(57)【要約】【課題】  本発明は、新規な皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤を提供することを課題とする。【解決手段】  本発明の皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤は、ダイオウウラボシの水不含有機溶媒による抽出物を有効成分とする。前記水不含有機溶媒が沸点６０℃以上の有機溶媒であることが好ましく、特に好ましくは酢酸エチルである。本発明の皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤は、また、ダイオウウラボシ中の水及び含水アルコールに不溶な成分を有効成分とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイオウウラボシの水不含有機溶媒による抽出物を有効成分とする、皮膚老化防止剤。
【請求項２】
前記水不含有機溶媒が沸点６０℃以上の有機溶媒である、請求項１に記載の皮膚老化防止剤。
【請求項３】
前記水不含有機溶媒が酢酸エチルである、請求項２に記載の皮膚老化防止剤。
【請求項４】
ダイオウウラボシ中の水及び含水アルコールに不溶な成分を有効成分とする、皮膚老化防止剤。
【請求項５】
ダイオウウラボシの水不含有機溶媒による抽出物を有効成分とする、エラスターゼ阻害活性剤。
【請求項６】
前記水不含有機溶媒が沸点６０℃以上の有機溶媒である、請求項５に記載のエラスターゼ阻害活性剤。
【請求項７】
前記水不含有機溶媒が酢酸エチルである、請求項６に記載のエラスターゼ阻害活性剤。
【請求項８】
ダイオウウラボシ中の水及び含水アルコールに不溶な成分を有効成分とする、エラスターゼ阻害活性剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚のたるみや皺などの老化現象を抑制ないし防止するための皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
身体の老化の要因は、加齢や酸化、糖化、ストレス、過度な運動などが挙げられるが、肌の老化は、これらに加えて、紫外線によるダメージが挙げられる。紫外線の皮膚へのダメージは、表皮ではＵＶＢによる炎症、真皮ではＵＶＡによるコラゲナーゼやエラスターゼの誘導・亢進が知られている。コラゲナーゼはコラーゲンを、エラスターゼはエラスチンをそれぞれ変性（分解）するため、これらの作用の亢進は、しわやたるみの原因となるといわれている。
そこで、皮膚のたるみや皺などの老化を防止するために、エラスチンの分解酵素であるエラスターゼの活性を阻害するエラスターゼ阻害剤や、コラーゲンの分解酵素であるコラゲナーゼの活性を阻害するコラゲナーゼ阻害剤が種々提案されている（例えば、特許文献１，２参照）。
【０００３】
一方、ダイオウウラボシ（ウラボシ目ウラボシ科フレボディウム属（ダイオウウラボシ属）、学名：Ｐｈｌｅｂｏｄｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ、別名：Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ  ｌｅｕｃｏｔｏｍｏｓ）は、中米原産のシダ植物の一種である。その水抽出エキスおよびエタノール含有水抽出エキスは、光老化防止作用があることが知られており、紫外線照射による皮膚角化細胞での炎症の抑制作用や、皮膚線維芽細胞でのマトリックスメタロプロテアーゼ産生亢進作用などの報告がある。
しかし、皮膚の老化関連酵素に対する阻害作用に関する研究は進んでいない。また、水系抽出エキスに含まれていない成分については評価もなされておらず、現在のダイオウウラボシエキスの抽出法では、水系抽出物を抽出した後の残渣は廃棄されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−３４２１２３号公報
【特許文献２】特開２０１６−０１１２５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新規な皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、ダイオウウラボシの水不含有機溶媒による抽出物が、水抽出物や含水アルコール抽出物（以下、「水系抽出物」と総称する）よりも高い皮膚老化防止作用、エラスターゼ阻害活性を有することを見出した。また、これらの活性本体が、水及び含水アルコールに不溶な成分に含まれていることを確認した。本発明は、このような知見に基づき完成されたものである。
【０００７】
すなわち、本発明の皮膚老化防止剤は、ダイオウウラボシの水不含有機溶媒による抽出物を有効成分とする。
本発明の皮膚老化防止剤は、また、ダイオウウラボシ中の水及び含水アルコールに不溶な成分を有効成分とする。
本発明のエラスターゼ阻害剤は、ダイオウウラボシの水不含有機溶媒による抽出物を有効成分とする。
本発明のエラスターゼ阻害剤は、また、ダイオウウラボシ中の水及び含水アルコールに不溶な成分を有効成分とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、従来用いられてきた水系抽出物よりも有効に皮膚の老化を抑制ないし防止することができる。また、従来廃棄されてきた水及び含水アルコールに不溶な成分を有効利用することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明にかかる皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。
【００１０】
本発明で用いるダイオウウラボシは、中米原産のシダ植物の一種である。
使用する部位については、特に限定されず、例えば、全草を使用してもよいし、茎、根、葉などの一部を使用してもよい。地上部、特に葉や茎を用いることが好ましい。
【００１１】
ダイオウウラボシの抽出方法は、特に限定されず、常法に従い、抽出溶媒を用いて抽出すればよい。
ここで、本発明において、「水不含有機溶媒」とは、「含水率１体積％未満の有機溶媒」と定義する。
水不含有機溶媒としては、例えば、酢酸エチル、酢酸メチル、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、クロロホルム、アセトニトリル、ジエチルエーテルなどが例示できる。高い活性成分を有効に抽出する上では、沸点６０℃以上の有機溶媒、例えば、酢酸エチル、メタノール、クロロホルム、アセトニトリルを用いることが好ましく、酢酸エチルが特に好ましい。有機溶媒の沸点の上限としては、抽出効率、作業性などを考慮すると、２００℃以下が好ましい。
【００１２】
本発明の皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤において、抽出物を各種用途に用いる際には、抽出溶媒を含む液状のまま用いても良いし、濃縮して用いても良い。また、凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥などの公知の方法により乾燥させて固体状として用いても良い。
また、必要に応じて、抽出操作後、精製処理を行っても良い。
【００１３】
ところで、本発明者は、ダイオウウラボシの水不含有機溶媒による抽出物の活性成分を調べている中で、水及び含水アルコールへの不溶な成分に、水系抽出物の活性成分よりも高い活性成分が含まれているという結果を得た。
すなわち、本発明の皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤は、「ダイオウウラボシの水不含有機溶媒による抽出物を有効成分とする」という捉え方とは別に、「ダイオウウラボシ中の水及び含水アルコールに不溶な成分を有効成分とする」という捉え方もできる。
この場合、ダイオウウラボシ中の水及び含水アルコールに不溶な成分を有効成分として得る方法としては、ダイオウウラボシを水不含有機溶媒により抽出するという上記方法の他に、ダイオウウラボシの水抽出や含水アルコール抽出における残渣を利用することも考えられる。すなわち、そのような残渣をそのまま、あるいは粉砕したり、水不含有機溶媒で抽出を行ったりして、各種用途に利用しても良い。
【００１４】
本発明の皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤は、経口投与、経皮投与のいずれの投与経路で用いても良く、化粧品、健康食品（飲料も含む）、食品添加剤、サプリメント、医薬用組成物などの原料として用いることができる。
例えば、前記抽出物（抽出溶媒を含む液状、その濃縮物又はそれらを乾燥した固体状等、使用形態は問わない）を健康食品、添加剤、サプリメントなどの原料として用いたり、前記抽出物をクリーム、乳液、軟膏、化粧水、パック、浴用剤などの原料として用いたりすることができる。
【００１５】
本発明の皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤を各種用途の原料として用いる場合、各種用途に常用される基材や薬剤と組み合わせて処方することができる。
【実施例】
【００１６】
以下、実施例を用いて、本発明にかかる皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤について詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例及び比較例で用いたダイオウウラボシは、乾燥ダイオウウラボシである。
【００１７】
〔実験１〕
実験１では、ダイオウウラボシの水不含有機溶媒による抽出物が、皮膚老化防止剤として有用であること、特に酢酸エチル抽出物に高いエラスターゼ阻害作用が認められることを示す。
【００１８】
＜実施例１＞
ダイオウウラボシの地上部を細断した。
この試料２，４００ｇに対して、酢酸エチル７Ｌを添加し、還流抽出を行った。この操作を３回繰り返した。
得られた抽出物を減圧濃縮し、９３．６ｇの酢酸エチル抽出エキスを得た。
【００１９】
＜実施例２＞
実施例１の酢酸エチル７Ｌによる還流抽出操作の後の試料残渣に対して、さらにメタノール７Ｌを添加し還流抽出する操作を３回繰り返した。
得られた抽出物を減圧濃縮し、３４５．２ｇのメタノール抽出エキスを得た。
【００２０】
＜比較例１＞
ダイオウウラボシの地上部を細断した。
この試料３００ｇに対して、水とエタノールの混合溶媒（３０体積％エタノール、以下単に「３０％エタノール」という）３Ｌを添加し、還流抽出を行った。
得られた抽出物を減圧濃縮し、２２．５ｇの３０％エタノール抽出エキスを得た。
【００２１】
＜性能評価試験１＞
上記実施例１，２及び比較例１の各抽出エキスについて、エラスターゼ阻害活性及びコラゲナーゼ阻害活性、一酸化窒素（ＮＯ）産生阻害を評価した。
【００２２】
（エラスターゼ阻害活性）
実施例１及び実施例２の抽出試料はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に、比較例１の抽出試料は反応用緩衝液に、それぞれ溶解した。反応のための緩衝液は、５０ｍＭトリス・１Ｍ塩化ナトリウム塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．８）を用いた。
９６穴マイクロプレートに、試料５０μｌ、緩衝液で調製した合成基質Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ（１ｍＭ）１００μｌ、緩衝液で調製したブタ膵臓由来エラスターゼ（０．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）５０μｌを加え、３７℃で１時間反応させた。
反応後、基質の分解生成物であるｐ−ニトロアニリンの生成量を、４０５ｎｍの吸光度を測定することにより求めた。
阻害率（％）は、以下の式で求めた。
阻害率（％）＝１００−｛［（試料あり・酵素ありの吸光度）−（試料あり・酵素なしの吸光度）］／［（陰性対照試料・酵素ありの吸光度）−（陰性対照試料あり・酵素なしの吸光度）］×１００｝
【００２３】
（コラゲナーゼ阻害活性）
実施例１及び実施例２の抽出試料はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に、比較例１の抽出試料は反応用緩衝液に、それぞれ溶解した。
予め氷冷した中和用バッファー（４００ｍＭ塩化ナトリウム・１０ｍＭ塩化カルシウム含有１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））に、同じく予め氷冷したＦＩＴＣ標識コラーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）を等量添加し、コラーゲン溶液を中和した。
１．５ｍｌマイクロチューブに中和済蛍光標識Ｉ型コラーゲン２５μｌ、試料２５μｌ、Ｉ型コラゲナーゼ（１ｕｎｉｔ／ｍｌ）５０μｌを加え、３５℃で２時間反応した。
反応後、５０％エタノール水溶液に溶解した４０ｍＭのＯ−フェナントロリン液を加え、反応を停止した。これに蒸留水で２倍希釈した中和用バッファー１００μｌを加え、３５℃で３０分間反応した。さらに、抽出液（１００％エタノール：０．６７Ｍ塩化ナトリウム含有・０．１７Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝９．５）＝７：３）を５０μｌ加え撹拌した。５，０００ｒｐｍ・１０分間遠心分離し、上清を採取し、酵素により遊離したＦＩＴＣ量を励起光４９５ｎｍ・測定波長５２０ｎｍで測定し、酵素活性を求めた。
阻害率（％）は、以下の式で求めた。
阻害率（％）＝１００−｛［（試料あり・酵素ありの蛍光強度）−（試料あり・酵素なしの蛍光強度）］／［（陰性対照試料・酵素ありの蛍光強度）−（陰性対照試料あり・酵素なしの蛍光強度）］×１００｝
【００２４】
（一酸化窒素（ＮＯ）産生阻害）
実施例１及び実施例２の抽出試料はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に、比較例１の抽出試料は反応用緩衝液に、それぞれ溶解した。
９６穴マイクロプレートの各穴に、ＲＡＷ２６４細胞（１．０×１０5ｃｅｌｌｓ）を播種後、試料希釈液とリポ多糖（ＬＰＳ：終濃度１μｇ／ｍｌ）を加え、全量２００μＬで培養、２４時間後に培養上清を回収した。対照試料は、実施例１及び実施例２の抽出物の場合はＤＭＳＯを、比較例１の抽出物の場合はリン酸緩衝液を用いた。
ＮＯ産生は、培養上清中の亜硝酸をＧｒｉｅｓｓ試薬を用いて間接的に測定した。
阻害率（％）は、以下の式で求めた。
阻害率（％）＝１００−｛［（試料あり・ＬＰＳありのＮＯ濃度）−（試料あり・ＬＰＳなしのＮＯ濃度）］／［（対照試料・ＬＰＳありのＮＯ濃度）−（対照試料あり・ＬＰＳなしのＮＯ濃度）］×１００｝
【００２５】
＜実験１の結果及び考察＞
上記測定の結果を下表１〜３に示す。
【００２６】
【表１】
2020026408.tif 000002
【００２７】
【表２】
2020026408.tif 000003
【００２８】
【表３】
2020026408.tif 000004
【００２９】
実施例１，２及び比較例１の結果を比較すると、水不含有機溶媒による抽出物には、水系抽出物よりも高いコラゲナーゼ阻害作用および抗炎症作用が認められ、皮膚老化防止剤の有効成分として利用できることが分かった。
実施例１及び比較例１の結果から、酢酸エチルによる抽出物の活性が特に高いことが分かる。そして、実施例１では、エラスターゼ阻害作用についても、水系抽出物よりも高い結果となっていることが分かる。
なお、酢酸エチル抽出エキスやメタノール抽出エキスには効果が期待できない葉緑素が非常に多く含まれていることに鑑みると、水不含有機溶媒による抽出物、特に酢酸エチルによる抽出物には、上記効果をもたらす非常に活性の高い成分が含有されていると推測される。
【００３０】
〔実験２〕
実験２では、種々の溶媒を用いた抽出エキスのエラスターゼ阻害活性を評価することにより、酢酸エチル以外の水不含有機溶媒による抽出物においても、エラスターゼ阻害活性及び皮膚老化防止作用が認められることを示す。
【００３１】
＜実施例３＞
ダイオウウラボシの地上部を細断した。
この試料１０ｇに対して、メタノール２００ｍＬを添加し、還流抽出を行った。この操作を３回繰り返した。
得られた抽出物を減圧濃縮し、９９７．１ｍｇのメタノール抽出エキスを得た。
【００３２】
＜実施例４＞
メタノール２００ｍＬに代えてアセトン２００ｍＬを用いたこと以外は、実施例３と同様にして、３１９．０ｍｇのアセトン抽出エキスを得た。
【００３３】
＜実施例５＞
メタノール２００ｍＬに代えてクロロホルム２００ｍＬを用いたこと以外は、実施例３と同様にして、１７４．６ｍｇのクロロホルム抽出エキスを得た。
【００３４】
＜実施例６＞
メタノール２００ｍＬに代えてアセトニトリル２００ｍＬを用いたこと以外は、実施例３と同様にして、２３９．３ｍｇのアセトニトリル抽出エキスを得た。
【００３５】
＜実施例７＞
メタノール２００ｍＬに代えてジエチルエーテル２００ｍＬを用いたこと以外は、実施例３と同様にして、７１．９ｍｇのジエチルエーテル抽出エキスを得た。
【００３６】
＜性能評価試験２＞
上記実施例２〜７の各抽出エキスについて、エラスターゼ阻害活性を評価した。その評価方法は、性能評価試験１と同様である。
【００３７】
＜実験２の結果及び考察＞
上記測定の結果を下表４に示す。
【００３８】
【表４】
2020026408.tif 000005
【００３９】
実験２の結果から、阻害率の程度の違いはあるものの、酢酸エチル以外の種々の水不含有機溶媒による抽出物においても、エラスターゼ阻害作用が認められた。
各抽出溶媒の沸点は、酢酸エチル７７．１℃、メタノール６４．５℃、アセトン５６．１℃、クロロホルム６１．２℃、アセトニトリル８１．６℃、ジエチルエーテル３４．４℃であり、沸点６０℃以上の有機溶媒を用いることが高い活性成分を抽出するのに有利であることが分かった。
なお、これらの抽出エキスには効果が期待できない葉緑素が非常に多く含まれていることから、表４に示す阻害率が低い実施例においても必ずしも活性が非常に低いということを意味するものではなく、むしろ、活性の高い成分が含有されていると推測される。
また、上述の実施例２と実施例３の関係について誤解を避けるため、説明すると、まず、上述の実施例２のメタノール抽出エキスは、酢酸エチル抽出物の残渣に対してメタノール抽出を行ったものであるのに対し、実施例３のメタノール抽出エキスはダイオウウラボシから直接メタノール抽出を行ったものである。実施例２の抽出エキスにエラスターゼ阻害作用が認められないという結果は、酢酸エチルに不溶でメタノールに可溶な成分にはエラスターゼ阻害作用は認められないということを意味するに過ぎず、ダイオウウラボシのメタノール抽出物にエラスターゼ阻害作用が認められないということを意味するものではない。そして、実施例３は、ダイオウウラボシのメタノール抽出物にエラスターゼ阻害作用が認められることを示している。
【００４０】
〔実験３〕
実験３では、上記実施例における各種抽出エキスの水溶出分及び３０％エタノール抽出物についてエラスターゼ阻害活性を評価することにより、水不含有機溶媒における活性成分が、従来の水系抽出物における活性成分とは異なる成分である可能性が高いことを示す。
【００４１】
＜比較例２＞
実施例１の酢酸エチル抽出エキスを秤量し、さらに４ｍｇ／ｍｌになるように、水を加え、５０℃、８００ｒｐｍで６０分間振とうした。上記溶媒の上清を採取し、比較例２とした。
【００４２】
＜比較例３＞
実施例１の酢酸エチル抽出エキスを秤量し、さらに４ｍｇ／ｍｌになるように、３０％エタノール水溶液を加え、５０℃、８００ｒｐｍで６０分間振とうした。上記溶媒の上清を採取し、比較例３とした。
【００４３】
＜比較例４＞
実施例２のメタノール抽出エキスを用いたこと以外は比較例２と同様にして、メタノール抽出エキスの水溶出分を採取し、比較例４とした。
【００４４】
＜比較例５＞
実施例２のメタノール抽出エキスを用いたこと以外は比較例３と同様にして、メタノール抽出エキスの３０％エタノール溶出分を採取し、比較例５とした。
【００４５】
＜比較例６＞
実施例３のアセトン抽出エキスを用いたこと以外は比較例２と同様にして、アセトン抽出エキスの水溶出分を採取し、比較例６とした。
【００４６】
＜比較例７＞
実施例３のアセトン抽出エキスを用いたこと以外は比較例３と同様にして、アセトン抽出エキスの３０％エタノール溶出分を採取し、比較例７とした。
【００４７】
＜比較例８＞
実施例４のクロロホルム抽出エキスを用いたこと以外は比較例２と同様にして、クロロホルム抽出エキスの水溶出分を採取し、比較例８とした。
【００４８】
＜比較例９＞
実施例４のクロロホルム抽出エキスを用いたこと以外は比較例３と同様にして、クロロホルム抽出エキスの３０％エタノール溶出分を採取し、比較例９とした。
【００４９】
＜比較例１０＞
実施例５のアセトニトリル抽出エキスを用いたこと以外は比較例２と同様にして、アセトニトリル抽出エキスの水溶出分を採取し、比較例１０とした。
【００５０】
＜比較例１１＞
実施例５のアセトニトリル抽出エキスを用いたこと以外は比較例３と同様にして、アセトニトリル抽出エキスの３０％エタノール溶出分を採取し、比較例１１とした。
【００５１】
＜比較例１２＞
実施例６のジエチルエーテル抽出エキスを用いたこと以外は比較例２と同様にして、ジエチルエーテル抽出エキスの水溶出分を採取し、比較例１２とした。
【００５２】
＜比較例１３＞
実施例６のジエチルエーテル抽出エキスを用いたこと以外は比較例３と同様にして、ジエチルエーテル抽出エキスの３０％エタノール溶出分を採取し、比較例１３とした。
【００５３】
＜性能評価試験３＞
上記比較例２〜１３の各抽出エキスについて、エラスターゼ阻害活性を評価した。その評価方法は、性能評価試験１と同様である。
【００５４】
＜実験３の結果及び考察＞
上記測定の結果を下表５に示す。
【００５５】
【表５】
2020026408.tif 000006
【００５６】
実験３の結果から、各種溶媒抽出物における活性成分が、主として、水及び含水アルコールに不溶な成分であることが確認できた。
従来は、水系溶媒の抽出物が活用されてきたが、その残渣は廃棄されてきた。しかし、上記結果から、水及び含水アルコールに不溶な成分にも高い活性を有する成分が含まれていることが分かり、これにより、水系抽出エキス製造の際に従来廃棄されてきた水及び含水アルコールに不溶な成分を有効に利用することが可能となった。