(57)【要約】【課題】細胞又は組織の確認作業が容易である凍結保存用治具を提供する。【解決手段】細胞又は組織を保存液と共に載置する略シート状の載置部を有し、該載置部表面の水に対する接触角が３０度以下である細胞又は組織の凍結保存用治具。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞又は組織を保存液と共に載置する略シート状の載置部を有し、該載置部表面の水に対する接触角が３０度以下であることを特徴とする細胞又は組織の凍結保存用治具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞又は組織を凍結保存する際に使用する、細胞又は組織の凍結保存用治具に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞又は組織の優れた保存技術は、様々な産業分野で求められている。例えば、牛の胚移植技術においては、胚を凍結保存し、受胚牛の発情周期に合わせて胚を融解し、移植することが行われている。また、ヒトの不妊治療においては、母体から卵子又は卵巣を採取後、移植に適したタイミングに合わせるために凍結保存しておき、移植時に融解して用いることがなされている。
【０００３】
一般に、生体内から採取された細胞又は組織は、たとえ培養液の中であっても、次第に活性が失われていくことから、生体外での細胞又は組織の長期間の培養は好ましくない。そのため、生体活性を失わせずに長期間保存するための技術が重要である。優れた保存技術によって、採取された細胞又は組織をより正確に分析することが可能になる。また優れた保存技術によって、より高い生体活性を保ったまま細胞又は組織を移植に用いることが可能となり、移植後の生着率が向上することが望める。さらには、生体外で培養した培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シートのような移植のための人工の組織を、順次生産して保存しておき、必要な時に使用することも可能となり、医療の面だけではなく、産業面においても大きなメリットが期待できる。
【０００４】
細胞又は組織の保存方法として、例えば緩慢凍結法が知られている。この方法では、まず、例えばリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤を含有させることで得られた保存液に、細胞又は組織を浸漬する。該耐凍剤としては、グリセロール、エチレングリコール等の化合物が用いられる。該保存液に、細胞又は組織を浸漬後、比較的遅い冷却速度（例えば０．３〜０．５℃／分の速度）で、−３０〜−３５℃まで冷却することにより、細胞内外又は組織内外の溶液が十分に冷却され、粘性が高くなる。このような状態で、該保存液中の細胞又は組織をさらに液体窒素の温度（−１９６℃）まで冷却すると、細胞内又は組織内とその外の周囲の微少溶液がいずれも非結晶のまま固体となるガラス化が起こる。ガラス化により、細胞内外又は組織内外が固化すると、実質的に分子の動きがなくなるので、ガラス化された細胞又は組織を液体窒素中に保存することで、半永久的に保存できると考えられる。
【０００５】
しかしながら、前記緩慢凍結法では、比較的遅い冷却速度で冷却する必要があるために、凍結保存のための操作に時間を要する。また、冷却速度を制御するための装置又は治具を必要とする問題がある。加えて、前記緩慢凍結法では、細胞外又は組織外の保存液中に氷晶が形成されるので、細胞又は組織が該氷晶により物理的に損害を受けるおそれがある。
【０００６】
前記緩慢凍結法での問題点を解決するための方法として、ガラス化凍結法が提案されている。ガラス化凍結法とは、グリセロール、エチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）等の耐凍剤を多量に含む保存液の凝固点降下により、氷点下であっても氷晶ができにくくなる原理を用いたものである。この保存液を急速に液体窒素中で冷却させると、氷晶を生じさせないまま固体化させることができる。このように固体化することをガラス化凍結という。また、耐凍剤を多量に含む保存液は、ガラス化液と呼称される。
【０００７】
前記ガラス化凍結法の具体的な操作としては、耐凍剤を多量に含む保存液に細胞又は組織を浸漬させ、その後、液体窒素の温度（−１９６℃）で冷却する。ガラス化凍結法は、このような簡便かつ迅速な工程であるために、凍結保存のための操作に長い時間を必要としない他、温度制御をするための装置又は治具を必要としないという利点がある。
【０００８】
ガラス化凍結法を用いると、原理的には、細胞内外のいずれにも氷晶が生じないために凍結時及び融解時の細胞への物理的障害（凍害）を回避することができるが、適切なガラス化凍結を成し得るためには、ガラス化に用いる保存液に含有される耐凍剤の濃度を高いものとしなければならない。一方で、保存液に含まれる高濃度の耐凍剤は細胞にとっての化学的毒性が高い。
【０００９】
上記した背景から、細胞又は組織の凍結保存においては、保存液に含まれる高濃度の耐凍剤に由来する毒性を回避する観点から、細胞又は組織が保存液に暴露される時間（つまりは凍結されるまでの時間）が短時間であることが好ましく、操作者は迅速な操作が求められる。
【００１０】
また、適切なガラス化凍結を成し得るために、凍結速度は速ければ速いほど好ましいことが知られている。さらに、凍結後の融解時においても、細胞又は組織中への再氷晶形成を抑制する観点で、融解速度は速ければ速いほど好ましいことが知られている。
【００１１】
ガラス化凍結法を用いた細胞又は組織の凍結保存については、様々な方法で、様々な種類の細胞又は組織を用いた例が示されている。例えば、特許文献１では、動物又はヒトの生殖細胞又は体細胞へのガラス化凍結法の適用が、凍結保存及び融解後の生存率の点で、極めて有用であることが示されている。
【００１２】
ガラス化凍結法は、主にヒトの生殖細胞を用いて発展してきた技術であるが、最近では、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞への応用も広く検討されている。また、非特許文献１では、ショウジョウバエの胚の保存にガラス化凍結法が有効であったことが示されている。さらに、特許文献２では、植物培養細胞や組織の保存において、ガラス化凍結法が有効であることが示されている。このように、ガラス化凍結法は広く様々な種の細胞及び組織の保存に有用であることが知られている。
【００１３】
特許文献３、特許文献４では、ヒトの不妊治療分野で使用されているいわゆるクライオトップ法という方法で、卵付着保持用ストリップとして短冊状の可撓性かつ無色透明なフィルムを使用した卵凍結保存用具を使用して、顕微鏡観察下で該フィルム上に極少量の保存液と共に卵子又は胚を載置し、凍結保存する方法が提案されている。
【００１４】
特許文献５では、生物試料の載置部と、試料載置部を収納しうる凍結保存容器からなる構造の生物学的試料保存用デバイスが提案されている。本文献の試料載置部の素材は、生物学的試料の脱落を防止する観点から純水接触角が約６０〜９０度が好ましいことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特許第３０４４３２３号公報
【特許文献２】特開２００８−５８４６号公報
【特許文献３】特開２００２−３１５５７３号公報
【特許文献４】特開２００６−２７１３９５号公報
【特許文献５】国際公開第２００６／０５９６２６号パンフレット
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｓｔｅｐｏｎｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：１７０−１７２（１９９０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
特許文献３、特許文献４では、卵子又は胚を載置するフィルムの幅を制限することにより、少ない量の保存液と共に卵子又は胚を凍結保存し、優れた生存率を得る方法が提案されている。この方法では、作業者の操作によって、少量の保存液と共に、卵子又は胚をフィルム上に載せる必要があり、操作の難度が高いといった問題があった。また、卵子又は胚がフィルム上に載置されたことを顕微鏡下で確認するために、一度、保存液と共に卵子又は胚をフィルム上に載せた後に、余分な保存液を吸引してフィルム上から除去するといった煩雑な操作がされることもあるが、やはり操作の難度が高いといった問題があった。
【００１８】
特許文献５では、生物試料の載置部と、試料載置部を収納しうる凍結保存容器からなる構造の生物学的試料保存用デバイスが提案されているが、特許文献３、特許文献４と同様に、試料載置部に試料が載置されたことを確実に確認するために、余分な保存液を吸引して除去する操作が必要な場合があった。
【００１９】
本発明は、細胞又は組織の凍結保存作業を容易かつ確実に行うことが可能な、細胞又は組織の凍結保存用治具を提供することを主な課題とする。より具体的には、細胞又は組織を保存液に浸漬した後、顕微鏡観察下において細胞又は組織を載置部上に滴下付着した際に、載置された細胞又は組織を良好な視認性で確認することができる凍結保存用治具を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下の構成を有する細胞又は組織の凍結保存用治具（本明細書中、「細胞又は組織の凍結保存用治具」を、単に「凍結保存用治具」ともいう）によって、上記課題を解決できることを見出した。
【００２１】
細胞又は組織を保存液と共に載置する略シート状の載置部を有し、該載置部表面の水に対する接触角が３０度以下であることを特徴とする細胞又は組織の凍結保存用治具。
【発明の効果】
【００２２】
上記の発明によれば、顕微鏡観察下において、細胞又は組織を載置部上に滴下付着した際に、載置された細胞又は組織を良好な視認性で確認することができる凍結保存用治具を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の凍結保存用治具の一例を示す全体図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織を凍結保存する際に用いられるものである。本発明において、細胞とは、単一の細胞のみならず、複数の細胞からなる生物の細胞集団を含むものである。複数の細胞からなる細胞集団とは単一の種類の細胞から構成される細胞集団でも良いし、複数の種類の細胞から構成される細胞集団でも良い。また、組織とは、単一の種類の細胞から構成される組織でも良いし、複数の種類の細胞から構成される組織でも良く、細胞以外に細胞外マトリックスのような非細胞性の物質を含むものでも良い。
【００２５】
本発明に係る凍結保存作業は、細胞又は組織を極低温の冷媒を用いて凍結させる凍結作業、細胞又は組織を極低温の冷媒中で貯蔵する保管作業、細胞又は組織を融解液中で解凍する融解作業の一連の作業を含むものとする。
【００２６】
本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織の凍結保存作業に用いるものであり、好ましくは細胞又は組織のガラス化凍結保存作業に用いるものである。詳細には、本発明の凍結保存用治具は、保存液に浸漬された細胞又は組織を液体窒素等の冷却溶媒に浸漬し凍結させるためのものである。また、該載置部上に載置された細胞又は組織を融解する際には、細胞又は組織を凍結保存用治具と共に冷却媒体から取りだし、融解液中に浸漬させて融解する。本発明の凍結保存用治具を用いると、顕微鏡観察下で細胞又は組織を載置部上に滴下付着した際に、載置された細胞又は組織を良好な視認性で確認することができる。つまりは、凍結作業の際に、顕微鏡を用いた観察下での細胞又は組織の載置作業が容易となる。
【００２７】
本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織を保存液と共に載置する略シート状の載置部を有する。本発明における略シート状とは、少なくとも細胞又は組織を保持しうる平面を有する形状であることを意味し、平面シート状、曲率を有するシート状、波型シート状、Ｖ字型シート状等の形状が例示される。
【００２８】
本発明の凍結保存用治具が有する載置部表面の、水に対する接触角は３０度以下である。該接触角が３０度以下であると、細胞又は組織を載置部上に滴下付着した際に、細胞又は組織と共に滴下付着した保存液が載置部表面に対して均一に伸展し、薄膜を形成する。そのため、滴下付着した保存液中の細胞又は組織を、顕微鏡観察下において良好な視認性にて確認することができる。より好ましくは、該載置部表面の水に対する接触角は１５度以下である。一方、載置部表面の水に対する接触角が３０度を超える場合には、細胞又は組織と共に滴下付着した保存液が載置部表面に伸展せず、細胞又は組織の周囲に比較的多く残存し、保存液表面での光屈折等により、保存液中の細胞又は組織の視認が阻害される。このような場合は、顕微鏡の設定（コントラスト又は照明の当て方）を変更する作業を行うか、又は一度滴下付着した保存液を再度取り除く作業をすることで、滴下付着した細胞又は組織を顕微鏡下で確認する必要が生じる。
【００２９】
本発明の凍結保存用治具が有する略シート状の載置部は、該載置部表面の水に対する接触角が３０度以下であればよく、該接触角を有する該載置部表面を形成する方法として、前記した接触角を有する親水性の高い素材を用いて該載置部を形成する他に、一般的な塗工工法等によって基体表面の接触角が改質された載置部を例示することができる。
【００３０】
上記した表面の親水性の高い素材としてはガラスを例示することができる。
【００３１】
上記した塗工工法によって水に対する接触角を３０度以下に調整する場合には、被表面改質対象である基体として、各種樹脂フィルム、ゴム、金属等が例示される。また、本発明の効果を奏することになる限り、２種以上の基体を組み合わせて用いてもよい。中でも樹脂フィルムは、取扱い性が優れている点で好適に用いられる。樹脂フィルムの具体例としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）やポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）等のポリエステル樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ジアセテート樹脂、トリアセテート樹脂、ポリアリレート樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリスルフォン樹脂、ポリエーテルスルフォン樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミド樹脂、ポリオレフィン樹脂、環状ポリオレフィン樹脂等からなる樹脂フィルムが挙げられる。
【００３２】
これら基体の厚さは１０〜１０００μｍであることが好ましい。
【００３３】
基体表面を塗工工法により改質する場合には、塗工表面に高い親水性を発現するような塗工液を用いて、表面改質を行うことができる。表面に高い親水性を発現する塗工液としては、例えば、酸化ケイ素微粒子を主体とし、バインダー成分が該酸化ケイ素微粒子の固形分量に対して５質量％以下である塗工液、層状ケイ酸塩を含有する塗工液、魚類由来の抽出物からなる親水性高分子化合物を含有する塗工液、微分散されたセルロースを含有する塗工液などが挙げられる。これらは併用して用いても良い。特に高い親水性を発現するという観点で、酸化ケイ素微粒子を主体とし、バインダー成分が該酸化ケイ素微粒子の固形分量に対して５質量％以下である塗工液を用いることが好ましい。なお、ここで主体とは、塗工液が含有する全固形分量の５０質量％以上が酸化ケイ素微粒子であることを意味する。
【００３４】
上記した塗工液には、表面特性に影響を及ぼさない範囲で塗工性を向上させる助剤を添加しても良い。また、塗工性をコントロールすることを目的として、前記した基体表面に下塗り層を設けても良い。塗工後に、光照射や熱処理などの各種加工を行い、載置部表面をさらに表面改質することもできる。
【００３５】
本発明の凍結保存用治具が有する載置部は、全光線透過率が８０％以上であることが好ましい。より好ましくは８５％以上である。また、光透過性を有する基体のヘーズ値は１０％以下であることが好ましい。これにより、該載置部に載置した細胞又は組織の確認作業（載置部を介して細胞又は組織に観察照明を当て、透過型の顕微鏡で細胞又は組織を観察する作業）を容易に行うことができる。
【００３６】
本発明において載置部の面積は、細胞又は組織と共に滴下される保存液の滴下量等に応じて適宜設定すればよく、特に限定されないが、例えば、滴下する保存液１μＬにつき１００ｍｍ２以上とすることが好ましい。また、作業性の観点で、本発明の凍結保存用治具が有する該載置部の面積は、５〜４００ｍｍ２とすることがより好ましい。
【００３７】
本発明の凍結保存用治具は、載置部の一端を把持して使用する構成でも良いが、載置部の一端を把持部と連結するような構成とすると、凍結／融解時の作業性が良好であるため、好ましい。
【００３８】
図１は本発明の凍結保存用治具の一例を示す全体図である。図１において凍結保存用治具３は、把持部１と載置部２を有している。把持部１は液体窒素耐性素材であることが好ましい。このような素材としては、例えばアルミ、鉄、銅、ステンレス合金などの各種金属、ＡＢＳ樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、フッ素系樹脂や各種エンジニアプラスチック、さらにはガラスなどを好適に用いることができる。また載置部２は略シート状である。
【００３９】
図１の把持部１と載置部２の接合方法について説明する。把持部１が樹脂の場合、例えば、成形加工する時にインサート成形により載置部２を把持部１に接合することができる。また、把持部１に図示しない挿入部を作製して接着剤にて載置部２を接合することもできる。接着剤は様々なものが使用できるが、低温に強いシリコン系やフッ素系の接着剤が好適に用いることができる。
【００４０】
本発明の細胞又は組織の凍結保存用治具を用いて細胞又は組織を長期凍結保存する場合、図１に示す凍結保存用治具の載置部に安全のため、外界と遮断するためにキャップを被せることも可能である。さらに、通常液体窒素は滅菌されておらず、直接液体窒素に接触させて凍結させる場合、凍結保存用治具が滅菌されていても無菌状態を保証できない場合がある。よって凍結前に細胞又は組織を付着させた載置部にキャップをして、直接液体窒素に接触させないで凍結させることがある。また、細胞又は組織を付着させた載置部を物理的に保護する観点でも有用である。キャップは液体窒素耐性のある素材である各種金属、各種樹脂、ガラス、セラミックなどで作製することが好ましい。形状としては、鉛筆用のキャップや円柱状のストローキャップなど、載置部と接触せず、外界と遮断できるような形状ならどのような形状でもよい。
【００４１】
本発明の凍結保存用治具を用いて細胞又は組織を凍結保存する方法は特に限定されず、例えば、まず保存液に浸漬した細胞又は組織を保存液と共にマイクロピペットで載置部上に滴下する。保存液を滴下した際に、載置部上の細胞又は組織を良好な視認性の下に、顕微鏡下で観察し、細胞又は組織の有無を確認する。次いで、前記細胞又は組織を載置部に保持させたまま該凍結保存用治具を液体窒素等の中に浸漬することにより、細胞又は組織を凍結する。この際、前記した載置部上の細胞又は組織を外界と遮断することができるキャップを載置部に装着して、液体窒素等の中に浸漬することもできる。保存液は、通常卵子、胚等の細胞の凍結のために使用されるものを使用でき、例えば、リン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤（グリセロール、エチレングリコール等）を含有する保存液や、グリセロールやエチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）等の各種耐凍剤を多量に（少なくとも保存液の全質量に対して１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上）含有する保存液を使用できる。融解作業の際は、液体窒素等の冷却溶媒中から、該凍結保存用治具を取りだし、凍結された細胞又は組織を載せた載置部を融解液中に浸漬させ、その後、細胞又は組織を回収する。
【００４２】
本発明の凍結保存用治具を用いて凍結保存することができる細胞として、例えば、哺乳類（例えば、人（ヒト）、牛、豚、馬、ウサギ、ラット、マウス等）の卵子、胚、精子等の生殖細胞；人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞が挙げられる。また、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等の培養細胞が挙げられる。また、細胞は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞、膵ガン・肝ガン細胞等のガン由来細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、軟骨細胞、組織幹細胞、及び免疫細胞等の接着性細胞が挙げられる。さらに、凍結保存することができる組織として、同種又は異種の細胞からなる組織、例えば、卵巣、皮膚、角膜上皮、歯根膜、心筋等の組織が挙げられる。本発明は、特にシート状構造を有する組織（例えば、細胞シート、皮膚組織等）の凍結保存に好適である。本発明の凍結保存用治具は、直接生体から採取した組織だけでなく、例えば、生体外で培養し増殖させた培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シート、特開２０１２−２０５５１６号公報で提案されている三次元構造を有する組織モデルのような人工の組織の凍結保存についても、好適に用いることができる。本発明の凍結保存用治具は、上記のような細胞又は組織の凍結保存用治具として好適に用いられる。
【実施例】
【００４３】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、実施例中に記載した接触角は、全自動接触角計ＣＡ−Ｗ（協和界面科学株式会社）と多機能統合解析ソフトＦＡＭＡＳ（協和界面科学株式会社）を用いて測定した動的接触角である。
【００４４】
（実施例１）
基体として透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率８９％、ヘーズ値２．３％）を用い、該基体上に、酸化ケイ素微粒子を主体とし、バインダー成分が該酸化ケイ素微粒子の固形分量に対して１質量％以下であるセルフェイスコート（丸昌産業株式会社製）を乾燥時の固形分量が１０ｍｇ／ｍ２となるように塗布し、室温乾燥後、さらに６０℃で１時間乾燥させ、載置部を作製した。なお、実施例１の載置部の接触角は１０度であった。この載置部を２ｍｍ×２０ｍｍの大きさ（４０ｍｍ２）に裁断し、ＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例１の凍結保存用治具を作製した。
【００４５】
（実施例２）
層状ケイ酸塩を含有するスメクトン（登録商標）（クニミネ工業株式会社製）を塗工液として、乾燥時の固形分量が２００ｇ／ｍ２となるように塗布し、６０℃で２４時間乾燥させた以外は、実施例１と同様にして、実施例２の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例２の載置部の接触角は２０度であった。
【００４６】
（実施例３）
魚類由来の抽出物からなるゼラチン、ＳＡＭ−Ｍ０２（多木化学株式会社製）を水に溶解して塗工液とし、乾燥時の固形分量が１ｇ／ｍ２となるように塗布し、室温乾燥後、さらに３０℃で１２時間乾燥させた以外は、実施例１と同様にして、実施例３の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例３の載置部の接触角は１８度であった。
【００４７】
（実施例４）
微分散されたセルロース分散液であるＢｉＮＦｉ−ｓ（登録商標）（株式会社スギノマシン製）を塗工液とし、乾燥時の固形分量が１００ｇ／ｍ２となるように塗布し、室温で十分に乾燥させた以外は、実施例１と同様にして、実施例４の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例４の載置部の接触角は２０度であった。
【００４８】
（比較例１）
基体である透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率８９％、ヘーズ値２．３％）をそのまま用いて比較例１の載置部とした以外は、実施例１と同様にして、比較例１の凍結保存用治具を作製した。なお、比較例１の載置部の接触角は６０度であった。
【００４９】
（比較例２）
ポリビニルアルコールであるＰＶＡ１０３（株式会社クラレ製）を水に溶解して塗工液とし、乾燥時の固形分量が１００ｇ／ｍ２となるように塗布し室温乾燥させた以外は、実施例１と同様にして、比較例２の凍結保存用治具を作製した。なお、比較例２の載置部の接触角は４０度であった。
【００５０】
＜視認性の評価＞
実施例１〜４及び比較例１、２の各凍結保存用治具の載置部上に、落射型正立光学顕微鏡ＶＣ４５００−Ｓ１（オムロン株式会社）で観察を行いながら、マウス８細胞期胚を０．１μＬの保存液と共に滴下付着させ、滴下付着後に保存液を除去する操作は行わずに、滴下付着後の載置部上のマウス８細胞期胚の様子を観察し、その視認性を以下の基準で評価した。これらの結果を、表１の「視認性の評価」の項目に示す。なお、保存液は、Ｌ−グルタミン、フェノールレッド、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）を含む市販のＭｅｄｉｕｍ１９９培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を基礎液として、エチレングリコールを１５容量％とＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を１５容量％、スクロースを０．５Ｍ、ゲンタマイシンを５０ｍｇ／Ｌ含有するものを使用した。
【００５１】
○：載置部上の胚の存在が明確に視認できる。
△：載置部上の胚の存在が視認できる。
×：載置部上の胚の存在が視認できない、又は極めて視認しにくい。
【００５２】
【表１】
2020096554.tif 000003
【００５３】
上記の結果から、本発明の凍結保存用治具は、凍結作業時に、顕微鏡観察下において細胞又は組織を載置部上に滴下付着した後、余分な保存液を除去する操作を行わずに良好な視認性にて確認作業を行うことが可能であることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、牛等の家畜や動物の胚移植や人工授精、人への人工授精等の他、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、一般に用いられている培養細胞、胚又は卵子を含む生体から採取した検査用又は移植用の細胞又は組織、生体外で培養した細胞又は組織等の凍結保存に用いることができる。
【符号の説明】
【００５５】
１  把持部
２  載置部
３  凍結保存用治具
【図１】
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