(57)【要約】      （修正有）【課題】創傷を治療および封鎖するための、並びに組織充填材応用のための、ミクロゲル粒子および前記粒子を含む足場の使用。【解決手段】複数のミクロゲル粒子を含む水溶液；および複数のミクロゲル粒子に適用された場合に、ミクロゲル粒子に、内部間隙を有する共有結合的に安定化したミクロゲル粒子から成る足場を形成させるアニーリング剤、を含む、微小孔性ゲル系。【選択図】図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のミクロゲル粒子を含む水溶液；および
複数のミクロゲル粒子に適用された場合に、ミクロゲル粒子に、内部間隙を有する共有結合的に安定化したミクロゲル粒子から成る足場を形成させるアニーリング剤、
を含む、微小孔性ゲル系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年７月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／０２５，８４４号、２０１４年１０月３日に出願された同第６２／０５９，４６３号、および２０１５年１月１３日に出願された同第６２／１０３，００２号に基づく優先権を主張する。米国特許法第１１９条によって優先権が主張される。上記特許出願は本明細書に完全に記載されたかの如く参照により援用される。
【０００２】
技術分野は全体として、創傷治療の分野、特に、創傷を治療および封鎖するための、並びに組織充填材応用のための、ミクロゲル粒子および前記粒子を含む足場の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
組織の発生および再生に関係する中心的な概念は、細胞ネットワーク全体がある発生領域に同時に移動することで機能的組織の形成が促進されるプロセスである、集団的な細胞遊走である。研究者らにより創傷（ｗｏｕｌｄ）治癒剤の発見する努力が為されてきたが；これらの物質は、バッチ間変動を示し、成長中の組織に対する構造的支持の拡大を制限する分解率を示す。合成物質は天然物質と比べてより調整が可能であり、それらの機械的特性は、広範な組織種に対し使用できるように設計されている。しかし、このように調整が可能であるにもかかわらず、注射用の合成生体材料は、材料中の細胞遊走のために、物理的な分解を必要とする非多孔性またはナノ多孔性の足場に限定されてきた。事前形成された、微小スケールの、相互連結した細孔を含有する多孔性合成ヒドロゲルによって、分解の必要無く、より大きな細胞移動性が可能となり、非多孔性足場に固有の、細胞移動性と材料安定性との間のトレードオフが回避される。典型的な細孔形成様式には、毒性のあるポロゲン除去、または被包微小粒子の分解が含まれ、これは、注射用生体材料のように、これらの構築物がエキソビボで成型されることを必要として、前記構築物が周辺組織と途切れなく統合することを妨げる、または、多孔性構造を分解するのに長期のインビボ発達を必要とする。例えば、ヒーリオニクス社（Ｈｅａｌｉｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって、Ｓｐｈｅｒｅ  Ｔｅｍｐｌａｔｅｄ  Ａｎｉｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ＳＴＡＲ）と自称される技術が開発された。この技術では、サイズが揃えられた一連の充填ビーズを焼結し、ビーズ間隙にポリマーを成型し、ビーズを溶解除去することで、相互連結した球状空隙からなる細孔ネットワークが得られ、これによりＳＴＡＲ足場が形成される。しかし、上記で言及したように、これらの従来法は毒性のあるポロゲン除去を必要とする。
【発明の概要】
【０００４】
ヒトの皮膚創傷は、公衆衛生および経済に対する高まる一方の脅威であり、処置が非常に困難である。乾燥した創傷は湿った創傷よりも治癒がかなり遅いことから、医師は、皮膚創傷を治療する際にその領域を湿らせたままにするよう努める。これを達成するため、医師はしばしば、道にできた穴に新しいアスファルトを詰めるように、軟膏剤を用いて創傷を塞ぐ。しかし、創傷治癒へのこれらおよび他の従来のアプローチは、新しい組織の成長を可能にする最適な足場を提供することができない。結果として、新しい組織の成長は、たとえあったにしても、比較的緩慢で脆弱になるため、適時な治癒も可能である範囲で、治癒時間がより長くなる。
【０００５】
人工的な組織治癒に関連して、本発明者らは、足場分解の必要なく相互連結した細胞ネットワークおよび集団的遊走を可能にする、相互連結した微小孔性足場の開発のゴールドスタンダードを特定した。さもなければ、移植のための侵襲的手法が周辺組織とのバルク統合（ｂｕｌｋ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）に必須となる。実際に、最も効果的であるために、本発明者らは、これらの物質が、創傷治癒および適所認識を促進する分子的な手がかりを提供しつつ、再生を仲介する集団的細胞遊走を促進するはずであることを特定した。さらに、本発明者らは、これらの物質が、遊走細胞および天然母組織と途切れなく置換可能であり、置換前に安定な構造的支持を提供することが可能であり、容易に送達され、損傷部位に適合して線維性反応および炎症性反応を最小限にすることが可能であるはずであることも特定した。
【０００６】
これらの原理を実行し、創傷の周辺組織の構造的支持を維持しながら急速な組織再生を促す生体材料を提供する、系、組成物、方法、およびデバイスが、本明細書において提供される。実際に、本発明者らは、流動性または注射用のミクロゲルに基づく、目的に適った材料化学、および、例えばヒトの毛髪の幅の構築ブロックを含む、均一な球状構築ブロックのマイクロ流体成形加工（ｍｉｃｒｏ  ｆｌｕｉｄｉｃ  ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）を用いることで、組織工学分野における長年に亘り対処されてこなかった医療ニーズへの解決に至った。
【０００７】
本明細書に記載の技術は、細胞浸潤のための通路を残しながら大型ユニットに組立て可能である小型ミクロゲルを作製するための化学作用を利用する。結果は、互いの表面に付着し合った微視的な合成ポリマー体（例えば、球体）の充填クラスターであり、共に固着されたガムボールのジャーに類似している。クラスターは創傷を塞ぐ微小孔性の被アニール粒子の足場（例えば、多孔性ゲル足場）をつくりだす。新しい組織がミクロゲル粒子間の空隙に急速に成長し、ミクロゲル粒子は身体へと分解されるため、新たに成長した組織のマトリックスがかつて創傷があった場所に残る。新組織は創傷が完全に治癒するまで成長し続ける。
【０００８】
本明細書に記載のミクロゲル系は従来製品に対する実質的改善である。例えば、本明細書に記載の技術は、細胞を前記材料に引き付けるための増殖因子の添加を必要としない。前記ミクロゲルネットワークの形状によって、細胞のミクロゲルへの遊走が促される。
【０００９】
本発明者らは、前記ミクロゲルが、以前は見られなかった速度で、新細胞の成長および連結された細胞からなるネットワークの形成を促進可能であることを示した。例えば、インビボでの研究中、最初の４８時間に有意な組織再生が観察され、今日使用されている従来材料と比較して、５日間に亘ってより多くの治癒がもたらされた。
【００１０】
本明細書に記載の技術は幅広い応用において有用である。例えば、前記ミクロゲル技術は、裂傷および外科的な創傷閉鎖のような急性損傷を含む創傷適用に、また、糖尿病性潰瘍および広域熱傷のようなより長期的な適用に、使用することができる。本明細書に記載のヒドロゲル足場は、戦地または緊急治療室等の外傷状況（ｔｒａｕｍａ  ｓｉｔｕａｔｉｏｎ）においても有用であり得る。
【００１１】
複数のミクロゲル粒子を含む水溶液および架橋剤（例えば生分解性架橋剤）を含む微小孔性ゲルを含む、系、組成物、方法、およびデバイスが、ある態様で、本明細書に記載される。本明細書に記載の微小孔性ゲルは、流動性および／または注射可能であり、複数の異なる方法で、例えば局所的に、または注射によって、適用可能である。注射されたおよび／または流動性の微小孔性ゲルは、経皮的に、または深部組織に、挿入可能である。流動性の微小孔性ゲルは、真皮および他の組織に局所的に投与することもできる。
【００１２】
一態様において、アニーリング剤が複数のミクロゲル粒子に適用された場合、ミクロゲル粒子は内部間隙を有する共有結合的に安定化したミクロゲル粒子から成る足場を形成する。ある特定の適用において、前記系、組成物、方法、およびデバイスは特に、生物医学的応用のために設計される。いくつかの実施形態において、微小孔性ゲル粒子は架橋剤をさらに含み、前記架橋剤としてはマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−分解性架橋剤が挙げられる。一つまたは複数の実施形態において、アニーリング剤は活性化第ＸＩＩＩａ因子を含む。さらなるまたは追加の実施形態において、アニーリング剤はエオシンＹ、フリーラジカル移動剤、またはこれらの組合せを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、前記ミクロゲル系、組成物、方法、およびデバイスは、複数のミクロゲル粒子およびアニーリング剤の混合物を照射するように構成された光源をさらに含む。一つまたは複数の実施形態において、微小孔性ゲル粒子はその表面上に露出される細胞接着性ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、微小孔性ゲル粒子はＫ−ペプチドを含む。さらなるまたは追加の実施形態において、微小孔性ゲル粒子は、活性化第ＸＩＩＩａ因子によって認識されるリジン基を含むＫ−ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、微小孔性ゲル粒子はＱ−ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｑ−ペプチドは活性化第ＸＩＩＩａ因子によって認識されるグルタミン基を含む。ある実施形態において、微小孔性ゲル粒子は分解可能である架橋剤を含む。ある実施形態において、微小孔性ゲル粒子は、負の凹面を示す境界面を含む間隙を含む。一つまたは複数の実施形態において、ミクロゲル粒子の共有結合的に安定化した足場は、約１０％〜約５０％の空隙容量を有する。
【００１４】
一実施形態において、生物医学的応用のための微小孔性ゲル系は、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−分解性架橋剤等の生分解性架橋剤を用いて形成される複数のミクロゲル粒子を含有する水溶液、および、複数のミクロゲル粒子に適用された場合に、ミクロゲル粒子に、内部間隙を有する共有結合的に安定化したミクロゲル粒子から成る足場を形成させるアニーリング剤を含む。
【００１５】
別の実施形態において、微小孔性ゲル系は、送達デバイスおよび水溶液中に含有され送達デバイス内に貯蔵される生分解性ミクロゲル粒子の集合を含む。アニーリング剤またはアニーリング剤前駆物質は送達デバイス内にも貯蔵される。送達デバイスは、採用される特定の実施形態に応じて単一または複数の区画を含有してもよい。
【００１６】
別の実施形態において、組織を治療する方法は、細胞接着性ペプチドで装飾された複数のミクロゲル粒子を含有する水性溶液を組織に送達することを含み、ミクロゲル粒子はマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−分解性架橋剤等の生分解性架橋剤を用いて形成される。複数のミクロゲル粒子は、ミクロゲル粒子をアニールすることで内部間隙を有する共有結合的に安定化したミクロゲル粒子から成る足場を形成させるアニーリング剤に暴露される。
【００１７】
別の実施形態において、生物医学的応用のための微小孔性ゲル系は、一つまたは複数の細胞接着部分、一つまたは複数のアニーリング成分、および生分解性ネットワーク架橋剤成分を有する骨格ポリマーの反応によって形成される、ミクロゲル粒子の集合を含む。微小孔性ゲル系は、アニーリング成分を介してミクロゲル粒子をインサイツで連結して、内部間隙を有する共有結合的に安定化したミクロゲル粒子から成る足場を形成させる、内在性または外来性のアニーリング剤を含む。
【００１８】
別の態様において、送達デバイスまたは送達機構および微小孔性ゲルを含む系、組成物、方法、およびデバイスが、本明細書に記載される。ある実施形態において、送達デバイスは、複数のミクロゲル粒子を含む水溶液およびアニーリング剤またはアニーリング剤前駆物質を含有する。一つまたは複数の実施形態において、送達デバイスは、複数のミクロゲル粒子を含む水溶液およびアニーリング剤を含有する単一区画送達デバイスを含む。一つまたは複数の実施形態において、送達デバイスは複数（例えば、二重）区画送達デバイスを含み、一方の区画は複数のミクロゲル粒子を含有する水溶液および第一アニーリング剤前駆物質を含有し、第二の区画は複数のミクロゲル粒子を含有する水溶液および第二アニーリング剤前駆物質を含有する。ある実施形態において、微小孔性ゲルは、少なくとも１つのＤ−アミノ酸を含む（ＭＭＰ）−分解性架橋剤をさらに含む。さらなるまたは追加の実施形態において、ミクロゲル粒子は、複数のＤ−アミノ酸を含む（ＭＭＰ）−分解性架橋剤を含む。
【００１９】
さらに別の態様において、送達デバイス；水溶液中に含有され送達デバイス内に貯蔵される複数の生分解性ミクロゲル粒子；および送達デバイス内に貯蔵されるアニーリング剤またはアニーリング剤前駆物質を含む微小孔性ゲル系が、本明細書に記載される。一つまたは複数の実施形態において、微小孔性ゲル粒子は、水溶液中に含有され送達デバイス内に貯蔵される２種以上の生分解性ミクロゲル粒子の集合をさらに含む。ある実施形態において、送達デバイスは２つの区画を含み、生分解性ミクロゲル粒子は２つの区画のそれぞれに貯蔵され、第一アニーリング前駆物質は一方の区画内に貯蔵され、第二アニーリング前駆物質は他方の区画内に貯蔵され、アニーリング剤は第一アニーリング前駆物質および第二アニーリング前駆物質の両方の存在によって形成される。一つまたは複数の実施形態において、送達デバイスは単一区画を含み、生分解性ミクロゲル粒子の集合およびアニーリング剤は共に単一区画内に貯蔵される。さらなるまたは追加の実施形態において、アニーリング剤は単一区画内に貯蔵される光開始剤およびフリーラジカル移動剤を含む。さらなるまたは追加の実施形態において、微小孔性ゲル系は、生分解性ミクロゲル粒子の集合およびアニーリング剤の混合物を照射するように構成された発光デバイスをさらに含む。ある実施形態において、ミクロゲル粒子は実質的に単分散の球体を含む。一つまたは複数の実施形態において、実質的に単分散の球体は約３０マイクロメーター〜約１５０マイクロメーターの範囲内の直径を有する。さらなるまたは追加の実施形態において、ミクロゲル粒子は、アニーリング後に共有結合的に互いに連結される。
【００２０】
別の態様において、複数のミクロゲル粒子を含有する水性溶液を組織に送達し；ミクロゲル粒子をアニールすることで内部間隙を有する共有結合的に安定化したミクロゲル粒子から成る足場を形成させるアニーリング剤に複数のミクロゲル粒子を暴露することを含む、組織を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、複数のミクロゲル粒子は細胞接着性ペプチドで装飾されており、ミクロゲル粒子はマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−分解性架橋剤を用いて形成される。一つまたは複数の実施形態において、アニーリング剤は組織に送達される。いくつかの実施形態において、アニーリング剤は組織内に存在する。さらなる追加の実施形態において、前記方法は、露光によりミクロゲル粒子のアニーリングを開始させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、光の波長は可視域内である。いくつかの実施形態において、光の波長は赤外領域内である。一つまたは複数の実施形態において、水性溶液およびアニーリング剤は同時に送達される。いくつかの実施形態において、水性溶液およびアニーリング剤は順に送達される。さらなるまたは追加の実施形態において、ミクロゲル粒子は治療効果のある化学物質を含む。ある実施形態において、ミクロゲル粒子は前記化学物質を組織に露出または溶離する。一つまたは複数の実施形態において、組織は、美容的再建、長期に亘る創傷発達、急性組織損傷、または外科的切開により生じた組織間隙の部位を含む。さらなる追加の実施形態において、（ＭＭＰ）−分解性架橋剤はＤ−アミノ酸を含む。
【００２１】
別の態様において、一つまたは複数の細胞接着部分、一つまたは複数のアニーリング成分、および一つまたは複数の生分解性ネットワーク架橋剤成分を有する骨格ポリマーを含むミクロゲル粒子の集合；並びに、アニーリング成分を介してミクロゲル粒子をインサイツで連結して、内部間隙を有する共有結合的に安定化したミクロゲル粒子から成る足場を形成させる、内在性または外来性のアニーリング剤を含む、微小孔性ゲル系またはデバイスが提供される。ある実施形態において、骨格ポリマーはポリ（エチレングリコール）ビニルスルホンを含む。一つまたは複数の実施形態において、一つまたは複数の細胞接着部分は、ＲＧＤペプチドもしくはその断片、フィブロネクチンもしくはその断片、コラーゲンもしくはその断片、またはラミニンもしくはその断片を含む。いくつかの実施形態において、一つまたは複数の細胞接着部分はＲＧＤペプチドまたはその断片を含む。一実施形態において、一つまたは複数の細胞接着部分は配列番号３またはその断片を含む。さらなるまたは追加の実施形態において、一つまたは複数のアニーリング成分はＫ−ペプチドおよびＱ−ペプチドを含む。ある実施形態において、Ｋ−ペプチドは活性化第ＸＩＩＩａ因子によって認識されるリジン基を含み、Ｑ−ペプチドは活性化第ＸＩＩＩａ因子によって認識されるグルタミン基を含む。いくつかの実施形態において、生分解性ネットワーク架橋剤成分はマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−分解性架橋剤を含む。一つまたは複数の実施形態において、（ＭＭＰ）−分解性架橋剤はＤ−アミノ酸を含む。ある実施形態において、ミクロゲル粒子の集合は２種以上のミクロゲル粒子を含む。一つまたは複数の実施形態において、第一の種類のミクロゲル粒子は、Ｄ−アミノ酸を含む（ＭＭＰ）−分解性架橋剤を含み、第二の種類のミクロゲル粒子がＬ−アミノ酸のみを含む（ＭＭＰ）−分解性架橋剤を含む。一つまたは複数の実施形態において、前記系またはデバイスは、ミクロゲル粒子の集合およびアニーリング剤を含有する単一区画送達デバイスを含む。一つまたは複数の実施形態において、前記系またはデバイスは二重区画送達デバイスをさらに含み、一方の区画は複数のミクロゲル粒子を含有する水溶液および第一アニーリング剤前駆物質を含有し、第二の区画は複数のミクロゲル粒子を含有する水溶液および第二アニーリング剤前駆物質を含有し、アニーリング剤は第一アニーリング剤前駆物質および第二アニーリング剤前駆物質の存在によって形成される。
【００２２】
さらなる態様において、細胞接着性ペプチドで装飾されたミクロゲル粒子の第一層を組織に送達し、ここで、ミクロゲル粒子は生分解性架橋剤を用いて形成され；ミクロゲル粒子をアニールすることで内部間隙を有する共有結合的に安定化したミクロゲル粒子から成る足場を形成させるアニーリング剤に第一層を暴露し；細胞接着性ペプチドで装飾されたミクロゲル粒子の第二層を組織に送達し、ここで、ミクロゲル粒子は生分解性架橋剤を用いて形成され、第二層中のミクロゲル粒子は第一層中のミクロゲル粒子と比較して物性または化学組成の一方において異なり；ミクロゲル粒子をアニールすることで内部間隙を有する共有結合的に安定化したミクロゲル粒子から成る足場を形成させるアニーリング剤に第二層を暴露すること、を含む、組織を治療する方法が記載される。一つまたは複数の実施形態において、第二層中のミクロゲル粒子は異なるサイズを有する。さらなる追加の実施形態において、第二層中のミクロゲル粒子は異なる形状を有する。一つまたは複数の実施形態において、第二層中のミクロゲル粒子は異なる剛性を有する。ある実施形態における、第一層における化学成分と異なる化学成分を有する第二層中のミクロゲル粒子。さらなるまたは追加の実施形態における、第一層における同一の化学成分とは異なる濃度の化学成分を有する第二層中のミクロゲル粒子。
【００２３】
別の態様において、細胞接着性ペプチドで装飾された複数のミクロゲル粒子を含有する水性溶液を組織に送達すること、ここで、ミクロゲル粒子は生分解性架橋剤を用いて形成される；および、ミクロゲル粒子をアニールすることで内部間隙を有する共有結合的に安定化したミクロゲル粒子から成る足場を形成させるアニーリング剤に複数のミクロゲル粒子を暴露すること、を含む、組織を治療する方法が提供される。
【００２４】
別の実施形態において、組織を治療する方法は、細胞接着性ペプチドで装飾されたミクロゲル粒子の第一層を組織に送達することを含み、ミクロゲル粒子は生分解性架橋剤を用いて形成される。第一層は、ミクロゲル粒子をアニールすることで内部間隙を有する共有結合的に安定化したミクロゲル粒子から成る足場を形成させるアニーリング剤に暴露される。細胞接着性ペプチドで装飾されたミクロゲル粒子の第二層は組織に送達され、ミクロゲル粒子は生分解性架橋剤を用いて形成され、第二層中のミクロゲル粒子は第一層中のミクロゲル粒子と比較して物性または化学組成の一方において異なる。第二層は、ミクロゲル粒子をアニールすることで内部間隙を有する共有結合的に安定化したミクロゲル粒子から成る足場を形成させるアニーリング剤に暴露される。
【００２５】
別の実施形態において、組織を治療する方法は、細胞接着性ペプチドで装飾された複数のミクロゲル粒子を含有する水性溶液を組織に送達することを含み、ミクロゲル粒子は生分解性架橋剤を用いて形成される。複数のミクロゲル粒子は、ミクロゲル粒子をアニールすることで内部間隙を有する共有結合的に安定化したミクロゲル粒子から成る足場を形成させるアニーリング剤に暴露される。
【００２６】
さらなる追加の態様において、共通チャネルに通じる複数の投入チャネルおよび下流位置で共通チャネルと交差する油狭窄（ｏｉｌ−ｐｉｎｃｈｉｎｇ）チャネル対を有する、油中水滴を発生させるマイクロ流体デバイスを準備し；生分解性架橋剤を含有する第二溶液を第二投入チャネルに流し込み；油および界面活性剤を油狭窄チャネル対に流し込むことで、第一プレポリマー溶液および第二溶液を含有する液滴を形成させ；前記液滴の架橋結合によって形成されたミクロゲル粒子を収集すること、を含む、ミクロゲル粒子を作製する方法が記載される。別の実施形態において、前記方法は、第一投入チャネルと第二投入チャネルの間に挿入された第三投入チャネルをさらに含み、プレポリマーを含有する第三の不活性溶液が第三投入チャネルに流し込まれる。一つまたは複数の実施形態において、前記方法は、発生した液滴を、油狭窄チャネル対が共通チャネルと交差する位置の下流に位置する追加の被覆用（ｓｈｅａｔｈｉｎｇ）チャネル対で被覆することをさらに含み、追加の被覆用チャネル対は油および油狭窄チャネル対の上流で含有される界面活性剤よりも高い濃度の界面活性剤を保有する一実施形態において、前記方法は、収集されたミクロゲル粒子を遠心することをさらに含む。別の態様において、前記方法は、遠心されたミクロゲル粒子の自由水体積含量を減少させることを含む。一つまたは複数の実施形態において、前記方法は、収集されたミクロゲル粒子を長期間（例えば、数ヶ月〜数年）貯蔵することを含む。
【００２７】
さらなる別の実施形態において、ミクロゲル粒子を作製する方法は、共通チャネルに通じる複数の投入チャネルおよび下流位置で共通チャネルと交差する油狭窄チャネル対を有する、油中水滴を発生させるマイクロ流体デバイスを準備することを含む。オリゴペプチドで修飾されたポリマー骨格を含有する第一プレポリマー溶液は第一投入チャネルに流し込まれる。生分解性架橋剤を含有する第二溶液は第二投入チャネルに流し込まれる。油および界面活性剤は、油狭窄チャネル対に流し込まれることで、第一プレポリマー溶液および第二溶液を含有する液滴を形成する。ミクロゲル粒子は液滴の架橋結合によって形成され、その後収集される。
【００２８】
本開示の他の目的、特徴および利点は、以下の発明を実施するための形態から、当業者に明らかとなる。しかし、発明を実施するための形態および特定の実施例が、本開示のいくつかの実施形態を示しつつも、限定のためではなく例示のために与えられていることを理解されたい。本開示の範囲内の多くの改変および変更が、その精神から逸脱することなく、為され得る。本開示はそのような変更形態を全て包含する。さらに、一実施形態の態様は、他の異なる実施形態において利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
本開示の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記述される。本開示の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の発明を実施するための形態、および添付図面を参照することにより、本開示の特徴および利点のより深い理解が得られる。
【図１】図１は、複数のアニール後ミクロゲル粒子から形成された足場の一部を図示している。
【図２】図２Ａは、創傷部位を治すための、創傷部位にミクロゲル粒子を注入する例示的な方法を図示している。図２Ｂは、ミクロゲル粒子表面上のリンカーによって促進される、異なるミクロゲル粒子間の例示的なアニーリング反応を模式的に示している。図２Ｃは、組織上の送達部位内に形成された足場内への組織浸潤の例示的な過程を図示しており、組織とミクロゲルとの間の境界はそれらの間のあらゆる接触部分を表し、細胞は組織から内向きに、またはミクロゲルから組織に向かって外向きに移動しながら前記接触部分を通過することができる。
【図３】図３Ａは、微小孔性ゲル系の一部としての、複数のミクロゲル粒子を作製するために使用された、一実施形態によるマイクロ流体デバイスの上視図を示している。図３Ｂは、液滴生成領域および下流の油／界面活性剤狭窄領域の拡大図を示している（図３Ａのボックス領域を参照）。図３Ｃは、図３Ａに図示される２本の分岐チャネルの拡大された透視図を示している。図３Ｄは、一実施形態による、図３Ａのマイクロ流体デバイスの側面図を示している。図３Ｅは、図３Ｂに示されたスキームの実施化の撮影写真を示しており、左側の蛍光溶液は架橋剤を含有しており、右側の蛍光溶液はポリマーおよび反応緩衝液を含有しており、中央の流れは液滴分割化前の左側溶液および右側溶液の混合を防ぐための不活性溶液を含有している。中央流および右側流の間の明るい蛍光は、反応緩衝液の拡散による中央流におけるｐＨ変化を示している。図３Ｆは、図３Ｂおよび図３Ｅに示されたスキームの実施化の写真を示しており、一方で、狭窄する油流が導入された後の液滴分割化の光学顕微鏡的な概観も示している。
【図４】図４Ａは、微小孔性ゲル系の一部としての、複数のミクロゲル粒子を作製するために使用された、別の実施形態によるマイクロ流体デバイスの上視図を示している。図４Ｂは、液滴分割化領域における、０．２５％Ｓｐａｎ（登録商標）８０を含有するミネラルオイルによるＰＥＧプレゲルの狭窄および分割、並びに、下流のミネラルオイル中５％Ｓｐａｎ（登録商標）８０溶液による、完全なゲル化前の、混合および下流でのミクロゲル合体の防止を示している。図４Ｃは、液滴が、分岐領域におけるインキュベーション中に再結合せず、マイクロチャネルから収集ウェルに出ること、を示している。
【図５】図５は、一実施形態による、ミクロゲル液滴を生じさせるのに使用され得る例示的なマイクロ流体Ｔ接合器を図示している。
【図６】図６Ａは、一実施形態による、二連注射器の形態をとる例示的な分注デバイスを図示している。図６Ｂは、別の実施形態による、一連注射器の形態をとる例示的な分注デバイスを図示している。図６Ｃは、一実施形態による、ミクロゲル粒子を保持する管の形態をとる例示的な分注デバイスを図示している。
【図７】図７Ａは、注射から２４時間後の、足場（微小孔性アニール後粒子（Ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ  Ａｎｎｅａｌｅｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ）または「ＭＡＰ」足場）を注射された組織、並びに非多孔性対照を注射された組織に対する、ＳＫＨ１−Ηｒｈｒマウスにおける組織切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）を示している。図７Ｂは、注射後日数の関数としての、創傷閉鎖（％）のグラフを示している。このグラフは、非多孔性の両側性（ｂｉｌａｔｅｒａｌ）対照（Ｎ＝５）と比較した場合に、足場使用において、５日間に亘って、創傷閉鎖率における統計的に有意な改善があることを示している。図７Ｃは、ゲル足場（左パネル）と非多孔性ＰＥＧゲル対照（右パネル）とを比較している、ＳＫＨ１−Ｈｒｈｒマウスにおける５日間のインビボ創傷治癒モデルにおいての創傷閉鎖の代表的な画像を示している。図７Ｄは、７日間のインビボＢＡＬＢ／ｃ実験においての創傷閉鎖の代表的な画像を示している。インビボでの７日間の後、足場は、無処置対照、ＫペプチドおよびＱペプチドを欠いたゲル、非多孔性ＰＥＧゲルよりも有意により速い創傷治癒、並びに予成形多孔性ゲルよりも速い創傷治癒、を促す。標準的なポロゲンに基づく成形法を用いて創傷形状に正確に適合するようにエキソビボでつくられた多孔性ゲルは、足場に匹敵するかなりの創傷治癒率を示したが、注射適性（ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）に欠いていた（Ｎ＞５）。図７Ｅは、ＢＡＬＢ／ｃインビボ創傷治癒から得られた、創傷閉鎖の定量化データを示す棒グラフであり、各々の処置区分は図７Ｄと対応している。全てのデータは平均値＋／−ＳＥＭとして表される。標準的な両側ｔ検定を用いて実行された統計的有意性（＊：ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。図７Ｆは、インビボにおける７日間の創傷床閉鎖の追跡を示しており、各々の処置区分は図７Ｄおよび図７Ｅに対応している。図７Ｇは、どのようにして、ミクロゲル粒子を含有する溶液またはスラリーが、図６Ａまたは図６Ｂの注射器のような注射用デバイス（例えば、２５ゲージ注射器）を用いて、処置部位に注射され、そこで、ミクロゲルが注射部位の形状（例えば、この場合では、星形にレーザー切断されたアクリル鋳物）に適合し得るか、およびその後の、足場の星形へのアニーリングを示している。
【図８】図８Ａは、皮膚切除およびゲル適用の２１日後のマウスモデルにおける、ミクロゲル足場で処置された（図８Ａ）、および処置されていないまたは「偽の」（図８Ｂ）、損傷組織（すなわち、創傷部位）の染色された顕微鏡画像を示している。ミクロゲル足場によって可能となった瘢痕減少が、図８Ａに明瞭に見られる。四角は、創傷へのゲル適用後の再形成中組織における毛包および油腺（皮脂腺）を示している。丸は、再形成中組織における残留ミクロゲル粒子を示している。図８Ｂは、皮膚切除およびゲル適用の２１日後のマウスモデルにおける、ミクロゲル足場で処置された（図８Ａ）、および処置されていないまたは「偽の」（図８Ｂ）、損傷組織（すなわち、創傷部位）の染色された顕微鏡画像を示している。ミクロゲル足場によって可能となった瘢痕減少が、図８Ａに明瞭に見られる。四角は、創傷へのゲル適用後の再形成中組織における毛包および油腺（皮脂腺）を示している。丸は、再形成中組織における残留ミクロゲル粒子を示している。図８Ｃは、偽処置された組織およびゲル足場で処置された組織の上皮厚を示すグラフを示している。図８Ｄは、偽処置された組織およびゲル足場で処置された組織の、皮脂腺の数を示すグラフを示している。図８Ｅは、偽処置された組織およびゲル足場で処置された組織の、毛包の数を示すグラフを示している。図８Ｆは、偽処置された組織およびゲル足場で処置された組織の、瘢痕幅を示すグラフを示している。図８Ｇは、偽処置された組織およびゲル足場で処置された組織の、稗粒腫嚢胞（ｍｉｌｉａｌ  ｃｙｓｔ）の数を示すグラフを示している。
【図９】図９Ａは、異なるゲル化速度論（ｐＨおよび温度）における、混合後時間の関数としての貯蔵弾性率のグラフを示している。ｐＨ８．２５、２５℃はグラフの一番下の線で表され；ｐＨ８．８、２５℃はグラフの一番上の線で表され；ｐＨ８．２５、３７℃はグラフの真ん中の線で表される。図９Ｂは、様々なヒドロゲル重量パーセントの使用により、Ｘ軸上の様々な剛性材料が生成されることを示している。グラフは、様々なヒドロゲル重量パーセントにおける貯蔵弾性率（Ｐａ）を示した。図９Ｃは、Ｘ軸上の得られたゲルにおける様々な剛性値を生じさせるために使用された、様々な架橋剤化学量論を示している。グラフは、貯蔵弾性率（Ｐａ）を、ＰＥＧ分子上のビニル基（−ＶＳ）に対する遊離架橋剤末端（−ＳＨ）のｒ比の関数として示した。図９Ｄは、非多孔性対照（グラフの一番下の線）および本明細書に記載の多孔性ゲル（グラフの一番上の線）の両方についての、時間の関数としての分解率（％）のグラフを示している。図９Ｅは、２００μｍ（上段パネル）または１００μｍ（下段パネル）での、ＦＸＩＩＩａを用いてアニールされた足場のＳＥＭ画像を示している。図９Ｆは、２００μｍ（上段パネル）または１００μｍ（下段パネル）での、ＦＸＩＩＩａ無しでのミクロゲル粒子のＳＥＭ画像を示している。アニールされていないミクロゲル粒子が図９Ｆに見られる。
【図１０】図１０は、上記の技術を用いて作製されたミクロゲルを示しており、図では、ミクロゲルの表面が、ホスフィン−アジド「クリック」化学の使用により、蛍光性ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質（外周部）を用いて増強されている。さらに、ナノ粒子（５００ｎｍ）が、マイクロ流体作製の間にミクロゲル内に埋め込まれる。
【図１１】図１１は、本明細書に記載の微小孔性ゲル系を用いて損傷組織を治療するための例示的な方法を示している。ミクロゲル粒子が塗布され（上段パネル）、所望により、塗布器が使用され（２番目のパネル）、ミクロゲル粒子のアニーリングが開始されて足場が形成され（３番目のパネル）、創傷治癒の改善が観察される（下段パネル）。
【図１２】図１２Ａは、インビトロにおける多孔性ゲル足場内での６日間の培養中の３Ｄ細胞ネットワークの形成、および６日後の非多孔性ゲル、を示す蛍光画像を示している。（３５０Ｐａ：多孔性ゲル足場と同一の体積弾性率、６００Ｐａ：個々のミクロゲルに適合した微小スケール係数（ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  ｍｏｄｕｌｕｓ））。図１２Ｂは、アニーリングから２４時間後の細胞生存が、様々なヒト組織種を代表する３つの細胞株にわたって９３％よりも大きいというグラフを示している。ＨＤＦ：ヒト皮膚線維芽細胞、ＡｈＭＳＣ：脂肪由来ヒト間葉系幹細胞、ＢＭｈＭＳＣ：骨髄由来ヒト間葉系幹細胞。
【図１３】図１３Ａは、アニーリング前に、生細胞を予形成ミクロゲル粒子と混合するための例示的な方法を示している。ミクロゲル粒子が互いにアニールし合い、ミクロゲルのアニーリングの後に生じた相互連結した微小孔性ネットワークの中に生細胞を捕捉する。図１３Ｂは、生細胞と混合されたミクロゲル粒子溶液が、巨視的規模の形状に成形可能であり、注入によって、アニーリング後に維持される複雑な形状を形成させることが可能であることを示す写真画像である。図１３Ｂは、例示的なインビトロにおける注射器による注入を示している。図１３Ｃは、生細胞と混合されたミクロゲル粒子溶液が、巨視的規模の形状に成形可能であり、注入によって、アニーリング後に維持される複雑な形状を形成させることが可能であることを示す写真画像である。図１３Ｃは、例示的なインビトロにおける成形を示している。図１３Ｄは、生細胞と混合されたミクロゲル粒子溶液が、巨視的規模の形状に成形可能であり、注入によって、アニーリング後に維持される複雑な形状を形成させることが可能であることを示す写真画像である。図１３Ｄは、例示的なインビトロにおけるアニール後の足場を示している。図１３Ｅは、ミクロゲル粒子が、巨視的規模の形状に成形可能であり、生細胞の存在下で実施可能であること（蛍光性ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を指し示す矢印によって示される）を示している。
【図１４】図１４Ａは、様々なサイズのミクロゲル粒子が例示的な実施形態において一連の発生頻度にわたって合成可能であること示すグラフを示している。図１４Ｂは、別の例示的な実施形態において、各々の溶液注入口に高い注入口圧力を与えることで（油注入口は３０Ｐｓｉを上回る）、発生頻度の増加が可能になることを示している。図１４Ｃは、ミクロゲル構築ブロックの高精度作製によって、既定のゲル足場の作製が可能となることを示すグラフを示している。異なる構築ブロックのサイズは、本明細書において孔径中央値＋／−標準偏差（ＳＤ）として示される、得られる微孔性ネットワークの特徴に対する決定論的制御を可能にする。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
好ましい実施形態の説明において、その一部を形成する添付図面が参照され、添付図面では、本明細書に記載の発明の主題が実施され得る特定の実施形態が説明のために示される。他の実施形態を利用することができ、本明細書に記載の発明の主題の範囲および精神から逸脱することなく構造的変化を実施できることを理解されたい。さらに、様々な実施形態の種々の態様は、本発明の範囲から逸脱することなく本明細書に記載の他の実施形態で利用することができる。
【００３１】
本明細書に記載の発明の主題の一態様において、複数のミクロゲル粒子がアニーリング反応で互いにアニールされた場合に形成される、創傷治癒等の生物医学的応用のための固形ミクロゲル足場が開示される。アニーリング反応は、本明細書に記載の発明の主題の一態様において、隣接するミクロゲル粒子の間で共有結合を形成する。例えば、アニール後の状態において、この足場は、適用部位または送達部位に適合する三次元構造を形成する。ミクロゲル粒子が不完全に充填されることで、これらの粒子から形成されたアニール後の足場は、足場内に形成された間隙を含み、その間隙において、細胞は遊走、結合、および増殖することができる。形成された足場構造は、創傷部位または他の送達部位におけるアニーリングの後に多孔性となる（フィブリン系製品によって提供される非多孔性固形足場とは異なる）。この多孔性は、上記の間隙、および、粒子それ自体の中に作られ得る、または形成され得る、ナノスケールの細孔を含む。足場構造の微小孔性は、栄養分、細胞成長因子および細胞分化因子の高い拡散率、並びに細胞遊走、内部増殖、および浸透を可能にする。足場の微小孔性は、足場全体の完全性が維持されながら間隙中の細胞遊走が増強されることから、従来のフィブリン糊、超分岐ポリマー、または任意の分解性架橋剤を有するポリマーを超えた、治癒の促進または治療上の薬剤もしくは医療品の送達の向上をもたらす。さらに、生体材料を天然材料に限定しないことで、例えば、有効範囲がより大きくより多様な生物学的シグナルを有することにより、分解特性および物理的性質（例えば、剛性、内部拡散率等）が向上され、あるいは、治療効果のある化学製品を、前記材料内に含ませることができる（例えば、抗生物質、ステロイド類、増殖因子等を足場に搭載することができる）。さらに、生物活性を惹起または制御するための薬剤、化合物、または他の物質の放出または溶出が、ある実施形態において、所望の生体材料の改変を通じて調整され得る。上記のシグナル化合物またはシグナル分子は、治癒過程中または足場分解後に組織に暴露され得る。シグナル化合物またはシグナル分子はまた、送達部位における足場の初期配置後に、患部に放出または溶出され得る。
【００３２】
ＳＴＡＲ（商標）技術等の方法を上回る、本明細書に記載の発明の主題の１つの利点は、足場の形成がインビボで起こることであり、これにより、所望の空間を完全に充填させること、および周辺組織に（化学的または別様に）結合するように調整することが可能となる。さらに、ミクロゲル粒子の送達前形成は、周辺組織の特性に適合させるための、得られる形成後足場の機械的同調性（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｔｕｎａｂｉｌｉｔｙ）の制御を可能にする。これらの能力は、より良好な封鎖および組織との全体的な統合をもたらす。より良好な統合は、材料破壊の可能性の減少および長期的再生の増強をもたらす。これはまた、環境からの汚染を防止するのにも役立つ。さらに、アニールされた足場の微小孔性は、足場に対する免疫異物反応を低減させるのに有利である。
【００３３】
図１は、複数のアニール後ミクロゲル粒子１２によって形成される、形成後の三次元足場１０の一部を図示している。足場１０は、より大きな足場１０の中に微小孔を形成する空隙である、内部間隙１４を含む。間隙１４は、細胞の浸潤、結合、および増殖を許す寸法および幾何学的特性を有する。本明細書で開示される足場１０の微小孔性が、より大きな足場構造を形成するアニール後ミクロゲル粒子１２の間に位置する間隙または空隙１４のネットワークに関与するは理解されよう。一実施形態において、足場１０の内部に作られた間隙または空隙１４は、負の凹面を示す（例えば、内部空隙表面が凸面である）。図１は、負の凹面を示す空隙壁１６を有する例示的な空隙１４を図示している。負の凹面は、１つの好ましい実施形態において、互いにアニールされるミクロゲル粒子１２が、形状において、概して、または実質的に球状であることから生じる。これは、一実施形態によれば約１０％〜約５０％の、別の実施形態では約２６％〜約３６％の、低い空隙容量分率をもたらす、ミクロゲル粒子１２の充填を可能にする。空隙容量分率が低い一方で、空隙１４のネットワーク内にある実施形態において示される負の凹面は、細胞が相互作用するための空隙容量に、比較的高い表面積を提供する。所与の細胞体積において、細胞は、概して、さらにより多くの且つより大きな表面（例えば、空隙壁１６）に暴露されることで、足場１０内の空隙ネットワークの中で相互作用するだろう。
【００３４】
空隙ネットワークが、ミクロゲル表面が極めて近接している（例えば、近く隣接しているアニール後ミクロゲル粒子１２）領域から成ることで、細胞が付着しその中を素早く遊走する高表面積の付着領域がもたらされ、一方で、さらにミクロゲル粒子１２の間の間隙にある隣接領域は、この空間内での細胞増殖および組織成長を可能にし得るより大きな空間を有する、ということを留意することは重要である。従って、密接な空隙領域およびより広々とした空隙ギャップ（ｖｏｉｄ  ｇａｐ）を組み合わせた隣接性は、全体的に小さな空隙または全てがより大きな空隙と比較して、組織の内部成長および再成長に対し有益な作用を有すると予想される。
【００３５】
上記の実施形態において、負の凹面がミクロゲル粒子１２の球形によって生じることに留意されたい。他の実施形態では、ミクロゲル粒子１２は球形でない場合がある。他の非球形が足場１０で使用されてもよい。図１を参照すると、足場１０は、アニーリング表面１７を介して互いに固定し合うミクロゲル粒子１２によって形成される。本明細書で説明されるように、アニーリング表面１７は、目的とする送達部位へのミクロゲル粒子１２の適用中または適用後に形成される。
【００３６】
足場１０は、戦地医学、医学的な外傷治療、術後閉鎖、熱傷、炎症性、遺伝性、および自己免疫性の水疱形成疾患等の種々の医学的応用を含む様々な応用に、使用され得る。一つまたは複数の実施形態において、足場１０は、組織シーラントとして使用される（例えば、急性創傷治癒物質、外科用シーラント、中間層、全層、またはトンネル型の創傷、褥瘡性潰瘍、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、慢性血管性潰瘍（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｕｌｃｅｒ）、ドナー皮膚移植部位、モース氏手術後、レーザー手術後、足病学的創傷（ｐｏｄｉａｔｒｉｃ  ｗｏｕｎｄ）、創傷離開、擦過傷、裂傷、第２度または第３度熱傷、放射線損傷、皮膚裂傷、および排液性創傷等に対する局所用剤）。図２Ａ〜図２Ｃは、哺乳動物の組織１０２に形成された創傷部位１００を治療するために足場１０が使用される、ある実施形態を図示している。ある実施形態において、足場１０は急性創傷の緊急治療に使用される。急性創傷において、足場１０は、より自然な組織発達をもたらす（例えば、瘢痕組織の形成を回避する）ための、創傷１００の封鎖、経皮水分損失の防止、細胞または薬剤の供給、および皮膚創傷（例えば、手術部位、熱傷、潰瘍）の治癒の増強のための迅速な方法を含む、いくつかの利点を提供する。足場１０の１つの特定の利点は、瘢痕組織の形成を低減または最小化する足場１０の能力である。足場１０は、組織接着剤（ｔｉｓｓｕｅ  ｇｌｕｅ）並びに他の現在の注射用組織充填剤および注射用組織接着剤の、より有効な代替物を提供する。
【００３７】
図２Ａに示されるように、ミクロゲル粒子１２が創傷部位１００に送達された後、アニーリング反応が開始され、ミクロゲル粒子１２が互いにアニールされることで、足場１０が形成される。図２Ａに示されるように、創傷部位１００は足場１０によって封鎖され、時間が進むにつれ、創傷部位１００は正常組織へと治癒される（図１１も参照）。図２Ｂは、隣接するミクロゲル粒子１２（粒子Ａおよび粒子Ｂ）がどのようにして、アニーリング反応を化学的または酵素的に惹起してミクロゲル粒子１２間にアニーリング表面１７を形成させるか、を図示している。図２Ｃは、足場１０の多孔性による、足場１０がどのようにして、構造的支持として作用する一方で、組織浸潤および生体材料吸収を可能にするかを示す、拡大図を示している。足場１０内に形成された間隙に浸潤する細胞１０６が図示される。
【００３８】
足場１０はまた、再生能において利用され得、例えば、熱傷、急性および慢性の創傷等に対して組織に適用され得る。一実施形態において、足場１０は慢性創傷に対し使用される。正常な治癒過程が抑制される慢性創傷において、足場１０を使用することで、創傷を封鎖できるだけでなく、過剰な水分を除去し、薬剤を適用することもでき、例えば、正常な創傷治癒過程を促進するのに役立ち得る細胞治療が含まれる。加齢、脂肪組織萎縮症、脂肪異栄養症、皮膚瘢痕、または表在性もしくは深在性の皺に関連した体積減少に対する組織充填材適用の場合、ミクロゲル粒子１２の針またはカニューレを介した真皮への直接注射を用いることで、組織輪郭、組織欠損、または組織変位が改善され得る。再生医療で使用される細胞はミクロゲル粒子１２内で増殖することができるため、組織における生体位でのアニーリングの前に、細胞（例えば、間葉系幹細胞、線維芽細胞等）は、はじめに細胞（１〜２０個の細胞）をミクロゲル粒子内に重合することにより治療として含まれてもよく、あるいは、細胞ははじめにミクロゲル粒子に接着されてもよく、あるいは、細胞はミクロゲル粒子溶液と共に導入されてもよい（非接着型）。
【００３９】
足場１０はまた、インビトロ組織成長、生物科学研究のための三次元（３Ｄ）マトリックス、並びに美容および皮膚科応用に使用され得る。例えば、がん細胞が、ミクロゲル前駆体と共に播種され得、アニールされた後、他の３Ｄ培養ゲル（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標））では必要とされるであろうマトリックス分解の必要無く、より生理学的に適切な薬剤試験のための腫瘍球状体の急速な３Ｄ成長を可能にし得る。アニールされたゲルの３Ｄマトリックス内での細胞間接触を急速に形成する能力は、薬剤スクリーニングまたは化粧品試験に使用され得る、単一の細胞型または複数の細胞型からの微小組織の成長および形成を増強すると期待される。表皮層が足場１０の表面上に形成可能であり、これは、動物モデルと比較してより皮膚に似た代替物に対する薬剤または化粧品の試験を可能にし得る。以前の３Ｄ培養材料は、体積全体で均一なゲル内の細胞播種を可能にし得るが、多孔性が欠如しているために細胞間接触を維持することができず、あるいは、多孔性を生み出し得るが、組立後の細胞播種と足場への細胞遊走を必要とし得る。
【００４０】
本明細書で説明されたように、アニールされた足場１０は通常決められた構造を形成するが、一方で、最終アニーリングの前の前駆体物質は、流動性を有し、目的の送達部位に、ペースト、スラリーとして送達され得、あるいは注射もされ得る。他の注射用ヒドロゲルはインサイツでの組織の再成長および再生のための足場を提供し得るが、これらの注入物質は組織再形成の前にゲル分解を必要とし、これにより、物理的支持を与えるそれらの能力が制限される。本明細書に記載の注射用微小孔性ゲル系は、組織再形成および材料分解の併発のための相互連結した微小孔性ネットワークを提供することにより、この問題を回避する。
【００４１】
マイクロ流体形成は、実質的に単分散のミクロゲル粒子１２が、（本明細書に記載の発明の主題の一態様における）相互連結した微小孔性のアニールされた粒子足場１０を形成することを可能にし、それにより、ミクロゲル粒子１２（例えば、構築ブロック）の化学的、物理的、および幾何学的な特性の制御を可能にすることで、構築された足場１０の物理的および化学的な性質の下流制御をもたらす。インビトロにおいて、足場１０形成の間に取り込まれた細胞は、増殖し、４８時間以内に大規模な三次元ネットワークを形成する。インビボにおいて、足場１０を形成する注射用ゲル系は、細胞遊走を促すことで、５日以内の急速な皮膚組織再生および組織構造形成をもたらす。足場１０によって達成される微小孔性および注射適性の組合せは、インビボでの組織再生および新規の組織形成のための新規経路を可能にする。
【００４２】
図２Ａは、創傷部位１００内に形成された足場１０を示している。好結果となる組織再生用材料は、材料分解速度を組織発達に正確に調和させることから恩恵を受ける。分解があまりにも速く起こる場合、組織内部増殖を支持するのに不十分な足場しか残らない。逆に、遅過ぎる速度は、適切な組織発達を妨げ、線維症および／または免疫拒絶を促し得る。局所環境に基づく分解速度の調整が、加水分解的および酵素的に分解可能な材料を用いて取り組まれている。しかし、細胞浸潤に伴う材料の機械的安定性の脱結合喪失（ｄｅｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｌｏｓｓ）は、非常に厄介であることが分かっている。材料内への細胞浸潤の促進はまた、軽度に架橋されたマトリックスを用いて取り組むこともできるが、これはしばしば、周辺組織との機械的不整合および材料安定性の不足をもたらす。あるいは、ヒドロゲル分解速度は、ポリマー骨格のアイデンティティ（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）または架橋密度を変更し、分解速度と組織形成を調和させることにより、調整することができる。これらの技術は、注射用ヒドロゲルの特定の適用に取り組むために調整可能であるが、材料安定性の減少に依らないバルク組織統合（ｂｕｌｋ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を達成するためのロバストな経路を提供しない。
【００４３】
全ての創傷部位は、機能的な組織再生のためのその物理的、化学的、および分解における要求が独特であり、種々の厄介な環境に左右されない材料戦略を必要とする。微小孔性ゲル系および本明細書に記載の通りに作製された得られた足場１０は、細胞遊走および周辺組織とのバルク統合（ｂｕｌｋ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）のための、安定に連結され相互接続した微小孔ネットワークを提供することによって、組織内部増殖の前の材料分解の要求を回避する。微小孔性ゲル系はこれらの好ましい特徴を、一実施形態によれば、マイクロ流体油中水型液滴分割化により形成される「構築ブロック」または「サブユニット」としてのミクロゲル粒子１２の自己集合を利用して、達成する。一実施形態によれば、このように形成されたミクロゲル粒子１２は実質的に単分散である。ミクロゲル粒子１２はあらゆる所望の形状に注入および成形可能である。ミクロゲル粒子１２の格子はその後、表面の官能基を介して互いにアニールし合い、相互連結した多孔性ネットワーク内に存在する細胞を伴って、または伴わずに、相互連結した微小孔性足場１０を形成する。一実施形態において、足場１０は、好ましくは、組織再生および内部増殖のための三次元足場１０を形成する共有結合したミクロゲル粒子１２を含む。
【００４４】
注射適性と微小孔性を組み合わせることにより、微小孔性ゲル系は、インビトロにおける効率的な細胞ネットワーク形成およびインビボにおけるバルク組織統合（ｂｕｌｋ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）に理想的な生体材料足場を提供する。モジュール式の微小孔性ゲル系はまた、迅速な細胞遊走、直接的な細胞接着のための分子的手がかり、並びに組織再生の間および後の再吸収のための機械的支持を提供する。マイクロ流体作製を通じて、ミクロゲル粒子１２の化学的、物理的、および幾何学的な特性は、予想通りに且つ均一に調整可能であり、これにより、応急の足場１０の特性を下流制御することができる。ロバストに達成される不完全な自己集合が微小孔性を達成するのに望ましい、新規の構築ブロックに基づくアプローチは、組織模倣構築物としてのヒドロゲルの使用および実施を根本的に変化させ、バルク組織統合（ｂｕｌｋ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）のための注射可能な足場へのアプローチに、考え方の変化を与える。
【００４５】
本明細書に記載の発明の主題の一態様において、微小孔性ゲル系は、約５μｍ〜約１，０００μｍの範囲内の直径寸法を有するミクロゲル粒子１２を使用する。ミクロゲル粒子１２は、親水性ポリマー、両親媒性ポリマー、合成または天然ポリマー（例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ゼラチン、フィブリン、キトサン、ヘパリン、ヘパラン、およびＨＡ、ゼラチン、フィブリン、キトサン、ヘパリン、またはヘパランの合成型）から作製され得る。一実施形態において、ミクロゲル粒子１２は、ヒドロゲルを形成可能ないかなる天然ポリマー（例えば、修飾ＨＡ）または合成ポリマー（例えば、ＰＥＧ）からも作製される。一つまたは複数の実施形態において、ポリマーネットワークおよび／または固形ヒドロゲル構築物を形成可能な他のあらゆる支持ネットワークが使用され得る。大部分の組織工学／再生医療適用に適した支持材は、概して、生体適合性であり、好ましくは生分解性である。適切な生体適合性および生分解性の支持の例としては、天然の高分子炭水化物およびそれらの合成による修飾、架橋、または置換された誘導体、例えば、ゼラチン、寒天、アガロース、架橋アルギン酸、キチン、置換および架橋結合されたグアーガム、特に亜硝酸およびカルボン酸とのセルロースエステル、混合セルロースエステル、並びにセルロースエーテル；架橋結合または修飾されたゼラチン、およびケラチンを含む、タンパク質および誘導体等の、窒素を含有する天然ポリマー；ビニルポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）アクリレート／メタクリレート／ビニルスルホン／マレイミド／ノルボルネン／アリル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸、上記重縮合物のコポリマーおよびターポリマー、例えば、ポリエステル、ポリアミド、および他のポリマー、例えば、ポリウレタン；並びに、上記クラスの混合物またはコポリマー、例えば、既存の天然ポリマーに対する合成ポリマーの重合を開始することにより得られるグラフト共重合体が挙げられる。種々の生体適合性および生分解性のポリマーが治療応用に利用でき；例としては、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、およびポリ−３−ヒドロキシブチレートが挙げられる。このような材料からネットワークを作製するための方法は周知である。
【００４６】
一つまたは複数の実施形態において、ミクロゲル粒子１２は、ミクロゲル粒子１２形成中に形成されるシグナル伝達修飾として機能する共有結合した化学製品または分子をさらに含む。シグナル伝達修飾は、例えば、接着性ペプチド、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質等の添加を含む。官能基および／またはリンカーを、共有結合的な方法または非共有結合的相互作用（例えば、静電気的な電荷間相互作用または拡散律速隔離（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ））を通じて、ミクロゲル粒子１２の形成後に、ミクロゲル粒子１２に付加することもできる。架橋剤は所望の分解特性に応じて選択される。例えば、ミクロゲル粒子１２の架橋剤は、加水分解、酵素、光分解等により分解され得る。１つの特定の好ましい実施形態において、架橋剤はマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−分解性架橋剤である。
【００４７】
これらの架橋剤の例は、ＭＭＰ−１標的基質、ＭＭＰ−２標的基質、ＭＭＰ−９標的基質に対応する配列、ランダム配列、Ｏｍｉ標的配列、熱ショックタンパク質標的配列、および、全てまたはいくつかのアミノ酸がＤキラリティーまたはＬキラリティーであるこれらの列挙された配列のいずれかを有する、合成により製造された、または天然から単離されたペプチドである。別の実施形態において、架橋剤配列は、上記の同一骨格（例えば、ヘパリン、アルギン酸、ポリ（エチレングリコール）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸、上記重縮合物のコポリマーおよびターポリマー、例えば、ポリエステル、ポリアミド、および他のポリマー、例えばポリウレタン）から成る、加水分解により分解可能な天然ポリマーおよび合成ポリマーである。
【００４８】
別の実施形態において、架橋剤は、制限酵素認識配列、ＣｐＧモチーフ、Ｚｎフィンガーモチーフ、ＣＲＩＳＰＲ配列またはＣａｓ−９配列、Ｔａｌｏｎ認識配列、および転写因子結合ドメインに対応する配列を有する、合成により製造された、または天然から単離されたＤＮＡオリゴである。上記の実施形態からの架橋剤のいずれかは、架橋剤を架橋反応に参加させてポリマーネットワークまたはゲルを形成させる化学基と定義される反応性基によって各末端において活性化され、これらの官能基としては、システインアミノ酸、合成および天然に存在するチオール含有分子、カルベン含有基、活性化エステル、アクリレート、ノルボレン（ｎｏｒｂｏｒｅｎｅ）、一級アミン、ヒドラジド、ホスフェン（ｐｈｏｓｐｈｅｎｅ）、アジド、エポキシ含有基、ＳＡＮＰＡＨ含有基、およびジアジリン含有基を挙げることができる。
【００４９】
一実施形態において、ミクロゲル粒子１２を作製するために使用される化学作用（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）は、急激に開始される（ｒａｄｉｃａｌｌｙ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ）重合を介した後のアニーリングおよび足場１０形成を可能にする。これには、テトラメチルエチレンジアミンと組み合わされた過硫酸アンモニウム等の、化学的開始剤が含まれる。あるいは、Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９またはエオシンＹ等の光開始剤（ｐｈｏｔｏｉｎｉｔａｔｏｒ）を、遊離チオール基等のフリーラジカル移動剤と共に（１０μΜ〜１ｍＭの範囲内の濃度で使用される）、本明細書に記載の反応を開始させるために使用される光源と組み合わせて使用してもよい。遊離チオール基の一例としては、例えば、本明細書に記載のアミノ酸システインが挙げられ得る。言うまでもなく、遊離システインを含むペプチドまたは遊離チオールを含む小分子を使用してもよい。フリーラジカル移動剤の別の例としては、Ｎ−ビニルピロリドン（ＮＶＰ）が挙げられる。
【００５０】
あるいは、求核性基（例えば、チオール、アミン、アミノキシ（ａｍｉｎｏｘｙ））に対する、α，β−不飽和カルボニル基（例えば、アクリレート、ビニルスルホン、マレイミド等）を含む、マイケル付加反応および偽マイケル付加反応を用いて、ミクロゲル粒子１２をアニールし、足場１０を形成させてもよい。別の実施形態において、ミクロゲル粒子１２形成の化学作用は、フィブリノーゲンからフィブリンへの（触媒酵素トロンビンの添加を介した）ゾル−ゲル転位を含む、ゾル−ゲル転位の惹起を介した、ネットワーク形成を可能にする。
【００５１】
粒子間アニーリングを可能にする官能基は、ミクロゲル粒子１２の形成の間または後に含まれる。一つまたは複数の実施形態において、これらの官能基は、隣接粒子上のα，β−不飽和カルボニル基とのラジカル開始反応、または、粒子間の多機能性リンカーとして、もしくは隣接粒子上に存在する官能基として外因的に存在する求核性官能基とのマイケル付加反応および偽マイケル付加反応のいずれかを介したアニーリングのために活性化され得るα，β−不飽和カルボニル基を含む。この方法は、混合された際に足場１０を形成する、複数のミクロゲル粒子１２集合型を使用し得る。例えば、例えば求核性表面基を提示するＸ型のミクロゲル粒子１２が、例えばα，β−不飽和カルボニル基を提示するＹ型ミクロゲル粒子１２と共に使用され得る。別の実施形態では、クリックケミストリーに関与する官能基が含まれ得、この官能基により、優遇の（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）クリック官能基を提示する隣接ミクロゲル粒子１２に直接的な、または、クリック反応に関与する、もしくはそれを開始させる外因的に提示される多機能性分子（例えば、銅）を介した、結合が可能となる。
【００５２】
アニーリング官能基は、初期架橋反応と比較して、その開始条件（例えば、温度、光、ｐＨ）の点で、直交性（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）または類似の（潜在的な反応性基が残っている場合）、ミクロゲル架橋に使用されるあらゆる前述の官能基を含み得る。例えば、初期架橋反応が温度依存性のマイケル付加反応から成る場合、続くアニーリング官能基は、は、温度開始または光開始（例えば、エオシンＹ、Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標））を通じて惹起され得る。別の例として、初期ミクロゲルがある光波長で（例えば、Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）を用いて紫外線波長で）光重合され、ミクロゲル粒子１２のアニーリングが同じまたは別の光波長で（例えば、エオシンＹを用いて可視波長で）起こり得、あるいは、逆もまた起こり得る。共有結合反応によるアニーリングに加え、アニーリング部分は、非共有結合的な疎水性のゲスト／ホスト相互作用（例えば、シクロデキストリン）、隣接ミクロゲル粒子１２上の相補的核酸配列もしくは核酸模倣体（例えば、タンパク質核酸）間のハイブリダイゼーション、またはイオン性相互作用を含み得る。イオン性相互作用の一例は、Ｃａ２＋でアニールされるミクロゲル粒子表面上のアルギン酸官能基から成るであろう。いわゆる「Ａ＋Ｂ」反応を使用することによっても、同様にミクロゲル粒子１２をアニールすることができる。本実施形態では、２つの別々のミクロゲル型（Ａ型およびＢ型）が様々な比（０．０１：１〜１：１００  Ａ：Ｂ）で混合され、Ａ型の表面官能基がＢ型と反応して（逆の場合も同じ）、アニーリングが開始される。これらの反応型は本明細書に記載される機構のいずれかに分類され得る。
【００５３】
一実施形態において、ミクロゲル粒子１２は、小さなばらつきで、且つハイスループット（例えば、１０粒子／秒を超える頻度）に、確定的なミクロゲル粒子の長さスケールを生み出す、マイクロ流体法またはミリ流体法（ｍｉｌｌｉｆｌｕｉｄｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて作製される。ミクロゲル粒子１２長さスケール（例えば、直径）の変動係数は、平均的な長さスケールの３５％以内、あるいはより好ましくは１５％以内、さらにより好ましくは５％以内であり得る。ミリフルイディクス（ｍｉｌｌｉｆｌｕｉｄｉｃｓ）またはマイクロフルイディクスは、均一な、既定の、簡潔な材料特性が、ミクロゲル粒子１２の形成の前、間および後に含まれることを可能にする。さらに、マイクロ流体／ミリ流体作製機構は、生成規模拡大の容易さ、並びに、ミクロゲル粒子１２の化学組成および物理的特徴に対する良好な品質管理を可能にする。ミクロゲル粒子１２生成のためのミリ流体技術および／またはマイクロ流体技術は、ミクロゲル粒子１２特徴における正確度および精度を高く維持しつつ、商業的な需要に対して大量の物質を作り出すために容易に拡張が可能な工程である。さらに、これは全て、静電紡糸または大規模フィブリン精製を含む他の技術に比べて、低コストで達成される。
【００５４】
一実施形態において、ミクロゲル粒子１２は、油中水型エマルジョン生成に依る自動化された流体法を用いて形成される。これには、ガラス／ＰＤＭＳ、ＰＤＭＳ／ＰＤＭＳ、ガラス／ガラス、または成形（ｍｏｌｄｅｄ）／鋳造（ｃａｓｔ）／型押（ｅｍｂｏｓｓｅｄ）プラスチックチップを利用して、３５％未満のサイズ分布変動を有する油中水型液滴を作り出す、マイクロ流体法またはミリ流体法が含まれる。
【００５５】
図３Ａ〜図３Ｆは、ミクロゲル粒子１２を生成するために使用されたマイクロ流体デバイス２０の一実施形態を示している。マイクロ流体デバイス２０は、基板２２と結合した別の基盤材料２４（例えば、ガラス）を含み得る、ＰＤＭＳ等の基盤材料２２に形成される。この実施形態において、マイクロ流体デバイス２０は、第一注入口２６、第二注入口２８、および第三注入口３０を含む。図３Ａに示されるように、第三注入口３０は、第一注入口２６と第二注入口２８の間に挿入される。この実施形態において、第一注入口２６は、細胞接着特性のためのオリゴペプチド（例えば、ＲＧＤ）および表面／組織アニーリング官能基（例えば、ＫペプチドおよびＱペプチド）で事前に修飾された、４腕のポリ（エチレングリコール）ビニルスルホン（ＰＥＧ−ＶＳ）骨格（２０ｋＤａ）を含有する溶液に連結される。ＰＥＧ−ＶＳ骨格は、５００μΜ  Ｋ−ペプチド（Ａｃ−ＦＫＧＧＥＲＣＧ−ＮＨ２［配列番号１］）（ジェンスクリプト社（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ））、５００μΜ  Ｑ−ペプチド（Ａｃ−ＮＱＥＱＶＳＰＬＧＧＥＲＣＧ−ＮＨ２［配列番号２］）、および１ｍＭ  ＲＧＤ（Ａｃ−ＲＧＤＳＰＧＥＲＣＧ−ＮＨ２［配列番号３］）（ジェンスクリプト社）を用いて事前に官能基化され得る。第一注入口２６に注入される溶液は、０．３Ｍトリエタノールアミン（シグマ社）の緩衝液（ｐＨ８．２５）中に含有される約５％（重量ベースで）の修飾ＰＥＧ−ＶＳを含有し得る。第二注入口２８は、架橋剤を含有する溶液に連結され、前記架橋剤は、一実施形態では、１２ｍＭ  ジ−システイン修飾マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）（Ａｃ−ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣＧ−ＮＨ２［配列番号４］）基質（ジェンスクリプト社）である。蛍光イメージングを利用して実施された実験では、ＭＭＰ基質は１０μΜ  Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ６４７−マレイミド（ライフテクノロジーズ社）と事前に反応させられた。言うまでもなく、実際の適用では、蛍光プローブの使用は必要ではない。全ての溶液は、ルアーロック式シリンジフィルター内の０．２μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を通じて無菌濾過され得る。
【００５６】
本明細書で使用される場合、Ｋ−ペプチドは、活性化第ＸＩＩＩａ因子によって認識されるリジン基を内部に含有するペプチドを指す。本明細書で使用される場合、Ｑ−ペプチドは、活性化第ＸＩＩＩａ因子によって認識されるグルタミン基を内部に含有するペプチドを指す。従って、上記に具体的に記載されたペプチド配列以外のペプチド配列も使用され得る。同じことが上記のＲＧＤペプチド配列にも当てはまる。
【００５７】
第三注入口３０は、５重量％のＰＥＧ−ＶＳ（Ｋペプチド、Ｑペプチド、またはＲＧＤペプチドで修飾されていない）を含有する水溶液に連結される。ＰＥＧ−ＶＳ水溶液は、第一注入口２６を介して導入されるＰＥＧ−ＶＳ溶液と粘度が一致していることが好ましく、架橋剤溶液のｐＨを調節するために、および液滴形成までの架橋を阻害するために、使用され得る。第一注入口２６と第二注入口２８の間に挿入された第三注入口３０を有することで、ＰＥＧ−ＶＳ水溶液は、液滴生成領域の上流での反応性溶液のあらゆる物質拡散混合を防止する障壁として機能する。これにより、汚損が起きる前のデバイスの寿命が有意に延長される。図３Ｅおよび図３Ｆは、不活性溶液が液滴分割化前の左の溶液と右の溶液の混合をどのようにして防ぐかを示している。ミクロゲル粒子１２を作製する方法は、第三注入口３０を取り除き、ペプチド／架橋剤濃度を適宜調整することによっても上手くいくが、デバイスの寿命がそれほど長くはならないことに留意されたい。
【００５８】
図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃを参照すると、第一注入口２６、第二注入口２８、および第三注入口３０は、それぞれ、チャネル３２、３４、３６に連結されている。チャネルは接合部３８で交差しており、共通チャネル４０の中に保有される。第四注入口４２がデバイスに備えられ、界面活性剤（他の界面活性剤を使用することができるが、例えば、１体積％ＳＰＡＮ（登録商標）８０）を含有する油相に連結される。第四注入口４２は、共通チャネル４０の下流領域における接合部４８で交差する、２つのチャネル４４、４６に連結される。デバイス２０内の接合部４８は、ＰＥＧ−ＶＳ成分および架橋剤を含む水性液滴が形成される場所である。液滴の内容物は混合を経て、ゲル化後にミクロゲル粒子１２を形成し、この形成は、この実施形態において、周囲温度および経過時間の関数である。このデバイスでは、第四注入口４２に連結された油相よりも高い体積パーセントの界面活性剤を含有する別の油相に連結された第五注入口５０が備えられている。例えば、第五注入口５０は、５体積％ＳＰＡＮ（登録商標）８０を含有する油相に連結され得る。繰り返しになるが、ＳＰＡＮ（登録商標）８０以外の他の界面活性剤も使用することができる。第五注入口５０は、図示されるように狭窄する配向で接合部５６において交差する２つのチャネル５２、５４に連結される。
【００５９】
共通チャネル４０は一連の次第に分岐する分岐チャネル５８へと続く。分岐チャネル５８は局所的環境条件を所望により調節可能な個々の並行チャネルを通じたミクロゲル粒子１２の連続流を可能にする。例えば、個々の分岐チャネル５８の温度を調節することにより、ミクロゲル粒子１２の架橋条件を制御することが可能である。同様に、分岐チャネル５８に光を照射することで、光によって活性化される反応を調節することができる。ミクロゲル粒子１２は、出口５９を用いてデバイス２０から除去され得る。しかし、デバイスが周囲温度でまたはおよそ周囲温度で作動される場合、架橋反応は時間の経過だけでも起こり得るため、分岐チャネル５８の温度制御または光活性化の使用が完全に任意なものであることを理解されたい。
【００６０】
図３Ｄに最も良く示されるように、第一注入口２６、第二注入口２８、第三注入口３０、第四注入口４２、および第五注入口５０は、同様に接続された注入口２８、２８、３０、４２、５０に各々の液体をポンプ式に押し出す、ポンプデバイス５１または複数のポンプデバイス５１に接続された、流線２６’、２８’、３０’、４２’、および５０’にそれぞれ接続される。ポンプデバイス５１は、各々異なる液体に接続された別々のポンプを含んでいてもよい。使用され得るポンプの種類の例としては、注射器ポンプまたはマイクロ流体デバイスに関連して一般に使用される他のポンプが挙げられる。一態様において、ポンプデバイス５１は、デバイスを通じて所望の流速で液体をポンプ式に押し出すために、液だめ上部に制御された加圧ガスを使用する。
【００６１】
図４Ａ〜図４Ｃは、ミクロゲル粒子１２を生成するために使用されたマイクロ流体デバイス６０の別の実施形態を示している。この別の実施形態では、図３Ａ〜図３Ｃの実施形態と異なり、液滴生成前にＰＥＧと架橋成分を分離するために使用される水溶液を運ぶ第三注入口３０が存在しない。適切には、この実施形態では、マイクロ流体デバイス６０は、第一注入口６２、第二注入口６４、第三注入口６６、および第四注入口６８を含む。第一注入口６２は、例えば上記の修飾ＰＥＧ−ＶＳ供給源に連結される。第二注入口６４は架橋剤に連結される。第三注入口６６は油および界面活性剤を含有する供給源に連結される。第四注入口６８は、第三注入口６６に連結された供給源よりも高い濃度で油および界面活性剤を含有する供給源に連結される。この実施形態では、第一注入口６２および第二注入口６４は、共通チャネル７４に繋がるチャネル７０、７２に各々連結される。第三注入口６６は、接合部８０で共通チャネル７４と交差するチャネル対７６、７８に連結され（図４Ｂに最もよく示される）、接合部８０で液滴生成が起こる（液滴は反応後にミクロゲル粒子１２を形成する）。第四注入口６８は、接合部８０に対して下流位置８６において共通チャネル７４と交差するチャネル対８２、８４に連結される（図４Ｂに最もよく示される）。図４Ａに示されるように、デバイス６０は、図３Ａ〜図３Ｃの実施形態との関連で記載されたものに類似した、一連の次第に分岐する分岐チャネル８８を含む。分岐チャネル８８を通過するミクロゲル粒子１２は、デバイス６０から取り外しできる収集チャンバ９０等に収集され得る。液体は、図３Ａ〜図３Ｃの実施形態に関連して先に記述された流線およびポンプデバイスを用いてデバイス６０に送達される。
【００６２】
ミクロゲル粒子１２形成をもたらす流体条件は、一実施形態において、一方の部分が基礎ポリマーを含有し、他方が架橋剤または開始剤を含有する、ＰＥＧをベースとした水溶液および架橋剤をベースとした水溶液のオンチップ混合を含む。言うまでもなく、図３Ａ〜図３Ｃの実施形態には、前記成分を含む３入力混合（ｔｈｒｅｅ−ｉｎｐｕｔ  ｍｉｘｉｎｇ）＋水性の不活性流の追加がある。これらのＰＥＧ溶液および架橋剤溶液は、１：１の体積比で、または１：１００までの別の制御可能な比（デバイス内への相対流速により制御される）で、混合される。油流速および総水流速の比を調節することにより、特定のサイズのミクロゲル粒子１２が決定され、ここで、これらの比は４：１（水：油）から１：１０（水：油）までの範囲を取り得る。
【００６３】
上記で説明したように、図３Ａ〜図３Ｄの実施形態において、チップデバイス２０は、３つの水性溶液を合わせてミクロゲル粒子１２を形成するように設計され、液滴生成の上流領域における溶液の反応および経時的なチップの汚損を防止するために、基礎ポリマーおよび架橋剤／開始剤が液滴生成器の上流で非反応性溶液によって分離される。この構成において、非反応性溶液の部分は、基礎および架橋剤溶液と等しいかそれ未満、他の溶液の体積比の１〜０．０５倍であるべきである。このようにして、この実施形態は、ミクロゲル生成に使用されるチップの信頼性および寿命を向上させることができる。さらに、この実施形態または先の実施形態では、細胞を２つまたは３つの導入される水溶液のどれかに導入することによって、封入された細胞が創傷治癒または細胞の内部増殖を増強するための因子を産生できるような、ミクロゲル粒子１２内へのこれらの細胞の封入（粒子当たり１つの細胞または２〜２０個の細胞からなるクラスター）が可能となり得る。
【００６４】
図３Ａ〜図３Ｄおよび図４Ａ〜図４Ｃは、ミクロゲル粒子１２を生成するために使用され得るマイクロ流体デバイス２０、６０の異なる実施形態を示しているが、別の実施形態では、マイクロ流体流路は、例えば図５に示されるような「Ｔ字形」構造を含み得る。この実施形態では、マイクロ流体デバイス９２は、水相を運ぶ第一チャネル９４の間に形成される接合部を含み、一方、第二チャネル９６は油相を含む。液滴９７が形成され、出口チャネル９８（第一または第二チャネル９４、９６と同じであってもよい）を介して運ばれる。あるいは、異なる液滴形成構成を用いてミクロゲル粒子１２を生成してもよい。例えば、参照により本明細書に援用されるＤａｎｇｌａ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｒｏｐｌｅｔ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｄｒｉｖｅｎ  ｂｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔｓ  ｏｆ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１１０（３）：８５３−８５８（２０１３）に開示されたデバイス等、デバイスは、非並行な上部壁および底部壁による閉じ込めの勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）を利用して液滴９７を生成し得る。
【００６５】
前記マイクロ流体デバイスにおいて、チャネル表面は、水相が非湿潤であるように修飾されるべきであり、前記修飾は、表面のフッ素付加、すなわち、共有結合的なシランに基づく処理または別の非特異的な吸着に基づくアプローチによって、疎水性または親フルオロ性になるように表面を変換することを含み得る。あるいは、親フルオロ性基を含有する可塑性ポリマーは、チップ材料を含み、前記表面コーティングと組合せることができ、あるいは表面コーティングは行われない。さらに、好ましい実施形態で使用される油は、非イオン性界面活性剤を添加されたミネラルオイル（パラフィン油）、イオン性界面活性剤を添加された植物油、またはフッ素化界面活性剤を添加されたフッ素化油（またはこれらの２つの油／界面活性剤系のあらゆる組合せ）であるべきである。これらのマイクロ流体法またはミリ流体法は、ミクロゲル粒子１２の単分散（３５％未満の変動係数）集合を１０Ｈｚ以上の速度で生成し、収集は手動で、または自動化された流体処理系を用いて達成される。架橋反応の完了前のミクロゲル粒子１２の合体を防止するためには、プレゲル液滴を安定化するのに十分な界面活性剤が必要であるが、高レベルの界面活性剤は液滴生成プロセスを不安定にもする。従って、ミクロゲル粒子１２生成のためのマイクロ流体系の好ましい実施形態は、液滴を生成する初回狭窄油流（１％以下）中に低濃度の界面活性剤を含み、その後、形成された液滴および油と混合され、より高いレベルの界面活性剤（１０倍まで、または５０倍も、初回界面活性剤よりも高い）を含有する、別の注入口からの油＋界面活性剤溶液が追加される。これは、例えば、図３Ａ〜図３Ｄおよび図４Ａ〜図４Ｃの実施形態に示される。
【００６６】
別の実施形態において、２つの油狭窄流は同じ濃度の界面活性剤を有する。さらなる別の実施形態では、第二の狭窄油流は存在せず、液滴を生じさせるための、流れを集束させる油流のみが存在する。さらに、上記で説明したように、いくつかの別の実施形態では、第二の狭窄油流が存在せず、液滴を生じさせるために、Ｔ字路油流のみが使用される。言うまでもなく、Ｔ字路型液滴接合部は、所望により、同じまたはより大きな界面活性剤濃度を有する第二の集束油注入口と組み合わせてもよい。
【００６７】
形成後、ミクロゲル粒子１２は、水相を通じた遠心分離、または固形物膜濾過デバイスを通じた濾過を用いて、油相から抽出される。例えば、濾過を用いることにより、ミクロゲル粒子１２を保持する自由水溶液の体積（自由体積）を減少させることができる。一実施形態において、水の自由体積は総体積の約３５％未満である。別の実施形態において、意図的な多分散集合を生成するために、ミクロゲル粒子生成が、ミリ流体プラットフォームまたはマイクロ流体プラットフォームで実行され、比較的に単分散のミクロゲル粒子１２のストックを生成し、次に所望の比で混合することで、ミクロゲル粒子１２サイズの確定的な分布および割合が得られる。ミクロゲル粒子１２サイズの割合を正確に調節することで、１：１、１０：１、または１００超：１の化学量論比で、最終的なアニール後足場１０の細孔構造または化学的性質を調節することができる。
【００６８】
あるいは、油中水滴系を介したミクロゲル粒子１２の生成は、音波混合法または回転ボルテックスを用いて実行することもできる。これらの後者の方法は、１００ナノメートル〜５００マイクロメーターの範囲のサイズを有する、ミクロゲル粒子１２の多分散集合を生成する。これらの粒子を次に、多孔性フィルター、マイクロ流体濾過、または当該技術分野において公知の他の技術を用いて濾過することで、ミクロゲル粒子１２のより狭いサイズ分布（例えば、５０％未満の変動係数）を得ることができる。別の代替法として、様々な形状の成分ミクロゲル粒子１２が、ストップフローリソグラフィー（ｓｔｏｐ  ｆｌｏｗ  ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）、連続流リソグラフィー（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｆｌｏｗ  ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）、および成形流に依存した成形粒子を生成するための他の方法（参照によって本明細書に援用される、Ａｍｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１３／０４９４０４号を参照）を、形状を定めるマスクを介したＵＶ開始重合と組合せて用いることにより、作製可能である。この場合、ミクロゲル粒子１２は、５〜１０００マイクロメーターで変動し得る長さおよび幅を有する非球状である。成形粒子はまた、油中水型エマルジョン中で球状粒子を生成し、次いで、粒子の直径よりも小さな長さスケールを有する微細加工狭窄部（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）を通じて前記粒子を押出し加工することによって、作製することができる。前記球状粒子は、ゲルに移行しながら狭窄部の形状をとり、上記の架橋剤反応のいずれかによって狭窄部においてゲル化しながら、その形状を保持する。ゲルは、微細加工構築物（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を出た後もその形状を保持する。成形粒子は、ミクロゲル粒子１２アニーリングによって形成される最終的な足場内での、さらなる細孔制御、全体的な多孔性、細孔のねじれ、および接着性向上を可能にし得る。
【００６９】
一つまたは複数の実施形態において、ミクロゲル粒子１２が、共有結合的に修飾されることで、またはされないことで（例えば、拡散による空間的内部への包含）、生物学的に活性な分子（例えば、小分子薬剤、抗生物質、ペプチド、タンパク質、ステロイド、マトリックスポリマー、増殖因子、抗原、抗体等）が提供される。ミクロゲル粒子１２の形成後のシグナル伝達分子の包含は、受動拡散、表面固定化（永久または一時的）、および／またはバルク固定化（ｂｕｌｋ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（永久または一時的）によって達成され得る。
【００７０】
別の実施形態では、ナノ粒子が、初期プレポリマー溶液中に含まれ、初期重合またはゲル化中にミクロゲル粒子１２に組み込まれる。前記ナノ粒子は、持続的または迅速な放出および送達のための生物学的に活性な分子を含み得る。別の実施形態では、遊離一級アミン（リジン含有オリゴペプチドの一部として含まれる）を含有するミクロゲル粒子１２が、ＮＨＳ−アジドで修飾され得る。このために、一連のミクロゲル粒子１２にＮＨＳ−ホスフィンで修飾されたタンパク質が加えられることで、修飾タンパク質によるミクロゲル粒子１２の表面コーティングがもたらされ得る。図１０は、ミクロゲル粒子１２が、内部に埋め込まれたナノ粒子、およびクリックケミストリーを用いてタンパク質で修飾された表面を有する、実施形態を示している。
【００７１】
生成および任意の修飾の後、ミクロゲル粒子１２（均一または不均一な混合物であり得る）は、所望の部位（インビトロ、インサイツ、インビボ）に適用され得る。哺乳類組織１０２上の所望の部位には、例えば、創傷部位１００または他の損傷組織部位が含まれ得る。ミクロゲル粒子１２は、等張食塩水溶液またはスラリー中で単独で導入することができる（３０〜９９％の体積分率のミクロゲル粒子１２が好ましく、１〜３０％の体積分率はあまり好ましくない）。あるいは、ミクロゲル粒子１２は、単一細胞または凝集塊としての細胞と共に導入することができ、細胞：粒子の比は、最終的なアニール後足場１０内に密な細胞ネットワークを生成するための１０：１、または、再生に有用な可溶性因子を産生する細胞を含む低密度播種足場１０を生成するための１：１００もしくは１：１０００である。別の実施形態において、ミクロゲル粒子１２を、細胞と共に、低い粒子体積分率で（１０％未満）、ある時間、細胞許容培地（ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ  ｍｅｄｉａ）中で培養することで、個々のミクロゲル粒子１２への接着を促進することができる。これらの細胞接着ミクロゲル粒子１２複合体は、修復活性の速度を増加させるのに有益であり得る、アニールすることで微小孔性の細胞播種足場１０を形成するであろう有効成分として、導入することができる。ミクロゲル粒子１２を導入するのに望ましいインビトロ部位には、アニーリング後に細胞用の３Ｄ微小孔性培養環境を形成し、その後の、より生理学的に適切な３Ｄまたは多細胞条件を用いた生物検定またはハイスループットスクリーニングアッセイを可能にするための、ウェルプレート（例えば、６ウェル、９６ウェル、３８４ウェル）またはマイクロ流体デバイスが含まれる。インビトロ導入では、ミクロゲル粒子１２溶液が、ウェル内にピペットで移されるか、または注射器注入により導入され、その後、アニーリング溶液が導入されるか、または光化学的にアニーリングが惹起され得る。あるいは、ミクロゲル粒子１２溶液は、送達前に遅効性アニーリング溶液（１０〜３０分かけてアニーリングが起こる）と混合され得る。インサイツの部位には外部創傷部位（例えば、切り傷、水疱、糜爛、褥瘡性潰瘍、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、慢性血管性潰瘍（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｕｌｃｅｒ）、ドナー皮膚移植部位、モース氏手術後部位、レーザー手術後部位、足病学的創傷（ｐｏｄｉａｔｒｉｃ  ｗｏｕｎｄ）、創傷離開、擦過傷、裂傷、第２度または第３度熱傷、放射線損傷、皮膚裂傷および排液性創傷等）が含まれる。表皮は上皮性構造であるため、ミクロゲル粒子溶液を用いることで、皮膚上皮（すなわち、胃潰瘍または十二指腸潰瘍；肺、膀胱または腸瘻等への貫通性外傷後）と同様に、他の上皮表面（すなわち、尿路上皮（膀胱および腎臓）、気道・消化器（肺、胃腸）が治癒され得る。さらに、ミクロゲル粒子溶液は、カテーテルまたはカニューレを介して、他の組織に、例えば、脊髄外傷、大脳梗塞／脳卒中、および心筋梗塞等の傷害後の瘢痕の予防および修復性治癒の促進に組織の内部増殖が有益であり得る神経組織および心臓組織に、適用することができる。
【００７２】
インサイツ導入では、ミクロゲル粒子含有溶液は、創傷部位１００への進入前のアニーリング反応の早発的な開始を防止するために、アニーリング溶液とは別に貯蔵され、導入中に混合され得る（エポキシ接着剤に似た方法）。
【００７３】
別で、前記２つの溶液は、直径が等しいまたは不等な２つのバレルを備えた注射器またはスクイーズチューブ型塗布器内に貯蔵され、それによって、注射器のプランジャーが押された際、またはスクイーズチューブが圧迫された際に、ミクロゲル粒子１２およびアニーリング溶液の両方が正確な化学量論で同時に送達され得る。図６Ａは、ミクロゲル粒子１２を含有する溶液を各々のバレル１１２、１１４から分配するために使用される、第一バレル１１２、第二バレル１１４、およびプランジャー１１６を含む、送達デバイス１１０の１つのそのような実施形態を示している。例えば、第一バレル１１２は、ミクロゲル粒子１２および０．１〜５Ｕ／ｍｌの範囲の濃度のトロンビンを含有し、第二バレル１１４は、ミクロゲル粒子１２および０．１〜１，０００Ｕ／ｍｌの濃度のＦＸＩＩＩを含有する。バレル１１２、１１４の両方の中には、１：１体積分率の、ＫペプチドおよびＱペプチドを含有するミクロゲル粒子１２が存在し、ＫペプチドおよびＱペプチドの濃度はミクロゲル粒子１２中で１０〜１，０００μΜの範囲である。この実施形態では、混合後に、トロンビンがＦＸＩＩＩを活性化して（ＦＸＩＩＩａを形成させ）、生じたＦＸＩＩＩａが、表面アニーリングおよび隣接するミクロゲル粒子１２上のＫペプチドおよびＱペプチドの連結に関与する。
【００７４】
あるいは、２つのバレル１１２、１１４は、架橋結合の開始に組み合わせを必要とするアニーリング部分を有する２つの別々のミクロゲル粒子１２型を含有し得る。別の貯蔵および送達の方法は、ミクロゲル粒子スラリーが、所望の体積に押し出され、創傷部位１００に広がり、その後、１０μΜ〜１ｍＭの範囲内の濃度も効き目があるが、光化学のための活性薬剤が１００μΜの濃度のエオシン−Ｙである露光を通じてアニールされ得る、図６Ｂに示されるような単一バレル注射器１１０または図６Ｃに示されるような複数回使用もしくは使い捨て用の圧縮チューブ（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｂｌｅ  ｔｕｂｅ）（例えば、歯磨き粉または抗生物質軟膏に類似した）においての方法であろう。エオシン−Ｙは、例えば遊離チオール基を有する化学種であり得る、ラジカル移動剤を伴うことが好ましい。１つのそのようなラジカル移動剤の一例としては、本明細書に記載のシステインまたはシステイン含有ペプチド（例えば、５００μΜの濃度で使用される）が挙げられる。光は、広域スペクトルの白色光（白熱またはＬＥＤ）、または緑色もしくは青色のＬＥＤ光を介して送達されるべきである。懐中電灯、ワンド（ｗａｎｄ）、ランプ、または周辺光も、白色光の供給に使用され得る。露光は０．１秒〜１０００秒の間に起こるべきであり、光の強度はアニーリング部位において０．０１ｍＷ／ｃｍ２〜１００ｍＷ／ｃｍ２の範囲であるべきである。別の実施形態において、光を介したアニーリングは、紫外光（３００〜４５０ｎｍの波長）を用いて達成され得、光化学のための作用剤は０．０１％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖの濃度のＩＲＧＡＣＵＲＥ（登録商標）２９５９である。露光時間は０．１秒〜１００秒であるべきであり、光強度はアニーリング部位において０．１ｍＷ／ｃｍ２〜１００ｍＷ／ｃｍ２であるべきである。光開始アニーリングが用いられる実施形態では、ミクロゲル前駆体１２は、使用前に、不透明な（アニーリングを惹起する波長範囲に対し不透明な）注射器またはスクイーズチューブ１１０容器の中に貯蔵されるであろう。所望のインサイツ部位には、内部切断および組織間隙（例えば、外科的切開または切除による）、熱傷、放射線創傷（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｗｏｕｎｄ）および潰瘍、または、今日の注射剤に共通している線維形成過程ではなく、組織部位を充填し組織の内部増殖および再生を促進するための美容外科適用におけるインサイツ部位が含まれる。
【００７５】
二連バレルまたは単一バレルの注射器を用いた送達は、この適用、並びに光活性化および手術部位に挿入可能なＵＶ源または白色光源を用いたアニーリングにも適している。インサイツ適用およびインビボ適用の両方において、ミクロゲル粒子スラリーが、創傷とちょうど重なるように、または創傷部位１００の範囲内および周辺に（創傷の範囲内に、および元の創傷範囲を２ｍｍ〜１ｃｍ超えて）盛られるように、無菌塗布器を用いて広げられることで、創傷部位１００または組織再生を支持するための追加の保護、水分、および構造の供給に欠陥がある組織の全体に広がるアニール後足場が生成され得る。
【００７６】
アニーリング過程は、刺激（例えば、ラジカル開始剤、酵素、マイケル付加等）の適用を通じて、または、ミクロゲル粒子１２の表面上の官能基と相互作用する、ミクロゲル粒子１２の適用部位に既に存在する刺激との相互作用を通じて開始され、それにより、アニールされた（連結された）ミクロゲル粒子１２から形成される、固体の連続した高度に多孔性の足場１０が形成される。組織において使用される場合、アニーリング過程は、周辺組織への足場１０の癒着を可能にさせ、有効な封鎖、局所的な薬物適用および／または細胞送達のためのデバイス、インビボ検出のための血管が新生された足場、並びに組織再生に至るより良好な経路を提供し得る。アニーリング過程は、その場での／要求に応じたゲル形成（インビトロ適用およびインビボ適用において理想的）、例えば、最小限に侵襲的な手術部位への小さな切開による送達、または、針による、もしくはカテーテルもしくはカニューレを通じた注入による送達、を可能にする。足場１２は、均一または不均一なミクロゲル粒子１２集合から構成され得る。論じられたように、不均一なミクロゲル粒子１２集団は、物性におけるばらつき（例えば、サイズ、形状、または剛性におけるばらつき）、または、化学組成におけるばらつき（例えば、分解速度を変更させる、分解可能なリンカー、またはＬ−もしくはＤ−アミノ酸の比のばらつき、アニーリング部分、細胞接着部分のばらつき、または、ミクロゲル１２への生物活性分子もしくはナノ粒子の積載）を有し得る。最終的なアニール後足場１０の不均一な組成が、無秩序であるか、または均一組成の層を成して構築されることにより、微孔性構造における勾配（例えば、層内のミクロゲル粒子１２サイズの変動による）、または、化学組成の勾配（異なる組成または生物活性分子積載を有するミクロゲル粒子１２の層による）がもたらされ得る。勾配は、インビボにおける細胞の内部増殖および組織再生、またはインビトロにおける組織構造の発達の指示において有用であり得る。ミクロゲル粒子１２組成中の勾配は、単一組成のゲルスラリーを連続的に送達してその後アニーリングし、次いで、第二組成の次のゲルを送達してその後アニーリングして、所望の数の層が堆積されるまで新しいミクロゲル層を前の層に連結することにより、達成され得る。各層の厚さは、注入されるスラリーの体積および注射部位の面積を用いて、調節することができる。勾配を達成するための別の実施形態は、各々のバレルに異なるミクロゲル組成を有する、図６Ａに示される塗布器等の、多バレル注射器型塗布器の積載である。各々のバレルは、同時に加圧され、層状シートにおいてノズル１２０に送り込まれる。注射器型塗布器のノズル１２０それ自体が非円形または矩形であることで、帯状構造で部位に注入される複数組成の層状スラリーを生成することができ、前記層状スラリーはその後にこの配置でアニールされ得る。構造的に連続したアニール後足場１０の形成は、ラジカルによる、酵素による、または化学的な（例えば、クリックケミストリー）プロセスを通じて達成され得る。
【００７７】
一つまたは複数の実施形態において、アニーリングは、ミクロゲル粒子１２が送達部位に配置される準備ができた後に、ミクロゲル粒子１２間の界面化学的相互作用によって起こる。一実施形態において、前記過程は、表面の重合可能な基を介した、ラジカルによって開始されるアニーリング（例えば、感光性ラジカル開始剤等によるラジカル開始）を通じて起こる。別の実施形態において、前記過程は、表面に提示される酵素活性型基質（例えば、活性化第ＸＩＩＩａ因子のようなトランスグルタミナーゼ酵素）を介した酵素的化学作用を通じて起こる。別の実施形態において、前記過程は、マイケル付加反応および偽マイケル付加反応を介した共有結合を通じて起こる。この方法は、混合時に固体足場１０を形成する複数の種類のミクロゲル粒子集合を使用し得る（例えば、例えば求核性表面基を提示するミクロゲル粒子１２Ａ型、および、例えばα，β−不飽和カルボニル基を提示するミクロゲル粒子１２Ｂ型）。別の実施形態において、前記過程は、クリックケミストリー結合を通じて起こる。同様に、この方法は、混合時に固体微小孔性ゲルを形成する、不均一なミクロゲル粒子１２集合を使用し得る。別の実施形態では、アニーリングは、光（例えば、白色光または紫外光）を用いて達成され得、それにより、本明細書に記載されるようなミクロゲル内およびミクロゲル周囲の（または直接的に共有結合された）溶解型の光活性型分子を介した、ゲル表面上の分子間の化学反応が開始される。
【００７８】
一つの好ましい実施形態において、ミクロゲル粒子１２は、生体吸収性を可能にするために、酵素的に分解可能な架橋剤と組み合わせて、ＰＥＧ系ポリマー骨格を含む。ある実施形態において、ＰＥＧ系ポリマー骨格は、細胞接着特性のためのオリゴペプチド（例えば、ＲＧＤ）および表面アニーリング官能基（例えば、ＫペプチドおよびＱペプチド）で事前に修飾された４腕のポリ（エチレングリコール）ビニルスルホン（ＰＥＧ−ＶＳ）骨格であり、架橋剤はマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−分解性架橋剤である。
【００７９】
一つまたは複数の実施形態において、ミクロゲル粒子１２は、油中水型エマルジョンによって形成される。ミクロゲル粒子１２のゲル化は、ＰＥＧ溶液と架橋剤溶液の混合後に起こる（ゲル化が完了する前に、その後すぐにミクロゲル液滴に分割される）。生理活性の増強のために、ペプチドリガンドを含む種々の基質がさらに添加され得る。一実施形態において、足場形成は、精製されたミクロゲル粒子１２に対するラジカル光開始剤の添加および活性化により、化学的架橋結合が誘導されることで、達成される。別の実施形態において、足場形成は、形成前、形成中、または形成後の、２つのペプチドリガンドで修飾された精製ミクロゲル粒子１２に対する、内因的に存在する、または外因的に適用されたトランスグルタミナーゼ酵素、第ＸＩＩＩ因子の使用および／または活性化により、酵素的な架橋結合が誘導されることによって、達成される。別の実施形態において、足場形成は、前述のラジカル法および酵素法の組合せを用いて達成される。
【００８０】
結果として生じる、本開示の発明の主題の足場１０は、インビボにおいて十分に相互連結した微小孔性足場を形成する能力による、現在の多孔性足場技術に優る利点を提供する。概して、多孔性足場は、細孔を通じた移動の自由による、生細胞へのより良いアクセスを提供する（すなわち、全ての現在および以前の非多孔性足場およびナノ多孔性足場のような、浸透を可能にするための分解を必要としない）。例えば、インビボでの皮膚創傷における足場１０の植え込みおよびアニーリングの場合、図７Ｂに示されるように、同じ材料の非多孔性ゲルと比較した場合に、有意に増強された細胞浸潤および成長中の組織構造が５日後に観察された。図７Ａは、注射から２４時間後の、足場１０（ＭＡＰ足場と同定）を注射された組織、および非多孔性対照を注射された組織に対する、ＳＫＨ１−Ηｒｈｒマウスにおける組織切片のＨ＆Ｅ染色を示している。図７Ｂは、注射後日数の関数としての、創傷閉鎖（％）のグラフを示している。このグラフは、非多孔性の両側性（ｂｉ−ｌａｔｅｒａｌ）対照（Ｎ＝５）と比較した場合に、足場１０使用において、５日間に亘って、創傷閉鎖率における統計的に有意な改善があることを示している。図７Ｃは、ＳＫＨ１−Ｈｒｈｒマウスにおける５日間のインビボ創傷治癒モデルにおける、創傷閉鎖の代表的な画像を示している。図７Ｄは、７日間のインビボＢＡＬＢ／ｃマウス実験においての創傷閉鎖の代表的な画像を示している。図７Ｅは、ＢＡＬＢ／ｃインビボ創傷治癒から得られた、創傷閉鎖の定量化データを示している。インビボでの７日間の後、足場１０は、無処置対照、非多孔性ＰＥＧゲル、並びにＫペプチドおよびＱペプチドを欠いたゲルよりも有意により速い創傷治癒を促す。標準的なポロゲンに基づく成形法を用いて創傷形状に正確に適合するようにエキソビボでつくられた多孔性ゲルは、足場１０に匹敵するかなりの創傷治癒率を示したが、注射適性（ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）に欠いていた（Ｎ＞５）。図７Ｆは、インビボにおける７日間の創傷床閉鎖の追跡を示しており、各々の処置区分は図７Ｄに対応している。
【００８１】
さらに、ミクロゲル粒子１２または足場１０に適用された治療薬が、緩徐にまたは急速に放出されることが可能であり、足場１０は、目的の治療に応じて（例えば、慢性創傷の治療に使用される場合、長い時間をかけてゆっくりと分解するより安定な架橋剤が使用される）、加水分解、タンパク質分解、または酵素分解によって、所定の時間をかけて分解する能力を有する。さらに、ミクロゲル足場１０のアニーリング特性は、足場１０が、組織シーラント（例えば、急性創傷、外科的閉鎖等）、および組織を模倣するのに臨床的に有用である様々な成形形材の充填物として機能することを可能にする。図７Ｇは、どのようにして、ミクロゲル粒子を含有する溶液またはスラリーが、図６Ａまたは図６Ｂの注射器のような注射用デバイスを用いて、処置部位に適用され、そこで、ミクロゲルが注射部位の形状（例えば、この場合では、星形の部位）に適合し得るか、およびその後の、足場１０の星形へのアニーリングを示している。
【００８２】
ミクロゲル足場１０の分解速度を調整することにより、創傷における瘢痕形成または再生反応を変更することができる。一実施形態において、ミクロゲル足場１０の分解速度は、ＭＭＰ分解性架橋剤にＬ−アミノ酸ではなくＤ−アミノ酸を用いることにより、変更された。架橋剤中のＤ−またはＬ−キラリティーと共に、ミクロゲル粒子１２の比を調整することによって、組織における分解速度が調整された。インビボにおいて、ＤおよびＬ架橋ミクロゲルの混合物（１：１の比）から作られた足場１０は、注入の２１日後にゲルが組織内に存在する結果をもたらしたが、Ｄのみのゲルでは、２１日後には、残留ゲルは残っていなかった。組織治癒および瘢痕反応はまた、Ｄ：Ｌの化学量論に依存し、故に、分解速度に依存する。図８Ａ〜図８Ｇは、無処置の創傷と直接比較した、Ｄ：Ｌの１：１混合物を使用した場合の瘢痕減少の効果を示している。１：１  Ｄ：Ｌゲル処置において、皮膚の厚さは倍増され、瘢痕サイズは２５％減少される。さらに、無処置の場合と比較して、ゲルで処置された場合において毛包および汗腺が６倍より多く存在する。
【実施例】
【００８３】
マイクロ流体油中水型エマルジョン法を用いて、連続的なプレゲル水相を、本明細書に記載の均一な足場構築ブロックに分割した。典型的なボルテックスおよび超音波処理に基づく方法を使用しない、微小スケールでの連続的な、構築ブロックとしてのミクロゲル粒子１２の生成によって、形成環境および生じる足場１０の最終的な材料特性に対する厳密な制御が可能となった。プレゲル溶液および狭窄油流の両方の流速、並びにマイクロ流体チャネルの形状を調整することにより、ある範囲のミクロゲル粒径を低い多分散性で生成した。前記作製法は連続的であったが、そのハイスループット性において実用性を保持しており、生成速度は、大粒子（＞１００μｍ）の２５０Ｈｚから小粒子（〜１５μｍ）の〜１２００Ｈｚまでの範囲であった。これは、１つのデバイスにつき、５０分毎の、およそ１００μｌの膨潤前ゲルに言い換えられた。この方法によって、最終的に、物理的且つ化学的に高度に単分散であった粒子が得られた。ミクロゲル粒子「構築ブロック」のマイクロ流体生成は、広範な採用および使用のための実際的な要求条件である、容易な規模調整が可能なプロセスである。
【００８４】
得られたミクロゲル粒子１２は、細胞接着性ペプチド（ＲＧＤ［配列番号３］）および２つのトランスグルタミナーゼペプチド基質（Ｋ［配列番号１］およびＱ［配列番号２］）で装飾されたポリ（エチレン）グリコール−ビニルスルホン（ＰＥＧ−ＶＳ）骨格の完全合成ヒドロゲルメッシュから構成されていた。ミクロゲル粒子１２を、細胞によって制御される（ｃｅｌｌ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）材料分解およびその後の吸収を可能にする、システイン末端を有するマトリクスメタロプロテアーゼ感受性ペプチド配列のマイケル付加により、架橋した。
【００８５】
ミクロゲル粒子１２を、貯蔵用の等張細胞培地の水溶液中に精製し、ゲル形成に使用する際は、血餅の安定化に関与する天然に存在する酵素である活性化第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩａ）によって仲介される、ＫペプチドおよびＱペプチド間の非標準のアミド結合を介して互いにアニーリングさせた。この酵素介在性アニーリング過程は、相互連結した微小孔性ネットワークを含有する動的に形成されつつある足場１０への生細胞の取り込みを可能にした。ＦＸＩＩＩａの添加後、ただし、足場アニーリング前に、ミクロゲル粒子１２のスラリーは注射器適用を介して送達され、最終的に、注入された腔の形状で凝固し得る。図９Ａは、ｐＨおよび温度の調整によって、アニーリング速度論がどのように変化し得るかを示している。この実験のために選択されたアニーリング環境は、ｐＨ８．２５、および３７℃の温度であった。
【００８６】
アニール後ゲルの貯蔵弾性率において３倍超の増加をもたらす構造変化が、ミクロゲル粒子１２へのＦＸＩＩＩａの添加後に観察された。アニーリングは、高真空ＳＥＭ観察を介して、脱水後に足場が高度に延伸されているが相互連結した網目の形状をとる、足場形成に必要であることが確認され、一方、ＦＸＩＩＩａ無しの構築ブロックは個々の球状ビーズに分離した（図９Ｅ）。
【００８７】
ミクロゲルの粒径および組成を調整することにより、多様な構築足場１０を生成することができた。直径３０〜１５０μｍのミクロゲル粒子１２を用いることにより、約１０〜約３５μｍの範囲の孔径中央値を有するネットワークが達成された。様々なＰＥＧ重量パーセントおよび架橋剤化学量論をふるいにかけることで、哺乳類軟部組織の模倣体に必要な剛性レジーム（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ  ｒｅｇｉｍｅ）にまたがる、約１０〜１０００Ｐａの容易に達成可能な貯蔵弾性率の範囲が示された。図９Ｂは、様々なヒドロゲル重量パーセントの使用により、様々な剛性材料が生成されることを示している。図９Ｃは、得られたゲルにおける様々な剛性値を生じさせるために使用された、様々な架橋剤化学量論（架橋剤末端（−ＳＨ）：ビニル基（−ＶＳ）のｒ比）を示している。図９Ｄは、非多孔性対照および本明細書に記載の本発明の多孔性ゲルの両方についての、時間の関数としての分解率（％）のグラフを示している。インビトロにおける、等体積のゲルについての、粒子に基づく多孔性ゲルおよび非多孔性ゲルの分解速度論が示される。粒子に基づく多孔性ゲルは、体積比に対するより大きな表面積および微小孔性ゲル内のより速い輸送により、非多孔性ゲルよりも速く分解する。分解を１：１０００ＴｒｙｐＬＥ（登録商標）を用いて行った結果、創傷床よりも高いプロテアーゼ濃度およびより速い分解速度論が得られた。図９Ｅは、ＦＸＩＩＩａを用いてアニールされた足場のＳＥＭ画像を示している。図９Ｆは、ＦＸＩＩＩａ無しでのミクロゲル粒子１２のＳＥＭ画像を示している。アニールされていない粒子が図９Ｆに見られる。
【００８８】
生成された足場の、細胞成長およびネットワーク形成を支持する能力を評価するために、３つのヒト細胞株を用いるインビトロでの細胞形態および増殖モデルを開発した。これらには、皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡｈＭＳＣ）、および骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭｈＭＳＣ）が含まれた。単一細胞懸濁液を、ＦＸＩＩＩａでアニールされたゲル内に動的に取り込ませた。３つの細胞株は、２４時間の足場内培養の後に、高い細胞生存率（９３％以上）を示した。ＨＤＦ細胞株およびＡｈＭＳＣ細胞株は、それぞれ１．５日および２日の倍加時間で、６日間の培養期間に亘って、連続的な増殖を示した。ＢＭｈＭＳＣも増殖を行うことが観察されたが、約１２日間という延長された倍加時間が算出された。
【００８９】
足場に取り込まれた細胞は、アニーリング開始の９０分後に展開形態を示し始めた。２日間の培養の後、足場内の全ての観察細胞は完全に展開した形態を示し、これは６日目を通じて持続した。重要なことに、全ての細胞株において２日目までに広範なネットワーク形成が観察された。細胞ネットワークは、実験全体を通じてサイズおよび複雑さを増した。ＢＭｈＭＳＣの展開性のあるネットワーク形成およびより遅い増殖速度は、これらの細胞が、極端な長さに広がり、微小孔性足場内に高度に相互連結した細胞ネットワークを形成可能であったことを示すものであったことから、ＢＭｈＭＳＣは特に注目すべきものであった。特に、同一の化学的性質（５ｗｔ％、Ｇ＝６００Ｐａゲル）および機械的特性（４．５ｗｔ％、Ｇ＝３５０Ｐａゲル）の非多孔性ゲル内で増殖した細胞は、生存率を維持したが、６日間の培養の後でも、明らかなネットワーク形成を示さなかった。
【００９０】
インビトロにおける細胞増殖および適宜のネットワーク形成の両方を可能にする足場の能力は、インビボにおける足場内での細胞遊走およびバルク組織統合（ｂｕｌｋ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を支持する能力を示すものであると仮定された。この仮説を試験するため、マウス皮膚創傷治癒モデルを使用し、予め植え込まれた多孔性生体材料について目的組織を検討した。重要なことに、組織の内部増殖のために閉鎖を制限するゴム製副子の縫合を用いて創傷の収縮を妨げることにより、ヒトの治癒反応がより良好に刺激された。ミクロゲル粒子に基づく足場の注射適性により、ミクロゲル粒子を創傷部位に直接送達し、その後、外因性ＦＸＩＩＩａを介してインサイツでアニーリングすることができた。これにより、ミクロゲル粒子「構築ブロック」が、互いと、並びに、周辺組織に存在する内在性のリジン残基およびグルタミン残基と同時に連結することによる、途切れのない境界面がもたらされた。同様に、化学的に同一の、非多孔性の両側性（ｂｉ−ｌａｔｅｒａｌ）対照においても、途切れのない境界面が観察された。それらの境界面は同様であるにもかかわらず、生成された足場は、図７Ｂに示されるように、ＣＬＲ：ＳＫＨ１−Ｈｒｈｒマウスの創傷に注入された場合に、非多孔性対照よりも有意により速い創傷閉鎖（それぞれ、６０％対１００％の、５日後の残存創傷面積）をもたらした。
【００９１】
創傷閉鎖速度の相違は、非多孔性の、および注射可能な分割性に基づく（ｐａｒｔｉｂｌｅ−ｂａｓｅｄ）ゲルに対する組織応答の差異の研究に繋がった。ミクロゲル粒子を用いた足場注射は、インビボにおいて、５日後に広範な創傷再上皮化をもたらした。ケラチン−５＋細胞が、足場の頂端表面を超えて、層化した扁平上皮形態で観察されたが、非多孔性の創傷端を超えて細胞（ケラチン−５＋または他）は観察されなかった。重要なことに、足場は、未損傷の皮膚における腺の構造に似た、創傷床内での、隣接する皮脂腺を伴う完全な毛包であると思われるものの形成を維持することができた。さらに、管状構造および上皮陥入を含む、大型のケラチン−５＋組織構造の他の例が、足場内に観察された。まとめると、これらの結果は、上皮再生に寄与する高次の集団的遊走（すなわち、多細胞クラスターの一斉移動）を示すものであると仮定される。細胞は非多孔性の両側性（ｂｉ−ｌａｔｅｒａｌ）対照に浸潤することができたが（ＤＡＰＩ染色で示されるように）、再上皮化または皮膚組織形成の証拠はインビボでの５日後に見つからなかった。
【００９２】
さらなる研究を通じて、足場が、インビボにおいて、複雑な血管網形成を介して、バルク統合（ｂｕｌｋ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を促進したことが分かった。５日後、内皮細胞および支持周皮細胞の両方が足場内に存在したが、一方で、非多孔性の両側性（ｂｉｌａｔｅｒａｌ）対照においては、支持周皮細胞を伴わずに、内皮細胞の単一枝のみが存在した。共存した内皮細胞および周皮細胞の存在は、成熟した血管網形成の証拠であった。我々が知る限り、これは、外来性の増殖因子を含まない、合成注射用材料または植え込まれた多孔性足場への、早期（７日未満）の周皮細胞遊走の最初の例である。
【００９３】
注射可能な足場によってもたらされる途切れのない境界面を調べる一方で、１日目の全細胞含量および免疫細胞含量の両方における差異を観察した。注射から１日後、足場は、それらの非多孔性の両側性（ｂｉ−ｌａｔｅｒａｌ）対照と比較して、有意により多い数の細胞を足場内に含有した。これにより、我々のインビトロにおけるネットワーク形成実験で先に観察された、細胞移動の容易さの向上が裏付けられた。さらに、足場およびその周辺組織は、同一マウスの非多孔性の両側性（ｂｉ−ｌａｔｅｒａｌ）対照と比較した場合に、有意により少ない数の多形核細胞を含有した。この結果は、１日目における、足場に対する、全体的により少ない初期自然免疫反応を示すものであった。注射の５日後、非多孔性対照と比較して、より少ない分率のＣＤ１１ｂ＋細胞（活性化白血球）が、周辺組織および足場内の両方に存在し、このことは、エキソビボで構築され植え込まれた微孔性足場において観察されたものと一致した、持続性のより低レベルの炎症性免疫応答を示している。まとめると、これら２つの結果は、化学的に同一な注射用生体材料からの免疫刺激に対する幾何的な成分（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）についての目下の調査を裏付けるものである。
【００９４】
アニールされた、ミクロゲル粒子に基づく足場は、個々の構築ブロックの頑強に成された不完全な自己集合およびアニーリングを通じて、微小スケールの相互連結した多孔性を導入する、新しい種類の注射用生体材料である。この方法は、確定的な化学組成およびマイクロ流体粒子生成を通じた、微小スケールの特性および階層的な巨視的規模の特性の制御を可能にする。取り込まれた生細胞および周囲の宿主組織の両方が、材料分解の必要無く、即時に足場に浸潤することができ、これは、注射用の足場を用いて達成されたことのない偉業である。
【００９５】
インビボにおいて、注射用のミクロゲル粒子は、組織空隙を完全に充填し、周辺組織との途切れのない境界をもたらした。得れれた足場の相互連結した微小孔性は、注射用の非多孔性対照と比較した場合に、減弱した宿主免疫応答を誘発しつつ、周辺組織とのより大きなバルク統合（ｂｕｌｋ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）をもたらす、創傷部位における細胞遊走を促進した。最終的に、これにより、同様に構成された注射用非多孔性ゲルを用いるよりも、より速い健常組織再形成がもたらされた。
【００９６】
このゲル系は、格子形成ネガティブスペース（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｐａｃｅ）を利用することで、現在のヒドロゲル技術を用いてこれまで見られなかったタイムスケールでの複雑な三次元ネットワークの発達を促進することにより、ボトムアップ型のモジュール式生体材料へのアプローチに根本的な変化をもたらす。この戦略の「プラグアンドプレイ」性は、広範な、既に確立された材料（例えば、フィブリン）、シグナル（例えば、増殖因子）、および細胞集団（例えば、幹細胞）の取り込みを可能にする。確定的な化学的性質および物理的性質を有する構築ブロックの複雑な組合せは、一連の異なる生理学的適所（例えば、神経、心臓、皮膚等）における組織再生を可能にし得、ここで、粒子がアニールされた足場は、それらの構築ブロック特性を介して各々の適所に合わせて調整される。足場に固有の、微小孔性、注射適性、およびモジュール組立の独特な組合せは、インビボにおける組織再生および新規の組織形成の状況を変える可能性を有する。
【００９７】
マイクロ流体油中水型液滴生成器を前述のソフトリソグラフィーを用いて作製した。簡潔に説明すると、ＫＭＰＲ１０２５または１０５０フォトレジスト（マイクロケム社（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ））を用いて、元型（ｍａｓｔｅｒ  ｍｏｌｄ）をメカニカルグレードシリコンウェハー（ユニバーシティ・ウェハー社（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｗａｆｅｒ））上に作製した。製造業者の提案に従って異なる速度でフォトレジストを回転させることで、様々なチャネル高を得た。ポリ（ジメチル）シロキサン（ＰＤＭＳ）ＳＹＬＧＡＲＤ（登録商標）１８４キット（ダウコーニング社（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ））を用いて、元型からデバイスを成型した。基剤（ｂａｓｅ）および架橋剤を１０：１の質量比で混合し、型にふりかけ、脱気し、その後、６５℃で６時間硬化させた。ＰＤＭＳ型およびガラス製顕微鏡用スライド（ＶＷＲ）を５００ｍＴｏｒｒおよび７５Ｗの酸素プラズマで１５秒間処理することにより、チャネルを密封した。チャネル密封の直後に、１００μｌのＲＡＩＮ−Ｘ（登録商標）溶液を注入し、室温で２０分間反応させることにより、チャネルを官能基化した。次に、チャネルを風乾し、その後一晩乾燥させた。
【００９８】
図３Ａ〜図３Ｆおよび図４Ａ〜図４Ｃに示されるマイクロ流体油中水型分割系を用いて、液滴を生成した。水相は、２つの部分の１：１体積混合物である：（ｉ）５００μΜ  Ｋ−ペプチド（Ａｃ−ＦＫＧＧＥＲＣＧ−ＮＨ２［配列番号１］）（ジェンスクリプト社）、５００μΜ  Ｑ−ペプチド（Ａｃ−ＮＱＥＱＶＳＰＬＧＧＥＲＣＧ−ＮＨ２［配列番号２］）、および１ｍＭ  ＲＧＤ（Ａｃ−ＲＧＤＳＰＧＥＲＣＧ−ＮＨ２［配列番号３］）（ジェンスクリプト社）で予め官能基化された、３００ｍＭトリエタノールアミン（シグマ社）（ｐＨ８．２５）中の１０％ｗ／ｖ４腕ＰＥＧ−ＶＳ（２０ｋＤａ）、並びに（ｉｉ）１０μΜ  Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ６４７−マレイミド（ライフテクノロジーズ社）と予め反応させた８ｍＭ（３注入口デバイスの場合１２ｍＭ）ジ−システイン修飾マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）（Ａｃ−ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣＧ−ＮＨ２［配列番号４］）（ジェンスクリプト社）基質。溶液は全て、分割系での使用前に、Ｌｅｕｒ−Ｌｏｋシリンジフィルター内の０．２μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を通じて無菌濾過した。
【００９９】
生成は、ミクロゲル品質のリアルタイム追跡用の保温された載物台（ＮＩＫＯＮ（登録商標）Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ）上で３７℃で行った。投入水溶液は液滴分割化までほとんど混合しなかった（ペクレ数＞１０）。油相は０．２５％ｖ／ｖ  ＳＰＡＮ（登録商標）８０（シグマ・アルドリッチ社）を添加した重鉱（Ｆｉｓｈｅｒ）油であった。分割化領域の下流で、第二油注入口に高濃度のＳＰＡＮ（登録商標）８０（５％ｖ／ｖ）を加え、流れている液滴エマルジョンと混合させた。最終的に、油中ミクロゲル混合物を大型（直径１２ｍｍ、体積約１ｍＬ）ウェルに排出させ、そこで、ミクロゲル粒子を最低１時間３７℃で硬化された。次に、油剤をＨＥＰＥＳ緩衝食塩水の緩衝水溶液（ｐＨ７．４）上に上積みし、卓上用遠心機で１８０００×ｇで５分間ペレット形成することにより、混合物を抽出および精製した。ミクロゲルをベースとしたペレットを、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．０１％ｗ／ｖ  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（シグマ社）を含有するＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中で洗浄した。次に、ミクロゲル水溶液を、３７℃で少なくとも２時間、膨潤させ、緩衝液と平衡させた。
【０１００】
液滴分割化の操作レジームを決定するため、デバイス作動を高速カメラ（ファントム社（Ｐｈａｎｔｏｍ））を用いてリアルタイムでモニターし、次いで、サイズおよび多分散測定（ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用）並びに分割頻度（Ｐｈａｎｔｏｍ  ＰＣ２）について画像解析を行った。このプラットフォーム上での安定な液滴分割化のために、（ｉ）全ての空気がデバイスから流れるまで、全ての流れを同時に（両方の水流および両方の油流）５μｌ／分で開始させ、（ｉｉ）水流速を所望の全体体積速度（ｏｖｅｒａｌｌ  ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｒａｔｅ）（１．５〜２μＬ／分の水流速および１〜５μＬ／分の油流速  に５分間かけて下げ、（ｉｉｉ）蓄積された全液体を収集ウェルから吸引して、確実に単分散のμゲルを収集し、（ｉｖ）生成を実行する。
【０１０１】
十分に膨潤および平衡化させた「構築ブロック」ミクロゲル粒子を、１８０００×ｇでの５分間の遠心分離によりペレット化し、過剰な緩衝液（ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４＋１０ｍＭ  ＣａＣｌ２）を、クリーンルーム用ワイプを用いた吸引および乾燥によって除去した。その後、ミクロゲル粒子を、５０μｌの濃縮構築ブロックを各々含有する一定分量に分割した。等量のＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）＋１０ｍＭ  ＣａＣｌ２を濃縮構築ブロック溶液に加えた。これらの半分は最終濃度２Ｕ／ｍｌまでのトロンビン（シグマ社）を含み、もう半分は最終濃度１０Ｕ／ｍｌまでのＦＸＩＩＩ（ＣＳＬベーリング社（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ））を含む。次に、これらの溶液を十分に混合し、１８０００×ｇで遠心沈殿させ、次いで、クリーンルーム用ワイプ（アメリカン・クリーンスタット社（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｌｅａｎｓｔａｔ））を用いて過剰な液体を除去した。
【０１０２】
トロンビンおよびＦＸＩＩＩを含有する等量の構築ブロック溶液を、容積式ピペット（ギルソン社）を用いて混合することにより、アニーリングを開始した。これらの溶液を、ピペットチップを用いて撹拌すると同時に、繰り返しピペッティングすることによって、十分に混合した。次に、混合溶液を、所望の部位（型、ウェルプレート、マウス創傷等）にピペットで移した。
【０１０３】
各ミクロゲルのゲル化速度を決定するため、同じ化学組成を有するマクロスケール（５０μＬ）の非多孔性ゲルを生成した。０．３Ｍ  ＴＥＯＡ中に溶解された２Ｘ  ＰＥＧ−ＶＳ＋ペプチド（ＲＧＤ、Ｋ、およびＱペプチド）の３０μＬ溶液を、水に溶解された３０μＬの２Ｘ  ＭＭＰ−１架橋剤と混合した。この混合物を素早くボルテックスし、５０μＬの混合物を、１ｍｍの間隔で２枚の８ｍｍレオロジーディスク（ｒｈｅｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｃ）の間に配置した（アントンパール社（Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ）Ｐｈｙｓｉｃａ  ＭＣＲ３０１レオメータ）。次に、貯蔵弾性率を２０分間に亘って測定した（２．５Ｈｚ、０．１％歪み）。
【０１０４】
アニール前のミクロゲル粒子およびアニール後の足場のバルク貯蔵弾性率（ｂｕｌｋ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｍｏｄｕｌｕｓ）を決定するため、振幅掃引（０．０１〜１０％歪み）を実行して、各々について直線的な振幅範囲を見つけた。直線範囲内の振幅を選択して、周波数掃引（０．５〜５Ｈｚ）を実行した。アニール前のミクロゲル粒子について、５０μＬのミクロゲル粒子（５ｗｔ％ＰＥＧ−ＶＳ  ４腕  ＭＷ＝２０ＫＤａ、ｒ＝０．８  ＭＭＰ−１架橋剤、合成ペプチド濃度は２５０μΜの合成Ｋ、２５０μΜの合成Ｑ、５００μΜの合成ＲＧＤ）を、１ｍｍの間隔で２枚の８ｍｍレオロジーディスクの間に注入した。アニール後の足場の測定について、まず、ＦＸＩＩＩａ（５Ｕ／ｍＬ最終濃度）、およびトロンビン（１Ｕ／ｍＬ最終濃度）を添加された、５０μＬのミクロゲル粒子（Ｎ＝３）（５ｗｔ％  ＰＥＧ−ＶＳ  ４腕  ＭＷ＝２０ＫＤａ、ｒ＝０．８  ＭＭＰ−１架橋剤、合成ペプチド濃度は２５０μΜの合成Ｋ、２５０μΜの合成Ｑ、５００μΜの合成ＲＧＤ）を、２枚のスライドガラスの間にピペットで移した。この混合物を１０分間部分的にアニールさせ、その後、上側のスライドガラスを取り除き、３７℃の加湿恒温器内に９０分間置いた。次に、足場をＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中に一晩置いて平衡にさせた。次に、試料をレオメータ上の２枚の８ｍｍディスクの間に配置し、アニール前のミクロゲル粒子と同様に試験した。
【０１０５】
アニール後のミクロゲル足場の孔径中央値を決定するため、様々なサイズのミクロゲル粒子の原液を用いて、各々から３つの別々の足場（合計９足場）を上記のようにアニールした。Ｃ２レーザーＬＥＤ共焦点を備えたニコン社製Ｔｉ  ｅｃｌｉｐｓｅを用いて、各スライス間を５０μｍ隔てて、個々のスライスを各ゲルに取った（ゲル当たり１０枚のスライス、各ゲル型につき合計３０枚のスライス）。次に、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）で書かれたカスタムスクリプトを用いてこれらの画像を解析して、細孔領域を特定し、各々の細孔サイズをｐｘ２で算出した。次に、各々の細孔サイズを用いて、そのゲルの孔径中央値を算出し、元の顕微鏡画像からのピクセルμｍ変換を用いて（０．３１μｍ／ｐｘ）、μｍ２に変換した。次に、面積を円に押し込み、これらの円の特性直径を算出することにより、これらの面積を特性長測定値に変換した。３０μｍミクロゲル粒子において、平均孔径は約１２μｍであった。１００μｍミクロゲル粒子において、平均孔径は約１９μｍであった。１５０μｍミクロゲル粒子において、平均孔径は約３７μｍであった。間隙または空隙は連続しており、微小粒子浸出または逆オパールゲル作製法を通じて生成された円形細孔によって接続された詳細に明らかにされた球状の開口領域と類似していないことに留意されたい。しかし、孔径の参照は、空隙の長さスケールを単純に記載するのに有用である。
【０１０６】
ミクロゲル粒子がＦＸＩＩＩａの添加後に共有結合されたかどうかを決定するために、ＳＥＭを用いて足場を直接的に可視化した。ミクロゲル粒子混合物をＦＸＩＩＩａ（１０Ｕ／ｍｌ）または緩衝液のみで処理した。その後、構築ブロック溶液を、シリコンウェハー小片内の１×１上に置き、ＳＥＭ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓ４７００）高真空チャンバ（１×１０−３ｍＴｏｒｒ）内で乾燥させた。次に、ＦＸＩＩＩａ有りまたは無しの構築ブロックを、図９Ｄおよび図９Ｆに示されるように、２００×または５００×で、１０ｋＶ（最大１０ｍＡ）を用いて可視化した。
【０１０７】
レンチウイルストランスフェクションを介してＧＦＰを恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０μｇ／ｍｌピューロマイシンを添加したＤＭＥＭ（ライフテクノロジーズ社）中で維持した。３つの細胞株をインビトロ実験に使用した：ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ、ライフテクノロジーズ社）、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞（ＢＭｈＭＳＣ、ライフテクノロジーズ社）、および脂肪由来ヒト間葉系幹細胞（ＡｈＭＳＣ、ライフテクノロジーズ社）。細胞株は全て、製造業者の仕様書に従って維持した（多孔性ゲルまたは非多孔性ゲルへの取り込みの前および後）。具体的には、ＭＳＣ集団については、血清低減基本培地（ライフテクノロジーズ社）を用いて厳格さ（ｓｔｅｒｎｎｅｓｓ）を保持した。
【０１０８】
インビトロにおける多孔性足場内での細胞増殖の定量化およびネットワーク形成の可視化のために、粒子に基づく足場を、上記のようにミクロゲル粒子を用いてアニールし、アニーリング前に細胞懸濁液を構築ブロック溶液に添加した。各細胞株について、細胞懸濁液を、血清無添加のそれぞれの培地中、２５×１０６細胞／ｍｌの最終濃度で準備した。その後、２μｌの細胞懸濁液を、５０μｌのＦＸＩＩＩ含有ミクロゲル粒子混合物に添加し、５０μｌのトロンビン含有ミクロゲル粒子混合物と混合した（５００細胞／μｌゲル）。この混合物をカバーガラス底ＰＤＭＳウェルの角に注入した。ウェル頂部を２枚目のカバーガラスで覆い、μゲル／細胞混合物を３７℃で９０分間アニーリングさせた。
【０１０９】
アニーリングが完了した後、上部カバーガラスを取り除き、適切な完全培地をＰＤＭＳウェルに加えた。０日目の時点において、４％ＰＦＡをＰＤＭＳウェルに直接添加し、４℃一晩固定した。他の細胞は表示された時間（２、４、および６日間）、５％ＣＯ２、３７℃で増殖させ、その時点において、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄し、４℃で一晩、４％ＰＦＡで固定した。ＨＥＫ−２９３−Ｔ細胞は、（上記のように）細胞をミクロゲル粒子と混合し、５μｌの混合物を型の角にピペットで移すことにより、星形の型に組み込んだ。直後、細胞無しのミクロゲル粒子を型の残部にピペットで移し、上記のようにアニーリングした。
【０１１０】
０、２、４、および６日間のインビトロ培養の後、粒子に基づく足場構築物内に存在する細胞核の数を計数することにより、増殖を評価した。核を、１×ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ溶液で２時間染色し、その後、４０５ｎｍ  ＬＥＤレーザーを使用するＮｉｋｏｎ  Ｃ２で可視化した。具体的には、各足場は、１５０μｍの合計ｚ高さで５５のｚスライスを撮影し、５スライス毎に最大値投影法（ＭＩＰ）画像に圧縮することによって、イメージングした。ＭＩＰにおける核を、カスタムＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを用いて数え上げ、全細胞数を計数した。各時点について、３つの別々のミクロゲル足場のｚスタック（ｚ−ｓｔａｃｋ）画像を解析し、それぞれのｚスタック画像は、１２７０×１２７０×１５０μｍ３（または約２８０ｎＬ）の総体積を測定した。９０分の計数により、実験的添加量（５００細胞／μｌゲル）と一致する、約５２５細胞／μｌゲルが算出された。
【０１１１】
インビトロにおけるミクロゲル足場内の細胞ネットワーク形成の可視化のために、上記のように、構築物を準備し、増殖させ、固定した。足場を、１×ＰＢＳ中１％ＢＳＡで室温で１時間ブロッキングし、その後、Ｆアクチンを、ローダミンＢ・ファロイジン複合物（ライフテクノロジーズ社）により、室温で３時間染色した。次に、足場を１×ＰＢＳ中１％ＢＳＡで洗浄し、その後、室温で１時間、１×ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ溶液で対比染色した。４０×倍率水浸レンズを使用したこと以外は増殖イメージングと同様に、イメージングを行った。画像スタックの全高は１３０μｍであり、スライスの総数は２６０であった（体積捕捉  約１５ｎＬ）。
【０１１２】
ＰＥＧ−ＶＳ足場（５ｗｔ％  ＰＥＧ−ＶＳ  ４腕  ＭＷ＝２０ＫＤａ、ｒ＝０．８  ＭＭＰ−１架橋剤、合成ペプチド濃度は２５０μΜの合成Ｋ［配列番号１］、２５０μΜの合成Ｑ［配列番号２］、５００μΜの合成ＲＧＤ［配列番号３］）を用いて、細胞（５００細胞／μＬ）を被包した。使用した細胞株はミクロゲル足場実験におけるものと同じであった。ゲルを２０分間かけて形成させ（ＴＥＯＡ  ０．３Ｍ、ｐＨ８．２５）、その後、適切な培地中に配置した。ゲルを、所定の時点（ｔ＝９０分、２日、４日、および６日）の後、ＰＦＡを用いて４℃で一晩固定し、洗浄し、ＰＢＳ中で貯蔵した。ゲルをミクロゲル足場と同様に染色した。全ての試料は、イメージングされていない場合、Ｐ／Ｓを含有するＰＢＳ中に４℃で貯蔵した。イメージングは、ミクロゲル足場インビトロ実験と全く同様にＮＩＫＯＮ（登録商標）Ｃ２共焦点を用いて行った。
【０１１３】
ＣＬＲ：ＳＫＨ１−Ｈｒｈｒマウス（チャールス・リバー・ラボラトリーズ社）（試験当たりＮ＝６）を、イソフルオラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）（１．５％、１０分間）で麻酔し、その後爪を切り、鎮痛剤（ブプレノルフィン、０．０１５μｇ／μＬで２０ｇ当たり６０μＬ）を注射した。皮膚を引っ張り、４ｍｍ生検パンチを用いてマウスの背中に同一の円形創傷をつくった。周囲皮膚に７〜８針で縫ったゴム製副子を用いて創傷の外面を防護し、収縮による創傷閉鎖を妨げた。１０Ｕ／ｍｌ  ＦＸＩＩＩａを含む非多孔性または多孔性のヒドロゲルを、創傷床に注入し、１０分間ゲル化させ、その後、伸縮性ガーゼラップで創傷を覆って動物間の相互作用を防止した。次に、マウスを個々のケージに分けた。その後４８時間、１２時間毎に鎮痛剤を皮下投与した（１日目の屠殺については、鎮痛剤を手術後に１回投与した）。
【０１１４】
１日目に、マウス（Ｎ＝６）を、イソフルオラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）の過剰投与およびその後の脊椎脱臼により屠殺した。背中の皮膚を外科用鋏を用いて除去し、創傷部位を１０ｍｍ生検パンチにより単離した。試料を即座に４％ホルムアルデヒドを用いて４℃で（一晩）固定し、その後エタノールに移し、試料をパラフィンブロックに包埋した。次に、ブロックをミクロトーム（ライカ社）により６μｍ厚に切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。ヒドロゲル内の細胞浸潤およびヒドロゲル周囲の免疫応答の定量化のために、各切片について、一連の３つの無作為な強拡大（４０×）視野（ＨＰＦ）を試験した。注入されたヒドロゲル内のあらゆる種類の細胞の合計数を計数することにより（Ｎ＝５、３切片における細胞の和を創傷につき分析）、試料を細胞浸潤（ゲル内へ＞０．１ｍｍ）について分析した。ゲルに浸潤している細胞の９５％超が好中球であった。免疫応答を測定するため、創傷の異なる切片からの３つのＨＰＦの平均を調べた。各創傷型について、創傷端におけるヒドロゲルの０．２ｍｍ内の白血球／ＨＰＦの総数を、定量化および平均した。各創傷の白血球数を同一動物のその両側性対照（ｂｉｌａｔｅｒａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）に対して比較し、相対的差異を各動物の全体免疫応答の分率として記録した。各動物がミクロゲル足場を注入された１つの創傷および非多孔性対照を注入された１つの創傷を有していたため、この比較は可能であった。
【０１１５】
創傷の閉鎖を追跡するために、創傷を毎日イメージングした。高分解度カメラ（（ＮＩＫＯＮ（登録商標）ＣＯＯＬＰＩＸ（登録商標））を用いて各創傷部位をイメージングした。創傷の画素面積を赤色ゴム製副子の１０ｍｍ中央穴内の画素面積と比較することにより、閉鎖分率を決定した。各マウス／足場型について、閉鎖分率を０日目に対して正規化した（図７Ｂ）。
【０１１６】
５日目に、１日目のマウスと同様に、マウス（Ｎ＝６）を屠殺して組織を採取した。試料を即座にＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ（登録商標）最適切断温度（Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（ＯＣＴ）液に浸し、液体窒素で固体ブロックに凍結した。次に、ブロックをクライオスタットミクロトーム（ライカ社）により２５μｍ厚に凍結切片化し、使用まで凍結したままにした。次に、切片をパラホルムアルデヒドで室温で３０分間固定し、ＰＢＳで水和し、染色まで４℃で維持した。
【０１１７】
組織切片を含有するスライドを、１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）中の３％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）でブロッキングするか、または、抗ケラチン−５単独で染色された切片については、１×ＰＢＳＴ中の３％ＮＧＳ中の０．２％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００でブロッキングおよび透過処理を同時に行った。次に、切片を１×ＰＢＳＴ中の３％ＮＧＳで洗浄した。一次抗体希釈物を１×ＰＢＳＴ中の３％ＮＧＳ中で以下の通りに調製した：
【０１１８】
ラット抗マウスＣＤ１１ｂ（ＢＤファーミンゲン社（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））−１：１００
【０１１９】
ラット抗マウスＰＥＣＡＭ−１（ＢＤファーミンゲン社）−１：１００
【０１２０】
ウサギ抗マウスＮＧ２（ミリポア社）−１：１００
【０１２１】
ウサギ抗マウスケラチン５（コーヴァンス社（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｉｎｃ．））−１：２５０
【０１２２】
切片を一次抗体で４℃で一晩染色し、その後１×ＰＢＳＴ中３％ＮＧＳで洗浄した。二次抗体は全て１×ＰＢＳＴ中３％ＮＧＳ中で１：１００希釈に調製した。切片を二次抗体中で室温で１時間インキュベートし、その後、１×ＰＢＳＴで洗浄した。切片を１×ＰＢＳＴ中の２μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩで室温で３０分間対比染色した。切片をＡｎｔｉｆａｄｅ  Ｇｏｌｄ封入剤に封入した。
【０１２３】
非多孔性およびミクロゲル足場組織ブロックの両方から得られた５日目の組織切片から得られた共焦点ｚスタック画像を、ＭＩＰに圧縮し、各レーザーチャネル（すなわち、Ｇｅｌ、ＤＡＰＩ、ＣＤ１１ｂ）に対応する個々の画像に分離させた。Ａｄｏｂｅイラストレーターを用いたゲル−組織接触面の縁の追跡に、ゲルチャネル画像を使用した。この線の幅は接触面から組織およびゲルの両方に７５μｍ広がっていた（全厚１５０μｍ）。次に、この線の新しい縁を用いて、元のＤＡＰＩおよびＣＤ１１ｂ画像の不要部分を裁ち落とし、組織ゲル接触面から＋／−７５μｍに対応する領域のみを捕捉した。次に、これらの画像をＩｍａｇｅＪにインポートし、オーバーレイして、ＤＡＰＩおよびＣＤ１１ｂチャネルを単一画像にマージした。この画像を、ＩｍａｇｅＪの細胞カウンタープラグインを用いて解析し、核の総数およびＣＤ１１ｂ＋細胞の総数の両方を定量化した。最後に、組織内およびゲル内の両方について、対応するＣＤ１１ｂ＋シグナルを有する核の分率を報告した。
【０１２４】
図１１は、損傷組織１０２を治療する方法の一例を示している。図１１は、哺乳動物の組織１０２に形成された創傷部位１００を示している。操作５００では、水溶液中に含有されたミクロゲル粒子１２のスラリーを内部に含有する送達デバイス１１０（例えば、図示された管）を用いて、ミクロゲル粒子１２が創傷部位１００に送達される。次に、操作５１０に示されるように、任意の塗布器１２２を用いて、ミクロゲル粒子１２が創傷部位１００の内および全体に広げられる。塗布器１２２はまた、ミクロゲル粒子１２の上部露出面を、組織１０２の表面と概ね同一平面とさせるのにも使用される。また、塗布器１２２を用いて、ミクロゲル粒子１２の上部露出面を、組織１０２の表面に対して盛り上げる、または高めることにより、細胞の内部増殖のための構造の増加および完全治癒後の組織界面の陥没予防が可能となり得る。次に、操作５２０に示されるように、ミクロゲル粒子１２のアニーリングが開始されて、アニールされたミクロゲル粒子１２から成る足場１０が形成される。この具体例では、懐中電灯の形態をした光源１２４を用いて、ミクロゲル粒子１２、光開始剤（例えば、エオシンＹ）、およびフリーラジカル移動剤（例えば、ＲＧＤペプチド）の混合物が照射される。言うまでもなく、本明細書に記載の他のアニーリング様式も使用され得る。図１１に示されるアニーリング反応は、内部に間隙を有する、ミクロゲル粒子１２から成る共有結合的に安定化した足場１０の形成を引き起こす。その後、周辺組織１０２由来の細胞１０６（図２Ｃに示されるような）が、足場１０内の空間への浸潤を開始し、増殖し、刺激し、最終的に、組織１０２の治癒過程を遂げる。一実施形態では、アニーリング反応の後、所望により包帯または湿潤包帯材が足場を充填された創傷の上に配置され、治癒過程中の傷害から創傷を保護する。時間経過の後、操作５３０に示されるように、足場１０は分解され、組織１０２は治癒した状態に回復した。
【０１２５】
多孔性ゲル足場の、細胞成長およびネットワーク形成を支持する能力を評価するために、３つのヒト細胞株：皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡｈＭＳＣ）、および骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭｈＭＳＣ）を用いるインビトロでの細胞形態および増殖モデルを開発した。単一細胞懸濁液を、ＦＸＩＩＩａでアニールされた多孔性ゲル足場内に動的に取り込ませた。３つの細胞株は、２４時間の多孔性ゲル足場内培養の後に、高い細胞生存率（９３％以上、図１２Ｂ）を示した。
【０１２６】
多孔性ゲル足場に取り込まれた細胞は、アニーリング開始の９０分後に展開形態を示し始めた。２日間の培養の後、多孔性ゲル足場内の全ての観察細胞は完全に展開した形態を示し、これは６日目を通じて持続した。重要なことに、全ての細胞株において２日目までに広範なネットワーク形成が観察された。細胞ネットワークは、実験全体を通じてサイズおよび複雑さを増した。図１２Ａに示されるように、ＢＭｈＭＳＣの展開性のあるネットワーク形成およびより遅い増殖速度は、これらの細胞が、極端な長さに広がり、微小孔性足場内に高度に相互連結した細胞ネットワークを形成可能であったことを示すものであったことから、ＢＭｈＭＳＣは特に注目すべきものであった。
【０１２７】
図１３Ａに示されるように、ミクロゲル粒子１２を、アニーリング前に生細胞１０６の溶液と組合せて混合することにより、微小孔性ネットワーク内に存在し、巨視的なアニール後のゲル足場１０内に均一または不均一に分散した、生細胞１０６を含有する、微小孔性足場１０を生成することができる。
【０１２８】
ミクロゲル粒子１２は、貯蔵用の等張細胞培地の水溶液中に精製することができ、ゲル形成に使用する際は、血餅の安定化に関与する天然に存在する酵素である活性化第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩａ）によって仲介される、ＫペプチドおよびＱペプチド間の非標準のアミド結合を介して互いにアニーリングさせた。この酵素介在性アニーリング過程は、相互連結した微小孔性ネットワークを含有する動的に形成されつつある多孔性足場１０への生細胞１０６の取り込みを可能にした。ＦＸＩＩＩａの添加後、ただし、足場アニーリング前に、ミクロゲル粒子１２のスラリーは注射器適用を介して送達され（図１３Ａ）、最終的に、図１３Ｂ〜Ｅに示されるように、注入された腔の形状で凝固し得る。
【０１２９】
図１４Ａに示されるように、ミクロゲル粒子１２のマイクロ流体作製は、ミクロゲルのサイズおよび生成頻度に対する決定論的制御を可能にする。マイクロ流体系２０の注入口に適用される圧力は、ミクロゲル生成の頻度を決定する（図１４Ｂ）。さらに、図１４Ｃに示されるように、異なるサイズのミクロゲル粒子１２を用いて生成された多孔性ミクロゲル足場１０は、ネットワーク内の孔径中央値等の、異なる多孔性特徴を有する。
【０１３０】
実施形態が示され、記述されたが、本明細書で開示される本発明の概念の範囲から逸脱することなく、種々の変更が可能である。従って、本明細書に記載の発明の主題は、以下の特許請求の範囲、およびそれらの等価物以外には、限定されるべきではない。
【図１】
2020075150.tif 000003
【図２−１】
2020075150.tif 000004
【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
2020075150.tif 000011
【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９−１】
2020075150.tif 000015
【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
2020075150000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月28日(2020.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小孔性ゲル系であって、当該微小孔性ゲル系が：
架橋ヒドロゲルポリマー骨格および１つまたは複数のアニーリング成分を含む複数の球状ミクロゲル粒子を含む水溶液であって、前記球状ミクロゲル粒子が５μｍ〜１０００μｍの直径を有する水溶液；および
前記複数の球状ミクロゲル粒子に適用された場合に、球状ミクロゲル粒子に、前記１つまたは複数のアニーリング成分を介して共有結合的に安定化した球状ミクロゲル粒子の足場であって、細胞を浸透、遊走および増殖させるのに十分な大きさの相互連結した細孔を有する球状ミクロゲル粒子の足場を形成させるアニーリング剤；
を含むことを特徴とする微小孔性ゲル系。
【請求項２】
請求項１に記載の微小孔性ゲル系において、前記架橋ヒドロゲルポリマー骨格が、多腕ポリ（エチレングリコール）ＰＥＧビニルスルホンを含むことを特徴とする微小孔性ゲル系。
【請求項３】
請求項１に記載の微小孔性ゲル系において、前記架橋ヒドロゲルポリマー骨格が、ヒアルロン酸を含むことを特徴とする微小孔性ゲル系。
【請求項４】
請求項１に記載の微小孔性ゲル系において、前記球状ミクロゲル粒子が、（ＭＭＰ）−分解性架橋剤を含むことを特徴とする微小孔性ゲル系。
【請求項５】
請求項１に記載の微小孔性ゲル系において、前記球状ミクロゲル粒子が、ポリ（エチレングリコール）ＰＥＧ架橋剤を含むことを特徴とする微小孔性ゲル系。
【請求項６】
請求項１に記載の微小孔性ゲル系において、前記１つまたは複数のアニーリング成分が、Ｋペプチドおよび／またはＱペプチドを含むことを特徴とする微小孔性ゲル系。
【請求項７】
請求項１に記載の微小孔性ゲル系において、前記アニーリング剤が、ＸＩＩＩａ因子を含むことを特徴とする微小孔性ゲル系。
【請求項８】
請求項１に記載の微小孔性ゲル系において、前記１つまたは複数のアニーリング成分が、不飽和カルボニル基を有する分子を含むことを特徴とする微小孔性ゲル系。
【請求項９】
請求項１に記載の微小孔性ゲル系において、前記アニーリング剤が、求核性基を有するポリ（エチレングリコール）分子を含むことを特徴とする微小孔性ゲル系。
【請求項１０】
請求項１に記載の微小孔性ゲル系において、前記アニーリング剤が、エオシンＹを含むことを特徴とする微小孔性ゲル系。
【請求項１１】
請求項１０に記載の微小孔性ゲル系において、前記複数の球状ミクロゲル粒子および前記アニーリング剤の混合物を照射するように構成された光源をさらに備えることを特徴とする微小孔性ゲル系。
【請求項１２】
請求項６に記載の微小孔性ゲル系において、前記Ｋペプチドが、ＸＩＩＩａ因子によって認識されるリジン基を含み、前記Ｑペプチドが、ＸＩＩＩａ因子によって認識されるグルタミン基を含むことを特徴とする微小孔性ゲル系。
【請求項１３】
請求項１に記載の微小孔性ゲル系において、前記共有結合的に安定化した球状ミクロゲル粒子の足場が、約１０％〜約５０％の空隙容量を有することを特徴とする微小孔性ゲル系。
【請求項１４】
請求項１に記載の微小孔性ゲル系において、送達デバイスをさらに備えることを特徴とする微小孔性ゲル系。
【請求項１５】
請求項１４に記載の微小孔性ゲル系において、前記送達デバイスが、前記複数の球状ミクロゲル粒子およびアニーリング剤またはそこに貯蔵されるアニーリング剤前駆物質を含む水溶液を含むことを特徴とする微小孔性ゲル系。
【請求項１６】
請求項１４に記載の微小孔性ゲル系において、前記送達デバイスが、複数区画送達デバイスを備え、一方の区画は、複数の球状ミクロゲル粒子を含む水溶液および第一アニーリング剤前駆物質を備え、第二の区画は、複数の球状ミクロゲル粒子を含む水溶液および第二アニーリング剤前駆物質を備えることを特徴とする微小孔性ゲル系。
【請求項１７】
請求項１に記載の微小孔性ゲル系において、前記球状ミクロゲル粒子が、前記水溶液中で３０〜９９％の体積分率で存在することを特徴とする微小孔性ゲル系。
【請求項１８】
請求項１に記載の微小孔性ゲル系において、前記球状ミクロゲル粒子が、最低で１０Ｐａの貯蔵弾性率を有することを特徴とする微小孔性ゲル系。
【請求項１９】
請求項１に記載の微小孔性ゲル系において、相互連結した細孔が、約１２μｍ〜約３７μｍの平均孔径によって特徴付けられていることを特徴とする微小孔性ゲル系。
【請求項２０】
請求項１に記載の微小孔性ゲル系において、前記微小孔性ゲル系が、３０分以下でアニーリング可能であることを特徴とする微小孔性ゲル系。