(57)【要約】【課題】細胞の遺伝子を傷つけることなく、短期間で効率よく神経系細胞を作製可能な、神経系細胞の作製方法を提供する。【解決手段】  幹細胞を用意することと、幹細胞にセンダイウイルスを感染により導入し、幹細胞内でセンダイウイルスに誘導因子を合成するｍＲＮＡを発現させることで、幹細胞を神経系細胞に誘導することと、を含む、神経系細胞の作製方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を用意することと、
前記幹細胞にセンダイウイルスを感染により導入し、前記幹細胞内で前記センダイウイルスに誘導因子を合成するｍＲＮＡを発現させることで、前記幹細胞を神経系細胞に誘導することと、
を含む、神経系細胞の作製方法。
【請求項２】
前記幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１に記載の神経系細胞の作製方法。
【請求項３】
前記幹細胞が胚性幹細胞である、請求項１に記載の神経系細胞の作製方法。
【請求項４】
前記誘導因子が、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ（ＮＧＮ）を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
【請求項５】
前記誘導因子が、ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ（ＡＳＣＬ）を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
【請求項６】
前記誘導因子が、ｍｙｅｌｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ（ＭＹＴ）を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
【請求項７】
前記誘導因子が、ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ（ＤＬＸ）を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
【請求項８】
前記神経系細胞が、興奮性神経細胞、抑制性神経細胞、ドーパミン産生神経細胞、運動神経細胞、及び大脳神経細胞からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１から７のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
【請求項９】
前記神経系細胞が、ＴＨ陽性、ＴＵＪ１陽性、ＢＲＮ２陽性、ＮＧＮ陽性、β−ＩＩＩＴｕｂｕｌｉｎ陽性、ＭＡＰ２陽性、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ陽性、ｖＧＬＵＴ陽性、ＳＡＴＢ２陽性、ｃｈＡＴ陽性、ＨＢ９陽性、ＭＵＮＣ１３陽性、ＨＯＭＥＲ１陽性、ｖＧＡＴ陽性、及びＧＡＤ６５／６７陽性からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１から７のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
【請求項１０】
前記センダイウイルスが、前記幹細胞内で、薬剤耐性遺伝子のｍＲＮＡを発現させる、請求項１から９のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
【請求項１１】
前記薬剤耐性遺伝子が、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストシジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１０に記載の神経系細胞の作製方法。
【請求項１２】
前記幹細胞に前記センダイウイルスを感染した後、薬剤耐性を示す細胞を選択することを含む、請求項１０又は１１に記載の神経系細胞の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞技術に関し、神経系細胞の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、体を構成するあらゆる細胞に変化することができる。そのため、様々な種類の体細胞や組織に変化することができるｉＰＳ細胞は、細胞移植治療や創薬研究に利用されることが期待されている。また、例えば、２０１４年にはｉＰＳ細胞から作製された網膜の細胞が移植治療に応用された。日本のみならず、世界各国でも、ｉＰＳ細胞から脳の細胞や、各種臓器の細胞を作製し、移植治療に用いるプロジェクトが進んでいる。
【０００３】
従来、ｉＰＳ細胞を分化細胞に変化させる方法は数多くある。しかし、ｉＰＳ細胞を移植治療に利用するためには、ｉＰＳ細胞の効率の良い誘導方法を確立することが重要である。具体的には、ｉＰＳ細胞を分化細胞へと誘導するときに用いる技術を確立し、誘導の効率及び精度を向上させ、作製した分化細胞の機能性などが移植治療に耐えうるものである必要がある。
【０００４】
従来、ｉＰＳ細胞や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から分化細胞へ誘導する方法は、細胞の性質を決定するホルモンや成長因子、並びに低分子化合物を組み合わせ、それらの量比や濃度を経時的に変える事で、発生の過程を模倣して行なわれてきている。しかし、発生の過程を試験管内で完全に模倣することは難しく効率が悪い。また、マウスの体細胞の誘導期間に比べてヒトの場合は非常に長い誘導期間が必要であり、例えば成熟した神経を作製するためには、従来、３ヶ月以上を要する。
【０００５】
さらに、ＥＳ／ｉＰＳ細胞株によって誘導の効率が大きく異なり、誘導された体細胞の性質が不均一である等の問題がある。実際に、複数のＥＳ細胞クローンに化学物質を添加し、様々な細胞を作製したところ、膵臓の細胞に誘導しやすいクローンや、心臓の細胞に誘導しやすいクローンなどが存在し、クローンによって誘導されやすさに違いがあることが示された（例えば、非特許文献１参照。）。また、無血清凝集浮遊培養法（ＳＦＥＢｑ法）とよばれる、血清や神経細胞への誘導を阻害する化学物質を含まない培地でｉＰＳ細胞を培養することで、ｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞から神経細胞を作製する方法を利用し、数十種類のｉＰＳ細胞から神経細胞を作製したところ、神経細胞に変化しにくいｉＰＳ／ＥＳ細胞クローンが存在することが証明された（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００６】
具体的には、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞からホルモンや化学物質を利用する方法を用いて誘導された細胞は、初期の段階では胎児段階の体細胞であることが確認されている。ヒトの成熟した体細胞の誘導は極めて難しく、数か月にわたる長期の培養が必要である。しかし、発生が完了した個体を対象とする創薬や移植医療において、個体の成熟度に一致する体細胞を作製することは重要である。
【０００７】
また、神経細胞には、様々なサブタイプの細胞が存在するが、ホルモンや化学物質を利用する方法では、これらのサブタイプ神経を均一にＥＳ／ｉＰＳ細胞から誘導できない。そのため、特定の神経サブタイプ特異的な創薬スクリーニングができない。したがって、創薬スクリーニングの効率が低い。また、移植医療においても、疾患のある特定の細胞だけを濃縮して移植することができない。
【０００８】
これに対し、ゲノムにインテグレートするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ウイルスを用いて特定の体細胞の性質を規定する遺伝子をＥＳ／ｉＰＳ細胞に直接を導入し、目的の体細胞を作製する方法が提案されている。ゲノムにインテグレートするＤＮＡウイルスを用いる方法は、ホルモンや化学物質を利用する方法に比べて、例えば２週間のような非常に短い期間で成熟した神経細胞を特異的に作製可能である。また、特定の遺伝子導入により神経細胞を作製すると、例えば興奮性神経のみを均一に得ることができる。そのため、特定の神経サブタイプ特異的な創薬スクリーニングが可能であり、移植医療においても、疾患のある特定の細胞だけを濃縮して移植できると考えられている。
【０００９】
しかし、特定の遺伝子を発現させるためにゲノムにインテグレートするＤＮＡウイルスを用いて幹細胞を体細胞に誘導する方法においては、ＥＳ／ｉＰＳ細胞のゲノム上に遺伝子が挿入され、内在性の遺伝子に傷を付けてしまう。その結果、創薬スクリーニングが正しく行なわれず、移植においては癌化のリスクが伴うという問題がある（例えば、非特許文献３、４参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Nature Biotechnol 26(3): 313-315, 2008.
【非特許文献２】PNAS, 111:12426-12431, 2014
【非特許文献３】N Eng J Med, 346:1185-1193, 2002
【非特許文献４】Science 302: 415-419, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、細胞の遺伝子を傷つけることなく、短期間で効率よく神経系細胞を作製可能な、神経系細胞の作製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の態様によれば、幹細胞を用意することと、幹細胞にセンダイウイルスを感染により導入し、幹細胞内でセンダイウイルスに誘導因子を合成するメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を発現させることで、幹細胞を神経系細胞に誘導することと、を含む、神経系細胞の作製方法が提供される。
【００１３】
上記の神経系細胞の作製方法において、幹細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）であってもよい。
【００１４】
上記の神経系細胞の作製方法において、幹細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であってもよい。
【００１５】
上記の神経系細胞の作製方法において、誘導因子が、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ（ＮＧＮ）を含んでいてもよい。誘導因子が、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ（ＮＧＮ）のみを含んでいてもよい。
【００１６】
上記の神経系細胞の作製方法において、誘導因子が、ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ（ＡＳＣＬ）を含んでいてもよい。
【００１７】
上記の神経系細胞の作製方法において、誘導因子が、ｍｙｅｌｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ（ＭＹＴ）を含んでいてもよい。
【００１８】
上記の神経系細胞の作製方法において、誘導因子が、ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ（ＤＬＸ）を含んでいてもよい。
【００１９】
上記の神経系細胞の作製方法において、神経系細胞が、神経細胞、神経幹細胞及び神経前駆細胞のいずれかであってもよい。神経細胞が、興奮性神経細胞、抑制性神経細胞、ドーパミン産生神経細胞、運動神経細胞、及び大脳神経細胞からなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。神経系細胞が、オリゴデンドロサイト前駆細胞及びオリゴデンロドサイトであってもよい。
【００２０】
上記の神経系細胞の作製方法において、神経系細胞が、ＮＧＮ遺伝子陽性、ＡＳＣＬ遺伝子陽性、ＭＹＴ遺伝子陽性、及びＤＬＸ遺伝子陽性から選択される少なくとも一つであってもよい。
【００２１】
上記の神経系細胞の作製方法において、神経系細胞が、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）陽性、ＴＵＪ１陽性、ＢＲＮ２陽性、ＮＧＮ陽性、β−ＩＩＩＴｕｂｕｌｉｎ陽性、ＭＡＰ２陽性、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ陽性、ｖＧＬＵＴ陽性、ＳＡＴＢ２陽性、ｃｈＡＴ陽性、ＨＢ９陽性、ＭＵＮＣ１３陽性、ＨＯＭＥＲ１陽性、ｖＧＡＴ陽性、及びＧＡＤ６５／６７陽性からなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。
【００２２】
上記の神経系細胞の作製方法において、センダイウイルスが、幹細胞内で、薬剤耐性遺伝子のｍＲＮＡを発現させてもよい。
【００２３】
上記の神経系細胞の作製方法において、薬剤耐性遺伝子が、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストシジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。
【００２４】
上記の神経系細胞の作製方法が、幹細胞にセンダイウイルスを感染した後、薬剤耐性を示す細胞を選択することを含んでいてもよい。
【００２５】
上記の神経系細胞の作製方法が、幹細胞にセンダイウイルスを感染した後、ピューロマイシン耐性、ブラストシジン耐性、ハイグロマイシン耐性、及びネオマイシン耐性からなる群から選択される少なくとも一つの薬剤耐性を示す細胞を選択することを含んでいてもよい。
【００２６】
上記の神経系細胞の作製方法において、センダイウイルスに感染させる際の幹細胞の密度が、１２ウェルプレートのウェルにおいて、０．２×１０5個／ウェルから１．０×１０6個／ウェルであってもよい。
【００２７】
上記の神経系細胞の作製方法において、センダイウイルスの感染多重度（ＭＯＩ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が１回あたり０．１から１００．０であってもよい。
【００２８】
上記の神経系細胞の作製方法において、幹細胞をセンダイウイルスに感染させる際の培地が、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１、ＴｅＳＲ２（登録商標）及びＳｔｅｍ  Ｆｉｔから選択されるいずれかであってもよい。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、細胞の遺伝子を傷つけることなく、短期間で効率よく神経系細胞を作製可能な神経系細胞の作製方法を提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】実施例１に係る細胞の顕微鏡写真である。
【図２】実施例１に係る抗ＢＲＮ２抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図３】実施例２に係る抗ＨＯＭＥＲ１抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図４】実施例３に係る抗ＭＡＰ２抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図５】実施例４に係る抗ＭＵＮＣ１３−１抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図６】実施例５に係る抗ＳＡＴＢ２抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図７】実施例６に係る抗ＴＵＪ１抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図８】実施例７に係る抗ｖＧＬＵＴ抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図９】実施例８に係る抗ｃｈＡＴ抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図１０】実施例９に係る抗ＨＢ９抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図１１】実施例１０に係る抗ＴＨ抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図１２】図１２（ａ）及び図１２（ｂ）は、実施例１１に係る細胞の顕微鏡写真である。図１２（ｃ）は、実施例１１に係る抗ＴＵＪ１抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図１３】実施例１２に係る抗ＢＲＮ２抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図１４】実施例１３に係る抗ＧＡＤ６５／６７抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図１５】実施例１４に係る抗ＭＡＰ２抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図１６】実施例１５に係る抗ｖＧＡＴ抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図１７】実施例１６に係る抗ＴＵＪ１抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図１８】実施例１７に係る抗ＭＡＰ２抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図１９】実施例１８に係る抗ＢＲＮ２抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図２０】実施例１９に係る抗ｖＧＡＴ抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図２１】実施例２０に係る抗ＧＡＤ６５／６７抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図２２】実施例２１に係る抗ＴＨ抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図２３】実施例２２に係る抗ｃｈＡＴ抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図２４】実施例２３に係る抗ｖＧＬＵＴ抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図２５】実施例２４に係る抗ＳＡＴＢ２抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図２６】実施例２５に係るフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお以下の示す実施の形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
【００３２】
本発明の実施の形態に係る幹細胞から体細胞を作製する方法は、幹細胞を用意することと、幹細胞にセンダイウイルスを感染により導入し、幹細胞内でセンダイウイルスに誘導因子を合成するｍＲＮＡを発現させることで、幹細胞を神経細胞に誘導することと、を含む。
【００３３】
幹細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）及び胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の両方が使用可能である。幹細胞は、ヒトの幹細胞であってもよいし、非ヒト動物の幹細胞であってもよい。
【００３４】
誘導とは、リプログラミング、初期化、形質転換、分化転換(Transdifferentiation or Lineage reprogramming)、分化誘導及び細胞の運命変更(Cell fate reprogramming)等を指す。
【００３５】
誘導される神経系細胞の例としては、神経細胞、神経幹細胞及び神経前駆細胞が挙げられる。神経細胞の例としては、興奮性神経細胞、抑制性神経細胞、ドーパミン産生神経細胞、運動神経細胞、及び大脳神経細胞が挙げられる。あるいは、神経系細胞は、オリゴデンドロサイト前駆細胞及びオリゴデンロドサイト等であってもよい。
【００３６】
幹細胞に導入されるセンダイウイルス（ＳｅＶ）は、幹細胞を神経細胞に誘導する誘導因子を合成するｍＲＮＡを発現するＲＮＡゲノムを有する。なお、任意のｍＲＮＡを発現可能な組換えセンダイウイルスベクターの作製は、例えば、株式会社ＩＤファーマが特許技術を利用して受託している。誘導因子を合成するｍＲＮＡとしては、例えば、ＮＧＮ２等のＮＧＮ遺伝子のｍＲＮＡ、ＡＳＣＬ１等のＡＳＣＬ遺伝子のｍＲＮＡ、ＭＹＴ１Ｌ等のＭＹＴ遺伝子のｍＲＮＡ、及びＤＬＸ２等のＤＬＸ遺伝子のｍＲＮＡが挙げられる。ＮＧＮ２、ＡＳＣＬ１、ＭＹＴ１Ｌ、及びＤＬＸ２は、神経細胞生成に必要なスイッチタンパク質である。ＮＧＮ２は、興奮性神経細胞を生成することができる。ＡＳＣＬ１、ＭＹＴ１Ｌ、ＤＬＸ２のそれぞれは、抑制性神経細胞を生成することができる。ＡＳＣＬ１とＭＹＴ１Ｌの組み合わせは、興奮性神経細胞、抑制性神経細胞、及びドーパミン産生神経細胞を生成することができる。
【００３７】
例えば、幹細胞に導入されたセンダイウイルスは、誘導因子を合成するｍＲＮＡとして、ＮＧＮ２等のＮＧＮ遺伝子のｍＲＮＡ、ＡＳＣＬ１等のＡＳＣＬ遺伝子のｍＲＮＡ、ＭＹＴ１Ｌ等のＭＹＴ遺伝子のｍＲＮＡ、及びＤＬＸ２等のＤＬＸ遺伝子のｍＲＮＡから選択される少なくとも一つを発現させる。
【００３８】
センダイウイルスは、薬剤耐性遺伝子のｍＲＮＡを発現するＲＮＡゲノムを有していてもよい。薬剤とは、例えばピューロマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、Ｇ４１８、及びゼオシン等の抗生物質である。例えば、幹細胞に導入されたセンダイウイルスは、薬剤耐性遺伝子のｍＲＮＡを発現させる。薬剤耐性遺伝子のｍＲＮＡが発現した細胞は、薬剤耐性を示す。
【００３９】
センダイウイルスが、薬剤耐性遺伝子のｍＲＮＡを発現させた場合、感染の後、薬剤耐性を示す細胞を選択してもよい。例えば、センダイウイルスによって、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子、及びゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ、登録商標）耐性遺伝子のｍＲＮＡの少なくともいずれかを発現させた場合、感染の後の細胞を対応する抗生物質に曝すことにより、センダイウイルスが導入された細胞以外を死滅させ、センダイウイルスが導入された細胞を選別することが可能である。
【００４０】
センダイウイルスは、例えば、ＮＧＮ２遺伝子のｍＲＮＡ及びピューロマイシン耐性遺伝子のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ（以下、「ＮＧＮ２−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡ」という。）を発現可能なＲＮＡを有していてもよい。ＮＧＮ２遺伝子のｍＲＮＡの配列は、例えば、配列番号１（マウス）又は配列番号２（ヒト）に示すＤＮＡの配列に対応する。ＮＧＮ２−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡが発現した細胞は、ＮＧＮ２を産生し、かつ、ピューロマイシン耐性を示す。
【００４１】
センダイウイルスは、例えば、ＡＳＣＬ１遺伝子のｍＲＮＡ、ＭＹＴ１Ｌ遺伝子のｍＲＮＡ、及びピューロマイシン耐性遺伝子のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ（以下、「ＡＳＣＬ１−ＭＹＴ１Ｌ−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡ」という。）を発現可能なＲＮＡを有していてもよい。ＡＳＣＬ１遺伝子のｍＲＮＡの配列は、例えば、配列番号３（マウス）又は配列番号４（ヒト）に示すＤＮＡの配列に対応する。ＭＹＴ１Ｌ遺伝子のｍＲＮＡの配列は、例えば、配列番号５（マウス）、配列番号６（マウス）、配列番号７（マウス）又は配列番号８（ヒト）に示すＤＮＡの配列に対応する。ＡＳＣＬ１−ＭＹＴ１Ｌ−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡが発現した細胞は、ＡＳＣＬ１及びＭＹＴ１Ｌを産生し、かつ、ピューロマイシン耐性を示す。
【００４２】
センダイウイルスは、例えば、ＤＬＸ２遺伝子のｍＲＮＡ及びブラストサイジン耐性遺伝子のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ（以下、「ＤＬＸ２−Ｂｌａｓｔ  ｍＲＮＡ」という。）を発現可能なＲＮＡを有していてもよい。ＤＬＸ２遺伝子のｍＲＮＡの配列は、例えば、配列番号９（マウス）又は配列番号１０（ヒト）に示すＤＮＡの配列に対応する。ＤＬＸ２−Ｂｌａｓｔ  ｍＲＮＡが発現した細胞は、ＤＬＸ２を産生し、かつ、ブラストサイジン耐性を示す。
【００４３】
センダイウイルスは、細胞培養液に懸濁されることにより幹細胞に導入される。センダイウイルスは、細胞表面抗原を認識し、幹細胞を感染する。
【００４４】
センダイウイルスの感染の際の幹細胞の密度は、例えば、１２ウェルプレートのウェルにおいて、０．２×１０5個／ウェルから１．０×１０6個／ウェル、０．５×１０5個／ウェルから８．０×１０5個／ウェル、あるいは１．０×１０5個／ウェルから４×１０5個／ウェルである。
【００４５】
用いられるセンダイウイルスの力価は、例えば、１×１０12ＣＩＵ／ｍＬから１×１０5ＣＩＵ／ｍＬ、１×１０10ＣＩＵ／ｍＬから１×１０6ＣＩＵ／ｍＬ、あるいは、１×１０9ＣＩＵ／ｍＬから１×１０7ＣＩＵ／ｍＬである。センダイウイルスの感染多重度（ＭＯＩ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）は、例えば、１回あたり０．１から１００．０、１．０から５０．０、あるいは１．０から２０．０である。
【００４６】
センダイウイルスの感染の際に用いられる培地は、例えばｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２、（登録商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、及びＳｔｅｍ  Ｆｉｔ（株式会社リプロセル）等の幹細胞培地である。センダイウイルスの感染の後、培地を神経系細胞への誘導に適した培地（以下、「神経誘導培地」ともいう。）に交換してもよい。神経誘導培地としては、例えば、ＮＤｉｆｆ  ２２７（登録商標、ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ．）、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）、Ｈｕｍａｎ  ＥＳ／ｉＰＳ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）、及びＮ３培地等が挙げられる。Ｎ３培地は、例えば、５００ｍＬのＤＭＥＭＦ１２に、１０ｍＬのＢ２７と、５ｍＬのＮ２サプルメント（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）と、濃度が６．２５ｍｇ／ｍＬの１．６ｍＬのインスリンを加えることにより調製される。
【００４７】
センダイウイルスの感染の際、及びその前後に用いられる培地は、Ｂ１８Ｒタンパク質を含んでいてもよい。Ｂ１８Ｒタンパク質は、細胞の先天性抗ウイルス反応を緩和する。Ｂ１８Ｒタンパク質は、ウイルス感染に伴う免疫反応に伴う細胞死を抑制するために使用されることがある。ただし、実施の形態に係る方法は、短期間で幹細胞から神経系細胞を作製可能であるため、培地はＢ１８Ｒタンパク質を含まなくともよく、あるいは、Ｂ１８Ｒタンパク質を０．０１％から１％のような薄い濃度で含有してもよい。
【００４８】
センダイウイルスの感染から２５日以内、２０日以内、１０日以内、９日以内、８日以内、７日以内、６日以内、５日以内あるいは４日以内に幹細胞が神経系細胞に誘導される。幹細胞が神経系細胞に誘導されたか否かは、例えば、ＭＡＰ２、ＴＵＪ１(β−ＩＩＩＴｕｂｕｌｉｎ)、ＢＲＮ２、ＨＯＭＥＲ１、ＮＧＮ２等のＮＧＮ、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ、ＭＵＮＣ１３−１、ＳＡＴＢ２、ｖＧＬＵＴ、ｃｈＡＴ、ＨＢ９、ＬＨＸ３、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、ＴＨ、ＡＳＣＬ１(ＭＡＳＨ１)等のＡＳＣＬ、ｖＧＡＴ、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＣＤ１３３、Ｎｅｓｔｉｎ、ＨＢ９、ＩＳＬ１、Ｏ４、ＰＬＰ１、ＭＯＧ、及びＭＢＰから選択される少なくとも一つが陽性であるか否かによって確認される。
【００４９】
ＮＧＮ２は、神経細胞生成に必要なスイッチタンパク質であり、興奮性神経細胞のマーカーである。ＴＵＪ１(β−ＩＩＩＴｕｂｕｌｉｎ)、ＭＡＰ２、ＢＲＮ２、ＡＳＣＬ１(ＭＡＳＨ１)及びＰＳＡ−ＮＣＡＭは、神経細胞のマーカーである。ＨＯＭＥＲ１及びＭＵＮＣ１３−１は、シナプスを作る成熟した神経細胞のマーカーである。ＳＡＴＢ２は、大脳皮質神経細胞のマーカーである。ｖＧＬＵＴは、グルタミン酸作動性神経細胞のような興奮性神経細胞のマーカーである。ｃｈＡＴは、コリン性神経細胞等の運動神経細胞のマーカーである。ＨＢ９は、運動神経細胞のマーカーである。ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７は、ＧＡＢＡ作動性神経細胞のような抑制性神経細胞のマーカーである。ＴＨは、ドーパミン産生神経細胞のマーカーである。ｖＧＡＴは、抑制性神経細胞のマーカーである。ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＣＤ１３３、及びＮｅｓｔｉｎは、神経幹細胞のマーカーである。ＬＨＸ３、ＨＢ９及びＩＳＬ１は運動神経細胞のマーカーである。Ｏ４、ＰＬＰ１、ＭＯＧ、及びＭＢＰは、オリゴデンドロサイト前駆体のマーカーである。また、アストロサイト前駆体及びアストロサイトのマーカーとして、ＧＦＡＰ及びＣＤ４４が利用可能である。
【００５０】
以上説明した本発明の実施の形態に係る方法によれば、幹細胞に誘導因子を合成するｍＲＮＡを発現させることで、幹細胞の遺伝子に傷をつけることなく、インテグレーションフリーで、神経系細胞を効率よく作製することが可能である。
【００５１】
ホルモンや化学物質のみを利用して幹細胞から神経系細胞を作製する方法では、神経系細胞が作製されるまで非常に長い時間が必要である。これに対し、本発明の実施の形態に係る方法によれば、短い時間で神経系細胞を作製することが可能である。
【００５２】
また、ホルモンや化学物質のみを利用して幹細胞から神経系細胞を作製する方法においては、幹細胞のうちの一部のみが目的の神経系細胞になる。これに対し、本発明の実施の形態に係る方法によれば、センダイウイルスの感染が成立した細胞のほとんどが目的の神経系細胞になり得る。
【００５３】
さらに、ホルモンや化学物質のみを利用して幹細胞から神経系細胞を作製する方法においては、同じプロトコールに従っても、目的の神経系細胞になるクローンと、ならないクローンがあり、クローン間にばらつきが生じる。これに対し、本発明の実施の形態に係る方法によれば、複数のクローンで高い誘導効率を得ることが可能である。
【００５４】
また、未分化な細胞集団からサイトカイン等を用いて誘導を行って移植用細胞を作製する場合、移植用細胞の中に誘導されなかった細胞が残存する可能性がある。この残存した誘導されなかった細胞は移植位置で独自に細胞分裂、増殖をし、テラトーマ等を形成する危険性がある。これに対し、本発明の実施の形態に係る方法によれば、薬剤耐性遺伝子のｍＲＮＡも同時に発現させることができるため、センダイウイルスが導入された細胞の薬剤選択が可能である。そのため誘導されなかった細胞の混入やテラトーマ形成などの危険性を回避することが可能であり、移植医療に適している。
【００５５】
さらに、本発明の実施の形態に係る方法によれば、センダイウイルスを用いており、ゲノムに遺伝子を挿入するウイルスを利用していない。そのため、インテグレーションフリーであり、幹細胞の遺伝子に傷がつかず、作製される神経系細胞に癌化のリスクがないため、臨床への利用が可能である。
【００５６】
またさらに、例えば血液の細胞からｉＰＳ細胞を完全閉鎖系のクリーンな環境下で作製し、引き続き、本発明の実施の形態に係る方法によって、ｉＰＳ細胞から神経系細胞を完全閉鎖系のクリーンな環境下で作製すれば、より清潔で安全な神経系細胞を作製することが可能である。
【００５７】
加えて、本発明の実施の形態に係る方法によれば、短期間で神経系細胞を作製することが可能であるため、Ｂ１８Ｒ等を使用しなくてもよく、また、使用する場合も、非常に薄い濃度にすることが可能である。
【００５８】
（実施例１）
株式会社ＩＤファーマにて、ＮＧＮ２−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスを用意した。用意したセンダイウイルスの力価は、１×１０9ＣＩＵ／ｍＬであった。
【００５９】
可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされた１２ウェルディッシュを用意し、各ウェルに１０ｎｍｏｌ／ｍＬの濃度でＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）を含むフィーダーフリー培地（ｍＴｅＳＲ（登録商標）１、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を入れた。ＲＯＣＫ阻害剤は、細胞死を抑制する。
【００６０】
ｉＰＳ細胞を組織・培養細胞の剥離／分離／分散溶液（Ａｃｃｕｔａｓｅ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分散させ、１２ウェルディッシュにまいた。センダイウイルスに感染されるｉＰＳ細胞は、１ウェルあたり、２×１０5個の密度でまかれた。センダイウイルスに感染されないコントロールｉＰＳ細胞も、１ウェルあたり、２．０×１０5個の密度でまかれた。その後、ｉＰＳ細胞を、フィーダーフリー培地中で、５％二酸化炭素濃度及び２０％酸素濃度の気体条件下で、２４時間培養した。
【００６１】
ＭＯＩが２０になるよう、ＮＧＮ２−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させた。センダイウイルス感染後２日目に、ウェル内の培地を、２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを含む神経誘導培地（Ｎ３培地）に置換し、未感染の細胞を死滅させた。Ｎ３培地は、５００ｍＬのＤＭＥＭＦ１２に、１０ｍＬのＢ２７と、５ｍＬのＮ２と、濃度が６．２５ｍｇ／ｍＬの１．６ｍＬのインスリンを加えて調製した。
【００６２】
センダイウイルス感染後２日目、３日目、５日目、及び７日目の細胞の顕微鏡写真を図１（ａ）に示す。センダイウイルス感染後２４日目の細胞の顕微鏡写真を図１（ｂ）に示す。図１に示すように、センダイウイルス感染後、細胞が神経系細胞に誘導されていることが、形態的に確認された。
【００６３】
センダイウイルス感染後２８日目、プレートから培地を除き、ＰＢＳで細胞を洗った。次に、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）をプレートに入れ、１５分４℃で反応させ、細胞を固定した。さらに、ＰＢＳで細胞を２回洗浄後、５％ＣＣＳ及び０．１％トライトンを含むＰＢＳ培地で一次抗体を希釈し、プレートに添加した。一次抗体としては、神経細胞のマーカーであるＢＲＮ２に対するヤギモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用した。
【００６４】
室温で一時間反応後、プレートにＰＢＳを添加し、プレートによくなじませた後、ＰＢＳを廃棄した。再度、ＰＢＳを添加、廃棄し、蛍光標識されたゴリラ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、登録商標、５５５、ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含む溶液をプレートに加えて、室温で３０分間反応させた。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図２に示すように、誘導された神経系細胞は、ＢＲＮ２を発現していることが確認された。
【００６５】
（実施例２）
実施例１と同様にＮＧＮ２−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体としてシナプスを作る成熟した神経細胞のマーカーであるＨＯＭＥＲ１に対するウサギモノクローナル抗体（ＳＹＮＡＰＴＩＣ  ＳＹＳＴＥＭＳ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図３に示すように、誘導された神経系細胞は、ＨＯＭＥＲ１を発現していることが確認された。
【００６６】
（実施例３）
実施例１と同様にＮＧＮ２−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２に対するマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図４に示すように、誘導された神経系細胞は、ＭＡＰ２を発現していることが確認された。
【００６７】
（実施例４）
実施例１と同様にＮＧＮ２−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体としてシナプスを作る成熟した神経細胞のマーカーであるＭＵＮＣ１３−１に対するラビットモノクローナル抗体（ＳＹＮＡＰＴＩＣ  ＳＹＳＴＥＭＳ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図５に示すように、誘導された神経系細胞は、ＭＵＮＣ１３−１を発現していることが確認された。
【００６８】
（実施例５）
実施例１と同様にＮＧＮ２−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として大脳神経細胞のマーカーであるＳＡＴＢ２に対するマウスモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図６に示すように、誘導された神経系細胞は、ＳＡＴＢ２を発現していることが確認された。
【００６９】
（実施例６）
実施例１と同様にＮＧＮ２−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として神経細胞のマーカーであるＴＵＪ１に対するマウスモノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図７に示すように、誘導された神経系細胞は、ＴＵＪ１を発現していることが確認された。
【００７０】
（実施例７）
実施例１と同様にＮＧＮ２−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体としてグルタミン酸作動性神経細胞のような興奮性神経細胞のマーカーであるｖＧＬＵＴに対するウサギモノクローナル抗体（ＳＹＮＡＰＴＩＣ  ＳＹＳＴＥＭＳ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図８に示すように、誘導された神経系細胞は、ｖＧＬＵＴを発現していることが確認された。
【００７１】
（実施例８）
実施例１と同様にＮＧＮ２−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として運動神経細胞のマーカーであるｃｈＡＴに対するマウスモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図９に示すように、誘導された神経系細胞は、ｃｈＡＴを発現していることが確認された。
【００７２】
（実施例９）
実施例１と同様にＮＧＮ２−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として運動神経細胞のマーカーであるＨＢ９に対するマウスモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１０に示すように、誘導された神経系細胞は、ＨＢ９を発現していることが確認された。
【００７３】
（実施例１０）
実施例１と同様にＮＧＮ２−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体としてドーパミン産生神経細胞のマーカーであるＴＨに対するヒツジモノクローナル抗体（Ｐｅｌ  Ｆｒｅｅｚ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１１に示すように、誘導された神経系細胞は、ＴＨを発現していることが確認された。
【００７４】
（実施例１１）
ＡＳＣＬ１−ＭＹＴ１Ｌ−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡと、ＤＬＸ２−Ｂｌａｓｔ  ｍＲＮＡと、を発現させることができるセンダイウイルスを用いた以外は、実施例１と同様にセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させた。センダイウイルス感染後２日目、５日目、１１日目、及び２１日目の細胞の顕微鏡写真を図１２（ａ）に示す。センダイウイルス感染後２４日目の細胞の顕微鏡写真を図１２（ｂ）に示す。図１２（ａ）及び図１２（ｂ）に示すように、センダイウイルス感染後、細胞が神経系細胞に誘導されていることが、形態的に確認された。
【００７５】
センダイウイルス感染後２８日目、一次抗体として一般的な神経細胞のマーカーであるＴＵＪ１に対するマウスモノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１２（ｃ）に示すように、誘導された神経系細胞は、ＴＵＪ１を発現していることが確認された。
【００７６】
（実施例１２）
実施例１１と同様にＡＳＣＬ１−ＭＹＴ１Ｌ−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡと、ＤＬＸ２−Ｂｌａｓｔ  ｍＲＮＡと、を発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として神経細胞のマーカーであるＢＲＮ２に対するヤギモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１３に示すように、誘導された神経系細胞は、ＢＲＮ２を発現していることが確認された。
【００７７】
（実施例１３）
実施例１１と同様にＡＳＣＬ１−ＭＹＴ１Ｌ−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡと、ＤＬＸ２−Ｂｌａｓｔ  ｍＲＮＡと、を発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として抑制性（ＧＡＢＡ作動性）神経細胞のマーカーであるＧＡＤ６５／６７に対するマウスモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１４に示すように、誘導された神経系細胞は、ＧＡＤ６５／６７を発現していることが確認された。
【００７８】
（実施例１４）
実施例１１と同様にＡＳＣＬ１−ＭＹＴ１Ｌ−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡと、ＤＬＸ２−Ｂｌａｓｔ  ｍＲＮＡと、を発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２に対するマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１５に示すように、誘導された神経系細胞は、ＭＡＰ２を発現していることが確認された。
【００７９】
（実施例１５）
実施例１１と同様にＡＳＣＬ１−ＭＹＴ１Ｌ−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡと、ＤＬＸ２−Ｂｌａｓｔ  ｍＲＮＡと、を発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として抑制性神経細胞のマーカーであるｖＧＡＴに対するラビットモノクローナル抗体（ＳＹＮＡＰＴＩＣ  ＳＹＳＴＥＭＳ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１６に示すように、誘導された神経系細胞は、ｖＧＡＴを発現していることが確認された。
【００８０】
（実施例１６）
ＡＳＣＬ１−ＭＹＴ１Ｌ−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスを用いた以外は、実施例１と同様にセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させた。センダイウイルス感染後２１日目、一次抗体として一般的な神経細胞のマーカーであるＴＵＪ１に対するマウスモノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１７に示すように、誘導された神経系細胞は、ＴＵＪ１を発現していることが確認された。
【００８１】
（実施例１７）
実施例２２と同様に配ＡＳＣＬ１−ＭＹＴ１Ｌ−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２に対するマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１８に示すように、誘導された神経系細胞は、ＭＡＰ２を発現していることが確認された。
【００８２】
（実施例１８）
実施例２２と同様にＡＳＣＬ１−ＭＹＴ１Ｌ−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として神経細胞のマーカーであるＢＲＮ２に対するヤギモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１９に示すように、誘導された神経系細胞は、ＢＲＮ２を発現していることが確認された。
【００８３】
（実施例１９）
実施例２２と同様にＡＳＣＬ１−ＭＹＴ１Ｌ−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として抑制性神経細胞のマーカーであるｖＧＡＴに対するラビットモノクローナル抗体（ＳＹＮＡＰＴＩＣ  ＳＹＳＴＥＭＳ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図２０に示すように、誘導された神経系細胞は、ｖＧＡＴを発現していることが確認された。
【００８４】
（実施例２０）
実施例２２と同様にＡＳＣＬ１−ＭＹＴ１Ｌ−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として抑制性神経細胞(ＧＡＢＡ作動性神経細胞)のマーカーであるＧＡＤ６５／６７に対するマウスモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図２１に示すように、誘導された神経系細胞は、ＧＡＤ６５／６７を発現していることが確認された。
【００８５】
（実施例２１）
実施例２２と同様にＡＳＣＬ１−ＭＹＴ１Ｌ−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体としてドーパミン産生神経細胞のマーカーであるＴＨに対するヒツジモノクローナル抗体（Ｐｅｌ  Ｆｒｅｅｚ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図２２に示すように、誘導された神経系細胞は、ＴＨを発現していることが確認された。
【００８６】
（実施例２２）
実施例２２と同様にＡＳＣＬ１−ＭＹＴ１Ｌ−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体としてコリン性神経細胞のマーカーであるｃｈＡＴに対するヤギモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図２３に示すように、誘導された神経系細胞は、ｃｈＡＴを発現していることが確認された。
【００８７】
（実施例２３）
実施例２２と同様にＡＳＣＬ１−ＭＹＴ１Ｌ−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として興奮性神経(グルタミン酸作動性神経細胞)のマーカーであるｖＧＬＵＴに対するウサギモノクローナル抗体（ＳＹＮＡＰＴＩＣ  ＳＹＳＴＥＭＳ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図２４に示すように、誘導された神経系細胞は、ｖＧＬＵＴを発現していることが確認された。
【００８８】
（実施例２４）
実施例２２と同様にＡＳＣＬ１−ＭＹＴ１Ｌ−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として大脳神経細胞のマーカーであるＳＡＴＢ２に対するマウスモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図２５に示すように、誘導された神経系細胞は、ＳＡＴＢ２を発現していることが確認された。
【００８９】
（実施例２５）
実施例１で用意したＮＧＮ２−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスに感染させなかったコントロール細胞をフローサイトメトリーで分析したところ、図２６（ａ）に示すように、神経細胞のマーカーであるＰＳＡ−ＮＣＡＭは陰性であった。実施例１で用意したＮＧＮ２−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスに感染させた細胞を感染後７日目にフローサイトメトリーで分析したところ、図２６（ｂ）に示すように、神経細胞のマーカーであるＰＳＡ−ＮＣＡＭは陽性であった。なお、感染後４日目にフローサイトメトリーで分析しても、神経細胞のマーカーであるＰＳＡ−ＮＣＡＭは陽性であった。
【００９０】
実施例１１で用意したＡＳＣＬ１−ＭＹＴ１Ｌ−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡと、ＤＬＸ２−Ｂｌａｓｔ  ｍＲＮＡと、を発現させることができるセンダイウイルスに感染させた細胞を感染後７日目にフローサイトメトリーで分析したところ、図２６（ｃ）に示すように、神経細胞のマーカーであるＰＳＡ−ＮＣＡＭは陽性であった。なお、感染後４日目にフローサイトメトリーで分析しても、神経細胞のマーカーであるＰＳＡ−ＮＣＡＭは陽性であった。実施例２２で用意したＡＳＣＬ１−ＭＹＴ１Ｌ−Ｐｕｒｏ  ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスに感染させた細胞を感染後７日目にフローサイトメトリーで分析したところ、図２６（ｄ）に示すように、神経細胞のマーカーであるＰＳＡ−ＮＣＡＭは陽性であった。なお、感染後４日目にフローサイトメトリーで分析しても、神経細胞のマーカーであるＰＳＡ−ＮＣＡＭは陽性であった。
【図１】
2020188814.tif 000003
【図２】
2020188814.tif 000004
【図３】
2020188814.tif 000005
【図４】
2020188814.tif 000006
【図５】
2020188814.tif 000007
【図６】
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【図７】
2020188814.tif 000009
【図８】
2020188814.tif 000010
【図９】
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【図１０】
2020188814.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
2020188814.tif 000014
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2020188814.tif 000018
【図１７】
2020188814.tif 000019
【図１８】
2020188814.tif 000020
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
2020188814000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月28日(2020.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を用意することと、
前記幹細胞にセンダイウイルスを感染により導入し、前記幹細胞内で前記センダイウイルスにａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ（ＡＳＣＬ）及びｍｙｅｌｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ（ＭＹＴ）を含む誘導因子を合成するｍＲＮＡを発現させることで、前記幹細胞をドーパミン産生神経細胞に誘導することと、
を含む、ドーパミン産生神経細胞の作製方法。
【請求項２】
前記幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１に記載のドーパミン産生神経細胞の作製方法。
【請求項３】
前記幹細胞が胚性幹細胞である、請求項１に記載のドーパミン産生神経細胞の作製方法。
【請求項４】
前記ドーパミン産生神経細胞が、ＴＨ陽性である、請求項１から３のいずれか１項に記載のドーパミン産生神経細胞の作製方法。
【請求項５】
前記センダイウイルスが、前記幹細胞内で、薬剤耐性遺伝子のｍＲＮＡを発現させる、請求項１から４のいずれか１項に記載のドーパミン産生神経細胞の作製方法。
【請求項６】
前記幹細胞に前記センダイウイルスを感染した後、薬剤耐性を示す細胞を選択することを含む、請求項５に記載のドーパミン産生神経細胞の作製方法。