(57)【要約】【課題】複雑な条件を検討しなくても、タンパク質成形体の物性を向上させる方法、物性が向上した物品及びその製造方法を提供すること。【解決手段】タンパク質を成形して得られるタンパク質成形体に圧力をかける工程を含む、タンパク質成形体の加圧体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を成形して得られるタンパク質成形体に圧力をかける工程を含む、タンパク質成形体の加圧体の製造方法。
【請求項２】
前記タンパク質成形体に圧力をかける工程において、タンパク質成形体を延伸しない、請求項１に記載の加圧体の製造方法。
【請求項３】
前記タンパク質成形体に圧力をかける工程が、少なくとも２方向から前記タンパク質成形体に圧力をかける、請求項１又は２に記載の加圧体の製造方法。
【請求項４】
前記タンパク質成形体に圧力をかける工程が、液体を介して前記タンパク質成形体に圧力をかける、請求項１〜３のいずれか一項に記載の加圧体の製造方法。
【請求項５】
前記液体が極性溶媒を含む、請求項４に記載の加圧体の製造方法。
【請求項６】
前記液体が添加剤を含有する、請求項４又は５に記載の加圧体の製造方法。
【請求項７】
加える圧力が５０ＭＰａ以上である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の加圧体の製造方法。
【請求項８】
圧力をかける前に、前記タンパク質成形体を液体に２４時間以上浸漬させる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の加圧体の製造方法。
【請求項９】
前記タンパク質成形体が、糸又はフィルムの形状である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の加圧体の製造方法。
【請求項１０】
前記タンパク質が構造タンパク質である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の加圧体の製造方法。
【請求項１１】
前記構造タンパク質がクモ糸タンパク質である、請求項１０に記載の加圧体の製造方法。
【請求項１２】
タンパク質を成形して得られるタンパク質成形体に、圧力をかける工程を含む、タンパク質成形体の物性を向上する処理方法。
【請求項１３】
前記タンパク質成形体に圧力をかける工程が、液体を介してタンパク質成形体に圧力をかける、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質がクモ糸タンパク質である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成形後高圧処理されたタンパク質成形体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質を成形して得られるタンパク質成形体の物性を向上させる方法として、例えば、タンパク質成形体の形状が糸である場合には、紡糸条件を最適化する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１６５４７７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載の技術は、タンパク質成形体の形状及びその原料となるアミノ酸配列等に合わせて、詳細な条件を設定する必要があった。
【０００５】
そこで、本発明の目的は、複雑な条件を検討しなくても、タンパク質成形体の物性を向上させる方法、物性が向上した物品及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の［１］〜［３６］を提供する。
［１］  タンパク質を成形して得られるタンパク質成形体に圧力をかける工程を含む、タンパク質成形体の加圧体の製造方法。
［２］  タンパク質成形体に圧力をかける工程において、タンパク質成形体を延伸しない、［１］に記載の加圧体の製造方法。
［３］  タンパク質成形体に圧力をかける工程が、少なくとも２方向からタンパク質成形体に圧力をかける、［１］又は［２］に記載の加圧体の製造方法。
［４］  タンパク質成形体に圧力をかける工程が、液体を介してタンパク質成形体に圧力をかける、［１］〜［３］のいずれかに記載の加圧体の製造方法。
［５］  タンパク質成形体に圧力をかける工程が、液体中でタンパク質成形体に圧力をかける、［１］〜［４］のいずれかに記載の加圧体の製造方法。
［６］  液体が極性溶媒を含む、［４］又は［５］に記載の加圧体の製造方法。
［７］  極性溶媒がアルコールを含む、［６］に記載の加圧体の製造方法。
［８］  アルコールがエタノールである、［７］に記載の加圧体の製造方法。
［９］  液体が添加剤を含有する、［４］〜［８］のいずれかに記載の加圧体の製造方法。
［１０］  添加剤が架橋剤、酸化防止剤である、［９］に記載の加圧体の製造方法。
［１１］  加える圧力が５０ＭＰａ以上である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の加圧体の製造方法。
［１２］  圧力をかける前に、タンパク質成形体を液体に２４時間以上浸漬させる、［１］〜［１１］のいずれかに記載の加圧体の製造方法。
［１３］  液体がアルコールである、［１２］に記載の加圧体の製造方法。
［１４］  アルコールがエタノールである、［１３］に記載の加圧体の製造方法。
［１５］  タンパク質成形体が、糸又はフィルムの形状である、［１］〜［１４］のいずれかに記載の加圧体の製造方法。
［１６］  タンパク質が構造タンパク質である、［１］〜［１５］のいずれかに記載の加圧体の製造方法。
［１７］  構造タンパク質がクモ糸タンパク質である、［１６］に記載の加圧体の製造方法。
［１８］  タンパク質を成形して得られるタンパク質成形体に、圧力をかける工程を含む、タンパク質成形体の物性を向上する処理方法。
［１９］  タンパク質成形体に圧力をかける工程において、タンパク質成形体を延伸しない、［１８］に記載の方法。
［２０］  タンパク質成形体に圧力をかける工程が、少なくとも２方向からタンパク質成形体に圧力をかける、［１８］又は［１９］に記載の方法。
［２１］  タンパク質成形体に圧力をかける工程が、液体を介してタンパク質成形体に圧力をかける、［１８］〜［２０］のいずれかに記載の方法。
［２２］  タンパク質成形体に圧力をかける工程が、液体中でタンパク質成形体に圧力をかける、［１８］〜［２１］のいずれかに記載の方法。
［２３］  液体が極性溶媒を含む、［１８］又は［２１］に記載の加圧体の製造方法。
［２４］  極性溶媒がアルコールを含む、［２３］に記載の方法。
［２５］  アルコールがエタノールである、［２４］に記載の方法。
［２６］  液体が添加剤を含有する、［２１］〜［２５］のいずれかに記載の方法。
［２７］  添加剤が架橋剤、酸化防止剤である、［２６］に記載の方法。
［２８］  加える圧力が５０ＭＰａ以上である、［１８］〜［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９］  圧力をかける前に、タンパク質成形体を液体に２４時間以上浸漬させる、［１８］〜［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０］  タンパク質成形体が、糸又はフィルムの形状である、［１８］〜［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１］  タンパク質が構造タンパク質である、［１８］〜［３０］のいずれかに記載の方法。
［３２］  構造タンパク質がクモ糸タンパク質である、［１８］〜［３１］のいずれかに記載の方法。
［３３］  タンパク質を成形して得られるタンパク質成形体を、アルコールに浸漬する工程を含む、浸漬されたタンパク質成形体の製造方法。
［３４］  アルコールがエタノールである、［３３］に記載の浸漬されたタンパク質成形体の製造方法。
［３５］  タンパク質を成形して得られるタンパク質成形体を、アルコールに浸漬する工程を含む、タンパク質成形体の物性を向上する処理方法。
［３６］  アルコールがエタノールである、［３５］に記載のタンパク質成形体の処理方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、複雑な条件の検討をしなくても、簡便な操作によって、物性が向上したタンパク質成形体の加圧体を提供できる。本発明によって提供される加圧体は、生分解性を有し、加圧する前のタンパク質成形体よりも、応力、伸度及びタフネスに優れる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】改変クモ糸フィブロイン繊維を製造するための紡糸装置の一例を示す概略図である。
【図２】可撓性容器にタンパク質成形体及び液体を封入した状態を示す写真である。
【図３】タンパク質成形体に圧力をかける工程の一例を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
【００１０】
本発明の一実施形態は、タンパク質を成形して得られるタンパク質成形体の加圧体である。タンパク質成形体は、タンパク質を成形して得ることができるものであり、加圧体は、該タンパク質成形体に圧力をかける工程を含む方法により製造できる。本実施形態に係る方法は、タンパク質を成形してタンパク質成形体を得る工程と、当該タンパク質成形体に圧力をかける工程と、を含む、タンパク質成形体の加圧体の製造方法も包含する。
【００１１】
［タンパク質］
タンパク質は、特に限定されるものではなく、遺伝子組換え技術により微生物等により製造されたものであってもよく、化学的に合成されたものであってもよく、また天然由来のタンパク質を精製したものであってもよい。
【００１２】
本明細書において、用語「主成分として含む」とは、タンパク質繊維の全質量の少なくとも５０質量％がタンパク質であることを意味する。タンパク質繊維におけるタンパク質が占める質量割合は、６０質量％以上、６５質量％以上、７０質量％以上、７５質量％以上、８０質量％以上、９０質量％以上であってもよい。
【００１３】
上記タンパク質は、例えば、構造タンパク質、又は当該構造タンパク質に由来する人造タンパク質であってもよい。構造タンパク質とは、生体内で構造、形態等を形成又は保持するタンパク質を意味する。構造タンパク質としては、例えば、フィブロイン、ケラチン、コラーゲン、エラスチン、レシリン等を挙げることができる。好ましいタンパク質は、フィブロイン、又はフィブロインに由来する人造タンパク質である。上述した構造タンパク質及び当該構造タンパク質に由来する人造タンパク質は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００１４】
フィブロインは、例えば、絹フィブロイン、クモ糸フィブロイン、及びホーネットシルクフィブロインからなる群より選択される１種以上であってよい。特に、構造タンパク質は、絹フィブロイン、クモ糸フィブロイン又はこれらの組み合わせであってもよい。絹フィブロインとクモ糸フィブロインとを併用する場合、絹フィブロインの割合は、例えば、クモ糸フィブロイン１００質量部に対して、４０質量部以下、３０質量部以下、又は１０質量部以下であってよい。
【００１５】
絹フィブロインとしては、セリシン除去絹フィブロイン、セリシン未除去絹フィブロイン、又はこれらの組み合わせであってもよい。セリシン除去絹フィブロインは、絹フィブロインを覆うセリシン、及びその他の脂肪分などを除去して精製したものである。このようにして精製した絹フィブロインは、好ましくは、凍結乾燥粉末として用いられる。セリシン未除去絹フィブロインは、セリシンなどが除去されていない未精製の絹フィブロインである。
【００１６】
クモ糸フィブロインは、天然クモ糸タンパク質、又は天然クモ糸タンパク質に由来する人造タンパク質であってもよい。
【００１７】
天然クモ糸タンパク質としては、例えば、大吐糸管しおり糸タンパク質、横糸タンパク質、及び小瓶状腺タンパク質が挙げられる。大吐糸管しおり糸タンパク質は、結晶領域と非晶領域（無定形領域とも言う。）からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つ。一方、横糸タンパク質は、結晶領域を持たず、非晶領域からなる繰り返し領域を持つという特徴を有する。横糸タンパク質は、大吐糸管しおり糸タンパク質と比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。
【００１８】
大吐糸管しおり糸タンパク質は、クモの大瓶状腺で産生され、強靭性に優れるという特徴も有する。大吐糸管しおり糸タンパク質としては、例えば、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する大瓶状腺スピドロインＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２、並びにニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来するＡＤＦ３及びＡＤＦ４が挙げられる。ＡＤＦ３は、ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つである。天然クモ糸タンパク質に由来する人造タンパク質は、これらのしおり糸タンパク質に由来する人造タンパク質であってもよい。ＡＤＦ３に由来する人造タンパク質は、比較的合成し易く、強伸度及びタフネスの点で優れた特性を有する。
【００１９】
横糸タンパク質は、クモの鞭毛状腺（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｇｌａｎｄ）で産生される。横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する鞭毛状絹タンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられる。
【００２０】
天然クモ糸タンパク質に由来する人造タンパク質は、組換えクモ糸タンパク質であってよい。組換えクモ糸タンパク質としては、天然型クモ糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体等が挙げられる。このような人造タンパク質の好適な一例は、大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えクモ糸タンパク質である。例えば、組換えクモ糸タンパク質は、いくつかの異種タンパク質生産系で産生されており、その製造方法として、トランスジェニック・ヤギ、トランスジェニック・カイコ、又は組換え植物若しくは哺乳類細胞が利用されている。
【００２１】
組換えクモ糸タンパク質は、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２２】
大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えクモ糸タンパク質及びカイコシルクに由来する人造タンパク質としては、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。ここで、式１中、（Ａ）ｎモチーフは、Ａはアラニン残基を示し、ｎは２〜２７、２〜２０、４〜２７、４〜２０、８〜２０、１０〜２０、４〜１６、８〜１６、又は１０〜１６の整数であってよい。また（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ＲＥＰは２〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは２〜３００の整数を示す。式１で表されるアミノ酸配列中に含まれるグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）及びアラニン（Ａｌａ）の合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して４０％以上が好ましく、６０％以上、又は７０％以上であってよい。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。大吐糸管しおり糸に由来する人造タンパク質の具体例としては、配列番号１又は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。
【００２３】
横糸タンパク質に由来するタンパク質としては、例えば、式２：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式２中、ＲＥＰ２はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘはアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選ばれる一つのアミノ酸を示す。ｏは８〜３００の整数を示す。）を挙げることができる。横糸タンパク質に由来するポリペプチドとしては、式２：ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を１０以上、好ましくは２０以上、より好ましくは３０以上含むポリペプチドが挙げられる。横糸タンパク質に由来するポリペプチドは、大腸菌等の微生物を宿主とした組み換えタンパク質生産を行う場合、生産性の観点から、分子量が５００ｋＤａ以下であることが好ましく、より好ましくは３００ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは２００ｋＤａ以下である。具体的には配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号３で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）のリピート部分及びモチーフに該当するＮ末端から１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列（ＰＲ１配列と記す。）と、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３８８４７、ＧＩ：２８３３６４９）のＣ末端から８１６残基目から９０７残基目までのＣ末端アミノ酸配列を結合し、結合した配列のＮ末端に配列番号４で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００２４】
コラーゲンに由来するタンパク質として、例えば、式３：［ＲＥＰ３］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式３中、ｐは５〜３００の整数を示す。ＲＥＰ３は、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはグリシン（Ｇｌｙ）以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号５で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号６で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００２５】
レシリンに由来するタンパク質として、例えば、式４：［ＲＥＰ４］ｑで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式４中、ｑは４〜３００の整数を示す。ＲＥＰ４はＳｅｒ−Ｊ−Ｊ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｕ−Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にアスパラギン酸（Ａｓｐ）、セリン（Ｓｅｒ）及びスレオニン（Ｔｈｒ）からなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にプロリン（Ｐｒｏ）、アラニン（Ａｌａ）、スレオニン（Ｔｈｒ）及びセリン（Ｓｅｒ）からなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ４は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＰ  ６１１１５７、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のスレオニン（Ｔｈｒ）をセリン（Ｓｅｒ）に置換し、かつ９５残基目のアスパラギン（Ａｓｎ）をアスパラギン酸（Ａｓｐ）に置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１２で示されるアミノ酸配列（タグ配列）が付加されたものである。
【００２６】
エラスチンに由来するタンパク質として、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。具体的には、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号６で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００２７】
ケラチンに由来するタンパク質として、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ  ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。具体的には、配列番号９で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＣＹ３０４６６のアミノ酸配列）を含むタンパク質を挙げることができる。
【００２８】
（人造タンパク質の製造方法）
タンパク質繊維に含まれるタンパク質は、例えば、所望のタンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
【００２９】
所望のタンパク質をコードする核酸の製造方法は、特に制限されない。例えば、天然の構造タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的に合成する方法によって、当該核酸を製造することができる。核酸の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した構造タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製及び／又は確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸を合成してもよい。
【００３０】
調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、目的とするタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
【００３１】
発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、目的とするタンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
【００３２】
宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
【００３３】
原核生物の宿主の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ等を挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ等を挙げることができる。セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス等を挙げることができる。バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス等を挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等を挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム等を挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等を挙げることができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ等を挙げることができる。
【００３４】
原核生物を宿主とする場合、目的タンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
【００３５】
真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
【００３６】
真核生物を宿主とする場合、所望のタンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。
【００３７】
発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
【００３８】
タンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
【００３９】
所望の組換えタンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
【００４０】
宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００４１】
炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
【００４２】
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
【００４３】
また、培養中、必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００４４】
形質転換された宿主により生産された組換えタンパク質は、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法で単離及び精製することができる。例えば、当該タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
【００４５】
上記クロマトグラフィーとしては、フェニル−トヨパール（東ソー）、ＤＥＡＥ−トヨパール（東ソー）、セファデックスＧ−１５０（ファルマシアバイオテク）を用いたカラムクロマトグラフィーが好ましく用いられる。
【００４６】
また、タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてタンパク質の不溶体を回収する。回収したタンパク質の不溶体はタンパク質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法によりタンパク質の精製標品を得ることができる。当該タンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該タンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、その培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００４７】
＜タンパク質成形体の製造方法＞
タンパク質成形体の形状は、特に限定されず、粉末、長繊維、短繊維、モノフィラメント、マルチフィラメント、紡績糸、撚糸、加工糸、混繊糸、混紡糸、不織布、綿（わた）、板状、フィルム、シート等の形状であってよい。
【００４８】
（１）タンパク質フィルムの製造方法
フィルム状のタンパク質成形体（タンパク質フィルム）は、例えば、以下の手順で作製できる。すなわち、得られたタンパク質を溶媒に溶解させて、必要に応じて、安定化剤を添加し、撹拌することでドープ溶液を調製した。調製したドープ溶液を、例えば、ポリスチレン（ＰＳ）製のペトリ皿にキャストし、静置させることで乾燥を行った。その後、キャストされたドープ液の乾燥物をペトリ皿とともに、アセトン、メタノール混合溶液（例えば、体積比７：３）に浸漬させ、ペトリ皿からフィルムを剥がし取る。剥がしたフィルムをメタノール溶液に浸漬させ、自然乾燥を行うことによって、タンパク質フィルムを作製する。
【００４９】
（２）タンパク質繊維の製造方法
繊維状のタンパク質成形体（タンパク質繊維）は、公知の紡糸方法によって製造することができる。すなわち、例えば、タンパク質を主成分として含むタンパク質繊維を製造する際には、まず、上述した方法に準じて製造したタンパク質をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ギ酸、又はヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）等の溶媒に、必要に応じて、溶解促進剤としての無機塩と共に添加し、溶解してドープ液を作製する。次いで、このドープ液を用いて、湿式紡糸、乾式紡糸、乾湿式紡糸又は溶融紡糸等の公知の紡糸方法により紡糸して、タンパク質繊維を得ることができる。好ましい紡糸方法としては、湿式紡糸又は乾湿式紡糸を挙げることができる。
【００５０】
図１は、タンパク質繊維を製造するための紡糸装置の一例を示す概略図である。図１に示す紡糸装置１０は、乾湿式紡糸用の紡糸装置の一例であり、押出し装置１と、未延伸糸製造装置２と、湿熱延伸装置３と、乾燥装置４とを有している。
【００５１】
紡糸装置１０を使用した紡糸方法を説明する。まず、貯槽７に貯蔵されたドープ液６が、ギアポンプ８により口金９から押し出される。ラボスケールにおいては、ドープ液をシリンダーに充填し、シリンジポンプを用いてノズルから押し出してもよい。次いで、押し出されたドープ液６は、エアギャップ１９を経て、凝固液槽２０の凝固液１１内に供給され、溶媒が除去されて、タンパク質が凝固し、繊維状凝固体が形成される。次いで、繊維状凝固体が、延伸浴槽２１内の温水１２中に供給されて、延伸される。延伸倍率は供給ニップローラ１３と引き取りニップローラ１４との速度比によって決まる。その後、延伸された繊維状凝固体が、乾燥装置４に供給され、糸道２２内で乾燥されて、タンパク質繊維３６が、巻糸体５として得られる。１８ａ〜１８ｇは糸ガイドである。
【００５２】
凝固液１１としては、脱溶媒できる溶媒であればよく、例えば、メタノール、エタノール及び２−プロパノール等の炭素数１〜５の低級アルコール、並びにアセトン等を挙げることができる。凝固液１１は、適宜水を含んでいてもよい。凝固液１１の温度は、０〜３０℃であることが好ましい。口金９として、直径０．１〜０．６ｍｍのノズルを有するシリンジポンプを使用する場合、押出し速度は１ホール当たり、０．２〜６．０ｍＬ／時間が好ましく、１．４〜４．０ｍＬ／時間であることがより好ましい。凝固した改変フィブロインが凝固液１１中を通過する距離（実質的には、糸ガイド１８ａから糸ガイド１８ｂまでの距離）は、脱溶媒が効率的に行える長さがあればよく、例えば、２００〜５００ｍｍである。未延伸糸の引き取り速度は、例えば、１〜２０ｍ／分であってよく、１〜３ｍ／分であることが好ましい。凝固液１１中での滞留時間は、例えば、０．０１〜３分であってよく、０．０５〜０．１５分であることが好ましい。また、凝固液１１中で延伸（前延伸）をしてもよい。凝固液槽２０は多段設けてもよく、また延伸は必要に応じて、各段、又は特定の段で行ってもよい。
【００５３】
なお、タンパク質繊維を得る際に実施される延伸は、例えば、上記した凝固液槽２０内で行う前延伸、及び延伸浴槽２１内で行う湿熱延伸の他、乾熱延伸も採用される。
【００５４】
湿熱延伸は、温水中、温水に有機溶剤等を加えた溶液中、又はスチーム加熱中で行うことができる。温度としては、例えば、５０〜９０℃であってよく、７５〜８５℃が好ましい。湿熱延伸では、未延伸糸（又は前延伸糸）を、例えば、１〜１０倍延伸することができ、２〜８倍延伸することが好ましい。
【００５５】
乾熱延伸は、電気管状炉、乾熱板等を使用して行うことができる。温度としては、例えば、１４０℃〜２７０℃であってよく、１６０℃〜２３０℃が好ましい。乾熱延伸では、未延伸糸（又は前延伸糸）を、例えば、０．５〜８倍延伸することができ、１〜４倍延伸することが好ましい。
【００５６】
湿熱延伸及び乾熱延伸はそれぞれ単独で行ってもよく、またこれらを多段で、又は組み合わせて行ってもよい。すなわち、一段目延伸を湿熱延伸で行い、二段目延伸を乾熱延伸で行う、又は一段目延伸を湿熱延伸行い、二段目延伸を湿熱延伸行い、更に三段目延伸を乾熱延伸で行う等、湿熱延伸及び乾熱延伸を適宜組み合わせて行うことができる。
【００５７】
最終的な延伸倍率は、その下限値が、未延伸糸（又は前延伸糸）に対して、好ましくは、１倍超、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上のうちの何れかであり、上限値が、好ましくは４０倍以下、３０倍以下、２０倍以下、１５倍以下、１４倍以下、１３倍以下、１２倍以下、１１倍以下、１０倍以下である。
【００５８】
＜改変フィブロイン繊維＞
本実施形態に係るタンパク質繊維は、上述した改変フィブロインを紡糸したもの（「改変フィブロイン繊維」ともいう。）であってもよく、この場合、上述した改変フィブロインを主成分として含む。
【００５９】
改変フィブロイン繊維の収縮率は、下記式で定義される。
収縮率＝｛１−（沸点未満の水に接触させることを含む収縮工程を経たタンパク質繊維の長さ／収縮工程を経る前のタンパク質繊維の長さ）｝×１００（％）
【００６０】
本実施形態に係る改変フィブロイン繊維は、水と接触させた際の収縮率が、７％超であることが好ましく、１５％以上であることがより好ましく、２５％以上であることが更に好ましく、３２％以上であることが更により好ましく、４０％以上であることが更によりまた好ましく、４８％以上であることが特に好ましく、５６％以上であることが特により好ましく、６４％以上であることが特によりまた好ましく、７２％以上であることが最も好ましい。収縮率の上限は、通常、８０％以下である。
【００６１】
＜タンパク質糸＞
糸状のタンパク質成形体（タンパク質糸）は、例えば、改変フィブロイン繊維を含む撚糸、改変フィブロイン繊維を含む仮撚糸、および、改変フィブロイン繊維を含む紡績糸のうちの何れかである単糸である。編地の編成または織地の製織に用いられる原料糸であるタンパク質糸は、主として改変フィブロイン繊維からなる。このタンパク質糸は、改変フィブロイン繊維からなってもよい。この場合、タンパク質糸は、改変フィブロインを主成分として含む。編地の編成に用いられる原料糸は、他の繊維を一部に含んでいてもよい。
【００６２】
原料糸は、フィラメント（長繊維）の撚糸または仮撚糸であってよい。原料糸は、ステープル（短繊維）からなる紡績糸であってよい。本実施形態において編地の編成に用いられる原料糸は、単糸である。単糸が用いられることにより、編地において、双糸では得られない風合いが実現され得る。
【００６３】
撚糸または仮撚糸または紡績糸の撚り方向は、Ｓ撚り（右撚）であってよく、Ｚ撚り（左撚）であってもよい。
【００６４】
本明細書において、編地または織地における斜行の発生が無い乃至は十分に抑制されていることを「無斜行」と言い、そのような編地を「無斜行編地」と言い、そのような織地を「無斜行織地」と言う。また、織地の歪みとは、織地において斜行と同様な不良状態を言う。斜行や歪みの有無は、編目または織目の目視によって判断され得る。
【００６５】
撚糸または仮撚糸または紡績糸の繊度は使用する編機のゲージまたは織機の適した番手である事が好ましく、それに合わせ紡績を行う。
【００６６】
１３〜１５０Ｎｍの番手を有する単糸は、双糸等に比べて細く、優れた風合いと軟らかさを有する。なお、単糸の糸番手は、特に限定されず、周知の紡績法で得られるあらゆる番手であってよい。糸撚り数は、特に限定されず、周知の紡績で用いられるあらゆる撚り数であってよい。
【００６７】
＜浸漬処理＞
タンパク質成形体は、液体に浸漬した後に、加圧処理を行ってもよい。タンパク質成形体を液体に浸漬することによって、成形体の物性（例えば、応力、伸度、タフネス）が向上し得る。
【００６８】
液体は、極性溶媒であれば特に制限されず、例えば、プロトン性極性溶媒、非プロトン性極性溶媒が挙げられる。プロトン性極性溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール（イソプロパノール）、ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンが挙げられる。非プロトン性極性溶媒としては、例えば、アセトン、エチルメチルケトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−アセトアミド、ジメチルスルホキシドが挙げられる。好ましい極性溶媒は、エタノールである。タンパク質成形体を浸漬処理することにより、特に伸度及びタフネスが向上し得る。
【００６９】
液体は、架橋剤、抗酸化剤等の添加剤を含有してもよい。これらの添加剤を含有する液体に浸漬することによって、加圧処理で加える圧力がより低くても、成形体の物性（例えば、応力、伸度、タフネス）を向上させることができる。
【００７０】
架橋剤としては、例えば、ＤＭＴＭＭ（４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム  クロリド）、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド）、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）などが挙げられる。
【００７１】
抗酸化剤としては、例えば、ＢＨＴ（２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ｐ−クレゾール）、没食子酸プロピル、ＢＨＡ（ブチル化ヒドロキシアニソール）、ＴＢＨＱ（ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン）などが挙げられる。
【００７２】
＜加圧処理＞
本実施形態に係るタンパク質成形体の加圧体は、タンパク質成形体に圧力をかけることにより製造することができる。加圧処理の加圧手段は、少なくとも２方向からタンパク質成形体に加圧することが好ましい。圧力を加える少なくとも２つの方向は、互いに対向する２つの方向であればよい。加圧手段としては、例えば、タンパク質成形体を液体中に浸漬させた状態で、その液体に圧力をかけることにより、タンパク質成形体に圧力をかけることが挙げられる。また、当該加圧処理において、タンパク質成形体を加圧しながら、延伸しなくてもよい。
【００７３】
好ましい加圧手段としては、例えば、図２に示すように、タンパク質成形体を液体とともに、フィルム性の袋等の可撓性容器に封入し、その可撓性容器の外側から圧力をかけることである。より具体的には、例えば、図３に示すように、圧力センサを備えた加圧装置６０の圧力容器６１に加圧用液体６２に満たし、タンパク質成形体６５及び液体６４を封入した可撓性容器６３を加圧用液体６２に浸漬して、圧力をかける方法であってもよい。
【００７４】
加える圧力の下限値は、特に限定されず、例えば、２５ＭＰａ以上、５０ＭＰａ以上、１００ＭＰａ以上、２００ＭＰａ以上、又は６００ＭＰａ以上であってもよい。また、加える圧力の上限値は、特に限定されず、例えば、８００ＭＰａ以下、２００ＭＰａ以下、又は１００ＭＰａ以下であってもよい。特に好ましい圧力は、５０〜８００ＭＰａ、５０〜６００ＭＰａ、又は１００〜６００ＭＰａである。
【００７５】
可撓性容器は、加圧処理の圧力に破断せず、外部の圧力を容器内に十分に伝え得るものであればよい。可撓性容器の素材としては、例えば、ポリプロピレンが挙げられる。
【００７６】
可撓性容器内の液体が添加剤を含有する場合には、加える圧力の下限値は、特に限定されず、例えば、２５ＭＰａ以上、５０ＭＰａ以上、１００ＭＰａ以上、２００ＭＰａ以上、又は６００ＭＰａ以上であってもよい。また、この場合に加える圧力の上限値は、８００ＭＰａ以下、２００ＭＰａ以下、又は１００ＭＰａ以下であってもよい。特に好ましい圧力は、５０〜８００ＭＰａ、５０〜６００ＭＰａ、又は１００〜６００ＭＰａである。
【００７７】
圧力をかける時間は、適宜設定することができ、例えば、１時間であってもよく、０．５分間、３分間、５分間又は１０分間であってもよい。
【００７８】
また、加圧処理は、２段階以上の多段階で実施してもよい。加圧処理で加える圧力は、その１つ前の加圧処理で加えた圧力よりも高くてもよく、低くてもよい。例えば、加える圧力が徐々に高くなるように多段階で加圧処理を実施してもよい。具体的には、１回目の加圧処理では、５０ＭＰａの圧力を所定の時間かけて、２回目の加圧処理では６００ＭＰａの圧力を所定の時間かけてもよい。
【００７９】
本発明の他の実施形態は、タンパク質を成形して得られるタンパク質成形体に、圧力をかける工程を含む、タンパク質成形体の物性を向上する処理方法である。本実施形態におけるタンパク質、タンパク質成形体、圧力をかける工程は、上述のとおりである。
【００８０】
本明細書における物性とは、タンパク質成形体の物性であり、より具体的には、応力、伸度、タフネスを意味する。本明細書において、「物性を向上する」とは、応力、伸度、タフネスのうちの少なくとも１つが、圧力をかける前のタンパク質成形体の数値と比較して向上することを意味する。
【００８１】
本発明の他の実施形態は、タンパク質を成形して得られるタンパク質成形体の加圧体であって、複屈折率が向上した加圧体である。
【００８２】
複屈折率とは、タンパク質の配向の指標として用いられるデータの１つである。タンパク質成形体に圧力をかけることにより、圧力をかける前のタンパク質成形体よりもタンパク質の配向がより向上する。
【００８３】
本実施形態に係るタンパク質成形体の加圧体は、加圧することにより、加圧前のタンパク質成形体と比較して、その複屈折率が向上し得る。複屈折率が向上すると、応力、伸度及びタフネスが向上する傾向がある。
【実施例】
【００８４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００８５】
＜改変クモ糸フィブロインの製造＞
（１）プラスミド発現株の作製
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ７９９」ともいう。）を設計した。なお、配列番号１１で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列を有し、さらにＮ末端に配列番号６で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されている。
【００８６】
次に、ＰＲＴ７９９をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
【００８７】
（２）タンパク質の発現
配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表１）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。
【００８８】
【表１】
2020026409.tif 000002
【００８９】
当該シード培養液を５００ｍＬの生産培地（表２）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。
【００９０】
【表２】
2020026409.tif 000003
【００９１】
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のタンパク質を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするクモ糸フィブロインサイズのバンドの出現により、目的とするクモ糸フィブロインの発現を確認した。
【００９２】
（３）タンパク質の精製
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ  グアニジン緩衝液（８Ｍグアニジン塩酸塩、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収することにより、改変クモ糸フィブロイン「ＰＲＴ７９９」を得た。
【００９３】
＜改変クモ糸フィブロイン繊維の調製＞
（１）ドープ液の調製
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に、上述の改変クモ糸フィブロイン（ＰＲＴ７９９）を濃度２４質量％となるよう添加した後、溶解促進剤としてＬｉＣｌを濃度４．０質量％となるように添加した。その後、シェーカーを使用して、改変クモ糸フィブロインを３時間かけて溶解させ、ＤＭＳＯ溶液を得た。得られたＤＭＳＯ溶液中のゴミと泡を取り除き、ドープ液を調製した。ドープ液の粘度は、９０℃において５０００ｃＰ（センチポアズ）であった。
【００９４】
（２）紡糸
図１に示される紡糸装置１０を用いて、得られたドープ液を凝固液（メタノール）中に吐出し、延伸処理をし、乾燥を行うことにより、ＰＲＴ７９９のフィラメントを得た。得られたＰＲＴ７９９のフィラメントをボビンに巻き取った。
凝固液（メタノール）の温度：５〜１０℃
延伸倍率：４．５２倍
乾燥温度：８０℃
【００９５】
＜成形体の浸漬処理＞
（１）浸漬処理条件
ＰＲＴ７９９のフィラメントを１００ｃｍに切断し、浸漬処理を行った。浸漬処理は、図２のようにポリプロピレン製の袋の中に浸漬用溶媒とフィラメントを封入することで実施した。
【００９６】
（２）フィラメントの引張試験
ＰＲＴ７９９のフィラメントの物性（応力、伸度、タフネス）を測定した。具体的には、フィラメントをつかみ治具間距離２０ｍｍで試験紙片に接着剤で固定し、温度２０℃、相対湿度６５％の条件で、引張試験機（インストロン社製、型式：３３４２）を用いて、引張速度１０ｃｍ／分で応力（強度）及び伸度測定を行った。試験において、ロードセル容量を１０Ｎに設定し、つかみ冶具はクリップ式のものを用いた。
【００９７】
（３）測定結果
評価結果を表３に示す。参考例２の応力、伸度及びタフネスの数値は、参考例１の数値を１００とした場合の相対値として示した。ＰＲＴ７９９のフィラメントをエタノールに４８時間浸漬することによって、浸漬を行わなかったフィラメントよりも伸度及びタフネスが向上した。
【表３】
2020026409.tif 000004
【００９８】
＜成形体の加圧処理−１＞
（１）加圧処理条件
ＰＲＴ７９９のフィラメントを１００ｃｍに切断し、超高圧静水圧処理装置（スギノマシン社製、型式：ＨＰＶ−８０Ｃ２０−ＳＡ）を用いて、所定の圧力で１０分間、加圧処理を行った。
浸漬用溶媒として水又はエタノールを使用し、一部の実施例では、ＤＭＴＭＭ（架橋剤、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム  クロリド）、ＢＨＴ（抗酸化剤、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ｐ−クレゾール）を溶媒に添加した。浸漬時間が「０時間」であることは、袋に浸漬用溶媒とフィラメントを封入した直後に、加圧処理を行ったことを意味する。
【００９９】
（２）フィラメントの引張試験
ＰＲＴ７９９のフィラメントの物性（応力、伸度、タフネス）を測定した。具体的には、フィラメントをつかみ治具間距離２０ｍｍで試験紙片に接着剤で固定し、温度２０℃、相対湿度６５％の条件で、引張試験機（インストロン社製、型式：３３４２）を用いて、引張速度１０ｃｍ／分で応力（強度）及び伸度測定を行った。試験において、ロードセル容量を１０Ｎに設定し、つかみ冶具はクリップ式のものを用いた。
【０１００】
（３）測定結果
評価結果を表４及び５に示す。実施例１の応力、伸度及びタフネスの数値は、比較例１の数値を１００とした場合の相対値として示した。実施例２〜１１の応力、伸度及びタフネスの数値は、比較例２の数値を１００とした場合の相対値として示した。いずれの実施例においても加圧処理をすることにより、フィラメントの強度及び伸度が向上した。また、添加剤を含有するエタノールに浸漬させて加圧処理を行った場合（実施例１０、１１、１２）では、より低い圧力（５０ＭＰａ）であっても、伸度及びタフネスが大きく向上した。
【表４】
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【表５】
2020026409.tif 000006
【０１０１】
＜成形体の加圧処理−２＞
（１）加圧処理条件
ＰＲＴ７９９のフィラメントを１００ｃｍに切断し、超高圧静水圧処理装置（スギノマシン社製、型式：ＨＰＶ−８０Ｃ２０−ＳＡ）を用いて、所定の圧力で１０分間、加圧処理を行った。
浸漬用溶媒としてエタノールを使用し、一部の実施例では、ＢＨＴ（抗酸化剤、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ｐ−クレゾール）を溶媒に添加した。浸漬時間が「０時間」であることは、袋に浸漬用溶媒とフィラメントを封入した直後に、加圧処理を行ったことを意味する。実施例１５では、２段階の加圧処理を行っており、５０ＭＰａで１０分間加圧した後（第１の加圧処理）、６００ＭＰａで１０分間加圧処理を行った（第２の加圧処理）。
浸漬時間：０時間（封入直後）、４８時間（２日後）
【０１０２】
（２）フィラメントの引張試験
ＰＲＴ７９９のフィラメントの物性（応力、伸度、タフネス）を測定した。具体的には、フィラメントをつかみ治具間距離２０ｍｍで試験紙片に接着剤で固定し、温度２０℃、相対湿度６５％の条件で、引張試験機（インストロン社製、型式：３３４２）を用いて、引張速度１０ｃｍ／分で応力（強度）及び伸度測定を行った。試験において、ロードセル容量を１０Ｎに設定し、つかみ冶具はクリップ式のものを用いた。
【０１０３】
（３）測定結果
評価結果を表６に示す。各実施例の応力、伸度及びタフネスの数値は、比較例１の数値を１００とした場合の相対値として示した。いずれの実施例においても加圧処理をすることにより、フィラメントの強度及び伸度が向上した。また、添加剤を含有するエタノール中で加圧処理を行った実施例１４及び１５では、より低い圧力（５０ＭＰａ）であっても、伸度及びタフネスが大きく向上し、特に２段階で加圧処理した実施例１５では、応力がさらに向上した。
【表６】
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【０１０４】
＜複屈折率の測定＞
ＰＲＴ７９９のフィラメントを１００ｃｍに切断し、超高圧静水圧処理装置（スギノマシン社製、型式：ＨＰＶ−８０Ｃ２０−ＳＡ）を用いて、所定の圧力で１０分間、加圧処理を行った。得られた実施例１６及び１７のフィラメントについて、顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社製、型式：ＢＸ５１）を用いて、複屈折率を測定した。
【０１０５】
結果を表７に示す。各実施例の複屈折率の数値は、比較例１の数値を１００とした場合の相対値として示した。実施例１６及び１７のフィラメントは、浸漬処理及び加圧処理を行っていない比較例３のフィラメントと比較して、複屈折率が向上しており、配向がより進んでいることが確認された。
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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