(57)【要約】      （修正有）【課題】骨などの組織特異的細胞への分化をより正確に制御することによって細胞形成を増強し、また、化学添加剤を加えずに脊椎固定処置における癒着不能率を低減させる物品および方法を提供する。【解決手段】テクスチャを有する少なくとも１つの表面を有する基材と、第１の種類の成長細胞とを含む物品であって、テクスチャを形成する特徴部の平均長さが、細胞成長、細胞配向、細胞形態および細胞分化を促進するのに有効である、物品が開示される。基材の少なくとも１つの表面上にポリマー材料の第１の層を形成する工程と、第１の層をテクスチャ加工して、テクスチャ加工した第１の層を形成する工程と、テクスチャ加工した第１の層上に第１の種類の成長細胞を形成する工程とを含む方法であって、テクスチャ加工した第１の層を形成する特徴部の平均長さが、細胞成長、細胞配向、細胞形態および細胞分化を促進するのに有効である、方法も開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
テクスチャを有する少なくとも１つの表面を有する基材と、
第１の種類の成長細胞と
を含む物品であって、前記テクスチャを形成する特徴部の平均長さが、細胞成長、細胞配向、細胞形態および細胞分化を促進するのに有効である、物品。
【請求項２】
前記第１の種類の成長細胞が前記テクスチャに配置される、請求項１に記載の物品。
【請求項３】
前記テクスチャが複数の離間した特徴部を含み、各々の特徴部は隣接する特徴部と実質的に異なる形状を有し、前記複数の離間した特徴部は複数の集団で配列され、前記集団の各々内の前記離間した特徴部は約１０ナノメートル〜約２００マイクロメートルの平均距離で離間しており、特徴部の隣接する集団は中間の蛇行した経路を規定するように互いに離間している、請求項１に記載の物品。
【請求項４】
前記第１の種類の成長細胞の平均細胞縦横比が、テクスチャ加工されていない基材上で成長した細胞と比較して増加している、請求項１に記載の物品。
【請求項５】
前記第１の種類の成長細胞が、胚幹細胞、成体幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の物品。
【請求項６】
前記第１の種類の成長細胞がヒト間充織幹細胞である、請求項１に記載の物品。
【請求項７】
前記テクスチャを形成する特徴部の平均サイズおよび配列が、前記第１の種類の成長細胞のヒト骨細胞への細胞分化を促進するのに有効である、請求項１に記載の物品。
【請求項８】
前記テクスチャを形成する特徴部の平均サイズおよび配列が、前記テクスチャを有さない表面と比較して細胞移動を増加させるのに有効である、請求項１に記載の物品。
【請求項９】
前記テクスチャが、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリオルガノシロキサン、リン酸カルシウム、ポリエーテルエーテルケトン、生体活性ガラス、セラミック材料、セラミック材料とポリマーの複合材、生体活性ガラスとポリマーの複合材、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の物品。
【請求項１０】
前記テクスチャが生分解性ポリマーを含む、請求項１に記載の物品。
【請求項１１】
前記生分解性ポリマーが、ポリ乳酸−グリコール酸、ポリウレタンとポリ乳酸−グリコール酸の共重合体、ポリ−カプロラクトン、ポリ乳酸−グリコール酸とポリ−カプロラクトンの共重合体、ポリヒドロキシ−ブチレート−バレレート（ＰＨＢＶ）、ポリオルトエステル（ＰＯＥ）、ポリエチレンオキシド−ブチレンテレフタレート（ＰＥＯ−ＰＢＴＰ）、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸−ｐ−ジオキサノン−ポリエチレングリコールブロックコポリマー（ＰＬＡ−ＤＸ−ＰＥＧ）、または前述の生分解性ポリマーの少なくとも１つを含む組み合わせである、請求項１０に記載の物品。
【請求項１２】
前記基材が、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリオルガノシロキサン、リン酸カルシウム、ポリエーテルエーテルケトン、生体活性ガラス、セラミック材料、セラミック材料とポリマーの複合材、生体活性ガラスとポリマーの複合材、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の物品。
【請求項１３】
基材の少なくとも１つの表面上にポリマー材料の第１の層を形成する工程と、
前記第１の層をテクスチャ加工して、テクスチャ加工した第１の層を形成する工程と、
前記テクスチャ加工した第１の層上に第１の種類の成長細胞を形成する工程と
を含む方法であって、前記テクスチャ加工した第１の層を形成する特徴部の平均長さが、細胞成長、細胞配向、細胞形態および細胞分化を促進するのに有効である、方法。
【請求項１４】
前記第１の種類の成長細胞が前記テクスチャ加工した第１の層上に配置される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記テクスチャ加工した第１の層が複数の離間した特徴部を含み、各々の特徴部が隣接する特徴部と実質的に異なる形状を有し、前記複数の離間した特徴部が複数の集団で配列され、前記集団の各々内で前記離間した特徴部が約１０ナノメートル〜約２００マイクロメートルの平均距離で離間しており、特徴部の隣接する集団は中間の蛇行した通路を規定するように互いに離間している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の種類の成長細胞の平均細胞縦横比が、前記テクスチャを有する少なくとも１つの表面を有さない基材と比較して増加する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の種類の成長細胞が、胚幹細胞、成体幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の種類の成長細胞がヒト間充織幹細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記テクスチャ加工した第１の層を形成する特徴部の平均長さが、前記第１の種類の成長細胞の、ヒト骨細胞、筋肉および神経細胞への細胞分化を促進するのに有効である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の層が、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリオルガノシロキサン、リン酸カルシウム、ポリエーテルエーテルケトン、生体活性ガラス、セラミック材料、セラミック材料とポリマーの複合材、生体活性ガラスとポリマーの複合材、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞形成を増強するためのテクスチャ加工物品に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎固定術などの医療は、患者における骨損傷を処置し、修復するための自家骨移植技術を利用する矯正手術を提供する。４００，０００を超える脊椎固定処置が毎年米国において実施されている。自家骨移植は、骨が患者から採取され、融合される同じ患者の脊椎の部分に移される処置である。しかしながら、この手法は、標準的な脊椎固定処置が最大で患者の５０％における合併症および最大で３５％の癒着不能率をもたらすという点で制限される。
【０００３】
幹細胞から成長した骨組織を操作することにより、この処置の代替法が提供されている。ヒト間葉幹細胞（ＨＭＳＣ）は、未分化細胞として複製できるか、または組織特異的細胞に分化できる細胞である。より具体的には、ＨＭＳＣは、骨髄、骨、軟骨、腱、筋肉、または脂肪細胞に分化できる。しかしながら、分化を誘導するための化学添加剤の使用を含む標準的な処置は、不均一の細胞集団を導く、すなわち限定されないが、所望の細胞機能（または組織特異的細胞）を有するもの、例えば骨を含む、細胞のミックスを生じる、変動性を適切に制御することに関する欠点に悩まされる。これらの人工的な化学処置は分化を一貫して誘導せず、実験および臨床結果の両方に有害となり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、所望の組織特異的細胞、例えば骨へのヒト幹細胞の分化をより正確に制御することによって細胞形成を増強し、また、化学添加剤を加えずに脊椎固定処置における癒着不能率を低減させる物品および方法についての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
テクスチャを有する少なくとも１つの表面を有する基材と、第１の種類の成長細胞とを含む物品であって、テクスチャを形成する特徴部の平均長さが、細胞成長、細胞配向、細胞形態および細胞分化を促進するのに有効である、物品が本明細書に開示される。
【０００６】
基材の少なくとも１つの表面上にポリマー材料の第１の層を形成する工程と、第１の層をテクスチャ加工して、テクスチャ加工した第１の層を形成する工程と、テクスチャ加工した第１の層上に第１の種類の成長細胞を形成する工程とを含む方法であって、テクスチャ加工した第１の層を形成する特徴部の平均長さは、細胞成長、細胞配向、細胞形態および細胞分化を促進するのに有効である、方法もまた、本明細書に開示される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】Ｓｈａｒｋｌｅｔ（商標）（ＳＫ）表面上に配置された細胞の縦横比および細胞の配向の例示である。
【図２Ａ】ＳＭ（平滑）表面上のヒト間充織幹細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。
【図２Ｂ】−１．７ＳＫ２×２  Ｓｈａｒｋｌｅｔテクスチャ加工表面上のヒト間充織幹細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。
【図２Ｃ】＋１．７ＳＫ２×２  Ｓｈａｒｋｌｅｔテクスチャ加工表面上のヒト間充織幹細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。
【図２Ｄ】−１．５ＳＫ１０×５  ＳＫ表面上のヒト間充織幹細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。
【図２Ｅ】＋１．５ＳＫ１０×５  ＳＫテクスチャ加工表面上のヒト間充織幹細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。
【図３】図２の平滑およびパターン化されたＳＫ表面上に形成された細胞の平均細胞縦横比のグラフである。
【図４】図４Ａは、ＳＭ（平滑）表面上の成長培地中で培養したｈＭＳＣを示す写真である。図４Ｂは、ＳＫ（Ｓｈａｒｋｌｅｔ）テクスチャ加工表面上の成長培地中で培養したｈＭＳＣを示す写真である。図４Ｃは、骨形成についての初期マーカーとしてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）について染色した成長培地中でＳＫ（Ｓｈａｒｋｌｅｔ）テクスチャ加工表面上で培養したｈＭＳＣを示す写真である。
【図５】図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃのそれぞれの平滑およびパターン化されたＳＫ表面上で培養したｈＭＳＣについてのＡＬＰスコアのグラフである。
【図６】図６Ａは、ＳＭ（平滑）表面上の骨形成培地中で培養したｈＭＳＣを示す写真である。図６Ｂは、ＳＫ（Ｓｈａｒｋｌｅｔ）表面上の骨形成培地中で培養したｈＭＳＣを示す写真である。図６Ｃは、骨形成についての初期マーカーとしてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）について染色したＳＫ（Ｓｈａｒｋｌｅｔ）表面上の骨形成培地中で培養したｈＭＳＣを示す写真である。
【図７】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃのそれぞれの平滑およびパターン化されたＳＫ表面上で培養したｈＭＳＣについてのＡＬＰスコアのグラフである。
【図８】図８Ａは、ＳＭ（平滑）表面上の骨形成培地中で培養したｈＭＳＣを示す。図８Ｂは、Ｓｈａｒｋｌｅｔ（ＳＫ）テクスチャ加工表面上の骨形成培地中で培養し、骨細胞の機能的出力としてのカルシウム産生を検出するためにアリザリンレッドについて染色したｈＭＳＣを示す。
【図９】アリザリンレッドが細胞によって産生されたカルシウムを選択的に標識する、吸光度によるアリザリンレッド抽出および定量に基づいた、ＳＭおよびＳＫ表面上で培養したｈＭＳＣのアリザリンレッド染色の濃度のグラフである。
【図１０Ａ】＋１．７ＳＫ２×２  Ｓｈａｒｋｌｅｔテクスチャを有するＳｈａｒｋｌｅｔパターン上のｈＭＳＣ移動に対するＳｈａｒｋｌｅｔテクスチャ加工マイクロパターンの影響を示す写真である。
【図１０Ｂ】＋１．５ＳＫ１０×５  Ｓｈａｒｋｌｅｔテクスチャを有するＳｈａｒｋｌｅｔパターン上のｈＭＳＣ移動に対するＳｈａｒｋｌｅｔテクスチャ加工マイクロパターンの影響を示す写真である。
【図１０Ｃ】平滑（ＳＭ）表面上のｈＭＳＣ移動を示す写真である。
【図１０Ｄ】平滑（ＳＭ）表面ならびに＋１．７ＳＫ２×２および＋１．５ＳＫ１０×５テクスチャを有するテクスチャ加工表面上の正規化被覆率を反映する棒グラフである。
【図１１Ａ】平滑およびテクスチャ加工表面上の成長細胞を示す顕微鏡写真を示す。これらの図は、Ｓｈａｒｋｌｅｔマイクロパターンが、ＳＭ表面と比較してＭＳＣを有意に増強させることを実証しており、マイクロパターンが脊椎固定装置上でＭＳＣ移動を促進するように最適化され得ることを示唆している。
【図１１Ｂ】平滑およびテクスチャ加工表面上の経時的なＡＬＰスコア変化を示す棒グラフである。
【図１１Ｃ】経時的なアリザリンレッド濃度の変化を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
細胞成長、細胞配向、細胞形態および細胞分化を増強させるパターン化された物品が本明細書に開示される。その物品は、テクスチャを有する少なくとも１つの表面を有する基材と、第１の種類の成長細胞とを含む。テクスチャ加工された表面は複数の特徴部を含む。テクスチャを形成する特徴部の平均長さは細胞形態および配向に影響を及ぼし、その結果として、得られる組織特異的細胞機能、例えば骨組織に影響を及ぼす。
【０００９】
基材は細胞成長を促進するのに適した任意の材料から形成され得る。非限定的な例としては、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレンまたはポリオルガノシロキサンが挙げられる。基材は少なくとも１つの表面上に配置されるテクスチャを有する。一実施形態において、基材は組織培養ディッシュである。テクスチャ加工により、テクスチャの配向によって決定される特定の方向に沿って細胞成長が促進される。テクスチャ加工はまた、幹細胞の細胞分化を促進する。
【００１０】
一実施形態において、物品は細胞培養物を成長させるための容器である。別の実施形態において、物品は、細胞培養物由来の移植片を生成するために使用される移植足場、例えば骨移植片を生成するための骨移植足場である。
【００１１】
一実施形態において、テクスチャ加工表面および／または基材は熱可塑性ポリマーを含む。別の実施形態において、テクスチャ加工表面および／または基材は骨移植片における使用に適した任意の材料を含む。非限定的な例としては、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリオルガノシロキサン、リン酸カルシウム、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、生体活性ガラス、セラミック材料、セラミック材料とポリマーの複合材、生体活性ガラスとポリマーの複合材など、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００１２】
例示的な実施形態において、ポリジメチルシロキサンはテクスチャ加工される表面に好ましいポリマーである。テクスチャは、限定されないが、射出成形、熱エンボス加工、鋳造、レーザーエッチング、化学エッチングなどを含む、任意の適切な技術を使用して基材の少なくとも１つの表面上に形成され得る。
【００１３】
基材の表面は任意の種類のテクスチャを有してもよい。表面テクスチャの例は、Ｓｐａｔｈによる米国特許出願公開第２００５／０００３１４６  Ａ１号、Ｂｒｅｎｎａｎらによる米国特許第７，１４３，７０９  Ｂ２号およびＢｒｅｎｎａｎらによる米国特許出願シリアル番号１２／５５０，８７０号に詳述され、それらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００１４】
一実施形態において、テクスチャ加工された表面は複数の離間した特徴部を含み、特徴部は複数の集団で配列され、特徴部の集団は、第１の方向から見て、蛇行した経路を規定するように互いに対して配列される。第２の方向から見て、特徴部の集団は直線経路を規定するように配列される。半径方向パターンもまた、使用されてもよい。半径方向パターンにおいて、そのパターンは中心から発生し、半径方向において外側に広がる。
【００１５】
別の実施形態において、第２の方向から見て、特徴部の間の経路は非直線であり、非正弦曲線であってもよい。言い換えると、経路は非直線であり、非周期的であってもよい。さらに別の実施形態において、特徴部の間の経路は直線であるが、様々な厚さであってもよい。複数の離間した特徴部は基材表面から外側に突出してもよいか、または基材表面内に突出してもよい。一実施形態において、複数の離間した特徴部は基材と同じ化学組成を有する。別の実施形態において、複数の離間した特徴部は基材の化学組成と異なる化学組成を有する。
【００１６】
複数の離間した特徴部の各々は、少なくとも１つのマイクロスケール（マイクロメートルまたはナノメートルサイズ）寸法を有し、実質的に異なる形状を有する少なくとも１つの隣接する特徴部を有する。隣接する特徴部間の平均の第１の特徴部の間隔は、テクスチャ加工表面の少なくとも一部において約１０ナノメートル〜約１００マイクロメートルであり、前記複数の離間した特徴部は周期関数により表される。一実施形態において、第１の特徴部の間隔は、テクスチャ加工表面の少なくとも一部において約０．５マイクロメートル（μｍ）〜約５μｍである。別の実施形態において、第１の特徴部の間隔は、テクスチャ加工表面の少なくとも一部において約１５〜約６０μｍである。上記に示すように、周期関数は２つの異なる正弦波を含む。一実施形態において、トポグラフィーはサメの皮膚（例えばＳｈａｒｋｌｅｔ）のトポグラフィーに似ている。別の実施形態において、パターンは基板の一部に配置される少なくとも１つの多素子プラトー層を含み、プラトー層の素子の間の間隔の距離は第２の特徴部の間隔を提供し、第２の特徴部の間隔は、前記第１の特徴部の間隔と比較して実質的に異なる。複数の特徴部のうちの各々の特徴部は互いに離間し、互いに接触しないことに留意されるべきである。
【００１７】
テクスチャのパターンは蛇行した経路によって隣接するパターンから分離される。蛇行した経路は周期関数によって表され得る。周期関数は各々の蛇行した経路について異なっていてもよい。一実施形態において、パターンは２つ以上の周期関数によって表され得る蛇行した経路によって互いに分離されてもよい。周期関数は正弦波を含んでもよい。例示的な実施形態において、周期関数は２つ以上の正弦波を含んでもよい。
【００１８】
別の実施形態において、複数の異なる蛇行した経路がそれぞれ、複数の周期関数によって表される場合、それぞれの周期関数は一定の位相差によって分離されてもよい。さらに別の実施形態において、複数の異なる蛇行した経路がそれぞれ、複数の周期関数によって表される場合、それぞれの周期関数は様々な位相差によって分離されてもよい。
【００１９】
一実施形態において、複数の離間した特徴部は実質的に平面の上面を有する。別の実施形態において、多素子プラトー層が表面の一部に配置されてもよく、前記プラトー層の素子の間の間隔の距離は第２の特徴部の間隔を提供し、第２の特徴部の間隔は、第１の特徴部の間隔と比較して実質的に異なる。
【００２０】
一実施形態において、２つの隣接する集団によって共有される特徴部の数の合計は奇数に等しい。別の実施形態において、２つの隣接する集団によって共有される特徴部の数の合計は偶数に等しい。テクスチャの詳細は、Ｂｒｅｎｎａｎらによる米国特許出願シリアル番号１２／５５０，８７０号において図面の形態で見ることができ、それらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００２１】
第１の種類の成長細胞はテクスチャ加工表面に配置される。一実施形態において、第１の種類の成長細胞は、胚幹細胞、成体幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群から選択される。例示的な実施形態において、第１の種類の成長細胞はヒト間充織幹細胞（ｈＭＳＣ）である。
【００２２】
ヒト間葉幹細胞の増殖、拘束、系統進行、分化および成熟の間葉形成（ｍｅｓｅｎｇｅｎｉｃ）プロセスにおいて、間葉幹細胞の細胞形態は、骨髄基質、骨形成、軟骨形成、腱形成（ｔｅｎｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）、筋形成または脂質生成経路による増殖後、そられに応じて、骨髄、骨、軟骨、腱、筋肉および脂肪組織に変化する。間葉形成プロセスの間の細胞成長の間の細胞の細胞形態（または形状）は、得られる細胞機能を決定する。テクスチャ加工表面は細胞形状に影響を及ぼし、特定の種類の細胞機能、例えば骨組織への細胞分化を誘導する。
【００２３】
図１を参照すると、Ｓｈａｒｋｌｅｔ（商標）（ＳＫ）表面上に配置される細胞の縦横比および細胞の配向の例が示される。図１に示されるように、細胞伸長は、式ＡＲ＝ａ／ｂ（式中、ａは細胞の長軸の長さであり、ｂは細胞の短軸の長さである）を使用して平均細胞縦横比（ＡＲ）を算出することによって定量される。細胞の配向（θ）は細胞の長軸とテクスチャ特徴部の方向との間の角度を測定することによって決定される。
【００２４】
一実施形態において、テクスチャを形成する特徴部の平均長さは、第１の種類の成長細胞の、特定の選択された組織特異的細胞、例えば骨組織への細胞分化を促進するのに有効である。例示的な実施形態において、テクスチャ特徴部の平均長さは増加するので、平均細胞縦横比もまた、増加する。別の実施形態において、第１の種類の成長細胞の平均細胞縦横比は、テクスチャを有さない基材と比較して増加する。
【００２５】
細胞は接着点を介して基材の表面と相互作用し、それは局所的に修飾された基材に応答して成長し、適合する機械感受性（ｍｅｃｈａｎｏ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）シグナル伝達複合体であり、細胞伸長および細胞異方性を生じる。Ｓｈａｒｋｌｅｔマイクロトポグラフィーにおける不連続な特徴部は高レベルの細胞異方性を誘導し、接着点を、細胞集団の形態に対して、およびその結果として細胞分化に対して高レベルの制御へと正確に誘導することができる。一実施形態において、ＳＫ表面は平滑な表面または細長いチャネルもしくは柱状パターンを含む表面より高レベルの細胞異方性を示す。
【００２６】
基材の少なくとも１つの表面上にポリマー材料の第１の層を形成する工程；第１の層をテクスチャ加工して、テクスチャ加工した第１の層を形成する工程；およびテクスチャ加工した第１の層上に第１の種類の成長細胞を形成する工程を含む方法であって、テクスチャ加工した第１の層を形成する特徴部の平均長さは、細胞成長、細胞配向、細胞形態および細胞分化を促進するのに有効である、方法もまた、本明細書に開示される。
【００２７】
テクスチャ加工した表面は、細胞形態および細胞の配向を制御するためにテクスチャ加工したパターンを使用することによって組織細胞形成を増強し、それによって幹細胞、例えば骨組織の組織特異的細胞機能を標的とする。例示的な実施形態において、得られる骨組織は、テクスチャ加工した表面を使用して生成していない骨組織と比較して癒着不能率の低減を示す。
【実施例】
【００２８】
実施例１
平滑（ＳＭ）およびマイクロパターン化されたＳＫサンプルを、ネガティブシリコンウエハモールドに対してポリジメチルシロキサンエラストマー（Ｘｉａｍｅｔｅｒ  ＲＴＶ−４２３２−Ｔ２、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ；ＰＤＭＳｅ）を鋳造することによって製造した。ヒト間充織幹細胞（ｈＭＳＣ）をこれらのウエハモールド上の成長培地で３日間培養し、次いで染色し、固定し、測定した。
【００２９】
蛍光顕微鏡画像を各サンプルについて撮り、各サンプルについての平均細胞縦横比を算出した。図２は、ＳＭ（平滑）および−１．７ＳＫ２×２、＋１．７ＳＫ２×２、−１．５ＳＫ１０×５および＋１．５ＳＫ１０×５  ＳＫ表面上のヒト間充織幹細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。図２（Ａ）は、ＳＭ（平滑）表面上のヒト間充織幹細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。図２（Ｂ）は、−１．７ＳＫ２×２  Ｓｈａｒｋｌｅｔテクスチャ加工表面上のヒト間充織幹細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。図２（Ｃ）は、＋１．７ＳＫ２×２  Ｓｈａｒｋｌｅｔテクスチャ加工表面上のヒト間充織幹細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。図２（Ｄ）は、−１．５ＳＫ１０×５  ＳＫ表面上のヒト間充織幹細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。図２（Ｅ）は、＋１．５ＳＫ１０×５  ＳＫテクスチャ加工表面上のヒト間充織幹細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。
【００３０】
差込図は下部のＳＭおよびパターン化されたＳＫ表面の共焦点顕微鏡画像を示す。ＳＫ表面の矩形の特徴部の平均長さは４〜８０マイクロメートルまで変化する。
【００３１】
ここで採用される用語体系（例えば、＋１．７ＳＫ２×２）は以下のように判読されるべきである：＋１．７は底面から上のテクスチャの高さを示し、ＳＫは、Ｂｒｅｎｎａｎｒによる米国特許第７１４３７０９  Ｂ２号およびＢｒｅｎｎａｎらによる特許出願シリアル番号１２／５５０，８７０号に示され、記載されるＳｈａｒｋｌｅｔパターンを指す。１．７の単語の前の負の記号（−）は、テクスチャが底面より下にあることを示す。ＳＫ２×２における最初の２はパターンにおける各特徴部の幅を意味し、２番目の２はパターンにおける特徴部間の間隔を意味する。
【００３２】
平均細胞縦横比（ＡＲ）は、図１に示されるように、式ＡＲ＝ａ／ｂ（式中、ａは細胞の長軸の長さであり、ｂは細胞の短軸の長さである）を使用して算出した。平滑およびパターン化されたＳＫ上に形成される細胞の平均細胞縦横比を図３のグラフにプロットする。これらの結果は、有意に高い平均細胞縦横比が、ＳＭ表面と比較してＳＫ表面を使用して得られることを示す。これらの結果はまた、平均特徴部長さが増加すると、平均細胞縦横比も増加するＳＫマイクロパターンを示す。このように、ＳＫ表面は、細胞形態を調節し、それによって細胞分化を制御するように適合され得る。
【００３３】
実施例２
図４（Ａ）、４（Ｂ）および４（Ｃ）は、ＳＭ（平滑）およびＳＫ（Ｓｈａｒｋｌｅｔ）表面上の成長培地中で培養し、７、１４および２１日後に骨形成についての初期マーカーとしてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）について染色したｈＭＳＣを示す。図５は、４（Ａ）、４（Ｂ）および４（Ｃ）の平滑およびパターン化されたＳＫ表面上で培養したｈＭＳＣについてのＡＬＰスコアのグラフであり、ｙ軸のスケールバーは５０μｍ増分で表している。染色により、ＳＫ表面が利用される場合、ＳＭ表面と比較してＡＬＰ産生が有意に増加することが明らかになる。これらの結果により、ＳＫ表面がｈＭＳＣにおいて骨形成および骨細胞分化を誘導することが示される。
【００３４】
実施例３
図６（Ａ）、６（Ｂ）および６（Ｃ）は、ＳＭ（平滑）およびＳＫ（Ｓｈａｒｋｌｅｔ）表面上の骨形成培地中で培養し、骨形成についての初期マーカーとしてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）について染色したｈＭＳＣを示す。図７は、それぞれ６（Ａ）、６（Ｂ）および６（Ｃ）の平滑およびパターン化されたＳＫ表面上で培養したｈＭＳＣについてのＡＬＰスコアのグラフである。図７のグラフから見ることができるように、増加したＡＬＰ産生が、＋１．５ＳＫ２×２およびＳＭ表面と比較して＋１．７ＳＫ２×２ＳＫ表面で観察される。
【００３５】
実施例４
図８（Ａ）および８（Ｂ）は、ＳＭ（平滑）およびＳＫ（Ｓｈａｒｋｌｅｔ）表面上の骨形成培地中で培養し、骨細胞の機能的出力としてのカルシウム産生を検出するためにアリザリンレッドについて染色したｈＭＳＣを示す。図９は、吸光度によるアリザリンレッド抽出および定量に基づいた、ＳＭ組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）およびＳＫ表面上で培養したｈＭＳＣのアリザリンレッド染色の濃度のグラフであり、アリザリンレッドは細胞によって産生されたカルシウムを選択的に標識する。図９において見ることができるように、増加したカルシウム産生が、＋１．５ＳＫ２×２およびＳＭ表面と比較して＋１．７ＳＫ２×２  ＳＫ表面で観察される。
【００３６】
実施例５
図１０Ａ〜１０Ｄは、ｈＭＳＣ移動に対するＳｈａｒｋｌｅｔマイクロパターンの影響を示し、２つのマイクロパターン（＋１．７ＳＫ２×２および＋１．５ＳＫ１０×５）をポリジメチルシロキサンエラストマー（ＰＤＭＳｅ）で複製し、平滑（ＳＭ）対照と比較して改変した掻創アッセイにおいて試験した。図１０Ａは、＋１．７ＳＫ２×２  Ｓｈａｒｋｌｅｔテクスチャを有するＳｈａｒｋｌｅｔパターン上のｈＭＳＣ移動に対するＳｈａｒｋｌｅｔテクスチャ加工マイクロパターンの影響を示す写真である。図１０Ａは、＋１．５ＳＫ１０×５Ｓｈａｒｋｌｅｔテクスチャを有するＳｈａｒｋｌｅｔパターン上のｈＭＳＣ移動に対するＳｈａｒｋｌｅｔテクスチャ加工マイクロパターンの影響を示す写真である。図１０Ｃは、平滑（ＳＭ）表面上のｈＭＳＣ移動を示す写真である。図１０Ｄは、平滑（ＳＭ）表面および＋１．７ＳＫ２×２および＋１．５ＳＫ１０×５テクスチャを有するテクスチャ加工表面上の正規化被覆率を反映する棒グラフである。
【００３７】
ＳＭおよびＳｈａｒｋｌｅｔマイクロパターン上のＭＳＣの代表的な蛍光顕微鏡画像をここに示し、白色の破線は創傷領域を表す。ＭＳＣを、移動アッセイフォーマットにおいて、増殖培地中で７日間、これらのサンプル上で培養し、固定し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ膜染料で染色し、人口創傷内の細胞で覆われた領域を測定し、比較した。
【００３８】
図１１における結果により、Ｓｈａｒｋｌｅｔマイクロパターンが、ＳＭ表面と比較してＭＳＣを有意に増強させることが実証され、マイクロプレートが、脊椎固定装置上でＭＳＣ移動を促進するように最適化され得ることが示唆される。スケールバー、１ｍｍ。
【００３９】
図１１（Ａ）は、平滑およびテクスチャ加工表面上の成長細胞を示す顕微鏡写真を示す。それらの図は、Ｓｈａｒｋｌｅｔマイクロパターンが、ＳＭ表面と比較してＭＳＣを有意に増強させることを実証し、マイクロパターンが、脊椎固定装置上でＭＳＣ移動を促進するように最適化され得ることを示唆する。図１１（Ｂ）は、平滑およびテクスチャ加工表面上の経時的なＡＬＰスコア変動を示す棒グラフであり、図１１（Ｃ）は、経時的なアリザリンレッド濃度変化を示す棒グラフである。
【００４０】
まとめると、テクスチャ加工物品は細胞を成長させるために使用することができる。成長細胞はテクスチャ上に配置される。テクスチャを形成する特徴部の平均長さは、細胞成長、細胞配向、細胞形態および細胞分化を促進するのに有効である。テクスチャは複数の離間した特徴部を含み；各々の特徴部は隣接する特徴部と実質的に異なる形状を有し；複数の離間した特徴部は複数の集団で配列され、集団の各々内の離間した特徴部は約１０ナノメートル〜約２００マイクロメートルの平均距離で離間しており；特徴部の隣接する集団は中間の蛇行した経路を規定するように互いに離間している。
【００４１】
一実施形態において、成長細胞の平均細胞縦横比は、テクスチャを有する少なくとも１つの表面を有さない基材上で成長させた細胞と比較して増加する。成長細胞は、胚幹細胞、成体幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群から選択される。一実施形態において、成長細胞はヒト間充織幹細胞である。
【００４２】
一実施形態において、テクスチャを形成する特徴部の平均サイズおよび配列は、第１の種類の成長細胞のヒト骨細胞への細胞分化を促進するのに有効である。別の実施形態において、テクスチャを形成する特徴部の平均サイズおよび配列は、テクスチャを有さない表面と比較して細胞移動を増加させるのに有効である。
【００４３】
上記に詳述したように、成長細胞が堆積される基材はテクスチャ加工される。一実施形態において、テクスチャは、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリオルガノシロキサン、リン酸カルシウム、ポリエーテルエーテルケトン、生体活性ガラス、セラミック材料、セラミック材料とポリマーの複合材、生体活性ガラスとポリマーの複合材、またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態において、基材は、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリオルガノシロキサン、リン酸カルシウム、ポリエーテルエーテルケトン、生体活性ガラス、セラミック材料、セラミック材料とポリマーの複合材、生体活性ガラスとポリマーの複合材、またはそれらの組み合わせを含む。
【００４４】
さらに別の実施形態において、テクスチャは生分解性ポリマーを含む。生分解性ポリマーは、ポリ乳酸−グリコール酸、ポリウレタンとポリ乳酸−グリコール酸の共重合体、ポリ−カプロラクトン、ポリ乳酸−グリコール酸とポリ−カプロラクトンの共重合体、ポリヒドロキシ−ブチレート−バレレート（ＰＨＢＶ）、ポリオルトエステル（ＰＯＥ）、ポリエチレンオキシド−ブチレンテレフタレート（ＰＥＯ−ＰＢＴＰ）、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸−ｐ−ジオキサノン−ポリエチレングリコールブロックコポリマー（ＰＬＡ−ＤＸ−ＰＥＧ）、または前述の生分解性ポリマーの少なくとも１つを含む組み合わせである。
【００４５】
本発明は、その好ましい特定の実施形態と併せて記載しているが、前述の説明および実施例は本発明を例示することを意図し、その範囲を限定するものではないことが理解される。本発明の範囲内の他の態様、利点および修飾が、本発明に関する当業者により明らかになるであろう。
【図１】
2020188808.tif 000003
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月11日(2020.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テクスチャを有する少なくとも１つの表面を有する基材と、
第１の種類の成長細胞と
を含む物品であって、
前記テクスチャが複数の離間した特徴部を含み、各々の特徴部は隣接する特徴部と実質的に異なる形状を有し、
前記複数の離間した特徴部は複数の集団で配列され、前記集団の各々内の前記離間した特徴部は１０ナノメートル〜２００マイクロメートルの平均距離で離間しており、特徴部の隣接する集団は中間の蛇行した経路を規定するように互いに離間しており、
前記第１の種類の成長細胞が前記テクスチャに配置され、
前記テクスチャを形成する特徴部の平均長さが、細胞成長、細胞配向、細胞形態および細胞分化を促進するのに有効であり、
前記テクスチャの離間した特徴部の配向が、細胞成長の方向を決定し、
平均細胞縦横比が、前記テクスチャの離間した特徴部の平均長さの増加とともに増加する、
物品。
【請求項２】
前記第１の種類の成長細胞の平均細胞縦横比が、テクスチャ加工されていない基材上で成長した細胞と比較して増加している、請求項１に記載の物品。
【請求項３】
前記第１の種類の成長細胞が、胚幹細胞、成体幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の物品。
【請求項４】
前記第１の種類の成長細胞がヒト間充織幹細胞である、請求項１に記載の物品。
【請求項５】
前記テクスチャを形成する特徴部の平均サイズおよび配列が、前記第１の種類の成長細胞のヒト骨細胞への細胞分化を促進するのに有効である、請求項１に記載の物品。
【請求項６】
前記テクスチャが、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリオルガノシロキサン、リン酸カルシウム、ポリエーテルエーテルケトン、生体活性ガラス、セラミック材料、セラミック材料とポリマーの複合材、生体活性ガラスとポリマーの複合材、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の物品。
【請求項７】
前記テクスチャが生分解性ポリマーを含み、
前記生分解性ポリマーが、ポリ乳酸−グリコール酸、ポリウレタンとポリ乳酸−グリコール酸の共重合体、ポリ−カプロラクトン、ポリ乳酸−グリコール酸とポリ−カプロラクトンの共重合体、ポリヒドロキシ−ブチレート−バレレート（ＰＨＢＶ）、ポリオルトエステル（ＰＯＥ）、ポリエチレンオキシド−ブチレンテレフタレート（ＰＥＯ−ＰＢＴＰ）、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸−ｐ−ジオキサノン−ポリエチレングリコールブロックコポリマー（ＰＬＡ−ＤＸ−ＰＥＧ）、または前述の生分解性ポリマーの少なくとも１つを含む組み合わせである、請求項１に記載の物品。
【請求項８】
基材の少なくとも１つの表面上にポリマー材料の第１の層を形成する工程と、
前記第１の層をテクスチャ加工して、テクスチャ加工した第１の層を形成する工程と、
前記テクスチャ加工した第１の層上に第１の種類の成長細胞を形成する工程と
を含む方法であって、
前記テクスチャが複数の離間した特徴部を含み、各々の特徴部が隣接する特徴部と実質的に異なる形状を有し、
前記複数の離間した特徴部が複数の集団で配列され、前記集団の各々内で前記離間した特徴部が１０ナノメートル〜２００マイクロメートルの平均距離で離間しており、特徴部の隣接する集団は中間の蛇行した通路を規定するように互いに離間しており、
前記第１の種類の成長細胞が前記テクスチャの上に配置され、
前記テクスチャを形成する特徴部の平均長さが、細胞成長、細胞配向、細胞形態および細胞分化を促進するのに有効であり、
前記テクスチャの離間した特徴部の配向が、細胞成長の方向を決定し、
平均細胞縦横比が、前記テクスチャの離間した特徴部の平均長さの増加とともに増加する、
方法。
【請求項９】
前記第１の種類の成長細胞が前記テクスチャ加工した第１の層上に配置される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記テクスチャ加工した第１の層が複数の離間した特徴部を含み、各々の特徴部が隣接する特徴部と実質的に異なる形状を有し、前記複数の離間した特徴部が複数の集団で配列され、前記集団の各々内で前記離間した特徴部が１０ナノメートル〜２００マイクロメートルの平均距離で離間しており、特徴部の隣接する集団は中間の蛇行した通路を規定するように互いに離間している、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の種類の成長細胞の平均細胞縦横比が、前記テクスチャを有する少なくとも１つの表面を有さない基材と比較して増加する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の種類の成長細胞がヒト間充織幹細胞である、請求項８に記載の方法。
【外国語明細書】
2020188808000001.pdf