(57)【要約】【課題】細胞の集団が所望の密度に達したときにポリペプチドを放出するように遺伝子操作された細胞を提供することを課題とする。【解決手段】細胞の集団が所望の密度に達したときにポリペプチドを放出するように遺伝子操作された細胞を提供した。いくつかの実施形態では、放出されたポリペプチドは、治療用ポリペプチドであり得る。また、いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは、腫瘍細胞を殺すか、または腫瘍細胞の増殖を阻害する。【選択図】図１−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作された細胞であって、前記細胞の集団が所望の密度に達したときにポリペプチドを放出するように遺伝子操作された前記細胞。
【請求項２】
前記細胞が細菌細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項１〜２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４】
前記治療用ポリペプチドが、腫瘍細胞を殺すか、または腫瘍細胞の増殖を阻害するポリペプチドである、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
前記治療用ポリペプチドが、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発するポリペプチドである、請求項３に記載の細胞。
【請求項６】
前記治療用ポリペプチドが、Ｔ細胞または樹状細胞を動員するポリペプチドである、請求項３に記載の細胞。
【請求項７】
前記治療用ポリペプチドが、アポトーシスを引き起こすか、または促進するポリペプチドである、請求項３に記載の細胞。
【請求項８】
前記治療用ポリペプチドが、抗癌剤の放出および/または効能を増強するポリペプチド
である、請求項３に記載の細胞。
【請求項９】
前記抗癌剤がリポソーム抗癌剤である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞の前記集団が前記所望の密度に達したときに前記細胞が溶解する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
前記細胞が腫瘍内で増殖することができる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
前記細胞が腫瘍の壊死領域において増殖することができる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３】
前記細胞が嫌気性細胞である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
前記細胞の前記集団が前記所望の密度に達したときに前記細胞を溶解するポリペプチドを産生するように前記細胞が遺伝子操作されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５】
前記細胞を溶解する前記ポリペプチドが、φＸ１７４Ｅ溶解ポリペプチド、コリシン産生細菌由来のＥ７溶解ポリペプチド、またはラムダファージ溶解ポリペプチドを含んでなる、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
前記細胞を溶解する前記ポリペプチドが、φＸ１７４Ｅ溶解ポリペプチドを含んでなる、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記細胞を溶解する前記ポリペプチドが、調節可能なプロモーターの制御下にある、請
求項１４〜１６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、前記調節可能なプロモーターの強度を増加させる拡散性誘発因子を産生する、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１９】
前記調節可能なプロモーターが、ｌｕｘＩプロモーターまたはその機能性断片を含んでなる、請求項１７〜１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２０】
前記拡散性誘発因子がアシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）を含んでなる、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２１】
前記アシルホモセリンラクトンが、ｌｕｘＩタンパク質の作用によって産生される、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
前記ｌｕｘＩタンパク質の発現がｌｕｘＩプロモーターの制御下にある、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
前記アシルホモセリンラクトンが、ｌｕｘＲタンパク質に結合し、前記ｌｕｘＲタンパク質が前記ｌｕｘＩプロモーターからの転写を活性化する、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４】
前記細胞中のアシルホモセリンラクトンのレベルが、前記細胞中のＡｉｉＡタンパク質のレベルによって制御される、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５】
前記ＡｉｉＡタンパク質の発現が、調節可能なプロモーターの制御下にある、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
前記治療用ポリペプチドが、前記細胞内のプラスミドによってコードされる、請求項３〜２５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２７】
前記細胞を溶解する前記ポリペプチドが、前記細胞内のプラスミドによってコードされる、請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２８】
前記治療用ポリペプチドが、前記細胞内の第１のプラスミドによってコードされ、前記細胞を溶解する前記ポリペプチドが、前記細胞内の第２のプラスミドによってコードされる、請求項１４〜２７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２９】
前記治療用ポリペプチドおよび前記細胞を溶解する前記ポリペプチドが、前記細胞中の同じプラスミドによってコードされる、請求項１４〜２７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３０】
前記細胞集団が前記所望の密度にあるときに、前記集団中の細胞の全てが溶解されるわけではなく、それによって溶解後の前記細胞の再増殖を可能にし、前記治療用ポリペプチドのパルス放出を促進する、請求項１０〜２９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３１】
前記誘発因子のレベルが、前記細胞を溶解する前記ポリペプチドと同じ調節可能なプロモーターによって制御される、請求項１８〜３０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３２】
前記治療用ポリペプチドが、溶血素Ｅを含んでなる、請求項３〜３１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３３】
前記細胞が、腫瘍の壊死領域内に優先的に局在する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３４】
前記ポリペプチドの放出のタイミングが、遺伝子回路の活性に直接的または間接的に連動している、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３５】
前記遺伝子回路が、ＣｌｐＸＰプロテアーゼの活性を制御する遺伝子回路を含んでなる、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３６】
前記放出されたポリペプチドがＬＡＡタグを含んでなる、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
前記放出されたポリペプチドでの前記ＣｌｐＸＰプロテアーゼの活性レベルが、過酸化水素のレベルによって制御される、請求項３５〜３６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３８】
前記細胞の溶解のタイミングが、遺伝子回路の活性に直接的または間接的に連動している、請求項１０〜３７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３９】
前記細胞の溶解のタイミングに連動する前記遺伝子回路が、前記ＣｌｐＸＰプロテアーゼの活性を制御する遺伝子回路を含んでなる、請求項３８に記載の細胞。
【請求項４０】
前記細胞を溶解するポリペプチドが、ＬＡＡタグを含んでなる、請求項３９に記載の細胞。
【請求項４１】
前記細胞を溶解する前記ポリペプチドでの前記ＣｌｐＸＰプロテアーゼの活性レベルが、過酸化水素のレベルによって制御される、請求項３９〜４０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４２】
請求項１〜４１のいずれか一項に記載の細胞の複数の株を含んでなる回収物であって、前記株が前記所望の密度に達したときに、各株が異なるポリペプチドを放出する、前記回収物。
【請求項４３】
前記複数の株中の各株が異なる抗生物質に対して耐性である、請求項４２に記載の回収物。
【請求項４４】
前記複数の菌株中の各株が、前記回収物中の他の株に作用するバクテリオシンを産生する、請求項４２に記載の回収物。
【請求項４５】
前記複数の株の１つ以上の株が、前記回収物中の１つ以上の他の株の放出頻度とは異なる頻度でポリペプチドを放出する、請求項４２に記載の回収物。
【請求項４６】
個体にポリペプチドを与える方法であって、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の細胞を、前記個体における前記細胞による前記ポリペプチドの放出を促進する条件下で、前記個体に投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項４７】
個体の健康状態を治療する方法であって、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の細胞を前記個体に投与することを含んでなり、前記ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、前記方法。
【請求項４８】
前記ポリペプチドが、腫瘍の増殖を殺すか、または阻害するポリペプチドであり、前記腫瘍に前記細胞を送達する様式で前記細胞を投与する、請求項４６〜４７のいずれか一項
に記載の方法。
【請求項４９】
前記ポリペプチドがパルス様式で前記個体において放出される、請求項４６〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記個体に第２の治療剤を投与することをさらに含んでなる、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
請求項１〜４１のいずれか一項に記載の前記細胞を前記個体に投与するのと同時に、前記第２の治療剤を前記個体に投与する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
請求項１〜４１のいずれか一項に記載の前記細胞を前記個体に投与するのとは異なる時に、前記第２の治療剤を前記個体に投与する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記第２の治療剤が、化学療法剤または生物学的治療剤である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記第２の治療剤が５−フルオロウラシルを含んでなる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
複数のポリペプチドを個体に与える方法であって、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の細胞の複数の株を含んでなる回収物を、前記複数の株による前記異なるポリペプチドのそれぞれの放出を前記個体において促進する条件下で、前記個体に投与することを含んでなる前記方法。
【請求項５６】
前記異なるポリペプチドの１つ以上が、腫瘍の増殖を殺すかまたは阻害する治療用ポリペプチドであり、前記細胞の前記複数の株を含んでなる前記回収物を、前記細胞の前記複数の株を前記腫瘍に送達する様式で投与する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記治療用ポリペプチドが、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発するポリペプチドである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記治療用ポリペプチドが、Ｔ細胞または樹状細胞を動員するポリペプチドである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記治療用ポリペプチドが、アポトーシスを引き起こすか、または促進するポリペプチドである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記治療用ポリペプチドが、抗癌剤の放出および/または効能を増強するポリペプチド
である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記抗癌剤がリポソーム抗癌剤である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記異なるポリペプチドの各々が、パルス様式で前記個体において放出される、請求項５５〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記複数の株中の第１の株を前記個体に投与し、所望の期間増殖させ、続いて前記複数の株中の第２の株を前記個体に投与し、所望の期間増殖させ、前記第２の株の投与の結果として、前記第１の株の増殖が防止または阻害される、請求項５５〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記第１の株が第１の抗生物質に耐性であり、第２の抗生物質に感受性であり、前記第２の株が前記第２の抗生物質に耐性であり、前記第１の抗生物質に感受性であり、前記第１の株の増殖が求められる場合には、前記第１の抗生物質を前記個体に投与し、前記第２の株の増殖が求められる場合には、前記第２の抗生物質を前記個体に投与する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記第１の株が、第２の株の増殖を殺すか、または阻害する第１のバクテリオシンを産生し、前記第２の株が、前記第１の株の増殖を殺すか、または阻害するバクテリオシンを産生する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記複数の株中の前記株のそれぞれを、前記個体に周期的に投与する、請求項５５〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記個体における前記複数の株のうちの１つのみの増殖を、前記複数の株中の他の株の増殖が防止または阻害されている間に一時促進する、請求項５５〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞から個体に放出されるポリペプチドを与えるための請求項１〜４１のいずれか一項に記載の細胞の使用。
【請求項６９】
個体の健康状態を治療する個体における健康状態を治療するための請求項１〜４１のいずれか一項に記載の細胞の使用。
【請求項７０】
個体に複数のポリペプチドを与えるための請求項１〜４１のいずれか一項に記載の細胞の複数の株を含んでなる回収物の使用。
【請求項７１】
前記ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項６８〜７０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７２】
前記治療用ポリペプチドが、腫瘍細胞を殺すか、または腫瘍細胞の増殖を阻害するポリペプチドである、請求項７１に記載の使用。
【請求項７３】
前記治療用ポリペプチドが、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発するポリペプチドである、請求項７１に記載の使用。
【請求項７４】
前記治療用ポリペプチドが、Ｔ細胞または樹状細胞を動員するポリペプチドである、請求項７１に記載の使用。
【請求項７５】
前記治療用ポリペプチドが、アポトーシスを引き起こすか、または促進するポリペプチドである、請求項７１に記載の使用。
【請求項７６】
前記治療用ポリペプチドが、抗癌剤の放出および/または効能を増強するポリペプチド
である、請求項７１に記載の使用。
【請求項７７】
前記抗癌剤がリポソーム抗癌剤である、請求項７６に記載の使用。
【請求項７８】
前記ポリペプチドがパルス様式で前記個体において放出される、請求項６８〜７７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７９】
前記個体に第２の治療剤を投与することをさらに含んでなる、請求項６８〜７８のいず
れか一項に記載の使用。
【請求項８０】
請求項１〜４１のいずれか一項に記載の前記細胞を前記個体に投与するのと同時に、前記第２の治療剤を前記個体に投与する、請求項７９に記載の使用。
【請求項８１】
請求項１〜４１のいずれか一項に記載の前記細胞を前記個体に投与するのとは異なる時に、前記第２の治療剤を前記個体に投与する、請求項７９に記載の使用。
【請求項８２】
前記第２の治療剤が、化学療法剤または生物学的治療剤である、請求項７９に記載の使用。
【請求項８３】
前記第２の治療剤が５−フルオロウラシルを含んでなる、請求項８１に記載の使用。
【請求項８４】
前記複数の株中の第１の株を前記個体に投与し、所望の期間増殖させ、続いて前記複数の株中の第２の株を前記個体に投与し、所望の期間増殖させ、前記第２の株の投与の結果として、前記第１の株の増殖が防止または阻害される、請求項７０に記載の使用。
【請求項８５】
前記第１の株が第１の抗生物質に耐性であり、第２の抗生物質に感受性であり、前記第２の株が前記第２の抗生物質に耐性であり、前記第１の抗生物質に感受性であり、前記第１の株の増殖が求められる場合には、前記第１の抗生物質を前記個体に投与し、前記第２の株の増殖が求められる場合には、前記第２の抗生物質を前記個体に投与する、請求項８４に記載の使用。
【請求項８６】
前記第１の株が、第２の株の増殖を殺すか、または阻害する第１のバクテリオシンを産生し、前記第２の株が、前記第１の株の増殖を殺すか、または阻害するバクテリオシンを産生する、請求項８４に記載の使用。
【請求項８７】
前記複数の株中の前記株のそれぞれを、前記個体に周期的に投与する、請求項７０〜８６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８８】
前記個体における前記複数の株のうちの１つのみの増殖を、前記複数の株中の他の株の増殖が防止または阻害されている間に一時促進する、請求項７０〜８７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８９】
前記放出されるポリペプチドをコードする核酸を前記細胞に導入することを含んでなる、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の細胞を作製する方法。
【請求項９０】
前記細胞を溶解する前記ポリペプチドをコードする核酸を前記細胞に導入することを含んでなる、請求項１４〜４１のいずれか一項に記載の細胞を作製する方法。
【請求項９１】
前記核酸の導入を、細菌接合を介して実施する、請求項８９〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先出願の参照による援用
２０１５年４月９日に出願された米国仮特許出願第６２／１４５，４１７号を含む、本出願と同時に提出された出願データシートにおいて外国または国内の優先権主張が確認されるあらゆる出願は、米国特許法施行規則１．５７に基づき参照により本明細書に援用される。
【０００２】
連邦支援研究開発に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所の国立医学総合研究所によって与えられたＮＩＨ助成／契約第ＧＭ０６９８１１号の下での政府の支援、国立環境衛生学研究所からのコアセンター助成（Core Center Grant）Ｐ３０−ＥＳ００２１０９、および全米癌研究所（スワン
ソンバイオテクノロジーセンター（Swanson Biotechnology Center）からのコッホ研究所（Koch Institute）の支援助成Ｐ３０−ＣＡ１４０５１を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
背景
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、細胞の集団が所望の密度に達したときにポリペプチドを放出するように遺伝子操作された細胞に関する。いくつかの実施形態では、放出されたポリペプチドは、治療用ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは、腫瘍細胞を殺すか、または腫瘍細胞の増殖を阻害する。
【背景技術】
【０００４】
腫瘍溶解性ウイルスおよび遺伝子操作された免疫細胞などの生物療法は、癌の治療において代替療法として台頭してきており、メラノーマ、カルチノーマ、および白血病について臨床試験が行われている（O’Shea, C. C. Viruses-seeking and destroying the tumor program.Oncogene 24, 7640-7655 (2005); June, C. H. et al.Engineered t cells for cancer therapy.Cancer Immunology, Immunotherapy 1-7 (2014); Miest, T. S. & Cattaneo, R. New viruses for cancer therapy: meeting clinical needs.Nature Reviews Microbiology 12, 23-34 (2014)）。同時に、病原体としての細菌の長年にわたるモノリ
シックな見解は、人体内に機能性微生物が広範に見られるという認識に変わってきた（Cho, I. & Blaser, M. J. The human microbiome: at the interface of health and disease.Nature Reviews Genetics 13, 260-270 (2012); Xuan, C. et al.Microbial dysbiosis is associated with human breast cancer.PloS One 9, e83744 (2014); Fischbach, M. A., Bluestone, J. A. & Lim, W. A. Cell-based therapeutics: the next pillar of medicine.Science Translational Medicine 5, 179ps7-179ps7 (2013)）。この広大な環
境を考えると、おそらく必然的に、特定の細菌が腫瘍内で優先的に増殖するように進化し、それゆえ、遺伝子操作療法の開発のための天然のプラットフォームを提供するであろう（Pawelek, J. M., Low, K. B. & Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel
anticancer vector.Cancer research 57, 4537-4544 (1997); Ruder, W. C., Lu, T. & Collins, J. J. Synthetic biology moving into the clinic.Science 333, 1248-1252 (2011); Weber, W. & Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic
biology.Nature Reviews Genetics 13, 21-35 (2011)）。腫瘍内の微生物の局在化は、
癌細胞を標的とする宿主免疫系を刺激するために利用されているが、このような療法は、局所的に放出される抗腫瘍剤を絶えず産生しながら、全身性炎症応答を安全に回避するようにプログラムされた細菌からなることが理想的である（Baban, C. K., Cronin, M., O
’Hanlon, D., O’Sullivan, G. C. & Tangney, M. Bacteria as vectors for gene therapy of cancer.Bioeng Bugs 1, 385-394, 2010; Cann, S. H., Van Netten, J. & Van Ne
tten, C. Dr William Coley and tumour regression: a place in history or in the future.Postgraduate Medical Journal 79, 672-680, 2003) Davila, M. L. et al.Efficacy and toxicity management of 19-28z CAR T cell therapy in B cell acute lymphoblastic leukemia.Science Translational Medicine 6, 224-224ra25, 2014）。本明細書に
記載の実施形態の中には、閾値集団密度で溶解し、遺伝子にコードされた抗腫瘍治療剤を放出する、遺伝子操作された臨床的検査を受けた細菌の使用がある。溶解すると、少数の生き残った細菌が集団を再生し、したがってステルスなインビボでのフットプリントを有するパルス溶解および送達サイクルをもたらす。
【０００５】
遺伝子回路のフォワード・エンジニアリングにおける最近の進歩は、生物療法を開発するための新規アプローチとして合成生物学を位置づけている（Fischbach, M. A., Bluestone, J. A. & Lim, W. A. Cell-based therapeutics: the next pillar of medicine.Science Translational Medicine 5, 179 ps7-179ps7, 2013; Ruder, W. C., Lu, T. & Collins, J. J. Synthetic biology moving into the clinic.Science 333, 1248-1252, 2011; Weber, W. & Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology.Nature Reviews Genetics 13, 21-35, 2011; and Folcher, M. & Fussenegger, M. Synthetic biology advancing clinical applications.Current Opinion in Chemical Biology, 2012）。有益な微生物が広範に見られること、およびその体内での機能的役割を考えると、細菌は、代謝障害、胃腸疾患、および癌の治療における生物療法の開発のための天然のプラットフォームに相当する（Cho, I. & Blaser, M. J. The human microbiome: at the interface of health and disease.Nature Reviews Genetics 13, 260-270 (2012); Garrett, W. S. Cancer and the microbiota.Science 348, 80-86, 2015; Pawelek, J. M., Low, K. B. & Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector.Cancer Research 57, 4537-4544, 1997）。治療的遺伝子発現のためのモジュールの開発の継続的な進歩により、コロニーの成長および治療的発現を動的に制御する回路の構築が、探求されてない実現可能な事項となっている（Jeong, J.-H. et al.Anti-tumoral effect of the mitochondrial target domain of noxa delivered by an engineered Salmonella typhimurium.PloS One 9, e80050, 2014; Loessner, H. et al.Remote control of tumour-targeted Salmonella enterica serovar typhimurium by the use of l-arabinose as inducer of bacterial gene expression in vivo.Cellular Microbiology 9, 1529-1537, 2007; Swofford, C. A., Van Dessel, N. & Forbes, N. S. Quorum-sensing Salmonella selectively trigger protein expression within tumors.Proceedings of the National Academy of Sciences 112, 3457-3462, 2015）。これらの遺伝子操作された細菌は、集団密度を自己維持する一方で、その部位で治療剤を絶えず産生し放出することが理想的である。本明細書に記載の実施形態の中には、閾値集団密度で同調的に溶解し、遺伝子にコードされた治療剤を放出する臨床的に意義のある特徴を有する遺伝子操作された細菌の使用がある。溶解すると、少数の生き残った細菌が増殖集団を再生し、そのため、パルス溶解および放出サイクルがもたらされる。
【発明の概要】
【０００６】
このセクションは、本開示の一般的な概要を与え、その全範囲またはその全ての特徴を網羅してはいない。本開示の一部の実施形態は、以下の番号を付与された項に記載されている。
【０００７】
１．遺伝子操作された細胞であって、前記細胞の集団が所望の密度に達したときにポリペプチドを放出するように遺伝子操作された前記細胞。
【０００８】
２．前記細胞が細菌細胞である、項１に記載の細胞。
【０００９】
３．前記ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、項１〜２のいずれか一項に記載の
細胞。
【００１０】
４．前記治療用ポリペプチドが、腫瘍細胞を殺すか、または腫瘍細胞の増殖を阻害するポリペプチドである、項３に記載の細胞。
【００１１】
５．前記治療用ポリペプチドが、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発するポリペプチドである、項３に記載の細胞。
【００１２】
６．前記治療用ポリペプチドが、Ｔ細胞または樹状細胞を動員するポリペプチドである、項３に記載の細胞。
【００１３】
７．前記治療用ポリペプチドが、アポトーシスを引き起こすか、または促進するポリペプチドである、項３に記載の細胞。
【００１４】
８．前記治療用ポリペプチドが、抗癌剤の放出および/または効能を増強するポリペプ
チドである、項３に記載の細胞。
【００１５】
９．前記抗癌剤がリポソーム抗癌剤である、項８に記載の細胞。
【００１６】
１０．前記細胞の前記集団が前記所望の密度に達したときに前記細胞が溶解する、項１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【００１７】
１１．前記細胞が腫瘍内で増殖することができる、項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【００１８】
１２．前記細胞が腫瘍の壊死領域において増殖することができる、項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【００１９】
１３．前記細胞が嫌気性細胞である、項１〜１２のいずれか一項に記載の細胞。
【００２０】
１４．前記細胞の前記集団が前記所望の密度に達したときに前記細胞を溶解するポリペプチドを産生するように前記細胞が遺伝子操作されている、項１〜１３のいずれか一項に記載の細胞。
【００２１】
１５．前記細胞を溶解する前記ポリペプチドが、φＸ１７４Ｅ溶解ポリペプチド、コリシン産生細菌由来のＥ７溶解ポリペプチド、またはラムダファージ溶解ポリペプチドを含んでなる、項１４に記載の細胞。
【００２２】
１６．前記細胞を溶解する前記ポリペプチドが、φＸ１７４Ｅ溶解ポリペプチドを含んでなる、項１５に記載の細胞。
【００２３】
１７．前記細胞を溶解する前記ポリペプチドが、調節可能なプロモーターの制御下にある、項１４〜１６のいずれか一項に記載の細胞。
【００２４】
１８．前記細胞が、前記調節可能なプロモーターの強度を増加させる拡散性誘発因子を産生する、項９に記載の細胞。
【００２５】
１９．前記調節可能なプロモーターが、ｌｕｘＩプロモーターまたはその機能性断片を含んでなる、項９〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【００２６】
２０．前記拡散性誘発因子がアシルホモセリンラクトンを含んでなる、項１８に記載の細胞。
【００２７】
２１．前記アシルホモセリンラクトンが、ｌｕｘＩタンパク質の作用によって産生される、項２０に記載の細胞。
【００２８】
２２．前記ｌｕｘＩタンパク質の発現がｌｕｘＩプロモーターの制御下にある、項２１に記載の細胞。
【００２９】
２３．前記アシルホモセリンラクトンが、ｌｕｘＲタンパク質に結合し、前記ｌｕｘＲタンパク質が前記ｌｕｘＩプロモーターからの転写を活性化する、項２０〜２２のいずれか一項に記載の細胞。
【００３０】
２４．前記細胞中のアシルホモセリンラクトンのレベルが、前記細胞中のＡｉｉＡタンパク質のレベルによって制御される、項２０〜２３のいずれか一項に記載の細胞。
【００３１】
２５．前記ＡｉｉＡタンパク質の発現が、調節可能なプロモーターの制御下にある、項２４に記載の細胞。
【００３２】
２６．前記治療用ポリペプチドが、前記細胞内のプラスミドによってコードされる、項３〜２５のいずれか一項に記載の細胞。
【００３３】
２７．前記細胞を溶解する前記ポリペプチドが、前記細胞内のプラスミドによってコードされる、項１４〜２６のいずれか一項に記載の細胞。
【００３４】
２８．前記治療用ポリペプチドが、前記細胞内の第１のプラスミドによってコードされ、前記細胞を溶解する前記ポリペプチドが、前記細胞内の第２のプラスミドによってコードされる、項１４〜２７のいずれか一項に記載の細胞。
【００３５】
２９．前記治療用ポリペプチドおよび前記細胞を溶解する前記ポリペプチドが、前記細胞中の同じプラスミドによってコードされる、項１４〜２７のいずれか一項に記載の細胞。
【００３６】
３０．前記細胞集団が前記所望の密度にあるときに、前記集団中の細胞の全てが溶解されるわけではなく、それによって溶解後の前記細胞の再増殖を可能にし、前記治療用ポリペプチドのパルス放出を促進する、項１０〜２９のいずれか一項に記載の細胞。
【００３７】
３１．前記誘発因子のレベルが、前記細胞を溶解する前記ポリペプチドと同じ調節可能なプロモーターによって制御される、項１８〜３０のいずれか一項に記載の細胞。
【００３８】
３２．前記治療用ポリペプチドが、溶血素Ｅを含んでなる、項３〜３１のいずれか一項に記載の細胞。
【００３９】
３３．前記細胞が、腫瘍の壊死領域内に優先的に局在する、項１〜３２のいずれか一項に記載の細胞。
【００４０】
３４．前記ポリペプチドの放出のタイミングが、遺伝子回路の活性に直接的または間接的に連動している、項１〜３３のいずれか一項に記載の細胞。
【００４１】
３５．前記遺伝子回路が、ＣｌｐＸＰプロテアーゼの活性を制御する遺伝子回路を含ん
でなる、項３４に記載の細胞。
【００４２】
３６．前記放出されたポリペプチドがＬＡＡタグを含んでなる、項３５に記載の細胞。
【００４３】
３７．前記放出されたポリペプチドでの前記ＣｌｐＸＰプロテアーゼの活性レベルが、過酸化水素のレベルによって制御される、項３５〜３６のいずれか一項に記載の細胞。
【００４４】
３８．前記細胞の溶解のタイミングが、遺伝子回路の活性に直接的または間接的に連動している、項１０〜３７のいずれか一項に記載の細胞。
【００４５】
３９．前記細胞の溶解のタイミングに連動する前記遺伝子回路が、前記ＣｌｐＸＰプロテアーゼの活性を制御する遺伝子回路を含んでなる、項３８に記載の細胞。
【００４６】
４０．前記細胞を溶解するポリペプチドが、ＬＡＡタグを含んでなる、項３９に記載の細胞。
【００４７】
４１．前記細胞を溶解する前記ポリペプチドでの前記ＣｌｐＸＰプロテアーゼの活性レベルが、過酸化水素のレベルによって制御される、項３９〜４０のいずれか一項に記載の細胞。
【００４８】
４２．項１〜４１のいずれか一項に記載の細胞の複数の株を含んでなる回収物であって、前記株が前記所望の密度に達したときに、各株が異なるポリペプチドを放出する、前記回収物。
【００４９】
４３．前記複数の株中の各株が異なる抗生物質に対して耐性である、項４２に記載の回収物。
【００５０】
４４．前記複数の菌株中の各株が、前記回収物中の他の株に作用するバクテリオシンを産生する、項４２に記載の回収物。
【００５１】
４５．前記複数の株の１つ以上の株が、前記回収物中の１つ以上の他の株の放出頻度とは異なる頻度でポリペプチドを放出する、項４２に記載の回収物。
【００５２】
４６．個体にポリペプチドを与える方法であって、項１〜４１のいずれか一項に記載の細胞を、前記個体における前記細胞による前記ポリペプチドの放出を促進する条件下で、前記個体に投与することを含んでなる、前記方法。
【００５３】
４７．個体の健康状態を治療する方法であって、項１〜４１のいずれか一項に記載の細胞を前記個体に投与することを含んでなり、前記ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、前記方法。
【００５４】
４８．前記ポリペプチドが、腫瘍の増殖を殺すか、または阻害するポリペプチドであり、前記腫瘍に前記細胞を送達する様式で前記細胞を投与する、項４６〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【００５５】
４９．前記ポリペプチドがパルス様式で前記個体において放出される、項４６〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【００５６】
５０．前記個体に第２の治療剤を投与することをさらに含んでなる、項４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【００５７】
５１．項１〜４１のいずれか一項に記載の前記細胞を前記個体に投与するのと同時に、前記第２の治療剤を前記個体に投与する、項５０に記載の方法。
【００５８】
５２．項１〜４１のいずれか一項に記載の前記細胞を前記個体に投与するのとは異なる時に、前記第２の治療剤を前記個体に投与する、項５０に記載の方法。
【００５９】
５３．前記第２の治療剤が、化学療法剤または生物学的治療剤である、項５０に記載の方法。
【００６０】
５４．前記第２の治療剤が５−フルオロウラシルを含んでなる、項５３に記載の方法。
【００６１】
５５．複数のポリペプチドを個体に与える方法であって、項４２〜４５のいずれか一項に記載の細胞の複数の株を含んでなる回収物を、前記複数の株による前記異なるポリペプチドのそれぞれの放出を前記個体において促進する条件下で、前記個体に投与することを含んでなる前記方法。
【００６２】
５６．前記異なるポリペプチドの１つ以上が、腫瘍の増殖を殺すかまたは阻害する治療用ポリペプチドであり、前記細胞の前記複数の株を含んでなる前記回収物を、前記細胞の前記複数の株を前記腫瘍に送達する様式で投与する、項５５に記載の方法。
【００６３】
５７．前記治療用ポリペプチドが、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発するポリペプチドである、項５６に記載の方法。
【００６４】
５８．前記治療用ポリペプチドが、Ｔ細胞または樹状細胞を動員するポリペプチドである、項５６に記載の方法。
【００６５】
５９．前記治療用ポリペプチドが、アポトーシスを引き起こすか、または促進するポリペプチドである、項５６に記載の方法。
【００６６】
６０．前記治療用ポリペプチドが、抗癌剤の放出および/または効能を増強するポリペ
プチドである、項５６に記載の方法。
【００６７】
６１．前記抗癌剤がリポソーム抗癌剤である、項６０に記載の細胞。
【００６８】
６２．前記異なるポリペプチドの各々が、パルス様式で前記個体において放出される、項５５〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【００６９】
６３．前記複数の株中の第１の株を前記個体に投与し、所望の期間増殖させ、続いて前記複数の株中の第２の株を前記個体に投与し、所望の期間増殖させ、前記第２の株の投与の結果として、前記第１の株の増殖が防止または阻害される、項５５〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【００７０】
６４．前記第１の株が第１の抗生物質に耐性であり、第２の抗生物質に感受性であり、前記第２の株が前記第２の抗生物質に耐性であり、前記第１の抗生物質に感受性であり、前記第１の株の増殖が求められる場合には、前記第１の抗生物質を前記個体に投与し、前記第２の株の増殖が求められる場合には、前記第２の抗生物質を前記個体に投与する、項６３１に記載の方法。
【００７１】
６５．前記第１の株が、第２の株の増殖を殺すか、または阻害する第１のバクテリオシ
ンを産生し、前記第２の株が、前記第１の株の増殖を殺すか、または阻害するバクテリオシンを産生する、項６３に記載の方法。
【００７２】
６６．前記複数の株中の前記株のそれぞれを、前記個体に周期的に投与する、項５５〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【００７３】
６７．前記個体における前記複数の株のうちの１つのみの増殖を、前記複数の株中の他の株の増殖が防止または阻害されている間に一時促進する、項５５〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【００７４】
６８．前記細胞から個体に放出されるポリペプチドを与えるための項１〜４１のいずれか一項に記載の細胞の使用。
【００７５】
６９．個体の健康状態を治療する個体における健康状態を治療するための項１〜４１のいずれか一項に記載の細胞の使用。
【００７６】
７０．個体に複数のポリペプチドを与えるための項１〜４１のいずれか一項に記載の細胞の複数の株を含んでなる回収物の使用。
【００７７】
７１．前記ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、項６８〜７０のいずれか一項に記載の使用。
【００７８】
７２．前記治療用ポリペプチドが、腫瘍細胞を殺すか、または腫瘍細胞の増殖を阻害するポリペプチドである、項７１に記載の使用。
【００７９】
７３．前記治療用ポリペプチドが、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発するポリペプチドである、項７１に記載の使用。
【００８０】
７４．前記治療用ポリペプチドが、Ｔ細胞または樹状細胞を動員するポリペプチドである、項７１に記載の使用。
【００８１】
７５．前記治療用ポリペプチドが、アポトーシスを引き起こすか、または促進するポリペプチドである、項７１に記載の使用。
【００８２】
７６．前記治療用ポリペプチドが、抗癌剤の放出および/または効能を増強するポリペ
プチドである、項７１に記載の使用。
【００８３】
７７．前記抗癌剤がリポソーム抗癌剤である、項７６に記載の使用。
【００８４】
７８．前記ポリペプチドがパルス様式で前記個体において放出される、項６８〜７７のいずれか一項に記載の使用。
【００８５】
７９．前記個体に第２の治療剤を投与することをさらに含んでなる、項６８〜７８のいずれか一項に記載の使用。
【００８６】
８０．項１〜４１のいずれか一項に記載の前記細胞を前記個体に投与するのと同時に、前記第２の治療剤を前記個体に投与する、項７９に記載の使用。
【００８７】
８１．項１〜４１のいずれか一項に記載の前記細胞を前記個体に投与するのとは異なる時に、前記第２の治療剤を前記個体に投与する、項７９に記載の使用。
【００８８】
８２．前記第２の治療剤が、化学療法剤または生物学的治療剤である、項７９に記載の使用。
【００８９】
８３．前記第２の治療剤が５−フルオロウラシルを含んでなる、項８１に記載の方法。
【００９０】
８４．前記複数の株中の第１の株を前記個体に投与し、所望の期間増殖させ、続いて前記複数の株中の第２の株を前記個体に投与し、所望の期間増殖させ、前記第２の株の投与の結果として、前記第１の株の増殖が防止または阻害される、項７０に記載の使用。
【００９１】
８５．前記第１の株が第１の抗生物質に耐性であり、第２の抗生物質に感受性であり、前記第２の株が前記第２の抗生物質に耐性であり、前記第１の抗生物質に感受性であり、前記第１の株の増殖が求められる場合には、前記第１の抗生物質を前記個体に投与し、前記第２の株の増殖が求められる場合には、前記第２の抗生物質を前記個体に投与する、項８４に記載の使用。
【００９２】
８６．前記第１の株が、第２の株の増殖を殺すか、または阻害する第１のバクテリオシンを産生し、前記第２の株が、前記第１の株の増殖を殺すか、または阻害するバクテリオシンを産生する、項８４に記載の使用。
【００９３】
８７．前記複数の株中の前記株のそれぞれを、前記個体に周期的に投与する、項７０〜８６のいずれか一項に記載の使用。
【００９４】
８８．前記個体における前記複数の株のうちの１つのみの増殖を、前記複数の株中の他の株の増殖が防止または阻害されている間に一時促進する、項７０〜８７のいずれか一項に記載の使用。
【００９５】
８９．前記放出されるポリペプチドをコードする核酸を細菌接合を介して前記細胞に導入することを含んでなる、項１〜４１のいずれか一項に記載の細胞を作製する方法。
【００９６】
９０．前記細胞を溶解する前記ポリペプチドをコードする核酸を前記細胞に導入することを含んでなる、項１４〜４１のいずれか一項に記載の細胞を作製する方法。
【００９７】
９１．前記核酸の導入を、細菌接合を介して実施する、項８９〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【００９８】
上記の概要は例示的なものに過ぎず、決して限定することを意図するものではない。上記の例示的な態様、実施形態、および特徴に加えて、本開示の他の態様、実施形態、対象、および特徴は、図面および以下の詳細な説明および特許請求の範囲から完全に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１−１】ＳＬＣの一実施形態の構築および特徴付け。（Ａ）回路はアクチベーター（Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44, 2012）および溶解プラスミドを含む。集団が臨界ＡＨＬ濃度でクオラム閾値に達すると、ｌｕｘＩプロモーターは、溶解のための遺伝子Ｅ、ＬｕｘＩ、およびｓｆＧＦＰ、またはリポーターモジュールとしてのｌｕｘＣＤＡＢＥの転写を駆動する。ｌｕｘＩまたはｐｔａｃプロモーターはまた、インビボ回路では治療的遺伝子の転写を駆動する。この系におけるＬｕｘＲは天然のｐＬｕｘＲプロモーターによって駆動される。（Ｂ）播種からクオラム「発火」までの各溶解サイクルの主な段階を説明する図。図の下のパネルには、マイクロ流体グロースチャンバ内の３つの主なクオラム発火段階を経る回路保有細胞の典型的な時系列画像が示されている（Danino, T., Mondragon-Palomino, O., Tsimring, L. & Hasty, J. A synchronized quorum of genetic clocks. Nature 463, 326-330, 2010）。
【図１−２】ＳＬＣの一実施形態の構築および特徴付け。（Ｃ）典型的なマイクロ流体実験の蛍光プロファイル。推定される細胞集団の軌跡は、溶解事象がｓｆＧＦＰ蛍光のピークに対応することを明らかにする。（Ｄ）マイクロ流体デバイスの培地チャネルにおける推定流速および環境温度の関数としての周期。エラーバーは、１３〜５０ピークの±１標準偏差を示す。上記実験は、Stecher, B. et al.Flagella and chemotaxis are required for efficient induction of Salmonella enterica serovar typhimurium colitis in streptomycin-pretreated mice. Infection and Immunity 72, 4138-4150 (2004)に記載されている株１を用いて行った。完全な株の情報については補足情報を参照されたい。
【図２−１】計算モデリングおよび調整可能性。（Ａ）計算モデルからの細菌コロニーについての時系列のコロニーサイズ、コロニーＡＨＬ、単一細胞ｓｆＧＦＰまたはＬｕｘＩの細胞内濃度、および単一細胞溶解タンパク質の細胞内濃度。（Ｂ）ＣｌｐＸＰによるＬｕｘＩの分解を変化させることによって発振周期を調整する能力を示す計算モデルの結果。実線：コロニーサイズ；破線：単一細胞溶解タンパク質の細胞内濃度。
【図２−２】計算モデリングおよび調整可能性。（Ｃ）ＬｕｘＩ  ｓｓｒＡ（塗りつぶしの円を結ぶ線、株２）および非ｓｓｒＡ（白抜きの円を結ぶ線、株１）タグ付き型の回路の溶解発振を示す蛍光プロファイル。（Ｄ）飽和および不飽和ＡＨＬ条件およびモデル予測（差込み図）下の回路の挙動。２００ｎＭのＡＨＬ下での定常状態の溶解挙動は、安定した蛍光出力によって特徴付けられ、一方、ＡＨＬの除去は系を発振挙動（株１）に戻す。破線：ＡＨＬ濃度。実線：蛍光。
【図３−１】インビトロでの治療の特徴付け。（Ａ）癌細胞および細菌のマイクロ流体共培養の図。このチップでは、癌細胞接着を可能にし、放出された治療剤をトラップからチャネルに拡散させるために、安定したほぼ停滞する流量減少を達成するために、流体抵抗性を改変した（補足情報の方法を参照）。（Ｂ）サルモネラ（S. typhimurium）（株３）「発火」、溶解、およびＨｅＬａ細胞死を経時的に可視化する共培養時系列からのフレーム。（Ｃ）時間の経過に伴う（Ｂ）からの細菌の蛍光プロファイル（白抜きの円）およびＨｅＬａ細胞の生存率（塗りつぶしの円）（画像フレーム中の生存細胞数／死細胞数）。
【図３−２】インビトロでの治療の特徴付け。（Ｄ）ＳＬＣ＋ＨｌｙＥ回路（株４）、ＳＬＣのみの回路（株５）、構成的ｈｌｙＥのみ（株６）、またはプラスミドなし（株７）を保有するサルモネラ（S. typhimurium）培養からの上清と共に共培養したＨｅＬａ細胞の生存率％。エラーバーは、３回の測定で平均した±１標準誤差を示す。（Ｅ）種々の初期播種密度でＨｅＬａ細胞と共培養したＳＬＣ＋ＨｌｙＥ回路（株４）の蛍光プロファイル。黒い「ｘ」は、完全なＨｅＬａ細胞死の時点を示す。（Ｆ）ｓｆＧＦＰ産生速度の関数としての、蛍光の初期存在からＨｅＬａ細胞死まで測定した毒素曝露時間（（Ｅ）の例を参照）。死に至る時間は播種に依存するが、曝露の総量は保存されている（差込み図）。エラーバーは、３回の測定での±１標準誤差を示す。ＥＬＨ１３０１宿主株情報については補足情報を参照されたい（Hohmann, E. L., Oletta, C. A. & Miller, S. I. Evaluation of a phop/phoq-deleted, aroa-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers.Vaccine 14, 19-24, 1996）。
【図４−１】インビボ治療および動態。（Ａ）安定化された治療用ｔＳＤＣ株（株８、クオラム療法およびクオラム溶解）を有する腫瘍マウスの経時的ＩＶＩＳイメージング。（Ｂ）この株を有するサルモネラ（S.typhimurium）注射後の個々の腫瘍からの相対発光プロファイル。（Ｃ）ゲノム組み込みされた構成的発光株（株９）からの相対発光プロファイル。終点発光は、構成的発光株（右）に対して平均して３２倍高い。（Ａ）〜（Ｃ）の実験は、より高い発光シグナルのために腫瘍内注入によって行った（図７Ａも参照）。
【図４−２】インビボ治療および動態。（Ｄ）ｔＳＤＣ回路（実線、株１０）およびプラスミドのない対照（破線、株７）を注射した腫瘍マウスの経時的平均相対腫瘍容積。個々の相対腫瘍容積の軌跡が示されており（中央）、実線または破線は平均の軌跡を表している。両方の場合の最終相対的腫瘍容積が示されている（右）。エラーバーは、対照およびｔＳＤＣの両方の場合について、それぞれ１７および２２の個々の腫瘍について±１標準誤差を示す。各場合、＞９マウスからなった。＊Ｐ＜０．０１、１元配置分散分析。（Ｄ）の実験は、静脈内注射によって行った（図７Ｂも参照）。（Ｅ）試験した３つの株（細菌のみ、株７；ｔＳＤＣ、株１０；構成的治療株、株１２）の実験からの相対回収重量を示す。エラーバーは、５〜１１匹の個々のマウスについて±１標準誤差を示す。＊＊Ｐ＜０．０００１、１元配置分散分析。
【図５−１】様々な細菌宿主における回路ロバスト性。（Ａ）サルモネラ（S.typhimurium）（株１）の典型的なマイクロ流体実験について、グロースチャンバ内の連続的な発振周期当りに溶解された細菌細胞の割合および数。実線：溶解された細胞の割合。破線：溶解された細胞。（Ｂ）大腸菌について、マイクロ流体デバイスの培地チャネルにおける推定流速の関数としての周期。エラーバーは、１２〜１９ピークの±１標準偏差を示す。（Ｃ）大腸菌について、環境温度の関数としての周期。回路は、大腸菌では３７℃以上の温度では発振しない。エラーバーは、１２〜１９ピークの±１標準偏差を示す。（ｂ）および（ｃ）における実験は、株１３を用いて行った。
【図５−２】様々な細菌宿主における回路ロバスト性。（Ｄ）大腸菌におけるｓｓｒＡ（実線および塗りつぶしの円、株１３）、ＴＳ−ｓｓｒＡ（破線および白抜きの円、株１５）および非ｓｓｒＡ（破線および塗りつぶしの円、株１４）タグ付きＬｕｘＩ型の回路について回路挙動を示す蛍光プロファイル。回路が発振挙動を失い、分解効率が低下するため、周期は、大腸菌において可変分解タグ戦略を用いて調整可能ではない。（Ｅ）回路が発振挙動を示す流れおよび温度パラメータ空間内の領域。サルモネラ（S.typhimurium）の株パラメータは、ロバストな発振を可能にするより広い領域を与える（本明細書の追加情報を参照）。ヒートマップの色は、発振の周期に対応する。
【図６−１】溶解が媒介する細胞内放出の調査。（Ａ）放出後のｓｆＧＦＰ可視化のための０．４μｍシンクを有する細菌グロースチャンバ。（Ｂ）典型的な発振サイクル（株１）についての細菌の数（破線および白抜きの円）、細菌の蛍光（実線および塗りつぶしの円）、シンク蛍光（実線および白抜きの円）。（Ｃ）（Ｂ）からのマイクロ流体シンクの蛍光時系列画像。
【図６−２】溶解が媒介する細胞内放出の調査。（Ｄ）マイクロ流体デバイスで細菌および癌細胞共培養実験を行うための一般的手順（補足情報も参照）（Kolnik, M., Tsimring, L. S. & Hasty, J. Vacuum-assisted cell loading enables shear-free mammalian microfluidic culture.Lab On a Chip 12, 4732-4737 (2012)）。
【図７】インビボでの治療用回路の調査。（Ａ）約２０時間の増殖後の図４で使用した治療株についての終点インビトロ発光強度。宿主株ＡおよびＢは、株８および１０である。宿主Ａは宿主Ｂよりも約２倍高い発光を示す。（Ｂ）治療用回路を保有するサルモネラ（S.typhimurium）は尾静脈を介して注射され、その後腫瘍に局在する。（Ｃ）ｔＳＤＣ（太い実線）、構成的療法／基礎溶解株（細い破線）、および細菌のみの対照（太い破線）を有する腫瘍マウスの経時的な相対的体重。エラーバーは、対照および治療の場合についてそれぞれ５匹および１１匹のマウスについて±１標準誤差を示す。実験は静脈内で行った。（Ｄ）プレートリーダーで測定したインビボで使用される様々な回路（株７、１０、および１２）のインビトロでの増殖曲線。
【図８−１】本研究で使用した一部のプラスミドの図示（本明細書の追加情報を参照）。
【図８−２】本研究で使用した一部のプラスミドの図示（本明細書の追加情報を参照）。
【図８−３】本研究で使用した一部のプラスミドの図示（本明細書の追加情報を参照）。
【図９】クオラムクロックは、小さなマイクロ流体デバイス（１００細胞）を使用して観察される機能ために臨界コロニーサイズを必要とするため、クオラムクロックの寄与がない高速かつ非同期の細胞内クロック発振。
【図１０−１】共有分解に基づく迅速な翻訳後結合プラットフォーム。（Ａ）ｌｕｘプロモーターを導入し（破線の矢印）、単一細胞においてスーパーフォルダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）−ＬＡＡ（ｌｕｘプロモーター，実線矢印）およびＣＦＰ−ＬＡＡ（Ｐlac/ara-1プロモーター，実線矢印）の応答を追跡することによる単一実験において、ＣｌｐＸＰ分解によるモジュール−モジュール調整（１±１分（±ｓ．ｅ．ｍ．），点線の矢印で表される）と、転写および翻訳を介した入出力応答（３１±５分）とに関連する遅延を測定した（右パネル，３つの代表的なペアが強調表示された５５個の灰色細胞の軌跡ペア）。
【図１０−２】共有分解に基づく迅速な翻訳後結合プラットフォーム。（Ｂ）外部から供給されたＨ2Ｏ2によるタンパク質分解の迅速な（＜２分、我々の実験時間ステップ）誘発は、ＲｓｓＢの妨害に応答してＣｌｐＸＰロードの可逆的変化を生じる。
【図１０−３】共有分解に基づく迅速な翻訳後結合プラットフォーム。（Ｃ）下流モジュールを駆動する翻訳後結合を使用するために、同一のＬＡＡタグの付加により、定常的に発現される蛍光タンパク質にクオラムクロックを連結した。同じ分解タグを使用すると、構成モジュールはクオラムペースメーカに密接に結合する。分解タグの前に可変長リンカー（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（ＴＳ）リピート）を加えると、分解動態を位相シフトし、より長いリンカーがより長い遅延を生じる。エラーバーは、平均を中心とするオフセット時間の標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す（各ＴＳ−リンカー長について５０〜２００細胞）。ａ．ｕ．、任意単位。
【図１１−１】複数のスケールでの翻訳後に連結された遺伝子クロック。（Ａ）ネットワークは、結合された細胞内クオラムクロックで構成される。細胞内クロックは、それ自身のプロモーター上の遅延したネガティブフィードバックの結果として発振し、その周期はＩＰＴＧおよびアラビノースによって調整可能である。クオラムクロック発振は、培地流速によって調整可能であり、コロニーレベルでＡＨＬを介して同期される。（Ｂ）結合された細胞内クオラムクロック系は、少数の集団で非同期に発振し、クロラムクロックが一度発火すると、より大きな集団の同期発振に移行する。細胞間コミュニケーション自体のモードが欠如しているにもかかわらず、細胞内クロックの変動係数（ＣＶ）は、クオラムクロックとの宿主連鎖性結合により著しく低下する（下、２８の単一細胞トレースからのデータ）。
【図１１−２】複数のスケールでの翻訳後に連結された遺伝子クロック。（Ｃ）ＩＰＴＧは、クオラムクロックなしの小細胞集団における細胞内クロック周期（実線）を減少させ、クオラムクロックありの大きな集団における結合周期（破線）を増加させる。各データ点は、１０〜３０の発振ピークから取られた。エラーバーは、平均を中心とし、周期のｓ．ｅ．ｍ．を示す。（Ｄ）我々の計算モデルでは、細胞内クロックが結合パルス間で発振を継続し、パルスの開始を促進するので、ロード介在結合により、細胞内クロックは、ＣｌｐＸＰでの分解結合を介してクオラムクロック周期を変調することが可能になる。
【図１１−３】複数のスケールでの翻訳後に連結された遺伝子クロック。（Ｅ）パルス周波数変調のこの適応形は、パルス間の持続時間が調整されている間、パルス動態が変化しないことを保証する（左，モデル；右、実験；６〜９発振ピーク）。差込み図は、細胞内クロックに起因する結合パルスのより早い開始を示す。エラーバーは相対的なクオラムクロック周期のｓ．ｅ．ｍ．を示す。（Ｆ）この機構はまた、より高い培地流速での発振を可能にすることにより、結合系をよりロバストにする。ＮＦＢ，ネガティブフィードバックオシレータ；ＱＳ，クオラムセンシングオシレータ。
【図１２−１】遺伝的マルチスペクトルコード化。（Ａ）別個のＩＰＴＧおよびアラビノースならびに流速の入力を、細胞内クロックのレポーターの時系列から測定できる周波数変調発振にコード化する。この遺伝子操作された系は、２つの基礎をなすネットワークからの情報を単一のマルチスペクトル時系列にコード化することができる。太い実線：ＱＳ（ＣＦＰ）；細い実線：ＮＢＦ（ＹＦＰ）。
【図１２−２】遺伝的マルチスペクトルコード化。（Ｂ）細胞内クロック（上部，それぞれ３０個の単一細胞トレースからのデータ）およびクオラムクロック（底部，元の研究からのデータを単離して適用したモデル）の実験データおよび計算モデルから作成された周波数応答曲線。エラーバーは、平均を中心とし、周期のｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図１２−３】遺伝的マルチスペクトルコード化。（Ｃ）結合系では、両方のクロックからの周波数変調発振が細胞内クロックの出力で観測され、逆フーリエ変換によって抽出される（差込み図，補足情報の方法）。
【図１２−４】遺伝的マルチスペクトルコード化。（Ｄ）ＩＰＴＧおよびアラビノースならびに流速の入力の両方の独立した回復。ＩＰＴＧおよびアラビノースに対する細胞内クロックの周波数応答は、孤立したクロックと同等であり（上部）、クオラムクロックの周波数応答は、細胞内クロックによってシフトされる（下部）。各条件について５〜１０個の単一細胞トレースから周期を算出した。エラーバーは、平均を中心とし、周期のｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図１３−１】マルチコロニーレベルでの翻訳後結合。（Ａ）マルチコロニーレベルでは、酸化還元シグナリングによって産生されたＨ2Ｏ2と細胞ストレス応答ネットワークとの相互作用は、コロニー間のクオラムクロック発振を同期させる。アレイ全体で１０個の別個のコロニーからトレースを取った。（Ｂ）宿主連鎖性発振は、ＮＤＨ（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼＩＩ）の酵素活性によって生じるＨ2Ｏ2に応答して、別個の波形の様相を変化させる。Ｈ2Ｏ2（破線）では、発振はより大きな振幅とより急なダウンスロープを有し、合成クロックネットワークと天然のストレス応答との相互作用によって生じる転写および分解の両方の増加を明らかにする。暗い線は、全ての軌跡の平均を示す。
【図１３−２】マルチコロニーレベルでの翻訳後結合。（Ｃ）Ｈ2Ｏ2は、発振振幅を増加させる一方、必要な分解時間を減少させ、ＣｌｐＸＰ活性の増加を明らかにする。実線：Ｈ2Ｏ2なし；破線：Ｈ2Ｏ2あり。Ｈ2Ｏ2に応答するＣｌｐＸＰ能力のこの増加は、周期における振幅変動の影響を最小限に抑えることによって転写ノイズの影響を緩和するのに役立ち、Ｈ2Ｏ2による周期分布の引き締めをもたらす（モデル，図１７Ｃ、図１７Ｄ）。
【図１４−１】ＴＳリンカー配列の長さを長くすると、下流モジュール分解の遅延が増大する。（Ａ）単一蛍光軌跡分析の詳細な内容。ピークは塗りつぶしの円、トラフは開いた菱形、アップスロープ１０％点は塗りつぶしの四角、ダウンスロープ１０％点は塗りつぶしの菱形で示されている。２周期測定値は、ピーク・トゥ・ピーク値であり、２つの連続する１０％のアップスロープ点の間の時間である。（Ｂ）上部：ｓｆＧＦＰは、ＣＦＰ蛍光チャネルへのブリードオーバーを示さない。１０ｎＭアシル−ホモセリンラクトン（ＡＨＬ，破線）を用いるｓｆＧＦＰの導入は、ｓｆＧＦＰの蛍光の増加を示したが、これはＣＦＰチャネルでは検出されなかった。底部：公表されているＡＡＶ分解タグの使用（Andersen, J. B. et al.New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria.Appl.Environ.Microbiol.64, 2240-2246 (1998)) は、１５分の下流モジュール分解の遅延を示す。
【図１４−２】ＴＳリンカー配列の長さを長くすると、下流モジュール分解の遅延が増大する。（Ｃ）ＴＳリンカー配列がなければ、ダウンストリームモジュール分解にはほとんど遅延がない。（Ｄ）単一ＴＳリンカー配列により１０分の遅延が生じる。
【図１４−３】ＴＳリンカー配列の長さを長くすると、下流モジュール分解の遅延が増大する。（Ｅ）二重ＴＳリンカー配列により、ＡＡＶ分解配列と同様に１６分の遅延が生じる。（Ｆ）５−ＴＳリンカー配列により２５分の遅延が生じる（図１０Ｃを作成するためにＣ〜Ｆに示されるデータを使用した）。図１４Ｃ〜１４Ｆにおいて、暗い線は、全ての軌跡の平均を示す。
【図１５−１】ＡＨＬによる細胞間コミュニケーションは、クオラムクロックの変動を低減する。（Ａ）個々の「リーダー」細胞は、平均集団応答と比較して、クオラムクロックタンパク質の早期活性化を示す。（Ｂ）２細胞シミュレーションでは、細胞１および２は、ＡｉｉＡおよびＬｕｘＩの僅かに異なる構成的産生と連動せずに開始する。ｔ＝１００分で、２つの細胞は培地中の外部ＡＨＬを介して連動され、より遅い動態を有する細胞（細胞２）が、より短い期間で細胞１に連動することを示す。
【図１５−２】ＡＨＬによる細胞間コミュニケーションは、クオラムクロックの変動を低減する。（Ｃ）細胞１および２は、細胞１内でより高い頻度の発振を生じる細胞内クロック動態（緑色）を含む細胞１と連動せずに開始する。細胞が連動されると（ｔ＝１００）、遅い細胞２は、細胞内クロックなしでは、細胞間の外部ＡＨＬコミュニケーションを介してより速い細胞に連動する。（Ｄ）ｌｕｘプロモーターでノイズの多い構成的産生を伴う２０個の細胞の軌跡（異なる線トレース）は、それらの外部ＡＨＬプールがｔ＝４００分で混合されるときに同期する。平均軌跡は太い実線で示されている。
【図１５−３】ＡＨＬによる細胞間コミュニケーションは、クオラムクロックの変動を低減する。（Ｅ）細胞同期後（右斜め）の周期変動は、個々の細胞（左斜め）よりも低い。ＱＳ：クオラムセンシングオシレータ
【図１６−１】細胞内クロックは、クオラムクロックの周期を短縮することにより、結合オシレータ系のロバスト性を向上させる。（Ａ）細胞内クロック強度を増加させるＩＰＴＧの除去は、より規則的な発振をもたらす（実験上）。（Ｂ）ＩＰＴＧなしの結合オシレータのパルス間時間の変動性の減少は、細胞内クロックがパルス間動態において重要な役割を果たすことを示唆している（実験上）。
【図１６−２】細胞内クロックは、クオラムクロックの周期を短縮することにより、結合オシレータ系のロバスト性を向上させる。（Ｃ）非常に高い流速では、クオラムクロックは不規則に発振する。細胞内クロックをチューニングすることにより、クオラムクロック周期が短縮され、規則的な発振が回復し、Ｈ2Ｏ2バイオピクセル（biopixel）結合によるコロニー間の全体的なレベルの同期が可能になる。細胞内クロック（０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ）の遺伝子追加は、高い流速（４３０μｍｓ-1）でクオラムクロックを同期させるのに役立つ。ＩＰＴＧを除去して細胞内クロックの強度を増加させることにより、Ｈ2Ｏ2のコロニー間の同期化がさらに促進される（実験上，黒い太線は実験的競走の平均を示す）。
【図１７】Ｈ2Ｏ2はＣｌｐＸＰによる分解速度を増加させ、これはｌｕｘプロモーターでの転写増加と組み合わさって、オシレータ周期の変動性を減少させる。（Ａ）Ｈ2Ｏ2による分解時間の有意な減少がある（実験上）。（Ｂ）Ｈ2Ｏ2に起因する分解時間の減少は、ＣｌｐＸＰ分解速度の有効な増加によるものである（実験上）。（Ｃ）ｌｕｘプロモーター単独のＨ2Ｏ2活性化は、クオラムクロック発振の振幅を増加させるだけである。同様に、ＣｌｐＸＰ活性のＨ2Ｏ2依存性増加は、より急な分解およびより長いパルス間持続時間をもたらすだけである。２つの効果の組み合わせは、実験（モデル）と一致する振幅の増加およびパルス間持続時間の減少をもたらす。（Ｄ）個別には、２つのＨ2Ｏ2効果は、クオラムクロック周期ＣＶを低下させることはほとんどなく、両方とも存在するときに低下する（モデル）。
【図１８−１】計算モデリングおよび調整可能性。（Ａ）モデルは細胞内変数（溶解遺伝子ＥおよびＬｕｘＩ）ならびに細胞外変数（コロニーサイズおよびＡＨＬ）からなる。右側に時系列のコロニーサイズ（上パネル，破線）、コロニーＡＨＬ（上パネル，実線）、細胞内ＬｕｘＩ（下パネル、破線）および溶解タンパク質（下パネル，実線）が示されている。（Ｂ）温度の代用としてのｃｌｐＸＰ媒介性分解のためのモデルパラメータ空間における領域（Purcell, O., Grierson, C. S., Bernardo, M. & Savery, N. J. Temperature dependence of ssra-tag mediated protein degradation.Journal of BiologicalEngineering 6, 10, 2012）およびモデル出力が振動性である流れは、より高い産生および分解項で増加する。
【図１８−２】計算モデリングおよび調整可能性。（Ｃ）ＬｕｘＩのＣｌｐＸＰ媒介性分解を変化させることによって発振周期を調整する能力を示す計算モデルからの結果。（Ｄ）ＬｕｘＩ  ｓｓｒＡ（塗りつぶしの円を結ぶ線、株２）および非ｓｓｒＡ（白抜きの円を結ぶ線、株１）タグ付き型の回路の溶解発振を示す蛍光プロファイル。完全なモデルの情報については、補足情報を参照されたい。
【図１９−１】インビボ細菌動態。（Ａ）安定化されたＳＬＣ−ｈｌｙ株（株８，同期溶解および治療）で１回注射された２つの後部側腹腫瘍を有するマウスの経時的なＩＶＩＳイメージング。（Ｂ）（Ａ）の画像からの左（実線）および右（破線）腫瘍の（０ｈでの発光に対する）相対発光プロファイル。（Ｃ）ＳＬＣ−ｈｌｙ株の細菌発光の単一腫瘍密度マップの軌跡。
【図１９−２】インビボ細菌動態。（Ｄ）ゲノム組み込みされた構成的発光株（株９）からの相対発光プロファイル。腫瘍内注射により、静脈内注射と比較して注射後発光が３５倍以上高くなった（図２３Ｄ）。（Ｂ）と（Ｄ）の線軌跡の各値は、プロットの上の密度マップとして示されている。（Ｅ）構成的株についての細菌発光の単一腫瘍密度マップ軌跡。各軸のデータは、別々の実験を表す。
【図１９−３】インビボ細菌動態。（Ｆ）ＳＬＣ＋構成的ｈｌｙＥ（実線，ｎ＝９マウス，株１１）、構成的ｈｌｙＥを有する非ＳＬＣ株（点線，ｎ＝５マウス，株１２）、またはプラスミドのない対照株（破線，ｎ＝９マウス、株７）を単回静脈内注射した皮下腫瘍マウスの経時的平均相対体重（＊＊＊Ｐ＜０．００１，ボンフェローニ事後検定（Bonferroni post test）を用いた二元分散分析，ｓ．ｅ．）。（Ｇ）ＳＬＣ−３株（実線，株１０、１４、および１５）ならびにプラスミドのない対照（破線，株７）を注射した皮下腫瘍を有するマウスの経時的平均相対体重。細菌を、０、２、６、および１０日目（黒色矢印）に腫瘍内に注射した（両方の場合、ｎ＝１０マウス，ｓ．ｅ．）。
【図２０】インビボ治療。（Ａ）細菌または化学療法（５−ＦＵ）の投与計画でのマウスの肝臓大腸転移の実験同系移植モデルの図。細菌を経口的に送達し、５−ＦＵは腹腔内注射によって送達した。（Ｂ）ＳＬＣ−３株（太い実線）、５−ＦＵ化学療法（細い実線）、または組み合わせ（破線）を与えた肝臓大腸転移を有するマウスの経時的相対的体重。エラーバーは、５〜７匹のマウスについて±１標準誤差を示す。（Ｃ）（Ｂ）からの化学療法および遺伝子操作された細菌療法の場合についての、ＩＶＩＳイメージングを用いて腫瘍細胞発光を介して測定した相対的腫瘍活性の中央値。（Ｄ）（Ｂ）からの併用療法の場合の相対的腫瘍活性の中央値。（Ｃ）および（Ｄ）のエラーバーは、５〜７匹のマウスの四分位範囲を示す。破線は腫瘍活性の相対値０．７０を示す。（Ｅ）時間の経過に伴う３０％の腫瘍活性の低下に対応する（Ｂ）の場合からのマウスの割合。（Ｆ）（Ｂ）におけるマウスの経時的な生存率（＊＊Ｐ＜０．０１，ログランク検定；ｎ＝５〜７マウス）。
【図２１】ＳＬＣの様々な特性。（Ａ）トラップの外側の細胞の溶解および流れの影響を含む、サルモネラ（S.typhimurium）（株１）に関する典型的なマイクロ流体実験についてのグロースチャンバ内の連続的発振サイクル当りの除去された細菌細胞の割合および数。上の線：除去率；下の線；除去された細胞。（Ｂ）初期溶解事象の生存細菌（１６０分枠、囲まれた部分）が溶解感受性の子孫（２５０分枠、囲まれた部分）を産生するグロースチャンバの一部を示す（Ａ）の実験からの時系列画像のサブセット。（Ｃ）大腸菌（株１３）の環境温度の関数としての周期。回路は、大腸菌では３７℃以上の温度では発振しない。エラーバーは、１２〜１９ピークの±１標準偏差を示す。（Ｄ）計算モデルにおけるＬｕｘＩアクチベータータンパク質の分解を増加させるためのクオラム発火時のコロニー振幅。これらの結果を、サルモネラ（S.typhimurium）におけるＬｕｘＩ  ｓｓｒＡ（実線，株２）および非ｓｓｒＡ（破線，株１）タグ付き型の回路のバッチウェルプレート実験によって確認する（差込み図）。
【図２２−１】溶解が媒介する細胞内放出の調査。（Ａ）放出後のｓｆＧＦＰ可視化のための０．４μｍシンクを有する細菌グロースチャンバ。（Ｂ）典型的な発振サイクル（株１）についての細菌の数（破線、白抜きの円）、細菌の蛍光（実線、塗りつぶしの円）、シンク蛍光（実線、白抜きの円）。（Ｃ）（Ｂ）からのマイクロ流体シンクの蛍光時系列画像。
【図２２−２】溶解が媒介する細胞内放出の調査。（Ｄ）マイクロ流体デバイスで細菌および癌細胞共培養実験を行うための一般的手順（補足情報も参照）（Kolnik, M., Tsimring, L. S. & Hasty, J. Vacuum-assisted cell loading enables shear-free mammalian microfluidic culture.Lab On a Chip 12, 4732-4737, 2012）。
【図２３−１】インビボ発現および治療試験。（Ａ）約２０時間の増殖後の弱毒化ＳＬＣ株の終点インビトロ発光強度。宿主株ＡおよびＢは、株８および１０の宿主細菌である。それぞれ、ＥＬＨ１３０１およびＥＬＨ４３０である（Hohmann, E. L., Oletta, C.A. & Miller, S. I. Evaluation of a phop/phoq-deleted, aroa-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers.Vaccine 14, 19-24, 1996）。宿主Ａは、同じ回路で宿主Ｂよりも約２倍高い発光を示す。（Ｂ）ゲノム組み込みされた構成的発光株（株９）を注射した皮下腫瘍を有するマウスの経時的ＩＶＩＳイメージング。（Ｃ）図１９に表された実験からのＳＬＣ株（溶解＋）および構成的株（溶解−）の終点インビボ細菌発光。エラーバーは、９個の腫瘍からの平均細菌発光の標準誤差を表す。（Ｄ）静脈内（静脈）または腫瘍内（腫瘍）投与された構成的株についての注射後インビボ細菌発光。発光を注射後約２０時間で測定した。エラーバーは、それぞれ、静脈内および腫瘍内の場合について、６および９の腫瘍からの平均細菌発光の標準誤差を表す。
【図２３−２】インビボ発現および治療試験。（Ｅ）ＳＬＣ−ｈｌｙ（細い破線，株１０）、ＳＬＣ−ｃｄｄ（太い破線，株１４）、ＳＬＣ−ｃｃｌ２１（点線，株１５）、および全て一緒（ＳＬＣ−３）（実線）を注射した皮下腫瘍を有するマウスの経時的な平均相対腫瘍容積。０、２、６、８、および１０日目（黒矢印）に細菌を腫瘍内に注射した（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１，ボンフェローニ事後検定（Bonferroni post test）を用いた二元分散分析，ｎ＝１４〜１７腫瘍、ｓ．ｅ．）。（Ｆ）ＳＬＣ−３株（実線，株１０、１４、および１５）ならびにプラスミドのない対照（破線，株７）を注射した皮下腫瘍を有するマウスの経時的平均相対腫瘍容積。０、２、６、および１０日目（黒矢印）に細菌を腫瘍内に注射した（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１，ボンフェローニ事後検定（Bonferroni post test）を用いた二元分散分析，ｎ＝１８〜１９腫瘍、ｓ．ｅ．）。（Ｇ）プラスミドのない細菌（株７）、５−ＦＵ化学療法、ＳＬＣ−３株、およびＳＬＣ−３と化学療法との併用を注射した皮下腫瘍を有するマウスの経時的平均相対腫瘍容積。細菌を、０、４、および７日目に腫瘍内に注射し（黒色の矢印）、化学療法を２および９日目に投与した（白い矢印）（＊Ｐ＜０．０５，＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１，ボンフェローニ事後検定（Bonferroni post test）を用いた二元分散分析，ｎ＝１２〜１６腫瘍、ｓ．ｅ．）。（Ｈ）時間の経過に伴う３０％の腫瘍容積の低下に対応する（Ｇ）の場合からのマウスの割合。（Ｉ）時間の経過に伴う３０％の腫瘍容積の低下に対応するＳＬＣ−ｈｌｙの単回静脈内注射を行った皮下腫瘍を有するマウスの経時的平均相対腫瘍容積および割合（差込み図）（ｎ＝１７〜２２腫瘍、ｓ．ｅ．）。（Ｊ）ＳＬＣ−３株（点線）またはプラスミドのない対照（実線）のいずれかを与えた肝臓大腸転移を有するマウスについての経時的生存率（＊Ｐ＜０．０５，ログランク検定；ｎ＝１１〜１２マウス）。
【図２４】（Ａ）投与３日後に異なる治療をしたマウスから採取した腫瘍切片の組織像：（ｉ）治療用細菌（ＳＬＣ−３）、化学療法（５−ＦＵ）、または治療用でない細菌対照（株７）の組み合わせを静脈内注射した組織切片のＨＥ染色。（ｉｉ）細胞アポトーシスを示す同じ切片におけるＴＵＮＥＬ染色。（ｉｉｉ）腫瘍における細菌の存在を確認する同じ切片におけるサルモネラ免疫組織化学。（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のスケールバーは５０μｍを示す。（ｉｖ）および（ｖ）全腫瘍切片におけるＴＵＮＥＬおよびサルモネラ染色。（ｉｖ）および（ｖ）のスケールバーは１００μｍを示す。ＤＡＰＩ染色を使用して、（ｉｉ）〜（ｉｖ）の生細胞および死細胞の尺度を得た。２０×画像からの組織学的検査用スライス（ｎ＝６）を群間で比較し、サンプル面積で正規化したＴＵＮＥＬ染色の平均強度は、他の２つの群と比較してＳＬＣ−３で有意に高く（Ｐ＜０．０００１，１元配置分散分析）、化学療法と細菌のみの場合との間に有意差はなかったことが示された。さらに、ＳＬＣ−３サンプルでは、腫瘍の細菌コロニー形成が観察され、組織における有意に高い細胞死も観察された。
【図２５−１】本研究で使用した一部のプラスミドの図示（より詳細については本明細書に記載の追加情報を参照）。
【図２５−２】本研究で使用した一部のプラスミドの図示（より詳細については本明細書に記載の追加情報を参照）。
【図２５−３】本研究で使用した一部のプラスミドの図示（より詳細については本明細書に記載の追加情報を参照）。
【０１００】
本開示の前述およびその他の特徴は、添付の図面と併せて以下の説明および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。これらの図面は、本開示に係るいくつかの実施形態のみを描写し、その範囲を限定するものとみなされるべきではないという了解の下で、本開示を、添付の図面を使用することにより、さらに具体的かつ詳細に説明することにする。
【発明を実施するための形態】
【０１０１】
本開示の詳細な説明
以下の詳細な説明では、本明細書の一部を形成する添付の図面を参照する。図面において、類似の記号は、別段の記載がない限り、通常、類似の構成要素を識別する。詳細な説明、図面、および特許請求の範囲に記載された例示的な実施形態は、限定することを意味するものではない。本明細書に提示される対象の精神または範囲から逸脱することなく、他の実施形態を使用することができ、他の変更をなすことができる。本明細書に一般的に記載され、図に示された本開示の態様は、種々様々な異なる構成で配置され、置換され、結合され、設計され得、これらの全てが明示的に企図され 、本開示の一部をなすことが
容易に理解できるであろう。
【０１０２】
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、細菌が高い細胞密度で動的溶解を示すようにプログラムする遺伝子回路に関する。これにより集団が剪定され、集団が遺伝子にコードされた治療用タンパク質を放出することを可能にする。我々が使用する細菌は、注射または摂取時に腫瘍内部に内在化し、壊死組織内で増殖する、（ＰｈｏＰ、ＰｈｏＱ、ａｒｏＡ、およびｍｓｂＢなどの病原性遺伝子の遺伝子欠損を有し得る）遺伝的に弱毒化された「腫瘍標的」細菌である。遺伝子操作された細菌は腫瘍の壊死領域内でしか増殖することができないため、我々の回路は、集団センサーとして機能し、特に腫瘍内でのペイロード放出を可能にする。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、遺伝子にコードされ得る抗腫瘍剤を産生するように株を遺伝子操作することができる。遺伝子にコードされた抗腫瘍剤の非限定的な例には、溶血素Ｅ、メリチン、抗菌ペプチド、ジフテリア毒素、ゲロニン毒素、および炭疽毒素などの毒素が含まれる。遺伝子がコードする抗腫瘍剤の他の例には、アポトーシス促進性ペプチドおよび腫瘍ホーミングペプチドなどの非細菌源由来のタンパク質および小分子（例えば、ｃｄｄ−ｉＲＧＤ）、ならびにサイトカインおよびケモカインなどの癌に対する免疫応答を誘発するタンパク質（例えば、ＩＬ−２、ＣＣＬ２１など）が含まれる。本明細書に記載されているのは、併用療法として組み合わせ的に試験されている３つの治療株である。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、細菌維持のための方法を、治療用ポリペプチドを産生する株に組み込み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の治療用ポリペプチドは、遺伝子にコードされた抗腫瘍治療用ポリペプチドである。例えば、いくつかの実施形態は、それぞれが異なる治療用ポリペプチドを産生する２つ以上の株を利用し、それぞれが他の株とは異なる抗生物質に対して感受性および耐性である。例えば、株Ａは抗生物質ａに耐性であり得、株Ｂは抗生物質ｂに耐性であり得る。いくつかの実施形態では、治療剤は、１日おきなど、周期的に投与され得る。例えば、株Ａおよび抗生物質ａを１日目に投与し、次に株Ｂおよび抗生物質ｂを２日目に投与し得る。このサイクルを繰り返し得る。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、バクテリオシンを使用し得る。このようなバクテリオシンは
、細菌によって産生され、次いで、溶解で放出されて、他の細菌を殺すことができる（特定のバクテリオシンに抵抗性を付与することができる）。例えば、ある実施形態は、株Ａが株Ｂを殺すバクテリオシンを産生し、株Ｂが株Ｃを殺すバクテリオシンを産生し、株Ｃが株Ａを殺すバクテリオシンを産生するという３種の系である。ある実施形態では、１日目に株Ｃを投与し、次いで２日目に株Ｂを投与し（Ｃを消失させる）、次いで３日目に株Ａを投与し（Ｂを消失させる）、次いで株Ｃを投与するといったこと等をし得る。この系は、治療用細菌と競合し得る腫瘍環境内に存在する細菌を除去するというさらなる利点を有する。
【０１０６】
いくつかの実施形態は、治療用ポリペプチドの多段階送達を採用する。例えば、２つの直交クオラムセンシング／溶解系を、同じ治療用細菌の２つの株または２つの異なる治療用細菌株で設計し得る。クオラムセンシング系は、各系が他からの自己誘発因子から独立して機能できるという点で直交性である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のクオラムセンシング系は、細菌におけるＬｕｘ、Ｌａｓ、Ｒｈｌ、またはＲｐａ系などの様々な公知の系を含むことができる。これらの代替系をプラスミド上に構成することができ、その後細菌に形質転換することができる。いくつかの実施形態では、直交クオラムセンシング系を有する２つの株を用いて、異なる治療剤を送達することができる。いくつかの実施形態において、共培養は、２つの直交するクオラムセンシング系間で増殖特性または回路特性が異なる場合に達成され得る、１つの速度で治療剤を送達する１つの集団と、第２の速度で送達する別の集団とをもたらす。溶解は完全に起こるので、系は結合されない。さらなる実施形態は、以下を含み得る。
【０１０７】
１．迅速または高頻度溶解を引き起こす我々の回路の一種を用いることにより癌細胞を「弱める」ために役立ち得る強力ではないが速い作用/輸送治療剤として治療剤を送達す
るための株の使用。これを、強力であるが潜在的に遅い作用の治療剤のより低頻度の送達または溶解を生じる株と組み合わせ得る。異なる薬剤の作用の時間スケールは重要である− 一方では防御を弱め、他方ではハンマーを下げる。溶解の頻度は、以下により詳細に
議論される様々なアプローチによって調整することができる。高頻度および低頻度溶解株は、所望の溶解頻度を達成するために適切な改変を加えた溶解回路（ＳＤＣまたはＳＬＣ）で形質転換された株であり得る。
【０１０８】
２．第２の株によって送達される治療剤に対してより感受性が高くなるような癌性細胞の進化を誘発するための１つの株の使用。
【０１０９】
３．２つの株の共存。２つの共溶解系は、同じ培養物中の２種の細菌について、長期安定性をもたらす。すなわち、溶解を駆動する異なる周期の直交クオラムセンシング系を有する２つの株は、両方の株が共培養物中に共存する集団をもたらし得る。溶解のせいで、どちらの集団も制御できない。これは、共培養物内でクオラム閾値に到達するための第１の株の増殖および溶解として視覚化することができる。この第１の株が溶解事象を経験すると、その集団は減少し、第２の株が増殖してその溶解閾値に達することを可能にする。第２の株は溶解を経験し、それによって両方の株の動態および共存が永続する。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、腫瘍に既に存在する細菌は、所望の細胞密度で治療用タンパク質を放出するように適合され得る。例えば、いくつかの実施形態では、細菌接合を用いて、溶解回路と治療剤で既に腫瘍環境にある細菌を形質転換し得る。天然の細菌は、その後、送達細菌（メッセンジャー）を殺すことができ、それにより、既に腫瘍環境に存在する細菌に溶解系をトランスフェクションさせ得る。我々は、この目的のために無差別接合系の使用を検討している。
【０１１１】
いくつかの実施形態は、多数の壊死性コアの攻撃を調整するために、大きな腫瘍環境に
亘って同期溶解を利用する場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、その開示がその全体で参照により本明細書に援用される２０１２年１２月１４日に出願された「Multiscale platform for coordinating cellular activity using synthetic biology」と題されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９９１４号に記載された組成物および方法、又はその開示がその全体で参照により本明細書に援用される２０１１年１２月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／５７６，９７６号に記載されている組成物および方法を使用し得る。特に、いくつかの実施形態では、センチメートルの長さスケールを超える同期オシレータを使用し得る。いくつかの実施形態において、Ｈ2Ｏ2長距離シグナル伝達は、腫瘍長スケールに亘って溶解バーストを同期させるために使用される。このような状況では、溶解は制限的な形状を必要とせずにコロニーの大きさを規定するので、マイクロ流体の「ピクセル」がコロニーを収容する必要はない。センチメートルスケールに亘る同期送達に加えて、ラジカルが癌と相互作用する可能性もある。
【０１１２】
いくつかの実施形態は、発振溶解を示すように細菌を遺伝子操作することによって、遺伝子回路の使用により細菌において精巧な挙動を構築することができることを利用する。我々は、Hastyグループによってこれまでに記載されている遺伝子オシレータに遺伝子回
路モチーフを使用し、この場合、結合されたネガティブおよびポジティブフィードバックループを利用する。集団の溶解により、細菌集団を低く維持することができ、全身性の炎症反応を回避することに役立つ。集団溶解が周期的に起こるので、ペイロード放出もパルス様式で起こる。さらに、系は、細菌が閾値サイズに達することを可能にする環境において内部ペイロードのみを放出する。したがって、いくつかの実施形態は、腫瘍内部の高密度集団において自己誘発し、内部ペイロードを放出し、細菌集団を低レベルに維持して、有害な免疫応答を回避することができる腫瘍標的化デバイスと考えられ得る。
【０１１３】
本発明の組成物および方法は、（化学的または環境的シグナルのいずれかを介した）誘導性プロモーターからの治療用タンパク質の単純な発現を用いる他の方法と比較して利点を与える。本明細書で使用される場合、用語「調節可能なプロモーター」、「誘導性プロモーター」は、交換可能に使用され、その活性がシスまたはトランス作用因子によって影響を受ける任意のプロモーターを指す。いくつかの実施形態では、「調節可能なプロモーター」は、分子制御要素（例えば、アシルホモセリンラクトン−ＡＨＬ）またはｐＨまたは温度の存在または非存在などの外部条件に応答して転写のために活性化または抑制されるプロモーターを指す。調節可能なプロモーターの一般的で具体的な例が広く知られており、容易に入手可能である。このようは他のアプローチは、動的送達に依存するのではなく、より単純に特定の遺伝子産物の構成的産生に依存する。また、このような他のアプローチは、腫瘍標的化細菌の（例えば、溶解による）自己誘発性集団制御のための戦略を採用しない。
【０１１４】
いくつかの実施形態は、遺伝子回路を形成し、結合したポジティブおよびネガティブフィードバック遺伝因子からなる組換えプラスミドを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ポジティブフィードバック遺伝因子は、ＬｕｘＩプロモーターから遺伝子発現を駆動する（ＬｕｘＩおよびＬｕｘＲ遺伝子を含んでなる）Ｌｕｘクオラムセンシング系を利用し得る。このプロモーターは、ＬｕｘＩ遺伝子、溶解遺伝子、およびレポーター遺伝子の転写を可能にする。したがって、一旦活性化されると、このプロモーターは、ネガティブフィードバック因子、バクテリオファージΦＸ１７４からの溶解遺伝子Ｅ、および蛍光または発光レポーター遺伝子の転写を駆動する。これらの回路プラスミドを含む細菌集団（遺伝子操作された細菌）は、コロニー中の隣接する細胞間で拡散し、ｐＬｕｘＩ転写（ＬｕｘＩプロモーター）についてコロニーを同期させることができる小分子であるＡＨＬ（アシルホモセリンラクトン）を酵素的に産生するＬｕｘＩタンパク質を産生するようになる。その後、ＡＨＬはＬｕｘＲタンパク質に結合し、ＬｕｘＲタンパク質は、ＡＨＬ濃度が閾値レベルに達するとＬｕｘＩプロモーターからの転写を活性化する。従って、遺伝子
操作された細菌集団は、閾値集団サイズまで増殖し、この時点で、十分なＡＨＬがコロニー内に蓄積してＬｕｘＩプロモーターからの転写を活性化し、溶解タンパク質を産生する。集団の一部が溶解し、小さいコロニーサイズが残り、それによりＡＨＬ濃度が低下するようになる。これらの生き残った細菌は、その後、閾値集団サイズまで再増殖し、さらなる溶解事象を呈する。この過程は周期的な様式で継続する。溶解すると、細胞は、治療的遺伝子の産物を含む細胞内の内容物を細胞外空間に放出するようになる。したがって、集団は細胞内ペイロードを放出しながら動的に減弱する。回路の図および上記の様々な段階の図については、図１を参照されたい。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された腫瘍標的化細菌を用いて、治療用タンパク質を腫瘍に動的に送達し、小さなインビボでのフットプリントを維持し得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態は、高細胞密度で動的溶解を示すように遺伝子回路によってプログラムされた細菌に関連する方法、材料、およびデバイス/系に関する。これにより集団が
弱毒化され、集団が遺伝子にコードされた治療用タンパク質を放出することが可能になる。使用される細菌は、注射または摂取時に腫瘍の内部に内在化し、壊死組織内で増殖する弱毒化「腫瘍標的化」細菌であり得る。遺伝子操作された細菌は腫瘍の壊死領域内でしか増殖することができないため、回路は、集団センサーとして機能し、特に腫瘍内でのペイロード放出を可能にする。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、組換えプラスミドは、遺伝子回路を形成し、結合したポジティブおよびネガティブフィードバック遺伝因子を含んでなる。好適なポジティブフィードバック遺伝因子の例には、限定はされないが、Ｌｕｘクオラムセンシング系、およびＬａｓ、Ｒｈｌ、およびＲｐａ系などの他のクオラムセンシング系が含まれる（Waters, Christopher M., and Bonnie L. Bassler."Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria."Annu.Rev. Cell Dev.Biol.21: 319-346, 2005, Schaefer, Amy L., et al."A new class of homoserine lactone quorum-sensing signals."Nature 454: 595-599, 2008.）。好適なネガティブフィードバック遺伝因子の例には、限定はされないが、細
菌内で使用することができる溶解系のいずれか、例えば、バクテリオファージΦＸ１７４由来の溶解遺伝子Ｅ、ラムダファージ溶解遺伝子、コリシン産生細菌由来のＥ７溶解遺伝子などが含まれる。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ポジティブフィードバック遺伝因子は、ＬｕｘＩプロモーターから遺伝子発現を駆動する（ＬｕｘＩアクチベーターおよびＬｕｘＲ遺伝子を含んでなる）Ｌｕｘクオラムセンシング系を含んでなり得る。このプロモーターは、ＬｕｘＩ遺伝子、溶解遺伝子、およびレポーター遺伝子の転写を可能にする。したがって、一旦活性化されると、このプロモーターは、ネガティブフィードバック因子、例えばバクテリオファージΦＸ１７４由来の溶解遺伝子Ｅ、および蛍光または発光レポーター遺伝子の転写を駆動する。これらの回路プラスミドを含む細菌集団（遺伝子操作された細菌）は、コロニー中の隣接する細胞間で拡散し、ｐＬｕｘＩ転写（ＬｕｘＩプロモーター）についてコロニーを同期させることができる小分子である、Ｌｕｘ系のためのＡＨＬ（アシルホモセリンラクトン）を酵素的に産生するＬｕｘＩタンパク質を産生するようになる。異なるＡＨＬは、Ｌａｓ、Ｒｈｌ、およびＲｐａ系などの異なるクオラムセンシング系の自己誘発因子として機能する。その後、ＡＨＬはＬｕｘＲタンパク質（またはそれぞれのＲタンパク質、例えば、ＬａｓＲ、ＲｈｌＲ、またはＲｐａＲ）に結合し、ＬｕｘＲタンパク質は、ＡＨＬ濃度が閾値レベルに達するとＬｕｘＩプロモーターからの転写を活性化する。従って、遺伝子操作された細菌集団は、閾値集団サイズまで増殖し、この時点で、十分なＡＨＬがコロニー内に蓄積してＬｕｘＩプロモーターからの転写を活性化し、溶解タンパク質を産生する。集団の一部が溶解し、小さいコロニーサイズが残り、それによりＡＨＬ濃度が低下するようになる。これらの生き残った細菌は、その後、閾値集団サイズまで再増殖し、さらなる溶解事象を呈する。この過程は周期的な様式で継続する。溶解すると、細胞は、治療的遺伝子の産物を含む細胞内の内容物を細胞外
空間に放出するようになる。したがって、集団は細胞内ペイロードを放出しながら動的に減弱する。
【０１１８】
本発明の組成物および方法は、（化学的または環境的シグナルのいずれかを介した）誘導性プロモーターからの治療用タンパク質の単純な発現を用いる方法と比較して利点を与える。これらの他のアプローチは、動的送達に依存するのではなく、より単純に特定の遺伝子産物の構成的産生に依存する。また、このような他のアプローチは、腫瘍標的化細菌の（例えば、溶解による）自己誘発性集団制御のための戦略を採用しない。
【０１１９】
いくつかの実施形態は、その開示がその全体で参照により本明細書に援用される“Rapid and tunable post-translational coupling of genetic circuits” Nature 508, 387-391 (17 April 2014), by Arthur Prindle, Jangir Selimkhanov, Howard Li, Ivan Razinkov, Lev S. Tsimring & Jeff Hasty; Published online 09 April 2014に記載の遺伝子回路を利用する。いくつかの実施形態において、上記刊行物に記載された技術および遺伝子回路は、本明細書に記載の方法および組成物において２つの異なる薬剤および異なる頻度の送達のために使用され得る。
【０１２０】
腫瘍溶解性ウイルスおよび遺伝子操作された免疫細胞などの生物療法は、癌の治療において代替療法として台頭してきており、メラノーマ、カルチノーマ、および白血病について臨床試験が行われている（O’Shea, C. C. Viruses-seeking and destroying the tumor program.Oncogene 24, 7640-7655 (2005); June, C. H. et al.Engineered t cells for cancer therapy.Cancer Immunology, Immunotherapy 1-7 (2014); Miest, T. S. & Cattaneo, R. New viruses for cancer therapy: meeting clinical needs.Nature Reviews Microbiology 12, 23-34 (2014)）。同時に、病原体としての細菌の長年にわたるモノリ
シックな見解は、人体内に機能性微生物が広範に見られるという認識に変わってきた（Cho, I. & Blaser, M. J. The human microbiome: at the interface of health and disease.Nature Reviews Genetics 13, 260-270 (2012); Xuan, C. et al.Microbial dysbiosis is associated with human breast cancer.PloS one 9, e83744 (2014); Fischbach, M. A., Bluestone, J. A. & Lim, W. A. Cell-based therapeutics: the next pillar of medicine.Science translational medicine 5, 179ps7-179ps7 (2013)）。この広大な環
境を考えると、おそらく必然的に、特定の細菌が腫瘍内で優先的に増殖するように進化し、それゆえ、遺伝子操作療法の開発のための天然のプラットフォームを提供するであろう（Pawelek, J. M., Low, K. B. & Bermudes, D. Tumor-targeted salmonella as a novel
anticancer vector.Cancer research 57, 4537-4544 (1997); Ruder, W. C., Lu, T. & Collins, J. J. Synthetic biology moving into the clinic.Science 333, 1248-1252 (2011); Weber, W. & Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic
biology.Nature Reviews Genetics 13, 21-35 (2011)）。腫瘍内の微生物の局在化は、
癌細胞を標的とする宿主免疫系を刺激するために利用されているが、このような療法は、局所的に放出される抗腫瘍剤を絶えず産生しながら、全身性炎症応答を安全に回避するようにプログラムされた細菌からなることが理想的である（Baban, C. K., Cronin, M., OSHanlon, D., OSSullivan, G. C. & Tangney, M. Bacteria as vectors for gene therapy
of cancer.Bioeng Bugs 1, 385-394 (2010); Cann, S. H., Van Netten, J. & Van Netten, C. Dr William Coley and tumour regression: a place in history or in the future.Postgraduate medical journal 79, 672-680 (2003); Davila, M. L. et al.Efficacy
and toxicity management of 19-28z car t cell therapy in b cell acute lymphoblastic leukemia.Science translational medicine 6, 224ra25-224ra25 (2014)）。ここで
、我々は、閾値集団密度で溶解し、遺伝子にコードされた抗腫瘍治療剤を放出するように臨床的検査を受けた細菌を設計する。溶解すると、少数の生き残った細菌が集団を再生し、したがってステルスなインビボでのフットプリントを有するパルス溶解および送達サイクルをもたらす。マイクロ流体デバイスを使用して、遺伝子操作された細菌のロバストで
調整可能な特性を明らかにし、マイクロケモスタット（microchemostats）およびバッチ
培養でそれぞれヒト癌細胞と共培養したときの治療可能性を実証する。インビボでの送達動態をモニタリングするために、ルシフェラーゼを用いた癌の同系大腸マウスモデルにおける溶解プログラムのステルス特性を試験する。断続的な発光ピークは、プログラムされていない株と比較して、最終的な腫瘍容積の２倍の減少とともに、平均コロニー発光の３２倍の減少と相関する。我々のプラットフォームは、ウイルスおよびナノ粒子などの他の治療剤と組み合わせて新規な送達戦略の実施を可能にし得る（Cheong, I. et al.A bacterial protein enhances the release and efficacy of liposomal cancer drugs.Science
314, 1308-1311 (2006)）。
【０１２１】
腫瘍環境内の安全な集団レベルを維持するように細菌を遺伝子操作するために、我々は、ロバストな発振動態を生じることができることがこれまでに示されている結合ポジティブおよびネガティブフィードバックループを用いてステルス送達回路（ＳＤＣ）を設計した（Danino, T., Mondragon-Palomino, O., Tsimring, L. & Hasty, J. A synchronized quorum of genetic clocks.Nature 463, 326-330 (2010); Prindle, A. et al.A sensing
array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44 (2012)）。用語「同期溶解回路」（ＳＬＣ）および「ステルス送達回路」（ＳＤＣ）は、本開示では交換可能に使用される。我々の回路（図１Ａ）では、共通のプロモーターが、それぞれそれ自身のアクチベーター（ポジティブフィードバック）および溶解遺伝子（ネガティブフィードバック）の両方の発現を駆動する。例えば、ｌｕｘＩプロモーターは、ＬｕｘＲに結合し、ＬｕｘＲがプロモーターを転写活性化することを可能にする自己誘発因子（ＡＨＬ）の産生を制御する。これは、それぞれのＡＨＬ、Ｒタンパク質、およびアクチベータータンパク質を有する細菌からの他のクオラムセンシング系の場合にも当てはまる。そのような要素の例には、ＲｈｌＲ、ＬａｓＲ、ＬａｓＩまたはＲｈｌＩが含まれる。
【０１２２】
ネガティブフィードバックは、同様にＬｕｘＩプロモーターの制御下にある（例えば、φＸ１７４Ｅ、Ｅ７溶解遺伝子、またはラムダファージ由来の他の溶解遺伝子であり得る）細胞溶解遺伝子によって誘発される細胞死から生じる（Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44 (2012); Young, K. D. & Young, R. Lytic action of cloned phi x174 gene e. Journal of virology 44, 993-1002 (1982); Marguet, P., Tanouchi, Y., Spitz, E., Smith, C. & You, L. Oscillations by minimal bacterial suicide circuits reveal hidden facets of host-circuit physiology.PloS one 5, e11909 (2010)）。重要なことに、ＡＨＬは、隣接する
細胞に拡散することができ、それにより、細胞間の同期機構を与える。
【０１２３】
ステルス送達回路から生じる動態は、ＡＨＬの閾値レベルへのゆっくりとした蓄積、次いで集団を迅速に剪定し、細菌の内容物の放出を可能にする溶解事象に概念化することができる（図１Ｂ）。溶解後、残っている少数の細菌が新たにＡＨＬを産生し始め、この過程が周期的な様式で繰り返される。我々は、ｓｆＧＦＰを治療的発現の代用物として使用して、増殖、溶解、およびタンパク質放出を観察するためにマイクロ流体デバイスを使用した。弱毒化されたサルモネラ（S.typhimurium）中の我々の回路を試験すると、蛍光レ
ポータープロファイルのピークが集団溶解に対応するマイクロ流体チャンバ内の周期的な溶解事象が観察された（図１Ｃ）。発振はロバストであり、時間と共に減衰せず、１８時間の増殖にわたって全細胞数において５％未満だけ変化する一定の集団サイズを生じた（図５Ａ）。さらに、インビボの微小環境は変動する環境条件によって特徴付けられるため、可変インキュベーション温度（３６℃〜４０℃）および灌流速度（１００μｍ／ｓ〜２００μｍ／ｓ）を試験し、全ての条件に亘って３時間の平均周期を測定した（図１Ｄ）。これらの実験の結果は、本明細書に与えられている補足ビデオ１、２、および３の議論にさらに要約されている。したがって、我々は、ＳＤＣが、インビボの状況で起きる可能性のある環境変動に晒されても、溶解および放出のロバストなサイクルを生じることを予想
した。
【０１２４】
我々は、ＳＤＣのロバスト性に影響を与えるパラメータを探索するための計算モデルを開発した（図２Ａおよび補足情報）。高い生産速度および分解速度が、パラメータ空間におけるより広い領域の発振動態をもたらすことが分かった。これは、サルモネラ（S.typhimurium）における発振が、タンパク質産生および分解の速度がより低いことが判明した
大腸菌（E.coli）における発振よりもロバストであったという観察結果を説明した（Prindle, A. et al.Genetic circuits in Salmonella typhimurium.ACS synthetic biology 1, 458-464 (2012)）（図５Ｂ〜Ｅ）。従って、回路のロバストな挙動は、結局、宿主細菌の固有のパラメータに依存する。
【０１２５】
回路挙動を操作する能力は、様々な状況で我々の系を適用するための汎用性を大幅に向上させるので、ＬｕｘＩタンパク質にｓｓｒＡ分解タグ付け配列を加えることによって、溶解周期の調整可能性を探った。モデルの予測と一致して、発現の振幅が約３倍増加し、周期が約２倍増加することが観察された（図２Ｂ〜Ｃ）。また、細胞外ＡＨＬによる化学的誘発を介した回路挙動の調整可能性を探った。我々の計算モデルは、飽和濃度での「定常」集団溶解を予測した（図２Ｄ、差込み図）。代替的または追加的に、サイクルの周期の改変のために、細菌の増殖速度、プロモーター強度、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）強度の改変、および/または異なるクオラムセンシング系の使用を含む、多くの好適なアプ
ローチおよび技術を使用することもできる。
【０１２６】
高濃度のＡＨＬ下で回路を試験すると、細胞増殖と溶解とが均衡しているように見え、細胞外ＡＨＬを除去すると、発振挙動に戻ることが観察された（図２Ｄ）。これらの実験の結果を、６０倍の倍率での株１（サルモネラ（S.typhimurium））におけるＳＤＣの経
時的蛍光顕微鏡検査を描写するビデオ（補足ビデオ４）にさらに記録した。このビデオは、実験の最初の部分において、２００ｎＭのＡＨＬを含む培地を使用し、細菌が一定の溶解状態になるのを見ることができることを示している。このデバイスでは、蛍光色素（赤色チャネル）で示されている。その後、培地を蛍光色素が存在しないＡＨＬなしの別の源に切り替え、細菌は発振状態に戻り、コロニーはイメージング終了前に４回の溶解サイクルの間持続した。チャンバサイズは１００×１００μｍであり、２分ごとに画像を撮った。したがって、ＳＤＣは、発振的および構成的様式の集団溶解を示すことができる可変系を表す。
【０１２７】
治療的機能性をＳＤＣに組み込むために、抗腫瘍治療用毒素として使用されている、大腸菌の溶血素ＥまたはｈｌｙＥのコピーを含む別のモジュールを加えた（Ryan, R. et al.Bacterial delivery of a novel cytolysin to hypoxic areas of solid tumors.Gene therapy 16, 329-339 (2009); Nguyen, V. H. et al.Genetically engineered Salmonella
typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer.Cancer research 70, 18-23 (2010)）。グロースチャンバの下に位置する小さなマイクロ流体シンクを用いて放出されたｓｆＧＦＰを視覚化することによって細胞内の内容物を放出する回路の能力を確認した（図６Ａ〜Ｃ）。インビトロでの細菌の溶解および癌細胞の死滅を可視化するために、細菌の溶解および癌細胞死の単一細胞視覚化を可能にする、より小さい細菌グロースチャンバに隣接するグロースチャネル内に癌細胞が接着する新規なマイクロ流体技術を採用した（図６Ｄ）。ＨｅＬａ細胞と回路を有するサルモネラ（S. Typhimurium ）とを共培
養すると、細菌溶解の開始時にＨｅＬａ細胞死が観察され、効率的な毒素放出が示された（図３Ａ〜Ｂ）。これらの実験の結果は、本明細書に与えられている補足ビデオ５および６の議論にさらに要約されている。トラップの外側の完全な細胞死は、最初のｓｆＧＦＰ蛍光の約１１１分以内に実現された（図３Ｃ）。したがって、ＳＤＣはインビトロで癌細胞を殺すのに必要なレベルでＨｌｙＥを放出することが可能であった。
【０１２８】
治療活性の機序を確認するために、放出された細菌の内容物の毒性を評価し、溶解のない構成的ｈｌｙＥ発現からの基礎毒素放出も評価した。予想通り、ｈｌｙＥモジュールを有するＳＤＣの培養物からの上清に晒されたＨｅＬａ細胞が、生存率のほぼ完全な低下を示したことが分かった（図３Ｄ）。ｈｌｙＥモジュールを有しないＳＤＣの上清に晒されたＨｅＬａ細胞、または溶解のない構成的ｈｌｙＥ株は、約１５％の生存率のわずかな低下を示した。我々は、溶解がインビトロでの効率的なＨｌｙＥ放出を可能にすること、および、天然の細胞内の細菌の内容物の方がＨｅＬａ細胞生存率に有意に影響しないことを結論付けた。我々はさらに、ウェルプレート中のＨｅＬａ培養物を用いて様々な量の回路保有細菌を播種することにより、ｈｌｙＥを有するＳＬＣの薬剤送達特性を調べた。最初の播種からのＨｅＬａ細胞死のタイミングは、細菌がクオラム閾値に達するのに必要な時間が長くなることにより、細菌の播種量が少なくなるにつれて長くなることが観察された（図３Ｅ）。これらの実験の結果は、２０倍の倍率で組織培養ウェルプレートで共培養した細菌および癌細胞を描写するビデオ（補足ビデオ７）にも記録されている。このビデオは、株４（運動性サルモネラ（S. Typhimurium ），ＨｌｙＥを有するＳＤＣ）を、単層
ＨｅＬａ細胞とウェルに入れたことを示している。細菌が増殖した後、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現によってクオラム事象を可視化した。まもなくＨｅＬａ細胞が細胞死を呈することを見ることができた。経時的蛍光顕微鏡画像を１分ごとに撮った。また、ｓｆＧＦＰおよび溶解遺伝子Ｅなどのクオラム依存性遺伝子の発火速度または産生速度が、播種密度が高くなるにつれて増加することも観察された。これを、臨界放出時間、または発火からＨｅＬａ細胞死までの時間の発火速度に対する依存性によって確認した。全ての場合において必要とされる曝露量は類似しているように見えるが、速度の増加は、放出時間の短縮に対応し、溶解および治療剤放出の増加を示す（図３Ｆ）。このようにして、播種された細菌の量は、回路の初期タイミングおよび放出特性を決定する。
【０１２９】
効率的な治療剤送達が可能なロバスト回路を用いて、我々は、インビボで我々の系の動態を特徴付けようとした。腫瘍治療のための細菌の使用は、１世紀以上にわたり認識されている（Coley, W. B. The treatment of inoperable sarcoma by bacterial toxins (the mixed toxins of the Streptococcus erysipelas and the Bacillus prodigiosusProceedings of the Royal Society of Medicine 3, 1 (1910)), and certain facultative anaerobic bacteria, such as S. typhimurium, possess the ability to preferentially localize and form colonies within the necrotic regions of the tumor (Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy.Nature Reviews Cancer 10, 785-794 (2010)）。抗生物質選択の非存在下で回路の長期安定性を確保するために、我々は、プラスミド保持および分離のための安定化要素を組み込んだ（Gerdes, K. The parB (hok/sok) locus of plasmid R1: a general purpose plasmid stabilization system.Nature Biotechnology 6, 1402-1405 (1988); Wood, T., Kuhn, R. & Peretti, S. Enhanced plasmid stability through post-segregational killing of plasmid-free cells.Biotechnology techniques 4, 39-44 (1990); Derman, A. I. et al.Phylogenetic analysis
identifies many uncharacterized actin-like proteins (alps) in bacteria: regulated polymerization, dynamic instability and treadmilling in alp7a.Molecular microbiology 73, 534-552 (2009)）。さらに、細菌発光を介したｈｌｙＥ産生およびクオラム発火の指標として、ｈｌｙＥ遺伝子およびｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子の両方（インビボレポーターモジュール）をｌｕｘＩプロモーター下に配置した（図１Ａ）。免疫適合性マウスで大腸癌の皮下モデル（ＭＣ２６細胞系）を用いて、治療用ステルス送達回路（ｔＳＤＣ）を静脈内および腫瘍内に注射した（図７Ｂ）。細菌はこれまでに観察されているように腫瘍微小環境に局在し、ＩＶＩＳ測定値が定期的に得られた（Danino, T., Prindle, A.,
Hasty, J. & Bhatia, S. Measuring growth and gene expression dynamics of tumor-targeted S.typhimurium bacteria.JoVE (Journal of Visualized Experiments) e50540-e50540 (2013)）。腫瘍領域に局在する細菌発光における断続的な１４時間および７６時間のピークから回路の挙動を観察した（図４Ａ〜Ｂ）。次に、組み込まれた構成的発光カセ
ットを含む対照株を試験し、断続的なピークを示さない細菌発光の安定した増加が観察された（図４Ｃ）。また、ｔＳＤＣを有する腫瘍からの発光強度が、構成的株よりも平均して約３２倍低く、コロニーサイズの減少を示すことが観察された（図４Ｃ，右）。これらの結果は、ｔＳＤＣがインビボで動的挙動を保持し、腫瘍内の細菌集団を弱毒化することができることを示している。
【０１３０】
次に、我々の回路が腫瘍容積およびマウスの体重に及ぼす影響を調べた。ｔＳＤＣを静脈注射したマウスでは、腫瘍容積は最初の３日以内にわずかに減少し、その後は発育不全を示した（図４Ｄ，左）。プラスミドのない細菌で処理した腫瘍は、大きさが１日目から３倍以上の増加に達し、最終腫瘍容積は、治療剤の場合より約２倍高かった（図４Ｄ，右）。治療剤の場合の腫瘍容積の軌跡は、対照と比較して分散の減少も示した（図４Ｄ，中央）。注射後の体重の初期低下の後、治療用回路およびプラスミドのない対照マウスの両方が６〜１１日以内に全体重を回復した（図４Ｅおよび図７Ｃ）。治療剤が構成的に産生され、溶解のためのｌｕｘＩアクチベーターが除去され、溶解遺伝子の基礎発現をもたらす回路も試験した（図７Ｄ）。プラスミドのない対照およびｔＳＤＣと比較して、この株で最初の５日間で体重の有意な１６％の低下が観察された（図４Ｅ）。我々の結果は、クオラム溶解および治療剤を与えることにより、マウスにおいて安全な健康プロファイルを有する顕著な治療効果がもたらされることを示している。
【０１３１】
遺伝子操作された細胞の臨床への応用を進めるには、様々な状況で複雑な機能を実行することができるロバストで動的な遺伝子回路が必要である。これらのタイプの回路を利用することは、薬剤送達の頻度および振幅を調節することによって新規の治療戦略を可能にし得る。将来の進歩により、複数の治療剤の放出、局所腫瘍環境の遺伝子読み取りを可能にする細菌センサーの構築、または動的かつ低用量の薬剤送達プロファイルのコード化が可能になり得る（Lien, K., Georgsdottir, S., Sivanathan, L., Chan, K. & Emmenegger, U. Low-dose metronomic chemotherapy: A systematic literature analysis.European Journal of Cancer (2013); Shaked, Y. et al.Low-dose metronomic combined with intermittent bolus-dose cyclophosphamide is an effective long-term chemotherapy treatment strategy.Cancer research 65, 7045-7051 (2005); Thakur, M. D. et al.Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance.Nature 494, 251-255 (2013)）。さらに、このような工学的戦略は、遺伝子操
作されたウイルス、細菌、および宿主細胞（Ｔ細胞など）からなる腫瘍環境における治療群の構築を可能にし得る。複数の構成要素が相乗的に働く環境は、腫瘍の異なる領域で様々な治療機能の具現をもたらすことができる。
【０１３２】
方法
株およびプラスミド
我々の回路株を、３７℃のインキュベーターで、０．２％グルコースと共に、カナマイシンおよびクロラムフェニコールをそれぞれ５０μｇｍｌ-1、３４μｇｍｌ-1含むＬＢ培地中で培養した。哺乳類細胞を、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＣｅｌｌＧｒｏ３０−００２−ＣＩ）を補充したＤＭＥＭ培地で培養し、３７℃で５％ＣＯ2を維持した組織培養インキュベーター内に置いた。プラスミドを、クロー
ニングのＣＰＥＣ法を用いて、または標準的な制限消化／ライゲーションクローニングを用いて構築した（Quan, J. & Tian, J. Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways.PloS one 4, e6441 (2009)）。我々のグループの以
前の研究では、アクチベータープラスミド（Ｋａｎ，ＣｏｌＥ１）を使用したが、ｅＰｏｐプラスミドから溶解遺伝子ＥをＰＣＲで取り出し、ＬｕｘＩプロモーターの制御下でこれをベクター（Ｃｈｌｏｒ、ｐ１５Ａ）にクローニングすることにより溶解プラスミドを構築した（Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44 (2012); Marguet, P., Tanouchi, Y., Spitz, E., Smith, C.
& You, L. Oscillations by minimal bacterial suicide circuits reveal hidden facets of host-circuit physiology.PloS one 5, e11909 (2010)）。ＭＧ１６５５のゲノム
ＤＮＡからＰＣＲを介してｈｌｙＥ遺伝子を取り、ｐｔａｃまたはｐＬｕｘＩプロモーターの制御下で溶解プラスミドにクローニングした（De Boer, H. A., Comstock, L. J. & Vasser, M. The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences 80, 21-25 (1983)）。共
培養は、ＨｅＬａ細胞および運動性または非運動性のサルモネラ（S. typhimurium）、ＳＬ１３４４で行った。完全な株およびプラスミド情報については、補足情報を参照されたい。
【０１３３】
マイクロ流体工学および顕微鏡検査
この研究で使用されたマイクロ流体デバイスおよび実験準備プロトコルは、以前に我々のグループから報告されたものと同様である（Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44 (2012)）。細菌グロース
チャンバは、面積が１００×１００μｍ、高さが約１．４μｍであった。チップ上での共培養実験では、最初にＨｅＬａ細胞の浮遊培養物を非常に低い流速でデバイス培地チャネルにロードして接着させた後、デバイスを組織培養インキュベーター中で０．５〜２日間インキュベートして増殖させた（Kolnik, M., Tsimring, L. S. & Hasty, J. Vacuum-assisted cell loading enables shear-free mammalian microfluidic culture.Lab on a chip 12, 4732-4737 (2012)）。実験の日に、デバイスを顕微鏡に移し、回路を含む細菌を
イメージング前にグロースチャンバにロードした。画像の取得は、Photometrics CoolSnap冷却ＣＣＤカメラを用いるNikon TI2で行った。スコープおよび付属品を、Nikon Elementsソフトウェアを使用してプログラミングした。マイクロ流体工学および顕微鏡検査に関するさらなる詳細は、補足情報で見ることができる。
【０１３４】
インビボ実験
腫瘍モデル：移植されたマウス大腸癌細胞系（MC26, Tanabe lab, Massachusetts General Hospital）由来の両側皮下後部側腹腫瘍を有する６週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（Taconic）で動物実験を行った。腫瘍細胞を、ＤＭＥＭ（フェノールレッドなし）中１ｅ８
細胞ｍｌ-1の濃度で移植用に調製した。次いで、細胞を側腹当り１００μＬの容量で皮下に１ｅ７細胞からなる各移植片で移植した。腫瘍は直径が４〜１０ｍｍに達するまで約２週間増殖した。
【０１３５】
細菌の増殖および投与：インビトロ実験と同様に、適切な抗生物質および０．２％グルコースを含むＬＢ培地中で細菌株を一晩増殖させた。抗生物質を含む新鮮な培地で１／１００倍希釈を注射の日に開始し、細菌がクオラム閾値に達するのを防ぐためにＯＤ＜０．１まで増殖させた（特にＳＤＣの場合）。細菌を遠心沈殿させ、マウスに注射する前に滅菌ＰＢＳで２〜３回洗浄した。細菌株を、発光軌跡実験のための腫瘍内注射または腫瘍治療実験のための静脈注射のいずれかを介して送達した。腫瘍内注射を、ＰＢＳ中５ｅ７細胞ｍｌ-1の濃度で行い、腫瘍当り３０〜４０μＬの全容積を注射した。静脈内注射を、ＰＢＳ中５ｅ７細胞ｍｌ-1の濃度で行い、１００μＬの全容積を尾静脈を介して注射した。
【０１３６】
投与後のモニタリング：発光シグナルを、細菌注射後、IVIS Spectrum in vivo imaging systemで測定した。測定値を、注射前の値と比較して、細菌増殖および溶解サイクルを追跡した。腫瘍容積は、イメージング過程を通じて、カリパスを用いて各腫瘍の長さ、幅、および高さを測定して定量した。容積を注射前の値と比較して、物理的な腫瘍増殖を追跡した。マウスの体重を、実験開始前に測定し、開始点後は通常１日１回測定して、体重および全体的な健康状態をモニタリングした。動物実験を２回実施して同様の結果を得た。
【０１３７】
宿主株および培養
我々の溶解回路を有する株を、３７℃の振盪インキュベーターで、０．２％グルコースと共に、それぞれの抗生物質（カナマイシンおよびクロラムフェニコール）を５０μｇｍｌ-1、３４μｇｍｌ-1含むＬＢ培地中で増殖させた。ｌｕｘＲプロモーターがＣＡＰ−ｃＡＭＰ活性化複合体のための結合部位を有するので、このプロモーターからの発現を減少させるためにグルコースを添加した（Meighen, E. A. Genetics of bacterial bioluminescence.Annual review of genetics 28, 117-139 (1994)）。細胞内のグルコースレベル
が高い場合、ｃＡＭＰレベルは低く、ＣＡＰ−ｃＡＭＰからの転写活性化を低下させる。
【０１３８】
マイクロ流体工学実験では、我々の回路用の非運動性サルモネラ（S. typhimurium）宿主、ＳＬ１３４４（Ｍ９１３：ｆｌｉＧＨＩ変異体）を選択した。(Stecher, B. et al.Flagella and chemotaxis are required for efficient induction of Salmonella enterica serovar typhimurium colitis in streptomycin-pretreated mice.Infection and Immunity 72, 4138-4150 (2004)）。ウェルプレート共培養実験および治療および体重についてのインビボ実験では、以前の研究でプラスミド保持における効率が良いことが示されている、弱毒化されたサルモネラ（S. typhimurium）宿主、ＳＬ１３４４（ＥＬＨ１３０１：ΔｐｈｏＰＱ  ΔａｒｏＡ）を利用した(Danino, T., Lo, J., Prindle, A., Hasty, J. & Bhatia, S. N. In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria.ACS Synthetic Biology 1, 465-470 (2012)）。回路の発光発現を測定したインビボ実験で
は、発光発現がより高い回路宿主（ＥＬＨ４３０：ΔｐｈｏＰＱ）として、サルモネラ（S. typhimurium）ＳＬ１３４４の別の弱毒化株を利用した（図７Ａおよび図２３Ａ参照）。構成的発光の場合では、構成的発光カセットを有するよく特徴付けられた細菌、ｐ１６Ｓｌｕｘを組み込んだ大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７を使用した（Riedel, C. U. et al.Construction of p16slux, a novel vector for improved bioluminescent labeling of gram-negative bacteria.Applied and Environmental Microbiology 73, 7092-7095 (2007)）。株およびプラスミドのリストを以下の表１および２に示す。
【表１】
2020096645.tif 000003
【表２】
2020096645.tif 000004
【０１３９】
共培養実験では、１０％ウシ胎児血清および回路用の適切な抗生物質を補充したＤＭＥＭ（完全培地）中でＨｅＬａ細胞株を使用した。ＨｅＬａ細胞を、増殖培地中でペニシリン／ストレプトマイシン（CellGro 30-002-CI）存在下で最初に増殖させ、実験前に、３
７℃、５％ＣＯ2で、組織培養インキュベーター内に置いた。マイクロ流体チップまたは
ウェルプレートにロードするために、ＨｅＬａ細胞を最初にｄＰＢＳで洗浄し、０．０５％または０．２５％トリプシンＥＤＴＡで剥離させた。次いで、細胞をペレット化し、ＤＭＥＭ＋ＦＢＳおよび適切な抗生物質に再懸濁した。
【０１４０】
プラスミド
我々の回路は、アクチベータープラスミドおよび溶解／治療用プラスミドの２つのプラスミドから構成される。主なアクチベータープラスミドは、我々のグループの以前の研究で使用されたｐＴＤ１０３ＬｕｘＩ  ｓｆＧＦＰである（Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44 (2012)）。こ
のプラスミドは、ＬｕｘＩおよびｓｆＧＦＰ上のｓｓｒＡ−ＬＡＡ分解タグ（ＡＡＮＤＥＮＹＡＬＡＡのアミノ酸配列）、スーパーフォールディング緑色蛍光タンパク質変異体を含む（Pedelacq, J.-D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C. & Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.Nature Biotechnology 24, 79-88 (2005)）。ＬｕｘＩからｓｓｒＡ−ＬＡＡタグを除去す
ることによってｐＴＤ１０３ＬｕｘＩ（−ＬＡＡ）およびｐＴＤ１０３ＬｕｘＩ（ＴＳ）を構築した。構築の大部分は、クローニングのＣＰＥＣ法を用いて行った（Quan, J. & Tian, J. Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways.PloS One 4, e6441 (2009)）。
【０１４１】
溶解プラスミドは、ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性マーカーを有するモジュラーｐＺプラスミド配列を用いて構築した（Lutz, R. & Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the lacr/o, the tetr/o and arac/i1-i2 regulatory elements.Nucleic acids research 25, 1203-1210 (1997)）。バクテリオファージφＸ１７４由来の溶解遺伝子Ｅは、Lingchong Youによって親切にも提供され、以前に報告されたｅＰｏｐプラスミドからＰＣＲによって得られた（Marguet, P., Tanouchi, Y., Spitz, E., Smith, C. & You, L. Oscillations by minimal bacterial suicide circuits reveal hidden facets of host-circuit physiology.PloS One 5, e11909 (2010)）。Ｅ遺伝子をＬｕｘＲ−ＡＨＬで活性化可能なｌｕｘＩプロモーターの発現下に置いた。治療型の溶解プラスミドを構築するために、ＰＣＲにより大腸菌株ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡからｈｌｙＥ遺伝子を抽出し、それを溶解プラスミドに挿入した。毒素の発現を駆動するために使用されたプロモーターは、インビトロキャラクタリゼーションではｔａｃプロモーターであり、インビボ試験ではｌｕｘＩプロモーターであった。遺伝子の終わりにある転写ターミネーターと共に、これは治療用毒素カセットを形成した。適切なプラスミドに挿入する前に、ＣＤＤ−ｉＲＧＤおよびｍＣＣＬ２１遺伝子を断片として合成した。
【０１４２】
インビボで試験される回路株で使用されるプラスミドでは、２つの安定化要素、ｈｏｋ／ｓｏｋ系およびａｌｐ７分配系をアクチベーターおよび溶解／治療用プラスミドに挿入した。最近の研究は、枯草菌（B. subtilis）プラスミドｐＬＳ２０からのｈｏｋ／ｓｏ
ｋ毒素−抗毒素系およびａｌｐ７ＡＲカセットの添加が、インビボでほぼ完全なプラスミド保持を可能にすることを示している（Gerdes, K. The parB (hok/sok) locus of plasmid R1: a general purpose plasmid stabilization system.Nature Biotechnology 6, 1402-1405 (1988); Wood, T., Kuhn, R. & Peretti, S. Enhanced plasmid stability through post-segregational killing of plasmid-free cells.Biotechnology Techniques 4,
39-44 (1990)）。
【０１４３】
この研究で使用したプラスミドのマップについては、図８および図２５を参照されたい。
【０１４４】
顕微鏡検査およびマイクロ流体工学
本明細書に記載されている顕微鏡検査およびマイクロ流体工学技術は、以前に我々のグループから報告されたものと同様である（Danino, T., Mondragon-Palomino, O., Tsimring, L. & Hasty, J. A synchronized quorum of genetic clocks.Nature 463, 326-330 (
2010)）。手短に言えば、我々のマイクロ流体デバイスを、架橋フォトレジストによって
形成されたミクロンスケールの特徴を有するシリコンウェーハ上に成形され焼成されたＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）から構築した。その後、（ウェーハからＰＤＭＳに移された一組の特徴によって形成された）個々のデバイスを焼成したＰＤＭＳから切り取り、デバイスに穴をあけて流体ラインの接続を可能にした。次いで、デバイスをカバーガラス上に接着し、細胞ローディングおよびイメージングのために顕微鏡ステージ上に置いた。流体ラインは、培地、細胞を供給する、または廃棄リザーバとして機能する様々なシリンジからデバイスに接続された。デバイス内の流れの方向は、関連するシリンジ間の相対的な高さを変化させ、静水圧によって駆動される流れを生じさせることによって制御した。
【０１４５】
デバイスをロードする前に、（Plastibrandからの１．５ｍｌキュベットを使用して）
細胞を約０．１の光学密度（Ａ６００ｎｍ）に培養した。ロードする前に、デバイスを培地シリンジで「濡らし」、チャネル内の気泡を除去した（Ferry, M., Razinkov, I. & Hasty, J. Microfluidics for synthetic biology from design to execution.Methods Enzymol 497, 295 (2011)）。細胞ローディングシリンジおよび廃棄シリンジの高さの相対的な変化が、細胞ポートから廃棄ポートへの細胞の流れをもたらすように、所定の廃棄ポートを下げることによって、デバイスを細胞ポートからロードした。細胞がトラップにロードされたら、流れの方向を逆転させて培地を全てのポートに流し、トラップされた細胞に栄養分の連続的な灌流を供給した。これらのマイクロ流体実験では、培地および細胞懸濁液に０．０７５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加して、細胞がデバイス内のチャネルおよびポートに接着するのを防いだ。図１〜２の回路挙動を特徴付ける実験を、これまでに記載されているように、サイドトラップアレイデバイスで行った（Danino, T., Mondragon-Palomino, O., Tsimring, L. & Hasty, J. A synchronized quorum of genetic clocks.Nature 463, 326-330 (2010)）。ＧＦＰシンクと共に使用されるデバイスを、サイドトラップアレ
イとしても配置する。トラップおよびシンクの図については、図６Ａおよび図２２Ａを参照されたい。
【０１４６】
チップ上での共培養実験では、サイドトラップアレイデバイスを利用し、達成可能な流速のダイナミックレンジを増大させるために、波形チャネルを有する入口/出口ポートの
全てに流体抵抗を加えた。哺乳類細胞のローディングでは、細胞をトリプシン処理し、ペレット化し、ローディング前に０．５〜１．０ｍＬのＤＭＥＭ＋ＦＢＳ＋抗生物質（カナマイシンおよびクロラムフェニコール）に再懸濁した。未接着細胞が、ほぼ停滞した流動条件下で、培地チャネルに局在するように、細胞を光学顕微鏡下でロードした。次いで、ほぼ停滞した流動を維持するようにシリンジの相対的高さの変化を回避しながら、マイクロ流体チップおよびシリンジ装置をＣＯ2インキュベーター内に注意深く置いた。細胞を
２〜４時間以内に接着させた後、培地シリンジをわずかに上昇させてチャネルに新鮮な培地を供給し、その後一晩増殖させた。翌日、チップおよびシリンジ装置を、これまでに記載されている温度およびＣＯ2環境チャンバ下で、顕微鏡に移した（Kolnik, M., Tsimring, L. S. & Hasty, J. Vacuum-assisted cell loading enables shear-free mammalian microfluidic culture.Lab On a Chip 12, 4732-4737, 2012）。次いで、細菌培養物を調
製し、イメージングの前に上記のようにロードした。流速が高すぎる場合、放出された治療剤の哺乳類グロースチャネルへの良好な拡散を可能にするために、（ｓｆＧＦＰの出現によって示される）細菌集団がクオラム閾値に達したときに、流速を下げた。関連する主なステップの図については、図６Ｄおよび図２２Ｄを参照されたい。
【０１４７】
顕微鏡検査では、以前の研究で記載したのと同じシステムを使用した（Prindle, A. etal.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44,
2012）。手短に言えば、位相差に基づくイメージングと共にNikon Eclipse TI落射蛍光
顕微鏡を使用した。画像の取得には、PhotometricsのCoolSNAP HQ2 CCDカメラを使用した
。顕微鏡検査および取得は、Nikon Elementsソフトウェアによって制御した。マイクロ流体デバイスの温度を維持するために、ステージの周りの広い領域を包含する加熱ユニットに接続されたプレキシガラスインキュベーションチャンバを使用した。位相差画像を５０〜２００ｍｓの露光時間で６０倍の倍率で撮った。６０倍での蛍光イメージングは、ＧＦＰについては１５０ｍｓで、Lumencor SOLA光源で３０％設定で実施した。通常の実験の
過程では、２〜３分ごとに画像を撮った。デバイスチャネルの流速を推定するために、蛍光灯の２００ｍｓ露光時の蛍光ビーズ（１．０μｍ）のトレースの長さを測定して平均流体速度を推定した。これらの画像の分析に関するその他の情報は、以下のデータ分析セクションで与えられている。
【０１４８】
ウェルプレート実験
生存率実験では、ペニシリンおよびストレプトマイシン抗生物質を含む標準組織培養９６ウェル平底プレート（Fisher Scientific）上に単層のＨｅＬａ細胞を播種した。５０
ｍＬの培養物中の図３Ｄからの４つの細菌株を、０．０８の光学密度まで増殖させた後、ペレット化し、適切な抗生物質を含む１．２ｍＬの培地に再懸濁した。次いで、細菌培養物を１時間増殖させ、次いで、１．５ｍＬマイクロ遠心管中でペレット化した。得られた各上清１００μＬを３つのＨｅＬａ培養ウェルに添加した。その後、Vybrant MTT Cell Proliferation Assay Kit （V-13154, Molecular Probes）のプロトコルを実施して、ＨｅＬａ細胞の生存率を測定した。
【０１４９】
様々な播種実験（図３Ｅ〜Ｆ）についても、同じウェルプレートを利用した。ＳＤＣ＋ＨｌｙＥ株を約０．０７の光学密度まで増殖させた後、細胞をペレット化し、１ｍＬの新鮮な培地および抗生物質に再懸濁した。次に、様々な容積のこの高密度培養物をそれぞれの場合について３つのウェルに播種し、イメージングを２０倍の倍率で行った。
【０１５０】
データ分析
蛍光強度プロファイルを、蛍光チャネルからのフレームを分析し、平均ピクセル強度を経時的にプロットすることによって得た。測定した周期は、蛍光プロファイルのピーク・トゥ・ピーク期間である。トラップ内の細胞の数は、ImageJの位相差画像を分析することによって分かった。細菌はグロースチャンバ内で単層を形成したので、最初に個々の細菌細胞の平均面積および平均空隙率（トラップ内の細菌間のオープンスペース）を推定した。画像のμｍ/ピクセルを考慮して、ImageJを用いて細胞によって取り込まれたトラップ
の面積を測定し、細菌細胞の平均面積で割った。次いで、この値に（１−空隙率）を掛けて、トラップ内の総推定細胞数を得た。主要細胞群に近接していない細菌を個々に数え、最終数に加えた。溶解前の細菌の最大数で溶解した細菌の数を割ることによって、１周期当りの溶解した細胞の割合が分かった。プロットはMATLABを使用して得た。
【０１５１】
培地チャネルの流速を推定するために、２０倍で蛍光１μｍビーズをイメージングし、MATLABを用いて画像を分析した。蛍光ビーズトレースの長さをピクセル単位で測定し、ミクロンに変換した。その後、トレースの長さを露光時間（２００ｍｓ）で割って流速を得た。この研究では、ビーズトレースの外れ値に対しては感度が低いため、流速の中央値を報告する。
【０１５２】
モデリング
ＳＤＣの動的挙動を説明するために、細胞集団サイズ（Ｎ）、ＡＨＬ（Ｈ）、細胞間ＬｕｘＩ（Ｉ）、および細胞間溶解タンパク質Ｅ（Ｌ）に関する式を有する常微分方程式モデルを開発した。集団変数は、細胞集団数（Ｎ）および細胞外ＡＨＬ（Ｈ）である（ＬｕｘＲ−ＡＨＬ結合が速いと仮定する）。このモデルは、細胞数とともに続いて増加する細胞外ＡＨＬに応答する実験を通して生存している系統を（単一の細胞を介して）追跡する系と考えることができる。細胞外ＡＨＬ閾値に達すると、活性化項Ｐｌｕｘによってもた
らされるポジティブフィードバックのために、Ｌｕｘ駆動遺伝子であるＬｕｘＩおよびＥの細胞内産生がＯＮ状態（第２安定状態）になる。溶解タンパク質の増加は、溶解タンパク質の濃度に基づいて死滅をＯＮ／ＯＦＦに切り替えるヒル関数としてモデル化された死滅項γＮを介して細胞数の急速な減少をもたらす。ＡＨＬおよび溶解タンパク質レベルが減衰すると、ＰｌｕｘおよびγＮはＯＦＦ状態に戻り、細胞数が上昇して過程を繰り返す。発火はＡＨＬの閾値に依存するので、ＳＬＣは積分発火挙動を示す回路と考えることができる。
【０１５３】
最大細胞集団（Ｎ0）は、単一細胞トラップ内に収まり得る細胞の最大数によって定義
される。細胞は、細胞増殖（μG）の結果としてトラップを離れる。溶解による細胞分解
の速度は、ヒル関数γNによって説明される。我々は、トラップ内の全ＡＨＬ（Ｈ）の動
的記述を可能にするために、細胞膜を通るＡＨＬの拡散が速いと仮定した。ＡＨＬ（Ｈ）の産生は、細胞集団（Ｎ）とＬｕｘＩ（Ｉ）の細胞当り濃度との積に比例する。ＡＨＬ希釈は、細胞蓄積の結果としてのトラップからのＡＨＬ除去の妨害の増加のために、Ｎに反比例する。ＬｕｘＩおよび溶解タンパク質の内部産生は、Ｐluxによって説明される。両
方のタンパク質の分解は、細胞増殖（μＧ）ならびにある程度の基礎分解（γIおよびγL）に起因する。さらに、ＬｕｘＩは、ＣｌｐＸＰ機構（γC）によってさらに分解される
。
【数１】
2020096645.tif 000005
【０１５４】
パラメータ：
モデルパラメータを選択して、実験集団およびＧＦＰ（ＬｕｘＩの代用）軌跡に定性的に適合させた（図２Ａ）。大腸菌と比較したサルモネラ（S.typhimurium）のタンパク質
産生および分解の増加は、以前の研究で報告されている（Prindle, A. et al.Genetic circuits in Salmonella typhimurium.ACS Synthetic Biology 1, 458-464 (2012)）。大腸菌とサルモネラ（S.typhimurium）との間の挙動の主要な定性的差異を説明する３つのパ
ラメータ（ＡＨＬ、ＬｕｘＩ産生速度、および基礎ＬｕｘＩ分解速度：ＣＬ、ＣＩ、γＬ、γＩ）を見出した（図２Ｂ）。３つのパラメータ全てを精査して、３つ全てにおける増加が回路発振の領域を拡大することが分かった（図５Ｅ）。
【０１５５】
モデルパラメータ値：
本明細書に記載のいくつかの実験では、以下のモデルパラメータ値を使用した：μG（
細胞増殖による希釈）０．２；Ｎ0（最大細胞集団サイズ）１０；ｋ（細胞溶解の最大速
度）１０；Ｌ0（最大溶解の半分をもたらす溶解遺伝子の濃縮）２；ｎ（溶解関数のヒル
係数）４；ｂ（ＡＨＬ産生速度）５０；μ（流動による最大ＡＨＬ除去速度）１５；ＣL
（溶解遺伝子コピー数）０．５；ＣI（ＬｕｘＩコピー数）１；α0（Ｌｕｘプロモーター基礎産生）０．５；αH（ＬｕｘプロモーターＡＨＬ誘発産生）３０；Ｈ0（Ｌｕｘプロモーターに対するＡＨＬ結合親和性）５；γL（溶解タンパク質の基礎分解）２；γI（ＬｕｘＩの基礎分解）２；γC（ＬｕｘＩのＣｌｐＸＰ分解）８。
【０１５６】
いくつかの実験では、以下のモデルパラメータ値を使用した：μＧ（細胞増殖による希釈）０．２；Ｎ０（最大細胞集団サイズ）１０；ｋ（細胞溶解の最大速度）１０；Ｌ０（最大溶解の半分をもたらす溶解遺伝子の濃縮）２；ｎ（溶解関数のヒル係数）２；ｂ（ＡＨＬ産生速度）２５；μ（流動による最大ＡＨＬ除去速度）１２；ＣＬ（溶解遺伝子コピー数）０．５；ＣＩ（ＬｕｘＩコピー数）１；α０（Ｌｕｘプロモーター基礎産生）０．５；αＨ（ＬｕｘプロモーターＡＨＬ誘発産生）３５；Ｈ０（Ｌｕｘプロモーターに対するＡＨＬ結合親和性）５；γＬ（溶解タンパク質の基礎分解）２；γＩ（ＬｕｘＩの基礎分解）２；γＣ（ＬｕｘＩのＣｌｐＸＰ分解）１２。
【０１５７】
補足ビデオ
補足ビデオ１．株１（サルモネラ（S.typhimurium），ＬｕｘＩ上のｓｓｒＡタグなし）
中のステルス送達回路（ＳＤＣ）の６０倍の倍率での経時的蛍光顕微鏡検査を示すビデオを撮った。このビデオは、（回路遺伝子のクオラム活性化を示す）細胞が蛍光を発するクオラム閾値に達し、一部分の集団が溶解するまで、マイクロ流体チャンバ内で細菌のコロニーが増殖したことを示す。生存細菌は、再集合化し、再び閾値に達するまで増殖し、過程を繰り返した。ビデオはコロニーを８回の溶解サイクルで追跡し、この株の溶解周期は約３時間であった。１００×１００μｍのチャンバの底部で２分ごとに画像を撮った。
【０１５８】
補足ビデオ２．株２（サルモネラ（S.typhimurium），ＬｕｘＩ上のｓｓｒＡタグあり）
中のＳＤＣの６０倍の倍率での経時的蛍光顕微鏡検査を示すビデオを撮った。このビデオは、溶解周期が長いと、ＬｕｘＩでの分解効率が高いことを示す。（回路遺伝子のクオラム活性化を示す）細胞が蛍光を発するクオラム閾値に達し、一部分の集団が溶解するまで、マイクロ流体チャンバ内で細菌のコロニーが増殖した。生存細菌は、再集合化し、再び閾値に達するまで増殖し、過程を繰り返した。ビデオはコロニーを６回の溶解サイクルで追跡し、この株の溶解周期は約６時間であった。チャンバのサイズは１００×１００μｍであり、２分ごとに画像を撮った。
【０１５９】
補足ビデオ３．株１３（大腸菌）中のＳＤＣの６０倍の倍率での経時的蛍光顕微鏡検査を示すビデオを撮った。このビデオは、定期的な溶解発振が３７℃で依然として観察されたが、回路が大腸菌においてロバストではなかったことを示す。（回路遺伝子のクオラム活性化を示す）細胞が蛍光を発するクオラム閾値に達し、一部分の集団が溶解するまで、マイクロ流体チャンバ内で細菌のコロニーが増殖した。生存細菌は、再集合化し、再び閾値に達するまで増殖し、過程を繰り返した。ビデオはコロニーを６回の溶解サイクルで追跡し、この株の溶解周期は約３時間であった。チャンバのサイズは１００×１００μｍであり、２分ごとに画像を撮った。
【０１６０】
補足ビデオ４．株１（サルモネラ（S.typhimurium））中のＳＤＣの６０倍の倍率での経
時的蛍光顕微鏡検査を示すビデオを撮った。このビデオは、実験の最初の部分において、２００ｎＭのＡＨＬを有する培地を使用し、細菌が一定の溶解状態になるのを見ることができることを示している。このデバイスでは、蛍光色素（赤色チャネル）で示されている。その後、培地を蛍光色素が存在しないＡＨＬなしの別の源に切り替え、細菌は、コロニーがイメージング終了前に４回の溶解サイクルの間持続する発振状態に戻った。チャンバ
のサイズは１００×１００μｍであり、２分ごとに画像を撮った。
【０１６１】
補足ビデオ５．６０倍の倍率でマイクロ流体デバイス上の細菌および癌細胞の共培養を示すビデオを撮った。このビデオは、ＨｅＬａ細胞がデバイスの主チャネルで増殖している間に、株３（非運動性サルモネラ（S.typhimurium），ＨｌｙＥを有するＳＤＣ）がグロ
ースチャンバにロードされたことを示す。細菌が、クオラム閾値に達し溶解するまで、そのチャンバ内で増殖するのを見ることができた。溶解すると、チャネル中のＨｅＬａ細胞が、細胞死を起こしているのを見ることができた。経時的蛍光顕微鏡画像を３分ごとに撮った。
【０１６２】
補足ビデオ６．６０倍の倍率でのマイクロ流体デバイス上の細菌および癌細胞の共培養の第２のビデオ。このビデオは、ＨｅＬａ細胞がデバイスの主チャネルで増殖している間に、株３（非運動性サルモネラ（S.typhimurium），ＨｌｙＥを有するＳＤＣ）がグロース
チャンバにロードされたことを示す。細菌が、クオラム閾値に達し溶解するまで、そのチャンバ内で増殖するのを見ることができた。溶解すると、チャネル中のＨｅＬａ細胞が、細胞死を起こしているのを見ることができた。経時的蛍光顕微鏡画像を３分ごとに撮った。
【０１６３】
補足ビデオ７．２０倍の倍率で組織培養ウェルプレート中の細菌および癌細胞の共培養のビデオを撮った。このビデオは、株４（運動性サルモネラ（S. Typhimurium ），Ｈｌｙ
Ｅを有するＳＤＣ）を、単層ＨｅＬａ細胞とウェルに入れたことを示している。細菌が増殖した後、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現によってクオラム事象が可視化された。まもなくＨｅＬａ細胞が細胞死を呈することを見ることができた。経時的蛍光顕微鏡画像を１分ごとに撮った。
【０１６４】
合成生物学の１つの約束は、生きた細胞における論理プログラミングの実行を可能にする遺伝子回路の創造である。このような「ウェットプログラミング」は、治療剤および診断薬から水処理戦略までに亘る幅広く多様なバイオテクノロジーを変革するように位置づけられている。しかし、遺伝子モジュールのライブラリの開発における進歩は急速に進み続ける（Gardner, T. S., Cantor, C. R. & Collins, J. J. Construction of a genetic
toggle switch from Escherichia coli.Nature 403, 339-342; Siuti, P., Yazbek, J. & Lu, T. K. Synthetic circuits integrating logic and memory in living cells.Nature Biotechnol.31, 448-452 (2013); Tigges, M., Marquez-Lago, T., Stelling, J. & Fussenegger, M. A tunable synthetic mammalian oscillator.Nature 457, 309-312 (2009); Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R. & Benenson, Y. Multi-input
RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells.Science 333, 1307-1311 (2011)), a major challenge for their integration into larger circuits is the generation of sufficiently fast and precise communication between modules (Moon, T. S., Tamsir, A., Stanton, B. C. & Voigt, C. A. Genetic programs constructed from layered logic gates in single cells.Nature 491, 249-253, 2012; Del
Vecchio, D., Ninfa, A. J. & Sontag, E. D. Modular cell biology: retroactivity and insulation.Mol.Syst.Biol.4, 161, 2008）。魅力的なアプローチは、ロバストな細胞シグナル伝達を容易にする宿主過程を設計した回路に組み込むことである（Nandagopal, N. & Elowitz, M. B. Synthetic biology: integrated gene circuits.Science 333, 1244-1248 (2011)）。これに関連して、最近の研究では、細菌タンパク質分解が、限られた
細胞内プロテアーゼの供給に過負荷をかけることにより、ストレスに対する正確な応答を引き起こすことができることが示されている（Fredriksson, A. et al.Decline in ribosomal fidelity contributes to the accumulation and stabilization of the master stress response regulator σS upon carbon starvation.Genes Dev.21, 862-874 (2007);Merrikh, H., Ferrazzoli, A. E., Bougdour, A., Olivier-Mason, A. & Lovett, S. T.A
DNA damage response in Escherichia coli involving the alternative sigma factor,
RpoS.Proc.Natl Acad.Sci.USA 106, 611-616 (2009); Cookson, N. A. et al.Queueing up for enzymatic processing: correlated signaling through coupled degradation.Mol.Syst.Biol.7, 561 (2011)）。ここで、我々は、プロテアーゼ競合を利用して、複数の
空間スケールおよび時間スケールにわたる遺伝子回路の迅速かつ調整可能な結合を設計する。我々は、標準的な転写因子ベースの結合法よりも一桁以上速い結合遅延時間（約２０〜４０分と比較して１分未満）を特徴付け、タンパク質とその分解タグとの間のリンカーの操作による調整可能性を実証する。我々は、細胞内およびコロニーレベルで遺伝子クロックを結合させ、次に、両方のクロックの変動性を減少させるためにマルチコロニー動態を同期させるプラットフォームとしてこの機構を使用する。我々は、結合されたクロックネットワークを用いて、独立した環境入力を単一の時系列出力にコード化し、それにより、遺伝子回路情報（context）において周波数分割多重化（別個の周波数によって共通チ
ャネル上に伝達される情報）を可能にする方法を示す。我々の結果は、競合するタンパク質分解などの天然の「キューイング」過程の使用による遺伝子回路の迅速かつ調整可能な結合のための一般的なフレームワークを確立する。
【０１６５】
合成遺伝子モジュール間の迅速な結合を設計するために、ＣｌｐＸＰプロテアーゼによる共通の分解を介して作用する翻訳後結合プラットフォームを開発した（図１０Ａ）。このスキームでは、全てのＬＡＡタグ付き要素（Keiler, K. C., Waller, P. & Sauer, R. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA.Science 271, 990-993 (1996)）は、限られた数のプロテアーゼをめぐる競争により動的に連結され（Keiler, K. C., Waller, P. & Sauer, R. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA.Science 271, 990-993 (1996); Goldbeter, A. & Koshland, D. E. An amplified
sensitivity arising from covalent modification in biological systems.Proc.Natl Acad.Sci.USA 78, 6840-6844 (1981))、そのため、有意な誘発遅延（３１±５分、図１０Ａの誘発因子の添加からＧＦＰ出現までの経過時間）にもかかわらず、タグ付けされたモジュールは、密接に整列したままである（１±１分（±ｓｅｍ）、図１０ＡのＧＦＰ−ＣＦＰ（緑色蛍光タンパク質−シアン蛍光タンパク質）実験軌跡対）。この結合法は、標準的な転写因子ベースの結合法（約２０〜４０分）よりも１桁以上速い遅延を生じる（Rosenfeld, N. & Alon, U. Response delays and the structure of transcription networks.J. Mol.Biol.329, 645-654 (2003); Hooshangi, S., Thiberge, S. & Weiss, R. Ultrasensitivity and noise propagation in a synthetic transcriptional cascade.Proc.Natl Acad.Sci.USA 102, 3581-3586 (2005)）。ＣｌｐＸＰ活性を調節することによりモジュール出力を調整させることによって達成できる応答時間を直接説明するために、外部から提供される低レベル（９０ｍＭ）のＨ2Ｏ2「誘発因子」が、迅速に（＜２分、我々の実験時間ステップ）かつ可逆的に、構成的に発現されるＧＦＰの濃度をＣｌｐＸＰ依存的様式で調節することを示す（図１０Ｂ）。ここで、Ｈ2Ｏ2は、ＣｌｐＸＰによる分解のための代替的なシグマ因子ＲｐｏＳを標的とするアダプタータンパク質であるＲｓｓＢを妨害することによって、ＣｌｐＸＰ上への天然の基質のロードを低減する（Fredriksson, A. et
al.Decline in ribosomal fidelity contributes to the accumulation and stabilization of the master stress response regulator σS upon carbon starvation.Genes Dev.21, 862-874 (2007); Merrikh, H., Ferrazzoli, A. E., Bougdour, A., Olivier-Mason, A. & Lovett, S. T. A DNA damage response in Escherichia coli involving the alternative sigma factor, RpoS.Proc.Natl Acad.Sci.USA 106, 611-616 (2009); Mika, F.
& Hengge, R. A two-component phosphotransfer network involving ArcB, ArcA, and RssB coordinates synthesis and proteolysis of σS (RpoS) in E. coli.Genes Dev.19, 2770-2781 (2005)）。ＲｐｏＳがＣｌｐＸＰによって連続的に産生され、分解されるので、その律速アダプタータンパク質を不活性化すると、ＬＡＡタグ付きタンパク質の有効なＣｌｐＸＰ分解速度が瞬間的に上昇する（Pruteanu, M. & Hengge-Aronis, R. The cel
lular level of the recognition factor RssB is transduction in σS turnover in Escherichia coli.Mol.Microbiol.45, 1701-1713 (2002)）。
【０１６６】
クオラムセンシングクロックを有する構成モジュールを駆動することによって、結合機構を体系的に調査した（図１０Ｃ）。ペースメーカとして、クオラムクロックは、１００μｍ以下の距離で細胞の挙動を同期させることができる小分子であるアシル−ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）を介してコロニーレベルで密度依存性の同期発振を発生させる（Danino, T., Mondrago´n-Palomino, O., Tsimring, L. & Hasty,J. A synchronized quorum of genetic clocks.Nature 463, 326-330 (2010)）。マイクロ流体デバイスを使用して(Unger, M. A., Chou, H.-P., Thorsen, T., Scherer, A. & Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.Science, 288, 113-116 (2000))、構成モジュールのコロニーレベルの発現を観察し、発振する発現がクオラムクロックに同期していることが分かった（図１０Ｃ，右上）。次いで、下流のタンパク質とその分解タグとの間に一連の可変長スペーサー領域を付加することによって、分解タグのライブラリを構築した。スペーサー領域は、アミノ酸配列「Ｔｈｒ−Ｓｅｒ」（ＴＳ）の１コピーと５コピーとの間に含まれ、オフセット時間に対するそれらの効果を、以前に公表された別の分解タグの効果と比較した（図１４Ｂ〜Ｆ）。全てのスペーサー配列は同期活性化動態を生じたが、下流のモジュールの分解動態は、リンカー配列の長さに依存してオフセットされ、リンカーが長いと、ＧＦＰ−ＣＦＰオフセット時間がより長くなった（図１０Ｃ，下）。したがって、我々のＣｌｐＸＰ結合プラットフォームは、遺伝子モジュールを共有分解によって迅速に連結し、個々のモジュールの分解動態を変化させることによって結合の強度およびタイミングを調整することを可能にする。
【０１６７】
独自の動態を生み出すことができる遺伝子モジュール間の結合を設計するために、クオラムクロックおよび以前に記載された細胞内クロックの変異体を含む回路を設計した（図１１Ａ）（Stricker, J. et al.A fast, robust and tunable synthetic gene oscillator.Nature 456, 516-519 (2008)）。Ｐlac/ara-1プロモーターをベースとするこの細胞内
クロック変異体は、ＰLlacO-1プロモーターを使用する公表されたバージョンの高速動態
および単純な遺伝的構造を保持する。細胞内クロックは、発振をもたらす遅延を有するネガティブフィードバックループに基づいている。Ｐlac/ara-1またはＰLlacO-1プロモーターは、それらの転写リプレッサーであるＬａｃＩタンパク質の発現を駆動する。ＬａｃＩ転写リプレッサーのフォールディングおよび成熟において引き起こされる遅延は、転写活性の発振バーストをもたらす。より一般的には、発振をもたらすこのネガティブフィードバックモチーフを、ＴｅｔＲを駆動するｔｅｔ抑制性プロモーターまたはｃＩリプレッサーを駆動するラムダプロモーターなどの他のプロモーター／リプレッサーの組み合わせを用いて構築してもよい。Ｐlac/ara-1プロモーターをベースとする細胞内クロックの周期
は、染色体ａｒａＣの存在下で、イソプロピル−β−D−１−チオガラクトピラノシド（
ＩＰＴＧ）およびアラビノースの両方によって調節可能である。クオラムクロックは機能するためには臨界コロニーサイズを必要とするため、最初に小さなマイクロ流体デバイス（１００細胞）を使用し、クオラムクロックの影響を受けない高速かつ非同期の細胞内クロック発振を観察した。より大きなデバイス（５，０００細胞）では、集団が大きくなるにつれて、非同期発振から同一の細胞内発振およびクオラムクロック発振への移行が観察された（図１１Ｂ）。より大きい集団の場合、クオラムクロックパルスの間のＣｌｐＸＰへの基質のロードは、細胞内クロックをその発振状態からシフトさせるのに十分であり、その空間的および時間的スケールがはるかに異なるにもかかわらず、２つのクロック間の完全な連動を可能にする。したがって、細胞間コミュニケーションのモード自体が欠如しているにもかかわらず、細胞内クロックは、クオラムクロックとのＣｌｐＸＰ媒介性結合によって、コロニーレベルで効果的に同期される。
【０１６８】
より長い細胞内クロック周期に関連するＩＰＴＧ値がより短いクオラムクロック周期を
逆に生じさせたので、個々の細胞の細胞内クロック周期を変えることがクオラムクロック周期を間接的に調整することが分かった（図１１Ｃ）。この効果を説明するために、ロード媒介パルス周波数調節の一形態を含むオシレータネットワークの計算モデルを開発した（図１１Ｄ〜Ｆ）。結合したパルス間では、より大きな細胞内クロックロードがより高いレベルのＡＨＬ−シンターゼを産生するので、ＬｕｘＩの分解速度のロード媒介による減少を通じてクオラムパルス開始を加速する（図１１Ｅ、左および図１１Ａ−Ｅ）。結合したパルスの間に、細胞内クロックの寄与は、パルス自体の持続時間を未変化のままにする（図１１ｅ，左（モデル）および右（実験））。細胞内クロックおよびクオラムクロックを分解によって連結することにより、クオラムクロックのみと比較して、流速に関して結合系の発振状態が拡大した（図１１Ｆ）。このようにして、細胞内クロックはクオラムクロックを連続的に発火させ、より高い外部流速でよりロバストな機能を可能にする（図１２Ａ〜Ｃ）。
【０１６９】
遺伝子クロックを複数のスケールで迅速に結合するためのプラットフォームを用いて、両方のクロックからの情報を周波数エンコードすることができる系を単一のレポーターのマルチスペクトル時系列に設計しようとした（図１２Ａ）。ここで、細胞内クロックレポーターの測定された出力は、遅いクオラムクロックバースト間のそれ自身の高速な細胞内クロック動態からの寄与を含む。より速いＰlac/ara-1細胞内クロックの固有周期の範囲
がより遅いクオラムクロックから完全に分離されるので（Danino, T., Mondrago´n-Palomino, O., Tsimring, L. & Hasty, J. A synchronized quorum of genetic clocks.Nature 463, 326-330 (2010); Stricker, J. et al.A fast, robust and tunable synthetic gene oscillator.Nature 456, 516-519 (2008)）、ＩＰＴＧおよびアラビノースの入力と
流速の入力との両方を、時間領域で周波数変調発振にコード化し、フーリエ変換によって独立して抽出することができる。したがって、単一のクロック過程の測定は、基礎となるクロックネットワークの両方の活性を明らかにする。
【０１７０】
ＩＰＴＧおよびアラビノースの入力と流速の入力とを掃引したときに、細胞内クロックおよびクオラムクロックの両方の周波数応答曲線を分離して特徴づけることから始め、それぞれ７〜２５分および５５〜９５分の範囲を見出した（図１２Ｂ，上（ａｒａＣ１株の細胞内クロック）、および下（クオラムクロック、元の研究データ）（Marguet, P., Tanouchi, Y., Spitz, E., Smith, C. & You, L. Oscillations by minimal bacterial suicide circuits reveal hidden facets of host-circuit physiology.PloS One 5, e11909 (2010)）。次に、結合されたクロック系から得られた軌跡を測定し、フーリエ変換によって両方のクロックの周波数要素を抽出した（Press, W. H. in Numerical Recipes: The Art of Scientific Computing 3rd ed. (Cambridge Univ.Press, 2007)）(図３Ｃおよび方法の要約）。ＩＰＴＧ誘発因子およびアラビノース誘発因子の掃引では、ＩＰＴＧおよびアラビノースに対する細胞内周波数応答が単独のクロックと同等であったため、クオラムクロックを含めることによって、マルチスペクトルレポーターへの細胞内クロック寄与の周波数応答は変化しないことが分かった（図１２Ｄ，上（結合）、および図１２Ｂ，上（単独））。次に、３つの固定された誘発因子レベルで流速を掃引し、細胞内クロックによるＣｌｐＸＰ媒介周波数変調の我々のモデルに従ってシフトされたマルチスペクトルレポーターへのクオラムクロック寄与について互いに異なる応答曲線を見出した（図１２Ｄ、下）。したがって、所与の対のＩＰＴＧおよびアラビノースの入力ならびに流速の入力を解読するために、最初にＩＰＴＧおよびアラビノースの測定値として細胞内クロック周波数を回復させ、流速を測定するために対応するクオラムクロック応答曲線を使用する。
【０１７１】
迅速な結合をより大きな空間スケールにまで拡大するために、遺伝的Ｈ2Ｏ2シグナルリング（Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44 (2012))カセットをネットワークに加え、マルチコロニーレベルでの同期を観察した（図１３Ａ）。これらの実験を実施する際に、天然のストレス応答ネッ
トワークおよび我々の合成回路との間のＣｌｐＸＰにおけるＨ2Ｏ2媒介相互作用も観察した（図１３Ｂ）。元のデザインでは、Ｈ2Ｏ2は、好気性応答制御系ＡｒｃＡＢを介したｌｕｘプロモーターの転写アップレギュレーションにより、クオラムクロック発振を同期させた（Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44 (2012)）。転写量の増加に加えて（図１３Ｃ，上）、外部から供
給されたＨ2Ｏ2に応答したＣｌｐＸＰ活性の増加と一致して、Ｈ2Ｏ2による見かけの分解速度の増加が見られた（図１３Ｃ，下、ならびに図１７Ａおよび１７Ｂ）。また、Ｈ2Ｏ2に応答した転写出力および有効なＣｌｐＸＰ分解速度の結合された増加は、個々のコロニーにおける周期変動の影響を緩和することによって、マルチコロニーレベルで周期分布を狭める（図１３Ｃ、上および図１７Ｃ、１７Ｄ）。
【０１７２】
相互作用するモジュールからなる合成回路の設計は、一般的に転写および翻訳に依存している進行中の試みであり(Gardner, T. S., Cantor, C. R. & Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch from Escherichia coli.Nature 403, 339-342; Siuti, P., Yazbek, J. & Lu, T. K. Synthetic circuits integrating logic and memory in living cells.Nature Biotechnol.31, 448-452 (2013); Tigges, M., Marquez-Lago, T.,
Stelling, J. & Fussenegger, M. A tunable synthetic mammalian oscillator.Nature 457, 309-312 (2009); Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R. & Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer
cells.Science 333, 1307-1311 (2011); Moon, T. S., Tamsir, A., Stanton, B. C. & Voigt, C. A. Genetic programs constructed from layered logic gates in single cells.Nature 491, 249-253 (2012); Del Vecchio, D., Ninfa, A. J. & Sontag, E. D. Modular cell biology: retroactivity and insulation.Mol.Syst.Biol.4, 161 (2008))、翻訳後結合機構にはあまり注意を払っていない（Grunberg, R. & Serrano, L. Strategies for protein synthetic biology.Nucleic Acids Res.38, 2663-2675, 2010）。
【０１７３】
プロテアーゼ競合は、迅速な応答、異なる認識配列を有するモジュール性、およびプロテアーゼアダプターを用いた複数の回路の同時制御という利点を与える（McGinness, K. E., Baker, T. A. & Sauer, R. T. Engineering controllable protein degradation.Mol.Cell 22, 701-707 (2006); Griffith, K. L. & Grossman, A. D. Inducible protein degradation in Bacillus subtilis using heterologous peptide tags and adaptor proteins to target substrates to the protease ClpXP.Mol.Microbiol.70, 1012-1025 (2008)）。より一般的には、天然の生体ネットワークにおいて、細胞資源（例えば、代謝産物
、酵素、転写因子、結合部位）に対する競合は、ノイズを低減し、入力濃度に対する感受性を高め、複数の入力を識別するのに役立つ非線形結合効果をもたらす（Goldbeter, A. & Koshland, D. E. An amplified sensitivity arising from covalent modification in
biological systems.Proc.Natl Acad.Sci.USA 78, 6840-6844 (1981); Burger, A., Walczak, A. M. & Wolynes, P. G. Abduction and asylum in the lives of transcription factors.Proc.Natl Acad.Sci.USA 107, 4016-4021 (2010); Mukherji, S. et al.MicroRNAs can generate thresholds in target gene expression.Nature Genet.43, 854-859 (2011); Buchler, N. E. & Louis, M. Molecular titration and ultrasensitivity in regulatory networks.J. Mol.Biol.384, 1106-1119 (2008); Strogatz, S. Nonlinear Dynamics and Chaos: with Applications to Physics, Biology, Chemistry and Engineering (Perseus Books, 2001)）。本来備わっている細胞過程を介して設計した回路を調整する
こと−我々が「宿主連鎖性」結合と呼ぶもの−は、合成モジュール間のロバストなシグナリングを促進することにより、より精巧な回路を生み出す可能性を有することが想定される。
【０１７４】
遺伝子回路のフォワード・エンジニアリングにおける最近の進歩は、生物療法を開発するための新規アプローチとして合成生物学を位置づけている（Fischbach, M. A., Bluest
one, J. A. & Lim, W. A. Cell-based therapeutics: the next pillar of medicine.Science Translational Medicine 5, 179 ps7-179ps7, 2013; Ruder, W. C., Lu, T. & Collins, J. J. Synthetic biology moving into the clinic.Science 333, 1248-1252, 2011; Weber, W. & Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology.Nature Reviews Genetics 13, 21-35, 2011; and Folcher, M. & Fussenegger, M. Synthetic biology advancing clinical applications.Current opinion in chemical biology, 2012）。有益な微生物が広範に見られること、およびその体内での機能的役割を考えると、細菌は、代謝障害、胃腸疾患、および癌の治療における生物療法の開発のための天然のプラットフォームに相当する（Cho, I. & Blaser, M. J. The human microbiome: at the interface of health and disease.Nature Reviews Genetics 13, 260-270 (2012); Garrett, W. S. Cancer and the microbiota.Science 348, 80-86, 2015; Pawelek, J. M., Low, K. B. & Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector.Cancer Research 57, 4537-4544, 1997）。治療的遺伝子発現のためのモジュールの開発の継続的な進歩により、コロニーの成長および治療的発現を動的に制御する回路の構築が、探求されてない実現可能な事項となっている（Jeong, J.-H. et al.Anti-tumoral effect of the mitochondrial target domain of noxa delivered by an engineered Salmonella typhimurium.PloS One 9, e80050, 2014; Loessner, H. et al.Remote control of tumour-targeted Salmonella enterica serovar typhimurium by the use of l-arabinose as inducer of bacterial gene expression in vivo.Cellular Microbiology 9, 1529-1537, 2007; Swofford, C. A., Van Dessel, N. & Forbes, N. S. Quorum-sensing Salmonella selectively trigger protein expression within tumors.Proceedings of the National Academy of Sciences 112, 3457-3462, 2015）。これらの遺伝子操作された細菌は、集団密度を自己維持する一方で、その部位で治療剤を絶えず産生し放出することが理想的である。本明細書に記載の実施形態の中には、閾値集団密度で同調的に溶解し、遺伝子にコードされた治療剤を放出する臨床的に意義のある特徴を有する遺伝子操作された細菌の使用がある。溶解すると、少数の生き残った細菌が増殖集団を再生し、したがってパルス溶解および放出サイクルをもたらす。マイクロ流体デバイスを使用して、遺伝子回路のロバスト性および調整可能性を特徴付け、インビトロでヒト癌細胞との共培養における抗癌剤としてのその可能性を実証する。マウスの移植同系大腸腫瘍に「同期溶解菌株」を注射し、ルシフェラーゼレポーターを使用してインビボでパルス性コロニー動態を観察する。細菌が化学療法に天然の補助物質を提供できるというこれまでの知見に基づいて（Dang, L. H., Bettegowda, C., Huso, D. L., Kinzler, K. W. & Vogelstein, B. Combination bacteriolytic therapy for the treatment of experimental tumors.Proceedings of the National Academy of Sciences 98, 15155-15160, 2001）、ヒトの結果の不完全な予測にもかかわらず、前臨床試験においてパラダイムを保持する動物モデルで我々の系を試験した(Begley, C. G. & Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer re- search.Nature 483, 531-533 2012; Sausville, E. A. & Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development.Cancer Research 66, 3351-3354, 2006）。肝臓大腸転移の実験的同系移植モデルで化学
療法および遺伝子操作された細菌の組み合わせを使用して、治療可能性を実証し、併用療法が顕著な生存利益とともに全身腫瘍組織量の顕著な減少をもたらすことを見出す。我々のアプローチは、伝統的な医学、新しい生物学的治療法、またはナノ粒子との併用で遺伝子操作された細菌を用いる新規の送達戦略を可能にし得る（Cheong, I. et al.A bacterial protein enhances the release and efficacy of liposomal cancer drugs.Science 314, 1308-1311, 2006; O’Shea, C. C. Viruses-seeking and destroying the tumor program.Oncogene 24, 7640-7655, 2005; June, C. H. et al.Engineered t cells for cancer therapy.Cancer Immunology, Immunotherapy, 1-7, 2014）。
【０１７５】
細菌の治療株で集団レベルを制御し、薬剤送達を促進するために、ロバストな発振動態を生じさせるためにこれまでに使用されてきた結合ポジティブおよびネガティブフィード
バックループを用いて同期溶解回路（ＳＬＣ）を設計した（Danino, T., Mondragon-Palomino, O., Tsimring, L. & Hasty, J. A synchronized quorum of genetic clocks.Nature 463, 326-330, 2010; Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44, 2012）。回路（図１Ａ）は、それ自身のアクチベーター（ポジティブフィードバック）および溶解遺伝子（ネガティブフィードバック）の両方の発現を駆動する共通のプロモーターからなる。具体的には、ｌｕｘＩプロモーターは、ＬｕｘＲに結合し、ＬｕｘＲがプロモーターを転写活性化することを可能にする自己誘発因子（ＡＨＬ）の産生を制御する。
【０１７６】
ネガティブフィードバックは、同様にｌｕｘＩプロモーターの制御下にあるバクテリオファージ溶解遺伝子（φＸ１７４Ｅ）によって誘起される細胞死に起因する（Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44, 2012; Young, K. D. & Young, R. Lytic action of cloned φ X174 gene E. Journal of virology 44, 993-1002, 1982; Marguet, P., Tanouchi, Y., Spitz, E., Smith,
C. & You, L. Oscillations by minimal bacterial suicide circuits reveal hidden facets of host-circuit physiology.PloS One 5, e11909, 2010）。重要なことに、ＡＨ
Ｌは、隣接する細胞に拡散することができ、それにより、細胞間の同期機構を与える。
【０１７７】
同期溶解回路から生じる細菌集団動態は、シグナル伝達分子（ＡＨＬ）の閾値レベルへのゆっくりとした蓄積、次いで集団を迅速に剪定し、細菌の内容物の放出を可能にする溶解事象に概念化することができる（図１Ｂ）。溶解後、残っている少数の細菌が新たにＡＨＬを産生し始め、「組み込みおよび発火」過程が周期的な様式で繰り返されることを可能にする。弱毒化されたサルモネラ（S.typhimurium）中の回路動態および治療的発現の
代用物としてｓｆＧＦＰを使用して、増殖、溶解、およびタンパク質放出を観察するためにマイクロ流体デバイスを使用した。集団溶解に対応する蛍光レポータープロファイルのピークによって特徴付けられる周期的な溶解事象を観察した（図１Ｃ）。各サイクル後に生存している細胞は、溶解感受性の子孫を産生するため、溶解した細胞の割合がサイクルを通して一定のままであり、溶解および生存が確率的様式で起こることを示唆する（図２１Ａ〜Ｂ）。変動する生体内微小環境における実施という最終目標を前提に、我々のマイクロ流体デバイスにおいて、全ての条件にわたって、インキュベーション温度（３６℃〜４０℃）および灌流速度（１００μｍ／ｓ〜２００μｍ／ｓ）の範囲を試験し、３時間の平均周期を測定した。（図１Ｄ）。これらの実験の結果は、本明細書に与えられている補足ビデオ１、２、および３の議論にさらに要約されている。これらの知見は、ＳＬＣが、インビボの状況で起きる可能性のある関連する環境変動にさらされても、溶解および放出のロバストなサイクルを生じさせる能力を有することを示唆する。
【０１７８】
合成生物学における細菌療法の出現は、予測モデリングの必要性を強調している。この必要性は、細菌クローニングと動物実験との時間スケールの違いによって生じるボトルネックに起因しており、すなわち、インビボで試験することができるよりもはるかに速く治療法を創出することができる。したがって、動物モデルで試験する前にＳＬＣ回路を定量的に特徴付けるために、最初に、ロバスト性および調整可能性に影響を与えるパラメータを探索するための計算モデルを開発した（図１８Ａ）。高い生産速度および分解速度が、パラメータ空間におけるより広い領域の発振動態をもたらすことが観察された（図１８Ｂ）。このモデルは、サルモネラ（S.typhimurium）における発振が、タンパク質産生およ
び分解の速度がより低いことがこれまでに判明している大腸菌よりもロバストであったという我々の観察と一致している（Prindle, A. et al.Genetic circuits in Salmonella typhimurium.ACS Synthetic Biology 1, 458-464, 2012），（図２１Ｃ）。
【０１７９】
回路挙動を操作する能力は、様々な状況で我々の系を適用するための汎用性を大幅に向上させるので、ＬｕｘＩタンパク質にｓｓｒＡ分解タグ付け配列を加えることによって、
溶解周期の調整可能性を探った。モデル予測と一致して、周期およびコロニー発火振幅の増加が実験的に観察された（図１８Ｃ〜Ｄおよび図２１Ｄ）。したがって、ＳＬＣは薬剤送達周期および量の調整を可能にする。
【０１８０】
治療的機能性をＳＬＣに組み込むために、孔形成抗腫瘍毒素として試験されている大腸菌の溶血素ＥまたはｈｌｙＥの発現を加えた(Ryan, R. et al.Bacterial delivery of a novel cytolysin to hypoxic areas of solid tumors.Gene Therapy 16, 329-339, 2009;
Nguyen, V. H. et al.Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer.Cancer Research 70, 18-23, 2010）。インビトロで
の細菌の溶解および癌細胞の死滅を可視化するために、細菌の溶解および癌細胞死の単一細胞視覚化を可能にする、より小さい細菌グロースチャンバに隣接するグロースチャネル内に癌細胞が接着するように、マイクロ流体デバイスを設計した（図２２Ｄ）。ヒト子宮頸癌ＨｅＬａ細胞とＳＬＣ回路を有するサルモネラ（S. Typhimurium ）とを共培養した
後、細菌溶解の開始時にＨｅＬａ細胞死が観察され、効率的な毒素放出が示された（図３Ａ〜Ｂ）。これらの実験の結果は、本明細書に与えられている補足ビデオ５および６の議論にさらに要約されている。トラップの外側の完全な細胞死は、最初のｓｆＧＦＰ蛍光の約１１１分以内に起こった（図３Ｃ）。したがって、ＳＬＣはインビトロで癌細胞を殺すのに必要なレベルでＨｌｙＥを放出することが可能であった。
【０１８１】
治療活性の機序を検証するために、バッチ培養で放出された細菌内容物の毒性を評価した。予想通り、ｈｌｙＥモジュールを有するＳＬＣの培養物からの上清に晒されたＨｅＬａ細胞が、生存率のほぼ完全な低下を示し（図３Ｄ）、一方、ｈｌｙＥモジュールを有しないＳＬＣの上清に晒されたＨｅＬａ細胞が、生存率のわずかな低下（約１５％）しか示さないことが分かった。細菌溶解がインビトロでの効率的なＨｌｙＥ放出を可能にすること、および、天然の細胞内の細菌の内容物がＨｅＬａ細胞生存率に有意に影響しないことを結論付けた。さらに、ウェルプレート中のＨｅＬａ培養物を用いて様々な量の回路保有細菌を播種することにより、ｈｌｙＥを有するＳＬＣの薬剤送達特性を調べた。最初の播種からのＨｅＬａ細胞死のタイミングは、細菌がクオラム閾値に達するのに必要な時間が長くなることにおそらく起因して、細菌の播種量が少なくなるにつれて長くなることが観察された（図３Ｅ）。これらの実験の結果は、６０倍の倍率でマイクロ流体デバイス上の細菌および癌細胞共培養を示す補足ビデオ６にさらに映像により概略が示されている。このビデオは、ＨｅＬａ細胞がデバイスの主チャネルで増殖している間に、株３（非運動性サルモネラ（S.typhimurium），ＨｌｙＥを有するＳＤＣ）がグロースチャンバにロード
されたことを示す。細菌が、クオラム閾値に達し溶解するまで、そのチャンバ内で増殖するのを見ることができた。溶解すると、チャネル中のＨｅＬａ細胞が、細胞死を起こしているのを見ることができた。経時的蛍光顕微鏡画像を３分ごとに撮った。全ての場合に必要とされる曝露量は類似しているが、発火速度の上昇は細胞死までのＨｌｙＥへのより短い曝露時間に対応し、溶解および治療剤放出の増加を示した（図３Ｆ）。このようにして、播種された細菌の初期集団レベルは、回路の初期タイミングおよび放出特性を決定する。
【０１８２】
続いて、マウスの移植同系大腸腫瘍における細菌集団動態をモニタリングするために、ルシフェラーゼレポーターを使用した。インビボでの抗生物質選択の非在下でのプラスミド消失の程度を最小にするために、プラスミド保持および分離のためのこれまでに記載されている安定化要素をＳＬＣへ組み込んだ(Gerdes, K. The parB (hok/sok) locus of plasmid R1: a general purpose plasmid stabilization system.Nature Biotechnology 6,
1402-1405, 1988; Wood, T., Kuhn, R. & Peretti, S. Enhanced plasmid stability through post-segregational killing of plasmid-free cells.Biotechnology Techniques 4, 39-44, 1990; Derman, A. I. et al.Phylogenetic analysis identifies many uncharacterized actin-like proteins (alps) in bacteria: regulated polymerization, dyna
mic instability and treadmilling in alp7a.Molecular Microbiology 73, 534-552, 2009; Danino, T., Lo, J., Prindle, A., Hasty, J. & Bhatia, S. N. In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria.ACS Synthetic Biology 1, 465-470, 2012; Danino, T. et al.Programmable probiotics for detection of cancer in urine.Science translational medicine 7, 289ra84-289ra84; 2015）。さらに、細菌発光を介したｈｌｙＥ産生およびクオラム発火の指標として、治療的遺伝子およびｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子の両方（インビボレポーターモジュール）をｌｕｘＩプロモーター下に配置した（図１Ａ）。免疫適合性マウスで大腸癌の皮下モデル（ＭＣ２６細胞系）を用いて、ＳＬＣ細菌の株（ＳＬＣ−ｈｌｙ）を腫瘍内に注射した。インビボイメージング（ＩＶＩＳ）技術を使用して（Danino, T., Prindle, A., Hasty, J. & Bhatia, S. Measuring growth and
gene expression dynamics of tumor-targeted S. typhimurium bacteria.JoVE, Journal of Visualized Experiments, e50540-e50540, 2013）、設計およびインビトロの特徴付けと一致して、腫瘍内のパルス性細菌集団動態が観察された（図１９Ａ〜Ｃ、図２３Ａ）。発光強度の大きさは、構成的対照株より平均して約３００倍低く、腫瘍内の細菌集団レベルの有意な減少を示した（図２３Ｃ）。これらの結果は、インビボ適用のための細菌集団動態の成功裏の設計を実証する。
【０１８３】
マウスにおける回路の健康への影響を理解するための予備段階として、樹立皮下腫瘍を有するマウスの血流に直接単回注射して、ＨｌｙＥを構成的に産生する２つの株のインビボ効果を比較した。１つの株は、完全に同期した溶解回路を含み（ＳＬＣ−ｃｏｎｓｔ  ｈｌｙ）、他の株は、同期した溶解のためのＬｕｘＩ媒介ポジティブフィードバックを含まなかった（非ＳＬＣ−ｃｏｎｓｔ  ｈｌｙ）。ＳＬＣおよび非回路対照株と比較して、非ＳＬＣ治療的産生株では、マウスの健康状態の有意な低下が観察された（図２３Ｅ）。次に、ＳＬＣ系の多機能性を活用して、（ＣＣＬ−２１を用いる、Ｔ細胞および樹状細胞の動員を介した）宿主免疫応答を活性化する、および、（ＣＤＤ−ｉＲＧＤを用いる）腫瘍細胞アポトーシスを誘発する、２つの追加の治療株を作製した（Chen, R. et al.Application of a pro-apoptotic peptide to intratumorally spreading cancer therapy.Cancer Research 73, 1352-1361, 2013; Loeffler, M., Le’Negrate, G., Krajewska, M. &
Reed, J. C. Salmonella typhimurium engineered to produce CCL21 inhibit tumor growth.Cancer Immunology, Immunotherapy 58, 769-775, 2009）（図２３）。腫瘍に直接
送達される反復注射は、複数のＳＬＣ−３株と対照との間に有意な重量差をもたらさず、ＳＬＣ−３株で処置したマウスが有意な治療効果を示すことが分かった（図２３Ｆ〜Ｇ）。さらに、ＳＬＣ−３株、化学療法、または非回路細菌で処置したマウスから採取した腫瘍切片の組織像を調べた。ＳＬＣ−３の場合では、腫瘍の細菌コロニー形成が観察され、組織における有意に高い細胞死も観察された（図２４）。まとめると、これらの結果は、回路が、静脈内に注射されたマウスに対して安全性を高め、腫瘍内の細胞死の増加ももたらすことを示している。癌治療との関連で我々の回路を適用するための原理証明を確立するために、化学療法は酸素欠乏のために効果がないと考えられている無血管の腫瘍コンパートメントを嫌気性細菌が占めることができることを示した以前の研究からインスピレーションを得た（Dang, L. H., Bettegowda, C., Huso, D. L., Kinzler, K. W. & Vogelstein, B. Combination bacteriolytic therapy for the treatment of experimental tumors.Proceedings of the National Academy of Sciences 98, 15155-15160, 2001）。最適な治療アプローチには、細菌が腫瘍の壊死性コアに薬剤を送達し、一方で、標準的な化学療法を血管新生領域に使用するという相乗的な組み合わせが含まれ得ることが提唱されている（Dang, L. H., Bettegowda, C., Huso, D. L., Kinzler, K. W. & Vogelstein, B. Combination bacteriolytic therapy for the treatment of experimental tumors.Proceedings of the National Academy of Sciences 98, 15155-15160, 2001; Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy.Nature Reviews Cancer 10, 785-794, 2010）。このパラダイムに基づいて、肝臓大腸転移の実験的同系移植モデルにおいて、ＳＬＣ細菌と一般的な化学療法（５−フルオロウラシル、または略して５−ＦＵ）と
の併用を試験した。細菌株の経口送達は、樹立肝腫瘍の安全かつ効率的なコロニー形成をもたらし、移植後５〜７日間送達され、したがってマウスに有害な影響を与えない反復投薬を可能にすることが観察された（図２０Ａ〜Ｂ）。細菌療法のみの反復経口送達、または０日目および２１日目の化学療法の単独の投与に応答して、腫瘍は同様の活性軌跡を示した（図２０Ｃ）。しかしながら、２つの療法の併用は、１８日間に亘る腫瘍活性の顕著な低下をもたらした（図２０Ｄ）。この最初の１８日間、腫瘍の大部分は、腫瘍サイズの３０％以上の減少を誘発するものとして認定された（図２０Ｅ）。全体の応答は、不治の大腸転移を有する動物の生存期間の約５０％の増加をもたらした（図２０Ｆ）。長期的な回路安定性のための戦略または追加の治療用カーゴの利用により、改良が為され得る。
【０１８４】
同期溶解回路は、プログラムされた集団制御による全身性炎症反応の問題に直接対処し、細菌コロニーは各発振溶解事象後に剪定されるので、設計は望ましくない宿主応答を緩和する可能性を有する。ほとんどのナノテク戦略とは対照的に、このアプローチは薬剤のプレローディングまたは送達媒体の繰り返しの導入を必要とせず、細胞溶解は追加の分泌機構の必要性を排除する。宿主−微生物相互作用および代謝障害に対する概日リズムの影響に関する最近の洞察を考慮すると、周期的薬剤放出は、より広い意味を有する可能性がある（Leone, V. et al.Effects of diurnal variation of gut microbes and high-fat feeding on host circadian clock function and metabolism.Cell Host & Microbe 17, 681-689, 2015; Thaiss, C. A., Levy, M. & Elinav, E. Chronobiomics: The biological clock as a new principle in host-microbial interactions.PLoS Pathog 11, e1005113, 2015）。より一般的には、同期溶解回路は、合成生物学のツールを活用して、ある種の細菌が固形腫瘍をコロニー形成するという天然の性質を十分に利用するための方法論を例示する。このような工学的戦略は、相互作用するウイルス、細菌、および宿主細胞（Ｔ細胞）によって集団動態が引き起こされる、腫瘍環境における治療群の開発を可能にし得る(Cheong, I. et al.A bacterial protein enhances the release and efficacy of liposomal cancer drugs.Science 314, 1308-1311, 2006）。
【０１８５】
方法の要約
株およびプラスミド
本開示に記載されているいくつかの回路株を、３７℃のインキュベーター内で、０．２％グルコースと共に、カナマイシンおよびクロラムフェニコールをそれぞれ５０μｇｍｌ-1および３４μｇｍｌ-1含むＬＢ培地で培養した。哺乳類細胞を、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＣｅｌｌＧｒｏ３０−００２−ＣＩ）を補充したＤＭＥＭ培地で培養し、３７℃で５％ＣＯ2を維持した組織培養インキュベーター内
に置いた。プラスミドを、クローニングのＣＰＥＣ法を用いて、または標準的な制限消化／ライゲーションクローニングを用いて構築した（Quan, J. & Tian, J. Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways.PloS One 4, e6441
(2009)）。我々のグループの以前の研究では、アクチベータープラスミド（Ｋａｎ，Ｃ
ｏｌＥ１）を使用したが、ｅＰｏｐプラスミドから溶解遺伝子ＥをＰＣＲで取り出し、ＬｕｘＩプロモーターの制御下でこれをベクター（Ｃｈｌｏｒ、ｐ１５Ａ）にクローニングすることにより溶解プラスミドを構築した（Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44, 2012; Marguet, P., Tanouchi, Y., Spitz, E., Smith, C. & You, L. Oscillations by minimal bacterial suicide circuits reveal hidden facets of host-circuit physiology.PloS One 5, e11909, 2010）。ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡからｈｌｙＥ遺伝子をＰＣＲにより得、ｍＣＣＬ２
１（マウスＣＣＬ２１）およびＣＤＤ−ｉＲＧＤを合成した。これらの遺伝子を、ｐｔａｃプロモーターまたはｐＬｕｘＩプロモーターのいずれかの制御下で、溶解プラスミドにクローン化した（De Boer, H. A., Comstock, L. J. & Vasser, M. The tac promoter: a
functional hybrid derived from the trp and lac promoters.Proceedings of the National Academy of Sciences 80, 21-25, 1983）。共培養は、ＨｅＬａ細胞および運動性
または非運動性のサルモネラ（S. typhimurium）、ＳＬ１３４４で行った。完全な株およびプラスミドの情報については、補足情報も参照されたい。
【０１８６】
オシレータプラスミドを、公表されたコンストラクト（Danino, T., Mondrago´n-Palomino, O., Tsimring, L. & Hasty, J. A synchronized quorum of genetic clocks.Nature 463, 326-330 (2010); Stricker, J. et al.A fast, robust and tunable synthetic gene oscillator.Nature 456, 516-519 (2008); Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44 (2012))を改変および組
み合わせることによりＰＣＲ反応によって構築し、ｌｕｘＲを除く全ての回路要素を、迅速分解のためにカルボキシ末端ｓｓｒＡタグ（ＡＡＮＤＥＮＹＡＬＡＡ）（Keiler, K. C., Waller, P. & Sauer, R. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA.Science 271, 990-993 (1996)）を用いてＰＣＲによりタグ付けした。１つのベクター（ＩＲＡＰ２、Ｋａｎ、およびＣｏｌＥ１）上にアクチベーターおよびレポート要素（ＬｕｘＩ、ＣＦＰ、およびＹＦＰ）を、第２のベクター（ＩＲＡＰ３、Ａｍｐ、およびｐ１５Ａ）上に抑制要素（ＡｉｉＡおよびＬａｃＩ）を配置した。Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（ＴＳ）コンストラクトを、ＣＦＰとＬＡＡタグとの間に種々のＴＳリピートインサートを付加することによって構築した。例えば、２つのＴＳについて、分解タグ「ＡＡＮＤＥＮＹＡＬＡＡ」の直前にアミノ酸配列「ＴＳＴＳ」を挿入した。ＡＡＶコンストラクトを、分解タグの「ＬＡＡ」部分を「ＡＡＶ」で置換することによって構築した。
【０１８７】
マイクロ流体工学と顕微鏡検査
この研究で使用されたマイクロ流体デバイスおよび実験準備プロトコルは、以前に我々のグループから報告されたものと同様である（Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44, 2012）。細菌グロースチャンバは、面積が１００×１００μｍ、高さが約１．４μｍであった。チップ上での共培養実験では、最初にＨｅＬａ細胞の浮遊培養物を非常に低い流速でデバイス培地チャネルにロードして接着させた後、組織培養インキュベーター中で０．５〜２日間インキュベートして増殖させた（Kolnik, M., Tsimring, L. S. & Hasty, J. Vacuum-assisted cell loading enables shear-free mammalian microfluidic culture.Lab On a Chip 12, 4732-4737, 2012）。実験の日に、デバイスを顕微鏡に移し、回路を含む細菌をイメージング前にグロースチャンバにロードした。画像の取得は、Photometrics CoolSnap冷却ＣＣＤカ
メラを用いるNikon TI2で行った。スコープおよび付属品を、Nikon Elementsソフトウェ
アを使用してプログラミングした。マイクロ流体工学および顕微鏡検査に関するさらなる詳細は、補足情報で見ることができる。
【０１８８】
Nikon TIで画像取得を行い、Photometrics CoolSnap冷却ＣＣＤカメラまたはPhotometrics QuantEM EMCCDカメラを使用し、両方ともNikon Elementsソフトウェアによって制御
して画像を取得した。２つの異なる培地源を混合または切り替えることができるマイクロ流体デバイスの内部で細胞をイメージングした。実験の日に、５０ｍｌの一晩培養物を５０μｌのLysogeny Broth（Difco）および抗生物質で希釈した。細胞が０．１のＤ600nmに達したとき、細胞を遠心沈殿させ、５ｍｌの新鮮培地に再懸濁し、デバイスにロードした。様々なサイズの集団：小規模コロニー（１００細胞）（Ferry, M. S., Razinkov, I. &
Hasty, J. Microfluidics for synthetic biology from design to execution.、Methods Enzymol.497, 295-372）、大きなコロニー（５，０００細胞）(Danino, T., Mondrago
´n-Palomino, O., Tsimring, L. & Hasty, J. A synchronized quorum of genetic clocks.Nature 463, 326-330 (2010)）、および複数の大きなコロニー（５，０００細胞の５
００コロニー）（Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic 
‘biopixels’.Nature 481, 39-44 (2012)）を研究するために３つのデバイスを使用した。
【０１８９】
データ分析
単一細胞および個々のトラップの蛍光軌跡を、我々がこれまでに開発したアルゴリズム（Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44 (2012); Ferry, M. S., Razinkov, I. & Hasty, J. Microfluidics for synthetic biology from design to execution.Methods Enzymol.497, 295-372）およ
び組み込みＭＡＴＬＡＢ関数を使用して、経時画像から得た。これらの軌跡からピークおよびトラフを特定し、これらの値を使用して周期および振幅を計算した。図１０Ａの結合遅延および図１０Ａのオフセット時間を計算するために、軌跡対の１０％振幅点間の差を測定した。誘発時間を、誘発開始時間から誘発されたモジュールの１０％振幅まで測定した。時系列データから両方の周波数を抽出するために、Lomb-Scargleアルゴリズムを用いてフーリエ変換を行った。２つの逐次変換を使用して、各要素を別々に分離した。まず、バンドパスフィルタ（５〜２５分）を使用して、速い細胞内クロック要素を抽出した。次に、第２のバンドパスフィルタ（７５〜１５０分）を使用してこれらの速い周波数を通さないようにして、より遅いクオラムクロック要素を抽出した。最後に、２つのパワースペクトルをオーバーレイし、ピークの相対的な振幅を保存する。
【０１９０】
オンラインコンテンツ
追加の方法、拡張データ表示項目、およびソースデータは、論文のオンライン版で入手でき、これらのセクションに固有の参考文献は、オンライン・ペーパーにのみ掲載されている。
【０１９１】
その他の実験結果
分解タグの実験
モジュール分解の位相シフトに対する可変長リンカー（ＴＳリピート）の影響を調べることに加えて（図１４Ａ〜Ｆ）、十分に特徴付けられたＡＡＶ分解タグ(Andersen, J. B.
et al.New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria.Applied and Environmental Microbiology 64, 2240-2246, 1998）を試験した。Andersenらにおいて、ＧＦＰ−ＡＡＶは、ＧＦＰ−ＬＡＡより
５０％高い半減期を有することが示された。この研究では、下流モジュール（ＣＦＰ−ＡＡＶ）は、２つのＴＳ−リンカー配列の分解の遅延と同様であるドライバーモジュール（ＧＦＰ−ＬＡＡ）に対する分解の遅延を示した（図１４Ｂ下部）。さらなる特徴付けが、ＳｓｐＢ結合領域の前の可変長ＴＳリンカー配列とＡＡＶ分解タグとの間の作用機序の相違を決定するために必要とされる。ＣＦＰからＧＦＰへのブリードオーバーは、ＧＦＰからＣＦＰへのブリードオーバーよりも有意であるが、ＣＦＰからＧＦＰへのブリードオーバーは、誘発タンパク質（ＧＦＰ）が結合タンパク質（ＣＦＰ）のタンパク質レベルを駆動する図１０Ａの実験とは無関係である。したがって、ＣＦＰフルオロフォアを欠く株で１０ｎＭのＡＨＬを用いて、活性化ｓｆＧＦＰによるｓｆＧＦＰからＣＦＰ蛍光チャネルへのブリードの可能性を試験する実験を行った。ｓｆＧＦＰは予想通りに増加したが、ＣＦＰ蛍光は変化しないことが分かった（図１４Ｂ上部パネル）。
【０１９２】
ＮＦＢはＨ2Ｏ2がコロニー間の発振を同期させるのに役立つ
パルス間（待機）時間は、１ピークの１０％ダウンスロープ点と、次のピークの１０％アップスロープ点との間の時間として定義した（図１４Ａ）。平均ＱＳパルス間時間は、結合系にＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）を添加すると減少したが、各パルスの時間は一定のままであった。さらに、結合オシレータ系からのＱＳ軌跡は、０．５ｍＭのＩＰＴＧと比較して、ＩＰＴＧなしで有意に低い変動性を示した（図１６Ａ〜Ｂ）。これらの結果は、より高いＮＦＢタンパク質産生に関連するより強いＮＦＢ（０ｍＭ  ＩＰＴＧ）(Stricker, J. et al.A fast, robust and tunable synthetic gene oscillator.Nature 456, 516-519
(2008))が、結合系において、より短くよりロバストなパルス間挙動をもたらすことを示
唆する。大きなバイオピクセル（biopixel）デバイスでは、よりロバスト性が低いコロニーレベル発振は、Ｈ2Ｏ2が隣接するピクセルを効率的に結合することを防止し、非同期ＱＳ発振をもたらす（図１６ＣではＮＦＢなし）。ＮＦＢは、パルス間持続時間ノイズを低減し、このことは、Ｈ2Ｏ2が、バイオピクセルデバイス内の隣接するコロニーでＱＳ発振を同期させることを可能にする（図１６Ｃの０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ）。さらにＮＦＢ強度を増加させる。
【０１９３】
Ｈ2Ｏ2はタンパク質分解速度を増加させる
Ｈ2Ｏ2同期化クオラムクロック軌跡の解析では、発振の周期の減少および振幅の増大が示された（図１３Ｂ上部）。Ｈ2Ｏ2同期化は、これらの軌跡における分解時間の明らかな減少をもたらす（図１７Ａ）。周期の減少の重要な要因の１つは、ピーク時間から１０％ダウンスロープ時間までのＣＦＰ蛍光の減少率として定量化した、ＣｌｐＸＰ標的化タンパク質の活性の増加である。図１７Ｂは、Ｈ2Ｏ2結合によるＣｌｐＸＰ分解速度の有意な増加（３倍）を示す。
【０１９４】
モデル製剤
ＱＳオシレータ
非結合ＱＳオシレータの動的挙動を説明するために、（Danino, T., Mondragon-Palomino, O., Tsimring, L. & Hasty, J. A synchronized quorum of genetic clocks.Nature 463, 326-330 (2010)）で発表されている遅延微分方程式モデルを進展させた。ＬｕｘＩ
（Ｉ）、ＡｉｉＡ（Ａ）、内部ＡＨＬ（Ｈｉ）、外部ＡＨＬ（Ｈｅ）の式に加えて、アシル−ＡＣＰおよびＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）からなるＡＨＬ基質（Ｓ）を含めて（Parsek, M. R. & Greenberg, E. P. Acyl-homoserine lactone quorum sensing in gram-negative bacteria: a signaling mechanism involved in associations with higher organisms.Proceedings of the National Academy of Sciences 97, 8789-8793 (2000)）、Ｈｉの産生が減速する一方でＬｕｘＩ分子の数が依然として増加していることを説明した。タンパク質の転写、翻訳、および成熟速度をまとめて単一の時間遅延パラメータτHにする。ＬｕｘＲおよびＡＨＬ複合体（各ＬｕｘＲ分子およびＡＨＬ分子の２つ）によ
る転写活性化は、内部ＡＨＬの過去の濃度Ｈｉ（ｔ−τH）に依存する遅延産生期間Ｐ（
τH）を生じる。ＬｕｘＲは、速い分解のためにタグ付けされておらず、プラスミド上に
多量の遺伝子コピーを有するので（ｃｏｌＥ１上に２回、ｐ１５Ａ上に１回）、一定レベルのＬｕｘＲを想定した。（Muller, J., Kuttler, C., Hense, B. A., Rothballer, M. & Hartmann, A. Cell-cell communication by quorum sensing and dimension-reduction.Journal of Mathematical Biology 53, 672-702 (2006)）に基づいてヒル係数４を用い
て、ＡＨＬ−ＬｕｘＲ重合におそらく起因するＡＨＬの高い協同作用を説明した。細胞膜を通したＡＨＬの拡散を、Ｄに比例する項によって説明し、外部ＡＨＬの希釈を、μに比例する項によって説明する。細胞密度パラメータｄを系に組み込み、総細胞容積および培地容積の差を説明した。γIおよびγAに比例する酵素分解の項は、ミカエリスメンテン速度式を通じてＬｕｘＩおよびＡｉｉＡの酵素分解をそれぞれ説明する。ｋIおよびｋAの異なる値は、ＬｕｘＩおよびＡｉｉＡのＣｌｐＸＰへの異なる優先的結合動態を表す。
【数２】
2020096645.tif 000006
【０１９５】
これに関するさらなる情報は、例えば、本出願の「モデルパラメータ値」のセクションで見られる。
【０１９６】
ＮＦＢオシレータ
ＮＦＢオシレータの動的挙動を説明するために、（Mather, W., Bennett, M. R., Hasty, J. & Tsimring, L. S. Delay-induced degrade-and-fire oscillations in small genetic circuits.Physical Review Letters 102, 068105 (2009)）に基づいてＬａｃＩ（Ｌ）の単一の遅延微分方程式を使用した。タンパク質の転写、翻訳、および成熟を、時間遅延パラメータτLに一緒にまとめて扱う。ＬａｃＩの転写不活性化は、ＬａｃＩの過去の
濃度Ｌ（ｔ−τL）に依存する遅延産生項Ｑ（τＬ）を与える。ＬａｃＩの酵素分解は、
ミカエリスンテン反応速度式を通じてγLに比例する項によって説明される。産生式Ｑに
おけるパラメータＣは、ＬａｃＩ抑制の強度に対するＩＰＴＧの効果を表す。
【数３】
2020096645.tif 000007
【０１９７】
上記モデルの動態は、実験結果の大部分を説明した。ＱＳパルスの間にＱＳオシレータに結合されたときのＮＦＢオシレータの振幅増加を分析するために、ＹＦＰ前駆体（γp
）および成熟ＹＦＰ（γm）のための式を有するレポーター動態を含める必要があった。
これらの追加の方程式は、結合系におけるＱＳ動態を説明するためには必要ない。これに関するさらなる情報は、例えば、本出願の「モデルパラメータ値」のセクションで見られる。
【数４】
2020096645.tif 000008
【０１９８】
結合されたＮＦＢオシレータおよびＱＳオシレータ
２つのオシレータの結合は、ＣｐｌＸＰ分解による効果的な「キューイング」効果を増加させることによって達成された（Cookson, N. A. et al.Queueing up for enzymatic processing: correlated signaling through coupled degradation.Mol.Syst.Biol.7, 561
(2011)）。結合されていない場合、２つのオシレータ要素の分解は独立しており、
【数５】
2020096645.tif 000009
一方、結合されたシナリオでは、
【数６】
2020096645.tif 000010
分解された要素は、同じ分解項で終わる。ＮＦＢオシレータおよびＱＳオシレータをＣｌｐＸＰ分解により結合するために、ＱＳ系からのＬｕｘＩおよびＡｉｉＡをＮＦＢ系の分解式に加え、ＮＦＢ系からのＬａｃＩ（Ｌ）をＱＳ系の分解式に加えた。
【数７】
2020096645.tif 000011
【０１９９】
これに関するさらなる情報は、例えば、本出願の「モデルパラメータ値」のセクションで見られる。流量μ、ＩＰＴＧ濃度Ｃ、およびアラビノース濃度αLを変化させて、実験
結果の多くを再現した。
【０２００】
リーダー細胞待機時間の短縮
ＱＳパルス活性化の多細胞動態を理解するために、外部ＡＨＬ（Ｈe）を共有する２つ
の同一細胞を有するモデルを構築した。最初に、ＡｉｉＡとＬｕｘＩのわずかに異なる構成的産生を有する２つの細胞からなるＱＳのみの系を検討した。この系では、より遅い細胞がより速い細胞に結合し、このことは、ＱＳパルスが最初に発火する細胞が、ＡＨＬ細胞間コミュニケーションを介して近くの細胞においてＱＳパルス活性化を引き起こすことを示唆する（図１５Ａ）。次に、２細胞系の細胞１にＮＦＢを加え、その細胞の周期を短くした。結果として、２つの細胞が外部ＡＨＬを介して連結された場合、より遅い細胞２（ＮＦＢなし）は、より速い細胞１に結合した（図１５Ｂ）。結果として、ＮＦＢが異なる細胞で位相がずれていても、より速い細胞におけるＱＳパルスの開始は、近傍領域の残りの細胞中をＱＳパルスが伝播するのを開始することができる。この効果はさらに、細胞間のＱＳ変動性を低下させ、これは２０細胞モデルにおける周期変動性の減少から見られる（図１５Ｄ）。２０個の細胞のそれぞれのＡｉｉＡタンパク質およびＬｕｘＩタンパク質の構成的産生にノイズを加え（α0＝０．６±０．１）、同期細胞対非同期細胞におけ
る周期変動性の低下を示した（図１５Ｅ）。
【０２０１】
キューイングにより結合されたＱＳおよびＨ2Ｏ2
ＬｕｘＩ蛍光レポーター発現中に産生されたＨ2Ｏ2（ＶiおよびＶe）に応答するＱＳオシレータの動的挙動を説明するために、Ｈ2Ｏ2の産生および分解を説明する微分方程式を、ＱＳオシレータ遅延−微分方程式モデルに追加した。Ｈ2Ｏ2の産生が、ＣＦＰ蛍光タンパク質と同じプロモーター下にあるＬｕｘＩの濃度に依存すると仮定した。カタラーゼによるＨ2Ｏ2の分解は、その濃度に比例する。Ｈ2Ｏ2は、２つの特徴的な方法でＱＳオシレータに影響を与える。第１に、正常条件下であるＡｒｃＡは、Ｌｕｘプロモーターを部分的に抑制し、Ｈ2Ｏ2によって引き起こされる酸化条件下で不活性化され、Ｌｕｘ抑制を緩
和し、ＬｕｘＩおよびＡｉｉＡ産生を増加させる。この現象を、Ｈ2Ｏ2濃度に依存する産生項に乗数を加えることによってモデル化する。第二に、Ｈ2Ｏ2は、ＣｌｐＸＰロードを減少させ、ＡｉｉＡおよびＬｕｘＩ分解の速度を増加させることが示されている。ここでも、Ｈ2Ｏ2濃度に依存する分解項の前に乗数を加えることによって、この挙動をモデル化する。最後に、Ｈ2Ｏ2は、細胞膜を自由に拡散することができ、拡散パラメータＤVによ
って特徴付けられる拡散項を記述する。細胞外Ｈ2Ｏ2（Ｖe）は、さらに、その濃度に比
例した速度で系を離れることができる。
【数８】
2020096645.tif 000012
【０２０２】
Ｈ2Ｏ2はＱＳ周期ロバスト性を増加させる
前に述べたように、パルス間持続時間の短縮は、ノイズに起因する周期変動を減少させる。我々のモデル（上記参照）にＱＳオシレータに対するＨ2Ｏ2の効果を組み込むと、ＱＳ軌跡にいくつかの大きな変化が生じる。第１に、予想通りに、Ｈ2Ｏ2の添加によりＱＳの振幅およびＱＳのダウンスロープ時間が減少する（図１７Ｃ）。また、これらの２つの効果の結果として、パルス間持続時間が短くなり、よりロバストなＱＳ発振がもたらされる（図１７Ｄ）。周期ＣＶ計算のための５０以上の周期測定値を得るためにモデルをシミュレートした。ノイズを、遅延産生項にノイズ生成項（α0＝±０．１）を追加すること
によってモデルに導入した。
【数９】
2020096645.tif 000013
【０２０３】
興味深いことに、我々のモデルは、ｌｕｘプロモーターのＨ2Ｏ2活性化およびＣｌｐＸＰ活性の増加の個々の効果が、ＱＳ周期のＣＶを増加させることを示す（図１７Ｄ）。増加したＣｌｐＸＰ活性に関しては、より高いＣＶは、結果的により長くなったパルス間持続時間に主に起因する（図１７Ｃ緑色）。しかしながら、ｌｕｘプロモーター活性の増加は、より高いパルス振幅変動のために、より変動性の分解をもたらす。２つの反するＨ2
Ｏ2の影響は、互いの変動性を相殺して、よりロバストなＱＳ発振を生じさせるように見
える。
【０２０４】
モデルパラメータを実験結果にフィッティングする
実験からのＮＦＢ周期データをフィッティングするために、ＬａｃＩ産生項のための以下のパラメータスケーリング機能を使用して、
【数１０】
2020096645.tif 000014
ＩＰＴＧ濃度およびアラビノース（ＡＲＡ）濃度をフィッティングした。
【数１１】
2020096645.tif 000015
【０２０５】
同様に、以下の関数を使用してモデル流量項μを実験流量値にフィッティングする。
【数１２】
2020096645.tif 000016
【０２０６】
モデルパラメータ値：
ＣA＝１（ＡｉｉＡコピー数）；ＣI＝４（ＬｕｘＩコピー数）；γA＝８（ＡｉｉＡの
ＣｌｐＸＰ分解）；γI＝８（ＬｕｘＩのＣｌｐＸＰ分解）；ＫA＝１（ＣｌｐＸＰに対するＡｉｉＡ結合親和性）；ＫI＝０．２（ＣｌｐＸＰに対するＬｕｘＩ結合親和性）；α0＝０．６（Ｌｕｘプロモーター基礎産生）；αH＝３（ＬｕｘプロモーターＡＨＬ誘発産
生）；ｈ0＝０．１（ＡＨＬプロモーター結合親和性）；τH＝１（ＬｕｘＩおよびＡｉｉＡ産生の遅延）；ｂ＝１（ＬｕｘＩによるＡＨＬ合成速度）；ｋS＝２５（ＬｕｘＩに対
するＡＨＬ基質結合親和性）；Ｓ0＝５０（基礎ＡＨＬ基質産生）；γH＝１（ＡｉｉＡによるＡＨＬ分解速度）；ｋH＝０．１（ＡＩＩＡに対するＡＨＬ結合親和性）；Ｄ＝０．
８（膜を通るＡＨＬ拡散）；ｄ＝０．１（細胞密度）；μ＝０．５（流速）；αL＝１（
ＬａｃＩ／ＹＦＰ産生速度）；Ｃ＝０．００２５（ＬａｃＩプロモーター結合親和性）；τL＝０．７（ＬａｃＩ／ＹＦＰ産生の遅延）；ｋL＝０．００１（ＣｌｐＸＰに対するＬａｃＩ／ＹＦＰ結合親和性）；γL＝０．０５（ＬａｃＩ／ＹＦＰのＣｌｐＸＰ分解）；
δ＝１（ＱＳフルオロフォアによるＨ２Ｏ２産生）；ＣI＝２（ミカエリス定数）；ｆp＝１．３（ＬｕｘＩプロモーターのＨ2Ｏ2活性化の強度）；ＤV＝８（膜を通るＨ2Ｏ2拡散
）；μV＝０（細胞外Ｈ2Ｏ2希釈）。
【０２０７】
インビトロ実験
全ての動物実験は、動物実験委員会（MIT、protocol 0414-022-17）によって承認され
た。皮下腫瘍モデル：移植されたマウス結腸癌細胞系（MC26, Tanabe lab, Massachusetts General Hospital）由来の両側皮下後部側腹腫瘍を有する６週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（Taconic Biosciences, Inc.）で動物実験を行った。腫瘍細胞を、ＤＭＥＭ（フェ
ノールレッドなし）中に１ｅ８細胞ｍｌ-1の濃度で移植用に調製した。次いで、細胞を側腹当り１００μＬの容量で皮下に１ｅ７細胞からなる各移植片で移植した。腫瘍は直径が４〜１０ｍｍに達するまで約２週間増殖した。
【０２０８】
実験用肝臓転移モデル
実験用転移モデルを、ルシフェラーゼ産生マウス癌細胞を免疫適合性マウスの外科的に外面化させた脾臓に注射することによって得た。腫瘍細胞を９０秒間肝臓に播種した後、異所的腫瘍増殖を防ぐために脾臓を除去した。ＭＣ２６−ＬｕｃＦ細胞系（Tanabe Lab, MGH）を用い、６週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウス（Taconic Biosciences, Inc.）の脾臓に５×１０4細胞／１００μＬのＰＢＳで注射した。
【０２０９】
細菌の増殖および投与：
インビトロ実験と同様に、適切な抗生物質および０．２％グルコースを含むＬＢ培地中で細菌株を一晩増殖させた。抗生物質を含む新鮮な培地で１／１００倍希釈を注射の日に開始し、細菌がクオラム閾値に達するのを防ぐためにＯＤ＜０．１まで増殖させた（特にＳＬＣの場合）。細菌を遠心沈殿させ、マウスに注射する前に滅菌ＰＢＳで２〜３回洗浄した。細菌の腫瘍内注射は、腫瘍当り１０〜２０μＬの注射総容積でＰＢＳ中５ｅ７細胞ｍｌ-1の濃度で行い、一方、静脈内注射を１００μＬの総容積で行った。ＳＬＣ−３株注射では、この最終容積を、示された密度で３つの株間で等しく分割した。肝臓転移実験では、適切な抗生物質および０．２％グルコースを含むＬＢ培地で０．０５のＯＤに達するまで細菌を増殖させた後、１〜５ｅ９細菌／ｍＬに濃縮し、経口強制栄養により送達した。
【０２１０】
皮下肝臓転移モデルの投与後モニタリング
発光シグナルを、細菌注射後、IVIS Spectrum in vivo imaging systemで測定した。測定値を、注射前の値と比較して、動態を追跡した。皮下腫瘍容積は、イメージング過程を通じて、カリパスを用いて各腫瘍の長さ、幅、および高さを測定して定量した（Ｖ＝Ｌ×Ｗ×Ｈ）。容積を注射前の値と比較して、物理的な腫瘍増殖を追跡した。腫瘍を、通常、皮下実験では平均３００ｍｍ3まで増殖させ、肝臓転移モデルの実験の前に５〜７日間増
殖させた。マウスの生存は、安楽死を必要とする認可された特徴に基づいて追跡した。
【０２１１】
統計解析
統計的検定は、Microsoft Excel（スチューデントのｔ検定）またはGraphPad Prism 5.0（ボンフェローニ事後検定、ログランク検定を用いる分散分析）のいずれかで計算した
。実施された統計検定の詳細は、各図の凡例に示されている。データがほぼ正規分布していた場合、単一変数ではスチューデントｔ検定もしくは１元配置分散分析、または２変数では２元配置分散分析を使用して値を比較した。実験前に、マウスを異なるグループで無作為化した。
【０２１２】
個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み入れられると示されているかのように、本明細書で言及された全ての刊行物および特許出願は、参照により本明細書に援用される。
【０２１３】
前述から、本開示の様々な実施形態が説明のために本明細書に記載されており、本開示の範囲および精神から逸脱することなく様々な修正がなされ得ることが理解される。したがって、本明細書に開示された様々な実施形態は限定することを意図するものではなく、以下の特許請求の範囲によって真の範囲および精神が示されている。
【０２１４】
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【０２９１】
Wood, T., Kuhn, R. & Peretti, S. Enhanced plasmid stability through post-segregational killing of plasmid-free cells. Biotechnology Techniques 4, 39-44 (1990).
【０２９２】
補足ビデオ１．株１（サルモネラ（S.typhimurium），ＬｕｘＩ上のｓｓｒＡタグなし
）中のステルス送達回路（ＳＤＣ）の６０倍の倍率での経時的蛍光顕微鏡検査を示すビデオを撮った。このビデオは、（回路遺伝子のクオラム活性化を示す）細胞が蛍光を発するクオラム閾値に達し、一部分の集団が溶解するまで、マイクロ流体チャンバ内で細菌のコロニーが増殖したことを示す。生存細菌は、再集合化し、再び閾値に達するまで増殖し、過程を繰り返した。ビデオはコロニーを８回の溶解サイクルで追跡し、この株の溶解周期は約３時間であった。１００×１００μｍのチャンバの底部で２分ごとに画像を撮った。
【０２９３】
補足ビデオ２．株２（サルモネラ（S.typhimurium），ＬｕｘＩ上のｓｓｒＡタグあり
）中のＳＤＣの６０倍の倍率での経時的蛍光顕微鏡検査を示すビデオを撮った。このビデオは、溶解周期が長いと、ＬｕｘＩでの分解効率が高いことを示す。（回路遺伝子のクオラム活性化を示す）細胞が蛍光を発するクオラム閾値に達し、一部分の集団が溶解するまで、マイクロ流体チャンバ内で細菌のコロニーが増殖した。生存細菌は、再集合化し、再び閾値に達するまで増殖し、過程を繰り返した。ビデオはコロニーを６回の溶解サイクルで追跡し、この株の溶解周期は約６時間であった。チャンバのサイズは１００×１００μｍであり、２分ごとに画像を撮った。
【０２９４】
補足ビデオ３．株１３（大腸菌）中のＳＤＣの６０倍の倍率での経時的蛍光顕微鏡検査を示すビデオを撮った。このビデオは、定期的な溶解発振が３７℃で依然として観察されたが、回路が大腸菌においてロバストではなかったことを示す。（回路遺伝子のクオラム活性化を示す）細胞が蛍光を発するクオラム閾値に達し、一部分の集団が溶解するまで、マイクロ流体チャンバ内で細菌のコロニーが増殖した。生存細菌は、再集合化し、再び閾
値に達するまで増殖し、過程を繰り返した。ビデオはコロニーを６回の溶解サイクルで追跡し、この株の溶解周期は約３時間であった。チャンバのサイズは１００×１００μｍであり、２分ごとに画像を撮った。
【０２９５】
補足ビデオ４．株１（サルモネラ（S.typhimurium））中のＳＤＣの６０倍の倍率での
経時的蛍光顕微鏡検査を示すビデオを撮った。このビデオは、実験の最初の部分において、２００ｎＭのＡＨＬを含む培地を使用し、細菌が一定の溶解状態になるのを見ることができることを示している。このデバイスでは、蛍光色素（赤色チャネル）で示されている。その後、培地を蛍光色素が存在しないＡＨＬなしの別の源に切り替え、細菌は発振状態に戻り、コロニーはイメージング終了前に４回の溶解サイクルの間持続した。チャンバのサイズは１００×１００μｍであり、２分ごとに画像を撮った。
【０２９６】
補足ビデオ５．６０倍の倍率でマイクロ流体デバイス上の細菌および癌細胞の共培養を示すビデオを撮った。このビデオは、ＨｅＬａ細胞がデバイスの主チャネルで増殖している間に、株３（非運動性サルモネラ（S.typhimurium），ＨｌｙＥを有するＳＤＣ）がグ
ロースチャンバにロードされたことを示す。細菌が、クオラム閾値に達し溶解するまで、そのチャンバ内で増殖するのを見ることができた。溶解すると、チャネル中のＨｅＬａ細胞が、細胞死を起こしているのを見ることができた。経時的蛍光顕微鏡画像を３分ごとに撮った。
【０２９７】
補足ビデオ６．６０倍の倍率でのマイクロ流体デバイス上の細菌および癌細胞の共培養の第２のビデオ。このビデオは、ＨｅＬａ細胞がデバイスの主チャネルで増殖している間に、株３（非運動性サルモネラ（S.typhimurium），ＨｌｙＥを有するＳＤＣ）がグロー
スチャンバにロードされたことを示す。細菌が、クオラム閾値に達し溶解するまで、そのチャンバ内で増殖するのを見ることができた。溶解すると、チャネル中のＨｅＬａ細胞が、細胞死を起こしているのを見ることができた。経時的蛍光顕微鏡画像を３分ごとに撮った。
【０２９８】
補足ビデオ７．２０倍の倍率で組織培養ウェルプレート中の細菌および癌細胞の共培養のビデオを撮った。このビデオは、株４（運動性サルモネラ（S. Typhimurium ），Ｈｌ
ｙＥを有するＳＤＣ）を、単層ＨｅＬａ細胞とウェルに入れたことを示している。細菌が増殖した後、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現によってクオラム事象を可視化した。まもなくＨｅＬａ細胞が細胞死を呈することを見ることができた。経時的蛍光顕微鏡画像を１分ごとに撮った。
【０２９９】
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【０３００】
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【０３０９】
２０１２年１２月１４日に出願された、名称がMULTISCALE PLATFORM FOR COORDINATINGCELLULAR ACTIVITY USING SYNTHETIC BIOLOGYというＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２
／０６９９１４号。
【０３１０】
２０１１年１２月１６日に出願された米国仮特許出願シリアル番号第６１／５７６，９７６号。
【０３１１】
本明細書に引用された参考文献はいずれも先行技術を構成するとは認められない。参考文献の議論は、著者が主張する内容を述べており、出願人は引用された文書の正確さと妥当性に異議を唱える権利を留保している。科学雑誌記事、特許文書、およびテキストブックを含む多くの情報源が本明細書に言及されているが、この言及は、これらの文書のいずれかが、当業における共通の一般的な知識の一部を形成することを認めるものではないことは明らかに理解されるであろう。
【０３１２】
本明細書に示された一般的方法の考察は、例示的な目的のみを意図されている。網羅的であること、または本開示を限定することを意図するものではない。特定の実施形態の個々の態様または特徴は、通常、その特定の実施形態に限定されず、適用可能であれば、交換可能であり、特に示されていない、または記載されていなくても、選択した実施形態で使用することができる。本開示の態様または特徴は、本明細書に開示される他の態様、特徴、または態様および特徴の組み合わせと組み合わせることができることが明白に企図されている。他の代替の方法および実施形態は、本開示を精査すると当業者には明らかとなるものであり、本出願の精神および範囲内に含まれるべきである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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