(57)【要約】      （修正有）【課題】ペプチド結合だけでなく、Ｔ細胞エピトープの免疫原性を正確に予測する方法を提供する。【解決手段】免疫原性アミノ酸修飾を予測するための方法であって、１つ以上のＭＨＣ分子への修飾ペプチドの結合に関するスコアを確認する工程、および１つ以上のＭＨＣ分子への非修飾ペプチドの結合に関するスコアを確認する工程、および／または１つ以上のＴ細胞受容体への、ＭＨＣ−ペプチド複合体中に存在する場合の修飾ペプチドの結合に関するスコアを確認する工程を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性アミノ酸修飾を予測するための方法であって、
ａ）１つ以上のＭＨＣ分子への修飾ペプチドの結合に関するスコアを確認する工程、および
ｂ）１つ以上のＭＨＣ分子への非修飾ペプチドの結合に関するスコアを確認する工程、および／または
ｃ）１つ以上のＴ細胞受容体への、ＭＨＣ−ペプチド複合体中に存在する場合の前記修飾ペプチドの結合に関するスコアを確認する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記修飾ペプチドが修飾タンパク質のフラグメントを含み、前記フラグメントが前記タンパク質中に存在する修飾を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非修飾ペプチドが、前記修飾ペプチド中の修飾の位置に対応する位置に生殖系列アミノ酸を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記非修飾ペプチドおよび修飾ペプチドが、前記修飾を除き同一である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記非修飾ペプチドおよび修飾ペプチドが、８〜１５、好ましくは８〜１２アミノ酸長である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上のＭＨＣ分子が、異なるＭＨＣ分子型、特に異なるＭＨＣ対立遺伝子を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上のＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩ分子および／またはＭＨＣクラスＩＩ分子である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関する前記スコアを、ＭＨＣ結合モチーフのデータベースとの配列比較を含む工程によって確認する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程ａ）が、前記スコアが１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関する所定の閾値を満たすかどうかを確認することを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｂ）が、前記スコアが１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関する所定の閾値を満たすかどうかを確認することを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程ａ）で適用される前記閾値が工程ｂ）で適用される前記閾値と異なる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関する前記所定の閾値が、１つ以上のＭＨＣ分子への結合の確率を反映する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｃ）が、前記非修飾アミノ酸と修飾アミノ酸との間の化学的および物理的類似性に関するスコアを確認することを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程ｃ）が、前記スコアがアミノ酸の間の前記化学的および物理的類似性に関する所定の閾値を満たすかどうかを確認することを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記化学的および物理的類似性に関する前記スコアを、アミノ酸が自然界で交換される確率に基づいて確認する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
アミノ酸が自然界で交換される頻度が高いほど、前記アミノ酸をより類似するとみなす、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記化学的および物理的類似性を、進化に基づく対数オッズ行列を用いて決定する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記非修飾ペプチドが、１つ以上のＭＨＣ分子への結合を示す閾値を満たす１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関するスコアを有し、および前記修飾ペプチドが、１つ以上のＭＨＣ分子への結合を示す閾値を満たす１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関するスコアを有する場合、前記非修飾アミノ酸および修飾アミノ酸が、化学的および物理的非類似性を示す閾値を満たす化学的および物理的類似性に関するスコアを有すれば、前記修飾または修飾ペプチドを免疫原性と予測する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記非修飾ペプチドが１つ以上のＭＨＣ分子に結合するかまたは１つ以上のＭＨＣ分子に結合する確率を有し、および前記修飾ペプチドが１つ以上のＭＨＣ分子に結合するかまたは１つ以上のＭＨＣ分子に結合する確率を有する場合、前記非修飾アミノ酸および修飾アミノ酸が化学的および物理的に非類似性であるかまたは化学的および物理的に非類似性である確率を有すれば、前記修飾または修飾ペプチドを免疫原性と予測する、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記修飾が、１つ以上のＭＨＣ分子に結合するためのアンカー位置には存在しない、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記非修飾ペプチドが、１つ以上のＭＨＣ分子に結合しないことを示す閾値を満たす１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関するスコアを有し、および前記修飾ペプチドが、１つ以上のＭＨＣ分子への結合を示す閾値を満たす１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関するスコアを有する場合、前記修飾または修飾ペプチドを免疫原性と予測する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記非修飾ペプチドが１つ以上のＭＨＣ分子に結合しないかまたは１つ以上のＭＨＣ分子に結合しない確率を有し、および前記修飾ペプチドが１つ以上のＭＨＣ分子に結合するかまたは１つ以上のＭＨＣ分子に結合する確率を有する場合、前記修飾または修飾ペプチドを免疫原性と予測する、請求項１から１７および２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記修飾が、１つ以上のＭＨＣ分子に結合するためのアンカー位置に存在する、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
２つ以上の異なる修飾ペプチドに関して工程ａ）を実施することを含み、前記２つ以上の異なる修飾ペプチドが同じ修飾を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記同じ修飾を含む２つ以上の異なる修飾ペプチドが、修飾タンパク質の異なるフラグメントを含み、前記異なるフラグメントが、前記タンパク質中に存在する同じ修飾を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記同じ修飾を含む２つ以上の異なる修飾ペプチドが、修飾タンパク質のすべての潜在的なＭＨＣ結合フラグメントを含み、前記フラグメントが、前記タンパク質中に存在する同じ修飾を含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記同じ修飾を含む２つ以上の異なる修飾ペプチドから、１つ以上のＭＨＣ分子に結合する確率を有するまたは最も高い確率を有する修飾ペプチドを選択することをさらに含む、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記同じ修飾を含む２つ以上の異なる修飾ペプチドが、長さおよび／または修飾の位置において異なる、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
２つ以上の異なる修飾ペプチドに関して工程ａ）ならびに場合により工程ｂ）およびｃ）の一方または両方を実施することを含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記２つ以上の異なる修飾ペプチドが、同じ修飾を含むおよび／または異なる修飾を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記異なる修飾が同じタンパク質中および／または異なるタンパク質中に存在する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記異なる修飾ペプチドの２つ以上のスコアを比較することを含む、請求項２４から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
１つ以上のＭＨＣ分子への前記修飾ペプチドの結合に関するスコアを、１つ以上のＴ細胞受容体への、ＭＨＣ−ペプチド複合体中に存在する場合の前記修飾ペプチドの結合に関するスコア、好ましくは前記非修飾アミノ酸と修飾アミノ酸との間の化学的および物理的類似性に関するスコアよりも高く重み付け、ならびに１つ以上のＴ細胞受容体への、ＭＨＣ−ペプチド複合体中に存在する場合の前記修飾ペプチドの結合に関するスコア、好ましくは前記非修飾アミノ酸と修飾アミノ酸との間の化学的および物理的類似性に関するスコアを、１つ以上のＭＨＣ分子への前記非修飾ペプチドの結合に関するスコアよりも高く重み付ける、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
１つ以上のタンパク質コード領域内の非同義変異を同定することをさらに含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
１つ以上の癌細胞および場合により１つ以上の非癌性細胞などの１つ以上の細胞のゲノムまたはトランスクリプトームを部分的または完全に配列決定すること、ならびに１つ以上のタンパク質コード領域内の変異を同定することによって修飾を同定する、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記変異が体細胞変異である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記変異が癌変異である、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ワクチンの製造において使用される、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ワクチンが、前記方法によって免疫原性と予測された修飾または修飾ペプチドに由来する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法によって免疫原性と予測された修飾または修飾ペプチドを同定する工程を含む、ワクチンを提供するための方法。
【請求項４１】
免疫原性と予測された前記修飾もしくは修飾ペプチドを含むペプチドもしくはポリペプチド、または前記ペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸を含有するワクチンを提供する工程をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
請求項３８から４１のいずれか一項に記載の方法に従って生産されるワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ細胞エピトープを予測するための方法に関する。特に、本発明は、腫瘍関連ネオ抗原などのペプチドまたはポリペプチドにおける修飾が免疫原性であるか否かを予測するための方法に関する。本発明の方法は、特に、患者の腫瘍に特異的なワクチンを提供するためおよび、したがって、個別化癌ワクチンに関連して有用である。
【背景技術】
【０００２】
個別化癌ワクチンは、所与の患者に固有の腫瘍特異的突然変異を標的とするように特別に適合された治療ワクチンである。そのような治療は、健康な細胞を傷つけず、生涯にわたる寛解を提供する潜在的可能性を有するので、癌患者に大きな希望を与える。ただし、腫瘍によって発現されるあらゆる変異がワクチンのための標的として使用できるわけではない。実際に、大部分の癌体細胞変異は、それに対してワクチン接種された場合免疫応答に結びつかない（Ｊ．Ｃ．Ｃａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｎｏｍｅ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７２，１０８１（２０１２））。腫瘍は１００，０００もの体細胞変異をコードすることができるが（Ｍ．Ｒ．Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ３３１，１５５３（２０１１））、ワクチンは一握りのエピトープだけを標的とするので、癌免疫療法の重要な目標は、いずれの変異が免疫原性である可能性が高いかを同定することであるのは明白である。
【０００３】
生物学的観点から、体細胞変異が免疫応答を生じさせるためにはいくつかの基準を満たす必要がある：変異を含む対立遺伝子が細胞によって発現されねばならない、変異がタンパク質コード領域内にあり、非同義でなければならない、翻訳されたタンパク質がプロテアソームによって切断されねばならない、変異を含むエピトープがＭＨＣ複合体によって提示されねばならない、提示されたエピトープがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識されねばならない、および最後にＴＣＲ−ｐＭＨＣ複合体がＴ細胞を活性化するシグナル伝達カスケードを開始させねばならない（Ｓ．Ｗｈｅｌａｎ，Ｎ．Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  １８，６９１（２００１））。これまでのところ、いずれの変異がこれらの基準全部を満たす可能性が高いかを高い確実度で予測することができるアルゴリズムは提案されていない。本報告において本発明者らは、免疫原性に寄与し得るいくつかの因子を検討し、これらの因子を実験データに対して比較して、免疫原性変異を同定するための簡単なモデルを提案する。
【０００４】
ＭＨＣ結合予測：技術水準
２０年以上前に、結合能力に他よりも大きく寄与する、ＭＨＣ結合ペプチド内の位置が存在することが確認された（例えば、Ａ．Ｓｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８６，３２９６（１９８９））。これらのアンカー位置の同定と記述は、ＭＨＣ結合ペプチドのパターンを見出すことを可能にし、したがって予測の方法を開発するための基礎となった。近年、抗原プロセシング機構のインシリコモデルの分野において重要な開発が達成された。１９９０年代後半に開発された２つの先駆的なアプローチ、ＢＩＭＡＳ（Ｋ．Ｃ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｍ．Ａ．Ｂｅｄｎａｒｅｋ，Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５２，１６３（１９９４））およびＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Ｈ．−Ｇ．Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｊ．Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｎ．Ｐ．Ｎ．Ｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｏ．Ａ．Ｂａｃｈｏｒ，Ｓ．Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５０，２１３（１９９９））は、アンカー位置の知識および由来する対立遺伝子特異的モチーフに基づいた。ますます多くの実験的ＭＨＣペプチド結合データが利用可能となってきたので、多種多様な統計およびコンピュータ技術を用いてより多くのツールが開発されている（概略については図１参照）。いわゆる行列ベースの方法は、位置特異的スコアリング行列を使用して、ペプチド配列が特定のＭＨＣ対立遺伝子の結合モチーフにマッチするかどうかを決定する。別のクラスのＭＨＣ結合予測方法は、人工ニューラルネットワークまたはサポートベクターマシンなどの機械学習技術を用いる（図１参照）。これらのアルゴリズムの成績は、結合についての予測能力を有する、基礎となるパターン／特徴を「学習する」ための各対立遺伝子モデル（例えば「ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１」、「Ｈ２−Ｄｂ」等）に関する利用可能なトレーニングデータセットの量と質に強く依存する。最近、構造ベースの方法が登場してきており、これらは、例えばエネルギー最小化原理によってペプチド−ＭＨＣ相互作用を予測するために単にペプチド−ＭＨＣ結晶構造およびスコアリング関数（例えば種々のエネルギー関数）だけに頼るので、大きなトレーニングセットを得るという障害を回避する（図１参照）。しかし、それらのアプローチの精度はまだ配列ベースの方法には遠く及ばない。ベンチマーク試験は、人工ニューラルネットワークに基づくツールＮｅｔＭＨＣ（Ｃ．Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３６，Ｗ５０９（２００８））および行列ベースのアルゴリズムＳＭＭ（Ｂ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ａ．Ｓｅｔｔｅ，ＢＭＣ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ６，１３２（２００５））が試験された評価データに関して最良の成績を発揮することを示す（Ｂ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ａ．Ｓｅｔｔｅ，ＢＭＣ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ６，１３２（２００５）；Ｈ．Ｈ．Ｌｉｎ，Ｓ．Ｒａｙ，Ｓ．Ｔｏｎｇｃｈｕｓａｋ，Ｅ．Ｌ．Ｒｅｉｎｈｅｒｚ，Ｖ．Ｂｒｕｓｉｃ，ＢＭＣ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９，８（２００８））。どちらのアプローチも、免疫エピトープデータベースで入手可能な、いわゆるＩ���ＤＢコンセンサス法に統合される（Ｙ．Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０，Ｗ５２５（２０１２））。ＭＨＣ  ＩＩ分子は両側が開放端である結合溝を有し、異なる長さのペプチドの結合を可能にするので、ペプチド−ＭＨＣ  ＩＩ結合の相互作用をモデリングすることはＭＨＣ  Ｉに関するよりもはるかに複雑である。ＭＨＣ  Ｉに結合するペプチドは主として８〜１２アミノ酸に限定されるが、この長さはＭＨＣ  ＩＩペプチドについては著しく異なり得る（９〜３０アミノ酸）。最近のベンチマーク試験は、利用可能なＭＨＣ  ＩＩ予測方法はＭＨＣ  Ｉ予測に比べて限られた精度しか提供しないことを示す（Ｈ．Ｈ．Ｌｉｎ，Ｓ．Ｒａｙ，Ｓ．Ｔｏｎｇｃｈｕｓａｋ，Ｅ．Ｌ．Ｒｅｉｎｈｅｒｚ，Ｖ．Ｂｒｕｓｉｃ，ＢＭＣ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９，８（２００８））。
【０００５】
Ｔ細胞エピトープを見出すためのそれらのアルゴリズムの最初の大規模で体系的な使用は、Ｍｏｕｔａｆｔｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍ．Ｍｏｕｔａｆｔｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，８１７（２００６））によって行われ、種々のツールを組み合わせてワクシニアウイルスに感染させたＣ５７ＢＬ７６マウスの可能なワクチン候補物を予測し、脾細胞を抽出して、予測されたペプチドの上位１％に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を測定した。それらはＴ細胞応答を誘導する４９個（２２５６個の中から）のペプチドを同定した。それ以来、様々なＭＨＣ結合予測ツールを用いて、主として病原体、例えば森林型熱帯リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）に対するワクチンの候補物としてＴ細胞エピトープを探索する多くの試験が公表されている（Ｃ．Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｎａｊｅｒａ，Ｒ．Ｐｉｎａ−Ａｇｕｉｌａｒ，Ｆ．Ｘａｃｕｒ−Ｇａｒｃｉａ，Ｍ．Ｊ．Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｓｉｅｒｒａ，Ｅ．Ｄｕｍｏｎｔｅｉｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ９，１２９３（２００９））。しかし、免疫原性の予測のためにＭＨＣ  Ｉ結合予測ツールだけを使用することは、それらのツールは所与のペプチドが所与のＭＨＣ対立遺伝子に結合する潜在能を有するかどうかを予測するようにトレーニングされているので、誤りを導きやすい。免疫原性を予測するためにＭＨＣ結合予測を用いることの論理的根拠は、それぞれのＭＨＣ対立遺伝子に高親和性で結合するペプチドは免疫原性である可能性がより高いという仮定である（Ａ．Ｓｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５３，５５８６（１９９４））。しかし、低いＭＨＣ結合親和性も高い免疫原性をもたらし得ること（Ｍ．Ｃ．Ｆｅｌｔｋａｍｐ，Ｍ．Ｐ．Ｖｉｅｒｂｏｏｍ，Ｗ．Ｍ．Ｋａｓｔ，Ｃ．Ｊ．Ｍｅｌｉｅｆ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３１，１３９１（１９９４））およびペプチド−ＭＨＣの安定性がペプチド親和性よりも良好な免疫原性の予測因子であると考えられること（Ｍ．Ｈａｒｎｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４２，１４０５（２０１２））を示す数多くの試験が存在する。その理由で、免疫原性予測は今までのところあまり正確ではなく、これは免疫原性を予測することについての低い成功率に反映されている。それにもかかわらず、ペプチド結合はＴ細胞エピトープ認識のための必要条件であるが十分条件ではなく、効率的な予測は、実験的に試験すべきペプチドの数を劇的に低減することができる。
【０００６】
免疫原性を予測するモデルの開発は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の認識ならびに中枢寛容、すなわち胸腺における発生の間のＴ細胞の陰性および陽性選択も考慮に入れる必要があることは明らかである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．Ｃ．Ｃａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｎｏｍｅ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７２，１０８１（２０１２）
【非特許文献２】Ｍ．Ｒ．Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ３３１，１５５３（２０１１）
【非特許文献３】Ｓ．Ｗｈｅｌａｎ，Ｎ．Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  １８，６９１（２００１）
【非特許文献４】Ａ．Ｓｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８６，３２９６（１９８９）
【非特許文献５】Ｋ．Ｃ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｍ．Ａ．Ｂｅｄｎａｒｅｋ，Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５２，１６３（１９９４）
【非特許文献６】Ｈ．−Ｇ．Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｊ．Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｎ．Ｐ．Ｎ．Ｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｏ．Ａ．Ｂａｃｈｏｒ，Ｓ．Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５０，２１３（１９９９）
【非特許文献７】Ｃ．Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３６，Ｗ５０９（２００８）
【非特許文献８】Ｂ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ａ．Ｓｅｔｔｅ，ＢＭＣ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ６，１３２（２００５）
【非特許文献９】Ｈ．Ｈ．Ｌｉｎ，Ｓ．Ｒａｙ，Ｓ．Ｔｏｎｇｃｈｕｓａｋ，Ｅ．Ｌ．Ｒｅｉｎｈｅｒｚ，Ｖ．Ｂｒｕｓｉｃ，ＢＭＣ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９，８（２００８）
【非特許文献１０】Ｙ．Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０，Ｗ５２５（２０１２）
【非特許文献１１】Ｍ．Ｍｏｕｔａｆｔｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，８１７（２００６）
【非特許文献１２】Ｃ．Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｎａｊｅｒａ，Ｒ．Ｐｉｎａ−Ａｇｕｉｌａｒ，Ｆ．Ｘａｃｕｒ−Ｇａｒｃｉａ，Ｍ．Ｊ．Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｓｉｅｒｒａ，Ｅ．Ｄｕｍｏｎｔｅｉｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ９，１２９３（２００９）
【非特許文献１３】Ａ．Ｓｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５３，５５８６（１９９４）
【非特許文献１４】Ｍ．Ｃ．Ｆｅｌｔｋａｍｐ，Ｍ．Ｐ．Ｖｉｅｒｂｏｏｍ，Ｗ．Ｍ．Ｋａｓｔ，Ｃ．Ｊ．Ｍｅｌｉｅｆ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３１，１３９１（１９９４）
【非特許文献１５】Ｍ．Ｈａｒｎｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４２，１４０５（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
結合だけでなく、エピトープの免疫原性を正確に予測するために上述したすべての態様を具現化することができる予測モデルが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１つの態様では、本発明は、免疫原性アミノ酸修飾を予測するための方法であって、
ａ）１つ以上のＭＨＣ分子への修飾ペプチドの結合に関するスコアを確認する工程、および
ｂ）１つ以上のＭＨＣ分子への非修飾ペプチドの結合に関するスコアを確認する工程、および／または
ｃ）１つ以上のＴ細胞受容体への、ＭＨＣ−ペプチド複合体中に存在する場合の修飾ペプチドの結合に関するスコアを確認する工程
を含む方法に関する。
【００１０】
１つの実施形態では、修飾ペプチドは修飾タンパク質のフラグメントを含み、前記フラグメントはタンパク質中に存在する修飾を含む。１つの実施形態では、非修飾ペプチドまたはタンパク質は、修飾ペプチドまたはタンパク質中の修飾の位置に対応する位置に生殖系列アミノ酸を有する。
【００１１】
１つの実施形態では、非修飾ペプチドまたはタンパク質と修飾ペプチドまたはタンパク質は、修飾を除き同一である。好ましくは、非修飾ペプチドまたはタンパク質と修飾ペプチドまたはタンパク質は、同じ長さおよび／または配列（修飾を除く）を有する。
【００１２】
１つの実施形態では、非修飾ペプチドおよび修飾ペプチドは、８〜１５、好ましくは８〜１２アミノ酸長である。
【００１３】
１つの実施形態では、１つ以上のＭＨＣ分子は異なるＭＨＣ分子型、特に異なるＭＨＣ対立遺伝子を含む。１つの実施形態では、１つ以上のＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩ分子および／またはＭＨＣクラスＩＩ分子である。１つの実施形態では、１つ以上のＭＨＣ分子はＭＨＣ対立遺伝子のセット、例えば個別のＭＨＣ対立遺伝子のセットまたはそのサブセットを含む。
【００１４】
１つの実施形態では、１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関するスコアは、ＭＨＣ結合モチーフのデータベースとの配列比較を含む工程によって確認される。
【００１５】
１つの実施形態では、工程ａ）は、前記スコアが１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関する所定の閾値を満たすかどうかを確認することを含み、および／または工程ｂ）は、前記スコアが１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関する所定の閾値を満たすかどうかを確認することを含む。１つの実施形態では、工程ａ）に適用される閾値は、工程ｂ）に適用される閾値と異なる。１つの実施形態では、１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関する所定の閾値は、１つ以上のＭＨＣ分子への結合の確率を反映する。
【００１６】
１つの実施形態では、１つ以上のＴ細胞受容体は、Ｔ細胞受容体のセット、例えば個別のＴ細胞受容体のセットまたはそのサブセットを含む。１つの実施形態では、工程ｃ）は、Ｔ細胞受容体の前記セットが、ＭＨＣ−ペプチド複合体中に存在する場合の非修飾ペプチドに結合するＴ細胞受容体を含有しないおよび／またはＭＨＣ−ペプチド複合体中に存在する場合の非修飾ペプチドに高親和性で結合するＴ細胞受容体を含有しないと仮定することを含む。
【００１７】
１つの実施形態では、工程ｃ）は、非修飾アミノ酸と修飾アミノ酸との間の化学的および物理的類似性に関するスコアを確認することを含む。１つの実施形態では、工程ｃ）は、前記スコアがアミノ酸の間の化学的および物理的類似性に関する所定の閾値を満たすかどうかを確認することを含む。１つの実施形態では、アミノ酸の間の化学的および物理的類似性に関する前記所定の閾値は、アミノ酸が化学的および物理的に類似する確率を反映する。１つの実施形態では、化学的および物理的類似性に関するスコアを、アミノ酸が自然界で交換される確率に基づいて確認する。１つの実施形態では、アミノ酸が自然界で交換される頻度が高いほどアミノ酸はより類似するとみなされ、逆もまた同様である。１つの実施形態では、化学的および物理的類似性を、進化に基づく対数オッズ行列を用いて決定する。
【００１８】
１つの実施形態では、非修飾ペプチドが、１つ以上のＭＨＣ分子への結合を示す閾値を満たす１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関するスコアを有し、および修飾ペプチドが、１つ以上のＭＨＣ分子への結合を示す閾値を満たす１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関するスコアを有する場合、非修飾アミノ酸および修飾アミノ酸が、化学的および物理的非類似性を示す閾値を満たす化学的および物理的類似性に関するスコアを有すれば、修飾または修飾ペプチドは免疫原性と予測される。
【００１９】
１つの実施形態では、非修飾ペプチドが１つ以上のＭＨＣ分子に結合するかまたは１つ以上のＭＨＣ分子に結合する確率を有し、および修飾ペプチドが１つ以上のＭＨＣ分子に結合するかまたは１つ以上のＭＨＣ分子に結合する確率を有する場合、非修飾アミノ酸および修飾アミノ酸が化学的および物理的に非類似性であるかまたは化学的および物理的に非類似性である確率を有すれば、修飾または修飾ペプチドは免疫原性と予測される。
【００２０】
１つの実施形態では、修飾は、１つ以上のＭＨＣ分子に結合するためのアンカー位置には存在しない。
【００２１】
１つの実施形態では、非修飾ペプチドが、１つ以上のＭＨＣ分子に結合しないことを示す閾値を満たす１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関するスコアを有し、および修飾ペプチドが、１つ以上のＭＨＣ分子への結合を示す閾値を満たす１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関するスコアを有する場合、修飾または修飾ペプチドは免疫原性と予測される。
【００２２】
１つの実施形態では、非修飾ペプチドが１つ以上のＭＨＣ分子に結合しないかまたは１つ以上のＭＨＣ分子に結合しない確率を有し、および修飾ペプチドが１つ以上のＭＨＣ分子に結合するかまたは１つ以上のＭＨＣ分子に結合する確率を有する場合、修飾または修飾ペプチドは免疫原性と予測される。
【００２３】
１つの実施形態では、修飾は、１つ以上のＭＨＣ分子に結合するためのアンカー位置に存在する。
【００２４】
１つの実施形態では、本発明の方法は、２つ以上の異なる修飾ペプチドに関して工程ａ）を実施することを含み、前記２つ以上の異なる修飾ペプチドは同じ修飾を含む。１つの実施形態では、同じ修飾を含む２つ以上の異なる修飾ペプチドは、修飾タンパク質の異なるフラグメントを含み、前記異なるフラグメントはタンパク質中に存在する同じ修飾を含む。１つの実施形態では、同じ修飾を含む２つ以上の異なる修飾ペプチドは、修飾タンパク質のすべての潜在的なＭＨＣ結合フラグメントを含み、前記フラグメントはタンパク質中に存在する同じ修飾を含む。１つの実施形態では、本発明の方法は、同じ修飾を含む２つ以上の異なる修飾ペプチドから、１つ以上のＭＨＣ分子に結合する確率を有するまたは最も高い確率を有する修飾ペプチドを選択することをさらに含む。１つの実施形態では、同じ修飾を含む２つ以上の異なる修飾ペプチドは、長さおよび／または修飾の位置が異なる。
【００２５】
１つの実施形態では、本発明の方法は、２つ以上の異なる修飾ペプチドに関して工程ａ）ならびに場合により工程ｂ）およびｃ）の一方または両方を実施することを含む。１つの実施形態では、前記２つ以上の異なる修飾ペプチドは、同じ修飾を含むおよび／または異なる修飾を含む。１つの実施形態では、異なる修飾は同じタンパク質中および／または異なるタンパク質中に存在する。工程ａ）ならびに場合により工程ｂ）およびｃ）の一方または両方で使用される２つ以上の異なる修飾ペプチドのセットは、同じであってもよくまたは異なっていてもよい。１つの実施形態では、工程ｂ）および／または工程ｃ）で使用される２つ以上の異なる修飾ペプチドのセットは、工程ａ）で使用される２つ以上の異なる修飾ペプチドのセットのサブセットである。好ましくは、前記サブセットは、工程ａ）において最良のスコアであるペプチドを含む。
【００２６】
１つの実施形態では、本発明の方法は、前記異なる修飾ペプチドの２つ以上のスコアを比較することを含む。１つの実施形態では、本発明の方法は、前記異なる修飾ペプチドの２つ以上を順位付けることを含む。１つの実施形態では、１つ以上のＭＨＣ分子への修飾ペプチドの結合に関するスコアは、１つ以上のＴ細胞受容体への、ＭＨＣ−ペプチド複合体中に存在する場合の修飾ペプチドの結合に関するスコア、好ましくは非修飾アミノ酸と修飾アミノ酸との間の化学的および物理的類似性に関するスコアよりも高く重み付けられ、ならびに１つ以上のＴ細胞受容体への、ＭＨＣ−ペプチド複合体中に存在する場合の修飾ペプチドの結合に関するスコア、好ましくは非修飾アミノ酸と修飾アミノ酸との間の化学的および物理的類似性に関するスコアは、１つ以上のＭＨＣ分子への非修飾ペプチドの結合に関するスコアよりも高く重み付けられる。
【００２７】
１つの実施形態では、本発明の方法は、１つ以上のタンパク質コード領域内の非同義変異を同定することをさらに含む。
【００２８】
１つの実施形態では、修飾は、１つ以上の細胞、例えば１つ以上の癌細胞および場合により１つ以上の非癌性細胞のゲノムまたはトランスクリプトームを部分的または完全に配列決定することおよび１つ以上のタンパク質コード領域内の変異を同定することにより、本発明に従って同定される。
【００２９】
１つの実施形態では、前記変異は体細胞変異である。１つの実施形態では、前記変異は癌変異である。
【００３０】
１つの実施形態では、本発明の方法はワクチンの製造において使用される。１つの実施形態では、ワクチンは、本発明の方法によって免疫原性と予測された修飾または修飾ペプチドに由来する。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は、
本発明の方法によって免疫原性と予測された修飾または修飾ペプチドを同定する工程
を含む、ワクチンを提供するための方法を提供する。
【００３２】
１つの実施形態では、本発明の方法は、
免疫原性と予測された修飾もしくは修飾ペプチドを含むペプチドもしくはポリペプチド、または前記ペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸を含有するワクチンを提供する工程
をさらに含む。
【００３３】
さらなる態様では、本発明は、本発明による方法を使用して得られるワクチンを提供する。そのようなワクチンの好ましい実施形態を本明細書で述べる。
【００３４】
本発明に従って提供されるワクチンは、医薬的に許容される担体を含んでよく、場合により１つ以上のアジュバント、安定剤等を含んでよい。ワクチンは、治療ワクチンまたは予防ワクチンの形態であり得る。
【００３５】
別の態様は、本発明に従って提供されるワクチンを患者に投与することを含む、患者において免疫応答を誘導するための方法に関する。
【００３６】
別の態様は、
（ａ）本発明による方法によってワクチンを提供する工程；および
（ｂ）前記ワクチンを癌患者に投与する工程
を含む、癌患者を治療する方法に関する。
【００３７】
別の態様は、本発明によるワクチンを癌患者に投与することを含む、癌患者を治療する方法に関する。
【００３８】
さらなる態様では、本発明は、本明細書で述べる治療の方法において使用するため、特に癌を治療するまたは予防するのに使用するための、本明細書で述べるワクチンを提供する。
【００３９】
本明細書で述べる癌の治療は、外科的切除術および／または放射線および／または伝統的化学療法と組み合わせることができる。
【００４０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ＭＨＣ結合予測の概要。
【図２】そのうち３０が免疫原性であった、５０の優先順位付けたＢ１６Ｆ１０変異および８２の優先順位付けたＣＴ２６．ＷＴ変異（合計１３２の変異）に関するＭｍｕｔスコアの関数としての免疫原性の分析。すべてのワクチン接種を、ＲＮＡを用いて実施した。Ｂ１６Ｆ１０に関して、ＲＮＡでＢＭＤＣを攻撃誘発し、ＥＬＩＳＰＯＴおよびＦＡＣＳで脾細胞の免疫応答を測定することによって免疫原性を評価した。ＣＴ２６．ＷＴに関しては、ＲＮＡおよびペプチドで別々にＢＭＤＣを攻撃誘発し、ＥＬＩＳＰＯＴで脾細胞の免疫応答を測定することによって免疫原性を評価した；ペプチドまたはＲＮＡのいずれかが免疫応答を記録した場合、変異を免疫原性とみなした。（Ａ）Ｍｍｕｔスコアの関数としての免疫原性変異の累積分布。グラフは、これらの所与のＭｍｕｔスコアより低い変異の総数（赤色）、免疫原性であった変異の数（青色）および全体からの免疫原性変異のパーセント（黒色）を示す。（Ｂ）以下の範囲に関するＭｍｕｔビン当たりの免疫原性変異のパーセントのヒストグラム：≦０．３、（０．３，１］、＞１。示されている誤差は標準誤差である。
【図３】Ｍｍｕｔの関数としてのＢ１６Ｆ１０およびＣＴ２６．ＷＴ免疫原性の分析。Ｂ１６（Ａ）およびＣＴ２６（Ｃ）に関するＭｍｕｔスコアの関数としての免疫原性変異の累積分布。以下の範囲に関するＭｍｕｔビン当たりの免疫原性変異のパーセントのヒストグラム：Ｂ１６（Ｂ）およびＣＴ２６（Ｄ）に関して［０．１，０．３］、（０．３，１］、（１，∞）。図ＡおよびＢは、５０のＢ１６Ｆ１０の優先付けた変異の分析に基づき、そのうち１２が免疫原性であった。図ＣおよびＤは、８２のＢ１６Ｆ１０の優先付けた変異の分析に基づき、そのうち３０が免疫原性であった。さらなる詳細については図２の脚注参照。誤差は標準誤差である。
【図４】免疫原性および対照仮説のモデル。ＨＡによって表されるクラスＩ免疫原性から、ＷＴおよびＭＵＴエピトープの両方が細胞によって提示されることおよび変異の十分性がアミノ酸の物理化学的特性を変化させ、そのため免疫系がこの変化を登録し、免疫応答を生じさせる（稲妻によって表される）という推測が立てられる。ＨＡの対照としての役割を果たす、Ｈｎ仮説は、単純に逆ＨＡ仮説であり、すなわち変異がアミノ酸の物理化学的特性を有意に変化させず、それゆえ免疫系によって「検出」されて免疫応答を生じさせる可能性がより低いという仮説である。クラスＩＩ免疫原性（ＨＢＵＨＣ）では、ＷＴエピトープは提示されないが、ＭＵＴエピトープは提示される。ＨＢとＨＣは、それぞれ高いＴスコア（Ｔ＞τ）と低いＴスコア（Ｔ≦τ）によって区別される。α＊＝αに関して、免疫原性に関するＨＢＣ１モデル（Ｍｍｕｔ＜β）は４つすべての群の複合物であることに留意されたい：ＨＢＣ１＝Ｕ［ＨＡ，ＨＢ，ＨＣ，Ｈｎ］。
【図５】免疫原性に対するＴスコアの仮説上の関係。クラスＩ免疫原性モデルによれば、Ｔ細胞発生の間に野生型エピトープに強力に結合するＴＣＲが欠失された。現存するＴＣＲは野生型エピトープに弱い結合親和性だけを示すかまたは全く結合親和性を示さないはずである（Ａ）。高いＴスコアを有するアミノ酸置換を含むエピトープは、野生型アミノ酸と類似の物理化学的特性を有し、それゆえ現存ＴＣＲへの結合親和性にほとんど影響を及ぼさないと考えられる（Ｂ）。Ｔスコアを有するアミノ酸置換を含むエピトープは、現存ＴＣＲへの結合親和性を増大させる可能性がより高く、それゆえ免疫原性である可能性がより高い（Ｃ）。この略図では、Ｔ細胞をマッチするペプチドと対合させるために色識別を使用する。橙色／黄色変異は高いＴスコアを有する変異を表し（ＷＴに類似）、青色／紫色変異は低いＴスコアを有する変異を表す（ＷＴと比較して有意の物理化学的相違）。
【図６】Ｍｍｕｔの関数としての免疫原性変異の累積分布。（Ａ）α＝１、τ＝１に関して、基線対照仮説ＨＢＣ１：｛Ｍｍｕｔ≦β｝を満たす免疫原性変異のパーセントと、部分仮説ＨＡ'：ＨＢＣ１∩｛Ｔ≦τ｝、部分仮説ＨＢＣ２：ＨＢＣ１∩｛Ｍｍｕｔ≦α｝および完全仮説ＨＡ：ＨＢＣ１∩｛Ｍｍｕｔ≦α｝∩｛Ｔ≦τ｝を満たす免疫原性変異のパーセントとの比較。（Ｂ）基線対照仮説ＨＢＣ１：｛Ｍｍｕｔ≦β｝を満たす免疫原性変異のパーセントと、逆部分仮説：ＨＢＣ１∩｛Ｔ＞τ｝およびＨＢＣ１∩｛Ｍｍｕｔ＞α｝を満たす免疫原性変異のパーセントとの比較。  ＡおよびＢにおける分析は、１３２の変異を含み、そのうち３０が免疫原性であった、プールされたＢ１６Ｆ１０およびＣＴ２６．ＷＴデータベースに基づく。グラフ中の各データ点は≧４変異に基づく。
【図７】Ｍｍｕｔスコアの関数としての免疫原性変異の累積分布。Ｂ１６（Ａ）およびＣＴ２６（Ｃ）に関してα＝１、τ＝１と仮定して、基線対照仮説ＨＢＣ１：｛Ｍｍｕｔ≦β｝を満たす免疫原性変異のパーセントと、部分仮説ＨＡ'：ＨＢＣ１∩｛Ｔ≦τ｝、部分仮説ＨＢＣ２：ＨＢＣ１∩｛Ｍｍｕｔ≦α｝および完全仮説ＨＡ：ＨＢＣ１∩｛Ｍｍｕｔ≦α｝∩｛Ｔ≦τ｝を満たす免疫原性変異のパーセントとの比較。Ｂ１６（Ｂ）およびＣＴ２６（Ｄ）に関して基線対照仮説ＨＢＣ１：｛Ｍｍｕｔ≦β｝を満たす免疫原性変異のパーセントと、逆部分仮説：ＨＢＣ１∩｛Ｔ＞τ｝およびＨＢＣ１∩｛Ｍｍｕｔ＞α｝を満たす免疫原性変異のパーセントとの比較。図ＡおよびＢは、５０のＢ１６Ｆ１０の優先変異の分析に基づき、そのうち１２が免疫原性であった。図ＣおよびＤは、８２のＢ１６Ｆ１０の優先変異の分析に基づき、そのうち３０が免疫原性であった。グラフ中の各データ点は≧４変異に基づく。
【図８】ＷＴ免疫原性についての検査。ＭＵＴ＋／ＷＴ＋の解を除外することがこれらの所見に影響を及ぼすかどうかを調べるため、データセットから９のＭＵＴ＋／ＷＴ＋変異およびＷＴが測定されていなかった２つの変異を除外し、合計１２１の変異（４３のＢ１６および７８のＣＴ２６）を残して、そのうち１９はＭＵＴ＋／ＷＴ−（Ｂ１６に関して５およびＣＴ２６に関して１４）であった。本発明者らは再び、完全なデータセットにおけるのと同様の傾向を見出し、すなわちＭｍｕｔスコアの関数としての高度に非線形の応答、部分仮説に対するＨＡ仮説の優越性、および基線対照ＨＢＣ１と比較した逆仮説の劣等性。（Ａ）Ｍｍｕｔスコアの関数としての免疫原性の累積分布。（Ｂ）Ｍｍｕｔビン当たりの免疫原性変異のパーセントのヒストグラム。（Ｃ）基線対照仮説ＨＢＣ１を満たす免疫原性変異のパーセントと、ＨＡ'、ＨＢＣ２およびＨＡを満たす免疫原性変異のパーセントとの比較。（Ｄ）基線対照仮説ＨＢＣ１を満たす免疫原性変異のパーセントと逆仮説を満たす免疫原性変異のパーセントとの比較。さらなる詳細については図５の脚注参照。
【図９】ＲＰＫＭの関数としての免疫原性変異の割合。（Ａ）赤色：フィルタリングなしで全５０のＢ１６変異および８２のＣＴ２６変異（合計１３２の変異）。青色：α＝１、β＝０．５、τ＝１でＨＡ仮説を通過する変異。（Ｂ）フィルタリングなしで異なるＲＰＫＭ範囲に関する免疫原性変異のパーセント。ＲＰＫＭビンは：１＝（０，１］、２＝（１，５］、３＝（５，５０］、４＝（５０，∞）である。（Ｃ）α＝１、β＝０．５、τ＝１でＨＡ仮説の下での異なるＲＰＫＭ範囲に関する免疫原性変異のパーセント。ＲＰＫＭビンは：１＝（０，１］、２＝（１，∞）である。誤差はＳ．Ｅ．である。
【図１０】アンカー位置および非アンカー位置で変異したクラスＩＩ免疫原性エピトープ。ＳＹＦＰＥＩＴＨＩを用いてアンカー位置モチーフを分析した。
【図１１】免疫原性腫瘍関連エピトープに関する提案モデル。
【図１２】変異の順位位置を比較検討するための方法の例。各変異に関して、順位付けた変異のリスト中の順位位置を、患者についてのＨＬＡ型、ＨＬＡ型の可能なウィンドウ長およびエピトープ内の変異位置の組合せが低いＭｍｕｔを有する解をもたらしたかまたはＨＡおよび／もしくはＨＢＵＨＣ分類をもたらした解の数によってさらに比較検討することができる。変異当たりのすべて解が潜在的に並行して提示され得るので、この比較検討因子は変異の順位位置への重要な寄与因子であり得る。
【図１３】ＭｍｕｔおよびΔＭ＝Ｍｍｕｔ−Ｍｗｔに対するＣＴ２６からの変異ｃｈｒ１４＿５２８３７８８２についてのすべてのエピトープ解の散布図の例。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明を以下で詳細に説明するが、本発明は、本明細書で述べる特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および学術用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００４３】
以下において、本発明の要素を説明する。これらの要素を特定の実施形態と共に列挙するが、それらを任意の方法および任意の数で組み合わせて付加的な実施形態を創製し得ることが理解されるべきである。様々に説明される実施例および好ましい実施形態は、本発明を明確に記述される実施形態だけに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明確に記述される実施形態を多くの開示されるおよび／または好ましい要素と組み合わせた実施形態を裏付け、包含することが理解されるべきである。さらに、本出願中で述べるすべての要素の任意の順序および組合せが、文脈によって特に指示されない限り、本出願の記述によって開示されるとみなされるべきである。
【００４４】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、"Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）"，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ  Ｈ．Ｋｏｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載されているように定義される。
【００４５】
本発明の実施は、特に指示されない限り、当該分野の文献中で説明される生化学、細胞生物学、免疫学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  １９８９参照）。
【００４６】
本明細書および以下の特許請求の範囲全体を通じて、文脈上特に必要とされない限り、「含む」という語および「含むこと」などの変形は、記述される成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の包含を意味し、いかなる他の成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の排除も意味しないが、一部の実施形態では、そのような他の成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群が排除され得る、すなわち主題が記述される成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の包含に存することが理解される。本発明を説明することに関連して（特に特許請求の範囲に関連して）使用される「１つの」および「その」という用語および同様の言及は、本明細書で特に指示されない限りまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を含むと解釈されるべきである。本明細書中の数値の範囲の列挙は、単に範囲内に属する各々別々の数値を個別に言及することの簡略化した方法としての役割を果たすことが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各々個別の数値は、本明細書で個別に列挙されているがごとくに本明細書に組み込まれる。
【００４７】
本明細書で述べるすべての方法は、本明細書で特に指示されない限りまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的な言語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図し、特許請求される本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に必須の特許請求されない要素を指示すると解釈されるべきではない。
【００４８】
いくつかの資料が本明細書の本文全体にわたって引用される。上記または下記で、本明細書において引用される資料の各々は（すべての特許、特許出願、学術出版物、製造者の仕様書、指示書等を包含する）、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明を理由にそのような開示に先行する権利を有さないことの承認と解釈されるべきではない。
【００４９】
本発明によれば、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって共有結合で連結された２個以上、好ましくは３個以上、好ましくは４個以上、好ましくは６個以上、好ましくは８個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１６個以上、好ましくは２１個以上、および好ましくは８、１０、２０、３０、４０または５０個まで、特に１００個までのアミノ酸を含む物質を指す。「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、大きなペプチド、好ましくは１００個を超えるアミノ酸残基を有するペプチドを指すが、一般に「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は同義語であり、本明細書では互換的に使用される。
【００５０】
本発明によれば、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に関する「修飾」という用語は、野生型ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列などの親配列と比較したペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の配列変化に関する。この用語は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体およびアミノ酸置換変異体、好ましくはアミノ酸置換変異体を包含する。本発明によるこれらの配列変化はすべて、潜在的に新しいエピトープを生成し得る。
【００５１】
アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列における１個または２個以上のアミノ酸の挿入を含む。
【００５２】
アミノ酸付加変異体は、１個以上のアミノ酸、例えば１、２、３、４または５個以上のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端融合物を含む。
【００５３】
アミノ酸欠失変異体は、配列からの１個以上のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、４または５個以上のアミノ酸の除去を特徴とする。
【００５４】
アミノ酸置換変異体は、配列中の少なくとも１個の残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されていることを特徴とする。
【００５５】
本発明によれば、本発明の方法において試験するために使用される修飾または修飾ペプチドは、修飾を含むタンパク質に由来し得る。
【００５６】
「由来する」という用語は、本発明によれば、特定の実体、特に特定のペプチド配列が、それが由来する対象物中に存在することを意味する。アミノ酸配列、特に特定の配列領域の場合、「由来する」は特に、関連アミノ酸配列が、その配列がその中に存在するアミノ酸配列から誘導されることを意味する。
【００５７】
本発明の方法において試験するために使用される修飾または修飾ペプチドが由来し得る、修飾を含むタンパク質は、ネオ抗原であり得る。
【００５８】
本発明によれば、「ネオ抗原」という用語は、親ペプチドまたはタンパク質と比較して１つ以上のアミノ酸修飾を含むペプチドまたはタンパク質に関する。例えば、ネオ抗原は腫瘍関連ネオ抗原であり得、ここで「腫瘍関連ネオ抗原」という用語は、腫瘍特異的変異に起因するアミノ酸修飾を含むペプチドまたはタンパク質を包含する。
【００５９】
本発明によれば、「腫瘍特異的変異」または「癌特異的変異」という用語は、腫瘍または癌細胞の核酸中に存在するが、対応する正常細胞、すなわち非腫瘍性または非癌性細胞の核酸中には存在しない体細胞変異に関する。「腫瘍特異的変異」および「腫瘍変異」ならびに「癌特異的変異」および「癌変異」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【００６０】
「免疫応答」という用語は、抗原などの標的に対する統合された身体応答を指し、好ましくは細胞性免疫応答または細胞性ならびに体液性免疫応答を指す。免疫応答は、保護的／防止的／予防的および／または治療的であり得る。
【００６１】
「免疫応答を誘導する」とは、誘導前は免疫応答が存在しなかったことを意味し得るが、誘導前に一定レベルの免疫応答が存在し、誘導後に前記免疫応答が増強されることも意味し得る。したがって、「免疫応答を誘導する」はまた、「免疫応答を増強する」ことも包含する。好ましくは、被験体において免疫応答を誘導した後、前記被験体が癌疾患などの疾患を発症することから保護されるか、または免疫応答を誘導することによって疾患状態が改善される。例えば、腫瘍発現抗原に対する免疫応答を、癌疾患を有する患者または癌疾患を発症する危険性がある被験体において誘導し得る。この場合免疫応答を誘導することは、被験体の疾患状態が改善されること、被験体が転移を発症しないこと、または癌疾患を発症する危険性がある被験体が癌疾患を発症しないことを意味し得る。
【００６２】
「細胞性免疫応答」および「細胞性応答」という用語または同様の用語は、「ヘルパー」または「キラー」のいずれかとして働くＴ細胞またはＴリンパ球を含む、クラスＩまたはクラスＩＩ  ＭＨＣによる抗原の提示を特徴とする細胞に対する免疫応答を指す。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも称される）は、免疫応答を調節することによって中心的な役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＴＬとも称される）は、癌細胞などの異常細胞を死滅させ、さらなる異常細胞の産生を防止する。好ましい実施形態では、本発明は、１つ以上の腫瘍発現抗原を発現し、好ましくはそのような腫瘍発現抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示する腫瘍細胞に対する抗腫瘍ＣＴＬ応答の刺激を含む。
【００６３】
本発明による「抗原」は、抗体またはＴリンパ球（Ｔ細胞）との特異的反応などの免疫応答の標的であるおよび／または免疫応答を誘導する任意の物質、好ましくはペプチドまたはタンパク質を包含する。好ましくは、抗原は、Ｔ細胞エピトープなどの少なくとも１つのエピトープを含む。好ましくは、本発明に関連して抗原は、場合によりプロセシング後に、好ましくは抗原（抗原を発現する細胞を含む）に特異的な、免疫反応を誘導する分子である。抗原またはそのＴ細胞エピトープは、ＭＨＣ分子に関連して、好ましくは細胞によって、好ましくは異常細胞、特に癌細胞を含む抗原提示細胞によって提示され、これは抗原（抗原を発現する細胞を含む）に対する免疫応答をもたらす。
【００６４】
１つの実施形態では、抗原は、腫瘍抗原（本明細書では腫瘍発現抗原とも称される）、すなわち細胞質、細胞表面または細胞核に由来し得る腫瘍細胞中で発現されるタンパク質またはペプチドなどの腫瘍細胞のパート、特に主として腫瘍細胞の細胞内にまたは表面抗原として存在するものである。例えば、腫瘍抗原には、癌胎児性抗原、α１−フェトプロテイン、イソフェリチンおよび胎児性スルホグリコプロテイン、α２−Ｈ−鉄タンパク質およびγ−フェトプロテインが含まれる。本発明によれば、腫瘍抗原は、好ましくは、腫瘍または癌においてならびに腫瘍細胞または癌細胞において発現され、場合により型および／または発現レベルに関して腫瘍または癌に特有のならびに腫瘍細胞または癌細胞に特有の任意の抗原、すなわち腫瘍関連抗原を含む。１つの実施形態では、「腫瘍関連抗原」という用語は、正常条件下では限られた数の組織および／もしくは器官中でまたは特定の発生段階で特異的に発現されるタンパク質に関し、例えば腫瘍関連抗原は、正常条件下では胃組織中、好ましくは胃粘膜中、生殖器官中、例えば精巣中、栄養膜組織中、例えば胎盤中、または生殖系列細胞中で特異的に発現され得、１つ以上の腫瘍または癌組織中で発現されるかまたは異常発現される。これに関連して、「限られた数」は、好ましくは３以下、より好ましくは２以下を意味する。本発明に関連して腫瘍抗原には、例えば分化抗原、好ましくは細胞型特異的分化抗原、すなわち正常条件下では特定の発生段階で特定の細胞型中で特異的に発現されるタンパク質、癌／精巣抗原、すなわち正常条件下では精巣中および時として胎盤中で特異的に発現されるタンパク質、ならびに生殖系列特異的抗原が含まれる。好ましくは、腫瘍抗原または腫瘍抗原の異常発現は癌細胞を同定する。本発明に関連して、被験体、例えば癌疾患に罹患している患者において癌細胞によって発現される腫瘍抗原は、好ましくは前記被験体における自己タンパク質である。好ましい実施形態では、本発明に関連して腫瘍抗原は、正常条件下では、必須ではない組織もしくは器官、すなわち免疫系によって損傷された場合に被験体の死をもたらさない組織もしくは器官中で、または免疫系によってアクセスされないもしくはほとんどアクセスされない身体の器官もしくは構造体中で特異的に発現される。
【００６５】
本発明によれば、「腫瘍抗原」、「腫瘍発現抗原」、「癌抗原」および「癌発現抗原」という用語は等価であり、本明細書では互換的に使用される。
【００６６】
「免疫原性」という用語は、好ましくは癌に対する処置などの治療処置に関連する免疫応答を誘導する相対的有効性に関する。本明細書で使用される場合、「免疫原性の」という用語は、免疫原性を有するという特性に関する。例えば、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に関連して使用される場合の「免疫原性修飾」という用語は、前記修飾によって引き起こされるおよび／または前記修飾に対する免疫応答を誘導するための前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の有効性に関する。好ましくは、非修飾ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、免疫応答を誘導しないか、異なる免疫応答を誘導するか、または異なるレベル、好ましくはより低レベルの免疫応答を誘導する。
【００６７】
「主要組織適合遺伝子複合体」という用語および「ＭＨＣ」という略語は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、すべての脊椎動物中に存在する遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質または分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞または異常細胞との間のシグナル伝達のために重要であり、ここでＭＨＣタンパク質または分子は、ペプチドと結合し、Ｔ細胞受容体による認識のためにそれらを提示する。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、細胞の表面上に発現され、自己抗原（細胞自体からのペプチドフラグメント）および非自己抗原（例えば侵入微生物のフラグメント）の両方をＴ細胞に表示する。
【００６８】
ＭＨＣ領域は、３つのサブグループ、クラスＩ、クラスＩＩおよびクラスＩＩＩに分けられる。ＭＨＣクラスＩタンパク質はα鎖およびβ２ミクログロブリン（１５番染色体によってコードされるＭＨＣのパートではない）を含む。それらは抗原フラグメントを細胞傷害性Ｔ細胞に提示する。大部分の免疫系細胞、特に抗原提示細胞上で、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質はα鎖およびβ鎖を含み、抗原フラグメントをＴヘルパー細胞に提示する。ＭＨＣクラスＩＩＩ領域は、他の免疫成分、例えば補体成分およびサイトカインをコードする一部の成分をコードする。
【００６９】
ＭＨＣは、多遺伝子性（いくつかのＭＨＣクラスＩおよびＭＨクラスＩＩ遺伝子が存在する）および多型性（各遺伝子の複数の対立遺伝子が存在する）である。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「ハプロタイプ」という用語は、１本の染色体上に認められるＨＬＡ対立遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質を指す。ハプロタイプはまた、ＭＨＣ内のいずれか１つの遺伝子座に存在する対立遺伝子も表し得る。各々のクラスのＭＨＣはいくつかの遺伝子座によって表される：例えば、クラスＩについてはＨＬＡ−Ａ（ヒト白血球抗原Ａ）、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｈ、ＨＬＡ−Ｊ、ＨＬＡ−Ｋ、ＨＬＡ−Ｌ、ＨＬＡ−ＰおよびＨＬＡ−ＶならびにクラスＩＩについてはＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１−９、ＨＬＡ−、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＨＬＡ−ＤＯＡおよびＨＬＡ−ＤＯＢ。「ＨＬＡ対立遺伝子」および「ＭＨＣ対立遺伝子」という用語は本明細書では互換的に使用される。
【００７１】
ＭＨＣは極度の多型性を示す：ヒト集団内で、各々の遺伝子座において、異なる対立遺伝子を含む非常に多くのハプロタイプが存在する。クラスＩおよびクラスＩＩの両方の、異なる多型ＭＨＣ対立遺伝子は異なるペプチド特異性を有する：各対立遺伝子は、特定の配列パターンを示すペプチドに結合するタンパク質をコードする。
【００７２】
本発明のすべての態様の１つの好ましい実施形態では、ＭＨＣ分子はＨＬＡ分子である。
【００７３】
本発明に関連して、「ＭＨＣ結合ペプチド」という用語は、ＭＨＣクラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ結合ペプチドまたはプロセシングされてＭＨＣクラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ結合ペプチドを生成することができるペプチドを含む。クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には８〜１２、好ましくは８〜１０アミノ酸長であるが、より長いまたはより短いペプチドが有効であり得る。クラスＩＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には９〜３０、好ましくは１０〜２５アミノ酸長であり、特に１３〜１８アミノ酸長であるが、より長いおよびより短いペプチドが有効であり得る。
【００７４】
ペプチドが直接、すなわちプロセシングされずに、特に切断されずに提示される場合、そのペプチドは、ＭＨＣ分子、特にクラスＩ  ＭＨＣ分子に結合するのに適した長さを有し、好ましくは７〜３０アミノ酸長、例えば７〜２０アミノ酸長、より好ましくは７〜１２アミノ酸長、より好ましくは８〜１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長である。
【００７５】
ペプチドが、付加的な配列を含むより大きな実体、例えばワクチン配列またはポリペプチドのパートであり、プロセシング後に、特に切断後に提示される場合、プロセシングによって生成されるペプチドは、ＭＨＣ分子、特にクラスＩ  ＭＨＣ分子に結合するのに適した長さを有し、好ましくは７〜３０アミノ酸長、例えば７〜２０アミノ酸長、より好ましくは７〜１２アミノ酸長、より好ましくは８〜１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長である。好ましくは、プロセシング後に提示されるペプチドの配列は、ワクチン接種のために使用される抗原またはポリペプチドのアミノ酸配列に由来し、すなわちその配列は抗原またはポリペプチドのフラグメントに実質的に対応し、好ましくは完全に同一である。
【００７６】
したがって、１つの実施形態でのＭＨＣ結合ペプチドは、抗原のフラグメントに実質的に対応し、好ましくは完全に同一である配列を含む。
【００７７】
「エピトープ」という用語は、抗原などの分子中の抗原決定基、すなわち、特にＭＨＣ分子に関連して提示された場合、免疫系によって認識される、例えばＴ細胞によって認識される分子中のパートまたは分子のフラグメントを指す。腫瘍抗原などのタンパク質のエピトープは、好ましくは前記タンパク質の連続するまたは不連続な部分を含み、好ましくは５〜１００、好ましくは５〜５０、より好ましくは８〜３０、最も好ましくは１０〜２５アミノ酸長であり、例えばエピトープは、好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５アミノ酸長であり得る。本発明に関連してエピトープはＴ細胞エピトープであることが特に好ましい。
【００７８】
本発明によれば、エピトープは、細胞の表面上のＭＨＣ分子などのＭＨＣ分子に結合することができ、したがって「ＭＨＣ結合ペプチド」であり得る。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「ネオエピトープ」という用語は、正常な非癌性細胞または生殖系列細胞などの参照物中には存在せず、癌細胞中で認められるエピトープを指す。これには、特に、正常な非癌性細胞または生殖系列細胞中で対応するエピトープが認められるが、癌細胞中の１つ以上の変異に起因してエピトープの配列がネオエピトープを生じるように変化している状況が含まれる。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、Ｔ細胞受容体によって認識される立体配置でＭＨＣ分子に結合するペプチドを指す。典型的には、Ｔ細胞エピトープは抗原提示細胞の表面上に提示される。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞エピトープを予測する」という用語は、ペプチドがＭＨＣ分子に結合して、Ｔ細胞受容体によって認識されるかどうかの予測を指す。「Ｔ細胞エピトープを予測する」という用語は、「ペプチドが免疫原性であるかどうかを予測する」という表現と基本的に同義である。
【００８２】
本発明によれば、Ｔ細胞エピトープは、１個より多いＴ細胞エピトープを含むワクチン配列および／またはポリペプチドなどのより大きな実体のパートとしてワクチン中に存在し得る。提示されるペプチドまたはＴ細胞エピトープは、適切なプロセシング後に生成される。
【００８３】
Ｔ細胞エピトープは、ＴＣＲ認識のためまたはＭＨＣへの結合のために必須ではない１つ以上の残基において修飾され得る。そのような修飾されたＴ細胞エピトープは免疫学的に等価とみなされ得る。
【００８４】
好ましくは、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣによって提示され、Ｔ細胞受容体によって認識された場合、適切な共刺激シグナルの存在下で、ペプチド／ＭＨＣ複合体を特異的に認識するＴ細胞受容体を担持するＴ細胞のクローン増殖を誘導することができる。
【００８５】
好ましくは、Ｔ細胞エピトープは、抗原のフラグメントのアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗原の前記フラグメントはＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ提示ペプチドである。
【００８６】
本発明によるＴ細胞エピトープは、好ましくは、抗原に対するまたは抗原の発現および好ましくは抗原の提示を特徴とする細胞、例えば異常細胞、特に癌細胞に対する免疫応答、好ましくは細胞性応答を刺激することができる抗原の部分またはフラグメントに関する。好ましくは、Ｔ細胞エピトープは、クラスＩ  ＭＨＣによる抗原の提示を特徴とする細胞に対する細胞性応答を刺激することができ、および好ましくは抗原応答性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を刺激することができる。
【００８７】
「抗原プロセシング」または「プロセシング」は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の、前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のフラグメントであるプロセシング産物への分解（例えばポリペプチドのペプチドへの分解）、および細胞、好ましくは抗原提示細胞による特異的Ｔ細胞への提示のためのＭＨＣ分子とこれらのフラグメントの１つ以上との会合（例えば結合による）を指す。
【００８８】
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、その細胞表面にＭＨＣ分子と会合したタンパク質抗原のペプチドフラグメントを提示する細胞である。一部のＡＰＣは抗原特異的Ｔ細胞を活性化し得る。
【００８９】
プロフェッショナル抗原提示細胞は、食作用または受容体媒介性エンドサイトーシスのいずれかによって抗原をインターナライズし、その後クラスＩＩ  ＭＨＣ分子に結合した抗原のフラグメントをその膜上に提示することにおいて非常に効率的である。Ｔ細胞は、抗原提示細胞の膜上の抗原−クラスＩＩ  ＭＨＣ分子複合体を認識し、これと相互作用する。次に、さらなる共刺激シグナルが抗原提示細胞によって生成され、Ｔ細胞の活性化をもたらす。共刺激分子の発現は、プロフェッショナル抗原提示細胞の決定的な特徴である。
【００９０】
プロフェッショナル抗原提示細胞の主な種類は、最も広範囲の抗原提示を有し、おそらく最も重要な抗原提示細胞である樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞および特定の活性化上皮細胞である。樹状細胞（ＤＣ）は、末梢組織中で捕獲された抗原を、ＭＨＣクラスＩＩおよびクラスＩの両方の抗原提示経路によってＴ細胞に提示する白血球集団である。樹状細胞が免疫応答の強力な誘導物質であり、これらの細胞の活性化が抗腫瘍免疫の誘導のために必須の工程であることは周知である。樹状細胞は、「未成熟」細胞および「成熟」細胞として好都合に分類され、２つの十分に特性付けられた表現型を区別する簡単な方法として使用することができる。しかし、この命名法は分化のすべての可能な中間段階を除外すると解釈されるべきではない。未成熟樹状細胞は、抗原の取込みおよびプロセシングのための高い能力を有する抗原提示細胞として特性付けられ、前記能力はＦｃγ受容体およびマンノース受容体の高発現と相関する。成熟表現型は、典型的にはこれらのマーカーのより低い発現を特徴とするが、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ、接着分子（例えばＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに共刺激分子（例えばＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ）などのＴ細胞活性化の責任を担う細胞表面分子の高発現も特徴とする。樹状細胞の成熟は、そのような抗原提示樹状細胞がＴ細胞のプライミングをもたらす樹状細胞活性化の状態と称されるが、未成熟樹状細胞による提示は寛容を生じさせる。樹状細胞の成熟は、主として、先天性受容体によって検出される微生物特徴を有する生体分子（細菌ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、内毒素等）、炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＦＮ）、ＣＤ４０Ｌによる樹状細胞表面上のＣＤ４０の連結、およびストレス性細胞死を受けた細胞から放出される物質によって引き起こされる。樹状細胞は、骨髄細胞をサイトカイン、例えば顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および腫瘍壊死因子αなどと共にインビトロで培養することによって誘導することができる。
【００９１】
非プロフェッショナル抗原提示細胞は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要なＭＨＣクラスＩＩタンパク質を構成的に発現しない；これらは、ＩＦＮγなどの特定のサイトカインによる非プロフェッショナル抗原提示細胞の刺激後にのみ発現される。
【００９２】
抗原提示細胞は、ペプチドまたは提示されるべきペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸、好ましくはＲＮＡ、例えばワクチン接種に使用される抗原またはポリペプチドをコードする核酸を細胞に形質導入することによってＭＨＣクラスＩ提示ペプチドを搭載することができる。
【００９３】
一部の実施形態では、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする核酸送達ビヒクルを含有する医薬組成物またはワクチンを患者に投与し、インビボで起こるトランスフェクションを生じさせ得る。樹状細胞のインビボトランスフェクションは、例えば、国際公開第９７／２４４４７号に記載されている方法またはＭａｈｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７５：４５６−４６０，１９９７によって記述されている遺伝子銃アプローチなどの当分野で公知の任意の方法を用いて一般的に実施し得る。
【００９４】
本発明によれば、「抗原提示細胞」という用語は標的細胞も包含する。
【００９５】
「標的細胞」は、細胞性免疫応答などの免疫応答の標的である細胞を意味するものとする。標的細胞は、抗原、すなわち抗原に由来するペプチドフラグメントを提示する細胞を含み、癌細胞などの任意の望ましくない細胞を含む。好ましい実施形態では、標的細胞は、本明細書で述べる抗原を発現し、および好ましくは前記抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示する細胞である。
【００９６】
「部分」という用語は画分を指す。アミノ酸配列またはタンパク質などの特定の構造体に関して、その「部分」という用語は、前記構造体の連続または不連続画分を表し得る。好ましくは、アミノ酸配列の部分は、前記アミノ酸配列のアミノ酸の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに一層好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を含む。好ましくは、部分が不連続画分である場合、前記不連続画分は構造体の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個またはそれ以上のパートから構成され、各々のパートは構造体の連続する要素である。例えば、アミノ酸配列の不連続画分は、前記アミノ酸配列の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個またはそれ以上、好ましくは４個以下のパートから構成され得、ここで各々のパートは、好ましくはアミノ酸配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸、少なくとも１０個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも２０個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも３０個の連続するアミノ酸を含む。
【００９７】
「パート」および「フラグメント」という用語は、本明細書では互換的に使用され、連続する要素を指す。例えばアミノ酸配列またはタンパク質などの構造体のパートとは、前記構造体の連続する要素を指す。構造体の部分、パートまたはフラグメントは、好ましくは前記構造体の１つ以上の機能的特性を含む。例えばエピトープ、ペプチドまたはタンパク質の部分、パートまたはフラグメントは、好ましくはそれが由来するエピトープ、ペプチドまたはタンパク質と免疫学的に等価である。本発明に関連して、アミノ酸配列などの構造体の「パート」は、構造体全体またはアミノ酸配列全体の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％を好ましくは含み、好ましくはこれらから成る。
【００９８】
本発明に関連して「免疫反応性細胞」という用語は、免疫反応の間にエフェクター機能を及ぼす細胞に関する。「免疫反応性細胞」は、好ましくは、抗原または抗原もしくはそのペプチドフラグメント（例えばＴ細胞エピトープ）の提示を特徴とする細胞に結合することができ、免疫応答を媒介することができる。例えば、そのような細胞は、サイトカインおよび／またはケモカインを分泌し、抗体を分泌し、癌性細胞を認識し、および場合によりそのような細胞を排除する。例えば、免疫反応性細胞には、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤性Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージおよび樹状細胞が含まれる。好ましくは、本発明に関連して、「免疫反応性細胞」はＴ細胞、好ましくはＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００９９】
好ましくは、「免疫反応性細胞」は、抗原またはそのペプチドフラグメントを、特にＭＨＣ分子に関連して、例えば抗原提示細胞または癌細胞などの異常細胞の表面上に提示された場合、ある程度の特異性で認識する。好ましくは、前記認識は、抗原またはそのペプチドフラグメントを認識する細胞が応答性または反応性であることを可能にする。細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ分子に関連して抗原またはそのペプチドフラグメントを認識する受容体を担持するヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）である場合、そのような応答性または反応性は、サイトカインの放出ならびに／またはＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）および／もしくはＢ細胞の活性化を含み得る。細胞がＣＴＬである場合、そのような応答性または反応性は、ＭＨＣクラスＩ分子に関連して提示される細胞、すなわちクラスＩ  ＭＨＣによる抗原の提示を特徴とする細胞の、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介性細胞溶解による排除を含み得る。本発明によれば、ＣＴＬ応答性には、持続的なカルシウム流入、細胞分裂、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生、ＣＤ４４およびＣＤ６９などの活性化マーカーの上方調節、ならびに抗原を発現する標的細胞の特異的細胞溶解性死滅が含まれ得る。ＣＴＬ応答性はまた、ＣＴＬ応答性を正確に示す人工レポーターを使用しても決定し得る。抗原または抗原フラグメントを認識し、応答性または反応性であるＣＴＬは、本明細書では「抗原応答性ＣＴＬ」とも称される。細胞がＢ細胞である場合、そのような応答性は免疫グロブリンの放出を含み得る。
【０１００】
「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」という用語は、本明細書では互換的に使用され、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）および細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を含む。
【０１０１】
Ｔ細胞は、リンパ球として公知の白血球の群に属し、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たす。それらは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれるその細胞表面上の特殊な受容体の存在によって、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞などの他のリンパ球型から区別することができる。胸腺はＴ細胞の成熟の責任を担う主要な器官である。各々が異なる機能を有する、Ｔ細胞のいくつかの異なるサブセットが発見されている。
【０１０２】
Ｔヘルパー細胞は、数ある機能の中でも特に、Ｂ細胞の形質細胞への成熟ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的過程において他の白血球を助ける。これらの細胞は、その表面にＣＤ４タンパク質を発現するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても公知である。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原と共に提示された場合に活性化する。ひとたび活性化すると、それらは速やかに分裂し、能動免疫応答を調節するかまたは助けるサイトカインと呼ばれる小さなタンパク質を分泌する。
【０１０３】
細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶反応にも関与する。これらの細胞は、その表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するので、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても公知である。これらの細胞は、身体のほぼあらゆる細胞の表面上に存在する、ＭＨＣクラスＩと会合した抗原に結合することによってその標的を認識する。
【０１０４】
Ｔ細胞の大部分は、いくつかのタンパク質の複合体として存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。実際のＴ細胞受容体は、独立したＴ細胞受容体アルファおよびベータ（ＴＣＲαおよびＴＣＲβ）遺伝子から産生される、α−ＴＣＲ鎖およびβ−ＴＣＲ鎖と呼ばれる２つの別々のペプチド鎖から成る。γδＴ細胞（ガンマデルタＴ細胞）は、その表面に異なるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の小さなサブセットである。しかし、γδＴ細胞では、ＴＣＲは１本のγ鎖と１本のδ鎖で構成される。このＴ細胞の群はαβＴ細胞よりもはるかにまれである（全Ｔ細胞の２％）。
【０１０５】
Ｔ細胞の活性化における最初のシグナルは、Ｔ細胞受容体が別の細胞上のＭＨＣによって提示された短いペプチドに結合することによって与えられる。これは、そのペプチドに特異的なＴＣＲを有するＴ細胞だけが活性化されることを確実にする。パートナー細胞は、通常はプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞であり、ナイーブ応答の場合は通常樹状細胞であるが、Ｂ細胞およびマクロファージは重要なＡＰＣであり得る。
【０１０６】
本発明によれば、分子は、標準的なアッセイにおいてあらかじめ定められた標的に有意の親和性を有し、前記あらかじめ定められた標的に結合する場合、前記あらかじめ定められた標的に結合することができる。「親和性」または「結合親和性」は、しばしば平衡解離定数（ＫＤ）によって測定される。分子は、標準的なアッセイにおいて標的に有意の親和性を有さず、前記標的に有意に結合しない場合、前記標的に（実質的に）結合することができない。
【０１０７】
細胞傷害性Ｔリンパ球は、抗原またはそのペプチドフラグメントをインビボで抗原提示細胞に組み込むことによってインビボで生成し得る。抗原またはそのペプチドフラグメントは、タンパク質として、ＤＮＡとして（例えばベクター内で）またはＲＮＡとして存在し得る。抗原は、ＭＨＣ分子のペプチドパートナーを生成するようにプロセシングされ得るが、そのフラグメントはさらなるプロセシングを必要とせずに提示され得る。特にこれらがＭＨＣ分子に結合することができる場合、後者が当てはまる。一般に、皮内注射による患者への投与が可能である。しかし、注射は、リンパ節内への結節内注射によっても実施し得る（Ｍａｌｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：３２９９−３０３）。生じる細胞は関心対象の複合体を提示し、自己細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識され、前記自己細胞傷害性Ｔリンパ球はその後増殖する。
【０１０８】
ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的活性化は様々な方法で検出し得る。特異的Ｔ細胞活性化を検出する方法には、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン（例えばリンホカイン）の産生または細胞溶解活性の発生を検出することが含まれる。ＣＤ４＋Ｔ細胞に関しては、特異的Ｔ細胞活性化を検出するための好ましい方法は、Ｔ細胞の増殖の検出である。ＣＤ８＋Ｔ細胞に関しては、特異的Ｔ細胞活性化を検出するための好ましい方法は、細胞溶解活性の発生の検出である。
【０１０９】
「抗原の提示を特徴とする細胞」または「抗原を提示する細胞」または同様の表現により、ＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩ分子に関連して、その細胞が発現する抗原または前記抗原に由来するフラグメントを、例えば抗原のプロセシングによって提示する異常細胞、例えば癌細胞、または抗原提示細胞などの細胞が意味される。同様に、「抗原の提示を特徴とする疾患」という用語は、特にクラスＩ  ＭＨＣによる、抗原の提示を特徴とする細胞を含む疾患を表す。細胞による抗原の提示は、抗原をコードするＲＮＡなどの核酸で細胞をトランスフェクトすることによって実施され得る。
【０１１０】
「提示される抗原のフラグメント」または同様の表現により、フラグメントが、例えば抗原提示細胞に直接加えられた場合、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ、好ましくはＭＨＣクラスＩによって提示され得ることが意味される。１つの実施形態では、フラグメントは、抗原を発現する細胞によって天然に提示されるフラグメントである。
【０１１１】
「免疫学的に等価」という用語は、免疫学的に等価の分子、例えば免疫学的に等価のアミノ酸配列が、例えば体液性および／もしくは細胞性免疫応答の誘導などの免疫学的作用の種類、誘導される免疫反応の強さおよび／もしくは持続期間、または誘導される免疫反応の特異性に関して、同じかもしくは基本的に同じ免疫学的特性を示すおよび／または同じかもしくは基本的に同じ免疫学的作用を及ぼすことを意味する。本発明に関連して、「免疫学的に等価」という用語は、好ましくは免疫化のために用いられるペプチドの免疫学的作用または特性に関して使用される。例えば、アミノ酸配列が被験体の免疫系に暴露されたとき参照アミノ酸配列と反応する特異性を有する免疫反応を誘導する場合、前記アミノ酸配列は参照アミノ酸配列と免疫学的に等価である。
【０１１２】
本発明に関連して「免疫エフェクター機能」という用語は、例えば腫瘍細胞の死滅、または腫瘍の播種および転移の阻害を含む腫瘍増殖の阻害および／もしくは腫瘍発生の阻害をもたらす、免疫系の成分によって媒介される任意の機能を包含する。好ましくは、本発明に関連して免疫エフェクター機能は、Ｔ細胞媒介性エフェクター機能である。そのような機能には、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）の場合は、Ｔ細胞受容体によるＭＨＣクラスＩＩ分子に関連した抗原または抗原フラグメントの認識、サイトカインの放出ならびに／またはＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）および／もしくはＢ細胞の活性化が含まれ、ＣＴＬの場合は、Ｔ細胞受容体によるＭＨＣクラスＩ分子に関連した抗原または抗原フラグメントの認識、ＭＨＣクラスＩ分子に関連して提示される細胞、すなわちクラスＩ  ＭＨＣによる抗原の提示を特徴とする細胞の、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介性細胞溶解による排除、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生ならびに抗原を発現する標的細胞の特異的細胞溶解性死滅が含まれる。
【０１１３】
本発明によれば、「スコア」という用語は、試験または検査の、通常は数字として表される結果に関する。「より良好なスコアである」または「最良のスコアである」などの用語は、試験または検査のより良好な結果または最良の結果に関する。
【０１１４】
「予測する」、「予測すること」または「予測」などの用語は、可能性の決定に関する。
【０１１５】
本発明によれば、１つ以上のＭＨＣ分子へのペプチドの結合に関するスコアを確認することは、１つ以上のＭＨＣ分子へのペプチドの結合の可能性を決定することを含む。
【０１１６】
１つ以上のＭＨＣ分子へのペプチドの結合に関するスコアは、任意のペプチド：ＭＨＣ結合予測ツールを使用することによって確認され得る。例えば、免疫エピトープデータベース分析リソース（ＩＥＤＢ−ＡＲ：ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）を使用し得る。
【０１１７】
予測は通常、ＭＨＣ分子のセット、例えばすべての可能なＭＨＣ対立遺伝子などの異なるＭＨＣ対立遺伝子のセットまたは、好ましくは本発明に従ってその免疫原性が決定されるべき修飾を有する患者において見出されるＭＨＣ対立遺伝子のセットもしくはサブセットに対して行われる。
【０１１８】
本発明によれば、１つ以上のＴ細胞受容体への、ＭＨＣ−ペプチド複合体中に存在する場合の修飾ペプチドの結合に関するスコアを確認することは、Ｔ細胞受容体への、ＭＨＣ分子との複合体中に存在する場合のペプチドの結合の可能性を決定することを含む。
【０１１９】
予測は、患者において見出されるＴ細胞受容体などの１つのＴ細胞受容体に対して、または好ましくはＴ細胞受容体のセット、例えば異なるＴ細胞受容体の未知のセットもしくは好ましくは本発明に従ってその免疫原性が決定されるべき修飾を有する患者において見出されるＴ細胞受容体のセットもしくはサブセットに対して行われ得る。
【０１２０】
さらに、予測は通常、ＭＨＣ分子のセット、例えばすべての可能なＭＨＣ対立遺伝子などの異なるＭＨＣ対立遺伝子のセットまたは、好ましくは本発明に従ってその免疫原性が決定されるべき修飾を有する患者において見出されるＭＨＣ対立遺伝子のセットもしくはサブセットに対して行われる。
【０１２１】
１つ以上のＴ細胞受容体への、ＭＨＣ−ペプチド複合体中に存在する場合の修飾ペプチドの結合に関するスコアは、（未知の）Ｔ細胞受容体レパートリーを考慮してＴ細胞受容体−ペプチド−ＭＨＣ複合体の結合への修飾の影響を評価することによって確認され得る。１つ以上のＴ細胞受容体への、ＭＨＣ−ペプチド複合体中に存在する場合の修飾ペプチドの結合に関するスコアは、一般にマッチするＴ細胞受容体に対する所与のペプチド−ＭＨＣ分子の認識の一種の代用物と定義され得る。
【０１２２】
１つ以上のＴ細胞受容体への、ＭＨＣ−ペプチド複合体中に存在する場合の修飾ペプチドの結合に関するスコアは、修飾アミノ酸と非修飾アミノ酸との間の物理化学的相違を確認することによって確認され得る。例えば、置換行列を使用し得る。そのような行列は、配列中の１個のアミノ酸が経時的に他のアミノ酸状態に変化する割合を表す。
【０１２３】
例えば進化に基づく対数オッズ行列などの対数オッズ行列を使用し得る：低い対数オッズスコアを有する置換は、高い対数オッズスコアを有する置換よりも、（未知の）Ｔ細胞受容体分子のプールからマッチするＴ細胞受容体を見出すより良好な可能性を有する（非修飾ペプチドにマッチするＴ細胞受容体の陰性選択に起因する）。しかし、このスコアを確認する他の方法がある。例えば、ペプチド中の変異の位置を検討すること（一部の位置は他の位置よりも結合に対してより少ない影響を有し得る）、置換アミノ酸に最も近い隣接アミノ酸（置換アミノ酸の二次構造に影響を及ぼし得る）を考慮に入れること、ペプチド配列全体を考慮に入れること、ＭＨＣ分子内のペプチドの完全な構造情報を考慮に入れること等。スコアを確認することはまた、例えばＮＧＳおよびＴ細胞受容体−ペプチド−ＭＨＣ複合体のドッキングシミュレーションを実施することによって、Ｔ細胞受容体レパートリー（例えば患者のＴ細胞受容体レパートリーまたはそのサブセット）を決定することも含み得る。
【０１２４】
本発明はまた、同じ修飾および／または異なる修飾を含む異なるペプチドに関して本発明の方法を実施することも含み得る。
【０１２５】
１つの実施形態における「同じ修飾を含む異なるペプチド」という用語は、修飾タンパク質の異なるフラグメントを含むまたはこれらから成るペプチドに関し、前記異なるフラグメントは、タンパク質中に存在する同じ修飾を含むが、長さおよび／または修飾の位置が異なる。タンパク質が位置ｘに修飾を有する場合、各々が前記位置ｘをカバーする前記タンパク質の異なる配列ウィンドウを含む、前記タンパク質の２つ以上のフラグメントは、同じ修飾を含む異なるペプチドとみなされる。
【０１２６】
１つの実施形態における「異なる修飾を含む異なるペプチド」という用語は、同じおよび／または異なるタンパク質の異なる修飾を含む同じおよび／または異なる長さのペプチドに関する。タンパク質が位置ｘおよびｙに修飾を有する場合、各々が位置ｘまたは位置ｙのいずれかをカバーする前記タンパク質の配列ウィンドウを含む、前記タンパク質の２つのフラグメントは、異なる修飾を含む異なるペプチドとみなされる。
【０１２７】
本発明はまた、本発明に従ってその免疫原性が決定されるべき修飾を有するタンパク質配列を、ＭＨＣ結合のための適切なペプチド長に分割することならびに同じおよび／または異なるタンパク質の同じおよび／または異なる修飾を含む異なる修飾ペプチドの１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関するスコアを確認することも含み得る。出力を順位付けることができ、前記出力は、ペプチドおよびそれらの結合の可能性を指示する予測スコアのリストを構成し得る。
【０１２８】
１つ以上のＭＨＣ分子への非修飾ペプチドの結合に関するスコアを確認する工程および／または１つ以上のＴ細胞受容体への、ＭＨＣ−ペプチド複合体中に存在する場合の修飾ペプチドの結合に関するスコアを確認する工程を、その後、同じおよび／もしくは異なる修飾を含むすべての異なる修飾ペプチド、そのサブセット、例えば１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関して最良のスコアである同じおよび／もしくは異なる修飾を含む修飾ペプチドに関して、または１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関して最良のスコアである１個の修飾ペプチドだけに関して実施し得る。
【０１２９】
前記さらなる工程後、結果を順位付けることができ、前記結果は、ペプチドおよびそれらの免疫原性である可能性を指示する予測スコアのリストを構成し得る。
【０１３０】
好ましくは、そのような順位付けにおいて、１つ以上のＭＨＣ分子への修飾ペプチドの結合に関するスコアは、１つ以上のＴ細胞受容体への、ＭＨＣ−ペプチド複合体中に存在する場合の修飾ペプチドの結合に関するスコア、好ましくは非修飾アミノ酸と修飾アミノ酸との間の化学的および物理的類似性に関するスコアよりも高く重み付けられ、ならびに１つ以上のＴ細胞受容体への、ＭＨＣ−ペプチド複合体中に存在する場合の修飾ペプチドの結合に関するスコア、好ましくは非修飾アミノ酸と修飾アミノ酸との間の化学的および物理的類似性に関するスコアは、１つ以上のＭＨＣ分子への非修飾ペプチドの結合に関するスコアよりも高く重み付けられる。
【０１３１】
本発明に従ってその免疫原性が決定されるべきアミノ酸修飾は、細胞の核酸における変異から生じ得る。そのような変異は公知の配列決定技術によって同定され得る。
【０１３２】
１つの実施形態では、変異は、腫瘍標本のゲノム、エクソームおよび／またはトランスクリプトームと非腫瘍形成性標本のゲノム、エクソームおよび／またはトランスクリプトームとの間の配列相違を同定することによって決定され得る、癌患者の腫瘍標本中の癌特異的体細胞変異である。
【０１３３】
本発明によれば、腫瘍標本は、腫瘍または癌細胞を含むまたは含むと予想される患者に由来する身体試料などの任意の試料に関する。身体試料は、血液、原発性腫瘍からもしくは腫瘍転移から得られた組織試料、または腫瘍もしくは癌細胞を含む任意の他の試料などの任意の組織試料であり得る。好ましくは、身体試料は血液であり、癌特異的体細胞変異または配列相違は、血液中に含まれる１つ以上の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）において決定される。別の実施形態では、腫瘍標本は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの１つ以上の単離された腫瘍もしくは癌細胞、または循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの１つ以上の単離された腫瘍もしくは癌細胞を含む試料に関する。
【０１３４】
非腫瘍形成性標本は、患者または、好ましくは患者と同じ種の別の個体、好ましくは腫瘍もしくは癌細胞を含まないもしくは含まないと予想される健常個体に由来する身体試料などの任意の試料に関する。身体試料は、血液または非腫瘍形成性組織からの試料などの任意の組織試料であり得る。
【０１３５】
本発明は、患者の癌変異シグネチャーの決定を含み得る。「癌変異シグネチャー」という用語は、患者の１つ以上の癌細胞中に存在するすべての癌変異を表し得るか、または患者の１つ以上の癌細胞中に存在する癌変異の一部分だけを表し得る。したがって、本発明は、患者の１つ以上の癌細胞中に存在するすべての癌特異的変異の同定を含み得るか、または患者の１つ以上の癌細胞中に存在する癌特異的変異の一部分だけの同定を含み得る。一般に、本発明の方法は、本発明の方法に含めるのに十分な数の修飾または修飾ペプチドを提供する多数の変異の同定を提供する。
【０１３６】
好ましくは、本発明に従って同定される変異は非同義変異、好ましくは腫瘍または癌細胞中で発現されるタンパク質の非同義変異である。
【０１３７】
１つの実施形態では、癌特異的体細胞変異または配列相違を、腫瘍標本のゲノム、好ましくはゲノム全体において決定する。したがって、本発明は、１つ以上の癌細胞のゲノム、好ましくはゲノム全体の癌変異シグネチャーを同定することを含み得る。１つの実施形態では、癌患者の腫瘍標本中の癌特異的体細胞変異を同定する工程は、全ゲノム癌変異プロフィールを同定することを含む。
【０１３８】
１つの実施形態では、癌特異的体細胞変異または配列相違を、腫瘍標本のエクソーム、好ましくはエクソーム全体において決定する。したがって、本発明は、１つ以上の癌細胞のエクソーム、好ましくはエクソーム全体の癌変異シグネチャーを同定することを含み得る。１つの実施形態では、癌患者の腫瘍標本中の癌特異的体細胞変異を同定する工程は、全エクソーム癌変異プロフィールを同定することを含む。
【０１３９】
１つの実施形態では、癌特異的体細胞変異または配列相違を、腫瘍標本のトランスクリプトーム、好ましくはトランスクリプトーム全体において決定する。したがって、本発明は、１つ以上の癌細胞のトランスクリプトーム、好ましくはトランスクリプトーム全体の癌変異シグネチャーを同定することを含み得る。１つの実施形態では、癌患者の腫瘍標本中の癌特異的体細胞変異を同定する工程は、全トランスクリプトーム癌変異プロフィールを同定することを含む。
【０１４０】
１つの実施形態では、癌特異的体細胞変異を同定するまたは配列相違を同定する工程は、１個以上、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはさらにそれ以上の癌細胞の単一細胞シークエンシングを含む。したがって、本発明は、前記１つ以上の癌細胞の癌変異シグネチャーを同定することを含み得る。１つの実施形態では、癌細胞は循環腫瘍細胞である。循環腫瘍細胞などの癌細胞は、単一細胞シークエンシングの前に単離し得る。
【０１４１】
１つの実施形態では、癌特異的体細胞変異を同定するまたは配列相違を同定する工程は、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を用いることを含む。
【０１４２】
１つの実施形態では、癌特異的体細胞変異を同定するまたは配列相違を同定する工程は、腫瘍標本のゲノムＤＮＡおよび／またはＲＮＡを配列決定することを含む。
【０１４３】
癌特異的体細胞変異または配列相違を明らかにするため、腫瘍標本から得られた配列情報を、好ましくは、患者または異なる個体のいずれかから入手し得る生殖系列細胞などの正常な非癌性細胞のＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸を配列決定することから得られた配列情報などの参照と比較する。１つの実施形態では、正常なゲノム生殖系列ＤＮＡは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られる。
【０１４４】
「ゲノム」という用語は、生物または細胞の染色体中の遺伝情報の総量に関する。
【０１４５】
「エクソーム」という用語は、発現される遺伝子のコード部分であるエクソンによって形成される生物のゲノムのパートを指す。エクソームは、タンパク質および他の機能的遺伝子産物の合成において使用される遺伝的青写真を提供する。これは、ゲノムの機能的に最も重要なパートであり、それゆえ、生物の表現型に寄与する可能性が最も高い。ヒトゲノムのエクソームは全ゲノムの１．５％を構成すると推定されている（Ｎｇ，ＰＣ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｇｅｎ．，４（８）：１−１５，２００８）。
【０１４６】
「トランスクリプトーム」という用語は、１個の細胞または細胞の集団において産生されるｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよび他の非コードＲＮＡを含む、すべてのＲＮＡ分子のセットに関する。本発明に関連してトランスクリプトームは、特定の時点で所与の個体の１個の細胞、細胞の集団、好ましくは癌細胞の集団、またはすべての細胞において産生されるすべてのＲＮＡ分子のセットを意味する。
【０１４７】
「核酸」は、本発明によれば、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、より好ましくはＲＮＡ、最も好ましくはインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ  ＲＮＡ）または合成ＲＮＡである。核酸には、本発明によれば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産された分子および化学合成された分子が含まれる。本発明によれば、核酸は一本鎖または二本鎖としておよび直鎖状または共有結合閉環分子として存在し得る。核酸は、本発明によれば、単離することができる。「単離された核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が、（ｉ）インビトロで、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産された、（ｉｉｉ）例えば切断およびゲル電気泳動による分離によって精製された、または（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。核酸は、細胞への導入、すなわち細胞のトランスフェクションのために、特にＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって調製することができるＲＮＡの形態で使用することができる。前記ＲＮＡは、適用の前に配列の安定化、キャッピングおよびポリアデニル化によってさらに修飾することができる。
【０１４８】
「遺伝物質」という用語は、ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかの単離された核酸、二重らせんの一部分、染色体の一部分、または生物もしくは細胞のゲノム全体、特にそのエクソームもしくはトランスクリプトームを指す。
【０１４９】
「変異」という用語は、参照と比較した核酸配列の変化または相違（ヌクレオチドの置換、付加または欠失）を指す。「体細胞変異」は、生殖細胞（精子および卵子）を除く身体のいずれの細胞においても起こり得、それゆえ子には伝わらない。これらの変化は癌または他の疾患を引き起こし得る（が、常にというわけではない）。好ましくは、変異は非同義変異である。「非同義変異」という用語は、翻訳産物中にアミノ酸置換などのアミノ酸変化を生じさせる変異、好ましくはヌクレオチド置換を指す。
【０１５０】
本発明によれば、「変異」という用語は、点突然変異、インデル、融合、クロモスリプシスおよびＲＮＡ編集を包含する。
【０１５１】
本発明によれば、「インデル」という用語は、共局在する挿入と欠失およびヌクレオチドの正味の増加または減少をもたらす変異と定義される、特殊な変異クラスを表す。ゲノムのコード領域では、インデルの長さが３の倍数でない限り、これはフレームシフト変異を生じさせる。インデルは点突然変異と対比させることができる；インデルが配列からヌクレオチドを挿入および欠失させる場合、点突然変異はヌクレオチドの１個を置き換える置換の１つの形態である。
【０１５２】
融合は、２個のそれまでは別々の遺伝子から形成されたハイブリッド遺伝子を生成することができる。これは、転座、中間部欠失または染色体逆位の結果として起こり得る。しばしば、融合遺伝子は癌遺伝子である。発癌性融合遺伝子は、２つの融合パートナーから新しいまたは異なる機能を有する遺伝子産物をもたらし得る。あるいは、癌原遺伝子が強力なプロモーターに融合し、それにより、強力なプロモーターによって引き起こされる上流の融合パートナーの上方調節によって発癌機能が作動し始める。発癌性融合転写物は、トランススプライシングまたはリードスルー事象によってももたらされ得る。
【０１５３】
本発明によれば、「クロモスリプシス」という用語は、単一の破壊事象によってゲノムの特定領域が崩壊し、その後一緒に縫合される遺伝的現象を指す。
【０１５４】
本発明によれば、「ＲＮＡ編集」または「ＲＮＡエディティング」という用語は、ＲＮＡ分子中の情報内容が塩基組成の化学的変化を介して改変される分子過程を指す。ＲＮＡエディティングには、シチジン（Ｃ）からウリジン（Ｕ）へおよびアデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への脱アミノ化、ならびに非鋳型ヌクレオチド付加および挿入などのヌクレオシド修飾が含まれる。ｍＲＮＡにおけるＲＮＡエディティングは、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を、ゲノムＤＮＡ配列によって予測されるものと異なるように有効に改変する。
【０１５５】
「癌変異シグネチャー」という用語は、非癌性参照細胞と比較した場合に癌細胞中に存在する変異のセットを指す。
【０１５６】
本発明によれば、「参照」は、腫瘍標本から本発明の方法で得られた結果を関連付け、比較するために使用し得る。典型的には、「参照」は、患者または１つ以上の異なる個体、好ましくは健常個体、特に同じ種の個体から得られた、１つ以上の正常標本、特に癌疾患に罹患していない標本に基づいて入手し得る。「参照」は、十分に多い数の正常標本を試験することによって経験的に決定することができる。
【０１５７】
変異を決定するために任意の適切なシークエンシング法を本発明に従って使用することができ、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術が好ましい。第三世代シークエンシング法は、方法のシークエンシング工程を迅速化するために将来はＮＧＳ技術に取って代わる可能性がある。明確化のために、本発明に関連して「次世代シークエンシング」または「ＮＧＳ」という用語は、サンガー化学として公知の「従来の」シークエンシング法に対して、ゲノム全体を小片に分割することによって核酸鋳型をゲノム全体に沿って並行してランダムに読み取る、すべての新規ハイスループットシークエンシング技術を意味する。そのようなＮＧＳ技術（超並列シークエンシング技術としても公知である）は、全ゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム（ゲノムのすべての転写配列）またはメチローム（ゲノムのすべてのメチル化配列）の核酸配列情報を非常に短期間、例えば１〜２週間以内、好ましくは１〜７日間以内、または最も好ましくは２４時間未満内に送達することができ、原理上は、単一細胞シークエンシングアプローチを可能にする。市販されているかまたは文献中で言及されている複数のＮＧＳプラットフォーム、例えばＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１１：Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｎ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３８（３），９５−１０９；またはＶｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００９：Ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｆｒｏｍ  ｂａｓｉｃ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｔｏ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５５，６４１−６５８に詳述されているものを本発明に関連して使用することができる。そのようなＮＧＳ技術／プラットフォームの非限定的な例は以下のものである：
１）例えば、Ｒｏｎａｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８：Ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１（５３７５），３６３−３６５に最初に記載された、Ｒｏｃｈｅ関連会社である４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）のＧＳ−ＦＬＸ  ４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（商標）において実行されるパイロシークエンス法として公知の「合成によるシークエンシング」技術。この技術は、一本鎖ＤＮＡ結合ビーズが、激しくボルテックスすることにより、エマルジョンＰＣＲ増幅のために油に取り囲まれたＰＣＲ反応物を含有する水性ミセル中に被包される、エマルジョンＰＣＲを用いる。パイロシークエンシング工程中、ポリメラーゼがＤＮＡ鎖を合成すると共に、ヌクレオチド組込みの間にリン酸分子から放出される光が記録される。
２）可逆的色素−ターミネータに基づいてＳｏｌｅｘａ（現在はＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａの一部）によって開発された、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）およびＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）において実行される「合成によるシークエンシング」アプローチ。この技術では、４つすべてのヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼと共にフローセルチャネル中のオリゴプライミングしたクラスターフラグメントに同時に添加する。架橋増幅は、シークエンシングのために４つすべての蛍光標識ヌクレオチドを有するクラスター鎖を伸長させる。
３）例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（現在はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ．Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＳＯＬｉｄ（商標）プラットフォームにおいて実行される、「ライゲーションによるシークエンシング」アプローチ。この技術では、固定された長さのすべての可能なオリゴヌクレオチドのプールを配列決定された位置に従って標識する。オリゴヌクレオチドをアニーリングし、連結する；配列をマッチさせるためのＤＮＡリガーゼによる選択的なライゲーションは、その位置のヌクレオチドの情報を与えるシグナルをもたらす。シークエンシングの前に、ＤＮＡをエマルジョンＰＣＲによって増幅する。各々が同じＤＮＡ分子のコピーだけを含有する、生じたビーズをスライドガラス上に載せる。２番目の例として、Ｄｏｖｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｌｅｍ，Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）のＰｏｌｏｎａｔｏｒ（商標）Ｇ．００７プラットフォームも、ランダムに配置したビーズに基づくエマルジョンＰＣＲを使用して並列シークエンシングのためにＤＮＡフラグメントを増幅することによる、「ライゲーションによるシークエンシング」アプローチを用いる。
４）例えばＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＰａｃＢｉｏ  ＲＳシステムまたはＨｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）のＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）プラットフォームにおいて実行される、単一分子シークエンシング技術。この技術の明らかな特徴は、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）ＤＮＡシークエンシングと定義される、単一ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を増幅せずに配列決定するその能力である。例えばＨｅｌｉＳｃｏｐｅは、各々のヌクレオチドが合成されると共にそれを直接検出する高感度蛍光検出システムを用いる。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく同様のアプローチがＶｉｓｉｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ）から開発されている。他の蛍光に基づく単一分子技術には、Ｕ．Ｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＧｅｎｅＥｎｇｉｎｅ（商標））およびＧｅｎｏｖｏｘｘ（ＡｎｙＧｅｎｅ（商標））からのものがある。
５）例えば複製中の一本鎖上のポリメラーゼ分子の動きを観測するためにチップ上に配置された様々なナノ構造体を用いる単一分子シークエンシングのためのナノ技術。ナノ技術に基づくアプローチの非限定的な例は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）のＧｒｉｄＯＮ（商標）プラットフォーム、Ｎａｂｓｙｓ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ，Ｒｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ）によって開発されたハイブリダイゼーション支援ナノポアシークエンシング（ＨＡＮＳ（商標））プラットフォーム、およびコンビナトリアルプローブアンカーライゲーション（ｃＰＡＬ（商標））と呼ばれるＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）技術を用いた、特許保護されているリガーゼに基づくＤＮＡシークエンシングプラットフォームである。
６）単一分子シークエンシングのための電子顕微鏡検査に基づく技術、例えばＬｉｇｈｔＳｐｅｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＨａｌｃｙｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって開発されたもの。
７）ＤＮＡの重合の間に放出される水素イオンの検出に基づくイオン半導体シークエンシング。例えばＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）は、この生化学的工程を超並列的に実施するために微細加工ウェルの高密度アレイを使用する。各々のウェルは異なるＤＮＡ鋳型を保持する。ウェルの下にはイオン感受性層があり、その下には特許保護されているイオンセンサーがある。
【０１５８】
好ましくは、ＤＮＡおよびＲＮＡ調製物はＮＧＳのための出発物質としての役割を果たす。そのような核酸は、生物学的物質などの試料から、例えば新鮮、急速冷凍もしくはホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織（ＦＦＰＥ）から、または新たに単離された細胞から、または患者の末梢血中に存在するＣＴＣから容易に得ることができる。正常な非変異ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡは正常な体組織から抽出することができるが、生殖系列細胞が本発明に関連して好ましい。生殖系列ＤＮＡまたはＲＮＡは、非血液学的悪性腫瘍を有する患者における末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から抽出し得る。ＦＦＰＥ組織または新鮮単離された単一細胞から抽出された核酸は高度に断片化されているが、これらはＮＧＳ適用に適する。
【０１５９】
エクソームシークエンシングのためのいくつかの標的ＮＧＳ方法が文献に記載されており（総説については、例えばＴｅｅｒ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｋｉｎ  ２０１０：Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １９（２），Ｒ１４５−５１参照）、それらのすべてが本発明と共に使用できる。これらの方法の多くは（例えばゲノム捕捉、ゲノム分配、ゲノム濃縮等として記述されている）、ハイブリダイゼーション技術を使用し、アレイに基づく（例えばＨｏｄｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７：Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３９，１５２２−１５２７）および液体に基づく（例えばＣｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６，１９０９６−１９１０１）ハイブリダイゼーションアプローチを含む。ＤＮＡ試料の調製およびその後のエクソーム捕獲のための市販のキットも入手可能である；例えばＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）は、ＴｒｕＳｅｑ（商標）ＤＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔおよびエクソーム濃縮キット、ＴｒｕＳｅｑ（商標）Ｅｘｏｍｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔを提供している。
【０１６０】
例えば腫瘍試料の配列を生殖系列試料の配列などの参照試料の配列と比較する場合、癌特異的体細胞変異または配列相違を検出する際に偽陽性所見の数を低減するために、これらの試料タイプの一方または両方のレプリケート中の配列を決定することが好ましい。したがって、生殖系列試料の配列などの参照試料の配列を２回または３回以上決定することが好ましい。あるいはまたは加えて、腫瘍試料の配列を２回または３回以上決定する。また、生殖系列試料の配列などの参照試料の配列および／または腫瘍試料の配列を、ゲノムＤＮＡ中の配列を少なくとも１回決定し、前記参照試料および／または前記腫瘍試料のＲＮＡ中の配列を少なくとも１回決定することにより、２回以上決定することも可能であり得る。例えば、生殖系列試料などの参照試料のレプリケート間の変動を決定することにより、統計的量としての体細胞変異の予想される偽陽性率（ＦＤＲ）を推定することができる。１つの試料の技術的反復は同一の結果を生じるはずであり、この「対同一物比較」において検出されるいずれの変異も偽陽性である。特に、参照試料と比較して腫瘍試料における体細胞変異検出についての偽発見率を決定するため、参照試料の技術的反復を、偽陽性の数を推定するための参照として用いることができる。さらに、様々な品質関連測定基準（例えばカバレッジまたはＳＮＰ品質）を、機械学習アプローチを用いて単一品質スコアに組み合わせ得る。所与の体性変化に関して、上回る品質スコアを有するすべての他の変化を計数することができ、これはデータセット中のすべての変化の順位付けを可能にする。
【０１６１】
本発明に関連して、「ＲＮＡ」という用語は、少なくとも１個のリボヌクレオチド残基を含み、好ましくは全面的にまたは実質的にリボヌクレオチド残基から成る分子に関する。「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。「ＲＮＡ」という用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的または完全に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、基本的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡならびに組換え生成されたＲＮＡ、例えば１個以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変化によって天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡを包含する。そのような変化には、例えばＲＮＡの末端へのまたは内部での、例えばＲＮＡの１個以上のヌクレオチドにおける、非ヌクレオチド物質の付加が含まれ得る。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドには、非標準ヌクレオチド、例えば天然には存在しないヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドも含まれ得る。これらの変化したＲＮＡは、類似体または天然に存在するＲＮＡの類似体と称され得る。
【０１６２】
本発明によれば、「ＲＮＡ」という用語は、「ｍＲＮＡ」を包含し、好ましくは「ｍＲＮＡ」に関する。「ｍＲＮＡ」という用語は「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡ鋳型を使用することによって生成され、およびペプチドまたはポリペプチドをコードする、「転写産物」に関する。典型的には、ｍＲＮＡは、５'−ＵＴＲ、タンパク質コード領域および３'−ＵＴＲを含む。ｍＲＮＡは、細胞中およびインビトロで限られた半減期しか有さない。本発明に関連して、ｍＲＮＡはＤＮＡ鋳型からインビトロ転写によって生成され得る。インビトロ転写の方法は当業者に公知である。例えば、様々なインビトロ転写キットが市販されている。
【０１６３】
本発明によれば、ＲＮＡの安定性および翻訳効率は必要に応じて改変し得る。例えば、ＲＮＡの安定化作用を有するおよび／または翻訳効率を高める１つ以上の修飾によってＲＮＡを安定化し、その翻訳を増大させ得る。そのような修飾は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＥＰ２００６／００９４４８号に記載されている。本発明に従って使用されるＲＮＡの発現を増大させるために、コード領域内、すなわち発現されるペプチドまたはタンパク質をコードする配列内で、好ましくは発現されるペプチドまたはタンパク質の配列を変化させずに、ＧＣ含量を増大させてｍＲＮＡの安定性を高め、コドン最適化を実施し、したがって細胞中での翻訳を増強するようにＲＮＡを修飾し得る。
【０１６４】
本発明で使用されるＲＮＡに関連して「修飾」という用語は、天然では前記ＲＮＡ中に存在しないＲＮＡの任意の修飾を包含する。
【０１６５】
本発明の１つの実施形態では、本発明に従って使用されるＲＮＡは、キャップされていない５'−三リン酸を有さない。そのようなキャップされていない５'−三リン酸の除去は、ＲＮＡをホスファターゼで処理することによって達成できる。
【０１６６】
本発明によるＲＮＡは、その安定性を高めるおよび／または細胞傷害性を低下させるために修飾されたリボヌクレオチドを有し得る。例えば、１つの実施形態では、本発明に従って使用されるＲＮＡ中で、シチジンを５−メチルシチジンで部分的または完全に、好ましくは完全に置換する。あるいはまたは加えて、１つの実施形態では、本発明に従って使用されるＲＮＡ中で、ウリジンをプソイドウリジンで部分的または完全に、好ましくは完全に置換する。
【０１６７】
１つの実施形態では、「修飾」という用語は、ＲＮＡに５'キャップまたは５'キャップ類似体を提供することに関する。「５'キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５'末端に認められるキャップ構造を指し、一般に独特の５'−５'三リン酸結合によってｍＲＮＡに連結されたグアノシンヌクレオチドから成る。１つの実施形態では、このグアノシンは７位でメチル化されている。「従来の５'キャップ」という用語は、天然に存在するＲＮＡの５'キャップ、好ましくは７−メチルグアノシンキャップ（ｍ７Ｇ）を指す。本発明に関連して、「５'キャップ」という用語には、ＲＮＡキャップ構造に類似し、好ましくはインビボおよび／または細胞中で、ＲＮＡに結合した場合ＲＮＡを安定化するおよび／またはＲＮＡの翻訳を増強する能力を有するように修飾されている５'キャップ類似体が含まれる。
【０１６８】
ＲＮＡに５'キャップまたは５'キャップ類似体を提供することは、前記５'キャップまたは５'キャップ類似体の存在下でのＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって達成でき、前記５'キャップを生成されたＲＮＡ鎖に同時転写によって組み込むか、または、例えばインビトロ転写によってＲＮＡを生成し、キャッピング酵素、例えばワクシニアウイルスのキャッピング酵素を用いて転写後に５'キャップをＲＮＡに結合し得る。
【０１６９】
ＲＮＡはさらなる修飾を含み得る。例えば、本発明で使用されるＲＮＡのさらなる修飾は、天然に存在するポリ（Ａ）尾部の伸長もしくは末端切断、または前記ＲＮＡのコード領域に関連しない非翻訳領域（ＵＴＲ）の導入などの５'ＵＴＲもしくは３'ＵＴＲの変化、例えばグロビン遺伝子、例えばα２グロビン、α１グロビン、βグロビン、好ましくはβグロビン、より好ましくはヒトβグロビンに由来する３'ＵＴＲの１コピー以上、好ましくは２コピーと既存の３'ＵＴＲの交換もしくは前記グロビン遺伝子由来の３'ＵＴＲの１コピー以上、好ましくは２コピーの挿入であり得る。
【０１７０】
マスクされていないポリＡ配列を有するＲＮＡは、マスクされたポリＡ配列を有するＲＮＡよりも効率的に翻訳される。「ポリ（Ａ）尾部」または「ポリＡ配列」という用語は、典型的にはＲＮＡ分子の３'末端に位置するアデニル（Ａ）残基の配列に関し、「マスクされていないポリＡ配列」は、ＲＮＡ分子の３'末端のポリＡ配列がポリＡ配列のＡで終了し、ポリＡ配列の３'末端側、すなわち下流に位置するＡ以外のヌクレオチドが後続していないことを意味する。さらに、約１２０塩基対の長いポリＡ配列は、ＲＮＡの最適な転写産物安定性および翻訳効率をもたらす。
【０１７１】
それゆえ、本発明に従って使用されるＲＮＡの安定性および／または発現を増大させるために、好ましくは１０〜５００、より好ましくは３０〜３００、さらに一層好ましくは６５〜２００、特に１００〜１５０個のアデノシン残基の長さを有するポリＡ配列と共に存在するようにＲＮＡを修飾し得る。特に好ましい実施形態では、ポリＡ配列は約１２０個のアデノシン残基の長さを有する。本発明に従って使用されるＲＮＡの安定性および／または発現をさらに増大させるために、ポリＡ配列を脱マスク化することができる。
【０１７２】
加えて、ＲＮＡ分子の３'非翻訳領域（ＵＴＲ）内への３'非翻訳領域の組込みは、翻訳効率の上昇をもたらすことができる。２つ以上のそのような３'非翻訳領域を組み込むことによって相乗効果を達成し得る。３'非翻訳領域は、それらが導入されるＲＮＡに対して自己または異種であり得る。１つの特定の実施形態では、３'非翻訳領域はヒトβグロビン遺伝子に由来する。
【０１７３】
上述した修飾、すなわちポリＡ配列の組込み、ポリＡ配列の脱マスク化および１つ以上の３'非翻訳領域の組込みの組合せは、ＲＮＡの安定性および翻訳効率の上昇に相乗的影響を及ぼす。
【０１７４】
ＲＮＡの「安定性」という用語は、ＲＮＡの「半減期」に関する。「半減期」は、分子の活性、量または数の半分を除去するのに必要な期間に関する。本発明に関連して、ＲＮＡの半減期は前記ＲＮＡの安定性の指標である。ＲＮＡの半減期は、ＲＮＡの「発現の持続期間」に影響を及ぼし得る。長い半減期を有するＲＮＡは長期間にわたって発現されると予想することができる。
【０１７５】
言うまでもなく、本発明によれば、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を低下させることが望ましい場合、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を上昇させる上述した要素の機能を妨げるようにＲＮＡを修飾することが可能である。
【０１７６】
「発現」という用語は、本発明によればその最も一般的な意味で使用され、例えば転写および／または翻訳による、ＲＮＡおよび／またはペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、特にペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の産生に関する。また、核酸の部分的発現も含む。さらに、発現は一過性または安定であり得る。
【０１７７】
本発明によれば、発現という用語には、「異所発現」または「異常発現」も含まれる。「異所発現」または「異常発現」は、本発明によれば、参照、例えば特定のタンパク質、例えば腫瘍抗原の異所または異常発現に関連する疾患を有していない被験体の状態と比較して、発現が変化している、好ましくは増大していることを意味する。発現の増大は、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％または少なくとも１００％以上の増大を指す。１つの実施形態では、発現は罹患組織においてのみ認められ、健常組織中での発現は抑制されている。
【０１７８】
「特異的に発現される」という用語は、タンパク質が基本的に特定の組織または器官中でのみ発現されることを意味する。例えば、胃粘膜中で特異的に発現される腫瘍抗原は、前記タンパク質が主として胃粘膜中で発現され、他の組織では発現されないかまたは他の組織または器官型では有意の程度に発現されないことを意味する。したがって、胃粘膜の細胞中で排他的に発現され、精巣などの他の組織では有意に低い程度に発現されるタンパク質は、胃粘膜の細胞中で特異的に発現される。一部の実施形態では、腫瘍抗原はまた、正常条件下では２以上の組織型または器官、例えば２または３の組織型または器官で、しかし好ましくは３以下の異なる組織または器官型において特異的に発現され得る。この場合、腫瘍抗原はこれらの器官中で特異的に発現される。例えば、腫瘍抗原が、正常条件下で好ましくは肺と胃においてほぼ同程度に発現される場合、前記腫瘍抗原は肺および胃において特異的に発現される。
【０１７９】
本発明に関連して、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列中の遺伝暗号がＲＮＡに転写される過程に関する。その後、ＲＮＡはタンパク質へと翻訳され得る。本発明によれば、「転写」という用語は「インビトロ転写」を含み、ここで「インビトロ転写」という用語は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが、好ましくは適切な細胞抽出物を使用して、無細胞系においてインビトロ合成される過程に関する。好ましくは、クローニングベクターを転写産物の生成に適用する。これらのクローニングベクターは一般に転写ベクターと称され、本発明によれば「ベクター」という用語に包含される。本発明によれば、本発明で使用されるＲＮＡは、好ましくはインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって入手し得る。転写を制御するためのプロモーターは、任意のＲＮＡポリメラーゼについての任意のプロモーターであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの特定の例は、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは、本発明によるインビトロ転写は、Ｔ７またはＳＰ６プロモーターによって制御される。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって入手し得る。ｃＤＮＡはＲＮＡの逆転写によって入手し得る。
【０１８０】
本発明による「翻訳」という用語は、メッセンジャーＲＮＡの鎖が、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を作製するようにアミノ酸の配列のアセンブリを指令する、細胞のリボソームにおける過程に関する。
【０１８１】
本発明によれば、核酸と機能的に連結し得る発現制御配列または調節配列は、核酸に関して同種または異種であり得る。コード配列および調節配列は、コード配列の転写または翻訳が調節配列の制御下または影響下にあるように一緒に共有結合されている場合、「機能的に」一緒に連結されている。コード配列と調節配列の機能的連結により、コード配列が機能性タンパク質に翻訳される場合、調節配列の誘導は、コード配列の読み枠シフトを引き起こすことなくまたはコード配列が所望のタンパク質もしくはペプチドに翻訳されるのを不可能にすることなく、コード配列の転写をもたらす。
【０１８２】
「発現制御配列」または「調節配列」という用語は、本発明によれば、核酸の転写または誘導されたＲＮＡの翻訳を制御する、プロモーター、リボソーム結合配列および他の制御要素を含む。本発明の特定の実施形態では、調節配列を制御することができる。調節配列の正確な構造は、種または細胞型に依存して異なり得るが、一般に転写または翻訳の開始に関与する５'非転写配列ならびに５'および３'非翻訳配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等を含む。特に、５'非転写調節配列は、機能的に結合した遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含有する。調節配列はまた、エンハンサー配列または上流活性化配列も含み得る。
【０１８３】
好ましくは、本発明によれば、細胞中で発現されるべきＲＮＡを前記細胞に導入する。本発明による方法の１つの実施形態では、細胞に導入されるべきＲＮＡは、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られる。
【０１８４】
本発明によれば、「を発現することができるＲＮＡ」および「をコードするＲＮＡ」などの用語は、本明細書では互換的に使用され、特定のペプチドまたはポリペプチドに関して、ＲＮＡが、適切な環境中に、好ましくは細胞内に存在する場合、発現されて前記ペプチドまたはポリペプチドを産生できることを意味する。好ましくは、本発明によるＲＮＡは、細胞の翻訳機構と相互作用して、ＲＮＡが発現することができるペプチドまたはポリペプチドを提供することができる。
【０１８５】
「移入する」、「導入する」または「トランスフェクトする」などの用語は、本明細書では互換的に使用され、核酸、特に外因性または異種核酸、特にＲＮＡの、細胞への導入に関する。本発明によれば、細胞は、器官、組織および／または生物のパートを形成することができる。本発明によれば、核酸の投与は、裸の核酸としてまたは投与試薬と組み合わせて達成される。好ましくは、核酸の投与は裸の核酸の形態で行われる。好ましくは、ＲＮＡは、ＲＮアーゼ阻害剤などの安定化物質と組み合わせて投与される。本発明はまた、長期間の持続的発現を可能にするために細胞への核酸の反復導入も想定する。
【０１８６】
ＲＮＡが、例えばＲＮＡと複合体を形成するかまたはＲＮＡが封入もしくは被包された小胞を形成することによって会合し、裸のＲＮＡと比較してＲＮＡの安定性の増大をもたらすことができる任意の担体を用いて細胞をトランスフェクトすることができる。本発明による有用な担体には、例えば脂質含有担体、例えばカチオン性脂質、リポソーム、特にカチオン性リポソーム、ミセル、およびナノ粒子が含まれる。カチオン性脂質は、負に荷電した核酸と複合体を形成し得る。任意のカチオン性脂質を本発明に従って使用し得る。
【０１８７】
好ましくは、ペプチドまたはポリペプチドをコードするＲＮＡの細胞への、特にインビボで存在する細胞への導入は、細胞中での前記ペプチドまたはポリペプチドの発現をもたらす。特定の実施形態では、特定の細胞への核酸の標的化が好ましい。そのような実施形態では、細胞への核酸の投与に適用される担体（例えばレトロウイルスまたはリポソーム）は標的化分子を示す。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体または標的細胞上の受容体のリガンドなどの分子を、核酸担体中に組み込み得るかまたは核酸担体に結合し得る。核酸をリポソームによって投与する場合は、標的化および／または取り込みを可能にするために、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質をリポソーム製剤に組み込み得る。そのようなタンパク質は、特定の細胞型に特異的なキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、インターナライズされるタンパク質に対する抗体、細胞内の位置を標的とするタンパク質等を包含する。
【０１８８】
「細胞」または「宿主細胞」という用語は、好ましくは無傷の細胞、すなわち酵素、細胞小器官または遺伝物質などのその正常な細胞内成分が放出されていない無傷の膜を有する細胞である。無傷の細胞は、好ましくは生存可能な細胞、すなわちその正常な代謝機能を果たすことができる生細胞である。好ましくは、前記用語は、本発明によれば外因性核酸で形質転換またはトランスフェクトすることができる任意の細胞に関する。「細胞」という用語は、本発明によれば原核細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））または真核細胞（例えば樹状細胞、Ｂ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｋ５６２細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＬＡ細胞、酵母細胞および昆虫細胞）を包含する。外因性核酸は、細胞の内部で（ｉ）それ自体で自由に分散して、（ｉｉ）組換えベクターに組み込まれて、または（ｉｉｉ）宿主細胞ゲノムまたはミトコンドリアＤＮＡに組み入れられて見出され得る。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギおよび霊長動物由来の細胞などの哺乳動物細胞が特に好ましい。細胞は多くの組織型に由来してよく、初代細胞および細胞株を包含する。具体的な例には、ケラチノサイト、末梢血白血球、骨髄幹細胞および胚性幹細胞が含まれる。さらなる実施形態では、細胞は抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである。
【０１８９】
核酸分子を含む細胞は、好ましくは前記核酸によってコードされるペプチドまたはポリペプチドを発現する。
【０１９０】
「クローン増殖」という用語は、特定の実体が増加する過程を指す。本発明に関連して、この用語は、好ましくは、リンパ球が抗原によって刺激され、増殖して、前記抗原を認識する特定のリンパ球が増幅される免疫応答に関連して使用される。好ましくは、クローン増殖はリンパ球の分化をもたらす。
【０１９１】
「低減する」または「阻害する」などの用語は、レベルの全体的な低下、好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上のレベルの全体的な低下を生じさせる能力に関する。「阻害する」または同様の表現は、完全なまたは基本的に完全な阻害、すなわちゼロへのまたは基本的にゼロへの低減を包含する。
【０１９２】
「増大させる」、「増強する」、「促進する」または「延長する」などの用語は、好ましくは、およそ少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも１００％、好ましくは少なくとも２００％、特に少なくとも３００％の増大、増強、促進または延長に関する。これらの用語はまた、ゼロからまたは測定不能もしくは検出不能のレベルからゼロを上回るレベルまたは測定可能もしくは検出可能なレベルへの増大、増強、促進または延長にも関し得る。
【０１９３】
本発明は、本発明の方法によって免疫原性であると予測されたアミノ酸修飾または修飾ペプチドに基づいて設計された癌ワクチンなどのワクチンを提供する。
【０１９４】
本発明によれば、「ワクチン」という用語は、投与時に、病原体または癌細胞などの異常細胞を認識し、攻撃する免疫応答、特に細胞性免疫応答を誘導する医薬調製物（医薬組成物）または生成物に関する。ワクチンは、疾患の予防または治療のために使用し得る。「個別化癌ワクチン」または「個体に合わせた癌ワクチン」という用語は、特定の癌患者に関し、癌ワクチンが個々の癌患者の必要性または特有の状況に適合されていることを意味する。
【０１９５】
１つの実施形態では、本発明に従って提供されるワクチンは、本発明の方法によって免疫原性であると予測された１つ以上のアミノ酸修飾もしくは１つ以上の修飾ペプチドを含むペプチドもしくはポリペプチド、または前記ペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸、好ましくはＲＮＡを含有し得る。
【０１９６】
本発明に従って提供される癌ワクチンは、患者に投与された場合、患者の腫瘍に特異的なＴ細胞を刺激する、プライミングするおよび／または増殖させるのに適した１つ以上のＴ細胞エピトープを提供する。Ｔ細胞は、好ましくはＴ細胞エピトープが由来する抗原を発現する細胞に対するものである。したがって、本明細書で述べるワクチンは、好ましくは、クラスＩ  ＭＨＣによる１つ以上の腫瘍関連ネオ抗原の提示を特徴とする癌疾患に対する細胞性応答、好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞活性を誘導するまたは促進することができる。本発明に従って提供されるワクチンは癌特異的変異を標的とするので、患者の腫瘍に特異的である。
【０１９７】
本発明に従って提供されるワクチンは、患者に投与された場合、好ましくは、本発明の方法によって免疫原性であると予測されたアミノ酸修飾または修飾ペプチドを組み込んだ、１個以上のＴ細胞エピトープ、例えば２個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上および好ましくは６０個まで、５５個まで、５０個まで、４５個まで、４０個まで、３５個までまたは３０個までのＴ細胞エピトープを提供するワクチンに関する。そのようなＴ細胞エピトープは、本明細書では「ネオエピトープ」とも称される。患者の細胞、特に抗原提示細胞によるこれらのエピトープの提示は、好ましくは、ＭＨＣに結合した場合エピトープを標的とする、したがって、Ｔ細胞エピトープが由来する抗原を発現し、腫瘍細胞の表面に同じエピトープを提示する患者の腫瘍、好ましくは原発性腫瘍ならびに腫瘍転移を標的とするＴ細胞を生じさせる。
【０１９８】
本発明の方法は、癌ワクチン接種のための同定されたアミノ酸修飾または修飾ペプチドの有用性を決定するさらなる工程を含み得る。したがってさらなる工程は、以下の１つ以上を含み得る：（ｉ）修飾が公知のまたは予測されるＭＨＣ提示エピトープ中に位置するかどうかを評価すること、（ｉｉ）修飾がＭＨＣ提示エピトープ中に位置するかどうかをインビトロおよび／またはインシリコで試験すること、例えば修飾がＭＨＣ提示エピトープへとプロセシングされるおよび／またはＭＨＣ提示エピトープとして提示されるペプチド配列のパートであるかどうかを試験すること、ならびに（ｉｉｉ）想定される修飾エピトープが、特にそれらの天然配列状況で存在する場合、例えば天然に存在するタンパク質中でも前記エピトープに隣接するアミノ酸配列に隣接している場合、および抗原提示細胞中で発現された場合、Ｔ細胞、例えば所望の特異性を有する患者のＴ細胞を刺激することができるかどうかをインビトロで試験すること。そのような隣接配列は各々、３個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上および好ましくは５０個まで、４５個まで、４０個まで、３５個までまたは３０個までのアミノ酸を含んでよく、Ｎ末端および／またはＣ末端でエピトープ配列に隣接し得る。
【０１９９】
本発明に従って決定された修飾ペプチドを、癌ワクチン接種のためのエピトープとしてのそれらの有用性に関して順位付けし得る。したがって、１つの態様では、本発明の方法は、同定された修飾ペプチドを、提供されるべきそれぞれのワクチン中でのそれらの有用性に関して分析し、選択する手動またはコンピュータに基づく分析処理を含む。好ましい実施形態では、前記分析処理はコンピュータアルゴリズムに基づく処理である。好ましくは、前記分析処理は、エピトープを、免疫原性であるそれらの能力の予測に従って決定するおよび／または順位付けることを含む。
【０２００】
本発明に従って同定され、本発明のワクチンによって提供されるネオエピトープは、好ましくは、ポリエピトープポリペプチドなどの前記ネオエピトープを含むポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸、特にＲＮＡの形態で存在する。さらに、ネオエピトープは、ワクチン配列の形態でポリペプチド中に存在し得る、すなわちそれらの天然配列状況で、例えば天然に存在するタンパク質中でも前記エピトープに隣接するアミノ酸配列に隣接して存在し得る。そのような隣接配列は各々、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上および好ましくは５０個まで、４５個まで、４０個まで、３５個までまたは３０個までのアミノ酸を含んでよく、Ｎ末端および／またはＣ末端でエピトープ配列に隣接し得る。したがって、ワクチン配列は、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上および好ましくは５０個まで、４５個まで、４０個まで、３５個までまたは３０個までのアミノ酸を含み得る。１つの実施形態では、ネオエピトープおよび／またはワクチン配列は、ポリペプチド中で頭部から尾部の方向に並んでいる。
【０２０１】
１つの実施形態では、ネオエピトープおよび／またはワクチン配列は、リンカー、特に中性リンカーによって分けられている。本発明による「リンカー」という用語は、エピトープまたはワクチン配列などの２つのペプチドドメインの間に、前記ペプチドドメインを連結するために付加されたペプチドに関する。リンカー配列に関して特に制限はない。しかし、リンカー配列は、２つのペプチドドメイン間の立体障害を低減し、良好に翻訳され、エピトープのプロセシングを支持するまたは許容することが好ましい。さらに、リンカーは免疫原性配列要素を全く有していないかまたはわずかしか有するべきではない。リンカーは、好ましくは、望ましくない免疫反応を生じさせ得る、隣接ネオエピトープ間の接合部縫合から生じるもののような非内因性ネオエピトープを生成するべきではない。それゆえ、ポリエピトープワクチンは、好ましくは、望ましくないＭＨＣ結合性接合エピトープの数を低減することができるリンカー配列を含むべきである。Ｈｏｙｔ  ｅｔ  ａｌ．（ＥＭＢＯ  Ｊ．２５（８），１７２０−９，２００６）およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（１０），８６３５−４１，２００４）は、グリシンリッチ配列がプロテアソームプロセシングを妨げ、したがってグリシンリッチリンカー配列の使用は、プロテアソームによってプロセシングされ得るリンカーに含まれるペプチドの数を最小限に抑えるように働くことを示した。さらに、グリシンは、ＭＨＣ結合溝位置における強力な結合を阻害することが観察された（Ａｂａｓｔａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１（７），３５６９−７５，１９９３）。Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，６１（１），１１５−２６，２００５）は、アミノ酸配列中に含まれるアミノ酸グリシンおよびセリンが、より効率的に翻訳され、プロテアソームによってプロセシングされて、コードされるネオエピトープへのより良好なアクセスを可能にする、より柔軟性のあるタンパク質をもたらすことを見出した。リンカーは各々、３個以上、６個以上、９個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上および好ましくは５０個まで、４５個まで、４０個まで、３５個までまたは３０個までのアミノ酸を含み得る。好ましくは、リンカーはグリシンおよび／またはセリンアミノ酸が富化されている。好ましくは、リンカーのアミノ酸の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％はグリシンおよび／またはセリンである。１つの好ましい実施形態では、リンカーは実質的にアミノ酸グリシンおよびセリンから成る。１つの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＳ）ａ（ＧＳＳ）ｂ（ＧＧＧ）ｃ（ＳＳＧ）ｄ（ＧＳＧ）ｅを含み、ここでａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅは、独立して０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０から選択される数であり、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅは０ではなく、好ましくは２以上、３以上、４以上または５以上である。１つの実施形態では、リンカーは、配列ＧＧＳＧＧＧＧＳＧなどの実施例に記載するリンカー配列を含む、本明細書で述べる配列を含む。
【０２０２】
１つの特に好ましい実施形態では、本発明によるポリエピトープポリペプチドなどの、１つ以上のネオエピトープを組み込んだポリペプチドを、抗原提示細胞などの患者の細胞中で発現されてポリペプチドを生成し得る核酸、好ましくはＲＮＡ、例えばインビトロ転写ＲＮＡまたは合成ＲＮＡの形態で患者に投与する。本発明はまた、本発明の目的上「ポリエピトープポリペプチド」という用語に含まれる１つ以上のマルチエピトープポリペプチドを、抗原提示細胞などの患者の細胞中で発現されて１つ以上のポリペプチドを生成し得る核酸、好ましくはＲＮＡ、例えばインビトロ転写ＲＮＡまたは合成ＲＮＡの形態で投与することも想定する。１つより多いマルチエピトープポリペプチドの投与の場合、異なるマルチエピトープポリペプチドによって提供されるネオエピトープは、異なっていてもよくまたは部分的に重複していてもよい。ひとたび抗原提示細胞などの患者の細胞中に存在すると、本発明によるポリペプチドはプロセシングされて、本発明に従って同定されるネオエピトープを生成する。本発明に従って提供されるワクチンの投与は、ＭＨＣ提示エピトープが由来する抗原を発現する細胞に対してＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答を誘発することができる、ＭＨＣクラスＩＩ提示エピトープを提供し得る。あるいはまたは加えて、本発明に従って提供されるワクチンの投与は、ＭＨＣ提示エピトープが由来する抗原を発現する細胞に対してＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することができる、ＭＨＣクラスＩ提示エピトープを提供し得る。さらに、本発明に従って提供されるワクチンの投与は、１つ以上のネオエピトープ（公知のネオエピトープおよび本発明に従って同定されるネオエピトープを含む）、ならびに癌特異的体細胞変異を含まないが、癌細胞によって発現され、好ましくは癌細胞に対する免疫応答、好ましくは癌特異的免疫応答を誘導する１つ以上のエピトープを提供し得る。１つの実施形態では、本発明に従って提供されるワクチンの投与は、ＭＨＣクラスＩＩ提示エピトープであるおよび／またはＭＨＣ提示エピトープが由来する抗原を発現する細胞に対してＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答を誘発することができるネオエピトープ、ならびにＭＨＣクラスＩ提示エピトープであるおよび／またはＭＨＣ提示エピトープが由来する抗原を発現する細胞に対してＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することができる、癌特異的体細胞変異を含まないエピトープを提供する。１つの実施形態では、癌特異的体細胞変異を含まないエピトープは腫瘍抗原に由来する。１つの実施形態では、ネオエピトープおよび癌特異的体細胞変異を含まないエピトープは、癌の治療において相乗効果を及ぼす。好ましくは、本発明に従って提供されるワクチンは、細胞傷害性応答および／またはヘルパーＴ細胞応答のポリエピトープ刺激のために有用である。
【０２０３】
本明細書に従って提供されるワクチンは組換えワクチンであり得る。
【０２０４】
本発明に関連して「組換え」という用語は、「遺伝子操作を通して作製された」ことを意味する。好ましくは、本発明に関連して組換えポリペプチドなどの「組換え実体」は、天然には存在せず、および好ましくは自然界では組み合わされないアミノ酸配列または核酸配列などの実体の組合せの結果である。例えば、本発明に関連して組換えポリペプチドは、ネオエピトープまたは、例えばペプチド結合もしくは適切なリンカーによって一緒に融合された異なるタンパク質もしくは同じタンパク質の異なる部分に由来するワクチン配列などの、いくつかのアミノ酸配列を含み得る。
【０２０５】
本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、ある物体が自然界で見出すことができるという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、天然源から単離することができ、実験室内で人の手によって意図的に改変されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在する。
【０２０６】
本明細書で述べる作用物質、組成物および方法は、疾患、例えば抗原を発現し、そのフラグメントを提示する異常細胞の存在を特徴とする疾患を有する被験体を治療するために使用することができる。特に好ましい疾患は癌疾患である。本明細書で述べる作用物質、組成物および方法はまた、本明細書で述べる疾患を防止する免疫化またはワクチン接種のためにも使用し得る。
【０２０７】
本発明によれば、「疾患」という用語は、癌疾患、特に本明細書で述べる癌疾患の形態を含む、任意の病的状態を指す。
【０２０８】
「正常な」という用語は、健常な状態または健常な被験体または組織における状況、すなわち非病的状況を指し、ここで「健常な」は、好ましくは非癌性を意味する。
【０２０９】
「抗原を発現する細胞を含む疾患」は、本発明によれば、罹患組織または器官の細胞における抗原の発現が検出されることを意味する。罹患組織または器官の細胞における発現は、健常組織または器官における状態と比較して増大し得る。増大とは、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも１００００％またはさらにそれ以上の増大を指す。１つの実施形態では、発現は罹患組織においてのみ認められ、健常組織中での発現は抑制されている。本発明によれば、抗原を発現する細胞を含むまたは抗原を発現する細胞に関連する疾患には、癌疾患が含まれる。
【０２１０】
本発明によれば、「腫瘍」または「腫瘍疾患」という用語は、好ましくは腫脹または病変を形成する細胞（新生細胞、腫瘍形成性細胞または腫瘍細胞と呼ばれる）の異常増殖を指す。「腫瘍細胞」とは、急速で制御されない細胞増殖によって成長し、新たな成長を開始させた刺激が停止した後も成長し続ける異常細胞を意味する。腫瘍は、構造機構および正常組織との機能的協調の部分的または完全な欠如を示し、通常、良性、前悪性または悪性のいずれかであり得る、明確な組織塊を形成する。
【０２１１】
癌（医学用語：悪性新生物）は、一群の細胞が制御されない成長（正常限界を超えた分裂）、浸潤（隣接する組織への侵入およびその破壊）ならびに時として転移（リンパまたは血液を介した身体の他の場所への拡大）を示す疾患のクラスである。癌のこれら３つの悪性特性により、自己限定性で、浸潤しないまたは転移しない良性腫瘍とは区別される。大部分の癌は腫瘍を形成するが、白血病のような一部の癌は腫瘍を形成しない。悪性疾患、悪性新生物および悪性腫瘍は基本的に癌と同義である。
【０２１２】
新生物は、新形成の結果としての異常な組織塊である。新形成（ギリシャ語で新たな成長の意）は細胞の異常増殖である。細胞の成長は、その周囲の正常組織の成長を上回り、それらの組織と協調しない。成長は、刺激の停止後も同じ過剰な方法で持続する。これは通常、しこりまたは腫瘍を引き起こす。新生物は良性、前悪性または悪性であり得る。
【０２１３】
本発明による「腫瘍の成長」または「腫瘍成長」は、腫瘍がその大きさを増大する傾向および／または腫瘍細胞が増殖する傾向に関する。
【０２１４】
本発明の目的上、「癌」および「癌疾患」という用語は、「腫瘍」および「腫瘍疾患」という用語と互換的に使用される。
【０２１５】
癌は、腫瘍に類似する細胞の種類によって、それゆえその腫瘍の起源であると推定される組織によって分類される。これらは、それぞれ組織学および場所である。
【０２１６】
本発明による「癌」という用語は、癌腫、腺癌、芽細胞腫、白血病、セミノーマ、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎癌、副腎癌、甲状腺癌、血液癌、皮膚癌、脳の癌、子宮頸癌、腸癌、肝癌、結腸癌、胃癌、腸癌、頭頸部癌、胃腸の癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵癌、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌および肺癌ならびにそれらの転移を含む。その例は、肺癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、結腸癌腫、腎細胞癌腫、子宮頸癌腫または上記で述べた癌型または腫瘍の転移である。本発明による癌という用語は、癌転移および癌の再発も含む。
【０２１７】
「転移」とは、そのもとの部位から身体の別の部分への癌細胞の拡大を意味する。転移の形成は非常に複雑な過程であり、原発性腫瘍からの悪性細胞の分離、細胞外マトリックスの侵襲、体腔および脈管に侵入するための内皮基底膜の貫入、ならびに次に、血液によって運ばれた後、標的器官の浸潤に依存する。最後に、標的部位における新たな腫瘍、すなわち二次性腫瘍または転移性腫瘍の成長は、血管新生に依存する。腫瘍転移はしばしば原発性腫瘍の除去後でも起こり、これは、腫瘍細胞または腫瘍成分が残存し、転移能を発現し得るからである。１つの実施形態では、本発明による「転移」という用語は「遠隔転移」に関し、これは原発性腫瘍および所属リンパ節系から遠く離れた転移に関する。
【０２１８】
二次性または転移性腫瘍の細胞はもとの腫瘍における細胞に類似する。これは、例えば、卵巣癌が肝臓に転移した場合、二次性腫瘍は異常な肝細胞ではなく異常な卵巣細胞で構成されることを意味する。肝臓における腫瘍は、その場合、肝癌ではなく転移性卵巣癌と呼ばれる。
【０２１９】
「循環腫瘍細胞」または「ＣＴＣ」という用語は、原発性腫瘍または腫瘍転移から離れて、血流中を循環している細胞に関する。ＣＴＣは、異なる組織におけるさらなる腫瘍（転移）のその後の成長のための種を構成し得る。循環腫瘍細胞は、転移性疾患を有する患者において全血１ｍＬ当たりほぼ１〜１０個程度のＣＴＣという頻度で認められる。ＣＴＣを単離するための検査方法が開発されている。ＣＴＣを単離するためのいくつかの検査方法が当分野で記述されており、例えば上皮細胞が、正常な血球中には存在しない細胞接着タンパク質ＥｐＣＡＭを一般的に発現するという事実を利用する技術がある。免疫磁気ビーズに基づく捕獲法は、磁性粒子と結合したＥｐＣＡＭに対する抗体で血液標本を処理し、続いて磁場で標識細胞を分離することを含む。次に単離された細胞を、まれなＣＴＣを混入白血球から識別するために、もう１つの上皮マーカーであるサイトケラチンならびに共通の白血球マーカーＣＤ４５に対する抗体で染色する。この堅固で半自動化されたアプローチは、約１個のＣＴＣ／ｍＬの平均収率および０．１％の純度でＣＴＣを同定する（Ａｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４：Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０，６８９７−６９０４）。ＣＴＣを単離するための２番目の方法は、マイクロフルイディクスに基づくＣＴＣ捕獲装置を使用し、これは、ＥｐＣＡＭに対する抗体で被覆することによって機能性にした８０，０００個のマイクロスポットを包埋したチャンバーを通して全血を流すことを含む。次にＣＴＣをサイトケラチンまたは組織特異的マーカー、例えば前立腺癌におけるＰＳＡまたは乳癌におけるＨＥＲ２に対する二次抗体で染色し、三次元座標に沿った複数の平面でのマイクロスポットの自動走査によって視覚化する。ＣＴＣチップは、患者において５０細胞／ｍｌの平均収率および１〜８０％の範囲の純度でサイトケラチン陽性循環腫瘍細胞を同定することができる（Ｎａｇｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７：Ｎａｔｕｒｅ  ４５０，１２３５−１２３９）。ＣＴＣを単離するための別の可能性は、Ｖｅｒｉｄｅｘ，ＬＬＣ（Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）からのＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（商標）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ（ＣＴＣ）Ｔｅｓｔを使用することであり、これは血液チューブ中でＣＴＣを捕獲し、同定し、計数する。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（商標）システムは、全血中のＣＴＣの計数のための米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された方法であり、免疫磁気標識と自動デジタル顕微鏡検査の組合せに基づく。その他にも文献中で記述されているＣＴＣを単離するための方法があり、そのすべてが本発明と共に使用できる。
【０２２０】
再発または回帰は、人が過去に罹患した状態に再び罹患する場合に起こる。例えば、患者が腫瘍疾患に罹患したことがあり、前記疾患の治療を受けて成功したが、前記疾患を再び発症した場合、前記新たに発症した疾患は再発または回帰とみなされ得る。しかし、本発明によれば、腫瘍疾患の再発または回帰は、もとの腫瘍疾患の部位でも起こり得るが、必ずしもそうとは限らない。したがって、例えば、患者が卵巣腫瘍に罹患し、治療を受けて成功したことがある場合、再発または回帰は、卵巣腫瘍の発生または卵巣とは異なる部位における腫瘍の発生であり得る。腫瘍の再発または回帰は、腫瘍がもとの腫瘍の部位とは異なる部位で起こる状況ならびにもとの腫瘍の部位で起こる状況も含む。好ましくは、患者が治療を受けたことがあるもとの腫瘍は原発性腫瘍であり、もとの腫瘍の部位とは異なる部位における腫瘍は二次性または転移性腫瘍である。
【０２２１】
「治療する」とは、被験体において腫瘍の大きさもしくは腫瘍の数を低減することを含む、疾患を予防するもしくは排除するため；被験体において疾患を停止させるもしくは疾患の進行を遅らせるため；被験体において新たな疾患の発症を阻害するもしくは遅らせるため；現在疾患を有しているもしくは以前に疾患を有していたことがある被験体において症状および／もしくは再発の頻度もしくは重症度を低下させるため；ならびに／または被験体の生存期間を延長させる、すなわち増大させるために、本明細書で述べる化合物または組成物を被験体に投与することを意味する。特に、「疾患の治療」という用語は、疾患またはその症状を治癒する、期間を短縮する、改善する、予防する、進行もしくは悪化を減速させるもしくは阻害する、または疾患もしくはその症状の発症を予防するもしくは遅延させることを含む。
【０２２２】
「危険性がある」とは、一般集団と比較して、疾患、特に癌を発症する可能性が通常より高いと同定される被験体、すなわち患者を意味する。加えて、疾患、特に癌を有していたことがあるまたは現在有している被験体は、そのような被験体は引き続き疾患を発症する可能性があるので、疾患を発症する危険性が高い被験体である。現在癌を有しているまたは癌を有していたことがある被験体は、癌転移の危険性も高い。
【０２２３】
「免疫療法」という用語は、特異的免疫反応の活性化を含む治療に関する。本発明に関連して、「防御する」、「予防する」、「予防的」、「防止的」または「保護的」などの用語は、被験体における疾患の発症および／または伝播の予防または治療またはその両方、特に被験体が疾患を発症する可能性を最小限に抑えることまたは疾患の発症を遅延させることに関する。例えば、上述したように、腫瘍の危険性がある人は、腫瘍を予防する療法の候補である。
【０２２４】
免疫療法の予防的投与、例えば本発明のワクチンの予防的投与は、好ましくは受容者を疾患の発症から保護する。免疫療法の治療的投与、例えば本発明のワクチンの治療的投与は、疾患の進行／成長の阻害をもたらし得る。これは、好ましくは疾患の排除をもたらす、疾患の進行／成長の減速、特に疾患の進行の停止を含む。
【０２２５】
免疫療法は、本明細書で提供される作用物質が患者から異常細胞を除去するように機能する、様々な技術のいずれかを用いて実施し得る。そのような除去は、抗原または抗原を発現する細胞に特異的な、患者における免疫応答を増強するまたは誘導することの結果として起こり得る。
【０２２６】
特定の実施形態の中で、免疫療法は能動免疫療法であり得、この場合の治療は、免疫応答調節物質（本明細書で提供されるポリペプチドおよび核酸など）の投与による、異常細胞に対して反応する内因性宿主免疫系のインビボ刺激に基づく。
【０２２７】
本明細書で提供される作用物質および組成物は、単独でまたは従来の治療レジメン、例えば手術、放射線、化学療法および／もしくは骨髄移植（自家、同系、同種異系もしくは無関係）と組み合わせて使用し得る。
【０２２８】
「免疫」または「ワクチン接種」という用語は、治療的または予防的理由から免疫応答を誘導することを目的として被験体を治療する過程を表す。
【０２２９】
「インビボ」という用語は、被験体における状況に関する。
【０２３０】
「被験体」、「個体」、「生物」または「患者」という用語は互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物に関する。例えば、本発明に関連して哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長動物、家畜、例えばイヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ等、実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット等、ならびに動物園の動物などの捕らわれている動物である。本明細書で使用される「動物」という用語はヒトも含む。「被験体」という用語は、患者、すなわち動物、好ましくは疾患を有するヒト、好ましくは本明細書で述べる疾患を有するヒトも含み得る。
【０２３１】
「自家」という用語は、同じ被験体に由来するものを表すために使用される。例えば「自家移植」は、同じ被験体に由来する組織または器官の移植を指す。そのような手順は、さもなければ拒絶反応をもたらす免疫学的障壁を乗り越えるので、好都合である。
【０２３２】
「異種」という用語は、複数の異なる要素から成るものを表すために使用される。一例として、ある個体の骨髄の異なる個体への移入は異種移植を構成する。異種遺伝子は、その被験体以外の供給源に由来する遺伝子である。
【０２３３】
免疫またはワクチン接種のための組成物のパートとして、好ましくは本明細書で述べる１つ以上の作用物質を、免疫応答を誘導するためまたは免疫応答を増大させるために１つ以上のアジュバントと共に投与する。「アジュバント」という用語は、免疫応答を延長するまたは増強するまたは促進する化合物に関する。本発明の組成物は、好ましくはアジュバントの添加なしでその作用を及ぼす。それでもやはり、本出願の組成物は任意の公知のアジュバントを含有し得る。アジュバントには、油性エマルジョン（例えばフロイントアジュバント）、無機化合物（ミョウバンなど）、細菌生成物（百日咳菌毒素など）、リポソームおよび免疫刺激性複合体などの不均一な群の化合物が含まれる。アジュバントの例は、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ  ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、サポニン、例えばＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、ＤＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ；国際公開第９６／３３７３９号）、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８およびＱＳ−Ｌ１（Ｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ  ７：１７８−１８６）、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、ビタミンＥ、モンタニド、ミョウバン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｋｒｉｅｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６−５４９）、ならびにスクアレンおよび／またはトコフェロールなどの生分解性油から調製される様々な油中水型エマルジョンである。
【０２３４】
患者の免疫応答を刺激する他の物質も投与し得る。例えばサイトカインを、それらのリンパ球への調節特性により、ワクチン接種において使用することが可能である。そのようなサイトカインには、例えば、ワクチンの防御作用を増大することが示された（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１４３２−１４３４，１９９５参照）インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１８が含まれる。
【０２３５】
免疫応答を増強し、それゆえワクチン接種において使用し得る多くの化合物がある。前記化合物には、Ｂ７−１およびＢ７−２（それぞれＣＤ８０およびＣＤ８６）などのタンパク質または核酸の形態で提供される共刺激分子が含まれる。
【０２３６】
本発明によれば、身体試料は、体液を含む組織試料および／または細胞試料であり得る。そのような身体試料は従来の方法で、例えばパンチ生検を含む組織生検によって、および血液、気管支吸引物、痰、尿、糞便または他の体液を採取することによって入手し得る。本発明によれば、「試料」という用語は、生物学的試料の分画または単離物、例えば核酸または細胞単離物などの加工された試料も包含する。
【０２３７】
本明細書で述べるワクチンおよび組成物などの作用物質は、注射または注入を含む、任意の従来の経路によって投与し得る。投与は、例えば経口的、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下的または経皮的に実施し得る。１つの実施形態では、投与は、リンパ節への注射などによって節内に実施する。他の形態の投与は、本明細書で述べる核酸による樹状細胞などの抗原提示細胞のインビトロトランスフェクション、それに続く抗原提示細胞の投与を想定する。
【０２３８】
本明細書で述べる作用物質は有効量で投与される。「有効量」は、単独でまたはさらなる投与物と共に、所望の反応または所望の作用を達成する量を指す。特定の疾患または特定の状態の治療の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の進行の阻害に関する。これは、疾患の進行を遅らせる、特に疾患の進行を妨げるまたは逆転させることを含む。疾患または状態の治療における所望の反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の防止であり得る。
【０２３９】
本明細書で述べる作用物質の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、患者の年齢、生理的状態、大きさおよび体重を含む患者の個別パラメータ、治療の期間、併用療法の種類（存在する場合）、特定の投与経路ならびに同様の因子に依存する。したがって、本明細書で述べる作用物質の投与される用量はそのような様々なパラメータに依存し得る。患者における反応が初期用量では不十分である場合、より高用量（または異なる、より限局された投与経路によって達成される効果的により高い用量）を使用し得る。
【０２４０】
本明細書で述べる医薬組成物は、好ましくは滅菌であり、所望の反応または所望の作用を生じさせる有効量の治療活性物質を含有する。
【０２４１】
本明細書で述べる医薬組成物は、一般に医薬的に適合性の量でおよび医薬的に適合性の調製物中で投与される。「医薬的に適合性」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない非毒性物質を指す。この種の調製物は通常、塩、緩衝物質、防腐剤、担体、アジュバントなどの補足的な免疫増強物質、例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド、サイトカイン、ケモカイン、サポニン、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＲＮＡ、ならびに、適切な場合は、他の治療活性化合物を含有し得る。薬剤中で使用される場合、塩は医薬的に適合性であるべきである。しかし、医薬的に適合性でない塩は、医薬的に適合性の塩を調製するために使用されることがあり、本発明に含まれる。この種の薬理学的および医薬的に適合性の塩には、非限定的に、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等から調製されるものが含まれる。医薬的に適合性の塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩としても調製され得る。
【０２４２】
本明細書で述べる医薬組成物は、医薬的に適合性の担体を含有し得る。「担体」という用語は、適用を容易にするために活性成分が組み合わされる、天然または合成の有機または無機成分を指す。本発明によれば、「医薬的に適合性の担体」という用語は、患者への投与に適する、１つ以上の適合性の固体もしくは液体充填剤、希釈剤または被包物質を含む。本発明の医薬組成物の成分は、通常、所望の医薬的効果を実質的に損なう相互作用が起こらないものである。
【０２４３】
本明細書で述べる医薬組成物は、適切な緩衝物質、例えば塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸および塩中のリン酸を含有し得る。
【０２４４】
医薬組成物は、適切な場合は、適切な防腐剤、例えば塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールも含有し得る。
【０２４５】
医薬組成物は、通常、単位投与形態で提供され、それ自体公知の方法で調製され得る。本発明の医薬組成物は、例えばカプセル、錠剤、ロゼンジ、溶液、懸濁液、シロップ、エリキシルまたは乳剤の形態であり得る。
【０２４６】
非経口投与に適する組成物は、通常、好ましくは受容者の血液と等張である、活性化合物の滅菌水性または非水性調製物を含む。適合性担体および溶媒の例は、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液である。加えて、通常は滅菌の固定油を溶液または懸濁液媒質として使用する。
【０２４７】
本発明を以下の図面および実施例によって詳細に説明するが、これらは説明のためにのみ使用されるものであり、限定を意図しない。説明および実施例により、同様に本発明に包含されるさらなる実施形態が当業者にアクセス可能である。
【実施例】
【０２４８】
本明細書で使用される技術および方法は、本明細書において説明されるかまたはそれ自体公知の方法でおよび、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されているように実施される。キットおよび試薬の使用を含むすべての方法は、特に指示されない限り製造者の情報に従って実施される。
【０２４９】
（実施例１）
Ｔ細胞エピトープの免疫原性を予測するためのモデルの確立
以前に本発明者らは、Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞株において同定された５０の体細胞変異の免疫原性を検討した（Ｊ．Ｃ．Ｃａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｎｏｍｅ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７２，１０８１（２０１２））。これら５０の変異は、主としてＭＨＣクラスＩ発現を最大化するように５６３の発現された非同義体細胞変異のプールから選択した（Ｊ．Ｃ．Ｃａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｎｏｍｅ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７２，１０８１（２０１２））（実施例２も参照のこと）。すべての可能なＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の空間、潜在的なエピトープの長さおよび配列ウィンドウ（変異を位置付ける）を探索する場合（Ｊ．Ｃ．Ｃａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｎｏｍｅ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７２，１０８１（２０１２））、各々の変異に関して本発明者らは最小エピトープ、すなわち最も低いＭＨＣクラスＩコンセンサススコアを有するエピトープを予測した（Ｙ．Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０，Ｗ５２５（２０１２））（本明細書ではＭｍｕｔと定義される）。ＲＮＡワクチン接種、続いてペプチド読み出しを用いてこれらの変異の免疫原性を測定すると（実施例２参照）、ペプチドワクチン接種を用いた先の所見を確認し（Ｊ．Ｃ．Ｃａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｎｏｍｅ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７２，１０８１（２０１２））、５０の変異のうち１２だけが（２４％）免疫原性であり（表１）、ＭＵＴ＋／ＷＴ−配列は試験したすべての変異に関して１０％だけを構成することを示した。
【０２５０】
表１．Ｂ１６Ｆ１０およびＣＴ２６．ＷＴマウス株のＲＮＡワクチン接種後の免疫原性変異の数。
【表１】
2020103297.tif 000003
＊２つのＣＴ２６  ＭＵＴ＋変異は、それらのＷＴ反応性がまだ測定されていなかったためこの表から除外した。合計で、これまでに測定された８２のＣＴ２６変異の中で１８のＭＵＴ＋変異が存在し、２２％の成功率をもたらした。
【０２５１】
Ｂ１６Ｆ１０マウス試験の場合の結果は、低いＭｍｕｔスコア（≦３．９）を有する発現非同義変異を単純に選択することは免疫原性を予測するためにかなり低い成功率しかもたらさないことを明らかにする。したがって腫瘍特異的ネオ抗原を標的とする個別化ワクチンを有効な療法にしようとするならば、免疫原性を駆動する機構のよりよい理解が必要である。免疫原性に寄与する付加的な変数を見出すことを目指して、本発明者らは結腸直腸マウス細胞株ＣＴ２６．ＷＴにおいて同定された発現非同義体細胞変異の免疫原性を検討した。合計で、９６の変異をそれらのＭｍｕｔスコア（低対高）、平均ＲＰＫＭ（低対高）および細胞局在（細胞内対細胞外）に基づいて選択し、ＲＮＡワクチン接種およびペプチドとＲＮＡの両方の読み出しを用いて免疫原性を試験した（さらなる詳細については実施例２参照）。Ｂ１６Ｆ１０細胞株と合わせると、本発明者らのデータセットは１３２のエピトープから成り、その免疫原性をマウス脾細胞に関してエクスビボで測定した。
【０２５２】
ＭＨＣコンセンサススコア。Ｍｍｕｔへの免疫原性の依存性を検討するため、Ｍｍｕｔの関数としての免疫原性変異の累積パーセント、すなわち免疫原性であった所与の閾値（βで表される）よりも小さなＭｍｕｔスコアを有する変異のパーセントをプロットした。合計１３２の変異にわたる合わせたＢ１６およびＣＴ２６データセットの分析は、Ｍｍｕｔへの免疫原性成功率の高度に非線形の依存性を明らかにする（図２Ａ）。図２Ａは、免疫原性変異が極めて低いＭｍｕｔスコア（≦〜０．２）に関して濃縮されていることを示す。Ｍｍｕｔ≦０．１に関しては、免疫原性変異のパーセントは約６０％でピークに達し、Ｍｍｕｔが上昇すると共に急速に減衰して、Ｍｍｕｔ≧２では約２５％より下に低下する。Ｍｍｕｔ＞０．３に対してＭｍｕｔ≦０．３を有する免疫原性変異のパーセントは、１７．１％と比較して４４．４％であり、これは統計的に有意の差であった（Ｐ値＝０．００４、フィッシャーの正確確率検定、片側）。３つのＭｍｕｔビン：≦０．３、（０．３，１］および＞１に関する免疫原性変異のパーセントのヒストグラムは、Ｍｍｕｔが上昇すると共に免疫原性変異のパーセントが低下することを示す（図２Ｂ）。図２Ｂにおける最小ビン（Ｍｍｕｔ≦０．３）、４４．４％と、中央ビン、２０．７％および最大ビン（Ｍｍｕｔ＞１）、１５．８％の両方との成功率の差は統計的に有意であり（Ｐ値＝それぞれ０．０５および０．００４、フィッシャーの正確確率検定、片側）、Ｍｍｕｔ＞〜０．３に関しては成功率が統計的に有意に低下することを指示した。成功率の同様の傾向は、Ｂ１６およびＣＴ２６ミュータノームを別々に分析した場合にも認められる（図３）。
【０２５３】
これまでのところ変異を選択するための本発明者らの基準は提示に焦点を合わせており、変異エピトープのＭＨＣ結合スコアを限定することにより、最大６０％までの精度で免疫原性エピトープの予測が可能になることを認めた。提示は、しかしながら、免疫原性を誘導するための必要条件であるが十分条件ではない。ＴＣＲ認識のためのさらなる基準を同定することにより、本発明者らの予測の正確さをさらに改善できる可能性がある。本発明者らは、免疫原性を駆動するための２つの相互に排他的な機構を仮定し、これをクラスＩおよびクラスＩＩ免疫原性モデルと称する。
【０２５４】
クラスＩ免疫原性。ＴＣＲレパートリーが変異エピトープを認識し、免疫応答を生じさせるために、本発明者らは３つの条件を満たさなければならないと仮定した（ＨＡ、図４）：（ｉ）  野生型エピトープが、生物の発生のいずれかの時点で、免疫系に提示され、強力なＴＣＲ／ｐＭＨＣ結合を介してマッチするＴＣＲの欠失をもたらした、（ｉｉ）変異エピトープが提示される、および（ｉｉｉ）変異アミノ酸の物理化学的特性が野生型アミノ酸と十分に「異なる」（本発明者らが以下で定義する何らかの基準によって）ため、ＴＣＲレパートリーがこの置換を「検出」または「登録」することができる。条件（ｉ）および（ｉｉ）は、免疫系が実際に変化、すなわち変異に暴露されることを確実にする。条件（ｉｉｉ）は、変異が野生型アミノ酸の物理化学的特性を有意に変化させ、そのために変異エピトープの現存（非欠失）ＴＣＲへの結合親和性が潜在的に上昇して、それにより免疫応答をもたらすシグナル伝達カスケードを作動させることを必要とする（図５）。
【０２５５】
ＴＣＲ認識スコア。クラスＩ免疫原性モデルは、２つのアミノ酸間の物理化学的相違を評価するための基準を必要とする。頻繁に入れ替わるアミノ酸は化学的および物理的類似性を有する可能性が高いが、まれにしか入れ替わらないアミノ酸は異なる物理化学的特性を有する可能性が高いことは分子進化において周知である。所与の置換が自然発生する可能性は、この置換が偶然に起こる可能性と比較して対数オッズ行列によって測定される。自然選択によって課せられる対数オッズ行列において認められるパターンは、「タンパク質の三次元立体配座での相互の弱い相互作用におけるアミノ酸残基の機能の類似性を反映する」（Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｒ．Ｍ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｂ．Ｃ．Ｏｒｃｕｔｔ，Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ．ＭＯ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄ．Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．５，３４５（１９７８））。本発明者らはそれゆえ、進化に基づく対数オッズ行列を使用し、これを本明細書では、癌関連アミノ酸置換に関する有効なスコアリング行列として、ＴＣＲ認識を反映する「Ｔスコア」と称する。正のＴスコア（すなわち対数オッズ）を有する置換は自然発生する可能性が高く、したがって類似の物理化学的特性を有する２つのアミノ酸に対応する。クラスＩモデルは、正のＴスコアを有する置換は免疫原性である可能性がより低いと予測する。反対に、負のＴスコアを有する置換は、自然発生する可能性が低く、したがって有意に異なる物理化学的特性を有する２つのアミノ酸に対応する置換を反映する。本発明者らのモデルによれば、そのような置換は免疫原性である可能性がより高い。本発明者らは、対数オッズ行列を評価する種々の方法を比較し、選択した正確法に対して概して堅固であるという結果を認めた。２５０のＰＡＭ（受け入れられた点突然変異）距離を用いる、ＷＡＧ（Ｓ．Ｗｈｅｌａｎ，Ｎ．Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  １８，６９１（２００１））として公知の最大尤度（ＭＬ）に基づく評価アプローチは、予測された免疫原性変異を非免疫原性変異から最も良く分離すると思われ、それゆえ本発明者らはこの行列による結果を提示する（さらなる詳細については実施例２参照）。
【０２５６】
クラスＩＩ免疫原性。免疫原性のクラスＩＩモデルでは、本発明者らは、免疫系がこれまで一度も野生型エピトープに接したことがなく、それゆえ変異エピトープによって攻撃誘発される場合、変異は免疫原性である可能性が高いと仮定する。したがってこのモデルにおいて変異が免疫原性であるためには、２つの条件を満たさなければならないと仮定した：（ｉ）野生型エピトープが一度も免疫系に提示されなかった、（ｉｉ）変異ペプチドが提示される。例えば変異がアンカー位置にヒットし、それにより「非結合型」エピトープを「結合型」に変化させる場合、これらの条件を同時に満たすことができる。正式には、クラスＩＩ免疫原性は２つのサブ仮説に分けることができる：高いＴスコア（図４におけるＨＢ）および低いＴスコア（図４におけるＨＣ）。しかし、野生型エピトープは提示されないという前提であるので、アミノ酸置換の性質はＴＣＲ認識に影響を及ぼさないと予想され、本発明者らはそれゆえクラスＩＩ免疫原性を統合仮説：ＨＢＵＨＣと同等とみなす。
【０２５７】
クラスＩ免疫原性の試験。クラスＩ免疫原性の仮説（図４におけるＨＡ）は、以下のように数学的に言い換えることができる：本発明者らは、野生型エピトープが提示されること（Ｍｗｔ≦α）、変異エピトープが提示されること（Ｍｍｕｔ≦β）、およびアミノ酸置換が些細ではないこと（Ｔ≦τ）を必要とし、ここでＭｗｔは、変異アミノ酸を野生型アミノ酸で置き換える変異エピトープ（同じＨＬＡ対立遺伝子およびウィンドウ長）のＭＨＣコンセンサススコアと定義され、およびＴはＴスコアを表す。３つの条件すべてが必要であるので、本発明者らは、ＨＡ分類器の精度がＭｍｕｔ単独に基づく分類器（図４におけるＨＢＣ１）と比較してまたは部分仮説：ＨＢＣ１∩｛Ｍｗｔ≦α｝およびＨＢＣ１∩｛Ｔ≦τ｝と比較してより高いと予想する。本発明者らはそれゆえ、ＨＢＣ１に関して、部分仮説ＨＡ'：ＨＢＣ１∩｛Ｔ≦τ｝に関しておよび部分仮説ＨＢＣ２：ＨＢＣ１∩｛Ｍｗｔ≦α｝に関して、βの関数としての免疫原性変異のパーセント（真陽性を真陽性と偽陽性の合計で除した数）を計算した。本発明者らは、≒０．５から１の範囲内でτに関する保守的閾値が最良の成績であることを認めた（ＷＡＧ２５０行列の範囲は−５．１（ＦとＧとの間の置換）から＋５．４（ＦとＹとの間の置換）である）。本発明者らはまた、α≒１と設定して、αがβと比較して保守的に限定され得ることを見出した。図６Ａは、実際に、Ｂ１６およびＣＴ２６のプールされたミュータノームを検討した場合、ＨＢＣ２およびＨＡ'に基づく分類器が基線対照仮説ＨＢＣ１より高い精度を達成したことを示す。さらに、完全仮説ＨＡに基づく分類器は、部分仮説ＨＢＣ１およびＨＢＣ２よりも高い精度を達成し、それにより相加効果を明らかにした。Ｂ１６およびＣＴ２６データセットを別々に分析した場合も同じ結論が当てはまる（図７）。
【０２５８】
条件Ｍｗｔ≦αおよびＴ≦τは免疫原性のための必要条件であると仮定されるので、条件ＨＢＣ１∩｛Ｔ＞τ｝または条件ＨＢＣ１∩｛Ｍｗｔ＞α｝のいずれか（すなわち二次条件をなくす）に基づく分類器はＨＢＣ１より良好に機能しないと予想される。実際に本発明者らは、Ｂ１６およびＣＴ２６を一緒に（図６Ｂ）または別々に（図７）分析した場合にこれが当てはまることを認めた。それゆえ本発明者らは、Ｂ１６およびＣＴ２６データセットが両方一緒におよび別々にＨＡ仮説を支持すると結論する。ＷＴ  ＲＮＡも反応性を示した変異を除外しても、これらの結論には影響を及ぼさなかった（図８）。
【０２５９】
ＨＡ仮説に関する検査。高いＴスコアを有する変異はなおも免疫原性であり得るが、そのような変異を濃縮する仮説は統計的に非免疫原性変異も濃縮するはずである。それゆえ本発明者らがＨＡ仮説（ＨＢＣ２∩｛Ｔ≦τ｝）をその逆であるＨＢＣ２∩｛Ｔ＞τ｝（図４におけるＨｎ）と比較した場合、免疫原性変異の統計的に有意の減少を観察するはずである。表２は、実際に、Ｍｍｕｔ≦β＝０．５、Ｍｗｔ≦α＝１およびＴ≦τ＝１に関して、ＨＡがＨｎを上回り、２１．４％（ｎ＝１４；Ｐ＝０．０６８、片側フィッシャーの正確確率検定）と比較して５２．５％（ｎ＝２１）の成功率であることを示す。
【０２６０】
表２．１３３の変異を含むＢ１６およびＣＴ２６のプールされたデータセットに基づく様々な仮説の下での免疫原性変異のパーセント。
【表２】
2020103297.tif 000004
【０２６１】
ＨＡはまた、４１．２％（ｎ＝３５）を達成する基線対照ＨＢＣ２よりも良好な成績である。βに関する条件が厳しいほど、より多くの偽陽性がＨＡ群から除去されるので、βを低下させると共にＨＡとＨｎの成功率の差がより大きくなる。例えば、β＝０．２５に関してＨＡ群の成功率は６７％（ｎ＝１４）であり、これと比較してＨｎ群については１７％（ｎ＝６）の成功率であった（Ｐ＝０．０６６、片側フィッシャーの正確確率検定）−表３参照。
【０２６２】
表３．互いに共通元のない３つの仮説クラス：免疫原性変異についてのＨＡ仮説（Ｍｗｔ≦０．８、Ｔ≦０．５）、Ｈｎ／非免疫原性変異が濃縮されている逆ＨＡ仮説（Ｍｗｔ≦０．８、Ｔ＞０．５）および免疫原性変異についてのＨＢＵＨＣ仮説（Ｍｗｔ＞０．８）に分解した基本対照仮説ＨＢＣ１（Ｍｍｕｔ≦０．２５）を満たす１３３の測定されたＢ１６Ｆ１０／ＣＴ２６．ＷＴ変異の順位付けたリスト。ＨＡおよびＨＢＵＨＣ候補物は、変数を区別する相対的重要性に基づいて順位付けることが提案される。ＨＡに関して提案される順序は次のとおりである：Ｍｍｕｔ（降順）→Ｔスコア（降順）→ＭＷＴ降順。ＨＢＵＨＣに関して提案される順序は次のとおりである：Ｍｍｕｔ（降順）→ＭＷＴ（昇順）。誤差は標準誤差である。
【表３】
2020103297.tif 000005
【０２６３】
免疫原性順位付けをさらに改善し得るさらなる比較検討因子の一例を実施例３に示す。
【０２６４】
より一般的には、ＨＢＣ１（Ｍｍｕｔ≦β）を満たす変異のリストを３つのカテゴリー：ＨＡ、ＨｎおよびＨＢＵＨＣに分類することができ（表３）、ここでＨＡは免疫原性変異が濃縮され、Ｈｎは非免疫原性変異が濃縮されている。Ｂ１６およびＣＴ２６の場合は、ＨＢＵＨＣ群における３つの候補物すべてが、本発明者らの予想に反して、非免疫原性であった。しかし、Ｍｗｔに関してα＊＞＞αとなるようにより現実的な閾値α＊を選択した場合、ＨＢＵＨＣに関して試験することができる予測は存在しない。
【０２６５】
免疫原性分類器の最大精度。表１によれば、合わせたＢ１６およびＣＴ２６データセットにおける予測免疫原性の平均成功率は２２．７％（＝３０／１３２）であった。Ｍｍｕｔスコアに最も厳しい閾値（β＝０．１）を適用することにより、免疫原性分類器の精度は６０％に上昇する（＝６／１０；表２におけるＨＢＣ１）。ＨＢＣ１をＭｗｔ≦α条件またはＴ≦τ条件（α＝１、τ＝１）のいずれかと組み合わせることにより、精度は６６．７％（＝６／９）まで上昇する。両方の基準を組み合わせた、ＨＡに基づく分類器は付加的な応答をもたらし、これは精度を７５％（＝６／８）に上昇させる（表２）。
【０２６６】
Ｂ１６エピトープＭＵＴ３３。プールされたＢ１６／ＣＴ２６データセットの中で、すべての進化モデル（ＰＡＭ行列を除く）によって最も高く順位付けられたＨＡクラスエピトープは、Ｂ１６のＭＵＴ３３であった（表３参照）。さらなる分析は、ＭＵＴ３３が実際にＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＤ８＋応答を誘発し、最小予測エピトープに対してエクスビボ免疫原性を示すことを明らかにした（データは示していない）。
【０２６７】
遺伝子発現の役割。免疫原性変異の割合（免疫原性変異の総数に対する所与の閾値より下のＲＰＫＭ値を有する免疫原性変異の数）をＢ１６およびＣＴ２６に関するＲＰＫＭ値の関数としてプロットすると、この比率が非常に低いＲＰＫＭ値でいくぶん停滞することを示す（図９Ａ）。この作用は、ＨＡ基準を適用するか否かに関わらず認められる。種々のＲＰＫＭビンについての免疫原性変異パーセントをプロットすると（図９ＢおよびＣ）、ＲＰＫＭ値≦〜１はいくぶんより低い成功率を有する（ＨＡフィルタリング仮説を適用した場合または適用しない場合の両方で）ことを示唆し、示唆的ではあるが、これらの結果は誤差の範囲内であることに留意すべきである。
【０２６８】
公表されているＣＤ８＋エピトープの調査。本発明者らは次に、ＣＤ８＋拘束性応答を誘発する単一アミノ酸置換を有する、公表されているＴ細胞規定腫瘍抗原が免疫原性に関する本発明者らのモデルを満たすかどうかを検討することに関心を抱いた。公表された１７のエピトープ（Ｐ．Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ，Ｖ．Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ，Ｎ．Ｖｉｇｎｅｒｏｎ，Ｂ．Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅ／，２０１３））（表４）のうちで、５つがＨＡに関する基準を満たし（α＝０．７、β＝０．２、τ＝０．５）、４つがＨＣＵＨＢの基準を満たし（α＝２．２、β＝０．４）、２つがＨｎ基準を満たした（α＝０．６、β＝０．３、τ＝１．７）。
【０２６９】
表４．ＣＤ８＋応答を生じさせる単一アミノ酸置換を有する公表エピトープ。参考文献のリストについては実施例２参照。ＨＢＵＨＣ群におけるアンカー位置変異を赤色でハイライトする。
【表４】
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【０２７０】
したがって、ＨＡおよびＨＣＵＨＢ仮説を合わせると公表エピトープのおよそ５０％を占めた。興味深いことに、ＨＣＵＨＢ条件を満たした４つの公表エピトープのうち３つ（表４の赤色の箱）は、アンカー位置変異に起因して１０より大きいＭｗｔスコアを有していた（図１０）。ＨＣＵＨＢ仮説についての必要条件は、生物の発生の間に何らかの細胞が野生型エピトープを提示する確率が無視できるほど小さいままであることなので、Ｍｗｔについての閾値は高く保持される、すなわちα＊≫αに保持されるはずであると予測される。実際に、αを０．８から＞３の上昇させた場合、表３におけるＢ１６／ＣＴ２６についての偽陽性は消失する。それゆえ、ＨＣＵＨＢ仮説の下でのＭｗｔに関するより現実的な閾値はおよそ３から１０の間付近であり得る。
【０２７１】
ＭＺ７−ＭＥＬ細胞株。ヒト腫瘍モデル設定で免疫原性エピトープを予測する本発明者らの免疫原性モデルの能力を試験するため、本発明者らは、悪性黒色腫を有する患者の脾転移から１９８８年に樹立されたＭＺ７−ＭＥＬ細胞株を検討した（Ｖ．Ｌｅｎｎｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０２，１６０１３（２００５））。自己腫瘍反応性Ｔ細胞によるＭＺ７−ＭＥＬ細胞からのｃＤＮＡライブラリのスクリーニングは、ＣＤ８＋応答を生じさせることができる少なくとも５つのネオ抗原を明らかにした（Ｖ．Ｌｅｎｎｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０２，１６０１３（２００５））。これは、現在までの患者に由来するＣＤ８＋ネオ抗原の最大セットを構成する。本発明者らの免疫原性モデルをこれらのエピトープに適用して、本発明者らは、３つのネオ抗原がＨＡエピトープとして分類され、アンカー位置変異である１つのネオ抗原がＨＢＵＨＣエピトープとして分類されることを見出した（表４における矢印および図１０）。したがって、５つのエピトープのうち４つは本発明者らの免疫原性モデルによって説明され得る。
【０２７２】
ＭＺ７−ＭＥＬ細胞株において新たにこれらのエピトープを予測する本発明者らの能力を試験するため、ＭＺ７−ＭＥＬ細胞株のエクソームを配列決定した（実験方法参照）。合計で７４３の発現非同義変異が同定された。Ｌｅｎｎｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ｖ．Ｌｅｎｎｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０２，１６０１３（２００５））によって以前に同定された５つの変異すべてが認められた。本発明者らは次に、各々の変異についてＴスコア、ＭｍｕｔおよびＭｗｔを計算し、また所与の変異に関して最小ＭＨＣコンセンサススコアをもたらすＨＬＡ対立遺伝子およびエピトープも報告した。変異を、閾値α＝０．８、β＝０．２、τ＝０．５（加えて条件ＲＰＫＭ＞０．２）を用いて３つの群：ＨＡ、ＨＢＵＨＣおよびＨｎの１つに分類し、その後、表３で説明したように、それらの免疫原性である潜在的可能性に基づいて順位付けた。７４３変異のうちで、３２の変異がＨＡ基準を満たし（表５）、１２がＨＢＵＨＣ基準を満たし（表６）、１５がＨｎ基準を満たすことを認めた。
【０２７３】
表５．ＨＡに分類されたＭＺ７−ＭＥＬ細胞の変異。ＭＺ７−ＭＥＬにおける７４３の発現非同義変異のうち３２は、閾値：α＝０．８、β＝０．２およびτ＝０．５を使用してＨＡ免疫原性と分類された。順位はＭｍｕｔ（降順）→Ｔスコア（降順）選別スキームに基づく。Ｌｅｎｎｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．によって同定された免疫原性ネオ抗原を黄色でハイライトする。加えてＲＰＫＭが０．２を超えることが必要であった。
【表５】
2020103297.tif 000007
【０２７４】
表６．ＨＢＵＨＣに分類されたＭＺ７−ＭＥＬ細胞の変異。ＭＺ７−ＭＥＬにおける７４３の発現非同義変異のうち１２は、閾値：α＊＝０．８、β＝０．２およびＲＰＫＭ＞２を使用してＨＢＵＨＣ免疫原性と分類された。順位はＭｍｕｔ（降順）→Ｍｗｔ（昇順）選別スキームに基づく。Ｌｅｎｎｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．によって同定された免疫原性ネオ抗原を黄色でハイライトする。
【表６】
2020103297.tif 000008
【０２７５】
ＨＡとして分類された３２変異のうちで、Ｌｅｎｎｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．によって同定された３つのＨＡクラス変異（ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１およびＲＢＡＦ６００）は、Ｍｍｕｔ→Ｔスコア順位付けスキーム（表３参照）を使用して１８の順位クラスの中で２位、４位および１３位に順位付けられた。ＨＢＵＨＣとして分類された１２変異のうちで、４番目のＬｅｎｎｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．の変異（ＳＮＲＰ１１６）は３位に順位付けられた。さらに、Ｍｗｔに関してより高い（より現実的な）閾値を用いた場合（例えばα＊〜５）、４番目のＬｅｎｎｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．の変異は１位に順位付けられる（１つだけの付加的なアンカー位置変異と共に−表７）。最後に、４つのＬｅｎｎｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．の変異は、著者によって報告されたように正しいＨＬＡ対立遺伝子、エピトープ長および変異位置を有すると予測された。
【０２７６】
表７．ＨＢＵＨＣに分類されたＭＺ７−ＭＥＬ細胞の変異。ＭＺ７−ＭＥＬにおける７４３の発現非同義変異のうち２は、閾値：α＊＝５、β＝０．２およびＲＰＫＭ＞２を使用してＨＢＵＨＣ免疫原性と分類された。順位はＭｍｕｔ（降順）→Ｍｗｔ（昇順）選別スキームに基づく。Ｌｅｎｎｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．によって同定された免疫原性ネオ抗原を黄色でハイライトする。
【表７】
2020103297.tif 000009
【０２７７】
結論
Ｂ１６およびＣＴ２６データセットの分析は、３つの条件：野生型ペプチドが提示される、変異ペプチドが提示される、およびアミノ酸置換が十分に低い対数オッズスコアを有する、を満たす場合に免疫原性が付与されるモデルを支持する（図１１Ａ）。本発明者らがクラスＩ免疫原性と称する、免疫原性に関するこのモデルは、ヒト黒色腫細胞株モデル、ＭＺ７−ＭＥＬによってさらに裏付けられる。ＭＺ７−ＭＥＬモデルおよび公表されているＣＤ８＋拘束性ネオ抗原は、本発明者らがクラスＩＩ免疫原性と称する、２番目のモデルを支持し、この場合は野生型エピトープが提示されないが、置換（例えばアンカー位置における）がＭＨＣコンセンサススコアの有意の上昇（＞５から１０）をもたらし、新規のこれまで見たことがないエピトープを生じさせる（図１１Ｂ）。免疫原性を定義するためのこの枠組みは、３変数分類スキーム（Ｍｍｕｔ、Ｍｗｔ、Ｔスコア）で獲得される。この分類スキームを使用して、本発明者らはＭＺ７−ＭＥＬの７４３変異を３４変異のリストに低減することができ、５つのＬｅｎｎｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．のエピトープは上位５クラスに順位付けられた。
【０２７８】
表７は、クラスＩＩ免疫原性変異がまれであることを明らかにする。７４３変異のうちで、およそ３０のクラスＩ免疫原性変異と比較して２つだけがクラスＩＩ免疫原性として分類された（Ｍｗｔに関する現実的な閾値を用いて）。ＨＢＵＨＣクラス変異の少なさはマウス黒色腫モデルにおいても観察された（表８）。この所見は個別化ワクチンのためのクラスＩ免疫原性変異の重要性を強調するものであり、これがワクチン接種のために使用することができる患者試料中で見出される主要なタイプの変異であると予想される。同時に、Ｌｅｎｎｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．によって見出された５つのエピトープの１つがクラスＩＩ免疫原性であったという事実は、クラスＩＩ免疫原性変異がより強力であるかまたは何らかの方法で免疫系によって選択されることを指示し得る。
【０２７９】
表８．種々の腫瘍モデルにおける候補ＨＡおよびＨＢＵＨＣ変異の数。
（α＝０．８、α＊＝５、β＝０．２、τ＝０．５）
【表８】
2020103297.tif 000010
【０２８０】
（実施例２）
実験材料および方法
実施例１で使用した実験材料および方法を以下で述べる：
【０２８１】
実験動物
Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＢａｌｂ／ｃＪマウス（ＣＲＬ）を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｉｎｚにおいて動物実験に関する連邦および州の方針に従って飼育した。
【０２８２】
黒色腫および結腸直腸マウス腫瘍モデルのための細胞
Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞株（生成物：ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６４７５、ロット番号：５８０７８６４５）およびＣＴ２６．ＷＴ結腸癌細胞株（生成物：ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６３８、ロット番号：５８４９４１５４）を２０１０年にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。初期（第３、第４）継代の細胞を配列決定実験に使用した。細胞をマイコプラスマに関して定期的に試験した。受領以後に細胞の再確認は実施しなかった。ＭＺ７−ＭＥＬ細胞株（１９８８年１月に樹立）および自己エプスタイン−バーウイルス形質転換Ｂ細胞株をＤｒ．Ｔｈｏｍａｓ  Ｗｏｌｆｅｌ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈａｎｎｅｓ  Ｇｕｔｅｎｂｅｒｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手した。
【０２８３】
合成ペプチド
ペプチドをＪｅｒｉｎｉ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入するかまたはＴＲＯＮペプチド施設から合成した。合成ペプチドは、１４位に変異（ＭＵＴ）または野生型（ＷＴ）アミノ酸を有する２７アミノ酸長であった。
【０２８４】
マウスの免疫
年齢をマッチさせた雌性Ｃ５７ＢＬ／６またはＢａｌｂ／ｃマウスに、ＰＢＳ中でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２０μｌと共に製剤化したインビトロ転写ｍＲＮＡ  ２０μｇを２００μｌの総注射容量で静脈内注射した（各群につき３匹のマウス）。マウスを０、３、７、１４および１８日目に免疫した。初回注射の２３日後にマウスを犠死させ、免疫学的試験のために脾細胞を単離した（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ参照）。１つの変異（モノエピトープ）または２つの変異（バイエピトープ）を示すＤＮＡ配列を、１４位に変異を有する２７アミノ酸（ａａ）の配列を使用して構築し、ｐＳＴ１−２ＢｇＵＴＲ−Ａ１２０骨格にクローニングした（Ｓ．Ｈｏｌｔｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０８，４００９（２００６））。この鋳型からのインビトロ転写および精製は以前に記述されている（Ｓ．Ｋｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ５６，１５７７（２００７））。
【０２８５】
酵素結合免疫スポットアッセイ
酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ（Ｓ．Ｋｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７０，９０３１（２０１０））および刺激因子としての同系骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の生成は以前に記述されている（Ｌ．ＭＢ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２３，７７（１９９９））。Ｂ１６Ｆ１０モデルに関して、ＢＭＤＣを、指示されている変異、対応する野生型または対照ペプチド（ＶＳＶ−ＮＰ）を用いてペプチドパルスした（６μｇ／ｍｌ）。ＣＴ２６モデルに関しては、ペプチドでの再刺激に加えて、対応するインビトロ転写ｍＲＮＡでＢＭＤＣをトランスフェクトし、同様に再刺激のために使用した。アッセイのために、５×１０４ＢＭＤＣを、抗ＩＦＮ−γ抗体（１０μｇ／ｍＬ、クローンＡＮ１８；Ｍａｂｔｅｃｈ）で被覆したマイクロタイタープレート中で５×１０５の新鮮単離した脾細胞と共に同時インキュベートした。３７℃で１８時間後、サイトカイン分泌を抗ＩＦＮ−γ抗体（クローンＲ４−６Ａ２；Ｍａｂｔｅｃｈ）で検出した。スポット数をカウントし、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓ５  Ｖｅｒｓａ  ＥＬＩＳＰＯＴ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＩｍｍｕｎｏＣａｐｔｕｒｅ（商標）Ｉｍａｇｅ  ＡｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎソフトウェアおよびＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアバージョン５で分析した。統計分析はスチューデントｔ検定およびマン−ホイットニー検定（ノンパラメトリック検定）によって行った。ｐ値＜０．０５で応答を有意とみなした。
【０２８６】
細胞内サイトカインアッセイ
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ用に調製した脾細胞のアリコートを、細胞内フローサイトメトリによるサイトカイン産生の分析に供した。このために各試料につき２×１０６脾細胞を、９６ウェルプレートにおいてゴルジ阻害剤ブレフェルジンＡ（１０μｇ／ｍＬ）を添加した培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ）に塗布した。各動物からの細胞を、２×１０５のペプチドパルスしたまたはＲＮＡでトランスフェクトしたＢＭＤＣで３７℃にて５時間再刺激した。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ  ５０μｌ中に再懸濁して、以下の抗マウス抗体：抗ＣＤ４  ＦＩＴＣ、抗ＣＤ８  ＡＰＣ−Ｃｙ７（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で４℃にて２０分間細胞外染色した。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後外膜の透過処理のためにＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）溶液１００μＬ中に４℃にて２０分間再懸濁した。透過処理後、細胞をＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ−Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で洗浄し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ−Ｂｕｆｆｅｒ中に５０μＬ／試料で再懸濁し、以下の抗マウス抗体：抗ＩＦＮ−γ  ＰＥ、抗ＴＮＦ−α  ＰＥ−Ｃｙ７、抗ＩＬ２  ＡＰＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で４℃にて３０分間細胞内染色した。Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ−Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、フローサイトメトリ分析のために１％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に細胞を再懸濁した。ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ血球計算器およびＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．３）を用いて試料を分析した。
【０２８７】
次世代シークエンシング
核酸抽出：バルク細胞からのＤＮＡおよびＲＮＡならびにマウス組織からのＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅキット（ＤＮＡ用）およびＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏキット（ＲＮＡ用）を用いて抽出した。
【０２８８】
ＤＮＡエクソームシークエンシング：Ｂ１６Ｆ１０、Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＣＴ２６．ＷＴに関するエクソーム捕獲ならびにＢａｌｂ／ｃＪに関するＤＮＡリシークエンシングを以前に記述されているように三つ組で実施した（Ｊ．Ｃ．Ｃａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｎｏｍｅ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７２，１０８１（２０１２））。ＭＺ７−ＭＥＬ／ＥＢＶ−Ｂ  ＤＮＡリシークエンシングのためのエクソーム捕獲を、すべてのタンパク質コード領域を捕獲するように設計されたＡｇｉｌｅｎｔ  ＸＴ  Ｈｕｍａｎ  ａｌｌ  Ｅｘｏｎ  ５０  Ｍｂ溶液に基づく捕獲アッセイを用いて二つ組で実施した。精製ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）３μｇを、Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｓ２超音波装置を用いて１５０〜２００ｂｐに断片化した。フラグメントを、製造者の指示に従って末端修復し、５'リン酸化して、３'アデニル化した。Ａｇｉｌｅｎｔインデキシング特異的ペアエンドアダプタを、アダプタ対ｇＤＮＡの１０：１モル比を用いてｇＤＮＡフラグメントに連結した。ＡｇｉｌｅｎｔのＩｎＰＥ  １．０およびＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔインデキシング捕獲前ＰＣＲプライマーならびにＨｅｒｃｕｌａｓｅＩＩポリメラーゼを使用して４サイクルの捕獲前増幅を行った。アダプタ連結し、ＰＣＲ濃縮したｇＤＮＡフラグメント５００ｎｇをＡｇｉｌｅｎｔのエクソーム捕獲ベイトに６５℃で２４時間ハイブリダイズした。ハイブリダイズしたｇＤＮＡ／ＲＮＡベイト複合体を、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを用いて取り出し、洗浄して、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ溶出緩衝液中での溶出の間にＲＮＡベイトを切断した。溶出したｇＤＮＡフラグメントを、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔインデキシング捕獲後ＰＣＲおよびインデックスＰＣＲプライマーならびにＨｅｒｃｕｌａｓｅＩＩポリメラーゼを使用して捕獲後に１０サイクルＰＣＲ増幅した。すべての清浄化を１．８倍容のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ磁気ビーズで実施した。すべての品質管理はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＱｕｂｉｔ  ＨＳアッセイを用いて実施し、フラグメントサイズはＡｇｉｌｅｎｔの２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＨＳ  ＤＮＡアッセイを用いて決定した。エクソーム濃縮したｇＤＮＡライブラリを、７ｐＭライブラリを使用するＴｒｕｓｅｑ  ＳＲクラスターキットｖ２．５を用いてｃＢｏｔでクラスター化し、１×１００ｂｐを、Ｔｒｕｓｅｑ  ＳＢＳキットを使用してＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００で配列決定した。
【０２８９】
ＲＮＡ遺伝子発現プロファイリング（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）：バーコード化されたｍＲＮＡ−ｓｅｑ  ｃＤＮＡライブラリを全ＲＮＡ  ５μｇから二つ組で調製した（ＮＥＢ試薬を使用する修正Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｍＲＮＡ−ｓｅｑプロトコル）。Ｓｅｒａｍａｇ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｍＲＮＡを単離し、二価カチオンと熱を用いて断片化した。生じたフラグメント（１６０〜２２０ｂｐ）を、ランダムプライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡに変換し、続いてＤＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮａｓｅＨを使用して第二鎖を合成した。ｃＤＮＡをＮＥＢ  ＲＮＡライブラリキットの指示に従って末端修復し、５'リン酸化して、３'アデニル化した。単一の３'ＴオーバーハングＩｌｌｕｍｉｎａマルチプレックス特異的アダプタを、アダプタ対ｃＤＮＡインサートの１０：１モル比を用いてＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結した。ｃＤＮＡライブラリを精製し、３００ｂｐでサイズ選択した（Ｅ−Ｇｅｌ  ２％  ＳｉｚｅＳｅｌｅｃｔゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＩｌｌｕｍｉｎａ特異的ＰＣＲプライマーを使用したＰＣＲによって濃縮し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ６塩基インデックス配列およびフローセル特異的配列の付加を実施した。この工程までのすべての清浄化は１．８倍容のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ磁気ビーズで行った。すべての品質管理はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＱｕｂｉｔ  ＨＳアッセイを用いて実施し、フラグメントサイズはＡｇｉｌｅｎｔの２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＨＳ  ＤＮＡアッセイを用いて決定した。バーコード化されたＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリを上述したようにクラスター化し、５０ｂｐを配列決定した。
【０２９０】
ＮＧＳデータ解析、遺伝子発現：ＲＮＡ試料からの出力された配列リードをＩｌｌｕｍｉｎａ標準プロトコルに従って前処理し、これは低品質リードのフィルタリングを含んだ。配列リードを、ｂｏｗｔｉｅ（バージョン０．１２．５）（Ｂ．Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｃ．Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｍ．Ｐｏｐ，Ｓ．Ｌ．Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １０，Ｒ２５（２００９）））を用いてｍｍ９（Ａ．Ｔ．Ｃｈｉｎｗａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２０，５２０（２００２））またはｈｇ１８（Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｅ．Ｌａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｒｏｇｅｒｓ，Ｒ．Ｗａｔｅｒｓｔｏｎ，Ｉ．Ｃｏｎｓｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ４３１，９３１（２００４））参照ゲノム配列に整列させた。ゲノムアラインメントに関しては２つのミスマッチを許容し、最適アラインメント（「−ｖ２−ｂｅｓｔ」）だけを報告し、転写産物アラインメントについてはデフォルトパラメータを使用した。ゲノム配列に整列可能でないリードは、ＵＣＳＣ既知遺伝子のすべての可能なエクソン−エクソン接合部配列のデータベースに整列させた（Ｆ．Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２２，１０３６（２００６））。リード座標をＲｅｆＳｅｑ転写産物のものとインターセクトさせることによって発現値を決定し、オーバーラップするエクソンと接合部リードをカウントして、ＲＰＫＭ発現単位（１００万本のマッピングされたリード当たりのエクソンモデルのキロベースごとにマッピングされるリード（Ｒｅａｄｓ  ｗｈｉｃｈ  ｍａｐ  ｐｅｒ  Ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｅｘｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄｓ））（Ａ．Ｍｏｒｔａｚａｖｉ，Ｂ．Ａ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｋ．ＭｃＣｕｅ，Ｌ．Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｂ．Ｗｏｌｄ，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ５，６２１（２００８））に正規化した。
【０２９１】
ＮＧＳデータ解析、体細胞変異の発見：体細胞変異を以前に記述されているように同定した（Ｊ．Ｃ．Ｃａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｎｏｍｅ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７２，１０８１（２０１２））。配列リードを、ｂｗａ（デフォルトオプション、バージョン０．５．８ｃ）（Ｈ．Ｌｉ，Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，１７５４（２００９））を用いてｍｍ９またはｈｇ１８参照ゲノムに整列させた。ゲノムの複数箇所にマッピングされる曖昧なリードを除去した。２つのソフトウェアプログラム：ｓａｍｔｏｏｌｓ（バージョン０．１．８）（Ｈ．Ｌｉ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２７，１１５７（２０１１））およびＳｏｍａｔｉｃＳｎｉｐｅｒ（Ａ．ＭｃＫｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０，１２９７（２０１０））のコンセンサスを用いて変異を同定した。Ｂ１６Ｆ１０およびＣ５７ＢＬ／６Ｊに関しては、ＧＡＴＫも含めた（Ａ．ＭｃＫｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０，１２９７（２０１０））。それぞれのすべてのレプリケートにおいて同定された潜在的体細胞変異に「偽発見率」（ＦＤＲ）の信頼値を割り当てた（Ｍ．Ｌｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ８，ｅ１００２７１４（２０１２））（ＣＴ２６およびＭＺ７−ＭＥＬのみ）。
【０２９２】
変異選択および検証
免疫原性試験のための５０のＢ１６Ｆ１０変異を選択する基準は以前に記述されている（Ｊ．Ｃ．Ｃａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｎｏｍｅ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７２，１０８１（２０１２））。変異に関するこれらの基準には以下が含まれた：（ｉ）３つすべてのＢ１６Ｆ１０レプリケートに存在し、およびすべてのＣ５７ＢＬ／６三つ組に存在しない、（ｉｉ）ＲｅｆＳｅｑ転写産物中に存在する、（ｉｉｉ）非同義変化を生じさせる、（ｉｖ）Ｂ１６Ｆ１０発現遺伝子中に存在する（レプリケート全体にわたる平均ＲＰＫＭ＞１０、エクソン発現＞０）ならびに（ｖ）各変異についてＭｍｕｔスコア（以下参照）が＜５である必要があった。５９の残りの変異について、ＭＨＣクラスＩスコア、ＭＨＣクラスＩＩスコアおよび転写産物発現の四分位ランクの成果を形成し、最初の５０の変異（０．１≦Ｍｍｕｔ≦３．９）をＰＣＲによる確認のために選択した（さらなる詳細については（Ｊ．Ｃ．Ｃａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｎｏｍｅ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７２，１０８１（２０１２）参照）。免疫原性試験のために選択された９６のＣＴ２６．ＷＴ変異についての基準をさらに精緻化し、これには以下が含まれた：（ｉ）３つすべてのＣＴ２６．ＷＴレプリケートに存在し、３つすべてのＢａｌｂ／ｃＪレプリケートに存在しない、（ｉｉ）ＦＤＲ≦０．０５、（ｉｉｉ）ＵＣＳＣ既知遺伝子転写産物中に存在する、（ｉｖ）非同義変化を生じさせる、（ｖ）ｄｂＳＮＰデータベース中に存在しない、（ｖｉ）ゲノム反復領域中に存在しない。残りの４９３の変異から、８つの１２員の群を３つの特徴：Ｍｍｕｔスコア（最小−［０．１，１．９］対最大−［３．９−２０．３］）、タンパク質の区画（細胞外、細胞内）、および遺伝子発現（７．１ＲＰＫＭの平均値より下対上）に従って定義し、貪欲法に従って変異を選択して、それに応じて閾値を調整した。生じた９６変異のうち９４は、ＰＣＲ、続いてサンガー配列決定法によって確認された。
【０２９３】
分析のためにＭＺ７−ＭＬ変異を選択する基準には以下が含まれた：（ｉ）２つのＭＺ７−ＭＥＬレプリケートに存在し、２つの自己ＥＢＶ−Ｂレプリケートには存在しない、続いて（ｉｉ）〜（ｖｉ）の工程はＣＴ２６．ＷＴに関して上述されている。工程（ｉ）〜（ｖｉ）を適用することにより、約８０００変異の初期リストが７４３に低減された。
【０２９４】
ＭＨＣ結合予測およびＭｍｕｔスコアの計算
ＭＨＣ結合予測を、ＩＥＤＢ分析リソースＣｏｎｓｅｎｓｕｓツール（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ａｎａｌｙｚｅ／ｈｔｍｌ／ｍｈｃ＿ｂｉｎｄｉｎｇ．ｈｔｍｌ）（Ｙ．Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０，Ｗ５２５（２０１２））を用いて実施し、これは、ＡＮＮ（Ｃ．Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３６，Ｗ５０９（２００８）；Ｍ．Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２，１００７（２００９））、ＳＭＭ（Ｂ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ａ．Ｓｅｔｔｅ，ＢＭＣ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ６，１３２（２００５））および一部の対立遺伝子モデルについては合わせてｃｏｍｂｌｉｂ（Ｊ．Ｓｉｄｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４，２（２００８））からのベンチマーク試験に基づき最良の成績の予測方法を組み合わせるものである（Ｈ．Ｈ．Ｌｉｎ，Ｓ．Ｒａｙ，Ｓ．Ｔｏｎｇｃｈｕｓａｋ，Ｅ．Ｌ．Ｒｅｉｎｈｅｒｚ，Ｖ．Ｂｒｕｓｉｃ，ＢＭＣ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９，８（２００８）；Ｂ．Ｐｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２，ｅ６５（２００６））。コンセンサスアプローチは、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴからの５００万個のランダムなペプチドのペプチドスコアに対する所与のペプチドの結合予測スコアを反映する、パーセンタイル順位を作成することによってすべてのツールの予測スコアを組み合わせる。
【０２９５】
各変異について、本発明者らは、すべての可能な（ｉ）配列ウィンドウ（変異を位置付ける）、（ｉｉ）エピトープ長および（ｉｉｉ）可能なマウスＭＨＣクラスＩ対立遺伝子、に関する予測ＭＨＣコンセンサススコアを計算した。すべてのＭＨＣコンセンサススコアの最小値がＭｍｕｔスコアであると定義した。
【０２９６】
対数オッズ行列およびＴスコアの計算
対数オッズ行列は、大きなタンパク質データベースの配列アラインメント比較から推定することができる。初期対数オッズ行列は配列のペアワイズ比較（ＢＬＯＳＵＭ６２（Ｓ．Ｋｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ５６，１５７７（２００７）））および最大節約（ＭＰ）推定方法（例えばＰＡＭ２５０（Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｒ．Ｍ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｂ．Ｃ．Ｏｒｃｕｔｔ，Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ．ＭＯ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄ．Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．５，３４５（１９７８））、ＪＴＴ２５０（Ｓ．Ｑ．Ｌｅ，Ｏ．Ｇａｓｃｕｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ２５，１３０７（２００８））およびＧｏｎｎｅｔ行列（Ｃ．Ｃ．Ｄａｎｇ，Ｖ．Ｌｅｆｏｒｔ，Ｖ．Ｓ．Ｌｅ，Ｑ．Ｓ．Ｌｅ，Ｏ．Ｇａｓｃｕｅｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２７，２７５８（２０１１）））に基づいた。最近になって、最大尤度（ＭＬ）に基づく方法が開発された（例えばＶＴ１６０（Ｐ．Ｇ．Ｈｉｇｇｓ，Ｔ．Ｋ．Ａｔｔｗｏｏｄ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．（Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，２００９））、ＷＡＧ（Ｓ．Ｗｈｅｌａｎ，Ｎ．Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  １８，６９１（２００１））およびＬＧ（Ｖ．Ｌｅｎｎｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０２，１６０１３（２００５）））。ＭＬは、ＭＰに基づくアプローチの場合のように、密接に関連する配列だけの比較に限定されないので、この推定アプローチは最も正確であると予想される。
【０２９７】
対数オッズ行列の計算は他のところで詳細に説明されている（Ｃ．Ｃ．Ｄａｎｇ，Ｖ．Ｌｅｆｏｒｔ，Ｖ．Ｓ．Ｌｅ，Ｑ．Ｓ．Ｌｅ，Ｏ．Ｇａｓｃｕｅｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２７，２７５８（２０１１））。簡単に述べると、アミノ酸置換の標準モデルは、２０×２０速度行列Ｑｉｊによって表されるマルコフの時間連続、時間逆転モデルを想定し、ここでｑｉｊ（ｉ≠ｊ）は時間単位当たりのアミノ酸ｉからｊへの置換の数であり、対角要素は
【数１】
2020103297.tif 000011
を満たすように選択される。Ｑは、ｉ≠ｊに関して、Ｑｉｊ＝Ｓｉｊ・πｊと分解することができ、ここでＳｉｊは対称交換可能性行列であり、およびπｊはアミノ酸ｉが認められる確率である（Ｃ．Ｃ．Ｄａｎｇ，Ｖ．Ｌｅｆｏｒｔ，Ｖ．Ｓ．Ｌｅ，Ｑ．Ｓ．Ｌｅ，Ｏ．Ｇａｓｃｕｅｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２７，２７５８（２０１１））。最後に、時間単位ｔ＝１．０が、１００のＰＡＭ距離によって表される、部位当たり１．０の予想置換または部位当たり１つの「受け入れられた点突然変異」に対応するように、
【数２】
2020103297.tif 000012
となるようにＱを正規化する（Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｒ．Ｍ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｂ．Ｃ．Ｏｒｃｕｔｔ，Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ．ＭＯ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄ．Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．５，３４５（１９７８）；Ｓ．Ｑ．Ｌｅ，Ｏ．Ｇａｓｃｕｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ２５，１３０７（２００８）；Ｃ．Ｃ．Ｄａｎｇ，Ｖ．Ｌｅｆｏｒｔ，Ｖ．Ｓ．Ｌｅ，Ｑ．Ｓ．Ｌｅ，Ｏ．Ｇａｓｃｕｅｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２７，２７５８（２０１１））。時間ｔ後にアミノ酸ｉがアミノ酸ｊに置き換えられる確率、Ｐｒ（ｉ→ｊ│ｔ）＝Ｐｉｊ（ｔ）は、２０×２０確率行列Ｐ（ｔ）＝ｅｔＱ（行列指数化を表す表記法による）によって与えられる。時間ｔに関して計算された対数オッズ行列は、対数オッズ２０×２０行列
【数３】
2020103297.tif 000013
によって与えられる（Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｒ．Ｍ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｂ．Ｃ．Ｏｒｃｕｔｔ，Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ．ＭＯ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄ．Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．５，３４５（１９７８，１９７８））。時間逆転とはπｉＰｉｊ（ｔ）＝πｊＰｊｉ（ｔ）を意味し、およびそれゆえＴｉｊは対称である（Ｐ．Ｇ．Ｈｉｇｇｓ，Ｔ．Ｋ．Ａｔｔｗｏｏｄ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．（Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，２００９））。
【０２９８】
ｉとｊとの間の置換についてのＴスコアは、本明細書ではＴｉｊと定義され、進化モデルおよび時間ｔに依存する。本発明者らは、ＰＡＭ、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＪＴＴ、ＶＴ１６０、Ｇｏｎｎｅｔ、ＷＡＧ、ＷＡＧ＊およびＬＧ（上記参考文献参照）を含む、Ｔスコアについての様々なモデルおよびＰＡＭ距離を検討した。この報告における図面は、ＷＡＧモデルおよび２５０のＰＡＭ距離に基づくＴスコアを使用して作成した。そのような大きなＰＡＭ距離は、アミノ酸が変化する実質的な可能性が存在することを意味し（Ｐ．Ｇ．Ｈｉｇｇｓ，Ｔ．Ｋ．Ａｔｔｗｏｏｄ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．（Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，２００９））、残基が同一ではないことがあり得るが、アミノ酸の物理化学的特性は保存されている配列の間の遠い関係を検出するのに有用である（Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｒ．Ｍ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｂ．Ｃ．Ｏｒｃｕｔｔ，Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ．ＭＯ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄ．Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．５，３４５（１９７８）；Ｐ．Ｇ．Ｈｉｇｇｓ，Ｔ．Ｋ．Ａｔｔｗｏｏｄ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．（Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，２００９））。
【０２９９】
ｔ分布検定統計量を使用して、様々なＰＡＭスコア（１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００および２５０）を使用してＷＡＧ行列に関する表３からの免疫原性エピトープと非免疫原性エピトープの平均Ｔスコアを比較した。検定統計量の分析は、Ｐ値がＰＡＭ距離と共に単調に減少することを示し、予想されたように、２５０のＰＡＭ距離が最適解であることを示唆した（データは示していない）。ＨＡおよびＨｎへの分類は、ＰＡＭ行列を除くすべての行列について同じであり、ＰＡＭ行列はすべての進化モデルの最小精度である。すべての進化モデルのうちで、ＷＡＧ２５０モデルは、検定統計量：［最大Ｔスコア（ＨＡ）−最小Ｔスコア（Ｈｎ）］／σ（Ｔスコア（ＨＡ）、Ｔスコア（Ｈｎ））で分離を測定する、表３におけるＨＡエピトープとＨｎエピトープとの間の最大分離をもたらした（データは示していない）。同じ検定統計量は、より小さな距離と比較してＰＡＭ距離２５０に関しても最大であった。
【０３００】
公表されているＣＤ８＋エピトープ
単一変異アミノ酸を有するＣＤ８＋エピトープを、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ（Ｐ．Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ，Ｖ．Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ，Ｎ．Ｖｉｇｎｅｒｏｎ，Ｂ．Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅ／，２０１３）（ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅ／ｍｕｔａｔｉｏｎｓ／）によって公表された変異から生じる腫瘍抗原のリストより収集した。ＨＬＡ対立遺伝子を、公表された表からまたはもとの論文がより正確である場合はもとの論文から取り出した。表４に列挙されている参考文献は以下のものである：（１）Ｌｅｎｎｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  １０２（４４），ｐｐ．１６０１３-１６０１８（２００５）；（２）Ｋａｒａｎｉｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１（９），ｐｐ．３７１８−３７２４（２００１）；（３）Ｓｅｎｓｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５（２），ｐｐ．６３２−６４０（２００５）；（４）Ｌｉｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６８（９），ｐｐ．４８０２−４８０８（２００２）；（５）Ｚｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９（２），ｐｐ．５９２−６０１（１９９９）；（６）Ｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １０９（７），ｐｐ．２９８５−２９８８（２００７）；（７）Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １８３（３），ｐｐ．１１８５−１１９２（１９９６）；（８）Ｖｉｇｎｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ  ２，ｐｐ．９（２００２）；（９）Ｅｃｈｃｈａｋｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１（１０），ｐｐ．４０７８−４０８３（２００１）；（１０）Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８（２２），ｐｐ．５１４４−５１５０（１９９８）；（１１）Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １２０（１２），ｐｐ．２６１８−２６２４（２００７）；（１２）Ｗｏｌｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９（５２２８），ｐｐ．１２８１−１２８４（１９９５）；（１３）Ｇｊｅｒｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７２（５），ｐｐ．７８４−７９０（１９９７）。
【０３０１】
（実施例３）
免疫原性変異の優先順位付けを改善するために変異スコアを比較検討するためのスキームの例
細胞に注入されたＲＮＡは、ひとたび翻訳され、短いペプチドに切断されると、細胞内で種々のＨＬＡ型上に提示され得る。それゆえ、所与の変異は潜在的に１つより多いＨＬＡ型上に並行して提示され得るので、低いＭＨＣコンセンサス（または類似）スコアを有すると予測されるＨＬＡ型が多いほど、所与の変異が免疫原性である可能性がより高くなるのは当然である。したがって、変異がＨＡおよび／もしくはＨＢＵＨＣと分類されるＨＬＡ型の数によって変異を比較検討すること、またさらには各々の変異を単純に低いＭｍｕｔスコアを有するＨＬＡ型の数によって比較検討することは、免疫原性の順位付けを改善し得る。最も一般的な解では、２７量体のＲＮＡまたはペプチドを細胞に注入した場合、ＨＬＡ型だけでなく、ペプチドの長さおよびこのペプチド内の変異の位置も自由に選択することができる。それゆえ、すべての可能なＨＬＡ型、すべての可能なウィンドウ長およびウィンドウ内の変異に関するすべての可能な位置を精査して、ＨＡおよび／またはＨＢＵＨＣと分類される解の数（所与の変異当たりの）を計算することができる（図１２）。これは、ワクチン接種のために最も有効なエピトープを選択する変異の優先順位付けのための重要な比較検討因子であり得る。ＭｍｕｔおよびΔＭ＝Ｍｍｕｔ−Ｍｗｔの関数としてのこれらすべての解の散布図の一例を図１３に示す。
【図１】
2020103297.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月13日(2020.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌特異的変異に起因するアミノ酸修飾を含む免疫原性修飾ペプチドを予測するための方法であって、前記修飾は置換であり、
ａ）１つ以上のＭＨＣ分子への修飾ペプチドの結合に関するスコアを確認する工程、
ｂ）１つ以上のＭＨＣ分子への非修飾ペプチドの結合に関するスコアを確認する工程、および
ｃ）前記非修飾アミノ酸と修飾アミノ酸との間の化学的および物理的類似性に関するスコアを確認する工程であって、前記化学的および物理的類似性に関する前記スコアは、アミノ酸が自然界で交換される確率に基づいて確認される、工程、
を含み、
アミノ酸が自然界で交換される頻度が高いほど、前記アミノ酸をより類似するとみなし、
（ｉ）前記非修飾ペプチドが、１つ以上のＭＨＣ分子への結合を示す閾値を満たす１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関するスコアを有し、かつ（ｉｉ）前記修飾ペプチドが、１つ以上のＭＨＣ分子への結合を示す閾値を満たす１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関するスコアを有し、かつ（ｉｉｉ）前記非修飾アミノ酸および修飾アミノ酸が、化学的および物理的非類似性を示す閾値を満たす化学的および物理的類似性に関するスコアを有する場合、前記修飾ペプチドを免疫原性と予測する、
方法。
【請求項２】
前記修飾ペプチドが修飾タンパク質のフラグメントを含み、前記フラグメントが前記タンパク質中に存在する修飾を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非修飾ペプチドが、前記修飾ペプチド中の修飾の位置に対応する位置に生殖系列アミノ酸を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記非修飾ペプチドおよび修飾ペプチドが、前記修飾を除き同一である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記非修飾ペプチドおよび修飾ペプチドが、８〜１５、または８〜１２アミノ酸長である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上のＭＨＣ分子が、異なるＭＨＣ分子型を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上のＭＨＣ分子が、異なるＭＨＣ対立遺伝子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ以上のＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩ分子および／またはＭＨＣクラスＩＩ分子である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関する前記スコアを、ＭＨＣ結合モチーフのデータベースとの配列比較を含む工程によって確認する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ａ）が、前記スコアが１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関する所定の閾値を満たすかどうかを確認することを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｂ）が、前記スコアが１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関する所定の閾値を満たすかどうかを確認することを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程ａ）および工程ｂ）の両方が、前記スコアが１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関する所定の閾値を満たすかどうかを確認することを含み、工程ａ）で適用される前記閾値が工程ｂ）で適用される前記閾値と異なる、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
１つ以上のＭＨＣ分子への結合に関する前記所定の閾値が、１つ以上のＭＨＣ分子への結合の確率を反映する、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程ｃ）が、前記スコアがアミノ酸の間の前記化学的および物理的類似性に関する所定の閾値を満たすかどうかを確認することを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記化学的および物理的類似性を、進化に基づく対数オッズ行列を用いて決定する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ）前記非修飾ペプチドが、１つ以上のＭＨＣ分子に結合し、かつ（ｉｉ）前記修飾ペプチドが１つ以上のＭＨＣ分子に結合し、かつ（ｉｉｉ）前記非修飾アミノ酸および修飾アミノ酸が化学的および物理的に非類似性である場合、前記修飾または修飾ペプチドを免疫原性と予測する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記修飾が、１つ以上のＭＨＣ分子に結合するためのアンカー位置には存在しない、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
２つ以上の異なる修飾ペプチドに関して工程ａ）を実施することを含み、前記２つ以上の異なる修飾ペプチドが同じ修飾を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記同じ修飾を含む２つ以上の異なる修飾ペプチドが、修飾タンパク質の異なるフラグメントを含み、前記異なるフラグメントが、前記タンパク質中に存在する同じ修飾を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記同じ修飾を含む２つ以上の異なる修飾ペプチドが、修飾タンパク質のすべての潜在的なＭＨＣ結合フラグメントを含み、前記フラグメントが、前記タンパク質中に存在する同じ修飾を含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記同じ修飾を含む２つ以上の異なる修飾ペプチドから、１つ以上のＭＨＣ分子に結合する確率を有するまたは最も高い確率を有する修飾ペプチドを選択することをさらに含む、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記同じ修飾を含む２つ以上の異なる修飾ペプチドが、長さおよび／または修飾の位置において異なる、請求項１８から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
２つ以上の異なる修飾ペプチドに関して工程ａ）ならびに工程ｂ）およびｃ）の両方を実施することを含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記２つ以上の異なる修飾ペプチドが、同じ修飾を含むかまたは異なる修飾を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記異なる修飾が同じタンパク質中または異なるタンパク質中に存在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記異なる修飾ペプチドの２つ以上のスコアを比較することを含む、請求項１８から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
１つ以上のＭＨＣ分子への前記修飾ペプチドの結合に関するスコアを、前記非修飾アミノ酸と修飾アミノ酸との間の化学的および物理的類似性に関するスコアよりも高く重み付ける、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記非修飾アミノ酸と修飾アミノ酸との間の化学的および物理的類似性に関するスコアを、１つ以上のＭＨＣ分子への前記非修飾ペプチドの結合に関するスコアよりも高く重み付ける、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
１つ以上のタンパク質コード領域内の非同義変異を同定することをさらに含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
１つ以上の癌細胞のゲノムまたはトランスクリプトームを部分的または完全に配列決定すること、ならびに１つ以上のタンパク質コード領域内の変異を同定することによって修飾を同定する、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
１つ以上の非癌細胞のゲノムまたはトランスクリプトームを部分的または完全に配列決定することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記変異が体細胞変異である、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ワクチンの製造において使用される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ワクチンが、前記方法によって免疫原性と予測されたアミノ酸修飾または修飾ペプチドに由来する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法によって免疫原性と予測された修飾または修飾ペプチドを同定する工程を含む、ワクチンを提供するための方法。
【請求項３６】
免疫原性と予測された前記修飾もしくは修飾ペプチドを含むペプチドもしくはポリペプチド、または前記ペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸を含有するワクチンを提供する工程をさらに含む、請求項３５に記載の方法。