(57)【要約】      （修正有）【課題】公知のＯＲＦＶベクターおよびＯＲＦＶベクターシステムの欠点を軽減または回避できる、新規の組換えＯＲＦＶベクターを提供する。【解決手段】（１）外来遺伝子をコードし、発現する、少なくとも１つのヌクレオチド配列、および、（２）前記ヌクレオチド配列の発現を制御する少なくとも１つのプロモーターを含む組換えオルフウイルス（ＯＲＦＶ）ベクターであって、ＯＲＦＶゲノム内の挿入遺伝子座（ＩＬ）１、ＩＬ２およびＩＬ３の少なくとも１つに前記ヌクレオチド配列が配置されていることを特徴とするＯＲＦＶベクター。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）外来遺伝子をコードし、発現する、少なくとも１つのヌクレオチド配列、および、
（２）前記ヌクレオチド配列の発現を制御する少なくとも１つのプロモーター
を含む組換えオルフウイルス（ＯＲＦＶ）ベクターであって、下表に記載の領域に位置する、ＯＲＦＶゲノム内の挿入遺伝子座（ＩＬ）１、ＩＬ２およびＩＬ３の少なくとも１つに前記ヌクレオチド配列が配置されていることを特徴とするＯＲＦＶベクター。
2020188776.tif 000005
【請求項２】
ＯＲＦＶがＤ１７０１株である、請求項１の組換えＯＲＦＶベクター。
【請求項３】
前記ＯＲＦＶのプロモーターが、初期ＯＲＦプロモーターであり、好ましくは配列番号１（Ｐ１）、配列番号２（Ｐ２）、配列番号３（ＶＥＧＦ）、配列番号４（最適化「初期」）、配列番号５（７．５ｋＤａプロモーター）および配列番号６（コンセンサス「初期」）から選択されるヌクレオチド配列を含む初期ＯＲＦプロモーターであることを特徴とする、請求項１または２の組換えＯＲＦＶベクター。
【請求項４】
前記プロモーターが、前記外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列より上流のヌクレオチド番号−２８±１０位〜−１３±１０位に位置することを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項の組換えＯＲＦＶベクター。
【請求項５】
ＩＬ１、ＩＬ２およびＩＬ３の少なくとも１つにおいて、外来遺伝子をコードし、発現する複数のヌクレオチド配列、好ましくは２、３または４以上のヌクレオチド配列が挿入されていることを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項の組換えＯＲＦＶベクター。
【請求項６】
前記組換えＯＲＦＶベクターが、別の外来遺伝子をコードし、発現するヌクレオチド配列をさらに含み、該ヌクレオチド配列が、ＯＲＦＶゲノムのｖｅｇｆ  Ｅ遺伝子に位置する挿入遺伝子座に挿入されているとともに、好ましくは初期ＯＲＦＶプロモーターの制御下にあることを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項の組換えＯＲＦＶベクター。
【請求項７】
前記外来遺伝子が、
−ウイルス抗原、好ましくは、糖タンパク質（ＲａｂＧ）を含む狂犬病ウイルス抗原；核タンパク質（ＮＰ）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含むインフルエンザＡ抗原；
−腫瘍抗原、好ましくは、ＨＰＶ選択的ウイルス性腫瘍抗原を含むウイルス性腫瘍抗原；
−ＨＰＶ選択的ウイルス性腫瘍関連抗原などのウイルス性腫瘍関連抗原を含む腫瘍関連抗原；
−寄生虫抗原、好ましくは、マラリア原虫抗原；および
−サイトカイン
からなる群から選択されることを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項の組換えＯＲＦＶベクター。
【請求項８】
先行する請求項のいずれか１項の組換えＯＲＦＶベクターを含む細胞、好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはベロ細胞。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項の組換えＯＲＦＶベクターおよび／または請求項８の細胞を含む組成物、好ましくは医薬組成物。
【請求項１０】
前記医薬組成物がワクチン、好ましくは多価ワクチンであることを特徴とする、請求項９の組成物。
【請求項１１】
少なくとも１つの外来遺伝子を発現させるための、先行する請求項のいずれか１項の組換えＯＲＦＶベクターの使用。
【請求項１２】
少なくとも１つの外来遺伝子産物を含むワクチン（１価ワクチン）、好ましくは、少なくとも２つの外来遺伝子産物を含むワクチン（多価ワクチン）を製造するための、請求項１１の使用。
【請求項１３】
配列番号１（Ｐ１）および配列番号２（Ｐ２）から選択されるヌクレオチド配列を含むＯＲＦＶプロモーターをコードする核酸分子。
【請求項１４】
前記ＯＲＦＶプロモーターが、初期ＯＲＦＶプロモーターであることを特徴とする、請求項１３の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えオルフウイルスベクター、該組換えオルフウイルスベクターを含む細胞、本発明の組換えオルフウイルスベクターおよび／または本発明の細胞を含む組成物、外来遺伝子を発現させるための本発明の組換えオルフウイルスベクターの使用、ならびにオルフウイルスベクタープロモーターをコードする核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスベクターは、バイオテクノロジーの分野で遺伝物質を標的細胞に導入するために使用される。導入される遺伝物質には、多くの場合、組換えタンパク質を製造するための外来遺伝子がコードされている。したがって、ウイルスベクターは重要なプラットフォーム技術であり、特に、感染症の従来の予防法との併用で使用頻度が増えている組換えワクチンの製造や、例えば腫瘍免疫療法などの新規の革新的な治療概念の開発のための重要なプラットフォーム技術である。
【０００３】
オルフウイルス（ＯＲＦＶ）は、ポックスウイルスの１種であり、組換えワクチンの製造において他の技術よりも好適な種々の特性を有している。ＯＲＦＶは、パラポックス属の代表的なウイルスであり、ポックスウイルス科に属する。ＯＲＦＶは、エンベロープを有する複雑な二本鎖ＤＮＡウイルスであり、毛糸玉のような形態をしており、平均的な大きさは約２６０×１６０ｎｍである。ＯＲＦＶは、ＧＣ含量の高い、直鎖状のＤＮＡゲノムを有し、ゲノムサイズは約１３０〜１５０ｋｂｐである。ゲノムの中心領域は、両側に位置するＩＴＲ領域（「逆方向末端反復配列」）に挟まれており、末端にヘアピン構造を有し、２本のＤＮＡ鎖は共有結合で結合している。ゲノムの中心領域には、主にウイルスの増殖や形態形成に関わる必須遺伝子が多く存在しており、これらの遺伝子はポックスウイルス間で高度に保存されている。一方、ＩＴＲ領域には、いわゆる非保存的病原性遺伝子が存在しており、これらは宿主域、病原性および免疫調節能に大きく影響することから、ウイルスの特徴付けに関与している。
【０００４】
ポックスウイルスにおいては、ウイルスの増殖は細胞質でのみ行われ、宿主細胞の表面にウイルスが結合することから始まる。ウイルスと細胞が融合した後、いわゆるウイルスコア、すなわちタンパク質コアが細胞質内に放出される。ウイルスコアには、ウイルスゲノム、ウイルス初期ｍＲＮＡおよびウイルス転写因子（ＴＦ）が含まれている。その後、ポックスウイルス特異的な初期プロモーターの制御下で、ウイルスｍＲＮＡが合成され、ウイルス初期遺伝子が発現する。そして、コア構造が分解され、ウイルスＤＮＡが細胞質に放出される。ウイルス転写因子の制御下でのみ起こる「初期」遺伝子の転写とは異なり、これ以降の「中期」遺伝子および「後期」遺伝子の転写は、細胞質に存在する転写因子を利用して行われる。そのため、ポックスウイルスの初期遺伝子の発現においては、「中期」遺伝子および「後期」遺伝子の発現とは異なり、ウイルスＤＮＡの複製もウイルス産生も要しない。
【０００５】
ＯＲＦＶの自然宿主域は極めて狭く、自然宿主の例としては、ヒツジやヤギが挙げられる。感染は、ウイルスが皮膚の病変部から侵入することにより起こる。その後、この皮膚向性ウイルスは、再生能を有する角化細胞でのみ増殖し、その結果、伝染性皮膚炎または伝染性膿疱が生じる。通常緩やかに進行する自己限定的（自然治癒的）なこの感染症では、局所的な皮膚病変または粘膜病変が現れ、主に口腔内および乳房で、大量の多形核顆粒球が浸潤して形成される膿疱が認められる。この病変は、痕跡を残すことなく約４〜６週間で治癒する。感染により強力な免疫応答が誘導されるものの、免疫防御の持続期間は長くないため、わずか数週間で再感染する恐れがある。ただし再感染時の臨床症状やウイルス産生は顕著に減弱されている。ＯＲＦＶにおいては、全身への拡散やウイルス血症が確認された症例はなく、実験的に高用量の感染性ウイルスを静脈内注射した場合も全身への拡散やウイルス血症は確認されなかった。
【０００６】
ＯＲＦＶは、人獣共通感染症の病原体と考えられており、稀にではあるが、損傷した皮膚からヒトに感染する場合もある。感染後、局所的な結節性腫脹が、通常手指や手に限定的に見られる。また、時にリンパ節の腫脹や発熱も伴う。通常、ＯＲＦＶによる感染症は、合併症を伴うことなく、無害のまま進行し、後遺症が残ることなく３〜８週間で完治する。免疫が低下している患者では、感染が重症化した症例もあるが、シドホビルまたはイミキモドなどの抗ウイルス薬の処置により完治している。
【０００７】
ＯＲＦＶには、組換えワクチンの製造において高い関心が寄せられている。ＯＲＦＶは、オルソポックスウイルスと比較して、自然宿主の指向性が極めて狭いという特徴があり、ＯＲＦＶの自然宿主の例としては、ヒツジやヤギが挙げられる。そのため、最も一般的なウイルスベクターであるワクシニアウイルスやアデノウイルスでは、自然感染によりヒト体内で、ベクターに対して抑制的に働く「前免疫」が生じる場合があるが、ＯＲＦＶベクターに対してこの「前免疫」が生じることはほぼない。さらに、ＯＲＦＶ特異的なベクター免疫は非常に弱く、短期間しか持続しないため、ＯＲＦＶを利用した、別の病原体に対するワクチンを用いて、ブースター投与および／または追加投与としてのワクチン接種または免疫感作を極めて効果的に行うことができる。
【０００８】
ＯＲＦＶを宿主に投与すると、許容宿主、非許容宿主のいずれにおいても強力な免疫賦活反応が起こる。この免疫賦活反応では、自然免疫機構が顕著に誘導され、インターフェロン、サイトカインやケモカインが分泌される。免疫感作を行った直後に、樹状細胞が注射部位に集積し、次いで、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化を介して、特異的な適応免疫応答が誘導される。主に体液性免疫応答を誘導する不活化ウイルスワクチンや生ベクターワクチンとは異なり、組換えＯＲＦＶで免疫感作を行うと、細胞性免疫応答と体液性免疫応答とがバランスよく誘導されるという大きな利点がある。また、本発明の組換えＯＲＦＶを用いることにより、意図しない副作用や炎症反応の原因となりうるアジュバントを使用しなくても済む。さらに、その他の利点としては、（タンパク質や抗生物質に対する不耐が増加傾向にある昨今において）抗生物質を使用せずに、永久細胞株で組換えワクチンの規格化生産が可能であることや、鶏卵を用いてワクチンを製造する必要がなくなることが挙げられる。
【０００９】
獣医分野で承認されている弱毒化ＯＲＦＶワクチンは、使用しているＯＲＦＶの株名からＤ１７０１と呼ばれている。この不活化ワクチンは、Ｂａｙｐａｍｕｎ（Ｂａｙｅｒ社）やＺｙｌｅｘｉｓ（Ｐｆｉｚｅｒ社）という商品名で知られており、以下のようにして作製される。まず、ヒツジから野生型ウイルスを単離した後、ウシ由来の腎臓培養細胞で複数回にわたって継代培養して適応させ、次いで、ベロ細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞）でさらに適応させることにより、ＯＲＦＶベクターＤ１７０１−Ｖが得られる。Ｄ１７０１−Ｖはさらに弱毒化されており、免疫が抑制された状態にあるヒツジに感染しても不顕性感染で終息する。
【００１０】
従来、組換えＯＲＦＶベクターは、ＶＥＧＦ遺伝子座を挿入箇所として用いてきた。現在の知識によれば、ｖｅｇｆ−ｅ遺伝子はポックスウイルス特異的な「初期」プロモーターの制御下にあり、病原性因子と考えられていることから、ＶＥＧＦ遺伝子座を挿入箇所として利用することで、ｖｅｇｆ−ｅ遺伝子が欠失し、ＯＲＦＶベクターがさらに弱毒化されるという利点が生じると考えられる。また、ＯＲＦＶを利用した様々な組換えワクチンが製造され、動物モデルでの検証が行われてきた。現在では、例えば、オーエスキー病、狂犬病、ボルナ病、インフルエンザまたは古典的な豚コレラなどの様々な感染症に対して組換えＯＲＦＶワクチンが用いられている。
【００１１】
組換えオルフウイルスが優れた免疫賦活効果を有し、予防的観点から有用であることは、この数年間、様々なウイルス感染症に対するワクチンが数多く構築されていることから明らかである。組換えタンパク質の製造を目的とした、ＯＲＦＶなどの組換えポックスウイルスの利用に関する概要は、Ｒｚｉｈａら（２０００），Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ：ｎｏｎ−ｅｓｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．８３，ｐａｇｅｓ１３７−１４５，およびＢｕｔｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｚｉｈａ（２００２），Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ：Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｌｅｓｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ，  Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｂ．Ｖｏｌ．４９，ｐａｇｅｓ７−１６に記載されている。
【００１２】
現行の組換えＯＲＦＶベクターの使用が限られている理由としては、特に、上述の選別過程に時間を要することが挙げられる。特に多価ワクチンの製造はこれまで不可能であった。さらに、公知の組換えＯＲＦＶベクターでは、外来遺伝子の発現を厳密に制御することができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の基礎となる課題は、公知のＯＲＦＶベクターおよびＯＲＦＶベクターシステムの欠点を軽減または回避できる、新規の組換えＯＲＦＶベクターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この課題は、
（１）外来遺伝子をコードし、発現する、少なくとも１つのヌクレオチド配列、および、
（２）前記ヌクレオチド配列の発現を制御する少なくとも１つのプロモーター
を含む組換えオルフウイルス（ＯＲＦＶ）ベクターであって、下表に記載の領域に位置する、ＯＲＦＶゲノム内の挿入遺伝子座（ＩＬ）１、ＩＬ２およびＩＬ３の少なくとも１つに前記ヌクレオチド配列が挿入されていることを特徴とするＯＲＦＶベクターの提供により解決される。
2020188776.tif 000002
【００１５】
本発明において、オルフウイルス（ＯＲＦＶ）は、Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ  ｏｖｉｓ種に該当するすべてのウイルスおよびウイルス株を指すが、特にＤ１７０１株を指す。
【００１６】
本発明において、組換えＯＲＦＶベクターとは、生体細胞への外来遺伝子の導入および／または生体細胞における外来遺伝子の発現が可能な構成を有する、ＯＲＦＶゲノムをベースとするベクターを指す。
【００１７】
本発明において、外来遺伝子とは、ＯＲＦＶゲノムに由来しない遺伝子またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を指す。
【００１８】
本発明において、プロモーターとは、本発明のＯＲＦＶベクター内の外来遺伝子の発現を調節可能な核酸部分を指す。好ましくは、プロモーターとは、ＯＲＦプロモーター、すなわち野生型ＯＲＦＶゲノムに存在するプロモーターもしくはこれに由来するプロモーター、またはポックスウイルスプロモーター、ＣＭＶプロモーターなどの人工的なプロモーターを指す。
【００１９】
本発明の組換えＯＲＦＶベクターにおける、ＯＲＦＶゲノムの挿入遺伝子座ＩＬ１、ＩＬ２およびＩＬ３の位置は、ＯＲＦＶゲノムの制限酵素断片、ＯＲＦＶ遺伝子もしくはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）またはヌクレオチド番号などの様々な形式で規定することができる。
【００２０】
従来の形式によれば、ＩＬ１、ＩＬ２およびＩＬ３の位置は、制限酵素切断地図およびこれらの挿入領域が含まれる制限酵素断片により記載される。例えば、ＯＲＦＶのＤ１７０１株の制限酵素切断地図は、Ｃｏｔｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｏｒｆ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ｄ１７０１，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．５６，ｐａｇｅｓ  ５３−６７に記載されている。この文献の内容は本開示の一部をなす。ここで、本発明において、例えば、ＩＬ１に関する「ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｃ、ＫｐｎＩ断片Ｇ、ＢａｍＨＩ断片Ｃ／Ｇ、ＥｃｏＲＩ断片Ｂ」という記載は、この挿入遺伝子座ＩＬ１が、ＨｉｎｄＩＩＩ断片ＣからＥｃｏＲＩ断片Ｂにわたっていることを意味する。ＩＬ２は、ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｉ／ＪからＥｃｏＲＩ断片Ａ／Ｅにわたっている。ＩＬ３は、ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｇ／ＤからＥｃｏＲＩ断片Ｄにわたっている。
【００２１】
ＩＬ１に関する「００６、００７（ｄＵＴＰａｓｅ）、００８（Ｇ１Ｌｉ−Ａｎｋ）、００９（Ｇ２Ｌ）」という記載は、この挿入遺伝子座ＩＬ１が、遺伝子番号またはＯＲＦ番号００６から遺伝子番号またはＯＲＦ番号００９までの領域であることを意味する。括弧内の記載は、現時点で明らかになっている、当該遺伝子がコードしている遺伝子産物または当該遺伝子によりコードされている酵素活性である。
【００２２】
本発明において、ＩＬ１は、ヌクレオチド番号４００位〜６００位（５００±１００位）からヌクレオチド番号１８００位〜３０００位（２，４００±６００位）までの領域である。
【００２３】
上記のＩＬ１に関する記述は、上記表中のＩＬ２およびＩＬ３にも適用される。
【００２４】
本発明で記載されているヌクレオチド番号は、本発明者らが様々なＯＲＦＶ株において複数の分析を行った上で規定したものである。Ｄ１７０１株またはその変異体に関して検討した結果、以下の位置が特に好適であることが判明した。
ＩＬ１：ヌクレオチド番号４９６位〜２，７５０位、４９６位〜１，９１２位および５１１位〜２，７５０位
ＩＬ２：ヌクレオチド番号５，２１１２位〜７，７３６位
ＩＬ３：ヌクレオチド番号１５，６５６位〜１７，８４９位
【００２５】
本発明者らは、新たに発見した上記の挿入遺伝子座に外来遺伝子を挿入することにより、該外来遺伝子をＯＲＦＶゲノムに安定して組み込むことができることを見出した。これは予想外のことであった。というのも、これまでのところ、これらの挿入遺伝子座に相当するゲノム領域は、ウイルスの増殖に必要であるものの、外来遺伝子の発現には適さないと考えられていたからである。
【００２６】
しかし、挿入遺伝子座の選択によって遺伝子発現を制御できることは、本発明のＯＲＦＶベクターの大きな利点であることが分かった。例えば、挿入遺伝子座としてＩＬ２を用いることにより、外来遺伝子の発現量は、これまで使用されてきたＶＥＧＦ遺伝子座における外来遺伝子の発現量の１／２に抑えられる。さらに、プロモーターの選択により、外来遺伝子の発現強度および発現時期を狙い通りに変更することができる。
【００２７】
上記により、本発明の基礎となる課題は完全に達成される。
【００２８】
本発明の組換えＯＲＦＶベクターの好ましい一実施形態において、ＯＲＦＶはＤ１７０１株である。
【００２９】
この場合、宿主に感染しても不顕性感染で終息する弱毒化ベクターが使用されるという利点がある。本発明において、Ｄ１７０１株には、Ｄ１７０１−ＢおよびＤ１７０１−Ｖを含むＤ１７０１のすべての変異株が包含される。
【００３０】
本発明の組換えＯＲＦＶベクターの好ましい別の実施形態において、前記プロモーターはＯＲＦＶプロモーターであり、さらに好ましくは初期ＯＲＦＶプロモーターであり、該初期ＯＲＦＶプロモーターは、配列番号１（Ｐ１）、配列番号２（Ｐ２）、配列番号３（ＶＥＧＦ）、配列番号４（最適化「初期」）、配列番号５（７．５ｋＤａプロモーター）および配列番号６（コンセンサス「初期」）から選択されるヌクレオチド配列を含むことが好ましい。
【００３１】
この場合、外来遺伝子の高レベル発現および発現の標的制御が可能なプロモーターが使用されるという利点がある。Ｐ１およびＰ２は、本発明者らが新たに開発したプロモーターである。これら以外のプロモーターは、ワクシニアウイルス由来のプロモーターであり、他との関連で、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ（１９８９），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２１０，ｐａｇｅｓ  ７７１−７８４、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５′ａｎｄ  ３′ｅｎｄｓ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  ｅａｒｌｙ  ｍＲＮＡｓ  ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ａｎｎｏｔａｔｅｄ  ａｎｄ  ａｎｏｍａｌｏｕｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８５，Ｎｒ．１２，Ｓ．５８９７−５９０９、およびＢｒｏｙｌｅｓ（２００３），Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，Ｊ．ｇｅｎｅ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．８４，Ｎｒ．９，Ｓ．２２９３−２３０３に記載されている。本発明者らは、Ｐ２の発現活性がＰ１よりも有意に高いことを見出した。プロモーターＰ１はワクシニアウイルスのコンセンサス配列と１００％一致するが、一方Ｐ２はそうではないため、これは予想外であった。ＯＲＦＶ（パラポックス属）において「最適化された」ワクシニアウイルス（オルソポックス属）プロモーターによる発現が低いという結果は、矛盾があり想定外である。さらに、プロモーターＰ２により高発現が得られることも予想外である。
【００３２】
本発明の組換えＯＲＦＶベクターのさらに好ましい一実施形態において、前記プロモーターは、外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列より上流のヌクレオチド番号２８±１０位〜−１３±１０位に位置する。
【００３３】
この場合、外来遺伝子の高レベル発現および発現制御が可能な領域に前記プロモーターが配置されているという利点がある。
【００３４】
本発明の組換えＯＲＦＶベクターのさらに好ましい一実施形態において、ＩＬ１、ＩＬ２およびＩＬ３の少なくとも１つに、外来遺伝子をコードし、発現する複数のヌクレオチド配列、好ましくは２、３または４以上のヌクレオチド配列が挿入されている。
【００３５】
この場合、本発明の１つの組換えＯＲＦＶベクターによって、複数の外来遺伝子を発現させることができるという利点がある。この一実施形態は、複数の異なる抗原構造に対する免疫が同時に誘導される多価ワクチンの製造に特に適している。いずれの挿入遺伝子座においても、複数の外来遺伝子、好ましくは、２、３または４以上の外来遺伝子を発現させることができる。
【００３６】
本発明の好ましい構成において、前記組換えＯＲＦＶベクターは、別の外来遺伝子をコードし、発現するヌクレオチド配列をさらに含み、該ヌクレオチド配列は、ＯＲＦＶゲノムのｖｅｇｆ  Ｅ遺伝子に位置する挿入遺伝子座に挿入されており、好ましくは初期ＯＲＦＶプロモーターの制御下にある。
【００３７】
この場合、先行技術で既に報告があり、十分に特性が明らかになっている挿入遺伝子座が使用されるという利点がある。ｖｅｇｆ遺伝子座を用いることにより、遺伝子発現の標的制御が可能である。ｖｅｇｆ遺伝子座で外来遺伝子を発現させることにより、ＩＬ２またはそれ以外の新規の遺伝子座で発現させる場合よりも、高い発現が得られる。
【００３８】
本発明の好ましい一実施形態において、組換えＯＲＦＶベクターの外来遺伝子は、
−ウイルス抗原、好ましくは、糖タンパク質（ＲａｂＧ）を含む狂犬病ウイルス抗原；核タンパク質（ＮＰ）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含むインフルエンザＡ抗原；
−腫瘍抗原、好ましくは、ＨＰＶ選択的ウイルス性腫瘍抗原を含むウイルス性腫瘍抗原；
−ＨＰＶ選択的ウイルス性腫瘍関連抗原などのウイルス性腫瘍関連抗原を含む腫瘍関連抗原；
−寄生虫抗原、好ましくは、マラリア原虫抗原；および
−サイトカイン
からなる群から選択される。
【００３９】
この場合、非常に重要な抗原、特にワクチン製造において非常に重要な抗原が、本発明の組換えＯＲＦＶウイルスにより発現可能な状態であるという利点がある。
【００４０】
本発明の別の主題は、本発明のＯＲＦＶベクターを含む生体細胞、好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはベロ細胞に関する。
【００４１】
本発明の別の主題は、本発明のＯＲＦＶベクターおよび／または本発明の細胞を含む組成物、好ましくは医薬組成物に関する。前記医薬組成物は、ワクチンであることが好ましく、多価ワクチンであることがさらに好ましい。
【００４２】
本発明のＯＲＦＶベクターの特性、利点、特徴およびさらに別の発展形態は、本発明の細胞および本発明の組成物にも同様に適用される。
【００４３】
本発明の別の主題は、少なくとも１つの外来遺伝子を発現させるための、本発明の組換えＯＲＦＶベクターの使用に関し、好ましくは、１つの外来遺伝子産物を含むワクチン（１価ワクチン）を少なくとも１つ発現させるための、本発明の組換えＯＲＦＶベクターの使用に関し、さらに好ましくは、少なくとも２つの外来遺伝子産物を含むワクチン（多価ワクチン）を発現させるための、本発明の組換えＯＲＦＶベクターの使用に関する。
【００４４】
この場合、「少なくとも」とは、外来遺伝子の数として、２、３、４、５、６、７、８、９などが包含されることを意味する。
【００４５】
本発明の組換えＯＲＦＶベクターの特徴、利点、特性およびさらに別の発展形態は、本発明の使用にも同様に適用される。
【００４６】
本発明の別の主題は、配列番号１（Ｐ１）および配列番号２（Ｐ２）で示されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含むＯＲＦＶプロモーターをコードする核酸分子に関し、好ましくは、該ヌクレオチド配列を含む初期ＯＲＦＶプロモーターをコードする核酸分子に関する。
【００４７】
本発明の核酸分子は、組換えＯＲＦＶベクターにおける外来遺伝子の発現に特に適した新規のＯＲＦＶプロモーターをコードしている。このようなプロモーターにより、初期遺伝子の極めて高い発現が誘導される。
【００４８】
当然のことながら、上述した特徴および以下に述べる特徴は、個々の事例で示した組み合わせだけでなく、本発明の範囲から逸脱しない限りは、他の組み合わせまたは単独でも使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
以下に、実施形態により本発明についてさらに説明する。本発明のさらなる特徴、利点および特性は、以下の説明により明らかになるであろう。以下の実施形態は単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の説明に際して、以下に示す添付の図面を参照する。
【図１】ＯＲＦＶ  Ｄ１７０１−Ｖ  ＤＮＡゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素断片地図である。網掛けの四角は、それぞれ挿入位置ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３およびｖｅｇｆを示す。ＩＴＲＬは、ゲノム末端の逆方向末端反復配列を示す。
【図２】遺伝子導入プラスミドｐＤ１−ＧＦＰ−Ｄ２Ｃｈｅｒｒｙの概略図である。このベクターには、人工的な初期プロモーターＰ１（黒矢印、上部）の制御下にあるＡｃＧＦＰ遺伝子（縞状の網掛け部）および人工的な初期プロモーターＰ２（黒矢印、右側）の制御下にあるｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子（格子状の網掛け部）が示されている。この２つの蛍光遺伝子の下流には、それぞれポックスウイルス特異的な初期転写終止モチーフＴ５ＮＴ（黒色）が存在する。この２つの蛍光遺伝子の間には、スペーサー（Ｓｐ）が配置されている。複数のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ１〜ＭＣＳ６）が存在し、これらを用いることにより、蛍光標識遺伝子と所望の外来遺伝子とを入れ替えることができる。この２つの蛍光遺伝子は、ＯＲＦＶゲノムのＯＲＦ１１７／１１８領域と相同性を有する下流のフランキング領域と、ＯＲＦＶゲノムのＯＲＦ１１４領域と相同性を有する上流のフランキング領域に挟まれており、相同組換えによりＤ１７０１−Ｖゲノムの遺伝子座ＩＬ２への標的組込みが可能である。
【図３】種々の蛍光組換体の発現解析結果である。（Ａ，ａ）６ウェルプレート上のＤ１７０１−Ｖ−Ｄ２Ｃｈｅｒｒｙ感染ベロ細胞の蛍光顕微鏡像。所望の組換体の選別は、Ｃｈｅｒｒｙ遺伝子由来の赤色蛍光を呈するプラークを複数選び、各プラークのウイルスを増殖させることにより行った。４つのプラークを精製した後、Ｄ１７０１−Ｖ−Ｄ２Ｃｈｅｒｒｙの均一性をＰＣＲ分析により確認した。（Ａ，ｂ）フローサイトメトリーによるＣｈｅｒｒｙの発現解析。この図は、フローサイトメーターによる、Ｄ１７０１−Ｖ−Ｄ２Ｃｈｅｒｒｙ感染ベロ細胞（ＭＯＩ＝１．０）の発現解析の代表的な結果である。４８時間後、単一細胞に分離された生細胞のうち約４５％がＣｈｅｒｒｙを発現していた。非感染のベロ細胞をネガティブコントロールとした。（Ｂ）組換体Ｄ１７０１−Ｖ−ＧＦＰ−Ｄ２Ｃｈｅｒｒｙの蛍光発現。ベロ細胞にＤ１７０１−Ｖ−ＧＦＰ−Ｄ２Ｃｈｅｒｒｙ（ＭＯＩ＝０．５）を感染させた。感染後４８時間の蛍光画像を上段に示す（拡大倍率：２０倍）。２４時間後の蛍光発現を下段に示す（拡大倍率：６３倍）。蛍光顕微鏡法により、ＡｃＧＦＰ発現（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ発現（ｍＣｈｅｒｒｙ）および同一細胞における両方の蛍光発現（重ね合わせ）のイメージングを行った。さらに、同じ細胞を用いて顕微鏡の透過光によるイメージングも行った（透過光）。（Ｃ）組換体Ｄ１７０１−Ｖ−Ｄ１ＧＦＰ−Ｄ２Ｃｈｅｒｒｙの蛍光発現。ベロ細胞にＤ１７０１−Ｖ−Ｄ１ＧＦＰ−Ｐ２Ｃｈｅｒｒｙ（ＭＯＩ＝１．０）を感染させ、フローサイトメーターで遺伝子の発現を調べた。２４時間後、単一細胞に分離された生細胞のうち約２５％がｍＣｈｅｒｒｙとＧＦＰの両方を発現していた。非感染のベロ細胞をネガティブコントロールとした。
【図４】種々の組換体の蛍光強度を測定した結果である。（Ａ）ベロ細胞にＧＦＰ発現組換体（ＭＯＩ＝約１．５）を感染させ、２４時間後に、フローサイトメーターで平均蛍光強度を測定した。非感染のベロ細胞をネガティブコントロールとした。Ｍ１は、全非感染細胞のうち９９．３９％が検出された領域（前方の第１の曲線部）である。一方、Ｍ２領域においては、ＧＦＰ陽性細胞が検出された。感染後のＧＦＰ陽性細胞集団は、ＧＦＰ発現組換体と一致した（３８．２％〜４０．０％）。ＧＦＰ強度は、Ｄ１７０１−Ｖ−Ｄ１ＧＦＰ感染細胞（実線）が最も低く、Ｄ１７０１−Ｖ−Ｄ２ＧＦＰ感染細胞（一点鎖線）が最も高かった。（Ｂ）ベロ細胞にｍＣｈｅｒｒｙ発現組換体（ＭＯＩ＝約３．０）を感染させ、２４時間後に、フローサイトメトリーで平均蛍光強度を測定した。非感染のベロ細胞をネガティブコントロールとした。Ｍ１は、全非感染細胞のうち９９．４７％が検出された領域（前方の第１の曲線部）である。一方、Ｍ２領域においては、Ｃｈｅｒｒｙ陽性細胞が検出された。感染後のｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞集団は、ＧＦＰ発現組換体と一致した（６２．５％〜６３．３％）。Ｄ１７０１−Ｖ−Ｃｈｅｒｒｙ感染細胞（破線）のｍＣｈｅｒｒｙ強度は、Ｄ１７０１−Ｖ−Ｄ２Ｃｈｅｒｒｙ感染細胞（青線）またはＤ１７０１−Ｖ２Ｃｈｅｒｒｙ感染細胞（赤線）より有意に低かった。（Ｃ＋Ｄ）これらのグラフは、Ｄ１７０１−Ｖ−ＧＦＰ（Ｃ）またはＤ１７０１−Ｖ−Ｃｈｅｒｒｙ（Ｄ）に関する種々の蛍光組換体の蛍光強度をパーセントで示したものである。データは、独立して行った少なくとも３回の実験の平均値で示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
実施形態
１．ＯＲＦＶゲノム
ＯＲＦＶゲノムは、全長約１３８ｋＢ、ＧＣ含量約６４％の直鎖状二本鎖ＤＮＡからなり、１３０〜１３２個の遺伝子を含む。ＯＲＦＶゲノムの構成は、他のポックスウイルスと類似している。ＯＲＦＶゲノムの中心領域は、ポックスウイルス科のウイルス間で高度に保存されている必須遺伝子を含む。ＯＲＦＶゲノムの遺伝子のうち８８個の遺伝子は、コードポックスウイルス亜科全体で保存されている遺伝子である。ゲノムの末端領域には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのウイルス増殖に必須ではないが、ウイルスの病原性および指向性において重要なウイルス遺伝子が存在する。
【００５１】
細胞培養における増殖に適応したＤ１７０１ウイルスは、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が他のオルフウイルスより顕著に長い。この適応変化により、ｖｅｇｆ−ｅ遺伝子を含む複数の遺伝子の欠失や重複が生じている。ウシ由来のＢＫ−ＫＬ３Ａ細胞で増殖させたＤ１７０１−Ｂは、ベロ細胞内での増殖に適応した結果、ウイルスゲノム内に３つの挿入遺伝子座ＩＬ１、ＩＬ２およびＩＬ３が追加された。このウイルスは現在Ｄ１７０１−Ｖと称されている。この構造を図１に示す。
【００５２】
２．ポックスウイルスプロモーター
ポックスウイルスは、「初期」プロモーター、「中期」プロモーターおよび「後期」プロモーターを含む。これらのプロモーターは、それぞれ複数の特徴的な配列特性を有する。以下に、ＶＡＣＶを例に挙げてさらに説明する。ＶＡＣＶの「初期」プロモーターは、１６または１５ヌクレオチド長の重要領域からなり、この重要領域と７ヌクレオチド長のイニシエーター領域との間に、１１ヌクレオチド長のスペーサー領域が存在する。この重要領域は、アデニン含量が高く、一方、スペーサー領域はチミン含量が高い。転写は、ごく稀に例外もあるが、常にプリン塩基から開始される。上記の重要領域内のヌクレオチドの置換によっては、プロモーター活性が劇的に低下する場合があり、プロモーター活性が完全に消失する場合もある。ＶＡＣＶの７．５ｋＤａの初期プロモーターの置換解析により、最適化された重要領域が示されるとともに、「初期」ポックスウイルスプロモーターのコンセンサス配列（表１に示す）が推定された。「中期」プロモーターは、約１４ヌクレオチド長のＡＴ含量の高いコア配列、続いて１０〜１１ヌクレオチド長のスペーサー領域、続いて短いイニシエーター領域から構成される。「後期」プロモーターは、上流に位置する約２０ヌクレオチド長のＡＴ含量の高い領域からなる構造を有し、転写開始点との間に、高度に保存されている配列−１  ＴＡＡＡＴ  ＋４を含む約６ヌクレオチド長のスペーサー領域が存在する。
【表１】
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【００５３】
３．組換えＯＲＦＶベクターの製造
本発明者らは、組換え多価ＯＲＦＶベクターの新たな製造方法を模索してきた。ＯＲＦＶは、ベロ培養細胞に適応する過程で、ゲノム内で複数の欠失が生じている。欠失の生じた領域が複数の外来遺伝子の組込みに適しているかどうかを検討した（図１Ａ）。
【００５４】
そこで、他のプラスミドと共に、ＩＬ２領域と相同性を有する部位を含む遺伝子導入プラスミドｐＤｅｌ２を設計した（図２）。プラスミドｐＤｅｌ２への複数の外来遺伝子のクローニングは、複数のＭＣＳ（マルチクローニングサイト）を用いることで可能である。さらに、プラスミドｐＤｅｌ２は、複数の外来遺伝子をそれぞれ人工的な初期ＯＲＦＶプロモーターの制御下に配し、ポックスウイルス特異的な初期転写終止モチーフＴ５ＮＴで制限することにより、これら複数の外来遺伝子を同時に組み込むことができるように設計されている（図２）。
【００５５】
新規の人工的な初期ＯＲＦＶプロモーターＰ１およびＰ２のヌクレオチド配列を設計した。
【００５６】
最初の実験として、遺伝子座ＩＬ２が外来遺伝子の安定した組込みに適しているかどうかを検討する必要があった。そこで、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光マーカー遺伝子を、プロモーターＰ２の制御下に配置されるようにｐＤｅｌ２遺伝子導入プラスミドにクローニングした。次いで、得られたプラスミドを、Ｄ１７０１−ＶｒＶで感染させたベロ細胞にトランスフェクトした。新たに産生された組換えウイルスの選別は、蛍光顕微鏡で赤色蛍光を発する細胞を確認することにより目視で行った。選択した複数のプラークを精製して得られた均一な組換体Ｄ１７０１−Ｖ−Ｄ２−Ｃｈｅｒｒｙを培養した（図３Ａ，ａ）。
【００５７】
Ｄ１７０１−ＶｒＶの遺伝子座ＩＬ２にｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子が適切に組み込まれていることを、特異的なＰＣＲ分析およびサザンブロットハイブリダイゼーションにより確認した。また、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子が適切に発現することも、蛍光分析およびウエスタンブロット分析、さらにフローサイトメトリーにより確認することができた（図３Ａ，ｂ）。
【００５８】
本実験において、感染後の初期相で高い発現が確認された。この組換体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで複数回継代培養して、外来遺伝子がＯＲＦＶゲノムに安定して組み込まれていることを確認した。
【００５９】
さらに、ＡｃＧＦＰ遺伝子がｖｅｇｆ−ｅ遺伝子に組み込まれ、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子が遺伝子座ＩＬ２に組み込まれた組換体Ｄ１７０１−Ｖ−ＧＦＰ−Ｄ２−Ｃｈｅｒｒｙを作製し、異なる挿入遺伝子座に存在する２つの蛍光遺伝子が同時に初期発現することを確認した（図３Ｂ）。
【００６０】
さらに、同じ遺伝子座ＩＬ２に別の外来遺伝子も同時に安定して組み込むことができるかどうかを検討する必要があった。そこで、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子がＰ２の制御下に配置されている遺伝子導入プラスミドｐＤｅｌ２に、ＡｃＧＦＰ遺伝子を、Ｐ１プロモーターの制御下に配置されるようにクローニングした。先に記載したＤ１７０１−Ｖ−Ｐ２−Ｃｈｅｒｒｙの選別と同様にして、相同組換体Ｄ１７０１−Ｖ−Ｄ１−ＧＦＰ−Ｄ２−Ｃｈｅｒｒｙの選別および精製を行った。
【００６１】
この実験においても、ＰＣＲおよびサザンブロット解析により、２つの外来遺伝子が遺伝子座ＩＬ２に適切に組み込まれていることが確認された。蛍光顕微鏡による観察とフローサイトメトリーにより、２つの外来遺伝子の発現が確認された（図３Ｃ）。
【００６２】
発現解析を行い、プロモーターＰ１とＰ２との活性強度の比較、さらにプロモーターＰｖｅｇｆとの活性強度の比較を行った。プロモーターＰ２による遺伝子発現が最も高く、プロモーターＰ１による遺伝子発現が最も低いことが示された（図４Ａ＋図４Ｃ）。Ｐ１はワクシニアウイルスのコンセンサス配列と１００％一致しているが、Ｐ２はそうではないため、この結果は予想外であった。
【００６３】
さらに、第１の外来遺伝子とは別のプロモーターの制御下にある第２の外来遺伝子の組込みは、第１の外来遺伝子の発現強度に影響を与えないことも確認された。第１の遺伝子が組み込まれる挿入遺伝子座と第２の遺伝子が組み込まれる挿入遺伝子座が同一であるか異なるかは結果に影響を与えなかった。Ｐ２の制御下にあるｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子がＶＥＧＦ遺伝子座に組み込まれた組換体と、Ｐ２の制御下にあるｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子が遺伝子座ＩＬ２に組み込まれた組換体とを比較して、挿入領域が及ぼす影響を調べた。ＶＥＧＦ遺伝子座における遺伝子発現は、遺伝子座ＩＬ２における遺伝子発現の約２倍の強度であることが示された（図４Ｂ＋図４Ｄ）。
【００６４】
以上を総括すると、オルフウイルスベクターＤ１７０１−Ｖは多価組換体の製造に極めて適していることが確認された。複数の外来遺伝子を、例えば、新たに発見された挿入遺伝子座ＩＬ１、ＩＬ２およびＩＬ３、または公知の挿入遺伝子座ＶＥＧＦを介することにより、オルフウイルスゲノムへ安定して組み込むことができた。外来遺伝子の発現強度は、プロモーター、挿入遺伝子座の両方によって決定される。Ｐ２の制御下にある外来遺伝子をＶＥＧＦ遺伝子座に組み込んだ場合に、最も高い遺伝子発現が得られることが分かった。
【００６５】
本発明者らは、マーカー外来遺伝子、挿入領域およびプロモーターの種類および組合せがそれぞれ異なる種々のベクターをさらに作製した（表２）。
【表２】
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【００６６】
上掲の表は、本発明につながる研究の過程で作製された蛍光性組換えＯＲＦＶベクターの概要を示したものである。各組換体における挿入領域（遺伝子座）および外来遺伝子の発現制御に用いたプロモーター（Ｐｖｅｇｆ、Ｐ１、Ｐ２）を表に示した。また、外来遺伝子の発現強度も示した（非常に高い＝＋＋＋＋〜低い＝＋）。
【００６７】
本発明は、新規の組換えＯＲＦＶを利用したワクチンを開発するための様々なオプションを提供するものである。本発明により、複数の抗原を同時に発現する組換体の作製が可能である。このような組換体の作製は、複数のワクチンを組み合わせた万能ワクチン、またはそれぞれ異なる腫瘍抗原を対象とした複数の治療用腫瘍ワクチンに相当する万能ワクチンの製造において、大きな利点となりうる。さらに、抗原とサイトカインとを標的手法により同時に組み込むことにより、免疫応答に影響を与えることも可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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