(57)【要約】      （修正有）【課題】血液脳関門の透過性を亢進させる技術及び癌の脳転移を抑制する医薬組成物の提供。【解決手段】エキソーム分泌阻害剤を有効成分して含有する、脳転移を抑制するための医薬組成物。前記エキソーム分泌阻害剤が、以下から選択される薬剤である、前記医薬組成物。（ｉ）ｎＳＭａｓｅ２遺伝子及び／又はＲＡＢ２７Ｂ遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、又はｓｉＲＮＡ；あるいは、（ｉｉ）ｎＳＭａｓｅ２及び／又はＲＡＢ２７Ｂに対する抗体若しくはその免疫反応性断片；ｎＳＭａｓｅ２及び／又はＲＡＢ２７Ｂに特異的に結合するペプチドｍｉｍｅｔｉｃｓ、又はアプタマー；あるいは、ｎＳＭａｓｅ２及び／又はＲＡＢ２７Ｂのアンタゴニスト。ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤を有効成分として含有する、血液脳関門の透過性を亢進させるための医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エキソーム分泌阻害剤を有効成分して含有する、脳転移を抑制するための医薬組成物。
【請求項２】
エキソーム分泌阻害剤が、以下から選択される薬剤である、請求項１に記載の医薬組成物
（ｉｉｉ）ｎＳＭａｓｅ２遺伝子及び／又はＲＡＢ２７Ｂ遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、又はｓｉＲＮＡ；あるいは、
（ｉｖ）ｎＳＭａｓｅ２及び／又はＲＡＢ２７Ｂに対する抗体若しくはその免疫反応性断片；ｎＳＭａｓｅ２及び／又はＲＡＢ２７Ｂに特異的に結合するペプチドｍｉｍｅｔｉｃｓ、又はアプタマー；あるいは、ｎＳＭａｓｅ２及び／又はＲＡＢ２７Ｂのアンタゴニスト。
【請求項３】
ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤を有効成分として含有する、血液脳関門の透過性を亢進させるための医薬組成物。
【請求項４】
前記ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤が、ＰＤＰＫ１遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＤＰＫ１遺伝子と特異的に結合するアプタマー、ＰＤＰＫ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、又は、ＰＤＰＫ１遺伝子の発現を抑制可能なｍｉＲＮＡ；あるいは、ＰＤＰＫ１に対する抗体若しくはその免疫反応性断片；ＰＤＰＫ１と特異的に結合するペプチドｍｉｍｅｔｉｃｓ、又はアプタマー；あるいは、ＰＤＰＫ１のアンタゴニストである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＰＤＰＫ１遺伝子の発現を抑制可能なｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１８１ｃである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤を有効成分として含有する、所望の活性成分を脳内に到達させるための薬剤送達用組成物。
【請求項７】
前記ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤と共に前記所望の活性成分を含有する、請求項６に記載の薬剤送達用組成物。
【請求項８】
前記ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤が、ＰＤＰＫ１遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＤＰＫ１遺伝子と特異的に結合するアプタマー、ＰＤＰＫ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、又は、ＰＤＰＫ１遺伝子の発現を抑制可能なｍｉＲＮＡ；あるいは、ＰＤＰＫ１に対する抗体若しくはその免疫反応性断片；ＰＤＰＫ１と特異的に結合するペプチドｍｉｍｅｔｉｃｓ、又はアプタマー；あるいは、ＰＤＰＫ１のアンタゴニストである、請求項６又は請求項７に記載の薬剤送達用組成物。
【請求項９】
前記ＰＤＰＫ１遺伝子の発現を抑制可能なｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１８１ｃである、請求項８に記載の薬剤送達用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液脳関門の透過性制御、特には、血液脳関門の透過性を亢進させる技術に関する。更に本発明は、癌の脳転移の分野に関する。より具体的には、本発明は脳転移の診断又はリスク評価、及び、脳転移の治療又は予防の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌患者の脳転移は予後不良と関係することが知られている。また、脳転移において、癌細胞の血液脳関門（ＢＢＢ）通過が重要なイベントであること、ＢＢＢの主な構成細胞は、脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣｓ）であること、ＢＭＥＣｓは細胞間の密着結合（ｔｉｇｈｔ  ｊｙｎｃｔｉｏｎｓ）により互いに結合されており、それにより非常に選択的な透過性を有することが知られている。また、密着結合を構成するタンパク質として、接合部接着分子（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２及びＪＡＭ−３）、オクルジン（ｏｃｃｌｕｄｉｎ）、クラウジン（ｃｌａｕｄｉｎｓ）、及び閉鎖帯タンパク質（ｚｏｎｕｌａ  ｏｃｃｌｕｄｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＺＯ−１及びＺＯ−２）が知られている。更に、癌細胞のＢＢＢ侵襲に関与するメディエーターとしてで、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）リガンドＨＢ−ＥＧＦ、及びα２、６−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５）が同定されている。しかし、癌細胞がＢＢＢを通過する初期段階の分子メカニズムについては未だ明らかとなっていない（非特許文献１）。高転移乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いた研究では、乳癌細胞において高度に発現している血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）が、内皮細胞の透過性を高めると共に、癌細胞の内皮細胞への接着を増加させることから、ＶＥＧＦが脳転移に関与することが報告されている（非特許文献２）しかし、ＶＥＧＦの発現は脳転移には必須ではあるものの、これのみで脳転移が生じるわけではないことも報告されており、ＶＥＧＦは脳転移におけるＢＢＢの破壊を十分に説明できるものではなかった（非特許文献３）。
【０００３】
一方、中枢神経系（ＣＮＳ）に感染するクリプトコッカス  ネオフォルマンスが如何にＢＢＢを通過するかについての研究が行われており、クリプトコッカスのヒトＢＭＥＣｓへの接着によりコフィリンの脱リン酸化が起こり、アクチンの再構成が起こっていることが報告されている。本報告では更に、クリプトコッカスによるコフィリンの脱リン酸化がＲｈｏキナーゼ−ＬＩＭキナーゼ−コフィリン経路を経て制御されていることを示している（非特許文献４）。
【０００４】
エキソソームを含む細胞外小胞（ＥＶｓ）は、内包するタンパク質、ｍＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を運搬することにより細胞間情報伝達を仲介することが知られている（非特許文献５）。また、癌細胞から放出される細胞外小胞は、ＮＫ細胞の機能を阻害したり（非特許文献６）、骨髄前駆細胞のＭＥＴ癌タンパク質の発現を高めて転移促進性（ｐｒｏ−ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ）の形質に変化させたり（非特許文献７）するなど、癌細胞の悪性度に様々な観点で関与することが報告されている（非特許文献８）。このようにＥＶｓと癌転移との関係は示唆されていたものの、ＥＶｓ及びそれに内包される物質とＢＢＢとの関係については、何も知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ａｒｓｈａｄ、Ｆ．ら、Ｐａｔｈｏｌｏｇ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ  ２０１１：９２０５０９（２０１０）．
【非特許文献２】Ｌｅｅ、Ｔ．Ｈ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：５２７７−５２８４（２００３）．
【非特許文献３】Ｙａｎｏ、Ｓ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：４９５９−４９６７（２０００）．
【非特許文献４】Ｃｈｅｎ、Ｈ．Ｍ．Ｓｔｅｖｅｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５２：９６１−９７０（２００３）．
【非特許文献５】Ｖａｌａｄｉ、Ｈ．ら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９：６５４−６５９（２００７）．
【非特許文献６】Ｌｉｕ、Ｃｕｎｒｅｎら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７６：１３７５−１３８５（２００６）
【非特許文献７】Ｐｅｉｎａｄｏ、Ｈ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １８：８８３−８９１（２０１２）．
【非特許文献８】Ｙａｎｇ、Ｃ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｄｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１１：８４２８４９（２０１１）．
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、脳転移におけるＢＢＢの破壊メカニズムを解明し、癌の脳転移の新たな診断・リスク評価方法、及び治療・予防方法を提供することを目的とする。または、本発明は新規のＢＢＢを破壊するメカニズムを利用した、脳への薬剤送達方法を提供することを目的とする。更に、本発明はこれらの方法において用いる薬剤、組成物及びキット等を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明者らは、脳転移のメカニズムを解明するため、転移能の高いヒト乳癌細胞株をマウスに移植し、脳転移した癌細胞から得たＥＶｓについて解析した。その結果、癌細胞由来のＥＶｓが脳微小血管内皮細胞に取り込まれること、及び癌細胞由来のＥＶｓが取り込まれることにより血液脳関門（ＢＢＢ）が破壊されることを見出した。次に、本発明者らはＥＶｓに含まれる物質の中から、血液脳関門の破壊に関係する物質について探索した結果、脳転移癌細胞由来のＥＶｓに特異的に含まれていたマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１８１ｃに血液脳関門を破壊する作用があることを見出した。そこで、本発明者らはｍｉＲ−１８１ｃの脳微小血管内皮細胞内における作用について検討した結果、ｍｉＲ−１８１ｃが３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ−１（以下、「ＰＤＰＫ１」という）の非翻訳領域に結合してその発現を減少させることを見出した。更に本発明者らは、ＰＤＰＫ１の発現減少と血液脳関門（ＢＢＢ）破壊との関係を検討した結果、ＰＤＰＫ１の発現を阻害することにより、密着結合タンパク質の局在が変化することを見出した。よって、本発明者らは、癌細胞由来のＥＶｓは内包するｍｉＲ−１８１ｃを脳微小血管内皮細胞内で放出することにより、ＰＤＰＫ１の発現を阻害し、それにより密着結合タンパク質の局在を変化させて血液脳関門を破壊することを見出した。
【０００８】
ｍｉＲ−１８１ｃは、細胞の増悪化に関与することは報告されていたが、血液脳関門との関係はこれまで知られていなかった。
【０００９】
また、ＰＤＰＫ１は、主には、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ／ＡＫＴ１、ＰＫＢ／ＡＫＴ２、ＰＫＢ／ＡＫＴ３）、ｐ７０リボソーマルプロテインＳ６キナーゼ（ＲＰＳ６ＫＢ１）、ｐ９０リボソーマルプロテインＳ６キナーゼ（ＲＰＳ６ＫＡ１、ＲＰＳ６ＫＡ及びＲＰＳ６ＫＡ３）、ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＲＫＡＣＡ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＲＫＣＤ及びＰＲＫＣＺ）、血清及びグルココルチコイド誘導性キナーゼ（ＳＧＫ１、ＳＧＫ２及びＳＧＫ３）、ｐ２１活性化キナーゼ−１（ＰＡＫ１）、プロテインキナーゼＰＫＮ（ＰＫＮ１及びＰＫＮ２）を標的として、細胞増殖と生存の調節やグルコース及びアミノ酸の摂取と貯蔵に関与していることが知られているが、血液脳関門との関係についてはこれまで報告はなかった。
【００１０】
よって、本発明は、脳転移癌細胞が血液脳関門を破壊するメカニズムを解明したことに基づくものであり、具体的には以下の発明に関する。
（１）  被検癌患者由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを測定することを備える、脳転移を診断するための情報を提供する方法。
（２）  被検癌患者における脳転移を診断するための情報を提供する方法であって、
前記被検癌患者由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定するステップ、
決定されたｍｉＲ−１８１ｃレベルから前記被検癌患者における脳転移を判定するステップを備え、
ここで、前記被検癌患者由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルが陰性比較対象由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルと比較して高い場合には、前記被検癌患者は脳転移を有するとの情報が提供される方法。
（３）  前記被検癌患者がステージＩＶの癌患者である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）  被検癌患者由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを測定することを備える、脳転移を診断するための情報を提供する方法。
（５）  被検癌患者における脳転移が生じるリスクを評価するための情報を提供する方法であって、
前記被検癌患者由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定すること、
決定されたｍｉＲ−１８１ｃレベルから前記被検癌患者における脳転移が生じるリスクを判定するステップを備え、
ここで、前記被検癌患者由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルが陰性比較対象由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルと比較して高い場合には、前記被検癌患者は脳転移が生じるリスクが高いとの情報が提供される方法。
（６）  前記被検癌患者がステージＩ〜ＩＩＩの癌患者である、（４）又は（５）に記載の方法。
（７）  前記被検癌患者が乳癌患者である、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の方法。
（８）  前記陰性比較対象が、脳への転移が無い癌患者又は健常人である、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の方法。
（９）  前記検体が血液である、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）  検体中のｍｉＲ−１８１ｃが、検体中のＥＶｓから抽出されたｍｉＲ−１８１ｃである、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法。
（１１）  （１）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法に用いるためのｍｉＲ１８１ｃを測定することによる、脳転移の診断又はリスク評価に供する体外診断用試薬又は体外診断用測定器。
（１２）  ｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合する物質を備える、脳転移の診断又はリスク評価のための薬剤。
（１３）  前記ｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合する物質が、ｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合する核酸である、（１２）に記載の薬剤。
（１４）  前記ｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合する核酸が、少なくとも一部に人工的に設計された配列を有する核酸である、（１３）に記載の薬剤。
（１５）  ｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合する物質が、標識化されていることを特徴とする、（１２）〜（１４）のいずれか１項に記載の薬剤。
（１６）  ｍｉＲ−１８１ｃの発現抑制剤、ｍｉＲ−１８１ｃの活性阻害剤、及びエキソーム分泌阻害剤からなる群から選択される１以上の薬剤を有効成分として含有する、脳転移を抑制するための医薬組成物。
（１７）  ｍｉＲ−１８１ｃの発現抑制剤、ｍｉＲ−１８１ｃの活性阻害剤、及びエキソーム分泌阻害剤からなる群から選択される薬剤が、以下から選択される薬剤である、（１６）に記載の医薬組成物
（ｉ）ｐｒｉ−ｍｉＲ−１８１ｃ又はｐｒｅ−ｍｉＲ−１８１ｃに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、又はｓｉＲＮＡ；
（ｉｉ）、ｍｉＲ−１８１ｃのアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合するアプタマー、ｍｉＲ−１８１ｃに対するｓｉＲＮＡ、又はｍｉＲ−１８１ｃのｍｉＲＮＡ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ；
（ｉｉｉ）ｎＳＭａｓｅ２遺伝子及び／又はＲＡＢ２７Ｂ遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、又はｓｉＲＮＡ；あるいは、
（ｉｖ）ｎＳＭａｓｅ２及び／又はＲＡＢ２７Ｂに対する抗体若しくはその免疫反応性断片；ｎＳＭａｓｅ２及び／又はＲＡＢ２７Ｂに特異的に結合するペプチドｍｉｍｅｔｉｃｓ、又はアプタマー；あるいは、ｎＳＭａｓｅ２及び／又はＲＡＢ２７Ｂのアンタゴニスト。
（１８）  ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤を有効成分として含有する、血液脳関門の透過性を亢進させるための医薬組成物。
（１９）  前記ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤が、ＰＤＰＫ１遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＤＰＫ１遺伝子と特異的に結合するアプタマー、ＰＤＰＫ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、又は、ＰＤＰＫ１遺伝子の発現を抑制可能なｍｉＲＮＡ；あるいは、ＰＤＰＫ１に対する抗体若しくはその免疫反応性断片；ＰＤＰＫ１と特異的に結合するペプチドｍｉｍｅｔｉｃｓ、又はアプタマー；あるいは、ＰＤＰＫ１のアンタゴニストである、（１８）に記載の医薬組成物。
（２０）  前記ＰＤＰＫ１遺伝子の発現を抑制可能なｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１８１ｃである、（１９）に記載の医薬組成物。
（２１）  ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤を有効成分として含有する、所望の活性成分を脳内に到達させるための薬剤送達用組成物。
（２２）  前記ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤と共に前記所望の活性成分を含有する、（２１）に記載の薬剤送達用組成物。
（２３）  前記ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤が、ＰＤＰＫ１遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＤＰＫ１遺伝子と特異的に結合するアプタマー、ＰＤＰＫ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、又は、ＰＤＰＫ１遺伝子の発現を抑制可能なｍｉＲＮＡ；あるいは、ＰＤＰＫ１に対する抗体若しくはその免疫反応性断片；ＰＤＰＫ１と特異的に結合するペプチドｍｉｍｅｔｉｃｓ、又はアプタマー；あるいは、ＰＤＰＫ１のアンタゴニストである、（２１）又は（２２）に記載の薬剤送達用組成物。
（２４）  前記ＰＤＰＫ１遺伝子の発現を抑制可能なｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１８１ｃである、（２３）に記載の薬剤送達用組成物。
（２５）  被検癌患者における脳転移を判定する装置であって、
当該被検癌患者由来の検体を用いてｍｉＲ−１８１ｃの塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドを測定するｍｉＲ−１８１ｃ測定手段と、
該ｍｉＲ−１８１ｃ測定手段にて測定された検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定するｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手段と、
該ｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手段にて決定されたｍｉＲ−１８１ｃレベルから前記被検癌患者における脳転移を判定する転移判定手段と、
を備え、
前記転移判定手段は、前記被検癌患者由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルが陰性比較対象由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルと比較して高い場合には、前記被検癌患者は脳転移を有すると判定することとした癌患者の脳転移判定装置。
（２６）  被検癌患者における脳転移が生じるリスクを判定する装置であって、
前記被検癌患者由来の検体を用いてｍｉＲ−１８１ｃの塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドを測定するｍｉＲ−１８１ｃ測定手段と、
該ｍｉＲ−１８１ｃ測定手段にて測定された検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定するｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手段と、
該ｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手段にて決定されたｍｉＲ−１８１ｃレベルから前記被
検癌患者における脳転移が生じるリスクを判定するリスク判定手段と、
を備え、
前記リスク判定手段は、前記被検癌患者由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルが陰性比較対象由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルと比較して高い場合には、前記被検癌患者は脳転移が生じるリスクが高いと判定することとした癌患者の脳転移リスク判定装置。
（２７）  被検癌患者における脳転移を診断するための情報を提供する装置にインストールされるコンピュータプログラムであって、
当該コンピュータプログラムは、
前記被検癌患者由来の検体を用いてｍｉＲ−１８１ｃの塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドを測定するｍｉＲ−１８１ｃ測定手順と、
該ｍｉＲ−１８１ｃ測定手順にて測定された検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定するｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手順と、
該ｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手順にて決定されたｍｉＲ−１８１ｃレベルから前記被検癌患者における脳転移を判定する転移判定手順と、
該転移判定手順による判定結果を出力する判定結果出力手順と、を癌患者の脳転移診断装置に実行させ、
前記転移判定手順は、前記被検癌患者由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルが陰性比較対象由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルと比較して高い場合には、前記被検癌患者は脳転移を有すると判断することとしたコンピュータプログラム。
（２８）  被検癌患者における脳転移が生じるリスク判定する装置にインストールされるコンピュータプログラムであって、
そのコンピュータプログラムは、
当該被検癌患者由来の検体を用いてｍｉＲ−１８１ｃの塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドを測定するｍｉＲ−１８１ｃ測定手順と、
該ｍｉＲ−１８１ｃ測定手順にて測定された検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定するｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手順と、
該ｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手順にて決定されたｍｉＲ−１８１ｃレベルから前記被検癌患者における脳転移が生じるリスクを判定するリスク判定手順と、
該リスク判定手順による判定結果を出力する判定結果出力手順と、を癌患者の脳転移診断装置に実行させ、
前記リスク判定手順は、前記被検癌患者由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルが陰性比較対象由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルと比較して高い場合には、前記被検癌患者は脳転移が生じるリスクが高いと判断することとしたコンピュータプログラム。
【００１１】
本明細書において、「癌」との用語は、上皮性悪性腫瘍、脊髄由来の造血器悪性腫瘍などが含まれ、特に、卵巣癌（非粘液性卵巣癌など）、子宮癌、子宮内膜癌、乳癌、乳腺癌、前立腺癌、精巣癌（睾丸絨毛上皮癌など）、脳癌（上衣腫など）、咽喉癌、肺癌、肺腺癌、腎臓癌（腎細胞癌など）、肝癌、大腸癌（結腸癌など）、胸膜中皮腫、肉腫、慢性および急性骨髄性白血病、肺転移癌などの各種転移癌を含む。本明細書において、「癌患者」とは、転移の有無にかかわらず（脳以外の部位に）癌を発症している患者を意味し、例えば、白血病、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキンリンパ腫など）、多発性骨髄腫等の造血細胞悪性腫瘍；乳癌；子宮体癌；子宮頚癌；卵巣癌；食道癌；胃癌；虫垂癌；大腸癌（大腸癌、直腸癌など）；肝癌（肝細胞癌など）胆嚢癌；胆管癌；膵臓癌；副腎癌；消化管間質腫瘍；中皮腫；喉頭癌、口腔癌（口腔底癌、歯肉癌、舌癌、頬粘膜癌など）等の頭頚部癌；唾液腺癌；副鼻腔癌（上顎洞癌、前頭洞癌、篩骨洞癌、蝶型骨洞癌など）；甲状腺癌；腎臓癌；肺癌；骨肉腫；前立腺癌；精巣腫瘍（睾丸癌）；腎細胞癌；膀胱癌；横紋筋肉腫；皮膚癌；又は、肛門癌の患者であってもよい。
【００１２】
癌のステージは、ステージ分類（臨床進行期分類）により決定される。ステージ分類は、例えば、癌の大きさ（Ｔ）、周辺リンパ節への転移（Ｎ）、及び遠隔臓器への転移（Ｍ）（ＴＮＭ分類）等に基づいて、各癌（臓器）について詳細な判定基準が定められており、この内容は当業者に広く知られている（米国立がんセンターウェブサイト「Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｇｉｎｇ」ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃａｎｃｅｒｔｏｐｉｃｓ／ｆａｃｔｓｈｅｅｔ／ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ／ｓｔａｇｉｎｇ；ＡＪＣＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ）の最新版参照）。例えば、乳癌の場合、ステージ判定基準は以下のとおりである。ステージ０：非浸潤がん：乳がんが発生した乳腺の中にとどまっているもの（パジェット病を含む）；ステージＩ：しこり２ｃｍ以下でリンパ節に転移なし；ステージＩＩＡ：しこり２ｃｍ以下で腋窩リンパ節に転移あり、又はしこり２．１〜５ｃｍでリンパ節に転移なし；ステージ２Ｂ：しこり２．１〜５ｃｍで腋窩リンパ節に転移あり、又はしこり５．１ｃｍ以上でリンパ節に転移なし；ステージＩＩＩＡ：しこり５．１ｃｍ以上で腋窩リンパ節に転移あり、又はしこりの大きさ問わず腋窩リンパ節転移が強い、または腋窩リンパ節転移を認めず、胸骨傍リンパ節に転移あり；ステージＩＩＩＢ：しこりの大きさ問わず皮膚や胸壁に浸潤のあるもの；ステージＩＩＩＣ：しこりの大きさ問わず鎖骨下リンパ節や鎖骨上リンパ節に転移が拡がっているもの；ステージＩＶ：乳房から離れたところに転移しているもの。
【００１３】
癌のステージ分類でステージＩＶの患者は、通常、遠隔地への転移が認められる。よって、このような患者においては癌細胞が既に血管内に侵入しているため、血液中（血液に含まれるＥＶｓ中）のｍｉＲ−１８１ｃレベルが高く血液脳関門が開いていれば脳に転移する確立は極めて高くなる。一方で、遠隔地への転移が認められないステージＩ〜ＩＩＩの患者においては、癌細胞が血管内に侵入していない可能性が高く、血液中（血液に含まれるＥＶｓ中）のｍｉＲ−１８１ｃレベルが高く血液脳関門が開いていたとしても、即座に脳転移を生じるものではないが、将来、癌細胞が血液中に侵入した場合には、脳転移を生じる可能性（リスク）が高い。よって、本発明の方法、薬剤、装置、コンピュータプログラム等が、脳転移の診断に用いられるか、脳転移のリスク判定に用いられるかは、測定対象の検体が由来する患者の状態によって、決定することができる。癌のステージ分類を利用する場合、ステージＩ〜ＩＩＩの患者に対しては、脳転移のリスク判定を行うことができ、ステージＩＶの患者に対しては、脳転移の診断を行うことができる。癌のステージ分類の変わりに、遠隔臓器への転移の有無、又は血中への癌細胞の浸潤の有無を利用して、脳転移の診断に用いられるか、脳転移のリスク判定に用いられるかを決定しても良い。この場合、遠隔臓器への転移がある場合、又は血中への癌細胞の浸潤がある場合には、脳転移の診断として行うことができ、遠隔臓器への転移がない場合、又は血中への癌細胞の浸潤がない場合には、脳転移のリスク判定として行うことができる。よって、本明細書において、「ステージＩＶの患者」は、遠隔臓器への転移がある患者、又は血中への癌細胞の浸潤がある患者と置き換えてもよく、「ステージＩ〜ＩＩＩの患者」は、遠隔臓器への転移がない患者、又は血中への癌細胞の浸潤がない患者と置き換えても良い。
【００１４】
本明細書において、「脳転移」、及び「脳への転移」とは、脳以外の部位に発症した原発巣から癌細胞が離脱して脳内に浸潤し、脳内で増殖すること、又は脳内で増殖した状態を意味する。脳以外の部位に原発巣を有する癌患者に脳転移があるか否かは、当業者周知の画像診断方法により決定することができる。例えば、脳以外の部位に原発巣を有する癌患者にガドリニウム造影剤などを投与して、ＣＴやＭＲＩ等の画像から脳内の腫瘍形成が確認された場合には脳転移があると決定することができる。
【００１５】
また、本明細書において、「健常人」とは、癌を発症していないヒトを意味する。本明細書における健常人は、必ずしも他の疾患にも罹患していないことを必要とするものではないが、好ましくは、癌以外の疾患にも罹患していない健康なヒトである。
【００１６】
本発明によれば、癌患者においてｍｉＲ−１８１ｃはＢＢＢを開き、脳転移を促進させる働きをしている。よって、癌患者におけるｍｉＲ−１８１ｃレベルを測定することにより、当該癌患者の脳転移に関する情報を得ることができる。本明細書において、「ｍｉＲ−１８１ｃ」とは、約２２塩基からなるヒト由来のｍｉＲＮＡである（配列番号１）（Ｌｉｍ  ＬＰら（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９９：１５４０；Ｌａｎｄｇｒａｆ  Ｐら（２００７）Ｃｅｌｌ、１２９：１４０１−１４１４）。
【００１７】
ｍｉＲ−１８１ｃレベルの測定は、ｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合する物質を用いて行われる。本明細書において、「ｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合する物質」とは、ｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合することができる物質であれば特に制限されるものではない。通常核酸は、相補的な配列を有する核酸と特異的に結合することから、ｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合する物質として好ましくはｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合する核酸である。
【００１８】
「ｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合する核酸」とは、ｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合することができる核酸分子を意味する。通常は、このような核酸分子はｍｉＲ−１８１ｃと相補的な配列を有する。本明細書における「核酸」はＤＮＡ、ＲＮＡ又は人工的に創製した核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（２’，４’−ＢＮＡ）などの架橋型核酸を含む）、あるいはそれらの組み合わせを含む。例えば、ｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合する核酸は、プライマー又はプローブを含むが、これらに限定されるものではない。「プライマー」とは通常、核酸増幅のために用いられる１０〜３０ｍｅｒ（好ましくは、１７〜２５ｍｅｒ、１５〜２０ｍｅｒなど）の核酸分子であり、少なくともその一部に（好ましくは、７ｍｅｒ以上、８ｍｅｒ以上、９ｍｅｒ以上、１０ｍｅｒ以上、１１ｍｅｒ以上、１２ｍｅｒ以上、１３ｍｅｒ以上、１４ｍｅｒ以上、１５ｍｅｒ以上、２０ｍｅｒ以上、２５ｍｅｒ以上、又は３０ｍｅｒ以上の）増幅対象配列の末端に位置する配列と相補的な配列を有する。また、「プローブ」とは、標的配列と相補的な配列を有し、標的配列と特異的に結合可能な１０〜２００ｍｅｒ（好ましくは、１０〜１００ｍｅｒ、１０〜５０ｍｅｒ、１０〜３０ｍｅｒ、１０〜２０ｍｅｒなど）の核酸分子であり、少なくともその一部に（好ましくは、７ｍｅｒ以上、８ｍｅｒ以上、９ｍｅｒ以上、１０ｍｅｒ以上、１１ｍｅｒ以上、１２ｍｅｒ以上、１３ｍｅｒ以上、１４ｍｅｒ以上、１５ｍｅｒ以上、２０ｍｅｒ以上、２５ｍｅｒ以上、３０ｍｅｒ以上、５０ｍｅｒ以上、１００ｍｅｒ以上の）増幅対象配列の末端に位置する配列と相補的な配列を有する。標的配列に対するプライマー及びプローブの設計方法は当技術分野においてよく知られている。好ましくは、ｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合する核酸は、少なくとも一部に人工的に設計された配列（例えば、標識化やタグ化の為の配列など）を含む。
【００１９】
本明細書において、ある物質が「特異的に結合する」とは、当該物質が他のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列、あるいはこれらの構造に対する親和性よりも、標的配列又は構造に対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、所望の測定装置または方法によって、標的配列又は構造を他の配列又は構造から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味する。例えば、実質的に高い親和性は、ｍｉＲ−１８１ｃと結合するｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合する物質の分子数が、他の配列又は構造と結合するｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合する物質の分子数の３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、３０倍以上、５０倍以上であってもよい。本発明のｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合する物質とｍｉＲ−１８１ｃとの結合における結合定数（Ｋａ）としては、例えば、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１を挙げることができる。
【００２０】
本明細書における、「ｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合する物質」（ｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合する核酸を含む）は必要に応じて標識化されていても良い。標識化の方法としては、例えば、放射性同位体（ＲＩ）標識、蛍光標識、及び酵素標識を挙げることができる。ＲＩ標識する場合の放射性同位体としては、３２Ｐ、１３１Ｉ、３５Ｓ、４５Ｃａ、３Ｈ、１４Ｃを挙げることができる。また、蛍光標識する場合の蛍光色素としては、ＤＡＰＩ、ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ（登録商標）９、ＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）−３、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、Ｃｙ（登録商標）３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ｃｏｕｍａｒｉｎ、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＴＲＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｇｒｅｅｎ（商標）、Ｃｙ（登録商標）５、及び、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４を挙げることができる。酵素標識としては、ビオチン（ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、ビオチン−１１−ｄＵＴＰなど）、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ：ステロイド系天然物）（デオキシウリジン５´−三リン酸）、アルカリホスファターゼなどが利用可能である。
【００２１】
本発明によれば、ＰＤＰＫ１はＢＢＢの構造維持において主要な役割を担う物質の一つであることから、ＰＤＰＫ１の発現を抑制し、又は活性を阻害することにより、ＢＢＢを開かせることができる。よって、ＰＤＰＫ１発現抑制剤又はＰＤＰＫ１活性阻害剤は、脳内への到達を目的とする薬剤のＤＤＳ用薬剤として利用することができる。本明細書において「ＰＤＰＫ１」とは、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ−１の略称である。ＰＤＰＫ１は、プロテインキナーゼのＡＧＣファミリーをリン酸化及び活性化するセリン／スレオニンキナーゼである。ＰＤＰＫ１のｍＲＮＡ及びタンパク質としては、複数のバリアントが存在することが知られている。ＰＤＰＫ１  ｖｕｌａｒｉａｎｔ１のｍＲＮＡコードする核酸配列及びタンパク質をコードするアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２及び配列番号３に示す。ＰＤＰＫ１  ｖｕｌａｒｉａｎｔ２のｍＲＮＡコードする核酸配列及びタンパク質をコードするアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号４及び配列番号５に示す。ＰＤＰＫ１  ｖｕｌａｒｉａｎｔ３のｍＲＮＡコードする核酸配列及びタンパク質をコードするアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号６及び配列番号７に示す。ＰＤＰＫ１  ｖｕｌａｒｉａｎｔＸ１のｍＲＮＡコードする核酸配列及びタンパク質をコードするアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号８及び配列番号９に示す。本明細書におけるＰＤＰＫ１は、これらのいずれのバリアントであっても良いし、生体内で生じ得るこれらの変異体であってもよい。
【００２２】
また、本発明者らが見出したところによれば、癌患者において、ｍｉＲ−１８１ｃはエキソソーム中に包埋されて血液中を移動し、ＢＢＢに到達すると該ＢＢＢを構成する細胞に取り込まれることにより、血液脳関門を開くように作用する。よって、癌患者においてエキソソームの分泌を阻害することにより、血液脳関門が開くことを阻止し、それにより脳転移を抑制することができる。よって、一態様において、本発明は、エキソソーム分泌阻害剤を利用した脳転移の抑制に関する。本明細書において、「エキソソーム分泌阻害剤」とは、癌細胞からのエキソソーム分泌を阻害し得る薬剤であれば、特に制限されるものではない。エキソソームの分泌には、中性スフィンゴミエリナーゼ（以下、「ｎＳＭａｓｅ２」という）（配列番号１０にｃＤＮＡ配列を示し、配列番号１１にアミノ酸配列を示す）、及びＲＡＢ２７Ｂ（配列番号１２にｃＤＮＡ配列を示し、配列番号１３にアミノ酸配列を示す）が関与していることが知られている。よって、これらのｎＳＭａｓｅ２又はＲＡＢ２７Ｂの発現を抑制し、又は活性を阻害することにより、エキソソームの分泌を阻害することができる。即ち、ｎＳＭａｓｅ２又はＲＡＢ２７Ｂの発現抑制剤又は活性阻害剤は、本発明におけるエキソソーム分泌阻害剤として使用することができる。
【００２３】
本明細書において、遺伝子、タンパク質、又はｍｉＲＮＡの「発現抑制剤」とは、当該遺伝子、タンパク質、又はｍｉＲＮＡの発現を抑制する薬剤であれば特に制限されるものではない。標的遺伝子の発現抑制剤としては、例えば、当該遺伝子配列又は当該遺伝子が転写されることにより生成するｍＲＮＡ配列に対するアンチセンス、当該遺伝子が転写されることにより生成するｍＲＮＡに対するｄｓＲＮＡ、当該遺伝子が転写されることにより生成するｍＲＮＡに対するアプタマー、あるいは、当該遺伝子の発現に必須のコーディング領域の上流に位置する核酸配列に結合可能なｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを含む）を設計及び／又は選択することにより取得及び利用できることは当技術分野においてよく理解されている。
【００２４】
また、標的タンパク質の発現抑制剤としては、例えば、当該タンパク質をコードする遺伝子配列又は当該遺伝子が転写されることにより生成するｍＲＮＡ配列に対するアンチセンス、当該タンパク質をコードする遺伝子が転写されることにより生成するｍＲＮＡに対するｄｓＲＮＡ、当該タンパク質をコードする遺伝子又は該遺伝子が転写されることにより生成するｍＲＮＡに対するアプタマー、あるいは、当該タンパク質をコードする遺伝子の発現に必須のコーディング領域の上流に位置する核酸配列に結合可能なｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを含む）を設計及び／又は選択することにより取得及び利用できることは当技術分野においてよく理解されている。
【００２５】
ｍｉＲＮＡの発現抑制剤としては、例えば、当該ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子、当該ｍｉＲＮＡのｐｒｉ−ｍｉＲ、又は当該ｍｉＲＮＡのｐｒｅ−ｍｉＲに対するアンチセンス、当該ｍｉＲＮＡのｐｒｉ−ｍｉＲ、又は当該ｍｉＲＮＡのｐｒｅ−ｍｉＲに対するｄｓＲＮＡ、当該ｍｉＲＮＡのｐｒｉ−ｍｉＲ、又は当該ｍｉＲＮＡのｐｒｅ−ｍｉＲに対するアプタマー、あるいは、当該ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の発現に必須のコーディング領域の上流に位置する核酸配列に結合可能なｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを含む）を設計及び／又は選択することにより取得及び利用できることは当技術分野においてよく理解されている。
【００２６】
例えば、本発明者らの見出したところにより、ＰＤＰＫ１の発現抑制剤には、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８１ｃ及びそれらの誘導体が含まれる。
【００２７】
本明細書において、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの誘導体とは、少なくとも、当該ｍｉＲＮＡにおけるシード配列（５’末端から２〜８塩基目の７塩基：ＡＣＵＵＡＣＡ）を有し、かつ、目的の遺伝子（又はタンパク質）（ｍｉＲ−１８１ｃの場合は、ＰＤＰＫ１）の発現を抑制する作用を有する分子である。このような誘導体の機能は、必ずしもオリジナルのｍｉＲＮＡと定量的に同程度であることを要するものではなく、本発明の目的を達成する限り、オリジナルのｍｉＲＮＡよりも強い作用又は弱い作用を有していても良い。更に、該誘導体は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡと約７０％以上１００％未満、約７５％以上１００％未満、約８０％以上１００％未満、約８５％以上１００％未満、約９０％以上１００％未満、約９５％以上１００％未満の相同性を有するヌクレオチド配列を有する。配列同一性が高いほど、該誘導体はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡとより近い構造となる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの誘導体は、オリジナルのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡが有しない配列を有していてもよい。また、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの塩基長は、ｍｉＲＮＡとしての機能を発揮できる限りオリジナルの塩基長と異なっていても良く、例えば、１０〜５０ｍｅｒ、１５〜３０ｍｅｒ、２０〜２５ｍｅｒとすることができる。
【００２８】
また、前記ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの誘導体は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡにおけるシード配列を有する核酸分子であって、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）より選択される１種類以上の付加、置換、欠失及び修飾を（シード配列以外に）有する核酸分子を含む：
（ｉ）１個以上（例えば、１〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、又は１個）のヌクレオチドのｐｒｉ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８１ｃの天然配列への付加；
（ｉｉ）ｐｒｉ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８１ｃの天然配列における１個以上（例えば、１〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、又は１個）のヌクレオチドの他のヌクレオチドによる置換；
（ｉｉｉ）ｐｒｉ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８１ｃの天然配列における１個以上（例えば、１〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、又は１個）のヌクレオチドの欠失；及び、
（ｉｖ）ｐｒｉ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８１ｃの天然配列における１個以上（例えば、１〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、又は１個）のヌクレオチドの修飾。
【００２９】
本明細書において、タンパク質又はｍｉＲＮＡの「活性阻害剤」とは、当該タンパク質又はｍｉＲＮＡがその活性を発揮できない状態とする薬剤であれば特に制限されるものではない。例えば、活性阻害剤は、当該タンパク質又はｍｉＲＮＡと結合する物質であってもよく、あるいは、当該タンパク質又はｍｉＲＮＡが結合する相手と結合する物質であっても良い。タンパク質の活性阻害剤としては、ｍｉｍｅｔｉｃｓ、抗体若しくはその免疫反応性断片、アプタマー、受容体誘導体、又はアンタゴニストが知られている。また、ｍｉＲＮＡの活性阻害剤としては、ｍｉｍｅｔｉｃｓ、該ｍｉＲＮＡの少なくとも一部の配列と相補的な配列を有するアンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ、あるいは、該ｍｉＲＮＡに対するアプタマーが知られている。
【００３０】
本明細書において、「アンチセンス」とは、標的とする配列（例えば、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１８１ｃ、又はｍｉＲ−１８１ｃの配列、又は、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１８１ｃをコードするＤＮＡ配列）に相補的な配列を有する核酸のことであり、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。また、アンチセンスは標的配列と１００％相補的である必要はなく、ストリンジェントな条件下（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．；  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  １９９５，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．  Ｎ．Ｙ．）    ａｔ  Ｕｎｉｔ  ２．１０）で特異的にハイブリダイズすることができれば、相補的でない塩基を含んでいてもよい。アンチセンスは、細胞に導入されると、標的配列に結合し、転写、ＲＮＡのプロセッシング、翻訳又は安定性を阻害する。また、アンチセンスは、アンチセンスポリヌクレオチドの他に、ポリヌクレオチドミメティックス、変異された骨格（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂａｃｋ  ｂｏｎｅ）を備えるものを含む。このようなアンチセンスは、標的配列情報を基に、当業者周知に方法を利用して適宜設計及び製造（例えば、化学合成）することができる。
【００３１】
「ｄｓＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、少なくとも１部において標的配列と相補的な配列を有し、標的配列を有するｍＲＮＡと結合することにより当該ｍＲＮＡを分解して、それにより標的配列の翻訳（発現）を抑制する二本鎖ＲＮＡ構造を含むＲＮＡのことである。ｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）及びｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）を含む。ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子発現を抑制する限り、標的配列と１００％の相同性を備える必要はない。また、ｄｓＲＮＡは、安定化その他の目的で、その一部がＤＮＡに置換されていてもよい。ｓｉＲＮＡとして、好ましくは、２１〜２３塩基を備える二本鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、当業者周知の方法、例えば、化学合成又は自然発生ＲＮＡのアナログとして得ることができる。ｓｈＲＮＡは、ヘアピンターン構造をとるＲＮＡ短鎖である。ｓｈＲＮＡは当業者周知の方法、例えば、化学合成又はｓｈＲＮＡをコードする遺伝子を細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。
【００３２】
「アプタマー」とはタンパク質又は核酸等の物質と結合する核酸である。アプタマーはＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。核酸の形態は二本鎖であっても一本鎖であってもよい。アプタマーの長さは標的分子に特異的に結合することができれば特に限定されないが、例えば、１０〜２００ヌクレオチド、好ましくは、１０〜１００ヌクレオチド、より好ましくは１５〜８０ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜５０ヌクレオチドのものである。アプタマーは、当業者において周知の方法を用いて選択することができ、例えば、ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（Ｔｕｅｒｋ、  Ｃ．  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ、  Ｌ．、  １９９０、  Ｓｃｉｅｎｃｅ、  ２４９：  ５０５−５１０）を用いることができる。
【００３３】
本明細書において、「ｍｉｍｅｔｉｃｓ」とは、当該タンパク質又はｍｉＲＮＡと類似の構造を有し、当該タンパク質又はｍｉＲＮＡの結合相手と結合することができるか、あるいは、当該タンパク質又はｍｉＲＮＡと競合することができるが、当該タンパク質又はｍｉＲＮＡの奏する活性は発揮することができない物質である。
【００３４】
本明細書における「抗体」は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得、非ヒト動物の抗体、非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体（キメラ抗体及びヒト化抗体など）、及びヒト抗体を含む。また、抗体のイムノグロブリンクラスは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＹのいずれのイムノグロブリンクラス（アイソタイプ）であってもよく、また、ＩｇＧの場合、いずれのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）であってもよい。更に、抗体は、モノスペシフィック、バイスペシフィック（二重特異性抗体）、トリスペシフィック（三重特異性抗体）（例えば、ＷＯ１９９１／００３４９３号）であってもよい。抗体の免疫反応性断片とは、抗体の一部分（部分断片）を含むタンパク質又はペプチドであって、抗体の抗原への作用（免疫反応性・結合性）を保持するタンパク質又はペプチドを意味する。このような免疫反応性断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆａｂ３、一本鎖Ｆｖ（以下、「ｓｃＦｖ」という）、（タンデム）バイスペシフィック一本鎖Ｆｖ（ｓｃ（Ｆｖ）２）、一本鎖トリプルボディ、ナノボディ、ダイバレントＶＨＨ、ペンタバレントＶＨＨ、ミニボディ、（二本鎖）ダイアボディ、タンデムダイアボディ、バイスペシフィックトリボディ、バイスペシフィックバイボディ、デュアルアフィニティリターゲティング分子（ＤＡＲＴ）、トリアボディ（又はトリボディ）、テトラボディ（又は［ｓｃ（Ｆｖ）２］２）、若しくは（ｓｃＦｖ−ＳＡ）４）ジスルフィド結合Ｆｖ（以下、「ｄｓＦｖ」という）、コンパクトＩｇＧ、重鎖抗体、又はそれらの重合体を挙げることができる（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２９（１）：５−６（２０１１）；Ｍａｎｅｅｓｈ  Ｊａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５（７）（２００７）：３０７−３１６；及び、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ  ｓｔｅｉｎら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１）：８８−１２３（２０１２）参照）。本明細書において、免疫反応性断片は、モノスペシフィック、バイスペシフィック（二重特異性）、トリスペシフィック（三重特異性）、及びマルチスペシフィック（多重特異性）のいずれであってもよい。アプタマーとは、特定の核酸又はタンパク質に結合可能な核酸分子のことである。また、受容体誘導体とは、目的のタンパク質が結合する受容体における結合領域の構造を有する物質を意味し、例えば、受容体と抗体の定常領域を結合させた物質や、膜タンパク質受容体の膜貫通領域を欠落させて可溶化させた物質を挙げることができる。アンタゴニストは、目的のタンパク質又はｍｉＲＮＡと競合してその機能を阻害する物質を広く含む。
【００３５】
本明細書において、活性阻害剤が当該タンパク質又はｍｉＲＮＡと結合する場合、あるいは、当該タンパク質又はｍｉＲＮＡが結合する相手と結合する場合、当該結合は好ましくは特異的であり、結合定数（Ｋａ）としては、例えば、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１を挙げることができる。
【００３６】
本明細書において「薬剤」とは、主には有効成分として用いられる物質のことであり、低分子化合物、核酸分子（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、タンパク質、及びそれらの融合物を含む。また、本明細書において「組成物」とは、少なくとも有効成分となる薬剤を含み、必要に応じて水、溶媒、及びその他の添加物を含む。本明細書における組成物は、有効成分として１種類の物質のみを含んでいても良いし、２種類以上の物質を含んでいても良い。本明細書において、「有効成分」とは、所望の生物学的作用を発揮することができる物質であれば特に限定されるものではなく、治療効果又は予防効果を発揮することができる物質のほか、ＤＤＳとしての機能を発揮する物質も含む。また、ある物質が有効成分か否かは、単に当該物質が生物学的作用を有するか否かではなく、当該組成物中に含まれる当該物質の量が当該物質による生物学的作用を発揮可能な量であるか否かに応じて決定することもできる。
【００３７】
「脳転移の診断又はリスク評価のための組成物」とは、以下に記載する脳転移を診断する方法又は脳転移が生じるリスクを評価する方法に用いるための組成物であり、診断薬（体外診断薬を含む）を含む。脳転移の診断又はリスク評価のための組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏ用、ｅｘ  ｖｉｖｏ用、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ用のいずれで行われるものであってもよいが、好ましくは、ｅｘ  ｖｉｖｏ用、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ用である。ｉｎ  ｖｉｖｏ用の診断又はリスク評価のための組成物は、以下の医薬組成物に準じて患者に投与することができる製剤とすることができる。本明細書における診断又はリスク評価のための組成物としては、例えば、Ｘ線造影剤、一般検査用試薬、血液検査用試薬、生化学的検査用試薬、免疫血清学的検査用試薬、細菌学的検査用剤、及び機能検査用試薬を挙げることができる。また、本明細書における診断又はリスク評価のための組成物は、検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定することを目的とすることから、上述のｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合する物質を備える。
【００３８】
別の態様において、本明細書における診断又はリスク評価のための組成物は、当該組成物を有効成分として含有する、診断又はリスク評価のためのキットとして提供されていても良い。当該キットは、ｍｉＲＮＡレベルを決定可能であればその構成が限定されるものではなく、例えば、本明細書における診断又はリスク評価のためのキットは、ｍｉＲ−１８１ｃと結合可能なプライマーを備えるキット（ＰＣＲ等の遺伝子増幅技術を用いることによりｍｉＲＮＡレベルを測定可能なキット）、又は、ｍｉＲ−１８１ｃと結合可能なプローブを備えるキット（ハイブリダイゼーション等の核酸結合検出技術を用いることによりｍｉＲＮＡレベルを測定可能なキット）であってもよい。
【００３９】
あるいは、本明細書における本明細書における診断又はリスク評価のためのキットは、ｍｉＲＮＡによる発現阻害作用を指標として、ｍｉＲＮＡレベルを確認するためのキットであってもよい。この場合は、例えば、ｍｉＲ−１８１ｃと特異的に結合可能なｍＲＮＡ  ３’ＵＴＲを有する標識物質（ルシフェラーゼなど）をコードする核酸を備えるキット（当該標識物質の発現をレポーターアッセイなどで確認することにより、ｍｉＲＮＡレベルを測定可能なキット）とすることもできる。
【００４０】
本明細書において「医薬組成物」とは、治療又は予防に使用するための組成物であり、治療薬及び予防薬を含む。医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好適である。また、患者に投与することができる製剤であれば経口又は非経口のいかなる製剤を採用してもよい。非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、点鼻剤、坐剤、貼布剤、軟膏等を挙げることができ、好ましくは、注射剤である。本発明の医薬組成物の剤形は、例えば、液剤又は凍結乾燥製剤を挙げることができる。本発明の医薬組成物を注射剤として使用する場合、必要に応じて、プロピレングリコール、エチレンジアミン等の溶解補助剤、リン酸塩等の緩衝材、塩化ナトリウム、グリセリン等の等張化剤、亜硫酸塩等の安定剤、フェノール等の保存剤、リドカイン等の無痛化剤等の添加物（「医薬品添加物事典」薬事日報社、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」ＡＰｈＡ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社参照）を加えることができる。また、本発明の医薬組成物を注射剤として使用する場合、保存容器としては、アンプル、バイアル、プレフィルドシリンジ、ペン型注射器用カートリッジ、及び、点滴用バッグ等を挙げることができる。例えば、医薬組成物は、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、５〜１００ｍｇ、１０〜２５０ｍｇの活性成分を含有していても良い。
【００４１】
本明細書において、脳転移を抑制するための医薬組成物は、有効成分として、ｍｉＲ−１８１ｃ発現抑制剤、ｍｉＲ−１８１ｃ活性阻害剤、及びエキソソーム分泌阻害剤から選択される１種類以上の薬剤を含有することができる。また、脳転移を抑制するための医薬組成物は、ｍｉＲ−１８１ｃ発現抑制剤、ｍｉＲ−１８１ｃ活性阻害剤、及びエキソソーム分泌阻害剤から選択される１種類又はそれ以上の薬剤を唯一の有効成分として含有することもできるし、併用される他の薬剤を有効成分として含有していても良い。このような他の薬剤としては、他の癌転移抑制剤や抗癌剤を挙げることができる。
【００４２】
脳転移を抑制するための医薬組成物が含有することができる、他の癌転移抑制剤又は抗癌剤としては、例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファン、チオテパ等のナイトロジェンマスタード類、及び、ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバシン、プロカルバシン、テモゾロミド、カルムスチン、ストレプトゾトシン、ベンダムスチン等のニトロウレア類を含むアルキル化薬；シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチンなどの白金化合物；エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリビン、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、デカフール、デカフール・ウラシル、デカフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、ドキシフルリジン、ネララビン、ヒドロキシカルバミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メルカプトプリン、メトトレキサートなどの代謝拮抗薬；イリノテカン、エトポシド、エリブリン、ソブゾキサン、ドセタキセル、ノギテカン、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチンなどの植物アルカロイド又は微小管阻害薬；アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ジノスタチンスチマラマー、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルピシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、リポソーマルドキソルビシンなどの抗癌性抗生物質；シプリューセル−Ｔ等の癌ワクチン；イブリツモマブチウキセタン、イマチニブ、エベロリムス、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、スニチニブ、セツキシマブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、タミバロテン、トラスツズマブ、トレチノイン、パニツムマブ、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、ラパチニブ、リツキシマブ等の分子標的薬；アナストロゾール、エキセメスタン、エストラムスチン、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、ゴセレリン、タモキシフェン、デキサメタゾン、トレミフェン、ビカルタミド、古民度、ブレドニゾロン、ホスフェストロール、ミトタン、メチルテストステロン、メドロキシプロゲステロン、メピチオスタン、リュープロレリン、レトロゾールなどのホルモン剤；インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン、ウベニメクス、乾燥ＢＣＧ、レンチナンなどの生物学的応答調節剤を挙げることができる。
【００４３】
本明細書において、血液脳関門の透過性を亢進させるための医薬組成物は、有効成分として、１種類又はそれ以上のＰＤＰＫ１発現抑制剤又はＰＤＰＫ１活性阻害剤を含有することができる。また、血液脳関門の透過性を亢進させるための医薬組成物は、ＰＤＰＫ１発現抑制剤及び／又はＰＤＰＫ１活性阻害剤を唯一の有効成分として含有することもできるし、併用される他の薬剤を有効成分として含有していても良い。このような他の薬剤としては、血液脳関門に作用して透過性を高める薬物の他、脳へ送達される目的の薬剤を挙げることができる。本明細書においては、血液脳関門の透過性を亢進させるための医薬組成物が、特に、所望の薬剤を脳へ送達することを目的して利用される場合、このような医薬組成物を「薬剤送達用組成物」と呼ぶ。また、本明細書の薬剤送達用組成物において、「脳へ送達される目的の薬剤」は、ＢＢＢを開放させるために含まれる薬剤（ＰＤＰＫ１発現抑制剤又はＰＤＰＫ１活性阻害剤）と区別するために、「活性成分」と呼ぶ。
【００４４】
本明細書において「薬剤送達用組成物」は、少なくとも、有効成分としてＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤を含有する。薬剤送達用組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好適である。このような投薬単位の剤形としては、注射剤（アンプル、バイアル、プレフィルドシリンジ）が例示され、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、５〜１００ｍｇ、１０〜２５０ｍｇのＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤を含有していても良い。
【００４５】
また、薬剤送達用組成物は、ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤に加えて、脳へ到達させることを目的とする薬剤、即ち、活性成分を含んでいても良い。この場合、ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤と活性成分とは、一つの製剤中に含まれていても良いし、併用のための別々の製剤として提供されていても良い。
【００４６】
本明細書において、「活性成分」とは、脳内へ送達されることを目的とする医薬であり、例えば、脳血管障害（脳梗塞・脳出血・脳動脈瘤など）、脳腫瘍（髄膜腫・下垂体腺腫など、脳転移を含む）、感染性疾患（髄膜炎など）、機能的脳疾患（三叉神経痛など）、脊髄疾患（椎間板ヘルニア・脊柱管狭窄症など）などの脳神経外科疾患；パーキンソン病、脊髄小脳変性症、てんかんなどの神経疾患；及び、アルツハイマー病、非アルツハイマー性変性痴呆、不眠症、うつ病などの精神疾患を対象疾患とする治療薬又は予防薬を含む。例えば、対象疾患が脳腫瘍の場合、上述の各種抗癌剤を利用することができ、特に、グリオーマの場合、好ましくはアバスチン又はギリアデルを利用することができる。
【００４７】
別の態様において、本明細書における薬剤送達用組成物は、当該組成物を有効成分として含有する、治療又は予防のためのキットとして提供されていても良い。当該キットは、ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤を含有していればその構成が限定されるものではなく、例えば、ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤、及び、活性成分を含有していてもよい。この場合、ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤と、活性成分とは、同時に投与される形態で提供されていても良いし、別々に投与される形態で提供されていても良い。
【００４８】
本明細書全体において、「レベル」とは、数値化されたｍｉＲ−１８１ｃの存在量に関する指標を意味し、例えば、濃度、量あるいはその代わりとして用いることができる数値化可能なあらゆる指標を含む。よって、レベルは蛍光等の測定値そのものであってもよいし、濃度や量に換算された値であってもよい。また、レベルは、絶対的な数値（存在量、単位面積当たりの存在量など）であっても良いし、又は必要に応じて設定された比較対象と比較した相対的な数値であってもよい。更に、同一サンプルについて（同時に又は異なる時期に）複数回測定した場合には、レベルはその平均値又は中央値とすることができる。
【００４９】
本明細書において「キット」は、上述の有効成分に加えて、紙箱又はプラスチックケース等のキットの構成物を格納するパッケージ、各成分を格納するアンプル、バイアル、チューブ、又はシリンジ等、及び取扱い説明書等を含んでいてもよい。
【００５０】
別の態様において本発明は、癌患者の脳転移判定装置及び脳転移リスク判定装置、並びに、それらの装置において用いられるコンピュータプログラムである（図２３）。これらの装置は、脳転移があるか否かを診断をする者（通常は医師）に対して診断のための情報を提供する。本発明の脳転移判定装置は、ｍｉＲ−１８１ｃ測定手段を備える。ここで、「ｍｉＲ−１８１ｃ測定手段」は、被験者由来の検体における、ｍｉＲ−１８１ｃ（配列番号１）の塩基配列若しくはその一部を有するポリヌクレオチドの測定を実行する装置であって、被検癌患者由来の検体に対する所定の処理によって、検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルに関する情報をデジタル化又は電気信号化する。ｍｉＲ−１８１ｃ測定手段は、上述の脳転移の診断又はリスク評価のための薬剤と被検癌患者由来の検体とを接触させ、必要に応じて反応させることにより生じたｍｉＲ−１８１ｃレベルを反映した強度を有する光（蛍光、発光など）等のパラメータを測定する。脳転移の診断又はリスク評価のための薬剤と被検癌患者由来の検体との接触は、通常、プレートやチューブなどの容器（反応槽）内で行われる。
【００５１】
本発明のコンピュータプログラムは、上述の癌患者の脳転移判定装置及び脳転移リスク判定装置が、他の測定や判定にも使用できる汎用装置である場合であっても、その汎用装置へインストールすることにより、癌患者の脳転移判定装置又は脳転移リスク判定装置として使用可能とするコンピュータプログラムを含む。また、本発明のコンピュータプログラムは、必ずしも脳転移判定装置及び脳転移リスク判定装置にインストールされていることを必要とするものではなく、例えば、本発明のコンピュータプログラムは、記録媒体へ記憶させて提供することもできる。ここで、「記録媒体」とは、それ自身では空間を占有し得ないプログラムを担持することができる媒体であり、例えば、フレキシブルディスク、ハードディスク、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＭＯ（光磁気ディスク）、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＷ、フラッシュメモリなどが含まれる。また、本発明のコンピュータプログラムは、当該コンピュータプログラムを格納したコンピュータから、通信回線を通じて他のコンピュータ又は装置へ伝送することも可能である。本発明のコンピュータプログラムは、このようなコンピュータに格納されたコンピュータプログラム、及び、伝送中のコンピュータプログラムをも含む。
【発明の効果】
【００５２】
ｍｉＲ−１８１ｃは、ＢＢＢを破壊することにより脳転移に寄与し、また、脳転移癌患者において特異的に発現が上昇していることから、脳転移の診断又はリスク評価に使用することができる。また、ｍｉＲ−１８１ｃの発現若しくは活性を阻害するか、又は、（ｍｉＲ−１８１ｃを含む）ＥＶｓの分泌を阻害することにより、脳転移を抑制することができる。更に、ｍｉＲ−１８１ｃを含むＰＤＰＫ１の発現抑制剤、及びＰＤＰＫ１の活性抑制剤は、ＢＢＢの透過性を高めることから、脳への送達が希望される薬剤のＤＤＳに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】（ａ）脳転移誘導体のｉｎ  ｖｉｖｏ選択のプロトコルの概略図である。（ｂ）ＢＭＤ２ａ細胞の脳転移を有するマウスの生物発光イメージングの写真である（左）。右は癌細胞転移を有するマウス脳の生物発光イメージングの写真である。（ｃ）マウス大脳皮質及び中脳から得た切片のヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）染色の写真である。上段は大脳皮質（Ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃｏｒｔｅｘ）、下段は中脳（ｍｉｄｂｒａｉｎ）の写真である。左（Ｎｏｒｍａｌ）は癌細胞の転移のないマウス由来を示し、中央（Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）は、癌細胞の転移があるマウス由来を示す。矢じりは転移癌細胞をあらわす。右の写真は、高倍率の写真を示す。各写真の右下のバーは、１００μｍを示す。
【図２】（ａ）サル脳毛細血管内皮細胞、周皮細胞、及び星状膠細胞の初代培養細胞からのｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液脳関門モデルの構築の概略図である。（ｂ）内皮細胞、周皮細胞、及び星状膠細胞の代表的な写真を示す。星状膠細胞は蛍光顕微鏡を用いて可視化させた。各写真の右下のバーは、１００μｍを表す。（ｃ）密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（クラウジン−５、オクルジン、及びＺＯ−１）及びＮ−カドヘリンの免疫蛍光染色の結果を示す写真である。各写真の右下のバーは、２０μｍを示す。（ｄ）解凍後、実験開始までの間のＴＥＥＲの変化を示すグラフである。ＢＢＢ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを解凍後、ＴＥＥＲ値は最大で８６９．５５Ω×ｃｍ２まで増加した。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示す。
【図３】（ａ）マトリゲルを侵襲したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ１細胞（以下、Ｄ３Ｈ１細胞）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞（以下、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞）、また樹立した脳転移細胞株であるＢＭＤ２ａ細胞及びＢＭＤ２ｂ細胞の代表的な写真である。各写真の右下のバーは１００μｍを表す。（ｂ）マトリゲルを侵襲したＤ３Ｈ１細胞、ＢＭＤ２ａ細胞及びＢＭＤ２ｂ細胞の数を、マトリゲルを侵襲したＤ３Ｈ２ＬＮ細胞数に対する割合（倍）で示したグラフである。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示し、＊＊はＰ＜０．０１を示す。（ｃ）Ｄ３Ｈ１細胞、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞及びＢＭＤ２ｂ細胞の代表的な形態を示す写真である。各写真の右下のバーは１００μｍを表す。
【図４】（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルにおけるＰＫＨ−６７標識化各癌細胞の侵襲性試験の概略図である。（ｂ）左のグラフはｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを通過した、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞及びＢＭＤ２ｂ細胞の細胞数を、ＢＢＢモデルを通過したＤ３Ｈ１細胞に対する割合（倍）で示したグラフである。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示し、＊はＰ＜０．０１、＊＊はＰ＜０．０１を示す。右の写真は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを通過した、Ｄ３Ｈ１細胞、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞及びＢＭＤ２ｂ細胞の細胞の写真を示す。
【図５】（ａ）上段は位相差電子顕微鏡によりＥＶｓを可視化した写真を示す。バーは１００ｎｍを表す。下段はＥＶのサイズをＮａｎｏＳｉｇｈｔで測定した結果を示すグラフである。グラフ中の数値は全てのＥＶｓのサイズの平均値を表す。（ｂ）ＥＶマーカーであるＣＤ６３及びＣＤ９、並びにチトクロムＣの発現をウェスタンブロッティングで確認した結果の写真である。左から順に、Ｄ３Ｈ１由来ＥＶｓ（レーン１）、Ｄ３Ｈ２ＬＮ由来ＥＶｓ（レーン２）、ＢＭＤ２ａ由来ＥＶｓ（レーン３）、及びＢＭＤ２ｂ由来ＥＶｓ（レーン４）を表す。（ｃ）Ｄ３Ｈ１細胞、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞及びＢＭＤ２ｂ細胞から単離されたＥＶｓの数をＮａｎｏＳｉｇｈｔにより測定した結果を表すグラフである。横軸は左から順に、Ｄ３Ｈ１由来ＥＶｓ、Ｄ３Ｈ２ＬＮ由来ＥＶｓ、ＢＭＤ２ａ由来ＥＶｓ、及びＢＭＤ２ｂ由来ＥＶｓを表す。縦軸は１ｍＬ当たりのＥＶｓの粒子数（×１０９個／ｍＬ）を表す。
【図６】ｓｉＲＮＡ処理ＢＭＤ２ａ細胞の実験結果を表すグラフである。全てのグラフにおいて、横軸は処理したｓｉＲＮＡを表し、左から、陰性コントロール細胞（Ｎ．Ｃ．）、ＲＡＢ２７Ｂ  ｓｉＲＮＡ（ＲＡＢ２７Ｂ）、ｎＳＭａｓｅ２  ｓｉＲＮＡ（ｎＳＭａｓｅ２）、ＲＡＢ２７Ｂ  ｓｉＲＮＡ及びｎＳＭａｓｅ２  ｓｉＲＮＡ（Ｓ＋Ｒ）を表す。（ａ）ｓｉＲＮＡ処理ＢＭＤ２ａ細胞から放出されたＥＶｓ数を表すグラフである。縦軸は、ＥＶｓ粒子数（個／ｍＬ）について、ＥＶｓ放出関連タンパク質に対するｓｉＲＮＡで処理した細胞の、陰性コントロール細胞に対する割合（倍）を表す。（ｂ）マトリゲルを侵襲した各種ｓｉＲＮＡ処理ＢＭＤ２ａ細胞に関するグラフである。縦軸は、マトリゲルを侵襲した細胞数について、ＥＶｓ放出関連タンパク質に対するｓｉＲＮＡで処理した細胞の、陰性コントロール細胞に対する割合（％）を表す。（ｃ）ｓｉＲＮＡ処理ＢＭＤ２ａ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢ通過活性試験の結果を示すグラフである。縦軸は、ＢＢＢ通過細胞数について、ＥＶｓ放出関連タンパク質に対するｓｉＲＮＡで処理した細胞の、陰性コントロール細胞に対する割合（倍）を表す。
【図７】ＢＭＤ２ａ、ＢＭＤ２ｂ又はＤ３Ｈ２ＬＮ細胞由来のＥＶｓを添加したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを用いたＤ３Ｈ１細胞のＢＢＢ通過能を測定した結果を示すグラフである。縦軸は、ＢＢＢ通過細胞数についてＢＭＤ２ａ、ＢＭＤ２ｂ又はＤ３Ｈ２ＬＮ細胞由来のＥＶｓを添加したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを浸潤したＤ３Ｈ１細胞の、陰性コントロール細胞に対する割合（倍）を表す。横軸は、添加したＥＶｓの由来する細胞を表し、左から、陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞を表す。
【図８】（ａ）ＥＶｓ添加から２４時間後のＴＥＥＲ測定の結果を表すグラフである。縦軸はＴＥＥＲの測定値（Ω・ｃｍ２）を表し、横軸は、添加したＥＶｓの由来する細胞を表し、左から、陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）、Ｄ３Ｈ１細胞、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞を表す。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表し、＊はＰ＜０．０５を、＊＊はＰ＜０．０１表す。（ｂ）ＥＶｓ添加前及びＥＶｓ添加２４時間後のＴＥＥＲの変化を表すグラフである。縦軸は、ＥＶｓ添加前のＴＥＥＲ値に対するＥＶｓ添加２４時間後のＴＥＥＲ値の割合（倍）を表す。（ｃ）ＮａＦにより測定したＢＢＢの透過性試験の結果を表すグラフである。縦軸は、見かけの透過性係数（Ｐａｐｐ）（１０−６ｃｍｓ−１）を表す。横軸は、添加したＥＶｓの由来する細胞を表し、左から、陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）、Ｄ３Ｈ１細胞、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞を表す。
【図９】（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを構成する内皮細胞へのＥＶｓの取り込みを測定した結果を表すグラフである。縦軸は、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞由来に対する、他の細胞の内皮細胞に取り込まれたＥＶｓの蛍光強度の比率（倍）を表す。横軸は、使用したＥＶｓが由来する細胞を表し、左から、Ｄ３Ｈ１細胞、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞を表す。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表す。（ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを構成する内皮細胞（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、周皮細胞（Ｐｅｒｉｃｙｔｅ）、及び星状膠細胞（Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）のＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色（水色）及び取り込まれたＥＶｓのＰＫＨ６７（緑色）を蛍光顕微鏡で観察した写真である。写真左は用いたＥＶｓの由来する細胞を表す。内皮細胞（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）及び周皮細胞（Ｐｅｒｉｃｙｔｅ）の写真のバーは２０μｍを表す。星状膠細胞（Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）の写真のバーは、１００μｍを表す。
【図１０】（ａ）Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞由来ＥＶｓ添加後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを構成する血管内皮細胞内における密着結合タンパク質（クラウジン−５、オクルジン、及びＺＯ−１）（赤色）及びアクチンフィラメント（緑色）の共蛍光免疫染色の写真である。バーは２０μｍを表す。（ｂ）Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞由来ＥＶｓ添加後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを構成する血管細胞内におけるＮ−カドヘリン（赤色）及びアクチンフィラメント（緑色）の共蛍光免疫染色の写真である。バーは２０μｍを表す。（ｃ）ＰＢＳ（陰性コントロール：Ｎ．Ｃ．）又はＤ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、又はＢＭＤ２ｂ細胞由来ＥＶｓで処理した内皮細胞から回収したタンパク質を用いて、密着結合タンパク質、Ｎ−カドヘリン、アクチン、及びＧＡＰＤＨ（内在性コントロール）をウェスタンブロット解析した写真である。
【図１１】Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞（コントロール）又はＢＭＤ２ａ細胞由来のＥＶｓを投与したマウス脳の蛍光イメージ写真である。上段の蛍光強度は、マウス脳に取り込まれたＤｉＲ−標識化ＥＶｓを表す。下段の蛍光強度は、マウス脳の血管透過性を表す。
【図１２】（ａ）マウス脳内光子強度の分布を表すグラフである。縦軸は光子強度（×１０５）を表す。横軸は、各マウス群を示し、左から、陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）、Ｄ３Ｈ２ＬＮ由来ＥＶｓ投与群（Ｄ３Ｈ２ＬＮ）、及びＢＭＤ２ａ由来ＥＶｓ投与群（ＢＭＤ２ａ）を表す。＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１を表す。（ｂ）陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）（左）、Ｄ３Ｈ２ＬＮ由来ＥＶｓ（Ｄ３Ｈ２ＬＮ  ＥＶｓ）（中央）、及びＢＭＤ２ａ由来ＥＶｓ（ＢＭＤ２ａ  ＥＶｓ）（右）を投与した後、マウスに癌細胞を移植し、癌細胞の転移をの生物発光イメージとして示したの代表的な写真である。上段はマウスの全身の生物発光イメージであり、下段はマウス脳の生物発光イメージである。（ｃ）マウス大脳皮質から得た切片の写真である。上段はヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）染色の写真であり、矢じりは転移癌細胞を示す。写真の右下のバーは、１００μｍを表す。下段は抗ヒトビメンチン免疫蛍光染色のイメージ写真であり、写真の右下のバーは、２０μｍを示す。
【図１３】（ａ）癌細胞由来ＥＶｓにおけるｍｉＲ−１８１ｃの発現レベルのヒートマップである。（ｂ）単離されたＥＶｓにおける全ＲＮＡ量に対するｍｉＲ−１８１ｃの量（ｍｉＲ−１８１ｃ／全エキソソームＲＮＡ）について、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞のＤ３Ｈ２ＬＮ細胞に対する割合（倍）を表すグラフである。縦軸は、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞から単離されたＥＶｓにおける全ＲＮＡ量に対するｍｉＲ−１８１ｃの量を１とした場合の、単離されたＥＶｓにおける全ＲＮＡ量に対するｍｉＲ−１８１ｃの量の比率（倍）を示す。ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表し、＊＊は、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞由来のＥＶｓに対してＰ＜０．０１を表す。
【図１４】（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルの血管内皮細胞内のｍｉＲ−１８１ｃ量の変化を示したグラフである。縦軸は、癌細胞由来ＥＶｓをｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルに添加した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルの血管内皮細胞から回収したＲＮＡに含まれるｍｉＲ−１８１ｃの量についてＲＮＵ６で補正した値をＤ３Ｈ２ＬＮ細胞由来ＥＶｓを添加した血管内皮細胞に含まれるｍｉＲ−１８１ｃの量に対する割合（倍）示す。横軸は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルに添加したＥＶｓの由来する細胞を表し、左から、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞を表す。ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表し、＊＊は、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞由来のＥＶｓに対してＰ＜０．０１を表す。（ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルの血管内皮細胞内に対してｍｉＲ−１８１ｃを形質導入した後、２４時間後のＴＥＥＲ測定の結果を表すグラフである。縦軸はＴＥＥＲの測定値（Ω・ｃｍ２）を表し、横軸は、形質導入したｍｉｃｒｏＲＮＡを表し、左から、陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）、ｍｉＲ−１８１ｃを表す。エラーバーは標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表す。（ｃ）陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）又はｍｉＲ−１８１ｃを形質導入した後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを構成する血管内皮細胞内における密着結合タンパク質（クラウジン−５、オクルジン、及びＺＯ−１）、Ｎ−カドヘリン（赤色）及びアクチンフィラメント（緑色）の共蛍光免疫染色の写真である。バーは２０μｍを表す。（ｄ）陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）又はｍｉＲ−１８１ｃを形質導入した後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを構成する血管内皮細胞から回収したタンパク質を用いて、密着結合タンパク質、Ｎ−カドヘリン、アクチン、及びＧＡＰＤＨ（内在性コントロール）をウェスタンブロット解析した写真である。
【図１５】患者由来の血清中のＥＶｓに含まれるｍｉＲ−１８１ｃの量を表すグラフである。縦軸は、ｍｉＲ−１６量に対するｍｉＲ−１８１ｃ量の比を表す。横軸は、左が脳転移無し（ｗｉｔｉｏｕｔ  ｂｒａｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）（ｎ＝４６）を示し、右が脳転移有り（Ｂｒａｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）（ｎ＝１０）を示す。＊はＰ＜０．０５を表す。ｍｉＲ−１８１ｃレベルの検定はＴ検定により行った。
【図１６】乳癌患者血清に含まれるｍｉＲ−１８１ｃの量の分布を示すグラフである。縦軸は、ｍｉＲ−１８１ｃの存在量をｍｉＲ−１６の存在量で補正した値（ΔΔＣｔ値）である。横軸は、ＴＮＭ分類を用いた乳癌の病期（ステージ）を示す。＊は、ステージ３及び脳転移を有しないステージ４患者群に対する、脳転移を有する患者群、Ｍａｎｎ  −Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔを用いた有意差を示しており、  Ｐ＜０．０５である。
【図１７】（ａ）マイクロアレイ解析によるＰＤＰＫ１の発現量の比率を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを構成する血管内皮細胞に対し、陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）及びｍｉＲ−１８１ｃを形質導入した後、血管内皮細胞から回収したＲＮＡに対して、マイクロアレイ解析を行った。縦軸は、陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）を形質導入したときのＰＤＰＫ１の発現量を１とした値である。横軸は、形質導入したｍｉｃｒｏＲＮＡを示し、左からＮ．Ｃ．及びｍｉＲ−１８１ｃである。（ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを構成する血管内皮細胞におけるＰＤＰＫ１  ｍＲＮＡの発現量を示す。血管内皮細胞に対し、陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）及びｍｉＲ−１８１ｃを形質導入した後、血管内皮細胞からＲＮＡを回収し、そこに含まれるＰＤＰＫ１  ｍＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲにより解析を行った。縦軸には、ＰＤＰＫ１  ｍＲＮＡの量をＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの量で補正した値（ΔΔＣｔ値）を１とした値を示す。横軸は、形質導入したｍｉｃｒｏＲＮＡを示し、左からＮ．Ｃ．及びｍｉＲ−１８１ｃである。＊＊は、Ｐ＜０．０１を示す。（ｃ）陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）又はｍｉＲ−１８１ｃを形質導入した後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを構成する血管内皮細胞から回収したタンパク質を用いて、ＰＤＰＫ１及びＧＡＰＤＨ（内在性コントロール）をウェスタンブロット解析した写真である。グラフは、ウェスタンブロット解析した時のＰＤＰＫ１の発光強度を、ＧＡＰＤＨの発光強度で補正した値を示す。（ｄ）マイクロアレイ解析によるＰＤＰＫ１の発現量の比率を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを構成する血管内皮細胞に対し、陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）及びＤ３Ｈ２ＬＮ細胞由来ＥＶｓ、ＢＭＤ２ａ細胞由来ＥＶｓ、ＢＭＤ２ｂ細胞由来ＥＶｓを添加した後、血管内皮細胞から回収したＲＮＡに対して、マイクロアレイ解析を行った。縦軸は、陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）を処理した時のＰＤＰＫ１の発現量を１とした値である。横軸は、陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）及びＤ３Ｈ２ＬＮ細胞由来ＥＶｓ、ＢＭＤ２ａ細胞由来ＥＶｓ、ＢＭＤ２ｂ細胞由来ＥＶｓを添加したことを示す。（ｅ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを構成する血管内皮細胞におけるＰＤＰＫ１  ｍＲＮＡの発現量を示す。血管内皮細胞に対し、陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）及びＤ３Ｈ２ＬＮ細胞由来ＥＶｓ、ＢＭＤ２ａ細胞由来ＥＶｓ、ＢＭＤ２ｂ細胞由来ＥＶｓを添加した後、血管内皮細胞から回収したＲＮＡに対して、そこに含まれるＰＤＰＫ１  ｍＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲにより解析を行った。縦軸には、ＰＤＰＫ１  ｍＲＮＡの量をＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの量で補正した値（ΔΔＣｔ値）を１とした値を示す。横軸は、横軸は、陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）及びＤ３Ｈ２ＬＮ細胞由来ＥＶｓ、ＢＭＤ２ａ細胞由来ＥＶｓ、ＢＭＤ２ｂ細胞由来ＥＶｓを添加したことを示す。＊＊は、Ｐ＜０．０１を示す。（ｆ）陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）及びＤ３Ｈ２ＬＮ細胞由来ＥＶｓ、ＢＭＤ２ａ細胞由来ＥＶｓ、ＢＭＤ２ｂ細胞由来ＥＶｓを添加した後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを構成する血管内皮細胞から回収したタンパク質を用いて、ＰＤＰＫ１及びＧＡＰＤＨ（内在性コントロール）をウェスタンブロット解析した写真である。グラフは、ウェスタンブロット解析した時のＰＤＰＫ１の発光強度を、ＧＡＰＤＨの発光強度で補正した値を示す。
【図１８】（ａ）陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）又はＰＤＰＫ１  ｓｉＲＮＡを形質導入した後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを構成する血管内皮細胞内における密着結合タンパク質（クラウジン−５、オクルジン、及びＺＯ−１）、Ｎ−カドヘリン（赤色）及びアクチンフィラメント（緑色）の共蛍光免疫染色の写真である。バーは２０μｍを表す。（ｂ）陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）又はＰＤＰＫ１  ｓｉＲＮＡを形質導入した後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを構成する血管内皮細胞から回収したタンパク質を用いて、密着結合タンパク質、Ｎ−カドヘリン、アクチン、及びＧＡＰＤＨ（内在性コントロール）をウェスタンブロット解析した写真である。（ｃ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルの血管内皮細胞内に対してＰＤＰＫ１  ｓｉＲＮＡを形質導入した後、２４時間後のＴＥＥＲ測定の結果を表すグラフである。縦軸はＴＥＥＲの測定値（Ω・ｃｍ２）を表し、横軸は、形質導入したｍｉｃｒｏＲＮＡを表し、左から、陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）、ＰＤＰＫ１  ｓｉＲＮＡを表す。エラーバーは標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表す。
【図１９】（ａ）３‘ＵＴＲレポーター検定の結果である。ヒト（Ｈｕｍａｎ）とカニクイザル（Ｍａｃａｃａ）由来のＰＤＰＫ１  ｍＲＮＡ  ３’ＵＴＲ領域を用いて行った。陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）の結果を黒でｍｉＲ−１８１ｃの結果を白で示している。値は、それぞれ、陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）を１としたときの比率である。＊＊はＰ＜０．０１を示す。（ｂ）ヒト（Ｈｕｍａｎ）（配列番号１４）及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ）（配列番号１５）由来のＰＤＰＫ１  ｍＲＮＡ  ３’ＵＴＲ領域の配列とｍｉＲ−１８１ｃ配列（配列番号１）及びその結合領域を示す。
【図２０】（ａ）Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞由来ＥＶｓ、ＢＭＤ２ａ細胞由来ＥＶｓ及びＢＭＤ２ｂ細胞由来ＥＶｓを添加した後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを構成する血管内皮細胞から回収したタンパク質を用いて、ＰＤＰＫ１、Ｃｏｆｉｌｉｎ、リン酸化Ｃｏｆｉｌｉｎ（Ｐ−ｃｏｆｉｌｉｎ）及びＧＡＰＤＨ（内在性コントロール）をウェスタンブロット解析した写真である。（ｂ）陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）、ｍｉＲ−１８１ｃ又はＰＤＰＫ１  ｓｉＲＮＡを形質導入した後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを構成する血管内皮細胞から回収したタンパク質を用いて、ＰＤＰＫ１、Ｃｏｆｉｌｉｎ、リン酸化Ｃｏｆｉｌｉｎ（Ｐ−ｃｏｆｉｌｉｎ）及びＧＡＰＤＨ（内在性コントロール）をウェスタンブロット解析した写真である。
【図２１】本発明の実施の形態に係る脳転移判定装置の概略構成図を示す。
【図２２】図２２は、本発明の実施の形態に係る脳転移リスク判定装置の概略構成図を示す。
【図２３】脳転移判定装置用のコンピュータプログラムを実行したときの脳転移判定装置の行う処理のフローを示す。
【図２４】脳転移リスク判定装置用のコンピュータプログラムを実行したときの脳転移リスク判定装置の行う処理のフローを示す。
【図２５】本発明の装置及び当該装置を用いた脳転移判定方法（実線）又は脳転移リスク判定方法（点線）の概念図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
１．癌患者の脳転移の診断又はリスク評価方法
一態様において、本発明は被検癌患者由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを測定することを備える、脳転移を診断する方法、又は脳転移が生じるリスクを判定する方法に関する。一態様において、本発明は、被検癌患者における脳転移を診断する（又は、脳転移が生じるリスクを判定する）方法であって、前記被検癌患者由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定するステップ、決定されたｍｉＲ−１８１ｃレベルから前記被検癌患者における脳転移の有無（又は、脳転移が生じるリスク）を判定するステップを備え、ここで、前記被検癌患者由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルが陰性比較対象由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルと比較して高い場合に、前記被検癌患者は脳に転移していると判定する（又は、脳転移が生じるリスクが高いと判定する）方法に関する。
【００５５】
あるいは、一態様において、本発明は被検癌患者由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを測定することを備える、脳転移を診断するための情報を提供する方法に関する。本発明は、被検癌患者における脳転移を診断する（又は、脳転移をリスク評価する）ための情報を提供する方法であって、前記被検癌患者由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定するステップ、決定されたｍｉＲ−１８１ｃレベルから前記被検癌患者における脳転移の有無（又は、脳転移が生じるリスク）を判定するための情報を提供することを備えるステップを備え、ここで、前記被検癌患者由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルが陰性比較対象由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルと比較して高い場合には、前記被検癌患者は脳転移を有する（又は、脳転移が生じるリスクが高い）との情報が提供される方法。
【００５６】
ｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定するステップは、被験者由来の検体における、ｍｉＲ−１８１ｃ（配列番号１）の塩基配列若しくはその一部を有するポリヌクレオチドを測定することにより行う。前記ポリヌクレオチドの測定は、ハイブリダイゼーション等の核酸結合の検出を利用した方法；ＰＣＲ等の核酸増幅を利用した方法；レポーターアッセイなどのｍｉＲ−１８１ｃの発現阻害機能を利用した方法；あるいは、ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡから転写されたｃＤＮＡの配列を解読することにより行うことができる。
【００５７】
ハイブリダイゼーションを利用した方法としては、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーション、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、マイクロアレイ、ＡＳＯ法を挙げることができる。
【００５８】
例えば、本発明における「ｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定するステップ」は、以下のステップを備えていてもよい：
（ａ）少なくとも１つのｍｉＲ−１８１ｃ（配列番号１）の塩基配列若しくはその一部と結合する核酸コンストラクト（プローブ）と被検癌患者由来の検体を接触させるステップ；
（ｂ）前記プローブと前記検体中のｍｉＲ−１８１ｃとの結合を測定するステップ；及び、
（ｃ）測定された該プローブとｍｉＲ−１８１ｃとの結合から当該検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定するステップ。
【００５９】
上述において、測定される「プローブとｍｉＲ−１８１ｃとの結合」とは、これらの物質の結合量、結合数、又は結合割合とすることができる。また、プローブとｍｉＲ−１８１ｃとの結合から当該検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定するステップは、例えば、以下の方法により行うことができる。ｍｉＲ−１８１ｃの段階希釈系列を標準検体として用いて、前記プローブと標準検体中のｍｉＲ−１８１ｃの結合を測定し、測定値から検量線を作成する。被検癌患者由来の検体を用いて測定された、プローブとｍｉＲ−１８１ｃとの結合に関する測定値を前記検量線に当てはめることにより、被検癌患者由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルとして算出することができる。このような検量線は、被検癌患者由来の検体と同時に標準検体を測定することにより決定することもできるし、被検癌患者由来の検体とは分かれて（異なる時期に）標準検体を測定することにより決定することもできる。よって、検量線は、被検癌患者由来の検体の測定前に、標準検体に関する測定を行い、当該標準検体に関する測定値から予め得られたものであっても良い。また、ｍｉＲＮＡとプローブを直接結合させる代わりに、患者由来のサンプル中のｍｉＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成されたｃＤＮＡとプローブとの結合を測定しても良い。
【００６０】
また、ＰＣＲを利用した方法としては、ＡＲＭＳ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）法、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ）法、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を挙げることができる。
【００６１】
例えば、本発明におけるｍｉＲ−１８１ｃレベルの決定は、以下のステップを備えていてもよい：
（ａ）少なくとも１つのｍｉＲ−１８１ｃ（配列番号１）の塩基配列の一部と結合する核酸コンストラクト（プライマー）を用いて、被検癌患者由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃ（配列番号１）若しくはその一部を有する核酸分子を増幅させるステップ：
（ｂ）前記核酸分子の増幅量を測定するステップ；並びに、
（ｃ）測定された該核酸の増幅量から、当該検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定するステップ。
【００６２】
上述において、測定された該核酸の増幅量から当該検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定するステップは、例えば、以下の方法により行うことができる。予めコピー数の判明している核酸を標準検体として使用し、得られた増幅量の値から検量線を作成する。被検癌患者由来の検体中の核酸の増幅に関する測定値を当該検量線に当てはめて算出することにより被検癌患者由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃを決定することができる。このような検量線は、被検癌患者由来の検体と同時に標準検体を測定することにより決定することもできるし、被検癌患者由来の検体とは分かれて（異なる時期に）標準検体を測定することにより決定することもできる。よって、検量線は、被検癌患者由来の検体の測定前に、標準検体に関する測定を行い、当該標準検体に関する測定値から予め得られたものであっても良い。また、ｍｉＲＮＡを直接増幅させる代わりに、患者由来のサンプル中のｍｉＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成されたｃＤＮＡを用いて増幅させても良い。
【００６３】
ｍｉＲ−１８１ｃの発現阻害機能を利用した方法としては、蛍光タンパク質等（ルシフェラーゼ等）の標識遺伝子を用いた方法が広く知られている。例えば、ｍｉＲ−１８１ｃのシード配列（ＡＣＵＵＡＣＡ）と結合する３’ＵＴＲ配列（例えば、配列番号１４又は配列番号１５）をｍＲＮＡに有する標識遺伝子を設計し、当該遺伝子を導入した細胞を用いて、当該遺伝子が発現する条件下で検体を共存させることにより、ｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定することができる。
【００６４】
例えば、本発明におけるｍｉＲ−１８１ｃレベルの決定は、以下のステップを備えていてもよい：
（ａ）以下の（ｉ）及び（ｉｉ）をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞と、被検癌患者由来の検体を接触させるステップ、
（ｉ）標識遺伝子、
（ｉｉ）ｍｉＲ−１８１ｃのシード配列（ＡＣＵＵＡＣＡ）と結合するｍＲＮＡ上の３’ＵＴＲ配列：
（ｂ）前記細胞中において前記ポリヌクレオチドを発現させるステップ；並びに、
（ｃ）発現した標識遺伝子産物の量から、当該検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定するステップ。
【００６５】
上述において、発現した標識遺伝子産物の量から当該検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定するステップは、例えば、予め量が判明している標準検体を用いた場合の標識遺伝子産物の量から検量線を作成し、標識遺伝子産物の量に関する測定値と当該検量線から算出することにより行うことができる。
【００６６】
ｍｉＲＮＡ又はｃＤＮＡの配列を解読する場合、必要に応じてＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成されたｃＤＮＡの配列をシーケンサーで解読し、解読されたｍｉＲ−１８１ｃの量からｍｉＲ−１８１ｃのレベルをすることができる。
【００６７】
上述において、ｍｉＲＮＡからｃＤＮＡを合成する場合、ｃＤＮＡ合成キット（ＲＮＡ−Ｑｕａｎｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ＬＬＣ、サンフランシスコ、米国）等を用いて行うことができる。
【００６８】
本発明の診断方法等における「判定するステップ」及び「判定するための情報を提供することを備えるステップ」（本段落において、総称して「判定ステップ」という）は、決定されたｍｉＲ−１８１ｃレベルを利用して行うことができる。判定ステップは、決定された被験者のｍｉＲ−１８１ｃレベルを、陰性比較対象のｍｉＲ−１８１ｃレベルと比較することにより行うことができる。被験者由来の検体におけるｍｉＲ−１８１ｃレベルが、陰性比較対象由来の検体におけるｍｉＲ−１８１ｃレベルよりも高い場合には、ｍｉＲ−１８１ｃレベルが高く、脳転移を有する（又は、脳転移が生じるリスクが高い）と判定することができる。また、被験者由来の検体におけるｍｉＲ−１８１ｃレベルが、陰性比較対象由来の検体におけるｍｉＲ−１８１ｃレベルと比較して高くない（即ち、同等か低い）場合には、ｍｉＲ−１８１ｃレベルが高くなく、脳転移が無い（又は、脳転移が生じるリスクが低い）と判定することができる。
【００６９】
本明細書において「陰性比較対象」とは、健常人又は脳転移を有さない癌患者（例えば、ステージ１及び／又はステージ２の癌患者、及び／あるいは、ステージ３及び／又はステージ４の癌患者で脳転移を有さない癌患者）を意味する。「陰性比較対象のｍｉＲ−１８１ｃレベル」は、このような陰性比較対象におけるｍｉＲ−１８１ｃレベルを上述の方法に従って測定することにより得ることができる。あるいは、既にこのような陰性比較対象について測定したｍｉＲ−１８１ｃレベルに関する情報があれば、そのようなレベルを「陰性比較対象」のｍｉＲ−１８１ｃレベルとして利用することもできる。また、「陰性比較対象」のｍｉＲ−１８１ｃレベルと同量のｍｉＲ−１８１ｃを含有する標準比較検体を被検癌患者由来の検体と同時に測定してもよい。
【００７０】
本明細書全体に亘って、検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルが、比較対象となる検体におけるｍｉＲ−１８１ｃレベルより高いか否かは、統計的分析により決定することができる。統計学的有意性は、２以上の検体を比較し、信頼区間及び／又はｐ値を決定することにより決定される（Ｄｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｅｌｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｄ、１９８３）。本発明の信頼区間は、例えば、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は９９．９９％であってもよい。また、本発明のｐ値は、例えば、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００２又は０．０００１であってもよい。
【００７１】
本明細書全体に亘って、「診断方法」及び「リスク判定方法」は、そのように解することが不整合である場合を除き、脳転移又は脳転移が生じるリスクの状態又は変化をモニターする方法を含む。よって、本明細書において、「診断」又は「リスク評価」の語は、特にそのように解することが不整合である場合を除き、脳転移又は脳転移が生じるリスクの状態又は変化をモニターすることと解釈しても良い。また、本明細書における診断方法及びリスク評価方法がモニターする方法である場合、当該診断又はリスク評価は、連続的又は断続的に行われても良い。また、本発明の診断方法及びリスク判定方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれで行われるものであってもよいが、好ましくは、ｅｘ  ｖｉｖｏ、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。
【００７２】
本明細書において「検体」は、利用目的に応じて適宜選択することができる。例えば、検体は、細胞培養上清、細胞溶解物、生検として被験者から採取した組織試料または被験者から採取した液体であってもよい。例えば、検体としては、組織、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、便、漿液、髄液、脳脊髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができる。好ましくは、検体は、血液、血漿、血清、リンパ液である。
【００７３】
脳転移のリスク評価は、それにより患者の状態の経過又は転帰を予測する方法を意味し、状態の経過又は転帰を１００％の正確さで予測可能であることを意味するものではない。脳転移が生じるリスクの判定は、ある経過又は転帰が起こるリスクが増大しているか否かを意味するものであり、当該経過又は転帰が起こらない場合を基準として起こりやすいことを意味するものではない。即ち、脳転移が生じるリスクの判定結果は、本発明のｍｉＲ−１８１ｃレベルが上昇している患者において、そのような特徴を示さない患者に比較して、脳転移の経過又は転帰がより生じやすいということを意味する。
【００７４】
本明細書の診断方法及びリスク評価方法において、「被検癌患者」とは、上述の癌患者であれば特に限定されない。上述のとおり、脳転移の診断方法の場合、脳転移は主に癌の後期ステージで生じることから、好ましくは、ステージＩＶの癌患者、遠隔臓器への転移がある患者、又は血中への癌細胞の浸潤がある患者である。一方、脳転移のリスク判定方法の場合、脳転移のリスクが高い状態であっても、転移そのものはまだ発生していない可能性が高いステージＩ〜ＩＩＩの患者、遠隔臓器への転移がない患者、又は血中への癌細胞の浸潤がない患者を対象とすることが好ましい。また、被検癌患者として好ましくは、乳癌患者である。
【００７５】
２．癌患者の脳転移の治療又は予防方法
本発明者らが見出した癌転移メカニズムによれば、癌細胞から分泌されるＥＶｓ（エキソソームを含む）に含まれるｍｉＲ−１８１ｃが脳転移に寄与していることから、別の態様において、本発明は、癌患者の脳転移を治療又は予防する方法であって、前記癌患者におけるｍｉＲ−１８１ｃの発現又は活性を阻害することを備える方法に関する。本方法において、ｍｉＲ−１８１ｃの発現又は活性の阻害は、ｍｉＲ−１８１ｃの発現抑制剤又は活性阻害剤を、それを必要とする患者に投与することにより行うことができる。よって、ある態様において、本発明は、癌患者の脳転移を治療又は予防する方法であって、前記癌患者にｍｉＲ−１８１ｃの発現抑制剤又は活性阻害剤を投与することを備える方法に関する。
【００７６】
あるいは、ｍｉＲ−１８１ｃの発現又は活性の阻害は、ｍｉＲ−１８１ｃを含むＥＶｓの分泌を阻害することにより、間接的に達成することができる。よって、一態様において本発明は、癌患者の脳転移を治療又は予防する方法であって、前記癌患者におけるｍｉＲ−１８１ｃを含有するＥＶｓの分泌を阻害することを備える方法に関する。ＥＶｓの分泌阻害は、例えば、ＥＶｓの分泌に必須のタンパク質（ｎＳＭａｓｅ２及びＲＡＢ２７Ｂ）の発現又は活性を阻害することにより達成することができる。よって、別の態様において、本発明は、癌患者の脳転移を治療又は予防する方法であって、前記癌患者にエキソーム分泌阻害剤を投与することを備える方法に関する。具体的な態様としては、本発明は、癌患者の脳転移を治療又は予防する方法であって、前記癌患者にｎＳＭａｓｅ２の発現抑制剤若しくは活性阻害剤、及び／又は、ＲＡＢ２７Ｂの発現抑制剤若しくは活性阻害剤を投与することを備える方法に関する。
【００７７】
医薬組成物（脳転移の治療薬若しくは予防薬）の投与は、局所的であってもよく、全身的であってもよい。投与方法には特に制限はなく、上述のとおり非経口的又は経口的に投与される。非経口的投与経路としては、皮下、腹腔内、血中（静脈内、若しくは動脈内）又は脊髄液への注射又は点滴等が挙げられ、好ましくは血中への投与である。また、医薬組成物（治療薬若しくは予防薬）は、一時的に投与してもよいし、持続的又は断続的に投与してもよい。例えば、投与は、１分間〜２週間の持続投与することもできる。
【００７８】
医薬組成物（脳転移の治療薬若しくは予防薬）の投与量は、所望の治療効果又は予防効果が得られる投与量であれば特に限定は無く、癌のステージ、脳転移の有無、症状、性別、年齢等により適宜決定することができる。本発明の医薬組成物の投与量は、例えば、脳転移の治療効果又は予防効果を指標として決定することができる。例えば、医薬組成物の有効成分の１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１月１〜１０回程度、好ましくは１月１〜５回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量または投与回数を増加させてもよい。
【００７９】
３．血液脳関門の透過性を亢進させる方法、及び、所望の活性成分を血液脳関門を通過させて脳内に到達させる方法
本発明者らは、ＰＤＰＫ１の発現又は活性が低下することにより血液脳関門の透過性が向上することを見出した。よって、別の態様において、本発明は、血液脳関門の透過性を亢進させる方法であって、血管内皮細胞におけるＰＤＰＫ１の発現又は活性を阻害することを備える方法に関する。更に別の態様において本発明は、所望の活性成分を血液脳関門を通過させて脳内に到達させる方法であって、前記所望の活性成分をＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤と共に投与することを備える方法に関する。
【００８０】
例えば、本発明の血液脳関門の透過性を亢進させる方法は、以下の方法を含む：患者の血液脳関門の透過性を亢進させる方法であって、該患者の脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣｓ）におけるＰＤＰＫ１の発現を抑制し、又は活性を阻害することを備える方法。ＰＤＰＫ１の発現の抑制、又は活性の阻害はＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤により達成することができる。よって、別の態様において、本発明は、患者の血液脳関門の透過性を亢進させる方法であって、ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤を投与することを備える方法に関する。
【００８１】
所望の活性成分を血液脳関門を通過させて脳内に到達させる方法は、以下の方法を含む：所望の活性成分を患者の血液脳関門を通過させて脳内に到達させる方法であって、該患者の脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣｓ）におけるＰＤＰＫ１の発現を抑制し、又は活性を阻害すること、及び、該患者に前記所望の活性成分を投与することを備える方法。本方法において、ＰＤＰＫ１の発現又は活性の阻害は、ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤をそれを必要とする患者に投与することにより行うことができる。例えば、ＰＤＰＫ１の発現の阻害は、ｍｉＲ−１８１ｃ又はｍｉＲ−１８１ｃを含むＥＶｓを投与することにより達成することができる。よって、別の態様において、本発明は、所望の活性成分を患者の血液脳関門を通過させて脳内に到達させる方法であって、前記所望の活性成分とＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤とを投与することを備える方法に関数する。あるいは、本発明は、所望の活性成分を患者の血液脳関門を通過させて脳内に到達させる方法であって、該患者にＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤を投与することにより、該患者の血液脳関門の透過性を高めること、及び、血液脳関門の透過性を高まった患者に前記所望の活性成分を投与して、該医薬を血液脳関門を通過させて脳内に到達せしめることを備える方法であってもよい。ここで、前記所望の活性成分は、前記ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤と同時に投与されても良いし、別々に（例えば、前記ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤の投与前又は投与後に）投与されてもよい。
【００８２】
本発明のＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤、あるいは、薬剤送達用組成物の投与は、局所的であってもよく、全身的であってもよい。投与方法には特に制限はなく、上述のとおり非経口的又は経口的に投与される。非経口的投与経路としては、皮下、腹腔内、血中（静脈内、若しくは動脈内）又は脊髄液への注射又は点滴等が挙げられ、好ましくは血中への投与である。また、ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤、あるいは、薬剤送達用組成物は、一時的に投与してもよいし、持続的又は断続的に投与してもよく、例えば、１分間〜２週間の持続投与とすることもできる。また、ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤、あるいは、薬剤送達用組成物は、活性成分と同時に投与してもよいし、別々に投与してもよく、好ましくは、活性成分の投与前又は活性成分と同時に投与される。
【００８３】
ＰＤＰＫ１の発現抑制剤又は活性阻害剤、あるいは、薬剤送達用組成物の投与量は、所望の血液脳関門の透過性又は所望の活性成分の脳内送達効果が得られる投与量であれば特に限定は無く、治療又は予防の対象疾患、投与する所望の活性成分の種類、量、及び投与経路、患者の症状、性別、及び年齢等により適宜決定することができる。投与量は、例えば、脳への医薬の送達量やそれによる治療効果又は予防効果を指標として決定することができる。例えば、有効成分の１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１月１〜１０回程度、好ましくは１月１〜５回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量または投与回数を増加させてもよい。
【００８４】
４．脳転移判定装置・脳転移リスク判定装置
（脳転移判定装置）
一態様において、本発明は、ｍｉＲ−１８１ｃレベルを測定することによる脳転移判定装置に関する。図２１に示すように、この実施の形態に係る脳転移判定装置１は、被検癌患者における脳転移を判定する装置である。より具体的には、脳転移判定装置１は、脳転移を有する可能性のある癌患者（通常、ステージＩＶの患者）が脳転移に至っているかを判定する装置である。脳転移判定装置１は、後述する測定部２１、レベル決定部３１および転移判定部３２を備える。この実施の形態では、脳転移判定装置１は、測定部２１を少なくとも備える入力装置２と、レベル決定部３１および転移判定部３２を少なくとも備える情報処理装置３と、出力装置４とを備える。ただし、入力装置２、情報処理装置３および出力装置４は、互いに分離した装置でなくとも良く、これら装置２，３，４の２以上が１つの装置となっていても良い。
【００８５】
入力装置２は、ｍｉＲ−１８１ｃ測定手段として機能する測定部２１を備え、好ましくは、試料入出部２２をも備える。ただし、試料入出部２２は、入力装置２と別体であっても良い。入力装置２は、例えば、中央処理装置（ＣＰＵ）、読み取り専用のメモリ（ＲＯＭ）、読み書き可能なメモリ（ＲＡＭ）およびハードディスクドライブ（ＨＤＤ）を備えるコンピュータ、あるいはそのコンピュータを含む装置である。測定部２１の処理は、主として、ＣＰＵがＨＤＤ内のコンピュータプログラムを読み出すことにより実行される。なお、当該コンピュータプログラムは、ＨＤＤに格納されるものではなく、例えば、ＲＡＭあるいはＲＯＭに格納されるものでも良い。
【００８６】
測定部２１は、検体２３を用いてｍｉＲ−１８１ｃの塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドを測定するｍｉＲ−１８１ｃ測定手段として機能する構成部である。試料入出部２２は、好ましくは、検体２３と試薬２４とを含む試料２５を保持する試料保持部２６と、試料２５に励起光を照射する発光部２７と、励起光を照射された試料２５から発する蛍光２８を検知する光検知部２９と、を備える。ただし、外部から励起光を照射することなく、試料２５自体が発光可能な場合には、試料入出部２２に発光部２７を備えていなくても良く、光検地部２９は蛍光ではなく発光を検出する。
【００８７】
情報処理装置３は、レベル決定部３１と、転移判定部３２と、を少なくとも備える。情報処理装置３は、好適には、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭおよびＨＤＤを備えるコンピュータである。レベル判定部３１および転移判定部３２の両処理は、主として、ＣＰＵがＨＤＤ内のコンピュータプログラムを読み出すことにより実行される。なお、当該コンピュータプログラムは、ＨＤＤに格納されるものではなく、例えば、ＲＡＭあるいはＲＯＭに格納されるものでも良い。また、入力装置２および情報処理装置３は、共通のＣＰＵ、共通のＲＯＭ、共通のＲＡＭあるいは共通のＨＤＤを備えていても良い。その場合、コンピュータプログラムは、入力装置２および情報処理装置３に共通のＨＤＤ、ＲＡＭあるいはＲＯＭに格納されていても良い。
【００８８】
レベル決定部３１は、入力装置２の測定部２１から電気信号を受け取って、測定された検体２３中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定するｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手段として機能する構成部である。転移判定部３２は、レベル決定部３１にて決定されたｍｉＲ−１８１ｃレベルから被検癌患者における脳転移を判定する転移判定手段として機能する構成部である。転移判定部３２は、被検癌患者から得られた検体を検体２３として用いて、当該検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルが陰性比較対象由来である検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルと比較して高い場合に、被検癌患者が脳転移を有すると判定する。レベル決定部３１による決定は、好ましくは、ＣＰＵがＨＤＤあるいはＲＡＭなどのメモリに予め格納された情報（一例として、検量線データ）を読み出して、その情報を参照することによって行われる。ただし、その情報は、予めメモリに格納されたものではなく、予め濃度の判明しているコントロール検体（例えば、段階希釈系列の検体）を検体２３として用いてｍｉＲ−１８１ｃの塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドを測定しながら逐次蓄積されたものであっても良い。転移判定部３２による判定は、好ましくは、ＣＰＵがＨＤＤあるいはＲＡＭなどのメモリに予め格納された情報（すなわち、陰性比較対象由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルの情報）を読み出して、その情報を参照することによって行われる。ただし、その情報は、予めメモリに格納されたものではなく、陰性比較対象由来の検体を検体２３として用いて、当該検体中のｍｉＲ−１８１ｃの塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドを測定しながら逐次蓄積されたものであっても良い。
【００８９】
出力装置４は、転移判定部３２の判定結果を出力する装置であり、例えば、静止画像あるいは動画を出力するモニタである。出力装置４は、入力装置２あるいは情報処理装置３と同様、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭおよびＨＤＤを備えるコンピュータ、あるいはそのコンピュータを含む装置であっても良い。その場合、コンピュータプログラムは、入力装置２と情報処理装置３と出力装置４に共通、入力装置２と出力装置４に共通、あるいは情報処理装置３と出力装置４に共通するＨＤＤ、ＲＡＭ若しくはＲＯＭに格納されていても良い。
【００９０】
出力装置４は、モニタに限定されず、判定結果を音声にて出力するスピーカ、紙などの媒体に印字して出力するプリンタ、あるいは発光の形態で出力する発光装置などの如何なる出力形態を有する装置であっても良い。
【００９１】
（脳転移リスク判定装置）
別の態様において、本発明は、ｍｉＲ−１８１ｃレベルを測定することによる脳転移リスク判定装置に関する。図２２に示すように、この実施の形態に係る脳転移リスク判定装置１ａは、被検癌患者であって未だ脳転移に至っていない患者（通常、ステージＩ、ＩＩまたはＩＩＩの患者）が脳転移に至るリスクを判定する装置である。脳転移リスク判定装置１ａは、測定部２１、レベル決定部３１および後述のリスク判定部３３を備える。この実施の形態では、脳転移リスク判定装置１ａは、先に説明した脳転移判定装置１と類似の構成を有し、入力装置２と、情報処理装置３と、出力装置４とを備える。ただし、脳転移リスク判定装置１ａは、脳転移判定装置１と同様、入力装置２、情報処理装置３および出力装置４に分離された形態の装置でなくとも良い。入力装置２、情報処理装置３および出力装置４の内の２以上を１つの装置としていても良い。
【００９２】
脳転移リスク判定装置１ａは、脳転移判定装置１の転移判定部３２に代えて、リスク判定部３３を備える。脳転移リスク判定装置１ａのその他の構成は、脳転移判定装置１の転移判定部３２以外の構成と共通するので、重複した説明を省略する。
【００９３】
リスク判定部３３は、レベル決定部３１にて決定されたｍｉＲ−１８１ｃレベルから被検癌患者における脳転移が生じるリスクを判定するリスク判定手段として機能する構成部である。リスク判定部３３は、被検癌患者由来の検体２３中のｍｉＲ−１８１ｃレベルが陰性比較対象由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルと比較して高い場合に、被検癌患者が脳転移が生じるリスクが高いと判定する。リスク判定部３３による判定は、好ましくは、ＣＰＵがＨＤＤあるいはＲＡＭなどのメモリに予め格納された情報（すなわち、陰性比較対象由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルの情報）を読み出して、その情報を参照することによって行われる。ただし、その情報は、予めメモリに格納されたものではなく、陰性比較対象由来の検体を検体２３として用いて、当該検体中のｍｉＲ−１８１ｃの塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドを測定しながら逐次蓄積されたものであっても良い。
【００９４】
５．脳転移判定用又は脳転移リスク判定用コンピュータプログラム
一態様において、本発明は、上述の脳転移判定装置又は脳転移リスク判定装置において利用されるコンピュータプログラムに関する。
【００９５】
（脳転移判定装置用のコンピュータプログラム）
この実施の形態に係るコンピュータプログラムは、被検癌患者における脳転移を診断するための情報を提供する装置、すなわち、上述の脳転移判定装置１にインストールされるコンピュータプログラムである。当該コンピュータプログラムは、被検癌患者由来の検体２３を用いてｍｉＲ−１８１ｃの塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドを測定するｍｉＲ−１８１ｃ測定手順と、そのｍｉＲ−１８１ｃ測定手順にて測定された検体２３中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定するｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手順と、そのｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手順にて決定されたｍｉＲ−１８１ｃレベルから被検癌患者における脳転移を判定する転移判定手順と、その転移判定手順による判定結果を出力する判定結果出力手順と、を癌患者の脳転移診断装置である脳転移判定装置１に実行させ、転移判定手順により、被検癌患者由来の検体２３中のｍｉＲ−１８１ｃレベルが陰性比較対象由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルと比較して高い場合には、被検癌患者が脳転移を有すると判断される。
【００９６】
上述のｍｉＲ−１８１ｃ測定手順は、脳転移判定装置１の測定部２１により実行される。ｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手順は、脳転移判定装置１のレベル決定部３１により実行される。転移判定手順は、脳転移判定装置１の転移判定部３２により実行される。判定結果出力手順は、出力装置４により実行される。これらの各手順は、例えば、ＣＰＵがＨＤＤ内に格納されたコンピュータプログラムを読み込んで実行される。なお、このコンピュータプログラムは、ＣＰＵの処理によって読み込まれることによって、ｍｉＲ−１８１ｃ測定手順、ｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手順および転移判定手順を行うプログラムであって、その後の判定結果出力手順を行わないものでも良い。
【００９７】
このコンピュータプログラムは、単独では空間を占有できないものであるが、情報記録媒体に格納することによって市場に流通することができる。ここで、「情報記録媒体」とは、例えば、フレキシブルディスク、ハードディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＭＯ（光磁気ディスク）、ＭＤ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＷ、フラッシュメモリ、ＩＣカードなどである。これら情報記録媒体を脳転移判定装置１のデータ入出力部（不図示）に接続して、コンピュータプログラムを脳転移判定装置１内のＨＤＤ等のメモリにインストールすることができる。また、このコンピュータプログラムを格納した別のコンピュータから、通信回線を通じて脳転移判定装置１へ当該コンピュータプログラムを伝送して、その内部のＨＤＤ等のメモリにインストールすることも可能である。
【００９８】
図２３は、脳転移判定装置用のコンピュータプログラムを実行したときの脳転移判定装置の行う処理のフローを示す。脳転移判定装置１のＣＰＵは、同装置１のＨＤＤ等のメモリ内に格納された脳転移判定装置用のコンピュータプログラムを読み込んで、被検がん患者由来の検体２３を用いてｍｉＲ−１８１ｃの塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドを測定する（ステップ１０１：ｍｉＲ−１８１ｃ測定手順）。次に、上記ＣＰＵは、上記コンピュータプログラムを読み込み、測定された検体２３中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定する（ステップ１０２：ｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手順）。次に、上記ＣＰＵは、上記コンピュータプログラムを読み込み、ｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手順にて決定されたｍｉＲ−１８１ｃレベルから被検がん患者における脳転移の有無を判定する（ステップ１０３：転移判定手順）。次に、上記ＣＰＵは、上記コンピュータプログラムを読み込み、脳転移が有るとの結果および脳転移が無いとの結果を出力装置４から出力する（ステップ１０４：判定結果出力手順）。
【００９９】
（脳転移リスク判定装置用のコンピュータプログラム）
別の実施の形態に係るコンピュータプログラムは、被検癌患者における脳転移が生じるリスクを判定する装置、すなわち、上述の脳転移リスク判定装置１ａにインストールされるコンピュータプログラムである。当該コンピュータプログラムは、被検癌患者由来の検体２３を用いてｍｉＲ−１８１ｃの塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドを測定するｍｉＲ−１８１ｃ測定手順と、そのｍｉＲ−１８１ｃ測定手順にて測定された検体２３中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定するｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手順と、そのｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手順にて決定されたｍｉＲ−１８１ｃレベルから被検癌患者における脳転移が生じるリスクを判定するリスク判定手順と、そのリスク判定手順による判定結果を出力する判定結果出力手順と、を癌患者の脳転移診断装置である脳転移リスク判定装置１ａに実行させ、リスク判定手順により、被検癌患者由来の検体２３中のｍｉＲ−１８１ｃレベルが陰性比較対象由来の検体中のｍｉＲ−１８１ｃレベルと比較して高い場合には、被検癌患者は脳転移が生じるリスクが高いと判断される。
【０１００】
上述のリスク判定手順は、脳転移リスク判定装置１ａのリスク判定部３３により実行される。ｍｉＲ−１８１ｃ測定手順、ｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手順および判定結果出力手順は、先に説明した脳転移判定装置用のコンピュータプログラムと同様、それぞれ、測定部２１、レベル決定部３１および出力装置４により実行される。これらの各手順は、例えば、ＣＰＵがＨＤＤ内に格納されたコンピュータプログラムを読み込んで実行される。なお、このコンピュータプログラムは、ＣＰＵの処理によって読み込まれることによって、ｍｉＲ−１８１ｃ測定手順、ｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手順およびリスク判定手順を行うプログラムであって、その後の判定結果出力手順を行わないものでも良い。
【０１０１】
このコンピュータプログラムも、先に例示した情報記録媒体に格納することができる。これら情報記録媒体を脳転移リスク判定装置１ａのデータ入出力部（不図示）に接続して、コンピュータプログラムを脳転移リスク判定装置１ａ内のＨＤＤ等のメモリにインストールすることができる。また、このコンピュータプログラムを格納した別のコンピュータから、通信回線を通じて脳転移リスク判定装置１ａへ当該コンピュータプログラムを伝送して、その内部のＨＤＤ等のメモリにインストールすることも可能である。
【０１０２】
図２４は、脳転移リスク判定装置用のコンピュータプログラムを実行したときの脳転移リスク判定装置の行う処理のフローを示す。脳転移リスク判定装置１ａのＣＰＵは、同装置１ａのＨＤＤ等のメモリ内に格納された脳転移リスク判定装置用のコンピュータプログラムを読み込んで、被検がん患者由来の検体２３を用いてｍｉＲ−１８１ｃの塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドを測定する（ステップ２０１：ｍｉＲ−１８１ｃ測定手順）。次に、上記ＣＰＵは、上記コンピュータプログラムを読み込み、測定された検体２３中のｍｉＲ−１８１ｃレベルを決定する（ステップ２０２：ｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手順）。次に、上記ＣＰＵは、上記コンピュータプログラムを読み込み、ｍｉＲ−１８１ｃレベル決定手順にて決定されたｍｉＲ−１８１ｃレベルから被検がん患者における脳転移のリスクの高低を判定する（ステップ２０３：リスク判定手順）。次に、上記ＣＰＵは、上記コンピュータプログラムを読み込み、脳転移のリスクが高いとの結果および脳転移のリスクが低いとの結果を出力装置４から出力する（ステップ２０４：判定結果出力手順）。
【０１０３】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【実施例】
【０１０４】
以下の実施例に記載された実験において、全ての動物を用いた実験は、独立行政法人国立がん研究センター動物実験倫理委員会の承認を得たプロトコルに従って行った。以下に記載された実験において、数値は全て平均値±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）で表す。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定又はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定において、Ｐ値が０．０５未満の場合を統計的有意とした。
【０１０５】
（細胞培養）
本実施例記載の実験において、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞の培養は、１０％熱不活化ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び抗菌−抗真菌剤含有ＲＰＭＩ  １６４０倍地中、３７℃、５％ＣＯ２環境下で行った。
【０１０６】
（実施例１）脳転移乳癌細胞株の樹立
腫瘍形成能及び転移能が高いヒト乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞（以下、「Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞」という）（Ｂｏｓ、Ｐ．Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４５９：１００５−１００９（２００９））を用いて、新たに脳高転移細胞株を作製した（図１ａ）。具体的には、２×１０５個のＤ３Ｈ２ＬＮ細胞を含む細胞懸濁液１００μＬを、７週令のメス免疫不全マウスであるＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスの左心室に心臓内注射で投与した。脳転移による腫瘍形成は、毎週、ルシフェリンを腹腔内注射して、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ、米国）を用いて、生物発光ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを行うことにより観察した。２６〜３０日後、癌細胞の脳への転移が観察された（図１ｂ）。
【０１０７】
脳転移部位は、解剖後に組織分析を行うことにより確認した。組織の半分を４％パラフォルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色によって組織分析することにより、脳組織の癌細胞コロニー形成を確認した（図１ｃ）。
【０１０８】
脳転移癌細胞を回収し、培養するため組織の残りの半分は磨り潰して、抗菌−抗真菌剤及び１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に加えた。細胞は、短時間遠心分離した後、０．０２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁させ、３７℃で１０分間インキュベートした。細胞を５０μｇ／ｍＬ  Ｚｅｏｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）含有培地に再懸濁させた後、１０ｃｍディッシュに播種して、コンフルエントになるまで約３０日間培養して増殖させた。
【０１０９】
増殖させた細胞集団（脳転移誘導体１ａ、以下、「ＢＭＤ１ａ細胞」という）を用いて、上述と同じ方法により２回目のｉｎ  ｖｉｖｏ選択を行い、２種類の脳転移誘導体細胞集団２ａ及び２ｂ（以下、それぞれ、「ＢＭＤ２ａ細胞」及び「ＢＭＤ２ｂ細胞」という）を得た。
【０１１０】
得られたＢＭＤ２ａ細胞及びＢＭＤ２ｂ細胞をＤ３Ｈ２ＬＮ細胞と同様にマウスに投与して脳転移活性を調べた。その結果、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞を左心室に注入すると１５匹中１匹（６．７％）のマウスのみにおいて脳への転移が認められたのに対し、ＢＭＤ１ａ細胞を左心室に注入すると、６０％（５匹中３匹）のマウスにおいて脳へ転移していた。よって、ＢＭＤ２ａ細胞及びＢＭＤ２ｂ細胞は、親細胞であるＤ３Ｈ２ＬＮ細胞よりも脳転移
活性が顕著に増加していることが示された。
【０１１１】
（実施例２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液脳関門（ＢＢＢ）モデルの構築
（１）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液脳関門モデル
ＢＢＢへの影響を簡便に測定するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＢＢＢ培養システムを構築した。従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液脳関門モデルは単層の細胞培養系を用いている（Ｚｈｏｕ、Ｗ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２８８：１０８４９−１０８５９）。しかし、ＢＢＢは異なる三種類の細胞から構成されており、これらの細胞が互いに協調してＢＢＢの構造を維持している。そこで、脳毛細血管内皮細胞、脳周皮細胞、及び星状膠細胞の初代培養からなるＢＢＢモデル系であるＢＢＢキット（ＴＭ）（＃ＭＴＢ−２４Ｈ、ファーマコセル株式会社、長崎、日本）を用いた（図２ａ）。脳毛細血管内皮細胞、脳周皮細胞、及び星状膠細胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色により確認した。その結果、図２ｂに示すとおり、構築したｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液脳関門モデルにおいて、脳毛細血管内皮細胞、脳周皮細胞、及び星状膠細胞が存在することが確認された。
【０１１２】
（２）内皮細胞中の密着結合タンパク質等の局在の確認
密着結合はＢＢＢの透過性低下を調節しており、内皮細胞内の特定のタンパク質（クローディン−５、オクルジン、及びＺＯ−１など）により構成されていることが知られている。一方で、カルシウム依存性細胞間接着糖タンパク質であり、５つの細胞外カドヘリンリピートを有することにより強力な細胞間接着を媒介するＮ−カドヘリンは、頂端膜及び基底膜に最も発現している。密着結合タンパク質及びＮ−カドヘリンはアクチン細胞骨格ネットワークとの密接な結合を介して細胞の極性を制御している。そこで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルの内皮細胞中のクローディン−５、オクルジン、ＺＯ−１又はＮ−カドヘリンを免疫蛍光染色して局在を確かめることにより、密着結合（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）形成、及び接着結合（ａｄｈｅｒｅｎｓ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を確認した。
【０１１３】
具体的には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルから採取した内皮細胞は、室温で１０分間、３％ＰＦＡ含有ＰＢＳにより固定させ、Ｍｇ２＋及びＣａ２＋含有ＰＢＳで洗浄した後、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有ＰＢＳで１０分間処理して細胞を透過性にした。固定後、細胞を３％ＢＳＡ含有ＰＢＳと共に１時間インキュベートして抗体の非特異的結合をブロックした。その後、内皮細胞を、クラウジン−５（Ｚ４３．ＪＫ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、米国）、オクルジン（ＺＭＤ．４６７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＺＯ−１（ＺＭＤ．４３７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、又はＮ−カドヘリン（３Ｂ９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対するウサギポリクローナル抗体と共に３７℃で１時間インキュベートした。Ｍｇ２＋及びＣａ２＋含有ＰＢＳで洗浄した後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４−融合抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。アクチンは、ＡｃｔｉｎＧｒｅｅｎＴＭ４８８  ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓＴＮ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒ３７１１０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。染色された細胞は、Ｍｇ２＋及びＣａ２＋非含有ＰＢＳで洗浄した後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｈ−１２００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ、米国）にマウントして、共焦点顕微鏡（ＦｌｕｏＶｉｅｗＦＶ１０００、オリンパス、東京、日本）で観察した。
【０１１４】
また、図２ｃに示すとおり、密着結合タンパク質（クローディン−５、オクルジン、及びＺＯ−１）及びＮ−カドヘリンは、いずれも細胞膜表面に結合し、細胞間の密着結合及び接着結合を構成していることが示された。
【０１１５】
（３）経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定
脳毛細血管内皮細胞による密着結合の形成を、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）（Ｇａｉｌｌａｒｄ、Ｐ．Ｊ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１２：２１５−２２２（２００１）；Ｗｉｌｈｅｌｍ、Ｉ．ら、Ａｃｔａ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｅｘｐ．（Ｗａｒｓ）、７１：１１３−１２８（２０１１））により測定した。抵抗値（Ω）はｏｈｍｍｅｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ  ＥＲＳ−２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により測定した。経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）は以下の計算式により単位面積当たりの抵抗として算出した。Ｒ＝（Ａ−Ｂ）×０．３３ｃｍ２（式中、ＲはＴＥＥＲ（Ω・ｃｍ２）、Ａは測定された抵抗値（Ω）、Ｂはブランクの抵抗値（Ω）を示す）。ｎ＝１２とした。
【０１１６】
脳毛細血管内皮細胞による密着結合の形成を、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）により測定した結果を図２ｄに示す。経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）は１５０超であったことから、このシステムがｉｎ  ｖｉｔｒｏＢＢＢモデルとして利用可能であることが確認された。
【０１１７】
（４）透過性評価（Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ）
ＮａＦは分子量が低い（分子量：３７６．２７）にもかかわらず、ＢＢＢを通過しない（Ｎａｋａｇａｗａ、Ｓら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．５４：２５３−２６３（２００９））。よって、ＮａＦの濃度を蛍光単色光分光器で測定することにより、ＢＢＢの透過性を測定した。具体的には、透過性評価は、既に報告された方法（Ｂ．  Ｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、  Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  １２、  ４１３９−４１４２  （２００１））を改変して行った。チャンバーの上面側に２００μＬのＮａＦ（１０μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、チャンバーの下面側に９００μＬのＤＰＢＳ−Ｈ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、及び４．５ｍｇ／ｍＬ  Ｄ−グルコース含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（Ｍｇ＋、Ｃａ＋））を添加した。プレートを３７℃で振盪培養した。３０分後、チャンバー下面側のＤＰＢＳ−Ｈを黒色プレート内に分注し（ｎ＝８）、ｍｕｌｔｉ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｅｔｅｒ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（４８５／５３５ｎｍ、ＳＡＦＩＲＥ、Ｔｅｃａｎ）で測定した。見かけの透過性係数（Ｐａｐｐ）は次の計算式で算出した：
Ｐａｐｐ＝（ＶＡ×［Ｃ］Ａ）×Ａ−１×［Ｃ］Ｌｕｍｉｎａｌ−１×ｔ−１
式中の略号は以下を表す：
ＶＡ：チャンバーの反管腔側における容積（０．９ｃｍ３）
Ａ：膜表面面積（０．３３ｃｍ２）
［Ｃ］Ｌｕｍｉｎａｌ：初期管腔内トレーサー濃度（μｇ／ｍＬ）
［Ｃ］Ａ：反管腔側トレーサー濃度（μｇ／ｍＬ）
ｔ：実験時間（分）
【０１１８】
上記の方法により、透過性試験を行った結果、ＮａＦの透過性は極めて低いことが示された。
【０１１９】
（実施例３）マトリゲル（商標）を用いた脳転移癌細胞の浸潤能の検討
脳転移癌細胞は非常に侵襲的であると考えられる。そこで、マトリゲル（商標）を用いた浸潤チャンバーアッセイを用いて、樹立した細胞株の転移能に関する病理学的な意義を確認した。ＢＭＤ２ａ細胞、ＢＭＤ２ｂ細胞、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、及びＤ３Ｈ１細胞をトリプシン処理し、ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識化した。２×１０４細胞の各癌細胞を、血清非含有ＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁させ、マトリゲル（登録商標）コーティング膜を有するチャンバー（２４穴インサート、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪ、米国）の上面側に添加した。チャンバーの下面側には、遊走因子として１０％血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。細胞を２４時間培養し、膜孔を通過又は侵入しなかった細胞を綿棒で除去した。膜の下面上の細胞をＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｅｔ（Ｓｙｓｍｅｘ、兵庫、日本）を用いて染色し、計数した。全てのアッセイをトリプリケートで行った。データは、製造者の説明書に従い、コントロール膜を通過した細胞に対する、マトリゲル（商標）マトリックス及び膜を通過した細胞のパーセントで表示した。
【０１２０】
ＢＭＤ２ａ細胞及びＢＭＤ２ｂ細胞は、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、及びより転移能の低いＤ３Ｈ１細胞と比較して高い浸潤能を示した（図３ａ及び図３ｂ）。しかし、ＢＭＤ２ａ細胞及びＢＭＤ２ｂ細胞の形態はＤ３Ｈ２ＬＮ細胞とは異ならなかった（図３ｃ）。
【０１２１】
（実施例４）ＢＢＢモデルを用いた脳転移癌細胞の浸潤能の検討
ＢＭＤ２ａ細胞及びＢＭＤ２ｂ細胞の脳実質細胞側への進入を確認するため、ＢＭＤ２ａ細胞、ＢＭＤ２ｂ細胞、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、及びＤ３Ｈ１細胞をトリプシン処理し、ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識化した。その後、各２×１０４個の癌細胞を無血清のＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地（Ｇｉｂｃｏ）中に懸濁させて、実施例２で作製したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルの上側チャンバーに添加して培養した。２日（４８時間）後、非浸潤細胞を綿棒で除去し、核をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所、熊本、日本）で染色した。その後、下面側に通過した浸潤細胞のＰＫＨ２６を蛍光顕微鏡を用いて計数した（図４ａ）。全ての細胞について、トリプリケートで実験を行った。
【０１２２】
ＢＭＤ２ａ細胞及びＢＭＤ２ｂ細胞は、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、及びＤ３Ｈ１細胞と比較して高い浸潤能を示した（図４ｂ）。よって、樹立されたＢＭＤ２ａ細胞及びＢＭＤ２ｂ細胞はＢＢＢを通過して脳実質細胞側へ進入する能力が高いことが確認された。
【０１２３】
（実施例５）ＥＶｓの調製
Ｄ３Ｈ１細胞、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞を、抗菌−抗真菌剤及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン含有Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ培地（以下、「培地Ａ」という）で３回洗浄した。洗浄後の細胞に新鮮な培地Ａを加えて２日間培養後、培地を回収して４℃、２０００×ｇで１０分間遠心分離した。細胞破片を完全に除去するため、培養上清を０．２２μｍ  Ｓｔｅｒｉｃｕｐ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ、米国）フィルターでろ過した。得られた調整培地を、４℃、１１０、０００×ｇで７０分間超遠心にかけた。得られたペレットを１１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中に懸濁させた。
【０１２４】
ＥＶｓを含むフラクションについて、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡプロテインアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、米国）を用いてタンパク質含有について測定した。また、位相差顕微鏡観察により、得られたＥＶｓを観察した。更に、ＥＶｓのサイズ及び数をＮａｎｏＳｉｇｈｔを用いて測定した。
【０１２５】
また、標準的なエキソソームのマーカーであるＣＤ６３及びＣＤ９の発現、並びに、ＥＶｓでは欠落していることが知られているミトコンドリア膜間タンパク質チトクロムＣの発現をウェスタンブロッティングにより測定した。Ｍ−ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ．米国）を用いて、Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）  ＴＧＸ  Ｇｅｌ（４−１２％）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に各細胞から得られたサンプルを５００ｎｇ／レーン（ＣＤ６３及びＣＤ９）又は３μｇ／レーン（チトクロムＣ）でロードしてタンパク質を分離した後、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気泳動転写した。得られた膜は、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ、京都、日本）中でブロッキングした後、抗ＣＤ６３抗体（精製マウス抗ヒトＣＤ６３抗体、Ｈ５Ｃ６、１／２００、ＢＤ）、抗ＣＤ９抗体（ＡＬＢ６、ｓｃ−５９１４０、１／２００、ＢＤ）、又は抗チトクロムＣ抗体（精製マウス抗チトクロムＣ、７Ｈ８．２Ｃ１２、１／２００、ＢＤ）である第一抗体と共に室温で１時間インキュベートした。第二抗体であるＨＲＰ−結合抗マウスＩｇＧ抗体（ＮＡ９３１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又はＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（ＮＡ９３４、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１／２０００倍希釈で用いた。その後、膜をＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ（登録商標）  ＬＤ（Ｗａｋｏ、大阪、日本）で発光させた。
【０１２６】
タンパク質含有については、Ｄ３Ｈ１細胞由来ＥＶｓ、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞由来ＥＶｓ、ＢＭＤ２ａ細胞由来ＥＶｓ、ＢＭＤ２ｂ細胞由来ＥＶｓのタンパク質濃度に差はなかった。位相差顕微鏡観察の結果の写真及びＥＶのサイズ分析の結果を図５ａに示す。Ｄ３Ｈ１細胞、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞由来のＥＶｓの平均粒径は、それぞれ、１４９ｎｍ、１５７ｎｍ、１３６ｎｍ、及び１４８ｎｍであった。いずれのＥＶｓにおいても、標準的なエキソソームのマーカーであるＣＤ６３及びＣＤ９を発現していたが、チトクロムＣは発現していなかった（図５ｂ）。更に、ＥＶｓの放出数については、細胞間で違いは見られなかった（図５ｃ）。
【０１２７】
（実施例６）ＥＶｓの分泌と癌細胞の浸潤能との相関の検討
脳転移細胞の侵襲におけるＥＶｓの関与を調べるため、ＥＶの分泌に関与するタンパク質である、ｎＳＭａｓｅ２及びＲＡＢ２７Ｂに対するｓｉＲＮＡ（Ｋｏｓａｋａ、Ｎ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８８：１０８４９−１０８５９（２０１３）；Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ、Ｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１２：１９−３０（２０１０））でＥＶの分泌が阻害されたＢＭＤ２ａ細胞を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルによる浸潤能評価を行った。
【０１２８】
（１）ｓｉＲＮＡトランスフェクション
ＲＡＢ２７Ｂ  ｓｉＲＮＡ及びｎＳＭａｓｅ２  ｓｉＲＮＡのいずれか、又は両方のｓｉＲＮＡ、あるいは、コントロールｓｉＲＮＡの各２５ｎＭを、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造者のプロトコルに従って、ＰＫＨ２６標識化ＢＭＤ２ａ細胞に導入した。形質転換から２４時間後の細胞をアッセイに使用した。
【０１２９】
（２）ｓｉＲＮＡ導入細胞中のｎＳＭａｓｅ２及びＲＡＢ２７ＢのｍＲＮＡレベルでの発現確認
ＱＩＡｚｏｌ試薬及びｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（共にＱｕｉａｇｅｎ）を用いて、細胞から全ＲＮＡを抽出した。内部標準として、ＲＮＵ６を使用して記述の方法に従って行った（Ｋｏｓａｋａ、Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｔ．Ｍｅｄ．、１８：８８３−８９１（２０１２））。各ｍＲＮＡ及びＲＮＵ６の発現レベルは、９６穴プレート内で、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、７３００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（全て、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、米国）でｑＲＴ−ＰＣＲを行うことにより測定した。全ての反応はトリプリケートで行った。プライマー及びプローブは以下のとおり定義した、ＰＡＢ２７Ｂ（アッセイＩＤ：Ｈｓ０１０７２２０６＿ｍ１）、ｎＳＭａｓｅ２（アッセイＩＤ：Ｈｓ００９２０３５４＿ｍ１）。
【０１３０】
（３）ｓｉＲＮＡ導入細胞中のｎＳＭａｓｅ２のタンパク質レベルでの発現確認
ｓｉＲＮＡ導入細胞中のｎＳＭａｓｅ２のタンパク質レベルでの発現をウェスタンブロッティングにより確認した。Ｍ−ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ．米国）を用いて、Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）  ＴＧＸ  Ｇｅｌ（４−１２％）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に各細胞から得られたサンプルをロードしてタンパク質を分離した後、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気泳動転写した。得られた膜は、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ、京都、日本）中でブロッキングした後、抗ｎＳＭａｓｅ２抗体（Ｈ−１９５、ｓｃ−６７３０５、１／２００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）である第一抗体と共に室温で１時間インキュベートした。第二抗体であるＨＲＰ−結合抗マウスＩｇＧ抗体（ＮＡ９３１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又はＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（ＮＡ９３４、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１／２０００倍希釈で用いた。その後、膜をＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ（登録商標）  ＬＤ（Ｗａｋｏ、大阪、日本）で発光させた。
【０１３１】
（４）ｓｉＲＮＡ導入細胞よるＥＶｓ放出数測定
ｓｉＲＮＡ導入細胞よるＥＶｓ放出数をＮａｎｏＳｉｇｈｔを用いて測定した。
【０１３２】
（５）ＢＢＢモデルを用いた脳転移癌細胞の浸潤能の検討
作製した形質転換細胞のマトリゲル侵襲能及びＢＢＢ通過を、それぞれ、実施例３及び実施例４記載の方法に従って調べた。
【０１３３】
（６）結果
ｎＳＭａｓｅ２  ｓｉＲＮＡ及びＲＡＢ２７Ｂ  ｓｉＲＮＡのいずれかを導入した細胞、及びそれらのｓｉＲＮＡの両方を導入した細胞では、コントロールｓｉＲＮＡ導入細胞と比較して、ｎＳＭａｓｅ２及びＲＡＢ２７Ｂの発現量がｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベル共に低下していた（非図示）。ｓｉＲＮＡ導入細胞よるＥＶｓ放出数を測定した結果、ｎＳＭａｓｅ２  ｓｉＲＮＡ及びＲＡＢ２７Ｂ  ｓｉＲＮＡのいずれかを導入した細胞、及びそれらのｓｉＲＮＡの両方を導入した細胞では、コントロールｓｉＲＮＡ導入細胞と比較して、ＥＶｓの放出数が減少していた（図６ａ）。ＢＢＢ通過能試験の結果、コントロールｓｉＲＮＡで処理した細胞はＢＢＢを通過して下面側に移動したが、ＥＶｓの産生が阻害された細胞は、下面側では確認されなかった（図６ｃ）。一方、マトリゲルを用いた侵襲能アッセイでは、ＥＶｓの分泌阻害は細胞の浸潤能に影響を与えなかった（図６ｂ）。このことから、溢出は細胞の浸潤能のみに依存するものではないことが示唆された。
【０１３４】
（実施例７）ＥＶｓと癌細胞のＢＢＢ浸潤能との相関の検討
ＥＶｓが癌細胞の脳実質細胞側への溢出に関与するか否かを更に調べるため、転移能の低いＤ３Ｈ１細胞が、ＢＭＤ２ａ、ＢＭＤ２ｂ又はＤ３Ｈ２ＬＮ細胞由来のＥＶｓを添加することによりＢＢＢを通過して溢出するか否かについて調べた。
【０１３５】
ＢＭＤ２ａ、ＢＭＤ２ｂ又はＤ３Ｈ２ＬＮ細胞由来のＥＶｓを各ウェルに添加後、２４時間培養した。その後、ＰＫＨ２６標識化Ｄ３Ｈ１細胞を加えた。２日後、フィルターを通過した細胞数を計数した。
【０１３６】
結果を図７に示す。Ｄ３Ｈ１細胞はＥＶｓの添加がない状態ではＢＢＢを通過することはできなかったが、ＢＭＤ２ａ、及びＢＭＤ２ｂ由来ＥＶｓの添加により、下面側へとＢＢＢを通過した細胞数が顕著に増加した。ＢＭＤ２ａ、及びＢＭＤ２ｂ由来ＥＶｓと比較して、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞由来のＥＶｓ添加群は、転移能の低いＤ３Ｈ１細胞のＢＢＢを通過を効果的に促進しなかった。これらの結果から、脳転移乳癌細胞由来のＥＶｓには、癌細胞がＢＢＢを超えて脳実質側へと溢出することに影響することが示された。
【０１３７】
（実施例８）ＥＶｓがＢＢＢの透過性へ与える影響の検討
脳転移癌細胞由来のＥＶｓがＢＢＢの破壊に直接影響を与えるか否かを決定するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルにＥＶｓを添加して、ＢＢＢを破壊させるか否かを調べた。ＥＶｓは実施例５の記載に従い調製した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを解凍から４日後に、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞由来の精製されたＥＶ又はＰＢＳ（陰性コントロール）を添加した。ＥＶｓの添加前、及び添加から２４時間後に、実施例２に記載の方法に従い、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定して脳毛細血管内皮細胞の密着結合の強度を測定した。全てのアッセイはトリプリケートで行った。
【０１３８】
更に、実施例２（２）に記載の方法に従い、ＮａＦを用いた透過性試験を行い、ＢＢＢの透過性を測定した。Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞由来の精製されたＥＶ添加してから２４時間後、ＮａＦを添加した。ＢＢＢを通過したＮａＦを蛍光光度計で測定した。見かけの透過性係数（Ｐａｐｐ）（１０−６ｃｍｓ−１）を実施例２（２）に記載の計算式に従い算出した。全てのアッセイはトリプリケートで行った。
【０１３９】
測定されたＴＥＥＲの値を図８ａに、ＴＥＥＲのＥＶｓ添加前後の相対的な変化を図８ｂに示す。ＢＭＤ２ａ細胞及びＢＭＤ２ｂ細胞由来ＥＶｓ投与群は、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞由来のＥＶｓ投与群（Ｐ＜０．０５）、及びＤ３Ｈ１細胞由来のＥＶｓ投与群（Ｐ＜０．０１）と比較して有意にＴＥＥＲが低下していた。
【０１４０】
透過性試験の結果を図８ｃに示す。ＢＭＤ２ａ細胞及びＢＭＤ２ｂ細胞由来ＥＶｓ投与群は共に、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞由来のＥＶｓ投与群（Ｐ＜０．０５）、及びＤ３Ｈ１細胞由来のＥＶｓ投与群（Ｐ＜０．０１）と比較して、明らかに高い（Ｐ＜０．０１）透過性係数（Ｐａｐｐ）を示した。
【０１４１】
（実施例９）ＢＢＢ構成細胞へのＥＶの取り込みの解析
ＥＶｓがＢＢＢ構成細胞へ取り込まれるかを確かめるため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルにＥＶｓを添加して、ＢＢＢ構成細胞における取り込みを調べた。全てのアッセイはトリプリケートで行った。
【０１４２】
（１）ＰＫＨ６７によるＥＶの標識化
実施例４の方法により調製した、Ｄ３Ｈ１細胞、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞由来の精製されたＥＶｓをＰＫＨ６７緑色蛍光ラベリングキット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ、米国）を用いて標識化した。ＥＶを２μＭのＰＫＨ６７と５分間反応させ、１００ｋＤａフィルター（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて５回洗浄して、余分な染料を除去した。
【０１４３】
（２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルにおけるＥＶｓの細胞内への取り込み
実施例８に記載の方法に従って、標識化したＥＶｓ又はＰＢＳ（陰性コントロール）をｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルの上面側に添加して３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養した。脳毛細血管内皮細胞、脳周皮細胞、及び星状膠細胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色により確認した。
【０１４４】
（３）結果
ＢＢＢ構成細胞へのＥＶｓの取り込みを測定した結果を図９ａ及び図９ｂに示す。全ての癌細胞由来のＥＶｓが内皮細胞に取り込まれたが、周皮細胞及び星状膠細胞への取り込みはほとんど見られなかった。ＢＭＤ由来のＥＶｓにおいて内皮細胞内の蛍光強度が最も強かったことから、ＢＭＤ細胞由来のＥＶｓの脳血管内皮細胞への指向性が明らかとなった。
【０１４５】
（実施例１０）ＥＶｓによるＢＢＢ破壊のメカニズムの解析
ＥＶｓによるＢＢＢ破壊のメカニズムを調べるため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルにＥＶｓを添加して、ＢＢＢ構成細胞内における分子挙動の変化を調べた。全てのアッセイはトリプリケートで行った。
【０１４６】
（１）ＥＶｓ添加後の内皮細胞中の密着結合タンパク質等の局在
実施例４の方法により調製した、Ｄ３Ｈ１細胞、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞由来の精製されたＥＶｓ又はＰＢＳ（陰性コントロール）を添加して２４時間後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルの内皮細胞中のクローディン−５、オクルジン、ＺＯ−１又はＮ−カドヘリンをアクチンフィラメントと共に免疫蛍光染色して局在が変化するか否かについて、実施例２（２）と同様の方法を用いて調べた。
【０１４７】
（２）ＥＶｓ添加後の内皮細胞中の密着結合タンパク質等のレベルの変化
各細胞からのタンパク質の単離は、Ｍ−ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ．米国）を用いて、Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）  ＴＧＸ  Ｇｅｌ（４−１２％）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気泳動転写することにより行った。得られた膜は、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ、京都、日本）中でブロッキングした後、抗クローディン−５抗体（Ｚ４３．ＪＫ、１／２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗オクルジン抗体（ＺＭＤ．４８１、１／２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ＺＯ−１抗体（Ｈ−３００、ｓｃ−１０８０４、１／１００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗Ｎ−カドヘリン抗体（３Ｂ９、１／５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、又は、抗ＧＡＰＤＨ抗体（６Ｃ５、１／１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）である第一抗体と共に室温で１時間インキュベートした。第二抗体であるＨＲＰ−結合抗マウスＩｇＧ抗体（ＮＡ９３１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又はＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（ＮＡ９３４、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１／２０００倍希釈で用いた。その後、膜をＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ（登録商標）  ＬＤ（Ｗａｋｏ、大阪、日本）で発光させた。
【０１４８】
（３）結果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルの内皮細胞中の密着結合タンパク質の局在を確認した結果を図１０ａ及び図１０ｂに示す。密着結合タンパク質及びＮ−カドヘリンは、ＰＢＳ又はＤ３Ｈ２ＬＮ細胞由来のＥＶｓで処理した内皮細胞の細胞膜表面上に局在化していた。しかし、ＢＭＤ２ａ及びＢＭＤ２ｂ由来ＥＶｓで処理した細胞では、密着結合タンパク質及びＮ−カドヘリンは細胞質内に存在していた。また、脳血管内皮細胞のＢＭＤ２ａ及びＢＭＤ２ｂ由来ＥＶｓによる処理は、密着結合タンパク質、Ｎ−カドヘリン及びアクチンの発現には影響しなかった（図１０ｃ）。よって、癌由来ＥＶｓは、密着結合タンパク質、Ｎ−カドヘリン、及びアクチンフィラメントの発現には影響を与えることなく局在を変化させることが明らかとなった。
【０１４９】
（実施例１１）ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＥＶｓの血液脳関門透過性への影響の検討
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデル試験の結果から、癌細胞由来ＥＶｓが内皮細胞に取り込まれてＢＢＢの透過性を高めていることが示されたことから、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても血液能関門へ影響するか否かを検討するため、ｉｎ  ｖｉｖｏ透過性試験を行った。Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞（コントロール）及びＢＭＤ２ａ細胞由来の精製されたＥＶｓをＸｅｎｏＬｉｇｈｔ  ＤｉＲ蛍光染色で標識化した。標識化したＥＶｓをマウスの尾静脈に注入して６時間後、血液脳関門の崩壊を観察するため、ｉｎ  ｖｉｖｏ血管透過性試験用色素であるＴｒａｃｅｒ−６５３をマウスに注入した。
【０１５０】
図１１の上図は、ＥＶｓの取り込みを示し、下図は脳血管の透過性を示す。図１１の上図に示すとおり、ＢＭＤ２ａ由来ＥＶｓは、Ｄ３Ｈ２ＬＮ由来ＥＶｓと比較して、より多くがマウスの脳に集積していた。また、図１１の下図に示すとおり、ＢＭＤ２ａ由来のＥＶｓで処理されたマウスは、Ｄ３Ｈ２ＬＮ由来ＥＶｓで処理されたマウスと比較して、脳血管の透過性が増大した。
【０１５１】
（実施例１２）ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＥＶｓの癌転移に与える影響
上述の実施例で確認されたＥＶｓによるｉｎ  ｖｉｖｏでの脳血管透過性の増大が、実際に脳転移に影響しているか否かを調べるため、ＥＶｓ処理したマウスに癌細胞を注入して脳転移の有無を調べた。Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞（コントロール）又はＢＭＤ２ａ細胞由来の精製されたＥＶｓ（各５μｇ／匹）、又はＰＢＳ（ネガティブコントロール）を、各群９匹のＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスの尾静脈に注入した（０日目）。２４時間後（１日目）、Ｄ３Ｈ２ＬＮ乳癌細胞株（２×１０５細胞）を各マウスの左心室に注入した。１８日後（１９日目）にルシフェリンを腹腔内注射して、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ、米国）を用いて、生物発光ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを行うことにより、癌細胞の脳転移を観察した。得られた画像は、脳内の光子強度を測定することで評価した。有意差の評価はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙの片側検定により決定した。また、ヘマトキシリン及びエオリン（ＨＥ）染色、並びに、ヒトビメンチンに対する免疫蛍光染色により、脳転移を確認した。
【０１５２】
ＢＭＤ２ａ由来ＥＶｓ投与群では、９匹中５匹（５５．６％）に脳転移が認められ、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞由来ＥＶｓ投与群（９匹中１匹に脳転移：１１．１％）及びＰＢＳ投与群（９匹中０匹に脳転移：０％）よりも明らかに多い脳転移が認められた。また、蛍光強度を測定した結果、ＢＭＤ２ａ由来ＥＶｓ投与群では、脳内に浸潤・転移した癌細胞が他の群と比較して明らかに多かった（図１２ａ、ｂ、ｐ＜０．０５）。また、ＨＥ染色によって、脳転移が確認された（図１２ｃ）。これらの結果が示す通り、ＥＶｓによる脳血管透過性の増大が、脳転移を増加させることが明らかとなった。
【０１５３】
（実施例１３）ＥＶｓによる血液脳関門透過性変化を担う分子の解明
ＥＶｓによる血液脳関門透過性変化の分子メカニズムを解明するため、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞由来のＥＶｓに含まれるｍｉＲＮＡについて分析を行った。
【０１５４】
ＱＩＡｚｏｌ試薬及びｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（共にＱｕｉａｇｅｎ）を用いて、ＥＶｓから全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの質と量はＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）、及びＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて推奨されている方法に従って決定した。得られた全ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｈｙｂ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造者の説明書に従ってｃｙａｎｉｎｅ  ３（Ｃｙ３）で標識化した。即ち、１００ｎｇの全ＲＮＡを、Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣＩＰ）  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いて３７℃で３０分間反応させることにより脱リン酸化した。脱リン酸化ＲＮＡはＤＭＳＯを用いて１００℃で５分間インキュベートすることにより変性させ、その後すぐに氷上に移して２分間インキュベートした。その後、得られた反応物を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ  ｆｏｒ  Ｔ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ、及びＣｙ３−ｐＣｐ（Ｃｙａｎｉｎｅ  ３−Ｃｙｔｉｄｉｎｅ重リン酸塩）と混合し、１６℃で２時間インキュベートした。標識化されたＲＮＡは減圧濃縮装置を用いて、５５℃で１．５時間乾燥させた。Ｃｙ３−ｐＣｐ−標識化ＲＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  ８×６０Ｋ  Ｒｅｌ．１９マイクロアレイ（デザインＩＤ：０４６０６４）上に、５５℃で２０時間ハイブリダイズさせた。このマイクロアレイには、コントロールを除き、全部で２００６種類のｍｉＲＮＡプローブが搭載されている。洗浄後、マイクロアレイをＡｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡマイクロアレイスキャナでスキャンした。スキャンされた各特性の強度値は、背景差分を行うＡｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ソフトウェア  バージョン１０．７．３．１を用いて定量した。エラー無し（ｎｏ  ｅｒｒｏｒ）と表示された特徴（Ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｆｌａｇｓ）のみを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ  バージョン１２．６．１を用いて発現解析を行った。陽性ではない（ｎｏｔ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）特徴、有意ではない（ｎｏｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）特徴、均一ではない（ｎｏｔ  ｕｎｉｆｏｒｍ）特徴、バックグラウンドを超えない（ｎｏｔ  ａｂｏｖｅ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）特徴、飽和した（ｓａｔｕｒａｔｅｄ）特徴、及び異常値（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｕｔｌｉｅｒｓ）は除外した（Ｎｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｆｌａｇｓ）。なお、本実験において、遺伝子発現の有意（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）な違いの特定は、シグナル強度において２倍以上の変化を適用して行った。
【０１５５】
ｍｉＲＮＡに加え、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞由来のＥＶｓに含まれるタンパク質についても分析したが、ＢＭＤ２ａ細胞及びＢＭＤ２ｂ細胞に特徴的な候補タンパク質は見出されなかった（非図示）。一方、ｍｉＲＮＡ分析の結果、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞由来ＥＶｓと比較して、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞由来のＥＶｓにおいて顕著に高発現しているｍｉＲ−１８１ｃが見出された（図１３ａ、図１３ｂ）。そこで、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞内にもｍｉＲ−１８１ｃが発現されているかを確認するため、細胞内のｍｉＲ−１８１ｃを検出した。その結果、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞のいずれの細胞においても、細胞内にｍｉＲ−１８１ｃの顕著な発現量の違いは確認されなかった（非図示）。
【０１５６】
（実施例１４）ＢＢＢに与えるｍｉＲ−１８１ｃの影響の評価
以上の結果から、癌細胞由来ＥＶｓによるＢＢＢ破壊には、内皮細胞に取り込まれたＥＶｓに含まれるｍｉＲ−１８１ｃが関与していることが示唆された。そこで、ｍｉＲ−１８１ｃのＢＢＢへの影響を調べるため、ＥＶｓ添加後の内皮細胞におけるｍｉＲ−１８１ｃの存在量を確認した。また、ｍｉＲ−１８１ｃを導入した内皮細胞を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを用いて透過性及び密着結合タンパク質の挙動の変化を調べた。
【０１５７】
（１）ＥＶｓの添加による内皮細胞中のｍｉＲ−１８１ｃ存在量の変化
ＢＢＢに与えるｍｉＲ−１８１ｃの影響を評価するため、ＢＭＤ２ａ及びＢＭＤ２ｂから単離されたＥＶｓを内皮細胞に添加し、ｍｉＲ−１８１ｃの存在量の変化を確認した。ＥＶｓは実施例５の記載に従い調製した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを解凍から４日後に、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、及びＢＭＤ２ｂ細胞由来の精製されたＥＶ又はＰＢＳ（陰性コントロール）を添加した。ＥＶｓ添加から２４時間後に、内皮細胞中のｍｉＲ−１８１ｃ発現を測定した。全てのアッセイはトリプリケートで行った。
【０１５８】
（２）内皮細胞中におけるｍｉＲ−１８１ｃ存在量変化の影響
更に、ｍｉＲ−１８１ｃの存在量の変化が内皮細胞に与える影響を調べるため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを構成する内皮細胞に合成ｍｉＲ−１８１ｃを導入した。経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を、実施例２（３）に記載の方法に従って測定した。また、密着結合タンパク質、Ｎ−カドヘリン、及びアクチンの局在及び発現レベルを実施例１０に記載の方法に従って検出した。陰性コントロールとして、ｍｉＲ−１８１ｃを導入していない内皮細胞を用いた。
【０１５９】
（３）結果
ＢＭＤ２ａ及びＢＭＤ２ｂ由来ＥＶｓ添加により内皮細胞におけるｍｉＲ−１８１ｃの存在量は顕著に増加していた（図１４ａ）。ｍｉＲ−１８１ｃの形質導入により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルのＴＥＥＲの値を顕著に低下させた（図１４ｂ）。密着結合タンパク質、Ｎ−カドヘリン、及びアクチンは、陰性コントロール群では膜上に局在していたのに対し、ｍｉＲ−１８１ｃを形質導入した細胞においては、細胞質内に局在が変化していた（図１４ｃ）。更に、脳血管内皮細胞へのｍｉＲ−１８１ｃの形質導入は、密着結合タンパク質、Ｎ−カドヘリン、及びアクチンの発現量には影響を及ぼさないことが判明した（図１４ｄ）。
【０１６０】
（実施例１５）脳転移乳癌患者の血清中のｍｉＲ−１８１ｃの測定
実際にｍｉＲ−１８１ｃが脳転移乳癌患者の血液中ＥＶｓに存在しているか否かを確認するため、脳転移乳癌患者の血清からＥＶｓを精製し、ｍｉＲ−１８１ｃの発現を確認した。５６人の乳癌患者（脳転移患者１０人、非脳転移患者４６人）からの血清を国立がん研究センターにおいて採取した（Ｎｏ．２０１３−１１１）。全ての患者について、インフォームドコンセントを得ている。血清は分注され、可能な限り凍結解凍を避けて、使用するまで−８０℃で保存した。Ｔｏｔａｌ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ｆｒｏｍ  ｓｅｒａ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、血清からＥＶｓを単離した。その後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて得られたＥＶｓから全ＲＮＡを単離した。ｍｉＲＮＡの発現は、既に報告された方法を用いて、内部標準として、ＲＮＵ６を使用して、ｑＲＴ−ＰＣＴにより測定した（Ｋｏｓａｋａ、Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｔ．Ｍｅｄ．、１８：８８３−８９１（２０１２））。即ち、ｍｉＲ−１８１ｃ及びＲＮＵ６の発現レベルは、９６穴プレート内で、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ、及びＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いて、７３００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（全て、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、米国）でｑＲＴ−ＰＣＲを行うことにより測定した。全ての反応はトリプリケートで行った。
【０１６１】
脳転移患者では、非脳転移患者と比較して、血清から得られたＥＶｓ中に、有意に多いｍｉＲ−１８１ｃが存在していた（Ｐ＜０．０５、Ｔ検定）（図１５）。血清中のｍｉＲ−１８１ｃ存在量は、非脳転移乳癌患者のステージによる違いは見られなかった（図１６）。また、同じステージ４の患者同士の比較においては、脳転移の有無で有意な差があり（Ｐ＜０．０５）、脳転移のある患者において明らかに血清由来ＥＶｓ中のｍｉＲ−１８１ｃレベルが高かった。このことから、血中へのｍｉＲ−１８１ｃ分泌が実際の患者においても脳転移に寄与していることが示唆された。
【０１６２】
以上の結果から、脳転移癌細胞由来のＥＶｓは、ｍｉＲ−１８１ｃを内皮細胞内へ取り込ませることにより密着結合タンパク質の異常な局在を誘導し、それにより細胞間の接触を破壊していることが示された。
【０１６３】
（実施例１６）内皮細胞内のｍｉＲ−１８１ｃの標的の探索
ｍｉＲ−１８１ｃによるＢＢＢ崩壊メカニズムを解明するため、内皮細胞内のｍｉＲ−１８１ｃの標的を探索した。陰性コントロール又はｍｉＲ−１８１ｃを形質導入した内皮細胞内の遺伝子発現、並びに、ＢＭＤ２ａ、ＢＭＤ２ｂ又はＤ３Ｈ２ＬＮ細胞由来のＥＶｓを添加後の内皮細胞内の遺伝子発現を分析した。
【０１６４】
ＱＩＡｚｏｌ試薬及びｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（共にＱｕｉａｇｅｎ）を用いて、各内皮細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの質と量はＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）、及びＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて推奨されている方法に従って決定した。得られた全ＲＮＡは、Ｌｏｗ  Ｉｎｐｕｔ  Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ、ｏｎｅ−ｃｏｌｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製造者の説明書に従い、増幅させながらｃｙａｎｉｎｅ  ３（Ｃｙ３）で標識化した。即ち、ポリｄＴ−Ｔ７プロモータプライマーを用いて、１００ｎｇの全ＲＮＡを、二本鎖の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写した。プライマー、鋳型ＲＮＡ、及び既知の濃度及び品質の品質管理転写産物は、まず、６５℃で１０分間変性させ、その後、５×ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ緩衝液、０．１Ｍ  ジチオスレイトール、１０ｍＭ  デオキシヌクレオチドトリホスフェートミックス、及びＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ  ＲＮａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ  Ｍｉｘと共に４０℃で２時間インキュベートした。ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ酵素を７０℃で１５分間インキュベートした。ｃＤＮＡ産物を鋳型として試験管内転写により蛍光相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を生成させた。ｃＤＮＡ産物は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及びＣｙ３−標識化ＣＴＰ（ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ５’−三リン酸塩）の存在下で、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘと混合させ、４０℃で２時間インキュベートした。標識化されたｃＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、３０ｍＬのヌクレアーゼフリーの水で溶出させた。増幅及び標識化の後、ｃＲＮＡの量及びｃｙａｎｉｎｅの取り込みをＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）、及びＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて決定した。各ハイブリダーゼーションにおいては、０．６μｇのＣｙ３−標識化ｃＲＮＡを断片化し、６５℃で１７時間、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ａｒｒａｙ（デザインＩＤ：０２８５２０）にハイブリダイズさせた。本アレイには、コントロールを除き、全部で１２２４３種類のプローブが搭載されている。マイクロアレイを洗浄後、Ａｇｉｌｅｎｔ    ＤＮＡマイクロアレイスキャナによりスキャンした。スキャンされた各特性の強度値は、背景差分を行うＡｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ソフトウェア  バージョン１０．７．３．１を用いて定量した。エラー無し（ｎｏ  ｅｒｒｏｒ）と表示された特徴（Ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｆｌａｇｓ）のみを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ  バージョン１２．６．１を用いて正規化を行なった（チップ毎：第三四分位数シフトに対する正規化；遺伝子毎：全てのサンプルの中央地に対する正規化）。陽性ではない（ｎｏｔ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）特徴、有意ではない（ｎｏｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）特徴、均一ではない（ｎｏｔ  ｕｎｉｆｏｒｍ）特徴、バックグラウンドを超えない（ｎｏｔ  ａｂｏｖｅ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）特徴、飽和した（ｓａｔｕｒａｔｅｄ）特徴、及び異常値（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｕｔｌｉｅｒｓ）は除外した（Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ及びＮｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｆｌａｇｓ）。変化した転写産物は比較法を用いて定量化した。なお、本実験において、遺伝子発現の有意（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）な違いの特定は、シグナル強度において２倍以上の変化を適用して行った。
【０１６５】
陰性コントロールと比較して、ｍｉＲ−１８１ｃが形質導入された脳血管内皮細胞内において、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ−１（ＰＤＰＫ１）の発現が抑制されていることが、ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルのいずれにおいても確認された（図１７ａ〜ｃ）。更に、ＢＭＤ２ａ細胞及びＢＭＤ２ｂ細胞由来ＥＶｓで処理した内皮細胞においても、コントロール（Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞由来ＥＶｓで処理した内皮細胞）と比較して、ＰＤＰＫ１の発現が抑制されていることが、ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルのいずれにおいても確認された（図１７ｄ〜ｆ）。これらの結果から、ｍｉＲ−１８１ｃが脳血管内皮細胞におけるＰＤＰＫ１の発現を抑制することが示された。
【０１６６】
（実施例１７）ＰＤＰＫ１の密着結合タンパク質等の局在に与える影響
ＰＤＰＫ１が脳血管内皮細胞内に与える影響を調べるため、ＰＤＰＫ１  ｓｉＲＮＡで処理した後の径内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）及び密着結合タンパク質、Ｎ−カドヘリン、及びアクチンフィラメントの局在及び発現量を調べた。
【０１６７】
ＰＤＰＫ１  ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、ＩＤ：Ｓ１０２７５）、又は、コントロールｓｉＲＮＡの各２５ｎＭを、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造者のプロトコルに従って脳血管内皮細胞に導入した。２４時間後の形質転換細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルにおける経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を、実施例２（３）に記載の方法に従って測定した。また、２４時間後の形質転換細胞における密着結合タンパク質、Ｎ−カドヘリン、及びアクチンフィラメントの局在及び発現量の測定を、実施例１０に記載の方法に従って行った。
【０１６８】
ＰＤＰＫ１  ｓｉＲＮＡの導入により、ＰＤＰＫ１タンパク質の発現量は低下した（図２０ｂ参照）。コントロールｓｉＲＮＡで処理した細胞においては、密着結合タンパク質及びＮ−カドヘリンが細胞膜に局在していたのに対し、ＰＤＰＫ１  ｓｉＲＮＡ処理細胞においては細胞膜への局在が失われていた（図１８ａ）。密着結合タンパク質、Ｎ−カドヘリン及びアクチンは細胞質内に存在しており、これは、ＢＭＤ２ａ細胞若しくはＢＭＤ２ｂ細胞由来のＥＶｓ投与細胞、又はｍｉＲ−１８１ｃ形質導入細胞において観察された結果と一致した。ＰＤＰＫ１  ｓｉＲＮＡ処理内皮細胞内において、アクチンの凝縮が観察され、この現象もＢＭＤ２ａ細胞若しくはＢＭＤ２ｂ細胞由来のＥＶｓ投与細胞、又はｍｉＲ−１８１ｃ形質導入細胞の結果と一致した（図１０ａ、図１０ｂ、図１４ｃ、及び図１８ａ）。また、密着結合タンパク質、Ｎ−カドヘリン及びアクチンのタンパク質発現量は、ＰＤＰＫ１  ｓｉＲＮＡの処理の有無にかかわらず変化しなかった（図１８ｂ）。また、内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）は、ＰＤＰＫ１  ｓｉＲＮＡの導入により低下していた（図１８ｃ）。これらの結果から、ＰＤＰＫ１の阻害が、密着結合タンパク質及びＮ−カドヘリンの局在を変化させ、ＢＢＢの透過性を高めることが明らかとなった。
【０１６９】
以上の結果から、脳転移癌細胞が分泌するＥＶｓが内皮細胞に取り込まれた後、該ＥＶｓに封入されたｍｉＲ−１８１ｃが内皮細胞中のＰＤＰＫ１の発現を抑制し、それにより密着結合タンパク質及びＮ−カドヘリンの局在を変化させ、ＢＢＢの透過性を高めることが示された。
【０１７０】
（実施例１８）ｍｉＲ−１８１ｃによるＰＤＰＫ１発現抑制の確認
更に、内皮細胞内においてｍｉＲ−１８１ｃがＰＤＰＫ１の発現を直接抑制し得るか否かについて、ＰＤＰＫ１遺伝子の非翻訳領域（３’ＵＴＲ）（Ｍａｃａｃａ：配列番号１４；Ｈｕｍａｎ：配列番号１５）を用いた、３’ＵＴＲルシフェラーゼレポーターアッセイにより確認した。
【０１７１】
ＰＤＰＫ１の３’ＵＴＲは、カニクイザルの脳血管内皮細胞から抽出した全ＲＮＡを鋳型にＰＣＲ増幅させて得た。３’ＵＴＲ増幅に使用したＰＣＲプライマーは、以下のとおりである：
Ｆｏｒｗａｒｄ：ＡＡＣＴＣＧＡＧＡＡＴＧＣＴＧＧＣＴＡＴＴＧＴＴＧＧＣＣＴＣ（配列番号１６）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＡＴＴＡＡＡＴＣＡＣＴＧＡＣＣＣＡＡＴＡＧ（配列番号１７）
ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ、米国）にクローニングして組み込んだ。増幅させた３’ＵＴＲは、ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ＴＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のウミシイタケルシフェラーゼコード領域の下流にクローニングした。また、アラインメント解析により、ＰＤＰＫ１の３’ＵＴＲ中にｍｉＲ−１８１ｃと相補的な配列が確認された（図１９ｂ）。
【０１７２】
ＨＥＫ２９３細胞は、５×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種して一晩培養した。１００ｎｇのレポータープラスミドと１００ｎＭのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１８１ｃをＤｈａｒｍａＦＥＣＴ  Ｄｕｏ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて同時に形質導入した。
【０１７３】
形質導入から２４時間後に細胞を回収し、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＭＡ、米国）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。内因性ｍｉＲＮＡの影響を調べるため、陰性コントロールとして合成ｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲ）（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を同時に形質導入した。全ての実験をトリプリケートで行った。
【０１７４】
ＨＥＫ２９３細胞を用いた結果、ｍｉＲ−１８１ｃにより、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼの発現量が低下していた（図１９ａ）。これらの結果から、ＰＤＰＫ１がｍｉＲ−１８１ｃの直接の標的であることが明らかとなった。
【０１７５】
（実施例１９）コフィリンリン酸化に与える影響
ＰＤＰＫ１は、コフィリン（ｃｏｆｉｌｉｎ）のリン酸化を制御する経路の上流に位置するタンパク質の一つであることが知られている（Ｌｙｌｅ、Ａ．Ｎ、ｅｔ  ａｌ．、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、２１：２６９−２８０（２００６）；Ｈｉｇｕｃｈｉ、Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１０：１３５６−１３６４（２００８））。また、コフィリンは、アクチン結合タンパク質ファミリーの一つであり、脱リン酸化により活性化されてアクチンフィラメントを分解する。ＰＤＰＫ１  ｓｉＲＮＡ処理内皮細胞内において、アクチンの凝縮が観察されたことから、ｍｉＲ−１８１ｃによるＢＢＢ破壊にコフィリンが関与しているか否かについて検討した。
【０１７６】
脳血管内皮細胞に、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞、ＢＭＤ２ａ細胞、又はＢＭＤ２ｂ細胞由来のＥＶｓで処理した。また、脳血管内皮細胞にｍｉＲ−１８１ｃを導入した。更に、実施例１７に記載の方法に従って脳血管内皮細胞をＰＤＰＫ１  ｓｉＲＮＡで処理した。各細胞における、リン酸化コフィリンの発現をウェスタンブロット分析により解析した。
【０１７７】
Ｍ−ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ．米国）を用いて、Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）  ＴＧＸ  Ｇｅｌ（４−１２％）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に各細胞から得られたサンプルをロードしてタンパク質を分離した後、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気泳動転写した。得られた膜は、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ、京都、日本）中でブロッキングした後、抗ＰＤＰＫ１抗体（＃３０６２、１／５００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗コフィリン抗体（Ｄ３Ｆ９、＃５１５７、１／１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗リン酸化コフィリン抗体（Ｓｅｒ３）（＃３３１１、１／５００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、又は、抗ＧＡＰＤＨ抗体（６Ｃ５、１／１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、である第一抗体と共に室温で１時間インキュベートした。第二抗体であるＨＲＰ−結合抗マウスＩｇＧ抗体（ＮＡ９３１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又はＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（ＮＡ９３４、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１／２０００倍希釈で用いた。その後、膜をＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ（登録商標）  ＬＤ（Ｗａｋｏ、大阪、日本）で発光させた。
【０１７８】
ＢＭＤ２ａ細胞、又はＢＭＤ２ｂ細胞由来のＥＶｓ投与細胞においては、Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞由来のＥＶｓ投与細胞と比較して、コフィリンのリン酸化が低下していた（図２０ａ）。更に、コフィリンのリン酸化は、ｍｉＲ−１８１ｃ又はＰＤＰＫ１  ｓｉＲＮＡ処理脳血管内皮細胞において、コントロールｓｉＲＮＡ処理細胞と比較して低下していた（図２０ｂ）。これらの結果から、ＥＶｓ中のｍｉＲ−１８１ｃは、脳血管内皮細胞内においてＰＤＰＫ１の発現を低下させ、その結果、コフィリンのリン酸化が阻害されてアクチンの挙動が変化して凝集することにより、血液脳関門の透過性が増大することが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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