(57)【要約】      （修正有）【課題】タウに対する抗体の提供。【解決手段】タウへの結合について抗体１６Ｂ５と競合するモノクローナル抗体。いくつかの抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、ベニヤ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体またはヒト抗体である。いくつかのそのような抗体は、特定の配列を有するヒトＩｇＧ１定常領域を有する。いくつかの抗体は、特定の配列を有するヒトκ定常領域を有する。いくつかの抗体は、定常領域内に少なくとも１つの変異を有する。これらの抗体は、タウに関連する病変およびタウに関連する痴呆の症状を抑制するか、または遅延させる。【選択図】図５
2020109103.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タウへの結合について抗体１６Ｂ５と競合するモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１３日出願の非仮出願第６１／７８０，６２４号および２０１３年３月１５日出願の同第６１／８００，３８２号であり、それぞれ、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
タウは、リン酸化型で存在し得る周知のヒトタンパク質である（例えば、Ｇｏｅｄｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：４０５１−４０５５（１９８８）；Ｇｏｅｄｅｒｔ，ＥＭＢＯ Ｊ．８：３９３−３９９（１９８９）；Ｌｅｅ，Ｎｅｕｒｏｎ ２：１６１５−１６２４（１９８９）；Ｇｏｅｄｅｒｔ，Ｎｅｕｒｏｎ ３：５１９−５２６（１９８９）；Ａｎｄｒｅａｄｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：１０６２６−１０６３３（１９９２）を参照されたい）。タウは、特に中枢神経系における微小管の安定化に関与すると報告されている。総タウ（ｔ−タウ、すなわち、リン酸化型および非リン酸化型）ならびにリン酸化タウ（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｔａｕ）（ｐ−タウ、すなわち、リン酸化されたタウ）は、神経損傷および神経変性に応答して脳によって放出され、一般集団と比べて、アルツハイマー病患者のＣＳＦにおいてレベルが増加していることが報告されている（Ｊａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ ９：１１９−２８（２０１０））。
【０００３】
タウは、神経原線維変化の主要な構成要素であり、プラークと共にアルツハイマー病の特徴的な特徴である。凝集体は、８０ｎｍの定期的な周期で螺旋状に巻かれたペアで生じる直径１０ｎｍの異常な線維で構成されている。神経原線維変化内のタウは、分子上の特定の部位に付着したリン酸基で異常にリン酸化（高リン酸化）されている。アルツハイマー病における神経原線維変化の深刻な関与は、嗅内皮質層ＩＩニューロン、海馬のＣＡ１および海馬台領域、扁桃体、ならびに新皮質のより深い層（層ＩＩＩ、Ｖ、および表面のＶＩ）に見られる。高リン酸化タウはまた、微小管アセンブリーを妨害することが報告されており、これは神経回路網の破壊を促進し得る。
【０００４】
タウ封入体は、アルツハイマー病、前頭側頭葉変性症、進行性核上性麻痺およびピック病を含むいくつかの神経変性疾患の決定的な神経病理の一部である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、タウへの結合についてモノクローナル抗体１６Ｂ５と競合するモノクローナル抗体を提供する。いくつかの抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、ベニヤ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体またはヒト抗体である。いくつかの抗体は、ヒトＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４）の抗体である。いくつかのそのような抗体は、配列番号２９の配列を有するヒトＩｇＧ１定常領域を有する。いくつかの抗体は、配列番号３２の配列を有するヒトκ定常領域を有する。いくつかの抗体は、定常領域内に少なくとも１つの変異を有する。
【０００６】
抗体のいくつかは、モノクローナル抗体１６Ｂ５のヒト化型、キメラ型またはベニヤ型である。いくつかの抗体は、モノクローナル抗体１６Ｂ５のカバットによって定義されるような３つの軽鎖ＣＤＲおよびカバットによって定義されるような３つの重鎖ＣＤＲを有する。いくつかの抗体は、リン酸化型および非リン酸化型でタウに結合する。
【０００７】
本発明はさらに、配列番号１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号Ｐ１０６３６−８）の残基２４〜４６内のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。いくつかのそのような抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはベニヤ抗体である。いくつかの抗体は、配列番号１の残基２５〜４４内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、配列番号１の残基３０〜３９内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、リン酸化型および非リン酸化型でタウに結合する。
【０００８】
本発明はさらに、配列番号１５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域および配列番号２２と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）同一である成熟軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体を提供する。特定の実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号１５の３つのカバットＣＤＲおよび配列番号２２の３つカバットＣＤＲを含む。いくつかの抗体において、成熟重鎖可変領域は配列番号１５と命名されたアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は、配列番号２１、２２、または２３と命名されたアミノ酸配列を有する。
【０００９】
いくつかの抗体において、位置Ｈ１３、Ｈ４８およびＨ９１の少なくとも１つは、それぞれＫ、Ｍ、およびＦによって占有され、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３の少なくとも１つは、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占有されている。いくつかの抗体において、位置Ｈ１３、Ｈ４８およびＨ９１は、それぞれＫ、Ｍ、およびＦにより占有され、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３の少なくとも２つは、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占有されている。いくつかの抗体において、位置Ｈ１３、Ｈ４８およびＨ９１は、それぞれＫ、Ｍ、およびＦにより占有され、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３の少なくとも３つは、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占有されている。いくつかの抗体において、位置Ｈ１３、Ｈ４８およびＨ９１は、それぞれＫ、ＭおよびＦによって占有され、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３は、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占有されている。
【００１０】
いくつかの抗体において、成熟重鎖可変領域は重鎖定常領域に融合され、成熟軽鎖可変領域は軽鎖定常領域に融合されている。いくつかの抗体において、重鎖定常領域は、天然のヒト定常領域と比較して、Ｆｃγ受容体への結合が低減した天然のヒト定常領域の変異型である。いくつかの抗体において、重鎖定常領域はＩｇＧ１アイソタイプのものである。
【００１１】
いくつかの抗体において、それぞれ配列番号１５および２２由来の成熟重鎖可変領域および成熟軽鎖可変領域のＣＤＲ内の違いは、位置Ｈ６０〜Ｈ６５の中に存在する。
【００１２】
抗体は、Ｆａｂ断片などのインタクトな抗体または断片であり得る。
【００１３】
モノクローナル抗体またはその断片のいずれも、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤にコンジュゲートさせることができる。
【００１４】
本発明はさらに、抗体をヒト化する方法を提供する。いくつかの方法は、マウス抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の配列を決定することと、マウス抗体重鎖のＣＤＲを含むヒト化重鎖をコードする核酸およびマウス抗体軽鎖のＣＤＲを含むヒト化軽鎖をコードする核酸を合成することと、ヒト化抗体を産生するために宿主細胞内で核酸を発現させることと、を含み、その際、マウス抗体は１６Ｂ５である。
【００１５】
本発明はさらに、ヒト化抗体、キメラ抗体またはベニヤ抗体を産生する方法を提供する。いくつかの方法は、細胞が抗体を分泌するように、抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸で形質転換された細胞を培養することと、細胞培地から抗体を精製することと、を含み、その際、抗体は１６Ｂ５のヒト化型、キメラ型またはベニヤ型である。
【００１６】
本発明はさらに、ヒト化抗体、キメラ抗体またはベニヤ抗体を産生する細胞株を産生する方法を提供する。いくつかの方法は、抗体の重鎖および軽鎖ならびに選択マーカーをコードするベクターを細胞に導入することと、コピー数が増加したベクターを有する細胞について選択する条件下で細胞を増殖させることと、選択細胞から単一細胞を単離することと、抗体の収量に基づいて選択した単一細胞からクローニングした細胞を保存することと、を含み、その際、抗体は１６Ｂ５のヒト化型、キメラ型またはベニヤ型である。
【００１７】
本発明はさらに、本明細書に開示される全ての抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、配列番号１０の配列を有する重鎖可変領域をコードするセグメントを含む核酸を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、配列番号１５の配列を有する重鎖可変領域をコードするセグメントを含む核酸を提供する。いくつかの核酸において、セグメントは配列番号２５のヌクレオチド配列を有する。いくつかの核酸はさらに、Ｃ末端リジンを省くことができるという条件で、例えば、配列番号２９の配列を有するＩｇＧ１定常領域、必要に応じて、ヒトＩｇＧ１の定常領域をコードするセグメントを含む。いくつかの核酸において、ＩｇＧ１定常領域をコードするセグメントは、配列番号３０のヌクレオチド配列を有する。いくつかのそのような核酸はさらに、重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域をコードするセグメントを連結するイントロンを含む。例えば、イントロンは、配列番号３１で見られるイントロンの配列を有し得る。したがって、イントロンおよびＩｇＧ１定常領域をコードするセグメントは、配列番号３１のヌクレオチド配列を有し得る。
【００２０】
本発明はさらに、配列番号１６の配列を有する軽鎖可変領域をコードするセグメントを含む核酸を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、配列番号２１、２２、または２３の配列を有する軽鎖可変領域をコードするセグメントを含む核酸を提供する。いくつかの核酸において、軽鎖可変領域をコードするセグメントは、配列番号２６、２７または２８の配列を有する。いくつかのこのような核酸は、さらに、κ定常領域をコードするセグメントを含む。κ定常領域はヒトκ定常領域であり得、配列番号３２の配列を有し得る。必要に応じて、κ定常領域をコードする核酸は、配列番号３３の配列を有する。いくつかのそのような核酸は、さらに、κ定常領域をコードするセグメントに軽鎖可変領域をコードするセグメントを連結するイントロンを含む。例えば、イントロンは、配列番号３４に見られるイントロンの配列を有し得る。したがって、イントロンおよびκ定常領域をコードするセグメントは、配列番号３４のヌクレオチド配列を有し得る。
【００２２】
上記の抗体のいずれも、配列番号２９の配列を有するヒトＩｇＧ１定常領域および／または配列番号３２の配列を有するヒトκ定常領域を含む軽鎖を含むことができる。
【００２３】
本発明はさらに、配列番号１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号Ｐ１０６３６−８）の残基２４〜４６内にタウの３〜１０個の連続残基を含むタウの単離断片を提供する。いくつかの断片は、配列番号１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号Ｐ１０６３６−８）の残基３０〜３９内にタウの３〜１０個の連続残基を含む。いくつかの断片は、配列番号１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号Ｐ１０６３６−８）の残基３３〜３７を含む。一部の断片は、必要に応じて、スペーサーを介して、この断片に対する抗体を生じさせるのに役立つ担体分子に連結される。いくつかの断片は、ヒトへの投与に許容可能なアジュバントを含む医薬組成物の一部である。
【００２４】
本発明はさらに、アルツハイマー病の治療法または効果的な予防法を提供する。いくつかの方法は、配列番号１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号Ｐ１０６３６−８）の残基２４〜４６内のエピトープに特異的に結合する抗体、またはそのような抗体を誘導する薬剤を有効投与計画で、アルツハイマー病を有するまたはアルツハイマー病のリスクのある患者に投与し、それによってこの疾患を治療または効果的に予防することを含む。好ましくは、この抗体は本明細書に記載の抗体である。いくつかの方法において、抗体を誘導する薬剤は、配列番号１の残基２４〜４６内にタウの３〜１０個の連続残基を含むタウの断片である。いくつかの方法において、患者はＡｐｏＥ４保因者である。
【００２５】
本発明はさらに、タウと関連する疾患の治療法または効果的な予防法を提供する。いくつかの方法は、配列番号１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号Ｐ１０６３６−８）の残基２４〜４６内のエピトープに特異的に結合する抗体、またはそのような抗体を誘導する薬剤を有効投与計画で、疾患を有するまたは疾患のリスクのある患者に投与し、それによってその疾患を治療または効果的に予防することを含む。好ましくは、この抗体は、本明細書に記載の抗体（例えば、ヒト化１６Ｂ５抗体）である。いくつかの方法において、抗体を誘導する薬剤は、配列番号１の残基２４〜４６内にタウの３〜１０個の連続残基を含むタウの断片である。いくつかの方法において、この疾患は神経疾患である。
【００２６】
本発明はさらに、タウの異常な伝達を減少させる方法を提供する。いくつかの方法は、配列番号１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号Ｐ１０６３６−８）の残基２４〜４６内のエピトープに特異的に結合する抗体、またはそのような抗体を誘導する薬剤を有効投与計画で、タウの異常な伝達と関連する疾患を有するまたはその疾患のリスクのある患者に投与し、それによってその疾患を治療または効果的に予防することを含む。好ましくは、この抗体は、本明細書に記載の抗体（例えば、ヒト化１６Ｂ５抗体）である。いくつかの方法において、抗体を誘導する薬剤は、配列番号１の残基２４〜４６内にタウの３〜１０個の連続残基を含むタウの断片である。
【００２７】
本発明はさらに、タウの食作用を誘導する方法を提供する。いくつかの方法は、配列番号１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号Ｐ１０６３６−８）の残基２４〜４６内のエピトープに特異的に結合する抗体、またはそのような抗体を誘導する薬剤を有効投与計画で、タウの蓄積と関連する疾患を有するまたはその疾患のリスクのある患者に投与することを含む。好ましくは、この抗体は、本明細書に記載の抗体（例えば、ヒト化１６Ｂ５抗体）である。いくつかの方法において、抗体を誘導する薬剤は、配列番号１の残基２４〜４６内にタウの３〜１０個の連続残基を含むタウの断片である。いくつかの方法において、この疾患は神経疾患である。
【００２８】
本発明はさらに、タウの凝集または沈着を抑制する方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、配列番号１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号Ｐ１０６３６−８）の残基２４〜４６内のエピトープに特異的に結合する抗体、またはそのような抗体を誘導する薬剤を有効投与計画で、タウの凝集または沈着と関連する疾患を有するまたはその疾患のリスクのある患者に投与することを含む。好ましくは、この抗体は、本明細書に記載の抗体（例えば、ヒト化１６Ｂ５抗体）である。いくつかの方法において、抗体を誘導する薬剤は、配列番号１の残基２４〜４６内にタウの３〜１０個の連続残基を含むタウの断片である。いくつかの方法において、この疾患は神経疾患である。
【００２９】
本発明はさらに、タウの凝集体の形成を抑制する方法を提供する。いくつかの方法は、配列番号１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号Ｐ１０６３６−８）の残基２４〜４６内のエピトープに特異的に結合する抗体、またはそのような抗体を誘導する薬剤を有効投与計画で、タウの凝集体の形成と関連する疾患を有するまたはその疾患のリスクのある患者に投与することを含む。好ましくは、この抗体は、本明細書に記載の抗体（例えば、ヒト化１６Ｂ５抗体）である。いくつかの方法において、抗体を誘導する薬剤は、配列番号１の残基２４〜４６内にタウの３〜１０個の連続残基を含むタウの断片である。いくつかの方法において、この疾患は神経疾患である。
【００３０】
本発明はさらに、アルツハイマー病に対する活性剤をスクリーニングする方法を提供する。いくつかの方法は、タウ導入遺伝子を発現するトランスジェニック動物に薬剤を投与することと、薬剤がアルツハイマー病の少なくとも１つの徴候もしくは症状を抑制または遅延するかどうかを判定することと、を含み、その際、薬剤は、配列番号１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号Ｐ１０６３６−８）の残基２４〜４６内のエピトープに特異的に結合する抗体、またはそのような抗体を誘導する薬剤である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】１６Ｂ５モノクローナル抗体が結合するエピトープ（複数可）をマッピングするために設計した実験の結果を示す。全長タウまたはタウの欠失変異体（Δ５−２４またはΔ２５〜４４）を含むウェスタンブロットを１６Ｂ５抗体（左パネル）またはタウ４６抗体（右パネル）で染色した。タウ４６抗体は、タウのＣ末端エピトープに結合する。
【図２】１６Ｂ５モノクローナル抗体が結合するエピトープ（複数可）をマッピングするために設計した実験の結果を示す。全長タウまたはタウの欠失変異体を含むウェスタンブロットを１６Ｂ５抗体（左パネル）またはタウ４６抗体（右パネル）で染色した。１６Ｂ５抗体で染色したブロットのより長い露光を左下のパネルに示す。この実験で分析したタウの欠失変異体には、Δ２５〜４４、Δ５−２４、Δ２３−３２、Δ３０−３９、およびΔ３７−４６が含まれる。
【図３】１６Ｂ５モノクローナル抗体が結合するエピトープ（複数可）をマッピングするために設計したアラニンスキャニング実験の結果を示す。野生型タウ（ＷＴ）またはタウのアラニン点変異体を含むウェスタンブロットを、１６Ｂ５抗体（左パネル）またはタウ４６抗体（右パネル）で染色した。この実験で分析したタウのアラニン変異体には、Ｔ３０Ａ、Ｍ３１Ａ、Ｈ３２Ａ、Ｑ３３Ａ、Ｄ３４Ａ、Ｑ３５Ａ、Ｅ３６Ａ、Ｇ３７Ａ、Ｄ３８Ａ、Ｔ３９Ａ、Ｄ４０Ａ、Ａ４１Ｌ、およびＧ４２Ａが含まれる。
【図４】ヒトタウ．Ｐ３０１Ｌタンパク質を発現するトランスジェニックマウスの脳幹のサルコシル不溶性画分に検出されたタウタンパク質の相対量を示す。マウスに、１６Ｂ５抗体または非免疫ＩｇＧ１アイソタイプ対照の６Ｆ１０抗体のいずれかで受動免疫した。試料を、ウェスタンブロット法、抗体染色、および結果として生じるシグナルの定量によって分析した。タウを検出するために使用した抗体には、抗リン酸化タウ特異的抗体（ＡＴ８、左上のパネル；ＡＴ１００、左下のパネル；または１Ｆ５、右上のパネル）、およびパンタウ抗体（ＨＴ７、右下のパネル）が含まれた。
【図５】ヒトタウ．Ｐ３０１Ｌタンパク質を発現するトランスジェニックマウスの全脳幹ホモジネート中で検出された総タウ蛋白質に対するリン酸化タウの比率（左パネル）および総タウの正規化した量（右パネル）を示す。マウスに、１６Ｂ５抗体または非免疫ＩｇＧ１アイソタイプ対照の６Ｆ１０抗体のいずれかで受動免疫した。試料を、ウェスタンブロット法、抗体染色、結果として生じるシグナルの定量によって分析した。ＡＴ８抗体を用いてリン酸化タウを検出し、ＨＴ７抗体を用いて総タウを検出した。抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いて、対照６Ｆ１０抗体で治療したマウスにおいて検出されたタウの量に対して、１６Ｂ５抗体で治療したマウスにおいて検出されたタウの量を正規化した。
【図６】ヒトタウ．Ｐ３０１Ｌタンパク質を発現するトランスジェニックマウスの、ＡＴ８抗リン酸化タウ抗体を用いて免疫組織化学染色した小脳核の切片を示す。マウスに、１６Ｂ５抗体（左パネル）または非免疫ＩｇＧ１アイソタイプ対照の６Ｆ１０抗体（右パネル）のいずれかで受動免疫した。１６Ｂ５または６Ｆ１０抗体で受動免疫したマウスの小脳の挿入核、前方および後方部、アネックス外側小脳核（ａｎｎｅｘ ｌａｔｅｒａｌ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｎｕｃｌｅｕｓ（ＩｎｔＡ／Ｐ／ＬＡＴ））ならびに視床下核アネックス不確帯（ｓｕｂｔｈａｌａｍｉｃ ｎｕｃｌｅｕｓ ａｎｎｅｘ ｚｏｎａ ｉｎｃｅｒｔａ（ＳＴＨ／ＺＩ））におけるＡＴ８抗体で検出したタウ染色の量の定量化を上部の棒グラフのパネルに示す。１６Ｂ５または６Ｆ１０抗体で受動免疫したマウスのＩｎｔＡ／Ｐ／ＬＡＴおよびＳＴＨ／ＺＩ切片にＡＴ１００抗リン酸化タウ抗体を用いて検出したリン酸化タウ染色の量の定量化を、下の棒グラフのパネルに示す。統計的有意性を、スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５を用いて評価した。
【図７】キメラ１６Ｂ５抗体およびヒト化１６Ｂ５抗体（Ｈ１Ｌ２およびＨ１Ｌ３バージョン）で得られたタウ免疫沈降の結果を示す。アルツハイマー病患者から得られた死後前頭皮質試料の可溶性画分および不溶性画分の両方からタウを免疫沈降した。ブロットした免疫沈降物中のタウ存在を、ポリクローナル抗タウ抗体（タウｐＡｂ）を用いて検出した。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
定義
モノクローナル抗体および他の治療剤は、典型的には、単離された形態で提供される。これは、薬剤が通常、干渉タンパク質およびその製造または精製から生じる他の汚染物質に対して少なくとも５０％ｗ／ｗの純度であることを意味するが、その薬剤が、過剰の薬学的に許容される担体（複数可）またはその使用を容易にすることが意図される他のビヒクルと組み合わされる可能性を排除しない。時には、モノクローナル抗体（または他の治療薬）は、干渉タンパク質および製造または精製から生じる他の汚染物質に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％ｗ／ｗの純度である。
【００３３】
本発明の抗体は、典型的には少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０Ｍ−１の会合定数でその指定された標的に結合する。このような結合は、それが大きさにおいて検出可能なほど高く、かつ少なくとも１つの無関係な標的に生じる非特異的結合と区別できるという点で特異的結合である。特異的結合は、特定の官能基または特定の空間的フィット（例えば、ロックおよびキータイプ）との間の結合の形成の結果であり得るが、非特異的結合は、通常、ファンデルワールス力の結果である。しかし、特異的結合は、必ずしもモノクローナル抗体が唯一の標的に結合することを意味するものではない。
【００３４】
基本的な抗体構造単位は、サブユニットの四量体である。各四量体はポリペプチド鎖の２つの同一の対を含み、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。切断可能なシグナルペプチドに連結されたこの可変領域が、最初に発現される。シグナルペプチドを含まない可変領域は、しばしば成熟可変領域と呼ばれる。したがって、例えば、軽鎖の成熟可変領域は、軽鎖シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域を意味する。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。定常領域は、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域のいずれかまたは全てを含み得る。
【００３５】
軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖はまた、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む（一般に、基礎免疫学（Ｐａｕｌ，Ｗ．（編）、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９）の７章を参照されたい（全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる））。
【００３６】
各軽鎖／重鎖対の成熟可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、インタクトな抗体は２つの結合部位を有する。二官能性または二重特異性抗体を除いて、２つの結合部位は同一である。鎖の全ては、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の２つの鎖のＣＤＲはフレームワーク領域によって整列し、特異的エピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖および重鎖の両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、カバットの免疫学的に重要なタンパク質の配列（Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ、１９８７年および１９９１年）、またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。カバットはまた、異なる重鎖間または異なる軽鎖間の対応する残基に同じ番号が割り当てられる、広く使用されている番号付け規則（カバット番号付け）を提供する。
【００３７】
「抗体」という用語は、インタクトな抗体およびその結合断片を含む。典型的には、断片は、標的への特異的結合のために誘導されたインタクトな抗体と競合する。断片は、別々の重鎖、軽鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）ｃ、Ｆｖおよび単一ドメイン抗体を含む。単一（可変）ドメイン抗体は、従来の抗体のＶＬパートナーから分離されたＶＨ領域（またはその逆）（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）ならびにＶＨ領域がＶＬ領域と結合していないラクダ科または軟骨魚類（例えば、テンジクザメ）などの種の（時にはＶＨＨとして知られる）ＶＨ領域を含む（例えば、ＷＯ９４０４６７８を参照されたい）。１つの鎖がその天然のパートナーから分離された単一ドメイン抗体は、時にはＤａｂとして知られておりラクダ科または軟骨魚類からの単一ドメイン抗体は、時にはナノボディとして知られる。定常領域または定常領域の部分は、単一ドメイン抗体中に存在してもまたはしなくてもよい。例えば、ラクダ科由来の天然単一可変領域の抗体は、ＶＨＨ可変領域、ならびにＣＨ２およびＣＨ３定常領域を含む。単一ドメイン抗体は、従来の抗体と類似の方法によってヒト化の対象となり得る。Ｄａｂタイプの抗体は、通常、ヒト由来の抗体から得られる。ナノボディタイプの抗体はラクダ科またはサメ由来のものであり、ヒト化の対象となり得る。断片は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的または化学的分離により生成できる。用語「抗体」はまた、二重特異性抗体も含む。二重特異性または二機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である（例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７−５３（１９９２）を参照されたい）。
【００３８】
用語「エピトープ」は、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続アミノ酸または１つもしくは複数のタンパク質の三次フォールディングによって近接して並べられた非連続アミノ酸から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒に曝露されても保持されるが、三次フォールディングによって形成されたエピトープは、典型的には変性溶媒での処理で失われる。エピトープは、典型的には、独特の空間的コンフォメーションにおいて少なくとも３個以上、通常は少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含む。エピトープがタンパク質中のアミノ酸残基の範囲内（例えば、タウの残基２５〜４４内）にあると言われるとき、その範囲はその境界を定義する残基を含む。範囲内の特定の残基はエピトープに寄与するが、その他は寄与しない場合がある。エピトープを形成する残基は、互いに連続してもまたはしなくてもよい。同様に、抗体が、アミノ酸の特定の範囲内に見出されるエピトープに結合する場合、抗体は範囲内の全てのアミノ酸残基と接触する必要はなく、抗体と接触するエピトープの残基は、互いに隣接していてもまたはしていなくてもよい。エピトープの空間的高次構造を決定する方法には、例えば、ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ（編）（１９９６）の分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）の６６巻の中のエピトープマッピングプロトコル（Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）を参照されたい。
【００３９】
同じまたは重複するエピトープを認識する抗体は、標的抗原に対して他方の抗体の結合と競合する一方の抗体の能力を示す簡単な免疫アッセイで同定できる。抗体のエピトープはまた、接触残基を同定するために、その抗原に結合した抗体のＸ線結晶学によって定義することもできる。あるいは、一方の抗体の結合を低減または排除する抗原内の全てのアミノ酸変異が、他方の結合を低減または排除する場合は、２つの抗体は同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を低減または排除するいくつかのアミノ酸変異が、他方抗体の結合を低減または排除する場合は、２つの抗体は重複するエピトープを有する。本発明は、１６Ｂ５と競合するか、かつ／または１６Ｂ５と同じタウ上のエピトープに結合する抗体を含む。
【００４０】
抗体間の競合は、試験抗体が共通抗原への参照抗体（例えば、１６Ｂ５）の特異的結合を抑制するアッセイによって決定される（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：１４９５，１９９０）。競合結合アッセイで測定した時、過剰（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍）の試験抗体が参照抗体の結合を少なくとも５０％、好ましくは７５％、９０％または９９％阻害する場合、試験抗体は参照抗体と競合する。競合アッセイによって同定される抗体（競合抗体）には、立体障害が起こるために、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体および参照抗体が結合するエピトープに十分近位にある隣接エピトープに結合する抗体が含まれる。
【００４１】
「患者」という用語は、予防的治療または治療的治療のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物被験体を含む。
【００４２】
アミノ酸置換を保存的または非保存的アミノ酸置換として分類する目的のために、アミノ酸は次のようにグループ化される：グループＩ（疎水性側鎖）：ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖の配向に影響を与える残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；グループＶＩ族（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は、同じクラスのアミノ酸間の置換を含む。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することである。
【００４３】
パーセント配列同一性は、カバット番号付け慣例により最大限整列させた抗体配列を用いて決定される。整列後、対象抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の全体の成熟可変領域）を参照抗体の同じ領域と比較する場合、対象抗体領域と参照抗体領域の間のパーセント配列同一性は、対象抗体領域と参照抗体領域の両方において同じアミノ酸が占有する位置の数を、整列させた２つの領域の位置の総数（ギャップはカウントしない）で割り、１００を乗じてパーセンテージに変換したものである。
【００４４】
用語「アジュバント」は、抗原と共に投与した場合、抗原に対する免疫応答を増大および／または再指示するが、単独で投与した場合には、抗原に対する免疫応答を生じさせない化合物を指す。アジュバントは、リンパ球動員、Ｂおよび／またはＴ細胞の刺激、ならびにマクロファージの刺激を含むいくつかのメカニズムによって免疫応答を増強できる。
【００４５】
疾患を有する患者集団の脳内においてタウのレベルが増加するか、タウ沈着もしくは封入体が増加するか、脳内にタウの凝集体が存在するか、脳内のタウのリン酸化（タウ１分子あたりリン酸基の平均数）が増加するか、または神経疾患を有することが知られていない対象集団と比較して、タウの細胞間もしくは細胞内伝達が異常である場合に、疾患はタウと関連する。タウ遺伝子の変異型を有する患者が、野生型（ヒト集団において最も頻繁に発生する型）のタウ遺伝子を有する患者と比較して、疾患を発症するリスクが増加している場合に、疾患はタウとも関連する。
【００４６】
対象が、リスクファクターを有する個体をリスクファクターがない個体よりも疾患を発症するリスクを統計的に有意に高い位置に置く少なくとも１つの既知のリスクファクター（例えば、遺伝的、生化学的、家族歴、状況暴露）を有する場合に、個人は疾患のリスクが高い。
【００４７】
用語「症状」は、患者が気付くような歩調の変化などの疾患の主観的証拠を指す。「徴候」は、医師が認めるような疾患の客観的証拠を指す。
【００４８】
統計的有意性とは、ｐ＜０．０５を意味する。
【００４９】
詳細説明
Ｉ．概要
本発明は、タウに結合する抗体を提供する。いくつかの抗体は、配列番号１の残基２３〜４６内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、リン酸化状態に関わりなくタウに結合する。本発明のいくつかの抗体は、タウに関連する病状およびタウに関連する徴候の悪化を抑制するかまたは遅らせるのに役立つ。機構を理解することは本発明の実施に必要ではないが、他のメカニズムの中で、非毒性高次構造を安定化するか、または病原性タウ形態の細胞間もしくは細胞内伝達を抑制することによって、毒性の低下がタウの抗体誘発性食作用の結果として生じ、タウが分子間もしくは分子内凝集するのを抑制するか、または他の分子に結合するのを抑制し得る。このような抗体を誘導する本発明の抗体または薬剤は、アルツハイマー病およびタウと関連する他の疾患の治療法または効果的な予防法において使用できる。
【００５０】
ＩＩ．タウ
文脈から特に明らかな場合を除き、タウへの言及は、翻訳後修飾（例えば、リン酸化、糖化、またはアセチル化）が存在するか否かにかかわらず、全てのアイソフォームを含むヒトのタウの天然型を意味する。ヒトの脳にはタウの６つの主要なアイソフォーム（スプライスバリアント）が生じる。これらの変異型の最長のものは、最初のメチオニン残基が切断された４４１個のアミノ酸を有する。残基は、４４１アイソフォームに従って番号が付けられている。したがって、例えば、位置４０４でのリン酸化への言及は、４４１アイソフォームの位置４０４、または４４１アイソフォームと最大限整列させた場合には任意の他のアイソフォームの対応する位置を意味する。アイソフォームのアミノ酸配列およびスイスプロット番号を以下に示す。
Ｐ１０６３６−８（配列番号１）
【化１】
2020109103.tif 000003
2020109103.tif 000004
2020109103.tif 000005
【００５１】
タウへの言及は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏデータベースおよびその順列に列挙されている約３０個の既知の天然の変化、ならびに認知症、ピック病、核上性麻痺などのタウ病理と関連する変異を含む（例えば、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏデータベースおよびＰｏｏｒｋａｊ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．４３：８１５−８２５（１９９８）を参照されたい）。４４１アイソフォームにより番号付けられたタウ変異のいくつかの例としては、アミノ酸残基２５７におけるリジンからスレオニンへの変異（Ｋ２５７Ｔ）、アミノ酸位置２６０におけるイソロイシンからバリンへの変異（Ｉ２６０Ｖ）、アミノ酸位置２７２におけるグリシンからバリンへの変異（Ｇ２７２Ｖ）、アミノ酸位置２７９におけるアスパラギンからリジンへの変異（Ｎ２７９Ｋ）、アミノ酸位置２９６におけるアスパラギンからヒスチジンへの変異（Ｎ２９６Ｈ）、アミノ酸位置３０１におけるプロリンからセリンへの変異（Ｐ３０１Ｓ）、アミノ酸位置３０３におけるグリシンからバリンへの変異（Ｇ３０３Ｖ）、位置３０５におけるセリンからアスパラギンへの変異（Ｓ３０５Ｎ）、アミノ酸位置３３５におけるグリシンからセリンへの変異（Ｇ３３５Ｓ）、位置３３７におけるバリンからメチオニンへの変異（Ｖ３３７Ｍ）、位置３４２におけるグルタミン酸からバリンへの変異（Ｅ３４２Ｖ）、アミノ酸位置３６９におけるリジンからイソロイシンへの変異（Ｋ３６９Ｉ）、アミノ酸位置３８９におけるグリシンからアルギニンへの変異（Ｇ３８９Ｒ）、位置４０６におけるアルギニンからトリプトファンへの変異（Ｒ４０６Ｗ）が挙げられる。
【００５２】
タウは、アミノ酸位置１８、２９、９７、３１０、および３９４におけるチロシン、アミノ酸位置１８４、１８５、１９８、１９９、２０２、２０８、２１４、２３５、２３７、２３８、２６２、２９３、３２４、３５６、３９６、４００、４０４、４０９、４１２、４１３、および４２２におけるセリン、ならびにアミノ酸位置１７５、１８１、２０５、２１２、２１７、２３１、および４０３におけるスレオニンを含む１個または複数個のアミノ酸残基においてリン酸化できる。
【００５３】
ＩＩＩ．抗体
Ａ．結合特異性および機能特性
本発明は、タウに結合する抗体を提供する。いくつかの抗体は、配列番号１の残基２３〜４６内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、配列番号１の残基２５〜４４内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、配列番号１の２８〜４１内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体、配列番号１の残基３０〜３９内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、配列番号１の残基３０〜３６内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、配列番号１の残基３３〜３９内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、配列番号１の残基３３〜３６内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、配列番号１の残基２８〜３０、２８〜３１、２８〜３２、２８〜３３、２８〜３４、２８〜３５、２８〜３６、２８〜３７、２８〜３８、２８〜３９、２８〜４０、２８〜４１、２９〜３１、２９〜３２、２９〜３３、２９〜３４、２９〜３５、２９〜３６、２９〜３７、２９〜３８、２９〜３９、２９〜４０、２９〜４１、３０〜３２、３０〜３３、３０〜３４、３０〜３５、３０〜３６、３０〜３７、３０〜３８、３０〜３９、３０〜４０、３０〜４１、３１〜３３、３１〜３４、３１〜３５、３１〜３６、３１〜３７、３１〜３８、３１〜３９、３１〜４０、３１〜４１、３２〜３４、３２〜３５、３２〜３６、３２〜３７、３２〜３８、３２〜３９、３２〜４０、３２〜４１、３３〜３５、３３〜３６、３３〜３７、３３〜３８、３３〜３９、３３〜４０、３３〜４１、３４〜３６、３４〜３７、３４〜３８、３４〜３９、３４〜４０、３４〜４１、３５〜３７、３５〜３８、３５〜３９、３５〜４０、３５〜４１、３６〜３８、３６〜３９、３６〜４０、３６〜４１を含むエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体はリン酸化状態に関係なくタウに結合する。いくつかの抗体は、リン酸化の影響を受けやすい残基を含まないエピトープに結合する。これらの抗体は、天然源から精製するかまたは組換え発現させたタウポリペプチドで免疫することにより取得できる。抗体は、非リン酸化型のタウ、およびリン酸化を受けやすい１つもしくは複数の残基がリン酸化された形態のタウへの結合ついてスクリーニングできる。このような抗体は、好ましくは、区別できない親和性で結合するか、または非リン酸化タウと比較してリン酸化タウに少なくとも１．５倍、２倍または３倍の係数の範囲内で結合する（すなわち、「汎特異的である」）。１６Ｂ５は、汎特異的モノクローナル抗体の一例である。本発明はまた、例えば、１６Ｂ５のエピトープなどの上記の抗体のいずれかと同じエピトープに結合する。また、例えば、１６Ｂ５と競合するものなどの上記の抗体のいずれかとタウへの結合について競合する抗体も含まれる。
【００５４】
上記の抗体は、配列番号１の残基２３〜４６、２５〜４４、２８〜３０、２８〜３１、２８〜３２、２８〜３３、２８〜３４、２８〜３５、２８〜３６、２８〜３７、２８〜３８、２８〜３９、２８〜４０、２８〜４１、２９〜３１、２９〜３２、２９〜３３、２９〜３４、２９〜３５、２９〜３６、２９〜３７、２９〜３８、２９〜３９、２９〜４０、２９〜４１、３０〜３２、３０〜３３、３０〜３４、３０〜３５、３０〜３６、３０〜３７、３０〜３８、３０〜３９、３０〜４０、３０〜４１、３１〜３３、３１〜３４、３１〜３５、３１〜３６、３１〜３７、３１〜３８、３１〜３９、３１〜４０、３１〜４１、３２〜３４、３２〜３５、３２〜３６、３２〜３７、３２〜３８、３２〜３９、３２〜４０、３２〜４１、３３〜３５、３３〜３６、３３〜３７、３３〜３８、３３〜３９、３３〜４０、３３〜４１、３４〜３６、３４〜３７、３４〜３８、３４〜３９、３４〜４０、３４〜４１、３５〜３７、３５〜３８、３５〜３９、３５〜４０、３５〜４１、３６〜３８、３６〜３９、３６〜４０、３６〜４１を含むペプチドで免疫するか、または、このような残基を含む全長タウポリペプチドまたはその断片で免疫し、このような残基を含むペプチドへの特異的結合についてスクリーニングすることによって新たに作製できる。このようなペプチドは、好ましくは、ペプチドに対する抗体応答の誘発を促進する異種コンジュゲート分子に結合している。結合は、直接的に、またはスペーサーペプチドもしくはスペーサーアミノ酸を介して行うことができる。遊離ＳＨ基が担体分子の結合を促進するため、システインは、スペーサーアミノ酸として使用される。グリシンとペプチドとの間のシステイン残基の有無に関わらず、ポリグリシンリンカー（例えば、２〜６グリシン）も使用できる。担体分子は、ペプチドに対する抗体応答の誘発を促進するＴ細胞エピトープを提供するのに役立つ。いくつかの担体は、特に、一般的に使用されているキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミンおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。ペプチドスペーサーは、固相ペプチド合成の一部として、ペプチド免疫原に付加できる。担体は、典型的には、化学的架橋によって付加される。使用できる化学架橋剤のいくつかの例としては、クロス−Ｎ−マレイミド−６−アミノカプロイルエステルまたはｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）が挙げられる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．らの抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、１９８８；Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：７７８−７８０（１９８８）；Ｃｈｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：２７−４７（１９９３）；Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７４：１９７−２０３（１９９３）；Ｆａｌｋ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９：２３０−２４２（１９９４）；ＷＯ９８／２３６３５；およびＳｏｕｔｈｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６��：３３６３−３３７３（１９９８）。担体およびスペーサーが存在する場合は、免疫原のいずれかの端部に取り付けることができる。
【００５５】
任意のスペーサーおよび担体を有するペプチドを用いて、以下により詳細に記載するように、実験動物またはＢ細胞を免疫することができる。ハイブリドーマ上清は、配列番号１の残基２４〜４６、２５〜４４、２８〜３０、２８〜３１、２８〜３２、２８〜３３、２８〜３４、２８〜３５、２８〜３６、２８〜３７、２８〜３８、２８〜３９、２８〜４０、２８〜４１、２９〜３１、２９〜３２、２９〜３３、２９〜３４、２９〜３５、２９〜３６、２９〜３７、２９〜３８、２９〜３９、２９〜４０、２９〜４１、３０〜３２、３０〜３３、３０〜３４、３０〜３５、３０〜３６、３０〜３７、３０〜３８、３０〜３９、３０〜４０、３０〜４１、３１〜３３、３１〜３４、３１〜３５、３１〜３６、３１〜３７、３１〜３８、３１〜３９、３１〜４０、３１〜４１、３２〜３４、３２〜３５、３２〜３６、３２〜３７、３２〜３８、３２〜３９、３２〜４０、３２〜４１、３３〜３５、３３〜３６、３３〜３７、３３〜３８、３３〜３９、３３〜４０、３３〜４１、３４〜３６、３４〜３７、３４〜３８、３４〜３９、３４〜４０、３４〜４１、３５〜３７、３５〜３８、３５〜３９、３５〜４０、３５〜４１、３６〜３８、３６〜３９、３６〜４０、３６〜４１を含む１つもしくは複数のペプチドおよび／または、例えば、リン酸化型で位置４０４を有するタウの全長アイソフォームなどのタウのリン酸化型および非リン酸化型に結合する能力について試験され得る。ペプチドは、スクリーニングアッセイを容易にするために、担体または他のタグに結合させることができる。この場合には、タウペプチドよりもむしろスペーサーまたは担体に特異的な抗体を除去するために、担体またはタグは、免疫化のために使用されるスペーサーおよび担体分子の組み合わせよりも優先的に異なる。タウのアイソフォームの全てを使用できる。
【００５６】
選択されたマウス抗体（例えば、１６Ｂ５）の結合特異性を有する抗体はまた、ファージディスプレイ法の変形を用いて産生できる。ＷｉｎｔｅｒのＷＯ９２／２０７９１を参照されたい。この方法は、ヒト抗体を産生するのに特に適している。この方法では、選択されたマウス抗体の重鎖または軽鎖可変領域のいずれかが出発材料として使用される。例えば、軽鎖可変領域を出発物質として選択した場合、ファージライブラリーは、メンバーが同じ軽鎖可変領域（すなわち、マウス出発物質）および異なる重鎖可変領域を提示するように構成されている。重鎖可変領域は、例えば、再配列ヒト重鎖可変領域のライブラリーから得ることができる。所望の標的（例えば、タウペプチド）に強い特異的結合を示すファージ（例えば、少なくとも１０８および好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１）が選択される。その後、このファージ由来の重鎖可変領域は、さらなるファージライブラリーを構築するための出発物質として役立つ。このライブラリーでは、各ファージは、同じ重鎖可変領域（すなわち、第一のディスプレイライブラリーから同定された領域）および異なる軽鎖可変領域を提示する。軽鎖可変領域は、例えば、再配列ヒト可変軽鎖領域のライブラリーから取得できる。ここでも、所望の標的に対して強力な特異的結合を示すファージが選択される。得られた抗体は、通常、マウス出発物質と同一または類似のエピトープ特異性を有する。
【００５７】
他の抗体は、１６Ｂ５などの代表的な抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡの変異誘発によって取得できる。成熟重鎖および／または軽鎖可変領域のアミノ酸配列において１６Ｂ５と少なくとも９０％、９５％または９９％同一であり、その機能特性を保持するモノクローナル抗体、および／または少数の機能的に重要でないアミノ酸置換（例えば、保存的置換）、欠失、もしくは挿入によってそれぞれの抗体とは異なるモノクローナル抗体も本発明に含まれる。カバットによって定義されるような、１６Ｂ５の対応するＣＤＲと９０％、９５％、９９％または１００％同一である少なくとも１つ、好ましくは全６つのＣＤＲ（複数可）を有するモノクローナル抗体も含まれる。
【００５８】
Ｂ．非ヒト抗体
免疫原に対する他の非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス、モルモット、霊長類、ウサギまたはラットの産生は、例えば、上記のように免疫原で動物を免疫することによって行うことができる。Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、抗体、実験室マニュアル（ＣＳＨＰ ＮＹ、１９８８）（全ての目的のために参照により組み込まれる）を参照されたい。このような免疫原は、ペプチド合成または組換え発現によって、天然源から取得できる。
【００５９】
必要に応じて、免疫原はアジュバントと共に投与できる。アジュバントのいくつかの種類は、以下に記載されるように使用できる。完全フロイントアジュバントに続く不完全アジュバントは、実験動物の免疫化に好ましい。ウサギまたはモルモットは、典型的には、ポリクローナル抗体を作製するために使用される。マウスは、典型的には、モノクローナル抗体を作製するために使用される。抗体は、特異的結合についてスクリーニングされ、必要に応じて、抗体はさらに、タウの特定の領域への結合についてスクリーニングされる。このようなスクリーニングは、タウの欠失変異体のコレクションへの抗体の結合を決定し、どの欠失変異体が抗体に結合するかを決定することによって達成できる。結合は、例えば、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ（商標）またはＥＬＩＳＡにより評価できる。
【００６０】
Ｃ．ヒト化抗体
ヒト化抗体は遺伝子操作された抗体であり、非ヒト「ドナー」抗体（例えば、１６Ｂ５）のＣＤＲがヒト「アクセプター」抗体配列に接合されている（例えば、Ｑｕｅｅｎの米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号；Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、Ｃａｒｔｅｒの米国特許第６，４０７，２１３号、Ａｄａｉｒの米国特許第５，８５９，２０５号、同第６，８８１，５５７号、Ｆｏｏｔｅの米国特許第６，８８１，５５７号を参照されたい）。アクセプター抗体の配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、そのような配列の複合体、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、または生殖系列領域の配列であり得る。したがって、ヒト化抗体は、完全にもしくは実質的にドナー抗体由来の一部または全てのＣＤＲ、存在する場合には、完全にもしくは実質的にヒト抗体配列由来の可変領域フレームワーク配列および定常領域を有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、完全にもしくは実質的にドナー抗体重鎖由来の少なくとも１つ、２つ、通常は全３つＣＤＲ、存在する場合には、実質的にヒト重鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列由来の重鎖可変領域フレームワーク配列および重鎖定常領域を有する。同様に、ヒト化軽鎖は、完全にもしくは実質的にドナー抗体軽鎖由来の少なくとも１つ、２つ、通常は全３つＣＤＲ、存在する場合には、実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列由来の軽鎖可変領域フレームワーク配列および軽鎖定常領域を有する。ナノボディおよびｄＡｂ以外に、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体中のＣＤＲは、（カバットの定義により）対応する残基の少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％がそれぞれのＣＤＲ間で同一である場合に、実質的に非ヒト抗体中の対応するＣＤＲに由来する。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、カバットによって定義される対応する残基の少なくとも８５、９０、９５または１００％が同一である場合に、それぞれ実質的にヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域に由来する。
【００６１】
ヒト化抗体は、マウス抗体由来の（好ましくはカバットによって定義されるような）全６つのＣＤＲを包含する場合が多いが、マウス抗体由来の全てのＣＤＲ未満（例えば、少なくとも３、４、または５個のＣＤＲ）でも作製できる（例えば、Ｐａｓｃａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６，２００２；Ｖａｊｄｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３２０：４１５−４２８，２００２；Ｉｗａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１０７９−１０９１，１９９９；Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６４：１４３２−１４４１，２０００）。
【００６２】
いくつかの抗体において、ＣＤＲの一部のみ、すなわち、ＳＤＲと呼ばれる結合に必要なＣＤＲ残基のサブセットは、ヒト化抗体において結合を保持するために必要とされる。抗原に接触せず、ＳＤＲ中に存在しないＣＤＲ残基は、以前の研究に基づいて（例えば、ＣＤＲ Ｈ２中の残基Ｈ６０〜Ｈ６５は必要とされない場合が多い）、コチア超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１，１９８７）の外側にあるカバットＣＤＲの領域から分子モデリングおよび／もしくは経験的に、またはＧｏｎｚａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：８６３，２００４に記載のとおりに同定することができる。このようなヒト化抗体において、１個または複数個のドナーＣＤＲ残基が存在しないか、またはドナーＣＤＲ全体が除去されている位置において、その位置を占めるアミノ酸は、アクセプター抗体配列中の（カバット番号付けによる）対応する位置を占めるアミノ酸であり得る。含めるＣＤＲ中のドナーアミノ酸のためのアクセプターのこのような置換の数は、競合する考慮事項のバランスを反映している。このような置換は、潜在的に、ヒト化抗体中のマウスアミノ酸の数を減少させ、結果として潜在的な免疫原性を減少させる点で都合がよい。しかし、置換はまた親和性の変化を引き起こし得、親和性の有意な減少が好ましくは回避される。ＣＤＲ内の置換の位置および置換するアミノ酸も経験的に選択できる。
【００６３】
ヒトアクセプター抗体配列は、ヒトアクセプター配列の可変領域フレームワークとドナー抗体鎖の対応する可変領域フレームワークとの間に高度な配列同一性（例えば、６５〜８５％の同一性）を提供するために、必要に応じて、多くの既知のヒト抗体配列の中から選択できる。
【００６４】
ヒト可変領域フレームワーク残基の特定のアミノ酸は、ＣＤＲ立体構造および／または抗原への結合に対するそれらの可能性のある影響に基づく置換について選択できる。このような可能性のある影響の研究は、モデリング、特定の位置でのアミノ酸の特徴の検査、または特定のアミノ酸の置換もしくは変異誘発の効果の経験的観察によるものである。
【００６５】
例えば、アミノ酸がマウス可変領域フレームワーク残基と選択したヒト可変領域フレームワーク残基との間で異なる場合、ヒトフレームワークアミノ酸は、マウス抗体の等価のフレームワークアミノ酸によって置換でき、その際、アミノ酸が、
（１）非共有結合で直接抗原と結合する、
（２）ＣＤＲ領域に隣接している、
（３）そうでなければ、ＣＤＲ領域と相互作用する（例えば、ＣＤＲ領域の約６Å内である）、（例えば、相同な既知免疫グロブリン鎖の解析された構造上で軽鎖または重鎖をモデリングすることにより識別される）、かつ
（４）ＶＬ−ＶＨ界面に関与する残基である、
ことは合理的に予想される。
【００６６】
Ｑｕｅｅｎの米国特許第５，５３０，１０１号によって定義されるとおり、クラス（１）〜（３）のフレームワーク残基は、交互にカノニカルおよびバーニア（ｖｅｒｎｉｅｒ）残基と呼ばれることもある。ＣＤＲループの立体構造を決定するドナーＣＤＲループのカノニカルクラスを定義するフレームワーク残基は、カノニカル残基と呼ばれることもある（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１−９１７（１９８７），Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ＆ Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６３，８００−８１５，１９９６）。抗原に対する抗体の適合を微調整する役割を果たす抗原結合ループの立体構造を支持するフレームワーク残基の層は、バーニア残基と呼ばれることもある（Ｆｏｏｔｅ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ，１９９２，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏ．２２４，４８７−４９９）。置換の他の候補は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す残基である。置換の他の候補は、ヒト免疫グロブリンにとってその位置に珍しいアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー抗体の等価位置のアミノ酸またはより典型的なヒト免疫グロブリンの等価位置のアミノ酸で置換できる。置換の他の候補は、ヒト免疫グロブリンにとってその位置に珍しいアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。
【００６７】
本発明は、マウス１６Ｂ５抗体のヒト化型を提供する。マウス抗体は、配列番号１０および１６をそれぞれ含むアミノ酸配列を有する成熟重鎖および軽鎖の可変領域を含む。本発明は、１つの代表的なヒト化成熟重鎖可変領域（Ｈ１）および３つの代表的なヒト化成熟軽鎖可変領域（Ｌ１、Ｌ２およびＬ３）を提供する。Ｈ１Ｌ２変異型は、キメラ１６Ｂ５と同じまたはより良好な親和性および７個の復帰突然変異を有する。Ｈ１Ｌ１およびＨ１Ｌ３は、キメラ１６Ｂ５と同様の親和性および６個の復帰突然変異を有する。
【００６８】
本発明は、ヒト化成熟重鎖可変領域が配列番号１５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を示し、ヒト化成熟軽鎖成熟可変領域が配列番号２２と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示すＨ１Ｌ２ヒト化１６Ｂ５抗体の変異型を提供する。好ましくは、このような抗体において、Ｈ１Ｌ２内の復帰突然変異の一部または全てが保持される。すなわち、少なくとも１、２、または３個の位置において、位置Ｈ１３はＫが占有し、位置Ｈ４８はＭが占有し、かつ位置Ｈ９１はＦが占有している。好ましくは、少なくとも１、２、３または４個の全ての位置において、位置Ｌ１はＮが占有し、位置Ｌ４はＬが占有し、位置Ｌ３６はＦが占有し、かつ位置Ｌ４３はＳが占有している。このようなヒト化抗体のＣＤＲ領域は、好ましくは、Ｈ１Ｌ２のＣＤＲ領域と同一または実質的に同一であり、マウスドナー抗体のものと同じである。ＣＤＲ領域は、任意の従来の定義（例えば、コチア）によって定義できるが、好ましくはカバットによって定義されるようなものである。
【００６９】
１６Ｂ５変異型における追加の変化の１つの可能性は、可変領域フレームワークにおける追加の復帰突然変異である。ヒト化ｍＡｂ中のＣＤＲと接触しないフレームワーク残基の多くは、ドナーマウスｍＡｂまたは他のマウスもしくはヒトの抗体の対応する位置のアミノ酸の置換に順応でき、さらに多くの潜在的なＣＤＲ接触残基もまた置換の影響を受けやすいか、またはＣＤＲ内のアミノ酸でさえ、例えば、可変領域フレームワークを提供するために使用されるヒトアクセプター配列の対応する位置に見られる残基で変更されてもよい。さらに、例えば、重鎖および／または軽鎖について、別のヒトアクセプター配列が使用できる。異なるアクセプター配列が使用される場合、対応するドナーおよびアクセプター残基はすでに復帰突然変異を含まない同じものであるため、上記で推奨する復帰突然変異のうちの１つまたは複数は実行されなくてもよい。例えば、位置Ｈ１３がすでにＫによって占有されている重鎖アクセプター配列を用いる場合、復帰突然変異は必要ではない。
【００７０】
本発明はまた、成熟軽鎖および重鎖可変領域が、ヒト化１６Ｂ５  Ｈ１Ｌ１抗体の成熟軽鎖および重鎖可変領域（それぞれ配列番号２１および１５）またはヒト化１６Ｂ５  Ｈ１Ｌ３抗体（それぞれ配列番号２３および１５）と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を示すヒト化抗体も含む。
【００７１】
Ｄ．キメラ抗体およびベニヤ抗体
本発明はさらに、非ヒト抗体、特に、１６Ｂ５抗体のキメラおよびベニヤ型を提供する。
【００７２】
キメラ抗体は、非ヒト抗体（例えば、マウス）の軽鎖および重鎖の成熟可変領域をヒト軽鎖および重鎖定常領域と組み合わせた抗体である。このような抗体は、実質的にまたは完全にマウス抗体の結合特異性を保持し、ヒト配列の約２／３である。
【００７３】
ベニヤ抗体は、ＣＤＲのいくつかおよび通常は全てならびに非ヒト抗体の非ヒト可変領域フレームワーク残基の一部を保持しているが、Ｂ−細胞エピトープまたはＴ−細胞エピトープ、例えば、露出した残基（Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９，１９９１）に寄与し得る他の可変領域フレームワーク残基がヒト抗体配列の対応する位置の残基と置換されているヒト化抗体の一種である。その結果、ＣＤＲが完全にまたは実質的に非ヒト抗体に由来し、非ヒト抗体の可変領域フレームワークが置換によってよりヒト様に作られた抗体が得られる。１６Ｂ５抗体のいずれかのベニヤ型は本発明に含まれる。
【００７４】
Ｅ．ヒト抗体
タウに対するヒト抗体は、以下に記載の様々な技術によって提供される。ヒト抗体を産生するための方法には、Ｏｅｓｔｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２：３６１−３６７（１９８３）；Ｏｅｓｔｂｅｒｇの米国特許第４，６３４，６６４号、およびＥｎｇｌｅｍａｎらの米国特許第４，６３４，６６６号のトリオーマ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスの使用（例えば、ＬｏｎｂｅｒｇらのＷＯ９３／１２２２７（１９９３）；米国特許第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号、同第５，８１４，３１８号、同第５，７８９，６５０号、同第５，７７０，４２９号、同第５，６６１，０１６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，５４５，８０６号、Ｎａｔｕｒｅ  １４８，１５４７−１５５３（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８２６（１９９６），Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、ＷＯ９１／１０７４１（１９９１）を参照されたい）ならびにファージディスプレイ法（例えば、ＤｏｗｅｒらのＷＯ９１／１７２７１およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらのＷＯ９２／０１０４７、米国特許第５，８７７，２１８号、同第５，８７１，９０７号、同第５，８５８，６５７号、同第５，８３７，２４２号、同第５，７３３，７４３号および同第５，５６５，３３２号を参照されたい）が含まれる。
【００７５】
Ｆ．定常領域の選択
キメラ抗体、（ベニヤ抗体を含む）ヒト化抗体、またはヒト抗体の重鎖および軽鎖の可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部に連結できる。定常領域の選択は、ある程度、抗体依存性補体および／または細胞媒介性細胞傷害が所望されるか否かに依存する。例えば、ヒトアイソタイプのＩｇＧ１およびＩｇＧ３は補体媒介細胞傷害を有するが、ヒトアイソタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４は、補体媒介細胞傷害をほとんどまたは全く有していない。軽鎖定常領域は、ラムダまたはカッパであり得る。抗体は、２つの軽鎖および２つの重鎖を含む四量体として、別々の重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖとして、または重鎖および軽鎖の可変領域がスペーサーを介して連結されている一本鎖抗体として発現させることができる。
【００７６】
ヒト定常領域は、異なる個人間でアロタイプ変異およびイソアロタイプ変異を示す。すなわち、定常領域は、１つまたは複数の多型位置で別々の個人において異なり得る。イソアロタイプは、イソアロタイプを認識する血清が１つまたは複数の他のアイソタイプの非多型領域に結合する点で、アロタイプとは異なる。ヒト定常領域への言及は、任意の天然のアロタイプもしくは天然のアロタイプ中の多型位置を占める残基の任意の順列または以下に記載のエフェクター機能を減少または増加させるための最大で３、５もしくは１０個の置換を有する定常領域を含む。
【００７７】
重鎖のＣ末端リジンなどの軽鎖および／または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端における１つまたはいくつかのアミノ酸は、分子の一部または全てを欠損していても、または誘導体化されていてもよい。置換は、補体媒介性細胞傷害もしくはＡＤＣＣなどのエフェクター機能を低減または増加させるために（例えば、Ｗｉｎｔｅｒらの米国特許第５，６２４，８２１号、Ｔｓｏらの米国特許第５，８３４，５９７号、およびＬａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：４００５，２００６を参照されたい）、またはヒトにおける半減期を延長するために定常領域で行われ得る（例えば、Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６２１３，２００４を参照されたい）。抗体の半減期を増加させるための代表的な置換には、位置２５０におけるＧｌｎおよび／または位置４２８におけるＬｅｕが含まれる（定常領域のＥＵナンバリングがこの段落で使用される）。位置２３４、２３５、２３６および／もしくは２３７のいずれかまたは全ての置換は、Ｆｃγ受容体、特に、ＦｃγＲＩ受容体の親和性を低下させる（例えば、米国特許第６，６２４，８２１号を参照されたい）。ヒトＩｇＧ１の位置２３４、２３５および２３７でのアラニン置換は、エフェクター機能を低下させるのに好ましい。必要に応じて、ヒトＩｇＧ２中の２３４、２３６および／または２３７はアラニンと置換され、位置２３５はグルタミンと置換されている（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号を参照されたい）。
【００７８】
Ｇ．組換え抗体の発現
キメラ抗体、（ベニヤを含む）ヒト化抗体およびヒト抗体は、典型的には、組換え発現によって産生される。抗体をコードする核酸は、所望の細胞型（例えば、ＣＨＯまたはＳｐ２／０）での発現のためにコドン最適化できる。本明細書に開示されるヒト化１６Ｂ５重鎖および軽鎖の可変領域をコードする核酸は、例えば、（Ｈｕ１６Ｂ５ Ｈ１をコードする）配列番号２５、（Ｈｕ１６Ｂ５ Ｌ１をコードする）配列番号２６、（Ｈｕ１６Ｂ５ Ｌ２をコードする）配列番号２７、または（Ｈｕ１６Ｂ５ Ｌ３をコードする）配列番号２８を含むかまたはそれらからなる配列を有する。配列番号１０および１６などのシグナルペプチドを含む可変領域については、核酸は、シグナルペプチドの有無にかかわらず、可変領域をコードすることができる。重鎖および軽鎖をコードする核酸セグメントは、同一の連続した核酸分子上または別々の分子上に存在できる。重鎖および軽鎖は、同一のベクターまたは異なるベクターから発現させることができる。核酸は、典型的には、単離された形態で提供される。
【００７９】
ヒト化１６Ｂ５重鎖可変領域をコードする核酸は、例えば、配列番号３０の配列を有する、ヒトＩｇＧ１定常領域をコードする核酸セグメントに連結できる。このような核酸はまた、重鎖可変領域をコードするセグメントとＩｇＧ１定常領域をコードするセグメントの間、すなわち、定常領域をコードするセグメントの５’側に位置するイントロンも含むことができる。ヒトＩｇＧ１定常領域をコードし、その５’末端にマウスイントロンを有する代表的な核酸配列を配列番号３１に示す。
【００８０】
ヒト化１６Ｂ５軽鎖可変領域をコードする核酸は、例えば、配列番号３３の配列を有するヒトκ定常領域をコードする核酸セグメントに連結できる。このような核酸はまた、軽鎖可変領域をコードするセグメントとκ定常領域をコードするセグメントの間（すなわち、κ定常領域の５’側）にイントロンを含むこともできる。ヒトκ定常領域をコードし、その５’末端にヒトイントロンを有する代表的な核酸配列を配列番号３４に示す。
【００８１】
組換えポリヌクレオチド構築物は、典型的には、天然に関連するまたは異種のプロモーター領域を含む抗体鎖のコード配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクター中の真核生物プロモーター系である。ベクターが適切な宿主に組み込まれた後、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現、ならびに交差反応抗体の収集および精製に適する条件下で維持される。抗体鎖をコードするベクター（複数可）はまた、抗体鎖をコードする核酸のコピー数の増幅を可能にするために、ジヒドロ葉酸還元酵素またはグルタミン合成酵素などの選択可能な遺伝子を含むこともできる。
【００８２】
大腸菌は、抗体、特に、抗体断片を発現させるのに特に有用な原核生物宿主である。酵母などの微生物も発現に有用である。サッカロミセス属は、必要に応じて、発現制御配列、複製起点、および終止配列などを有する適切なベクターを有する好ましい酵母宿主である。代表的なプロモーターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の糖分解酵素が含まれる。誘導性酵母プロモーターには、とりわけ、アルコール脱水素酵素、イソチトクロームＣ、およびマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーターが含まれる。
【００８３】
哺乳動物細胞は、免疫グロブリンまたはその断片をコードするヌクレオチドセグメントを発現するための好ましい宿主である。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、遺伝子からクローンへ（Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ（ＶＣＨ出版社、ニューヨーク、１９８７））を参照されたい。インタクトな異種タンパク質を分泌することができるいくつかの適切な宿主細胞株は、当技術分野において開発されており、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ細胞、ならびにＳＰ２／０およびＮＳ０を含む非抗体産生骨髄腫を含む。好ましくは、細胞は非ヒトである。これらの細胞用の発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサーなどの発現制御配列（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列などの必要な情報処理部位を含むことができる。好ましい発現制御配列は、内因性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、およびウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照されたい。
【００８４】
細胞培養物中に抗体の重鎖および軽鎖をコードするベクター（複数可）を導入し、無血清培地中で成長生産性および製品品質について細胞プールをスクリーニングできる。その後、トップの産生細胞プールをＦＡＣＳベースの単一細胞クローニングに供し、モノクローナル株を作製できる。７.５ｇ／Ｌ超の培養物の製品力価に相当する、一日あたり細胞あたり５０ｐｇまたは１００ｐｇを上回る比生産性が好ましい。単一細胞クローンが産生する抗体はまた、濁度、濾過特性、ＰＡＧＥ、ＩＥＦ、ＵＶスキャン、ＨＰ−ＳＥＣ、炭水化物−オリゴ糖マッピング、質量分析、およびＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅ社などの結合アッセイについて試験され得る。その後、選択されたクローンは、複数のバイアルに入れ、後の使用のために凍結保存され得る。
【００８５】
発現させると、抗体は、プロテインＡ捕捉、カラムクロマトグラフィー（例えば、疎水性相互作用またはイオン交換）、およびウイルス不活性化のための低ｐＨなどを含む、当技術分野の標準的な手順に従って精製できる（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ ＰｕｒｉｆｉｃａＴｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９８２）を参照されたい）。
【００８６】
コドン最適化、プロモーターの選択、転写要素、およびターミネーター、無血清の単一細胞クローニング、細胞バンク、コピー数の増幅のための選択マーカーの使用、ＣＨＯターミネーター、無血清単一細胞クローニング、タンパク質力価の改善を含む抗体の商業生産のための方法論を用いることができる（例えば、米国特許第５，７８６，４６４号、同第６，１１４，１４８号、同第６，０６３，５９８号、同第７，５６９，３３９号、ＷＯ２００４／０５０８８４、ＷＯ２００８／０１２１４２、ＷＯ２００８／０１２１４２、ＷＯ２００５／０１９４４２、ＷＯ２００８／１０７３８８、およびＷＯ２００９／０２７４７１、ならびに米国特許第５，８８８，８０９号を参照されたい）。
【００８７】
ＩＶ．能動免疫原
能動免疫に使用される薬剤は、上記の受動免疫に関連して説明した同じ種類の抗体を患者に誘導するのに役立つ。能動免疫に使用される薬剤は、実験動物内でモノクローナル抗体を生成するために使用される同じ種類の免疫原、例えば、配列番号１の残基２３〜４６、２５〜４４、２８〜４１または３０〜３９に対応するタウの領域由来の３〜１５もしくは３〜１２もしくは５〜１２、または５〜８個の連続アミノ酸のペプチド、例えば、配列番号１の残基２８〜３０、２８〜３１、２８〜３２、２８〜３３、２８〜３４、２８〜３５、２８〜３６、２８〜３７、２８〜３８、２８〜３９、２８〜４０、２８〜４１、２９〜３１、２９〜３２、２９〜３３、２９〜３４、２９〜３５、２９〜３６、２９〜３７、２９〜３８、２９〜３９、２９〜４０、２９〜４１、３０〜３２、３０〜３３、３０〜３４、３０〜３５、３０〜３６、３０〜３７、３０〜３８、３０〜３９、３０〜４０、３０〜４１、３１〜３３、３１〜３４、３１〜３５、３１〜３６、３１〜３７、３１〜３８、３１〜３９、３１〜４０、３１〜４１、３２〜３４、３２〜３５、３２〜３６、３２〜３７、３２〜３８、３２〜３９、３２〜４０、３２〜４１、３３〜３５、３３〜３６、３３〜３７、３３〜３８、３３〜３９、３３〜４０、３３〜４１、３４〜３６、３４〜３７、３４〜３８、３４〜３９、３４〜４０、３４〜４１、３５〜３７、３５〜３８、３５〜３９、３５〜４０、３５〜４１、３６〜３８、３６〜３９、３６〜４０、３６〜４１を含むペプチドであり得る。１６Ｂ５と同じまたは重複するエピトープに結合する抗体を誘導するために、これらの抗体のエピトープ特異性を（例えば、タウにわたる一連の重複ペプチドへの結合を試験することによって）マッピングできる。その後、エピトープからなるかまたはそれを含むもしくは重複するタウの断片を免疫原として使用できる。このような断片は、典型的には、リン酸化されていない形態で使用される。
【００８８】
異種担体およびアジュバントは、用いる場合、モノクローナル抗体を生成するために使用されるものと同じであってもよいが、ヒトにおける使用のためにより良い医薬適合性について選択されてもよい。適切な担体には、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、またはジフテリア（例えば、ＣＲＭ１９７）、大腸菌、コレラ、もしくはＨ．ピロリなどの他の病原性細菌由来のトキソイド、または弱毒化毒素誘導体が含まれる。Ｔ細胞エピトープも好適な担体分子である。一部のコンジュゲートは、免疫刺激性ポリマー分子（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリンシステイン（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）、マンナン（マンノースポリマー）、またはグルカン（ａβ１→２ポリマー））、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βペプチド、ＩＬ−２、γ−ＩＮＦ、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ）、およびケモカイン（例えば、ＭＩＰ１−αおよびＭＩＰ１−β、ならびにＲＡＮＴＥＳ）に本発明の薬剤を連結することにより形成できる。免疫原は、スペーサーアミノ酸（例えば、ｇｌｙ−ｇｌｙ）の有無に関わらず担体に連結してもよい。さらなる担体にはウイルス様粒子が含まれる。偽ビリオンまたはウイルス由来粒子とも呼ばれるウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、複数コピーのウイルスキャプシドおよび／または定義される球対称のＶＬＰ内でインビボで自己集合可能なエンベロープタンパク質で構成されるサブユニット構造を示す（Ｐｏｗｉｌｌｅｉｔ，ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２（５）：ｅ４１５．）。もう１つの方法として、ペプチド免疫原を、パンＤＲエピトープ（「ＰＡＤＲＥ」）などのＭＨＣクラスＩＩ分子の大部分に結合可能な少なくとも１つの人工Ｔ細胞エピトープに連結できる。ＰＡＤＲＥは、米国特許第５，７３６，１４２号、ＷＯ９５／０７７０７、およびＡｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１：７５１−７６１（１９９４）に記載されている。能動免疫原は、複数コピーの免疫原および／またはその担体が単一共有結合分子として提示される多量体形態で存在できる。
【００８９】
断片は、薬学的に許容できるアジュバントと共に投与される場合が多い。アジュバントは、ペプチドが単独で使用された場合の状況に比べて、誘導された抗体の力価および／または誘導された抗体の結合親和性を増加させる。様々なアジュバントは、免疫応答を誘発するためにタウの免疫原性断片と組み合わせて使用できる。好ましいアジュバントは、応答の質的な形態に影響を与える免疫原の立体構造変化を引き起こすことなく、免疫原に対する固有の応答を増大させる。好ましいアジュバントには、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（商標））（ＧＢ２２２０２１１（ＲＩＢＩ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、モンタナ州ハミルトン、現在はコリキサの一部を参照されたい）が含まれる。Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１は、南米で見つかったキラヤ・サポナリア・モリナの樹皮から単離されるトリテルペングリコシドすなわちサポニンである（Ｋｅｎｓｉｌら、ワクチンデザイン（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ）：サブユニットおよびアジュバントアプローチ（Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ（編）、ニューヨーク州プレナム・プレス、１９９５）；米国特許第５，０５７，５４０号）、（Ａｑｕｉｌａ ＢｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、マサチューセッツ州フレーミングハム；現在はＡｎｔｉｇｅｎｉｃｓ社、ニューヨーク州ニューヨークを参照されたい）。他のアジュバントは、場合により、モノホスホリル脂質Ａなどの免疫刺激剤（Ｓｔｏｕｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６，８６−９１（１９９７))と組み合わせた（スクアレンまたはピーナッツ油などの）水中油型エマルジョン、プルロニックポリマー、および死滅させたマイコバクテリアである。リビアジュバントは、水中油型エマルジョンである。リビは、Ｔｗｅｅｎ８０を含む生理食塩水で乳化した代謝可能な油（スクアレン）を含む。リビはまた、免疫賦活剤として機能する精製されたマイコバクテリア生成物および細菌モノホスホリル脂質Ａも含む。別のアジュバントはＣｐＧ（ＷＯ９８／４０１００）である。アジュバントは、活性剤と共に治療組成物の成分として投与されるか、または別々に治療薬の投与前、それと同時、もしくはその後に投与され得る。
【００９０】
タウに対する抗体を誘導するタウの天然断片の類似体も使用できる。例えば、１つもしくは複数または全てのＬ−アミノ酸は、そのようなペプチド中のＤ−アミノ酸と置換できる。また、アミノ酸の順序は逆にすることができる（レトロペプチド）。必要に応じて、ペプチドは、逆の順序で全てのＤ−アミノ酸を含む（レトロインベルソペプチド）。ペプチドおよび他の化合物は、タウペプチドと顕著なアミノ酸配列類似性を必ずしも有する必要はないが、それにもかかわらず、タウペプチドの模倣体として機能し、同様の免疫応答を誘発する。上記のようにタウのモノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体も使用できる。このような抗Ｉｄ抗体は、抗原を模倣し、それに対する免疫応答をもたらす（最も重要な免疫学（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｒｏｉｔ（編）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ出版社、カリフォルニア州パロアルト、第６版、１８１ページを参照されたい）。
【００９１】
ペプチド（および必要に応じてペプチドに融合された担体）はまた、ペプチドをコードする核酸の形態で投与して、患者の体内で発現させることができる。免疫原をコードする核酸セグメントは、典型的には、患者の意図する標的細胞内でＤＮＡセグメントの発現を可能にするプロモーターおよびエンハンサーなどの調節エレメントに連結されている。免疫応答の誘導に望ましいような、血液細胞中での発現には、軽鎖または重鎖免疫グロブリン遺伝子のプロモーターおよびエンハンサーエレメントまたはＣＭＶ主要最初期プロモーターおよびエンハンサーが発現を指示するのに適している。連結された調節エレメントおよびコード配列は、ベクターにクローニングされる場合が多い。抗体はまた、抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸の形態で投与できる。重鎖および軽鎖の両方が存在する場合、鎖は好ましくは、一本鎖抗体として連結される。受動的投与のための抗体はまた、例えば、ペプチド免疫原で治療した患者の血清からアフィニティークロマトグラフィーにより調製できる。
【００９２】
ＤＮＡは裸の形態で（すなわち、コロイド状またはカプセル化材料なしで）送達できる。あるいは、レトロウイルス系（例えば、Ｌａｗｒｉｅ ａｎｄ Ｔｕｍｉｎ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３，１０２−１０９（１９９３）参照）；アデノウイルスベクター（例えば、Ｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，５９１１（１９９３）参照）；アデノ随伴ウイルスベクター（例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９，１８６７（１９９４）参照）；ワクシニアウイルスおよびトリのポックスウイルスを含むポックスファミリーのウイルスベクター、シンドビスおよびセムリキ森林ウイルス由来のものなどのアルファウイルス属のウイルスベクター（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，５０８−５１９（１９９６）参照）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（米国特許第５，６４３，５７６号参照）および水疱性口内炎ウイルスなどのラブドウイルス（ＷＯ９６／３４６２５参照）ならびにパピローマウイルス（Ｏｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６，３２５−３３３（１９９５）；ＷｏｏらのＷＯ９４／１２６２９およびかけるＸｉａｏ ＆ Ｂｒａｎｄｓｍａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２４，２６３０−２６２２（１９９６））を含むいくつかのウイルスベクター系が使用できる。
【００９３】
免疫原をコードするＤＮＡ、またはそれを含有するベクターは、リポソームにパッケージすることができる。適切な脂質および関連類似体は、米国特許第５，２０８，０３６号、同第５，２６４，６１８号、同第５，２７９，８３３号および同第５，２８３，１８５号によって記載されている。免疫原をコードするベクターおよびＤＮＡはまた、微粒子担体に吸着または結合させることもでき、その例として、ポリメチルメタクリレートポリマーおよびポリラクチドならびにポリ（ラクチド−コ−グリコリド）が挙げられる（例えば、ＭｃＧｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏ Ｅｎｃａｐ．１９９６を参照されたい）。
【００９４】
Ｖ．スクリーニング法
上記のように、抗体は、最初に意図した結合特異性についてスクリーニングされ得る。能動免疫原は、同様に、そのような結合特異性を有する抗体を誘導する能力についてスクリーニングされ得る。この場合、能動免疫原を用いて実験動物を免疫し、得られた血清を適切な結合特異性について試験する。
【００９５】
その後、所望の結合特異性を有する抗体は、細胞および動物モデルで試験できる。このようなスクリーニングに使用される細胞は、優先的に神経細胞である。神経芽腫細胞が、必要に応じて、タウ病理と関連する変異と共にタウの４リピートドメインでトランスフェクトされたタウ病理の細胞モデルが報告されている（例えば、デルタＫ２８０）、Ｋｈｌｉｓｔｕｎｏｖａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４，５４４−５４６（２００７）。別のモデルでは、タウは、ドキシサイクリンを添加することにより神経芽細胞腫Ｎ２ａ細胞株において誘導される。この細胞モデルは、可溶性または凝集状態で細胞に対するタウの毒性、タウ遺伝子発現のスイッチをオンにした後のタウ凝集体の外観、再び遺伝子発現のスイッチをオフにした後のタウ凝集体の溶解、ならびにタウ凝集体の形成抑制またはそれらを脱凝集させることにおける抗体の効率を研究するのを可能する。
【００９６】
抗体または能動免疫原はまた、タウと関連する疾患のトランスジェニック動物モデルにおいてスクリーニングできる。このようなトランスジェニック動物は、タウ導入遺伝子（例えば、ヒトアイソフォームのいずれか）および必要に応じて、とりわけタウ、アポＥ、プレセニリンまたはα−シヌクレインをリン酸化するキナーゼなどのヒトＡＰＰ導入遺伝子を含み得る。このようなトランスジェニック動物は、タウと関連する疾患の少なくとも１つの徴候または症状を発症するように治療されている。
【００９７】
代表的なトランスジェニック動物は、マウスのＫ３株である（Ｉｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５（４１）：１５９９７−６００２（２００８））。これらのマウスは、Ｋ３６９Ｉ変異（この変異はピック病と関連している）およびＴｈｙ１.２プロモーターを有するヒトタウ導入遺伝子を有する。このモデルは、神経変性、運動障害ならびに求心性繊維および小脳顆粒細胞の変性の迅速な経過を示す。別の代表的な動物は、マウスのｐＲ５株である。これらのマウスは、Ｐ３０１Ｌ変異（この変異は前頭側頭型認知症と関連している）およびＴｈｙ１.２プロモーターを有するヒトタウ導入遺伝子を有する（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｎ．Ｙ．，Ｌｅｗｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２５：４０２−４０５（２０００））。これらのマウスは、神経変性のより緩やかな経過を有する。このマウスは、いくつかの脳領域および脊髄における神経原線維変化を発症し、これは本明細書にその全体が参照により組み込まれる。これは、凝集体の発症の結果を研究するため、かつこれらの凝集体の生成を抑制することができる治療法をスクリーニングするための優れたモデルである。これらの動物の別の利点は、病変の比較的早期発症である。ホモ接合系統では、タウ病理と関連する行動異常は、少なくとも、早ければ３ヶ月目に観察できるが、これらの動物は少なくとも生後８ヶ月まで比較的健康を維持する。つまり、８ヶ月の時点で、これらの動物は歩き回り、それら自体で摂食し、治療効果の監視を可能にするのに十分なほど行動タスクを実行できる。６〜１３ヶ月間、これらのマウスをＡＩ ｗＩ ＫＬＨ−ＰＨＦ−１で能動免疫すると、約１，０００の力価を生じさせ、未治療の対照マウスと比較して神経原線維変化はほとんど少なく、ｐＳｅｒ４２２も、体重減少も低下した。
【００９８】
抗体または活性剤の活性は、総タウまたはリン酸化タウの量の減少、Αβのアミロイド沈着物などの他の病理学的特徴の減少、および抑制もしくは遅延または行動障害を含む様々な基準によって評価できる。能動免疫原はまた、血清中の抗体の誘導について試験され得る。受動と能動の両方の免疫原は、トランスジェニック動物の血液脳関門から脳内への抗体の通過について試験され得る。抗体または抗体を誘発する断片はまた、天然または誘導を介してタウを特徴とする疾患の症状を発症する非ヒト霊長類において試験され得る。抗体または活性剤の試験は、通常、抗体または活性剤が存在しない（例えば、ビヒクルで置き換えられる）ことを除いて並列に行われる対照実験と同時に実行される。その後、試験中の抗体または活性剤に起因する疾患の徴候または症状の減少、遅延または抑制が対照と比較して評価され得る。
【００９９】
ＶＩ．治療に適する患者
神経原線維変化の存在は、アルツハイマー病、ダウン症候群、軽度認知障害、脳炎後のパーキンソニズム、外傷後の認知症もしくはパンチドランカー、Ｃ型ニーマン・ピック病、核上性麻痺、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、筋萎縮性側索硬化症／グアムのパーキンソン認知症症候群、およびＰＳＰ進行性核上性麻痺を含むいくつかの疾患において見出されている。本投与計画はまた、これらの疾患のいずれかの治療または予防にも使用できる。神経疾患および病状とタウの間の広範囲に及ぶ関係のために、本投与計画は、神経疾患のない個人の平均値と比較して、（例えば、ＣＳＦ内の）タウもしくはリン酸化タウのレベルの上昇を示す任意の対象の治療または予防に使用できる。本投与計画は、神経疾患と関連するタウの変異を有する個人における神経疾患の治療または予防にも使用できる。本方法は、アルツハイマー病、および特に患者における治療または予防に特に適している。
【０１００】
治療に適する患者は、疾患のリスクはあるが、症状を示さない個人および現在症状を示す患者を含む。疾患のリスクのある患者には、疾患の既知の遺伝的リスクを有する患者が含まれる。このような個人には、この疾患を経験している親類を有する患者、およびそのリスクが遺伝子マーカーまたは生化学的マーカーの分析によって決定される患者が含まれる。リスクの遺伝子マーカーには、上述したものなどのタウの変異、ならびに神経疾患と関連する他の遺伝子の変異が含まれる。例えば、ホモ接合型はもちろんだがヘテロ接合型のＡｐｏＥ４対立遺伝子は、アルツハイマー病のリスクと関連している。アルツハイマー病のリスクの他のマーカーは、ＡＰＰ遺伝子の変異、特に７１７位での変異を含み、位置６７０および６７１での変異はそれぞれハーディ変異およびスウェーデン変異と呼ばれ、プレセニリン遺伝子のＰＳ１およびＰＳ２の変異は、ＡＤ、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化症の家族歴に関係する。現在アルツハイマー病に罹患している個人は、特徴的な認知症、および上述の危険因子の存在から、ＰＥＴイメージングによって認識できる。さらに、いくつかの診断テストは、ＡＤを有する個人を同定するために利用可能である。これらには、ＣＳＦタウまたはリン酸化タウおよびΑβ４２レベルの測定が含まれる。タウまたはリン酸化タウのレベルの上昇およびΑβ４２レベルの低下は、ＡＤの存在を意味する。いくつかの変異はパーキンソン病と関連する。Ａｌａ３０ＰｒｏもしくはＡｌａ５３、またはロイシンリッチリピートキナーゼのＰＡＲＫ８などの他の遺伝子の変異は、パーキンソン病と関連する。個人はまた、ＤＳＭ ＩＶ ＴＲの基準によって、上述の神経疾患のいずれかを用いて診断され得る。
【０１０１】
無症状の患者では、治療は全ての年齢（例えば、１０、２０、３０）で開始できる。しかし、通常、患者が４０、５０、６０または７０歳に達するまでは治療を開始する必要はない。治療は、典型的には、ある期間にわたって複数回投与を必要とする。治療は、経時的に抗体レベルをアッセイすることにより監視できる。応答が低下した場合は、追加免疫用量が示される。潜在的なダウン症候群患者の場合には、母親に治療薬を投与することによって治療を出生前に開始するか、または出生直後に開始できる。
【０１０２】
ＶＩＩ．医薬組成物および治療法
予防的適用では、抗体もしくは抗体を誘導するための薬剤またはその医薬組成物は、疾患（例えば、アルツハイマー病）の影響を受けやすい患者、またはそうでなければ疾患のリスクのある患者に、疾患のリスクを低減する、疾患の重症度を軽減する、または疾患の少なくとも１つの徴候もしくは症状の発症を遅延させるのに有効な投与計画（投与の用量、頻度および経路）で投与される。特に、投与計画は、好ましくは脳内でタウもしくはリン酸化タウおよびそれから形成される対のフィラメントを抑制もしくは遅延させるか、かつ／またはその毒性作用を抑制もしくは遅延させるか、かつ／または行動障害の発症を抑制もしくは遅延させるのに有効である。治療用途では、抗体または抗体を誘発する薬剤は、疾患の少なくとも１つの徴候または症状の改善または少なくともさらなる悪化を抑制するのに効果的な投与計画（投与の用量、頻度および経路）で疾患（例えば、アルツハイマー病）の疑いのある患者、または既に疾患に罹患している患者に投与される。特に、この投与計画は、好ましくは、タウ、リン酸化タウ、もしくはそれから形成される対のフィラメントのレベルのさらなる上昇、関連する毒性および／または行動障害を低減または少なくとも抑制するのに効果的である。
【０１０３】
個々の治療された患者が、本発明の方法によって治療されない同等の患者の対照集団における平均的な治療成績よりも良好な治療成績を達成した場合、または比較臨床試験（例えば、フェーズＩＩ、フェーズＩＩ／ＩＩＩまたはフェーズＩＩＩ試験）で、対照患者に対する治療患者のより良好な治療成績がｐ＜０.０５または０.０１、あるいはさらに０.００１のレベルで示される場合には、投与計画は治療的または予防的に有効であると考えられる。
【０１０４】
投与手段、標的部位、患者の生理的状態などの多くの異なる要因、患者がＡｐｏＥ保因者であるか否か、患者がヒトまたは動物であるか否か、他の薬剤が投与されるか、治療が予防的または治療的であるか否かに応じて、有効用量は変化する。
【０１０５】
抗体のための代表的な用量範囲は、患者の体重１ｋｇあたり約０.０１〜５ｍｇ／ｋｇであり、より一般的には０.１〜３ｍｇ／ｋｇまたは０.１５〜２ｍｇ／ｋｇまたは０.１５〜１.５ｍｇ／ｋｇである。抗体は、このような用量で毎日、代替日に、毎週、隔週、毎月、四半期ごと、または実証的分析によって決定された任意の他のスケジュールに従って投与できる。代表的な治療は、長期間にわたって、例えば、少なくとも６ヶ月間、複数回投与での投与を必要とする。さらなる代表的な投与計画は、２週間に１回ごと、または月に１回、または３〜６ヶ月に１回の投与を必要とする。
【０１０６】
能動投与のための薬剤の量は、患者あたり０.１〜５００μｇで、より一般的にはヒトへの投与のための注射あたり１〜１００または１〜１０μｇと変化する。注射のタイミングは、１日に１回から１年に１回、数年に１回と著しく変化し得る。典型的な投与計画は、免疫化に続いて６週間間隔または２ヶ月などの時間間隔でのブースター注射からなる。別の投与計画は、免疫化に続いて１、２および１２ヶ月後のブースター注射からなる。別の投与計画は、生きている間、２ヶ月ごとの注射を伴う。あるいは、免疫応答の監視によって示されるように、ブースター注射は不定期になり得る。
【０１０７】
抗体または抗体を誘導するための薬剤は、好ましくは末梢経路（すなわち、投与または誘導される抗体が血液脳関門を通過し、脳内の意図された部位に到達する経路）を介して投与される。投与経路には、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、鼻腔内または筋肉内投与が含まれる。好ましい抗体の投与経路は、静脈内および皮下経路である。能動免疫に好ましい経路は、皮下および筋肉内経路である。この種の注射は、最も典型的には、腕または脚の筋肉に行われる。いくつかの方法では、薬剤は、沈着物が蓄積した特定の組織に直接注射、例えば、頭蓋内注射される。
【０１０８】
非経口投与のための医薬組成物は、好ましくは無菌であり、実質的に等張で、ＧＭＰ条件下で製造される。医薬組成物は、（すなわち、単回投与のための用量）単位剤形で提供され得る。医薬組成物は、１つまたは複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を用いて製剤化できる。製剤は、選択された投与経路に依存する。注射のために、抗体は、水溶液で、好ましくは、（注射部位での不快感を軽減するために）ハンクス液、リンゲル液、もしくは生理食塩水または酢酸緩衝液などの生理的に適合性のある緩衝液で製剤化ができる。溶液は、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含有できる。あるいは、抗体は、使用前に適切なビヒクル、例えば、無菌で発熱物質を含まない水で構成するために凍結乾燥形態であり得る。
【０１０９】
本投与計画は、治療される疾患の治療または予防に有効な別の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、アルツハイマー病の場合、本投与計画は、Αβ（ＷＯ／２０００／０７２８８０）、コリンエステラーゼ阻害剤もしくはメマンチンに対する免疫療法と組み合わせることができ、またはパーキンソン病の免疫療法の場合には、α−シヌクレイン（ＷＯ／２００８／１０３４７２）、レボドパ、ドーパミン作動薬、ＣＯＭＴ阻害剤、ＭＡＯ−Ｂ阻害剤、アマンタジン、もしくは抗コリン薬に対する免疫療法と組み合わせることができる。
【０１１０】
ＶＩＩＩ．インビボイメージング、診断方法、および最適化免疫療法
本発明は、患者におけるタウタンパク質沈着物（例えば、神経原線維変化およびタウ封入体）をインビボイメージングする方法を提供する。本方法は、タウに結合する抗体（例えば、マウス、ヒト化、キメラまたはベニヤ１６Ｂ５抗体）などの薬剤を患者に投与し、その後、タウに結合した薬剤を検出することによって動作する。アミノ酸２４〜４６内のタウのエピトープに結合する抗体が好ましい。いくつかの方法において、抗体は、アミノ酸２５〜４４内またはアミノ酸３０〜３９内のエピトープに結合する。投与した抗体の除去反応は、Ｆａｂなどの全長の定常領域を欠く抗体断片を使用することによって回避または低減することができる。いくつかの方法において、同一の抗体は、治療および診断試薬の両方として機能し得る。
【０１１１】
診断試薬は、患者の体内への静脈内注射によって、または頭蓋内注射によるかもしくは、頭蓋骨に穴を穿孔することによって脳に直接投与できる。試薬の投与量は、治療方法の場合と同じ範囲内である必要がある。典型的には、試薬は標識されるが、いくつかの方法では、タウに対する親和性を有する一次試薬は標識されず、二次標識剤を一次試薬に結合させるために使用される。標識の選択は検出の手段に依存する。例えば、蛍光標識は光学的検出に適する。常磁性標識の使用は、外科的介入なしに断層撮影検出に適する。放射性標識はまた、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴを用いて検出できる。
【０１１２】
タウタンパク質沈着物のインビボイメージングの方法は、アルツハイマー病、前頭側頭葉変性症、進行性核上性麻痺およびピック病、またはそのような疾患に対する感受性などのタウオパチーを診断するのに、またはその診断を確認するのに有用である。例えば、本方法は、認知症の症状を示す患者に使用できる。患者に異常な神経原線維変化がある場合、その患者は、アルツハイマー病を罹患している可能性がある。もう１つの方法として、患者に異常なタウ封入体がある場合には、封入体の位置に応じて、その患者は前頭側頭葉変性症を患っている可能性がある。本方法はまた、無症状の患者にも使用できる。異常なタウタンパク質沈着物の存在は、将来、症候性疾患に罹りやすいことを示す。本方法はまた、以前にタウ関連疾患と診断された患者における疾患の進行および／または治療に対する応答を監視するのに有用である。
【０１１３】
診断は、標識された遺伝子座の数、サイズ、および／または強度を対応するベースライン値と比較することによって行われ得る。ベースライン値は、病気でない個人の集団における平均レベルを表し得る。ベースライン値はまた、同じ患者で決定された以前のレベルを表し得る。例えば、患者のベースライン値は、タウ免疫療法治療を開始する前に決定することができ、その後、測定値とベースライン値を比較する。ベースラインに対する値の減少は、治療への好応答を示す。
【０１１４】
一部の患者では、タウオパチーの診断は、ＰＥＴスキャンを実行することによって支援され得る。ＰＥＴスキャンは、例えば、従来のＰＥＴ撮像装置および補助装置を用いて実行され得る。スキャンは、典型的には、タウタンパク質沈着物と関連することが一般に知られている脳の１つまたは複数の領域、および沈着物がたとえあったとしても、一般に、対照としての役割を果たすために存在する１つまたは複数の領域を含む。
【０１１５】
ＰＥＴスキャンで検出したシグナルは、多次元画像として表すことができる。多次元画像は、二次元では脳の断面を表し、三次元では三次元脳を表すか、または四次元では三次元脳の経時的変化を表し得る。カラースケールは、異なる色を用いて行うことができ、異なる標識量および検出される推定タウタンパク質沈着物を示す。スキャンの結果はまた、検出される標識の量および結果的にタウタンパク質沈着物の量と関連する数で数値的に提示できる。特定のタウオパチー（例えば、アルツハイマー病）について、沈着物と関連することが知られている脳の領域に存在する標識は、前者の領域内における沈着物の程度を表す比率を提供するために、沈着物と関連することが知られていない領域内に存在する標識と比較できる。同じ放射性標識リガンドについては、このような比率は、タウタンパク質沈着物の比較可能な尺度および異なる患者間でのその変化をもたらす。
【０１１６】
いくつかの方法において、ＰＥＴスキャンは、ＭＲＩまたはＣＡＴスキャンと同時に、またはＭＲＩまたはＣＡＴスキャンと同じ患者の訪問で実行される。ＭＲＩまたはＣＡＴスキャンは、ＰＥＴスキャンよりも脳のより解剖学的な詳細を提供する。しかし、ＰＥＴスキャンからの画像は、脳内の解剖学的構造に対するＰＥＴリガンドおよび推定タウ沈着物の位置をより正確に示すＭＲＩまたはＣＡＴスキャン画像上に重ね合わせることができる。一部の機械は、スキャンの間に患者が位置を変えることなく患者のＰＥＴスキャンとＭＲＩまたはＣＡＴスキャンの両方を実行し、画像の重ね合わせを容易にすることできる。
【０１１７】
適切なＰＥＴリガンドは、本発明の抗体（例えば、マウス、ヒト化、キメラまたはベニヤ１６Ｂ５抗体）の放射性標識抗体を含む。使用される放射性同位体は、例えば、Ｃ１１、Ｎ１３、Ｏ１５、Ｆ１８、またはＩ１２３であり得る。ＰＥＴリガンドを投与し、スキャンを実行する間隔は、ＰＥＴリガンド、特に脳への取り込み速度および除去速度、ならびにその放射性標識物の半減期に依存し得る。
【０１１８】
ＰＥＴスキャンはまた、無症状の患者または軽度認知障害の症状を有するが、タウオパチーと診断されておらず、タウオパチーを発症するリスクが高い患者で予防措置として実施することもできる。無症状の患者では、スキャンは、家族歴、遺伝的もしくは生化学的危険因子または熟年のためにタウオパチーのリスクが高いと考えられる個人に特に有用である。予防的スキャンは、例えば、４５〜７５歳の年齢の患者で開始できる。一部の患者では、最初のスキャンは５０歳で行われる。
【０１１９】
予防的スキャンは、例えば、６ヶ月〜１０年、好ましくは、１〜５年の間隔で行われ得る。一部の患者では、予防的スキャンが毎年行われる。予防的措置として行われるＰＥＴスキャンが異常に高いレベルのタウタンパク質沈着物を示す場合、免疫療法が開始され、その後、ＰＥＴスキャンが、タウオパチーと診断された患者と同様に行われ得る。予防措置として行われるＰＥＴスキャンが正常レベル内にあるタウタンパク質沈着物のレベルを示す場合、さらにＰＥＴスキャンが、前述のように、６ヶ月〜１０年、好ましくは、１〜５年の間隔で、またはタウオパチーもしくは軽度認知障害の徴候および症状の出現に応答して行われ得る。上記の正常レベルのタウタンパク質沈着物が検出される場合および検出された時に、予防的スキャンとタウ指向免疫療法の投与を組み合わせることによって、タウタンパク質沈着物のレベルは正常レベルまで低下するかもしくはそれにより近いレベルになるか、または少なくともさらに増加するのを妨げることができ、患者は、予防的スキャンおよびタウ指向免疫療法を受けていない場合よりも長い期間（例えば、少なくとも５、１０、１５もしくは２０年、または患者の残りの人生の間）、タウオパチーのない状態のままであり得る。
【０１２０】
正常レベルのタウタンパク質沈着物は、特定のタウオパチー（例えば、アルツハイマー病）と診断されておらず、このような疾患を発症するリスクが高いとみなされていない一般集団の個人の代表的な試料（例えば、年齢が５０歳未満の無病の個人の代表的な試料）の脳内における神経原線維変化またはタウ封入体の量によって決定され得る。もう１つの方法として、タウタンパク質沈着物が生じることが知られている脳の領域における、本発明の方法によるＰＥＴシグナルが、このような沈着物が普通では生じることが知られている脳の領域からのシグナルと（測定の精度内で）異なっていない場合には、正常なレベルは個々の患者で認識され得る。個人におけるレベルの上昇は、正常レベルとの比較（例えば、外部の平均と標準偏差の分散）によってまたは、単に、沈着物と関連することが知られていない領域と比較したタウタンパク質沈着物と関連する脳の領域における実験誤差を超えて上昇したシグナルから認識され得る。個人および集団におけるタウタンパク質沈着物のレベルを比較する目的で、タウタンパク質沈着物は、好ましくは、脳の同じ領域（複数可）において決定されるべきであり、これらの領域は、特定のタウオパチー（例えば、アルツハイマー病）と関連するタウタンパク質沈着物が形成することが知られている少なくとも１つの領域を含む。タウタンパク質沈着物のレベルが上昇した患者は、免疫療法を開始するための候補である。
【０１２１】
免疫療法を開始した後のタウタンパク質沈着物のレベルの低下は、最初に、治療が所望の効果を有していることを示すものとして見ることができる。観察された減少は、例えば、ベースライン値の１〜１００％、１〜５０％、または１〜２５％の範囲内であり得る。このような効果は、沈着物を形成することが知られている脳の１つまたは複数の領域で測定できるか、またはそのような領域の平均値から測定できる。治療の総合効果は、そうでなければ、普通の治療されていない患者で生じるタウタンパク質沈着物の増加にベースラインに対する減少率を加えることによって概算できる。
【０１２２】
タウタンパク質沈着物のほぼ一定のレベルでの維持またはタウタンパク質沈着物が少しでも増加することは、準最適な応答ではあるが、治療への応答の指標となり得る。このような応答は、免疫療法がタウタンパク質沈着物のさらなる増加を抑制する効果を有するか否かを決定するために、治療を受けていない特定のタウオパチー（例えば、アルツハイマー病）を有する患者におけるタウタンパク質沈着物のレベルの時間経過と比較できる。
【０１２３】
タウタンパク質沈着物の変化の監視により、治療に応答して免疫療法または他の治療の投与計画の調整が可能になる。ＰＥＴ監視は、治療に対する応答の性質および程度の指標を提供する。その後、治療の調整を行うべきか否かを判断することができ、必要であれば、治療はＰＥＴ監視に応じて調整できる。したがって、他のバイオマーカー、ＭＲＩまたは認知の測定が検出可能なほど応答する前に、ＰＥＴ監視によって、タウ指向免疫療法または他の治療の投与計画の調整が可能になる。著しい変化は、ベースに対する治療後のパラメータの値を比較することで、治療が有益な効果をもたらしたかまたはもたらしていないという証拠が得られることを意味する。場合によって、患者自身におけるパラメータの値の変化から、治療が有益な効果をもたらしたかまたはもたらしていないという証拠が得られる。他の例では、もしあれば、患者における値の変化が、もしあれば、免疫療法を受けていない患者の代表的な対照集団における値の変化と比較される。特定の患者の応答と対照患者の正常な応答の差異（例えば、平均値プラス標準偏差の分散）はまた、免疫療法の投与計画が患者において有益な効果を達成しているかまたはしていないかという証拠を提供することができる。
【０１２４】
一部の患者では、監視によって、タウタンパク質沈着物の検出可能な低下が示されるが、タウタンパク質沈着物のレベルは正常を上回ったままである。このような患者では、許容できない副作用がない場合、そのままの投与頻度および／もしくは用量で、または最大推奨用量でない場合は、投与頻度および／もしくは用量を増加させて、治療の投与計画を継続することができる。
【０１２５】
監視によって、患者におけるタウタンパク質沈着物のレベルが正常またはほぼ正常まで低下したことが示される場合は、免疫療法の投与計画は、誘導の投与計画（すなわち、タウタンパク質沈着物のレベルを低下させる計画）から維持の投与計画（すなわち、ほぼ一定のレベルでタウタンパク質沈着物を維持する計画）に調整できる。このような投与計画は、免疫療法の用量および／または投与頻度を減少させることによって影響され得る。
【０１２６】
他の患者では、監視は、免疫療法がいくつかの有益な効果ではあるが準最適な効果を有していることを示し得る。最適な効果は、治療の開始後の所定の時点で免疫療法を受けているタウオパチー患者の代表的な試料が経験する（タウタンパク質沈着物が形成することが知られているその全脳もしくは代表的な領域（複数可）にわたって測定または計算された）タウタンパク質沈着物の変化の上半分または四分位内のタウタンパク質沈着物のレベルの減少率として定義され得る。タウタンパク質沈着物が少し低下した患者、またはタウタンパク質沈着物が一定のままの患者、または増加するが、免疫療法の非存在下で（例えば、免疫療法を投与されていない患者の対照群から推測した時に）予想される値よりも低い程度までの増加である患者は、陽性ではあるが準最適な反応を経験する患者として分類され得る。このような患者には、必要に応じて、薬剤の用量および／または投与頻度を増加させる投与計画の調整が施され得る。
【０１２７】
一部の患者では、タウタンパク質沈着物は、免疫療法を受けていない患者におけるタウ沈着と同様にまたはそれを上回って増加し得る。このような増加が、１８ヶ月または２年などの期間にわたって継続する場合は、薬剤の頻度または用量が増加した後であっても、必要に応じて、他の治療を優先して免疫療法が中断され得る。
【０１２８】
タウオパチーの診断、監視、および治療の調整についての前述の説明は、主にＰＥＴスキャンを使用することに焦点を置いてきた。しかし、本発明のタウ抗体（例えば、マウス、ヒト化、キメラもしくはベニヤ１６Ｂ５抗体）の使用の影響を受けやすいタウタンパク質沈着物の視覚化および／または測定ための任意の他の技術が、このような方法を実行するためのＰＥＴスキャンの代わりに使用できる。
【０１２９】
実施例
実施例１．抗体１６Ｂ５の作製
リン酸化されているタウまたはされていないタウを認識するパン抗体１６Ｂ５を精製したタウに対して作製し、ＥＬＩＳＡアッセイでの高い親和性捕捉特性に基づいて選択した。
【０１３０】
実施例２．抗体１６Ｂ５のクローニングおよび配列決定
ＲＮＡを、トリゾールＬＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、１６Ｂ５抗体を発現するペレット化細胞から抽出した。ＲＮＡ濃度を、Ｑｕａｎｔ−ＩＴキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて測定した。
【０１３１】
５’−ＲＡＣＥを利用して、Ｓｍａｒｔ ＲＡＣＥキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてＩｇＧのｍＲＮＡの５’末端を増幅した。約１μｇのＲＮＡをＲＴ反応に使用し、Ｓｍａｒｔ ＲＡＣＥキットのユニバーサルプライマーおよびＥｘｏｎＢＩＯで設計した遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）を用いて、ｃＤＮＡプールをさらに増幅した。
【０１３２】
プライマー配列：
ユニバーサルプライマー：ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ（配列番号７）
ＧＳＰ：
ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ：ＣＴＣ ＡＡＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＧＴＣ ＣＡＣ ＣＴＴ ＧＧＴ ＧＣ（配列番号８）
ＩｇＧ２ｂ：ＣＴＣ ＡＡＧ ＴＴＴ ＴＴＴ ＧＴＣ ＣＡＣ ＣＧＴ ＧＧＴ ＧＣ（配列番号９）
【０１３３】
ＰＣＲ産物をゲル生成し、ｐＳＵＰＥＲ−ブラントベクター（Ａｄｅｘｏｎ社、ｗｗｗ.ａｄｅｘｏｎｂｉｏｔｅｃｈ.ｃｏｍ）にクローニングした。重鎖については、１５個のコロニーをミニプレップし、配列決定した。軽鎖については、コロニーＰＣＲを行い、内因性の異常な軽鎖を区別し、コロニーＰＣＲから増幅されなかった唯一のクローンの配列決定を行った。配列決定の結果は、ＮＴＩベクター上で分析した。アダプターおよびＧＳＰのプライマー配列をマップ上にマークした。アダプターとＧＳＰ配列の間の領域は、リーダー、シグナルペプチドおよびＶ−領域、ならびに定常領域の一部を含むＩｇＧ重鎖配列である。ＯＲＦをマップ上にマークした。
【０１３４】
実施例３．抗体１６Ｂ５のエピトープマッピング
ペプチド断片分析によるエピトープの同定
Ｎ末端インサートを含まず、４つの微小管結合リピートおよびＰ３０１Ｌ変異（ｒタウ）を含むヒトのタウ配列を大腸菌内で発現させ、精製した。タウのこの形態は、タウの最長のアイソフォームに基づく番号付け規則を使用してＰ３０１Ｌに相当する）２４３位のロイシンがプロリンに置き換わった配列番号３の配列を有する。２００μｇのタウの酵素消化を次の４つの異なるプロテアーゼのいずれかを用いて行った：（アルギニンおよびリジンのカルボキシル末端で切断する）トリプシン、（チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンおよびロイシンのカルボキシル末端で主として切断する）キモトリプシン、（リジンのカルボキシル末端で切断する）ＬｙｓＣ、または（グルタミン酸残基およびまれにアスパラギン残基の後ろで切断する）Ｇｌｕｃ。全てのプロテアーゼをＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から入手し、消化を３７℃で１６時間行った。得られたペプチド断片を１０μｇの１６Ｂ５と共にインキュベートし、プロテインＧ磁気ビーズ（ＮＥＢ）を用いて沈殿させた。沈殿物を完全に３００ｍＭのＮａＣｌおよび０．５％ＮＰ−４０を含有するＰＢＳ中で洗浄し、次いで、１００ｍＭグリシン中１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ２.８）で溶出した。溶出物を真空乾燥し、０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に再懸濁した。再懸濁した溶出液を４.６×５０ｍｍのＣ１８カラム上にロードし、その後、０.０７５％ＴＦＡとアセトニトリルの直線勾配を用いてＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ１２６０インフィニティ・システム）により分画した。ピーク画分を収集し、乾燥させ、蒸留水に再懸濁した。ペプチドの質量および同一性を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦによって決定した。配列番号１の残基２５〜４４に対応するピークは、ＬｙｓＣのＭＳスペクトルで同定された。残基配列１の番号２５〜４４および２４〜４４に対応するピークを、トリプシンのＭＳスペクトルで同定した。キモトリプシンおよびＧｌｕＣ消化物からのシグナルが得られなかったことは、いくつかのエピトープが、配列番号１の残基２９および／または配列番号１の残基３７を含むことができることを示唆する。
【０１３５】
変異分析によるエピトープの同定
（上述の）ペプチド断片分析によって決定された結果を用いて、ｒタウの欠失変異誘発を標準的な分子生物学的方法を用いる全プラスミドの増幅により行った。タンパク質を少量の細菌培養物中で発現させ、浄化した細菌溶解物の等容量を電気泳動し、ブロットし、１６Ｂ５抗体で染色した。試料のローディングの対照には、タウのＣ末端領域（Ｃ末端エピトープ）に特異性を有する抗体のタウ４６を用いて、重複ブロットを染色した。両方の抗体を０.２μｇ／ｍｌの濃度で使用した。Ｌｉｃｏｒオデッセイ蛍光スキャナーを用いて画像を取得した。タウの次の欠失変異体を作製し、このようにして分析した：Δ５−２４、Δ２３−３２、Δ２５−４４、Δ３０−３９、およびΔ３７−４６。図１および図２に示すように、タウのΔ２５−４４およびΔ３０−３９欠失変異体は１６Ｂ５抗体により検出されず、１６Ｂ５によって認識されるエピトープがそれらの残基内にある証拠が得られた。タウのΔ３７−４６欠失変異体は１６Ｂ５でごくわずかに検出可能であり、３７−４６内の残基のいくつか（例えば、残基３７）が１６Ｂ５のタウへの結合において役割を果たし得るという証拠が得られた。１６Ｂ５抗体は、タウのΔ２３−３２欠失変異体をΔ５−２４欠失変異体より少ない程度、かつΔ２５−４４およびΔ３０−３９欠失変異体よりも多い程度に染色し、１６Ｂ５がまた、残基３３〜３６、３０〜３６、３３〜３７、３０〜３７または３３〜３９を含むペプチドに結合することができるという証拠が得られた。全体として、タウ欠失変異体から得られたデータは、１６Ｂ５により認識されるエピトープが配列番号１の残基２３〜３２の一部または全部および配列番号１の残基３７〜４６の一部または全部を含み得ることを示唆する。例えば、１６Ｂ５は、配列番号１の残基３２〜３８または２８〜４１内のエピトープを認識できる。
【０１３６】
アラニンスキャニングによるエピトープの同定
次に、残基３０〜４２に及ぶタウの領域内の単一残基を、ＰＣＲ変異誘発を用いてアラニン変異させた。変異したタンパク質を発現させ、上記のように溶解物を電気泳動によって分離し、１６Ｂ５抗体またはタウ４６抗体のいずれかを用いてブロットした。この分析の結果を図３に示す。Ｔ３０Ａ、Ｍ３１Ａ、Ｈ３２Ａ、Ｑ３３Ａ、Ｄ３４Ａ、Ｑ３５Ａ、Ｅ３６Ａ、Ｇ３７Ａ、Ｄ３８Ａ、Ｔ３９Ａ、Ｄ４０Ａ、Ａ４１Ｌ、およびＧ４２Ａを含む分析した特定の点変異体をブロット上に列挙する。特に関心のある残基を各ブロット上にボックスで囲んである。１６Ｂ５の検出可能な結合は、Ｑ３３Ａタウ変異によって完全に除去され、Ｇ３７Ａタウ変異によって実質的に減少し、残基３３およびより少ない程度の残基３７が１６Ｂ５によって認識されるエピトープの重要な構成要素であり得る証拠が得られた。他の残基は、ビアコア分析において１６Ｂ５によって認識されるエピトープの重要な構成要素であり得る。
【０１３７】
実施例４．タウオパチーのｈタウ．Ｐ３０１Ｌトランスジェニックマウスモデルにおける受動免疫
免疫
ＦＶＢ／Ｎ遺伝的バックグラウンドの３ヶ月齢のｈタウ．Ｐ３０１Ｌ−Ｔｇの雌マウスをこの研究に使用した。１０ｍｇ／ｋｇの試験抗体および対照抗体の投与を、週に一度、腹腔内に行った。治療期間は約５ヶ月であった。２３回の注射の後、マウスを屠殺して本研究を終えた。本研究で投与した試験抗体および対照抗体を表１に記載する。
【０１３８】
【表１】
2020109103.tif 000006
2020109103.tif 000007
【０１３９】
時期尚早の死は、トランスジェニックマウスのタウオパチーのモデルで観察された表現型である。本研究で用いた特定のモデルは、発症の変動が高いが、６ヶ月の年齢で高リン酸化タウを発現する。このマウスはまた、後肢がクラスピング（ｃｌａｓｐｉｎｇ）のような運動欠陥を患い、全般的な移動性が低減し、８〜１１ヶ月の年齢で早期に死亡する（ｒｅＭＹＮＤ未発表データ、Ｔｅｒｗｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００５）。クラスピング表現型および体重減少の存在によって特徴付けられる末期の疾患症状を呈するマウスを屠殺した。予想外に高い数のマウスが、これらの症状の存在なしに早期に死亡した。そのような場合の死の原因は、後期タウオパチーまたは試験抗体とは無関係であると考えられ、その代わりに近交系ＦＶＢ／Ｎバックグラウンドと関連すると考えられる。
【０１４０】
表２は、本研究の過程における全てのマウスの全生存期間の概要を示す。
【０１４１】
【表２】
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【０１４２】
屠殺後、マウスを解剖し、ポッター型メカニカルホモジナイザー（ＶＯＳ １４ Ｓ４０、速度７５０ｒｐｍ、ＶＷＲ）を用いて、２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８.１）；１５０ｍＭのＮａＣｌ;１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、Ｍｅｒｃｋ社）；１ｍＭのエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）;５ｍＭのピロリン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社）；３０ｍＭのフッ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）；１ｍＭのＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ社）；２ｍＭのバナジン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社）；１０ｍＭの１，１０−オルト−フェナントロリン一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）;５μｇ／ｍｌの大豆トリプシンインヒビター;５μｇ／ｍｌのペプスタチン;およびプロテイナーゼインヒビターのカクテル（ＣＰＩ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ社、ドイツ）を含む１０重量体積の氷冷トリスプロテイナーゼ−ホスファターゼ−阻害剤の緩衝液（ＴＰＰＩ−緩衝液）中で脳幹および中脳をホモジナイズした。それぞれ１４０μｌおよび１００μｌの脳幹および中脳ホモジネート（ＴｏｔＨ）の固定体積（総容積の約半分）を４℃で６０分間、１３６０００×ｇで遠心分離（ＴＬＡ−５５ローター、ＯｐｔｉｍａＴＭＴＬＸ超遠心機、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）し、トリス可溶性画分（ＳＦ）を作製し、全ホモジネートの残りを−８０℃で保存した。遠心分離機ホルダの数（Ｎ＝１２）が限られているため、試料を無作為化して、遠心分離を均等にし、異なる治療群を異なる遠心分離セッションにわたって分割した。
【０１４３】
上清（Ｓ１、「可溶性画分」または「ＳＦ」とも呼ばれる）を、ペレット（Ｐ１）から分離し、等分して、−８０℃で保存した。Ｐ１ペレットを１０重量体積の高塩溶液（０.８５ＭのＮａＣｌ含有ＴＰＰＩ緩衝液）に可溶化し、４℃で３０分間、２００００×ｇで遠心分離した。得られた高塩ペレット（Ｐ２）を−８０℃で保存した。上清（Ｓ２）を１０％サルコシルの１０分の１の１％サルコシルに入れ、トップオーバートップロータリータンブラー（ｔｏｐ−ｏｖｅｒ−ｔｏｐ ｒｏｔａｒｙ ｔｕｍｂｌｅｒ）で６０分間室温でインキュベートし、その後、４℃で６０分間、１３６０００×ｇで遠心分離した。サルコシル可溶性上清（Ｓ３）を−８０℃で保存し、サルコシル不溶性ペレット（Ｐ３、「不溶性画分」または「ＩＦ」とも呼ばれる）を、３０μｌのＴＰＰＩ緩衝液に再懸濁し、分注した。上記の分画プロトコルによって作製した全ホモジネート（ＴｏｔＨ）、トリス可溶性（ＳＦ）、およびサルコシル不溶性（ＩＦ）の脳幹画分を、その後のポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング分析に使用した。
【０１４４】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング
従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングの適用のために、試料を変性させ、１０分間９５℃でインキュベートすることによって還元し、７.５％のＴｒｉｓ−ＨＣｌゲル（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＸＴプレキャストゲル、２６ウェルコーム、１５μｌ、１.０ｍｍ；Ｂｉｏｒａｄ社）上で分離した。ＰＶＤＦ−膜（ｉＢｌｏｔ（商標）ゲルトランスファースタック（Ｇｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｔａｃｋ）、ＰＶＤＦ、レギュラー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を乾燥電気泳動転写（ｄｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ（ｉＢｌｏｔ（商標）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））した後、膜を３０分間、０.４％ＰＦＡ中で洗浄し、その後、トリス緩衝食塩水で洗浄した。次に、膜を５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳および０.１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ、ｐＨ７.６）中で１時間インキュベートした。ブロットを、表３に示した作業濃度で、様々な抗タウ一次抗体と一晩インキュベートした。洗浄し、抗マウスまたは抗ウサギＨＲＰ結合二次抗体（ヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギＩｇＧ、ＤＡＫＯ）とインキュベートした後に、ブロットをＥＣＬ検出システム（スーパーシグナルウェストフェムト最大感度基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、製品番号３４０９６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で発色させた。異なる露光時間で画像をデジタル記録（ＶｉｓｉｏｎＷｏｒｋｓ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ、ＵＶＰ)し、専用ソフトウェア（ＶｉｓｉｏｎＷｏｒｋｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ、ＵＶＰ）をブロットの分析のために使用した。比較のために、インターゲルリファレンスゲルの泳動を行い、比較のために４画分のアリコートを各ゲル上で移動させた。検出のために使用した抗タウ一次モノクローナル抗体には、ＡＴ１００（リン酸化タウ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、希釈１：２５０）、ＡＴ８（リン酸化タウ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、希釈１：５００）、ＨＴ７（パンタウ、Ｐｉｅｒｃｅ社、希釈１：１０００）、および１Ｆ５（試験施設には知られていないエピトープ、Ｎｅｏｔｏｐｅ、希釈３：５００）が含まれていた。ブロットを、ローディングコントロールとして抗ＧＡＰＤＨで再プローブした（Ａｂｃａｍ９４８５;希釈１：２５００）。パンタウ抗体は、リン酸化タウに特異的ではない。
【０１４５】
【表３】
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【０１４６】
図４に示すように、６Ｆ１０対照抗体で治療した動物と比較して、タウの量の統計的に有意な減少が、１６Ｂ５抗体で治療した動物からサルコシル不溶性脳幹画分で観察された。統計的有意性を、スチューデントｔ検定、ｐ＜０.０５を用いて評価した。この減少は、リン酸化タウ特異的抗体（ＡＴ８、左上のパネル；ＡＴ１００、左下のパネル；１Ｆ５、右上のパネル）およびパン−タウ抗体（ＨＴ７、右下のパネル）の両方で観察された。全ホモジネートのウェスタンブロットはまた、リン酸特異的抗体で検出した場合、６Ｆ１０抗体で治療した対照動物と比較して１６Ｂ５治療動物における総タウに対するリン酸化タウの比率の有意な低下を示した。（ＨＴ７パンタウ抗体で検出されたシグナルで割ったＡＴ８抗リン酸化タウ抗体で検出されたシグナルを示す）図５の左パネルを参照されたい。対照的に、６Ｆ１０抗体で治療した対照動物と比較して１６Ｂ５で治療した動物の全ホモジネートにおけるＧＡＰＤＨレベルに対する総タウの比率において有意な変化はなかった。（ＧＡＰＤＨ抗体で検出されたシグナルで割ったＨＴ７パンタウ抗体で検出されたシグナルを示す）図５の右パネルを参照されたい。これらのデータは、ホモジネート中の総タウではないリン酸化タウのレベルが低下したという証拠を提供する。
【０１４７】
組織学的分析
視床下核アネックス不確帯（ＳＴＨ／ＺＩ）および小脳の挿入核、前方および後方部、アネックス外側小脳核（ＩｎｔＡ／Ｐ／ＬＡＴ）において、抗リン酸化タウ抗体を用いた免疫組織化学的分析を行った。矢状ビブラトーム切片（４０μｍ）を０.１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中で、使用するまで４℃で保存した。示したブレグマで、マウスあたり８つの切片をｍＡｂのＡＴ８、ＡＴ１００または１Ｆ５でフリーフローティング染色した。切片を、以下の表４に記載の示した抗体での染色のために選択した。特定の染色のために選択した全ての動物の切片を、染色および盲検定量化のために無作為化した。
【０１４８】
フリーフローティング切片を、Ｎｅｔｗｅｌｌｓ（商標）中でインキュベートした。次いで、切片をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳおよびメタノール（１：１）中の１.５％過酸化水素で２０分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性を除去した。０.１％トリトンＸ１００を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で切片を３回洗浄した後、切片をＰＢＳＴ中１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中で３０分間ブロックし、その後、１０％ＦＣＳを有するＰＢＳＴ中、それぞれ０.４μｇ／ｍｌおよび０.０５μｇ／ｍｌの濃度を使用して一次抗体ＡＴ８、ＡＴ１００（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と一晩インキュベートした。洗浄後、切片をヤギ抗マウスペルオキシダーゼ標識（ＧＡＭＰＯ）二次抗体（ＤＡＫＯ社、ＰＢＳＴ中１／５００、１０％ＦＣＳ）でインキュベートし、シグナルを３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ、１０ｍｌあたり３μｌのＨ２Ｏ２を有する１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌあたり１錠）で発色させた。切片をマイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、エタノールおよびキシレン（Ｍｅｒｃｋ Ｅｕｒｏｌａｂ）中で５ステップ（５０、７０、９５および２×１００％）で脱水し、Ｄｅｐｅｘ（Ｄｅｐｅｘマウンティング溶剤（Ｄｅｐｅｘ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＤＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）にマウントした。
【０１４９】
【表４】
2020109103.tif 000011
【０１５０】
カラービューＩＩオリンパスカメラを装備したオリンパスＢＸ４１顕微鏡を用いて画像を取得し、ＡｎａｌｙＳＩＳ Ｆｉｖｅ−Ｃｅｌｌ＾Ｄソフトウェアを用いてコンピュータで分析した。顕微鏡のための光強度およびコンデンサーの設定は、画像取得プロセス中一定に維持した。全ての取得画像を同じコンピュータサブルーチンに供し、調査者の偏見を最小限にした。解析の間中、密度スライス閾値化を均一に適用した。
【０１５１】
以下に定義するような関心領域を、染色シグナル（複数可）の自動定量化のために選択した。視床下核および不確帯を、それぞれ大脳脚により腹側に、および白質によって背側に、かつ細胞密度の違いに基づいて区切った（矢状小脳切片、ブレグマ１，３２−１，９２）。小脳の挿入核、前方および後方部分、ならびに横小脳核を、白質および細胞密度の変化ならびに第三脳室によって区切った（矢状小脳切片、ＬＡＴについてはブレグマ１，９２−２，６４およびＩｎｔＡ／Ｐについては０，８４−１，８）。それぞれの染色について、マウスあたりＳＴＨ／ＺＩを含む６個の脳切片およびＩｎｔＡ／Ｐ／ＬＡＴを含む１６個の切片を分析に含めた。
【０１５２】
図６に示すように、１６Ｂ５抗体で治療した動物の小脳核および視床下部領域で検出されたリン酸化タウの量は、６Ｆ１０抗体で治療した対照動物の同じ構造で検出されたリン酸化タウの量と比較して有意に減少した。統計的有意性をスチューデントｔ検定、ｐ＜０.０５を用いて評価した。
【０１５３】
実施例５．１６Ｂ５のヒト化
配列解析により、１６Ｂ５抗体が、マウスカバットサブグループ１に属し、ヒトカバットサブグループ４に対応する配列番号１６の配列を有する可変カッパ（Ｖｋ）ドメインを有することが示される。カバットＣＤＲに下線が引いてある。１６Ｂ５抗体の可変重鎖（Ｖｈ）ドメインは、マウスカバットサブグループ２ｂに属し、ヒトカバットサブグループ１に対応する配列番号１０の配列を有する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ.（１９９１）、免疫学的に興味のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２）。カバットＣＤＲに下線が引いてある。
【０１５４】
１６Ｂ５Ｖｋドメインは、１７残基のＣＤＲ−Ｌ１配列（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡ、配列番号１７）、７残基のＣＤＲ−Ｌ２配列（ＷＡＳＴＲＥＳ、配列番号１８）、および８残基のＣＤＲ−Ｌ３（ＫＱＳＹＴＬＲＴ、配列番号１９）を含む。ＣＤＲ−Ｌ１配列はカノニカルクラス３に属し、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３配列はクラス１に属する（Ｍａｒｔｉｎ ＆ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ （１９９６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００−１５）。
【０１５５】
１６Ｂ５ Ｖｈドメインは、カバット番号付けに基づいて５残基のＣＤＲ−Ｈ１配列（ＹＨＧＭＤ、配列番号１１）またはカバットおよびコチア番号付けに基づいて１０残基のＣＤＲ−Ｈ１配列（ＧＹＰＦＴＹＨＧＭＤ、配列番号２４）、１７残基のＣＤＲ−Ｈ２配列（ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＴＹＡＤＤＦＫＧ、配列番号１２）、および８残基のＣＤＲ−Ｈ３配列（ＲＲＤＦＴＭＤＦ、配列番号１３）を含む。ＣＤＲ−Ｈ１配列は、カノニカルクラス１に属し、ＣＤＲ−Ｈ２配列はクラス２に属する（Ｍａｒｔｉｎ ＆ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ（１９９６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００−１５）。ＣＤＲ−Ｈ３配列はカノニカルクラスを有していないが、おそらく、白井ら（（１９９９），ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５５：１８８−９７）の規則に従ってねじれベースを有している。
【０１５６】
ＶｋおよびＶｈドメイン間の界面における残基は、マウスのこれらの位置にとって通常の残基である。
【０１５７】
１６Ｂ５抗体の大まかな構造モデルを提供する構造を見つけるために、ＰＤＢデータベース中のタンパク質配列上で検索を行った（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８５：１８２０−３３）。抗コレラ毒素抗体Ｆａｂ断片Ｔｅ３３（ｐｄｂコード１ＺＥＡ＿Ｈ）の構造を、ＶＬのために１.７８Ａの分解能で使用した。これは、ループについて１６Ｂ５と同じカノニカル構造を保持していた。Ｄｓｂｂ−Ｆａｂ複合体（ｐｄｂコード２ＺＵＱ＿Ｂ）でのＦａｂ結晶構造を用いて、１６Ｂ５のＶＨドメインをモデル化した。これは、３．３Ａの分解能で解析すると、ＣＤＲ−Ｈ１およびＣＤＲ−Ｈ２について同じカノニカル構造を含み、またねじれベースを有する同じ長さのＣＤＲ−Ｈ３を含んでいた。バイオルミネート（ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ）プログラムを用いて、１６Ｂ５ Ｆｖの大まかな構造をモデル化した。
【０１５８】
ＣＤＲ“Ｘ”ｅｄ １６Ｂ５ Ｆｖ配列を用いたＮＣＢＩの非冗長タンパク質配列データベースの検索により、マウスＣＤＲを移植するのに適切するヒトフレームワークの選択が可能になった。Ｖｋについては、ＮＣＢＩアクセッションコードＡＣＪ７１７１８．ｐｒｏを有するヒトκ軽鎖を選択した（配列番号２０）。このヒトκ軽鎖配列は、ＣＤＲ−Ｌ２およびＬ３について同じカノニカルクラスを有する。Ｖｈについては、ヒトＩｇ重鎖ＢＡＣ０２００２．１を選択した（配列番号１４）。これは１６Ｂ５ ＣＤＲ−Ｈ１およびＨ２のカノニカル形を共有し、Ｈ３は予測されるねじれベースと共に８残基長である。
【０１５９】
ヒト化重鎖および軽鎖の設計ならびにこれらのヒトフレームワークに基づく復帰突然変異を、それぞれ表５および表６に示す。
【０１６０】
配列番号１５の配列を有するヒト化１６Ｂ５可変重鎖（Ｈ１）を設計した。この設計は、３つの復帰突然変異：Ｒ１３Ｋ、Ｖ４８Ｍ、およびＹ９８Ｆを含む。ヒトにおいてＲよりも高頻度であるため、１３位にはＫを選択した。ヒトにおいてＶよりも高頻度であるため、４８位にはＭを選択した。界面に位置しており、マウス残基を保持することが望ましい
ので、位置９８にはＦを選択した。
【０１６１】
３つのヒト化１６Ｂ５可変軽鎖配列を設計した：
バージョン１（Ｌ１）は、配列番号２１の配列を有し、３つの復帰突然変異のＤＩＮ、Ｍ４Ｌ、およびＹ３６Ｆを含む。ＨＣＤＲ２のＮ６１と潜在的な水素結合を形成するため、１位にＮを選択した。ＬＣＤＲ３のＫ９６、Ｑ９７およびＳ９８と接触するので、４位にＬを選択した。これは界面の残基のＦ１０４とも接触する。Ｆはできないが、ＹがＨＣＤＲ３のＤ１０６と水素結合できるので、３６位にＦを選択した。水素結合は、ＨＣＤＲ３機能に影響を与える可能性がある余分な相互作用を構成し、したがって、好ましくは回避される。
【０１６２】
バージョン２（Ｌ２）は、配列番号２２の配列を有し、４つの復帰突然変異のＤ１Ｎ、Ｍ４Ｌ、Ｙ３６Ｆ、およびＰ４３Ｓを含む。Ｄ１Ｎ、Ｍ４Ｌ、およびＹ３６Ｆの論理的根拠はバージョン１と同じである。ＳはＶＨ中のＱ１１０と水素結合を形成し、ＨＣＤＲ３に近いので、４３位にはＳを選択した。
【０１６３】
バージョン３（Ｌ３）は、配列番号２３の配列を有し、３つの復帰突然変異のＭ４Ｌ、Ｙ３６Ｆ、およびＰ４３Ｓを含む。これらの変異の各々についての理論的根拠は、バージョン１および２と同様である。
【０１６４】
【表５】
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2020109103.tif 000014
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【０１６５】
【表６】
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2020109103.tif 000018
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【０１６６】
実施例６．ヒト化１６Ｂ５抗体のタウ親和性
Ｈ１Ｌ１またはＨ１Ｌ２設計を有するヒト化１６Ｂ５抗体についての結合データを以下の表７に示す。比較のために、キメラ１６Ｂ５についての結合データも示す。ビアコア装置を用いてデータが得られた。バージョンＨ１Ｌ２は、キメラ１６Ｂ５のものと本質的に同じである最も強い親和性を有すると結論付けられた。ヒト化１６Ｂ５バージョンＨ１Ｌ１およびＨ１Ｌ３も十分な親和性を有していた。
【０１６７】
ビアコアＴ２００（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて表面プラズモン共鳴測定を行った。全ての実験を、抗マウスまたは抗ヒト捕捉抗体をアミン結合することにより調製したＣＭ５センサーチップ上で、３０μｌ／分で１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０.０５％のＴｗｅｅｎ−２０の移動相を用いて行った。１６Ｂ５（キメラ型またはヒト化型）を固定した捕捉抗体に結合させ、精製した様々な濃度の組換えｈタウ．Ｐ３０１Ｌを、逐次反復で抗体複合体に適用した。反復ステップは、高塩または低ｐＨの再生ステップで分離した。抗体と抗原の異なる調製物を用いて実験を繰り返した。分析は、搭載されているビアコアソフトウェアを用いて行った。
【０１６８】
【表７】
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【０１６９】
実施例７．タウのヒト化１６Ｂ５抗体との免疫沈降検出
６のＢｒａａｋスコアを有するアルツハイマー病患者の前頭皮質の死後試料を、次の順序で、可溶化力を増加させる緩衝液で連続的に抽出した：（ｉ）高塩緩衝液（２０ｍＭのトリス、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１０％スクロース、７５００ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ７．４）、（ｉｉ）トリトン緩衝液（２０ｍＭのトリス、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１０％スクロース、１％のトリトンＸ１００、５００ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ７.４）、（ｉｉｉ）サルコシル緩衝液（１０ｍＭのトリス、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１０％スクロース、５００ｍＭのＮａＣｌ、１％サルコシル、ｐＨ７.４）。
【０１７０】
各試料について、高塩可溶性画分２００マイクログラム、またはサルコシル不溶性画分２０マイクログラムを、４００マイクロリットルの免疫沈降緩衝液（１０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０.５％のトリトンＸ１００、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７.４）に希釈した。試料を、プロテインＧ磁気ビーズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）でプレクリアし、抗体５マイクログラムを各チューブに添加した。使用した抗体には次のものが含まれる：１）対照としてのマウスの非免疫ＩｇＧ抗体（ｍＩｇＧ）；２）対照としてのヒト非免疫ＩｇＧ抗体（ｈＩｇＧ）；３）キメラ１６Ｂ５抗体（Ｃｈｉ１６Ｂ５）；４）ヒト化１６Ｂ５、バージョンＨ１Ｌ２（ｈ１６Ｂ６−Ｈ１Ｌ２）；およびヒト化１６Ｂ５、バージョンＨ１Ｌ３（ｈ１６Ｂ６−Ｈ１Ｌ３）。プレクリア溶解物および抗体を４℃で２時間インキュベートした。抗体／抗原複合体を、プロテインＧ磁気ビーズを用いて沈殿させ、沈殿物をＰＢＳ／３５０ｍＭのＮａＣｌで十分に洗浄した。Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を用いて溶出した後、溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ポリクローナル抗タウ抗体（ＤＡＫＯ社）を用いてブロットした。
【０１７１】
図７に示すように、キメラ１６Ｂ５およびヒト化１６Ｂ５ Ｈ１Ｌ２およびＨ１Ｌ３は、アルツハイマー脳からの可溶性画分と不溶性画分の両方でタウを認識した。
【０１７２】
実施例８．アルツハイマー病の脳におけるマウスおよびヒト化１６Ｂ５タウ抗体の免疫組織化学的特性
マウスモノクローナル抗タウ抗体１６Ｂ５ならびにその２つのヒト化変異型であるｈ１６Ｂ５−Ｈ１Ｌ２およびｈ１６Ｂ５−Ｎ１Ｄを、アルツハイマー病のドナーおよび非罹患高齢者対照からのヒト脳皮質の新鮮凍結切片上で免疫組織化学的試験も行った。
【０１７３】
方法：
ヒト脳組織
前頭皮質を、サン衛生研究所（Ｓｕｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から入手した。症例には、アルツハイマー病と診断され、死後の神経病理学的評価で確認された６人の患者（平均年齢８６.８±０.４０ＳＥＭ）、および３人の非罹患高齢者対照（平均年齢７７±９.７ＳＥＭ）が含まれた。症例の人口統計学データを以下の表８に記載する。免疫組織化学を、スライドにマウントし、軽くアセトン固定した１０μｍの凍結切片上で行った。
【０１７４】
【表８】
2020109103.tif 000021
【０１７５】
免疫組織化学
免疫ペルオキシダーゼ法は、ヤギ抗マウス免疫グロブリンにコンジュゲートしたペルオキシダーゼ標識ポリマー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋システムＨＲＰ標識ポリマー；Ｄａｋｏ Ｋ４００１）または直接ビオチン化したヒト化抗体用のベクターＡＢＣ増幅システム（ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ；ＰＫ−６１００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のいずれかからなる主要な検出システムであった。染色をＤＡＢ色原体（液体ＤＡＢ＋基質色素原システム；Ｄａｋｏ Ｋ３４６８）を用いて可視化し、茶色の堆積物が生成した。
【０１７６】
陰性対照は、ＩｇＧアイソタイプ対照抗体を用いるか、または一次抗体を省略して隣接切片上で全免疫組織化学的手順を実行することからなっていた。
【０１７７】
免疫蛍光標識
二重免疫蛍光染色を行い、抗体のマウス変異型およびヒト化変異型、様々なリン酸化エピトープを認識する他のタウ抗体と、アミロイドベータの関係を決定した。組織切片を、ビオチン化またはＦＩＴＣタグ付きヒト化１６Ｂ５変異型（１μｇ／ｍＬ）およびマウス抗体（モノクローナル１６Ｂ５（１μｇ／ｍＬ）、ＡＴ８（１：１０００）、ＡＴ１００（１：１０００）、または３Ｄ６（μｇ／ｍＬ）のいずれか）を含む抗体カクテルで並行して染色した。マウス抗体は、４８８または６３５フルオロフォア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体で検出した。ビオチニル化ヒト化抗体は、ストレプトアビジン６３５で検出した。
【０１７８】
プレ吸収
標的抗原に対する抗体の特異性を評価するために、１μｇ／ｍＬの１６Ｂ５抗体を４℃で一晩、５０μｇ／ｍＬの精製ヒトＰ３０１Ｌタウまたは野生型シヌクレイン（無関係なタンパク質）でプレ吸収した。次いで、これらの抗体を組織に適用し、上記のように免疫組織化学手順を行った。
【０１７９】
画像解析
スライドをオリンパスＢＸ６１顕微鏡、オリンパスＮａｎｏｚｏｏｍｅｒ ２．０ＨＴ、またはライカＳＰＥスペクトル共焦点システムのいずれかを用いて画像化した。画像は、ＴＩＦＦファイルとして収集した。
【０１８０】
結果
以下の表９に示すように、マウスモノクローナル抗体１６Ｂ５および両方のヒト化変異型は、アルツハイマー病の組織上で応答性を示し、神経網スレッドを顕著に、神経原線維変化（主に球形）およびいくつかのタウ陽性老人斑をある程度染色した。ほとんどの１６Ｂ５ＡＤ−線維性病変は灰白質に限られていたが、ある程度の応答性が白質でも検出された。対照的に、非疾患対照組織は、拡散背景（ｄｉｆｆｕｓｅ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）応答性を示したが、ＡＤ組織で検出される病状については陰性であった。
【０１８１】
二重標識実験を、１６Ｂ５のマウスモノクローナルバージョンならびに（１）両方のヒト化変異型、（２）様々なリン酸化エピトープにてタウを認識する抗体、および（３）ベータアミロイドを用いて行い、抗体変異型によって認識される病変をさらに特徴付けた。
【０１８２】
ｈ１６Ｂ５−Ｈ１Ｌ２とｈ１６Ｂ５−Ｎ１Ｄの両方は、ＡＤ−原線維病理学的構造において高度な合同を有するモノクローナル１６Ｂ５抗体と共局在化した。ｈ１６Ｂ５−Ｈ１Ｌ２はまた、セリン２０２およびトレオニン２０５（ＡＴ８）、セリン２１２およびトレオニン２１４（ＡＴ１００）、およびセリン３９６（組織内独自の抗体、２０Ｈ１）を含む様々なリン酸化タウエピトープに免疫応答性であることが示された病理も検出した。最後に、Ｎ末端アミノ酸配列（３Ｄ６；ａａ１−５）を認識するアミロイドβ抗体と１６Ｂ５で二重標識すると、アミロイド斑上にΑβ構造と１６Ｂ５免疫応答性構造の間にほとんど共局在性がないことが示された。
【０１８３】
１６Ｂ５の免疫応答性を、十分に特徴付けられた市販のモノクローナル抗タウ抗体（Ｄａｋｏ社）と比較した場合、両方ともタウ陽性老人斑、神経網スレッド、および神経原線維変化を含む原線維ＡＤ病理を染色した。
【０１８４】
抗体の特異性は、精製した組換えＰ３０１Ｌタウでのプレ吸収により評価した。１６Ｂ５をＰ３０１Ｌタウでプレ吸収させた時に、染色の減少が観察されたが、抗体を同じモル濃度で無関係なタンパク質（野生型シヌクレイン）でプレ吸収させた時には、染色は影響を受けなかった。
【０１８５】
ＩｇＧアイソタイプ対照抗体と一次抗体の省略セクションの両方は、試験した全ての組織全体の染色について陰性であった。
【０１８６】
【表９】
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【０１８７】
引用した（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号、およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号などを含む）全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許および特許出願が全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示される場合と同程度に、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＧｅｎＢａｎｋおよびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔの受入番号などに関連する配列中でいかなる差異が発生した場合にも、本出願は、実際の出願日を意味する本出願の有効出願日以後か、または関連する受入番号を開示する優先権出願の日付より早くに引用された受入番号と関連する配列を指す。本発明の任意の特徴、工程、要素、実施形態、または態様は、特に具体的に示されない限り、任意の他のものと組み合わせて使用できる。本発明は、明確さおよび理解の目的のために例示および実施例によっていくらか詳細に説明してきたが、特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲内で実施され得ることは明らかであろう。
【図１】
2020109103.tif 000023
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月1日(2020.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号Ｐ１０６３６−８）の残基２４〜４６内のエピトープに特異的に結合する、ヒト、ヒト化、キメラまたはベニヤモノクローナル抗体。
【請求項２】
配列番号１の残基３０〜３９内のエピトープに結合する、ヒト化、キメラまたはベニヤ抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号１５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域および配列番号２１または２３と少なくとも９０％同一である成熟軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
配列番号１７のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１８のＣＤＲ−Ｌ２、配列番号１９のＣＤＲ−Ｌ３、並びに配列番号１１または配列番号２４のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１３のＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
位置Ｈ１３、Ｈ４８およびＨ９１が、それぞれＫ、ＭおよびＦによって占有され、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３のうち少なくとも３つが、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占有されている、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
配列番号１５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域および配列番号２１または２３と少なくとも９５％同一である成熟軽鎖可変領域を含む、請求項３または４に記載の抗体。
【請求項７】
前記成熟重鎖可変領域が重鎖定常領域に融合され、前記成熟軽鎖可変領域が軽鎖定常領域に融合されている、請求項３〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
前記重鎖定常領域が、天然のヒト定常領域と比較してＦｃγ受容体への結合が低減した前記天然のヒト定常領域の変異型である、請求項３〜７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
前記重鎖定常領域がＩｇＧ１アイソタイプである、請求項７または８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号１５と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が配列番号２１または２３と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３または８に記載の抗体。
【請求項１１】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号２５によりコードされ、前記成熟軽鎖可変領域が配列番号２６または２８によりコードされる、請求項３に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項３〜１１のいずれか１項に記載の抗体の前記重鎖および／または軽鎖をコードする核酸を含むポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
タウと関連する疾患、任意にアルツハイマー病、の治療法または効果的な予防法に用いるための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
前記抗体の重鎖が、Ｃ末端リジンを有するまたは有しない配列番号２９の配列を有するヒトＩｇＧ１定常ドメインを含み、前記抗体の軽鎖が、配列番号３２の配列を有するヒトκ定常領域を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体。