(57)【要約】【課題】核酸の自動化された加工処理および電気泳動による試料調製のための装置、方法およびシステムを提供すること。【解決手段】生体試料からの核酸の自動化された抽出、精製、および加工処理のための方法、システムおよび装置が提供される。一部の実施形態では、投入する粒状の生体試料を固定して操作中に核酸を抽出するために、ヒドロゲル支持体が使用される。ヒドロゲルの使用により、ロボット液体取扱いシステム上での自動化された試料加工処理が容易にされる。デバイス、方法、およびシステムは、電気泳動による試料調製のためにも提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与されたＳＢＩＲフェーズＩＩ助成金第１Ｒ４４ＨＧ００８７２０−０１  ＰＩ号の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１４年１０月１５日に出願された「Ａｐｐａｒａｔｕｓｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」との表題の米国仮特許出願第６２／０６４，４５４号および２０１５年６月２３日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」との表題の米国仮特許出願第６２／１８３，５１４号に対する優先権を主張する。本出願は、上記参照された出願のそれぞれの開示全体を参考として本明細書に援用する。
【０００３】
本開示の一部の実施形態は、核酸および他の非核酸要素を含有する試料から核酸を単離するための装置、方法およびシステム、ならびに電気泳動による試料調製のための方法およびデバイスに関連した実施形態を提供する。
【背景技術】
【０００４】
ロングリードシークエンシングおよび長距離マッピングの技術は、より正確なゲノムアセンブリを作製するために使用されうる。簡単に言えば、業界の先導者ら（ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなど）によって作製された典型的なシークエンシングデータを含む、ショートリードのペアエンドシークエンシングデータから正確にアセンブリすることができない、多くのゲノム領域、および多くの種類の構造的バリエーションがある。しかし、これらの領域およびバリエーションのうちの多くは、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ、１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖｉｓｉｏｎ、Ｒｏｃｈｅ／ＧｅｎｉａおよびＢｉｏｎａｎｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって開発された技術のように、何十から何百のキロベース（ｋｂ）で測定される一次リード長（またはゲノムマップ）を作り出す、より新しい技術を使用して正確にアセンブリすることができる。
【０００５】
ロングリード技術は、依然として開発の初期段階にあるが、ショートリードシークエンシング能力を補うために使用されうる。例えば、ＤＮＡ抽出およびライブラリー調製の技術は、長い高品質のＤＮＡライブラリーを作製するために使用されうる。しかし、長いＤＮＡ断片を作製することができる市販の技術について、市場におけるギャップが存在する。大部分の市販のゲノムＤＮＡ抽出キットにより、２０〜５０ｋｂの最長ＤＮＡサイズが得られる。一部の現在のシステムは、５０ｋｂを超える一次リードの能力があるが、既存のＤＮＡ抽出キットは、これらのシステムの能力を制限する。さらに、長いＤＮＡ断片は、長さが何百ｋｂであるゲノムＤＮＡ試料から作製されるライブラリーを必要とする、光学マッピングおよび合成ロングリードシステム（例えば、１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｂｉｏｎａｎｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）に使用されうる。したがって、きわめて長い（例えば、長さが何百から何千ｋｂの）、高品質なゲノムＤＮＡ試料を作製するための自動化された再現性のある方法が必要とされている。これらの試料を達成するための実証された必要性があり努力がなされているにもかかわらず、解決法はいまだ開発されていない。
【０００６】
さらに、ライブラリー調製は、１）生体試料からのＤＮＡ抽出（体液、粒子、細胞、および組織）と、２）ライブラリー構築の２つの主要部分に分けられる多段階プロセスである。ＤＮＡシークエンシングが臨床的な研究、診断、および療法管理にとってより有用になるにつれて、統合されたワークフローにより、プロセス全体が合理化され自動化されうる。ここでも、実証された必要性があるにもかかわらず、ライブラリーワークフローへの試料全体のさらなる統合はいまだ達成されていない。
【０００７】
さらに、感染症の検出および診断のための次世代シークエンシング（ＮＧＳ）は、分子診断において大きな可能性を有する。例えば、臨床試料（多くは全血または全血由来の白血球（ＷＢＣ））を使用する臨床ワークフローを、ＮＧＳシークエンシング、およびその後のヒト参照配列にマップされうる全配列のコンピュータによるサブトラクションに付すことができる。残りの「ヒト以外の」配列は、あらゆる公知の病原体配列との同一性について調査される。このプロセスは成功しうるが、それにはきわめて効率的なライブラリー構築方法およびディープシークエンシングの実行が必要とされ、そのいずれも経費が高くなりうる。この経費のために、コンピュータによるサブトラクション方法は、広範に使用されないままとなっている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示の実施形態は、例えば、核酸および他の非核酸要素を含有する試料から核酸を単離するための装置、システムおよび方法、ならびに電気泳動による試料調製のための方法およびデバイスに関連した実施形態を対象とする多数の発明概念を提供する。以下は、本明細書中に開示の一部の実施形態の例示である。
【０００９】
試料から核酸を単離するためのシステムは、核酸および非核酸要素を含む試料を固定するように構成されているヒドロゲルマトリクスを含んでいてもよい。システムは、ヒドロゲルマトリクス中に拡散し、固定された生体試料と反応し、細胞の試料の非核酸要素を放出するように構成されている試薬も有していてもよい。さらに、システムは、非核酸要素の放出後にヒドロゲルマトリクスから核酸を溶出するための手段を含んでいてもよい。
【００１０】
一部の実施形態では、ヒドロゲルマトリクスは、アガロースゲルを含んでいてもよい。ヒドロゲルマトリクスは、ほぼ等しい体積部のヒドロゲルおよび生体試料を含有していてもよい。試薬は、溶解のための界面活性剤溶液、細菌、真菌、および／もしくは植物の細胞壁を消化するように構成されている酵素を含有する溶液、プロテアーゼ溶液、ＤＮＡ加工処理酵素を含有する溶液、シークエンシングライブラリーを作製するための酵素および合成アダプターを含有する溶液、ならびに／またはトランスポザソーム（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｏｍｅ）を含有する溶液であってもよい。
【００１１】
システムは、生体試料を、ヒドロゲルを含有する融解したゲルと混合してヒドロゲルマトリクスを調製すること、ならびに試薬の添加および除去を調節することのうちのいずれかまたは両方をするように構成されている少なくとも１つの自動化された液体取扱いデバイスも含んでいてもよい。システムは、ヒドロゲルマトリクスが担体に付着することを可能にするためにヒドロゲルマトリクスと互いにかみ合う形状を有するように構成されている担体を有していてもよい。一部の実施形態では、システムは、ヒドロゲルマトリクスからの核酸の電気泳動による溶出を補助する濾過膜も有していてもよく、濾過膜は、核酸をサイズに基づいて選択的に保持するようにサイズが設定された細孔を含有していてもよい。
【００１２】
核酸および非核酸要素を含有する試料から核酸を単離するための方法も提供されうる。方法は、温度調節された容器内で試料を融解したヒドロゲルと混合することを含んでいてもよく、容器の温度は、生体試料および融解したヒドロゲルの混合物のゲル化を引き起こし、ヒドロゲルマトリクスを形成するために低下されてもよい。ヒドロゲルマトリクスは、生体試料を固定するように構成されている。試薬は、ヒドロゲルマトリクスに導入されてもよく、試薬は、固定された生体試料と反応してかつ非核酸要素を放出するために、ヒドロゲルマトリクス中に拡散するように構成されていてもよい。次いで、核酸は、ヒドロゲルマトリクスから抽出されてもよい。
【００１３】
一部の実施形態では、ヒドロゲルマトリクスは、アガロースゲルを含んでいてもよく、かつ生体試料は、ＤＮＡ分子を含んでいてもよい。さらに、融解したヒドロゲルと生体試料を混合するために、自動化された液体取扱いデバイスが使用されてもよい。
【００１４】
さらに、ヒドロゲルマトリクスを試薬に導入するために、ヒドロゲルマトリクスを担持する担体が試薬の混合物中に浸漬されてもよい。試薬は、試薬をヒドロゲルマトリクス中に電気泳動によって移動させることによってヒドロゲルマトリクスに導入されてもよい。
【００１５】
一部の実施形態では、方法は、核酸をサイズに基づいて選択的に保持するようにサイズが設定された細孔を含有する濾過膜を使用して核酸を濾過することを含んでいてもよい。方法は、非核酸要素の放出後にヒドロゲルマトリクスから非核酸要素を電気泳動によって除去することも含んでいてもよい。
【００１６】
電気泳動カセットは、電気泳動バッファーを有する容器、容器内に構成されている電気泳動ゲルマトリクス部分、および電気泳動ゲルマトリクス部分中に構成されている試料ウェルを含んでいてもよい。電気泳動ゲルマトリクス部分は、容器を横切って側方に延在して容器を２つのチャンバーに分割していてもよい。２つの部分のそれぞれは、電気泳動バッファーで満たされていてもよい。試料ウェルは、電気泳動ゲルマトリクス部分によって電気泳動バッファーから隔離されていてもよい。
【００１７】
電気泳動ゲルマトリクス部分は、アガロースであってもよく、またはデンプン、寒天、アガロース、およびポリアクリルアミドのうちの少なくとも１種であってもよい。電気泳動バッファーは、ｐＨ７およびｐＨ９の間のｐＨを有していてもよく、キレート剤としてＥＤＴＡを含んでいてもよい。
【００１８】
一部の実施形態では、カセットは、少なくとも１つの陽極および少なくとも１つの陰極も含んでいてもよく、陽極がチャンバーのうちの第１のチャンバーに接続されており、陰極がチャンバーのうちの第２のチャンバーに接続されている。チャンバーは、電気泳動バッファーで満たされていてもよく、溶解試薬を受け入れるように構成されていてもよい。試薬ウェルは、試料ウェルと２つのチャンバーのうちの第２のチャンバーとの間に配置されていてもよい。溶解試薬は、陰イオン性界面活性剤および界面活性剤適合性プロテアーゼのうちの１種または複数であってもよい。試薬が陰イオン性界面活性剤を含む場合、界面活性剤は、約０．１％から約１０％重量／体積の間の濃度を有するＳＤＳであってもよい。溶解試薬は、陰イオン性界面活性剤ＳＤＳおよびプロテイナーゼＫの混合物であってもよい。
【００１９】
電圧が電極間を横切って印加されると、溶解試薬は、電気泳動ゲルマトリクス部分を通して試料ウェル内に駆動されてもよい。一部の実施形態では、試料ウェルが生体試料を含有し、電圧を印加することによって２つのチャンバーのうちの第２のチャンバーの近くの試料ウェルの側面に生体試料内のＤＮＡ分子の蓄積が引き起こされる。電圧を逆にすることによって、ＤＮＡ分子が試料ウェルの側面から離れて移動されてもよい。
【００２０】
電気泳動システムも提供される。システムは、第１の端部、第２の端部、長さ、幅、第１の長さ方向の側面および第２の長さ方向の側面を有する電気泳動ゲルマトリクスを含んでいてもよい。試薬ウェルは、試薬を含有していてもよく、第１の端部に近接する電気泳動ゲルマトリクス部分中に構成されていてもよい。生体細胞の試料を含有する、試料ウェルは、第１の端部に近接し試薬ウェルと第２の端部との間の電気泳動ゲルマトリクス中に構成されていてもよい。１対の電気泳動電極の第１の陰極は、第１の端部に配置されていてもよく、１対の電気泳動電極の第１の陽極は、第２の端部に配置されていてもよい。１対の電気泳動電極を横切って第１のバイアス電圧を印加すると、試薬が、試薬ウェルから、試料ウェル内にかつ／または試料ウェルを通して駆動されてもよい。
【００２１】
一部の実施形態では、試料ウェルは、細胞懸濁物を含んでいてもよく、試薬ウェルは、負に荷電した溶解試薬を含んでいてもよい。溶解剤からの溶解の結果として、細胞懸濁物中に含有される細胞のＤＮＡ分子が生成されてもよい。ＤＮＡ分子は試料ウェルの少なくとも１つの側面に蓄積してもよく、１対の電気泳動電極を横切って第２のバイアス電圧を印加すると、蓄積したＤＮＡが試料ウェルの外に電気泳動しうる。
【００２２】
システムは、ゲルの第１の長さ方向の側面に沿って配置された複数の溶出受け入れ領域またはチャネルも含んでいてもよい。それぞれの受け入れ領域は、ゲルの第１の長さ方向の側面に隣接して配置された第１の側面と、受け入れ領域の第１の側面から離れて配置された第２の側面とを有していてもよい。さらに、システムは、それぞれの対が溶出受け入れチャネルに対応する複数対の溶出電極を含んでいてもよい。第１の対の溶出電極の第１の溶出陰極は、第１の溶出受け入れチャネルの第１の側面の反対側のゲルの第２の長さ方向の側面に近接して配置され、かつ第１の対の第１の溶出陽極は、第１の溶出受け入れチャネルの第２の側面に近接して配置される。第２の始動により、溶出受け入れチャネルのうちの１つのチャネルおよび／または別のチャネルに近接して、電気泳動されたＤＮＡのＤＮＡ断片の蓄積が引き起こされうる。さらに、複数対の溶出電極のうちの１つの対および／または別の対の間を横切ってバイアス電圧を印加することにより、ＤＮＡ断片がそれぞれの溶出チャネルのうちの１つのチャネルおよび／または別のチャネルの中に駆動される。
【００２３】
電気泳動のための方法は、上記の電気泳動システムを含んでいてもよい。試料は、試料ウェル内にロードされてもよく、試薬は、試薬ウェル内にロードされてもよい。第１の電圧バイアスは、試薬ウェルから試料ウェルへの試薬の移動を引き起こすように構成されている１対の電気泳動電極を横切って印加されてもよい。試薬は、懸濁物中の細胞の溶解を引き起こすように構成されていてもよく、細胞からのＤＮＡ分子は、試料ウェルの少なくとも１つの側面に蓄積する。
【００２４】
一部の実施形態では、ＤＮＡ断片は、試料ウェルから複数の溶出チャネルに電気泳動によって駆動されてもよい。方法は、細胞懸濁物を試料ウェル内でインキュベートすること、および／またはＤＮＡ分子を断片に破壊することをさらに含んでいてもよい。さらに、細胞懸濁物のインキュベーションは、第１、第２、および／または第３の添加物を逐次的に試料ウェルに添加およびインキュベートし、その中で試料ウェルの内容物である細胞と共にインキュベートすることを含んでいてもよい。第１、第２、および第３の添加物は、同時に添加されてもよい。一部の実施形態では、第１の添加物は、ＴｎおよびＰａｃＢｉｏアダプターであり、第２の添加物は、Ｔ４ｐｏｌ、ｄＮＴＰ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、およびＮＡＤであり、第３の添加物は、エキソヌクレアーゼＴ５である。
【００２５】
上記の概念および以下でより詳細に論述されるさらなる概念のすべての組合せが（こうした概念が相互に矛盾していないという条件で）本明細書中に開示されている本発明の主題の部分であるとして意図されることは、当業者によって理解されよう。特に、本開示の最後において見出される特許請求されている主題のすべての組合せは、本明細書中に開示されている本発明の主題の部分であるとして意図される。参照によって組み込まれているいずれかの開示においても見出されうる、本明細書において明確に用いられている用語は、本明細書中に開示されている特定の概念と最も整合した意味と一致するはずであることも理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、一部の実施形態による、高分子量（ＨＭＷ）核酸、例えば、ＤＮＡを調製するために使用されうる、例えば、これに限定されないが、アガロースゲルなどの、ヒドロゲルの断面図を示す。
【００２７】
【図２】図２は、一部の実施形態による、複数の生体試料を並行して加工処理するための本明細書に記載のシステムの例示的構成を示す。
【００２８】
【図３】図３は、一部の実施形態による、担体への試料プラグの付着を促進するために担体中に含まれる多孔性要素の例を示す。
【００２９】
【図４】図４は、一部の実施形態による、多孔性要素を含む担体との試料プラグの形成の態様を示す。
【００３０】
【図５】図５および６は、一部の実施形態による、ゲルプラグの加工処理を速めるために使用されうる電気泳動の実例を示す。
【図６】図５および６は、一部の実施形態による、ゲルプラグの加工処理を速めるために使用されうる電気泳動の実例を示す。
【００３１】
【図７】図７は、図６に示されている構成の多重化された実施形態を示す。
【００３２】
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、一部の実施形態による、分析用ゲル上にロードされたゲル試料の例を示す。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、一部の実施形態による、分析用ゲル上にロードされたゲル試料の例を示す。
【００３３】
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、一部の実施形態による、アガロースプラグをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）バッファー中で電気泳動にかけることによる、アガロース試料プラグ中に埋め込まれた全血の高速除タンパクの例を示す。
【図９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、一部の実施形態による、アガロースプラグをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）バッファー中で電気泳動にかけることによる、アガロース試料プラグ中に埋め込まれた全血の高速除タンパクの例を示す。
【００３４】
【図１０−１】図１０Ａ〜Ｇは、一部の実施形態による、使い捨てカセットの断面図を示す。
【図１０−２】図１０Ａ〜Ｇは、一部の実施形態による、使い捨てカセットの断面図を示す。
【００３５】
【図１０−３】図１０Ｈは、一部の実施形態による、使い捨てカセットの上面図を示す。
【００３６】
【図１１】図１１は、一部の実施形態による、カセットの上面図を示す。
【００３７】
【図１２】図１２ａ〜ｈは、一部の実施形態による、カセットの試薬ウェルおよび試料ウェルの側面図を示す。
【００３８】
【図１３】図１３Ａ〜Ｂは、一部の実施形態による、カセットの上面図を示す。
【００３９】
【図１４】図１４Ａ〜Ｂは、一部の実施形態による、カセットの上面図を示す。
【００４０】
【図１５−１】図１５Ａ〜Ｃは、一部の実施形態による、カセットの上面図を示す。
【図１５−２】図１５Ａ〜Ｃは、一部の実施形態による、カセットの上面図を示す。
【００４１】
【図１６−１】図１６Ａ〜Ｌは、一部の実施形態による、カセットを使用した例示的なワークフローを示す。
【図１６−２】図１６Ａ〜Ｌは、一部の実施形態による、カセットを使用した例示的なワークフローを示す。
【図１６−３】図１６Ａ〜Ｌは、一部の実施形態による、カセットを使用した例示的なワークフローを示す。
【図１６−４】図１６Ａ〜Ｌは、一部の実施形態による、カセットを使用した例示的なワークフローを示す。
【００４２】
【図１７】図１７Ａ〜Ｃは、一部の実施形態による、電気泳動による抽出の前、間、および後のゲルを示す。
【００４３】
【図１８】図１８Ａ〜Ｄは、一部の実施形態による、電気泳動による抽出後の多様な段階におけるゲルを示す。
【００４４】
【図１９Ａ】図１９Ａは、一部の実施形態による、ウェルの列を作製するためのコームを示す。
【００４５】
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、一部の実施形態による、コームによって作製されたゲルの列を示す。
【００４６】
【図２０】図２０Ａ〜Ｂは、一部の実施形態による、ゲル中にロードされた白血球からのＤＮＡにおけるトランスポザーゼ活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
当業者は、本開示の図面が、主に、例示目的のためのものであって本明細書に記載の本発明の主題の範囲を制限することを意図するものではないことを理解および認識されよう。図面は、必ずしも一定の拡大縮小比ではない；一部の例では、本明細書中に開示されている本発明の主題の多様な態様は、異なる特徴の理解を容易にするために図面中で誇張または拡大されて示されていてもよい。図面中、同様の参照符号は、一般に、同様の特徴（例えば、機能的に類似したかつ／または構造的に類似した要素）を指す。
【００４８】
一部の実施形態では、ヒドロゲルは、ＨＭＷ核酸を調製するプロセスのうちの一部において使用されうる。一部の実施形態では、ヒドロゲル支持体（例えば、アガロースゲル）は、ＨＭＷ核酸の自動化された抽出および加工処理に利用される。ゲルは、ゲルに埋め込まれた試料の取扱いを簡単にしその自動化された加工処理を可能にする多様な種類の固体支持体上に形成されてもよい。粒状生体試料の例としては、動物、植物、真菌、または細菌の細胞が含まれる。さらに、一部の実施形態では、粒状試料は、ウイルス、および核酸を含有する非細胞性の膜で区切られた小胞（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｄｅｌｉｍｉｔｅｄ  ｖｅｓｉｃｌｅ）などの、非生存性生体粒子を含む。
【００４９】
一部の実施形態では、粒状生体試料は、その後の加工処理のためにヒドロゲルマトリクス中に埋め込まれる。ヒドロゲルマトリクスの例は、例えば、Ｈｏｆｆｍａｎ，  Ａｌｌａｎ  Ｓ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４巻、３〜１２頁、２００２年に論述されているもののように、生物医学的な適用、ならびに、例えば、Ｆｏｏｄ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａ．  Ｍ．  ＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎおよびＧ．  Ｏ．  Ｐｈｉｌｉｐｓ編、２００６年に論述されているもののように、食品および微生物学的な適用に有用なものである。これらの刊行物の全体の内容、およびその中の引用文献は、参照により本明細書に明白に組み込まれている。一部の実施形態では、ヒドロゲルマトリクスは、アガロースである。本明細書中の論述の大部分はアガロースを含むヒドロゲル支持体を扱っているものであるが、以下の説明におけるアガロースの使用は、例示的かつ非限定的なものであるとみなされるべきである。
【００５０】
一部の実施形態では、ヒドロゲルマトリクスは、試料構成成分のうちの１種または複数が選択的に結合しうる置換基を有していてもよい。こうした相互作用により、試料の加工処理中に、または加工処理された核酸の溶出中に、１種または複数の試料構成成分の選択的保持が引き起こされうる。
【００５１】
一部の実施形態では、図１Ａ〜Ｈに関して、ヒドロゲル、例えば、これに限定されないが、高分子量（ＨＭＷ）核酸、例えば、ＤＮＡを調製する際のアガロースゲルなどの使用が開示されている。例えば、容器１０１は、これに限定されないが、プログラム可能なサーモサイクラーなどの、熱的に調節された支持体１０２と接触して配置される。次いで、この容器内に、適切なバッファー中のある体積の融解したアガロースゲルが配置され、そして融解した混合物がゲル化しないようにするのに十分な温度で維持されてもよい。一部の実施形態では、ゲル形成中の熱に対する試料の曝露を制限するために、低融点アガロースが使用されてもよい（例えば、Ｌｏｎｚａ社製のＳｅａＰｌａｑｕｅ（登録商標）アガロースは、１．５％ゲルの融点はおよそ６５℃であり、ゲル化温度はおよそ３０℃である）。一部の実施形態では、ｐＨ感受性でありうるヒドロゲルを使用する場合に、ヒドロゲルのゲル化特性を調節するために酸性系が使用されてもよい。一部の実施形態では、ヒドロゲルは、光感受性であってもよく、ヒドロゲルのゲル化特性を調節するために光（例えば、紫外線、可視光など）が使用されてもよい。ゲルがそのゲル化温度を超えてインキュベートされているときに、目的の生体材料試料を含む体液（ｆｌｕｉｄ  ｌｉｑｕｉｄ）試料１０５が、融解したゲル溶液と混合されてもよい。一部の例では、生体試料は、手動で、かつ／または自動化された液体取扱いデバイス、例えば、１０４を介して、添加される。一部の実施形態では、ゲル溶液および／または生体試料の体積は、最終ゲル試料が、その後のステップにおいて簡単に操作されるのに十分に高いアガロース濃度を含むように選択的に選ばれる。例えば、約１．５％アガロースでの融解したゲル溶液に関して、最終ゲル溶液１０６が少なくとも０．７５％のゲル濃度を有するように、融解したゲル溶液と生体試料の体積がほぼ等しくてもよい。
【００５２】
ゲルおよび生体試料を含む最終混合物は、容器１０１内でゲル化温度のすぐ上の温度で維持されてもよく、その融解した混合物中に担体１０７が浸漬されてもよい。融解した混合物中に担体が浸漬された後に、支持体１０２の温度はゲル化温度より低い温度まで低下し、それによりゲルおよび生体試料を含む混合物が（例えば、担体上で）凝固することが可能になる。一部の実施形態では、担体は、注入成形プラスチック部分であってもよく、ゲル化された試料プラグ１０８と互いにかみ合うように設計された形状を有していてもよい。例えば、担体は、ゲルのための良好な機械的支持のためにフィンまたは突起を備え、それにより試料プラグが担体に付着した状態を維持することが可能になってもよい。一部の実施形態では、試料プラグ１０８は、担体の上部を手動操作用のハンドルとして使用して、または代替的に、担体の上部を、試料プラグの自動化されたロボットによる取扱いのための取り付け点として使用して、元の容器１０１から取り外してもよい。
【００５３】
一部の実施形態では、試料プラグは、第２の容器１０９内の試薬混合物１１０中に浸漬されてもよい。さらに、担体１０７、および／または第２の容器１０９は、試薬混合物１１０と試料プラグ１０８との混合を促進するために、撹拌されてもよい。一部の実施形態では、固体担体上に形成される試料プラグは、ゲル支持体中への加工処理試薬の拡散を促進するために、きわめて薄くてもよく、好ましくは、厚さが１ミリメートル未満（例えば、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１ｍ、０．０５ｍｍ、０．０１ｍｍ）であってもよい。一部の実施形態では、ゲル層の厚さは、２００マイクロメートル未満である。ｍｍ未満の厚さを有する支持体は、ゲル支持体の中および外における、プロテアーゼなどの、酵素的加工処理試薬の拡散を可能にするのに有用である。
【００５４】
一部の実施形態では、試料プラグへの加工処理試薬の添加は、試薬を保持している容器内で試料プラグを再融解させること、融解したゲルおよび試薬を混合してゲルおよび生体試料を含む混合物の全体に試薬を分散させること、ならびに混合物を再ゲル化させることによって達成されてもよい。こうした実施形態では、試薬は、液体形態で容器に添加されてもよく、またはゲルに埋め込まれた形態で添加されてもよい。試薬が液体形態で添加される場合、その後のゲル化が妨げられるので、または試料プラグが脆くなるので、試薬添加によって混合物が希釈されてはならない。試薬がゲルに埋め込まれた形態で添加される場合、使用されるゲルは、試料プラグのために使用されるのと同じ条件下で融解および再ゲル化していてもよい。試料プラグを再融解させることによって加工処理試薬の添加が加えられる実施形態では、低温で融解または液化されうるヒドロゲルマトリクスが使用されてもよい。例えば、マトリクスは、低融点アガロース（ＬｏｎｚａからのＳｅａＰｌａｑｕｅ（登録商標）アガロースなど）であってもよい。試料プラグを再融解させることによって加工処理試薬の添加が行われる実施形態では、混合ステップは、核酸に対するせん断損傷を回避するために可能な限り穏やかに行われうる。
【００５５】
一部の実施形態では、図２に関して、システムは、複数の生体試料を並行して加工処理するように構成されていてもよい。例えば、担体は、複数の試料プラグ２０８を担持し、試薬２１０の一定分量をそれぞれ保有しているマルチウェル容器２０９内でそれらのプラグを加工処理することができる、コーム形状を有していてもよい。
【００５６】
図３Ａ〜Ｈに関して、一部の実施形態では、担体は、担体への試料プラグの付着を促進するための多孔性要素３０２を含んでいてもよい。一部の実施形態では、多孔性要素は、担体の操作を促進するための固体部分３１１に取り付けられている。固体部分の例示的な材料としては、注入成形可能なプラスチックが含まれるが、これに限定されない。多孔性要素の例示的な材料としては、紙、フィルター、プラスチックまたはガラスウール、多孔性焼結ガラスまたはプラスチック、織物状材料、例えば、プラスチックメッシュまたは布などが含まれるが、これらに限定されない。担体の多孔性要素は、多様な形状を有していてもよく、その非限定的な例は、図３に示されており、円形（図３Ａおよび３Ｂ）、半円板（図３Ｃおよび３Ｄ）、矩形（図３Ｅおよび３Ｆ）、および辺縁が固体である矩形（図３Ｇおよび３Ｈ）を含む。
【００５７】
図４に関して、一部の実施形態における、多孔性要素を含む担体との試料プラグの形成が例示されている。ゲルおよび生体試料を含む融解した混合物は、熱的に調節された支持体４０２内に保持された容器４０１内でゲル化温度を超えて保持される。担体は、液体混合物が担体の多孔性要素を満たすように液体混合物中に浸漬される。一部の実施形態では、混合物は、多孔性要素の内部に空隙／または気泡を含むことなく均一に多孔性要素を満たす。ゲルおよび生体試料を含む融解した混合物中に多孔性要素を浸漬した後、熱的に調節された支持体の温度は、試料プラグのゲル化を可能にするために低下される。一部の実施形態では、混合物を保持している容器４０１の空洞は、担体の多孔性要素の外部に支持されていない試料プラグがほとんどまたは全くないように、担体の多孔性要素とほぼ同じ寸法でありうる。
【００５８】
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムは、例えば、図１Ｇおよび１Ｈに、示されているように、試料プラグにおいて逐次の化学的プロセスおよび／または酵素的プロセスを行うために使用されてもよい。試料プラグを有する担体は、それぞれ異なる試薬１１０を含む複数の容器１０９内で逐次インキュベートされうる。ＤＮＡの抽出および加工処理に有用な試薬の非限定的な例としては、以下が含まれる：溶解のための界面活性剤溶液；細菌、真菌、または植物の細胞壁を消化するための酵素を含有する溶液；プロテアーゼ溶液；ＤＮＡ加工処理酵素を含有する溶液；シークエンシングライブラリーを作製するための酵素および合成アダプターを含有する溶液；ならびにシークエンシングライブラリーを構築するためのトランスポザソームを含有する溶液。こうした実施形態では、改変されたＤＮＡ産物を後に残して、前のステップからの反応物が試料プラグから拡散するのを可能にするために、純粋なバッファーの溶液を含有する試薬容器内での１回または複数のインキュベーションを含むことが有用でありうる。一部の実施形態では、ヒドロゲル中の生体試料は、試料を細胞レベル以下の区画に分画するように加工処理されてもよく、例えば、全血または分散された哺乳動物細胞を、０．１〜１％重量／体積のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００などの界面活性剤を含有する溶液で処理することにより、哺乳動物の形質膜が溶解されることになるが、核はインタクトなままである。
【００５９】
一部の実施形態では、システムは、一連の試薬が、単一の試薬容器１０９に逐次的に添加され、そしてそれから除去されるように構成されていてもよい。試薬の添加および除去は、容器内の流体チャネルを介して達成されてもよく、前記チャネルは、容器の外部の１つまたは複数の液体取扱い手段（例えば、試薬容器）に接続している。他の実施形態では、試薬は、標準的な液体取扱い手段（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｔｅｃａｎ、Ｈａｍｉｌｔｏｎなどによって販売されるガントリー式の液体取扱いロボットなど）によって容器の上部から添加および除去されてもよい。両方のこうした実施形態では、試料プラグを有する担体は、試薬交換中に試薬容器に内在したまま、または近いままでありうる。
【００６０】
一部の実施形態では、試料プラグは、より小さなＤＮＡ断片を生成する加工処理ワークフローを促進するために、より高濃度のアガロースを用いて形成されてもよい。こうしたワークフローの非限定的な例は、トランスポザーゼを介した（例えば、ｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）からのＮｅｘｔｅｒａ、Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｅｒｍｅｎｔａｓからのＭｕＳｅｅｋなど、化学を使用した）ショートリード次世代ライブラリーの作製構築であろう。一部のこうしたワークフローにおいて、ＤＮＡは、長さが数百から数千ｂｐまでの範囲に及ぶサイズに断片化される。こうしたワークフローにおいて、試料プラグ中のより高濃度のアガロースは、プラグからのライブラリー産物の拡散を制限することになるが、トランスポザーゼおよび遊離アダプターが効率良く除去されるのを依然として可能にするはずである。
【００６１】
図５Ａ〜Ｄおよび６Ａ〜Ｂに関して、一部の実施形態では、電気泳動は、ゲルプラグの加工処理を速めるために使用されてもよい。図３Ｃ〜３Ｈに示されているもののように、比較的薄い平面形態を有するゲルプラグが使用されてもよく、（試料ＤＮＡ、非ＤＮＡ試料成分、および試薬を含む）試料プラグの多様な成分が、印加された電場に均一かつ急速に応答するのを可能にする。電気泳動を用いる際には、例えば、試薬容器５０９、６０９は、容器５０９、６０９の対向する側に１対の電極５１３、６１３を取り付けられていてもよい。試料プラグ５１２、６１２は、容器内で２つの電極間で試薬５１０、６１０中に浸漬されてもよく、かつ電圧は、プラグの内部の試料成分がプラグの外に移動されうるように、または試薬溶液の成分がプラグ中に移動されうるように、電極間を横切って設定される。電気泳動方法の一部の実施形態では、電気分解産物が試料プラグ５１２、６１２中のＤＮＡに到達するのを防ぐために、伝導性障壁５１４、６１４を使用することが有用でありうる。こうした障壁の例は、米国特許第５，９２９，２０８号、米国特許第６，３０６，３４８号、および米国特許第６，３１９，４７２号に記載されている。これらの特許の全体の内容、およびその中の引用文献は、参照により本明細書に明白に組み込まれている。
【００６２】
試料プラグの中および外に一連の試薬交換を行うときに、ゲル濃度、電圧、および／または電気泳動期間は、試薬成分が効率良く交換されるように、かつ／またはＤＮＡが試料プラグ中に残るように選択されてもよい。ＨＭＷのＤＮＡはアガロース中で非常にゆっくりと移動するので、通常、こうした条件は、きわめてＨＭＷのＤＮＡについて満たされる。ショートリードライブラリー（例えば、約５００ｂｐの断片サイズ）を作製するときに、より高濃度のゲル、より低い電圧、およびさらなる最適化が使用されてもよい。
【００６３】
図６Ａ〜Ｂは、図３Ｇおよび３Ｈに示されている形態の担体を用いた電気泳動を示している。一部の実施形態では、ゲルプラグは、すべての縁上で担体に取り付けられた多孔性要素上に支持される。したがって、完成した試料プラグは、担体を通る窓を形成する。担体は、試薬容器を、それ自体の電極６１３をそれぞれ含有する、２つのチャンバーに分割する様式で試薬容器６０９内に挿入される。一部の例では、担体および／または試料プラグは、２つのチャンバー間の液密シールを提供してもよい。単一の容器６０９内に担体を保持し、担体の片側または両側上で試薬６１０を交換することによって試料プラグ上で逐次的な加工処理ステップを行うことを可能にする。電気泳動は、試料プラグ中に新しい試薬を駆動して、試料プラグから古い試薬を除去するために使用されうる。
【００６４】
図７Ａ〜Ｂに関して、一部の実施形態における、図６Ａ〜Ｂに示されている本発明の概念の多重化が例示されている。図７Ａは、コーム様形状を有する多重化された担体７１４を示している。それぞれの歯は、図３Ｇおよび３Ｈに示されている単一の試料担体と同様な、試料プラグ７１２用の担体を形成する。コームは、自動化された移動手段に取り付けるための領域７１５を有し、これにより、コームは、自動化された加工処理ワークフローにおいて自動的にかつ／またはロボットで試薬容器に挿入、かつ／または試薬容器から除去されうる。図７Ｂには、図７Ａのコーム様担体を加工処理するための多重化された試薬容器７０９が示されている。容器は、容器内の特定の部位７１８でコームを受け入れるように設計される。図７Ｂの実施形態では、コームは、容器のそれぞれの空洞内の１セットのスロット７１８内に挿入されるように設計される。１セットの電極は、容器のそれぞれの空洞内に設置される。この非限定的な例では、それぞれの電極は、容器の左端の接続部７１６を通して別々に対処されうる。図７Ａ〜Ｂの実施形態は、例示的であり、他の多くの電極およびコームの配置構成も、本明細書中に開示されている実施形態のうちの１つおよび／または別のものと適合性でありうる。
【００６５】
一部の実施形態では、加工処理された核酸、例えば、これに限定されないが、ＤＮＡなどは、電気泳動によって試料プラグから溶出されてもよい。一部の例では、図５Ｃおよび５Ｄに示されている一般的な設計のデバイスは、加工処理された核酸の電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）に使用されてもよく、そこでは、陽（＋）極に最も近い障壁５１４が、加工処理された核酸を保持するのに十分に小さな細孔サイズの限外濾過膜を含む。１つの例示的なこうした膜は、１０ｋＤａの分子量カットオフを有するポリエーテルスルホン膜（ＥＭＤ  ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＢｉｏｍａｘ（登録商標）１０ｋＤａ）である。
【００６６】
一部の実施形態では、電気溶出に使用される電場は、ある特定のサイズ範囲の加工処理された核酸を選択的に回収するように操作されてもよい。例えば、パルスフィールド方法は、参照により本明細書にその全体が組み込まれている、Ｊａｎｎ  ＮｏｏｌａｎｄｉおよびＣｈａｎｔａｌ  ＴｕｒｍｅｌによってＩｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１２巻：Ｐｕｌｓｅｄ−ｆｉｅｌｄ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｉｅｓ．、Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ，  ＭａｒｇｉｔおよびＵｌａｎｏｖｓｋｙ，  Ｌｅｖｙ編、Ｈｕｍａｎａ．、７３〜１０３頁および１３５〜１４３頁の中に示されているように、サイズが約２０００ｋｂを超えるＤＮＡ断片を試料プラグ中に残したまま長さが５０〜５００ｋｂの加工処理されたＤＮＡ断片を溶出するために使用されうる。より大きなサイズ画分がより小さなものを含まないことが望ましい場合、より小さな画分が、まず、サイズ選択的なパルスフィールド条件下で溶出され、次いで、より大きな画分が、他のパルスフィールド条件下または連続的な電場条件下で回収されうる。こうした実施形態では、担体は、望ましくない第１の溶出産物から持ち越された混入を回避するために、第２の溶出のために第２の溶出容器（例えば、図５Ｃおよび５Ｄ）に移動されてもよい。
【００６７】
一部の実施形態では、加工処理された試料プラグを含有する担体は、加工処理された核酸を、分析のためのまたは他の試料調製プロセスのための、例えば、サイズ選択などの、他の電気泳動デバイス内にロードするために使用されてもよい。例えば、図７Ａに示されている多重化された担体の概念は、コームの歯が分析用スラブゲルの試料ローディングウェル内に適合するように、分析用アガローススラブゲルをロードするために使用されうる。同様の様式において、こうしたコーム設計は、いずれも参照により本明細書にその全体が組み込まれている、米国特許第８，３６１，２９８号および第８，３６１，２９９号に記載されているもののような分取用の電気泳動によるサイズ選択システムをロードするために使用されうる。さらなる試料調製方法およびデバイスは、例示的な実験実施の後に説明される。
【実施例】
【００６８】
一部の実施形態による例示的な実験実施
実施例：迅速電気泳動精製と共にアガロース試料プラグを使用した、ウシ全血からの超高分子量ＤＮＡの調製。
アガロースにおける血液細胞の固定。
２％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  Ｇｏｌｄ、Ｌｏｎｚａ）を、２ｇのアガロースを１００ｍＬの１×ＫＢＢ／２ｍＭ  ＥＤＴＡ（５０ｍＬの１０×ＫＢＢ、２ｍＬの５００ｍＭ
ＥＤＴＡを５００ｍＬとする）に添加することにより調製する。
一定分量を４５℃まで冷却する。
２ｍＬのアガロースを、２ｍＬのウシ全血（Ｌａｍｐｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）と混合し、直径６０ｍｍのペトリ皿内に注ぎ、冷却させる。
（０．５×ＫＢＢバッファーは、５１ｍＭトリス塩基、２８．８ｍＭ  ＴＡＰＳ酸、０．０８ｍＭ  ＥＤＴＡ酸、ｐＨ８．７である。）
【００６９】
電気泳動による除タンパク
試行１：ＳＤＳバッファーからの除タンパク。
２つの１２ウェル１．５ｍｍ厚コームを有するＧａｌｉｌｅｏ  ｇａｌｉｌｅｏ  １２１４ゲルボックストレイ内に水平アガロースゲルを調製し、０．５×ＫＢＢ＋０．５％ＳＤＳ中の１％ＳｅａＫｅｍ  Ｇｏｌｄアガロース（Ｌｏｎｚａ）１００ｍＬを添加する。
全血／アガロースを有するペトリ皿から、直径６．３５ｍｍのディスクをパンチアウトし、アガロースゲルのウェルに移す。
２５０Ｖでの２１分間の電気泳動により除タンパクする。
ウェルからディスクを除去し、ＴＥを伴う新しいペトリ皿に移す。
試行２：ＳＤＳ／チオ尿素バッファーからの除タンパク
ゲルが、上に列挙した成分に加えて、２Ｍチオ尿素を含有することを除き、すべてのステップを上の試行１の通り実施する。このゲルは、固めるのに冷却（４℃、３０分）を要する。
【００７０】
制限酵素消化
ディスクは、ＴＥ内のペトリ皿内にある。
ディスクをプラスチックスパチュラでＴＥから除去し、一端をペーパータオルにタップすることによりブロット乾燥させ、７８μＬの水／１６μＬの１０×ＮＥＢバッファー／１μＬの１Ｍ  ＤＴＴ／３μＬのＮＥＢ  ＢＳＡおよび以下の通り酵素を有する２ｍＬ微量遠心チューブに添加する。
【表１】
2020103308.tif 000002
【００７１】
すべての酵素はＮＥＢ製であり、（ＥｃｏＲＩおよびＡｐａを除き）１０または２０ｕ／μＬである。１μＬの酵素しか使わなかったＥｃｏＲ１（１００ｕ／μＬ）およびＡｐａ１（５０ｕ／μＬ）を除き、すべての消化物が２μＬ酵素／ウェルを使用した。すべてを、３７℃で一晩インキュベートした。反応を、８μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（約２５ｍＭ）および８μＬの１０％ＳＤＳ（約０．５％）を用いて停止させた。
Ｃｕｔｓｍａｒｔを使用した反応は強いｐｐｔを有し、おそらくバッファー中のＫ＋による。
【００７２】
分析アガロースゲル電気泳動
１％ｓｅａｋｅｍ  ｇｏｌｄおよび０．５×ＫＢＢバッファーを用いて水平ゲルを調製し、ディスクを上のものから試料ウェルに移し、Ｐｉｐｐｉｎ  Ｐｕｌｓｅ（Ｓａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、８０Ｖで、３００、１００、３０、１０、３０、１０、４５のフィールドパラメータ（定数Ａ〜Ｇ）（ＭＪ５プロトコール）で１２時間泳動させる。
標準は、低分子量マーカー（ＮＥＢエクステンドラダー）、ラムダゲノムＤＮＡ（４８．５Ｋｂｐ）およびＮＥＢラムダラダーＰＦ標準を含む。
【００７３】
分析用ゲル上にロードされたゲル試料の説明（図８Ａ〜Ｂ）
【表２】
2020103308.tif 000003
【００７４】
分析ゲル電気泳動後の試料プラグの染色
分析ゲル電気泳動後、試料プラグディスクを、ゲルローディングウェルから除去し、２４ウェルマイクロプレートにおいて７００μＬの０．５μｇ／ｍＬ臭化エチジウム中で染色した。除タンパクしたが、分析用ゲル上で泳動させなかった対照ディスクもまた染色し、右下のウェルに示す。
【００７５】
ゲルを、臭化エチジウムを用いて染色し、ＵＶ透過照明を用いて撮影し、画像をＣａｐｔｕｒｅＮＸソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）を用いて分析した。
【００７６】
結果：電気泳動で除タンパクしたが、制限酵素処理なしのＴＥバッファー中に残った試料プラグは、分析ゲル電気泳動後に、エチジウムにより明るく染色されたままであった（図８Ｂ、一番下の列、左から２番目および３番目のウェル）。未消化ＴＥプラグからはＤＮＡがほとんど電気泳動されず、約１００〜１５０ｋｂの見かけ上のサイズで移動した（図８Ａ、一番下のレーン）。分析用ゲルの一番上のレーンのラムダラダーからは、約２５０ｋｂのラムダマルチマーが、使用したパルス条件下でゲルに進入すると見られる。したがって、これらのパルス条件下では、ゲルを離脱しないので、ＴＥプラグ内のＤＮＡは、２５０ｋｂよりも実質的に大きいかのように振る舞う。
【００７７】
染色したプラグからわかる通り、すべての他の制限酵素処理が、多量のＤＮＡを試料プラグから解放した。制限バッファーで処理されたが、酵素では処理されなかったプラグに見られる通り（図８Ａ「Ｍｇ＋＋酵素なし」レーン、図８Ｂ、一番上の列、左から２番目）、試料のわずかなヌクレアーゼ活性が残されていたが、活性は十分に低く、プラグ内に移動するＤＮＡのほとんどは、１５０ｋｂよりも大きい見かけ上のサイズで移動した。プラグから解放されたＤＮＡのサイズは、酵素切断サイズの予測頻度と相関した。特に、ウシＤＮＡは、ＥｃｏＲＩでの消化で１．４ｋｂをもたらす豊富なＤＮＡリピートエレメントを有し、この予測バンドは図８Ａに明確に見られる。まとめると、これらの結果は、除タンパクされたプラグにおけるＤＮＡのほとんどが、超高分子量直鎖状二本鎖ＤＮＡであることを示唆する。
【００７８】
実施例：電気泳動によるアガロースに埋め込まれた全血試料からのタンパク質の迅速な除去。
目的：全血をアガロースと混合するとき、ＳＤＳの存在下で電気泳動によりタンパク質のすべてを除去できることを実証し、アガロースプラグ試料の得られたタンパク質プロファイルを、プロテイナーゼＫで処理したアガロースプラグのタンパク質プロファイルと比較する。
【００７９】
実験
全血をアガロースと混合する
４８℃の０．５×ＫＢＢバッファー（Ｓａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）プラス１ｍＭ  ＥＤＴＡ中１．５％ｓｅａｋｅｍ  ｇｏｌｄアガロース２ｍＬに、２ｍＬの全血を添加し、混合するための急速回旋後、混合物を直径６０ｍｍのペトリ皿中に注ぎ、冷却させる。
プロテイナーゼＫで処理することにより除タンパクする
ラン１：ペトリ皿から、パンチを使用して直径６．３５ｍｍのディスクを製造し、ディスクを一晩、揺動しながら、１ｍＬのＳａｒＥバッファーを有する２ｍＬ微量遠心チューブ内でインキュベートする。
（ＳａｒＥバッファー：１ｍＬを製造するため、３７５μＬの水、１００μＬの１０％重量／体積  Ｎラウリルサルコシン、５００μＬのＮａ２ＥＤＴＡ、および２５μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ溶液（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃
ＦＰ２５００１５０）を混合する）
ラン２：６．３５ｍｍのディスクを、１ｍＬのＳＴＣＰバッファーを用いることを除いて上の通りインキュベートする
ＳＴＣＰバッファー：１ｍＬを製造するため、８９０μＬの水、５０μＬの１０％重量／体積ＳＤＳ、５０μＬ  １ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１μＬの１Ｍ  ＣａＣｌ２、５μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを混合する
ラン３：（プロテアーゼなしの対照）：ディスクを、０．５×ＫＢＢ／０．５％ＳＤＳを含有するバッファーを用いることを除いて上の通りインキュベートする
ＳＤＳの存在下で電気泳動により除タンパクする
ラン４：６．３５ｍｍのディスクを、アガロースゲル（１％ｓｅａｋｅｍ  ｇｏｌｄ、０．５×ＫＢＢ、０．５％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）のウェルに移す。泳動バッファーは同じ（０．５×ＫＢＢ／０．５％ＳＤＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）である。ゲル（総体積５０ｍＬのアガロース）を、６ウェルフォーマーを有する１．５ｍｍ厚コームを有するＧａｌｉｌｅｏ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅモデル０７０８ゲルボックス内に注ぐ。  ２２０Ｖで５分間電気泳動する。この時間は、暗褐色のヘモグロビンバンドがアガロースディスクを完全にクリアにするのに十分である。
ディスクを、１ｍＬの新しい泳動バッファーを有する２ｍＬ微量遠心チューブに移す。
ラン５：電気泳動が２２０Ｖで８分間であることを除き、ラン４と同様。
ラン６：４分後にアガロースゲルウェル（現在は無色のディスクを含有）に５ｍＭ  ＴＣＥＰ溶液を充填し、５分間待機し、４分間２２０Ｖで電気泳動することを除き、ラン４と同様。
ラン７：電気泳動がＴＣＥＰ添加後に８分間であることを除き、ラン６と同様。
ラン８：さらなる処理なしの対照（未処理）Ａ  ６．３５ｍｍディスク（全血からの明赤色）。
アガロースディスクを可溶化し、分析ＳＤＳ  ＰＡＧＥ上に可溶性物質を泳動させることにより、除タンパクの程度を決定する
ランからのディスクを、８０μＬのＴＵＳバッファー、１０μＬのＳＤＳ  ＰＡＧＥ用４×ＬＤＳ試料バッファー（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１μＬの５００ｍＭ  ＴＣＥＰ溶液と混合し、８５℃で６分間加熱することにより可溶化した。
（ＴＵＳバッファーは、３ｇｒのチオ尿素、２６０μＬの５０×ＴＥ（ＵＳＢ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、２．６ｍＬの１０％ＳＤＳ、および１３ｍＬまでの水を組み合わせることにより製造され、この溶液は４２℃で可溶性である。このバッファーは、チオ尿素約３Ｍ、１×ＴＥおよびＳＤＳ２％である。）
２０μＬの可溶化物質を、４〜２０％の勾配ＳＤＳゲル（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ＥｘｐｒｅｓｓＰｌｕｓ  ＰＡＧＥ  Ｇｅｌ、４〜２０％、１５ウェル、カタログＮｏ：Ｍ４２０１５）上にロードした。
ゲル分析のための対照
Ａ：５μＬの全血＋８０μＬのＴＵＳ、１０μＬの４×ＬＤＳ、１μＬのＴＣＥＰ
Ｂ：１μＬの全血＋８０μＬのＴＵＳ、１０μＬの４×ＬＤＳ、１μＬのＴＣＥＰ
Ｃ：２μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ＋＋８０μＬのＴＵＳ、１０μＬの４×ＬＤＳ、１μＬのＴＣＥＰ
追跡用色素が底部に到達するまで、１９ワットの定電力でゲルを泳動させ、ゲルを水ですすぎ、クマシーブルー（Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒカタログ＃２４６２０、ＰａｇｅＢｌｕｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で染色し、水で脱染し、ライトボックスを使用して撮影した（透過照明）。画像を、Ｃａｐｔｕｒｅ  ＮＸソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）で分析した。
【００８０】
図９Ａおよび９Ｂにおける試料のローディング。
【表３】
2020103308.tif 000004
【００８１】
図９Ａは、クマシーで染色されたＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルを示す。
レーン９は、約０．１μＬの未処理全血である。レーン１４は、処理なしの全血／アガロースディスク（約０．２６μＬの全血に等しいゲルローディング）である。
レーン３および４は、界面活性剤およびプロテイナーゼＫのみとのインキュベーションによって（タンパク質の電気泳動除去なし）除タンパクされたディスクを示し、消化のために使用されたプロテイナーゼＫ混合物自体は、レーン１０におけるものである。
レーン５〜８は、電気泳動で除タンパクされたディスクを示す。
図９Ｂは、薄いバンドを示すために強化された、同じゲルを示す。
【００８２】
結果
【００８３】
図９Ａおよび９Ｂは、アガロース試料プラグ中に埋め込まれた全血が、ＳＤＳバッファー中でアガロースプラグを電気泳動することにより迅速に除タンパクされうることを示す（図９Ａおよび９Ｂ、レーン５〜８）。試料プラグのタンパク質含有量の低減は、少なくとも１００×である（レーン５〜８をレーン１４と比較のこと）。
【００８４】
除タンパクのために使用された電気泳動条件が、実施例１の試行１試料のために使用されたものと類似していたと認識することが重要である。上の実施例１で示した通り、未制限の電気泳動で除タンパクした試料（図８Ａおよび８Ｂの「ＴＥ」試料）からのＤＮＡは、ゲル試料プラグから電気泳動されるには大きすぎた（図８について使用された電気泳動条件下で２５０ｋｂよりもはるかに大きい）。したがって、ＤＮＡがゲル試料プラグにおいて超高分子量のままである条件下で、アガロースに埋め込まれた血液細胞からのＤＮＡを電気泳動により迅速に精製できる条件を見出すことが可能である。さらに、ＤＮＡ分子の大部分が、様々な制限酵素により加工処理されるそれらの能力により評価するとインタクトな二本鎖ＤＮＡのようである。
【００８５】
電気泳動による試料調製
一部の実施形態では、ライブラリー構築の前に試料からヒトＤＮＡを物理的に引く（ｓｕｂｔｒａｃｔ）ことによりコストを減少させる、試料調製のための方法が提供される。かかる実施形態では、試料からの９０％またはそれ超までの核酸を除去でき、必要とされる１試料当たりのシークエンシングの量の低減をもたらす（したがって、１試料あたりのシークエンシングコストを比例して減少させる）。したがって、一部の実施形態では、全血試料からのＷＢＣ  ＤＮＡのサブトラクションのための高速でスケーラブルな方法が提供される。
【００８６】
電気泳動溶解法を使用した全血からのＨＭＷ  ＤＮＡの迅速な精製
図１０Ａ〜Ｇは、電気泳動バッファー（５）が充填されたプラスチック容器（２）と、高分子の分離に好適な電気泳動ゲルマトリクス（３）とを含む、一部の実施形態による使い捨てカセットデバイス（１）の断面図を示す。カセットのゲル部分はまた、ゲルによりいずれかの側に電気泳動バッファーチャンバーから隔離された試料ウェル（６）を有する。図１０Ｈの概略上面図に示す通り、ゲル部分（３）は、カセット容器（２）を側方に満たし、そのことにより、２つの隔離されたバッファーチャンバー（５）をゲルのいずれかの側に創出する。
【００８７】
ゲル材料は、デンプン、寒天、アガロース、およびポリアクリルアミドを含んでいてもよいが、類似の特性を有する多くの他のマトリクスもまた使用できる。一部の実施形態では、ゲル材料は、アガロースである。
【００８８】
概して、ＤＮＡおよびタンパク質電気泳動のために一般に使用される７〜９のｐＨ範囲内の電気泳動バッファーを使用できる。試料の酵素的加工処理を伴う特定の実施形態（下に記載）について、特定のｐＨおよびイオン組成を有するバッファーを使用できる。
【００８９】
事前充填ゲルカセットを使用した実施形態について、相対的に低いイオン強度で高い緩衝能を有するバッファーを使用できる。この態様では、Ｌｉｕ、Ｌｉ、およびＳｏｍｍｅｒ（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９９年、２７０巻、１１２〜１２２頁）により記載されたバッファー（およびバッファー設計原理）が配合物のなかにある。
【００９０】
電気泳動バッファーは、精製プロセス中にヌクレアーゼ活性を制限できるキレート剤として、ＥＤＴＡを有していてもよい。一部の実施形態では、高濃度のＥＤＴＡ（５〜５０ｍＭ）が、細胞溶解物中で迅速にヌクレアーゼを失活させるのに有益でありうるが、少なくとも１ｍＭのＥＤＴＡを、電気泳動バッファーにおいて使用できる。一部の実施形態では、１ｍＭ未満のＥＤＴＡを使用できる。
【００９１】
カセットを横切って電気泳動電圧を印加するため、電極（４）を、ゲルのいずれかの側のバッファーチャンバー内に挿入できる。電極は、カセットの使い捨て部品であってもよく、またはそれらは、使い捨てカセットを保持して作動させるよう設計された機器の再使用可能部分であってもよい。例は、米国特許第８，３６１，２９８号および第８，３６１，２９９号、ならびに米国特許公開第２０１４／０２８４２１３号および第２０１５／０１０１９３２号に見出すことができ、それらのすべては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９２】
試料は、細胞の液体懸濁物を含んでいてもよい。細胞懸濁物は、図１０Ａ（円は細胞を表す）に示す通り、試料ウェル（６）内にロードされる。試料組成物は、細胞およびローディング液がほぼ同じ密度を有するよう密度が高められる。これは、加工処理中にウェル内で細胞が沈降または浮遊するのを防止することにより、試料ウェル体積全体にわたる試料の均一な分布を保つのに役立つ。
【００９３】
試料組成物は、細胞の溶解が電気泳動による溶解の誘導前に生じないよう、細胞試料と等浸透圧となるよう構成できる。加えて、加工処理中の電気泳動による加熱を最小限に保てるよう、試料のイオン強度は低く保たれてもよい。一部の実施形態では、試料のイオン強度は、電気泳動バッファーのイオン強度と概ね等しくてもよい。
【００９４】
精製プロセスを開始する前に、溶解試薬（８、図１０Ａ）を、２つの電気泳動バッファーチャンバーのうちの一方に添加できる。溶解試薬は、陰イオン性界面活性剤、例えば約０．１から約１０％（重量／体積）の間の濃度のＳＤＳであってもよい。陰イオン性界面活性剤および界面活性剤適合性プロテアーゼ、例えばＳＤＳおよびプロテイナーゼＫ（例えば、約５０から約１００００μｇ／ｍｌの濃度範囲を有するプロテイナーゼＫ）の混合物を含む、他の溶解試薬を使用できる。
【００９５】
一部の実施形態では、溶解試薬が電気泳動バッファーチャンバーと試料ウェルとの間のゲル障壁を横切って拡散する時間がないように、試料ローディング後、電気泳動プロセス開始直前に溶解試薬を添加できる。加工処理のこの順序は、試料溶解およびＨＭＷ  ＤＮＡの電気泳動精製が迅速かつ同調的な様式で生じることを保証するのに役立つ。
【００９６】
精製プロセスを開始するため、図１０Ｃ〜１０Ｄに示す通り、電気泳動電圧がカセットを横切って印加され、その結果、溶解試薬が試料ウェル内にゲルを通して駆動されて試薬が細胞溶解を刺激する。溶解反応は、混合および粘性剪断力なしに生じ、超ＨＭＷ  ＤＮＡ分子の回収を可能にする。二価イオンをキレート化し、そのことにより、細胞溶解中のヌクレアーゼ活性を防止するため、電気泳動バッファーおよび試料ローディング液において高濃度のＥＤＴＡを使用できる。
【００９７】
電気泳動を継続するにつれて、超ＨＭＷ  ＤＮＡ分子が蓄積し、（−）電極から遠位の試料ウェルの壁に絡まるようになる。ＨＭＷ  ＤＮＡ分子は、連続的または交互的な電場条件下でゲルに進入するには大きすぎ、試料ウェル壁上に留まる。下の実施例のために使用された条件下では、絡まって固定したＨＭＷ  ＤＮＡ分子は、分析パルスフィールドゲル電気泳動によって見積もって＞２メガ塩基のサイズであるようである。
【００９８】
電気泳動溶解プロセス中、細胞タンパク質、溶解試薬、界面活性剤ミセル中の脂質、および塩を含むすべての他の荷電種は、試料ウェルの外へと迅速に電気泳動される。ほとんどが、図１０Ｅに示す通り、陰イオン性溶解界面活性剤、例えばＳＤＳとの複合体として（＋）電極へと移動させられる。
【００９９】
（例えば）図１０Ｆ〜１０Ｇに示す方法を含め、精製されたＨＭＷ  ＤＮＡ画分を回収するいくつかの方法がある。夾雑物は、リザーバー中のバッファーを交換することにより、カセットから除去される。ＨＭＷ  ＤＮＡを試料ウェルの壁から離れるよう移動させるため、逆電場電圧がカセットに印加される。この逆電場電気泳動のための条件は、各カセットおよびゲルタイプについて慎重に較正される。なぜなら、電気泳動を長く継続させすぎると、ＤＮＡは反対側の壁に絡まりうるからである。次に、解放されたＤＮＡを、自動化または手動ピペッティング手段（図１０Ｇ）により、液体電気泳動バッファーにおいて試料ウェルから除去できる。
【０１００】
自動化電気泳動ＤＮＡ抽出および酵素的加工処理のためのプロセスおよびデバイス
図１１（カセットの上面図を示す。米国特許公開第２０１５／０１０１９３２号も参照のこと）の使い捨てカセットは、試料ウェル（１６）に加えて、試料ウェルの上流の試薬ウェル（１５）を含む。試薬ウェルは、試料ウェルと（−）分離バッファーチャンバーとの間に位置していてもよい。ＤＮＡのような負に荷電した分析物を、一方向から他方向へと移動させることができる分離電極（４）も含まれ、分析物の所望の分離が達成されたとき、分離電極は停止され、溶出チャネル電極（１３）が始動し、分離された負に荷電した分析物を上方へと、バッファーが充填された溶出モジュール（１０）内に移動させる。溶出モジュールは、（＋）電極側でＰＥＳ限外濾過膜（カットオフ１０ｋＤａ）を用いてシールされており、これは、ゲノムＤＮＡ分子を溶出モジュールの内側に保持する。
【０１０１】
図１２は、図１１の点線１４により示されるカセットの矢状断面に沿って見た、試薬および試料ウェル（１５、１６、図１１）の機能を示す。図１２Ａは、細胞懸濁物が充填された試料ウェル（１６）および負に荷電した溶解試薬、例えばＳＤＳが充填された試薬ウェルを示す。図１２Ａは、電気泳動電圧を始動する直前のウェルの構成を示す。図１２Ｂ、１２Ｃ、および１２Ｄは、電気泳動の始動後のウェルの状態を示す。図１２Ｂにおいて、試薬は、試料ウェル内に移動し、細胞溶解を開始する。図１２Ｃにおいて、溶解はほぼ完了しており、ＨＭＷ  ＤＮＡが試料ウェルの（＋）面上に蓄積しており、夾雑物および溶解試薬が右側へと、分離ゲル内に、（＋）分離電極に向かって電気泳動されている。図１２Ｄにおいて、高度に精製されたＨＭＷ  ＤＮＡ（９）が、試料ウェル壁上に絡まっており、夾雑物が試料ウェルからさらに右側へと離れて移動している。上で図１０Ｅについて記載した通り、ＤＮＡ（９）は、試料ウェルの（＋）壁に固く付着している。電気泳動バッファーは、図１２Ｅに示す通り、ゲルに絡まったＤＮＡ層を撹乱することなしに試料ウェルから除去でき、試料ウェルには手動または自動のいずれかで、図１２Ｆに示す通り、ＤＮＡ修飾酵素（１８）を含有するバッファーを再充填できる。
【０１０２】
図１２に示す酵素処理は、１００ｋｂ〜１０００ｋｂの範囲のサイズ分布を伴うランダムに断片化されたＨＭＷ  ＤＮＡを生成するために、二本鎖エンドヌクレアーゼによる固定ＨＭＷ  ＤＮＡの制御された切断を伴う。インキュベーション期間、例えば所望のサイズ分布を生成するのに十分な期間後、分離電極を再始動し、加工処理されたＤＮＡ断片（１７）を、試料ウェルの外に、分離チャネル内へと右側に電気泳動する。加工処理のために使用されるヌクレアーゼは、分離電気泳動を開始する前に、試料ウェルまたは試薬ウェルへのＳＤＳの添加により不活性化できる。ＳＤＳで変性された加工処理ヌクレアーゼ（１８）は、図１２Ｈに側面図で概略的に示す通り、それよりもはるかに大きい加工処理されたＤＮＡ断片のはるか前方を移動する。図１３Ａは、図１１Ｈに示す分離電気泳動段階後のカセットの上面図を示す。この段階で、加工処理されたＤＮＡ断片は、溶出チャネルの正面に位置する。分離電極を停止し、溶出電極を始動し、そのことにより、加工処理されたＤＮＡを、分離ゲルからバッファーが充填された溶出モジュール内に電気溶出し（図１３Ｂに概略的に示す）、加工処理されたＤＮＡは手動または自動で回収できる。
【０１０３】
一部の実施形態では、試料ウェルから固定されたＨＭＷ  ＤＮＡを放出するための試薬は、非特異的二本鎖エンドヌクレアーゼ、例えばＭｎ＋＋イオンの存在下でのＤＮａｓｅ
Ｉ、およびＦｒａｇｍｅｎｔａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む。他の試薬、例えば合成オリゴヌクレオチドアダプター二重鎖をロードさせたトランスポザーゼもまた使用でき、その例には、変異体Ｔｎ５トランスポザーゼ、Ｎｅｘｔｅｒａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより製造された変異体Ｔｎ５トランスポザーゼ、および変異体Ｍｕトランスポザーゼ試薬、ＭｕＳｅｅｋ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌｉｆｅ）が含まれる。他の試薬は、制限エンドヌクレアーゼを含む。制限エンドヌクレアーゼを使用するとき、放出されたＤＮＡ生成物がきわめて大きくなるように、消化条件は、非常に限定された範囲の消化のみを可能にするものであってもよい。とりわけ好ましいＤＮＡ切断試薬は、制限酵素、例えばＣｖｉＫＩ−１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）であり、これは、非常に低い配列特異性を有し、ゲノムＤＮＡのメチル化状態に影響されない。ＣｖｉＫＩ−１および類似の低特異性酵素による限定的な消化は、切断部位のほぼランダムなセットを生成しうる。
【０１０４】
図１２の概略的ワークフローはまた、Ｎｅｘｔｅｒａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）のようなトランスポザーゼベースの試薬システムを使用したＮＧＳライブラリー構築のためにも使用できる。かかるワークフローにおいて、トランスポザーゼ分子は、トランスポザーゼ結合部位に付着されたシークエンシングアダプターを担持し、ゲノムＤＮＡと反応させられる。トランスポザーゼ反応は、同時に、ゲノムＤＮＡを断片化し、断片化されたゲノムＤＮＡの端部にシークエンシングアダプターを付着させる。ＮＧＳライブラリー構築のためのトランスポザーゼ試薬は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｎｅｘｔｅｒａ、変異体Ｔｎ５トランスポザーゼに基づく）およびＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（ＭｕＳｅｅｋキット、Ｍｕトランスポザーゼに基づく）から市販されている。トランスポザーゼに媒介されるライブラリーワークフローは、図１２に示すものと同様に機能しうるが、但し、図１２Ｆ〜Ｇにおいて使用された酵素（１８）は、特化したシークエンシングアダプターをロードさせた好適なトランスポザーゼであることを条件とした。このようにして、図１２および１３に示すワークフローは、単一の使い捨てカセット、３つまたは４つの自動化された液体取扱いステップ、および単純でプログラム可能な電気泳動電源を使用して、全血試料から直接ＮＧＳライブラリーを生成可能である。
【０１０５】
ＨＭＷ  ＤＮＡは、電気泳動での絡まりによりアガロース試料ウェルの表面上に固定されるとき、そのＨＭＷ  ＤＮＡ上で様々な他の酵素的および化学的修飾反応を実施するために使用できることに留意すべきである。概して、試料ウェル壁上でのＨＭＷ  ＤＮＡの可逆的固定は、ＤＮＡの逐次的酵素処理によく適合した便利な水性支持体を提供する。原理では、支持体からほどけるほどにＤＮＡのサイズを低減しない任意の処理セットを、試料ウェル内の試薬混合物を交換することにより実施できる。一部の実施形態では、残留荷電反応成分を試料ウェルから分離ゲル内へと除去するため、電気泳動精製を反応ステップ間に実施できる。
【０１０６】
非限定的な一例として、ＨＭＷ  ＤＮＡの光学マッピングにおいて使用されるプロセスである、配列特異的ニッキングエンドヌクレアーゼ部位でのＤＮＡの蛍光標識化（例えば、Ｂｉｏｎａｎｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓワークフローを参照のこと）が、代替的な加工処理ワークフローであってもよい。上および図１２に記載のＨＭＷ  ＤＮＡの電気泳動精製後、精製反応中に導入されたすべてのランダムニックをシールするため、ＤＮＡ修復ミックスを試料ウェルに再充填できる。修復後、試料ウェルを空にし、すすぎ、特定の塩基配列に一本鎖ニックを導入するニッキングエンドヌクレアーゼを含有する反応ミックスを再充填できる（ＮＥＢ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ  ２００６年７月、１．２巻から、Ｓｉｕ−ｈｏｎｇ  Ｃｈａｎ博士およびＳｈｕａｎｇ−ｙｏｎｇ  Ｘｕ博士による、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ；  ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｔｏｏｌｓ−ａｎｄ−ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｆｅａｔｕｒｅ−ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｎｉｃｋｉｎｇ−ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ−ｔｈｅ−ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−ａｎｄ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−ｏｆ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ−ｅｎｚｙｍｅ−ｖａｒｉａｎｔｓを参照のこと、この文献は参照により本明細書に明示的に組み込まれる）。ニッキング後、試料ウェルを空にし、すすぎ、次に、好適なバッファー中のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光ヌクレオチドの混合物を再充填できる。ゲルカセットの温度を約５０℃まで上げた後、ポリメラーゼはニッキング部位でニックトランスレーション反応を実行でき、そのことにより、光学マッピングのため配列をニック部位で蛍光標識化する。ニッキングおよび標識化反応を通して、ＤＮＡはＨＭＷ形態のままであってもよく、アガロースウェル壁と絡まったままであってもよい。標識化反応後、上および図１２に記載の通り、非特異的二本鎖エンドヌクレアーゼによりＤＮＡを軽度に断片化でき、上ならびに図１２および１３に記載の通り、電気泳動により精製できる。
【０１０７】
図１２Ａ〜Ｄの概略的ワークフローもまた、例えば、非ヒト配列臨床試料の検出を通じて感染性病原体を検出しようとするＮＧＳ診断法を補助して、インタクトなゲノムＤＮＡの物理的サブトラクションのために使用できる。例えば、図１２Ａ〜Ｄに示すワークフローを使用して、血液試料から損傷していない事実上すべてのヒト配列を捕捉して、試料ウェルの（＋）壁上に固定できる。より小さな病原体ＤＮＡゲノム（ゲル内への進入を保証するようサイズは＜８００ｋｂ）およびすべてのＲＮＡ分子（宿主および病原体）が、電気泳動によって移動可能なままであってもよく、試料ウェルの外へ移動してもよい。これらのより小さな分子は、図１３に概略的に示す通り、ＮＧＳライブラリー調製のために電気溶出および回収できる。ＲＮＡ分子は、ゲノムＤＮＡよりも小さく、サイズが不均一であるので、ｇＤＮＡが引かれたＲＮＡのために使用されるカセットは、より高いアガロース濃度、および、より大きな溶出チャネル領域を必要としうる。これは、より広い回収サイズ範囲を提示でき、カセット、例えば米国特許公開第２０１５／０１０１９３２号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものを使用できる。
【０１０８】
図１６Ｆ〜Ｊに示す通り、一部の実施形態では、同じ試料からの複数の分析物を精製および／または単離できる。これらの図は、図１３に示すものと類似のカセットからの分離ゲルおよび溶出モジュールを示す。図１６Ｆは、試料ウェル（１５０２ａ）内にロードされた細胞懸濁物および試薬ウェル（１５０２ｂ）内にロードされた溶解試薬を有するカセットを示す。この実施形態のための溶解試薬は、陰イオン性界面活性剤、例えば約０．１％から約１０％（重量／体積）の間の濃度のＳＤＳであってもよい。段階１（図１６Ｆから１６Ｇ）において、分離電気泳動は、負に荷電した種がカセットの頂部から底部へと移動するよう実施される。負に荷電したＳＤＳは、試料ウェルを通って下方に移動し、細胞を溶解させる。ＨＭＷゲノムＤＮＡは、その大きなサイズゆえに試料ウェルの（＋）側上に固定されたままである。しかしながら、細胞ＲＮＡおよびＳＤＳに被覆された細胞タンパク質は、試料ウェルから解放され、（＋）電極に向かって分離ゲルの下方に移動する。２％およびそれ未満のゲル濃度で、アガロースゲルは、タンパク質−ＳＤＳ複合体の遅滞をほとんど有しない。結果として、ほとんどの細胞タンパク質が、高移動度のＳＤＳミセルと共に移動する（図１６Ｇ、括弧１６０２の領域）。ほとんどの細胞ＲＮＡは、実質的により大きな分子量であり、サイズが約６００から約３０００塩基の間（２００〜１０００ｋＤａ）であり、したがって、ＳＤＳ−タンパク質バンドのすぐ上で部分的に分離したバンドとして移動する（図１６Ｇ、括弧１６０１の領域）。溶出電圧の印加の際（段階２、図１６Ｇから１６Ｈ）、ＲＮＡおよびＳＤＳ−タンパク質画分は、溶出モジュール内に溶出され、ここでこれらは電気泳動バッファー中で回収される。ゲルシステムおよび電気泳動条件に応じて、括弧１６０１と１６０２との間の重複によって図において示唆される通り、小ＲＮＡ画分（６００塩基未満のＲＮＡ）とＳＤＳ−タンパク質画分との間にある程度の重複があってもよい。必要に応じて、ＳＤＳは、市販の界面活性剤除去カラム（例えば、ＨｉＰＰＲスピンカラム、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌｉｆｅ）またはアセトン沈殿を使用して、電気溶出されたタンパク質画分から除去できる。
【０１０９】
カセットの複数分析物適用における、高速で移動する核酸画分とＳＤＳ−タンパク質複合体との間の分解の改善は、２部分型分離ゲルを使用して達成できる。例えば、試薬および試料ウェルを含有する領域を含むゲルカラムの上部は、例えば約０．７５％またはそれよりも低い、相対的に低い濃度のアガロースゲルを含みうるが、一方で、ゲルの下半分は、例えば約２％またはそれよりも高い、より高い濃度のアガロースゲルを含み得、これは、界面活性剤−タンパク質複合体とより低い分子量の核酸画分との間の、移動度のより良好な識別を可能にする。
【０１１０】
カセットの複数分析物適用における分解の改善はまた、等速電気泳動としても公知の電気泳動スタッキング（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｓｔａｃｋｉｎｇ）の使用によっても達成できる。かかる実施形態では、実施形態のカセット、例えば図１６Ｋに示すカセットでは、上部バッファーチャンバー（図１６Ｋ、１６０１）は、泳動時間（ｒｕｎ  ｔｉｍｅ）に、ゲル（１６１０）、下部バッファーチャンバー（１６０２）、および溶出バッファーチャネル（１６０９）内に含有されるものと異なるバッファーと置き換えられる。上部バッファーは、試料ウェル（１６０３）内の細胞試料を溶解させるに好適な陰イオン性界面活性剤を含んでいてもよい。加えて、泳動時間の上部バッファーは、界面活性剤−タンパク質複合体、ＤＮＡ、またはＲＮＡの選択的スタッキングを達成するのに好適なイオン組成を含む。かかるスタッキング適用に好適なバッファー設計の例は、Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ  ２２７巻、６８０〜６８５頁、１９７０年；ＯｒｎｓｔｅｉｎおよびＤａｖｉｓ、Ａｎｎａｌ．  ＮＹ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ、１９６４年；Ｐｅｒｓａｔら  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ８１巻、９５０７〜９５１１頁、２００９年；Ｓｃｈｏｃｈら  Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ  ９巻、２１４５〜２１５２頁、２００９年に見出すことができる。図１６Ｌは、タンパク質をスタックさせるよう設計されたバッファー系（例えば、Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ  ２２７巻、６８０〜６８５頁、１９７０年）を使用した、細胞懸濁物の電気泳動精製および分離後のカセットの概略図を示す。ゲル（１６１０）、下部バッファーリザーバー（１６０２）、および溶出チャネル（１６０９）は、ＳＤＳを有しない電気泳動バッファーを含有する。試料ローディングの直前に、上部バッファーチャンバー（１６０１）を空にし、試料溶解およびタンパク質−界面活性剤複合体の電気泳動スタッキングに好適なＳＤＳバッファーを再充填する。電圧が分離電極（１６０８）に印加され、ＳＤＳはカセット内へと下方に移動し、そのことにより、試料ウェル（１６０３）内に保持された細胞懸濁物を溶解させる。ゲノムＤＮＡ（１６０５）は、試料ウェルの（＋）側に捕捉され、その大きなサイズゆえにそこに固定される。ＲＮＡおよび界面活性剤−タンパク質複合体は、分離ゲル内に電気泳動される。ＲＮＡ（１６０６）は、ゲルマトリクス中でサイズに基づいて分離される。アガロースゲルの非制限的な大きな細孔サイズゆえに、タンパク質−界面活性剤複合体は、バッファー系によりスタックされ、高移動度の密な単一のバンド（１６０７）で分離ゲルを通過して移動する。分離後、ＲＮＡおよびタンパク質成分を、比較的純粋な画分として溶出できる。所望であれば、図１６Ｆ〜Ｌについて上で議論した通り、ゲノムＤＮＡを、断片化、分離、および溶出の第２サイクルにおいて試料ウェルから回収できる。
【０１１１】
タンパク質分析物の調製が重要である場合、溶解試薬は、化学的に分解可能または不安定な陰イオン性界面活性剤を含んでいてもよい。かかる界面活性剤の例には、ＲａｐｉＧｅｓｔ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）、およびＭａＳＤｅＳ（Ｃｈａｎｇら、Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １４巻、１５８７頁、２０１５年）が含まれる。これらの界面活性剤は、酸性条件下（例えば２５ｍＭ重炭酸アンモニウム中の１０％ギ酸）での界面活性剤−タンパク質画分のインキュベーションにより不活性化される。かかる切断可能な界面活性剤は、タンパク質質量分析のための試料調製ワークフローを合理化するうえで非常に有用でありうる。
【０１１２】
カセットからのＲＮＡおよびタンパク質画分の溶出および除去後、試料ウェルおよび試薬ウェルに、試料ウェルの壁上に残されたＨＭＷ  ＤＮＡの制御された断片化に好適な試薬を再充填できる。断片化後、試薬ウェルに、精製試薬、例えば約０．１％から約１０％の間の濃度のＳＤＳの緩衝溶液を充填でき、精製電気泳動の第２ラウンドを実施して、断片化および精製されたゲノムＤＮＡを、試料ウェルの外に（段階３、図１６Ｈ〜Ｉ）領域の下方へ（図１６Ｉおよび１６Ｊ、括弧１６０３）移動させることができ、それを分離ゲルから純粋な形態で溶出できる（段階４、図１６Ｉ〜Ｊ）。
【０１１３】
一方で、図１６Ｆ〜Ｊに示す複数分析物精製は、２つの分離電気泳動ステップおよび２つの電気溶出ステップを利用して、同じ試料からの精製されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質を生成する。同じ試料からのＲＮＡおよびタンパク質画分だけが必要であるか、または、同じ試料からのＤＮＡおよびＲＮＡ画分だけが必要である、他の実施形態では、単一の分離および溶出サイクルのみを伴う発明プロセスで十分でありうる。
【０１１４】
溶解試薬試料ウェルを有するカセット
図１４Ａ〜Ｂは、例示的カセット１４００の上面図を示し、これは、中央試料ゲルチャネル１４０１、試料ウェル１４０２、試料チャネル電気泳動電極１４０３（陰極）および１４０４（陽極）を有する。図１４Ａに示す通り、電極は、試料（初期は試料ウェル１４０２内に含有される）を、チャネル１４０１に沿って、陽極１４０４に向かって電気泳動により駆動するために使用される。図１４Ｂは、陰極１４０６（陰極）と１４０７（陽極）との間の電気泳動を介した受け入れ領域１４０５内への異なる試料画分（例えば、ＤＮＡの画分）の回収を示す。
【０１１５】
一部の実施形態では、図１５Ａに示す通り、中央ゲルチャネル１５０１、試料ウェル１５０２ａ、試薬ウェル１５０２ｂ、一次電気泳動電極１５０３（陰極）および１５０４（陽極）、画分受け入れ領域１５０５、ならびに各受け入れ領域のための二次電気泳動電極１５０６（陰極）および１５０７（陽極）を含むカセットが提供される。図１５Ａのカセットの例示的実施形態を、図１５Ｃに示す。この実施形態は、現在ＳａｇｅＥＬＦ（Ｓａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）の名称で販売されている、公開米国出願第２０１１５０１０１９３２号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）のカセットに基づく。図１５Ｂは、ＳａｇｅＥＬＦカセットの上部を示し、図１５Ｃは、試料ウェルが、溶出モジュール領域により近接するよう移動され、より大きな体積の試薬ウェルが試料ウェルの上流に（分離陰極に近接して）提供された、修正バージョンを示す。図１６Ａ〜Ｅは、（例えば）図１５Ａ〜Ｃのいずれかのカセットを使用した一部の実施形態によるＤＮＡライブラリーを創出する際のワークフローを示す。図１６Ａに示す通り、細胞懸濁物をカセットの試料ウェル１５０２ａ内にロードでき、加えて、ＳＤＳおよび／または溶解試薬を試薬ウェル１５０２ｂ内にロードできる。一次電極１５０３／１５０４を横切る電圧バイアスを印加する際、溶解試薬は、試料ウェル内へとおよび／またはそれを通過して電気泳動により駆動される（図１６Ｃ）。試料ウェル内へと入ると、溶解剤は試料ウェル内で細胞を分解し、ゲルに沿って進行を続ける。しかしながら、ＤＮＡは、試料ウェル内（例えば、壁上）に実質的に固定されたままである。なぜなら、ＤＮＡ分子はゲルに進入するには大きすぎるからである。細胞が分解するにつれて、細胞残渣もまた、電気泳動によりゲルに沿って駆動される。
【０１１６】
溶解プロセスの完了時に、以下のものが試料ウェルに順次添加される（図１６Ｄを参照のこと）：
−  ＴｎおよびＰａｃＢｉｏアダプター（そしてインキュベートする）、
−  Ｔ４ｐｏｌ、ｄＮＴＰ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、およびＮＡＤ（そしてインキュベートする）、
−  エキソヌクレアーゼＴ５（そしてインキュベートする）。
一部の実施形態では、これらのインキュベーションは、順次（示した通り）実施されるが、他の実施形態では、インキュベーションは同時に実施できるか、および／または、これらのインキュベーションのすべてを使用しなくてもよい。
【０１１７】
図１６Ｅに示す通り、電気泳動および／または電気溶出は、試料からＤＮＡライブラリーを生成するために、サイズ選択を可能にする。
【０１１８】
本開示の一部の実施形態による他の実施例
実施例：ヤギ全血からのゲノムＤＮＡの電気泳動抽出。
２％アガロースゲル（ＳｅａＫｅｍ  Ｇｏｌｄ、Ｌｏｎｚａ）を、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６で注型した。ゲルは、厚さおよそ１１ｍｍで、厚さ１．５ｍｍ×深さ７ｍｍ×幅１１ｍｍの試料ウェルを有していた。ゲルを、０．５×ＫＢＢバッファー（１×ＫＢＢ＝５０ｍＭトリス、３７ｍＭ  ＴＡＰＳ、０．０８ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．７）を、追加の５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１％ＳＤＳと共に含有するミニゲルボックス内に置いた。ゲルを、ゲルの表面がバッファーの下に沈まないように（試料ウェル内容物が、リザーバー内のバッファーと流体接触しないように）浸漬させ、バッファーは、ゲルの端部でその高さの約７５％を覆っていた。ゲルを電気泳動バッファーと接触させた後、試料をできるだけ素早くロードし、電気泳動電力を始動した。各レーンの試料は、８０μｌのＴＢＳＥＧ（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール）と混合された、２０μｌの新鮮なヤギ全血（ＡＣＤで抗凝固処理、Ｌａｍｐｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）であった。
【０１１９】
図１７Ａは、電気泳動抽出を開始する直前のゲルを示す。電気泳動抽出を、１０Ｖ／ｃｍで３５分間実施した。図１７Ｂは、７分間の電気泳動後のゲルの外観を示し、図１７Ｃは、３５分間の抽出プロセスの終了時のゲルを示す。ゲルを、ミニゲルボックスから取り出し、ＳＤＳを有しない２００ｍｌの０．５×ＫＢＢ中で軽くすすぎ、次に、０．５×ＫＢＢ中０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムで２０分間染色した。図１８Ａは、電気泳動抽出直後（さらなる処理なし）の、エチジウム染色されたゲルの画像を示す。試料ウェルの（＋）側上のＤＮＡの太いバンドが、すべてのレーンに見られる。エチジウム染色されたゲルを、０．５×ＫＢＢで軽くすすぎ、試料ウェルを空にして、以下のものを再充填した：
レーン１−一般的制限バッファーのみ
レーン２−一般的制限バッファー＋５０ユニットのＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ）
レーン３−一般的制限バッファー＋５０ユニットのＳａｌＩ（ＮＥＢ）
レーン４−０．５×ＫＢＢ（ＳＤＳを有しない電気泳動バッファー）
【０１２０】
一般的制限バッファーは、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌのヒドロキシプロピルシクロデキストリンである。
【０１２１】
室温で１５分間のゲルのインキュベーション後、ゲルを０．５×ＫＢＢ中に浸漬させ（だが沈ませない）、１０Ｖ／ｃｍで１５分間電気泳動した。ゲルを前述の通り臭化エチジウム中で再染色し、得られた画像を図１８Ｂに示す。レーン１、３、および４は、図１８Ａから変化がないように見え、下部試料ゲル壁上のＨＭＷ  ＤＮＡが、Ｍｇ＋＋、またはＳａｌＩへの曝露により改変されなかったことを示す。Ｍｇ＋＋レーンにおいて切断がないことは、試料ウェルの表面上に絡まったＨＭＷ  ＤＮＡが、ヌクレアーゼ混入を実質的に有しないことを実証する。ＨｉｎｄＩＩＩで消化したレーン２は、あたかもある程度の切断が生じたかのように、ＤＮＡの移動度のある程度の増加を示す。ゲルをさらに１時間電気泳動し、再染色し、画像６ｃは、ゲルの上面像を示す一方で、６ｄは斜視像を示し、試料ウェルに向かってゲルの底端部の下の位置から見上げて、試料ウェルの断面像をより良好に示す。図１８Ｃ〜Ｄに見られる通り、ウェル２のＤＮＡのほとんどが、ＨｉｎｄＩＩＩにより、２％ゲルに進入するのに十分に小さい断片へと消化された。これは、試料ウェル上に固定されたＨＭＷ  ＤＮＡが、ＤＮＡ加工処理酵素にアクセス可能であることを実証する。
【０１２２】
実施例：ヤギＷＢＣからのＨＭＷ  ＤＮＡの急速電気泳動調製と、それに続く、抽出されたＤＮＡと変異体Ｔｎ５トランスポザーゼとのウェル内反応。
アガロースゲルの調製：
【０１２３】
４グラムのＳｅａＫｅｍ  ｇｏｌｄアガロース（Ｌｏｎｚａ）に、３８５グラムの水および１０ｍＬの１Ｍトリスアセテート、ｐＨ７．５および８０μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ二ナトリウムを添加することにより、アガロース溶液を調製し、アガロースが完全に溶解するまで溶液をレンジ加熱し、次に、溶液を水浴中で７０℃に保った。
【０１２４】
１６ウェルを２列創出するコームを、Ｇａｌｉｌｅｏ  ８０−１２１４−Ｃ１６−１．５コームからの２ウェルフォーマーおよび厚さ０．７５ｍｍのプラスチック片（図１９Ａ）を取り、バインダークランプとともにそれらをクランプ固定することにより製造した。
【０１２５】
コームアセンブリーを、Ｇａｌｉｌｅｏ  ８０−１２１４ゲルボックスのための注型トレイ内に置き、８０グラムのアガロースを添加し、ゲル化後に、コームを除去し、ゲルをバッファー（２５ｍＭトリスアセテート、ｐＨ７．５；０．１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ）中に沈めた。
【０１２６】
得られたゲル（図１９Ｂ）は、０．７５ｍｍ離れた２つのセットのウェルを有する。
【０１２７】
（＋）電極に最も近接するウェルが試料ウェルであり、（−）電極に最も近接するウェルが試薬ウェルである。
【０１２８】
ヤギ全血からの白血球（ＷＢＣ）の調製：
【０１２９】
注：すべてのステップが室温である
【０１３０】
１２ｍＬの全血（ＡＣＤ抗凝固剤を伴うヤギ、Ｌａｍｐｉｒｅ）に、３６ｍＬの赤血球（ＲＢＣ）溶解バッファー（１５５ｍＭアンモニウムＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ）を添加した。溶液を３分間揺動させ、４００×ｇ、４分間の遠心分離により白血球をペレットにした。
【０１３１】
ピンク色の上清をデカントし、赤色のペレットを、２５ｍＬのＲＢＣ溶解バッファー中でボルテックスすることにより再懸濁させ、２回目のスピンおよびデカンテーション後に、ピンク色のペレットを、９００μＬのＲＢＣ溶解バッファー中に再懸濁させた。
【０１３２】
ＱｕｂｉｔによるＷＢＣ  ＤＮＡ濃度の測定：
【０１３３】
Ｑｕｂｉｔ  ＨＳアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。
【０１３４】
４０μＬのＷＢＣを１６０μＬのＴＥ／５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１％ＳＤＳと混合し、続いて６５℃で３分間インキュベーションすることにより、ＷＢＣを溶解させた。ＴＥ（８００μＬ）を添加し、粘性を低減するためにボルテックスしたのち、１または２．５μＬのＤＮＡを１９９μＬのＱｕｂｉｔ試薬に、販売者のプロトコールに従って添加した。この方法を使用して、ＷＢＣ溶液中ＤＮＡの濃度を、４５３ｎｇ／μＬと推定した。
【０１３５】
ゲルへのＷＢＣおよび溶解溶液のローディング：
【０１３６】
アガロースゲルの各試薬ウェル（図２０Ａ、Ｂ）に、４０μＬの溶解バッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３％ＳＤＳ、５％グリセロール、５０μｇ／ｍＬずつのブロモフェノールブルーおよびフェノールレッド）を添加した。
【０１３７】
高ロードＷＢＣ試料を、以下：
ＲＢＣ溶解バッファー中４５３ｎｇ／μｌである１００μＬの単離ＷＢＣ、
３００μＬのＴＢＳＥＧ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％グリセロール）、
２ｍｇ／ｍＬずつのブロモフェノールブルーおよびフェノールレッドを有する５μＬの溶液
を混合することにより調製した。
【０１３８】
ＴＢＳＥＧ中の２０μｌの高ロードＷＢＣ試料（２，０００ｎｇのＤＮＡと等しい）を、試料ウェル３〜９内にロードした。
【０１３９】
低ロードＷＢＣ試料を、以下：
ＲＢＣ溶解バッファー中４５３ｎｇ／μｌである４０μｌの単離ＷＢＣ、
３００μＬのＴＢＳＥＧ、
２ｍｇ／ｍＬずつのブロモフェノールブルーおよびフェノールレッドを有する５μＬの溶液
を混合することにより調製した。
【０１４０】
ＴＢＳＥＧ中の１７μｌの低ロードＷＢＣ試料（１ウェル当たり８００ｎｇのＤＮＡと等しい）を、試料ウェル９〜１６内にロードした。
【０１４１】
ＷＢＣ  ＤＮＡを抽出および精製するため、ゲルを７４分間、１００Ｖ  ＤＣで泳動させた。
【０１４２】
アダプターをロードさせた変異体Ｔｎ５トランスポザーゼを用いた、電気泳動により抽出されたＤＮＡのウェル内加工処理：
【０１４３】
ゲルをタンクから取り出し、過剰なバッファーを流して捨て、ゲルを平らなプラスチック表面上に置いた。
【０１４４】
３２個すべてのウェルに、４０μＬのトランスポザーゼバッファー（ＴＢ、２５ｍＭトリスＡｃ  ｐＨ７．５；２０ｍＭ  ＭｎＣｌ）を添加した。
【０１４５】
１ｍＬの改変トランスポザーゼバッファー（ｍＴＢ）を調製した。
【表４】
2020103308.tif 000005
【０１４６】
下の表に示す通り、試料ウェルに、４０μＬの改変トランスポザーゼバッファーまたは４０μＬの１×ＨＭＷバッファー（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；１×ＨＭＷバッファーは、２５ｍＭトリスアセテートｐＨ７．５；１５％ＤＭＳＯである）または２５μＬのｍＴＢまたは１×ＨＭＷ＋合成二重鎖ＤＮＡアダプターを事前にロードさせた変異体Ｔｎ５トランスポザーゼ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を充填した。
【０１４７】
下の表は、酵素消化ステップのために試料ウェル内にロードされたものを示す。
【０１４８】
ＴＢはトランスポザーゼバッファーであり、すべてのウェルにこのバッファーが充填された。ＴＢバッファーのみを受け入れ、その後に何も添加しなかったウェルは「ＴＢ」と標示する。
【０１４９】
ＴＢバッファーをすべてのウェルに添加後に、「ｍＴＢ」または「ＨＭＷ」と印されたいくつかのウェルは、改変トランスポザーゼバッファーまたは変異体Ｔｎ５トランスポザーゼを含有するＨＭＷバッファーを受け入れた（「ＴｎＰ」と印されたレーン、１８０ｎｇ／μｌ、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ローディング前に、トランスポザーゼは、トランスポザーゼ結合部位を担持する二本鎖シークエンシングアダプターと共に事前インキュベートされ、十分にロードされたトランスポザソームを生成し、これは、白血球ＨＭＷ  ＤＮＡ標的内へのアダプターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転位のための能力を有する。
【表５】
2020103308.tif 000006
【０１５０】
ロードされたゲルを１時間、室温でインキュベートした。
【０１５１】
レーン１および２の試料ウェルに標準を添加した（レーン１、５μＬのＮＥＢ  １ｋｂエクステンドラダー（カタログ＃Ｎ３２３９Ｓ）；レーン２、ＮＥＢラムダラダーのスライス（カタログ＃Ｎ０３４０Ｓ））。
【０１５２】
ゲルを、３０Ｖで３０分間、次に１００Ｖで９０分間泳動させ、次に、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ透過照明を用いて撮影した。
【０１５３】
結果：ゲルにロードされたＷＢＣからのＤＮＡに対するトランスポザーゼ活性
結果を図２０に示す。レーン１２および１４（８００ｎｇのＤＮＡ／レーン、トランスポザーゼなし）を、レーン１３、１５、および１６（８００ｎｇのＤＮＡ／レーン、トランスポザーゼあり）と比較すると、ＤＮＡの用量依存性切断があることがわかり、トランスポザーゼなしでは、ＤＮＡは試料ウェルの壁に留まり、それが大きすぎてゲルに進入できないことを示す。トランスポザーゼ添加ありでは、数百ｋｂｐよりも大きい見かけ上の移動度を有する、消化されたＤＮＡのバンドが見られる。これは予想されたことである。なぜなら、合成アダプターをロードさせた変異体Ｔｎ５トランスポザソームは、ＨＭＷ  ＤＮＡと容易に反応し、合成アダプターの挿入の際にＨＭＷ標的ＤＮＡを断片化することが実証されているからである。
【０１５４】
（図２０Ｂは、各レーンで使用されるトランスポザーゼの量を明示するよう標示しなおしたことを除き、図２０Ａ  １２〜１６と同じレーンを示す。）
【０１５５】
これは、ウェルの壁上に捕捉された精製ＨＭＷ  ＤＮＡがアクセス可能であり、電気泳動精製後に試料ウェル内にロードできる酵素試薬により容易に修飾されることを実証する。これはまた、トランスポザーゼに媒介されるアダプター付加および断片化反応を利用する、標準ＮＧＳライブラリー調製ワークフローとの適合性も実証する。
【０１５６】
実施例：哺乳動物白血球から直接Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＳＭＲＴｂｅｌｌ（商標）シークエンシングライブラリーを生成するための急速電気泳動ワークフロー。
０．５×ＫＢＢバッファー中の０．７５％アガロースを含有する、図１５Ｃに示すタイプのカセットを使用した。試薬および試料ウェルの総体積はそれぞれ、３５０および９０μｌであった。
【０１５７】
ヤギＷＢＣを、前の実施例（例えば、１２７〜１３３段落を参照のこと）に記載のＲＢＣの選択的溶解により、全血から調製した。
【０１５８】
精製ヤギＷＢＣ（１２μｇのゲノムＤＮＡを含有する）を、ＲＢＣ溶解バッファー中のカセットの空の試料ウェル内にロードした（例えば、１３６段落を参照のこと）。ロードされた試料の総体積は８０μｌであった。溶解バッファー（例えば、１３５段落を参照のこと）３２０μｌを、空の試薬ウェルに添加した。細胞溶解およびＤＮＡ精製を、ＳａｇｅＥＬＦ機器（Ｓａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）内で電気泳動により分離電極を使用して１００Ｖで４０分間実施した。
【０１５９】
精製電気泳動後に、試薬および試料ウェルを空にした。試薬ウェルに、３２０μｌのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２を再ロードした。試料ウェルに、ヘアピンアダプターを事前にロードさせた０．７２μｇの変異体Ｔｎ５トランスポザーゼ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する同じバッファーを再ロードした。このヘアピンアダプターは、二重鎖領域にＴｎ５トランスポザーゼ認識配列を担持し、また、ヘアピンの一本鎖ループにＰａｃＢｉｏシークエンシングプライマー結合部位を担持する：
５’ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ３’／
【０１６０】
カセットを、３７℃で３０分間インキュベートし、固定されたヤギゲノムＤＮＡでの転位反応を可能にした。
【０１６１】
転位後、試薬および試料ウェルを空にし、試薬ウェルに、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を再充填した。試料ウェルに、０．１ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、０．０６ｍＭ  ＮＡＤ＋、３ユニットのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、および１０ユニットのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼを追加で含有する、７０μｌの同じバッファーを充填した。カセットを、３７℃で３０分間インキュベートし、ギャップ充填およびヤギゲノムＤＮＡへのＳＭＲＴｂｅｌｌ（商標）ヘアピンアダプターの転位により創出されたギャップのニックライゲーションを可能にした。
【０１６２】
ギャップが閉じた後、Ｔ４ポリメラーゼおよびリガーゼを不活性化させるために、４００ｎｇのトリプシンを３μｌで試料ウェルに添加した。試料ウェルの内容物をピペッティングにより混合し、カセットを３０分間３７℃でインキュベートした。トリプシン消化を停止するため、１μｇのダイズトリプシン阻害因子を１μｌの体積で添加した。試料ウェルの内容物をピペッティングにより混合し、カセットをさらに１５分間３７℃でインキュベートした。
【０１６３】
未反応アダプターおよび未反応ヤギゲノムＤＮＡを除去するため、３０ユニットのＴ５エキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を、試料ウェルに（３μｌの体積で）添加し、試料ウェルの内容物をピペッティングにより混合した。エキソヌクレアーゼ消化を、３０分間、３７℃で実施した。
【０１６４】
エキソヌクレアーゼ消化後、試薬ウェルを空にし、溶解バッファーを再充填した。カセットを、ＳａｇｅＥＬＦ機器内で分離モードで、連続的な６０Ｖ電気泳動電場を使用して１時間電気泳動し、続いて、Ｐｉｐｐｉｎ  Ｐｕｌｓｅ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｇｅｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ−ｓｕｐｐｏｒｔ／ｐｉｐｐｉｎ−ｐｕｌｓｅ−ｓｕｐｐｏｒｔ／）に記載の、５〜４３０ｋｂのＤＮＡを分解するための波形を使用して２時間パルスフィールド電気泳動した。分離電気泳動後に、ＥＬＦ機器内で４５分間、５０Ｖの電圧を使用して電気溶出を実施する。溶出の終了時に、２５Ｖの電場を逆方向に５秒間印加して、溶出モジュールの限外濾過膜から溶出されたＤＮＡを放出するのを助ける。完成したＳＭＲＴｂｅｌｌ（商標）ライブラリーを、電気泳動バッファー中の溶出モジュールから回収する。
【０１６５】
本出願のどこかに提示されたあらゆる参考文献から刊行物、または、特許、特許出願、記事、ウェブページ、書籍等を含むが、これらに限定されない他の文献に至るまで、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６６】
少数の変形形態が上で詳細に説明されたとはいえ、他の修正が可能である。例えば、添付の図面に描写されているか、かつ／または、本明細書に記載されている論理フローのいずれも、所望の結果を達成するのに示された特定の順序または逐次的な順序を必要としない。他の実施が、以下の例示的な請求項のうちの少なくともいくつかの範囲内であってもよい。
【０１６７】
別の箇所に記した通り、これらの実施形態は、例示目的のためだけに記載されており、限定するものではない。他の実施形態が可能であり、本開示により包含され、それは、本明細書に含まれる教示から明らかである。したがって、本開示の広さおよび範囲は、上述の実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、本開示によりサポートされる特許請求の範囲およびその均等物に従ってのみ定義されるべきである。さらに、本開示の実施形態は、方法、システムおよび装置／デバイスを含んでいてもよく、これらは、任意の他の開示の方法、システム、およびデバイスからのあらゆる要素、例えば、生物学的試料（例えば、核酸および非核酸要素を含有する）から核酸を単離することに相当する、あらゆる要素をさらに含んでいてもよい。例えば、一部の実施形態では、システム、デバイスおよび方法である。換言すれば、１つまたは別の開示された実施形態からの要素は、他の開示された実施形態からの要素と互換可能であってもよい。加えて、開示された実施形態の１つまたは複数の特徴／要素は除去でき、それでも特許性を有する主題をもたらしうる（したがって、本開示のさらに多くの実施形態をもたらす）。また、一部の実施形態は、先行技術の教示と比較して、１つおよび／または別の要素、構造、および／またはステップを（適用可能なものとして）特に欠いているシステム、デバイスおよび方法に相当し、したがって、特許性を有する主題を表し、それら先行技術の教示から区別可能である（すなわち、かかる実施形態に関する請求項は、先行技術の教示の１つまたは複数の特徴の欠如を記す否定的限定を含みうる）。
【０１６８】
核酸加工処理を記述するとき、連結される（ｌｉｎｋｅｄ）、結合された（ｂｏｕｎｄ）、接続する（ｃｏｎｎｅｃｔ）、付くまたは付着する（ａｔｔａｃｈ）、相互作用する（ｉｎｔｅｒａｃｔ）等の用語は、言及されている要素の結合をもたらす連結を、かかる結合が永続的であるにしろ潜在的に可逆的であるにしろ、指すものとして理解されるべきである。これらの用語は、共有結合タイプの結合が形成される可能性があるとはいえ、共有結合の形成を必要とするものとして解釈すべきでない。
【０１６９】
本明細書において定義および使用するすべての定義が、辞書の定義、参照により組み込まれた文献における定義、および／または定義される用語の通常の意味に優先するものと理解されるべきである。
【０１７０】
本明細書および特許請求の範囲において使用する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、特に別段の指示のない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。
【０１７１】
本明細書および特許請求の範囲において使用する「および／または」という文言は、そのように結合された要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、ある場合には結合して存在し、他の場合には分離して存在する要素を意味するものと理解されるべきである。「および／または」と共に挙げられた複数の要素は、同じ仕方で、すなわち、そのように結合された要素の「１つまたは複数」と解釈されるべきである。他の要素が、「および／または」節により特に同定された要素以外に、特に同定された要素と関係するかしないかにかかわらず、任意選択で存在していてもよい。したがって、非限定的な一例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、範囲が開かれた言語、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併用されたとき、一実施形態では、Ａのみ（任意選択でＢ以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ｂのみ（任意選択でＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、ＡとＢの両方（任意選択で他の要素を含む）等を指しうる。
【０１７２】
本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、「または」は、上に定義した「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストの項目を分離するとき、「または」または「および／または」は包含的、すなわち、いくつかのまたはリストの要素および任意選択で追加の挙げられていない項目のうちの少なくとも１つの包含であるが、２つ以上もまた含むと解釈されるものとする。特に別段の指示のある用語、例えば「のうちの１つのみ」もしくは「のうちの厳密に１つ」、または、特許請求の範囲において使用する場合には「からなる」のみが、いくつかのまたはリストの要素のうちの厳密に１つの要素の包含を指す。概して、本明細書において使用する「または」という用語は、排他性の用語、例えば「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、または「のうちの厳密に１つ」が後にあるとき、排他的代替案（すなわち、「一方または他方であるが、両方でない」）を示すものとしてのみ解釈されるものとする。「から本質的になる」は、特許請求の範囲において使用する場合、特許法の分野において使用されるその通常の意味を有するものとする。
【０１７３】
本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、１つまたは複数の要素のリストへの言及における「少なくとも１つ」という文言は、要素のリスト中の要素のうちの任意の１つまたは複数から選択される少なくとも１つの要素を意味するものと理解されるべきであるが、要素のリスト内に特に挙げられたあらゆる要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含まず、要素のリスト中の要素の任意の組合せを排除しない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という文言が指す要素のリスト内で特に同定された要素以外の要素が、特に同定された要素と関係するかしないかにかかわらず、任意選択で存在しうることを可能にする。したがって、非限定的な一例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または同義で、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または同義で、「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、任意選択で２つ以上のＡを含み、Ｂが存在しない、少なくとも１つのＡ（任意選択でＢ以外の要素を含む）、別の実施形態では、任意選択で２つ以上のＢを含み、Ａが存在しない、少なくとも１つのＢ（任意選択でＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、任意選択で２つ以上のＡを含む、少なくとも１つのＡ、および、任意選択で２つ以上のＢを含む、少なくとも１つのＢ（任意選択で他の要素を含む）等を指しうる。
【０１７４】
上の本明細書においてと同様に、特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「担持する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ
ｏｆ）」等のすべての移行句は、オープンエンド型である、すなわち、含むが限定されないことを意味するものと理解されるべきである。米国特許庁特許審査基準セクション２１１１．０３に記載の通り、「からなる」および「から本質的になる」という移行句のみがそれぞれ、クローズドエンド型であるか、セミクローズドエンド型である移行句とする。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
試料から核酸を単離するためのシステムであって、
核酸および非核酸要素を含む試料を固定するように構成されているヒドロゲルマトリクス、
前記ヒドロゲルマトリクス中に拡散し、
固定された生体試料と反応し、
細胞の試料の非核酸要素を放出する
ように構成されている試薬、
ならびに
前記非核酸要素の放出後に前記ヒドロゲルマトリクスから前記核酸を溶出するための手段を含む、システム。
（項目２）
前記ヒドロゲルマトリクスが、アガロースゲルを含む、項目１に記載のシステム。
（項目３）
前記生体試料を、ヒドロゲルを含有する融解したゲルと混合して前記ヒドロゲルマトリクスを調製すること、ならびに前記試薬の添加および除去を調節することのうちの少なくとも１つを行うように構成されている１つまたは複数の自動化された液体取扱いデバイスをさらに含む、項目１に記載のシステム。
（項目４）
前記ヒドロゲルマトリクスが担体に付着することを可能にするために前記ヒドロゲルマトリクスと互いにかみ合う形状を有するように構成されている担体
をさらに含む、項目１に記載のシステム。
（項目５）
前記ヒドロゲルマトリクスが、ほぼ等しい体積部のヒドロゲルおよび前記生体試料を含有する、項目１に記載のシステム。
（項目６）
前記試薬が、溶解のための界面活性剤溶液、細菌、真菌、および／もしくは植物の細胞壁を消化するように構成されている酵素を含有する溶液、プロテアーゼ溶液、ＤＮＡ加工処理酵素を含有する溶液、シークエンシングライブラリーを作製するための酵素および合成アダプターを含有する溶液、ならびに／またはトランスポザソームを含有する溶液を含む、項目１に記載のシステム。
（項目７）
前記ヒドロゲルマトリクスからの前記核酸の電気泳動による溶出を補助するための濾過膜をさらに含み、前記濾過膜は、前記核酸をサイズに基づいて選択的に保持するようにサイズが設定された細孔を含有する、項目１に記載のシステム。
（項目８）
電場が、核酸をサイズに基づいて選択的に回収するように操作される、項目１に記載のシステム。
（項目９）
核酸および非核酸要素を含有する試料から核酸を単離するための方法であって、
温度調節された容器内で前記試料を融解したヒドロゲルと混合するステップ、
生体試料および前記融解したヒドロゲルの混合物のゲル化を引き起こし、前記生体試料を固定するように構成されているヒドロゲルマトリクスを形成するように、前記容器の温度を低下させるステップ、
固定された前記生体試料と反応し前記非核酸要素を放出するために、前記ヒドロゲルマトリクス中に拡散するように構成されている試薬を前記ヒドロゲルマトリクスに導入するステップ、ならびに
前記ヒドロゲルマトリクスから前記核酸を抽出するステップ
を含む方法。
（項目１０）
前記ヒドロゲルマトリクスが、アガロースゲルを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記生体試料が、ＤＮＡ分子を含む、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記融解したヒドロゲルと前記生体試料の前記混合が、自動化された液体取扱いデバイスを介して行われる、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記試薬への前記ヒドロゲルマトリクスの前記導入が、前記ヒドロゲルマトリクスを担持する担体を前記試薬の混合物中に浸漬することによって行われる、項目９に記載の方法。
（項目１４）
前記試薬への前記ヒドロゲルマトリクスの前記導入が、前記試薬を前記ヒドロゲルマトリクス中に電気泳動によって移動させることによって行われる、項目９に記載の方法。
（項目１５）
前記核酸をサイズに基づいて選択的に保持するようにサイズが設定された細孔を含有する濾過膜を介して前記核酸を濾過するステップをさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１６）
非核酸要素の放出後に前記ヒドロゲルマトリクスから前記非核酸要素を電気泳動によって除去するステップをさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１７）
電気泳動バッファーを有する容器、
前記容器内に構成されている電気泳動ゲルマトリクス部分、および
前記電気泳動ゲルマトリクス部分中に構成されている試料ウェル
を含む、電気泳動カセットであって、
前記電気泳動ゲルマトリクス部分が、前記容器を横切って側方に延在して前記容器を２つのチャンバーに分割し、２つの部分のそれぞれが、前記電気泳動バッファーで満たされており、
試料ウェルが、前記電気泳動ゲルマトリクス部分によって前記電気泳動バッファーから隔離されている、
電気泳動カセット。
（項目１８）
前記電気泳動ゲルマトリクス部分が、アガロースである、項目１７に記載の電気泳動カセット。
（項目１９）
前記電気泳動ゲルマトリクス部分が、デンプン、寒天、アガロース、およびポリアクリルアミドのうちの少なくとも１種である、項目１７に記載の電気泳動カセット。
（項目２０）
前記電気泳動バッファーが、ｐＨ７およびｐＨ９の間のｐＨを有する、前記項目のいずれかに記載の電気泳動カセット。
（項目２１）
前記電気泳動バッファーが、キレート剤としてＥＤＴＡを含む、前記項目のいずれかに記載の電気泳動カセット。
（項目２２）
少なくとも１つの陽極および少なくとも１つの陰極をさらに含み、
前記少なくとも１つの陽極が、前記２つのチャンバーのうちの第１のチャンバーに接続されており、
前記少なくとも１つの陰極が、前記２つのチャンバーのうちの第２のチャンバーに接続されている、
項目１７に記載の電気泳動カセット。
（項目２３）
電気泳動バッファーで満たされた前記２つのチャンバーが、溶解試薬を受け入れるようにさらに構成されている、項目２２に記載の電気泳動カセット。
（項目２４）
前記溶解試薬が、陰イオン性界面活性剤および界面活性剤適合性プロテアーゼのうちの少なくとも１種である、項目２３に記載の電気泳動カセット。
（項目２５）
前記陰イオン性界面活性剤が、約０．１％から約１０％重量／体積の間の濃度を有するＳＤＳである、項目２４に記載の電気泳動カセット。
（項目２６）
前記溶解試薬が、陰イオン性界面活性剤ＳＤＳおよびプロテイナーゼＫの混合物である、項目２４に記載の電気泳動カセット。
（項目２７）
電圧が前記電極間を横切って印加されると、前記溶解試薬が、前記電気泳動ゲルマトリクス部分を通して前記試料ウェル内に駆動される、項目２３に記載の電気泳動カセット。（項目２８）
前記試料ウェルが生体試料を含有し、電圧を印加することにより、前記２つのチャンバーのうちの前記第２のチャンバーの近くの前記試料ウェルの側面に前記生体試料内のＤＮＡ分子の蓄積が引き起こされる、項目２４に記載の電気泳動カセット。
（項目２９）
前記電圧を逆にすることによって、前記ＤＮＡ分子が前記試料ウェルの前記側面から離れて移動される、項目２８に記載の電気泳動カセット。
（項目３０）
前記試料ウェルと前記２つのチャンバーのうちの前記第２のチャンバーとの間に配置された試薬ウェルをさらに含む、項目２２に記載の電気泳動カセット。
（項目３１）
第１の端部、第２の端部、長さ、幅、第１の長さ方向の側面および第２の長さ方向の側面を有する電気泳動ゲルマトリクス、
前記第１の端部に近接する電気泳動ゲルマトリクス部分中に構成されている試薬を含有する試薬ウェル、
生体細胞の試料を含有し、前記第１の端部に近接し前記試薬ウェルと前記第２の端部との間の前記電気泳動ゲルマトリクス中に構成されている試料ウェル、
前記第１の端部に配置された１対の電気泳動電極のうちの第１の陰極、
前記第２の端部に配置された前記１対の電気泳動電極のうちの第１の陽極
を含む、電気泳動システムであって、
前記１対の電気泳動電極を横切って第１のバイアス電圧を印加すると、試薬が、前記試薬ウェルから、前記試料ウェル内にかつ／または前記試料ウェルを通して駆動される、
電気泳動システム。
（項目３２）
前記試料ウェルが、細胞懸濁物を含む、項目３１に記載の電気泳動システム。
（項目３３）
前記試薬ウェルが、負に荷電した溶解試薬を含む、項目３１または３２に記載の電気泳動システム。
（項目３４）
溶解剤からの溶解の結果として、前記細胞懸濁物中に含有される前記細胞のＤＮＡ分子が生成される、項目３３に記載の電気泳動システム。
（項目３５）
前記ＤＮＡ分子が、前記試料ウェルの少なくとも１つの側面に蓄積する、項目３４に記載の電気泳動システム。
（項目３６）
前記１対の電気泳動電極を横切って第２のバイアス電圧を印加すると、蓄積した前記ＤＮＡが前記試料ウェルの外に電気泳動されることが引き起こされる、項目３５に記載の電気泳動システム。
（項目３７）
前記ゲルの前記第１の長さ方向の側面に沿って配置された複数の溶出受け入れ領域またはチャネルであって、それぞれの受け入れ領域が、前記ゲルの前記第１の長さ方向の側面に隣接して配置された第１の側面と、前記受け入れ領域の前記第１の側面から離れて配置された第２の側面とを有する、複数の溶出受け入れ領域またはチャネル、ならびに
それぞれの溶出受け入れチャネルに対応する複数対の溶出電極であって、第１の対の溶出電極の第１の溶出陰極が、第１の溶出受け入れチャネルの前記第１の側面の反対側の前記ゲルの前記第２の長さ方向の側面に近接して配置され、前記第１の対の第１の溶出陽極が、前記第１の溶出受け入れチャネルの前記第２の側面に近接して配置される、複数対の溶出電極
をさらに含み、ここで
第２の始動により、前記溶出受け入れチャネルのうちの１つのチャネルおよび／または別のチャネルに近接して、電気泳動された前記ＤＮＡのＤＮＡ断片の蓄積が引き起こされ、
前記複数対の溶出電極のうちの１つの対および／または別の対の間を横切ってバイアス電圧を印加することにより、前記ＤＮＡ断片がそれぞれの溶出チャネルのうちの１つのチャネルおよび／または別のチャネルの中に駆動される、
項目３６に記載の電気泳動システム。
（項目３８）
項目３１に記載のシステムを提供するステップ、
試料ウェル内に細胞懸濁物をロードするステップ、
試薬ウェル内に試薬をロードするステップ、
第１の電圧バイアスを１対の電気泳動電極を横切って印加するステップであって、前記第１の電圧バイアスの印加は、前記試薬ウェルから前記試料ウェルへの前記試薬の移動が引き起こされる、ステップ
を含む、電気泳動方法であって、
前記試薬は、前記懸濁物中の細胞の溶解を引き起こすように構成されており、
前記細胞からのＤＮＡ分子は、前記試料ウェルの少なくとも１つの側面に蓄積する、
電気泳動方法。
（項目３９）
前記細胞懸濁物を前記試料ウェル内でインキュベートするステップをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記ＤＮＡ分子を断片に破壊するステップをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
ＤＮＡ断片を前記試料ウェルから複数の溶出チャネルに電気泳動によって駆動するステップをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４２）
インキュベーションが、
第１の添加物を前記試料ウェルに添加し、その中で前記試料ウェルの内容物である前記細胞と共にインキュベートすること、ならびに／または
第２の添加物を前記試料ウェルに添加し、その中で前記細胞と共にインキュベートすること、ならびに／または
第３の添加物を前記試料ウェルに添加し、その中で前記細胞と共にインキュベートすること
を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４３）
前記第１の添加物、前記第２の添加物、および前記第３の添加物、ならびにそれらの対応するインキュベーションが逐次行われる、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記第１の添加物が、ＴｎおよびＰａｃＢｉｏアダプターであり、
前記第２の添加物が、Ｔ４ｐｏｌ、ｄＮＴＰ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、およびＮＡＤであり、
前記第３の添加物が、エキソヌクレアーゼＴ５である、
項目４２または４３に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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