(57)【要約】【課題】ペプチドハイドロゲルの機械的強度を向上し、関節疾患における患部の組織再生に好適なペプチドハイドロゲルを含む医薬組成物を得る。【解決手段】本発明に係る医薬組成物は、自己組織化したペプチドにより構成されたペプチドハイドロゲルを含有し、前記ペプチドは、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸との交互の配列からなるβシート構造と、生物学的活性を有するβターン構造とによって構成されたβヘアピン構造を含む関節疾患治療用の医薬組成物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己組織化したペプチドにより構成されたペプチドハイドロゲルを含有し、
前記ペプチドは、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸との交互の配列からなるβシート構造と、生物学的活性を有するβターン構造とによって構成されたβヘアピン構造を含む関節疾患治療用の医薬組成物。
【請求項２】
前記ペプチドハイドロゲルは、貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ’’との差が３９００Ｐａ以上である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記関節疾患は、半月板損傷である請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ペプチドを含む水溶液を調製する工程と、
前記水溶液にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えてペプチドハイドロゲルを生成する工程とを含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物を製造する方法。
【請求項６】
前記リン酸緩衝生理食塩水は、最終濃度が３倍濃度（３×ＰＢＳ）以上となるように前記水溶液に加えられる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物を適用する部位に従って、最適な前記ペプチドハイドロゲルの弾性率を調整するために、前記リン酸緩衝生理食塩水の濃度を調整する工程をさらに含む請求項５又は６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節疾患治療用の医薬組成物及びその製造方法に関し、特にペプチドハイドロゲルを含む関節疾患治療用の医薬組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、組織工学の分野では、細胞、成長因子及び足場材料の３つの要素によって生体組織が再生すると考えられている。有効な足場材料の条件としては、３次元構造体の形成可能性、生分解性、細胞接着性、及び周囲の環境を模倣した力学的強度が求められる。近年では、これらの条件を満たす足場材料にコラーゲンゲルやゼラチンゲルといった動物由来のタンパク質からなるハイドロゲルが使用されている。しかしながら、これらのタンパク質ゲルは動物由来の抽出物であるため、ロット間の組成の違いや、再生医療等の医療応用を考えた場合に感染症の危険性がある。
【０００３】
そこで、このような問題を解決するために、足場材料として人工的に合成できるペプチドにより構成されたペプチドハイドロゲルを使用することが考えられている。親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸との繰り返し配列で構成されたペプチドは、当該繰り返し配列によってβシート（βストランド）構造を形成し、当該ペプチドに対する塩の添加によって自己組織化が起こり、その際に水を内包してハイドロゲルが形成されることが知られている。
【０００４】
上記のようにして形成されたペプチドハイドロゲルは、上記動物由来のタンパク質からなるハイドロゲルの問題を解決でき、再生医療等の医療応用に有効と考えられる。実際に、ペプチドハイドロゲルは、骨欠損部に移植されることで骨再生に必要な細胞の良好な足場となって、骨再生を促すことが知られており、特に、ペプチドハイドロゲルを骨組織や歯周組織の再生医療に応用することが特許文献１及び２に提示されている。具体的に、特許文献１には、犬の歯槽骨に形成された骨欠損部に直接にペプチドハイドロゲルを移植することで新生骨の形成が認められた旨が開示されている。また、特許文献２には、ラットの頭蓋骨に形成された骨欠損部にペプチドハイドロゲルを移植することで骨再生を促進する旨が開示されている。
【０００５】
また、上述した通り、有効な足場材料の条件として周囲の環境を模倣した力学的強度が求められるため、ペプチドハイドロゲルは移植部位の周囲の環境と同等の力学的強度（剛性）が要求されるものの、従来のペプチドハイドロゲルは力学的強度が低く、その強度を向上する必要がある旨について非特許文献１及び２に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−１０５１８６号公報
【特許文献２】特表２０１０−５０４９７２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Sotirios Koutsopoulos., Journal of BiomedicalMaterials Research A, 2016, 104(4), p1002-1016.
【非特許文献２】Jiaju Lu and Xiumei Wang, Biomimetic MedicalMaterials (Part of the Advances in Experimental Medicine and Biology bookseries (AEMB, volume 1064)), 2018, p297-312.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献１及び２に記載のようにペプチドハイドロゲルを生体組織への移植材料として応用するためには剛性を増大することが必要であり、これまでに種々の研究がなされているが、現状ではペプチドハイドロゲルの剛性を十分に上げることはできておらず、比較的液体に近い剛性を有するゲルが用いられている。従って、特に骨やその周辺に移植する場合には、上記の周囲の環境を模倣した力学的強度といった有効な足場条件を十分に満たすことができない。また、このようなゲルを生体内の所望の部位に移植すると、ゲルが所望の部位に留まらずに周囲に流れるため、所望の部位における高い組織再生効果を期待できない。上記特許文献１及び２では、骨に比較的深い骨欠損部を作製して、その中にゲルを充填しているため剛性が低いゲルであっても、ある程度の量のゲルが骨欠損部に留まることが期待できるが、種々の組織における実際の組織欠損に対して十分な効果が得られるとはいえない。
【０００９】
また、特許文献１及び２において開示された骨組織は、比較的血液循環が良好な組織であり、細胞や成長因子が集まりやすく組織再生には有利ではあるが、例えば関節等の血液循環が乏しく組織再生に不利な環境にある部位においても、優れた組織再生効果を示す再生療法が求められている。
【００１０】
本発明は、前記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、ペプチドハイドロゲルの力学的強度を向上し、関節疾患における患部の組織再生に好適なペプチドハイドロゲルを含む医薬組成物を得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、生物学的活性を有するβターン構造を含むβヘアピン構造のペプチドの自己組織化によって従来よりも力学的強度が高いペプチドハイドロゲルを作製でき、さらに、当該ペプチドハイドロゲルを関節組織の欠損部に移植することで組織再生を促すことが可能であることを見出して本発明を完成した。
【００１２】
具体的に、本発明に係る医薬組成物は、関節疾患治療用であり、自己組織化したペプチドにより構成されたペプチドハイドロゲルを含有し、前記ペプチドは、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸との交互の配列からなるβシート構造と、生物学的活性を有するβターン構造とによって構成されたβヘアピン構造を含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明に係る医薬組成物によると、ペプチドハイドロゲルを構成するペプチドがβヘアピン構造であるため、βシート構造のペプチドで構成されたペプチドハイドロゲルよりもペプチド同士の結合点（分子内水素結合等）を増大できて力学的強度（剛性）を大きくすることができる。従って、本発明に係るペプチドハイドロゲルは関節組織内に移植される際に、所望の移植部位の周囲に流れ難くなり当該部位に比較的維持できるため、組織再生の促進に極めて有効となる。また、当該ペプチドは生物学的活性を有するβターンを含むため、ペプチドハイドロゲルに種々の生物学的活性を付与でき、例えばβターンが細胞接着活性を示す配列からなる場合、ペプチドハイドロゲルに細胞接着活性を付与でき、細胞との相互作用が向上するため足場材料としての機能を向上できる。以上のような効果により、本発明に係る医薬組成物は、血液循環が乏しく組織再生に不利な環境にある関節組織であっても組織再生を促進できる効果を示すことができる。
【００１４】
本発明に係る医薬組成物において、前記ペプチドハイドロゲルは、貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ’’との差が３９００Ｐａ以上であることが好ましい。
【００１５】
このようにすると、ペプチドハイドロゲルの力学的強度が大きくなって、上記効果をより向上することができる。
【００１６】
本発明に係る医薬組成物において、前記ペプチドは、ＩＫＩＫＩＫＩＫＩＫＲＧＤＳＫＩＫＩＫＩＫＩＫＩ（配列番号１）のアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００１７】
本発明に係る医薬組成物において、前記関節疾患は、半月板損傷であることが好ましい。
【００１８】
本発明に係る医薬組成物の製造方法は、上記本発明に係る医薬組成物を製造する方法であって、前記ペプチドを含む水溶液を調製する工程と、前記水溶液にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えてペプチドハイドロゲルを生成する工程とを含むことを特徴とする。
【００１９】
本発明者らは、上記のような特徴を有するペプチドの水溶液に対して、種々の濃度のＰＢＳを加えることで、その濃度依存的に生成されるペプチドハイドロゲルの力学的強度を向上できることを見出した。すなわち、本発明に係る医薬組成物の製造方法によると、簡便に上記ペプチドハイドロゲルを作製することができ、さらにＰＢＳの濃度によって、ペプチドハイドロゲルの力学的強度を調整することができる。
【００２０】
本発明に係る医薬組成物の製造方法において、前記リン酸緩衝生理食塩水は、最終濃度が３倍濃度（３×ＰＢＳ）以上となるように前記水溶液に加えられることが好ましい。
【００２１】
このようにすると、貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ’’との差が３９００Ｐａ以上の力学的強度が大きいペプチドハイドロゲルを得ることができる。
【００２２】
本発明に係る医薬組成物の製造方法は、上記本発明に係る医薬組成物を適用する部位に従って、最適な前記ペプチドハイドロゲルの弾性率を調整するために、前記リン酸緩衝生理食塩水の濃度を調整する工程をさらに含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係る医薬組成物及びその製造方法によると、力学的強度が大きいペプチドハイドロゲルを含み、生体組織に移植した際に所望の部位に維持することができて優れた組織再生の促進効果を示す医薬組成物を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＥＭＥＭ、５ｗｔ％ＮａＣｌ水溶液及び５×ＰＢＳのそれぞれを用いて得られたペプチドハイドロゲルの貯蔵弾性率Ｇ’（左のバー）及び損失弾性率Ｇ’’（右のバー）を示すグラフである。
【図２】５ｗｔ％ＮａＣｌ水溶液、１×ＰＢＳ、３×ＰＢＳ及び５×ＰＢＳのそれぞれを用いて得られたペプチドハイドロゲルの貯蔵弾性率Ｇ’（左のバー）及び損失弾性率Ｇ’’（右のバー）を示すグラフである。
【図３】（ａ）は本実施例において作製したウサギの半月板の欠損部を示す写真であり、（ｂ）は本実施例において移植するのに用いたペプチドハイドロゲルを示す写真である。
【図４】本実施例で行ったQuantitative Analysis of the Occupation Ratio of Tissue Regeneration（Ｒ／Ｄ  ｒａｔｉｏ）を説明するための写真である。
【図５】ウサギの半月板欠損部にペプチドハイドロゲルを移植した場合（ＫＩ２４ＲＧＤＳ群）及び移植しなかった場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）のそれぞれにおける２、４、８及び１２週後の半月板を示す写真である。
【図６】ウサギの半月板欠損部にペプチドハイドロゲルを移植した２、４、８及び１２週後のサフラニンＯ染色された半月板組織を示す写真である（ＫＩ２４ＲＧＤＳ群）。
【図７】ウサギの半月板欠損部の欠損部作製から２、４、８及び１２週後のサフラニンＯ染色された半月板組織を示す写真である（コントロール群）。
【図８】本実施例におけるＫＩ２４ＲＧＤＳ群とコントロール群の石田スコア（Ishida Score）の結果を示すグラフである。
【図９】本実施例におけるＫＩ２４ＲＧＤＳ群とコントロール群のQuantitative Analysis of the Occupation Ratio of Tissue Regeneration（Ｒ／Ｄ  ｒａｔｉｏ）の結果を示すグラフである。
【図１０】ウサギの半月板欠損部にペプチドハイドロゲルを移植した２週後の半月板組織を示す写真及びモデル図であり、（ａ）はＨＥ染色された写真であり、（ｂ）はサフラニンＯ染色された写真であり、（ｃ）は組織再生の様子を示すモデル図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
【００２６】
本発明に係る医薬組成物は、自己組織化したペプチドにより構成されたペプチドハイドロゲルを含有するものであり、特に関節疾患の治療に用いる医薬組成物である。また、本発明に係る医薬組成物において、前記ペプチドは、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸との交互の配列からなるβシート構造と、生物学的活性を有するβターン構造とによって構成されたβヘアピン構造を含むことを特徴とする。
【００２７】
本発明の一実施形態に係る医薬組成物において、ペプチドハイドロゲルとは、親水性表面と疎水性表面とを併せ持つ構造のペプチドが所定の条件で自己組織化された際に水を内包することで得られたハイドロゲルである。また、当該ペプチドハイドロゲルを構成するペプチドは、上述の通りβシートと、βシート同士の間に位置してそれらを結ぶβターンとにより形成されたβヘアピン構造のペプチドである。βシートは、上述のような親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸との交互の配列によって形成されており、親水性表面と疎水性表面とを併せ持つ。本実施形態において、βシートは、リシン（Ｋ）とイソロイシン（Ｉ）との繰り返し配列によって形成されていることが好ましい。
【００２８】
βターンは、通常、ｎ番目のアミノ酸残基のカルボニル酸素原子とｎ＋３番目のアミノ酸残基のアミドプロトンとが水素結合を形成することにより安定したターン構造をいう。βターンを形成するアミノ酸配列は種々存在し、それらは当業者に周知である。本実施形態において、βターンを形成するアミノ酸配列は生物学的活性を有し、当該生物学的活性としては細胞接着活性であることが好ましい。本実施形態において、βターンは、アルギニン‐グリシン‐アスパラギン酸‐セリン（ＲＧＤＳ）配列からなることが好ましい。ＲＧＤＳ配列は、βターンを形成する配列として知られており、さらにＲＧＤＳ配列はフィブロネクチン由来の配列であり、インテグリンαＶβＩと結合し、細胞接着活性を示すことが知られている。
【００２９】
本実施形態において、βヘアピン構造は、上記配列を有するペプチドに対する塩の作用によってβシートの親水性表面（リシン残基）の静電反発を遮蔽することで形成される。βヘアピン構造は、側鎖間による分子内での疎水性相互作用、及びペプチド骨格のカルボニル部分とアミド部分との間の分子内水素結合により安定に形成され、これにより、自己組織化を容易に起こすことができる。
【００３０】
特に、本実施形態において、βヘアピン構造は、ＫとＩとの繰り返し配列同士の間にＲＧＤＳ配列が配置されてなるβヘアピン構造であることが好ましい。βシートにおけるＫとＩとの繰り返し数は特に限定はされないが、例えば繰り返し数が５であることが好ましく、従って、本実施形態におけるβヘアピン構造を形成するアミノ酸配列は、ＩＫＩＫＩＫＩＫＩＫＲＧＤＳＫＩＫＩＫＩＫＩＫＩ（ＫＩ２４ＲＧＤＳ：配列番号１）であることが好ましい。
【００３１】
本実施形態において、ペプチドハイドロゲルは、その力学的強度が高いことが好ましい。具体的に、ペプチドハイドロゲルが生体内の所望の移植部分において、周囲に流れ難くなる程度の力学的強度を有することが好ましく、特に、貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ’’との差が３９００Ｐａ以上であることが好ましく、１００００Ｐａ以上であることがより好ましい。
【００３２】
本実施形態に係る医薬組成物において、関節疾患とは、関節において、例えば変形、損傷及び炎症等の異常が生じた疾患をいう。本実施形態において、関節とは、以下に限定されないが、例えば肩、肘、指、股、膝及び足首等の部位における骨同士が接続された部分をいう。本実施形態における関節疾患は、具体的には関節における骨以外の部位の疾患であり、例えば、軟骨、靭帯及び半月板の疾患を含む。
【００３３】
本実施形態に係る医薬組成物は、関節疾患の患部に移植して用いられ、より具体的には関節疾患の部位の欠損部に移植される。欠損部は、疾患自体が原因で欠損された部分であってもよく、また、手術によって積極的に切除されることで生じた部分であってもよい。
【００３４】
本実施形態に係る医薬組成物は、上記ペプチドハイドロゲルの他に医薬的に許容可能な種々の添加剤を含んでいても構わない。但し、当該添加物は、ペプチドハイドロゲルの力学的強度を低減することなく、医薬組成物としての力学的強度を低減しないものであることが好ましい。
【００３５】
本発明に係る医薬組成物の製造方法は、上記のようなペプチドハイドロゲルを調製することを含む方法であり、具体的にはペプチドを含む水溶液を調製する工程と、前記水溶液にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えてペプチドハイドロゲルを生成する工程とを含む。
【００３６】
本発明の一実施形態に係る医薬組成物の製造方法において、ペプチド及びペプチドハイドロゲルは、それぞれ上述の特徴を有するペプチド及びペプチドハイドロゲルである。所望の配列のペプチドは、従来から当業者に周知の方法で合成が可能であり、例えば周知のＦｍｏｃ固相合成法を用いて合成することができる。なお、合成されたペプチドは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の周知の方法で精製されてもよい。その後、得られたペプチドを水に溶解することでペプチド水溶液を調製できる。なお、当該水溶液のペプチド濃度は特に限定されないが、例えば１〜１０％程度に調製することができる。
【００３７】
本実施形態において、上記のように調製された水溶液にＰＢＳを加えることにより、ペプチドハイドロゲルが得られる。具体的に、ＰＢＳ中の塩がペプチドの親水性表面の静電反発を遮蔽し、βヘアピン構造を形成し、ペプチドにおける側鎖間による分子内での疎水性相互作用、及びペプチド骨格のカルボニル部分とアミド部分との間の分子内水素結合により安定となって、自己組織化が容易に起こる。この際に、水溶液中の水を内包して、その結果、ペプチドハイドロゲルが生成される。ペプチドを含む水溶液にＰＢＳを加える場合、当該水溶液と等量のＰＢＳを加えることが好ましい。この場合、所望のＰＢＳの最終濃度の２倍の濃度のＰＢＳを加えることとなる。
【００３８】
本実施形態において、ＰＢＳの濃度は特に限定されないが、ＰＢＳの濃度を上げることによって、得られるペプチドハイドロゲルの力学的強度を上げることができる。但し、ＰＢＳの濃度を過剰に上げると塩の析出が起こる虞があるため、過剰に濃度を上げることは好ましくない。本実施形態において、例えば１０×ＰＢＳをペプチド含有水溶液と等量で混合することで、最終濃度を５×ＰＢＳにすることが好ましい。なお、１×ＰＢＳは、周知の方法で調製可能であり、例えば８ｇの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．２ｇの塩化カリウム（ＫＣｌ）、１．４４ｇのリン酸水素二ナトリウム及び０．２４ｇのリン酸二水素カリウムに１Ｌの水を加え、塩酸等でｐＨ７．４に調整することにより調製され得る。従って、上記各塩の量を２倍にすることで２×ＰＢＳを調製でき、１０倍にすることで１０×ＰＢＳを調製できる。上記のように、ＰＢＳの濃度を上げることによって、得られるペプチドハイドロゲルの力学的強度を上げることができるため、用いるＰＢＳの濃度を調整することによって、ペプチドハイドロゲルの力学的強度を調整することができる。
【実施例】
【００３９】
以下に、本発明に係る医薬組成物及びその製造方法について詳細に説明するための実施例を示す。
【００４０】
［実施例１：ペプチドハイドロゲルの調製］
まず、本実施例に係るペプチドハイドロゲルを調製するために、ペプチド合成法として常法であるＦｍｏｃ固相合成法を利用して、ＩＫＩＫＩＫＩＫＩＫＲＧＤＳＫＩＫＩＫＩＫＩＫＩのアミノ酸配列からなるペプチド（ＫＩ２４ＲＧＤＳ：配列番号１）を合成した。なお、合成されたペプチドは、周知のＨＰＬＣを用いて単離及び精製を行った。
【００４１】
上記のようにして得られたＫＩ２４ＲＧＤＳペプチド６ｍｇをそれぞれ１００μＬの超純水に溶解させて６％ペプチド水溶液を調製した。
【００４２】
次に、当該ペプチド水溶液に対して等量（１００μＬ）の２×ＰＢＳ、４×ＰＢＳ、６×ＰＢＳ又は１０×ＰＢＳを加えて混合した。従って、混合液中のＰＢＳの最終濃度はそれぞれ１×ＰＢＳ、２×ＰＢＳ、３×ＰＢＳ、５×ＰＢＳとなる。その後、冷暗所で１日間静置した。これにより、ペプチド水溶液中のペプチドがＰＢＳ中の塩の作用により自己組織化を起こし、ペプチドハイドロゲルが得られた。また、比較例として、ゲルの生成に必要な塩を含むものの生体内において毒性を示すと考えられるイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）又は１０ｗｔ％ＮａＣｌ水溶液（最終濃度は５ｗｔ％）を当該ペプチド水溶液に対して等量加えて混合し、冷暗所で１日間静置した。当該比較例においても、ペプチドハイドロゲルが得られた。
【００４３】
［実施例２：ペプチドハイドロゲルの力学的強度の測定］
上記のようにして得られた各ペプチドハイドロゲルの力学的強度を評価するために、各ペプチドハイドロゲルに対して、レオメーター（HAAKE粘度・粘弾性測定装置（HAAKE MARS40）Thermo Scientific製）を用いてレオロジー測定を行った。図１及び図２に、レオロジー測定により得られた各ペプチドハイドロゲルの貯蔵弾性率Ｇ’及び損失弾性率Ｇ’’を示す。具体的に、図１はＫＩ２４ＲＧＤＳのペプチドを用い、ＥＭＥＭ、５ｗｔ％ＮａＣｌ、５×ＰＢＳにより生成されたペプチドハイドロゲルの測定結果を比較するグラフを示し、また、図２はＫＩ２４ＲＧＤＳのペプチドを用い、ＥＭＥＭ、１×ＰＢＳ、２×ＰＢＳ、３×ＰＢＳ、５×ＰＢＳにより生成されたペプチドハイドロゲルの測定結果を比較するグラフを示す。
【００４４】
図１に示すように、ペプチドハイドロゲルを生成するための塩としてＥＭＥＭ又は５ｗｔ％ＮａＣｌ水溶液を用いた場合では、いずれの場合でもペプチドハイドロゲルの貯蔵弾性率Ｇ’は約５０００であり、損失弾性率Ｇ’’は約６００であった。一方、塩として５×ＰＢＳを用いた場合では、ペプチドハイドロゲルの貯蔵弾性率Ｇ’は約１５０００であり、損失弾性率Ｇ’’は約８００であった。従って、塩としてＥＭＥＭ又は５ｗｔ％ＮａＣｌ水溶液を用いるよりも、５×ＰＢＳを用いた方が貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ’’との差が大きく、力学的強度が高い剛性の大きいペプチドハイドロゲルが得られることが明らかとなった。
【００４５】
また、図２（ａ）に示すように、ペプチドハイドロゲルの生成のために用いられるＰＢＳの濃度を上げるに従って、貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ’’との差が大きくなり、すなわち力学的強度が高い剛性の大きいペプチドハイドロゲルが得られた。５ｗｔ％ＮａＣｌ水溶液を用いた場合と比較すると、３×ＰＢＳ以上の濃度のＰＢＳを用いると５ｗｔ％ＮａＣｌ水溶液を用いた場合よりも貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ’’との差が大きくなり（３×ＰＢＳで約３９５０、５ｗｔ％ＮａＣｌ水溶液で約３７５０）、力学的強度が高いペプチドハイドロゲルが得られる。以上の結果から、用いるＰＢＳの濃度依存的に得られるペプチドハイドロゲルの剛性を向上できることが明らかとなった。
【００４６】
［実施例３：ペプチドハイドロゲルのウサギ半月板への適用］
次に、ペプチドハイドロゲルを半月板の欠損部に移植することによる半月板再生効果について検討するために、ウサギ半月板欠損モデルを用いてその効果を評価した。その方法及び結果を以下に説明する。
【００４７】
（方法）
まず、６ヶ月齢で体重が３．０〜３．４ｋｇである日本白色家兎のオスを２０羽準備し、それらの両膝の半月板内側前節に直径２．０ｍｍの円柱欠損を作製した（図３（ａ））。また、ＫＩ２４ＲＧＤＳのペプチド及び５×ＰＢＳを用いて上記の方法で作製されたペプチドハイドロゲルを準備し（図３（ｂ））、上記欠損部内に当該ペプチドハイドロゲルを充填した。欠損部にペプチドハイドロゲルを充填した群をＫＩ２４ＲＧＤＳ群とし、欠損部に対して何ら処置を施さなかった群をコントロール群とした。移植後、各群の膝に対してヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）、又はサフラニンＯ染色を用いて組織評価を行った。組織評価は、移植の２、４、８及び１２週後に行い、各評価時期に５羽（１０膝）を評価した。また、組織評価は、石田スコア及びQuantitative Analysis of the Occupation Ratio of Tissue Regeneration（Ｒ／Ｄ  ｒａｔｉｏ）を用いた。石田スコアによる評価は、下記表１に示すような３つの観点においてスコアを付けてその合計により組織修復の程度を評価した。一方、Ｒ／Ｄ  ｒａｔｉｏによる評価は、図４に示すように、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、全体の欠損部の面積（Ｄ）及び修復組織の面積（Ｒ）を分析し、Ｒ／Ｄの比率を算出することで組織修復の程度を評価した。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
（結果）
図５にＫＩ２４ＲＧＤＳ群及びコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）群の移植後２、４、８及び１２週後における半月板の写真を示し、図６にＫＩ２４ＲＧＤＳ群の移植後２、４、８及び１２週後におけるサフラニンＯ染色された半月板欠損部の写真を示し、図７にコントロール群における欠損部作製後２、４、８及び１２週後におけるサフラニンＯ染色された半月板欠損部の写真を示す。また、図８に各群における石田スコアの結果を示し、図９にＲ／Ｄ  ｒａｔｉｏの結果を示す。さらに、図１０にＫＩ２４ＲＧＤＳ群の移植後２週後におけるＨＥ染色及びサフラニンＯ染色された半月板欠損部の写真、並びにペプチドハイドロゲルによる組織再生の過程のモデル図を示す。
【００５０】
図５に示すように、半月板の肉眼所見において、ＫＩ２４ＲＧＤＳ群では移植後２、４、８及び１２週後と経過するに従って、欠損部（図中の矢印で示す部分）が小さくなり、修復されることが明らかである。一方、コントロール群では、欠損部作製から２、４、８及び１２週後と経過するに従って欠損部が小さくなるものの、ＫＩ２４ＲＧＤＳ群と比較して明らかに修復の程度が低く、１２週後においても半月板を貫通する穴の存在が認められた。
また、半月板組織をサフラニンＯにて染色した写真においても、図６に示すように、ＫＩ２４ＲＧＤＳ群では移植後２、４、８及び１２週後と経過するに従って、欠損部に細胞が集まり組織が修復されたことが明らかである。一方、図７に示すように、コントロール群ではＫＩ２４ＲＧＤＳ群と比較して明らかな修復の様子が認められなかった。これは、図８に示す石田スコア及び図９に示すＲ／Ｄ  ｒａｔｉｏの結果からも明らかであり、移植後２、４、８及び１２週のいずれの段階においてもコントロール群よりもＫＩ２４ＲＧＤＳ群の方が石田スコア及びＲ／Ｄ  ｒａｔｉｏが高く、組織の修復がより進んでいることが示唆された。
【００５１】
次に、図１０を参照して半月板欠損部へのペプチドハイドロゲルの移植による組織再生の過程について説明する。図１０（ａ）はＫＩ２４ＲＧＤＳ群の移植後２週後における半月板組織のＨＥ染色写真であり、図１０（ｂ）はサフラニンＯ染色写真を示す。理解を容易にするためのモデル図を図１０（ｃ）に示す。図１０（ａ）〜（ｃ）に示されるように、欠損部にペプチドハイドロゲルが充填されることにより、ペプチドハイドロゲルが足場となり、欠損部に隣接する組織から細胞がペプチドハイドロゲルの周縁を伝って遊走する。これにより、欠損部に半月板組織に分化可能な細胞が集まって組織を再生すると考えられる。
【００５２】
以上の結果より、本実施例に係るペプチドハイドロゲルは、力学的強度が大きく、関節組織の組織欠損部に移植した際に当該欠損部に維持することができて、欠損部において優れた組織再生の促進効果を示すことができるため、関節疾患等の再生療法に極めて有用である。
【図１】
2020188833.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月2日(2020.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節疾患治療用の医薬組成物及びその製造方法に関し、特にペプチドハイドロゲルを含む関節疾患治療用の医薬組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、組織工学の分野では、細胞、成長因子及び足場材料の３つの要素によって生体組織が再生すると考えられている。有効な足場材料の条件としては、３次元構造体の形成可能性、生分解性、細胞接着性、及び周囲の環境を模倣した力学的強度が求められる。近年では、これらの条件を満たす足場材料にコラーゲンゲルやゼラチンゲルといった動物由来のタンパク質からなるハイドロゲルが使用されている。しかしながら、これらのタンパク質ゲルは動物由来の抽出物であるため、ロット間の組成の違いや、再生医療等の医療応用を考えた場合に感染症の危険性がある。
【０００３】
そこで、このような問題を解決するために、足場材料として人工的に合成できるペプチドにより構成されたペプチドハイドロゲルを使用することが考えられている。親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸との繰り返し配列で構成されたペプチドは、当該繰り返し配列によってβシート（βストランド）構造を形成し、当該ペプチドに対する塩の添加によって自己組織化が起こり、その際に水を内包してハイドロゲルが形成されることが知られている。
【０００４】
上記のようにして形成されたペプチドハイドロゲルは、上記動物由来のタンパク質からなるハイドロゲルの問題を解決でき、再生医療等の医療応用に有効と考えられる。実際に、ペプチドハイドロゲルは、骨欠損部に移植されることで骨再生に必要な細胞の良好な足場となって、骨再生を促すことが知られており、特に、ペプチドハイドロゲルを骨組織や歯周組織の再生医療に応用することが特許文献１及び２に提示されている。具体的に、特許文献１には、犬の歯槽骨に形成された骨欠損部に直接にペプチドハイドロゲルを移植することで新生骨の形成が認められた旨が開示されている。また、特許文献２には、ラットの頭蓋骨に形成された骨欠損部にペプチドハイドロゲルを移植することで骨再生を促進する旨が開示されている。
【０００５】
また、上述した通り、有効な足場材料の条件として周囲の環境を模倣した力学的強度が求められるため、ペプチドハイドロゲルは移植部位の周囲の環境と同等の力学的強度（剛性）が要求されるものの、従来のペプチドハイドロゲルは力学的強度が低く、その強度を向上する必要がある旨について非特許文献１及び２に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−１０５１８６号公報
【特許文献２】特表２０１０−５０４９７２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Sotirios Koutsopoulos., Journal of Biomedical Materials Research A, 2016, 104(4), p1002-1016.
【非特許文献２】Jiaju Lu and Xiumei Wang, Biomimetic Medical Materials (Part of the Advances in Experimental Medicine and Biology bookseries (AEMB, volume 1064)), 2018, p297-312.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献１及び２に記載のようにペプチドハイドロゲルを生体組織への移植材料として応用するためには剛性を増大することが必要であり、これまでに種々の研究がなされているが、現状ではペプチドハイドロゲルの剛性を十分に上げることはできておらず、比較的液体に近い剛性を有するゲルが用いられている。従って、特に骨やその周辺に移植する場合には、上記の周囲の環境を模倣した力学的強度といった有効な足場条件を十分に満たすことができない。また、このようなゲルを生体内の所望の部位に移植すると、ゲルが所望の部位に留まらずに周囲に流れるため、所望の部位における高い組織再生効果を期待できない。上記特許文献１及び２では、骨に比較的深い骨欠損部を作製して、その中にゲルを充填しているため剛性が低いゲルであっても、ある程度の量のゲルが骨欠損部に留まることが期待できるが、種々の組織における実際の組織欠損に対して十分な効果が得られるとはいえない。
【０００９】
また、特許文献１及び２において開示された骨組織は、比較的血液循環が良好な組織であり、細胞や成長因子が集まりやすく組織再生には有利ではあるが、例えば関節等の血液循環が乏しく組織再生に不利な環境にある部位においても、優れた組織再生効果を示す再生療法が求められている。
【００１０】
本発明は、前記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、ペプチドハイドロゲルの力学的強度を向上し、関節疾患における患部の組織再生に好適なペプチドハイドロゲルを含む医薬組成物を得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、生物学的活性を有するβターン構造を含むβヘアピン構造のペプチドの自己組織化によって従来よりも力学的強度が高いペプチドハイドロゲルを作製でき、さらに、当該ペプチドハイドロゲルを関節組織の欠損部に移植することで組織再生を促すことが可能であることを見出して本発明を完成した。
【００１２】
具体的に、本発明に係る医薬組成物は、関節疾患治療用であり、自己組織化したペプチドにより構成されたペプチドハイドロゲルを含有し、前記ペプチドは、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸との交互の配列からなるβシート構造と、生物学的活性を有するβターン構造とによって構成されたβヘアピン構造を含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明に係る医薬組成物によると、ペプチドハイドロゲルを構成するペプチドがβヘアピン構造であるため、βシート構造のペプチドで構成されたペプチドハイドロゲルよりもペプチド同士の結合点（分子内水素結合等）を増大できて力学的強度（剛性）を大きくすることができる。従って、本発明に係るペプチドハイドロゲルは関節組織内に移植される際に、所望の移植部位の周囲に流れ難くなり当該部位に比較的維持できるため、組織再生の促進に極めて有効となる。また、当該ペプチドは生物学的活性を有するβターンを含むため、ペプチドハイドロゲルに種々の生物学的活性を付与でき、例えばβターンが細胞接着活性を示す配列からなる場合、ペプチドハイドロゲルに細胞接着活性を付与でき、細胞との相互作用が向上するため足場材料としての機能を向上できる。以上のような効果により、本発明に係る医薬組成物は、血液循環が乏しく組織再生に不利な環境にある関節組織であっても組織再生を促進できる効果を示すことができる。
【００１４】
本発明に係る医薬組成物において、前記ペプチドハイドロゲルは、貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ’’との差が３９００Ｐａ以上であることが好ましい。
【００１５】
このようにすると、ペプチドハイドロゲルの力学的強度が大きくなって、上記効果をより向上することができる。
【００１６】
本発明に係る医薬組成物において、前記ペプチドは、ＩＫＩＫＩＫＩＫＩＫＲＧＤＳＫＩＫＩＫＩＫＩＫＩ（配列番号１）のアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００１７】
本発明に係る医薬組成物において、前記関節疾患は、半月板損傷であることが好ましい。
【００１８】
本発明に係る医薬組成物の製造方法は、上記本発明に係る医薬組成物を製造する方法であって、前記ペプチドを含む水溶液を調製する工程と、前記水溶液にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えてペプチドハイドロゲルを生成する工程とを含むことを特徴とする。
【００１９】
本発明者らは、上記のような特徴を有するペプチドの水溶液に対して、種々の濃度のＰＢＳを加えることで、その濃度依存的に生成されるペプチドハイドロゲルの力学的強度を向上できることを見出した。すなわち、本発明に係る医薬組成物の製造方法によると、簡便に上記ペプチドハイドロゲルを作製することができ、さらにＰＢＳの濃度によって、ペプチドハイドロゲルの力学的強度を調整することができる。
【００２０】
本発明に係る医薬組成物の製造方法において、前記リン酸緩衝生理食塩水は、最終濃度が３倍濃度（３×ＰＢＳ）以上となるように前記水溶液に加えられることが好ましい。
【００２１】
このようにすると、貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ’’との差が３９００Ｐａ以上の力学的強度が大きいペプチドハイドロゲルを得ることができる。
【００２２】
本発明に係る医薬組成物の製造方法は、上記本発明に係る医薬組成物を適用する部位に従って、最適な前記ペプチドハイドロゲルの弾性率を調整するために、前記リン酸緩衝生理食塩水の濃度を調整する工程をさらに含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係る医薬組成物及びその製造方法によると、力学的強度が大きいペプチドハイドロゲルを含み、生体組織に移植した際に所望の部位に維持することができて優れた組織再生の促進効果を示す医薬組成物を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】５ｗｔ％ＮａＣｌ水溶液、１×ＰＢＳ、３×ＰＢＳ及び５×ＰＢＳのそれぞれを用いて得られたペプチドハイドロゲルの貯蔵弾性率Ｇ’（左のバー）及び損失弾性率Ｇ’’（右のバー）を示すグラフである。
【図２】（ａ）は本実施例において作製したウサギの半月板の欠損部を示す写真であり、（ｂ）は本実施例において移植するのに用いたペプチドハイドロゲルを示す写真である。
【図３】本実施例で行ったQuantitative Analysis of the Occupation Ratio of Tissue Regeneration（Ｒ／Ｄ  ｒａｔｉｏ）を説明するための写真である。
【図４】ウサギの半月板欠損部にペプチドハイドロゲルを移植した場合（ＫＩ２４ＲＧＤＳ群）及び移植しなかった場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）のそれぞれにおける２、４、８及び１２週後の半月板を示す写真である。
【図５】ウサギの半月板欠損部にペプチドハイドロゲルを移植した２、４、８及び１２週後のサフラニンＯ染色された半月板組織を示す写真である（ＫＩ２４ＲＧＤＳ群）。
【図６】ウサギの半月板欠損部の欠損部作製から２、４、８及び１２週後のサフラニンＯ染色された半月板組織を示す写真である（コントロール群）。
【図７】本実施例におけるＫＩ２４ＲＧＤＳ群とコントロール群の石田スコア（Ishida Score）の結果を示すグラフである。
【図８】本実施例におけるＫＩ２４ＲＧＤＳ群とコントロール群のQuantitative Analysis of the Occupation Ratio of Tissue Regeneration（Ｒ／Ｄ  ｒａｔｉｏ）の結果を示すグラフである。
【図９】ウサギの半月板欠損部にペプチドハイドロゲルを移植した２週後の半月板組織を示す写真及びモデル図であり、（ａ）はＨＥ染色された写真であり、（ｂ）はサフラニンＯ染色された写真であり、（ｃ）は組織再生の様子を示すモデル図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
【００２６】
本発明に係る医薬組成物は、自己組織化したペプチドにより構成されたペプチドハイドロゲルを含有するものであり、特に関節疾患の治療に用いる医薬組成物である。また、本発明に係る医薬組成物において、前記ペプチドは、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸との交互の配列からなるβシート構造と、生物学的活性を有するβターン構造とによって構成されたβヘアピン構造を含むことを特徴とする。
【００２７】
本発明の一実施形態に係る医薬組成物において、ペプチドハイドロゲルとは、親水性表面と疎水性表面とを併せ持つ構造のペプチドが所定の条件で自己組織化された際に水を内包することで得られたハイドロゲルである。また、当該ペプチドハイドロゲルを構成するペプチドは、上述の通りβシートと、βシート同士の間に位置してそれらを結ぶβターンとにより形成されたβヘアピン構造のペプチドである。βシートは、上述のような親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸との交互の配列によって形成されており、親水性表面と疎水性表面とを併せ持つ。本実施形態において、βシートは、リシン（Ｋ）とイソロイシン（Ｉ）との繰り返し配列によって形成されていることが好ましい。
【００２８】
βターンは、通常、ｎ番目のアミノ酸残基のカルボニル酸素原子とｎ＋３番目のアミノ酸残基のアミドプロトンとが水素結合を形成することにより安定したターン構造をいう。βターンを形成するアミノ酸配列は種々存在し、それらは当業者に周知である。本実施形態において、βターンを形成するアミノ酸配列は生物学的活性を有し、当該生物学的活性としては細胞接着活性であることが好ましい。本実施形態において、βターンは、アルギニン‐グリシン‐アスパラギン酸‐セリン（ＲＧＤＳ）配列からなることが好ましい。ＲＧＤＳ配列は、βターンを形成する配列として知られており、さらにＲＧＤＳ配列はフィブロネクチン由来の配列であり、インテグリンαＶβＩと結合し、細胞接着活性を示すことが知られている。
【００２９】
本実施形態において、βヘアピン構造は、上記配列を有するペプチドに対する塩の作用によってβシートの親水性表面（リシン残基）の静電反発を遮蔽することで形成される。βヘアピン構造は、側鎖間による分子内での疎水性相互作用、及びペプチド骨格のカルボニル部分とアミド部分との間の分子内水素結合により安定に形成され、これにより、自己組織化を容易に起こすことができる。
【００３０】
特に、本実施形態において、βヘアピン構造は、ＫとＩとの繰り返し配列同士の間にＲＧＤＳ配列が配置されてなるβヘアピン構造であることが好ましい。βシートにおけるＫ
とＩとの繰り返し数は特に限定はされないが、例えば繰り返し数が５であることが好ましく、従って、本実施形態におけるβヘアピン構造を形成するアミノ酸配列は、ＩＫＩＫＩＫＩＫＩＫＲＧＤＳＫＩＫＩＫＩＫＩＫＩ（ＫＩ２４ＲＧＤＳ：配列番号１）であることが好ましい。
【００３１】
本実施形態において、ペプチドハイドロゲルは、その力学的強度が高いことが好ましい。具体的に、ペプチドハイドロゲルが生体内の所望の移植部分において、周囲に流れ難くなる程度の力学的強度を有することが好ましく、特に、貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ’’との差が３９００Ｐａ以上であることが好ましく、１００００Ｐａ以上であることがより好ましい。
【００３２】
本実施形態に係る医薬組成物において、関節疾患とは、関節において、例えば変形、損傷及び炎症等の異常が生じた疾患をいう。本実施形態において、関節とは、以下に限定されないが、例えば肩、肘、指、股、膝及び足首等の部位における骨同士が接続された部分をいう。本実施形態における関節疾患は、具体的には関節における骨以外の部位の疾患であり、例えば、軟骨、靭帯及び半月板の疾患を含む。
【００３３】
本実施形態に係る医薬組成物は、関節疾患の患部に移植して用いられ、より具体的には関節疾患の部位の欠損部に移植される。欠損部は、疾患自体が原因で欠損された部分であってもよく、また、手術によって積極的に切除されることで生じた部分であってもよい。
【００３４】
本実施形態に係る医薬組成物は、上記ペプチドハイドロゲルの他に医薬的に許容可能な種々の添加剤を含んでいても構わない。但し、当該添加物は、ペプチドハイドロゲルの力学的強度を低減することなく、医薬組成物としての力学的強度を低減しないものであることが好ましい。
【００３５】
本発明に係る医薬組成物の製造方法は、上記のようなペプチドハイドロゲルを調製することを含む方法であり、具体的にはペプチドを含む水溶液を調製する工程と、前記水溶液にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えてペプチドハイドロゲルを生成する工程とを含む。
【００３６】
本発明の一実施形態に係る医薬組成物の製造方法において、ペプチド及びペプチドハイドロゲルは、それぞれ上述の特徴を有するペプチド及びペプチドハイドロゲルである。所望の配列のペプチドは、従来から当業者に周知の方法で合成が可能であり、例えば周知のＦｍｏｃ固相合成法を用いて合成することができる。なお、合成されたペプチドは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の周知の方法で精製されてもよい。その後、得られたペプチドを水に溶解することでペプチド水溶液を調製できる。なお、当該水溶液のペプチド濃度は特に限定されないが、例えば１〜１０％程度に調製することができる。
【００３７】
本実施形態において、上記のように調製された水溶液にＰＢＳを加えることにより、ペプチドハイドロゲルが得られる。具体的に、ＰＢＳ中の塩がペプチドの親水性表面の静電反発を遮蔽し、βヘアピン構造を形成し、ペプチドにおける側鎖間による分子内での疎水性相互作用、及びペプチド骨格のカルボニル部分とアミド部分との間の分子内水素結合により安定となって、自己組織化が容易に起こる。この際に、水溶液中の水を内包して、その結果、ペプチドハイドロゲルが生成される。ペプチドを含む水溶液にＰＢＳを加える場合、当該水溶液と等量のＰＢＳを加えることが好ましい。この場合、所望のＰＢＳの最終濃度の２倍の濃度のＰＢＳを加えることとなる。
【００３８】
本実施形態において、ＰＢＳの濃度は特に限定されないが、ＰＢＳの濃度を上げることによって、得られるペプチドハイドロゲルの力学的強度を上げることができる。但し、Ｐ
ＢＳの濃度を過剰に上げると塩の析出が起こる虞があるため、過剰に濃度を上げることは好ましくない。本実施形態において、例えば１０×ＰＢＳをペプチド含有水溶液と等量で混合することで、最終濃度を５×ＰＢＳにすることが好ましい。なお、１×ＰＢＳは、周知の方法で調製可能であり、例えば８ｇの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．２ｇの塩化カリウム（ＫＣｌ）、１．４４ｇのリン酸水素二ナトリウム及び０．２４ｇのリン酸二水素カリウムに１Ｌの水を加え、塩酸等でｐＨ７．４に調整することにより調製され得る。従って、上記各塩の量を２倍にすることで２×ＰＢＳを調製でき、１０倍にすることで１０×ＰＢＳを調製できる。上記のように、ＰＢＳの濃度を上げることによって、得られるペプチドハイドロゲルの力学的強度を上げることができるため、用いるＰＢＳの濃度を調整することによって、ペプチドハイドロゲルの力学的強度を調整することができる。
【実施例】
【００３９】
以下に、本発明に係る医薬組成物及びその製造方法について詳細に説明するための実施例を示す。
【００４０】
［実施例１：ペプチドハイドロゲルの調製］
まず、本実施例に係るペプチドハイドロゲルを調製するために、ペプチド合成法として常法であるＦｍｏｃ固相合成法を利用して、ＩＫＩＫＩＫＩＫＩＫＲＧＤＳＫＩＫＩＫＩＫＩＫＩのアミノ酸配列からなるペプチド（ＫＩ２４ＲＧＤＳ：配列番号１）を合成した。なお、合成されたペプチドは、周知のＨＰＬＣを用いて単離及び精製を行った。
【００４１】
上記のようにして得られたＫＩ２４ＲＧＤＳペプチド６ｍｇをそれぞれ１００μＬの超純水に溶解させて６％ペプチド水溶液を調製した。
【００４２】
次に、当該ペプチド水溶液に対して等量（１００μＬ）の２×ＰＢＳ、４×ＰＢＳ、６×ＰＢＳ又は１０×ＰＢＳを加えて混合した。従って、混合液中のＰＢＳの最終濃度はそれぞれ１×ＰＢＳ、２×ＰＢＳ、３×ＰＢＳ、５×ＰＢＳとなる。その後、冷暗所で１日間静置した。これにより、ペプチド水溶液中のペプチドがＰＢＳ中の塩の作用により自己組織化を起こし、ペプチドハイドロゲルが得られた。また、比較例として、ゲルの生成に必要な塩を含むものの生体内において毒性を示すと考えられるイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）又は１０ｗｔ％ＮａＣｌ水溶液（最終濃度は５ｗｔ％）を当該ペプチド水溶液に対して等量加えて混合し、冷暗所で１日間静置した。当該比較例においても、ペプチドハイドロゲルが得られた。
【００４３】
［実施例２：ペプチドハイドロゲルの力学的強度の測定］
上記のようにして得られた各ペプチドハイドロゲルの力学的強度を評価するために、各ペプチドハイドロゲルに対して、レオメーター（HAAKE粘度・粘弾性測定装置（HAAKE MARS40）Thermo Scientific製）を用いてレオロジー測定を行った。図１に、レオロジー測定により得られた各ペプチドハイドロゲルの貯蔵弾性率Ｇ’及び損失弾性率Ｇ’’を示す。具体的に、図１はＫＩ２４ＲＧＤＳのペプチドを用い、５ｗｔ％ＮａＣｌ、１×ＰＢＳ、３×ＰＢＳ、５×ＰＢＳにより生成されたペプチドハイドロゲルの測定結果を比較するグラフを示す。
【００４４】
図１に示すように、ペプチドハイドロゲルを生成するための塩として５ｗｔ％ＮａＣｌ水溶液を用いた場合よりも、５×ＰＢＳを用いた方が貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ’’との差が大きく、具体的には貯蔵弾性率Ｇ’は約１５０００であり、損失弾性率Ｇ’’は約８００であり、力学的強度が高い剛性の大きいペプチドハイドロゲルが得られることが明らかとなった。また、図示はしないがＥＭＥＭを用いた場合も５ｗｔ％ＮａＣｌを用いた場合と同程度の結果であった。
【００４５】
また、図１に示すように、ペプチドハイドロゲルの生成のために用いられるＰＢＳの濃度を上げるに従って、貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ’’との差が大きくなり、すなわち力学的強度が高い剛性の大きいペプチドハイドロゲルが得られた。５ｗｔ％ＮａＣｌ水溶液を用いた場合と比較すると、３×ＰＢＳ以上の濃度のＰＢＳを用いると５ｗｔ％ＮａＣｌ水溶液を用いた場合よりも貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ’’との差が大きくなり（３×ＰＢＳで約３９５０、５ｗｔ％ＮａＣｌ水溶液で約３７５０）、力学的強度が高いペプチドハイドロゲルが得られる。以上の結果から、用いるＰＢＳの濃度依存的に得られるペプチドハイドロゲルの剛性を向上できることが明らかとなった。
【００４６】
［実施例３：ペプチドハイドロゲルのウサギ半月板への適用］
次に、ペプチドハイドロゲルを半月板の欠損部に移植することによる半月板再生効果について検討するために、ウサギ半月板欠損モデルを用いてその効果を評価した。その方法及び結果を以下に説明する。
【００４７】
（方法）
まず、６ヶ月齢で体重が３．０〜３．４ｋｇである日本白色家兎のオスを２０羽準備し、それらの両膝の半月板内側前節に直径２．０ｍｍの円柱欠損を作製した（図２（ａ））。また、ＫＩ２４ＲＧＤＳのペプチド及び５×ＰＢＳを用いて上記の方法で作製されたペプチドハイドロゲルを準備し（図２（ｂ））、上記欠損部内に当該ペプチドハイドロゲルを充填した。欠損部にペプチドハイドロゲルを充填した群をＫＩ２４ＲＧＤＳ群とし、欠損部に対して何ら処置を施さなかった群をコントロール群とした。移植後、各群の膝に対してヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）、又はサフラニンＯ染色を用いて組織評価を行った。組織評価は、移植の２、４、８及び１２週後に行い、各評価時期に５羽（１０膝）を評価した。また、組織評価は、石田スコア及びQuantitative Analysis of the Occupation Ratio of Tissue Regeneration（Ｒ／Ｄ  ｒａｔｉｏ）を用いた。石田スコアによる評価は、下記表１に示すような３つの観点においてスコアを付けてその合計により組織修復の程度を評価した。一方、Ｒ／Ｄ  ｒａｔｉｏによる評価は、図３に示すように、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、全体の欠損部の面積（Ｄ）及び修復組織の面積（Ｒ）を分析し、Ｒ／Ｄの比率を算出することで組織修復の程度を評価した。
【００４８】
【表１】
2020188833.tif 000013
【００４９】
（結果）
図４にＫＩ２４ＲＧＤＳ群及びコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）群の移植後２、４、８及び１２週後における半月板の写真を示し、図５にＫＩ２４ＲＧＤＳ群の移植後２、４、８及び１２週後におけるサフラニンＯ染色された半月板欠損部の写真を示し、図６にコントロール群における欠損部作製後２、４、８及び１２週後におけるサフラニンＯ染色された半月板欠損部の写真を示す。また、図７に各群における石田スコアの結果を示し、図８にＲ／Ｄ  ｒａｔｉｏの結果を示す。さらに、図９にＫＩ２４ＲＧＤＳ群の移植後２週後におけるＨＥ染色及びサフラニンＯ染色された半月板欠損部の写真、並びにペプチドハイドロゲルによる組織再生の過程のモデル図を示す。
【００５０】
図４に示すように、半月板の肉眼所見において、ＫＩ２４ＲＧＤＳ群では移植後２、４、８及び１２週後と経過するに従って、欠損部（図中の矢印で示す部分）が小さくなり、修復されることが明らかである。一方、コントロール群では、欠損部作製から２、４、８及び１２週後と経過するに従って欠損部が小さくなるものの、ＫＩ２４ＲＧＤＳ群と比較して明らかに修復の程度が低く、１２週後においても半月板を貫通する穴の存在が認められた。
また、半月板組織をサフラニンＯにて染色した写真においても、図５に示すように、ＫＩ２４ＲＧＤＳ群では移植後２、４、８及び１２週後と経過するに従って、欠損部に細胞が集まり組織が修復されたことが明らかである。一方、図６に示すように、コントロール群ではＫＩ２４ＲＧＤＳ群と比較して明らかな修復の様子が認められなかった。これは、図７に示す石田スコア及び図８に示すＲ／Ｄ  ｒａｔｉｏの結果からも明らかであり、移植後２、４、８及び１２週のいずれの段階においてもコントロール群よりもＫＩ２４ＲＧＤＳ群の方が石田スコア及びＲ／Ｄ  ｒａｔｉｏが高く、組織の修復がより進んでいることが示唆された。
【００５１】
次に、図９を参照して半月板欠損部へのペプチドハイドロゲルの移植による組織再生の過程について説明する。図９（ａ）はＫＩ２４ＲＧＤＳ群の移植後２週後における半
月板組織のＨＥ染色写真であり、図９（ｂ）はサフラニンＯ染色写真を示す。理解を容易にするためのモデル図を図９（ｃ）に示す。図９（ａ）〜（ｃ）に示されるように、欠損部にペプチドハイドロゲルが充填されることにより、ペプチドハイドロゲルが足場となり、欠損部に隣接する組織から細胞がペプチドハイドロゲルの周縁を伝って遊走する。これにより、欠損部に半月板組織に分化可能な細胞が集まって組織を再生すると考えられる。
【００５２】
以上の結果より、本実施例に係るペプチドハイドロゲルは、力学的強度が大きく、関節組織の組織欠損部に移植した際に当該欠損部に維持することができて、欠損部において優れた組織再生の促進効果を示すことができるため、関節疾患等の再生療法に極めて有用である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己組織化したペプチドにより構成されたペプチドハイドロゲルを含有し、
前記ペプチドは、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸との交互の配列からなるβシート構造と、生物学的活性を有するβターン構造とによって構成されたβヘアピン構造を含み、
前記ペプチドハイドロゲルは、貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ’’との差が１００００Ｐａ以上である関節疾患治療用の医薬組成物。
【請求項２】
前記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記関節疾患は、半月板損傷である請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ペプチドを含む水溶液を調製する工程と、
前記水溶液にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えてペプチドハイドロゲルを生成する工程とを含み、
前記リン酸緩衝生理食塩水は、最終濃度が５倍濃度（５×ＰＢＳ）以上となるように前記水溶液に加えられる請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物を製造する方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物を適用する部位に従って、最適な前記ペプチドハイドロゲルの弾性率を調整するために、前記リン酸緩衝生理食塩水の濃度を調整する工程をさらに含む請求項４に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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