(57)【要約】      （修正有）【課題】大腸菌内でコードプラスミドＤＮＡと共に持続的な増殖を示し、およびＲＮＡの安定性と翻訳効率を支持することについての作用を維持する３’ポリ（Ａ）配列をコードする、３’ポリアデニルカセットの提供。【解決手段】転写の５’→３’方向に、（ａ）プロモーター；（ｂ）転写可能な核酸配列または転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列；および（ｃ）プロモーターの制御下で転写された場合、転写産物において少なくとも８０個の連続するヌクレオチド配列をコードする核酸配列であって、ポリアデニル配列内に、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの配列を含む核酸配列、を含む核酸分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写の５’→３’方向に、
（ａ）プロモーター；
（ｂ）転写可能な核酸配列または転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列；および
（ｃ）前記プロモーター（ａ）の制御下で転写された場合、転写産物において少なくとも８０個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列であって、前記転写産物中の少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列が、ポリアデニル配列内に、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの配列を含む前記ポリアデニル配列である、核酸配列
を含む核酸分子。
【請求項２】
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列が、２つ以上の連続する、ヌクレオチドの配列、好ましくは恣意的な配列であり、２つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列の最初と最後のヌクレオチドがＡヌクレオチド以外のヌクレオチドである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記核酸配列（ｃ）が、前記核酸配列（ｃ）の代わりに、前記プロモーター（ａ）の制御下で転写された場合、転写産物において少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列と同じ長さのポリアデニル配列をコードする核酸配列（ｃ）’を含む核酸分子と比較して、大腸菌での前記核酸分子の増殖時により高い安定性を示す、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列が、少なくとも９０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００個のヌクレオチドを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列が、前記ポリアデニル配列の２１位から８０位まで、好ましくは２１位から６０位まで、より好ましくは３１位から５０位までの領域内に位置する、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列に、前記ポリアデニル配列中の少なくとも２０個のＡ残基が先行するおよび／または前記ポリアデニル配列中の少なくとも２０個のＡ残基が続く、請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７】
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列が、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドの長さを有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列が、５０個未満、好ましくは３０個未満、より好ましくは２０個未満のヌクレオチドの長さを有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列が、３個より多い連続するＡ残基を含まず、好ましくは２個以下の連続するＡ残基を含み、好ましくは連続するＡ残基を全く含まない、請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記プロモーター（ａ）の制御下の前記核酸配列（ｂ）および（ｃ）が、転写されて共通の転写産物を与えることができる、請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記転写産物において少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列が３’末端に位置する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１２】
閉環状分子または直鎖状分子である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記転写可能な核酸配列がペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を含み、および転写可能な核酸配列を導入するための前記核酸配列がマルチクローニングサイトである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１４】
（ｉ）レポーター遺伝子；（ｉｉ）選択マーカー；および（ｉｉｉ）複製起点から成る群より選択される１つ以上の成員をさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１５】
特に線状化後に、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡのインビトロ転写に適する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の核酸分子を鋳型として使用して、転写によって、好ましくはインビトロ転写によって得られるＲＮＡ。
【請求項１７】
核酸分子を増殖させる方法であって、
（ｉ）請求項１から１５のいずれか一項に記載の核酸分子を提供する工程、および
（ｉｉ）前記核酸分子を大腸菌中で増殖させる工程
を含む方法。
【請求項１８】
大腸菌中で前記核酸分子を増殖させる工程が、前記核酸分子で大腸菌を形質転換する工程および前記形質転換した大腸菌を培養する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
増殖後に大腸菌から前記核酸分子を単離する工程をさらに含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＲＮＡを得る方法であって、
（ｉ）請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法に従って核酸分子を増殖させる工程、および
（ｉｉ）前記核酸分子を鋳型として使用してＲＮＡをインビトロ転写する工程
を含む方法。
【請求項２１】
ペプチドまたはタンパク質を得る方法であって、
（ｉ）請求項２０に記載の方法に従って前記ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡを得る工程、および
（ｉｉ）前記ｍＲＮＡを翻訳する工程
を含む方法。
【請求項２２】
前記核酸分子の転写の前に、前記核酸分子の切断をさらに含む工程を特徴とする、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
宿主細胞をトランスフェクトするための、請求項１６に記載のＲＮＡの使用。
【請求項２４】
前記宿主細胞が抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
ワクチン接種のための、請求項１６に記載のＲＮＡの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＲＮＡの使用は、ＤＮＡの治療的使用に関連する潜在的な安全性リスクを回避する魅力的なDNAの代替策を提供する。インビトロ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）は治療アプローチにおいて特に興味深い。ＲＮＡの治療的使用の利点には、一過性の発現および非形質転換特性が含まれる。ＲＮＡは、発現されるために核内に入る必要がなく、さらに宿主ゲノムに組み込まれることができないので、それにより発癌の危険性が排除される。ワクチン接種に使用された場合、ＲＮＡの注入は、インビボで細胞性および体液性の両方の免疫応答を誘導することができる。しかし、臨床適用のためのＲＮＡの使用は、特にＲＮＡの短い半減期によって大きく制限される。
【背景技術】
【０００２】
ＩＶＴベクターは、インビトロ転写のための鋳型として標準化された方法で使用し得る。そのようなＩＶＴベクターは、以下の構造を有し得る：ＲＮＡ転写を可能にする５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、次いで３’および／または５’側のいずれかで非翻訳領域（ＵＴＲ）が隣接する対象遺伝子、ならびにＡヌクレオチドを含有する３’ポリアデニルカセット。インビトロ転写の前に、環状プラスミドはＩＩ型制限酵素（認識配列は切断部位に対応する）によってポリアデニルカセットの下流で線状化される。ポリアデニルカセットは、したがって転写産物における後期ポリ（Ａ）配列に対応する。
【０００３】
ＲＮＡの３’ポリ（Ａ）配列は、真核生物メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の核外輸送、ＲＮＡの安定性および翻訳効率のために重要である。３’ポリ（Ａ）配列は経時的に短縮され、十分に短くなれば、ＲＮＡは酵素的に分解される。
【０００４】
我々は以前に、１２０ヌクレオチドの長さを有する３’ポリ（Ａ）配列（Ａ１２０）がＲＮＡの安定性および翻訳効率に著明な作用を及ぼし、したがって全体的なＲＮＡの有効性に有益であることを明らかにした。
【０００５】
しかし、３’ポリ（Ａ）配列（３’ポリアデニルカセット）をコードするＤＮＡ配列、すなわち一続きの連続するｄＡ：ｄＴ塩基対は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で増殖させた場合、一部の細菌サブクローンで短縮を受けることが観察されている。したがって、インビトロ転写の出発物質としてプラスミドＤＮＡを作製する前に、正しい長さの３’ポリ（Ａ）配列をコードする正しい長さの３’ポリアデニルカセットを有する単一クローンを得るために、多数の細菌クローンを、例えば適切な制限分析により３’ポリアデニルカセットの長さを決定することによって、試験しなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
大腸菌内でコードプラスミドＤＮＡと共に持続的な増殖を示し、およびＲＮＡの安定性と翻訳効率を支持することについての作用を維持する３’ポリ（Ａ）配列をコードする、３’ポリアデニルカセットを見出すことが本発明の目的であった。
【０００７】
この目的は、特許請求の範囲の主題により本発明に従って達成される。
【０００８】
本発明によれば、４個のヌクレオチド（リンカー）が等しく分布する、１０ヌクレオチドのランダムな配列による３’ポリアデニルカセット（ポリ（ｄＡ：ｄＴ）領域）の分断は、コードされるＲＮＡの機能性にごくわずかな影響しか及ぼさないが、大腸菌における３’ポリアデニルカセットの安定性を増大させることが見出された。さらに、３’ポリ（Ａ）配列内のリンカーの配列または位置のいずれもが、インビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ  ＲＮＡ）の翻訳効率および安定性の低減をもたらさなかった。
【０００９】
３’ポリ（Ａ）配列をコードするＩＶＴベクター領域の安定性試験のために、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドをポリ（ｄＡ：ｄＴ）領域の上流でクローン化した。この構築物は、５０〜６０％のポリ（ｄＡ：ｄＴ）不安定性（すなわち短縮されたポリ（ｄＡ：ｄＴ）での増殖後のクローンの割合）を示した。記述されている制限分析法を用いた詳細な分析は、３０〜５０位の領域をポリ（ｄＡ：ｄＴ）ストレッチの短縮に特に感受性であると同定した。この感受性領域に１０ヌクレオチドのランダムな配列を導入すると、ポリ（ｄＡ：ｄＴ）安定性の増大をもたらした。３０または４０個のアデノシンヌクレオチド、次いでリンカー配列およびそれぞれ別の７０または６０個のアデノシン（Ａ３０Ｌ７０およびＡ４０Ｌ６０）を有する構築物は、大腸菌中で３〜４％のポリ（ｄＡ：ｄＴ）不安定性しかもたらさなかった。結果は、いくつかの異なる大腸菌株において前記構築物を試験することによって確認された。
【００１０】
安定化されたポリ（ｄＡ：ｄＴ）尾部を担持するＤＮＡによってコードされるＩＶＴ  ＲＮＡの機能性を種々のアッセイで試験した。体細胞株だけでなく未熟樹状細胞などの免疫細胞においても、ＩＶＴ  ＲＮＡの電気穿孔は、７２時間にわたってＡ１２０と比較して翻訳能力の差を示さなかった。ルシフェラーゼをコードするＩＶＴ  ＲＮＡのマウスへの注入は、挿入された３’ポリ（Ａ）配列の種類とは無関係に等しいタンパク質翻訳を確認した。
【００１１】
種々の３’ポリ（Ａ）配列の免疫学的応答への影響を、ＳＩＩＮＦＥＫＬ  ＩＶＴ  ＲＮＡの注入後の抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の量の比較によって分析した。実験は、Ａ１２０とその安定化型Ａ３０Ｌ７０およびＡ４０Ｌ６０との間で差を示さなかった。
【００１２】
合わせて考慮すると、我々は、ポリ（ｄＡ：ｄＴ）領域の３０位と５０位の間に１０ヌクレオチドのランダムな配列を挿入することが大腸菌中で１０倍を超える配列安定化をもたらすことを示す。鋳型ＤＮＡから転写されたＲＮＡの対応する修飾３’ポリ（Ａ）配列は、古典的Ａ１２０と同じ機能性、すなわちインビボおよびインビトロでの安定性および翻訳効率を有する。加えて、免疫学的応答は修飾ポリ（Ａ）配列の使用によって変化しない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
１つの態様では、本発明は、転写の５’→３’方向に、
（ａ）プロモーター；
（ｂ）転写可能な核酸配列または転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列；および
（ｃ）プロモーター（ａ）の制御下で転写された場合、転写産物において少なくとも８０個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列であって、転写産物中の少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列が、ポリアデニル配列内に、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの配列を含むポリアデニル配列である、核酸配列
を含む核酸分子に関する。
【００１４】
１つの実施形態では、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列は、２つ以上の連続するヌクレオチドの配列、好ましくは恣意的な配列であり、ここで２つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列の最初と最後のヌクレオチドは、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【００１５】
言い換えると、本発明の核酸分子は、もっぱらＡ残基だけから成る配列をコードしない配列による少なくとも１つの分断を含む３’ポリアデニルカセット（ポリ（ｄＡ：ｄＴ）領域）を含み、すなわちポリ（ｄＡ：ｄＴ）領域は、（ｄＡ：ｄＴ）以外の塩基対を含む１つ以上のストレッチの塩基対によって分断されている。したがって、核酸配列（ｃ）は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された場合、転写産物において少なくとも８０個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードし、ここで転写産物中の少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列はポリアデニル配列であり、ここでポリアデニル配列の少なくとも１つの部分は、２つ以上の連続するヌクレオチドの配列などのＡヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する配列によって置換されており、ここで２つ以上のヌクレオチドの前記配列の最初と最後のヌクレオチドは、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドである。言い換えると、核酸配列（ｃ）は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された場合、１つ以上のヌクレオチドの１つ以上の配列ストレッチを、前記ポリアデニル配列内に散在して含有するポリアデニル配列をコードし、ここで前記配列ストレッチは各々、ＡヌクレオチドまたはＡヌクレオチドのストレッチ、すなわちオリゴＡ配列またはポリＡ配列ではない。
【００１６】
１つの実施形態では、前記核酸分子はＤＮＡ分子である。１つの実施形態では、前記核酸分子は、ＩＶＴベクターなどの発現ベクターまたはプラスミドである。
【００１７】
１つの実施形態では、前記核酸配列（ｃ）は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された場合、転写産物において少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列と同じ長さのポリアデニル配列をコードする核酸配列（ｃ）’を前記核酸配列（ｃ）の代わりに含む核酸分子と比較して、大腸菌での前記核酸分子の増殖時により高い安定性を示す。
【００１８】
１つの実施形態では、少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列は、少なくとも９０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１１０個のヌクレオチドを含む。１つの実施形態では、少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列は、約１２０個のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列は、最大で２００個まで、好ましくは１５０個まで、特に１３０個までのヌクレオチドを含む。１つの実施形態では、少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列のヌクレオチドの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９５％、９７％または９８％は、前記ポリアデニル配列中のＡヌクレオチドである（Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列中にはＡヌクレオチドを含まない）。
【００１９】
１つの実施形態では、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列は、前記ポリアデニル配列の２１位から８０位まで、好ましくは２１位から６０位まで、より好ましくは３１位から５０位までの領域内に位置する。
【００２０】
１つの実施形態では、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列の前には、前記ポリアデニル配列中の少なくとも２０個のＡ残基、好ましくは少なくとも３０、４０または５０個のＡ残基が先行する。特定の実施形態では、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列の前には、前記ポリアデニル配列中の最大で８０個までのＡ残基、好ましくは７０個または６０個までのＡ残基が先行する。
【００２１】
１つの実施形態では、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列の後には、前記ポリアデニル配列中の少なくとも２０個のＡ残基、好ましくは少なくとも３０、４０、５０、６０または７０個のＡ残基が続く。特定の実施形態では、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列の後には、前記ポリアデニル配列中の最大で１００個までのＡ残基、好ましくは８０個までのＡ残基が続く。
【００２２】
１つの実施形態では、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列の前には、前記ポリアデニル配列中の２０〜５０個、好ましくは３０〜４０個のＡ残基が先行し、および前記配列の後には、前記ポリアデニル配列中の３０〜８０個、好ましくは４０〜７０個のＡ残基が続く。
【００２３】
１つの実施形態では、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列は、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドの長さを有する。
【００２４】
１つの実施形態では、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列は、５０個未満、好ましくは３０個未満、より好ましくは２０個未満のヌクレオチドの長さを有する。
【００２５】
１つの実施形態では、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列は、３個を超える連続するＡ残基を含まず、好ましくは２個以下の連続するＡ残基を含み、好ましくは連続するＡ残基を全く含まない。
【００２６】
１つの実施形態では、プロモーター（ａ）の制御下の核酸配列（ｂ）および（ｃ）は、転写されて共通の転写産物を与えることができる。
【００２７】
１つの実施形態では、前記転写産物において少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列は３’末端に位置する。
【００２８】
１つの実施形態では、本発明の核酸分子は閉環状分子または直鎖状分子である。
【００２９】
１つの実施形態では、転写可能な核酸配列は、ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を含み、転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列はマルチクローニングサイトである。
【００３０】
１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、（ｉ）レポーター遺伝子；（ｉｉ）選択マーカー；および（ｉｉｉ）複製起点から成る群より選択される１つ以上の成員をさらに含む。
【００３１】
１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、特に線状化後に、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡのインビトロ転写に適する。
【００３２】
好ましくは、核酸配列（ｃ）から転写された核酸配列、すなわち少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列は、転写可能な核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるために、好ましくは活性である。
【００３３】
インビトロ転写の前に、環状ＩＶＴベクターは、一般にＩＩ型制限酵素（認識配列は切断部位に対応する）によってポリアデニルカセットの下流で線状化される。ポリアデニルカセットは、したがって転写産物における後期ポリ（Ａ）配列に対応する。この手順の結果として、一部のヌクレオチドは線状化後に酵素切断部位の一部として残存し、３’末端でポリ（Ａ）配列を伸長するかまたはマスクする。しかし、開放末端ポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡは、末端がマスクされたポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡよりも効率的に翻訳されることが見出された。
【００３４】
したがって、発現ベクターとして使用された場合、本発明の核酸分子は、好ましくはポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡの転写を可能にし、その前記ポリ（Ａ）配列は、好ましくは、前記ＲＮＡ中で開放末端を有する、すなわち、前記ポリ（Ａ）配列の３’末端に隣接するＡヌクレオチド以外のヌクレオチドを有するものである。ＲＮＡ中の開放末端ポリ（Ａ）配列は、ＲＮＡが５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下で転写されることを可能にするものであり、またポリアデニルカセットを含むものである発現ベクターに、ＩＩＳ型制限切断部位を導入することによって達成できる。ここでポリアデニルカセット内において、認識配列がポリアデニルカセットの下流に位置し、一方切断部位が上流に位置する。ＩＩＳ型制限切断部位での制限切断は、プラスミドをポリアデニルカセット内で線状化することを可能にする。線状化プラスミドは、その後インビトロ転写のための鋳型として使用することができ、生じる転写産物はマスクされていないポリ（Ａ）配列で終了する。
【００３５】
したがって、１つの実施形態では、本発明の核酸分子を、その切断が、転写の５’→３’方向に、プロモーター（ａ）、核酸配列（ｂ）および核酸配列（ｃ）の少なくとも一部を含む核酸分子をもたらすように核酸配列（ｃ）内で、好ましくは酵素的にまたは別の生化学的方法で切断できることが好ましく、ここで核酸配列（ｃ）の前記少なくとも一部は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された場合、転写産物において少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列をコードし、および転写産物において３’末端のヌクレオチドは、少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列のＡヌクレオチドである。
【００３６】
好ましくは、切断後、核酸分子は、少なくとも８０個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列の鋳型として働く鎖の末端に、転写産物中の少なくとも８０個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列の鋳型として働く核酸配列の一部であるＴヌクレオチドを有する。
【００３７】
本発明の核酸分子は、好ましくは、切断前は閉環状分子であり、切断後は直鎖状分子である。
【００３８】
好ましくは、切断は、好ましくはＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの制限切断部位である制限切断部位を用いて実施される。
【００３９】
１つの実施形態では、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列は、核酸配列（ｃ）の３’末端の５〜２６塩基対、好ましくは２４〜２６塩基対下流に位置する。
【００４０】
１つの実施形態では、本発明による核酸分子は閉環状立体配座であり、および好ましくは、特に線状化後に、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡのインビトロ転写に適する。
【００４１】
さらなる態様では、本発明は、上述した核酸分子の線状化によって、好ましくは核酸配列（ｃ）内の切断によって得られる核酸分子に関し、およびプロモーター（ａ）の制御下での上述した核酸分子を用いた転写、好ましくはインビトロ転写によって得られるＲＮＡに関する。
【００４２】
さらなる態様では、本発明は、
（ｉ）本発明の核酸分子を提供すること、および
（ｉｉ）前記核酸分子を大腸菌中で増殖させること
を含む、核酸分子を増殖させる方法に関する。
【００４３】
１つの実施形態では、大腸菌中で前記核酸分子を増殖させることは、前記核酸分子で大腸菌を形質転換することおよび前記形質転換した大腸菌を培養することを含む。
【００４４】
１つの実施形態では、本発明の方法は、増殖後に大腸菌から前記核酸分子を単離することをさらに含む。
【００４５】
さらなる態様では、本発明は、
（ｉ）核酸分子を増殖させる本発明の方法に従って核酸分子を増殖させること、および
（ｉｉ）前記核酸分子を鋳型として使用してＲＮＡをインビトロ転写すること
を含む、ＲＮＡを得る方法に関する。
【００４６】
さらなる態様では、本発明は、ペプチドまたはタンパク質を得る方法であって、
（ｉ）ＲＮＡを得る本発明の方法に従って前記ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡを得ること、および
（ｉｉ）ｍＲＮＡを翻訳すること
を含む方法に関する。
【００４７】
１つの実施形態では、ＲＮＡを得る方法またはペプチドもしくはタンパク質を得る方法は、核酸分子の転写の前に、核酸分子を切断することをさらに含む。
【００４８】
１つの実施形態では、切断は、このようにして得られた核酸の転写が、その３’末端に少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列を有する転写産物を生じるように核酸配列（ｃ）内で行われ、ここで前記転写産物の３’末端ヌクレオチドは、少なくとも８０個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列のＡヌクレオチドである。
【００４９】
本発明による方法のすべての態様において、切断は、好ましくは制限切断部位を用いて実施され、好ましくはＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの制限切断部位を用いて実施される。
【００５０】
１つの実施形態では、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列は、核酸配列（ｃ）の３’末端の５〜２６塩基対、好ましくは２４〜２６塩基対下流である。
【００５１】
本発明はまた、ＲＮＡを得る、本発明に従う方法によって得られるＲＮＡに関する。
【００５２】
本発明は、例えば細胞の転写および発現において組換えタンパク質の発現を増大させるために利用し得る。より具体的には、組換えタンパク質を生産する場合、細胞系での組換え核酸の転写および組換えタンパク質の発現のために本発明の発現ベクターを使用することが可能である。これには、例えば組換え抗体、ホルモン、サイトカイン、酵素等の作製が含まれる。これは、中でも特に生産コストを低減することを可能にする。
【００５３】
また、遺伝子治療適用に本発明の核酸分子を使用することも可能である。したがって、本発明の核酸分子は遺伝子治療ベクターであり得、導入遺伝子の発現のために使用し得る。この目的で、任意の核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）に基づくベクター系（例えばプラスミド、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、インフルエンザウイルスベクター、アルファウイルスベクター等）も使用し得る。例えばリンパ球もしくは樹状細胞では、インビトロで細胞をこれらのベクターでトランスフェクトすることができ、またはインビボで直接投与によってトランスフェクトすることもできる。
【００５４】
本発明のＲＮＡ（本明細書で述べる核酸分子を転写鋳型として使用して得られる）は、例えば、可能な適用分野が、インビトロで細胞にトランスフェクトされるかまたはインビボで直接投与されるＲＮＡベースのワクチンである、遺伝子の一過性発現のため、例えば細胞において分化過程を開始させるもしくはタンパク質の機能を検討するためのインビトロでの機能性組換えタンパク質の一過性発現のため、およびインビボで、特に医薬品としての、エリスロポエチン、ホルモン、凝固阻害因子等のような機能性組換えタンパク質の一過性発現のために使用し得る。
【００５５】
本発明のＲＮＡは、特に抗原提示細胞をトランスフェクトするために、したがって提示される抗原を送達するためおよび抗原提示細胞に、特に切断などの細胞内プロセシングによって、前記ＲＮＡから発現されるペプチドもしくはタンパク質に対応するかまたはそれに由来する、提示されるべき前記抗原を負荷するためのツールとして使用することができ、すなわち提示される抗原は、例えばＲＮＡから発現されるペプチドまたはタンパク質のフラグメントである。そのような抗原提示細胞は、Ｔ細胞、特にＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激するために使用し得る。
【００５６】
したがって、さらなる態様では、本発明は、宿主細胞をトランスフェクトための本発明のＲＮＡの使用に関する。１つの実施形態では、宿主細胞は抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである。
【００５７】
さらなる態様では、本発明は、ワクチン接種のための本発明のＲＮＡに使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
［図１］ポリ（ｄＡ：ｄＴ）安定性に関する半自動スクリーニング
ポリ（ｄＡ：ｄＴ）領域を有するプラスミドＤＮＡを担持する９６個の大腸菌クローンを採取し、９６ウェルプレートの１．４ｍＬ中に１４〜１６時間接種した（３７℃、２２５ｒｐｍ）。細菌培養懸濁液を採取し、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ９６ｗｅｌｌ  ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  ＆  Ｎａｇｅｌ）を製造者のプロトコルに従って使用してプラスミドＤＮＡを精製した。プラスミドＤＮＡ濃度を紫外分光法（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定した。ポリ（ｄＡ：ｄＴ）の完全性をＳａｃＩ制限分析（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によって判定した。生じたフラグメントを自動キャピラリーゲル電気泳動（Ｑｉａｇｅｎ）で分離した。
【図１Ａ】８個のクローンのポリ（ｄＡ：ｄＴ）分析の例。２５ｂｐおよび５００ｂｐの内部サイズマーカーのバンドを黒い星印で示す。１４２ｂｐおよび２７０ｂｐの正しい長さのポリ（ｄＡ：ｄＴ）配列についての予想されるバンドを黒い矢印で示す。クローン１およびクローン４は、赤い星印で示した、短縮ポリ（ｄＡ：ｄＴ）配列から生じる付加的なバンドを示す。
【図１Ｂ】５’非翻訳領域（５ＵＴＲ）、対象とする遺伝子（ＧＯＩ）、３’非翻訳領域（３ＵＴＲ）およびポリ（Ａ）尾部（Ａ１２０）から成るｍＲＮＡをコードするベクターマップの例。ＳａｃＩ制限部位を表示し、ＳａｃＩとのインキュベーション後のフラグメントの長さを示している。
【図２】種々のポリ（ｄＡ：ｄＴ）構築物の安定性  各々のポリ（ｄＡ：ｄＴ）構築物の９６個の大腸菌クローンのプラスミドＤＮＡを精製し、ＳａｃＩ制限分析を実施した。構築物名：Ａ＋数：リンカー配列の５’側のアデノシンの数＋Ｌ：リンカー配列＋数：リンカー配列の３’側のアデノシンの数。短縮ポリ（ｄＡ：ｄＴ）配列を有するクローンを決定し、大腸菌クローンの総数のパーセントとして示している。
【図３】種々の大腸菌株におけるポリ（ｄＡ：ｄＴ）構築物の安定性  大腸菌株ＴＯＰ１０、ＤＨ５αおよびＸＬ１−ｂｌｕｅを、ＳａｃＩ制限分析によるポリ（ｄＡ：ｄＴ）完全性試験に使用した。構築物Ａ１２０、Ａ３０Ｌ７０およびＡ４０Ｌ６０についての９６個のクローンを試験した。短縮ポリ（ｄＡ：ｄＴ）配列を有するクローンの数を総数のパーセントで示している。                                      ［図４］種々のポリ（Ａ）尾部の機能的インビトロ特徴付け  Ａ１２０、Ａ３０Ｌ７０またはＡ４０Ｌ６０のいずれかを含むホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドを、クラスＩＩＳ制限酵素を用いてポリ（ｄＡ：ｄＴ）の下流で線状化し、それによってポリ（ｄＡ：ｄＴ）以降に付加的なヌクレオチドを有さない鋳型を作製した。線状化プラスミドＤＮＡを、カルボキシル化磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製し、分光光度法で定量化して、インビトロ転写に供した。インビトロ転写のために、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、それぞれの反応緩衝液および６ｍＭ  ＮＴＰを使用した。ＲＮＡの効率的なキャッピングのために、ＧＴＰ濃度を１．５ｍＭに下げ、６ｍＭのβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）を反応物に添加して、３７℃で２時間半インキュベートした。ＲＮＡをカルボキシル化磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって精製し、ＲＮＡ濃度および品質を分光測光法および２１００  Ｂｉｏｎａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）での分析によって評価した。
【図４Ａ】１×１０６のヒト未熟樹状細胞（ｉＤＣ）を１０ｐｍｏｌのＲＮＡと混合し、電気穿孔に供した。５×１０４細胞を２４ウェル皿において添加物を含むＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）に接種した。接種後２、４、８、２４、４８および７２時間目に、蛍光リーダー（ＴＥＣＡＮ）においてＬｕｃｉｆｅｒｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加することによってホタルルシフェラーゼ活性を測定した。
【図４Ｂ】１×１０６のヒト線維芽細胞（ＣＣＤ）を１０ｐｍｏｌのＲＮＡと混合し、電気穿孔に供した。５×１０４細胞を２４ウェル皿において添加物を含むＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）に接種した。接種後２、４、８、２４、４８および７２時間目に、蛍光リーダー（ＴＥＣＡＮ）においてＬｕｃｉｆｅｒｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加することによってホタルルシフェラーゼ活性を測定した。
【図４Ｃ】１×１０６のマウス筋芽細胞腫細胞（Ｃ２Ｃ１２）を１０ｐｍｏｌのＲＮＡと混合し、電気穿孔に供した。５×１０４細胞を２４ウェル皿において添加物を含むＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）に接種した。接種後２、４、８、２４、４８および７２時間目に、蛍光リーダー（ＴＥＣＡＮ）においてＬｕｃｉｆｅｒｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加することによってホタルルシフェラーゼ活性を測定した。    ［図５］種々のポリ（Ａ）尾部の機能的インビボ特徴付け  ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）に、ルシフェラーゼをコードし、種々のポリ（Ａ）尾部Ａ１２０、Ａ３０Ｌ７０またはＡ４０Ｌ６０を担持するＲＮＡ  ２０μｇ（Ｌｕｃ−ＲＮＡ）を含有するＲＮＡ−リポプレックスを静脈内注射した。Ｌｕｃ−ＲＮＡの取込みと翻訳を、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたインビボ生物発光イメージングによって評価した。簡単に述べると、Ｄ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ体重）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の水溶液をＲＮＡリポプレックスの投与の６時間後にｉ．ｐ．注射した。その５分後、放射された光子を定量化した（積分時間１分）。対象とする領域におけるインビボ生物発光を、ＩＶＩＳ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウェアを用いて平均放射輝度（ｐ［光子］／秒／ｃｍ２／ｓｒ［ステラジアン］）として定量化した。動物の体内のルシフェラーゼ発現細胞から生じる透過光の強度をカラースケール画像として表し、青色は最も弱く、赤色は最も強い生物発光シグナルである。マウスのグレースケール参照画像をＬＥＤ微光照明下で得た。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウェアを用いて画像を重ね合わせた。ルシフェラーゼシグナルを４８時間にわたって観測した。
【図５Ａ】マウスの脾臓におけるルシフェラーゼ活性を示す。
【図５Ｂ】４８時間にわたって観測した累積ルシフェラーゼシグナルの定量化。    ［図６］種々のポリ（Ａ）尾部の免疫学的応答の比較  Ｃ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝５）を、０日目および３日目に種々のポリ（Ａ）尾部Ａ１２０、Ａ３０Ｌ７０またはＡ４０Ｌ６０を担持するＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドをコードするＲＮＡ  ２０μｇを含有するＲＮＡ−リポプレックスにより静脈内経路で２組ずつ免疫した。抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度を、最後の免疫の５日後（８日目）にＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＭＨＣ四量体染色によって末梢血中で測定した。簡単に述べると、低張溶解した血液試料を抗ＣＤ８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＨ−２  Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ四量体（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）と共に４℃でインキュベートし、洗浄して非結合抗体を除去した後、フローサイトメトリ分析に供した。ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ分析フローサイトメータでフローサイトメトリデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）ソフトウェアを用いることによって分析した。ＲＮＡプロフィールを、ポリ（Ａ）尾部Ａ４０Ｌ６０、Ａ３０Ｌ７０およびＡ１２０をそれぞれ担持するルシフェラーゼをコードするＲＮＡの２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒから得た。
【図６Ａ】抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のゲーティング戦略。
【図６Ｂ】ＣＤ８＋  Ｔ細胞中の抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明を以下で詳細に説明するが、本発明は、本明細書で述べる特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および学術用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００６０】
以下において、本発明の要素を説明する。これらの要素を具体的な実施形態と共に列挙するが、それらを任意の方法および任意の数で組み合わせて付加的な実施形態を創製し得ることが理解されるべきである。様々に説明される実施例および好ましい実施形態は、本発明を明確に説明される実施形態だけに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明確に説明される実施形態を任意の数の開示されるおよび／または好ましい要素と組み合わせた実施形態を裏付け、包含することが理解されるべきである。さらに、本出願で述べるすべての要素の任意の順序および組合せは、文脈上特に指示されない限り、本出願の説明によって開示されるとみなされるべきである。例えば、１つの好ましい実施形態においてＡヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの配列の前に、前記ポリアデニル配列中の少なくとも２０個のＡ残基が先行する場合、および別の好ましい実施形態においてＡヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの配列の後に、前記ポリアデニル配列中の少なくとも２０個のＡ残基が続く場合、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの配列の前に前記ポリアデニル配列中の少なくとも２０個のＡ残基が先行し、および前記ヌクレオチドの配列の後に前記ポリアデニル配列中の少なくとも２０個のＡ残基が続くことが、企図される好ましい実施形態である。
【００６１】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、“Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）”，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ  Ｈ．  Ｋｏｅｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載されているように定義される。
【００６２】
本発明の実施は、特に指示されない限り、当該分野の文献中で説明される化学、生化学、細胞生物学、免疫学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  １９８９参照）。
【００６３】
本明細書および以下の特許請求の範囲全体を通して、文脈上特に必要とされない限り、「含む」という語および「含むこと」などの変形は、記述される成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の包含を意味するが、いかなる他の成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の排除も意味しないことが理解される。本発明の説明に関連して（特に特許請求の範囲に関連して）使用される「１つの」および「その」という用語および同様の言及は、本明細書で特に指示されない限りまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を含むと解釈されるべきである。本明細書中の数値の範囲の列挙は、単に範囲内に属する各々別々の数値を個別に言及することの簡略化した方法としての役割を果たすことが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各々個別の数値は、本明細書で個別に列挙されるがごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書で述べるすべての方法は、本明細書で特に指示されない限りまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的な言語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することが意図されており、特に記載されない限り特許請求される本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に必須の特許請求されない要素を指示すると解釈されるべきではない。
【００６４】
いくつかの資料が本明細書の本文全体にわたって引用される。上記または下記で、本明細書において引用される資料（すべての特許、特許出願、学術出版物、製造者の仕様書、指示書等を含む）の各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明を理由にそのような開示に先行する権利を有さないことの承認と解釈されるべきではない。
【００６５】
本発明は、大腸菌中で短縮を受けることなく持続的な増殖を示す修飾された３’ポリ（ｄＡ：ｄＴ）カセット（修飾された３’ポリ（Ａ）配列をコードする）を含むＲＮＡ発現ベクターとして有用なＤＮＡプラスミドなどの核酸分子を説明する。
【００６６】
大腸菌は、温血生物の大腸で一般的に認められるエシェリキア属のグラム陰性、通性嫌気性の杆菌である。この細菌は研究室環境で容易におよび安価に増殖させることができ、６０年以上にわたって集中的に研究されてきた。大腸菌は最も広く検討されているモデル原核生物であり、生物工学および微生物学の分野において重要な種であって、これらの分野で大腸菌は組換えＤＮＡに関する研究の大部分に宿主生物としての役割を果たしてきた。本発明に従う大腸菌株には以下のものが含まれる：ＡＧ１、ＡＢ１１５７、Ｂ２１５５、ＢＬ２１、ＢＮＮ９３、ＢＮＮ９７、ＢＷ２６４３４、Ｃ６００、ＣＳＨ５０、Ｄ１２１０、ＤＢ３．１、ＤＨ１、ＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ１２Ｓ、ＤＭ１、Ｅ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）、大腸菌Ｋ１２  ＥＲ２７３８、ＥＲ２５６６、ＥＲ２２６７、ＨＢ１０１、ＩＪ１１２６、ＩＪ１１２７、ＪＭ８３、ＪＭ１０１、ＪＭ１０３、ＪＭ１０５、ＪＭ１０６、ＪＭ１０７、ＪＭ１０８、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、ＪＭ２．３００、ＬＥ３９２、Ｍａｃｈ１、ＭＣ１０６１、ＭＣ４１００、ＭＦＤｐｉｒ、ＭＧ１６５５、ＯｍｎｉＭＡＸ２、ＲＲ１、ＲＶ３０８、ＳＯＬＲ、ＳＳ３２０、ＳＴＢＬ２、ＳＴＢＬ３、ＳＴＢＬ４、ＳＵＲＥ、ＳＵＲＥ２、ＴＧ１、ＴＯＰ１０、Ｔｏｐ１０Ｆ’、Ｗ３１１０、ＷＭ３０６４、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−ＲｅｄおよびＸＬ１０−Ｇｏｌｄ。
【００６７】
本発明によれば、核酸分子または核酸配列とは、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である核酸を指す。本発明によれば、核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え作製された分子および化学合成された分子を含む。本発明によれば、核酸は、一本鎖または二本鎖の、直鎖状または共有結合閉環状分子の形態であり得る。
【００６８】
本発明に関連して、「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含有し、好ましくは完全にまたは実質的にリボヌクレオチド残基から成る分子に関する。「リボヌクレオチド」という用語は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２’位置にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。「ＲＮＡ」という用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的にまたは完全に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、基本的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ならびに１個以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変化によって天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾されたＲＮＡなどの組換え生成されたＲＮＡを含む。そのような変化には、例えばＲＮＡの末端へのまたは内部での、例えばＲＮＡの１個以上のヌクレオチドにおける非ヌクレオチド物質の付加が含まれ得る。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドには、天然には存在しないヌクレオチドまたは化学合成ヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドなどの、非標準ヌクレオチドも含まれ得る。これらの変化したＲＮＡは、類似体、特に天然に存在するＲＮＡの類似体と称され得る。本発明によれば、ＲＮＡはｍＲＮＡを包含する。
【００６９】
「ｍＲＮＡ」という用語は「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡ鋳型を使用することによって生成され、ペプチドまたはタンパク質をコードする「転写産物」に関する。典型的には、ｍＲＮＡは、５’−ＵＴＲ、タンパク質コード領域および３’−ＵＴＲを含む。ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からインビトロ転写によって生成され得る。インビトロ転写の方法は当業者に公知である。例えば、様々なインビトロ転写キットが市販されている。本発明によれば、ｍＲＮＡは、本発明による修飾に加えて、さらなる安定化修飾およびキャップ形成によって修飾され得る。
【００７０】
１つの実施形態では、「修飾」という用語は、ＲＮＡに５’キャップまたは５’キャップ類似体を与えることに関する。「５’キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に認められるキャップ構造を指し、一般に独特の５’−５’三リン酸結合によってｍＲＮＡに連結されたグアノシンヌクレオチドから成る。１つの実施形態では、このグアノシンは７位でメチル化されている。「従来の５’キャップ」という用語は、天然に存在するＲＮＡの５’キャップ、好ましくは７−メチルグアノシンキャップ（ｍ７Ｇ）を指す。本発明に関連して、「５’キャップ」という用語は、ＲＮＡキャップ構造に類似し、好ましくはインビボおよび／または細胞中で、ＲＮＡに結合した場合ＲＮＡを安定化する能力を有するように修飾されている５’キャップ類似体を包含する。ＲＮＡに５’キャップまたは５’キャップ類似体を与えることは、前記５’キャップまたは５’キャップ類似体の存在下でのＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって達成することができ、この場合前記５’キャップは生成されたＲＮＡ鎖に共転写的に組み込まれ、またはＲＮＡは、例えばインビトロ転写によって生成することができ、５’キャップは、キャッピング酵素、例えばワクシニアウイルスのキャッピング酵素を用いて転写後に生成し得る。
【００７１】
本発明による「核酸」という用語はまた、ヌクレオチド塩基、糖またはリン酸における核酸の化学的誘導体ならびに非天然のヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含有する核酸も含む。
【００７２】
本発明によれば、「核酸配列に由来する核酸配列」とは、それが由来する核酸と比較して、単一または複数のヌクレオチド置換、欠失および／または付加を含む核酸を指す。好ましくは、前記核酸の間にはある程度の相同性が存在し、および前記核酸のヌクレオチド配列は有意の直接的または相補的な方法で対応する。本発明によれば、核酸に由来する核酸は、それが由来する核酸の機能的特性を有する。そのような機能的特性には、特に、ＲＮＡに転写され得る核酸（転写可能な核酸配列）との機能的連結において、完全なＲＮＡ分子中でこの核酸から生成されるＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を高める能力が含まれる。
【００７３】
本発明によれば、「機能的連結」または「機能的に連結された」は、機能的関係の範囲内での連結に関する。核酸は、別の核酸配列と機能的に関連している場合、「機能的に連結されて」いる。例えば、プロモーターは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、前記コード配列に機能的に連結されている。機能的に連結された核酸は、該当する場合はさらなる核酸配列によって隔てられて、典型的には互いに隣接しており、特定の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されて、単一ＲＮＡ分子（共通転写産物）を生じる。
【００７４】
本発明に従って述べる核酸は、好ましくは単離されている。「単離された核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が、（ｉ）インビトロで、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産された、（ｉｉｉ）例えば切断とゲル電気泳動による分画によって精製された、または（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。単離された核酸は、組換えＤＮＡ技術による操作に利用可能な核酸である。
【００７５】
核酸は、２つの配列が互いにハイブリダイズして、安定な二重鎖を形成することができる場合、別の核酸に「相補的」であり、前記ハイブリダイゼーションは、好ましくはポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件（ストリンジェント条件）下で実施される。ストリンジェント条件は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されており、および、例えばハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中６５℃でのハイブリダイゼーションを指す。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが転写された膜を、例えば２×ＳＳＣ中室温で、次に０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中６８℃までの温度で洗浄する。
【００７６】
本発明によれば、相同な核酸は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチドを有する。
【００７７】
「％同一」という用語は、比較する２つの配列間の最適なアライメントにおいて同一であるヌクレオチドのパーセントを指すことが意図されており、前記パーセントは純粋に統計学的であって、前記２つの配列間の相違は、配列の全長にわたってランダムに分布していてもよく、また２つの配列間の最適アライメントを得るために、比較する配列は参照配列に比べて付加または欠失を含んでいてもよい。２つの配列の比較は通常、対応する配列の局所領域を同定するために、最適なアライメント後に前記配列をセグメントまたは「比較ウィンドウ」に関して比較することによって実施される。比較のための最適なアライメントは、手操作でまたはＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２による局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３による局所相同性アルゴリズムおよびＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４による類似性検索アルゴリズムを用いて、または前記アルゴリズムを使用したコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）を援用して実施し得る。
【００７８】
同一性パーセントは、比較する配列が一致する同一位置の数を決定し、この数を比較した位置の数で除して、この結果に１００を乗じることによって得られる。
【００７９】
例えば、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉで入手できるＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ  ２配列」を使用し得る。
【００８０】
「核酸の３’末端」とは、本発明によれば、遊離ヒドロキシ基を有するその末端を指す。二本鎖核酸、特にＤＮＡの図式表示では、３’末端は常に右側にある。「核酸の５’末端」とは、本発明によれば、遊離リン酸基を有するその末端を指す。二本鎖核酸、特にＤＮＡの図式表示では、５’末端は常に左側にある。
５’末端      ５’−−Ｐ−ＮＮＮＮＮＮＮ−ＯＨ−３’    ３’末端
３’−ＨＯ−ＮＮＮＮＮＮＮ−Ｐ−−５’
【００８１】
特定の実施形態では、核酸は、本発明によれば、その核酸に相同であってもよくまたは異種であってもよい発現制御配列に機能的に連結されている。
【００８２】
転写可能な核酸配列、特にペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列と発現制御配列は、それらが、転写可能な、および特にコード核酸配列の転写または発現が前記発現制御配列の制御下または影響下にあるように互いに共有結合されている場合、互いに「機能的に」連結されている。核酸配列が機能的ペプチドまたはタンパク質に翻訳される場合、そのコード配列に機能的に連結された発現制御配列の誘導は、コード配列にフレームシフトを引き起こすことなくまたはコード配列が所望のタンパク質もしくはペプチドに翻訳されるのを不可能にすることなく、前記コード配列の転写をもたらす。
【００８３】
「発現制御配列」という用語は、本発明によれば、プロモーター、リボソーム結合配列および遺伝子の転写または誘導されるＲＮＡの翻訳を制御する他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施形態では、発現制御配列は調節され得る。発現制御配列の厳密な構造は種または細胞型に依存して異なり得るが、通常は、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等のような、それぞれ転写および翻訳を開始することに関与する５’非転写配列ならびに５’および３’非翻訳配列を含む。より具体的には、５’非転写発現制御配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を包含するプロモーター領域を含む。発現制御配列はまた、エンハンサー配列または上流活性化配列も含み得る。
【００８４】
本明細書で特定される核酸配列、特に転写可能なおよびコード核酸配列は、前記核酸配列に相同であってもよくまたは異種であってもよい任意の発現制御配列、特にプロモーターと組み合わせてもよく、「相同」という用語は、核酸配列が天然でも発現制御配列に機能的に連結されているという事実を表し、「異種」という用語は、核酸配列が天然では発現制御配列に機能的に連結されていないという事実を表す。
【００８５】
「プロモーター」または「プロモーター領域」という用語は、遺伝子のコード配列の上流（５’）のＤＮＡ配列であって、ＲＮＡポリメラーゼの認識および結合部位を提供することによって前記コード配列の発現を制御するＤＮＡ配列を指す。プロモーター領域は、前記遺伝子の転写を調節することに関与するさらなる因子のためのさらなる認識または結合部位を含み得る。プロモーターは原核生物または真核生物遺伝子の転写を制御し得る。プロモーターは、「誘導的」であり得、誘導物質に応答して転写を開始させ得るか、または転写が誘導物質によって制御されない場合は「構成的」であり得る。誘導的プロモーターは、誘導物質が存在しない場合は、極めてわずかな程度にしか発現されないかまたは全く発現されない。誘導物質の存在下では、遺伝子は「スイッチが入る」かまたは転写のレベルが上昇する。これは通常、特定の転写因子の結合によって媒介される。
【００８６】
本発明による好ましいプロモーターの例は、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ポリメラーゼのプロモーターである。
【００８７】
本発明によれば、「発現」という用語は、その最も一般的な意味で使用され、ＲＮＡの産生またはＲＮＡとタンパク質の産生を含む。この用語はまた、核酸の部分的発現も含む。さらに、発現は一過性であってもよくまたは安定であってもよい。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、メッセンジャーＲＮＡの鎖がペプチドまたはタンパク質を作製するようにアミノ酸の配列の構築を指令する、細胞のリボソームにおける過程に関する。
【００８８】
「転写されて共通の転写産物を生じることができる核酸配列」という用語は、前記核酸配列が、該当する場合は前記核酸配列を含む核酸分子、特に閉環状核酸分子の制限酵素切断などの線状化後に、プロモーターの制御下での転写が、該当する場合はその間に位置する配列によって隔てられて、互いに共有結合された前記核酸配列の転写産物を含むＲＮＡ分子を生じるように、互いに機能的に連結されていることを意味する。
【００８９】
本発明に関連して、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列中の遺伝暗号がＲＮＡに転写される過程に関する。その後、ＲＮＡはタンパク質へと翻訳され得る。本発明によれば、「転写」という用語は「インビトロ転写」を包含し、ここで「インビトロ転写」という用語は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが無細胞系でインビトロ合成される過程に関する。好ましくは、クローニングベクターが転写産物の生成に適用される。これらのクローニングベクターは、一般に転写ベクターと称され、本発明によれば「ベクター」という用語に包含される。本発明によれば、ＲＮＡは、好ましくはインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって入手し得る。転写を制御するためのプロモーターは、任意のＲＮＡポリメラーゼの任意のプロモーターであり得る。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって入手し得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって入手し得る。
【００９０】
「核酸配列から転写された核酸配列」という用語は、前者の核酸配列の転写産物である、該当する場合は完全なＲＮＡ分子の一部としての、ＲＮＡを指す。
【００９１】
「核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるために活性である核酸配列」という用語は、第一の核酸配列が、第二の核酸配列との共通転写産物において、前記第二核酸配列の翻訳効率および／または安定性が前記第一核酸配列の不在下での前記第二核酸配列の翻訳効率および／または安定性に比べて上昇するように、前記第二核酸配列の翻訳効率および／または安定性を修飾することができることを意味する。これに関連して、「翻訳効率」という用語は、特定の期間内にＲＮＡ分子によって提供される翻訳産物の量に関し、「安定性」という用語は、ＲＮＡ分子の半減期に関する。
【００９２】
ＲＮＡ分子において、特にヒトβ−グロビン遺伝子の２つの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）が、２つの個々のＵＴＲを使用して予測される全体的効果を明らかに上回るように翻訳効率を改善することが実証されている。
【００９３】
ＲＮＡの修飾ならびにそれによる安定化および／または翻訳効率の増大は、本発明によれば、本発明の発現核酸分子を、発現ベクターとして使用した場合に、その３’末端に、好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードする配列（オープンリーディングフレーム）とポリ（Ａ）配列またはＡヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの配列を含むポリ（Ａ）配列との間に、２つ以上の３’非翻訳領域を有するＲＮＡの転写を可能にするように遺伝的に修飾することによって達成され得る。
【００９４】
したがって、本発明の核酸分子は、好ましくは核酸配列（ｂ）と核酸配列（ｃ）の間に、２つ以上の核酸配列を含んでもよく、前記２つ以上の核酸配列の各々は、遺伝子の３’非翻訳領域に対応するかまたはそれに由来する。前記２つ以上の核酸配列は同一であってもよくまたは異なっていてもよい。好ましい実施形態では、前記２つ以上の核酸配列は、互いに独立して、α２グロビン、α１グロビン、βグロビンおよび成長ホルモン、好ましくはヒトβグロビンなどのグロビン遺伝子から成る群より選択される遺伝子に由来する。
【００９５】
３’非翻訳領域は、タンパク質コード領域の終止コドンの下流の、遺伝子の３’末端に位置し、転写されるがアミノ酸配列に翻訳されない領域に関する。
【００９６】
本発明によれば、第一ポリヌクレオチド領域は、前記第一ポリヌクレオチド領域の５’末端が第二ポリヌクレオチド領域の３’末端に最も近い前記第一ポリヌクレオチド領域の一部である場合、前記第二ポリヌクレオチド領域の下流に位置するとみなされる。
【００９７】
３’非翻訳領域は、典型的には翻訳産物の終止コドンから、通常は転写過程後に付加されるポリ（Ａ）配列へと伸びる。哺乳動物ｍＲＮＡの３’非翻訳領域は、典型的にはＡＡＵＡＡＡヘキサヌクレオチド配列として公知の相同性領域を有する。この配列はおそらくポリ（Ａ）付加シグナルであり、ポリ（Ａ）付加部位の１０〜３０塩基上流に位置することが多い。
【００９８】
３’非翻訳領域は、エキソリボヌクレアーゼに対するバリアとして働くかまたはＲＮＡの安定性を高めることが公知のタンパク質（例えばＲＮＡ結合タンパク質）と相互作用するステム−ループ構造が生じるように折りたたむことができる１つ以上の逆方向反復を含み得る。
【００９９】
５’および／または３’非翻訳領域は、本発明によれば、転写可能な、特にコード核酸と、前記転写可能な核酸から転写されたＲＮＡの安定性および／または翻訳効率が上昇するようにこれらの領域を前記核酸と結合させるために、機能的に連結され得る。
【０１００】
免疫グロブリンｍＲＮＡの３’非翻訳領域は比較的短く（約３００ヌクレオチドより短い）が、他の遺伝子の３’非翻訳領域は比較的長い。例えばｔＰＡの３’非翻訳領域は約８００ヌクレオチドの長さであり、第ＶＩＩＩ因子の３’非翻訳領域は約１８００ヌクレオチドの長さであり、およびエリスロポエチンの３’非翻訳領域は約５６０ヌクレオチドの長さである。
【０１０１】
本発明によれば、３’非翻訳領域またはそれに由来する核酸配列がＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を高めるかどうかは、前記３’非翻訳領域またはそれに由来する核酸配列を遺伝子の３’非翻訳領域に組み込み、前記組込みが合成されるタンパク質の量を増大させるかどうかを測定することによって判定することができる。
【０１０２】
上記の内容は、したがって、本発明に従って核酸が２つ以上の３’非翻訳領域を含み、前記２つ以上の３’非翻訳領域が、好ましくは、その間にリンカーが存在してまたは存在せずに、好ましくは「ヘッド・トゥ・テール関係」（すなわち３’非翻訳領域は同じ配向、好ましくは核酸において天然に存在する配向を有する）で、連続的に結合されている場合に適用される。
【０１０３】
本発明によれば、「遺伝子」という用語は、１つ以上の細胞産物を産生するおよび／または１つ以上の細胞間もしくは細胞内機能を達成する役割を担う特定の核酸配列を指す。より具体的には、前記用語は、特定のタンパク質または機能ＲＮＡ分子もしくは構造ＲＮＡ分子をコードする核酸を含むＤＮＡの部分に関する。
【０１０４】
ポリアデニル化とは、一次転写産物ＲＮＡにポリ（Ａ）配列または尾部を付加することである。ポリ（Ａ）配列は複数のアデノシン一リン酸から成る。言い換えると、ポリ（Ａ）配列はアデニン塩基だけを有する一続きのＲＮＡである。真核生物では、ポリアデニル化は、翻訳のために成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を産生する過程の一部である。ポリアデニル化は、それゆえ、遺伝子発現のより大きな過程の一部を形成する。ポリアデニル化の過程は、遺伝子の転写が終了するまたは終結すると共に開始される。新たに作製されたプレｍＲＮＡの３’末端セグメントが最初に１セットのタンパク質によって切断される；次にこれらのタンパク質がＲＮＡの３’末端にポリ（Ａ）配列を合成する。ポリ（Ａ）配列は、ｍＲＮＡの核外輸送、翻訳および安定性のために重要である。前記配列は経時的に短縮され、十分に短くなったとき、ｍＲＮＡは酵素的に分解される。
【０１０５】
「ポリアデニル配列」、「ポリ（Ａ）配列」または「ポリ（Ａ）尾部」という用語は、典型的にはＲＮＡ分子の３’末端に位置するアデニル残基の配列を指す。本発明は、コード鎖に相補的な鎖中の反復チミジル残基に基づくＤＮＡ鋳型を介したＲＮＡ転写の間に付加されるそのような配列を提供するが、前記配列は通常ＤＮＡにはコードされておらず、核内で転写後に鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡの自由３’末端に付加される。「Ａヌクレオチド」または「Ａ」という用語はアデニル残基を指す。
【０１０６】
好ましい実施形態では、本発明による核酸分子はベクターである。「ベクター」という用語は、本明細書ではその最も一般的な意味で使用され、例えば核酸が原核生物および／または真核生物の宿主細胞に導入され、該当する場合は、ゲノムに組み込まれることを可能にする、前記核酸のための任意の中間ビヒクルを含む。そのようなベクターは、好ましくは細胞内で複製されるおよび／または発現される。ベクターは、プラスミド、ファージミドまたはウイルスゲノムを含む。「プラスミド」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる染色体外遺伝物質の構築物、通常は環状ＤＮＡ二本鎖に関する。
【０１０７】
本発明によれば、「宿主細胞」という用語は、外因性核酸で形質転換またはトランスフェクションすることができる任意の細胞を指す。「宿主細胞」という用語は、本発明によれば、原核細胞（例えば大腸菌）または真核細胞（例えば酵母細胞および昆虫細胞）を含む。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、霊長動物由来の細胞などの哺乳動物細胞が特に好ましい。細胞は多様な組織型に由来してよく、一次細胞および細胞株を含む。具体的な例としては、ケラチノサイト、末梢血白血球、骨髄幹細胞および胚性幹細胞が含まれる。他の実施形態では、宿主細胞は抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである。核酸は１コピーまたは数コピーで宿主細胞中に存在してよく、１つの実施形態では宿主細胞内で発現される。
【０１０８】
本発明によれば、「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合によって互いに連結された２つ以上、好ましくは３以上、好ましくは４以上、好ましくは６以上、好ましくは８以上、好ましくは１０以上、好ましくは１３以上、好ましくは１６以上、好ましくは２０以上、および好ましくは最大で５０まで、好ましくは１００までまたは好ましくは１５０までの連続するアミノ酸を含む物質を指す。
【０１０９】
「タンパク質」という用語は、大きなペプチド、好ましくは少なくとも１５１個のアミノ酸を有するペプチドを指すが、「ペプチド」と「タンパク質」という用語は、本明細書では通常同義語として使用される。「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本発明によれば、アミノ酸成分だけでなく、糖およびリン酸構造体などの非アミノ酸成分も含有する物質を含み、またエステル結合、チオエーテル結合またはジスルフィド結合などの結合を含有する物質も含む。
【０１１０】
本発明によれば、ＲＮＡなどの核酸は、ペプチドまたはタンパク質をコードし得る。したがって、転写可能な核酸配列またはその転写産物は、ペプチドまたはタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み得る。前記核酸は、コードされるペプチドまたはタンパク質を発現し得る。例えば前記核酸は、抗原または免疫学的に活性な化合物（好ましくは抗原ではない）などの医薬的に活性なペプチドもしくはタンパク質をコードし、発現する核酸であり得る。
【０１１１】
本発明によれば、「ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸」という用語は、核酸が、適切な環境、好ましくは細胞内に存在する場合、翻訳の過程の間にペプチドまたはタンパク質を産生するようにアミノ酸の構築を指令できることを意味する。好ましくは、本発明に従うＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質の翻訳を可能にする細胞翻訳機構と相互作用することができる。
【０１１２】
本発明によれば、１つの実施形態では、ＲＮＡは、医薬的に活性なＲＮＡを含むまたは医薬的に活性なＲＮＡから成る。「医薬的に活性なＲＮＡ」とは、医薬的に活性なペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡであり得る。
【０１１３】
「医薬的に活性なペプチドまたはタンパク質」は、治療有効量で被験体に投与された場合、被験体の状態または疾患状態にプラスのまたは有益な作用を及ぼす。好ましくは、医薬的に活性なペプチドまたはタンパク質は治療特性または緩和特性を有しており、疾患または障害の１つ以上の症状の重症度を改善する、緩和する、軽減する、逆転させる、発症を遅らせるまたは重症度を減少させるために投与され得る。医薬的に活性なペプチドまたはタンパク質は予防特性を有していてもよく、疾患の発症を遅らせるためまたはそのような疾患もしくは病的状態の重症度を減少させるために使用され得る。「医薬的に活性なペプチドまたはタンパク質」という用語は、タンパク質またはポリペプチド全体を包含し、医薬的に活性なそのフラグメントも意味し得る。前記用語はまた、ペプチドまたはタンパク質の医薬的に活性な類似体も包含し得る。「医薬的に活性なペプチドまたはタンパク質」という用語は、抗原であるペプチドおよびタンパク質、すなわちペプチドまたはタンパク質の被験体への投与が、被験体において治療的であり得るまたは部分的もしくは完全に保護的であり得る免疫応答を誘発するペプチドおよびタンパク質を包含する。
【０１１４】
医薬的に活性なタンパク質の例には、サイトカインおよび免疫系タンパク質、例えば免疫学的に活性な化合物（例えばインターロイキン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、インテグリン、アドレシン、セレチン、ホーミング受容体、Ｔ細胞受容体、免疫グロブリン、可溶性主要組織適合遺伝子複合体抗原、免疫学的に活性な抗原、例えば細菌、寄生生物またはウイルス抗原、アレルゲン、自己抗原、抗体）、ホルモン（インスリン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン、ゴナドトロピン、刺激ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、ドーパミン、ウシソマトトロピン、レプチン等）、成長ホルモン（例えばヒト成長ホルモン）、増殖因子（例えば上皮増殖因子、神経成長因子、インスリン様増殖因子等）、増殖因子受容体、酵素（組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、コレステロール生合成または分解性酵素、ステロイド産生酵素、キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、デヒドロゲナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アロマターゼ、シトクロム、アデニル酸またはグアニル酸シクラーゼ、ノイラミニダーゼ等）、受容体（ステロイドホルモン受容体、ペプチド受容体）、結合タンパク質（成長ホルモンまたは増殖因子結合タンパク質等）、転写因子および翻訳因子、腫瘍成長抑制タンパク質（例えば血管新生を阻害するタンパク質）、構造タンパク質（例えばコラーゲン、フィブロイン、フィブリノーゲン、エラスチン、チューブリン、アクチンおよびミオシン）、血液タンパク質（トロンピン、血清アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、インスリン、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、プロテインＣ、フォンビルブランド因子、アンチトロンビンＩＩＩ、グルコセレブロシダーゼ、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）または改変第ＶＩＩＩ因子、抗凝固因子等）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１５】
１つの実施形態では、本発明による医薬的に活性なタンパク質は、リンパ球ホメオスタシスを調節することに関与するサイトカイン、好ましくは、Ｔ細胞の発生、プライミング、増殖、分化および／または生存に関与し、および好ましくはそれを誘導するまたは増強するサイトカインである。１つの実施形態では、サイトカインはインターロイキンである。１つの実施形態では、本発明による医薬的に活性なタンパク質は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１から成る群より選択されるインターロイキンである。
【０１１６】
「免疫学的に活性な化合物」という用語は、好ましくは免疫細胞の成熟を誘導するおよび／もしくは抑制することによって、免疫応答を改変する、サイトカイン生合成を誘導するおよび／もしくは抑制する、ならびに／またはＢ細胞による抗体産生を刺激することによって体液性免疫を改変する任意の化合物に関する。免疫学的に活性な化合物は、抗ウイルスおよび抗腫瘍活性を含むがこれらに限定されない強力な免疫刺激活性を有し、また免疫応答の他の態様を下方調節することもでき、例えば免疫応答をＴＨ２免疫応答からシフトさせることができ、これは広範囲のＴＨ２媒介性疾患を処置するのに有用である。免疫学的に活性な化合物はワクチンアジュバントとして有用であり得る。
【０１１７】
本発明によれば、ＲＮＡを本明細書で述べるように使用することによって免疫応答を誘導するまたは増強することを所望する場合、ＲＮＡによって免疫応答を誘発または増強し得る。例えばＲＮＡによってコードされるタンパク質もしくはペプチドまたはそのプロセシング産物は、抗原提示細胞上に発現された主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質によって提示され得る。ＭＨＣペプチド複合体は、その後、それらの活性化をもたらすＴ細胞などの免疫細胞によって認識され得る。
【０１１８】
「疾患」という用語は、個体の身体を侵す異常な状態を指す。疾患はしばしば、特定の症状および徴候と関連する医学的状態と解釈される。疾患は、感染性疾患などの、もともと外部起源からの因子によって引き起こされ得るか、または自己免疫疾患などの、内部機能不全によって引き起こされ得る。
【０１１９】
本発明によれば、「疾患」という用語は癌疾患も指す。「癌疾患」または「癌」（医薬用語：悪性新生物）という用語は、細胞の群が制御されない成長（正常限界を超える分裂）、浸潤（隣接組織への侵入およびその破壊）ならびに時として転移（リンパまたは血液を介した体内の他の場所への拡大）を示す疾患のクラスを指す。癌のこれら３つの悪性特性は癌を良性腫瘍と区別し、良性腫瘍は自己限定的で、浸潤または転移しない。大部分の癌は腫瘍、すなわち細胞（新生細胞または腫瘍細胞と呼ばれる）の異常増殖によって形成される腫脹または病変を形成するが、白血病のような一部の癌は腫瘍を形成しない。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、神経膠腫および白血病が含まれるが、これらに限定されない。より特定すると、そのような癌の例には、骨癌、血液癌、肺癌、肝癌、膵癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、性器および生殖器の癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、膀胱癌、腎癌、腎細胞癌、腎盂の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、神経外胚葉癌、脊髄軸の腫瘍、神経膠腫、髄膜腫ならびに下垂体腺腫が含まれる。本発明による「癌」という用語は癌転移も含む。
【０１２０】
「感染性疾患」という用語は、個体から個体へまたは生物から生物へと伝播され得る、微生物因子によって引き起こされる任意の疾患（例えば普通の風邪）を指す。感染性疾患の例には、ウイルス感染症、例えばＡＩＤＳ（ＨＩＶ）、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎、疱疹、帯状疱疹（水痘）、風疹（風疹ウイルス）、黄熱病、デング熱等、フラビウイルス、インフルエンザウイルス、出血性感染症（マールブルグウイルスまたはエボラウイルス）、および重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、細菌感染症、例えばレジオネラ病（レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ））、性感染症（例えばクラミジアまたは淋病）、胃潰瘍（ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ））、コレラ（ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ））、結核、ジフテリア、大腸菌、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）または連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）による感染（破傷風）；原生動物病原体による感染、例えばマラリア、睡眠病、リーシュマニア症；トキソプラズマ症、すなわちプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）およびトキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）による感染；または真菌感染症、例えばクリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマチチディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）またはカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）によって引き起こされる真菌感染症が含まれる。
【０１２１】
「自己免疫疾患」という用語は、身体が自らの組織の何らかの成分に対して免疫原性（すなわち免疫系）応答を生じる任意の疾患を指す。言い換えると、免疫系は、体内の何らかの組織または系を自己として認識するその能力を喪失しており、それが異物であるかのごとくに標的とし、攻撃する。自己免疫疾患は、主として１つの器官が侵されるもの（例えば溶血性貧血および自己免疫性甲状腺炎）、ならびに自己免疫疾患の過程が多くの組織を介して拡散するもの（例えば全身性エリテマトーデス）に分類することができる。例えば多発性硬化症は、脳および脊髄の神経線維を取り囲む鞘を攻撃するＴ細胞によって引き起こされると考えられている。これは、協調の喪失、衰弱および視朦をもたらす。自己免疫疾患は当分野で公知であり、例えば橋本甲状腺炎、グレーヴズ病、狼瘡、多発性硬化症、関節リウマチ、溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、大腸炎、糖尿病、強皮症、乾癬等が含まれる。
【０１２２】
本発明によれば、免疫応答は、抗原またはそのフラグメント、例えば疾患関連抗原をコードする適切なｍＲＮＡを被験体に導入することによって刺激し得る。
【０１２３】
「抗原」という用語は、それに対して免疫応答が引き起こされるエピトープを含有する作用物質に関する。「抗原」という用語は、特にタンパク質、ペプチド、多糖、核酸、特にＲＮＡおよびＤＮＡ、ならびにヌクレオチドを包含する。「抗原」という用語はまた、形質転換を通してのみ抗原性になる−および感作させる−（例えば分子中で中間的にまたは体タンパク質で完全に）作用物質も包含する。抗原は、好ましくは、樹状細胞またはマクロファージのような抗原提示細胞などの免疫系の細胞によって提示可能である。加えて、抗原またはそのプロセシング産物は、好ましくはＴもしくはＢ細胞受容体によって、または抗体などの免疫グロブリン分子によって認識可能である。好ましい実施形態では、抗原は疾患関連抗原、例えば腫瘍関連抗原、ウイルス抗原または細菌抗原である。
【０１２４】
「疾患関連抗原」という用語は、その最も広い意味で使用され、疾患に関連する任意の抗原を指す。疾患関連抗原は、宿主の免疫系を刺激して、疾患に対する細胞性抗原特異的免疫応答および／または体液性抗体応答を生じさせるエピトープを含有する分子である。疾患関連抗原は、それゆえ、治療目的に使用され得る。疾患関連抗原は、好ましくは微生物、典型的には微生物抗原による感染に関連するか、または癌、典型的には腫瘍に関連する。
【０１２５】
「抗原に関わる疾患」という用語は、抗原が関与する任意の疾患、例えば抗原の存在を特徴とする疾患を指す。抗原に関わる疾患は、感染性疾患、自己免疫疾患、または癌疾患もしくは単に癌であり得る。上述したように、抗原は疾患関連抗原、例えば腫瘍関連抗原、ウイルス抗原または細菌抗原であり得る。
【０１２６】
１つの実施形態では、疾患関連抗原は腫瘍関連抗原である。この実施形態では、本発明は癌または癌転移を処置するのに有用であり得る。好ましくは、罹患器官または組織は、疾患関連抗原を発現するおよび／またはその表面と疾患関連抗原の結合を特徴とする癌細胞などの異常細胞を特徴とする。無傷または実質的に無傷の腫瘍関連抗原またはそのフラグメント、例えばＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩペプチドまたはそのような抗原もしくはフラグメントをコードする核酸、特にｍＲＮＡでの免疫は、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ型応答を誘発し、したがって、癌細胞を溶解することができるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞などのＴ細胞を刺激することを可能にする。そのような免疫はまた、腫瘍関連抗原に対する抗体の産生をもたらす体液性免疫応答（Ｂ細胞応答）も誘発し得る。さらに、樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）に、インビトロで腫瘍抗原をコードする核酸でのトランスフェクションによってＭＨＣクラスＩ提示ペプチドを負荷し、患者に投与することができる。１つの実施形態では、「腫瘍関連抗原」という用語は、細胞質、細胞表面および細胞核に由来し得る癌細胞の成分を指す。特に、この用語は、腫瘍細胞の細胞内でまたは腫瘍細胞上に表面抗原として、好ましくは大量に、産生される抗原を指す。腫瘍抗原の例には、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＣＡＭＰＡＴＨ１抗原、ＣＤ２２、ＣＡ−１２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ホジキンリンパ腫またはムチン１が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２７】
本発明によれば、腫瘍関連抗原は、好ましくは、腫瘍または癌に特徴的であり、ならびに型および／または発現レベルに関して腫瘍細胞または癌細胞に特徴的である何らかの抗原を含む。１つの実施形態では、「腫瘍関連抗原」という用語は、正常条件下では、すなわち健常被験体では、限られた数の組織および／もしくは器官においてまたは特定の発生段階で特異的に発現されるタンパク質に関し、例えば腫瘍関連抗原は、正常条件下では胃組織、好ましくは胃粘膜において、生殖器官、例えば精巣において、栄養膜組織、例えば胎盤において、または生殖系列細胞において特異的に発現され得、および１つ以上の腫瘍または癌組織で発現されるまたは異常発現される。これに関連して、「限られた数」とは、好ましくは３以下、より好ましくは２以下または１を意味する。本発明に関連して腫瘍関連抗原には、例えば分化抗原、好ましくは細胞型特異的分化抗原、すなわち正常条件下では特定の分化段階で特定の細胞型において特異的に発現されるタンパク質、癌／精巣抗原、すなわち正常条件下では精巣においておよび時として胎盤において特異的に発現されるタンパク質、ならびに生殖細胞特異抗原が含まれる。本発明に関連して、腫瘍関連抗原は、好ましくは正常組織では発現されないもしくはごくまれにしか発現されないかまたは腫瘍細胞では変異している。好ましくは、腫瘍関連抗原または腫瘍関連抗原の異常発現は癌細胞を同定する。本発明に関連して、被験体、例えば癌疾患に罹患している患者において癌細胞によって発現される腫瘍関連抗原は、好ましくは前記被験体における自己タンパク質である。好ましい実施形態では、本発明に関連して腫瘍関連抗原は、正常条件下では、必須ではない組織もしくは器官、すなわち免疫系によって損傷された場合に被験体の死をもたらさない組織もしくは器官において、または免疫系がアクセスできないもしくはほとんどアクセスできない身体の器官もしくは構造体において特異的に発現される。好ましくは、腫瘍関連抗原は、それが発現されている癌細胞によってＭＨＣ分子に関連して提示される。
【０１２８】
腫瘍免疫療法、特に腫瘍ワクチン接種における標的構造体として本発明によって企図される腫瘍関連抗原の基準を理想的に満たす分化抗原の例は、ＣＬＤＮ６およびＣＬＤＮ１８．２などのクローディンファミリーの細胞表面タンパク質である。これらの分化抗原は様々な起源の腫瘍で発現され、それらの選択的発現（毒性に関わる正常組織では発現されない）および形質膜への局在化により、抗体媒介性癌免疫療法に関連する標的構造体として特に適する。
【０１２９】
本発明において有用であり得る抗原のさらなる例は、ｐ５３、ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ、β−カテニン／ｍ、Ｂｃｒ−ａｂＬ  ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディン１２、ｃ−ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇａｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、ＨＡＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ−Ａ、好ましくはＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１またはＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｂ、ＭＡＧＥ−Ｃ、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、−２、−３、ＮＡ８８−Ａ、ＮＦ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ｐ１９０マイナーＢＣＲ−ａｂＬ、Ｐｍ１／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１またはＳＡＲＴ−３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥおよびＷＴ、好ましくはＷＴ−１である。
【０１３０】
「ウイルス抗原」という用語は、抗原性を有する、すなわち個体において免疫応答を誘発することができる任意のウイルス成分を指す。ウイルス抗原は、ウイルスリボ核タンパク質またはエンベロープタンパク質であり得る。
【０１３１】
「細菌抗原」という用語は、抗原性を有する、すなわち個体において免疫応答を誘発することができる任意の細菌成分を指す。細菌抗原は、細菌の細胞壁または細胞質膜に由来し得る。
【０１３２】
「免疫応答」という用語は、本明細書で使用される場合、細菌またはウイルスなどの免疫原性生物、細胞または物質などに対する免疫系の反応に関する。「免疫応答」という用語は、先天性免疫応答および適応免疫応答を包含する。好ましくは、免疫応答は、免疫細胞の活性化、サイトカイン生合成の誘導および／または抗体産生に関連する。免疫応答は、樹状細胞および／またはマクロファージなどの抗原提示細胞の活性化、前記抗原提示細胞による抗原またはそのフラグメントの提示ならびにこの提示による細胞傷害性Ｔ細胞の活性化の工程を含むことが好ましい。
【０１３３】
「処置する」または「処置」という用語は、個体の健康状態を改善するおよび／または生存期間を延長する（増大させる）任意の処置に関する。前記処置は、個体において疾患を排除し得る、個体において疾患の発症を停止もしくは遅らせ得る、個体において疾患の発症を阻止もしくは遅らせ得る、個体において症状の頻度もしくは重症度を減少させ得る、および／または現在疾患を有しているもしくは以前に疾患を有していたことがある個体において再発を減少させ得る。
【０１３４】
特に、「疾患の処置」という用語は、疾患またはその症状を治癒する、期間を短縮する、改善する、進行または悪化を遅らせるまたは阻止することを包含する。
【０１３５】
「免疫療法」という用語は、好ましくは特定の免疫反応および／または免疫エフェクター機能を含む処置に関する。
【０１３６】
「免疫」または「ワクチン接種」という用語は、治療的または予防的理由で被験体を処置する過程を表す。
【０１３７】
「被験体」または「個体」という用語は、本明細書で使用される場合、好ましくは哺乳動物に関する。例えば、本発明に関連して哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長動物、家畜、例えばイヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ等、実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット等、ならびに飼育動物、例えば動物園の動物である。好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【０１３８】
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）という用語は、その細胞表面上に（またはその細胞表面において）少なくとも１つの抗原または抗原フラグメントを展示する、獲得するおよび／または提示することができる様々な細胞の１つに関する。抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞と非プロフェッショナル抗原提示細胞に分類することができる。
【０１３９】
「プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要な主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）分子を構成的に発現する抗原提示細胞に関する。Ｔ細胞が抗原提示細胞の膜上でＭＨＣクラスＩＩ分子複合体と相互作用した場合、抗原提示細胞は、Ｔ細胞の活性化を誘導する共刺激分子を産生する。プロフェッショナル抗原提示細胞は、樹状細胞およびマクロファージを含む。
【０１４０】
「非プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を構成的には発現しないが、インターフェロンγなどの特定のサイトカインによる刺激後にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する抗原提示細胞に関する。例示的な非プロフェッショナル抗原提示細胞には、線維芽細胞、胸腺上皮細胞、甲状腺上皮細胞、グリア細胞、膵ベータ細胞または血管内皮細胞が含まれる。
【０１４１】
本発明の１つの実施形態では、ＲＮＡなどの核酸をエクスビボ法によって、すなわち患者から細胞を取り出し、前記細胞を遺伝的に修飾して、修飾された細胞を再び患者に導入することによって患者に投与する。トランスフェクションおよび形質導入法は当業者に公知である。
【０１４２】
本発明によれば、「トランスフェクション」という用語は、１つ以上の核酸を生物にまたは宿主細胞に導入することを指す。本発明に従ってインビトロまたはインビボで核酸を細胞に導入するために様々な方法を使用し得る。そのような方法には、核酸−ＣａＰＯ４沈殿物のトランスフェクション、ＤＥＡＥと会合した核酸のトランスフェクション、対象とする核酸を担持するウイルスによるトランスフェクションまたは感染、リポソーム媒介性トランスフェクション等が含まれる。
【０１４３】
本発明によれば、核酸は特定の細胞に向けられ得る。そのような実施形態では、核酸を細胞に投与するために使用される担体（例えばレトロウイルスまたはリポソーム）は、結合標的分子を有し得る。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体または標的細胞上の受容体のリガンドなどの分子を核酸担体に組み込み得るかまたは結合し得る。リポソームによる核酸の投与を所望する場合は、標的化および／または吸収を可能にするためにエンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合しているタンパク質をリポソーム製剤に組み込み得る。そのようなタンパク質には、特定の細胞型に特異的なキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、インターナライズされるタンパク質に対する抗体、細胞内部位を標的とするタンパク質等が含まれる。
【０１４４】
「レポーター」とは、レポーター遺伝子によってコードされ、レポーターアッセイで測定される分子、典型的にはペプチドまたはタンパク質に関する。従来の系は、通常酵素レポーターを使用し、前記レポーターの活性を測定する。
【０１４５】
「マルチクローニングサイト」という用語は、そのいずれか１つが、例えばベクターの切断および核酸の挿入に使用され得る制限酵素部位を含む核酸領域を指す。
【０１４６】
本発明によれば、ヌクレオチドまたはアミノ酸などの２つのエレメントは、それらが互いに直接隣接している場合、中断することなく連続している。例えば、ｘ個の連続するヌクレオチドＮの配列は、配列（Ｎ）ｘを指す。
【０１４７】
「制限エンドヌクレアーゼ」または「制限酵素」とは、特定の塩基配列内でＤＮＡ分子の両方の鎖のホスホジエステル結合を切断する酵素のクラスを指す。それらは、二本鎖ＤＮＡ分子上の、認識配列と称される特定の結合部位を認識する。ＤＮＡ中の前記ホスホジエステル結合が前記酵素によって切断される部位は切断部位と称される。ＩＩＳ型酵素の場合、切断部位はＤＮＡ結合部位から所定の距離を置いて位置する。本発明によれば、「制限エンドヌクレアーゼ」という用語は、例えば酵素ＳａｐＩ、ＥｃｉＩ、ＢｐｉＩ、ＡａｒＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｅＩ、ＢｂｖＣＩ、ＰｐｉＩおよびＰｓｒＩ、ＢｓｒＤ１、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＦａｕＩ、ＢｂｓＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｅＲＩ、ＥｃｉＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｇＩ、ＭｍｅＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＭＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＰｃｔＩ、Ｂｓｅ３ＤＩ、ＢｓｅＭＩ、Ｂｓｔ６Ｉ、Ｅａｍ１１０４Ｉ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＢｆｉＩ、Ｂｓｏ３１Ｉ、ＢｓｐＴＮＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＢｆｕＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＡａｒＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、ＧｓｕＩ、ＡｌｏＩ、Ｈｉｎ４Ｉ、ＰｐｉＩおよびＰｓｒＩを含む。
【０１４８】
ＲＮＡの「安定性」という用語は、ＲＮＡの「半減期」に関する。「半減期」とは、分子の活性、量または数の半分を除去するのに必要とされる時間に関する。本発明に関連して、ＲＮＡの半減期は前記ＲＮＡの安定性の指標である。
【０１４９】
本明細書で述べるＲＮＡなどの核酸は、特に本明細書で述べる処置のために使用される場合、核酸ならびに場合により１つ以上の医薬的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含む医薬組成物またはキットの形態で存在し得る。
【０１５０】
医薬組成物は、好ましくは無菌であり、有効量の核酸を含有する。
【０１５１】
医薬組成物は、通常は均一剤形で提供され、当分野で公知の方法で調製され得る。医薬組成物は、例えば溶液または懸濁液の形態であり得る。
【０１５２】
医薬組成物は、塩、緩衝物質、防腐剤、担体、希釈剤および／または賦形剤を含有してよく、それらすべてが、好ましくは医薬的に許容される。「医薬的に許容される」という用語は、医薬組成物の活性成分（１つまたは複数）の作用と相互作用しない物質の非毒性を指す。
【０１５３】
医薬的に許容されない塩は、医薬的に許容される塩を調製するために使用してよく、本発明に包含される。この種の医薬的に許容される塩は、非限定的に、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等から調製されるものを含む。医薬的に許容される塩はまた、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩としても調製され得る。
【０１５４】
医薬組成物における使用のための適切な緩衝物質には、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸および塩中のリン酸が含まれる。
【０１５５】
医薬組成物における使用のための適切な防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールが含まれる。
【０１５６】
「担体」という用語は、適用を容易にする、増強するまたは可能にするために活性成分と組み合わせる、天然または非天然（合成）の有機または無機成分を指す。本発明によれば、「担体」という用語はまた、患者への投与に適した、１つ以上の適合性の固体または液体充填剤、希釈剤または被包物質も包含する。
【０１５７】
非経口投与のための可能な担体物質は、例えば滅菌水、グルコース溶液、リンガー液、乳酸リンガー液、滅菌塩化ナトリウム溶液、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレンおよび、特に生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーである。
【０１５８】
本明細書で使用される場合の「賦形剤」という用語は、医薬組成物中に存在してもよく、および活性成分ではないすべての物質、例えば担体、結合剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、乳化剤、緩衝剤、着香剤または着色剤を指示することが意図されている。
【０１５９】
本明細書で述べる医薬組成物は、任意の従来の経路によって、例えば注射または注入を含む非経口投与によって投与し得る。投与は、好ましくは非経口的であり、例えば静脈内、動脈内、皮下、リンパ節内、皮内または筋肉内経路である。
【０１６０】
非経口投与に適する組成物は、通常、好ましくは受容者の血液と等張である、活性化合物の滅菌水性または非水性調製物を含む。適合性担体および溶媒の例は、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液である。加えて、通常は滅菌の、固定油が溶液または懸濁媒質として使用される。
【０１６１】
本明細書で述べる作用物質および組成物は、好ましくは有効量で投与される。「有効量」とは、単独でまたはさらなる用量と共に所望の反応または所望の作用を達成する量を指す。特定の疾患または特定の状態の処置の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻止に関する。これは、疾患の進行を遅らせることおよび、特に疾患の進行を妨げるまたは逆転させることを含む。疾患または状態の処置における所望の反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の予防であり得る。
【０１６２】
本明細書で述べる作用物質または組成物の有効量は、処置される状態、疾患の重症度、患者の年齢、生理的状態、体格および体重を含む患者の個別パラメータ、処置の期間、併用療法の種類（存在する場合）、特定の投与経路ならびに同様の因子に依存する。したがって、本明細書で述べる作用物質の投与される用量は、これらのパラメータのいくつかに依存し得る。患者における反応が初期用量で不十分である場合は、より高用量（または異なる、より限局された投与経路によって達成される効果的により高い用量）を使用し得る。
【０１６３】
本発明を以下の図面および実施例によって詳細に説明するが、これらは例示のみを目的とするものであり、限定と解釈されるべきではない。説明および実施例に基づき、さらなる実施形態が当業者に容易に理解され、それらも同様に本発明の範囲内である。
【実施例】
【０１６４】
［実施例１］
ポリ（ｄＡ：ｄＴ）安定性に関する半自動スクリーニング
個々の大腸菌クローンによって担持されるプラスミド上にコードされる重要なポリ（ｄＡ：ｄＴ）配列領域の完全性に関して多数の大腸菌クローンをスクリーニングするため、半自動工程を確立した。１つの特定のポリ（ｄＡ：ｄＴ）構築物のスクリーニングのために、９６個の大腸菌クローンを９６ウェルプレート中３７℃で接種し、インキュベートした。細胞を遠心分離によって採取し、９６ウェルプレートの減圧に基づく精製プラットフォームでプラスミドを精製した。試験したプラスミドＤＮＡは３つのＳａｃＩ制限部位を含み、ベクターを３−ＵＴＲ（３’非翻訳領域）内で２回およびポリ（ｄＡ：ｄＴ）配列の下流で１回切断した。ＳａｃＩ制限は、常に１４２ｂｐと２７０ｂｐのサイズの２つの特異的バンドをもたらし、ポリ（ｄＡ：ｄＴ）の長さの計算を可能にした。３番目のバンドは、ベクター骨格および挿入された抗原（ＧＯＩ＝対象とする遺伝子）に依存するサイズの抗原を表した。制限部位の位置およびフラグメントの長さを含む例示的なベクターマップを図１Ｂに示す。
【０１６５】
多数のクローンを観測するため、ＳａｃＩ制限消化物の試料を半自動キャピラリーゲル電気泳動システムに適用し、２５ｂｐから５００ｂｐの間のバンドパターンを高分解能で分析した（図１Ａは８個のクローンの制限分析の例を示す）。２５ｂｐおよび５００ｂｐの内部サイズ標準品のバンドを黒い星印（＊）で示す。１４２ｂｐおよび２７０ｂｐの無傷ポリ（ｄＡ：ｄＴ）を表すバンドを黒い矢印（→）で示す。クローン１およびクローン４は、１４２ｂｐと２７０ｂｐの間に付加的なバンド（赤い星印（＊）で示す）をもたらす短縮ポリ（ｄＡ：ｄＴ）領域を有する亜集団を示す。ポリ（ｄＡ：ｄＴ）の不安定性を、短縮ポリ（ｄＡ：ｄＴ）配列を有するクローンと無傷ポリ（ｄＡ：ｄＴ）配列を有するクローンとの比率として示す。
【０１６６】
［実施例２］
種々のポリ（ｄＡ：ｄＴ）構築物の安定性試験
モデル抗原としてＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを選択した。その理由は、以前の実験でこの抗原のポリ（ｄＡ：ｄＴ）不安定性が再現可能に５０〜６０％と測定され、それゆえ安定性試験のために大きな実験ウィンドウを提供するからである。１０個の異なるポリ（ｄＡ：ｄＴ）構築物を設計し、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドの後に直接融合した。１０個のヌクレオチドリンカー（Ｌ）をポリ（ｄＡ：ｄＴ）配列の異なる位置でポリ（ｄＡ：ｄＴ）ストレッチに挿入した。リンカー配列（ＧＣＡＴＡＴＧＡＣＴ）は、４個すべてのヌクレオチド（２×Ｇ、２×Ｃ、３×Ｔおよび３×Ａ）のバランスの取れた寄与を含むように選択した。４つの構築物を、ポリ（ｄＡ：ｄＴ）の中央にリンカーを配置し、各々の側で４５個のアデノシン残基（４５×Ａ）から出発して（Ａ４５Ｌ４５）、両側に５×Ａを段階的に増加し、リンカーの各々の側の６０×Ａで終了する（それぞれＡ５０Ｌ５０、Ａ５５Ｌ５５およびＡ６０Ｌ６０）ように設計した。
【０１６７】
残りの６個の構築物は、Ａ５０Ｌ５０のように合計で１００×Ａを含んだ。しかし、２０×Ａの後にリンカーを挿入し、その後にはリンカー配列および別の８０×Ａが続いた（Ａ２０Ｌ８０）。したがって、リンカーを、３０×Ａの後（Ａ３０Ｌ７０）、４０×Ａの後（Ａ４０Ｌ６０）、６０×Ａの後（Ａ６０Ｌ４０）、７０×Ａの後（Ａ７０Ｌ３０）および８０×Ａの後（Ａ８０Ｌ２０）にそれぞれ挿入した。
【０１６８】
１０個の構築物の各々の９６個のクローンを、前述した制限分析法でポリ（ｄＡ：ｄＴ）の完全性に関して分析した。１０個のリンカーすべてを含む構築物は、Ａ１２０と比較してポリ（ｄＡ：ｄＴ）安定性に有益な作用を示した（図２参照）。測定された安定性データを表１に要約する。構築物Ａ４５Ｌ４５は、対照のＡ１２０に比べて６倍以上高い安定性を示したが、ポリ（ｄＡ：ｄＴ）の全長の段階的な増加は、Ａ６０Ｌ６０のわずかに１．６６倍の残存安定化に反映されるようにより高い不安定性をもたらした。１００×Ａおよびポリ（ｄＡ：ｄＴ）配列の様々な位置にリンカーを有する構築物の安定化は、Ａ２０Ｌ８０についての２．９倍からＡ４０Ｌ６０の１３倍までにわたった。驚くべきことに、Ａ３０Ｌ７０およびＡ４０Ｌ６０は、ポリ（ｄＡ：ｄＴ）領域の特に高い安定化を示した。合わせて考慮すると、我々の結果は、１０個のヌクレオチドのランダムな配列の挿入がポリ（ｄＡ：ｄＴ）の完全性に安定化作用を及ぼすことを明らかにする。特にポリ（ｄＡ：ｄＴ）領域の３０位から５０位の間の領域は、ポリ（ｄＡ：ｄＴ）の短縮に特に感受性である。この配列領域へのリンカー配列の導入は、その他の構築物と比較して少なくとも２倍のポリ（ｄＡ：ｄＴ）安定性のさらなる増大をもたらした（表１および図２参照）。
【０１６９】
【表１】
2020188758.tif 000002
【０１７０】
［実施例３］
種々の大腸菌株におけるポリ（ｄＡ：ｄＴ）構築物の安定性
さらなる実験では、構築物Ａ３０Ｌ７０およびＡ４０Ｌ６０の卓越した安定性の特異性と機能性を試験した。安定性試験で認められた結果が試験した大腸菌株ＴＯＰ１０に限定されるという可能性を、他の２つの大腸菌株を試験に含めることによって評価した。Ａ３０Ｌ７０およびＡ４０Ｌ６０についての試験を、ＤＨ５α、ＸＬ１−ｂｌｕｅおよびＴＯＰ１０を対照として用いてそれぞれ反復した。これらの菌株は、ｉ）高い遺伝的多様性を有する（表２参照）およびｉｉ）分子生物学研究室において広く使用されている大腸菌株を代表する、として選択した。
【０１７１】
Ａ１２０の不安定性は、ＤＨ５αについては４２％およびＸＬ１−ｂｌｕｅについては６１．８％と測定され、それゆえ大腸菌ＴＯＰ１０株に関して検出された不安定性と同等とみなされた（図３参照）。Ａ３０Ｌ７０およびＡ４０Ｌ６０はどちらも３〜４％の不安定性を示し、ＴＯＰ１０におけるＡ４０Ｌ６０に関してのみ、不安定性がわずかに６．８％まで上昇した。大腸菌の３つの異なる研究室株の試験は、ポリ（ｄＡ：ｄＴ）安定化に関する結果を確認した。３０〜５０位の切断感受性領域への１０ヌクレオチドのリンカー配列の導入は、種々の大腸菌株におけるポリ（ｄＡ：ｄＴ）配列の遺伝的安定化のための一般原則として同定された。
【０１７２】
【表２】
2020188758.tif 000003
【０１７３】
［実施例４］
種々のポリ（Ａ）尾部の機能的インビトロ特徴付け
同定された安定化ポリ（Ａ）尾部Ａ３０Ｌ７０およびＡ４０Ｌ６０の、ＲＮＡ分子の機能性への影響を明らかにするため、ルシフェラーゼレポーターに基づく実験を実施した。構築物Ａ３０Ｌ７０、Ａ４０Ｌ６０およびＡ１２０をホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合し、それぞれのメッセンジャーＲＮＡをインビトロ転写によって作製した。ＲＮＡ分子は同等の完全性を示し、これらを細胞電気穿孔に使用した（表３参照）。ＲＮＡを、関連のｍＲＮＡ腫瘍ワクチンアプローチの標的細胞である、ヒト血液から単離したヒト未熟樹状細胞に電気穿孔した。ルシフェラーゼ翻訳を７２時間にわたって観測した。３つの異なるｍＲＮＡ分子はごくわずかの差で等しく発現された（図４Ａ）。一般的なｍＲＮＡの機能性がポリ（Ａ）尾部の性質によって影響されないことを証明するため、ヒト線維芽細胞株（ＣＣＤ細胞）およびマウス筋芽細胞株（Ｃ２Ｃ１２）において実験を反復した（図４Ｂおよび図４Ｃ）。ｍＲＮＡ翻訳の細胞型特異的パターンを経時的に観測したが、ヒトまたはマウス細胞株のいずれもが、異なるポリ（Ａ）尾部を含むｍＲＮＡによるタンパク質発現の相違を示さなかった。
【０１７４】
【表３】
2020188758.tif 000004
【０１７５】
これらの結果は、選択したポリ（Ａ）尾部がインビトロで全体的なｍＲＮＡの機能性にごくわずかな影響しか及ぼさないことを明らかにする。それゆえ、それぞれ３０位および４０位のポリ（ｄＡ：ｄＴ）領域へのリンカー配列の挿入は、それぞれのＲＮＡ分子の完全な機能性を維持することによって実質的な遺伝的安定化を可能にする。
【０１７６】
［実施例５］
種々のポリ（Ａ）尾部の機能的インビボ特徴付け
ワクチン接種のためのｍＲＮＡの全身的インビボ適用のために、ＲＮＡを脂質と共に製剤することによってＲＮＡリポプレックスを作製し、静脈内投与した。ＲＮＡリポプレックスは、脾臓を標的とし、それぞれのｍＲＮＡを翻訳する未熟樹状細胞によって取り込まれるように作製されている。インビボでの機能性タンパク質発現を確実にするためにマウス実験において２つの安定化ポリ（Ａ）尾部、すなわちＡ３０Ｌ７０とＡ４０Ｌ６０を試験することを目的とした。Ａ１２０を有するＲＮＡを発現対照として使用した。各５匹の動物のＢＡＬＢ／ｃマウスの３つの群に、種々のポリ（Ａ）尾部（Ａ３０Ｌ７０、Ａ４０Ｌ６０およびＡ１２０）を有する機能的インビトロ試験に使用したＲＮＡ（表３）をコードするホタルルシフェラーゼを含有するＲＮＡ−リポプレックスを静脈内注射した。インビボ生物発光イメージングシステムを用いて４８時間にわたってホタルルシフェラーゼ発現を観測した（図５Ａ）。累積ルシフェラーゼシグナルの定量化を図５Ｂに示す。ルシフェラーゼシグナルの位置または強度のいずれもが、異なるポリ（Ａ）尾部を有するＲＮＡの間で有意に異ならず、両方の安定化ポリ（Ａ）尾部が全身的インビボ適用に適することを証明した。
【０１７７】
［実施例６］
種々のポリ（Ａ）尾部に対する免疫学的応答
最後のセットの実験では、安定化ポリ（Ａ）尾部、Ａ３０Ｌ７０およびＡ４０Ｌ６０が、ｍＲＮＡワクチンによって誘導される特異的免疫応答に影響を及ぼすかどうかを評価した。それゆえ、安定化ポリ（Ａ）尾部および対照Ａ１２０を先の安定性試験に関してのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに融合した。ポリ（Ａ）尾部Ａ３０Ｌ７０、Ａ４０Ｌ６０およびＡ１２０を含む３つのＲＮＡをインビトロ転写によって作製し、これらのＲＮＡは同等の品質と完全性を示した（表４）。Ｃ５７／ＢＬ６マウスの３つの群に、各々５匹の動物で２回、０日目と３日目に種々のＳＩＩＮＦＥＫＬ  ＲＮＡを含むＲＮＡ−リポプレックスを２組ずつ静脈注射した。抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度を最後の免疫の５日後（８日目）にＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＭＨＣ四量体染色によって測定することにより、ＲＮＡ誘導性免疫応答を分析した。ＦＡＣＳ分析によるそれぞれのゲーティング戦略を図６Ａに示す。抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞頻度の比較は、試験したすべてのポリ（Ａ）尾部を有するＲＮＡが免疫応答を誘導することを示した。それにより、同じ群内（各ＲＮＡについて２×５匹の動物）または異なるＩＶＴ  ＲＮＡを摂取した３つの群間のいずれにおいても有意差は検出されず、安定化ポリ（Ａ）尾部がｍＲＮＡによって誘導される特異的免疫応答に影響を及ぼさないことが実証された（図６Ｂ）。
【０１７８】
【表４】
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【０１７９】
制限ベースの分析法を確立することにより、我々はここで、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部をコードするポリ（ｄＡ：ｄＴ）領域が一般的な大腸菌株において遺伝的に不安定であることを示すことができる。この不安定性は、安定なポリ（ｄＡ：ｄＴ）配列を有するクローンを得るために多大の労力を要するスクリーニング作業をもたらす。我々は、１０ヌクレオチドのリンカー配列の挿入がこの配列ストレッチを安定化することを明らかにした。それにより３０位から５０位までがポリ（ｄＡ：ｄＴ）短縮に特に感受性であると同定された。この特定領域へのリンカー挿入は、他の位置における挿入に比べて安定性を少なくとも２倍、さらに増大させた。安定性試験は、いくつかの一般的に使用される大腸菌株において確認された。配列挿入は、いくつかの細胞株においておよびマウスでのインビボ活性の比較によって実証されたように、それぞれのインビトロ転写ＲＮＡの機能性を変化させなかった。最後に、ＲＮＡ誘導性免疫応答はポリ（Ａ）尾部の修飾によって影響を受けなかった。合わせて考慮すると、我々は、それぞれのプラスミドＤＮＡの取り扱いを容易にし、およびそれによりインビトロおよびインビボでのＲＮＡの機能性またはＲＮＡ特異的免疫応答の誘導に影響を及ぼさない、ポリ（ｄＡ：ｄＴ）領域を遺伝的に安定化するツールを同定した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月12日(2020.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写の５’→３’方向に、
（ａ）プロモーター；
（ｂ）転写可能な核酸配列または転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列；および
（ｃ）前記プロモーター（ａ）の制御下で転写された場合、転写産物において少なくとも８０個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列であって、前記転写産物中の少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列が、ポリアデニル配列内に、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの配列を含む前記ポリアデニル配列である、核酸配列を含み、
３個から５０個のヌクレオチドの長さを有するＡヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列に、前記ポリアデニル配列中の少なくとも２０個のＡ残基が先行するおよび／または前記ポリアデニル配列中の少なくとも２０個のＡ残基が続く、
核酸分子。
【請求項２】
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列が、２つ以上の連続する、２つ以上の連続するヌクレオチドの配列であり、２つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列の最初と最後のヌクレオチドがＡヌクレオチド以外のヌクレオチドである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列が、恣意的な配列である、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記核酸配列（ｃ）が、前記核酸配列（ｃ）の代わりに、前記プロモーター（ａ）の制御下で転写された場合、転写産物において少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列と同じ長さのポリアデニル配列をコードする核酸配列（ｃ）’を含む核酸分子と比較して、大腸菌での前記核酸分子の増殖時により高い安定性を示す、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列が、少なくとも９０個のヌクレオチド、又は少なくとも１００個のヌクレオチドを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列が、前記ポリアデニル配列の２１位から８０位まで、２１位から６０位まで、又は３１位から５０位までの領域内に位置する、請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７】
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列が、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１０個、又は少なくとも１５個のヌクレオチドの長さを有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列が、３０個未満、又は２０個未満のヌクレオチドの長さを有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列が、３個より多い連続するＡ残基を含まず、２個以下の連続するＡ残基を含まず、又は連続するＡ残基を全く含まない、請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記プロモーター（ａ）の制御下の前記核酸配列（ｂ）および（ｃ）が、転写されて共通の転写産物を与えることができる、請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記転写産物において少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列が３’末端に位置する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１２】
閉環状分子または直鎖状分子である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記転写可能な核酸配列がペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を含み、および転写可能な核酸配列を導入するための前記核酸配列がマルチクローニングサイトである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１４】
（ｉ）レポーター遺伝子；（ｉｉ）選択マーカー；および（ｉｉｉ）複製起点から成る群より選択される１つ以上の成員をさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１５】
ＲＮＡ、又はＲＮＡのインビトロ転写に適する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の核酸分子を鋳型として使用して、転写によって、又はインビトロ転写によって得られるＲＮＡ。
【請求項１７】
核酸分子を増殖させる方法であって、
（ｉ）請求項１から１５のいずれか一項に記載の核酸分子を提供する工程、および
（ｉｉ）前記核酸分子を大腸菌中で増殖させる工程
を含む方法。
【請求項１８】
大腸菌中で前記核酸分子を増殖させる工程が、前記核酸分子で大腸菌を形質転換する工程および前記形質転換した大腸菌を培養する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
増殖後に大腸菌から前記核酸分子を単離する工程をさらに含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＲＮＡを得る方法であって、
（ｉ）請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法に従って核酸分子を増殖させる工程、および
（ｉｉ）前記核酸分子を鋳型として使用してＲＮＡをインビトロ転写する工程
を含む方法。
【請求項２１】
ペプチドまたはタンパク質を得る方法であって、
（ｉ）請求項２０に記載の方法に従って前記ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡを得る工程、および
（ｉｉ）前記ｍＲＮＡを翻訳する工程
を含む方法。
【請求項２２】
前記核酸分子の転写の前に、前記核酸分子の切断をさらに含む工程を特徴とする、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
宿主細胞をトランスフェクトするための、請求項１６に記載のＲＮＡ。
【請求項２４】
前記宿主細胞が抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである、請求項２３に記載のＲＮＡ。
【請求項２５】
ワクチン接種に使用される、請求項１６に記載のＲＮＡ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
本発明を以下の図面および実施例によって詳細に説明するが、これらは例示のみを目的とするものであり、限定と解釈されるべきではない。説明および実施例に基づき、さらなる実施形態が当業者に容易に理解され、それらも同様に本発明の範囲内である。
以下、参考形態の例を付記する。
１．  転写の５’→３’方向に、
（ａ）プロモーター；
（ｂ）転写可能な核酸配列または転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列；および
（ｃ）前記プロモーター（ａ）の制御下で転写された場合、転写産物において少なくとも８０個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列であって、前記転写産物中の少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列が、ポリアデニル配列内に、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの配列を含む前記ポリアデニル配列である、核酸配列
を含む核酸分子。
２．  Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列が、２つ以上の連続する、ヌクレオチドの配列、好ましくは恣意的な配列であり、２つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列の最初と最後のヌクレオチドがＡヌクレオチド以外のヌクレオチドである、１．に記載の核酸分子。
３．  前記核酸配列（ｃ）が、前記核酸配列（ｃ）の代わりに、前記プロモーター（ａ）の制御下で転写された場合、転写産物において少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列と同じ長さのポリアデニル配列をコードする核酸配列（ｃ）’を含む核酸分子と比較して、大腸菌での前記核酸分子の増殖時により高い安定性を示す、１．または２．に記載の核酸分子。
４．  少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列が、少なくとも９０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００個のヌクレオチドを含む、１．から３．のいずれか一つに記載の核酸分子。
５．  Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列が、前記ポリアデニル配列の２１位から８０位まで、好ましくは２１位から６０位まで、より好ましくは３１位から５０位までの領域内に位置する、１．から４．のいずれか一つに記載の核酸分子。
６．  Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列に、前記ポリアデニル配列中の少なくとも２０個のＡ残基が先行するおよび／または前記ポリアデニル配列中の少なくとも２０個のＡ残基が続く、１．から５．のいずれか一つに記載の核酸分子。
７．  Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列が、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドの長さを有する、１．から６．のいずれか一つに記載の核酸分子。
８．  Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列が、５０個未満、好ましくは３０個未満、より好ましくは２０個未満のヌクレオチドの長さを有する、１．から７．のいずれか一つに記載の核酸分子。
９．  Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１つ以上の連続するヌクレオチドの前記配列が、３個より多い連続するＡ残基を含まず、好ましくは２個以下の連続するＡ残基を含み、好ましくは連続するＡ残基を全く含まない、１．から８．のいずれか一つに記載の核酸分子。
１０．  前記プロモーター（ａ）の制御下の前記核酸配列（ｂ）および（ｃ）が、転写されて共通の転写産物を与えることができる、１．から９．のいずれか一つに記載の核酸分子。
１１．  前記転写産物において少なくとも８０個の連続するヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列が３’末端に位置する、１．から１０．のいずれか一つに記載の核酸分子。
１２．  閉環状分子または直鎖状分子である、１．から１１．のいずれか一つに記載の核酸分子。
１３．  前記転写可能な核酸配列がペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を含み、および転写可能な核酸配列を導入するための前記核酸配列がマルチクローニングサイトである、１．から１２．のいずれか一つに記載の核酸分子。
１４．  （ｉ）レポーター遺伝子；（ｉｉ）選択マーカー；および（ｉｉｉ）複製起点から成る群より選択される１つ以上の成員をさらに含む、１．から１３．のいずれか一つに記載の核酸分子。
１５．  特に線状化後に、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡのインビトロ転写に適する、１．から１４．のいずれか一つに記載の核酸分子。
１６．  １．から１５．のいずれか一つに記載の核酸分子を鋳型として使用して、転写によって、好ましくはインビトロ転写によって得られるＲＮＡ。
１７．  核酸分子を増殖させる方法であって、
（ｉ）１．から１５．のいずれか一つに記載の核酸分子を提供する工程、および
（ｉｉ）前記核酸分子を大腸菌中で増殖させる工程
を含む方法。
１８．  大腸菌中で前記核酸分子を増殖させる工程が、前記核酸分子で大腸菌を形質転換する工程および前記形質転換した大腸菌を培養する工程を含む、１７．に記載の方法。
１９．  増殖後に大腸菌から前記核酸分子を単離する工程をさらに含む、１７．または１８．に記載の方法。
２０．  ＲＮＡを得る方法であって、
（ｉ）１７．から１９．のいずれか一つに記載の方法に従って核酸分子を増殖させる工程、および
（ｉｉ）前記核酸分子を鋳型として使用してＲＮＡをインビトロ転写する工程
を含む方法。
２１．  ペプチドまたはタンパク質を得る方法であって、
（ｉ）２０．に記載の方法に従って前記ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡを得る工程、および
（ｉｉ）前記ｍＲＮＡを翻訳する工程
を含む方法。
２２．  前記核酸分子の転写の前に、前記核酸分子の切断をさらに含む工程を特徴とする、２０．または２１．に記載の方法。
２３．  宿主細胞をトランスフェクトするための、１６．に記載のＲＮＡの使用。
２４．  前記宿主細胞が抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである、２３．に記載の使用。
２５．  ワクチン接種のための、１６．に記載のＲＮＡの使用。