(57)【要約】      （修正有）【課題】ＦＡＤ２座中の遺伝子破壊、遺伝子編集または遺伝子スタッキングのための方法および組成物の提供。【解決手段】部位特異的様式で大豆細胞中のＦＡＤ２遺伝子中の特定のヌクレオチド配列のいずれか内の標的部位をヌクレアーゼにより切断して、それによって前記ＦＡＤ２遺伝子中に切断部位を生じる工程を含む、大豆細胞のＦＡＤ２遺伝子を修飾する方法であって、少なくとも１つのＦＡＤ２遺伝子が前記切断部位に対象となる外因性核酸配列を組み込むことにより改変され、前記ＦＡＤ２遺伝子が、特定の配列で表されるヌクレオチド配列を含むＦＡＤ２  ２．３遺伝子またはそのホモログもしくはパラログ、特定の配列で表されるヌクレオチド配列を含むＦＡＤ２  ２．６遺伝子またはそのホモログもしくはパラログ、またはその両方である、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
部位特異的様式で大豆細胞中のＦＡＤ２遺伝子中の標的部位を切断して、それによって
前記ＦＡＤ２遺伝子中の破壊を引き起こす工程を含む、大豆細胞のＦＡＤ２遺伝子を修飾
する方法であって、前記ＦＡＤ２遺伝子が切断後に修飾される方法。
【請求項２】
対象となる核酸配列を前記破壊に組み込む工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＦＡＤ２遺伝子がＦＡＤ２  ２．３、ＦＡＤ２  ２．６遺伝子、または両方である
、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
部位特異的様式での前記切断が、ＤＮＡ結合ドメイン、および切断ドメインまたは切断
ハーフドメインを含む融合タンパク質或いは前記融合タンパク質をコードするポリヌクレ
オチドを前記細胞に導入する工程を含み、前記融合タンパク質が特異的に前記標的部位に
結合し、前記標的部位またはその近くを切断して、それによって前記破壊を引き起こす、
請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパー
ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化物質様（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡガイド化
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、リコンビナーゼ、ジンクフィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメ
イン、および前記のいずれかのキメラ組み合わせからなる群から選択される、請求項４に
記載の方法。
【請求項６】
前記切断ドメインまたは切断ハーフドメインがＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼからの
切断ハーフドメイン、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、ＳｔｓＩ
エンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、およびホーミングエンドヌクレアーゼか
らなる群から選択される、請求項４または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記融合タンパク質がジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項４から６のいずれ
かに記載の方法。
【請求項８】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが３〜６個のジンクフィンガードメインを含み、各
ジンクフィンガードメインが認識ヘリックス領域を含み、前記ジンクフィンガータンパク
質が表２の一列に整列され、示される前記認識ヘリックス領域を含む、請求項７に記載の
方法。
【請求項９】
部位特異的様式での前記切断がＦＡＤ２  ２．３およびＦＡＤ２  ２．６のいくつかで
あるが全てではないコピーに特異的である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記標的部位が配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択される、請求項１から
９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
対象となる前記核酸配列が標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む配列、１つま
たはそれ以上の殺虫剤耐性遺伝子、１つまたはそれ以上の除草剤耐性遺伝子、１つまたは
それ以上の窒素利用効率遺伝子、１つまたはそれ以上の水利用効率遺伝子、１つまたはそ
れ以上の栄養価遺伝子、１つまたはそれ以上のＤＮＡ結合遺伝子、１つまたはそれ以上の
選択可能なマーカー遺伝子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求
項２から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれかに記載の方法によって修飾された大豆細胞を含む大豆細胞
または大豆植物。
【請求項１３】
大豆細胞または植物が、ＦＡＤ２  ２．３および／またはＦＡＤ２  ２．６遺伝子の１
つまたはそれ以上のコピーに組み込まれた対象となるヌクレオチド配列を含むトランスジ
ェニック細胞または植物である、請求項１２に記載の細胞または植物。
【請求項１４】
前記ヌクレオチド配列が前記細胞と異種性または相同性である、請求項１３に記載の細
胞または植物。
【請求項１５】
前記相同性配列が少なくとも１つの一塩基多型を含む、請求項１４に記載の細胞または
植物。
【請求項１６】
前記核酸配列が配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択される標的部位または
その近くで組み込まれる、請求項１３から１５のいずれかに記載の細胞または植物。
【請求項１７】
配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択される核酸標的部位またはその近くを
切断する、部位特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ。
【請求項１８】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが３〜６個のジンクフィンガードメインを含み、各
ジンクフィンガードメインが認識ヘリックス領域を含み、前記ジンクフィンガータンパク
質が表２の一列に整列され、示される前記認識ヘリックス領域を含む、請求項１７に記載
のジンクフィンガーヌクレアーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、これによりその開示の全体が参照により組み込まれる、２０１２年９月７日
出願の米国仮特許出願第６１／６９７，８８６号の利益に対する優先権を主張するもので
ある。
【０００２】
本開示は、概して組換え植物技術に使用するため（例えば、トランスジェニック植物を
産生するため）の組成物および方法に関する。より具体的には、本開示は、対象となる任
意の核酸の部位特異的導入に使用され得るゲノム中の座を含む植物細胞および植物に関す
る。
【背景技術】
【０００３】
多くの植物が、例えば、農業的価値を改善するために、望ましい形質を導入するために
外因性核酸（例えば、導入遺伝子）で遺伝的に形質転換されている。遺伝子形質転換を通
して達成され得る農業的価値の改善の例は、改善した栄養価、増加した収量、有害生物ま
たは病気耐性、乾燥およびストレス耐性、改善した園芸品質（例えば、改善した色素沈着
および／または成長）、除草剤耐性、植物からの産業上有用な化合物および／または材料
の製造、ならびに／或いは医薬品の製造を含む。クローニング遺伝子の植物細胞への導入
および安定な繁殖可能なトランスジェニック植物の回収が、植物の遺伝子修飾を複数世代
を通して安定にし、それによって作物植物の遺伝子操作を可能にするために使用され得る
。
【０００４】
遺伝子形質転換およびトランスジェニック植物産生のための方法では、外因性ＤＮＡが
真核植物細胞の核またはプラスミドＤＮＡに典型的にはランダムに導入され、引き続いて
組み込まれた外因性ＤＮＡを含む細胞が単離され、その後安定に形質転換した植物が再生
される。トランスジェニック植物は、典型的にはアグロバクテリウム媒介形質転換技術に
よって産生された。これらの技術での成功が、対象となる核酸分子を植物のゲノムに導入
するための他の方法、例えば、プロトプラストへのＰＥＧ媒介ＤＮＡ取り込み、微粒子銃
およびケイ素ウィスカー媒介形質転換の開発を刺激した。
【０００５】
しかしながら、これらの植物形質転換法の全てにおいて、植物ゲノムに組み込まれる外
因性核酸は、植物細胞のゲノムにランダムに、かつ予測不可能なコピー数で組み込まれる
。Terada et al.(2002) Nat Biotechnol 20(10):1030；Terada et al.(2007) Plant Phys
iol 144(2):846；D'Halluin et al.(2008) Plant Biotechnology J.6(1):93。 例えば、
導入遺伝子はしばしば、導入遺伝子全体またはその一部の配列反復の形態で組み込まれる
。このような複雑な組込みパターンは、一般的に（例えば、転写後遺伝子サイレンシング
機構を通した転写ＲＮＡの破壊により、または組み込まれたＤＮＡのメチル化の誘導によ
り）組み込まれた核酸の発現レベルに悪影響を及ぼす。また、組込み部位の位置が一般的
に組み込まれた核酸の発現レベルに影響を及ぼす。さらに、外因性ＤＮＡの組込みは、組
込みが起こるゲノムの領域に破壊的効果をもたらし、それによって標的領域の正常な機能
に影響を及ぼすまたはこれを妨害して望ましくない副作用をもたらし得る。前記を含む因
子の組み合わせは、同じ方法によって作成されたものでさえ、異なるトランスジェニック
植物細胞と植物系統との間で導入遺伝子または外因性ＤＮＡの発現レベル（および農学的
品質全体）における広い変動をもたらす。組込みがランダムであるために、これらの効果
は専門家によって制御され得ないが、専門家は望ましい特性を有する新規な植物を産生し
ようと試みている。
【０００６】
前記の考慮は、特定の外因性核酸を植物に導入することの効果が調査される場合はいつ
でも、有意な結果を得るために、多数のトランスジェニック植物系統が産生および分析さ
れなければならないことを要する。同様に、所望の表現型を有するトランスジェニック植
物を提供するための特定の組み込まれた核酸を含むトランスジェニック植物の産生におい
ては、核酸の最適な発現を有する、ならびにトランスジェニック植物の表現型および性能
全体への副作用が最小であるまたは無い植物系統の選択を可能にするために、大集団の独
立に作成されたトランスジェニック植物系統が作成されなければならない。これらの実際
的な考慮は、複数の外因性核酸を挿入することによって（例えば、遺伝子スタッキング）
作成されるトランスジェニック植物においてさらなる重要性を帯びる。このような植物で
は、現象、例えば、転写後遺伝子サイレンシングが増幅され得る。
【０００７】
植物への導入遺伝子挿入を制御しようとしていくつかの方法が開発されてきた。例えば
、Kumar and Fladung (2001) Trends Plant Sci.6:155-9を参照されたい。これらの方法
は、原核生物と下等真核生物の両方でうまく適用されてきた相同組換えに基づく導入遺伝
子組込みに頼るものである。Paszkowski et al.(1988) EMBO J.7:4021-6。しかしながら
、植物では近年まで、導入遺伝子組込みのための支配的機構は、組換えＤＮＡ鎖間の相同
性をほとんど伴わない非正統的組換えに基づいてきた。そのため、この分野での主な課題
は、非正統的組換えを介したずっと効率的な組込みイベントによって隠されている、まれ
な相同組換えイベントの検出および選択的産生である。さらに、標的化された相同組換え
イベントの選択的産生および検出が達成されたとしても、この戦略の最大の利益を実現す
るために、このイベントが宿主ゲノム中の望ましい位置に標的化されなければならない。
【０００８】
例えば、標的化された遺伝子形質転換の想定される利益は、ランダムな組込みから得ら
れる形質転換イベントと比べた、導入遺伝子発現のイベント間変動性の減少である。さら
なる想定される利益は、導入された核酸をスクリーニングし、形質転換構築物をソートし
、得られたトランスジェニック植物の望ましい特徴全体に寄与するイベントをもたらすた
めに要求されるイベントの数の有意な減少である。これらの利益を実現するために要求さ
れる重要な因子は、導入遺伝子性能が一貫しており、可能であれば宿主植物に対する有害
効果が排除または最小化されるゲノム中の特異的位置の同定である。
【０００９】
近年、ゲノムＤＮＡの標的化切断のための方法および組成物が記載されている。例えば
、標的化突然変異誘発を誘導し、細胞ＤＮＡ配列の標的化欠失を誘導し、かつ所定の染色
体座において標的化組換えおよび組込みを促進するために、このような標的化切断イベン
トが使用され得る。例えば、全ての目的のためにその開示の全体が参照により組み込まれ
る、Urnov et al.(2010) Nature 435(7042):646-51；米国特許出願公開第２００３０２３
２４１０号明細書；第２００５０２０８４８９号明細書；第２００５００２６１５７号明
細書；第２００５００６４４７４号明細書；第２００６０１８８９８７号明細書；第２０
０９０２６３９００号明細書；第２００９０１１７６１７号明細書；第２０１０００４７
８０５号明細書；第２０１１０２０７２２１号明細書；第２０１１０３０１０７３号明細
書；第２０１１０８９７７５号明細書；第２０１１０２３９３１５号明細書；第２０１１
０１４５９４０号明細書；および国際公開第２００７／０１４２７５号パンフレットを参
照されたい。切断は、特異的ヌクレアーゼ、例えば、操作されたジンクフィンガーヌクレ
アーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化物質様作動因子ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用、また
は特異的切断を導くために操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ（「単一ガイドＲ
ＮＡ」）を用いるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用を通して起こり得る。米国特許出
願公開第２００８０１８２３３２号明細書は、植物ゲノムの標的化修飾のための非標準ジ
ンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の使用を記載しており；米国特許出願公開第２０
０９０２０５０８３号明細書は、植物ＥＰＳＰＳ座のＺＦＮ媒介標的化修飾を記載してお
り；米国特許出願公開第２０１００１９９３８９号明細書は、植物Ｚｐ１５座の標的化修
飾を記載しており、米国特許出願公開第２０１１０１６７５２１号明細書は、脂肪酸生合
成に関与する植物遺伝子の標的化修飾を記載している。さらに、Moehle et al.(2007) Pr
oc.Natl.Acad, Sci.USA 104(9):3055-3060は、特定の座における標的化遺伝子付加のため
の設計されたＺＦＮの使用を記載している。米国特許出願公開第２０１１００４１１９５
号明細書は、ホモ接合型二倍体生物を作成する方法を記載している。
【００１０】
しかしながら、ＦＡＤ２座において所望の導入遺伝子が標的化挿入された植物の産生を
含む、植物のＦＡＤ２遺伝子の発現を修飾および／または調節するための組成物および方
法が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５０２０８４８９号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５００２６１５７号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００６０１８８９８７号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００９０２６３９００号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００９０１１７６１７号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２０１１０２０７２２１号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２０１１０８９７７５号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２０１１０２３９３１５号明細書
【特許文献１３】米国特許出願公開第２０１１０１４５９４０号明細書
【特許文献１４】国際公開第２００７／０１４２７５号パンフレット
【特許文献１５】米国特許出願公開第２００８０１８２３３２号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第２００９０２０５０８３号明細書
【特許文献１７】米国特許出願公開第２０１００１９９３８９号明細書
【特許文献１８】米国特許出願公開第２０１１０１６７５２１号明細書
【特許文献１９】米国特許出願公開第２０１１００４１１９５号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Terada et al.(2002) Nat Biotechnol 20(10):1030
【非特許文献２】Terada et al.(2007) Plant Physiol 144(2):846
【非特許文献３】D'Halluin et al.(2008) Plant Biotechnology J.6(1):93
【非特許文献４】Kumar and Fladung (2001) Trends Plant Sci.6:155-9
【非特許文献５】Paszkowski et al.(1988) EMBO J.7:4021-6
【非特許文献６】Urnov et al.(2010) Nature 435(7042):646-51
【非特許文献７】Moehle et al.(2007) Proc.Natl.Acad, Sci.USA 104(9):3055-3060
【発明の概要】
【００１３】
本開示は、（例えば、植物、藻類および真菌類において）ＦＡＤ２遺伝子の発現を調節
するための組成物および方法、ならびに対象となる核酸配列（例えば、外因性核酸配列）
の宿主細胞への標的化組込みのための部位としてのこれらの座の使用を記載する。いくつ
かの実施形態では、宿主細胞が、そのいずれかまたは全てが選択的に修飾および／または
破壊され得る１つまたはそれ以上のＦＡＤ２配列（例えば、ホモログまたはパラログ）を
含む１つまたはそれ以上のゲノムを含み得る。具体的な例では、本開示が、ダイズ（Glyc
ine max）（例えば、ダイズ栽培品種Ｊａｃｋ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２、Ｘ５、Ｗｅｓ
ｔａｇおよびＭａｖｅｒｉｃｋ）のＦＡＤ２  ２．３およびＦＡＤ２  ２．６遺伝子、な
らびに対応するホモログまたはパラログ、ならびに対象となる核酸配列の標的化組込みの
ための座としてのその使用を記載する。本明細書に記載されるように、ＦＡＤ２遺伝子は
宿主の脂肪酸生合成に関与しているが、（例えば、ＦＡＤ２コード配列への外因性核酸の
組込みによる）修飾または破壊は、結果として生じる宿主生物に予想外に全く有害効果を
もたらさないまたは最小の有害効果しかもたらし得ない。
【００１４】
また、本明細書においては、ＦＡＤ２座において特異的核酸配列の切断および／または
組込みを行うことができるポリペプチドと協力した１つまたはそれ以上の特定のＦＡＤ２
座の使用も記載される。ＦＡＤ２座の切断および／または組込みを行うことができるポリ
ペプチドと協力したＦＡＤ２座の使用の例は、ジンクフィンガータンパク質、メガヌクレ
アーゼ、ＴＡＬドメイン、ＴＡＬＥＮ、ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、リコン
ビナーゼ、ロイシンジッパー、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓおよび当業者に公知のその他のもの
からなる群から選択されるポリペプチドを含む。特定の例は、部位特異的ＤＮＡ結合ドメ
インポリペプチドおよび切断ドメインポリペプチド（例えば、ヌクレアーゼ）を含むキメ
ラ（「融合」）タンパク質、例えば、ジンクフィンガーポリペプチドおよびＦｏｋＩヌク
レアーゼポリペプチドを含むＺＦＮタンパク質を含む。例えば、本明細書においては、対
応するホモログまたはパラログを切断することなく、ＦＡＤ２  ２．３およびＦＡＤ２  
２．６遺伝子ならびにこれらの組み合わせにおける二本鎖切断を結合および誘導するよう
設計された特定のＺＦＮのインビトロおよびインビボでの有効性および特異性の証明が記
載される。いくつかの実施形態では、宿主の農学的性能に及ぼす有害な影響が最小限であ
りながら、その後宿主中で発現される対象となる核酸の部位特異的組込みを行うために、
特定のＦＡＤ２座が前記ポリペプチドのいずれかと共に使用され得る。
【００１５】
特定の態様では、本明細書において、ＦＡＤ２遺伝子に特異的に結合するＤＮＡ結合ド
メインを含むポリペプチドが記載される。いくつかの実施形態では、このようなポリペプ
チドが、標的化二本鎖切断を誘導し得る、および／または切断部位での対象となる核酸の
組換えを促進し得るように、ヌクレアーゼ（切断）ドメインまたはハーフドメイン（例え
ば、ＺＦＮ、リコンビナーゼ、トランスポサーゼ、または修飾ＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡ
Ｌドメイン、ＴＡＬＥＮ、ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を含むホーミングエン
ドヌクレアーゼを含むホーミングエンドヌクレアーゼ）、ならびに／或いはリガーゼドメ
インを含んでもよい。特定の実施形態では、ＦＡＤ２座を標的化するＤＮＡ結合ドメイン
がＤＮＡ切断機能ドメインであってもよい。いくつかの実施形態では、外因性核酸を、１
つまたはそれ以上のＦＡＤ２座で宿主生物（例えば、植物または動物種）のゲノムに導入
するために前記ポリペプチドが使用され得る。特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン
が、１つまたはそれ以上のジンクフィンガー（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９
もしくはそれ以上のジンクフィンガー）を含み、ＦＡＤ２遺伝子中の任意の配列に結合す
るよう操作され得る（自然には起こらない）ジンクフィンガータンパク質を含む。本明細
書に記載されるジンクフィンガータンパク質のいずれも、標的遺伝子のコード配列中また
は隣接配列（例えば、プロモーターもしくは他の発現要素）中の標的部位に結合し得る。
特定の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質が、例えば、表１に示されるように、
ＦＡＤ２遺伝子中の標的部位に結合する。代表的なＦＡＤ２結合ジンクフィンガーの認識
ヘリックス領域が表２に示される。ジンクフィンガータンパク質の構成ジンクフィンガー
結合ドメインの１つまたはそれ以上は、標準（Ｃ２Ｈ２）ジンクフィンガーまたは非標準
（例えば、Ｃ３Ｈ）ジンクフィンガー（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端ジンクフィ
ンガーが非標準フィンガーであり得る）であり得る。
【００１６】
また、本明細書においては、ＦＡＤ２遺伝子を破壊または編集する方法も記載される。
さらに、本明細書においては、本発明の実施形態による方法によって産生された遺伝子組
換え宿主生物（例えば、トランスジェニック植物）が記載される。特定の例では、本発明
の実施形態による方法によって産生されたトランスジェニック生物が、限定されないが、
藻類、真菌類、単子葉植物、双子葉植物等であり得る。いくつかの特定の実施形態では、
双子葉植物が大豆（ダイズ）植物であり得る。
【００１７】
本明細書に開示されるＦＡＤ２遺伝子は、１つまたはそれ以上のＦＡＤ２遺伝子を有す
る任意の植物、藻類または真菌類に見られるものを含み得る。
【００１８】
前記および他の特徴は、添付の図面を参照して進むいくつかの実施形態の以下の詳細な
説明からより明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１−１】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２（配列番号４）、Ｗｅｓｔａｇ（配列番号５）、Ｘ５（配列番号６）、Ｊａｃｋ（配列番号７）およびＭａｖｅｒｉｃｋ（配列番号８）からのＦＡＤ２  ２．３コード配列のアラインメントを示す。
【図１−２】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２（配列番号４）、Ｗｅｓｔａｇ（配列番号５）、Ｘ５（配列番号６）、Ｊａｃｋ（配列番号７）およびＭａｖｅｒｉｃｋ（配列番号８）からのＦＡＤ２  ２．３コード配列のアラインメントを示す。
【図１−３】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２（配列番号４）、Ｗｅｓｔａｇ（配列番号５）、Ｘ５（配列番号６）、Ｊａｃｋ（配列番号７）およびＭａｖｅｒｉｃｋ（配列番号８）からのＦＡＤ２  ２．３コード配列のアラインメントを示す。
【図２−１】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２（配列番号９）、Ｗｅｓｔａｇ（配列番号１０）、Ｘ５（配列番号１１）、Ｊａｃｋ（配列番号１２）およびＭａｖｅｒｉｃｋ（配列番号１３）からのＦＡＤ２  ２．６コード配列のアラインメントを示す。
【図２−２】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２（配列番号９）、Ｗｅｓｔａｇ（配列番号１０）、Ｘ５（配列番号１１）、Ｊａｃｋ（配列番号１２）およびＭａｖｅｒｉｃｋ（配列番号１３）からのＦＡＤ２  ２．６コード配列のアラインメントを示す。
【図２−３】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２（配列番号９）、Ｗｅｓｔａｇ（配列番号１０）、Ｘ５（配列番号１１）、Ｊａｃｋ（配列番号１２）およびＭａｖｅｒｉｃｋ（配列番号１３）からのＦＡＤ２  ２．６コード配列のアラインメントを示す。
【図３】ＤＬＳＳＡアッセイにおけるＦＡＤ２  ２．３および２．６遺伝子設計ＺＦＮの活性を示す。 ＦＡＤ２  ２．３および２．６座に向けて設計されたＺＦＮが、レポーターとして哺乳動物細胞にクローニングされたＦＡＤ２  ２．３および２．６配列の切断活性について評価された。
【図４】ｐＤＡＢ１１５６２０のプラスミドマップを示す。
【図５】ｐＤＡＢ１１５６２２のプラスミドマップを示す。
【図６】ｐＤＡＢ７２２１のプラスミドマップを示す。
【図７】座破壊アッセイのためのプローブ／プライマーを示す概略図である。 ＦＡＤ２  ２．３および２．６遺伝子のＦ２  ＺＦＮ結合部位ならびに破壊アッセイに使用されるプライマーが示されている。
【図８】ＦＡＤ２  ２．３座におけるＦ２  ＺＦＮ２ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いたドナー配列のＮＨＥＪ標的化から得られたイン−アウトＰＣＲ産物の配列を示す。基準配列（図の上部）は、逆方向配向でのドナーベクターの標的化挿入の構成を表している。基準配列を作成するためにＦｏｋＩ消化から生じたＤＮＡの一本鎖末端が挿入された。Ｓａｎｇｅｒ配列が示されている。 Ｆ２  ＺＦＮ２  ＺＦＮ結合配列は下線を引かれている。指定された配列と類似の配列を有するプラスミドクローンが右に列挙されている。
【００２０】
配列
核酸配列は、米国特許法施行規則第１．８２２条に定義されるヌクレオチド塩基につい
ての標準的な文字略語を用いて示される。１本鎖のみの各核酸配列が示されるが、示され
る鎖への任意の言及により、相補鎖が含まれると理解される。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
Ｉ．いくつかの実施形態の概要
本発明の実施形態は、組み込まれた核酸によって影響を及ぼされるものを超えて宿主の
他の表現型に大いに悪影響を及ぼすことのない、外因性核酸（例えば、導入遺伝子）の宿
主ゲノムへの標的化組込みのための手法を確立する。単一の宿主ゲノム中の複数の核酸を
「スタッキングする」ために、いくつかの実施形態が使用され得る。このような手法は、
４つの相互接続技術の開発および配置を要する：特異的ゲノムＤＮＡ位置への二本鎖切断
の導入を可能にする標的化技術（例えば、Puchta et al.(1993) Nucleic Acids Res.21:5
034-40；Siebert and Puchta (2002) Plant Cell 14:1121-31；D'Halluin et al.(2008) 
Plant Biotechnol.J.6(1):93-102；Cai et al.(2009) Plant Mol.Biol.69(6):699-709；S
hukla et al.(2009) Nature 459(7245):437-41)；Shan et al.(2103) Nature Biotechnol
.31:686-680；Le et al.(2013) Nature Biotechnol 31: 688-691；Nekrasov et al.(2013
) Nature Biotechnol.31:691-693、Ainely et al.(2013) Plant Biotechnol.J.(On Line 
19 Aug)参照）；最適化外因性（ドナー）核酸の送達を可能にする送達技術（Bibikova et
al.(2003) Science 300(5620):764）；標的化ドナーＤＮＡ挿入のためにＨＤＲまたはＮ
ＨＥＪ頻度を増加させるための、（相同組換えまたはＮＨＥＪ経路のいずれかに位置する
）宿主遺伝子の修飾を伴う組込み技術；標的化組込みイベントを富化し特徴付けるための
分析ツール；および遺伝的に十分定義されかつ形質転換された宿主生物に大いに悪影響を
及ぼすことなく世代にわたる安定な遺伝子発現を支持する特異的な所望の宿主ゲノム位置
（「性能座」）。また、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号明細書；第２００
５０２０８４８９号明細書；第２００５００２６１５７号明細書；第２００５００６４４
７４号明細書；第２００６０１８８９８７号明細書；第２００９０２６３９００号明細書
；第２００９０１１７６１７号明細書；第２０１０００４７８０５号明細書；第２０１１
０２０７２２１号明細書；第２０１１０３０１０７３号明細書；第２０１１０８９７７５
号明細書；第２０１１０２３９３１５号明細書；第２０１１０１４５９４０号明細書；第
２００８０１８２３３２号明細書；第２００９０２０５０８３号明細書；第２０１００１
９９３８９号明細書；第２０１１０１６７５２１号明細書も参照されたい。例えば、植物
では、性能座は、座で導入遺伝子が挿入されたトランスジェニック植物の農学的または品
質特性に対する負の影響が無視できるまたは存在しない座である。
【００２２】
本明細書に記載される実施形態は、植物ＦＡＤ２遺伝子が外因性核酸（例えば、遺伝子
；非コードＤＮＡ配列、例えば、操作されたランディングパッド（ＥＬＰ）（米国特許出
願第１２／０１１，７３５号明細書）および操作された導入遺伝子挿入プラットホーム（
ＥＴＩＰ）（係属中の米国特許出願第６１／６９７８８２号明細書）；および植物形質転
換ユニット）の標的化挿入のための性能座であるという予期しない知見を利用する。植物
におけるＦＡＤ２座の遍在性の性質、ならびにアブラナ、トウモロコシ、ヒマワリ、コム
ギ、ワタおよび大豆におけるＦＡＤ２の変化またはノックアウトが農学的または品質の不
利益を有さないという証拠は、ＦＡＤ２座を商業的に関連する植物種にわたる広範なクラ
スの性能座と証明する。
【００２３】
いくつかの実施形態は、例えば、標的部位特異的ＤＮＡ認識および切断タンパク質の送
達および発現から生じる、ＦＡＤ２座における部位特異的二本鎖ＤＮＡ切断を利用する。
具体的な例では、このようなＦＡＤ２特異的ＤＮＡ認識および切断タンパク質が、例えば
、限定されないが、ＺＦＮ；ＴＡＬＥＮ；ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、リコ
ンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、Ｈｉｎ、ＲｅｃＡ、ＴｒｅおよびＦＬＰリコンビナーゼ）
；メガヌクレアーゼ、および前記のいずれかまたはその同等物に由来する操作タンパク質
であり得る。切断は、特異的切断を導くよう操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ
（「単一ガイドＲＮＡ」）を用いるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いても行われ得る
。いくつかの実施形態では、このような二本鎖切断が、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ
）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって、ＦＡＤ２性能座中の切断部位でのドナー
核酸の組込みを介して修復され得る。
【００２４】
本開示は、例えば、大豆（ダイズ）のＦＡＤ２  ２．３およびＦＡＤ２  ２．６座、な
らびにＦＡＤ２  ２．３および／またはＦＡＤ２  ２．６座において外因性核酸を組み込
むために利用され得る対応するＦＡＤ２特異的ＺＦＮを記載することによって、性能座と
してのＦＡＤ２座の有用性を示す。
【００２５】
本発明の実施形態は、当分野における多くの未解決の課題に対処する。例えば、本明細
書に記載される標的化組込み手法の選択性は、不必要な遺伝子導入イベントの排除に要求
される度重なる野外試験の必要性を低減または排除することができる（この試験は関与す
る資源およびこの区域における負担となる規制要求のために高価である）。さらに、本明
細書に記載される標的化ＤＮＡ挿入手法は、導入遺伝子スタッキングのプロセスにおいて
特に有益となり得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、対象となる核酸を直接標的化するために内因性ＦＡＤ２座に
おける野生のヌクレオチド配列が使用され得るが、対象となるさらなる核酸分子の宿主へ
の組込みが促進されるように、核酸が最初に宿主の少なくとも１つのＦＡＤ２座に標的化
され得る。他の例では、ＤＮＡ認識部位（例えば、ジンクフィンガー認識部位）に隣接す
る宿主生物の野生の配列（例えば、本質的にランダムに産生された核酸配列）と相同でな
いヌクレオチド配列が利用され得る。
【００２７】
ＩＩ．用語
特許請求の範囲を含む本出願で使用される場合、例えば、「ａ」、「ａｎ」および「ｔ
ｈｅ」という単数および単数形の用語は、別段の明確な指示がない限り、複数指示対象を
含む。したがって、例えば、「植物（plant）」、「植物（the plant）」または「植物（
a plant）」への言及は、複数の植物も指す。さらに、文脈に応じて、「植物（plant）」
という用語の使用は、その植物の遺伝的に類似または同一の子孫も指し得る。同様に、「
核酸」という用語は、核酸分子の多くのコピーを指し得る。同様に、「プローブ」という
用語は、多くの類似または同一のプローブ分子を指し得る。
【００２８】
数値範囲は、その範囲を定義する数を含み、定義される範囲内の各整数および非整数分
数を明示的に含む。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および
科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２９】
本開示に記載される種々の実施形態の概観を容易にするために、具体的な用語の以下の
説明が提供される：
【００３０】
単離された：「単離された」生物学的成分（例えば、核酸またはタンパク質）は、該成
分の化学的または機能的変化をもたらしながら（例えば、核酸は、染色体で核酸と残りの
ＤＮＡを結合している化学結合を破壊することによって染色体から単離され得る）、該成
分が自然に生じる生物の細胞中の他の生物学的成分（例えば、他の染色体および染色体外
ＤＮＡおよびＲＮＡ、およびタンパク質）から実質的に分離されている、別に産生されて
いる、または精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質は、標準的精製
法によって精製された核酸分子およびタンパク質を含む。この用語はまた、宿主細胞での
組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸
分子、タンパク質およびペプチドも包含する。
【００３１】
交雑：植物に関して本明細書で使用される場合、「交雑する」または「交雑した」とい
う用語は、子孫（例えば、細胞、種子および植物）を産生するための受粉を介した配偶子
の融合を指す。この用語は、性的交雑（すなわち、ある植物の別の植物による受粉）と自
殖（すなわち、例えば、同じ植物からの花粉および胚珠を用いた自家受粉）の両方を包含
する。
【００３２】
戻し交雑：核酸配列を植物に導入するために戻し交雑法が使用され得る。この技術は、
新しい形質を植物に導入するために数十年間広く使用されてきた。Jensen, N., Ed.Plant
Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988。典型的な戻し交雑プロトコル
では、対象となる元の品種（反復親）が、移植するための対象となる核酸配列を保有する
第２の品種（非反復親）と交雑される。次いで、この交雑から得られた子孫が反復親と再
度交雑され、非反復親から移植された核酸配列に加えて、反復植物の所望の形態学的およ
び生理学的特性の本質的に全てが変換植物で取り戻された植物が得られるまでこのプロセ
スが繰り返される。
【００３３】
遺伝子移入：本明細書で使用される場合、「遺伝子移入」という用語は、特定の座にお
ける対立遺伝子（または外因性核酸を含む修飾対立遺伝子）の遺伝的背景への伝達を指す
。いくつかの実施形態では、座における特異的対立遺伝子の遺伝子移入が、同じ種の２つ
の親（親の少なくとも一方はそのゲノム中に特異的対立遺伝子型を有する）の間での性的
交雑を介して対立遺伝子を少なくとも１つの子孫に伝達することによって起こり得る。特
異的対立遺伝子を含む子孫が、所望の遺伝的背景を有する系統と繰り返し戻し交雑され得
る。特異的対立遺伝子型が遺伝的背景で固定された新しい品種を産生するために、戻し交
雑子孫が特異的対立遺伝子型について選択され得る。いくつかの実施形態では、特異的対
立遺伝子の遺伝子移入が、２つのドナーゲノム（例えば、融合プロトプラスト）（ドナー
ゲノムの少なくとも一方はそのゲノム中に特異的対立遺伝子型を有する）の間での組換え
によって起こり得る。遺伝子移入は、例えば、限定されないが、破壊または修飾対立遺伝
子；導入遺伝子；ＰＴＵ；およびＥＬＰであり得る特異的対立遺伝子型の伝達を伴い得る
。
【００３４】
生殖質：本明細書で使用される場合、「生殖質」という用語は、個々の植物、植物のグ
ループ（例えば、植物系統、品種および科）、および植物または植物のグループに由来す
るクローンのまたはこれらから得られる遺伝物質を指す。生殖質は生物もしくは細胞の一
部であり得る、またはこれは生物もしくは細胞とは別（例えば、単離されている）であり
得る。一般に、生殖質は、植物の遺伝的質の基礎である特定の分子構造を有する遺伝物質
を提供する。本明細書で使用される場合、「生殖質」は、特定の植物の細胞；種子；特定
の植物の組織（例えば、そこから新しい植物が栽培され得る組織）；および特定の植物の
種子以外の部分（例えば、葉、茎、花粉および細胞）を指す。本明細書で使用される場合
、「生殖質」という用語は「遺伝物質」と同義であり、そこから植物が繁殖され得る種子
（または他の植物材料）を指すために使用され得る。「生殖質バンク」は、そこから公知
の栽培品種が栽培され得る、およびそこから新しい栽培品種が産生され得る、異なる種子
または他の遺伝物質（各遺伝子型が独自に同定されている）の組織的収集物を指し得る。
【００３５】
遺伝子：本明細書で使用される場合、「遺伝子」（または「遺伝要素」）という用語は
、機能的重要性を有する遺伝的ゲノムＤＮＡ配列を指し得る。遺伝子は野生の核酸であっ
ても、ゲノムに組み込まれた核酸であってもよい。「遺伝子」という用語は、例えば、限
定されないが、遺伝的ゲノムＤＮＡ配列によってコードされているｃＤＮＡおよび／また
はｍＲＮＡを指すためにも使用され得る。
【００３６】
核酸分子：本明細書で使用される場合、「核酸分子」という用語は、ヌクレオチド（す
なわち、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよび／または前記のいずれかの
修飾型）のポリマー型を指し得る。本明細書で使用される「核酸分子」は、「核酸」およ
び「ポリヌクレオチド」と同義である。この用語は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡな
らびにこれらの合成型および混合ポリマーのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含む。こ
の用語は、一本鎖、二本鎖、部分的二重鎖、三重鎖、ヘアピン、円形および南京錠構造を
含む任意の形態的構造を含む。核酸分子は、天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドの
いずれかまたは両方を含むことができる。このようなヌクレオチドは、天然および／また
は非天然ヌクレオチド結合によって結合され得る。
【００３７】
核酸分子は、当業者によって容易に認識されるように、化学的もしくは生化学的に修飾
されていてもよく、または誘導体化ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。このような修
飾は、例えば、限定されないが、ラベル；メチル化；類似体による天然ヌクレオチドの１
つまたはそれ以上の置換；およびヌクレオチド間修飾（例えば、無電荷結合、例えば、メ
チルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデートおよびカルバメート；荷電
結合、例えば、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート；ペンダント部分、例え
ば、ペプチド；インターカレーター、例えば、アクリジンおよびソラレン；キレート剤；
アルキル化剤；および修飾結合、例えば、αアノマー核酸）を含む。
【００３８】
外因性：「外因性」分子は、ポリヌクレオチドについてはヌクレオチド配列および／ま
たはゲノム位置（すなわち、座）に関して（およびポリペプチドについてはアミノ酸配列
および／または細胞局在に関して）、特定の系（例えば、生殖質、品種、エリート品種お
よび／または植物）に生まれつき備わっていない分子である。実施形態では、外因性また
は異種性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、生物系（例えば、植物細胞、植物遺
伝子、特定の植物種もしくは品種、および／または植物染色体）に人工的に供給されてお
り、かつ特定の生物系に生まれつき備わっていない分子であり得る。したがって、「外因
性」としての核酸の指定は、その核酸が天然源以外の源に由来することを示す、またはそ
の核酸が非天然構造、遺伝子位置もしくは要素の配列を有することを示し得る。
【００３９】
対照的に、例えば、「野生の」または「内因性」核酸は、染色体またはその核酸が天然
で通常見られる他の遺伝物質中に通常存在するもの以外の核酸要素を含まない核酸（例え
ば、遺伝子）である。内因性遺伝子転写産物は、その天然の染色体座でヌクレオチド配列
によってコードされ、細胞に人工的に供給されていない。
【００４０】
作動可能に連結された：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係にある場合、第
１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコ
ード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列と作動可能に
連結されている。組換え的に産生されると、作動可能に連結された核酸配列は一般的に隣
接しており、必要な場合には同じリーディングフレーム中の２つのタンパク質コード領域
を連結する。しかしながら、要素は作動可能に連結されるために隣接している必要はない
。
【００４１】
プロモーター：プロモーターは、一般的に核酸の転写を増強する核酸の（５’領域に向
かって）上流に位置するＤＮＡの領域である。プロモーターは、作動可能に連結されてい
る核酸の適当な活性化または抑制を可能にする。プロモーターは、転写因子によって認識
される特異的配列を含む。これらの因子がプロモーターＤＮＡ配列に結合し、ＲＮＡポリ
メラーゼ、すなわち核酸のコード領域からＲＮＡを合成する酵素の動員をもたらす。形質
転換された：ベクターが核酸分子を細胞中に移す場合、ベクターは細胞を「形質転換する
」または「形質導入する」。核酸分子が、核酸分子の細胞ゲノムへの組込みまたはエピソ
ーム複製によって、細胞により安定的に複製されるようになると、細胞は核酸分子により
「形質転換されている」。本明細書で使用される場合、「形質転換」という用語は、核酸
分子が細胞に導入され得る全ての技術を包含する。例は、限定されないが、ウイルスベク
ターを用いたトランスフェクション；プラスミドベクターを用いた形質転換；エレクトロ
ポレーション（Fromm et al.(1986) Nature 319:791-3）；リポフェクション（Felgner e
t al.(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7）；マイクロインジェクション（Muelle
r et al.(1978) Cell 15:579-85）；アグロバクテリウム媒介移入（Fraley et al.(1983)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7）；直接ＤＮＡ取り込み；および微粒子銃（Klein e
t al.(1987) Nature 327:70）を含む。
【００４２】
導入された：本明細書で使用される場合、「導入された」という用語は、外因性核酸の
細胞への転位に言及する場合には、当分野で利用可能な任意の方法論を用いた核酸の細胞
への組込みを指す。この用語は、例えば、限定されないが、トランスフェクション；形質
転換；および形質導入を含む核酸導入法を包含する。
【００４３】
導入遺伝子：本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、対象となる外
因性核酸コード配列を指す。例えば、導入遺伝子は産業的もしくは薬学的に有用な化合物
、または望ましい農業的形質（例えば、除草剤耐性もしくは有害生物耐性）に寄与する発
現産物をコードし得る。さらなる例では、導入遺伝子がアンチセンス核酸であってもよく
、アンチセンス核酸の発現は標的核酸配列の発現を阻害する。導入遺伝子は、導入遺伝子
と作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーター）を含み得る。いくつかの実施
形態では、ＦＡＤ２座において部位特異的標的化によって導入される対象となる核酸分子
が導入遺伝子である。しかしながら、他の実施形態では、対象となる核酸分子がＰＴＵ、
ＥＬＰ、ＥＴＩＰまたは内因性核酸配列（例えば、内因性核酸配列の追加の外因性ゲノム
コピーが望まれる場合）であり得る。
【００４４】
要素は、構造ＲＮＡ、例えばｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡも含むことができる。この
ようなＲＮＡは、限定されないが、ポスティングに影響を及ぼすまたは除草剤耐性を与え
ることを含む外因性または内因性遺伝子を修飾することができる。
【００４５】
組換え：本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、ヒトの介入によって変
えられた材料（例えば、核酸、遺伝子、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド）
を指す。例えば、組換え分子の一部または要素の配列は野生の配列でなくてもよく、およ
び／または組換え分子の一次配列は、例えば、その発現および／または活性を最適化する
ためにその野生の配列から変更されていてもよい。自然の環境または状態で組換え材料を
産生するまたはそこから取り出すために材料が変化され得る。一例として、オープンリー
ディングフレームのヌクレオチド配列がその自然の状況から取り出され、人工核酸分子（
例えば、ベクター）にクローニングされた場合、核酸のオープンリーディングフレームは
組換えである。組換え分子（例えば、組換え核酸）を産生するためのプロトコルおよび試
薬は、当分野で一般的であり、その使用は日常的である。「組換え」という用語はまた、
本明細書において、組換え材料を含む細胞または生物（例えば、組換え核酸を含む植物お
よび／または植物細胞）も指し得る。いくつかの例では、組換え生物がトランスジェニッ
ク生物である。
【００４６】
ベクター：本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、少なくとも１つの
核酸セグメントを細胞に移入することができるポリヌクレオチドまたは他の分子を指す。
ベクターは場合により、ベクター維持を媒介するおよび／またはその意図した使用を可能
にする成分／要素（例えば、複製に必要な配列、薬剤もしくは抗生物質耐性を与える遺伝
子、マルチクローニングサイト、および／またはクローニングされた遺伝子の発現を可能
にする作動可能に連結されたプロモーター／エンハンサー要素）を含んでもよい。ベクタ
ーは、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、または植物もしくは動物ウイルスに由
来し得る。「クローニングベクター」、「シャトルベクター」または「サブクローニング
ベクター」は、一般的にクローニングまたはサブクローニング工程を促進するための作動
可能に連結された要素を含む（例えば、マルチクローニングサイトは複数の制限エンドヌ
クレアーゼ部位を含む）。
【００４７】
発現ベクター：本明細書で使用される「発現ベクター」という用語は、特定の宿主生物
においてコード配列の発現を促進することができる作動可能に連結されたポリヌクレオチ
ド配列を含むベクターを指す。例えば、細菌発現ベクターは、細菌においてコード配列の
発現を促進することができる。同様に、植物発現ベクターは、植物細胞においてコード配
列の発現を促進することができる。原核生物において発現を促進するポリヌクレオチド配
列は、例えば、限定されないが、プロモーター；オペレーター；およびリボソーム結合部
位を含み得る。真核生物発現ベクター（例えば、植物発現ベクター）は、例えば、原核生
物発現ベクターで使用されるものとは一般的に異なるプロモーター；エンハンサー；終止
シグナル；およびポリアデニル化シグナル（および他の配列）を含み得る。
【００４８】
配列同一性：２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用される
「配列同一性」または「同一性」という用語は、指定された比較窓にわたって最大の対応
で整列された場合に、同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の値は、比較窓
にわたって２つの最適整列配列（例えば、核酸配列およびアミノ酸配列）を比較すること
によって決定され得、比較窓中の配列の一部は２つの配列の最適整列のための（付加も欠
失も含まない）基準配列と比べて付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい
。配列同一性は、同一ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両配列中で生じる位置の数を決
定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較窓中の位置の総数で割り、その
結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって百分率として計算される。
【００４９】
比較のために配列を整列させる方法は当分野で周知である。種々のプログラムおよびア
ラインメントアルゴリズムが、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv.Appl.Math.2:48
2；Needleman and Wunsch (1970) J.Mol.Biol.48:443；Pearson and Lipman (1988) Proc
.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44；Higgins a
nd Sharp (1989) CABIOS 5:151-3；Corpet et al.(1988) Nucleic Acids Res.16:10881-9
0；Huang et al.(1992) Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson et al.(1994) Methods Mo
l.Biol.24:307-31；Tatiana et al.(1999) FEMS Microbiol.Lett.174:247-50に記載され
ている。配列アラインメント法および相同性計算の詳細な検討は、Altschul et al.(1990
) J.Mol.Biol.215:403-10に見出され得る。
【００５０】
国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ
Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）； Altschul et al.(1990)）が配列を整
列させるために使用され得、これはいくつかの配列解析プログラムに関連して使用するた
めに、国立生物工学情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの供給源か
ら、およびインターネット上で入手可能である。どのようにこのプログラムを用いて配列
同一性を決定するかについての説明は、ＢＬＡＳＴ（商標）についての「ヘルプ」の項目
でインターネット上で入手可能である。核酸配列を比較するために、デフォルトパラメー
タを用いて、ＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」機
能が使用され得る。基準配列との類似性が大きい核酸配列は、この方法で評価されると、
同一性百分率の増加を示すだろう。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「実質的に同一の」という用語は、８０％超同一であるヌ
クレオチド配列を指し得る。例えば、実質的に同一のヌクレオチド配列は、基準配列と少
なくとも８５％；少なくとも８６％；少なくとも８７％；少なくとも８８％；少なくとも
８９％；少なくとも９０％；少なくとも９１％；少なくとも９２％；少なくとも９３％；
少なくとも９４％；少なくとも９５％；少なくとも９６％；少なくとも９７％；少なくと
も９８％；少なくとも９９％；または少なくとも９９．５％同一であり得る。
【００５２】
座：本明細書で使用される場合、「座」という用語は、測定可能な特性（例えば、形質
）に対応するゲノム上の位置を指す。いくつかの実施形態では、特に対象となる座がＦＡ
Ｄ２遺伝子のゲノム位置であり、この遺伝子の破壊は野生型遺伝子から転写されたｍＲＮ
Ａの発現を減少させるまたは排除する。座は、サザンハイブリダイゼーションまたはＰＣ
Ｒ中に座中に含まれる特有のヌクレオチド配列にハイブリダイズするプローブによって定
義され得る。
【００５３】
マーカー：本明細書で使用される場合、「マーカー」は特定の対立遺伝子を有するおよ
び／または特定の形質もしくは表現型を示すと見られる植物を同定するために使用され得
る遺伝子またはヌクレオチド配列を指す。マーカーは、所与のゲノム座で変異として記載
され得る。遺伝子マーカーは、短ＤＮＡ配列、例えば、単一塩基対変化（一塩基多型、す
なわち「ＳＮＰ」）を囲む配列、または長配列、例えば、ミニサテライト／単純反復配列
（「ＳＳＲ」）であり得る。「マーカー対立遺伝子」は、特定の植物中に存在するマーカ
ーのバージョンを指す。本明細書で使用されるマーカーという用語は、植物染色体ＤＮＡ
のクローン化セグメント（例えば、ＦＡＤ２座、或いは修飾および／または破壊ＦＡＤ２
座を含むセグメント）を指し得、同様にまたは或いは、植物染色体ＤＮＡのクローン化セ
グメントに相補的なＤＮＡ分子を指し得る。当業者によって認識されるように、マーカー
に包含するための追加の隣接ヌクレオチド配列を得る工程がほとんど無限に反復され（染
色体の長さによってのみ限定される）、それによって染色体に沿って追加のマーカーが同
定され得る。上記の多様なマーカーのいずれかおよび全てが本発明のいくつかの実施形態
で使用され得る。
【００５４】
いくつかの実施形態では、生殖質中の（「標的」配列によって特徴付けられる）導入遺
伝子またはマーカーの存在は、核酸プローブ、例えば、オリゴヌクレオチドの使用を通し
て検出され得る。プローブはＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。オリゴヌクレオチ
ドプローブは、合成的にまたはクローニングによって調製され得る。適当なクローニング
ベクターは当業者に周知である。ＲＮＡプローブは当分野で公知の手段によって、例えば
、ＤＮＡ分子テンプレートを用いて合成され得る。
【００５５】
オリゴヌクレオチドプローブは標識されていても非標識であってもよい。例えば、限定
されないが、ニックトランスレーションによる放射標識；ランダムプライミング；および
末端デオキシトランスフェラーゼによるテーリング（使用されるヌクレオチドが、例えば
、放射性３２Ｐで標識される）を含む、核酸分子を標識するための多種多様な技術が存在
する。使用され得る他の標識は、例えば、限定されないが、発蛍光団；酵素；酵素基質；
酵素補因子；および酵素阻害剤を含む。あるいは、単独でまたは他の反応性薬剤と併せて
、検出可能なシグナルを提供する標識の使用は、受容体が結合するリガンドによって置き
換えられ得、ここでは受容体が（例えば、上に示される標識によって）標識されて、単独
でまたは他の試薬と併せて、検出可能なシグナルを提供する。例えば、Leary et al.(198
3) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4045-9を参照されたい。
【００５６】
プローブは、検出される導入遺伝子またはマーカーの正確なコピーであり得る。プロー
ブはまた、検出される導入遺伝子またはマーカーを含む染色体ＤＮＡのクローン化セグメ
ントと実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、またはこれからなる核酸分子であり得る
。プローブは、追加の核酸配列、例えば、プロモーター；転写シグナル；および／または
ベクター配列をさらに含んでもよい。
【００５７】
プローブは、ゲノムからの標的ヌクレオチド配列および追加の隣接ヌクレオチド配列の
全部または一部を含んでもよい。これは本明細書において「隣接プローブ」と呼ばれる。
追加の隣接ヌクレオチド配列は、染色体からの隣接ヌクレオチド配列が慣用的に理解され
るように元のマーカーの５’または３’側にあるかどうかに応じて、元の標的の「上流」
または「下流」と呼ばれる。プローブは元の標的のヌクレオチド配列と隣接しないヌクレ
オチド配列を含んでもよく、このプローブは本明細書において「非隣接プローブ」と呼ば
れる。非隣接プローブの配列は、非隣接プローブが元のマーカーまたは導入遺伝子と連結
するように、染色体上の元の標的の配列の十分近くに位置し得る。
【００５８】
いくつかの実施形態では、プローブが、検出される標的の正確なコピーに「特異的にハ
イブリダイズ可能」または「特異的に相補的」である核酸分子である。「特異的にハイブ
リダイズ可能」および「特異的に相補的」は、核酸分子と標的との間で安定かつ特異的な
結合が起こるのに十分な程度の相補性を示す用語である。核酸分子は、特異的にハイブリ
ダイズ可能となるためにその標的配列と１００％相補的である必要はない。特異的結合が
望まれる条件下、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で核酸と非
標的配列の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合に、核酸分子は特
異的にハイブリダイズ可能である。
【００５９】
特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択する
ハイブリダイゼーション法の性質ならびにハイブリダイズしている核酸配列の組成および
長さに応じて変化するだろう。一般的に、洗浄時間もストリンジェンシーに影響を及ぼす
が、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーションバッファのイオン強度
（特に、Ｎａ＋および／またはＭｇ＋＋濃度）がハイブリダイゼーションのストリンジェ
ンシーを決定するだろう。特定の程度のストリンジェンシーを達成するために要求される
ハイブリダイゼーション条件に関する計算は、当業者に公知であり、例えば、Sambrook e
t al.(ed.) Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 2nd ed., vol.1-3, Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11；およ
びHames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985に
論じられている。核酸のハイブリダイゼーションに関するさらなる詳細な指示および手引
きは、例えば、Tijssen, 「Overview of principles of hybridization and the strateg
y of nucleic acid probe assays」 in Laboratory Techniques in Biochemistry and Mo
lecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Else
vier, NY, 1993；およびAusubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biolo
gy, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995に見出され得る
。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション
分子とＤＮＡ標的との間のミスマッチが２５％未満である場合にのみハイブリダイゼーシ
ョンが起こる条件を包含する。「ストリンジェントな条件」はさらなる特定のレベルのス
トリンジェンシーを含む。したがって、本明細書で使用される場合、「中等度ストリンジ
ェンシー」条件は、２５％超の配列ミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件
であり；「中程度ストリンジェンシー」の条件は、１５％超のミスマッチを有する分子が
ハイブリダイズしない条件であり；また「高ストリンジェンシー」の条件は、１０％超の
ミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。「極めて高ストリンジェン
シー」の条件は、６％超のミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。
【００６１】
特定の実施形態では、ストリンジェントな条件が、６ｘ生理食塩水−クエン酸ナトリウ
ム（ＳＳＣ）バッファ、５ｘデンハルト液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ断片化サケ
精巣ＤＮＡ中６５℃でのハイブリダイゼーション、引き続いて２ｘＳＳＣバッファおよび
０．５％ＳＤＳ、引き続いて１ｘＳＳＣバッファおよび０．５％ＳＤＳ、そして最後に０
．２ｘＳＳＣバッファおよび０．５％ＳＤＳ中６５℃での１５〜３０分の連続的洗浄であ
る。
【００６２】
連鎖（不）平衡：本明細書で使用される場合、「連鎖平衡」という用語は、マーカーお
よび第２の核酸（例えば、導入遺伝子、ＰＴＵおよび第２のマーカー）が独立に分離する
、すなわち、マーカーおよび第２の核酸が子孫間でランダムにソートする状態を指す。連
鎖平衡を示す核酸は（それらが同じ染色体上にあろうとなかろうと）連結していないとみ
なされる。本明細書で使用される場合、「連鎖不平衡」は、マーカーおよび第２の核酸が
ランダムでない様式で分離する；すなわち、核酸が５０％未満の組換え頻度を有する（し
たがって、定義によると、同じ連鎖群上で５０ｃＭ未満離れている）状態を指す。いくつ
かの例では、連鎖不平衡を示す核酸は連結しているとみなされる。
【００６３】
連結した、密に連結した、および極めて密に連結した：本明細書で使用される場合、マ
ーカーと第２の核酸（例えば、導入遺伝子、ＰＴＵおよび第２のマーカー）との間の連鎖
は、染色体上の核酸が次の世代の個体に一緒に伝えられる測定可能な確率を示す現象を指
し得る。したがって、あるマーカーと第２の核酸の連鎖は、組換え頻度として測定および
／または表現され得る。２つの核酸が互いに近いほど、この確率が「１」に近くなる。し
たがって、「連結した」という用語は、０．５より大きい確率（マーカー／遺伝子が異な
る染色体上に位置する場合、独立組み合わせから予測される）で、第２の核酸と一緒に伝
えられる１つまたはそれ以上の遺伝子またはマーカーを指し得る。遺伝子（例えば、導入
遺伝子）の存在が個体の表現型に寄与する場合、遺伝子に連結したマーカーは表現型に連
結していると言われ得る。したがって、「連結している」という用語は、マーカーと遺伝
子との間、またはマーカーと表現型との間の関係を指し得る。
【００６４】
相対的遺伝的距離（交差度数によって決定され、センチモルガン（ｃＭ）で測定される
）は、一般的に２つの連結したマーカーまたは遺伝子が染色体上で互いに離れている物理
的距離（塩基対で測定される）に比例する。１センチモルガンは、１％組換え頻度を示す
（すなわち、２つのマーカーの間で交差イベントが１００回の細胞分裂毎に１回起こる）
２つの遺伝子マーカーの間の距離として定義される。一般に、あるマーカーが別のマーカ
ーまたは遺伝子と近いほど（これらの間の距離が遺伝的距離に関して測定されようと、物
理的距離に関して測定されようと）、これらがより密に連結している。染色体距離は形質
間の組換えイベントの頻度にほぼ比例するので、組換え頻度と相関するおおよその物理的
距離が存在する。この相関は、主要な作物植物（Helentjaris and Burr (eds.) (1989) D
evelopment and Application of Molecular Markers to Problems in Plant Genetics. C
old Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY；Gresshoff (ed.) (1994) Pla
nt Genome Analysis. CRC Press, Boca Raton, FL；Lander et al.(1987) Genomics 1:17
4-81；Tanksley et al.(1988) 「Molecular mapping of plant chromosomes」 In Chromo
some Structure and Function. Gustafson and Appels (eds.) Plenum Press, NY, pp.15
7-73）および多くの他の生物にわたって一般的に知られているまたは容易に決定可能であ
る。例えば、１ｃＭは酵母では約２．５〜３．０ｋｂ、シロイヌナズナでは約１４０ｋｂ
、ヒマワリでは約４００ｋｂおよびユーカリでは約３５０ｋｂに相当する。
【００６５】
「連結している」という用語は、本明細書においては５０％未満（すなわち、５０ｃＭ
未満）の組換え頻度を示す１つまたはそれ以上の核酸を指し得る。例えば、「連結してい
る」核酸は、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下
、約２０％以下、約１５％以下、および約１０％以下の頻度で再結合し得る。前記組換え
頻度に対応する同じ染色体上の（異なる染色体上の核酸は連鎖平衡であると予想される）
このような核酸間の物理的距離は宿主ゲノムに依存し、上に示されているように容易に計
算され得る。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「密に連結している」という用語は、約２０％以下（すな
わち、約２０ｃＭ以下）の組換え頻度を示す１つまたはそれ以上の核酸を指し得る。例え
ば、「密に連結している」核酸は、２２％以下、約１８％以下、約１６％以下、約１４％
以下、約１２％以下、約１０％以下、約８％以下、約６％以下、約４％以下、および約２
％以下の頻度で再結合し得る。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「極めて密に連結している」という用語は、約１０％以下
（すなわち、約１０ｃＭ以下）の組換え頻度を示す１つまたはそれ以上の核酸を指し得る
。例えば、「極めて密に連結している」核酸は、１１％以下、約９％以下、約８％以下、
約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、および約
１％以下の頻度で再結合し得る。
【００６８】
特定の核酸が特定の表現型に寄与するポリペプチドをコードする遺伝子に近いほど（遺
伝的距離に関して測定されようと、物理的距離に関して測定されようと）、特定の核酸は
表現型とより密に連結している。前記を考慮して、特定の遺伝子または表現型と連結して
いる核酸は、遺伝子または表現型と密に連結している核酸、および極めて密に連結してい
る核酸を含むと認識されるだろう。いくつかの実施形態では、特定の核酸がＦＡＤ２座（
例えば、修飾または破壊ＦＡＤ２座）に近いほど（遺伝的距離に関して測定されようと、
物理的距離に関して測定されようと）、特定の核酸はＦＡＤ２座において組み込まれてい
る外因性核酸によって与えられる任意の形質／表現型と（または非修飾座の場合、野生型
ＦＡＤ２表現型と）より密に連結している。したがって、組み込まれた外因性核酸を含む
ＦＡＤ２座と連結している、密に連結しているおよび／または極めて密に連結している遺
伝子マーカーは、組み込まれた核酸を含む生物（例えば、植物および植物品種）を同定す
る、組み込まれた核酸によって与えられる表現型を含む生物を同定する、ならびにこのよ
うな組み込まれた核酸および／または組み込まれた核酸によって与えられる表現型を他の
適合性生物中で繁殖させるためのＭＡＳプログラムで有用となり得る。
【００６９】
マーカー利用育種：本明細書で使用される場合、「マーカー利用育種」という用語は、
１つまたはそれ以上の形質（例えば、ポリジーン形質）のために直接植物を育種する手法
を指し得る。現在の実際問題として、植物育種家は、容易に検出可能な形質、例えば、花
の色、種皮の外観、または農業経済学的に望ましい形質に関連するアイソザイム変異形を
同定しようと試みている。その結果、植物育種家は、容易に検出可能な形質の分離に従う
ことによって、分離している育種集団の農学的形質に従う。しかしながら、対象となる形
質と、植物育種に使用するために利用可能な容易に検出可能な形質との間のこれらの連鎖
関係はほとんど存在しない。本発明のいくつかの実施形態では、マーカー利用育種が、対
象となる形質に寄与する外因性核酸が組み込まれたＦＡＤ２座に連結した１つまたはそれ
以上の遺伝子マーカー（例えば、ＳＮＰ、アイソザイムおよび／またはＳＳＲマーカー）
を同定する工程と、１つまたはそれ以上の遺伝子マーカーの分離に従うことによって分離
している育種集団の対象となる形質に従う工程とを含む。いくつかの例では、１つまたは
それ以上の遺伝子マーカーの分離が、１つまたはそれ以上の遺伝子マーカーの存在につい
て子孫植物からの遺伝子サンプルをアッセイすることによって、１つまたはそれ以上の遺
伝子マーカーのためのプローブを利用して決定され得る。マーカー利用育種は、植物品種
の改善のための時間および費用効率的なプロセスを提供する。
【００７０】
形質または表現型：「形質」および「表現型」という用語は本明細書において互換的に
使用される。本開示の目的のために、特に対象となる形質は、例えば、作物植物において
発現され得るような農業経済学的に重要な形質、および標的化組込みイベントからの導入
遺伝子発現産物の産生を含む。「分子表現型」という用語は、（１つまたはそれ以上の）
分子の集団のレベルで検出可能な表現型を指し得る。いくつかの例では、分子表現型は、
分子レベルでのみ検出可能であり得る。表現型の検出可能な分子は核酸（例えば、ゲノム
ＤＮＡもしくはＲＮＡ）；タンパク質；および／または代謝産物であり得る。例えば、分
子表現型は、（例えば、植物発育の特定の段階における、または環境条件もしくはストレ
スに応じた）１つまたはそれ以上の遺伝子産物についての発現プロファイルであり得る。
【００７１】
量的形質座位：遺伝子（相加、優先および上位）および環境の影響により絶えず変化す
る形質は一般的に「量的形質」と呼ばれる。量的形質は、表現型の連続分布をもたらす遺
伝子発現への環境的影響、および多遺伝子遺伝によってもたらされる複雑な分離パターン
の２つの因子に基づいて「質的」または「離散」形質から識別され得る。量的形質の発現
に関連するゲノムの１つまたはそれ以上の領域の同定が、このような領域を「量的形質座
位（「ＱＴＬ」）と定義する。
【００７２】
植物：本明細書で使用される場合、「植物」という用語は、全植物、植物に由来する細
胞もしくは組織培養物、および／または前記のいずれかの任意の部分を指し得る。したが
って、「植物」という用語は、例えば、限定されないが、全植物；植物成分および／また
は器官（例えば、葉、茎および根）；植物組織；種子；ならびに植物細胞を包含する。植
物細胞は、例えば、限定されないが、植物中および／または植物の細胞、植物から単離さ
れた細胞、ならびに植物から単離された細胞の培養を通して得られた細胞であり得る。
【００７３】
「トランスジェニック植物」は、その細胞の少なくとも１つの中に外因性ポリヌクレオ
チドを含む植物である。「トランスジェニック」という用語は、本明細書において、その
遺伝子型が外因性核酸の存在によって変えられた任意の細胞、細胞系、カルス、組織、植
物部位、または植物を指すために使用される。したがって、この用語は、外因性ポリヌク
レオチドを含むように最初に変えられたトランスジェニック生物および細胞、ならびに最
初のトランスジェニック生物または細胞の交雑または無性繁殖によって作成された生物お
よび細胞を包含する。本明細書で使用される「トランスジェニック」という用語は、従来
の植物育種法（例えば、非トランスジェニック生物のみの交雑）または天然のイベント（
例えば、ランダム多家受粉、非組換えウイルス感染、非組換え細菌形質転換、非組換え転
位および自然突然変異）によって導入されたゲノム（染色体または染色体外）変化を包含
しない。
【００７４】
植物「系統」、「品種」または「株」は、同じ血統を有する個々の植物の群である。あ
る系統の植物は、一般的にある程度近交系であり、一般的にほとんどの遺伝子座（例えば
、ＦＡＤ２座）でホモ接合性および同種である。「亜系統」は、同じ祖先に由来する他の
類似の近交系サブセットとは遺伝的に異なる共通の祖先からの子孫の近交系サブセットを
指し得る。いくつかの実施形態では、「亜系統」は、残りの分離座がほとんどまたは全て
の座にわたってホモ接合性となるまで、Ｆ３〜Ｆ５世代で選択される個々のトランスジェ
ニック植物からの種子を近親交配することによって産生され得る。
【００７５】
「結合タンパク質」は、別の分子に結合することができるタンパク質である。結合タン
パク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タン
パク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することが
できる。タンパク質結合タンパク質の場合、これは（ホモダイマー、ホモトリマー等を形
成するために）自身に結合することができる、および／または異なるタンパク質の１つま
たはそれ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、２つ以上の型の結合活
性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ
結合およびタンパク質結合活性を有する。
【００７６】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、１つまたはそ
れ以上のジンクフィンガーを通して配列特異的様式でＤＮＡに結合するタンパク質または
大型タンパク質中のドメインであり、ジンクフィンガーはその構造が亜鉛イオンの配位を
通して安定化される結合ドメイン中のアミノ酸配列の領域である。ジンクフィンガーＤＮ
Ａ結合タンパク質という用語は通常、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略され
る。
【００７７】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたはそれ以上のＴＡ
ＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥとその同
族の標的ＤＮＡ配列の結合に関与する。単一「反復単位」（「反復」とも呼ばれる）は、
典型的には長さ３３〜３５個のアミノ酸であり、天然のＴＡＬＥタンパク質中の他のＴＡ
ＬＥ反復配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。
【００７８】
ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然のジンクフィンガーま
たはＴＡＬＥタパク質の認識ヘリックス領域の操作（１つまたはそれ以上のアミノ酸を変
化させる）を通して、所定のヌクレオチド配列に結合するよう「操作」され得る。そのた
め、操作ＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然タンパク
質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作する方法の非限定的例は、設計および選択である
。設計ＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が原則として合理的な基準から生じる、
天然で生じないタンパク質である。設計のための合理的な基準は、置換ルールならびに既
存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計の情報を記憶するデータベース中の情報を処理す
るための計算機化アルゴリズムの適用、ならびにデータの結合を含む。例えば、米国特許
第６，１４０，０８１号明細書；第６，４５３，２４２号明細書；および第６，５３４，
２６１号明細書；を参照されたい；また国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；国
際公開第９８／５３０５９号パンフレット；国際公開第９８／５３０６０号パンフレット
；国際公開第０２／０１６５３６号パンフレットおよび国際公開第０３／０１６４９６号
パンフレットならびに米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照された
い。
【００７９】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生が経験的プロ
セス、例えば、ファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択から主
に生じる、天然で見られないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８
号明細書；米国特許第５，９２５，５２３号明細書；米国特許第６，００７，９８８号明
細書；米国特許第６，０１３，４５３号明細書；米国特許第６，２００，７５９号明細書
；国際公開第９５／１９４３１号パンフレット；国際公開第９６／０６１６６号パンフレ
ット；国際公開第９８／５３０５７号パンフレット；国際公開第９８／５４３１１号パン
フレット；国際公開第００／２７８７８号パンフレット；国際公開第０１／６０９７０号
パンフレット；国際公開第０１／８８１９７号パンフレット；国際公開第０２／０９９０
８４号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照さ
れたい。
【００８０】
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破壊を指す。切断は、それだけに限らないが
、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含む種々の方法によって開始さ
れ得る。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は２つの異なる一本鎖
切断イベントの結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれ
かの産生をもたらし得る。特定の実施形態では、融合ポリペプチドが標的化二本鎖ＤＮＡ
切断に使用される。
【００８１】
「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なる）と併せて、切断
活性（好ましくは、二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である
。「第１および第２の切断ハーフドメイン」、「＋および−切断ハーフドメイン」および
「右および左切断ハーフドメイン」という用語は、二量体化する対の切断ハーフドメイン
を指すために互換的に使用される。
【００８２】
「操作切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作切断ハー
フドメイン）と共に絶対ヘテロダイマーを形成するよう修飾された切断ハーフドメインで
ある。全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／００６
４４７４号明細書、第２００７０２１８５２８号明細書、第２００８／０１３１９６２号
明細書および第２０１１／０２０１０５５号明細書も参照されたい。
【００８３】
二本鎖ＤＮＡ切断をもたらす手段：本明細書で使用される場合、「二本鎖ＤＮＡ切断を
もたらす手段」という用語は、米国特許法第１１２条第６パラグラフによって認可される
特別請求規定を援用することが意図されている。具体的には、「二本鎖ＤＮＡ切断をもた
らす手段」は、二本鎖ＤＮＡ分子の両鎖を切断することができる分子構造を指す。このよ
うな構造は、多くの公知のヌクレアーゼタンパク質、例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメ
インに含まれるポリペプチドドメインを含み、触媒ドメインはタンパク質Ｍｍｅｌ、コリ
シンＥ７（ＣＥＡ７＿ＥＣＯＬＸ）、コリシンＥ９、ＡＰＦＬ、ＥｎｄＡ、エンドＩ（Ｅ
ＮＤ１＿ＥＣ０ＬＩ）、ヒトエンドＧ（ＮＵＣＧ＿ＨＵＭＡＮ）、ウシエンドＧ（ＮＵＣ
Ｇ＿ＢＯＶＩＮ）、Ｒ．ＨｉｎＰｌｌ、ｌ−Ｂａｓｌ、ｌ−Ｂｍｏｌ、ｌ−Ｈｍｕｌ、ｌ
−Ｔｅｖｌ、ｌ−Ｔｅｖｌｌ、ｌ−Ｔｅｖｌｌｌ、ｌ−Ｔｗｏｌ、Ｒ．Ｍｓｐｌ、Ｒ．Ｍ
ｖａｌ、ＮｕｃＡ、ＮｕｃＭ、Ｖｖｎ、Ｖｖｎ＿ＣＬＳ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ（ＮＵ
Ｃ＿ＳＴＡＡＵ）、ブドウ球菌ヌクレアーゼ（ＮＵＣ＿ＳＴＡＨＹ）、小球菌ヌクレアー
ゼ（ＮＵＣ＿ＳＨＩＦＬ）、エンドヌクレアーゼｙｎｃＢ、エンドデオキシリボヌクレア
ーゼＩ（ＥＮＲＮ＿ＢＰＴ７）、Ｍｅｔｎａｓｅ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＤＩ  Ａ、
Ｎｔ．ＢｓｐＤ６ｌ（Ｒ．ＢｓｐＤ６ｌ大型サブユニット）、ｓｓ．ＢｓｐＤ６ｌ（Ｒ．
ＢｓｐＤ６ｌ小型サブユニット）、Ｒ．ＰＩｅｌ、Ｍｌｙｌ、Ａｌｗｌ、Ｍｖａｌ２６９
ｌ、Ｂｓｒｌ、Ｂｓｍｌ、Ｎｂ．ＢｔｓＣＩ、Ｎｔ．ＢｔｓＣＩ、Ｒｌ．Ｂｔｓｌ、Ｒ２
．Ｂｔｓｌ、ＢｂｖＣＩサブユニット１、ＢｂｖＣＩサブユニット２、ＢｐｕｌＯＩαサ
ブユニット、ＢｐｕｌＯＩβサブユニット、Ｂｍｒｌ、Ｂｆｉｌ、ｌ−Ｃｒｅｌ、ｈＥｘ
ｏｌ（ＥＸ０１ＪＨＵＭＡＮ）、酵母Ｅｘｏｌ（ＥＸ０１＿ＹＥＡＳＴ）、大腸菌Ｅｘｏ
ｌ、ヒトＴＲＥＸ２、マウスＴＲＥＸ１、ヒトＴＲＥＸ１、ウシＴＲＥＸ１、ラットＴＲ
ＥＸ１、ヒトＤＮＡ２、酵母ＤＮＡ２（ＤＮＡ２＿ＹＥＡＳＴ）からなる群から選択され
る。
【００８４】
二本鎖ＤＮＡ切断を修復する手段：本明細書で使用される場合、「二本鎖ＤＮＡ切断を
修復する手段」という用語も、米国特許法第１１２条第６パラグラフによって認可される
特別請求規定を援用することが意図されている。具体的には、「二本鎖ＤＮＡ切断を修復
する手段」は、例えば、単一の二本鎖ＤＮＡ分子を切断することによって産生される末端
を連結する、または単一の二本鎖ＤＮＡ分子を切断することによって産生される一端と外
因性二本鎖ＤＮＡ分子の末端を連結することによって、二本鎖ＤＮＡ分子の末端の連結を
促進／触媒することができる分子構造を指す。このような構造は、多くの公知のリガーゼ
タンパク質、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼに含まれるポリペプチドドメインを含む。い
くつかの例では、同じ分子構造が、二本鎖ＤＮＡ切断をもたらす手段と、二本鎖ＤＮＡ切
断を修復する手段の両方として作用することができ、ここでは同じ構造が二本鎖ＤＮＡ分
子の切断と修復の両方を促進する（例えば、Ｈｉｎリコンビナーゼ）。
【００８５】
ゲノム中の部位特異的二本鎖切断の誘導は、相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末
端結合（ＮＨＥＪ）修復を通して二本鎖切断を回復させる宿主植物細胞ＤＮＡ修復経路を
誘導する。植物では、科学文献が、野生のゲノムまたは予備操作位置への正確な遺伝子ま
たはドナーＤＮＡ組込みが、標的化二本鎖切断に隣接する配列との種々の量の配列相同性
を含む入来ドナーＤＮＡ構築物を伴っていることを報告している。このようなドナーの特
定の標的座への組込みは、おそらくＨＤＲ経路に頼っている。植物における遺伝子標的化
のためにＨＤＲアプローチにもっぱら頼ることは、ＨＤＲ修復経路が、ＮＨＥＪと比べる
と支配的ＤＮＡ修復経路ではないという報告のために、制限を有し得る。 標的特異的Ｄ
ＮＡ切断（ＺＦＮ、ＴＡＬｅＮｓまたは操作メガヌクレアーゼ等）を利用する公開されて
いる植物科学文献では、ＮＨＥＪ経路が特異的点突然変異（挿入または欠失）をゲノムに
導入する方法として報告されている。ここでは、本発明者らは、０〜１０ｂｐ未満の相同
性領域を有する種々のドナーＤＮＡ設計の存在下で、（ＺＦＮ、ＴＡＬｅＮｓ等によって
誘導される）部位特異的二本鎖切断が、植物におけるＮＨＥＪ修復経路を介して標的化切
断において特異的に挿入され得ることを報告する。 線状から環状の一本鎖から二本鎖に
及ぶ小型の１〜１０ｂｐとの相同性が０の種々の異なるＤＮＡドナー設計が、ＮＨＥＪ経
路を用いて特異的位置に標的化され得る。ＮＨＥＪベースのドナーＤＮＡ植物ゲノム標的
化は、「付着末端捕捉」に基づくことができ、ここではＦｏｋ１（または他のＩＩ型エン
ドヌクレアーゼドメイン）によって産生されたゲノム中の標的化二本鎖切断および対応す
る付着末端がＮＨＥＪドナーＤＮＡ設計となる。付着末端ドナーＤＮＡは、予め定義され
たオーバーハングを有する線状ドナーＤＮＡとして細胞に直接送達され得る。代替手法は
、宿主標的ＺＦＮおよび標的認識部位と同一の少なくとも１つのＺＦＮ認識部位を含む環
状ＤＮＡドナー分子を同時送達することによってインビボでドナーＤＮＡ付着末端を産生
することである。少なくとも１つのＺＦＮの発現が、宿主ゲノムＤＮＡ（野生のまたは予
備操作された）および環状ドナーＤＮＡを切断して、宿主ＮＨＥＪ修復経路を用いて回復
される付着末端を産生する。
【００８６】
ドナー分子上に１つまたはそれ以上のＺＦＮ切断部位を有することが可能である（ドナ
ー分子全体を直線化するための単一ＺＦＮ切断部位、小型ドナーＤＮＡ断片を放出するた
めの２つの同じＺＦＮ部位、またはドナーから断片および宿主ゲノムＤＮＡから対応する
断片（ＤＮＡ置換）を放出するための２つの異なるＺＦＮ部位）。
【００８７】
したがって、ドナーポリヌクレオチドは一本鎖および／または二本鎖のＤＮＡまたはＲ
ＮＡであり得、線状または環状型で細胞に導入され得る。例えば、米国特許出願公開第２
０１０００４７８０５号明細書および第２０１１０２０７２２１号明細書を参照されたい
。ある場合、本発明の実施形態は、線状外因性（ドナー）核酸、これらの核酸を含む組成
物、ならびにこれらの線状ドナー分子を製造および使用する方法も含み得る。特定の実施
形態では、線状ドナー分子が、導入される細胞中に安定的に持続する。他の実施形態では
、線状ドナー分子が、例えば、ドナー分子の端部に１つまたはそれ以上の塩基対間の１つ
またはそれ以上のホスホロチオエートホスホジエステル結合を配置することによって、エ
キソヌクレアーゼ切断に耐えるよう修飾される。線状外因性核酸は、一本鎖特異的ＤＮＡ
を含んでもよい。
【００８８】
ＩＩＩ．ＦＡＤ２性能座
ＦＡＤ２（脂肪酸デサチュラーゼ２）と命名される座は、植物中の脂肪酸含量の複雑な
多遺伝子形質の遺伝に関与するＱＴＬに含まれる。ＦＡＤ２は、オレイン酸（１８：１）
のリノール酸（Ｃ１８：２）への不飽和化を担う酵素をコードしている。Tanhuanpaa et 
al.(1998) Mol. Breed. 4:543-50; Schierholt et al.(2001) Crop Sci. 41:1444-9。
【００８９】
植物油生合成経路において、脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）は植物脂質生合成におい
て重要な役割を果たしており、その活性は脂肪酸組成に有意に影響を及ぼす。ＦＡＤは植
物中に豊富にあり、発現解析が、ＦＡＤ  ｍＲＮＡが過剰に産生されていることを示唆し
た。さらに、ＦＡＤ遺伝子は、種々の組織および細胞型、ならびにプラスチドおよび小胞
体を含む細胞内区画で発現している。
【００９０】
植物の脂肪酸組成、および多くの用途におけるそこから産生される油の性能は、主要な
脂肪酸構成成分であるオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸（Ｃ１８：３）の相対濃
度によって決定される。これらの脂肪酸の濃度は、酵素ＦＡＤ２およびＦＡＤ３の機能に
よって主に調節される。オレイン酸は以下のスキームにしたがって、植物中でリノール酸
およびリノレン酸に変換される：
Ｃ１８：０    →    Ｃ１８：１    →    Ｃ１８：２    →    Ｃ１８：３
ＦＡＤ２            ＦＡＤ３
ＦＡＤ２遺伝子は、それだけに限らないが、トウモロコシ、大豆、ワタ、シロイヌナズナ
、コムギ、イネ科牧草、イネ、ヒマワリおよびアブラナ属を含む主要な植物および藻類の
種で同定されており、ＦＡＤ２発現の修飾は、このような生物における脂肪酸プロファイ
ルの変化をもたらす。さらに、修飾ＦＡＤ２遺伝子を含む植物が商品化されており、ＦＡ
Ｄ２遺伝子の破壊は、宿主植物への農学的不利益なしに宿主植物によって産生される油の
栄養的および機能的特性を改善することができることが示されている。例えば、Ｎｅｘｅ
ｒａ（登録商標）ブランド（Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＬＬＣ）で商品化され
ているアブラナおよびヒマワリ品種は、野生型アブラナおよびヒマワリのプロファイルと
比べると、高いオレイン酸、低いリノール酸および低いリノレン酸（および低い飽和脂肪
酸）組成によって特徴付けられる。
【００９１】
参照による本明細書に組み込まれるChi, X等（(2011) Genome-wide analysis of fatty
acid desaturases in soybean (Glycine max). Plant Molecular Biology Reports 29, 
769-783）に記載されているように、大豆におけるＦＡＤ２の公知の機能遺伝子コピーが
、シロイヌナズナカウンターパートの９つのサブファミリー、ＦＡＢ２、ＦＡＤ２、ＦＡ
Ｄ３、ＦＡＤ５、ＦＡＤ６、ＦＡＤ７、ＦＡＤ８、ＳＬＤ１およびＤＥＳ１に系統学的に
位置していた。２９個デサチュラーゼ遺伝子が、２０本の大豆染色体の少なくとも１５本
上に分布していることが分かった。遺伝子構造およびモチーフ組成は、サブファミリー間
でかなり保存されていた。デサチュラーゼ遺伝子の大部分が、マイクロアレイデータ分析
に基づいて、異なる組織および発達段階にわたって特異的な時間的および空間的発現パタ
ーンを示した。
【００９２】
ＦＡＤ２座は、植物の価値に悪影響を及ぼすことなく、かつ多くの目的のために、ＦＡ
Ｄ２発現の変化、油含量／比の変化ならびに／或いは所望の導入遺伝子の組込みおよび発
現を含むその価値を実際に増加させて、植物中で修飾および／または破壊され得る。さら
に、植物におけるＦＡＤ座の遍在的性質により、ＦＡＤ２座は、例えば、限定されないが
、アブラナ；大豆；トウモロコシ；コムギ；イネ科牧草；アブラナ属の種；イネ；トマト
；オオムギ；エンバク；ソルガム；ワタ；およびヒマワリ、ならびに真菌類および藻類を
含む多くの種で少なくともいくつかの目的を損なうことなく修飾および／または破壊され
得る。本発明の実施形態は、ＦＡＤ２座、および外因性核酸の組込みのための性能座とし
てのその使用を含む。例では、ＦＡＤ２座が、例えば、限定されないが、宿主生物の生活
環中にほぼ一貫したレベルの発現があること；および驚くべきことに、ＦＡＤ２座におけ
るドナーＤＮＡの挿入が宿主に質または適合性の不利益を誘導しないことを含む、性能座
としてのその使用の状況の中で望ましいことが分かっているいくつかの特徴の少なくとも
１つを示す。
【００９３】
本発明のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのＦＡＤ２座（例えば、ＦＡＤ２  
２．３座およびＦＡＤ２  ２．６座）が、外因性核酸（例えば、対象となるポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列を含む核酸）の部位特異的組込みのための標的部位として
使用される。特定の実施形態では、外因性核酸の組込みが修飾された座をもたらす。例え
ば、外因性核酸の組込みは、破壊された（すなわち、不活性化された）ＦＡＤ２遺伝子を
産生するように座を修飾し得る。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ＦＡＤ２座が配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選
択されるヌクレオチド配列の相補鎖に特異的にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を
含み得る。例えば、ＦＡＤ２座は、配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択され
るヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＦＡＤ２座が配列番号１４〜
配列番号２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド
配列を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＦＡＤ２座が配列番号１４〜配列番
号２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約８５％同一のヌクレオ
チド配列を含むＦＡＤ２ホモログ（例えば、オルソログまたはパラログ）である。ＦＡＤ
２ホモログは、例えば、限定されないが、配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選
択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％；少なくとも８５％；少なくとも約９０％
；少なくとも約９１％；少なくとも約９２％；少なくとも約９３％；少なくとも約９４％
；少なくとも約９５％；少なくとも約９６％；少なくとも約９７％；少なくとも約９８％
；少なくとも約９９％；少なくとも約９９．５％；９９．６％、９９．７％、９９．８％
および／または少なくとも約９９．９％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。このよ
うなＦＡＤ２ホモログは、種々の生物について当業者に容易に利用可能な任意の完全また
は部分的ゲノムから容易に同定および単離され得る。
【００９５】
ＩＶ．ＦＡＤ２座における核酸の標的化組込み
ＦＡＤ２座における外因性核酸の部位特異的組込みは、当業者に公知の任意の技術によ
って達成され得る。いくつかの実施形態では、ＦＡＤ２座における外因性核酸の組込みが
、細胞（例えば、単離細胞または組織もしくは生物中の細胞）を外因性核酸を含む核酸分
子と接触させることを含む。例では、このような核酸分子が、核酸分子と少なくとも１つ
のＦＡＤ２座との間の相同組換えを促進する外因性核酸に隣接するヌクレオチド配列を含
み得る。特定の例では、相同組換えを促進する外因性核酸に隣接するヌクレオチド配列が
、ＦＡＤ２座の外因性ヌクレオチドと相補的であり得る。特定の例では、相同組換えを促
進する外因性核酸に隣接するヌクレオチド配列が、予め組み込まれた外因性ヌクレオチド
と相補的であり得る。いくつかの実施形態では、複数の外因性核酸が、１つのＦＡＤ２座
において、例えば、遺伝子スタッキングで組み込まれ得る。
【００９６】
ＦＡＤ２座における核酸の組込みは、いくつかの実施形態では、宿主細胞の内因性細胞
機構、例えば、限定されないが、内因性ＤＮＡおよび内因性リコンビナーゼ酵素によって
促進（例えば、触媒）され得る。いくつかの実施形態では、ＦＡＤ２座における核酸の組
込みが、宿主細胞に提供される１つまたはそれ以上の因子（例えば、ポリペプチド）によ
って促進され得る。例えば、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼおよび／またはリガーゼポリ
ペプチドは、ポリペプチドを宿主細胞と接触させることによって、またはポリペプチドを
宿主細胞中で発現させることによって、（独立にまたはキメラポリペプチドの一部として
）提供され得る。したがって、いくつかの例では、少なくとも１つのヌクレアーゼ、リコ
ンビナーゼおよび／またはリガーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核
酸が、ＦＡＤ２座において部位特異的に組み込まれる核酸と同時にまたは順次、宿主細胞
に導入され得、少なくとも１つのヌクレアーゼ、リコンビナーゼおよび／またはリガーゼ
ポリペプチドが宿主細胞中のヌクレオチド配列から発現される。
【００９７】
Ａ．ＤＮＡ結合ポリペプチド
いくつかの実施形態では、部位特異的組込みが、例えば、宿主生物のゲノム中の特定の
ヌクレオチド配列を認識し、これに結合することができる因子を利用することによって達
成され得る。例えば、多くのタンパク質が、部位特異的様式でＤＮＡを認識し、これに結
合することができるポリペプチドドメインを含む。ＤＮＡ結合ポリペプチドによって認識
されるＤＮＡ配列は、「標的」配列と呼ばれ得る。部位特異的様式でＤＮＡを認識し、こ
れに結合することができるポリペプチドドメインは、一般的にドメインが元々単離された
タンパク質以外のポリペプチド中で発現する場合でさえ、正確に折り畳み、独立に機能し
て部位特異的様式でＤＮＡに結合する。同様に、ＤＮＡ結合ポリペプチドによる認識およ
び結合のための標的配列は、一般的に大型ＤＮＡ構造（例えば、染色体）中に存在する場
合でさえ、特に標的配列が位置する部位が可溶性細胞タンパク質にアクセス可能であるこ
とが知られているもの（例えば、遺伝子）である場合に、このようなポリペプチドによっ
て認識され、結合され得る。
【００９８】
天然に存在するタンパク質から同定されたＤＮＡ結合ポリペプチドは、典型的には離散
的ヌクレオチド配列またはモチーフ（例えば、コンセンサス認識配列）に結合するが、異
なるヌクレオチド配列またはモチーフを認識するように多くのこのようなＤＮＡ結合ポリ
ペプチドを修飾する方法が存在し当分野で公知である。ＤＮＡ結合ポリペプチドは、例え
ば、限定されないが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン；ロイシンジッパー；ＵＰＡ
ＤＮＡ結合ドメイン；ＧＡＬ４；ＴＡＬ；ＬｅｘＡ；Ｔｅｔリプレッサー；ＬａｃＲ；
およびステロイドホルモン受容体を含む。
【００９９】
いくつかの例では、ＤＮＡ結合ポリペプチドがジンクフィンガーである。個々のジンク
フィンガーモチーフは、大きい範囲のＤＮＡ部位のいずれかに特異的に標的化および結合
するよう設計され得る。標準Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２（ならびに非標準Ｃｙｓ３Ｈｉｓ）ジンク
フィンガーポリペプチドは、αヘリックスを標的ＤＮＡ二重螺旋の主溝に挿入することに
よって、ＤＮＡに結合する。ジンクフィンガーによるＤＮＡの認識はモジュール式であり
；各フィンガーが主に標的中の３つの連続した塩基対に接触し、ポリペプチド中の数個の
重要な残基が認識を媒介する。標的化エンドヌクレアーゼに複数のジンクフィンガーＤＮ
Ａ結合ドメインを包含させることによって、標的化エンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異
性がさらに増加され得る（したがって、それによって与えられる任意の遺伝子調節効果の
特異性も増加され得る）。例えば、Urnov et al.(2005) Nature 435:646-51を参照された
い。したがって、１つまたはそれ以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ポリペプチドは、宿
主細胞に導入された標的化エンドヌクレアーゼが宿主細胞のゲノム中で特有のＤＮＡ配列
と相互作用するように操作および利用され得る。
【０１００】
好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択された標的部位に結合するよう操作
されているという点で非天然である。例えば、全て全体が参照により本明細書に組み込ま
れる、Beerli et al.(2002) Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo et al.(2001) Ann.Re
v.Biochem.70:313-340；Isalan et al.(2001) Nature Biotechnol.19:656-660；Segal et
al.(2001) Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo et al.(2000) Curr.Opin.Struct.B
iol.10:411-416；米国特許第６，４５３，２４２号明細書；第６，５３４，２６１号明細
書；第６，５９９，６９２号明細書；第６，５０３，７１７号明細書；第６，６８９，５
５８号明細書；第７，０３０，２１５号明細書；第６，７９４，１３６号明細書；第７，
０６７，３１７号明細書；第７，２６２，０５４号明細書；第７，０７０，９３４号明細
書；第７，３６１，６３５号明細書；第７，２５３，２７３号明細書；および米国特許出
願公開第２００５／００６４４７４号明細書；第２００７／０２１８５２８号明細書；第
２００５／０２６７０６１号明細書を参照されたい。
【０１０１】
操作ジンクフィンガー結合ドメインは、天然ジンクフィンガータンパク質と比べて新規
な結合特異性を有することができる。操作法は、それだけに限らないが、合理的な設計お
よび種々の型の選択を含む。合理的な設計は、例えば、トリプレット（またはクアドラプ
レット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベー
スを用いることを含み、ここでは各トリプレットまたはクアドラプレットヌクレオチド配
列が、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの１
つまたはそれ以上のアミノ酸配列と関連する。例えば、全体が参照により本明細書に組み
込まれる、共有されている米国特許第６，４５３，２４２号明細書および第６，５３４，
２６１号明細書を参照されたい。
【０１０２】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む代表的な選択法は、米国
特許第５，７８９，５３８号明細書；第５，９２５，５２３号明細書；第６，００７，９
８８号明細書；第６，０１３，４５３号明細書；第６，４１０，２４８号明細書；第６，
１４０，４６６号明細書；第６，２００，７５９号明細書；および第６，２４２，５６８
号明細書ならびに国際公開第９８／３７１８６号パンフレット；国際公開第９８／５３０
５７号パンフレット；国際公開第００／２７８７８号パンフレット；国際公開第０１／８
８１９７号パンフレットおよび英国特許第２，３３８，２３７号明細書に開示されている
。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化が、例えば、共有さ
れている国際公開第０２／０７７２２７号パンフレットに記載されている。
【０１０３】
さらに、これらおよび他の文献に開示されているように、ジンクフィンガードメインお
よび／またはマルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質は、例えば、長さが５個以
上のアミノ酸のリンカーを含む、任意の適当なリンカー配列を用いて連結され得る。代表
的なリンカー配列の長さ６個以上のアミノ酸については、米国特許第６，４７９，６２６
号明細書；第６，９０３，１８５号明細書；および第７，１５３，９４９号明細書も参照
されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間
に適当なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。
【０１０４】
標的部位の選択；ＺＦＰならびに融合タンパク質（および同タンパク質をコードするポ
リヌクレオチド）の設計および構築法は当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０
８１５号明細書；第７８９，５３８号明細書；第６，４５３，２４２号明細書；第６，５
３４，２６１号明細書；第５，９２５，５２３号明細書；第６，００７，９８８号明細書
；第６，０１３，４５３号明細書；第６，２００，７５９号明細書；国際公開第９５／１
９４３１号パンフレット；国際公開第９６／０６１６６号パンフレット；国際公開第９８
／５３０５７号パンフレット；国際公開第９８／５４３１１号パンフレット；国際公開第
００／２７８７８号パンフレット；国際公開第０１／６０９７０号パンフレット；国際公
開第０１／８８１９７号パンフレット；国際公開第０２／０９９０８４号パンフレット；
国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；国際公開第９８／５３０５９号パンフレッ
ト；国際公開第９８／５３０６０号パンフレット；国際公開第０２／０１６５３６号パン
フレットおよび国際公開第０３／０１６４９６号パンフレットに詳細に記載されている。
【０１０５】
さらに、これらおよび他の文献に開示されているように、ジンクフィンガードメインお
よび／またはマルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質は、例えば、長さが５個以
上のアミノ酸のリンカーを含む、任意の適当なリンカー配列を用いて連結され得る。代表
的なリンカー配列の長さ６個以上のアミノ酸については、米国特許第６，４７９，６２６
号明細書；第６，９０３，１８５号明細書；および第７，１５３，９４９号明細書も参照
されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間
に適当なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。
【０１０６】
いくつかの例では、ＤＮＡ結合ポリペプチドがＧＡＬ４からのＤＮＡ結合ドメインであ
る。ＧＡＬ４は出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のモジュラートランス活性化因子
であるが、多くの他の生物のトランス活性化因子としても作用する。例えば、Sadowski e
t al.(1988) Nature 335:563-4を参照されたい。この調節システムでは、出芽酵母のガラ
クトース代謝経路の酵素をコードする遺伝子の発現が利用可能な炭素源によってストリン
ジェントに調節される。Johnston (1987) Microbiol.Rev.51:458-76。これらの代謝酵素
の転写制御は、正の調節タンパク質、ＧＡＬ４とＧＡＬ４が特異的に結合する１７ｂｐの
対称ＤＮＡ配列（ＵＡＳ）との間の相互作用によって媒介される。
【０１０７】
野生のＧＡＬ４は８８１個のアミノ酸残基からなり、９９ｋＤａの分子量を有する。Ｇ
ＡＬ４は、その組み合わせられた活性がインビボでＧＡＬ４の活性の原因となる機能的自
律ドメインを含む。Ma and Ptashne (1987) Cell 48:847-53); Brent and Ptashne (1985
) Cell 43(3 Pt 2):729-36。ＧＡＬ４のＮ末端の６５個のアミノ酸は、ＧＡＬ４  ＤＮＡ
結合ドメインを含む。Keegan et al.(1986) Science 231:699-704; Johnston (1987) Nat
ure 328:353-5。配列特異的結合は、ＤＮＡ結合ドメイン中に存在する６個のＣｙｓ残基
によって配位された二価カチオンの存在を要する。配位カチオン含有ドメインは、ＤＮＡ
ヘリックスの主溝との直接接触を介して１７ｂｐのＵＡＳの各端で保存されたＣＣＧトリ
プレットと相互作用し、これを認識する。Marmorstein et al.(1992) Nature 356:408-14
。タンパク質のＤＮＡ結合機能は、活性化ドメインが転写を指示することができるように
、Ｃ末端転写活性化ドメインをプロモーターの近くに配置する。
【０１０８】
特定の実施形態で利用され得るさらなるＤＮＡ結合ポリペプチドは、例えば、限定され
ないが、ＡＶＲＢＳ３誘発性遺伝子からの結合配列；ＡＶＲＢＳ３誘発性遺伝子からのコ
ンセンサス結合配列またはそこから操作された合成結合配列（例えば、ＵＰＡ  ＤＮＡ結
合ドメイン）；ＴＡＬ；ＬｅｘＡ（例えば、Brent & Ptashne (1985)、上記参照）；Ｌａ
ｃＲ（例えば、Labow et al.(1990) Mol.Cell.Biol.10:3343-56；Baim et al.(1991) Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 88(12):5072-6参照）；ステロイドホルモン受容体（Ellliston et 
al.(1990) J.Biol.Chem.265:11517-121）；Ｔｅｔリプレッサー（米国特許第６，２７１
，３４１号明細書）およびテトラサイクリン（Ｔｃ）の存在下ではｔｅｔオペレーター配
列に結合するが、不在下では結合しない突然変異Ｔｅｔリプレッサー；ＮＦ−κＢのＤＮ
Ａ結合ドメイン；ならびにＧＡＬ４、ホルモン受容体およびＶＰ１６の融合を利用する、
Wang et al.(1994) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(17):8180-4に記載されている調節システ
ムの成分を含む。
【０１０９】
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物に使用されるヌクレアー
ゼの１つまたはそれ以上のＤＮＡ結合ドメインが天然のまたは操作された（非天然の）Ｔ
ＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、全体が参照により本明細書に組み
込まれる、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい。キサン
トモナス（Xanthomonas）属の植物病原性細菌は、重要な作物植物において多くの病気を
引き起こすことが知られている。キサントモナスの病原性は、２５種超の異なるエフェク
タータンパク質を植物細胞に注入する保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。
これらの注入されるタンパク質の中には、植物転写活性化物質を模倣し、植物トランスク
リプトームを操作する転写活性化物質様（ＴＡＬ）エフェクターがある（Kay et al (200
7) Science 318:648-651参照）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写
活性化ドメインを含んでいる。最もよく特徴付けられているＴＡＬエフェクターの１つが
キサントモナス・カムペストリス病原型ベスカトリア（Xanthomonas campestgris pv. Ve
sicatoria）のＡｖｒＢｓ３である（Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136お
よび国際公開第２０１００７９４３０号パンフレット参照）。ＴＡＬエフェクターは、タ
ンデム反復の集中ドメインを含んでおり、各反復は、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特
異性の鍵となる約３４個のアミノ酸を含んでいる。さらに、ＴＡＬエフェクターは、核局
在化配列および酸性転写活性化ドメインを含んでいる（概要については、Schornack S, e
t al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272参照）。さらに、植物病原性細菌である
青枯病菌（Ralstonia solanacearum）では、青枯病菌次亜種１菌株ＧＭＩ１０００および
次亜種４菌株ＲＳ１０００においてキサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同性の
ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と命名された２つの遺伝子が発見された（Heuer et al (200
7) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384参照）。これらの遺伝子は互いにヌクレオ
チド配列が９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおける１，５７５ｂｐ
の欠失が異なる。しかしながら、両遺伝子産物は、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミ
リータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば、米国特許第８，４２０，７
８２号明細書および第８，４４０，４３１号明細書ならびに米国特許出願公開第２０１１
０３０１０７３号明細書を参照されたい。
【０１１０】
他の実施形態では、ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む。系のＲＮＡ成分を
コードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（clus
tered regularly interspaced short palindromic repeats））座、およびタンパク質を
コードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）座（Jansen et al., 2002.Mol.Microbiol.43: 15
65-1575；Makarova et al., 2002.Nucleic Acids Res.30: 482-496；Makarova et al., 2
006.Biol.Direct 1: 7；Haft et al., 2005.PLoS Comput.Biol.1: e60）がＣＲＩＳＰＲ
／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主のＣＲＩＳＰＲ座は、ＣＲ
ＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介核酸切断の特異性をプログラミ
ングすることができる非コードＲＮＡ要素の組み合わせを含む。
【０１１１】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最も良く特徴付けられた系の１つであり、４つの連続工程で標
的化ＤＮＡ二本鎖切断を行う。最初に、２つの非コードＲＮＡであるプレｃｒＲＮＡアレ
イおよびｔｒａｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡ
がプレｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズし、プレｃｒＲＮＡの、個々のスペーサー
配列を含む成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒ
ａｃｒＲＮＡ複合体が、標的認識のためのさらなる要件であるｃｒＲＮＡ上のスペーサー
と、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する標的ＤＮＡ上のプロトスペーサ
ーとの間のワトソン−クリック塩基対形成を介して、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに向ける。最
後に、Ｃａｓ９が標的ＤＮＡの切断を媒介してプロトスペーサー中に二本鎖切断を作り出
す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活動は３つの工程を含む：（ｉ）「適応」と呼ばれる工程
で、外来ＤＮＡ配列をＣＲＩＳＰＲアレイに挿入して将来の攻撃を防ぐ、（ｉｉ）関連す
るタンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、引き続いて（ｉｉｉ）
外来核酸によるＲＮＡ媒介干渉。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパ
ク質のいくつかがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の自然な機能と関係し、外来ＤＮＡの挿入等の
機能において役割を果たす。
【０１１２】
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質が天然Ｃａｓタンパク質の「機能的誘導体」で
あり得る。野生の配列のポリペプチドの「機能的誘導体」は、野生の配列のポリペプチド
と共通の質的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」は、それだけに限
らないが、対応する野生の配列のポリペプチドと共通の生物学的活性を有する限り、野生
の配列の断片、ならびに野生の配列のポリペプチドおよびその断片の誘導体を含む。本明
細書において考えられる生物学的活性は、機能的誘導体がＤＮＡ基質を断片に加水分解す
る能力である。「誘導体」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異形、その共有
結合修飾、および融合体のいずれも包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の適当
な誘導体は、それだけに限らないが、Ｃａｓタンパク質またはその断片の突然変異体、融
合体、共有結合修飾を含む。Ｃａｓタンパク質またはその断片を含むＣａｓタンパク質、
ならびにＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体は、細胞から得られても、化学的に合
成されても、これらの２つの手順の組み合わせによってもよい。細胞はＣａｓタンパク質
を天然に産生する細胞、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、より高い発現レベルで
内因性Ｃａｓタンパク質を産生するもしくは外因的に導入された核酸（この核酸は内因性
Ｃａｓと同じまたは異なるＣａｓをコードする）からＣａｓタンパク質を産生するように
遺伝的に操作された細胞であり得る。いくつかの場合、細胞はＣａｓタンパク質を天然に
は産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝的に操作される。
【０１１３】
特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ポリペプチドが、宿主生物のゲノム核酸に含まれる標
的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、これに結合する。いくつかの例では、任意の数の
個別の例の標的ヌクレオチド配列が宿主ゲノム中に見出され得る。標的ヌクレオチド配列
は、生物のゲノム中でまれであり得る（例えば、約１０、約９、約８、約７、約６、約５
、約４、約３、約２または約１未満のコピーの標的配列がゲノム中に存在し得る）。例え
ば、標的ヌクレオチド配列は、生物のゲノム中の特有の部位に位置し得る。標的ヌクレオ
チド配列は、例えば、限定されないが、互いに関してゲノムの全体にわたってランダムに
分布していてもよいし；ゲノム中の異なる連鎖群に位置していてもよいし；同じ連鎖群に
位置していてもよいし；異なる染色体上に位置していてもよいし；同じ染色体上に位置し
ていてもよいし；生物において類似の条件下で（例えば、同じ、または実質的に機能的に
同一の調節因子の制御下で）発現する部位においてゲノム中に位置していてもよいし；ゲ
ノム中に互いに接近して位置していてもよい（例えば、標的配列がゲノム座においてコン
カテマーとして組み込まれた核酸中に含まれていてもよい）。
【０１１４】
Ｂ．標的化エンドヌクレアーゼ
特定の実施形態では、キメラポリペプチドに標的配列との特異的結合を与えるために、
標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、これに結合するＤＮＡ結合ポリペプチドが、キ
メラポリペプチドに含まれ得る。例では、これらのポリペプチドは上に記載されているの
で、このようなキメラポリペプチドは、例えば、限定されないが、ヌクレアーゼ、リコン
ビナーゼおよび／またはリガーゼポリペプチドを含み得る。ＤＮＡ結合ポリペプチド、な
らびにヌクレアーゼ、リコンビナーゼおよび／またはリガーゼポリペプチドを含むキメラ
ポリペプチドは、他の機能的ポリペプチドモチーフおよび／またはドメイン、例えば、限
定されないが、キメラタンパク質中の機能的ポリペプチド間に位置するスペーサー配列；
リーダーペプチド；融合タンパク質を小器官（例えば、核）に標的化するペプチド；細胞
酵素によって切断されるポリペプチド；ペプチドタグ（例えば、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ等）；お
よびキメラポリペプチドの機能に干渉しない他のアミノ酸配列を含んでもよい。
【０１１５】
キメラポリペプチド中の機能的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドおよび
ヌクレアーゼポリペプチド）は作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、キメ
ラポリペプチドの機能的ポリペプチドが、キメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子を
作成するために、少なくともインフレームの互いに連結した機能的ポリペプチドをコード
する単一ポリヌクレオチドからの発現によって作動可能に連結され得る。代替実施形態で
は、キメラポリペプチドの機能的ポリペプチドが、他の手段、例えば、独立に発現するポ
リペプチドの架橋によって作動可能に連結され得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、これに結合するＤ
ＮＡ結合ポリペプチドが、天然の単離タンパク質（またはその突然変異体）に含まれ、天
然の単離タンパク質またはその突然変異体がヌクレアーゼポリペプチドも含む（また、リ
コンビナーゼおよび／またはリガーゼポリペプチドを含んでもよい）。このような単離タ
ンパク質の例は、ＴＡＬＥＮ、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、Ｈｉｎ、Ｔｒｅおよび
ＦＬＰリコンビナーゼ）、ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、およびメガヌクレア
ーゼを含む。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「標的化エンドヌクレアーゼ」という用語は、ＤＮＡ結合
ポリペプチドおよびヌクレアーゼポリペプチドを含む天然のまたは操作された単離タンパ
ク質およびその突然変異体、ならびにＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼを含む
キメラポリペプチドを指す。（例えば、標的配列は座において野生の配列に含まれるので
、または標的配列は、例えば、組換えによって座に導入されているので）ＦＡＤ２座に含
まれる標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、これに結合するＤＮＡ結合ポリペプチド
を含む任意の標的化エンドヌクレアーゼが特定の実施形態で利用され得る。
【０１１８】
本発明の特定の実施形態で有用となり得るキメラポリペプチドのいくつかの例は、限定
されないが、以下のポリペプチドの組み合わせを含む：ジンクフィンガーＤＮＡ結合ポリ
ペプチド；ＦｏｋＩヌクレアーゼポリペプチド；ＴＡＬＥドメイン；ロイシンジッパー；
転写因子ＤＮＡ結合モチーフ；ならびに例えば、限定されないが、ＴＡＬＥＮ、リコンビ
ナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、Ｈｉｎ、ＲｅｃＡ、ＴｒｅおよびＦＬＰリコンビナーゼ）、Ｒ
ＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、メガヌクレアーゼから単離されたＤＮＡ認識およ
び／または切断ドメイン；ならびに当業者に公知のその他。特定の例は、部位特異的ＤＮ
Ａ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼポリペプチドを含むキメラタンパク質を含む。キ
メラポリペプチドは、キメラポリペプチドを対象となる特定のヌクレオチド配列に標的化
するために、キメラポリペプチドに含まれるＤＮＡ結合ポリペプチドの認識配列を変える
よう当業者に公知の方法によって操作され得る。
【０１１９】
特定の実施形態では、キメラポリペプチドがＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィ
ンガー、ＴＡＬエフェクタードメイン等）およびヌクレアーゼ（切断）ドメインを含む。
切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインお
よびヌクレアーゼからの切断ドメイン、またはＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインおよび切
断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼから
の切断ドメインと異種性であり得る。異種性切断ドメインは任意のエンドヌクレアーゼま
たはエキソヌクレアーゼから得られ得る。切断ドメインが得られ得る代表的なエンドヌク
レアーゼは、それだけに限らないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌ
クレアーゼを含む。例えば、2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA;
and Belfort et al.(1997) Nucleic Acids Res.25:3379-3388を参照されたい。ＤＮＡを
切断するさらなる酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレア
ーゼ；膵ＤＮアーゼＩ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Linn et al
.(eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993も参照）。これらの酵
素（またはその機能的断片）の１つまたはそれ以上が切断ドメインおよび切断ハーフドメ
インの供給源として使用され得る。
【０１２０】
同様に、切断ハーフドメインは、切断活性のために二量体化を要する、上に示される任
意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。一般に、融合タンパク質が切断ハーフド
メインを含む場合、切断に２つの融合タンパク質が要求される。あるいは、２つの切断ハ
ーフドメインを含む単一のタンパク質が使用され得る。２つの切断ハーフドメインが同じ
エンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来してもよいし、または各切断ハーフ
ドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来してもよい。さら
に、２つの融合タンパク質のための標的部位は、好ましくは、互いに対して、２つの融合
タンパク質とそれぞれの標的部位の結合が、切断ハーフドメインを、切断ハーフドメイン
が例えば、二量体化によって機能的切断ドメインを形成することを可能にする、互いに対
する空間的配向に配置するように配置される。したがって、特定の実施形態では、標的部
位の接近端が５〜８個のヌクレオチドまたは１５〜１８個のヌクレオチドによって分離さ
れている。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が２つの標的
部位の間に介在することができる（例えば、２〜５０個のヌクレオチド対またはそれ以上
）。一般に、切断の部位は標的部位の間にある。
【０１２１】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、例えば、１つまたはそれ以
上の外因性配列（ドナー／導入遺伝子）が結合（標的）部位でまたはその近くに組み込ま
れるように、（認識部位で）ＤＮＡに配列特異的に結合し、結合の部位でまたはその近く
でＤＮＡを切断することができる。特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位か
ら離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。
例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上の認識部位からの９個のヌクレオチドおよ
び他方の鎖上の認識部位からの１３個のヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する
。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号明細書；第５，４３６，１５０号明細書およ
び第５，４８７，９９４号明細書；ならびにLi et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
9:4275-4279；Li et al.(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim et al.(199
4a) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim et al.(1994b) J.Biol.Chem.269:31,978-
31,982を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質が、少なくとも１
つのＩＩＳ型制限酵素からの切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）と、１つまたは
それ以上の操作されていてもされていなくてもよいジンクフィンガー結合ドメインとを含
む。
【０１２２】
その切断ドメインが結合ドメインから分離可能な代表的なＩＩＳ型制限酵素はＦｏｋＩ
である。この特定の酵素は二量体として活性である。Bitinaite et al.(1998) Proc.Natl
.Acad.Sci.USA 95: 10,570-10,575。したがって、本開示の目的のために、開示の融合タ
ンパク質に使用されるＦｏｋＩ酵素の一部が切断ハーフドメインとみなされる。したがっ
て、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合体を用いた細胞配列の標的化二本鎖切断および／ま
たは標的化置換のために、触媒活性切断ドメインを再構成するためにそれぞれがＦｏｋＩ
切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質が使用され得る。あるいは、ＤＮＡ結合
ドメインと２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインとを含む単一のポリペプチド分子も使用さ
れ得る。
【０１２３】
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持する、または多量体化（例
えば、二量体化）して機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の
部分であり得る。
【０１２４】
代表的なＩＩＳ型制限酵素は、全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２
００７０１３４７９６号明細書に記載されている。さらなる制限酵素も分離可能な結合ド
メインと切断ドメインとを含み、これらも本開示によって考慮される。例えば、Roberts 
et al.(2003) Nucleic Acids Res.31:418-420を参照されたい。
【０１２５】
特定の実施形態では、切断ドメインが、例えば、その全ての開示の全体が参照により本
明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書；第２００
６０１８８９８７号明細書および第２００８０１３１９６２号明細書に記載されているよ
うに、１つまたはそれ以上のホモ二量体化を最小化するまたは防ぐ操作切断ハーフドメイ
ン（二量体化ドメイン突然変異体とも呼ばれる）を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４
７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５
００、５３１、５３４、５３７および５３８位のアミノ酸残基は全てＦｏｋＩ切断ハーフ
ドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。
【０１２６】
絶対ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの代表的な操作切断ハーフドメインは、第１の切
断ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０および５３８位のアミノ酸残基に突然変異を含み、
かつ第２の切断ハーフドメインがアミノ酸残基４８６および４９９に突然変異を含む対を
含む。
【０１２７】
したがって、一実施形態では、４９０の突然変異が、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）に置
換し；５３８の突然変異がＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し；４８６の突然変異がＧ
ｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）に置換し；４９９の突然変異がＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に
置換する。具体的には、本明細書に記載される操作切断ハーフドメインは、一方の切断ハ
ーフドメイン中の４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を突然変異させて「Ｅ４
９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と示される操作切断ハーフドメインを製造し、かつ別の切断ハーフ
ドメイン中の４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を突然変異させて「Ｑ４８６
Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と示される操作切断ハーフドメインを製造することによって調製された
。本明細書に記載される操作切断ハーフドメインは、異常な切断が最小化されたまたは消
滅した絶対ヘテロ二量体突然変異体である。例えば、全ての目的のためにその開示の全体
が参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号明細書を参
照されたい。
【０１２８】
特定の実施形態では、操作切断ハーフドメインが、４８６、４９９および４９６位（野
生型ＦｏｋＩに対して番号付け）の突然変異、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残
基をＧｌｕ（Ｅ）残基に置換する突然変異、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ
（Ｌ）残基に置換する突然変異および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）
またはＧｌｕ（Ｅ）残基に置換する突然変異（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ド
メインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、操作切断ハーフドメインが、４９０、
５３８および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付け）の突然変異、例えば、４９０
位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に置換する突然変異、５３８位の野生型
Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に置換する突然変異および５３７位の野生型Ｈｉｓ
（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基に置換する突然変異（それぞれ、
「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、操作切
断ハーフドメインが、４９０および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付け）の突然
変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に置換する突然変
異、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残
基に置換する突然変異（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）
を含む。（米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号明細書を参照されたい）。本明
細書に記載される操作切断ハーフドメインは、任意の適当な方法を用いて、例えば、米国
特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書；第２００８０１３１９６２号明細書；
および第２０１１０２０１０５５号明細書に記載されているような野生型切断ハーフドメ
イン（ＦｏｋＩ）の部位特異的突然変異誘発によって調製され得る。
【０１２９】
あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術を用いて核酸標的部位に
おいてインビボで組み立てられ得る（例えば、米国特許出願公開第２００９００６８１６
４号明細書参照）。このようなスプリット酵素の成分は別々の発現構築物で発現してもよ
いし、または個々の成分が例えば、自己切断２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって
分離されている１つのオープンリーディングフレームで連結されていてもよい。成分は個
々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメイン
であり得る。
【０１３０】
Ｃ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ
具体的な実施形態では、キメラポリペプチドが、外因性核酸またはドナーＤＮＡが組み
込まれ得る標的化部位特異的二本鎖ＤＮＡ切断に送達されるよう設計され得るカスタム設
計のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である（参照により本明細書に組み込まれ
る、共有されている米国特許出願公開第２０１００２５７６３８号明細書参照）。ＺＦＮ
は、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）からの非特異的切断ドメインと、ジン
クフィンガーＤＮＡ結合ドメインポリペプチドとを含むキメラポリペプチドである。例え
ば、Huang et al.(1996) J.Protein Chem.15:481-9；Kim et al.(1997a) Proc.Natl.Acad
.Sci.USA 94:3616-20；Kim et al.(1996) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1156-60；Kim et 
al.(1994) Proc Natl.Acad.Sci.USA 91:883-7；Kim et al.(1997b) Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 94:12875-9；Kim et al.(1997c) Gene 203:43-9；Kim et al.(1998) Biol.Chem.379:
489-95；Nahon and Raveh (1998) Nucleic Acids Res.26:1233-9；Smith et al.(1999) N
ucleic Acids Res.27:674-81を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＺＦＮが非標準
ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む（参照により本明細書に組み込まれる、共有
されている米国特許出願公開第２００８０１８２３３２号明細書参照）。ＦｏｋＩ制限エ
ンドヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断し、二本鎖切断を導入するために、ヌクレアーゼドメ
インを介して二量体化しなければならない。結果として、このようなエンドヌクレアーゼ
からのヌクレアーゼドメインを含むＺＦＮも、標的ＤＮＡを切断するためにヌクレアーゼ
ドメインの二量体化を要する。Mani et al.(2005) Biochem.Biophys.Res.Commun.334:119
1-7; Smith et al.(2000) Nucleic Acids Res.28:3361-9。ＺＦＮの二量体化は、２つの
隣接する正反対に配向したＤＮＡ結合部位によって促進され得る。前記。
【０１３１】
ＺＦＮ系の柔軟性および特異性は、公知のリコンビナーゼ媒介遺伝子編集戦略によって
以前は達成することができなかった一定レベルの制御をもたらす。一例として、ＺＦＮは
、例えば、特異的核酸配列を認識するように容易に操作され得る。Wu et al.(2007) Cell
.Mol.Life Sci.64:2933-44（全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公
開第２００９０２０５０８３号明細書、第２０１１０１８９７７５号明細書、第２０１１
０１６７５２１号明細書および第２０１００１９９３８９号明細書参照）。ジンクフィン
ガー認識残基に関するコドンのランダム化は、恣意的に選択されたＤＮＡ配列に対して高
い親和性を有する新しいフィンガーの選択を可能にする。さらに、ジンクフィンガーは天
然のＤＮＡ結合分子であり、操作されたジンクフィンガーは生細胞でその設計された標的
に作用することが示されている。したがって、ジンクフィンガーに基づくヌクレアーゼは
、特異的であるが、恣意的な認識部位を標的化可能である。
【０１３２】
特定の例では、外因性核酸を宿主の少なくとも１つのＦＡＤ２性能座に部位特異的に組
み込む方法が、ＺＦＮを宿主の細胞に導入する工程を含み、ＺＦＮが標的ヌクレオチド配
列を認識し、これに結合し、標的ヌクレオチド配列が宿主の少なくとも１つのＦＡＤ２座
に含まれる。特定の例では、標的ヌクレオチド配列が、少なくとも１つのＦＡＤ２座以外
の位置において宿主のゲノムに含まれない。例えば、ＺＦＮのＤＮＡ結合ポリペプチドは
、（例えば、ＦＡＤ２座をシーケンシングすることによって）少なくとも１つのＦＡＤ２
座中の同定された標的ヌクレオチド配列を認識し、これに結合するよう操作され得る。Ｚ
ＦＮを宿主の細胞に導入する工程を含む、外因性核酸を宿主の少なくとも１つのＦＡＤ２
性能座に部位特異的に組み込む方法は、外因性核酸を細胞に導入する工程を含んでもよく
、外因性核酸の少なくとも１つのＦＡＤ２座を含む宿主の核酸への組換えは、ＺＦＮの部
位特異的認識および標的配列との結合（およびその後のＦＡＤ２座を含む核酸の切断）に
よって促進される。
【０１３３】
Ｖ．ＦＡＤ２座における組込みのための外因性核酸
本発明の実施形態は、少なくとも１つのＦＡＤ２座への部位特異的組込みのための外因
性核酸、例えば、限定されないが、ＰＴＵ、ＥＬＰ、ＥＴＩＰまたはＯＲＦ；標的化エン
ドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；および前記のいずれかまたは
両方の少なくとも１つを含むベクターからなる群から選択される１つまたはそれ以上の核
酸を含んでもよい。したがって、いくつかの実施形態で使用するための特定の核酸は、ポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列、構造ヌクレオチド配列ならびに／或いはＤＮ
Ａ結合ポリペプチド認識および結合部位を含む。
【０１３４】
Ａ．部位特異的組込みのための外因性核酸分子
上記のように、例えば、ポリペプチドの発現、突然変異遺伝子の修正または野生型遺伝
子の発現増加のために、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝
子」とも呼ばれる）が挿入される。ドナー配列が典型的には配置されるゲノム配列と同一
ではないことが容易に明らかであるだろう。ドナー配列は、対象となる位置での効率的な
ＨＤＲを可能にするための相同性の２つの領域が隣接した非相同性配列を含むことができ
る。さらに、ドナー配列は、細胞クロマチン中の対象となる領域と相同性でない配列を含
むベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンと相同性のいくつか
の不連続領域を含むことができる。例えば、対象となる領域中に通常は存在しない配列の
標的化挿入のために、前記配列がドナー核酸分子中に存在し、対象となる領域中の配列と
相同性の領域が隣接していてもよい。
【０１３５】
ドナーポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり得、線状ま
たは環状型で細胞に導入され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１０００４７８０５
号明細書、第２０１１０２８１３６１号明細書、第２０１１０２０７２２１号明細書およ
び米国特許出願第１３／８８９，１６２号明細書を参照されたい。線状型で導入される場
合、ドナー配列の末端は当業者に公知の方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解
から）保護され得る。例えば、１つまたはそれ以上のジデオキシヌクレオチド残基が線状
分子の３’末端に付加される、および／または自己相補性オリゴヌクレオチドが一方また
は両方の末端に連結される。例えば、Chang et al.(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4
959-4963；Nehls et al.(1996) Science 272:886-889を参照されたい。外因性ポリヌクレ
オチドを分解から保護するさらなる方法は、限定されないが、末端アミノ基の付加および
修飾ヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミデートおよびＯ−
メチルリボースまたはデオキシリボース残基の使用を含む。
【０１３６】
ポリヌクレオチドは、さらなる配列、例えば、複製起点、プロモーターおよび抗生物質
耐性をコードする遺伝子を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さらに
、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として、薬剤、例えば、リポソームもしくはポロ
キサマーと複合体化した核酸として導入され得る、またはウイルス（例えば、アデノウイ
ルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびインテグラー
ゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達され得る。
【０１３７】
ドナーは一般的に、その発現が組込み部位の内因性プロモーター、すなわち、ドナーが
組み込まれる内因性遺伝子（例えば、ＦＡＤ２）の発現を駆動するプロモーターによって
駆動されるように組み込まれる。しかしながら、ドナーがプロモーターおよび／またはエ
ンハンサー、例えば、構成型プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的プロモーター
を含んでもよいことが明らかであるだろう。
【０１３８】
さらに、発現に要求されないが、外因性配列は、転写または翻訳調節配列、例えば、プ
ロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチド
をコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルを含んでもよい。
【０１３９】
実施形態において、ＦＡＤ２座を修飾するために、少なくとも１つのＦＡＤ２座に部位
特異的様式で組み込まれ得る外因性核酸は、例えば、限定されないが、対象となるポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；農学的遺伝子を含む核酸；ＲＮＡｉ分
子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸；またはＦＡＤ２遺伝子を破壊する核酸を含
む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、ＦＡＤ２座を修飾するために、外因性核酸がＦＡＤ２座にお
いて組み込まれ、農学的遺伝子またはヌクレオチド配列がＦＡＤ２座から宿主中で発現す
るように、核酸が農学的遺伝子または対象となるポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列を含む。いくつかの例では、対象となるポリペプチド（例えば、外来タンパク質）が
、商業的な量で対象となるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から発現する。こ
のような例では、対象となるポリペプチドが、宿主細胞、組織またはバイオマスから抽出
され得る。いくつかの実施形態では、宿主が植物であり、対象となるポリペプチドの商業
的製造のために用意される植物材料が植物、植物部位、植物組織または植物細胞であり得
る。いくつかの例では、植物部位が植物種子であり得る。植物バイオマスからのタンパク
質抽出は、例えば、Heney and Orr (1981) Anal.Biochem.114:92-6で論じられている公知
の方法によって達成され得る。
【０１４１】
同様に、農学的遺伝子は、形質転換植物細胞、植物および／またはその子孫で発現され
得る。例えば、植物は、少なくとも１つのＦＡＤ２座から農学的対象となる種々の表現型
を発現するように特定の実施形態の方法を介して遺伝的に操作され得る。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドをコードする農学的遺伝子またはヌ
クレオチド配列を含む核酸が、例えば、限定されないが、有害生物または病気に対する耐
性を与える遺伝子（例えば、Jones et al.(1994) Science 266:789（クラドスポリウム・
フルバム（Cladosporium fulvum）に対する耐性のためのトマトＣｆ−９遺伝子のクロー
ニング）；Martin et al.(1993) Science 262:1432; Mindrinos et al.(1994) Cell 78:1
089（シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）に対する耐性のためのＲＳＰ
２遺伝子）；ＰＣＴ国際特許出願公開第９６／３０５１７号パンフレット（ダイズシスト
センチュウに対する耐性）；ＰＣＴ国際特許出願公開第９３／１９１８１号パンフレット
）；バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）タンパク質、その誘導体
、またはその上にモデル化される合成ポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、Geiser
et al.(1986) Gene 48:109（Ｂｔδ−エンドトキシン遺伝子のクローニングおよびヌク
レオチド配列；さらに、δ−エンドトキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、例えば、
ＡＴＣＣ寄託番号４００９８；６７１３６；３１９９５；および３１９９８で、アメリカ
培養細胞系統保存機関（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入され得る））；レクチンをコ
ードする遺伝子（例えば、Van Damme et al.(1994) Plant Molec.Biol.24:25（いくつか
のクンシラン（Clivia miniata）マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列）参
照）；ビタミン結合タンパク質、例えば、アビジンをコードする遺伝子（ＰＣＴ国際特許
出願公開第ＵＳ９３／０６４８７号パンフレット（害虫に対する殺幼虫剤としてのアビジ
ンおよびアビジンホモログの使用）参照）；酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼ、プロテ
イナーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤をコードする遺伝子（例えば、Abe et al.(1987)
J.Biol.Chem.262:16793（イネシステインプロテイナーゼ阻害剤のヌクレオチド配列）；
Huub et al.(1993) Plant Molec.Biol.21:985（タバコプロテイナーゼ阻害剤Ｉをコード
するｃＤＮＡのヌクレオチド配列）；Sumitani et al.(1993) Biosci.Biotech.Biochem.5
7:1243（ストレプトマイセス・ニトロスポレウス（Streptomyces nitrosporeus）αアミ
ラーゼ阻害剤のヌクレオチド配列）および米国特許第５，４９４，８１３号明細書参照）
；昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン、例えば、エクジステロイドもしくは幼若ホルモ
ン、その変異形、それに基づく模倣体、またはそのアンタゴニストもしくはアゴニストを
コードする遺伝子（例えば、Hammock et al.(1990) Nature 344:458（クローニング幼若
ホルモンエステラーゼのバキュロウイルス発現、幼若ホルモンの不活性化因子）参照）；
発現すると、冒された有害生物の生理学を破壊する昆虫特異的ペプチドまたは神経ペプチ
ドをコードする遺伝子（例えば、Regan (1994) J.Biol.Chem.269:9（発現クローニングが
昆虫利尿ホルモン受容体をコードするＤＮＡをもたらす）；Pratt et al.(1989) Biochem
.Biophys.Res.Comm.163:1243（ディプロプテラ・パンタタ（Diploptera puntata）のアロ
スタチン）；および米国特許第５，２６６，３１７号明細書（昆虫特異的麻痺性神経毒を
コードする遺伝子）参照）；ヘビ、スズメバチまたは他の生物によって天然に産生される
昆虫特異的毒液をコードする遺伝子（例えば、Pang et al.(1992) Gene 116:165（サソリ
昆虫毒性ペプチドをコードする遺伝子の植物における異種発現）参照）；モノテルペン、
セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫
活性を有する他の分子の高度蓄積を担う酵素をコードする遺伝子；生物学的活性分子の転
写後修飾を含む修飾に関与する酵素、例えば、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂質分解
酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼ、エステラーゼ、ヒドロラーゼ、
ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼ
またはグルカナーゼ（天然または合成のいずれも）をコードする遺伝子（例えば、ＰＣＴ
国際特許出願公開第９３／０２１９７号パンフレット（カラーゼ遺伝子のヌクレオチド配
列）；さらに、キチナーゼコード配列を含むＤＮＡ分子は、例えば、寄託番号３９６３７
および６７１５２で、ＡＴＣＣから得られ得る；Kramer et al.(1993) Insect Biochem.M
olec.Biol.23:691（タバコスズメガキチナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
）；およびKawalleck et al.(1993) Plant Molec.Biol.21:673（パセリｕｂｉ４−２ポリ
ユビキチン遺伝子のヌクレオチド配列）参照）；シグナル伝達を刺激する分子をコードす
る遺伝子（例えば、Botella et al.(1994) Plant Molec.Biol.24:757（リョクトウカルモ
ジュリンｃＤＮＡクローンについてのヌクレオチド配列）；およびGriess et al.(1994) 
Plant Physiol.104:1467（トウモロコシカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド
配列）参照）；疎水性モーメントペプチドをコードする遺伝子（例えば、ＰＣＴ国際特許
出願公開第９５／１６７７６号パンフレット（真菌植物病原体を阻害するタキプレシンの
ペプチド誘導体）；およびＰＣＴ国際特許出願公開第９５／１８８５５号パンフレット（
耐病性を与える合成抗微生物ペプチド）参照）；膜パーミアーゼ、チャネルフォーマーま
たはチャネルブロッカーをコードする遺伝子（例えば、Jaynes et al.(1993) Plant Sci 
89:43（トランスジェニックタバコ植物をシュードモナス・ソラナセアラム（Pseudomonas
solanacearum）に対して耐性にするためのセクロピン−β溶解ペプチド類似体の異種発
現）参照）；ウイルス侵入タンパク質またはこれに由来する複合毒素をコードする遺伝子
（例えば、Beachy et al.(1990) Ann.rev.Phytopathol.28:451参照）；昆虫特異抗体また
はこれに由来する免疫毒素をコードする遺伝子（例えば、Taylor et al., Abstract #497
, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions (Edinburgh, Sc
otland) (1994)（単鎖抗体断片の産生を介したトランスジェニックタバコにおける酵素不
活性化）参照）；ウイルス特異抗体をコードする遺伝子（例えば、Tavladoraki et al.(1
993) Nature 366:469（組換え抗体遺伝子を発現しているトランスジェニック植物はウイ
ルス攻撃から保護される）参照）；病原体または寄生生物によって天然に産生される発育
遅滞タンパク質をコードする遺伝子（例えば、Lamb et al.(1992) Bio/Technology 10:14
36（真菌エンドα−１，４−Ｄ−ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−１，４
−Ｄ−ガラクツロナーゼを可溶化することによって真菌定着および植物栄養放出を促進す
る）；Toubart et al.(1992) Plant J.2:367（マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害タン
パク質をコードする遺伝子のクローニングおよび特徴付け）参照）；植物によって天然に
産生される発育遅滞タンパク質をコードする遺伝子（例えば、Logemann et al.(1992) Bi
o/Technology 10:305（オオムギリボソーム不活性化遺伝子を発現しているトランスジェ
ニック植物は真菌病に対する増加した耐性を有する）参照）を含んでもよい。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドをコードする農学的遺伝子またはヌ
クレオチドを含む核酸が同様におよび／または代わりに、例えば、限定されないが、除草
剤、例えば、成長点または分裂組織を阻害する除草剤、例えば、イミダゾリノンまたはス
ルホニル尿素に対する耐性を与える遺伝子（このカテゴリーの代表的な遺伝子は、例えば
、それぞれLee et al.(1988) EMBO J.7:1241およびMiki et al.(1990) Theor.Appl.Genet
.80:449に記載されているように突然変異ＡＬＳおよびＡＨＡＳ酵素をコードする；例え
ば、（組換え核酸の導入および／または野生型ＥＰＳＰ遺伝子（それだけに限らないが、
ＣＰ４、ＤＭＭＧおよびＤＧＴ−２８を含む）の種々の形態のインビボ突然変異誘発を介
して）突然変異５−エノイルピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰ）遺伝
子；ａｒｏＡ遺伝子およびグリホサートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子に
よってそれぞれ与えられるグリホサート耐性）；他のホスホノ化合物、例えば、ストレプ
トマイセス・ハイグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）およびストレプトマイ
セス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridichromogenes）を含むストレプトマイセ
ス属の種からのグルホシネートホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ
）遺伝子；ならびにピリジノキシまたはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソン（
ＡＣＣａｓｅ阻害剤コード遺伝子）を含んでもよい。例えば、米国特許第４，９４０，８
３５号明細書および第６，２４８，８７６号明細書（植物にグリホサート耐性を与えるこ
とができるＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列）を参照されたい。突然変異ａｒｏＡ遺伝
子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ寄託番号３９２５６で得られ得る。米国特許第４
，７６９，０６１号明細書（突然変異ａｒｏＡ遺伝子のヌクレオチド配列）も参照された
い。欧州特許出願第０３３３０３３号明細書および米国特許第４，９７５，３７４号明細
書は、除草剤、例えば、Ｌ−ホスフィノトリシンに対する耐性を与えることができる、グ
ルタミンシンテターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示している。代表的なＰＡＴ遺伝子
のヌクレオチド配列は、欧州特許出願第０２４２２４６号明細書およびDeGreef et al.(1
989) Bio/Technology 7:61（ＰＡＴ活性をコードするキメラｂａｒ遺伝子を発現するトラ
ンスジェニック植物の製造）に提供されている。フェノキシプロピオン酸およびシクロヘ
キソン、例えば、セトキシジムおよびハロキシホップに対する耐性を与える遺伝子の例は
、Marshall et al.(1992) Theor.Appl.Genet.83:435に記載されているＡｃｃ１−Ｓ１、
Ａｃｃ１−Ｓ２およびＡｃｃ１−Ｓ３遺伝子を含む。グリホサート耐性を与えることがで
きるＧＡＴ遺伝子は、例えば、国際公開第２００５０１２５１５号パンフレットに記載さ
れている。２，４−Ｄ−フェノキシプロピオン酸およびピリジルオキシオーキシン除草剤
に対する耐性を与える遺伝子は、例えば、国際公開第２００５１０７４３７号パンフレッ
トおよび国際公開第２００７０５３４８２号パンフレットに記載されている。
【０１４４】
対象となるポリペプチドをコードする農学的遺伝子またはヌクレオチド配列を含む核酸
は、例えば、限定されないが、光合成を阻害する除草剤、例えば、トリアジン（ｐｓｂＡ
およびｇｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）に対する耐性を与え
る遺伝子を含んでもよい。例えば、Przibila et al.(1991) Plant Cell 3:169（突然変異
ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドによるクラミドモナス属の形質転換）を参照され
たい。ニトリラーゼ遺伝子に関するヌクレオチド配列は米国特許第４，８１０，６４８号
明細書に開示されており、これらの遺伝子を含むＤＮＡ分子はＡＴＣＣ寄託番号５３４３
５；６７４４１；および６７４４２で入手可能である。Hayes et al.(1992) Biochem.J.2
85:173（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニングおよび
発現）も参照されたい。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドをコードする農学的遺伝子またはヌ
クレオチド配列を含む核酸が同様におよび／または代わりに、付加価値形質、例えば、限
定されないが、例えば、植物のステアリン酸含量を増加させるためにステアリルＡＣＰデ
サチュラーゼのアンチセンス遺伝子を用いて植物を形質転換することによって修飾された
脂肪酸代謝（例えば、Knultzon et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:2624参照）
；例えば、フィターゼコード遺伝子の導入がフィターゼの破壊を強化し、より多くの遊離
ホスフェートを形質転換植物に付与する（例えば、Van Hartingsveldt et al.(1993) Gen
e 127:87（クロコウジカビ（Aspergillus niger）フィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列
；トウモロコシ中のフィターゼ含量を低下させるための遺伝子が導入されてもよく、例え
ば、これは低レベルのフィチン酸によって特徴付けられるトウモロコシ突然変異体の原因
となり得る単一対立遺伝子に関連するＤＮＡをクローニングし、次いで再導入することに
よって達成され得る（Raboy et al.(1990) Maydica 35:383参照）参照）；および例えば
、デンプンの分岐パターンを変える酵素をコードする遺伝子を用いて植物を形質転換する
ことによってもたらされる修飾された炭水化物組成（例えば、Shiroza et al.(1988) J.B
acteol.170:810（ストレプトコッカス属突然変異体フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝
子のヌクレオチド配列）；Steinmetz et al.(1985) Mol.Gen.Genet.20:220（レバンスク
ラーゼ）；Pen et al.(1992) Bio/Technology 10:292（α−アミラーゼ）；Elliot et al
.(1993) Plant Molec.Biol.21:515（トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）
；Sogaard et al.(1993) J.Biol.Chem.268:22480（オオムギα−アミラーゼ遺伝子）；お
よびFisher et al.(1993) Plant Physiol.102:1045（トウモロコシ胚乳デンプン分岐酵素
ＩＩ）参照）を与えるまたはこれに寄与する遺伝子を含んでもよい。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、ＦＡＤ２座を修飾するために、外因性核酸がＦＡＤ２座にお
いて組み込まれ、例えば、その後のＰＴＵまたはＥＬＰの部位における第２の外因性核酸
の部位特異的組込みが促進されるように、核酸がＰＴＵまたはＥＬＰを含む。米国特許出
願第１３／８８９，１６２号明細書も参照されたい。
【０１４７】
標的化組込みを介した対象となる核酸分子の植物ゲノムへの標的化エンドヌクレアーゼ
媒介組込みは、標的化エンドヌクレアーゼまたは標的化エンドヌクレアーゼコード核酸分
子の送達、引き続いて宿主中での機能的標的化エンドヌクレアーゼタンパク質の発現を要
する。機能的標的化エンドヌクレアーゼタンパク質が少なくとも１つのＦＡＤ２座の標的
部位において二本鎖切断を誘導し、次いでこれが例えば、外因性核酸の座への相同性駆動
組込みを介して修復されるように、標的化エンドヌクレアーゼが宿主細胞に送達されるま
たはそこで発現するのと同時に外因性核酸も好ましくは宿主細胞中に存在する。当業者で
あれば、機能的標的化エンドヌクレアーゼタンパク質の発現が、それだけに限らないが、
標的化エンドヌクレアーゼコード構築物の遺伝子組換え、および標的化エンドヌクレアー
ゼコード構築物の一過性発現を含むいくつかの方法によって達成され得ることを認識し得
る。これらの両ケースで、ＦＡＤ２座における標的化組込みを駆動するために、機能的標
的化エンドヌクレアーゼタンパク質の発現および外因性核酸の宿主細胞への送達が同時に
達成され得る。
【０１４８】
標的化エンドヌクレアーゼとしてＺＦＮを利用する実施形態で得られる特定の利点は、
キメラジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメインの二量体化の必要条件が高レベルの
配列、したがって切断特異性を与えることである。３つのフィンガーの各セットが９個の
連続塩基対に結合するので、各ジンクフィンガードメインが完全な特異性を有する場合、
２つのキメラヌクレアーゼが１８ｂｐの標的を有効に要求する。この長さの任意の所与の
配列は、単一ゲノム中で特有であると予想される（約１０９ｂｐと仮定）。上記Bibikova
et al.(2001) Mol.Cell.Biol.21(1):289-97; Wu et al.(2007)。さらに、さらなるフィ
ンガーが強化された特異性を提供することができる（Beerli et al.(1998) Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 95:14628-33；Kim and Pabo (1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:2812-7；Li
u et al.(1997) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:5525-30）ので、さらなる特異性を提供する
ために各ＤＮＡ結合ドメイン中のジンクフィンガーの数が増加され得る。例えば、２４ｂ
ｐ配列を認識する４−、５−、６−またはそれ以上のフィンガーＺＦＮ対を用いることに
よって、特異性がさらに増加され得る。Urnov et al.(2005) Nature 435:646-51。したが
って、宿主植物ゲノムに導入された認識配列がゲノム中で特有となるように、ＺＦＮが使
用され得る。
【０１４９】
Ｂ．標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子
いくつかの実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が
、標的化エンドヌクレアーゼ中に含まれるポリペプチドをコードする野生のヌクレオチド
配列の操作（例えば、ライゲーション）によって操作され得る。例えば、ＤＮＡ結合ポリ
ペプチドに対応する遺伝子のヌクレオチド配列を同定するために、ＤＮＡ結合ポリペプチ
ドを含むタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列が調査され得、このヌクレオ
チド配列がＤＮＡ結合ポリペプチドを含む標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレ
オチド配列の要素として使用され得る。あるいは、例えば、遺伝暗号の縮重にしたがって
、標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を推定するために、標的化エ
ンドヌクレアーゼのアミノ酸配列が使用され得る。
【０１５０】
標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む代表的な核酸分子では
、ヌクレアーゼポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列の最後のコドン、
およびＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列の最初のコドン
が、例えば、イントロンまたは「ＳＴＯＰ」をコードすることなく、任意の数のヌクレオ
チドトリプレットによって分離され得る。同様に、ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする
第１のポリヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列の最後のコドン、およびヌク
レアーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列の最初のコドンが、任意
の数のヌクレオチドトリプレットによって分離され得る。これらのおよびさらなる実施形
態では、ヌクレアーゼポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列およびＤＮ
Ａ結合ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列の最後の（すなわち、核酸
配列のほぼ３’）の最後のコドンが、そこに直接隣接する、または短ペプチド配列、例え
ば、合成ヌクレオチドリンカー（例えば、融合を達成するために使用されたかもしれない
ヌクレオチドリンカー）によってコードされるもの以下によってそこから分離されたさら
なるポリヌクレオチドコード配列の最初のコドンと相レジスターで融合され得る。このよ
うなさらなるポリヌクレオチド配列の例は、例えば、限定されないが、タグ、標的化ペプ
チド、および酵素切断部位を含む。同様に、第１および第２のポリヌクレオチド配列のほ
ぼ５’（核酸配列中）の最初のコドンが、そこに直接隣接する、または短ペプチド配列以
下によってそこから分離されたさらなるポリヌクレオチドコード配列の最後のコドンと相
レジスターで融合され得る。
【０１５１】
標的化エンドヌクレアーゼ中の機能的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチド
およびヌクレアーゼポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド配列を分離する配列は
、例えば、コードされるアミノ酸配列が標的化エンドヌクレアーゼの翻訳を有意に変えに
くいような任意の配列からなることができる。公知のヌクレアーゼポリペプチドおよび公
知のＤＮＡ結合ポリペプチドの自律的性質のために、例では介在配列はこれらの構造のそ
れぞれの機能に干渉しないだろう。
【０１５２】
Ｃ．ベクターおよび発現構築物
いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドおよび／または標的化エンドヌクレ
アーゼをコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチド配列を含む少なくとも１つ
の核酸分子が、発現のために細胞、組織または生物に導入され得る。例えば、少なくとも
１つのＦＡＤ２座中に含まれるヌクレオチド配列を特異的に認識する標的化エンドヌクレ
アーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子が、標的化エンドヌクレアーゼ
の発現のために細胞に導入され得、また対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド配列が、例えば、発現した標的エンドヌクレアーゼによる座における二本鎖切断の
導入後の相同組換えによって少なくとも１つのＦＡＤ２座に組み込まれ、対象となるポリ
ペプチドが組み込まれたポリヌクレオチド配列から発現するように、対象となるポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子が細胞に導入され得る。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、核酸分子、例えば、前記の１つが、例えば、限定されないが
、直線状プラスミドまたは閉環状プラスミドを含むベクター系であってもよい。特定の例
では、ベクターが発現ベクターであってもよい。特定の実施形態による核酸配列は、例え
ば、核酸配列が１つまたはそれ以上の調節配列と作動可能に連結されるように、ベクター
に組み込まれ得る。多くのベクターがこの目的のために利用可能であり、特定のベクター
の選択は、例えば、ベクターに挿入される核酸のサイズ、ベクターを用いて形質転換され
る特定の宿主細胞、および／または発現することが望まれる任意のコードされたポリペプ
チドの量に依存し得る。ベクターは、典型的には種々の成分を含み、その素性はベクター
の機能（例えば、ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）、およびベクターが適合性である特
定の宿主細胞に依存する。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上のコード配列と作動可能に連結された調
節配列が、核酸分子が増幅または発現される宿主細胞、例えば、細菌細胞、藻類細胞、真
菌細胞または植物細胞中で機能するプロモーター配列であってもよい。いくつかの実施形
態は、対象となるポリペプチドまたは標的化エンドヌクレアーゼをコードする１つまたは
それ以上のヌクレオチド配列と作動可能に連結された少なくとも１つの調節配列を含むヌ
クレオチド配列を含む植物形質転換ベクターを含むことができ、１つまたはそれ以上のヌ
クレオチド配列は、対象となるポリペプチドまたは標的化エンドヌクレアーゼを産生する
ために、植物細胞、組織または生物中で調節配列の制御下で発現され得る。
【０１５５】
いくつかの実施形態による核酸分子に使用するのに適したプロモーターは、その全てが
当分野で周知である、誘導性、組織特異的、ウイルス、合成または構成型であるものを含
む。本発明の実施形態に有用となり得るプロモーターの非限定的例は、米国特許第６，４
３７，２１７号明細書（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）；第５，６４１，８７６号
明細書（イネアクチンプロモーター）；第６，４２６，４４６号明細書（トウモロコシＲ
Ｓ３２４プロモーター）；第６，４２９，３６２号明細書（トウモロコシＰＲ−１プロモ
ーター）；第６，２３２，５２６号明細書（トウモロコシＡ３プロモーター）；第６，１
７７，６１１号明細書（構成型トウモロコシプロモーター）；第５，３２２，９３８号明
細書、第５，３５２，６０５号明細書、第５，３５９，１４２号明細書および第５，５３
０，１９６号明細書（３５Ｓプロモーター）；第６，４３３，２５２号明細書（トウモロ
コシＬ３オレオシンプロモーター）；第６，４２９，３５７号明細書（イネアクチン２プ
ロモーターおよびイネアクチン２イントロン）；第６，２９４，７１４号明細書（光誘導
性プロモーター）；第６，１４０，０７８号明細書（塩誘導性プロモーター）；第６，２
５２，１３８号明細書（病原体誘導性プロモーター）；第６，１７５，０６０号明細書（
リン欠乏誘導性プロモーター）；第６，３８８，１７０号明細書（双方向性プロモーター
）；第６，６３５，８０６号明細書（γ−コイキシンプロモーター）；第５，４４７，８
５８号明細書（大豆ヒートショックプロモーター）；ならびに米国特許出願第０９／７５
７，０８９号明細書（トウモロコシクロロプラストアルドラーゼプロモーター）によって
提供される。
【０１５６】
さらなる代表的なプロモーターは、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Eber
t et al.(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(16):5745-9）；オクトピンシンターゼ（Ｏ
ＣＳ）プロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaci
ens）の腫瘍誘発プラスミドに維持される）；カリモウイルスプロモーター、例えば、カ
リフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーター（Lawton et al.(1987) Pl
ant Mol.Biol.9:315-24）；ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Odell et al.(1985) Nature
313:810-2）；ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Walker et al.(1987
) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(19):6624-8）；スクロースシンターゼプロモーター（Yang
and Russell (1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4144-8）；Ｒ遺伝子複合体プロモータ
ー（Chandler et al.(1989) Plant Cell 1:1175-83）；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク
質遺伝子プロモーター；ＣａＭＶ３５Ｓ（米国特許第５，３２２，９３８号明細書、第５
，３５２，６０５号明細書、第５，３５９，１４２号明細書および第５，５３０，１９６
号明細書）；ＦＭＶ３５Ｓ（米国特許第６，０５１，７５３号明細書および第５，３７８
，６１９号明細書）；ＰＣ１ＳＶプロモーター（米国特許第５，８５０，０１９号明細書
）；ＳＣＰ１プロモーター（米国特許第６，６７７，５０３号明細書）；ならびにＡＧＲ
ｔｕ．ｎｏｓプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｖ０００８７；Depicker et al.(19
82) J.Mol.Appl.Genet.1:561-73；Bevan et al.(1983) Nature 304:184-7）を含む。
【０１５７】
特定の実施形態では、核酸分子が組織特異的プロモーターを含んでもよい。組織特異的
プロモーターは、生物の他の組織に対してプロモーターが特異的である組織中の作動可能
に連結されたヌクレオチド配列の高レベルの転写を指示するヌクレオチド配列である。組
織特異的プロモーターの例は、限定されないが、タペータム特異的プロモーター；葯特異
的プロモーター；花粉特異的プロモーター（例えば、米国特許第７，１４１，４２４号明
細書および国際ＰＣＴ公開第９９／０４２５８７号パンフレット参照）；胚珠特異的プロ
モーター（例えば、米国特許出願公開第２００１／０４７５２５  Ａ１号明細書参照）；
果実特異的プロモーター（例えば、米国特許第４，９４３，６７４号明細書および第５，
７５３，４７５号明細書参照）；および種子特異的プロモーター（例えば、米国特許第５
，４２０，０３４号明細書および第５，６０８，１５２号明細書参照）を含む。いくつか
の実施形態では、発育段階特異的プロモーター（例えば、発育の後期で活性のプロモータ
ー）が使用され得る。
【０１５８】
いくつかの実施形態で、核酸分子と作動可能に連結され得るさらなる調節配列は、翻訳
リーダー配列として機能する、プロモーター配列とコード配列との間に位置する５’ＵＴ
Ｒを含む。翻訳リーダー配列は、完全にプロセシングを受けたｍＲＮＡ中に存在し、一次
転写産物のプロセシングおよび／またはＲＮＡ安定性に影響を及ぼし得る。翻訳リーダー
配列の例は、トウモロコシおよびペチュニアヒートショックタンパク質リーダー（米国特
許第５，３６２，８６５号明細書）、植物ウイルスコートタンパク質リーダー、植物リブ
ロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシゲナーゼリーダーなどを含む。例え
ば、Turner and Foster (1995) Molecular Biotech.3(3):225-36を参照されたい。５’Ｕ
ＴＲの非限定的例は、ＧｍＨｓｐ（米国特許第５，６５９，１２２号明細書）；ＰｈＤｎ
ａｋ（米国特許第５，３６２，８６５号明細書）；ＡｔＡｎｔ１；ＴＥＶ（Carrington a
nd Freed (1990) J.Virol.64:1590-7）；およびＡＧＲｔｕｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託
番号Ｖ０００８７；およびBevan et al.(1983)、上記）によって提供される。
【０１５９】
いくつかの実施形態で、核酸分子と作動可能に連結され得るさらなる調節配列は、３’
非翻訳配列、３’転写終結領域またはポリアデニル化領域も含む。これらはヌクレオチド
配列の下流に位置する遺伝要素であり、ポリアデニル化シグナルおよび／または転写もし
くはｍＲＮＡプロセシングに影響を及ぼすことができる他の調節シグナルを提供するポリ
ヌクレオチドを含む。ポリアデニル化シグナルは、植物において、ポリアデニル酸ヌクレ
オチドのｍＲＮＡ前駆体の３’末端への付加を引き起こすよう機能する。ポリアデニル化
配列は、種々の植物遺伝子、またはＴ−ＤＮＡ遺伝子に由来し得る。３’転写終結領域の
非限定的例は、ノパリンシンターゼ３’領域である（ｎｏｓ３’；Fraley et al.(1983) 
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7）。異なる３’非翻訳領域の使用の例は、Ingelbrech
t et al.(1989) Plant Cell 1:671-80で提供される。ポリアデニル化シグナルの非限定的
例は、エンドウ（Pisum sativum）ＲｂｃＳ２遺伝子（Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al.(198
4) EMBO J.3:1671-9）およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｅ０１３１２
）からのものを含む。
【０１６０】
特定の実施形態で有用となり得る調節配列に関するさらなる情報は、例えば、Goeddel 
(1990)「Gene Expression Technology」, Methods Enzymol.185, Academic Press, San D
iego, CAに記載されている。
【０１６１】
組換え核酸分子またはベクターは、形質転換細胞、例えば、植物細胞に選択可能な表現
型を与える選択可能なマーカーを含んでもよい。選択可能なマーカーは、選択可能なマー
カーを含む核酸分子を含む細胞または生物を選び出すためにも使用され得る。マーカーは
、殺生物剤耐性、抗生物質耐性（例えば、カナマイシン、ジェネテシン（Ｇ４１８）、ブ
レオマイシンおよびハイグロマイシン）または除草剤耐性（例えば、グリホサート）をコ
ードし得る。選択可能なマーカーの例は、それだけに限らないが、カナマイシン耐性を与
え、例えば、カナマイシンおよびＧ４１８を使用して選び出され得るｎｅｏ遺伝子；ビア
ラホス耐性を与えるｂａｒ遺伝子；グリホサート耐性を与える突然変異ＥＰＳＰシンター
ゼ遺伝子；ブロモキシニルに対する耐性を与えるニトリラーゼ遺伝子；イミダゾリノンま
たはスルホニル尿素耐性を与える突然変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）
；およびメトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含む。例えば、限定されないが、アンピ
シリン；ブレオマイシン；クロラムフェニコール；ゲンタマイシン；ハイグロマイシン；
カナマイシン；リンコマイシン；メトトレキサート；ホスフィノトリシン；プロマイシン
；スペクチノマイシン；リファンピシン；ストレプトマイシン；およびテトラサイクリン
を含む化学薬剤に対する耐性を与える複数の選択可能なマーカーが利用可能である。この
ような選択可能なマーカーの例は、例えば、米国特許第５，５５０，３１８号明細書；第
５，６３３，４３５号明細書；第５，７８０，７０８号明細書および第６，１１８，０４
７号明細書に示されている。
【０１６２】
核酸分子またはベクターが、同様にまたは代わりにスクリーニング可能なマーカーを含
んでもよい。発現を監視するためにスクリーニング可能なマーカーが使用され得る。代表
的なスクリーニング可能なマーカーは、種々の発色基質が知られている酵素をコードする
β−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（Jefferson et al.(1987) Plant
Mol.Biol.Rep.5:387-405）；植物組織においてアントシアニン色素（赤色）の産生を調
節する産物をコードするＲ座遺伝子（Dellaporta et al.(1988) 「Molecular cloning of
the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac.」In 18th Stadler Genetics 
Symposium, P.Gustafson and R.Appels, eds., Plenum, NY (pp.263-82)）；β−ラクタ
マーゼ遺伝子（Sutcliffe et al.(1978) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3737-41）；種々の
発色基質が知られている酵素をコードする遺伝子（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色性セファロ
スポリン）；ルシフェラーゼ遺伝子（Ow et al.(1986) Science 234:856-9）；発色性カ
テコールを変換するカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Zukowski
et al.(1983) Gene 46(2-3):247-55）；アミラーゼ遺伝子（Ikatu et al.(1990) Bio/Te
chnol.8:241-2）；チロシンを、ＤＯＰＡおよび縮合してメラニンになるドーパキノンに
酸化することができる酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katz et al.(1983) J.Gen.
Microbiol.129:2703-14）；およびα−ガラクトシダーゼを含む。
【０１６３】
例えば、対象となる特定のポリペプチドまたは特定の標的化エンドヌクレアーゼをコー
ドするヌクレオチド配列の全ては、当業者によって直ちに認識可能であるだろう。遺伝暗
号の縮重が、特定のアミノ酸配列に有限数のコード配列を提供する。本発明の実施形態に
よるポリペプチドをコードする特定の配列の選択は専門家の裁量の範囲内にある。異なる
コード配列は異なる用途に望ましくなり得る。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、例えば、特定の宿主の核酸中に含まれるポリヌクレオチド配
列の発現を強化するために、核酸のヌクレオチドを修飾することが望ましくなり得る。遺
伝暗号は６４個の可能なコドンで冗長であるが、ほとんどの生物はこれらのコドンのサブ
セットを優先的に使用する。種において最も一般的に利用されているコドンは最適コドン
と呼ばれ、あまり一般的に利用されていないものはレアまたは低使用頻度コドンとして分
類される。Zhang et al.(1991) Gene 105:61-72。コドンは、時々「コドン最適化」と呼
ばれるプロセスで、特定の宿主の好ましいコドン使用を反映するよう置換され得る。特定
の原核生物または真核生物宿主によって好まれるコドンを含む最適化コード配列が、例え
ば、翻訳速度を増加させるまたは望ましい特性（例えば、非最適化配列から産生される転
写産物と比べて長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写産物を産生するために調製され得
る。
【０１６５】
核酸は、本発明の実施形態において、例えば、限定されないが、プロトプラストの形質
転換（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号明細書参照）；乾燥／阻害−媒介ＤＮＡ
取り込み（例えば、Potrykus et al.(1985) Mol.Gen.Genet.199:183-8参照）；電気穿孔
（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号明細書参照）；炭化ケイ素繊維を用いた攪拌
（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号明細書および第５，４６４，７６５号明細書
参照）；アグロバクテリウム媒介形質転換（例えば、米国特許第５，５６３，０５５号明
細書、第５，５９１，６１６号明細書、第５，６９３，５１２号明細書、第５，８２４，
８７７号明細書、第５，９８１，８４０号明細書および第６，３８４，３０１号明細書参
照）；およびＤＮＡコーティング粒子の加速（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号
明細書、第５，５５０，３１８号明細書、第５，５３８，８８０号明細書、第６，１６０
，２０８号明細書、第６，３９９，８６１号明細書および第６，４０３，８６５号明細書
参照）を含む当業者に公知の任意の方法によって宿主細胞に導入され得る。これらのよう
な技術の適用を通して、事実上いずれの種の細胞も安定的に形質転換され得る。いくつか
の実施形態では、形質転換ＤＮＡが宿主細胞のゲノムに組み込まれる。多細胞種の場合、
トランスジェニック細胞がトランスジェニック生物に再生され得る。例えば、トランスジ
ェニック植物のゲノム中に本発明の１つまたはそれ以上の核酸配列を含むトランスジェニ
ック植物を産生するために、これらの技術のいずれかが使用され得る。
【０１６６】
発現ベクターを植物に導入するための最も広く利用されている方法は、アグロバクテリ
ウムの自然形質転換システムに基づくものである。アグロバクテリウム・ツメファシエン
スおよびアグロバクテリウム・リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形
質転換する植物病原性土壌細菌である。アグロバクテリウム・ツメファシエンスおよびア
グロバクテリウム・リゾゲネスのＴｉおよびＲｉプラスミドがそれぞれ植物の遺伝子形質
転換を担う遺伝子を導入する。Ｔｉ（腫瘍誘発）−プラスミドは、形質転換植物に運ばれ
る、Ｔ−ＤＮＡとして知られる大型セグメントを含む。Ｔｉプラスミドの別のセグメント
であるｖｉｒ領域はＴ−ＤＮＡ導入を担う。Ｔ−ＤＮＡ領域は、それぞれ末端反復ヌクレ
オチド配列で構成された左手および右手境界に縁どられている。いくつかの修飾バイナリ
ーベクターでは、腫瘍誘発性遺伝子が欠失しており、Ｔ−ＤＮＡボーダー配列に縁どられ
ている外来ＤＮＡを導入するためにｖｉｒ領域の機能が利用される。Ｔ−領域はまた、例
えば、トランスジェニック植物および細胞を効率的に回収するための選択可能なマーカー
、ならびに導入するための挿入配列、例えば、本発明の融合タンパク質をコードする核酸
のための複数のクローニングサイトを含んでもよい。
【０１６７】
したがって、いくつかの実施形態では、植物形質転換ベクターが、アグロバクテリウム
・ツメファシエンスのＴｉプラスミド（例えば、米国特許第４，５３６，４７５号明細書
、第４，６９３，９７７号明細書、第４，８８６，９３７号明細書および第５，５０１，
９６７号明細書；ならびに欧州特許第０１２２７９１号明細書）またはアグロバクテリウ
ム・リゾゲネスのＲｉプラスミドに由来する。さらなる植物形質転換ベクターは、例えば
、限定されないが、Herrera-Estrella et al.(1983) Nature 303:209-13；Bevan et al.(
1983)、上記；Klee et al.(1985) Bio/Technol.3:637-42；および欧州特許第０１２０５
１６号明細書に記載されているもの、ならびに前記のいずれかに由来するものを含む。い
くつかの多様な植物への遺伝子導入を媒介するために、植物と自然に相互作用する他の細
菌、例えば、シノリゾビウム属、リゾビウム属およびメソリゾビウム属が修飾され得る。
これらの植物関連共生細菌は、非武装Ｔｉプラスミドと適当なバイナリーベクターの両方
の獲得によって遺伝子導入に適格性にされ得る。
【０１６８】
外因性ＤＮＡをレシピエント細胞に供給した後、形質転換細胞は、一般的にさらなる培
養および植物再生のために同定される。形質転換細胞を同定する能力を改善するために、
形質転換体を産生するために使用されるベクターと共に、前記の選択可能なまたはスクリ
ーニング可能なマーカー遺伝子を使用することが望まれ得る。選択可能なマーカーが使用
される場合、形質転換細胞は、これらの細胞を１つまたはそれ以上の選択剤に暴露するこ
とによって、潜在的に形質転換された細胞集団中で同定される。スクリーニング可能なマ
ーカーが使用される場合、細胞は所望のマーカー遺伝子形質についてスクリーニングされ
得る。
【０１６９】
選択剤への暴露を生き延びた細胞、またはスクリーニングアッセイで陽性とスコア化さ
れた細胞が、植物の再生を支持する培地中で培養され得る。いくつかの実施形態では、任
意の適当な植物組織培養培地（例えば、ＭＳおよびＮ６培地）が、さらなる物質、例えば
、成長調節物質を含めることによって修飾され得る。植物再生運動を開始するのに十分な
組織が利用可能になるまで、または反復ラウンドの手動選択後、組織の形態が再生に適し
たものになるまで（例えば、少なくとも２週間）、組織が成長調節物質を含む基本培地に
維持され、次いで、シュート形成を促す培地に移され得る。十分なシュート形成が起こる
まで、培養物が定期的に移される。いったんシュートが形成されたら、これらは根形成を
促す培地に移される。いったん十分な根が形成されたら、植物はさらなる成長および成熟
のために土壌に移され得る。
【０１７０】
再生植物中の対象となる核酸分子（例えば、本発明の少なくとも１つの融合タンパク質
を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）の存在を確認するために、種々のア
ッセイが行われ得る。このようなアッセイは、例えば、分子生物学的アッセイ、例えば、
サザンブロット法およびノーザンブロット法、ＰＣＲ、ならびに核酸シーケンシング；生
化学的アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよび／またはウエスタンブロット
法）または酵素機能によるタンパク質産物の存在の検出；植物部位アッセイ、例えば、葉
または根アッセイ；および全再生植物の表現型の分析を含む。
【０１７１】
組込みイベントは、例えば、対象となるヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって分析され得る。ＰＣＲジェノタイピングは、そ
れだけに限らないが、ゲノムに組み込まれた対象となる核酸分子を含むと予想される単離
宿主植物組織に由来するゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、引き続い
てＰＣＲ増幅産物の標準的クローニングおよび配列解析を含むと理解される。ＰＣＲジェ
ノタイピングの方法は十分に記載されており（例えば、Rios, G.et al.(2002) Plant J.3
2:243-53参照）、細胞培養物を含む任意の植物種または組織型に由来するゲノムＤＮＡに
適用され得る。
【０１７２】
アグロバクテリウム依存型形質転換法を用いて形成されたトランスジェニック植物は、
典型的には単一から複数コピーの組換えＤＮＡを含む。単一組換えＤＮＡ配列は「トラン
スジェニックイベント」または「組込みイベント」と呼ばれる。このようなトランスジェ
ニック植物は挿入されたＤＮＡ配列がヘテロ接合性である。いくつかの実施形態では、導
入遺伝子に関してホモ接合性のトランスジェニック植物が、単一外因性遺伝子配列を含む
独立分離トランスジェニック植物を自身、例えばＦ０植物と有性交配（自殖）してＦ１種
子を産生することによって得られ得る。産生されたＦ１種子の４分の１が導入遺伝子に関
してホモ接合性となる。Ｆ１種子の出芽が、典型的にはＳＮＰアッセイまたはヘテロ接合
体とホモ接合体との間の差異を認める熱増幅アッセイ（すなわち、接合生殖性アッセイ）
を用いて、ヘテロ接合性について試験され得る植物をもたらす。
【０１７３】
いくつかの実施形態における植物または植物細胞の核酸分子を用いた直接形質転換に加
えて、特定の実施形態では、少なくとも１つのトランスジェニックイベントを有する第１
の植物をこのようなイベントを欠く第２の植物と交雑することによって、トランスジェニ
ック植物が調製され得る。例えば、外因性核酸が部位特異的様式で組み込まれた少なくと
も１つの修飾ＦＡＤ２座を含む核酸が、形質転換に修正可能な第１の植物系統に導入され
てトランスジェニック植物を産生し、このトランスジェニック植物が第２の植物系統と交
雑されて少なくとも１つの修飾ＦＡＤ２座（およびそれゆえに外因性核酸）を第２の植物
系統に遺伝子移入することができる。
【０１７４】
再生植物中の対象となる核酸分子の存在を確認するために、種々のアッセイが行われ得
る。このようなアッセイは、例えば、分子生物学的アッセイ、例えば、サザンブロット法
およびノーザンブロット法、ならびにＰＣＲ；生化学的アッセイ、例えば、免疫学的手段
（ＥＬＩＳＡおよび／またはウエスタンブロット法）または酵素機能によるタンパク質産
物の存在の検出；植物部位アッセイ、例えば、葉または根アッセイ；および全再生植物の
表現型の分析を含む。
【０１７５】
標的化組込みイベントは、例えば、対象となる核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチド
プライマーを用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングされ得る。ＰＣＲジェノタイピン
グは、それだけに限らないが、ゲノムに組み込まれた対象となる核酸分子を含むと予想さ
れる単離宿主植物カルス組織に由来するゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
増幅、引き続いてＰＣＲ増幅産物の標準的クローニングおよび配列解析を含むと理解され
る。ＰＣＲジェノタイピングの方法は十分に記載されており（例えば、Rios, G.et al.(2
002) Plant J.32:243-53参照）、細胞培養物を含む任意の植物種または組織型に由来する
ゲノムＤＮＡに適用され得る。標的化配列と導入配列の両方に結合するオリゴヌクレオチ
ドプライマーの組み合わせがＰＣＲ増幅反応で連続的に使用され得るまたは多重化され得
る。標的部位にアニールするよう設計されたオリゴヌクレオチドプライマー、導入された
核酸配列、および／または２つの組み合わせが実行可能である。したがって、ＰＣＲジェ
ノタイピング戦略は、（それだけに限らないが）植物ゲノム中の特異的配列の増幅、植物
ゲノム中の複数の特異的配列の増幅、植物ゲノム中の非特異的配列の増幅、またはこれら
の組み合わせを含み得る。当業者であれば、ゲノムを調べるためのプライマーと増幅反応
のさらなる組み合わせを考案することができる。例えば、順方向および逆方向オリゴヌク
レオチドプライマーのセットが、導入された核酸配列の境界の外側の標的に特異的な核酸
配列にアニールするよう設計され得る。
【０１７６】
順方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、対象となる核酸分子中
のコード領域に相当する配列、または対象となる核酸分子の他の部分で、対象となる導入
された核酸分子に特異的にアニールするよう設計され得る。これらのプライマーは、上記
プライマーと併せて使用され得る。オリゴヌクレオチドプライマーは所望の配列にしたが
って合成され得、（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
，Ｉｎｃ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｅ、ＩＡから）商業的に入手可能である。増幅に、クローニ
ングおよびシーケンシング、または増幅産物の直接配列解析が続き得る。当業者であれば
、ＰＣＲジェノタイピング中に産生した増幅産物の解析のための代替法を認識するだろう
。 一実施形態では、遺伝子標的に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーがＰＣＲ増幅
に使用される。
【０１７７】
ＶＩ．ＦＡＤ２性能座において組み込まれた核酸を含むトランスジェニック植物および
植物材料
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾された（例えば、外因性配列の破壊お
よび／または標的化組込み）ＦＡＤ２座（例えば、大豆ＦＡＤ２  ２．３座および／また
はＦＡＤ２  ２．６座）を含む植物細胞を含むトランスジェニック植物が提供される。特
定の実施形態では、このような植物が、植物組織または植物細胞の形質転換、および全植
物の再生によって産生され得る。さらなる実施形態では、このような植物が、部位特異的
様式での少なくとも１つのＦＡＤ２座における外因性核酸の導入、または修飾ＦＡＤ２座
の生殖質への遺伝子移入を通して得られ得る。このような植物細胞を含む植物材料も提供
される。このような植物材料は、植物細胞を含む植物から得られ得る。
【０１７８】
少なくとも１つの修飾ＦＡＤ２座を含む植物細胞を含むトランスジェニック植物または
植物材料は、いくつかの実施形態では、以下の特性の１つまたはそれ以上を示し得る：植
物の細胞中の標的化エンドヌクレアーゼの発現；植物の細胞中（またはその中のプラスチ
ド中）の対象となるポリペプチドの発現；植物の細胞の核中の標的化エンドヌクレアーゼ
の発現；植物の細胞中の標的化エンドヌクレアーゼの局在化；植物の細胞のゲノム中のＦ
ＡＤ２座における組込み；植物の細胞のゲノム中のＦＡＤ２座における対象となるポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列または農学的遺伝子の組込み；ならびに／或いは植
物の細胞のゲノム中のＦＡＤ２座において組み込まれたコード配列に対応するＲＮＡ転写
産物の存在。このような植物は、例えば、限定されないが、植物の細胞のゲノム中のＦＡ
Ｄ２座において組み込まれた対象となるポリペプチドまたは農学的遺伝子によってその発
現が調節される、内因性または導入遺伝子ヌクレオチド配列の発現から生じるもの；昆虫
、他の有害生物および病原性因子に対する耐性；除草剤に対する耐性；強化された安定性
、収量または貯蔵寿命；環境耐性；医薬製造；工業製品製造；および栄養強化を含む１つ
またはそれ以上の望ましい形質をさらに有することができる。
【０１７９】
本発明によるトランスジェニック植物は、その後本明細書に記載される方法によって少
なくとも１つのＦＡＤ２座に組み込まれる核酸を用いて形質転換され得る任意の植物であ
り得る。したがって、植物は双子葉植物であっても単子葉植物であってもよい。本方法に
使用可能な双子葉植物の非限定的例は、シロイヌナズナ、アルファルファ、マメ、ブロッ
コリー、キャベツ、アブラナ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、ワタ、キュ
ウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウマメ、コショウ、ラッカセイ、ジャガイモ、カボ
チャ、ラディッシュ、ナタネ、ホウレンソウ、大豆、スカッシュ、サトウダイコン、ヒマ
ワリ、タバコ、トマトおよびスイカを含む。本方法に使用可能な単子葉植物の非限定的例
は、トウモロコシ、オオムギ、タマネギ、イネ、ソルガム、コムギ、ライムギ、アワ、サ
トウキビ、オートムギ、ライコムギ、スイッチグラスおよび芝草を含む。本発明によるト
ランスジェニック植物は任意の様式で使用または栽培され得る。
【０１８０】
いくつかの実施形態は、本発明のトランスジェニック植物から製造された商品産物も提
供する。商品産物は、例えば、限定されないが、少なくとも１つのＦＡＤ２座に組み込ま
れた１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を含む植物の食品、粗粉、油または粉砕穀物
もしくは全粒粉または種子を含む。１つまたはそれ以上の商品または商品産物中の１つま
たはそれ以上のこのようなヌクレオチド配列の検出は、商品または商品産物が少なくとも
一部は本発明の実施形態により産生されたトランスジェニック植物から製造されたという
事実上の証拠である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾ＦＡＤ２座を含む
植物細胞を含むトランスジェニック植物または種子が、限定されないが、ＲＮＡｉ分子が
転写されるトランスジェニックイベント；殺虫タンパク質（例えば、バチルス・チューリ
ゲンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫タンパク質）をコードする遺伝子；除草剤耐性
遺伝子（例えば、グリホサートに対する耐性を提供する遺伝子）；およびトランスジェニ
ック植物における望ましい表現型に寄与する遺伝子（例えば、増加した収量、変化した脂
肪酸代謝または細胞質雄性不稔の修復）を含む、そのゲノム中の少なくとも１つの他のト
ランスジェニックイベントを含んでもよい。
【０１８１】
少なくとも１つの修飾ＦＡＤ２座を含む植物細胞を含むトランスジェニック植物は、１
つまたはそれ以上の望ましい形質を有することができる。このような形質は、例えば、昆
虫、他の有害生物および病原性因子に対する耐性；除草剤に対する耐性；強化された安定
性、収量または貯蔵寿命；環境耐性；医薬製造；工業製品製造；および栄養強化を含むこ
とができる。望ましい形質は、望ましい形質を示す植物中で発現されるＦＡＤ２座におけ
る標的化組換えによって組み込まれた１つまたはそれ以上の核酸分子によって与えられ得
る。したがって、いくつかの実施形態では、所望の形質が、少なくとも１つの修飾ＦＡＤ
２座の部位において植物のゲノム中に導入された、植物中の導入遺伝子の存在により得る
。さらなる実施形態では、望ましい形質が、従来の育種を通して得られ、この形質は少な
くとも１つの修飾ＦＡＤ２座における標的化組換えによって組み込まれた１つまたはそれ
以上の核酸分子によって与えられ得る。
【０１８２】
本発明によるトランスジェニック植物は、少なくとも１つの修飾ＦＡＤ２座の存在が望
ましい任意の様式で使用または栽培され得る。したがって、植物は、特に、その後本発明
による少なくとも１つのＦＡＤ２座に部位特異的様式で組み込まれる核酸分子を用いて形
質転換されることによって、１つまたはそれ以上の所望の形質を有するように操作され、
当業者に公知の任意の方法によって収穫および栽培され得る。
【０１８３】
ＶＩＩ．ＦＡＤ２性能座において組み込まれた核酸を含むトランスジェニック植物のマ
ーカー利用育種
ダイズにおいてｆａｄ２と連結した（例えば、密に連結した）分子マーカーが提供され
る。例えば、ＨＯ形質（ｆａｄ２）に関与する配列を含むＤＮＡセグメントが同定される
。これらのセグメントは、ゲノム連鎖群中の突然変異対立遺伝子と連結した（例えば、密
に連結した）マーカーの周りおよびその間に位置している。したがって、不活性化突然変
異を有する突然変異ＦＡＤ２遺伝子を含む核酸分子も提供される。同定されるセグメント
、およびそのマーカーは、一部はダイズゲノムの連鎖群中の位置によって、本主題に含ま
れる。
【０１８４】
本明細書において引用される刊行物、特許および特許出願を含む全ての参考文献は、こ
れにより、それらが本開示の明示的詳細と矛盾しない程度に参照により組み込まれ、あた
かも各参考文献が参照により組み込まれることが個別的かつ具体的に示されており、かつ
全体が本明細書に示されているのと同程度に組み込まれる。本明細書において論じられる
参考文献は、本出願の出願日より前の開示についてのみ提供される。本発明者らが先行発
明によってこのような開示に先立つ権利がないことの承認として解釈されるべきものは本
明細書中にない。以下の実施例は、ある特定の特徴および／または実施形態を示すために
提供される。これらの実施例は、本開示を例示される特定の特徴または実施形態に限定す
るものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１８５】
実施例１：５種の大豆栽培品種からのＦＡＤ２標的配列のシーケンシング
シーケンシング反応
ゲノムＤＮＡを大豆組織から単離した。ゲノムＤＮＡを、栽培品種Ｘ５およびＷｅｓｔ
ａｇについては凍結乾燥胚形成浮遊細胞から、また栽培品種Ｊａｃｋ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ
８２およびＭａｖｅｒｉｃｋについては若葉から単離および精製した。製造業者のプロ
トコルによって、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ
；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
【０１８６】
ＦＡＤ２  ２．３および２．６遺伝子
プライマーＭＡ４９（配列番号１  ｃａａｇｇｇｔｔｃｃａａａｃａｃａａａｇｃｃ）
およびＭＡ５１（配列番号２  ｃａｔｃａａｔａｃｔｔｇｔｔｃｃｔｇｔａｃｃ）、また
はＭＡ５０（配列番号３  ｇａａｇａａｇｃｃｔｃｔｃｔｃａａｇｇｇｔｔｃ）およびＭ
Ａ５１を用いたＰＣＲによって、ＦＡＤ２  ２．３およびＦＡＤ２  ２．６ゲノムＤＮＡ
配列を増幅した。１１４０ｂｐの遺伝子の塩基約４０〜１１４０の断片についてゲノムＤ
ＮＡ配列を得た。ＰＣＲ反応条件は、初期変性について９８℃で１分、次いで、３５サイ
クルの９８℃で３０秒、６０℃で１５秒、７２℃で３分、および７２℃で５分の最後の伸
長であった。
【０１８７】
得られたＰＣＲアンプリコンをＴＥバッファに懸濁し（ＴＥバッファ中１μｇ）、設定
：ピーク放射電力１４０、デューティファクタ１０％、２００サイクル／爆発、および処
理時間４３０秒を用いたＣｏｖａｒｉｓ  Ｅ２２０  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）超音波発生装
置（Ｃｏｖａｒｉｓ；Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）により、約３００ｂｐの断片にせん断した。
製造業者の推奨プロトコルにしたがって、Ａｐｏｌｌｏ  ３２４ＴＭ  Ａｕｔｏｍａｔｉ
ｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（ＩｎｔｅｇｅｎＸ）でＰｒｅｐＸ  ＤＮＡライブラリーキ
ット（商標）（ＩｎｔｅｇｅｎＸ；Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）を用いて、Ｉｌｌｕｍ
ｉｎａ（商標）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）末端対合（paired-end）シーケンシングラ
イブラリーを調製した。手短に言えば、５’または３’オーバーハングを有するせん断Ｄ
ＮＡ断片を、５’リン酸化平滑末端ＤＮＡに変換した。１つのアデニン（Ａ）伸長を末端
修復ＤＮＡ断片の３’末端に付加し、引き続いて索引付きＩｌｌｕｍｉｎａ（商標）末端
対合（ＰＥ）アダプターに連結した。最後に、アダプター連結ライブラリー産物をロボッ
トから回収し、初期変性については９８℃で３０秒、次いで１０サイクルの９８℃で１０
秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒、および７２℃で５分の最後の伸長のサーモサイク
リング条件下でＩｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ＰＣＲ（商標）試薬を用いたＰＣＲで
富化した。富化ライブラリーを２ｎＭに正規化し、プールした。次いで、プールしたライ
ブラリーを水酸化ナトリウムで変性し、Ｍｉｓｅｑフローセル（商標）（Ｉｌｌｕｍｉｎ
ａ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にロードするためにハイブリダイゼーションバッファ中
６ｐＭに希釈した。６インデックスサイクルで実行する２ｘ１５０サイクルをＩｌｌｕｍ
ｉｎａの推奨プロトコルにしたがってＭｉｓｅｑ（商標）で行った。
【０１８８】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑ（商標）装置から得られた配列反応産生末端対合解読を
、ＴｒｕＳｅｑアダプター配列（商標）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にトリミングした。トリミ
ング後、Ｂｕｒｒｏｗｓ  Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）（Li H.and Durbi
n R.(2009) Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform
.Bioinformatics, 25:1754-60）を用いて、解読を栽培品種Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２の大
豆基準骨格にマッピングした。
【０１８９】
各大豆栽培品種を別々のサンプルとして処理したので、各栽培品種のシーケンシング解
読を別々にマッピングした。マッピングしたシーケンシング解読の深さが０より大きい骨
格上の領域を調査した。これらはアンプリコンからのシーケンシング解読であったので、
骨格上の特異的領域のみがこれらにマッピングされた解読を有すると予想された。シーケ
ンシング解読を、異なるサンプルにまたがって大豆染色体１０および２０にマッピングし
た。各サンプルについて、Ｍｐｉｌｅｕｐコンピュータプログラムを用いてコンセンサス
配列を得た。これらの結果は、シーケンシング解読が２つのパラログ推定ＦＡＤ遺伝子に
マッピングされることを示した。得られた配列解読をアラインメントして、栽培品種Ｘ５
、Ｗｅｓｔａｇ、Ｊａｃｋ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２およびＭａｖｅｒｉｃｋから得られ
たパラログ推定遺伝子配列間のＳＮＰ／変異を同定した。
【０１９０】
配列アラインメントを、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ  １１．０コンピュー
タプログラムのＡｌｉｇｎＸ（登録商標）プログラム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を介して行い、図１および図２に示す。ＡｌｉｇｎＸ（
登録商標）は、類似性比較およびアノテーションのためにタンパク質または核酸配列の複
数の配列アラインメントを作成するために修正Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを使用す
る。図１および図２に示されるように、単離配列の解析は、それぞれのＦＡＤ２  ２．３
およびＦＡＤ２  ２．６配列が高レベルの配列類似性を共有していることを示した。
【０１９１】
ＦＡＤ２  ２．３遺伝子は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２基準ゲノム配列（配列番号４）の
染色体１０上の塩基４９，４１７，０７０〜４９，４１８，２１９に相当する。 ５種の
栽培品種（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２、Ｊａｃｋ、Ｍａｖｅｒｉｃｋ、Ｘ５およびＷｅｓｔ
ａｇ）の遺伝子の配列は、塩基４１〜１１４０（使用したプライマーにより得られた被覆
率）で同一であった。ＦＡＤ２  ２．６遺伝子は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２基準ゲノム配
列（配列番号９）の染色体２０上の塩基３４，１７８，３３０〜３４，１７９，４７５に
相当する。 ２３３位（Ｃ＞Ｔ）、３５２位（Ａ＞Ｇ）、６３３位（Ｃ＞Ｔ）、６４５位
（Ｔ＞Ｃ）、６５８位（Ｔ＞Ｃ）、８９４位（Ａ＞Ｇ）においてＷｉｌｌｉａｍｓ  ８２
基準配列に対する配列差異をＸ５配列で同定した。 Ｍａｖｅｒｉｃｋは、３５２位およ
び８９４位においてＸ５と同じ塩基変化を有していた。
実施例２：ＦＡＤ２遺伝子に特異的なジンクフィンガー結合ドメインの設計
【０１９２】
ＦＡＤ２遺伝子座の種々の機能配列をコードするＤＮＡ配列に向けられたジンクフィン
ガータンパク質を前記のように設計した。例えば、Urnov et al.(2005) Nature 435:646-
651を参照されたい。代表的な標的配列および認識ヘリックスを表１（標的部位）および
表２（認識ヘリックス領域設計）に示す。  ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）標
的部位を、ＦＡＤ２の標的部位に結合するように設計した。ＦＡＤ２ジンクフィンガー設
計を、ＣＣＨＣ構造の少なくとも１つのフィンガーを有するタンパク質をコードするジン
クフィンガー発現ベクターに組み込んだ。米国特許出願公開第２００８／０１８２３３２
号明細書を参照されたい。特に、各タンパク質の最後のフィンガーは、認識ヘリックスの
ためのＣＣＨＣ骨格を有していた。非標準ジンクフィンガーコード配列を、４つのアミノ
酸ＺＣリンカーおよびトウモロコシ（Zea mays）に由来するオペーク−２核移行シグナル
を介してＩＩＳ型制限酵素ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメイン（Wah et al., (1998) Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 95:10564-10569のアミノ酸３８４〜５７９）に融合してＦＡＤ２ジン
クフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成した。ＺＦＮ１〜３については野生型Ｆｏｋ
ＩとｅＨＦ−ＦｏｋＩドメインの両方（米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号明
細書参照）を構築したが、ＺＦＮ４〜７についてはｅＨＦ−ＦｏｋＩドメインのみを使用
した。
【０１９３】
ＦＡＤ２  ２．３および２．６設計ＺＦＮの活性をＤＬＳＳＡアッセイ（米国特許出願
公開第２０１１０３０１０７３号明細書参照）で試験して、最高活性を有するＺＦＮを同
定した。ＺＦＮによって哺乳動物細胞にクローニングした関連ＦＡＤ２  ２．３および２
．６配列の切断を評価した（図３）。 活性を高度活性基準ＺＦＮ（８２６６：８１９６
）と比較した；ベースライン活性が示されている。
【表１】
2020096611.tif 000002
【表２】
2020096611.tif 000003
2020096611.tif 000004
【０１９４】
実施例３：ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびドナー構築物
ＺＦＮ構築物
実施例２に記載されるように、アッセイを用いて同定された、代表的なジンクフィンガ
ーヌクレアーゼのＺＦＮ発現構築物を含むプラスミドベクターを、設計し、完成させた。
【０１９５】
各ジンクフィンガーコード配列を、ジンクフィンガーヌクレアーゼの上流に位置するオ
ペーク−２核移行シグナル（Maddaloni et al.(1989) Nuc.Acids Res.17(18):7532）をコ
ードする配列に融合した。次に、オペーク−２核移行シグナル：：ジンクフィンガーヌク
レアーゼ融合配列を、相補的オペーク−２核移行シグナル：：ジンクフィンガーヌクレア
ーゼ融合配列と対形成した。よって、各構築物は、ゾセア・アシグナウイルスからの２Ａ
配列によって分離された２つのオペーク−２核移行シグナル：：ジンクフィンガーヌクレ
アーゼ融合配列で構成された単一のオープンリーディングフレームからなっていた（Matt
ion et al.(1996) J.Virol.70:8124-8127）。融合タンパク質の発現を、比較的強い構成
型プロモーター、例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーター
に由来し、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＯＲＦ２３  ３’未翻訳領域（Ａｔ
ｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ）が隣接するプロモーターによって駆動した。
【０１９６】
ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いてベクターをアセンブルした。制限
エンドヌクレアーゼをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；Ｉｐｓｗｉｃ
ｈ、ＭＡ）から得て、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＮＡラ
イゲーションに使用した。供給業者の指示にしたがってＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標
）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｌｅｈ
ｅｍ、ＰＡ）またはＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラス
ミド調製を行った。アガローストリス酢酸ゲル電気泳動後にＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡ断片を単離した
。全てのアセンブルしたプラスミドのコロニーを最初にミニプレップＤＮＡの制限消化に
よってスクリーニングした。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、商業的シーケン
シング販売業者（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａ
Ｌ）によってシーケンシングした。配列データを、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフト
ウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いてアセ
ンブルおよび分析した。
【０１９７】
ダイズプロトプラストに送達する前に、プラスミドＤＮＡを、供給業者の指示にしたが
ってＰｕｒｅ  Ｙｉｅｌｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商
標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）またはＰｌａ
ｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を
用いて大腸菌の培養物から調製した。
【０１９８】
得られた１１個のプラスミド構築物；ｐＤＡＢ１１５６０３（ｅＨＦ−ＦｏｋＩと共に
ＺＦＮ３７３５４およびＺＦＮ３７３５５構築物を含む）、ｐＤＡＢ１１５６００（野生
型ＦｏｋＩと共にＺＦＮ３７３５４およびＺＦＮ３７３５５構築物を含む）、ｐＤＡＢ１
１５６０５（ｅＨＦ−ＦｏｋＩと共にＺＦＮ３７３７０およびＺＦＮ３７３７１構築物を
含む）、ｐＤＡＢ１１５６０１（野生型ＦｏｋＩと共にＺＦＮ３７３７０およびＺＦＮ３
７３７１構築物を含む）、ｐＤＡＢ１１５６０６（ｅＨＦ−ＦｏｋＩと共にＺＦＮ３７３
７４およびＺＦＮ３７３７５構築物を含む）、ｐＤＡＢ１１５６０４（ｅＨＦ−ＦｏｋＩ
と共にＺＦＮ３７３６６およびＺＦＮ３７３６７構築物を含む）、ｐＤＡＢ１１５６０７
（ｅＨＦ−ＦｏｋＩと共にＺＦＮ３７３８４およびＺＦＮ３７３８５構築物を含む）、ｐ
ＤＡＢ１１５６０２（野生型ＦｏｋＩと共にＺＦＮ３７３８４およびＺＦＮ３７３８５構
築物を含む）、ｐＤＡＢ１１５６０９（ｅＨＦ−ＦｏｋＩと共にＺＦＮ３７３９８および
ＺＦＮ３７３９９構築物を含む）、およびｐＤＡＢ１１５６０８（ｅＨＦ−ＦｏｋＩと共
にＺＦＮ３７３９２およびＺＦＮ３７３９３構築物を含む）を、制限酵素消化およびＤＮ
Ａシーケンシングを介して確認した。
【０１９９】
ドナー構築物
合成デノボ線状片を高コピープラスミドベクター中に結合することによって、ＦＡＤ２
ドナーベクターを構築した。ｐＤＡＢ１１５６２０（図４）およびｐＤＡＢ１１５６２２
（図５）を大豆ゲノムのＦＡＤ２座へのドナー組込みに使用した。ドナーベクターの両方
を、ジンクフィンガーヌクレアーゼ結合ドメインを含むように合成した。ｐＤＡＢ１１５
６２０（「ドナー１」）は３７３５４：３７３５５ＺＦＮ結合ドメイン、３７３６６：３
７３６７ＺＦＮ結合ドメイン、３７３７０：３７３７１ＺＦＮ結合ドメインおよび３７３
７４：３７３７５ＺＦＮ結合ドメインを含む。ｐＤＡＢ１１５６２２（「ドナー２」）は
３７３８４：３７３８５ＺＦＮ結合ドメイン、３７３９２：３７３９３ＺＦＮ結合ドメイ
ンおよび３７３９８：３７３９９ＺＦＮ結合ドメインを含む。ＺＦＮ結合ドメインは対応
する発現ジンクフィンガーヌクレアーゼによって認識され、ドナーベクターおよびジンク
フィンガーヌクレアーゼベクターを用いた植物細胞の同時形質転換中に切断される。
【０２００】
実施例４：大豆プロトプラストの形質転換
大豆（例えば、ダイズ栽培品種Ｍａｖｅｒｉｃｋ）プロトプラスト系形質転換法を開発
した。プロトプラストを、葉外植片から産生されたカルスに由来するＭａｖｅｒｉｃｋ懸
濁培養液から単離した。下記の技術が本方法を説明する。
【０２０１】
培養液維持
大豆細胞懸濁液を、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．５ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄおよび７
ｇのｂａｃｔｏ  ａｇａｒ、ｐＨ５．７を含む新鮮なＬＳ培地（Linsmaier and Skoog 19
65）への１：５希釈によって７日毎に継代培養した。全ての実験は、下記のプロトコルに
基づいて、継代培養７日後に開始して行った。
【０２０２】
プロトプラスト単離
３０ｍｌの継代培養７日後のＭａｖｅｒｉｃｋ懸濁培養液を５０ｍｌ円錐形遠心管に移
し、２００ｇで３分間遠心分離すると、管１本当たり約１０ｍｌの沈降細胞体積（settle
d cell volume）（ＳＣＶ）が得られた。細胞ペレットを乱すことなく、上清を除去した
。２０ｍｌの酵溶液（ＭＭＧ溶液（４ｍＭ ＭＥＳ、０．６Ｍマンニトール、１５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、ｐＨ６．０）中０．３％ペクトリアーゼ（３２０９５２；ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄ
ｉｃａｌｓ）、３％セルラーゼ（「Ｏｎｏｚｕｋａ」Ｒ１０（商標）；Ｙａｋｕｌｔ  Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、日本））を、懸濁細胞４ＳＣＶ毎に添加し、管をＰａｒ
ａｆｉｌｍ（商標）で包んだ。管をプラットホームロッカーに一晩（約１６〜１８時間）
置いた。翌朝、消化細胞のアリコートを顕微鏡的に観察して細胞壁の消化が十分であるこ
とを確認した。
【０２０３】
プロトプラスト精製
細胞／酵素溶液を１００μＭセルストレーナーを通してゆっくり濾過した。セルストレ
ーナーをＷ５＋培地（１．８２ｍＭ ＭＥＳ、１９２ｍＭ ＮａＣｌ、１５４ｍＭ ＣａＣ
ｌ２、４．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ６．０）１０ｍｌですすいだ。７０μＭスクリーンを用
いて濾過工程を繰り返した。Ｗ５＋培地１０ｍｌを添加することによって、最終体積を４
０ｍｌにした。管を反転させることによって細胞を混合した。スクロースクッション溶液
（５００ｍＭスクロース、１ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＭＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ６．０）８
ｍｌを、細胞を含む５０ｍｌ円錐形遠心管の底部に添加することによって、プロトプラス
トをスクロースクッション溶液上にゆっくり積層した。管をスインギングバケットロータ
ー中３５０ｇで１５分間遠心分離した。５ｍｌピペットチップを使用してプロトプラスト
バンド（約７〜８ｍｌ）をゆっくり取り出した。次いで、プロトプラストを５０ｍｌ円錐
形管に移し、Ｗ５＋洗浄液２５ｍｌを添加した。管をゆっくり反転させ、２００ｇで１０
分間遠心分離した。上清を除去し、ＭＭＧ溶液１０ｍｌを添加し、管をゆっくり反転させ
てプロトプラストを再懸濁した。血球計算器またはフローサイトメーターを用いてプロト
プラスト密度を測定した。典型的には、細胞懸濁液４ＰＣＶが約２００万個のプロトプラ
ストを産生した。
【０２０４】
ＰＥＧを用いたプロトプラストの形質転換
ＭＭＧを用いてプロトプラスト濃度を１６０万個／ｍｌに調整した。３００μｌのプロ
トプラストアリコート（約５００，０００個のプロトプラスト）を２ｍｌ滅菌チューブに
移した。プロトプラストをチューブに移す間、プロトプラスト懸濁液を規則的に混合した
。実験設計にしたがって、プラスミドＤＮＡをプロトプラストアリコートに添加した。プ
ロトプラストのチューブを含むラックを１分間毎に３回ゆっくり反転させてＤＮＡとプロ
トプラストを混合した。プロトプラストを室温で５分間インキュベートした。３００μｌ
のポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）溶液（４０％エチレングリコール（８１２
４０−Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．３Ｍマンニトール、０．４Ｍ ＣａＣｌ２）
をプロトプラストに添加し、チューブのラックを１分間混合し、インキュベーション中に
２回穏やかに反転させながら５分間インキュベートした。Ｗ５＋１ｍｌをチューブにゆっ
くり添加し、チューブのラックを１５〜２０回反転させた。次いで、チューブを３５０ｇ
で５分間遠心分離し、ペレットを乱すことなく上清を除去した。ＷＩ培地（４ｍＭ ＭＥ
Ｓ、０．６Ｍマンニトール、２０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ６．０）１ｍｌを各チューブに添加
し、ラックを穏やかに反転させてペレットを再懸濁した。ラックをアルミ箔で覆い、横置
きして２３℃で一晩インキュベートした。
【０２０５】
形質転換率の測定およびプロトプラストの収穫
Ｑｕａｎｔａ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔ
ｅｒ  Ｉｎｃ．）を用いて、プロトプラストの定量化および形質転換効率を測定した。形
質転換約１６〜１８時間後、各複製物から１００μｌをサンプリングし、９６ウェルプレ
ートに入れ、ＷＩ溶液を用いて１：１希釈した。複製物を３回再懸濁し、フローサイトメ
トリーを用いて１００μｌを定量化した。サンプルを解析に供する前に、サンプルを２０
０ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、サンプルを液体窒素で瞬間凍結した。次いで、
分子解析のために処理するまで、サンプルを−８０℃冷凍庫に入れた。
【０２０６】
実施例５：ジンクフィンガーヌクレアーゼ切断およびドナー組込み
上記形質転換方法論を用いて、設計ＺＦＮを大豆プロトプラストに形質転換した。ＦＡ
Ｄ２座についての切断効率を、米国仮特許出願第６１／７３６，８５６号明細書に記載さ
れている座破壊アッセイを介して種々のＺＦＮについて評価した。さらに、イン−アウト
ＰＣＲアッセイを介してドナー配列のＦＡＤ２座へのジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介
組込みを評価し、得られたＰＣＲアンプリコンをシーケンシングして大豆ゲノムへのドナ
ー組込みを特徴付けた。
【０２０７】
実験は、ドナーベクターのみ、ＺＦＮベクターのみ、またはＺＦＮとドナーベクターを
合わせたものを含む処理群で構成された（表３）。さらに、実験は、未形質転換細胞また
はコントロールベクター、ＣｓＶＭＶプロモーターによって駆動され、高コピー数プラス
ミド中のＡｔｕＯＲＦ２４  ３’−ＵＴＲが隣接したＧＦＰ発現カセットを含むｐＤＡＢ
７２２１（図６）で形質転換された細胞のネガティブコントロール処理群を含んでいた。
トランスフェクション約１８〜２４時間後に形質転換サンプルを収穫した。実験データが
ＺＦＮプラスミド、ｐＤＡＢ１１５６０１の高活性を証明したので、このＺＦＮプラスミ
ドを全てのその後の実験でポジティブコントロールとして使用した。
【０２０８】
表３に詳述されるように、形質転換実験はＤＮＡ合計８０μｇを含んでおり、必要に応
じてプラスミドｐＤＡＢ７２２１を添加してＤＮＡの総濃度を８０μｇにした。ドナーベ
クターとＺＦＮ発現プラスミドの比は約１０：１であった。各実験または処理は、６実験
反復からなり、これらを独立に処理および解析した。 ＺＦＮを評価する実験は２セット
の実験で行い、ＺＦＮプラスミド、ｐＤＡＢ１１５６０１を全ての最終実験にポジティブ
コントロールとして使用した。
【表３】
2020096611.tif 000005
2020096611.tif 000006
2020096611.tif 000007
2020096611.tif 000008
【０２０９】
標的化の解析
座破壊アッセイを用いて標的化実験からのＤＮＡサンプルを解析して、ＦＡＤ２  ＺＦ
Ｎ切断部位における修飾を検出またはＮＨＥＪによる標的化を評価した。 ＦＡＤ２標的
中の無傷ＺＦＮ結合部位を測定するようｑＰＣＲアッセイを設計した。ＺＦＮ媒介ドナー
挿入または切断、引き続いてＮＨＥＪ修復が、ＺＦＮ結合部位の喪失およびその後の検出
可能なｑＰＣＲシグナルの減少をもたらす。有意な切断活性を有するＺＦＮは、ドナーの
みの処理と比べてシグナルが減少したアンプリコンの産生をもたらした。座破壊アッセイ
に使用されるプライマーおよびプローブが表４に提供され、ＦＡＤ２座上のその相対位置
が図７に示される。
【０２１０】
結果を未処理大豆細胞の無傷ＦＡＤ２座から得られたシグナルと比較した。適当なドナ
ーベクターの存在下でのＦＡＤ２  ２．３  ＺＦＮ２＿ＷＴ  ＺＦＮ（両実験）およびＦ
ＡＤ２  ２．６  ＺＦＮ  ＺＦＮ４＿ＨＦ（１実験）およびＦ２  ＺＦＮ５＿ＨＦ（両実
験）によるプロトプラストの処理は、無傷配列（ドナーのみ）から得られたものと比べて
統計学的に有意に低いシグナルをもたらした。
【表４】
2020096611.tif 000009
2020096611.tif 000010
【０２１１】
座特異的イン−アウトＰＣＲ
標的化ドナー挿入を確認するために、全ての処理からのＤＮＡを座特異的イン−アウト
ＰＣＲアッセイに供した。実験のドナーベクターを、ＦＡＤ２座への標的化組込みについ
て試験されている全てのＺＦＮについて結合部位を含むように設計した。ＺＦＮおよびド
ナーの大豆細胞への同時送達は、標的およびドナーベクターにおけるＺＦＮ結合部位の切
断、ならびに非相同末端結合機構を介したその後のドナーの切断ＦＡＤ２座への組込みを
もたらす。ＺＦＮ切断により産生されたＦＡＤ２染色体部位および線状ドナーベクターの
末端が、ＦＡＤ２座への組込み前にプロセシングを受け、不完全な末端結合産物をもたら
し得る。標的における標的化組込みの確認を「イン−アウト」ＰＣＲ戦略に基づいて行っ
た（「Ｏｕｔ」プライマーは野生のゲノム座の配列を認識し、「Ｉｎ」プライマーはドナ
ーＤＮＡ中の配列に結合する）。挿入ジャンクションの５’末端と３’末端の両方でイン
−アウトＰＣＲアッセイを行った。
【０２１２】
試験したＺＦＮの全てが、ドナーおよびＺＦＮサンプル中のＰＣＲ産物によって決定さ
れるように、少なくとも１つの実験でドナー断片のＦＡＤ２大豆座への標的化および組込
みのいくらかの証拠を示した。ＰＣＲ産物が５’末端と３’末端の両方で６実験反復のう
ちの少なくとも２つで産生されたので、以下のＺＦＮ；Ｆ２  ＺＦＮ２＿ＷＴ、Ｆ２  Ｚ
ＦＮ２＿ＨＦおよびＦ２  ＺＦＮ４＿ＨＦを用いたドナー組込み標的化の結果は再現性が
あった（表５）。
【表５】
2020096611.tif 000011
【０２１３】
イン−アウトＰＣＲ産物のシーケンシング
ｐＤＡＢ１１１５６２０およびＦ２  ＺＦＮ２＿ＷＴ、またはｐＤＡＢ１１１５６２０
およびＦ２  ＺＦＮ２＿ＨＦを用いて完了したイン−アウトＰＣＲ標的化実験の各々から
の（予想されるサイズの）アンプリコンの２つをプラスミドにクローニングした。Ｓａｎ
ｇｅｒシーケンシング法を用いて、得られたプラスミドをシーケンシングした。 配列を
基準配列（ＦｏｋＩ切断から生じると予想される一本鎖４ｂｐ末端を複製して末端の全て
の可能な組み合わせを表した）にアラインメントした。１０個の特有の配列パターンが、
得られた２３個のクローニング配列から見出された（図８）。全ての配列パターンがＺＦ
Ｎ結合部位間に位置するＦＡＤ２ゲノム基準配列（ＧＡＡＡＴＴＴＣ）の一部を保持した
が、これらの配列パターンはＦＡＤ２ゲノム基準配列に対する欠失も有していた。 配列
４ＷＴ１および４ＷＴ４は、ＧＡＡＡＴＴＴＣ配列の３’末端上のＺＦＮ結合部位に広が
る欠失を含んでいた。２つの配列、１ＨＦ４および６ＨＦ４は一塩基挿入を有していた。
観察されたＤＮＡ配列パターンは、ドナーＤＮＡの大豆ＦＡＤ２座への標的化が起こった
ことを証明している。
【０２１４】
特定の代表的な実施形態が本明細書において記載されてきたが、当業者であれば、代表
的な実施形態への多くの付加、欠失および修正が以下の請求項の範囲から逸脱することな
く行われ得ることを認知および認識するだろう。さらに、一実施形態からの特徴が別の実
施形態の特徴と組み合わされてもよい。
【図１−１】
2020096611.tif 000012
【図１−２】
2020096611.tif 000013
【図１−３】
2020096611.tif 000014
【図２−１】
2020096611.tif 000015
【図２−２】
2020096611.tif 000016
【図２−３】
2020096611.tif 000017
【図３】
2020096611.tif 000018
【図４】
2020096611.tif 000019
【図５】
2020096611.tif 000020
【図６】
2020096611.tif 000021
【図７】
2020096611.tif 000022
【図８】
2020096611.tif 000023
【配列表】
2020096611000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月4日(2020.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部位特異的様式で大豆細胞中のＦＡＤ２遺伝子中の配列番号１４〜配列番号２０のいずれか１つで表されるヌクレオチド配列のいずれか内の標的部位をヌクレアーゼにより切断して、それによって前記ＦＡＤ２遺伝子中に切断部位を生じる工程を含む、大豆細胞のＦＡＤ２遺伝子を修飾する方法であって、
少なくとも１つのＦＡＤ２遺伝子が前記切断部位に対象となる外因性核酸配列を組み込むことにより改変され、前記ＦＡＤ２遺伝子が、配列番号４で表されるヌクレオチド配列を含むＦＡＤ２  ２．３遺伝子またはそのホモログもしくはパラログ、配列番号９で表されるヌクレオチド配列を含むＦＡＤ２  ２．６遺伝子またはそのホモログもしくはパラログ、またはその両方である、方法。
【請求項２】
前記ＦＡＤ２遺伝子が、ＦＡＤ２  ２．３、ＦＡＤ２  ２．６遺伝子、または両方である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヌクレアーゼが、ＤＮＡ結合ドメイン、および切断ドメインまたは切断ハーフドメイン或いは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ＤＮＡ結合ドメインが特異的に前記標的部位に結合し、前記標的部位またはその近くを切断して、それによって前記切断部位を生じる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパーＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化物質様（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、リコンビナーゼ、ジンクフィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、および前記のいずれかのキメラ（chimeric）組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記切断ドメインまたは切断ハーフドメインが、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、ＳｔｓＩエンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、Ｃａｓタンパク質、およびホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の対を含むジンクフィンガーヌクレアーゼであり、各ジンクフィンガーヌクレアーゼが、Ｆ１からＦ５またはＦ１からＦ６に整列された５つまたは６つのジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質を含み、各ジンクフィンガードメインが、下記表の１つの列（横一列）に整列され、示される認識ヘリックス領域を含む、請求項３から５のいずれかに記載の方法であって、
【表２】
2020096611.tif 000024
2020096611.tif 000025
配列番号１４で表されるヌクレオチド配列は、ＺＦＰ＃３７３５４およびＺＦＰ＃３７３５５を含むＺＦＮ対により切断され、配列番号１５で表されるヌクレオチド配列は、ＺＦＰ＃３７３７０およびＺＦＰ＃３７３７１を含むＺＦＮ対によって切断され、配列番号１６で表されるヌクレオチド配列は、ＺＦＰ＃３７３７４およびＺＦＰ＃３７３７５を含むＺＦＮ対によって切断され、配列番号１７で表されるヌクレオチド配列は、ＺＦＰ＃３７３６６およびＺＦＰ＃３７３６７を含むＺＦＮ対によって切断され、配列番号１８で表されるヌクレオチド配列は、ＺＦＰ＃３７３８４およびＺＦＰ＃３７３８５を含むＺＦＮ対によって切断され、配列番号１９で表されるヌクレオチド配列は、ＺＦＰ＃３７３９８およびＺＦＰ＃３７３９９を含むＺＦＮ対によって切断され、配列番号２０で表されるヌクレオチド配列は、ＺＦＰ＃３７３９２およびＺＦＰ＃３７３９３を含むＺＦＮ対によって切断される、方法。
【請求項７】
部位特異的様式での前記切断が、配列番号４で表されるヌクレオチド配列を含むＦＡＤ２  ２．３および配列番号９で表されるヌクレオチド配列を含むＦＡＤ２  ２．６のいくつかであるが全てではないコピーに特異的である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
対象となる前記外因性核酸配列が、標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む配列、１つまたはそれ以上の殺虫剤耐性遺伝子、１つまたはそれ以上の除草剤耐性遺伝子、１つまたはそれ以上の窒素利用効率遺伝子、１つまたはそれ以上の水利用効率遺伝子、１つまたはそれ以上の栄養価遺伝子、１つまたはそれ以上のＤＮＡ結合遺伝子、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＦＡＤ２  ２．３遺伝子および／またはＦＡＤ２  ２．６遺伝子の少なくとも１つの１つまたはそれ以上のコピーに組み込まれた前記外因性核酸配列を含むように請求項１から８のいずれかに記載の方法によって修飾された大豆細胞を含む大豆細胞または大豆植物であって、前記ＦＡＤ２  ２．３遺伝子が、配列番号４により表されるヌクレオチド配列またはそのホモログもしくはパラログを含み、前記ＦＡＤ２  ２．６遺伝子が、配列番号９で表されるヌクレオチド配列またはそのホモログもしくはパラログを含む、大豆細胞または大豆植物。
【請求項１０】
前記核酸配列が配列番号１４〜配列番号２０で表されるヌクレオチド配列からなる群から選択される標的部位またはその近くで組み込まれる、請求項９に記載の細胞または植物。
【請求項１１】
配列番号１４〜配列番号２０で表されるヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸標的部位またはその近くを切断する、ＦＡＤ２遺伝子を修飾するために使用するための部位特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼであって、
前記ＦＡＤ２遺伝子が、配列番号４で表されるヌクレオチド配列を含むＦＡＤ２  ２．３遺伝子、配列番号９で表されるヌクレオチド配列を含むＦＡＤ２  ２．６遺伝子、またはその両方であり、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼの対を含み、各ジンクフィンガーヌクレアーゼがＦ１からＦ５またはＦ１からＦ６に整列される５または６個のジンクフィンガードメインを含み、各ジンクフィンガードメインが認識ヘリックス領域を含み、前記ジンクフィンガータンパク質が、以下の表の一つの列（横一列）に整列され、示される前記認識ヘリックス領域を含み、
【表２】
2020096611.tif 000026
2020096611.tif 000027
配列番号１４で表されるヌクレオチド配列は、ＺＦＰ＃３７３５４およびＺＦＰ＃３７３５５を含むＺＦＮ対により切断され、配列番号１５で表されるヌクレオチド配列は、ＺＦＰ＃３７３７０およびＺＦＰ＃３７３７１を含むＺＦＮ対によって切断され、配列番号１６で表されるヌクレオチド配列は、ＺＦＰ＃３７３７４およびＺＦＰ＃３７３７５を含むＺＦＮ対によって切断され、配列番号１７で表されるヌクレオチド配列は、ＺＦＰ＃３７３６６およびＺＦＰ＃３７３６７を含むＺＦＮ対によって切断され、配列番号１８で表されるヌクレオチド配列は、ＺＦＰ＃３７３８４およびＺＦＰ＃３７３８５を含むＺＦＮ対によって切断され、配列番号１９で表されるヌクレオチド配列は、ＺＦＰ＃３７３９８およびＺＦＰ＃３７３９９を含むＺＦＮ対によって切断され、配列番号２０で表されるヌクレオチド配列は、ＺＦＰ＃３７３９２およびＺＦＰ＃３７３９３を含むＺＦＮ対によって切断される、部位特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本開示は以下の［１］から［１８］を含む。
［１］部位特異的様式で大豆細胞中のＦＡＤ２遺伝子中の標的部位を切断して、それによって上記ＦＡＤ２遺伝子中の破壊を引き起こす工程を含む、大豆細胞のＦＡＤ２遺伝子を修飾する方法であって、上記ＦＡＤ２遺伝子が切断後に修飾される方法。
［２］対象となる核酸配列を上記破壊に組み込む工程をさらに含む、上記［１］に記載の方法。
［３］上記ＦＡＤ２遺伝子がＦＡＤ２  ２．３、ＦＡＤ２  ２．６遺伝子、または両方である、上記［１］または上記［２］に記載の方法。
［４］部位特異的様式での上記切断が、ＤＮＡ結合ドメイン、および切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む融合タンパク質或いは上記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを上記細胞に導入する工程を含み、上記融合タンパク質が特異的に上記標的部位に結合し、上記標的部位またはその近くを切断して、それによって上記破壊を引き起こす、上記［１］から［３］のいずれかに記載の方法。
［５］上記ＤＮＡ結合ドメインが、メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパーＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化物質様（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、リコンビナーゼ、ジンクフィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、および上記のいずれかのキメラ組み合わせからなる群から選択される、上記［４］に記載の方法。
［６］上記切断ドメインまたは切断ハーフドメインがＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、ＳｔｓＩエンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、およびホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、上記［４］または上記［５］に記載の方法。
［７］上記融合タンパク質がジンクフィンガーヌクレアーゼである、上記［４］から［６］のいずれかに記載の方法。
［８］上記ジンクフィンガーヌクレアーゼが３〜６個のジンクフィンガードメインを含み、各ジンクフィンガードメインが認識ヘリックス領域を含み、上記ジンクフィンガータンパク質が表２の一列に整列され、示される上記認識ヘリックス領域を含む、上記［７］に記載の方法。
［９］部位特異的様式での上記切断がＦＡＤ２  ２．３およびＦＡＤ２  ２．６のいくつかであるが全てではないコピーに特異的である、上記［１］から［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］上記標的部位が配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択される、上記［１］から［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］対象となる上記核酸配列が標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む配列、１つまたはそれ以上の殺虫剤耐性遺伝子、１つまたはそれ以上の除草剤耐性遺伝子、１つまたはそれ以上の窒素利用効率遺伝子、１つまたはそれ以上の水利用効率遺伝子、１つまたはそれ以上の栄養価遺伝子、１つまたはそれ以上のＤＮＡ結合遺伝子、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［２］から［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］上記［１］から［１１］のいずれかに記載の方法によって修飾された大豆細胞を含む大豆細胞または大豆植物。
［１３］大豆細胞または植物が、ＦＡＤ２  ２．３および／またはＦＡＤ２  ２．６遺伝子の１つまたはそれ以上のコピーに組み込まれた対象となるヌクレオチド配列を含むトランスジェニック細胞または植物である、上記［１２］に記載の細胞または植物。
［１４］上記ヌクレオチド配列が上記細胞と異種性または相同性である、上記［１３］に記載の細胞または植物。
［１５］上記相同性配列が少なくとも１つの一塩基多型を含む、上記［１４］に記載の細胞または植物。
［１６］上記核酸配列が配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択される標的部位またはその近くで組み込まれる、上記［１３］から［１５］のいずれかに記載の細胞または植物。
［１７］配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択される核酸標的部位またはその近くを切断する、部位特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ。
［１８］上記ジンクフィンガーヌクレアーゼが３〜６個のジンクフィンガードメインを含み、各ジンクフィンガードメインが認識ヘリックス領域を含み、上記ジンクフィンガータンパク質が表２の一列に整列され、示される上記認識ヘリックス領域を含む、上記［１７］に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ。
本開示は、（例えば、植物、藻類および真菌類において）ＦＡＤ２遺伝子の発現を調節するための組成物および方法、ならびに対象となる核酸配列（例えば、外因性核酸配列）の宿主細胞への標的化組込みのための部位としてのこれらの座の使用を記載する。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、そのいずれかまたは全てが選択的に修飾および／または破壊され得る１つまたはそれ以上のＦＡＤ２配列（例えば、ホモログまたはパラログ）を含む１つまたはそれ以上のゲノムを含み得る。具体的な例では、本開示が、ダイズ（Glycine max）（例えば、ダイズ栽培品種Ｊａｃｋ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２、Ｘ５、ＷｅｓｔａｇおよびＭａｖｅｒｉｃｋ）のＦＡＤ２  ２．３およびＦＡＤ２  ２．６遺伝子、ならびに対応するホモログまたはパラログ、ならびに対象となる核酸配列の標的化組込みのための座としてのその使用を記載する。本明細書に記載されるように、ＦＡＤ２遺伝子は宿主の脂肪酸生合成に関与しているが、（例えば、ＦＡＤ２コード配列への外因性核酸の組込みによる）修飾または破壊は、結果として生じる宿主生物に予想外に全く有害効果をもたらさないまたは最小の有害効果しかもたらし得ない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
「切断（cleavage）」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断（breakage）を指す。切断は、それだけに限らないが、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含む種々の方法によって開始され得る。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は２つの異なる一本鎖切断イベントの結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生をもたらし得る。特定の実施形態では、融合ポリペプチドが標的化二本鎖ＤＮＡ切断に使用される。
【外国語明細書】
2020096611000001.pdf