣⾈汭臣骃菣랂菣뎃ㄭ〰볎⽧汭臣릂菣것菣袃菣ꒂ苣뎃倨湥匯牴灥‬楇换⥯苣鲣藥鞁戼㹲龁胣ં䐼噉邀볯颼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣䆹閃苣벃菣ꊃ菣麃苣⾹⼱㤱㜴䘨ㅍ誏臣䆳趃菣螃菣ꦃ菣袃㘯㈰㈯戼㹲《㤰苣麃苣릂苨ꞁ뛧ꎻ臣膀臣꺁뻥膀〱韦ꊽ臣몙苨辶跥궸臣㒧芙雩邈闩閁臣龁胣骤ꇥ몟胦螈戼㹲궖菩趽臣꒙軥閁苣龁뷤薗軥Ꞁ⽁菣袃菣ꂃㄯ〲⼳㐰嘨ぎ⤴债㡒㈠㘺蛥蚛郥��苣ꒂ菣릂设臣㲈牢ਾ臣膀瑓敥覂臣螖賧⢮〲㤰‬⁊楖潲⁬㌸ㄺ㐷ⴲ㜱㌵芏藧⦧臣膀⽂뇥ꊽㄯ⼶㤱㠸苣ꒂ菣릂臣銂戼㹲膀臣貂臣貂胣ㆁꖗ뷩꺁駧늂뛩떍룤膀㜳蓢ꞁ㠴駦鎖迥꾁㌳蓢ꞁ㈷駦鎖裦랕臣鮁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖 蒵迦袁苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣銂룤風臣袂臣ꪁ迥뎁믤趉臣風볨閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣ꪃ菣벃戼㹲릂苣Ꞃ菣蚃苣莃苣릂돧ꮁ苣誂铧龔臣龁设臣낁胣冁極汮癩湡苣꺁雦꺌㈨〰ⰵ䨠嘠物汯㜠㨹㐸戼㹲㌊ⴱ㐸㤳芏藧⦧胣䢂릂菣벃苣⢯剐Ꚃ苣ꮃ苣놔鷦⦥臣誸臣䢫Ꚃ苣ꮃ苣꺁䅈郧뚊菣莃菣覃菣ꒂ菣㲳牢ਾ苣몙迧馁苣Ꚃ苣ꮃ苣ꞁ臣讂䡣⼹‱ㅎ苣ꒂ菣릂臣膀䡣⼵⠱㕈菣莃菣⢉乖㐰膀ㅈ苣袃菣꾂丩㰱牢ਾ苣ꒂ菣릂臣銂胣ꖻ觥ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣꺁臣貐꟦꺁뷥ꞁ菣릂苣ꖃ菣鞁臣⢟뻤袁臣膀楐慣苣꺁戼㹲螖賧⢮〲㈱‬乐十唠䅓ㄠ㤰㈺㜵ⴳ㔲㠷芏藧⦧胣如䵁䠭Ꚃ苣ꮃ苣銂뷤붣臣讂臣膂臣膀⽂뇥ꊽ㰯牢ਾ㘱ㄯ㠹⠸呗夠䵁 䅈臣내菨隤菣ꆃ苣뎃苣䆒鞃苣ꮃ菣ꪃ苣⾳⼸㤱㐳苣ꒂ菣릂䠠꺁꿥鲿臣讂菣㲉牢ਾ菣ꒂ菣ꢁ뷧鮏臣龁设臣낁胣䢁楡苣꺁雦꺌㈨㄰ⰱ䨠畯湲污漠⁦楶潲潬祧㠠㨵㠶㈳㘭㐸⤳迥ꞅ戼㹲⤊胣隻臣㞮臣꺁呗夠䵁苣ꒂ菣릂苣낂菣뎃菣銂苣벃菣馁苣ꪃ菣벃苣뢂苣趃菣ꎂ菣꾂菣ꦃ苣龃菣㲉牢ਾ苣ꖻ觥꺁ꃧ뚩臣讧꿧鞁臣⢟뻤袁臣膀慈覂臣螖賧⢮〲㠰‬⁊楖潲⁬㈸ㄺ㔰〸ㄭ㔰〹芏藧⦧胣㲂牢ਾ菣릂苣ꖃ菣꺁뻥膀䡣몙迧蒵迦袁苣ꒂ菣릂苣膀〱韦ꊽ臣몙苨辶跥궸胣㎁莄臣㒧芙雩鞢껦閁戼㹲鮁臣芀䅙ⵍ䅈苣ꒂ菣릂苣膀ꖗ뷩꺁駧늂뛩떍룤膀㌳蓢ꞁ㈷駦鎖裦랕臣鮁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖 蒵迦袁苣ꒂ菣릂迥뎁蟩龔黥Ꚃ苣ꮃ苣꺁諥ꆾ苣膀룤風臣袂臣ꮁ胣咁䍐袃菣鞃苣뎃臣颭鳥许戼㹲膀䑍䭃듧麃䄨䍔⥃臣겸껥鞁臣芀䱅卉ꊂ菣뮂苣ꞁ뷤ꢔ臣讂臣膂臣膀䡣⼵‱ㅎ苣ꒂ菣릂苣㎒㰰牢ਾ볯랂菣隳苣莃苣ꞃ菣誸臣ꢃ裥뺲ꏨ鞁臣芀䡣⼹‱ㅎ胣掁㕈ㄯ丠膀迥뎁䵆Ꚃ苣ꮃ苣銂该超臩㲠牢ਾ뿥蚈鯩ꞁ닧붣臣膀駩Ꞁ꿥ꞅ菣꾂菣뎃臣鞁臣뾽铧閁苣讂苣蚁臣膀䉐ꮁ룥袇臣龁ㄨ㐺〰⤰菣㲛牢ਾ菣ꂃ苣ꮃ菣銃菣ꞁ룤뮴賥鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶⸹⸱′挠㙈ㄯ迥뎁䡣⼹뾂菣醃苣ꪳ꟦覯觧꺁뷤붣㰩牢ਾ†迥뚺胦控㙈ㄯ迥뎁䡣⼹뾂菣醃苣ꪳ苣膀룤風臣袂臣ꪁ迥뎁믤趉臣風볨閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣邃戼㹲궂菣궃苣ꒂ菣릂駧뺏돧銂铧蒁臣龔裦閁臣龁设臣낁胣傁捩覂臣螖賧⢮〲㈱‬乐十唠䅓ㄠ㤰㈺戼㹲㔊㌷㈭㜵⤸迥ꞅ芀냧钽臣낿臣讂臣膀菣궂菣궃믨뮧菣꾂苣벃苣肜裥ꮁ뷤붣臣膀곦蒁臣膀晓㰹牢ਾ듧麃臣꺁菣꾂菣覃臣袃菣뎃苣閃苣꾂苣ꞃ菣銂ꇨꪁ臣龁胣鶁臣貾胣蒵迦袁菣궂菣궃苣ꒂ菣릂戼㹲銂铧蒁臣膀楈桧䘠��내菨ꮁ〱臣䶮䥏臣龄鿦閁臣龁胣龄鿦꺁㘹駦鎖뻥膀룤薸苣麛迥鞁胣鶁臣㲮牢ਾ뻥膀楎中䅔꣦芄儨慩敧⥮臣ꢁ苣ꮁ莄臣㊧駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣膀楈뾂苣隌뗧鮏臣授䅈苣㲿牢ਾ菣醃苣ꪳ苣뺲ꏨ鞁臣芀苣ꦃ菣벃苣ꮂ菣ꂃ臣薅ꇥ鞁胣鞴뗦鞁臣貾胣炁⁈꺁뫦몇菣莃菣ꆂ菣⢼㰵牢ਾ洰⁍慎䠲佃膀〳洰⁍慎汃胣㊁〵䵭苣龃菣뺂菣ꮃ궸臣뚺蟥閁臣龁胣뾂菣醃苣ꪳ苣ꮐ苣鞃菣㲼牢ਾ菣뮔裥銂䉐궸臣邃菣閃苣벃뫤鮏臣膀〱欭慄裥邭돨辇苣莃菣ꪂ菣銂鳦馁苣䆋業潣⁮汕牴ꂁ戼㹲莿裥ꊛ菣ꎂ菣뾂菣ꚃ菣莃菣⢈楍汬灩牯⥥苣ꢔ臣ꚁ胣릂苣뎃苣込菣놂菣袃菣벃苣벃룤ꞁ뿦꺸戼㹲鞁臣芀苣뎃菣꾂돨꺁듧ꚺ迥뎁苣ꒂ菣뎃菣ꎂ菣ꎂ苣膀䑓⽓䅐䕇胣꾂菣랂菣鎟觨膀迥뎁苣Ꞃ苣㲹牢ਾ苣뎃菣궃菣袃臣袂苣ꚩ꣩鞁臣芀鳦芵髧ꪁ苣뎃菣꾂돨莿뫥銂菣ꦃ菣覃菣ꦂ菣覃ꧨ겖臣몱껥鞁戼㹲龁胣ં䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾ㘨㤮ㄮ㌮†该ꦉ㰩牢ਾ†该ꦉ臣膀ꏩ貤迥뎁냦銂蟨놔臣ꦈ铧馁苣鎁臣銂꣨鞁胣ㆁ芙雩꺁飦⾎髦ꢑ鳦ꞁ뛧膌臣龁胣ꢅ戼㹲ꚁ臣뮼藨薆蟥꺽臣龁苣ꮁ胣貛臣㚮胣㢜胩ꊽ䅂䉌振菣Ꚃ苣⢹慊正潳⁮慌潢慲潴楲獥銂⸰洱꺁戼㹲놂苣龃菣⾳苣랂菣뢂菣⢳⸰㔱杭苣뾂菣뎃迥뎁⸰㌰杭苣랂菣뢂菣⦳臣릅藨薆䤨⥐돦蒰臣뮺藩鞁戼㹲龁胣ં䐼噉邀볯颼볯馼胣㲑䐯噉ਾ㘨㤮ㄮ㐮†菣꾂菣뎃軦꺨迥뎁蓦鎟껥鎨㰩牢ਾ†鳦龄뷤꺁鲀놀뷩꺁鯩䊌䱁⽂麃苣릂臣膀䡣⼹뾂菣醃苣ꪳ苣膀苣뢂菣邃菣袃㡒㠴䤨癮瑩㱲牢ਾ杯湥꺁귥ꢜ룤ꞁ볩钅蛥ꮁㄨ田⥧胣誏臣䶳㕆颧苣뢂菣邃菣袃䤨癮瑩潲敧⥮臣芁苣䆋摤癡硡臣㲨牢ਾ臣节臣릅藨薆臣⢫〱杵꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣芀裥麛藥ꮖ臣㎮胩鎖뻥膀该ꦉ苣排㙈ㄯ苣뎃菣꾂돨袏戼㹲꾁卂⡁楂副摡ꞁ뿨ꂊ藥ꮖ臣龁胣붿諥超雧꾃苣膃菣ꖎ꣧节볩钅蛥⢅〱杵誏臣릅藨薆ㄨ田⥧戼㹲ꮁ諦躸臣龁臣膀菣ꪃ㩉銂苣뢂菣邃菣袃䤨癮瑩潲敧⥮臣鞁臣뾽铧鞁臣芀룤뮴賥䚖ㅍ苣ꒂ菣릂戼㹲⠊由⥧苣㖒田꺁껥辇臣붙胦뺯藧ꢁ臣ꚁ귧覂蛥閊룤鞁臣芀뿨ꂊ藥ꮖ臣㎮胩鎖뻥膀该ꦉ臣覂軦股戼㹲鞁胣股룦銂鯥躏臣膀该ꦉ苣㖒䰠㕄꺁䵆Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ蓦鎟臣鮁臣芀蟩辇苣膀蓦鎟뻥ㆌꖗ雩ꊃ戼㹲讃苣ꪃ菣낂臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†믤꺁껥鎨臣誁臣ꚁ胣開觧銂胣掁㥈ㄯ苣뎂菣覃臣讂菣ꦃ苣龃菣䒉䅎㠨田膀牔䝩楲膀臩뮳※戼㹲䤊档牯䴠摥捩污匠獹整獭ꞁ裥麛藥ꮖ臣膀곦蒁臣㎧胩鎖뻥膀菣ꪃ㩉ꢁ臣节臣뮼藨薆ㄨ田⥧迥㲊牢ਾ臣训苨薆ㄨ田⥧諦躸臣貂苣掋㙈ㄯ迥꾁䡣⼹⠱꿥ꞅ뾂菣醃苣ꪳ臣붿諥超雧鞁臣芀놀雩貾胣掁戼㹲䠊⼵袏臣掯㥈ㄯ뺯藧⦧苣뎃菣꾂돨ꞁ뿨ꂊ藥ꮖ苣낹苣钿臣龁胣뺯藧開觧ꮁ苣貐臣辁胣掁㥈ㄯ苣㲒牢ਾ苣벃菣��馁苣䒋䅎苣䒒䅎鯩鞰ꧧ钭臣龁臣膀ꚇ뷧꒾臣貐꟦꺁雦閳臣⦧卂ꞁ麛뿨ꂊ藥ꮖ臣龁胣붙戼㹲Ꞁ꿥ꞅ该ꦉ臣膀룤뮴賥䚖ㅍ苣鞁臣꾁剐Ꚃ苣ꮃ苣⢹츱枼袏臣ㆯ볎꺁䡰丱肸뻤릂菣ꪃ菣袃菣㲯牢ਾ苣膃菣꺁臣骁苣讁苣训苨薆臣鞏껥鞁臣⢟䕂⥉胣ꆬ臣ꞁ胣붿諥超雧꺁鲀鎖뻥膀该ꦉ苣膀‵㱌牢ਾ㕄꺁剐节臣辁臣䚯ㅍ胣袏臣ㆯ‰䑌〵臣炮ㅈㅎ苣ꒂ菣릂臣龄鿦閁臣龁胣龄鿦꺁㠴迥뎁㐲駦鎖戼㹲趉臣膀䑃⬸吠듧麃駩뮎臣뾽铧閁苣讂该ꦉ苣膀〳츰枼臣鞊䑃⬸吠듧麃諦鎽䄨䍔讁苣벳藥鞁戼㹲龁菣ꒂ菣ꪃ菣벃菣ꪠ⸲㌴铧ꖝ臣节臣⦮臣ꚇ뷧鞁设臣낁胣䶁䰮‮慓敬꺁雦꺌㈨〰ⰰ䤠瑮‮⹊戼㹲 浉畭潮桰牡慭潣⹬㈠㨲〷⤷迥ꞅ膀‵䑌〵臣傮㡒苣ꒂ菣릂臣龄鿦閁臣龁胣趇蟩銂胣龄鿦貾㰱牢ਾꖗ雩ꊃ菣뾂菣뎃苣鞁臣芀〲볯ꮂ菣袃苣閃苣ꢅ臣꺁苣ꒂ菣릂臣뾽铧鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 隻臣龮꣩꺁臣膂臣膀菣Ꚃ苣ꮁ䅙ⵍ䅈迥꾁呗夠䵁苣ꒂ菣릂苣ꖎ꣧鞁胣ꆬ臣ꞁ놀雩貾胣鶃戼㹲ꪃ㩉꺁귥ꢜ룤膀卂袏臣掯㙈ㄯ苣뎃菣꾂돨銂귧覂蛥誏臣릅藨薆臣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣芀鳦龄戼㹲鲽该ꦉ臣膀뿨ꂊ臣뺯藧ꢁ臣ꚁ臣립觥銂黦龁臣龁胣ꢅ臣꺁该ꦉ臣覂軦股臣膀菣꾂菣뎃軦꺨臣㲮牢ਾ鲀놀雩貾胣㊁〵䰠㕄꺁䡣⼹‱ㅎ苣ꒂ菣릂胣袏臣傯㡒菣莃苣낂菣Ꚃ菣覃臣骤ꇥ몟胦螈雦ꢃ戼㹲趽臣꒙軥閁苣龁〱䰠㕄꺁㨲趆鯩袐뷤䢓Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ蓦鎟臣鮁臣⢟뻤袁臣膀瑓敥覂臣螖賧⢮㰲牢ਾ〰ⰹ䨠嘠物汯㠠㨳㜱㈴ㄭ㔷⤳迥ꞅ芀菣ꮃ菣ꊂ菣螃菣覃臣趸듦隌臣龁䡣⼹‱ㅎ苣ꒂ菣릂ㄨ㱵牢ਾ⥧迥뎁䡣⼵‱ㅎ苣ꒂ菣릂苣膀臩螈臣Ꚃ苣ꮃ苣龄鿦꺁駩Ꞁ꿥ꞅ臣鞁臣膀〵汵臣릮蟩ꞁ귧覂蛥㲅牢ਾ諦躸臣龁胣開觧貁蓦鎟뻥ꮁ臣꺁裥龜뷤趇臣㎮薼뛨銂ꓥꎁ臣뒠郥膀雦궨蛥겂苣覃菣ꒂ菣ꮁ뫦㲖牢ਾ详鞁臣膀该ꦉ苣覮ꗦ뮭臣鮁臣芀〲볯ꮂ菣袃苣閃苣躽韧龎胦꺁䡣⼹‱ㅎ迥뎁⽁菣벃菣ꮃ菣뎃戼㹲袃㘯㈰㈯〰Ꚃ苣ꮃ苣꺁蓦鎟臣뾽铧鞁臣芀臣貂苣㊉臣꺁苣ꒂ菣릂苣ꢔ臣讂蓦鎟臣ꒁ臣ꚁ臣膀戼㹲ꢅ臣꺁꿥ꞅ臣뮭뫤袏臣龮돨蒚臣鎽蟩鮸냥銂ꧨꆾ臣讂臣膂臣膀苣誂苣袃菣뎃苣Ꞃ菣袃臣ꢔ蟩㲏牢ਾ苣뾽铧鞁臣⢟㔲袏臣ㆯ‰䑌〵芀㰊䥄㹖胣邼볯鎼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶⸹⸱‵떅듧邵郥超雧뢐鷧ꊂ菣뮂苣⦤戼㹲 䤠浭汵湯㐠䉈⡘桔牥潭匠楣湥楴楦⥣菣것菣袃臣膀电⽧䱭臣ꪁ苣뺁臣傧卂臣貸蟩鞁臣ꢃ裥뺲戼㹲붣䡣⼵‱ㅎ苣ꒂ菣릂苣肸駦뎂菣蚃苣뎃苣鞁臣芀菣것菣袃苣膀薼蓧芄苨뎹닧ꮜ苣ꮐ苣むㄮ볯㲅牢ਾ睔敥⁮〲倭卂吨䉐⥓臣ㆧ駦鎖菣궃菣궂菣낂臣膀臣꺁뻥膀薼닧뎹苣ꮐ苣咀䉐ꮁ胩骶룥袇臣龁戼㹲麃苣릂ꇨ薸臣ꢁ苣ꮁ胣꒮룦ꞁ芙雩ꒂ菣궂菣馃菣��臣龁胣㎂鯥鞴뗦鞁臣貾胣鞃菣벃菣銂胣ꊂ戼㹲ꮃ苣ꪃ菣릂菣ꆂ苣벃苣⢼偁邵郥鞊菣Ꚃ苣䦹䝧츨階觧낕髧膀湉楶牴杯湥ꢁ臣节臣꒮룦ꞁ芙戼㹲鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀臣꺁뻥膀菣것菣袃苣咒䉐ꞁ麛듦蒵臣膀⵰菣袃菣閃苣讃菣鮃苣閃戼㹲Ꞃ菣袃倨偎⥐鿥ꪳ娨浹摥ꞁ駧늉臣鮁胣め㔮⁍慎䡏臣鲁귦閁臣膀〴渵꺁藥ꚭ꿥ꚺ臣궪臣随戼㹲ꎁ臣芀藥ꚁ臣龮꣩꺁臣膂臣膀祓敮杲⁹⠴楂呯步鞃菣벃菣ꪃ菣肃菣銂뷤ꢔ臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†苣袃菣꾂觧낕髧鞊뷤鮊뻤銂룤風臣袂臣ꪁ䱅卉ꮁ苣誂ꓦ몇臣龁胣릂菣벃苣릉闧蒚迥鲿胦㲧牢ਾ苣骮蟩馁苣龁苣ꮁ胣傁㡒諦龎苣ꢔ臣ꚁ胣䖁䥌䅓菣것菣袃苣뎂菣蚃苣뎃苣鞁臣芀菣꾂菣뎃軦꺨戼㹲銂迥醁臣麃苣릂臣誁臣讂苣袃菣꾂觧낕髧鞊뷤꺁룤貒菨鮊苣鲤蟥馁苣龁苣ꮁ胣股룦銂菣벃菣㲫牢ਾ臣膀藥股룦䦅䝧苣뺲ꏨ鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 䠠‵䅈苣몙迧馁苣북닧邭苣膀믤趉臣風볨閁苣ꚁ臣讂胩誂臣膀臥銲귥떾藥ꊂ菣뮂苣ꞁ뷤ꢔ戼㹲鞁臣⢟뻤袁臣膀慈覂臣螖賧⢮〲㈱‬⹊嘠物汯‮㘸㔺㜷ⴴ㜵ㄸ誏臣亳‮楐慣苣꺁雦꺌㈨㄰ⰲ㰠牢ਾ乐十ㄠ㤰㈺㜵ⴳ㔲㠷芏藧⦧胣떾藥馁苣ꢁ胣북닧邭臣膀菣랂菣Ꞃ菣벃苣것菣벃苣벃苣몙迧馁戼㹲讂胣䦂䝧臣袂苣鎁臣떾藥꺁飩뎮苣膀杉ꚇ뷧鞁臣蒁臣蒁꿥ꞅ臣钯臣龁駧뺏臣醃菣뮂菣蚃菣뢂戼㹲ꢁ臣ꚁ껥辇臣龁胣開觧꾁胣䢁莐諧颃菣覃菣ꆃ苣뎃臣鶛鳩閁苣ꚁ臣ꪁ臣ꎁ臣꺁臣膀臣貂苣꺁戼㹲ꊂ菣뮂苣꾁胣꾃苣膃菣ꖎ꣧ꮁ苣ꎁ臣ꎔ铧閁苣讂苣袃菣꾂觧낕髧鞊뷤貁苣ꒂ菣릂苣궸鋥馁苣㲋牢ਾ꣧ꚺ苣몱껥鞁臣芀菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤䎓㙒㘲膀迥뎁讞苣뎃菣ꮃ苣뎃苣躇铧讞蓦鎟菣Ꚃ苣㲹牢ਾ铧ꖝ臣뺲ꏨ䦽䝧苣뺯藧ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ㘨㤮ㄮ㘮†菣ꦃ菣꾂룦醰룤貒苣莃苣ꒂ倨乒⥁㰩牢ਾ†臣骁胣涁扁臣貸蟩늶苣膀〶胣㢜鞃菣벃苣ꊽ裦颍뷤⢍晰⥵臣Ꚃ苣ꮃ苣⢹䡣丹‱讞苣뎃菣ꮃ苣㲨牢ਾ菣뚂苣ꒂ菣릂ꢁ臣节臣膀呒臣ㆧ駦鎖胣랂苣벃苣벃룤ꞁ菣것苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀臣꺁뻥膀戼㹲Ꚃ苣ꮃ苣誏臣뺲ꏨ䦽䝧럦袐觧銂铧蒁臣膀䑍䭃듧麃臣颍뇥ꮁ胣㊁胩ꞁ胣ㆁꚂ苣ꮃ菣ꦂ菣麃菣袃戼㹲ꞁ蓦鎟臣鮁胣ㆁ蚈꿦ꮁ雩ꂬ髧ꮁ迦誂该讁臣ꪁ臣覂胣㎁莄臣ㆧ駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀꿥㲒牢ਾꓥꪂ菣邃菣것苣ꮁ胣뺯뿥馁苣䦋䝧룥袇뛦銂ꏨ薅臣龁胣㊂蓦鎟뻥ꖗ搨楰ꞁ胣颍뇥銂薼倠䅆ㄯ戼㹲쌊傗卂臣㎧蚈雩몛껥鞁臣芀듧麃苣膀薼䙎龃菣꾂ㄯ韃䉐ꞁ胣劁ꞁ〳裥鎖菣궃菣궂菣낂臣膀戼㹲뚊돦ꮁ뿥颁臣膀臣骁苣讁臣䢮릉闧蒚菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤⢓층枼洯⥌臣ꢁ��ꮁ胣劁ꞁ芙雩ꒂ戼㹲뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀剈ꮁ苣뎃苣ꖃ苣벃菣閁苣龁諦麃苣릂뫤ꆬ諦鎽苣㆒ㄺ〰貸蟩ꞁ뫤ꆬ諦㲗牢ਾ뷤ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣龁胣鞃菣벃苣銂胣咁畲䉥畬骃菣ꪂ苣랂菣벃苣몟돨⢪偋뺤銂铧蒁臣꾏ꛨ隌戼㹲鞁胣趏뿥銂냦鎁냦ꞁ臥ꊭ臣鮁臣芀菣ꦃ菣꾂苣蒐胣꺁諦鎽臣ꒁ臣ꚁ꣨낕臣膀䅭ꪁ臣꺁뻧ꢁ戼㹲钯臣ꚁ胣醃菣뮂菣袃飩뎮苣袨껧鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯鎼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶⸹⸱‷놵꣨ꚭ髧鲤껥⦚戼㹲 놵꣨ꎧ黦銂胣螉臥릂菣ꖃ菣螃菣袃鲤껥⢚牐獩㑭‬片灡偨摡銂铧蒁臣龮雦鞁臣芀鯥㒳䌴臣㲫牢ਾ臣蒁臣膀胥꾁藥ꚁ胣馨뫦꒪럥颻臣꺁맥螝胥ꢁ臣ꚁ菣궃菣袃臣貂臣蒁苣芀铧颭臣꺷臣膀菣낂戼㹲ꦃ菣꾂鳦辄ꓦ骮臣袂苣ꮂ菣ꦃ菣麃苣ꒃ菣龔귥ꎧ黦ꞁ꣨鞮臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†ꒀ苣ꢔ臣龁꟨邞臣ꒁ臣ꚁ臣膀⸰㔰迥꾁臣貂鳦肺臣傮胥銂뗧袨髧覜蓦ꢁ臣ꪁ臣芀裥ꎕ臣膀戼㹲놵꣨蒚臣낕臣讂苣꺁臣몱껥閁苣讂ꃥ袐臣膀苣Ꞃ菣膃臣鲣귦銂뷤ꢔ臣龁胣も〮袏臣鶁苣ꪜ뫦㲀牢ਾ臣傮胥銂뗧袨髧覜蓦ꢁ臣ꪁ臣芀苣袃菣꾂ꇨ薸迥鲿胦銂鯥㎳臣肜ꓥ趇蟩鮸냥ꢁ꿦莼臣龁臣趁胣㲁牢ਾ杉敬楷穣迥뎁潈条楬꺁雦閳䔨‮祍祫歴⡡럧⦨‬鏥ꪳ껧蚐臣誁臣讂十䍑鿥겜迥莀雦꺌놵꣨㲈牢ਾ髧肊ꇨ⢓桔⁥十䍑䈠獡捩删晥牥湥散⁳湩儠慵楬祴䌠湯牴汯›瑓瑡獩楴慣⁬敔档楮畱獥⸩䄠㱭牢ਾ牥捩湡匠捯敩祴漠⁦畑污瑩⁹潃瑮潲⥬臣誁臣讂胣䦁汧睥捩ⱺ䈠誏臣䢳Ⱞ䐠꺁雦꺌ㄨ㤹⸳㰠牢ਾ곧ㆬ뮷隤苣ꒀ臣鲤蟥誏臣ꚇ郧릖돦⢕潈⁷潴搠瑥捥⁴湡⁤慨摮敬漠瑵楬牥⹳芏藧⦧臣鎾臣ꚁ戼㹲膀ꒁ臣ꒀ苣隤苣ꒀ꺿귦媣릂苣ꊂ볯뎹鷥銂룤麛苣㎋㔮꣦隺臥꺷ꢁ臣ꚁꓦ몇臣膀꟨邞臣覂駩㲤牢ਾꓥ鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯鎼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶⸹′邵黦⦜戼㹲⠊⸶⸹⸲‱挠䅈꟦覯觧꺁ꃩꆬ菣꾂菣뎃軦꺨臣䢯릂菣벃苣릉闧蒚諦鎽苣颪駧鞁胣뒇귦蒚苣뎃戼㹲閃菣ꢂ菣뚂蓦鎟臣覂臣늘뻥銂苣龁苣馁㰩牢ਾ†闧ꪁ苣鞊軥Ꞁ苣覜臣讂苣ꒂ菣릂铧ꖝ臣莐諧颃菣覃菣ꆃ苣뎃苣몙迧馁苣讧꿧ꦉ臣膀䅈臣릂戼㹲袃菣꾂菣ꆃ苣뎃臣뺯臣讂菣ꪃ苣궃菣誃菣鲿귧銂裥肿臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂臣꺻껥鞁臣芀臣貂苣㲒牢ਾꓦ벨臣讂臣膂臣膀臣骁胣麃苣릂臣膀䅈臣릂菣벃苣貁⽁菣ꢂ菣袃菣뎂㠯ㄯ㌹⠴剐⤸苣ꒂ菣릂戼㹲ꮁ铧ꖝ臣讂苣꺁臣芁苣膀臣ꒁ菣莃菣貁㥈裥ꊛꃦꮁ铧ꖝ臣讂苣꺁臣芁苣掋㥈ㄯ迥뚺胦뾂菣醃戼㹲꾂돨銂胣ꊂ苣ꖃ菣뎃菣ꢁ臣节臣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣芀裥麛藥ꮖ臣㎮胩鎖뻥膀裥邭臣릂菣벃苣㲯牢ਾ菣ꆃ苣뎃臣뺯臣讂뛦Ꞁ뿥钭苣몈뿦馁苣꺛髧ꞁ胣麃苣릂苣膀곧㊬臣꾏뫦Ꞁ䡣ꞁ臣讂䡣⼶⠱㙈戼㹲Ꚃ苣ꮃ苣놔鷦꺁菣莃菣��膀剐Ꚃ苣ꮃ苣놔鷦꺁苣袃菣꾂ꞁ뿨ꂊ藥ꮖ臣龁胣⢂룤뮴賥䚖ㅍ苣ꒂ菣㲫牢ਾ苣銂菣꾂菣뎃軦꺨臣龁菣Ꚃ苣꾁胣붙胦뺯藧ꢁ臣ꚁ臣립觥銂黦龁臣龁芀뿨ꂊ藥ꮖ臣㎮胩鎖뻥㲌牢ਾ胣麃苣릂臣覂軦股臣ꚁ胣䢁릂菣벃苣覃菣ꒂ菣ꮁ꿥馁苣股룦趏뿥Ꞁ苣閩뻤鞁胣鶁臣貾胣麃苣㲦牢ਾ苣ꮁ臩鲿臣龁⽁菣ꦂ菣袃菣벃菣ꊃ苣⢹潆瑲䴠畯浮瑯⥨ㄯㄯ㐹⠷䵆⤱苣ꒂ菣릂臣龄鿦閁臣龁戼㹲芀鯥㒳䄲臣몤臣袂臣ꮁ胣꾃苣膃菣ꖎ꣧麃苣릂臣膀䅈苣袃菣꾂菣ꆃ苣뎃臣뺯臣讂ꇨ薸諦鎽뿥㲜牢ਾ귧銂铧颁臣鮁臣芀䵆ꮁ蓦鎟臣龁뻥膀该ꦉ臣膀臣ꪁ苣꺁蟩꺁蟩辇苣놤臣龁臣⢌鯥㒳䈲膀ꖗ戼㹲貾臣膀〹볯꺁藥龔귥螎苣随苣뮈臣龁뎛㈴⥃胣麃苣릂臣䢌誏臣䢳Ꚃ苣ꮃ苣꺁郧뚊菣莃菣覃戼㹲ꆃ苣뎃臣鞁臣鶛鳩閁苣ꚁ臣ꪁ臣ꎁ臣ꢁ臣ꚁ苣膀藥ꚁ臣麃苣릂臣䚌ㅍ苣ꒂ菣릂臣뺯臣ꚁ䥈駩㲰牢ਾ胦ꞁ臣讂臣ꢁ臣讫꣨閁苣膀臣貂臣袂苣膀菣꾂菣뎃軦꺨臣覂ꫨ몙臣貂苣늘뻥貁苣袃菣꾂菣ꆃ戼㹲ꒂ菣ꮁ觧낕髧ꪁ藥ꮖ뿥钭臣邵黦ꞁ臣讂臣ꢁ臣몢ꫨ閁苣龁胣鞁臣貁臣ꚁ胣傁㡒臣몟臣辁䡣꺁戼㹲꾃苣膃菣ꖎ꣧꾁胣䚁ㅍ苣ꒂ菣릂蓦鎟臣뺯臣ꚁ飩ꆾ髧ꞁ臣讂苣袃菣꾂觧낕髧超雧銂苣龁苣馁戼㹲芀㰊䥄㹖胣邼볯鎼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶⸹⸲′挠㙈ㄯ苣뎃菣꾂돨꺁菣꾂菣뎃軦꺨臣膀䡣⼹‱ㅎ苣ꒂ菣릂蓦鎟臣覂臣늘뻥銂ꫥ讻戼㹲馁苣릂菣벃苣릉闧蒚藥ꮖ苣颪駧馁苣⦋戼㹲 ㈠臣꺁闧ꪁ苣꾏뫦Ꞁ䡣讧꿧ꦉ苣閊룤馁苣鎁臣ꮁ苣誂胣鞊뷤鲿귧銂苣袃菣꾂臣뺯臣ꚁ铧颁戼㹲閁臣龁臣膀䵆龄鿦貾胣讁臣誂臣讨뫥꺁뷧ꎂ臣讦苣貂臣芀菣Ꚃ苣꾁胣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂苣ꒂ戼㹲ꮃ苣ꮁ꿥鞁臣超雧ꚭ髧ꮁ鳦龄뷤ꞁ臣讂臣ꞁ胣䢁릂菣벃苣ꮁ꿥馁苣颫臣股룦鞊뷤鮊뻤銂ꫨ躰戼㹲馁苣龁苣ꮁ胣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂苣ꒂ菣릂臣꺁ꓥ趇鯦늜臣膀臣貂臣骶臣膀諦龎胦貁闧ꪁ苣颃菣㲃牢ਾ菣꺁냥ꖅ臣薿ꛨꢁ臣貂苣꾏菨Ꞁ臣芁臣龁胣股郧鶇鯩ꂴ苣袃菣꾂臣뺯臣讂觧낕胦銂鳦馁苣股戼㹲薸諦鎽諥ꆾ臣몈뿦꺁ꋥ랼臣膀蓦鎟苣薿ꛨꢁ臣讂迥붃胦貁臣誂胣掁䅈苣뎃菣꾂돨꺁臣ꮁ苣讂戼㹲鶈鯥超雧誏臣붿諥超雧貾臣랼諥ꪁ飩ꆾ臣뎦꿥閁苣ꪁ臣蚐铧銂ꫨ躘臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં䐼噉邀볯颼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†苣ꒂ菣릂ꇨ莐蟥蚛듧ꮁ꿥馁苣超雧鲿귧銂裥肿臣讂臣膀믤꺁苣ꒂ菣릂苣뎃菣꾂돨ꮁ꿥馁苣㲋牢ਾ飩ꆾ髧超雧銂铧颁臣鮁臣蒁臣膂臣膀剐Ꚃ苣ꮃ苣놔鷦꺁䅈臣내菨隤菣ꆃ苣뎃苣몙迧馁苣蒵戼㹲鮏臣䊈놱뷥⾢㘱ㄯ㠹Ꚃ苣ꮃ苣⢹䅙ⵍ䅈銂꟦覯臣龁设臣낁胣䢁楡苣꺁雦꺌㈨㄰ⰱ䨠畯湲污漠戼��昊瘠物汯杯⁹㔸㘺㌸ⴲ㠶㌴芏藧⦧胣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂苣ꒂ菣릂臣꺁뫤趉鯦늜苣ꆨ胥馁苣龁苣㲁牢ਾ臣膀菣Ꚃ苣ꮁ䅙ⵍ䅈苣ꖎ꣧鞁胣ꆬ臣ꞁ놀雩貾胣䊁䅓迥꾁䡣⼶뾂菣醃苣ꪳ苣꾃苣膃菣ꖎ꣧㲮牢ਾ臣龁胣閁苣ꪁ苣뺯藧ꢁ臣ꚁ胣麃苣릂苣躇铧讞⽂뇥ꊽㄯ⼶㤱㠸在⁔䅙⥍苣ꒂ菣릂臣龄鿦閁臣㲛牢ਾ胣䊁䅓苣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣芀臣꺁뻥膀䅈苣袃菣꾂臣뾁臣뺯臣讂藥ꮖ뿥钭臣늘뻥蒚胦ꪳ苣몱戼㹲骮髧ꮁꓧ馁臣膂臣膀䡣⼹⠱㥈菣莃菣膀ㅈ苣袃菣꾂銂駧뺏臣讂讞苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣㲹牢ਾ苣龄鿦Ꚃ苣ꮃ苣ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣龁胣鎁臣뒠郥节胣開觧꾁胣䢁誏臣䢳Ꚃ苣ꮃ苣놔鷦꺁郧뚊菣莃戼㹲覃菣ꆃ苣뎃臣鶛鳩閁苣讂臣ꞁ胣掁㥈ㄯ䠠銂駧뺏臣讂苣ꒂ菣릂臣龄鿦貾臣讦苣貂苣늘뻥꾁胣㲁牢ਾㅈ苣袃菣꾂菣ꆃ苣뎃臣뺯臣讂藥ꮖ臣邵黦ꞁ臣讂迥붃胦貁鳦节ꯩ蒁胣ં䐼噉邀볯颼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†鯥㒳䄳臣몤臣袂臣ꮁ胣掁㙈ㄯ苣뎃菣꾂돨꾃苣膃菣銂迥醁胣ꆬ臣ꞁ胣妁䵁䠭ꮁ鯦늜臣貂臣開戼㹲ꦉ臣膀剐邃菣꾂苣ꦃ苣뎃菣ꞁ䡣⼹銂駧뺏臣讂苣ꒂ菣릂臣㊮〵䰠㕄龄鿦讁苣貮藥ꮁ飩ꆾ臣㲕牢ਾ苣龁胣掂㙈ㄯ迥뚺胦뾂菣醃苣ꪳ苣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣開觧꾁胣䊁䅓苣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣開觧ꢁ戼㹲钯臣ꚁ뗧袨髧ꮁ苣誂냥ꪁ臣趇蟩銂膀膀迥뎁ꖗ鯧ꮁꓥꎁ臣芀臣꺁蟩辇룦醰臣覂臣늘뻥꾁戼㹲膀卂銂菣꾂菣뎃軦꺨臣龁苣鮃菣袃臣钯臣ꚁ胣掁㙈ㄯ苣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁臣꒾臣誁臣讂铧颭臣㲮牢ਾ믥랕苣节臣覂臣龁瀨볯ゝ〮㠳뎛㌴⥂胣ꪜ蓦鲽该ꦉ迥뎁呗夠䵁苣ꖎ꣧鞁臣開觧꾁胣龄鿦讁苣㲉牢ਾ飩ꆾ臣貂臣膀믤꺁菣꾂菣뎃軦꺨뻧ꞁꛨ覂苣龁飩ꆾ臣蒁臣貂苣膀苣ꒂ菣릂臣螤ꏨ꺁뗧鲞臣꾁戼㹲ꪁ臣膀믤辂苣ꮁ胣䢁릂菣벃苣覃菣ꒂ菣ꮁ꿥馁苣릉闧蒚臣鲿귧ꞁ臣ꎁ臣鎁臣銂ꓧ鞁臣蒁苣芀戼㹲開觧꾁胣䢁誏臣䢳Ꚃ苣ꮃ苣놔鷦꺁郧뚊菣莃菣覃菣ꒂ菣ꮁ鯦늜臣貂胣讁臣掤㥈ㄯ蓦鎟苣ꒂ菣㲫牢ਾ苣ꮁ꿥鞁臣䢦낙胦ꞁ臣ꎁ臣꺁臣膀臣鎁臣讦苣貂臣늘뻥꾁胣䢁릂菣벃苣覃菣ꒂ菣ꮁ꿥馁苣超戼㹲ꮖ臣邵黦ꞁ臣讂臣莀臣覂苣讂胣ં䐼噉邀볯颼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†䅈苣袃菣꾂臣뺯臣讂觧낕胦銂鳦馁苣ꊃ菣꾂菣벃菣ꮃ諦鎽臣膀귥肯胦䢧丱Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ蓦鎟戼㹲鞁臣袏臣늩苣ꒂ菣릂臣뺯臣讂菣꾂菣뎃軦꺨苣鞏臣龁胥鎽臣覂跥ꊛ臣貂设臣낁胣䎁牯楴苣꺁戼㹲螖賧⢮〲〱‬桔⁥潊牵慮⁬景挠楬楮慣⁬湩敶瑳杩瑡潩⁮㈱㨰㘱㌶ㄭ㜶⤳※潃瑲覂臣螖賧⢮㰲牢ਾ㄰ⰱ匠楣湥散㌠㌳㠺〵㠭㘵㬩䔠楫牥覂臣螖賧⢮〲ㄱ‬捓敩据⁥㌳㨳㐸ⴳ㔸⤰※畓覂臣螖戼㹲꺌㈨〰ⰹ丠瑡匠牴捵⁴潍⁬楂汯ㄠ㨶㘲ⴵ㜲⤳※桔潲扳覂臣螖賧⢮〲㠰‬䱐卯传敮��攺㤳㈴戼㹲⤊迥ꞅ膀臣ꒁ苣袃菣꾂諥ꆾ臣膀苣誂뷤蒁菣馃菣ꞁ臣芁苣貁胣炁ㅈㅎ苣ꒂ菣릂臣龄鿦鞁臣蒁戼㹲ꪁ臣讀뷤ꞁꫨ膂苣貂苣⢋뻤袁臣膀楐慣苣꺁雦꺌㈨㄰ⰲ倠䅎⁓单⁁〱㨹㔲㌷㈭㜵⤸迥ꞅ鎁臣㲨牢ਾ臣ꢳ鯧馁臣趁臣ꢁ臣芁苣芀臣龁臣ꎁ臣膀䅙ⵍ䅈軦꺨该ꦉ臣芁苣讨뫥꺁苣袃菣꾂諥ꆾ苣龔臣㲘牢ਾ臣鮁苣鎁臣貁臣趁苣鎁臣꾁ꧩ辁臣趁臣ꢁ臣꾁臣蒁胣鞁臣鞁臣貁苣膀䡣⼶讧꿧ꦉ臣꾃苣膃戼㹲뎃軦꺨臣膀ꇨ薸苣袃菣꾂諥ꆾ苣㒒胥⢍郥覭臣侮ꒀ苣龔臣閁臣讂룥袇臣蚀闦⢰敲楣牰捯污搠汩㱵牢ਾ楴湯⥳鞢ꓥ閁臣⢛鯥㒳䌳膀该ꦉ苣龮돨蒚臣趇蟩鮸냥誏臣뮭뫤讁苣늘뻥鞁臣⢟鯥㒳䄳迥뎁㌴⥂戼㹲芀䡣⼶讧꿧ꦉ臣꾃苣膃菣ꖎ꣧貁胣Ꚃ苣ꮃ苣銂〱薼臣릊軧ꞁ룤貒臣讂苣袃菣꾂觧낕髧䦄䝧戼㹲꺁铧龔苣颪駧鞁臣꺁臣뺯臣⢗䅙ⵍ䅈볯䊋䅓⠩鯥㒳䐳膀裥麛藥ꮖ臣뾁臣開觧놔鷦꺁ꇨ薸臣膀菣㲐牢ਾ菣꾂苣ꦃ苣뎃菣銂뻨蚁臣ꚁ룤麛苣궸鋥것菣ꮃ苣몤臣龁夨䵁䠭讼卂⥁胣龮髩膀䅙ⵍ䅈苣ꖎ戼㹲꺨臣膀臣꺁뻥膀卂銂菣꾂菣뎃軦꺨臣龁该ꦉ臣膀呗夠䵁苣ꒂ菣릂苣ꖎ꣧鞁胣䊁䅓苣꾃苣膃菣㲳牢ਾ軦꺨臣龁该ꦉ臣놵꣨蒚臣麡볤鞁臣龔귥螎苣覜臣ꚁ臣龁瀨볯ゝ〮㠵芀꿥ꞅ髧ꮁ胣掁㙈ㄯ苣뎃戼㹲醃苣ꪳ苣꾃苣膃菣ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣讂臣膀呗夠䵁苣ꖎ꣧鞁臣開觧꺁铧颭臣钯臣龁ꃥ袐臣떥苣ꚁ戼㹲覜蓦ꪁ軧ꞁ臣讂胣龄鿦讁苣꺁〱薼臣龔귥貁苣龁苣閁苣龁瀨볯⺜〰㄰芀铧颭臣膀䅙ⵍ䅈苣㲒牢ਾ軦꺨臣膀卂銂菣꾂菣뎃軦꺨臣龁菣Ꚃ苣꺁铧颭臣钯臣龁ꃥ袐臣节ꯩ뺁臣龁瀨볯ゝ〮㠳芀臣㲓牢ਾ苣覂臣꺷臣膀臥銲귥떾藥ꊂ菣뮂苣ꞁ臣趏飦閁苣ꪁ臣ꎁ臣貁胣鶁苣꾁胣妁䵁䠭讼卂麃苣릂戼㹲誏臣妳䵁䠭讼䡣⼶麃苣릂铧ꖝ臣䦮䝧臣膀㕈䠠銂苣벃菣馁苣북닧邭臣떾藥銂郥颧臣릊軧ꞁ戼㹲뮘껥鞁臣龁苣ꞁ臣讂뎛㌴⥅胣貾胨꺁苣莃苣ꒂ臣뾁臣膀臥銲귥꺁뻤ꖅ苣뮘귦馁苣鞊뷤꺁菨㲽牢ਾ諥銂ꓦ몇臣讂臣ꢁ臣馕蓦馁苣꺁臣趇ꛨꪁ臣ꢁ臣芁苣芀臣龁臣ꎁ臣膀뻤ꖅ臣许뗦ꞁ臣릂菣벃戼㹲꾂諦鎽臣鲽铧誏臣⾳迥꾁蓦鎟超雧⦫듧麃臣꺁臣꺁鯧銺뷤ꢔ臣膀臣꺁苣莃苣ꒂ臣꾁ꓦ몇臣貂戼㹲ꪁ臣芀臣貂臣袂苣膀룤貒臣꺷臣鎁苣覂ꒁ臣꒾臣뎦꿥閁苣骁胣ꒂ菣鎃菣ꞁ臣ꖟꛨ銂迥ꂘ臣㲗牢ਾ臣讁臣龁郧놔苣겪飦馁苣鎁臣貁臣趁苣芀臣貂臣节臣讁苣覂臣膀臣貂苣꺁蓦鎟菣궃菣뎂菣ꮁ戼㹲袂臣ꚁꫨ몙臣貂苣鞊뷤꾁胣릂菣벃苣릉闧蒚臣芁苣膀臣ꒁ뫥龟룤貒胦ꞁ臣ꎁ臣芀蓦鎟苣ꒂ菣㲫牢ਾ苣꾁胣䢁Ꚃ苣ꮃ苣놔鷦꺁苣袃菣꾂菣ꆃ苣뎃臣뾁苣뎂菣覃臣讂臣ꞁ胣讦苣貂臣��뻥貁胣掁㙈㰯牢ਾ꾃苣膃菣ꖎ꣧ꮁ苣ꎁ臣몈뿦閁苣讂䅈苣袃菣꾂菣ꆃ苣뎃臣뺯臣讂껥뮸藥ꮖ뿥钭臣邵黦ꞁ臣㲂牢ਾ臣龁臣邵ꯨ颻臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં䐼噉邀볯颼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ㘨㤮㈮㌮†䡣⼶뾂菣醃苣ꪳ臣꾃苣膃菣ꖎ꣧꾁胣뒇귦蒚㕈苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣龄鿦讁戼㹲覂菣Ꚃ苣銂飩ꆾ臣讂㰩牢ਾ†곦ꮁ胣掁㙈ㄯ苣뎃菣꾂돨꺁菣꾂菣뎃軦꺨臣䢌Ꚃ苣ꮃ苣꺁蓦鎟臣覂菣Ꚃ苣銂飩ꆾ臣讂臣ꢁ戼㹲貁臣趁苣讁臣蚁臣銂ꋧ讁苣龁胣誸꣨꺁苣蚁臣膀菣Ꚃ苣ꮁ軦꺨迥뎁菣꾂菣뎃軦꺨臣膀剐邃戼㹲莃苣낂菣Ꚃ菣覃臣䆧馃菣誃菣⾠㈱㌰㈯〰Ꚃ苣ꮃ苣놔鷦꺁䅈迥뎁䅎苣몙迧馁苣ㆋ‰䑌〵臣㊮㘺戼㹲趆鯩袐뷤Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ蓦鎟臣鮁臣⢟뻤袁臣膀瑓敥覂臣螖賧⢮〲㤰‬⁊楖潲⁬㌸ㄺ㐷ⴲ㜱㌵芏戼㹲ꞅ芀뫤뎃臣貂臣骀苣膀鳦龄뷤開觧誏臣垳⁔䅙Ꚃ苣ꮃ苣銂軦꺨臣龁该ꦉ臣龄鿦讁苣늘뻥閁戼㹲貂臣膀ꖗ鯧뺁臣ꮁ蓦鎟臣龁苣ꮁ귦ꆺ臣龁胣如䵁䠭Ꚃ苣ꮃ苣銂軦꺨臣膀卂銂菣꾂菣뎃軦꺨戼㹲鞁臣開觧꾁胣龄鿦讁苣鮾臣颁臣늘뻥閁苣膀铧颭軧꾁〴볯ꞁ臣ꎁ臣芀飩ꆾ臣鞢ꓥ꾁胣開觧ꮁ戼㹲挊㙈ㄯ苣뎃菣꾂돨銂菣꾂菣뎃軦꺨臣龁臣趁臣讦苣貂胣龔귥꾁〹볯ꞁ臣ꎁ臣芀ꒁ臣꾃苣膃菣㲳牢ਾ뻧鎖臣龔귥螎臣꺷臣膀뗧袨髧覜蓦ꮁ뿨벼臣龁臣⢌鶼⸰㘰膀䡣⼶뾂菣醃苣ꪳ苣꾃苣膃菣ꖎ戼㹲꺨臣龁菣Ꚃ苣꾁胣놵꣨蒚臣袂苣랕臣芙雩龔귥鞁臣⢟鶼⸰㌰⤷뎛㐴誏臣㒳䈴芀䅈苣袃菣꾂戼㹲ꮁ꿥馁苣趏뿥Ꞁ臣膀㕈蓦鎟뻥꺁菣讃苣ꪃ菣낂鳦鎖臣辂臣讂볯肜ꓥ趇蟩鮸냥ꢁ苣钯볨鞁臣ꢁ戼㹲趁胣袂苣颫臣股룦릂菣벃苣鮊뻤銂鳦馁苣開觧貁胣龄鿦貾臣袂苣醰臣蒁蟩辇苣놤臣뺂郥ꮁ臣㲂牢ਾ苣蚀鯧ꊖ臣鲤蟥閁苣⢌鯥㒳䌴膀䡣⼶貁䅈苣袃菣꾂臣몟臣辁藥ꮖ苣鞢胩閁臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂戼㹲ꢁ臣蚁胨袁苣꾔賦鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯钼볯醀⼼䥄㹖 꾃苣膃菣ꖎ꣧麃苣릂臣膀臣貂臣뺯臣ꚁ藥ꮖ귥蒚臣龄뷤閁苣ꚁ臣覂臣膀臣ꒁ䥈駩Ꞁ臣芁苣㲋牢ਾ䅈郧뚊菣莃菣覃菣ꒂ菣銂鳦馁苣龄鿦Ꚃ苣ꮃ苣銂铧蒁臣膀臣貂苣꺁뗧鲞臣膀菣꾂菣뎃軦꺨뻥㲌牢ਾ臣龄鿦讁苣꺁飩ꆾ臣膀䅈苣袃菣꾂臣뺯臣讂藥ꮖ뿥钭臣뾁臣몟臣蒁臣蒁臣鎁臣銂ꓧ鞁臣蒁苣㲋牢ਾ胣鞏껥鎽뗧袐菩趽臣뺯臣讂뫤꺷迥鲿胦鞊뷤貁胣鎁臣ꞁꛨ覂苣龁飩ꆾ臣誁臣ꚁ뷥늉苣鲞臣鞁戼㹲鞾苣꾏菨Ꞁ苣銎駩馁苣龁苣ꮁ胣麃苣릂苣ꢅ臣䢦ꮁ臣蒁臣ꚩ꣩鞁胣鶁臣鶁苣麁苣꺁蓦鎟苣ꒂ戼㹲ꮃ苣ꮁ꿥鞁臣䢦낙胦ꞁ臣讂臣ꢁ臣蚈臣ꎁ臣芀㰊䥄㹖胣邼볯钼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶⸹⸲‴挠䅈臣꾃苣膃菣ꖎ꣧꾁胣䢁��Ꚃ苣ꮃ苣龄鿦讁苣꺁飩ꆾ苣銪믤馁苣릂菣벃苣릉闧㲰牢ਾ髧超雧銂ꫨ몙臣讂㰩牢ਾ†苣袃菣꾂觧낕髧鞊뷤꾁胣銃菣股룦궸臣鲤蟥閁苣ꚁ臣讂设臣낁胣뎛㜲誏臣㊳䈷※⹍吠潨㱲牢ਾ扳覂臣螖賧⢮〲㠰‬䱐卯传敮㌠攺㤳㈴膀⹄⹃䔠楫牥覂臣螖賧⢮〲㤰‬捓敩据⁥㈳㨴㐲ⴶ㰲牢ਾㄵ膀⹄⹃䔠楫牥覂臣螖賧⢮〲ㄱ‬捓敩据⁥㌳㨳㐸ⴳ㔸⤰胣䪁‮牗浡敭瑲苣꺁雦꺌㈨㄰ⰱ䨠戼㹲⸊䔠灸‮敍⹤㈠㠰ㄺㄸㄭ㌹膀迥뎁⹎倠捩覂臣螖賧⢮〲㈱‬乐十ㄠ㤰㈺㜵ⴳ㔲㠷芏藧⦧胣躁戼㹲뮎臣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂苣ꒂ菣릂䅈臣꺁鯦늜臣릂菣벃苣릉闧蒚藥ꮖ뿥钭臣랼諥ꪁ铧邈臣ꢁ臣ꚁ戼㹲趇ꛨꞁ臣讂迥붃胦貁臣讂臣ꞁ胣麃苣릂臣誁臣讂苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ꿥馁苣ꊗ귥꺁藥㲍牢ਾ雧銂蛥뺏臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂臣ꦁ臣讁苣몢ꫨ鞁臣芀臣貂臣袂苣膀苣ꒂ菣릂蓦鎟뻥꺁뷧ꎂ臣覂戼㹲袂苣릊軧蒚臣늘뻥閁苣讂臣꺻껥鞁臣芀臣貂苣钁裦馁苣龁苣ꮁ胣麃苣릂苣膀䡣⼹銂苣벃菣㲉牢ਾ臣讂乄몙迧馃苣뾂菣ꞁ裥麛藥ꮖ臣⢗뻤袁臣膀⹊匠整汥苣꺁雦꺌㈨㄰ⰰ䴠楂⁯⠱⤱‬楰㩩づ戼㹲《㄰ⴸ〱芏藧⦧胣鶁臣貾胣꾏뫦Ꞁ䡣⼶뾂菣醃苣ꪳ胣ꆬ臣ꞁ胣掁㕈ㄯ苣뎃菣꾂돨⢪㕈菣莃菣膀戼㹲䠊릂菣벃苣⦯臣붿諥超雧鞁胣肜뻥ꮁ胣䢁丱Ꚃ苣ꮃ苣꺁菣趃菣ꮁ蓦鎟臣鮁臣⢟鯥㒳䄵胣㒜䘵芀㱆牢ਾㅍ뎛㔴誏臣㒳䈵膀⽁菣벃菣ꮃ菣뎃菣⾈〶⼲〲㤰瀨ㅈㅎ⠩鯥㒳䌵迥뎁㔴⥄胣ꚸ臣ꮁ剐Ꚃ苣㲤牢ਾ菣릂뎛㔴誏臣㒳䘵ꮁ蓦鎟臣鮁臣貾胣ꢅ臣꺁䡣꾃苣膃菣ꖎ꣧開觧꾁蓦鎟臣覂飩ꆾ臣貂胣㲁牢ਾ臣讂臣鞁臣节胣肜냥辇臣趇蟩鮸냥鞁臣몤臣ꪁ臣ꎁ臣芀꿥ꞅ髧ꮁ胣掁㥈ㄯ䐠䅎臣鶈鯥超雧貾戼㹲ꮁ卂銂迥릮臣龁駩Ꞁ꿥ꞅ该ꦉ臣膀릌臣開觧銂駩蒁臣膀臣ꪁ苣꺁蟩꺁蟩辇苣놤臣膀ꖗ鯧㲮牢ਾ臣ꞁ臣龄鿦꺁臣膂臣뮭뫤鞁臣⢟鯥㒳䄵胣㒜䘵芀蓦鎟껥鎨臣蒐胣ꮁ臣醁苣掋䅈菣꾂菣뎃軦꺨该㲕牢ਾ觧꺁铧颭臣膀꿥ꞅ臣龔귥ꢁ鳦辄臣낕臣ꎁ臣蒁臣⢟鯥㒳䈵胣㒁䐵胣誏臣㒳䘵芀ꫨ몙臣貂臣늘뻥㲡牢ਾ臣릂菣벃苣릉闧蒚뛦Ꞁ藥ꮖ臣邵黦ꞁ臣讂臣ꢁ苣몢ꫨ馁苣龁苣ꮁ胣股룦貁䱅卉ꮁ苣誂ㅈ䠠㱁牢ਾ臣邵郥馁苣鎁臣貁臣趁苣ꮁ苣讁臣辂苣骁胣ꢅ臣꺁菣Ꚃ苣貁郥薀臣龄鿦Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ꿥鞁臣䢦㱉牢ਾ駩Ꞁ臣芁苣鎁臣銂ꋧ趪臣⢗鯥㒳䜵膀鳦몙飦薀苣꺁菣꾂菣뎃軦꺨菣궃菣뎂菣ꮁ苣讂苣袃菣꾂戼㹲릉闧蒚諦鎽臣ꎔ铧貁ꋧ趪臣貂臣芀䅈苣袃菣꾂蛥꺁苣钃菣벃菣ꮁ꿥馁苣䎋㡄吠듧麃臣膀臣鎁戼㹲ꞁꛨ覂苣龁飩ꆾ臣誁臣ꚁ뷥늉苣鲞臣鞁뻥讂迥붃胦貁臣讂臣ꞁ设臣낁胣䶁‮慔畭慲苣꺁雦꺌戼㹲⠊⹊嘠物汯‮㈷㤺〴ⴴ㐹㘰芏藧⦧胣麃苣릂臣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞁胣ꊃ菣꾂菣벃菣��諦鎽⸲㌴苣㲒牢ਾ諦躸臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ䑃‸내菨銂駩뮎臣膀臣꺁뻥膀剐ꮁ蓦鎟臣鮁臣⢟⹍⹌匠污浥臣螖賧⢮戼㹲㈊〰ⰰ䤠瑮‮⹊䤠浭湵灯慨浲捡汯‮㈲㜺㜰㜭㠱⤩胣꒙軥꾁胣趇蟩鮸냥ꮁ苣龔귥ꊻ룥ꮁ苣놽戼㹲뾟苣誏臣閁臣膀菣꾂菣뎃軦꺨臣袂臣ꚁꫨ몙臣貂苣늘뻥ꮁ臣醁苣늶胦鲿귧꺁雩躸苣몤铥鞁臣㲟牢ਾ뎛㔴誏臣㒳䤵芀臣龁臣ꎁ臣膀菣莃菣ꞁ臣ꪁ臣膀䅈苣袃菣꾂臣뺯臣讂臩鲿髧늶胦超雧鲿귧㲔牢ਾ臣膀ꒁ臣낕臣讂ㅈㅎ苣ꒂ菣릂臣뺯臣讂飩ꆾ苣节臣覂臣ꚁ臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†䡣ꮁ鿥ꖁ臣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞃菣袃苣ꮃ臣膀믤꺁뫤讞臣뺯臣讂룤貒菨鮊苣覜臣讂苣袃菣꾂戼㹲릉闧蒚諦鎽苣颪냥鞁臣鎁臣銂臣覂臣讫꣨馁苣龁苣ꮁ胣䢁′䅈苣覜臣讂臥銲귥꺁뻤ꖅ苣뮘귦㲢牢ਾ臣讂菣꾂菣뎃軦꺨菣Ꚃ苣놔鷦꺁닧붣杉꺁菨鮊苣ꚩ꣩鞁臣芀臥銲귥꾁胣떾藥貾臣ꮃ苣閃苣㲧牢ਾ菣벃苣것菣벃苣벃臩鶼귥銂駧뺏臣讂臣ꞁ胣궸鋥뮴胦銂胣내菨誸룦궸臣ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂藩ꂴ戼㹲뮴胦꺁곦芦臣袂臣ꚁ룦骮臣龁刨‮慈覂臣螖賧⢮〲㈱‬⹊嘠物汯‮㘸㔺㜷ⴴ㜵ㄸ誏臣亳‮楐戼㹲挊覂臣螖賧⢮〲㈱‬乐十ㄠ㤰㈺㜵ⴳ㔲㠷⤩胣龄鿦貾臣讦苣貂苣늘뻥ꢁ룤뒇臣ꚁ胣꾃苣膃菣㲳牢ਾ軦꺨菣Ꚃ苣讁苣뺲ꏨ閁苣讂杉꾁胣ꢔ蟩鶾귥蒚臣ꊽ臣膀臣ꒁ駩Ꞁ꿥ꞅ臣鞁臣뾽铧閁苣讂䅈戼㹲릂菣벃苣ꮁ꿥馁苣릉闧Ꞁ苣覜臣讂菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤ꞁ臣讂剃㈶ㄶ臣릊諥ꢁ郥颧臣릊諥ꞁ戼㹲북닧邭臣떾藥銂飩뎮臣龁뎛㔴⥊胣鞁臣貁臣ꚁ胣꾃苣膃菣ꖎ꣧鞃菣袃苣ꮃ臣膀㉈臣貐꟦ꮁ戼㹲膀믤꺁苣ꮃ菣鞃‱䅈苣궸鋥馁苣鎁臣貁臣趁苣膀뫥蒯臣릉闧Ꞁ苣覜臣讂苣袃菣꾂諦鎽苣颪駧㲺牢ਾ臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ㘨㤮㌮†뗧隫㰩牢ਾ†臣꺁껥붖뻤꾁胣궂菣ꦃ䅈臣꾃苣膃菣ꖎ꣧ꮁ苣ꎁ臣颪駧馁苣鎁臣貁臣趁苣릂菣벃苣릉闧蒚戼㹲超雧鲿귧꺁飩ꆾ髧릊黦銂ꓧ鞁臣蒁苣芀䅈苣袃菣꾂臣뺯臣讂藥ꮖ뿥钭臣Ꚃ苣ꮃ苣龄鿦讁苣꺁戼㹲늘뻥ꮁ跥蚈臣芁苣鎁臣膀迥뎁臣꺁菣꾂菣뎃軦꺨菣궃菣뎂菣貁闧꺨뫤讞飩ꆾ苣节臣覂臣鎁臣㲨牢ਾ臣몤臣貂臣芀맥ꮁꚺ臣꾃苣膃菣ꖎ꣧꺁뿥膦胦銂臣辁臣膀臣ꒁ菣뎃菣龃菣꾂臣뺯臣讂뫦馂戼㹲銂ꋥ랼臣讂胣莺꿧늛臣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂苣ꒂ菣릂臣뺯臣讂飩ꆾ苣节臣覂臣龁苣꺁郥颧臣Ꚉ闧㲥牢ਾ苣銃菣ꞁ雩몙臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾ㘨ㄮ‰龮雦设〱股郧鶇鯩ꂴ苣袃菣꾂迥鲿胦鞊뷤꾁胣麃苣릂臣誁臣讂귥肯胦誏臣醃菣螃菣㲟牢ਾ菣꾂ㅈㅎ苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣꺁ꃩꆬ蓦鎟뻥ꮁꋥꂊ��讂㰩牢ਾ†臣꺁껥붖뻤꾁胣ꎭ꿧Ꞁ苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣꺁蓦鎟臣膀臣貂臣骶臣醃菣螃菣莃苣ꒂ菣㲳牢ਾ菣ꮃ苣뎃苣ꪠ臣龄鿦貁胣麃苣릂臣誁臣讂苣袃菣꾂觧낕髧鞊뷤꺁铧龔苣몈뿦馁苣鎁臣銂ꓧ鞁戼㹲膀菣袃苣뎃菣ꮃ苣뎃苣龄鿦誏臣颻髩馁苣릂菣벃苣鞊뷤超雧鲿귧꺁菣Ꚃ苣ꊃ菣ꮃ臣ꎭ뷥Ꞁ苣㲒牢ਾꯧ벨臣讂胣ં䐼噉邀볯颼볯馼胣㲑䐯噉ਾ㘨ㄮ⸰‱邝雦誏臣릖돦⦕戼㹲⠊⸶〱ㄮㄮ†듧麃迥뎁苣ꒂ菣릂㰩牢ਾ†㤲吳迥뎁䑍䭃듧麃苣䆒䍔讁苣ꖅ触鞁胣麁苣麁苣膀郥薀〱볯躃믤Ꚃ苣股룦⢅祈汃湯⥥胣誏戼㹲뎁〱ꚃ菣莃菣⾈汭臣骃菣랂菣뎃ㄭ〰볎⽧汭臣릂菣것菣袃菣ꒂ苣뎃倨湥匯牴灥‬楇换⥯苣鲣戼㹲薅臣龁菣ꮃ菣莃苣꺁铦覤苣벃苣ꮃ鿥난䐨䕍⥍迥뎁鳦辰뿥袠鿥난ꆸ雦ꢁ苣䞂扩潣ꏨ⦽룤ꞁ뛧㲭牢ਾ賦鞁臣芀苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣ꪠ⽁菣ꖃ菣ꮂ菣覃菣ꊂ㈯⼰㤹丨㥃⤹䠨丱⤱胣䆁붂菣ꊃ菣㲳牢ਾꯨ뚳㌯㈯〰⠶䥓㘰⠩ㅈㅎ膀⽁菣ꢂ菣袃菣뎂㠯ㄯ㌹⠴剐⤸䠨丱⤱胣䆁閃苣벃菣ꊃ菣麃苣⾹⼱戼㹲ㄊ㐹⠷䵆⤱䠨丱⤱胣䆁ꮂ菣閃苣ꮃ菣ꊂ〯⼴〲㤰䌨污㤰⠩㌹䠠丱⤱胣誏臣躽韧龎胦䆧馃菣誃戼㹲ꂃㄯ〲⼳㐰嘨ぎ⤴债㡒㈠㘺蛥蚛郥鎽苣ꒂ菣릂䠨丵⤱设臣낁胣䪁‮瑓敥覂臣螖賧⢮〲㤰‬⹊戼㹲 楖潲⹬㠠㨳㜱㈴ㄭ㔷⤳迥ꞅ銂〱韦ꊽ臣몙苨떍룤ꞁ㠴駦鎖裦랕臣鮁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯閼볯醀⼼䥄㹖 倠㡒諦龎胦銂鳦馁苣躽룦ꦁ뿥Ꚃ苣ꮃ苣銂꟦覯臣讂臣膂臣膀⽁苣뎃苣벃菣벃㘯㘯ꮁ鿥ꖁ臣㲏牢ਾ菣릂苣ꖃ菣뮳苣膀慗杮苣ꮁ苣ꎁ臣風볨閁苣龁뗧鮏臣鞃菣袃苣ꮃ设臣낁胣厁‮慗杮苣꺁雦꺌戼㹲⠊〲㠰‬⹊嘠物汯‮敍桴摯⁳㔱㨱㐷㜭⤸迥ꞅꮁ뻥ꎁ臣膀닧붣菣ꪃ苣뎃乒讁苣꺁苣ꒂ菣릂戼㹲몁볤邭臣蚀믨馆吨慲獮牣灩潴⁲呒‬潒档⥥胣傁剃ꋥ薹倨商琠牵潢‬瑓慲慴敧敮膀迥뎁菣꾂戼㹲뾂菣炼佐ㅌ臣꺁苣궃菣讃菣낂臣袂臣ꚁ뷤붣臣龁设臣낁胣䖁‮潆潤覂臣螖賧⢮㤱㤹‬⹊嘠物㱯牢ਾ⁬㌷㤺㜶ⴹ㘹㈸芏藧⦧胣傂ㅂ胣傁㉂胣傁膀偎胣䶁胣誏臣亳銂苣벃菣馁苣䆋ꊂ菣ꊂ菣邃菣⾼⼶〶戼㹲鞃菣릂菣覃苣膀剐ꪠ铧ꖝ臣䢮誏臣亳銂苣벃菣馁苣鞃菣릂菣覃臣ꢁ苣ꮁ铧蒁臣膀剐ꮁ鿥ꖁ戼㹲辁뷤ꦸ臩鲿苣ꒂ菣릂苣것苣궂菣벃臣龁胣躽룦ꦁ뿥Ꚃ苣ꮃ苣銂〱韦ꊽ臣몙苨辶跥궸臣㒧芙雩㲓牢ਾ裦랕臣鮁臣芀鷩讧胩뾂菣醃苣ꪳ⠱华⤱臣ꂬꓥ銂鳦馁苣傋㡒苣ꒂ菣릂꟦覯臣讂臣膂臣膀ꒁ臣㲮牢ਾ믤꺁剐ꮁ鿥ꖁ臣것苣궂菣벃菣ꦃ苣龃菣ꮁ諥袁臣膀华꺁鳦鶈臣㞮ꊂ菣躃藩ꂁ臣銂苣벃菣馁戼㹲讂菣ꦃ苣龃菣銂뷤ꢔ臣龁胣鶁臣것苣궂菣벃臣貾胣Ꚃ苣ꮃ苣銂ꖗ뷩꺁駧늂뛩떍룤ꞁ㠴駦鎖戼㹲鞢껦閁臣龁设臣낁胣厁䄮‮潋数正⵹牂浯敢杲臣螖賧⢮〲㤰‬慖捣湩⁥㜲㌺㘷ⴶ㜳㐷��藧⦧戼㹲芀㰊䥄㹖胣邼볯閼볯醀⼼䥄㹖 蒵迦袁迥뎁蟩龔黥Ꚃ苣ꮃ苣꺁諥ꆾ苣膀믤趉臣風볨閁苣ꚁ臣讂胩誂臣膀偔䭃菣ꪃ菣랂菣꺁戼㹲颭鳥许胣䶁䍄내菨⢞呁䍃ꞁ룦骮臣龁㘨芀苣ꒂ菣릂臣膀莄臣㞧芙雩꺁菣ꮃ菣ꊂ菣螃菣覃蟥㲦牢ਾ郧貾臣趸듦隌臣貂臣芀㰊䥄㹖胣邼볯閼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶〱ㄮ㈮†뗧鮏臣邃苣ꖃ菣Ꚃ苣ꮃ苣鲽ꏨ膀苣뎃菣꾂돨몙迧膀迥뎁닧붣㰩牢ਾ†䍎㤹胣䎁污㤰胣掁㙈ㄯ䠨丶‱⽁菣겂菣⾢苣Ꚃ苣벃菣뎃㠯⼱㈰铧ꖝ臣莐諧颃菣覃菣ꆃ苣뎃胣傁戼㹲刊놔鷦꺁苣袃菣꾂菣ꆃ苣뎃膀迥꾁乖㐰䠠誏臣嚳ぎ‴䅎苣鲽ꏨ馁苣龁苣ꮁ胣邃苣ꖃ菣Ꚃ苣㲤牢ਾ菣릂臣몟臣辁駧뺏돧銂믤趉臣風볨閁苣ꚁ臣讂胩誂臣ꦈ铧鞁臣⢟⹎倠捩覂臣螖賧⢮〲㈱‬乐㱁牢ਾ⁓〱㨹㔲㌷㈭㜵⤸芀냧钽臣낿臣讂臣膀菣궂菣궃믨뮧菣꾂苣벃苣Ꞥ藨貏ꃦ䒪ㅈ䈰捡䤨癮瑩潲戼㹲朊湥궸臣ꊽ돨ꊻ迦鞁胣뎂菣讃菣銂軦随臣膀裦랕臣鮁臣芀菣꾂菣覃苣膀汐獡業⁤ㄱ‶楍楤䬠戼㹲椊⡴楑条湥銂铧蒁臣뾪ꏨ鞁胣鶁臣貾胣붣胩궥胨꺁賦몤臣鎾臣ꚁ敃汬敦瑣湩䤠⡉湉楶牴杯湥戼㹲⤊苣ꢔ臣ꚁ胣厁㥦듧麃臣袃菣뎃苣閃苣꾂菣鞁臣芀뗧鮏臣邃苣ꖃ菣Ꚃ苣ꮃ苣銂胣咁䵎䘭릟鳥⢰㱇牢ਾ浥湩⁩楂灯潲畤瑣⥳룤ꞁ裦랕臣鮁臣原㥦듧麃臣鞢맥閁臣膀臣꺁뻥膀臣貂苣ꢔ臣ꚁ胣䢁䍹潬敮戼㹲 䙓蚘駨내菨릟鳥⢰桔牥潭䘠獩敨⁲捓敩瑮晩捩궸臣邈闩閁臣龁楈桧䘠癩내菨ꮁ〱臣䶮䥏臣㲧牢ਾ蓦鎟臣鮁臣芀蓦鎟臣㦮芙雩貾胣誸룦銂鯥躏臣膀臣꺁뻥膀楎中䅔꣦芄儨慩敧⥮臣ꢁ苣ꮁ莄戼㹲ꞁ芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣ꚁ胣䢁獩㈱뾂苣隌뗧鮏臣䢈뾂菣醃苣ꪳ苣뺲ꏨ鞁臣芀苣ꦃ菣벃苣㲒牢ਾ苣ꦃ菣ꮁ藥ꮡ臣膀듦蒵菣莃菣ꆂ菣⢼〵䵭丠㉡䍈㍏胣㎁〰䵭丠䍡膀〲䵭苣龃菣뺂菣ꮃ胣炁⁈⤸戼㹲ꞁ麛듦蒵臣龁胣뾂菣醃苣ꪳ苣뚺蟥邃菣閃苣벃㔨洰⁍慎䠲佃膀〳洰⁍慎汃胣㊁〵䵭苣龃菣㲀牢ਾ苣벃菣膀䡰㠠ꞁ⸰洵骁臣뚺蟥閁臣膀菣ꦃ菣覃菣ꦂ菣覃ꧨ겖臣뾂菣醃苣ꪳ郥辇臣ꒁ臣ꚁꧨ㲦牢ਾ꣩鞁胣뾂菣醃苣ꪳ苣ꮐ苣뮔裥銂菣벃菣鞁臣芀菣벃菣뮔裥銂䉐궸臣邃菣閃苣벃뫤鮏臣膀〱㰭牢ਾ䑫蚈귥ꪳ蟩ꮂ菣袃苣閃苣覜臣讂流捩湯唠瑬慲臩莿裥ꊛ菣ꎂ菣뾂菣ꚃ菣莃菣⢈楍汬灩牯⥥苣㲒牢ਾ铧蒁臣膀苣ꒂ菣낂볥邃苣莃菣궃菣뾂菣궸臣莿룧鞁臣芀苣뎃菣꾂돨꺁듧ꚺ迥뎁苣ꒂ菣뎃菣ꎂ戼㹲蚃苣銂胣厁卄倯䝁膀苣麃苣벃鿦늉胣誏臣Ꚃ苣릂苣뎃菣궃菣袃臣袂苣ꚩ꣩鞁臣芀鳦芵髧ꪁ苣㲿牢ਾ菣醃苣ꪳ뿦ꚺ苣隃菣莃菣閃苣벃菣ꚩ雨ꞁ뇦骮臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ㘨ㄮ⸰⸱″開觧⦩戼㹲 開觧龮꣩꾁藥ꚁ胣麃苣뎃菣떂苣誃苣뮌꟧Ꞥ귥붖꣨薆该ꦉ껧蚐뷤ꢔ꟥ꆓ볤⢚潍湵⁴楓慮⁩��牢ਾ档潯⁬景䴠摥捩湩⁥湉瑳瑩瑵潩慮⁬湁浩污䌠牡⁥湡⁤獕⁥潃浭瑩整⥥臣겂苣覃菣ꒂ菣ꮁ뫦㲖牢ਾ详鞁臣龮雦鞁臣芀该ꦉ臣膀ꏩ貤迥뎁냦銂蟨놔臣ꦈ铧馁苣鎁臣銂꣨鞁胣ㆁ芙雩꺁飦⾎髦ꢑ鳦㲟牢ਾ臣궶賦鞁臣芀藥ꚁ臣뮼藨薆蟥꺽臣龁苣ꮁ胣貛臣㚮胣㢜胩ꊽ䅂䉌振菣Ꚃ苣⢹慊正潳⁮慌潢慲潴㱲牢ਾ敩⥳苣をㄮ汭臣놂苣龃菣⾳苣랂菣뢂菣⢳⸰㔱杭苣뾂菣뎃迥뎁⸰㌰杭苣랂菣뢂菣⦳臣릅藨薆䤨⥐戼㹲ꢳ냥ꞁ뫩钅臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯钼胣㲑䐯噉ਾ㘨ㄮ⸰⸱‴龄鿦誏臣꾃苣膃菣ꖎ꣧⦮戼㹲 㔠賥꺁鲀놀뷩꺁鯩꺁䅂䉌振菣Ꚃ苣꺁뻧銂뫩钅臣膀䉐ꮁ룥袇臣龁〵汵臣ㆮ㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯灵倾商臣亮㥃膀戼㹲匊ぉ膀苣鞁臣꾁慃ぬꚂ苣ꮃ苣膀〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹰苣鞁臣꾁〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹰䙐꺁뷤ꦸ臩鲿剐Ꚃ苣ꮃ苣膀迥꾁〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹰苣鞁戼㹲辁臣ㆯ㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯灵倾商臣亮ㅓ裥궖黥傋㡒苣ꒂ菣릂臣蒁臣貂臣銂볩钅蛥ꖎ꣧鞁臣芀菣Ꚃ苣꾁胣㖁田꺁껥辇戼㹲ꞁ귧覂蛥ꮁ諦躸臣貂苣ㆋ볎꺁菣ꮃ菣ꊂ菣螃菣覃룤뮴賥傖㡒苣鞁臣꾁䵆Ꚃ苣ꮃ苣袏臣ㆯ볎꺁戼㹲䄊隃菣릂菣뎃㔯⼷㜰吨噉 ㅈ䠠銂郥肂룥ꦲ臣覸뻤릂菣ꪃ菣袃菣꾂菣뎃늩铧辇臣膀츱枼臣㲮牢ਾ㍈裦蚈⽁苣ꮃ苣ꊂ苣⾤ㄷ⼶㜰迥뎁邈裥䊆隃菣릂菣뎃㘯⼰㠰苣ꮐ苣ꞁ臣龁节迥릮臣龁胣閁戼㹲覂臣膀꒾臣麃苣릂臣膀牔䝩楲ꢂ菣꾂菣궃菣것菣랂菣뎃ꏨ꺽䤨档牯䴠摥捩污匠獹整獭銂戼㹲ꢔ臣ꚁ胣傁㡒䠠袏臣亯㥃‹䅈臣蒁臣貂臣銂苣벃菣馁苣㢋츰枼臣炮䅃䝇鞃菣릂菣覃苣꾃苣膃菣㲳牢ਾ軦꺨臣龁设臣낁胣䪁‮瑓敥꺁雦꺌㈨㄰ⰰ䴠楂⁯⠱⤱‬楰㩩づ〰㠱ㄭ⤰迥ꞅ芀蓦鎟迥꾁菣㲯牢ਾ苣膃菣ꖎ꣧꺁놀雩貾胣開觧꺁鳧ꦪ뻥릖臣覂軦股臣膀藥股臣覂ꇨ薸苣麛迥鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯閼볯醀⼼䥄㹖 丠㥃Ꚃ苣ꮃ苣꺁蓦鎟뻥膀菣Ꚃ苣ꮁ胣傁卂臣貸蟩鞁臣㆟㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰵猯灵节臣辁臣ㆯ㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰶猯灵倾商臣厮ぉꚂ苣ꮃ苣膀戼㹲袏臣ㆯ㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯灵节臣辁臣ㆯ㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯灵倾商臣䎮污㤰苣ꒂ菣릂苣뮼藨薆軦꺨臣龁胣붿諥超雧꺁ꖗ뻥膀꒾뷥龁苣㲊牢ਾ릌臣開觧銂佃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢臣覮ꗦ뮭臣鮁胣몂苣频蟥鞁胣䚁獡側敲⵰㐲菣ꊃ苣誃苣뚂菣⢼偍ꞁ菣ꊃ苣誃戼㹲ꒂ苣鞁臣芀苨Ꚃ苣ꮃ苣鮊뻤銂䑍䭃듧麃臣꺁諥ꆾ룦骮臣袂苣겸껥鞁臣芀麛鯧꺁蓦鎟臣㒮胩鎖戼㹲貾胣開觧꺁鳧ꦪ뻥릖臣覂軦股臣膀藥股臣覂ꇨ薸苣ꆎ迥鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯閼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶〱ㄮ㔮†藩ꂴ뗧袐藥��郥肝苣莃苣ꒂ迥뎁臥銲귥떾藥ꊂ菣뮂苣⦤戼㹲 䤠浭汵湯㐠䉈⡘桔牥潭匠楣湥楴楦⥣菣것菣袃臣膀닧붣臣貂臣邃苣ꖃ菣Ꚃ苣ꮃ苣몙迧亾㥃㰹牢ਾ胣䎁污㤰胣掁㙈ㄯ胣节臣辁臣嚯ぎ‴䅈ꢅ臣䎦鳦꾫㑔菣ꦂ菣覃菣銂鳦馁苣⦋胣袏臣嚯ぎ‴䅎丨鳦㲫牢ਾꯧ鮛蟩鎽賥覃菣ꒂ菣銂鳦馁苣⦋苣膀苣벃菣ꎂ菣낂菣莃菣ꆂ菣⢼⸰䴱丠㉡佃⼳慎䍈㍏胣炁⁈⸹㰲牢ਾ胣㖁츰沼Ꚃ苣ꮃ袏臣傯卂룤ꞁ룤ꦙ苣벃菣ꎂ菣낂臣龁丨‮楐慣苣꺁雦꺌㈨㄰ⰲ倠䅎⁓〱㨹㔲戼㹲㜊ⴳ㔲㠷⤩胣鞃菣벃菣銂胣㎁볯ꆄ蓨ꪂ매覲鳦銂郥肂⸰薼睔敥⁮〲倭卂吨䉐⥓臣ㆧ駦鎖菣궃菣㲃牢ਾ苣뎃苣鞁胣鶁臣貾胣ㆁ볯覲매銂郥肂偔卂臣ꎀ뛧貸蟩鞁臣麃苣릂ꇨ薸臣ꢁ苣ꮁ껥ꦸ臣ㆧ駦鎖苣㲤牢ਾ菣궂菣馃菣袃臣龁胣㎂鯥鞴뗦鞁臣貾胣鞃菣벃菣銂胣貺곦뾥듦꾃苣鎃菣ꮃ苣궂苣肃菣벂䠨偒㰩牢ਾ苣뎃苣ꖃ苣벃菣鞊菣Ꚃ苣䦹䝧諦鎽匨杩慭袏臣ꊂ菣ꮂ菣鮃苣閃苣뾂菣벂䄨⥐뗧袐諦麃苣릂杉戼㹲䜊츨階觧낕髧膀湉楶牴杯湥ꢁ臣节臣꒮룦ꞁ芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣鶁臣貾胣鞃菣벃菣㲈牢ਾ苣咒䉐ꞁ麛듦蒵臣膀駧늉臣鮁臣芀剈貺곦鞊뷤銂뷤ꢔ臣讂ꃥ袐臣膀菣것菣袃苣膀楓浧䙡十戼㹲吊传䑐鿥ꪳ匨杩慭⠩〱田⽬苣Ꞃ菣⦫苣ꢔ臣ꚁ駧늉臣鮁胣㎁⁍䍈ꞁ臥ꊭ臣鮁胣㒁〹浮臣궪臣随戼㹲ꎁ臣芀偁뗧袐뫤ꆬ諦鎽苣뾽铧馁苣뒠郥꾁胣鞃菣벃菣銂胣炁讃菣궃菣Ꞃ菣ꮃ菣릂菣Ꞃ菣袃倨戼㹲上偐몟돨⢪祚敭⥤臣몙觨閁臣膀⸰䴵丠佡ꞁ臥ꊭ臣鮁胣㒁㔰浮臣覅귥蚯뫥ꞁꫨ뾁迥ꎁ臣芀藥㲨牢ਾ臣꺁껥鎨臣ꒁ臣ꚁ胣厁湹牥祧㐠䈨潩敔⥫菣것菣袃菣벃菣벃苣뾽铧鞁臣芀㕈䠠ꮁ꿥馁苣趏뿥㲜牢ਾ胦銂ꓦ몇臣讂䱅卉龮꣩ꮁ臣蒁臣꾁胣ㆁ㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰵猯灵倾商臣亮ㅓ螈雦讞⽁菣袃菣ꂃㄯ〲⼳〲㐰苣ꒂ菣릂戼㹲ꮁ蓦鎟臣龁菣Ꚃ苣놔鷦꺁ꇨ薸苣붙胦뺯藧ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ㘨ㄮ⸰⸱‶鶃菣꾂菣벃菣ꮃꇨ薸臣覂臣麃苣릂杉꺁닧붣㰩牢ਾ†菣Ꚃ苣股룦銂䉐⡓䡰㜠㐮ꮁ룥袇臣膀⸰㔴浵믦貏菣ꎂ菣뾂菣ꚃ菣莃菣ꮁ胩鞁臣芀뿦躁臣㲗牢ਾ臣股룦銂胣㎁汭臣㒮䘠獡䙴潬⁷敓桰牡獯⁥⡇䕇䠠慥瑬捨牡⥥苣ꮐ苣ꮂ菣ꂃ臣薅ꇥ鞁臣芀臣꺁戼㹲ꮂ菣ꂃ苣㚒洰꺁䉐ꞁ듦蒵臣膀藥䦨䝧苣をㄮ낂菣랂菣䢳汃菣莃菣ꆂ菣⢼䡰㈠㜮ꞁ뫦몇臣鮁胣㊁戼㹲䴊吠䥒ⵓ䍈邃菣閃苣벃瀨⁈〱銂铧蒁臣馁臣ꮁ룤貒臣龁䄨‮畊杮慢敵覂臣螖賧⢮㤱㤸‬⹊㰠牢ਾ桃潲慭潴牧㐠㘷㈺㜵㈭㠶⤩胣鶁臣貾胣뚺蟥閁苣龁杉銂뿦꺸臣膀〳䑫꺁苣莃菣ꪂ菣銂鳦馁戼㹲讂流捩湯唠瑬慲散汬䴨汩楬潰敲ꂁ뿥蚈鯩ꚃ菣莃菣銂铧蒁臣⢦䉐ꮁ邃菣閃苣벃뫤鮏臣龁胣㲂牢ਾ苣뎃菣꾂돨莿뫥銂胣䆁㠲閳苣ꢔ臣ꚁ胣亁湡䑯潲⁰〲〰裥覅藥ꚺ꣨ꞁ룦骮臣��胣ં䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾ㘨ㄮ⸰⸱‷랂菣벃菣뾂苣鞃賥銲귥궸鋥ꊂ菣뮂苣⦤戼㹲 랂菣벃菣뾂苣鞃닧邭铧龔臣讉ꃩ꾁胣ꖻ觥꺁ꃧ뚩苣몟臣릔ꓥ鞁臣节臣ꞁ臣誂ㄨ㔸膀믤趉戼㹲ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣⢋뻤袁臣膀⹍⹊䔠慶獮臣螖賧⢮〲㜰‬慎畴敲㐠㘴㠺㄰㠭㔰膀⹒䠠楡苣꺁戼㹲螖賧⢮〲㈱‬⹊嘠物汯‮㘸㔺㜷ⴴ㜵ㄸ膀迥뎁⹎倠捩覂臣螖賧⢮〲㈱‬乐十ㄠ㤰㈺㜵ⴳ㔲㠷戼㹲⤊迥ꞅ芀냧钽臣낿臣讂臣膀㤲″내菨ꮁ胣ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂菣鶃菣뾂菣몁볤邭胣䢁噉䜠条倭汯戼㹲膀苣ꆃ菣掩㕈ㄯꇨ莐蟥蚛듧뾂菣醃苣ꪳ䄨馃菣誃菣⾠㈱㌰〯‴㕈菣莃菣覃菣ꒂ菣誏臣傳㡒苣袃戼㹲벃苣覃菣ꒂ菣⦳胣䊁黥ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂苣ꒂ菣릂⽂뇥ꊽㄯ⼶㠸铧ꖝ臣躃苣ꦃ菣讃菣벃苣銂郥肂戼㹲鞃菣Ꚃ苣ꮃ苣銂苣벃菣馁苣㒋臣꺁菣ꦃ苣龃菣銂苣袃菣뎃苣閃苣꾂菣鞁臣芀菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣㲯牢ਾ苣ꞃ菣꺁㠴駦鎖뻥膀룤薸苣麛迥鞁胣鶁臣貾胣掁㕈ㄯ닧邭ꫨ붣觧銂닧붣臣讂臣膂臣뺿臩鞁臣⢟戼㹲《㐮층涼귥蒾芀臣꺁뻥膀닧邭苣颧胣ꪁ뿦ꚺ臣뺲ꏨ麃苣릂杉ꢁ臣节臣ꒂ菣궂菣馃菣袃臣膀㱍牢ਾ䍄내菨ꮁ럦ꂊ臣龁胣ꊽ돨躰藥貁芙雩늀ꇨ鞁臣貾胣내菨銂듦蒵臣膀雦꺮臣릟鳥銂듧麃臣誸戼㹲ꮁ藩꺽臣龁胣ꊽ돨躰藥꾁藥ꚁ胣ㆁ볎⽧䱭菣ꪃ菣것菣⢳楓浧ⱡ匠⹴䰠畯獩‬位꺁귥ꢜ룤ꞁ껥㲟牢ਾ雦鞁臣芀뷥ꪳ냥ꖅ臣㒮芙雩貾胣ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂苣莃苣ꒂ苣龮雦鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯閼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶〱ㄮ㠮†迥開볤钁껥鎨㰩牢ਾ†菣Ꚃ苣⢹꒾뷥龁苣溊볯㖝ꮁ胣亁㥃Ꚃ苣ꮃ苣ꞁ臣讂䍎㤹胣ꆬ臣ꞁ胣䎁污㤰苣鞁臣꾁䥓㘰苣ꒂ戼㹲ꮃ苣ꮁ蓦鎟臣鮁臣꒾铧ꖝ臣㊮〰汵臣股룦膀迥꾁鳦龄뷤開觧놔鷦꺁ꇨ薸苣릅藨薆軦꺨臣龁胣㲂牢ਾ軦꺨芙雩貾胣麃苣릂苣뮺藩鞁胣㖁䴠䑌〵臣嚮ぎ㨴剐‸㨲趆鯩袐뷤ꮁ蓦鎟臣鮁臣⢟뻤袁臣膀㱊牢ਾ‮瑓敥覂臣螖賧⢮〲㤰‬⹊嘠物汯‮㌸ㄺ㐷ⴲ㜱㌵芏藧⦧胣趇蟩鮸냥銂㐱韦鎖꿦ꖗ菣讃苣ꪃ戼㹲뎃苣鞁胣鶁臣鶈鳦鎽蟩꺁〳볯薶苣놤臣龁菣Ꚃ苣銂귦ꆺ臣風賩鞁胣覮ꗦ뮭臣鮁臣芀牐獩㑭䜨戼㹲爊灡偨摡銂铧蒁臣놵꣨ꎧ黦銂껥붖臣龁胣龔귥꺁럥銂胣궃苣ꦃ菣꾂鳦辄ꓦ骮臣袂苣ꮂ菣ꦃ菣㲳牢ਾ菣ꒂ菣벃铧颭꟨邞臣袨껧鞁臣芀⸰㔰迥꾁臣貂鳦肺臣傮胥銂뗧袨髧覜蓦ꢁ臣ꪁ臣芀㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶〱㈮†뗧鲞㰩牢ਾ㘨ㄮ⸰⸲‱릂菣벃苣龄迥Ꞁ諦鎽臣膀귥肯胦袏臣醃菣螃菣莃苣䢯丱Ꚃ苣ꮃ苣꺁蓦鎟臣袂臣㲣牢ਾ臣颪냥閁苣讂臣膀菣꾂菣뎃軦꺨臣袂臣ꚁ臣颪냥閁苣ꪁ臣⦄戼㹲 㔠賥꺁菣Ꚃ苣꺁뻧ꮁ胣ㆁ㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯灵倾商臣亮㥃膀䥓㘰胣袏臣䎯污㤰苣ꒂ菣릂苣뒇귦辇鳦肺臣龄鿦閁臣㲛牢ਾ胣㒁胩��鎖뻥膀ꇨ薸苣袃菣꾂諦鎽諥ꆾ臣閩뻤꺁臣膂臣ꆎꇨ鞁臣芀蓦鎟臣袂臣ꚁꫨ躰臣貂苣릂戼㹲袃菣꾂諦鎽臣讨뫥銂飦覂臣ꮁ臣讂臣膂臣膀ㅈ苣ꒂ菣릂臣릂菣벃苣誏臣䢳Ꚃ苣ꮃ苣꺁菣莃菣㲉牢ਾ苣ꮐ苣꾏뫦Ꞁ䅈꟦覯觧ꞁ臣讂䡣⼶뾂菣醃苣ꪳ苣뾽铧鞁臣⢟뻤袁臣膀⹎倠捩覂臣螖賧⢮〲㈱戼㹲Ⰺ倠䅎⁓〱㨹㔲㌷㈭㜵⤸迥ꞅ芀臣꺁ꧨ겖臣膀菣ꪃ苣궃菣誃菣股룦ꮁ臣醁苣릂菣벃苣릉闧蒚戼㹲鞊뷤꺁鯧ꖎ髧鲤蟥銂迥붃臣馁苣芀귥肯胦袏臣醃菣螃菣莃苣Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ蓦鎟臣龁菣Ꚃ苣꾁藥㲨牢ਾ臣膀䅈苣袃菣꾂臣뺯臣讂迥鲿胦銂鳦馁苣鞊뷤銂铧龔臣龁뎛㘴芀꿥ꞅ髧ꮁ胣傁㡒苣鞁臣꾁㱎牢ਾ㥃‹䅈苣뎂菣覃臣讂乄ꞁ裥麛藥ꮖ臣龁该ꦉ胣隈臣꾁룤뮴賥傖㡒苣鞁臣꾁䵆꾃苣膃菣袏臣㲯牢ਾ룥ꦲ臣릂菣ꪃ菣袃菣꾂菣뎃苣训苨薆臣鞏臣龁该ꦉ臣膀臣貂苣ꮁ菣꾂菣뎃軦꺨臣龁諦龎臣뺯戼㹲馁苣鶁臣股룦ꊻ迦ꮁ苣讁臣辂苣骁胣䖁䥌䅓臣袂苣掊㙈ㄯ臣뺯臣讂迥鲿胦銂鳦閁臣讁臣龁胣開戼㹲ꦉ臣膀〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹰迥꾁〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹰臣躽룦ꦁ뿥Ꚃ苣ꮃ苣袏臣亯ㅓ裥궖臣袂臣ꚁ볥銯賥閁苣龁铧Ꚃ苣ꮃ苣銂菣㲯牢ਾ苣膃菣ꖎ꣧鞁臣ꢁ臣膀苣袃菣꾂觧낕髧鞊뷤鮊뻤꾁菣莃苣낂菣Ꚃ菣覃苣鮾臣颁臣誸鯥ꎁ臣芀戼㹲颃菣覃臣ꪁ臣股郧鶇鯩ꂴ꟦覯觧銂菣꾂菣뎃軦꺨臣龁菣Ꚃ苣놔鷦꺁ꇨ薸设臣낁胣䪁‮瑓敥㱬牢ਾ苣꺁雦꺌㈨㄰ⰰ䴠楂⁯⠱⤱‬楰㩩づ〰㠱ㄭ⤰迥ꞅ誏臣릂菣벃苣릉闧蒚菣躃苣궃菣誃菣鞊戼㹲鎽䘶㈱苣붙胦뺯藧ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣龁设臣낁胣䞁匮‮慔覂臣螖賧⢮〲㈱‬⹊嘠物汯‮㘸㘺㜱ⴹ戼㹲㘊㠱⤸迥ꞅ芀볥銯賥Ꚃ苣ꮃ苣꺁ꓨ붣菣馃菣꾁胣躇铧讞苣ꒂ菣릂臣螤ꏨ것菣ꮃ苣誂苣躽臣膀戼㹲趸듦隌䐯䅎菣꾂菣뎃臣膀苣袃菣꾂迥鲿胦鞊뷤銂ꫨ躰臣ꪁ臣ꎁ臣꺁臣膀臣貂苣꺁諦鎽臣鶈鳦㲟牢ਾꫨ躰臣螤ꏨ꾏菨Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ苣ꎁ臣Ꞥ臣辁ꋥ랼臣貂臣ꢁ믤骮臣貂苣芀㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶〱㈮㈮†菣뎃菣龃菣꾂ㅈㅎ臣붿諥超雧꾁胣ꎀ뛧覤闧鞁臣ꎭ꿧Ꞁㅈㅎ裥ꊛꃦ꺁뿨ꂊ藥ꮖ戼㹲袂苣节ꯩ蒁諥ꆾ臣릂菣벃苣趏뿥Ꞁ諦鎽苣颪駧馁苣⦋戼㹲 ㄠ㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯灵倾商臣亮㥃Ꚃ苣ꮃ苣ꞁ裥麛藥ꮖ臣龁该ꦉ苣膀裥麛藥ꮖ臣㒮胩鎖뻥ꮁ胣㊁臣꺁闧ꪁ苣ꢔ蟩㲏牢ਾ臣厮ぉ⠶〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾⼼畳㹰胣ㆁ㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰶猯灵倾商貀䍎匯趀袏臣䎯污㤰ㄨ㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯灵膀〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹰䙐㭕胣二⽃慃趀ꞁ뿨ꂊ藥ꮖ臣龁胣㒂戼㹲놀雩��胣麃苣릂臣覂鳦龜軦股臣膀ꇨ薸苣膀뗧鮏臣授㙈ㄯ苣뎃菣꾂돨銂铧蒁臣膀苣袃菣꾂迥㲍牢ਾ뿥Ꞁ諦鎽臣颭鳥ꮁ臣蒁臣ꎧ黦鞁臣芀麛鯧꺁苣ꒂ菣릂軦꺨苣鞏臣龁该ꦉ臣ꢅ臣膀䍎㤹臣鞁戼㹲讁蓦鎟臣ꚁ臣ꪁ臣ꎁ臣麃苣릂臣钯臣ꚁ룤螘臣龁苣袃菣꾂諥ꆾ苣覜臣ꚁ臣龁뎛㜴芀껥鮚胣㲁牢ਾ苣誂뷤蒁铧辇ㄨ㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯灵꺁慃ぬ袏臣ㆯ㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰵猯灵倾商臣厮ぉꚂ苣ꮃ苣⦹苣鞏껥鞁臣開觧꾁胣袂苣颫臣ꢔ蟩⢏㰱牢ਾ㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯灵倾商臣䎮污㤰迥꾁〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾⼼畳㹰臣厮ぉꚂ苣ꮃ苣⦹苣鞏껥鞁臣開觧袂苣节볥蒁ꋥꂊ苣覜臣ꚁ臣龁臣ꞁ胣㲁牢ਾ諥鲞臣ꢔ蟩鶾귥蒚臣芁臣龁胣鞁臣鞁臣貁苣膀䍎䌯污蓦鎟该ꦉ臣膀䍎匯龄鿦꒾臣钯臣ꚁ苣㲈牢ਾ苣랼臣릂菣벃苣鮊뻤颪냥銂ꓧ鞁臣鎁臣꾁돦꺛臣릁臣鎁臣ꞁ臣讂胣论껥膀䍎䌯污뻧ꢁ郥讨뫥㲦牢ਾ臣股룦릂菣벃苣鮊뻤銂铧颁臣鮁苣龁苣ꮁ胣ㆁ〰趀ꓥ辁臣ꎭ꿧Ꞁ苣ꒂ菣릂䥓㘰苣薿ꛨꢁ臣龁戼㹲⠊鯥㒳⤷胣肸곦誏臣貺곦龄鿦ꮁ꿥馁苣股룦ꊻ迦銂ꋧ趪臣讂臣膂臣膀藥ꚁ臣股룦銂胣蒵迦袁䍎戼㹲㤊誏臣䎳污㤰䠠뾂菣醃苣ꪳ臣뺯臣讂迥鲿胦ꮁ臣蒁臣膀䱅卉ꮁ苣誂ꧨ鎨臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†ꓨ붣臣袂臣ꚁ苣袃菣꾂臣뺯臣讂諦鎽臣颪駧貁볥辁ꋥ랼臣貂苣ꢁ臣蚁鿧讦臣몟臣蒁臣膀慃戼㹲氊㤰蓦鎟该ꦉ臣讦苣貂苣鞊苣袃菣꾂諥ꆾ臣鞢諥꺁룤螘臣膀苣ꒂ菣릂臣螤ꏨ붃諥꺁ꋥ랼臣邵戼㹲鲞臣芁苣鞾苣讁臣蚁臣銂ꋧ讁苣龁胣붿諥超雧꺁ꖗ뻥膀䍎䌯污迥뎁䍎匯開觧銂뇥몮臣膀苨㲺牢ਾ뗧钹苣麛迥鞁臣芀䥓苣ꒂ菣릂臣膀ꃩꆬ蓦鎟臣鮁臣麃苣릂臣몂臣꾁ꓦ몇臣貂臣讁臣龁臣膀慃戼㹲氊㤰苣ꒂ菣릂臣膀臣꺁駦릂臣ꞁ臣膀〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㔾⼼畳㹰䙐⽕䱭臣뺁臣邈闩鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶〱㈮㌮†ꫨ몙臣貂臣릂菣벃苣趏뿥Ꞁ諦鎽臣膀苣뎃菣袃菣ꞁ룤貒듦Ꞁ苣覜臣讂㰩牢ਾ†臣貂苣꺁苣袃菣꾂觧낕髧鞊뷤꺁룤貒菨鮊苣閩뻤馁苣龁苣ꮁ胣랂菣벃菣뾂苣鞃賥銲귥궸鋥㲌牢ਾ苣莃苣ꒂ苣뾽铧鞁臣芀ㅈ苣蚃菣誏臣䢳颃菣覃苣覜臣讂䅈苣몙迧馁苣북닧邭挨㕈ㄯ銂胣내戼㹲麃臣꺁臥銲귥꺁뻤ꖅ臣邈諥貾臣몙迧閁苣讂菣랂菣Ꞃ菣벃苣㊼㌵菣鶃菣뾂菣몁볤邭苣覜臣讂戼㹲袂臣ꮁ铦覤臣龁胣鶁臣龁苣膀뻤ꖅ苣ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂駧뺏臣ꊖ闦ꢁ臣ꚁ룦骮臣龁胣開觧꾁ㅈ戼㹲上Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ臣讁鯦늜臣貂臣讁臣龁臣ꞁ胣떾藥꺁飩뎮臣蒁臣貂苣膀䅈䠨⤱苣袃菣꾂臣뺯臣㲙牢ਾ苣궸��鞊뷤꺁뗧鲞臣芁臣龁胣ꖅ触꾏菨ꪁꇨ薸臣辇臣邙苣貂臣蒁苣龁苣膀䍎㤹苣ꒂ菣릂臣鶈戼㹲麛藥ꮖ臣貂臣貁胣鶁臣貾胣ㆁ㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯灵‾慃ぬꚂ苣ꮃ苣袏臣ㆯ㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰵猯灵‾䥓㘰苣ꒂ菣릂臣붿諥超雧閁苣龁菣㲞牢ਾ苣릂铧ꖝ臣股룦꺁닧붣杉뾪ꏨꦉ臣뢛꿥蒚臣궸鋥릊軧꺁臣銂ꧨ鎨臣龁胣䎂污㤰臣뾁臣龄鿦鞁戼㹲龁菣Ꚃ苣놔鷦꺁ꇨ薸苣閁苣ꪁ苣钯볨릂臣鞁臣뾽铧鞁臣芀맥莺臣낂菣벃菣㆗觧낕胦銂鳦馁苣㲋牢ਾ苣袃菣꾂觧낕髧鞊뷤ꞁ臣讂菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤㚓ㅆ⠲뻤袁臣膀⹇⹓吠湡苣꺁雦꺌㈨㄰ⰲ䨠㰮牢ਾ嘠物汯‮㘸㘺㜱ⴹㄶ㠸芏藧⦧苣붙胦뺯藧ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†〹볯銂뛨袁苣뮘껥꾁胣亁⽃慃麃苣릂迥꾁䍎匯麃苣릂臣蒁臣貂臣ꮁ铧ꖝ臣讂苣骁臣㖋田⽧戼㹲洊꺁닧붣杉ꞁꛨ覂苣龁胣亂⽃慃麃苣릂迥뎁䍎匯麃苣릂臣覂跥ꊛ臣貂臣䦟䝧臣膀〵迥꾁〱㱵牢ਾ⽧䱭臣膀郥颧臣릊軧ꞁ䡣⼵몙迧북닧邭臣떾藥銂飩뎮臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣龁臣ꢁ臣ꢳ鯧馁臣趁戼㹲鎁臣ꞁ臣讂胣䎂污㤰苣ꒂ菣릂臣뾁臣龄鿦鞁臣麃苣릂铧ꖝ臣䦮䝧臣躽菣馃菣꺁뻤ꖅ飩뎮苣몤臣㲗牢ਾ胣鎁苣꾁胣ꪜ蓦鲽菣Ꚃ苣ꞁꛨ覂苣讂菣馃菣ꢁ郥颧臣芁臣龁胣뎛㜴臣몤臣袂臣ꮁ胣鎁臣뒠郥㲈牢ਾ苣膀臣貂臣膀臣꺁뻧ꮁ臣醁苣뢛꿥蒚臣릂菣벃苣鞊뷤鮊뻤銂迥ꂘ臣ꚁ臣讂胣ં䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ㘨ㄮ⸰⸲‴릂菣벃苣趏뿥Ꞁ諦鎽臣鞏该鶼臩龮꣩ꮁ臣蒁臣낕꣧龄鿦讁苣늘뻥馁苣⦋戼㹲 鶁臣袂臣ꪁ諦鎽臣ꒂ菣鎃菣ꞁ臣늘뻥릊軧銂ꧨꆾ臣讂臣膂臣膀ꃩꆬ蓦鎟臣鮁臣開觧놔鷦꺁戼㹲股룦銂鳦龄뷤麃苣릂臣릅藨薆諦躸臣膀곦蒁臣膀剐邃菣꾂苣ꦃ苣뎃菣⢉乖㐰ꞁ㕈ㅎ蛥蚛郥㲈牢ਾ뷤Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ蓦鎟臣鮁臣芀귥肯胦Ꚃ苣ꮃ苣誏臣醃菣螃菣莃苣Ꚃ苣ꮃ苣⢹䍎㤹ㄠ㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯灵倾商䌭污㤰戼㹲 〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹰䙐⥕苣蚠곦龄鿦閁臣龁菣Ꚃ苣놔鷦꺁ꇨ薸苣鞏껥鞁臣開觧꾁胣龄鿦讁苣ꢃ裥蒚臣늘뻥閁戼㹲貂胣龔귥螎臣㢯薼臣芁臣龁胣ꎀ뛧覤闧鞁臣ꎭ꿧Ꞁꃦ⢪䍎㤹ㄠ㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯灵倾商匭ぉ‶〱‶䙐⥕臣鞁臣鶛戼㹲늜臣貂臣蒁臣蒁菣Ꚃ苣节臣龁胣龄鿦讁苣ꢃ裥蒚臣늘뻥閁苣龁㘨薼铧颭芀䍎㤹苣ꒂ菣릂ㄨ戼㹲《猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹰䙐⥕臣ㆮ鯥꺁軦꺨臣讁迥醁臣蒁臣蒁菣Ꚃ苣꾁蓦鎟臣覂飩ꆾ臣貂臣膀ꖗ鯧뺁臣ꮁ胣龄鿦꺁戼㹲龁苣ꮁ胣ꢅ臣뮭뫤鞁臣⢟鯥㒳⤸胣ં䐼噉邀볯颼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†ꒁ臣鶈鯥超雧ⶫ뿨ꂊ藥ꮖ뻧鎖臣龔귥꺁럥��꾁胣놵꣨蒚臣覜蓦ꪁ苣꺁臣꾁臣讁臣龁瀨볯ゝ㔮㰷牢ਾ⤵胣鞁臣鞁臣貁苣膀ꃩꆬ蓦鎟臣鮁臣麃苣릂臣龔귥꾁胣鶈鯥超雧꺁臣꺁菣Ꚃ苣⢹䍎㤹匯ぉ‶㱰牢ਾ볯ゝ〮㠱胣亁㥃⼹慃ぬ‹鶼⸰〰㌲誏臣뺯藧麃苣릂丨㥃⼹䥓㘰瀠볯ゝ〮㌰膀䍎㤹䌯污㤰瀠볯㲝牢ਾ⸰〰ㄳ꺁铧颭臣놵꣨蒚臣낕臣ꎁ臣誁苣膀苣袃菣꾂迥鲿胦鞊뷤꺁菣馃菣꺁룤螘臣膀闧꺨뫤㲜牢ਾ黥龄鿦讁苣늘뻥馁苣鎁臣貁臣趁苣鎁臣銂ꓧ鞁臣蒁苣芀㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖 鎁苣覂臣ꖟꛨ꾁胣龮꣩꒾臣蒐胣ꮁ臣蒁臣꺁䅈苣袃菣꾂臣뺯臣讂ꇨ薸迥鲿胦꺁꣧ꚺ臣袂臣㲏牢ਾ鯧ꊖ臣龁臣ꞁ胣嚁ぎꚂ苣ꮃ苣놔鷦꺁䅈臣趏뿥Ꞁ苣閩뻤鞁臣芀뫤뎃臣貂臣骀苣膀㕈䠠ꮁ꿥㲾牢ਾ臣讂迥鲿胦꾁胣ꎭ꿧Ꞁ苣ꒂ菣릂蓦鎟臣醃菣螃菣莃苣Ꚃ苣ꮃ苣龄鿦꺁룤릖苣貵꣩鞁臣꒾臣肜戼㹲节ꯩ讁臣龁胣ꎀ뛧覤闧鞁臣ꎭ꿧Ꞁꃦꮁ蓦鎟臣龁菣Ꚃ苣꾁胣ㆁ㰰畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯灵倾商臣亮㥃Ꚃ苣ꮃ苣銂麛臣㲗牢ਾ臣ꖎ꣧鞁臣蒁臣蒁菣Ꚃ苣ꢁ꿦릁臣膀乖㐰苣ꒂ菣릂铧ꖝ臣䢮ꮁ꿥馁苣袂苣颫臣讨뫥꺁迥鲿胦㲧牢ਾ苣몤臣龁臣膀臣꺁諥ꆾ臣膀〱趀냥ꪁ臣Ꚃ苣ꮃ苣銂뿨ꂊ藥ꮖ臣뾽铧鞁臣亟㥃⼹慃ぬ꒾臣鮊戼㹲ꆾ苣誂苣閁苣ꮁ뷤讁臣龁胣鎁臣ꞁꛨ覂苣龁飩ꆾ臣讨뫥ꮁ꿥馁苣事릉闧蒚諦鎽臣蒯룤꺁迥붃戼㹲Ꞁ苣銎駩馁苣龁苣ꮁ胣股룦鞊뷤鮊뻤銂䱅卉ꮁ苣誂ꧨꆾ臣龁胣鮊뻤꾁胣肜裥꺁䍎㤹苣ꒂ菣㲫牢ਾ苣龄鿦銂볥隌臣讂臣膂臣뾽铧閁苣龁苣ꒂ菣릂臣ꆄ雩芿臣貐귧ꞁ臣ꎁ臣芀귥肯胦袏臣醃菣螃戼㹲龃菣꾂ㅈㅎ苣ꒂ菣릂臣붿諥超雧节郥颧臣膀麛臣Ꚃ苣ꮃ苣龄鿦貾臣讦苣貂苣鲿귧ꢁ꿦릁臣㲦牢ਾ胣亁鞊뷤鮊뻤銂ꋥ랼臣鮁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶〱㌮†뗧隫㰩牢ਾ†臣꺁껥붖뻤꾁胣炁ㅈㅎ苣ꒂ菣릂臣龄鿦鞁臣讀뷤貁胣ꪜ蓦鎟胥鎽设臣낁胣龮雦设⸶芏藧⦧戼㹲ꢁ꿦릁臣膀苣誂ꯩ蒁苣袃菣꾂觧낕髧鞊뷤鮊뻤銂鳦馁苣ꢁ臣蚁鿧讦苣麃苣릂臣趆迧鞁臣蒁苣㲋牢ਾ胣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂蓦鎟臣鎁臣麃苣릂菣螃菣ꮁ臣蒁臣膀귥肯胦䢧丱Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ苣讂菣Ꚃ苣꺁戼㹲龄鿦ꢁ胣鶁苣ꮁ뛧辁菣뎃菣龃菣꾂ㅈㅎꃦ뢁臣鶛鳩꾁胣ꎀ뛧覤闧鞁臣ꎭ꿧Ꞁㅈㅎ苣ꒂ菣릂臣㲮牢ਾꃩꆬ蓦鎟苣誂苣Ꞥ臣蒁꣧ꚺ臣䢫릂菣벃苣鞊뷤鮊뻤銂ꋥꂊ臣鮁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶ㄱ†껥붖뻤ㆋ㨱苣ꪃ苣랂菣隌苣覤賥閁臣讂臣ꢁ臣袂苣膀苣뎃菣ꮃ苣뎃苣股郧鶇鯩ꂴ臣뺯戼㹲馁苣늶胦超雧鲿귧銂뿤颭臣貂臣릂菣벃苣覃菣ꒂ菣ꮁ郥醁苣⦋戼㹲 鎁臣龮雦设臣膀苣ꪃ苣랂菣隌菩趽臣躰藥ꮁ苣誂苣뎃��ꮃ苣뎃苣颃菣覃菣ꆃ苣뎃룤꺁諦龎戼㹲Ꞁ菩趽苣麃苣꾂臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ胣誏臣낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤꺁駩뮎臣袂苣鞊軥Ꞁ菩趽苣릂菣㲈牢ਾ菣꾂菣ꆃ苣뎃룤ꞁ苣誂뿨ꖁ臣蒂臣蒁苣꺁臣馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣膀苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣꺁戼㹲鶿귥閁苣龁苣袃菣꾂菣ꆃ苣뎃臣뺯臣讂諦鎽苣ꎔ铧馁苣袂臣ꮁ胣超雧뮳苣躰臣鎁臣貁臣趁苣㲋牢ਾ臣ꢁ苣몤臣芀㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶ㄱㄮ†鷦首迥뎁雦閳㰩牢ਾ㘨ㄮ⸱⸱‱ꂬꓥ讞苣ꪃ苣랂菣隌ꫧ뚄ꓥ낕뷤誏臣躁觥낂菣뎂苣ꮃ賥膪蓧覤闧鎽臣鲽ꏨ誏臣㲳牢ਾ苣궃菣讃菣낂㰩牢ਾ†邵郥讞苣ꪃ苣랂菣隌臣膀苣뎃菣꾂돨薆臣䆮湳堭匭牥启牨藩鞈菣膃菣閃臣袂臣ꚁ菣궃苣ꦃ戼㹲ꂃ臣貂臣誁苣膀臣꺁ꃥ袐胣墁臣膀菣궃菣뎃苣꒙臣뮻蓦꺁苣龃菣뢅臣芁苣鎁臣貁臣趁苣芀⽁㱐牢ਾ⽒⼸㐳䠠꺁胥薀臣낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤袏臣鶁臣蒵郥鮁臣꒙軥銂胣ꢃ뷤릉闧蒚ꫧ뚄ꓥ낕铧邈㰨牢ਾ瑓慲慴敧敮‬慓瑮⁡汃牡ⱡ䌠⥁苣ꢔ臣ꚁ胣䆁湳껦몟苣蚯軦ꮁ雩ꎀ臣讂汇ꮁꫧ뚄ꓥ낕臣鮁苣㲋牢ਾ臣ꢁ臣袂苣龮雦鞁臣芀菣邃菣릂裦ꖕ苣ꢔ臣ꚁ胣붿諥꺁獁⵮ⵘ敓⽲桔超裥膃菣閃苣꾏ꓥ鞊戼㹲龎胦ꢃ뷤궸臣鲽蟥馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣膀䅈臣莐諧颃菣覃菣ꆃ苣뎃臣붿諥꺁邵郥讞苣ꪃ苣랂戼㹲ꮃ賥ꢃ뷤銂냥ꖅ臣龁胣膪蓧覤闧閁臣龁臩鶼귥銂䍰䝁升苣뎃菣꾂돨몙迧鞃菣릂菣覃迥꾁苣ꒂ戼㹲ꮃ苣것苣궂菣벃铧꺁䑰鞃菣릂菣覃臣躰藥鞁臣⢟뻤袁臣膀⹅䘠摯牯苣꺁雦꺌ㄨ㤹ⰹ䨠‮楖潲戼㹲氊‮㌷㤺㜶ⴹ㘹㈸誏臣劳‮慈覂臣螖賧⢮〲㠰‬⹊嘠物汯‮㈸ㄺ㔰〸ㄭ㔰〹芏藧⦧胣ં䐼噉邀볯颼볯醼胣㲑䐯噉ਾ㘨ㄮ⸱⸱′超雧趛藥ꊂ菣뮂苣⦤戼㹲 ㈠㌹吠듧麃臣膀⽁剐㠯㌯袏臣掯㕈ㄯꇨ莐蟥蚛듧꺁蟩龔黥誏臣낂菣뎂苣ꮃ賥膪蓧覤闧鎽苣㲒牢ਾ苣벃菣馁苣炋䅃䝇鞃菣릂菣覃苣袃菣뎃苣閃苣꾂菣鞁臣芀菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃臣㊮芙雩貾戼㹲膀듧麃苣膀⸰薼䙐⽁쌱傗卂臣膀껥ꦸ刨⥔臣㎧蚈雩몛껥鞁胣㖁볯亅ⵆ菣ꮃ苣⾯쌱傗卂臣膀呒臣㲧牢ਾ〳裥鎖菣궃菣궂菣낂臣龁胣涂扁苣㖒볯亅ⵆ菣ꮃ苣⾯쌱傗卂臣貸蟩鞁胣㖁볎⽧䱭臣肜뗧莿뫥ꞁ胣劁戼㹲吊臣ㆧ駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀駩Ꞁ꿥ꞅꇨ薸苣㆒ㄺ〰룥袇臣龁胣내菨颍뇥銂쌱傗卂臣㎧鯥鞴戼㹲蒵臣膀臣꺁뻥膀汁硥⁡汆潵⁲㠴궃菣鞊菣Ꚃ苣䦹䝧䤨癮瑩潲敧⥮臣ꢁ苣ꮁ胣ㆁㄺ〰꺁룥袇臣㲧牢ਾ胣劁ꞁ芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣趛藥趏뿥Ꞁ苣膀汏浹異⁳塉〷胥讫鯨覅ꇩ꺾迩銂铧蒁臣㲦牢ਾ迥隦賥鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶ㄱㄮ㌮†苣Ꞃ苣뾂菣隃菣莃菣⦈戼㹲 匠卄倭䝁⡅楂牯摡誏臣Ꚃ苣릂苣뎃菣궃菣袃꟨邞苣膀諦鎽剎㐭㌵誏臣鞊菣Ꚃ苣��뾥듦꾃苣㲵牢ਾ菣骃菣ꪂ苣랂菣벃苣뎂菣뢂菣늂菣袃뫤ꆬ諦鎽匨湡慴䌠畲⁺楂瑯捥湨汯杯⥹苣ꢔ臣ꚁ胣袃菣㲩牢ਾ菣릂菣Ꞃ苣袃듧麃臣蒂藥閁苣龁듧麃菣ꒂ苣벃菣ꞁ껥붖臣龁胣亂ⵒ㔴㤳菣躃苣궃菣誃菣鞊讞戼㹲ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂苣ꒂ菣릂䅈鞊뷤꾁胣亁䡉臣龔뷤늘뻥誏臣낖裨龄鿦螗ꃧ뚩돨邺菣鶃苣袃菣⢪㱂牢ਾ潩敤敦獮⁥湡⁤浅牥楧杮䤠普捥楴湯⁳敒敳牡档删獥畯捲獥删灥獯瑩牯⥹‬䥎䥁讁苣ꖅ触㲋牢ਾ臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ㘨ㄮ⸱⸱‴股郧뢐鷧ꊂ菣뮂苣⦤戼㹲 袃菣뎃苣閃苣꾂菣내菨銂苣것菣貏嘨扩楲⁯档汯牥⥡铧ꖝ臣躃苣ꦃ菣讃菣벃苣⢼苣ꊂ菣肃戼㹲벃苣⦼刨捯敨ꢁ臣节臣㎫莄臣ㆧ駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁胣め〮薼慃汃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢迥뎁杍汃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢苣ꮐ苣ㆀ韃䉐戼㹲匊臣㎧鯥鞴뗦鞁臣芀곦ꮁ胣내菨颍뇥銂胣傁卂䌯䍡㉬䴯䍧㉬룤꺁薼菣꾃菣ꪃ뗨股郧뢇뿦늶臣ꢁ戼㹲节臣膀냦誸臣㎧蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣膀䉐⽓慃汃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢䴯䍧㱬畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵ꞁ蛥뎁麛듦蒵臣龁胣ꖎ鷧鞁臣꒵戼㹲股郧銂胣㖁洰⁍䡎猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㐾⼼畳㹢汃苣뮷諥鞁胣내菨銂㔱裥鎖賦ꪛ臣鮁苣鎁臣ꮁ苣誂뫦ꎧ臣鮁臣芀菣ꒂ苣벃戼㹲袃苣내菨讁苣꒙軥鞁胣뢐藥ꚺ苣㖒〴浮臣겸껥鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶ㄱㄮ㔮†苣ꒂ菣릂菣릂苣ꖃ菣⦼戼㹲 鞃菣릂菣覃乄讁苣꺁讞苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣꺁菣릂苣ꖃ菣銂믤趉臣風볨閁苣ꚁ臣讂戼㹲骀苣ꮁ껥붖臣龁芏藧设臣낁胣䖁‮潆潤覂臣螖賧⢮㤱㤹‬⹊嘠物汯‮㌷㤺㜶ⴹ㘹㈸膀⹒䠠㱡牢ਾ覂臣螖賧⢮〲㠰‬⹊嘠物汯‮㈸ㄺ㔰〸ㄭ㔰〹膀迥뎁⹇丠略慭湮苣꺁雦꺌ㄨ㤹ⰹ倠䅎⁓㘹㰺牢ਾ㌹㔴㤭㔳⤰芀뗧鮏臣躇铧讞爨呗倩㡒苣ꒂ菣릂苣鲽ꏨ馁苣龁苣ꮁ胣㊁㌹내菨ꮁ胣ㆁ볎꺁ꒁ戼㹲꺁䑰⁚剐것苣궂菣벃菣ꦃ苣龃菣꺁郥薀苣膀楌潰敦瑣浡湩⁥〲〰䤨癮瑩潲敧Ɱ䌠牡獬慢Ɽ㰠牢ਾ䅃銂铧蒁臣뎂菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣龁胣颧胣ꪁ苣ꪃ苣膪蓧覤闧鎽䅈苣몙迧馁苣Ꚃ苣ꮃ苣銂戼㹲膀郥颁雦閳臣膀臣讁臣膀䅈菣ꦃ苣龃菣銂胣膪蓧覤闧鎽䅈藩鞈苣뎂菣覃臣讂꿥鲿臣讂菣ꦃ苣㲹牢ਾ菣覃臣꺽臣鮏臣ꚁ뷤붣臣膀꿥鲿臣讂ꫧ뚄ꓥ낕뷤Ꚃ苣ꮃ苣銂鯥躏臣龁胣袃菣뎃苣閃苣꾂苣ꞃ戼㹲뎃臣㊮芙雩貾胣Ꚃ苣ꮃ苣ꮐ鳦誸룦銂ꖗ뷩꺁駧늂뛩떍룤ꮁ軦꺨臣龁胣㎂莄臣㊧韦鎖臣ꒂ菣궂戼㹲ꖃ菣벃苣ꞃ菣꺁뻥膀냥鲆藨늶苣麛迥鞁胣讃菣袃菣꒵ꇨ莐臣股郧鶇鯩ꮁ苣ꎁ臣膀迥뎁䑍䭃듧㲰牢ਾ菨ꞁ臣鞃菣벃苣ꊽ裦ꮁ苣ꎁ臣膀苣ꒂ菣릂臣颭鳥ꮁ臣蒁臣ꊂ菣뮂苣鞁臣⢟뻤袁臣膀⹅䘠摯��戼㹲覂臣螖賧⢮㤱㤹‬⹊嘠物汯‮㌷㤺㜶ⴹ㘹㈸誏臣劳‮慈覂臣螖賧⢮〲㠰‬⹊嘠物汯‮㈸ㄺ㔰㰸牢ਾⴰ〱㤵⤰迥ꞅ芀㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶ㄱ㈮†뗧鲞㰩牢ਾ㘨ㄮ⸱⸲‱ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂苣ꪃ苣랂菣隌ꫧ뚄ꓥ낕뷤꾁駧뺏臣膀臩螈臣躁觥낂菣뎂苣ꮃ賥㲖牢ਾ迥꾁뷤낂菣뎂苣ꮃ賥閁苣讂㰩牢ਾ†鳦Ꞥꒁ臣붿諥꺁苣ꪃ苣랂菣隌菩趽苣傒㡒臣莐諧颃菣覃菣ꆃ苣뎃臣躰藥鞁臣⢟ꇨ㎨迥ꞅ芀戼㹲閁苣ꮁ胣傁㡒臣릂菣벃苣覃菣ꒂ菣궸臣낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤㎍誏臣㊳㤸臣뺯臣讂곦놤苣鲽蟥鞁臣㲟牢ਾ胣鶁臣袂臣ꪁ郧뚊菣莃菣覃菣ꒂ菣膪蓧覤闧꺁臣銂鳦馁苣䢋膪蓧覤闧鎽胣誏臣鶁臣袂臣ꪁ郧㲃牢ਾ諧颃菣覃菣ꆃ苣뎃ꫧ뚄ꓥ낕苣릂菣벃苣覃菣ꒂ菣膪蓧覤闧ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ鳦馁苣䢋膪蓧覤闧㲰牢ਾ뷤銂뷤몇臣膀꟨邞臣龁胣㲂牢ਾꇨ㎨倮㡒菣莃菣覃菣ꒂ菣낂菣뎂苣ꮃ賥膪蓧覤闧鎽戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯鞼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰ㄴ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†ꫧ뚄ꓥ낕臣鮁臣䢟뾂菣醃苣ꪳ臣몙迧鞁胣躰藥閁苣龁苣ꪃ苣랂菣隌菩趽臣ꒂ菣鎃菣궃臣낂戼㹲ꪃ苣랂菣隌臣貂臣讁臣蚁臣銂飦覂臣ꮁ臣讂臣膂臣膀㤲″내菨ꮁ䅈ꫧ뚄ꓥ낕뷤讧꿧ꦉ苣袃戼㹲ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣膀苣Ꞃ苣뾂菣隃菣莃菣ꎧ黦銂듧麃菣ꒂ苣벃菣ꮁ꿥鞁臣龮雦鞁臣芀諦䆗黥㲋牢ਾ苣뎃菣ꮃ苣뎃苣䢶㉁諦鎽臣袂苣Ꚃ苣릂苣뎃菣궃菣袃臣鞃菣벃菣뎃苣꾁胣ꢅ臣꺁苣ꒂ菣릂꟦㲋牢ਾ꿧ꦉ臣몙迧馁苣鎁臣銂ꓧ鞁臣⢟鯥㒳⤹胣Ꚃ苣릂苣뎃菣궃菣袃룤ꞁ臣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂苣뎃菣꾂戼㹲ꪳ臣몤럥뮧该꾁胣낂菣ꮂ菣貁胣躰藥閁苣龁苣ꪃ苣랂菣隌菩趽臣낕臣뺯뿥馁苣ꊽ臣颻諥閁苣㲌牢ਾ臣蒁臣鎁臣銂ꓧ鞁臣芀苣ꪃ苣랂菣隌菩趽螤闦꾏貁믤ꂊ臣貂臣蒁臣讧꿧ꦉ臣膀蟩龔黥傋㡒戼㹲ꢁ꿦릁臣袂苣Ꞥ臣蒁裥邭蟩ꮁ꟧開臣龁臣膀苣ꪃ苣랂菣隌菩趽螤闦꾏貁곦놤臣ꚁ臣龁꟦覯戼㹲ꦉ臣膀蟩龔黥傋㡒臣钯臣ꚁ苣誂냥閁臣蚈귥辇臣뮧该鞁臣⢟鯥㒳⤹胣躇铧讞剐ꮁ蓦鎟臣龁菣Ꚃ戼㹲릂铧ꖝ臣鞊ꇨ薸臣늩꟦覯觧ꮁ꿥馁苣邵郥꾁뷤许臣膀ꇨ薸룤꺁諦鎽臣邵郥ꢃ뷤貁胣颻諥閁苣㲌牢ਾ臣閁苣ꪁ苣낂菣ꮂ菣ꢃ뷤ꮁ苣ꎁ臣蚦苣貂臣鎁臣銂ꓧ蚔臣ꚁ臣讂胣ં䐼噉邀볯颼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†藥ꮖ鯨覅苣ꢔ臣ꚁ胣ꒂ菣鎃菣궃臣꺁ꫧ뚄ꓥ낕뷤䢓讧꿧ꦉ臣몙迧것菣ꮃ苣钯볨鞁胣낂菣뎂戼㹲랂菣隌ꫧ뚄ꓥ낕뷤䢓뾂菣醃苣ꪳ臣膀臣꺁ꓥ뚄臣讫뷤讧胩뢁臣ꦁ裥ꮁ菣ꦂ菣ꮃ菣ꎂ菣낂臣ꚁ戼㹲蒁苣讁臣蚁臣銂飦覂臣ꮁ臣龁胣㒂臣ꢅ臣꺁諦龎胦ꢃ뷤ꞁ臣䢮꺁郧뚊菣莃��覃菣ꒂ菣뢁臣讀戼㹲薀臣낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤꺁냥ꖅ臣膀뻤뚄臣鞁臣膀苣뎃菣꾂돨몙迧誏臣䢳릂菣벃苣覃菣ꒂ菣릉戼㹲낕髧鞊뷤邵郥銂迥붃臣鞁臣⢟鯥㖳䄰芀䅈郧뚊菣莃菣覃菣ꒂ菣뢁臣낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤꺁믤ꂊ戼㹲꾁胣躇铧讞剐‸䅈臣钯臣ꚁ胣鞊菣莃菣覃菣ꒂ菣릉闧蒚諦鎽藥ꮖ鯨覅苣낂菣ꮃ倨ㅙ㈰諦鎽㰩牢ਾ臣鮸냥銂苣龁苣鞁胣䢁꺁菣莃菣覃菣ꒂ菣궸臣鞊軥Ꞁ菩趽臣膀껥鮚臣膀냥ꖅ臣貂臣ꢃ뷤ꞁ臣㲮牢ਾ苣ꪃ苣랂菣隌臣袂臣ꚁ菣릂苣閁苣讂臣ꢁ苣몤臣龁뎛〵誏臣ꢡ⤴胣㲂牢ਾꇨ㒨ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂苣ꪃ苣랂菣隌ꫧ뚄ꓥ낕뷤꺁駧뺏迥뎁ꧨ膪蓧覤闧鎽臣뺯臣讂諦鎽뗧袐戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㈴⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†苣袃菣꾂룤꺁ꯧ鎽꟦ꂀ苣钃菣벃菣ꮁ觧낕髧ꮁ뗧袐臣讂諦鎽䬨㉂胣䎁㜱膀迥뎁䘶㈱諦鎽㰩牢ਾ臣袂苣릂菣벃苣覃菣ꒂ菣꺁鯨覅鿦늉臣膀蟩龔黥傋㡒臣趛藥鎟觨ꢁ郥讨뫥ꞁ臣誂胣膪蓧覤闧㲰牢ਾ뷤Ꚃ苣ꮃ苣뾂菣醃苣ꪳ臣膀菣莃菣覃菣ꒂ菣뢁臣낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤꺁믤ꂊ臣节臣讁苣覂臣膀戼㹲鶁臣ꦤ蓧꺁ꯧ鎽꟦ꂀ臣ꦁ裥ꮁ菣ꦂ菣ꮃ菣ꎂ菣낂臣貂臣鎁臣銂ꓧ鞁臣蒁苣⢋鯥㖳䌰芀苣ꪃ苣㲳牢ਾ苣ꮃ賥ꢃ뷤貁菣莃菣覃菣ꒂ菣ꮁ냥ꖅ臣貂臣蒁苣膪蓧覤闧鎽剐‸䅈꟦覯觧⢩㈴ㄭ胣㒁ⴲ膀迥㲊牢ਾ臣㒳ⴲ⤵苣袃菣뎃苣閃苣꾂菣鞁臣내菨膀룤뎁臣낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤貁菣莃菣覃菣ꒂ菣ꮁ냥ꖅ戼㹲閁苣ꚁ臣讂ꫧ뚄ꓥ낕뷤讧꿧ꦉ迥뎁苣ꪃ苣랂菣隌菩趽臣릂菣벃苣覃菣ꒂ菣讁苣꒙軥閁苣ꚁ臣㲄牢ਾ苣膪蓧覤闧鎽꟦覯觧⢩㈴ㄭ胣캁㲔牢ਾ㌳㈯㤸※㈴㐭胣캁㎔⼳㠲㬹㐠ⴲ膀铎㌳㈯㤸銂菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣龁듧麃臣超雧趛藥鎟觨㲲牢ਾ臣袂苣膀蟩龔黥傋㡒䠠讧꿧ꦉ苣袃菣뎃苣閃苣꾂菣鞁臣내菨誏臣䢳릂菣벃苣覃菣ꒂ菣궸臣㊮戼㹲ꒁ臣낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤ꂁ臣貁駩뮎臣貂臣傟㡒䠠讧꿧ꦉ츨㎔⼳㠲⤹苣袃菣뎃苣閃苣꾂菣鞁臣㲟牢ਾ듧麃臣钯臣ꚁ胣鞊菣莃菣覃菣ꒂ菣鞊뷤⢓奐〱⤲臣뺯臣讂뗧袐臣鮸냥貁ꓧ閁苣龁뎛〵⥃胣뺯戼㹲ꞅ髧ꮁ胣躇铧讞剐誏臣낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤貁苣袃菣꾂菣ꆃ苣뎃臣覂駩뮎臣貂臣傟㡒臣钯臣ꚁ戼㹲膀臣貂苣꺁郥颁ꫧ뚄ꓥ낕뷤銂駧뺏臣讂듧麃臣릂菣벃苣覃菣ꒂ菣ꮁ뗧袐臣讂諦릂菣벃苣鞊뷤㲓牢ਾ臣붃諥ꮁ럥꾁臣讁臣龁뎛〵⥃胣ં䐼噉邀볯颼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†铧颭菨鮊臣芁苣膪蓧覤闧鎽苣ꒂ菣릂苣龄鿦내菨讁苣麛迥馁苣鎁臣貁臣趁苣讁臣蚁臣銂ꧨ㲕牢ਾ뻤馁苣龁苣ꮁ胣股郧뢐鷧ꊂ菣뮂苣銂铧蒁臣膀苣ꒂ菣릂ꫧ뚄ꓥ낕뷤貁��讃菣袃菣꒵ꇨ莐룤꺁戼㹲랂苣ꪃ菣隌迥릮뷤ꮁ臣誁苣邵郥馁苣鎁臣貁臣趁苣讁臣蚁臣銂뇦骮臣龁胣랂苣ꪃ菣隌迥릮뷤㲓牢ਾ臣邵郥馁苣붃諥銂뿤膌臣讂ꫧ뚄ꓥ낕뷤Ꚃ苣ꮃ苣꾁胣늩苣ꒂ菣릂臣膀臣꺁迥릮뷤銂믤鞁臣내戼㹲麃臣떾藥馁苣鎁臣貁臣趁苣鎁臣銂ꓧ馁臣ꢁ臣ꪁ苣芀觧骮臣낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤貁䅈苣袃菣꾂戼㹲讁苣꒙軥閁苣ꚁ臣讂䅈ꫧ뚄ꓥ낕뷤銂駧뺏臣讂苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣銂菣릂苣ꖃ菣馁苣鎁戼㹲ꢁ臣ꞁ臣龁뎛ㄵ芀곦ꮁ胣것苣궂菣벃臣貂苣Ꚃ苣ꮃ苣꺁菨鮊苣膀믤趉臣風볨閁苣ꚁ臣讂胩㲚牢ਾ苣ꮁ胣讃菣袃菣骃跥궸臣꺁ꇨ莐蟥蚛듧ꊂ菣뮂苣銂铧蒁臣閩뻤鞁臣芀觧ꮁ胣趽뷧㊮㤸迥뎁㠴㰳牢ਾ胣袏臣㎯膀㠲膀迥뎁㠴꺁苣ꪃ苣랂菣隌菩趽臣꒙軥閁苣ꚁ臣讂䅈ꫧ뚄ꓥ낕뷤銂駧뺏臣讂苣㲤牢ਾ菣閃菣ꢂ菣뚂苣ꒂ菣릂臣膀蟩龔黥傋㡒苣ꒂ菣릂臣貐꟦ꮁ胣꒵ꇨ莐臣邵郥鞁臣⢟鯥㖳⤱胣뺯藧㲧牢ਾ髧ꮁ胣䢁꺁菣莃菣覃菣ꒂ菣뢁臣낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤꺁믤ꂊ臣膀ꫧ뚄ꓥ낕뷤䢓뾂菣醃苣ꪳ苣몙戼㹲뺏臣讂苣ꒂ菣릂臣꒵ꇨ莐臣邵郥馁苣붃諥銂껥ꪳ髧ꮁꛥ뎮臣讂苣蚁臣鶀苣貂臣⢟鯥㖳⤱胣ં䐼噉邀볯颼볯邼胣㲑䐯噉ਾ㘨ㄮ′龮雦设㈱ꮂ菣鲃苣랂鳦꾫룤辇뷤隌菣ꆃ苣뎃臣膀迥뚺胦蒵迦袁ꇨ莐蟥蚛듧몟뷤꺁苣㲹牢ਾ菣벃苣覃菣ꒂ菣誸臣讫뷤讧胩ꢂ菣袃菣鞃苣覮껥隌臣讂㰩牢ਾ†臣꺁껥붖뻤꾁胣ꮂ菣鲃苣랂鳦꾫룤辇뷤隌菣ꆃ苣뎃臣膀뗧鮏臣꾏뫦Ꞁ苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣㲤牢ਾ菣릂ꇨ莐蟥蚛듧誸臣릂菣벃苣ꢂ菣袃菣鞃臣讧胩貮藥Ꞁ臣趇ꛨꞁ臣讂臣ꢁ苣몤臣芀㰊䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶㈱ㄮ†鷦首迥뎁雦閳㰩牢ਾ㘨ㄮ⸲⸱‱내菨⦞戼㹲 匠㥦飦ꮙ듧麃䄨䍔⁃‣剃ⵌ㜱ㄱ銂胣ㆁ薼䉆⡓瑁慬瑮⁡楂汯杯捩污⥳胣めㄮ볯傅畬潲楮⁣㙆戼㹲㠊匨杩慭膀迥뎁菣讃苣ꪃ菣ⶳ苣袃菣鞃菣麃苣랂菣鞊铧ꦉ돨⢪楇换⥯럦袐觧銂ꏨ薅臣龁䵔ⵎ䡆戼㹲릟鳥⢰敇業楮䈠潩倭潲畤瑣⥳룤ꞁ裦랕臣鮁臣芀呂ⵉ乔㔭ㅂ㐭듧麃䠨杩⁨楆敶ⴠ嘠敩湮⁡湉㱳牢ਾ楴畴整漠⁦楂瑯捥湨汯杯꺁苣隃苣궃菣뎃銂胣骃菣랂菣뎃릂菣것菣袃菣ꒂ苣뎃諦龔觧ꪳ戼㹲랷郥ꦉ䜨扩潣銂ꏨ薅臣龁祈汃湯⁥䙓ꆄꇨ薸鿥난䘨獩敨⁲捓敩瑮晩捩궸臣邈闩閁臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯銼胣㲑䐯噉ਾ㘨ㄮ⸲⸱′꾂菣벃菣뎃苣誏臣蒵迦袁菣궂菣궃苣ꒂ菣릂뷤붣㰩牢ਾ†ㅈꃦ䆪鞃苣ꮃ菣ꪃ苣⾳⼸㐳倨㡒膀⽁苣ꪃ菣ꦂ菣讃苣⾢㐰〯⠹慃ぬ⤹胣䢁ꪠ⽁慊慰⽮〳⼵㰵牢ਾ⠷䅊㕐⤷胣䢁ꪠ⽁ꛩ꾸ㄯ㘯⠸䭈㠶膀⽁苣ꎂ苣뎂菣랂菣⾳㜶〯⠵楗捳㔰膀迥뎁㕈ꃦ䆪馃菣㲈牢ਾ菣ꂃㄯ〲⼳㐰嘨ぎⴴꓥꦡ鿥Ꞁ裥궖菩趽臣꒙軥閁苣龁苣꺁医整汥苣꺁雦꺌㈨〰ⰹ䨠嘠物��㠠戼㹲㌊›㜱㈴ㄭ㔷⤳迥ꞅ꺁䅈苣뎂菣覃臣讂藩鞈苣膀菣ꪃ菣ꦃ菣벂胩階迥鲿臣袂苣炊䅃䝇鞃菣릂戼㹲龃菣讁苣鞢맥閁臣膀慂䡭袏臣厯畴誏臣亳瑯뚈駩ꢂ菣覃菣꾂菣ꊂ菣벂丨䉅銂铧蒁臣膀뿤뺣戼㹲閁苣龁䙰獡䉴捡菣꾂苣벃䤨癮瑩潲敧⥮臣꾂菣벃菣뎃苣鞁臣芀菣ꦃ苣麃菣超裥꾁ꯨ花臣鲿臣㲘牢ਾ臣ꖅ触꾏菨ꞁ臣讂胣覸蟩鎽賥覃菣ꒂ菣銂鳦閁臣蒁䅈迥뎁룤辇뷤隌菣ꆃ苣뎃苣覜臣讂䅈臣蒁戼㹲蚁蒵臣讧꿧ꦉ苣꾂菣벃菣뎃苣鞁臣㪟룤辇뷤隌菣ꆃ苣뎃苣覜臣ꪁ臣䢄讧꿧ꦉ臣膀䅈臣䎮鳦꾫戼㹲鲆단骀迥뎁듧麃蛥覃菣ꒂ菣貁菣궂苣銃苣膃苣뎃뾂苣ꢁ뷧趁迦袁苣貂苣袂臣ꮁ꣨袨臣貂䠨㱁牢ਾ藩鞈臣膀ㅈ臣ꒁ臣ꚁ臣䦯〵膀㉈迥뎁㕈臣ꒁ臣ꚁ臣嚯〵膀룤뎁臣䢫ꮁ臣蒁臣꾁㕇㠰臣芵苣讂戼㹲㬊㍈믤ꪕ㬩苣蚁蒵臣讧꿧ꦉ臣芁苣覸蟩鎽賥覃菣ꒂ菣銂鳦馁苣䢋节ꮜꯧ鲆단骀迥뎁듧麃蛥㲅牢ਾ菣ꆃ苣뎃苣ꂬ臣貁䠨超裥꾁胣嚁〵ꞁ뗧辂苣ⶋ㍈믤ꪕ膀ꮜꯧ颃苣떂菣릂菣뢂菣ⶳ苣낂臣ꂊ戼㹲袁臣膀菣궃菣鎃菣螈雦ꢃ뷤誏臣咳閃苣ꮃ菣뎃룤辇뷤隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣⢀뻤袁臣膀敍敩覂臣㲮牢ਾ雦꺌㈨〰ⰴ䨠䴠汯䈠潩⁬㐳㨴ㄠ㔰ⴱ〱㤶芏藧⦧뎛㈵芀뷤붣臣貂臣蒵迦袁䙰獡䉴捡苣궃菣㲼牢ਾ菣銂胣붣胩궥胨꺁賦몤臣鎾臣ꚁ䡄〱慂내迨⢌湉楶牴杯湥궸臣ꊽ돨ꊻ迦鞁胣蒵迦袁菣꾂菣㲟牢ਾ菣銂畐敲楌歮倠慬浳摩䘠汩整⁲楍楤牰灥苣莃菣⢈湉楶牴杯湥ꞁꫨ붣臣龁胣䎂汥晬捥楴⁮䥉㰨牢ਾ湉楶牴杯湥銂뗧鮏臣邃苣ꖃ菣Ꚃ苣ꮃ苣꺁菣릂苣ꖃ菣ꮁ铧蒁臣膀뗧鮏臣邃苣龃菣銂晓내菨㲞牢ਾ룤ꮁ뷥ꪳ믨鮏臣龁胣ꢅ臣꺁藩鞈苣떂菣겂菣랂菣꾂苣뎃苣뎃苣ꮁ苣誂ꋧ趪臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ㘨ㄮ⸲⸱″뾂菣醃苣ꪳ駧뺏胣뺲ꏨ膀迥뎁觧뒾믤醁㰩牢ਾ†菣궂菣궃苣ꒂ菣릂苣厒㥦듧麃臣馶믤낕꺁苣袃菣꾂臣ꪁ苣뺁臣鞢맥閁臣膀臣꺁뻥膀臣貂苣㲒牢ਾ铧蒁臣膀呂ⵉ乔㔭ㅂ㐭䠨杩⁨楆敶내菨ꮁ胣䢁䍹潬敮匠塆蓧股룦릟鳥⢰楆桳牥匠楣湥楴楦⥣戼㹲궸胣ㆁ韃〱猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㘾⼼畳㹰듧麃洯ꞁ胣ㆁ꺁蓦鎟ꓥ趇뫥ꞁ蓦鎟臣鮁臣芀駧뺏苣膀〱〰汭臣꾌鯧閃菣릂苣궸戼㹲膀㠲蓢ꞁ㘹駦鎖껥붖臣龁胣㦂芙雩貾胣誸룦銂뷤龀臩莿裥ꊛ㔨〰朰胣㒁蓢膀〲裥⦆臣袂苣薸뻦㲄牢ਾ賥鞁胣亁⵩呎⡁楑条湥릨蓨⢂㔲洰꺁鿥誤룤薸臣뺯臣ꚁ洳꺁苣ꦃ菣벃ꢁ臣节臣膀껥ꦸ刨⥔戼㹲ꞁ芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣鶁臣貾胣릨蓨ⶂ룤薸럦袐觧銂〱汭臣鶃菣鞃菣钃菣뎃苣ꦃ菣⢠㱑牢ਾ慩敧⥮臣骀臣龁胣鶿賦閁苣龁꣦芄苣㆒洵꺁듦蒵菣莃菣ꆂ菣⢼〵䵭丠㱡畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵䠾佃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢胣㎁〰��丠䍡膀㰲牢ਾ洰ꒂ菣肃苣벃菣膀䡰㠠ꞁ麛듦蒵臣膀苣뎃菣꾂돨銂뫦몇菣莃菣ꆂ菣⢼〵䵭丠㱡畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵䠾佃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹢胣㎁〰㱭牢ਾ⁍慎汃胣㎁〰䵭苣龃菣뺂菣ꮃ胣炁⁈⤸臣뚺蟥閁臣龁胣뚺蟥늶苣膀〳䑫꺁苣莃菣ꪂ菣銂鳦馁戼㹲讂流捩湯唠瑬慲散汬䴨汩楬潰敲ꂁ뿥蚈鯩ꚃ菣莃菣銂铧蒁臣莿룧鞁胣邃菣閃苣벃苣炒⁈⸷㰴牢ਾ臣ꪃ菣뢅럧鶡铧蚐ꏩꦡ냦⢴䉐⥓臣꒺迦鞁臣芀苣뎃菣꾂돨莿뫥銂胣Ꚃ苣股룦ꊂ菣隃菣뎃꣦隺戼㹲늛럧ꢁ臣节臣冫極正瑳牡⁴牂摡潦摲䐠敹删慥敧瑮䈨潩刭摡銂铧蒁臣骮蟩鞁臣芀苣뎃菣꾂돨㲪牢ਾ臣钴뫥膀껥ꢅ胦膀迥뎁苣ꒂ菣뎃菣ꎂ菣ꎂ苣膀菣螃苣ꮃꇧ뢅菣袃菣Ꚃ菣鶃菣ꊂ苣ꪃ菣ꊂ菣覃戼㹲늂菣뮛냦뎳该閳匨卄倭䝁⥅㐨㈭薼菣ꪃ苣꾂菣ꮃ苣龃菣₉‭楍楮倠佒䕔乁吠塇苣ꮃ‬楂ⵯ慒戼㹲搊膀苣麃苣벃鿦늉胣誏臣Ꚃ苣릂苣뎃菣궃菣袃胣袏臣떅듧邵郥超雧뢐鷧ꊂ菣뮂苣⢤䱅卉⥁臣㲫牢ਾ苣誂ꧨꆾ臣龁胣覸蟩鎽賥誏臣⾳迥꾁ꓥ辇뷤隌臣讨뫥銂胣붣胩궥胨꺁ꗥ膂臣鎾臣ꚁ胣䢁銂菣㲓牢ਾ苣ⶹ릂菣鮃苣꾂苣뎃苣龃苣ꮃ릂菣것菣袃䈨㱓畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯灵‾‭楆桳牥匠楣湥楴楦⥣臣뚞ꧦ馁苣鎁臣ꮁ苣㲈牢ਾ苣ꚩ꣩鞁臣芀냧钽臣낿臣讂臣膀츳枼臣䢮銂胣㊁趀菣ꮃ뿦ꚺ臩낉臣䊮㱓畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳猯灵꾂菣릂菣뎃苣벃臣颭戼㹲ꢜ룤膀〳볎꺁䉐궸臣ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣랷郥ꦉ苣劒ꞁ〳裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁胣鶁臣㲮牢ਾ뻥膀䴱吠楲⵳䍈邃菣閃苣벃瀨⁈⤸苣㖒洰꺁鳦芵뿦ꚺ臣ꞁ럦ꂊ臣讂臣ꢁ臣袂苣膀卂猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹰苣꾂苣㲨牢ਾ菣膃臣龁胣鶁臣貾胣厁卄倭䝁ꚸ臣ꮁ袏臣麃苣릂諦梗獩룤ꆬ諦鎽匨杩慭誏臣鞊菣Ꚃ苣뾥듦㲋牢ਾ菣떂菣骃菣ꪂ苣랂菣벃苣⢼慓瑮⁡牃穵䈠潩整档潮潬祧节臣辁臣ꊂ菣ꮂ菣鮃苣閃苣뾂菣벂匨戼㹲愊瑮⁡牃穵䈠潩整档潮潬祧뎂菣뢂菣늂菣袃뫤ꆬ諦鎽苣ꢔ臣龁苣Ꞃ苣뾂菣隃菣莃菣ꎧ黦銂껥㲟牢ਾ雦鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖⠊⸶㈱ㄮ㐮†藩ꂴ뗧袐藥ꮖ郥肝苣莃苣ꒂ㰩牢ਾ†浉畭潮潬⁮䠴塂䘨獩敨⁲捓敩瑮晩捩鞃菣벃菣ꮁ胣覸蟩鎽賥覃菣ꒂ菣銂鳦馁苣蒵迦袁䅈戼㹲誏臣覸蟩鎽賥覃菣ꒂ菣銂鳦閁臣蒁뗧鮏臣䢈銂胣뎂菣蚃苣뎃苣邃菣閃苣벃〨ㄮ⁍慎䌲㍏丯䡡戼㹲䌊㍏胣炁⁈⸹膀〵볎⽬苣Ꞃ菣⦫룤膀층枼洯꺁뿦ꚺ臣膀莄臣肸駦뎂菣蚃苣뎃苣鞁臣芀臣꺁뻥㲌牢ਾ胣鞃菣벃菣銂胣ㆁ볯咅敷湥㈠銂郥肂䉐⡓䡰㜠㐮⠩䉔卐誏臣㎳볯ꆄ蓨ꪂ매覲鳦銂郥肂⸰薼睔戼㹲攊湥㈠ⴰ䉐⡓偔卂ꞁ胣劁ꞁ芙雩隃菣莃苣뎃苣鞁臣芀菣궃菣궂菣낂뻥膀菣것菣袃苣咒䉐ꞁ㰱牢ਾ鯥鞴뗦鞁胣鶁臣��貾胣㎁胥貸蟩꺁菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤袏臣股룦⢅薼닧뎹苣ꮐ苣咀䉐궸胣ㆁ苣Ꞃ戼㹲ꮃ뷥龁苣ㆊ〰볎⵬菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤꺁蟥몙뿦ꚺ〳볎⽧汭股룦ꮁ臣蒁臣꾁胣ㆁㄺ〰룥袇ꢁ戼㹲ꢁ苣ꮁ呒臣ㆧ駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀臣꺁뻥膀菣것菣袃苣㆒〰볎꺁偔卂臣㎧鯥鞴뗦鞁胣ㆁ㰺牢ਾ〳〰룥袇ㄨ苣Ꞃ菣鎽臣誂〵볎⥬臣뾥듦꾃苣鎃菣ꮃ苣궂苣肃菣벂苣뎃苣ꖃ苣벃菣鞊菣Ꚃ苣䦹㱧牢ਾ⡇慓瑮⁡牃穵䈠潩整档潮潬祧袏臣鞊菣袃慆貺곦鞊뷤⢓楓浧⥡臣ꢁ苣ꮁ胣劁ꞁ臣覂臣ㆫ駦鎖戼㹲ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣閁苣ꮁ麛듦蒵臣龁뻥膀菣것菣袃苣膀楓浧䙡十⁔偏몟돨⢪楓浧⥡ㄨ㰰牢ਾ田⽬苣Ꞃ菣⦫苣ꢔ臣ꚁ駧늉臣鮁胣㎁⁍䍈⡬〵볎⽬苣Ꞃ菣⦫臣鲁귦閁臣膀㤴渰꺁郥覅뫥ꞁ胣厁㱹牢ਾ敮杲⁹⠴楂呯步鞃菣벃菣ꪃ菣肃菣ꞁꫨ뾁迥ꎁ臣芀뻥覂苣龁ꫨ몇臣讁苣膀뫤ꆬ諦鎽臣뾁臣㲨牢ਾ臣节臣ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁苣Ꞃ菣讁苣꺁胥銂菣莃苣낂菣Ꚃ菣覃룦鞮臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†껥骮胦钠ꧧ꺁臣膂臣膀룤辇뷤隌菣ꆃ苣뎃苣覜臣讂剐Ꚃ苣ꮃ苣놔鷦꺁䅈苣㒒蓢ꞁ〶韦鎖胣㲁牢ਾ迥꾁㠭莄臣鶿귥鞁胣ㆁ鯥⢞꣦隺膀麛胣㎁鯥膀迥꾁麛臣趇뗧ⶐ꟨趇苣ꒂ苣ꮃ臣鮾臣龁胣릂菣㲈牢ਾ菣꾂뗧袐諦鎽臣钯臣龁菣莃菣邵郥鞊뷤꺁껥骮胦銂胣傁ㅙ㈰迥뎁ㅃ㤷菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤銂戼㹲ꢔ臣ꚁ꿦莼臣龁胣䖂䥌䅓臣誁臣讂諦鎽䠭蒵郥鮁苣膀뫤麛迥ꦾ苣뾽铧馁苣覮껥Ꞁꃧ뚩苣꒙臣㲍牢ਾ胣覸鯥趏뻥ꞁꇨꪁ臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯隼胣㲑䐯噉ਾ㘨ㄮ⸲′邵黦⦜戼㹲⠊⸶㈱㈮ㄮ†ꮜꯧ覸蟩鎽賥覃菣ꒂ菣꾁䅈苣覮껥隌臣膀룤辇뷤ꊽ裦銂ꫨ躰臣讂㰩牢ਾ†꟦薀臣낂菣벃菣㆗迥뎁苣ꮃ菣鞃′䅈臣내菨隤菣ꆃ苣뎃苣膀菣궂菣궃苣ꒂ菣릂駧뺏돧ꞁ胣䎁戼㹲ꮜꯧ咯閃苣벃苣覸蟩鎽賥覃菣ꒂ菣銂鳦馁苣袏臣䎯鳦꾫㑔菣ꆂ菣뢂룤辇뷤隌菣ꆃ苣뎃苣覜臣㲕牢ਾ臣蒁迥뚺胦ꊽ藦ꞁ駧뺏臣鮁臣⢟鯥㖳⤲胣龄鿦꺁㘹駦鎖뻥膀苣뎃菣꾂돨銂鯥躏臣膀楎中䅔苣ꦃ戼㹲ꂃ苣ꢔ臣ꚁ胣䎁鳦꾫菣궂苣銃苣膃苣뎃뾂苣銂믤鞁臣뺲ꏨ鞁臣芀닧붣苣뎃菣꾂돨銂胣薶臩莿戼㹲릂菣뎃苣ꦃ菣銂铧蒁臣莿룧鞁胣뾂菣醃苣ꪳ臣貮藥Ꞁ迥뎁룤钴뫥ꮁ臣蒁臣厦卄倭䝁誏臣꾂菣㲞牢ਾ苣벃鿦늉臣袂苣閩뻤鞁胣隃菣莃菣閃苣벃菣ꚩ雨ꞁ껥辇臣龁胣ꊂ菣躃藩超裥ꢁ胣骤ꇥ몟胦螈戼㹲궖菩趽臣ꪁ臣邃苣ꖃ菣Ꚃ苣ꮃ苣몙迧ꢅ闩䢷꾁胩뢸裥궖臣貂臣蒁臣蒁臣论껥ꢁ臣몟臣辁臣膀戼㹲䠊꺁듧麃ꓥ覃菣ꒂ菣꾁胣낂菣뎂苣ꮃ賥銂胨꺅臣ꪁ臣貂臣膀跥辇뷤鎽臣誂듧㚄欰慄臣袺菦蚈戼㹲邭돨辇馁臣辂臣膀룤辇뷤鎽臣誂㠱欰慄銂鳦馁苣��臣ꮁ臣讂胣㚂欰慄臣螈雦閁苣ꚁ臣ꪁ臣䢄戼㹲䄊菣뎃菣⢉䅈⤰臣ꂊ臣ꚁ胣蒴〴䑫⡡䅈⤱迥뎁㔲䑫⡡䅈⤲臣邃菣覃臣颭鳥馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣몤戼㹲閁苣讂苣蚁臣膀룤辇뷤隌菣ꆃ苣뎃苣覜臣ꪁ臣䎄污㤰䠨⤱胣䪁偁㜵䠨⤲胣誏臣嚳ぎ⠴ꓥꦡ鿥Ꞁ戼㹲螈雦ꢃ뷤꺁臣蒁㕈 䅈臣膀룤ꢃ裥궖臣貂臣膀䅈ꢁ䅈ꮁ臣讂苣蚁臣鶀苣貂臣芀鷩蒂藥覤胦㲧牢ਾ䑓ⵓ䅐䕇臣膀룤辇뷤隌菣ꆃ苣뎃苣覜臣讂慃ぬ膀䅊㕐膀迥뎁乖㐰䠠ꮁ臣蒁臣㚦欰慄臣邃菣㲳牢ਾ菣ꂁ臣貁귥ꢜ臣讂臣ꢁ臣몟臣趁胣鎁苣覂臣뾂菣醃苣ꪳ臣膀ꓥꢃ裥貁胣螈雦閁苣ꚁ臣ꪁ臣䢄㱁牢ਾꢁ臣ꚁ駧뺏臣貂苣ꢁ믤骮臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂뎛㌵⥁胣閁苣ꮁ胣覸蟩鎽賥覃菣ꒂ菣꺁臣蒁楗戼㹲猊っ⠵㍈ 䅈臣뾪ꏨꦉ臣膀諦릂菣벃苣鞊뷤⢓㈱ㅄꞁ菣궃菣鎃菣낂臣龁臣趁臣趏뿥Ꞁ臣芁苣㒋戼㹲《䑫꺁裥ꎧ铧ꦉ苣몤臣龁胣鞁臣貁臣ꚁ胣鎁臣꺨臣膀鷩릉闧蒚裥궖臣ꎔ觧ꞁ臣讂迥붃胦貁ꯩ㲘牢ਾ臣ꎁ臣芀룤辇뷤隌菣ꆃ苣뎃苣覜臣讂楗捳㔰䠠꾁胣䢁ぁ菣뎃菣ꢁ臣ꚁ臣뾁蟥뺏臣龁뎛㌵⥁戼㹲芀剐誏臣䢳㙋‸䅈臣膀룤辇뷤隌菣ꆃ苣뎃臣ꪁ臣ꚁ苣膀鷩뢸臣覮껥ꞁ臣讂䠨ぁ臣鞁臣颭鳥馁戼㹲讂袂臣ꮁꛨ袁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖 䠠꺁룤辇뷤隌苣몤臣龁苣ꮁ鳦醿뷤ꢔ臣貂苣ꪦ냦Ꞁ臣ㆮꪂ菣낂苣袃菣벃菣꺁賥ꚭ苣궃苣ꪃ戼㹲뎃苣벃臣䊮㍓苣ꢔ臣ꚁ胣咁覸蟩鎽賥覃菣ꒂ菣銂鳦馁苣䢋袏臣咯覸蟩鎽賥覃菣ꒂ菣銂鳦閁臣㲪牢ਾ臣䢄銂黦让臣龁设臣낁胣垁汥潤覂臣螖賧⢮〲〱‬䱐卯传敮㔠芏藧⦧胣뚞ꧦ貾胣ꚩ雦銂苩莅戼㹲覤胦궃菣螃苣뎃苣늉듧ꮁ룥袇臣膀苩莅ꓥꞀ䑓ⵓ䅐䕇苣ꮃ룤ꞁ裥ꊛ臣龁胣覸蟩鎽賥覃菣ꒂ菣㲳牢ਾ苣覜臣ꪁ臣낂菣벃菣㆗䠠꾁胣ꦃ菣讃菣낂苣ꮃ룤銂臣ꢁ苣ꦁ돦開臣骁胣Ꞥ菩蚈臣릂苣莃苣뎃戼㹲낂苣ꮃ臣鶿賦閁苣讂ꯩ蚈귥辇苣ꪃ苣麃菣銂뷥邈臣龁뎛㌵誏臣㖳䌳芀鳦节볥蒁ꇨ뺏黥꾁胣㲁牢ਾ乖㐰迥뎁䅊㕐꺁ꃥ袐臣鲤蟥閁苣㮌믤꺁苣ꮃ菣鞃‱䅈臣膀臣覂臣讂룤辇뷤⢓듧㊄〳䑫⥡胣貺蟩㲏牢ਾ뷤⢓㌱鲀㔱欰慄膀迥뎁跥辇뷤⢓〶䑫⥡苣ꊽ裦鞁臣⢟鯥㖳䈳迥뎁㌵⥃胣覸蟩鎽賥覃菣ꒂ菣銂鳦㲉牢ਾ臣讂苣ꮃ菣鞃‱䅈臣膀ꓥꢃ裥貁胣厁卄倭䝁늂菣誸臣蒴㌲欰ꮁ돦開臣讂룤辇뷤銂뷥邈臣膀戼㹲뺁臣膀菣뎃菣뎃苣늂菣궸臣躘ꋧꪁ菣뎃菣銂뷥邈臣龁胣鞁臣鞁臣貁苣膀臣貂苣꾁胣貺蟩鎽㰨牢ਾ듧ㆄ〳胣㆜〵䑫膀慃ぬ꺁ꃥ袐臣肜苣랼臣⦄迥뎁跥辇뷤⢓〶䑫⥡苣ꊽ裦鞁臣芀苣ꮃ菣鞃′䅈臣㲯牢ਾ胣낕臣讂뷥ꞁ賦開臣㪗䠠㙋‸䅈臣膀룤ꮁ룤辇뷤銂뷥邈臣膀룤辇뷤隌菣ꆃ苣뎃臣颭鳥銂闥辂戼㹲骁胣芁苣讨뫥膀뫤辇뷤銂뷥��臣龁胣垂獩っ‵䅈臣膀룤辇뷤隌菣ꆃ苣뎃臣麝귥ꢜ룤ꞁ胣뮸臣㲫牢ਾ뫤辇뷤隌苣몤臣龁臣膀㑔菣ꆃ苣뎃苣覜臣讂䅈臣膀ꓥꢃ裥貁룤辇뷤隌臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾ㘨ㄮ⸲⸲′䌠鳦꾫룤辇뷤隌菣ꆃ苣뎃臣膀䅈鿥鎽臣뺯臣讂苣袃菣꾂迥鲿胦鞊뷤꺁뗧袐苣랼臣㲏牢ਾꋥ랼臣讂㰩牢ਾ†룤辇뷤隌菣ꆃ苣뎃苣覜臣讂䅈鿥鎽迥뎁룤辇뷤隌菣ꆃ苣뎃苣覜臣ꪁ臣䢄몟돨ꮁ꿥馁苣鎁苣㲌牢ਾ苣꺁諦鎽臣몤럥邵郥銂飦覂臣ꮁ臣讂臣膂臣膀䅈꟦覯觧ꮁ꿥馁苣莺鿥趏뿥Ꞁ臣궸鋥鞊뷤꺁菣㲑牢ਾ菣ꮃ臣趏뿥Ꞁ苣閩뻤鞁臣芀苣袃菣꾂觧낕髧鞊뷤涓扁䌠㜱膀菣Ꚃ苣涹扁㘠ㅆ膀菣袃䅭⁢剃㈶戼㹲㘊⠱藥ꚁ苣ꮃ菣鞃릉闧蒚㬩룤뎁臣麃苣릂䅭⁢㈱ㅄ迥뎁菣袃䅭⁢剃〸〲ꆸ雦ꢁ苣낂菣벃菣㊗戼㹲릉闧蒚銂鳦龮꣩ꞁ뷤ꢔ臣龁胣肜뿨颍鯩閁苣膀ㅈ䠠ꢁ㕈䠠꺁룤릖臣뺯臣讂迥鲿胦銂鳦馁戼㹲讂臣ꢁ臣릉뻥颻臣覂苣龁ꒁ臣隻臣릂菣벃苣趏뿥Ꞁ諦鎽胣䮁㉂胣䊁㍄胣䞁㍇胣誏臣䦳ㅂ节鳦龮戼㹲鎨臣뾽铧鞁臣芀꿥ꞅ臣鞁臣膀䅈臣莐諧颃菣覃菣ꆃ苣뎃臣邵郥馁苣鎁臣貁鿧覂苣ꚁ臣讂ꃦ릉戼㹲낕髧鞊뷤銂뷤ꢔ臣龁胣閁苣ꪁ苣뺯藧ꢁ臣ꚁ胣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂苣ꒂ菣릂ꃦ⢪剐膀慃ぬ膀㍈戼㹲膀乖㐰ꮁ蟨뮭蟩ꪜ뫦ꞁ蓦鎟臣鮁臣袏臣嚯偌䨨偁㜵銂菣꾂菣뎃軦꺨臣龁菣Ꚃ苣꺁ꇨ薸苣뾽戼㹲ꢔ臣龁胣鞊뷤䎓㜱膀剃㈶ㄶ胣誏臣㚳ㅆ꾁胣ꚩ꣩閁苣龁룤릖臣䢮‱䅈䌨污㤰迥뎁剐⤸臣뺯臣㲙牢ਾ苣랼臣邵郥ꢡ迧讞苣몤臣龁胣鶁苣覂臣膀룤辇뷤隌菣ꆃ苣뎃苣覜臣讂䅈臣꺁臣邵郥鞁뎛㐵㱁牢ਾ迥뎁㐵⥂覸蟩鎽賥覃菣ꒂ菣銂鳦閁臣蒁䅈臣뺯臣讂뗧袐臣뎦꿥閁苣ꪁ臣ꎁ臣鎁臣꾁돦꺛臣㲙牢ਾ臣趁臣ꢁ臣芁苣芀郥颧臣邵郥릉뻥꾁胣隻臣㒮臣꺁苣袃菣꾂迥鲿胦莺鿥궸鋥Ꞁㅈ䠭鞊뷤ꞁꛨ㲋牢ਾ苣貂臣芀꿥ꞅ髧ꮁ胣颃菣覃觧낕髧鞊뷤膀뻤袁臣膀䈷⠲慃ぬ⤹迥뎁奐〱⠲剐⤸臣膀룤辇뷤隌戼㹲覃菣ꒂ菣꺁駧뺏臣꾁蓧ꊖ뿤ꮁ䅈臣趏뿥鞁胣鎁苣覂臣ꖟꛨ꾁胣䎁污㤰迥꾁剐龄鿦開觧놔鷦꺁戼㹲股룦銂铧蒁臣몢ꫨ閁苣龁뎛㐵誏臣㖳䈴芀㰊䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖 鎁臣鲽铧꾁胣䢁鲺黥ꮁ觧낕髧ꪁ苣꺁臣꾁臣辁覸蟩鎽賥覃菣ꒂ菣銂鳦馁苣䪋偁㜵䠨⤲迥뎁戼㹲嘊ぎ⠴㕈 䅈룤뎁臣覸蟩鎽賥覃菣ꒂ菣銂鳦閁臣蒁䅊㕐⠷㉈誏臣嚳ぎ⠴㕈 䅈臣뺯臣讂ㅃ㤷戼㹲誏臣䎳㙒㘲꺁뗧袐苣ꚩ꣩鞁臣ꢁ臣膀郥颧臣ꢡ迧讞臣뎦꿥閁苣膀臣꺁ꃥ袐胣鎁苣覂臣鞊뷤꾁戼㹲膀룤辇뷤隌뷥讅臣뾂菣醃苣ꪳ臣꺁臣趏뿥鞁臣⢟鯥㖳䄵迥뎁㔵⥂胣貐臣邵黦꾁胣㒁臣꺁ㅈ䠭鞊戼㹲鎽臣趏뿥Ꞁ苣閩뻤鞁臣ꢁ臣ꮁꛨ覂苣龁胣颃菣覃��낕髧鞊뷤㢓㡆䨨偁㜵誏臣涳扁㠣嘨ぎ⤴迥㲈牢ਾ臣鶃菣꾂菣벃菣ꮃ諦䢗节臣辁臣鞊㕈ꇨ薸臣膀룤릖臣ꊽ藦꺁䅈苣貐꣧ꚺ臣袂臣趪귨鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖 낂菣벃菣㊗䠠邵郥鞊뷤ꮁ臣蒁臣꾁胣낕臣讂菣뾂菣뎃臣몇迧鞁臣芀苣袃菣꾂諦鎽臣낂菣벃戼㹲鞃′䅈臣꺁迥鲿胦ꮁ꿥馁苣覸蟩鎽賥覃菣ꒂ菣꺁諥鲞苣鲤꣨馁苣龁苣ꮁ胣莺鿥趏뿥Ꞁ諦鎽剃戼㹲㠊㈰誏臣ㆳ䐲銂뷤ꢔ臣龁胣䎂㡒㈰貁苣ꮃ菣鞃′䅈룤꺁ꯧ鎽꟦ꂀ苣钃菣벃菣ꮁ뗧袐臣讂臣ꮁ戼㹲뺯臣膀㈱ㅄ臣膀䅈떂菣ꚃ菣莃菣꺁闩蒁뇎菣ꪃ菣꾂苣⢹䅌⥈蛥꺁럧뚊苣钃菣벃菣ꮁ뗧袐臣讂戼㹲ꢁ胨袁苣貂苣芀룤辇뷤隌菣ꆃ苣뎃苣覜臣讂䭈㠶迥뎁楗捳㔰䠠ꮁ꿥馁苣䎋㡒㈰邵郥꾁胣覸戼㹲辇뷤隌菣ꆃ苣뎃苣覜臣ꪁ臣䢄ꮁ꿥馁苣邵郥ꢁ꿦릁臣膀ꓥ趁臣鞢볥閁苣龁뎛㘵誏臣㖳䈶芀戼㹲鞁臣鞁臣貁苣膀룤辇뷤隌菣ꆃ苣뎃臣ꂬꛥ꾁胣낂菣벃菣㆗䠠ꞁꛨ覂苣讂苣蚁臣膀뗧袐苣貮藥㲨牢ਾ臣ꆄ諥隌臣讂苣꺁臣꾁臣ꪁ臣ꎁ臣芀㈱ㅄ臣膀룤辇뷤隌菣ꆃ苣뎃苣覜臣讂䅈臣覸蟩鎽賥覃菣㲡牢ਾ苣뎃苣覜臣ꪁ臣䢄銂賥ꖈ臣ꪁ臣ꎁ臣⢟鯥㖳⤶胣ં䐼噉邀볯颼볯醼胣㲑䐯噉ਾ㘨ㄮ⸲″邵ꯨ⦖戼㹲 吠覸蟩鎽賥覃菣ꒂ菣꾁胣꾏뫦Ꞁ䅈裥邭臣覸蟩鎽賥꺁裦龊苣꾏菨ꮁ臣膀菣궂菣궃苣ꒂ菣릂戼㹲몙迧貾臣鎁苣覂臣蚈귥꺁껥骮胦銂ꓥ趁臣鞢ꓥ閁臣讂胣ં䐼噉邀볯颼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣閼铧閁苣ꚁ臣讂藥ꚁ臣誈ꇨꦉ胣릉꣨膀迥뎁觧놨蟥颡臣膀郥薀臣讀胣꺁裥財觧㲩牢ਾ迥꾁觧놨蟥颡臣閼铧ꮁ苣誂뗧뾁뻨뺁苣ꚁ臣讂臣ꢁ臣랅뷤蒚臣讁臣讀裥ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂臣꺁戼㹲袂臣ꮁ胣閼铧ꮁ苣誂鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂臣蒁苣芀룤꺁駧躘臣蚐꟨꺁飦ꮿ臣꺁鯧蒚臣龁苣㲁牢ਾ臣뎛迥뎁껥붖뻤ꮁ苣ꎁ臣醰臣뎩듧ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣貁胣겜駧躘臣馕ꓧꮁ藧覂臣膀럦颻臣讫戼㹲花ꃩ꺁닧麥迥꾁꿧늛苣뢀蓨馁苣鎁臣ꪁ臣膀룤骮臣覤鯦誏臣꺿귦銂臣貂臣ꂊ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣㲍牢ਾ苣鎁臣貁胣鎽ꗦ薀臣꾁껥鎘臣躘苣讁臣芁苣蚁胣ં⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣뎛볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㌴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㐴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㔴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯꒼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㘴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㜴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㠴⼼㹡⼼䥄��㰊䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㐱㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰〵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㔱㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㈵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㔱㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㐵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㔱㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㔱㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㔱㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯ꆼ裢醼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㠵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㔱㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰〶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㘱㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㈶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯銈볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㘱㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯ꆼ裢醼볯ꚼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㐶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㔶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㘶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㜶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㠶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㤶⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㜱㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯ꊼ裢銼볯ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰ㄷ⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㈷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼볯銈볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㜱㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯꒼裢銼볯ꚼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㐷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼볯銈볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㜱㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯ꆼ裢銼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㘷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯銈볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㜱��愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㜱㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯ꆼ裢銼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㤷⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鞼볯銈볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㠱㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㠱㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㠱㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㠱㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㠱㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㠱㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㠱㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㠱㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㠱㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㠱㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㤱㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㤱㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㤱㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㤱㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㤱㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㔹⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㤱㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㜹⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鎼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㤱㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㄰㤹⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰〲㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꖼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㈰㄰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰〲㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㈰㌰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰〲㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㈰㔰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰〲㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾��牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㈰㜰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰〲㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꖼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㈰㤰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰ㄲ㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯Ꞽ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㈰ㄱ⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰ㄲ㰲愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯ꦼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㈰㌱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰ㄲ㰴愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰ㄲ㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰ㄲ㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰ㄲ㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰ㄲ㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㈰㤱⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯邼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㈲㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㈰ㄲ⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㈰㈲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯銼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㈲㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯ꆼ裢ꎼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㈰㐲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㈲㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㈰㘲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㈲㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㈰㠲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㈲㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥閼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㈰〳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣超裥ꢡ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽⼮〲〲㤰㘶㐰㈯〮〲㤰㘶㐰⭅㄰⼵〲〲㤰㘶㐰〰〰㄰愮灰㸢〲〲㤰㘶㐰〰〰㄰愮灰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉邀触骶ꏨꎭ鯦醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣邏蟥ꖗ胣꒻鋥㊌맥㊴鳦㊈ꖗ㈨㈰⸰⸲㜲㰩䐯噉ਾ䐼噉邀触骶ꏨꎭ볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨뢛ꇩ趐胣릉꣨讫뇦꺁꿧늛⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨薠鯧趐胣ꢅ雦㲇䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ雦閳胣覤鯦㲴䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ臣薆껥醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣릉꣨讫뇦꺁꿧늛胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀ꯨ花ꃩ醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉ਾ†鳦颡飦내鯦ꮁ껥��ꪳ髧ꮁ꣨覼臣貂臣膀雦辦臣ꦉ胣릖돦誏臣붣胩릖돦芀㰊䐯噉ਾਊ䐼噉邀触骶ꏨꎭ볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨뢛ꇩ趐胣躘듧뢛⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨薠鯧趐胣邼볯钼볯㲒䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ雦閳胣覤鯦㲴䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ臣薆껥醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣邼볯钼볯醀⼼䥄㹖 貀䅈꺁ꮜꯧ릂菣ꂃ苣낂菣뎃菣趀臣膀苣뎃菣ꮃ苣뎃苣股郧鶇鯩ꂴ䅈鶃菣骃菣膃菣꺁苣㲹牢ਾ菣ꂃ菣ꆃ苣뎃臣ꮂ菣鲃苣랂鳦꾫菩蚈臣뺯뿥馁苣鶃菣骃菣膃菣뮂苣ꆃ菣袃苣螌臣芀臣讂껥붖戼㹲讅꟦ꮁ臣蒁臣膀䅈꺁ꮜꯧ릂菣ꂃ苣낂菣뎃菣꾁胣䢁ㅁ菣ꆃ苣뎃臣ꊂ菣躃藩䆸猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾⼼畳㹢臣覂䅈㰱畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢ⵃ整浲⼼畳㹢戼㹲뺁臣ꮁ臣벁꿥鲿臣讂苣龃菣뢅껦몟臣覂臣讂胣䢂ㅁ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䌾琭牥㱭猯扵꾁胣鎽ꗦ薀臣袂臣ꚁꫨ颭臣貂臣蒁戼㹲讂苣蚁臣䢪ㅁ菣ꆃ苣뎃臣䎮鳦꾫苣龃菣뢅臣芁苣芀껦몟㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱱猯扵꾁胣뎛꺁讞苣뎃菣ꮃ苣뎃苣股郧鶇戼㹲蚛듧鶃菣骃菣膃菣궸臣릉껥閁苣ꚁ臣讂胣设ꓧ蒚臣䢪ㅁ臣䎮鳦꾫苣蚃菣뮂苣ꆃ菣袃臣겜飦내鯦㲸牢ਾ臣風볨閁苣ꚁ臣讂胣芁苣龮雦讅꟦ꮁ臣蒁臣膀䅈꺁ꮜꯧ릂菣ꂃ苣낂菣뎃菣꾁胣䢁股郧鶇鯩㲆牢ਾ듧놔鷦꺁䅈꺁苣龃菣뢅㜲鲀㰳⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㤲⼼㹵臣뮁臣뺯뿥馁苣ꊂ菣躃藩议鿥讁苣ꪁ苣芀臣꺁믤ꪕ뷤뮳臣㲧牢ਾ臣膀꾁胣랂苣誃菣骃菣膃菣貁駩뮎臣貂臣蒁苣邈蛧鞁臣䢟ぁ苣뎃菣꾂돨꺁ꮜꯧꊂ菣躃藩銂戼㹲螌臣鎁臣ꮁ闧辄臣貂臣蒁胣鎽ꗦ薀臣膀믤꺁苣뎃菣ꮃ苣뎃苣䢶鶃菣骃菣膃菣꺁䅈꺁ꮜꯧ릂戼㹲蚃菣뮂苣ꆃ菣袃臣뺯뿥馁苣ꊂ菣躃藩议鿥膀뻤袁臣膀ㅈꇨ莐蟥蚛듧놔鷦꺁䅈꺁䅈꺁ꮜꯧ㲯牢ਾ苣蚃菣뮂苣ꆃ菣袃臣뺯뿥馁苣ꊂ菣躃藩议鿥銂껥鎘臣趪귨馁苣鎁臣貁臣趁苣ꞁ臣趂臣⢆뻤袁戼㹲낁胣뎛芏藧⦧胣㲂牢ਾ戼㹲㰊牢ਾਊ䐼噉邀触骶ꏨꎭ볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨뢛ꇩ趐胣躘듧뢛⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨薠鯧趐胣邼볯钼볯㲓䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ雦閳胣覤鯦㲴䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ臣薆껥醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣邼볯钼볯醀⼼䥄㹖 貀䅈꺁ꮜꯧ꺁鿧蒁苣蚃菣뮂苣ꆃ菣袃胣꾁胣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂ꇨ莐蟥蚛듧䢠ㅁ菣ꪃ菣鞃菣㲁牢ਾ菣꺁苣蚃菣覃菣ꒂ菣꺁苣ꮃ菣궂苣ꮃ鳦꾫菩蚈臣뺯뿥馁苣鶃菣骃菣膃菣뮂苣ꆃ菣袃苣螌臣芀戼㹲芁苣龮雦讅꟦ꮁ臣蒁臣膀䅈꺁ꮜꯧ꺁鿧蒁苣蚃菣뮂苣ꆃ菣袃臣膀䅈覃菣ꒂ菣꺁苣龃菣뢅㱂牢ਾ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾⼼畳㹢臣覂䅈㰱畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢ⵃ整浲⼼畳㹢臣ꞁ臣뮁臣뺯뿥馁��ꊂ菣躃藩议鿥讁苣ꪁ苣芀껦몟㱂畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱱猯扵꾁胣뎛꺁讞苣뎃菣ꮃ戼㹲ꢂ菣뚂ꇨ莐蟥蚛듧鶃菣骃菣膃菣궸臣릉껥閁苣ꚁ臣讂胣设ꓧ蒚臣䢪ㅁ臣䎮鳦꾫臣궟臣릂菣ꂃ苣㲻牢ਾ苣ꆃ菣袃臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣芀臣讂껥붖藦颧臣誁臣ꚁ胣䢁ㅁ臣䎮鳦꾫臣궟臣릂菣ꂃ戼㹲뮂苣ꆃ菣袃臣膀㍈ꇨ莐蟥蚛듧놔鷦꺁䅈꺁苣龃菣뢅〳鲀㰳⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㤲⼼㹵臣뮁臣뺯뿥馁苣ꊂ菣躃藩议鿥㲺牢ਾ臣覂臣讂胣鎁臣颻闧鎽돧ꞁ臣膀꾁胣랂苣誃菣骃菣膃菣貁駩뮎臣貂臣蒁苣邈蛧鞁臣䢟ぁ苣뎃戼㹲醃苣ꪳ臣亮鳦꾫苣龃菣뢅苣螌臣鎁臣ꮁ闧辄臣貂臣蒁胣㲂牢ਾ戼㹲㰊牢ਾਊ䐼噉邀触骶ꏨꎭ볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨뢛ꇩ趐胣躘듧뢛⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨薠鯧趐胣邼볯钼볯㲕䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ雦閳胣覤鯦㲴䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ臣薆껥醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣邼볯钼볯醀⼼䥄㹖 貀䅈꺁ꮜꯧ꺁闩蒁苣蚃菣뮂苣ꆃ菣袃胣꾁胣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂ꇨ莐蟥蚛듧䢠ㅁ菣ꪃ菣鞃菣㲁牢ਾ菣꺁苣蚃菣覃菣ꒂ菣꺁苣ꮃ菣궂苣ꮃ鳦꾫菩蚈臣뺯뿥馁苣鶃菣骃菣膃菣뮂苣ꆃ菣袃苣螌臣芀戼㹲芁苣龮雦讅꟦ꮁ臣蒁臣膀䅈꺁ꮜꯧ꺁闩蒁苣蚃菣뮂苣ꆃ菣袃臣膀䅈覃菣ꒂ菣꺁苣龃菣뢅㱃牢ਾ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾⼼畳㹢臣覂䅈㰱畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢ⵃ整浲⼼畳㹢臣ꞁ臣뮁臣뺯뿥馁苣ꊂ菣躃藩议鿥讁苣ꪁ苣芀㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱱猯扵꾁胣䢁ㅁ臣亮鳦꾫臣랕臣릂菣㲆牢ਾ菣뮂苣ꆃ菣袃룤꺁苣릂菣ꒂ菣议鿥ꮁ胩邵臣ꚁ臣讂臣膀迥꾁臣貂臣ꎀ뗧馁苣鎁臣貁臣趁苣䢋㱁牢ਾ꺁ꮜꯧ꺁闩蒁苣蚃菣뮂苣ꆃ菣袃룤꺁苣ꦃ菣뎃껦몟臣芁苣芀껦몟㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱱猯扵꾁胣뎛꺁讞苣뎃菣ꮃ戼㹲ꢂ菣뚂ꇨ莐蟥蚛듧鶃菣骃菣膃菣궸臣릉껥閁苣ꚁ臣讂胣设ꓧ蒚臣䢪ㅁ臣䎮鳦꾫臣랕臣릂菣ꂃ苣㲻牢ਾ苣ꆃ菣袃臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣芀臣讂껥붖藦颧臣誁臣ꚁ胣䢁ㅁ臣䎮鳦꾫臣랕臣릂菣ꂃ戼㹲뮂苣ꆃ菣袃臣膀㍈ꇨ莐蟥蚛듧놔鷦꺁䅈꺁苣龃菣뢅㔲甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼㹵胣㎜甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾㰹甯ꮁ臣벁꿥鲿臣讂苣龃菣뢅껦몟戼㹲讁苣ꪁ苣芀臣꺁믤ꪕ뷤뮳臣꾁胣ㆁ臣膀苣낂菣ꮃ菣鞃菣覃臣꒙軥閁苣ꚁ臣讂裦龆臣龁䅈뾂菣㲳牢ਾ菣꾂돨꺁ꮜꯧꊂ菣躃藩銂賦馁臣ꢁ臣馕蓦閁苣龁臣芀戼㹲㰊牢ਾ戼㹲ਊ㰊䥄㹖胣讉뛧鲣귦閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ꿥ꆱ鯦麡郥醀飦내鯦㲸䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ꿥ꆱꃩ꺛郥醀볯邼볯閼⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦릖돦醀ꓥ뒛⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦꺁蛥릮胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀볯��볯閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⽁ꛩ꾸ㄯㄯ㘹⠸㍈膀⽁菣벃苣⾹㘱㈯〰⠹㍈膀⽁剐㠯㌯⠴ㅈ膀⽁慃⽬⼴㤰䠨⤱胣䆁馃菣誃菣⾠㈱㌰〯⠴㕈膀迥뎁⽁菣겂菣⾢苣ꮃ菣벃苣⾿㐲〯⠱㝈꺁ꇨ莐蟥蚛듧뾂菣醃苣ꪳ藩鞈臣超裥钯볨銂ꓧ馁胣䎂獹㈵迥뎁祃㉳㰷⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰷甯ꊂ菣躃藩议鿥貁䠨颻闧ꮁ鿥ꖁ臣ꚁ螌껥閁苣ꚁ臣讂胣銻臣낙뷥ꢃ臣膀뿤颭臣貂臣ꊂ菣躃藩銂ꓧ馁胣銻臣ꊳ럧꾁胣䢁꺁郧뚊菣莃菣颠鿥銂ꇨ馁胣䢂ㅁ迥뎁䅈꺁꟥릂臣몤臣貂臣蒁苣芀⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀触骶ꏨꎭ볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨뢛ꇩ趐胣躘듧뢛⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨薠鯧趐胣邼볯馼볯㲐䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ雦閳胣覤鯦㲴䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ臣薆껥醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢鯥ㆳ䄶胣㆜䘶臣膀⼼㹵苣ꆃ菣䢩股郧鶇鯩ꂴ苣袃菣뎃苣閃苣꾂菣鞁臣내菨꺁藥ꮖ鯨覅꟨邞苣몤臣芀㤲吳듧麃臣膀苣ꆃ菣䢩股郧鶇鯩ꂴ苣몙迧馁苣ㆋ볎꺁䍰䝁升菣ꦃ苣龃菣銂菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣龁胣䒂䅎㰨⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢鯥ㆳ㰶甯䄾膀慃⽬㤰蓦鎟㰨⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢鯥ㆳ㰶甯䈾膀乄誏臣䎳污〯龄鿦⢓甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰뎛㘱⼼㹵⥃胣袏臣䎯污〯릂菣ꪃ菣袃菣꾂菣뎃㰨⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢鯥ㆳ㰶甯䐾銂迥릮臣龁该ꦉ铧ꖝ臣股룦銂菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃듧麃臣뮷諥鞁胣䆁敬慸䘠畬牯㔠㐹苣뎃苣ꖃ苣벃菣鞊菣Ꚃ苣䦹䝧臣ꢁ苣ꮁ苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣貾胣趛藥閡뻥ꆏ돦ꞁ迥隦賥鞁臣芀甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰뺯藧ꢁ臣ꚁ胣꒺럥趏뿥Ꞁㅈ苣蚃菣鞊뷤䎓㜱⠹鯥ㆳ䔶膀迥꾁剐㰸甯㰾⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢臣莐諧颃菣覃臣뺯臣讂諦鎽臣芁苣傋ㅙ㈰뎛㘱⥆苣袃菣뎃苣閃苣꾂菣내菨ꮁ럦ꂊ臣膀汁硥⁡⼼㹵甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䘾畬牯㔠㐹苣뎃苣ꖃ苣벃菣鞊菣Ꚃ苣䦹䝧臣ꢁ苣ꮁ苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣貾胣趛藥閡뻥ꆏ돦ꞁ迥㲯甯㰾⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢ꛨ隌臣龁胣㲂甯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣讉뛧鲣귦鞼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ꿥ꆱ鯦麡郥醀飦내鯦㲸䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ꿥ꆱꃩ꺛郥醀볯醼볯銼⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦릖돦醀ꓥ뒛⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦꺁蛥릮胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀볯醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥鎼볯醀甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰뎛㠳鲀㠳꾁胣㲁甯릂菣벃苣릉闧蒚菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤貁䡣몙迧Ꚃ苣ꮃ苣誏臣랂菣벃菣뾂苣鞃닧邭苣궸鋥馁苣鎁臣銂ꓧ馁胣掂䅈駧뺏苣ꒂ菣릂迥꾁苣ꖃ菣覃苣ꒂ菣銲귥銂룤貒臣讂䅭⡢䉋⤲臣붃諥銂菣ꦃ菣꾂룦醰苣莃苣ꒂ迥꾁苣ꖃ菣覃苣ꒂ菣銲귥뮘껥ꊂ菣뮂苣ꮁ苣誂ꧨꆾ臣龁胣䶂䍄내菨銂胣ꢡꓧ閁苣龁蟩⢏杵洯⥌��涮扁臣颭鳥许臣膀迥꾁諦鎽臣鞁臣膀䡣몙迧Ꚃ苣ꮃ苣节臣辁臣랂菣벃菣뾂苣鞃닧邭臣龄鿦閁臣讂臣膀迥꾁臣貂苣ꞁ뷥ꪳ냥ꖅ臣龁胣鞃菣벃苣ꊽ裦袏臣ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂듦Ꞁ苣궪蟥鞁臣鞁臣ꢔ臣ꚁ胣涁扁臣袂苣뮘껥꺁꣧ꚺ苣몱껥鞁臣芀甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰⠾鯥㎳䄸㰩甯늩䅭꾁胣掁ㅈㄯ銻臣鮛꟨⦒迥뎁䡣⼵⠱믩蒁룤銧Ꚃ苣ꮃ苣螤ꏨ銂铧辇뻤颭髧ꪁ뷥ꞁ룤貒臣膀〱田⽧䱭苣薶臣讂뿦ꚺ臣ㆧ〰볯뮘껥馁苣芀菣벃苣릂臣膀껥鎨ꓨ붣臣뎹鷥ꒀ迥뎁꣦隺臥꺷苣ꢡ臣芀㰨⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢鯥㎳㰸甯䈾늩䅭꾁胣掁ㅈㄯ銻臣鮛꟨⦒苣ꖃ菣覃苣ꒂ菣銲귥꺁뻤ꖅ苣ꢔ蟩鶾귥蒚臣ꊽ臣뮘껥鞁胣㒁杵洯薶臣貮藥ꮁ飩뎮臣讂胣螃菣뾂苧꾁胣龮꣩螤ꏨ꺁맥螝胥誏臣馨뫦辁럥銂ꇨ馁胣랂菣벃菣뾂苣鞃飩뎮苣莃苣ꒂ臣겋ꯧꮁ蟥蚐臣貂臣芀⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀触骶ꏨꎭ볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨뢛ꇩ趐胣躘듧뢛⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨薠鯧趐胣邼볯钼볯㲓䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ雦閳胣覤鯦㲴䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ臣薆껥醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣邼볯钼볯醀⼼䥄㹖 ꖈ臣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀鳦躘듧뢛臣邏뻤閁苣讂臣꾁胣ㆁ믤誸臣꺿ꏩ閁苣龁苣ꪃ苣랂菣隌菩趽戼㹲誏臣⾳迥꾁ꖻ룤꺁鷩ꦤ蓧꺁苣ꪃ苣랂菣隌菩趽苣ꮐ苣暀畬ꇨ莐蟥蚛듧⢠䅈鶃菣骃菣膃菣⢉뻤袁戼㹲낁胣궂菣ꦃ苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣股郧鶇鯩ꂴ䠨⥁菣ꪃ菣鞃菣覃胣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂苣ꒂ菣㲫牢ਾ苣股郧鶇鯩ꂴ䠨⥁苣蚃菣覃菣ꒂ菣鶃菣骃菣膃菣⦉臣芁苣芀鯥㲳⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㤱⼼㹵ꮁꓧ馁苣蚁臣膀蟩龔黥股郧㲃牢ਾ蟥蚛듧꺁苣ꪃ苣랂菣隌臣膀郧뚊菣莃菣覃菣ꒂ菣ꢁ苣蚃菣覃菣ꒂ菣꺁룤릖臣龔臣讂胣鎁苣覂戼㹲꺁菣ꆃ苣뎃臣薆臣낂菣뎂苣ꮃ賥꾁諦龎胦颠鿥銂菣릂苣鞁胣鶁苣ꮁ苣誂胣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂苣㲦牢ਾ苣ꮃ苣貁껥뮸藥ꮖ돧鲿귧銂鯥뾁臣讂臣銂迥붃臣馁苣鎁臣貁臣趁苣ꢁ胨袁苣貂苣芀뻤袁臣膀戼㹲ꎭ꿧Ꞁ苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣ꪠ设臣낁胣䢁丱誏臣䢳丳⤲臣膀駦鎖臣ꢁ苣ꮁ郧뚊菣莃菣覃戼㹲ꆃ苣뎃臣超雧ꪄ胦鞊軥Ꞁꃩ龟룤ꮁ臣覂臣讂苣ꪃ苣랂菣隌菩趽苣늍뻥馁苣鎁臣貁鿧覂苣ꚁ臣㲄牢ਾ苣芀臣讁臣ꪁ臣覂胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂苣ꒂ菣릂䅈菣ꪃ菣鞃菣覃臣꺁雩ꎀ臣㲫牢ਾ臣蒁臣膀菣ꪃ菣鞃菣覃臣릂菣ꂃ菣ꆃ苣뎃蛥ꞁ臣낂菣뎂苣ꮃ賥꾁胣鎁臣覃菣ꒂ菣ꮁꛨ몇臣貂戼㹲讂뿤颭臣貂臣鞊軥Ꞁꃩ龟臣뺯臣讂触鮜臣超雧鲿귧銂ꛥ뎮迥꾁飩ꊭ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣뎛㤱戼㹲䌊苣芏藧閁苣龁臣芀룤龮雦讅꟦ꮁ臣蒁臣膀鳦躘��뢛臣邏뻤閁苣讂臣꾁胣醰臣辁臣节ꒁ臣꺿戼㹲뺣臣貂臣낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤銂鳦馁苣릂菣ꂃ菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣暀畬䠠鶃菣骃菣膃菣ꞁ臣誂胣鎁戼㹲鎁臣膀ꧨ꺿ꏩ閁苣龁苣ꪃ苣랂菣隌菩趽胣鎁臣ꞁ胣늩뿤뺣臣膀ꧨ꺿ꏩ閁苣龁苣ꪃ苣랂菣隌菩㲨牢ਾ뷤ꮁ뗧袐臣讂苣ꪃ苣뎃臣붃諥銂ꃧ誣臣讂胣ꖈ臣龮雦讅꟦ꮁ臣蒁臣膀鳦躘듧뢛臣邏뻤閁苣讂戼㹲꺁臣膀䅈郧뚊菣莃菣覃菣ꒂ菣銂郥肂汦⁵䅈菣ꪃ菣鞃菣覃臣芁苣膀臣鎁臣膀ꧨ䢲莐諧颃菣覃戼㹲覃菣ꒂ菣꾁胣ꊂ菣躃藩超裥䆗湳堭慡匭牥启牨䌯獹苣覜臣讂냥ꪁ臣ꢁ苣ㆂ臣꺁鷩ꦤ蓧꺁苣ꪃ苣㲳牢ਾ苣ꮃ賥ꢃ뷤銂郥뾁胣鎁臣ꞁ胣墁慡臣뮻蓦꺁苣龃菣뢅臣芁苣芀裥꺁껥붖藦颧臣誁臣ꚁ胣늩汦㱵牢ਾ䠠鶃菣骃菣膃菣꾁胣⢁⤱ꖻ룤꺁뿤뺣臣貂臣낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤銂郥肂苣蚃菣覃菣ꒂ菣⢳臣鎁戼㹲ꞁ胣늩뿤뺣臣貂臣낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤꾁胣ꦤ蓧꺁苣ꪃ苣랂菣隌菩趽臣꺿ꏩ銂郥뾁胣늩뿤뺣臣㲯牢ਾ胣늩뿤뺣臣貂臣낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤ꮁ뗧袐臣讂苣ꪃ苣뎃臣붃諥銂ꃧ誣臣讂㬩迥뎁㈨ꊂ菣躃戼㹲뢅藩鞈獁⵮慘ⵡ敓⽲桔⽲祃銂鳦馁苣ㆋ믤誸臣麝ꓥ뚄臣낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤銂郥肂䅈郧뚊菣莃戼㹲覃菣ꆃ苣뎃鎁臣ꞁ胣墁慡臣뮻蓦꺁苣龃菣뢅臣芁苣⦋苣ꮐ苣芀藥鎽髧ꪁ껥붖藦颧臣誁臣ꚁ胣㲁牢ਾꧨ暲畬䠠鶃菣骃菣膃菣꺁苣蚃菣覃菣ꒂ菣궸臣꺿ꏩ閁苣龁苣ꪃ苣랂菣隌菩趽臣膀苣龃菣뢅藩㲍牢ਾ裥䆗湳堭慡匭牥启牨䌯獹苣覜臣讂ꓥ뚄臣낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤꺁뿤뺣苣ꮐ臣膀臣鎁臣膀慘꾁믤㲻牢ਾ蓦꺁苣龃菣뢅臣芁苣芀戼㹲㰊牢ਾ戼㹲ਊ㰊䥄㹖胣讉뛧鲣귦馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ꿥ꆱ鯦麡郥醀飦내鯦㲸䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ꿥ꆱꃩ꺛郥醀볯銼볯醼⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦릖돦醀ꓥ뒛⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦꺁蛥릮胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀볯銼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†臣讂껥붖藦颧臣誁臣ꚁ胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣궂菣ꦃ苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣股郧鶇鯩ꂴ菣㲝牢ਾ菣骃菣膃菣꺁䅈꺁ꮜꯧ릂菣ꂃ苣낂菣뎃菣꾁胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾⼼畳㹢设臣낁胣䢁股郧鶇鯩ꂴ铧ꖝ臣䢮ㅁ苣隃菣㲦牢ਾ菣莃菣꺁祃㱳畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㈵⼼畳㹢ꞁ귦몢臣芵苣讂臣ꞁ臣ꪁ臣膀藩鞈룤誏臣讧胩誸㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱰猯扵ꮁ뿨蒁껦몟臣芵苣讂胣设戼㹲袁臣膀臣讂껥붖藦颧臣誁臣ꚁ胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣궂菣ꦃ苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣股郧鶇鯩㲆牢ਾ듧鶃菣骃菣膃菣꺁䅈꺁ꮜꯧ릂菣ꂃ苣낂菣뎃菣꾁胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾ㄭ⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㈭⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰��㌭⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㐭⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㔭⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㘭⼼畳㹢戼㹲膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰㰷猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰㰸猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰㰹猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰〱⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾ㄭ㰱猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰㈱⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾ㄭ㰳猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰㐱⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾ㄭ㰵猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰㘱⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾ㄭ㰷猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰㰱猯扵㰾牢ਾ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㠾⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾ㄭ㰹猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰〲⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㈭㰱猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰㈲⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㈭㰳猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰㌲⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㈭㰴猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰㔲⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㈭㰶猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰㜲⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㈭㰸猯扵膀戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㈭㰹猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰〳⼼畳㹢臣芵苣讂胣芁苣龮雦讅꟦ꮁ臣蒁臣膀鳦躘듧뢛臣風볨꺁苣ꆃ菣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂戼㹲Ꚃ苣ꮃ苣股郧鶇鯩ꂴ菣ꪃ菣鞃菣覃臣䢮ㅁ臣亮鳦꾫苣蚃菣뮂苣ꆃ菣袃臣膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰㰱猯扵鲀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰㰳猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰㰳猯扵鲀戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㔭⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㔭⼼畳㹢胣䆜猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㠭⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㠭⼼畳㹢胣䆜猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾ㄭ㰰猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰〱⼼畳㹢胣䆜猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾ㄭ㰵猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰㔱⼼畳㹢胣䆜猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㈭㰰猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰〲⼼畳㹢胣䆜猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㌭㰰猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰〳⼼畳㹢胣㲜牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰〴⼼畳㹢臣蒯鯥ꞁ뗧辂苣芀뻤袁臣膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵰〱⼼畳㹢臣芵苣讂䅈꺁ꮜꯧ릂菣ꂃ苣낂菣뎃菣꾁胣䢁股郧鶇戼㹲蚛듧꺁甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰䰾略⼼㹵㈴臣芵苣讂胣芁��龮雦讅꟦ꮁ臣蒁臣膀鳦躘듧뢛臣風볨꺁苣ꆃ菣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂戼㹲Ꚃ苣ꮃ苣股郧鶇鯩ꂴ菣ꪃ菣鞃菣覃臣䢮ㅁ臣亮鳦꾫苣蚃菣뮂苣ꆃ菣袃臣膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰㰱猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰㰲猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰㰳猯扵膀戼㹲䄊猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㐫⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㔫⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㘫⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㜫⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㠫⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㤫⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾ㄫ㰰猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰ㄱ⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾ㄫ㰲猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰㌱⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾ㄫ㰴猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰㔱⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾⼼畳㹢戼㹲㰊畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢ㄫ㰶猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰㜱⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾ㄫ㰸猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰㤱⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㈫㰰猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰ㄲ⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㈫㰲猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰㌲⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㈫㰴猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰㔲⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㈫㰶猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰㜲⼼畳㹢戼㹲膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰㠲⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㈫㰹猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰〳⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㌫㰱猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰㈳⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㌫㰳猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰㐳⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㌫㰵猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰㘳⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㌫㰷猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰㠳⼼畳㹢胣䆁戼㹲㰊畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰㤳⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㐫㰰猯扵ꞁ뗧辂苣芀臣讂껥붖藦颧臣誁臣ꚁ胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣궂菣ꦃ苣뎃菣ꮃ苣뎃苣㲶牢ਾ苣ꒂ菣릂ꇨ莐蟥蚛듧鶃菣骃菣膃菣꺁䅈꺁ꮜꯧ릂菣ꂃ苣낂菣뎃菣꾁胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾ㄫ⼼畳㹢胣䆜猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㔫⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㔫⼼畳㹢胣㲜牢ਾ㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰〱⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾ㄫ㰰猯扵鲀㱁畳��浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰㔱⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾ㄫ㰵猯扵鲀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰〲⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㈫㰰猯扵鲀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰㔲⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㈫㰵猯扵鲀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰〳⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㌫㰰猯扵鲀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰㔳⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㰫猯扵㰾牢ਾ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾㰵猯扵鲀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰〴⼼畳㹢胣袏臣䆯猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾㐫㰰猯扵鲀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰〵⼼畳㹢臣蒯鯥ꞁ뗧辂苣芀뻤袁臣膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭰㠳⼼畳㹢臣芵苣讂䅈꺁ꮜꯧ릂菣ꂃ戼㹲뮂苣ꆃ菣袃臣膀㍈ꇨ莐蟥蚛듧꺁牁㥧ꞁ뗧辂苣芀䅈꺁ꮜꯧ릂菣ꂃ苣낂菣뎃菣꺁뗧릂臣膀戼㹲鞾苣貂苣궂菣ꦃ苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣股郧鶇鯩ꂴ菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀蟩龔黥ꒂ菣閃菣ꢂ菣㲳牢ਾ苣股郧鶇鯩ꂴ臣麡볤鞁臣覸곦莅꟦ꂀ苣ꊽ裦馁苣鎁臣貁臣趁苣袂臣ꮁ胣䢁ㅁ臣䎮鳦꾫苣蚃菣뮂戼㹲낂菣뎃菣誏臣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂ꇨ莐蟥蚛듧颃菣覃菣ꆃ苣뎃菣ꪃ菣鞃菣覃臣芵苧ꢁ臣ꊖ胩ꞁ臩㲸牢ਾ諦閁苣讂臣趁臣芁苣芀臣꺁苣蚁臣龮雦讅꟦ꮁ臣蒁臣膀苣뎃菣ꮃ苣뎃苣股郧鶇鯩ꂴ菣莃菣覃戼㹲ꆃ苣뎃菣ꪃ菣鞃菣覃鎁苣꾁胣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂ꇨ莐蟥蚛듧릂菣ꂃ菣ꆃ苣뎃菣ꪃ菣鞃菣覃臣㲨牢ਾ闧꺨臣芁苣⦋臣膀룤ꆬ藩鞈룤膀苣뎃菣ꮃ苣뎃苣股郧鶇鯩ꂴ苣蚃菣覃菣ꒂ菣鶃菣骃菣膃菣꺁㱎牢ਾ鳦꾫苣낂菣뎃菣ꢁꮜꯧ뮂苣ꆃ菣袃臣鎖臣趽뷧馁苣芀戼㹲㰊牢ਾ戼㹲ਊ㰊䥄㹖胣讉뛧鲣귦醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨뢛ꇩ趐胣躘듧뢛⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨薠鯧趐胣邼볯邼볯㲒䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ雦閳胣覤鯦㲴䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ臣薆껥醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣邼볯邼볯醀⼼䥄㹖 芁苣龮雦讅꟦ꮁ臣蒁臣膀鳦躘듧뢛臣風볨꺁苣ꆃ菣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂苣ꒂ菣릂ꇨ莐蟥蚛듧鶃戼㹲ꪃ菣鞃菣覃臣䢮ㅁ臣䎮鳦꾫苣蚃菣뮂苣ꆃ菣袃臣膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱱猯扵⠾뻤袁臣膀㍈ꇨ莐蟥蚛듧놔鷦꺁䅈떂菣ꚃ戼㹲讃菣袃臣䎮獹猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾㜷⼼畳㹢讁苣讧臣讂臣ꞁ臣ꪁ臣膀藩鞈룤誏臣讧胩誸㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱱猯扵ꮁ뿨蒁껦몟臣覂꟥뺁苣芀뻤㲋牢ਾ臣낁胣芁苣龮雦讅꟦ꮁ臣蒁臣膀鳦躘듧뢛臣風볨꺁苣ꆃ菣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂苣ꒂ菣릂ꇨ莐蟥蚛戼㹲ꂴ菣ꪃ菣鞃菣覃臣䢮ㅁ臣䎮鳦꾫苣蚃菣뮂苣ꆃ菣袃臣膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰��⹯灪㸢⵱㰱猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㰲猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㰳猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㰴猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㰵猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㰶猯扵㰾牢ਾ胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㜭⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㠭⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㤭⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾ㄭ㰰猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱ㄱ⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾ㄭ㰲猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㌱⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾ㄭ㰴猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㔱⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㈭㰰猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㔲⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㌭⼼畳㹢戼㹲㰊畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰰猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㔳⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㐭㰰猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㔴⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㔭㰰猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㔵⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㘭㰰猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㔶⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㜭㰰猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㔷⼼畳㹢胣袏臣䆯猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㠭㰰猯扵ꢑ뻨㲺牢ਾ臣覂꟥뺁苣芀臣讂껥붖藦颧臣誁臣ꚁ胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣궂菣ꦃ苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣股戼㹲莐蟥蚛듧鶃菣骃菣膃菣꺁䅈꺁ꮜꯧ릂菣ꂃ苣낂菣뎃菣꾁胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾ㄭ⼼畳㹢胣䆜猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㔭⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㔭⼼畳㹢胣䆜猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾ㄭ㰰猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱⼼畳㹢戼㹲㰊畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢〱⼼畳㹢胣䆜猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾ㄭ㰵猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㔱⼼畳㹢胣䆜猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㈭㰰猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱〲⼼畳㹢胣䆜猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㈭㰵猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㔲⼼畳㹢胣䆜猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㌭㰰猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱〳⼼畳㹢胣䆜猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㌭㰵猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㔳⼼畳㹢胣䆜猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㐭㰰猯扵㰾牢ਾ胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㐭㰰猯扵鲀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㔴⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㐭㰵猯扵鲀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱〵⼼畳㹢胣䆁猼��砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㔭㰰猯扵鲀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㔵⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㔭㰵猯扵鲀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱〶⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㘭㰰猯扵鲀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㔶⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㘭㰵猯扵鲀㱁牢ਾ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㜭㰰猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㔷⼼畳㹢胣䆜猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㠭㰰猯扵꺁꿧늛臣覂꟥뺁苣芀뻤袁臣膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱㜷⼼畳㹢臣芵苣讂䅈꺁ꮜꯧ릂菣ꂃ苣낂菣㲡牢ਾ菣袃臣膀㍈ꇨ莐蟥蚛듧꺁汇㉹〰臣覂꟥뺁苣㮊㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⵱〱⼼畳㹢臣芵苣讂䅈꺁ꮜꯧ릂菣ꂃ苣낂菣뎃菣꾁戼㹲膀㍈ꇨ莐蟥蚛듧꺁苣붂菣ꒂ苣뎃㘲甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㜾⼼㹵臣覂꟥뺁苣芀臣讂껥붖藦颧臣誁臣ꚁ胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼戼㹲꺁苣ꆃ菣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂苣ꒂ菣릂ꇨ莐蟥蚛듧鶃菣骃菣膃菣꺁䅈꺁ꮜꯧ릂菣ꂃ苣낂菣뎃菣㲈牢ਾ臣膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㰱猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㰲猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㰳猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㰴猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㰵猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㰶猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㰷猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㰸猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㰹猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱〱⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾ㄫ㰱猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㈱⼼畳㹢胣䆁戼㹲㰊畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㌱⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾ㄫ㰴猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㔱⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾ㄫ㰶猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㜱⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾ㄫ㰸猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㤱⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㈫㰰猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱ㄲ⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㈫㰲猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㌲⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㈫⼼畳㹢戼㹲㰊畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰴猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㔲⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㈫㰶猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㜲⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㈫㰸猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㤲⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㌫㰰猯扵讁苣讧臣讂胣芁苣龮雦讅꟦ꮁ臣蒁臣膀鳦㲬牢ਾ飦내鯦��ꮁ꣨覼臣궂菣ꦃ苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣股郧鶇鯩ꂴ菣ꪃ菣鞃菣覃臣䢮ㅁ臣䎮鳦꾫苣蚃戼㹲ꂃ苣낂菣뎃菣꾁胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾ㄫ⼼畳㹢胣䆜猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㌫⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㌫⼼畳㹢胣䆜猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㔫⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㔫⼼畳㹢胣䆜猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㠫⼼畳㹢胣䆁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㠫⼼畳㹢胣䆜猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾ㄫ㰰猯扵膀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱〱⼼畳㹢胣䆜猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾ㄫ㰵猯扵膀戼㹲袏臣䆯猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾ㄫ㰵猯扵鲀㱁畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱〲⼼畳㹢臣蒯鯥讁苣讧臣讂胣䢂ㅁ臣亮鳦꾫苣蚃菣뮂苣ꆃ菣袃臣芵苧꾁胣鞾苣貂苣궂戼㹲ꆃ菣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂苣ꒂ菣릂ꇨ莐蟥蚛듧鶃菣骃菣膃菣貁胣躇铧讞苣뎃菣ꮃ苣뎃苣股郧鶇鯩㲆牢ਾ듧ꢁꇩ벼臣龁룤ꆬ藥讧胩銂뷥邈臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂苣蚁臣膀䅈꺁ꮜꯧ릂菣ꂃ苣낂菣뎃菣誏戼㹲뎁苣뎃菣ꮃ苣뎃苣股郧鶇鯩ꂴ菣莃菣覃菣ꒂ菣鶃菣骃菣膃菣꺁꟥릂臣꺁雩ꎀ臣뢁諦閁苣讂臣㲹牢ਾ臣ꞁ臣讂胣鶁臣袂臣ꪁ껥붖藦颧臣誁臣ꚁ胣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂ꇨ莐蟥蚛듧颃菣覃菣ꆃ苣뎃菣ꪃ戼㹲骃菣膃菣⢉臣貂臣膀苣뎃菣ꮃ苣뎃苣股郧鶇鯩ꂴ苣蚃菣覃菣ꒂ菣鶃菣骃菣膃菣ꢁ闧꺨臣芁苣⦋戼㹲꾁胣肸곦超裥궸胣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂ꇨ莐蟥蚛듧릂菣ꂃ菣ꆃ苣뎃菣ꪃ菣鞃菣覃臣亮鳦꾫苣낂菣㲡牢ਾ菣袃臣䎨鳦꾫苣낂菣뎃菣꺁雩ꮁ뷤꺽臣讂胣㲂牢ਾ戼㹲㰊牢ਾਊ䐼噉邀触骶ꏨꎭ볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ꿥ꆱ鯦麡郥醀飦내鯦㲸䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ꿥ꆱꃩ꺛郥醀볯鎼볯銼⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦릖돦醀ꓥ뒛⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦꺁蛥릮胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀볯鎼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†䅈꺁ꮜꯧ꺁闩蒁苣蚃菣뮂苣ꆃ菣袃臣膀鳦躘듧뢛臣邏뻤閁苣讂껥ꦾ臣몟臣蒁臣鎽ꗦ薀臣㲫牢ਾ苣誂ꫨ颭臣貂苣뮻蓦꺁䅈꺁ꮜꯧ꺁闩蒁苣蚃菣뮂苣ꆃ菣袃臣芁苣鎁臣貁臣趁苣芀胩뢸胣䢁㱁牢ਾ꺁ꮜꯧ꺁闩蒁苣蚃菣뮂苣ꆃ菣袃臣膀䅈꺁듧㊄㰵⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰳甯ꪕ鯧꺁껦몟䠨颻闧銂뷤ꢔ꺁藩鞈臣趽뷧㲮牢ਾ臣讂苣ꦃ菣뎃껦몟臣覂䅈꺁ꮜꯧꊂ菣躃藩뺁臣讁苣ꪁ苣鶃菣骃菣膃菣ꮁ꿥鲿臣讂胣겜飦내戼㹲뢛臣䎧猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾⼼畳㹢臣낧臣貂苣膀臣꺁苣ꦃ菣뎃껦몟臣膀胩뢸胣䢁ㅁ臣亮鳦꾫臣랕臣릂菣ꂃ苣낂菣뎃菣궸臣㲮牢ਾ苣릂菣ꒂ菣议鿥䎺猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰瀾⼼畳㹢臣ꎀ뗧閁苣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ㆂ讀臣ꎻꇨ蒚臣䆪黥ꒂ菣閃��ꢂ菣뚂ꇨ莐蟥㲝牢ਾ鯩ꂴ臣超裥貁鯥ㆳ臣몤臣貂臣誁苣膀껦몟㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱱猯扵貁郥薀臣릉껥閁苣ꚁ臣讂胣㲂牢ਾ戼㹲㰊牢ਾਊ䐼噉邀触骶ꏨꎭ볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ꿥ꆱ鯦麡郥醀飦내鯦㲸䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ꿥ꆱꃩ꺛郥醀볯鎼볯鎼⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦릖돦醀ꓥ뒛⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦꺁蛥릮胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀볯鎼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†臣讂껥붖藦颧臣誁臣ꚁ胣䢁ㅁ臣䎮鳦꾫臣랕臣릂菣ꂃ苣낂菣뎃菣꾁胣䎁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾⼼畳㹢设臣낁胣䢁股郧鶇戼㹲蚛듧놔鷦꺁䅈떂菣ꚃ菣莃菣꺁汁㱡畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔲甼㌾⼼㹵⼼畳㹢讁苣讧臣讂臣ꞁ臣ꪁ臣膀藩鞈룤誏臣讧胩誸㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㱱猯扵ꮁ뿨蒁戼㹲议鿥讁苣讧臣讂胣设臣낁胣芁苣龮雦讅꟦ꮁ臣蒁臣膀䅈꺁ꮜꯧ꺁闩蒁苣蚃菣뮂苣ꆃ菣袃臣㲯牢ਾ胣䎁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾ㄭ⼼畳㹢胣䎁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㈭⼼畳㹢胣䎁猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㌭⼼畳㹢胣袏臣䎯猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰焾㐭⼼畳㹢臣覂꟥뺁苣芀믤꺁껥붖藦颧臣誁臣ꚁ胣䢁ㅁ臣䎮鳦꾫臣랕臣릂戼㹲蚃菣뮂苣ꆃ菣袃臣膀㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㰱猯扵膀㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㰲猯扵膀㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㰳猯扵膀㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㰴猯扵膀迥꾁㱃畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢⭱㰵猯扵讁苣讧臣讂胣䢂ㅁ臣亮鳦꾫臣랕臣릂戼㹲蚃菣뮂苣ꆃ菣袃臣芵苧꾁胣鞾苣貂苣䢋ㅁ苣蚃菣覃菣ꒂ菣貁胣许꣨꺁苣蚁臣膀苣뎃菣ꮃ苣뎃戼㹲뚂ꇨ莐蟥蚛듧ꢁꇩ벼臣龁룤ꆬ藥讧胩銂뷥邈臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂苣蚁臣膀䅈꺁ꮜꯧ꺁闩蒁苣㲹牢ਾ菣ꂃ苣낂菣뎃菣誏臣ꪃ菣ꮂ菣꺁꟥릂臣꺁雩ꎀ臣뢁諦閁苣讂臣趁臣芁苣芀戼㹲ਊ㰊䥄㹖胣讉뛧鲣귦醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨뢛ꇩ趐胣躘듧뢛⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨薠鯧趐胣邼볯鞼볯㲐䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ雦閳胣覤鯦㲴䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ臣薆껥醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 궸鋥릂菣벃苣鞊뷤銂ꓦ몇臣讂鯧蒚臣膀苣ꆃ菣蚈귥銂駧뺏臣讂뗧鮏臣Ꚃ苣ꮃ苣节菣릂苣ꖃ戼㹲벃臣龁胣躁軥ㆻ룤肴臣辂臣讂菣袃苣뎃菣ꮃ苣뎃苣Ꚃ苣ꮃ苣꾁藥ꚁ胣亁袏臣亯鲺黥꺁䅎苣뎂戼㹲벃菣鞁臣蒁苣꺁臣膀䡣⼹丱趆鯩袐뷤Ꚃ苣ꮃ苣꺁菣릂苣ꖃ菣ꮁ苣誂胣ꦁ臣⢮ㅎ迥꾁㉎躃苣㲤牢ਾ菣龃菣肃菣벂諦鎽듦Ꞁ苣겸껥馁苣鎁臣ꪁ臣膀苣袃菣꾂觧낕髧鞊뷤꺁룤貒菨鮊臣閩뻤貁迥붃戼㹲ꮁ臣讂臣ꢎꯨ閁苣龁胣掂㥈ㄯ㍎苣ꒂ菣릂䠨莐諧颃菣覃䅈臣膀㍎뫤讞菣ꒂ菣龃菣肃菣벂臣ꢁ戼㹲节臣膀ㅈ苣袃菣꾂��몙迧馁苣⦋苣膀菣邃菣릂苣Ꞃ菣蚃苣莃苣릂苣ꢔ臣ꚁ菣릂苣ꖃ菣鞁胣颫戼㹲鮊뻤ꮁ臣讂臣ꞁ駧늂뛩떍룤ꞁ裦랕臣鮁臣芀臣꺁苣ꒂ菣릂臣鞃菣벃苣ꊂ菣뮂苣ꢡ迧讞臣膀剐戼㹲㠊蟩龔黥Ꚃ苣ꮃ苣꺁菣ꦃ菣꾂苣莃苣ꒂꇨ뺏黥ꢁ郥颧臣芁臣龁뎛㰲⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰹甯䌾芀苣ꒂ菣릂뛧ꎻ뻥꺁㥈戼㹲颃菣覃臣颭鳥銂ꋧ趪臣讂臣膂臣膀듧麃苣排㥈ㄯ㍎苣ꒂ菣릂臣龄鿦閁臣龁胣鶁臣貾胣龄鿦내戼㹲麃苣膀㥈뫤讞ꇨ莐蟥蚛듧뾂菣醃苣ꪳ臣릉闧蒚臣鞊뷤ꞁ臣讂菣Ꚃ苣涹扁䜠ⴱ㘲臣鞃菣벃菣뎃戼㹲낂臣龁胣躱ㅈ苣袃菣꾂觧낕髧鞊뷤㚓ㅆ銂铧蒁臣膀蟩龔黥傋㡒苣ꒂ菣릂蓦鎟듧麃臣推㥈ㄯ㍎苣㲦牢ਾ苣ꮃ苣龄鿦내菨꺁룤릖苣鲤蟥鞁臣⢟鯥㊳䈶芀戼㹲ਊ㰊䥄㹖胣讉뛧鲣귦醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨뢛ꇩ趐胣躘듧뢛⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨薠鯧趐胣邼볯邼볯㲒䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ雦閳胣覤鯦㲴䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ臣薆껥醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣邼볯邼볯醀⼼䥄㹖 것苣궂菣벃臣貂臣Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ臣醁苣掋䅈臣颭鳥銂蓦鎟듧麃臣Ꚃ苣릂苣뎃菣궃菣袃迥뎁雩㲓牢ਾ軦超雧趛藥ꮁ苣誂臣覂臣몢ꫨ鞁臣⢟鯥㲳⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔳⼼㹵迥뎁甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾㰶甯⤾胣䶂䍄내菨銂胣犁呗倠㡒胣躇铧讞菣벃苣⾹㤰戼㹲膀䡣⼱膀䡣⼵膀䡣⼷膀迥뎁䡣⼵Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ蓦鎟臣鮁臣⢟鯥㲳⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔳⼼㹵迥뎁甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾㰶甯⤾胣掂ㅈㄯ迥뎁䡣⼵㰱牢ਾ苣ꆃ菣䢩뾂菣醃苣ꪳ苣膀臣貂臣貂胣䎁污〯⠹ㅈ 䅈臣颃菣覃菣ꆃ苣뎃臣뺯臣ꚁ迥鲿臣讂諦㲗牢ਾ뷤⢓㤲㍅⠩敍楤慮苣꺁雦꺌㈨㄰ⰰ丠瑡牵⁥潃浭湵捩瑡潩獮ㄠ㈺⤸袏臣嚯⽎㐰䠨⤵䠠꺁菣莃戼㹲覃菣ꆃ苣뎃臣뺯臣ꚁ迥鲿臣讂諦鎽洨扁⌠⤸匨整汥苣꺁雦꺌㈨〰ⰹ䨠嘠物汯㠠㨳㜱㈴㔭⤳㰩牢ਾ苣ꢔ臣ꚁ胣뺯뿥馁苣ꚩ雦궸臣鲤蟥鞁臣⢟鯥㲳⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㔳⼼㹵芀뇦䢎鞊苣袃菣꾂䅭ꞁ臣讂㈱ㅄ苣ꢔ臣ꚁ胣掁戼㹲䠊⼷ꢁ䡣⼵ꢁ蟩龔黥醃菣릂䅈臣鎖臣貐꣧ꚺ臣몙迧것菣ꮃ在湡覂臣螖賧⢮〲〱‬䱐卯倠瑡㱨牢ਾ杯㘠攺〱〰㤷⤶迥ꞅ芀蟩龔黥醃菣릂䅈臣膀苣ꮃ룤ꞁ臣袂苣薁臣뮧该銂ꓧ鞁胣鎁苣꾁胣莐戼㹲뚊菣莃菣覃菣ꒂ菣궸臣낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤꺁闦貁苣誂ꓥ蒁臣膂臣芁苣꾏菨Ꞁ臣颫臣芀䡣⼷㰳牢ਾ迥꾁䡣⼵龄鿦ꚩ雦ꮁ꿥鞁臣膀臣貂臣貂胣鞊㝈菣ꪃ苣궃菣誃菣鞊뷤⢓剎㌭㔱⤲迥꾁諦䢗ꊃ菣㲎牢ਾ苣궃菣誃菣鞊뷤⢓䅭⁢㠣銂뷤ꢔ臣讂臣ꢁ臣袂苣膀귦몢臣䢪颃菣覃菣ꆃ苣뎃臣䢌릂菣벃苣꺁戼㹲誸臣몙迧馁苣鎁臣貁ꋧ趪臣貂臣芀駩Ꞁ菣뎃菣꾁胣ꦁ臣覂臣뒠郥ꮁ苣鲤蟥閁苣龁胣㲂牢ਾ戼㹲ਊ㰊䥄㹖胣讉뛧鲣귦醼볯��醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨뢛ꇩ趐胣뎛鷩㲢䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ꿥ꆱꃩ꺛郥醀鯥醼볯㲢䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ雦閳胣覤鯦㲴䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ臣薆껥醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㈰ㄳ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀触骶ꏨꎭ볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ꿥ꆱ鯦麡郥醀鯥ꊝ⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨薠鯧趐胣뎛볯ꎼ⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦릖돦醀ꓥ뒛⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦꺁蛥릮胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㌲㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣讉뛧鲣귦醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨뢛ꇩ趐胣뎛鷩㲢䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ꿥ꆱꃩ꺛郥醀鯥銼볯㲡䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ雦閳胣覤鯦㲴䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ臣薆껥醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲㤰㘶㐰琮晩㸢〲〲㤰㘶㐰琮晩ꃂ〰㈰㌳⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀触骶ꏨꎭ볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ꿥ꆱ鯦麡郥醀鯥ꊝ⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣鲣귦뺯뇨薠鯧趐胣뎛볯㲓䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ雦閳胣覤鯦㲴䐯噉ਾ䐼噉邀ꏨꎭ臣薆껥醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶⸴楴≦㈾㈰〰㘹〶⸴楴쉦゠〰㌲㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣隤鯥麪飦내鯦醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰〰㘹〶〴〰〰⸱摰≦㈾㈰〰㘹〶〴〰〰⸱摰㱦愯㰾䐯噉ਾ⼼潢祤ਾ⼼瑨汭ਾ