(57)【要約】      （修正有）【課題】魚にその食餌サイクルにわたって水産養殖試料組成物を与えることにより、水産養殖魚肉製品を持続的に生産する方法を提供する。【解決手段】組成物中の魚油のすべてまたは一部をエイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）およびドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）の単一の微生物源と置き換えることにより、水産養殖試料組成物を配合する。好ましい実施形態では、ＤＨＡおよびＥＰＡを含む微生物源は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）またはトラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の微生物／微細生物から得られる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、水産養殖の分野内にある。より具体的には、本発明は、魚にその食餌サイクルにわたって、少なくとも低下された量の魚油を含む水産養殖試料組成物を与えることにより、水産養殖魚肉製品を持続的に生産する方法に関連する。
【０００２】
水産養殖は、制御された環境における水生の動物および植物の繁殖、培養、および販売を含む農業の形態である。水産養殖業は、現在、世界中で最も急速に成長している食料生産部門である。世界の水産養殖は、約６千万トンの海産物を生産し、これは年間７００億（米国）ドルを超える価値がある。今日、養殖魚は、全世界で消費されるすべての魚の約５０％を占める。この割合は、海洋と淡水環境との両方における捕獲漁業からの漁獲量の漸減、および海産物消費（すなわち、合計および一人当たり）の増大の結果として増大すると予想される。今日、水産養殖生産における種群としては、例えば、以下が挙げられる：コイおよび他のコイ科の魚；カキ；ハマグリ（ｃｌａｍ）、ザルガイ、およびフネガイ；海老および蝦；サケ、マス、およびキュウリウオ；イガイ；ティラピアおよび他のカワスズメ科の魚；ならびにホタテガイ。
【０００３】
いくつかの水産養殖される種（例えばティラピア）は、完全に菜食の食餌で飼育することができるが、多くの他の種は肉食の食餌を与えられる。一般的に、肉食性の魚のための試料は、小さい浮魚（主にアンチョビー、マアジ、プタスダラ、カラフトシシャモ、イカナゴ、およびメンヘーデン）の野生で捕獲された種由来の魚粉および魚油を含む。これらの浮魚は魚粉および魚油に加工され、最終製品は、多くの場合、魚の大きさに応じてペレット化されたまたはフレーク状にされた試料となる。水産養殖試料組成物の他の構成要素としては、必要に応じて、植物性タンパク質、ビタミン、ミネラル、および色素を含めることができる。
【０００４】
海産魚の油は、その入手しやすさ、価格競争力、およびこの製品に含有される必須脂肪酸の豊富さを前提として、市販の魚類試料中の独占的な食餌用脂質源として従来使用されてきた。さらに、魚油は、魚の正常な成長、健康、生殖、および生体機能のために必要とされる必須脂肪酸を容易に供給する。より具体的には、魚類を含めたすべての脊椎動物種は、オメガ−６とオメガ−３多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］との両方の食餌的必要性を有する。エイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」；シス−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸；オメガ−３］およびドコサヘキサエン酸［「ＯＨＡ」；シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸；２２：６オメガ−３］は、魚の成長および健康に必要であり、魚油の添加を介して市販の魚類試料にしばしば組み込まれる。
【０００５】
水産養殖試料組成物は、現在、脂質源として約８７％の総供給量の魚油を使用することが推定される。年間の魚油生産は１年あたり１５０万トンを超えないため、急速に成長している水産養殖業は、魚油の供給物としての海洋浮魚の限りあるストックに依存し続けることができない。したがって、魚肉生産に対する高まる世界的需要に対応することが可能である、魚油に対する持続可能な代替物を発見および実行する重大な緊急性が存在する。
【０００６】
多くの組織は、魚油の入手可能性および水産養殖持続可能性に関する上に記載された限界を認識している。例えば、アメリカ合衆国では、アメリカ海洋大気庁（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｃｅａｎｉｃ  ａｎｄ  Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）は、「養殖された海産物の重要なヒト健康効果を維持しつつ、水産養殖試料に含有される魚粉および魚油の量を低下させることとなる、代替の食餌用成分を特定する．．．」ために、代替飼料に関する発議（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｆｅｅｄｓ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ）において、農務省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）と提携している。
【０００７】
米国特許第７，９３２，０７７号明細書は、組み換えによって作られたヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が、必要なオメガ−３および／またはオメガ−６  ＰＵＦＡを提供するための手段として、またその独特のタンパク質：脂質：炭水化物組成、ならびに独特の複合炭水化物プロフィール（およそ１：４：４．６の比のマンナン：ベータグルカン：キチンを含む）に基づき、水産養殖試料を含めた多くの動物試料への有用な添加物であり得ることを示唆している。
【０００８】
米国特許出願公開第２００７／０２２６８１４号明細書は、微生物を発酵させることから得られる少なくとも１種のバイオマス（ここで、バイオマスは、総脂肪酸含有量に対して少なくとも２０％のＤＨＡを含有する）を含有する魚の食料を開示している。ＤＨＡの原料として使用される好ましい微生物は、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）属に属する生物である。
【０００９】
成長している水産養殖業が、ヒト摂取に対する健康効果を提供し続ける水産養殖魚肉製品を生産しつつ、世界の魚供給へのその寄与を維持するべきである場合、世界の魚供給のより生態学的に健全な管理業務の採用と共に、使用する野生の魚の低下が必要とされる。
【００１０】
［発明の概要］
一実施形態では、本発明は、魚にその食餌サイクルにわたって水産養殖試料組成物を与えることにより、水産養殖魚肉製品を持続的に生産する方法であって、組成物中の魚油のすべてまたは一部をエイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）およびドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）の単一の微生物源と置き換えることにより、水産養殖試料組成物を配合するステップを含む方法に関する。
【００１１】
好ましい実施例では、ＤＨＡおよびＥＰＡを含む微生物源は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種の天然の微細生物の本来の能力に基づくプロセスを使用して産生される。
【００１２】
第２の実施形態では、本発明は、魚にその食餌サイクルにわたって水産養殖試料組成物を与えることにより、水産養殖魚肉製品を持続的に生産する方法に関し、ここで、水産養殖試料組成物は、水産養殖試料組成物に対する重量パーセントとして測定されて少なくとも約０．８％である総量の前記微生物源由来のＥＰＡおよびＤＨＡを含む。
【００１３】
第３の実施形態では、本発明は、魚にその食餌サイクルにわたって、ＥＰＡおよびＤＨＡの微生物油の原料を含む水産養殖試料組成物を与えることにより、水産養殖魚肉製品を持続的に生産する方法に関し、ここで、微生物油は、以下からなる群から選択される形態で提供される：いずれもある微細生物から得られるバイオマス、処理されたバイオマス、部分的に精製された油、および精製された油。
【００１４】
第４の実施形態では、本発明は、魚試料製品のための試料添加組成物に関し、前記添加組成物は、エイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）およびドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）の単一の微生物源を含む。
【００１５】
第５の実施形態では、本発明は、ＥＰＡおよびＤＨＡを含有する微生物添加組成物を含む水産養殖試料に関し、ここで、微生物添加は、ある単一の微細生物から得られる。
【００１６】
第６の実施形態では、本発明は、魚にその食餌サイクルにわたって水産養殖試料組成物を与えることにより、水産養殖魚肉製品を持続的に生産する方法であって、組成物中の魚油のすべてまたは一部をエイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）およびドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）の単一の微生物源と置き換えることにより、水産養殖試料組成物を配合するステップを含む方法に関し、ここで、前記微細生物は、ＥＰＡおよびＤＨＡを含む微生物油を含有する多価不飽和脂肪酸の生成のために遺伝子操作されたトランスジェニック微細生物である。
【００１７】
好ましくは、トランスジェニック微細生物は、トラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目の微生物である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】段階量のＯｖｅｇａＧｏｌｄを添加された食餌におけるＤＨＡの見かけの消化性である。統計分析の結果を表６に示す。
【図２】段階量のＯｖｅｇａＧｏｌｄを添加された食餌におけるＥＰＡの見かけの消化性である。統計分析の結果を表６に示す。
【図３】段階量のＯｖｅｇａＧｏｌｄを添加された食餌におけるＤＨＡの見かけの消化性である。統計分析の結果を表６に示す。
【図４】実験食餌を与えたおよそ４週後のオメガ−３脂肪酸の筋肉沈着である。筋肉含有量は、微細藻類源からのオメガ−３脂肪酸の高い生物学的利用能を裏付ける。
【００１９】
［詳細な説明］
本開示では、いくつかの用語および略語が使用される。次の定義が提供される：
「多価不飽和脂肪酸」は、「ＰＵＦＡ」と省略される。
「トリアシルグリセロール」は、「ＴＡＧ」と省略される。
「総脂肪酸」は、「ＴＦＡ」と省略される。
「脂肪酸メチルエステル」は、「ＦＡＭＥ」と省略される。
「乾燥細胞重量」は、「ＤＣＷ」と省略される。
【００２０】
本明細書で使用する場合、用語「発明」または「本発明」は、特許請求の範囲および本明細書に記載される通りの本発明のすべての態様および実施形態を指すものとし、いかなる特定の実施形態または態様にも限定されるように解釈されるべきではない。
【００２１】
魚の「食餌サイクル」という用語は、魚が食餌または水産養殖生産中に水産養殖試料を与えられる、成長の期間またはステージ（すなわち成長ステージ）を指す。タイセイヨウサケ（Ａｔｌａｎｔｉｃ  Ｓａｌｍｏｎ）についての食餌サイクルの例を下の表１に示す。この表では、記述された開始時および終了時重量に対応する６つのステージが存在する。ステージの番号、ならびに各ステージについての魚の開始時および終了時重量の観点での食餌サイクルは、魚の様々な種類および／または様々な水産養殖業務によって異なり得る。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
用語「水産養殖試料組成物」、「水産養殖試料配合物」、「水産養殖試料」、および「水産試料」は、本明細書では交換可能に使用される。これらは、水産養殖業における天然の試料を補うためのまたは置き換えるための製造されたまたは人工的な食餌（すなわち、配合された試料）を指す。これらの調製済み食品は、最も一般的には、フレーク、ペレット、またはタブレット形態で製造される。一般的に、水産養殖試料組成物は、養殖される魚および甲殻類（すなわち、より低価格の食糧用魚種［例えば、コイ、ティラピア、およびナマズなどの淡水魚］と、贅沢または隙間市場のためのより高価格の換金種［例えば、海老、サケ、マス、イエローテール、シーバス、タイ、およびハタなどの、主として海洋および回遊性の種］との両方）のために有用である、人工的に組み合わせた試料を指す。これらの配合された試料は、互いに補い合って、水産養殖される種にとって栄養的に完全な食餌を形成する様々な割合の成分からなる。水産養殖試料組成物は、多くの場合、ヒト摂取のために販売される回収可能な水産養殖される種（例えば、魚、甲殻類）である「水産養殖製品」の製造で使用される。例えば、サケは、水産養殖において集約的に産生されるため、水産養殖製品である。
【００２４】
用語「水産養殖魚肉製品」は、上で定義した通りの水産養殖製品からの魚肉の少なくとも一部分を含む、ヒト摂取を目的とする食料製品を指す。水産養殖魚肉製品は、例えば、魚全体または魚から切り出された切り身（これらはそれぞれ食品として摂取することができる）であり得る。
【００２５】
「エイコサペンタエン酸」［「ＥＰＡ」］は、ｅｉｓ−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸に対する一般名称である。この脂肪酸は、２０：５オメガ−３脂肪酸である。本開示において使用される場合の用語ＥＰＡは、別に特に言及のない限り、酸または酸の誘導体（例えば、グリセリド、エステル、リン脂質、アミド、ラクトン、塩など）を指すこととなる。
【００２６】
「ドコサヘキサエン酸」［「ＤＨＡ」］は、ｅｉｓ−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸に対する一般名称である。この脂肪酸は、２２：６オメガ−３脂肪酸である。本開示において使用される場合の用語ＤＨＡは、別に特に言及のない限り、酸または酸の誘導体（例えば、グリセリド、エステル、リン脂質、アミド、ラクトン、塩など）を指すこととなる。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「添加組成物」は、以下からなる群から選択される形態で提供される微生物源から得られる材料を指す：いずれもある単一の微細生物から得られるバイオマス、処理されたバイオマス、部分的に精製された油、および精製された油。
【００２８】
本明細書で使用する場合、用語「バイオマス」は、微生物細胞材料を指す。バイオマスは、自然の状態で産生させることもでき、または天然の宿主もしくは突然変異株もしくは組み換え型産生宿主の発酵から生じることもできる。バイオマスは、全細胞、全細胞溶解物、ホモジナイズされた細胞、部分的に加水分解された細胞材料、および／または部分的に精製された細胞材料（例えば、微生物によって産生された油）の形態であり得る。用語「処理されたバイオマス」は、乾燥、低温殺菌、破砕などの追加の処理（これらをそれぞれ下でより詳細に論じる）を受けているバイオマスを指す。
【００２９】
用語「脂質」は、あらゆる脂溶性の（すなわち親油性の）天然に存在する分子を指す。脂質の一般的概要は、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に提供されている。用語「油」は、２５℃で液体であり、かつ通常、多価不飽和である脂質物質を指す。
【００３０】
用語「抽出された油」は、油が合成された微生物などの細胞材料から分離された油を指す。抽出された油は、非常に様々な方法（そのうちの最も単純なものは、物理的手段のみを含む）を通して得られる。例えば、様々なプレス形状（例えば、スクリュー、エキスペラー、ピストン、ビードビーターなど）を使用する機械破砕は、油を細胞材料から分離することができる。あるいは、油抽出は、様々な有機溶媒（例えばヘキサン）での処理を介して、酵素抽出を介して、浸透圧衝撃を介して、超音波抽出を介して、超臨界流体抽出（例えばＣＯ２抽出）を介して、鹸化を介して、およびこれらの方法の組み合わせを介して行うことができる。抽出された油は、さらに精製または濃縮することができる。
【００３１】
「魚油」は、油分の多い魚の組織から得られる油を指す。油分の多い魚の例としては、限定はされないが、メンヘーデン、アンチョビー、ニシン、カラフトシシャモ、タラなどが挙げられる。魚油は、水産養殖において使用される試料の代表的な構成要素である。
【００３２】
「植物油」は、植物から得られるあらゆる食用油を指す。一般的に、植物油は、植物の種子または穀粒から抽出される。用語「トリアシルグリセロール」［「ＴＡＧ」］は、エステル化されてグリセロール分子となる、３つの脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す。
【００３３】
ＴＡＧは、長鎖ＰＵＦＡおよび飽和脂肪酸、並びにより短い鎖の飽和および不飽和脂肪酸を含有することができる。「中性脂質」は、貯蔵脂肪としての脂肪体中の細胞内に普通に見られる脂質を指し、そのように呼ばれる理由は、細胞内ｐＨでは、脂質が、電荷を有しない基を有するからである。これらは、一般に完全に非極性であり、水に対する親和性を有しない。中性脂質は、一般に、グリセロールと脂肪酸とのモノ−、ジ−、および／またはトリエステル（それぞれモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、またはトリアシルグリセロール、まとめてアシルグリセロールとも呼ばれる）を指す。アシルグリセロールから遊離の脂肪酸を放出させるために、加水分解反応が行われなければならない。
【００３４】
用語「総脂肪酸」［「ＴＦＡ」］は、本明細書では、所与の試料（これは、例えばバイオマスまたは油であり得る）における、塩基によるエステル交換反応方法（当技術分野で公知である通り）によって脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に誘導体化させることができる、すべての細胞内脂肪酸の総和を指す。したがって、総脂肪酸には、中性の脂質分画（ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、およびＴＡＧが含まれる）由来の、および極性の脂質分画（例えば、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン分画が含まれる）由来の脂肪酸が含まれるが、遊離の脂肪酸は含まれない。
【００３５】
細胞の「総脂質含有量」という用語は、乾燥細胞重量［「ＤｅＷ」］に対するパーセントとしてのＴＦＡの尺度であるが、総脂質含有量は、ＤｅＷに対するパーセントとしてのＦＡＭＥの尺度［「ＦＡＭＥ（％ＤｅＷ）」］と近似することができる。したがって、総脂質含有量［「ＴＦＡ（％ＤｅＷ）」］は、例えば、１００ミリグラムのＤｅＷあたりの総脂肪酸のミリグラムと等しい。
【００３６】
総脂質中の脂肪酸の濃度は、本明細書では、ＴＦＡに対する重量パーセント（％ＴＦＡ）、例えば、１００ミリグラムのＴＦＡあたりの所与の脂肪酸のミリグラムとして表される。本明細書の開示において別に特に記述のない限り、総脂質に関する所与の脂肪酸のパーセントへの言及は、％ＴＦＡとしての脂肪酸の濃度と等しい（例えば、総脂質の％ＥＰＡは、ＥＰＡ（％ＴＦＡ）と等しい）。
【００３７】
場合によっては、乾燥細胞重量に対するその重量パーセントとしての細胞内の所与の脂肪酸の含有量（％ＤＣＷ）を表すことが有用である。したがって、例えば、エイコサペンタエン酸（％ＤＣＷ）は、次の式に従って決定されることとなる：（エイコサペンタエン酸（％ＴＦＡ））＊（ＴＦＡ（％ＤＣＷ））］／１００。しかし、乾燥細胞重量に対するその重量パーセントとしての細胞内の所与の脂肪酸の含有量（％ＤＣＷ）は、（エイコサペンタエン酸（％ＴＦＡ））＊（ＦＡＭＥ（％ＤＣＷ））］／１００と近似することができる。
【００３８】
用語「脂質プロフィール」および「脂質組成」は、交換可能であり、特定の脂質分画、例えば総脂質または油に含有される個々の脂肪酸の量を指し、ここで、この量は、ＴＦＡに対する重量パーセントとして表される。混合物中に存在するそれぞれ個々の脂肪酸の合計は１００であるべきである。
【００３９】
用語「ブレンドされた油」は、所望の組成物を得るために、本明細書に記載した抽出された油を、任意の組み合わせの油または個々の油と混合またはブレンドすることによって得られる油を指す。したがって、例えば、異なる微細生物からの種類の油を共に混合して、所望のＰＵＦＡ組成物を得ることができる。あるいはまたはさらに、本明細書に開示されるＰＵＦＡを含有する油を、魚油、植物油、または両方の混合物とブレンドして、所望の組成物を得ることができる。
【００４０】
用語「脂肪酸」は、約Ｃ１２〜Ｃ２２の様々な鎖長の長鎖脂肪族酸（アルカン酸）を指すが、より長い鎖長の酸およびより短い鎖長の酸の両方も知られている。主な鎖長はＣ１６〜Ｃ２２である。脂肪酸の構造は、「Ｘ：Ｙ」（ここで、Ｘは、その特定の脂肪酸内の炭素［「Ｃ」］原子の総数であり、Ｙは、二重結合の数である）という簡単な表記法によって表される。「飽和脂肪酸」と「不飽和脂肪酸」、「一価不飽和脂肪酸」と「多価不飽和脂肪酸」［「ＰＵＦＡ」］、および「オメガ−６」脂肪酸」［「００−６」または「ｎ−６」］と「オメガ−３脂肪酸」［「００−３」または「ｎ−３」］との区別に関するさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２３８，４８２号明細書に提供されている。
【００４１】
「魚粉」は、水産養殖試料組成物用のタンパク質源を指す。魚粉は、一般的に、ヒト摂取のための魚（例えば、サケ、マグロ）の加工に伴う漁業系廃棄物から製造されるか、または魚粉を製造する目的でのみ採取される特定の魚（すなわち、ニシン、メンヘーデン）から製造される。
【００４２】
水産養殖は、水生の動物および植物を育てる業務である。これは、制御された条件下で水生製品（例えば、淡水および塩水動物）を養殖することを含む。これは、淡水、淡海水、または海水中で魚、貝類、および水生植物を成長させるおよび回収することを含む。
【００４３】
水産養殖において生育させる生物には、魚および甲殻類が含まれ得る。甲殻類は、例えば、ロブスター、カニ、海老、蝦、およびザリガニである。魚の養殖は、水産養殖の最も一般的な形態である。
【００４４】
水産養殖は、通常、食品用に、タンク、池、または海洋の囲いの中で、魚を商業的に飼育することを含む。幼魚を遊漁のために、またはある種類の自然数を補うために野生に逃がす設備は、一般に、魚の孵化場と称される。特に対象となるのは、サケ科のグループ、例えば、サクラマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍａｓｏｕ）、チヌークサーモン（Ｏ．ｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ）、シロザケ（Ｏ．ｋｅｔａ）、ギンザケ（Ｏ．ｋｉｓｕｔｃｈ）、カラフトマス（Ｏ．ｇｏｒｂｕｓｃｈａ）、ベニザケ（Ｏ．ｎｅｒｋａ）、およびタイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）の魚である。水産養殖のための対象となる他の魚としては、限定はされないが、様々なマス、ならびに白身魚、例えばティラピア（オレオクロミス（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ）、サロテロドン（Ｓａｒｏｔｈｅｒｏｄｏｎ）、およびティラピアの様々な種が含まれる）、シーバス、ナマズ（ナマズ目）、メバチ（Ｔｈｕｎｎｕｓ  ｏｂｅｓｕｓ）、コイ（コイ科）、およびタラ（マダラ属）などが挙げられる。
【００４５】
水産養殖は、一般的に、養殖される動物の食餌要件を満たすための調製された水産養殖試料組成物を必要とする。異なる水産養殖種の食餌要件は、異なる成長ステージ中の単一の種の食餌要件が異なるのと同様に異なる。したがって、養殖される生物の成長の各ステージに対する各水産養殖試料組成物を最適化することを目指して、多大な研究に投資が行われている。
【００４６】
水産養殖試料組成物は、微量構成要素と多量構成要素とからなる。一般に、１％よりも多いレベルで使用されるすべての構成要素は、多量構成要素とみなされる。１％未満のレベルで使用される試料成分は、微量構成要素である。これらは、全試料中の微量構成要素の均一な分布を実現するために予備混合される。多量成分および微量成分の両方とも、栄養機能および技術的機能を有する構成要素に細分割される。
【００４７】
技術的機能を有する構成要素は、水産養殖試料組成物の物理的品質またはその外観を改善する。
【００４８】
栄養機能を有する多量構成要素は、水生動物に、成長および能力に必要とされるタンパク質およびエネルギーを提供する。魚に関して、水産養殖試料組成物は、理想的には魚に以下を提供するべきである：１）エネルギーのための（特に心筋および骨格筋のための）脂肪酸の原料としての機能を果たす脂肪；および２）タンパク質の構成成分としての機能を果たすアミノ酸。脂肪はまた、ビタミン吸収を促進し、例えば、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、およびＫは、脂溶性であり、脂肪を伴って初めて消化、吸収、および輸送されることが可能である。一般的に植物起源の炭水化物（例えば、コムギ、ヒマワリミール、トウモロコシグルテン、ダイズミール）も試料組成物中にしばしば含まれるが、炭水化物は、魚にとってタンパク質または脂肪を上回るエネルギー源ではない。
【００４９】
脂肪は、一般的に、魚粉（微量の魚油を含有する）および魚油の水産養殖試料組成物への組み込みを介して提供される。水産養殖試料組成物に使用することができる抽出された油としては、魚油（例えば、油分の多い魚、メンヘーデン、アンチョビー、ニシン、カラフトシシャモ、およびタラ肝臓由来）、および植物油（例えば、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ種子、および亜麻仁由来）が挙げられる。一般的に、魚油は好ましい油である。なぜなら、魚油は、長鎖オメガ−３多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］、ＥＰＡ、およびＤＨＡを含有し、一方で植物油は、ＥＰＡおよび／またはＤＨＡの原料を提供しないからである。これらのＰＵＦＡは、多くの水産養殖産物の成長および健康のために必要とされる。典型的な水産養殖試料組成物は、水産養殖試料組成物に対する重量パーセントとして測定されて約１５〜３０％の油（例えば、魚、野菜など）を含むこととなる。
【００５０】
典型的な魚油において提供されるＥＰＡの量（総脂肪酸のパーセント［「％ＴＦＡ」］としての）およびＤＨＡ（％ＴＦＡ）は、ＥＰＡ対ＤＨＡの比が異なるのと同様に異なる。Ｔｕｒｃｈｉｎｉ、Ｔｏｒｓｔｅｎｓｅｎ、およびＮｇの研究（「Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ」１：１０−５７（２００９））に基づく典型的な値を表２にまとめて示す。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
水産養殖試料組成物中で供給されるタンパク質は、植物または動物起源のものであり得る。例えば、動物起源のタンパク質は、海洋動物（例えば、魚粉、魚油、魚タンパク質、オキアミ粉末、ムール貝粉末、むき海老、イカ粉末、イカ油など）または陸生動物（例えば、血粉、卵粉末、肝臓粉末、肉粉、肉骨粉、カイコ、蛹粉末、乳清粉末など）由来であり得る。植物起源のタンパク質には、ダイズミール、トウモロコシグルテンミール、小麦グルテン、綿実粕、ナタネ粕、ヒマワリ粕、コメなどが含まれ得る。
【００５３】
多量構成要素の技術的機能は、例えば、小麦グルテンをペレット化助剤として、またそのタンパク質含有量（これは比較的高い栄養価を有する）のために使用することができるように重複している可能性がある。グアーガムおよびコムギ粉についても言及することができる。
【００５４】
微量構成要素としては、ビタミン、微量元素、試料抗生物質、および他の生物学的薬剤などの試料添加物が挙げられる。１００ｍｇ／ｋｇ（１００ｐｐｍ）未満のレベルで使用される元素は、微量元素または痕跡元素とみなされる。
【００５５】
栄養機能を有する微量構成要素は、すべて生物学的薬剤かつ痕跡元素である。これらは生物学的プロセスに関与し、良好な健康状態および高い能力のために必要とされる。ビタミンＡ、Ｅ、Ｋ３、Ｄ３、Ｂ１、Ｂ３、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、ビオチン、葉酸、パントテン酸、ニコチン酸、塩化コリン、イノシトール、およびパラ−アミノ−安息香酸などのビタミンについても言及することができる。カルシウム、コバルト、銅、鉄、マグネシウム、リン、カリウム、セレン、および亜鉛の塩などの元素についても言及することができる。他の構成要素としては、限定はされないが、酸化防止剤、ベータ−カロテノイド、胆汁酸塩、コレステロール、酵素、グルタミン酸モノナトリウム、カロテノイドなどが含まれ得る。
【００５６】
微量成分の技術的機能は、主に、ペレット化、無毒化、カビ予防、抗酸化などに関する。
【００５７】
水産養殖では、一般的に、魚は、それが成長するにつれて、異なる食餌サイクルで飼育される。例えば、タイセイヨウサケは、上の表１に示した通り、１００グラムから４キログラムまで成長する間、６つの異なる食餌サイクルで飼育することができる。異なる食餌サイクルの魚の重量は、魚の種類および／または使用される水産養殖業務に応じて異なり得る。
【００５８】
第２の態様では、水産養殖試料組成物は、水産養殖試料組成物に対する重量パーセントとして測定されて少なくとも約０．８％である微生物源由来の総量のＥＰＡおよびＤＨＡを含むことができる。この量（すなわち０．８％）は、一般的に、水産養殖において成長させる様々な動物の成長を補助するのに適した、特にサケ科の魚の食餌への包含に適した適切な最小濃度である。
【００５９】
先に論じた通り、魚油（すなわちアンチョビー油）における最も高いＥＰＡ：ＤＨＡ比は１．９３：１であり（Ｔｕｒｃｈｉｎｉ、Ｔｏｒｓｔｅｎｓｅｎ、およびＮｇ、上記）、魚油における最も低いＥＰＡ：ＤＨＡ比は１．２１：１であった。したがって、市販品として入手できる水産養殖試料組成物は、１．９３：１よりも大きい、または１．２１：１よりも小さいＥＰＡ：ＤＨＡ比を有して生産されていることはないと考えられる。２：１よりも大きい、または１．２：１よりも小さいＥＰＡ：ＤＨＡ比を実現するために、本明細書に記載した通り、代替のＥＰＡおよびＤＨＡ源が必要とされる。
【００６０】
一実施例では、本発明の水産養殖試料組成物は、あるＥＰＡおよびＤＨＡ源を含み、ここで、ＥＰＡ：ＤＨＡの比は、それぞれ微生物源中または水産養殖試料組成物中の総脂肪酸に対する重量パーセントとして測定されるＥＰＡおよびＤＨＡの個々の濃度に基づいて２：１よりも大きい。
【００６１】
別の実施例では、本発明の水産養殖試料組成物は、あるＤＨＡおよびＥＰＡ源を含み、ここで、ＥＰＡ：ＤＨＡの比は、それぞれ微生物源中または水産養殖試料組成物中の総脂肪酸に対する重量パーセントとして測定されるＥＰＡおよびＤＨＡの個々の濃度に基づいて１：１よりも小さく、好ましくは０．２：１〜１：１である。
【００６２】
本発明の水産養殖試料組成物を製造するためのほとんどのプロセスは、微生物発酵から始めることとなり、ここで、特定の微生物が成長ならびにＥＰＡおよびＤＨＡを含む微生物油の産生を可能にする条件下で培養される。適切な時期に微生物細胞を発酵容器から回収する。この微生物バイオマスは、脱水、乾燥、機械的破砕、ペレット化などの様々な手段を使用して機械的に処理することができる。次いで、このバイオマス（またはそれから抽出された油）を水産養殖試料中の成分として（好ましくは、標準の水産養殖試料組成物中に使用される魚油の少なくとも一部分の代替として）使用する。次いで、この水産養殖試料を水生の動物にその生涯のある部分にわたって与えて、水産養殖試料からのＥＰＡおよびＤＨＡが水生の動物内に蓄積するようにした。それにより、回収後に得られる水産養殖魚肉製品は、２：１以上または１：１以下である比のＥＰＡ／ＤＨＡを含むこととなる。これらの態様のそれぞれを下にさらに詳細に論じることとする。
【００６３】
本発明によるＥＰＡおよびＤＨＡを含む微生物油は、本明細書の水産養殖試料組成物における使用のための様々な形態で提供することができ、ここで、微生物油は、一般的に、微生物バイオマスもしくは処理されたバイオマス内に含有され、または微生物油は、部分的に精製されたもしくは精製された油である。多くの場合、微生物油（部分的に精製されたまたは精製された形態の）とは異なり、水産養殖試料組成物に微生物バイオマスまたは処理されたバイオマスを組み込むことが最も費用効率的となる。しかし、これらの経済面は本明細書の限定とみなされるべきではない。
【００６４】
本発明による微生物は、藻類、菌類、または酵母である。好ましい微細生物は、トラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目の微生物であるトラウストキトリッド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）である。トラウストキトリッド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）には、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）およびトラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のメンバーが含まれ、ＤＨＡおよびＥＰＡを含めたオメガ−３脂肪酸の代替源と認識されている。米国特許第５，１３０，２４２号明細書を参照されたい。
【００６５】
好ましい実施形態では、微生物は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種の突然変異株である。シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）系統は、ＤＨＡなどのＰＵＦＡの天然の原料であり、本発明による微生物源として使用されるように変異誘発によって最適化することができる。
【００６６】
ＤＨＡおよびＥＰＡを産生するシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）系統は、連続的な変異誘発、それに続く優れたＥＰＡおよびＤＨＡ産生、ならびに特定のＥＰＡ：ＤＨＡ比を示す突然変異株の適切な選択によって得ることができる。出発する野生型系統としては、世界中の種々の微生物株保存機関、例えばＡＴＣＣおよびオランダ微生物株保存センター（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢＳ）に寄託されているものが含まれる。一般的に、望ましい突然変異株を得るために、連続的な２ラウンド以上の変異誘発を実施する必要がある。
【００６７】
酵母細胞に対する遺伝子変化を誘発することが可能な任意の化学薬品または非化学的因子（例えば紫外線（ＵＶ）照射）を変異原として使用することができる。これらの因子は、単独でまたは互いに組み合わせて使用することができ、化学薬品は、そのまま、または溶媒と共に使用することができる。
【００６８】
例えば、ある系統を商業的に実現可能である量で、かつ２：１以上であるＥＰＡ：ＤＨＡ比で、および少なくとも約２．２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１、５：１、５．５：１、６：１、６．５：１、７：１、７．５：１、８：１、８．５：１、９：１、９．５：１、もしくは１０：１またはそれよりも大きい比でＥＰＡおよびＤＨＡを産生するように変異させ、かつ選択することができる。あるいは、その系統を商業的に実現可能である量で、かつ１：１以下であるＥＰＡ：ＤＨＡ比で、および約０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０：２：１、またはそれよりも小さい比でＥＰＡおよびＤＨＡを産生するように変異させ、かつ選択することができる。
【００６９】
代わりに、本発明による微生物源は、ＰＵＦＡの産生のために遺伝的に形質転換された微細生物によって産生することができる。任意選択で、微生物は、例えば、宿主生物におけるデルタ−６デサチュラーゼ／デルタ−６エロンガーゼ経路またはデルタ−９エロンガーゼ／デルタ−８デサチュラーゼ経路のいずれかのデサチュラーゼおよびエロンガーゼをコードする適切な異種遺伝子を発現させることにより、ＤＨＡおよびＥＰＡの産生のために操作することができる。
【００７０】
発現カセット内の異種遺伝子が、一般的に、宿主細胞ゲノムに組み込まれる。特定の発現カセット内に含まれる特定の遺伝子は、宿主生物、そのＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロフィール、基質、および所望の最終産物の入手可能性に応じて決まる。ＥＰＡおよびＤＨＡ産生を可能にするために、例えばシュワネラ・プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）（米国特許第６，１４０，４８６号明細書）、シュワネラ・オレヤナ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｌｌｅｙａｎａ）（米国特許第７，２１７，８５６号明細書）、シュワネラ・ジャポニカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）（米国特許第７，２１７，８５６号明細書）、およびビブリオ・マリナス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ）（米国特許第６，１４０，４８６号明細書）に見られるものなど、ＥＰＡを産生するＰＵＦＡポリケチド合成酵素［「ＰＫＳ」］システムを適切なＤＨＡ産生微細生物に導入することもできるであろう。２：１よりも大きいまたは１：１よりも小さいＥＰＡ：ＤＨＡ比をもたらすため、ＰＵＦＡの適切な組み合わせの産生を可能にするように、ＤＨＡを自然に産生する他のＰＫＳシステムを有する宿主生物を操作することもできるであろう。
【００７１】
当業者は、ＥＰＡおよびＤＨＡ生合成のための適切な酵素をコードする１つ以上の発現カセットを最適な微生物宿主生物に導入するために必要な考慮事項および技術を熟知しており、多数の教示が文献中で当業者に提供されている。こうした遺伝子操作された生物からのＥＰＡおよびＤＨＡを含む微生物油はまた、本明細書の水産養殖試料組成物における使用に適している可能性があり、ここで、微生物油は、微生物バイオマスもしくは処理されたバイオマス内に含有され得、または微生物油は、部分的に精製されたもしくは精製された油であり得る。
【００７２】
本発明にとって有用な微生物の典型的な種は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２０８、ＰＴＡ−１０２０９、ＰＴＡ−１０２１０、またはＰＴＡ−１０２１１、ＰＴＡ−１０２１２、ＰＴＡ−１０２１３、ＰＴＡ−１０２１４、ＰＴＡ−１０２１５で寄託されている。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された種の性質を有する単離された微生物、またはそれから得られた系統を対象とする。ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された種の性質には、その成長および表現型特性（表現型特性の例としては、形態学的および生殖特性が挙げられる）、その物理および化学特性（乾燥重量および脂質プロフィールなど）、その遺伝子配列、およびこれらの組み合わせ（これらの性質は、これらの種を以前に特定された種と区別する）が含まれ得る。いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された種の性質を有する単離された微生物を対象とし、ここで、これらの性質には、配列番号１のポリヌクレオチド配列または配列番号１との少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む１８ｓ  ｒＲＮＡ、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された種の形態学的および生殖特性、およびＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託された種の脂肪酸プロフィールが含まれる。
【００７４】
さらなる実施形態では、突然変異株は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２１３、ＰＴＡ−１０２１４、またはＰＴＡ−１０２１５で寄託された系統である。ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２１３、ＰＴＡ−１０２１４、およびＰＴＡ−１０２１５と関連する微生物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に、２００９年７月１４日にブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ）に基づいて寄託された。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２０８で寄託された種の単離された微生物を対象とする。ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２０８と関連する単離された微生物は、本明細書では、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０２０８としても知られている。ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２０８と関連する微生物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に、２００９年７月１４日にブダペスト条約に基づいて寄託された。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２０８で寄託された微生物の突然変異株を対象とする。さらなる実施形態では、突然変異株は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２０９、ＰＴＡ−１０２１０、またはＰＴＡ−１０２１１で寄託された系統である。ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２０９、ＰＴＡ−１０２１０、およびＰＴＡ−１０２１１と関連する微生物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に、２００９年９月２５日にブダペスト条約に基づいて寄託された。
【００７７】
本発明による微細生物は、その微生物によってＰＵＦＡが産生される条件下において、発酵培地中で培養および成長させることができる。一般的に、微生物は、微生物の成長ならびに／またはＥＰＡおよびＤＨＡの産生を可能にするいくつかの追加の化学薬品または物質と共に、炭素および窒素源を用いて飼育される。発酵条件は、使用される微生物に応じて決まることとなり、得られるバイオマス中の高含有量の所望のＰＵＦＡのために最適化することができる。
【００７８】
一般に、培地条件は、炭素源の種類および量、窒素源の種類および量、炭素−対−窒素の比、様々な無機イオンの量、酸素レベル、成長温度、ｐＨ、バイオマス産生期の長さ、油蓄積期の長さ、ならびに細胞回収の時間および方法を改変することによって最適化することができる。
【００７９】
微生物により所望の量のＥＰＡおよびＤＨＡが産生された場合、ＰＵＦＡを含む微生物バイオマスを得るために発酵培地を処理することができる。例えば、発酵培地を濾過するか、または別の方法で処理して、水性の構成要素の少なくとも一部を除去することができる。発酵培地および／または微生物バイオマスをさらに処理することができる。例えば、微生物バイオマスを低温殺菌するか、または他の手段を介して処理して、微生物油および／またはＰＵＦＡを損傷させる可能性がある内在性の微生物酵素の活性を低下させることができる。微生物バイオマスを乾燥（例えば、所望の水分含量まで）もしくは機械的破砕の手段（例えば、細胞内容物へのより大きい接近性を提供するためのビードビーター、スクリュー押し出しなどの物理的手段を介して）、またはこれらの組み合わせにかけることができる。微生物バイオマスは、扱いやすくするために顆粒化またはペレット化することができる。したがって、上に記載した手段のいずれかから得られる微生物バイオマスを、ＥＰＡおよびＤＨＡを含む微生物油の原料として使用することができる。次いで、この微生物油の原料を水産養殖試料組成物中の成分として使用することができる。
【００８０】
本発明の第１の実施例では、水産養殖魚肉製品中のＥＰＡおよびＤＨＡのそれぞれの濃度に基づいて２：１以上である比でＥＰＡおよびＤＨＡを含む水産養殖魚肉製品が持続的に生産される。ＥＰＡ対ＤＨＡのそれぞれの濃度の比は、２：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１、５：１、５．５：１、６：１、６．５：１、７：１、７．５：１、８：１、８．５：１、９：１、９．５：１、もしくは１０：１、またはそれ以上と等しいまたはそれ以上であり得る。
【００８１】
本発明の第２の実施例では、水産養殖魚肉製品中のＥＰＡおよびＤＨＡそれぞれの濃度に基づいて１：１以下である比でＥＰＡおよびＤＨＡを含む水産養殖魚肉製品が持続的に生産される。ＥＰＡ対ＤＨＡのそれぞれの濃度の比は、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０：２：１またはそれ未満と等しいもしくはそれ未満であり得る。
【００８２】
本発明による微生物油の好ましい例は、
−  少なくとも４０％ｗ／ｗＤＨＡおよびＥＰＡ、好ましくは約５０％ｗ／ｗＤＨＡおよびＥＰＡ、
−  約０．２：１〜１：１、好ましくは０．４：１〜０．８：１のＥＰＡ：ＤＨＡ比、および
−  安定性を提供するために添加される少なくとも１種の酸化防止剤
を含有する、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）由来の油である
【００８３】
記載した通りのおよび上に記載した手段のいずれかから得られる微生物油は、２：１以上または１：１以下のＥＰＡ：ＤＨＡ比を有する水産養殖魚肉製品を製造するために、水産養殖動物に与えられる水産養殖試料組成物における使用のための単一のＥＰＡおよびＤＨＡ源として使用することができる。
【００８４】
本発明の方法を使用して得られる水産養殖魚肉製品は、水産養殖魚肉製品の重量パーセントとして少なくとも約０．５％である総量のＥＰＡおよびＤＨＡをさらに含むことができる。この量は、一般的に、水産養殖魚肉製品中に存在する量である。
【００８５】
水産養殖魚肉製品の重量パーセントとして少なくとも約０．５％である総量のＥＰＡおよびＤＨＡは、一般的に、重量で水産養殖試料組成物の少なくとも約１．６％であるＥＰＡ＋ＤＨＡの合計を有する水産養殖試料組成物で水産養殖動物を飼育することによって得ることができる。
【００８６】
本明細書の開示に基づいて、魚油に対する再生可能代替物が、水産養殖試料組成物を魚の食餌サイクルにわたって持続的に生産するための手段として利用できることが明らかであろう。
【００８７】
本発明を記載してきたが、本明細書に提供される実施例を参照することにより、さらなる理解を得ることができる。これらの実施例は、例示目的に過ぎず、限定を目的としない。
【００８８】
［実施例１  ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託されている単離された微生物の成長特性］
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２１２で寄託されている単離された微生物を、下に記載する通りに個々の発酵運転における成長特性について試験した。典型的な培地および培養条件を表３に示す。
【００８９】
【表３】
2020103312.tif 000005
【００９０】
典型的な培養条件としては、次のものが挙げられることになる：
ｐＨ６．５〜９．５、約６．５〜約８．０、または約６．８〜約７．８；
温度：摂氏１５〜３０度、摂氏約１８〜約２８度、または摂氏約２１〜約２３度；
溶存酸素：０．１〜約１００％飽和、約５〜約５０％飽和、または約１０〜約３０％飽和；および／または
以下に制御されるグリセロール：５〜約５０ｇ／Ｌ、約１０〜約４０ｇ／Ｌ、または約１５〜約３５ｇ／Ｌ。
【００９１】
ｐＨ７．３において、２０％溶存酸素を伴い、２２．５℃で１０００ｐｐｍ  Ｃｌを用いる炭素（グリセロール）および窒素供給培養において、ＰＴＡ−１０２１２は、１０Ｌ発酵槽体積での培養の１３８時間後、２６．２ｇ／Ｌの乾燥細胞重量を生じた。脂質収量は７．９ｇ／Ｌであり、オメガ−３収量は５．３ｇ／Ｌであり、ＥＰＡ収量は３．３ｇ／Ｌであり、ＤＨＡ収量は１．８ｇ／Ｌであった。脂肪酸含有量は重量で３０．３％であり、ＥＰＡ含有量は脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の４１．４％であり、ＤＨＡ含有量はＦＡＭＥの２６．２％であった。これらの条件下で脂質生産性は１．３８ｇ／Ｌ／日であり、オメガ−３生産性は０．９２ｇ／Ｌ／日であり、０．５７ｇ／Ｌ／日のＥＰＡ生産性および０．３１ｇ／Ｌ／日のＤＨＡ生産性であった。
【００９２】
ｐＨ７．３において、２０％溶存酸素を伴い、２２．５℃で１０００ｐｐｍ  Ｃｌを用いる炭素（グリセロール）および窒素供給培養において、ＰＴＡ−１０２１２は、１０Ｌ発酵槽体積での培養の１８９時間後、３８．４ｇ／Ｌの乾燥細胞重量を生じた。脂質収量は１８ｇ／Ｌであり、オメガ−３収量は１２ｇ／Ｌであり、ＥＰＡ収量は５ｇ／Ｌであり、ＤＨＡ収量は６．８ｇ／Ｌであった。脂肪酸含有量は重量で４５％であり、ＥＰＡ含有量はＦＡＭＥの２７．８％であり、ＤＨＡ含有量はＦＡＭＥの３７．９％であった。これらの条件下で脂質生産性は２．３ｇ／Ｌ／日であり、オメガ−３生産性は１．５ｇ／Ｌ／日であり、０．６３ｇ／Ｌ／日のＥＰＡ生産性および０．８６ｇ／Ｌ／日のＤＨＡ生産性であった。
【００９３】
ｐＨ６．８〜７．７において、２０％溶存酸素を伴い、２２．５℃で１０００ｐｐｍ  Ｃｌを用いる炭素（グリセロール）および窒素供給培養において、ＰＴＡ−１０２１２は、１０Ｌ発酵槽体積での培養の１８９時間後、１３ｇ／Ｌの乾燥細胞重量を生じた。脂質収量は５．６ｇ／Ｌであり、オメガ−３収量は３．５ｇ／Ｌであり、ＥＰＡ収量は１．５５ｇ／Ｌであり、ＤＨＡ収量は１．９ｇ／Ｌであった。脂肪酸含有量は重量で３８％であり、ＥＰＡ含有量はＦＡＭＥの２９．５％であり、ＤＨＡ含有量はＦＡＭＥの３６％であった。これらの条件下で脂質生産性は０．６７ｇ／Ｌ／日であり、オメガ−３生産性は０．４ｇ／Ｌ／日であり、０．２０ｇ／Ｌ／日のＥＰＡ生産性および０．２４ｇ／Ｌ／日のＤＨＡ生産性であった。
【００９４】
ｐＨ６．６〜７．２において、２０％溶存酸素を伴い、２２．５〜２８．５℃で１０００ｐｐｍ  Ｃｌを用いる炭素（グリセロール）および窒素供給培養において、ＰＴＡ−１０２１２は、１０Ｌ発酵槽体積での培養の１９１時間後、３６．７ｇ／Ｌ〜４８．７ｇ／Ｌの乾燥細胞重量を生じた。脂質収量は１５．２ｇ／Ｌ〜２５．３ｇ／Ｌであり、オメガ−３収量は９．３ｇ／Ｌ〜１３．８ｇ／Ｌであり、ＥＰＡ収量は２．５ｇ／Ｌ〜３．３ｇ／Ｌであり、ＤＨＡ収量は５．８ｇ／Ｌ〜１１ｇ／Ｌであった。脂肪酸含有量は重量で４２．４％〜５３％であり、ＥＰＡ含有量はＦＡＭＥの９．８％〜２２％であり、ＤＨＡ含有量はＦＡＭＥの３８．１％〜４３．６％であった。これらの条件下で脂質生産性は１．９ｇ／Ｌ／日〜３．２ｇ／Ｌ／日であり、オメガ−３生産性は１．２ｇ／Ｌ／日〜１．７ｇ／Ｌ／日であり、０．３１ｇ／Ｌ／日〜０．４１ｇ／Ｌ／日のＥＰＡ生産性および０．７２ｇ／Ｌ／日〜１．４ｇ／Ｌ／日のＤＨＡ生産性であった。
【００９５】
［実施例２  タイセイヨウサケにおける微生物バイオマスとしてのＤＨＡおよびＥＰＡの見かけの消化性］
最初の体重およそ２００ｇのタイセイヨウサケを、１タンクあたり５０匹の魚で１．５ｍタンクにランダムに分配した。水の温度は１０℃の範囲である。魚は、実験食餌を与えるのを開始する前に２週間、制御食餌に適応させる。
【００９６】
表４に記載する配合に従って、ベルゲン（Ｂｅｒｇｅｎ）のＮｏｆｉｍａでの押し出しにより、３ｍｍの食餌を生じた。この食餌にナタネ油のみを添加し、制御食餌におけるＤＨＡおよびＥＰＡの基礎レベルは、およそ２３％のレベルでの食餌に含まれている魚粉に由来する。この食餌には魚油を添加しなかった。
【００９７】
ＤＨＡおよびＥＰＡの微生物源として、ＯｖｅｇａＧｏｌｄＴＭとしても知られているシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０２０８の種のバイオマスが使用されている。このバイオマス含有物は、０、０．５、１．０、１．５％のＤＨＡレベルに相当する食餌の０、０．９、３．５、および６．２％であった。
【００９８】
魚には少なくとも４週間飼育し、各食餌処置を３連で実施した。実験飼育の４週後、それぞれ個々のタンクから各魚を取り出すことにより糞を収集した。１タンクあたり５匹の魚から筋肉サンプルを採取した。
【００９９】
オメガ−３脂肪酸について、ならびに乾燥物質、脂質およびタンパク質などの栄養素について、見かけの消化率を決定した。
【０１００】
Ｓｔａｔｂｏｘ  Ｐｒｏ（一元配置ＡＮＯＶＡ）を使用して、統計分析を実施した。
【０１０１】
【表４】
2020103312.tif 000006
【０１０２】
ＤＨＡおよびＥＰＡの送り込み回収の結果を表５に示す。結果は、押し出しによる試料加工後のＤＨＡおよびＥＰＡの非常に優れた回収および明確な用量応答を示す。
【０１０３】
【表５】
2020103312.tif 000007
【０１０４】
ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＤＨＡ＋ＥＰＡ、およびオメガ−３脂肪酸について、見かけの消化率を決定した。図１、２、および３は、それぞれＤＨＡ＋ＥＰＡ、ＥＰＡ、およびＤＨＡの消化性を提供する。結果は、藻類源によって提供されたＥＰＡおよびＤＨＡが非常に消化されやすいことを示す。
【０１０５】
【表６】
2020103312.tif 000008
【０１０６】
結果として、ＤＨＡおよびＥＰＡは、サケの食餌に添加される微細藻類バイオマスとして提供される場合、非常に生体利用能が高い。
【０１０７】
さらなる実施形態は以下のとおりである。
［実施形態１］
魚にその食餌サイクルにわたって水産養殖試料組成物を与えることにより、水産養殖魚肉製品を持続的に生産する方法であって、前記組成物中の魚油のすべてまたは一部をエイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）およびドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）の単一の微生物源と置き換えることにより、水産養殖試料組成物を配合するステップを含む方法。
［実施形態２］
前記水産養殖試料組成物が、前記水産養殖試料組成物に対する重量パーセントとして測定されて少なくとも約０．８％である総量のＥＰＡおよびＤＨＡを含む、実施形態１に記載の方法。
［実施形態３］
ＥＰＡの濃度対ＤＨＡの濃度の比が、前記微生物源中または前記水産養殖試料組成物中のＥＰＡおよびＤＨＡの個々の濃度に基づいて少なくとも２：１である、実施形態１または２に記載の方法。
［実施形態４］
ＥＰＡの濃度対ＤＨＡの濃度の比が、前記微生物源中または前記水産養殖試料組成物中のＥＰＡおよびＤＨＡの個々の濃度に基づいて１：１以下である、実施形態１または２に記載の方法。
［実施形態５］
前記微生物源が微生物油であり、前記微生物油が、いずれも前記微生物源から得られるバイオマス、処理されたバイオマス、部分的に精製された油、および精製された油からなる群から選択される形態で提供される、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態６］
前記微生物源が得られる微生物が藻類、菌類、または酵母である、実施形態１〜５のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態７］
前記微生物がシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）またはトラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のメンバーである、実施形態６に記載の方法。
［実施形態８］
前記微生物が、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２０８、またはＰＴＡ−１０２０９、またはＰＴＡ−１０２１０、またはＰＴＡ−１０２１１、またはＰＴＡ−１０２１２、またはＰＴＡ−１０２１３、またはＰＴＡ−１０２１４、またはＰＴＡ−１０２１５で寄託されている種の特性を有する、実施形態７に記載の方法。
［実施形態９］
前記微生物が突然変異株である、実施形態６〜８のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態１０］
前記微生物が、ＥＰＡおよびＤＨＡを含む微生物油を含有する多価不飽和脂肪酸の生成のために遺伝子操作されたトランスジェニック微細生物である、実施形態６〜８のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態１１］
前記水産養殖魚肉製品が、ＥＰＡの濃度対ＤＨＡの濃度の比であって、前記水産養殖魚肉製品中のそれぞれの前記濃度に基づいて２：１以上であるＥＰＡの濃度対ＤＨＡの濃度の比を有する、実施形態１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態１２］
前記水産養殖魚肉製品が、ＥＰＡの濃度対ＤＨＡの濃度の比であって、前記水産養殖魚肉製品中のそれぞれの前記濃度に基づいて１：１以下であるＥＰＡの濃度対ＤＨＡの濃度の比を有する、実施形態１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態１３］
単一の微生物源から得られるエイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）およびドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）を含む、水産養殖試料のための試料添加組成物。
［実施形態１４］
いずれも前記微生物源から得られるバイオマス、処理されたバイオマス、部分的に精製された油、および精製された油からなる群から選択される形態で提供される、実施形態１３に記載の添加組成物。
［実施形態１５］
前記微生物源が得られる微生物が藻類、菌類、または酵母である、実施形態１３または１４に記載の添加組成物。
［実施形態１６］
前記微生物がシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）またはトラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のメンバーである、実施形態１５に記載の添加組成物。
［実施形態１７］
前記微生物が、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２０８、またはＰＴＡ−１０２０９、またはＰＴＡ−１０２１０、またはＰＴＡ−１０２１１、またはＰＴＡ−１０２１２、またはＰＴＡ−１０２１３、またはＰＴＡ−１０２１４、またはＰＴＡ−１０２１５で寄託されている種の特性を有する、実施形態１６に記載の添加組成物。
［実施形態１８］
少なくとも４０％ｗ／ｗのＤＨＡおよびＥＰＡ、好ましくは約５０％ｗ／ｗのＤＨＡおよびＥＰＡを含有する精製された微生物油形態である、実施形態１３〜１７のいずれか一項に記載の添加組成物。
［実施形態１９］
エイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）およびドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）の単一の微生物源を含む水産養殖試料。
［実施形態２０］
前記試料に対する重量パーセントとして測定されて少なくとも約０．０８％である総量のＥＰＡおよびＤＨＡを含む、実施形態１９に記載の水産養殖試料。
［実施形態２１］
ＥＰＡの濃度対ＤＨＡの濃度の比が、前記微生物源中または前記試料中のＥＰＡおよびＤＨＡの個々の濃度に基づいて１：１以下である、実施形態１９または２０に記載の水産養殖試料。
［実施形態２２］
ＥＰＡの濃度対ＤＨＡの濃度の比が、前記微生物源中または前記試料中のＥＰＡおよびＤＨＡの濃度に基づいて２：１以上である、実施形態１９または２０に記載の水産養殖試料。
［実施形態２３］
前記微生物源が微生物油であり、前記微生物油が、いずれも前記微生物源から得られるバイオマス、処理されたバイオマス、部分的に精製された油、および精製された油からなる群から選択される形態で提供される、実施形態１９〜２２のいずれか一項に記載の水産養殖試料。
［実施形態２４］
前記微生物源が得られる微生物が藻類、菌類、または酵母である、実施形態１９〜２３のいずれか一項に記載の水産養殖試料。
［実施形態２５］
前記微生物がシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）またはトラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のメンバーである、実施形態２４に記載の水産養殖試料。
［実施形態２６］
前記微生物が、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２０８、またはＰＴＡ−１０２０９、またはＰＴＡ−１０２１０、またはＰＴＡ−１０２１１、またはＰＴＡ−１０２１２、またはＰＴＡ−１０２１３、またはＰＴＡ−１０２１４、またはＰＴＡ−１０２１５で寄託されている種の特性を有する、実施形態２５に記載の水産養殖試料。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【外国語明細書】
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