(57)【要約】      （修正有）【課題】本発明は、ヒト由来インターロイキン6のsiRNA、組換え発現CAR-Tベクターおよびその構築方法と使用を提供する。【解決手段】ヒト由来インターロイキン6のsiRNAであって、ある特定の２つの配列番号で示されるヌクレオチド配列の1対であるsiRNAと、該siRNAを含む組換え発現ベクターを提供する。当該siRNAは、CAR19-Tの急性Bリンパ性白血病に対する治療においてサイトカイン放出症候群（CRS）の症状の解消または軽減だけでなく、CAR-T治療によって腫瘍を治療する時に生じるCRS症状の緩和にも使用することができ、さらに他の種類の治療によるCRSの緩和に使用することもできる。【選択図】図２
2020188777.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来インターロイキン6のsiRNAであって、配列番号45および配列番号46で示されるヌクレオチド配列の1対であるsiRNA。  
【請求項２】
サイトカイン放出症候群を治療・緩和する薬物の製造における請求項1に記載のsiRNAの使用。
【請求項３】
請求項1に記載のsiRNAを含む組換え発現ベクター。
【請求項４】
前記発現ベクターは、レンチウイルス発現ベクター、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、アデノ随伴ウイルス発現ベクターまたはプラスミドであることを特徴とする請求項3に記載の組換え発現ベクター。
【請求項５】
前記のレンチウイルス発現ベクターは、配列番号2で示されるプラスミド複製のための原核レプリコンpUC Ori配列、配列番号1で示される目的菌株の大量増幅のためのアンピシリン耐性遺伝子含有AmpR配列、配列番号3で示される真核細胞内における複製を増強するためのウイルスレプリコンSV40 Ori配列、レンチウイルスパッケージングのためのレンチウイルスパッケージングのシスエレメント、配列番号11で示される真核細胞における緑色蛍光タンパク質の発現のためのZsGreen1緑色蛍光タンパク質、配列番号12で示されるタンパク質の共転写発現のためのIRESリボソーム結合配列、配列番号14で示されるキメラ抗原受容体遺伝子の真核転写のためのヒトEF1αプロモーター、配列番号52または配列番号53で示される認識、伝達、開始が一体化した第二世代CARまたは第三世代CARを組み立てるための抗CD19キメラ抗原受容体のコード遺伝子、配列番号13で示される遺伝子組換えの発現効率を増強するためのeWPRE増強型ウッドチャックB型肝炎ウイルス転写後調節エレメント、配列番号14で示される細胞内におけるsiRNAの転写のためのヒトRNAポリメラーゼIIIプロモーターhU6を含むことを特徴とする請求項4に記載の組換え発現ベクター。
【請求項６】
前記レンチウイルスパッケージングのシスエレメントは、第二世代のレンチウイルスベクターを使用し、配列番号5で示されるレンチウイルス5'末端LTR、配列番号6で示されるレンチウイルス3'末端自己不活性化LTR、配列番号7で示されるGagシスエレメント、配列番号8で示されるRREシスエレメント、配列番号9で示されるenvシスエレメント、配列番号10で示されるcPPTシスエレメントを含むことを特徴とする請求項5に記載の組換え発現ベクター。
【請求項７】
前記レンチウイルスパッケージングのシスエレメントは、第三世代のレンチウイルスベクターを使用し、配列番号5で示されるレンチウイルス5'末端LTR、配列番号6で示されるレンチウイルス3'末端自己不活性化LTR、配列番号7で示されるGagシスエレメント、配列番号8で示されるRREシスエレメント、配列番号9で示されるenvシスエレメント、配列番号10で示されるcPPTシスエレメント、および配列番号4で示されるRSVプロモーターを含むことを特徴とする請求項5に記載の組換え発現ベクター。
【請求項８】
前記eWPRE増強型ウッドチャックB型肝炎ウイルス転写後調節エレメントは、6つのヌクレオチドの増強突然変異、具体的には、g.396G＞A、g.397C＞T、g.398T＞C、g.399G＞A、g.400A＞T、g.411A＞Tを有することを特徴とする請求項5に記載の組換え発現ベクター。
【請求項９】
前記抗CD19キメラ抗原受容体は、順に直列に接続する配列番号16で示されるCD8 leaderキメラ受容体シグナルペプチド、配列番号17で示されるCD19の1本鎖抗体軽鎖VL、配列番号18で示されるOptimal Linker C、配列番号19で示されるCD19の1本鎖抗体重鎖VH、配列番号20で示されるCD8 Hingeキメラ受容体ヒンジ、配列番号21で示されるCD8 Transmembraneキメラ受容体膜貫通領域、配列番号22で示されるCD137キメラ受容体共刺激因子、および配列番号23で示されるTCRキメラ受容体T細胞活性化ドメインを含むことを特徴とする請求項5に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１０】
前記抗CD19キメラ抗原受容体は、順に直列に接続する配列番号16で示されるCD8 leaderキメラ受容体シグナルペプチド、配列番号17で示されるCD19の1本鎖抗体軽鎖VL、配列番号18で示されるOptimal Linker C、配列番号19で示されるCD19の1本鎖抗体重鎖VH、配列番号20で示されるCD8 Hingeキメラ受容体ヒンジ、配列番号21で示されるCD8 Transmembraneキメラ受容体膜貫通領域、配列番号24で示されるCD28キメラ受容体共刺激因子、配列番号22で示されるCD137キメラ受容体共刺激因子、および配列番号23で示されるTCRキメラ受容体T細胞活性化ドメインを含むことを特徴とする請求項5に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１１】
請求項1に記載のsiRNAを含むレンチウイルス発現ベクターの構築方法であって、
アンピシリン耐性遺伝子含有AmpR配列（配列番号1で示される）、原核レプリコンpUC Ori配列（配列番号2で示される）、ウイルスレプリコンSV40 Ori配列（配列番号3で示される）、レンチウイルスパッケージングのためのレンチウイルスパッケージングのシスエレメント、ZsGreen1緑色蛍光タンパク質（配列番号11で示される）、IRESリボソーム結合配列（配列番号12で示される）、eWPRE増強型ウッドチャックB型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（配列番号13で示される）、ヒトRNAポリメラーゼIIIプロモーターhU6（配列番号14で示される）をレンチウイルス骨格プラスミドに組み込む工程（1）と、
ヒトEF1αプロモーター（配列番号15で示される）、認識、伝達、開始が一体化した第二世代CARまたは第三世代CARを組み立てるための抗CD19キメラ抗原受容体を第二世代CARまたは第三世代CARの設計態様に組み立て、酵素切断、連結、組換え反応を経てレンチウイルス骨格プラスミドにクローニングし、第二世代CARまたは第三世代CARの設計の組換えレンチウイルスプラスミドを得る工程（2）と、
上記siRNAおよび配列番号41と配列番号42で示される陰性対照配列を、それぞれ工程（2）で得られた組換えレンチウイルスプラスミドにクローニングし、IL-6ノックダウン組換えレンチウイルスプラスミドを得る工程（3）と、
工程（3）で得られた組換えレンチウイルスプラスミドをそれぞれレンチウイルスパッケージングプラスミドおよび膜タンパク質プラスミドとHEK293T/17細胞に共形質移入させ、HEK293T/17細胞において遺伝子の転写・発現を行わせた後、パッケージングに成功した組換えレンチウイルスベクターが細胞培養上清に放出され、組換えレンチウイルスベクターを含む上清液を収集する工程（4）と、
得られた組換えレンチウイルス上清は、吸引ろ過、吸着、溶離のイオン交換手段によって精製し、それぞれ組換えレンチウイルスベクターを得る工程（5）と、
を含む構築方法。
【請求項１２】
工程（4）において、前記吸引ろ過ステップは、上清体積を200ml〜2000mlに、真空度を-0.5MPA〜-0.9MPAに抑え、穴詰まりによるベクターの損失を防ぎ、前記吸着ステップは、溶液のpH値を6〜8に抑え、pHの変化によるベクターの不活性化を防止し、前記溶離ステップは溶離液のイオン強度を0.5M〜1.0Mに抑え、イオン強度の変化による溶離の不完全またはベクターの不活性化を防ぐことを特徴とする請求項11に記載の構築方法。
【請求項１３】
CAR-T治療過程におけるIL-6の放出によるサイトカイン放出症候群の薬物の製造における請求項3〜10のいずれか一項に記載の組換え発現ベクターの使用。
【請求項１４】
請求項１に記載のsiRNAで修飾されたT細胞である、CAR-T細胞。
【請求項１５】
Bリンパ腫、膵臓腺癌、脳膠細胞腫、骨髄腫の治療薬の製造における請求項14に記載のCAR-T細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍免疫治療の技術分野に属し、具体的には、ヒト由来インターロイキン6（IL-6）のsiRNA、組換え発現CAR-Tベクター（特にIL-6ノックダウンによるCRSを緩和するためのCAR-T遺伝子組換えベクター）およびその構築方法と使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍免疫治療の論理的基礎は、免疫系が腫瘍関連抗原を認識し、生体を調節して腫瘍細胞を攻撃する（高度特異的な細胞溶解）能力を有することである。1950年代、BurnetとThomasは「免疫監視」理論を提出し、生体においてよく現れる突然変異した腫瘍細胞が免疫系によって認識されて排除されると考え、腫瘍免疫治療の論理的基礎を築いた[Burnet FM.Immunological aspects of malignant disease.Lancet,1967;1: 1171-4]。その後、様々な腫瘍免疫療法は、サイトカイン療法、モノクローナル抗体療法、養子免疫療法、ワクチン療法などを含め、次々と臨床に応用されてきた。
【０００３】
2013年、より進んだ腫瘍免疫療法−CAR-T療法は、臨床への応用に成功し、それまでになかった臨床の治療効果を示した。CAR-Tは、Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapyの略で、キメラ抗原受容体T細胞療法である。CAR-T療法で、臨床において最も進んでいるのはノバルティス社のCLT019であり、CLT019によって再発・難治急性リンパ性白血病患者を治療したところ、6か月の腫瘍無進行生存が67％に達し、その中で最も長かった奏効期間は2年超に達した。本社が中国上海にあるSHANGHAI UNICAR-THERAPY BIO-MEDICINE TECHNOLOGY CO. ,LTDは病院と提携し、計36例の再発・難治急性リンパ性白血病患者を治療したところ、そのうち24例が治癒され、緩和の比率が66.6％に達した。これは抗癌研究における破壊的なブレークスルーである。CAR-T細胞療法は癌を治癒する可能性が最も高い手段の一つで、「Science」誌によって2013年度の科学技術の１０大ブレークスルーの1位に選ばれた。
【０００４】
CAR-T療法は、効果が顕著であるが、治療過程において一つの特殊な臨床症候群が現れ、臨床所見は発熱、低血圧、身震いであり、血清における一連のサイトカインレベルの顕著な向上に関連する神経系の症状が現れ、サイトカイン放出症候群(Cytokine Release Syndrome、CRS)と呼ばれる。その発生機序は、抗原がT細胞受容体に結合すると、T細胞が活性化され、IL-6を含む一連のサイトカインを放出し、全身性の炎症反応につながるためであり、IL-6シグナル経路を図1に示す。早急に治療しないと、肺水腫を引き起こし、患者は死亡する可能性がある。
【０００５】
現在、臨床において抗ヒスタミン薬（例えば、クロルフェニラミン）またはコルチコステロイド（例えば、ヒドロコルチゾン）を静脈注射することによって炎症反応を抑制しているが、その分、CAR-T細胞の腫瘍に対する殺傷作用も抑制され、このような患者は再発率が高く、CAR-Tの治療効果に影響する。
【０００６】
また、もう一つの可能な技術案は市販品であるトシリズマブ（アクテムラ(登録商標)）であり、CRSの発生具合を抑えるものである。トシリズマブはヒト化のIL-6受容体モノクローナル抗体（Tocilizumab）で、IL-6受容体に特異的に結合し、IL-6シグナルの伝達を遮断することによって、急性発作時の反応物の減少、ヘプシジンによる産物の低下、B細胞の活性化の減少、骨吸収と軟骨軟化の減少、およびT細胞のTh17細胞への分化に対する抑制につながることで、有効に炎症反応を抑える。しかし、トシリズマブには明らかな欠点もあり、まずは費用が高い。10kg体重に対応する投与量のトシリズマブ1本は2000人民元で、成人の患者は通常毎回5本が必要で、一般的な家庭では負担しにくい。次に、トシリズマブを使用すると、IL-6受容体がブロックされ、患者は後期に感染しやすい。
【０００７】
1990年代以来、研究者は2本鎖RNA（「dsRNA」）がタンパク質の発現を抑制することができることを見出した。このような遺伝子を沈黙させる能力は、人類の疾患を治療する上で幅広い将来性があり、多くの研究者や企業は現在かなりの資源をこのような技術に基づいた治療方法の発展に投入している。
【０００８】
機序の面からすると、dsRNAが植物や無脊椎動物の細胞に入ると、III型エンドヌクレアーゼDicerによってsiRNAに分解される。（Sharp, RNA interference-2001, Genes Dev.2001, 15:485）。III型エンドヌクレアーゼDicerによって、dsRNAが2塩基オーバーハングの3'粘着末端を有する19〜23bpのsiRNAに分解される。（Bernstein, Caudy, Hammond, & Hannon, Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference, Nature 2001, 409:363）。siRNAはRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）に取り込まれ、複合体における一つまたは複数のヘリカーゼによって2本鎖siRNAに解離し、相補アンチセンス鎖をガイドして標的を認識させる。（Nykanen, Haley, & Zamore, ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway, Cell 2001, 107:309）。対応する標的mRNAに結合すると、RISC複合体における一つまたは複数のエンドヌクレアーゼによって標的mRNAが切断されてmRNAを沈黙させる。（Elbashir， Elbashir, Lendeckel, & Tuschl, RNA interference is mediated by 21-and 22-nucleotide RNAs, Genes Dev 2001, 15:188）。
【０００９】
このような干渉は効果が持続し、細胞分裂後も有効である。RNAiは非常に優れた配列特異性を有する（Kisielow, M.ら (2002) Isoform-specific knockdown and expression of adaptor protein ShcA using small interfering RNA, J. of Biochemistry 363: 1-5）。そのため、RNAi系は配列が類似する他のmRNAに影響せずに、特異的に1種類の転写物をノックダウンすることができる。これらの特性のため、siRNA系は遺伝子発現の抑制、遺伝子機能の研究および薬物の標的の検証において将来性と価値を示す。また、siRNA系は、（1）遺伝子の過剰発現または誤発現による疾患、（2）遺伝子の突然変異による疾患、を含む関連疾患の治療に使用することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、既存技術の欠点を克服し、ヒト由来インターロイキン6のsiRNA、組換え発現CAR-Tベクターおよびその構築方法と使用を提供することにある。
【００１１】
本発明の目的は、以下の技術案によって実現される。
【００１２】
本発明の第一の目的は、ヒト由来インターロイキン6のsiRNAであって、下記のa〜hから選ばれる任意の1対であるsiRNAを提供することにある。
a. 配列番号43および配列番号44で示されるヌクレオチド配列、
b. 配列番号45および配列番号46で示されるヌクレオチド配列、
c. 配列番号47および配列番号48で示されるヌクレオチド配列、
d. 配列番号49および配列番号50で示されるヌクレオチド配列、
e. 配列番号51および配列番号52で示されるヌクレオチド配列、
f. 配列番号53および配列番号54で示されるヌクレオチド配列、
g. 配列番号55および配列番号56で示されるヌクレオチド配列、
h. 配列番号57および配列番号58で示されるヌクレオチド配列
さらに、b. 配列番号45および配列番号46で示されるヌクレオチド配列がより好ましい。
【００１３】
本発明の第二の目的は、サイトカイン放出症候群を治療・緩和する薬物の製造における上記siRNAの使用を提供することにある。
【００１４】
本発明の第三の目的は、上記siRNAを含む組換え発現ベクターを提供することにある。
【００１５】
さらに、前記発現ベクターは、レンチウイルス発現ベクター、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、アデノ随伴ウイルス発現ベクターまたはプラスミドであり、好ましくは、上記siRNAを含むレンチウイルス発現ベクターである。
【００１６】
さらに、前記のレンチウイルス発現ベクターは、配列番号2で示されるプラスミド複製のための原核レプリコンpUC Ori配列、配列番号1で示される目的菌株の大量増幅のためのアンピシリン耐性遺伝子含有AmpR配列、配列番号3で示される真核細胞内における複製を増強するためのウイルスレプリコンSV40 Ori配列、レンチウイルスパッケージングのためのレンチウイルスパッケージングのシスエレメント、配列番号11で示される真核細胞における緑色蛍光タンパク質の発現のためのZsGreen1緑色蛍光タンパク質、配列番号12で示されるタンパク質の共転写発現のためのIRESリボソーム結合配列、配列番号14で示されるキメラ抗原受容体遺伝子の真核転写のためのヒトEF1αプロモーター、配列番号52または配列番号53で示される認識、伝達、開始が一体化した第二世代CARまたは第三世代CARを組み立てるための抗CD19キメラ抗原受容体のコード遺伝子、配列番号13で示される遺伝子組換えの発現効率を増強するためのeWPRE増強型ウッドチャックB型肝炎ウイルス転写後調節エレメント、配列番号14で示される細胞内におけるsiRNAの転写のためのヒトRNAポリメラーゼIIIプロモーターhU6を含む。
【００１７】
さらに、前記レンチウイルスパッケージングのシスエレメントは、第二世代のレンチウイルスベクターを使用し、配列番号5で示されるレンチウイルス5'末端LTR、配列番号6で示されるレンチウイルス3'末端自己不活性化LTR、配列番号7で示されるGagシスエレメント、配列番号8で示されるRREシスエレメント、配列番号9で示されるenvシスエレメント、配列番号10で示されるcPPTシスエレメントを含む。
【００１８】
さらに、前記レンチウイルスパッケージングのシスエレメントは、第三世代のレンチウイルスベクターを使用し、配列番号5で示されるレンチウイルス5'末端LTR、配列番号6で示されるレンチウイルス3'末端自己不活性化LTR、配列番号7で示されるGagシスエレメント、配列番号8で示されるRREシスエレメント、配列番号9で示されるenvシスエレメント、配列番号10で示されるcPPTシスエレメント、および配列番号4で示されるRSVプロモーターを含む。
【００１９】
さらに、前記eWPRE増強型ウッドチャックB型肝炎ウイルス転写後調節エレメントは、6つのヌクレオチドの増強突然変異、具体的には、g.396G＞A、g.397C＞T、g.398T＞C、g.399G＞A、g.400A＞T、g.411A＞Tを有する。
【００２０】
さらに、前記抗CD19キメラ抗原受容体（第二世代CAR）は、順に直列に接続する配列番号16で示されるCD8 leaderキメラ受容体シグナルペプチド、配列番号17で示されるCD19の1本鎖抗体軽鎖VL、配列番号18で示されるOptimal Linker C、配列番号19で示されるCD19の1本鎖抗体重鎖VH、配列番号20で示されるCD8 Hingeキメラ受容体ヒンジ、配列番号21で示されるCD8 Transmembraneキメラ受容体膜貫通領域、配列番号22で示されるCD137キメラ受容体共刺激因子、および配列番号23で示されるTCRキメラ受容体T細胞活性化ドメインを含む。
【００２１】
さらに、前記抗CD19キメラ抗原受容体（第三世代CAR）は、順に直列に接続する配列番号16で示されるCD8 leaderキメラ受容体シグナルペプチド、配列番号17で示されるCD19の1本鎖抗体軽鎖VL、配列番号18で示されるOptimal Linker C、配列番号19で示されるCD19の1本鎖抗体重鎖VH、配列番号20で示されるCD8 Hingeキメラ受容体ヒンジ、配列番号21で示されるCD8 Transmembraneキメラ受容体膜貫通領域、配列番号24で示されるCD28キメラ受容体共刺激因子、配列番号22で示されるCD137キメラ受容体共刺激因子、および配列番号23で示されるTCRキメラ受容体T細胞活性化ドメインを含む。
【００２２】
本発明の第四の目的は、上記siRNAを含むレンチウイルス発現ベクターの構築方法であって、以下の工程を含む方法を提供することにある：
【００２３】
（1）アンピシリン耐性遺伝子含有AmpR配列（配列番号1で示される）、原核レプリコンpUC Ori配列（配列番号2で示される）、ウイルスレプリコンSV40 Ori配列（配列番号3で示される）、レンチウイルスパッケージングのためのレンチウイルスパッケージングのシスエレメント、ZsGreen1緑色蛍光タンパク質（配列番号11で示される）、IRESリボソーム結合配列（配列番号12で示される）、eWPRE増強型ウッドチャックB型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（配列番号13で示される）、ヒトRNAポリメラーゼIIIプロモーターhU6（配列番号14で示される）をレンチウイルス骨格プラスミド（pLenti-3G silencer）に組み込む；
【００２４】
（2）ヒトEF1αプロモーター（配列番号15で示される）、認識、伝達、開始が一体化した第二世代CARまたは第三世代CARを組み立てるための抗CD19キメラ抗原受容体を第二世代CARまたは第三世代CARの設計態様に組み立て、酵素切断、連結、組換え反応を経てレンチウイルス骨格プラスミドにクローニングし、第二世代CARまたは第三世代CARの設計の組換えレンチウイルスプラスミドpCAR19-silencerを得る；
【００２５】
（3）上記siRNAおよび配列番号41と配列番号42で示される陰性対照配列を、それぞれ工程（2）で得られた組換えレンチウイルスプラスミドにクローニングし、IL-6ノックダウン組換えレンチウイルスプラスミド（pCAR19-1762〜pCAR19-1769および陰性対照のpCAR19-1761）を得る；
【００２６】
（4）工程（3）で得られた組換えレンチウイルスプラスミド（pCAR19-1761〜pCAR19-1769）をそれぞれレンチウイルスパッケージングプラスミドpPac-GP、pPac-Rおよび膜タンパク質プラスミドpEnv-GとHEK293T/17細胞に共形質移入させ、HEK293T/17細胞において遺伝子の転写・発現を行わせた後、パッケージングに成功した組換えレンチウイルスベクターが細胞培養上清に放出され、組換えレンチウイルスベクターを含む上清液を収集する；
【００２７】
（5）得られた組換えレンチウイルス上清は、吸引ろ過、吸着、溶離のイオン交換手段によって精製し、それぞれ組換えレンチウイルスベクターを得る。
【００２８】
さらに、工程（1）において、前記レンチウイルスパッケージングのシスエレメントは、第二世代のレンチウイルスベクターを使用し、配列番号5で示されるレンチウイルス5'末端LTR、配列番号6で示されるレンチウイルス3'末端自己不活性化LTR、配列番号7で示されるGagシスエレメント、配列番号8で示されるRREシスエレメント、配列番号9で示されるenvシスエレメント、配列番号10で示されるcPPTシスエレメントを含み、前記レンチウイルスパッケージングのシスエレメントは、第三世代のレンチウイルスベクターを使用し、配列番号5で示されるレンチウイルス5'末端LTR、配列番号6で示されるレンチウイルス3'末端自己不活性化LTR、配列番号7で示されるGagシスエレメント、配列番号8で示されるRREシスエレメント、配列番号9で示されるenvシスエレメント、配列番号10で示されるcPPTシスエレメント、前記のレンチウイルスパッケージングのシスエレメントおよび配列番号4で示されるRSVプロモーターを含む。
【００２９】
さらに、工程（2）において、前記認識、伝達、開始が一体化した第二世代CARを組み立てるための抗CD19キメラ抗原受容体は、順に直列に接続する配列番号16で示されるCD8 leaderキメラ受容体シグナルペプチド、配列番号17で示されるCD19の1本鎖抗体軽鎖VL、配列番号18で示されるOptimal Linker C、配列番号19で示されるCD19の1本鎖抗体重鎖VH、配列番号20で示されるCD8 Hingeキメラ受容体ヒンジ、配列番号21で示されるCD8 Transmembraneキメラ受容体膜貫通領域、配列番号22で示されるCD137キメラ受容体共刺激因子、および配列番号23で示されるTCRキメラ受容体T細胞活性化ドメインを含み、前記認識、伝達、開始が一体化した第三世代CARを組み立てるための抗CD19キメラ抗原受容体は、順に直列に接続する配列番号16で示されるCD8 leaderキメラ受容体シグナルペプチド、配列番号17で示されるCD19の1本鎖抗体軽鎖VL、配列番号18で示されるOptimal Linker C、配列番号19で示されるCD19の1本鎖抗体重鎖VH、配列番号20で示されるCD8 Hingeキメラ受容体ヒンジ、配列番号21で示されるCD8 Transmembraneキメラ受容体膜貫通領域、配列番号24で示されるCD28キメラ受容体共刺激因子、配列番号22で示されるCD137キメラ受容体共刺激因子、および配列番号23で示されるTCRキメラ受容体T細胞活性化ドメインを含む。
【００３０】
さらに、工程（1）において、前記eWPRE増強型ウッドチャックB型肝炎ウイルス転写後調節エレメントは、6つのヌクレオチドの増強突然変異、具体的には、g.396G＞A、g.397C＞T、g.398T＞C、g.399G＞A、g.400A＞T、g.411A＞Tを有する。
【００３１】
さらに、工程（2）において、ヒトEF1αプロモーターによってCAR遺伝子全体の発現が開始し、CD8 leaderキメラ受容体シグナルペプチドはCARコード配列のN末端に位置し、CARタンパク質の細胞膜への局在化をガイドするためのものであり、CD19の1本鎖抗体軽鎖VL、Optimal Linker C、CD19の1本鎖抗体重鎖VHはscfv領域を組み立て、CD19抗原を認識するためのものであり、CD8 Hingeキメラ受容体ヒンジはscfvを細胞膜の外側にアンカーさせるためのものであり、CD8 Transmembraneキメラ受容体膜貫通領域はキメラ受容体全体を細胞膜に固定させるためのものであり、CD137キメラ受容体共刺激因子はT細胞の増殖およびサイトカインの分泌を刺激するためのものであり、TCRキメラ受容体T細胞活性化ドメインは下流のシグナル経路の発現を活性化するためのものであり、scfv領域がCD20抗原に結合すると、シグナルがキメラ受容体を介して細胞内に伝達することで、T細胞の増殖、サイトカインの分泌の増加、抗アポトーシスタンパク質の分泌の増加、細胞死亡の遅延、標的細胞の分解を含む一連の生物学的効果が生じる。
【００３２】
さらに、工程（4）において、前記レンチウイルスベクターは、蛍光タグzsGreen1が付いているバージョンと蛍光タグzsGreen1が付いていないバージョンがあり、蛍光タグzsGreen1が付いているバージョンは体外実験用で、蛍光タグzsGreen1が付いていないバージョンは臨床実験用である。
【００３３】
さらに、工程（4）において、前記吸引ろ過ステップは、上清体積を200ml〜2000mlに、真空度を-0.5MPA〜-0.9MPAに抑え、穴詰まりによるベクターの損失を防ぎ、前記吸着ステップは、溶液のpH値を6〜8に抑え、pHの変化によるベクターの不活性化を防止し、前記溶離ステップは溶離液のイオン強度を0.5M〜1.0Mに抑え、イオン強度の変化による溶離の不完全またはベクターの不活性化を防ぐ。
【００３４】
本発明の第五の目的は、CAR-T治療過程におけるIL-6の放出によるサイトカイン放出症候群の薬物の製造における上記siRNAを含む組換え発現ベクターの使用を提供することにある。
【００３５】
本発明の第六の目的は、上記siRNAで修飾されたT細胞である、CAR-T細胞を提供することにある。
【００３６】
本発明のもう一つの目的は、Bリンパ腫、膵臓腺癌、脳膠細胞腫、骨髄腫の治療薬の製造における上記CAR-T細胞の使用を提供することにある。
【００３７】
本発明は、ヒトRNAポリメラーゼIIIプロモーターhU6、ヒトEF1αプロモーター、CD8 leaderキメラ受容体シグナルペプチド、CD19の1本鎖抗体軽鎖VL、Optimal Linker C、CD19の1本鎖抗体重鎖VH、CD8 Hingeキメラ受容体ヒンジ、CD8 Transmembraneキメラ受容体膜貫通領域、CD137キメラ受容体共刺激因子、TCRキメラ受容体T細胞活性化ドメインを組換えレンチウイルスベクターに組み込み、ヒトEF1αプロモーターによってCAR遺伝子全体の発現を開始させる。CARタンパク質は細胞膜の表面に局在化し、CD19抗原を認識し、T細胞の増殖およびサイトカインの分泌を刺激し、下流シグナル経路の発現を活性化させる。scfv領域がCD19抗原に結合すると、シグナルがキメラ受容体を介して細胞内に伝達することで、T細胞の増殖、サイトカインの分泌の増加、抗アポトーシスタンパク質の分泌の増加、細胞死亡の遅延、標的細胞の分解などの一連の生物学的効果が生じる。ヒトRNAポリメラーゼIIIプロモーターhU6によってsiRNAの発現を開始させ、RISC複合体の作用によって、IL-6 mRNAが分解され、IL-6の合成と分泌を抑制し、CRSを抑制する効果を実現させる。
【００３８】
本発明で使用される発現ベクターは、プラスミド複製のための原核レプリコン（pUC Ori）、目的菌株の大量増幅のための原核選別マーカー（AmpR）、真核細胞内における複製を増強するためのウイルスレプリコン（SV40 Ori）、レンチウイルスパッケージングのためのレンチウイルスパッケージングのシスエレメント（RSV、5'末端LTR、3'末端自己不活性化LTR、Gag、RRE、env、cPPT）、細胞内におけるsiRNAの転写のためのヒトRNAポリメラーゼIIIプロモーター（hU6）、真核細胞における緑色蛍光タンパク質の発現のための真核緑色蛍光タグタンパク質（ZsGreen1）、タンパク質の共転写発現のための共発現エレメント（IRES）、キメラ抗原受容体遺伝子の真核転写のための真核プロモーター（EF1α）、認識、伝達、開始が一体化した第二世代CARまたは第三世代CARを組み立てるためのキメラ抗原受容体（CD8 leader、CD19 VL、Optimal Linker C（配列番号19）、CD19 VH、CD8 Hinge、CD8 Transmembrane、CD137、TCR）、遺伝子組換えの発現効率を増強するための転写後調節エレメント（eWPRE）を含む。
【００３９】
本発明は、ペプチドを含む医薬配合品に関し、具体的には以下のものに関する。
【００４０】
一．ヒトRNAポリメラーゼIIIプロモーターhU6、アンピシリン耐性遺伝子含有AmpR配列、原核レプリコンpUC Ori配列、ウイルスレプリコンSV40 Ori配列、RSVプロモーター、ヒトEF1αプロモーター、レンチウイルス5'末端LTR、レンチウイルス3'末端自己不活性化LTR、Gagシスエレメント、RREシスエレメント、envシスエレメント、cPPTシスエレメント、IRESリボソーム結合配列、ZsGreen1緑色蛍光タンパク質、WPREウッドチャックB型肝炎ウイルス転写後調節エレメントからなる組換えレンチウイルスベクター骨格で、このような組換えレンチウイルスベクター骨格は異なる治療性遺伝子を担持して幅広く養子細胞治療の分野に使用することができ、また異なるsiRNAを担持して幅広く遺伝子の過剰発現、誤発現および遺伝子の突然変異による疾患に使用することもできる。
【００４１】
二．組換えレンチウイルスベクター骨格、IL6-siRNA、CD8リーダーキメラ受容体シグナルペプチド、CD19の1本鎖抗体軽鎖VL、1本鎖抗体ヒンジLinkerA、1本鎖抗体ヒンジLinker B、1本鎖抗体ヒンジLinker C、CD19の1本鎖抗体重鎖VH、CD8 Hingeキメラ受容体ヒンジ、CD8 Transmembraneキメラ受容体膜貫通領域、CD28キメラ受容体共刺激因子、CD137キメラ受容体共刺激因子、TCRキメラ受容体T細胞活性化ドメインで組換えレンチウイルスベクターを構築し、当該方法で得られる組換えレンチウイルスベクターはヒトT細胞におけるCD19キメラ抗原受容体の発現を実現させ、T細胞のCD19陽性細胞に対する殺傷作用を誘導して活性化し、臨床においてB細胞性白血病、Bリンパ腫および多発性骨髄腫の治療に使用することができる。ヒトT細胞においてインターロイキン-6(IL-6)のsiRNAを発現し、有効にインターロイキン-6の発現レベルを低下させ、臨床においてサイトカイン放出症候群(Cytokine Release Syndrome、CRS)を緩和することができる。
【００４２】
本発明で設計されたsiRNA配列は21 bpのヌクレオチドを含み、N2[CG]N8[AU]N8[AU]N2のオリゴヌクレオチドの配列パターンを使用し、相補配列の間にステムループ（stem-loop）のヘアピン構造を利用し、siRNA pattern、GC percentage、T or A or G in a row、consecutiver GC、3’end nt pattern、thermodynamic value、siRNA target、identity、alignmentなどの条件によるスクリーニングによって、siRNA設計の干渉成功率を大幅に向上させた。
【００４３】
本発明で使用されるヒトRNAポリメラーゼIIIプロモーターhU6はsiRNAを転写させ、IL-6発現のシステムを抑制し、T細胞殺傷実験において、QPCRによる測定では、有効にmRNAの転写レベルを抑制し、CBAによる測定では、有効に細胞培養上清におけるIL-6発現レベルを減少させ、将来、体内においてIL-6発現レベルを抑制し、CRSの症状を軽減することが可能である。
【００４４】
本発明では、レンチウイルスベクターの態様によってsiRNAを輸送する（図2に示す）。まず、コストを節約し、siRNAの体外合成の高い費用を避ける。次に、siRNAの体内輸送効率が低いという問題を防ぐ。第三に、ヒトRNAポリメラーゼIIIプロモーターhU6でsiRNAを発現させることによって、有効に細胞内におけるRNA転写系を利用し、大量に対応するsiRNAを発現させ、一連の酵素触媒作用を経て、優れた遺伝子サイレンシング効果を実現する。
【００４５】
本発明で使用されるベクター骨格は第三世代のレンチウイルスベクターで（図3Aに示す）、3' SIN LTRはU3領域を除去し、レンチウイルスベクターが自己複製する可能性を無くし、安全性を大幅に向上させる。cPPTとWPREエレメントを加え、導入効率と遺伝子組換えの発現効率を向上させる。RSVプロモーターによってレンチウイルスベクターのパッケージング時のコアRNAの持続的で効率的な転写を保証する。ヒト自身のEF1αプロモーターを利用し、CAR遺伝子が人体内において長時間持続的に発現できるようにさせる。
【００４６】
本発明で使用されるsiRNAノックダウン技術案は、同様に第三世代CARの設計案に使用することができる。第三世代CARの設計は、第二世代の設計と比べると、CD28キメラ受容体共刺激因子（配列番号24）が加えられている。
【００４７】
本発明で使用されるレンチウイルスベクターのカラム精製システム（図8に示す）は、本社で開発されたレンチウイルスの大規模生産プロセスである。通常の超遠心法または高速遠心法は、遠心沈降原理でレンチウイルス粒子を分離するものであり、不可避な沈降係数が近い不純物が多く残り、後続の実験に不利な影響を与える。そして、管への仕込み過程が複雑で、操作が煩雑で、数回の容器の入れ替えは多くの汚染の可能性をもたらす。一方、本発明のレンチウイルスベクターのカラム精製プロセスは半自動化操作で、全部の過程がクラス100の実験エリアで完了し、人工的操作の煩雑さおよび汚染の可能性を避け、回収されるレンチウイルスベクターは内毒素、マイコプラズマなどの指標において完全に臨床の標準に達する。後続は全自動精製装置の開発が可能である。
【００４８】
本発明で使用されるCAR設計案は、第二世代のレンチウイルスベクターの構造にも使用することができる。第二世代と第三世代のレンチウイルスベクターの構造における違い（図3Bに示す）は、主に第三世代のレンチウイルスベクターでは、第二世代のベクターの5' LTRのU3領域をRSVプロモーターに変えることで、U3転写時のTatタンパク質に対する依存を無くし、レンチウイルスの構造遺伝子からTat配列を削除するだけでなく、レンチウイルスのゲノムの転写レベルと転写の持続性も向上させることができることである。第二世代と第三世代のレンチウイルスベクターは主にゲノムの転写形態が違うため、本発明で使用されるCAR設計案は、この二つの世代のレンチウイルスベクターに使用することができる。
【００４９】
本発明の第三世代のレンチウイルス骨格のプラスミドは、増強されたWPREエレメントを使用し、ペンシルベニア大学のCarl H. Juneら（Porter DL, Levine BL, Kalos M, Bagg A, June CH. Chimeric antigen receptormodified T cells in chronic lymphoid leukemia.N Engl J Med 2011;365:725-33.）が使用するWPREエレメントと比べ、6つのヌクレオチドの増強突然変異（g.396G＞A、g.397C＞T、g.398T＞C、g.399G＞A、g.400A＞T、g.411A＞T）を有し、初期転写産物のポリアデノシン化を強化させ、細胞内におけるmRNAの含有量を増加し、遺伝子組換えの発現効率を増強する。
【００５０】
本発明のLentivalパッケージングシステムは補助ウイルスのない4プラスミドパッケージングシステムで、4種類のプラスミドをHEK293T/17細胞に共形質移入させることによって、組換えレンチウイルスベクターが生成される。組換え後のレンチウイルスベクターは複製欠陥型ベクターで、外来断片を宿主の遺伝子に組み込むことができ、使用が一回きりで、複製と増殖が不可で、安全性が大幅に向上する。
【００５１】
本発明で使用されるレンチウイルスベクターは、蛍光タグzsGreen1が付いているバージョンと蛍光タグzsGreen1が付いていないバージョンがあり、蛍光タグzsGreen1が付いているバージョンは体外実験用で、蛍光タグzsGreen1が付いていないバージョンは臨床実験用である。
【００５２】
本発明で使用されるscfv領域のLinker設計は、顕著にサイトカインの分泌、CAR-T細胞の体外殺傷作用および臨床の治療効果を向上させることができる。
【００５３】
このように、本発明に係る組換えレンチウイルスベクターは急性Bリンパ性白血病（ALL）のCAR-T治療に信頼できる遺伝子組換えの保証を提供すると同時に、CRSが発生するリスクを大幅に低下させ、患者の苦痛を軽減することができる。
【００５４】
本発明に係るIL-6ノックダウンsiRNA発現カセットおよびそのsiRNA発現産物は、CAR19-Tの急性Bリンパ性白血病(ALL)に対する治療においてCRSの症状の解消または軽減だけでなく、CAR-T治療によって、例えば、Bリンパ腫、膵臓腺癌、脳膠細胞腫、骨髄腫などのすべての種類の腫瘍を治療する時に生じるCRS症状の緩和にも使用することができ、さらに他の種類の治療によるCRSの緩和に使用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明に係るIL-6シグナル経路の概略図である。
【図２】本発明に係るレンチウイルスによるsiRNAの輸送態様の概略図である。
【図３】本発明に係るレンチウイルスベクターの構造の概略図である。ここで、図3（A）は本発明で使用される第三世代のレンチウイルスベクターの構造の概略図で、図3（B）は第二世代と第三世代のレンチウイルスベクターの構造の比較である。
【図４】本発明に係る組換えレンチウイルスベクターの構築のフロー図である。ここで、図（A）はレンチウイルス骨格プラスミドpLenti-3G silencerの構造概略図で、図（B）はpCAR19-silencerプラスミドの構造概略図で、図（C）はpCAR19-1761〜pCAR19-1769プラスミド概略図で、図（D）はレンチウイルスパッケージングプラスミドpPac-GPの構造概略図で、図（E）はレンチウイルスパッケージングプラスミドpPac-Rの構造概略図で、図（F）は膜タンパク質pEnv-Gの構造概略図である。
【図５】レンチウイルス骨格プラスミドpLenti-3G silencerの酵素切断の予想および酵素切断のアガロースゲル電気泳動パターンである。ここで、図5Aはレンチウイルス骨格プラスミドpLenti-3G silencerの酵素切断の予想の概略図で、レーン1は1kb DNAラダーマーカーで、バンドは上から下の順に10kb、8kb、6kb、5 kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bpで、レーン2はpLenti-3G silencerのCla I+BamH I酵素切断の予想で、バンドは上から下の順に7381bp、23bpである。図5Bはレンチウイルス骨格プラスミドpLenti-3G silencerの酵素切断のアガロースゲル電気泳動パターンで、レーン1はpLenti-3G silencerのCla I+BamH I酵素切断の電気泳動の結果で、レーン2は1kb DNAラダーマーカーの電気泳動の結果である。
【図６】組換えレンチウイルス骨格プラスミドpCAR19-silencerの酵素切断の予想および酵素切断のアガロースゲル電気泳動パターンである。ここで、図6Aは組換えレンチウイルス骨格プラスミドpCAR19-silencerの酵素切断の予想の概略図で、レーン1は1kb DNAラダーマーカーで、バンドは上から下の順に10kb、8kb、6kb、5 kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bpで、レーン2はpCAR19-silencerのKpn I酵素切断の予想で、バンドは上から下の順に8335bp、1708bpである。図6Bは組換えレンチウイルス骨格プラスミドpCAR19-silencerの酵素切断のアガロースゲル電気泳動パターンで、レーン1は1kb DNAラダーマーカーの電気泳動の結果で、レーン2はpCAR19-silencerのKpn I酵素切断の電気泳動の結果である。
【図７】IL-6ノックダウン組換えレンチウイルスプラスミドpCAR19-1761〜pCAR19-1769の配列決定比較の結果である。ここで、AはpCAR19-1761の配列決定比較の結果で、BはpCAR19-1762の配列決定比較の結果で、CはpCAR19-1763の配列決定比較の結果で、DはpCAR19-1764の配列決定比較の結果で、EはpCAR19-1765の配列決定比較の結果で、FはpCAR19-1766の配列決定比較の結果で、GはpCAR19-1767の配列決定比較の結果で、HはpCAR19-1768の配列決定比較の結果で、IはpCAR19-1769の配列決定比較の結果である。
【図８】イオン交換クロマトグラフィーによる組換えレンチウイルスベクターの精製のフロー図である。
【図９】組換えレンチウイルスベクターの力価の測定結果である。
【図１０】組換えレンチウイルスベクターの異なる精製手段におけるマイコプラズマの測定結果で、レーン1はDL2000マーカーで、バンドは上から下の順に2kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp、100bpで、レーン2は陽性対照で、レーン3は陰性対照で、レーン4はPBSで、レーン5は水で、レーン6はlvCAR19-1761で、レーン7はlvCAR19-1762で、レーン8はlvCAR19-1763で、レーン9はlvCAR19-1764で、レーン10はlvCAR19-1765で、レーン11はlvCAR19-1766で、レーン12はlvCAR19-1767で、レーン13はlvCAR19-1768で、レーン14はlvCAR19-1769である。
【図１１】mRNA相対発現量の縦棒グラフである。
【図１２】CARタンパク質発現量のWB測定図である。ここで、図12Aにおいて、レーン1はPBMC空細胞で、レーン2は対照ウイルスMOCKで、レーン3はlvCAR19-1761で、レーン4はlvCAR19-1762で、レーン5はlvCAR19-1763で、レーン6はlvCAR19-1764で、レーン7はlvCAR19-1765で、レーン8はlvCAR19-1766で、レーン9はlvCAR19-1767で、レーン10はlvCAR19-1768で、レーン11はlvCAR19-1769である。図12Bは、β-アクチンの内部参照のバンドである。
【図１３Ａ−１３Ｂ】IL-6ノックダウン組換えレンチウイルスlvCAR19-1761〜lvCAR19-1769を標的細胞とインキュベートした後、4hと24hの上清におけるCBAの測定結果である。図13Aは4hのCBA測定結果で、図13Bは24hのCBA測定結果である。
【図１４】異なるエフェクター細胞を標的細胞と共培養する条件において、4hと24hの上清におけるIL-6含有量の変化の様子である。
【図１５】異なるエフェクター細胞を標的細胞と共培養する条件において、24hのmRNA転写レベルの変化の様子である。
【図１６】異なるエフェクター細胞を標的細胞と10:1の比率で共培養する条件において、24h後標的細胞に対する殺傷の状況を測定したことを示す図である。Eはエフェクター細胞で、Tは標的細胞である。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
以下の実施例は本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常、通常の条件、あるいはメーカー推薦の条件で行われた。
【００５７】
実施例1  組換えレンチウイルスベクターの構築
一．材料
1．レンチウイルス骨格プラスミドpLenti-3G silencer、レンチウイルスパッケージングプラスミドpPac-GP、pPac-Rおよび膜タンパク質プラスミドpEnv-G、HEK293T/17細胞、相同組換え酵素、Oligo Annealing BufferはS&E （Shanghai) BIO-PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.によって提供された。
【００５８】
2．プライマー：プライマーの設計原則によってDNA断片と標的部位の増幅に必要なプライマーは、具体的には以下の通りである。
EF1α-F：5’-ATTCAAAATTTTATCGATGCTCCGGTGCCCGTCAGT-3’(配列番号25)
EF1α-R：5’-TCACGACACCTGAAATGGAAGA-3’(配列番号26)
CD8 leader-F：5’-GGTGTCGTGAGGATCCGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGC-3’ 
(配列番号27)
CD8 leader-R：5’-GTGTCATCTGGATGTCCGGCCTGGCGGCGTG-3’(配列番号28)
VL-F：5’-CACGCCGCCAGGCCGGACATCCAGATGACACAGACTACATC-3’(配列番号29)
VL-R：5’-TGTGATCTCCAGCTTGGTCC-3’(配列番号30)
OLC-VH-F：5’-CAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCG
GGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCA-3’(配列番号31)
VH-R：5’-TGAGGAGACGGTGACTGAGGT-3’(配列番号32)
CD8 Hinge-F：5’-AGTCACCGTCTCCTCAACCACGACGCCAGCGCC-3’(配列番号33)
CD8 Hinge-R：5’-GTAGATATCACAGGCGAAGTCCA-3’(配列番号34)
CD8 Transmembrane-F：5’-CGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGC-3’(配列番号35)
【００５９】
CD8 Transmembrane-R：5’-TCTTTCTGCCCCGTTTGCAGTAAAGGGTGATAACCAGTG- 3’(配列番号36)
CD137-F：5’-AAACGGGGCAGAAAGAAACTC-3’(配列番号37)
CD137-R：5’-TGCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTC-3’(配列番号 38)
TCR-F：5’-AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCG-3’(配列番号39)
TCR-R：5’-GGAGAGGGGCGTCGACTTAGCGAGGGGGCAGGGC-3’(配列番号40)
siRNA1761-F（陰性対照）：
5’-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGG
AGAATTTTTG-3’(配列番号41)
siRNA1761-R（陰性対照）：
5’-AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACAC
GTTCGGAGAA-3’(配列番号42) 
siRNA1762-F：5’-CCGGGTGAAGCTGAGTTAATTTATGCTCGAGTAAATTAACTCAGC
TTCACATTTTTTTG-3’(配列番号43)
siRNA1762-R：5’- AATTCAAAAAAATGTGAAGCTGAGTTAATTTACTCGAGCATAAA
TTAACTCAGCTTCAC-3’(配列番号44) 
siRNA1763-F：5’-CCGGGCACAGAACTTATGTTGTTCTCTCGAGAACAACATAAGTT
CTGTGCCCTTTTTTG-3’(配列番号45)
siRNA1763-R：5’-AATTCAAAAAAGGGCACAGAACTTATGTTGTTCTCGAGAGAAC
AACATAAGTTCTGTGC-3’(配列番号46) 
siRNA1764-F：5’-CCGGCTCAGATTGTTGTTGTTAATGCTCGAGTTAACAACAACAA
TCTGAGGTTTTTTTG-3’(配列番号47)
siRNA1764-R：5’-AATTCAAAAAAACCTCAGATTGTTGTTGTTAACTCGAGCATTAA
CAACAACAATCTGAG-3’(配列番号48) 
siRNA1765-F：5’-CCGGGCAGCTTTAAGGAGTTCCTGCCTCGAGAGGAACTCCTTA
AAGCTGCGCTTTTTTG-3’(配列番号49)
siRNA1765-R：5’-AATTCAAAAAAGCGCAGCTTTAAGGAGTTCCTCTCGAGGCAGG
AACTCCTTAAAGCTGC-3’(配列番号50) 
siRNA1766-F：5’-CCGGGTGTAGGCTTACCTCAAATAACTCGAGATTTGAGGTAAGC
CTACACTTTTTTTTG-3’(配列番号51)
siRNA1766-R：5’-AATTCAAAAAAAAGTGTAGGCTTACCTCAAATCTCGAGTTATTT
GAGGTAAGCCTACAC-3’(配列番号52) 
siRNA1767-F：5’-CCGGCTCAAATAAATGGCTAACTTACTCGAGAGTTAGCCATTTAT
TTGAGGTTTTTTTG-3’(配列番号53)
siRNA1767-R：5’-AATTCAAAAAAACCTCAAATAAATGGCTAACTCTCGAGTAAGTT
AGCCATTTATTTGAG-3’(配列番号54) 
siRNA1768-F：5’-CCGGGATGCTTCCAATCTGGATTCACTCGAGAATCCAGATTGGA
AGCATCCATTTTTTG-3’(配列番号55)
siRNA1768-R：5’-AATTCAAAAAATGGATGCTTCCAATCTGGATTCTCGAGTGAATC
CAGATTGGAAGCATC-3’(配列番号56) 
siRNA1769-F：5’-CCGGCTTCCAATCTGGATTCAATGACTCGAGATTGAATCCAGAT
TGGAAGCATTTTTTG-3’(配列番号57)
siRNA1769-R：5’-AATTCAAAAAATGCTTCCAATCTGGATTCAATCTCGAGTCATTG
AATCCAGATTGGAAG-3’(配列番号58)
WPRE-QPCR-F：5’-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3’(配列番号59)
WPRE-QPCR-R：5’-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3’(配列番号60)
Actin-QPCR-F：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’(配列番号61)
Actin-QPCR-R：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’(配列番号62)
CAR-QPCR-F：5’-GACTTGTGGGGTCCTTCTCCT-3’(配列番号63)
CAR-QPCR-R：5’-GCAGCTACAGCCATCTTCCTC-3’(配列番号64)
IL6-QPCR-F：5’-GGATTCAATGAGGAGACTT-3’(配列番号65)
IL6-QPCR-R：5’-ATCTGTTCTGGAGGTACT-3’(配列番号66)
【００６０】
3．配列番号15〜配列番号66で示されるDNA配列は、Generay Biotech Co, Ltd.によって合成され、かつオリゴヌクレオチドの乾燥粉末またはプラスミドの態様で保存する。
【００６１】
4．ツール酵素BspE I、EcoR I、BamH I、Kpn I、Cla I、T4 DNAリガーゼはいずれもNEB社から購入した。
【００６２】
5．高忠実度酵素PrimeSTAR、RNはTakara社から購入した。
【００６３】
6．0.22μm〜0.8μm PESフィルターはmillipore社から購入した。
【００６４】
7．プラスミド抽出キット、アガロースゲル回収キットはいずれもMN社から購入した。
【００６５】
8．感受性細胞TOP10はtiangen社から購入した。
【００６６】
9．NaCl、KCl、Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、トリプシン、EDTA、CaCl2、NaOH、PEG6000はいずれも上海生工社から購入した。
【００６７】
10．Opti-MEM、FBS、DMEM、1640、Pen-Srep、Hepesはinvitrogen社から購入した。
【００６８】
11．Biotinylated protein LはGeneScript社から購入した。
【００６９】
12．西洋ワサビペルオキシダーゼ標識の二次抗体、DAB使用液はいずれも北京中杉金橋社から購入した。
【００７０】
13．ECL+plusTM Western blotting systemはAmersham社から購入した。
【００７１】
14．DNeasyキットは上海Generay社から購入した。
【００７２】
15．リンパ球分離液は深センDakewe Biotech Co., Ltd.から購入した。
【００７３】
16．フィコエリトリン(PE)結合ストレプトアビジン、CBAキットはBD Bioscience社から購入した。
【００７４】
17．SA-HRPは上海Yeasen社から購入した。
【００７５】
18．マイコプラズマ測定キット、内毒素測定キット、CD19+K562細胞はS&E （Shanghai)社によって提供された。
【００７６】
19．LDH測定キットはpromega社によって提供された。
【００７７】
二．組換えレンチウイルスベクターlvCAR19-1761〜lvCAR19-1769の構築方法
図4を参照すると、本発明に係る組換えレンチウイルスベクターの構築方法は以下の通りである。
【００７８】
1．ヒトEF1αプロモーター、CD8 leaderキメラ受容体シグナルペプチド、CD19の1本鎖抗体軽鎖VL、Optimal Linker C、CD19の1本鎖抗体重鎖VH、CD8 Hingeキメラ受容体ヒンジ、CD8 Transmembraneキメラ受容体膜貫通領域、CD137キメラ受容体共刺激因子、TCRキメラ受容体T細胞活性化ドメインをレンチウイルス骨格プラスミドpLenti-3G silencerにクローニングし、組換えレンチウイルスプラスミドpCAR19-silencerを得た後、siRNA断片をそれぞれpCAR19-silencerに連結し、IL-6ノックダウン組換えレンチウイルスプラスミドpCAR19-1761〜pCAR19-1769を得た。
【００７９】
（1）レンチウイルス骨格プラスミドpLenti-3G silencerは制限酵素Cla IとBamH Iで二重酵素切断し、産物を1.5％のアガロースゲル電気泳動を行ったところ、7381bpの断片V1が確認され（図5に示す）、ゲルを切断してエッペンドルフ（Eppendorf）管に収集し、MN社のアガロースゲル回収キットによって対応する断片を回収し（表1に示す）、産物の純度と濃度を測定した。
【００８０】
2020188777.tif 000003
【００８１】
（2）プライマーEF1α-FとEF1α-Rで合成された配列番号15を鋳型とし、表2におけるシステムを使用し、PCRサイクル条件は98℃ 3min、（98℃ 10s、55℃ 15s、72℃ 2min）×35サイクル、72℃ 10minであった。産物を1.5％のアガロースゲル電気泳動を行ったところ、1208bpの断片aが確認され、ゲルを切断してエッペンドルフ管に収集し、MN社のアガロースゲル回収キットによって対応する断片を回収し（表1に示す）、産物の純度と濃度を測定した。
【００８２】
2020188777.tif 000004
【００８３】
（3）プライマーCD8 leader-FとCD8 leader-Rで合成された配列番号16を鋳型とし、表2におけるシステムを使用し、PCRサイクル条件は98℃ 3min、（98℃ 10s、55℃ 15s、72℃ 30s）×35サイクル、72℃ 5minであった。産物を1.5％のアガロースゲル電気泳動を行ったところ、101bpの断片bが確認され、ゲルを切断してエッペンドルフ管に収集し、MN社のアガロースゲル回収キットによって対応する断片を回収し（表1に示す）、産物の純度と濃度を測定した。
【００８４】
（4）プライマーVL-FとVL-Rで合成された配列番号17を鋳型とし、表2におけるシステムを使用し、PCRサイクル条件は98℃ 3min、（98℃ 10s、55℃ 15s、72℃ 30s）×35サイクル、72℃ 5minであった。産物を1.5％のアガロースゲル電気泳動を行ったところ、336bpの断片cが確認され、ゲルを切断してエッペンドルフ管に収集し、MN社のアガロースゲル回収キットによって対応する断片を回収し（表1に示す）、産物の純度と濃度を測定した。
【００８５】
（5）プライマーOLC-VH-FとVH-Rで合成された配列番号19を鋳型とし、表2におけるシステムを使用し、PCRサイクル条件は98℃ 3min、（98℃ 10s、55℃ 15s、72℃ 30s）×35サイクル、72℃ 5minであった。産物を1.5％のアガロースゲル電気泳動を行ったところ、421bpの断片dが確認され、ゲルを切断してエッペンドルフ管に収集し、MN社のアガロースゲル回収キットによって対応する断片を回収し（表1に示す）、産物の純度と濃度を測定した。
【００８６】
（6）プライマーCD8 Hinge-FとCD8 Hinge-Rで合成された配列番号20を鋳型とし、表2におけるシステムを使用し、PCRサイクル条件は98℃ 3min、（98℃ 10s、55℃ 15s、72℃ 30s）×35サイクル、72℃ 5minであった。産物を1.5％のアガロースゲル電気泳動を行ったところ、147bpの断片eが確認され、ゲルを切断してエッペンドルフ管に収集し、MN社のアガロースゲル回収キットによって対応する断片を回収し（表1に示す）、産物の純度と濃度を測定した。
【００８７】
（7）プライマーCD8 Transmembrane-FとCD8 Transmembrane-Rで合成された配列番号21を鋳型とし、表2におけるシステムを使用し、PCRサイクル条件は98℃ 3min、（98℃ 10s、55℃ 15s、72℃ 30s）×35サイクル、72℃ 5minであった。産物を1.5％のアガロースゲル電気泳動を行ったところ、100bpの断片fが確認され、ゲルを切断してエッペンドルフ管に収集し、MN社のアガロースゲル回収キットによって対応する断片を回収し（表1に示す）、産物の純度と濃度を測定した。
【００８８】
（8）プライマーCD137-FとCD137-Rで合成された配列番号22を鋳型とし、表2におけるシステムを使用し、PCRサイクル条件は98℃ 3min、（98℃ 10s、55℃ 15s、72℃ 30s）×35サイクル、72℃ 5minであった。産物を1.5％のアガロースゲル電気泳動を行ったところ、142bpの断片gが確認され、ゲルを切断してエッペンドルフ管に収集し、MN社のアガロースゲル回収キットによって対応する断片を回収し（表1に示す）、産物の純度と濃度を測定した。
【００８９】
（9）プライマーTCR-FとTCR-Rで合成された配列番号23を鋳型とし、表2におけるシステムを使用し、PCRサイクル条件は98℃ 3min、（98℃ 10s、55℃ 15s、72℃ 30s）×35サイクル、72℃ 5minであった。産物を1.5％のアガロースゲル電気泳動を行ったところ、355bpの断片hが確認され、ゲルを切断してエッペンドルフ管に収集し、MN社のアガロースゲル回収キットによって対応する断片を回収し（表1に示す）、産物の純度と濃度を測定した。
【００９０】
（10）DNA断片b、c、dを1μlずつ鋳型とし、表3におけるシステムを使用し、プライマー以外のものをエッペンドルフ管に入れ、PCRサイクル条件は98℃ 3min、（98℃ 10s、60℃ 10s、72℃ 30s）×6サイクルで、プライマーCD8 leader-F/VH-Rを入れ、サイクル条件は（98℃ 10s、60℃ 10s、72℃ 40s）×24サイクル、72℃ 5minであった。産物を1.5％のアガロースゲル電気泳動を行ったところ、814bpの断片iが確認され、ゲルを切断してエッペンドルフ管に収集し、MN社のアガロースゲル回収キットによって対応する断片を回収し（表1に示す）、産物の純度と濃度を測定した。
【００９１】
2020188777.tif 000005
【００９２】
（11）DNA断片e、f、g、hを1μlずつ鋳型とし、表3におけるシステムを使用し、プライマー以外のものをエッペンドルフ管に入れ、PCRサイクル条件は98℃ 3min、（98℃ 10s、60℃ 10s、72℃ 30s）×6サイクルで、プライマーCD8 Hinge-F/TCR-Rを入れ、サイクル条件は（98℃ 10s、60℃ 10s、72℃ 30s）×24サイクル、72℃ 5minであった。産物を1.5％のアガロースゲル電気泳動を行ったところ、704bpの断片jが確認され、ゲルを切断してエッペンドルフ管に収集し、MN社のアガロースゲル回収キットによって対応する断片を回収し（表1に示す）、産物の純度と濃度を測定した。
【００９３】
（12）DNA断片V1、a、i、jを総体積5μlかつモル比1:1:1:1の比率でエッペンドルフ管に入れ、相同組換え酵素反応液15μlを入れ、均一に混合した後42℃で30分間インキュベートし、氷の上に移して2〜3分間放置し、反応液を50μlのTOP10に入れ、軽く回転させて均一に内容物を混合し、氷の中に30分間放置し、管を42℃に加熱しておいた恒温水浴に入れて90秒加熱刺激し、直ちに管を氷浴に移し、細胞を2〜3分間冷却し、各管にLB培養液を900 μlずつ入れた後、管を37℃のシェーカーに移し、1時間インキュベートして細胞を回復させ、100μlの形質転換菌をAmp LB寒天プレートに塗布し、逆さまに置き、恒温インキュベーターで37℃で16時間培養した。
【００９４】
クローンを選んでコロニーのPCR同定を行い、正確と同定されたクローンは組換えレンチウイルスプラスミドpCAR19-silencerで、正確なクローンに対して酵素切断の同定を行った（図6に示す）。
【００９５】
（13）組換えレンチウイルスプラスミドpCAR19-silencerは制限酵素BspE IとEcoR Iで二重酵素切断し、産物を1.5％のアガロースゲル電気泳動を行ったところ、10029bpの断片V2が確認され、ゲルを切断してエッペンドルフ（Eppendorf）管に収集し、MN社のアガロースゲル回収キットによって対応する断片を回収し（表1に示す）、産物の純度と濃度を測定した。
【００９６】
（14）合成されたsiRNA1761-F/R〜siRNA1769-F/Rをそれぞれoligo annealing bufferで20μMに溶解させ、対応するFとRを30μlずつ取って混合した。その後、siRNA1761-F/R〜siRNA1769-F/R混合物を水浴で95℃で5分間加熱した後、水浴を蓋をせずに室温で置いて室温に自然冷却し、2本鎖のオリゴヌクレオチド断片を形成した。1μl取って連結反応に使用し（表4に示す）、4℃で16h連結し氷の上に移して2〜3分間放置し、反応液を50μlのTOP10に入れ、軽く回転させて均一に内容物を混合し、氷の中に30分間放置し、管を42℃に加熱しておいた恒温水浴に入れて90秒加熱刺激し、直ちに管を氷浴に移し、細胞を2〜3分間冷却し、各管にLB培養液を900 μlずつ入れた後、管を37℃のシェーカーに移し、1時間インキュベートして細胞を回復させ、100μlの形質転換菌をAmp LB寒天プレートに塗布し、逆さまに置き、恒温インキュベーターで37℃で16時間培養した。
【００９７】
クローンを選んでコロニーのPCR同定を行い、正確と同定されたクローンはIL-6ノックダウン組換えレンチウイルスプラスミドpCAR19-1761〜pCAR19-1769で、正確なクローンに対して配列決定の同定を行った（図7に示す）。
【００９８】
2020188777.tif 000006
【００９９】
2．組換えレンチウイルスベクターlvCAR19-1761〜lvCAR19-1769のパッケージング
【０１００】
（1）完全培地：予熱した新鮮な培地を取り、10％FBS +5ml Pen-Srepを入れ、上下反転して均一に混合した。
【０１０１】
（2）1XPBS溶液：NaCl 8g、KCl 0.2、Na2HPO4・12H2O 3.58g、KH2PO4 0.24gを量って1000mlビーカーに入れ、900mlのMilli-Qグレードの超純水を加えて溶解させ、完全に溶解した後、1000mlメスシリンダーで容積を1000mlにし、121℃の高温で20min湿熱滅菌した。
【０１０２】
（3）0.25％トリプシン溶液: トリプシン 2.5g、EDTA 0.19729gを量って1000mlビーカーに入れ、900mlの1×PBSを加えて溶解させ、完全に溶解した後、メスシリンダーで容積を1000mlにし、0.22μMのろ過除菌を行い、長期的な使用の場合-20℃の冷蔵庫で保存する。
【０１０３】
（4）0.5M CaCl2溶液：36.75g CaCl2を量って400mlのMilli-Qグレードの超純水に溶解させた。Milli-Qグレードの超純水で総体積を500mlにし、均一に混合した。0.22μmのろ過除菌を行い、分けて50ml遠心管に保存し、各管に45mlずつ、4℃で保存した。
【０１０４】
（5）2×HBS溶液：4.09g NaCl、0.269g Na2HPO4、5.96g Hepesを量って、400ml Milli-Qグレードの超純水に溶解させた。pH計を較正した後、2M NaOH溶液でHBS溶液のpHを7.05に調整した。各瓶のHBSのpHの調整に消費した2M NaOHは3ml程度であった。
【０１０５】
（6）液体窒素タンクから冷凍保存したHEK293T/17細胞を取り出し、直ちに37℃の水浴に移し、1〜2min後クリーンベンチに移し、無菌操作で冷凍保存管における液体を全部10cm2培養シャーレに移し、8mL/10cm2シャーレまで10％FBS含有DMEMを追加し、24h後顕微鏡で細胞を観察し、細胞が80％コンフルエントを超えたら継代を行った。
【０１０６】
（7）細胞状態が良く、汚染のないHEK293T/17細胞を選び、2〜6個の培養シャーレを一組として、細胞をトリプシンで消化した後、電動ピペットで4〜12mlの完全培地を吸い取り、培養シャーレが乾燥しないように消化された各培養シャーレに2ml入れた。1mlピペットですべての細胞を吹きかつ混ぜて単細胞懸濁液にし、培地瓶に移した。
【０１０７】
（8）上記2〜6個の培養シャーレにおける残留細胞を培地瓶に移し、培地でもう一回培養シャーレを洗った。
【０１０８】
（9）培地瓶の蓋をし、上下反転を10回程度して細胞懸濁液を十分に混合し、細胞を8〜24個の10cm2培養シャーレに継代し、各シャーレの細胞密度は約4 × 106個/10ml完全培地程度であった。細胞密度が予想と大きく違ったら、細胞をカウントした後、4×106個/シャーレの量で接種した。
【０１０９】
（10）6個の培養シャーレをひと重ねにし、上下のシャーレの間のマッチングを維持するように注意した。培養シャーレを左右、前後に数回振とうし、細胞を十分に分散させた後、5％ CO2インキュベーターに入れた。残留細胞に対して同様の処理を行った。
【０１１０】
（11）継代された細胞をチェックしたところ、細胞は70〜80％コンフルエントで、輪郭がふっくらとし、付着が良く、細胞培養シャーレに均一に分布していた。
【０１１１】
（12）細胞の液置換を行い、培地を新鮮な完全培地に替え、各シャーレに9mlずつであり、インキュベーターのCO2濃度設定値を8％に上げた。
【０１１２】
（13）N+0.5になるようにDNA/CaCl2溶液を調製した。各シャーレのHEK293T/17細胞のプラスミド形質移入量は、組換えレンチウイルスプラスミド(20μg)、pPac-GP(15μg)、pPac-R(10μg)、pEnv-G(7.5μg)のような比率とした。新たな5ml遠心管を取り、0.5M CaCl2：0.25ml、組換えレンチウイルスプラスミド20μg：pPac-GP 15μg：pPac-R 10μg：pEnv-G 7.5μgを入れ、超純水を追加して0.5mlにして蓋をし、十分に混合した。
【０１１３】
（14）5ml遠心管をもう1本取り、0.5mlのDNA/CaCl2溶液を入れた。ボルテックス振とう機を開け、片手で5ml遠心管の上端を持ち、管底を振とうヘッドに当て、液体を管壁に分散させて流動させ、もう一方の手で1mLピペットを持ち、0.5mLの2×HBS溶液を吸い取り、ゆっくり遠心管に滴下し、３０秒で滴下が完了するように流速をコントロールした。2×HBSを入れた後、続けて5秒振とうし、振とうを止め、そのまま形質移入しようとする細胞に入れた。
【０１１４】
（15）一つのシャーレの細胞を取り、カルシウム形質移入試薬がシャーレ全体に分布するように、遠心管における1mLのカルシウム形質移入液をそれに滴下した。
【０１１５】
（16）カルシウム形質移入液を入れた後、シャーレの蓋に印をつけ、培養シャーレをもう一台の5％ CO2インキュベーターに置いた。培養シャーレを水平に置き、重ねたシャーレが6個を超えないようにした。5％ CO2インキュベーターに置いた（6〜8 h）。
【０１１６】
（17）一台目のインキュベーターのCO2濃度設定値を5％に戻した。
【０１１７】
（18）24時間後、細胞の状態をチェックした。細胞は80〜85％コンフルエント程度で、状態が良かった。培地を吸い取り、10 mLの新鮮なDMEM完全培地に替えた。
【０１１８】
（19）48時間後、形質移入の効率を観察した。ほとんどの細胞はまだ付着していた。95％超の細胞に緑色蛍光がついたことがわかった。同一のウイルスパッケージング上清液を合わせ、培養シャーレに続けて10 mLの新鮮な培地を添加した。
【０１１９】
（20）72時間後、もう一回同一のウイルス上清液を合わせ、2回収集されたウイルスを合わせてもよく、培養シャーレを捨てた。この時収集された上清に組換えレンチウイルスベクターlvCAR19-1761〜lvCAR19-1769が含まれていた。
【０１２０】
実施例2  組換えレンチウイルスベクターの濃縮と測定
一．イオン交換クロマトグラフィーによって組換えレンチウイルスベクターを精製した（図8に示す）。
（1）収集された上清液をThermo真空ポンプで、0.22μm〜0.8μmのPESフィルターで吸引ろ過し、不純物を除去した。
（2）1:1〜1:10の比率で上清に1.5M NaCl 250 mM Tris-HCl（pH 6-8）を入れた。
【０１２１】
（3）2本のイオン交換カラムを直列に設置し、4ml 1M NaOH、4ml 1M NaCl、5ml 0.15M NaCl 25 mM Tris-HCl（pH 6〜8）溶液を順にカラムに通過させた。
（4）工程2で得られた溶液をペリスタポンプで1〜10ml/minの速度でイオン交換カラムに仕込んだ。
（5）上清液が全部カラムを通過した後、10ml 0.15M NaCl 25 mM Tris-HCl（pH 6〜8）溶液で1回洗浄した。
（6）仕込み量に応じて1〜5ml 1.5M NaCl 25 mM Tris-HCl（pH 6〜8）で溶離させ、溶離液を収集した。
（7）溶離液を25〜50μl/管で分け、-80℃の冷蔵庫で冷凍保存し、長期間保存した。
【０１２２】
二．力価の測定：
（1）24ウェルプレートを取って293T細胞を接種した。各ウェルの細胞は5×104個で、加えられた培地の体積は500μlで、異なる種類の細胞の生長速度は異なり、ウイルス感染時の細胞融合率は40％〜60％であった。
【０１２３】
（2）3本の無菌エッペンドルフ管を準備し、各管に90μlずつ新鮮な完全培地（高糖DMEM+10％FBS）を加えて細胞を接種してから24時間後、2つのウェルの細胞を血球計算板でカウントし、感染時の細胞の実際の数を確認し、Nと記録した。
【０１２４】
（3）測定されるウイルス原液10μlを1本目の管に入れ、軽く均一に混合した後、10μl取って2本目の管に入れ、さらに順に最後の管まで操作した。最終体積が500μlになるように、各管に410μlの完全培地（高糖DMEM+10％FBS）を入れた。
【０１２５】
（4）感染開始から20時間で、培養上清を除去し、500μlの完全培地（高糖DMEM+10％FBS）に替え、5％CO2で続けて48時間培養した。
【０１２６】
（5）72時間後、蛍光発現状況を観察し、正常の場合、蛍光細胞数が希釈倍率の増加につれて減少したので、写真撮影した。
【０１２７】
（6）0.2mlの0.25％トリプシン-EDTA溶液で細胞を消化し、37℃で1分間放置した。培地で細胞の面全体をパージし、遠心分離で細胞を収集した。DNeasyキットの説明に従ってゲノムDNAを抽出した。各サンプル管に200μlの溶離液を加えてDNAを洗い落として定量した。
【０１２８】
（7）目的DNAを準備しqPCRmix総管Iを測定した（QPCRプライマー配列は配列番号59−配列番号60）。
【０１２９】
2020188777.tif 000007
【０１３０】
n = 反応数である。例えば、総反応数が40の場合、1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix、4μl フォワードプライマー、4μl リバースプライマー、4μl プローブおよび788μl H2Oを混合する。振とう後、氷の上に置いた。
【０１３１】
（8）内部参照DNAを準備しqPCRmix管IIを測定した（QPCRプライマー配列は配列番号61−配列番号62）。
【０１３２】
2020188777.tif 000008
【０１３３】
n = 反応数である。例えば、総反応数が40の場合、1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix、100μl 10×RNasePプライマー/プローブミックスおよび700μl H2Oを混合する。振とう後、氷の上に置いた。
【０１３４】
（9）冷却しておいた96ウェルPCRプレートにPCR系を構築した。総管Iからそれぞれ45μl取ってA〜Dの各列のウェルに加え、総管IIからそれぞれ45μl取ってE〜Gの各列のウェルに加えた。
【０１３５】
（10）それぞれ5μlのプラスミド標準品および被験サンプルのゲノムDNAをA〜Dの列に加え、各サンプルは1回繰り返した。別に1つのウェルに5μlの水を加えて無鋳型対照（no-template control）とした。
【０１３６】
（11）それぞれ5μlのゲノム標準品および被験サンプルのゲノムDNAをE〜Gの列に加え、各サンプルは1回繰り返した。別に1つのウェルに5μlの水を加えて無鋳型対照（no-template control）とした。
【０１３７】
（12）使用された定量PCR装置はABI PRISM 7500定量システムであった。サイクル条件は、50℃ 2分、95℃ 10分、さらに95℃ 15秒、60℃ 1分の40サイクルとした。
【０１３８】
データ分析：測定されたDNAサンプルに組み込まれたレンチウイルスベクターのコピー数をゲノム数で表記し、各ゲノムに組み込まれたウイルスのコピー数を得た。
力価（integration units per ml，IU ml-1）の計算式は以下の通りである。
IU ml-1 = (C ×N× D×1000)/V
【０１３９】
2020188777.tif 000009
【０１４０】
（13）組換えレンチウイルスベクターlvCAR19-1761〜lvCAR19-1769の力価の結果（図9に示す）。
【０１４１】
三．内毒素の測定：
（1）内毒素使用標準品は15EU/本であった。
（2）ライセート試薬の感度はλ＝0.25EU/ml、0.5ml/管であった。
【０１４２】
（3）内毒素標準品の希釈：内毒素標準品1本を取り、それぞれBET水で比率に従って4λと2λの溶解に希釈し、密封膜で封じ、15min振とうして溶解させた。希釈時、毎回の希釈はボルテックスミキサーで30s均一に混合した。
【０１４３】
（4）仕込み：ライセート試薬を数本取り、1本あたりBET水0.5mlを加えて溶解させ、それぞれ数本の内毒素試験管に0.1ml/管で加えた。そのうち、2本は陰性対照管であり、BET水0.1mlを加えた。
【０１４４】
2本は陽性対照管であり、濃度2λの内毒素使用標準品溶液0.1mlを加えた。
【０１４５】
2本はサンプル陽性対照管であり、0.1mlの2λ内毒素標準品を含有するサンプル溶液（20倍に希釈された被験サンプル1ml + 4λの内毒素標準品溶液1ml=2mlの2λ内毒素標準品を含有する40倍に希釈されたサンプル）を加えた。
【０１４６】
サンプル管に0.1mlのサンプルを加え、表5に示す希釈比率で、37±1℃の水浴（またはインキュベーター）で60±1min保温した。
【０１４７】
2020188777.tif 000010
【０１４８】
（5）組換えレンチウイルスベクターlvCAR19-1761〜lvCAR19-1769の内毒素の測定結果（表6に示す）であり、内毒素は0〜2.5 EU/mLの間で、以下の要求に合うものであった。
【０１４９】
2020188777.tif 000011
【０１５０】
四．マイコプラズマの測定と比較：
（1）実験前の3日は、細胞サンプルを無抗生物質培地で培養した。
（2）1mlの細胞懸濁液（細胞数は1×105よりも多い）を収集し、1.5ml遠心管に入れた。
（3）13000×gで1min遠心分離し、沈殿を収集し、培地を捨てた。
（4）500μlのPBSをピペットチップで吹きかつ吸いをするかボルテックス振とうし、沈殿を再懸濁させた。13000×gで5min遠心分離した。
（5）工程4を1回繰り返した。
（6）50μlの細胞分解緩衝液を入れ、ピペットチップで吹きかつ吸いをし、十分に混合した後、55℃の水浴で20minインキュベートした。
（7）サンプルを95℃で5min加熱した。
【０１５１】
（8）13000×gで5min遠心分離した後、5μl上清を鋳型とし、25μlPCR反応系は、ddH20 6.5μl、Myco Mix 1μl、2x Taq Plus Mix Master (Dye Plus) 12.5μl、鋳型5μlで、PCRサイクル条件は、95℃ 30s、（95℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 30s）×30サイクル、72℃ 5minであった。
【０１５２】
（9）マイコプラズマの測定結果（図10と表7に示す）から、組換えレンチウイルスベクターlvCAR19-1761〜lvCAR19-1769がいずれもマイコプラズマを含まなかったことが示された。
【０１５３】
2020188777.tif 000012
【０１５４】
実施例3  組換えレンチウイルスベクターlvCAR19-1761〜lvCAR19-1769の機能測定
一．CAR遺伝子の細胞レベルの発現測定：
（1）組換えレンチウイルスベクターlvCAR19-1761〜lvCAR19-1769および対照ウイルスMOCKでPBMC細胞に感染させた後、細胞を収集してRT-PCRによってCARのmRNA転写レベルの測定を行い、CAR遺伝子の発現を検証したが、CARのmRNA転写レベルが向上すると、CAR遺伝子の転写レベルの発現に成功したことになる。
【０１５５】
（2）組換えレンチウイルスベクターlvCAR19-1761〜lvCAR19-1769および対照ウイルスMOCKでPBMC細胞に感染させた後、細胞を収集してウエスタンブロットによってCARのタンパク質発現レベルの測定を行い、CAR遺伝子の発現を検証したが、CARのタンパク質発現レベルが向上すると、CAR遺伝子の翻訳レベルの発現に成功したことになる。
【０１５６】
（3）それぞれMOI=15のlvCAR19-1761〜lvCAR19-1769および対照ウイルスMOCKで細胞に感染させ、48h後6ウェルプレートにおける細胞の全RNAおよび全タンパク質を抽出してそれぞれ蛍光定量PCR実験とイムノブロット実験を行った。具体的な工程：6ウェルプレートの4つのウェルをコーティングし、各ウェルに対応するPSBとRNを入れ、4℃で一晩放置した。12時間後MOI=15でウイルスをコーティングし、37℃のインキュベーターで5h放置した。6ウェルプレートを取り出し、ウイルス上清を捨て、PBSで2回洗浄し、1×106/ウェルでPBMC（リンパ球分離液でヒト血から分離されたもの）をコーティングし、500μlの培地（10％血清、20U/ml IL-2、ポリブレン 8μg/mlを含有する）を加えた。20min静置し、1000g、20℃で30min遠心分離し、37℃で48h培養した。
【０１５７】
（4）Trizol法によって6ウェルプレートにおけるPBMC細胞の全RNAを抽出し、逆転写でcDNAを増幅し、QPCRプライマー（配列は配列番号63−配列番号64）で蛍光定量PCR実験を行い、反応系を表8に示す。内部参照のアクチンを対照群とし、そのmRNAの転写状況を検証した。
【０１５８】
2020188777.tif 000013
【０１５９】
（5）ウエスタンブロット(Western Blot)：ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってPBMCから抽出された全タンパク質を相対的な分子質量によって分離させた。湿式転写（4℃、400 mA、120min）によって、タンパク質をPVDF膜に移した。ブロッキング液（5％脱脂牛乳含有TBST溶液）で室温でPVDF膜を1hブロッキングし、ブロッキング液で1:1000でBiotinylated protein Lを希釈した後、ブロッキングされたPVDF膜を室温でインキュベートして4℃で一晩放置した。TBSで膜を10 minずつ3回洗浄した。ブロッキング液で1:500で対応するSA-HRPを希釈し、室温でPVDF膜を2hインキュベートし、TBSTで膜を10minずつ3回洗浄した。Amersham社のECL+plusTM Western blotting systemキットによって呈色させた。X線で現像してバンドを示すフィルムを得た。 
【０１６０】
（6）RT-QPCR測定から、組換えレンチウイルスベクターでPBMCを感染させた後のCAR遺伝子の転写レベルは対照ウイルスMOCKと空細胞よりも顕著に向上した（図11と表9に示す）ことがわかり、CAR遺伝子の転写レベルの発現に成功したことが示された。
【０１６１】
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【０１６２】
（7）ウエスタンブロット(Western Blot)の結果から、組換えレンチウイルスベクターでPBMCを感染させた後のCARタンパク質の発現レベルは対照ウイルスMOCKと空細胞よりも顕著に向上した（図12に示す）ことがわかり、CAR遺伝子の翻訳レベルの発現に成功したことが示された。
【０１６３】
二．IL-6ノックダウン効果の評価（mRNA転写レベルと上清におけるIL-6の発現レベル）。
（1）それぞれCD19+K562細胞とPBMC細胞を培養した。
【０１６４】
（2）実験開始前の4日は、MOI=15のlvCAR19-1761〜lvCAR19-1769のウイルスでPBMC細胞に感染させ、72-96h培養した後、実験を開始した。
【０１６５】
（3）標的細胞（CD19+K562）4x105細胞とエフェクター細胞（lvCAR19-1761-PBMC〜lvCAR19-1769-PBMC細胞）2.8x106細胞を収集し、800gで6min遠心分離し、上清を捨てた。
【０１６６】
（4）1mlの1×PBS溶液でそれぞれ標的細胞とエフェクター細胞を再懸濁させ、800gで6min遠心分離し、上清を捨てた。
【０１６７】
（5）工程（4）を1回繰り返した。
【０１６８】
（6）700μlの培地（1640培地+10％ FBS）でエフェクター細胞を再懸濁させ、2mlの培地（1640培地+10％ FBS）で標的細胞を再懸濁させた。
【０１６９】
（7）エフェクター細胞対標的細胞比が10:1の実験ウェルを設け、対照群を設けた。 
【０１７０】
（8）250×gで5minプレート遠心分離した。
【０１７１】
（9）37℃、5％CO2インキュベーターで4時間共培養し、100μlの共培養上清を収集し、CBAによってIL-6含有量を測定した。
【０１７２】
（10）続いて37℃、5％CO2インキュベーターで24時間まで共培養し、1000×gで2minプレート遠心分離し、100μlの共培養上清を収集してCBAによってIL-6含有量を測定し、細胞を収集してIL-6 mRNA転写レベルを測定した。
【０１７３】
（11）CBAによるIL-6含有量の測定の工程は、IL-6標準品管、サンプル管、陰性対照管にそれぞれ50μlのIL-6捕獲マイクロスフェア懸濁液を加え、仕込み前にマイクロスフェアを均一に混合した。各管にそれずれ50μlのPEシグナル抗体を加えた。IL-6標準品管にIL-6標準品希釈液を加えた。サンプル管、陰性対照管にそれぞれ希釈後のサンプルと陰性対照液を加えた。室温で光を避けて3hインキュベートした。各管に1mlの洗浄液を加え、200×gで5min遠心分離した。上清を捨てた。各管に300μlの洗浄液を入れ、マイクロスフェアを再懸濁させた。Attune（登録商標） NxTフローサイトメーターによって標本を分析し、当日に仕込み、仕込み前に十分に3〜5s混合した。
【０１７４】
（12）Trizol法によって上記混合細胞の全RNAを抽出し、逆転写でcDNAを増幅し、QPCRプライマー（配列は配列番号65−配列番号66）で蛍光定量PCR実験を行い、反応系を表6に示した。内部参照のアクチンを対照群とし、そのmRNAの転写状況を検証した。
【０１７５】
（13）4hと24hのCBA測定結果（図13A-13Bに示す）から、IL-6ノックダウン組み換えレンチウイルスベクターでPBMCに感染させて標的細胞をインキュベートした後、IL-6遺伝子の上清含有量は対照ウイルスlvCAR19-1761と空細胞よりも顕著に低下した（図14に示す）ことがわかり、IL-6遺伝子の発現レベルが顕著に低下したことが示された。
【０１７６】
（14）RT-QPCR測定結果から、IL-6ノックダウン組み換えレンチウイルスベクターでPBMCに感染させて標的細胞をインキュベートした後、IL-6遺伝子のmRNAは対照ウイルスlvCAR19-1761と空細胞よりも顕著に低下した（図15に示す）ことがわかり、IL-6遺伝子の転写レベルが顕著に低下したことが示された。
【０１７７】
三．細胞殺傷実験の効果の評価。
（1）それぞれCD19+K562細胞とPBMC細胞を培養した。
【０１７８】
（2）実験開始前の4日は、MOI=15のlvCAR19-1761〜lvCAR19-1769のウイルスでPBMC細胞に感染させ、72-96h培養した後、実験を開始した。
【０１７９】
（3）標的細胞（CD19+K562）4x105細胞とエフェクター細胞（CART細胞）2.8x106細胞を収集し、800gで6min遠心分離し、上清を捨てた。
【０１８０】
（4）1mlの1×PBS溶液でそれぞれ標的細胞とエフェクター細胞を再懸濁させ、800gで6min遠心分離し、上清を捨てた。
【０１８１】
（5）工程（４）を1回繰り返した。
【０１８２】
（6）700μlの培地（1640培地+10％ FBS）でエフェクター細胞を再懸濁させ、2mlの培地（1640培地+10％ FBS）で標的細胞を再懸濁させた。
【０１８３】
（7）エフェクター細胞対標的細胞比が1:1、5:1、10:1の実験ウェルを設け、対照群を設け、各群に3つの重複ウェルを設けた。 
【０１８４】
（8）250×gで5minプレート遠心分離した。
【０１８５】
（9）37℃、5％CO2インキュベーターで4時間培養した。
【０１８６】
（10）250×gで5minプレート遠心分離した。
【０１８７】
（11）各ウェルの50μl上清を取って新たな96ウェルプレートに加え、各ウェルに50μlの基質溶液を加えた（光を避けた操作）。
【０１８８】
（12）光を避けて25分間インキュベートした。
【０１８９】
（13）各ウェルに50uLの停止液を加えた。
【０１９０】
（14）マイクロプレートによって490nmにおける吸光度を測定した。
【０１９１】
（15）3つの重複ウェルの平均値を取った。すべての実験ウェル、標的細胞ウェルおよびエフェクター細胞ウェルの吸光値から培地の背景吸光値の平均値を引いた。標的細胞の最大値の吸光値から体積で較正された対照吸光値の平均値を引いた。
【０１９２】
（16）工程15で得られた較正された値を以下の式に代入し、各エフェクター細胞対標的細胞比による細胞毒性百分率を計算した結果から、図16に示すように、IL-6ノックダウン組み換えレンチウイルスベクターで形質移入されたPBMC細胞はエフェクター細胞対標的細胞比10:1の条件で殺傷効率がPBMC空細胞よりも顕著に高く、対照ウイルスlvCAR19-1761で形質移入されたPBMC細胞よりも低かったことがわかった。ここで、lvCAR19-1763-PBMCは殺傷効率が対照ウイルスlvCAR19-1761-PBMCよりもやや低かったが、IL-6の発現レベルの低下は70％超で、将来腫瘍細胞を殺傷すると同時に、少ないIL-6を放出し、有効にCRSを緩和することができる。
殺傷効率= （実験ウェル−エフェクター細胞ウェル−標的細胞ウェル）/（標的細胞最大ウェル−標的細胞ウェル）×100％
【０１９３】
本発明で創造された好適な実施例を具体的に説明したが、本発明の創造は前記実施例だけでなく、本分野を熟知する技術者は本発明の創造の趣旨に反さない前提で様々な同等の変形または置換を行ってもよく、これらの同等の変形または置換はいずれも本願の請求項によって限定される範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１９４】
本発明に係るIL-6ノックダウンsiRNA発現カセットおよびそのsiRNA発現産物は、CAR19-Tの急性Bリンパ性白血病(ALL)に対する治療においてCRSの症状の解消または軽減だけでなく、CAR-T治療によって、例えば、Bリンパ腫、膵臓腺癌、脳膠細胞腫、骨髄腫などのすべての種類の腫瘍を治療する時に生じるCRS症状の緩和にも使用することができ、さらに他の種類の治療によるCRSの緩和に使用することもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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