(57)【要約】      （修正有）【課題】アルツハイマー病又は軽度認知症を高精度に検出することを補助する、アルツハイマー病又は軽度認知症の検出補助方法の提供。【解決手段】生体から分離された被検試料中に含まれる、miR-122、miR-144、let-7f、miR-128-3p及びmiR-107から成る群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの存在量を指標とするアルツハイマー病又は軽度認知症の検出を補助する方法であって、miR-122の存在量が健常者よりも多いこと、並びに／又はmiR-144、let-7f、miR-128-3p及びmiR-107から成る群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの存在量が健常者よりも少ないことが、アルツハイマー病又は軽度認知症を発症している可能性が大きいことを示す、方法（ただし、miR-144、let-7f又はmiR-107を単独で指標とする方法を除く）。【選択図】図１２
2020096621.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から分離された被検試料中に含まれる、miR-122、miR-144、let-7f、miR-128-3p及びmiR-107から成る群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの存在量を指標とするアルツハイマー病又は軽度認知症の検出を補助する方法であって、miR-122の存在量が健常者よりも多いこと、並びに／又はmiR-144、let-7f、miR-128-3p及びmiR-107から成る群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの存在量が健常者よりも少ないことが、アルツハイマー病又は軽度認知症を発症している可能性が大きいことを示す、方法（ただし、miR-144、let-7f又はmiR-107を単独で指標とする方法を除く）。
【請求項２】
生体から分離された被検試料中に含まれる、miR-122、miR-144及びlet-7fから成る群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの存在量を指標とするアルツハイマー病又は軽度認知症の検出を補助する請求項１記載の方法。
【請求項３】
(1)miR-122とmiR-144、
(2) miR-122とlet-7f、
(3) miR-122とmiR-128-3p、及び
(4) miR-122とmiR-107
から成る群より選ばれる少なくとも１種の組合せの存在量を指標とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
(3) miR-122とmiR-128-3pの組合せの存在量を指標とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記被検試料が血清又は血漿である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
let-7g-5p、miR425-3p及びmiR425-5pから成る群より選ばれる少なくとも１種のマイクロRNAを内部標準として用いる請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病又は軽度認知症の検出を補助する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、認知症の過半数を占める代表的な認知症であり、今後の高齢化社会において患者数は益々増えると考えられている。アルツハイマー病は、進行性であり、現在の医学では、完治させたり進行を完全に食い止めることはできないが、進行を遅らせる医薬や療法は存在する。したがって、アルツハイマー病をできるだけ早期に検出することが望まれる。特に、アルツハイマー病を発症する前段階として、軽度認知症（ＭＣＩという）を患う場合が少なくないが、軽度認知症を検出することができれば、アルツハイマー病への移行を食い止め又は可能な限り遅らせることができる。現在、アルツハイマー病の診断は、問診や脳のMRI画像等により行われているが、早期のアルツハイマー病や軽度認知症を検出することは容易ではない。
【０００３】
早期にアルツハイマー病を検出すべく、血液中のマイクロRNA（以下、「miRNA」）の存在量を指標とする方法が提案されている（特許文献１〜３、非特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2014-132863号公報
【特許文献２】特表2014-520529号公報
【特許文献３】EP 2733219 A1
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Pavan Kumar et al., PLOS ONE, July 2013, Volume 8, Issue 7, e69807, pp.1-10
【非特許文献２】Petra Leindinger et al., Genome Biology 2013, 14:R78
【非特許文献３】Wang-Xia Wang et al., The Journal of Neuroscience, January 30, 2008, 28(5) 1213-1223
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の通り、種々のmiRNAが、アルツハイマー病の検出のための指標として提案されているが、より正確にアルツハイマー病を検出することができれば有利であることは言うまでもない。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、アルツハイマー病又は軽度認知症を高精度に検出することを補助する、アルツハイマー病又は軽度認知症の検出を補助する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、アルツハイマー病又は軽度認知症において存在量が増大する特定のmiRNAと、アルツハイマー病又は軽度認知症において存在量が減少する特定のmiRNAを種々見出し、これらのうちで、特定のmiRNAを指標とすることで高精度にアルツハイマー病又は軽度認知症の検出が可能になることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1)生体から分離された被検試料中に含まれる、miR-122、miR-144、let-7f、miR-128-3p及びmiR-107から成る群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの存在量を指標とするアルツハイマー病又は軽度認知症の検出を補助する方法であって、miR-122の存在量が健常者よりも多いこと、並びに／又はmiR-144、let-7f、miR-128-3p及びmiR-107から成る群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの存在量が健常者よりも少ないことが、アルツハイマー病又は軽度認知症を発症している可能性が大きいことを示す、方法（ただし、miR-144、let-7f又はmiR-107を単独で指標とする方法を除く）。
(2)生体から分離された被検試料中に含まれる、miR-122、miR-144及びlet-7fから成る群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの存在量を指標とするアルツハイマー病又は軽度認知症の検出を補助する(1)記載の方法。
(3)
(I)miR-122とmiR-144、
(II) miR-122とlet-7f、
(III) miR-122とmiR-128-3p、及び
(IV) miR-122とmiR-107
から成る群より選ばれる少なくとも１種の組合せの存在量を指標とする(1)記載の方法。
(4)(III) miR-122とmiR-128-3pの組合せの存在量を指標とする(3)記載の方法。
(5)前記被検試料が血清又は血漿である(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)let-7g-5p、miR425-3p及びmiR425-5pから成る群より選ばれる少なくとも１種のマイクロRNAを内部標準として用いる(5)記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、高精度に、かつ、それでいて簡便にアルツハイマー病又は軽度認知症を検出することが可能であるので、アルツハイマー病又は軽度認知症の検出に大いに寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１−Ａ】下記実施例において、次世代シーケンサー解析によりアルツハイマー、健常人群間で有意に差がみられたマイクロRNAを示す。縦軸は total 1,000,000 リード数あたりの 各miRNA のリード数をあらわす。Let-7f-1,let-7f-2 は mature の配列は同じであるため、let-7f として解析を進めた。
【図１−Ｂ】同上
【図２−Ａ】下記実施例において、qRT-PCR によるデータをΔΔCt 法で解析した結果を示す。次世代シーケンサー解析で候補にあげた10種類の miRNA のうち、7 種類で有意差が見いだせた。
【図２−Ｂ】同上
【図３−Ａ】下記実施例において、qRT-PCR の結果に基づきROC曲線を作成したものと、各サンプルのΔCt値の散布図を示す。
【図３−Ｂ】同上
【図４−Ａ】下記実施例において、let-7f と miR-122 のΔCt値の差、 miR-144 と miR-122 のΔCt値の差を算出し、散布図とROC曲線を作成したものを示す。
【図４−Ｂ】同上
【図５−Ａ】下記実施例において、アルツハイマー群、MCI群、健常人群において miR-122, let-7f, miR-144 のΔCt値を box plot であらわしたものを示す。MCI群と健常人群の間で P<0.05 で有意に差がみられた。
【図５−Ｂ】同上
【図５−Ｃ】同上
【図６−Ａ】下記実施例において、アルツハイマー病群、MCI群及び健常人群について測定した、ΔCt(let-7f) - (miR-122)の測定結果を比較して示す図である。
【図６−Ｂ】下記実施例において、アルツハイマー病群、MCI群及び健常人群について測定した、ΔCt(miR-144) - (miR-122) の測定結果を比較して示す図である。
【図６−Ｃ】下記実施例において、アルツハイマー病群、MCI群及び健常人群について測定した、ΔCt(miR-128-3p) - (miR-122-5p)の測定結果を比較して示す図である。
【図６−Ｄ】下記実施例において、アルツハイマー病群、MCI群及び健常人群について測定した、ΔCt(miR-107) - (miR-122-5p)の測定結果を比較して示す図である。
【図７】下記実施例において、アルツハイマー病で減少するmiRNAとして同定されたmiR-128-3pについての測定結果を示す図である。
【図８】下記実施例において、アルツハイマー病で減少するmiRNAとして同定されたmiR-107についての測定結果を示す図である。
【図９】下記実施例における検体情報を示す図である。
【図１０】下記実施例において得られた、健常人とアルツハイマー病患者におけるlet-7gの相対発現値を比較して示す図である。
【図１１−Ａ】下記実施例において得られた、let-7gを内部標準として用いてΔCtを補正した。miR-122及びlet-7fについての測定結果を示す図である。
【図１１−Ｂ】下記実施例において得られた、let-7gを内部標準として用いてΔCtを補正した。miR-144についての測定結果を示す図である。
【図１２】下記実施例において得られた、ΔCt(miR-128)-ΔCt(miR-122)のAUCを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
上記の通り、本発明の方法では、生体から分離された被検試料中に含まれるmiR-122、miR-144、let-7f、miR-128-3p及びmiR-107から成る群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの存在量を指標とする（ただし、miR-144、let-7f又はmiR-107を単独で指標とする方法を除く）。これらのmiRNA自体は周知であり、その塩基配列も周知である。念のためにこれらのmiRNAの塩基配列を記載すると次のとおりである。
miR-122：uggagugugacaaugguguuug（配列番号１）
miR-144：ggauaucaucauauacuguaag（配列番号２）
let-7f：ugagguaguagauuguauaguu（配列番号３）
miR-128-3p：ucacagugaaccggucucuuu（配列番号４）
miR-107：agcagcauuguacagggcuauca（配列番号５）
【００１３】
これらのmiRNAのうち、miR-122は、アルツハイマー病又は軽度認知症患者では、健常人よりも存在量が多く、miR-144、let-7f 、miR-128-3p及びmiR-107は、アルツハイマー病又は軽度認知症患者では、健常人よりも存在量が少なくなる。
【００１４】
これらの５種類のmiRNAは、単独でも組み合わせても用いることができるが、組み合わせるとさらに精度が高くなる。アルツハイマー病又は軽度認知症患者において存在量が低下するmiR-144及びlet-7fは、これらのうちの少なくとも１つがmiR-122と共に指標として用いることが好ましく、いずれか１つを指標として用いればよい。(I)miR-122とmiR-144、(II) miR-122とlet-7f、(III) miR-122とmiR-128-3p、及び (IV) miR-122とmiR-107から成る群より選ばれる少なくとも１種の組合せの存在量を指標とすることにより、下記実施例に具体的に記載するように、ROC（受信者操作特性）曲線におけるAUC（Area Under Curve、曲線下面積）が、0.9という非常に高い精度が得られる。特に、(III) miR-122とmiR-128-3pの組合せにより、AUCが1.00という完璧な結果が得られる。AUCが1.00ということは、偽陽性率０％、偽陰性率０％ということであり、最高の精度が達成される。
【００１５】
被検試料としては、miRNAを含む体液であれば特に限定されないが、通常、血液試料（血漿、血清及び全血を包含する）が好ましく用いられる。
【００１６】
miRNAの定量方法自体は周知であり、定量のために必要な試薬類や装置は全て市販されているので、当業者が容易に行うことができ、下記実施例にも１例が具体的に記載されている。下記実施例に記載されている方法では、市販の試薬を用いて、miRNAの3'末端にポリＡテール領域を付加し、この付加領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（すなわち、ポリＴ）をリバースプライマーとし、各miRNAとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（各miRNAの相補鎖）をフォワードプライマーとして用いる定量的リアルタイムＰＣＲ(qRT-PCR)により各miRNAを定量しており、この方法により容易に各miRNAを定量できるが、定量方法はこれに限定されるものではなく、例えば、市販されている、いわゆる「次世代シーケンサー」を用いる方法等によっても定量可能である。
【００１７】
被検試料としては、上記の通り血液試料を好ましく用いることができ、特に血清及び血漿を好ましく用いることができる。血清又は血漿中の上記miRNAを測定する場合には、血清及び血漿中で存在量の変動が少ないmiRNAであるlet-7g-5p、miR425-3p及びmiR425-5pから成る群より選ばれる少なくとも１種のマイクロRNAを内部標準として用いることが好ましい。
【００１８】
本発明の方法では、miR-122の存在量が健常者よりも多く、並びに／又はmiR-144、let-7f、miR-128-3p及びmiR-107から成る群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの存在量が健常者よりも少ない場合に、アルツハイマー病又は軽度認知症の可能性が高いと判定する。ここで用いられる各miRNAは、それぞれ単独でもアルツハイマー病又は軽度認知症患者と健常者の間に統計学的有意差（実施例では、t-検定でp<0.001又はp<0.01）があるので、健常者に対する統計学的有意差(t検定で、p<0.05、好ましくはp<0.01、さらに好ましくはp<0.001)の有無を基準とすることが好ましい。具体的には、下記実施例に示されるように、好ましくは、例えば、偽陽性率が最良の値（最も低くなる値）なるプロット点におけるΔCt値（カットオフ値）が、miR-122とlet-7fの組み合わせ（ΔCt(let-7f)-(miR-122))で1.49以上である場合に、アルツハイマー病又は軽度認知症の可能性が高いと判定することができる（図４−Ｂ参照）。また、上記の通り、アルツハイマー病又は軽度認知症で増大するmiR-122と、減少するmiR-144、let-7f、miR-128-3p又はmiR-107を組み合わせて、
ΔCt(miR-144) - (miR-122)、
ΔCt(let-7f) - (miR-122)、
ΔCt(miR-128-3p) - (miR-122)、
ΔCt(miR-107) - (miR-122)
を指標とすることが好ましい。
【００１９】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２０】
実験材料と実験方法
第 1 節  臨床検体
第 1 項  使用した臨床検体
末梢血の採取は、広島大学ヒトゲノム・遺伝子解析研究倫理審査委員会から承認されたヒトゲノム遺伝子解析研究計画書に基づいて行われた。本実施例で解析に用いた末梢血の内訳を以下の表に示す。
【００２１】
第 2 項  全血からの血漿の回収と保存
1) EDTA-2K が添加されたベノジェクトII真空採血管に採血された 5 mL の全血を 15 mL チューブに移し、3500rpmで10分間、室温で遠心した。
2) 遠心により、上から血漿層、白血球層、赤血球層の 3 層に分離される。そのうち、血漿層のみを新しい 2 mL チューブ に移した。
3) 2)を 10000 rpm で 10 分間、室温で遠心し、採取した血漿に混入している血球成分を沈殿させた。
4) 血漿層のみを新しい1.5mLチューブに250μＬずつ分注し、-80℃で凍結保存した。
【００２２】
第 2 節  血漿中 RNA の抽出
血漿中 RNA の抽出は、miRNeasy Mini kit (QIAGEN) を用いて行った。
1) 凍結した血漿サンプルを融解し、10000 rpm で 5 分間、室温で遠心し、凝集タンパク質や血球成分を沈殿させた。
2) 上清 200 μＬ を新しい 1.5 mL チューブ に移した。
3) 1000 μＬ の QIAzol Lysis Reagent を加えて十分に混和し、タンパク質成分を変性した。
4) RNA 抽出のコントロール RNA として 0.05 nM cel-miR-39 を 10 μＬ 加え、ピペッティングで混和した後、室温で 5 分間静置した。
5) 水層と有機溶媒層の分離促進のため、200μＬのクロロホルムを加え、十分に混和し、室温で 3 分間静置した。
6) 12000 xg、15分間、4℃で遠心し、上層の水層650μＬを新しい2mLチューブ に移した。
7) RNA を析出させるため、975μＬの 100% エタノールを加え、ピペッティングで混和した。
8) 650 μＬ の 7) を miRNeasy Mini spin column (以下、カラム) に移し、室温で 1 分間静置後、8000 xg、15 秒間、室温で遠心し、RNA をカラムのフィルターに吸着させた。カラムから通過した溶液は廃棄した。
9) 7) の溶液を全てカラムに通すまで 8) を繰り返し、全ての RNA をフィルターに吸着させた。
10) フィルターに付着した夾雑物の除去のため、650 μＬ の Buffer RWT をカラムに加え、 8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。 カラムから通過した溶液は廃棄した。
11) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μＬ のBuffer RPE をカラムに加え、8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。カラムから通過した溶液は廃棄した。
12) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μＬ のBuffer RPE をカラムに加え、8000 xg、2 分間、室温で遠心した。 カラムから通過した溶液は廃棄した。
13) フィルターに付着している溶液を完全に除去するため、カラムを新しい 2 mL collection チューブ に移し、10000 xg、1 分間、室温で遠心した。
14) カラムを 1.5 mL チューブ に移し、50 μＬ の RNase-free water を加え、室温で 1 分間静置した。
15) 8000 xg、1 分間、室温で遠心し、フィルターに吸着した RNA を溶出した。溶出した RNAは、そのまま次の実験に用い、残りは -80 ℃ で保存した。
【００２３】
第 3 節  血漿中 microRNA の解析
第 1 項  次世代シーケンサーにおける網羅的解析
本実施例では、血漿中より抽出できる RNA 量が微量であり、濃度測定が困難であったため、 RNA 溶液の濃度調節は行わなかった。したがって、「同じ質量の RNA 中にどれだけの目的 miRNA が含まれていたか」ではなく、「同容量の血漿から抽出した RNA 溶液中にどれだけの目的 miRNA が含まれていたか」を比較したことになる。これは、この後の qRT-PCR 解析でも同様である。
【００２４】
次世代シーケンサーによる解析は Ion Total RNA-seq Kit v2, Ion PGM (lifetechnologies), Bioanalyzer(Agilent) を用いて行った。
第２節で抽出した 50μＬの血漿由来 microRNA を 10μＬに減圧濃縮する。
アダプターのハイブリダイゼーションのため、1)で濃縮したRNA溶液 4μＬ に 1μＬの Ion Adoptor Mix v2 と 3μＬのHybridization buffer を加える。 
10回ゆっくりピペッチィングをした後、スピンダウンをする。
サーマルサイクラーで 65℃ 10分、16℃ 5分  反応させる。
アダプターライゲーションのため、4)で反応させた溶液に 10μＬ の 2x Ligation buffer と 2μＬ のLigation Enzyme Mix を加える。
穏やかにピペッティングし、スピンダウンをする。
サーマルサイクラーで 16℃ 16時間反応させる。
アダプターをライゲーションした microRNA を逆転写するため、7)の溶液に 2μＬの Nuclease-Free water, 4μＬの10x RT buffer, 2μＬ の 2.5mM dNTP Mix, 8μＬのIon RT Primer v2 を加える。
穏やかにピペッティングしスピンダウンをする。
サーマルサイクラーで 70℃ 10分 反応させる。
直ちに反応溶液を氷上に置き、4μＬの10x SuperScript III Enzyme Mix を加える。
穏やかにピペッティングし、スピンダウンする。
サーマルサイクラーで42℃ 30分反応させる。
ビーズ精製により目的の cDNA と同じ長さを持つ核酸を抽出する。Nucleic Acid Binding Beads を穏やかにvortexする。
Plocessing Plate に 5μＬの Nucleic Acid Binding Beads を加える。
15)に 250μＬのBinding Solution Concentrate を加え、10回ピペッティングをする。
60μＬの Nuclease-Free water を13)のcDNA溶液に加える。
17)の溶液を16)に加える。
P-1000のピペットマンを275μＬに合わせ、100%エタノールでチップを３回リンスする。
19)のチップのまま、275μＬの100%エタノールを17)に加え、10回ピペッティングをする。
5分間室温に置く。
Processing Plate を磁気スタンドに5分間置く。
上清は廃棄し、磁気スタンドに置いたまま2分間 Nucleic Acid Binding Beads を風乾させる。
磁気スタンドからProcessing Plate を外し、13μＬの Nuclease-Free water を加え、10回ピペッティングをする。
1分間室温に置く。
磁気スタンドにProcessing Plate を1分間置き、溶液 13μＬを回収する。
精製した cDNA を増幅させるため、0.2mLチューブに26)のcDNA溶液 を6μＬ分注する。
27)に 45μＬの Platinum PCR SuperMix High Fidelity, 1μＬの Ion Xpress RNA-Seq Barcode, 1μＬの Ion Xpress RNA 3’ Barcode Primer を加える。
サーマルサイクラーで以下の条件で反応を行った。
94℃ 2分
（2 Cycles）94℃ 30秒、50℃ 30秒、68℃ 30秒
（19 Cycles）94℃ 30秒、62℃ 30秒、68℃ 30秒
68℃ 5分
アダプターダイマーを取り除くため、増幅したcDNAを電気泳動し、ゲル切り出しを行う。10% TBE アクリルアミドゲルを作成し、120V で泳動を行う。バッファーは 1x TBE を用いた。
タッパーに 20 mL の1x TBE と、30)の10% TBE アクリルアミドゲル を入れる。
2μＬのSYBR gold を加え、5分間振とうさせる。
UV照射を行い、100-106 bp 付近のバンドを切り出す。
切り出したゲルを 1.5mLチューブに入れ、チップの先で適度に砕く。
500μＬ の TE buffer を加える。
37℃でオーバーナイトする。
3000 rpm で3分間遠心をする。
上清を新しい 1.5 mL チューブに移し、1μＬの20 mg/mLグリコーゲンを共沈剤として加える。
50μＬの 3M 酢酸ナトリウムを加える。
400μＬのイソプロパノールを加え、vortex を行う。
-80℃ 30分静置する。
15,000 xg 30分間 4℃ で遠心をする。
上清を廃棄し、1 mL の70%エタノールを加える。
15,000 xg 5分間 4℃ で遠心をする。
上清を廃棄し、風乾させる。
15μＬの Nuclease-Free water を加える。
Bioanalyzer で DNA High Sensitivity Kit を用いて濃度測定を行う。
cDNA を 20 pM に希釈し、エマルジョンPCR を行う。エマルジョンPCR はIon OneTouch 2(lifetechnologies) を用いた。
Ion OneTouch 2 に Recovery tube, Amplification Plate を装着する。
Reagent tube に Oil を 2分の1、別のReagent tube に Recovery Solution を 4分の1 入れ、Ion OneTouch 2 に装着する。
1.5 mL low-binding チューブに、48)で希釈した 25μＬの cDNA, 25μＬの Nuclease-Free water, 500μＬの Reagent Mix, 300μＬの PCR Reagent B, 50μＬの Enzyme mix を混合する。
Ion Sphere Particles を vortex し、スピンダウンした後 100μＬを51)に加える。
Vortex し、スピンダウンする。
Reaction Filter Assembly に反応液を充填し、Ion OneTouch 2 に装着し、エマルジョンPCR を開始する。
エマルジョンPCR サンプルを回収し、Ion One Touch ES(lifetechnologies) を用いてビーズ精製を行う。
サンプルを回収し、全量を 0.2 mL に移す。
5μＬの Control Ion Sphere を加える。
15,500 xg で2分間遠心する。
チューブに 15μＬ 残して上清を廃棄する。
12μＬ の Sequencing Primer を加える。
サーマルサイクラーで 95℃ 2分、37℃ 2分 反応させる。反応後は室温に戻す。
サンプルを 318 Chip にローディングする。
Ion PGM に装着し、解析を行う。
【００２５】
第 2 項  結果の解析
解析は CLC bio Genomics Workbench を用いて行った。各 microRNA のリード数は、各サンプルのリード数を 1,000,000 とした時の数に補正する。アルツハイマー群と健常人群で各 micro RNA で t検定を行い、P<0.05 となり、且つ少なくとも片方の群の平均リード数が50以上となる microRNAをピックアップし、次の qRT-PCR でさらに解析を行った。
【００２６】
第 4 節  qRT-PCR による血漿中 microRNA 量の測定
第 1 項  血漿中 miRNA の網羅的解析は、miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR, Universal cDNA synthesis kit II, LightCycler480 multi-well plate (Exiqon) を用いて行った。
【００２７】
Universal cDNA synthesis kit II は、mature miRNA の 3’ 末端に poly-A tail を付加し、poly-T primer を含む primer を用いて逆転写を行うことで、サンプル中に含まれる miRNA を 1 チューブ で全て逆転写できるように設計された miRNA 用の cDNA 合成キットである。
【００２８】
LightCycler480 multi-well plate に合成したcDNA と酵素や蛍光物質の混ざった反応試薬 SYBR Green master mix、primer を加えることで、PCR 反応が進行し、蛍光強度の差としてサンプル中の miRNA 量の測定ができるようになる。Ct 値の算出には、蛍光の増幅曲線の変化幅が最大となる点を Ct 値とする二次導関数法を用い、解析には、検量線を作成せず、相対的に miRNA 量を比較する ΔΔCt 法を用いた。  
【００２９】
第 2 項  microRNA の逆転写
血漿中 miRNA の逆転写は Universal cDNA Synthesis Kit II (EXIQON) を用いて行った。
1) 0.2 mL チューブ に、2μＬ の 5x Reaction buffer,5μＬ の Nuclease-Free water,1μＬ の Enzyme mix, 2μＬの血漿由来 RNA 溶液 を分注する。
2) タッピングで混和後、スピンダウンする。
3) サーマルサイクラーで 42℃ 60分、95℃ 5分反応を行った。
4) 合成した cDNA は 1.5 mL チューブ に移し、-80 ℃ で保存した。
【００３０】
第 3 項  SYBR Green での qRT-PCR
real-time PCR 反応は LightCycler（商品名） 480 (Roche)、miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR (EXIQON)、384-well plate は LightCycler（商品名）480 Multiwell Plate 384, white (Roche) を用いて行った。PCR reaction mix、希釈済み cDNA の384-well plate への分注は、Bravo Automated Liquid Handling Platform (Agilent Technologies) を用いた。
【００３１】
1) 0.65 mL チューブ に、合成した cDNA を DNase-free water を用いて 40 倍に希釈した。
2) 0.65 mL チューブ に、次のように PCR reaction mix を調製した (表示はレプリケート数 1 のときの 1 サンプルあたりの量)。
PCR Master mix 5μＬ, PCR primer mix 1μＬ
3) PCR reaction mix を 384-well plate に 6μＬずつ分注した。
4) 1) で調製した希釈 cDNA を 384-well plate に 4μＬずつ分注し、ピペッティングで十分に混和した。
5) サンプルの蒸発防止のため、384-well plate にシールを貼り、1500 xg、1 分間、室温で遠心した。
6) LightCycler（商品名） 480 (Roche) を用い、以下の条件で real-time PCR を行った。
95℃ 10分
(45 Cycles) 95℃ 10秒、60℃ 1分
【００３２】
第 4 項  結果の解析
Ct 値の算出には、蛍光の増幅曲線の変化幅が最大となる点を Ct 値とする二次導関数法を用い、解析には、検量線を作成せず、相対的に miRNA 量を比較する ΔΔCt 法を用いた。また、サンプル同士を比較するために、miRNA 量の補正を行う必要があるが、この補正には、第 2 節の 4) で添加した外部コントロール cel-miR-39 を用いた。補正値 (ΔCt 値) の算出方法を下記に示す。
ΔCt = Ct - Ctcel-miR-39
【００３３】
qRT-PCR 解析においては、上記の式に従い、測定したサンプルの Ct値から、そのサンプル中に含まれる cel-miR-39 の Ct 値を引いたものをΔCt 値として解析に用いた。
【００３４】
ROC 曲線による マーカー microRNA の精度評価
ROC (受信者操作特性) 曲線を描き AUC を算出して比較する方法は、診断マーカーの精度評価の方法である。ROC は横軸に「1-特異度」(偽陽性率) を、縦軸に「感度」をプロットし、陽性/陰性を判断するカットオフ値を媒介変数として変化させたときに得られる曲線である。AUC (曲線下面積) はこの ROC 曲線下の面積のことであり、0.5〜1 の値をとる。ある診断マーカーを用いてROC 曲線を作成し、AUC を算出した際、その値が 1 に近づけば近づく程精度の良いマーカーと評価される。一般にAUC ≧ 0.7 であれば診断マーカーとして精度がよいとされる。
【００３５】
結果
第 1 節  アルツハイマー患者特異的な変動を示す血漿中 microRNA の同定
第 1 項  
本節では、健常人とアルツハイマー患者の血漿中 miRNA プロファイルを網羅的に解析し、比較することで、アルツハイマー患者で変動する miRNA の同定を行った。
【００３６】
第 2 項  健常人とアルツハイマー患者の血漿中 microRNA の網羅的解析と比較
(第１のスクリーニング)
健常人群、アルツハイマー患者群、各 62 名の血漿中における miRNA 量を次世代シーケンサー Ion PGM (lifetechnologies)を用いて網羅的に解析し、各群における miRNA 量を比較した。各群毎に miRNA 量の平均値を算出し、各群間での比較を行った（図１−Ａ及び図１−Ｂ）。
【００３７】
健常人群に比べ、アルツハイマー患者群で 有意に量が増加した miRNA を3種類、アルツハイマー患者群で有意に量が減少した miRNAを7種類同定した(図２−Ａ及び図２−Ｂ）。
これら 10 種類の miRNA をアルツハイマー マーカー 候補 miRNA として、qRT-PCR による解析を行った。以下にその miRNA を記す。
健常人に比べ、アルツハイマー病患者で血漿中 miRNA 量増加：miR-122-5p, miR-185-5p
健常人に比べ、アルツハイマー病患者で血漿中 miRNA 量減少：let-7f-5p, let-7g-5p, miR-15b-5p,miR-30b-5p,miR-484-5p,miR-660-5p, miR-144-5p 
【００３８】
第 3 項  qRT-PCR による健常人とアルツハイマー患者の マーカー 候補 microRNA 量の比較
(第２のスクリーニング)
第１のスクリーニング で示された健常人とアルツハイマー病患者における miRNA の血漿中量の違いは、実験に用いた検体の個人差の影響を少なからず受けていると考えられる。そこで、マーカー 候補 miRNAの血漿中量から個人差の影響を排除するため、健常人群とアルツハイマー患者群の各群をそれぞれ 62 検体に増やし、第２のスクリーニング として各検体における個々の候補 miRNA の血漿中量を qRT-PCR で測定した。第２のスクリーニング での マーカー 候補 miRNA 量の測定は、SYBR Green を用いた qRT-PCR 法で行った。
【００３９】
各検体のΔCt値を算出し、5%有意水準でt検定を行った。10種類の マーカー 候補 miRNA のうち、健常人群とアルツハイマー群で有意差がみられたものは、miR-122,miR-185,let-7f,miR-15b,miR-484,miR-144の 7 種類であった。他3種類では、有意差はみられなかった。また、この7種類の miRNA のΔCt値を用いて ROC曲線を作成したところ、miR-122,let-7f,miR-144 において AUC≧0.8 と精度よくアルツハイマー患者の診断ができた（図３−Ａ及び図３−Ｂ）。また、miR-122 と let-7f、miR-122 と miR-144 のΔCt値の差を算出し、再び ROC 曲線を作成したところ、AUC>0.9 とさらに精度よく診断が可能となった(図４−Ａ及び図４−Ｂ）。
【００４０】
以上の結果より、アルツハイマー患者において上昇している miR-122, 減少しているlet-7f,miR-144 をマーカー 候補 miRNA として同定することができた。
【００４１】
第 4 項  qRT-PCR による健常人と軽度認知症(MCI)患者の マーカー 候補 microRNA 量の比較
第 3 項でアルツハイマー診断 miRNA 候補として同定した miR-122, let-7f, mir-144 について、同様に qRT-PCR を行った。MCI 患者 42名におけるΔCt値を算出し、健常人群とt検定にて比較したところ、P<0.05 で有意に差がみられた。MCI 患者においても、miR-122 は上昇傾向、let-7f と miR-144 は減少傾向と、アルツハイマー患者と同様の傾向がみられた（図５−Ａ、図５−Ｂ及び図５−Ｃ）。
【００４２】
第５項  miRNAの組み合わせ
２種類のmiRNAを組合せた場合の精度を検討した。具体的には以下の試験を行った。第３項及び第６項で使用した検体においてqRT-PCRを行い、ΔCt値を算出した。そして、2種類のmiRNAのΔCt値の差、ΔCt(let-7f) - (miR-122)、ΔCt(miR-144) - (miR-122)、ΔCt(miR-128-3p) - (miR-122-5p)及びΔCt(miR-107) - (miR-122-5p)を算出した。結果をそれぞれ図６−Ａから図６−Ｄに示す。
【００４３】
第６項  網羅的なqRT-PCRによりアルツハイマー病で減少するマイクロRNAの同定
上記した網羅的なqRT-PCRにより、アルツハイマー病で減少するマイクロRNAとして、miR-128-3p及びmiR-107が同定された。結果をそれぞれ図７及び図８に示す。また、検体情報を図９に示す。
【００４４】
第７項  let-7gの内部標準としての優位性
健常人とアルツハイマー病患者におけるlet-7gを測定した。結果を図１０に示す。let-7gは変動が少なく内部標準として用いることができ、診断の精度を上げることができる優位性があることがわかった。なお、let-7gの塩基配列は、ugagguaguaguuuguacaguu（配列番号６）である。
【００４５】
let-7gを内部標準として用いてΔCtを補正した。miR-122、let-7f及びmiR-144についての測定結果を図１１−Ａ及び図１１−Ｂに示す。
【００４６】
第８項  miR-122とmiR-128-3pの組合せ
第５項と同様にして、MCI患者４２名におけるΔCt(miR-128) - (miR-122)を算出した。結果を図１２に示す。
【００４７】
図１２に示されるように、miR-122とmiR-128-3pの組合せにより、AUC1.00（すなわち、偽陽性率０％、偽陰性率０％）という驚くべき結果が得られた。
【図１−Ａ】
2020096621.tif 000003
【図１−Ｂ】
2020096621.tif 000004
【図２−Ａ】
2020096621.tif 000005
【図２−Ｂ】
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【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
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【図４−Ａ】
2020096621.tif 000009
【図４−Ｂ】
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【図５−Ａ】
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【図５−Ｂ】
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【図５−Ｃ】
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【図６−Ａ】
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【図６−Ｂ】
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【図６−Ｃ】
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【図６−Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−Ａ】
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【図１１−Ｂ】
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【図１２】
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【配列表】
2020096621000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月10日(2020.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から分離された被検試料中に含まれる、miR-122及びlet-7fの存在量、又は、miR-122及びmiR-144の存在量を指標とするアルツハイマー病又は軽度認知症の検出を補助する方法であって、miR-122の存在量が健常者よりも多く且つlet-7fの存在量が健常者よりも少ないこと、又は、miR-122の存在量が健常者よりも多く且つmiR-144の存在量が健常者よりも少ないことが、アルツハイマー病又は軽度認知症を発症している可能性が大きいことを示す、方法。
【請求項２】
前記被検試料が血清又は血漿である請求項１記載の方法。
【請求項３】
let-7g-5p、miR425-3p及びmiR425-5pから成る群より選ばれる少なくとも１種のマイクロRNAを内部標準として用いる請求項１又は２記載の方法。