(57)【要約】      （修正有）【課題】合成代謝弁を用いた迅速かつ動的なフラックス制御のための組成物及び方法を提供する。【解決手段】遺伝子修飾された微生物は、生成物の生産のための少なくとも１つの酵素を含む生産経路と、（ｉ）遺伝子修飾された微生物の成長に不可欠な第１の酵素をコードする遺伝子の遺伝子発現の制御されたサイレシング、又は（ｉｉ）前記遺伝子修飾された微生物の成長に不可欠な第２の酵素のタンパク質分解によって特性決定された少なくとも１つの合成代謝弁と、を備え、ＧＭＯが成長している成長培地からの制限栄養因子の枯渇は、固定又は非分裂細胞状態を誘導し、前記微生物の前記合成代謝弁（ＳＭＶ）は、条件付きでトリガされる。【選択図】図１
2020103304.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生成物の生産のための少なくとも１つの酵素を含む生産経路と、
（ｉ）遺伝子修飾された微生物の成長に不可欠な第１の酵素をコードする遺伝子の遺伝子発現の制御されたサイレシング、又は（ｉｉ）前記遺伝子修飾された微生物の成長に不可欠な第２の酵素のタンパク質分解によって特性決定された少なくとも１つの合成代謝弁と、を備え、
前記ＧＭＯが成長している成長培地からの制限栄養因子の枯渇は、固定又は非分裂細胞状態を誘導し、
前記微生物の前記合成代謝弁（ＳＭＶ）は、条件付きでトリガされる、
遺伝子修飾された微生物。
【請求項２】
前記遺伝子修飾された微生物は、産物産生経路の異種酵素を発現することができ、前記異種酵素の前記発現は、条件付きであり、及び／又は前記ＳＭＶの前記条件付きトリガで調整される、
請求項１に記載の遺伝子修飾された微生物。
【請求項３】
前記異種酵素は、
酢酸キナーゼ、
耐酸素性エタノールデヒドロゲナーゼ、
アセトアセチル‐ＣｏＡチオラーゼ、クロトナーゼ、クロトニル‐ＣｏＡリダクターゼ、酪酸ホスホトランスフェラーゼ、酪酸キナーゼ、又はそれらの組み合わせ、
ケトアセチル‐ＣｏＡシンターゼ、３‐ヒドロキシアシル‐ＣｏＡデヒドラターゼ、エノイル‐ＣｏＡリダクターゼ、アシル‐ＣｏＡチオエステラーゼ、又はそれらの組み合わせ、
ケトアセチル‐ＣｏＡシンターゼ、３‐ヒドロキシアシル‐ＣｏＡデヒドラターゼ、エノイル‐ＣｏＡリダクターゼ、アシル‐ＣｏＡワックスエステルシンターゼ、又はそれらの組み合わせ、
ケトアシル‐ＣｏＡチオラーゼ、３‐ヒドロキシアシル‐ＣｏＡデヒドラターゼ、エノイル‐ＣｏＡリダクターゼ、アシル‐ＣｏＡチオエステラーゼ、又はそれらの組み合わせ、
ケトアセチル‐ＣｏＡシンターゼ、３‐ヒドロキシアシル‐ＣｏＡデヒドラターゼ、エノイル‐ＣｏＡリダクターゼ、脂肪アシル‐ＣｏＡリダクターゼ、脂肪アルデヒドリダクターゼ、又はそれらの組み合わせ、
アセトアセチル‐ＣｏＡチオラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル‐ＣｏＡシンターゼ、ヒドロキシメチルグルタリル‐ＣｏＡリダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ジホスフェートデカルボキシラーゼ、イソペンテニル‐ジホスフェートイソメラーゼ、イソプレンシンターゼ、又はそれらの組み合わせ、
ストレプトマイセス・セリカラーのｒｐｐＡ、
クロロフレクサス・アウランティカスのｍｃｒ遺伝子の断片及び大腸菌のｙｄｆＧ遺伝子、
シュードモナス・フルヴァのイソブチリル‐ＣｏＡチオエステラーゼの突然変異体、
バチルス・スブティリスのアラニンデヒドロゲナーゼ、
エンテロコッカス・フェカリス由来のｍｖａＥ遺伝子及びエンテロコッカス・フェカリス由来のｍｖａＳ遺伝子、又は、
エンテロバクター・クロアカエ亜種ディスソルベンス由来のｂｕｄＡ、ｂｕｄＢ、及びｂｕｄＣ遺伝子、からなる群から選択される、
請求項２に記載の遺伝子修飾された微生物。
【請求項４】
前記生産経路は、アセチル‐ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の発現の増大と生産経路の酵素の発現の増大の両方を含む、
請求項１に記載の遺伝子修飾された微生物。
【請求項５】
前記遺伝子修飾された微生物の成長に不可欠な前記第１の酵素及び前記第２の酵素は、エノイル‐ＡＣＰリダクターゼ（ｆａｂＩ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、可溶性トランスヒドロゲナーゼ（ｕｄｈＡ）、グルコース‐６‐リン酸‐１‐デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、リポアミドデヒドロゲナーゼ（ｌｐｄ）、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、
請求項１に記載の遺伝子修飾された微生物。
【請求項６】
前記遺伝子修飾された微生物の成長に不可欠な前記第１の酵素及び前記第２の酵素は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）、サクシニル‐ＣｏＡシンテターゼ（ｓｕｃＤ）、イソクエン酸リアーゼ（ａｃｅＡ）、ＡＴＰ依存性６‐ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋＡ）、ＡＴＰ依存性Ｌｏｎプロテアーゼ（ｌｏｎ）、シグマ因子シグマ−３８（ｒｐｏＳ）、トランスケトラーゼ１（ｔｋｔＡ）、トランスケトラーゼ２（ｔｋｔＢ）、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、
請求項１に記載の遺伝子修飾された微生物。
【請求項７】
前記合成代謝弁は、
（ｉ）前記遺伝子修飾された微生物の成長に不可欠な酵素の複数の遺伝子をターゲッティングするのに特異的な複数の小さなガイドＲＮＡをコードする遺伝子と、
（ｉｉ）Ｃａｓ９をコードする遺伝子、又はｄＣＡＳ９をコードする遺伝子と、
（ｉｉｉ）タンパク質分解酵素増強因子ｓｓｐＢをコードする遺伝子と、を含む、
請求項１に記載の遺伝子修飾された微生物。
【請求項８】
前記生産経路は、アルコール、ジオール、ポリオール、有機酸、アミノ酸、脂肪酸、脂肪酸誘導体、エステル、アルカン、アルケン、及び、イソプレノイドからなる群から選択される、
請求項１に記載の遺伝子修飾された微生物。
【請求項９】
前記成長培地の制限栄養因子は、リン酸塩、窒素、硫黄、及びマグネシウム、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される栄養素である、
請求項１に記載の遺伝子修飾された微生物。
【請求項１０】
前記遺伝子修飾された微生物は、前記遺伝子修飾された微生物に自然発生する遺伝子の破壊又は欠失と、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）、ピルビン酸‐ギ酸リアーゼ（ｐｆｌＢ）、メチルグリオキサールシンターゼ（ｍｇｓＡ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）、ｃｌｐＸＰプロテーゼ特異性増強因子（ｓｓｐＢ）、ＡＴＰ依存性Ｌｏｎプロテアーゼ（ｌｏｎ）、外膜プロテアーゼ（ｏｍｐＴ）、ａｒｃＡ転写二重調節因子（ａｒｃＡ）、ｉｃｌＲ転写調節因子（ｉｃｌＲ）、及びそれらの任意の組み合わせをコードする遺伝子からなる群から選択された遺伝子の破壊又は欠失と、を含む、
請求項１に記載の遺伝子修飾された微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代謝に関して設計された細菌及び／又は真菌株等の微生物、並びにこれらの株を利用するバイオプロセスに関する。これらの株は、代謝経路の動的制御を可能とする。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年６月１１日出願の米国仮特許出願第６１／０１０，５７４号の利益を主張するものであり、上記仮特許出願の全内容は、参照により本出願に援用される。
【０００３】
連邦政府資金による研究又は開発
本発明は、米国科学財団によって与えられた連邦政府補助金Ｎｏ．ＭＣＢ‐１４４５７２６、及び米国国防総省の国防高等研究計画局によって与えられた連邦契約Ｎｏ．ＨＲ００１１‐１４‐Ｃ‐００７５の下で、政府支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００４】
電子提出された文献の参照による援用
本出願は配列表を含む。上記配列表は、「ＯＬＧ  Ｒｅｆ  ２１０‐４４＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というタイトルのＡＳＣＩＩテキストファイルとして、ＥＦＳ‐Ｗｅｂによって電子提出されている。上記配列表のサイズは１８４，３５２バイトであり、２０１５年６月１１日に作成された。上記配列表はその全体が参照により本出願に援用される。
【背景技術】
【０００５】
石油は、我々が使用する燃料だけでなく、我々が消費する化学物質の大半の、主要な原料である。化学産業はこの非再生可能リソースに大いに依存している。石油を再生可能原料で置換することにより、長期実現性及び環境持続可能性が保証される。化学物質を作製するための新規の発酵系プロセスは、これに貢献する技術であり、再生可能原料への変化を可能とする（非特許文献１、２）。発酵科学、合成生物学、並びに代謝及び酵素設計の分野における技術的発展により、これらの発酵プロセスは近年急速に進歩している（非特許文献３、４）。これらの有意な進歩にもかかわらず、理論的根拠が指向する設計アプローチのほとんどの成功例もまた、相当な回数の試行錯誤サイクルに大きく依存している。代謝設計の分野は、インビボの複雑な生物系の挙動を、簡略化されたモデル及び基本的なインビトロ生化学的原理から推察するという点で、歴史的に制限されている。このような推論によるアプローチは、多くの場合は不完全なものである微生物生理学の先験的知識を大量に必要とする。これは、関連しないと思われる多くの遺伝子産物の活性間の複雑なバランスを必要とする、複雑な表現型に関して特に当てはまる。多くの場合、恐らく十分に特性決定される産生経路を生体宿主に組み込んで、バイオマス成長及び産生の両方の複雑な要件のバランスを取ることは、予想されるよりもはるかに困難であることが分かっている。
【０００６】
１つの解決策は、産物形成から成長を切り離すことができる合成代謝弁（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｖａｌｖｅ：ＳＭＶ）を利用した、プラットフォーム微生物株の開発である。これらの株は、変化した場合に微生物成長に対して悪影響を及ぼすものを含む代謝経路の動的制御を可能とする。代謝に対する動的制御は、転写サイレンシング及び制御下酵素タンパク質分解を含むがこれらに限定されない方法論の組み合わせによって達成される。これらの微生物株は、少なくとも２つの段階を内包する多段バイオプロセスにおいて利用され、上記少なくとも２つの段階とは：微生物を成長させ、微生物成長のために代謝を最適化できる第１の段階；及び成長を遅らせるか又は停止させることができ、化学物質又は燃料といった所望の産物の産生を改善するために代謝に対して動的変更を実施できる、少なくとも１つの他の段階である。成長する培養物の複数の段階間での遷移、及び代謝フラックスの操作は、人工的な化学誘導物質によって、又は好ましくは主要な制限栄養因子のレベルを制御することによって、制御できる。更に、１つ又は複数の化学物質又は燃料産物の生合成のための代謝経路を提供するために、遺伝子修飾を実施してよい。また、グルコース、スクロース、キシロース、アラビノース、マンノース及びラクトースといった糖類；油；二酸化炭素；一酸化炭素；メタン；メタノール；並びにホルムアルデヒドを含むがこれらに限定されない、多様な炭素原料の利用を可能とするために、遺伝子修飾を実施してよい。
【０００７】
このアプローチにより、産生相中の代謝フラックス及び生理学的要求のより簡潔なモデルを可能とし、成長細胞を固定相の生体触媒に変化させる。これらの合成代謝弁を使用して、必須遺伝子をオフにして、炭素、電子及びエネルギ束を、多段発酵プロセスでの産物形成へとリダイレクトできる。これらの合成弁は、以下のうちの１つ又は複数によって実現できる：固定又は非分割細胞状態を誘導するための２）誘導性酵素分解及び３）栄養制限と組み合わせた、１）転写遺伝子サイレンシング又は抑制技術。ＳＭＶは、いずれの経路及び微生物宿主に一般化できる。これらの合成代謝弁により、再生可能化学物質及び燃料並びに全細胞触媒作用によって産生できるいずれの産物の産生のために有用な、新規の迅速な代謝設計戦略が可能となる。
【０００８】
合成代謝弁を用いた、簡略化された２段バイオプロセスが図１に示されており、株は、無機リン酸塩等の、単一の制限栄養因子を有する最小の培地内で成長する。この成長相中、細胞はバイオマス以外のいずれの産物も産生せず、結果として、産物形成の発生し得るいずれの有毒な又は望ましくない副作用に晒されることがない。バイオマス成長及び収率を最適化できる。制限栄養因子が枯渇すると、細胞成長は停止する。同時にこれらの株は、合成代謝弁を含むように設計されることになり、上記合成代謝弁は、成長のために必須である遺伝子及び酵素をサイレンシングし、炭素、電子及びエネルギを、関心対象となるいずれの分子へとリダイレクトする。このプロセスは、２段産生と、同時の代謝設計戦略との新規の組み合わせを利用する。
【０００９】
図１において説明されているものと同様の２段プロセスを使用及び規模拡大するための、生物科学産業における重要な先例が存在する。多くの同様のプロセスが、タンパク質の異種発現のために慣用的に使用される。これらの標準的なプロセスでは、細胞は、タンパク質合成のための産生可能又は「準備刺激（ｐｒｉｍｅｄ）」状態（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の対数期中期等）へと成長した後、異種タンパク質を発現するよう誘導される。多くの場合、細胞アミノ酸及びエネルギの、異種タンパク質への転換は、細胞成長が停止していない場合は細胞成長に大きく影響する。小分子の産生を代謝的に設計するための、歴史的に最も成功した努力は、産物形成を成長と結びつけるための嫌気性代謝の力を活用するものであったため、上述のタイプのプロセスが、小分子の生物的産生のために開発されていなかったことは驚くべきことではない。
【００１０】
嫌気性成長に結びついた産物形成により、より優れた産生因子を識別するための、強力な成長に基づく選択の利用が可能となる。細胞が迅速に成長すればするほど、これらの細胞はより多くの産物を生成する。これにより、エタノール及びイソブタノールといった多くの天然産物のための、産業用の株の従来の選択が可能となる。しかしながら、嫌気性産生のための要件により、合成生物学を用いて生成できる異なる分子又は産物の数及び多様性が大幅に制限される。多数の産物が、熱力学的に実現可能な代謝経路を得るために必要なエネルギ及び補助因子を嫌気性代謝が供給することを必要とする。このような場合、包括的かつロバストな嫌気性産生プラットフォームにより、多様な多数の産物の最適化及び規模拡大が大幅に簡略化される。合成代謝弁によって実現可能な制御下多段プロセスにより、このようなプラットフォームが提供される。
【００１１】
合成代謝弁により、合成生物学者及び代謝設計者は、産物形成に関する複雑な代謝的及び熱力学的要求から、成長に関する複雑な代謝的及び熱力学的要求を切り離すことができる。このように切り離すことによって、産物形成を阻害し得る、成長に基づく調節機構を取り除くこともでき、また産生を損ねる又は阻害する場合がある重要な代謝経路のサイレンシングを可能とすることもできる。これらの重要な阻害性代謝経路としては、アミノ酸生合成又はクエン酸サイクル、及び多くの二次代謝産物の生合成、並びに細胞間酸化還元及びエネルギ平衡の維持に関わる経路が挙げられる。これらの経路は従来、これらを操作しようとする試みは成長の欠陥につながるため、多くの代謝設計戦略にとって触れてはならないものであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ウェアピー及びピーターソン（Ｗｅｒｐｙ  ＆Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）著「バイオマスからの高付加価値化学物質  １巻‐糖類及び合成ガスからの潜在的候補のスクリーニングの結果（Ｔｏｐ  Ｖａｌｕｅ  Ａｄｄｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ  ‐  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｕｇａｒｓ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｇａｓ）」
【非特許文献２】イイシャンら（Ｙｉｘｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）著「再生可能農業バイオマスの「グリーン」化学物質‐ミニレビュー（Ｇｒｅｅｎ“Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｍａｓｓ‐Ａ  Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖｉｅｗ）」  オープン  アグリカルチャ  ジャーナル）Ｔｈｅ  Ｏｐｅｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ）、２００８年
【非特許文献３】ジャーボー、Ｌ．Ｒら（Ｊａｒｂｏｅ，  Ｌ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．）「生物学的再生可能燃料及び化学物質の産生のための代謝設計：合成生物学の寄与（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｒｅｎｅｗａｂｌｅ  ｆｕｅｌｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ：  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ）」  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２０１０年
【非特許文献４】リー、Ｊ．Ｗら（Ｌｅｅ，  Ｊ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．）「天然及び非天然化学物質のための微生物の代謝設計システム（Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｎｏｎ‐ｎａｔｕｒａｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，  ２０１２年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一実施形態によると、本発明は、制御可能な合成代謝弁を構築するための方法を対象とする。これらの実施形態のうちの特定のものにおいて、合成代謝弁は、１つ又は複数の代謝経路を通したフラックスを制御下で削減又は排除ために使用される。更なる実施形態では、所与の環境における微生物成長に必須の酵素を有する１つ又は複数の代謝経路を通したフラックスを削減又は排除する。他の実施形態では、本発明は、１つ又は複数の合成代謝弁を利用することによって、代謝経路を動的に制御できる、遺伝子修飾された微生物に関する。本発明の他の実施形態は、動的フラックス制御を可能とする１つ又は複数の合成代謝弁を利用する遺伝子修飾された微生物を利用した、多段バイオプロセスを対象とする。本発明の更に他の実施形態では、遺伝子修飾された微生物を用いた多段バイオプロセスにおける段階と段階との間の遷移は、化学誘導物質の添加によって、又は主要栄養因子レベルの制御によって、制御される。微生物に更なる遺伝子修飾を加えることによって、化学物質又は燃料産物への炭素原料の変換を可能とすることができる。特定の実施形態では、炭素原料としては、限定するものではないが、グルコース、スクロース、キシロース、アラビノース、マンノース、ラクトースといった糖類、あるいは二酸化炭素、一酸化炭素、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド又は油が挙げられる。更に、様々な炭素原料から化学物質又は燃料産物を産生するための遺伝子修飾としては、限定するものではないが、中心代謝産物アセチル‐ＣｏＡ、マロニル‐ＣｏＡ、ピルビン酸塩、オキサロ酢酸塩、エリスロース‐４‐リン酸塩、キシルロース‐５‐リン酸塩、α‐ケトグルタル酸塩及びクエン酸塩を利用した代謝経路が挙げられる。これらの中心代謝産物から得ることができる産物としては、酢酸、アルコール（エタノール、ブタノール、ヘキサノール及び更に長鎖のｎ‐アルコール）、有機酸（３‐ヒドロキシプロピオン酸、乳酸、イタコン酸）、アミノ酸（アラニン、セリン、バリン）、脂肪酸及びその誘導体（脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）、脂肪アルデヒド、アルケン、アルカン）並びにイソプレノイドが挙げられる。
【００１４】
様々な実施形態では、アセチルリン酸からの酢酸塩の産生の増大は、酢酸キナーゼの発現の増大によって起こり得る。非限定的な例は、ａｃｋＡ遺伝子によってエンコードされた大腸菌からの酢酸キナーゼである。酢酸キナーゼの発現の増大は、任意に、大腸菌のｐｔａ遺伝子によってエンコードされるもの等のホスホアセチルトランスフェラーゼの活性の低下をもたらす遺伝子修飾と組み合わせてよい。
【００１５】
様々な実施形態では、アセチル‐ＣｏＡからのエタノールの産生の増大は、デロモナコら（Ｄｅｌｌｏｍｏｎａｃｏ  ｅｔ  ａｌ．）著、ＡＥＭ．２０１０年８月、第７６巻、Ｎｏ．１５、５０６７ページ及びホランド‐スターレーら（Ｈｏｌｌａｎｄ‐Ｓｔａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）、ＪＢＡＣｓ．２０００年１１月、第１８２巻、Ｎｏ．２１、６０４９ページに教示されているような、突然変異型Ｇｌｕ５６８Ｌｙｓを有するａｄｈＥ遺伝子によってエンコードされた大腸菌からの酵素等の、耐酸素性エタノールデヒドロゲナーゼの発現の増大によって起こり得る。
【００１６】
様々な実施形態では、アセチル‐ＣｏＡからの酪酸塩の産生の増大は、フィッシャーら（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ）、アプライド  マイクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２０１０年９月、第８８巻、Ｎｏ．１、２６５‐２７５ページに教示されているような、アセトアセチル‐ＣｏＡチオラーゼ、クロトナーゼ、クロトニル‐ＣｏＡリダクターゼ、酪酸ホスホトランスフェラーゼ及び酪酸キナーゼを含む酪酸塩経路酵素の発現の増大によって起こり得る。あるいは酪酸塩の増大は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３０２０９に教示されているような、アセトアセチル‐ＣｏＡシンターゼ、クロトナーゼ、クロトニル‐ＣｏＡリダクターゼ及びブチリル‐ＣｏＡチオエステラーゼを含む酪酸塩経路酵素の発現の増大によって達成してもよい。
【００１７】
様々な実施形態では、アセチル‐ＣｏＡからのｎ‐ブタノールの産生の増大は、渥美ら（Ａｔｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ）、メタボリック  エンジニアリング（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、２００８年１１月、第１０巻、Ｎｏ．６、３０５ページに教示されているような、アセトアセチル‐ＣｏＡチオラーゼ、クロトナーゼ、クロトニル‐ＣｏＡリダクターゼ、ブチリル‐ＣｏＡリダクターゼ及びブチルアルデヒドリダクターゼを含むｎ‐ブタノール経路酵素の発現の増大によって起こり得る。
【００１８】
様々な実施形態では、アセチル‐ＣｏＡからの、４を超える鎖長の脂肪酸の産生の増大は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３０２０９に教示されているような、ケトアセチル‐ＣｏＡシンターゼ、３‐ヒドロキシアシル‐ＣｏＡデヒドラターゼ、エノイル‐ＣｏＡリダクターゼ及びアシル‐ＣｏＡチオエステラーゼを含む脂肪酸合成経路酵素の発現の増大によって起こり得る。
【００１９】
様々な実施形態では、アセチル‐ＣｏＡからの脂肪酸メチルエステルの産生の増大は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３０２０９及び米国特許第２０１１０１４６１４１号に教示されているような、ケトアセチル‐ＣｏＡシンターゼ、３‐ヒドロキシアシル‐ＣｏＡデヒドラターゼ、エノイル‐ＣｏＡリダクターゼ及びアシル‐ＣｏＡワックスエステルシンターゼを含む脂肪酸メチルエステル合成経路酵素の発現の増大によって起こり得る。
【００２０】
様々な実施形態では、アセチル‐ＣｏＡからのｎ‐ヘキサノールの産生の増大は、出来島ら（Ｄｅｋｉｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  ソサイエティ（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．）、２０１１年８月、第１３３巻、Ｎｏ．３０、１１３９ページに教示されているような、ケトアシル‐ＣｏＡチオラーゼ、３‐ヒドロキシアシル‐ＣｏＡデヒドラターゼ、エノイル‐ＣｏＡリダクターゼ及びアシル‐ＣｏＡチオエステラーゼを含む脂肪酸合成経路酵素の発現の増大によって起こり得る。
【００２１】
様々な実施形態では、アセチル‐ＣｏＡからの、４を超える鎖長のｎ‐アルコールの産生の増大は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３０２０９に教示されるようなケトアセチル‐ＣｏＡシンターゼ、３‐ヒドロキシアシル‐ＣｏＡデヒドラターゼ、エノイル‐ＣｏＡリダクターゼ、並びにツェン・ヤンニンら（Ｙａｎ‐Ｎｉｎｇ  Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、マイクロバイアル  セル  ファクトリーズ（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ）、２０１２年、第１１巻：６５に教示されているような脂肪アシル‐ＣｏＡリダクターゼ及び脂肪アルデヒドリダクターゼを含む、脂肪酸合成経路酵素の発現の増大によって起こり得る。
【００２２】
様々な実施形態では、ｎ‐アルケンの産生の増大は、まず他の箇所に記載されているようにｎ‐アルコールを産生した後、当該技術分野において公知の触媒法によって上記ｎ‐アルコールをｎ‐アルケンへと化学的に脱水することによって達成できる。
【００２３】
様々な実施形態では、ｎ‐アルカンの産生の増大は、まず他の箇所に記載されているように脂肪酸を産生した後、当該技術分野において公知の触媒法によって上記脂肪酸をアルカンへと化学的に脱水することによって達成できる。
【００２４】
様々な実施形態では、アセチル‐ＣｏＡからのイソプレンの産生の増大は、米国特許第２０１２０２７６６０３Ａ１号に教示されているような、アセトアセチル‐ＣｏＡチオラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル‐ＣｏＡシンターゼ、ヒドロキシメチルグルタリル‐ＣｏＡリダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ジホスフェートデカルボキシラーゼ、イソペンテニル‐ジホスフェートイソメラーゼ及びイソプレンシンターゼを含む経路酵素の発現の増大によって起こり得る。
【００２５】
様々な実施形態では、アセチル‐ＣｏＡからの産物の産生の増大は、アセチル‐ＣｏＡをマロニル‐ＣｏＡに変換できるアセチル‐ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の発現の増大、及びマロニル‐ＣｏＡを産物に変換できる複数の経路酵素を含む産生経路の発現の増大の両方によって、起こり得る。
【００２６】
様々な実施形態では、マロニル‐ＣｏＡからの産物の産生の増大は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３０２０９、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２２２７９０及び英国特許第２４７３７５５号が教示するような１つ又は複数の脂肪酸合成酵素の突然変異によって引き起こすことができるアセチル‐ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の活性の増大、及びマロニル‐ＣｏＡを産物へと更に変換できる複数の経路酵素を含む産生経路の発現の増大の両方によって、起こり得る。
【００２７】
遺伝子修飾された微生物も本発明の範囲内であり、上記微生物は、０．０５ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．０８ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．１ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．１３ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．１５ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．１７５ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．２ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．２５ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．３ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．３５ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．４ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．４５ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、又は０．５ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超の速度から選択される特定の速度で、アセチル‐ＣｏＡ由来産物を産生できる。
【００２８】
遺伝子修飾された微生物も本発明の範囲内であり、上記微生物は、０．０５ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．０８ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．１ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．１３ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．１５ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．１７５ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．２ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．２５ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．３ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．３５ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．４ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、０．４５ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超、又は０．５ｇ／ｇＤＣＷ‐ｈｒ超の速度から選択される特定の速度で、マロニル‐ＣｏＡ、ピルビン酸塩、オキサロ酢酸塩、エリスロース‐４‐リン酸塩、キシルロース‐５‐リン酸塩、α‐ケトグルタレート及びクエン酸塩を含むがこれらに限定されないいずれの重要な代謝中間体由来の産物を産生できる。
【００２９】
様々な実施形態では、本発明は、水性培地中の炭素源と、本出願の請求項のいずれか１項による遺伝子修飾された微生物とを含む、培養系を含み、上記遺伝子修飾された微生物は、水性培地の体積を５ｍＬ超、１００ｍＬ超、０．５Ｌ超、１Ｌ超、２Ｌ超、１０Ｌ超、２５０Ｌ超、１０００Ｌ超、１０，０００Ｌ超、５０，０００Ｌ超、１００，０００Ｌ又は２００，０００Ｌ超から選択した場合、及び水性培地の容積が２５０Ｌ超であり、鋼鉄製容器に内包されている場合に、０．０５ｇＤＣＷ／Ｌ超、０．１ｇＤＣＷ／Ｌ超、１ｇＤＣＷ／Ｌ超、５ｇＤＣＷ／Ｌ超、１０ｇＤＣＷ／Ｌ超、１５ｇＤＣＷ／Ｌ又は２０ｇＤＣＷ／Ｌ超から選択された量で存在する。
【００３０】
本明細書中で言及する全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許又は特許出願それぞれが参照により援用されることを具体的かつ別個に示したかのように、参照により本出願に援用される。
【００３１】
本発明の新規の特徴は、特に請求項に記載される。本発明の特徴及び利点のより良好な理解は、本発明の原理を利用した例示的実施形態を示す以下の詳細な説明、及び上記例示的実施形態の添付の図面を参照することによって得られる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】合成代謝弁を有する微生物を利用した２相発酵プロセスの概観を示す。上パネル：発酵プロセスの概観。バイオマスを、無機リン酸塩等の単一の制限主要栄養因子を用いて、最少の培地中で成長させる。バイオマスレベル（黒線）又は細胞の数が増大するに従って、制限栄養因子（赤線）は枯渇する。制限栄養因子が完全に消費されると、バイオマス成長は停止する。同時に、上記制限は、代謝変化を誘発し、設計された合成弁による産物生合成を開始させる。下パネル：２相プロセスにおける代謝変化。系のレベルの変化と相関して、制限栄養因子が枯渇すると代謝変化が誘発される。具体的には、細胞成長に必須の代謝経路をエンコードする遺伝子「成長遺伝子」は、成長相において活性であり、産物生合成をエンコードする「産生遺伝子」はサイレンシングされる。栄養の枯渇によって産生相への移行がトリガされると、「成長遺伝子」がサイレンシングされ、「産生遺伝子」が活性化される。
【図２】ＣＲＩＳＰＲ干渉遺伝子サイレンシング及び制御下タンパク質分解を併用して、大腸菌における合成代謝弁の概観を示す。上パネル：（右）触媒的に不活性のＣａｓ９又はｄＣａｓ９といったカスケードタンパク質複合体の制御下誘導及びシャペロン（ｃｌｐＸＰ増強因子）ｓｓｐＢの制御下誘導に加えて、（左）関心対称の遺伝子をターゲッティングする小さなガイドＲＮＡを発現するための構築が行われる。この構築は、ターゲッティングｓｇＲＮＡに加えて、ｄＣａｓ９及びｓｓｐＢタンパク質を産生する。下パネル：標的遺伝子／タンパク質は、ｓｓｐＢに結合するためのＣ末端ＤＡＳ４タグを含有する。発現が誘導されると、ｄＣａｓ９は、上記ターゲッティングｓｇＲＮＡによって関心対称の遺伝子にターゲッティングされ、これによって転写がサイレンシングされる。同時に、ｓｓｐＢの発現により、既に翻訳されているタンパク質のＤＡＳ４  Ｃ末端タグへのｓｓｐＢの結合がもたらされる。続いてｓｓｐＢ／ＤＡＳ４複合体は、ｃｌｐＸＰプロテアーゼによる分解のためにターゲッティングされる。
【図３】マロニル‐ＣｏＡからのフラックスをリダイレクトすることによる、テトラヒドロキシナフタレン（ＴＨＮ）の産生を示す。上パネル：大腸菌中のｆａｂＩ（エノイルＣｏＡリダクターゼレベル）の制御による、成長から産生へのフラックスのリダイレクトの概観。大腸菌において、中間物マロニル‐ＣｏＡの主要な最終的役割は、脂肪酸合成のための前駆体の提供である。脂質合成の速度を制御する重要な酵素である、ａｃｃＡＢＣＤ遺伝子によってエンコードされるアセチル‐ＣｏＡカルボキシラーゼは、脂肪酸産生中間物である脂肪族アシル‐ＡＣＰによって強力に阻害される。ｆａｂＩの除去により、アシル‐ＡＣＰプールの減少及びアセチル‐ＣｏＡカルボキシラーゼの阻害の低減がもたらされ、これによりマロニル‐ＣｏＡレベルを蓄積して、産物合成に使用できる。ｆａｂＩの除去は、脂質産生を制限し、成長を停止させる。下パネル：可能性のあるマロニル‐ＣｏＡからの１つの産物は、テトラヒドロキシナフタレン（ＴＨＮ）である。ＴＨＮは、ポリケチドシンターゼ、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓ．Ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のｒｐｐＡ遺伝子によってエンコードされるＴＨＮシンターゼによって、マロニル‐ＣＯＡの分子５個から産生される。
【図４】温度感受性ｆａｂＩ対立遺伝子の制御下不活性化の結果としての、２段プロセスにおけるマロニル‐ＣｏＡからのテトラヒドロキシナフタレンの産生の増大を示す。ｆａｂＩの温度感受性対立遺伝子を不活性化するために温度制御下プロセスを用いた、マロニル‐ＣｏＡフラックスのリダイレクトによるＴＨＮの産生の改善。ＢＷａｌｐｄｆ（ＢＷ２５１１３：ΔｌｄｈＡ、ΔｐｆｌＢ、ΔｐｏｘＢ、ΔａｃｋＡ‐ｐｔａ、ΔａｄｈＥ）、ＢＷａｌｐｄｆ‐ｆａｂＩ（ｔｓ）（ＢＷ２５１１３：ΔｌｄｈＡ、ΔｐｆｌＢ、ΔｐｏｘＢ、ΔａｃｋＡ‐ｐｔａ、ΔａｄｈＥ、ｆａｂＩ（Ｆ２４１Ｓ）、ｇｅｎｔＲ）として列挙された株。プラスミドは、ｉ）ｐＳＭＡＲＴ‐ＨＣ‐Ｋａｎ‐ｙｉｂＤ‐ＴＨＮＳ及びｉｉ）ｐＳＭＡＲＴ‐ＨＣ‐Ｋａｎ（対照）である。
【図５】制御下タンパク質分解及び遺伝子サイレンシングの組み合わせの結果としての、２段プロセスにおけるマロニル‐ＣｏＡからのテトラヒドロキシナフタレンの産生の増大を示す。ＣＲＩＳＰＲ干渉遺伝子サイレンシングと、図２において概説した制御下プロテオリシスとの組み合わせを含む合成代謝弁を用いた、マロニル‐ＣｏＡフラックスのリダイレクトによる、ＴＨＮの産生の改善。４時間及び２０時間におけるＴＨＮ産生を、２つの株に関して比較した。左：株ＢＷ２５１１３：ΔｌｄｈＡ、ΔｐｆｌＢ、ΔｐｏｘＢ、ΔａｃｋＡ‐ｐｔａ、ΔａｄｈＥ、ΔｓｓｐＢ、ｆａｂＩ：：プラスミドｉ）ｐＳＭＡＲＴ‐ＨＣ‐Ｋａｎ‐ｙｉｂＤ‐ＴＨＮＳ、ｉｉ）ｐｄＣａｓ９‐ｐｔｅｔ‐ｓｓｐＢ及びｉｉｉ）ｐＣＤＦ‐ターゲッティングｓｇＲＮＡを有しない対照を含有する、ＤＡＳ４、ｇｅｎｔＲ。右：株ＢＷ２５１１３：ΔｌｄｈＡ、ΔｐｆｌＢ、ΔｐｏｘＢ、ΔａｃｋＡ‐ｐｔａ、ΔａｄｈＥ、ΔｓｓｐＢ、ｆａｂＩ：：プラスミドｉ）ｐＳＭＡＲＴ‐ＨＣ‐Ｋａｎ‐ｙｉｂＤ‐ＴＨＮＳ、ｉｉ）ｐｄＣａｓ９‐ｐｔｅｔ‐ｓｓｐＢ及びｉｉｉ）ｓｇＲＮＡターゲッティングｆａｂＩを発現するｐＣＤＦ‐Ｔ２‐ｆａｂＩｓｇＲＮＡを含有する、ＤＡＳ４、ｇｅｎｔＲ。
【図６】様々な低リン酸塩誘導性プロモータを用いた、ＧＦＰレポータの低リン酸塩誘導を示す。以下の遺伝子プロモータ：ａｍｎ、ｐｈｏＡ、ｐｈｏＢ、ｐｈｏＥ、ｐｈｏＨ、ｐｈｏＵ、ｍｉｐＡ、ｐｓｔＳ、ｕｇｐＢ、ｗａａＨ及びｙｄｆＨに関する、低リン酸塩誘導性発現の比較を示す。紫外線励起性の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰｕｖ）レポータ遺伝子を使用し、相対蛍光単位（ＲＦＵ）を時間の関数としてプロットした。成長の停止、及びリン酸塩の枯渇は、約１５〜２０時間において開始される。
【図７】ＣＡＳＣＡＤＥ系及び制御下プロテオリシスを用いた、大腸菌中のタンパク質レベルに対する動的制御を示す。（低リン酸塩ＤＡＳ＋４分解が可能な）株ＤＬＦ＿００２５を修飾して、Ｃ末端ＤＡＳ＋４分解タグを有するｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を構成的に発現させた。更に上記株を、ＧＦＰｕｖ、及びｍＣｈｅｒｒｙ発現を抑制するガイドＲＮＡの低リン酸塩誘導のために修飾した。細胞が成長するにつれてリン酸塩は枯渇し、細胞はｍＣｈｅｒｒｙを「オフに（ｔｕｒｎ  ｏｆｆ）」し、ＧＦＰｕｖを「オンに（ｔｕｒｎ  ｏｎ）」した。バイオマスは、１リットルあたりの細胞乾燥重量グラムとしてプロットされ、ＧＦＰｕｖ及びｍＣｈｅｒｒｙは、バイオマスレベルに対して平準化した相対蛍光単位（ＲＦＴ）としてプロットされている。
【図８】ｍＬ（ミリリットル）規模での、マロニル‐ＣｏＡ及びＮＡＤＰＨからの３‐ＨＰの産生を示す。平均最大３‐ＨＰ滴定量を、複数の産生株に関してプロットしている。
【図９】Ｌ（リットル）規模での、マロニル‐ＣｏＡ及びＮＡＤＰＨからの３‐ＨＰの産生を示す。バイオマス及び３‐ＨＰ滴定量は、時間の関数としてプロットされている。
【図１０】ｍＬ（ミリリットル）規模での、ピルビン酸塩及びＮＡＤＰＨからのアラニンの産生を示す。バイオマス及びアラニン滴定量は、時間の関数としてプロットされている。
【図１１】Ｌ（リットル）規模での、ピルビン酸塩及びＮＡＤＰＨからのアラニンの産生を示す。バイオマス及びアラニン滴定量は、時間の関数としてプロットされている。
【図１２】ｍＬ（ミリリットル）規模での、ピルビン酸塩及びＮＡＤＨからの２，３‐ブタンジオールの産生を示す。バイオマス及び２，３‐ブタンジオール滴定量は、時間の関数としてプロットされている。
【図１３】Ｌ（リットル）規模での、ピルビン酸塩及びＮＡＤＨからの２，３‐ブタンジオールの産生を示す。バイオマス及び２，３‐ブタンジオール滴定量は、時間の関数としてプロットされている。
【図１４】ｍＬ（ミリリットル）規模での、ピルビン酸塩及びＮＡＤＰＨからの２，３‐ブタンジオールの産生を示す。バイオマス及び２，３‐ブタンジオール滴定量は、時間の関数としてプロットされている。
【図１５】Ｌ（リットル）規模での、アセチル‐ＣｏＡ及びＮＡＤＰＨからのメバロン酸の産生を示す。バイオマス及びメバロン酸滴定量は、時間の関数としてプロットされている。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、様々な化学産物の発酵産生に関して有用性を有する様々な産生方法及び／又は遺伝子修飾された微生物、容器内でこれらの微生物の集団を利用して上記化学産物を作製する方法、並びにこれらの微生物及び方法を採用した化学産生のためのシステムに関する。本発明の便益としては特に、産生に干渉し得る微生物増殖に必要な代謝経路を提言又は排除する能力の増大が挙げられる。
【００３４】
定義
本明細書及び請求項において使用される場合、単数形「ａ、ａｎ（ある）」及び「上記、前記（ｔｈｅ）」は、文脈がそうでないことを明らかに指示していない限り、複数の指示対象を含む。従って例えば、「ある発現ベクター（ａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）」に関する言及は、単一の発現ベクター、及び同一の（例えば同一オペロンの）又は異なる複数の発現ベクターを含み、また「ある微生物（ａ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」に関する言及は、単一の微生物及び複数の微生物を含み、他の表現もまた同様である。
【００３５】
本出願において使用される場合、「低減された酵素活性（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」、「低下した酵素活性（ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」等は、ある微生物細胞の、又は単離された酵素が、同一種の対応する細胞又はそのネイティブ酵素において測定される活性よりも低いレベルの活性を呈することを示すことを意図している。即ち、当該酵素に関する公知の標準的条件下での、１つ又は複数の指示されている基質から１つ又は複数の指示されている産物への酵素変換は、は、ネイティブ（未修飾）酵素による同一の生化学的変換に関する酵素活性よりも少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０又は少なくとも９０％低い。この用語はまた、上記酵素活性の排除も含むことができる。酵素の酵素活性が低減された細胞は、当該技術分野において公知のいずれの方法を用いて識別できる。例えば、酵素活性が低下した細胞を識別するために、酵素活性アッセイを使用できる。例えば酵素命名法（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）、アカデミック  プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、２００７年を参照。
【００３６】
本出願において使用される場合、用語「異種ＤＮＡ（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ＤＮＡ）」、「異種核酸配列（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」等は、以下のうちの少なくとも１つが当てはまる核酸配列を指す：（ａ）所与の宿主微生物に対して外来の（即ち上記微生物において天然では確認されない）核酸の配列：（ｂ）上記配列が所与の宿主微生物において天然で確認され得るものの、不自然な（例えば予想を超えた）量である；又は（ｃ）拡散の配列が、天然では互いに対して同一の関係で確認されない２つ以上のサブ配列を含む。例えば例（ｃ）に関して、組み換えによって産生された異種核酸配列は、遺伝子発現を促進する非ネイティブプロモータ等、新規の機能性拡散を得るために配置された無関係の遺伝子からの２つ以上の配列を有することになる。
【００３７】
本出願において使用される場合、用語「合成代謝弁（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｖａｌｖｅ）」等は、代謝フラックスを変化させるための、制御下プロテオリシス、遺伝子サイレンシング、又はプロテオリシスと遺伝子サイレンシングの組み合わせの使用を指す。
【００３８】
用語「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」は、当該技術分野において一般に使用される用語である用語「外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」を含むことを意図したものである。異種核酸配列導入前の宿主微生物のゲノムを参照すると、酵素をコードする核酸配列は（上記異種核酸配列が当該ゲノムに導入されているかいないかにかかわらず）異種である。
【００３９】
本出願において使用される場合、  用語「遺伝子破壊（ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）」又はその文法的等価物（「酵素機能を破壊すること（ｔｏ  ｄｉｓｒｕｐｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、「酵素機能の破壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」等を含む）は、修飾されていない微生物細胞における又は上記微生物細胞からのポリペプチド活性と比較して、エンコードされた遺伝子産物が低減されたポリペプチド活性を有するようにする、微生物に対する遺伝子修飾を意味することを意図したものである。この遺伝子修飾は例えば、全遺伝子の欠失、転写若しくは翻訳のために必要な制御配列の欠失若しくは他の修飾、切断遺伝子産物（例えば酵素）をもたらす遺伝子の一部分の欠失、又はエンコードされた遺伝子産物の活性を低減する（検出不可能な活性レベルまでの低減を含む）様々な突然変異戦略のうちのいずれによるものであってよい。破壊は、酵素をエンコードする核酸配列の全体又は一部の欠失を幅広く含んでよく、また、限定するものではないが、他のタイプの遺伝子修飾、例えば終結コドンの導入、フレームシフト突然変異、遺伝子の一部分の導入又は除去、及び分解シグナルの導入も含み、これらの遺伝子修飾は、ｍＲＮＡ転写レベル及び／又は安定性に影響を及ぼし、酵素をエンコードする遺伝子の上流のプロモータ又はリプレッサを変化させる。
【００４０】
本出願において使用される場合、生物学的産生（ｂｉｏ‐ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）又は発酵（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は、好気性、微好気性又は嫌気性であってよい。
【００４１】
請求項を含む本出願において遺伝子産物、即ち酵素の遺伝子修飾に言及する場合、遺伝子修飾は、言及されている遺伝子産物、即ち酵素を通常エンコードする、遺伝子等の、又は遺伝子を含む核酸配列の遺伝子修飾であることが理解される。
【００４２】
本出願において使用される場合、用語「代謝フラックス（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｆｌｕｘ）」等は、産生速度、産生滴定量及び所与の基質からの産生収率を含む産物及び／又は副産物形成の変化をもたらす代謝の変化を指す。
【００４３】
種及び他の系統発生的識別は、微生物学の分野における技能を有する者に公知の分類に従っている。
【００４４】
本出願において、酵素は、当業者に公知であろうＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（Ｕｎｉｐｒｏｔ）識別番号を参照して列挙されている。（Ｕｎｉｐｒｏｔは、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍが管理しており、Ｕｎｉｐｏｒｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍを通して入手できる。）
【００４５】
本出願に記載の方法及びステップが、複数の特定のイベントが特定の順序で発生することを示している場合、当業者であれば、複数の特定のステップの順序付けを修正してよいこと、及びこのような修正が本発明の変形例によるものであることを認識できるだろう。更に、複数の特定のステップは、可能であれば並行プロセスにおいて同時に実施してよく、また順次実施してよい。
【００４６】
本出願において提供される仮想例は、広範囲の例示を意味しており、いずれの方法での限定も意味していない。
【００４７】
略語の意味は以下の通りである：「Ｃ」は、その用法から明らかであるようにセルシウス又はセルシウス度を意味し；ＤＣＷは乾燥細胞重量を意味し；「ｓ」は秒を意味し；「ｍｉｎ」は分を意味し；「ｈ」、「ｈｒ」又は「ｈｒｓ」は時間を意味し；「ｐｓｉ」はポンド／平方インチを意味し；「ｎｍ」はナノメートルを意味し；「ｄ」は日を意味し；「μＬ」又は「ｕＬ」又は「ｕｌ」はマイクロリットルを意味し；「ｍＬ」はミリリットルを意味し；「Ｌ」はリットルを意味し；「ｍｍ」はミリメートルを意味し；「ｎｍ」はナノメートルを意味し；「ｍＭ」はミリモルを意味し；「μＭ」又は「ｕＭ」はマイクロモルを意味し；「Ｍ」はモルを意味し；「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し；「μｍｏｌ」又は「ｕＭｏｌ」はマイクロモルを意味し；「ｇ」はグラムを意味し；「μｇ」又は「ｕｇ」はマイクログラムを意味し、また「ｎｇ」はナノグラムを意味し；「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し；「ＯＤ」は光学密度を意味し；「ＯＤ６００」は、光子波長６００ｎｍで測定された光学密度；「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し；「ｇ」は重力定数を意味し；「ｂｐ」は塩基対を意味し；「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味し；「％ｗ／ｖ」は重量／体積パーセントを意味し；「％ｖ／ｖ」は体積／体積パーセントを意味し；「ＩＰＴＧ」はイソプロピル‐μ‐Ｄ‐チオガラクトピラノイシドを意味し；「ａＴｃ」はアンヒドロテトラサイクリンを意味し；「ＲＢＳ」はリボソーム結合部位を意味し；「ｒｐｍ」は回転数／分を意味し；「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィを意味し；「ＧＣ」はガスクロマトグラフィを意味する。
【００４８】
Ｉ．炭素源
本発明において組み換え微生物が使用する生物学的産生培地は、成長段階及び産生段階の両方のために、好適な炭素源又は基質を含有していなければならない。好適な基質としては、グルコース、スクロース、キシロース、マンノース、アラビノース、油、二酸化炭素、一酸化炭素、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド及びグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。全ての上述の炭素基質及びその混合物は、本発明において１つ又は複数の炭素源として好適であると考える。
【００４９】
ＩＩ．微生物
本出願において記載及び請求されるような特徴は、本出願のリストから選択された微生物、又は１つ若しくは複数の天然の、導入された、若しくは増強された産物生物学的産生経路を備える別の好適な微生物において提供できる。従っていくつかの実施形態では、上記１つ又は複数の微生物は、（いくつかのこのような実施形態では増強されていてよい）内因性産物産生経路を備え、他の実施形態では、上記微生物は内因性産物産生経路を備えない。
【００５０】
実施例は、特定の細菌性及び真菌性微生物に対する具体的な修飾及び評価について記載している。本発明の範囲はこれらの種に限定されることは意図されておらず、幅広い好適な微生物に広く適用されることが意図されている。
【００５１】
より詳細には、本出願に記載の様々な基準に基づき、化学産物の生物学的産生のための好適な微生物宿主は一般に、「一般的方法（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ）」の節に記載された微生物を含んでよいが、これらに限定されない。
【００５２】
ＩＩＩ．培地及び培養条件
本出願に開示されているタイプのうちの１つから選択されるもの等の適切な炭素源に加えて、生物学的産生培地は、好適な無機物、塩、共因子、緩衝剤、並びに当業者に公知であり、かつ培養物の成長、及び本発明のもとでの化学産物の生物学的産生に必要な酵素経路の促進のために好適な、他の成分を含有していなければならない。
【００５３】
本発明の別の態様は、本発明の遺伝子修飾された微生物及び任意の捕捉物を含む培地及び培養条件に関する。
【００５４】
典型的な細胞は、適切な培地において、約２５℃〜約４０℃の範囲内の温度で成長し、また好熱性微生物に関しては最高７０℃である。好適な成長培地は、当該技術分野において十分に特性決定されており、また公知である。
【００５５】
生物学的産生のための好適なｐＨ範囲は、ｐＨ２．０〜ｐＨ１０．０であり、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が初期条件のための典型的なｐＨ範囲である。しかしながら、特定の実施形態のための実際の培養条件は、これらのｐＨ範囲に限定されることを意図していない。
【００５６】
生物学的産生は、好気性、微好気性又は嫌気性条件下において、撹拌しながら又は撹拌せずに実施できる。
【００５７】
ＩＶ．生物学的産生リアクタ及び系
本発明による方法及び／又は組成物を利用する発酵系もまた、本発明の範囲内である。
【００５８】
本出願において記載及び／又は言及した組み換え微生物のうちのいずれを、工業的な生物学的産生系に導入してよく、ここでは微生物は炭素源を、商業的に実現可能な動作において産物へと変換する。上記生物学的産生系は、上記組み換え微生物を、炭素源基質、及び上記組み換え微生物の成長に好適な生物学的産生培地と共に、バイオリアクタ容器に導入するステップ、並びに上記生物学的産生系を好適な温度範囲（及び反応が好気性又は微好気性である場合は好適な溶解酸素濃度範囲）に、基質分子の一部の、選択された化学産物への所望の変換を得るために好適な時間に亘って、維持するステップを含む。生物学的産生は、好気性、微好気性又は嫌気性条件下において、撹拌しながら又は撹拌せずに実施できる。工業的な生物学的産生系及びその動作は、化学設計及びバイオプロセス設計の分野の技能を有する者には公知である。
【００５９】
以下の公開されている情報源は、その各教示に関して、これらの関連技術の技能レベルを示すために、また必要に応じて、糖源から本発明のもとで産生される、１つ又は複数の化学産物の工業的な生物学的産生方法の実施及び使用方法、並びに本発明の組み換え微生物のうちのいずれによる上述のような変換を達成するために使用できる工業的な系を教示する開示をサポートするために、参照により援用される（生化学工学の基礎（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ）、第２版、Ｊ．Ｅ．ベイリー及びＤ．Ｆ．オリス（Ｊ．  Ｅ．  Ｂａｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｆ．  Ｏｌｌｉｓ）著、マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ）社、ニューヨーク、１９８６年、上記の目的に関してはこの書籍全体、生物学的リアクタ設計に関しては特に第９節５３３〜６５７ページ；化学工学の単位操作（Ｕｎｉｔ  Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、第５版、Ｗ．Ｌ．マッケイブら（Ｗ．  Ｌ．  ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．）著、マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ）社、ニューヨーク、１９９３年、上記の目的、並びに特にプロセス及び分離技術分析に関して、この書籍全体；平衡段階化分離（Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ｓｔａｇｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）、Ｐ．Ｃ．ワンカット（Ｐ．  Ｃ．  Ｗａｎｋａｔ）著、プレンティスホール（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ）社、米国ニュージャージー州エングルウッドクリフス、１９８８年、分離技術の教示に関してこの書籍全体）。
【００６０】
生物学的産生培地中で産生される産物の量は一般に、当該技術分野において公知の多数の方法、例えば高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）又はＧＣ／質量分光測定（ＭＳ）を用いて決定できる。
【００６１】
Ｖ．遺伝子修飾、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列
本発明の実施形態は、宿主微生物への発現ベクターの導入によって得られ、上記発現ベクターは、宿主微生物中に通常確認される、又は確認されない酵素に対する核酸配列コーディングを含有する。
【００６２】
宿主細胞を遺伝子修飾する能力は、いずれの遺伝子修飾された（組み換え）微生物の産生に必須である。遺伝子転写技術のこの態様は、電気穿孔、接合、形質導入又は自然形質転換によるものであってよい。広範囲の宿主接合性プラスミド及び薬剤耐性マーカが利用可能である。クローニングベクターは、当該宿主内で機能できる抗生物質耐性マーカの性質に基づいて、宿主微生物に合わせて調整される。また、本出願において開示されるように、遺伝子修飾（組み換え）微生物は、そのゲノムＤＮＡの修飾を含む、プラスミド導入によるもの以外の修飾を含み得る。
【００６３】
より一般には、制御配列と適合する条件下で、大腸菌等の微生物中でのコード配列の発現を指向する１つ又は複数の（いくつかの）制御配列に動作可能に結合された酵素活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを含む核酸構築物を調製できる。上記単離されたポリヌクレオチドを操作して、上記ポリペプチドの発現を提供できる。発現ベクターによっては、上記ポリヌクレオチドの配列をベクターに挿入する前に操作することが望ましいか又は必要である場合がある。組み換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチド配列を修飾するための技術は、当該技術分野において十分に確立されている。
【００６４】
制御配列は、適切なプロモータ配列、本発明のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識されるヌクレオチド配列であってよい。上記プロモータ配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有してよい。上記プロモータ配列は、突然変異、切断型及びハイブリッドプロモータを含む、選択された宿主細胞において転写活性を示すいずれのヌクレオチド配列であってよく、また、宿主細胞と同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをエンコードする遺伝子から得ることができる。組み換えＤＮＡプロモータ配列を修飾及び利用するための技術は、当該技術分野において十分に確立されている。
【００６５】
本発明の様々な実施形態に関して、遺伝的操作は、各経路のいずれにおいて識別された酵素又は酵素の酵素活性の調節を変化させ、これによって最終的な酵素又は酵素の酵素活性を変化させることを目的としたものを含む、様々な遺伝子操作を含むものとして記載され得る。このような遺伝子修飾は、選択された及び／若しくは識別された培養条件下での酵素活性及び／若しくは選択性の変化をもたらす転写、翻訳及び翻訳後修飾、並びに／又は産物産生に関連する酵素のコピー数及び／若しくは突然変異体を増大させるため等の追加の配列の提供を目的としてよい。このような遺伝子修飾を達成するための具体的な方法及びアプローチは、当業者には公知である。
【００６６】
様々な実施形態において、より効率的に機能するために、微生物は、１つ又は複数の遺伝子欠失を含んでよい。例えば大腸菌では、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）、ピルビン酸‐ギ酸リアーゼ（ｐｆｌＢ）、メチルグリオキサールシンターゼ（ｍｇｓＡ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）、ｃｌｐＸＰプロテーゼ特異性増強因子（ｓｓｐＢ）、ＡＴＰ依存性Ｌｏｎプロテアーゼ（ｌｏｎ）、外膜プロテアーゼ（ｏｍｐＴ）、ａｒｃＡ転写二重調節因子（ａｒｃＡ）、及びｉｃｌＲ転写調節因子（ｉｃｌＲ）をエンコードする遺伝子が、破壊（欠失も含む）されていてよい。欠失を含むこのような遺伝子破壊は、限定を意味するものではなく、様々な実施形態において様々な組み合せで実装できる。遺伝子欠失は、外来ＤＮＡを宿主染色体に組み込む方法と同様に、当該技術分野において公知の多くの戦略によって達成できる。
【００６７】
様々な実施形態において、より効率的に機能するために、微生物は、制御下プロテオリシス、発現サイレンシング、又は制御下プロテオリシス及び発現サイレンシングの両方の組み合わせに関してターゲッティングされた酵素からなる、１つ又は複数の合成代謝弁を含んでよい。例えば、大腸菌中の１つの遺伝子によってエンコードされる１つの酵素、又は多数の酵素の組み合せによってコードされる多数の酵素は、代謝を改変して産物形成を改善するための合成代謝として設計され得る。大腸菌における代表的な遺伝子としては、ｆａｂＩ、ｚｗｆ、ｇｌｔＡ、ｐｐｃ、ｕｄｈＡ、ｌｐｄ、ｓｕｃＤ、ａｃｅＡ、ｐｆｋＡ、ｌｏｎ、ｒｐｏＳ、ｔｋｔＡ又はｔｋｔＢが挙げられるが、これらに限定されない。これらの遺伝子及び／又は更なる微生物種の他の遺伝子の相同体を識別する方法は当業者には公知であることが理解される。
【００６８】
本出願において提供される全ての核酸及びアミノ酸配列に関して、本発明の様々な実施形態において、これらの配列の保存的に修飾された変異体が含まれており、本発明の範囲内であることが理解される。保存的に修飾された変異体及びより広範囲に変化した配列（これらは十分に当業者の技能の範囲内である）を含んでよい、機能的に等価な核酸及びアミノ酸配列（機能的変異体）、並びにこれらを含む微生物もまた、このような配列及び／又は微生物を含む方法及び系と同様に、本発明の様々な実施形態の範囲内である。
【００６９】
従って、上述の様々な節に記載されているように、本発明のいくつかの組成物、方法及び系は、中央中間体から所望の産物を産生する産生経路と、これと組み合わされた、フラックスを再分配するための合成代謝弁との両方を含む、遺伝子修飾された微生物を提供することを含む。
【００７０】
本発明の複数の態様はまた、選択された炭素源を選択された産物に変換する際の微生物全体の有効性を改善するための、複数の遺伝子修飾の提供に関する。より基本的な遺伝子修飾の組み合わせを有意に超えて比生産性、体積生産性、滴定量及び収率を増大させるために、実施例中のもの等の具体的な組み合わせを示す。
【００７１】
上述の遺伝子修飾に加えて、様々な実施形態において、産物の産生において消費され得る共因子ＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨのプール及び利用可能性を増加させるための、合成代謝弁を含む遺伝子修飾も提供される。
【００７２】
より一般的には、遺伝子修飾のために選択された微生物の特定の代謝経路に応じて、以下からなる群から選択される、所望の発酵産物以外の１つ又は複数の発酵産物の細胞産生を減少させるために、遺伝子修飾のいずれのサブグループを実施してよい：酢酸塩、アセトン、アクリル酸塩、リンゴ酸塩、脂肪酸エチルエステル、イソプレノイド、グリセロール、エチレングリコール、エチレン、プロピレン、ブチレン、イソブチレン、酢酸エチル、酢酸ビニル、他の酢酸塩類、１，４‐ブタンジオール、２，３‐ブタンジオール、ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ‐ブタノール、酪酸塩、イソ酪酸塩、２‐ＯＨ‐イソ酪酸塩、３‐ＯＨ‐酪酸塩、エタノール、イソプロパノール、Ｄ‐乳酸塩、Ｌ‐乳酸塩、ピルビン酸塩、イタコン酸塩、レブリン酸塩、グルタル酸塩、カプロラクタム、アジピン酸、プロパノール、イソプロパノール、フーゼルアルコール、及び１，２‐プロパンジオール、１，３‐プロパンジオール、ギ酸塩、フマル酸、プロピオン酸、コハク酸、吉草酸、マレイン酸、及びポリヒドロキシ酪酸塩。遺伝子欠失は、本出願に一般的に開示されているように実施してよく、また他のアプローチを用いて、所望の産物以外の選択された発酵産物の、所望の減少した細胞産生を達成してもよい。
【００７３】
ＶＩ．合成代謝弁
特に本発明は、制御遺伝子サイレンシング及び制御下プロテオリシスのうちの１つ若しくは複数、又はその組み合せを含む、合成代謝弁の構築について記載している。当業者であれば、遺伝子サイレンシング及び制御下プロテオリシスのためのいくつかの方法論を認識していることが理解される。ＣＲＩＳＰＲ干渉に基づく遺伝子サイレンシングと制御下プロテオリシスとの組み合わせの例を図２に示す。
【００７４】
ＶＩ．Ａ  遺伝子サイレンシング
特に本発明は、制御下多段階発酵プロセスにおける代謝フラックスの制御の実現を補助するための、制御下遺伝子サイレンシングの使用について記載している。ｍＲＮＡサイレンシング又はＲＮＡ干渉、転写リプレッサを介するサイレンシング、及びＣＲＩＳＰＲ干渉を含むがこれらに限定されない、制御下遺伝子サイレンシングについて、当該技術分野において公知のいくつかの方法が存在する。ＲＮＡ干渉のための方法及び機序は、アグラワール（Ａｇｒａｗａｌ）ら著「ＲＮＡ干渉：生物学、機序及び応用（ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、マイクロバイオロジー  アンド  モレキュラーバイオロジー  レビュー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）、２００３年１２月；６７（４）、６５７‐６８５ページ、ＤＯＩ：１０．１１２８／ＭＭＢＲ．６７．６５７‐６８５．２００３年によって教示されている。ＣＲＩＳＲＰＲ干渉のための方法及び機序は、チー（Ｑｉ）ら著「遺伝子発現の配列特異的制御のためのＲＮＡガイドプラットフォームとしてのＣＲＩＳＰＲの再利用（Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ａｓ  ａｎ  ＲＮＡ‐ｇｕｉｄｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、セル（Ｃｅｌｌ）、２０１３年２月；１５２（５）、１１７３‐１１８３ページ、ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．０２．０２２によって教示されている。更に、ネイティブ大腸菌ＣＡＳＣＡＤＥ系を用いたＣＲＩＳＲＰＲ干渉のための方法及び機序は、ルオー（Ｌｕｏ）ら著「プログラム可能な遺伝子抑制のための内因性Ｉ型ＣＲＩＰＲ‐Ｃａｓ系の再利用（Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）」ＮＡＲ．、２０１４年１０月；ＤＯＩ：１０．１０９３によって教示されている。更なる多数の転写リプレッサ系が当該技術分野において公知であり、遺伝子発現をオフにするために使用できる。
【００７５】
ＶＩ．Ｂ  制御下プロテオリシス
特に本発明は、制御下多段発酵プロセスにおける代謝フラックスの制御の実現を補助するための、制御下タンパク質分解又はプロテオリシスの使用について記載している。特定のプロテアーゼによる標的タンパク質切断、及び特定のペプチドタグによる分解のためのタンパク質の制御下ターゲッティングを含むがこれらに限定されない、制御下タンパク質分解のための、当技術分野において公知のいくつかの方法が存在する。制御下タンパク質分解のために大腸菌ｃｌｐＸＰプロテアーゼを使用するための系は、マッギネス（ＭｃＧｉｎｎｅｓｓ）ら著「制御可能なタンパク質分解の設計（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）」、モレキュラー  セル（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ）、２００６年６月；２２（５）、７０１‐７０７ページによって教示されている。この方法は、ＤＡＳ４（又はＤＡＳ  ＋  ４）タグのような特定のＣ末端ペプチドタグの付加によるものである。このタグを有するタンパク質は、特異性増強シャペロンｓｓｐＢが発現されるまで、ｃｌｐＸＰプロテアーゼによって分解されない。ｓｓｐＢは、ｃｌｐＸＰプロテアーゼによるＤＡＳ４標識タンパク質の分解を誘導する。更なる多くの部位特異的プロテアーゼ系が当該技術分野において公知である。タンパク質は、所与のプロテアーゼの特定の標的部位を含むように設計でき、次いでプロテアーゼの制御下発現後に切断できる。いくつかの実施形態では、上記切断はタンパク質の不活性化又は分解をもたらすことが予想され得る。例えばシュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）ら著「ＣｌｐＳは、Ｎ末端分解経路の大腸菌基質に対する認識成分である（ＣｌｐＳ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎ‐ｅｎｄ  ｒｕｌｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）」、モレキュラー  マイクロバイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、２００９年３月、７２（２）、５０６‐５１７ページ、ｄｏｉ：１０．１１１１は、ｃｌｐＳ依存性ｃｌｐＡＰ分解を可能にする関心対象のタンパク質にＮ末端配列を付加できると教示している。またこの配列は更に、ＵＬＰ加水分解酵素等によって制御可能に切断できる追加のＮ末端配列によってマスクできる。これにより、加水分解酵素の発現に応じた、制御下Ｎ則分解が可能となる。従って、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかにおいて、制御下プロテオリシスに関してタンパク質を標識できる。Ｎ末端タグとＣ末端タグとの使用の優先性は、分解の制御下での開始前にいずれのタグがタンパク質機能に影響を及ぼすかに大きく左右される。
【００７６】
本発明では、大腸菌中での制御下多段階発酵プロセスにおける代謝フラックスの制御の実現を補助するための、制御下タンパク質分解又はプロテオリシスの使用について記載している。広範囲のグラム陰性及びグラム陽性細菌、酵母、更には古細菌を含む他の微生物宿主における制御下タンパク質分解に関しては、当該技術分野において公知のいくつかの方法が存在する。特に、制御下プロテオリシスのための系を、ネイティブ微生物宿主から移入させて、非ネイティブ宿主で使用できる。例えばグリリー（Ｇｒｉｌｌｙ）ら著「サッカロマイセス・セレビシエにおけるタンパク質分解を調節するための合成遺伝子ネットワーク（Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ｔｕｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）」、モレキュラー  システムズ  バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）３、論文１２７、ｄｏｉ：１０．１０３８は、酵母サッカロマイセス・セレビシエにおける大腸菌ｃｌｐＸＰプロテアーゼの発現及び使用を教示している。このようなアプローチを用いて、合成代謝弁のための方法を、いずれの遺伝的に扱いやすい宿主に移入できる。
【００７７】
ＶＩ．Ｃ  合成代謝弁制御
特に本発明は、多段発酵プロセスにおける代謝フラックスを制御するための合成代謝弁の使用について記載している。多段階発酵の段階間の遷移において使用できる、発現を誘導するための当該技術分野で公知の多数の方法が存在する。上記方法としては、テトラサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、ラクトース、ＩＰＴＧ（イソプロピル‐ベータ‐Ｄ‐１‐チオガラクトピラノシド）、アラビノース、ラフィノース、トリプトファン及び多数の他のものを含む人工化学誘発剤が挙げられるが、これらに限定されない。これらの公知の誘導物質の使用を遺伝子発現サイレンシング及び／又は制御下プロテオリシスの制御に結び付ける系を、遺伝子修飾微生物系に組み込むことによって、多段発光プロセスにおける成長相と産生相との間の遷移を制御できる。
【００７８】
また、成長中に消費される１つ又は複数の制限栄養因子の枯渇によって、多段発酵における成長と産生との間の遷移を制御することが望ましい場合がある。制限栄養因子としては、リン酸塩、窒素、硫黄及びマグネシウムが挙げられるが、これらに限定されない。これらの栄養素制限に応答する天然の遺伝子発現系を用いて、遺伝子発現サイレンシング及び／又は制御下プロテオリシスの制御を、多段発酵プロセスにおける成長段相と産生相との間の遷移に動作可能に結び付けることができる。
【００７９】
ＶＩＩ．本開示の実施形態は非限定的である
本出願において、本発明の様々な実施形態を示し、説明したが、これらの実施形態は実施例のみによって提供されることを強調しておく。本発明の様々な実施形態において、本発明から逸脱することなく、多くの変形、変更及び置換を行うことができる。具体的には、いずれの理由においても、本出願において言明されているか又はリスト、表で提示されている、化合物；核酸配列；機能的酵素、代謝経路酵素若しくは中間体を含む特定のタンパク質、元素、若しくは他の組成物を含むポリペプチド；又は濃度のいずれのグループ分け、あるいは他のグループ分け（図示されている代謝経路酵素等）に関して、そうでないことが言明されていない限り、このようなグループ分けはそれぞれ、様々な部分集合的実施形態の基礎を提供し、それらを識別する役割を果たすことを意図しており、上記部分集合的実施形態はその最大範囲において、言明されている各グループ分けの１つ又は複数のメンバー（又は部分集合）を除外することによる、上記グループ分けの各部分集合を含む。更に、本出願にいずれの範囲が記載されている場合、そうでないことが言明されていない限り、当該範囲はその中の全ての値及びその中の全ての下位範囲を含む。
【００８０】
また、より一般的には、本出願の開示、議論、実施例及び実施形態に従って、当該技術分野の技能の範囲内の従来の分子生物学、細胞生物学、微生物学及び組み換えＤＮＡ技術を採用してよい。これらの技術は文献に十分に説明されている。（例えばサムブルック及びラッセル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ）著、「分子クローニング；実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第３版、２００１年（第１‐３巻），コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）社、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー；動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）、Ｒ．Ｉ．フレッシュニー（Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）編，１９８６年を参照）。これらの公開されている情報源は、これらの中で確認される標準的な実験室法の教示それぞれについて、参照により本出願に援用される。このような援用は、最低でも、具体的な教示、及び／又は本出願において引用文献を引用する際に留意され得る他の目的のためのものである。ある具体的教示及び／又はその他の目的がそれほど留意されない場合は、上記公開されている情報源は、その題名、要約、及び／又は概要のうちの１つ又は複数が示す１つ又は複数の教示のために具体的に組み込まれる。このような具体的に識別された教示及び／又は他の目的がそれほど重要でない場合は、上記公開されている情報源は、本発明が関係する最新技術をより完全に説明するために、及び／又は当業者に一般的に知られている教示を適用可能なものとして提供するために援用される。しかしながら、本出願中の上記公開されている情報源の引用は、それらが本発明の先行技術であることを認めるものと解釈されてはならないことを特に言明しておく。また、援用された上記公開されている情報源のうちの１つ又は複数が、定義された用語、用語の使用法、説明されている技術等を含むがこれに限定されない本出願と異なる又は矛盾する場合、本出願が支配的である。実施例の主題は、まだ存在しない範囲で本節に組み込まれる。
【実施例】
【００８１】
本明細書の実施例は、いくつかの例を提供し、限定を意味するものではない。全ての試薬は、そうでないことが示されていない限り、市販されている。種及び他の系統発生的識別は、微生物学、分子生物学及び生化学分野における技能を有する者に公知の分類に従っている。
【００８２】
本出願では、主要な供給業者の名前及び都市の住所を提供する。
【００８３】
実施例１：温度感受性酵素を用いて大腸菌におけるマロニル‐ＣｏＡフラックスを改善するための動的フラックス制御
この実施例は、温度感受性対立遺伝子を介したｆａｂＩの制御下不活性化を用いる、中間体マロニル‐ＣｏＡからの大腸菌におけるテトラヒドロキシナフタレン（ＴＨＮ）の産生の増大について記載する。簡潔には、株ＢＷａｐｌｄｆ（ＢＷ２５１１３：ΔｌｄｈＡ、ΔｐｆｌＢ、ΔｐｏｘＢ、ΔａｃｋＡ‐ｐｔａ、ΔａｄｈＥ）を更に遺伝子修飾することによって、ｆａｂＩ遺伝子を、温度感受性（ｔｓ）突然変異（Ｆ２４１Ｓ）を含有するよう、及びｆａｂＩ遺伝子のＣ末端においてゲンタマイシン耐性カセットを組み込むよう、突然変異させた。これは、標準的な組み換えプロトコルを用いて達成された。上記株を更に修飾することによって、プラスミドｐＳＭＡＲＴ‐ＨＣ‐Ｋａｎ‐ｙｉｂＤ‐ＴＨＮＳ（配列番号１）を用いた形質転換によってリン酸塩制限条件下でテトラヒドロキシナフタレン（ＴＨＮ）シンターゼ遺伝子（ストレプトマイセス・セリカラー由来のｒｐｐＡ）を発現させた。対照株は、ルシゲン（Ｌｕｃｉｇｅｎ）社から入手した対照空ベクターｐＳＭＡＲＴ‐ＨＣ‐Ｋａｎ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号＃ＡＦ５３２１０７．１）を用いて作製した。ルシゲン社から入手したｐＳＭＡＲＴ‐ＨＣ‐Ｋａｎキットを利用する慣用の分子生物学的方法を用いて、カナマイシン耐性を付与するこの高コピープラスミドを構築した。低リン酸塩のプロモータの制御下のｒｐｐＡ遺伝子は、大腸菌のｙｉｂＤ（ｗａａＨ）遺伝子を誘導した。この株及び対照を、「一般的方法」の節に「振盪フラスコプロトコル‐１（Ｓｈａｋｅ  Ｆｌａｓｋ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ‐１）」として概説されているような２段プロトコルを使用して、ＴＨＮ産生について評価した。相対ＴＨＮ産生を、３４０ｎｍにおける上清の光学密度を測定することによって定量した。図４に結果をまとめる。
【００８４】
実施例２：大腸菌におけるマロニル‐ＣｏＡフラックスを改善するための合成代謝弁
この実施例は、合成代謝技術を用いたｆａｂＩの制御下抑制を用いる、中間体マロニル‐ＣｏＡからの大腸菌中のテトラヒドロキシナフタレン（ＴＨＮ）の産生の増大について記載する。この実施例では、ＣＲＩＳＰＲ干渉遺伝子サイレンシング技術と制御下タンパク質分解との組み合わせを２段プロセスにおいて使用した。簡潔には、株ＢＷａｐｌｄｆ（ＢＷ２５１１３：ΔｌｄｈＡ、ΔｐｆｌＢ、ΔｐｏｘＢ、ΔａｃｋＡ‐ｐｔａ、ΔａｄｈＥ）を更に遺伝子修飾することによって、ｆａｂＩ遺伝子を、Ｃ末端ＤＡＳ４タグを含有するよう、及びｆａｂＩ遺伝子のＣ末端においてゲンタマイシン耐性カセットを組み込むよう、タグ付けした。ＤＡＳ４タグをエンコードするＣ末端ヌクレオチド配列は、以下の配列として組み込まれた：５’‐ＧＣＧＧＣＣＡＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡＣＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＣＴＡＴＧＣＧＧＡＴＧＣＧＴＣＴ‐３４。これは、標準的な組み換えプロトコルを用いて達成された。また、株を更に修飾することによって、ｓｓｐＢ遺伝子を欠失させた。これもまた、標準的な組み換え方法で実施した。更に、これらの株をまた更に修飾することによって、３つのプラスミドを含有させた：第１のプラスミドは、上記のように、テトラヒドロキシナフタレン（ＴＨＮ）シンターゼ遺伝子ｐＳＭＡＲＴ‐ＨＣ‐Ｋａｎ‐ｙｉｂＤ‐ＴＨＮＳ（配列番号１）を発現する。第２のプラスミドは、ＥＭＤミリポアバイオサイエンス（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社から入手したｐＣＤＦ‐１ｂ由来の高コピースペクチノマイシン耐性プラスミドから、ｆａｂＩ遺伝子をターゲッティングする小さなガイドＲＮＡを発現するように構築された。上記プラスミドｐＣＤＦ‐Ｔ２‐ｆａｂＩｓｇＲＮＡ（配列番号２）は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ｄＣａｓ９と共に使用するための小さなガイドＲＮＡを発現する。特定のｆａｂＩ  Ｔ２ターゲッティング配列は、５’‐ＣＡＧＣＣＴＧＣＴＣＣＧＧＴＣＧＧＡＣＣＧ‐３’（配列番号４７）によって与えられる。チー（Ｑｉ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、２０１３年２月；１５２（５）、１１７３‐１１８３ページ、ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．０２．０２２に記載されているように、いずれのターゲッティング配列を失った対照プラスミドも作製した。最後のプラスミドｐｄＣａｓ９‐ｐｔｅｔ‐ｓｓｐＢ（配列番号３）は、アドジーン（Ａｄｄｇｅｎｅ）社（マサチューセッツ州ケンブリッジ；プラスミドＩＤ４４２４９）から入手した、チー（Ｑｉ）らからのプラスミドｐｄＣａｓ９‐細菌由来であった。簡潔には、ｐｄＣａｓ９‐細菌を直鎖化し、ｓｓｐＢ遺伝子を、触媒的に不活性のｄｃａｓ９遺伝子の３’における付加的なｐｔｅｔプロモータの制御下で導入した。アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）の添加は、このクロラムフェニコール耐性授与プラスミドからのｄＣａｓ９及びｓｓｐＢの両方の発現を誘導する。全てのプラスミドは、標準的な分子生物学的方法と、ＤＮＡ配列決定によって確認された配列とを用いて構築した。これらの株及び対照を、「一般的方法」の節に「振盪フラスコプロトコル‐２」として概説されているような２段プロトコルを使用して、ＴＨＮ産生について評価した。相対ＴＨＮ産生を、３４０ｎｍにおける上清の光学密度を測定することによって定量した。図５に結果をまとめる。
【００８５】
実施例３：一般例
例えば「一般的方法」の節に列挙されている株のうちのいずれか等の多数の微生物株は、産物の生合成のための酵素を発現するように遺伝子修飾してよい。更に、これらの修飾された微生物株を更に修飾することによって、増殖に必要なものを含む１つ又は複数の代謝経路の酵素活性の動的低減のための、制御可能な合成代謝弁を含有させることができる。これらの弁は、遺伝子サイレンシング及び制御下プロテオリシスを含む方法のうちの１つ又は組み合わせを利用してよい。更に、これらの修飾された株を多段階発酵プロセスで使用してよく、ここでは段階間の遷移はこれらの弁の制御下活性化と同時に行われる。具体的には、これらの微生物株のいずれかを更に、産物形成を可能にする異種産生経路を発現するように設計してよい。
【００８６】
実施例４：大腸菌宿主株構築
簡潔には、株ＢＷａｐｌｄｆ（ＢＷ２５１１３：ΔｌｄｈＡ、ΔｐｆｌＢ、ΔｐｏｘＢ、ΔａｃｋＡ‐ｐｔａ、ΔａｄｈＥ）を、以下の遺伝子：ａｒｃＡ、ｉｃｌＲ及びｓｓｐＢの欠失のために更に遺伝子修飾して、株ＤＬＦ＿０００２を構築した。これもまた、標準的な無瘢痕組み換え方法で実施した。大腸菌のネイティブＣＡＳＣＡＤＥ系を用いたＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子サイレンシング及び制御下プロテオリシスの両方が可能な株を構築するために、まず大腸菌のｃａｓ３遺伝子を欠失させた。この遺伝子をある配列で置換することによって、ＣＡＳＣＡＤＥベースの遺伝子サイレンシングを可能にするｃａｓＡＢＣＤＥ‐ｃａｓ１，２オペロンの構成的発現と、ｓｓｐＢシャペロンの低リン酸塩誘導を可能にする構築との両方を可能とした。組み込まれる上記ＤＮＡ配列を、単一の合成構築物：配列番号４として配列し、標準的な組み換え方法を用いて組み込んだ。ｃａｓ３遺伝子の代わりに、この構築物は、転写ターミネータ、続いて低リン酸塩誘導性大腸菌ｕｇｐＢ遺伝子プロモータ及びｓｓｐＢ遺伝子を組み込む。ｓｓｐＢ遺伝子には、別の転写ターミネータ、及びそれに続く（デイビス、ＪＨ．、ルービン、ＡＪ．及びザウアー、ＲＴ．（Ｄａｖｉｓ，  ＪＨ．，  Ｒｕｂｉｎ，  ＡＪ．，  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，  ＲＴ．）、ＮＡＲ．２０１１年２月；３９（３）、１１３１‐１１４１ページ、ＤＯＩ：１０．１０９３）からの、カスケードオペロンの定常発現を駆動するために適合された構成的ｐｒｏＢプロモータが続く。結果として得られる株はＤＬＦ＿００２５と呼ばれる。
【００８７】
非ＰＴＳ依存性グルコース取り込み系を利用するために、大腸菌株ＤＬＦ＿００２５の誘導体を構築した。ＰＴＳ（ホスホトランスフェラーゼ系）ベースの糖取り込みは、当該技術分野において公知であり、グルコンのリン酸化をピルビン酸塩の産生に結び付ける。代替的な取り込みは大腸菌において以前に記載されており（ヘルナンデス‐モンタルヴォ、Ｖ．（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ‐Ｍｏｎｔａｌｖｏ，  Ｖ．）ら、バイオテクノロジー  アンドバイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．）、２００３年９月；８３（６）、６８７‐６９４ページ）、大腸菌ｐｔｓＧ遺伝子の欠失に伴う大腸菌ｇａｌＰパーミアーゼ及びグルコキナーゼ（ｇｌｋ遺伝子）の過剰発現に依存する。ｐｔｓＧ遺伝子を欠失させ、構成的に発現されたグルコキナーゼ構築物で置換し、この構築物を単一の合成直鎖ＤＮＡ構築物として配列し（配列番号５）、標準的な方法に従って組み込んだ。更に、ｇａｌＰプロモータもまた、別の単一の合成直鎖ＤＮＡ構築物（配列番号６）を用いた染色体置換によって置換され、結果として得られた株はＤＬＦ＿０２８６と呼ばれた。いずれの場合も、ｐｒｏＣプロモータを用いて構成的発現を促進した（デイビス、ＪＨ．、ルービン、ＡＪ．及びザウアー、ＲＴ．（Ｄａｖｉｓ，  ＪＨ．，  Ｒｕｂｉｎ，  ＡＪ．，  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，  ＲＴ．）、ＮＡＲ．２０１１年２月；３９（３）、１１３１‐１１４１ページ、ＤＯＩ：１０．１０９３）。
【００８８】
大腸菌株ＤＬＦ＿００２５及びＤＬＦ＿０２８６を：１）脂肪酸生合成に関与する、ｆａｂＩ遺伝子によってエンコードされるエノイル‐ＡＣＰリダクターゼ；２）クエン酸サイクルに関与するｇｌｔＡ遺伝子によってエンコードされるクエン酸シンターゼ；３）ＮＡＤＰＨ代謝に関与する、ｕｄｈＡ遺伝子によってエンコードされる可溶性トランスヒドロゲナーゼ；４）ペントースリン酸塩経路に関与する、ｚｗｆ遺伝子によってエンコードされるグルコース‐６‐リン酸‐１‐デヒドロゲナーゼ；及び５）ｌｐｄ遺伝子によってエンコードされる、リポアミドデヒドロゲナーゼ、又はピルビン酸塩デヒドロロゲナーゼ複合体のＥ３成分を含む、中央代謝における主要酵素の制御下プロテオリシスのために、更に修飾した。ｓｓｐＢ制御下プロテオリシスを可能にするＣ末端ＤＡＳ＋４タグを、上述の各遺伝子の３’末端に以下の配列として組み込んだ：５’‐ＧＣＧＧＣＣＡＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡＣＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＣＴＡＴＧＣＧＧＡＴＧＣＧＴＣＴ‐３’（配列番号４８）。これは、ＤＡＳ４タグ、ターゲッティング配列、及び下流の抗生物質耐性カセットを含有する、単一のＤＮＡカセットの挿入によって達成された。ｆａｂＩ‐ＤＡＳ４タグ及びｌｐｄ‐ＤＡＳ４タグの後にゲンタマイシン耐性カセットが続き、ｇｌｔＡ‐ＤＡＳ４タグの後にゼオシン耐性カセットが続き、ｕｄｈＡ‐ＤＡＳ４及びｚｗｆ‐ＤＡＳ４タグの両方の後にブラストサイジン耐性カセットが続いた。Ｃ末端タグ付けｆａｂＩ、ｌｐｄ、ｇｌｔＡ、ｕｄｈＡ及びｚｗｆのために使用される、組み込まれる配列は、それぞれ配列番号７、配列番号８、配列番号９配列番号１０及び配列番号１１である。単一の及び組み合わせられたＤＡＳ４タグ付け酵素を有する株を構築した。宿主株の遺伝子型を表１に示す。
【００８９】
表１：大腸菌宿主株
【表１】
2020103304.tif 000003
【表２】
2020103304.tif 000004
【表３】
2020103304.tif 000005
【００９０】
実施例５：大腸菌における低リン酸塩遺伝子発現
合成代謝弁を制御するための異なる低リン酸塩誘導スキームを評価するために、大腸菌からのいくつかの公知の低リン酸塩誘導性プロモータを、紫外線励起性緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰｕｖ）レポータ遺伝子を用いて評価した。これらの遺伝子プロモータは、以下の遺伝子に関するものを含んでいた：ａｍｎ、ｐｈｏＡ、ｐｈｏＢ、ｐｈｏＥ、ｐｈｏＨ、ｐｈｏＵ、ｍｉｐＡ、ｐｓｔＳ、ｕｇｐＢ、ｗａａＨ及びｙｄｆＨを、低リン酸塩誘導について評価した。各プロモータをＧＦＰｕｖ遺伝子レポータに連結するレポータプラスミドを構築し、配列は以下の通りである：ｐＳＭＡＲＴ‐ａｍｎｐ‐ＧＦＰｕｖ（配列番号３６）、ｐＳＭＡＲＴ‐ｐｈｏＡｐ‐ＧＦＰｕｖ（配列番号３７）、ｐＳＭＡＲＴ‐ｐｈｏＢｐ‐ＧＦＰｕｖ（配列番号３８）、ｐＳＭＡＲＴ‐ｐｈｏＥｐ‐ＧＦＰｕｖ（配列番号３８）、ｐＳＭＡＲＴ‐ｐｈｏＨｐ‐ＧＦＰｕｖ（配列番号４０）、ｐＳＭＡＲＴ‐ｐｈｏＵｐ‐ＧＦＰｕｖ（配列番号４１）、ｐＳＭＡＲＴ‐ｍｉｐＡｐ‐ＧＦＰｕｖ（配列番号４２）、ｐＳＭＡＲＴ‐ｐｓｔＳｐ‐ＧＦＰｕｖ（配列番号４３）、ｐＳＭＡＲＴ‐ｕｇｐＢｐ‐ＧＦＰｕｖ（配列番号１２）、ｐＳＭＡＲＴ‐ｗａａＨｐ‐ＧＦＰｕｖ（配列番号４４）、及びｐＳＭＡＲＴ‐ｙｄｆＨｐ‐ＧＦＰｕｖ（配列番号４５）。簡潔には、プラスミドは大腸菌株ＢＷａｐｌｄｆに形質転換された（実施例４参照）。コロニーを用いて、カナマイシン（「一般的方法」の節を参照）を含む４ｍＬのＳＭ３培地に接種し、３７℃、振盪速度２２５ｒｐｍで一晩インキュベートした。一晩成長させた後、細胞を６００ｎｍの光学密度で５に正規化し、正規化した培養物４０μＬを使用して、４８ウェルフラワープレート（ＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅ）（商標）Ｂのウェル中で、７６０μＬの新鮮なＦＧＭ３（「一般的方法」の節参照）培地にカナマイシンを接種し、バイオリアクタ・マイクロバイオリアクタ（ＢｉｏＬｅｃｔｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）に移した（フラワープレート及びバイオリアクタ・マイクロバイオリアクタはいずれもＭ２Ｐラボ（Ｍ２Ｐ  Ｌａｂｓ）社（ドイツ、ベスヴァイラー）から入手した）。バイオリアクタ・マイクロバイオリアクタは蛍光を連続的に測定できる。細胞をマイクロバイオリアクタ内で３７℃、振盪速度１２００ｒｐｍで６０時間インキュベートした。成長が停止し、約１５から２０時間でリン酸塩枯渇が始まる（明瞭化のためにデータは示されていない）。各レポータ構築物及び空ベクター対照に関する蛍光結果を、図６において相対蛍光単位（Ｒ．Ｆ．Ｕ）として報告する。全てのプラスミドは、標準的なギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）法（ギブソンアセンブリマスターミックス（Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）、ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチから入手）、及びジーブロックス（Ｇｂｌｏｃｋｓ）（商標）（インテグレーテッド・ＤＮＡテクノロジー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社、米国アイオワ州コーラルヴィル）として提供された合成直鎖二本鎖ＤＮＡを用いて構築した。プラスミドＤＮＡ配列の確認には、イートン・バイオサイエンス（Ｅｔｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（米国ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク）を用いた。標準的なコドン最適化を実施して、大腸菌での発現のために構築物を最適化した。
【００９１】
実施例６：ｐＣＡＳＣＡＤＥプラスミドクローニング
ｐｃｒＲＮＡプラスミドのテトラサイクリン誘導性プロモータ（ルオー（Ｌｕｏ）ら著「プログラム可能な遺伝子抑制のための内因性Ｉ型ＣＲＩＰＲ‐Ｃａｓ系の再利用（Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）」ＮＡＲ．、２０１４年１０月；ＤＯＩ：１０．１０９３）を、絶縁されたｕｇｐＢプロモータに交換することにより、ｐＣＡＳＣＡＤＥ‐対照（配列番号１３）を調製した。プラスミドは、標準的なギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）法（ギブソンアセンブリマスターミックス（Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）、ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチから入手）、及びジーブロックス（Ｇｂｌｏｃｋｓ）（商標）（インテグレーテッド・ＤＮＡテクノロジー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社、米国アイオワ州コーラルヴィル）として提供された合成直鎖二本鎖ＤＮＡを用いて構築した。プラスミドＤＮＡ配列の確認には、イートン・バイオサイエンス（Ｅｔｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（米国ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク）を用いた。
【００９２】
Ｑ５  ＰＣＲ反応に５％ｖ／ｖのＤＭＳＯを添加したことを除いて、製造元のプロトコルに従って、Ｑ５部位指向性突然変異誘発（ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）により、単一ＲＮＡガイドを有する追加のｐＣＡＳＣＡＤＥプラスミドを調製した。例えば、ｐＣＡＳＣＡＤＥ‐ｇｌｔＡ２（配列番号１４）を、鋳型としてのｐＣＡＳＣＡＤＥ‐対照と、以下のプライマとを用いて調製した：ｇｌｔＡ２‐ＦＯＲ  ５’‐ＧＧＧＡＣＡＧＴＴＡＴＴＡＧＴＴＣＧＡＧＴＴＣＣＣＣＧＣＧＣＣＡ  ＧＣＧＧＧＧＡＴＡＡＡＣＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣ‐３’（配列番号４９）及びｇｌｔＡ２‐ＲＥＶ  ５’‐ＧＡＡＴＧＡＡＴＴＧＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＴＴＴＡＴＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＡＡＣＴＣＧＡＧＧＴＧＧＴ  ＡＣＣＡＧＡＴＣＴ‐３’（配列番号５０）。ｐＣＡＳＣＡＤＥ‐ｆａｂＩ（配列番号１５）、ｐＣＡＳＣＡＤＥ‐ｕｄｈＡ（配列番号１６）、ｐＣＡＳＣＡＤＥ‐ｚｗｆ（配列番号１７）及びｐＣＡＳＣＡＤＥ‐ｇｌｔＡ１（配列番号１８）を含む追加のｐＣＡＳＣＡＤＥプラスミドを、同様の方法で、Ｑ５突然変異誘発を用いてガイドＲＮＡターゲッティング配列を交換することによって調整した。
【００９３】
複数のＲＮＡガイドを有する追加のｐＣＡＳＣＡＤＥプラスミドを、以下のように調製した。例えばｐＣＡＳＣＡＤＥ‐ｇｌｔＡ２‐ｕｄｈＡ（配列番号１９）プラスミドは、Ｑ５高忠実度２Ｘマスターミックス（Ｑ５  Ｈｉｇｈ‐Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）（ＮＥＢ、マサチューセッツ州）を用いて、それぞれｐＣＡＳＣＡＤＥ‐ｇｌｔＡ２及びｐＣＡＳＣＡＤＥ‐ｕｄｈＡからｇｌｔＡ２ガイド半体及びｕｄｈＡガイド半体を増幅することによって調製した。使用したプライマ：Ｇ２Ｕ‐ＦＯＲ１：５’‐ＣＣＧＧＡＴＧＡＧＣＡＴＴＣＡＴＣＡＧＧＣＧＧＧＣＡＡＧ‐３  ’（配列番号５１）、ＲＥＶ１：５’‐ＣＧＧＴＴＴＡＴＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＡＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＡＴＡＡＣＴＴＴＴＡＣ‐３’（配列番号５２）及びＦＯＲ２：５’‐ＧＣＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＴＡＡＡＣＣＧＴＴＡＣＣＡＴＴＣＴＧＴＴＧ‐３  ’（配列番号５３）、並びにＲＥＶ２：５’‐ＣＴＴＧＣＣＣＧＣＣＴＧＡＴＧＡＡＴＧＣＴＣＡＴＣＣＧＧ‐３’（配列番号５４）。ＰＣＲ産物をゲル抽出によって精製した後、ギブソンアセンブリ（ＮＥＢ、マサチューセッツ州）に使用した。ｐＣＡＳＣＡＤＥ‐ｆａｂＩ‐ｕｄｈＡ（配列番号２０）、ｐＣＡＳＣＡＤＥ‐ｆａｂＩ‐ｇｌｔＡ１（配列番号２１）、ｐＣＡＳＣＡＤＥ‐ｆａｂＩ‐ｇｌｔＡ２（配列番号２２）、ｐＣＡＳＣＡＤＥ‐ｆａｂＩ‐ｚｗｆ（配列番号２３）、ｐＣＡＳＣＡＤＥ‐ｇｌｔＡ１‐ｕｄｈＡ（配列番号２４）、ｐＣＡＳＣＡＤＥ‐ｇｌｔＡ２‐ｚｗｆ（配列番号２５）、ｐＣＡＳＣＡＤＥ‐ｇｌｔＡ１‐ｚｗｆ（配列番号２６）、ｐＣＡＳＣＡＤＥ‐ｇｌｔＡ２‐ｚｗｆ（配列番号２７）を、同様の方法で、各ガイド及びベクターバックボーンの一部の増幅並びにこれに続くギブソンアセンブリによって調製した。全てのプラスミド配列をＤＮＡ配列決定（イートン・バイオサイエンス（Ｅｔｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（米国ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク））により確認した。
【００９４】
実施例７：ＣＡＳＣＡＤＥ系及び制御下プロテオリシスを用いた、大腸菌におけるタンパク質レベルの動的制御
全てのプラスミドは、標準的なギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）法（ギブソンアセンブリマスターミックス（Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）、ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチから入手）、及びジーブロックス（Ｇｂｌｏｃｋｓ）（商標）（インテグレーテッド・ＤＮＡテクノロジー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社、米国アイオワ州コーラルヴィル）として提供された合成直鎖二本鎖ＤＮＡを用いて構築した。プラスミドＤＮＡ配列の確認には、イートン・バイオサイエンス（Ｅｔｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（米国ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク）を用いた。標準的なコドン最適化を実施して、大腸菌での発現のために構築物を最適化した。最初に、標準的なクローニング技術を用いて、低リン酸塩誘導性（大腸菌由来の低リン酸塩誘導性ｗａａＨ遺伝子プロモータを利用する）紫外線励起性緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰｕｖ）を発現するプラスミドを構築し、これをｐＳＭＡＲＴ‐ｗａａＨｐ‐ＧＦＰｕｖ（配列番号１２）と呼んだ。第２に、制御下プロテリオリシスを可能にするＤＡＳ＋４タグでタグ付けされた赤色蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）の構成的発現を有する適合性ベクターｐＢＴ１‐ｍＣｈｅｒｒｙ‐ＤＡＳ＋４（配列番号２８）を構築した。構成的発現は、ｐｒｏＤプロモータ（デイビス、ＪＨ．、ルービン、ＡＪ．及びザウアー、ＲＴ．（Ｄａｖｉｓ，  ＪＨ．，  Ｒｕｂｉｎ，  ＡＪ．，  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，  ＲＴ．）、ＮＡＲ．２０１１年２月；３９（３）、１１３１‐１１４１ページ、ＤＯＩ：１０．１０９３）を用いて達成された。最後に、ｐｒｏＤプロモータをターゲッティングする遺伝子サイレンシングガイドＲＮＡの低リン酸塩発現（大腸菌由来の低リン酸塩誘導性ｕｇｐＢ遺伝子プロモータの利用する）を可能にする、別の適合ベクターｐＣＡＳＣＡＤＥ‐ｐｒｏＤ（配列番号２９）を構築した。これらのプラスミドは、実施例４に記載されているように、いくつかの株を生成するための株ＤＬＦ＿００２５を含むいくつかの宿主株に変換された。コロニーを用いて、カナマイシン（「一般的方法」の節を参照）を含む４ｍＬのＳＭ３培地に接種し、３７℃、振盪速度２２５ｒｐｍで一晩インキュベートした。一晩成長させた後、細胞を６００ｎｍの光学密度で５に正規化し、正規化した培養物４０μＬを使用して、４８ウェルフラワープレート（ＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅ）（商標）Ｂのウェル中で、７６０μＬの新鮮なＦＧＭ３（「一般的方法」の節参照）培地にカナマイシンを接種し、バイオリアクタ・マイクロバイオリアクタ（ＢｉｏＬｅｃｔｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）に移した（フラワープレート及びバイオリアクタ・マイクロバイオリアクタはいずれもＭ２Ｐラボ（Ｍ２Ｐ  Ｌａｂｓ）社（ドイツ、ベスヴァイラー）から入手した）。バイオリアクタ・マイクロバイオリアクタは蛍光を連続的に測定できる。細胞をマイクロバイオリアクタ内で３７℃、振盪速度１２００ｒｐｍで６０時間インキュベートした。各レポータ構築物及び空ベクター対照に関する蛍光結果を���図７において、バイオマスレベルに対して平準化された相対蛍光単位（Ｒ．Ｆ．Ｕ）として報告する。全てのプラスミドは、標準的なギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）法（ギブソンアセンブリマスターミックス（Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）、ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチから入手）、及びジーブロックス（Ｇｂｌｏｃｋｓ）（商標）（インテグレーテッド・ＤＮＡテクノロジー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社、米国アイオワ州コーラルヴィル）として提供された合成直鎖二本鎖ＤＮＡを用いて構築した。プラスミドＤＮＡ配列の確認には、イートン・バイオサイエンス（Ｅｔｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（米国ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク）を用いた。標準的なコドン最適化を実施して、大腸菌での発現のために構築物を最適化した。
【００９５】
実施例８：大腸菌経路プラスミドクローニング
全ての産生プラスミドは、標準的なギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）法（ギブソンアセンブリマスターミックス（Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）、ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチから入手）、及びジーブロックス（Ｇｂｌｏｃｋｓ）（商標）（インテグレーテッド・ＤＮＡテクノロジー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社、米国アイオワ州コーラルヴィル）として提供された合成直鎖二本鎖ＤＮＡを用いて構築した。プラスミドＤＮＡ配列の確認には、イートン・バイオサイエンス（Ｅｔｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（米国ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク）を用いた。標準的なコドン最適化を実施して、大腸菌での発現のために構築物を最適化した。
【００９６】
ＮＡＤＰＨ依存性３‐ヒドロキシプロピオン酸（３‐ＨＰ）産生経路を発現するプラスミドを、２つの遺伝子のオペロンとして構築した。マロニル‐ＣｏＡリダクターゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ＃Ａ９ＷＩＵ３）をエンコードするクロロフレクサス・アウランティカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉｃｕｓ）（ＣａＭＣＲ）由来のｍｃｒ遺伝子、及びＮＡＤＰＨ依存性３‐ＨＰデヒドロゲナーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ３９８３１）をエンコードする大腸菌由来のｙｄｆＧ遺伝子を使用した。マロニル‐ＣｏＡリダクターゼドメインをエンコードするｍｃｒ酵素のＣ末端（残基５５０‐１２１９）のみを利用した（（ルー、Ｃ．、ワン、Ｑ．、ディン、Ｙ．及びツァオ、Ｇｕ．（Ｌｉｕ，  Ｃ．，  Ｗａｎｇ，  Ｑ．，  Ｄｉｎｇ．，  Ｙ  ａｎｄ  Ｚｈａｏ，  Ｇｕ．）、ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ、２０１３年９月、ＤＯＩ：１０．１３７１）。オペロンをｐＳＭＡＲＴ‐ＨＣ‐Ｋａｎベクターに組み込み、プラスミドｐＳＭＡＲＴ‐３ＨＰ１（配列番号３０）を得た。
【００９７】
マロン酸産生経路を発現するプラスミドは、特異性が改変された三重突然変異体（Ｅ９５Ｎ／Ｑ３８４Ａ／Ｆ３０４Ｒ）シュードモナス・フルヴァ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ）（株１２‐Ｘ）イソブチリル‐ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ＃Ｆ６ＡＡ８２）をエンコードする単一の遺伝子から構築した（スティーン、Ｅ．（Ｓｔｅｅｎ，Ｅ．）、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４７６４５）。大腸菌由来のリン酸塩依存性ｗａａＨ遺伝子プロモータの後ろにこの遺伝子をクローニングした。次に上記遺伝子をｐＳＭＡＲＴ‐ＨＣ‐Ｋａｎベクター（ルシゲン社、ウィスコンシン州ミドルトン）に組み込み、プラスミドｐＳＭＡＲＴ‐Ｆ６ＡＡ８２Ｍ（配列番号３１）を得た。
【００９８】
ＮＡＤＰＨ依存性Ｌ‐アラニン産生経路を発現するプラスミドを、ＮＡＤＰＨ補因子特異性を有する二重突然変異体（Ｌｅｕ１９７Ａｒｇ  Ａｓｐ１９６Ａｌａ）バチルス・スブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アラニンデヒドロゲナーゼ（ＡｌａＤＨ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ＃Ｑ０８３５２）をコードする単一の遺伝子から構築した（ハース、Ｔ．（Ｈａａｓ，Ｔ．）国際出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０５７８５５）。大腸菌由来のリン酸塩依存性ｗａａＨ遺伝子プロモータの後ろにこの遺伝子をクローニングした。次に上記遺伝子をｐＳＭＡＲＴ‐ＨＣ‐Ｋａｎベクター（ルシゲン社、ウィスコンシン州ミドルトン）に組み込み、プラスミドｐＳＭＡＲＴ‐Ａｌａ１（配列番号３２）を得た。大腸菌由来のリン酸塩依存性ｕｇｐＢ遺伝子プロモータを用いて、同一のＮＡＤＰＨ依存性Ｌ‐アラニン産生経路を発現する追加のプラスミドを構築した。次に上記遺伝子をｐＳＭＡＲＴ‐ＨＣ‐Ｋａｎベクター（ルシゲン社、ウィスコンシン州ミドルトン）にアセンブリし、プラスミドｐＳＭＡＲＴ‐Ａｌａ２（配列番号４６）を得た。
【００９９】
メバロン酸塩産生経路を発現するプラスミドを、２つの転写ユニットにアセンブリされた２つの遺伝子から構築された。最初に、大腸菌由来のリン酸塩依存性ｗａａＨ遺伝子プロモータの絶縁型の後ろに、二官能性アセトアセチルＣｏＡチオラーゼをエンコードするエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のｍｖａＥ遺伝子及びＮＡＤＰＨ依存性ＨＭＧ‐ＣｏＡリダクターゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ＃Ｑ９ＦＤ７０）をクローニングした。更に、大腸菌由来のリン酸塩依存性ｍｉｐＡ遺伝子プロモータの絶縁型の後に、ヒドロキシメチルグルタリル‐ＣｏＡシンターゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ＃Ｑ９ＦＤ７１）をエンコードする、これもまたエンテロコッカス・フェカリス由来のｍｖａＳ遺伝子をクローニングした。ｍｖａＳ発現構築物をｍｖａＥ構築物の後ろにクローニングし、両方をｐＳＭＡＲＴ‐ＨＣ‐Ｋａｎベクターにアセンブリし、プラスミドｐＳＭＡＲＴ‐Ｍｅｖ１（配列番号３３）を得た。
【０１００】
ＮＡＤＨ依存性２，３‐ブタジオール産生経路を発現するプラスミドを、３つの遺伝子のオペロンとして構築した。それぞれα‐アセト乳酸デカルボキシラーゼ、アセト乳酸シンターゼ及びアセトインリダクターゼをエンコードする、エンテロバクター・クロアカエ亜種ディスソルベンスＳＤＭ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ  ｓｕｂｓｐ．  ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ  ＳＤＭ）由来のｂｕｄＡ、ｂｕｄＢ及びｂｕｄＣ遺伝子を、大腸菌由来のリン酸塩依存性ｗａａＨ遺伝子プロモータの後ろにクローニングした。オペロンをｐＳＭＡＲＴ‐ＨＣ‐Ｋａｎベクターにアセンブリし、プラスミドｐＳＭＡＲＴ‐２，３‐ＢＤＯ１（配列番号３４）を得た。
【０１０１】
ＮＡＤＰＨ依存性２，３‐ブタジオール産生経路を発現するプラスミドを、３つの遺伝子のオペロンとして構築した。α‐アセトラクテートデカルボキシラーゼ、アセトラクテートシンターゼをエンコードする、エンテロバクター・クロアカエ亜種ディスソルベンスＳＤＭ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ  ｓｕｂｓｐ．  ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ  ＳＤＭ）由来のｂｕｄＡ、ｂｕｄＢ遺伝子と、ＮＡＤＰＨ依存性アセトインリダクターゼをエンコードするサッカロマイセス・セレビシエ由来のＧｌｕ２２１Ｓｅｒ／Ｉｌｅ２２２Ａｒｇ／Ａｌａ２２３Ｓｅｒ三重突然変異型ｂｄｈ１遺伝子（エーサニ、Ｍ．、フェルナンデス、ＭＲ．、ビオスカ、ＪＡ．及びデキン、Ｓ．（Ｅｈｓａｎｉ，  Ｍ．，  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，  ＭＲ．，  Ｂｉｏｓｃａ  ＪＡ  ａｎｄ  Ｄｅｑｕｉｎ，  Ｓ．）、バイオテクノロジー  バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ）、２００９年１０月１日；１０４（２）：３８１‐９、ｄｏｉ：１０．１００２）とをそれぞれ、大腸菌由来のリン酸塩依存性ｗａａＨ遺伝子プロモータの後ろにクローニングした。オペロンをｐＳＭＡＲＴ‐ＨＣ‐Ｋａｎベクターにアセンブリし、プラスミドｐＳＭＡＲＴ‐２，３‐ＢＤＯ２（配列番号３５）を得た。
【０１０２】
実施例９：９６ウェルプレート中での、マロニル‐ＣｏＡ及びＮＡＤＰＨからの大腸菌における３‐ヒドロキシプロピオン酸（３‐ＨＰ）の産生
実施例５に記載されているような宿主株、実施例８に記載されているような産生経路プラスミド、及び実施例６に記載されているもののようなＣＡＳＣＡＤＥベースの遺伝子サイレンシン構築物を組み合わせて、いくつかの大腸菌株を構築した。次に、「一般的方法」の節に記載されているような標準９６ウェルプレート評価プロトコル「９６ウェルプロトコル‐１」を使用して、上記株を産物形成について評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。これらの株及び関連する産生データを表２に示す。
【０１０３】
表２．９６ウェルプレート中での、マロニル‐ＣｏＡ及びＮＡＤＰＨからの３−ＨＰの産生
【表４】
2020103304.tif 000006
【表５】
2020103304.tif 000007
【表６】
2020103304.tif 000008
【０１０４】
実施例１０：ｍＬ規模での、マロニル‐ＣｏＡ及びＮＡＤＰＨからの大腸菌における３‐ヒドロキシプロピオン酸（３‐ＨＰ）の産生
実施例５に記載されているような宿主株、実施例６に記載されているような産生経路プラスミド、及び実施例７に記載されているもののようなＣＡＳＣＡＤＥベースの遺伝子サイレンシング構築物を組み合わせて、いくつかの大腸菌株を構築した。次に、「一般的方法」の節に記載されているような標準的なｍＬ規模評価プロトコル「Ｍｉｃｒｏ２４プロトコル‐１」を使用して、上記株を産物形成について評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。測定の概要を表３に列挙し、図８に示す。
【０１０５】
表３．ｍＬ規模での、マロニル‐ＣｏＡ及びＮＡＤＰＨから産生された３−ＨＰに関する３−ＨＰ産生測定の概要
【表７】
2020103304.tif 000009
【０１０６】
実施例１１：Ｌ規模での、マロニル‐ＣｏＡ及びＮＡＤＰＨからの大腸菌における３‐ヒドロキシプロピオン酸（３‐ＨＰ）の産生
実施例１０の大腸菌株３９を、「一般的方法」の節に記載されているような標準的な評価プロトコル「１Ｌ発酵プロトコル‐１」を用いて、１Ｌ規模で評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。バイオマス成長及び３‐ＨＰ産生を図９に示す。
【０１０７】
実施例１２：９６ウェルプレート中での、マロニル‐ＣｏＡからの大腸菌におけるマロン酸の産生
実施例５に記載されているような宿主株、実施例８に記載されているような産生経路プラスミド、及び実施例６に記載されているもののようなＣＡＳＣＡＤＥベースの遺伝子サイレンシン構築物を組み合わせて、いくつかの大腸菌株を構築した。次に、「一般的方法」の節に記載されているような標準９６ウェルプレート評価プロトコル「９６ウェルプロトコル‐１」を使用して、上記株を産物形成について評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。これらの株及び関連する産生データを表４に示す。
【０１０８】
表４．９６ウェルプレート中での、マロニル‐ＣｏＡからのマロン酸の産生
【表８】
2020103304.tif 000010
【０１０９】
実施例１３：９６ウェルプレート中での、ピルビン酸塩からの大腸菌におけるアラニンの産生
実施例５に記載されているような宿主株、実施例８に記載されているような産生経路プラスミド、及び実施例６に記載されているもののようなＣＡＳＣＡＤＥベースの遺伝子サイレンシン構築物を組み合わせて、いくつかの大腸菌株を構築した。次に、「一般的方法」の節に記載されている標準９６ウェルプレート評価プロトコル「９６ウェルプロトコル‐１」を使用して、産物形成について評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。これらの株及び関連する産生データを表５に示す。
【０１１０】
表５．９６ウェルプレート中での、ピルビン酸塩及びＮＡＤＰＨからのアラニンの産生
【表９】
2020103304.tif 000011
【表１０】
2020103304.tif 000012
【０１１１】
実施例１４：ｍＬ規模での、ピルビン酸塩からの大腸菌におけるアラニンの産生
実施例１３の大腸菌株４９を、「一般的方法」の節に記載されているような標準的な評価プロトコル「Ｍｉｃｒｏ２４プロトコル‐１」を用いて、ｍＬ規模で評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。バイオマス成長及びアラニン産生を図１０に示す。
【０１１２】
実施例１５：Ｌ規模での、ピルビン酸塩からの大腸菌におけるアラニンの産生
実施例１３の大腸菌株６０を、「一般的方法」の節に記載されているような標準的な評価プロトコル「１Ｌ発酵プロトコル‐１」を用いて、１Ｌ規模で評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。バイオマス成長及びアラニン産生を図１１に示す。
【０１１３】
実施例１６：ｍＬ規模での、ピルビン酸塩及びＮＡＤＨからの大腸菌における２，３‐ブタンジオールの産生
宿主株ＤＬＦ＿００１６５をプラスミドｐＳＭＡＲＴ‐２，３‐ＢＤＯ１及びｐＣＡＳＣＡＤＥ‐ｚｗｆの両方で形質転換することによって、大腸菌株を作製した（実施例４，６及び８を参照）。この株を、「一般的方法」の節に記載されているような標準的な評価プロトコル「Ｍｉｃｒｏ２４プロトコル‐１」を用いて、ｍＬ規模で評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。バイオマス成長及びアラニン産生を図１２に示す。
【０１１４】
実施例１７：Ｌ規模での、ピルビン酸塩及びＮＡＤＨからの大腸菌における２，３‐ブタンジオールの産生
宿主株ＤＬＦ＿００１６５をプラスミドｐＳＭＡＲＴ‐２，３‐ＢＤＯ１及びｐＣＡＳＣＡＤＥ‐ｚｗｆの両方で形質転換することによって、大腸菌株を作製した（実施例４，６及び８参照）。この株を、「一般的方法」の節に記載されているような標準的な評価プロトコル「１Ｌ発酵プロトコル‐１」を用いて、１Ｌ規模で評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。バイオマス成長及びアラニン産生を図１３に示す。
【０１１５】
実施例１８：ｍＬ規模での、ピルビン酸塩及びＮＡＤＰＨからの大腸菌における２，３‐ブタンジオールの産生
宿主株ＤＬＦ＿０００４９をプラスミドｐＳＭＡＲＴ‐２，３‐ＢＤＯ２及びｐＣＡＳＣＡＤＥ‐ｕｄｈＡの両方で形質転換することによって、大腸菌株を作製した（実施例４，６及び８参照）。この株を、「一般的方法」の節に記載されているような標準的な評価プロトコル「Ｍｉｃｒｏ２４プロトコル‐１」を用いて、ｍＬ規模で評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。バイオマス成長及びアラニン産生を図１４に示す。
【０１１６】
実施例１９：Ｌ規模での、アセチル‐ＣｏＡ及びＮＡＤＰＨからの大腸菌におけるメバロン酸の産生
宿主株ＤＬＦ＿０００４をプラスミドｐＳＭＡＲＴ‐Ｍｅｖ１で形質転換することによって、大腸菌株を作製した（実施例４及び８参照）。この株を、「一般的方法」の節に記載されているような標準的な評価プロトコル「１Ｌ発酵プロトコル‐１」を用いて、１Ｌ規模で評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。バイオマス成長及びアラニン産生を図１５に示す。
【０１１７】
一般的方法の節（ＣＯＭＭＯＮ  ＭＥＴＨＯＤ  ＳＥＣＴＩＯＮ）
この節の全ての方法は、参照された場合に実施例に組み込むために提供される。
【０１１８】
項Ｉ．微生物種及び株、培養及び成長培地
必要に応じて利用できる微生物種は以下の通りである：
【０１１９】
アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）（ＤＳＭＺ＃１１３９）を、ドイツ微生物及び細胞培養物コレクション（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ドイツ、ブラウンシュヴァイク）から、真空乾燥培養物として入手する。培養物を、脳心臓浸出物（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ））培養液（ＲＰＩコーポレーション（ＲＰＩ  Ｃｏｒｐ）社、米国イリノイ州マウントプロスペクト）中で再懸濁する。再懸濁したアシネトバクター・カルコアセティカス培養物の連続希釈液をＢＨＩに入れ、３７℃、２５０ｒｐｍで４８時間好気的に成長させる。
【０１２０】
バチルス・スブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、ギル（Ｇｉｌｌ）研究室（コロラド大学、ボールダー）からの贈与品であり、活性成長性培養物として入手される。上記活性成長性脳心臓浸出物（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ））培養液（ＲＰＩコーポレーション（ＲＰＩ  Ｃｏｒｐ）社、米国イリノイ州マウントプロスペクト）培養物の連続希釈液を、ルリア（Ｌｕｒｉａ）培養液（ＲＰＩコーポレーション（ＲＰＩ  Ｃｏｒｐ）社、米国イリノイ州マウントプロスペクト）に入れ、３７℃、２５０ｒｐｍで２４時間、飽和するまで好気的に成長させる。
【０１２１】
クロロビウム・リミコラ（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａ）（ＤＳＭＺ＃２４５）を、ドイツ微生物及び細胞培養物コレクション（ドイツ、ブラウンシュヴァイク）から、真空乾燥培養物として入手する。培養物を、ＤＳＭＺの説明書に記載されているように、ペニヒ（Ｐｆｅｎｎｉｇ）培地Ｉ及びＩＩ（＃２８及び＃２９）を用いて再懸濁する。クロロビウム・リミコラを、２５℃において定常ボルテックス下で成長させる。
【０１２２】
シトロバクター・ブラーキー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉ）（ＤＳＭＺ＃３００４０）を、ドイツ微生物及び細胞培養物コレクション（ドイツ、ブラウンシュヴァイク）から、真空乾燥培養物として入手する。培養物を脳心臓浸出物（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ））培養液（ＲＰＩコーポレーション（ＲＰＩ  Ｃｏｒｐ）社、米国イリノイ州マウントプロスペクト）中で再懸濁する。再懸濁したシトロバクター・ブラーキー培養物の連続希釈液をＢＨＩに入れ、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間好気的に成長させる。
【０１２３】
クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＤＳＭＺ＃７９２）を、ドイツ微生物及び細胞培養物コレクション（ドイツ、ブラウンシュヴァイク）から、真空乾燥培養物として入手する。培養物を、ＤＳＭＺの説明書に記載されているようにクロストリジウム・アセトブチリカム培地（＃４１１）中で再懸濁する。クロストリジウム・アセトブチリカムを、３７℃、２５０ｒｐｍで、飽和するまで嫌気的に成長させる。
【０１２４】
クロストリジウム・アミノブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）（ＤＳＭＺ＃２６３４）を、ドイツ微生物及び細胞培養物コレクション（ドイツ、ブラウンシュヴァイク）から、真空乾燥培養物として入手する。培養物を、ＤＳＭＺの説明書に記載されているようにクロストリジウム・アミノブチリカム培地（＃２８６）中で再懸濁する。クロストリジウム・アミノブチリカムを、３７℃、２５０ｒｐｍで、飽和するまで嫌気的に成長させる。
【０１２５】
クロストリジウム・クルイヴェリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）（ＤＳＭＺ＃５５５）を、ドイツ微生物及び細胞培養物コレクション（ドイツ、ブラウンシュヴァイク）から、活性成長性培養物として入手する。クロストリジウム・クルイヴェリ培養物の連続希釈液を、ＤＳＭＺの説明書に記載されているようにクロストリジウム・クルイヴェリ培地（＃２８６）に入れる。クロストリジウム・クルイヴェリを、３７℃、２５０ｒｐｍで、飽和するまで嫌気的に成長させる。
【０１２６】
コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＤＳＭＺ＃１４１２）を、ドイツ微生物及び細胞培養物コレクション（ドイツ、ブラウンシュヴァイク）から、活性成長性培養物として入手する。コリネバクテリウム・グルタミカム培養物の連続希釈液を、ＤＳＭＺの説明書に記載されているようにコリネバクテリウム・グルタミカム培地（＃１）に入れる。コリネバクテリウム・グルタミカムを、３７℃、２５０ｒｐｍで、飽和するまで好気的又は嫌気的に成長させる。
【０１２７】
カプリアヴィダス・メタリドゥランス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）（ＤＭＳＺ＃２８３９）を、ドイツ微生物及び細胞培養物コレクション（ドイツ、ブラウンシュヴァイク）から、真空乾燥培養物として入手する。培養物を、脳心臓浸出物（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ））培養液（ＲＰＩコーポレーション（ＲＰＩ  Ｃｏｒｐ）社、米国イリノイ州マウントプロスペクト）中で再懸濁する。再懸濁したカプリアヴィダス・メタリドゥランス培養物の連続希釈液をＢＨＩに入れ、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間、飽和するまで好気的に成長させる。
【０１２８】
カプリアヴィダス・ネカトル（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）（ＤＳＭＺ＃４２８）を、ドイツ微生物及び細胞培養物コレクション（ドイツ、ブラウンシュヴァイク）から、真空乾燥培養物として入手する。培養物を、脳心臓浸出物（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ））培養液（ＲＰＩコーポレーション（ＲＰＩ  Ｃｏｒｐ）社、米国イリノイ州マウントプロスペクト）中で再懸濁する。再懸濁したカプリアヴィダス・ネカトル培養物の連続希釈液をＢＨＩに入れ、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間、飽和するまで好気的に成長させる。他の箇所に記載したように、この種の以前の名称は、アルカリゲネス・エウトロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）及びラルストニア・エウトロファス（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）である。
【０１２９】
デスルフォヴィブリオ・フルクトソヴォランス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｆｒｕｃｔｏｓｏｖｏｒａｎｓ）（ＤＳＭＺ＃３６０４）を、ドイツ微生物及び細胞培養物コレクション（ドイツ、ブラウンシュヴァイク）から、真空乾燥培養物として入手する。培養物を、ＤＳＭＺの説明書に記載されているようにデスルフォヴィブリオ・フルクトソヴォランス培地（＃６３）中で再懸濁する。デスルフォヴィブリオ・フルクトソヴォランスを、３７℃、２５０ｒｐｍで、飽和するまで嫌気的に成長させる。
【０１３０】
大腸菌株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ）ＢＷ２５１１３を、エール遺伝子ストックセンター（Ｙａｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（コネチカット州ニューヘイブン））から得られ、活性成長性培養物として入手する。上記活性成長性大腸菌Ｋ１２培養物の連続希釈液を、ルリア（Ｌｕｒｉａ）培養液（ＲＰＩコーポレーション（ＲＰＩ  Ｃｏｒｐ）社、米国イリノイ州マウントプロスペクト）に入れ、３７℃、２５０ｒｐｍで２４時間、飽和するまで好気的に成長させる。
【０１３１】
大腸菌株ＢＷａｐｌｄｆは、中華人民共和国の清華大学からのジョージ・チェン（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｃｈｅｎ）氏からの惜しみない贈与品である。上記活性成長性大腸菌ＢＷａｐｌｄｆ培養物の連続希釈液を、ルリア（Ｌｕｒｉａ）培養液（ＲＰＩコーポレーション（ＲＰＩ  Ｃｏｒｐ）社、米国イリノイ州マウントプロスペクト）に入れ、３７℃、２５０ｒｐｍで２４時間、飽和するまで好気的に成長させる。
【０１３２】
ハロバクテリウム・サリナルム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｉｎａｒｕｍ）（ＤＳＭＺ＃１５７６）を、ドイツ微生物及び細胞培養物コレクション（ドイツ、ブラウンシュヴァイク）から、真空乾燥培養物として入手する。培養物を、ＤＳＭＺの説明書に記載されているようにＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培地（＃９７）中で再懸濁する。ハロバクテリウム・サリナルムを、３７℃、２５０ｒｐｍで、飽和するまで好気的に成長させる。
【０１３３】
ラクトバチルス・デルブルエッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）（＃４３３５）を、ＷＹＥＡＳＴ  ＵＳＡ  （Ｏｄｅｌｌ、米国オレゴン州）から、活性成長性培養物として入手する。上記活性成長性ラクトバチルス・デルブルエッキー培養物の連続希釈液を、脳心臓浸出物（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ））培養液（ＲＰＩコーポレーション（ＲＰＩ  Ｃｏｒｐ）社、米国イリノイ州マウントプロスペクト）に入れ、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間、飽和するまで好気的に成長させる。
【０１３４】
メタリオスフェラ・セデュラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ）（ＤＳＭＺ＃５３４８）を、ドイツ微生物及び細胞培養物コレクション（ドイツ、ブラウンシュヴァイク）から、活性成長性培養物として入手する。メタリオスフェラ・セデュラ培養物の連続希釈液を、ＤＳＭＺの説明書に記載されているようにメタリオスフェラ培地（＃４８５）に入れる。メタリオスフェラ・セデュラを、６５℃、２５０ｒｐｍで、飽和するまで好気的に成長させる。
【０１３５】
メチロコッカス・カプスラトゥス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）バス（ＡＴＣＣ＃３３００９）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））（米国ヴァージニア州マナッサス）から、真空乾燥培養物として入手する。培養物を、ＡＴＣＣ（登録商標）培地１３０６：５０％空気５０％メタン雰囲気下の硝酸無機塩培地（ＮＭＳ）（ＡＴＣＣ、米国ヴァージニア州マナッサス）中で再懸濁し、４５℃で成長させる。
【０１３６】
メチロコッカス・テルモフィルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＩＭＶ  ２  Ｙｕ  Ｔを入手する。続いて培養物を、ＡＴＣＣ（登録商標）培地１３０６：５０％空気５０％メタン雰囲気下の硝酸無機塩培地（ＮＭＳ）（ＡＴＣＣ、米国ヴァージニア州マナッサス）中で再懸濁し、５０℃で成長させる。
【０１３７】
メチロシヌス・ツポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｓｐｏｒｉｕｍ）（ＡＴＣＣ＃３５０６９）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））（米国ヴァージニア州マナッサス）から、真空乾燥培養物として入手する。培養物を、ＡＴＣＣ（登録商標）培地１３０６：５０％空気５０％メタン雰囲気下の硝酸無機塩培地（ＮＭＳ）（ＡＴＣＣ、米国ヴァージニア州マナッサス）中で再懸濁し、３０℃で成長させる。
【０１３８】
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（コマガテラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））（ＤＳＭＺ＃７０３８２）を、ドイツ微生物及び細胞培養物コレクション（ドイツ、ブラウンシュヴァイク）から、真空乾燥培養物として入手する。続いて培養物を、ＤＳＭＺの説明書に記載されているようにＹＰＤ培地（＃３９３）中で再懸濁する。ピキア・パストリスを、３０℃、２５０ｒｐｍで、飽和するまで好気的に成長させる。
【０１３９】
プロピオニバクテリウム・フレウデンレイキー亜種シェルマニー（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）（ＤＳＭＺ＃４９０２）を、ドイツ微生物及び細胞培養物コレクション（ドイツ、ブラウンシュヴァイク）から、真空乾燥培養物として入手する。続いて培養物を、ＤＳＭＺの説明書に記載されているようにＰＹＧ培地（＃１０４）中で再懸濁する。プロピオニバクテリウム・フレウデンレイキー亜種シェルマニーを、３０℃、２５０ｒｐｍで、飽和するまで嫌気的に成長させる。
【０１４０】
シュードモナス・プティダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）は、ギル（Ｇｉｌｌ）研究室（コロラド大学ボルダー校）からの贈与品であり、活性成長性培養物として入手される。上記活性成長性シュードモナス・プティダ培養物の連続希釈液を、ルリア（Ｌｕｒｉａ）培養液（ＲＰＩコーポレーション（ＲＰＩ  Ｃｏｒｐ）社、米国イリノイ州マウントプロスペクト）に入れ、３７℃、２５０ｒｐｍで２４時間、飽和するまで好気的に成長させる。
【０１４１】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））（米国ヴァージニア州マナッサス）から、真空乾燥培養物として入手する。続いて培養物をＹＰＤ培地中で再懸濁し、３０℃で成長させる。
【０１４２】
ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）（ＤＳＭＺ＃６１７８）を、ドイツ微生物及び細胞培養物コレクション（ドイツ、ブラウンシュヴァイク）から、真空乾燥培養物として入手する。培養物をルリア（Ｌｕｒｉａ）培養液（ＲＰＩコーポレーション（ＲＰＩ  Ｃｏｒｐ）社、米国イリノイ州マウントプロスペクト）中で再懸濁する。ストレプトコッカス・ムタンスを、３７℃、２５０ｒｐｍで、飽和するまで好気的に成長させる。
【０１４３】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（ＤＳＭＺ＃１３４５）を、ドイツ微生物及び細胞培養物コレクション（ドイツ、ブラウンシュヴァイク）から、真空乾燥培養物として入手する。続いて培養物を、ＤＳＭＺの説明書に記載されているようにＹＰＤ培地（＃３９３）中で再懸濁する。ヤロウィア・リポリティカを、３７℃、２５０ｒｐｍで、飽和するまで好気的に成長させる。
【０１４４】
項ＩＩ．分子生物学的技術‐ＤＮＡクローニング
上述の又は以下の具体的実施例に加えて、この実施例は、関心対象の核酸配列を導入する、除去する又は変化させるための、選択された微生物の遺伝子修飾への非制限的なアプローチを説明することを意図している。この一般的実施例内において、代替例及び変形例が提供される。この実施例の方法を実施することによって、選択された微生物種における所望の遺伝子修飾の組み合わせ、例えば本出願中の複数の節において記載されているような遺伝子修飾の組み合わせ、並びに他の細菌種及び他の微生物種におけるもののような、その機能的等価物を達成できる。
【０１４５】
関心対象の遺伝子又は他の核酸配列のセグメントを、（本出願に記載の大腸菌等の）特定の種において識別し、当該遺伝子又はセグメントを含む核酸配列を得る。
【０１４６】
関心対象のセグメントの末端の、又は上記末端に隣接する核酸配列に基づいて、５’及び３’核酸プライマを調製する。各プライマは、上記末端又は隣接領域とハイブリダイズする十分なオーバラップセクションを有するように設計される。上記プライマは、後続のベクター組み込み又はゲノム挿入に使用できるトランスポザーゼ挿入の制限消化のための酵素認識部位を含んでよい。これらの部位は典型的には、ハイブリッドオーバラップセクションの外側になるように設計される。プライマ配列を注文できるように準備している多数の契約サービス（例えばインテグレーテッド・ＤＮＡテクノロジー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社、米国アイオワ州コーラルヴィル）が公知である。
【０１４７】
プライマを設計及び準備した後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施して、関心対象の所望のセグメントを特異的に増幅する。この方法により、微生物のゲノムから分離された関心対象の領域の複数のコピーが得られる。微生物のＤＮＡ、プライマ及び好熱性ポリメラーゼを、緩衝液中で、カリウム及び２価カチオン（例えばＭｇ又はＭｎ）、及び十分な量のデオキシヌクレオシド三リン酸分子と組み合わせる。この混合物を、温度上昇及び低下の標準的なレジメンに供する。しかしながら、温度、成分、濃度及びサイクル時間は、コピーされる配列の長さ、アニール温度近似値、及び当業者に公知の、又は当業者が慣用的な実験によって容易に学習する他の因子に従った反応に応じて、変化し得る。
【０１４８】
代替実施形態では、関心対象のセグメントを、微生物又は他の天然のＤＮＡ源から得るのではなく、例えば販売業者が合成してよく、ＰＣＲによって調製してよい。
【０１４９】
次に上記核酸配列を、例えばアガロースゲル上で電気泳動によって精製及び分離する。任意に、上記領域を精製した後、標準的なＤＮＡシーケンシング法によって上記領域を検証でき、ベクターに導入してよい。いずれの数のベクターを使用してよく、これは一般に、当業者に公知のマーカを含み、またこのような導入には標準的な方法が慣用的に採用されている。一般的に使用されるベクター系は、当該技術分野において公知である。続いて、同様に、ベクターを多数の宿主細胞のいずれかに導入する。一般的に使用される宿主細胞は、大腸菌株である。これらのベクターのうちのいくつかは、関心対象の配列が（例えば複数のクローニング部位へ）挿入される領域に隣接する、誘導性プロモータ等のプロモータを有する。上記プラスミド蓄積細胞の培養は、プラスミドの複製、及びこれに伴った関心対象のセグメントの複製を可能とし、これは、関心対象のセグメントの発現に対応する場合が多い。
【０１５０】
様々なベクター系は、所定の条件下での成長又は生存のために必要なタンパク質をエンコードする発現性遺伝子等の、選択性マーカを含む。バックボーンベクター配列が含有する一般的な選択性マーカは、抗生物質耐性のために必要な１つ又は複数のタンパク質をエンコードする遺伝子、及び栄養要求性欠損を補足するため、又は特定の培養培地中に存在しない、若しくは上記培養培地中で利用できない重要な栄養素を供給するために必要な遺伝子を含む。ベクターは、関心対象の宿主細胞に好適な複製系も含む。
【０１５１】
続いて、関心対象のセグメントを含有するプラスミドを、慣用の方法で単離でき、また他の関心対象の微生物宿主細胞への導入のために使用できる。様々な導入方法が当該技術分野において公知であり、これは、ベクター導入又はゲノム組み込みを含むことができる。様々な代替実施形態では、関心対象のＤＮＡセグメントが他のプラスミド以外の手段によって関心対象の宿主細胞に導入される場合、上記関心対象のＤＮＡセグメントを、上記他のプラスミドＤＮＡから分離してよい。
【０１５２】
一般的な仮想例のステップはプラスミドの使用を伴うが、当該技術分野において公知の他のベクターを代わりに使用してもよい。これらには、コスミド、ウイルス（例えばバクテリオファージ、動物ウイルス、植物ウイルス）、並びに人工染色体（例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）及び細菌人工染色体（ＢＡＣ））が含まれる。
【０１５３】
関心対象のセグメントが導入された宿主細胞を、関心対象の化学化合物の特定の酵素的ステップ及び／若しくは耐性又は生物学的産物についての性能に関して評価してよい。より良好に機能する遺伝子修飾宿主細胞の選択を行い、関心対象の化学物質の全体的な性能、耐性、又は産生若しくは蓄積を選択してよい。
【０１５４】
この手順は、単一の遺伝子（若しくは関心対象の他の核酸配列セグメント）、又は（別個のプロモータ若しくは単一のプロモータの制御下にある）複数の遺伝子に関して核酸配列を組み込んでよく、またこの手順を反復して、発現ベクター中に所望の異種核酸配列を生成してよく、続いて上記異種核酸配列は選択された微生物に供給され、これにより上記微生物が、例えば本出願において開示されている代謝経路のうちのいずれに関して望ましい、酵素的変換ステップの機能性の相補性を有するようになることに留意されたい。しかしながら、多くのアプローチが、関心対象の配列の全体又は一部の転写を介した発現と、これに続く、酵素等のポリペプチドを得るための転写されたｍＲＮＡの翻訳とに依存しているものの、関心対象の特定の配列は、このような発現以外の手段によって効果を発揮し得ることに留意されたい。
【０１５５】
これらのアプローチに使用される具体的な実験室法は、当該技術分野において公知であり、サムブルック及びラッセル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ）著、「分子クローニング；実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第３版、２００１年（第１‐３巻），コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）社、ニューヨーク州コールドスプリング  ハーバー（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００１  （ｖｏｌｕｍｅｓ  １‐３），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（これ以降Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１と呼ぶ））等の、当業者に公知の様々な引用文献中で確認できる。
【０１５６】
以上に対する代替例として、宿主細胞のゲノムの核酸配列の欠失等の、他の遺伝子修飾も実施してよい。これを達成するための１つの非限定的な方法は、当業者に公知であり、かつＳｔｅｗａｒｔらに対して発行された、この方法に関するその教示について参照により本出願に援用される米国特許第６，３５５，４１２号及び６，５０９，１５６号に記載されている、Ｒｅｄ／Ｅｔ組み換えの使用によるものである。このような方法のための材料及びキットは、ジーン・ブリッジズ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ）社（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ、ドレスデン）から入手可能であり、また本方法は、上記製造元の説明書に従って進めることができる。ゲノムＤＮＡのターゲッティングされた欠失を実施することにより、宿主細胞の代謝を変化させて、望ましくない代謝産物の産生を低減又は排除できる。これは、この一般的な実施例において本出願に記載されているような他の遺伝子修飾と併用してよい。
【０１５７】
以上に加えて、より長い精製２重鎖ＤＮＡ断片を、様々な販売元から指定及び入手できる。これらのＤＮＡ片は、ギブソン、Ｄ．Ｇ．（Ｇｉｂｓｏｎ，  Ｄ．Ｇ．）ら「数百キロベースまでのＤＮＡ分子の酵素的アセンブリ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｐ  ｔｏ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｈｕｎｄｒｅｄ  ｋｉｌｏｂａｓｅｓ）」、ネイチャー  メソッズ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２００９年５月、第６巻３４３‐３４５ページ、ｄｏｉ：１０．１０３８が教示するようなギブソンアセンブリ法を用いて、プラスミドベクター及びより長い合成ＤＮＡ構築物に、容易にアセンブルできる。
【０１５８】
以上に加えて、オープンリーディングフレーム、プロモータ及びターミネータ等の合成遺伝子部分を合成した場合、これらの部分を、エングラー、Ｃ．、カンジア、Ｒ．及びマリロネット、Ｓ．（Ｅｎｇｌｅｒ，  Ｃ．，  Ｋａｎｄｚｉａ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，  Ｓ．）著「高スループット性能の１ポット・１ステップ精密クローニング方法（Ａ  ｏｎｅ  ｐｏｔ，  ｏｎｅ  ｓｔｅｐ，  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）」、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、２００８年、３（１１）：ｅ３６４７、ｄｏｉ：１０．１３７１が教示するゴールデンゲートアセンブリ（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）等の多数の変異体アセンブリ技術を用いて、多数の異なる組み合わせに容易にシャッフルできることは、当技術分野で周知である。
【０１５９】
項ＩＩＩ．分子生物学的技術‐大腸菌における染色体修飾
ファージ形質導入及び組み換えを含む多数の方法のうちの１つを用いて、大腸菌に染色体修飾を行うことができる。当業者はこれらの方法に精通していることが理解される。特に使用されるのは、リー、Ｘ．（Ｌｉ，  Ｘ．）ら著「ｔｅｔＡ‐ｓａｃＢカセットを用いた正及び負の選択：大腸菌における遺伝子改変及びＰ１形質導入（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｅｔＡ‐ｓａｃＢ  ｃａｓｓｅｔｔｅ：  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐ１  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）」、ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、２０１３年１２月、４１（２２）  ｄｏｉ：１０．１０９３によって教示されているような、不要な配列を残存させずに、染色体に対する配列の正確な欠失又は付加を可能にする、無瘢痕組み換え方法である。
【０１６０】
項ＩＶ．分子生物学的技術‐サッカロマイセス・セレビシエにおける染色体修飾
同種組み換えに関する技術分野において公知の方法を用いて、サッカロマイセス・セレビシエを含む多数の酵母株に染色体修飾を行うことができる。当業者はこれらの方法に精通していることが理解される。
【０１６１】
項Ｖ：大腸菌のための培地
ＧＭ２５培地：大腸菌のためのＧＭ２５最小成長培地は、１リットルあたり以下を含有していた：７３６ｍＬの滅菌蒸留した脱イオン水；２．０ｍＬの１００Ｘ微量金属原料（Ｔｒａｃｅ  Ｍｅｔａｌｓ  Ｓｔｏｃｋ）；１００ｍＬの１０Ｘ  ＧＭリン酸塩；２．０ｍＬの２Ｍ  ＭｇＳＯ４；５０ｍＬの５００ｇ／Ｌグルコース５０ｍＬ；１００ｍＬの１Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．４；及び１０．０ｍＬの１００ｇ／Ｌ酵母抽出物。１００Ｘ微量金属原料は、１．０Ｌの蒸留した脱イオン水に、１０．０ｍＬの濃縮ＨＣｌ、５．０ｇのＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、１．００ｇのＦｅＣｌ３＊６Ｈ２Ｏ、０．０５ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、０．３ｇのＣｕＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＺｎＣｌ２、０．０２ｇのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、０．０１ｇのＨ３ＢＯ３、及び０．０４ｇのＭｎＣｌ２＊４Ｈ２Ｏを加え、０．２μｍフィルタで滅菌濾過することによって調製された。１０Ｘ  ＧＭリン酸塩は、１．０Ｌの蒸留した脱イオン水に、３ｇのＫ２ＨＰＯ４、２ｇのＫＨ２ＰＯ４、３０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、及び１．５ｇクエン酸（無水）を加え、オートクレーブすることによって調製された。２Ｍ  ＭｇＳＯ４は、１．０Ｌの蒸留した脱イオン水に、２４０．０ｇの無水ＭｇＳＯ４を加え、０．２μｍフィルタで滅菌濾過することによって調製された。５００ｇ／Ｌグルコース溶液は、１．０Ｌの加熱され蒸留した脱イオン水に５００ｇの無水デキストロースを加え、０．２μｍフィルタで滅菌濾過することによって調製された。１Ｍ  ４‐モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液は、７００．０ｍＬの蒸留した脱イオン水に、２１０．０ｇのＭＯＰＳ及び３０．０ｍＬの５０％ＫＯＨ溶液を加えることによって調製された。ｐＨは撹拌しながら測定され、５０％ＫＯＨを、最終体積１．０Ｌまでの適量をゆっくりと添加することによって、ｐＨ７．４への最終調整が行われた。最終的なｐＨ７．４の溶液を、０．２μｍフィルタで滅菌濾過した。
【０１６２】
ＰＭ２５培地：大腸菌のためのＰＭ２５最小産生培地は、１リットルあたり以下を含有していた：６３６ｍＬの滅菌蒸留した脱イオン水；２．０ｍＬの１００Ｘ微量金属原料；１００ｍＬの１０Ｘ  ＰＭリン酸塩非含有塩；２．０ｍＬの２Ｍ  ＭｇＳＯ４；５０ｍＬの５００ｇ／Ｌグルコース５０ｍＬ；２００ｍＬの１Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．４；及び１０ｍＬの１ｍｇ／ｍＬチアミン。１００Ｘ微量金属原料は、１．０Ｌの蒸留した脱イオン水に、１０．０ｍＬの濃縮ＨＣｌ、５．０ｇのＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、１．００ｇのＦｅＣｌ３＊６Ｈ２Ｏ、０．０５ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、０．３ｇのＣｕＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＺｎＣｌ２、０．０２ｇのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、０．０１ｇのＨ３ＢＯ３、及び０．０４ｇのＭｎＣｌ２＊４Ｈ２Ｏを加え、０．２μｍフィルタで滅菌濾過することによって調製された。１０Ｘ  ＰＭリン酸塩非含有塩は、１．０Ｌの蒸留した脱イオン水に、３０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、及び１．５ｇクエン酸（無水）を加え、オートクレーブすることによって調製された。２Ｍ  ＭｇＳＯ４は、１．０Ｌの蒸留した脱イオン水に、２４０．０ｇの無水ＭｇＳＯ４を加え、０．２μｍフィルタで滅菌濾過することによって調製された。５００ｇ／Ｌグルコース溶液は、１．０Ｌの加熱され蒸留した脱イオン水に５００ｇの無水デキストロースを加え、０．２μｍフィルタで滅菌濾過することによって調製される。１Ｍ  ４‐モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液は、７００．０ｍＬの蒸留した脱イオン水に、２１０．０ｇのＭＯＰＳ及び３０．０ｍＬの５０％ＫＯＨ溶液を加えることによって調製された。ｐＨは撹拌しながら測定され、５０％ＫＯＨを、最終体積１．０Ｌまでの適量をゆっくりと添加することによって、ｐＨ７．４への最終調整が行われた。最終的なｐＨ７．４の溶液を、０．２μｍフィルタで滅菌濾過した。
【０１６３】
ＳＭ３培地：大腸菌のためのＳＭ３最小培地は、１リットルあたり以下を含有していた：５９６．２ｍＬの滅菌蒸留した脱イオン水：２．０ｍＬの１００Ｘ微量金属原料；１００ｍＬの１０Ｘクエン酸濃縮アンモニウム３０塩；３．６ｍＬのリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．８；２ｍＬの４０ｍＭ硫酸Ｆｅ（ＩＩ）；１．０ｍＬの２Ｍ  ＭｇＳＯ４；５．０ｍＬの１０ｍＭ  ＣａＳＯ４；９０ｍＬの５００ｇ／Ｌグルコース；２００ｍＬの１Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．４；及び０．２ｍＬの１ｍｇ／ｍＬチアミン；並びに１０．０ｇの１００ｇ／Ｌ酵母抽出物。１Ｌの１０Ｘクエン酸アンモニウム３０塩を、３０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４及び１．５ｇのクエン酸を水中で攪拌しながら混合することによって調製する。オートクレーブし、室温で保存する。１Ｍ  ３‐（Ｎ‐モルホリノ）プロパンスルホン酸カリウム（ＭＯＰＳ）を調製し、ＫＯＨ（〜４０ｍＬ）でｐＨ７．４に調整する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温において暗所で保存する。４９．７ｍＬの１．０Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４及び５０．３ｍＬの１．０Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４を混合することによって０．１  Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を調製し、超純水で最終体積１０００ｍＬに調整する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温において保存する。２Ｍ  ＭｇＳＯ４及び１０ｍＭ  ＣａＳＯ４溶液を調製する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温で保存する。以下を含有する、１０００ｍＬの１００Ｘ微量金属原料水溶液を調製する：１０ｍＬの濃縮Ｈ２ＳＯ４；０．６ｇのＣｏＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；５．０ｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ；０．６ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；０．２ｇのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ；０．１ｇのＨ３ＢＯ３；及び０．３ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温において暗所で保存する。新鮮な４０ｍＭ硫酸第一鉄７水和物水溶液を調製する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、１日後に廃棄する。チアミン‐ＨＣｌの５０ｇ／Ｌ溶液を調製する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、４℃で保存する。加熱しながら撹拌することによって、グルコースの５００ｇ／Ｌ溶液を調製する。冷却し、濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温で保存する。
【０１６４】
ＳＭ１０培地：大腸菌のためのＳＭ１０最小培地は、１リットルあたり以下を含有していた：５７４．３ｍＬの滅菌蒸留した脱イオン水：４．０ｍＬの１００Ｘ微量金属原料；１００ｍＬの１０Ｘ濃縮クエン酸アンモニウム９０塩；１０．０ｍＬのリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．８；４ｍＬの４０ｍＭ硫酸Ｆｅ（ＩＩ）；１．２５ｍＬの２Ｍ  ＭｇＳＯ４；６．２５ｍＬの１０ｍＭ  ＣａＳＯ４；９０ｍＬの５００ｇ／Ｌグルコース；２００ｍＬの１Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．４；及び０．２ｍＬの１ｍｇ／ｍＬチアミン；並びに１０．０ｇの１００ｇ／Ｌ酵母抽出物。１Ｌの１０Ｘクエン酸アンモニウム９０塩を、９０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４及び２．５ｇのクエン酸を混合することによって調製する。オートクレーブし、室温で保存する。４９．７ｍＬの１．０Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４及び５０．３ｍＬの１．０Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４を混合することによって０．１  Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を調製し、超純水で最終体積１０００ｍＬに調整する。１Ｍ  ３‐（Ｎ‐モルホリノ）プロパンスルホン酸カリウム（ＭＯＰＳ）を調製し、ＫＯＨ（〜４０ｍＬ）でｐＨ７．４に調整する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温において暗所で保存する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温において保存する。２Ｍ  ＭｇＳＯ４及び１０ｍＭ  ＣａＳＯ４溶液を調製する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温で保存する。以下を含有する、１０００ｍＬの１００Ｘ微量金属原料水溶液を調製する：１０ｍＬの濃縮Ｈ２ＳＯ４；０．６ｇのＣｏＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；５．０ｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ；０．６ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；０．２ｇのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ；０．１ｇのＨ３ＢＯ３；及び０．３ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温において暗所で保存する。新鮮な４０ｍＭ硫酸第一鉄７水和物水溶液を調製する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、１日後に廃棄する。チアミン‐ＨＣｌの５０ｇ／Ｌ溶液を調製する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、４℃で保存する。加熱しながら撹拌することによって、グルコースの５００ｇ／Ｌ溶液を調製する。冷却し、濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温で保存する。
【０１６５】
ＳＭ１０＋＋培地：大腸菌のためのＳＭ１０最小培地は、１リットルあたり以下を含有していた：５４９．３ｍＬの滅菌蒸留した脱イオン水：４．０ｍＬの１００Ｘ微量金属原料；１００ｍＬの１０Ｘクエン酸アンモニウム９０塩；１０．０ｍＬのリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．８；４ｍＬの４０ｍＭ硫酸Ｆｅ（ＩＩ）；１．２５ｍＬの２Ｍ  ＭｇＳＯ４；６．２５ｍＬの１０ｍＭ  ＣａＳＯ４；９０ｍＬの５００ｇ／Ｌグルコース；２００ｍＬの１Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．４；及び０．２ｍＬの１ｍｇ／ｍＬチアミン；並びに２５．０ｇの１００ｇ／Ｌ酵母抽出物；及び２５．０ｍＬの１００ｇ／Ｌカザミノ酸。１Ｌの１０Ｘ濃縮クエン酸アンモニウム９０塩を、９０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４及び２．５ｇのクエン酸を混合することによって調製する。オートクレーブし、室温で保存する。４９．７ｍＬの１．０Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４及び５０．３ｍＬの１．０Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４を混合することによって０．１  Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を調製し、超純水で最終体積１０００ｍＬに調整する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温において保存する。１Ｍ  ３‐（Ｎ‐モルホリノ）プロパンスルホン酸カリウム（ＭＯＰＳ）を調製し、ＫＯＨ（〜４０ｍＬ）でｐＨ７．４に調整する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温において暗所で保存する。２Ｍ  ＭｇＳＯ４及び１０ｍＭ  ＣａＳＯ４溶液を調製する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温で保存する。以下を含有する、１０００ｍＬの１００Ｘ微量金属原料水溶液を調製する：１０ｍＬの濃縮Ｈ２ＳＯ４；０．６ｇのＣｏＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；５．０ｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ；０．６ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；０．２ｇのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ；０．１ｇのＨ３ＢＯ３；及び０．３ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温において暗所で保存する。新鮮な４０ｍＭ硫酸第一鉄７水和物水溶液を調製する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、１日後に廃棄する。チアミン‐ＨＣｌの５０ｇ／Ｌ溶液を調製する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、４℃で保存する。加熱しながら撹拌することによって、グルコースの５００ｇ／Ｌ溶液を調製する。冷却し、濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温で保存する。
【０１６６】
ＦＧＭ３培地：大腸菌のためのＦＧＭ３培地は、１リットルあたり以下を含有していた：６３６．２ｍＬの滅菌蒸留した脱イオン水：２．０ｍＬの１００Ｘ微量金属原料；１００ｍＬの１０Ｘクエン酸アンモニウム２０塩；３．６ｍＬのリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．８；２ｍＬの４０ｍＭ硫酸Ｆｅ（ＩＩ）；１．０ｍＬの２Ｍ  ＭｇＳＯ４；５．０ｍＬの１０ｍＭ  ２Ｍ  ＣａＳＯ４；５０ｍＬの５００ｇ／Ｌグルコース；２００ｍＬの１Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．４；及び０．２ｍＬの１ｍｇ／ｍＬチアミン。１Ｌの１０Ｘ濃縮クエン酸アンモニウム２０塩を、２０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４及び１．５ｇのクエン酸を水中で攪拌しながら混合することによって調製する。オートクレーブし、室温で保存する。１Ｌの１０Ｘ濃縮クエン酸アンモニウム３０塩を、３０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４及び１．５ｇのクエン酸を水中で撹拌しながら混合することによって調製する。オートクレーブし、室温において保存する。４９．７ｍＬの１．０Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４及び５０．３ｍＬの１．０Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４を混合することによって０．１  Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を調製し、超純水で最終体積１０００ｍＬに調整する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温において保存する。２Ｍ  ＭｇＳＯ４及び１０ｍＭ  ＣａＳＯ４溶液を調製する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温で保存する。以下を含有する、１０００ｍＬの１００Ｘ  Ｔｒａｃｅ  Ｍｅｔａｌｓ  Ｓｔｏｃｋ水溶液を調製する：１０ｍＬの濃縮Ｈ２ＳＯ４；０．６ｇのＣｏＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；５．０ｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ；０．６ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；０．２ｇのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ；０．１ｇのＨ３ＢＯ３；及び０．３ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温において暗所で保存する。新鮮な４０ｍＭ硫酸第一鉄７水和物水溶液を調製する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、１日後に廃棄する。チアミン‐ＨＣｌの５０ｇ／Ｌ溶液を調製する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、４℃で保存する。加熱しながら撹拌することによって、グルコースの５００ｇ／Ｌ溶液を調製する。冷却し、濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温で保存する。
【０１６７】
ＦＧＭ１０培地：大腸菌のためのＦＧＭ１０培地は、１リットルあたり以下を含有していた：８２４．３ｍＬの滅菌蒸留した脱イオン水：４．０ｍＬの１００Ｘ微量金属原料；１００ｍＬの１０Ｘクエン酸アンモニウム９０塩；１０．０ｍＬのリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．８；４ｍＬの４０ｍＭ硫酸Ｆｅ（ＩＩ）；１．２５ｍＬの２Ｍ  ＭｇＳＯ４；６．２５ｍＬの１０ｍＭ  ２Ｍ  ＣａＳＯ４；５０ｍＬの５００ｇ／Ｌグルコース；及び０．２ｍＬの１ｍｇ／ｍＬチアミン。１Ｌの１０Ｘ濃縮クエン酸アンモニウム９０塩を、９０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４及び２．５ｇのクエン酸を混合することによって調製する。オートクレーブし、室温で保存する。１Ｌの１０Ｘ濃縮クエン酸アンモニウム９０塩を、９０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４及び２．５ｇのクエン酸を混合することによって調製する。オートクレーブし、室温において保存する。４９．７ｍＬの１．０Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４及び５０．３ｍＬの１．０Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４を混合することによって０．１  Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を調製し、超純水で最終体積１０００ｍＬに調整する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温において保存する。２Ｍ  ＭｇＳＯ４及び１０ｍＭ  ＣａＳＯ４溶液を調製する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温で保存する。以下を含有する、１０００ｍＬの１００Ｘ微量金属原料水溶液を調製する：１０ｍＬの濃縮Ｈ２ＳＯ４；０．６ｇのＣｏＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；５．０ｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ；０．６ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；０．２ｇのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ；０．１ｇのＨ３ＢＯ３；及び０．３ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温において暗所で保存する。新鮮な４０ｍＭ硫酸第一鉄７水和物水溶液を調製する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、１日後に廃棄する。チアミン‐ＨＣｌの５０ｇ／Ｌ溶液を調製する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、４℃で保存する。加熱しながら撹拌することによって、グルコースの５００ｇ／Ｌ溶液を調製する。冷却し、濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温で保存する。
【０１６８】
９６ＷＰＭ培地：大腸菌のための９６ＷＰＭ最小培地は、１リットルあたり以下を含有していた：５９６．２ｍＬの滅菌蒸留した脱イオン水：２．０ｍＬの１００Ｘ微量金属原料；１００ｍＬの１０Ｘクエン酸アンモニウム３０塩；３２ｍＬの４０ｍＭ硫酸Ｆｅ（ＩＩ）；２．０ｍＬの２Ｍ  ＭｇＳＯ４；５．０ｍＬの１０ｍＭ  ２Ｍ  ＣａＳＯ４；５０ｍＬの５００ｇ／Ｌグルコース；２００ｍＬの１Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．４；及び０．２ｍＬの１ｍｇ／ｍＬチアミン；並びに１０．０ｇの１００ｇ／Ｌ酵母抽出物。１Ｌの１０Ｘ濃縮クエン酸アンモニウム３０塩を、３０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４及び１．５ｇのクエン酸を水中で攪拌しながら混合することによって調製する。オートクレーブし、室温で保存する。１Ｍ  ３‐（Ｎ‐モルホリノ）プロパンスルホン酸カリウム（ＭＯＰＳ）を調製し、ＫＯＨ（〜４０ｍＬ）でｐＨ７．４に調整する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温において暗所で保存する。２Ｍ  ＭｇＳＯ４及び１０ｍＭ  ＣａＳＯ４溶液を調製する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温で保存する。以下を含有する、１０００ｍＬの１００Ｘ微量金属原料水溶液を調製する：１０ｍＬの濃縮Ｈ２ＳＯ４；０．６ｇのＣｏＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；５．０ｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ；０．６ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；０．２ｇのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ；０．１ｇのＨ３ＢＯ３；及び０．３ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温において暗所で保存する。新鮮な４０ｍＭ硫酸第一鉄７水和物水溶液を調製する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、１日後に廃棄する。チアミン‐ＨＣｌの５０ｇ／Ｌ溶液を調製する。濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、４℃で保存する。加熱しながら撹拌することによって、グルコースの５００ｇ／Ｌ溶液を調製する。冷却し、濾過滅菌（０．２ｕｍ）し、室温で保存する。
【０１６９】
抗生物質濃度：そうでないことが言明されていない限り、培地中の抗生物質の標準的な最終濃度は：カナマイシン（３５ｕｇ／ｍＬ）；アンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）；スペクチノマイシン（１００ｕｇ／ｍｌ）；クロラムフェニコール（２０ｕｇ／ｍｌ）；アンヒドロテトラサイクリン（５０ｎｇ／ｍｌ）；ゲンタマイシン（１０ｕｇ／ｍｌ）；ゼオシン（５０ｕｇ／ｍｌ）；ブラストサイジン（５０ｕｇ／ｍｌ）である。選択的抗生物質としてブラストサイジン又はゼオシンを使用する場合、低塩ＬＢ培地等の低塩培地が使用される。
【０１７０】
項ＶＩ：大腸菌における産生のためのプロトコル
振盪フラスコプロトコル‐１
生物学的産生を、リン酸塩を含まないＧＭ２５最小定義培地を用いて、５０ｍＬ規模で実証する。培養物を単一のコロニーから開始し、標準的な実施方法によって、３．２ｍＭリン酸塩及び適切な抗生物質を含有する５０ｍＬのＧＭ２５培地に入れ、２００ｒｐｍで回転させながら３０℃で１晩、静止相まで成長させる。各静止相培養物の光学密度（ＯＤ６００、光路長１ｃｍ）を測定し、培養物全体を５０ｍＬコニカルチューブに移し、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。ＧＭ２５培地の量を計算してペレットに添加することにより、各培養物について２０光学密度再懸濁液を生成する。この再懸濁液２．５ｍＬを、５０ｍＬのＰＭ２５培地及び適切な抗生物質に添加し、３つの２５０ｍＬ非バッフルフラスコに入れ、３０℃、２００ｒｐｍでインキュベートする。これらの培養物による細胞成長及び産生を監視するために、６００ｎｍでの光学密度測定（ＯＤ６００、光路長１ｃｍ）用に、試料（２ｍｌ）を指定の時点で回収する。試料を１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を分析物測定のために‐２０℃に保持する。接種４時間後に振盪インキュベータの温度を３７℃に変更することにより、培養物を産生へと移行させる。光学密度及び産物測定のために、この時点並びに接種後６時間、８時間及び２４時間において試料を収集する。
【０１７１】
振盪フラスコプロトコル‐２
生物学的産生を、リン酸塩を含まないＧＭ２５最小定義培地中で、５０ｍＬ規模で実証する。培養物を単一のコロニーから開始し、標準的な実施方法によって、３．２ｍＭリン酸塩及び適切な１つ又は複数の抗生物質を含有する５０ｍＬのＧＭ２５培地に入れ、２００ｒｐｍで回転させながら３７℃で１晩、静止相まで成長させる。各静止相培養物の光学密度（ＯＤ６００、光路長１ｃｍ）を測定し、培養物全体を５０ｍＬコニカルチューブに移し、４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。ＧＭ２５培地の量を計算してペレットに添加することにより、各培養物について２０光学密度再懸濁液を生成する。この再懸濁液２．５ｍＬを、５０ｍＬのＰＭ２５培地及び抗生物質に添加し、３つの２５０ｍＬ非バッフルフラスコに入れ、３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートする。これらの培養物による細胞成長及び産生を監視するために、６００ｎｍでの光学密度測定（ＯＤ６００、光路長１ｃｍ）用に、試料（２ｍｌ）を指定の時点で回収する。試料を１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を分析物測定のために‐２０℃に保持する。接種時に５０ｎｇ／ｍＬのアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）を用いて培養物を誘導することにより、培養物を産生へと移行させる。光学密度及び産物測定のために、この時点並びに接種後４時間及び２０時間において試料を収集した。
【０１７２】
９６ウェルプレートプロトコル‐１
生物学的産生を、最小培地中で、μＬ規模で実証する。複数のコロニーを用いて標準９６ウェルプレートの個々のウェルに接種し、必要に応じて適切な抗生物質を含む１５０μＬのＳＭ１０＋＋培地で充填した。プレートをサンドイッチカバー（Ｍｏｄｅｌ＃ＣＲ１５９６、エンジスクリーン（ＥｎｚｙＳｃｒｅｅｎ）社、オランダ、ハールレムから入手）で覆った。これらのカバーにより、インキュベーション中の蒸発による損失は確実に最小となる。十分な通気を保証するために、接種済みの９６ウェルプレート及びサンドイッチカバーを、温度３７℃、振盪速度１１００ｒｐｍに設定された小型振盪インキュベータ（ＶＷＲ  Ｃａｔａｌｏｇ＃１２６２０‐９４２、ＶＷＲインターナショナルＬＬＣ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＬＣ．）社、米国ペンシルバニア州ラドナー）内の所定の位置へとクランプ固定した。使用したプレートクランプは、エンジスクリーン（Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ）（Ｍｏｄｅｌ＃ＣＲ１６００、エンジスクリーン（ＥｎｚｙＳｃｒｅｅｎ）社、オランダ、ハールレム）から入手した。重要なことには、使用した振盪器は、０．１２５インチ、即ち３ｍｍの軌道を有していた。軌道と最小振盪速度とのこの組み合わせは、必要な物質移動係数を得るため、及び十分な培養物の酸素化を可能とするために必要である。培養物を１６時間成長させた。
【０１７３】
１６時間の成長後、１０μＬの試料を採取して、６００ｎｍ（ＯＤ（６００ｎｍ））での光学密度を測定した。これは、プレート分光光度計を用いて実施された。１晩経ったこの時点での細胞密度は５〜１５ＯＤ（６００ｎｍ）であることが多い。各ウェル内の１００μＬの１晩成長させた培養物からの細胞を、遠心分離によってペレット化し、過剰な培地を除去し、細胞を、リン酸塩を含有しない１５０μＬの９６ＷＰＭ中で再懸濁した。続いて細胞を再びペレット化し、過剰な培地を再び除去した。１晩測定した光学密度を用いて、十分に新鮮な９６ＷＰＭを各ウェルに添加し、再懸濁すると、２０の最終ＯＤ（６００ｎｍ）が得られた。ＯＤ（６００ｎｍ）＝２０の平準化及び洗浄された培養物７．５μＬを用いて、新たな標準９６ウェルプレートのウェル中の１５０μＬの新鮮な９６ＷＰＭ及び適切な抗生物質に接種した。プレートをサンドイッチカバー（Ｍｏｄｅｌ  ＃ＣＲ１５９６、エンジスクリーン（ＥｎｚｙＳｃｒｅｅｎ）社、オランダ、ハールレムから入手）で覆い、温度３７℃、振盪速度１１００ｒｐｍに設定されたＭｉｎｉ  Ｓｈａｋｉｎｇ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ  （ＶＷＲ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃  １２６２０‐９４２，ＶＷＲインターナショナルＬＬＣ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＬＣ．）社、米国ペンシルバニア州ラドナー）内の所定の位置へとクランプ固定した。使用したプレートクランプは、エンジスクリーン（ＥｎｚｙＳｃｒｅｅｎ）（Ｍｏｄｅｌ  ＃ＣＲ１６００、エンジスクリーン（ＥｎｚｙＳｃｒｅｅｎ）社、オランダ、ハールレム）から入手した。培養物を２４時間インキュベートした。産生の１６、２４時間後、各ウェルからの１００μＬの試料を遠心分離によってペレット化し、後続の分析のために上清を収集した。
【０１７４】
Ｍｉｃｒｏ２４プロトコル‐１
生物学的産生を、最小培地中で、ｍＬ規模で実証する。以下のようにして培養種を調製した。コロニーを用いて、必要に応じて適切な抗生物質を含む４ｍＬのＳＭ１０培地に接種し、滅菌された１４ｍＬの培養管に入れた。培養管を、２２５ｒｐｍの標準的なフロアモデル振盪インキュベータ中で、３７℃において１晩インキュベートした。１晩の成長後、２．５ｍＬのこれらの培養物を用いて、セルスター（Ｃｅｌｌｓｔａｒ）（商標）細胞培養フラスコ（ＶＷＲ  Ｃａｔａｌｏｇ＃８２０５０‐８５６、ＶＷＲインターナショナルＬＬＣ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＬＣ．）社、米国ペンシルバニア州ラドナー）等の、容積２５０ｍＬの使い捨ての滅菌された長方形細胞培養フラスコ中で、新鮮なＳＭ１０培地及び必要に応じて適切な抗生物質に５０ｍＬを接種した。これらの種培養物を、２２５ｒｐｍの標準的なフロアモデル振盪インキュベータ中で、３７℃においてインキュベートした。試料を数時間毎に採取し、光学密度（ＯＤ（６００ｎｍ））が４〜１０の範囲のＯＤ（６００ｎｍ）に到達するまで、光学密度（ＯＤ（６００ｎｍ））によって成長を測定した。この時点で、細胞を遠心分離によって採集し、過剰な培地を除去し、新鮮なＳＭ１０培地中で再懸濁して、最終ＯＤ（６００ｎｍ）１０を得た。５００μＬの洗浄及び平準化された細胞を、水中の３０％滅菌グリセロール５００μＬに添加し、混合し、超低温冷凍器内においてマイナス８０℃でクライオバイアル（種バイアル）中で冷凍した。
【０１７５】
Ｍｉｃｒｏ２４（商標）マイクロリアクタシステム（ポールコーポレーション（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）社、米国ペンシルバニア州エクストン）を用いて、株をｍＬ規模で評価した。Ｐａｌｌ２４ウェルＰＥＲＣカセット（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ＃ＭＲＴ‐ＰＲＣ）を、細胞成長及び産生のために、ステンレス鋼チェックバルブキャップ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ＃ＭＲＴ‐ＣＡＰ‐Ｅ２４）と共に使用した。実験プロトコルは、初期体積３ｍＬのＦＧＭ３培地、必要に応じて適切な抗生物質、及び１０００ｒｐｍの撹拌に設定した。ｐＨ制御は最初はオフとした。温度は、環境温度３５℃で３７℃に制御した。酸素制御は最初はオフとし、監視できるようにした。冷凍された種バイアルを氷上で解凍させ、１５０μＬを用いて、各Ｍｉｃｒｏ２４カセットウェル中にそれぞれ３ｍＬの培養物を接種した。接種時に及び等間隔で試料を収集した。試料の光学密度を６００ｎｍで測定し、以下に説明するように、ＹＳＩ生化学分析機を用いてグルコースを測定した。更に、後続の分析のために上清を収集した。６００ｎｍにおいて測定された培養物の光学密度が１．０を超えた時点で、ｐＨ制御をオンにした。加圧水酸化アンモニウムガスを用いてｐＨ制御を達成した。更に、溶解した酸素が６０％未満に達した場合に、酸素制御をオンにした。滅菌された５００ｇ／Ｌ原料溶液を用いて、１０ｇ／Ｌのグルコースボーラスを、接種後２４時間及び４８時間の両方において添加した。
【０１７６】
１Ｌ発酵プロトコル‐１
生物学的産生を、最小培地中で、Ｌ規模で実証する。以下のようにして培養種を調製した。コロニーを用いて、必要に応じて適切な抗生物質を含む４ｍＬのＳＭ１０培地に接種し、滅菌された１４ｍＬの培養管に入れた。培養管を、２２５ｒｐｍの標準的なフロアモデル振盪インキュベータ中で、３７℃において１晩インキュベートした。１晩の成長後、２．５ｍＬのこれらの培養物を用いて、セルスター（Ｃｅｌｌｓｔａｒ）（商標）細胞培養フラスコ（ＶＷＲ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃  ８２０５０‐８５６、ＶＷＲインターナショナルＬＬＣ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＬＣ．）社、米国ペンシルバニア州ラドナー）等の、容積２５０ｍＬの使い捨ての滅菌された長方形細胞培養フラスコ中で、新鮮なＳＭ１０培地及び必要に応じて適切な抗生物質に接種した。これらの種培養物を、２２５ｒｐｍの標準的なフロアモデル振盪インキュベータ中で、３７℃においてインキュベートした。試料を数時間毎に採取し、光学密度（ＯＤ（６００ｎｍ））が４〜１０の範囲のＯＤ（６００ｎｍ）に到達するまで、光学密度（ＯＤ（６００ｎｍ））によって成長を測定した。この時点で、細胞を遠心分離によって採集し、過剰な培地を除去し、新鮮なＳＭ１０培地中で再懸濁して、最終ＯＤ（６００ｎｍ）１０を得た。３．５ｍＬの洗浄及び平準化された細胞を、水中の３０％滅菌グリセロール３．５ｍＬに添加し、混合し、超低温冷凍器内においてマイナス８０℃でクライオバイアル（種バイアル）中で冷凍した。
【０１７７】
空気、酸素及び窒素ガス用に構成された３つのガス接続マスフローコントローラを含む、インフォス‐ＨＴマルチファイア（ローレル（Ｌａｕｒｅｌ）社、米国メリーランド州）並列バイオリアクタシステムを用いて、１Ｌ発酵を実施した。使用した容器の総容積は１４００ｍＬであり、作業容積は最大１Ｌであった。オンラインｐＨ及びｐＯ２監視及び制御は、ハミルトンプローブを用いて達成した。オフガス分析は、多重化ブルー・イン・ワン  ブルーセンス（Ｂｌｕｅ‐ｉｎ‐Ｏｎｅ  ＢｌｕｅＳｅｎｓ）ガス分析器（ブルーセンス（ＢｌｕｅＳｅｎｓ）社、米国イリノイ州ノースブルック）を用いて達成した。オプテック（Ｏｐｔｅｋ）２２５ｍｍＯＤプローブ（オプテック（Ｏｐｔｅｋ）社、米国ウィスコンシン州ジャーマンタウン）を用いて、培養物密度を絶えず監視した。使用したシステムは、ＩｒｉｓＶ６．０命令及び制御ソフトウェアを実行し、ＦＩＳＰセルフリーサンプリングプローブ、Ｓｅｇｍｏｄ４８００及びＦｌｏｗＦｒａｃｔｉｏｎ９６ウェルプレートフラクションコレクタを含むＳｅｇ‐ｆｌｏｗ自動サンプリングシステム（フローナミックス（Ｆｌｏｗｎａｍｉｃｓ）社、米国カリフォルニア州ロデオ）と統合されていた。
【０１７８】
タンクを、最終大腸菌バイオマス濃度を１０ｇ乾燥細胞重量／リットル付近に標的化するために十分なリン酸塩を含む８００ｍＬのＦＧＭ１０培地で充填した。抗生物質を適宜添加した。冷凍された種バイアルを氷上で解凍させ、種培養物７ｍＬを用いて、上記タンクに接種した。接種後、水酸化ナトリウムの１０Ｍ溶液を滴定剤として用いて、３７℃及びｐＨ６．８に制御した。以下の酸素制御スキームを用いて、溶解酸素を設定点２５％に維持した。まず、ガス流量を、最小値である空気０．３Ｌ／分から空気０．８Ｌ／分まで増大させ、その後、より多くの通気が必要である場合は、最小値である３００ｒｐｍから最大値である１０００ｒｐｍまで撹拌を増大させた。最後に、２５％の設定点に到達するために更なる酸素が必要である場合には、一体型のマスフローコントローラを用いた酸素補充を含めた。撹拌が８００ｒｐｍに達すると、一定濃度の滅菌濾過グルコース原料（５００ｇ／Ｌ）を、２ｍＬ／時間の速度でタンクに添加した。発酵の実施を７０時間まで延長し、試料を２〜４時間毎に自動的に回収した。その後の分析のために試料を保存した。
【０１７９】
項ＶＩＩ：分析方法
予想される全ての代謝物及び産物に関して、分析方法を開発した。
【０１８０】
有機酸及びアミノ酸の定量
有機酸及びアミノ酸を同時に定量するために、逆相ＵＰＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ法を開発した。クロマトグラフィ分離を、４５℃において、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＣＳＨ  Ｃ１８カラム（１００ｍｍ×２．１ｉ．ｄ．、１．７μｍ；Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、米国マサチューセッツ州ミルフォード）を用いて行った。以下の溶離液を使用した：溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．２％ギ酸及び０．０５％アンモニウム（ｖ／ｖ）；溶媒Ｂ：ＭｅＯＨ、０．１％ギ酸及び０．０５％アンモニウム（ｖ／ｖ）。勾配溶出は：均一濃度５％のＢで０〜０．２分、５％から９０％へ線形上昇するＢで０．２〜１．０分、均一濃度９０％のＢで１．０〜１．５分、９０％〜５％へ線形低下するＢで１．５〜１．８分であり、カラム平衡のための初期条件の５％のＢについては１．８〜３．０分であった。流量は０．４ｍｌ／分で一定のままであった。５μｌの試料注入体積を使用した。ＵＰＬＣ法の開発は、分析物の標準原料水溶液を用いて実施した。分離は、Ｘｅｖｏ（商標）ＴＱＤ質量分光測定器と一体化されたＡｃｑｕｉｔｙ  Ｈ‐Ｃｌａｓｓ  ＵＰＬＣ（ウォーターズコーポレーション（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）社、米国マサチューセッツ州ミルフォード）を用いて行った。ＭＲＭ遷移を含むＭＳ／ＭＳパラメータは、各分析物について調整され、以下の表６に列挙されている。濃度３６ｍｇ／Ｌのアジピン酸を、全ての試料の平準化のための内部標準として使用した。Ｍａｓｓ  Ｌｙｎｘ  ｖ４．１ソフトウェアを用いて、ピーク積分及び更なる分析を実施した。全ての代謝物の線形範囲は２〜５０ｍｇ／Ｌであった。正確な線形範囲内となるように、必要に応じて試料を希釈した。
【０１８１】
表６：ＭＳ／ＭＳパラメータ
【表１１】
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【０１８２】
質量分光測定を用いた２，３‐ブタンジオールの定量
２，３‐ブタンジオール（２，３‐ＢＤＯ）の定量のために、高速ＵＰＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ法を開発した。クロマトグラフィ分離を、４５℃において、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（５０ｍｍ×２．１ｉ．ｄ．、１．７μｍ；ウォーターズコーポレーション（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）社、米国マサチューセッツ州ミルフォード）を用いて行った。０．１％ギ酸及び０．０５％アンモニウム（ｖ／ｖ）を含むイソプロパノールを、均一濃度分離に使用した。５μｌの試料注入体積を使用した。ＵＰＬＣ法の開発は、分析物の標準原料水溶液を用いて実施した。分離は、Ｘｅｖｏ（商標）ＴＱＤ質量分光測定器と一体化されたＡｃｑｕｉｔｙ  Ｈ‐Ｃｌａｓｓ  ＵＰＬＣ（ウォーターズコーポレーション（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）社、米国マサチューセッツ州ミルフォード）を用いて行った。２，３‐ＢＤＯに関する９０．９７２→５５．０７４のＭＲＭ遷移を、ＥＳＩ＋モードで動作するコーン電圧１６Ｖ及び衝突エネルギ１０Ｖと共に用いた。濃度３６ｍｇ／Ｌのアジピン酸を、全ての試料の平準化のための内部標準として使用した。アジピン酸は、ＥＳＩ‐モードにおいて、１４４．７７→８２．９６のＭＲＭ遷移、３２Ｖのコーン電圧及び１２Ｖの衝突エネルギを用いて測定した。Ｍａｓｓ  Ｌｙｎｘ  ｖ４．１ソフトウェアを用いて、ピーク積分及び更なる分析を実施した。
【０１８３】
屈折率を用いたジオールの定量
２，３‐ブタンジオール立体異性体の定量のために、確証的ＨＰＬＣ法を開発した。バイオラッド・アミネックス（Ｂｉｏｒａｄ  Ａｍｉｎｅｘ）ＨＰＸ‐８７Ｈカラム（３００×７．８ｍｍ、１．７μｍ；バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）社、米国カリフォルニア州ハーキュレス）を用いてクロマトグラフィ分離を行った。均一濃度分離は、移動相として５ｍＭ硫酸を用いて、室温で行った。流量は、注入後４０分に亘って、０．４ｍｌ／分で一定のままであった。１０μｌの試料注入体積を使用した。方法の開発は、分析物の標準原料水溶液を用いて行った。分離は、ＥＳＡＴ／ＩＮ屈折率（ＲＩ）検出器と一体化されたＡｃｑｕｉｔｙ  Ｈ‐Ｃｌａｓｓ  ＵＰＬＣ（ウォーターズコーポレーション（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）社、米国マサチューセッツ州ミルフォード）を用いて実施した。メソ‐２，３‐ブタンジオールは２４．９分において溶出し、（Ｒ，Ｒ）‐２，３‐ブタンジオールは２６．３分において溶出した。Ｍａｓｓｌｙｎｘ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ４．１を使用してピーク積分した。
【０１８４】
グルコースの定量
ＹＳＩ生化学分析器モデル２９５０Ｍ（ＹＳＩインコーポレイテッド（ＹＳＩ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）社、米国オハイオ州イエロースプリングス）を用いて、グルコース濃度及びエタノールを慣用の方法で測定した。上記機器は、製造元の説明書に従って使用され、全ての試薬はＹＳＩから供給されたものを用いた。
〔付記１〕
代謝フラックスに関与する少なくとも１つのタンパク質の制御下プロテオリシス性不活性化によって、代謝フラックスが制御可能な様式で再分配される、遺伝子修飾された微生物。
〔付記２〕
ａ）代謝フラックスに関与する少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現の制御下サイレンシング；及び
ｂ）代謝フラックスに関与する少なくとも１つのタンパク質の制御下プロテオリシス性不活性化
の組み合わせによって、代謝フラックスが制御可能な様式で再分配される、遺伝子修飾された微生物。
〔付記３〕
前記代謝フラックスに関与する遺伝子は、成長に必須の酵素をエンコードし、
前記代謝フラックスに関与するタンパク質は、成長に必須の酵素である、付記１又は２に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記４〕
前記遺伝子発現の制御下サイレンシングは、少なくとも１つのサイレンシングＲＮＡの制御下発現を含む、付記２又は３に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記５〕
前記遺伝子発現の制御下サイレンシングは、転写サイレンシングを含み、
前記転写サイレンシングは、転写の少なくとも１つのリプレッサの発現を含む、付記２又は３に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記６〕
前記遺伝子発現の制御下サイレンシングは、転写サイレンシングを含み、
前記転写サイレンシングは、ＣＲＩＳＰＲ干渉、少なくとも１つのターゲッティング小型ガイドＲＮＡの発現、及びカスケードタンパク質又はカスケードタンパク質複合体の発現を含む、付記２又は３に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記７〕
前記プロテオリシス性不活性化は：
ｉ）前記代謝フラックスに関与するタンパク質に対するペプチド配列の付加；及び
ｉｉ）前記ペプチド配列を認識する少なくとも１つのプロテアーゼの制御下発現
を含む、付記１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記８〕
前記プロテオリシス性不活性化は：
ｉ）前記代謝フラックスに関与するタンパク質に対するペプチド配列の付加；及び
ｉｉ）前記ペプチド配列に結合する少なくとも１つのタンパク質の制御下発現
を含み、
前記ペプチド配列への前記タンパク質の前記結合は、少なくとも１つのプロテアーゼによる、前記代謝フラックスに関与するタンパク質の分解を引き起こす、付記１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記９〕
前記プロテアーゼの制御下発現は、前記ペプチド配列の切断を引き起こし、
前記ペプチド配列に結合する前記タンパク質は、切断された前記ペプチド配列に結合して、少なくとも１つのプロテアーゼによる、前記代謝フラックスに関与するタンパク質の分解を引き起こす、付記８に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記１０〕
前記制御下遺伝子サイレンシング及び／又は前記制御下タンパク質分解は、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超及び１００％超からなる群から選択される量の、代謝フラックス分配の変化を引き起こす、付記１〜９のいずれか１項に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記１１〕
前記代謝フラックスの分配の変化は、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超及び１００％超からなる群から選択される量の、所望の産物の産生速度の変化に対応する、付記１０に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記１２〕
付記１〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子修飾された微生物の使用を含む、バイオプロセスであって、
遺伝子発現の制御下サイレンシング及び／又は制御下プロテオリシス性不活性化は、化学誘導物質の添加を含む、バイオプロセス。
〔付記１３〕
付記１〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子修飾された微生物の使用を含む、バイオプロセスであって、
遺伝子発現の制御下サイレンシング及び／又は制御下プロテオリシス性不活性化は、栄養素の制限を含む、バイオプロセス。
〔付記１４〕
前記栄養素の制限は、無機リン酸塩の制限を含む、付記１３に記載のバイオプロセス。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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