(57)【要約】      （修正有）【課題】酸性条件下での安定性が向上した変異プロテアーゼの提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有する、又は、これと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列に対して、特定のアミノ酸配列の３０３位に相当する位置におけるアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、変異プロテアーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列の３０３位に相当する位置に、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、トレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンからなる群より選択されるアミノ酸残基を有する、変異プロテアーゼ。
【請求項２】
以下の（ａ´）〜（ｄｖ´）からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸残基を有する、請求項１記載の変異プロテアーゼ：
（ａ´）配列番号２のアミノ酸配列の６位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｂ´）配列番号２のアミノ酸配列の９位又はそれに相当する位置におけるＱ；
（ｃ´）配列番号２のアミノ酸配列の１１位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ又はＮ；
（ｄ´）配列番号２のアミノ酸配列の１５位又はそれに相当する位置におけるＨ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｅ´）配列番号２のアミノ酸配列の１６位又はそれに相当する位置におけるＴ、Ｑ、Ｖ、Ｃ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｆ´）配列番号２のアミノ酸配列の２０位又はそれに相当する位置におけるＦ又はＡ；
（ｇ´）配列番号２のアミノ酸配列の２２位又はそれに相当する位置におけるＷ；
（ｈ´）配列番号２のアミノ酸配列の２３位又はそれに相当する位置におけるＮ；
（ｉ´）配列番号２のアミノ酸配列の３７位又はそれに相当する位置におけるＴ；
（ｊ´）配列番号２のアミノ酸配列の４０位又はそれに相当する位置におけるＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ｋ´）配列番号２のアミノ酸配列の４１位又はそれに相当する位置におけるＩ；
（ｌ´）配列番号２のアミノ酸配列の４６位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷ；
（ｍ´）配列番号２のアミノ酸配列の４９位又はそれに相当する位置におけるＱ；
（ｎ´）配列番号２のアミノ酸配列の５２位又はそれに相当する位置におけるＧ又はＳ；
（ｏ´）配列番号２のアミノ酸配列の５３位又はそれに相当する位置におけるＡ、Ｖ又はＩ；
（ｐ´）配列番号２のアミノ酸配列の５４位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｑ´）配列番号２のアミノ酸配列の５６位又はそれに相当する位置におけるＶ；
（ｒ´）配列番号２のアミノ酸配列の５７位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｓ´）配列番号２のアミノ酸配列の５９位又はそれに相当する位置におけるＶ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｔ´）配列番号２のアミノ酸配列の６０位又はそれに相当する位置におけるＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ｕ´）配列番号２のアミノ酸配列の６３位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｄ又はＬ；
（ｖ´）配列番号２のアミノ酸配列の６５位又はそれに相当する位置におけるＷ又はＰ；
（ｗ´）配列番号２のアミノ酸配列の６６位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷ；
（ｘ´）配列番号２のアミノ酸配列の８０位又はそれに相当する位置におけるＨ又はＡ；
（ｙ´）配列番号２のアミノ酸配列の８１位又はそれに相当する位置におけるＱ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ｚ´）配列番号２のアミノ酸配列の８２位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ又はＭ；
（ａａ´）配列番号２のアミノ酸配列の８３位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｃ又はＡ；
（ａｂ´）配列番号２のアミノ酸配列の８４位又はそれに相当する位置におけるＲ；
（ａｃ´）配列番号２のアミノ酸配列の８９位又はそれに相当する位置におけるＨ；
（ａｄ´）配列番号２のアミノ酸配列の９１位又はそれに相当する位置におけるＣ；
（ａｅ´）配列番号２のアミノ酸配列の１００位又はそれに相当する位置におけるＬ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ａｆ´）配列番号２のアミノ酸配列の１０１位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｇ´）配列番号２のアミノ酸配列の１０２位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｈ´）配列番号２のアミノ酸配列の１０３位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｉ´）配列番号２のアミノ酸配列の１０４位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｊ´）配列番号２のアミノ酸配列の１０５位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｋ´）配列番号２のアミノ酸配列の１０６位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｌ´）配列番号２のアミノ酸配列の１０７位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｒ、Ｋ又はＡ；
（ａｍ´）配列番号２のアミノ酸配列の１０９位又はそれに相当する位置におけるＬ、Ｉ又はＦ；
（ａｎ´）配列番号２のアミノ酸配列の１１３位又はそれに相当する位置におけるＬ又はＷ；
（ａｏ´）配列番号２のアミノ酸配列の１１９位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｐ´）配列番号２のアミノ酸配列の１２０位又はそれに相当する位置におけるＹ、Ｒ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ａｑ´）配列番号２のアミノ酸配列の１２４位又はそれに相当する位置におけるＫ又はＡ；
（ａｒ´）配列番号２のアミノ酸配列の１３２位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｉ又はＭ；
（ａｓ´）配列番号２のアミノ酸配列の１３３位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｔ´）配列番号２のアミノ酸配列の１３４位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｔ又はＡ；
（ａｕ´）配列番号２のアミノ酸配列の１３３位又はそれに相当する位置と１３４位又はそれに相当する位置との間におけるＧ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷ；
（ａｖ´）配列番号２のアミノ酸配列の１３５位又はそれに相当する位置におけるＲ、Ａ、Ｌ又はＭ；
（ａｗ´）配列番号２のアミノ酸配列の１３６位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｘ´）配列番号２のアミノ酸配列の１３８位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｙ´）配列番号２のアミノ酸配列の１４０位又はそれに相当する位置におけるＬ、Ｗ又はＦ；
（ａｚ´）配列番号２のアミノ酸配列の１４８位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｂａ´）配列番号２のアミノ酸配列の１５１位又はそれに相当する位置におけるＦ；
（ｂｂ´）配列番号２のアミノ酸配列の１６３位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦ；
（ｂｃ´）配列番号２のアミノ酸配列の１６６位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ｂｄ´）配列番号２のアミノ酸配列の１６７位又はそれに相当する位置におけるＶ；
（ｂｅ´）配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はそれに相当する位置におけるＶ又はＬ；
（ｂｆ´）配列番号２のアミノ酸配列の１７１位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｔ、Ｅ又はＡ；
（ｂｇ´）配列番号２のアミノ酸配列の１８７位又はそれに相当する位置におけるＳ；
（ｂｈ´）配列番号２のアミノ酸配列の１９１位又はそれに相当する位置におけるＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ｂｉ´）配列番号２のアミノ酸配列の１９３位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｂｊ´）配列番号２のアミノ酸配列の１９４位又はそれに相当する位置におけるＹ、Ｒ又はＫ；
（ｂｋ´）配列番号２のアミノ酸配列の１９５位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｂｌ´）配列番号２のアミノ酸配列の２００位又はそれに相当する位置におけるＷ；
（ｂｍ´）配列番号２のアミノ酸配列の２０１位又はそれに相当する位置におけるＤ、Ｅ又はＱ；
（ｂｎ´）配列番号２のアミノ酸配列の２０２位又はそれに相当する位置におけるＥ；
（ｂｏ´）配列番号２のアミノ酸配列の２０４位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＰ；
（ｂｐ´）配列番号２のアミノ酸配列の２０５位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷ；
（ｂｑ´）配列番号２のアミノ酸配列の２１２位又はそれに相当する位置におけるＮ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｌ又はＷ；
（ｂｒ´）配列番号２のアミノ酸配列の２２６位又はそれに相当する位置におけるＹ；
（ｂｓ´）配列番号２のアミノ酸配列の２３３位又はそれに相当する位置におけるＬ、Ｉ又はＷ；
（ｂｔ´）配列番号２のアミノ酸配列の２３７位又はそれに相当する位置におけるＮ；
（ｂｕ´）配列番号２のアミノ酸配列の２３８位又はそれに相当する位置におけるＬ；
（ｂｖ´）配列番号２のアミノ酸配列の２４３位又はそれに相当する位置におけるＹ、Ｌ又はＩ；
（ｂｗ´）配列番号２のアミノ酸配列の２４５位又はそれに相当する位置におけるＮ；
（ｂｘ´）配列番号２のアミノ酸配列の２４６位又はそれに相当する位置におけるＹ、Ｖ、Ｌ、Ｗ又はＦ；
（ｂｙ´）配列番号２のアミノ酸配列の２４７位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｂｚ´）配列番号２のアミノ酸配列の２４８位又はそれに相当する位置におけるＦ；
（ｃａ´）配列番号２のアミノ酸配列の２５０位又はそれに相当する位置におけるＦ；
（ｃｂ´）配列番号２のアミノ酸配列の２５１位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ａ、Ｖ、Ｌ又はＩ；
（ｃｃ´）配列番号２のアミノ酸配列の２５６位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｃｄ´）配列番号２のアミノ酸配列の２５７位又はそれに相当する位置におけるＶ又はＩ；
（ｃｅ´）配列番号２のアミノ酸配列の２６４位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＭ；
（ｃｆ´）配列番号２のアミノ酸配列の２７３位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｔ又はＩ；
（ｃｇ´）配列番号２のアミノ酸配列の２７５位又はそれに相当する位置におけるＬ、Ｗ又はＦ；
（ｃｈ´）配列番号２のアミノ酸配列の２７７位又はそれに相当する位置におけるＶ、Ｌ、Ｉ又はＦ；
（ｃｉ´）配列番号２のアミノ酸配列の２８１位又はそれに相当する位置におけるＲ；
（ｃｊ´）配列番号２のアミノ酸配列の２９４位又はそれに相当する位置におけるＴ；
（ｃｋ´）配列番号２のアミノ酸配列の２９６位又はそれに相当する位置におけるＶ；
（ｃｌ´）配列番号２のアミノ酸配列の２９７位又はそれに相当する位置におけるＬ、Ｗ又はＦ；
（ｃｍ´）配列番号２のアミノ酸配列の３０４位又はそれに相当する位置におけるＳ又はＡ；
（ｃｎ´）配列番号２のアミノ酸配列の３１３位又はそれに相当する位置におけるＮ；
（ｃｏ´）配列番号２のアミノ酸配列の３１９位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｃｐ´）配列番号２のアミノ酸配列の３２０位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｔ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦ；
（ｃｑ´）配列番号２のアミノ酸配列の３２６位又はそれに相当する位置におけるＷ；
（ｃｒ´）配列番号２のアミノ酸配列の３３０位又はそれに相当する位置におけるＭ、Ｗ又はＦ；
（ｃｓ´）配列番号２のアミノ酸配列の３３２位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｔ又はＶ；
（ｃｔ´）配列番号２のアミノ酸配列の３３４位又はそれに相当する位置におけるＬ；
（ｃｕ´）配列番号２のアミノ酸配列の３３５位又はそれに相当する位置におけるＦ；
（ｃｖ´）配列番号２のアミノ酸配列の３３７位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ又はＶ；
（ｃｗ´）配列番号２のアミノ酸配列の３４２位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｃｘ´）配列番号２のアミノ酸配列の３４３位又はそれに相当する位置におけるＴ；
（ｃｙ´）配列番号２のアミノ酸配列の３４６位又はそれに相当する位置におけるＲ；
（ｃｚ´）配列番号２のアミノ酸配列の３５７位又はそれに相当する位置におけるＬ；
（ｄａ´）配列番号２のアミノ酸配列の３５９位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｑ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦ；
（ｄｂ´）配列番号２のアミノ酸配列の３６１位又はそれに相当する位置におけるＶ、Ｉ又はＷ；
（ｄｃ´）配列番号２のアミノ酸配列の３６９位又はそれに相当する位置におけるＮ；
（ｄｄ´）配列番号２のアミノ酸配列の３７６位又はそれに相当する位置におけるＷ；
（ｄｅ´）配列番号２のアミノ酸配列の３７８位又はそれに相当する位置におけるＬ又はＷ；
（ｄｆ´）配列番号２のアミノ酸配列の３７９位又はそれに相当する位置におけるＤ、Ｅ、Ｒ又はＫ；
（ｄｇ´）配列番号２のアミノ酸配列の３８０位又はそれに相当する位置におけるＦ；
（ｄｈ´）配列番号２のアミノ酸配列の３８５位又はそれに相当する位置におけるＹ、Ｍ又はＰ；
（ｄｉ´）配列番号２のアミノ酸配列の３８６位又はそれに相当する位置におけるＡ、Ｌ、Ｉ又はＭ；
（ｄｊ´）配列番号２のアミノ酸配列の３８７位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｄｋ´）配列番号２のアミノ酸配列の３９０位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｔ、Ｙ又はＦ；
（ｄｌ´）配列番号２のアミノ酸配列の３９３位又はそれに相当する位置におけるＱ；
（ｄｍ´）配列番号２のアミノ酸配列の３９６位又はそれに相当する位置におけるＧ；
（ｄｎ´）配列番号２のアミノ酸配列の４０３位又はそれに相当する位置におけるＴ又はＫ；
（ｄｏ´）配列番号２のアミノ酸配列の４０５位又はそれに相当する位置におけるＤ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｄｐ´）配列番号２のアミノ酸配列の４０６位又はそれに相当する位置におけるＶ、Ｗ又はＦ；
（ｄｑ´）配列番号２のアミノ酸配列の４０７位又はそれに相当する位置におけるＧ又はＣ；
（ｄｒ´）配列番号２のアミノ酸配列の４０８位又はそれに相当する位置におけるＮ、Ｙ、Ｉ又はＷ；
（ｄｓ´）配列番号２のアミノ酸配列の４０９位又はそれに相当する位置におけるＹ又はＷ；
（ｄｔ´）配列番号２のアミノ酸配列の４１１位又はそれに相当する位置におけるＡ、Ｖ、Ｌ又はＰ；
（ｄｕ´）配列番号２のアミノ酸配列の４２７位又はそれに相当する位置におけるＲ又はＶ；及び 
（ｄｖ´）配列番号２のアミノ酸配列の４３３位又はそれに相当する位置におけるＬ。
【請求項３】
以下のいずれかのアミノ酸残基又はその組み合わせを有する、請求項２記載の変異プロテアーゼ：
前記（ａｒ´）；
前記（ｂｋ´）；
前記（ｂｍ´）；
前記（ｃｊ´）；
前記（ｃｍ´）；
前記（ｄｃ´）；
前記（ｅ´）及び（ａａ´）の組み合わせ；
前記（ｂｃ´）及び（ｂｄ´）の組み合わせ；
前記（ｂｍ´）及び（ｂｎ´）の組み合わせ；
前記（ｂｍ´）及び（ｃｍ´）の組み合わせ；
前記（ｂｍ´）、（ｂｎ´）及び（ｃｍ´）の組み合わせ；
前記（ｄ´）、（ｂｍ´）及び（ｃｍ´）の組み合わせ；
前記（ｄ´）、（ｂｍ´）、（ｂｎ´）及び（ｃｍ´）の組み合わせ；
前記（ｖ´）、（ｃｆ´）、（ｄａ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
前記（ｊ´）、（ｓ´）、（ｙ´）、（ｂｈ´）及び（ｄｏ´）の組み合わせ；
前記（ａｓ´）及び（ａｔ´）及び（ａｕ´）の組み合わせ；
前記（ｅ´）、（ｖ´）、（ａａ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｃｆ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
前記（ｅ´）、（ｖ´）、（ａａ´）、（ａｒ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｃｆ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
前記（ｊ´）、（ｓ´）、（ｖ´）、（ｙ´）、（ａｓ´）、（ａｔ´）、（ａｕ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｈ´）、（ｂｋ´）、（ｃｆ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）、（ｄｊ´）及び（ｄｏ´）の組み合わせ；
前記（ｖ´）、（ａａ´）、（ａｒ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｃｆ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
前記（ｖ´）、（ａｓ´）、（ａｔ´）、（ａｕ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｃｆ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
前記（ｅ´）、（ｖ´）、（ａａ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｂｏ´）、（ｃｆ´）、（ｃｏ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
前記（ｖ´）、（ａｓ´）、（ａｔ´）、（ａｕ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｊ´）、（ｂｋ´）、（ｂｑ´）（ｃｆ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）、（ｄｆ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
前記（ｅ´）、（ｖ´）、（ａａ´）、（ａｒ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｃｆ´）、（ｃｊ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
前記（ｅ´）、（ｖ´）、（ｚ´）、（ａａ´）、（ａｒ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｂｏ´）、（ｃｆ´）、（ｃｊ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
前記（ｅ´）、（ｖ´）、（ｚ´）、（ａａ´）、（ａｒ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｂｍ´）、（ｂｎ´）、（ｂｏ´）、（ｃｆ´）、（ｃｊ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
前記（ｅ´）、（ｖ´）、（ｚ´）、（ａａ´）、（ａｒ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｂｍ´）、（ｂｏ´）、（ｃｆ´）、（ｃｊ´）、（ｃｍ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
前記（ｅ´）、（ｖ´）、（ｚ´）、（ａａ´）、（ａｒ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｂｍ´）、（ｂｎ´）、（ｂｏ´）、（ｃｆ´）、（ｃｊ´）、（ｃｍ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
前記（ｄ´）、（ｅ´）、（ｖ´）、（ｚ´）、（ａａ´）、（ａｒ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｂｍ´）、（ｂｏ´）、（ｃｆ´）、（ｃｊ´）、（ｃｍ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；ならびに
前記（ｄ´）、（ｅ´）、（ｖ´）、（ｚ´）、（ａａ´）、（ａｒ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｂｍ´）、（ｂｎ´）、（ｂｏ´）、（ｃｆ´）、（ｃｊ´）、（ｃｍ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ。
【請求項４】
以下の（ｄ1´）、（ｂｍ1´）、（ｂｎ1´）及び（ｃｍ1´）からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸残基を有する、請求項２記載の変異プロテアーゼ：
（ｄ1´）配列番号２の１５位に相当する位置におけるＤ又はＥ；
（ｂｍ1´）配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＤ又はＥ；
（ｂｎ1´）配列番号２の２０２位に相当する位置におけるＥ；及び
（ｃｍ1´）配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＡ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項７】
請求項５記載のポリヌクレオチド又は請求項６記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換体を用いる変異プロテアーゼの製造方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項記載の変異プロテアーゼを含有する洗剤組成物。
【請求項１０】
配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列の３０３位に相当する位置のアミノ酸残基をアスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、トレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンからなる群より選択されるアミノ酸残基に置換することを含む、変異プロテアーゼの製造方法。
【請求項１１】
配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列の３０３位に相当する位置のアミノ酸残基をアスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、トレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンからなる群より選択されるアミノ酸残基に置換することを含む、プロテアーゼの酸性条件下での安定性の向上方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異プロテアーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
洗剤はその形態により、粉末洗剤と液体洗剤に分類することが出来る。液体洗剤は、粉末洗剤に比べて溶解性に優れ、また汚れ部分に原液を直接塗布出来るという利点がある。反面、液体洗剤は、プロテアーゼ等の酵素を液体中で常温保存しなければならないため、酵素の安定保存に関して粉末洗剤には無い技術的な困難さを伴う。さらに、液体洗剤は、界面活性剤、脂肪酸、溶剤、キレート剤等を含有するため、酵素にとって極めて厳しい条件になっている。
【０００３】
粉末洗剤のｐＨは一般にアルカリ側にあるため、洗剤用プロテアーゼとしては、アルカリ側に至適ｐＨを有するプロテアーゼが開発されてきた。例えば、特許文献１には、タンパク質と脂質が混在する複合汚れに対して洗浄性を有する分子量約４３，０００のプロテアーゼが開示されている。さらに特許文献２〜７には、プロテアーゼに比活性、安定性、耐熱性、液体洗剤中での溶解性等を向上させる変異を導入して得られた変異プロテアーゼが開示されている。
【０００４】
一方、近年の液体洗剤は、様々な機能を付与するために組成やｐＨの条件が広がる傾向にある。例えば、洗浄した衣類に抗菌性を付与するため、液体洗剤にカチオン界面活性剤を配合する場合がある。その際には、該カチオン界面活性剤を配合した液体洗剤自体から発生する臭いを低減するために、該液体洗剤のｐＨを弱酸性以下にすることが望ましいとされる（特許文献８参照）。しかしながら、上記のような洗剤用プロテアーゼは、元来アルカリ側に至適ｐＨを有し、酸性の液体洗剤中では不安定である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第99/18218号パンフレット
【特許文献２】特開２００４−３０５１７５号公報
【特許文献３】特開２０１０−２７３６７２号公報
【特許文献４】特開２０１０−２７３６７３号公報
【特許文献５】特開２０１１−２００２４９号公報
【特許文献６】特開２０１３−２３３１４１号公報
【特許文献７】特開２０１７−２２１１８８号公報
【特許文献８】特開２０１７−００８３０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、酸性条件下での安定性が向上した変異プロテアーゼを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、分子量４３，０００のプロテアーゼＫＰ４３が、そのアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸残基を置換することによって、酸性条件下での安定性が向上することを見出した。
【０００８】
すなわち、一態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列の３０３位に相当する位置に、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなる群より選択されるアミノ酸残基を有する、変異プロテアーゼを提供する。
別の一態様において、本発明は、前記変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
別の一態様において、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
別の一態様において、本発明は、前記ポリヌクレオチド又は前記ベクターを含む形質転換体を提供する。
別の一態様において、本発明は、前記形質転換体を用いる変異プロテアーゼの製造方法を提供する。
さらなる一態様において、本発明は、前記変異プロテアーゼを含有する洗剤組成物を提供する。
さらなる一態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列の３０３位に相当する位置におけるアミノ酸残基をアスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなる群より選択されるアミノ酸残基に置換することを含む、変異プロテアーゼの製造方法を提供する。
さらなる一態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列の３０３位に相当する位置におけるアミノ酸残基をアスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなる群より選択されるアミノ酸残基に置換することを含む、プロテアーゼの酸性条件下での安定性の向上方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の変異プロテアーゼは、アルカリ側ｐＨで高いプロテアーゼ活性を有するとともに、酸性条件下でも酵素活性を安定に保持することができる。したがって、本発明の変異プロテアーゼは、幅広いｐＨ条件下において酵素活性を発揮することができる。本発明の変異プロテアーゼは、アルカリ性から弱酸性を有する様々な洗剤組成物に配合する酵素として使用され得る。例えば、本発明の変異プロテアーゼを、抗菌性付与のためにカチオン界面活性剤を含む弱酸性の洗剤組成物に配合すれば、該洗剤組成物は、弱酸性であるためカチオン界面活性剤による洗剤自体の臭いがしにくいだけでなく、プロテアーゼ活性を安定に保持しているため優れた洗浄性を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
【００１１】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【００１２】
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１３】
本明細書において、「１又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、１個以上２０個以下、好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。また本明細書において、「１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列」としては、１個以上６０個以下、好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列が挙げられる。また本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は複数個のアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。
【００１４】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ  ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ  ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ−ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。
【００１５】
当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリジン又はグルタミン；グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミン；セリンとトレオニン又はアラニン；グルタミンとアスパラギン又はアルギニン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置に対応する位置にアラインされた目的アミノ酸配列のアミノ酸残基の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされ、当該アミノ酸残基は「相当する位置のアミノ酸残基」と称される。
【００１７】
本明細書において、変異ポリペプチドの「親」ポリペプチドとは、そのアミノ酸残基に所定の変異がなされることにより、当該変異ポリペプチドとなるポリペプチドをいう。言い換えると、「親」ポリペプチドとは、ポリペプチド変異体が変異される前のポリペプチドである。同様に、変異ポリヌクレオチドの「親」ポリヌクレオチドとは、そのヌクレオチドに所定の変異がなされることにより、当該変異ポリヌクレオチドとなるポリヌクレオチドをいう。言い換えると、「親」ポリヌクレオチドとは、変異ポリヌクレオチドが変異される前のポリヌクレオチドである。
【００１８】
本明細書において、プロモーター等の制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
【００１９】
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。
【００２０】
本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。
【００２１】
本発明は、変異プロテアーゼを提供する。本発明の変異プロテアーゼは、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼに対して、配列番号２のアミノ酸配列の３０３位に相当する位置のアミノ酸残基がアスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなる群より選択されるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる。
【００２２】
本発明の変異プロテアーゼ（以下、本発明の変異体ともいう）の親プロテアーゼとしては、配列番号２のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ、及び配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼが挙げられる。配列番号２のアミノ酸配列からなるプロテアーゼの例としては、ＫＰ４３〔バチルス  エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３２）〕由来のプロテアーゼが挙げられる（特許文献１を参照）。
【００２３】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼの好ましい例としては、配列番号２のアミノ酸配列と９５％以上の同一性、より好ましくは９６％以上の同一性、さらに好ましくは９７％以上の同一性、さらに好ましくは９８％以上の同一性、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するプロテアーゼが挙げられる。配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼの別の例としては、配列番号２のアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるプロテアーゼが挙げられる。
【００２４】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼのさらなる例としては、プロテアーゼＫＰ９８６０［バチルス  エスピーＫＳＭ−ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３４）由来、ＷＯ９９／１８２１８、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０４６４０３］、及びプロテアーゼ９８６５〔バチルス  エスピーＫＳＭ−９８６５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６６）由来、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０８４１５５〕が挙げられる。
【００２５】
本発明で親プロテアーゼとして用いられる、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼは、配列番号２のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ由来の変異プロテアーゼであってもよい。当該変異プロテアーゼの例としては、上記ＫＰ−４３株由来のプロテアーゼに対して、特開２００２−２１８９８９号公報、特開２００２−３０６１７６号公報、特開２００４−０００１２２号公報、特開２００４−３０５１７６号公報、特開２００６−１２９８６５号公報、特開２００７−０６１１０１号公報、特開２００８−２１２０８４号公報、特開２００９−０３４０６２号公報、特開２０１０−２７３６７２号公報、特開２０１０−２７３６７３号公報、特開２０１１−２００２４９号公報、特開２０１２−２２８２１６号公報、特開２０１３−２３３１４１号公報、及び特開２０１７−２２１１８８号公報に記載される変異のうちの１つ以上を施した変異プロテアーゼが挙げられる。
【００２６】
上述した本発明で親プロテアーゼとして用いられる変異プロテアーゼの好ましい例としては、配列番号２のアミノ酸配列に対して以下の（ａ）〜（ｄｖ）からなる群より選択される１つ以上の変異を有する変異プロテアーゼが挙げられる：
（ａ）６位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｂ）９位又はそれに相当する位置におけるＫからＱへの置換；
（ｃ）１１位又はそれに相当する位置におけるＤからＧ、Ｓ又はＮへの置換；
（ｄ）１５位又はそれに相当する位置におけるＳからＨ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｅ）１６位又はそれに相当する位置におけるＳからＴ、Ｑ、Ｖ、Ｃ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｆ）２０位又はそれに相当する位置におけるＹからＦ又はＡへの置換；
（ｇ）２２位又はそれに相当する位置におけるＱからＷへの置換；
（ｈ）２３位又はそれに相当する位置におけるＧからＮへの置換；
（ｉ）３７位又はそれに相当する位置におけるＲからＴへの置換；
（ｊ）４０位又はそれに相当する位置におけるＳからＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｋ）４１位又はそれに相当する位置におけるＳからＩへの置換；
（ｌ）４６位又はそれに相当する位置におけるＦからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷへの置換；
（ｍ）４９位又はそれに相当する位置におけるＫからＱへの置換；
（ｎ）５２位又はそれに相当する位置におけるＡからＧ又はＳへの置換；
（ｏ）５３位又はそれに相当する位置におけるＬからＡ、Ｖ又はＩへの置換；
（ｐ）５４位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｑ）５６位又はそれに相当する位置におけるＬからＶへの置換；
（ｒ）５７位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｓ）５９位又はそれに相当する位置におけるＴからＶ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｔ）６０位又はそれに相当する位置におけるＮからＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｕ）６３位又はそれに相当する位置におけるＮからＳ、Ｄ又はＬへの置換；
（ｖ）６５位又はそれに相当する位置におけるＴからＷ又はＰへの置換；
（ｗ）６６位又はそれに相当する位置におけるＮからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷへの置換；
（ｘ）８０位又はそれに相当する位置におけるＧからＨ又はＡへの置換；
（ｙ）８１位又はそれに相当する位置におけるＳからＱ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｚ）８２位又はそれに相当する位置におけるＴからＧ、Ｓ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ又はＭへの置換；
（ａａ）８３位又はそれに相当する位置におけるＮからＳ、Ｃ又はＡへの置換；
（ａｂ）８４位又はそれに相当する位置におけるＫからＲへの置換；
（ａｃ）８９位又はそれに相当する位置におけるＱからＨへの置換；
（ａｄ）９１位又はそれに相当する位置におけるＮからＣへの置換；
（ａｅ）１００位又はそれに相当する位置におけるＳからＬ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ａｆ）１０１位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｇ）１０２位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｈ）１０３位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｉ）１０４位又はそれに相当する位置におけるＬからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｊ）１０５位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｋ）１０６位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｌ）１０７位又はそれに相当する位置におけるＬからＳ、Ｒ、Ｋ又はＡへの置換；
（ａｍ）１０９位又はそれに相当する位置におけるＳからＬ、Ｉ又はＦへの置換；
（ａｎ）１１３位又はそれに相当する位置におけるＴからＬ又はＷへの置換；
（ａｏ）１１９位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｐ）１２０位又はそれに相当する位置におけるＳからＹ、Ｒ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ａｑ）１２４位又はそれに相当する位置におけるＲからＫ又はＡへの置換；
（ａｒ）１３２位又はそれに相当する位置におけるＡからＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｉ又はＭへの置換；
（ａｓ）１３３位又はそれに相当する位置におけるＡからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｔ）１３４位又はそれに相当する位置におけるＶからＧ、Ｓ、Ｔ又はＡへの置換；
（ａｕ）１３３位又はそれに相当する位置と１３４位又はそれに相当する位置との間へのＧ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷの挿入；
（ａｖ）１３５位又はそれに相当する位置におけるＮからＲ、Ａ、Ｌ又はＭへの置換；
（ａｗ）１３６位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｘ）１３８位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｙ）１４０位又はそれに相当する位置におけるＴからＬ、Ｗ又はＦへの置換；
（ａｚ）１４８位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｂａ）１５１位又はそれに相当する位置におけるＫからＦへの置換；
（ｂｂ）１６３位又はそれに相当する位置におけるＥからＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦへの置換；
（ｂｃ）１６６位又はそれに相当する位置におけるＮからＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｂｄ）１６７位又はそれに相当する位置におけるＧからＶへの置換；
（ｂｅ）１７０位又はそれに相当する位置におけるＩからＶ又はＬへの置換；
（ｂｆ）１７１位又はそれに相当する位置におけるＳからＧ、Ｔ、Ｅ又はＡへの置換；
（ｂｇ）１８７位又はそれに相当する位置におけるＮからＳへの置換；
（ｂｈ）１９１位又はそれに相当する位置におけるＳからＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｂｉ）１９３位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｂｊ）１９４位又はそれに相当する位置におけるＳからＹ、Ｒ又はＫへの置換；
（ｂｋ）１９５位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｂｌ）２００位又はそれに相当する位置におけるＮからＷへの置換；
（ｂｍ）２０１位又はそれに相当する位置におけるＨからＤ、Ｅ又はＱへの置換；
（ｂｎ）２０２位又はそれに相当する位置におけるＶからＥへの置換；
（ｂｏ）２０４位又はそれに相当する位置におけるＱからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＰへの置換；
（ｂｐ）２０５位又はそれに相当する位置におけるＦからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷへの置換；
（ｂｑ）２１２位又はそれに相当する位置におけるＫからＮ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｌ又はＷへの置換；
（ｂｒ）２２６位又はそれに相当する位置におけるＦからＹへの置換；
（ｂｓ）２３３位又はそれに相当する位置におけるＳからＬ、Ｉ又はＷへの置換；
（ｂｔ）２３７位又はそれに相当する位置におけるＤからＮへの置換；
（ｂｕ）２３８位又はそれに相当する位置におけるＳからＬへの置換；
（ｂｖ）２４３位又はそれに相当する位置におけるＮからＹ、Ｌ又はＩへの置換；
（ｂｗ）２４５位又はそれに相当する位置におけるＤからＮへの置換；
（ｂｘ）２４６位又はそれに相当する位置におけるＳからＹ、Ｖ、Ｌ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｂｙ）２４７位又はそれに相当する位置におけるＫからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｂｚ）２４８位又はそれに相当する位置におけるＹからＦへの置換；
（ｃａ）２５０位又はそれに相当する位置におけるＹからＦへの置換；
（ｃｂ）２５１位又はそれに相当する位置におけるＭからＧ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ａ、Ｖ、Ｌ又はＩへの置換；
（ｃｃ）２５６位又はそれに相当する位置におけるＭからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｃｄ）２５７位又はそれに相当する位置におけるＡからＶ又はＩへの置換；
（ｃｅ）２６４位又はそれに相当する位置におけるＮからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＭへの置換；
（ｃｆ）２７３位又はそれに相当する位置におけるＶからＧ、Ｔ又はＩへの置換；
（ｃｇ）２７５位又はそれに相当する位置におけるＮからＬ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｃｈ）２７７位又はそれに相当する位置におけるＧからＶ、Ｌ、Ｉ又はＦへの置換；
（ｃｉ）２８１位又はそれに相当する位置におけるＫからＲへの置換；
（ｃｊ）２９４位又はそれに相当する位置におけるＡからＴへの置換；
（ｃｋ）２９６位又はそれに相当する位置におけるＩからＶへの置換；
（ｃｌ）２９７位又はそれに相当する位置におけるＧからＬ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｃｍ）３０４位又はそれに相当する位置におけるＮからＳ又はＡへの置換；
（ｃｎ）３１３位又はそれに相当する位置におけるＤからＮへの置換；
（ｃｏ）３１９位又はそれに相当する位置におけるＡからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｃｐ）３２０位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｔ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦへの置換；
（ｃｑ）３２６位又はそれに相当する位置におけるＳからＷへの置換；
（ｃｒ）３３０位又はそれに相当する位置におけるＳからＭ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｃｓ）３３２位又はそれに相当する位置におけるＫからＧ、Ｔ又はＶへの置換；
（ｃｔ）３３４位又はそれに相当する位置におけるＴからＬへの置換；
（ｃｕ）３３５位又はそれに相当する位置におけるＹからＦへの置換；
（ｃｖ）３３７位又はそれに相当する位置におけるＦからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ又はＶへの置換；
（ｃｗ）３４２位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｃｘ）３４３位又はそれに相当する位置におけるＫからＴへの置換；
（ｃｙ）３４６位又はそれに相当する位置におけるＫからＲへの置換；
（ｃｚ）３５７位又はそれに相当する位置におけるＳからＬへの置換；
（ｄａ）３５９位又はそれに相当する位置におけるＴからＧ、Ｓ、Ｑ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦへの置換；
（ｄｂ）３６１位又はそれに相当する位置におけるＳからＶ、Ｉ又はＷへの置換；
（ｄｃ）３６９位又はそれに相当する位置におけるＤからＮへの置換；
（ｄｄ）３７６位又はそれに相当する位置におけるＮからＷへの置換；
（ｄｅ）３７８位又はそれに相当する位置におけるＴからＬ又はＷへの置換；
（ｄｆ）３７９位又はそれに相当する位置におけるＱからＤ、Ｅ、Ｒ又はＫへの置換；
（ｄｇ）３８０位又はそれに相当する位置におけるＹからＦへの置換；
（ｄｈ）３８５位又はそれに相当する位置におけるＦからＹ、Ｍ又はＰへの置換；
（ｄｉ）３８６位又はそれに相当する位置におけるＴからＡ、Ｌ、Ｉ又はＭへの置換；
（ｄｊ）３８７位又はそれに相当する位置におけるＳからＧ、Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｄｋ）３９０位又はそれに相当する位置におけるＮからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｙ又はＦへの置換；
（ｄｌ）３９３位又はそれに相当する位置におけるＷからＱへの置換；
（ｄｍ）３９６位又はそれに相当する位置におけるＲからＧへの置換；
（ｄｎ）４０３位又はそれに相当する位置におけるＦからＴ又はＫへの置換；
（ｄｏ）４０５位又はそれに相当する位置におけるＮからＤ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｄｐ）４０６位又はそれに相当する位置におけるＡからＶ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｄｑ）４０７位又はそれに相当する位置におけるＰからＧ又はＣへの置換；
（ｄｒ）４０８位又はそれに相当する位置におけるＱからＮ、Ｙ、Ｉ又はＷへの置換；
（ｄｓ）４０９位又はそれに相当する位置におけるＳからＹ又はＷへの置換；
（ｄｔ）４１１位又はそれに相当する位置におけるＴからＡ、Ｖ、Ｌ又はＰへの置換；
（ｄｕ）４２７位又はそれに相当する位置におけるＴからＲ又はＶへの置換；
（ｄｖ）４３３位又はそれに相当する位置におけるＶからＬへの置換。
【００２７】
上記（ａ）〜（ｄｖ）の変異は、いずれか単独で適用してもいずれか２以上を組み合わせてもよい。好ましい例としては、以下が挙げられる：
該（ａｒ）；
該（ｂｋ）；
該（ｂｍ）；
該（ｃｊ）；
該（ｃｍ）；
該（ｄｃ）；
該（ｅ）及び（ａａ）の組み合わせ；
該（ｂｃ）及び（ｂｄ）の組み合わせ；
該（ｂｍ）及び（ｂｎ）の組み合わせ；
該（ｂｍ）及び（ｃｍ）の組み合わせ；
該（ｂｍ）、（ｂｎ）及び（ｃｍ）の組み合わせ；
該（ｄ）、（ｂｍ）及び（ｃｍ）の組み合わせ；
該（ｄ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）及び（ｃｍ）の組み合わせ；
該（ｖ）、（ｃｆ）、（ｄａ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｊ）、（ｓ）、（ｙ）、（ｂｈ）及び（ｄｏ）の組み合わせ；
該（ａｓ）及び（ａｔ）及び（ａｕ）の組み合わせ；
該（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｆ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｆ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｊ）、（ｓ）、（ｖ）、（ｙ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｈ）、（ｂｋ）、（ｃｆ）、（ｄａ）、（ｄｃ）、（ｄｊ）及び（ｄｏ）の組み合わせ；
該（ｖ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｆ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｖ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｆ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｏ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｖ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｑ）（ｃｆ）、（ｄａ）、（ｄｃ）、（ｄｆ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｅ）、（ｖ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｅ）、（ｖ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｅ）、（ｖ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｍ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｃｍ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｅ）、（ｖ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｃｍ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｄ）、（ｅ）、（ｖ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｍ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｃｍ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；ならびに、
該（ｄ）、（ｅ）、（ｖ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｃｍ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ。
【００２８】
好ましくは、当該本発明の変異体の親プロテアーゼのアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列の３０位に相当する位置のアミノ酸残基はアスパラギン酸であり、６８位に相当する位置のアミノ酸残基はヒスチジンであり、かつ２５５位に相当する位置のアミノ酸残基はセリンである。より好ましくは、当該本発明の変異体の親プロテアーゼは、配列番号２のアミノ酸配列における下記表１（ｉ）に記載の各位置に相当する位置に、表１（ｉｉ）に記載のアミノ酸残基を有する。表１に示すアミノ酸残基は、上記に例示した親プロテアーゼ間で高度に保存されているアミノ酸残基である（Ｓａｅｋｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００７，１０３：５０１−５０８）。
【００２９】
【表１】
2020145938.tif 000002
【００３０】
好ましくは、上述した本発明の変異体の親プロテアーゼにおける配列番号２の３０３位に相当する位置のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンではない。より好ましくは、該親プロテアーゼにおける配列番号２の３０３位に相当する位置のアミノ酸残基はグリシンである。
【００３１】
上述した本発明の変異体の親プロテアーゼは、アルカリ側（好ましくはｐＨ８以上）でタンパク質分解活性を有するポリペプチドである。好ましくは、該親プロテアーゼは、アルカリ側（好ましくはｐＨ８以上）に至適ｐＨを有するポリペプチドである。より好ましくは、該親プロテアーゼは、配列番号２のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ（特許文献１）が有する次の酵素学的性質のいずれかを有する：１）酸化剤耐性を有し、アルカリ側（ｐＨ８以上）で作用し、かつ安定である。ここで、酸化剤耐性を有するとは、当該プロテアーゼを５０ｍＭ過酸化水素（５ｍＭ塩化カルシウムを含有）溶液中（２０ｍＭブリットン・ロビンソン緩衝液、ｐＨ１０）で、２０℃で２０分間放置した後の残存活性（合成基質法）が少なくとも５０％以上であることをいう；２）５０℃、ｐＨ１０で１０分間処理したとき８０％以上の残存活性を示す；３）ジイソプロピルフルオルリン酸（ＤＦＰ）及びフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）で阻害される；４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が４３，０００±２，０００である。より好ましくは、当該親プロテアーゼは、上記１）〜４）の酵素学的性質を全て有する。
【００３２】
本発明の変異体の親プロテアーゼの好ましい例としては、配列番号２〜４のいずれかのアミノ酸配列からなるプロテアーゼが挙げられる。配列番号３及び４のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配に対して、それぞれ９７．２％及び９６．８％の同一性を有する。
【００３３】
本発明の変異プロテアーゼは、上述した親プロテアーゼのアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列の３０３位に相当する位置のアミノ酸残基を、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、トレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンからなる群より選択される他のアミノ酸残基に置換することによって製造することができる。好ましくは、該他のアミノ酸残基はアスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、バリン、トリプトファン、又はチロシンであり、より好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、又はバリンである。
【００３４】
上述した親プロテアーゼの間で、配列番号２のアミノ酸配列の３０３位に相当する位置のアミノ酸残基は、それらのタンパク質の三次元構造中で、配列番号２のプロテアーゼの３０３位グリシンと同等の位置に存在すると考えられる。したがって、親プロテアーゼにおける該３０３位に相当する位置に存在するアミノ酸残基の変異は、それらの特異的機能に対して互いに類似した効果を及ぼすと推定される。
【００３５】
なお、親プロテアーゼに上記（ａｕ）のように１アミノ酸残基が挿入されている場合、該親プロテアーゼにおける配列番号２の１３４位以降の位置に相当する位置は、配列番号２と比べて１残基下流に位置する。例えば、配列番号２に上記（ａｕ）の変異を導入されたアミノ酸配列からなる親プロテアーゼにおいては、該「３０３位に相当する位置」は３０４位である。
【００３６】
したがって、本発明の変異プロテアーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３０３位に相当する位置のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、トレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンからなる群より選択されるアミノ酸残基であればよく、好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、バリン、トリプトファン、又はチロシンであり、より好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、又はバリンである。好ましくは、該本発明の変異プロテアーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３０位に相当する位置のアミノ酸残基はアスパラギン酸であり、６８位に相当する位置のアミノ酸残基はヒスチジンであり、かつ２５５位に相当する位置のアミノ酸残基はセリンである。また好ましくは、本発明の変異プロテアーゼは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【００３７】
本発明の変異プロテアーゼは、その親プロテアーゼと比べて、酸性条件下、好ましくは弱酸性条件下での安定性が向上している。したがって、本発明の変異プロテアーゼは、その親プロテアーゼと比べて、酸性の液体、例えば弱酸性の液体洗剤原液、又は洗剤を溶解した弱酸性の洗剤溶液中でより安定であり、その結果、当該酸性の液体中でより高いプロテアーゼ活性を保持することができる。
【００３８】
本発明の変異プロテアーゼは、上記３０３位に相当する位置における変異に加えて、その酸性条件下での安定性向上効果を妨げない限り、親プロテアーゼに対して他の任意の位置における変異（例えば、欠失、置換、付加、挿入）を有するものであってもよい。当該変異は、天然に生じたものであっても、人工的に導入したものであってもよい。
【００３９】
例えば、本発明の変異プロテアーゼは、上記（ａ）〜（ｄｖ）に示した置換又は挿入後のアミノ酸残基からなる群より選択される１つ以上を有していてもよい。例えば、本発明の変異プロテアーゼは、以下のアミノ酸残基を有していてもよい：
該（ａｒ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｂｋ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｂｍ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｃｊ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｃｍ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｄｃ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｅ）及び（ａａ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｂｃ）及び（ｂｄ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｂｍ）及び（ｂｎ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｂｍ）及び（ｃｍ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｂｍ）、（ｂｎ）及び（ｃｍ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｄ）、（ｂｍ）及び（ｃｍ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｄ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）及び（ｃｍ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｖ）、（ｃｆ）、（ｄａ）及び（ｄｊ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｊ）、（ｓ）、（ｙ）、（ｂｈ）及び（ｄｏ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ａｓ）及び（ａｔ）に示した置換のアミノ酸残基、ならびに該（ａｕ）に示した挿入後のアミノ酸残基；
該（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｆ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｆ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｊ）、（ｓ）、（ｖ）、（ｙ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｈ）、（ｂｋ）、（ｃｆ）、（ｄａ）、（ｄｃ）、（ｄｊ）及び（ｄｏ）に示した置換のアミノ酸残基、ならびに該（ａｕ）に示した挿入後のアミノ酸残基；
該（ｖ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｆ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｖ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｆ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）に示した置換のアミノ酸残基、ならびに該（ａｕ）に示した挿入後のアミノ酸残基；
該（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｏ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｖ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｑ）（ｃｆ）、（ｄａ）、（ｄｃ）、（ｄｆ）及び（ｄｊ）に示した置換のアミノ酸残基、ならびに該（ａｕ）に示した挿入後のアミノ酸残基；
該（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｅ）、（ｖ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｅ）、（ｖ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｅ）、（ｖ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｍ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｃｍ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｅ）、（ｖ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｃｍ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）に示した置換後のアミノ酸残基；
該（ｄ）、（ｅ）、（ｖ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｍ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｃｍ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）に示した置換後のアミノ酸残基；又は、
該（ｄ）、（ｅ）、（ｖ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｃｍ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）に示した置換後のアミノ酸残基。
【００４０】
上記（ａ）〜（ｄｖ）に示した置換又は挿入後のアミノ酸残基を含む本発明の変異プロテアーゼを調製する手順の例としては、以下が挙げられる：該（ａ）〜（ｄｖ）に示した変異のいずれか１つ以上を有する親プロテアーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３０３位に相当する位置のアミノ酸残基を上述した他のアミノ酸残基に置換する；配列番号２のアミノ酸配列からなる親プロテアーゼにおいて、該３０３位に相当する位置の置換とともに、該（ａ）〜（ｄｖ）に示した変異のいずれか１つ以上を導入する；又は、該（ａ）〜（ｄｖ）に示した変異のいずれか１つ以上を有する親プロテアーゼにおいて、該３０３位の置換とともに、該（ａ）〜（ｄｖ）に示した変異のいずれか１つ以上（但し該親プロテアーゼが有する変異と異なるもの）を導入する。
【００４１】
好ましい一実施形態において、本発明の変異体は、親プロテアーゼに対して、上述した３０３位に相当する位置におけるアミノ酸残基の置換と、以下の（ｄ1）、（ｂｍ1）、（ｂｎ1）及び（ｃｍ1）からなる群より選択される少なくとも１つのさらなる置換を行うことによって製造される：
（ｄ1）配列番号２の１５位に相当する位置におけるＳからＤ又はＥへの置換；
（ｂｍ1）配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＨからＤ又はＥへ、好ましくはＤへの置換；
（ｂｎ1）配列番号２の２０２位に相当する位置におけるＶからＥへの置換；及び
（ｃｍ1）配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換。より好ましくは、当該さらなる置換は、該（ｃｍ1）であるか、（ｂｍ1）及び（ｃｍ1）であるか、（ｂｍ1）、（ｂｎ1）及び（ｃｍ1）であるか、（ｄ1）、（ｂｍ1）及び（ｃｍ1）であるか、又は（ｄ1）、（ｂｍ1）、（ｂｎ1）及び（ｃｍ1）である。好ましくは、該３０３位に相当する位置における置換は、Ｅ又はＮへの置換である。好ましくは、該親プロテアーゼは、配列番号２〜４のいずれかのアミノ酸配列からなるプロテアーゼである。
【００４２】
より好ましい実施形態において、本発明の変異体は、親プロテアーゼに対して、以下の１）〜１０）：
１）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＧからＥへの置換、及び
配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換；
２）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＧからＥへの置換、
配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＨからＤへの置換、及び
配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換；
３）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＧからＥへの置換、
配列番号２の１５位に相当する位置におけるＳからＤ又はＥへの置換、
配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＨからＤへの置換、及び
配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換；
４）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＧからＥへの置換、
配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＨからＤへの置換、
配列番号２の２０２位に相当する位置におけるＶからＥへの置換、及び
配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換；
５）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＧからＥへの置換、
配列番号２の１５位に相当する位置におけるＳからＤ又はＥへの置換、
配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＨからＤへの置換、
配列番号２の２０２位に相当する位置におけるＶからＥへの置換、及び
配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換；
６）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＧからＮへの置換、及び
配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換；
７）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＧからＮへの置換、
配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＨからＤへの置換、及び
配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換；
８）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＧからＮへの置換、
配列番号２の１５位に相当する位置におけるＳからＤ又はＥへの置換、
配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＨからＤへの置換、及び
配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換；
９）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＧからＮへの置換、
配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＨからＤへの置換、
配列番号２の２０２位に相当する位置におけるＶからＥへの置換、及び
配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換；
１０）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＧからＮへの置換、
配列番号２の１５位に相当する位置におけるＳからＤ又はＥへの置換、
配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＨからＤへの置換、
配列番号２の２０２位に相当する位置におけるＶからＥへの置換、及び
配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換、
のいずれかを行うことによって製造される。好ましくは、該親プロテアーゼは、配列番号２〜４のいずれかのアミノ酸配列からなるプロテアーゼである。このような本発明の変異体の例としては、配列番号５〜７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼが挙げられる。
【００４３】
本発明において、親プロテアーゼのアミノ酸残基を変異させる手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親プロテアーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、親ポリヌクレオチドともいう）において、変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させ、さらにその変異ポリヌクレオチドからタンパク質を発現させることにより、目的の変異プロテアーゼを得ることができる。
【００４４】
親ポリヌクレオチドへの目的の変異の導入は、例えば基本的には、該親ポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとして用いるＰＣＲ増幅や各種ＤＮＡポリメラーゼによる複製反応に基づき、当業者には周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版  新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ８２−８８）の任意の手法により行うことができる。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ等の各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。
【００４５】
親ポリヌクレオチドへの部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、親ポリヌクレオチドにおける変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つのプライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１−６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。
【００４６】
親ポリヌクレオチドを含む鋳型ＤＮＡは、上述したバチルス  エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３２）、バチルス  エスピーＫＳＭ―ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３４）、バチルス  エスピーＫＳＭ−９８６５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６６）等の菌、又はそれらの変異株から、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、親プロテアーゼのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を化学合成して鋳型ＤＮＡとして用いてもよい。
【００４７】
当該バチルス属菌株からのゲノムＤＮＡの調製は、例えば、Ｐｉｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｅｔｔ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８９，８：１５１−１５６に記載の方法などを用いて行うことができる。親ポリヌクレオチドを含む鋳型ＤＮＡは、調製したｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡから切り出した親ポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、任意のベクター中に挿入した形で調製してもよい。
【００４８】
変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９−７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて実施することもできる。該変異用プライマーを含むプライマーセットを使用し、親ポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異が導入された変異プロテアーゼ遺伝子を得ることができる。
【００４９】
したがって、本発明はまた、変異プロテアーゼ遺伝子を提供する。本発明の変異プロテアーゼ遺伝子は、当該本発明の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドである。当該本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また当該本発明のポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【００５０】
本発明はまた、当該本発明の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。該ベクターは、該本発明のポリヌクレオチドを常法により任意のベクター中に挿入し連結することにより作製することができる。該ベクターの種類は特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。また該ベクターは、限定ではないが、好ましくは、細菌内、とりわけバチルス属細菌内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、本発明の変異プロテアーゼを組換え生産する上で好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｉｓｈｉｋａｗａ  ａｎｄ  Ｓｈｉｂａｈａｒａ，Ｊｐｎ  Ｊ  Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５−２４３）、ｐＡＣ３（Ｍｏｒｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）等のシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｇｒｙｃｚａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８−３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｂｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８−１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミド；分泌シグナルを組換えタンパク質に付与可能な分泌ベクター（山根他，「枯草菌分泌ベクターによる融合タンパク質」澱粉科学，３４．（１９８７），１６３−１７０）等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。
【００５１】
本発明の変異プロテアーゼを組換え生産する場合、当該ベクターは発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターは、転写プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位等の宿主生物における発現に必須な各種エレメント；ポリリンカー、エンハンサー等のシスエレメント；ポリＡ付加シグナル；リボソーム結合配列（ＳＤ配列）；薬剤（例えばアンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール等）耐性遺伝子等の選択マーカー遺伝子、などの有用な配列を必要に応じて含み得る。
【００５２】
本発明はまた、本発明の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを含有するベクターを含む、形質転換体を提供する。該形質転換体は、本発明の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを含有するベクター（好ましくは組換え発現ベクター）を宿主に導入することにより製造することができる。したがって、該形質転換体は、本発明の変異プロテアーゼをコードする外来のポリヌクレオチドを含む。
【００５３】
当該形質転換体の宿主としては、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞を始めとする微生物の他、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、植物細胞等の任意の細胞が挙げられる。該宿主は、好ましくはバチルス属細菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株である。したがって、本発明の形質転換体は、好ましくは組換えバチルス属細菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株の組換え体である。
【００５４】
宿主の形質転換には、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ＰＥＧ法等の周知の形質転換技術を適用することができる。例えばバチルス属細菌に適用可能な形質転換法としては、コンピテントセル形質転換法（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９６７，９３：１９２５−１９３７）、エレクトロポレーション法（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ，１９９０，５５：１３５−１３８）、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ，１９７９，１６８：１１１−１１５）、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８３，１５６：１１３０−１１３４）などが挙げられる。
【００５５】
当該本発明の形質転換体を培養することにより、本発明の変異プロテアーゼを製造することができる。したがって、本発明はまた、本発明の形質転換体を用いる変異プロテアーゼの製造方法を提供する。変異プロテアーゼ製造のための該形質転換体の培養は、当業者に一般的な方法に従って行うことができる。例えば、大腸菌や酵母細胞等の微生物宿主に基づく形質転換体を培養する培地としては、該微生物宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であればよい。該培地は、天然培地及び合成培地のいずれを用いてもよい。例えば、組換えタンパク質を生産するための枯草菌形質転換体の培養には、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地、２×Ｌ−マルトース培地、又はＣＳＬ発酵培地等を用いることができる。該培地には、形質転換体に導入した薬剤耐性遺伝子（選択マーカー遺伝子）の種類に対応した薬剤を添加してもよい。また、誘導性プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加することができる。
【００５６】
あるいは、本発明の変異プロテアーゼは、無細胞翻訳系を使用して、本発明の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。
【００５７】
当該形質転換体又は無細胞翻訳系で製造された本発明の変異プロテアーゼは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、培養液、細胞破砕液、無細胞翻訳系の反応液などから取得することができる。あるいは、遠心分離や限外濾過型フィルター等を用いて分離又は濃縮した培養上清や溶菌液上清等の溶液を、粗酵素液としてそのまま使用することができる。発現された変異プロテアーゼが細胞内から分泌されない場合には、その細胞を破砕してからタンパク質の分離精製を行えばよい。
【００５８】
本発明において用いるｍＲＮＡの調製、ｃＤＮＡの作製、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ライブラリーの作製、ベクター中へのライゲーション、細胞の形質転換、ＤＮＡの塩基配列の決定、核酸化学合成、タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列決定、突然変異誘発、タンパク質の抽出等の実験は、通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。そのような実験書としては、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２００１，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＤＷ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを挙げることができる。さらに、枯草菌の遺伝子組換え実験については、例えば吉川博文著、“７．２  枯草菌系”「続生化学実験講座１．遺伝子研究法ＩＩ」，１９８６，東京化学同人社（東京），ｐ１５０−１６９等の、枯草菌の遺伝子操作に関する一般的な実験書を参照することができる。
【００５９】
本発明の製造方法により得られた変異プロテアーゼは、親プロテアーゼと比べて、酸性条件下、好ましくは弱酸性条件下での安定性が向上しており、酸性の液体、例えば弱酸性の液体洗剤原液、又は洗剤を溶解した弱酸性の洗剤溶液中でより安定性に存在することができる。したがって、本発明の別の態様は、上述したとおりに親プロテアーゼのアミノ酸配列における配列番号２のアミノ酸配列の３０３位に相当する位置のアミノ酸残基をアスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、トレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンからなる群より選択されるアミノ酸残基に置換することを含む、プロテアーゼの酸性条件下での安定性の向上方法であり得る。
【００６０】
本発明の変異プロテアーゼは、酸性条件下での安定性が高いため、アルカリ側ｐＨで高いプロテアーゼ活性を有するだけでなく、酸性条件下でも酵素活性を安定に保持することができる。そのため、本発明の変異プロテアーゼは、洗剤用酵素として有用であり、弱酸性洗剤用の酵素としてより好適である。したがって、本発明はまた、本発明の変異プロテアーゼを含有する洗剤組成物を提供する。該洗剤組成物は、固形（例えば粉末）洗剤組成物であってもよいが、好ましくは液体洗剤組成物である。また該洗剤組成物は、好ましくは弱酸性洗剤組成物である。本明細書における弱酸性洗剤には、ｐＨが弱酸性である液体洗剤原液、及び水に溶かしたときに弱酸性になる液体又は固形（例えば粉末）洗剤が包含される。また本明細書における弱酸性とは、好ましくはｐＨ５以上の酸性状態、より好ましくはｐＨ５〜７未満、さらに好ましくはｐＨ６〜６．８をいう。
【００６１】
本発明の洗剤組成物における本発明の変異プロテアーゼの含有量は、プロテアーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、洗剤組成物１ｋｇ当たり０．１〜２５０００Ｕが好ましく、０．１〜５０００Ｕがより好ましく、０．１〜２５００Ｕがさらに好ましい。本明細書におけるプロテアーゼの活性（Ｕ）は、以下の方法により測定される：１／１５Ｍリン酸緩衝液（例えばｐＨ７．４、和光純薬りん酸緩衝剤粉末（１６７−１４４９１）１包（１包中Ｎａ2ＨＰＯ4（無水）７．６ｇ。ＫＨ2ＰＯ4（無水）１．８ｇ含有）を１Ｌのイオン交換水に溶解した溶液）０．９ｍＬ、４０ｍＭＧｌｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐ−ニトロアニリド／ジメチルスルホキシド溶液０．０５ｍＬを試験管に採り、３０℃で５分間保温する。これに酵素液０．０５ｍＬを加えて３０℃で１０分間反応を行った後、５％（ｗ／ｖ）クエン酸水溶液２．０ｍＬを加えて反応を停止し、分光光度計を用いて４２０ｎｍにおける吸光度を測定する。ここで酵素１単位（Ｕ）は上記反応において１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを生成する量とする。
【００６２】
本発明の洗剤組成物は、本発明の変異プロテアーゼに加えて、界面活性剤及び水を含有する。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、及び陽イオン性界面活性剤等の任意の界面活性剤を１種で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。本発明の洗剤組成物における当該界面活性剤の含有量は、好ましくは１０〜８０質量％、より好ましくは３０〜７０質量％である。
【００６３】
非イオン性界面活性剤としては、一般的に液体洗剤に配合されているＣ８〜Ｃ２２の炭化水素基を有し、Ｃ２オキシアルキレン基が数モル以上付加された非イオン性界面活性剤であればよいが、例えば、以下が挙げられる：
Ｒ1Ｏ−（ＡＯ）ｍ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１６〜３５）〔特開２０１０−２７５４６８号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｌ−（ＡＯ）ｍ−（ＥＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ１８炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝３〜３０、ｍ＝１〜５、ｌ＋ｎ＝１４〜５０）〔特開２０１０−２６５４４５号公報、特開２０１１−６３７８４号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｍ／（ＡＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１０〜３０、ｎ＝０〜５、ＥＯ及びＡＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−１８９５５１号公報〕；
Ｒ1（ＣＯ）ｌＯ−（ＥＯ）ｍ／（ＡＯ）ｎ−Ｒ2（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝０〜１、ｍ＝１４〜５０、ｎ＝１〜５、Ｒ2＝水素（ｌ＝０）又はＣ１−Ｃ３アルキル基、ＥＯ及びＡＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２２９３８５号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｍ−（ＡＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１５〜３０、ｎ＝１〜５）〔特開２０１０−２２９３８７号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＡＯ）ｍ／（Ｇｌｙ）ｎ−Ｈ及び／又はＲ2−ＣＯＯ−（ＡＯ）ｐ／（Ｇｌｙ）ｑ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素基、Ｒ2＝Ｃ７−Ｃ２１炭化水素基、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ３オキシアルキレン基、Ｇｌｙ＝グリセロール基、ｍ＝０〜５、ｎ＝２〜１０、ｐ＝０〜５、ｑ＝２〜１０、ＡＯ及びＧｌｙはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２５４８８１号公報〕；
Ｒ1−ＣＯＯ−（ＰＯ）ｍ／（ＥＯ）ｎ−Ｒ2（Ｒ1＝Ｃ７−Ｃ２１炭化水素基，ＣＯＯ＝カルボニルオキシ基、Ｒ2＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ＰＯ＝オキシプロピレン基、ＥＯ＝オキシエチレン基、ｍ＝０．３〜５、ｎ＝８〜２５、ＰＯ及びＥＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２６５３３３号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｌ−（ＰＯ）ｍ−（ＥＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２０炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＰＯ＝オキシプロピレン基、ｌ＞＝１、ｎ＞＝１、０＜ｍ＜ｌ＋ｎ、ＥＯ及びＰＯはブロック結合）〔ＷＯ９８／２４８６５〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｍ−（ＰＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ１０−Ｃ１６のアルキル基又はアルケニル基、ＥＯ＝エチレンオキシド基、ＰＯ＝プロピレンオキシド基、ｍ＝５〜１５、ｎ＝１〜３）〔特開平８−１５７８６７号公報〕；
Ｒ1（ＣＯ）−（ＥＯ）ｍ−ＯＲ2（Ｒ1＝Ｃ１１−Ｃ１３直鎖又は分岐状アルキル基又はアルケニル基、Ｒ2＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ＥＯ＝エチレンオキシド基、ｍ＝１０〜２０）〔特開２００８−７７０６号公報、特開２００９−７４５１号公報、特開２００９−１５５５９４号公報、特開２００９−１５５６０６号公報〕；
Ｒ1（ＣＯ）−（ＡＯ）ｍ−ＯＲ2（Ｒ1＝Ｃ９−Ｃ１３直鎖又は分岐状アルキル基又はアルケニル基、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ４オキシアルキレン基、Ｒ2＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ｍ＝５〜３０）〔特開２００９−１４４００２号公報、特開２００９−１７３８５８号公報、特開２０１０−１８９６１２号公報〕；ならびに、
脂肪酸アルカノールアミド、脂肪酸アルカノールグルカミド、アルキルポリグルコシド等。
【００６４】
陰イオン界面活性剤としては、例えばカルボキシレート型陰イオン界面活性剤、スルホン酸型又は硫酸エステル型陰イオン界面活性剤、非石鹸系アニオン界面活性剤、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸又はその塩、ポリオキシベンゼンスルホン酸又はその塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、α−オレフィンスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、脂肪酸石鹸、リン酸エステル塩系界面活性剤、アシルアラニネート、アシルタウレート、アルキルエーテルカルボン酸、アルコール硫酸エステル等が挙げられる。
【００６５】
陽イオン界面活性剤としては、例えば長鎖アルキル基を有する第４級アンモニウム塩、長鎖アルキル基を１つ有する３級アミン、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩等が挙げられる。好ましくは炭素数８〜２２の長鎖アルキル基を１つ有する第４級アンモニウム型界面活性剤、炭素数８〜２２の長鎖アルキル基を１つ有する３級アミンが挙げられる。
【００６６】
両性イオン活性剤としては、例えばアルキル酢酸ベタイン、アルカノールアミドプロピル酢酸ベタイン、アルキルイミダゾリン、アルキルアラニン等、アルキルベタイン型、アルキルアミドベタイン型、イミダゾリン型、アルキルアミノスルホン型、アルキルアミノカルボン酸型、アルキルアミドカルボン酸型、アミドアミノ酸型又はリン酸型の両性界面活性剤等が挙げられる。好ましくは炭素数１０〜１８のアルキル基を有するスルホベタイン又はカルボベタインを挙げることができる。
【００６７】
本発明の洗剤組成物は、さらに、洗剤組成物に通常使用される成分、例えば、水溶性ポリマー、水混和性有機溶剤、アルカリ剤、有機酸又はその塩、キレート剤、本発明の変異プロテアーゼ以外の他の酵素、酵素安定化剤、蛍光剤、再汚染防止剤、分散剤、色移り防止剤、仕上げ剤、過酸化水素等の漂白剤、酸化防止剤、可溶化剤、ｐＨ調製剤、緩衝剤、防腐剤、香料、塩、アルコール、糖類、などを含み得る。
【００６８】
水溶性ポリマーとしては、例えば、（i）炭素数２〜５のエポキシド由来の重合単位を含んで構成されるポリエーテル鎖部分と（ii）アクリル酸、メタクリル酸及びマレイン酸から選ばれる一種以上の不飽和カルボン酸単量体由来の重合単位を含んで構成されるポリマー鎖部分とを有し、（i）又は（ii）のいずれかが幹鎖となり、他方が枝鎖となったグラフト構造を有する高分子化合物（特開２０１０−２７５４６８号公報、特開平１０−０６０４９６号公報）；アルキレンテレフタレート単位及び／又はアルキレンイソフタレート単位と、オキシアルキレン単位及び／又はポリオキシアルキレン単位を有する水溶性ポリマー（特開２００９−１５５６０６号公報）、などが挙げられる。本発明の洗剤組成物における当該水溶性ポリマーの含有量は、好ましくは０．２〜１０質量％、より好ましくは０．４〜５質量％である。
【００６９】
水混和性有機溶剤としては、例えば、アルカノール類のアルキレングリコール類やグリセリン、ポリアルキレングリコール類、（ポリ）アルキレングリコール（モノ又はジ）アルキルエーテル類、アルキルグリセリルエーテル類、（ポリ）アルキレングリコールの芳香族エーテル類が挙げられる。エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、又はヘキシレングリコールなどの炭素数２〜６のアルキレングリコール類やグリセリン、又はポリエチレングリコールモノフェニルエーテル、エチレングリコールモノベンジルエーテル、ジエチレングリコールモノベンジルエーテル等が好ましい。本発明の洗剤組成物における当該水混和性有機溶剤の含有量は、好ましくは１〜４０質量％、より好ましくは１〜３５質量％である。
【００７０】
アルカリ剤としては、例えば、Ｃ２−Ｃ４のアルカノールを１〜３個有するアルカノールアミンとして、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ポリオキシアルキレンアミン、ジメチルアミノプロピルアミン等が挙げられる。モノエタノールアミン、トリエタノールアミンが好ましい。本発明の洗剤組成物における当該アルカリ剤の含有量は、好ましくは０〜２０質量％、より好ましくは０〜１０質量％である。
【００７１】
有機酸又はその塩としては、例えば、飽和脂肪酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、又はそれらの塩等の多価カルボン酸類；クエン酸、リンゴ酸、グリコール酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、安息香酸又はそれらの塩等のヒドロキシカルボン酸類、などが挙げられ、なかでもクエン酸又はその塩が好ましい。本発明の洗剤組成物における当該有機酸又はその塩の含有量は、好ましくは０〜５質量％、より好ましくは０〜３質量％である。
【００７２】
キレート剤とは、金属イオンと配位結合をすることができる化合物をいう。洗剤組成物に添加されたキレート剤は、洗濯用水又は汚れの中のカルシウムイオン、マグネシウムイオン等の洗浄に悪影響を及ぼす金属イオンを封鎖する作用を有する。本発明の洗剤組成物に含まれ得るキレート剤の例としては、ニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸、エチレンジアミン酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、トリエチレンテトラアミン六酢酸、ジエンコル酸等のアミノポリ酢酸又はこれらの塩、ジグリコール酸、オキシジコハク酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、シュウ酸、リンゴ酸、オキシジコハク酸、グルコン酸、カルボキシメチルコハク酸、カルボキシメチル酒石酸等の有機酸又はこれらの塩、アミノトリ（メチレンホスホン酸）、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）、及びこれらのアルカリ金属又は低級アミン塩、などが挙げられる。本発明の洗剤組成物におけるキレート剤の含有量は、好ましくは０．１〜５質量％、より好ましくは０．１〜４質量％である。
【００７３】
再汚染防止剤及び分散剤としては、例えばポリアクリル酸、ポリマレイン酸、カルボキシメチルセルロース、重量平均分子量５０００以上のポリエチレングリコール、無水マレイン酸−ジイソブチレン共重合体、無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合体、無水マレイン酸−酢酸ビニル共重合体、ナフタレンスルホン酸塩ホルマリン縮合物、及び特開昭５９−６２６１４号公報の請求項１〜２１（１頁３欄５行〜３頁４欄１４行）記載のポリマーなどの再汚染防止剤及び分散剤を挙げることができる。
【００７４】
色移り防止剤としては、例えばポリビニルピロリドンが挙げられ、含有量は０．０１〜１０質量％が好ましい。
【００７５】
漂白剤としては、例えば過酸化水素、過炭酸塩、過硼酸塩などの漂白剤を、当該洗剤組成物中１〜１０質量％含有させることが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６−３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を、当該洗剤組成物中０．０１〜１０質量％含有させることができる。
【００７６】
蛍光剤としては、例えばビフェニル型蛍光剤（チノパールＣＢＳ−Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（ＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。本発明の洗剤組成物における当該蛍光剤の含有量は０．００１〜２質量が好ましい。
【００７７】
本発明の変異プロテアーゼ以外の他の酵素としては、例えば、他のプロテアーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、マンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びトランスグルタミナーゼ等の加水分解酵素、ならびにそれらの２種以上の混合物が挙げられる。
【００７８】
酵素安定化剤としては、例えばホウ素化合物、カルシウムイオン源（カルシウムイオン供給化合物）、ヒドロキシ化合物、蟻酸などが挙げられ、酸化防止剤としては、ブチルヒドロキシトルエン、ジスチレン化クレゾール、亜硫酸ナトリウム及び亜硫酸水素ナトリウムなどが挙げられ、可溶化剤としては、パラトルエンスルホン酸、クメンスルホン酸、メタキシレンスルホン酸、安息香酸塩（防腐剤としての効果もある）などが挙げられる。さらに、本発明の洗剤組成物は、オクタン、デカン、ドデカン、トリデカンなどのパラフィン類、デセン、ドデセンなどのオレフィン類、塩化メチレン、１，１，１−トリクロロエタンなどのハロゲン化アルキル類、Ｄ−リモネンなどのテルペン類などの水非混和性有機溶剤、色素、香料、抗菌防腐剤、シリコーン等の消泡剤などを含有していてもよい。
【００７９】
本発明の変異プロテアーゼを配合することができる洗剤組成物の好ましい例としては、特開２０１７−００８３０３号公報（特許文献８）に記載される液体洗剤組成物、及び特開２０１３−１２９７２９号公報の実施例２に記載されるｐＨ６．５の液体洗剤組成物が挙げられる。これらの洗剤組成物に本発明の変異プロテアーゼを配合することにより、本発明の洗剤組成物を調製することができる。
【００８０】
本発明の洗剤組成物は、限定するものではないが、好ましい例としては、衣料又は布製品（シーツ、カーテン、カーペット、壁クロス等）の洗浄用の洗剤組成物、及び顔又はボディ用の洗剤組成物が挙げられる。本発明に係る洗剤組成物は、本発明の変異プロテアーゼを含有することによりプロテアーゼ活性を安定に保持することができるため、高い洗浄力を発揮することができる。
【００８１】
本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００８２】
〔１〕配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列の３０３位に相当する位置に、以下のアミノ酸残基：
アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、トレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンからなる群より選択されるアミノ酸残基、
好ましくは、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、バリン、トリプトファン、及びチロシンからなる群より選択されるアミノ酸残基、
より好ましくは、アスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、及びバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基、
を有する、変異プロテアーゼ。
〔２〕該〔１〕記載の変異プロテアーゼであって、
(i) 好ましくは、以下の（ａ´）〜（ｄｖ´）からなる群より選択される１以上のアミノ酸残基をさらに有する：
（ａ´）配列番号２のアミノ酸配列の６位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｂ´）配列番号２のアミノ酸配列の９位又はそれに相当する位置におけるＱ；
（ｃ´）配列番号２のアミノ酸配列の１１位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ又はＮ；
（ｄ´）配列番号２のアミノ酸配列の１５位又はそれに相当する位置におけるＨ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｅ´）配列番号２のアミノ酸配列の１６位又はそれに相当する位置におけるＴ、Ｑ、Ｖ、Ｃ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｆ´）配列番号２のアミノ酸配列の２０位又はそれに相当する位置におけるＦ又はＡ；
（ｇ´）配列番号２のアミノ酸配列の２２位又はそれに相当する位置におけるＷ；
（ｈ´）配列番号２のアミノ酸配列の２３位又はそれに相当する位置におけるＮ；
（ｉ´）配列番号２のアミノ酸配列の３７位又はそれに相当する位置におけるＴ；
（ｊ´）配列番号２のアミノ酸配列の４０位又はそれに相当する位置におけるＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ｋ´）配列番号２のアミノ酸配列の４１位又はそれに相当する位置におけるＩ；
（ｌ´）配列番号２のアミノ酸配列の４６位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷ；
（ｍ´）配列番号２のアミノ酸配列の４９位又はそれに相当する位置におけるＱ；
（ｎ´）配列番号２のアミノ酸配列の５２位又はそれに相当する位置におけるＧ又はＳ；
（ｏ´）配列番号２のアミノ酸配列の５３位又はそれに相当する位置におけるＡ、Ｖ又はＩ；
（ｐ´）配列番号２のアミノ酸配列の５４位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｑ´）配列番号２のアミノ酸配列の５６位又はそれに相当する位置におけるＶ；
（ｒ´）配列番号２のアミノ酸配列の５７位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｓ´）配列番号２のアミノ酸配列の５９位又はそれに相当する位置におけるＶ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｔ´）配列番号２のアミノ酸配列の６０位又はそれに相当する位置におけるＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ｕ´）配列番号２のアミノ酸配列の６３位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｄ又はＬ；
（ｖ´）配列番号２のアミノ酸配列の６５位又はそれに相当する位置におけるＷ又はＰ；
（ｗ´）配列番号２のアミノ酸配列の６６位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷ；
（ｘ´）配列番号２のアミノ酸配列の８０位又はそれに相当する位置におけるＨ又はＡ；
（ｙ´）配列番号２のアミノ酸配列の８１位又はそれに相当する位置におけるＱ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ｚ´）配列番号２のアミノ酸配列の８２位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ又はＭ；
（ａａ´）配列番号２のアミノ酸配列の８３位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｃ又はＡ；
（ａｂ´）配列番号２のアミノ酸配列の８４位又はそれに相当する位置におけるＲ；
（ａｃ´）配列番号２のアミノ酸配列の８９位又はそれに相当する位置におけるＨ；
（ａｄ´）配列番号２のアミノ酸配列の９１位又はそれに相当する位置におけるＣ；
（ａｅ´）配列番号２のアミノ酸配列の１００位又はそれに相当する位置におけるＬ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ａｆ´）配列番号２のアミノ酸配列の１０１位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｇ´）配列番号２のアミノ酸配列の１０２位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｈ´）配列番号２のアミノ酸配列の１０３位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｉ´）配列番号２のアミノ酸配列の１０４位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｊ´）配列番号２のアミノ酸配列の１０５位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｋ´）配列番号２のアミノ酸配列の１０６位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｌ´）配列番号２のアミノ酸配列の１０７位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｒ、Ｋ又はＡ；
（ａｍ´）配列番号２のアミノ酸配列の１０９位又はそれに相当する位置におけるＬ、Ｉ又はＦ；
（ａｎ´）配列番号２のアミノ酸配列の１１３位又はそれに相当する位置におけるＬ又はＷ；
（ａｏ´）配列番号２のアミノ酸配列の１１９位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｐ´）配列番号２のアミノ酸配列の１２０位又はそれに相当する位置におけるＹ、Ｒ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ａｑ´）配列番号２のアミノ酸配列の１２４位又はそれに相当する位置におけるＫ又はＡ；
（ａｒ´）配列番号２のアミノ酸配列の１３２位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｉ又はＭ；
（ａｓ´）配列番号２のアミノ酸配列の１３３位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｔ´）配列番号２のアミノ酸配列の１３４位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｔ又はＡ；
（ａｕ´）配列番号２のアミノ酸配列の１３３位又はそれに相当する位置と１３４位又はそれに相当する位置との間におけるＧ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷ；
（ａｖ´）配列番号２のアミノ酸配列の１３５位又はそれに相当する位置におけるＲ、Ａ、Ｌ又はＭ；
（ａｗ´）配列番号２のアミノ酸配列の１３６位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｘ´）配列番号２のアミノ酸配列の１３８位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｙ´）配列番号２のアミノ酸配列の１４０位又はそれに相当する位置におけるＬ、Ｗ又はＦ；
（ａｚ´）配列番号２のアミノ酸配列の１４８位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｂａ´）配列番号２のアミノ酸配列の１５１位又はそれに相当する位置におけるＦ；
（ｂｂ´）配列番号２のアミノ酸配列の１６３位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦ；
（ｂｃ´）配列番号２のアミノ酸配列の１６６位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ｂｄ´）配列番号２のアミノ酸配列の１６７位又はそれに相当する位置におけるＶ；
（ｂｅ´）配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はそれに相当する位置におけるＶ又はＬ；
（ｂｆ´）配列番号２のアミノ酸配列の１７１位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｔ、Ｅ又はＡ；
（ｂｇ´）配列番号２のアミノ酸配列の１８７位又はそれに相当する位置におけるＳ；
（ｂｈ´）配列番号２のアミノ酸配列の１９１位又はそれに相当する位置におけるＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ｂｉ´）配列番号２のアミノ酸配列の１９３位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｂｊ´）配列番号２のアミノ酸配列の１９４位又はそれに相当する位置におけるＹ、Ｒ又はＫ；
（ｂｋ´）配列番号２のアミノ酸配列の１９５位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｂｌ´）配列番号２のアミノ酸配列の２００位又はそれに相当する位置におけるＷ；
（ｂｍ´）配列番号２のアミノ酸配列の２０１位又はそれに相当する位置におけるＤ、Ｅ又はＱ；
（ｂｎ´）配列番号２のアミノ酸配列の２０２位又はそれに相当する位置におけるＥ；
（ｂｏ´）配列番号２のアミノ酸配列の２０４位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＰ；
（ｂｐ´）配列番号２のアミノ酸配列の２０５位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷ；
（ｂｑ´）配列番号２のアミノ酸配列の２１２位又はそれに相当する位置におけるＮ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｌ又はＷ；
（ｂｒ´）配列番号２のアミノ酸配列の２２６位又はそれに相当する位置におけるＹ；
（ｂｓ´）配列番号２のアミノ酸配列の２３３位又はそれに相当する位置におけるＬ、Ｉ又はＷ；
（ｂｔ´）配列番号２のアミノ酸配列の２３７位又はそれに相当する位置におけるＮ；
（ｂｕ´）配列番号２のアミノ酸配列の２３８位又はそれに相当する位置におけるＬ；
（ｂｖ´）配列番号２のアミノ酸配列の２４３位又はそれに相当する位置におけるＹ、Ｌ又はＩ；
（ｂｗ´）配列番号２のアミノ酸配列の２４５位又はそれに相当する位置におけるＮ；
（ｂｘ´）配列番号２のアミノ酸配列の２４６位又はそれに相当する位置におけるＹ、Ｖ、Ｌ、Ｗ又はＦ；
（ｂｙ´）配列番号２のアミノ酸配列の２４７位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｂｚ´）配列番号２のアミノ酸配列の２４８位又はそれに相当する位置におけるＦ；
（ｃａ´）配列番号２のアミノ酸配列の２５０位又はそれに相当する位置におけるＦ；
（ｃｂ´）配列番号２のアミノ酸配列の２５１位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ａ、Ｖ、Ｌ又はＩ；
（ｃｃ´）配列番号２のアミノ酸配列の２５６位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｃｄ´）配列番号２のアミノ酸配列の２５７位又はそれに相当する位置におけるＶ又はＩ；
（ｃｅ´）配列番号２のアミノ酸配列の２６４位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＭ；
（ｃｆ´）配列番号２のアミノ酸配列の２７３位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｔ又はＩ；
（ｃｇ´）配列番号２のアミノ酸配列の２７５位又はそれに相当する位置におけるＬ、Ｗ又はＦ；
（ｃｈ´）配列番号２のアミノ酸配列の２７７位又はそれに相当する位置におけるＶ、Ｌ、Ｉ又はＦ；
（ｃｉ´）配列番号２のアミノ酸配列の２８１位又はそれに相当する位置におけるＲ；
（ｃｊ´）配列番号２のアミノ酸配列の２９４位又はそれに相当する位置におけるＴ；
（ｃｋ´）配列番号２のアミノ酸配列の２９６位又はそれに相当する位置におけるＶ；
（ｃｌ´）配列番号２のアミノ酸配列の２９７位又はそれに相当する位置におけるＬ、Ｗ又はＦ；
（ｃｍ´）配列番号２のアミノ酸配列の３０４位又はそれに相当する位置におけるＳ又はＡ；
（ｃｎ´）配列番号２のアミノ酸配列の３１３位又はそれに相当する位置におけるＮ；
（ｃｏ´）配列番号２のアミノ酸配列の３１９位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｃｐ´）配列番号２のアミノ酸配列の３２０位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｔ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦ；
（ｃｑ´）配列番号２のアミノ酸配列の３２６位又はそれに相当する位置におけるＷ；
（ｃｒ´）配列番号２のアミノ酸配列の３３０位又はそれに相当する位置におけるＭ、Ｗ又はＦ；
（ｃｓ´）配列番号２のアミノ酸配列の３３２位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｔ又はＶ；
（ｃｔ´）配列番号２のアミノ酸配列の３３４位又はそれに相当する位置におけるＬ；
（ｃｕ´）配列番号２のアミノ酸配列の３３５位又はそれに相当する位置におけるＦ；
（ｃｖ´）配列番号２のアミノ酸配列の３３７位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ又はＶ；
（ｃｗ´）配列番号２のアミノ酸配列の３４２位又はそれに相当する位置におけるＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｃｘ´）配列番号２のアミノ酸配列の３４３位又はそれに相当する位置におけるＴ；
（ｃｙ´）配列番号２のアミノ酸配列の３４６位又はそれに相当する位置におけるＲ；
（ｃｚ´）配列番号２のアミノ酸配列の３５７位又はそれに相当する位置におけるＬ；
（ｄａ´）配列番号２のアミノ酸配列の３５９位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｑ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦ；
（ｄｂ´）配列番号２のアミノ酸配列の３６１位又はそれに相当する位置におけるＶ、Ｉ又はＷ；
（ｄｃ´）配列番号２のアミノ酸配列の３６９位又はそれに相当する位置におけるＮ；
（ｄｄ´）配列番号２のアミノ酸配列の３７６位又はそれに相当する位置におけるＷ；
（ｄｅ´）配列番号２のアミノ酸配列の３７８位又はそれに相当する位置におけるＬ又はＷ；
（ｄｆ´）配列番号２のアミノ酸配列の３７９位又はそれに相当する位置におけるＤ、Ｅ、Ｒ又はＫ；
（ｄｇ´）配列番号２のアミノ酸配列の３８０位又はそれに相当する位置におけるＦ；
（ｄｈ´）配列番号２のアミノ酸配列の３８５位又はそれに相当する位置におけるＹ、Ｍ又はＰ；
（ｄｉ´）配列番号２のアミノ酸配列の３８６位又はそれに相当する位置におけるＡ、Ｌ、Ｉ又はＭ；
（ｄｊ´）配列番号２のアミノ酸配列の３８７位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｄｋ´）配列番号２のアミノ酸配列の３９０位又はそれに相当する位置におけるＧ、Ｓ、Ｔ、Ｙ又はＦ；
（ｄｌ´）配列番号２のアミノ酸配列の３９３位又はそれに相当する位置におけるＱ；
（ｄｍ´）配列番号２のアミノ酸配列の３９６位又はそれに相当する位置におけるＧ；
（ｄｎ´）配列番号２のアミノ酸配列の４０３位又はそれに相当する位置におけるＴ又はＫ；
（ｄｏ´）配列番号２のアミノ酸配列の４０５位又はそれに相当する位置におけるＤ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｄｐ´）配列番号２のアミノ酸配列の４０６位又はそれに相当する位置におけるＶ、Ｗ又はＦ；
（ｄｑ´）配列番号２のアミノ酸配列の４０７位又はそれに相当する位置におけるＧ又はＣ；
（ｄｒ´）配列番号２のアミノ酸配列の４０８位又はそれに相当する位置におけるＮ、Ｙ、Ｉ又はＷ；
（ｄｓ´）配列番号２のアミノ酸配列の４０９位又はそれに相当する位置におけるＹ又はＷ；
（ｄｔ´）配列番号２のアミノ酸配列の４１１位又はそれに相当する位置におけるＡ、Ｖ、Ｌ又はＰ；
（ｄｕ´）配列番号２のアミノ酸配列の４２７位又はそれに相当する位置におけるＲ又はＶ；及び 
（ｄｖ´）配列番号２のアミノ酸配列の４３３位又はそれに相当する位置におけるＬ、
(ii) より好ましくは、以下のいずれかのアミノ酸残基又はその組み合わせを有する：
該（ａｒ´）；
該（ｂｋ´）；
該（ｂｍ´）；
該（ｃｊ´）；
該（ｃｍ´）；
該（ｄｃ´）；
該（ｅ´）及び（ａａ´）の組み合わせ；
該（ｂｃ´）及び（ｂｄ´）の組み合わせ；
該（ｂｍ´）及び（ｂｎ´）の組み合わせ；
該（ｂｍ´）及び（ｃｍ´）の組み合わせ；
該（ｂｍ´）、（ｂｎ´）及び（ｃｍ´）の組み合わせ；
該（ｄ´）、（ｂｍ´）及び（ｃｍ´）の組み合わせ；
該（ｄ´）、（ｂｍ´）、（ｂｎ´）及び（ｃｍ´）の組み合わせ；
該（ｖ´）、（ｃｆ´）、（ｄａ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
該（ｊ´）、（ｓ´）、（ｙ´）、（ｂｈ´）及び（ｄｏ´）の組み合わせ；
該（ａｓ´）及び（ａｔ´）及び（ａｕ´）の組み合わせ；
該（ｅ´）、（ｖ´）、（ａａ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｃｆ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
該（ｅ´）、（ｖ´）、（ａａ´）、（ａｒ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｃｆ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
該（ｊ´）、（ｓ´）、（ｖ´）、（ｙ´）、（ａｓ´）、（ａｔ´）、（ａｕ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｈ´）、（ｂｋ´）、（ｃｆ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）、（ｄｊ´）及び（ｄｏ´）の組み合わせ；
該（ｖ´）、（ａａ´）、（ａｒ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｃｆ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
該（ｖ´）、（ａｓ´）、（ａｔ´）、（ａｕ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｃｆ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
該（ｅ´）、（ｖ´）、（ａａ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｂｏ´）、（ｃｆ´）、（ｃｏ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
該（ｖ´）、（ａｓ´）、（ａｔ´）、（ａｕ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｊ´）、（ｂｋ´）、（ｂｑ´）（ｃｆ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）、（ｄｆ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
該（ｅ´）、（ｖ´）、（ａａ´）、（ａｒ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｃｆ´）、（ｃｊ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
該（ｅ´）、（ｖ´）、（ｚ´）、（ａａ´）、（ａｒ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｂｏ´）、（ｃｆ´）、（ｃｊ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
該（ｅ´）、（ｖ´）、（ｚ´）、（ａａ´）、（ａｒ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｂｍ´）、（ｂｎ´）、（ｂｏ´）、（ｃｆ´）、（ｃｊ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
該（ｅ´）、（ｖ´）、（ｚ´）、（ａａ´）、（ａｒ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｂｍ´）、（ｂｏ´）、（ｃｆ´）、（ｃｊ´）、（ｃｍ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
該（ｅ´）、（ｖ´）、（ｚ´）、（ａａ´）、（ａｒ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｂｍ´）、（ｂｎ´）、（ｂｏ´）、（ｃｆ´）、（ｃｊ´）、（ｃｍ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；
該（ｄ´）、（ｅ´）、（ｖ´）、（ｚ´）、（ａａ´）、（ａｒ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｂｍ´）、（ｂｏ´）、（ｃｆ´）、（ｃｊ´）、（ｃｍ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ；ならびに
該（ｄ´）、（ｅ´）、（ｖ´）、（ｚ´）、（ａａ´）、（ａｒ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｂｍ´）、（ｂｎ´）、（ｂｏ´）、（ｃｆ´）、（ｃｊ´）、（ｃｍ´）、（ｄａ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｊ´）の組み合わせ、
(iii) さらに好ましくは、以下の（ｄ1´）、（ｂｍ1´）、（ｂｎ1´）及び（ｃｍ1´）からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸残基を有する：
（ｄ1´）配列番号２の１５位に相当する位置におけるＤ又はＥ；
（ｂｍ1´）配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＤ又はＥ；
（ｂｎ1´）配列番号２の２０２位に相当する位置におけるＥ；及び
（ｃｍ1´）配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＡ、
変異プロテアーゼ。
〔３〕好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記１）〜１０）のいずれかのアミノ酸残基を有する、〔１〕記載の変異プロテアーゼ：
１）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＥ、及び配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＡ；
２）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＥ、配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＤ、及び配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＡ；
３）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＥ、配列番号２の１５位に相当する位置におけるＤ又はＥ、配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＤ、及び配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＡ；
４）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＥ、配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＤ、配列番号２の２０２位に相当する位置におけるＥ、及び配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＡ；
５）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＥ、配列番号２の１５位に相当する位置におけるＤ又はＥ、配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＤ、配列番号２の２０２位に相当する位置におけるＥ、及び配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＡ；
６）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＮ、及び配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＡ；
７）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＮ、配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＤ、及び配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＡ；
８）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＮ、配列番号２の１５位に相当する位置におけるＤ又はＥ、配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＤ、及び配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＡ；
９）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＮ、配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＤ、配列番号２の２０２位に相当する位置におけるＥ、及び配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＡ；
１０）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＮ、配列番号２の１５位に相当する位置におけるＤ又はＥ、配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＤ、配列番号２の２０２位に相当する位置におけるＥ、及び配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＡ。
〔４〕好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列の３０位に相当する位置にアスパラギン酸を、６８位に相当する位置にヒスチジンを、かつ２５５位に相当する位置にセリンを有し、
より好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列の上記表１（ｉ）記載の位置に相当する位置に、当該表１（ｉｉ）記載のアミノ酸残基を有する、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の変異プロテアーゼ。
〔５〕好ましくは、親プロテアーゼと比べて酸性条件下での安定性が向上している、〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の変異プロテアーゼ。
〔６〕前記親プロテアーゼが、
好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼであり、
より好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列の３０３位に相当する位置にグリシンを有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼであり、
より好ましくは、配列番号２〜４のいずれかのアミノ酸配列からなるプロテアーゼである、
〔５〕記載の変異プロテアーゼ。
〔７〕前記酸性条件が、好ましくは、弱酸性条件であり、より好ましくはｐＨ５以上の条件であり、さらに好ましくはｐＨ５〜７未満の条件であり、さらに好ましくはｐＨ６〜６．８の条件である、〔５〕又は〔６〕記載の変異プロテアーゼ。
【００８３】
〔８〕〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド。
〔９〕〔８〕記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
〔１０〕〔８〕記載のポリヌクレオチド又は〔９〕記載のベクターを含む、形質転換体。
〔１１〕好ましくは、前記ベクターがバチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである、〔９〕記載のベクター又は〔１０〕記載の形質転換体。
〔１２〕好ましくは組換えバチルス属細菌である、〔１０〕又は〔１１〕記載の形質転換体。
〔１３〕〔１０〕〜〔１２〕記載の形質転換体を用いる変異プロテアーゼの製造方法。
【００８４】
〔１４〕〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載の変異プロテアーゼを含有する洗剤組成物。
〔１５〕好ましくは弱酸性である、〔１４〕記載の洗剤組成物。
〔１６〕好ましくは液体洗剤組成物である、〔１４〕又は〔１５〕記載の洗剤組成物。
〔１７〕界面活性剤の含有量が、好ましくは１０〜８０質量％、より好ましくは３０〜７０質量％である〔１６〕記載の洗剤組成物。
【００８５】
〔１８〕配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列の３０３位に相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することを含み、
該他のアミノ酸残基が、以下：
アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、トレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンからなる群より選択されるアミノ酸残基、
好ましくは、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、バリン、トリプトファン、及びチロシンからなる群より選択されるアミノ酸残基、
より好ましくは、アスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、及びバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基、
である、変異プロテアーゼの製造方法。
〔１９〕配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列の３０３位に相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することを含み、
該他のアミノ酸残基が、以下：
アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、トレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンからなる群より選択されるアミノ酸残基、
好ましくは、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、バリン、トリプトファン、及びチロシンからなる群より選択されるアミノ酸残基、
より好ましくは、アスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、及びバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基、
である、プロテアーゼの酸性条件下での安定性の向上方法。
〔２０〕好ましくは、前記配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列の３０３位に相当する位置にグリシンを有する、〔１８〕又は〔１９〕記載の方法。
〔２１〕該〔１８〕〜〔２０〕のいずれか１項記載の方法であって、
好ましくは、該方法が、前記配列番号２のアミノ酸配列において、前記配列番号２のアミノ酸配列の３０３位に相当する位置のアミノ酸残基の置換とともに、該３０３位の置換以外の変異を導入することを含むか、又は、前記配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列に対して該３０３位の置換以外の変異を有するアミノ酸配列であり、
ここで、該３０３位の置換以外の変異が、以下：
(i) 好ましくは、以下の（ａ）〜（ｄｖ）からなる群より選択される１つ以上：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列の６位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の９位又はそれに相当する位置におけるＫからＱへの置換；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列の１１位又はそれに相当する位置におけるＤからＧ、Ｓ又はＮへの置換；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列の１５位又はそれに相当する位置におけるＳからＨ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列の１６位又はそれに相当する位置におけるＳからＴ、Ｑ、Ｖ、Ｃ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列の２０位又はそれに相当する位置におけるＹからＦ又はＡへの置換；
（ｇ）配列番号２のアミノ酸配列の２２位又はそれに相当する位置におけるＱからＷへの置換；
（ｈ）配列番号２のアミノ酸配列の２３位又はそれに相当する位置におけるＧからＮへの置換；
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列の３７位又はそれに相当する位置におけるＲからＴへの置換；
（ｊ）配列番号２のアミノ酸配列の４０位又はそれに相当する位置におけるＳからＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｋ）配列番号２のアミノ酸配列の４１位又はそれに相当する位置におけるＳからＩへの置換；
（ｌ）配列番号２のアミノ酸配列の４６位又はそれに相当する位置におけるＦからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷへの置換；
（ｍ）配列番号２のアミノ酸配列の４９位又はそれに相当する位置におけるＫからＱへの置換；
（ｎ）配列番号２のアミノ酸配列の５２位又はそれに相当する位置におけるＡからＧ又はＳへの置換；
（ｏ）配列番号２のアミノ酸配列の５３位又はそれに相当する位置におけるＬからＡ、Ｖ又はＩへの置換；
（ｐ）配列番号２のアミノ酸配列の５４位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｑ）配列番号２のアミノ酸配列の５６位又はそれに相当する位置におけるＬからＶへの置換；
（ｒ）配列番号２のアミノ酸配列の５７位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｓ）配列番号２のアミノ酸配列の５９位又はそれに相当する位置におけるＴからＶ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｔ）配列番号２のアミノ酸配列の６０位又はそれに相当する位置におけるＮからＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｕ）配列番号２のアミノ酸配列の６３位又はそれに相当する位置におけるＮからＳ、Ｄ又はＬへの置換；
（ｖ）配列番号２のアミノ酸配列の６５位又はそれに相当する位置におけるＴからＷ又はＰへの置換；
（ｗ）配列番号２のアミノ酸配列の６６位又はそれに相当する位置におけるＮからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷへの置換；
（ｘ）配列番号２のアミノ酸配列の８０位又はそれに相当する位置におけるＧからＨ又はＡへの置換；
（ｙ）配列番号２のアミノ酸配列の８１位又はそれに相当する位置におけるＳからＱ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｚ）配列番号２のアミノ酸配列の８２位又はそれに相当する位置におけるＴからＧ、Ｓ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ又はＭへの置換；
（ａａ）配列番号２のアミノ酸配列の８３位又はそれに相当する位置におけるＮからＳ、Ｃ又はＡへの置換；
（ａｂ）配列番号２のアミノ酸配列の８４位又はそれに相当する位置におけるＫからＲへの置換；
（ａｃ）配列番号２のアミノ酸配列の８９位又はそれに相当する位置におけるＱからＨへの置換；
（ａｄ）配列番号２のアミノ酸配列の９１位又はそれに相当する位置におけるＮからＣへの置換；
（ａｅ）配列番号２のアミノ酸配列の１００位又はそれに相当する位置におけるＳからＬ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ａｆ）配列番号２のアミノ酸配列の１０１位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｇ）配列番号２のアミノ酸配列の１０２位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｈ）配列番号２のアミノ酸配列の１０３位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｉ）配列番号２のアミノ酸配列の１０４位又はそれに相当する位置におけるＬからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｊ）配列番号２のアミノ酸配列の１０５位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｋ）配列番号２のアミノ酸配列の１０６位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｌ）配列番号２のアミノ酸配列の１０７位又はそれに相当する位置におけるＬからＳ、Ｒ、Ｋ又はＡへの置換；
（ａｍ）配列番号２のアミノ酸配列の１０９位又はそれに相当する位置におけるＳからＬ、Ｉ又はＦへの置換；
（ａｎ）配列番号２のアミノ酸配列の１１３位又はそれに相当する位置におけるＴからＬ又はＷへの置換；
（ａｏ）配列番号２のアミノ酸配列の１１９位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｐ）配列番号２のアミノ酸配列の１２０位又はそれに相当する位置におけるＳからＹ、Ｒ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ａｑ）配列番号２のアミノ酸配列の１２４位又はそれに相当する位置におけるＲからＫ又はＡへの置換；
（ａｒ）配列番号２のアミノ酸配列の１３２位又はそれに相当する位置におけるＡからＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｉ又はＭへの置換；
（ａｓ）配列番号２のアミノ酸配列の１３３位又はそれに相当する位置におけるＡからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｔ）配列番号２のアミノ酸配列の１３４位又はそれに相当する位置におけるＶからＧ、Ｓ、Ｔ又はＡへの置換；
（ａｕ）配列番号２のアミノ酸配列の１３３位又はそれに相当する位置と１３４位又はそれに相当する位置との間へのＧ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷの挿入；
（ａｖ）配列番号２のアミノ酸配列の１３５位又はそれに相当する位置におけるＮからＲ、Ａ、Ｌ又はＭへの置換；
（ａｗ）配列番号２のアミノ酸配列の１３６位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｘ）配列番号２のアミノ酸配列の１３８位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｙ）配列番号２のアミノ酸配列の１４０位又はそれに相当する位置におけるＴからＬ、Ｗ又はＦへの置換；
（ａｚ）配列番号２のアミノ酸配列の１４８位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｂａ）配列番号２のアミノ酸配列の１５１位又はそれに相当する位置におけるＫからＦへの置換；
（ｂｂ）配列番号２のアミノ酸配列の１６３位又はそれに相当する位置におけるＥからＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦへの置換；
（ｂｃ）配列番号２のアミノ酸配列の１６６位又はそれに相当する位置におけるＮからＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｂｄ）配列番号２のアミノ酸配列の１６７位又はそれに相当する位置におけるＧからＶへの置換；
（ｂｅ）配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はそれに相当する位置におけるＩからＶ又はＬへの置換；
（ｂｆ）配列番号２のアミノ酸配列の１７１位又はそれに相当する位置におけるＳからＧ、Ｔ、Ｅ又はＡへの置換；
（ｂｇ）配列番号２のアミノ酸配列の１８７位又はそれに相当する位置におけるＮからＳへの置換；
（ｂｈ）配列番号２のアミノ酸配列の１９１位又はそれに相当する位置におけるＳからＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｂｉ）配列番号２のアミノ酸配列の１９３位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｂｊ）配列番号２のアミノ酸配列の１９４位又はそれに相当する位置におけるＳからＹ、Ｒ又はＫへの置換；
（ｂｋ）配列番号２のアミノ酸配列の１９５位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｂｌ）配列番号２のアミノ酸配列の２００位又はそれに相当する位置におけるＮからＷへの置換；
（ｂｍ）配列番号２のアミノ酸配列の２０１位又はそれに相当する位置におけるＨからＤ、Ｅ又はＱへの置換；
（ｂｎ）配列番号２のアミノ酸配列の２０２位又はそれに相当する位置におけるＶからＥへの置換；
（ｂｏ）配列番号２のアミノ酸配列の２０４位又はそれに相当する位置におけるＱからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＰへの置換；
（ｂｐ）配列番号２のアミノ酸配列の２０５位又はそれに相当する位置におけるＦからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷへの置換；
（ｂｑ）配列番号２のアミノ酸配列の２１２位又はそれに相当する位置におけるＫからＮ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｌ又はＷへの置換；
（ｂｒ）配列番号２のアミノ酸配列の２２６位又はそれに相当する位置におけるＦからＹへの置換；
（ｂｓ）配列番号２のアミノ酸配列の２３３位又はそれに相当する位置におけるＳからＬ、Ｉ又はＷへの置換；
（ｂｔ）配列番号２のアミノ酸配列の２３７位又はそれに相当する位置におけるＤからＮへの置換；
（ｂｕ）配列番号２のアミノ酸配列の２３８位又はそれに相当する位置におけるＳからＬへの置換；
（ｂｖ）配列番号２のアミノ酸配列の２４３位又はそれに相当する位置におけるＮからＹ、Ｌ又はＩへの置換；
（ｂｗ）配列番号２のアミノ酸配列の２４５位又はそれに相当する位置におけるＤからＮへの置換；
（ｂｘ）配列番号２のアミノ酸配列の２４６位又はそれに相当する位置におけるＳからＹ、Ｖ、Ｌ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｂｙ）配列番号２のアミノ酸配列の２４７位又はそれに相当する位置におけるＫからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｂｚ）配列番号２のアミノ酸配列の２４８位又はそれに相当する位置におけるＹからＦへの置換；
（ｃａ）配列番号２のアミノ酸配列の２５０位又はそれに相当する位置におけるＹからＦへの置換；
（ｃｂ）配列番号２のアミノ酸配列の２５１位又はそれに相当する位置におけるＭからＧ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ａ、Ｖ、Ｌ又はＩへの置換；
（ｃｃ）配列番号２のアミノ酸配列の２５６位又はそれに相当する位置におけるＭからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｃｄ）配列番号２のアミノ酸配列の２５７位又はそれに相当する位置におけるＡからＶ又はＩへの置換；
（ｃｅ）配列番号２のアミノ酸配列の２６４位又はそれに相当する位置におけるＮからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＭへの置換；
（ｃｆ）配列番号２のアミノ酸配列の２７３位又はそれに相当する位置におけるＶからＧ、Ｔ又はＩへの置換；
（ｃｇ）配列番号２のアミノ酸配列の２７５位又はそれに相当する位置におけるＮからＬ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｃｈ）配列番号２のアミノ酸配列の２７７位又はそれに相当する位置におけるＧからＶ、Ｌ、Ｉ又はＦへの置換；
（ｃｉ）配列番号２のアミノ酸配列の２８１位又はそれに相当する位置におけるＫからＲへの置換；
（ｃｊ）配列番号２のアミノ酸配列の２９４位又はそれに相当する位置におけるＡからＴへの置換；
（ｃｋ）配列番号２のアミノ酸配列の２９６位又はそれに相当する位置におけるＩからＶへの置換；
（ｃｌ）配列番号２のアミノ酸配列の２９７位又はそれに相当する位置におけるＧからＬ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｃｍ）配列番号２のアミノ酸配列の３０４位又はそれに相当する位置におけるＮからＳ又はＡへの置換；
（ｃｎ）配列番号２のアミノ酸配列の３１３位又はそれに相当する位置におけるＤからＮへの置換；
（ｃｏ）配列番号２のアミノ酸配列の３１９位又はそれに相当する位置におけるＡからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｃｐ）配列番号２のアミノ酸配列の３２０位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｔ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦへの置換；
（ｃｑ）配列番号２のアミノ酸配列の３２６位又はそれに相当する位置におけるＳからＷへの置換；
（ｃｒ）配列番号２のアミノ酸配列の３３０位又はそれに相当する位置におけるＳからＭ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｃｓ）配列番号２のアミノ酸配列の３３２位又はそれに相当する位置におけるＫからＧ、Ｔ又はＶへの置換；
（ｃｔ）配列番号２のアミノ酸配列の３３４位又はそれに相当する位置におけるＴからＬへの置換；
（ｃｕ）配列番号２のアミノ酸配列の３３５位又はそれに相当する位置におけるＹからＦへの置換；
（ｃｖ）配列番号２のアミノ酸配列の３３７位又はそれに相当する位置におけるＦからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ又はＶへの置換；
（ｃｗ）配列番号２のアミノ酸配列の３４２位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｃｘ）配列番号２のアミノ酸配列の３４３位又はそれに相当する位置におけるＫからＴへの置換；
（ｃｙ）配列番号２のアミノ酸配列の３４６位又はそれに相当する位置におけるＫからＲへの置換；
（ｃｚ）配列番号２のアミノ酸配列の３５７位又はそれに相当する位置におけるＳからＬへの置換；
（ｄａ）配列番号２のアミノ酸配列の３５９位又はそれに相当する位置におけるＴからＧ、Ｓ、Ｑ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦへの置換；
（ｄｂ）配列番号２のアミノ酸配列の３６１位又はそれに相当する位置におけるＳからＶ、Ｉ又はＷへの置換；
（ｄｃ）配列番号２のアミノ酸配列の３６９位又はそれに相当する位置におけるＤからＮへの置換；
（ｄｄ）配列番号２のアミノ酸配列の３７６位又はそれに相当する位置におけるＮからＷへの置換；
（ｄｅ）配列番号２のアミノ酸配列の３７８位又はそれに相当する位置におけるＴからＬ又はＷへの置換；
（ｄｆ）配列番号２のアミノ酸配列の３７９位又はそれに相当する位置におけるＱからＤ、Ｅ、Ｒ又はＫへの置換；
（ｄｇ）配列番号２のアミノ酸配列の３８０位又はそれに相当する位置におけるＹからＦへの置換；
（ｄｈ）配列番号２のアミノ酸配列の３８５位又はそれに相当する位置におけるＦからＹ、Ｍ又はＰへの置換；
（ｄｉ）配列番号２のアミノ酸配列の３８６位又はそれに相当する位置におけるＴからＡ、Ｌ、Ｉ又はＭへの置換；
（ｄｊ）配列番号２のアミノ酸配列の３８７位又はそれに相当する位置におけるＳからＧ、Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｄｋ）配列番号２のアミノ酸配列の３９０位又はそれに相当する位置におけるＮからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｙ又はＦへの置換；
（ｄｌ）配列番号２のアミノ酸配列の３９３位又はそれに相当する位置におけるＷからＱへの置換；
（ｄｍ）配列番号２のアミノ酸配列の３９６位又はそれに相当する位置におけるＲからＧへの置換；
（ｄｎ）配列番号２のアミノ酸配列の４０３位又はそれに相当する位置におけるＦからＴ又はＫへの置換；
（ｄｏ）配列番号２のアミノ酸配列の４０５位又はそれに相当する位置におけるＮからＤ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｄｐ）配列番号２のアミノ酸配列の４０６位又はそれに相当する位置におけるＡからＶ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｄｑ）配列番号２のアミノ酸配列の４０７位又はそれに相当する位置におけるＰからＧ又はＣへの置換；
（ｄｒ）配列番号２のアミノ酸配列の４０８位又はそれに相当する位置におけるＱからＮ、Ｙ、Ｉ又はＷへの置換；
（ｄｓ）配列番号２のアミノ酸配列の４０９位又はそれに相当する位置におけるＳからＹ又はＷへの置換；
（ｄｔ）配列番号２のアミノ酸配列の４１１位又はそれに相当する位置におけるＴからＡ、Ｖ、Ｌ又はＰへの置換；
（ｄｕ）配列番号２のアミノ酸配列の４２７位又はそれに相当する位置におけるＴからＲ又はＶへの置換；
（ｄｖ）配列番号２のアミノ酸配列の４３３位又はそれに相当する位置におけるＶからＬへの置換、
(ii) より好ましくは、以下のいずれか：
該（ａｒ）；
該（ｂｋ）；
該（ｂｍ）；
該（ｃｊ）；
該（ｃｍ）；
該（ｄｃ）；
該（ｅ）及び（ａａ）の組み合わせ；
該（ｂｃ）及び（ｂｄ）の組み合わせ；
該（ｂｍ）及び（ｂｎ）の組み合わせ；
該（ｂｍ）及び（ｃｍ）の組み合わせ；
該（ｂｍ）、（ｂｎ）及び（ｃｍ）の組み合わせ；
該（ｄ）、（ｂｍ）及び（ｃｍ）の組み合わせ；
該（ｄ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）及び（ｃｍ）の組み合わせ；
該（ｖ）、（ｃｆ）、（ｄａ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｊ）、（ｓ）、（ｙ）、（ｂｈ）及び（ｄｏ）の組み合わせ；
該（ａｓ）及び（ａｔ）及び（ａｕ）の組み合わせ；
該（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｆ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｆ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｊ）、（ｓ）、（ｖ）、（ｙ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｈ）、（ｂｋ）、（ｃｆ）、（ｄａ）、（ｄｃ）、（ｄｊ）及び（ｄｏ）の組み合わせ；
該（ｖ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｆ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｖ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｆ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｏ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｖ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｑ）（ｃｆ）、（ｄａ）、（ｄｃ）、（ｄｆ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｅ）、（ｖ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｅ）、（ｖ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｅ）、（ｖ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｍ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｃｍ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｅ）、（ｖ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｃｍ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；
該（ｄ）、（ｅ）、（ｖ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｍ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｃｍ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ；ならびに、
該（ｄ）、（ｅ）、（ｖ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｃｆ）、（ｃｊ）、（ｃｍ）、（ｄａ）、（ｄｃ）及び（ｄｊ）の組み合わせ、
(iii) さらに好ましくは、以下の（ｄ1）、（ｂｍ1）、（ｂｎ1）及び（ｃｍ1）からなる群より選択される１つ以上：
（ｄ1）配列番号２の１５位に相当する位置におけるＳからＤ又はＥへの置換；
（ｂｍ1）配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＨからＤ又はＥへの置換；
（ｂｎ1）配列番号２の２０２位に相当する位置におけるＶからＥへの置換；及び
（ｃｍ1）配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換、
である、方法。
〔２２〕配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列に対して、以下の１）〜１０）のいずれかを行うことを含む、該〔１８〕〜〔２０〕のいずれか１項記載の方法：
１）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＧからＥへの置換、及び
配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換；
２）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＧからＥへの置換、
配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＨからＤへの置換、及び
配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換；
３）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＧからＥへの置換、
配列番号２の１５位に相当する位置におけるＳからＤ又はＥへの置換、
配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＨからＤへの置換、及び
配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換；
４）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＧからＥへの置換、
配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＨからＤへの置換、
配列番号２の２０２位に相当する位置におけるＶからＥへの置換、及び
配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換；
５）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＧからＥへの置換、
配列番号２の１５位に相当する位置におけるＳからＤ又はＥへの置換、
配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＨからＤへの置換、
配列番号２の２０２位に相当する位置におけるＶからＥへの置換、及び
配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換；
６）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＧからＮへの置換、及び
配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換；
７）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＧからＮへの置換、
配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＨからＤへの置換、及び
配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換；
８）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＧからＮへの置換、
配列番号２の１５位に相当する位置におけるＳからＤ又はＥへの置換、
配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＨからＤへの置換、及び
配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換；
９）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＧからＮへの置換、
配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＨからＤへの置換、
配列番号２の２０２位に相当する位置におけるＶからＥへの置換、及び
配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換；
１０）配列番号２の３０３に相当する位置におけるＧからＮへの置換、
配列番号２の１５位に相当する位置におけるＳからＤ又はＥへの置換、
配列番号２の２０１位に相当する位置におけるＨからＤへの置換、
配列番号２の２０２位に相当する位置におけるＶからＥへの置換、及び
配列番号２の３０４位に相当する位置におけるＮからＡへの置換。
〔２３〕前記配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列が、
好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列の３０位に相当する位置にアスパラギン酸を、６８位に相当する位置にヒスチジンを、かつ２５５位に相当する位置にセリンを有し、
より好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列の上記表１（ｉ）記載の位置に相当する位置に、当該表１（ｉｉ）記載のアミノ酸残基を有する、
〔１８〕〜〔２２〕のいずれか１項記載の方法。
〔２４〕好ましくは、前記配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列が、配列番号２〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列である、〔１８〕〜〔２２〕のいずれか１項記載の方法。
〔２５〕好ましくは、前記変異プロテアーゼが、親プロテアーゼと比べて酸性条件下での安定性が向上した変異プロテアーゼである、〔１８〕、〔２０〕〜〔２４〕のいずれか１項記載の方法。
〔２６〕前記酸性条件が、好ましくは、弱酸性条件であり、より好ましくはｐＨ５以上の条件であり、さらに好ましくはｐＨ５〜７未満の条件であり、さらに好ましくはｐＨ６〜６．８の条件である、〔１９〕〜〔２５〕のいずれか１項記載の方法。
【実施例】
【００８６】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００８７】
以下の実施例で用いたプライマーの一覧を表２に示す。
【００８８】
【表２】
2020145938.tif 000003
【００８９】
参考例１  プラスミドｐＨＡ６４ＴＳＡの構築
プラスミドｐＨＡ６４（特許第３４９２９３号、発現プロモーター下流にＢａｍＨ  ＩサイトとＸｂａ  Ｉサイトを有する）を制限酵素ＢａｍＨ  Ｉ及びＸｂａ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ社）にて同時消化し、遺伝子挿入及び発現用ベクターとした。一方、野生型ＫＰ４３プロテアーゼ遺伝子（配列番号１）を含むＤＮＡ（遺伝子上流の５’−末端にＢａｍＨ  Ｉサイト、遺伝子下流の３’−末端にＸｂａ  Ｉサイトを有する）をＢａｍＨ  Ｉ及びＸｂａ  Ｉにて同時消化し、先の挿入及び発現用ベクターと混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いてライゲーション反応を行った。ライゲーション産物をエタノール沈殿にて精製したのち、これを用いて宿主菌であるバチルス  エスピーＫＳＭ−９８６５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６６）をエレクトロポレーション法にて形質転換した。処理した細胞をスキムミルク含有アルカリ寒天培地〔１％（ｗ／ｖ）スキムミルク（ディフコ）、１％バクトトリプトン（ディフコ）、０．５％酵母エキス（ディフコ）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天、０．０５％炭酸ナトリウム、１５ｐｐｍテトラサイクリン〕に塗沫した。数日後に寒天培地に出現したコロニーから、スキムミルク溶解斑の有無によりプロテアーゼ遺伝子が導入された形質転換体を選抜した。該形質転換体からプラスミドを抽出し、目的のプロテアーゼ遺伝子（配列番号１）が正しく挿入されていることを確認し、目的のプラスミドｐＨＡ６４ＴＳＡを得た。
【００９０】
参考例２  プロテアーゼの調製
酵素安定性評価に用いたプロテアーゼの調製方法について、野生型ＫＰ４３プロテアーゼを例として以下に示す。すなわち、ｐＨＡ６４ＴＳＡを保持するＫＳＭ−９８６５株の形質転換体を５ｍＬの種母培地〔６．０％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．０５％酵母エキス、１．０％マルトース、０．０２％硫酸マグネシウム７水和物、０．１％リン酸２水素カリウム、０．２５％炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン〕に植菌し、３０℃で１６時間振盪培養した。次いで２０ｍＬの主培地〔８％ポリペプトンＳ、０．３％酵母エキス、１０％マルトース、０．０４％硫酸マグネシウム７水和物、０．２％リン酸２水素カリウム、１．５％無水炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン〕に種母培養液を１％（ｖ／ｖ）植菌し、３０℃で３日間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離してプロテアーゼを含む培養上清を取得した。培養上清のタンパク質量は、プロテインアッセイラピッドキットワコー（和光純薬）を用いて測定した。
【００９１】
参考例３  プロテアーゼ活性の測定
ジメチルスルホキシドに溶解させた４０ｍＭのＧｌｔ―Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ｌｅｕ−ｐＮＡ（ＡＡＰＬ；ペプチド研究所  ３１２９）、２６６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、和光１６７−１４４９１）、及びイオン交換水を、それぞれ３容、１０容、７容の割合で混合して基質溶液を調製した。該基質溶液５０μＬを９６穴アッセイプレートの各ウェルに分注し、そこにイオン交換水で適宜希釈したプロテアーゼ含有液を５０μＬ添加することで反応を開始した。反応開始直後に、該アッセイプレートを予め３０℃に温度設定したマイクロプレートリーダーＶｅｒｓａＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社）のチャンバー内に挿入し、４２０ｎｍにおける吸光度変化をカイネティックモードで１０分間測定した。測定結果として出力される吸光度変化速度（ｍＯＤ／ｍｉｎ）の値をプロテアーゼの活性値とした。
【００９２】
参考例４  弱酸性条件における界面活性剤存在下でのプロテアーゼ安定性の評価
９６穴ディープウェルプレートの外周部分を除いた６０ウェルの各ウェルに、４５０μＬの１０％ＬＡＳ溶液（２００ｇのネオペレックス  Ｇ−２５（花王  有効成分２５％）を、イオン交換水で５００ｍＬに希釈して使用）と、５０μＬの２００ｍＭブリットン・ロビンソン緩衝液（ｐＨ８．５、６．５又は６．０）を添加し、ミキサー（ヤマト科学  ＣＭ−１０００）で２５００ｒｐｍにて攪拌して、各ｐＨの界面活性剤含有組成物を調製した。該組成物にタンパク質量１０ｍｇ／ｍＬに調整したプロテアーゼ溶液５μＬを加え、同ミキサーで２５００ｒｐｍ、１分間攪拌し、酵素液を得た。攪拌直後に酵素液２０μＬを分取し、予め各ウェル２５０μＬのイオン交換水を含む９６穴アッセイプレートに添加して充分に攪拌し、１３．５倍希釈液を得た。該希釈液５０μＬを、予め各ウェル５０μＬの基質溶液を含む９６穴アッセイプレートに添加して反応液を調製した。該反応液を含むプレートをマイクロプレートリーダーＶｅｒｓａＭａｘに挿入して吸光度変化を測定し、プロテアーゼの初期活性値を得た。プロテアーゼ活性測定時には、基質溶液の緩衝能により反応液がｐＨ７．４になっていることを確認した。また、界面活性剤含有組成物とプロテアーゼ溶液を混合してから、活性測定を開始するまで約２分を要した。
残りの酵素液を含むディープウェルプレートは、外周のウェルに１ｍＬの水を加え、ＰＣＲシールで厳重に密封して４０℃で保温した。所定時間後、ディープウェルプレートから再び酵素液２０μＬを分取し、初期活性値の測定と同様の手順で所定時間後のプロテアーゼの活性値を得た。
【００９３】
各プロテアーゼ変異体について、弱酸性条件（ｐＨ６．５又は６．０）下での初期（混合２分後）活性値及び所定時間後の活性値を、ｐＨ８．５条件下での初期活性値で除して、１００を乗じ、得られた値を初期及び所定時間後の残存活性（％）とした。得られた初期及び所定時間後の残存活性（％）を、該変異体の親プロテアーゼの同時間の残存活性（％）で除して、１００を乗じた。得られた値を、弱酸性条件における界面活性剤存在下でのプロテアーゼ活性についての、親プロテアーゼに対するプロテアーゼ変異体の初期及び所定時間後での相対残存活性（％％）とした。
【００９４】
実施例１  プロテアーゼ変異体の作製
本発明のプロテアーゼ変異体の作製手順を、野生型ＫＰ４３プロテアーゼ成熟酵素領域のアミノ酸配列（配列番号２）における３０３位のグリシン（Ｇ３０３）をアスパラギン酸に変異させた変異体（Ｇ３０３Ｄ変異体）の作製を例として、以下に示す。
【００９５】
変異用プライマー３０３Ｄ＿Ｆ及び３０３＿Ｒ（配列番号１１及び８、表２）を設計し、ユーロフィンジェノミクス株式会社に合成を依頼した。参考例１で得られた、プロテアーゼ遺伝子（配列番号１）を含有するプラスミドｐＨＡ６４ＴＳＡを鋳型とし、合成した変異用プライマーを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）のプロトコルに従ってＰＣＲを行い、変異を含むプロテアーゼ遺伝子のＰＣＲ産物を取得した。該ＰＣＲ産物をＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ロッシュ）にて精製し、これを用いて、宿主菌であるバチルス  エスピー  ＫＳＭ９８６５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６６）をエレクトロポレーション法にて形質転換した。参考例１と同様の方法で形質転換体を選抜し、培養することで、野生型ＫＰ４３プロテアーゼのＧ３０３Ｄ変異体を得た。
【００９６】
実施例２  プロテアーゼ変異体の作製
（１）親プロテアーゼの作製
特開２０１１−２００２４９号公報、特開２００２−２１８９８９号公報、特開２００２−３０６１７６号公報、特開２００４−０００１２２号公報、特開２００４−３０５１７６号公報、特開２０１０−２７３６７２号公報、特開２０１０−２７３６７３号公報、及び特開２０１７−２２１１８８号公報の記載を参考に、野生型ＫＰ４３プロテアーゼ（配列番号２）に以下の変異を導入し、ＫＰ４３プロテアーゼの１２重変異体（配列番号３）を作製した。この変異体は、野生型ＫＰ４３プロテアーゼ（配列番号２）対して９７．２％のアミノ酸配列の同一性を有していた。
１２重変異体（配列番号３）：
１３２位のアラニンをトレオニンに置換（特開２０１１−２００２４９号公報）；
１９５位のチロシンをグルタミンに置換（特開２００２−２１８９８９号公報）；
３６９位のアスパラギン酸をアスパラギンに置換（特開２００２−３０６１７６号公報）；
６５位のトレオニンをプロリンに置換、２７３位のバリンをイソロイシンに置換、３５９位のトレオニンをセリンに置換、及び３８７位のセリンをアラニンに置換（特開２００４−０００１２２号公報）；
１６位のセリンをバリンに置換、１６６位のアスパラギンをグリシンに置換、及び１６７位のグリシンをバリンに置換（特開２００４−３０５１７６号公報、特開２０１０−２７３６７３号公報）；
８３位のアスパラギンをアラニンに置換（特開２０１０−２７３６７２号公報、及び特開２０１０−２７３６７３号公報）；及び
２９４位のアラニンをトレオニンに置換（特開２０１７−２２１１８８号公報）。
【００９７】
（２）プロテアーゼ変異体の作製
上記（１）で得られた１２重変異体を親プロテアーゼとして、目的のプロテアーゼ変異体を作製した。該１２重変異体をコードするポリヌクレオチドに対して、表３記載の変異用プライマーを用いて、実施例１と同様の手順で、３０３位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換される変異を導入した。得られた変異ポリヌクレオチドで宿主を形質転換した。参考例２の手順にて形質転換体を培養して目的のプロテアーゼ変異体を含む培養上清を取得し、そのタンパク質量を測定した。
【００９８】
【表３】
2020145938.tif 000004
【００９９】
（３）二重変異体の作製
上記（１）で得られた１２重変異体をコードするポリヌクレオチドに対して、表４記載の変異用プライマーを用いて、実施例１と同様の手順で、の３０３位のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換する変異と、３０４位のアミノ酸残基をアラニンに置換する変異を導入し、変異ポリヌクレオチドを得た。同様に、該３０４位置換のみを導入した変異ポリヌクレオチドを得た。得られた変異ポリヌクレオチドで宿主を形質転換した。参考例２の手順にて形質転換体を培養して目的のプロテアーゼ変異体を含む培養上清を取得し、そのタンパク質量を測定した。
【０１００】
【表４】
2020145938.tif 000005
【０１０１】
実施例３  プロテアーゼ変異体の安定性評価
実施例１及び２で作製したプロテアーゼ変異体の安定性を調べた。参考例４の手順に従って、ｐＨ６．５の界面活性剤含有組成物中での初期（２分後）、ならびに１時間、２時間、及び３時間保存後の、各変異体の相対残存活性（％％）を測定した。結果を表５に示す。３０３位に相当する位置にアスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン又はバリンを有する変異体（Ｇ３０３Ｄ、Ｇ３０３Ｅ、Ｇ３０３Ｉ、Ｇ３０３Ｍ、Ｇ３０３Ｎ、及びＧ３０３Ｖ）は、親プロテアーゼに対して非常に高い相対残存活性（％％）を有し、弱酸性条件下で非常に高い安定性を有することが示された。３０３位に相当する位置にフェニルアラニン、グルタミン、トリプトファン又はチロシンを有する変異体（Ｇ３０３Ｆ、Ｇ３０３Ｑ、Ｇ３０３Ｗ、及びＧ３０３Ｙ）は、親プロテアーゼに対して高い相対残存活性（％％）を有し、弱酸性条件下で高い安定性を有することが示された。３０３位に相当する位置にプロリン又はトレオニンを有する変異体（Ｇ３０３Ｐ及びＧ３０３Ｔ）は、親プロテアーゼに対して比較的高い相対残存活性（％％）を有し、弱酸性条件下で比較的高い安定性を有することが示された。また、３０３位及び３０４位に変異を有する二重変異体は、単独変異体と比べて安定性が顕著に向上した。また、同様の手順で野生型酵素（ＫＰ４３プロテアーゼ）の安定性を調べたところ、ｐＨ６．５の界面活性剤組成物との混合直後に失活した。この結果から、プロテアーゼ１２重変異体の相対残存活性が野生型に比べて顕著に向上していたこと、したがって実施例２で得られたプロテアーゼ変異体の弱酸性条件下での安定性が野生型と比べて極めて高いことが示された。
【０１０２】
【表５】
2020145938.tif 000006
【０１０３】
実施例４  プロテアーゼ多重変異体の作製及び安定性評価−１
（１）親プロテアーゼの作製
特開２０１１−２００２４９号公報、特開２００２−２１８９８９号公報、特開２００２−３０６１７６号公報、特開２００４−０００１２２号公報、特開２００４−３０５１７６号公報、特開２０１０−２７３６７２号公報、特開２０１０−２７３６７３号公報、及び特開２０１７−２２１１８８号公報の記載を参考に、野生型ＫＰ４３プロテアーゼ（配列番号２）に以下の変異を導入し、ＫＰ４３プロテアーゼの１４重変異体（配列番号４）を作製した。この変異体は、野生型ＫＰ４３プロテアーゼ（配列番号２）対して、９６．８％のアミノ酸配列の同一性を有していた。
１４重変異体（配列番号４）：
１３２位のアラニンをトレオニンに置換（特開２０１１−２００２４９号公報）；
１９５位のチロシンをシステインに置換（特開２００２−２１８９８９号公報）；
３６９位のアスパラギン酸をアスパラギンに置換（特開２００２−３０６１７６号公報）；
６５位のトレオニンをプロリンに置換、２７３位のバリンをイソロイシンに置換、３５９位のトレオニンをセリンに置換、及び３８７位のセリンをアラニンに置換（特開２００４−０００１２２号公報）；
１６位のセリンをバリンに置換、１６６位のアスパラギンをグリシンに置換、及び１６７位のグリシンをバリンに置換（特開２００４−３０５１７６号公報、特開２０１０−２７３６７３号公報）；
８２位のトレオニンをグルタミン酸に置換、８３位のアスパラギンをアラニンに置換、２０４位のグルタミンをシステインに置換（特開２０１０−２７３６７２号公報、及び特開２０１０−２７３６７３号公報）；及び
２９４位のアラニンをトレオニンに置換（特開２０１７−２２１１８８号公報）。
【０１０４】
（２）プロテアーゼ多重変異体の作製
上記（１）で得られた１４重変異体を親プロテアーゼとして、表６（Ａ）記載のプロテアーゼ多重変異体を作製した。該１４重変異体をコードするポリヌクレオチドに対して、表６（Ｂ）記載の変異用プライマーを用いて実施例１の手順を繰り返すことで、表６（Ａ）記載の多重変異体、及びそれを含む培養上清を調製した。
【０１０５】
【表６】
2020145938.tif 000007
【０１０６】
（３）プロテアーゼの安定性評価
上記（２）で作製したプロテアーゼ多重変異体について、参考例４の手順に従って、ｐＨ６．０の界面活性剤含有組成物中での初期（２分後）、ならびに１日、２日、４日、及び８日間保存後の相対残存活性（％％）を測定した。結果を表７に示す。３０３位変異に１５位、２０１位、２０２位、又は３０４位の変異を加えた多重変異体は、ｐＨ６．０下で高い相対残存活性（％％）を示した。また、ｐＨ６．０の界面活性剤含有組成物中において、本実施例で親プロテアーゼとして用いた１４重変異体は、実施例２で親プロテアーゼとして用いたプロテアーゼ１２重変異体と比べて、相対残存活性が向上していた。
【０１０７】
同様の手順で、ｐＨ５．０の界面活性剤含有組成物中での初期（２分後）、及び１日後の各変異体の相対残存活性（％％）を測定した。結果を表７に示す。調べた変異体のほぼ全てが、ｐＨ５．０でも高い相対残存活性（％％）を示した。
【０１０８】
【表７】
2020145938.tif 000008
【０１０９】
実施例５  プロテアーゼ多重変異体の作製及び安定性評価−２
（１）プロテアーゼ多重変異体の作製
実施例４で得られた多重変異体２０１Ｄ／３０３Ｅ／３０４Ａ（配列番号５）、１５Ｄ／２０１Ｄ／３０３Ｅ／３０４Ａ（配列番号６）及び１５Ｅ／２０１Ｄ／３０３Ｅ／３０４Ａ（配列番号７）を親プロテアーゼとして、表８（Ａ）記載のプロテアーゼ多重変異体を作製した。該配列番号５〜７の親プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドに対して、表８（Ｂ）記載の変異用プライマーを用いて実施例１の手順を繰り返すことで、表８（Ａ）記載の多重変異体、及びそれを含む培養上清を調製した。
【０１１０】
【表８】
2020145938.tif 000009
【０１１１】
（２）プロテアーゼの安定性評価
参考例４の手順に従って、実施例４で作製した１４変異体に対する、上記（１）で作製したプロテアーゼ多重変異体の相対残存活性（％％）を測定した。すなわち、各多重変異体について、ｐＨ６．０の界面活性剤含有組成物中での初期（２分後）、ならびに１日、２日、及び４日間保存後の、該１４変異体に対する相対残存活性（％％）を測定した。結果を表９に示す。いずれの多重変異体も、ｐＨ６．０下で高い相対残存活性（％％）を示した。すなわち、配列番号５〜７のプロテアーゼに対して２０４位システイン及び１９５位のシステインを置換した変異体は、いずれの時間においても該１４変異体に対して明白に高い相対残存活性（％％）を示した。
【０１１２】
【表９】
2020145938.tif 000010
【０１１３】
以上、本発明の実施形態を説明したが、これらが、本発明を、説明した特定の実施形態に限定することを意図するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内にある様々な他の変更及び修正は当業者には明白である。
本明細書に引用されている文献及び特許出願は、あたかもそれが本明細書に完全に記載されているかのように参考として援用される。
【配列表】
2020145938000001.app