(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞の観察時に焦点距離の調整を安定的かつ容易にすることにより、細胞の培養および観察を容易にし、または、自動化する方法の提供。【解決手段】細胞培養観察用容器に培養液に含まれる細胞を注入する注入ステップと、前記細胞培養観察用容器で前記細胞を継代させる継代ステップと、前記継代ステップで継代された細胞を観察する観察ステップと、前記継代ステップで継代した細胞を遠心分離で培養液と培養細胞とに分離する遠心分離ステップとを含み、前記細胞培養観察用容器は、オートフォーカスの焦点調整に利用可能なマークを有し、前記観察ステップは、オートフォーカス機能を有する顕微鏡により前記マークを利用して焦点距離が調整されることを特徴とする細胞培養観察方法。【選択図】図５
2020103189.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養観察用容器に培養液に含まれる細胞を注入する注入ステップと、
前記細胞培養観察用容器で前記細胞を継代させる継代ステップと、
前記継代ステップで継代された細胞を観察する観察ステップと、
前記継代ステップで継代した細胞を遠心分離で培養液と培養細胞とに分離する遠心分離ステップとを含み、
前記細胞培養観察用容器は、オートフォーカスの焦点調整に利用可能なマークを有し、
前記観察ステップは、オートフォーカス機能を有する顕微鏡により前記マークを利用して焦点距離が調整されることを特徴とする、細胞培養観察方法。
【請求項２】
前記細胞培養観察用容器は、複数の側周壁を有し、前記複数の側周壁のうちのいずれか１つの側周壁は、内側面に前記側周壁を区分けるように一端から他端まで伸びる凸状の線を有し、前記継代ステップでは、初代継代が前記側周壁の前記内側面の区分けされた一方で行われる、請求項１に記載の細胞培養観察方法。
【請求項３】
前記細胞培養観察用容器は、多角柱状に形成され、前記多角柱状の閉鎖した多角形状の底面と、前記底面に対向する上端部に設けられた開口と、当該開口を封する蓋体と、前記の側周を形成する側周壁とを備え、
前記遠心分離ステップでは、前記細胞培養観察用容器の角部が遠心方向に向くように、前記細胞培養観察用容器が、その延在方向を鉛直方向に対して４５°傾斜して取り付けられた状態で遠心分離される、請求項１または２に記載の細胞培養観察方法。
【請求項４】
前記細胞培養観察用容器で細胞を継代させる継代ステップにより継代された細胞を観察する培養細胞観察システムであって、
前記細胞培養観察用容器は、オートフォーカスの焦点調整に利用可能なマークを有し、
前記細胞観察ステップでは、オートフォーカス機能を有する顕微鏡により前記マークを利用して焦点距離が調整されることを特徴とする、培養細胞観察システム。
【請求項５】
さらに、ＸＹＺ軸に移動可能な移動機構を備え、
前記オートフォーカス機能により前記マークを基準として、Ｚ軸において焦点距離を調整するとともに、ＸＹ平面において測地位置を調整する、請求項４に記載の培養細胞観察システム。
【請求項６】
多角柱状に形成され、前記多角柱状の閉鎖した多角形状の底面と、前記底面に対向する上端部に設けられた開口と、当該開口を封する蓋体と、前記の側周を形成する側周壁とを備える細胞培養観察用容器を利用して遠心分離する遠心分離システムであって、
前記細胞培養観察用容器の角部が遠心方向に向くように、前記細胞培養観察用容器が、その延在方向を鉛直方向に対して４５°傾斜して取り付けられた状態で遠心分離されることを特徴とする、遠心分離システム。
【請求項７】
複数の前記細胞培養観察用容器を回転の中心を中心軸として点対象に配置した状態で固定するロータを備える、請求項６に記載の遠心分離システム。
【請求項８】
多角柱状に形成され、前記多角柱状の閉鎖した多角形状の底面と、前記底面に対向する上端部に設けられた開口と、当該開口を封する蓋体と、前記の側周を形成する側周壁とを備える細胞培養観察用容器を利用して細胞を継代する継代システムであって、
前記複数の側周壁のうちのいずれか１つの側周壁は、内側面に前記側周壁を区分けるように一端から他端まで直線状に伸びる凸状部を有し、
前記凸状部を有する前記側周壁を下側の水平面とした状態で、前記内側面の前記凸状部で区分けされた領域の一方で初代継代が行われる、細胞継代システム。
【請求項９】
前記細胞培養観察用容器を所定の角度で回転させながら、各側周壁の前記内側面で継代が行われる、請求項８に記載の細胞継代システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養し、また、培養された細胞を観察するための容器に関し、詳細には、間葉系細胞や間葉系幹細胞などの付着性細胞を含む各種細胞を培養および観察するための方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、生体から単離した様々な種類の細胞を、生体環境を模した人工的な環境下にて培養し、さらに必要に応じて遺伝子導入を行い、それら細胞や、細胞から産生される各種因子を大量に得て、各種の疾患治療に用いることが行われている。そのような細胞として、細胞と足場との間で各種分子による相互作用により、足場となる部位に付着し、増殖する性質を有する繊維芽細胞、間葉系細胞や間葉系幹細胞などの付着性細胞がある。それら付着性細胞は、付着容易な培養面を有する細胞培養用の容器を用いて増殖させることができる。
【０００３】
そのような細胞培養用の容器として、一般的には培養皿や培養用フラスコが用いられるが、一部には、特許文献１に記載のような細胞培養用容器を用いられる。特許文献１に記載の細胞培養用容器は、閉塞した下端部および相対向する上端部に液体用開口を有する８角柱の細胞培養用容器として構成されており、該８角柱の側周を形成する各面が平面状であり、該８角柱を形成する各面のうち相対向する２面が水平である。
【０００４】
特許文献１に記載の細胞培養観察用容器によれば、細胞を培養しながら細胞の状態を確認することが可能となり、初期細胞数が極めて少ない、または、得ることが困難な細胞を用いる場合であっても、大量培養条件を設定できる。また、培養面が平面状であることから、細胞密度の均一性を保ち、疾患治療に用いられる間葉系幹細胞のような未分化状態を維持するなど、特定の細胞性状を維持する必要がある付着性細胞を、均質、大量かつ安価に培養し増殖できるも。さらに、閉塞した下端部が円錐状又は８角錐を呈する構造とすることで、遠心チューブの機能を併せ持つ細胞培養観察用容器となり、更なるコスト低減を図っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１５６３６７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上述のような８角柱の細胞培養観察用容器では、該８角柱を形成する各側周面が平面状であり、透過性のある樹脂材料等により製作されていることから、細胞培養観察用容器で細胞を培養し、そのまま、顕微鏡等の観察システムにより細胞を観察することができるものの、細胞を観察する際に、観察システムの有するオートフォーカス機能により焦点距離を合わせようとすると、観察するたびに焦点が異なってしまい、培養細胞の観察を含む細胞培養の一連の流れを自動化することが困難となっていた。
【０００７】
本発明は、上記のような課題に鑑み、細胞の観察時に焦点距離の調整を安定的かつ容易にすることにより、細胞の培養および観察を容易にし、または、自動化することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（１）本発明に係る細胞培養観察方法は、細胞培養観察用容器に培養液に含まれる細胞を注入する注入ステップと、前記細胞培養観察用容器で前記細胞を継代させる継代ステップと、前記継代ステップで継代された細胞を観察する観察ステップと、前記継代ステップで継代した細胞を遠心分離で培養液と培養細胞とに分離する遠心分離ステップとを含み、前記細胞培養観察用容器は、オートフォーカスの焦点調整に利用可能なマークを有し、前記観察ステップは、オートフォーカス機能を有する顕微鏡により前記マークを利用して焦点距離が調整されることを特徴とする。
【０００９】
この細胞培養観察用方法では、細胞培養観察用容器がオートフォーカスの焦点調整に利用可能なマークを備えている。したがって、この細胞培養観察方法よれば、容器内で培養された細胞を観察する観察ステップにおいて、マークによってオートフォーカス機能が、一律に焦点距離を調整する。これにより、測定のたびに焦点距離が異なり、観察される細胞寸法が変化してしまうということがなく、細胞の観察を容易にすることができる。
【００１０】
（２）前記した細胞培養観察方法において、前記細胞培養観察用容器は、複数の側周壁を有し、前記複数の側周壁のうちのいずれか１つの側周壁は、内側面に前記側周壁を区分けるように一端から他端まで伸びる凸状の線を有し、前記継代ステップでは、初代継代が前記側周壁の前記内側面の区分けされた一方で行われてもよい。そのようにすれば、区分けされて面積の小さくなった側周壁の内側面の一方にのみ培養液を集めることができ、少量の培養液で初代継代を行うことができる。
【００１１】
（３）前記した細胞培養観察方法において、前記細胞培養観察用容器は、多角柱状に形成され、前記多角柱状の閉鎖した多角形状の底面と、前記底面に対向する上端部に設けられた開口と、当該開口を封する蓋体と、前記の側周を形成する側周壁とを備え、前記遠心分離ステップでは、前記細胞培養観察用容器の角部が遠心方向に向くように、前記細胞培養観察用容器が、その延在方向を鉛直方向に対して４５°傾斜して取り付けられた状態で遠心分離されてもよい。そのようにすれば、細胞培養観察用容器を遠心分離する際に、多角形状の底面部と側周壁の内側面とから形成される角部が遠心方向に向き、遠心分離により培養液と培養細胞との分離が促進し、また遠心分離後の細胞や培養液回収が容易になる。また、遠心終了過程で回転を減速すると培養液量が適切な場合、沈殿部が上部に上清が下部に自動的に分離できる。
【００１２】
（４）本発明に係る培養細胞観察システムは、前記細胞培養観察用容器で細胞を継代させる継代ステップにより継代された細胞を観察する培養細胞観察システムであって、前記細胞培養観察用容器は、オートフォーカスの焦点調整に利用可能なマークを有し、前記細胞観察ステップでは、オートフォーカス機能を有する顕微鏡により前記マークを利用して焦点距離が調整されることを特徴とする。
【００１３】
この培養細胞観察システムによれば、細胞培養観察用容器がオートフォーカスの焦点調整に利用可能なマークを備えている。したがって、この細胞培養観察方法よれば、容器内で培養された細胞を観察する観察ステップにおいて、マークによってオートフォーカス機能が、一律に焦点距離を調整する。これにより、測定のたびに焦点距離が異なり、観察される細胞寸法が変化してしまうということがなく、細胞の観察を容易にすることができる。また、マークにスケール機能をもたせることにより、微妙なスケールの測定が精度よく可能になる。
【００１４】
（５）前記した培養細胞観察システムにおいて、さらに、ＸＹＺ軸に移動可能な移動機構を備え、前記オートフォーカス機能により前記マークを基準として、Ｚ軸において焦点距離を調整するとともに、ＸＹ平面において測地位置を調整してもよい。そのようにすれば、マークを基準としてＺ軸において焦点距離が調整されるとともに、ＸＹ平面の観察位置も同じマークを基準として調整されるため、細胞の観察を容易にすることができる。また、当該マーカーで規定される位置からの連続的観察により、いずれの観察点においても細胞の接着位置を基準とした立体像、すなわちボトル樹脂材料の位置の領域からの立体像を再構築することができる
【００１５】
（６）本発明に係る遠心分離システムは、多角柱状に形成され、前記多角柱状の閉鎖した多角形状の底面と、前記底面に対向する上端部に設けられた開口と、当該開口を封する蓋体と、前記の側周を形成する側周壁とを備える細胞培養観察用容器を利用して遠心分離する遠心分離システムであって、前記細胞培養観察用容器の角部が遠心方向に向くように、前記細胞培養観察用容器が、その延在方向を鉛直方向に対して４５°傾斜して取り付けられた状態で遠心分離される。
【００１６】
そのようにすれば、細胞培養観察用容器を遠心分離する際に、多角形状の底面部と側周壁の内側面とから形成される角部が遠心方向に向き、遠心分離により培養液と培養細胞との分離が促進し、また遠心分離後の細胞や培養液回収が容易になる。
【００１７】
（７）前記した遠心分離システムにおいて、複数の前記細胞培養観察用容器を回転の中心を中心軸として点対象に配置した状態で固定するロータを備えてもよい。そのようにすれば、ロータが回転においてバランスよく細胞培養観察用容器を配置されることになるため、遠心分離が容易になる。
【００１８】
（８）本発明に係る細胞継代システムは、多角柱状に形成され、前記多角柱状の閉鎖した多角形状の底面と、前記底面に対向する上端部に設けられた開口と、当該開口を封する蓋体と、前記の側周を形成する側周壁とを備える細胞培養観察用容器を利用して細胞を継代する継代システムであって、前記複数の側周壁のうちのいずれか１つの側周壁は、内側面に前記側周壁を区分けるように一端から他端まで直線状に伸びる凸状部を有し、前記凸状部を有する前記側周壁を下側の水平面とした状態で、前記内側面の前記凸状部で区分けされた領域の一方で初代継代が行われる。
【００１９】
この細胞継代システムによれば、そのようにすれば、区分けされて面積の小さくなった側周壁の内側面の一方にのみ培養液を集めることができ、少量の培養液で初代継代を行うことができる。
【００２０】
（９）前記した細胞継代システムにおいて、前記細胞培養観察用容器を所定の角度で回転させながら、各側周壁の前記内側面で継代が行われる。そのようにすれば、各側周壁において、順次、細胞の継代が行われ、効率的に細胞を継代することができる。これにより、細胞の培養が容易になる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、細胞の観察時に焦点距離の調整を安定的かつ容易にすることにより、細胞の培養および観察を容易にし、または、自動化する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の実施形態に係る細胞培養観察用容器を示す正面図である。
【図２】本発明の実施形態に係る細胞培養観察用容器の容器本体を示す図であり、（Ａ）は容器本体の正面図、（Ｂ）は容器本体の側面図、（Ｃ）は容器本体の平面図、（Ｄ）は容器本体の底面図を示す。
【図３】本発明の実施形態に係る本体容器の断面図であり、（Ａ）は図２に示すａ―ａの断面図であり、（Ｂ）は図３（Ａ）に示すｂ−ｂの断面図である。
【図４】本発明の実施形態に係る細胞培養観察用容器の一部断面図であり、図１に示すｃ−ｃの断面図である。
【図５】本発明の実施形態に係る細胞培養観察用容器を観察する観察システムＶＳの概念図である。
【図６】図５に示す細胞培養観察用容器が観察システムＶＳにより観察される一部を拡大した概略図である。
【図７】図５に示す細胞培養観察用容器の焦点距離について説明するための概略図である。
【図８】焦点距離により、顕微鏡で観察される像の見え方がことなることを示すサンプル図である。
【図９】本発明の実施形態に係る細胞培養観察用容器を回転させて細胞継代させる回転式細胞培養システムの概念図である。
【図１０】図９に示す細胞培養観察用容器の下側の側周壁付近を示す側断面図である。
【図１１】本発明の実施形態に係る細胞培養観察用容器を遠心分離する遠心分離システムの概念図である。
【図１２】図１１に示す細胞培養観察用容器を遠心分離している際に、容器内の培養液が角部に集中することを示す概念図である。
【図１３】本発明の実施形態に係る細胞培養観察方法を示すフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
［細胞培養観察用容器］
【００２４】
まず、本発明の実施形態に係る細胞培養観察方法、培養細胞観察システムＶＳ、遠心分離システムＣＳ、回転式細胞継代システムＲＳについて、図１〜図１２を参照して詳細説明する。
【００２５】
まず、細胞培養観察方法に利用される細胞培養観察容器Ｃは、図１〜図４に示すように、概略、多角柱状に形成されている。細胞培養観察用容器Ｃは、底面１０と側周壁２０と開口ｈとを備える容器本体１と、容器本体１の開口ｈを蓋する蓋体２とを含む。容器本体１は、多角形状の底面１０と、底面１０に対向する上端部に設けられた開口ｈと、筒状の側周を形成する側周壁２０とを備える。また、容器本体１は、側周壁２０の底面１０部と反対側に連続し、開口ｈを形成する首部３０を備える。なお、本実施形態において開口ｈは円形の孔であるが、例えば、四角形の孔であってもよい。
【００２６】
ここで、容器本体１の首部３０の外側と蓋体２の内側とは、相互に螺合するように雄ねじ３１および雌ねじ（図示なし）を形成されている。これにより、蓋体２は容器本体１に収容された培養液Ｗを外部に漏らさないように容器本体１に蓋をする。また、首部３０は、フランジ部３２を有し、容器本体１を上向きに保持したり、横向きに保持したり、または、開口ｈを斜め下向きにして保持することができる。
【００２７】
本実施形態において、容器本体１は、合成樹脂を材料として形成されており、容器本体１の内側面には、細胞接着に最適な表面処理を施されている。また、蓋体２も同様の材料により形成される。さらに、本体容器は、透過性を有し、容器の内部を観察可能となるように形成されている。なお、容器本体１は、首部３０とその他の部分とを別々に成形して製作されてもよい。
【００２８】
本実施形態において、細胞培養観察用容器Ｃの容器本体１は、正六角柱状に形成されており、底面１０部は正六角形状を有し、これに対応するように６つの側周壁２０を備える。側周壁２０は、それぞれ、矩形の平板形状を有する。したがって、容器本体１において、側周壁２０の内側面は、各辺が１２０°の角度を有し、また、並行に対向する側周壁２０の対が３つ形成されている（図３（Ｂ）を参照）。
【００２９】
また、側周壁２０の内側面は、底面１０部から略９０°の角度で立ち上がるように形成されており（図３（Ａ）を参照）、六角形状の底面１０部と側周壁２０とは、６つの角部ｋを形成している。細胞培養観察用容器Ｃは、顕微鏡のような培養細胞観察システムＶＳにより観察されるため、少なくとも側周壁２０は細胞培養観察用容器Ｃの内部を観察可能なように透過性を有する。なお、蓋体２は、透過性を有しなくてもよい。
【００３０】
側周壁２０はオートフォーカスの焦点調整に利用可能なマークを備える。本実施形態において、マークは、底面１０に対して４５°傾斜して側周壁２０の外側面に設けられ直線状の線傷２１である。マークは、例えば、レーザ加工により形成することができる。レーザ加工によれば形成された線傷２１の深さを精度よく調整できる。
【００３１】
本実施形態において、線傷２１は、各側周壁２０の角部ｋおよび中央に形成されている。角部ｋに形成された線傷２１は、後述する遠心分離装置に細胞培養観察用容器Ｃがセットされた際に、角部ｋに集められた培養液Ｗの目盛りとしても機能する。また、中央に形成された線傷２１は、
【００３２】
また、１つの矩形の側周壁２０の内側面には、上下方向（底面１０側から開口ｈ側）に一端から他端まで伸びる凸状部を左右方区の略中央に有する。これにより、当該側周壁２０の内側面は、２分割に区分けされている。これにより、細胞を回転培養する初代継代において、区分けされた一方に培養液Ｗを貯めることで、少量の培養液Ｗで初代継代を行うことができる。
【００３３】
なお、上記細胞培養観察用容器Ｃは、培養液Ｗを容器内に収容し、細胞を培養する際に十分な強度を持つ程度の壁圧を発揮する厚みを有したものとなるようにする必要がある。さらに、細胞培養観察用容器Ｃによって遠心分離により細胞回収する場合は、遠心分離に十分耐えることができる強度をもつように厚さを設計される。
【００３４】
細胞培養観察用容器Ｃは、多角柱状に成形できるように設計した金型を用いて製造し、前記した合成樹脂を用いる場合には、吹き込み成形により一体成形されたものとすることができる。培養する細胞の種類により、培養途中にて、顕微鏡などを利用して検鏡し培養中の細胞状態を詳細に確認する必要が生じる場合がある。
【００３５】
そこで、良好な状態で検鏡し培養中の細胞状態を詳細に確認することができるようにするため、金型の側周壁を形成する部分に、例えば鏡面処理を施すなどして、歪の少ない側周壁２０を有する数細胞培養観察用容器Ｃを製造することができる。
【００３６】
さらに、多角柱の細胞培養観察用容器Ｃの培養面への細胞の付着性を高めるために培養面を修飾するための成分として、ゼラチン、細胞外基質又はポリカチオン類を、培養面の表面に塗布されたものとしてもよく、または、物理化学的処理としてナノ構造処理、プラズマ処理、オゾン処理、マイクロウエーブ処理およびDLC（ダイアモンドライクカーボン）コーティング並びに接着してもよい。ゼラチン、細胞外基質又はポリカチオン類は、細胞培養に用いられているものであればその種類を特に限定しない。細胞外基質としては、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなど、ポリカチオン類としては、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリオルチニンなどを用いることができる。
【００３７】
また、上記の各成分は、培養面へのより高い付着性を発揮させることを望む部位に塗布することができ、多角柱の細胞培養観察用容器Ｃの培養面となる全ての面に塗布しても良く、１面おきに４面塗布しても良く、所望の面のみに塗布しても良く、また、面によって異なる成分を塗布したものとしてもよい。
【００３８】
［培養細胞観察システム］
【００３９】
図５に示すように、培養細胞観察システムＶＳは、細胞培養観察用容器Ｃが長手方向を水平方向に沿わせた状態で観察台（図示なし）に配置され、観察台に配置された細胞培養観察用容器Ｃの上側に位置する側周壁２０面側から照明Ｖ１により光を照射され、下側に位置する側周壁２０の下側からマイクロスコープＶ２により観察される。
【００４０】
詳細には、図６に示すように、観察対象の細胞ｗが側周壁２０の内側面に付着しており、周壁２０の外側面からマイクロスコープＶ２により観察される。本実施形態において、一方の面が下側の水平面となって観察台に置かれ、対向する他方の面が上側の水平面となって光の照射を受け、一方の面が下側の水平面から細胞が観察される。このとき、マークの設けられた側周壁２０を観察される一方の面（下側）となるように、細胞培養観察用容器Ｃが配置する。
【００４１】
これにより、図７に示すように、細胞培養観察用容器Ｃの下側の水平面を観察するとき、線傷２１を基準にして、オートフォーカスの焦点調整が行われる（図７のＬｃ）。線傷２１がない場合は、オートフォーカスの焦点調整が側周壁２０の外側の面（図７のＬａ）となったり、内側の面（図７のＬｂ）となったり、または付着した細胞そのもの（図示なし）となってしまっていた。そうすると、焦点調整が観察のたびに異なり、図８に示すように、奥行距離（被写界深度）が異なる観察対象物に対して、焦点の合う対象物が異なってしまったり、観察される細胞の寸法が異なってしまうという問題があった。
【００４２】
マークを基準にすることで、オートフォーカスの焦点調整が一律に行われるため、再現性の高い観察が可能となる。例えば、本実施形態において、マークは、側周壁２０の外側面に設けられた線傷２１であるため、線傷２１の底面１０がオートフォーカスの焦点調整の基準となる。なお、基準となる底面１０の深さと、側周壁２０の厚さを把握しておき、観察された像に補正をかけるようにしてもよい。
【００４３】
［回転式細胞継代システム］
【００４４】
図９に示すように、回転式細胞継代システムＲＳは、細胞培養観察用容器Ｃの長手方向を水平方向に沿わせ、側周壁２０の１つの面が水平面となる状態で固定する回転式固定部材Ｒ１を備える。本実施形態において、回転式固定部材Ｒ１は、六角柱状の細胞培養観察用容器Ｃの側周壁２０が向かい合い、かつ、大きな隙間が生じることなく細胞培養観察用容器Ｃが配置されるように細胞培養観察用容器Ｃの蓋体２を固定する。これにより、細胞培養観察用容器Ｃは、概略、空間充填した状態で回転式冶具Ｒ１に固定される。
【００４５】
回転式細胞継代システムＲＳでは、回転式冶具Ｒ１が、所定の角度で回転した後、所定の時間停止し、再度所定の角度で回転するように稼動する。これにより、長手方向を水平方向に沿わせた細胞培養観察用容器Ｃは、各側周壁２０が順次、下側の水平面となるように回転する。本実施形態において、回転式冶具Ｒ１は、細胞培養観察用容器Ｃが正六角柱状のため、６０°毎に回転する。
【００４６】
細胞培養観察用容器Ｃでは、培養液Ｗが下側の水平面となった側周壁２０に貯まり、細胞が側周壁２０に付着して増殖する。したがって、本実施形態における回転式細胞継代システムＲＳでは、細胞培養観察用容器Ｃの各側周壁２０が繰り返し水平面となることにより、各側周壁２０の内面で細胞培養が繰り返し行われる。
【００４７】
なお、細胞培養の初代継代においては、培養される細胞の数量が少量であることが望ましい。したがって、図１０に示すように、凸状部を内側面に設けられた側周壁２０を下側の水平面とし、凸状部で２つの区分けされた一方の領域に培養液Ｗを貯留し、初代継代を行うことができる。これにより、効率よく初代継代を行うことができる。
【００４８】
［遠心分離システム］
【００４９】
図１１に示すように、遠心分離システムＣＳは、複数の細胞培養観察用容器Ｃを所定の状態で固定して回転するロータＣ１を備える。本実施形態において、ロータＣ１は、細胞培養観察用容器Ｃを鉛直方向に対して４５°の角度で傾け、２つの細胞培養観察用容器Ｃの蓋体２が交差するように固定する。また、ロータＣ１は、遠心分離機（図示なし）に組み込まれ、固定した細胞培養観察用容器Ｃの培養液Ｗに１０００Ｇ以上の遠心力を付与するべく高速に回転する。
【００５０】
遠心分離システムＣＳでは、細胞培養観察用容器ＣがロータＣ１に固定され、遠心分離機により高速回転される。これにより細胞培養観察用容器Ｃの培養液Ｗは、矢印ｐの方向に遠心力を受け、細胞培養観察用容器Ｃの角部ｋに集中して（図１１を参照）、遠心力により細胞と液体とに分離する。
【００５１】
［細胞培養観察方法］
【００５２】
図１３に示すように、本発明の実施形態に細胞培養観察方法は、細胞培養観察用容器に培養液に含まれる細胞を注入する注入ステップと、前記細胞培養観察用容器で前記細胞を継代させる継代ステップと、前記継代ステップで継代された細胞を観察する観察ステップと、前記継代ステップで継代した細胞を遠心分離で培養液と培養細胞とに分離する遠心分離ステップとを含む。
【００５３】
注入ステップ注入ステップは従来よく知られるように、培養対象の細胞を含む培養液をスポイド等の注入手段により細胞培養観察用容器に注入する。
【００５４】
継代ステップは、回転式細胞継代システムにより実行される。具体的には、培養液を注入された細胞培養観察用容器を水平方向に沿わせて回転式冶具に取り付け、回転式冶具を所定の間隔にて回転させる。なお、初代培養を含む継代培養に関しては、前述のように、下側の側周壁２０の区分けされた領域の一方において行われる。
【００５５】
観察ステップは、培養細胞観察システムにより実行される。具体的には、作業者が細胞培養観察用容器を水平方向に沿わせて、観察台に配置し、マークを基準としてオートフォーカスの焦点が調整され、側周壁に継代した細胞を観察する。観察ステップは、所定量の細胞が継代されたことが観察されるまで継代ステップと交互に行われる。
【００５６】
遠心分離ステップは、遠心分離システムにより実行される。具体的には、細胞培養観察用容器を鉛直方向に対して４５°傾いた状態でロータに取り付けて固定する。その後、所定の遠心力がかかるように、ロータを回転させる。このとき、細胞培養観察用容器の角部に培養液が集まり、角部の先端に細胞が集中するように分離する。
【００５７】
本発明の実施形態に係る細胞培養観察方法において、各システムを作業者が動作させる形態について説明した。しかし、各システムについては、作業者が動作させてもよいし、ロボットにより自動化してもよい。このとき、細胞培養観察用容器を用いれば、１つの容器で培養細胞観察システム、回転式細胞継代システム、遠心分離システムに対応でき、細胞培養観察方法の実施が容易になる。
【００５８】
［変形例］
【００５９】
本実施形態において、容器本体１は、合成樹脂を材料として形成される形態について説明した。しかし、容器本体１は、所定の強度および透過性を有すれば、他の材料で形成されてもよい。例えば、容器本体１は、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等の合成樹脂を材料として形成されてもよく、ガラスや石英等の無機材料、金属を材料として形成されてもよい。なお、製造の容易性、コスト低減、細胞培養状態の把握の容易性を考慮し、該樹脂材料として、好ましくは、ポリエチレンテレフタレート樹脂又はポリスチレン樹脂を用いるとよい。また、蓋体２も同様の材料により形成される。
【００６０】
本実施形態において、容器本体１は、正六角柱状に形成される形態について説明した。しかし、容器本体１は、多角柱状に形成されていれば他の形状に形成されていてもよい。例えば、正三角柱状、正四角柱状、正五角柱状等の側周壁２０の内側面が相互に形成する角度が等しい、正多角柱状に形成されてもよく、側周壁２０が相互に形成する角度が異なる多角柱状に形成されてもよい。特に、側周壁２０の内側面が相互に形成する角度が１２０°以下であれば、底角が、適度に鋭い角度となり、遠心分離の際に、底角に培養液Ｗを集めやすくなる。
【００６１】
本実施形態において、側周壁２０に設けられるマークは、底面１０に対して４５°傾斜して側周壁２０の外側面に設けられ直線状の線傷２１である形態について説明した。しかし、マークは、側周壁２０の内側面に形成されてもよく、例えば、線傷２１に限らず、点や×のような記号等であってもよく、印刷や成形時に形成されてもよい。ただし、製造の容易性、コスト低減、マークの視認性を考慮して線傷２１として形成するとよい。また、マークは、レーザ加工に限らず、印刷や、エッジングにより形成されてもよい。
【００６２】
本実施形態において、側周壁２０は、内側面に直線状に設けられた凸状部を形成されている。オートフォーカスの焦点調整では、この凸状部を基準として焦点調整を行ってもよい。また、凸状部は、矩形の側周壁２０の長手方向に延在するように形成されているが、短手方向に延在するように形成されてもよい。
【００６３】
本実施形態において、培養細胞観察システムＶＳは上側の水平面を観察する形態について説明した。しかし、培養細胞観察システムＶＳは、他の面を観察するようにしてもよい。例えば、水平面に限らず、斜めの面を観察してもよいし、下側の面を観察してもよい。どのような面を観察する場合であっても、観察される面にオートフォーカスの焦点調整に利用するマークが設けられていれば、測定のたびに一律の焦点距離にて細胞を観察することができる。
【００６４】
本実施形態において、培養細胞観察システムＶＳは、継代ステップで継代された細胞を観察する形態について説明した。しかし、培養細胞観察システムＶＳは、継代前後および継代の途中で細胞を観察してもよく、観察の際に細胞培養観察用容器からそのまま観察可能なため、細胞培養観察用容器内の時間的変化を観察することができる。細胞の時間的変化は、電子データとして蓄積することができる。このとき、電子データからなる観察データが膨大な量になるが、サーバー等を利用し、自動的に観察データを蓄積するようにしてもよい。また、観察データは遠隔操作により、取得または確認できるようにしてもよい。
【００６５】
本実施形態において、回転式細胞継代システムＲＳは、４つの細胞培養観察用容器Ｃを同時に培養する形態について説明した。しかし、細胞継代システムは、１つ、または複数の細胞培養観察用容器Ｃを同時に培養してもよい。複数の細胞培養観察用容器Ｃを同時に培養する場合に、細胞培養観察用容器が三角柱状、四角柱状、六角柱状等であれば、空間充填した状態で回転培養することにより、回転培養システムを省スペースで設計できる。
【００６６】
本発明の実施形態において、遠心分離システムＣＳは、細胞培養観察用容器Ｃをはめ込んで固定する形態について説明した。しかし、遠心分離システムＣＳは、細胞培養観察用容器の角部ｋが遠心方向に向くように細胞培養観察用容器Ｃを固定できればよく、例えば、蓋体２を取り付ける冶具を用いて細胞培養観察用容器Ｃを取り付けてもよい。
【００６７】
また、本実施形態において、遠心分離システムＣＳは、２つの細胞培養観察用容器Ｃを遠心分離する形態について説明した。しかし、遠心分離システムＣＳは、１つ、または３以上の細胞培養観察用容器Ｃを同時に遠心分離してもよい。その際に、細胞培養観察用容器の角部ｋが遠心方向に向くように、回転する中心を中心点として点対象に配置してもよい。
【００６８】
以上、本発明の具体的な態様の例を、上記の実施形態、実施例により説明したが、本発明は、当該実施形態および変形例に限定されるものではない。
【符号の説明】
【００６９】
Ｃ      細胞培養観察用容器
ＶＳ    培養細胞観察システム
ＲＳ    回転式細胞継代システム
ＣＳ    遠心分離システム
ｈ      開口
ｋ      角部
１      容器本体
２      蓋体
１０    底面
２０    側周壁
２１    線傷
３０    首部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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