(57)【要約】【課題】p210 PHのCL結合部位に高親和性に結合し、ミトコンドリア障害に伴うBCR-ABLのミトコンドリアへの移行を阻害する分子（p210 PH結合ペプチド）を提供すること。【解決手段】p210 PH結合ペプチドは、３つのリジン（Lys）が結合して形成された分子核構造の端部に位置する４つのアミノ基の各々に、配列番号１のペプチドモチーフが、直接またはスペーサーを介して結合している４価ペプチドである。【選択図】図１３
2020075917.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
p210型BCR-ABLのBCR領域に存在するPHドメイン（p210 PH）に結合するp210 PH結合ペプチドであって、
３つのリジン（Lys）が結合して形成された分子核構造の端部に位置する４つのアミノ基の各々に、配列番号１のペプチドモチーフが、直接またはスペーサーを介して結合している４価ペプチドであることを特徴とするp210 PH結合ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドモチーフのＣ末端側の前記スペーサーが膜透過性配列を含むことを特徴とする請求項１のp210 PH結合ペプチド。
【請求項３】
前記膜透過性配列は、１〜４つのアルギニン（Arg）からなることを特徴とする請求項２のp210 PH結合ペプチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかのp210 PH結合ペプチドを含むことを特徴とする慢性骨髄性白血病治療薬。
【請求項５】
さらに、BCR-ABLのABL領域を標的としたチロシンキナーゼ阻害剤を含むことを特徴とする請求項４の慢性骨髄性白血病治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、p210型BCR-ABLのBCR領域に存在するPHドメイン（p210 PH）に結合するp210 PH結合ペプチドと、これを含有する慢性骨髄性白血病（CML）治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性骨髄性白血病(CML)は、造血幹細胞の腫瘍化に伴う白血球の異常増殖を主症状とする骨髄増殖性疾患である。CMLは、9 番染色体と22 番染色体の相互転座により生じる融合染色体、フィラデルフィア染色体、に由来する融合遺伝子産物であるp210型BCR-ABL(以下BCR-ABL)により引き起こされることが知られている。
【０００３】
もともとABL は非受容体型チロシンキナーゼであり、その活性は厳密な制御を受けている。しかしながら、融合遺伝子産物であるBCR-ABLは BCR領域のコイルドコイルドメイン依存的に多量体化（２量体あるいは４量体）しており、ABLが恒常的に活性化している。その結果、BCR-ABLの下流シグナル経路であるPI3K/AKT 経路、JAK/STAT 経路、RAS/MAPK 経路等が過剰に活性化され、CML 細胞の異常増殖が引き起こされる。
【０００４】
既存のCML治療薬として、ABL領域のキナーゼドメインを標的としたチロシンキナーゼ阻害剤 (TKIs: tyrosine kinase inhibitors)が使用されている。
【０００５】
しかしながら、第１世代のイマチニブ、第２世代のニロチニブ、ダサチニブに対しては薬剤耐性の問題が現実化しており、さらには第３世代のポナチニブに対しても薬剤耐性を示す変異が出現している。また、CML 幹細胞はABLのキナーゼ活性非依存的に増殖維持されていることが明らかにされており、TKIによる治療後であってもCML幹細胞による再発が起こることが報告されている。以上のことから、TKIとは異なる作用機構を有する新規治療薬の開発が急務である。
【０００６】
一方、本発明者らは、BCR-ABLのBCR領域に存在し、病理的機能が不明であったPHドメイン(以下「p210 PH」と記載する)に着目し、p210 PHはphosphatidylinositol diphosphate (PIP2)、phosphatidic acid (PA)、cardiolipin(CL) 等の酸性リン脂質に対して強い結合活性を示すこと、特にCLに非常に強く結合するというユニークなリガンド特性を有していることを見出している（非特許文献１）。
【０００７】
さらに、通常ミトコンドリア障害が誘導された場合、オートファジー系による障害ミトコンドリアの分解（マイトファジー）が引き起こされるが、BCR-ABLを高発現させた細胞ではp210 PH依存的にBCR-ABLがミトコンドリアへと局在性を変化させ、その結果マイトファジーが抑制されることを見出している（非特許文献１）。CLは通常ミトコンドリアの内膜に局在しており、ミトコンドリア障害によって外膜の細胞質側へと表出することが知られているが、p210 PHはこの外膜へと表出したCLに結合することにより、BCR-ABLのミトコンドリアへの移行を促進していることが示されている。さらに、マイトファジーが抑制された結果、障害ミトコンドリアが蓄積し、そのため活性酸素種（ROS）の産生亢進が引き起こされること、を見出している（非特許文献１）。
【０００８】
また、これまでに、過剰なROSは細胞死を誘導するが、適度なROSはがん細胞の増殖シグナルを活性化させるシグナル分子として機能すること、さらにCML細胞あるいはCML幹細胞においては、高レベルのROS産生が生じており、このためCMLの悪性化およびTKI耐性体の出現が促進されること、が報告されている（非特許文献２、３）。
【０００９】
一方、これまでに、本発明者らは、多量体形成によって発揮される強い相互作用（クラスター効果）を阻害する分子を同定する技術、多価型ペプチドライブラリー法を開発し、クラスター効果を発揮して機能する様々な分子(細菌毒素やprotein kinase等のシグナル分子)に対する阻害分子の開発に成功している（例えば、特許文献１〜５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第4744443号
【特許文献２】特許第5754008号
【特許文献３】特許第5897178号
【特許文献４】特許第5718574号
【特許文献５】特許第5635779号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Genes Cells, 2018, 23, 22-
【非特許文献２】Sanchez -Sanchez, B. et al. NADPH Oxidases as Therapeutic Targets in Chronic Myelogenous Leukemia. Clin. Cancer Res. 20, 4014-4025 (2014).
【非特許文献３】Nieborowska-skorska, M. et al. Rac2-MRC-cIII - generated ROS cause genomic instability in chronic myeloid leukemia stem cells and primitive progenitors. Blood 119, 4253-4263 (2012).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
以上のようなこれまでの知見から、本発明者らは、BCR-ABLによる障害ミトコンドリアの蓄積、それに続くROS産生を抑制することができれば、CML細胞のみならず、CML幹細胞の維持・増殖を抑制することができるのではないかとの新規な着想を得た。
【００１３】
また、上述したように、BCR-ABLは BCR領域 の コイルドコイルドメイン依存的に多量体構造をとっており、ABL のキナーゼドメインがクラスター化することにより恒常的に活性化している。そして、この時、p210 PHもクラスター化することにより効率良くリガンド認識を行っていると考えられることから、本発明者らによって確立された上記技術を用いることで、p210 PHのCL結合領域に強く結合するペプチド性化合物を同定することができると推察した。
【００１４】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、p210 PHのCL結合部位に高親和性に結合し、ミトコンドリア障害に伴うBCR-ABLのミトコンドリアへの移行を阻害する分子（p210 PH結合ペプチド）と、新規な慢性骨髄性白血病治療薬を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明のp210 PH結合ペプチドは、p210型BCR-ABLのBCR領域に存在するPHドメイン（p210 PH）に結合するペプチドであって、
３つのリジン（Lys）が結合して形成された分子核構造の端部に位置する４つのアミノ基の各々に、配列番号１のペプチドモチーフが、直接またはスペーサーを介して結合している４価ペプチドであることを特徴としている。
【００１６】
このp210 PH結合ペプチドでは、ペプチドモチーフのＣ末端側のスペーサーが膜透過性配列を含むことが好ましい。
【００１７】
このp210 PH結合ペプチドでは、膜透過性配列は、１〜４つのアルギニン（Arg）からなることがより好ましい。
【００１８】
本発明の慢性骨髄性白血病治療薬は、前記p210 PH結合ペプチドを含むことを特徴としている。さらに、この慢性骨髄性白血病治療薬では、BCR-ABLのABL領域を標的としたチロシンキナーゼ阻害剤を含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のp210 PH結合ペプチドは、p210 PHのCL結合部位に高親和性に結合し、ミトコンドリア障害に伴うBCR-ABLのミトコンドリアへの移行を阻害することができる。本発明の慢性骨髄性白血病(CML)治療薬は、p210 PH結合ペプチドを含むため、CMLを治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】１次ライブラリーを用いた検討を示す図である。Ａ）2次ライブラリー以下は全てセルロースシートを用いて各ペプチドをスポット合成しているが、１次ライブラリーのみ各ペプチドを384well plateに固相化されたセルロースディスクに合成した後、スポッターを用いてスライドグラス上にスポットしたものを使用した。図に示す配列を４価で有するペプチドライブラリーがスポットされたスライドグラスを10μg/mlのp210 PHまたはR726A 存在下、4℃で一晩インキュベートした。洗浄後、抗His-tag抗体、続いてHRP標識２次抗体を用いて発色させ、結合したp210 PHまたはR726Aを検出、定量した。Ｂ）４番目にGluあるいはValを持つモチーフの２種について、これらのモチーフの１価体ならびに４価体をセルロースシート上にスポット合成し、p210 PHあるいはR726Aとの結合力を比較した。
【図２】２次ライブラリーを用いた検討を示す図である。図に示す配列を４価で有するペプチドライブラリーをシート上にスポット合成し、同様の検討を行った。
【図３】３次ライブラリーを用いた検討を示す図である。図に示す配列を４価で有するペプチドライブラリーをシート上にスポット合成し、同様の検討を行った。
【図４】４次ライブラリーを用いた検討を示す図である。図に示す配列を４価で有するペプチドライブラリーをシート上にスポット合成し、同様の検討を行った。
【図５】５次ライブラリーを用いた検討を示す図である。図に示す配列を４価で有するペプチドライブラリーをシート上にスポット合成し、同様の検討を行った。
【図６】５次ライブラリーを用いた検討を示す図である。図に示す配列を４価で有するペプチドライブラリーをシート上にスポット合成し、同様の検討を行った。
【図７】６次ライブラリーを用いた検討を示す図である。図に示す配列を４価で有するペプチドライブラリーをシート上にスポット合成し、同様の検討を行った。
【図８】７次ライブラリーを用いた検討を示す図である。図に示す配列を４価で有するペプチドライブラリーをシート上にスポット合成し、同様の検討を行った。
【図９】４価型ランダムペプチドシートスクリーニング法を用いた、R726特異的高親和性p210 PH結合モチーフの同定スキームを示す図である。ライブラリー部であるMA-XXXXXXX-A-Ahx、のXXXXXXXに相当する７アミノ酸を示す。
【図１０】取得したモチーフの名称と配列を示す図である。
【図１１】テトラマー体のp210 PHならびにR726Aへの結合活性を示す図である。ELISA plateに、10μg/ml (A)あるいは1μg/ml (B)、の各テトラマーを固定化し、各濃度のp210 PHあるいはR726A存在下１時間、室温で反応させた。洗浄後、結合したp210 PHあるいはR726Aを抗His-tag抗体で検出した。縦軸は、(A)では吸光度を示し（n=1）、(B)では3μg/mlのp210 PHを用いた場合の吸光度を100%として示している（n=3, mean + SD）。
【図１２】WDD-tetがp210 PHとCLとの結合に対して競合的に働くことを示す図である。ELISA plateに、1μg/mlのWDD-tetを固定化し、各小胞存在下あるいは非存在下、1μg/mlのp210 PHを加え、１時間、室温で反応させた。洗浄後、結合したp210 PHを抗His-tag抗体で検出した。縦軸は吸光度を示す（n=3, mean + SD）。CLを含む小胞（CL(+)SUV）は、egg PC:CL:biotinylated-phosphatidylethanolamine(biotin-PE)=75:20:5、CLを含まない小胞（CL(-)SUV）は、egg PC: biotin-PE=95:5、の組成で作成し、10 μM (total lipid)で使用した。 *P <0.05 (Student’s t-test)
【図１３】WDD-R4-tetが、ミトコンドリア障害に伴うp210 PHのミトコンドリアへの移行を阻害することを示す図である。(A)HEK293細胞に、mito7-mcherry発現ベクターと、p210 BCR-ABL-Venus、あるいはR726A BCR-ABL-Venus発現ベクターをco-transfectionし、24時間培養した。これらの細胞を、30μMのCCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone) で、100μg/mlのWDD-R4-tet存在下あるいは非存在下で3時間培養し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて蛍光観察を行った。(B)ミトコンドリア（赤）の周りにP210 BCR-ABL（緑）が集積したリング構造を保有している細胞数をカウントし、総細胞数に対する割合で表示した（n=3, mean + SE）。**P <0.01 (Student’s t-test)
【図１４】P210  BCR-ABL安定発現Ba/F3細胞の増殖に対するイマチニブならびにWDD-R4-tetの効果を示す図である。（A）p210安定発現Ba/F3細胞（1*10^5/ml）をイマチニブ(0.3 or 0.4 microM)、WDD-R4-tet(100 microgram/ml)、あるいはイマチニブ(0.3 or 0.4 microM)とWDD-R4-tet(100 microgram/ml)共存下、で培養し、各日数培養後の細胞数を測定した(n=4)。(B)Aに示す条件下で培養２日後の細胞数を比較した(n=9)。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明のp210 PH結合ペプチドの一実施形態について説明する。
【００２２】
p210 PH結合ペプチドは、p210型BCR-ABLのBCR領域に存在するPHドメイン（p210 PH）に結合する。
【００２３】
本発明のp210 PH結合ペプチドの一実施形態は、３つのリジン（Lys）が結合して形成された以下の分子核構造（化学式１）、
【００２４】
【化１】
2020075917.tif 000003
【００２５】
の端部に位置する４つの‐ＮＨ基の各々に、以下のペプチドモチーフ、
配列番号１：Trp-Asp-Asp-Asp-Glu-Gln-Asn  (WDDDEQN)が、直接またはスペーサーを介して結合した４価ペプチドである。
【００２６】
このp210 PH結合ペプチドは、配列番号１のペプチドモチーフを４つ含むため、クラスター効果を発揮して、p210型BCR-ABLのPHドメイン（p210 PH）に強力に結合する。
【００２７】
具体的には、この実施形態のp210 PH結合ペプチドは、例えば、以下の化学式２、
【００２８】
【化２】
2020075917.tif 000004
【００２９】
において、３つのリジン（Lys）からなる分子核構造の端部に位置する４つのXXXX部のそれぞれに、配列番号１のペプチドモチーフが組み込まれた４価ペプチドが例示される。なお、上記の化学式２では、ペプチドモチーフが組み込まれる位置を便宜的に「XXXX」と記載している。
【００３０】
また、上記化学式２では、分子核構造の端部に位置する４つのアミノ基の各々に、スペーサーが結合している形態を例示しているが、スペーサーを介さず、４つのアミノ基の各々に、直接、配列番号１のペプチドモチーフを結合させることもできる。スペーサーを結合させる場合、p210 PHへの結合性を損なわないものであればよく、具体的な分子、長さは限定されず、適宜設計することができる。
【００３１】
スペーサーとしては、例えば、末端にアミノ基を有する炭素数４〜１０程度の鎖長のものが好ましく、特に上記化学式２中の「Ｕ」で示される、amino hexanoic acid [NH2-(CH2)5-COOH]（アミノカプロン酸）を好ましく例示することができる。また、スペーサーに含まれるアミノ酸としては、例えば、アラニン（Ａ）を例示することができる。
【００３２】
さらに、このp210 PH結合ペプチドは、化学式２のXXXX部に組み込まれた配列番号１のペプチドモチーフの各々の末端に修飾分子を有していてもよい。なお、上記化学式２で例示するペプチドは、末端にＭＡ（Met−Ala）を有しているが、これは、後述の実施例において、スクリーニングの際に導入したものを例示しており、上記化学式２のＭＡは、本発明のp210 PH結合ペプチドにおいては必ずしも必要ではない。ペプチドモチーフの末端にＮＨ２が露出するとプラス電荷になることから、電荷調節の観点からは、配列番号１のペプチドモチーフの各々の末端に、修飾分子として、電荷がない分子、さらには、疎水性の分子を結合させることも考慮される。また、例えば、本発明のp210 PH結合ペプチドを含有するCML治療薬を経口投与する場合、消化管内でのプロテアーゼによる分解を抑えるための安定化を目的として、末端のＮＨ２をアセチル基により保護することもできる。このように、ペプチドモチーフの末端の修飾分子は、所望の効果に応じて適宜選択することができ、リン酸化、メチル化、アデニリル化、糖鎖付加などの修飾が加えられていてよい。
【００３３】
さらに、このp210 PH結合ペプチドは水溶性が高いことから、配列番号１のペプチドモチーフのＣ末端側に膜透過性配列を含むことが好ましい。
【００３４】
膜透過性配列を構成するアミノ酸や長さは特に限定されず、適宜設計することができるが、ヒスチジン（His）、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）などのアミノ酸を含む塩基性に富む配列であることが好ましい。具体的には、例えば、膜透過性配列としては、１〜６つアルギニン（Arg）、特に好ましくは４つアルギニン（Arg）から構成されるポリアルギニン（Arg）を例示することができる。膜透過性配列の位置も特に限定されず、適宜設計することができるが、上記化学式２に例示した形態では、スペーサーであるアラニン（Ａ）とamino hexanoic acid [NH2-(CH2)5-COOH]（Ｕ）の間に導入することがより好ましい。p210 PH結合ペプチドがポリアルギニン（Arg）などの膜透過性配列を含むことで、p210 PH結合ペプチドのp210 PHへの結合性を高めることができる。
【００３５】
本発明のp210 PH結合ペプチドの作成方法は特に限定されず、例えば、ペプチド合成装置等を利用するなどの公知の方法によって作製することができる。本発明のp210 PH結合ペプチドに組み込まれる配列番号１のペプチドモチーフ（ペプチド性化合物）は、４価の核構造に順次アミノ酸を付加することにより合成でき、１価のペプチド合成と同様の手法にて簡便にバルク合成することができる。
【００３６】
そして、本発明のp210 PH結合ペプチドは、p210 PHのCL結合部位に高親和性に結合し、ミトコンドリア障害に伴うBCR-ABLのミトコンドリアへの移行を阻害する。これによって、障害ミトコンドリアの蓄積、それに続くROS産生が抑制され、CML細胞のみならず、CML幹細胞の維持・増殖を抑制することができる。このため、本発明のp210 PH結合ペプチドは、CML治療薬（医薬組成物）として有用である。すなわち、本発明のCML治療薬は、上述したp210 PH結合ペプチドを含む。
さらに、本発明のCML治療薬は、p210 PH結合ペプチドに加え、BCR-ABLのABL領域を標的としたチロシンキナーゼ阻害剤を含むことが好ましい。このようなチロシンキナーゼ阻害剤としては、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ポナチニブなどを例示することができる。本発明のCML治療薬として、上述したp210 PH結合ペプチドとチロシンキナーゼ阻害剤とを併用することで、イマチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤によるCML幹細胞の増殖抑制効果を増強することができる。
【００３７】
本発明のCML治療薬の投与形態は特に限定されず、経口的投与でも非経口的投与でもよい。非経口投与としては、例えば、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射等の注射投与、経皮投与、経粘膜投与（経鼻、経口腔、経肺）投与などを例示することができる。
【００３８】
本発明のCML治療薬は、有効成分としてのp210 PH結合ペプチドをそのまま用いてもよいし、薬学的に許容できる担体、賦形剤、添加剤等を加えて製剤化してもよい。剤形としては、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤等が挙げられる。
【００３９】
製剤化は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、溶解補助剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤などを適宜使用し、常法により行うことができる。
【００４０】
製剤化に用いられる成分の例としては、精製水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等薬学的に許容される有機溶剤、動植物油、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ソルビトール、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、コーンスターチ、無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、トラガント、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、高級アルコール、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミンなどを例示することができる。
【００４１】
本発明のCML治療薬をヒトに投与する場合の投与量は、症状、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、有効成分の種類、製剤の種類によって異なり、特に限定されないが、例えば、100μg〜1000 mgを1回または数回に分けて投与することができる。
本発明のp210 PH結合ペプチドおよびCML治療薬は、以上の実施形態に限定されることはなく、p210 PHのCL結合部位へ高親和性で結合し、BCR-ABLのミトコンドリアへの移行を阻害可能な範囲で適宜設計することができる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例により本発明についてさらに詳しく説明するが、本発明のp210 PH結合ペプチドおよび慢性骨髄性白血病治療薬は、以下の実施例に何ら限定されるものではない。
【００４３】
＜実施例１＞高親和性p210 PH結合ペプチドの同定
１-１）スクリーニングに使用するp210 PHならびにその変異体の作成
p210 PH、あるいはp210 PHとCLとの結合に重要な役割を果たしていることが知られている726番目のArgをAlaに置換した変異体、R726A、それぞれにHis-tagを導入したものを大腸菌発現系を用いて作成した。
【００４４】
１-２）多価型ランダムペプチドシートスクリーニング法を用いた高親和性p210 PH結合モチーフの同定
セルロースシート上に２価あるいは４価の多価型ペプチドライブラリーをシート合成する技術を用い（特許文献４）、以下に示すような４価の多価型ペプチドライブラリーをシート上に合成した。
【００４５】
(MA-ZXXXXXX-AU)4-3Lys    
ZはCysを除く１９種類の固定アミノ酸、XはCysを除く１９種類のアミノ酸のミクスチャー、Uはスペーサーとしてのカプロン酸を示す（基本構造は化学式２と同じ）。ここで、Zをposition１から７までずらしてゆくと、合計133(=19*7)種類のライブラリーをスポット合成することになる（１次ライブラリー）。このシートにHis-tag標識p210 PHあるいはその変異体であるR726Aを結合させ、抗His-tag抗体を用いて検出する。その結合活性を指標に最適アミノ酸とその固定位置（ここでは仮にXXXB4XXXとする）を決定する。決定にあたっては、R726Aに比べ、野生型p210 PHにより強く、かつ特異的に結合することを指標とする。次に、得られた情報に基づき、 (MA-ZXXB4XXX-AU)4-3Lysから構成される114(=19*6)種類をスポット合成する（２次ライブラリー）。同様の操作を行い、最適アミノ酸とその固定位置を決定する。以下同様のスクリーニングを繰り返し（Xが７個あるので７次ライブラリーまで行う）、全てのXについて最適アミノ酸を決定し、最適モチーフ、B1B2B3B4B5B6B7を決定する。
【００４６】
（１次スクリーニング）
２次ライブラリー以下は全てセルロースシートを用いて各ペプチドをスポット合成しているが、１次ライブラリーの場合のみ、以下に示す各ペプチドがスライドグラス上にスポットされたものを用いた。すなわち、各ペプチドを384well plateに固相化されたセルロースディスクに合成した後、溶解し、スポッターを用いてスライドグラス上にスポットした。
【００４７】
４価の１次ランダムペプチドライブラリー(ライブラリー部は、MA-AXXXXXX-A-Ahx、Xの数は６個にしぼってある)がスポットされたスライドグラスを、p210 PHあるいはR726Aでブロットすることにより、各ペプチドとの結合活性を評価した（図１-Ａ、表１）。
【００４８】
具体的には、p210 PH（野生型を意味するWTと表示）、あるいはR726Aでブロットし、それぞれについて各ペプチドの濃さ（PSL）を定量した。WTへの結合力を指標として上位２０位を選択し、各ペプチドのPSL値の総計がスポットの総数（20）になるように補正表示した（WT結合力、あるいはR726A結合力）。すなわち、各ペプチドの間で結合に差が全く存在しない場合には、値は全て1.0となる。また、結合特異性を示す指標として、補正後のp210 PHへの結合量（WT結合力）を、補正後のR726Aへの結合量（R726A結合力）で割った値、結合比を算出し、この値についても総計がペプチドの総数になるように補正して表示した（WT/R726A）。さらに、p210 PHへの結合力、ならびに結合比、双方に優れていることを示す指標として、WT結合力とWT/R726Aをかけた値を算出した（WT結合力×結合比）。表示は、WT結合力が高い順にソートしてある。各ペプチドのシート上での位置はシートの縦（A-E)と横（1-24）の組み合わせで表示した（ペプチドポジション）。
【００４９】
【表１】
2020075917.tif 000005
【００５０】
その結果、p210 PHへの結合量（WT結合力）、ならびに、p210 PHへの結合力及びR726Aに対する結合比が共に優れていることを示す指標（WT結合力×結合比）で評価し、上位２０位の中から、その両者が共に最も高い値を示すモチーフとして、MA-AXXEXXX-A-Ahxを同定した。
【００５１】
そこで、MA-AXXEXXX-A-Ahx、ならびに、WT結合力は低いもののWT結合力×結合比が高い値を示す、MA-AXXVXXX-A-Ahx、の２種について、これらのモチーフを１価体ならびに４価体としてセルロースシート上にスポット合成し、p210 PHあるいはR726Aとの結合力を比較した。
【００５２】
その結果、MA-AXXEXXX-A-Ahxの方が上記結果と一致して非常に強く、かつR726特異的な結合活性を示すことが明らかとなった。さらに、同じMA-AXXEXXX-A-Ahxを持つモチーフでも、１価体に比べると４価体の方が結合活性が著しく増強されること、を見出した（図１-B）。このことは、p210 PHはクラスター効果を発揮してリガンドを認識していることを示している。
【００５３】
（２次スクリーニング）
上記の結果から、ライブラリー部にMA-XXXXEXX-A-Ahxを４価で有する、２次ライブラリーを作成し、同様の検討を行った（図２、表２）。
【００５４】
【表２】
2020075917.tif 000006
【００５５】
その結果、WT結合力が上位２０位のモチーフの中から、WT結合力×結合比が最も高い値を示す、MA-XXXXEQX-A-Ahxを選出した。
【００５６】
（３次スクリーニング）
上記の結果から、ライブラリー部にMA-XXXXEQX-A-Ahxを４価で有する３次ライブラリーを作成し、同様の検討を行った（図３、表３）。
【００５７】
【表３】
2020075917.tif 000007
【００５８】
その結果、WT結合力が上位２０位のモチーフの中から、WT結合力×結合比が最も高い値を示す、MA-XXDXEQX-A-Ahxを選出した。
【００５９】
（４次スクリーニング）
上記の結果から、ライブラリー部にMA-XXDXEQX-A-Ahxを４価で有する４次ライブラリーを作成し、同様の検討を行った（図４、表４）。
【００６０】
【表４】
2020075917.tif 000008
【００６１】
その結果、WT結合力が上位２０位以内のモチーフの中から、WT結合力×結合比が最も高い値を示す、MA-XXDDEQX-A-Ahx、ならびにMA-XDDXEQX-A-Ahxを選出した。
【００６２】
（５次スクリーニング）
上記の結果から、ライブラリー部にMA-XDDXEQX-A-Ahx、ならびにMA-XXDDEQX-A-Ahx、を４価で有する５次ライブラリーを作成し、同様の検討を行った（図５、図６、表５、表６）。
【００６３】
【表５】
2020075917.tif 000009
【００６４】
【表６】
2020075917.tif 000010
【００６５】
MA-XDDXEQX-A-Ahxの場合、WT結合力が上位10位以内のモチーフの中から、WT結合力×結合比が最も高い値を示す、MA-XDDFEQX-A-Ahx、MA-RDDXEQX-A-Ahxを選出した（図５、表５）。MA-XXDDEQX-A-Ahxの場合、WT結合力が上位10位以内のモチーフの中から、WT結合力×結合比が最も高い値を示す、MA-XXDDEQN-A-Ahxを選出した（図６、表６）。
【００６６】
（６次スクリーニング）
上記の結果から、ライブラリー部にMA-XDDFEQX-A-Ahx、MA-RDDXEQX-A-Ahx、ならびにMA-XXDDEQN-A-Ahx、を４価で有する６次ライブラリーを作成し、同様の検討を行った（図７、表７）。なお評価は全てのライブラリーを総合して行った。
【００６７】
【表７】
2020075917.tif 000011
【００６８】
その結果、WT結合力が上位20位以内のモチーフの中から、WT結合力×結合比が高い値を示すMA-XFDDEQN-A-Ahx、MA-WXDDEQN-A-Ahx、MA-FXDDEQN-A-Ahx、MA-XDDFEQR-A-Ahx、MA-XDDFEQG-A-Ahx、を選出した（表７）。
【００６９】
（７次スクリーニング）
上記の結果から、ライブラリー部にMA-XFDDEQN-A-Ahx、MA-WXDDEQN-A-Ahx、MA-FXDDEQN-A-Ahx、MA-XDDFEQR-A-Ahx、MA-XDDFEQG-A-Ahx、を４価で有する７次ライブラリーを作成し、同様の検討を行った（図８、表８）。なお評価は全てのライブラリーを総合して行った。
【００７０】
【表８】
2020075917.tif 000012
【００７１】
その結果、WT結合力が上位２０位以内のモチーフから、WT結合力で評価し、７種を最終的な候補配列とした（表８）。なお、これらはいずれも十分なWT結合力×結合比の値を有していること確認している。
【００７２】
以上のスクリーニングの結果、以下の７種のモチーフ（配列番号１〜７）が得られた（図９）。また、これらの７種のモチーフの名称を図１０に示す。
配列番号２：Tyr-Asp-Asp-Phe-Glu-Gln-Arg （YDDFEQR）
配列番号３：Asp-Asp-Asp-Phe-Glu-Gln-Arg  (DDDFEQR)
配列番号４：Phe-Tyr-Asp-Asp-Glu-Gln-Asn  (FYDDEQN)
配列番号５：Phe-Gln-Asp-Asp-Glu-Gln-Asn  (FQDDEQN)
配列番号６：His-Phe-Asp-Asp-Glu-Gln-Asn  (HFDDEQN)
配列番号１：Trp-Asp-Asp-Asp-Glu-Gln-Asn  (WDDDEQN)
配列番号７：Trp-Trp-Asp-Asp-Glu-Gln-Asn  (WWDDEQN)
【００７３】
＜実施例２＞取得ペプチドのp210 PHへの結合活性の検討
実施例１で最終的に取得した各モチーフ（配列番号１〜７）を、クラスター効果を発揮させるためスクリーニングに使用したものと同じ核構造（化学式２のXXXX部）に導入し、以下のテトラマー体（YDD-tet、DDD-tet、FYD-tet、FQD-tet、HFD-tet、WDD-tet、WWD-tetと称する）を作成した（Uはカプロン酸を示す）。
【００７４】
YDD-tet： [MA-YDDFEQR-AU]4-3Lys
DDD-tet： [MA-DDDFEQR-AU]4-3Lys
FYD-tet： [MA-FYDDEQN-AU]4-3Lys
FQD-tet： [MA-FQDDEQN-AU]4-3Lys
HFD-tet： [MA-HFDDEQN-AU]4-3Lys
WDD-tet： [MA-WDDDEQN-AU]4-3Lys
WWD-tet： [MA-WWDDEQN-AU]4-3Lys
これら一連のテトラマー体を用いて、p210 PHならびにR726Aとの結合活性をELISA法にて検討した。
【００７５】
その結果、いずれの化合物もp210 PHの濃度依存的に結合活性を示すこと、一方でR726Aに対する結合活性は減弱していること、すなわちR726特異的に結合していることが明らかとなった（図１１-Ａ）。特に、高い結合親和性を示したWDD-tet 、WWD-tetの２種についてp210 PHの結合定数を算出したところ、0.34、0.47μg/mであった（図１１-Ｂ）。そこで以下の実験では、WDD-tetを使用した。
【００７６】
＜実施例３＞WDD-tetとp210 PHとの結合に対するCL含有小胞の阻害効果
これまでの結果から、配列番号１のペプチドを有するWDD-tetはp210 PHのCL結合部位に存在するR726に特異的に結合することが示されたが、実際にp210 PHとCLとの結合に対して競合的に働くか否かをELISA法を用いて検討した。CLは生理的な条件に近くなるように、20%のモル比でphosphatidylcholine(PC)から構成される小胞に存在している状態のものを使用した。
【００７７】
その結果、plate上に固定化されたWDD-tetに対するp210 PHの結合は、CLを含むPC小胞が存在する時にのみ顕著に阻害されること、一方でPCのみから構成される小胞では全く阻害効果が見られないことが見出された（図１２）。この結果は、WDD-tetはp210 PHとCLとの結合に対して競合的に働いていることを示している。
【００７８】
＜実施例４＞ミトコンドリア障害に伴うp210 PHのミトコンドリアへの移行に及ぼすWDD-tetの阻害効果
WDD-tetのp210 PH結合モチーフは、配列番号１：Trp-Asp-Asp-Asp-Glu-Gln-Asn（WDDDEQN）であり、７アミノ酸のうち酸性アミノ酸を４個含んでいる。このため、WDD-tetの細胞への効果を検討するに際し、細胞膜を通過できないことが懸念された。すでに我々は、膜透過性に乏しいテトラマー体を効率良く細胞に導入するためには、各モチーフのC末端側にArgを４個（配列番号８：Arg-Arg-Arg-Arg）導入することが有効であることを見出している（特願2018-163521）。そこで、WDD-tetに膜透過性を付与するため、WDD-tetに存在している各p210 PH結合モチーフのC末端側にArgを４個導入した、WDD-R4-tetを作成した。従って、WDD-R4-tet は、[MA-WDDDEQN-ARRRRU]4-3Lysの構造を有する。WDD-R4-tetを用いて、ミトコンドリア障害に伴うp210 PHのミトコンドリアへの移行に及ぼす阻害効果を検討した。
【００７９】
実験には、蛍光標識（赤）されたミトコンドリアマーカーであるmito7と、蛍光標識（緑）された野生型p210 BCR-ABL、あるいは、PHドメインにR726Aの変異を有するR726A BCR-ABL、とを同時に一過性に発現させたHEK293細胞を使用した。これらの細胞を、マイトファジー誘導作用をもちCLの表出を促進させることが知られている脱共役剤CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone) により刺激すると、野生型p210 BCR-ABLを用いた場合のみ、ミトコンドリアの周囲にBCR-ABLがドーナツ状に集積する様子が観察される。この時、CCCP刺激時にWDD-R4-tetを共存させておくと、顕著にBCR-ABLのミトコンドリアへの局在が阻害されることが明らかとなった（図１３-Ａ）。この局在性の変化を定量した結果を（図１３-Ｂ）に示す。
【００８０】
これまでの結果から、WDD-R4-tet はp210 BCR-ABLのPHドメインに結合することにより、CLを介したBCR-ABLのミトコンドリアへの集積を効率よく阻害すると考えられる。
【００８１】
＜実施例５＞p210 BCR-ABL安定発現Ba/F3細胞に対するイマチニブとWDD-R4-tetの併用効果
マウスpro-B細胞株であるBa/F3細胞はIL3非存在下ではほとんど増殖能を示さないが、p210型BCR-ABLを安定発現することにより、IL3非依存的増殖能を示すようになる。CMLモデル細胞として、p210型BCR-ABL安定発現Ba/F3（p210-Ba/F3）細胞を用い、増殖に及ぼすWDD-R4-tetの効果を検討した。
【００８２】
イマチニブは容量依存的にp210-Ba/F3細胞の増殖を抑制するが、WDD-R4-tetはほとんど増殖に影響を及ぼさない。一方で、両者を併用した場合、 WDD-R4-tet によってイマチニブによる増殖抑制効果が増強する傾向にあること（図１４-Ａ）、特に培養2日後では有意にこの増殖抑制増強作用が観察されることを見出した（図１４-Ｂ）。
【００８３】
イマチニブはABLのチロシンキナーゼ阻害活性を持つためp210-Ba/F3細胞の増殖を阻害する。一方で、イマチニブ処理により細胞のエネルギー獲得のための代謝が解糖系から酸化的代謝へとシフトすることが知られている。このシフトによってミトコンドリアの質が低下し、マイトファジーが誘導されるが、BCR-ABLのPHドメインは先述した機構によってマイトファジーを抑制する方向に働くことにより、細胞増殖を維持していると考えられる。WDD-R4-tetはこのPHドメインによるマイトファジー抑制を解除することによって、イマチニブによる増殖抑制効果を増強したものと考えられた。このようなエネルギー獲得のための代謝が酸化的代謝へとシフトした状態はCML幹細胞でも観察されていることから、CML幹細胞のチロシンキナーゼ非依存的な増殖維持にはBCR-ABLのPHドメインによるマイトファジー抑制が関与している可能性が考えられる。このことから、WDD-R4-tetはCML幹細胞の増殖抑制にも応用できると期待される。
【００８４】
＜まとめ＞
４価型ランダムペプチドシートスクリーニング法を用いた高親和性モチーフ同定技術を用い、P210 PHに対するペプチド性阻害薬WDD-tetを同定した。WDD-tetはP210 PHのCL結合領域に結合し、P210 PHとCLとの結合を効率よく阻害する。これまでにP210 PHを標的として、阻害分子が開発された例はなく、独自性が高い。
【００８５】
さらに、WDD-tetに細胞膜透過性を付与したWDD-R4-tetは、ミトコンドリア障害に伴うCLを介したBCR-ABLのミトコンドリアへの集積を効率よく阻害することを見出した。
また、CMLモデル細胞であるp210-Ba/F3細胞において、WDD-R4-tet はイマチニブによる増殖抑制効果を増強することを見出した。
【００８６】
これまでの知見から、CLを介したBCR-ABLのミトコンドリアへの集積は、マイトファジーを抑制し、その結果、ROS産生を亢進させ、CML細胞ならびにCML幹細胞の増殖に寄与していると考えられる。このことから、WDD-R4-tetは既存の治療薬とは作用機構を異にする新規CML治療薬として利用することができる。
【図１】
2020075917.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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