(57)【要約】      （修正有）【課題】所望のアミノ酸の産生を増強するために操作された組換え微生物、ならびに関連するバイオマスの提供。【解決手段】Ｌ−アミノ酸生合成酵素をコードする外因性核酸および天然のＬ−アミノ酸生合成酵素をコードする核酸に作動可能に連結された発現制御配列をコードする外因性核酸からなる群から選択される第１の外因性核酸を含む組換えＣ１代謝微生物であって、該組換えＣ１代謝微生物が、天然ガス由来の炭素供給材料を所望のＬ−アミノ酸に変換することができ、該組換えＣ１代謝微生物のδ１３Ｃが−３０‰未満である、組換えＣ１代謝微生物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１に従い、コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）で、ＥＦＳ−Ｗｅｂを経由して、ファイル名２００６０６＿４１５ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔとして本明細書と共に電子的に提出された「配列表」は、本明細書中に参考として援用される。配列表の電子コピーは、２０１５年１月１６日に作成されており、ディスクにおけるサイズは、８５１キロバイトである。
【０００２】
発明の分野
本開示は、アミノ酸の増強された産生のための新規微生物と、アミノ酸の増強された産生のために操作された代謝経路を含む組換えＣ１代謝微生物に由来する飼料生成物、ならびに関連する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
飼料添加物の使用により、動物飼料の利用効率における進歩は、過去数十年間にわたって達成されてきた。このような添加される物質は、動物飼料組成物の栄養含有量、エネルギー含有量および／または闘病特性を増加させる。商業的動物生産業者にとって大きくなりつつある課題は、穀物のコスト高騰である。コスト高騰は、一部には、バイオ燃料および人間用の食物の使用のための穀物の競争的需要によるものである。飼料生産に利用できる土地の限界と相まって、穀物およびタンパク質成分のコスト高騰により、有益な栄養および闘病特性を有する代替的な低コスト動物飼料生成物が、極めて望ましくなろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
第一の実施形態では、本発明は、Ｌ−アミノ酸生合成酵素をコードする外因性核酸および天然のＬ−アミノ酸生合成酵素をコードする核酸に作動可能に連結された発現制御配列をコードする外因性核酸からなる群から選択される第１の外因性核酸を含む組換えＣ１代謝微生物であって、該組換えＣ１代謝微生物が、天然ガス由来の炭素供給材料を所望のＬ−アミノ酸に変換することができ、該組換えＣ１代謝微生物のδ１３Ｃが−３０‰未満である、組換えＣ１代謝微生物を提供する。
【０００５】
別の実施形態では、本発明の組換えＣ１代謝微生物は、貯蔵（ｃａｃｈｅ）ポリペプチドをコードする第２の外因性核酸をさらに含む。さらなる実施形態では、本発明は、本発明の組換えＣ１代謝微生物の培養物に由来するバイオマスと、本発明のバイオマスを含む組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明のバイオマスから抽出された１または複数のアミノ酸を含むアミノ酸組成物を提供する。
【０００６】
なおさらなる実施形態では、本発明は、本発明のバイオマスまたはアミノ酸組成物を含む動物飼料を提供する。いくつかの実施形態では、動物飼料は、植物由来の材料、動物由来の材料および微生物由来の材料からなる群から選択される添加物をさらに含む。
【０００７】
なおさらなる実施形態では、本発明は、所望のＬ−アミノ酸を産生する方法であって、天然ガス由来の炭素供給材料の存在下、所望のＬ−アミノ酸の産生に十分な条件下で、本発明の組換えＣ１代謝微生物を培養する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、Ｌ−アミノ酸は、−３０‰未満のδ１３Ｃを示す。
【０００８】
追加的な実施形態では、本発明は、Ｌ−アミノ酸富化バイオマスを産生する方法であって、天然ガス由来の炭素供給材料の存在下、組換えＣ１代謝微生物からバイオマスへの成長の促進に十分な条件下で、培養培地において本発明の組換えＣ１代謝微生物を培養する工程を含む方法を提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
Ｌ−アミノ酸生合成酵素をコードする外因性核酸および天然のＬ−アミノ酸生合成酵素をコードする核酸に作動可能に連結された発現制御配列をコードする外因性核酸からなる群から選択される第１の外因性核酸を含む組換えＣ１代謝微生物であって、該組換えＣ１代謝微生物が、天然ガス由来の炭素供給材料を所望のＬ−アミノ酸に変換することができ、該組換えＣ１代謝微生物のδ１３Ｃが−３０‰未満である、組換えＣ１代謝微生物。
（項目２）
前記第１の外因性核酸が、Ｌ−アミノ酸生合成酵素をコードする、項目１に記載の組換えＣ１代謝微生物。
（項目３）
貯蔵ポリペプチドをコードする第２の外因性核酸をさらに含む、項目１〜２のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
（項目４）
前記天然ガス由来の供給材料が、天然ガスである、項目１〜３のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
（項目５）
前記天然ガス由来の供給材料が、メタンである、項目１〜３のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
（項目６）
前記組換えメタン資化性微生物が、天然のＣ１代謝微生物によって産生されるものよりも少なくとも約１０％大きいレベルで、前記所望のＬ−アミノ酸を産生する能力を含む、項目１〜５のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
（項目７）
メタン資化性菌である、項目１〜６のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
（項目８）
前記第１の外因性核酸が、リシン生合成酵素、トリプトファン生合成酵素、メチオニン生合成酵素、システイン生合成酵素およびトレオニン生合成酵素からなる群から選択されるＬ−アミノ酸生合成酵素をコードする、項目１〜７のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
（項目９）
前記所望のＬ−アミノ酸が、リシンであり、前記第１の外因性核酸が、リシン感受性アスパルトキナーゼＩＩＩ（ｌｙｓＣ）、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡ）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）、２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２，６−カルボン酸Ｎ−スクシニルトランスフェラーゼ（ｄａｐＤ）、アセチルオルニチン／スクシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｒｇＤ）、スクシニルジアミノピメリン酸デスクシニラーゼ（ｄａｐＥ）、スクシニルジアミノピメリン酸トランスアミナーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ（ｄａｐＦ）およびジアミノピメリン酸（diaminopimetatae）ジカルボキシラーゼ（ｌｙｓＡ）からなる群から選択されるリシン生合成酵素をコードする、項目８に記載の組換えＣ１代謝微生物。
（項目１０）
前記第１の外因性核酸が、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡ）をコードする、項目９に記載の組換えＣ１代謝微生物。
（項目１１）
前記所望のＬ−アミノ酸が、Ｌ−メチオニンであり、前記第１の外因性核酸が、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＡ）、シスタチオニンガンマ−シンターゼ（ｍｅｔＢ）、タンパク質ＭａｌＹ、シスタチオニンベータ−リアーゼ（ｍｅｔＣ）、Ｂ１２依存性メチオニンシンターゼ（ｍｅｔＨ）および５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＥ）からなる群から選択されるメチオニン生合成酵素をコードする、項目８に記載の組換えＣ１代謝微生物。
（項目１２）
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−システインであり、前記第１の外因性核酸が、セリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｙｓＥ）、システインシンターゼＡおよびシステインシンターゼＢからなる群から選択されるシステイン生合成酵素をコードする、項目８に記載の組換えＣ１代謝微生物。
（項目１３）
前記所望のＬ−アミノ酸が、Ｌ−トレオニンであり、前記第１の外因性核酸が、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、ＰＬＰ依存性アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼおよびトレオニンシンターゼからなる群から選択されるトレオニン生合成酵素をコードする、項目８に記載の組換えＣ１代謝微生物。
（項目１４）
前記所望のＬ−アミノ酸が、Ｌ−トリプトファンであり、前記第１の外因性核酸が、コリスミ酸−ピルビン酸リアーゼ（ｕｂｉＣ）、アントラニル酸シンターゼ構成成分Ｉ（ｔｒｐＥ）、アントラニル酸シンターゼ構成成分ＩＩ（ｔｒｐＧ）、アントラニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｔｒｐＤ）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ｔｒｐＣ）、トリプトファン生合成タンパク質（ｔｒｐＣ）、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ｔｒｐＦ）、インドール−３−グリセロールリン酸シンターゼ、トリプトファンシンターゼアルファ鎖（ｔｒｐＡ）およびトリプトファンシンターゼベータ鎖（ｔｒｐＢ）からなる群から選択されるトリプトファン生合成酵素をコードする、項目８に記載の組換えＣ１代謝微生物。
（項目１５）
前記第１の外因性核酸が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８および１５０からなる群から選択される参照配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＬ−アミノ酸生合成酵素をコードする、項目１〜７のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
（項目１６）
前記第１の外因性核酸が、天然のＬ−アミノ酸生合成酵素をコードする核酸に作動可能に連結された発現制御配列をコードする、項目１および３〜７のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
（項目１７）
前記第１の外因性核酸の配列が、前記組換えＣ１代謝微生物からの最適な発現のためにコドン最適化されている、項目１〜１６のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
（項目１８）
前記第２の外因性核酸の配列が、前記組換えＣ１代謝微生物からの最適な発現のためにコドン最適化されている、項目３〜１６のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
（項目１９）
前記第１の外因性核酸が、Ｌ−アミノ酸生合成酵素をコードし、該第１の外因性核酸が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７および１４９からなる群から選択される参照配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を含む、項目１〜７のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
（項目２０）
−３５‰未満のδ１３Ｃを示す、項目１〜１９のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
（項目２１）
項目１〜２０のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物の培養物に由来するバイオマス。
（項目２２）
前記バイオマスのδ１３Ｃが、−３０‰未満である、項目２１に記載のバイオマス。
（項目２３）
前記バイオマスのδ１３Ｃが、−３５‰未満である、項目２１に記載のバイオマス。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、実施例４に記載されているリシン生合成オペロンから個々の遺伝子を過剰発現するＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株における細胞外Ｌ−リシン産生のレベルの図による描写を提示する。培養物の光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）で割った、表示遺伝子を異種性発現する株の細胞上清において検出された細胞外Ｌ−リシンの濃度を、株毎に示す。遺伝子型キー（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｋｅｙ）３４および１０６７はそれぞれ、空のプラスミドコントロールおよび同じプロモーター文脈で無関係の遺伝子（蛍光タンパク質）を発現するコントロールである。グラフは、表示遺伝子の過剰発現が、空のプラスミドコントロール（遺伝子型キー３４）および無関係の遺伝子（緑色蛍光タンパク質）を発現するコントロールを上回る細胞外Ｌ−リシンの増加をもたらすことを示す。
【００１０】
【図２】図２は、実施例５に記載されている同じ貯蔵タンパク質（高リシン含有量ポリペプチド）をそれぞれコードする、異なるコドン最適化された配列を異種性発現する株の細胞バイオマスサンプルにおいて検出された細胞関連Ｌ−リシンの濃度の図による描写を提示する。遺伝子型キー３４は、空のプラスミドコントロールである。バーは、各実験遺伝子型における８クローンの平均値を表す。
【００１１】
【図３】図３は、実施例６に記載されているリシンリッチ貯蔵ポリペプチド（ＨｉｇｈＫ）およびｄａｐＡを異種性発現する株の培養物由来の乾燥重量バイオマスにおいてアッセイした細胞関連Ｌ−リシンのレベルの図による描写を提示する。バーは、各実験遺伝子型の８クローンの平均値を表す。実験株１１８６〜１１９３における全ＨｉｇｈＫ遺伝子は、同じアミノ酸配列をコードするが、異なるコドン使用を有する。グラフは、これらの遺伝子の共発現が、様々な増強された細胞関連Ｌ−リシン産生をもたらすことを示す。
【００１２】
【図４】図４は、実施例６に記載されているリシンリッチ貯蔵ポリペプチド（ＨｉｇｈＫ）およびｄａｐＡを異種性発現する株の培養上清サンプルにおいて検出された細胞外Ｌ−リシンのレベルの図による表現を提示する。バーは、各実験遺伝子型の８クローンの平均値を表す。グラフは、遺伝子の組合せの発現が、クローンの各セット由来の平均値に基づき、コントロール（遺伝子型キー１０６７）の８〜２３倍の間の細胞外Ｌ−リシンをもたらすことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
本開示は、エネルギー源として相対的に低コストの炭素供給材料を利用する能力を有する新規組換えＣ１代謝微生物を提供し、加えて、望ましい関連するバイオマス、栄養生成物、組成物を提供する。本発明の組換え微生物は、商業的に望ましいＬ−アミノ酸の増強された産生のために操作される。このような組換え微生物ならびにこれに由来するバイオマスおよびＬ−アミノ酸組成物は、動物（例えば、家畜、魚類、家禽などのような）と共に培養または発酵される微生物のための栄養源として有用である。
【００１４】
１つの実施形態では、本発明は、Ｌ−アミノ酸生合成酵素をコードする外因性核酸および天然のＬ−アミノ酸生合成酵素をコードする核酸に作動可能に連結された発現制御配列をコードする外因性核酸からなる群から選択される外因性核酸を含む組換えＣ１代謝微生物であって、天然ガス炭素供給材料を所望のＬ−アミノ酸に変換することができ、−３０‰未満、多くの場合、−３５‰未満のδ１３Ｃを示す組換えＣ１代謝微生物を提供する。典型的には、組換えＣ１代謝微生物は、非光合成Ｃ１代謝微生物であり、より典型的には、メタン資化性微生物である。
【００１５】
このような実施形態では、本発明の組換え微生物は、よりコストのかかる炭水化物や、より高い評価の栄養素と比較して、相対的に低コストで豊富な資源である天然ガス由来の供給材料（例えば、天然ガスまたは例えば、メタンなどの、天然ガスに由来するＣ１基質）を変換するように操作される。本明細書中で使用する場合、用語「天然ガス由来の供給材料」は、天然ガス、または天然ガスから単離された（Ｃ１基質を含む）もしくは天然ガスから変換された（例えば、シンガス（ｓｙｎｇａｓ））構成成分のいずれかをいう。
【００１６】
用語「天然ガス」は、本明細書において、従来プロセス（例えば、浸透性貯留層の掘削および水攻法）または非従来プロセス（例えば、低いガス透過性を有する層（ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の水圧破砕、水平掘削または傾斜掘削）によって得ることができる天然起源のガス混合物をいう。ガス混合物は、メタンおよび他のＣ１化合物を含む他の化合物ならびに他の軽質アルカンガス（例えば、エタン、プロパン、ブタン、ペンタンなどのような）、二酸化炭素、窒素、硫化水素など、ならびにこれらの組合せで構成されている。非従来型天然ガスは、例えば、砂岩または炭酸塩に形成されるタイトガスサンド（ｔｉｇｈｔ  ｇａｓ  ｓａｎｄ）、石炭鉱床に形成され石炭粒子に吸着される炭層メタン、細粒頁岩に形成され粘土粒子に吸着されるまたは小孔もしくは微細穴（microfracture）内に保持されるシェールガス、海洋および永久凍土下などの場所において低温高圧で形成される天然ガスおよび水の結晶性組合せであるメタンハイドレートなどの供給源から得ることができる。
【００１７】
本明細書中で使用する場合、「Ｃ１基質」または「Ｃ１化合物」は、炭素−炭素結合を欠く任意の炭素含有分子または炭素含有組成物をいう。例示的なＣ１基質には、シンガス、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸またはその塩、一酸化炭素、二酸化炭素、メチル化アミン（例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミンなど）、メチル化チオール、メチルハロゲン（例えば、ブロモメタン、クロロメタン、ヨードメタン、ジクロロメタンなど）、シアン化物、またはその任意の組み合わせが含まれる。
【００１８】
本発明の一定の実施形態では、天然ガス由来の供給材料は多くの場合、天然ガス、天然ガス由来のＣ１基質またはシンガスである。典型的には、Ｃ１基質は、メタンである。供給材料として天然ガス由来の炭素基質を利用した本発明の組換えＣ１代謝微生物は、より詳細に本明細書の以下に記載する、特有の同位体炭素サイン（signature）を示す。この特有の同位体炭素サインは、かかる組換え微生物の生成物（例えば、バイオマス、Ｌ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸組成物など）によっても示される。
【００１９】
本明細書中で使用する場合、用語「Ｃ１代謝微生物」または「Ｃ１代謝非光合成微生物」は、Ｃ１基質をエネルギー源としてか、エネルギーおよびバイオマスのその主要な供給源として使用する能力を有する任意の微生物をいい、この微生物は他の炭素基質（糖および複合糖質など）をエネルギーおよびバイオマスのために使用してもしなくても良い。例えば、Ｃ１代謝微生物は、Ｃ１基質（メタンまたはメタノールなど）を酸化することができる。Ｃ１代謝微生物には、細菌（メタン資化性菌およびメチロトローフ菌（methylotroph）など）および酵母が含まれる。一定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物には光合成微生物（藻類など）が含まれない。いくつかの実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、その唯一のエネルギー源がＣ１基質であることを意味する「偏性Ｃ１代謝微生物」であろう。さらなる実施形態では、Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）を、Ｃ１基質供給材料の存在下で（すなわち、エネルギー源としてＣ１基質を使用して）培養するであろう。
【００２０】
本発明の組換えＣ１代謝微生物は、Ｌ−アミノ酸生合成（ＡＢ）酵素コード核酸またはその発現の操作により、所望のＬ−アミノ酸の増強された産生のために操作される。用語「Ｌ−アミノ酸生合成酵素」および「ＡＢ酵素」は、組換え宿主Ｃ１代謝微生物によるＬ−アミノ酸の産生に関与する酵素をいうように、本明細書において互換的に使用される。
【００２１】
１つの実施形態では、本発明は、Ｌ−アミノ酸生合成酵素をコードする外因性核酸および天然のＬ−アミノ酸生合成酵素をコードする核酸に作動可能に連結された発現制御配列をコードする外因性核酸からなる群から選択される第１の外因性核酸を含む組換えＣ１代謝微生物を提供する。典型的には、組換えＣ１代謝微生物のδ１３Ｃは、より詳細に本明細書の以下に記載する通り、−３０‰未満である。通常、組換えＣ１代謝微生物は、メタン資化性微生物である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本発明の組換えＣ１代謝微生物は、貯蔵ポリペプチドをコードする第２の外因性核酸をさらに含む。本明細書中で使用する場合、用語「貯蔵ポリペプチド」は、（１）少なくとも約１０アミノ酸残基の長さであり、（２）アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の総数の、少なくとも１０％（種による）のレベルでの増強を目標とするＬ−アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。典型的には、貯蔵ポリペプチドは、ＡＢ（アミノ酸生合成）酵素ではない。
【００２３】
貯蔵ポリペプチドは、実施例において実証される通り、本発明の組換えＣ１代謝微生物における所望のＬ−アミノ酸の増強された産生を容易にするために有用である。いくつかの実施形態では、貯蔵ポリペプチドのアミノ酸配列は、（１）少なくとも約１０アミノ酸残基（amino  residue）の長さ、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０または少なくとも約５００アミノ酸残基の長さとなることができ、（２）アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の総数の、少なくとも約１０％（種による）のレベル、またはアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の総数の、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％、少なくとも約２６％、少なくとも約２７％、少なくとも約２８％、少なくとも約２９％、少なくとも約３０％、少なくとも約３１％、少なくとも約３２％、少なくとも約３３％、少なくとも約３４％、少なくとも約３５％、少なくとも約３６％、少なくとも約３７％、少なくとも約３８％、少なくとも約３９％、少なくとも約４０％、少なくとも約４１％、少なくとも約４２％、少なくとも約４３％、少なくとも約４４％、少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％のレベルでの増強を目標としたＬ−アミノ酸を含むことができる。本発明の実施において用いられる貯蔵ポリペプチドは、天然起源のポリペプチドまたは非天然起源のポリペプチドとなり得る。貯蔵ポリペプチドをコードする第２の外因性核酸は、典型的には、組換え宿主Ｃ１代謝微生物からの最適な発現のためにコドン最適化される。例示的な貯蔵ポリペプチドは、実施例５および６に示されているＳ９Ａファミリーペプチダーゼ（配列番号１５２）である。Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈからの最適な発現のためにコドン最適化されたＳ９Ａファミリーペプチダーゼをコードする核酸配列は、配列番号１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４および１６６として示されている。本明細書中で使用する場合、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいうように互換的に使用される。
【００２４】
当業者は、総アミノ酸含有量の少なくとも１０％が所望のＬ−アミノ酸であるタンパク質を探索することにより、本発明における使用に適切な貯蔵ポリペプチドを容易に同定することができる。これは、例えば、目的の生物由来のあらゆるタンパク質に対して、例えばＧＥＮＢＡＮＫ（ワールドワイドウェブ、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）などの配列データベースをクエリーし、続いてタンパク質毎に［所望のアミノ酸の出現］／［タンパク質配列長さ］の比を算出することにより行うことができる。この解析の結果をこの比に基づきフィルタリングおよびソートして、適切なタンパク質を見出すことができる。
【００２５】
本発明の実施において用いられるＡＢ酵素および貯蔵ポリペプチドをコードする外因性核酸は、典型的には、組換え宿主Ｃ１代謝微生物からの最適な発現のためにコドン最適化される。これらは、宿主Ｃ１微生物に対し異種性の種に本来備わっている酵素またはタンパク質をコードすることができるか、あるいは天然に存在するポリペプチドの変異体（すなわち、バリアント）をコードすることができる。第１の外因性核酸が、ＡＢ酵素をコードする場合、外因性核酸は、Ｌ−リシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリンおよびＬ−チロシンからなる群から選択されるＬ−アミノ酸の生合成に関与するＡＢ酵素をコードする核酸となり得る。いくつかの実施形態では、Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−リシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−トレオニンなどからなる群から選択される。いくつかの例では、Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−リシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システインおよびＬ−トレオニンからなる群から選択される。適切な外因性核酸は、次のものからなる群から選択されるＬ−アミノ酸生合成酵素をコードする核酸を含む：
（ｉ）例えば、リシン感受性アスパルトキナーゼＩＩＩ（ｌｙｓＣ）、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡ）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）、２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２，６−カルボン酸Ｎ−スクシニルトランスフェラーゼ（ｄａｐＤ）、アセチルオルニチン／スクシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｒｇＤ）、スクシニルジアミノピメリン酸デスクシニラーゼ（ｄｅｓｕｃｃｉｎｙｌａｓｅ）（ｄａｐＥ）、スクシニルジアミノピメリン酸トランスアミナーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ（ｄａｐＦ）、ジアミノピメリン酸ジカルボキシラーゼ（ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）（ｌｙｓＡ）などのような、Ｌ−リシン生合成酵素；
（ｉｉ）例えば、コリスミ酸−ピルビン酸リアーゼ（ｕｂｉＣ）、アントラニル酸シンターゼ構成成分Ｉ（ｔｒｐＥ）、アントラニル酸シンターゼ構成成分ＩＩ（ｔｒｐＧ）、アントラニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｔｒｐＤ）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ｔｒｐＣ）、トリプトファン生合成タンパク質（ｔｒｐＣ）、Ｎ−（５’ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ｔｒｐＦ）、インドール−３−グリセロールリン酸シンターゼ、トリプトファンシンターゼアルファ鎖（ｔｒｐＡ）、トリプトファンシンターゼベータ鎖（ｔｒｐＢ）などのような、Ｌ−トリプトファン生合成酵素；
（ｉｉｉ）例えば、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＡ）、シスタチオニンガンマ−シンターゼ（ｍｅｔＢ）、タンパク質ＭａｌＹ、シスタチオニンベータ−リアーゼ（ｍｅｔＣ）、Ｂ１２依存性メチオニンシンターゼ（ｍｅｔＨ）、５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＥ）などのような、Ｌ−メチオニン生合成酵素；
（ｉｖ）セリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｙｓＥ）、システインシンターゼＡ、システインシンターゼＢなどからなる群から選択されるＬ−システイン生合成酵素；および（ｖ）例えば、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、ＰＬＰ依存性アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼなどのような、Ｌ−トレオニン生合成酵素。
【００２６】
上記の酵素は、例えば、大腸菌およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの、微生物を含む多数の異種性の種に見出すことができる。一定の特異的な実施形態では、外因性核酸は、本明細書の以下に記載の表Ａに示す配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８または１５０のうちいずれか１つの配列を有するＬ−アミノ酸生合成酵素をコードする。上記の通り、外因性核酸は、典型的には、組換えＣ１代謝微生物からの最適な発現のためにコドン最適化される。これらのＡＢ酵素をコードする例示的な核酸配列も表Ａに示す。これらの核酸配列は、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈにおける発現のためにコドン最適化されている。
【００２７】
【表Ａ−１】
2020103305.tif 000002
【表Ａ−２】
2020103305.tif 000003
【表Ａ−３】
2020103305.tif 000004
【表Ａ−４】
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【表Ａ−５】
2020103305.tif 000006
【００２８】
本発明の実施に用いられる適切な外因性核酸は、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８または１５０のうちいずれか１つに相当する参照配列などの、参照または親野生型ポリペプチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるバリアントＡＢ酵素配列をコードする核酸を含むが、ただし、該バリアントが、目的のＬ−アミノ酸生合成酵素活性を保持することを条件とする。一定の実施形態では、ＡＢ酵素バリアントポリペプチドは、参照または親野生型ＡＢ酵素と比べて、所定の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換（例えば、１、２、３、５、６、７、８、９、または１０またはそれを超えるか、２０、２５または３０までの置換）を含むが、ただし、バリアントが、目的のＡＢ酵素活性を保持することを条件とする。ＡＢ酵素バリアントポリペプチドは、１または複数の保存的置換をさらに含むことができる。「保存的置換」は、当該分野で、あるアミノ酸の、類似の性質を有する別のアミノ酸への置換と認識されている。例示的な保存的置換は、当該分野で周知である（例えば、本明細書中に参考として援用される、ＷＯ９７／０９４３３号，ｐ．１０；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ：ＮＹ（１９７５），ｐｐ．７１−７７；Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ（１９９０），ｐ．８を参照のこと）。
【００２９】
かかるバリアント酵素をコードする適切な外因性核酸を作製するための方法について、より詳細に本明細書の以下に記載する。
【００３０】
２つまたはそれより多くの核酸配列間またはアミノ酸配列間の「同一率（％）」は、２つまたはそれより多くの配列のアラインメントを最適にするために導入する必要があるギャップ数および各ギャップの長さを考慮した配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、同一率（％）＝同一の位置の数／位置の総数×１００）である。２つまたはそれより多くの配列の間の配列の比較および同一率（％）の決定を、数学アルゴリズム（ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムなど）をそのデフォルトパラメーターで使用して行うことができる（例えば、本明細書に参考として援用される、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０；ワールドワイドウェブのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴでのＢＬＡＳＴＮも参照のこと）。
【００３１】
上に示す通り、本発明の実施に用いられる外因性核酸は、Ｃ１代謝微生物における発現のためにコドン最適化することができる。組換えタンパク質の発現は、その元の宿主の外部では困難であり得る。例えば、異なる細菌種間でコドン使用頻度の偏りの変動が認められている（本明細書中に参考として援用される、Ｓｈａｒｐら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３３：１１４１，２００５）。組換えタンパク質の過剰発現は、その天然の宿主内でさえも困難であり得る。一定の実施形態では、本明細書中に記載の宿主に導入すべき核酸を、宿主への導入前に、タンパク質発現が有効であるかまたは増強されることを確実にするためにコドン最適化に供することができる。コドン最適化とは、非天然ＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドを変更することなく宿主の典型的なコドン使用頻度を反映するための形質転換前の遺伝子または核酸のコード領域中のコドンの変更をいう。異種宿主中の最適な遺伝子発現のためのコドン最適化法は、以前に記載されている（例えば、Ｗｅｌｃｈら，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４：ｅ７００２，２００９；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：３４６，２００４；Ｗｕら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５：Ｄ７６，２００７；Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓら，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ７：２８５，２００６；米国特許出願公開第２０１１／０１１１４１３号および同第２００８／０２９２９１８号（その方法の開示全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。本発明の実施における使用に適切なＡＢ酵素をコードする外因性核酸は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７および１４９からなる群から選択される核酸参照配列と少なくとも約８５％同一の核酸配列を有する核酸を含む。本発明の実施における使用に適切なＣＢ酵素をコードする例示的な外因性核酸は、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７および１４９のうちいずれか１つなどの、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈにおける最適な発現のためにコドン最適化された配列を含む。
【００３２】
同様に、ポリペプチドバリアントをコードする本開示の外因性核酸分子を、上述の文献（米国特許第８，００５，６２０号；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら；Ｗｅｌｃｈら；Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓら；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら（これらはすべて本明細書中に参考として援用される））に記載の系統発生学ベースの方法を使用してデザインすることができる。
【００３３】
Ｌ−アミノ酸生合成酵素をコードする外因性核酸は、相当するＬ−アミノ酸生合成酵素活性を有するまたは保持するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。基質から生成物へと変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドが特定の活性を有するかどうかを決定する方法が当該分野で公知である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、外因性核酸は、天然の炭水化物生合成酵素をコードする核酸に作動可能に連結された発現制御配列をコードする。典型的には、発現制御配列は、天然のＬ−アミノ酸生合成酵素の過剰発現をもたらす配列である。
【００３５】
第１の外因性核酸は、ＡＢ酵素をコードする場合、典型的には、外因性発現制御配列に作動可能に連結される。外因性発現制御配列を、Ｌ−アミノ酸生合成酵素をコードする外因性核酸に作動的に連結して、所望のＬ−アミノ酸の産生を増強することができる。外因性発現制御配列は、典型的には、Ｃ１代謝微生物宿主細胞からの最適な発現のためにコドン最適化される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、第１の外因性核酸は、天然のＬ−アミノ酸生合成酵素をコードする核酸に作動可能に連結された発現制御配列をコードする。例示的な発現制御配列は、本明細書の以下に記載するプロモーターを含む。このような実施形態では、天然のＬ−アミノ酸生合成酵素の発現は典型的に増加する（すなわち、過剰発現する）。増加された発現または活性は、野生型（天然または非遺伝子操作）コントロールまたは参照微生物のレベルを上回って増加している遺伝子またはタンパク質の発現または活性を含む。遺伝子またはタンパク質は、通常は発現することも活性であることもない微生物で発現または活性がある場合、過剰発現されている。遺伝子またはタンパク質は、発現または活性が野生型コントロール微生物または参照微生物内よりも組換え微生物内で、より広範にまたはより長期間存在する場合、過剰発現されている。本明細書中で使用する場合、「過剰発現する」および「過剰発現」は、遺伝子またはタンパク質についていう場合、該遺伝子またはタンパク質の発現または活性の増加を意味する。用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「遺伝子」は、一本鎖型または二本鎖型のいずれかの核酸残基（例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）のポリマーをいうように本明細書において互換的に使用される。
【００３７】
本明細書で上記の外因性核酸に加えて、本発明の組換えＣ１代謝微生物は、所望のＬ−アミノ酸の産生を増強するさらなる遺伝子改変を含むことができる。例えば、本発明の組換えＣ１代謝微生物は、Ｌ−アミノ酸生合成酵素によって利用される同じ基質のうち１または複数を利用する、または基質として所望のＬ−アミノ酸を利用する内因性酵素（すなわち、「競合する」内因性酵素）をコードする内因性核酸に作動的に連結された外因性発現制御配列をさらに含むことができる。これを行って、競合する内因性酵素を下方制御することができる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、競合する内因性酵素を変異させて、その活性を欠失または減弱させることにより、競合する内因性酵素活性を低下または阻害することが望ましい場合がある。「阻害する」または「阻害された」は、本明細書中で使用する場合、コントロールの、内因性の、または基準の分子と比較した、標的遺伝子の発現における、または標的分子の活性における直接的または間接的な変更、減少、下方制御、抑止または欠失をいい、ここで変更、減少、下方制御または抑止は、統計的に、生物学的に、産業的に、または臨床的に有意である。
【００３９】
Ｃ１代謝微生物における内因性遺伝子機能を下方制御、不活性化、ノックアウトまたは欠失するための種々の方法は、当該分野で公知である。例えば、標的化遺伝子破壊は、遺伝子下方制御に有効な方法であり、外因性ポリヌクレオチドが構造遺伝子に挿入されて、転写を破壊する。破壊しようとする標的宿主遺伝子の部分に対し高度な相同性を有する配列に挟まれる外因性挿入ＤＮＡ（例えば、遺伝的マーカー）を含む遺伝的カセットが、宿主Ｃ１代謝微生物に導入される。外因性ＤＮＡは、天然のＤＮＡ複製機構を介して標的宿主遺伝子を破壊する。メタン資化性細菌を含むＣ１代謝微生物において欠失／挿入変異体を構築するための対立遺伝子交換は、例えば、これら全て本明細書中に参考として援用される、Ｔｏｙａｍａ  ａｎｄ  Ｌｉｄｓｔｒｏｍ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４４：１８３、１９９８；Ｓｔｏｙｌａｒら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４５：１２３５、１９９９；Ａｌｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２：２９３１、２００６；Ｖａｎ  Ｄｉｅｎら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４９：６０１、２００３；Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｍｕｒｒｅｌｌ、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２７：２４３、２００６に記載されている。例えば、炭水化物合成経路などの、他の経路に関与する酵素を下方制御のために標的化して、Ｌ−アミノ酸生合成における宿主微生物の代謝活性に集中することもできる。
【００４０】
よって、組換えＣ１代謝微生物は、増強されたレベルで所望のＬ−アミノ酸を産生する能力を有するように操作することができる。このような実施形態のいくつかでは、天然ガス由来の供給材料（例えば、天然ガス、メタンなど）の存在下、少なくとも１セットの培養条件下で培養される場合、組換えＣ１代謝微生物は、天然のＣ１代謝微生物によって産生されるレベルよりも少なくとも約１０％大きく、天然のＣ１代謝微生物によって産生されるレベルの最大約２倍、最大約３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍および最大約５００または約１０００倍のレベルで所望のＬ−アミノ酸を産生する。他の実施形態では、天然ガス由来の供給材料の存在下、少なくとも１セットの培養条件下で培養される場合、組換えＣ１代謝微生物は、天然のＣ１代謝微生物によって産生されるレベルよりも少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％大きく、天然のＣ１代謝微生物によって産生されるレベルの最大約２倍、最大約３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍から約５００または約１０００倍のレベルで所望のＬ−アミノ酸を産生する。典型的には、天然ガス由来の供給材料の存在下、少なくとも１セットの培養条件下で培養される場合、本発明の組換えＣ１代謝微生物による所望のＬ−アミノ酸の産生の増強されたレベルは、天然のＣ１代謝微生物の少なくとも約２倍、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００倍である。
【００４１】
微生物内での外因性核酸の組換え発現方法は当該分野で周知である。かかる方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９９）（これらはすべて本明細書中に参考として援用される）中に記載されており、見出すことができる。酵素をコードする核酸分子またはその機能的断片の遺伝子改変により、その天然に存在する状態から変化した組換え細胞に生化学的能力または代謝能力を付与することができる。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、用語「内因性」および「天然の」は、酵素、化合物または活性などの、核酸、ポリペプチドをいう場合、宿主細胞内に通常存在する核酸、ポリペプチド、化合物または活性をいう。用語「同種」または「ホモログ」は、宿主細胞、種、または株で見いだされるかまたは由来する分子または活性と同一または類似する分子または活性である外因性（非天然）供給源由来の分子または活性をいう。
【００４３】
本明細書中で使用する場合、核酸分子、構築物、または配列を言及する場合の用語「異種」および「外因性」は、発現される細胞には天然にない核酸分子もしくは核酸分子配列の一部、変化または変異した、宿主細胞に天然にある核酸分子もしくは核酸分子の一部、または類似の条件下における天然の発現レベルと比較して発現が変化した核酸分子をいう。例えば、異種調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）を使用して、天然または培養において通常発現する遺伝子または核酸分子と異なる方法で遺伝子または核酸分子の発現を調節することができる。一定の実施形態では、異種核酸分子は天然の宿主細胞遺伝子と同種であり得るが、変化した発現レベルを有し得るか、または異なる配列を有するか、またはその両方である。他の実施形態では、異種または外因性の核酸分子は、宿主細胞または宿主ゲノムに対して内因性でない可能性があるが、その代わりに接合、形質転換、トランスフェクション、またはエレクトロポレーションなどによって宿主細胞に付加されたかもしれず、付加した分子が宿主ゲノムに取り込まれ得るか、または染色体外遺伝子材料（例えば、プラスミドまたは他の自己複製ベクター）として存在することができる。用語「異種性」は、生物をいう場合、宿主細胞とは異なる種をいう。
【００４４】
一定の実施形態では、１つを超える異種または外因性の核酸分子を、個別の核酸分子としてか、ポリシストロン性の核酸分子としてか、融合タンパク質をコードする単一の核酸分子としてか、またはその任意の組み合わせとして宿主細胞に導入することができ、これを依然として１つを超える異種または外因性の核酸と見なすことができる。例えば、Ｃ１代謝微生物を、１または複数の本明細書中に開示のＬ−アミノ酸生合成酵素をコードする同一または異なり得る２つまたはそれより多くの異種または外因性の核酸分子を発現するように改変することができる。一定の実施形態では、Ｌ−アミノ酸生合成酵素コードポリヌクレオチド分子の複数のコピーを、宿主細胞に導入し、これは、同じＬ−アミノ酸生合成酵素コードポリヌクレオチドまたは異なるＬ−アミノ酸生合成酵素コードポリヌクレオチドの２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超えるコピーであり得る。
【００４５】
宿主細胞および形質転換方法
本発明の実施において、本明細書で上記の外因性核酸は、Ｃ１代謝微生物である宿主細胞へと形質転換される。用いられるＣ１代謝微生物は、天然であるか、適応させた株であるか（例えば、親株と比較して成長速度が改善され、総バイオマス収量が増加した株を選択するための発酵を実施する）または目的のＬ−アミノ酸生合成酵素を産生するか、または過剰発現するように、かつ／または成長速度を増加させるように、組換えによって改変することができる。典型的には、Ｃ１代謝微生物は、非光合成Ｃ１微生物である（例えば、藻類または植物ではない）。
【００４６】
一定の実施形態では、本開示は、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、ＲｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓなどの、原核生物または細菌であるＣ１代謝微生物を用いる。
【００４７】
さらなる実施形態では、用いられるＣ１代謝細菌は、メタン資化性菌またはメチロトローフ菌である。例示的なメタン資化性菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａまたはこれらの組合せを含む。例示的なメチロトローフ菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｐｕｌｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓまたはこれらの組合せを含む。本明細書中で使用する場合、用語「メチロトローフ性細菌」は、少なくとも１つの炭素を含み、且つ炭素−炭素結合を含まない任意の形態（例えば、固体、液体、気体）の任意の化合物を酸化することができる任意の細菌をいう。一定の実施形態では、メチロトローフ性細菌は、メタン資化性菌であり得る。例えば、「メタン資化性細菌」は、炭素およびエネルギーの供給源としてメタンを酸化する能力を有し、メタンが炭素およびエネルギーの主な供給源であり得る任意のメチロトローフ性細菌をいう。例示的なメタン資化性細菌には、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、またはＭｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓが含まれる。
【００４８】
メタン資化性細菌は、その炭素同化経路および内部膜構造に基づいて３群に分類される：タイプＩ（ガンマプロテオバクテリア綱）、タイプＩＩ（アルファプロテオバクテリア綱、およびタイプＸ（ガンマプロテオバクテリア綱）。タイプＩメタン資化性菌は炭素同化のためにリブロース一リン酸（ＲｕＭＰ）経路を使用するのに対して、タイプＩＩメタン資化性菌はセリン経路を使用する。タイプＸメタン資化性菌はＲｕＭＰ経路を使用するが、セリン経路の酵素も低レベルで発現する。本発明の実施に用いられるメタン資化性細菌は、炭素およびエネルギー源のためにＣ１基質のみを利用できる偏性メタン資化性菌と、炭素およびエネルギー源としていくつかの多炭素基質を利用する能力を天然に有する通性メタン資化性菌とを含む。
【００４９】
本発明の実施に用いられる例示的な通性メタン資化性菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ、ＭｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓおよびＭｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａのいくつかの種（例えば、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｔｕｎｄｒａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｄａｌｔｏｎａ  ＳＢ２株、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｂｒｙｏｐｈｉｌａおよびＭｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａ  ａｕｒｅａ  ＫＹＧ）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ  ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ
ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍまたはこれらの高成長バリアントを含む。本発明の実施において有用な例示的な偏性メタン資化性細菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｙ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｆｌａｇｅｌｌａｔａ  ｓｐ．ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ  Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ｆｕｍａｒｉｏｌｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏａｃｉｄａ  ｋａｍｃｈａｔｋｅｎｓｉｓまたはこれらの高成長バリアントを含む。
【００５０】
本発明の実施において有用な適切なＣ１代謝微生物は、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｅｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓなどのような、シンガス代謝細菌を含む。例示的なシンガス代謝細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎなどを含む。
【００５１】
本発明の実施において有用な他の適切なＣ１代謝微生物は、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａなどを含む酵母などのような、真核生物を含む。
【００５２】
本開示の各微生物を、成長を助けることができる異種生物を有する単離培養物として成長させることができるか、またはこれらの細菌のうちの１つもしくはそれより多くを混合培養物が生成されるように組み合わせることができる。なおさらなる実施形態では、本開示のＣ１代謝非光合成微生物は、偏性Ｃ１代謝非光合成微生物、例えば、偏性メタン資化性菌または偏性メチロトローフ菌である。
【００５３】
上記Ｃ１代謝微生物のうちの任意の１つを親または参照の宿主細胞として使用して、本開示の組換えＣ１代謝微生物を作製することができる。本明細書中で使用する場合、「組換え（体）」は、少なくとも１つの遺伝子変化を有するかまたは異種核酸分子の導入によって改変されている、天然に存在しない、生物、微生物、細胞、核酸分子、またはベクターをいうか、あるいは内因性の核酸分子または遺伝子の発現を調節することができるように変化した細胞をいう。組換え（体）はまた、１つまたは複数のかかる改変を有する細胞由来の細胞または細胞の子孫である細胞をいう。遺伝子変化には、例えば、タンパク質もしくは酵素をコードする発現可能な核酸分子を導入する改変、または他の核酸分子の付加、欠失、置換、もしくは細胞の遺伝子材料の他の機能的変化が含まれる。例えば、組換え細胞は、天然の細胞（すなわち、非改変細胞または野生型細胞）内に同一形態で見出されない遺伝子もしくは他の核酸分子を発現し得るか、または内因性遺伝子（そうでない場合には、過剰発現、過小発現、最小発現するか、または全く発現しない可能性があるような遺伝子）の変化した発現パターンを提供し得る。
【００５４】
本明細書中に記載の任意の組換えＣ１代謝微生物またはメタン資化性細菌を、新規または増強された活性（例えば、酵素活性）を有する宿主を得るために少なくとも１つの外因性核酸を含むように形質転換することができるか、あるいは当該分野で公知の種々の方法のうちの任意のものを使用して内因性遺伝子機能を除去または実質的に低下させるように遺伝子改変することができる。
【００５５】
形質転換とは、核酸分子（例えば、外因性または異種の核酸分子）の宿主細胞への導入をいう。形質転換された宿主細胞は、外因性または異種の核酸分子を染色体外に保有することができるか、染色体内に組み込むことができる。宿主細胞ゲノムへの組み込みおよびベクターの自己複製により、一般に、形質転換された核酸分子が遺伝的に安定に遺伝することとなる。形質転換された核酸分子を含む宿主細胞を、「天然に存在しない」または「遺伝子操作された」または「組換え」または「形質転換された」または「トランスジェニック」細胞（例えば、細菌）という。
【００５６】
Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性細菌）内での異種核酸の発現に有用な発現系および発現ベクターは公知である。
【００５７】
Ｃ１代謝細菌のエレクトロポレーションは本明細書中に記載されており、例えば、Ｔｏｙａｍａら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６６：１，１９９８；Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８：１０５，１９９７；Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２３：７８７，２００１，および米国特許出願公開第２００８／００２６００５号に以前に記載されている。
【００５８】
ドナー細胞とレシピエント細胞との直接的接触を含む特定のタイプの形質転換をいう細胞接合は、Ｃ１代謝細菌への核酸分子の移入のためにより頻繁に使用されている。細菌接合は、相互に密接して接触させた「ドナー」細胞および「レシピエント」細胞の混合を含む。接合は、新規に合成されたドナー核酸分子がレシピエント細胞に一方向性に移入される、ドナー細菌とレシピエント細菌との間の細胞質連結の形成によって生じる。接合反応におけるレシピエントは、ドナー細菌からの水平伝播によって核酸を受容することができる任意の細胞である。接合反応におけるドナーは、接合性プラスミド、接合性トランスポゾン、または可動化プラスミドを含む細菌である。ドナープラスミドの物理的移入は、自己伝達性プラスミドによるか、または「ヘルパー」プラスミドの補助によって行うことができる。Ｃ１代謝細菌に関する接合は本明細書中に記載されており、Ｓｔｏｌｙａｒら，Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｙａ  ６４：６８６，１９９５；Ｍｏｔｏｙａｍａら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４２：６７，１９９４；Ｌｌｏｙｄら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７１：３６４，１９９９；ＰＣＴ公開第０２／１８６１７号；およびＡｌｉら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２：２９３１，２００６に以前に記載されている。
【００５９】
本発明の実施における使用に適切な発現制御配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、リプレッサー、インデューサーなどを含む。本発明の実施における使用に適切なプロモーターは、構成的、漏出（leaky）または誘導性であり得、かつ用いられている宿主細胞に本来備わっているかまたは備わっていない可能性がある。例示的なプロモーターは、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）プロモーター、デオキシ−キシルロースリン酸シンターゼプロモーター、メタノールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＭＤＨ）（例えば、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ（Ａｃｃ．Ｎｏ．ＭＣＡ０７７９）由来のｍｘａＦ遺伝子の上流遺伝子間領域におけるプロモーターまたはＭ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ由来のＭＤＨプロモーター（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６０：１１９（１９９８）を参照）など）、ヘキスロース（ｈｅｘｕｌｏｓｅ）６−リン酸シンターゼプロモーター、リボソームタンパク質Ｓ１６プロモーター、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼプロモーター、セリン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼプロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔｒｃプロモーター、ＰＨＡ合成のためのプロモーター（Ｆｏｅｌｌｎｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：２８４、１９９３）、ピルビン酸デカルボキシラーゼプロモーター（Ｔｏｋｕｈｉｒｏら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３１：７９５、２００６）、ｌａｃオペロンＰｌａｃプロモーター（Ｔｏｙａｍａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３：５９５、１９９７）、Ｐｔｒｃ（Ｂｒｏｓｉｕｓら、Ｇｅｎｅ  ２７：１６１、１９８４）などのハイブリッドプロモーター、メチロトローフ菌（ＥＰ  ２９６４８４）、メタン資化性菌における天然のプラスミドから同定されたプロモーターなどを含む。
【００６０】
その上、外因性核酸分子の高発現のための適切な同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または異種プロモーターを利用することができる。例えば、米国特許第７，０９８，００５号は、Ｃ１代謝細菌における異種性コード核酸のメタンまたはメタノールの存在下で高度に発現するためのプロモーターの使用を記載している。
【００６１】
一定の実施形態では、Ｌ−アミノ酸生合成酵素をコードする外因性核酸の発現制御が、非天然起源のＣ１代謝微生物の成長速度の最適化に望ましい場合があり、種々の炭素源条件における細菌成長を改善することができる。これは、誘導性プロモーター系の使用により達成することができる。
【００６２】
一定の実施形態では、ＡＢ酵素をコードする核酸は、誘導性プロモーターに作動的に連結される。本発明の実施に用いられる誘導性プロモーター系は、当該分野で公知のものを含み、テトラサイクリン誘導性プロモーター系；ＩＰＴＧ／ｌａｃオペロン誘導性プロモーター系、熱ショック誘導性プロモーター系；金属応答性プロモーター系；硝酸塩誘導性プロモーター系；光誘導性プロモーター系；エクジソン誘導性プロモーター系、メチロトローフ細菌およびメタン資化性細菌における使用のための記載されている誘導性／調節可能な系（例えば、本明細書中に参考として援用される米国特許出願公開第２０１０／０２２１８１３号を参照）などを含む。例えば、１つの実施形態では、非天然起源のＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌、メチロトローフ菌）は、（１）ｌａｃＯオペレーター配列に挟まれるプロモーターに作動的に連結された、ＡＢ酵素をコードする外因性核酸および（２）構成的プロモーター（例えば、ヘキスロース−６−リン酸シンターゼプロモーター）に作動的に連結された、ｌａｃＩリプレッサータンパク質をコードする外因性核酸を含む。ＬａｃＩリプレッサータンパク質が、ＬＤＨまたは他のプロモーターに挟まれるｌａｃＯオペレーター配列に結合して、転写を防止すると、誘導が開始される。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレッサーに結合し、ｌａｃＯ配列からこれを放出させ、転写を可能にする。誘導性プロモーター系を使用することにより、インデューサーの添加により乳酸合成を制御することができる。
【００６３】
本発明の実施に用いられる発現系および発現ベクターは、例えば、１または複数の翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結部位、ポリアデニル化シグナル、制限酵素部位、多重クローニング部位、他のコードセグメントなどの、遺伝子エレメントを必要に応じて含有する。一定の実施形態では、プロモーターおよび／またはコドン最適化（より詳細に本明細書で上記）は、宿主メタン資化性細菌における１または複数の炭水化物生合成酵素をコードする外因性ポリヌクレオチドの高度な構成的発現のために使用される。宿主メタン資化性細菌における外因性核酸の発現制御を利用することもできる。例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２２１８１３号に記載されているメチロトローフ細菌およびメタン資化性細菌における組換えタンパク質発現の誘導性／調節可能な系を例えば使用することができる。
【００６４】
一定の実施形態では、プロモーターまたはコドン最適化（より詳細に本明細書で上記）は、宿主メタン資化性細菌における１または複数のＬ−アミノ酸生合成酵素をコードする外因性ポリヌクレオチドの高度な構成的発現のために使用される。宿主メタン資化性細菌における外因性核酸の発現制御を利用することもできる。例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２２１８１３号などに記載のメチロトローフ性細菌およびメタン資化性細菌における組換えタンパク質発現の誘導性／調節可能な系を使用することができる。
【００６５】
所望のＬ−アミノ酸を産生する方法
本発明は、天然ガス由来の炭素供給材料の存在下、Ｌ−アミノ酸の産生に十分な条件下で組換えＣ１代謝微生物を培養する工程を含む、Ｌ−アミノ酸を産生する方法であって、上記Ｃ１代謝微生物が、Ｌ−アミノ酸生合成酵素をコードする外因性核酸を含む方法を提供する。典型的には、天然ガス由来の炭素供給材料は、天然ガス、メタンまたはシンガスである。本発明の微生物の培養に適した例示的な条件を実施例に記載する。
【００６６】
種々の培養方法を、本明細書中に記載の微生物のために使用することができる。例えば、Ｃ１代謝微生物（メタン資化細菌またはメチロトローフ細菌など）を、バッチ培養または連続培養法によって成長させることができる。一定の実施形態では、培養物を、制御培養ユニット（発酵槽、バイオリアクター、中空繊維セルなど）で成長させる。一般に、対数期の細胞は、しばしば、いくつかのシステムにおいて目的の生成物または中間体の大量生産を担うのに対して、他のシステムでは静止期または指数期後の生産を得ることができる。
【００６７】
古典的なバッチ培養法は、培養液の組成を培養開始時に設定し、培養プロセス中には変更しない閉鎖系である。すなわち、培養プロセス開始時に１つまたはそれより多くの最適な微生物で培養液を接種し、次いで、いかなる物質も系に添加することなく成長させる。本明細書中で使用する場合、「バッチ」培養は、最初に添加した特定の炭素源量が不変であることに関するのに対して、ｐＨおよび酸素濃度などの因子の制御を培養中にモニタリングおよび変更することができる。バッチ系では、系の代謝産物およびバイオマス組成物は、培養終了時まで絶えず変化する。バッチ培養物内で、細胞（例えば、メチロトローフ菌などの細菌）は、一般に、静的な誘導期から高成長の対数増殖期に移行し、成長速度が低下または停止する定常期に移行するであろう（条件が変化しない場合、最終的に細胞は死滅するであろう）。
【００６８】
フェッドバッチ系は、培養が進行するにつれて目的の炭素基質を漸増的に添加する標準的なバッチ系のバリエーションである。フェッドバッチ系は、細胞代謝が異化代謝産物抑制によって阻害されている可能性が高い場合、および培地中の基質量が制限されることが望ましい場合に有用である。フェッドバッチ系内の実際の基質濃度を測定することが困難であるので、ｐＨ、溶存酸素、および老廃物ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定する。バッチ培養法およびフェッドバッチ培養法は、当該分野で一般的であり、且つ公知である（例えば、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ；Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：２２７，１９９２を参照のこと）。
【００６９】
連続培養は、規定培養培地をバイオリアクターに連続的に添加する一方で、処理のために同量の使用済み（「馴化」）培地を同時に除去するという意味で「開放」系である。連続培養は、一般的に、細胞が主に対数増殖期にあるように細胞の液相密度を高度に一定に維持する。あるいは、連続培養を、固定化細胞（例えば、バイオフィルム）を使用して実施することができ、この培養は、炭素および栄養素を連続的に添加し、価値のある生成物、副生成物、および廃棄物を細胞集団から連続的に取り出す。細胞固定化を、天然材料、合成材料、またはその組み合わせから構成される広範な固体支持体を使用して行うことができる。
【００７０】
連続培養または半連続培養により、細胞成長または最終生成物の濃度に影響を及ぼす１つまたはそれより多くの因子を調整可能である。例えば、１つの方法は、限定された栄養素を固定された比率で維持することができ（例えば、炭素源、窒素）、経時的に他の全てのパラメーターを変化させることが可能である。他の実施形態では、成長に影響を及ぼすいくつかの因子を連続的に変化させることができる一方で、培地混濁度によって測定される細胞濃度を一定に保つ。連続培養系の目的は、培養条件を定常状態に維持する一方で、培地除去に起因する細胞喪失と細胞成長速度との平衡を保つことである。生成物の形成速度を最大にするための連続培養プロセスおよび技術のための栄養素および成長因子の調整方法は、当該分野で周知である（Ｂｒｏｃｋ，１９９２を参照のこと）。
【００７１】
液相バイオリアクター（例えば、撹拌槽、充填ベッド、１液相、２液相、ホローファイバーメンブレン）は、当該分野で周知であり、非天然起源の微生物および生体触媒の成長に使用することができる。
【００７２】
気相バイオリアクターを使用することにより、生物学的生産のための基質は、非天然起源の微生物、その細胞ライセートまたは無細胞画分によって、液体からではなくガスから吸収される。微生物による気相バイオリアクターの使用は、当該分野で公知である（例えば、米国特許第２，７９３，０９６号；同第４，９９９，３０２号；同第５，５８５，２６６号；同第５，０７９，１６８号；および同第６，１４３，５５６号；米国法定発明登録制度（Ｕ．Ｓ．  Ｓｔａｔｕｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ）Ｈ１４３０；米国特許出願公開第２００３／００３２１７０号；Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｈａｚａｒｄｏｕｓ  Ｗａｓｔｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ＩＩＩ、１９９３、Ｔｅｄｄｅｒ  ａｎｄ  Ｐｏｈｌａｎｄ編、４１１〜４２８頁）。例示的な気相バイオリアクターは、単一パスシステム、閉ループポンプシステムおよび流動床反応器を含む。気相バイオリアクターを利用することにより、メタンまたは他のガス状基質は、例えば、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドによるバイオ変換に容易に利用できる。一定の実施形態では、ガスをＬ−アミノ酸に変換するための方法は、気相バイオリアクター内で行われる。さらなる実施形態では、気体をＬ−アミノ酸に変換するための方法は、流動床反応器内で行われる。流動床反応器において、流体（すなわち、気体または液体）は、微生物が付着し成長することができる粒子床キャリア、通常、砂、顆粒状活性炭または珪藻土を上向きに通される。流体速度は、粒子床キャリアおよび付着した微生物が懸濁されるようなものである（すなわち、床流動化）。粒子床キャリアに付着した微生物は、流体中を自由に循環し、微生物への流体中の基質の有効物質移動（effective  mass  transfer）と、微生物成長の増加を可能にする。例示的な流動床反応器は、管型反応器および完全混合型反応器を含む。微生物のバイオフィルムによる流動床反応器の使用は、当該分野で公知である（例えば、Ｐｆｌｕｇｅｒら、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０２：９９１９、２０１１；Ｆｅｎｎｅｌｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．４０：１２１８、１９９２；Ｒｕｇｇｅｒｉら、Ｗａｔｅｒ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２９：３４７、１９９４；米国特許第４，０３２，４０７号；同第４，００９，０９８号；同第４，００９，１０５号；および同第３，８４６，２８９号）。
【００７３】
本開示に記載されている組換えＣ１代謝微生物は、単離された純粋な培養物として成長させることができる、あるいは成長に役立ち得る異種性非Ｃ１代謝微生物（複数可）またはＣ１代謝微生物の１または複数の異なる株もしくは種を組み合わせて、混合培養物を作製することができる。
【００７４】
一定の実施形態では、本発明のＬ−アミノ酸は、細胞成長の特定の期（例えば、誘導期、対数期、定常期または死滅期）において産生される。Ｃ１代謝微生物の成長および維持よりもむしろ、供給材料由来の炭素がＬ−アミノ酸に変換されることが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される非天然起源のＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌、メチロトローフ菌）は、低〜中程度の細胞密度（ＯＤ６００）まで培養され、続いてＬ−アミノ酸の産生が開始される。いくつかの実施形態では、Ｌ−アミノ酸は、メタン資化性細菌がもはや分裂していないまたは非常にゆっくり分裂している間に産生される。いくつかの実施形態では、Ｌ−アミノ酸は、定常期の間のみに産生される。いくつかの実施形態では、Ｌ−アミノ酸は、対数期および定常期の間に産生される。
【００７５】
本明細書に提供される組換えＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌、メチロトローフ菌）によって産生されたＬ−アミノ酸を含む発酵槽組成物は、生物学的発酵プロセスに関連する他の有機化合物をさらに含むことができる。例えば、発酵の生物学的副生成物は、アルコール、エポキシド、アルデヒド、ケトン、エステルまたはこれらの組合せのうち１または複数を含むことができる。一定の実施形態では、発酵槽組成物は、次のアルコール：メタノール、エタノール、ブタノールまたはプロパノールのうち１または複数を含有することができる。Ｈ２Ｏ、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯ  Ｎ２、Ｈ２、Ｏ２ならびにメタン、エタン、プロパンおよびブタンなどの未利用の炭素供給材料などの、他の化合物が、発酵槽オフガスに存在することもできる。
【００７６】
一定の実施形態では、本明細書に提供される組換えＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌、メチロトローフ菌）は、約０．００１ｇ／Ｌ（培養物）〜約５００ｇ／Ｌ（培養物）の本発明のＬ−アミノ酸を産生する。いくつかの実施形態では、産生されるＬ−アミノ酸の量は、約１ｇ／Ｌ（培養物）〜約１００ｇ／Ｌ（培養物）である。いくつかの実施形態では、産生されるＬ−アミノ酸の量は、約０．００１ｇ／Ｌ、０．０１ｇ／Ｌ、０．０２５ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．１５ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．２５ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、７．５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１２．５ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１７５ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２２５ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌ、２７５ｇ／Ｌ、３００ｇ／Ｌ、３２５ｇ／Ｌ、３５０ｇ／Ｌ、３７５ｇ／Ｌ、４００ｇ／Ｌ、４２５ｇ／Ｌ、４５０ｇ／Ｌ、４７５ｇ／Ｌ、または５００ｇ／Ｌである。
【００７７】
生成物
本発明は、本発明の組換えＣ１代謝細胞に加えて他の有用な生成物を提供する。１つの実施形態では、本発明は、本発明の組換えＣ１代謝微生物の培養物に由来するバイオマスを提供する。特異的な実施形態では、本発明は、組換えＣ１代謝微生物を含むバイオマスであって、該組換えＣ１代謝微生物が、Ｌ−アミノ酸生合成酵素をコードする外因性核酸を含み、該組換えＣ１代謝微生物が、天然ガス由来の供給材料を所望のＬ−アミノ酸に変換することができるバイオマスを提供する。さらなる実施形態では、本発明は、組換えＣ１代謝微生物を含むバイオマスであって、該組換えＣ１代謝微生物が、Ｌ−アミノ酸生合成酵素をコードする外因性核酸を含み、該組換えＣ１代謝微生物が、メタンを所望のＬ−アミノ酸に変換することができるバイオマスを提供する。
【００７８】
本明細書中で使用する場合、「バイオマス」は、細胞全体（whole  cell）、溶解細胞、または細胞外物質などのうちの１つまたはそれより多くを含み得る生物起源の有機材料をいう。例えば、培養微生物（例えば、細菌または酵母の培養物）から回収した材料はバイオマスとみなされ、これは、細胞、細胞膜、細胞の細胞質、封入体、培養培地内に分泌または排出された生成物、またはその任意の組み合わせを含み得る。一定の実施形態では、バイオマスは、本開示のＣ１代謝微生物が成長した培養培地と共に本開示のＣ１代謝微生物を含む。他の実施形態では、バイオマスは、Ｃ１基質（例えば、天然ガス、メタンなど）で成長した培養物から回収した本開示のＣ１代謝微生物（細胞全体または溶解細胞またはその両方）を含む。さらなる他の実施形態では、バイオマスは、Ｃ１基質で培養したＣ１代謝微生物の培養物由来の使用済み培地上清を含む。かかる培養物を再生可能資源と見なすことができる。本発明のバイオマスは、所望のＬ−アミノ酸のレベルに関して富化される。
【００７９】
細胞成長のための天然ガス由来の基質と共に提供される本発明の組換えＣ１代謝微生物は、そのδ１３Ｃ値によって表されるそのカーボンフィンガープリント（ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）に関して特有である（かかる組換えＣ１代謝微生物に由来する生成物として）。背景として、安定同位体測定および物質収支アプローチは、メタンのグローバルなソースおよびシンクを評価するために広く使用されている（Ｗｈｉｔｉｃａｒ  ａｎｄ  Ｆａｂｅｒ，Ｏｒｇ．Ｇｅｏｃｈｅｍ．１０：７５９，１９８６；Ｗｈｉｔｉｃａｒ，Ｏｒｇ．Ｇｅｏｃｈｅｍ．１６：５３１，１９９０を参照のこと）。酸化量を決定するために残留メタンのδ１３Ｃ値を使用するために、メタンの微生物酸化に原因する同位体分留度を知ることが必要である。例えば、好気性メタン資化性菌は、特異的酵素であるメタンモノオキシゲナーゼ（ｍｅｔｈａｎｅ  ｍｏｎｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＭＭＯ））によってメタンを代謝することができる。メタン資化性菌は、メタンをメタノールに変換し、その後にホルムアルデヒドに変換する。ホルムアルデヒドを、ＣＯ２にさらに酸化して還元等価物（ＮＡＤＨ）の形態で細胞にエネルギーを供給することができるか、または光合成生物における炭素同化経路と直接的に類似するＲｕＭＰサイクルまたはセリンサイクル（Ｈａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：４３９，１９９６）のいずれかによってバイオマスに組み込むことができる。より詳細には、タイプＩメタン資化性菌は、バイオマス合成のためにＲｕＭＰ経路を使用して完全にＣＨ４に由来するバイオマスを生成するのに対して、タイプＩＩメタン資化性菌は、５０〜７０％のＣＨ４由来の細胞炭素および３０〜５０％のＣＯ２由来の細胞炭素を同化するセリン経路を使用する（Ｈａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｏｎ，１９９６）。炭素同位体組成の測定方法は、例えば、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら（Ｇｅｏｃｈｉｍ．Ｃｏｓｍｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７０：１７３９，２００６）（その方法全体が本明細書中で参考として援用される）に示されている。実施例２は、異なるＣ１代謝微生物の細胞における安定炭素同位体分布の特徴付けについて記載する。実施例に記載されている通り、細胞の高度に負のδ１３Ｃ値は、このような細胞から抽出された化合物のδ１３Ｃ値において同様に反映された。本明細書に記載されている本発明の生成物（すなわち、本発明の組換えＣ１代謝微生物（本明細書で上記の通り）、それに由来する関連するバイオマスおよびＬ−アミノ酸および組成物）のδ１３Ｃは、実施例３に実証される通り、使用したＣ１基質の供給源および純度に応じて変動し得る。
【００８０】
一定の実施形態では、本発明の組換えＣ１代謝微生物ならびにそれに由来する関連するバイオマスおよびＬ−アミノ酸および組成物は、−３０‰未満、−３１‰未満、−３２‰未満、−３３‰未満、−３４‰未満、−３５‰未満、−３６‰未満、−３７‰未満、−３８‰未満、−３９‰未満、−４０‰未満、−４１‰未満、−４２‰未満、−４３‰未満、−４４‰未満、−４５‰未満、−４６‰未満、−４７‰未満、−４８‰未満、−４９‰未満、−５０‰未満、−５１‰未満、−５２‰未満、−５３‰未満、−５４‰未満、−５５‰未満、−５６‰未満、−５７‰未満、−５８‰未満、−５９‰未満、−６０‰未満、−６１‰未満、−６２‰未満、−６３‰未満、−６４‰未満、−６５‰未満、−６６‰未満、−６７‰未満、−６８‰未満、−６９‰未満または−７０‰未満のδ１３Ｃを示す。
【００８１】
一定の実施形態では、本発明の組換えＣ１代謝微生物ならびにそれに由来する関連するバイオマスおよびＬ−アミノ酸および組成物は、約−３５‰〜約−５０‰、−４５‰〜約−３５‰または約−５０‰〜約−４０‰または約−４５‰〜約−６５‰または約−６０‰〜約−７０‰または約−３０‰〜約−７０‰のδ１３Ｃを示す。
【００８２】
さらなる実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物バイオマスは、約−３０‰未満のδ１３Ｃを有するか、または約−４０‰〜約−６０‰の範囲である。一定の実施形態では、バイオマスは使用済み培地と共に組換えＣ１代謝非光合成微生物を含むか、またはバイオマスは組換えＣ１代謝非光合成微生物の培養物由来の使用済み培地上清組成物を含み、ここで、バイオマスのδ１３Ｃは約−３０‰未満である。一定の他の実施形態では、Ｌ−アミノ酸組成物をバイオマス（このバイオマスは、培養物由来の使用済み培地と共に組換えＣ１代謝非光合成微生物を含み得る）または組換えＣ１代謝非光合成微生物の培養物由来の使用済み培地上清組成物から抽出または濃縮する。
【００８３】
一定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物由来のＬ−アミノ酸組成物（必要に応じてＣ１代謝微生物バイオマス由来の抽出物または単離物であり得る）は、組成物の重量の少なくとも約５０％〜約８０％の水素原子、酸素原子および炭素原子を含み、ここで、組成物のδ１３Ｃは、約−３５‰未満または約−３６‰未満または約−３７‰未満または約−３８‰未満または約−３９‰未満または約−４０‰未満である。一定の実施形態では、それに由来するＬ−アミノ酸組成物は、水素原子、酸素原子および炭素原子を有する分子を含み、ここで、水素原子、酸素原子および炭素原子は、組成物の重量の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％であり、組成物のδ１３Ｃは約−３０‰〜約−７０‰の範囲であるか、細胞密度が約−５‰〜約−２０‰増加するにつれてバイオマス中のδ１３Ｃは減少するか、バイオマスのδ１３Ｃは、銅の存在下または非存在下で培養した場合に、同時に産生されたＣＯ２のものより平均で５‰〜１５‰高い。
【００８４】
天然ガス由来の供給材料の存在下で培養された一部のＣ１代謝微生物のδ１３Ｃの特徴付けを本明細書の以下に記載の実施例において例示する。
【００８５】
本発明は、本発明の組換えＣ１代謝微生物、関連するバイオマスおよび／またはＬ−アミノ酸組成物を含む動物飼料をさらに提供する。本発明の実施において企図される通り、動物飼料は、家畜飼料（例えば、ブタ飼料、ウシ飼料、ヒツジ飼料などのような）、家禽飼料（例えば、ニワトリ飼料、シチメンチョウ飼料などのような）または魚類飼料（例えば、サケ飼料、甲殻類（ｓｈｅｌｌ  ｆｉｓｈ）飼料などのような）となり得る。動物飼料は、例えば、植物由来の材料（例えば、トウモロコシ、オオムギ、オートムギ、イネ、ライムギ、コムギ、ソルガム、醸造使用済み穀粒などのような、穀物に由来する材料；および例えば、アルファルファ、クローバ、エンドウマメ、マメ（ｂｅａｎ）、レンズマメ、ダイズなどのような、マメ科植物に由来する材料を含む）、動物由来の材料（例えば、魚粉など）および／または微生物由来の材料（例えば、細菌、酵母または藻類となり得る、例えば異種性微生物由来のバイオマスを含む）などの、添加物をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、植物由来の材料添加物は、ダイズミールまたはエンドウマメタンパク質である。
【００８６】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の組換えＣ１代謝微生物、関連するバイオマスおよび／またはＬ−アミノ酸組成物を含む培養物または発酵培地を提供する。典型的には、培養物または発酵培地は、炭水化物（例えば、糖その他）および／または水をさらに含む。追加的な実施形態では、本発明は、本発明の培養物または発酵培地および第２の微生物を含む細胞培養組成物を提供する。典型的には、第２の微生物は、細菌、酵母または藻類細胞である。
【００８７】
本発明の実施形態は、次の項目を含む：
【００８８】
１．組換えＣ１代謝微生物の培養物に由来するバイオマスであって、該組換えＣ１代謝微生物が、Ｌ−アミノ酸生合成酵素をコードする外因性核酸を含み、該Ｃ１代謝微生物が、天然ガス由来の炭素供給材料をＬ−アミノ酸に変換することができ、該バイオマスのδ１３Ｃが、−４０‰未満であるバイオマス。
【００８９】
２．前記組換えＣ１代謝微生物が、非光合成Ｃ１代謝微生物である、実施形態１に記載のバイオマス。
【００９０】
３．前記外因性核酸が、リシン生合成酵素、トリプトファン生合成酵素、メチオニン生合成酵素、システイン生合成酵素およびトレオニン生合成酵素からなる群から選択される酵素をコードする、実施形態１〜２のいずれかに記載のバイオマス。
【００９１】
４．前記外因性核酸が、リシン感受性アスパルトキナーゼＩＩＩ（ｌｙｓＣ）、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡ）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）、２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２，６−カルボン酸Ｎ−スクシニルトランスフェラーゼ（ｄａｐＤ）、アセチルオルニチン／スクシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｒｇＤ）、スクシニルジアミノピメリン酸デスクシニラーゼ（ｄａｐＥ）、スクシニルジアミノピメリン酸トランスアミナーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ（ｄａｐＦ）およびジアミノピメリン酸（diaminopimetate）ジカルボキシラーゼ（ｌｙｓＡ）からなる群から選択されるリシン生合成酵素をコードする、実施形態１〜３のいずれかに記載のバイオマス。
【００９２】
５．前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リシンである、実施形態４に記載のバイオマス。
【００９３】
６．前記外因性核酸が、コリスミ酸−ピルビン酸リアーゼ（ｕｂｉＣ）、アントラニル酸シンターゼ構成成分Ｉ（ｔｒｐＥ）、アントラニル酸シンターゼ構成成分ＩＩ（ｔｒｐＧ）、アントラニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｔｒｐＤ）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ｔｒｐＣ）、トリプトファン生合成タンパク質（ｔｒｐＣ）、Ｎ−（５’ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ｔｒｐＦ）、インドール−３−グリセロールリン酸シンターゼ、トリプトファンシンターゼアルファ鎖（ｔｒｐＡ）およびトリプトファンシンターゼベータ鎖（ｔｒｐＢ）からなる群から選択されるトリプトファン生合成酵素をコードする、実施形態１〜３のいずれかに記載のバイオマス。
【００９４】
７．前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−トリプトファンである、実施形態６に記載のバイオマス。
【００９５】
８．外因性核酸が、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＡ）、シスタチオニンガンマ−シンターゼ（ｍｅｔＢ）、タンパク質ＭａｌＹ、シスタチオニンベータ−リアーゼ（ｍｅｔＣ）、Ｂ１２依存性メチオニンシンターゼ（ｍｅｔＨ）および５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ  （ｍｅｔＥ）からなる群から選択されるメチオニン生合成酵素をコードする、実施形態１〜３のいずれかに記載のバイオマス。
【００９６】
９．前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−メチオニンである、実施形態８に記載のバイオマス。
【００９７】
１０．前記外因性核酸が、セリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｙｓＥ）、システインシンターゼＡおよびシステインシンターゼＢからなる群から選択されるシステイン生合成酵素をコードする、実施形態１〜３のいずれかに記載のバイオマス。
【００９８】
１１．前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−システインである、実施形態１０に記載のバイオマス。
【００９９】
１２．前記外因性核酸が、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、ＰＬＰ依存性アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼおよびトレオニンシンターゼからなる群から選択されるトレオニン生合成酵素をコードする、実施形態１〜３のいずれかに記載のバイオマス。
【０１００】
１３．前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−トレオニンである、実施形態１２に記載のバイオマス。
【０１０１】
１４．前記外因性核酸が、大腸菌およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからなる群から選択される微生物に対し内因性のＬ−アミノ酸生合成酵素をコードする、実施形態１〜１３のいずれかに記載のバイオマス。
【０１０２】
１５．前記外因性核酸が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８または１５０のうちいずれか１つからなる群から選択されるＬ−アミノ酸生合成酵素配列をコードする、実施形態１〜２のいずれかに記載のバイオマス。
【０１０３】
１６．前記外因性核酸の配列が、前記組換えＣ１代謝微生物からの最適な発現のためにコドン最適化されている、実施形態１〜１５のいずれかに記載のバイオマス。
【０１０４】
１７．前記Ｌ−アミノ酸生合成酵素をコードする前記外因性核酸が、発現制御配列に作動的に連結されている、実施形態１〜１６のいずれかに記載のバイオマス。
【０１０５】
１８．前記発現制御配列が、外因性発現制御配列である、実施形態１７に記載のバイオマス。
【０１０６】
１９．前記Ｃ１代謝微生物が、内因性酵素活性の欠失をさらに含む、実施形態１〜１８のいずれかに記載のバイオマス。
【０１０７】
２０．前記Ｃ１代謝微生物が、メタン資化性菌である、実施形態１〜１９のいずれかに記載のバイオマス。
【０１０８】
２１．前記メタン資化性菌が、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ、またはＭｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａである、実施形態２０に記載のバイオマス。
【０１０９】
２２．前記メタン資化性菌が、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ  １６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ  ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ  Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（ＡＴＣＣ  ７００７９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｔｕｎｄｒａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｄａｌｔｏｎａ  ＳＢ２株、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｂｒｙｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａ  ａｕｒｅａ  ＫＹＧ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、およびＭｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍからなる群から選択される、実施形態２０に記載のバイオマス。
【０１１０】
２３．前記天然ガス由来の炭素供給材料が、天然ガス、シンガス、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、一酸化炭素、二酸化炭素、シアン化物、メチルアミン、メチルチオール、メチルハロゲンおよびこれらのいずれかの組合せまたは２つもしくはそれ超からなる群から選択される、実施形態１〜２２のいずれか一実施形態に記載のバイオマス。
【０１１１】
２４．前記天然ガス由来の炭素供給材料が、天然ガスである、実施形態２３に記載のバイオマス。
【０１１２】
２５．前記天然ガス由来の炭素供給材料が、メタンである、実施形態２３に記載のバイオマス。
【０１１３】
２６．前記天然ガス由来の炭素供給材料が、シンガスである、実施形態２３に記載のバイオマス。
【０１１４】
２７．前記Ｃ１代謝微生物が、シンガス代謝細菌である、実施形態２３に記載のバイオマス。
【０１１５】
２８．前記シンガス代謝細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎからなる群から選択される、実施形態２７に記載のバイオマス。
【０１１６】
２９．前記バイオマスのδ１３Ｃが、−５０‰未満である、実施形態１〜２８のいずれかに記載のバイオマス。
【０１１７】
３０．Ｌ−アミノ酸を含む組成物であって、−４０‰未満のδ１３Ｃを示す組成物。
【０１１８】
３１．前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システインおよびＬ−トレオニンからなる群から選択される、実施形態３０に記載の組成物。
【０１１９】
３２．実施形態１〜２９のいずれかに記載のバイオマスまたは実施形態３０〜３１のいずれかに記載の組成物を含む動物飼料。
【０１２０】
３３．植物由来の材料をさらに含む、実施形態３２に記載の動物飼料。
【０１２１】
３４．前記植物由来の材料が、ダイズミールおよびエンドウマメタンパク質からなる群から選択される、実施形態３３に記載の動物飼料。
【０１２２】
３５．実施形態１〜２７のいずれかに記載のバイオマスまたは実施形態４０〜４２のいずれかに記載の組成物を含む培養物または発酵培地。
【０１２３】
３６．Ｌ−アミノ酸生合成酵素をコードする外因性核酸を含む組換えＣ１代謝微生物であって、該Ｃ１代謝微生物が、天然ガス由来の炭素供給材料をＬ−アミノ酸に変換することができ、該バイオマスのδ１３Ｃが、−４０‰未満である組換えＣ１代謝微生物。
【０１２４】
３７．前記組換えＣ１代謝微生物が、非光合成Ｃ１代謝微生物である、実施形態３６に記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１２５】
３８．前記外因性核酸が、リシン生合成酵素、トリプトファン生合成酵素、メチオニン生合成酵素、システイン生合成酵素およびトレオニン生合成酵素からなる群から選択される酵素をコードする、実施形態３６〜３７のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１２６】
３９．前記外因性核酸が、リシン感受性アスパルトキナーゼＩＩＩ（ｌｙｓＣ）、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡ）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）、２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２，６−カルボン酸Ｎ−スクシニルトランスフェラーゼ（ｄａｐＤ）、アセチルオルニチン／スクシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｒｇＤ）、スクシニルジアミノピメリン酸デスクシニラーゼ（ｄａｐＥ）、スクシニルジアミノピメリン酸トランスアミナーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ（ｄａｐＦ）およびジアミノピメリン酸（diaminopimetate）ジカルボキシラーゼ（ｌｙｓＡ）からなる群から選択されるリシン生合成酵素をコードする、実施形態３６〜３８のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１２７】
４０．前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リシンである、実施形態３９に記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１２８】
４１．前記外因性核酸が、コリスミ酸−ピルビン酸リアーゼ（ｕｂｉＣ）、アントラニル酸シンターゼ構成成分Ｉ（ｔｒｐＥ）、アントラニル酸シンターゼ構成成分ＩＩ（ｔｒｐＧ）、アントラニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｔｒｐＤ）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ｔｒｐＣ）、トリプトファン生合成タンパク質（ｔｒｐＣ）、Ｎ−（５’ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ｔｒｐＦ）、インドール−３−グリセロールリン酸シンターゼ、トリプトファンシンターゼアルファ鎖（ｔｒｐＡ）およびトリプトファンシンターゼベータ鎖（ｔｒｐＢ）からなる群から選択されるトリプトファン生合成酵素をコードする、実施形態３６〜３８のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１２９】
４２．前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−トリプトファンである、実施形態４１に記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１３０】
４３．外因性核酸が、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＡ）、シスタチオニンガンマ−シンターゼ（ｍｅｔＢ）、タンパク質ＭａｌＹ、シスタチオニンベータ−リアーゼ（ｍｅｔＣ）、Ｂ１２依存性メチオニンシンターゼ（ｍｅｔＨ）および５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ  （ｍｅｔＥ）からなる群から選択されるメチオニン生合成酵素をコードする、実施形態３６〜３８のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１３１】
４４．前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−メチオニンである、実施形態４３に記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１３２】
４５．前記外因性核酸が、セリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｙｓＥ）、システインシンターゼＡおよびシステインシンターゼＢからなる群から選択されるシステイン生合成酵素をコードする、実施形態３６〜３８のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１３３】
４６．前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−システインである、実施形態４５に記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１３４】
４７．前記外因性核酸が、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、ＰＬＰ依存性アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼおよびトレオニンシンターゼからなる群から選択されるトレオニン生合成酵素をコードする、実施形態３６〜３８のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１３５】
４８．前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−トレオニンである、実施形態４７に記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１３６】
４９．前記外因性核酸が、大腸菌およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからなる群から選択される微生物に対し内因性のＬ−アミノ酸生合成酵素をコードする、実施形態３６〜４８のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１３７】
５０．前記外因性核酸が、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８および１５０のうちいずれか１つからなる群から選択されるＬ−アミノ酸生合成酵素配列をコードする、実施形態３６〜３７のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１３８】
５１．前記外因性核酸の配列が、前記組換えＣ１代謝微生物からの最適な発現のためにコドン最適化されている、実施形態３６〜５０のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１３９】
５２．前記Ｌ−アミノ酸生合成酵素をコードする前記外因性核酸が、発現制御配列に作動的に連結されている、実施形態３６〜５１のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１４０】
５３．前記発現制御配列が、外因性発現制御配列である、実施形態５２に記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１４１】
５４．前記Ｃ１代謝微生物が、内因性酵素活性の欠失をさらに含む、実施形態３６〜５３のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１４２】
５５．前記Ｃ１代謝微生物が、メタン資化性菌である、実施形態３６〜５４のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１４３】
５６．前記メタン資化性菌が、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ、またはＭｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａである、実施形態５５に記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１４４】
５７．前記メタン資化性菌が、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ  １６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ  ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ  Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（ＡＴＣＣ  ７００７９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｔｕｎｄｒａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｄａｌｔｏｎａ  ＳＢ２株、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｂｒｙｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａ  ａｕｒｅａ  ＫＹＧ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、およびＭｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍからなる群から選択される、実施形態５５に記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１４５】
５８．前記天然ガス由来の炭素供給材料が、天然ガス、シンガス、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、一酸化炭素、二酸化炭素、シアン化物、メチルアミン、メチルチオール、メチルハロゲンおよびこれらのいずれかの組合せまたは２つもしくはそれ超からなる群から選択される、実施形態３６〜５７のいずれか一実施形態に記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１４６】
５９．前記天然ガス由来の炭素供給材料が、天然ガスである、実施形態５８に記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１４７】
６０．前記天然ガス由来の炭素供給材料が、メタンである、実施形態５８に記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１４８】
６１．前記天然ガス由来の炭素供給材料が、シンガスである、実施形態５８に記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１４９】
６２．前記Ｃ１代謝微生物が、シンガス代謝細菌である、実施形態６１に記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１５０】
６３．前記シンガス代謝細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎからなる群から選択される、実施形態６２に記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１５１】
６４．前記バイオマスのδ１３Ｃが、−５０‰未満である、実施形態３６〜６３のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物。
【０１５２】
６５．Ｌ−アミノ酸を産生する方法であって、天然ガス由来の炭素供給材料の存在下、該Ｌ−アミノ酸の産生に十分な条件下で、実施形態３６〜６４のいずれかに記載の組換えＣ１代謝微生物を培養する工程を含む方法。
【０１５３】
６６．実施形態６５に記載の方法によって産生されるＬ−アミノ酸であって、−４０‰未満のδ１３Ｃを示すＬ−アミノ酸。
【０１５４】
本発明の上記および他の態様は、次の非限定的な実施例に関連してより十分に理解することができる。
【実施例】
【０１５５】
実施例１
Ｃ１代謝微生物のための培養条件およびバイオリアクター条件
【０１５６】
例示的な本開示のＣ１代謝微生物（メタン資化性菌、メチロトローフ菌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）を、チューブ、バイアル、ボトル、プレート、またはバイオリアクター（発酵）内で培養した。種々の微生物についての成長条件、培地、および炭素源を、本実施例中に記載する。
【０１５７】
Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ株（ＮＣＩＭＢ  １１１３１）；Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２４０２）；またはＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ
血清ボトルのために、細菌を、ヒギンス最少硝酸塩培地（ＮＳＭ；Ｃｏｒｎｉｓｈら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：２５６５，１９８４；Ｐａｒｋら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３８：４２３，１９９１）またはＭＭ−Ｗ１培地中にて３０℃で培養した。上部空間の組成を、メタン：空気の体積比を１：１に調整した。ボトルを２００〜２５０ｒｐｍの速度で振盪した。あるいは、培養物を、１：１（ｖ／ｖ）メタン：空気ガス混合物を含む気密チャンバー中またはメタノール蒸気の存在下（パラフィルム密封プレートの蓋内の０．５ｍＬメタノールによる）で成長させた１．５％ｗ／ｖ寒天を含むＮＳＭ−培地プレート上または０．５％メタノールを補足したＮＳＭ−培地プレート上に維持した。プレートを逆さにして３０℃の加湿チャンバー中でインキュベートした。
【０１５８】
使用したＮＳＭ培地の組成は以下であった：１．０ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２０ｇのＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２．０ｍｌのキレート鉄溶液（０．１ｇのクエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム、または０．５ｇの塩化鉄（ＩＩＩ）；０．２ｇのＥＤＴＡ、ナトリウム塩；０．３ｍｌの濃ＨＣｌ；１００．０ｍｌの蒸留脱イオンＨ２Ｏ）、１．０ｇのＫＮＯ３、０．５ｍｌの微量元素溶液（５００．０ｍｇのＥＤＴＡ、２００．０ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０．０ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．０ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、３０．０ｍｇのＨ３ＢＯ３、２０．０ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２．０ｍｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、３．０ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１．０Ｌの蒸留水）、０．２７２ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．７１７ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、必要に応じて１２．５ｇの精製寒天（例えば、Ｏｘｏｉｄ  Ｌ２８またはＢａｃｔｏ（商標）寒天；プレート作製時に使用）、１．０Ｌの蒸留脱イオン水（ｐＨを６．８に調整し、１２１℃で１５分間オートクレーブする）。
【０１５９】
発酵について、１Ｌの滅菌限定培地ＭＭ−Ｗ１を含む２リットルのバイオリアクターに、メタンおよび空気の１：１（ｖ／ｖ）混合物を供給したＭＭ−Ｗ１で成長させた血清ボトルバッチ培養物（１０〜２０％ｖ／ｖ）由来の細胞を接種した。使用したＭＭ−Ｗ１の培地組成は以下であった：０．８ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍＭのＮａＮＯ３、０．１４ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＮａＨＣＯ３、２．３５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、３．４ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、２０．７μＭのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１μＭのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１０μＭのＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡ、および１ｍＬ／リットルの微量金属溶液（１リットルあたり５００ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４００ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｍｇのＭｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１５ｍｇのＨ３ＢＯ３、２５０ｍｇのＥＤＴＡを含む）。培地をオートクレーブし、冷却した後に、リン酸塩、重炭酸塩、およびＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡを添加した。一定の発酵において、重炭酸塩を０．１％（ｗ／ｖ）まで添加した。反応器の内容物を、オーバーヘッドインペラーを使用して７５０ｒｐｍの一定速度で撹拌した。培養物に約６０ｍＬ／分〜約１２０ｍＬ／分でスパージする一定量のメタンを供給し、その一方で、約４０％〜約８０％の溶存酸素レベル（培地の空気飽和と比較して）を維持するために約１０〜１００ｍＬ／分の可変速度で濃縮酸素（少なくとも８５％）を供給した。
【０１６０】
バイオリアクター内の温度を３０℃に維持し、約４時間毎〜約２４時間毎に（およそ５ＯＤ単位のＯＤ６００増加に相当する）他の添加物と共に培養物への０．５ＭのＮａＯＨおよび０．５ＭのＨＣｌの自動添加を使用してｐＨを７．１±０．１に維持した。他の添加を、金属添加（最終濃度が１０μＭのＣｕＳＯ４、５μＭのＦｅＳＯ４、５μＭのＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡ）と栄養素添加（５．７５ｍＭのＫｘＨｙＰＯ４、１０ｍＭのＮａＮＯ３）との間で交互に行った。これらの条件下で、２０超のＯＤ６００まで、約２．７〜約３．３グラム乾燥細胞重量／リットル／日の有効なバイオマス生成速度の本質的に線形の成長が認められた。培養バイオマスを遠心分離によって収集し、ＭＭ−Ｗ１培地で１回洗浄し、回収したバイオマスを−８０℃で冷凍するか、または細胞成分の分画（例えば、脂質抽出）のために直ちに使用した。
【０１６１】
バイオマス生産性を維持し、発酵のシャットダウンおよびスタートアップに関連する時間（すなわち、ターンアラウンドタイムまたはリードタイム）を短縮させるために、半連続発酵アプローチも適用することができる。
【０１６２】
培養密度が定常期に近づいた時（しかし、定常期に入る前）、細菌バイオマスの収集をおよそ１２〜２４時間間隔で行った。バイオリアクター体積の約半分を、遠心分離ポンプによって別個の容器に移すことによって除去した。次いで、バイオリアクターの光学密度がその初期値のおよそ半分であるように、等体積の滅菌または再利用した培地を該リアクターに戻した。単一の発酵ラン中に複数サイクルの成長およびバイオマス回収を行うことができるように、バイオリアクター発酵を上記プロトコールにしたがって継続した。
【０１６３】
Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）
細菌を、ヒギンス最少硝酸塩培地（ＮＳＭ）またはＭＭ−Ｗ１培地を含む血清ボトル中にて４２℃で培養した。上部空間の組成を、メタン：空気の体積比を１：１に調整した。ボトルを２００〜２５０ｒｐｍの速度で振盪した。あるいは、培養物を、１：１（ｖ／ｖ）メタン：空気ガス混合物を含む気密チャンバー中で成長させた１．５％ｗ／ｖ寒天で固化させたＮＳＭ−培地プレート上に維持した。プレートを逆さにして４２℃のチャンバー中でインキュベートした。
【０１６４】
発酵について、１．２５Ｌの滅菌培地ＭＭＦ１．１を含む３リットルのバイオリアクターに、メタンおよび空気の１：１（ｖ／ｖ）混合物を補充した同一の培地中で成長させた血清ボトルバッチ培養物（１０〜２０％ｖ／ｖ）由来の細胞を接種した。培地ＭＭＦ１．１の組成は以下であった：０．８ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４０ｍＭのＮａＮＯ３、０．１４ｍＭのＣａＣｌ２、６ｍＭのＮａＨＣＯ３、４．７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、６．８ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、２０．７μＭのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、６μＭのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１０μＭのＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡ、および１ｍＬ／リットルの微量金属溶液（１リットルあたり５００ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４００ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｍｇのＭｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１５ｍｇのＨ３ＢＯ３、２５０ｍｇのＥＤＴＡを含む）。培地をオートクレーブし、冷却した後に、リン酸塩、重炭酸塩、およびＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡを添加した。反応器の内容物を、オーバーヘッドインペラーを使用して７５０ｒｐｍの一定速度で撹拌した。培養物に約６０〜約２００ｍＬ／分でスパージする一定量のメタンを供給し、その一方で、濃縮酸素（８５％超）を１５〜９０ｍＬ／分の可変速度で供給し、溶存酸素レベル（培地の空気飽和と比較して）を１０％未満に維持した。
【０１６５】
バイオリアクター内の温度を４４℃に維持し、３〜６時間毎に（ＯＤ５到達後のおよそ３〜５ＯＤ単位のＯＤ６００の増加に相当する）銅および鉄（５μＭのＣｕＳＯ４、５μＭのＦｅＳＯ４、１０μＭのＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡ最終濃度）の培養物への添加と共に０．５ＭのＮａＯＨおよび０．５ＭのＨＣｌの自動添加を使用してｐＨを７．０±０．１に維持した。これらの条件下で、１０超のＯＤ６００まで、５グラム乾燥細胞重量／リットル／日超の有効なバイオマス生成速度で本質的に線形の成長が認められた。培養バイオマスを遠心分離によって収集し、細胞をＭＭ−Ｗ１培地で１回洗浄し、細胞ペレットを−８０℃で冷凍するか、または細胞成分の分画のために直ちに使用した。
【０１６６】
栄養の枯渇を、発酵中の増殖収率を制限し得る問題と認識した。栄養素（主に窒素およびリン酸塩）の制限を回避するために、培養物のＯＤ６００が５を超えた後に２倍濃縮のＭＭＦ１．１から構成される栄養素の供給を開始した。培養体積を拡大しながら洗い流しを回避し、且つＯＤ増加を維持するために、培養物の成長速度のおよそ半分に対応する希釈率で栄養供給を開始した。単一の発酵ラン中に複数サイクルの成長およびバイオマス回収を行うことができるように、バイオリアクター発酵を上記プロトコールにしたがって継続した。
【０１６７】
Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓまたはＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ株（ＮＣＩＭＢ  １１１３１）
細菌を、０．５％メタノールを補充したヒギンス最少硝酸塩培地（ＮＳＭ）を含むチューブ中にて３０℃で培養する。チューブを２００〜２５０ｒｐｍの速度で振盪する。あるいは、培養物を、メタノール蒸気の存在下（パラフィルム密封プレートの蓋内の０．５ｍＬメタノールによる）で成長させた１．５％ｗ／ｖ寒天を含むか、または０．５％メタノールを補充したＮＳＭ−培地プレート上に維持する。プレートを逆さにして通常大気下にて３０℃の加湿チャンバー中でインキュベートする。
【０１６８】
発酵について、１Ｌの限定培地ＭＭ−Ｗ１を含む２リットルのバイオリアクターに、培養チューブバッチ培養物由来の細胞（１０〜２０％ｖ／ｖ）を接種する。ＭＭ−Ｗ１の培地組成は上記の通りであった。反応器の内容物を、オーバーヘッドインペラーを使用して８００ｒｐｍの一定速度で撹拌する。培養物に、最終濃度０．５％までの初期ボーラスのメタノールおよび可変量のメタノール供給材料を供給し、一方で、６０〜９０％の溶存酸素レベル（培地の空気飽和と比較して）を維持するために３０〜１００ｍＬ／分の可変速度で純酸素を供給した。
【０１６９】
バイオリアクター内の温度を３０℃に維持し、上記の金属および栄養素の添加と共に０．５ＭのＮａＯＨおよび１ＭのＨＣｌの自動添加を使用してｐＨを７．１±０．１に維持した。これらの条件下で、２０超のＯＤ６００まで、２．７〜３．３グラム乾燥細胞重量／リットル／日の有効なバイオマス生成速度で本質的に線形の成長が認められた。培養バイオマスを遠心分離によって収集し、細胞をＭＭ−Ｗ１培地で１回洗浄し、細胞ペレットを−８０℃で冷凍するか、または胞成分の分画のために直ちに使用した。
【０１７０】
バイオマス生産性を維持し、発酵のシャットダウンおよびスタートアップに関連する時間（すなわち、ターンアラウンドタイムまたはリードタイム）を短縮させるために、半連続発酵アプローチも適用することができる。
【０１７１】
培養密度が定常期に近づいた時（しかし、定常期に入る前）、蓄積した細菌バイオマスの収集をおよそ１２〜２４時間間隔で行った。バイオリアクター体積の約半分を、遠心分離ポンプによって別個の容器に移すことによって除去した。次いで、バイオリアクターの光学密度がその初期値のおよそ半分であるように、等体積の新鮮なまたは再利用した培地を該リアクターに戻した。単一の発酵ラン中に複数サイクルの成長およびバイオマス回収が行われるように、バイオリアクター発酵を上記プロトコールにしたがって継続した。
【０１７２】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細菌を、ブチルゴム栓および２００ｋＰａの鉄鋼所排ガスを有するプラスチックコーティングした５００ｍｌ−Ｓｃｈｏｔｔ  Ｄｕｒａｎ（登録商標）ＧＬ４５ボトル内の１００ｍＬの改変ＰＥＴＣ培地（ＡＴＣＣ培地１７５４）中にて３７℃で嫌気的に培養する。６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）の測定によって成長をモニタリングする。
【０１７３】
改変ＰＥＴＣ培地は、（１リットルあたり）１ｇのＮＨ４Ｃｌ、０．４ｇのＫＣｌ、０．２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８ｇのＮａＣｌ、０．１ｇのＫＨ２ＰＯ４、２０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｍｌの微量元素溶液（以下を参照のこと）、１０ｍｌのウォルフスビタミン溶液（以下を参照のこと）、２ｇのＮａＨＣＯ３、および１ｍｇのレサズリンを含む。ｐＨを５．６に調整後、培地をボイルし、嫌気的に分注し、１２１℃で１５分間オートクレーブする。鉄鋼所排ガス（組成：４４％ＣＯ、３２％Ｎ２、２２％ＣＯ２、２％Ｈ２）または等価な合成混合物を炭素源として使用する。培地は最終ｐＨが５．９であり、濃度０．００８％（ｗ／ｖ）のシステイン−ＨＣｌおよびＮａ２Ｓで還元する。
【０１７４】
微量元素溶液は、１リットルあたり２ｇのニトリロ三酢酸（残存成分の添加前にＫＯＨでｐＨ６に調整済み）、１ｇのＭｎＳＯ４、０．８ｇのＦｅ（ＳＯ４）２（ＮＨ４）２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｍｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２０ｍｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２０ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２０ｍｇのＮａ２ＳｅＯ４、および２０ｍｇのＮａ２ＷＯ４を含む。
【０１７５】
ウォルフスビタミン溶液（Ｗｏｌｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３８：２８８２、１９６３）は、（１リットルあたり）２ｍｇのビオチン、２ｍｇの葉酸、１０ｍｇの塩酸ピリドキシン、５ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、５ｍｇのリボフラビン、５ｍｇのニコチン酸、５ｍｇのＤ−（＋）−パントテン酸カルシウム、０．１ｍｇのビタミンＢ１２、５ｍｇのｐ−アミノ安息香酸、および５ｍｇのチオクト酸を含む。
【０１７６】
ａ．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの発酵
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの発酵を、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０３００５９３号に記載の方法に類似の方法を使用して行う。簡潔に述べれば、１．３Ｌの溶液Ａ（３．０８３ｇのＮＨ４Ａｃ；０．６１ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；０．２９４ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．１５ｇのＫＣｌ；０．１２ｇのＮａＣｌ（任意）；これらを蒸留水で１Ｌにする）を含む２リットルのバイオリアクターに、Ｎ２ガスをスパージする。Ｈ３ＰＯ４の８５％溶液（２．０２５ｍＬ、３０ｍＭ）を添加し、濃ＮＨ４ＯＨ水溶液を使用してｐＨを５．３に調整する。次いで、１３．５ｍＬの溶液Ｂ（２０．０ｍｇのビオチン；２０．０ｍｇの葉酸；１０．０ｍｇのピリドキシンＨＣｌ；５０．０ｍｇのチアミン・ＨＣｌ；５０．０ｍｇのリボフラビン；５０．０ｍｇのニコチン酸；５０．０ｍｇのＤ−（＊）−パントテン酸カルシウム；５０．０ｍｇのビタミンＢ１２；５０．０ｍｇのｐ−アミノ安息香酸；５０．０ｍｇのチオクト酸；これらを蒸留水で１Ｌにする）を添加し、溶液にＮ２ガスをスパージする。溶液の酸化還元電位（ＯＲＰ）がおよそ−２００ｍＶに低下するまで塩化クロム（ＩＩ）を添加し、ここで、レサズリン（１．３５ｍＬの２ｇ／Ｌ溶液）を添加する。多硫化ナトリウム（５．４ｍＬの３Ｍ溶液、以下を参照のこと）を添加し、溶液にＮ２をスパージし、次いでＣＯ含有ガス（１％Ｈ２；１３％Ｎ２；７１％ＣＯ；１５％ＣＯ２）をスパージする。金属硫化物溶液（１５０ｍＬ、以下を参照のこと）を添加し、およそ５％（ｖ／ｖ）のレベルの活発に成長しているＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ培養物の接種前にこの溶液をさらに３０分間スパージする。
【０１７７】
多硫化ナトリウム溶液を、Ｎａ２Ｓ（９３．７ｇ、０．３９ｍｏｌ）および２００ｍｌのＨ２Ｏを充填した５００ｍｌフラスコ中に調製する。塩が溶解するまで溶液を撹拌し、硫黄（２５ｇ、０．１ｍｏｌ）を一定のＮ２流下で添加する。室温で２時間の撹拌後、多硫化ナトリウム溶液（Ｎａに関して約４Ｍおよび硫黄に関して約５Ｍ）（現時点で透明な赤褐色の液体）をＮ２パージした血清ボトルに移し、アルミニウム箔で包む。
【０１７８】
クロム（ＩＩ）溶液を、不活性ガス下で作業し、その後に所望の生成物を適切な貯蔵フラスコに移すための気密性の入口および出口を取り付けた１Ｌ三つ口フラスコ中で調製する。フラスコに、ＣｒＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（４０ｇ、０．１５ｍｏｌ）、亜鉛顆粒［２０メッシュ］（１８．３ｇ、０．２８ｍｏｌ）、水銀（１３．５５ｇ、１ｍＬ、０．０６７６ｍｏｌ）、および５００ｍＬの蒸留水を充填する。Ｎ２で１時間のフラッシング後、混合物を約８０℃に加温して反応を開始させる。一定のＮ２流下で２時間の撹拌後、混合物を室温に冷却し、さらに４８時間連続的に撹拌する（この時間までに反応混合物は濃青色溶液に変化する）。溶液をＮ２パージした血清ボトルに移し、さらなる使用のために４℃で保存する。
【０１７９】
金属硫化物溶液を、約９５０ｍＬの溶液Ａを１Ｌ発酵槽に添加し、Ｎ２ガスをスパージすることによって調製する。８５％Ｈ３ＰＯ４溶液（１．５ｍＬ、３０ｍＭ）を添加し、濃ＮＨ４ＯＨ水溶液を使用してｐＨを５．３に調整する。溶液Ｂ（１０ｍＬ）を添加し、溶液にＮ２をスパージする。溶液の酸化還元電位（ＯＲＰ）がおよそ−２００ｍＶに低下するまで塩化クロム（ＩＩ）を添加し、ここで、レサズリン（１ｍＬの２ｇ／Ｌ溶液）を添加する。溶液Ｃ（１／１０；１０ｍｌのＦｅＣｌ３；５ｍｌのＣｏＣｌ２；５ｍｌのＮｉＣｌ２；１ｍｌのＨ３ＢＯ３；１ｍｌのＮａ２ＭｏＯ４；１ｍｌのＭｎＣｌ２；１ｍｌのＮａ２ＷＯ４；１ｍｌのＺｎＣｌ２；１ｍｌのＮａ２ＳｅＯ３；１Ｌの培地中）を添加し、次いで、多硫化ナトリウム（２ｍＬの３Ｍ溶液）を添加し、次いで、この溶液にＮ２ガスをスパージする。
【０１８０】
ポリスルフィドの存在下でのバッチ条件下におけるＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍによるＣＯを含む基質の発酵により、蓄積速度が実質的に増加し、２〜３日間の期間にわたっておよそ４ｇ／Ｌのバイオマスが最終的に蓄積される。例えば、約１日間の短期の誘導期後、バイオマスは、およそ３６時間の発酵にわたって約０．５ｇ／Ｌから少なくとも３．５ｇ／Ｌまで増加し得る。さらに、酢酸塩はポリスルフィドの存在下で成長期中に生成されず（バッチ発酵で典型的に見出されるように）、一定の環境下でいくつかの酢酸塩が消費される。したがって、発酵槽内の酢酸塩の正味の量が減少する。培養バイオマスを遠心分離によって収集し、細胞を培地中で１回洗浄し、細胞ペレットを−８０℃で凍結するか、または細胞成分の分画のために直ちに使用した。
【０１８１】
バイオマス生産性を維持し、発酵のシャットダウンおよびスタートアップに関連する時間（すなわち、ターンアラウンドタイムまたはリードタイム）を短縮させるために、半連続発酵アプローチも適用することができる。
【０１８２】
培養密度が定常期に近づいた時（しかし、定常期に入る前）、蓄積した細菌バイオマスの収集をおよそ１２〜２４時間間隔で行った。バイオリアクター体積の約半分を、遠心分離ポンプによって別個の容器に移すことによって除去した。次いで、バイオリアクターの光学密度がその初期値のおよそ半分であるように、等体積の新鮮なまたは再利用した培地を該リアクターに戻した。単一の発酵ラン中に複数サイクルの成長およびバイオマス回収が行われるように、バイオリアクター発酵を上記プロトコールにしたがって継続した。
【０１８３】
ｂ．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの発酵
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの発酵を、例えば、米国特許第５，１７３，４２９号および同第５，５９３，８８６号に記載の方法に類似の方法を使用して行う。簡潔に述べれば、バッチ発酵を、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの生物学的に純粋な培養物を使用して行う。培地（（１）ＫＨ２ＰＯ４  ３．００ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ３．００ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ６．００ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ６．００ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・２Ｈ２Ｏ  １．２５ｇ／Ｌを含む８０．０ｍＬの塩；（２）１．０ｇの酵母エキス；（３）１．０ｇのトリプチケース；（４）ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  １５００ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ３０ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  ３００ｍｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ２００ｍｇ、ＣｕＣｌ２・Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ２０ｍｇ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ３０ｍｇ、Ｎａ２ＳｅＯ３  １０ｍｇを含み、蒸留水で１Ｌにした３．０ｍｌのＰＦＮ（Ｐｆｅｎｎｉｎｇ）微量金属溶液；（５）塩酸ピリドキサール１０ｍｇ、リボフラビン５０ｍｇ、塩酸チアミン５０ｍｇ、ニコチン酸（Ｎｉｃｔｏｔｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）５０ｍｇ、Ｃａ−Ｄ−パントテイナート５０ｍｇ、リポ酸６０ｍｇ、ｐ−アミノ安息香酸５０ｍｇ、葉酸２０ｍｇ、ビオチン２０ｍｇ、シアノコバラミン５０ｍｇを含み、蒸留水で１Ｌにした１０．０ｍｌのビタミンＢ群；（６）０．５ｇのシステインＨＣｌ；（７）０．０６ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；（８）２．０ｇのＮａＨＣＯ３；（９）１．０ｍＬのレサズリン（０．０１％）；および（１０）９２０．０ｍＬの蒸留水）の調製を、８０％窒素および２０％ＣＯ２の雰囲気下で嫌気的に行う。発酵中の培地のｐＨを制御し、ＨＣｌで５．０に維持する。必要な場合、滅菌１０％ＮａＯＨ溶液または１．０％酢酸溶液を使用してｐＨを調整する。培地を１５７．５ｍＬ血清ボトルに移し、ブチルゴム栓およびアルミニウムシールで密封する。次いで、ボトルを１２１℃で２０分間オートクレーブする。
【０１８４】
実験開始のおよそ４８時間前に、種培養物を、上記と類似のボトル中でＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの保存培養物から調製する。種培養物を振盪恒温器中にて３７℃で成長させ、１００ｒｐｍで振盪した。還元溶液（２．０ｍｌのＮａ２Ｓ（２．５％溶液）および２．０ｍｌのシステイン−ＨＣｌ（３．５％溶液））を培養物に添加し、これを振盪恒温器中に約１５分間入れて完全に酸素を除去し、温度馴化させる。生物の生物学的に純粋な培養物の単離に使用される手順と異なり、メタンインヒビターの添加はバッチ発酵で必要ない。
【０１８５】
Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉを使用した発酵を、栄養培地を含むＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｂｉｏｆｌｏｗ  ＩＩｃ  ２．５リットル発酵槽中にて３７℃で行い、１．５リットルの流体レベルを一定に維持する一方で、およそ５００ｃｍ３／分の速度でガスを導入しながら流体を最大１，０００回転／分までの可変速度で撹拌する。最適なガス保持時間は、３分間の範囲である。ガス供給は、細菌によるその取り込みによって異なり、これは細胞密度の関数でもある。
【０１８６】
培養密度が静止期に近づいた時（しかし、静止期に入る前）、蓄積した細菌バイオマスの収集をおよそ１２〜２４時間間隔で行った。バイオリアクター体積の約半分を、遠心分離ポンプによって別個の容器に移すことによって除去した。次いで、バイオリアクターの光学密度がその初期値のおよそ半分であるように、等体積の新鮮なまたは再利用した培地を該リアクターに戻した。単一の発酵ラン中に複数サイクルの成長およびバイオマス回収が行われるように、バイオリアクター発酵を上記プロトコールにしたがって継続した。
【０１８７】
実施例２
Ｃ１代謝微生物由来の脂質中の安定炭素同位体分布
Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍのバイオマスおよび脂質画分の乾燥サンプルを、ＩｓｏＰｒｉｍｅ１００  ＩＲＭＳ（Ｉｓｏｐｒｉｍｅ，Ｃｈｅａｄｌｅ，ＵＫ）を取り付けたＣＨＮＯＳ元素分析器（ｖａｒｉｏ  ＩＳＯＴＯＰＥ  ｃｕｂｅ，Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ，Ｈａｎａｕ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した元素分析器／連続フロー型同位体比質量分析によって、炭素および窒素含有量（％乾燥重量）、ならびに炭素（１３Ｃ）および窒素（１５Ｎ）安定同位体比について分析した。発酵槽または血清ボトルで培養したメタン資化性バイオマスのサンプルを遠心分離し、脱イオン水に再懸濁し、０．２〜２ｍｇの炭素（約０．５〜５ｍｇ乾燥細胞重量）に対応する体積を５×９ｍｍスズカプセル（Ｃｏｓｔｅｃｈ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に移し、８０℃で２４時間乾燥させた。同様に、事前に抽出した脂質画分をクロロホルムに懸濁し、０．１〜１．５ｍｇの炭素を含む体積をスズカプセルに移し、８０℃で２４時間蒸発乾固させた。０．１ｍｇの炭素を含む標準によって信頼性の有るδ１３Ｃ値を得た。
【０１８８】
同位体比を「δ」記号（‰）で示し、ここで、百万分の一（ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ）偏差方式での、標準の同位体組成と比較した材料の同位体組成はδ１３Ｃ（またはδ１５Ｎ）＝（Ｒサンプル／Ｒ標準−１）×１，０００（式中、Ｒは重い同位体型対軽い同位体型の分子比である）で与えられる。炭素標準はウィーンピーディーベレムナイト（Ｖ−ＰＤＢ）であり、窒素については大気である。ＮＩＳＴ（国立標準技術研究所）は、ＳＲＭ（標準参照物質）番号１５４７（モモの葉）を較正標準として使用することを推奨していた。全同位体分析を、カリフォルニア大学バークレー校の安定同位体生物地質化学センターで行った。Ｃ同位体およびＮ同位体分析の長期外部精度は、それぞれ０．１０‰および０．１５‰である。
【０１８９】
Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ株を３つの異なる発酵バッチ内のメタンで成長させ、Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈを２つの異なる発酵バッチ内のメタンで成長させ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａを単一の発酵バッチ内のメタンで成長させた。これらの各培養物由来のバイオマスを、安定炭素同位体分布（δ１３Ｃ値；表１を参照のこと）について分析した。
【０１９０】
【表１−１】
2020103305.tif 000007
【表１−２】
2020103305.tif 000008
【０１９１】
さらに、安定炭素同位体分析を、実施例１に記載のようにバイオリアクター中でメタンで成長させたＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ株（Ｍｔ  ＯＢ３ｂ）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株（Ｍｃ  Ｂａｔｈ）、およびＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ株（Ｍｍｓ  １６ａ）由来のバイオマスおよび対応する脂質画分（表２を参照のこと）について行った。
【０１９２】
【表２】
2020103305.tif 000009
【０１９３】
Ｍｔ  ＯＢ３ｂ株、Ｍｃ  Ｂａｔｈ株、およびＭｍｓ  １６ａ株由来のバイオマスを、それぞれ９４時間（３．１４ｇのＤＣＷ／Ｌ）、２６時間（２．２ｇのＤＣＷ／Ｌ）、および３９時間（１．１４ｇのＤＣＷ／Ｌ）で収集した。表４中の脂質についてのδ１３Ｃ値は、２連の決定値の平均を示す。
【０１９４】
実施例３
脂質における安定炭素同位体分布に及ぼすメタン供給源および純度の影響
【０１９５】
メタン含有天然ガス成分で成長させたメタン資化性菌を試験するために、１００ｍＬ特定培地ＭＭＳ１．０を含む一連の０．５リットル血清ボトルに、メタンおよび空気の１：１（ｖ／ｖ）混合物を供給した同一培地中で成長させた血清ボトルバッチ培養（５％ｖ／ｖ）由来のＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂまたはＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈを接種した。ＭＭＳ１．０培地の組成は以下であった：０．８ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３０ｍＭのＮａＮＯ３、０．１４ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＮａＨＣＯ３、２．３５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、３．４ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、２０．７μＭのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、６μＭのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１０μＭのＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡ、および１ｍＬ／リットルの微量金属溶液（Ｌあたり以下を含む：５００ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４００ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｍｇのＭｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１５ｍｇのＨ３ＢＯ３、２５０ｍｇのＥＤＴＡ）。培地をオートクレーブし、冷却した後に、リン酸塩、重炭酸塩、およびＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡを添加した。培地の最終ｐＨは７．０±０．１であった。
【０１９６】
接種したボトルをゴムスリーブストッパーで密封し、滅菌０．４５μｍフィルターおよび滅菌２７Ｇ針を通してシリンジを介して添加した６０ｍＬメタンガスを注入した。二連の培養物に６０ｍＬの体積の（Ａ）純度９９％のメタン（グレード２．０，Ｐｒａｘａｉｒ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｇａｓ，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）、（Ｂ）天然ガス標準を示す純度７０％のメタン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；９％エタン、６％プロパン、３％メチルプロパン、３％ブタン、および他の微量炭化水素成分も含む）、（Ｃ）メタン供給源ＡおよびＢの１：１混合物として送達させた純度８５％のメタン；ならびに（Ｄ）９３％超のメタン（グレード１．３，Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓｏｕｔｈ  Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ；インハウス分析ではメタン９９％超の組成を示した）をそれぞれ注入した。培養物を、２５０ｒｐｍでの回転振盪を使用して３０℃（Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ株）または４２℃（Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ）でインキュベートし、１ｍＬのサンプルを取り出してＯＤ６００を決定することによっておよそ１２時間間隔で成長を測定した。この時ボトルを通気し、上部空間を６０ｍＬの各メタン供給源（Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤ）および６０ｍＬの濃縮酸素（少なくとも純度８５％）と置換した。約２４時間間隔で、５ｍＬのサンプルを取り出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）によって細胞を回収し、次いで、分析するまで−８０℃で保存した。
【０１９７】
Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ株およびＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ由来のメタン資化性バイオマスについての炭素含有量および窒素含有量（％乾燥重量）ならびに炭素（１３Ｃ）および窒素（１５Ｎ）安定同位体比の分析を行った。表３は、異なるレベルの純度を有するメタンでボトル培養の種々のバッチで成長させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ由来のバイオマスサンプルについての安定炭素同位体分析の結果を示す。
【０１９８】
【表３】
2020103305.tif 000010
【０１９９】
１つのメタン供給源（Ａ、９９％）で成長させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈの平均δ１３Ｃは−４１．２±１．２であった一方で、異なるメタン供給源（Ｂ、７０％）で成長させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈの平均δ１３Ｃは−４４．２±１．２であった。メタン供給源ＡおよびＢを混合した場合、−４３．８±２．４という中間の平均δ１３Ｃが認められた。これらのデータは、メタン供給源ＡおよびＢで成長させた細胞材料のδ１３Ｃが投入メタンのδ１３Ｃの相違に起因して相互に有意に異なることを示す。しかし、２つのガスの混合物で成長させた細胞は１２Ｃを優先的に利用し、したがって、より負のδ１３Ｃ値となる傾向を示す。
【０２００】
異なるメタン供給源およびボトル培養の種々のバッチにおいて成長させた２つの異なるメタン資化性菌（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＢａｔｈおよびＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ）がδ１３Ｃ分布の相違を示すかどうかを試験するために、類似の実験を行った（表４を参照のこと）。
【０２０１】
【表４−１】
2020103305.tif 000011
【表４−２】
2020103305.tif 000012
【０２０２】
第１のメタン供給源（Ａ）で成長させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの平均δ１３Ｃは−４４．５±８．８であった一方で、同一メタン供給源で成長させたＭ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍの平均δ１３Ｃは−４７．８±２．０であった。第２のメタン供給源（Ｂ）で成長させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの平均δ１３Ｃが−３７．９±０．４であった一方で、Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍの平均δ１３Ｃは−３９．８±４．５であった。これらのデータは、メタン供給源で成長させた細胞材料のδ１３Ｃが同一のメタン供給源で成長させた異なる株由来の細胞材料のδ１３Ｃと高度に類似することを示す。したがって、細胞材料のδ１３Ｃの実測値は、研究された特定の細菌株の性質よりもむしろ投入ガスの組成に主に依存するようである。
【０２０３】
実施例４
Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株におけるＬ−リシン生合成オペロンからの個々のまたは２種の遺伝子のクローニングおよび発現
【０２０４】
アミノ酸Ｌ−リシンを過剰産生するメタン資化性細菌株を作製するために、酵素、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡ）（配列番号１２１）またはジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ｌｙｓＡ）（配列番号１２３）およびジアミノピメリン酸エピメラーゼ（ｄａｐＦ）（配列番号１２５）またはスクシニルジアミノピメリン酸デスクシニラーゼ（ｄａｐＥ）（配列番号１２７）またはアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）（配列番号１２９）またはジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）（配列番号１３１）またはアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ａｒｇＤ）（配列番号１３３）のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含有するメタン資化性菌発現ベクターを、接合交配（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ  ｍａｔｉｎｇ）によりＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈに導入した。これらの酵素は、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈに本来備わっている。エピソーム発現プラスミド（複製起点、転移起点（ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、薬物抵抗性マーカー（カナマイシン）および多重クローニング部位をコードする配列を含有）を使用して、操作されたＩＰＴＧ誘導性（ＬａｃＩｑ）メタノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）プロモーターの下流に、これらのポリヌクレオチド配列のそれぞれをクローニングした。経路遺伝子含有プラスミド、同じ発現系における無関係の遺伝子または記載されているプロモーター構築物なしのプラスミドのいずれかを有する接合能を有する（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌株（Ｓ−１７）のコロニー（ドナー株）を、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含有する液体ＬＢに接種し、３７℃で一晩成長させた。１部の液体ドナー培養物を、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含有する１００部の新鮮ＬＢに３〜５時間接種し、その後、これをレシピエントメタン資化性株との交配に使用した。メタン資化性（レシピエント）株を、交配に先立ち、対数増殖期（約０．３のＯＤ６００）に達するまで、約４０ｍＬメタンを有する液体ＭＭ−Ｗ１培地（Ｐｉｅｊａら、２０１１、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ６２：５６４〜５７３）に１〜２日間接種した。
【０２０５】
レシピエントおよびドナー株をＯＤ６００比が１：１となる体積で（例えば、ＯＤ６００が１．５のメタン資化性菌１ｍＬおよびＯＤ６００が１．５のドナー１ｍＬ）調製することにより、二親交配を行った。次に、６０秒間１３．２ｋ  ｒｐｍの遠心分離によりこれらの細胞を収集した。上清を除去し、細胞ペレットを５００μＬ  ＭＭ−Ｗ１に穏やかに再懸濁した。大腸菌ドナー株に対し、遠心分離および再懸濁をさらに２回反復して、抗生物質の除去を確実にした。次に、レシピエントおよびドナー株の等体積の再懸濁した細胞を組み合わせ、穏やかなピペッティングにより混合した。交配組成物を６０秒間１３．２ｋ  ｒｐｍで遠心分離し、可能な限り上清を除去した。次に、細胞ペレットを穏やかに混合し、交配寒天（無菌０．５％酵母エキスを含有する完全ＭＭ−Ｗ１培地）上に単一の液滴として沈着させた。交配プレートを、メタンおよび空気（１：１比）を含有する密封チャンバー内で４８時間３７℃にてインキュベートした。４８時間のインキュベーション期間後に、１ｍＬ  ＭＭ−Ｗ１培地を交配プレートに添加し、懸濁した細胞を２ｍＬエッペンドルフチューブに移すことにより、該プレートの細胞を採取した。遠心分離により細胞をペレット化し、１００μＬ新鮮ＭＭ−Ｗ１に再懸濁し、その後、選択プレート（カナマイシン７．５μｇ／ｍＬを含有する完全ＭＭ−Ｗ１寒天培地）にプレーティングして、構築物を安定的に維持する細胞を選択した。プラスミド保有メタン資化性菌は、約１週間の４２℃インキュベーション後にこれらのプレート上に出現した。次に、４２℃の振盪インキュベーター内で、１：１メタン対空気比を含有する密封容器中の２．５ｍｌ液体培地（ＭＭＳ１）においてコロニーを成長させた。２４時間後、ＩＰＴＧを最終濃度５ｍＭとなるように添加して、標的遺伝子の発現を誘導した。さらに７２時間後、実施例９に記載されている方法を使用して、アミノ酸産生に関して培養物をアッセイした。表５は、株の概要説明を示す。
【０２０６】
【表５】
2020103305.tif 000013
【０２０７】
結果を図１に示す。本図は、株の関数としての、培養物の光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）で割った細胞外Ｌ−リシン濃度（表示遺伝子を異種性発現する株の細胞上清において検出される）のグラフである。遺伝子型キー３４および１０６７は、空のプラスミドコントロールおよび同じプロモーター文脈において無関係の遺伝子（緑色蛍光タンパク質をコード）を発現するコントロールである。バーは、１〜８種の間のサンプル（いくつかのクローンは成長しなかった）の平均を表す。グラフは、表示遺伝子の過剰発現が、空のプラスミドコントロール（遺伝子型キー３４）の１０〜１６倍の間および無関係の遺伝子コントロール（遺伝子型キー１０６７）の１．２〜２．１倍の間の細胞外Ｌ−リシンの増加をもたらすことを示す。結果は、外因性プロモーターの制御下にある、表示のＬ−アミノ酸生合成酵素コード核酸の発現の結果としての細胞外Ｌ−リシンの産生増加を実証する。
【０２０８】
実施例５
Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈにおける高いＬ−リシン含有量を有するタンパク質（貯蔵タンパク質）をコードする遺伝子のクローニングおよび発現
【０２０９】
細胞関連バイオマスにおいてアミノ酸Ｌ−リシンを過剰産生するメタン資化性細菌株を作製するために、上昇したＬ−リシン含有量を有するタンパク質（本明細書において、ＨｉｇｈＫ（配列番号１５２）と命名されるＳ９Ａファミリーペプチダーゼ）のアミノ酸配列をコードする数種類の遺伝子バリアントのうち１種を含有するメタン資化性菌発現ベクターを、接合交配によりＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈに導入した。エピソーム発現プラスミド（複製起点、転移起点、薬物抵抗性マーカー（カナマイシン）および多重クローニング部位をコードする配列を含有）を使用して、操作されたＩＰＴＧ誘導性（ＬａｃＩｑ）メタノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）プロモーターの下流に、ＨｉｇｈＫポリヌクレオチド配列（配列番号１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３および１６５、それぞれ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈのための異なるコドン最適化された配列）をクローニングした。実験的遺伝子含有プラスミドまたは記載のプロモーター−遺伝子構築物を持たない「陰性コントロール」プラスミドのいずれかを有する接合能を有する大腸菌株（Ｓ−１７）のコロニー（ドナー株）を、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含有する液体ＬＢに接種し、３７℃で一晩成長させた。１部の液体ドナー培養物を、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含有する１００部の新鮮ＬＢに３〜５時間接種し、その後、これをレシピエントメタン資化性株との交配に使用した。メタン資化性（レシピエント）株を、交配に先立ち、対数増殖期（約０．３のＯＤ６００）に達するまで、約４０ｍＬメタンを有する液体ＭＭ−Ｗ１培地（Ｐｉｅｊａら、２０１１、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ６２：５６４〜５７３）に１〜２日間接種した。
【０２１０】
レシピエントおよびドナー株をＯＤ６００比が１：１となる体積で（例えば、ＯＤ６００が０．３のメタン資化性菌５ｍＬおよびＯＤ６００が０．３のドナー５ｍＬ）調製することにより、二親交配を行った。次に、６０秒間１３．２ｋ  ｒｐｍの遠心分離によりこれらの細胞を収集した。上清を除去し、細胞ペレットを５００μＬ  ＭＭ−Ｗ１に穏やかに再懸濁した。大腸菌ドナー株に対し、遠心分離および再懸濁をさらに２回反復して、抗生物質の除去を確実にした。次に、レシピエントおよびドナー株の等体積の再懸濁した細胞を組み合わせ、穏やかなピペッティングにより混合した。交配組成物を６０秒間１３．２ｋ  ｒｐｍで遠心分離し、可能な限り上清を除去した。次に、細胞ペレットを穏やかに混合し、交配寒天（無菌０．５％酵母エキスを含有する完全ＭＭ−Ｗ１培地）上に単一の液滴として沈着させた。交配プレートを、メタンおよび空気（１：１比）を含有する密封チャンバー内で４８時間３７℃にてインキュベートした。４８時間のインキュベーション期間後に、１ｍＬ  ＭＭ−Ｗ１培地を交配プレートに添加し、懸濁した細胞を２ｍＬエッペンドルフチューブに移すことにより、該プレートの細胞を採取した。遠心分離により細胞をペレット化し、１００μＬ新鮮ＭＭ−Ｗ１に再懸濁し、その後、選択プレート（カナマイシン７．５μｇ／ｍＬを含有する完全ＭＭ−Ｗ１寒天培地）にプレーティングして、構築物を安定的に維持する細胞を選択した。プラスミド保有メタン資化性菌は、約１週間の４２℃インキュベーション後にこれらのプレート上に出現した。次に、４２℃の振盪インキュベーター内で、１：１メタン対空気比を含有する密封容器中の２．５ｍｌ液体培地（ＭＭＳ１）においてコロニーを成長させた。２４時間後、ＩＰＴＧを最終濃度５ｍＭとなるように添加して、標的遺伝子の発現を誘導した。指定の期間（培養条件に応じて、さらに４８または７２時間のいずれか）後に、実施例９に記載されている方法を使用して、アミノ酸産生に関して培養物をアッセイした。表６は、株の概要説明を示す。
【０２１１】
【表６−１】
2020103305.tif 000014
【表６−２】
2020103305.tif 000015
【０２１２】
表示遺伝子を異種性発現する株（strains  heterologously  expressly  the  indicated  genes）の細胞バイオマスサンプルにおいて検出される細胞関連Ｌ−リシンの濃度は、図２に描写されている。遺伝子型キー３４は、空のプラスミドコントロールである。バーは、各実験遺伝子型における８クローンの平均値を表す。遺伝子は全て、同じＳ９Ａファミリーペプチダーゼ（ＨｉｇｈＫ）タンパク質をコードしたが、それぞれ、変動するコドン使用に相当する異なる配列を有する。グラフは、表示遺伝子の発現が、様々な細胞関連Ｌ−リシン含有量をもたらすことを示す。遺伝子型キー１１２２が、コントロール（３４）と比べてこの値の増加を示さない一方、遺伝子型キー１１１５は、コントロールを上回る５３％の増加を示す。
【０２１３】
実施例６
Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈにおけるジヒドロピコリン酸シンターゼおよび貯蔵タンパク質のクローニングおよび共発現
【０２１４】
アミノ酸Ｌ−リシンを過剰産生するメタン資化性細菌株を作製するために、酵素、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡ）（配列番号１２１）のアミノ酸配列をコードする遺伝子およびリシン含有量が上昇したタンパク質（本明細書において、ＨｉｇｈＫ（配列番号１５２）と命名されるＳ９Ａファミリーペプチダーゼ）のアミノ酸配列をコードする数種類の遺伝子バリアントの１つを含有するメタン資化性菌発現ベクターを、接合交配によりＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈに導入した。エピソーム発現プラスミド（複製起点、転移起点、薬物抵抗性マーカー（カナマイシン）および多重クローニング部位をコードする配列を含有）を使用して、操作されたＩＰＴＧ誘導性（ＬａｃＩｑ）メタノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）プロモーターの下流に、ｄａｐＡ（配列番号１２１）およびＨｉｇｈＫポリヌクレオチド配列（配列番号１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３および１６５、それぞれ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈのための異なるコドン最適化された配列）をクローニングした。実験的遺伝子含有プラスミドまたは記載のプロモーター−遺伝子構築物がない「陰性コントロール」プラスミドのいずれかを有する接合能を有する大腸菌株（Ｓ−１７）のコロニー（ドナー株）を、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含有する液体ＬＢに接種し、３７℃で一晩成長させた。１部の液体ドナー培養物を、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含有する１００部の新鮮ＬＢに３〜５時間接種し、その後、これをレシピエントメタン資化性株との交配に使用した。メタン資化性（レシピエント）株を、交配に先立ち、対数増殖期（約０．３のＯＤ６００）に達するまで、約４０ｍＬメタンを有する液体ＭＭ−Ｗ１培地（Ｐｉｅｊａら、２０１１、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ６２：５６４〜５７３）に１〜２日間接種した。
【０２１５】
レシピエントおよびドナー株をＯＤ６００比が１：１となる体積で（例えば、ＯＤ６００が０．３のメタン資化性菌５ｍＬおよびＯＤ６００が０．３のドナー５ｍＬ）調製することにより、二親交配を行った。次に、６０秒間１３．２ｋ  ｒｐｍの遠心分離によりこれらの細胞を収集した。上清を除去し、細胞ペレットを５００μＬ  ＭＭ−Ｗ１に穏やかに再懸濁した。大腸菌ドナー株に対し、遠心分離および再懸濁をさらに２回反復して、抗生物質の除去を確実にした。次に、レシピエントおよびドナー株の等体積の再懸濁した細胞を組み合わせ、穏やかなピペッティングにより混合した。交配組成物を６０秒間１３．２ｋ  ｒｐｍで遠心分離し、可能な限り上清を除去した。次に、細胞ペレットを穏やかに混合し、交配寒天（無菌０．５％酵母エキスを含有する完全ＭＭ−Ｗ１培地）上に単一の液滴として沈着させた。交配プレートを、メタンおよび空気（１：１比）を含有する密封チャンバー内で４８時間３７℃にてインキュベートした。４８時間のインキュベーション期間後に、１ｍＬ  ＭＭ−Ｗ１培地を交配プレートに添加し、懸濁した細胞を２ｍＬエッペンドルフチューブに移すことにより、該プレートの細胞を採取した。遠心分離により細胞をペレット化し、１００μＬ新鮮ＭＭ−Ｗ１に再懸濁し、その後、選択プレート（カナマイシン７．５μｇ／ｍＬを含有する完全ＭＭ−Ｗ１寒天培地）にプレーティングして、構築物を安定的に維持する細胞を選択した。プラスミド保有メタン資化性菌は、約１週間の４２℃インキュベーション後にこれらのプレート上に出現した。次に、４２℃の振盪インキュベーター内で、１：１メタン対空気比を含有する密封容器中の２．５ｍｌ液体培地（ＭＭＳ１）においてコロニーを成長させた。２４時間後、ＩＰＴＧを最終濃度５ｍＭとなるように添加して、標的遺伝子の発現を誘導した。指定の期間（培養条件に応じて、さらに４８または７２時間のいずれか）後に、アミノ酸産生に関して培養物をアッセイした。表７は、株の概要説明を示す。
【０２１６】
【表７】
2020103305.tif 000016
【０２１７】
以下に記載する通り、結果を下表８ならびに図３および図４に記載する。
【０２１８】
【表８−１】
2020103305.tif 000017
【表８−２】
2020103305.tif 000018
【０２１９】
表示遺伝子を異種性発現する株の培養物においてアッセイした細胞関連Ｌ−リシンの濃度を、図３に描写する。グラフにおいて、遺伝子型キー１０６７は、同じプロモーター文脈において無関係の遺伝子（蛍光レポーター遺伝子）を発現するコントロールである。バーは、各実験遺伝子型の８クローンの平均値を表す。実験株（１１８６〜１１９３）は、ｄａｐＡと、ＨｉｇｈＫと命名されたＬ−リシンリッチタンパク質をコードする遺伝子の両方を含有する。ＨｉｇｈＫ遺伝子は全て、同じアミノ酸配列をコードするが、異なるコドン使用を有する。様々なコドン使用が、産生されるＨｉｇｈＫポリペプチドの量をモジュレートすることが予想される。グラフは、表示遺伝子の発現が、様々な細胞関連Ｌ−リシンをもたらすことを示す；遺伝子型キー１１８６が、コントロール（１０６７）と比べてこの値の１８％増加を示す一方、遺伝子型キー１１８８は、コントロール（１０６７）を上回る３６％増加を示す。
【０２２０】
表示遺伝子を異種性発現する株の培養上清サンプルにおいて検出される細胞外Ｌ−リシンの濃度を、図４に描写する。図３と同様に、遺伝子型キー１０６７は、同じプロモーター文脈において無関係の遺伝子（蛍光レポーター遺伝子）を発現するコントロールである。バーは、各実験遺伝子型の８クローンの平均値を表す。グラフは、表示遺伝子の発現が、クローンの各セットからの平均値に基づき、コントロール（遺伝子型キー１０６７）を上回る８〜２３倍の間の細胞外Ｌ−リシンの増加をもたらすことを示す。
【０２２１】
図３および図４に表される結果は、表示の外因性核酸配列の発現の結果として、細胞外および細胞関連Ｌ−リシンの産生増加を実証する。
【０２２２】
実施例７
Ｌ−リシンの産生のためのＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈにおけるアミノ酸生合成オペロン由来の遺伝子のクローニングおよび共発現
アミノ酸Ｌ−リシンを過剰産生するメタン資化性細菌株を作製するために、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈおよび／または大腸菌アミノ酸生合成経路由来の酵素のアミノ酸配列をコードする別個の遺伝子組合せ（「オペロン」）を含有する様々なメタン資化性菌発現ベクターを構築し、接合交配によりＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈに導入した。これらのオペロンは、次の遺伝子を含有した：
オペロンＡ：アスパラギン酸キナーゼＩ（ｔｈｒＡ；配列番号１３５）；ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡ；配列番号１２１）；ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ｌｙｓＡ；配列番号１２３）
オペロンＢ：アスパラギン酸キナーゼＩＩ（ｍｅｔＬ；配列番号１３７）；ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡ；配列番号１２１）；ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ｌｙｓＡ；配列番号１２３）
オペロンＣ：アスパラギン酸キナーゼＩＩＩ（ｌｙｓＣ；配列番号１３９）；ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｈｏｍ；配列番号１４１）；ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡ；配列番号１２１）；ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ｌｙｓＡ；配列番号１２３）
オペロンＤ：ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＡ；配列番号１４３）；Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリンスルフヒドリラーゼ（ｍｅｔＺ；配列番号１４５）；ホモシステイントランスメチラーゼ（ｍｅｔＥ；配列番号１４７）；メチオニンシンターゼ（ｍｅｔＨ；配列番号１４９）
オペロンＦ：アスパラギン酸キナーゼＩＩ（ｍｅｔＬ；配列番号１３７）；ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＡ；（配列番号１４３）；ホモシステイントランスメチラーゼ（ｍｅｔＥ；配列番号１４７）
オペロンＧ：アスパラギン酸キナーゼＩＩＩ（ｌｙｓＣ；配列番号１３９）；ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｈｏｍ；配列番号１４１）；ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＡ；配列番号１４３）；ホモシステイントランスメチラーゼ（ｍｅｔＥ；配列番号１４７）
【０２２３】
エピソーム発現プラスミド（複製起点、転移起点、薬物抵抗性マーカー（カナマイシン）および多重クローニング部位をコードする配列を含有）を使用して、操作されたＩＰＴＧ誘導性（ＬａｃＩｑ）メタノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）プロモーターの下流に、上で注記したオペロンのポリヌクレオチド配列をクローニングした。オペロン含有プラスミドまたは記載されているプロモーター−オペロン構築物がないプラスミドのいずれかを有する接合能を有する大腸菌株（Ｓ−１７）のコロニー（ドナー株）を、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含有する液体ＬＢに接種し、３７℃で一晩成長させた。１部の液体ドナー培養物を、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含有する１００部の新鮮ＬＢに３〜５時間接種し、その後、これをレシピエントメタン資化性株との交配に使用した。メタン資化性（レシピエント）株を、交配に先立ち、対数増殖期（約０．３のＯＤ６００）に達するまで、約４０ｍＬメタンを有する液体ＭＭ−Ｗ１培地（Ｐｉｅｊａら、２０１１、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ６２：５６４〜５７３）に１〜２日間接種した。
【０２２４】
レシピエントおよびドナー株をＯＤ６００比が１：１となる体積で（例えば、ＯＤ６００が０．３のメタン資化性菌５ｍＬおよびＯＤ６００が０．３のドナー５ｍＬ）調製することにより、二親交配を行った。次に、６０秒間１３．２ｋ  ｒｐｍの遠心分離によりこれらの細胞を収集した。上清を除去し、細胞ペレットを５００μＬ  ＭＭ−Ｗ１に穏やかに再懸濁した。Ｅ．ｃｏｌｉドナー株に対し、遠心分離および再懸濁をさらに２回反復して、抗生物質の除去を確実にした。次に、レシピエントおよびドナー株の等体積の再懸濁した細胞を組み合わせ、穏やかなピペッティングにより混合した。交配組成物を６０秒間１３．２ｋ  ｒｐｍで遠心分離し、可能な限り上清を除去した。次に、細胞ペレットを穏やかに混合し、交配寒天（無菌０．５％酵母エキスを含有する完全ＭＭ−Ｗ１培地）上に単一の液滴として沈着させた。交配プレートを、メタンおよび空気（１：１比）を含有する密封チャンバー内で４８時間３７℃にてインキュベートした。４８時間のインキュベーション期間後に、１ｍＬ  ＭＭ−Ｗ１培地を交配プレートに添加し、懸濁した細胞を２ｍＬエッペンドルフチューブに移すことにより、該プレートの細胞を採取した。遠心分離により細胞をペレット化し、１００μＬ新鮮ＭＭ−Ｗ１に再懸濁し、その後、選択プレート（カナマイシン７．５μｇ／ｍＬを含有する完全ＭＭ−Ｗ１寒天培地）にプレーティングして、構築物を安定的に維持する細胞を選択した。プラスミド保有メタン資化性菌は、約１週間の４２℃インキュベーション後にこれらのプレート上に出現した。次に、４２℃の振盪インキュベーター内で、１：１メタン対空気比を含有する密封容器中の２．５ｍｌ液体培地（ＭＭＳ１）においてコロニーを成長させた。２４時間後、ＩＰＴＧを最終濃度５ｍＭとなるように添加して、標的遺伝子の発現を誘導した。指定の期間（培養条件に応じて、さらに４８または７２時間のいずれか）後に、アミノ酸産生に関して培養物をアッセイした。
【０２２５】
表９の結果は、表示の外因性核酸配列の発現の結果としての細胞外Ｌ−リシンの産生増加を実証する。
【０２２６】
【表９】
2020103305.tif 000019
【０２２７】
表９における配列毎に、表示の配列を推定的に含有するクローンのセットの最高の検出アッセイ値を列挙する。リシン産生が増加したと組換え細胞を指定するための下限は、無変更コントロール（すなわち、陰性コントロール株）のアッセイ値よりも２倍高い細胞外リシン濃度に設定した。検査したクローンのセットが、異種性遺伝子の同じ組合せを推定的に含有した数例において、コントロールと比較した細胞外リシン濃度の増加は、観察されなかった。Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈの成長が、低濃度であっても細胞外アミノ酸によってマイナスに影響されることが実証され（Ｅｒｏｓｈｉｎ、Ｈａｒｗｏｏｄ
ａｎｄ  Ｐｉｒｔ、１９６８、Ｊ．ａｐｐｌ．Ｂａｃｔ．、３１、５６０〜５６７）、アミノ酸生合成の変更が、正常細胞成長に不利益となる可能性があることを示唆する。いかなる理論に制約されることも望まないが、天然のアミノ酸生合成活性の変更が、発現細胞において高い選択圧を誘導して、導入遺伝子を変異または他の仕方で不活性化すると考えられる。よって、閾値を上回る活性の欠如は、核酸配列における変異またはプラスミドの喪失を含む多数の因子（検出閾値を下回ると同定された数種類のクローンにおいて観察された）に起因し得、この場合は酵素機能の存在または非存在の決定的証拠を提供しない。
【０２２８】
実施例８
Ｌ−メチオニンの産生のためのＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈにおけるアミノ酸生合成オペロン由来の遺伝子のクローニングおよび共発現
アミノ酸Ｌ−メチオニンを過剰産生するメタン資化性細菌株を作製するために、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈおよび／または大腸菌アミノ酸生合成経路由来の酵素のアミノ酸配列をコードする４種の別個の遺伝子組合せ（「オペロン」）を含有する様々なメタン資化性菌発現ベクターを構築し、接合交配によりＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈに導入した。これらのオペロンは、次の遺伝子を含有した：
オペロンＢ：アスパラギン酸キナーゼＩＩ（ｍｅｔＬ；配列番号１３７）；ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡ；配列番号１２１）；ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ｌｙｓＡ；配列番号１２３）
オペロンＤ：ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＡ；配列番号１４３）；Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリンスルフヒドリラーゼ（ｍｅｔＺ；配列番号１４５）；ホモシステイントランスメチラーゼ（ｍｅｔＥ；配列番号１４７）；メチオニンシンターゼ（ｍｅｔＨ；配列番号１４９）
オペロンＦ：アスパラギン酸キナーゼＩＩ（ｍｅｔＬ；配列番号１３７）；ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＡ；配列番号１４３）；ホモシステイントランスメチラーゼ（ｍｅｔＥ；配列番号１４７）
オペロンＧ：アスパラギン酸キナーゼＩＩＩ（ｌｙｓＣ；配列番号１３９）；ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｈｏｍ；配列番号１４１）；ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＡ；配列番号１４３）；ホモシステイントランスメチラーゼ（ｍｅｔＥ；配列番号１４７）
【０２２９】
エピソーム発現プラスミド（複製起点、転移起点、薬物抵抗性マーカー（カナマイシン）および多重クローニング部位をコードする配列を含有）を使用して、操作されたＩＰＴＧ誘導性（ＬａｃＩｑ）メタノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）プロモーターの下流に、これらのオペロン（上記を参照）のポリヌクレオチド配列をクローニングした。オペロン含有プラスミドまたは記載されているプロモーター−オペロン構築物がないプラスミドのいずれかを有する接合能を有する大腸菌株（Ｓ−１７）のコロニー（ドナー株）を、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含有する液体ＬＢに接種し、３７℃で一晩成長させた。１部の液体ドナー培養物を、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含有する１００部の新鮮ＬＢに３〜５時間接種し、その後、これをレシピエントメタン資化性株との交配に使用した。メタン資化性（レシピエント）株を、交配に先立ち、対数増殖期（約０．３のＯＤ６００）に達するまで、約４０ｍＬメタンを有する液体ＭＭ−Ｗ１培地（Ｐｉｅｊａら、２０１１、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ６２：５６４〜５７３）に１〜２日間接種した。
【０２３０】
レシピエントおよびドナー株をＯＤ６００比が１：１となる体積で（例えば、ＯＤ６００が０．３のメタン資化性菌５ｍＬおよびＯＤ６００が０．３のドナー５ｍＬ）調製することにより、二親交配を行った。次に、６０秒間１３．２ｋ  ｒｐｍの遠心分離によりこれらの細胞を収集した。上清を除去し、細胞ペレットを５００μＬ  ＭＭ−Ｗ１に穏やかに再懸濁した。Ｅ．ｃｏｌｉドナー株に対し、遠心分離および再懸濁をさらに２回反復して、抗生物質の除去を確実にした。次に、レシピエントおよびドナー株の等体積の再懸濁した細胞を組み合わせ、穏やかなピペッティングにより混合した。交配組成物を６０秒間１３．２ｋ  ｒｐｍで遠心分離し、可能な限り上清を除去した。次に、細胞ペレットを穏やかに混合し、交配寒天（無菌０．５％酵母エキスを含有する完全ＭＭ−Ｗ１培地）上に単一の液滴として沈着させた。交配プレートを、メタンおよび空気（１：１比）を含有する密封チャンバー内で４８時間３７℃にてインキュベートした。４８時間のインキュベーション期間後に、１ｍＬ  ＭＭ−Ｗ１培地を交配プレートに添加し、懸濁した細胞を２ｍＬエッペンドルフチューブに移すことにより、該プレートの細胞を採取した。遠心分離により細胞をペレット化し、１００μＬ新鮮ＭＭ−Ｗ１に再懸濁し、その後、選択プレート（カナマイシン７．５μｇ／ｍＬを含有する完全ＭＭ−Ｗ１寒天培地）にプレーティングして、構築物を安定的に維持する細胞を選択した。プラスミド保有メタン資化性菌は、約１週間の４２℃インキュベーション後にこれらのプレート上に出現した。次に、４２℃の振盪インキュベーター内で、１：１メタン対空気比を含有する密封容器中の２．５ｍｌ液体培地（ＭＭＳ１）においてコロニーを成長させた。２４時間後、ＩＰＴＧを最終濃度５ｍＭとなるように添加して、標的遺伝子の発現を誘導した。指定の期間（培養条件に応じて、さらに４８または７２時間のいずれか）後に、アミノ酸産生に関して培養物をアッセイした。
【０２３１】
表１０に表される結果は、表示の外因性核酸配列の発現の結果としての細胞外Ｌ−メチオニンの産生増加を実証する。
【０２３２】
【表１０】
2020103305.tif 000020
【０２３３】
表１０における配列毎に、表示の配列を推定的に含有するクローンのセットの最高の検出アッセイ値を列挙する。Ｌ−メチオニン産生が増加したと組換え細胞を指定するための下限は、無変更コントロール（すなわち、陰性コントロール株）のアッセイ値よりも２倍高い細胞外リシン濃度に設定した。検査したクローンのセットが、異種性遺伝子の同じ組合せを推定的に含有した数例において、コントロールと比べた細胞外リシン濃度の増加は、観察されなかった。Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈの成長が、低濃度であっても細胞外アミノ酸によってマイナスに影響されることが実証され（Ｅｒｏｓｈｉｎ、Ｈａｒｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｐｉｒｔ、１９６８、Ｊ．ａｐｐｌ．Ｂａｃｔ．、３１、５６０〜５６７）、アミノ酸生合成の変更が、正常細胞成長に不利益となる可能性があることを示唆する。いかなる理論に制約されることも望まないが、天然のアミノ酸生合成活性の変更が、発現細胞において高い選択圧を誘導して、導入遺伝子を変異または他の仕方で不活性化すると考えられる。よって、閾値を上回る活性の欠如は、核酸配列における変異またはプラスミドの喪失を含む多数の因子（検出閾値を下回ると同定された数種類のクローンにおいて観察された）に起因し得、この場合は酵素機能の存在または非存在の決定的証拠を提供しない。
【０２３４】
実施例９
Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＢａｔｈによるＬ−リシンおよびＬ−メチオニンの産生のアッセイ
【０２３５】
ＩＰＴＧ誘導性（ＬａｃＩｑ）プロモーター−ｄａｐＡ構築物を有するベクターまたはかかる構築物がないベクターのいずれかを含有するＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株由来の培養サンプル（両者共に５ｍＭ  ＩＰＴＧの存在下で成長させた）を得た。これらのサンプルを１．５分間１３．２ｋ  ｒｐｍで遠心分離し、アミノ酸産生に関して上清および細胞ペレットの両方をアッセイした。クロロギ酸メチルによる誘導体化後にＧＣ−ＭＳにより無細胞上清を解析した（参考文献、Ｓｕｅら）。バイオマスにおけるアミノ酸組成を評価するため、細胞ペレットを先ず連続的に撹拌しながら６Ｎ  ＨＣｌにおいて２４時間１００℃で消化し、続いて中和、クロロギ酸メチルによる誘導体化およびその後のＧＣ−ＭＳ解析を行った。Ａｇｉｌｅｎｔ  ６８９０／５９７２  ＧＣ−ＭＳシステムを使用して、定量的解析を行う。ＧＣは、０．２５ｍｍ×３０ｍ×０．２５μｍ寸法（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｉｔｙ）のＨＰ−５ＭＳキャピラリーカラムを備え、１ｍＬ／ｍｉｎの流速でヘリウムキャリアガスを受け取る。オーブン温度プログラムは、５５℃３分間から始まり、２０℃／ｍｉｎの速度で３２５℃まで徐々に上昇させ、２分間保持する。Ｈａｍｉｌｔｏｎ  １０μＬオートサンプラーシリンジを使用して、１μＬサンプルを注入する。サンプル入口は、２５０℃に保持され、１５：１の分割比を有し、グラスウールを充填したＲｅｓｔｅｋ  Ｓｋｙ高精度低圧ドロップインレットライナーで裏打ちされている。
【０２３６】
Ｌ−リシン誘導体は、１１．５１分でカラムから溶出し、１４２ｍ／ｚ特徴的イオンを使用して定量される。化合物同定は、標的イオンと比べて、８８ｍ／ｚおよび２６％存在量で修飾子（ｑｕａｌｉｆｉｅｒ）イオンをモニターすることにより検証される。脱イオン水中Ｌ−リシン二塩酸塩から較正標準を調製した。１／ｘ２加重線形回帰を使用して、Ｌ−リシンの較正曲線を適合させる。
【０２３７】
Ｌ−メチオニン誘導体は、９．９５４分でカラムから溶出し、６１ｍ／ｚ特徴的イオンを使用して定量される。化合物同定は、１１５ｍ／ｚ（５２％相対的存在量）および１４７ｍ／ｚ（３４％相対的存在量）で修飾子イオンをモニターすることにより検証される。脱イオン水中純粋メチオニンから較正標準を調製した。１／ｘ２加重線形回帰を使用して、Ｌ−メチオニンの較正曲線を適合させる。
【０２３８】
実施例１０
Ｃ１代謝微生物に由来するバイオマスおよび生成物における安定炭素同位体分布
【０２３９】
上昇したレベルのアミノ酸、特にＬ−リシンを産生することを示した（実施例１）Ｍ．ｃａｐｓｕｌｔｕｓ  Ｂａｔｈの操作株由来のメタン由来のバイオマスを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｄｅｌｔａ  ＩＲＭＳにカップルしたＣｏｓｔｅｃｈ元素分析計を使用した元素分析計／連続フロー型同位体比質量分析（ＩＲＭＳ）により、炭素（１３Ｃ）安定同位体比に関して解析した。血清ボトルにおいて培養したメタン資化性バイオマスのサンプルを遠心分離し、脱イオン水で１回洗浄し、脱イオン水に再懸濁し、０．２〜２ｍｇ炭素（約０．５〜５ｍｇ乾燥細胞重量）に相当する体積を、５×９ｍｍスズカプセル（Ｃｏｓｔｅｃｈ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）に移し、８０℃で少なくとも６０時間乾燥させた。コントロールとして、野生型Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈおよび蛍光タンパク質コード核酸配列を発現する操作Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株のサンプルを並行して培養し、洗浄し、脱イオン水に再懸濁し、５×９ｍｍスズカプセルに移し、８０℃で少なくとも６０時間乾燥させた。ＩＲＭＳ検出ウィンドウ内でほぼ１００〜１０，０００ｍＶの応答をもたらす、サンプルの信頼できるδ１３Ｃ値を得る。解析したバイオマスサンプルのＩＲＭＳ応答範囲は、３１９５〜８８２７ｍＶに及んだ。各サンプルを２重で解析し、平均炭素（１３Ｃ）安定同位体比を表１１に報告する。
【０２４０】
同位体比は、「δ」記号（‰）で表し、ここで、百万分の一（ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ）偏差方式での、標準の同位体組成と比較した材料の同位体組成は、δ１３Ｃ＝（Ｒサンプル／Ｒ標準−１）×１，０００（式中、Ｒは、重い同位体型（１３Ｃ）対軽い同位体型（１２Ｃ）の分子比である）で与えられる。炭素の標準は、ウィーンピーディーベレムナイト（Ｖｉｅｎｎａ  Ｐｅｅ  Ｄｅｅ  Ｂｅｌｅｍｎｉｔｅ；Ｖ−ＰＤＢ）である。同位体解析は、厳密な分析過程の管理（ｃｈａｉｎ  ｏｆ  ｃｕｓｔｏｄｙ）および品質管理（ＩＳＯ／ＩＥＣ  １７０２５：２００５  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ；ＰＪＬＡ証明書＃５９４２３）下で、Ｂｅｔａ  Ａｎａｌｙｔｉｃ  Ｉｎｃ．（Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）により行われた。ＮＩＳＴ−８５４１（グラファイト：−１５．９０＋／−０．２５‰）およびＮＩＳＴ−８５４２（スクロース：−１０．４７＋／−０．１３‰）に対しＩＲＭＳを較正した。これらのＮＩＳＴ標準に対し較正された作業標準（アセトアニリド：−３３．４＋／−０．３‰）を、未知物質の測定の前後両方でランした。ブランク補正後に、この二次標準のために測定した値は、−３３．２２‰および−３３．２２‰であった。次に、結果を０．２‰調整して、正規化を行って、一次ＮＩＳＴ参照に対し結果を系統分類した。＋／−０．３‰（絶対的）の保存的誤差を結果に割り当て、判定保留（ｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）誤差を説明する。検出器における再現性は、製造業者によって０．０２‰以内であると引用されるが、個々のランの間の偏差は、０．３〜０．５‰の間に変動し得、したがって、Ｂｅｔａ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．は、少数第２位ではなく第１位までの結果を引用し、＋／−０．３‰の絶対的誤差を割り当てる。
【０２４１】
ｄａｐＡまたは緑色蛍光タンパク質コード核酸の誘導性発現のために構築された別々のＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株（表１１を参照）を、５０ｕｇ／ｍＬカナマイシンで修正した１１０ｍＬの限定培地ＭＭＳ１．０を含有する０．５Ｌ血清ボトル中のメタンで成長させた。カナマイシンは、野生型Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈの培養に使用した培地では省略した。メタンおよび空気のおよそ１：１（ｖ／ｖ）混合物を（例えば、７５ｍＬ空気を含有するヘッドスペースへの６０ｍＬメタン）供給された同じ培地において成長させた２５ｍＬ血清ボトルバッチ培養物から、株を接種した。培地ＭＭＳ１．０の組成を次の通りであった：０．８ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３０ｍＭ  ＮａＮＯ３、０．１４ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２．３５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、３．４ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、２０．７μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、６μＭ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１０μＭ  ＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡおよび１リットル当たり１ｍＬの微量金属溶液（１Ｌ当たり：５００ｍｇ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４００ｍｇ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｍｇ  ＭｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１５ｍｇ  Ｈ３ＢＯ３、２５０ｍｇ  ＥＤＴＡを含有）。リン酸塩、炭酸水素塩およびＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡは、培地をオートクレーブして冷却した後に添加した。培地の最終ｐＨは、７．０±０．１であった。血清ボトルにおける１１０ｍＬ体積の培養物を接種して、初期ＯＤ６００を０．１とし、ゴムスリーブストッパーで密封し、無菌０．４５μｍフィルターおよび無菌２７Ｇ針を通してシリンジにより添加した１２０ｍＬメタンガス（９９％純度；グレード２．０、Ｐｒａｘａｉｒ；Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｇａｓ、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡにより供給）を注入した。培養物を、２５０ｒｐｍで回転振盪しつつ４２℃で垂直にインキュベートし、１ｍＬサンプルを取り出してＯＤ６００を決定することにより、成長を測定した。培養物が、少なくとも０．６のＯＤ６００に達したら、ボトルを通気し、ヘッドスペースを６０ｍＬのメタンおよび１２０ｍＬの濃縮酸素（少なくとも８５％純度）に置き換えた。８〜１２時間毎にこの様式でヘッドスペースを置き換えた。１．６のＯＤ６００に達したら（およそ４８時間の成長）、最終濃度５ｍＭとなる濾過滅菌したＩＰＴＧの添加により、全培養物を誘導して、標的遺伝子生成物の過剰発現を開始させた。ヘッドスペースガスを上で注記した通りに置き換えて、培養物をさらに４８時間成長させた。最終バイオマスサンプルを遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）により採取し、上記のとおり１３Ｃ安定同位体解析のために調製した。
【０２４２】
表１１は、ｄａｐＡを過剰発現してＬ−リシン産生を増加させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈの操作株（遺伝子型ＩＤ  １０５７）ならびにＤａｓｈｅｒ蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現するコントロール株（遺伝子型ＩＤ  １０６７）および野生型親株についての安定炭素同位体分布（δ１３Ｃ値）の概要を示す。結果は、δ１３Ｃ値が高度に負であることを示し、アミノ酸、蛍光タンパク質の過剰発現のために操作した株およびＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈの野生型株からのメタン由来のバイオマスおよび生成物における１２Ｃの高富化を示す。
【０２４３】
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【０２４４】
上記の種々の実施形態を組み合わせてさらなる実施形態を得ることができる。本明細書中で言及されており、そして／または出願データシートに列挙されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物（２０１４年１月１６日に出願された米国仮出願第６１／９２８，４０１号が含まれるが、これに限定されない）の全ては、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０２４５】
一般に、以下の特許請求の範囲では、使用した用語は、明細書および特許請求の範囲中に開示した特定の実施形態に特許請求の範囲を制限すると解釈すべきでないが、特許請求の範囲は、かかる特許請求の範囲が権利を付与される均等物の全範囲と共に全ての可能な実施形態を含むと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は、開示により制限されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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