(57)【要約】      （修正有）【課題】抗ＬＯＸ１抗体などのＬＯＸ１（ＬＯＸ１）結合タンパク質、並びにこれらの結合タンパク質を作製するための組成物及び方法を提供する。【解決手段】特定の態様において、本明細書に提供されるＬＯＸ１結合タンパク質はＬＯＸ１活性を阻害し、又はアンタゴナイズする。加えて、本開示は、アテローム性動脈硬化症、血栓症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、虚血（例えば心筋虚血）、梗塞（例えば心筋梗塞）、急性冠症候群（ＡＣＳ）、脳卒中、再灌流傷害、再狭窄、末梢血管疾患、高血圧、心不全、炎症（例えば慢性炎症）、血管新生、子癇前症、癌に関連する病態並びに他のＬＯＸ１媒介性疾患及び病態を診断及び治療するための組成物及び方法を提供する。【選択図】図１−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４、１９〜２９、４１、又は４８〜５４と少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；及び配列番号３３、３６、３７、５８又は６５〜７０と少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
【請求項２】
配列番号４、１９〜２９、４１、又は４８〜５４を含むＶＨからなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号３３、３６、３７、５８又は６５〜７０を含むＶＬからなる群から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
【請求項３】
一組の相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖可変領域（ＶＨ）−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質であって、
（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１がアミノ酸配列：
Ｅ  Ｌ  Ｓ  Ｍ  Ｈ（配列番号１）を含み、
（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２がアミノ酸配列：
Ｇ  Ｆ  Ｄ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  ＨＸ1  ＨＸ2  ＨＸ3  ＨＸ4  ＨＸ5  ＨＸ6  Ｑ  Ｋ  Ｆ  Ｑ  Ｇ（配列番号７１）を含み
（式中、ＨＸ１は、Ｇ、Ｗ、Ｙ及びＦからなる群から選択され、
ＨＸ２は、Ｅ、Ｔ、Ｑ、Ｋ、Ａ、及びＳからなる群から選択され、
ＨＸ３は、Ｔ、Ｙ、Ｉ、及びＮからなる群から選択され、
ＨＸ４は、Ｉ、Ａ、Ｒ及びＨからなる群から選択され、
ＨＸ５は、Ｙ、Ｖ、Ｔ、Ｌ及びＱからなる群から選択され、及び
ＨＸ６は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｓ及びＨからなる群から選択される）、
（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３がアミノ酸配列：
ＨＸ7  ＨＸ8  Ｇ  ＨＸ9  ＨＸ10  ＨＸ11  ＨＸ12  Ｇ  Ｖ  Ｒ  Ｇ  Ｗ  Ｄ  Ｙ  Ｙ  Ｙ  Ｇ  Ｍ  Ｄ  Ｖ（配列番号７２）を含み
（式中、ＨＸ７は、Ｐ、Ｓ及びＶからなる群から選択され、
ＨＸ８は、Ｎ、Ｗ、Ｄ、及びＴからなる群から選択され、
ＨＸ９は、Ｑ、Ｒ及びＴからなる群から選択され、
ＨＸ１０は、Ｑ及びＨからなる群から選択され、
ＨＸ１１は、Ｇ及びＱからなる群から選択され、及び
ＨＸ１２は、Ｋ及びＧからなる群から選択される）、
（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１がアミノ酸配列：
Ｔ  Ｇ  Ｓ  Ｓ  Ｓ  Ｎ  Ｉ  Ｇ  Ａ  Ｇ  Ｙ  Ｄ  Ｖ  Ｈ（配列番号３０）を含み、
（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２がアミノ酸配列：
Ｇ  Ｎ  Ｓ  Ｎ  Ｒ  Ｐ  Ｓ（配列番号３１）を含み、及び
（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３がアミノ酸配列：
Ｑ  Ｓ  Ｙ  Ｄ  Ｓ  ＬＸ1  ＬＸ2  ＬＸ3  ＬＸ4  ＬＸ5  ＬＸ6（配列番号７３）を含み
（式中、ＬＸ１は、Ｍ及びＳからなる群から選択され、
ＬＸ２は、Ｌ、Ｙ及びＨからなる群から選択され、
ＬＸ３は、Ｓ及びＲからなる群から選択され、
ＬＸ４は、Ａ及びＧからなる群から選択されるか又は省略され（アミノ酸無し）、
ＬＸ５は、Ｗ及びＦからなる群から選択され、及び
ＬＸ６は、Ｖ、Ｇ及びＡからなる群から選択される）、
前記ＬＯＸ１結合タンパク質がＬＯＸ１活性を低減し、阻害し、又はアンタゴナイズする、
単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質と同じエピトープに結合する単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質とＬＯＸ１に対する結合に関して競合する単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
【請求項６】
前記ＬＯＸ１結合タンパク質が抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
【請求項７】
前記抗体が、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、又はＬＯＸ１結合抗体断片である、請求項６に記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
【請求項８】
前記ＬＯＸ１結合抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、又は一本鎖抗体分子からなる群から選択される、請求項７に記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
【請求項９】
前記抗体が、
（ａ）ヒトＩｇＡ定常ドメイン、
（ｂ）ヒトＩｇＤ定常ドメイン、
（ｃ）ヒトＩｇＥ定常ドメイン、
（ｄ）ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、
（ｅ）ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、
（ｆ）ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、
（ｇ）ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、及び
（ｈ）ヒトＩｇＭ定常ドメイン、
からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを更に含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
【請求項１０】
前記抗体が、
（ａ）ヒトＩｇκ定常ドメイン、及び
（ｂ）ヒトＩｇλ定常ドメイン、
からなる群から選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを更に含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
【請求項１１】
前記ＬＯＸ１結合タンパク質が、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン及びヒトλ軽鎖定常ドメインを更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
【請求項１２】
前記ＩｇＧ１重鎖定常ドメインが、２３４位、２３５位及び３３１位（これらの位置の付番はＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスに従う）に突然変異を含有する、請求項１１に記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
【請求項１３】
前記ＩｇＧ１重鎖定常ドメインが、突然変異Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓ（これらの位置の付番はＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスに従う）を含有する、請求項１２に記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＬＯＸ１結合タンパク質をコードする単離核酸分子又は一組の核酸分子。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１４に記載の核酸分子で形質転換された宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＬＯＸ１結合タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項１８】
ＬＯＸ１に関連する疾患又は病態を治療するための医薬の製造における、請求項１７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１９】
前記疾患又は病態が、アテローム性動脈硬化症、血栓症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、虚血（例えば心筋虚血）、梗塞（例えば心筋梗塞）、急性冠症候群（ＡＣＳ）、脳卒中、再灌流傷害、再狭窄、末梢血管疾患、高血圧、心不全、炎症（例えば慢性炎症）、血管新生、子癇前症及び癌からなる群から選択される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＬＯＸ１結合タンパク質、又は請求項１７に記載の医薬組成物の有効量を含む、対象のＬＯＸ１活性を低減し、又は阻害するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１４年１０月１日に出願された米国仮特許出願第６２／０５８，２５４号明細書の利益を主張するものであり、この仮特許出願は全体として参照により本明細書に援用される。
【０００２】
電子的に提出された配列表の参照
本願の出願と共にＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：ＬＯＸ１−１００ＷＯ１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ａｓｃｉｉ．ｔｘｔ；サイズ：５０，９２６バイト；及び作成日：２０１５年９月３０日）で電子的に提出された配列表の内容は、全体として参照により本明細書に援用される。
【０００３】
本開示は、例えば、血管機能不全、アテローム性動脈硬化症（プラーク進展、破裂及び／又は血栓症）、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、虚血（例えば心筋虚血）、梗塞（例えば心筋梗塞）、脳卒中及び急性冠症候群（ＡＣＳ）を例えば含むＬＯＸ１に関連する疾患又は病態を治療し、予防し、及び／又は改善するための、レクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体１（ＬＯＸ１）結合タンパク質及びかかる結合タンパク質の使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
アテローム性動脈硬化症は、動脈壁に脂質、マクロファージ及び線維要素が病変として蓄積することによって生じる複合疾患である。この病変が複合プラークに発達して、動脈管腔が狭小化し、慢性炎症の病巣となる。プラークは破裂を起こし易く、脳卒中及び心筋梗塞を含めた有害な心血管イベントにつながる血栓症を惹起する。アテローム性動脈硬化症は冠動脈疾患、脳卒中及び末梢血管疾患の主因であり、従って世界的に最も多く見られる罹患原因に相当する（世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）２０１１年）。
【０００５】
レクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体１（ＬＯＸ１）は、ジスルフィド結合したＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＬＯＸ１は、初めは酸化低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）の主要な受容体として同定された（Ｋｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，７０ｔｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｅｓｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｅｒ．９６，１９９７）。この受容体は、短いＮ末端細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、ネックドメイン及びＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）からなり、ＣＴＬＤの構造は解かれている（Ｏｈｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １３：９０５−９１７（２００５））。加えて、ＬＯＸ１はネックドメインでタンパク質分解によって切断され、可溶性ＬＯＸ１（ｓＬＯＸ１）を放出し得る。ＬＯＸ１はクラスＥスカベンジャー受容体であり、ｏｘＬＤＬ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ホスファチジルセリン、終末糖化産物（ＡＧＥ）、スモールデンスリポタンパク質（ｓｄＬＤＬ）、酸化ＨＤＬ、Ｎ４−オキソノナノイルリジン（ＯＮＬ）、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、血小板、白血球及びアポトーシス細胞を含めた複数のリガンドに結合する。これらのリガンドの多く、特にｏｘＬＤＬは、アテローム性動脈硬化症に関連付けられている。ＲｈｏＡ／Ｒａｃ１、一酸化窒素、ｐ３８ＭＡＰＫ、プロテインキナーゼＢ及びＣ、ＥＲＫ１／２、及びＮＦκＢを含めて、複数のシグナル伝達経路がＬＯＸ１活性化に関連付けられている。例えば、Ｔａｙｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．４３（７）：７４０−５（２０１３）を参照のこと。
【０００６】
前臨床エビデンスによれば、ＬＯＸ１は、血管機能不全、プラーク進展、破裂及び血栓症、アテローム性動脈硬化症及び炎症状態の促進に関係している。例えば、Ｕｌｒｉｃｈ−Ｍｅｒｚｅｎｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ．１７（８）：９０５−１９（２０１３）を参照のこと。例えば、ＬＯＸ１ノックアウトマウスではアテローム性大動脈硬化症が軽減され、且つ血管壁コラーゲン沈着が減少しており（Ｍｅｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１００：１６３４−１６４２（２００７））、一方、ＬＯＸ１の過剰発現によりアテローム性動脈硬化プラークの形成が増加し（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９７：１７６−８４（２００５）；及びＷｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２０：３６９−７３（２０１１））、ここでＬＯＸ１発現は不安定プラークの肩に観察され、マクロファージ集積、アポトーシス、及びＭＭＰ−９発現が付随した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒ．Ｃａｒｄｉｏ．Ｉｍａｇｉｎｇ  ３：４６４−７２（２０１０））。中和ＬＯＸ１抗体によってアセチルコリン誘導性冠細動脈拡張が回復し（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２７（４）８７１−８７７（２００７））、ラットにおけるバルーン傷害後の内膜肥厚が減少した（Ｈｉｎａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．６９：２６３−７１（２００６））。ヒトにおけるＬＯＸ１発現は構成的でないが、炎症促進性刺激によって動的に誘導することが可能である。アテローム性動脈硬化プラークでは、ＬＯＸ１は内皮細胞、平滑筋細胞及びマクロファージに発現する。興味深いことに、血清中ｓＬＯＸ１が急性冠症候群（ＡＣＳ）患者におけるプラークの不安定性及び破裂の診断指標となること（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．５１：１５８−１６３（２０１０））；ＡＣＳの再発又は死亡の予測指標となること（Ｋｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，７０ｔｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｅｓｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｅｒ．９６，１９９７）が提案されており；及び複合病変数の増加に関連付けられている（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３４：１７２−１７７（２０１１））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
アテローム性動脈硬化症のリスク要因となる高血圧、糖尿病、脂質異常症及びライフスタイル特性（喫煙及び肥満など）がますます蔓延していることに起因して、アテローム性動脈硬化症に関連する死亡率は上昇の一途をたどっている。血小板阻害薬、降圧薬、ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害薬（スタチン）、血栓溶解剤、経皮的動脈拡張薬、ステント留置術又は冠動脈バイパス術を含めた標準ケア治療による介入は、多大な臨床的有益性をもたらしている。しかしながら、予防戦略及び治療の使用にも関わらず、なおも多数の患者に二次性主要有害心血管イベント（ＭＡＣＥ）が発生している。従って、単独で、又は標準ケアと組み合わせて使用し得る新規療法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、ＬＯＸ１結合タンパク質及びその使用方法を提供する。詳細な態様では、本明細書に開示されるＬＯＸ１結合タンパク質は、そのリガンドの１つ以上に対するＬＯＸ１結合を低減し、阻害し、又は遮断する。一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、酸化低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及び／又は終末糖化産物（ＡＧＥ）とのＬＯＸ１結合を低減し、阻害し、又は遮断する。一部の態様において、本開示は、ＬＯＸ１発現に関連する疾患又は病態を治療、予防及び／又は改善し、及び／又はＨＤＬ媒介性シグナル伝達を低減するためのＬＯＸ１結合タンパク質の使用方法を提供する。本開示はまた、急性冠症候群（ＡＣＳ）、心筋梗塞（ＭＩ）若しくは冠動脈疾患（ＣＡＤ）又はＡＣＳ、ＭＩ若しくはＣＡＤに関連する病態を治療、予防及び／又は改善するためのＬＯＸ１結合タンパク質の使用方法も提供する。一部の態様において、本開示は、限定はされないが、アテローム性動脈硬化症、血栓症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、虚血（例えば心筋虚血）、梗塞（例えば心筋梗塞）、急性冠症候群（ＡＣＳ）、脳卒中、再灌流傷害、再狭窄、末梢血管疾患、高血圧、心不全、炎症、血管新生、子癇前症及び癌を含む群から選択される疾患又は病態を治療、予防及び／又は改善するためのＬＯＸ１結合タンパク質の使用方法を提供する。
【０００９】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は一組の相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖可変領域（ＶＨ）−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで一組のＣＤＲは、（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し；（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２が配列番号５のアミノ酸配列を有し；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３が配列番号１４のアミノ酸配列を有し；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１が配列番号３０のアミノ酸配列を有し；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２が配列番号３１のアミノ酸配列を有し；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３が配列番号３２のアミノ酸配列を有する一組の参照ＣＤＲと同一であるか、又はそれと比べて合計１８個以下の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８個の）アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有する。
【００１０】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は一組の６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖可変領域（ＶＨ）−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで一組のＣＤＲは、（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し；（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２が配列番号２のアミノ酸配列を有し；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３が配列番号３のアミノ酸配列を有し；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１が配列番号３０のアミノ酸配列を有し；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２が配列番号３１のアミノ酸配列を有し；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３が配列番号３２のアミノ酸配列を有する一組の参照ＣＤＲと同一であるか、又はそれと比べて合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有する。
【００１１】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は一組の相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖可変領域（ＶＨ）−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、軽鎖可変領域（ＶＬ）−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで一組のＣＤＲは、（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１が配列番号３８のアミノ酸配列を有し；（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２が配列番号３９のアミノ酸配列を有し；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３が配列番号４０のアミノ酸配列を有し；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１が配列番号５５のアミノ酸配列を有し；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２が配列番号５６のアミノ酸配列を有し；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３が配列番号５７のアミノ酸配列を有する一組の参照ＣＤＲと同一であるか、又はそれと比べて合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有する。
【００１２】
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は一組の６個のＣＤＲ：ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで：（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１は配列番号１のアミノ酸配列を有し；（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２は配列番号２のアミノ酸配列を有し；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３は配列番号３のアミノ酸配列を有し；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１は配列番号３０のアミノ酸配列を有し；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２は配列番号３１のアミノ酸配列を有し；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３は配列番号３２のアミノ酸配列を有する。
【００１３】
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は一組の６個のＣＤＲ：ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで：（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１は配列番号３８のアミノ酸配列を有し；（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２は配列番号３９のアミノ酸配列を有し；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３は配列番号４４のアミノ酸配列を有し；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１は配列番号５５のアミノ酸配列を有し；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２は配列番号６０のアミノ酸配列を有し；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３は配列番号６１のアミノ酸配列を有する。
【００１４】
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は一組の６個のＣＤＲ：ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで：（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１は配列番号３８のアミノ酸配列を有し；（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２は配列番号３９のアミノ酸配列を有し；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３は配列番号４０のアミノ酸配列を有し；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１は配列番号５５のアミノ酸配列を有し；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２は配列番号５６のアミノ酸配列を有し；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３は配列番号５７のアミノ酸配列を有する。
【００１５】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４と少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は配列番号３３と少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００１６】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４１と少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するＶＨ及び／又は配列番号５８と少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するＶＬを含む。
【００１７】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４、１９〜２９、４１、又は４８〜５４と少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；及び配列番号３３、３６、３７、５８又は６５〜７０と少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００１８】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を有するＶＬ；及び（ｄ）配列番号５４のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号７０のアミノ酸配列を有するＶＬから選択されるＶＨ及びＶＬと少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）及び少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００１９】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここでＶＨ配列は、配列番号４、１９〜２８、又は２９の参照ＶＨ配列と同一であるか、又はそれと比べて合計１５個以下の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の）アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有し、及びＶＬ配列は、配列番号３３、３６又は３７の参照ＶＬ配列と同一であるか、又はそれと比べて６個以下の（例えば、１、２、３、４、５、又は６個の）アミノ酸置換、付加及び／又は欠失を有する。
【００２０】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４、１９〜２９、４１、又は４８〜５４を含むＶＨからなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）；及び配列番号３３、３６、３７、５８又は６５〜７０を含むＶＬからなる群から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００２１】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を有するＶＬ；及び（ｄ）配列番号５４のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号７０のアミノ酸配列を有するＶＬからなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００２２】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００２３】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ１と、配列番号２、５〜１２、又は１３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２と、配列番号３、１４〜１７又は１８のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３とを含むＶＨから選択される重鎖可変領域（ＶＨ）；及び配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１と、配列番号３１のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ２と、配列番号３２、３４又は３５のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３とを含むＶＬから選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００２４】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここでＶＨ配列は配列番号４１、４８〜５３又は５４の参照ＶＨ配列と同一であるか、又はそれと比べて合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有し、及びＶＬ配列は配列番号５８、６５〜６９又は７０の参照ＶＬ配列と同一であるか、又はそれと比べて合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失を有する。
【００２５】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ１と、配列番号３９、４２、又は４３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２と、配列番号４０、４４〜４６又は４７のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３とを含むＶＨから選択される重鎖可変領域（ＶＨ）；及び配列番号５５又は５９のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１と、配列番号５６又は６０のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ２と、配列番号５７、６１〜６３、又は６４のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３とを含むＶＬから選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００２６】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、表１、図４又は図５に記載されるとおりの一組のＣＤＲ：ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ３及びＶＬ−ＣＤＲ３（例えば、Ｌｏｘ５１４、ＬＸ５１４００１１、ＬＸ５１４００１４、ＬＸ５１４００１６、ＬＸ５１４００３８、ＬＸ５１４００９４、ＬＸ５１４０１０８、ＬＸ５１４０１１０、ＬＸ５１４００９２、ＬＸ５１４００９２＿Ｄ、ＬＸ５１４００９３、ＬＸ５１４００９３＿Ｄ、Ｌｏｘ６９６、ＬＸ６９６００６７＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６００７１＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６００７３＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６００８６＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６００９４＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６０１０１＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６０１０２＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６０１１６＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６００７３＿ｇｌ、又はＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂｓ＿ｇｌからの一組のＣＤＲ）を含む。
【００２７】
一部の更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、表１、図４又は図５に記載されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）（例えば、Ｌｏｘ５１４、ＬＸ５１４００１１、ＬＸ５１４００１４、ＬＸ５１４００１６、ＬＸ５１４００３８、ＬＸ５１４００９４、ＬＸ５１４０１０８、ＬＸ５１４０１１０、ＬＸ５１４００９２、ＬＸ５１４００９２＿Ｄ、ＬＸ５１４００９３、ＬＸ５１４００９３＿Ｄ、Ｌｏｘ６９６、ＬＸ６９６００６７＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６００７１＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６００７３＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６００８６＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６００９４＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６０１０１＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６０１０２＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６０１１６＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６００７３＿ｇｌ、又はＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂｓ＿ｇｌからのＶＨ及びＶＬ）を含む。
【００２８】
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は一組の相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖可変領域（ＶＨ）−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで：（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１はアミノ酸配列：Ｅ  Ｌ  Ｓ  Ｍ  Ｈ（配列番号１）を含み；（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２はアミノ酸配列：Ｇ  Ｆ  Ｄ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  ＨＸ１  ＨＸ２  ＨＸ３  ＨＸ４  ＨＸ５  ＨＸ６  Ｑ  Ｋ  Ｆ  Ｑ  Ｇを含み（式中、ＨＸ１は、Ｇ、Ｗ、Ｙ及びＦからなる群から選択され、ＨＸ２は、Ｅ、Ｔ、Ｑ、Ｋ、Ａ、及びＳからなる群から選択され、ＨＸ３は、Ｔ、Ｙ、Ｉ、及びＮからなる群から選択され、ＨＸ４は、Ｉ、Ａ、Ｒ及びＨからなる群から選択され、ＨＸ５は、Ｙ、Ｖ、Ｔ、Ｌ及びＱからなる群から選択され、及びＨＸ６は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｓ及びＨからなる群から選択される）（配列番号７１）；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３はアミノ酸配列：ＨＸ７  ＨＸ８  Ｇ  ＨＸ９  ＨＸ１０  ＨＸ１１  ＨＸ１２  Ｇ  Ｖ  Ｒ  Ｇ  Ｗ  Ｄ  Ｙ  Ｙ  Ｙ  Ｇ  Ｍ  Ｄ  Ｖを含み（式中、ＨＸ７は、Ｐ、Ｓ及びＶからなる群から選択され、ＨＸ８は、Ｎ、Ｗ、Ｄ、及びＴからなる群から選択され、ＨＸ９は、Ｑ、Ｒ及びＴからなる群から選択され、ＨＸ１０は、Ｑ及びＨからなる群から選択され、ＨＸ１１は、Ｇ及びＱからなる群から選択され、及びＨＸ１２は、Ｋ及びＧからなる群から選択される）（配列番号７２）；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１はアミノ酸配列：Ｔ  Ｇ  Ｓ  Ｓ  Ｓ  Ｎ  Ｉ  Ｇ  Ａ  Ｇ  Ｙ  Ｄ  Ｖ  Ｈ（配列番号３０）を含み；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２はアミノ酸配列：Ｇ  Ｎ  Ｓ  Ｎ  Ｒ  Ｐ  Ｓ（配列番号３１）を含み；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３はアミノ酸配列：Ｑ  Ｓ  Ｙ  Ｄ  Ｓ  ＬＸ１  ＬＸ２  ＬＸ３  ＬＸ４  ＬＸ５  ＬＸ６を含む（式中、ＬＸ１は、Ｍ及びＳからなる群から選択され、ＬＸ２は、Ｌ、Ｙ及びＨからなる群から選択され、ＬＸ３は、Ｓ及びＲからなる群から選択され、ＬＸ４は、Ａ及びＧからなる群から選択されるか又は省略され（アミノ酸無し）、ＬＸ５は、Ｗ及びＦからなる群から選択され、及びＬＸ６は、Ｖ、Ｇ及びＡからなる群から選択される）（配列番号７３）。
【００２９】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列を含むＬＯＸ−１結合タンパク質（例えばＬＯＸ−１抗体又はその断片）を含めた、表１、図４又は図５に示される重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＬＯＸ−１結合タンパク質（例えばＬＯＸ−１抗体又はその断片）と同じエピトープに結合する。
【００３０】
他の態様において、本開示は、配列番号４のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列を含むＬＯＸ−１結合タンパク質（例えばＬＯＸ−１抗体又はその断片）を含めた、表１、図４又は図５に示される重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＬＯＸ−１結合タンパク質（例えばＬＯＸ−１抗体又はその断片）とＬＯＸ１に対する結合に関して競合するか、又は交差競合するＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗体）を提供する。
【００３１】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列を含む抗体と同じエピトープに結合する。
【００３２】
他の態様において、本開示は、配列番号４のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列を含む抗体とＬＯＸ１に対する結合に関して競合するか、又は交差競合するＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗体）を提供する。
【００３３】
一部の態様において、本明細書に開示されるＬＯＸ１結合タンパク質はＬＯＸ１活性を低減し、阻害し又はアンタゴナイズする。一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、以下からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有する：（ａ）本明細書に開示されるアッセイ（例えば、実施例１０、アッセイ１、２及び／又は３又は実施例１１を参照）を含めた任意の好適なアッセイによって決定するとき、ＬＯＸ１に対するｏｘＬＤＬ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及び／又は終末糖化産物（ＡＧＥ）の結合を低減し、又は阻害する；（ｂ）本明細書に開示されるアッセイ（例えば、実施例１１を参照）を含めた任意の好適なアッセイによって決定するとき、細胞表面ＬＯＸ１を発現する内皮細胞のＲｈｏＡ／Ｒａｃ１、一酸化窒素（ＮＯ）、ｐ３８ＭＡＰＫ、プロテインキナーゼＢ及びＣ、ＥＲＫ１／２、及び／又はＮＦκＢシグナル伝達を低下させ、又は阻害する；（ｃ）本明細書に開示されるアッセイを含めた任意の好適なアッセイによって決定するとき、細胞表面ＬＯＸ１を発現する内皮細胞のカスパーゼ−８、カスパーゼ−９、及び／又はＢＡＸ活性を低下させ、又は阻害する；（ｄ）本明細書に開示されるアッセイ（例えば、実施例１０、アッセイ１、２及び／又は３又は実施例１１を参照）を含めた任意の好適なアッセイによって決定するとき、一塩基多型Ｋ１６７Ｎを有するＬＯＸ１に結合する；（ｅ）本明細書に開示されるアッセイ（例えば、実施例１０、アッセイ４又は実施例１１を参照）を含めた任意の好適なアッセイによって決定するとき、ｏｘＬＤＬインターナリゼーションを低下させ、又は阻害する；（ｆ）本明細書に開示されるアッセイ（例えば、実施例１０、アッセイ５又は実施例１１を参照）を含めた任意の好適なアッセイによって決定するとき、ｏｘＬＤＬ誘導性ＬＯＸ１シグナル伝達を低減し、又は阻害する；（ｇ）ＢＩＡＣＯＲＥ又はＫｉｎＥｘＡによって決定するとき約１５０ｐＭ〜約６００ｐＭ（例えば約４００ｐＭ）の解離定数（ＫＤ）でＬＯＸ１に結合する；（ｈ）ＢＩＡＣＯＲＥによって決定するとき約１×１０5Ｍ-1ｓ-1〜約６×１０6Ｍ-1ｓ-1（例えば約５×１０5Ｍ-1ｓ-1）のＫｏｎ速度でＬＯＸ１に結合する；及び（ｉ）ＢＩＡＣＯＲＥによって決定するとき約１×１０-4ｓ-1〜約３×１０-4ｓ-1（例えば約２．３×１０-4ｓ-1）のＫｏｆｆ速度でＬＯＸ１に結合する。
【００３４】
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は抗体である。一部の態様において、抗体は、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、又はＬＯＸ１結合抗体断片である。一部の態様において、抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、及び一本鎖抗体分子からなる群から選択されるＬＯＸ１結合抗体断片である。
【００３５】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、ＩｇＧ１重鎖免疫グロブリン定常領域を含む抗体である。一部の態様において、ＩｇＧ１定常領域は、エフェクター機能を低下させる突然変異を含む。更なる態様において、ＩｇＧ１定常領域は、エフェクターヌルＩｇＧ１をもたらす三重突然変異Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓを含む。
【００３６】
本開示は、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えばＬＯＸ−１抗体又はその断片）をコードする単離核酸又は一組の核酸を提供する。また、核酸又は一組の核酸を含むベクター又は一組のベクター、及び単離核酸又はベクターで形質転換された宿主細胞も提供される。一部の態様において、宿主細胞は、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ヒト細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類宿主細胞である。ＬＯＸ１結合タンパク質（例えばＬＯＸ−１抗体又はその断片）を産生する宿主細胞及びハイブリドーマもまた提供される。
【００３７】
本開示はまた、本明細書に開示されるＬＯＸ１結合タンパク質の作製方法も提供する。一部の態様において、本方法は、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えばＬＯＸ−１抗体又はその断片）の発現能を有する宿主細胞又はハイブリドーマを好適な条件下で培養するステップを含み、任意選択で、宿主細胞又はハイブリドーマから分泌されるＬＯＸ１結合タンパク質の単離方法を提供する。及び本開示は、更に、これらの方法を用いて単離されたＬＯＸ１結合タンパク質（例えばＬＯＸ−１抗体又はその断片）を提供する。
【００３８】
また、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えばＬＯＸ−１抗体又はその断片）と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物も提供される。対象における、例えば、アテローム性動脈硬化症、血栓症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、虚血（例えば心筋虚血）、梗塞（例えば心筋梗塞）、急性冠症候群（ＡＣＳ）、脳卒中、再灌流傷害、再狭窄、末梢血管疾患、高血圧、心不全、炎症（例えば慢性炎症）、血管新生、子癇前症及び／又は癌を含めた、ＬＯＸ１、ＬＯＸ１活性の上昇及び／又はＬＯＸ１発現レベルの上昇に関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法もまた本明細書に提供される。一部の態様において、本方法は、それを必要としている対象に、有効量のＬＯＸ１結合タンパク質を含む医薬組成物を投与するステップを含む。
【００３９】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は単独で投与される。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は併用療法として投与される。一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は標準ケア治療／療法に対する併用療法として投与される。
【００４０】
また、対象のＬＯＸ１活性を低減する方法であって、有効量のＬＯＸ１結合タンパク質を、それを必要としている対象に投与するステップを含む方法も提供される。
【００４１】
加えて、アテローム性動脈硬化症を治療し、予防し、及び／又は改善する方法が提供される。一部の例では、本方法は、アテローム性動脈硬化症を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質を投与される対象は、アテローム性動脈硬化症を発症するリスクがある。一部の態様において、対象はアテローム生成促進病態を有する。更なる態様において、アテローム生成促進病態は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、高血圧、高血糖、心不全、血管外傷、臓器移植、脂質異常症（例えば高脂血症）、炎症（例えば慢性炎症及びエンドトキシン誘導炎症）及び／又は細菌感染症である。また、アテローム性動脈硬化症を軽減する方法も提供される。一部の例では、本開示は、対象のアテローム性動脈硬化症を軽減する方法であって、アテローム性動脈硬化症を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質を投与するステップを含む方法を提供する。
【００４２】
また、血栓症を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供される。一部の例では、本方法は、血栓症を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質を投与される対象は、血栓症を発症するリスクがある。一部の態様において血栓症は動脈血栓症である。更なる態様において、血栓症は動脈血栓症である。
【００４３】
本開示はまた、冠動脈疾患（ＣＡＤ）又はＣＡＤに関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供する。一部の例では、本方法は、ＣＡＤを有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与される対象は、ＣＡＤを発症するリスクがある。一部の態様において、対象はアテローム生成促進病態を有する。更なる態様において、アテローム生成促進病態は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、高血圧、高血糖、心不全、血管外傷、臓器移植、脂質異常症（例えば高脂血症）、炎症（例えば慢性炎症及びエンドトキシン誘導炎症）及び／又は細菌感染症である。
【００４４】
本開示はまた、虚血又は虚血に関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供する。一部の例では、本方法は、虚血を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与される対象は、虚血を発症するリスクがある。一部の態様において、対象は心筋虚血を有する。他の態様において、対象は、心筋虚血を発症するリスクがある。更なる態様において、対象は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、高血圧、高血糖、心不全、血管外傷、臓器移植、脂質異常症（例えば高脂血症）、炎症（例えば慢性炎症及びエンドトキシン誘導炎症）及び／又は細菌感染症を有する。
【００４５】
また、梗塞又は梗塞に関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供される。一部の例では、本方法は、梗塞を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与される対象は、梗塞を発症するリスクがある。一部の態様において、対象は心筋梗塞を有する。他の態様において、対象は、心筋梗塞を発症するリスクがある。更なる態様において、対象は、虚血、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、高血圧、高血糖、心不全、血管外傷、臓器移植、脂質異常症（例えば高脂血症）、炎症（例えば、慢性炎症及びエンドトキシン誘導炎症）及び／又は細菌感染症を有する。
【００４６】
本開示はまた、急性冠症候群（ＡＣＳ）又はＡＣＳに関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供する。一部の例では、本方法は、ＡＣＳを有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与される対象は、ＡＣＳを発症するリスクがある。一部の態様において、対象は可溶性ＬＯＸ１（ｓＬＯＸ１）血清レベルの上昇又はＬＯＸ１活性の上昇を有する。更なる態様において、対象はアテローム性動脈硬化症を有する。
【００４７】
本開示はまた、脳卒中又は脳卒中に関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供する。一部の例では、本方法は、脳卒中を起こしたことがある対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質を投与される対象は、脳卒中を起こすリスクがある。一部の態様において、対象はｓＬＯＸ血清レベルの上昇及び／又はＬＯＸ１活性の上昇を有する。更なる態様において、対象はアテローム性動脈硬化症を有する。
【００４８】
また、再灌流傷害又は再灌流傷害に関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供される。一部の例では、本方法は、再灌流傷害を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与される対象は、再灌流傷害を発症するリスクがある。一部の態様において、対象は手術を受ける予定である。他の態様において、対象は手術を受けたことがある。一部の態様において手術は移植又は冠動脈バイパス術である。更なる態様において、患者は心筋虚血再灌流傷害を有するか、又はそれを発症するリスクがある。更なる態様において、本方法は心筋傷害を軽減し、血清クレアチニンキナーゼ−ＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）及び血清マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）レベルを低減し、心筋細胞サイズを低減し、傷害部位の白血球浸潤を低減し、及び／又は心機能不全を低減する（例えば、左室圧（ＬＶＰ）を低減し、及び左室拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）を増加させる。更なる態様において、本方法は、心一回拍出量、左室内径短縮率、及び／又は駆出分画を増加させる。
【００４９】
本開示はまた、再狭窄又は再狭窄に関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供する。一部の例では、本方法は、再狭窄を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質を投与される対象は、再狭窄を発症するリスクがある。一部の態様において、対象は手術を受ける予定である。他の態様において、対象は手術を受けたことがある。一部の態様において、手術は血管内手技であり、血管手術、心臓手術又は血管形成術である。更なる態様において、再狭窄、手技は移植又は冠動脈バイパス術である。更なる態様において、治療、予防、及び／又は改善される再狭窄は、ステント内再狭窄又は血管形成術後再狭窄である。
【００５０】
更なる態様において、本開示は、末梢血管疾患（ＰＶＤ）又はＰＶＤに関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法を提供する。一部の例では、本方法は、ＰＶＤを有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質を投与される対象は、ＰＶＤを発症するリスクがある。一部の態様において、対象はｓＬＯＸ血清レベルの上昇及び／又はＬＯＸ１活性の上昇を有する。更なる態様において、対象はアテローム性動脈硬化症を有する。
【００５１】
本開示はまた、炎症又は炎症に関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供する。一部の例では、本方法は、炎症を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。更なる態様において、対象は慢性炎症を有する。一部の態様において、対象はｏｘＬＤＬ及び／又はｓＬＯＸ血清レベルの上昇及び／又はＬＯＸ１活性の上昇を有する。更なる態様において、対象はアテローム性動脈硬化症を有する。
【００５２】
本開示はまた、子癇前症又は子癇前症に関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供する。一部の例では、本方法は、子癇前症又は子癇を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。更なる態様において、対象は高血圧及び大量の尿タンパクを有する。一部の態様において、対象はｏｘＬＤＬ及び／又はｓＬＯＸ血清レベルの上昇及び／又はＬＯＸ１活性の上昇を有する。更なる態様において、対象は、足、脚及び／又は手の腫脹を有する。
【００５３】
更なる態様において、本開示は、対象のアテローム性動脈硬化プラークを安定させる方法を提供する。一部の例では、本方法は、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）を、それを必要としている対象に投与するステップを含む。一部の態様において、本方法は、プラークにおけるＲｈｏＡ／Ｒａｃ１、一酸化窒素、ｐ３８ＭＡＰＫ、プロテインキナーゼＢ及びＣ、ＥＲＫ１／２、及び／又はＮＦκＢシグナル伝達経路のシグナル伝達を低減する。他の態様において、本方法は、プラークにおけるアポトーシスを低下させる。更なる態様において、本方法は、プラークにおけるカスパーゼ８、カスパーゼ９及び／又はＢＡＸ活性を低下させて、及び／又はＢＣＬ−２活性を増加させる。他の態様において、本方法は、プラークによって産生される接着分子又はサイトカインレベルを低下させる。更なる態様において、本方法は、プラークによるＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＭＣＰ１及び／又はＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ発現を低下させる。更なる態様において、本方法は、アテローム性動脈硬化プラークサイズ又は形成、アテローム性動脈硬化プラークにおけるマクロファージ集積及び／又はＭＭＰ（例えば、ＭＭＰ９）発現を低下させる。更なる態様において、本方法はプラークの進展低下又は退縮をもたらす。
【００５４】
また、対象の血管緊張の低下を低減する方法も提供される。一部の例では、本方法は、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）を、それを必要としている対象に投与するステップを含む。一部の態様において、本方法は血管緊張の低下を低減する。更なる態様において、本方法は、ＨＤＬによって駆動されるＮＯ産生（抗体が内皮ＮＯ産生を刺激する能力）を調節することによって対象の血管緊張の低下を低減する。加えて、対象の血管緊張を向上させる方法が提供される。一部の例では、本方法は、ＬＯＸ１結合タンパク質を、それを必要としている対象に投与するステップを含む。
【００５５】
加えて、癌を治療し、予防し、及び／又は改善する方法が提供される。一部の例では、本開示は、対象の癌を治療し、予防し、及び／又は改善する方法であって、癌を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様において、対象は、乳癌、結腸癌、卵巣癌、黒色腫、子宮頸癌、肺癌、子宮癌、腎癌、及び膵癌からなる群から選択される癌を有する。
【００５６】
また、腫瘍細胞の増殖、移動又は浸潤を阻害する方法も提供される。一部の例では、本開示は、ＬＯＸ１活性をアンタゴナイズする方法であって、ＬＯＸ１を発現する腫瘍細胞にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を接触させるステップを含む方法を提供する。一部の態様において、腫瘍細胞は、乳癌、結腸癌、卵巣癌、黒色腫、子宮頸癌、肺癌、子宮癌、腎癌、及び膵癌からなる群から選択される癌のものである。一部の態様において、腫瘍細胞は癌株のものである。
【００５７】
本開示は、加えて、血管新生を低減し、又は阻害する方法を提供する。一部の態様において、血管新生を低減し、又は阻害する方法は、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を、それを必要としている対象に投与するステップを含む。一部の態様において、対象は、病的血管新生に関連する病態を有する。更なる態様において、本開示は、血管新生を阻害する方法であって、ＬＯＸ１を発現する細胞にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を接触させるステップを含む方法を提供する。一部の態様において、細胞は内皮細胞である。更なる態様において、内皮細胞は冠血管内皮細胞である。一部の態様において、本方法はインビトロで実施される。他の態様において、本方法はインビボで実施される。
【００５８】
加えて、ＬＯＸ１活性を遮断し、又は低減する方法が提供される。一部の態様において、本開示は、ＬＯＸ１活性を遮断する方法であって、ＬＯＸ１と、ｏｘＬＤＬ、ＡＧＥ、及び／又はＣＲＰなどのＬＯＸ１結合タンパク質との間の相互作用を低減し、又は阻害するＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様において、ＬＯＸ１は、内皮細胞、マクロファージ、平滑筋血管細胞及び／又は血小板の表面上に発現する。一部の態様において、細胞は冠血管内皮細胞などの内皮細胞である。更なる態様において、細胞は、血管平滑筋細胞、マクロファージ、又は血小板である。他の態様において、細胞はアテローム性動脈硬化組織の一部である。一部の態様において、本方法はインビボで実施される。他の態様において、本方法はインビトロで実施される。一部の態様において、遮断又は低減されるＬＯＸ１活性はｏｘＬＤＬの結合及び／又は取込み（例えばインターナリゼーション）である。更なる態様において、遮断又は低減されるＬＯＸ１活性は、ｐ３８（ＭＡＰＫ）、ｐ４４／４２ＭＡＰＫ、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）、プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）、転写因子ＮＦ−ＫＢ及び／又はＡＰ１シグナル伝達経路の誘導である。更なる態様において、遮断又は低減されるＬＯＸ１活性はアポトーシスの誘導である。更なる実施形態において、アポトーシスの誘導はカスパーゼ−９、カスパーゼ−３及び／又はＢｃｌ−２によって媒介される。更なる態様において、遮断又は低減されるＬＯＸ１活性は、ＬＯＸ１を発現する内皮細胞におけるＰＤＦＧのＡ鎖及びＢ鎖及び／又はヘパリン結合性ＥＧＦ様タンパク質（ＨＢ−ＥＧＦ）の発現である。一部の態様において、遮断又は低減されるＬＯＸ１活性は、ＬＯＸ１に対するｏｘＬＤＬの結合によって誘導されるＬＯＸ１活性である。
【００５９】
加えて、ＬＯＸ１活性レベル又はＬＯＸ１発現レベル（例えばｓＬＯＸ１血清タンパク質レベル）の増加に関連する病理学的病態におけるＬＯＸ１活性を遮断し、又は低減する方法が提供される。一部の例では、本方法は、ＬＯＸ１活性又はＬＯＸ１発現レベル（例えばｓＬＯＸ１血清タンパク質レベル）が増加している対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。一部の態様において、病理学的病態は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、高血圧、高血糖、心不全、血管外傷、移植、脂質異常症（高脂血症）、炎症（例えば、慢性炎症及びエンドトキシン誘導炎症）又は細菌感染症である。一部の態様において、対象は、上昇したＯｘＬＤＬの血清レベルを有する。一部の態様において、対象は、上昇したＯｘＬＤＬ、１５リポキシゲナーゼ変性ＬＤＬ、１５リポキシゲナーゼ変性ＨＤＬ、糖化酸化ＬＤＬ、リゾホスファチジルコリンステラーゼ（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）（ＬＰＣ）及び／又はパルミチン酸の血清レベルを有する。更なる態様において、対象は、上昇したＴＮＦα、ＩＬ１、インターフェロンγ、ＬＰＳ（リポ多糖）、ＣＲＰ、アンジオテンシンＩＩ、エンドセリンＩ、及び／又はＡＧＥの血清レベルを有する。更なる態様において、対象は、上昇した可溶性ＬＯＸ１（ｓＬＯＸ１）の血清レベルを有する。一部の態様において、対象はＬＯＸ１遺伝子に一塩基多型（ＳＮＰ）を有する。一部の態様において、ＬＯＸ１遺伝子のＳＮＰはＬＯＸ１  Ｋ１６７Ｎ変異体である。
【００６０】
また、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）活性を作動させ、又は増加させる方法も提供される。一部の態様において、本開示は、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を、それを必要としている対象に投与することによってＨＤＬ活性を増加させ、又は作動させる方法を提供する。一部の態様において、増加させるＨＤＬ活性はＨＤＬ媒介性内皮ＮＯ産生の促進である。一部の態様において、増加させるＨＤＬ活性は内皮細胞のＮＦＫＢシグナル伝達活性の阻害である。一部の態様において、増加させるＨＤＬ活性は、内皮細胞修復の促進である。一部の態様において、増加させるＨＤＬ活性は炎症の低減である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１−１】ヒトＬＯＸ１（ｈＬＯＸ１）に対するｏｘＬＤＬ、ＡＧＥ−ＢＳＡ及びＣＲＰ結合の抗体ＬＯＸ５１４及びＬＯＸ６９６による阻害を示す。ｈＬＯＸ１トランスフェクト細胞に対するＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９標識ｏｘ−ＬＤＬ（図１Ａ）又はＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９標識ＡＧＥ−ＢＳＡ（図１Ｂ）の結合又は組換えｈＬＯＸ１に対するビオチン標識Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の結合（図１Ｃ）を、ＬＯＸ５１４（「ＬＯＸ１０５１４−ＩｇＧ１−ＴＭ」）（菱形）、ＬＯＸ６９６（「ＬＯＸ１０６９６−ＩｇＧ１−ＴＭ」）（丸）又は市販のマウス抗ＬＯＸ−１抗体である２３Ｃ１１（四角）の存在下で計測した。図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃに代表的なプロットを示し、それぞれｏｘＬＤＬ、ＡＧＥ−ＢＳＡ及びＣＲＰ結合のＬＯＸ５１４及びＬＯＸ６９６による用量依存的阻害が分かる。加えて、ＬＯＸ５１４及びＬＯＸ６９６はまた、ｈＬＯＸ１  Ｋ１６７Ｎトランスフェクト細胞に対するＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９標識ｏｘ−ＬＤＬの結合も遮断し（図１Ｄ）、これらの抗体がＬＯＸ１  ＳＮＰ  Ｋ１６７Ｎ変異体に結合して、それに対するｏｘＬＤＬ結合を遮断することが確認される。これらの結果は、ｏｘＬＤＬ、ＡＧＥ−ＢＳＡ及びＣＲＰに対するＬＯＸ１結合の抗体ＬＯＸ５１４及びＬＯＸ６９６による特異的なマルチリガンド阻害；及びＬＯＸ５１４及びＬＯＸ６９６が共通のＬＯＸ１  ＳＮＰ  Ｋ１６７Ｎ変異体と機能的に交差反応することを実証している。Ｍ＝抗体のモル濃度；バーは標準誤差を示す。
【図１−２】図１−１の続き。
【図２】抗体ＬＯＸ５１４及びＬＯＸ６９６によるｏｘＬＤＬインターナリゼーション及びｏｘＬＤＬ依存的活性酸素種（ＲＯＳ）生成の阻害を示す。ヒトＬＯＸ１トランスフェクト細胞におけるＣｙｐｈｅｒ  ５Ｅ標識ｏｘ−ＬＤＬインターナリゼーション（図２Ａ）又はｏｘＬＤＬ依存的ＲＯＳ生成（図２Ｂ）を、ＬＯＸ５１４（「ＬＯＸ１０５１４−ＩｇＧ１−ＴＭ」）（菱形）、ＬＯＸ６９６（「ＬＯＸ１０６９６−ＩｇＧ１−ＴＭ」）（丸）又は市販のマウス抗ＬＯＸ−１抗体である２３Ｃ１１（四角）の存在下で計測した。図２Ａ及び図２Ｂに代表的なプロットを示し、それぞれｏｘＬＤＬインターナリゼーション及びｏｘＬＤＬ依存的シグナル伝達のＬＯＸ５１４及びＬＯＸ６９６による用量依存的阻害が分かる。ｈＬＯＸ１トランスフェクト細胞におけるｏｘＬＤＬ依存的ＲＯＳ生成については、３つのレプリケートを平均したときの、ＬＯＸ５１４、ＬＯＸ６９６及び２３Ｃ１１を含むアッセイで生成されたカルボキシジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）の量の相対蛍光単位（ＲＦＵ）を示す（図２Ｂ）。これらの結果は、抗体ＬＯＸ５１４及びＬＯＸ６９６がｏｘＬＤＬインターナリゼーション及びｏｘＬＤＬ依存的ＬＯＸ−１シグナル伝達を阻害することを実証している。Ｍ＝抗体のモル濃度；バーは標準誤差を示す。
【図３】抗ＬＯＸ１抗体ＬＯＸ５１４及びＬＯＸ６９６の種交差反応性を示す。様々なＬＯＸ１種オルソログに対する抗ヒトＬＯＸ１抗体の交差反応性をｓｃＦｖ結合ＥＬＩＳＡを用いて評価した。図３Ａに示すとおり、ＬＯＸ５１４（「ＬＯＸ１０５１４」）及びＬＯＸ６９６（「ＬＯＸ１０６９６」）はヒト及びカニクイザルＬＯＸ１に結合するが、マウス、ラット又はウサギＬＯＸ１オルソログ又はウシ血清アルブミン（陰性対照）には結合しない。ＬＯＸ−１に関連する他のヒトＣ型レクチン及びスカベンジャー受容体に対するＬＯＸ５１４及びＬＯＸ６９６の特異性もまた、ＩｇＧ結合ＥＬＩＳＡを用いて評価した。図３Ｂに示すとおり、ＬＯＸ５１４（「ＬＯＸ１０５１４  ＩｇＧ１−ＴＭ」）及びＬＯＸ６９６（「ＬＯＸ１０６９６  ＩｇＧ１−ＴＭ」）はヒトＬＯＸ１にのみ結合し、ヒトＣＬＥＣ−７Ａ、ＣＬＥＣ−１Ａ、ＣＬＥＣ−４Ｌ、ＣＬＥＣ−１Ｂ、ＳＲ−Ａ１又はＳＲ−Ｂ３には結合しない。予想どおり、アイソタイプ対照抗体のＣＡＴ２５２  ＩｇＧ１−ＴＭは、試験したいずれのヒトＣ型レクチン及びスカベンジャー受容体にも結合しなかった。ＣＬＥＣ−７Ａ＝Ｃ型レクチンドメインファミリー７メンバーＡ（別名デクチン−１）；ＣＬＥＣ−１Ａ＝Ｃ型レクチンドメインファミリー１メンバーＡ；ＣＬＥＣ−４Ｌ＝Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＬ（別名ＤＣ−ＳＩＧＮ）；ＣＬＥＣ−１Ｂ＝Ｃ型レクチンドメインファミリー１メンバーＢ（別名ＣＬＥＣ−２）；ＳＲ−Ａ１＝マクロファージスカベンジャー受容体Ｉ型及びＩＩ型（別名ＭＳＲ）；ＳＲ−Ｂ３＝血小板糖タンパク質４（別名ＣＤ３６）。バーは標準誤差を示す。
【図４Ａ】ＬＯＸ５１４と幾つかの最適化ＬＯＸ５１４抗体との比較を示す。ＬＯＸ５１４と最適化ＬＯＸ５１４抗体との間の重鎖可変領域（ＶＨ）（図４Ａ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）（図４Ｂ）のアミノ酸配列アラインメントを示す。ＬＯＸ５１４  ＶＨ又はＶＬとの違いを強調表示する。ＦＷ＝フレームワーク；ＣＤＲ＝相補性決定領域。
【図４Ｂ】ＬＯＸ５１４と幾つかの最適化ＬＯＸ５１４抗体との比較を示す。ＬＯＸ５１４と最適化ＬＯＸ５１４抗体との間の重鎖可変領域（ＶＨ）（図４Ａ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）（図４Ｂ）のアミノ酸配列アラインメントを示す。ＬＯＸ５１４  ＶＨ又はＶＬとの違いを強調表示する。ＦＷ＝フレームワーク；ＣＤＲ＝相補性決定領域。
【図５Ａ】ＬＯＸ６９６と幾つかの最適化ＬＯＸ６９６抗体との比較を示す。ＬＯＸ６９６と最適化ＬＯＸ６９６抗体との間の重鎖可変領域（ＶＨ）（図５Ａ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）（図５Ｂ）のアミノ酸配列アラインメントを示す。ＬＯＸ６９６  ＶＨ又はＶＬとの違いを強調表示する。ＦＷ＝フレームワーク；ＣＤＲ＝相補性決定領域。
【図５Ｂ】ＬＯＸ６９６と幾つかの最適化ＬＯＸ６９６抗体との比較を示す。ＬＯＸ６９６と最適化ＬＯＸ６９６抗体との間の重鎖可変領域（ＶＨ）（図５Ａ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）（図５Ｂ）のアミノ酸配列アラインメントを示す。ＬＯＸ６９６  ＶＨ又はＶＬとの違いを強調表示する。ＦＷ＝フレームワーク；ＣＤＲ＝相補性決定領域。
【図６】ＬＯＸ−１に関連する幾つかのヒトＣ型レクチン及びスカベンジャー受容体と比較したヒトＬＯＸ１に対する抗ＬＯＸ１抗体の特異性を示す。ヒトＬＯＸ−１並びにＬＯＸ−１に関連する他のヒトＣ型レクチン及びスカベンジャー受容体に対するＩｇＧ１−ＴＭフォーマットの抗ＬＯＸ１抗体、ＬＸ５１４０１０８、ＬＸ５１４０１１０、ＬＸ５１４００９２＿Ｎ＞Ｄ、ＬＸ５１４００９３＿Ｎ＞Ｄ、ＬＸ６９６００７３＿ｇｌ（「ＬＸ６９６００７３」）及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌ（「ＬＸ６９６００７３Ｇ８２ｂＳ」）の特異性を、ＩｇＧ結合ＥＬＩＳＡを用いて評価した。ＬＸ５１４０１０８、ＬＸ５１４０１１０、ＬＸ５１４００９２＿Ｎ＞Ｄ、ＬＸ５１４００９３＿Ｎ＞Ｄ、ＬＸ６９６００７３＿ｇｌ及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌはヒトＬＯＸ１にのみ結合し、ヒトＣＬＥＣ−７Ａ、ＣＬＥＣ−１Ａ、ＣＬＥＣ−４Ｌ、ＣＬＥＣ−１Ｂ、ＳＲ−Ａ１又はＳＲ−Ｂ３には結合しない。アイソタイプヒトＩｇＧ１−ＴＭ対照抗体のＮＩＰ２２８は、ヒトＬＯＸ−１又は試験したいずれのヒトＣ型レクチン及びスカベンジャー受容体にも結合しなかった。ＣＬＥＣ−７Ａ＝Ｃ型レクチンドメインファミリー７メンバーＡ（別名デクチン−１）；ＣＬＥＣ−１Ａ＝Ｃ型レクチンドメインファミリー１メンバーＡ；ＣＬＥＣ−４Ｌ＝Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＬ（別名ＤＣ−ＳＩＧＮ）；ＣＬＥＣ−１Ｂ＝Ｃ型レクチンドメインファミリー１メンバーＢ（別名ＣＬＥＣ−２）；ＳＲ−Ａ１＝マクロファージスカベンジャー受容体Ｉ型及びＩＩ型（別名ＭＳＲ）；ＳＲ−Ｂ３＝血小板糖タンパク質４（別名ＣＤ３６）。バーは標準誤差を示す。
【図７Ａ】様々なＬＯＸ１種オルソログに対する抗ＬＯＸ１抗体の交差反応性を示す。様々なＬＯＸ１種オルソログに対するＩｇＧ１−ＴＭフォーマットの抗ＬＯＸ１抗体、ＬＸ５１４０１０８、ＬＸ５１４０１１０、ＬＸ５１４００９２＿Ｎ＞Ｄ、ＬＸ５１４００９３＿Ｎ＞Ｄ、ＬＸ６９６００７３＿ｇｌ及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌの交差反応性を、ＩｇＧ結合ＥＬＩＳＡを用いて評価した。図７Ａに示すとおり、抗ＬＯＸ１抗体、ＬＸ５１４０１０８、ＬＸ５１４０１１０、ＬＸ５１４００９２＿Ｎ＞Ｄ、ＬＸ５１４００９３＿Ｎ＞Ｄ、ＬＸ６９６００７３＿ｇｌ及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌは、ヒト及びカニクイザルＬＯＸ１に結合するが、マウス又はラットＬＯＸ１オルソログ又はＣＤ８６（陰性対照）には結合しない。ＬＸ５１４０１０８、ＬＸ５１４０１１０及びＬＸ５１４００９２＿Ｎ＞Ｄのみ、ウサギＬＯＸ−１にも結合する。アイソタイプヒトＩｇＧ１−ＴＭ対照抗体のＮＩＰ２２８は、ＣＤ８６又は試験したいずれのＬＯＸ−１オルソログにも結合しなかった。加えて、抗ＬＯＸ１  ＩｇＧ１−ＴＭ抗体、ＬＸ５１４０１０８、ＬＸ５１４０１１０及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌ（「ＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ」）について、競合ＥＬＩＳＡを用いてヒトＬＯＸ１（ｈｕＬＯＸ）とカニクイザルＬＯＸ１（ｃｙＬＯＸ）との間の交差反応性の特徴付けを実施した。
【図７Ｂ】図７Ｂに示すとおり、ＬＸ５１４０１０８（丸）、ＬＸ５１４０１１０（四角）及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌ（三角）はカニクイザルＬＯＸ１及びヒトＬＯＸ１の両方と競合し、抗ＬＯＸ１抗体、ＬＸ５１４０１０８、ＬＸ５１４０１１０及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌのカニクイザル交差反応性が更に確認される。バーは標準誤差を示す。
【図８−１】抗体ＬＸ５１４０１１０及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌによるヒトＬＯＸ１（ｈＬＯＸ１）に対するｏｘＬＤＬ、ＡＧＥ−ＢＳＡ及びＣＲＰ結合の阻害、ｏｘＬＤＬインターナリゼーションの阻害及びｏｘＬＤＬ依存的ＬＯＸ−１シグナル伝達の阻害を示す。ｈＬＯＸ１トランスフェクト細胞に対するＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９標識ｏｘ−ＬＤＬ（図８Ａ）又はＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９標識ＡＧＥ−ＢＳＡ（図８Ｂ）の結合又は組換えｈＬＯＸ１に対するビオチン標識Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の結合（図８Ｃ）を、ＬＸ５１４０１１０−ＩｇＧ１−ＴＭ（「ＬＯＸ５１４＿１１０」；丸  図８Ａ及び図８Ｃ、四角  図８Ｂ）、又はＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌ−ＩｇＧ１−ＴＭ（「ＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ」；四角  図８Ａ及び図８Ｃ、丸  図８Ｂ）の存在下で計測した。図８Ａ、図８Ｂ及び図８Ｃに代表的なプロットを示し、それぞれｈＬＯＸ１に対するｏｘＬＤＬ、ＡＧＥ−ＢＳＡ及びＣＲＰ結合のＬＸ５１４０１１０及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌによる用量依存的阻害が分かる。加えて、ＬＸ５１４０１１０及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌはまた、ｈＬＯＸ１  Ｋ１６７Ｎトランスフェクト細胞に対するＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９標識ｏｘ−ＬＤＬの結合も遮断し（図８Ｄ）、これらの抗体がＬＯＸ１  ＳＮＰ  Ｋ１６７Ｎ変異体に結合して、それに対するｏｘＬＤＬ結合を遮断することが確認される。ＬＸ５１４０１１０及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌがｏｘＬＤＬインターナリゼーション及びｏｘＬＤＬ依存的ＬＯＸ−１シグナル伝達を遮断する能力を調べるため、ヒトＬＯＸ１トランスフェクト細胞におけるｃｙｐｈｅｒ  ５Ｅ標識ｏｘ−ＬＤＬインターナリゼーション（図８Ｅ）又はｏｘＬＤＬ依存的ＲＯＳ生成（図８Ｆ）を、ＬＸ５１４０１１０−ＩｇＧ１−ＴＭ（「５１４＿１１０」、丸  図８Ｅ；及び「ＬＯＸ１０５１４＿１１０」、菱形  図８Ｆ）、又はＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌ−ＩｇＧ１−ＴＭ（「ＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ」、四角  図８Ｅ；及び「ＬＯＸ１０６９６＿７３」、四角  図８Ｆ）の存在下で計測した。図８Ｅ及び図８Ｆに代表的なプロットを示し、それぞれｏｘＬＤＬインターナリゼーション及びｏｘＬＤＬ依存的ＲＯＳ産生のＬＸ５１４０１１０及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌによる用量依存的阻害が示される。これらの結果は、（１）ｏｘＬＤＬ、ＡＧＥ−ＢＳＡ及びＣＲＰに対するＬＯＸ１結合の抗体ＬＸ５１４０１１０及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌによる特異的なマルチリガンド阻害；（２）ＬＸ５１４０１１０及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌが共通のＬＯＸ１  ＳＮＰ  Ｋ１６７Ｎ変異体と機能的に交差反応すること；及び（３）ＬＸ５１４０１１０及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌがｏｘＬＤＬインターナリゼーション及びｏｘＬＤＬ依存的ＬＯＸ−１シグナル伝達を阻害することを実証している。Ｍ＝抗体のモル濃度；バーは標準誤差を示す。
【図８−２】図８−１の続き。
【図８−３】図８−１の続き。
【図９Ａ】ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）のＯｘＬＤＬ取込みのＬＸ５１４０１１０による阻害を示す。０、０．５、１、５、又は１０ｎＭの抗ＬＯＸ１抗体ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）又は１０ｎＭの対照抗体（ＮＩＰ）と共にインキュベートしたＨＡＥＣによるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８−ＯｘＬＤＬ取込みを蛍光顕微鏡法を用いて計測し、ＬＸ５１４０１１０がＨＡＥＣによる酸化低密度リポタンパク質（ＯｘＬＤＬ）の結合及びインターナリゼーションを遮断する能力を試験した。各組につき約１２枚の画像を分析し、１時間インキュベートした後の各細胞におけるＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ−５６８コンジュゲートＯｘＬＤＬ赤色蛍光小胞の平均の数を決定した。細胞当たりの小胞の数＋１標準偏差（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）を報告する。これらの結果は、５ｎＭ又は１０ｎＭ  ＬＸ５１４０１１０がＨＡＥＣによるＯｘＬＤＬ取込みを有意に阻害することを実証している（５ｎＭ及び１０ｎＭについて、それぞれｐ＝０．０００３又はｐ＝０．０００２）。＊は、未処理対照（抗体無しに、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒタグ付加ＯｘＬＤのみとインキュベートした細胞）と比較したときＰ＜０．０５であることを示す；バーは標準偏差を示す。
【図９Ｂ】ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）のＯｘＬＤＬ依存的ＮＦｋＢシグナル伝達のＬＸ５１４０１１０による低減を示す。ＮＦκＢ−ルシフェラーゼ及びＧＦＰを共発現するＨＡＥＣを２４時間血清飢餓状態にし、媒体（対照）；ＯｘＬＤＬ単独（５０μｇ／ｍｌ）；ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（１０ｎＭ）；又はＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）＋ＮＩＰ（１０ｎＭ）と共に８時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性及びルミネセンスを計測し、一方でＧＦＰ蛍光を正規化対照として使用した。これらの結果は、ＮＩＰ（対照抗体）を加えても低下しないが、１０ｍＭ  ＬＸ５１４０１１０を加えると、ＨＡＥＣにおけるＯｘＬＤＬ依存的ＮＦｋＢシグナル伝達が有意に低下することを実証している。各群につきＮ＝５；＊はＰ＜０．０５を示す（媒体のみの対照と比較）；＃はＰ＜０．０５を示す（ＯｘＬＤＬ単独と比較）；バーは標準誤差を示す。
【図９Ｃ】ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）のアルギナーゼ活性のＯｘＬＤＬ依存的増大のＬＸ５１４０１１０による阻害を示す。ＨＡＥＣを２４時間血清飢餓状態にし、媒体単独（対照）；ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）；ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（１ｎＭ）；ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（３ｎＭ）；ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（１０ｎＭ）；又はＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）＋ＮＩＰ（１０ｎＭ）と共に３時間インキュベートした。細胞を溶解させて、尿素アッセイを用いてアルギナーゼ活性を決定した。これらの結果は、１０ｎＭ  ＮＩＰ（対照抗体）を加えても低下しないが、３ｎＭ又は１０ｎＭ  ＬＸ５１４０１１０を加えると、ＨＡＥＣにおけるＯｘＬＤＬ依存的アルギナーゼ活性が用量依存的に有意に低下することを実証している。各群につきＮ＝３；＊は、媒体のみの対照と比較したときＰ＜０．０５であることを示す；＃は、ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）対照（抗体無し）と比較したときＰ＜０．０５であることを示す；バーは標準誤差を示す。
【図９Ｄ】ＬＸ５１４０１１０がＨＡＥＣによる一酸化窒素産生のＯｘＬＤＬ依存的低下を遮断することを示す。ＨＡＥＣを一晩血清飢餓状態（１％血清）にし、媒体（対照）；ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）；ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（０．５ｎＭ）；ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（１ｎＭ）；ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（５ｎＭ）；ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（１０ｎＭ）；又はＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）＋ＮＩＰ（１０ｎＭ）と共に２４時間インキュベートした後、新鮮培地中のＤＡＦ−ＦＭ  ＤＡ（５μＭ）を添加し、ＤＡＦ−ＦＭ  ＤＡの全蛍光を計測した。これらの結果は、１０ｎＭ  ＮＩＰ（対照抗体）を加えても阻害されないが、５ｎＭ又は１０ｎＭ  ＬＸ５１４０１１０を加えると、ＨＡＥＣの一酸化窒素産生のＯｘＬＤＬ依存的低下が用量依存的に有意に阻害されることを実証している。一酸化窒素（ＮＯ）がｅＮＯＳによって産生されたことを確認するため、ＮＯＳ阻害薬Ｌ−ＮＡＭＥを対照として使用した（データは示さず）。各群につきＮ＝５；＊は、Ｐ＜０．０５（媒体のみの対照との比較）であることを示す；バーは標準誤差を示す。
【図９Ｅ】ＬＸ５１４０１１０がＨＡＥＣによる活性酸素種（ＲＯＳ）産生のＯｘＬＤＬ依存的増加を遮断することを示す。ＨＡＥＣを一晩血清飢餓状態（１％血清）にし、媒体（対照）；ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）；ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（０．５ｎＭ）；ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（１ｎＭ）；ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（５ｎＭ）；ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（１０ｎＭ）；又はＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）＋ＮＩＰ（１０ｎＭ）と共に２４時間インキュベートした後、４００μＭのルミノール類似体Ｌ−０１２を含有する新鮮フェノール不含培地と共に細胞をインキュベートした。ルミノール類似体Ｌ−０１２のルミネセンスから定量化した相対発光単位（ＲＬＵ）が、ＲＯＳ産生の変化を示す。これらの結果は、１０ｎＭ  ＮＩＰ（対照抗体）を加えても阻害されないが、０．５ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ又は１０ｎＭ  ＬＸ５１４０１１０を加えると、ＨＡＥＣにおけるＯｘＬＤＬ依存的ＲＯＳ産生が阻害されることを実証している。スーパーオキシドがｅＮＯＳによって産生されたことを確認するため、ＮＯＳ阻害薬Ｌ−ＮＡＭＥを対照として使用した（ここではデータを示す）。各群につきＮ＝５；＊は、媒体のみの対照と比較したときＰ＜０．０５を示す；＃は、ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）対照（抗体無し）と比較したときＰ＜０．０５を示す；バーは標準誤差を示す。
【図９Ｆ】ルミノール類似体Ｌ−０１２が活性酸素種（ＲＯＳ）に特異的であることを示す。ＨＡＥＣを一晩血清飢餓状態（１％血清）にし、媒体（Ｖｅｈ）又はスーパーオキシドスカベンジャーＳＯＤ（５ｍＭ）と共に２４時間インキュベートした。図示されるとおり、スーパーオキシドスカベンジャーＳＯＤを加えると、事実上ルミネセンスは検出不能なレベルとなり、図９Ｅにおけるスーパーオキシド（ＲＯＳ）の計測についてのＬ−０１２の特異性が確認される。＊は、Ｐ＜０．０５（媒体との比較）であることを示す；バーは標準誤差を示す。
【図９Ｇ】ＬＸ５１４０１１０がチロシン（Ｙ）３９７の接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）のＯｘＬＤＬ媒介性リン酸化を遮断することを示す。ＨＡＥＣを１８時間血清飢餓状態にし、０、０．１、０．５、１、５、又は１０ｎＭの抗ＬＯＸ１抗体ＬＸ５１４０１１０（５１４）又は１０ｎＭの対照抗体（ＮＩＰ）と共に１時間インキュベートした後、５０μｇ／ｍｌのＯｘＬＤＬを含む新鮮培地中で細胞を１時間インキュベートし、１０μｇのタンパク質ライセートを４〜１５％勾配ポリアクリルアミドゲルに流した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したタンパク質試料をウエスタンブロッティングのためニトロセルロース膜に転写した。Ｔｙｒ３９７におけるＦＡＫリン酸化の変化及びＧＡＰＤＨの発現を示す代表的なブロットを図９Ｇに示し、一方、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化したＴｙｒ３９７におけるＦＡＫリン酸化（ｐＹ３９７−ＦＡＫ）の増加率の定量化を図９Ｈに示す。これらの結果は、１０ｎＭ  ＮＩＰ（対照抗体）を加えても阻害されないが、５ｎＭ又は１０ｎＭ  ＬＸ５１４０１１０を加えると、ＨＡＥＣにおけるＴｙｒ３９７のＯｘＬＤＬ媒介性ＦＡＫリン酸化が阻害されることを実証している。＊は、Ｐ＜０．０５（未処理対照との比較）であることを示す；＃は、０ｎＭ  ＬＸ５１４０１１０（５１４）と比較したときＰ＜０．０５であることを示す；バーは標準誤差を示す。
【図９Ｈ】図９Ｇの続き。
【図９Ｉ】ＨＡＥＣにおけるＯｘＬＤＬシグナル伝達にＬＯＸ１が必要であることを示す。ＮＦＫＢ−ＬＵＣと、非標的ｓｈＲＮＡ（Ａｄ−ＮＴｓｈ）又はＬＯＸ１発現を特異的に阻害するためのＬｏｘ−１  ｓｈＲＮＡ（Ａｄ−Ｌｏｘ−１ｓｈ）のいずれかとをコードするアデノウイルスでヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）を同時形質導入した。形質導入の２４時間後、細胞をＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍＬ）を用いて又は用いずに処理し、３７℃で２４時間インキュベートした。化学発光を用いて細胞ライセートにおけるホタルルシフェラーゼ活性を計測した。Ａｄ−ＬＯＸ−１ｓｈは、対照の非標的ｓｈＲＮＡ（Ａｄ−ＮＴｓｈ）ウイルスとインキュベートした細胞と比較して、ＨＡＥＣにおけるＯｘＬＤＬ媒介性ＮＦｋＢシグナル伝達を有意に阻害した。＊はＰ＜０．０５（未処理対照との比較）を示す；＃は、ＯｘＬＤＬ＋Ａｄ−ＮＴｓｈと比較したときＰ＜０．０５であることを示す。
【図９Ｊ】ヒトＬＯＸ１遺伝子の５’ＵＴＲ領域を標的とする干渉低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）（ＬＯＸ１−ｓｈＲＮＡ）を発現するウイルスベクターがＬＯＸ１タンパク質発現を低下させることを示す。ＬＯＸ１タンパク質発現は、以下の試料：非標的ｓｈＲＮＡ（ＮＴ  ｓｈＲＮＡ）で形質導入したＨＡＥＣライセート（レーン１及び２）、又はＬｏｘ−１  ｓｈＲＮＡで形質導入したＨＡＥＣライセート（レーン３）から、抗Ｌｏｘ１抗体（ＩＢ：ＬＯＸ−１）及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＩＢ：ＧＡＰＤＨ、ここではタンパク質ロード対照として使用した）を用いたイムノブロッティングによってモニタした。レーン２及び３のライセートはＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍＬ）で処理し、一方、レーン１のライセートはＯｘＬＤＬに曝露しなかった。ＬＯＸ１−ｓｈＲＮＡを加えると、非標的ｓｈＲＮＡで処理した細胞からのライセートで計測されたレベル（レーン１及び２）と比較して、ＬＯＸ１タンパク質発現（レーン３）が有意に低下した。これらのデータから、ＬＯＸ１−ｓｈＲＮＡがＨＡＥＣにおけるＬＯＸ１発現を有効に阻害することが確認される。
【図９Ｋ】ヒトＬＯＸ１遺伝子の５’ＵＴＲ領域を標的とする干渉低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）（Ａｄ−ＬＯＸ−１ｓｈＲＮＡ）を発現するウイルスベクターがＬＯＸ１タンパク質発現を用量依存的に低下させることを示す。漸増濃度のＬｏｘ−１  ｓｈＲＮＡ（Ａｄ−ＬＯＸ−１ｓｈＲＮＡ）（レーン１〜５について、それぞれ０、１０、２０、３０及び１００ＭＯＩ）で形質導入したＨＡＥＣをＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍＬ）で刺激した（レーン１に示す未刺激の試料である対照を除く）。細胞ライセートを得て、抗ＬＯＸ−１抗体によるイムノブロッティングに供した。データは少なくとも３つの独立した実験の代表である。Ａｄ−ＬＯＸ−１ｓｈＲＮＡはＬＯＸ１タンパク質発現を用量依存的に有意に低下させた。
【図１０】ＬＸ５１４０１１０（「５１４Ａｂ」）を含め、本明細書に開示される抗ＬＯＸ１抗体によって遮断される、ＬＯＸ１受容体シグナル伝達に関わるシグナル伝達経路の一部を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本開示は、ＬＯＸ１結合タンパク質を提供する。一部の態様において、本開示は、完全長抗ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体であるＬＯＸ１活性のアンタゴニストを提供する。関連する核酸、ＬＯＸ１結合タンパク質を含む組成物、及びＬＯＸ１結合タンパク質の作製方法もまた提供される。例えば、対象のアテローム性動脈硬化症、血栓症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、虚血（例えば心筋虚血）、梗塞（例えば心筋梗塞）、急性冠症候群（ＡＣＳ）、脳卒中、再灌流傷害、再狭窄、末梢血管疾患、高血圧、心不全、炎症（例えば慢性炎症）、血管新生、子癇前症又は癌などのＬＯＸ１結合タンパク質関連疾患又は病態の改善、及び診断用途において、ＬＯＸ１結合タンパク質を使用する方法が更に提供される。
【００６３】
本開示がより容易に理解し得るものとなるように、初めに特定の用語を定義する。更なる定義は、詳細な説明の全体を通じて示される。
【００６４】
Ｉ．定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。用語「ａ」（又は「ａｎ」）、並びに用語「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書では同義的に用いられ得る。
【００６５】
用語「約」は、本明細書では、近似的に、〜の辺り、大まかに、〜前後、という意味で用いられる。用語「約」が数的な値又は範囲と併せて用いられるとき、それは、示される数的な値又は範囲の上下に境界を広げることによって当該の値又は範囲を改変する。概して、用語「約」は、本明細書では、記載される値又は範囲から１０％の変動分だけ上下に数的な値又は範囲を改変するように用いられる。
【００６６】
更に、「及び／又は」は、２つの指定される特徴又は構成要素の各々の、他方を伴う又は伴わない具体的な開示と解釈されなければならない。従って、用語「及び／又は」は、「Ａ及び／又はＢ」などの表現で用いられるとき、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、用語「及び／又は」は、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの表現で用いられるとき、以下の態様：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）の各々を包含することが意図される。
【００６７】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本開示が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；及びｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓが、本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
【００６８】
単位、接頭語、及び記号は、その国際単位系（ＳＩ）で認められている形式で示される。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。特に指示されない限り、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向に記載する。本明細書に提供される見出しは、本明細書を全体として参照することにより有され得る本開示の様々な態様の限定ではない。従って、以下に直ちに定義する用語は、本明細書を全体として参照することによってより完全に定義される。
【００６９】
態様が「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を伴い記載される場合は常に、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」及び／又は「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」の用語で記載される他の点では類似の態様もまた提供される。
【００７０】
アミノ酸は、本明細書では、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）が推奨するその一般的に知られる三文字記号又は一文字記号によって参照される。同様に、ヌクレオチドは、その一般的に認められた一文字コードによって参照される。
【００７１】
用語「ＬＯＸ１」及び「レクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体１」は、本明細書では同義的に使用され、ＬＯＸ１及び／又はＬＯＸ１の生物学的に活性な断片を指す。３つのｈＬＯＸ１アイソフォームのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００２５３４．１、ＮＰ＿００１１６６１０３．１、及びＮＰ＿００１１６６１０４．１（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）にて提供される。
【００７２】
用語「阻害する」、「遮断する」、「低減する」、及び「抑制する」は、本明細書では同義的に使用され、活性の完全な遮断を含めた、生物学的活性の統計的に有意な任意の低下を指す。例えば、「阻害」は、ＬＯＸ１生物学的活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の低下を指し得る。従って、例えば、細胞表面ＬＯＸ１を発現する細胞（例えば、内皮細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、及び血小板）における且つＬＯＸ１リガンド（例えば、ｏｘＬＤＬ、ＣＲＰ及びＡＧＥ）の存在下でのＬＯＸ１媒介性シグナル伝達経路に対する効果を記述するために用語「阻害」又は「抑制」が適用されるとき、これらの用語は、ＬＯＸ１結合タンパク質、例えば抗ＬＯＸ１抗体が、細胞におけるＬＯＸ１媒介性の誘導シグナル伝達を統計的に有意なレベルで（例えば、０．０５以下のｐ値で）低下させる能力を指す。一部の態様において、ＬＯＸ１媒介性シグナル伝達経路は、ＲｈｏＡ／Ｒａｃ１、一酸化窒素、ｐ３８ＭＡＰＫ、プロテインキナーゼＢ及びＣ、ＥＲＫ１／２、及び／又はＮＦκＢから選択されるメンバーである。更なる態様において、阻害又は遮断されるＬＯＸ１媒介性の生物学的活性は、プログラム細胞死（即ちアポトーシス）である。更なる実施形態において、低下、阻害又は遮断されるＬＯＸ１媒介性の生物学的活性は、ＬＯＸ１媒介性のカスパーゼ８、カスパーゼ９の増加、及び／又はＢＡＸ活性の低下である。細胞表面ＬＯＸ１を発現する細胞は、天然に存在する細胞（例えば、ヒト内皮細胞、平滑筋細胞、及びマクロファージ）、細胞株由来の細胞又はＬＯＸ１をコードする核酸を宿主細胞に導入することによって産生される組換え細胞であってもよい。
【００７３】
本明細書で同義的に使用されるとおりの用語「抗体」又は「免疫グロブリン」には、全抗体及びその任意の抗原結合断片又は単鎖が含まれる。典型的な抗体は、ジスルフィド結合によって相互に接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖とを含む。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと省略する）と重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと省略する）と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は１つのドメインＣｌを含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＷ）と呼ばれるより保存された領域が間に散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｉｔｙ）領域に更に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順番、即ち、ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４に並んだ３つのＣＤＲと４つのＦＷとを含む。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンが免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含めた宿主組織又は因子に結合するのを媒介することができる。本開示の例示的抗体には、典型的な抗体、ｓｃＦｖ、及びそれらの組み合わせ（例えばｓｃＦｖが典型的な抗体の重鎖及び／又は軽鎖のいずれかのＮ末端に（例えばペプチド結合を介するか、又は化学的リンカーを介して）共有結合的に連結しているか、又は典型的な抗体の重鎖及び／又は軽鎖にインターカレートしている）が含まれる。
【００７４】
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位によってタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、又は前述の組み合わせなどの標的を認識してそれに特異的に結合する免疫グロブリン分子を指し得る。用語「抗体」には、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、又はその抗体断片が含まれる。
【００７５】
用語「抗体」は、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片など）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）突然変異体、少なくとも２つのインタクトな抗体から作成される二重特異性抗体などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、及び抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を、その抗体が所望の生物学的活性を呈する限りにおいて包含する。抗体は、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと称されるそれらの重鎖定常ドメインのアイデンティティに基づき、５つの主要な免疫グロブリンクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、又はそのサブクラス（アイソタイプ）（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）のいずれかであり得る。異なる免疫グロブリンクラスは異なる周知のサブユニット構造及び三次元配置を有する。抗体はネイキッドであっても、又は毒素、放射性同位元素等の他の分子とコンジュゲートしていてもよい。
【００７６】
用語「生殖細胞系列化」は、抗体中の特定の位置にあるアミノ酸を、生殖細胞系列に見られるのと同じ位置に存在するそれらのアミノ酸に復帰突然変異させることを意味する。
【００７７】
用語「抗原結合抗体断片」又は「ＬＯＸ１結合抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分を指し、且つインタクトな抗体の相補性決定可変領域を指す。抗体断片の例としては、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、線状抗体、一本鎖抗体（例えば、ＳｃＦｖ）、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。本開示は、ＬＯＸ１結合抗体断片であって、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、又は一本鎖抗体分子である抗体断片を更に提供する。
【００７８】
「モノクローナル抗体」は、単一の抗原決定基又はエピトープの高度に特異的な認識及び結合に関与する均一な抗体集団を指す。これはポリクローナル抗体と対照的であり、ポリクローナル抗体は典型的には、種々の抗原決定基に対する種々の抗体を含む。用語「モノクローナル抗体」は、インタクトな及び完全長のモノクローナル抗体、並びに抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖（ｓｃＦｖ）突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、及び抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子の両方を包含する。更に、「モノクローナル抗体」は、限定はされないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、及びトランスジェニック動物によることを含め、幾つもの方法で作製されたかかる抗体を指す。
【００７９】
用語「ヒト化抗体」は、最小限の非ヒト（例えばマウス）配列を含むように操作された、非ヒト（例えばマウス）免疫グロブリンに由来する抗体を指す。典型的には、ヒト化抗体は、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、又はハムスター）のＣＤＲの残基によって相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が置き換えられているヒト免疫グロブリンである（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＷ）残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種の抗体の対応する残基に置き換えられる。
【００８０】
ヒト化抗体は、Ｆｖフレームワーク領域内及び／又は置き換えられた非ヒト残基の範囲内のいずれかにおける更なる残基の置換によって更に修飾することにより、抗体の特異性、親和性、及び／又は能力を精緻化し、最適化することができる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てを含有する少なくとも１つ、典型的には２つ又は３つの可変ドメインの実質的に全てを含む一方で、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含み得る。ヒト化抗体の作成に用いられる方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号明細書又は同第５，６３９，６４１号明細書に記載されている。
【００８１】
抗体の「可変領域」は、単独の、或いは組み合わせでの、抗体軽鎖の可変領域又は抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域は、各々、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＷ）からなる。各鎖のＣＤＲはＦＷ領域によって且つ他方の鎖のＣＤＲと近接して一体に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するには少なくとも２つの技法がある：（１）異種間配列多様性に基づく手法（即ち、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ  ｅｄ．，１９９１，国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ），Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．））；及び（２）抗原抗体複合体の結晶学的調査に基づく手法（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８（１９９７））。加えて、当該技術分野では、ＣＤＲの決定にこれらの２つの手法の組み合わせが時に用いられることもある。
【００８２】
Ｋａｂａｔ付番方式は、概して、可変ドメインの残基（およそ軽鎖の残基１〜１０７及び重鎖の残基１〜１１３）を参照するときに使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ），国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ），Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）（本明細書において参照により援用される））。Ｋａｂａｔにあるようなアミノ酸位置の付番は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ），国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ），Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）における抗体編集物の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに使用される付番方式を指す。この付番方式を使用すると、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＷ又はＣＤＲの短縮、又はそこへの挿入に対応するより少ない又は追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後ろに単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによるときの残基５２ａ）及び重鎖ＦＷ残基８２の後ろに挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによるときの残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等）を含み得る。
【００８３】
所与の抗体について、Ｋａｂａｔの残基付番は、相同性領域において抗体の配列を「標準」Ｋａｂａｔ付番配列とアラインメントすることにより決定し得る。代わりにＣｈｏｔｈｉａは、構造ループの位置を参照する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。Ｋａｂａｔ付番規則を用いて付番したとき、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ−Ｈ１ループの末端はループの長さに応じてＨ３２〜Ｈ３４の間で変わる（これは、Ｋａｂａｔ付番スキームがＨ３５Ａ及びＨ３５Ｂに挿入を置くためである；３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、このループは３２で終わる；３５Ａのみが存在する場合、このループは３３で終わる；３５Ａ及び３５Ｂの両方が存在する場合、このループは３４で終わる）。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの間の妥協案に相当し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデル化ソフトウェアに用いられている。
【００８４】
ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）もまた、ＣＤＲを含めた免疫グロブリン可変領域用の付番方式を提供している。例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５−７７（２００３）（本明細書において参照により援用される）を参照のこと。ＩＭＧＴ付番方式は、５，０００個を超える配列のアラインメント、構造データ、及び超可変ループの特徴付けに基づいたもので、あらゆる種の可変領域及びＣＤＲ領域の容易な比較が可能である。ＩＭＧＴ付番スキーマによれば、ＶＨ−ＣＤＲ１は２６〜３５位にあり、ＶＨ−ＣＤＲ２は５１〜５７位にあり、ＶＨ−ＣＤＲ３は９３〜１０２位にあり、ＶＬ−ＣＤＲ１は２７〜３２位にあり、ＶＬ−ＣＤＲ２は５０〜５２位にあり、及びＶＬ−ＣＤＲ３は８９〜９７位にある。
【００８５】
本明細書全体を通じて用いられるとおり、記載されるＶＨ  ＣＤＲ配列は古典的Ｋａｂａｔ付番位置に対応し、即ちＫａｂａｔ  ＶＨ−ＣＤＲ１は３１〜３５位にあり、ＶＨ−ＣＤＲ２は５０〜６５位にあり、及びＶＨ−ＣＤＲ３は９５〜１０２位にある。ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３もまた古典的Ｋａｂａｔ付番位置、即ち、それぞれ２４〜３４位、５０〜５６位及び８９〜９７位に対応する。
【００８６】
用語「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体、又は当該技術分野において公知の任意の技法を用いて作製された、ヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義には、インタクトな又は完全長の抗体、その断片、及び／又は少なくとも１つのヒト重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチドを含む抗体、例えばマウス軽鎖及びヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体などが含まれる。
【００８７】
用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ以上の種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する１つの哺乳動物種（例えば、マウス、ラット等）に由来する抗体の可変領域に対応し、一方、定常領域が、当該の種における免疫応答の誘導を回避するため、別の種（通常はヒト）に由来する抗体の配列と相同である。
【００８８】
用語「ＴＭ」又は「ＴＭ突然変異体」は、その突然変異を有する抗体のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ）の低下をもたらすＩｇＧ１定常領域における突然変異を指す。ＴＭ突然変異体は、ＩｇＧ１の重鎖に導入された、エフェクターヌルヒトＩｇＧ１をもたらす３つの突然変異Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓの組み合わせ（ＥＵ付番  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，米国公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ），国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ），Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を含む。
【００８９】
用語「ＹＴＥ」又は「ＹＴＥ突然変異体」は、ヒトＦｃＲｎとの結合の増加をもたらし、且つその突然変異を有する抗体の血清中半減期を改善するＩｇＧ１  Ｆｃにおける突然変異を指す。ＹＴＥ突然変異体は、ＩｇＧ１の重鎖に導入された、３つの突然変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅの組み合わせ（ＥＵ付番  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，米国公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ），国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ），Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を含む。米国特許第７，６５８，９２１号明細書（参照により本明細書に援用される）を参照のこと。ＹＴＥ突然変異体は、野生型バージョンの同じ抗体と比較したとき抗体の血清中半減期が約４倍増加することが示されている（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：２３５１４−２４（２００６））。米国特許第７，０８３，７８４号明細書（参照により全体として本明細書に援用される）も参照のこと。
【００９０】
用語「ＬＯＸ１結合タンパク質」、「抗ＬＯＸ１抗体」、又は「ＬＯＸ１に特異的に結合する抗体」は、抗体がＬＯＸ１の標的化において治療剤又は診断試薬として有用となるような十分な親和性でＬＯＸ１に結合する能力を有する抗ＬＯＸ１抗体などのＬＯＸ１結合タンパク質を指す。無関係の非ＬＯＸ１タンパク質に対する抗ＬＯＸ１抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）（分析物として組換えＬＯＸ１を使用し且つリガンドとして抗体を使用するか、又はその逆）、結合平衡除外アッセイ（ＫＩＮＥＸＡ（登録商標））、又は当該技術分野において公知の他の結合アッセイによって計測するとき、ＬＯＸ１に対するこの抗体の結合の約１０％未満である。特定の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、解離定数（ＫＤ）が≦１ｎＭ、≦０．５ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦１０ｐＭ、又は≦１ｐＭであるか、又は一部の例では、ＫＤが約１５０ｐＭ〜約６００ｐＭ又は約４００ｐＭ〜約６００ｐＭの完全長抗体又はＬＯＸ１結合抗体断片である。特定の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、解離定数（ＫＤ）が≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦１０ｐＭ、≦１ｐＭ、又は≦０．１ｐＭであるか、又は一部の例では、ＫＤが約１５０ｐＭ〜約６００ｐＭの完全長抗体又はＬＯＸ１結合抗体断片である。
【００９１】
「アンタゴニスト」又は「遮断」ＬＯＸ１結合タンパク質は、ＬＯＸ１の生物学的活性を阻害し又は低下させるものである。一部の態様において、アンタゴニストＬＯＸ１結合タンパク質は、ＬＯＸ１がｏｘＬＤＬ、ＡＧＥ、及び／又はＣＲＰに結合する能力を阻害する。一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、ＬＯＸ１がｏｘＨＤＬ、ＨＳＰ６０、白血球及び／又は活性化血小板に結合する能力を阻害する。特定の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、ＬＯＸ１の生物学的活性を実質的に又は完全に阻害する。望ましくは、ＬＯＸ１生物学的活性は１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は更には１００％低下する。詳細な態様では、ＬＯＸ１結合タンパク質は、完全長抗体又はＬＯＸ１結合抗体断片などの抗ＬＯＸ１抗体である。更なる態様において、抗ＬＯＸ１抗体はＬＯＸ１の生物学的活性を１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は更には１００％阻害し又は低下させる。
【００９２】
「結合親和性」は、概して、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合性相互作用の総和の強度を指す。特に指示がない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば抗体と抗原）の間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、概して解離定数（ＫD）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含めた、当該技術分野において公知の一般的な方法によって計測することができる。低親和性抗体は、概して抗原との結合が遅く、容易に解離する傾向があり、一方、高親和性抗体は、概して抗原と速やかに結合し、結合したまま長く留まる傾向がある。結合親和性を計測する種々の方法が当該技術分野において公知であり、本開示の目的上、そのいずれを用いてもよい。
【００９３】
「効力」は、通常は、特に指定されない限りｎＭ又はｐＭ単位のＩＣ50値として表される。ＩＣ50は抗体分子の阻害濃度中央値である。機能アッセイでは、ＩＣ50は、生物学的反応をその最大値の５０％低下させる濃度である。リガンド結合試験では、ＩＣ50は、受容体結合を最大特異的結合レベルの５０％低下させる濃度である。ＩＣ50は当該技術分野において公知の手段によって計算することができる。
【００９４】
参照抗体と比較したときの本明細書に開示されるＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗体）の効力の向上倍数は、少なくとも約２倍、少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、又は少なくとも約１８０倍又はそれ以上であり得る。
【００９５】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、分泌Ｉｇが特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合して、それらの細胞傷害性エフェクター細胞による抗原担持標的細胞への特異的結合及び続く細胞毒による標的細胞の死滅が可能となる形態の細胞傷害性を指す。標的細胞の表面に対する特異的高親和性ＩｇＧ抗体は細胞傷害性細胞を「武装」するものであり、かかる死滅に絶対的に必要である。標的細胞の溶解は細胞外であって、直接的な細胞間接触に必要であり、補体は関与しない。抗体に加えて、抗原担持標的細胞に特異的に結合する能力を有するＦｃ領域を含む他のタンパク質、具体的にはＦｃ融合タンパク質は、細胞媒介性細胞傷害性を達成可能であると考えられる。簡単にするため、Ｆｃ融合タンパク質の活性によって生じる細胞媒介性細胞傷害性は、本明細書ではＡＤＣＣ活性とも称される。
【００９６】
「単離されている」ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、その抗原結合断片、変異体、及び誘導体を含めたＬＯＸ１抗体）、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物は、天然には見られない形態のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物である。単離ポリペプチド（例えば、完全長抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片を含めた抗ＬＯＸ１抗体）、ポリヌクレオチド、ベクター、ポリヌクレオチド類、ベクター類、細胞又は組成物には、もはや天然に見られる形態ではなくなる程度まで精製されているものが含まれる。一部の態様において、単離されている抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物は、実質的に純粋である。
【００９７】
「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」は、診断、予後判定、又は治療が所望される任意の対象、特に哺乳類対象が意図される。哺乳類対象には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマなどを含めた、ヒト、家畜、農業動物、競技動物、及び動物園動物が含まれる。
【００９８】
用語「医薬組成物」は、活性成分（例えば、本明細書に開示されるＬＯＸ１結合タンパク質）の生物学的活性が有効になることを可能にするような形態の、且つ組成物が投与されるであろう対象にとって許容できない毒性の追加的な成分を含有しない調製物を指す。かかる組成物は無菌であり得る。
【００９９】
抗ＬＯＸ１抗体などのＬＯＸ１結合タンパク質、又は別の治療剤の「有効量」又は「薬学的に有効な量」は、具体的に記載される目的の実施に十分な量である。「有効量」は、記載される目的に関連して、実験的に常法で決定することができる。本開示は、ＬＯＸ１及び／又は低下したＨＤＬ媒介性シグナル伝達に関連する疾患及び病態を治療、予防又は改善する治療薬を提供する。これらの疾患及び病態には、例えば、アテローム性動脈硬化症、血栓症、ＣＡＤ、虚血（例えば心筋虚血）、梗塞（例えば心筋梗塞）、急性冠症候群（ＡＣＳ）、脳卒中、再灌流傷害、再狭窄、末梢血管疾患、高血圧、心不全、炎症（例えば慢性炎症）、血管新生、子癇前症及び癌が含まれる。
【０１００】
語句「標識」は、本明細書で使用されるとき、「標識」抗体を作成するため抗体に直接又は間接的にコンジュゲートされる検出可能な化合物又は組成物を指す。標識はそれ自体検出可能であってもよく（例えば、放射性同位元素標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的改変を触媒することができる。
【０１０１】
「治療している」又は「治療」又は「治療すること」又は「改善している」又は「改善すること」などの用語は、（１）診断された疾患又は病態に関連する病態を治癒し、減速させ、減少させ、及び／又はその進行を止める治療的処置、及び（２）標的の疾患又は病態の発症を防止し及び／又は遅延させる予防的又は防御的処置の両方を指す。従って、治療を必要としている者には、疾患又は病態を既に有する者；疾患又は病態を発症するリスクがある者；及び疾患又は病態を予防すべき者が含まれる。特定の態様において、対象が、例えば、疾患又は病態に関連する症状の全面的な、部分的な、又は一過性の改善又は消失を示す場合に、その対象は、本明細書に提供される方法による「治療」が成功している。かかる疾患又は病態には、例えば、アテローム性動脈硬化症、血栓症、ＣＡＤ、虚血（例えば心筋虚血）、梗塞（例えば心筋梗塞）、急性冠症候群（ＡＣＳ）、脳卒中、再灌流傷害、再狭窄、末梢血管疾患、高血圧、心不全、炎症（例えば慢性炎症）、血管新生、子癇前症及び癌が含まれる。
【０１０２】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用されるとき、１つ以上の「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド分子」、又は「ポリヌクレオチド配列」を含むことができ、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、且つＤＮＡ（ゲノム又はｃＤＮＡ）及びＲＮＡを含む。核酸はデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼによってポリマー中に取り込まれ得る任意の基質であり得る。「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体など、修飾ヌクレオチドを含み得る。前出の説明は、ＲＮＡ及びＤＮＡ（ゲノム又はｃＤＮＡ）を含め、本明細書において言及されるあらゆるポリヌクレオチドに適用される。
【０１０３】
用語「ベクター」は、宿主細胞において１つ以上の目的の遺伝子又は配列を送達し、且つ一部の態様では発現する能力を有するコンストラクトを意味する。ベクターの例としては、限定はされないが、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、カチオン性縮合剤に関連するＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、及びプロデューサー細胞などのある種の真核細胞が挙げられる。
【０１０４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書では、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指して同義的に使用される。ポリマーは線状又は分枝状であってもよく、修飾アミノ酸を含むことができ、及び非アミノ酸がそれに割り込むことができる。これらの用語はまた、天然に又は介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば標識成分とのコンジュゲーションによって修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。また、この定義の範囲内には、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸等を含む）、並びに当該技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。この開示のポリペプチドは抗体に基づくため、特定の態様においてポリペプチドは単鎖又は会合鎖として存在し得ることが理解される。
【０１０５】
２つ以上の核酸又はタンパク質の文脈における用語「同一」又はパーセント配列「同一性」は、いかなる保存的アミノ酸置換も配列同一性の一部として考慮することなく、最大の一致となるように（必要であればギャップを導入して）比較及びアラインメントしたときに同じであるか、又は同じである特定の割合のヌクレオチド又はアミノ酸残基を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェア若しくはアルゴリズムを使用するか、又は目視検査によって計測することができる。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用し得る様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当該技術分野において公知である。
【０１０６】
配列アラインメントアルゴリズムのかかる非限定的な例の一つは、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：５８７３−５８７７（１９９３）において改良されたとおりの、ＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９１））に導入されているＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：２２６４−２２６８（１９９０）に記載されるアルゴリズムである。特定の態様において、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）に記載されるとおりのギャップ付きＢＬＡＳＴを使用することができ、ＢＬＡＳＴ−２、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６：４６０−４８０（１９９６））、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）が、配列のアラインメントに使用し得る更なる公的に利用可能なソフトウェアプログラムである。特定の態様において、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して決定される（例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列並びに４０、５０、６０、７０、又は９０のギャップ加重及び１、２、３、４、５、又は６の長さ加重を使用する）。特定の代替的な態様では、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを組み込むＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を決定することができる（例えば、ＢＬＯＳＵＭ  ６２行列又はＰＡＭ２５０行列のいずれか、並びに１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップ加重及び１、２、３、４、５の長さ加重を使用する）。或いは、特定の態様において、ヌクレオチド又はアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））を使用して決定される。例えば、パーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を使用して、且つ残基テーブルを含むＰＡＭ１２０、１２のギャップ長ペナルティ及び４のギャップペナルティを使用して決定することができる。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによる最大限のアラインメントに適切なパラメータを決定することができる。特定の態様では、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
【０１０７】
特定の態様において、第１のアミノ酸配列と第２の配列アミノ酸とのパーセント配列同一性「Ｘ」は、１００×（Ｙ／Ｚ）として計算され、式中、Ｙは、第１及び第２の配列のアラインメントにおいて（目視検査又は特定の配列アラインメントプログラムによってアラインメントしたとき）同一のマッチとしてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、及びＺは、第２の配列中にある残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列より長い場合、第２の配列に対する第１の配列のパーセント同一性は、第１の配列に対する第２の配列のパーセント同一性より高くなる。
【０１０８】
「保存的アミノ酸置換」は、一つのアミノ酸残基が、同様の側鎖を有する別のアミノ酸残基に置き換えられているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含め、当該技術分野において定義されている。例えば、チロシンに対するフェニルアラニンの置換は保存的置換である。特定の態様において、本開示のＬＯＸ１結合タンパク質の配列における保存的置換が、置換されたアミノ酸配列を含有するタンパク質とＬＯＸ１との結合を無効にすることはない。抗原結合性を消失させないヌクレオチド及びアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１  １８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）；及びＢｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４１２−４１７（１９９７）を参照）。
【０１０９】
用語「エピトープ」は、本明細書で使用されるとき、本開示のＬＯＸ１結合タンパク質（例えば抗体）との結合能を有するＬＯＸ１、例えば、ヒトＬＯＸ１（ｈＬＯＸ１）又はサルＬＯＸ１（例えばＭ．シノモルグス（Ｍ．ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ））のタンパク質決定基を指す。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特定の三次元構造特性、並びに特定の電荷特性を有する。立体エピトープと非立体エピトープとは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合は失われるが、後者に対する結合は失われない点で区別される。かかるＬＯＸ１結合タンパク質は、標準的な抗原結合又は活性アッセイにおいて、例えば配列番号４のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列、又は配列番号４１のＶＨ配列及び配列番号５８のＶＬ配列を含む抗体と交差競合する能力（例えば、その結合を統計的に有意な形で競合的に阻害する能力）に基づき同定することができる。
【０１１０】
ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば抗体）は、それがＬＯＸ１に対する参照分子の結合をある程度遮断する程度にＬＯＸ１に結合する場合に、ＬＯＸ１との結合に関して参照分子と「競合する」と言われる。タンパク質がＬＯＸ１との結合に関して競合する能力は、例えば競合ＥＬＩＳＡアッセイを含めた、当該技術分野において公知の任意の方法により決定することができる。本明細書で使用されるとき、ＬＯＸ１結合タンパク質は、ＬＯＸ１に対する参照分子の結合を、例えば、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、又は少なくとも５０％だけ競合的に阻害すると言うことができる。
【０１１１】
ＩＩ．ＬＯＸ１結合タンパク質
本開示は、ＬＯＸ１と特異的に結合するＬＯＸ１結合タンパク質を提供する。一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は抗体（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、抗原結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）である。更なる態様において、抗体は、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、又はその抗体断片である。特定の態様において、ＬＯＸ１抗体は完全長抗体である。
【０１１２】
一部の態様において、ＬＯＸ１抗体はＬＯＸ１結合抗体断片である。一部の態様において、ＬＯＸ１結合抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ断片、ダイアボディ、又は一本鎖抗体分子である。更なる態様において、ＬＯＸ１抗体は、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド連結Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディ、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）3、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ2、（ｓｃＦｖ）2、又はｓｃＦｖ−Ｆｃである。
【０１１３】
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、ＶＨ及びＶＬを含む抗体である。一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えばＬＯＸ１抗体又はその断片）は、重鎖定常領域又はその断片を更に含む。一部の態様において、この抗体は、（ａ）ヒトＩｇＡ定常領域、又はその断片；（ｂ）ヒトＩｇＤ定常領域、又はその断片；（ｃ）ヒトＩｇＥ定常ドメイン、又はその断片；（ｄ）ヒトＩｇＧ１定常領域、又はその断片；（ｅ）ヒトＩｇＧ２定常領域、又はその断片；（ｆ）ヒトＩｇＧ３定常領域、又はその断片；（ｇ）ヒトＩｇＧ４定常領域、又はその断片；及び（ｈ）ヒトＩｇＭ定常領域、又はその断片からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常領域を含む。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えばＬＯＸ１抗体又はその断片）は、ＡＤＣＣ活性が低下した、又は低下するように突然変異した重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。詳細な態様では、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えばＬＯＸ１抗体又はその断片）は、エフェクター機能を低下させる突然変異を含むＩｇＧ１重鎖定常領域を含む。一部の態様において、ＩｇＧ１定常領域は２３４、２３５及び３３１位（これらの位置の付番はＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスに従う）に突然変異を含む。更なる態様において、ＩｇＧ１定常領域は、エフェクターヌルヒトＩｇＧ１をもたらす三重突然変異Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ（ＴＭ）（これらの位置の付番はＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスに従う）を含む。一部の態様において、ＩｇＧ１定常領域は、上記に定義の節で開示したとおりの、三重突然変異の突然変異体ＹＴＥを含む。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、三重突然変異ＴＭ及び三重突然変異ＹＴＥの両方を含むＩｇＧ１定常領域を含有する抗体である。
【０１１４】
特定の態様において、重鎖定常領域又はその断片、例えば、ヒトＩｇＧ定常領域又はその断片は、野生型ＩｇＧ定常ドメインと比べて１つ以上のアミノ酸置換を含むことができ、ここで修飾されたＩｇＧは、野生型ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧの半減期と比較して増加した半減期を有する。例えば、ＩｇＧ定常ドメインは、２５１〜２５７位、２８５〜２９０位、３０８〜３１４位、３８５〜３８９位、及び４２８〜４３６位（アミノ酸位置の付番はＫａｂａｔに示されるとおりのＥＵインデックスに従う）にアミノ酸残基の１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。特定の態様において、ＩｇＧ定常ドメインは、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、又はスレオニン（Ｔ）によるＫａｂａｔ２５２位のアミノ酸の置換、スレオニン（Ｔ）によるＫａｂａｔ２５４位のアミノ酸の置換、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、又はスレオニン（Ｔ）によるＫａｂａｔ２５６位のアミノ酸の置換、ロイシン（Ｌ）によるＫａｂａｔ２５７位のアミノ酸の置換、プロリン（Ｐ）によるＫａｂａｔ３０９位のアミノ酸の置換、セリン（Ｓ）によるＫａｂａｔ３１１位のアミノ酸の置換、スレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、又はセリン（Ｓ）によるＫａｂａｔ４２８位のアミノ酸の置換、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、又はグルタミン（Ｑ）によるＫａｂａｔ４３３位のアミノ酸の置換、又はトリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、セリン（Ｓ）、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、又はチロシンによるＫａｂａｔ４３４位のアミノ酸の置換のうちの１つ以上を含み得る。より具体的には、ＩｇＧ定常ドメインは、チロシン（Ｙ）によるＫａｂａｔ２５２位のアミノ酸の置換、スレオニン（Ｔ）によるＫａｂａｔ２５４位のアミノ酸の置換、及びグルタミン酸（Ｅ）によるＫａｂａｔ２５６位のアミノ酸の置換を含め、野生型ヒトＩｇＧ定常ドメインと比べてアミノ酸置換を含有し得る。
【０１１５】
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えばＬＯＸ１抗体又はその断片）は、（ａ）ヒトＩｇκ定常ドメイン；及び（ｂ）ヒトＩｇλ定常ドメインからなる群から選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えばＬＯＸ１抗体又はその断片）は、エフェクターヌルヒトＩｇＧ１をもたらす三重突然変異Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ（「ＩｇＧ−ＴＭ」）を含有するヒト重鎖ＩｇＧ１定常ドメインとヒト軽鎖λ定常ドメインとを含む。
【０１１６】
本開示は、本明細書に開示される参照ＶＨ又はＶＬと比べて合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するＶＨ及び／又はＶＬを含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質を提供する。一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、表１に示すとおりのＶＨ及び／又はＶＬを有する。
【０１１７】
表１に例示的ＬＯＸ−１結合タンパク質を提供する。
【０１１８】
【表１】
2020188765.tif 000003
【０１１９】
【表２】
2020188765.tif 000004
【０１２０】
【表３】
2020188765.tif 000005
【０１２１】
【表４】
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【０１２２】
【表５】
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【０１２３】
【表６】
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【０１２４】
【表７】
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【０１２５】
【表８】
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【０１２６】
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４の参照ＶＨ配列と比べて合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するＶＨ配列を含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１２７】
更なる態様において、本開示は、配列番号４のＶＨを含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質を提供する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１２８】
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３３の参照ＶＬ配列と比べて合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するＶＬ配列を含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１２９】
更なる態様において、本開示は、配列番号３３のＶＬを含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質を提供する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１３０】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号２、５〜１２又は１３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２、及び配列番号３、１４〜１７又は１８のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３を含むＶＨから選択されるＶＨ；及び配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ２、及び配列番号３２、３４、又は３５のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３を含むＶＬから選択される軽鎖ＶＬを含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１３１】
本開示はまた、本明細書に開示される参照ＶＨ及びＶＬ  ＬＯＸ１結合タンパク質と比べて合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を各々有するＶＨ及びＶＬ配列を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質も提供する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１３２】
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４、１９〜２８、又は２９を含むＶＨ、及び配列番号３３、３６、又は３７を含むＶＬを有する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１３３】
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は一組の相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖可変領域（ＶＨ）−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで一組のＣＤＲは、（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し；（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２が配列番号５のアミノ酸配列を有し；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３が配列番号１４のアミノ酸配列を有し；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１が配列番号３０のアミノ酸配列を有し；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２が配列番号３１のアミノ酸配列を有し；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３が配列番号３２のアミノ酸配列を有する一組の参照ＣＤＲと同一であるか、又はそれと比べて合計１８個以下の（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８個の）アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１３４】
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、一組のＣＤＲ：ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで：（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１は配列番号１のアミノ酸配列を有し；（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２は配列番号２のアミノ酸配列を有し；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３は配列番号３のアミノ酸配列を有し；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１は配列番号３０のアミノ酸配列を有し；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２は配列番号３１のアミノ酸配列を有し；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３は配列番号３２のアミノ酸配列を有する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１３５】
本開示はまた、本明細書に開示される参照ＶＨ配列と少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は本明細書に開示される参照ＶＬ配列（例えば、表１、図４又は図５に開示されるＶＨ及びＶＬ配列）と少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質も提供する。更なる態様において、本開示は、配列番号４と少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するＶＨ及び／又は配列番号３３と少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するＶＬを含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質を提供する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１３６】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を有するＶＬ；及び（ｄ）配列番号５４のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号７０のアミノ酸配列を有するＶＬからなる群から選択されるＶＨ及びＶＬと少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）及び少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１３７】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｇ）配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｈ）配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｊ）配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｋ）配列番号４８のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号６５のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｌ）配列番号４９のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号６６のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｍ）配列番号５０のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｎ）配列番号５１のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号６５のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｏ）配列番号５４のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号６８のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｐ）配列番号５２のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｑ）配列番号５４のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号６９のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｒ）配列番号５３のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を有するＶＬ；及び（ｓ）配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を有するＶＬからなる群から選択されるＶＨ及びＶＬと少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するＶＨ及び少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するＶＬを含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１３８】
更なる態様において、本開示は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質を提供する。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３及び配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２を含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３及び配列番号５〜１２又は１３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２を含む。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３、１４〜１７又は１８のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３及び配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２を含む。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３、１４〜１７又は１８のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３及び配列番号２、５〜１２又は１３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２を含む。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３、１４〜１７又は１８のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３及び配列番号２、５〜１２又は１３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２及び配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ１を含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１３９】
更なる態様において、本開示は、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＬＨ−ＣＤＲ３を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質を提供する。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３及び配列番号３１のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ２を含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３、アミノ酸配列配列番号３１を有するＶＬ−ＣＤＲ２及び配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１を含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３２、３４、又は３５のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３、アミノ酸配列配列番号３１を有するＶＬ−ＣＤＲ２を含む。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３２、３４、又は３５のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３、アミノ酸配列配列番号３１を有するＶＬ−ＣＤＲ２及び配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１を含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１４０】
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号１と同一であるか、又はそれに対して合計１、２個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号２、５〜１２又は１３と同一であるか、又はそれに対して合計１、２個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＨ−ＣＤＲ２、又は配列番号３、１４〜１７又は１８と同一であるか、又はそれに対して合計１、２、３、４個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＨ−ＣＤＲ３など、１、２、又は３個のＶＨ−ＣＤＲを含む。
【０１４１】
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３０と同一であるか、又はそれに対して合計１、２個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号３１と同一であるか、又はそれに対して合計１、２個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＬ−ＣＤＲ２、又は配列番号３２、３４、又は３５と同一であるか、又はそれに対して合計１、２、３、４個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＨ−ＣＤＲ３など、１、２、又は３個のＶＬ−ＣＤＲを含む。
【０１４２】
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４１の参照ＶＨ配列と比べて合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するＶＨ配列を含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１４３】
更なる態様において、本開示は、配列番号４１のＶＨを含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質を提供する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１４４】
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号５８の参照ＶＬ配列と比べて合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するＶＬ配列を含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１４５】
更なる態様において、本開示は、配列番号５８のＶＬを含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質を提供する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１４６】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号３９、４２又は４３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２、及び配列番号４０、４４〜４６又は４７のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３を含むＶＨから選択されるＶＨ；及び配列番号５５又は５９のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号５６又は６０のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ２、及び配列番号５７、６１〜６３、又は６４のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３を含むＶＬから選択される軽鎖ＶＬを含む。
【０１４７】
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４１、４８〜５３、又は５４の配列を含むＶＨ、及び配列番号５８、６５〜６９、又は７０の配列を含むＶＬを有する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１４８】
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は一組の相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖可変領域（ＶＨ）−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、軽鎖可変領域（ＶＬ）−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで一組のＣＤＲは、（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１が配列番号３８のアミノ酸配列を有し；（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２が配列番号３９のアミノ酸配列を有し；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３が配列番号４４のアミノ酸配列を有し；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１が配列番号５５のアミノ酸配列を有し；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２が配列番号６０のアミノ酸配列を有し；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３が配列番号６１のアミノ酸配列を有する一組の参照ＣＤＲと同一であるか、又はそれと比べて合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１４９】
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は一組の相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖可変領域（ＶＨ）−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、軽鎖可変領域（ＶＬ）−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで一組のＣＤＲは、（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１が配列番号３８のアミノ酸配列を有し、（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２が配列番号３９のアミノ酸配列を有し；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３が配列番号４０のアミノ酸配列を有し；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１が配列番号５５のアミノ酸配列を有し；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２が配列番号５６のアミノ酸配列を有し；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３が配列番号５７のアミノ酸配列を有する一組の参照ＣＤＲと同一であるか、又はそれと比べて合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１５０】
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、一組のＣＤＲ：ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで：（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１は配列番号３８のアミノ酸配列を有し；（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２は配列番号３９のアミノ酸配列を有し；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３は配列番号４０のアミノ酸配列を有し；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１は配列番号５５のアミノ酸配列を有し；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２は配列番号５６のアミノ酸配列を有し；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３は配列番号５７のアミノ酸配列を有する。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１５１】
更なる態様において、本開示は、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質を提供する。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３及び配列番号３９のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２を含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３及び配列番号４２又は４３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２を含む。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４０、４４〜４６、又は４７のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３及び配列番号３９のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２を含む。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４０、４４〜４６、又は４７のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３及び配列番号３９、４２、又は４３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２を含む。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４０、４４〜４６、又は４７のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３及び配列番号３９、４２、又は４３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２、及び配列番号３８のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ１を含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１５２】
更なる態様において、本開示は、配列番号５７のアミノ酸配列を有するＶＬＨ−ＣＤＲ３を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質を提供する。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号５７のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３及び配列番号５６のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ２を含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号５７のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３、アミノ酸配列配列番号５６を有するＶＬ−ＣＤＲ２及び配列番号５５のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３を含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号５７のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３、アミノ酸配列配列番号５６又は６０を有するＶＬ−ＣＤＲ２、及び配列番号５５又は５９のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１を含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１５３】
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号３８と同一であるか、又はそれに対して合計１、２個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号３９、４２又は４３と同一であるか、又はそれに対して合計１、２個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＨ−ＣＤＲ２、又は配列番号４０、４４〜４６又は４７と同一であるか、又はそれに対して合計１、２、３、４個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＨ−ＣＤＲ３など、１、２、又は３個のＶＨ−ＣＤＲを含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１５４】
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号５５又は５９と同一であるか、又はそれに対して合計１、２個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号５６又は６０と同一であるか、又はそれに対して合計１、２個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＬ−ＣＤＲ２、又は配列番号５７、６１〜６３又は６４と同一であるか、又はそれに対して合計１、２、３、４個以下のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するＶＨ−ＣＤＲ３など、１、２、又は３個のＶＬ−ＣＤＲを含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１５５】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、表１、図４又は図５に記載されるとおりの一組のＣＤＲ：ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ３及びＶＬ−ＣＤＲ３を含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１５６】
一部の更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、表１、図４又は図５に記載されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１５７】
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、Ｇ  Ｆ  Ｄ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  ＨＸ1  ＨＸ2  ＨＸ3  ＨＸ4  ＨＸ5  ＨＸ6  Ｑ  Ｋ  Ｆ  Ｑ  Ｇ（Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  ＨＸ1  ＨＸ2  ＨＸ3  ＨＸ4  ＨＸ5  ＨＸ6  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ）（式中、ＨＸ1はＧｌｙ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＰｈｅであり；ＨＸ2はＧｌｕ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、又はＡｌａであり；ＨＸ3はＴｈｒ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、又はＡｓｎであり；ＨＸ4はＩｌｅ、Ａｌａ、Ａｒｇ、又はＨｉｓであり；ＨＸ5はＴｙｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、又はＧｌｎであり、及びＨＸ6はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、又はＨｉｓである）のアミノ酸配列（配列番号７１）を有するＶＨ−ＣＤＲ２を含む。
【０１５８】
更なる態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、ＨＸ7  ＨＸ8  Ｇ  ＨＸ9  ＨＸ10  ＨＸ11  ＨＸ12  Ｇ  Ｖ  Ｒ  Ｇ  Ｗ  Ｄ  Ｙ  Ｙ  Ｙ  Ｇ  Ｍ  Ｄ  Ｖ（ＨＸ7  ＨＸ8  Ｇｌｙ  ＨＸ9  ＨＸ10  ＨＸ11  ＨＸ12  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ）（式中、ＨＸ7はＰｒｏ、Ｓｅｒ、又はＶａｌであり；ＨＸ8はＡｓｎ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、又はＡｓｐであり；ＨＸ9はＧｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｈｒであり；ＨＸ10はＧｌｎ又はＨｉｓであり；ＨＸ11はＧｌｙ又はＧｌｎであり；ＨＸ12はＬｙｓ又はＧｌｙである）のアミノ酸配列（配列番号７２）を有するＶＨ−ＣＤＲ３を含む。
【０１５９】
他の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、Ｑ  Ｓ  Ｙ  Ｄ  Ｓ  ＬＸ1  ＬＸ2  ＬＸ3  ＬＸ4  ＬＸ5  ＬＸ6（Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  ＬＸ1  ＬＸ2  ＬＸ3  ＬＸ4  ＬＸ5  ＬＸ6）（式中、ＬＸ1はＳｅｒ又はＭｅｔであり；ＬＸ2はＬｅｕ、Ｔｙｒ、又はＨｉｓであり；ＬＸ3はＳｅｒ又はＡｒｇであり；ＬＸ4はＧｌｙ、Ａｌａ、又はアミノ酸無しであり；ＬＸ5はＴｒｐ又はＰｈｅであり；及びＬＸ6はＶａｌ、Ｇｌｙ、又はＡｌａである）のアミノ酸配列（配列番号７３）を有するＶＬ−ＣＤＲ３を含む。
【０１６０】
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は一組の相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖可変領域（ＶＨ）−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで：（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１はアミノ酸配列：Ｅ  Ｌ  Ｓ  Ｍ  Ｈ（配列番号１）を含み；（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２はアミノ酸配列：Ｇ  Ｆ  Ｄ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  ＨＸ1  ＨＸ2  ＨＸ3  ＨＸ4  ＨＸ5  ＨＸ6  Ｑ  Ｋ  Ｆ  Ｑ  Ｇ（式中、ＨＸ１は、Ｇ、Ｗ、Ｙ及びＦからなる群から選択され、ＨＸ２は、Ｅ、Ｔ、Ｑ、Ｋ、Ａ、及びＳからなる群から選択され、ＨＸ３は、Ｔ、Ｙ、Ｉ、及びＮからなる群から選択され、ＨＸ４は、Ｉ、Ａ、Ｒ及びＨからなる群から選択され、ＨＸ５は、Ｙ、Ｖ、Ｔ、Ｌ及びＱからなる群から選択され、及びＨＸ６は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｓ及びＨからなる群から選択される）（配列番号７１）を含み；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３はアミノ酸配列：ＨＸ7  ＨＸ8  Ｇ  ＨＸ9  ＨＸ10  ＨＸ11  ＨＸ12  Ｇ  Ｖ  Ｒ  Ｇ  Ｗ  Ｄ  Ｙ  Ｙ  Ｙ  Ｇ  Ｍ  Ｄ  Ｖ（式中、ＨＸ７は、Ｐ、Ｓ及びＶからなる群から選択され、ＨＸ８は、Ｎ、Ｗ、Ｄ、及びＴからなる群から選択され、ＨＸ９は、Ｑ、Ｒ及びＴからなる群から選択され、ＨＸ１０は、Ｑ及びＨからなる群から選択され、ＨＸ１１は、Ｇ及びＱからなる群から選択され、及びＨＸ１２は、Ｋ及びＧからなる群から選択される）（配列番号７２）を含み；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１はアミノ酸配列：Ｔ  Ｇ  Ｓ  Ｓ  Ｓ  Ｎ  Ｉ  Ｇ  Ａ  Ｇ  Ｙ  Ｄ  Ｖ  Ｈ（配列番号３０）を含み；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２はアミノ酸配列：Ｇ  Ｎ  Ｓ  Ｎ  Ｒ  Ｐ  Ｓ（配列番号３１）を含み；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３はアミノ酸配列：Ｑ  Ｓ  Ｙ  Ｄ  Ｓ  ＬＸ1  ＬＸ2  ＬＸ3  ＬＸ4  ＬＸ5  ＬＸ6（式中、ＬＸ１は、Ｍ及びＳからなる群から選択され、ＬＸ２は、Ｌ、Ｙ及びＨからなる群から選択され、ＬＸ３は、Ｓ及びＲからなる群から選択され、ＬＸ４は、Ａ及びＧからなる群から選択されるか又は省略され（アミノ酸無し）、ＬＸ５は、Ｗ及びＦからなる群から選択され、及びＬＸ６は、Ｖ、Ｇ及びＡからなる群から選択される）（配列番号７３）を含む。
【０１６１】
更なる態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、Ｇ  ＨＸ1  Ｓ  ＨＸ2  ＨＸ3  ＨＸ4  ＨＸ5  ＨＸ6  ＨＸ7  ＨＸ8  ＨＸ9  ＨＸ10  Ｄ  Ｓ  Ｖ  Ｋ  Ｇ（Ｇｌｙ  ＨＸ1  Ｓｅｒ  ＨＸ2  ＨＸ3  ＨＸ4  ＨＸ5  ＨＸ6  ＨＸ7  ＨＸ8  ＨＸ9  ＨＸ10 Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ）（式中、ＨＸ1はＩｌｅ又はＶａｌであり；ＨＸ2はＴｒｐ又はＬｅｕであり；ＨＸ3はＡｓｎ又はＧｌｎであり；ＨＸ4はＳｅｒ又はＧｌｕであり；ＨＸ5はＧｌｙ、Ｌｅｕ、又はＰｒｏであり；ＨＸ6はＳｅｒ、Ｔｙｒ、又はＡｓｐであり；ＨＸ7はＩｌｅ、Ｔｈｒ、又はＡｒｇであり；ＨＸ8はＧｌｙ又はＴｙｒであり；ＨＸ9はＴｙｒ又はＭｅｔであり；及びＨＸ10はＡｌａ又はＡｓｐである）のアミノ酸配列（配列番号７４）を有するＶＨ−ＣＤＲ２を含む。
【０１６２】
更なる態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、Ｅ  Ｇ  ＨＸ11  Ｗ  Ｎ  Ｙ  Ｄ  Ａ  ＨＸ12  Ｄ  ＨＸ13（Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  ＨＸ11  Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ａｌａ  ＨＸ12  Ａｓｐ  ＨＸ13）（式中、ＨＸ11はＡｓｎ又はＳｅｒであり；ＨＸ12はＰｈｅ又はＬｅｕであり；及びＨＸ13はＩｌｅ又はＶａｌである）のアミノ酸配列（配列番号７５）を有するＶＨ−ＣＤＲ３を含む。
【０１６３】
更なる態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、Ｔ  Ｇ  Ｔ  Ｓ  ＬＸ1  Ｄ  Ｖ  Ｇ  Ｇ  Ｙ  Ｎ  Ｙ  Ｖ  Ｓ（Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  ＬＸ1  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ）（式中、ＬＸ1はＳｅｒ又はＡｓｎである）のアミノ酸配列（配列番号７６）を有するＶＬ−ＣＤＲ１を含む。
【０１６４】
更なる態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、Ｄ  Ｖ  Ｓ  ＬＸ2  Ｒ  Ｐ  Ｓ（Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｘ４  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ）（式中、ＬＸ2はＡｓｎ又はＬｙｓである）のアミノ酸配列（配列番号７７）を有するＶＬ−ＣＤＲ２を含む。
【０１６５】
更なる態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は、ＬＸ3  ＬＸ4  ＬＸ5  ＬＸ6  ＬＸ7  ＬＸ8  Ｓ  Ｔ  Ｎ  Ｗ  Ｖ（ＬＸ3  ＬＸ4  ＬＸ5  ＬＸ6  ＬＸ7  ＬＸ8  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ）（式中、ＬＸ3はＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、又はＡｌａであり；ＬＸ4はＳｅｒ、Ｇｌｙ、又はＧｌｎであり；ＬＸ5はＴｙｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、又はＧｌｙであり；ＬＸ6はＴｈｒ又はＭｅｔであり；ＬＸ7はＳｅｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、又はＶａｌであり；及びＬＸ8はＳｅｒ又はＡｒｇである）のアミノ酸配列（配列番号７８）を有するＶＬ−ＣＤＲ３を含む。
【０１６６】
一部の態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質は一組の相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖可変領域（ＶＨ）−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで：（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１はアミノ酸配列：Ｄ  Ｙ  Ａ  Ｍ  Ｈ（配列番号３８）を含み；（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２はアミノ酸配列：Ｇ  ＨＸ1  Ｓ  ＨＸ2  ＨＸ3  ＨＸ4  ＨＸ5  ＨＸ6  ＨＸ7  ＨＸ8  ＨＸ9  ＨＸ10  Ｄ  Ｓ  Ｖ  Ｋ  Ｇ（式中、ＨＸ１は、Ｉ及びＶからなる群から選択され、ＨＸ２は、Ｗ及びＬからなる群から選択され、ＨＸ３は、Ｎ及びＱからなる群から選択され、ＨＸ４は、Ｓ及びＥからなる群から選択され、ＨＸ５は、Ｇ、Ｌ及びＰからなる群から選択され、ＨＸ６は、Ｓ、Ｙ及びＤからなる群から選択され、ＨＸ７は、Ｉ、Ｔ及びＲからなる群から選択され、ＨＸ８は、Ｇ及びＹからなる群から選択され、ＨＸ９は、Ｍ及びＹからなる群から選択され、及びＨＸ１０は、Ａ及びＤからなる群から選択される）（配列番号７４）を含み；（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３はアミノ酸配列：Ｅ  Ｇ  ＨＸ11  Ｗ  Ｎ  Ｙ  Ｄ  Ａ  ＨＸ12  Ｄ  ＨＸ13（式中、ＨＸ１１は、Ｎ及びＳからなる群から選択され、ＨＸ１２は、Ｆ及びＬからなる群から選択され、及びＨＸ１３は、Ｉ及びＶからなる群から選択される）（配列番号７５）を含み；（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１はアミノ酸配列：Ｔ  Ｇ  Ｔ  Ｓ  ＬＸ1  Ｄ  Ｖ  Ｇ  Ｇ  Ｙ  Ｎ  Ｙ  Ｖ  Ｓ（式中、ＬＸ１は、Ｎ及びＳからなる群から選択される）（配列番号７６）を含み；（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２はアミノ酸配列：Ｄ  Ｖ  Ｓ  ＬＸ2  Ｒ  Ｐ  Ｓ（式中、ＬＸ２は、Ｎ及びＫからなる群から選択される）（配列番号７７）を含み；及び（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３はアミノ酸配列：ＬＸ3  ＬＸ4  ＬＸ5  ＬＸ6  ＬＸ7  ＬＸ8  Ｓ  Ｔ  Ｎ  Ｗ  Ｖ（式中、ＬＸ３は、Ｌ、Ｍ、Ａ及びＳからなる群から選択され、ＬＸ４は、Ｓ、Ｑ及びＧからなる群から選択され、ＬＸ５は、Ｙ、Ｓ、Ｇ及びＲからなる群から選択され、ＬＸ６は、Ｔ及びＭからなる群から選択され、ＬＸ７は、Ｓ、Ｗ、Ｇ及びＶからなる群から選択され、及びＬＸ８は、Ｓ及びＲからなる群から選択される）（配列番号７８）を含む。
【０１６７】
一部の態様において、本明細書に開示されるＬＯＸ１結合タンパク質の一組のＣＤＲは、抗体フレームワーク領域又は当該技術分野において公知の他のタンパク質スキャフォールド内に提供される。例示的抗体フレームワーク領域としては、生殖細胞系列フレームワーク領域、例えば、重鎖の抗体フレームワーク領域についてＶＨ１−２４（ＤＰ−５）、ＪＨ６、ＶＨ３−０９（ＤＰ−３１）、及びＪＨ３、並びに軽鎖の抗体フレームワーク領域についてＶλ１ｅ（ＤＰＬ−８）、Ｖλ２ａ２（ＤＰＬ−１１）、及びＪＬ３及び／又は当業者に周知の任意の好適なフレームワーク領域が挙げられる。
【０１６８】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、生殖細胞系列フレームワークである重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）由来の１つ以上のフレームワーク領域を含有する。重鎖ドメインのフレームワーク領域は、ＶＨ１−２４（ＤＰ−５）、ＪＨ６、ＶＨ３−０９（ＤＰ−３１）、ＪＨ３フレームワーク及び／又は当該技術分野において周知の任意の好適なフレームワーク領域若しくはタンパク質スキャフォールドから選択され得る。軽鎖のフレームワーク領域は、Ｖλ１ｅ（ＤＰＬ−８）、Ｖλ２ａ２（ＤＰＬ−１１）、及びＪＬ３フレームワーク、及び／又は当該技術分野において周知の任意の好適なフレームワーク領域若しくはタンパク質スキャフォールドから選択され得る。１つ以上のＣＤＲが本明細書に開示されるＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、表１、図４又は図５に示されるＬＯＸ１結合タンパク質）から選ばれ、好適なフレームワーク及び／又はタンパク質スキャフォールドに組み込まれてもよい。
【０１６９】
更なる態様において、本開示は、それぞれ配列番号４及び配列番号３３のＶＨ及びＶＬを含む抗体と同じＬＯＸ１エピトープに結合する単離ＬＯＸ１結合タンパク質を提供する。
【０１７０】
他の態様において、本開示は、配列番号４のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列を含む抗体とＬＯＸ１に対する結合に関して競合するか、又は交差競合するＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗体）を提供する。詳細な態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４のＶＨ及び配列番号３３のＶＬを含む抗体がＬＯＸ１に結合するのを競合的に阻害することが可能である。
【０１７１】
また、配列番号２９のＶＨ及び配列番号３３のＶＬを含むＬＯＸ１結合タンパク質（例えばＬＯＸ１抗体又はその断片）よりも高い親和性でＬＯＸ１に結合することのできるＬＯＸ１抗体（例えば、完全長抗ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体、及び誘導体）などのＬＯＸ１結合タンパク質も提供される。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１７２】
更なる態様において、本開示は、それぞれ配列番号４１及び配列番号５８のＶＨ及びＶＬを含む抗体と同じＬＯＸ１エピトープに結合する単離ＬＯＸ１結合タンパク質を提供する。
【０１７３】
他の態様において、本開示は、配列番号４１のＶＨ配列及び配列番号５８のＶＬ配列を含む抗体とＬＯＸ１に対する結合に関して競合するか、又は交差競合するＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗体）を提供する。詳細な態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４１のＶＨ及び配列番号５８のＶＬを含む抗体がＬＯＸ１に結合するのを競合的に阻害することが可能である。
【０１７４】
また、配列番号５４のＶＨ及び配列番号７０のＶＬを含む完全長抗体よりも高い親和性でＬＯＸ１に結合することのできるＬＯＸ１抗体（例えば、完全長抗ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体、及び誘導体）などのＬＯＸ１結合タンパク質も提供される。本開示はまた、このＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター並びにこれらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、並びにＬＯＸ１結合タンパク質の作製及び使用方法も提供する。
【０１７５】
一部の態様において、本明細書に提供される抗ＬＯＸ１抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、又はそれらの任意の組み合わせである。一部の態様において、抗ＬＯＸ１抗体は、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、ｄｓＦｖ断片、ｓｃＦｖ断片、又はｓｃ（Ｆｖ）２断片である。
【０１７６】
本開示は、種を超えてＬＯＸ１分子に結合することのできるＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの単離抗ＬＯＸ１抗体）を提供する。一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質はヒトＬＯＸ１（ｈＬＯＸ１）及びカニクイザルＬＯＸ１（ｃｙｎｏＬＯＸ１）に結合する。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質はヒトＬＯＸ１（ｈＬＯＸ１）及びウサギＬＯＸ１に結合する。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、ｈＬＯＸ１、ｃｙｎｏＬＯＸ１及びウサギＬＯＸ１に結合する。本明細書に提供される特定の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体）はＬＯＸ１（例えば、ｈＬＯＸ１、ｃｙｎｏＬＯＸ１及び／又はウサギＬＯＸ１）に特異的に結合し、且つＣＬＥＣ−７Ａ、ＣＬＥＣ−１Ａ、ＣＬＥＣ−４Ｌ、ＣＬＥＣ−１Ｂ、ＳＲ−Ａ１及び／又はＳＲ−Ｂ３の１つ以上に結合しない。例えば、図３、図６及び図７を参照のこと。
【０１７７】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、単離抗ＬＯＸ１抗体又はその（ｏｒ  ｔｈｅｒｅｏｆ））はヒトＩｇＧ１  ＴＭ突然変異重鎖を更に含み、ここで重鎖可変領域（ＶＨ）は、参照アミノ酸配列の配列番号４、１９〜２８又は２９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％  ９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１７８】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、単離抗ＬＯＸ１抗体又はその（ｏｒ  ｔｈｅｒｅｏｆ））はヒトＩｇＧ１  ＴＭ突然変異重鎖を更に含み、ここで重鎖可変領域（ＶＨ）は、参照アミノ酸配列の配列番号４１、４８〜５３又は５４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％  ９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１７９】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び任意選択で重鎖定常領域又はその断片に加えて、軽鎖定常領域又はその断片を含む。特定の態様において、軽鎖定常領域はκλ軽鎖定常領域、例えば、ヒトκ定常領域又はヒトλ定常領域である。ある具体的な態様において、軽鎖定常領域はヒトκ定常領域である。
【０１８０】
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）は、ヒトκ定常領域を含有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を有し、例えばＶＬは、参照アミノ酸配列の配列番号３３、３６、又は３７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有するＶＬアミノ酸配列を含む。特定の態様において、本開示は、ヒトＩｇＧ１  ＴＭ突然変異重鎖及びヒトκ軽鎖を更に含むＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を提供し、ここで重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）は、それぞれ、配列番号４及び配列番号３３；配列番号２９及び配列番号３３；配列番号４１及び配列番号５８；又は配列番号５４及び配列番号７０を含む。
【０１８１】
更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）は、ヒトκ定常領域を更に含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を有し、例えば軽鎖は、参照アミノ酸配列の配列番号５８、６５〜６９又は７０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含み得る。特定の態様において、本開示は、ヒトＩｇＧ１  ＴＭ突然変異重鎖及びヒトκ軽鎖を更に含むＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を提供し、ここで重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）は、それぞれ、配列番号４１及び配列番号５８、配列番号４８及び配列番号６５、配列番号４９及び配列番号６６、配列番号５０及び配列番号６７、又は配列番号５３及び配列番号５８を含む。
【０１８２】
一部の態様において、本開示は、抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）などの単離ＬＯＸ１結合タンパク質を提供し、ここでＬＯＸ１結合タンパク質は、以下からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有する：（ａ）本明細書に開示されるアッセイ（例えば、実施例１０、アッセイ１、２及び／又は３又は実施例１１を参照）を含めた任意の好適なアッセイによって決定するとき、ＬＯＸ１に対するｏｘＬＤＬ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及び／又は終末糖化産物（ＡＧＥ）の結合を低減し、又は阻害する；（ｂ）本明細書に開示されるアッセイ（例えば、実施例１１を参照）を含めた任意の好適なアッセイによって決定するとき、細胞表面ＬＯＸ１を発現する内皮細胞のＲｈｏＡ／Ｒａｃ１、一酸化窒素（ＮＯ）、ｐ３８ＭＡＰＫ、プロテインキナーゼＢ及びＣ、ＥＲＫ１／２、及び／又はＮＦκＢシグナル伝達を低下させ、又は阻害する；（ｃ）本明細書に開示されるアッセイを含めた任意の好適なアッセイによって決定するとき、細胞表面ＬＯＸ１を発現する内皮細胞のカスパーゼ−８、カスパーゼ−９、及び／又はＢＡＸ活性を低下させ、又は阻害する；（ｄ）本明細書に開示されるアッセイ（例えば、実施例１０、アッセイ１、２及び／又は３又は実施例１１を参照）を含めた任意の好適なアッセイによって決定するとき、一塩基多型Ｋ１６７Ｎを有するＬＯＸ１に結合する；（ｅ）本明細書に開示されるアッセイ（例えば、実施例１０、アッセイ４又は実施例１１を参照）を含めた任意の好適なアッセイによって決定するとき、ｏｘＬＤＬインターナリゼーションを低減し、又は阻害する；（ｆ）本明細書に開示されるアッセイ（例えば、実施例１０、アッセイ５又は実施例１１を参照）を含めた任意の好適なアッセイによって決定するとき、ｏｘＬＤＬ誘導性ＬＯＸ１シグナル伝達を低減し、又は阻害する；（ｇ）ＢＩＡＣＯＲＥ又はＫｉｎＥｘＡによって決定するとき約１５０ｐＭ〜約６００ｐＭ（例えば約４００ｐＭ）の解離定数（ＫＤ）でＬＯＸ１に結合する；（ｈ）ＢＩＡＣＯＲＥによって決定するとき約１×１０5Ｍ-1ｓ-1〜約６×１０6Ｍ-1ｓ-1（例えば約５×１０5Ｍ-1ｓ-1）のＫｏｎ速度でＬＯＸ１に結合する；及び（ｉ）ＢＩＡＣＯＲＥによって決定するとき約１×１０-4ｓ-1〜約３×１０-4ｓ-1（例えば約２．３×１０-4ｓ-1）のＫｏｆｆ速度でＬＯＸ１に結合する。
【０１８３】
特定の態様では、本明細書に記載されるＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）によってＬＯＸ１生物学的活性を遮断すると、アテローム性動脈硬化症が低減され、及び／又はアテローム性動脈硬化症に関連する１つ以上の病態が軽減される。詳細な態様において、ＬＯＸ１アンタゴニスト（例えば抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）は、ＬＯＸ１の媒介によるアテローム硬化病変の発症、冠動脈疾患、脳卒中、虚血、梗塞、末梢血管疾患、再灌流、傷害、又はアテローム性動脈硬化症の発症に関連する他の臨床症状を阻害し、又は軽減する。
【０１８４】
特定の態様において、抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）などのＬＯＸ１結合タンパク質は、ＬＯＸ１、例えば、ヒトＬＯＸ１（ｈＬＯＸ１）及び／又はカニクイザルＬＯＸ１（ｃｙｎｏＬＯＸ１）、及びその抗原断片に対し、例えばＫＩＮＥＸＡ（登録商標）又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって計測するとき１０-6Ｍ未満、又は１０-7Ｍ未満、又は１０-8Ｍ未満、又は１０-9Ｍ未満、又は１０-10Ｍ未満、又は１０-11Ｍ未満、１０-12Ｍ未満、１０-13Ｍ未満、１０-14Ｍ未満、又は１０-15Ｍ未満の解離定数又はＫDで特異的に結合することができる。一態様において、抗ＬＯＸ１抗体はｈＬＯＸ１及びｃｙｎｏＬＯＸ１に対し、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって計測するとき約１×１０-8Ｍ〜約１×１０-10Ｍ未満のＫDで結合することができる。
【０１８５】
別の態様において、抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）などのＬＯＸ１結合タンパク質は、ＬＯＸ１に対し、１×１０-3ｓ-1未満、又は２×１０-3ｓ-1未満のＫoffで結合することができる。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質はＬＯＸ１に対し、例えばＫＩＮＥＸＡ（登録商標）又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって計測するとき１０-3ｓ-1未満、５×１０-3ｓ-1未満、１０-4ｓ-1未満、５×１０-4ｓ-1未満、１０-5ｓ-1未満、５×１０-5ｓ-1未満、１０-6ｓ-1未満、５×１０-6ｓ-1未満、５×１０-7ｓ-1未満、１０-8ｓ-1未満、５×１０-8ｓ-1未満、１０-9ｓ-1未満、５×１０-9ｓ-1未満、又は１０-10ｓ-1未満のＫoffで結合する。一態様において、抗ＬＯＸ１抗体はｈＬＯＸ１及びｃｙｎＬＯＸ１に対し、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって計測するとき１〜１０×１０-4ｓ-1のＫoffで結合することができる。
【０１８６】
別の態様において、抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）などのＬＯＸ１結合タンパク質は、ＬＯＸ１、例えばヒトＬＯＸ１（ｈ  ＬＯＸ１）及び／又はカニクイザルＬＯＸ１に対し、例えばＫＩＮＥＸＡ（登録商標）又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって計測するとき少なくとも１０5Ｍ-1ｓ-1、少なくとも５×１０5Ｍ-1ｓ-1、少なくとも１０6Ｍ-1ｓ-1、少なくとも５×１０6Ｍ-1ｓ-1、少なくとも１０7Ｍ-1ｓ-1、少なくとも５×１０7Ｍ-1ｓ-1、又は少なくとも１０8Ｍ-1ｓ-1、又は少なくとも１０9Ｍ-1ｓ-1の会合速度定数又はｋon速度で結合することができる。一態様において、抗ＬＯＸ１抗体はｈＬＯＸ１及びｃｙｎＬＯＸ１に対し、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって計測するとき約１×１０5Ｍ-1ｓ-1〜約２０×１０5Ｍ-1ｓ-1のｋon速度で結合することができる。
【０１８７】
上述のとおり、ＬＯＸ１と結合するＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列を含有するＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）は、本明細書に示される配列（例えば、表１、図４又は図５を参照）と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し得る。一部の態様において、ＬＯＸ１と結合する１つ又は複数のＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列は、本明細書に示される配列と比べて１５個以下の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の）アミノ酸付加、置換（例えば保存的置換）又は欠失を含む。一部の態様において、ＬＯＸ１と結合する１つ又は複数のＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列は、本明細書に示される配列と比べて８個以下の（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８個の）アミノ酸付加、置換（例えば保存的置換）又は欠失を含む。更なる態様において、ＬＯＸ１と結合するＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列は、本明細書に示される配列と比べて５個以下の（例えば、１、２、３、４又は５個の）アミノ酸付加、置換（例えば保存的置換）又は欠失を含む。あるＶＨ領域又はＶＬ領域と特定のパーセント類似性を有するか、又は１つ以上の置換、欠失及び／又は挿入（例えば保存的置換）を有するＶＨ及びＶＬ領域を含有するＬＯＸ１結合タンパク質（例えば抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）は、本明細書に記載されるＶＨ及び／又はＶＬ領域をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的又はＰＣＲ媒介性突然変異誘発）と、続くＬＯＸ１との結合に関するコードされた改変抗体の試験、及び任意選択で、本明細書に記載される機能アッセイ又は保持機能を試験するため常法で改良し得る当該技術分野において公知のアッセイを用いた保持機能に関する試験によって得ることができる。
【０１８８】
抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）などのＬＯＸ１結合タンパク質のＬＯＸ１に対する親和性又はアビディティは、当該技術分野において公知の任意の好適な方法、例えば、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、又は動態学（例えば、ＫＩＮＥＸＡ（登録商標）又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）解析）を用いて実験的に決定することができる。直接結合アッセイ並びに競合的結合アッセイフォーマットは、容易に用いることができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；及び本明細書に記載される方法を参照）。特定の抗体抗原相互作用についての計測される親和性は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ、温度）で計測された場合には変動し得る。従って、親和性及び他のＬＯＸ１結合パラメータ（例えば、ＫD又はＫｄ、Ｋon、Ｋoff）の計測は、ＬＯＸ１結合タンパク質及びＬＯＸ１と、本明細書に記載される緩衝液などの、当該技術分野において公知のとおりの標準緩衝液との標準溶液で行われる。
【０１８９】
本開示は、本明細書に記載されるとおりの（例えば、表１、図４又は図５を参照）抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）などのＬＯＸ１結合タンパク質を更に提供し、この抗体は異種薬剤にコンジュゲートされている。特定の態様において、薬剤は、抗菌剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生物学的反応修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体又は抗体断片、検出可能標識、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ヘテロコンジュゲートＬＯＸ１結合タンパク質については、本明細書の他の部分で更に詳細に考察する。
【０１９０】
特定の態様では、ＬＯＸ１結合タンパク質は抗ＬＯＸ１抗体でない。タンパク質標的に高親和性で結合する非抗体ポリペプチドを同定及び作製する種々の方法が当該技術分野において公知である。例えば、Ｓｋｅｒｒａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：２９５−３０４（２００７）、Ｈｏｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５：１４−２７（２００６）、Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：６５３−６５８（２００６）、Ｎｙｇｒｅｎ，ＦＥＢＳ  Ｊ．２７５：２６６８−７６（２００８）、及びＳｋｅｒｒａ，ＦＥＢＳ  Ｊ．２７５：２６７７−８３（２００８）（これらの各々は、全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。特定の態様では、ファージディスプレイ技術を用いてＬＯＸ１結合タンパク質を同定／作製することができる。特定の態様では、ポリペプチドは、アンキリン、プロテインＡ、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサスリピートドメイン、及びチオレドキシンからなる群から選択されるタイプのタンパク質スキャフォールドを含む。
【０１９１】
ＬＯＸ１結合タンパク質と同じエピトープに結合するタンパク質
特定の態様において、本開示は、本明細書に開示される１つ以上のＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、表１、図４又は図５を参照）と同じエピトープに結合するＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長抗ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）を提供する。用語「エピトープ」は、本明細書で使用されるとき、本開示の抗体との結合能を有する標的タンパク質決定基を指す。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特定の三次元構造特性、並びに特定の電荷特性を有する。立体エピトープと非立体エピトープとは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合は失われるが、後者に対する結合は失われない点で区別される。かかる抗体は、標準的な抗原結合又は活性アッセイにおいて、配列番号４のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列を含む抗体、及び／又は配列番号４１のＶＨ配列及び配列番号５８のＶＬ配列を含む抗体と交差競合する能力（例えば、その結合を統計的に有意な形で競合的に阻害する能力）に基づき同定することができる。
【０１９２】
本開示はまた、本明細書に開示される単離ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、表１、図４又は図５を参照）と同じエピトープに結合する抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）などのＬＯＸ１結合タンパク質も提供する。
【０１９３】
ある試験ＬＯＸ１結合タンパク質が、例えば、配列番号４のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列を含む抗体及び／又は配列番号４１のＶＨ配列及び配列番号５８のＶＬ配列を含む抗体の結合を阻害する能力から、その試験ＬＯＸ１結合タンパク質がＬＯＸ１との結合に関して当該の抗体と競合し得ることが実証される；かかるＬＯＸ１結合タンパク質は、非限定的な理論によれば、その競合相手のＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長抗ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）とＬＯＸ１上の同じ又は関連する（例えば、構造的に類似した、又は空間的に近接した）エピトープに結合することができる。一態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列を含む抗体とＬＯＸ１上の同じエピトープに結合する。別の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、配列番号４１のＶＨ配列及び配列番号５８のＶＬ配列を含む抗体とＬＯＸ１上の同じエピトープに結合する。
【０１９４】
一態様において、本開示は、ＬＯＸ１との結合に関して配列番号４のＶＨ配列及び配列番号３３のＶＬ配列を含む抗体と競合するＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗体）を提供する。別の態様において、本開示は、ＬＯＸ１との結合に関して配列番号４１のＶＨ配列及び配列番号５８のＶＬ配列を含む抗体と競合するＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗体）を提供する。
【０１９５】
ＩＶ．ＬＯＸ１結合タンパク質の活性
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）は、以下からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有する：（ａ）本明細書に開示されるアッセイ（例えば、実施例１０、アッセイ１、２及び／又は３又は実施例１１を参照）を含めた任意の好適なアッセイによって決定するとき、ＬＯＸ１に対するｏｘＬＤＬ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及び／又は終末糖化産物（ＡＧＥ）の結合を低減し、又は阻害する；（ｂ）本明細書に開示されるアッセイ（例えば、実施例１１を参照）を含めた任意の好適なアッセイによって決定するとき、細胞表面ＬＯＸ１を発現する内皮細胞のＲｈｏＡ／Ｒａｃ１、一酸化窒素（ＮＯ）、ｐ３８ＭＡＰＫ、プロテインキナーゼＢ及びＣ、ＥＲＫ１／２、及び／又はＮＦκＢシグナル伝達を低下させ、又は阻害する；（ｃ）本明細書に開示されるアッセイを含めた任意の好適なアッセイによって決定するとき、細胞表面ＬＯＸ１を発現する内皮細胞のカスパーゼ−８、カスパーゼ−９、及び／又はＢＡＸ活性を低下させ、又は阻害する；（ｄ）本明細書に開示されるアッセイ（例えば、実施例１０、アッセイ１、２及び／又は３又は実施例１１を参照）を含めた任意の好適なアッセイによって決定するとき、一塩基多型Ｋ１６７Ｎを有するＬＯＸ１に結合する；（ｅ）本明細書に開示されるアッセイ（例えば、実施例１０、アッセイ４又は実施例１１を参照）を含めた任意の好適なアッセイによって決定するとき、ｏｘＬＤＬインターナリゼーションを低減し、又は阻害する；（ｆ）本明細書に開示されるアッセイ（例えば、実施例１０、アッセイ５又は実施例１１を参照）を含めた任意の好適なアッセイによって決定するとき、ｏｘＬＤＬ誘導性ＬＯＸ１シグナル伝達を低減し、又は阻害する；（ｇ）ＢＩＡＣＯＲＥ又はＫｉｎＥｘＡによって決定するとき約１５０ｐＭ〜約６００ｐＭ（例えば約４００ｐＭ）の解離定数（ＫＤ）でＬＯＸ１に結合する；（ｈ）ＢＩＡＣＯＲＥによって決定するとき約１×１０5Ｍ-1ｓ-1〜約６×１０6Ｍ-1ｓ-1（例えば約５×１０5Ｍ-1ｓ-1）のＫｏｎ速度でＬＯＸ１に結合する；及び（ｉ）ＢＩＡＣＯＲＥによって決定するとき約１×１０-4ｓ-1〜約３×１０-4ｓ-1（例えば約２．３×１０-4ｓ-1）のＫｏｆｆ速度でＬＯＸ１に結合する。
【０１９６】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）は、ＬＯＸ１を発現する細胞のＬＯＸ１媒介性シグナル伝達を抑制し、阻害し、又は低減することができる。一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞ベースのアッセイを用いて計測するとき、ＲｈｏＡ／Ｒａｃ１、一酸化窒素、ｐ３８ＭＡＰＫ、プロテインキナーゼＢ及びＣ、ＥＲＫ１／２、及び／又はＮＦκＢシグナル伝達経路のＬＯＸ１媒介性活性化を約５００ｐＭ未満、約４５０ｐＭ未満、約４５０ｐＭ未満、約３５０ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２５０ｐＭ未満、約１５０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約７５ｐＭ未満、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１０ｎＭ未満、又は約５ｎＭ未満のＩＣ50で抑制し、阻害し、又は低減することができる。
【０１９７】
特定の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長抗ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）は、ＬＯＸ１を発現するカニクイザル内皮細胞、平滑筋細胞、及び／又はマクロファージにおけるＲｈｏＡ／Ｒａｃ１、一酸化窒素、ｐ３８ＭＡＰＫ、プロテインキナーゼＢ及びＣ、ＥＲＫ１／２、及び／又はＮＦκＢシグナル伝達経路のカニクイザルＬＯＸ１媒介性活性化を約７００ｐＭ、約５５０ｐＭ、約５００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２２０ｐＭ、約１００ｐＭ、約１ｐＭ、約０．１、約１ｎＭ、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約５０ｎＭ又は約１００ｎＭのＩＣ50で抑制し、阻害し、又は低減することができる。特定の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、ＬＯＸ１を発現するカニクイザル内皮細胞、平滑筋細胞、及び／又はマクロファージにおけるカニクイザルＬＯＸ１媒介性活性化を約１ｎＭ〜約５００ｐＭのＩＣ50で抑制し、阻害し、又は低減することができる。
【０１９８】
更なる態様において、アンタゴニストＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長抗ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）は、ＬＯＸ１を発現する内皮細胞、平滑筋細胞、及び／又はマクロファージにおいて、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞ベースのアッセイを用いて計測するときのＲｈｏＡ／Ｒａｃ１、一酸化窒素、ｐ３８ＭＡＰＫ、プロテインキナーゼＢ及びＣ、ＥＲＫ１／２、及び／又はＮＦκＢシグナル伝達経路のヒトＬＯＸ１媒介性活性化を約３００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５５ｐＭ、約４４ｐＭ、約１ｐＭ、約０．１ｐＭ、約１００ｎｍ、約５０ｎｍ  約４４ｎＭ、約１０ｎＭ、又は約３ｎＭのＩＣ50で抑制し、阻害し、又は低減することができる。
【０１９９】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）は、ｏｘＬＤＬに対するＬＯＸ１結合を阻害し又は低減する。一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、複数のＬＯＸ１リガンドに対するＬＯＸ１結合を阻害し又は低減する。一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、ｏｘＬＤＬ及びＡＧＥに対するＬＯＸ１結合を阻害し又は低減する。一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、ｏｘＬＤＬ及びＣＲＰに対するＬＯＸ１結合を阻害し又は低減する。一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、ｏｘＬＤＬ、ＡＧＥ及びＣＲＰに対するＬＯＸ１結合を阻害し又は低減する。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、ｏｘＬＤＬ、ＣＲＰ、ホスファチジルセリン、進行ＡＧＥ、スモールデンスリポタンパク質（ｓｄＬＤＬ）、酸化ＨＤＬ、Ｎ４−オキソノナノイルリジン（ＯＮＬ）、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ、例えばＨＳＰ６０）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、血小板、白血球及び／又はアポトーシス細胞に対するＬＯＸ１結合を阻害し又は低減する。１つ以上のリガンドに対するＬＯＸ−１結合の阻害又は低減を計測する方法には、本明細書の実施例に記載されるもの及び当該技術分野において公知の任意の他の好適な方法が含まれる。
【０２００】
Ｖ．抗ＬＯＸ１抗体の調製
特定の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、完全長抗ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体、及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体である。
【０２０１】
モノクローナル抗ＬＯＸ１抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）によって記載されるものなどの、ハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法を用いて、上記に記載したとおりマウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物を免疫し、免疫抗原に特異的に結合するであろう抗体のリンパ球による産生を誘発する。リンパ球はまた、インビトロで免疫することもできる。免疫後、リンパ球を単離し、好適な骨髄腫細胞株と例えばポリエチレングリコールを使用して融合してハイブリドーマ細胞を形成し、これらの細胞は次に、融合していないリンパ球及び骨髄腫細胞を選択によって除き得る。次に、免疫沈降、イムノブロッティングによるか、又はインビトロ結合アッセイ（例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって決定するとき、ｈＬＯＸ１などのＬＯＸ１を特異的に標的化するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、標準方法を用いたインビトロ培養（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、或いは動物における腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。次にモノクローナル抗体は、上記にポリクローナル抗体について記載したとおり、培養培地又は腹水から精製することができる。
【０２０２】
或いは、抗ＬＯＸ１モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されるとおりの組換えＤＮＡ方法を用いて作製することもできる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによるなどして、成熟Ｂ細胞又はハイブリドーマ細胞から単離し、従来の手順を用いてそれらの配列を決定する。次に、重鎖及び軽鎖をコードする単離ポリヌクレオチドを好適な発現ベクターにクローニングし、これを、他の場合には免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、又は骨髄腫細胞（例えばＮＳ０細胞）などの宿主細胞にトランスフェクトすると、宿主細胞によってモノクローナル抗体が作成される。また、組換え抗ＬＯＸ１モノクローナル抗体は、記載されるとおり、所望の種のＣＤＲを発現するファージディスプレイライブラリからも単離することができる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１））。
【０２０３】
完全長抗ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体をコードする１つ又は複数の核酸は、更に、組換えＤＮＡ技術を用いた幾つもの異なる方法で修飾して、代替的な抗体を作成することができる。一部の態様では、例えばマウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の定常ドメインを、（１）キメラ抗体を作成するため例えばヒト抗体のそれらの領域に置換するか、又は（２）融合抗体を作成するため非免疫グロブリンポリペプチドに置換することができる。一部の態様では、定常領域をトランケートするか、又は取り除くことにより、モノクローナル抗体の所望の抗体断片が作成される。可変領域の部位特異的又は高密度突然変異誘発を用いて、モノクローナル抗体の特異性、親和性等を最適化することができる。
【０２０４】
特定の態様において、抗ＬＯＸ１結合タンパク質は、完全長抗ｈＬＯＸ１抗体及びｈＬＯＸ１結合ヒト抗体断片、並びにその変異体、及び誘導体などのヒトＬＯＸ１に結合する。ヒト抗体は、当該技術分野において公知の様々な技法を用いて直接調製することができる。インビトロで免疫されるか、又は標的抗原に対する抗体を産生する免疫個体から単離された不死化ヒトＢリンパ球を作成することができる（例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６−９５（１９９１）；及び米国特許第５，７５０，３７３号明細書を参照）。
【０２０５】
また、例えば、Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：３０９−３１４（１９９６）、Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：６１５７−６１６２（１９９８）、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）、及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））に記載されるとおり、ファージライブラリから抗ＬＯＸ１ヒト抗体（例えば、ＬＯＸ１結合ヒト抗体断片）を選択することもでき、ここで当該のファージライブラリはヒト抗体を発現する。抗体ファージライブラリの作成及び使用に関する技術はまた、米国特許第５，９６９，１０８号明細書、同第６，１７２，１９７号明細書、同第５，８８５，７９３号明細書、同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；同第６，５９３，０８１号明細書；同第６，３００，０６４号明細書；同第６，６５３，０６８号明細書；同第６，７０６，４８４号明細書；及び同第７，２６４，９６３号明細書；及びＲｏｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７６（４）：１１８２−２００（２００８）（これらの各々は、全体として参照により本明細書に援用される）にも記載される。
【０２０６】
親和性成熟戦略及びチェインシャッフリング戦略（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）（参照により全体として本明細書に援用される））が当該技術分野において公知であり、高親和性抗ＬＯＸ１ヒト抗体の作成に用いることができる。
【０２０７】
一部の態様において、ＬＯＸ１抗体（完全長抗ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体など）は、ヒト化抗体であってもよい。非ヒト又はヒト抗体のエンジニアリング、ヒト化又はリサーフェシング方法もまた用いることができ、当該技術分野において公知である。ヒト化されるか、リサーフェシングれるか、又は同様にエンジニアリングされた抗体は、非ヒト、例えば、限定はされないが、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類又は他の哺乳動物である供給源由来の１つ以上のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「インポート」残基と称されることの多い残基によって置き換えられ、インポート残基は、典型的には既知のヒト配列の「インポート」可変、定常又は他のドメインから取られる。かかるインポートされた配列を用いて、当該技術分野において公知のとおり、免疫原性を低減し、又は結合性、親和性、ｏｎ速度、ｏｆｆ速度、アビディティ、特異性、半減期、若しくは任意の他の好適な特性を低減し、増強し、若しくは変更することができる。一般に、ＬＯＸ１結合への影響としては、ＣＤＲ残基が直接、且つ最も実質的に関与する。従って、非ヒト又はヒトＣＤＲ配列の一部又は全てを維持する一方で、可変領域及び定常領域の非ヒト配列はヒト又は他のアミノ酸に置き換えることができる。
【０２０８】
抗ＬＯＸ１抗体はまた、任意選択で、抗原ＬＯＸ１に対する高親和性及び他の有利な生物学的特性を保持しつつエンジニアリングされたヒト化抗体、リサーフェシング抗体、エンジニアリング抗体又はヒト抗体であってもよい。この目標を達成するため、任意選択で、ヒト化（又はヒト）又はエンジニアリングＬＯＸ１抗体、例えば、完全長抗ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体、及び誘導体、例えば、リサーフェシング抗体を、親配列、エンジニアリングされた配列、及びヒト化された配列の三次元モデルを使用した親配列及び様々な概念的ヒト化産物及びエンジニアリング産物の分析プロセスによって調製することができる。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者は精通している。選択した候補免疫グロブリン配列の推定上の三次元立体構造を図解及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の見込まれる役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンがＬＯＸ１などのその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、コンセンサス配列及びインポート配列からフレームワーク（ＦＷ）残基を選択して組み合わせることにより、１つ又は複数の標的抗原に対する親和性の増加などの所望の抗体特性を実現することができる。
【０２０９】
本開示の抗ＬＯＸ１抗体のヒト化、リサーフェシング又はエンジニアリングは、限定はされないが、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８））、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、米国特許第５，６３９，６４１号明細書、５，７２３，３２３号明細書；同第５，９７６，８６２号明細書；同第５，８２４，５１４号明細書；同第５，８１７，４８３号明細書；同第５，８１４，４７６号明細書；同第５，７６３，１９２号明細書；同第５，７２３，３２３号明細書；同第５，７６６，８８６号明細書；同第５，７１４，３５２号明細書；同第６，２０４，０２３号明細書；同第６，１８０，３７０号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，２２５，５３９号明細書；同第４，８１６，５６７号明細書、同第７，５５７，１８９号明細書；同第７，５３８，１９５号明細書；及び同第７，３４２，１１０号明細書；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６２８０号明細書；ＰＣＴ／ＵＳ９６／１８９７８号明細書；ＰＣＴ／ＵＳ９１／０９６３０号明細書；ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５９３９号明細書；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２３４号明細書；ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１３３４号明細書；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号明細書；ＰＣＴ／ＧＢ９２／０１７５５号明細書；国際公開第９０／１４４４３号パンフレット；国際公開第９０／１４４２４号パンフレット；国際公開第９０／１４４３０号パンフレット；及び欧州特許第２２９２４６号明細書（これらの各々は、そこに引用される文献を含め、全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるものを含めた任意の公知の方法を用いて実施することができる。
【０２１０】
アンタゴニストヒト抗ＬＯＸ１抗体また、免疫時に内因性免疫グロブリンを産生することなくヒト抗体の完全レパートリーを産生する能力を有するヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスにおいても作製することができる。この手法は、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；及び同第５，６６１，０１６号明細書に記載されている。
【０２１１】
特定の態様において、抗ＬＯＸ１抗体はＬＯＸ１結合抗体断片である。抗体断片の作製については、様々な技法が公知である。従来、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解による消化によって得られている（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．２４：１０７−１１７（１９９３）；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５））。特定の態様において、ＬＯＸ１結合抗体断片は組換えで作製される。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ抗体断片は、いずれも大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は他の宿主細胞で発現させて、そこから分泌させることができ、このようにしてこれらの断片を大量に作製することが可能である。かかるＬＯＸ１結合抗体断片はまた、上記で考察した抗体ファージライブラリから単離することもできる。ＬＯＸ１結合抗体断片はまた、米国特許第５，６４１，８７０号明細書に記載されるとおりの線状抗体であってもよい。抗体断片の他の作製技法が当該技術分野において公知である。
【０２１２】
本開示によれば、ＬＯＸ１に特異的な一本鎖抗体の産生に、当該技術分野において公知の技法を適合させることができる（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号明細書を参照）。加えて、Ｆａｂ発現ライブラリの構築に、ＬＯＸ１に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速且つ有効な同定を可能にする方法を適合させることができる（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）を参照）。抗ＬＯＸ１結合抗体断片は、限定はされないが：（ａ）抗体分子のペプシン消化によって作製されるＦ（ａｂ’）２断片；（ｂ）Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋の還元によって生成されるＦａｂ断片、（ｃ）抗ＬＯＸ１抗体をパパイン及び還元剤で処理することによって生成されるＦａｂ断片、及び（ｄ）Ｆｖ断片を含め、当該技術分野において公知の技法によって作製することができる。
【０２１３】
特定の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、ＬＯＸ１抗体（完全長抗ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体など）は、その血清中半減期が増加するように修飾することができる。これは、例えば、ＬＯＸ１結合タンパク質の適切な領域の突然変異によってＬＯＸ１結合タンパク質にサルベージ受容体結合エピトープを組み込むことによるか、又は次にはいずれかの末端若しくは中央で（例えば、ＤＮＡ又はペプチド合成によって）ＬＯＸ１結合タンパク質に融合するペプチドタグにそのエピトープを組み込むことによるか、又はＹＴＥ突然変異によって達成し得る。ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長抗ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体、及び誘導体などのＬＯＸ１抗体）の血清中半減期を増加させる他の方法、例えば、ＰＥＧなどの異種分子とのコンジュゲーションが、当該技術分野において公知である。
【０２１４】
ヘテロコンジュゲートＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長抗ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）もまた、本開示の範囲内にある。ヘテロコンジュゲートＬＯＸ１結合タンパク質は、２つの共有結合的につながったタンパク質で構成される。かかるタンパク質は、例えば、免疫細胞を望ましくない細胞に標的化させることが提案されている（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号明細書を参照）。ヘテロコンジュゲートＬＯＸ１結合タンパク質は、架橋剤が関わる方法を含めた、合成タンパク質化学における公知の方法を用いてインビトロで調製し得ることが企図される。例えば、ジスルフィド交換反応を用いるか、又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を構築することができる。この目的に好適な試薬の例としては、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
【０２１５】
本明細書に提供されるとおりの完全長抗ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体、及び誘導体などの修飾抗ＬＯＸ１抗体は、抗体とＬＯＸ１との会合をもたらす任意の種類の可変領域を含み得る。この点で、可変領域は、ＬＯＸ１抗原に対する体液性応答を生じ且つ免疫グロブリンを生成するように誘導することのできる任意の種類の哺乳動物のものを含み、又はそれに由来することができる。従って、抗ＬＯＸ１抗体の可変領域は、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、マカク等）又はルピナス起源のものであり得る。一部の態様において、修飾抗ＬＯＸ１抗体の可変領域及び定常領域は、両方ともにヒトのものである。他の態様において、適合性抗体（通常は非ヒト供給源に由来する）の可変領域は、分子の結合特性が向上し、又は免疫原性が低下するようにエンジニアリングし、又は特異的に調整することができる。この点で、本開示に係る有用な可変領域は、インポートされたアミノ酸配列を含めることによってヒト化するか、又は他の形で改変することができる。
【０２１６】
特定の態様では、抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長抗ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）の重鎖及び軽鎖の両方の可変ドメインが、１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置換によって、及び／又は部分的フレームワーク領域置換及び配列変更によって改変される。ＣＤＲは、フレームワーク領域の由来である抗体と同じクラス又は更にはサブクラスの抗体に由来し得るが、ＣＤＲは異なるクラスの抗体、特定の態様では異なる種の抗体に由来することが想定される。ある可変ドメインの抗原結合能を別の可変ドメインに移すために、全てのＣＤＲをドナー可変領域の完全なＣＤＲに置き換える必要はない。むしろ、抗原結合部位の活性の維持に必要な残基を移しさえすれば十分である。米国特許第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６１号明細書及び同第５，６９３，７６２号明細書に記載される説明を所与とすれば、免疫原性が低下した機能性抗体を得ることは、ルーチンの実験を実施することによるか、或いは手探り試験によって、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【０２１７】
可変領域の改変にも関わらず、当業者は、本開示の修飾抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長抗ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）が、天然の又は改変されていない定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の抗体と比較したときに腫瘍局在化の増加又は血清中半減期の低下などの所望の生化学的特性がもたらされるように、定常領域ドメインの１つ以上の少なくとも一部が欠失しているか、又は他の形で改変されている抗体を含むことを理解するであろう。一部の態様において、修飾抗ＬＯＸ１抗体の定常領域はヒト定常領域を含み得る。定常領域の修飾には、１つ以上のドメインにおける１つ以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換が含まれ得る。即ち、本明細書に開示される修飾抗ＬＯＸ１抗体は、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）のうちの１つ以上及び／又は軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に対する改変又は修飾を含み得る。一部の態様において、修飾抗ＬＯＸ１抗体は、１つ以上のドメインが部分的又は完全に欠失している定常領域を含み得ることが企図される。一部の態様において、修飾抗ＬＯＸ１抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が取り除かれたドメイン欠失コンストラクト又は変異体を含み得る（ΔＣＨ２コンストラクト）。一部の態様において、削除された定常領域ドメインは、典型的には欠けている定常領域によって付与される分子柔軟性の一部を提供する短いアミノ酸スペーサー（例えば、１０残基）に置き換えることができる。
【０２１８】
その構成に加えて、当該技術分野では、定常領域が幾つかのエフェクター機能を媒介することが知られている。例えば、補体のＣ１成分が抗体に結合すると、補体系が活性化される。補体の活性化は細胞病原体のオプソニン化及び溶解に重要である。補体の活性化はまた炎症反応も刺激し、また、自己免疫性の過敏症にも関与し得る。更に、抗体はＦｃ領域を介して細胞に結合し、ここでは抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体部位が細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。ＩｇＧ（γ受容体）、ＩｇＥ（η受容体）、ＩｇＡ（α受容体）及びＩｇＭ（μ受容体）を含め、異なる抗体クラスに特異的なＦｃ受容体が幾つもある。抗体が細胞表面上のＦｃ受容体に結合すると、抗体被覆粒子の貪食及び破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、又はＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症性メディエーターの放出、胎盤通過及び免疫グロブリン産生の制御を含めた幾つもの重要且つ多様な生物学的反応が惹起される。
【０２１９】
特定の態様において、抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長抗ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）は改変されたエフェクター機能を有し、ひいてはそれが、投与される抗ＬＯＸ１抗体の生物学的プロファイルに影響を及ぼす。例えば、定常領域ドメインを（点突然変異又は他の手段によって）欠失又は不活性化させると、循環中の修飾抗体のＦｃ受容体結合が低下し得る。他の場合に、定常領域を修飾すると、補体結合が調節され、ひいてはコンジュゲートした細胞毒の血清中半減期及び非特異的な会合が低下し得る。定常領域の更に他の修飾を用いると、抗原特異性又は抗体柔軟性の増加による局在化の増進を可能にするジスルフィド結合又はオリゴ糖部分を除去することができる。同様に、本開示における定常領域に対する修飾は、十分に当業者の範囲内にある周知の生化学的又は分子工学的技法を用いて容易に作製することができる。
【０２２０】
一部の態様において、本明細書に提供されるＬＯＸ１結合タンパク質は、１つ以上のエフェクター機能を有しないＬＯＸ１抗体（例えば、完全長抗ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体、及び誘導体）である。例えば、一部の態様において、抗ＬＯＸ１抗体は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有しない。特定の態様において、抗ＬＯＸ１抗体はＦｃ受容体及び／又は補体因子に結合しない。特定の態様において、抗ＬＯＸ１抗体はエフェクター機能を有しない。
【０２２１】
一部の態様において、抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長抗ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）は、ＣＨ３ドメインがそれぞれの修飾抗体のヒンジ領域に直接融合するようにエンジニアリングされる。他のコンストラクトでは、ヒンジ領域と修飾ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインとの間にペプチドスペーサーが挿入される。例えば、適合性コンストラクトを発現させることができ、ここではＣＨ２ドメインが欠失しており、且つ残りのＣＨ３ドメイン（修飾又は非修飾）が５〜２０アミノ酸のスペーサーでヒンジ領域に結合している。かかるスペーサーを加えると、例えば、定常ドメインの調節エレメントが空いて利用可能なままであること、又はヒンジ領域が柔軟なままであることが確実になり得る。ある場合には、アミノ酸スペーサーが免疫原性で、且つコンストラクトに対する望ましくない免疫応答を誘導すると分かる。従って、特定の態様では、修飾抗ＬＯＸ１の所望の生化学的品質を維持するため、コンストラクトに加えられる任意のスペーサーは比較的免疫原性が低いか、又は更には完全に省かれてもよい。
【０２２２】
定常領域ドメイン全体の欠失に加えて、抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長抗ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）は、定常領域における数個の又は更には単一のアミノ酸の部分的欠失又は置換によって修飾することができる。例えば、ＣＨ２ドメインの選択範囲における単一アミノ酸の突然変異が、Ｆｃ結合を実質的に低下させるには且つそれによることで十分であり得る。同様に、エフェクター機能（例えば、補体Ｃ１Ｑ結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインを完全に又は部分的に欠失させることができる。定常領域のかかる部分欠失により、対応する定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能はインタクトなまま残しておきながら、アンタゴニスト抗ＬＯＸ１抗体の選択された特性（例えば、血清中半減期）を向上させることができる。更に、本明細書に提供される抗ＬＯＸ１抗体の定常領域は、得られるコンストラクトのプロファイルを強化する１つ以上のアミノ酸の突然変異又は置換によって修飾することができる。この点で、修飾抗ＬＯＸ１抗体の構成及び免疫原性プロファイルを実質的に維持しながら、保存された結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によって提供される活性を破壊することが可能である。本開示はまた、エフェクター機能の低下若しくは増加又はより多くの細胞毒、標識若しくは炭水化物部分に対する結合部位の提供などの望ましい特性を増強するため、定常領域に１つ以上のアミノ酸の付加を含む抗ＬＯＸ１抗体も提供する。かかる態様では、選択された定常領域ドメインに由来する特定の配列を挿入又は反復することが望ましい場合もある。
【０２２３】
本開示はまた、本明細書に開示される抗ＬＯＸ１抗体（例えば、マウス、キメラ、ヒト化及びヒトＬＯＸ１結合タンパク質）と構造が実質的に相同な及び／又は１つ以上の機能が類似している変異体及び均等物にも関する。これらの変異体は、例えば、保存的アミノ酸残基置換突然変異を含み得る。当該技術分野において一般に理解されているとおり、保存的アミノ酸残基置換とは、アミノ酸残基を同じ一般クラス内の別の残基で置換すること、例えば、ある酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸で置換すること、ある塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で置換すること、又はある中性アミノ酸を別の中性アミノ酸によって置換することを指す。保存的アミノ酸置換によって意味されるものは、当該技術分野において公知である。
【０２２４】
本明細書に提供される抗ＬＯＸ１抗体などのＬＯＸ１結合タンパク質は、通常はタンパク質の一部でない追加的な化学的部分を含むように誘導体化することができる。かかる誘導体化部分は当該技術分野において公知であり、例えば、ＬＯＸ１結合タンパク質の溶解度、生物学的半減期、バイオアベイラビリティを向上させ、且つその他、安定性、製剤化及び／又は治療特性を向上させる働きをし得る。かかる部分についての非包括的な概説は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（２０００）を参照することができる。
【０２２５】
ＶＩ．ＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸及びその発現
本開示は、完全長抗ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体を含めたＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、表１、図４又は図５に記載されるものを参照）をコードする核酸分子を提供する。本明細書に開示される核酸分子は、ＲＮＡの形態であっても、又はＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡが含まれ；二本鎖又は一本鎖であってもよく、一本鎖の場合にはコード鎖又は非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。特定の態様において、核酸分子は単離されている。更なる態様において、核酸分子は実質的に純粋である。一部の態様において、核酸はｃＤＮＡであるか、又はｃＤＮＡに由来する。一部の態様において、核酸は組換え産生される。
【０２２６】
一部の態様において、核酸分子は、宿主細胞又はインビトロでのコード配列の発現を制御する制御配列に作動可能に連結されたＬＯＸ１結合タンパク質コード配列を含む。詳細な態様では、コード配列はｃＤＮＡである。本開示はまた、宿主細胞又はインビトロでのコード配列の発現を制御する制御配列に作動可能に連結されたＬＯＸ１結合タンパク質コード配列を含む核酸分子を含むベクターにも関する。
【０２２７】
一部の態様において、核酸分子は、同じリーディングフレームにおいて異種ポリヌクレオチド配列に融合した成熟ＬＯＸ１結合タンパク質のコード配列を含む。一部の態様において、異種ポリヌクレオチド配列は、ＬＯＸ１コード核酸分子で形質転換された宿主細胞からの発現タンパク質の分泌を促進するリーダーペプチド配列をコードする。リーダー配列を含むタンパク質はプレタンパク質と称され、そのリーダー配列が宿主細胞によって切断されると成熟形態のポリペプチドが形成され得る。宿主細胞における組換えタンパク質の分泌を促進するかかるリーダーペプチド配列及びその使用は、概して当該技術分野において公知である。更なる態様において、異種ポリヌクレオチド配列は、例えば、組換え発現したＬＯＸ１結合タンパク質の精製を促進し、そのタンパク質安定性及び／又は治療若しくは診断特性を追加し又は向上させる働きをし得る追加的な５’及び／又は３’アミノ酸残基をコードする。
【０２２８】
一部の態様において、本開示は、ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー又はシーケンシングプライマーとしての使用に十分なｃＤＮＡ分子などの単離核酸を提供する。
【０２２９】
特定の態様において、本開示は、軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする単離核酸分子を提供し、ここでＶＬは、それぞれ配列番号３０；配列番号３１；又は配列番号３２、３４又は３５と同一であるか、又はそれに対してＶＬ−ＣＤＲの１つ以上に合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換を有するＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。他の態様において、本開示は、軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする単離核酸分子を提供し、ここでＶＬは、それぞれ配列番号５５又は５９；配列番号５６又は６０；又は配列番号５７、６１〜６３又は６４と同一であるか、又はそれに対してＶＬ−ＣＤＲの１つ以上に合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換を有するＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【０２３０】
本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする単離核酸分子を更に提供し、ここでＶＨは、それぞれ配列番号１；配列番号２、５〜１２又は１３；及び配列番号３、１４〜１７又は１８と同一であるか、又はそれに対してＶＨ−ＣＤＲの１つ以上に合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換を有するＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。他の態様において、本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする単離核酸分子を提供し、ここでＶＨは、それぞれ配列番号３８；配列番号３９、４２又は４３；及び配列番号４０、４４〜４６又は４７と同一であるか、又はそれに対してＶＨ−ＣＤＲの１つ以上に合計１、２、３、４、５、６、７、８個以下のアミノ酸置換を有するＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【０２３１】
本開示は、軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするｃＤＮＡなどの単離核酸を更に提供し、ここでＶＬは、配列番号３３、配列番号３６、及び配列番号３７からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様において、単離核酸分子は軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードし、ここでＶＬは、参照アミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２３２】
更に、本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする単離核酸分子を提供し、ここでＶＨは、配列番号４、１９〜２８及び２９からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様において、単離核酸分子は重鎖可変領域（ＶＨ）をコードし、ここでＶＨは、参照アミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２３３】
特定の態様において、本開示は、ＬＯＸ１に特異的に結合するＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、表１、図４又は図５に示されるＬＯＸ−１結合タンパク質）をコードする核酸分子又は核酸分子の組み合わせを提供する。更に、本明細書に記載されるとおりの、ｃＤＮＡなどの核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）又は核酸分子の組み合わせを含むベクターが提供される。好適なベクターは本明細書の他の部分に記載され、当該技術分野において公知である。
【０２３４】
特定の態様において、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）は、それぞれ配列番号４及び配列番号３３、配列番号２３及び配列番号３６、又は配列番号２７及び配列番号３７をコードする参照核酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。詳細な態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）は、それぞれ配列番号４及び配列番号３３をコードする核酸配列によってコードされる。
【０２３５】
本開示は、軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするｃＤＮＡなどの単離核酸を更に提供し、ここでＶＬは、配列番号５８、６５〜６９及び７０からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様において、単離核酸分子は軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードし、ここでＶＬは、参照アミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２３６】
本開示はまた、重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする単離核酸分子も提供し、ここでＶＨは、配列番号４１、４８〜５３及び５４からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様において、単離核酸分子は重鎖可変領域（ＶＨ）をコードし、ここでＶＨは、参照アミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２３７】
特定の態様において、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）は、それぞれ配列番号５４及び配列番号７０、配列番号４１及び配列番号５８、配列番号４８及び配列番号６５、配列番号４９及び配列番号６６、配列番号５０及び配列番号６７、又は配列番号５３及び配列番号５８をコードする参照核酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。詳細な態様において、単離ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）は、それぞれ配列番号４１及び配列番号５８をコードする核酸配列によってコードされる。
【０２３８】
一部の態様において、単離核酸は、表１、図４又は図５に示される一組のＣＤＲ：ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ３及びＶＬ−ＣＤＲ３を含むＬＯＸ１結合タンパク質をコードする。一部の更なる態様において、単離核酸は、表１、図４又は図５に示される重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＬＯＸ１結合タンパク質をコードする。
【０２３９】
上記に記載したとおりの核酸分子組成物において、ＶＨをコードする核酸及びＶＬをコードする核酸は単一のベクターに存在してもよく、又は別個のベクター上にあってもよい。従って、本開示は、上記に記載される核酸分子組成物又は核酸分子の組み合わせを含む１つ以上のベクターを提供する。
【０２４０】
ある場合には、上記に記載したとおりのＶＨ及びＶＬをコードするポリヌクレオチド組成物は、ＬＯＸ１、例えばヒト及びカニクイザルＬＯＸ１に特異的に結合する抗体（ＬＯＸ１結合抗体断片を含む）をコードすることができる。一部の態様において、ポリヌクレオチド組成物は、それぞれ配列番号４及び配列番号３３のＶＨ及びＶＬを含む抗体又は抗原結合断片と同じエピトープに特異的に結合する抗体をコードする。他の態様において、ポリヌクレオチド組成物は、それぞれ配列番号４１及び配列番号５８のＶＨ及びＶＬを含む抗体又は抗原結合断片と同じエピトープに特異的に結合する抗体をコードする。一部の更なる態様において、ポリヌクレオチド組成物は、表１、図４又は図５に示される重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＬＯＸ１結合タンパク質と同じエピトープに特異的に結合する抗体をコードする。
【０２４１】
更なる態様において、本開示は、上記に提供される１つ又は複数の核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供し、ここで宿主細胞は、一部の例では、ＬＯＸ１に特異的に結合するＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）を発現することができる。かかる宿主細胞は、本明細書に提供されるとおりのＬＯＸ１結合タンパク質の作製方法において利用することができ、ここでこの方法は、（ａ）宿主細胞を培養するステップと、（ｂ）宿主細胞から発現したＬＯＸ１結合タンパク質を単離するステップとを含む。
【０２４２】
本開示はまた、ＬＯＸ１結合タンパク質の発現能を有する宿主細胞又はハイブリドーマを好適な条件下で培養するステップを含むＬＯＸ１結合タンパク質の作製方法も提供し、任意選択で、宿主細胞又はハイブリドーマから分泌されたＬＯＸ１結合タンパク質の単離方法を提供する。加えて、本開示は、本開示の方法を用いて宿主細胞又はハイブリドーマからの分泌後に単離されたＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を更に提供する。
【０２４３】
特定の態様において、ポリヌクレオチドは、例えばコードされたポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列と同じリーディングフレームにおいて融合した１つ又は複数の成熟ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片などのＬＯＸ１抗体）の１つ又は複数のコード配列を含む。例えば、マーカー配列は、ｐＱＥ−９ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグであってもよく、それにより細菌宿主の場合にマーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製が提供され、又はマーカー配列は、哺乳類宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）を使用するときには、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）タグであってもよい。
【０２４４】
抗ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片などのＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸変異体もまた提供される。核酸変異体は、コード領域、非コード領域、又は両方に改変を含み得る。一部の態様において、核酸変異体は、サイレント置換、付加、又は欠失を生じるものの、コードされるポリペプチドの特性又は活性は改変しない改変を含む。一部の態様において、核酸変異体は、遺伝子コードの縮重に起因するサイレント置換によって作製される。核酸変異体は、種々の理由で、例えば、特定の宿主用にコドン発現を最適化するため（ヒトｍＲＮＡのコドンを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌宿主が選好するものに変更するため）作製され得る。本明細書に記載される核酸を含むベクター及び細胞もまた提供される。
【０２４５】
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片などの抗ＬＯＸ１抗体）をコードする核酸配列は、オリゴヌクレオチドシンセサイザーを使用した化学合成によって構築される。かかるオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づき設計し、宿主細胞の選好に基づきコドンを最適化することができる。標準方法を常法で適用して、ＬＯＸ１結合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド配列を合成することができる。
【０２４６】
アセンブル後（合成、部位特異的突然変異誘発又は別の方法による）、ＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸配列は、常法で、所望の宿主におけるＬＯＸ１結合タンパク質の発現に適切な制御配列に作動可能に連結することができる。一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸配列は、発現ベクターに挿入され、且つ所望の宿主におけるタンパク質の発現に適切な制御配列に作動可能に連結される。宿主におけるトランスフェクトした遺伝子の高い発現レベルを達成するため、遺伝子は、選択の発現宿主において機能性の転写及び翻訳発現制御配列に作動可能に連結し、又はそれと関連付けることができる。
【０２４７】
特定の態様では、組換え発現ベクターを使用して、抗ＬＯＸ１抗体又はＬＯＸ１結合抗体断片などのＬＯＸ１結合タンパク質をコードするＤＮＡを増幅し及び発現させる。組換え発現ベクターは、哺乳類、微生物、ウイルス又は昆虫遺伝子に由来する好適な転写又は翻訳調節エレメントに作動可能に連結された、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片などの抗ＬＯＸ１抗体）のポリペプチド鎖をコードする合成の又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を有する複製可能なＤＮＡコンストラクトである。転写単位は、概して、以下に更に詳細に記載するとおり、（１）遺伝子発現において調節的役割を有する１つ又は複数の遺伝エレメント、例えば転写プロモーター又はエンハンサーと、（２）ｍＲＮＡに転写され且つタンパク質に翻訳される構造又はコード配列と、（３）適切な転写及び翻訳開始及び終結配列との集合を含む。かかる調節エレメントは、転写を制御するためオペレーター配列を含み得る。一般に複製起点によって付与される宿主における複製能、及び形質転換体の認識を促進する選択遺伝子が、更に組み込まれ得る。ＤＮＡ領域は、それらが機能上互いに関係しているとき、作動可能に連結している。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現する場合、そのポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結している；プロモーターは、それが配列の転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結している；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするような位置にある場合、コード配列に作動可能に連結している。酵母発現系での使用が意図される構造エレメントは、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。或いは、組換えタンパク質がリーダー配列又は輸送配列なしに発現する場合、タンパク質はＮ末端メチオニン残基を含み得る。この残基は、任意選択で、後に発現した組換えタンパク質から切断されて、最終的なタンパク質を提供し得る。特定の態様において、本開示は、任意選択で１つ以上の担体、希釈剤、賦形剤、又は他の添加剤を更に含む、上記又は本明細書の他の部分に記載するとおりの核酸又はベクターを含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。
【０２４８】
また、本明細書に開示される核酸分子又はｃＤＮＡ分子及び／又はベクターで形質転換された宿主細胞も提供される。本開示はまた、制御配列に作動可能に連結され、且つ任意選択でベクターに挿入された本開示の１つ又は複数の核酸分子で形質転換された宿主細胞も提供する。一部の態様において、宿主細胞は哺乳類宿主細胞である。更なる態様において、哺乳類宿主細胞は、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ヒト細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。他の態様において、宿主細胞はハイブリドーマである。
【０２４９】
加えて、本明細書に開示されるＬＯＸ１結合タンパク質をコードする核酸を発現する宿主細胞は、ＬＯＸ１結合タンパク質を産生するハイブリドーマである。
【０２５０】
更なる態様において、本開示は、本明細書に提供されるＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）を作製する方法であって、本明細書に開示される形質転換宿主細胞又はハイブリドーマをＬＯＸ１結合タンパク質の産生に好適な条件下で培養するステップを含む方法を提供する。本開示は、任意選択で、宿主細胞又はハイブリドーマから分泌されたＬＯＸ１結合タンパク質を単離することを提供する。本開示はまた、任意選択で、この方法を用いて作製されるＬＯＸ１結合タンパク質、及びＬＯＸ１結合タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物も提供する。
【０２５１】
発現制御配列及び発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存することになる。幅広い種類の発現宿主／ベクターの組み合わせを用いることができる。真核生物宿主に有用な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターとしては、ｐＣＲ  １、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体を含めた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のプラスミドなど、公知の細菌プラスミドが挙げられ、また、Ｍ１３及び繊維状一本鎖ＤＮＡファージなど、より広い宿主域のプラスミドも挙げられる。
【０２５２】
ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）の発現に好適な宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下にある原核生物、酵母、昆虫又は高等真核生物細胞が含まれる。原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はバチルス属（ｂａｃｉｌｌｉ）が含まれる。高等真核生物細胞には、以下に記載するとおりの哺乳類起源の樹立細胞株が含まれる。無細胞翻訳系もまた用いることができる。抗体作製を含めたタンパク質作製方法に関する更なる情報については、例えば、米国特許出願公開第２００８／０１８７９５４号明細書、米国特許第６，４１３，７４６号明細書及び同第６，６６０，５０１号明細書、及び国際公開第０４００９８２３号パンフレット（これらの各々は本明細書によって全体として参照により本明細書に援用される）を参照することができる。
【０２５３】
種々の哺乳類又は昆虫細胞培養系もまた、組換えＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）の発現に有利に用いることができる。哺乳類細胞における組換えＬＯＸ１結合タンパク質の発現を実施してもよく、なぜならかかるタンパク質は概して正しく折り畳まれ、適切に修飾され、且つ完全に機能性であるためである。好適な哺乳類宿主細胞株の例としては、ＨＥＫ−２９３及びＨＥＫ−２９３Ｔ、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ  ２３：１７５（１９８１））によって記載されるサル腎細胞のＣＯＳ−７株、及び他の細胞株、例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞株が挙げられる。哺乳類発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、発現のため遺伝子に連結した好適なプロモーター及びエンハンサー、及び他の５’又は３’フランキング非転写配列、及び５’又は３’非翻訳配列、例えば、必須リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与・受容部位、及び転写終結配列などを含み得る。昆虫細胞における異種タンパク質産生用のバキュロウイルス系が、Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）によってレビューされている。
【０２５４】
形質転換宿主又はハイブリドーマによって産生されるＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長抗ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）は、任意の好適な方法によって精製することができる。かかる標準方法には、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心、溶解度差、又は任意の他の標準的なタンパク質精製技法によるものが含まれる。ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザ被覆配列及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのアフィニティータグをタンパク質に付加すると、適切なアフィニティーカラムに通過させることによる容易な精製が可能となり得る。単離されたＬＯＸ１結合タンパク質はまた、タンパク質分解、核磁気共鳴及びＸ線結晶学などの技法を用いて物理的に特徴付けることもできる。
【０２５５】
例えば、組換えＬＯＸ１結合タンパク質を培養培地に分泌する系からの上清を、初めに市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを使用して濃縮し得る。この濃縮ステップの後、濃縮物を好適な精製マトリックスに適用し得る。或いは、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックス又は基質を用いてもよい。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製において一般的に用いられる他のタイプであってもよい。或いは、陽イオン交換ステップが用いられてもよい。好適な陽イオン交換体としては、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが挙げられる。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えばペンダントメチル基又は他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ステップを用いて、ＬＯＸ１結合タンパク質を更に精製することができる。様々に組み合わせた前述の精製ステップの一部又は全てを常法的に用いて、均一な組換えＬＯＸ１結合タンパク質を提供することもできる。
【０２５６】
細菌培養物で産生された組換えＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）は、例えば、細胞ペレットからの初期抽出と、続く１つ以上の濃縮、塩析、水溶性イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィーステップによって単離することができる。最終精製ステップには、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。組換えタンパク質の発現に用いた微生物細胞は、凍結融解サイクル処理、音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用を含めた、任意の好都合な方法によって破壊することができる。
【０２５７】
完全長抗体及び抗原結合抗体断片などの標的結合タンパク質を精製するための当該技術分野において公知の方法としてはまた、例えば、米国特許出願公開第２００８／０３１２４２５号明細書、同第２００８／０１７７０４８号明細書、及び同第２００９／０１８７００５号明細書（これらの各々は本明細書によって全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるものも挙げられる。
【０２５８】
ＶＩＩ．治療用ＬＯＸ１結合タンパク質を使用した治療方法
ＬＯＸ１、ＬＯＸ１活性、及び／又はＬＯＸ１発現に関連する疾患を有する対象を治療するためのＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）の使用方法が提供される。ＬＯＸ１発現の検出方法は当該技術分野において公知であり、限定はされないが、ＰＣＲ法、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡなどが挙げられる。
【０２５９】
更なる態様において、本開示は、本明細書に提供されるＬＯＸ１結合タンパク質、例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）と薬学的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物を提供する。一部の態様において、本開示は、薬剤として使用するための、ＬＯＸ１結合タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物を提供する。本開示はまた、ＬＯＸ１、ＬＯＸ１活性、ＬＯＸ１発現及び／又は低下したＨＤＬ媒介性シグナル伝達に関連する疾患又は病態を治療し、予防し、及び／又は改善するための医薬組成物の使用も提供する。一部の態様において、本明細書に提供される医薬組成物を使用して治療される疾患又は病態は、アテローム性動脈硬化症、血栓症、ＣＡＤ、虚血（例えば心筋虚血）、梗塞（例えば心筋梗塞）、急性冠症候群（ＡＣＳ）、脳卒中、再灌流傷害、再狭窄、末梢血管疾患、高血圧、心不全、炎症（例えば慢性炎症）、血管新生、子癇前症及び／又は癌である。
【０２６０】
一部の態様では、医薬組成物が、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）と、薬学的に許容可能な担体とを含有し、更に、標識基又はエフェクター基を含む。本明細書で使用されるとき、「標識」は、スクリーニングでの検出を可能にするため付加される１つ以上のエレメント、同位元素、又は化学的化合物を指す。標識は概して３つのクラスに分類される：（ａ）同位体標識（これは放射性同位体又は重同位体であり得る）、（ｂ）小分子標識（これには、蛍光色素及び比色定量色素、又は他の標識方法を可能にするビオチンなどの分子が含まれ得る）、及び（ｃ）免疫標識（これは、抗体によって認識される融合パートナーとして組み込まれたエピトープであり得る）。「標識基」は任意の検出可能標識を指す。一部の態様において、標識基は、潜在的な立体障害を低下させるためスペーサー（例えばペプチドスペーサー）を介してＬＯＸ１結合タンパク質にカップリングされる。標識は化合物に任意の位置で組み込むことができ、タンパク質発現中にインビトロ又はインビボで組み込むことができる。タンパク質を標識するための様々な方法が当該技術分野において公知であり、提供される方法の実施に用いることができる。更なる態様において、標識基は、同位体標識、磁気標識、酸化還元活性部分、光学色素、ビオチン化基及び二次レポーターによって認識されるポリペプチドエピトープからなる群から選択される。一部の態様において、標識基は、緑色蛍光タンパク質又はその誘導体（例えば、高感度ＧＦＰ、青色蛍光タンパク質又はその誘導体（例えば、ＥＢＦＰ（高感度青色蛍光タンパク質）、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、シアン蛍光タンパク質又はその誘導体（例えば、ＥＣＦＰ（高感度シアン蛍光タンパク質）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ）、黄色蛍光タンパク質又はその誘導体（例えば、ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ）などの蛍光タンパク質である。一部の態様において、ポリペプチドエピトープは、ビオチンシグナル伝達ペプチド、ヒスチジンペプチド（ｈｉｓ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、Ｆｌａｇ、金結合ペプチドから選択されるメンバーである。更なる態様において、エフェクター基は、放射性同位元素、放射性核種、毒素、治療薬及び化学療法剤からなる群から選択される。
【０２６１】
更なる態様において、エフェクター基は、放射性同位元素、放射性核種、毒素、治療薬及び化学療法剤からなる群から選択される。
【０２６２】
以下の考察では、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）による診断方法並びに様々な疾患及び病態の治療、予防及び／又は改善方法を述べる。一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質はヒト抗体、マウス抗体、又はヒト化抗体である。
【０２６３】
一態様において、本開示は、ＬＯＸ１に関連する疾患若しくは病態を有するか、又はそうした疾患若しくは病態を発症するリスクがある対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）を投与するステップを含む、疾患又は病態の治療、予防又は改善を提供する。別の態様において、治療は、対象から単離された組織又は細胞へのＬＯＸ１結合タンパク質の投与を含み、ここで対象は、ＬＯＸ１に関連する疾患若しくは病態を有するか、又はそうした疾患若しくは病態を発症するリスクがある。
【０２６４】
本開示はまた、対象のアテローム性動脈硬化症、血栓症、ＣＡＤ、虚血（例えば心筋虚血）、梗塞（例えば心筋梗塞）、急性冠症候群（ＡＣＳ）、脳卒中、再灌流傷害、再狭窄、末梢血管疾患、高血圧、心不全、炎症（例えば慢性炎症）、血管新生、子癇前症及び癌に関連する疾患又は病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供する。一部の態様において、本方法は、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）を含む医薬組成物の有効量を、それを必要としている対象に投与するステップを含む。更なる態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は単独で、又は併用療法として投与される。
【０２６５】
本開示はまた、対象のＬＯＸ１活性を低減し又は阻害する方法及び／又はＨＤＬ媒介性シグナル伝達を刺激し又は増加させる方法も提供する。一部の態様において、本方法は、それを必要としている対象（例えば、アテローム性動脈硬化症、血栓症、ＣＡＤ、虚血（例えば心筋虚血）、梗塞（例えば心筋梗塞）、急性冠症候群（ＡＣＳ）、脳卒中、再灌流傷害、再狭窄、末梢血管疾患、高血圧、心不全、炎症（例えば慢性炎症）、血管新生、子癇前症及び／又は癌と診断された対象）に有効量のＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）を投与するステップを含む。
【０２６６】
加えて、アテローム性動脈硬化症を治療し、予防し、及び／又は改善する方法が提供される。一部の例では、本方法は、アテローム性動脈硬化症を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与される対象は、アテローム性動脈硬化症を発症するリスクがある。一部の態様において、対象はアテローム生成促進病態を有する。更なる態様において、アテローム生成促進病態は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、高血圧、高血糖、心不全、血管外傷、臓器移植、脂質異常症（例えば高脂血症）、炎症（例えば慢性炎症及びエンドトキシン誘導炎症）及び／又は細菌感染症である。また、アテローム性動脈硬化症を軽減する方法も提供される。一部の例では、本開示は、対象のアテローム性動脈硬化症を軽減する方法であって、アテローム性動脈硬化症を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質を投与するステップを含む方法を提供する。
【０２６７】
また、血栓症を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供される。一部の例では、本方法は、血栓症を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質を投与される対象は、血栓症を発症するリスクがある。一部の態様において血栓症は動脈血栓症である。更なる態様において、血栓症は深部静脈血栓症である。
【０２６８】
本開示はまた、冠動脈疾患（ＣＡＤ）又はＣＡＤに関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供する。一部の例では、本方法は、ＣＡＤを有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質を投与される対象は、ＣＡＤを発症するリスクがある。一部の態様において、対象はアテローム生成促進病態を有する。更なる態様において、アテローム生成促進病態は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、高血圧、高血糖、心不全、血管外傷、臓器移植、脂質異常症（例えば高脂血症）、炎症（例えば慢性炎症及びエンドトキシン誘導炎症）及び／又は細菌感染症である。
【０２６９】
本開示はまた、虚血又は虚血に関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供する。一部の例では、本方法は、虚血を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質を投与される対象は、虚血を発症するリスクがある。一部の態様において、対象は心筋虚血を有する。他の態様において、対象は心筋虚血を発症するリスクがある。更なる態様において、対象は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、高血圧、高血糖、心不全、血管外傷、臓器移植、脂質異常症（例えば高脂血症）、炎症（例えば慢性炎症及びエンドトキシン誘導炎症）及び／又は細菌感染症を有する。
【０２７０】
また、梗塞又は梗塞に関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供される。一部の例では、本方法は、梗塞を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質を投与される対象は、梗塞を発症するリスクがある。一部の態様において、対象は心筋梗塞を有する。他の態様において、対象は心筋梗塞を発症するリスクがある。更なる態様において、対象は、虚血、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、高血圧、高血糖、心不全、血管外傷、臓器移植、脂質異常症（例えば高脂血症）、炎症（例えば、慢性炎症及びエンドトキシン誘導炎症）及び／又は細菌感染症を有する。
【０２７１】
本開示はまた、急性冠症候群（ＡＣＳ）又はＡＣＳに関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供する。一部の例では、本方法は、ＡＣＳを有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質を投与される対象は、ＡＣＳを発症するリスクがある。一部の態様において、対象は、ｓＬＯＸ血清レベルの上昇又はＬＯＸ１活性の上昇を有する。更なる態様において、対象はアテローム性動脈硬化症を有する。
【０２７２】
本開示はまた、脳卒中又は脳卒中に関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供する。一部の例では、本方法は、脳卒中を起こしたことがある対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質を投与される対象は、脳卒中を起こすリスクがある。一部の態様において、対象は、ｓＬＯＸ血清レベルの上昇又はＬＯＸ１活性の上昇を有する。更なる態様において、対象はアテローム性動脈硬化症を有する。
【０２７３】
また、再灌流傷害又は再灌流傷害に関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供される。一部の例では、本方法は、再灌流傷害を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質を投与される対象は、再灌流傷害を発症するリスクがある。一部の態様において、対象は手術を受ける予定である。他の態様において、対象は手術を受けたことがある。一部の態様において手術は移植又は冠動脈バイパス術である。更なる態様において、患者は心筋虚血再灌流傷害を有するか、又はそれを発症するリスクがある。更なる態様において、本方法は、心筋傷害を軽減し、コラーゲン蓄積を軽減し、血清ＣＫ−ＭＢ及びＭＤＡを低減し、心筋細胞サイズを低減し、白血球浸潤を低減し、及び／又は心機能不全を低減する（例えば、ＬＶＰを低減してＬＶＥＤＰを増加させる）。更なる態様において、本方法は、心一回拍出量、左室内径短縮率、及び／又は駆出分画を増加させる。
【０２７４】
本開示はまた、再狭窄又は再狭窄に関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供する。一部の例では、本方法は、再狭窄を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質を投与される対象は、再狭窄を発症するリスクがある。一部の態様において、対象は手術を受ける予定である。他の態様において、対象は手術を受けたことがある。一部の態様において、手術は血管内手技である。更なる実施形態において、手術は、血管手術、心臓手術又は血管形成術である。更なる態様において、手技は移植又は冠動脈バイパス術である。更なる態様において、治療、予防、及び／又は改善される再狭窄は、ステント内再狭窄又は血管形成術後再狭窄である。
【０２７５】
更なる態様において、本開示は、末梢血管疾患（ＰＶＤ）又はＰＶＤに関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法を提供する。一部の例では、本方法は、ＰＶＤを有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中にある）を投与するステップを含む。他の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質を投与される対象は、ＰＶＤを発症するリスクがある。一部の態様において、対象はｓＬＯＸ血清レベルの上昇又はＬＯＸ１活性の上昇を有する。更なる態様において、対象はアテローム性動脈硬化症を有する。
【０２７６】
本開示はまた、炎症又は炎症に関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供する。一部の例では、本方法は、炎症を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。更なる態様において、対象は慢性炎症を有する。一部の態様において、対象はｏｘＬＤＬａ及び／又はｓＬＯＸ血清レベルの上昇及び／又はＬＯＸ１活性の上昇を有する。更なる態様において、対象はアテローム性動脈硬化症を有する。
【０２７７】
本開示はまた、子癇前症又は子癇前症に関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法も提供する。一部の例では、本方法は、子癇前症又は子癇を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される医薬組成物中の抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。更なる態様において、対象は高血圧及び大量の尿タンパクを有する。一部の態様において、対象はｏｘＬＤＬ及び／又はｓＬＯＸ血清レベルの上昇及び／又はＬＯＸ１活性の上昇を有する。更なる態様において、対象は、足、脚及び／又は手の腫脹を有する。
【０２７８】
更なる態様において、本開示は、対象のアテローム性動脈硬化プラークを安定させる方法を提供する。一部の例では、本方法は、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）を、それを必要としている対象に投与するステップを含む。一部の態様において、本方法は、プラークにおけるＲｈｏＡ／Ｒａｃ１、一酸化窒素、ｐ３８ＭＡＰＫ、プロテインキナーゼＢ及びＣ、ＥＲＫ１／２、及び／又はＮＦκＢシグナル伝達経路のシグナル伝達を低減する。他の態様において、本方法は、プラークにおけるアポトーシスを低下させる。更なる態様において、本方法は、プラークにおけるカスパーゼ８、カスパーゼ９及び／又はＢＡＸ活性を低下させて、及び／又はＢＣＬ−２活性を増加させる。他の態様において、本方法は、プラークによって産生される接着分子又はサイトカインレベルを低下させる。更なる態様において、本方法は、プラークによるＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＭＣＰ１及び／又はＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ発現を低下させる。更なる態様において、本方法は、アテローム性動脈硬化プラークサイズ又は形成、アテローム性動脈硬化プラークにおけるマクロファージ集積及び／又はＭＭＰ（例えば、ＭＭＰ９）発現を低下させる。更なる態様において、本方法はプラークの進展低下又は退縮をもたらす。
【０２７９】
また、対象の血管緊張の低下を低減する方法も提供される。一部の例では、本方法は、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）を、それを必要としている対象に投与するステップを含む。一部の態様において、本方法は血管緊張の低下を低減する。更なる態様において、本方法は、ＨＤＬによって駆動される一酸化窒素（ＮＯ）産生（抗体が内皮ＮＯ産生を刺激する能力）を調節することによって対象の血管緊張の低下を低減する。
【０２８０】
加えて、対象の血管緊張を向上させる方法が提供される。一部の例では、本方法は、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を、それを必要としている対象に投与するステップを含む。
【０２８１】
一部の態様において、本開示は、高血糖又は高血圧に関連する病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法を提供する。一部の例では、本方法は、高血糖又は高血圧を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質を投与するステップを含む。
【０２８２】
加えて、癌を治療し、予防し、及び／又は改善する方法が提供される。一部の例では、本開示は、対象の癌を治療し、予防し、及び／又は改善する方法であって、癌を有する対象にＬＯＸ１結合タンパク質を投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様において、対象は、乳癌、結腸癌、卵巣癌、黒色腫、子宮頸癌、肺癌、子宮癌、腎癌、及び膵癌からなる群から選択される癌を有する。
【０２８３】
また、腫瘍細胞の増殖、移動又は浸潤を阻害する方法も提供される。一部の例では、本開示は、ＬＯＸ１活性をアンタゴナイズする方法であって、ＬＯＸ１を発現する腫瘍細胞にＬＯＸ１結合タンパク質を接触させるステップを含む方法を提供する。一部の態様において、腫瘍細胞は、乳癌、結腸癌、卵巣癌、黒色腫、子宮頸癌、肺癌、子宮癌、腎癌、及び膵癌からなる群から選択される癌のものである。一部の態様において、腫瘍細胞は癌株のものである。
【０２８４】
本開示は、加えて、血管新生を低減し、又は阻害する方法を提供する。一部の態様において、血管新生を低減し、又は阻害する方法は、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を、それを必要としている対象に投与するステップを含む。一部の態様において、対象は、病的血管新生に関連する病態を有する。更なる態様において、本開示は、血管新生を阻害する方法であって、ＬＯＸ１を発現する細胞にＬＯＸ１結合タンパク質を接触させるステップを含む方法を提供する。一部の態様において、細胞は内皮細胞である。更なる態様において、内皮細胞は冠血管内皮細胞である。一部の態様において、本方法はインビトロで実施される。他の態様において、本方法はインビボで実施される。
【０２８５】
加えて、ＬＯＸ１活性を遮断し、又は低減する方法が提供される。一部の態様において、本開示は、ＬＯＸ１活性を遮断する方法であって、ＬＯＸ１とｏｘＬＤＬ、ＡＧＥ、及び／又はＣＲＰなどのＬＯＸ１リガンドとの間の相互作用を低減し、又は阻害するＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様において、ＬＯＸ１は、内皮細胞、マクロファージ、平滑筋血管細胞及び／又は血小板の表面上に発現する。一部の態様において、細胞は冠血管内皮細胞などの内皮細胞である。更なる態様において、細胞は、血管平滑筋細胞、マクロファージ、又は血小板である。他の態様において、細胞はアテローム性動脈硬化組織の一部である。一部の態様において、本方法はインビボで実施される。他の態様において、本方法はインビトロで実施される。一部の態様において、遮断又は低減されるＬＯＸ１活性はｏｘＬＤＬの結合及び／又は取込み（例えばインターナリゼーション）である。更なる態様において、遮断又は低減されるＬＯＸ１活性は、ｐ３８（ＭＡＰＫ）、ｐ４４／４２ＭＡＰＫ、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）、プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）、転写因子ＮＦ−ＫＢ及び／又はＡＰ１シグナル伝達経路の誘導である。更なる態様において、遮断又は低減されるＬＯＸ１活性はアポトーシスの誘導である。更なる実施形態において、アポトーシスの誘導はカスパーゼ−９、カスパーゼ−３及び／又はＢｃｌ−２によって媒介される。更なる態様において、遮断又は低減されるＬＯＸ１活性は、ＬＯＸ１を発現する内皮細胞におけるＰＤＦＧのＡ鎖及びＢ鎖及び／又はヘパリン結合性ＥＧＦ様タンパク質（ＨＢ−ＥＧＦ）の発現である。一部の態様において、遮断又は低減されるＬＯＸ１活性は、ＬＯＸ１に対するｏｘＬＤＬの結合によって誘導されるＬＯＸ１活性である。
【０２８６】
加えて、ＬＯＸ１活性レベル又はＬＯＸ１発現レベル（例えばｓＬＯＸ１血清タンパク質レベル）の増加に関連する病理学的病態におけるＬＯＸ１活性を遮断し、又は低減する方法が提供される。一部の例では、本方法は、ＬＯＸ１活性又はＬＯＸ１発現レベル（例えばｓＬＯＸ１血清タンパク質レベル）が増加している対象にＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を投与するステップを含む。一部の態様において、病理学的病態は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、高血圧、高血糖、心不全、血管外傷、移植、脂質異常症（高脂血症）、炎症（例えば、慢性炎症及びエンドトキシン誘導炎症）又は細菌感染症である。一部の態様において、対象は、上昇したＯｘＬＤＬの血清レベルを有する。一部の態様において、対象は、上昇したＯｘＬＤＬ、１５リポキシゲナーゼ変性ＬＤＬ、１５リポキシゲナーゼ変性ＨＤＬ、糖化酸化ＬＤＬ、リゾホスファチジルコリンステラーゼ（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）（ＬＰＣ）及び／又はパルミチン酸の血清レベルを有する。更なる態様において、対象は、上昇したＴＮＦα、ＩＬ１、インターフェロンγ、ＬＰＳ（リポ多糖）、ＣＲＰ、アンジオテンシンＩＩ、エンドセリンＩ、及び／又はＡＧＥの血清レベルを有する。更なる態様において、対象は、上昇した可溶性ＬＯＸ１（ｓＬＯＸ１）の血清レベルを有する。一部の態様において、対象はＬＯＸ１遺伝子に一塩基多型（ＳＮＰ）を有する。一部の態様において、ＬＯＸ１遺伝子のＳＮＰはＬＯＸ１  Ｋ１６７Ｎ変異体である。
【０２８７】
また、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）活性を作動させ、又は増加させる方法も提供される。一部の態様において、本開示は、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はその断片）を、それを必要としている対象に投与することによってＨＤＬ活性を増加させ、又は作動させる方法を提供する。一部の態様において、増加させるＨＤＬ活性はＨＤＬ媒介性内皮ＮＯ産生の促進である。一部の態様において、増加させるＨＤＬ活性は内皮細胞のＮＦＫＢシグナル伝達活性の阻害である。一部の態様において、増加させるＨＤＬ活性は、内皮細胞修復の促進である。一部の態様において、増加させるＨＤＬ活性は炎症の低減である。
【０２８８】
また、臨床試験手順の一環として血液又は組織中のタンパク質レベル（例えば、ＬＯＸ１レベル）を診断的にモニタして、それにより例えば所与の治療レジメンの有効性を判定するための、本明細書に提供されるＬＯＸ１結合タンパク質などのＬＯＸ１結合タンパク質の使用も提供される。例えば、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体）を検出可能な物質にカップリングすることにより、検出を促進することができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；好適な補欠分子族複合体の例としては、ｎプトアビジン（ｎｐｔａｖｉｄｉｎ）／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ；好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ；及び好適な放射性物質の例としては、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ、又は3Ｈが挙げられる。
【０２８９】
ＶＩＩＩ．医薬組成物及び投与方法
本明細書に提供されるＬＯＸ１結合タンパク質を調製して、それを必要としている対象に投与する方法は当業者に公知であり、又は当業者によって容易に決定される。ＬＯＸ１結合タンパク質の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入によるもの又は局所であり得る。用語の非経口は、本明細書で使用されるとき、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、又は腟内投与を含む。これらの投与形式の全てが、明らかに本開示の範囲内にあるものとして企図されるが、投与形式の別の例を挙げれば、注射用、詳細には静脈内若しくは動脈内注射又は点滴用の溶液であり得る。通常、好適な医薬組成物は、緩衝液（例えば酢酸塩、リン酸塩又はクエン酸塩緩衝液）、界面活性剤（例えばポリソルベート）、任意選択で安定剤（例えばヒトアルブミン）等を含み得る。本明細書の教示と適合性のある他の方法では、本明細書に提供されるとおりのＬＯＸ１結合タンパク質は、アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｌｅｒｏｓｉｓ）又は腫瘍の臓器及び／又は部位に直接送達し、それにより治療剤への罹患組織の曝露を増加させることができる。一態様において、投与は、例えば吸入又は鼻腔内投与によって気道に直接である。
【０２９０】
本明細書で考察するとおり、ＬＯＸ１結合タンパク質は、アテローム性動脈硬化症、血栓症、ＣＡＤ、虚血（例えば心筋虚血）、梗塞（例えば心筋梗塞）、急性冠症候群（ＡＣＳ）、脳卒中、再灌流傷害、再狭窄、末梢血管疾患、高血圧、心不全、炎症（例えば慢性炎症）、血管新生、子癇前症及び癌などのＬＯＸ１媒介性疾患及び病態のインビボ治療に薬学的に有効な量で投与することができる。この点で、本開示のＬＯＸ１結合タンパク質は、投与が促進され且つ活性薬剤の安定性が増進するように製剤化され得ることは理解されるであろう。本開示における医薬組成物は、生理食塩水、非毒性緩衝液、保存剤などの薬学的に許容可能な非毒性の無菌担体を含み得る。本願の目的上、コンジュゲートした又はコンジュゲートしていないＬＯＸ１結合タンパク質の薬学的に有効な量とは、ＬＯＸ１との有効な結合を達成し、且つ利益を達成する、例えば疾患若しくは病態の症状を改善したり、又は物質若しくは細胞を検出したりするのに十分な量を意味する。本明細書に開示される治療法における使用に好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）１６ｔｈ  ｅｄ．（１９８０）に記載されている。
【０２９１】
本明細書に提供される特定の医薬組成物は、例えば、カプセル、錠剤、水性懸濁液剤又は液剤を含めた許容可能な剤形で経口投与することができる。特定の医薬組成物はまた、鼻エアロゾル又は吸入によって投与することもできる。かかる組成物は、ベンジルアルコール又は他の好適な保存剤、バイオアベイラビリティを増強する吸収促進剤、及び／又は他の従来の可溶化剤若しくは分散剤を用いて、生理食塩水中の溶液として調製することができる。
【０２９２】
単一の剤形を作製するため担体材料と組み合わせることのできるＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）の量は、治療対象及び詳細な投与方法に応じて変わり得る。本組成物は、単一用量、複数用量として、又は決められた期間にわたって注入で投与することができる。投薬レジメンもまた、最適な所望の反応（例えば、治療的又は予防的反応）がもたらされるように調整することができる。
【０２９３】
本開示の範囲に従い、ＬＯＸ１結合タンパク質は、前述の治療方法において治療効果を生じさせるのに十分な量でヒト又は他の対象に投与することができる。本明細書に提供されるＬＯＸ１結合タンパク質は、公知の技法に従いＬＯＸ１結合タンパク質を従来の薬学的に許容可能な担体又は希釈剤と組み合わせることによって調製される従来の剤形で、かかるヒト又は他の動物に投与することができる。薬学的に許容可能な担体又は希釈剤の形態及び特性は、それと組み合わせる活性成分の量、投与経路及び他の周知の変動要因に左右される。１つ以上の異なるＬＯＸ１結合タンパク質を含むカクテルもまた使用することができる。
【０２９４】
「治療有効用量又は治療有効量」又は「有効量」とは、治療すべき疾患又は病態を有する対象の治療に関して投与時に好ましい治療応答をもたらすＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）の量が意図される。
【０２９５】
アテローム性動脈硬化症、血栓症、ＣＡＤ、虚血（例えば心筋虚血）、梗塞（例えば心筋梗塞）、急性冠症候群（ＡＣＳ）、脳卒中、再灌流傷害、再狭窄、末梢血管疾患、高血圧、心不全、炎症（例えば慢性炎症）、血管新生、子癇前症及び癌などのＬＯＸ１媒介性疾患又は病態を治療するためのＬＯＸ１結合タンパク質組成物の治療有効用量は、投与手段、標的部位、対象の生理学的状態、対象がヒトか、それとも動物か、投与される他の薬物療法、及び治療が予防的か、それとも治療的かを含めた多くの異なる要因に応じて変わる。通常、対象はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物もまた治療され得る。治療投薬量は、安全性及び有効性を最適化するため、当業者に公知の常法を用いてタイトレーションすることができる。
【０２９６】
本明細書で使用されるとき、ＬＯＸ１結合タンパク質の投与によって特定の疾患又は病態の症状を改善するとは、永久的か、それとも一時的か、持続性か、それとも一過性かに関わらず、ＬＯＸ１結合タンパク質の投与に帰することのできる、又はそれに関連付けることのできる何らかの軽減を指す。
【０２９７】
少なくとも１つのＬＯＸ１結合タンパク質、例えば抗体又は結合断片の投与量は、本開示を踏まえれば、過度の実験を行うことなく当業者によって容易に決定される。少なくとも１つのＬＯＸ１結合タンパク質の投与方法及びそれぞれの量に影響を与える要因には、限定はされないが、疾患の重症度、疾患歴、並びに治療を受ける個体の年齢、身長、体重、健康、及び体調が含まれる。同様に、ＬＯＸ１結合タンパク質の投与量は、投与方法、及び対象がこの薬剤の単回投与を受けるか、それとも複数回投与を受けるかに依存することになる。
【０２９８】
本開示はまた、例えば、ＨＤＬ活性を向上させる医薬の製造、並びにアテローム性動脈硬化症、血栓症、ＣＡＤ、虚血（例えば心筋虚血）、梗塞（例えば心筋梗塞）、急性冠症候群（ＡＣＳ）、脳卒中、再灌流傷害、再狭窄、末梢血管疾患、炎症（例えば慢性炎症）、血管新生、子癇前症及び癌を治療し、予防し、及び／又は改善する方法における抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）などのＬＯＸ１結合タンパク質の使用も提供する。
【０２９９】
併用療法
一部の態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）は、１つ以上の他の療法と併用して投与される。かかる療法には、更なる治療剤並びに他の医学的介入が含まれる。本明細書に提供されるＬＯＸ１結合タンパク質と併用して投与することのできる例示的治療剤としては、限定はされないが、血小板阻害薬、抗凝固薬、降圧薬、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体阻害薬、β遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害薬（スタチン）、エゼチミブ、フィブラート系薬（例えば、ゲムフィブロジル（Ｇｅｍｉｆｉｂｒｏｚｉｌ）及びフェノフィブラート）、Ｚｅｔｉａ、胆汁酸捕捉剤、硝酸塩、及び血栓溶解剤が挙げられる。
【０３００】
様々な態様において、ＬＯＸ１結合タンパク質は、外科手技の前、その最中、及び／又はその後に対象に投与される。一部の態様において、手術は血管内手技である。更なる実施形態において、手術は、血管手術、心臓手術又は血管形成術である。更なる態様において、手技は移植又は冠動脈バイパス術である。
【０３０１】
ＩＸ．診断法
本開示は、アテローム性動脈硬化症、血栓症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、虚血（例えば心筋虚血）、梗塞（例えば心筋梗塞）、急性冠症候群（ＡＣＳ）、脳卒中、再灌流傷害、再狭窄、末梢血管疾患、高血圧、心不全、炎症、血管新生、子癇前症及び癌などのＬＯＸ１媒介性疾患及び病態の診断において有用な診断方法を更に提供し、これには、個体からの組織又は血清などの体液におけるＬＯＸ１（ｓＬＯＸ１を含む）タンパク質の発現レベルの計測、及び計測した発現レベルと正常組織又は体液における標準ＬＯＸ１発現レベルとの比較が関わり、ここで標準と比較した発現レベルの増加が、本明細書に提供されるとおりの完全長抗ＬＯＸ１抗体及び抗原結合抗体断片など、本明細書に提供されるＬＯＸ１結合タンパク質によって治療可能な障害の指標となる。
【０３０２】
抗ＬＯＸ１抗体（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体）など、本明細書に提供されるＬＯＸ１結合タンパク質は、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を用いた生物学的試料中のＬＯＸ１タンパク質レベルのアッセイに使用することができる（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）。ＬＯＸ１タンパク質発現の検出に有用な他の抗体ベースの方法としては、イムノアッセイ、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、又はウエスタンブロッティングが挙げられる。
【０３０３】
「ＬＯＸ１タンパク質の発現レベルをアッセイする」とは、第１の生物学的試料中のＬＯＸ１タンパク質レベルを直接（例えば、絶対タンパク質レベルを決定又は推定することによる）、或いは相対的に（例えば、第２の生物学的試料中の疾患関連ポリペプチドレベルと比較することによる）、定性的又は定量的に計測又は推定することが意図される。第１の生物学的試料中のＬＯＸ１タンパク質発現レベルを計測又は推定して標準ＬＯＸ１タンパク質レベルと比較することができ、この標準は、障害を有しない個体から得た第２の生物学的試料から取られるか、又は障害を有しない個体集団の平均レベルによって決定される。当該技術分野では理解されるであろうとおり、一旦「標準」ＬＯＸ１タンパク質レベルが分かれば、それを比較用の標準として繰り返し使用することができる。
【０３０４】
「生物学的試料」とは、潜在的にＬＯＸ１を発現する個体、細胞株、組織培養物、又は他の細胞供給源から得られる任意の生物学的試料が意図される。哺乳動物から組織生検及び体液を得る方法は、当該技術分野において公知である。
【０３０５】
Ｘ．ＬＯＸ１結合タンパク質を含むキット
本開示は、好適な包装内にあるＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体、ＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）と、本明細書に記載される方法の実施に使用し得る文書とを含むキットを更に提供する。
【０３０６】
文書には、以下の情報：使用説明書、臨床試験の考察、副作用一覧、科学文献、添付文書資料、臨床試験結果、及び／又はそれらの要約などのうちの任意のものが含まれ得る。文書は、組成物の活性及び／又は利点を指示又は確立し、及び／又は用量決定、投与、副作用、薬物相互作用、又は医療ケア提供者に有用な他の情報を記載し得る。かかる情報は、様々な試験、例えば、インビボモデルが関わる実験動物を使用した試験及び／又はヒト臨床試験に基づく試験の結果に基づき得る。キットは、別の療法（例えば、別の薬剤）及び／又は当該の他の療法（例えば、当該の他の薬剤）に関する情報を提供する働きをする上記に記載されるものなどの文書を更に含み得る。
【０３０７】
特定の態様において、キットは、１つ以上の容器に少なくとも１つの精製されたＬＯＸ１結合タンパク質を含む。一部の態様において、キットは、全ての対照、アッセイの実施についての指図、並びに結果の分析及び発表に必要な任意のソフトウェアを含め、検出アッセイの実施に必要及び／又は十分な全ての構成要素を含む。
【０３０８】
ＸＩ．イムノアッセイ
ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合断片、その変異体、又は誘導体）は、当該技術分野において公知の任意の方法によって免疫特異的結合に関してアッセイすることができる。使用することのできるイムノアッセイとしては、限定はされないが、いくつか例を挙げれば、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどの技法を用いる競合及び非競合アッセイシステムが挙げられる。かかるアッセイは常法であり、当該技術分野において公知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ）Ｖｏｌ．１（参照により全体として本明細書に援用される）を参照のこと）。
【０３０９】
本明細書に提供されるＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、抗ＬＯＸ１抗体又はＬＯＸ１結合断片、その変異体、又は誘導体）は、免疫蛍光法、免疫電子顕微鏡法又は非免疫学的アッセイのように、ＬＯＸ１又はその保存された変異体若しくはペプチド断片のインサイチュー検出のため組織学的に用いることができる。インサイチュー検出は、対象から組織学標本を採取し、且つ標識ＬＯＸ１結合タンパク質を生物学的試料上に重ねてそれに標識ＬＯＸ１結合タンパク質を適用することにより達成することができる。かかる手順を用いることにより、ＬＯＸ１、又は保存された変異体若しくはペプチド断片の存在のみならず、被験組織におけるその分布もまた決定することが可能である。本開示を用いることにより、当業者は、かかるインサイチュー検出を実現するため、多種多様な組織学的方法の任意のもの（染色手順など）を変更し得ることを容易に理解するであろう。
【０３１０】
ＬＯＸ１結合タンパク質（例えば、完全長ＬＯＸ１抗体及びＬＯＸ１結合抗体断片、並びにその変異体及び誘導体などの抗ＬＯＸ１抗体）の所与のロットの結合活性は、当該技術分野において公知の方法により決定することができる。当業者は、ルーチンの実験を用いて各決定に有効且つ最適なアッセイ条件を決定することができるであろう。
【０３１１】
単離ＬＯＸ１結合タンパク質の結合特性の決定に好適な方法及び試薬は当該技術分野において公知であり、及び／又は市販されている。かかる動態学的分析用に設計された機器及びソフトウェアは市販されている（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（登録商標）ソフトウェア、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ＫＩＮＥＸＡ（登録商標）ソフトウェア、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。
【０３１２】
特に指示されない限り、本開示の実施には、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来技術が用いられ、それらは当該分野の技術の範囲内にある。かかる技法は、文献に十全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，（１９８５）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号明細書；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５；Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照のこと。
【０３１３】
抗体工学の一般原理は、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄ．（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）に記載される。タンパク質工学の一般原理は、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．）に記載される。抗体及び抗体−ハプテン結合の一般原理は、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ（１９８４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．）；及びＳｔｅｗａｒｄ（１９８４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）に記載される。加えて、当該技術分野において公知の、具体的には記載されない免疫学の標準方法が、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９４）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（８ｔｈ  ｅｄ；Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）及びＭｉｓｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ）（１９８０）Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，ＮＹ）にあるとおり、一般に用いられる。
【０３１４】
免疫学の一般原理について記載する標準的な参考文献としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ（１９８２）Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ）；Ｋｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８０）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｓ（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ（１９８４）“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｂｕｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｅｌｓｅｖｅｒｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｇｏｌｄｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（２０００）Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ  ｅｄ．；Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ  ＆  Ｃｏ．）；Ｒｏｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（６ｔｈ  ｅｄ．；Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ）；Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（５ｔｈ  ｅｄ．；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｌｅｗｉｎ（２００３）Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩＩ（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ２００３）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）が挙げられる。
【０３１５】
本発明は以下の実施形態を包含する：
［実施形態１］一組の相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖可変領域（ＶＨ）−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質であって、前記一組のＣＤＲは、  （ｉ）ＶＨ−ＣＤＲ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、
（ｉｉ）ＶＨ−ＣＤＲ２が配列番号５のアミノ酸配列を有し、
（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＤＲ３が配列番号１４のアミノ酸配列を有し、
（ｉｖ）ＶＬ−ＣＤＲ１が配列番号３０のアミノ酸配列を有し、
（ｖ）ＶＬ−ＣＤＲ２が配列番号３１のアミノ酸配列を有し、及び
（ｖｉ）ＶＬ−ＣＤＲ３が配列番号３２のアミノ酸配列を有する
一組の参照ＣＤＲと比べて合計１８個以下のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有する、単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態２］一組の相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖可変領域（ＶＨ）−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質であって、
（ａ）（ｉ）ＶＨ−ＣＤＲ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、
（ｉｉ）ＶＨ−ＣＤＲ２が配列番号２のアミノ酸配列を有し、
（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＤＲ３が配列番号３のアミノ酸配列を有し、
（ｉｖ）ＶＬ−ＣＤＲ１が配列番号３０のアミノ酸配列を有し、
（ｖ）ＶＬ−ＣＤＲ２が配列番号３１のアミノ酸配列を有し、及び
（ｖｉ）ＶＬ−ＣＤＲ３が配列番号３２のアミノ酸配列を有するか、
（ｂ）（ｉ）ＶＨ−ＣＤＲ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、
（ｉｉ）ＶＨ−ＣＤＲ２が配列番号５のアミノ酸配列を有し、
（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＤＲ３が配列番号１４のアミノ酸配列を有し、
（ｉｖ）ＶＬ−ＣＤＲ１が配列番号３０のアミノ酸配列を有し、
（ｖ）ＶＬ−ＣＤＲ２が配列番号３１のアミノ酸配列を有し、及び
（ｖｉ）ＶＬ−ＣＤＲ３が配列番号３２のアミノ酸配列を有するか、
（ｃ）（ｉ）ＶＨ−ＣＤＲ１が配列番号３８のアミノ酸配列を有し、
（ｉｉ）ＶＨ−ＣＤＲ２が配列番号３９のアミノ酸配列を有し、
（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＤＲ３が配列番号４４のアミノ酸配列を有し、
（ｉｖ）ＶＬ−ＣＤＲ１が配列番号５５のアミノ酸配列を有し、
（ｖ）ＶＬ−ＣＤＲ２が配列番号６０のアミノ酸配列を有し、及び
（ｖｉ）ＶＬ−ＣＤＲ３が配列番号６１のアミノ酸配列を有するか、
又は
（ｄ）（ｉ）ＶＨ−ＣＤＲ１が配列番号３８のアミノ酸配列を有し、
（ｉｉ）ＶＨ−ＣＤＲ２が配列番号３９のアミノ酸配列を有し、
（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＤＲ３が配列番号４０のアミノ酸配列を有し、
（ｉｖ）ＶＬ−ＣＤＲ１が配列番号５５のアミノ酸配列を有し、
（ｖ）ＶＬ−ＣＤＲ２が配列番号５６のアミノ酸配列を有し、及び
（ｖｉ）ＶＬ−ＣＤＲ３が配列番号５７のアミノ酸配列を有する、
単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態３］配列番号４、１９〜２９、４１、又は４８〜５４と少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；及び配列番号３３、３６、３７、５８又は６５〜７０と少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態４］重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質であって、前記ＶＨ配列が、配列番号４、１９〜２８及び２９からなる群から選択される参照ＶＨ配列と比べて合計１５個以下のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有し、且つ前記ＶＬ配列が、配列番号３３、３６、及び３７からなる群から選択される参照ＶＬ配列と比べて合計６個以下のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失を有する、単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態５］配列番号４、１９〜２９、４１、又は４８〜５４を含むＶＨからなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号３３、３６、３７、５８又は６５〜７０を含むＶＬからなる群から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態６］（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ、
（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ、
（ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を有するＶＬ、及び
（ｄ）配列番号５４のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号７０のアミノ酸配列を有するＶＬ、
からなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態７］配列番号４を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号３３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態８］表１、図４又は図５に示されるとおりの一組の相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖可変領域（ＶＨ）−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態９］表１、図４又は図５に示されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態１０］一組の相補性決定領域（ＣＤＲ）：重鎖可変領域（ＶＨ）−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３を含む単離ＬＯＸ１結合タンパク質であって、
（ａ）ＶＨ−ＣＤＲ１がアミノ酸配列：
Ｅ  Ｌ  Ｓ  Ｍ  Ｈ（配列番号１）を含み、
（ｂ）ＶＨ−ＣＤＲ２がアミノ酸配列：
Ｇ  Ｆ  Ｄ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  ＨＸ1  ＨＸ2  ＨＸ3  ＨＸ4  ＨＸ5  ＨＸ6  Ｑ  Ｋ  Ｆ  Ｑ  Ｇ（配列番号７１）を含み
（式中、ＨＸ１は、Ｇ、Ｗ、Ｙ及びＦからなる群から選択され、
ＨＸ２は、Ｅ、Ｔ、Ｑ、Ｋ、Ａ、及びＳからなる群から選択され、
ＨＸ３は、Ｔ、Ｙ、Ｉ、及びＮからなる群から選択され、
ＨＸ４は、Ｉ、Ａ、Ｒ及びＨからなる群から選択され、
ＨＸ５は、Ｙ、Ｖ、Ｔ、Ｌ及びＱからなる群から選択され、及び
ＨＸ６は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｓ及びＨからなる群から選択される）、
（ｃ）ＶＨ−ＣＤＲ３がアミノ酸配列：
ＨＸ7  ＨＸ8  Ｇ  ＨＸ9  ＨＸ10  ＨＸ11  ＨＸ12  Ｇ  Ｖ  Ｒ  Ｇ  Ｗ  Ｄ  Ｙ  Ｙ  Ｙ  Ｇ  Ｍ  Ｄ  Ｖ（配列番号７２）を含み
（式中、ＨＸ７は、Ｐ、Ｓ及びＶからなる群から選択され、
ＨＸ８は、Ｎ、Ｗ、Ｄ、及びＴからなる群から選択され、
ＨＸ９は、Ｑ、Ｒ及びＴからなる群から選択され、
ＨＸ１０は、Ｑ及びＨからなる群から選択され、
ＨＸ１１は、Ｇ及びＱからなる群から選択され、及び
ＨＸ１２は、Ｋ及びＧからなる群から選択される）、
（ｄ）ＶＬ−ＣＤＲ１がアミノ酸配列：
Ｔ  Ｇ  Ｓ  Ｓ  Ｓ  Ｎ  Ｉ  Ｇ  Ａ  Ｇ  Ｙ  Ｄ  Ｖ  Ｈ（配列番号３０）を含み、
（ｅ）ＶＬ−ＣＤＲ２がアミノ酸配列：
Ｇ  Ｎ  Ｓ  Ｎ  Ｒ  Ｐ  Ｓ（配列番号３１）を含み、及び
（ｆ）ＶＬ−ＣＤＲ３がアミノ酸配列：
Ｑ  Ｓ  Ｙ  Ｄ  Ｓ  ＬＸ1  ＬＸ2  ＬＸ3  ＬＸ4  ＬＸ5  ＬＸ6（配列番号７３）を含む
（式中、ＬＸ１は、Ｍ及びＳからなる群から選択され、
ＬＸ２は、Ｌ、Ｙ及びＨからなる群から選択され、
ＬＸ３は、Ｓ及びＲからなる群から選択され、
ＬＸ４は、Ａ及びＧからなる群から選択されるか又は省略され（アミノ酸無し）、
ＬＸ５は、Ｗ及びＦからなる群から選択され、及び
ＬＸ６は、Ｖ、Ｇ及びＡからなる群から選択される）、
単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態１１］実施形態１〜１０のいずれかに記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質と同じエピトープに結合する単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態１２］実施形態１〜１０のいずれかに記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質とＬＯＸ１に対する結合に関して競合する単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態１３］前記ＬＯＸ１結合タンパク質がＬＯＸ１活性を低減し、阻害し、又はアンタゴナイズする、実施形態１〜１０のいずれかに記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質。［実施形態１４］前記ＬＯＸ１結合タンパク質が、以下からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有する：
（ａ）ＬＯＸ１に対するｏｘＬＤＬ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及び／又は終末糖化産物（ＡＧＥ）の結合を低減し、又は阻害する、
（ｂ）細胞表面ＬＯＸ１を発現する内皮細胞のＲｈｏＡ／Ｒａｃ１、一酸化窒素（ＮＯ）、ｐ３８ＭＡＰＫ、プロテインキナーゼＢ及びＣ、ＥＲＫ１／２、及び／又はＮＦκＢシグナル伝達を低下させ、又は阻害する、
（ｃ）細胞表面ＬＯＸ１を発現する内皮細胞のカスパーゼ−８、カスパーゼ−９、及び／又はＢＡＸ活性を低下させ、又は阻害する、
（ｄ）一塩基多型Ｋ１６７Ｎを有するＬＯＸ１に結合する、
（ｅ）ｏｘＬＤＬインターナリゼーションを低減し、又は阻害する、
（ｆ）ｏｘＬＤＬ誘導性ＬＯＸ１シグナル伝達を低減し、又は阻害する、
（ｇ）ＢＩＡＣＯＲＥ又はＫｉｎＥｘＡによって決定するとき約１５０ｐＭ〜約６００ｐＭ又は約４００ｐＭの解離定数（ＫD）でＬＯＸ１に結合する、
（ｈ）ＢＩＡＣＯＲＥによって決定するとき約１×１０5Ｍ-1ｓ-1〜約６×１０6Ｍ-1ｓ-1又は約５×１０5Ｍ-1ｓ-1のＫon速度でＬＯＸ１に結合する、及び
（ｉ）ＢＩＡＣＯＲＥによって決定するとき約１×１０-4ｓ-1〜約３×１０-4ｓ-1又は約２．３×１０-4ｓ-1のＫoff速度でＬＯＸ１に結合する、
実施形態１〜１０のいずれかに記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態１５］前記ＬＯＸ１結合タンパク質が抗体である、実施形態１〜１４のいずれかに記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態１６］前記抗体が、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、又はＬＯＸ１結合抗体断片である、実施形態１５に記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態１７］前記ＬＯＸ１結合抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、又は一本鎖抗体分子からなる群から選択される、実施形態１６に記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態１８］前記ＬＯＸ１結合タンパク質又は抗体が、
（ａ）ヒトＩｇＡ定常ドメイン、
（ｂ）ヒトＩｇＤ定常ドメイン、
（ｃ）ヒトＩｇＥ定常ドメイン、
（ｄ）ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、
（ｅ）ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、
（ｆ）ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、
（ｇ）ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、及び
（ｈ）ヒトＩｇＭ定常ドメイン、
からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを更に含む、実施形態１〜１７のいずれかに記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態１９］前記ＬＯＸ１結合タンパク質又は抗体が、
（ａ）ヒトＩｇκ定常ドメイン、及び
（ｂ）ヒトＩｇλ定常ドメイン、
からなる群から選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを更に含む、実施形態１〜１８のいずれかに記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態２０］前記ＬＯＸ１結合タンパク質又は抗体が、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン及びヒトλ軽鎖定常ドメインを更に含む、実施形態１〜１９のいずれかに記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態２１］前記ＩｇＧ１定常Ｆｃ領域ドメインが、２３４位、２３５位及び３３１位（これらの位置の付番はＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスに従う）に突然変異を含有する、実施形態１８〜２０のいずれかに記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態２２］前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、突然変異Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓ（これらの位置の付番はＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスに従う）を含有する、実施形態２１に記載の単離ＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態２３］実施形態１〜２２のいずれかに記載のＬＯＸ１結合タンパク質をコードする単離核酸分子又は一組の核酸分子。
［実施形態２４］ｃＤＮＡである、実施形態２３に記載の単離核酸分子又は一組の核酸分子。
［実施形態２５］実施形態２３又は２４に記載の核酸分子又は一組の核酸分子の断片、又はその相補体である、ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー又はシーケンシングプライマーとしての使用に十分な単離ポリヌクレオチド又はｃＤＮＡ分子。
［実施形態２６］前記核酸分子が制御配列に作動可能に連結されている、実施形態２３又は２４に記載の核酸分子又はｃＤＮＡ分子。
［実施形態２７］実施形態２３、２４、又は２６のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
［実施形態２８］実施形態２３、２４、又は２６のいずれかに記載の核酸分子又は実施形態２７に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
［実施形態２９］哺乳類宿主細胞である、実施形態２８に記載の宿主細胞。
［実施形態３０］前記宿主細胞が、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ヒト細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、実施形態２９に記載の哺乳類宿主細胞。
［実施形態３１］実施形態２８、２９、又は３０のいずれかに記載の宿主細胞を、ＬＯＸ１結合タンパク質の産生に好適な条件下で培養するステップを含む、実施形態１〜２２のいずれかに記載のＬＯＸ１結合タンパク質を作製する方法。
［実施形態３２］前記宿主細胞から分泌されたＬＯＸ１結合を単離するステップを更に含む、実施形態３１に記載の方法。
［実施形態３３］実施形態３２に記載の方法を用いて作製されたＬＯＸ１結合タンパク質。
［実施形態３４］実施形態１〜２２又は３３のいずれかに記載のＬＯＸ１結合タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
［実施形態３５］標識基又はエフェクター基を更に含む、実施形態３４に記載の医薬組成物。
［実施形態３６］前記標識基が、同位体標識、磁気標識、酸化還元活性部分、光学色素、ビオチン化基、蛍光部分、例えば、ビオチンシグナル伝達ペプチド、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、及び黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び二次レポーターによって認識されるポリペプチドエピトープ、例えば、ヒスチジンペプチド（ｈｉｓ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、金結合ペプチド、及びＦｌａｇからなる群から選択される、実施形態３５に記載の医薬組成物。
［実施形態３７］前記エフェクター基が、放射性同位元素、放射性核種、毒素、治療薬及び化学療法剤からなる群から選択される、実施形態３５に記載の医薬組成物。
［実施形態３８］薬剤として使用される、実施形態３４〜３７のいずれかに記載の医薬組成物。
［実施形態３９］ＬＯＸ１に関連する疾患又は病態を治療するための、実施形態３４〜３７のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
［実施形態４０］前記疾患又は病態が、アテローム性動脈硬化症、血栓症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、虚血（例えば心筋虚血）、梗塞（例えば心筋梗塞）、急性冠症候群（ＡＣＳ）、脳卒中、再灌流傷害、再狭窄、末梢血管疾患、高血圧、心不全、炎症（例えば慢性炎症）、血管新生、子癇前症及び癌からなる群から選択される、実施形態３９に記載の使用。［実施形態４１］対象におけるＬＯＸ１に関連する疾患又は病態を治療し、予防し、及び／又は改善する方法であって、それを必要としている対象に、実施形態１〜２２又は３３のいずれかに記載のＬＯＸ１結合タンパク質を含む組成物、又は実施形態３４〜３７のいずれかに記載の医薬組成物の有効量を投与するステップを含む方法。
［実施形態４２］前記疾患又は病態が、アテローム性動脈硬化症、血栓症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、虚血（例えば心筋虚血）、梗塞（例えば心筋梗塞）、急性冠症候群（ＡＣＳ）、脳卒中、再灌流傷害、再狭窄、末梢血管疾患、高血圧、心不全、炎症（例えば慢性炎症）、血管新生、子癇前症及び癌からなる群から選択される、実施形態４１に記載の方法。［実施形態４３］前記ＬＯＸ１結合タンパク質又は医薬組成物が、単独で、又は併用療法として投与される、実施形態４１に記載の方法。
［実施形態４４］実施形態１〜２２又は３３のいずれかに記載のＬＯＸ１結合タンパク質、又は実施形態３４〜３７のいずれかに記載の医薬組成物の有効量を投与するステップを含む、対象のＬＯＸ１活性を低減し、又は阻害する方法。
以下の例は、限定としてではなく、例示として提供される。
【実施例】
【０３１６】
本開示の態様は、以下の非限定的な例を参照することによって更に定義され得る。これらの例は、本開示の特定の抗体の調製及び本開示の抗体の使用方法を詳細に記載するものである。当業者には、本開示の範囲から逸脱することなく材料及び方法の両方に対して多くの変更を行い得ることは明らかであろう。
【０３１７】
実施例１．抗ＬＯＸ１  ｓｃＦｖ抗体の単離及び同定
成人未処置ドナーの骨髄に由来する、繊維状ファージＭ１３ベースのファージミドベクターにクローニングした大規模単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ヒト抗体ライブラリを選択に使用した（Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ，Ｃ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎａｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｄｕｂｅｌ，Ｅｄｉｔｏｒｓ．２００１，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌｓ，Ｂｅｒｌｉｎ．ｐ．９３）。本質的に以前記載があるとおり（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０９（１９９６））、このファージディスプレイライブラリから組換え哺乳類発現ヒトＬＯＸ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する一連の反復選択サイクルでＬＯＸ１特異的ｓｃＦｖ抗体を単離した。このプロトコルの異なるバリエーションから幾つかの抗原特異的ｓｃＦｖを得た一方、親クローンＬＯＸ５１４（配列番号２９（ＶＨ）及び配列番号３３（ＶＬ）；本明細書では「ＬＯＸ１０５１４」とも称される）及びＬＯＸ６９６（配列番号５４（ＶＨ）及び配列番号７０（ＶＬ）；本明細書では「ＬＯＸ１０６９６」とも称される）を以下のとおり単離した：１０μｇ／ｍｌ  ヒトＬＯＸ１をＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ）上に固定化し、ファージディスプレイライブラリと共にインキュベートした。一連の洗浄サイクルで未結合のファージを洗い落とした。抗原上に保持されているファージ粒子を溶出し、細菌に感染させて、次の選択ラウンド用にレスキューした。このようにして３ラウンドの選択を行った。ラウンド２及びラウンド３選択アウトプットからの代表的な複数の個別クローンを９６ウェルプレートで成長させた。細菌ペリプラズムにおいてＳｃＦｖを発現させて、実施例１０、アッセイ１に記載するとおりのヒトＬＯＸ１：ｏｘＬＤＬ結合アッセイにおいてそれらの阻害活性に関してスクリーニングした。
【０３１８】
粗ペリプラズム抽出物としてのスクリーニングヒット、即ちＬＯＸ１：ｏｘＬＤＬ相互作用に対する阻害効果を示したｓｃＦｖクローンをＤＮＡシーケンシングに供した（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０９（１９９６）、及びＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：１８１（１９９６））。ユニークなｓｃＦｖを再び細菌で発現させて、アフィニティークロマトグラフィーによって精製し（国際公開第０１／６６７５４号パンフレットの実施例３に記載されるとおり）、上記のアッセイで精製ｓｃＦｖの希釈系列を試験することによってＩＣ50値を決定した。
【０３１９】
最も強力なｓｃＦｖクローンを、本質的にＰｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８７：９（１９９７）に記載されるとおり、但し以下の修正を加えて、全免疫グロブリンＧ１三重突然変異体（ＩｇＧ１−ＴＭ、突然変異Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓを組み込むヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列）抗体フォーマットに変換した。ＣＨＯ細胞での使用を促進し、且つエピソーム複製を可能にするため、発現ベクターにＯｒｉＰ断片を含めた。ヒト重鎖定常ドメイン及び調節エレメントを含有するベクターにＶＨドメインをクローニングして、哺乳類細胞で全ＩｇＧ１−ＴＭ重鎖を発現させた。同様に、ヒト軽鎖定常ドメイン及び調節エレメントの発現用ベクターにＶＬドメインをクローニングして、哺乳類細胞で全ＩｇＧ軽鎖を発現させた。ＩｇＧを得るため、重鎖及び軽鎖ＩｇＧ発現ベクターをＣＨＯ哺乳類細胞にトランスフェクトした。ＩｇＧを発現させて、培地中に分泌させた。回収されたものをプールしてろ過し、プロテインＡクロマトグラフィーを使用してＩｇＧを精製した。適切なサイズのセラミックプロテインＡ（ＢｉｏＳｅｐｒａ）のカラムに培養上清をロードし、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄した。０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）を使用して、結合したＩｇＧをカラムから溶出し、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を添加することによって中和した。溶出した材料をＮａｐ１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、＃１７−０８５４−０２）を使用してＰＢＳで緩衝液交換し、ＩｇＧの濃度を分光光度法でＩｇＧのアミノ酸配列に基づく吸光係数を使用して決定した（Ｍａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００：７４（１９９２））。精製したＩｇＧを凝集及び分解に関してＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用して、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０３２０】
実施例２−抗ＬＯＸ１抗体は、マルチリガンド結合、ｏｘＬＤＬインターナリゼーション及びｏｘＬＤＬ誘導シグナル伝達を阻害する
精製したＩｇＧについて、実施例１０、アッセイ１、２及び３に記載されるとおり、ＬＯＸ１に結合する酸化低密度リポタンパク質（「ｏｘＬＤＬ」）、ウシ血清アルブミンの終末糖化産物（「ＡＧＥ−ＢＳＡ」）及びＣ反応性タンパク質（「ＣＲＰ」）を特異的に阻害するそれらの能力を試験した。ＬＯＸ１０５１４及びＬＯＸ１０６９６を含む幾つもの単離クローン、及び市販のマウス抗ＬＯＸ１抗体（２３Ｃ１１）について、ＬＯＸ１に対するｏｘＬＤＬ、ＡＧＥ−ＢＳＡ及びＣＲＰ結合を遮断するそれらの能力を試験した。図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃに代表的なプロットを示し、それぞれｏｘＬＤＬ、ＡＧＥ−ＢＳＡ及びＣＲＰ結合のＬＯＸ５１４及びＬＯＸ６９６による阻害が示される。これらの抗体が交差反応し、ＬＯＸ１  ＳＮＰ  Ｋ１６７Ｎに対して機能活性を有したことを確認するため、ＬＯＸ１  ＳＮＰ  Ｋ１６７Ｎに対するｏｘＬＤＬ結合を遮断するそれらの能力に関して抗体を試験した。ＬＯＸ１  ＳＮＰ  Ｋ１６７Ｎ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ１０２８６１）は、当初虚血性心疾患患者群に発見された天然に存在するヒトＬＯＸ１変異体であり、心筋梗塞リスクの増加に関連すると考えられている。例えば、Ｔａｔｓｕｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２８；３０３（１）：２４７−５０（２００３）を参照のこと。代表的なプロットを図１Ｄに示し、ＬＯＸ５１４及びＬＯＸ６９６が両方ともにＬＯＸ１  ＳＮＰ  Ｋ１６７Ｎ変異体に対するｏｘＬＤＬ結合を遮断することが示される。結合の阻害に加え、ＬＯＸ１０５１４及びＬＯＸ１０６９６を含めた幾つもの単離クローンについて、ＬＯＸ１発現細胞に対するｏｘＬＤＬインターナリゼーション（実施例１０、アッセイ４に記載されるとおり）及びｏｘＬＤＬ誘導性ＬＯＸ１シグナル伝達（実施例１０、アッセイ５に記載されるとおり）を遮断するそれらの能力を試験した。図２Ａ及び図２Ｂに代表的なプロットを示し、それぞれｏｘＬＤＬインターナリゼーション及びシグナル伝達の阻害が示される。これらの試験の結果を表２に要約する。
【０３２１】
【表９】
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【０３２２】
これらの結果は、（１）ｏｘＬＤＬ、ＡＧＥ−ＢＳＡ及びＣＲＰに対するＬＯＸ１結合の抗体ＬＯＸ５１４及びＬＯＸ６９６による特異的阻害；（２）ＬＯＸ５１４及びＬＯＸ６９６が両方ともに共通のＬＯＸ１  ＳＮＰ  Ｋ１６７Ｎ変異体と機能的に交差反応すること；（３）ＬＯＸ５１４及びＬＯＸ６９６がｏｘＬＤＬインターナリゼーションを阻害すること；及び（４）ＬＯＸ５１４及びＬＯＸ６９６がｏｘＬＤＬ誘導性ＬＯＸ１シグナル伝達を阻害することを実証している。
【０３２３】
実施例３−抗ＬＯＸ１抗体の種交差反応性及びヒト関連ファミリーメンバーのパネルと比べたヒトＬＯＸ１に対する特異性
様々なＬＯＸ１種オルソログとの抗ヒトＬＯＸ１抗体の交差反応性をｓｃＦｖ結合ＥＬＩＳＡによって評価した。Ｎ末端又はＣ末端Ｆｌａｇタグ及びヒスチジンタグを有するヒト（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ７８３８０）、マウス（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＥＱ０９）、ラット（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｏ７０１５６）、ウサギ（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＸＴＡ８）及びカニクイザルＬＯＸ１の細胞外ドメインコンストラクトを設計し、Ｇａｔｅｗａｙデスティネーションベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。次にコンストラクトをタンパク質発現用の哺乳類ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトした。次にタンパク質を標準的なアフィニティー及びサイズ排除クロマトグラフィー精製にかけた。簡潔に言えば、ヒト（ＨｉｓＦｌａｇ）−ＬＯＸ１、カニクイザルＬＯＸ１−（ＦｌａｇＨｉｓ）、マウスＬＯＸ１−（ＦｌａｇＨｉｓ）、ラットＬＯＸ１−（ＦｌａｇＨｉｓ）及びウサギＬＯＸ１−（ＦｌａｇＨｉｓ）を、それぞれＰＢＳ緩衝液中１０、１０、５、５及び５μｇ／ｍＬでＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）プレートにコーティングした。かかる濃度を用いた効率的な抗原コーティングは、初めに市販の抗ヒトＬＯＸ１抗体（Ｈｙｃｕｌｔからの２３Ｃ１１）又は抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒからのユウロピウム標識されたもの）を使用したＥＬＩＳＡによって確かめた。３％粉乳を含有するＰＢＳでウェルをブロックした後、ＰＢＳ＋３％粉乳中の精製抗ＬＯＸ１  ｓｃＦｖを、コーティングされた種々の抗原と共に１時間インキュベートした。結合したｓｃＦｖ分子を、１００ｎｇ／ｍＬの二次ユウロピウム標識抗Ｍｙｃタグ抗体（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して検出した。３４０ｎｍ励起及び６１５ｎｍ発光を使用してプレートの蛍光を読み取った。１０μｇ／ｍＬでコーティングしたウシ血清アルブミン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に関して非特異的結合を決定した。
【０３２４】
図３Ａに示すとおり、ＬＯＸ５１４（「ＬＯＸ１０５１４」）及びＬＯＸ６９６（「ＬＯＸ１０６９６」）はヒト及びカニクイザルＬＯＸ１に結合するが、マウス、ラット又はウサギＬＯＸ１オルソログには結合しない。マウスＬＯＸ１との抗体交差反応性の欠如は、これらの種間のＣ型レクチンドメインにわたる低い相同性（ヒトとマウスとの間で約６２％の同一性）を考えると、意外ではない。
【０３２５】
他のヒトＣ型レクチン及びスカベンジャー受容体関連分子に対する抗ヒトＬＯＸ１抗体分子の特異性を、実施例１０、アッセイ６に記載されるとおりＩｇＧ結合ＥＬＩＳＡによって評価した。図３Ｂに示すとおり、ＬＯＸ５１４（「ＬＯＸ１０５１４」）及びＬＯＸ６９６（「ＬＯＸ１０６９６」）はヒトＬＯＸ１のみに結合し、ヒトＣＬＥＣ−７Ａ、ＣＬＥＣ−１Ａ、ＣＬＥＣ−４Ｌ、ＣＬＥＣ−１Ｂ、ＳＲ−Ａ１及びＳＲ−Ｂ３には結合しない。この結果は、ＬＯＸ１に対するＬＯＸ５１４及びＬＯＸ６９６の特異性を実証している。
【０３２６】
実施例４−ＬＯＸ５１４の標的ＣＤＲランダム化及び組換えによる効力最適化抗ＬＯＸ１  ｓｃＦｖ抗体の単離及び同定
親和性ベースのファージ選択を用いてＬＯＸ５１４を最適化した。記載されるとおりの標準的な分子生物学的技術を用いた可変重鎖（ＶＨ）相補性決定領域２又は３（ＶＨ−ＣＤＲ２又はＶＨ−ＣＤＲ３）又は可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発により、ＬＯＸ５１４  ｓｃＦｖ配列に由来する大規模ｓｃＦｖライブラリを作成した（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，２００４．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）。これらのライブラリを親和性ベースのファージディスプレイ選択に供することにより、ヒトＬＯＸ１に対する親和性がより高い変異体を選択した。これらは、ｏｘＬＤＬ及び他のＬＯＸ１リガンドに対するＬＯＸ１結合の阻害活性の向上を示すものと思われた。選択は、本質的に以前記載があるとおり実施した（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２５６（１）：７７−８８，（１９９６））。端的には、溶液中の組換えビオチン化ヒトＬＯＸ１（ＥＺ  ＬＩＮＫ（商標）スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｐｉｅｒｃｅ、製品：２１３３５）を使用した遊離アミンを介したビオチン化）と共にｓｃＦｖ−ファージ粒子をインキュベートした。次に抗原に結合したＳｃＦｖを、製造者の推奨に従い、ストレプトアビジンでコーティングされた常磁性ビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−２８０）上に捕捉した。次に選択されたｓｃＦｖ−ファージ粒子を以前記載されたとおりレスキューし（Ｏｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２（３）：１８１−９６，（１９９６））、漸減濃度のビオチン化ヒトＬＯＸ１（典型的な例は、４ラウンドで５０ｎＭ〜２０ｐＭであり得る）の存在下でこの選択プロセスを繰り返した。
【０３２７】
ＣＤＲ標的選択アウトプットからの代表的な複数の個別ｓｃＦｖについて粗ｓｃＦｖ含有ペリプラズム抽出物を調製し、実施例１０、アッセイ７に記載されるとおり、親抗体ＬＯＸ５１４に対するエピトープ競合ＨＴＲＦ（登録商標）（均一時間分解蛍光）アッセイフォーマットでスクリーニングした。スクリーニングヒット、即ち、親ＬＯＸ５１４と比較したとき阻害効果の有意な向上を示したｓｃＦｖ変異体をＤＮＡシーケンシングに供し、可変重鎖ＣＤＲ２又はＣＤＲ３及び可変軽鎖ライブラリＣＤＲ３アウトプットからのユニークな変異体を精製ｓｃＦｖとして生じさせ、試験した。次に一部のｓｃＦｖを選択し、更なる特徴付けのためＩｇＧ１−ＴＭに変換した。この手法に従い得られる最適化ＬＯＸ５１４抗体の典型的な例としては、ＬＸ５１４００１１、ＬＸ５１４００１４、ＬＸ５１４００１６及びＬＸ５１４００３８（表１又は図４に記載されるとおり）が挙げられる。
【０３２８】
更なる向上を生じさせるため、ヒトＬＯＸ１に対する親ＬＯＸ５１４の結合を阻害する能力を有する多数のｓｃＦｖ変異体を含むＣＤＲランダム化選択アウトプットを組み換えて、ランダムに対になった個別にランダム化されたＶＨ  ＣＤＲ２配列とＶＨ又はＶＬ  ＣＤＲ３配列とを含むクローンのライブラリを形成した。
【０３２９】
組換えＶＨ２／ＶＨ３又はＶＨ２／ＶＬ３ライブラリからエピトープ競合ＨＴＲＦ（登録商標）アッセイで代表的な複数の個別ｓｃＦｖの粗ｓｃＦｖ含有ペリプラズム抽出物を調製した。スクリーニングヒット、即ち親ｓｃＦｖ及び組換え前に生じたリードと比較したとき阻害効果の有意な向上を示したｓｃＦｖ変異体をＤＮＡシーケンシングに供し、精製ｓｃＦｖとしてユニークな組換え変異体を作製し、試験した。次に最も活性の高いｓｃＦｖを選択し、更なる特徴付けのためＩｇＧ１  ＴＭに変換した。これらの組換えライブラリから得られる最適化ＬＯＸ５１４抗体の典型的な例は、ＬＸ５１４００９２、ＬＸ５１４００９３、ＬＸ５１４００９４、ＬＸ５１４０１０８及びＬＸ５１４０１１０（表１又は図４に記載されるとおり）であった。
【０３３０】
ＬＯＸ５１４系統からの選択抗体に関する最適化した重鎖のアミノ酸配列のアラインメントを図４Ａに示す。ＬＯＸ５１４系統からの選択抗体に関する最適化した軽鎖のアミノ酸配列のアラインメントを図４Ｂに示す。
【０３３１】
実施例５−ＬＯＸ６９６に由来する効力最適化抗ＬＯＸ１  ｓｃＦｖ変異体の単離及び同定
初めに、本質的に欧州特許第４９４９５５号明細書、米国特許第５６５８７５４号明細書及びＨａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６（１）：７７−８８（１９９６））によって記載されるとおり、親和性ベースのリボソームディスプレイ選択を用いてＬＯＸ６９６を最適化した。
【０３３２】
記載されるとおりの標準的な分子生物学的技術を用いて、可変重鎖（ＶＨ）相補性決定領域２又は３（ＶＨ−ＣＤＲ２又はＶＨ−ＣＤＲ３）又は可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によってＬＯＸ６９６  ｓｃＦｖ配列に由来するリボソームディスプレイフォーマットの大規模ｓｃＦｖライブラリを作成した（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６（１）：７７−８８（１９９６））。ＤＮＡレベルでは、ｍＲＮＡへの効率的な転写のため５’末端にＴ７プロモーターを付加した。ｍＲＮＡレベルでは、コンストラクトは原核細胞リボソーム結合部位（シャイン−ダルガノ配列）を含有した。単鎖の３’末端の終止コドンを取り除き、新生ｓｃＦｖポリペプチドとリボソームとの間のスペーサーとして働くようにＭ１３バクテリオファージｇＩＩＩ（遺伝子ＩＩＩ）の一部分を付加した（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６（１）：７７−８８（１９９６））。
【０３３３】
ライブラリを親和性ベースのリボソームディスプレイ選択に供することにより、ヒトＬＯＸ１に対する親和性がより高い変異体を選択した。これらは、ｏｘＬＤＬ及び他のＬＯＸ１リガンドに対するＬＯＸ１結合の阻害活性の向上を示すものと思われた。ＲＩＢＯＭＡＸ（商標）大規模ＲＮＡ産生システム（Ｔ７）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者のプロトコルに従い使用し、且つ無細胞翻訳系を使用して、ｓｃＦｖをインビトロで発現させた。産生されたｓｃＦｖ抗体−リボソーム−ｍＲＮＡ（ＡＲＭ）複合体を、ビオチン化ヒトＬＯＸ１（ＥＺ  ＬＩＮＫ（商標）スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｐｉｅｒｃｅ、製品：２１３３５）を使用した遊離アミンを介したビオチン化）を含む溶液中でインキュベートした。特異的に結合した三次複合体（ＬＯＸ１：ＡＲＭ）を、製造者の推奨に従い（Ｄｙｎａｌ）ストレプトアビジンでコーティングされた常磁性ビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−２８０）上に捕捉し、一方で未結合のＡＲＭは洗い落とした。次に、結合したｓｃＦｖをコードするｍＲＮＡを逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって回収した。得られた集団に対して漸減濃度のビオチン化ヒトＬＯＸ１（４ラウンドで１μＭ〜最小２ｎＭ）で更なる選択ラウンドのため選択プロセスを繰り返し、それによりＬＯＸ１に対して親和性がより高いクローンをエンリッチした。選択ラウンド２、３及び４からのアウトプットをｓｃＦｖとして細菌発現用のｐＣａｎｔａｂ６（１）にサブクローニングし、実施例４に記載されるとおりのＬＯＸ６９６エピトープ競合（実施例１０、アッセイ７を参照）において向上したクローンをペリプラズム抽出物として同定した。
【０３３４】
ＬＯＸ６９６  ＣＤＲランダム化リボソームディスプレイアウトプット又は変異体に基づき二代目ファージディスプレイライブラリを構築した。合計４個のライブラリを、（１）両方ともにラウンド２のアウトプットであるＶＨ  ＣＤＲ２配列をＶＬ  ＣＤＲ３配列と組み換えることにより；（２）製造者の推奨に従いＤＩＶＥＲＳＩＦＹ（商標）ＰＣＲランダム突然変異誘発キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して組換えＶＨ  ＣＤＲ２×ＶＬ  ＣＤＲ３ライブラリ（上記参照）に対して追加のエラープローンＰＣＲを実施して、更なる配列多様性を取り込むことにより；（３）等モル比の初期リボソームディスプレイライブラリ＋ＬＯＸ６９６の親ｓｃＦｖ  ＤＮＡに由来する９個のｓｃＦｖ  ＤＮＡヒットのプールを鋳型として使用して上記に記載したとおりのエラープローンＰＣＲを用いてｓｃＦｖ配列全体に対してランダム突然変異誘発を行うことにより；（４）等モル比の初期リボソームディスプレイＶＬ  ＣＤＲ３ライブラリ＋ＬＯＸ６９６の親ｓｃＦｖ  ＤＮＡに由来する６個のｓｃＦｖ  ＤＮＡヒットのプールを鋳型として使用してＧａｌｌｏｐ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，３７（９）：１２３３−５１（１９９４）に記載されるとおりＶＨ  ＣＤＲ３全体に対してソフトランダム化を行うことにより作成した。
【０３３５】
漸減濃度のビオチン化ＬＯＸ１（典型的には４ラウンドで１００ｎＭ〜２ｐＭ）を使用して、実施例４に記載されるとおりファージディスプレイ選択を実施した。異なる二代目ライブラリから代表的な複数の個別ｓｃＦｖの粗ｓｃＦｖ含有ペリプラズム抽出物を調製し、エピトープ競合ＨＴＲＦ（登録商標）（実施例１０、アッセイ７に記載されるとおり）で試験した。最大の結合競合をもたらしたｓｃＦｖ変異体を再びシーケンシングし、試験のため実施例１にあるとおり精製ｓｃＦｖを調製した。それらの二代目ライブラリからの最も強力なｓｃＦｖを、後の例に記載するとおりの更なる特徴付けのためＩｇＧ１  ＴＭフォーマットに変換した。
【０３３６】
これらの二代目ライブラリから得られる最適化ＬＯＸ６９６抗体の典型的な例としては、ＬＸ６９６００６７＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６００７１＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６００７３＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６００８６＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６００９４＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６０１０１＿ｎｇｌ１、ＬＸ６９６０１０２＿ｎｇｌ１及びＬＸ６９６０１１６＿ｎｇｌ１（表１又は図５に記載されるとおり）が挙げられる。
【０３３７】
ＬＯＸ６９６系統からの選択抗体に関する最適化したＶＨのアミノ酸配列のアラインメントを図５Ａに示す。ＬＯＸ６９６系統からの選択抗体に関する最適化したＶＬのアミノ酸配列のアラインメントを図５Ｂに示す。
【０３３８】
実施例６−ＩｇＧ１−ＴＭとしての抗ＬＯＸ１抗体の生殖細胞系列化及び安定性エンジニアリング
ＬＯＸ５１４  ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列をＶＢＡＳＥデータベースの既知のヒト生殖系列配列とアラインメントし（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．，ＶＢＡＳＥ．１９９７，ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、配列類似性によって最も近縁の生殖細胞系列を同定した。ＶＨドメインについては、これはＶＨ１−２４（ＤＰ−５）及びＪＨ６であり、ＶＬドメインについては、これはＶλ１−ｅ（ＤＰＬ−８）及びＪＬ３であった。これらの２つのアラインメントにおける違いは１つのみで、重鎖のフレームワーク４に位置した。当該の単一の残基（Ｒ１０５−Ｋａｂａｔ付番）は標準的な分子生物学によるＩｇＧ変換プロセスの間に生殖細胞系列残基（Ｑ）に復帰しており、これはつまり、ＬＯＸ５１４系統からの全ての最適化したＩｇＧが事実上生殖細胞系列化されたフォーマットで産生されたことを意味する。加えて、重鎖Ｎ９６Ｄ突然変異誘発（ｍｕｔａｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｋａｂａｔ付番）を実施して、ＬＸ５１４００９２及びＬＸ５１４００９３の両方のＣＤＲ３における潜在的なＮ−アミド分解モチーフを取り除いた。変異体は、それぞれ、ＬＸ５１４００９２＿Ｎ＞Ｄ及びＬＸ５１４００９３＿Ｎ＞Ｄと命名した（表１又は図４を参照）。ＬＸ５１４００９２＿Ｎ＞Ｄ及びＬＸ５１４００９３＿Ｎ＞Ｄの重鎖及び軽鎖アミノ酸配列のアラインメントを、それぞれ図４Ａ及び図４Ｂに提供する。
【０３３９】
同様に、ＬＯＸ６９６抗体の生殖細胞系列分析もまた実施した。最も近縁の生殖細胞系列が、重鎖についてＶＨ３−０９（ＤＰ−３１）及びＪＨ３並びに軽鎖についてＶλ２ａ２（ＤＰＬ−１１）及びＪＬ３と同定された。Ｖｅｒｎｉｅｒ残基を除き（Ｆｏｏｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２４：４８７（１９９２））、合計５つの違い（全てＶＨ内）：フレームワーク１に２つ、フレームワーク３に１つ及びフレームワーク４に２つが見出された。最適化ＬＯＸ６９６  ＩｇＧ１−ＴＭ配列の違いを、Ｖ８９を除いて標準的な分子生物学的技術によって最も近縁の生殖細胞系列残基に復帰させた：Ｑ１Ｅ、Ｑ６Ｅ、Ｒ１０５Ｑ及びＴ１０８Ｍ。加えて、重鎖Ｇ８２ｂＳ突然変異誘発（Ｋａｂａｔ付番）を実施して、生殖細胞系列化ＬＸ６９６００７３＿ｇｌのフレームワーク３にある潜在的なＮ−アミド分解モチーフを取り除いた（表１又は図５を参照）。この変異体はＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌと命名した（表１又は図５を参照）。非生殖細胞系列化ＬＸ６９６００７３＿ｎｇｌ１、生殖細胞系列化ＬＸ６９６００７３＿ｇｌ及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌについての重鎖及び軽鎖アミノ酸配列のアラインメントを、それぞれ図５Ａ及び図５Ｂに提供する。
【０３４０】
実施例７−最適化抗ＬＯＸ１抗体の特異性及び種交差反応性
他のヒトＣ型レクチン及びスカベンジャー受容体関連分子に対するＩｇＧ１−ＴＭとしての最適化抗ヒトＬＯＸ１抗体の特異性をＩｇＧ結合ＥＬＩＳＡ（実施例１０、アッセイ７に記載されるとおり）によって評価した。関連分子のパネルには、ヒトＣＬＥＣ−７Ａ（デクチン−１）、ヒトＣＬＥＣ−１Ａ、ヒトＣＬＥＣ−４Ｌ（ＤＣ−ＳＩＧＮ）、ヒトＣＬＥＣ−１Ｂ（ＣＬＥＣ−２）、ヒトＳＲ−Ａ１及びヒトＳＲ−Ｂ３（ＣＤ３６）が含まれた。ヒトＬＯＸ１もまた、結合に関する陽性対照としてコーティングした。以下の最適化抗体を試験した：ＬＸ５１４０１０８、ＬＸ５１４０１１０、ＬＸ５１４００９２＿Ｎ＞Ｄ、ＬＸ５１４００９３＿Ｎ＞Ｄ、ＬＸ６９６００７３＿ｇｌ及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌ。試験する抗体パネルにアイソタイプヒトＩｇＧ１−ＴＭ対照抗体ＮＩＰ２２８を含めて、非特異的バックグラウンドレベルを決定した。
【０３４１】
図６に示すとおり、全ての最適化抗ＬＯＸ１抗体がヒトＬＯＸ１に結合するが、ヒトＣＬＥＣ−７Ａ、ＣＬＥＣ−１Ａ、ＣＬＥＣ−４Ｌ、ＣＬＥＣ−１Ｂ、ＳＲ−Ａ１又はＳＲ−Ｂ３には結合せず、従って、ヒトＬＯＸ１に対するＬＸ５１４０１０８、ＬＸ５１４０１１０、ＬＸ５１４００９２＿Ｎ＞Ｄ、ＬＸ５１４００９３＿Ｎ＞Ｄ、ＬＸ６９６００７３＿ｇｌ及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌの特異性を実証している。
【０３４２】
様々なＬＯＸ１種オルソログに対する抗ヒトＬＯＸ１抗体の交差反応性をＩｇＧ結合ＥＬＩＳＡ（実施例１０、アッセイ７に記載されるとおり）によって評価した。簡潔に言えば、ＰＢＳ緩衝液中５μｇ／ｍＬのヒト（ＨｉｓＦｌａｇ）−ＬＯＸ１、カニクイザルＬＯＸ１−（ＦｌａｇＨｉｓ）、マウスＬＯＸ１−（ＦｌａｇＨｉｓ）、ラットＬＯＸ１−（ＦｌａｇＨｉｓ）及びウサギＬＯＸ１−（ＦｌａｇＨｉｓ）をＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）プレートにコーティングした。３％粉乳を含有するＰＢＳでブロックした後、ブロッキング緩衝液中１０μｇ／ｍＬの精製抗ＬＯＸ１  ＩｇＧ１−ＴＭを、コーティングされた種々の抗原と共にインキュベートした。１００ｎｇ／ｍＬの二次ユウロピウム標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、結合したＩｇＧ分子を検出した。３４０ｎｍ励起及び６１５ｎｍ発光を使用してプレートの蛍光を読み取った。同様に５μｇ／ｍＬでコーティングしたＣＤ８６  ＦｌａｇＨｉｓ抗原上の非特異的結合を決定した。以下の最適化ＬＯＸ１抗体並びに陰性対照としてのＮＩＰ２２８ヒトＩｇＧ１−ＴＭを試験した：ＬＸ５１４０１０８、ＬＸ５１４０１１０、ＬＸ５１４００９２＿Ｎ＞Ｄ、ＬＸ５１４００９３＿Ｎ＞Ｄ、ＬＸ６９６００７３＿ｇｌ及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌ。図７Ａに示すとおり、試験した全ての抗体（ＬＸ５１４０１０８、ＬＸ５１４０１１０、ＬＸ５１４００９２＿Ｎ＞Ｄ、ＬＸ５１４００９３＿Ｎ＞Ｄ、ＬＸ６９６００７３＿ｇｌ及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌ）がヒト及びカニクイザルＬＯＸ１に結合するが、マウス又はラットＬＯＸ１タンパク質には結合しない。それらの抗体の一部（ＬＸ５１４０１０８、ＬＸ５１４０１１０及びＬＸ５１４００９２＿Ｎ＞Ｄ）はまた、ウサギＬＯＸ１にも結合するが、蛍光カウントがより小さいことによって示されるとおり、その程度はヒト又はカニクイザルＬＯＸ１に対するよりも低い。
【０３４３】
最適化抗ＬＯＸ１  ＩｇＧ１−ＴＭ抗体ＬＸ５１４０１０８、ＬＸ５１４０１１０及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌについて、ヒトＬＯＸ１とカニクイザルＬＯＸ１との間の更なる交差反応性の特徴付けを競合ＥＬＩＳＡによって実施した。
【０３４４】
簡潔に言えば、ＰＢＳ中０．１２５μｇ／ｍＬのビオチン化ヒトＬＯＸ１をストレプトアビジンプレート（Ａｂｇｅｎｅ）にコーティングした。３％粉乳を含有するＰＢＳでブロックした後、ブロッキング緩衝液中１２．５ｎｇ／ｍＬの精製抗ＬＯＸ１  ＩｇＧ１−ＴＭを競合相手のヒト又はカニクイザルＬＯＸ１タンパク質と共にコインキュベートした。ＬＸ５１４０１０８及びＬＸ５１４０１１０については４００ｎＭ及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌについては２μＭで開始して、ブロッキング緩衝液中の競合相手の１：３タイトレーションを使用した。１００ｎｇ／ｍＬの二次ユウロピウム標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、結合した抗ＬＯＸ１  ＩｇＧ分子を検出した。３４０ｎｍ励起及び６１５ｎｍ発光を使用してプレートの蛍光を読み取った。
【０３４５】
以下の図７Ｂ及び表３に示すとおり、３つ全ての最適化抗ＬＯＸ１  ＩｇＧ１−ＴＭ（ＬＸ５１４０１０８、ＬＸ５１４０１１０及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌ）がカニクイザルＬＯＸ１と競合し、ヒトＬＯＸ１競合のＩＣ５０の５倍以内のＩＣ５０を呈することから、抗ＬＯＸ１抗体ＬＸ５１４０１０８、ＬＸ５１４０１１０及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌのカニクイザル交差反応性が強力であることが実証される。
【０３４６】
【表１０】
2020188765.tif 000012
【０３４７】
実施例８−ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）及びＫｉｎＥｘＡ（商標）によって決定するときのｈＬＯＸ１に対する最適化抗ＬＯＸ１抗体の親和性
組換えヒト及びカニクイザルオルソログＬＯＸ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する抗ＬＯＸ１抗体の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅによるリアルタイム相互作用モニタリングを用いて３７℃で（ヒト及びカニクイザルについて）、及びＫｉｎＥｘＡを用いて平衡状態で（ヒトＬＯＸ１親和性計測について）決定した。
【０３４８】
Ｂｉａｃｏｒｅアッセイでは、組換えプロテインＧ＋プロテインＧによって捕捉された抗ＬＯＸ１抗体をＣＭ５チップ表面にアミン連結を介して固定化し、表面に流したＬＯＸ１オルソログの会合及び解離プロファイルを収集した。アッセイは、ＩＦＣ温度を３７℃に設定し、且つ試料コンパートメントは周囲温度のままとして実施した。実験は全て、ＩＦＣを一定の３０ｕｌ／分で通過するＨＢＳＥＰランニング緩衝液で実施した。毎回ＬＯＸ１適用の終了時に、結合した抗体及び抗体複合体を１０ｍＭグリシン  ｐＨ１．５の２回の４０秒パルスによってプロテインＧから剥がし取った。プロテインＧ表面に捕捉される抗ＬＯＸ１抗体の量は、第一に物質移動制限が回避され、第二に正確なモデル化に十分な解離を観察し得ることが確実となるように調整した。ＬＯＸ１相互作用物の濃度範囲は、抗体の飽和から検出可能な結合無しに至るまでの全結合範囲を観察し得ることを確実にするのに十分であった。データは、ＢｉａＥｖａｌ評価ソフトウェアを使用して、抗体のみのプロファイルのダブルリファレンスサブトラクション後に解析した。
【０３４９】
溶液中平衡アッセイは単一濃度の抗ＬＯＸ１抗体で実施し、ここで組換えヒトＬＯＸ１  ＥＣＤのタイトレーションは、抗体濃度の１００倍高い濃度から１００倍低い濃度まで行った。遊離抗体濃度は、続いて蛍光標識ヒトＦｃ特異的プローブによって検出した占有されていない抗体の捕捉により決定した。表４は、観察された速度定数及び全体的な親和性を詳述する。
【０３５０】
【表１１】
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【０３５１】
実施例９  最適化抗ＬＯＸ１抗体は、マルチリガンド結合、ｏｘＬＤＬインターナリゼーション及びｏｘＬＤＬ誘導シグナル伝達の阻害を実証する
精製ＩｇＧについて、ＬＯＸ１に対するｏｘＬＤＬ、ＡＧＥ−ＢＳＡ及びＣＲＰ結合を特異的に阻害するそれらの能力を試験した（実施例１０；アッセイ  １、２及び３を参照）。ＬＸ５１４０１１０及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌを含む幾つかの単離クローンについて、ＬＯＸ１に対するｏｘＬＤＬ、ＡＧＥ−ＢＳＡ及びＣＲＰ結合を遮断するそれらの能力を試験した。図８Ａ、図８Ｂ及び図８Ｃに代表的なプロットを示し、それぞれｏｘＬＤＬ、ＡＧＥ−ＢＳＡ及びＣＲＰ結合のＬＸ５１４０１１０及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌによる阻害が示される。これらの抗体がＬＯＸ１  ＳＮＰ  Ｋ１６７Ｎに対して交差反応し、機能活性を有したことを確認するため、これらの抗体について、ＬＯＸ１  ＳＮＰ  Ｋ１６７Ｎに対するｏｘＬＤＬ結合を遮断するそれらの能力を試験した。代表的なプロットを図８Ｄに示し、ＬＸ５１４０１１０及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌが両方ともにＬＯＸ１  ＳＮＰ  Ｋ１６７Ｎ変異体に対するｏｘＬＤＬ結合を遮断することが示される。結合の阻害に加え、ＬＸ５１４０１１０及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌを含む幾つかの単離クローンについて、ＬＯＸ１発現細胞に対するｏｘＬＤＬインターナリゼーション（実施例１０、アッセイ４を参照）及びｏｘＬＤＬ誘導性ＬＯＸ１シグナル伝達（実施例１０、アッセイ５を参照）を遮断するそれらの能力を試験した。図８Ａ及び図８Ｆに代表的なプロットを示し、それぞれｏｘＬＤＬインターナリゼーション及びｏｘＬＤＬ誘導性ＬＯＸ１シグナル伝達のＬＸ５１４０１１０及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌによる阻害が示される。これらの試験の結果を表５に要約する。
【０３５２】
【表１２】
2020188765.tif 000014
【０３５３】
これらの結果は、ｏｘＬＤＬ、ＡＧＥ−ＢＳＡ及びＣＲＰに対するＬＯＸ１結合の抗体ＬＸ５１４０１１０及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌによる特異的マルチリガンド阻害、並びにＬＸ５１４０１１０及びＬＸ６９６００７３＿Ｇ８２ｂＳ＿ｇｌが両方ともに共通のＬＯＸ１  ＳＮＰ  Ｋ１６７Ｎ変異体と機能的に交差反応し、ｏｘＬＤＬインターナリゼーション及びｏｘＬＤＬ誘導性ＬＯＸ１シグナル伝達を阻害することを実証している。
【０３５４】
実施例１０  アッセイ及び方法
実施例１〜９に記載する実験においては、以下の材料及び方法を使用した。
【０３５５】
材料
ドキシサイクリン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｄ９８９１−１Ｇ）；カルボキシＨ２ＤＣＦＤＡ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ  ＃Ｃ４００）；ヘキスト染色（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ  ＃３３３４２）；ＡＧＥ−ＢＳＡ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ  ＃２２２１−１０）；ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＃  １４１９０）；組換えＣ反応性タンパク質（Ｒ＆Ｄ  ＃１７０７−ＣＲＣＦ）；ＢＳＡ  ３０％（ＳＩＧＭＡ  ＃Ａ９５７６）；Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｌｉｎｋビオチンコンジュゲーションキット（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃７０４−００１０）；ＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９  ＮＨＳエステル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃４６４１６）；Ｃｙｐｈｅｒ  ５ＥモノＮＨＳ；エステル（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＃ＰＡ１５４０１）；ＨＢＳＳ（１×）（ＧＩＢＣＯ  ＃１４０２５）；Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３８４セル；Ｂｉｎｄ  ｂｌａｃｋアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  ＃３６８３）；Ｄｅｌｆｉａ増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＃４００１−００１０）；ユウロピウムストレプトアビジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＃１２４４−３６０）；０．５ｍＬ  Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ  ＃８９８８３）；ＣＨＯ−ＴＲＥｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｒ７１８−０７）；ｏｘＬＤＬ（Ｉｎｔｒａｃｅｌ  ＃ＲＰ０４９）；ＤｉＩ−ｏＸＬＤＬ（Ｉｎｔｒａｃｅｌ  ＃ＲＰ−１７３）；抗ＬＯＸ１抗体（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ  ＃３６５９）；ヘキスト染色（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ  ＃３３３４２）；ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＃１４１９０）；成長培地：Ｈａｍｓ：Ｆ１２−ＧｌｕｔａＭａｘ−Ｉ（Ｇｉｂｃｏ  ＃３１７６５−０２７）；添加物１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１６０００−０４４）；ブラストサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃  ４６−１１２０）；ゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｒ２５００１）；リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１１６６８−０１９）；ドキシサイクリン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｄ９８９１−１Ｇ）。
【０３５６】
試薬修飾
ｏｘＬＤＬのＣｙｐｈｅｒ  ５Ｅ標識
ｏｘ−ＬＤＬ（１ｍｇ／ｍＬ）のｐＨを、１／１０容積の０．５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液を使用してｐＨ８．５に調整し、製造者キットの説明書に従い４０：１のタンパク質：色素のモル比でｏｘＬＤＬを標識した（室温、暗所で１時間）。製造者の指示に従い（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのＣｙｐｈｅｒ  ５ＥモノＮＨＳエステル）Ｚｅｂａスピンカラムを使用して未反応の色素を取り除き、ＰＢＳで緩衝液交換した。標識したタンパク質は暗所で４℃に保った。計算上、９５％超のタンパク質が回収され、考慮すべき希釈係数はないものと仮定する。
【０３５７】
ｏｘＬＤＬ及びＡＧＥ−ＢＳＡのＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９標識
ｏｘ−ＬＤＬ又はＡＧＥ−ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）のｐＨを、１／１０容積の０．５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液を使用してｐＨ８．５に調整し、製造者の指示に従い（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９  ＮＨＳエステル、室温、暗所で１時間）標識した。製造者の指示に従いＺｅｂａスピンカラムを使用して未反応の色素を取り除き、ＰＢＳで緩衝液交換した。計算上、９５％超のタンパク質が回収され、考慮すべき希釈係数はないものと仮定する。
【０３５８】
ヒト抗ＬＯＸ１抗体のＤｙｌｉｇｈｔ  ６４９標識
ヒト抗ＬＯＸ１抗体（１ｍｇ／ｍＬ）のｐＨを、１／１０容積の０．５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液を使用してｐＨ８．５に調整し、製造者の指示に従い（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９  ＮＨＳエステル、室温、暗所で１時間）標識した。製造者の指示に従いＺｅｂａスピンカラムを使用して未反応の色素を取り除き、ＰＢＳで緩衝液交換した。計算上、９５％超のタンパク質が回収され、考慮すべき希釈係数はないものと仮定する。
【０３５９】
ＣＲＰのビオチン標識
Ｃ反応性タンパク質ＣＲＰ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ；担体不含）を４ｍｇ／ｍＬの濃度となるように蒸留水中に再構成し、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ（商標）ビオチンコンジュゲーションキット（タイプＡ）に同梱されるキットの指示に従いビオチン化した。
【０３６０】
ヒトＬＯＸ１  ＣＨＯ−ＴＲＥＸ細胞株３Ａ９
ヒトＬＯＸ１遺伝子（ＮＭ  ００２５４３）を使用して組換えプラスミドｐｃＤＮＡ４／ＴＯ−ＬＯＸ１（ｐＡＭ２０３７）を作成し、これはＧｅｎｅａｒｔによって合成され、引き渡された。５’末端にＡｆｌ  ＩＩ制限部位及びコザック配列を付加し、及び３’末端にＥｃｏＲＩ制限部位を付加したＬＯＸ１遺伝子を合成した。次に、ｌｉｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、テトラサイクリンリプレッサーを発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−ＴＲＥｘ細胞）にｐＡＭ２０３７をトランスフェクトした。ＣＨＯ−ＴＲＥｘは、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）リプレッサーの遺伝子を有するｐｃＤＮＡ６／ＴＲを含有するＣＨＯ−Ｋ細胞株であり、Ｔｅｔリプレッサーが、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯにクローニングされた遺伝子の発現を遮断する。これらの細胞をテトラサイクリンで処理すると、抑制が解除され、ＬＯＸ１遺伝子が発現することになる。
【０３６１】
トランスフェクトした細胞混合集団をＦＡＣＳ機を使用して９６ウェルプレートに分取し、各ウェルに単一の細胞を得た。１０μｇ／ｍｌブラストサイジンでｐｃＤＮＡ６／ＴＲを選択し、ｐｃＤＮＡ４ＴＯ−ＬＯＸ１プラスミドの選択に３００μｇ／ｍｌのゼオシン、及び維持用に２００μｇ／ｍｌを使用した。個々の細胞を増殖し、ハイコンテント分析手法を用いて細胞によって取り込まれる蛍光を定量化することにより、ＤｉＩ標識ｏｘＬＤＬを結合してインターナライズする能力によって安定クローンを選択した。数継代の成長にわたるＤｉＩ−ｏｘＬＤＬの取込み及び安定性に関して１つのクローンを選択した。Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎからの抗ＬＯＸ１特異抗体を使用した免疫染色によってＬＯＸ１タンパク質表面発現を確かめた。ＬＯＸ１タンパク質の機能活性は、ＣＨＯ−ＴＲＥｘ−ＬＯＸ１細胞におけるｏｘＬＤＬ取込み及びｏｘＬＤＬ媒介性ＲＯＳ反応の発生によって実証された。
【０３６２】
アッセイ１及び２−ＬＯＸ１：ｏｘＬＤＬ及びＬＯＸ１：ＡＧＥ−ＢＳＡ結合アッセイ
飽和結合曲線
ＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９標識ｏｘＬＤＬ及びＡＧＥ−ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）の両方をＨＢＳＳ中に１：５０希釈し、１６ポイントの１＋１系列希釈を使用して３８４ウェルプレートでトリプリケートでタイトレーションした。全結合の決定については、全てのウェルに１０μＬのＨＢＳＳを添加し、続いて１０μＬのヒトＬＯＸ１トランスフェクトＣＨＯ  ＴＲＥＸ細胞を添加した（ウェル当たり４０００細胞）。非特異的結合の決定については、１０μＬのＨＢＳＳを１０μＬの非標識ｏｘＬＤＬ（１ｍｇ／ｍＬ）に置き換えた。アッセイプレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８２００細胞検出システム（ＦＭＡＴプレートリーダー）で４２２のＰＭＴ１セッティングを使用し、最小カウントを１０に設定してプレートを読み取った；カラー＜０．４及びＦＬ１＜５６００。平均非特異的結合シグナルから平均全結合シグナルをサブトラクトし、得られた結合等温線をＰｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアでワンサイト特異的結合アルゴリズムを用いてプロットすることにより、特異的結合を決定した。ＫＤが決定された計算値濃度を、続くハイスループットスクリーニング及び抗体競合実験に使用した。
【０３６３】
抗ｈＬＯＸ１モノクローナル抗体の評価
ＣＨＯ  ＴＲＥＸ細胞上に発現するＬＯＸ１受容体との結合に関する抗ＬＯＸ１抗体とＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９標識リガンド（ｏｘＬＤＬ；ＡＧＥ−ＢＳＡ）との間の競合を、以下のとおり実施した。
【０３６４】
競合抗体はいかなる前希釈もなしに使用し、２４ポイントのアッセイ緩衝液（ＨＢＳＳ）中の１＋１系列希釈を使用して３８４ウェルプレートでデュプリケートでタイトレーションした（ウェル当たり１０μＬ）。抗体が入った全てのウェルにＤｙｌｉｇｈｔ  ６４９標識リガンド（それぞれのＫＤ濃度）を添加し（ウェル当たり１０μＬ）、続いてヒトＬＯＸ１トランスフェクトＣＨＯ  ＴＲＥＸ細胞（１０μＬ中ウェル当たり４０００細胞）又はＫ１６７Ｎ  ＳＮＰトランスフェクトＣＨＯ  ＴＲＥＸ細胞を添加した。
【０３６５】
アッセイプレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８２００細胞検出システム（ＦＭＡＴプレートリーダー）で４２２のＰＭＴ１セッティングを使用し、最小カウントを１０に設定してプレートを読み取った；カラー＜０．４及びＦＬ１＜５６００。ＧＲＡＰＨＰＡＤ（商標）Ｐｒｉｓｍ  バージョン５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｉｎｃ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で４パラメータロジスティック方程式を使用してデータを分析し、見かけのＩＣ５０値を決定した。Ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０＾（（Ｌｏｇ  ＩＣ５０−Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））（式中、Ｘは濃度の対数であり、Ｙは％特異的結合である）。ＩＣ５０は、特異的結合の５０％阻害を生じさせる試料濃度である。
【０３６６】
【表１３】
2020188765.tif 000015
【０３６７】
アッセイ３−ＬＯＸ１：ＣＲＰ結合アッセイ
飽和結合曲線
３８４ウェルＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートの表面上にＰＢＳ中３μｇ／ｍＬの濃度のＬＯＸ１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を４℃で一晩固定化した（ウェル当たり２５μＬ）。翌日、アッセイプレートをＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウム不含）で１２回洗浄した。ビオチン化ＣＲＰのワーキング溶液をＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０１％ｔｗｅｅｎ２０中２０μｇ／ｍＬ（７６９ｎＭ）で調製し、１６ポイントの１＋１系列希釈を使用して３８４ウェルプレートでトリプリケートでタイトレーションした（ウェル当たり１２．５μＬ）。更なる１２．５μＬのアッセイ緩衝液（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０１％ｔｗｅｅｎ２０中）を各ウェルに添加し、アッセイプレートを室温で２時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で１６回洗浄し、続いて５０μＬのユウロピウム標識ストレプトアビジン（１：１０００希釈）を添加した。アッセイプレートを室温で更に１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で１６回洗浄した。１００μＬ／ウェルのＤＥＬＦＩＡ増強溶液を添加することによりプレートを発色させ、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  Ｖプレートリーダーで工場出荷時インストール済みのＤＥＬＦＡユウロピウムプロトコルを使用して読み取った。得られた結合等温線をＰｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアでワンサイト特異的結合アルゴリズムを使用してプロットした。見かけのＫDが決定された計算値濃度を、続くハイスループットスクリーニング及び抗体競合実験に使用した。
【０３６８】
抗ヒトＬＯＸ１モノクローナル抗体の評価
組換えヒトＬＯＸ１との結合に関する抗体とビオチン標識ＣＲＰとの間の競合を以下のとおり実施した：３８４ウェルＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐアッセイプレートの表面上にＰＢＳ中３μｇ／ｍＬの濃度のＬＯＸ１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を４℃で一晩固定化した（ウェル当たり２５μＬ）。翌日、アッセイプレートをＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウム不含）で１２回洗浄した。競合抗体はいかなる前希釈もなしに使用し、２４ポイントのアッセイ緩衝液（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０１％ｔｗｅｅｎ２０）中１＋１系列希釈を使用して３８４ウェル希釈プレートでデュプリケートでタイトレーションした（ウェル当たり３０μＬ）。次に、抗体が入った全てのウェルにビオチン標識ＣＲＰ（ＫD濃度でウェル当たり３０μＬ）を添加した。次に、３８４ＭｉｎｉＴｒａｋ液体ハンドリングロボットを使用して、試料（５０μＬ）を希釈プレートから、固定化した組換えヒトＬＯＸ１を含むアッセイプレートに移した。プレートを室温で２時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で１６回洗浄し、続いて５０μＬのユウロピウム標識ストレプトアビジン（１：１０００希釈）を添加した。アッセイプレートを室温で更に１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で１６回洗浄した。１００μＬ／ウェルのＤＥＬＦＩＡ増強溶液を添加することによりプレートを発色させて、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  Ｖプレートリーダーで工場出荷時インストール済みのＤＥＬＦＡユウロピウムプロトコルを使用して読み取った。ＧＲＡＰＨＰＡＤ（商標）Ｐｒｉｓｍ  バージョン５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｉｎｃ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で４パラメータロジスティック方程式を使用してデータを分析し、見かけのＩＣ50値を決定した。Ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０＾（（Ｌｏｇ  ＩＣ５０−Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））（式中、Ｘは濃度の対数であり、Ｙは％特異的結合である）。ＩＣ50は、特異的結合の５０％阻害を生じさせる試料濃度である。
【０３６９】
【表１４】
2020188765.tif 000016
【０３７０】
アッセイ４−ＬＯＸ１：ｏｘＬＤＬインターナリゼーションアッセイ
飽和結合曲線
Ｃｙｐｈｅｒ  ５Ｅ標識ｏｘＬＤＬ（１ｍｇ／ｍＬで４０：１モル比）をＨＢＳＳ中に１：５０希釈し、１６ポイントの１＋１系列希釈を使用して３８４ウェルプレートでトリプリケートでタイトレーションした。全結合の決定については、全てのウェルに１０μＬのＨＢＳＳを添加し、続いて１０μＬのヒトＬＯＸ１トランスフェクトＣＨＯ  ＴＲＥＸ細胞を添加した（ウェル当たり４０００細胞）。非特異的結合の決定については、１０μＬのＨＢＳＳを１０μＬの非標識ｏｘＬＤＬ（１ｍｇ／ｍＬ）に置き換えた。
【０３７１】
アッセイプレートを３７℃で１時間インキュベートした。インターナリゼーションが代謝的に活性なプロセスであったことを実証するため、全ての試薬を４℃に保つ並行実験を実施した。インキュベーション後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８２００細胞検出システム（ＦＭＡＴプレートリーダー）で４２２のＰＭＴ１セッティングを使用し、最小カウントを１０に設定してプレートを読み取った；カラー＜０．４及びＦＬ１＜５６００。平均非特異的結合シグナルから平均全結合シグナルをサブトラクトし、得られた結合等温線をＰｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアでワンサイト特異的結合アルゴリズムを用いてプロットすることにより、特異的結合を決定した。ＫDが決定された計算値濃度を、続くハイスループットスクリーニング及び抗体競合実験に使用した。
【０３７２】
抗ｈＬＯＸ１モノクローナル抗体の評価
ＬＯＸ１受容体を発現するＣＨＯ  ＴＲＥＸ細胞におけるインターナリゼーションに関する抗ＬＯＸ１抗体とＣｙｐｈｅｒ５Ｅ標識ｏｘ−ＬＤＬとの間の競合を以下のとおり実施した。
【０３７３】
競合抗体はいかなる前希釈もなしに使用し、２４ポイントのアッセイ緩衝液（ＨＢＳＳ）中１＋１系列希釈を使用して３８４ウェルプレートでデュプリケートでタイトレーションした（ウェル当たり１０μＬ）。抗体が入った全てのウェルにＤｙｌｉｇｈｔ  ６４９標識リガンド（それぞれのＫD濃度）を添加し（ウェル当たり１０μＬ）、続いてヒトＬＯＸ１トランスフェクトＣＨＯ  ＴＲＥＸ細胞（１０μＬ中ウェル当たり４０００細胞）又はＫ１６７Ｎ  ＳＮＰトランスフェクトＣＨＯ  ＴＲＥＸ細胞を添加した。
【０３７４】
アッセイプレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８２００細胞検出システム（ＦＭＡＴプレートリーダー）で４２２のＰＭＴ１セッティングを使用し、最小カウントを１０に設定してプレートを読み取った。カラー＜０．４及びＦＬ１＜５６００。ＧＲＡＰＨＰＡＤ（商標）Ｐｒｉｓｍ  バージョン５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｉｎｃ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で４パラメータロジスティック方程式を使用してデータを分析し、見かけのＩＣ50値を決定した。Ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０＾（（Ｌｏｇ  ＩＣ５０−Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））（式中、Ｘは濃度の対数であり、Ｙは％特異的結合である）。ＩＣ50は、特異的結合の５０％阻害を生じさせる試料濃度である。
【０３７５】
【表１５】
2020188765.tif 000017
【０３７６】
アッセイ５−組換えＣＨＯ−ＬＯＸ１細胞におけるＲＯＳ誘導
細胞の調製
実験実施の２４時間前に、１μｇ／ｍＬ（最終濃度）のドキシサイクリンでヒトＬＯＸ１トランスフェクトＣＨＯ  ＴＲＥＸ細胞を誘導した。実験当日、細胞をスクラップし、１２００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を廃棄し、細胞ペレットを５０ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁し、１２００ｒｐｍで５分間遠心した。この手順を２回繰り返した。上清を廃棄し、細胞ペレットを５ｍＬのＨＢＳＳ中に再懸濁した。トリパンブルー排除法を用いて血球計算器で細胞をカウントした。合計４×１０5細胞となるように細胞の数を調整した。細胞は使用時まで氷上で保った。
【０３７７】
飽和結合曲線
Ｃｙｐｈｅｒ  ５Ｅ標識ｏｘＬＤＬ（１ｍｇ／ｍＬで４０：１のモル比）をＨＢＳＳ中に１：５０希釈し、１６ポイントの１＋１系列希釈を使用して３８４ウェルプレートでトリプリケートでタイトレーションした。全結合の決定については、全てのウェルに１０μＬのＨＢＳＳを添加し、続いて１０μＬのヒトＬＯＸ１トランスフェクトＣＨＯ  ＴＲＥＸ細胞を添加した（ウェル当たり４０００細胞）。非特異的結合の決定については、１０μＬのＨＢＳＳを１０μＬの非標識ｏｘＬＤＬ（１ｍｇ／ｍＬ）に置き換えた。
【０３７８】
アッセイプレートを３７℃で１時間インキュベートした。インターナリゼーションが代謝的に活性なプロセスであったことを実証するため、全ての試薬を４℃に保つ並行実験を実施した。
【０３７９】
インキュベーション後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８２００細胞検出システム（ＦＭＡＴプレートリーダー）で４２２のＰＭＴ１セッティングを使用し、最小カウントを１０に設定してプレートを読み取った；カラー＜０．４及びＦＬ１＜５６００。
【０３８０】
平均非特異的結合シグナルから平均全結合シグナルをサブトラクトし、得られた結合等温線をＰｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアでワンサイト特異的結合アルゴリズムを用いてプロットすることにより、特異的結合を決定した。ＫDが決定された計算値濃度を、続くハイスループットスクリーニング及び抗体競合実験に使用した。
【０３８１】
ＣＨＯ−ＴＲＥｘ−ＬＯＸ１トランスフェクト細胞を７０００細胞／ウェル（培地＋１０％ＦＣＳ（テトラサイクリン不含）中１００μｌ／ウェル）でアッセイプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。翌日、ドキシサイクリンをウェル当たり５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で添加することによりＬＯＸ発現を誘導し、プレートを３７℃、９５％Ｏ2／５％ＣＯ2雰囲気で一晩インキュベートした。各スクリーニング実験につき３つの別個のプレートを調製し、抗ＬＯＸ抗体は、１プレートにつき１つのレプリケートとしてトリプリケートで実行した。翌日、この抗体を別個の希釈プレートにおいて２倍濃縮溶液として温細胞培養培地中に系列希釈することにより、抗ＬＯＸ１抗体を調製した。アッセイプレートから培地を全て取り除き、アッセイプレートの各ウェルに抗ＬＯＸ１抗体の希釈系列（２倍濃縮溶液）の２５μＬアリコートを添加し、９５％Ｏ2／５％ＣＯ2雰囲気において３７℃で２０分間インキュベートした。これに続いてウェル当たり２５μＬのｏｘＬＤＬ（２５μｇ／ｍｌの固定最終濃度）を添加し、プレートを９５％Ｏ2／５％ＣＯ2において３７℃で６０分間インキュベートした。
【０３８２】
次にウェルを１×１００μｌの温ＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇで慎重に洗浄し、その後５０μｌ／ウェルのカルボキシ−Ｈ2ＤＣＦＤＡ（温ＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇ中１．５μＭ）を添加して、アッセイプレートを３０分間インキュベートした。カルボキシ−Ｈ2ＤＣＦＤＡとのインキュベーションの最後の５分間に、ウェル中に既にあるカルボキシ−Ｈ2ＤＣＦＤＡに温ＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇ中１０μｌ  ５０μｇ／ｍｌヘキストを添加することによって細胞を温ＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇ中ヘキスト染色（８．３μｇ／ｍｌの最終濃度）で対比染色した。
【０３８３】
次にアッセイプレートを温ＨＢＳＳ＋Ｃａ／Ｍｇで２回洗浄し、直ちにＡｒｒａｙｓｃａｎハイコンテントプレートリーダー（ＴｈｅｒｎｏＦｉｓｃｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）でＸＦ５３−ヘキスト（Ｃｈ１）及びＸＦ５３−ＦＩＴＣ（Ｃｈ２）セッティングを使用して読み取った。画像解析のため、Ｃｏｍｐａｒｔｅｍｅｎｔａｌ  ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎアルゴリズムを使用し、ＲＯＳプローブによって生じた蛍光をＣｉｒｃＳｐｏｔＡｖｇＩｎｔｅｎｓｉｔｙパラメータによって定量化した。競合データ、及び得られたＩＣ５０をプロットし、ＥｘｃｅｌＦｉｔ  ｖ．５．１で４パラメータロジスティックモデル（モデル９０３）を使用したシグモイド用量反応ワン・サイト・ゼロモデルを用いて計算した。
【０３８４】
アッセイ６−ＬＯＸ１特異性ＥＬＩＳＡ
以下の表９に掲載されるＬＯＸ１及びＬＯＸ１関連分子に対し、ＩｇＧ特異性ＥＬＩＳＡを本質的に以下のとおり実施した。ＭＡＸＩＳＯＲＢ（商標）（ＮＵＮＣ）プレートをＰＢＳ中５μｇ／ｍＬの抗原でコーティングして４℃で一晩インキュベートし、但しヒトＳＲ−Ｂ３については１０μｇ／ｍＬを使用した。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、２００μＬ／ウェルブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋３％粉乳）で１時間ブロックした。プレートをＰＢＳで３回洗浄した後、ＩｇＧをブロッキング緩衝液中０．２μｇ／ｍＬに希釈し、５０μＬ／ウェルで添加し、１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、検出試薬（抗ヒトＩｇＧλ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ  Ａ５１７５、０．２３μｇ／ｍＬに希釈）又はκ軽鎖（Ｓｉｇｍａ  Ａ７１６４、０．８μｇ／ｍＬに希釈））を添加し（ブロッキング緩衝液中５０μＬ／ウェル）、プレートを１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、５０μＬ／ウェルのＴＭＢを添加し、プレートを５〜１５分間発色させた。５０μＬ／ウェル  ０．１Ｍ  Ｈ2ＳＯ4で反応をクエンチし、ＥＮＶＩＳＩＯＮ（商標）プレートリーダー、又は同様の機器において４５０ｎｍでプレートを読み取った。
【０３８５】
【表１６】
2020188765.tif 000018
【０３８６】
アッセイ７−エピトープ競合
ＬＯＸ５１４及びＬＯＸ６９６を、上記でタンパク質修飾の節に記載したとおりＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９で標識し、リガンド結合アッセイと並行したハイスループットスクリーニング及びプロファイリングの両方の競合分子として使用した。標識抗体は、より高い親和性の非標識抗体が競合し難くなるように、そのそれぞれのＫD濃度を上回る幾つかの濃度で使用した。
【０３８７】
ＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９標識ＬＯＸ５１４及びＬＯＸ６９６のＫDの決定
Ｄｙｌｉｇｈｔ  ６４９標識ヒト抗ＬＯＸ１抗体をＨＢＳＳに１：５０希釈し、１６ポイントの１＋１系列希釈を使用して３８４ウェルプレートでトリプリケートでタイトレーションした。全結合の決定については、全てのウェルに１０μＬのＨＢＳＳを添加し、続いて１０μＬのヒトＬＯＸ１トランスフェクトＣＨＯ  ＴＲＥＸ細胞を添加した（ウェル当たり４０００細胞）。非特異的結合の決定については、１０μＬのＨＢＳＳを１０μＬの非標識ヒト抗ＬＯＸ１抗体（１ｍｇ／ｍＬ）に置き換えた。
【０３８８】
アッセイプレートを室温で１時間インキュベートした。
【０３８９】
インキュベーション後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８２００細胞検出システム（ＦＭＡＴプレートリーダー）で４２２のＰＭＴ１セッティングを使用し、最小カウントを１０に設定してプレートを読み取った；カラー＜０．４及びＦＬ１＜５６００。
【０３９０】
平均非特異的結合シグナルから平均全結合シグナルをサブトラクトし、得られた結合等温線をＰｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアでワンサイト特異的結合アルゴリズムを用いてプロットすることにより、特異的結合を決定した。抗体は計算値ＫD濃度に上乗せした倍数で使用した。
【０３９１】
【表１７】
2020188765.tif 000019
【０３９２】
実施例１１−抗ＬＯＸ１抗体が組織培養物及びヒト血管における内皮脂質取込み、細胞シグナル伝達及び一酸化窒素恒常性に及ぼす効果
ＬＯＸ１受容体は、ＯｘＬＤＬの特異的ライゲーション及びインターナリゼーションと、続く複数の細胞内シグナル伝達カスケードの活性化により、アテローム生成過程の近因の一つとして働く。例えば、Ｔｗｉｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｌ  Ｒｅｓ  Ｐｒａｃｔ．２０１２：６３２４０８（２０１２）を参照のこと。内皮細胞におけるＬＯＸ１受容体の活性化は、一部にはアルギナーゼ２の上方制御に誘導されるＲＯＳ産生の増加及び一酸化窒素（ＮＯ）シグナル伝達の障害を含めた内皮機能不全に寄与する。（例えば、Ｒｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ２１４（２）：２７９−２８７（２０１１）、Ｒｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．１０２（８）：９２３−９３２（２００８）；及びＲｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．９９（９）：９５１−６０（２００６）を参照のこと。加えて、ＬＯＸ１受容体活性化が、サイトカイン産生及び接着分子発現の増加を伴う血管壁の炎症過程の惹起及び永続化につながる。従ってＬＯＸ１受容体の生物学的阻害薬が開発されれば、アテローム生成過程の発達を減弱する有効な方法となる可能性が高い。ここで、本発明者らは、ＬＸ５１４０１１０がヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）によるＯｘＬＤＬの取込みを用量依存的に遮断することを実証する。加えて、ＬＸ５１４０１１０は、ＬＯＸ１依存的であることが以前実証された過程であるアルギナーゼ２の活性化を防ぐ。更に、ＬＸ５１４０１１０は、Ｏｘ−ＬＤＬ依存的なＮＯ産生の低下及びスーパーオキシド（ＲＯＳ）産生の増加を防ぐ。加えて、本発明者らは、ＮＦｋＢルシフェラーゼレポーターコンストラクトを使用して、ＬＸ５１４０１１０がＮＦｋＢ（アテローム発生における主要な炎症調節因子）の活性化を有意に減弱させることを実証する。例えば、Ｐａｍｕｋｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ．１２８（２）：１１７−２３（２０１１）を参照のこと。最後に、ＬＸ５１４０１１０抗体は、内皮細胞の関門機能において決定的に重要な過程である接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）のリン酸化及び活性化を防ぐ。従って、本発明者らは、内皮の活性化につながり且つアテローム発生を惹起及び促進する幾つものＬＯＸ１依存的過程をＬＸ５１４０１１０が遮断することを明らかにする。次には、これらの実験の結果を考察する。
【０３９３】
Ａ．ＬＸ５１４０１１０はＨＡＥＣにおけるＯｘＬＤＬの取込みを遮断する（図９Ａ）
方法：
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−５６８とのＯｘＬＤＬコンジュゲーション
５００マイクロリットルのヒト酸化ＬＤＬ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｔｒａｃｅｌ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）を、製造者のプロトコルに従いＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ−５６８タンパク質標識キット（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）を使用してＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ−５６８で標識した。簡潔に言えば、ＯｘＬＤＬを０．１Ｍ  重炭酸塩（ｐＨ８．３）中のＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ−５６８と共に室温で１時間インキュベートした。次にＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ−５６８コンジュゲートＯｘＬＤＬを精製樹脂カラムで精製した。
【０３９４】
ＨＡＥＣによるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−５６８コンジュゲートＯｘＬＤＬの取込み
フィブロネクチンがコーティングされた（１０μｇ／ｍｌ）カバーガラス上にＨＡＥＣを血清含有培地中８時間播種した後、１８時間血清飢餓状態にした。
【０３９５】
次に細胞を、０、０．５、１、５、又は１０ｎＭのＬＸ５１４０１１０（（「５１４」）又は１０ｎＭの対照抗体ＮＩＰと共に無血清培地で１時間インキュベートした。抗体を新鮮な無血清培地で完全に洗い落とした後、取込みのため、培地に約５０ｎｇ／ｍｌのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８−ＯｘＬＤＬを１時間添加した。次に細胞を３％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２分間透過処理し、続いて３％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。固定した細胞をフルオレセインファロイジン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）及びＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識し、落射蛍光Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ−２００顕微鏡で観察した。Ｖｏｌｏｃｉｔｙソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を備えたＲｏｌｅｒａ  ＥＭＣＣＤカメラ（ＱＩｍａｇｉｎｇ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、カナダ）で画像をキャプチャした。Ｖｏｌｏｃｉｔｙソフトウェアによって、ＨＡＥＣ細胞内部のＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ−５６８コンジュゲートＯｘＬＤＬ赤色蛍光粒子（０．１μｍ２より小さいサイズの粒子は除外）をカウントすることにより、画像を更に分析した（画像は示さず）。各組につき約１２枚の画像を取得し、各細胞の平均Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ−５６８コンジュゲートＯｘＬＤＬ赤色蛍光粒子数を分析した。用量反応データは図９Ａに示す（細胞当たりの小胞の数と標準偏差（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ））。図９Ａに示すとおり、５ｎＭ又は１０ｎＭ  ＬＸ５１４０１１０はＨＡＥＣによるＯｘＬＤＬ取込みを有意に阻害した（それぞれｐ＝０．０００３又はｐ＝０．０００２）。
【０３９６】
Ｂ．ＬＸ５１４０１１０はＨＡＥＣのＮＦｋＢシグナル伝達を減弱させる（図９Ｂ）
方法：ＮＦκＢ−ルシフェラーゼとＧＦＰとを共発現したＨＡＥＣのコンフルエントな６ウェルプレートを２４時間血清飢餓状態にした後、それらを以下の条件に供した（数字は図９Ｂ中のバーを左から右に示す）：１．対照；２．ＯｘＬＤＬ単独（５０μｇ／ｍｌ）；３．ＯｘＬＤＬ＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（１０ｎＭ）；４．ＯｘＬＤＬ＋ＮＩＰ（対照抗体）（１０ｎＭ）。
【０３９７】
抗体の１時間後にＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）を添加した。更に８時間、ＯｘＬＤＬとインキュベーションした。細胞を溶解させて、ルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に供し、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）でルミネセンスを決定した。簡潔に言えば、ＨＡＥＣをＰｒｏｍｅｇａ  ５×溶解緩衝液で溶解させて、各ウェルに５０μｌのＰｒｏｍｅｇａ基質が入った白色プレートに上清をプレーティングした。トランスフェクションの４８時間後、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％ＮＰ４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ  β−グリセロリン酸塩、１μｇ／ｍＬロイペプチン、及び１：１０００希釈のプロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｓｉｇｍａ）からなる氷冷改変溶解緩衝液中に細胞を溶解させた。ローディング緩衝液を２倍の最終濃度となるように添加し、５分間沸騰させ、３分間スピンして、ゲルにロードした。ＧＦＰ蛍光を正規化対照として使用した。各群につきＮ＝５；＊はＰ＜０．０５を示す（未処理対照との比較）；＃はＰ＜０．０５を示す（ＯｘＬＤＬ＋０ｎＭ  ａｂ  ５１４（ＬＸ５１４０１１０）との比較。図９Ｂに示すとおり、１０ｍＭ  ＬＸ５１４０１１０の添加によってＨＡＥＣにおけるＯｘＬＤＬ依存的ＮＦｋＢシグナル伝達が有意に低下したが、ＮＩＰ（対照抗体）では低下しなかった。これは、ＬＸ５１４０１１０が、ＬＯＸ−１受容体の下流であることが十分に確立されているシグナル伝達経路であるＬＯＸ１依存的ＮＦｋＢ活性化を阻害する能力を有することを示唆している。例えば、Ｚｈａｏ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ＬＯＸ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｉａ  ＴＬＲ４／ＭｙＤ８８／ＲＯＳ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐ３８ＭＡＰＫ−ＮＦ−κＢ  ｐａｔｈｗａｙ．”Ｖａｓｃｕｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２０１４）を参照のこと。
【０３９８】
Ｃ．ＬＸ５１４０１１０はＨＡＥＣにおけるアルギナーゼの活性化を阻害する（図９Ｃ）  方法：ＨＡＥＣのコンフルエントな６ウェルプレートを２４時間血清飢餓状態にした後、それらを以下の条件に供した（数字は図９Ｃ中のバーを左から右に示す）：１．対照；２．ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）；３．ＯｘＬＤＬ＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（１ｎＭ）；４．ＯｘＬＤＬ＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（３ｎＭ）；５．ＯｘＬＤＬ＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（１０ｎＭ）；６．ＯｘＬＤＬ＋ＮＩＰ（１０ｎＭ）。抗体を添加して１時間後に、ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）中でＨＡＥＣを更に３時間インキュベートした。細胞を溶解させて、α−イソニトロソプロピオフェノンを使用した尿素アッセイを用いてアルギナーゼ活性を決定した。簡潔に言えば、溶解緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ及びプロテアーゼ阻害薬）と共に４℃で３０分間インキュベートし、１４，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心した後、抽出細胞ライセートの上清を調製した。次に上清を１５０ｍＭ  Ｌ−アルギニンと共に３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、４００μｌの酸性溶液混合物（Ｈ２ＳＯ：Ｈ３ＰＯ４：Ｈ２Ｏ  １：３：７）を使用して反応を停止させ、次に２５μｌ  ９％α−イソニトロソプロピオフェノン（１００％ＥｔＯＨ中）を添加し、９５℃で３０分間加熱し、１０分後に５４０ｎｍで読み取った。各群につきＮ＝３；＊は、未処理対照と比較したときＰ＜０．０５であることを示す；＃は、０ｎＭ  抗体５１４（ＬＸ５１４０１１０）と比較したときＰ＜０．０５であることを示す。図９Ｃに示すとおり、３ｎＭ又は１０ｎＭ  ＬＸ５１４０１１０を加えると、ＨＡＥＣのＯｘＬＤＬ依存的アルギナーゼ活性が用量依存的に有意に低下したが、１０ｎＭ  ＮＩＰ（対照抗体）では低下しなかった。これは更に、最近になって血管内皮のＬＯＸ−１にカップリングすることが示された下流シグナル伝達経路であるアルギナーゼ２のＬＯＸ１依存的活性化がＬＸ５１４１１０によって阻害されることを示唆している。例えば、Ｒｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ２１４：２７９−８７（２０１１）を参照のこと。
【０３９９】
Ｄ．ＬＸ５１４０１１０は一酸化窒素産生のＯｘＬＤＬ依存的低下を遮断する（図９Ｄ）  方法：ＤＡＦ蛍光を使用してＮＯ産生を決定した。簡潔に言えば、ＮＯを計測するため、白色９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ）にＨＡＥＣ細胞をウェル当たり約５×１０４細胞の密度でプレーティングし、一晩血清飢餓状態にした（１％血清）。細胞は７つの実験群で調べた（数字は図９Ｄ中のバーを左から右に示す）：１．対照；２．ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）；３．ＯｘＬＤＬ＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（０．５ｎＭ）；４．ＯｘＬＤＬ＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（１ｎＭ）；５．ＯｘＬＤＬ＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（５ｎＭ）；６．ＯｘＬＤＬ＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（１０ｎＭ）；７．ＯｘＬＤＬ＋ＮＩＰ（１０ｎＭ）。抗体を添加して１時間後に、ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）中でＨＡＥＣを２４時間インキュベートした。次に培地を取り除き、ＤＡＦ−ＦＭ  ＤＡ（５μＭ）を含有するＥＢＭ２培地に３７℃で細胞を３７℃で３０分間置いた。次に培地を新鮮培地に交換し、細胞を更に２０分間インキュベートした後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において励起４９５ｎｍ及び発光５１５ｎｍで全蛍光を計測した。ｅＮＯＳによってＮＯが産生されたことを確認するため、ＮＯＳ阻害薬Ｌ−ＮＡＭＥを対照として使用した（データは示さず）。各群につきＮ＝５；＊は、Ｐ＜０．０５であることを示す（未処理対照との比較）。図９Ｄに示すとおり、５ｎＭ又は１０ｎＭ  ＬＸ５１４０１１０を加えると、ＨＡＥＣの一酸化窒素産生のＯｘＬＤＬ依存的低下が用量依存的に有意に阻害されたが、１０ｎＭ  ＮＩＰ（対照抗体）では阻害されなかった。
【０４００】
Ｅ．ＬＸ５１４０１１０はＲＯＳ産生のＯｘＬＤＬ依存的増加を遮断する（図９Ｅ及び図９Ｆ）
方法：ルミノール類似体Ｌ−０１２を使用してスーパーオキシド産生を決定した。スーパーオキシド（ＲＯＳ）を計測するため、白色ＴＣ処理９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ）にＨＡＥＣ細胞をウェル当たり約５×１０4細胞の密度でプレーティングし、一晩血清飢餓状態にした（１％血清）。７つの試験集団は以下のとおりであった（数字は図９Ｅ中のバーを左から右に示す）：１．対照；２．ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）；３．ＯｘＬＤＬ＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（０．５ｎＭ）；４．ＯｘＬＤＬ＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（１ｎＭ）；５．ＯｘＬＤＬ＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（５ｎＭ）；６．ＯｘＬＤＬ＋ＬＸ５１４０１１０（「５１４」）（１０ｎＭ）；７．ＯｘＬＤＬ＋ＮＩＰ（１０ｎＭ）。抗体を添加して１時間後に、ＯｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）中でＨＡＥＣを２４時間インキュベートした。次に培地を取り除き、４００μＭのルミノール類似体Ｌ−０１２（Ｗａｋｏ）を含有するフェノール不含ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）中で細胞を３７℃で最低２０分間更にインキュベートした後、アゴニストを添加した。ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してルミネセンスを経時的に定量化した。スーパーオキシドスカベンジャーＳＯＤ（５ｍＭ）とコインキュベートすることによって活性酸素種に対するＬ−０１２の特異性を確認したところ、これにより対照又はＯｘＬＤＬ刺激条件下で生じたルミネセンスは事実上検出不能なレベルであった（図９Ｆを参照のこと）。従ってＬ−０１２のルミネセンスから定量化した相対発光単位（ＲＬＵ）が、スーパーオキシド産生の変化を示す。スーパーオキシドがｅＮＯＳによって産生されたことを確認するため、ＮＯＳ阻害薬Ｌ−ＮＡＭＥを対照として使用した。各群につきＮ＝５。図９Ｅ及び図９Ｆに示されるとおり、０．５ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ又は１０ｎＭ  ＬＸ５１４０１１０を加えると、ＨＡＥＣのＯｘＬＤＬ依存的ＲＯＳ産生が阻害されたが、１０ｎＭ  ＮＩＰ（対照抗体）では阻害されなかった。従って、ＬＸ５１４０１１０は、ＬＯＸ−１活性化及びアルギナーゼ２の下流活性化を妨げることにより、ＯｘＬＤＬ媒介性ｅＮＯＳアンカップリング、及び続くＲＯＳ産生の増加を妨げる。例えば、Ｒｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ２１４：２７９−８７（２０１１）を参照のこと。
【０４０１】
Ｆ．ＬＸ５１４０１１０は接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）、Ｙ３９７のＯｘＤＬ媒介性リン酸化を遮断する（図９Ｇ及び図９Ｈ）
方法：５％血清を含むＥＣＭ培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）でＨＡＥＣを１日培養した後、１８時間血清飢餓状態にした。次にＬＸ５１４０１１０又は対照抗体ＮＩＰを図９Ｇに示す濃度で細胞に添加し、１時間インキュベートした。細胞を新鮮培地で洗浄して抗体を取り除いた後、それらを５０μｇ／ｍｌのＯｘＬＤＬと共に１時間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、次に、改変ＲＩＰＡ緩衝液（ＰＢＳ中０．１％ＤＯＣ、０．１％  Ｔｒｉｔｉｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、２ｍＭバナジン酸ナトリウム、２０ｍｇ／ｍｌロイペプチン、及び２０ｍｇ／ｍｌアプロチニン）を使用してタンパク質を抽出した。細胞ライセートを１５，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心することにより清澄化した。次にタンパク質濃度をビシンコニン酸アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって定量化した。１０μｇのタンパク質ライセートを２×レムリー試料緩衝液と混合し、沸騰させ、次に４〜１５％勾配ポリアクリルアミドゲルを使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、続いてニトロセルロース膜に転写してウエスタンブロッティングを行った。
【０４０２】
図９Ｇ及び図９Ｈに記載する実験で使用した一次抗体には、抗ｐＹ３９７−ＦＡＫ（ウサギポリクローナル、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）及び抗ＧＡＰＤＨ（マウスモノクローナル、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）が含まれる。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウス及び抗ウサギ二次抗体は、ＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｓｔａ、Ｍｅｓａ、ＣＡ）から入手した。
【０４０３】
スチューデントｔ検定を用いることにより、対照細胞、ＯｘＬＤＬ処理細胞、及び抗体プレインキュベート細胞におけるＴｙｒ３９７上のＦＡＫリン酸化の差を分析した。ｐ値は図９Ｈに提供し、全てのデータについて０．０５未満のｐ値で有意性（＊）が存在するものと見なした。これらの図は標準誤差バーを含む。ＨＡＥＣにおけるＴｙｒ３９７のＦＡＫリン酸化及びＧＡＰＤＨの発現の変化を示す代表的なブロットを図９Ｇに示し、一方、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化したＴｙｒ３９７におけるＦＡＫリン酸化（ｐＹ３９７−ＦＡＫ）のパーセンテージ増加率の定量化を図９Ｈに示す。これらの結果は、５ｎＭ又は１０ｎＭ  ＬＸ５１４０１１０を加えると、ＨＡＥＣにおけるＴｙｒ３９７のＯｘＬＤＬ依存媒介性ＦＡＫリン酸化が有意に阻害されたが、１０ｎＭ  ＮＩＰ（対照抗体）では阻害されなかったことを実証している。＊は、Ｐ＜０．０５であることを示す（未処理対照との比較）；＃は、０ｎＭ  ＬＸ５１４０１１０（５１４）と比較したときＰ＜０．０５であることを示す。このデータは、細胞間及び細胞−マトリックス間接着を含めた内皮細胞骨格機能を調節して、続いて内皮関門機能に効果を及ぼす過程であるＬＯＸ−１依存的ＦＡＫリン酸化のＯｘＬＤＬ媒介性誘導が、ＬＸ５１４０１１０によって阻害されることを示唆している。
【０４０４】
Ｇ．ＬＯＸ１は、ＨＡＥＣにおけるＯｘＬＤＬシグナル伝達に関与する主要な受容体である（図９Ｉ、図９Ｊ及び図９Ｋ）
方法：ＬＯＸ１  ｓｈＲＮＡアデノウイルスの構築：
ｐＡｄＢＬＯＣＫ−ｉＴキット（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、Ａｄ−ｓｈＮｏｎｔａｒｇｅｔｅｄコードウイルス及びＡｄ  ｓｈＬＯＸ１コードウイルスを作成した。簡潔に言えば、標的化されなかったオリゴヌクレオチド、及びヒトＬＯＸ１の他の標的化する５’ＵＴＲ領域をＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの専売のソフトウェアで設計し、ｐＵ６−ＥＮＴＲにクローニングした。使用した配列は以下のとおりであった。非標的化：Ｔｏｐ、５’−ＣＡＣ  ＣＧＡ  ＴＧＧ  ＡＴＴ  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＡＧＧ  ＴＴＣ  ＴＣＧ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＧＣＧ  ＴＧＣ  ＡＡＴ  ＣＣＡ  ＴＣ−３’（配列番号７９）；Ｂｏｔｔｏｍ、５’−ＡＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＧ  ＡＴＴ  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＡＧＧ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＧＣＧ  ＴＧＣ  ＡＡＴ  ＣＣＡ  ＴＣ−３’（配列番号８０）。ＬＯＸ１ｓｈ：Ｔｏｐ、５’−ＣＡＣ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＴＣＡ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＧＣＧ  ＡＡＣ  ＴＡＡ  ＧＡＡ  ＴＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＧＣ−３’（配列番号８１）；Ｂｏｔｔｏｍ、５’−ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＴＣＡ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＧＴＴ  ＣＧＣ  ＴＡＡ  ＧＡＡ  ＴＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＧＣ−３’（配列番号８２）。
【０４０５】
得られたｐＵ６−ｓｈ−Ｎｏｎｔａｒｇｅｔｅｄ及びｐＵ６−ＬＯＸ１ｓｈＲＮＡプラスミドについて、ＨＡＥＣ細胞による一過性トランスフェクション実験で機能を試験した。最大の阻害を示すコンストラクトをｐＡＤ／ＢＬＯＣＫ−ｉＴＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と組み換えて、ｐＡｄ−Ｎｏｎｔａｒｇｅｔｅｄ及びＡｄ−ｓｈＬＯＸ１を作成した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅキットを使用してウイルスを増幅し、精製し、濃縮した。
【０４０６】
ＨＡＥＣにおけるＯｘＬＤＬシグナル伝達にＬＯＸ１が不可欠であることを確認するため、ヒトＬＯＸ１遺伝子の５’ＵＴＲ領域を標的とする干渉低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）（ＬＯＸ１ｓｈＲＮＡ）を発現するウイルスベクターを使用してＬＯＸ１  ＲＮＡ発現を阻害した。簡潔に言えば、６０パーセントコンフルエントのＨＡＥＣを２５ＭＯＩ（感染多重度、病原性の尺度）のＬＯＸ１ｓｈＲＮＡ発現アデノウイルス（「ＬＯＸ１−ｓｈＲＮＡ」又は「Ａｄ−ＬＯＸ−１ｓｈＲＮＡ」）で形質導入した。２４時間後、培地を、ＮＦＫＢ−ＬＵＣをコードするウイルスを含有する低血清培地（１％）に交換した。ウイルス形質導入の翌日、細胞を５０μｇ／ｍＬのＯｘＬＤＬで処理し、更に８時間インキュベートし、続いて化学発光によってルシフェラーゼ活性を計測した。次に細胞ライセートを抗Ｌｏｘ−１抗体又は抗ＧＡＰＤＨ抗体によるイムノブロッティングに供した。図９Ｊ及び図９Ｋに示されるとおり、ＬＯＸ１ｓｈＲＮＡを加えるとＬＯＸ１タンパク質発現が有意に低下し（例えば、図９Ｊのレーン１及び２と比較したときのレーン３を参照のこと）、ＬＯＸ１ｓｈＲＮＡがＨＡＥＣのＬＯＸ１発現を有効に阻害したことが確認された。加えて、図９Ｉに示されるとおり、ＡｄｓｈＬＯＸ１は、ＯｘＬＤＬ及び対照の非標的ｓｈＲＮＡ（Ａｄ−ＮＴｓｈ）コンストラクトとインキュベートした細胞と比較して、ＨＡＥＣのＯｘＬＤＬ媒介性ＮＦｋＢシグナル伝達を有意に阻害した。＊はＰ＜０．０５を示す（未処理対照との比較）；＃は、ＯｘＬＤＬ＋Ａｄ−ＮＴｓｈと比較したときのＰ＜０．０５を示す。
【０４０７】
ＬＯＸ１受容体シグナル伝達に関与し且つ本明細書に開示される抗ＬＯＸ１抗体（例えばＬＸ５１４０１１０を含む；「５１４  Ａｂ」）によって遮断されるシグナル伝達経路の概要を図１０に示す。
【０４０８】
具体的な態様についての前述の説明は、本開示の概略的な本質を十全に明らかにするものであるため、他の者は、当該分野の技術の範囲内にある知識を適用することにより、過度の実験を行うことなく、本開示の概略的な概念から逸脱することなく、容易にかかる具体的な態様を改良し、及び／又は様々な適用に適合させることができるであろう。従って、かかる適合及び改良は、本明細書に提供される教示及び指針に基づけば、開示される態様の均等物の意味及び範囲内にあることが意図される。本明細書における表現法又は用語法は、限定ではなく、説明を目的としていることが理解されるべきであり、本明細書の用語法又は表現法は当業者によって教示及び指針を踏まえて解釈されるべきである。
【０４０９】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文書は、個々の刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文書が各々、あらゆる目的から参照によって援用されることを個々に示されたものとするのと同程度に、あらゆる目的から全体として参照により援用される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図９Ｋ】
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【図１０】
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【配列表】
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