(57)【要約】      （修正有）【課題】肝細胞構造体、特に、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を模倣する肝細胞構造体の提供。【解決手段】風船様肝細胞を含む肝細胞と非肝細胞である接着細胞とを含む凝集体を含む、肝細胞構造体、ならびに、（ｉ）肝細胞と非肝細胞である接着細胞とを含む細胞群を凝集させて、凝集体を形成する工程および（ｉｉ）前記凝集体を培養する工程を含む、肝細胞構造体の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞と、非肝細胞である接着細胞とを含む凝集体を含み、
前記肝細胞が、風船様肝細胞を含むことを特徴とする、肝細胞構造体。
【請求項２】
前記接着細胞が、線維芽細胞または間葉系幹細胞である、請求項１に記載の肝細胞構造体。
【請求項３】
前記接着細胞が、霊長類線維芽細胞である、請求項１または２に記載の肝細胞構造体。
【請求項４】
前記凝集体が、細胞シートである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の肝細胞構造体。
【請求項５】
正常肝細胞と比較して、細胞あたりのソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）タンパク質の発現が高い、請求項１〜４のいずれか１項に記載の肝細胞構造体。
【請求項６】
Ｍａｌｌｏｒｙ−Ｄｅｎｋ体を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の肝細胞構造体。
【請求項７】
前記肝細胞が、初代肝細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の肝細胞構造体。
【請求項８】
前記肝細胞構造体が、α−ＳＭＡを発現している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の肝細胞構造体。
【請求項９】
前記肝細胞：前記接着細胞の比が、１０：１〜１：１０である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の肝細胞構造体。
【請求項１０】
肝細胞構造体の製造方法であって、
（ｉ）肝細胞と非肝細胞である接着細胞とを含む細胞群を凝集させて、凝集体を形成する工程；および、
（ｉｉ）前記凝集体を、培養する工程、
を含む、方法。
【請求項１１】
前記接着細胞が、線維芽細胞または間葉系幹細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記接着細胞が、霊長類線維芽細胞である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記肝細胞が、初代肝細胞である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程（ｉ）が、
（ｉ−１）第１培養基材の上に肝細胞を播種して、培養する工程；
（ｉ−２）前記肝細胞が播種された前記第１培養基材の上に、前記接着細胞を播種し、培養する工程；および
（ｉ−３）前記第１培養基材から前記肝細胞と前記接着細胞とを含む前記細胞群を剥離して、前記凝集体を形成する工程、
を含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程（ｉｉ）が、前記凝集体を第２培養基材の上に接着させて、培養する工程である、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程（ｉ）において、前記肝細胞：前記接着細胞の比が、１０：１〜１：１０である、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の方法によって作製される肝細胞構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞構造体に関する。また、本発明は肝細胞構造体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、糖新生、グリコーゲン貯蔵、脂質代謝、血漿タンパク質の産生や、ビリルビン代謝、ホルモン代謝、ビタミン代謝、薬物代謝及びアルコール代謝等といった代謝機能を担う重要な臓器として知られている。
【０００３】
日本において、生活習慣の欧米化に伴い、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を罹患する患者数が増加している。ＮＡＳＨは肝硬変や肝がんに進行する重大な疾患であるが、現在のところ、有効性のある特異的な治療法は見出されていない。そのため、ＮＡＳＨを抜本的に治療する方法や薬剤を開発するための研究が世界中で実施されている。
【０００４】
ＮＡＳＨの新規治療法を開発するために、薬効評価に有用な「培養皿上でＮＡＳＨを模倣する系」が必要であり、その開発も行われている。ＮＡＳＨ生検細胞で見られる特徴の一部を有する肝細胞を作製するいくつかの技術が知られており、例えば、非特許文献１には、マイクロパターン技術を用いた共培養システムが開示されている。また、非特許文献２には、三次元灌流細胞培養システムが開示されている。また、非特許文献３には、生理的血流状態を模倣したヒト肝システムが開示されている。
【０００５】
しかしながら、これらの技術によって培養されたヒト肝細胞は、ＮＡＳＨ等の肝疾患患者から生検によって得られた肝細胞の特徴（例えば、脂肪滴の沈着、炎症性細胞の浸潤、肝細胞の風船様変性、Ｍａｌｌｏｒｙ−Ｄｅｎｋ体の出現、肝細胞周辺の線維化等）の「一部」しか再現できず、十分なＮＡＳＨモデルとは言いがたい。また、これらの技術を実施するためには、特殊な加工技術、器具または装置等が必要であり、システムも複雑となり、コストが増大するという課題があった。また、作業手順も複雑であり、再現性にも課題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｄａｖｉｄｓｏｎ  Ｍ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｂｉｏｌ．（Ｃａｍｂ）．２０１７  Ａｕｇ．１４；９（８）：６６２−６７７
【非特許文献２】Ｋｏｓｔｒｚｅｗｓｋｉ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｐｅｒｆｕｓｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１７  Ｊａｎ  １４；２３（２）：２０４−２１５
【非特許文献３】Ｆｅａｖｅｒ  Ｒ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ．ＪＣＩ  Ｉｎｓｉｇｈｔ．２０１６  Ｄｅｃ  ８；１（２０）：ｅ９０９５４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、肝疾患モデル、特に、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を模倣する肝細胞構造体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、驚くべきことに、肝細胞と霊長類線維芽細胞とを含むシート状の細胞群を剥離して収縮した細胞シートを得て、当該収縮した細胞シートを培養することによって、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を模倣する肝細胞構造体が得られることを見出した。すなわち、本発明は以下の内容が含まれる。
【０００９】
［１］  肝細胞と、非肝細胞である接着細胞とを含む凝集体を含み、
前記肝細胞が、風船様肝細胞を含むことを特徴とする、肝細胞構造体。
［２］  前記接着細胞が、線維芽細胞または間葉系幹細胞である、［１］に記載の肝細胞構造体。
［３］  前記接着細胞が、霊長類線維芽細胞である、［１］〜［２］のいずれか１項に記載の肝細胞構造体。
［４］  前記接着細胞が、真皮由来の霊長類線維芽細胞である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の肝細胞構造体。
［５］  前記凝集体が、細胞シートである、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の肝細胞構造体。
［６］  正常肝細胞と比較して、細胞あたりのソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）タンパク質の発現が高い、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の肝細胞構造体。
［７］  Ｍａｌｌｏｒｙ−Ｄｅｎｋ体を含む、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の肝細胞構造体。
［８］  前記肝細胞が、初代肝細胞である、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の肝細胞構造体。
［９］  前記肝細胞構造体が、α−ＳＭＡを発現している、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の肝細胞構造体。
［１０］  前記肝細胞：前記接着細胞の比が、１０：１〜１：１０である、［１］〜［９］のいずれか１項に記載の肝細胞構造体。
［１１］  前記肝細胞：前記接着細胞の比が、１：１〜１：１０である、［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の肝細胞構造体。
【００１０】
［１２］  肝細胞構造体の製造方法であって、
（ｉ）肝細胞と非肝細胞である接着細胞とを含む細胞群を凝集させて、凝集体を形成する工程；および、
（ｉｉ）前記凝集体を、培養する工程、
を含む、方法。
［１３］  前記接着細胞が、線維芽細胞または間葉系幹細胞ある、［１２］に記載の方法。
［１４］  前記接着細胞が、霊長類線維芽細胞である、［１２］〜［１３］のいずれか１項に記載の方法。
［１５］  前記肝細胞が、初代肝細胞である、［１２］〜［１４］のいずれか１項に記載の方法。
［１６］  前記工程（ｉ）が、
（ｉ−１）第１培養基材の上に肝細胞を播種して、培養する工程；
（ｉ−２）前記肝細胞が播種された前記第１培養基材の上に、前記接着細胞を播種し、培養する工程；および
（ｉ−３）前記第１培養基材から前記肝細胞と前記接着細胞とを含む前記細胞群を剥離して、前記凝集体を形成する工程、
を含む、［１２］〜［１５］のいずれか１項に記載の方法。
［１７］  前記工程（ｉｉ）が、前記凝集体を第２培養基材の上に接着させて、培養する工程である、［１２］〜［１６］のいずれか１項に記載の方法。
［１８］  前記工程（ｉ）において、前記肝細胞：前記接着細胞の比が、１０：１〜１：１０である、［１２］〜［１７］のいずれか１項に記載の方法。
［１９］  前記肝細胞：前記接着細胞の比が、１：１〜１：１０である、［１２］〜［１８］のいずれか１項に記載の方法。
［２０］  前記方法で用いられる培地が、１ｍＭ〜１００ｍＭのグルコースを含有する培地である、［１２］〜［１９］のいずれか１項に記載の方法。
［２１］  前記方法で用いられる培地が、０．１μＭ〜１０μＭのインスリンを含有する培地である、［１２］〜［２０］のいずれか１項に記載の方法。
［２２］  前記第１培養基材が、刺激応答性培養基材である、［１６］に記載の方法。
［２３］  前記第１培養基材が、温度応答性培養基材である、［１６］に記載の方法。
［２４］  前記第１培養基材が、細胞接着性ハイドロゲルでコートされている、［１６］及び［２２］〜［２３］のいずれか１項に記載の方法。
【００１１】
［２５］  ［１２］〜［２４］のいずれか１項に記載の方法によって作製される肝細胞構造体。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来のように、特殊な加工技術、器具または装置等を必要とせず、肝疾患、特に、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の肝細胞の特徴を模倣する肝細胞構造体を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、肝細胞構造体（初代ヒト肝細胞／線維芽細胞共培養細胞シート）を作製する方法の概略を示す。
【図２】図２はコンフルエントの単層の細胞を温度応答性培養皿の表面から剥離して得られた収縮した細胞シートの形態を示す。（ａ）初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）／正常ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ）細胞シートの剥離と収縮についてのタイムラプス像。（ｂ）ＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シート（左）とＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シート（右）の写真。（ｃ）細胞シートの面積を示すグラフ。全データは、少なくとも３つの値についての平均±ＳＤとして表されている。＊＊ｐ＜０．０１。
【図３】図３はＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートとＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートの形態を示す図である。（ａ）１日及び４日培養後のＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートとＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートの位相差顕微鏡写真。（ｂ）Ｄａｙ１，Ｄａｙ４及びＤａｙ１１におけるＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートとＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートのヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色像。Ｄａｙ４及びＤａｙ１１におけるＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートにおいて、細胞質が青白く染色された顕著に肥大化した肝細胞（丸で囲まれた細胞）が観察された。ＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートの肝細胞は正常であった。バーは１００μｍを示す。
【図４】図４は、ＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートにおける肥大化した肝細胞を定量した結果を示す。（ａ）Ｅ−カドヘリン／ＤＡＰＩ染色した像に対して免疫蛍光染色した結果、肝細胞の境界が明瞭に示された。緑：Ｅ−カドヘリン、青：ＤＡＰＩ（核）。バーは１００μｍを示す。（ｂ）細胞シート中のＰＨＨのそれぞれの断面積の測定を、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いて、３つの独立した実験にて実施した。各実験において２５個以上の細胞を測定した。＊＊ｐ＜０．０１。
【図５】図５は、ＰＨＨ／ＮＨＤＦ共培養細胞シートの肥大化した肝細胞が風船様肝細胞（Ｄａｙ１１）であることを示している。（ａ）ＣＫ８／１８について免疫組織化学（ＩＨＣ）染色したＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートの切片において、肥大化肝細胞では褐色の細胞質ケラチン染色が消失していた。一方、ＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートのＩＨＣ染色切片において、肝細胞は、細胞質ケラチンが一様に褐色に染色されており、正常であった。バーは１００μｍを示す。（ｂ）ＣＫ８／１８の免疫蛍光染色により、不規則な形態のＣＫ８／１８陽性細胞質含有物が、肥大化肝細胞の核の近傍に位置していることが明らかとなった。それは、Ｍａｌｌｏｒｙ−Ｄｅｎｋ体（矢頭）の存在を裏付けている。バーは２０μｍを示している。（ｃ）ナイルレッドで染色した後のＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートでは、大量の脂肪滴の蓄積が検出された。一方で、ＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートでは、限定した量の脂質しか観察されなかった。バーは１００μｍを示している。
【図６】図６は、ＰＨＨ／ＮＨＤＦ共培養細胞シートのＳＨＨ分泌及び筋線維芽細胞活性化の増加を示している。（ａ）ＳＨＨリガンドの測定は、２つのロットのＰＨＨ（Ｈｕ８２００＿Ａ  ×２  ＋  Ｈｕ１６５２×１）を用いて、３つの独立した実験で実施した。各実験において、３以上のサンプルを測定した。Ｄａｙ４におけるＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートと比較して、ＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートのＳＨＨ産生は、有意に増加していた。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。（ｂ）α−ＳＭＡ（赤）を免疫蛍光染色した切片から、α−ＳＭＡ陽性ＮＨＤＦが風船様肝細胞の周りに存在していることが明らかとなった。それは筋線維芽細胞が活性化していることを示している。バーは１００μｍを示している。
【図７】図７は、ＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートとＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートの肝臓特異的機能を示している。アルブミン（ａ）及び尿素（ｂ）の測定は、１つのロットのＰＨＨ（Ｈｕ８２００＿Ａ）を用いた３つの独立した実験によって実施した。各実験において、３以上の反復試験サンプルを測定した。（ｃ）ＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４を含むＣＹＰ酵素活性は、ＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートよりも、ＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートにおいて有意に低かった。ＣＹＰ活性の測定は、２つのロットのＰＨＨ（Ｈｕ８２００＿Ａ  ×２  ＋  Ｈｕ１６５２×１）を用いて、３つの独立した実験で実施した。それぞれの実験において、３以上のサンプルを測定した。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図８】図８は、ＰＨＨとＮＨＤＦの共培養比率が、肝細胞のダメージ及び変性の程度に影響を及ぼすことを示している。（ａ）ＳＨＨ産生は、ＰＨＨ：ＮＨＤＦ＝４：１の共培養と比較して、ＰＨＨ：ＮＨＤＦ＝１：４では３．５倍、ＰＨＨ：ＮＨＤＦ＝１：２では１．６倍上昇した。全てのデータは、３回以上の値の平均±ＳＤで表している。＊＊ｐ＜０．０１。（ｂ）肝細胞のサイズは、ＰＨＨ：ＮＨＤＦ＝１：２及び１：４よりも、４：１の共培養の方が小さかった。バーは１００μｍを示している。
【図９】図９はＰＨＨ／脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）シートと、ＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートの形態を示す図である。（ａ）ＰＨＨ／脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）シート（剥離後２８日目）の位相差顕微鏡写真。（ｂ）（ａ）の拡大図。（ｃ）ＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シート（剥離後２８日目）の位相差顕微鏡写真。（ｄ）（ｃ）の拡大図。いずれも、脂肪滴の蓄積が確認された。
【図１０】図１０は、ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ処理による肝細胞の風船様変化に及ぼす影響を調べた結果を示す図である。（ａ）ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ（６μｇ／ｍＬ）で２．５時間処理したＮＨＤＦ、または（ｂ）無処理のＮＨＤＦを用いて作製したマウス肝細胞／ＮＨＤＦ細胞シート（Ｄａｙ８）のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色像。ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ処理によって、肝細胞の風船様変化が抑制された。バーは１００μｍを示す。
【図１１】図１１は、オベチコール酸（ＯＣＡ）またはメトホルミンがマウス肝細胞の風船様変化に及ぼす影響を調べた結果を示す図である。（ａ）オベチコール酸（１０μＭ）、または（ｂ）メトホルミン（５００μＭ）をＤａｙ１で添加したマウス肝細胞／ＮＨＤＦ細胞シート（Ｄａｙ８）のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色像。オベチコール酸（ＯＣＡ）およびメトホルミンの添加によって、肝細胞の風船様変化が抑制された。バーは１００μｍを示す。
【図１２】図１２は、オベチコール酸（ＯＣＡ）またはメトホルミンがヒト肝細胞の風船様変化に及ぼす影響を調べた結果を示す図である。（ａ）オベチコール酸（１０μＭ）、または（ｂ）メトホルミン（５００μＭ）をＤａｙ１で添加したＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートの、それぞれＤａｙ１１およびＤａｙ４におけるヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色像。オベチコール酸（ＯＣＡ）、メトホルミンそれぞれの添加によって、肝細胞の風船様変化が抑制された。バーは１００μｍを示す。
【図１３】図１３は、グルコース濃度およびインスリン濃度がヒト肝細胞の風船様変化に及ぼす影響を調べた結果を示す図である。（ａ）低グルコース濃度（５．６ｍＭ）＋低インスリン濃度（１ｎＭ）、または（ｂ）高グルコース濃度（２５ｍＭ）＋高インスリン濃度（１μＭ）で培養したＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シート（Ｄａｙ４）のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色像。低グルコース濃度（５．６ｍＭ）＋低インスリン濃度（１ｎＭ）の培地で培養することにより、肝細胞の風船様変化がある程度抑制された。バーは１００μｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、発明の実施の形態を通じて本発明を説明するが、以下の実施形態は特許請求の範囲にかかる発明を限定するものではなく、また実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。なお、以下の「肝細胞構造体」、「肝細胞構造体の製造方法」及び「肝疾患を治療または予防するための因子を評価する方法」において説明されている事項は、相互に適用され得る。
【００１５】
＜＜肝細胞構造体＞＞
本発明は、肝細胞と、非肝細胞である接着細胞とを含む凝集体を含み、前記肝細胞が、風船様肝細胞を含むことを特徴とする、肝細胞構造体を提供する。また、本発明は、後述の肝細胞構造体の製造方法によって得られる肝細胞構造体も提供する。
【００１６】
本明細書において、「凝集体」とは、肝細胞と、非肝細胞である接着細胞とを含み、培養基材の上に播種された細胞群よりも、単位体積あたりの細胞密度が高い細胞群をいう。一実施形態において、本発明にかかる凝集体は、培養基材に細胞を播種し、コンフルエントまたはサブコンフルエントとなった細胞群を剥離し、当該細胞群が有する収縮作用によって収縮した細胞群（例えば、細胞シート）であり得る。また、他の実施態様において、本発明にかかる凝集体は、細胞が接着しない基材（例えば、ペトリ皿など）に細胞を播種し、前記基材の底面に向かって遠心力を作用させながら培養することによって得られる細胞凝集体であってもよい（例えば、特許第５４０７３４３号参照）。
【００１７】
一実施態様において、本発明に含まれる凝集体は、「収縮した細胞シート」であってもよい。本明細書において、「収縮した細胞シート」とは、刺激応答性培養基材の上に播種された細胞群を、刺激応答性培養基材から剥離し、細胞群が自発的に収縮することによって得られる細胞シートをいう。一実施態様において、本発明に含まれる「収縮した細胞シート」は、刺激応答性培養基材の上に播種された状態の細胞群の面積と比較して、１／４以下、より好ましくは１／５以下、さらに好ましくは１／６以下、最も好ましくは１／８以下の面積まで収縮したものがよい。細胞シートの収縮率が大きいと、細胞が密集した細胞シートが得られ、ＮＡＳＨで観察される肝細胞の特徴が顕著に再現される。
【００１８】
本明細書において、「肝細胞」とは、肝臓を構成する主要な細胞であって、タンパク質の合成と貯蔵、炭水化物の変換、コレステロール、胆汁酸、リン脂質の合成並びに物質の解毒、編成、排出に関与する細胞であり、「肝実質細胞」ともいう。
【００１９】
本発明に用いられる「肝細胞」は、肝臓又はその一部から単離される細胞であってもよく、初代肝細胞、肝前駆細胞、肝幹細胞又は不死化した肝細胞であってもよく、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞又はＭｕｓｅ細胞などの多能性幹細胞から分化誘導して得られる肝細胞であってもよいが、初代肝細胞であることが好ましい。
【００２０】
本発明に用いられる「肝細胞」は、哺乳動物由来（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモット等）、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、ヤギ、ヒツジ等）、より好ましくは、霊長類由来、特に好ましくはヒトの肝細胞である。本発明の肝細胞構造体に含まれる肝細胞の数は、細胞の状態、動物種、細胞種、共培養される接着細胞の数などによって異なるが、例えば、肝細胞構造体構築時に使用する細胞シートを作製する際の播種密度は、０．３×１０4〜１０×１０6個／ｃｍ2であってもよく、０．５×１０4〜８×１０6個／ｃｍ2であってもよく、０．７×１０4〜５×１０6個／ｃｍ2であってもよく、１．０×１０４〜１．０×１０６個／ｃｍ２であってもよく、５．０×１０４〜５．０×１０５個／ｃｍ２であってもよい。
【００２１】
本明細書において、「非肝細胞である接着細胞」とは、生存、増殖、物質産生のために適切な足場に自身を接着させる細胞であって、足場依存性細胞ともいわれる細胞であり、肝細胞以外の細胞をいう。例えば、上皮細胞、間質細胞、内皮細胞、粘膜細胞、線維芽細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞、生殖幹細胞またはこれらの株化細胞などを含むが、これらに限定されない。
【００２２】
一実施態様において、本発明で用いられる接着細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の産生量が高い細胞であることが好ましい。細胞外マトリックスとしては、例えば、コラーゲン、プロテオグリカン（例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、およびデルマタン硫酸プロテオグリカン）、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、またはフィブリリンなどが挙げられ、本発明で用いられる接着細胞は、上記いずれかの細胞外マトリックスの産生量が、例えば、３Ｔ３−Ｊ２株より高い細胞（例えば、霊長類線維芽細胞、間葉系幹細胞など）を用いることができる。細胞外マトリックスの産生量は、公知の方法（例えば、定量的ＰＣＲ法（ｑＰＣＲ）、ウエスタンブロット法、フローサイトメーター法（ＦＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡ法、免疫蛍光染色法、免疫組織化学法など）を用いることによって測定することができる。
【００２３】
また、一実施態様において、本発明で用いられる接着細胞は、足場から剥離された場合に収縮率が高い細胞であることが好ましい。本明細書において、「収縮率が高い細胞」とは、例えば、任意の培養基材（好ましくは、刺激応答性培養基材）に播種してコンフルエントまたはサブコンフルエントになるまで培養して剥離した場合、剥離前の面積と、剥離後の面積との比から算出することができる。一実施態様において、本発明で用いられる接着細胞は、例えば、３Ｔ３−Ｊ２株より収縮率が高い細胞（例えば、霊長類線維芽細胞、間葉系幹細胞など）を用いることができる。
【００２４】
本明細書において、「線維芽細胞」とは、結合組織を構成する主要な細胞であり、膠原線維（例えば、コラーゲン等）、弾性線維（エラスチン、マイクロフィブリル等）、細網繊維、基質（例えば、グルコサミノグリカン）及びフィブロネクチン等を産生することが知られている。一実施態様において、本発明の肝細胞構造体は、霊長類（ヒト及びヒト以外の霊長類）線維芽細胞を含み、好ましくはヒト線維芽細胞を含む。また、一実施態様において、本発明の肝細胞構造体に含まれる線維芽細胞は、真皮由来の線維芽細胞であることが好ましい。
【００２５】
本明細書において、「間葉系幹細胞」とは、未分化な細胞で、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、ストローマ細胞、及び／又は腱細胞等のさまざまな間葉系の細胞へ分化する能力を持ち、且つ自己複製の能力を持つ細胞をいう。間葉系幹細胞は、生体内においては、骨髄、脂肪組織、臍帯血、歯髄、滑膜、胎盤等の組織から単離される細胞であって、公知の方法を用いて単離することができる。
【００２６】
例えば、骨髄由来間葉系幹細胞は、骨髄から採取した骨髄液を、密度勾配遠心法にて血球系細胞を分離し、プラスチック培養皿に播種し、３７℃、５％ＣＯ２環境で培養することで、接着する細胞として単離することが可能である。
【００２７】
脂肪組織由来間葉系幹細胞（脂肪組織由来幹細胞ともいう）（ＡＤＳＣ）は、例えば、採取した脂肪組織を細分化し、コラゲナーゼタイプＩＩで消化し、培地を加えて遠心分離し、沈殿した細胞を基礎培地で洗浄し、セルストレーナー等のメッシュにてろ過し、プラスチック培養皿に播種し、３７℃、５％ＣＯ２環境で培養することで、接着する細胞として単離することができる。その他の組織由来の間葉系幹細胞を単離する方法については、公知の方法を用いればよく、限定されない。
【００２８】
本発明者らは、本発明の肝細胞構造体が、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の肝細胞が有する特徴（例えば脂肪滴の沈着、Ｍａｌｌｏｒｙ−Ｄｅｎｋ体の形成、風船様変性等）を示すことを見出した。このような複数のＮＡＳＨの特徴を示すインビトロで用いられる肝細胞構造体はこれまで開発されていない。そのため、本発明の肝細胞構造体は、ＮＡＳＨを抜本的に治療する方法や薬剤を開発（例えば、薬剤スクリーニング）するために有用である。また、本発明の肝細胞構造体は、肝疾患モデル動物を作製するために用いられてもよく、例えば、非ヒト哺乳動物（例えば、ヒト以外の霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモット等）、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、ヤギ、ヒツジ等）に本発明の肝細胞構造体を移植することによって肝疾患モデル動物を作製することができる。
【００２９】
本発明の肝細胞構造体に含まれる接着細胞の数は、細胞の状態、動物種、細胞種、共培養される肝細胞の数などによって異なるが、例えば、肝細胞との共培養細胞シートを作製する際の播種密度は、０．３×１０4〜１０×１０6個／ｃｍ2であってもよく、０．５×１０4〜８×１０6個／ｃｍ2であってもよく、０．７×１０4〜５×１０6個／ｃｍ2であってもよく、１．０×１０４〜１．０×１０６個／ｃｍ２であってもよく、５．０×１０４〜５．０×１０５個／ｃｍ２であってもよい。
【００３０】
一実施形態において、本発明の肝細胞構造体を作製する際に用いられる肝細胞：接着細胞の比は、例えば、１０：１〜１：１０の範囲であってもよく、好ましくは、５：１〜１：１０の範囲、より好ましくは１：１〜１：１０の範囲である。
【００３１】
本明細書において、「風船様肝細胞」とは、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患した患者の肝臓を生検した場合に見られる肝細胞の外見的特徴の一つであり、正常な肝細胞と比較して、風船のように膨らんだ肝細胞をいう。本発明の肝細胞構造体は、ＮＡＳＨで観察される風船様肝細胞を含んでいる。
【００３２】
本明細書において、「Ｍａｌｌｏｒｙ−Ｄｅｎｋ体」とは、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）や肝細胞癌患者組織に確認されるユビキチン化タンパク質、中間径フィラメントであるケラチン８および１８、ｐ６２等が不定形の構造物として蓄積した好酸性細胞質内封入体をいう。一実施態様において、本発明の肝細胞構造体に含まれる肝細胞は、ＮＡＳＨで観察されるＭａｌｌｏｒｙ−Ｄｅｎｋ体を含んでいる。Ｍａｌｌｏｒｙ−Ｄｅｎｋ体は、公知の方法によって可視化できるが、例えば、ケラチン８および１８に対する抗体を用いた染色によって可視化することができる。
【００３３】
一実施態様において、本発明の肝細胞構造体は、細胞あたりのソニックヘッジホッグタンパク質（以下、「ＳＨＨ」という。）の発現量が高いことを特徴としている。ＳＨＨは、ヘッジホッグシグナル伝達経路に関与するヘッジホッグホモログの一つとして当業者にとって周知の因子であり、例えば、これらに限定されないが、ヒトＳＨＨ遺伝子の核酸配列（ｍＲＮＡ）およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースにおいて受入番号ＮＭ＿０００１９３およびＮＭ＿００１３１０４６２、ならびにＮＰ＿０００１８４およびＮＰ＿００１２９７３９１として提供されている。すなわち、「ＳＨＨ」の配列は、用いられる細胞の生物種に応じて、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベース及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースから当業者であれば入手可能であり、それらの配列及びその変異体の配列も、本願発明のＳＨＨの範囲に含まれる。ＳＨＨは、肝臓において、肝星細胞に対するパラクライン性のプロ線維形成因子（ｐｒｏ−ｆｉｂｒｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）として作用し、それによって、筋線維芽細胞活性化を誘導し、線維化を引き起こすと考えられている。本発明の肝細胞構造体は、ＳＨＨの発現量が正常肝細胞と比較して有意に高く、これはＮＡＳＨ由来の肝細胞の特徴を再現している。ＳＨＨの発現量は、公知の方法によって測定することができ、例えば、定量的ＰＣＲ法（ｑＰＣＲ）、ウエスタンブロット法、フローサイトメーター法（ＦＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡ法、免疫蛍光染色法、免疫組織化学法など、周知の技術を用いて実施することができる。
【００３４】
一実施態様において、本発明の肝細胞構造体は、筋線維芽細胞の活性化マーカーであるα−ＳＭＡ（ＡＣＴＡ２／ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎともいう。）を発現している。例えば、これらに限定されないが、ヒトα−ＳＭＡ遺伝子の核酸配列（ｍＲＮＡ）およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースにおいて受入番号ＮＭ＿００１１４１９４５、ＮＭ＿００１６１３およびＮＭ＿００１３２０８５５、ならびにＮＰ＿００１１３５４１７、ＮＰ＿００１３０７７８４およびＮＰ＿００１６０４として提供されている。すなわち、「α−ＳＭＡ」の配列は、用いられる細胞の生物種に応じて、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベース及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースから当業者であれば入手可能であり、それらの配列及びその変異体の配列も、本願発明のα−ＳＭＡの範囲に含まれる。本発明の肝細胞構造体において、α−ＳＭＡは、特に風船様肝細胞の周辺の線維芽細胞において陽性となり、これもＮＡＳＨ由来の肝組織の特徴を再現している。α−ＳＭＡの発現は、公知の方法によって測定することができ、例えば、定量的ＰＣＲ法（ｑＰＣＲ）、ウエスタンブロット法、フローサイトメーター法（ＦＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡ法、免疫蛍光染色法、免疫組織化学法など、周知の技術を用いて実施することができる。
【００３５】
一実施態様において、本発明の肝細胞構造体は、上記の細胞の他の細胞を含んでもよく、例えば、肝星細胞、周皮細胞、内皮細胞もしくは平滑筋細胞、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。
【００３６】
＜＜肝細胞構造体の製造方法＞＞
本発明は、肝細胞構造体の製造方法であって、
（ｉ）肝細胞と非肝細胞である接着細胞とを含む細胞群を凝集させて、凝集体を形成する工程；および、
（ｉｉ）前記凝集体を、培養する工程、
を含む、方法を提供する。工程（１）によって得られる凝集体を、工程（２）によって培養することにより、肝細胞と、非肝細胞である接着細胞とを含む凝集体を含み、前記肝細胞が風船様肝細胞を含むことを特徴とする、肝細胞構造体を作製することができる。
【００３７】
一実施態様において、工程（ｉ）は、例えば、細胞が接着しない基材（例えば、ペトリ皿など）に肝細胞と非肝細胞である接着細胞とを播種し、前記基材の底面に向かって遠心力を作用させながら培養する工程、を含むものであってもよい（例えば、特許第５４０７３４３号参照）。
【００３８】
一実施態様において、工程（ｉ）は、例えば、以下：
（ｉ−１）第１培養基材の上に肝細胞を播種して、培養する工程；
（ｉ−２）前記肝細胞が播種された前記第１培養基材の上に、前記接着細胞を播種し、培養する工程；および
（ｉ−３）前記第１培養基材から前記肝細胞と前記接着細胞とを含む前記細胞群を剥離して、前記凝集体を形成する工程、
を含んでもよい。この場合、第１培養基材は、例えば「刺激応答性培養基材」であってもよい。
【００３９】
本明細書において、「刺激応答性培養基材」とは、温度、ｐＨ、光、電気等の刺激によって分子構造を変化させる高分子が被覆された細胞培養基材をいう。刺激応答性培養基材の上に任意の細胞を播種し、細胞がコンフルエントまたはサブコンフルエントになるまで培養した後、温度、ｐＨ、光、電気等の刺激の条件を変えて刺激応答性培養基材を変化させることで、細胞同士の接着状態は維持しつつ、刺激応答性培養基材から細胞群をシート状に剥離させ、凝集体を得ることができる。凝集体を、より早く剥離させるために、刺激応答性培養基材を軽くたたいたり、揺らしたりする方法や、ピペットを用いて培地を撹拌する方法、ピンセットを用いる方法等を、単独又は併用して用いてもよい。
【００４０】
本明細書において、刺激応答性培養基材に被覆されている「刺激応答性高分子」は、例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチルメタクリレート）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸ナトリウム）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ビニルフェロセン）共重合体、γ線照射したポリ（ビニルメチルエーテル）（ＰＶＭＥ）、ポリ（オキシエチレン）、核酸などの生体物質を高分子に組み込んだ樹脂、及び上記高分子に対して架橋剤によって架橋し作製したゲルなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００４１】
一実施態様において、第１培養基材として用いられ得る刺激応答性培養基材は、例えば温度応答性培養基材であってもよい。本明細書において、「温度応答性培養基材」とは、温度応答性高分子が被覆された細胞培養基材をいう。本明細書において「温度応答性高分子」は、刺激応答性高分子の１つであり、温度に応答して、その形状及び／又は性質を変化させる高分子をいう。温度応答性高分子としては、例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチルメタクリレート）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸ナトリウム）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ビニルフェロセン）共重合体、γ線照射したポリ（ビニルメチルエーテル）及び上記高分子に対して架橋剤によって架橋し作製したゲルなどが挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチルメタクリレート）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸ナトリウム）共重合体及び上記高分子に対して架橋剤によって架橋したものが挙げられるが、それらに限定されない。
【００４２】
一実施態様において、第１培養基材に被覆されている温度応答性高分子としては、例えば、水に対する上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ：Ｕｐｐｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）又は下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ：Ｌｏｗｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）が０〜８０℃であるものが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、臨界溶液温度とは、高分子の形状及び／又は性質を変化させる閾値の温度をいう。本発明の一実施態様において、第１培養基材は、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）が、少なくともその培養面の一部に被覆された温度応答性培養基材であってもよい。
【００４３】
ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）は３２℃に下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を有する高分子であり、遊離状態であれば、水中で３２℃以上の温度で脱水和を起こし、凝集して白濁する。逆に３２℃未満の温度ではＰＩＰＡＡｍは水和し、水に溶解した状態となる。本発明の一実施態様で用いられ得る温度応答性培養基材は、ＰＩＰＡＡｍがシャーレなどの培養基材に被覆されて固定されたものである。したがって、３２℃以上の温度であれば、培養表面のＰＩＰＡＡｍが脱水和し、培養基材表面が疎水性となる。逆に、３２℃未満の温度では、培養基材表面のＰＩＰＡＡｍは水和し、培養基材表面が親水性となる。疎水性の培養基材表面には細胞が付着して増殖することができ、また、親水性の培養基材表面は細胞が付着しにくい表面である。そのため、温度応答性培養基材を３２℃未満に冷却すると、細胞が培養基材表面から非侵襲的に剥離される。
【００４４】
一実施態様において、工程（ｉｉ）は、前記凝集体を第２培養基材の上に接着させて、培養する工程である。凝集体を第２培養基材の上に接着させて培養することにより、肝細胞が風船様肝細胞となることが促進される。本明細書において、「第２培養基材」とは、接着細胞を接着させて培養可能な基材であれば特に限定されないが、例えば、ディッシュ、マルチプレート、フラスコ、又は平膜状の基材などを用いることができる。
【００４５】
一実施態様において、本発明に用いられる培養基材（第１培養基材および／または第２培養基材）は、細胞接着性ハイドロゲルでコートされていてもよい。本明細書において、「細胞接着性ハイドロゲル」とは、細胞外基質成分、或いは、キトサンゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ペプチドゲル、ラミニンゲル及びフィブリンゲル、並びにそれらの混合物からなる群から選択されるものをいう。これらのうち、キトサンゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ペプチドゲル及びラミニンゲルは、例えば温度、ｐＨ及び／又は塩濃度を変更することによりゲル化される。フィブリンゲルは、モノマーであるフィブリノーゲンが酵素であるトロンビンと作用することによりゲル化される。本発明に用いられる細胞接着性ハイドロゲルは、好ましくはコラーゲンゲルである。本明細書において、コラーゲンゲルに含まれるコラーゲンとは、例えば、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、タイプＶ、タイプＶＩ、タイプＶＩＩ、タイプＶＩＩＩ、タイプＩＸ、タイプＸ、タイプＸＩ、タイプＸＶ、タイプＸＶＩＩ、もしくはタイプＸＶＩＩＩのコラーゲン又はアテロコラーゲン、あるいはその組み合わせである。コラーゲンゲルに含まれるコラーゲンは、例えば、哺乳動物由来（例えば、霊長類（ヒト及びヒト以外の霊長類を含む）、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモット等）、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、ヤギ、ヒツジ等）であってもよく、哺乳動物のコラーゲン遺伝子を基に、遺伝子工学的に得られたものであってもよい。
【００４６】
一実施態様において、工程（ｉ）で用いられる「肝細胞」：「非肝細胞である接着細胞」の比は、細胞の状態、動物種、または細胞種などによって異なるが、例えば、１０：１〜１：１０であってもよく、好ましくは、５：１〜１：１０の範囲、より好ましくは１：１〜１：１０の範囲である。一実施態様において、播種される「肝細胞」の細胞数は、細胞の状態、動物種、細胞種、共培養される「非肝細胞である接着細胞」の数などによって異なるが、例えば、０．３×１０4〜１０×１０6個／ｃｍ2であってもよく、０．５×１０4〜８×１０6個／ｃｍ2であってもよく、０．７×１０4〜５×１０6個／ｃｍ2であってもよく、１．０×１０４〜１．０×１０６個／ｃｍ２であってもよく、５．０×１０４〜５．０×１０５個／ｃｍ２であってもよい。一実施態様において、播種される「非肝細胞である接着細胞」の細胞数は、細胞の状態、動物種、細胞種、共培養される肝細胞の数などによって異なるが、例えば、０．３×１０4〜１０×１０6個／ｃｍ2であってもよく、０．５×１０4〜８×１０6個／ｃｍ2であってもよく、０．７×１０4〜５×１０6個／ｃｍ2であってもよく、１．０×１０４〜１．０×１０６個／ｃｍ２であってもよく、５．０×１０４〜５．０×１０５個／ｃｍ２であってもよい。
【００４７】
一実施態様において、播種する「非肝細胞である接着細胞」は、第１細胞培養基材から剥離される前の肝細胞と「非肝細胞である接着細胞」とを含む細胞群の面積と比較して、剥離された後の凝集体が１／４以下、より好ましくは１／５以下、さらに好ましくは１／６以下、最も好ましくは１／８以下の面積まで収縮させる密度で播種することが好ましい。凝集体の収縮率が大きいと、細胞がより密集した凝集体が得られ、ＮＡＳＨで観察される肝細胞の特徴を顕著に再現することができる。
【００４８】
本発明の方法において用いられる培地は、肝細胞を培養可能な公知の培地を用いればよく、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、基礎培地（ＭＥＭ）、ノックアウト−ＤＭＥＭ（ＫＯ−ＤＭＥＭ）、グラスゴー基本培地（Ｇ−ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＤＭＥＭ／ハムＦ１２、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／ハムＦ１２、イスコフ改変ダルベッコ培地および基礎培地（ＭＥＭ）、ハムＦ−１０、ハムＦ−１２、１９９培地、ならびにＲＰＭＩ１６４０培地などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
好ましい培地は、インスリンおよびトランスフェリンが添加された高グルコースの培地である。また、培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清）が添加されていてもよく、無血清培養であってもよい。一実施態様において、本発明に用いられる高グルコース含有培地とは、１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは５ｍＭ〜８０ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭ、例えば、約２５ｍＭのグルコースを含有する培地である。また、本発明に用いられる培地は、０．１μＭ〜１０μＭのインスリン、好ましくは０．５μＭ〜５μＭ、例えば約１μＭのインスリンを含有する。培地が高グルコースおよび／またはインスリンを含有することにより、ＮＡＳＨで観察される肝細胞の特徴をより効率的に再現することができる。
【００５０】
一実施態様において、工程（ｉ−１）の培養時間は、肝細胞が第１培養基材に十分接着する時間であればよく、特に限定されないが、例えば３時間〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間、より好ましくは１２時間〜３６時間、例えば約２４時間である。
【００５１】
一実施態様において、工程（ｉ−２）の培養時間は、「非肝細胞である接着細胞」が第１培養基材に十分接着し、コンフルエントまたはサブコンフルエントとなり、細胞シートを形成可能となる時間であればよく、特に限定されないが、例えば２４時間〜１２０時間、好ましくは３６時間〜９６時間、より好ましくは２４時間〜８４時間、例えば約７２時間である。
【００５２】
一実施態様において、工程（ｉｉ）の培養時間は、凝集体に含まれる肝細胞が、ＮＡＳＨで観察される肝細胞の特徴、例えば、風船様変性、Ｍａｌｌｏｒｙ−Ｄｅｎｋ体の蓄積、脂肪滴の沈着、肝細胞周辺の線維化、α―ＳＭＡ陽性細胞の出現等の特徴が観察される程度培養すればよく、特に限定されないが、例えば３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、または１５日以上培養してもよい。
【００５３】
＜＜肝疾患を治療または予防するための因子を評価する方法＞＞
本発明の肝細胞構造体、または本発明の方法によって得られる肝細胞構造体は、肝疾患を治療または予防するための因子を評価する方法に用いることができる。例えば、一実施態様において、本発明の方法は、
（１）肝細胞構造体に、候補因子を適用し、培養する工程、
（２）前記肝細胞構造体において、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の肝細胞が有する特徴（例えば脂肪滴の沈着、Ｍａｌｌｏｒｙ−Ｄｅｎｋ体の形成、風船様変性等）を指標として、前記候補因子の治療または予防効果を評価する工程、
を含んでいる。
【００５４】
一実施態様において、工程（１）で適用する候補因子は、肝細胞構造体に適用（例えば、培地に添加）してもよく、上記の肝細胞構造体の製造方法の任意の工程で適応（例えば、培地に添加）してもよい。
【００５５】
一実施形態において、工程（２）の非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の肝細胞が有する特徴（例えば脂肪滴の沈着、Ｍａｌｌｏｒｙ−Ｄｅｎｋ体の形成、風船様変性等）は、公知の染色方法（例えば、以下に限定されないが、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、ナイルレッド染色、ケラチンの免疫組織化学染色もしくは免疫蛍光染色など）を用いて肝細胞構造体を染色後、任意の顕微鏡を用いることによって評価することができる。
【００５６】
一実施態様において、候補因子は、例えば、低分子化合物、ペプチド、核酸、タンパク質、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の細胞、組織抽出物又は細胞培養上清、植物由来の化合物又は抽出物（例えば、生薬エキス、生薬由来の化合物）、及び微生物由来の化合物若しくは抽出物又は培養産物などであってもよい。
【実施例】
【００５７】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を限定することを意図するものではない。
【００５８】
＜実施例１＞
１．実験材料と方法
１−１．細胞
正常ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ；Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を添加した高グルコースＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳ）で維持し、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で培養した。ＮＨＤＦは、プレコンフルエントの段階で、トリプシンを用いて継代した。３継代目〜７継代目までのＮＨＤＦを共培養実験に用いた。
【００５９】
マウス３Ｔ３−Ｊ２線維芽細胞（Ｋｅｒａｆａｓｔ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳ）は、１０％ウシ胎児血清（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を添加した高グルコースＤＭＥＭで維持し、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で培養した。ＮＨＤＦは、プレコンフルエントの段階で、トリプシンを用いて継代した。３継代目〜５継代目までの細胞を共培養実験に用いた。
【００６０】
初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）（Ｌｏｔ：Ｈｕ８２００Ａ及びＨｕ１６５２）はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより購入した。サプライヤーによって提供された説明書に基づいて、ＰＨＨを融解し、トリパンブルーを用いてバイアビリティーを評価した。２ロットのバイアビリティーは、９０％以上であった。
【００６１】
１−２．初代ヒト肝細胞／線維芽細胞の共培養
温度応答性細胞培養用２４ウェルプレート（ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）；ＣｅｌｌＳｅｅｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を１００μｇ／ｍＬのｒａｔ  ｔａｉｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で一晩コーティングした。その後、ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）２４ウェルプレートをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。
【００６２】
図１に示すように、ＰＨＨを１×１０５個／ウェルにて、コラーゲンコートＵｐＣｅｌｌ（登録商標）２４ウェルプレートに播種した（Ｄａｙ  −４）。肝細胞は、０．１μＭのｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１％  ＩＴＳ  ｐｒｅｍｉｘ（インスリン／ヒトトランスフェリン／亜セレン酸及びリノール酸；Ｃｏｒｎｉｎｇ）、０．２μＭ  グルカゴン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加した高グルコース（２５ｍＭ）ＤＭＥＭを用いて、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で培養した。
【００６３】
ＰＨＨを一晩培養後（Ｄａｙ  −３）、線維芽細胞（３Ｔ３−Ｊ２又はＮＨＤＦ）を、２×１０５個／ウェルにて、肝細胞を培養中の培地に播種し、共培養させた。培地はｄａｙ０まで毎日交換した。
【００６４】
１−３．肝細胞構造体の作製
Ｄａｙ０において、ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）プレート上のＰＨＨ／線維芽細胞の共培養物を２０℃で３０分間インキュベートして、浮遊させた細胞シートとして剥離した。剥離したコンフルエントの単層の細胞シートは、迅速に収縮して、多層構造を有する収縮した厚い細胞シートへと変形した（図１参照）。
【００６５】
この浮遊させた細胞シートを、１０ｍＬピペットを用いて、コラーゲンＩコート３５ｍｍポリスチレン細胞培養皿（ＩＷＡＫＩ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）へ移した。その後、培地を吸い取り、培地を入れない状態にて３７℃でインキュベートし、コラーゲンコート表面へ接着させた。１０分後、１ｍＬの肝細胞培地（５％ＦＢＳ）を細胞培養皿に添加した。培地は、Ｄａｙ１１まで毎日交換した。位相差顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて細胞シートを観察し、撮像した。
【００６６】
１−４．免疫組織化学（ＩＨＣ）染色
所定の時間で、細胞シートサンプルを予め温めておいたＰＢＳを用いて２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１時間固定した。固定した細胞シートをパラフィンに包埋し、４μｍ切片へとスライスし、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）を用いた標準的な組織学染色用に脱パラフィン化した。サイトケラチン８＋１８（ＣＫ８／１８）の免疫染色用に、切片を、抗原回復のためのＤａｋｏ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳ）で処理し、Ｄａｋｏ  ＲＥＡＬ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）中でインキュベートし、内在性のペルオキシダーゼ活性を消失させ、その後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ  Ｈｉｓｔｏ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）中でブロックした。その後、切片を２５倍希釈したマウス抗ヒトＣＫ８／１８抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を添加してインキュベートし、続いてｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄｅコンジュゲート  ロバ抗マウスＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（Ａｂａｃａｍ）を添加してインキュベートした。切片をＤａｋｏ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ＋  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で染色し、核はヘマトキシリンで染色した。最後に、切片をマウントし、乾燥させ、光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）で撮像した。
【００６７】
１−５．免疫蛍光染色
簡単に述べると、パラフィン包埋切片を、以下の一次抗体を添加してインキュベートした：Ｅ−カドヘリン（Ａｂｃａｍ）、α−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ（α−ＳＭＡ）（Ａｂｃａｍ）、及びＣＫ８／１８（Ａｂｃａｍ）。染色用の二次抗体として、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ウサギ抗体及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４ヤギ抗マウス抗体を用いた。細胞核は、４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）で染色した。最後に、切片をマウントし、乾燥させ、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ；Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）又は蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を用いて撮像した。
【００６８】
Ｅ−カドヘリン／ＤＡＰＩ染色像では、Ｉｍａｇｅ  ＪソフトウェアによるＰＨＨ毎の断面の定量化のために、ＤＡＰＩ染色陽性のＰＨＨを選択した。測定は、３つの独立した実験で実施した。各実験において、２５個以上の細胞を測定した。
【００６９】
１−６．ナイルレッド染色
細胞質の脂肪滴の染色のために、Ｄａｙ１１の固定した細胞シートサンプルを２回ＰＢＳで洗浄し、１μｇ／ｍＬのナイルレッド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して、３０分間インキュベートした。その後、免疫蛍光標識された脂肪滴を、ＣＬＳＭ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて撮像した。
【００７０】
１−７．酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）解析
所定の時間において、２４時間の細胞培養上清を回収し、アッセイを行うまで−３０℃で保存した。肝細胞からのアルブミンの分泌を、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ定量キット（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ，ＵＳ）で検出した。培養した肝細胞による尿素合成をｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＢｉｏＣｈａｉｎ，Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ，ＵＳ）を用いて定量した。肝細胞が産生するＳＨＨリガンドの量を、ヒトＳＨＨ  ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ）で定量した。測定は、３つの独立した実験で実施した。それぞれの実験でおいて、３以上の反復試験サンプルを用いた。
【００７１】
１−８．シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素活性
簡単に述べると、細胞シートサンプルをＰＢＳで洗浄し、その後、１００μＭのフェナセチン（ＰＨＥ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５０μＭのミダゾラム（ＭＤＺ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）（それぞれ、ＣＹＰ１Ａ２とＣＹＰ３Ａ４の基質）を含む新鮮培地に置き換えた。細胞シート中のＰＨＨは、２つのＣＹＰ基質を吸収して代謝し、その代謝産物を培地中に放出した。１０分間のインキュベーション後、２０μＬの細胞培養上清を回収した。細胞培養上清中には、ＰＨＥとＭＤＺの代謝産物、すなわち、アセトアミノフェンおよびヒドロキシミダゾラムを含んでいる。２つの代謝産物は、ＡＰＩ５０００  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳ）で測定した。ＣＹＰ基質の特異的な代謝産物への生体内変換率は、ＣＹＰ酵素活性の指標として使用した。ＣＹＰ活性の測定は、２つのロットのＰＨＨ（Ｈｕ８２００＿Ａ  ×２  ＋  Ｈｕ１６５２×１）を用いて、３つの独立した実験で実施した。それぞれの実験において、３以上の反復試験サンプルを用いた。
【００７２】
１−９．統計解析
それぞれの実験において、少なくとも３つ反復試験サンプル由来の値を得た。実験の全てを、ＰＨＨの２つのロットを用いて、３又は４回繰り返して行った。データは、平均±標準偏差（ＳＤ）で表した。２つの群の有意差は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔで検定した。３つの所定の時点における、ＰＨＨ毎の断面の有意差は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて検定し、その後、ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２５ソフトウェアを使用してＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔを行った。ｐ＜０．０５の値を、統計的に有意であるものと見なした。
【００７３】
２．結果
２−１．初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）／線維芽細胞の共培養細胞シートの形態
【００７４】
ＰＨＨと線維芽細胞の二次元（２Ｄ）共培養物を、浮遊する細胞シートとして回収後、下の培養皿からの制限力が消失したために、浮遊する細胞シートは迅速かつ対称的に収縮した（面積は減少したが、肥厚した）（図２（ａ））。この収縮力は、剥離するプロセス中のインタクトな細胞シートにおける細胞骨格の変化により起こったものである。伸びた細胞は密集し、収縮力が生じ、３Ｄ多層化アセンブリを形成した。収縮の程度は、細胞の収縮能力に依存した。図２（Ｃ）に示されるように、ＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートの面積は約２４ｍｍ２であり、剥離前の元の面積（１９０ｍｍ２）のわずか１／８であった。一方で、ＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートの面積は４９ｍｍ２であり、ＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートよりも２倍大きいものであった（図２（ｂ）、（ｃ））。発明者らは、これは恐らくＮＨＤＦの強力な収縮能力に起因するものであると考えた。
【００７５】
位相差顕微鏡は、細胞が共に収縮して多くの小さな凝集塊を形成した、ＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートの非常に収縮した構造を明らかにした（図３（ａ）左上）。驚くことに、凝集塊は、４日間の培養後、肥大化しているようであった（図３（ａ）左下）。一方で、細胞凝集塊は、ＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートでは観察されなかった。実際、ＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シート中のＰＨＨは、４日間の培養後、非常に健常な形態であって、明瞭に境界を画定する細胞境界を有する立方体形状であった（図３（ａ）右下）。
【００７６】
ＨＥ染色により、ＰＨＨ／ＮＨＤＦ共培養細胞シートは細胞密度が高い構造であり、ＰＨＨが、密集したＮＨＤＦによって密集化されていることが明らかとなった（図３（ｂ）左）。位相差顕微鏡による観察から、ＰＨＨは、Ｄａｙ４とＤａｙ１１において、細胞質が青白く染色された顕著な細胞の肥大化が認められ、一方でＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートでは、Ｄａｙ４とＤａｙ１１において、細胞質がエオシン染色陽性の扁平なＰＨＨとなっていたことが明らかとなった（図３（ｂ）右）。
【００７７】
Ｅ−カドヘリンの免疫蛍光染色によって、ＰＨＨの明確な細胞−細胞境界を示し（図４（ａ））、それにより、各ＰＨＨの断面積を定量化した。ＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートのＤａｙ１のものと比較して、Ｄａｙ４では、各ＰＨＨの断面積が２倍増加しており、Ｄａｙ１１では３倍も増加していることが観察された（図４（ｂ））。しかしながら、健常なＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートのＰＨＨのサイズは、１１日間の培養期間中、有意に変化しなかった（図４（ｂ））。
【００７８】
２−２．ＰＨＨ／ＮＨＤＦ共培養細胞シート中の肥大化した肝細胞は、風船様肝細胞（ｂａｌｌｏｏｎｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）であった。
【００７９】
肥大化肝細胞の細胞質は、エオシン染色陰性であるので、それらは風船様肝細胞である可能性がある。この仮説を支持するために、ＣＫ８／１８の免疫組織化学染色を実施した。予想通り、ＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シート中の肥大化肝細胞は、細胞質ケラチン染色の障害、減少又は消失が観察され、一方でＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートの正常サイズの肝細胞では、ＣＫ８／１８の免疫染色の実質的な減少又は消失は見られなかった（図５（ａ））。
【００８０】
さらに、ＣＫ８／１８の免疫蛍光染色によって、不規則な形態のＣＫ８／１８陽性細胞質含有物が、肥大化肝細胞の核の近くに位置していることが示され（図５（ｂ））、それは、Ｍａｌｌｏｒｙ−Ｄｅｎｋ体（ＭＤＢ）の存在を裏付けている。一般に、ＭＤＢは、非アルコール性脂肪性肝炎（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）の組織学的特徴と考えられており、細胞骨格障害及び関連する風船様変性の結果、それらを形成する。
【００８１】
ＭＤＢに加え、Ｄａｙ１１において、ナイルレッドで染色した後のＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シート中では、脂肪滴の大量の蓄積が観察され、一方で、ＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートでは、限定した量の脂質しか観察されなかった（図５（ｃ））。
【００８２】
これらの結果から、ＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートの肥大化した肝細胞は、バルーン化ＰＨＨであることが示唆された。
【００８３】
２−３．ＰＨＨ／ＮＨＤＦ共培養細胞シートにおけるソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）の分泌増加、及び筋線維芽細胞活性化
【００８４】
ＳＨＨリガンド産生と、肝細胞のバルーニング化及び線維化との関連性が報告されている（Ｇｕｙ  Ｃ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１２  Ｊｕｎ；５５（６）：１７１１−１７２１；Ｒａｎｇｗａｌａ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２０１１，Ｊｕｌ；２２４（３）：４０１−４１０．）。風船様肝細胞によって産生されるＳＨＨリガンドは、肝星細胞に対するパラクライン  プロ線維形成因子（ｐｒｏ−ｆｉｂｒｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）として作用し、それによって、筋線維芽細胞活性化を誘導し、線維化を引き起こす。
【００８５】
本発明のインビトロモデルにおいて、発明者らは、Ｄａｙ４において、ＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートと比較して、ＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートにおいてＳＨＨ産生が有意に上昇したことを見出した（Ｈｕ１６５２では１．４倍、Ｈｕ８２００＿Ａでは２．０倍）（図６（ａ））。これらの結果は、ＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートにおける筋線維芽細胞活性化に対応しており、α−ＳＭＡ（筋線維芽細胞マーカー）陽性ＮＨＤＦが、肥大化した肝細胞の周りに観察された（図６（ｂ））。一方で、ＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートでは、α−ＳＭＡが全体的に存在していなかった。これらの発見は、本発明のモデルが、バルーン化した肝細胞の典型的な特徴を反映しているだけでなく、ヒトＮＡＳＨで見られる筋線維芽細胞活性化をも示すことを示唆している。
【００８６】
２−４．ＰＨＨ／線維芽細胞共培養細胞シートにおける肝細胞機能
【００８７】
図７（ａ）で示されるように、Ｄａｙ４又はＤａｙ１０であってもアルブミン産生は、ＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートとＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートの間では有意差がなかった。この結果は、ＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートの風船様肝細胞は、異常細胞であるだけでなく、依然として合成機能を維持できていたことを示唆していた。
【００８８】
尿素産生に関し、Ｄａｙ４におけるＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートとＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートとの間には、有意差がなかったが、Ｄａｙ１０においては、ＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートは、ＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートに比べて２．６倍上昇していた（図７（ｂ））。低酸素分圧において、尿素産生が減少することが報告されているため（Ｂｈａｔｉａ  Ｓ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｅｎｇ．１９９６，１，１２５）、発明者らは、Ｄａｙ１０におけるＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートの相対的な低尿素産生は、ＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートと比較して肥厚化したＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートの酸素欠乏が関連しているのではないかと考えられる（図３（ｂ））。
【００８９】
しかしながら、ＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４を含むＣＹＰ酵素活性は、ＰＨＨ／３Ｔ３−Ｊ２細胞シートよりも、ＰＨＨ／ＮＨＤＦ細胞シートにおいて有意に低かった（図７（ｃ））。これらの発見は、ＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４活性が病態の進行と共に減少したことを示した以前のＮＡＦＬＤ患者由来の臨床サンプルを用いた研究結果に沿うものであった（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２００９，３７（１０），２０８７−９４）。
【００９０】
２−５．ＰＨＨとＮＨＤＦの共培養比率
ＰＨＨとＮＨＤＦの共培養比率が、肝細胞のダメージ及び変性の程度に影響を及ぼすかどうかを調べた（図８）。その結果、ＳＨＨ産生は、ＰＨＨ：ＮＨＤＦ＝４：１の共培養と比較して、ＰＨＨ：ＮＨＤＦ＝１：４では３．５倍、ＰＨＨ：ＮＨＤＦ＝１：２では１．６倍上昇することが明らかとなった（図８（ａ））。肝細胞のサイズは、ＰＨＨ：ＮＨＤＦ＝１：２及び１：４よりも、４：１の共培養の方が小さくなることが明らかとなった（図８（ｂ））。
【００９１】
＜実施例２＞
１．実験材料と方法
１−１．細胞
脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ；ＬＯＮＺＡ）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を添加した高グルコースＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳ）で維持し、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で培養した。ＡＤＳＣは、プレコンフルエントの段階で、トリプシンを用いて継代した。３継代目の細胞を共培養実験に用いた。
【００９２】
また、実施例１で使用したＮＨＤＦを用いた。
【００９３】
１−２．ＰＨＨ／ＡＤＳＣの共培養、および肝細胞構造体の作製
上記、ＮＨＤＦの代わりにＡＤＳＣを用いること以外、実施例１と同様の方法により、初代ヒト肝細胞／ＡＤＳＣの共培養、及び肝細胞構造体の作製を行った。ただし、ＡＤＳＣは１×１０５個／ウェルで播種した。
【００９４】
２．結果
図９はＰＨＨ／ＡＤＳＣ共培養細胞シート（ａおよびｂ）、およびＰＨＨ／ＮＨＤＦ共培養細胞シート（ｃおよびｄ）の、剥離後２８日目の位相差顕微鏡写真を示す。ＰＨＨ／ＡＤＳＣ共培養細胞シート（ａおよびｂ）とＰＨＨ／ＮＨＤＦ共培養細胞シート（ｃおよびｄ）のいずれも、ＮＡＳＨの特徴である脂肪滴の蓄積が確認された。
【００９５】
＜実施例３＞
１．実験材料と方法
１−１．細胞
初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）はマウス肝臓から、改変２ステップコラゲナーゼ灌流法により単離し、４５％ｐｅｒｃｏｌｌ密度勾配遠心法で純化した。ＰＭＨの生存率は９０％であった。
【００９６】
ＮＨＤＦは、実施例１で使用したＮＨＤＦを用いた。
【００９７】
１−２．初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）／ＮＨＤＦの共培養、および肝細胞構造体の作製
上記、ＰＨＨの代わりにＰＭＨを用いること以外、実施例１と同様の方法により、初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）／ＮＨＤＦの共培養、及び肝細胞構造体の作製を行った。ＮＨＤＦとして、ＰＭＨと共培養する前にｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ（６μｇ／ｍＬ）で２．５時間処理したＮＨＤＦまたは無処理のＮＨＤＦを用いた（図１０）。
【００９８】
２．結果
ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃは、細胞の増殖を抑制する効果を有する。ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ処理によって、肝細胞の風船様変化が抑制されることが明らかとなった（図１０（ａ）参照）。
【００９９】
＜実施例４＞
１−１．細胞
初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）は実施例３と同様の方法により取得した。
【０１００】
ＮＨＤＦは、実施例１で使用したＮＨＤＦを用いた。
【０１０１】
１−２．初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）／ＮＨＤＦの共培養、および肝細胞構造体の作製
上記、ＰＨＨの代わりにＰＭＨを用いること以外、実施例１と同様の方法により、初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）／ＮＨＤＦの共培養、及び肝細胞構造体の作製を行った。
【０１０２】
ＮＡＳＨの治療薬として開発されているオベチコール酸（１０μＭ）（フナコシ、カタログ＃ＡＧ−ＣＲ１−３５６０−Ｍ０２５）または２型糖尿病の治療薬であるメタフォミン（５００μＭ）（シグマ、カタログ＃ＰＨＲ１０８４−５００ＭＧ）を上記肝細胞構造体にＤａｙ１で添加し、８日間培養を行った。
【０１０３】
２．結果
オベチコール酸（ＯＣＡ）およびメトホルミンの添加によって、肝細胞の風船様変化が抑制された（図１１参照）。
【０１０４】
＜実施例５＞
１．実験材料と方法
１−１．細胞
ＰＨＨおよびＮＨＤＦは、実施例１で使用したＰＨＨおよびＮＨＤＦを用いた。
【０１０５】
１−２．ＰＨＨ／ＮＨＤＦの共培養、および肝細胞構造体の作製
上記実施例１と同様の方法により、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）／ＮＨＤＦの共培養、及び肝細胞構造体の作製を行った。
【０１０６】
実施例４と同様、オベチコール酸（１０μＭ）（フナコシ）またはメタフォミン（５００μＭ）（シグマ）を上記肝細胞構造体にＤａｙ１で添加し、４〜１１日間培養を行った。
【０１０７】
２．結果
オベチコール酸（ＯＣＡ）、メトホルミンそれぞれの添加によって、肝細胞の風船様変化が抑制された（図１２参照）。
【０１０８】
＜実施例６＞
１．実験材料と方法
１−１．細胞
ＰＨＨおよびＮＨＤＦは、実施例１で使用したＰＨＨおよびＮＨＤＦを用いた。
【０１０９】
１−２．ＰＨＨ／ＮＨＤＦの共培養、および肝細胞構造体の作製
上記実施例１と同様の方法により、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）／ＮＨＤＦの共培養、及び肝細胞構造体の作製を行った。
【０１１０】
低グルコース濃度（５．６ｍＭ）＋低インスリン濃度（１ｎＭ）、または高グルコース濃度（２５ｍＭ）＋高インスリン濃度（１μＭ）の条件に調製した培地を用いて、上記肝細胞構造体を４日間培養した。
【０１１１】
２．結果
低グルコース濃度（５．６ｍＭ）＋低インスリン濃度（１ｎＭ）の培地で培養することにより、ヒト肝細胞の風船様変化がある程度抑制されることが明らかとなった（図１３参照）。
【図１】
2020145944.tif 000003
【図２】
2020145944.tif 000004
【図３】
2020145944.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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