(57)【要約】【課題】本発明は、長寿促進に関する。【解決手段】本発明は、長寿促進のための、特にＣｉｓｄ２遺伝子発現の増加、ミトコンドリア損傷の減少ならびに神経変性およびサルコペニア等の老化状態の遅延のための、乳酸菌の活性物質、それを含む組成物及びその利用を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）を含む長寿促進組成物であって、前記ラクトバチルス・パラカゼイは、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）に寄託されている（Ｎｏ．１４５６６）、長寿促進組成物。
【請求項２】
有効量のラクトバチルス・パラカゼイの活性物質を含む長寿促進組成物であって、前記ラクトバチルス・パラカゼイは、中国普通微生物菌種保蔵管理センターに寄託されている（Ｎｏ．１４５６６）、長寿促進組成物。
【請求項３】
前記活性物質が以下の方法により調製される、請求項２に記載の組成物：
（ａ）固体培地に乳酸菌をストリーキングして、単一コロニーを生成し、
（ｂ）液体培養用の液体培地にステップ（ａ）で培養した乳酸菌の単一コロニーを接種する。
【請求項４】
前記方法が、
（ｃ）ステップ（ｂ）で培養した液体培養物を遠心分離して、細菌ペレットを取得するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で取得した細菌ペレットを凍結乾燥するステップとを更に含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ステップ（ｂ）が、３０〜５０℃で、０〜１ｖｖｍの窒素または二酸化炭素中で行われ、１０〜１００ｒｐｍで回転し、および／または１６〜２４時間インキュベートされる、請求項３に記載の活性物質。
【請求項６】
ステップ（ｄ）での凍結乾燥の温度が−１９６から−４０℃である、請求項４に記載の活性物質。
【請求項７】
前記組成物が、賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、吸収増強剤、甘味料およびそれらの組み合わせからなる群から選択される添加剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、吸収増強剤、甘味料およびそれらの組み合わせからなる群から選択される添加剤を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、薬物、飼料、飲料、栄養補助食品、乳製品または健康食品である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、薬物、飼料、飲料、栄養補助食品、乳製品または健康食品である、請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、粉末、錠剤、顆粒、坐剤、マイクロカプセル、アンプル、液体スプレーまたは坐剤形態をとる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、粉末、錠剤、顆粒、坐剤、マイクロカプセル、アンプル、液体スプレーまたは坐剤形態をとる、請求項２に記載の組成物。
【請求項１３】
長寿促進するための請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物の製造方法。
【請求項１４】
長寿促進するために、前記活性物質が投与されていない対象と比較して、前記活性物質が投与された対象はＣｉｓｄ２遺伝子発現の増加を示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
長寿促進するために、前記活性物質を投与されていない対象と比較して、前記活性物質が投与された対象はミトコンドリア損傷の減少および遅延を示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
長寿促進するために、前記活性物質を投与されていない対象と比較して、前記活性物質が投与された対象は、神経変性、サルコペニアまたはその組み合わせの老化状態の遅延を示す、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、長寿促進のための、ラクトバチルス・パラカゼイの活性物質、それを含む組成物、およびその使用に関する。より具体的には、本発明は、活性物質を含む組成物、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＧＫＳ６の活性物質の製造方法、および被験者に投与した場合のＧＫＳ６の適用によるＣｉｓｄ２遺伝子発現の増加、ミトコンドリア損傷の減少、神経変性及びサルコペニアなどの老化状態の遅延に関する。
【背景技術】
【０００２】
長寿遺伝子
科学者は長寿の謎を解明することを長い間望んでいた。環境ストレスへのより良い調整はより長い寿命をもたらすと仮定されているため、科学者は環境ストレスに関連する寿命に影響を与える遺伝子のグループの検索を開始した（例えば、猛暑のような極端な天候や食料と水の不足による極端な飢餓など）。これらの遺伝子は、それらが属する個人の年齢に関係なく、個人を強化して直面する危機を通じて生き残るのを助けるように、自然な形で個人を保護し、活動を回復させることができる。そのため、「長寿遺伝子」とも呼ばれるこのような遺伝子は、長期にわたって活動し続ける限り、個人の健康状態を改善し、寿命を大幅に延長するのに役立つ。
【０００３】
別の科学者グループは、１００歳以上の人の遺伝子検査を実施することを選択した。彼らは、１００歳以上の人の特定の遺伝子の発現レベルは、平均寿命の人の遺伝子の発現レベルと比較すると、かなり強いことを発見した。したがって、これらの遺伝子が寿命を決定する役割を果たす可能性があると仮定された。
【０００４】
Ｃｉｓｄ２遺伝子
Ｃｉｓｄ２遺伝子は、進化の過程で高度に保存された遺伝子であり、下等無脊椎動物、脊椎動物および高等哺乳類を含む様々な種に見出すことができる。この点で、Ｃｉｓｄ２遺伝子は重要な生物学的機能の制御に重要な役割を果たすと思われる。Ｃｉｓｄ２遺伝子のタンパク質はミトコンドリアの外膜に発現し、ミトコンドリアにＣｉｓｄ２遺伝子がないと、通常、ミトコンドリアの損傷が引き起こされ、ミトコンドリアの構造と機能が損なわれ、老化につながる。Ｃｉｓｄ２遺伝子ノックアウトマウスの研究では、それらは対照群よりも著しく小さいだけでなく、平均寿命が対照群の平均寿命のわずか半分であることが示されている。さらに、Ｃｉｓｄ２−ノックアウトマウスは、３週目（ヒトの１０〜１２年に相当）に神経変性とサルコペニア、約４週目（ヒトの約１５年に相当）に大幅な体重減少、約８週目（ヒトの約１８〜２０年に相当）に白くて濁った斑点のある眼球突出、骨粗鬆症、約１２〜４８週目（ヒトの約３０〜４５年に相当）に脊柱後彎、失明、皮膚のゆるみを示し始める。さらに、加齢が進むと正常マウスのＣｉｓｄ２遺伝子の発現が減少することが観察されており、若い年齢のマウスと比較したとき、発現は約１４か月目（ヒトの約６０年に相当）で６０％に低下し、約２８か月目（ヒトの約９０年に相当）で３０％に低下する。上記の過去の研究と観察によれば、Ｃｉｓｄ２は通常の平均余命を維持するために不可欠であり、加齢に大きく関連していることが確認されている。
【０００５】
ラクトバチルス種
ラクトバチルス種は一般的な環境条件に存在し、炭水化物を乳酸に発酵させることができ、それにより、発酵食品の製造によく使用される。１９００年代初頭、ラクトバチルス属は消化の改善や腸の健康など、複数の健康上の利点をもたらすことが発見された。したがって、消化機能と排便を促進するため、ラクトバチルス属を消費することが勧められている。さらに、乳酸菌が炭水化物（ラクトース、グルコース、スクロース、フルクトースなど）を溶解し、乳酸と酢酸を生成し、それが腸内酸性化を促進して悪玉菌の増殖を防ぎ、腸内細菌叢を健康的なバランスに保つことを可能にすることがさらに発見された。
【０００６】
ラクトバチルス種の細菌は、種が異なっていても、又は同じ種であって株が異なっていても、人体に明確な特性と影響を与える可能性がある。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉは人間の健康に有益であることが分かっている。特に、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＰＨ０４は血中コレステロールを下げ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９Ｖは、ＩＬ−１０欠損マウスの大腸炎の症状を軽減させ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  １０ｈｋ２は、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αなどの炎症誘発性メディエーターのレベルを増加させ、さらに、抗炎症性メディエーターＩＬ−１０のレベルを増加させ、炎症に対抗し、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｋ２１は、血中コレステロールとトリグリセリドを低下させ、さらに、炎症に対抗する。
【０００７】
ビフィドバクテリウム
ビフィドバクテリウムは、グラム陽性、非運動性、桿状で分岐状のこともある嫌気性細菌の属である。それらは、人間や動物の胃腸管、膣、口に遍在する。１８９９年、健康な乳児の糞から最初に分離され、後に、特定のビフィドバクテリウム株が食品、医薬品、飼料に添加されるプロバイオティクスとして使用できることが発見された。
【０００８】
しかし、乳酸菌の寿命への影響は、関連する研究で言及されたことがない。また、乳酸菌がＣｉｓｄ２遺伝子発現を介して生理学的条件を変更することにより、どのように個人の寿命を決定するかを実証しようとする実験はなかった。
【発明の概要】
【０００９】
ラクトバチルス・パラカゼイを含む長寿促進組成物であって、ラクトバチルス・パラカゼイは、中国普通微生物菌種保蔵管理センターに寄託されている（Ｎｏ．１４５６６）。
本発明の別の目的は、有効量のラクトバチルス・パラカゼイの活性物質を含む長寿促進組成物を提供することであり、ラクトバチルス・パラカゼイは、中国普通微生物菌種保蔵管理センターに寄託されている（Ｎｏ．１４５６６）。
【００１０】
好ましくは、活性物質は以下の方法により調製される。
（ａ）ビフィズス菌株を固体培地にストリーキングして、単一コロニーを生成し、
（ｂ）ステップ（ａ）で培養した乳酸菌の単一コロニーを液体培養用の液体培地に接種する。
【００１１】
好ましくは、この方法はさらに、
（ｃ）ステップ（ｂ）で培養された乳酸菌コロニーを含む液体培養物を遠心分離して、細菌ペレットを取得するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で取得した細菌ペレットを凍結乾燥するステップとを含む。
【００１２】
好ましくは、ステップ（ｂ）は、３０〜５０℃で、０〜１ｖｖｍの窒素または二酸化炭素中で、１０〜１００ｒｐｍで振盪し、および／または１６〜２４時間インキュベートする。
【００１３】
好ましくは、ステップ（ｄ）での凍結乾燥の温度は、−１９６〜−４０℃である。
好ましくは、組成物は、賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、吸収増強剤、甘味料およびそれらの組み合わせからなる群から選択される添加剤を含む。
【００１４】
好ましくは、組成物は、薬物、飼料、飲料、栄養補助食品、乳製品または健康食品である。
好ましくは、組成物は、粉末、錠剤、顆粒、坐剤、マイクロカプセル、アンプル、液体スプレーまたは坐剤の形態をとる。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、長寿促進のための乳酸菌の組成物を製造する方法を提供することである。
好ましくは、長寿促進のための方法に関して、活性物質を投与されていない対象と比較して、活性物質を投与された対象は、Ｃｉｓｄ２遺伝子発現の増加を示す。
【００１６】
好ましくは、長寿促進のための方法に関して、活性物質を投与されていない対象と比較して、活性物質を投与された対象は、ミトコンドリア損傷の減少および遅延を示す。
好ましくは、長寿促進のための方法に関して、活性物質を投与されていない対象と比較して、活性物質を投与された対象は、神経変性、サルコペニアまたはそれらの組み合わせの老化状態の遅延を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】異なるタイプの乳酸菌（番号ＡからＪ）活性物質を異なる用量で処理した後のＨＥＫ２９３細胞におけるＣｉｓｄ２遺伝子プロモーター制御蛍光強度の相対的発現レベルを示す。
【図２】ＨＥＫ２９３細胞を異なる乳酸菌（番号Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＨおよびＩ）活性物質で異なる用量でそれぞれ処理した後の内因性Ｃｉｓｄ２メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現レベルのゲル画像を示す。
【図３】図２のＣｉｓｄ２メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現レベルの統計結果を示す。
【図４】動物実験の手順を示している。
【図５】前腕の握力試験中に雄マウスによって示された握力を示す。
【図６】単一試行受動的回避試験中に雌マウスにより示される潜伏時間を示す。
【図７】単一試行受動的回避試験中に雄マウスにより示された潜伏時間を示す。
【図８】能動的シャトル回避試験中に雌マウスにより示された回避応答の数を示す。
【図９】能動的シャトル回避試験中に雄マウスにより示された回避応答の数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
乳酸菌の供給源
本発明で使用される乳酸菌には、ラクトバチルス・パラカゼイおよびビフィドバクテリウムが含まれる。好ましい実施形態では、本発明の乳酸菌は、台湾の財団法人食品工業発展研究所（Ｔａｉｗａｎ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の生物資源収集研究センター（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）から購入される。好ましい実施形態では、以下の実験で使用される乳酸菌には、ＡからＪの番号が付けられている。各番号の細菌の株および寄託番号は、以下の表１に示されている。細菌ＡからＨの収集、分離、精製のプロセス、および遺伝子分析とアッセイの結果は、台湾特許出願第１０６１３７７７３号および第１０６１３６１３４号に記載されている。
【００１９】
【表１】
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乳酸菌の培養
上記の１０個の乳酸菌（Ａ〜Ｊ）を固体培地にストリークして単一コロニーを生成した。好ましい実施形態では、固体培地はＭＲＳ寒天である。完全に成長したら、乳酸菌の単一コロニーを液体培養用の液体培地を含むフラスコに接種する。好ましい実施形態では、乳酸菌は、液体培地で３５〜５０℃、窒素または二酸化炭素０〜１ｖｖｍで培養され、１０〜１００ｒｐｍで回転される。好ましい実施形態では、細菌は１６から２４時間、より好ましくは１８時間培養される。好ましい実施形態では、液体培地はＭＲＳ液体培地である。好ましい実施形態では、液体培地の成分を以下の表２に示す。
【００２０】
【表２】
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凍結乾燥粉末の調製
乳酸菌の各株が液体培養で完全に成長すると、乳酸菌を遠心分離して細菌ペレットを得る。好ましい実施形態では、乳酸菌を含む液体培地は、１０００〜１５０００ｒｐｍで遠心分離される。得られた細菌ペレットを保護剤（６−３０％脱脂粉乳）と混合し、低温で保存するために凍結乾燥する。好ましい実施形態では、凍結温度は−１９６〜−４０℃に設定される。好ましい実施形態では、混合物は１６〜７２時間凍結乾燥される。好ましい実施形態では、凍結乾燥混合物は、−３０〜０℃で保存される。乳酸菌の凍結乾燥粉末は、以下の細胞実験の原料として、すなわち本願が請求する乳酸菌活性物質の実施形態の一つとして使用するために保存されている。本願によって特許請求される乳酸菌活性物質の実施形態は、上記の液体培地中で単一の細菌コロニーを培養することから得られるペレットも含む。
【００２１】
Ｃｉｓｄ２ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ
Ｃｉｓｄ２遺伝子プロモーター、ｃｉｓｄ２遺伝子およびルシフェラーゼレポーター遺伝子を融合するヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３）プラットフォーム（台湾、陽明大学）は、乳酸菌活性物質がＣｉｓｄ２遺伝子発現に影響を与えるかどうかを調べるために実施される。ルシフェラーゼレポーター遺伝子（２ｘ１０５細胞／ｍＬ）を運ぶＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレートに接種し、３７℃のインキュベーターで５％ＣＯ２にて１日インキュベートする。次に、上記の乳酸菌（Ａ−Ｊ）の保存凍結乾燥粉末を、担体として機能する０．１％ＤＭＳＯに溶解する。得られた混合物から以下の表３に示すさまざまな濃度を調製し、それぞれＨＥＫ２９３液体培地に加える。対照群では、０．１％ＤＭＳＯのキャリアのみがＨＥＫ２９３液体培地に添加され、実験群は異なる乳酸菌活性物質とともにインキュベートされる。両方のグループを、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで２４時間インキュベートする。ＨＥＫ２９３細胞のルシフェラーゼ活性を測定および定量する。上記の実験を３回実行する。結果を図１に示す。
【００２２】
【表３】
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内因性Ｃｉｓｄ２発現レベル
内因性Ｃｉｓｄ２遺伝子の活性を測定して、Ｃｉｓｄ２発現レベルに対する乳酸菌活性物質の効果をさらに決定する。まず、正常なＨＥＫ２９３細胞（２ｘ１０５細胞／ｍＬ）を６ウェルプレートに接種し、インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２で１日インキュベートする。次に、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＨおよびＩと番号付けされた乳酸菌の凍結乾燥粉末を０．１％ＤＭＳＯ担体に溶解し、以下の表４に示すように様々な濃度の混合物に調製する。次に、各混合物をＨＥＫ２９３細胞培養に加える。対照群では、０．１％ＤＭＳＯのキャリアのみがＨＥＫ２９３細胞培養に加えられ、実験群は乳酸菌活性物質とともにインキュベートされる。両方のグループをインキュベーターで２４時間インキュベートする。次いで、細胞を氷上で回収し、それら細胞から市販のＧｅｎｅ  ＪＥＴ  ＲＮＡ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してｍＲＮＡを抽出する。ｍＲＮＡ抽出物を適切な濃度に調整し、Ｒｅｖｅｒｔ  Ａｉｄ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してｃＤＮＡに戻す。最後に、ＰＣＲを使用して内因性Ｃｉｓｄ２遺伝子発現レベルを測定する。結果のゲル画像を図２に示し、図２の結果を統計的に分析して図３に示す。
【００２３】
【表４】
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Ｃｉｓｄ２実験データを分析するための統計的方法
データは、平均±標準偏差（ＳＤ）として表される。対照群と試験群の活動の違いは、倍率変化として記述されている。グループ間の統計的差異はｐ値で表される。＊ｐ＜０．０５は統計的に有意であると定義され、＊＊ｐ＜０．０１は統計的に高度に有意であると定義される。
【００２４】
Ｃｉｓｄ２実験の結果
Ｃｉｓｄ２ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの結果を図１に示す。Ａ〜Ｊの番号が付けられた乳酸菌の１０株のうち、細菌Ａ、Ｃ、ＨおよびＩの活性物質で処理したＨＥＫ２９３細胞は、対照群より高い蛍光強度を示す。これらの結果は、細菌Ａ、Ｃ、Ｈ、およびＩの活性物質がＣｉｓｄ２遺伝子の発現レベルを増加させる可能性があることを示唆している。細菌Ａの結果に関して、ＨＥＫ２９３細胞を１２．５μｇ／ｍｌまたは２５μｇ／ｍｌの濃度で刺激した場合、ルシフェラーゼ発現レベルは対照群のレベルよりも高くなる。これらの結果は、細菌Ａの活性物質がＣｉｓｄ２遺伝子発現レベルを増加させる可能性があることを示している。細菌Ｃに関しては、結果は細菌Ａの結果と似ており、ルシフェラーゼの発現レベルは、０．２５μｇ／ｍｌまたは０．５μｇ／ｍｌのいずれかの濃度でＨＥＫ２９３細胞を刺激すると、対照群のレベルよりも高くなる。繰り返すが、このような結果は、細菌Ｃの活性物質がＣｉｓｄ２遺伝子の発現レベルを増加させる可能性があることを示している。一方、１．５μｇ／ｍｌの細菌Ｈは、対照群と比較して１．１４倍のルシフェラーゼ発現レベルを示す。同様に、そのような結果は、細菌Ｈの活性物質がＣｉｓｄ２遺伝子発現レベルを大幅に（ｐ＜０．０５）増加させる可能性があることを示している。細菌Ｉについては、ＨＥＫ２９３細胞を２．５μｇ／ｍｌまたは５μｇ／ｍｌの濃度で刺激すると、ルシフェラーゼの発現レベルが対照群のレベルより高くなり、細菌Ｉの活性物質がＣｉｓｄ２遺伝子の発現レベルを増加させる可能性があることを示す。
【００２５】
内因性Ｃｉｓｄ２遺伝子発現レベルの測定結果を図２および図３に示す。細菌ＡおよびＣは、対照群と比較して高いｃｉｓｄ２ｍＲＮＡ発現レベルを示さず、細菌Ｃは対照群と比較して低いｍＲＮＡ発現レベルさえ示した。一方、細菌ＨおよびＩは、対照群と比較して高いｍＲＮＡ発現レベルを示す。細菌Ｈ（１．５μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌ）、および細菌Ｉ（２．５μｇ／ｍｌ）は両方とも、対照群と比較して統計的有意性を示し、細菌ＨおよびＩはＣｉｓｄ２遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを有意に上昇させる。具体的には、細菌Ｈは、対照群と比較して、１．５μｇ／ｍｌで１．１５倍のｍＲＮＡ発現レベル（ｐ＜０．０５）、５μｇ／ｍｌで１．３７倍の発現レベル（ｐ＜０．０１）をもたらした。ｍＲＮＡ発現レベルは、乳酸菌活性物質の濃度が増加すると増加し、濃度と効果の関係を示す。さらに、２．５μｇ／ｍｌの細菌Ｉは、対照群と比較した場合、１．２１倍の発現レベル（ｐ＜０．０５）をもたらした。
【００２６】
上記の結果は、特定の乳酸菌（好ましくはラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイおよびビフィドバクテリウム）の活性物質がＣｉｓｄ２遺伝子発現レベルを増加させたことを証明しており、それにより寿命を延長できる可能性があり、ひいては乳酸菌の新規医薬用途を提供できる可能性がある。上記を考慮して、乳酸菌活性物質を含む組成物は、新規な用途のために製造される。さらに、組成物の有効量は、所望の効果を達成するために対象に投与されるよう決定される。
【００２７】
以下の実験では、細菌Ａ（ＧＫＳ６）を使用して、老化の遅延および長寿の促進に対するその効果を決定する。細菌Ｉ（ＧＫＫ２）と細菌Ｈ（ＧＫＭ３）は、それぞれ他の出願で特許請求することとする。
【００２８】
実験動物における加齢評価
本発明における動物実験の一般的な手順を図４に示す。この実験で使用するために選択された動物は、ＡＫＲ／Ｊ兄弟交配の選択的繁殖のプログラムを通じて京都大学（日本）によって開発された老化促進マウス（ＳＡＭ）である。この実験で使用したＳＡＭＰ８マウスは、脳のニューロン損失、脳萎縮、リポフスチン沈着、脳幹の網状形成における海綿状奇形およびアミロイド蛋白沈着を特徴とする。他の特徴としては、他の臓器の急速な老化と寿命の短縮が挙げられ、これにより、それらは老化と生殖機能の遅延に関連する研究にとって理想的な実験動物モデルになる。これらのマウスは、温度２５±２°Ｃ、相対湿度６５±５％の無塵自動部屋の３０（Ｗ）ｘ２０（Ｄ）ｘ１０（Ｈ）ｃｍ３透明プラスチックケージに収容された。ライトサイクルは自動タイマーによって制御され、０７：００から１９：００に暗い期間が設定され、１９：００から０７：００に明るい期間が設定された。
【００２９】
この実験は、「老化遅延および健康促進機能の健康食品の規制および評価方法」に従って設計された。３ヶ月齢のオスおよびメスのＳＡＭ−Ｐ８マウスを実験動物として使用した。マウスを最初に対照群と試験群に分割して乳酸菌Ａ処理し、次に各群を雌群と雄群に分け、グループあたりのマウスが１０個体の合計４群とした（合計４０マウス）。対照群のマウスにはｄｄＨ２Ｏのサンプルを経管栄養で与えたが、試験群のマウスには乳酸菌Ａ（ＧＫＳ６）の凍結乾燥粉末をｄｄＨ２Ｏで溶解し、それぞれ所望の用量で調製されたサンプルを経管栄養で与えた。各グループおよび各グループで使用される用量を以下の表５に示す。
【００３０】
【表５】
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実験は１３週間にわたって行われ、その間、各グループは１日１回それぞれのサンプルを経管栄養で与えられた。各グループの食物と水の摂取量は、実験中に記録された。１２週目に、マウスを加齢スコアによって評価し、単一試行受動的回避試験を実施した。１３週目に、マウスに能動的シャトル回避試験を実施した。試験後、マウスはＣＯ２窒息に供され、断頭により屠殺された（屠殺前８時間絶食）。断頭されたマウスの血液と臓器を分析のために収集した。
【００３１】
老化スコア
グレーディングスコアシステムは、ＳＡＭマウスの脆弱レベルを測定するために、１９８１年に武田および他の学者によって考案された。この実験で使用したマウスの加齢レベルを測定するために、毛の光沢、毛の粗さ、脱毛、皮膚潰瘍、眼周囲病変、脊椎弯曲の６つの測定項目を選択した。マウスの加齢レベルを０〜４のスケールで等級付けした。各項目について得られたスコアを合計して、最終スコアを得た。より高いスコアのマウスはより高い加齢レベルを示す。
【００３２】
前腕の握力試験
加齢は、筋肉の廃用性萎縮を加速させる変性した生理学的機能または複数の慢性疾患を引き起こす可能性がある。通常、人々は３０歳以降には１年あたり１〜２％の筋肉を失い、６０歳以降は１年あたり１５％程度劇的に減少する。筋肉バイオマスの損失は、障害、転倒、機能低下、寝たきり、さらには死のような負の健康イベントにつながるリスク要因である。
【００３３】
加齢により誘発される骨格筋の喪失は、「骨格筋の老化」または「老人の骨格消耗」とも呼ばれるサルコペニアを発症する可能性がある。サルコペニアは、（１）低筋量（２）低筋力（３）低い身体パフォーマンスという３つの主要な症状を示す。２０１０年、欧州連合老年医学協会（ＥＵＧＭＳ）は、加齢誘発性サルコペニアの診断基準および定義を開発および公開した。６５歳以上の歩行速度が１ｍ／秒未満で、握力が低く、筋肉量が臨界値よりも小さいと、サルコペニアと診断される。国立台湾大学病院の内科および家庭医学部門から収集されたデータは、サルコペニアの有病率が年齢増加とともに中年男性では１８％から６４％に、中年女性では９％から４１％に増加したことを示した。臨床的には、サルコペニアと筋力低下の悪化は、その後の健康状態の悪化を防ぐための効果的な介入と診断を実施することで遅らせることができる。
【００３４】
マウス実験では、握力メーター（ＧＳＭ、カタログ番号４７２００）を使用してＳＡＭＰ８マウスの前腕握力を測定し、筋力を判定した。この方法は動物を尾でつかみ、前足でプルバーを握らせることによって実行された。動物は、その後、握り解放するまで、尾で水平に引き戻された。この時点で加えられた力は、ＧＳＭを使用して３回連続して記録され、記録された最高値が選択され、統計的に分析された。
【００３５】
単一試行受動的回避試験
マウスの学習および記憶に対する乳酸菌の効果は、古典的な条件付けおよび動物の暗さ嗜好によって測定された。この実験には、中央のゲートによって明るい部屋と暗い部屋に分けられた特別な箱が使用された。部屋は互いに接続されるように設計され、電源に接続された平行金属棒アレイがボックスの底に配置された。試験の開始時に、マウスをゲートが開いた状態で明るい部屋に入れ、探索できるようにした。マウスが暗い部屋に入るとすぐにゲートが閉じられ、その後、マウスは電気ショック（０．５μＡ、０．５秒）を一度与えられ、学習のために訓練された。トレーニングの終了から２４、４８、７２時間後に、マウスの記憶を明るい部屋内での潜伏時間を記録することで測定した。最大継続時間は１８０秒に設定されている。明るい部屋内での潜伏時間が長いほど、学習と記憶が優れていることを示す。
【００３６】
能動的回避試験
マウスの学習および記憶に対する乳酸菌の効果は、古典的な条件付けおよび光および音刺激からの動物の回避により測定された。この実験には、中央のゲートによって明るい部屋と暗い部屋に分けられた特別な箱が使用された。部屋は互いに接続されるように設計され、電源に接続された平行金属棒アレイがボックスの底に配置された。すべてのマウスに１０秒間光と音の刺激（条件刺激、ＣＳ）を与え、ＣＳからの回避を示さなかったマウスにはさらに電気ショック（無条件刺激、ＵＣＳ）を与えた。ただし、ＣＳを回避した個体には、電気ショックは与えられなかった。実験動物に、ＣＳ／ＵＣＳによる上記の回避試験を、連続４日間、１日４回、各回５度与えた。この試験は、そのような試験条件下で回避を示す時間を測定することにより、マウスの学習と記憶を決定することを目的としている。能動的回避時間が長いほど、学習と記憶が優れていることを示す。
【００３７】
動物実験で使用される統計的方法
この研究から収集されたデータは、ＳＰＳＳ統計ソフトウェアを使用して分析された。得られた結果は、平均±ＳＥＭとして表され、一元配置分散分析（一元配置ＡＮＯＶＡ）によって分析され、複数のテストグループ間の差異がテストされた。グループのペア間の違いは、ダンカンの複数範囲テストを使用して測定された。ｐ＜０．０５は、統計的に有意な差を示す。
【００３８】
動物実験から得られた結果
各グループの老化スコア試験から得られた結果を以下の表６および７に示す。
【００３９】
【表６】
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【００４０】
【表７】
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１２週目の試験から得られた加齢スコアを考慮して、高用量および低用量の乳酸菌Ａ（ＧＫＳ６）を与えられた３ヶ月齢の雌および雄のＳＡＭＰ８マウスは、対照群よりも有意に低いスコアを示した。特に雌マウスでは、より有意な減少が見られた（ｐ＜０．０５）。高齢化スコアが高いほど（表６および７に示すように）、高齢化のレベルが高いことが示された。これらの結果は、ＳＡＭＰ８マウスに乳酸菌Ａ（ＧＫＳ６）サンプルを与えると、加齢スコアが低下する可能性があることを示している。したがって、乳酸菌Ａ（ＧＫＳ６）が老化防止に役立つことは明らかだ。
【００４１】
前腕握力試験から雄マウス群で得られた結果を表８に示し、図５に統計的に要約する。
【００４２】
【表８】
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１３週目の試験から得られたグリップ強度値を考慮して、乳酸菌Ａ（ＧＫＳ６）を与えられた３ヶ月齢の雌および雄の両方のＳＡＭＰ８マウスは、対照群と比較して有意に高い値（ｐ＜０．０５）を示した。グリップ強度の値が高いほど、筋肉の強度が高いことを示している。これらの結果は、乳酸菌Ａ（ＧＫＳ６）サンプルをマウスに与えると、筋力の改善に役立つ可能性があることを示している。したがって、乳酸菌Ａ（ＧＫＳ６）が加齢によるサルコペニアの緩和に役立つことは明らかだ。
【００４３】
単一試行受動的回避試験から雌マウス群で得られた結果を表９に示し、図６に統計的に要約する。一方、雄マウス群での単一試行受動的回避試験の結果を表１０に示し、図７に統計的に要約する。
【００４４】
【表９】
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【００４５】
【表１０】
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１３週目の試験から得られた潜伏時間を考慮して、乳酸菌Ａ（ＧＫＳ６）を与えられた３ヶ月齢の雌および雄の両方のＳＡＭＰ８マウスは、対照群よりも有意に長い潜伏時間を示した。特にトレーニング後２４時間で、対照群のマウスと比較して、試験群のマウスは潜伏時間の最も顕著な上昇（ｐ＜０．０５）を示した。潜伏時間が長いほど、学習と記憶が強いことを示している。これらの結果は、乳酸菌Ａ（ＧＫＳ６）サンプルをマウスに与えると、マウスの学習と記憶力を高めるのに役立つ可能性があることを示している。したがって、乳酸菌Ａ（ＧＫＳ６）が老化防止に役立つことは明らかだ。
【００４６】
能動的回避試験から雌マウス群で得られた結果を表１１に示し、図８に統計的に要約する。雄マウス群における能動的回避試験の結果を表１２に示し、図９に統計的に要約する。
【００４７】
【表１１】
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【００４８】
【表１２】
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１４週目の試験から得られた回避応答を考慮して、乳酸菌試料を与えられた３ヶ月齢の雌および雄のＳＡＭＰ８マウスの両方が、対照群と有意な差を示さなかった。これは、彼らが給餌後１日目にまだ学習段階にあったためである。ただし、２日目から４日目の雌試験群と雄試験群は、対照群と比較してより成功した回避反応を示した。特に二日目では、対照群と比較して、雌試験群は約２倍の回避反応を示した（Ｐ＜０．０５）。より成功した回避応答は、より強力な学習および記憶能力を示すことを考慮すると、これらの結果は、乳酸菌Ａ（ＧＫＳ６）サンプルをマウスに与えると、マウスの学習と記憶力を高めるのに役立つ可能性があることを示している。したがって、乳酸菌Ａ（ＧＫＳ６）は、加齢による神経変性によって損なわれている学習と記憶の改善に役立つことは明らかである。
【００４９】
要約すると、上記の試験結果から、乳酸菌、特にラクトバチルス・パラカゼイ、好ましくは乳酸菌Ａ（ＧＫＳ６）が、Ｃｉｓｄ２遺伝子（「長寿遺伝子」）の発現を増加させ、さまざまな老化スコア、握力、および学習と記憶を強化することに明らかに有用であると証明できたといえる。したがって、乳酸菌Ａ（ＧＫＳ６）の活性物質は、長寿促進に役立つ。
【００５０】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、前記予防および／または治療効果を生み出すのに十分な量を指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養実験では、上記の有効量はμｇ／ｍＬで表され、細胞培養で使用される培地の総量に基づいている。動物実験では、上記有効量は「ｇ／６０ｋｇ体重／日」として表される。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養実験から得られた有効量データは、次の式を使用して動物に適した有効量に変換できる。
【００５１】
Ｉ．一般的に言えば（Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈａｗｅｔａｌ．，２００８を参照）、１“μｇ／ｍＬ”（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養実験から計算された有効量に基づく）は１“ｍｇ／ｋｇ体重／日”（マウスモデル実験から計算された有効量に基づいて）と同等である。マウスの代謝率は人間の６倍であるという事実を考えると、人間の有効量をさらに計算できる。
【００５２】
ＩＩ．したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養実験から計算された有効量が５００μｇ／ｍＬの場合、マウスの有効量は５００ｍｇ／ｋｇ体重／日（つまり０．５ｇ／ｋｇ体重／日）として決定できる。さらに、ヒトの有効量は、上記のマウスと代謝率のヒトの違いを考慮して、５ｇ／６０ｋｇ体重／日として決定することができる。
【００５３】
ＩＩＩ．前の段落で説明したテスト結果を考慮すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養実験に基づく有効量は１．５μｇ／ｍＬである。したがって、マウスでの有効量は１．５ｍｇ／ｋｇ体重／日であり、したがって、ヒトでの合理的な有効量は０．０１５ｇ／６０ｋｇ体重／日であると想定されている。
【００５４】
好ましい実施形態では、組成物に含まれる乳酸菌活性物質の有効量は、１０ｍｇ／６０ｋｇ−１ｇ／６０ｋｇ体重／日である。
組成物は、添加剤をさらに含む。好ましい実施形態では、添加剤は、賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、吸収増強剤、甘味料、またはそれらの組み合わせであり得る。賦形剤は、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、スクロースまたはそれらの組み合わせから選択することができる。ベンジルアルコールやパラベンなどの防腐剤は、医薬組成物の貯蔵期間を延ばすことができる。希釈剤は、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセロールまたはそれらの組み合わせから選択することができる。充填剤は、ラクトース、高分子量ポリエチレングリコールまたはそれらの組み合わせから選択することができる。吸収増強剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ラウロカプラム、プロピレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコールまたはそれらの組み合わせから選択することができる。甘味料は、アセスルファムＫ、アスパルテーム、サッカリン、スクラロース、ネオテームまたはそれらの組み合わせから選択することができる。上記の添加物に加えて、活性物質細菌の薬理効果が影響を受けないのであれば、実際のニーズに応じて他を選択できる。
【００５５】
この組成物は、製薬業界でさまざまな製品に開発できる。好ましい実施形態では、組成物は、薬物、飼料、飲料、栄養補助食品、乳製品または健康食品である。
組成物は、対象のニーズを満たすために様々な形態をとることができる。好ましい実施形態では、組成物は、粉末、錠剤、顆粒、坐剤、マイクロカプセル、アンプル、液体スプレーまたは坐剤形態であり得る。
【００５６】
本発明の組成物は、動物またはヒトに投与することができる。活性物質細菌の効果が影響を受けない限り、それは任意の剤形で作られ、剤形に応じて動物またはヒトに適切な経路を介して投与される。
【００５７】
組成物の準備
本発明の乳酸菌活性物質が食用である場合、以下に説明される組成物１の形態は、乳酸菌活性物質の例示であり得る。
【００５８】
組成物１：乳酸菌Ａ（ＧＫＳ６）の凍結乾燥粉末を乳酸菌活性物質として使用し（２０重量％）、防腐剤として使用するベンジルアルコール（８重量％）および希釈剤として使用されるグリセロール（７ｗｔ％）とよく混合した。得られた混合物を純水（６５ｗｔ％）に溶解し、将来の使用のために４℃で保存した。「重量％」という表記は、組成物の総重量に対する各成分の重量の割合を指す。
【００５９】
本発明の乳酸菌活性物質が医療用途である場合、以下に説明される組成物２の形態は、乳酸菌活性物質の例示であり得る。
組成物２：乳酸菌Ａ（ＧＫＳ６）の凍結乾燥粉末を乳酸菌活性物質として使用し（２０重量％）、防腐剤として使用するベンジルアルコール（８重量％）、希釈剤として使用されるグリセロール（７ｗｔ％）、および希釈剤として使用されるスクロース（１０ｗｔ％）とよく混合した。得られた混合物を純水（５５ｗｔ％）に溶解し、将来の使用のために４℃で保存した。「重量％」という表記は、組成物の総重量に対する各成分の重量の割合を指す。
【００６０】
乳酸菌Ｈ（ＧＫＭ３）の寄託番号：ＣＧＭＣＣＮｏ．１４５６５
乳酸菌Ｉ（ＧＫＫ２）の寄託番号：ＣＧＭＣＣＮｏ．１５２０５
乳酸菌Ａ（ＧＫＳ６）の寄託番号：ＣＧＭＣＣＮｏ．１４５６６
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【外国語明細書】
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