(57)【要約】      （修正有）【課題】１種又は複数の分析物の検出及び測定のための方法、システム、及びデバイスの提供。【解決手段】一実施形態において、本発明は、リザーバ部分とアッセイ部分を含むカートリッジデバイスであって、１種又は複数の液体を保持するための１つ又は複数のリザーバ部分と、少なくとも１つのリザーバ部分からの１種又は複数の液体を受容するための少なくとも１つのアッセイ部分であり、１つ又は複数のリザーバからの１種又は複数の液体がその上に繰り返し（２回以上）流され得る複数の結合部位を有する、アッセイ部分と、１種又は複数の液体中の１種又は複数の分析物の、複数の結合部位に対する結合を測定するための測定デバイスとを備えるアッセイシステムを提供する。【選択図】図１
2020098202.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カートリッジデバイスを備えるアッセイシステムであって、
前記カートリッジデバイスが、
・加圧された試料のリザーバであり、
試料のリザーバと、
前記試料のリザーバを覆う膜と、
前記試料のリザーバの周縁部を囲むリングと、
前記リングにかみ合うインターフェースデバイスと、
を有する、加圧された試料のリザーバと、
・加圧された試薬のリザーバであり、
試薬のリザーバと、
前記試薬のリザーバを覆う膜と、
前記試薬のリザーバの周縁部を囲むリングと、
前記リングにかみ合うインターフェースデバイスと、
を有する、加圧された試薬のリザーバと、
・前記加圧された試料のリザーバからの液体を受けるためのアッセイ部分であり、
前記液体を該アッセイ部分に導入するよう、前記加圧された試料のリザーバに接続された導入部と、
該アッセイ部分から前記液体を排出する排出部と、
前記導入部と前記排出部との間に設けられた複数の結合部位であり、該結合部位を経て前記液体が前記導入部から前記排出部に繰り返し流され得る、結合部位と
を有する、アッセイ部分と、
・前記液体中の１種以上の分析物の前記複数の結合部位への結合を、前記導入部から前記排出部への前記液体の複数の流れの各々の後に、測定するための測定装置と
を含む、アッセイシステム。
【請求項２】
前記カートリッジデバイスが受け入れられたり取り出されたりするインターフェースであって、前記加圧された試料のリザーバから前記アッセイ部分を通る前記液体の流れ又は移動を制御するための装置を含む、インターフェースをさらに備え、
前記液体の流れを制御するための前記装置が、以下の事項の少なくとも１つ、すなわち
前記アッセイ部分を横切る前記液体の流速、
前記アッセイ部分を横切る前記液体の流れの持続時間、及び、
ある量の前記液体が、前記アッセイ部分を通って流される回数
の少なくとも１つを独立に制御することができる、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項３】
流速センサーをさらに備え、
前記インターフェースが、前記流速センサーからの出力に基づいて、前記アッセイ部分を横切る前記液体の流速と持続時間の少なくとも一方を制御する可変の陽圧と可変の陰圧の両方又はその一方を提供する、請求項２に記載のアッセイシステム。
【請求項４】
前記液体が、蛍光標識、発光標識、及び比色標識からなる群から選択される１種以上の標識を含み、
前記測定装置が、蛍光測定装置、発光測定装置、及び比色測定装置からなる群から選択される、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項５】
前記測定装置が、コンピューター制御下で、レーザー又は他の形態の標識刺激を、前記カートリッジデバイスの前記アッセイ部分に向けることができるように、かつ、続いて蛍光、発光又は比色シグナルの検出及び／又は測定を実施できるように、当該アッセイシステムに構成されている、請求項４に記載のアッセイシステム。
【請求項６】
コンピューターソフトウェアをさらに備え、
該コンピューターソフトウェアは、実行されると、
前記アッセイ部分中における前記複数の結合部位の１つ又は複数に結合する１種以上の分析物の１つ以上の結合曲線の表示を分析し、
前記１種以上の分析物について該分析を１つ以上の既知の標準物質の時間経過結合曲線と比較し、
前記液体中の前記１種以上の分析物の存在と濃度の少なくとも一方を決定する
ように動作する、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項７】
前記加圧された試料のリザーバが、該加圧された試料のリザーバ内の液体を封じる薄い膜により覆われている、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項８】
前記液体が、
ストレプトアビジン、アビジン及び色素標識型のストレプトアビジンを含むストレプトアビジン種、
二量化ビオチン分子、ビオチンで部分的に若しくは完全に標識されたＰＡＭＡＭ（ポリアミドアミン）デンドリマー、又はビオチン−アビジンネットワークを形成し得る任意のビオチン含有分子若しくは高分子、ビオチン化タンパク質、ビオチン化抗体、ビオチン化ペプチド、ＤＮＡのビオチン化ストランド、及びビオチン化デンドリマーを含むビオチン化種、又は、
分析物とは独立した態様で、捕捉された活性物質と検出試薬とを架橋させることができる任意の活性物質及び抗種抗体
のうち少なくとも１つを含む、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項９】
前記複数の結合部位が、生物学的実体と化学的実体の一方又は両方を含む、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項１０】
前記生物学的実体が、タンパク質、ホルモン、抗体、抗原、ウイルス、抗体複合体、機能的抗体断片、ペプチド、細胞、細胞断片、アプタマー、細胞溶解物、分画された細胞溶解物、分画された細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、遺伝子、及び遺伝子発現生成物からなる群から選択され、
前記化学的実体が、化学元素、化合物、薬学的に活性な化合物又はそれらの代謝物、鉱物、及び汚染物質からなる群から選択される、請求項９に記載のアッセイシステム。
【請求項１１】
前記カートリッジデバイスが、前記排出部に接続された廃棄物チャンバーをさらに備える、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項１２】
加圧された試料のリザーバであり、
試料のリザーバと、
前記試料のリザーバを覆う膜と、
前記試料のリザーバの周縁部を囲むリングと、
前記リングにかみ合うインターフェースデバイスと、
加圧された試料のリザーバと、
加圧された試薬のリザーバであり、
試薬のリザーバと、
前記試薬のリザーバを覆う膜と、
前記試薬のリザーバの周縁部を囲むリングと、
前記リングにかみ合うインターフェースデバイスと、
を有する、加圧された試薬のリザーバと、
前記加圧された試料のリザーバからの流体を受けるためのアッセイ部分であって、
前記流体を該アッセイ部分に導入するよう、前記加圧された試料のリザーバに接続された導入部と、
該アッセイ部分から前記流体を排出する排出部と、
前記導入部と前記排出部との間に設けられた複数の結合部位であり、該結合部位を経て前記流体が前記導入部から前記排出部に繰り返し流され得る、結合部位と
を有する、アッセイ部分と、
を備えるカートリッジデバイス。
【請求項１３】
前記排出部に接続された廃棄物チャンバーをさらに備える、請求項１２に記載のカートリッジデバイス。
【発明の詳細な説明】
【関連出願への相互参照】
【０００１】
本出願は、本明細書に組み込まれる２０１３年３月１５日出願の同時係属中の米国仮特許出願第６１／８００，１０１号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
生命科学産業は、新薬の発見、疾患を診断及びモニタリングするための新しいバイオマーカーの同定又はバイオマーカーレベルの測定のために、バイオアッセイとして知られる試験の正確で適時の開発及び処理に依存している。
【０００３】
しかしながら、公知のアッセイ法は、いくつかの限界に悩まされている。そのような限界の１つは、アッセイ中における標的分析物の捕捉試薬に対する特異的結合を、アッセイ中における非標的物質、分子、又は分析物の捕捉試薬に対する非特異的結合と識別できないことである。いずれの非特異的結合も、分析物濃度の不自然に高い測定値及び不正確な定量をもたらす可能性もある。実際に、一部の場合に、分析物が試験試料中に存在しなくても、非特異的相互作用により生じたシグナルが偽陽性の試験結果を生ずる。
【０００４】
公知のアッセイ法のさらに重大な限界は、それらが、分析される少なくとも１種の試料中に数桁もの異なる濃度で存在し得る異なった分析物を正確に検出及び測定することができないことである。このような広いダイナミックレンジにわたり１回の試験で分析物濃度を定量することに対する限界が、多くの現在利用可能な多重アッセイの生物学的妥当性を限定しており、さらに試料の多数回の逐次希釈を行うことも必要になり、追加の時間、費用及び貴重な試料の使用が必要になる。
【０００５】
さらに、大部分の公知のアッセイ法は、比較的複雑な使用者集約的プロトコルを必要とすることから、多くのアッセイの利用は訓練された熟練スタッフがいる設備の整った実験室のみに限定される。
【０００６】
その全てが記載されたものとして本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０７１０４４（「’０４４出願」）は、公知のアッセイの限界の多くを克服する長期的なアッセイ法を記載しているが、本明細書で開示されたシステム及び方法は、上で述べられた限界をさらに取り扱うものであり、複数の分析物の正確な検出及び測定に対する独特の新規な手法を提供するものである。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書で開示される本発明は、長期的なアッセイスクリーニングから組み込み及び構築するシステム及び関係する方法に関する。
【０００８】
開示されるシステム及び方法にとって重要なことは、バイオアッセイのインキュベーションプロセスの途中に像データを集める能力である。これにより、リアルタイムの速度論的な結合曲線の発生に使用される時間経過又は長期的なデータの収集が可能になる。
【０００９】
一実施形態において、本発明は、カートリッジデバイスと、測定デバイスとを備えるアッセイシステムであって、前記カートリッジデバイスが、１種又は複数の液体を保持するための１つ又は複数のリザーバ部分と、少なくとも１つのリザーバ部分からの１種又は複数の液体を受けるための少なくとも１つのアッセイ部分であり、１つ又は複数のリザーバからの１種又は複数の液体がその上に繰り返し（２回以上）流され得る複数の結合部位を有する、アッセイ部分とを含み、前記測定デバイスが、１種又は複数の液体中の１種又は複数の分析物の複数の結合部位への結合を測定するためのものである、アッセイシステムを提供する。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、流体用のカートリッジを受けるための受け部であって、前記カートリッジは、前記カートリッジ中の１つ又は複数のリザーバからの１種又は複数の流体の流速を制御するためのインターフェースを有する、受け部と；  流体を含有する１つ又は２つ以上のリザーバを有する流体用のカートリッジであって、前記流体の少なくとも１つは１種又は複数の標的分析物を含有し得る分析しようとする流体であり、少なくとも１つの流体が蛍光、発光又は比色標識を含有し、前記カートリッジはさらに、１種又は複数の流体をコンピューター制御下でカートリッジの１つの区画から別の少なくとも１つのそのような区画へ移すことができる流体のチャネルを備え、前記カートリッジのアッセイ部分は、１種又は複数の特異的捕捉剤を各々含有する２箇所以上の結合部位のアレイを備え、各部位は１種又は複数の特異的捕捉剤を含有する、カートリッジと；  蛍光又は発光又は比色標識と相互作用し及び／又は刺激して、蛍光又は発光又は比色シグナルの強度をそのような各部位において時系列で測定するためのデバイスと；  時系列のそのような測定を取り入れて、結合部位内における非標的物質／分子／分析物と捕捉剤又は他の物質の間の動的又は速度論的結合曲線の表示を作製するための装置とを具備するシステムを提供する。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、アッセイにおいて特異的結合と非特異的結合とを識別する方法であって、複数のシグナル強度測定の各々が、分析される試料と分析される試料中の標的分析物の捕捉剤との反復する相互作用の間に行われて、分析される試料の複数のシグナル強度測定値を得るステップと；  複数のシグナル強度測定値を分析される試料と捕捉剤との相互作用の累積持続時間の関数としてプロットするステップとを含む方法を提供する。
【００１２】
さらに別の実施形態において、本発明は、分析物を含有する試料中の分析物濃度を計算する方法であって、試料の成分の分析物に結合することができる捕捉剤への結合を表す複数のシグナル強度測定値を得るステップであって、複数のシグナル強度測定が既知の時間間隔で試料と捕捉剤の間の相互作用の既知の持続時間の間に行われるステップと；  複数のシグナル強度測定値を試料と捕捉剤の相互作用の累積持続時間の関数としてプロットするステップと；  プロットされたシグナル強度測定値に対する１つ又は複数の１次微分又は接線（初速度）を計算するステップであって、１つ又は複数の１次微分又は接線（初速度）の各々が近接してプロットされたシグナル強度測定値を使用して計算されるステップとを含み；  １つ又は複数の標準分析物濃度についての１次微分又は接線（初速度）が、後で逆算曲線の適合を決定するために使用され得る、方法を提供する。酵素基質複合体が反応に先立って形成される場合、逆算の適合は、酵素触媒モデルに基づく適合である。次いで、未知の試料の１次微分又は接線（初速度）は、分析物濃度を１つ又は複数の標準物質の分析濃度から逆算するために使用される。
【００１３】
さらに別の実施形態において、本発明は、１種又は複数の流体を保持するための少なくとも１つのリザーバ部分と；  少なくとも１つのリザーバ部分からの１種又は複数の流体を受けるための少なくとも１つのアッセイ部分であって、その上に流体が流される複数の結合部位を有し、流体のチャネル又は配管を通して少なくとも１つのリザーバ部分に接続された少なくとも１つのアッセイ部分とを備えるカートリッジデバイスを提供する。
【００１４】
本発明のこれらの及び他の特徴は、本発明の種々の実施形態を示す添付の図面と併せた本発明の種々の態様及び実施形態の以下の詳細な説明から、より容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施形態によるアッセイカートリッジの分解斜視図である。
【図２】本発明の実施形態によるアッセイカートリッジの４つのアッセイ部分の単純化した模式図である。
【図３】アッセイカートリッジの１つのアッセイ部分の単純化した模式図に、本発明の実施形態によるシステム及びアッセイカートリッジのリザーバ及びバルブ要素についての単純化した概略図を加えて示す図である。
【図４】本発明の実施形態によるアッセイ法のステップを単純化した図である。
【図５】本発明の実施形態によるアッセイ法の別のステップを単純化した図である。
【図６】本発明の実施形態によるアッセイ法のさらに別のステップを単純化した図である。
【図７】本発明の実施形態によるアッセイ法の他のステップを単純化した図である。
【図８】本発明の別の実施形態による分析物−捕捉剤と促進剤の相互作用の単純化した図である。
【図９】本発明の別の実施形態による分析物−捕捉剤と促進剤の相互作用の単純化した図である。
【図１０】本発明の別の実施形態による分析物−捕捉剤と促進剤の相互作用の単純化した図である。
【図１１】標的分析物及び非標的分析物の結合のシグナル強度のグラフである。
【図１２】本発明の実施形態による、ＩＬ−６を標的とする３連のアッセイの結合曲線を示す図である。
【図１３】本発明の実施形態による、ＣＲＰを標的とする３連のアッセイの結合曲線を示す図である。
【図１４】本発明の実施形態による、ＩＬ−１ｂを標的とする３連のアッセイの結合曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
図面は縮尺で描いたものではなく、本発明の典型的な態様のみを描写することが意図されていることを注意しておく。それ故、図面は、本発明の範囲を限定すると考えられるべきではない。図面において、同様な番号付けは、図面の中で同様な要素を表す。
【００１７】
定義
本明細書において使用する種々の用語及び語句は、ここで記載するように、特許請求された発明の文脈において意味を有することが意図される。用語「流体」は、流動性の移動をさせられる又はそれが可能な物体の状態を広く包含することを意図し、液体、気体、及び微細な粒子状固体、並びにそれらの組合せ及びコロイド状懸濁液などの懸濁液を含む。本発明の関係で、「液体」は、動物の（ヒトを含むが、それに限定されない）血液、血清、唾液、尿、血漿、気管肺胞の洗浄液、気管洗浄液、組織、腫瘍、及び組織／腫瘍のホモジェネート、並びに植物抽出液、液化された食物、腹水、有機流体、無機流体、緩衝液、標識された緩衝液、洗浄液、その他を含むことができるが、これらに限定されない。
【００１８】
用語「分析物」は、検出若しくは測定されるべき又はそれが可能な任意の物を意味することが意図される。分析物は、タンパク質、ホルモン、抗体、抗原、ウイルス、抗体複合体、ペプチド、細胞、細胞断片、アプタマー、細胞溶解物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、遺伝子、遺伝子発現生成物などの生物学的実体、並びに化学元素、化合物、薬学的に活性な化合物又はそれらの代謝物、鉱物、汚染物質などの化学的実体を含むが、これらに限定されない。
【００１９】
用語「検出用試薬（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｒｅａｇｅｎｔ）」（又は検出試薬（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ））は、分析物の可視化（検出）及び／又は測定を可能にする仕組みとして使用される任意のものを意味することが意図される。これは、タンパク質、ホルモン、抗体、抗原、ウイルス、抗体複合体、抗体断片、ペプチド、細胞、細胞断片、アプタマー、細胞溶解物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、遺伝子、遺伝子発現生成物などの生物学的実体、並びに化学元素、化合物、薬学的に活性な化合物又はそれらの代謝物、鉱物、汚染物質などの化学的実体を含むが、これらに限定されない。
【００２０】
検出用試薬は、可視化（検出）及び／又は測定を容易にするために、蛍光、発光又は比色標識で標識することもでき、それらはビオチンなどの親和性のタグ標識とさらに複合体化することもできる。このことは、検出抗体の可視化（検出）及び測定のために、蛍光、発光、又は比色標識されたストレプトアビジンを使用することを可能にする。
【００２１】
用語「検出する」及び「測定する」並びにそれらの変形体は、物の存在の同定、及び濃度、強さ、強度などの物の変化し得る特徴の評価をそれぞれ指すことを意図する。用語「分析する」及びその変形体は、そのような検出及び測定、並びに事象の他の又は異なった評価をより広く指す。
【００２２】
語句「結合部位」は、分析物との相互作用が可能な又は意図されて検出又は測定が為され得る所を指すことを意図する。典型的には、結合部位は捕捉剤を含む。順送りで語句「捕捉剤」（又は捕捉試薬）は、分析物が相互作用し得る任意の構造、化合物、システム、又はデバイスを指すことが意図される。しばしば、そのような相互作用は、構造的又は化学的相互作用を含むが、これは必須ではない。捕捉剤は、タンパク質、ホルモン、抗体、抗原、ウイルス、抗体複合体、抗体断片、ペプチド、細胞、細胞断片、アプタマー、細胞溶解物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、遺伝子、遺伝子発現生成物などの生物学的実体、並びに、化学元素、化合物、薬学的に活性な化合物又はそれらの代謝物、鉱物、汚染物質などの化学的実体を含むが、これらに限定されない。
【００２３】
語句「シグナル強度」は、捕捉剤と分析物の相互作用などによる結合部位における相互作用の測定を指すことが意図される。そのような測定は、蛍光、発光、又は比色標識などの技法の任意の数又は組合せにより、直接又は間接的に行うことができる。
【００２４】
語句「標準物質の結合曲線」は、既知の濃度における捕捉剤と分析物との結合相互作用の結合曲線を指すことが意図され、それに対して未知の濃度における捕捉剤と分析物の結合相互作用を比較することができる。語句「動的結合曲線の表示」及び「速度論的結合曲線の表示」は、捕捉剤と分析物との結合相互作用の動態又は速度論の表示を指すことが意図される。これらは、所与の分析物の希釈における特定の時点（即ち、アッセイの完結時）におけるアッセイからのシグナル強度の表示である典型的な及びより従来的な終点標準曲線とは異なる。これらは、結合アッセイのステップの全て又は一部から得られたデータを含むことができ、検出又は測定された相互作用及び／又は対応するシグナル強度が、特異的結合相互作用に帰すことができるかどうかを決定するために使用することができる。「結合曲線」又は「速度論的曲線」は、結合部位の試料及び検出用試薬に対する露出（会合）に起因して低から高へ強くなるシグナル並びに試料及び検出用試薬が存在しないときには（解離）高から低へ弱くなるシグナルを記載することができる。
【００２５】
アッセイシステム又はプラットフォーム
本発明の一部の実施形態によるアッセイシステムの構成要素は、’０４４出願に記載されている。これらは、例えば、結合部位を越える液体の移動を制御するためのデバイス及び装置を含む。これらは、例えば、陽圧又は陰圧を、それぞれ液体にかけることができるポンプ又は真空デバイスを含んでもよい。他の場合に、デバイス又は装置は、それを通って液体が毛細管作用により移動することができる毛細管又は同様な構造を含んでもよい。任意の場合に、そのようなデバイス及び装置は、液体の流れの１つ又は複数の態様、例えば液体の流速、液体の流れの持続時間、又はある量の液体が結合部位上に流される回数などの制御を可能にする。
【００２６】
上で述べたように及び下でさらに詳細に記載するように、本発明によるアッセイシステムの一部の実施形態では、試料の含有及び他のアッセイ試薬の供給の両方並びにアッセイ自体が実施される領域のためにカートリッジが利用される。したがって、そのようなカートリッジの一部の実施形態は、試料及び／又はアッセイ試薬を保持するための１つ又は複数のリザーバ部分並びにその中に及びそれを通して試料及び試薬が流され得る別のアッセイ部分を含む。図３に関して記載するように、アッセイ部分は、その上に液体が流されて、そこで標的分析物と捕捉剤とが相互作用する複数の結合部位（捕捉剤を含有する）を含む。
【００２７】
カートリッジのアッセイ部分は、標的分析物と捕捉剤の結合が検出及び／又は測定され得る少なくとも１つの場所を含み、より典型的には、捕捉剤のプリントされたスポット（又はドット）などの複数の場所がある。各プリントされたスポットは、１つ又は複数のタイプの捕捉剤を含有することができ、アッセイ部分における各プリントされたスポットは、同じ又は異なったタイプの捕捉剤を含有する。本発明の一部の実施形態では、カートリッジのアッセイ部分は、それを通して結合事象の検出／測定が為され得る透明な表面−しばしばガラス−を含む。アッセイシステムが蛍光検出デバイスを使用する場合には、励起ビームが透明な表面を通って結合部位に至り、蛍光標識された分析物又は分析物と捕捉剤の複合体を励起することができる。次に、蛍光標識された分析物又は分析物と捕捉剤の複合体による発光を、同じ又は異なった透明な表面を通して検出／測定することができる。
【００２８】
ある実施形態において、システムは、５３２ｎｍのレーザービームが焦点を結んでカートリッジのアッセイ部分の表面に入射する共焦点の進入路を使用するスキャナーを組み込む。
【００２９】
撮像は、アッセイ溶液の直ぐ下からカートリッジの底を通して遂行される。アッセイ表面は、プリントされた捕捉剤（典型的にはタンパク質又は抗体であるが、一部の実施形態では、ホルモン、ウイルス、抗体複合体、抗体断片、ペプチド、細胞、細胞断片、アプタマー、細胞溶解物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、遺伝子、遺伝子発現生成物などの他の生物学的実体、並びに化学元素、化合物、薬学的に活性な化合物又はそれらの代謝物、鉱物、汚染物質などの化学的実体であってもよい）を含有し、それらは、蛍光標識されたサンドイッチ型結合アッセイで、分析物濃度を定量的に測定するために使用される。
【００３０】
カートリッジ表面におけるアッセイから発せられた蛍光は、励起光路を逆行して集められて、一連の空間フィルター及びミラーを通して光電子倍増管（ＰＭＴ）に向けられる。システムにおける「走査」は、時間で整列された画素である高い解像度の像を発生させることができる、２軸ガルバノメーターで駆動されるミラーアセンブリー及びテレセントリックレンズシステムにより遂行されるが、他のミラー及びレンズシステムも使用することができる。ある実施形態において、システムのために許容される走査面積は２５×２５ｍｍであり、他の実施形態では、これは、減少させることも又は１００ｍｍ×１００ｍｍ以上に増大させることもできるが、しかしながら、これらの及び他の実施形態では、カートリッジのアッセイ部分は、許容される走査面積より小さいことがあり、１ｍｍ×１ｍｍ〜１００ｍｍ×１００ｍｍ以上の範囲であり得る。一部の実施形態では、１つのカートリッジ当たり利用できる４つのアッセイ部分がある。例えば、図１及び２を参照されたい。しかしながら、他の実施形態では、アッセイ部分の数が、１〜１００の範囲であることもある。
【００３１】
蛍光レーザーは、試料がアッセイ中に反復して流されるときに、カートリッジの下側を通してアッセイを走査し；時間経過を追って結合データが集められることが可能であり、高感度の速度論的結合曲線に編集される。カートリッジ上の各アッセイの結合曲線が分析ソフトウェアにより処理されて、分析物の存在及び濃度についてのデータが使用者に送達される。
【００３２】
システムの構成要素
１．検出器
ある実施形態において、検出器は、検出器を含むように組み合わされる励起光の光路及び発光の光路を含むことができる。励起光の光路は光源を含むことができ、ある実施形態において、これは、ビーム拡大器及びレーザー光源のサイズを整えて光を平行に整えるアパーチャアセンブリーにより調節された５３２ｎｍのレーザーであってもよい。
【００３３】
ある実施形態において、次に、光源は、二色性のビームスプリッター、集束レンズアセンブリー、Ｘ−Ｙ軸ガルバノメーターで駆動されるミラーアセンブリー及びテレセントリックレンズにより試料に導かれ得る。ガルバノメーターで駆動されるミラー及びテレセントリックレンズアセンブリーにより、標的試料の固定据え付けが可能になり、したがって、後処理で複数の像をアラインメントする必要がなくなる。試料の固定据え付けにより、流れ制御モジュールの試料カートリッジへのカップリングも可能になり、典型的には、高精度の流れの系の動きから来る振動によりもたらされる流体制御システムにおけるノイズが排除される。
【００３４】
ある実施形態において、検出光路は、検出器（例えば、光電子倍増管（ＰＭＴ））、帯域通過フィルター、ピンホールの開口、集束レンズ、二色性のビームスプリッター及びテレセントリックレンズを含む。そのような実施形態では、試料が光源により励起されると、試料は光子を放射して、それはテレセントリックレンズにより集められ、励起光路を逆行して二色性のビームスプリッターに導かれる。ビームスプリッターにより、発光波長が集束レンズを通過して、１点で焦点を結び、ピンホール開口を通過することが可能になる。ピンホール開口は、焦点から外れたいかなる光も排除して、それ故、検出器を事実上共焦点にする。焦点に集められた光は、次に帯域通過フィルターを通過することができ、目的の波長のみがＰＭＴと相互作用することが可能になる。次にＰＭＴ強度の値は、単画素として記録することができ、ガルバノメーターで制御されたミラーのｘ−ｙ位置に基づいて空間的に割り当てられ得る。このようにして、画素位置及び強度を含む像が作製され得る。
【００３５】
２．流れ制御モジュール
システムは、カートリッジの複数のアッセイ部分（アッセイセル）を通る液体の流れを制御するためのマイクロ流体コントローラーを組み込むことができる。アッセイカートリッジが４つのそのようなアッセイ部分（又はアッセイセル−図２を参照されたい）を備える実施形態において、マイクロ流体コントローラーは、コンピューターで制御される圧力制御器、３方弁、加圧された試料容器、８つの導入弁、４つの排出弁、及びある実施形態においては、流れを４つの排出弁から精密流れセンサーへ向けることができるマイクロマニホールドを含むことができる。次にコントローラーは、流れ事象の精密なタイミングをミリ秒まで可能にし、並びにアッセイ操作前／後でより遅くすることができる。精密流れセンサー（流路の終端にある）と対になった動的に制御される制御器（流路の開始箇所にある）は、タンデムにはたらき、流路特性に無関係な正確な流速及び流量を保証する閉じたループ流れ制御システムを作製することができる。コントローラーは、全ての弁の状態についてリアルタイムのフィードバックも使用者に提供する。流れ制御モジュールは、場合によりシステムの本体部中に組み込まれ、使用者が試料及び試薬を効率的に挿入して置き換えることを可能にするように設計することができる。ある実施形態では、流れ制御モジュールは、８つの導入弁及び４つの排出弁より多く有しても又は少なく有してもよく、弁の数はカートリッジに含まれるアッセイ部分の数に比例し、例えばある実施形態では、各アッセイ部分が２つの導入弁及び１つの排出弁を必要とする（図３を参照されたい）。
【００３６】
３．アッセイカートリッジ
図１に示したような一部の実施形態では、アッセイカートリッジ１００は、下でさらに詳細に記載するように、捕捉剤（典型的にはタンパク質又は抗体であるが、一部の実施形態では、ホルモン、ウイルス、抗体複合体、抗体断片、ペプチド、細胞、細胞断片、アプタマー、細胞溶解物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、遺伝子、遺伝子発現生成物などの他の生物学的実体、並びに、化学元素、化合物、薬学的に活性な化合物又はそれらの代謝物、鉱物、汚染物質などの化学的実体であってもよい）でプリントされて、流れチャネル及びアッセイ部分（アッセイセル）を含んで成形されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）ブロック１２に結合した処理されたガラス表面２０を含む。ＰＤＭＳは、使用され得る１つの材料にすぎず、言うまでもなく、本発明の範囲を限定すると考えるべきではない。他の適当な材料には、例えば、化学処理されたガラス、ナノ粒子で覆われたガラス、金属でコートされたガラス、他の形態の材料で処理されたガラス、炭素（全ての形態）、ケイ素、ゴム、プラスチック、金属、結晶類、ポリマー、半導体、有機材料及び無機材料が含まれる。
【００３７】
図１に示したような一部の実施形態では、アッセイカートリッジ１００は、それを通して分析物と捕捉剤の相互作用が検出／測定できる透明部分１４を有する底板１０、アッセイリザーバをＰＤＭＳブロック１２とつなぎ合わせる本体部３０及び処理されたガラス表面２０、及び場合により、本体部３０の上に上板６０をさらに含む。処理されたガラスは、表面２０のために使用され得る１つの材料にすぎず、本発明の範囲を限定すると考えられるべきではない。他の適当な材料には、例えば、ＰＤＭＳ、ナノ粒子で覆われたガラス、金属でコートされたガラス、他の形態の材料で処理されたガラス、炭素（全ての形態）、ケイ素、ゴム、プラスチック、金属、結晶類、ポリマー、半導体、有機材料及び無機材料が含まれる。
【００３８】
本体部３０は、試験試料及び／又はアッセイ試薬（検出用試薬及び場合により促進剤を含む）を保持するための複数のリザーバ４２を有するリザーバ部分４０を含むことができる。本体部３０は、複数のチャネル５２を有する輸送領域５０をさらに含むことができ、それを通して試験試料及びアッセイ試薬のある特定の量がＰＤＭＳブロック１２及び処理されたガラス表面２０に及びそこから流され得る。
【００３９】
ある実施形態では、本体部３０及びＰＤＭＳブロック１２は、成形されたか又はそうでなければＰＤＭＳ若しくは他の適当な材料、例えば、化学処理されたガラス、ナノ粒子で覆われたガラス、金属でコートされたガラス、他の形態の材料で処理されたガラス、炭素（全ての形態）、ケイ素、ゴム、プラスチック、金属、結晶類、ポリマー、半導体、有機材料及び無機材料などから構築された１つの一体化された本体部／ブロックで置き換えることができる。そのような実施形態並びに他の実施形態では、底板１０、透明部分１４及び処理されたガラス表面部分２０は、処理されたガラスであってもよく、又はある実施形態では、ナノ粒子で覆われたガラス、金属でコートされたガラス、他の形態の材料で処理されたガラス、炭素（全ての形態）、ケイ素、ゴム、プラスチック、金属、結晶類、ポリマー、半導体、有機材料及び無機材料であってもよい１枚の表面で、全て置き換えることができる。
【００４０】
またさらなる実施形態において、リザーバは、アッセイカートリッジから分離されて、接続配管を通してＰＤＭＳブロック（又は上記のような他の材料）に接続されていてもよい。そのような実施形態では、ＰＤＭＳブロックリザーバ（又は上記のような他の材料）及び処理されたガラス表面２０（又は上記のような他の材料）のみがアッセイカートリッジを形成するために必要とされる。
【００４１】
図２は、図１及び上記の他の実施形態のＰＤＭＳブロック１２及び処理されたガラス表面２０の詳細な図を示す。この実施形態では、アッセイカートリッジに備えられた４つのアッセイ部分がある。この図で、処理されたガラス表面２０上の複数の結合部位２２（又は捕捉スポット又はドット）をより容易に見ることができる。図１及び２に示されたような一部の実施形態では、各アッセイ部分２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃ、２４Ｄが、２つの導入口２６Ａ１〜２、２６Ｂ１〜２、２６Ｃ１〜２、２６Ｄ１〜２及び１つの排出口２８Ａ、２８Ｂ、２８Ｃ、２８Ｄを有し、さらに下で記載するように複数のアッセイ試薬の迅速な交換が可能である。
【００４２】
前に注意したように、処理されたガラスは、表面２０のために使用できる１つの材料にすぎず、本発明の範囲を限定すると考えられるべきではない。他の適当な材料としては、例えば、ＰＤＭＳ、ナノ粒子で覆われたガラス、金属でコートされたガラス、他の形態の材料で処理されたガラス、炭素（全ての形態）、ケイ素、ゴム、プラスチック、金属、結晶類、ポリマー、半導体、有機材料及び無機材料が含まれる。
【００４３】
前に注意したように、図１及び２に示したようなある実施形態においては、カートリッジは、４つのそのようなアッセイ部分（セル）を備えることができ、各々１セル当たり非常に多数の結合部位（捕捉スポット）が可能である（１セル当たりスポットの数は２から２０，０００を超える範囲であり得る）。結合部位又は捕捉スポットは、本明細書においては、捕捉剤の群を含有する表面上の領域を記載するために使用される。そのような捕捉スポットは、マイクロアレイプリンターデバイスを使用して、又は当業者には明らかな任意の代替法により、処理されたガラス表面２０上に置くことができる。一部の実施形態では、アッセイカートリッジは、リザーバに及びリザーバを通してピーク配管（接続配管）を使用してマルチピン接続マニホールドを通して流れ制御システムに接続されていてもよい。
【００４４】
図３は、例えば、流体制御システム２００の部分としての種々のアッセイ試薬と共に、本発明の実施形態によるカートリッジの単純化した図を示す。簡単にする目的で、カートリッジのＰＤＭＳブロック１２及び処理されたガラス表面２０のみを示す。
【００４５】
この図では、試験試料２１２及びアッセイ試薬２１４が加圧されたリザーバ（導入ウェル）２１０内に含有される。第１の導入弁２２０を開くと、試験試料２１２が、カートリッジのアッセイ部分（ＰＤＭＳブロック１２及び処理されたガラス表面２０を含む）に、試験試料が結合部位（捕捉スポット）２２上に流れるように導入される。次に排出弁２３０を開くと試験試料２１２が廃棄物チャンバー２４０に進むことが可能になる。
【００４６】
次に、導入弁２２２を開くことにより、アッセイ試薬２１４を、アッセイ部分に導入して、アッセイ試薬２１４を結合部位（捕捉スポット）２２の上に流すことができる。次に、アッセイ試薬２１４を、上記のように廃棄物チャンバー２４０に排出することができる。次に、この反復する流すプロセスを複数回繰り返すことができる。
【００４７】
アッセイ部分を出た後のある実施形態では、試料２１２及びアッセイ試薬２１４の両方が、最初に精密流れセンサーを越えて流されてから、廃棄物チャンバー２４０中に排出される。コントローラーは、流れ事象の精密なタイミングをミリ秒まで可能にして、並びにアッセイ操作前／後でより遅くすることができる。精密流れセンサー（流路の終端にある）と対になった動的に制御される制御器（流路の開始箇所にある）は、タンデムにはたらき、流路特性に無関係な正確な流速及び流量を保証する閉じたループ流れ制御システムを作製する。
【００４８】
当業者は、言うまでもなく、本発明の実施形態が複数の試験試料及びアッセイ試薬を含み得ることを認識するであろう。図３に示した実施形態は単なる例示目的である。
【００４９】
他の実施形態では、カートリッジは、受動弁を組み込むことができ、液体（試料、標識された検出用抗体、緩衝溶液その他）が、カートリッジ自体上のリザーバ中に入れられて、リザーバからカートリッジのアッセイ部分を通る液体の流れは、使い捨てカートリッジに取り付けられたシステム中に組み込まれたインターフェースを通して圧力を調節することにより制御され得る。
【００５０】
システム方法及び手順
１．アッセイプロセス
一実施形態において、各カートリッジ及び関係するアッセイのための全体の処理時間は、検出及び測定される分析物濃度に依存して２〜２００分であり得る。試料が注入されると、少なくとも１つのアッセイを越える少なくとも１種の試料の処理及び関係データの収集／処理は、完全に自動化することができる。使用者は、ただ、使用するアッセイプロトコルを選択すればよく（システムのソフトウェアインターフェースにより）、そうすれば、システムは自動的にアッセイを実行して、全ての関係データを集めて処理することができる。
【００５１】
例のプロセスを図４〜７に詳細に示す。図４は、各々複数の捕捉剤２３を含む複数の結合部位（捕捉スポット）２２を含む、アッセイカートリッジのアッセイ部分の模式図を示す。本発明の一部の実施形態は、異なった捕捉剤を含有する複数の捕捉スポットを含むことができる。他の実施形態では、各捕捉スポット２２が同じ（唯一のタイプの）捕捉剤を含んでもよく、異なった捕捉スポットが異なった又は同じ捕捉剤を含有してもよく、その結果、カートリッジのアッセイ部分に複数の捕捉スポットがあり、各々１つのタイプの捕捉剤を含有するが、多くの異なった捕捉剤が表面全体にわたる多くの異なった捕捉スポットにより表される。
【００５２】
カートリッジ表面のアッセイ部分が捕捉剤２３で適切にプリントされて封鎖されると、図５に示すように、試料は、カートリッジのアッセイ部分を越えて流されるＡ。試料が標的分析物（目的の分析物）７０を含有する場合、その分析物７０は固定化された捕捉剤２３に結合するが、試料中の他の分析物７２、７４は結合せずにカートリッジのアッセイ部分を越えてそれを通って流れるであろう。
【００５３】
図６に示したように、所定の体積の試料が、所定の時間（場合により、コンピューターソフトウェアにより制御される）流された後、検出試薬７１がカートリッジのアッセイ部分（アッセイチャンバー）を通して流されるＢ。検出試薬７１がチャンバーから試料を流出させて、捕捉剤２３により固定化された任意の分析物７０に特異的に結合する。所定の体積の検出試薬が所定の時間流された後、図５に示したように、試料が再びアッセイ部分（チャンバー）を通して流されてもよく、これらのステップは任意の回数繰り返される回路になる。結合部位（捕捉スポット）は、これらの反復する回路の間に測定装置により撮像され（可視化され）、標的分析物の捕捉剤に対する速度論的又は動的結合曲線の表示が描かれる。
【００５４】
図７に示したような本発明の一部の実施形態では、試料は、蛍光標識されたストレプトアビジン７６又は同様な化合物も含むことができる。そのような実施形態では、蛍光標識されたストレプトアビジン７６はビオチン化された検出剤２３と結合し、測定することができて試料中に存在する少なくとも１種の標的分析物７０のレベルを定量するために使用できるシグナルを生ずる。加えて、そのような実施形態では、より多くの目的の少なくとも１種の分析物（標的分析物）７０が、固定化された捕捉剤２３に結合することができ、その後の反復する流れサイクルで検出試薬が結合するための追加の部位を提供する。
【００５５】
図８〜１０は、シグナルを増幅することができる本発明による別のプロセスのステップを示す。図８においては、蛍光標識されたストレプトアビジン７６がビオチン化捕捉剤７１に結合する。ストレプトアビジンは４価であり、４分子のビオチンと結合することができる。検出試薬カクテル中にはビオチン化デンドリマー７８も存在し、それはビオチン１〜８分子／デンドリマーを含有し、蛍光標識されたストレプトアビジン７６に結合することができる。
【００５６】
図９及び１０は、追加の蛍光標識されたストレプトアビジンのビオチン化デンドリマーに対する結合が、シグナルにおける大きい増大及び大きく向上した感度及び非常に低レベルの少なくとも１種の標的分析物７０を検出する能力を生じさせることを示す。反応が進行するにつれて、蛍光標識されたストレプトアビジン及びビオチン化デンドリマーの複数の層が、分析物に依存する様式で（即ち、試料中の標的分析物７０の濃度に直接相関して）、捕捉スポット上に累積し得る。
【００５７】
この記載及び関係する図は、全プロセスをあたかも別々のステップにおけるよう簡単に説明しているが、実際には、反応にあるのは２ステップだけである。第１のステップにおいては、目的の分析物及び蛍光標識されたストレプトアビジンを含有する試料が表面全体にわたって流される。目的の分析物は、固定化された捕捉試薬に結合して、蛍光標識されたストレプトアビジンが、表面に存在する任意のビオチン化された検出試薬又はデンドリマーに結合する。反応の第２のステップでは、ビオチン化された検出試薬及びビオチン化デンドリマーが、アッセイ表面の全体にわたって流される。固定化された分析物があれば、ビオチン化された検出試薬が、これらの分析物に結合し、固定化されたストレプトアビジンがあれば、ビオチン化デンドリマーが固定化されたストレプトアビジンに結合する。これらの２ステップが所定のサイクル数繰り返されて、アッセイ表面が全てのサイクル中の各ステップの完了時に可視化（像化）される。このアッセイの枠組みの結果が、非常に低レベルの分析物を特異的に検出することができる高度に特異的で非常に感度の高いサンドイッチ免疫測定である。
【００５８】
２．アッセイの実行
本明細書で開示したシステムに基づくアッセイを実行するある実施形態において、典型的な設計要因は、アッセイのタイプ、アッセイ試薬及び濃度、カートリッジのアッセイ部分当たりのアッセイ数、並びにマイクロアレイの設計（表面における捕捉剤のパターン）である。カートリッジにおける各アッセイ部分は、同じ又は異なったアッセイについて調製することができる。加えて、各アッセイ部分（又はセル）は、別々の実験又は試料で実行することができる。例になる実験計画を下に示すが、しかしながら、これは単なる例の目的のためであり、時間、配列及び／又は下記に含まれるいくつかの若しくはより多くのパラメータの存在を変化させる他の実験計画も使用することができ、参照により本明細書に組み込まれることが注意されるべきである。
【００５９】
システムの開始試験：これは、フラッシング緩衝液でシステムをフラッシュして、システムの性能を検証する作業であるその日のプロセスの短い２〜１５分の始まりである。「試験デバイス」は、前日からシステムに接続されている。使用者は、流れの量を集めて測定し、システム性能を検証する。典型的には、流れの変動は、５％〜１０％の合否基準でおよそ１〜２％ＣＶである。しかし、これらの基準は、使用者が望むように及び／又は任意の所与のアッセイ若しくは実験に適するように場合により設定してもよい。システムの流れの試験は、コンピューターで制御される流れ制御モジュールにより自動的に実施され得る。
【００６０】
デバイス接続及び封鎖：試験デバイスを取り外して、使用者が特化したアッセイカートリッジを、本明細書で開示したシステムの台上に置いて、接続マニホールドは、カートリッジの出入り口（４つのアッセイ部分を備えるカートリッジのための例えば８つの導入口及び４つの排出口であるが、それより多いことも少ないこともある）に流れの配管を接続することができる。アッセイ部分を封鎖溶液で満たして、短い（２〜１５分）充填プロセスで空気を追い出す。一部の実施形態では、液体（試料、試薬、検出抗体、標識、緩衝液その他）を使い捨てアッセイカートリッジ内に収納されたリザーバ中に直接入れることもできるので、流れの配管がない。
【００６１】
試料の注入：封鎖溶液を試料バイアルで置き換えることができ、デバイスを通す急速な試料の注入を実施して、最大試料及び試薬濃度が流れデバイスの導入口に（配管はフラッシュされるか又は適切な場合は注入される）確実に存在するようにできる。
【００６２】
アッセイインキュベーション及びデータ収集：試料及び／又は検出試薬をアッセイ部分上に所望のインキュベーション時間の間流すプロセス。各インキュベーション時間の後、撮像事象を実施して分析物の捕捉剤への結合に起因するシグナル強度を捕らえる。多くのそのような撮像事象はアッセイ流れプロセスを通して自動的に行われ、蛍光の時間経過の複数の測定から結合曲線を描く。
【００６３】
システムのフラッシュ：試験デバイス及びフラッシング緩衝液を使用して実施される。システムのフラッシュにより流れコントローラーからアッセイ試薬を除去して、次のアッセイ実行のためにシステムを準備する。
【００６４】
３．データ収集及び分析（あるシステム実施形態について）
生データ：ある実施形態において、その最も生の形態で、データを１６ビットのグレースケールｔｉｆｆ像として集めることができる。像中の各画素は予め選択された像の解像度に対応する。データは、ＰＭＴから所望の時間間隔で瞬時に集められる。
【００６５】
時間経過データ：ある時間が経過する間のシグナル強度は、行われる処理の第１のレベルである。このタイプのデータは数通りの方法（使用者に選択される）を使用して誘導され得る。全ての場合に、それは、各アッセイについてある時間が経過する間のシグナル強度数の変動である。
【００６６】
分析物濃度の計算：アッセイに特異的な標準物質の時間経過曲線を発生させるために既知の濃度の標準物質が使用される。次に、これらの既知の標準物質に加えて本明細書で開示した速度方程式及び付属の専有のアルゴリズムを、各使用者が処理したアッセイの速度論的曲線の分析に使用することにより、各標的分析物濃度の精密な測定が達成される。
【００６７】
統計的信頼性：これは、予想される曲線に対する試料曲線に関する閾値の信頼レベルである。未知の曲線の信頼度（多重の全てのアッセイ全体にわたる）が満たされたら、アッセイインキュベーションプロセスを停止して、処理時間を最小化しながら、データ収集を最適化することができる。
【００６８】
４．詳細な分析手順
本明細書で開示したシステム及び方法から発生したデータの分析は、一部の実施形態ではプリントされ又は他の形態ではマイクロアレイ形態で配置される捕捉試薬（それは一部の実施形態では標的モノクローナル抗体である）と目的の分析物又は標的分析物（それは一部の実施形態では標的タンパク質である）との間の初期結合速度の測定に基づく。定量的分析方法は、測定された初期結合速度及び既知の標準物質からの逆算に基づく。初期結合速度は、２つの時点間のデルタ測定であり、したがって、変動し得るバックグラウンドと関係する絶対シグナル強度の結果に影響され易くないが、検出限界の決定は、変動し得るバックグラウンドのトレンドにより影響される。そういうものとして、データは、各像及び各時点における低シグナルのバックグラウンド領域からのシグナル強度を単に差し引くことにより補正することができる。
【００６９】
一部の実施形態では、「線形データ」は、本明細書で開示したシステム及び方法により生成されて、以下のように分析される。アッセイプロセス中に、時間経過像が固定された時間間隔で集められる（数秒から数十分のどこでもできる）。各像に先立って、試料の体積（流れる溶液１）、続いて検出用試薬の体積（流れる溶液２）が、システムの制御及び関係する流れカートリッジを使用して、カートリッジのアッセイ部分の上を順に通過し又は流される。アッセイ結合部位（ある実施形態では、これらはマイクロアレイスポットである）のシグナル強度は、像から抽出されて、数回の繰り返しの平均として数で表される。試料濃度は固定されたままであるので（アッセイプロセスを通じて未使用又は新鮮溶液を流すことにより）、及び捕捉試薬の表面濃度が比較的高いので（試料中の分析物濃度と比較して）、時間経過データの線形分析により勾配が得られる（シグナル／時間の単位における初速度として直接使用される）。初速度は、試料により提示される抗原の量に正比例する（より多い抗原はより大きい初速度に等しい）。撮像装置の飽和（ＰＭＴの範囲外）又は表面飽和（線形性の喪失）のいずれかを生ずる非常に高い抗原濃度の場合、線形適合は、より早期の時点でのみ行われる。中程度の及び低濃度の場合には、追加の又は全ての時点を線形適合のために使用することができる。
【００７０】
一部の実施形態では、「非線形のデータ」は、本明細書で開示したシステム及び方法により生成されて以下のよう分析される。上記の線形データに対する代替法は、典型的には、非線形のデータの発生を生ずるシグナルの促進又は増幅の形態を利用する方法である。そのような場合には、シグナルは初期には線形データの場合のように分析物の結合に依存するが、次には、促進試薬の「セット」から追加のシグナルを発生させるための触媒のように作用する（下でさらに詳細に記載する）。典型的には、促進試薬のセットは、２種の試薬、リザーバ１（チューブ１）に入れられた１種及びリザーバ２（チューブ２）中の他種を含み、促進されたシグナルが流れサイクルの反復回数及び促進試薬の増幅の性質の尺度であることを可能にする。生成した時間データに対するシグナルは、線形であれば上のように適合し、非線形であれば、それは、多項式型の方程式への適合であり、１次微分が、特定の分析時間における勾配を抽出するために使用される。どの位の長さの時間経過の結合実験が先行したかに関わらず、任意のより早期の分析時間が逆算のために使用され得る。早期の分析時間は、典型的には、より低い感度の結果を生じて、それなりに、２つの異なった分析時間を使用して高濃度分析物を低濃度分析物と同時に測定するために有用である。
【００７１】
標準化及び逆算。上記のように、初速度は、標準物質及び未知物質の両方について測定される。一般的に、未知の試料濃度は、既知の濃度の標準物質から逆算される。本明細書で開示したシステム及び方法の開発中に、分析物濃度を変えた初速度の実験による分析から、初速度は増大した濃度で結合反応の速度が最大に近づく平衡又は飽和モデルに従ったことが決定された。最大速度に大きく影響する数種のアッセイパラメータが発見されたが、任意の所与の方法について、最大速度により最高の定量可能な用量が効果的に決定される（後でこの節中で定義する）。
【００７２】
多くの酵素について、触媒作用の速度即ち速度（Ｖ）は、低めの濃度では線形様式で基質濃度と共に変化して、より高い濃度で最大に達する。１９１３年に、Ｌｅｏｎｏｒ  Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ及びＭａｕｄ  Ｍｅｎｔｅｎは、これらの速度論的特性を説明するために、ミカエリス−メンテンモデルとして知られる下の方程式で記載される簡単なモデルを提案した（Ｖｍａｘは触媒作用の最大速度を表し、Ｓは基質濃度を表し、及びＫｍはＭｉｃｈａｅｌｉｓの定数として知られる）。
速度＝（Ｖｍａｘ＊Ｓｎ）／（Ｓｎ＋Ｋｍｎ）
【００７３】
ミカエリス−メンテンモデルは、酵素に触媒される反応を記載するために開発され、そのような反応におけるＶｍａｘの観察の背後の理由付けは、平衡又は飽和に達する酵素基質複合体の形成に基づき、該モデルにより、本明細書で開示されたシステム及び方法により発生したデータも説明される。観察に対する１つの可能な説明は、溶液相の分析物が、反応又は結合事象が起こり得る前に最初に表面相の捕捉試薬と相互作用しなければならない、結合反応の固体相の性質に関する。この第１のステップは、ミカエリス−メンテンモデルの公式における酵素基質複合体の形成におそらく「相当する」ものである。この表面の会合ステップは、より高い濃度における平衡又は飽和において効力を有する。飽和又は平衡に達する反応に関するいくつかの他のモデルが、データの処理で同様に有用であることが見出された。実際、上のミカエリス−メンテンの方程式は、初速度データを適合するために使用できる１つのタイプの方程式を表すにすぎない。他の実施形態は他の同様な方程式を使用する。例として、これらに限定されないが、
ワグナーモデル：適合＝ｅｘｐ（（Ａ＋（Ｂ＊ｌｎ（ｘ）））＋（Ｃ＊（ｌｎ（ｘ）２）））
非特異的結合についての１つの部位飽和モデル：適合＝（Ｃ＋（（ＢＬｍａｘ＊ｘ）／（Ｋｄ＋ｘ）））
双曲線の平衡モデル：適合＝（Ｃ＋（ＢＬｍａｘ＊（ｌ−（ｘ／（Ｋｄ＋ｘ）））））
Ｅａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅモデル：適合＝（Ａ＋（（Ｂ＊ｘ）／（（Ｃ＊（Ｄ＋ｌ））＋ｘ）））
Ｃからの双曲線のモデル：適合＝（Ｃ＋（（Ａ＊ｘ）／（Ｂ＋ｘ）））
ミカエリス−メンテンモデル：適合＝（（Ｖｍａｘ＊（ｘｎ））／（（ｘｎ）＋（Ｋｍｎ）））
積分ミカエリス−メンテンモデル：適合＝（（ｌ／Ｖｍａｘ）＊（（Ｓ０−ｘ）＋（Ｋｍ＊ｌｎ（Ｓ０／ｘ））））
ミカエリス−メンテン定常状態モデル：適合＝（Ｖｍａｘ／（ｌ＋（Ｋｍ／ｘ）））
ミカエリス−メンテン方程式：適合＝（（ＢＬｍａｘ＊ｘ）／（Ｋｄ＋ｘ））
ＭＭＦモデル：適合＝（（（Ａ＊Ｂ）＋（Ｃ＊（ｘＤ）））／（Ｂ＋（ｘＤ）））
並びに当技術分野において知られている多くの他の同様なそのようなモデルが含まれる。
【００７４】
速度方程式自体は新規ではなく、これらが多年の間酵素型反応のために使用されてきたことは注意されるべきである。本明細書で記載される最も重要な新規性及びブレークスルーは、これらの方程式（酵素触媒作用に基づく反応方程式）の、本明細書で開示されたシステム及び方法を使用して処理されたアッセイ（典型的には生物学的アッセイ、及びある実施形態では、タンパク質に基づく生物学的アッセイ）を説明するための使用である。
【００７５】
複合体（又は単一の）試料中から標的分析物濃度を計算するそのような手法は、本明細書で開示されたシステム及び方法にとって重要な時間に基づく分析を容易にして、そのことは、順送りで単一試料から、その試料中に非常に異なった濃度で存在する異なった標的分析物濃度を正確に定量することができるシステムの独特の能力を生み出す。この理由は、非常に高い濃度で存在するこれらの標的分析物は、該アッセイプロセスで早期に検出及び測定されるが（計算される濃度）、それに対して非常に低い濃度で存在するこれらの標的分析物は、同じアッセイプロセスにおける後期（システムがこれらの比較的低濃度の分析物から発生された結合曲線を検出するとき）に検出及び測定（計算される濃度）されるからである。
【００７６】
この速度に基づく分析手法は、下でさらに詳細に記載するアッセイ内で特異的シグナルを非特異的シグナルから（標的結合を、非標的結合から）区別するシステム独特の能力も助長する。
【００７７】
５．特異的対非特異的シグナル
特異的シグナル（標的分析物の捕捉剤に対する結合からのシグナル）を、非特異的シグナル（非標的物質／分子／分析物の捕捉剤に対する結合により発生されるシグナル）から区別することは、アッセイの開発、検証及び処理の多くの領域に大きな利益をもたらす。
【００７８】
本明細書で開示されたシステム及び方法は、これらの利益を提供する。まとめると、非標的結合を標的結合から差別するために又はシグナルを標的シグナルであると検証するために、試験している試料は、標準化プロセス中に観察された結合速度／曲線の軌跡に従わなければならない。
【００７９】
勾配、及びそれ故分析物濃度は、２つのシグナル強度が測定された後に決定することができるが、そのような決定は、第３の又はそれに続くシグナルの測定の後には、特に第３の、第４の、第５の又はそれに続くシグナルが、バックグラウンドシグナルの標準偏差の少なくとも２倍の強度であれば、さらに正確である。例えば、図１１は、標的ＩＬ−１ｂ抗原（特異的分析物）に結合するＩＬ−１ｂ抗体（捕捉剤）のシグナル強度のプロットを、ストレプトアビジンに結合するＩＬ−１ｂ抗体（捕捉剤）のシグナル強度のプロット（シミュレートされた非標的結合シグナルを表す）と並べて示す。この例では、第３の測定からの非線形に加えて、第１の測定された速度はＩＬ−１ｂについて計算されたＶｍａｘの有意に外側にある。これらの観察の各々は、ストレプトアビジンシグナルに対するＩＬ−１ｂ抗体及び関係するプロットを結合部位（及びそこにある捕捉剤）への非特異的（非標的）結合事象から生じたものと分類する根拠を与える。
【００８０】
或いは、シグナルが非特異的相互作用の比較的高い濃度の結果である場合には、初速度は早期の時点で非常に高く、後期の時点でゼロに近づくことが観察されるであろう。一般的には、しかしながら、真のシグナルと真でないシグナルの区別は、未知の分析物の存在及び濃度についての所与の実験からの結合曲線と、既知の存在及び濃度を用いた標準分析物の結合曲線との比較分析から判明する。
【００８１】
特異的結合事象の非特異的結合事象からの追加の区別（真のシグナルか又は偽のシグナルか）は、以下のように行うことができる（サンドイッチ型アッセイの目的のために、特異的シグナルは、標的分析物が捕捉剤と検出用試薬との間に橋かけしたシグナルであるが、それに対して非特異的シグナルは、標的分析物以外の一部の他の物質／分子／分析物が、捕捉剤と検出用試薬との間に橋かけしたか、又はカートリッジのアッセイ部分の表面に直接粘着し、それに続いて検出試薬を付着させる及び／又は促進試薬、例えばビオチン化デンドリマー、又はストレプトアビジンをカートリッジ表面に直接付着させるかのいずれかであるシグナルであることに言及しておく）。
【００８２】
選択肢１：アッセイ実行の終了時に、試料及び検出試薬を交換して、アッセイ緩衝液及びある濃度の捕捉剤を含有するアッセイ緩衝液で置き換える。
【００８３】
選択肢２：アッセイ実行の終了時に、試料及び検出試薬を交換して、アッセイ緩衝液及びある濃度の検出試薬を含有するアッセイ緩衝液で置き換える。
【００８４】
選択肢３：アッセイ実行の終了時に、試料及び検出試薬を交換して、アッセイ緩衝液及びある濃度の少なくとも１つの標的分析物を含有するアッセイ緩衝液で置き換える。
【００８５】
上で詳細に説明した各選択肢において、これらの試薬の各々の反復する流れの数サイクルを実行して、カートリッジのアッセイ部分を撮像する。特異的結合の場合には、シグナルは減少して、したがって、この場合にはシグナル及び関係する結合曲線は標的分析物からの特異的シグナルであると推定することができる。しかしながら、シグナルが事実上非特異的であれば、その場合は、シグナルは、目的の分析物（標的分析物）の存在に依存しないので殆ど安定なままであるはずである。そのような状況では、シグナル及び関係する結合曲線は、試料中の非標的物質からの非特異的シグナルであると推定することができる。
【００８６】
別の方法を提起すると、本明細書で開示されたシステムは、シグナルをリアルタイムで検出するので、アッセイ実行の終了時に、中程度から高い濃度の特異的な何物か（上の選択肢で概略を説明した）を、カートリッジ及びシステムのリザーバ中に挿入して、カートリッジのアッセイ部分を越えて流すことができる。シグナルが減少することが観察される場合、これは、シグナルが事実上特異的である（真であり分析物による）ことをさらに示すものであり、それに対してシグナルがその強度においておおまかに一定のままにとどまっていることが観察される場合、これは観察されるシグナルが非特異的（偽）であることを示すものである。
【００８７】
特異的結合事象の非特異的結合事象からの追加の区別（真のシグナルか又は偽のシグナルか）は、以下のように行うことができる。上記のように追加の試薬を添加するよりもむしろ解離を測定するために、分析物又は試料及び／又は検出試薬を単に除去する。続いて測定された速度論的結合のサインは、シグナルが特異的結合事象又は非特異的結合事象から作製されたかどうかについてのさらなる洞察を提供する。早い且つ低いシグナル強度変化は、非特異的結合事象を示すが、それに対して遅い且つ高いシグナル強度変化は、特異的結合事象を示す。非特異的結合と特異的結合の間のこの「解離速度」の差は、前に記載した「会合速度」の差（シグナル強度の低い方から高い方への展開よりむしろ高い方からから低い方への）を反映する。会合速度と解離速度は異なり得るので、この手法は、特異的結合事象を非特異的結合事象及び関係するシグナルから区別するための、前に記載した方法を補完する。
【００８８】
アッセイにおいて、非特異的（非標的）結合を、特異的（標的分析物）結合相互作用に対して区別して、特異的成分と非特異的成分の両者を混合することにより形成されるシグナルをさらに調整して補正するさらなる手法及び方法は、カートリッジのアッセイ部分に含有される対照スポットの使用に関する。最も一般的なタイプのバックグラウンドシグナルは異好性の抗体により惹起され、これらはヒト血清試料中で見出される本質的に抗種抗体であり、大部分のこれらの血清試料は、関節リウマチ及び過敏性腸症候群及び同様なそのような状態などの自己免疫患者に由来する。これらの異好性の抗体は、捕捉物と検出抗体の間を架橋させることができ、分析物に依存する（即ち、標的分析物濃度に基づく）と思われるが、本当はそうでないシグナルを生ずる。
【００８９】
少なくとも１つのアッセイで使用される捕捉剤（この例では捕捉抗体）と同じ種であるが、アッセイで測定される標的分析物のいずれにも向けられていない抗体（ヤギ、ウサギ、マウス、その他）の混合物を含有する「陰性対照スポット」を含むことにより、本明細書で開示されたシステムは、この「陰性対照スポット」が試料に依存する様式でシグナルを生ずるので、異好性の抗体を含有する試料を検出することができる。したがって、この「陰性対照スポット」からのシグナルは、存在する異好性抗体の「濃度」に適応して分析物に特異的なスポットにおけるシグナルを調整し、このようにして、標的分析物濃度のより正確な測定を提供するために使用することができる。さらに、異好性の抗体を含有する試料は、この新規な方法を使用して容易に同定され得るので、そのような試料は定量プロセスにおいてより高いレベルの不確かさを有すると「旗を上げる」ことができる。
【００９０】
６．促進剤法
本発明の一部の実施形態では、アッセイ感度及び動的範囲を増大するための促進試薬の意図的使用により、非線形の速度データを得ることができ、所与のアッセイプロトコルのために特徴的であることができる。例えば、抗原と捕捉剤の結合から生ずるシグナル強度を促進又は増幅する促進試薬が実行され得る。
【００９１】
促進剤は、典型的には２種の試薬を含み、結合した分析物の上に繰り返し通される。第１の試薬は、分析物及び／又は検出用試薬及び／又は他の促進試薬と相互作用することができる。第２の促進試薬は、第１の促進試薬と相互作用して、促進剤のみの試薬の二次ネットワークを生成し、その濃度が分析物濃度を直接反映する。これらのタイプの試薬の例として；試薬１：ストレプトアビジン、アビジン、色素標識型のストレプトアビジン、アビジン；試薬２：二量化ビオチン分子、ビオチンで部分的に若しくは完全に標識されたＰＡＭＡＭデンドリマー、又はビオチン−アビジンネットワークを形成し得る任意のビオチンを含有する分子若しくは高分子が含まれるが、これらに限定されない。さらに広く、促進剤は：ビオチン化タンパク質、ビオチン化抗体、ビオチン化ペプチド、ＤＮＡのビオチン化ストランド、ビオチン化デンドリマー、抗種抗体、及び分析物とは独立した様式で捕捉された抗体と検出種とを架橋させることができる任意の活性物質を含むことができるが、これらに限定されない。
【００９２】
シグナル強度のこの促進又は増幅は、したがって、第１の及び第２の液体（試料及び試薬）の反復する流れの数の関数である。生じたデータは、非線形であれば、多項方程式に適合させることができ、その１次微分は、特定の時点における結合曲線の勾配を計算するために使用することができる。最も重要な特徴は、標準化及び未知試料の分析中の試料の初速度又は勾配の矛盾のない決定である。加えて、結合曲線の線形部分は、結合速度を計算するために利用することができる。
【００９３】
７．典型的なアッセイパラメータ
本明細書で開示されたシステム及び方法は、アッセイの処理及び関係するアッセイデータの発生を可能にする。データを例示して提示するために使用される典型的なアッセイパラメータは、以下を含むがこれに限定されない。
【００９４】
最少検出可能用量（ＬＤＤ）：６０〜９０％の信頼度でバックグラウンドシグナルを超えて観察され得る分析物の最低の濃度と定義される。ＬＤＤは、初速度及びそれに続いて、バックグラウンドシグナルの平均を標準偏差の１倍だけ超えるシグナル又は測定されたゼロ用量シグナルを丁度超えるシグナルのいずれかと関係する逆算された濃度として計算することができる。バックグラウンドシグナルは、分析物試料及び／又は検出試薬が流れる前に結合部位から得られたシグナル又は分析物試料及び／又は検出試薬が流れた後でさえ典型的には非常に低いシグナル強度を示す結合部位間の領域から得られたシグナルに基づいてもよい。選択された方法に関わらず、ＬＤＤは、典型的には、ゼロでない最低の分析物濃度で観察されたシグナル強度の所与の複数倍（場合により３倍）である値を超えないように設定される。ＬＤＤは、既知の標準物質の濃度をＬＤＤで実行して回収率（パーセント）を計算することにより検証することができる。
【００９５】
最少定量可能用量（ＬＱＤ）：９０〜９５％の信頼度でバックグラウンドシグナルを超えて観察され得る分析物の最低の濃度として定義される。ＬＱＤは、初速度及びそれに続いて、バックグラウンドシグナルを超える標準偏差の２倍又は測定されたゼロ用量シグナルの２倍のいずれか（どちらも最少の感知されるＬＱＤを与える）であるシグナルと関係する逆算される濃度として計算することができる。再言すると、バックグラウンドシグナルは、分析物試料及び／又は検出試薬が流れる前の結合部位から又は結合部位と関係しない領域から得られるシグナルに基づいてもよい。バックグラウンドシグナルの標準偏差は、アッセイ実行の終了時に取られる５つのシグナル強度から計算することができる。標準偏差を合計インキュベーション時間により除して濃度単位で初速度及び関係するＬＱＤを決定する。ゼロ用量法が使用される場合、ゼロ用量で観察された速度の２倍に等しい値を使用することができる。選択された方法に関わらず、ＬＱＤは、測定されたゼロでない最低の標準物質濃度の３倍である値を超えないように設定される。ＬＱＤは、既知の標準物質の濃度をＬＱＤで実行して回収率（パーセント）を計算することにより検証することができる。
【００９６】
最高定量可能用量（ＨＱＤ）：計算された最大速度又は触媒作用の速度、Ｖｍａｘ（前に開示した）より５％下であるが、典型的には最高の測定された標準物質の濃度を超えないと定義される。ＨＱＤは、既知の標準物質の濃度をＨＱＤで実行して回収率（パーセント）を計算することにより検証することができる。
【００９７】
動的範囲：アッセイ中に定量され得る高い方から低い方への濃度範囲。高い終端としてＨＱＤにより及び低い終端としてＬＱＤにより定義される。
【００９８】
データの変動性／精度：本質的に同じ実験条件で時間枠を変えて実施される実験について測定されるシグナル強度の固有の変動性。分析物定量の実験内及び実験間の変動（ＣＶ）は、ＬＤＤ、ＬＱＤ、及びＨＱＤを示す複数の実験により受動的に得られる。試薬は一定に保たれて、スポット間、実験間（日内）、アッセイセル間、カートリッジ間、及び日間の変動を生ずる。
【００９９】
実施例の実験計画、実行及びデータ
本項は、本明細書で開示したシステムに基づいてアッセイを実行するための１つの可能な手法をまとめて、一部の例のデータも組み込む。
【０１００】
概要：この例の実験手法は、本明細書では、「リアルタイムのＥＬＩＳＡ」又は「リアルタイムのタンパク質定量」と称する。リアルタイムのＥＬＩＳＡは、標準的な市販のＥＬＩＳＡキット並びに本明細書で開示されたシステム及び方法に再構成された試薬を使用して、比較の基準データ、加えて本明細書で開示したシステム及び方法によってのみ入手できる補完データを提供するので、優れた説明になる。
【０１０１】
リアルタイムのＥＬＩＳＡの方法：典型的なＥＬＩＳＡキットは、以下の試薬で完全になる：Ａ）捕捉抗体（標的に特異的）、Ｂ）タンパク質／抗原標的（既知の濃度の標準物質として）、Ｃ）標識された二次抗体（ビオチンで標識された標的に特異的）。典型的には、ＥＬＩＳＡアッセイは、ビオチンを別の酵素（ＳＡ−ＨＲＰ）とさらに反応させて、ＨＲＰの色素基質に対する触媒作用によってシグナルが発色する追加のステップ（「酵素の連結」）を含む。
【０１０２】
リアルタイムのＥＬＩＳＡでは、捕捉抗体（試薬Ａ）が、プリントされて（アレイされて）又は他の方法で、本明細書で開示した流れカートリッジ上に置かれる。ＥＬＩＳＡアッセイのように、リアルタイムの方法では、既知の濃度の標準物質としてタンパク質／抗原標的（試薬Ｂ）が使用される。ＥＬＩＳＡアッセイとは異なって、二次抗体（試薬Ｃ）が、選択されたストレプトアビジン色素試薬（ＳＡ−Ｃｙ３又は等価物）との組合せで使用されて、捕捉／測定された抗原標的からシグナルを発色させる。２つの流れ方法（２つの流れチャネルを通る試薬及び試料の反復する流れを含む）では、抗原標的とＳＡ−色素が組み合わされて、流れチャネル２（リザーバ２）に入れられ、二次抗体が流れチャネル１（リザーバ１）に入れられる。プリントされた捕捉抗体上のチャネル１とチャネル２の順に繰り返す流れが、抗原標的濃度を定量するために使用されるリアルタイムのシグナルを発生させる。
【０１０３】
１．実験
本明細書で開示されたシステム及び方法のこの実施形態では、３連アッセイが、３種のヒトの分析物：Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１ｂ）、及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）について試験するために使用された。任意の他の分析物及びそれらの任意の数が使用されてもよいが、ここで使用される３種は、アッセイのプロセス、システム、方法及びデバイスを例示する例としてのみ含まれる。３連アッセイの効力及び正確さを試験するために計画された研究が、下記の研究計画並びに関連する手順及びシステム情報で実施された。
【０１０４】
各カートリッジは、ＣＲＰ、ＩＬ−１ｂ及びＩＬ−６の各々のための結合部位を有するアッセイ部分と使用される試験試料及び種々の緩衝液及び試薬を含有するためのリザーバ部分とを備えた。
【０１０５】
これらの結合部位は、既知の濃度及び量でアッセイ部分にプリントされた又は他の方法で適用された捕捉剤を含む。この場合に、捕捉剤は、ヒトＣＲＰ、ＩＬ−６、及びＩＬ−１ｂの分析物に対する既知の抗体であった。ここで、多くの、しかし全てではない実施形態に典型的であるように、カートリッジは、各試料が試験されたときに予測可能な結果を例証として挙げることを意図される陽性の対照及び陰性の対照も含んだ。さらに、システムに組み込まれた対照の特徴は、適当な試薬がほぼ正確な濃度で添加されたことを保証した。
【０１０６】
カートリッジは、最初に各分析物について標準物質の結合曲線を用意するために使用された。実用では、そのような標準物質の結合曲線は、提供されるか又は別に入手することもできる。各分析物について、逐次希釈を既知の濃度の標準物質から調製して、分析物を含有しない「ゼロ用量」試料と一緒に分析した。試料希釈物を、別のリザーバ内に含有された他の必要な緩衝液、試薬、その他と共にカートリッジの試料リザーバに加えた。いくつかの場合に、カートリッジは、複数の試料リザーバを備えることができ、異なった希釈の試料又は異なった試料を同じカートリッジを使用して分析できる。
【０１０７】
３連の標準物質の結合曲線を作製するときに、試料の検出は、８つ（７つの試料希釈物及び１つのゼロ用量）濃度の各々について３連で実施した。この研究においては、標識されていない分析物を含有する試料の体積を、最初に試料リザーバ部分からカートリッジのアッセイ部分を通して流し、続いて検出標識を含有する検出用試薬の体積を流した。蛍光検出標識をこの研究で使用したが、前に注意したように、これは、本明細書で開示したシステム及び方法を使用する実験の１つを例示する例にすぎず、他の検出標識及び対応する検出デバイスを使用することもできる。
【０１０８】
検出用試薬を流した後、検出デバイス、ここでは蛍光検出器がアッセイ部分中で検出標識の存在を検出して、シグナル強度を撮像により記録する。前に、並びに’０４４出願でより詳細に記載したが、当業者には明らかであるように、蛍光検出器は、検出標識を特定の波長で励起するための励起装置、通常はレーザーを含む。そのような励起に応答して、検出標識が異なった波長で蛍光を発し、そのシグナル強度が測定される。
【０１０９】
２．データ
図１２〜１４は、ＩＬ−６、ＣＲＰ、及びＩＬ−１ｂのそれぞれについて標準物質の結合曲線のプロットを示す。結合曲線は、示したように、個々のシグナル強度に適合する。各結合曲線の初速度は、生じた結合曲線の線形部分の勾配から計算した。特性結合曲線が非線形の場合には、より高次の速度方程式又は所与の時間における多項式の微分を、反応の全体速度を決定するために使用することができる。各標準物質の濃度について、特定の勾配（又は初速度）を決定した。それに続く濃度データに対する初速度は、酵素触媒作用を記載する方程式（その様式は前に開示した）に適合した。標準化に続いて、未知の勾配（又は初速度）を速度方程式及び適合に基づく濃度に逆算することができる。
【０１１０】
各濃度標準の少なくとも３回の実行を使用して一致する標準曲線を作製することが好ましい。方法の精度は、繰り返し実行して、初速度、逆算濃度、又は回収率（パーセント）のいずれかから評価することができる。方法の正確さは、逆算濃度又は回収率（パーセント）を見て、濃度範囲全体にわたって評価することができる。表１は、実施例の実験からのデータのまとめである。
【表１】
2020098202.tif 000003
［発明の項目］
［項目１］
カートリッジデバイスと、測定デバイスとを備えるアッセイシステムであって、
前記カートリッジデバイスが、
１種以上の液体を保持するための１つ以上のリザーバ部分と、
前記１つ以上のリザーバ部分からの前記１種以上の液体を受けるための１つ以上のアッセイ部分であり、前記１つ以上のリザーバ部分からの前記１種以上の液体が該アッセイ部分の上に繰り返し（２回以上）流され得る複数の結合部位を有する、１つ以上のアッセイ部分と
を含み、
前記測定デバイスが、前記１種以上の液体中の１種以上の分析物の複数の結合部位への結合を測定するためのものである、アッセイシステム。
［項目２］
前記カートリッジデバイスが受け入れられたり取り出されたりするインターフェースであって、前記１つ以上のリザーバ部分から前記１つ以上のアッセイ部分を通る前記１種以上の液体の流れ又は移動を制御するための装置を含む、インターフェースをさらに備える、項目１に記載のアッセイシステム。
［項目３］
前記１種以上の液体の流れを制御するための前記装置がコンピューター制御され、該装置が、以下の事項の少なくとも１つ以上、すなわち
前記１つ以上のアッセイ部分を越える前記１種以上の液体の流速、
前記１つ以上のアッセイ部分を越える前記１種以上の液体の流れの持続時間、
ある量の前記１種以上の液体が、前記１つ以上のアッセイ部分の上に流される回数
の１つ以上を独立に制御することができる、項目２に記載のアッセイシステム。
［項目４］
前記インターフェースが、前記１つ以上のアッセイ部分から前記１種以上の液体を取り出す又は流出させるための装置を備える、項目３に記載のアッセイシステム。
［項目５］
前記１種以上の液体が、蛍光標識、発光標識、及び比色標識からなる群から選択される１種以上の標識を含み、
前記測定デバイスが、蛍光測定装置、発光測定装置、及び比色測定装置からなる群から選択される、項目１に記載のアッセイシステム。
［項目６］
前記測定デバイスが、コンピューター制御下で、レーザー又は他の形態の標識刺激を、前記カートリッジデバイスの前記１つ以上のアッセイ部分に向けることができるシステムであって、続いて蛍光、発光又は比色シグナルの検出及び／又は測定を実施できるシステムに構成されている、項目５に記載のアッセイシステム。
［項目７］
前記１種以上の液体が、検出、測定及び／又は分析しようとする１種以上の分析物を含有し得る、項目１に記載のアッセイシステム。
［項目８］
前記カートリッジデバイスの前記アッセイ部分中の結合部位からのシグナルの複数の時系列測定がコンピューター制御下で実施され、生じたシグナルが、前記１つ以上のアッセイ部分中の複数の結合部位の１つ又は複数に結合するこれらの分析物の動的又は速度論的結合曲線の表示を生成するために使用されることをさらに含む、項目１に記載のアッセイシステム。
［項目９］
前記インターフェースが、前記１つ以上のアッセイ部分を越える前記１種以上の液体の流速及び持続時間を制御する可変圧力（陽圧及び／又は陰圧）を提供する、項目２に記載のアッセイシステム。
［項目１０］
前記１つ以上のアッセイ部分中における複数の結合部位の１つ又は複数に結合する１種以上の分析物の１つ以上の結合曲線の表示を分析して、前記１種以上の分析物について該分析を既知の標準物質の時間経過（速度論的）結合曲線と比較して、液体中の前記１種以上の分析物の存在及び／又は濃度を決定するためのコンピューターソフトウェアをさらに備える、項目８に記載のアッセイシステム。
［項目１１］
前記１つ以上のリザーバ部分が、該リザーバ中の液体を封じる薄い膜により覆われている、項目１に記載のアッセイシステム。
［項目１２］
検出用試薬に対する追加の結合部位を提供して、蛍光、発光又は比色シグナルの強度の増大を促進及び／又は増幅することを助長する１種以上の促進剤分子又は実体を、前記液体の１種が含有する、項目１に記載のアッセイシステム。
［項目１３］
前記１種以上の促進剤分子又は実体が、ストレプトアビジン、アビジン、色素標識型のストレプトアビジン、アビジン；二量化ビオチン分子、ビオチンで部分的に若しくは完全に標識されたＰＡＭＡＭデンドリマー、又はビオチン−アビジンネットワークを形成し得る任意のビオチンを含有する分子若しくは高分子、ビオチン化タンパク質、ビオチン化抗体、ビオチン化ペプチド、ＤＮＡのビオチン化ストランド、ビオチン化デンドリマー、抗種抗体、及び分析物とは独立した様式で捕捉された活性物質と検出試薬とを架橋させることができる任意の活性物質からなる群から選択される、項目１２に記載のアッセイシステム。
［項目１４］
増幅の効果が、少なくとも１種の促進剤、少なくとも１種の分析物及び少なくとも１種の検出用試薬の循環的処理によって得ることができ、一部の促進剤が、一部の検出試薬に結合して、さらなる検出試薬が結合する多数の追加の部位を提供することにより、促進されたシグナル効果がもたらされる、項目１２に記載のアッセイシステム。
［項目１５］
結合部位が、以下の実体の１つ又は複数、すなわち、
タンパク質、ホルモン、抗体、抗原、ウイルス、抗体複合体、抗体断片、ペプチド、細胞、細胞断片、アプタマー、細胞溶解物、分画された細胞溶解物、分画された細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、遺伝子、遺伝子発現生成物などの生物学的実体と、
化学元素、化合物、薬学的に活性な化合物若しくはそれらの代謝物、鉱物、又は汚染物質などの化学的実体と
の１つ又は複数を含有する、項目１に記載のアッセイシステム。
［項目１６］
動的又は速度論的結合曲線の表示が、１種以上の標的分析物濃度を計算するために使用される、項目１０に記載のアッセイシステム。
［項目１７］
動的又は速度論的結合曲線の表示が、結合部位内における標的分析物と捕捉剤との特異的相互作用から生ずるシグナルを、非特異的相互作用から生ずるシグナルから区別するために使用される、項目１０に記載のアッセイシステム。
［項目１８］
項目１５に記載のアッセイシステムの使用であって、
時間依存性の結合曲線及び関係する速度の分析による流体中の分析物濃度の決定は、分析物の超高濃度（例えば５００，０００ｐｇ／ｍＬを超える）と同じ試験及び同じカートリッジで、分析物の超低濃度（例えば１０ｐｇ／ｍＬ未満）を流体から検出及び／又は測定することを可能にし、該決定は、超高濃度分析物の結合曲線の分析によりアッセイプロセスにおける初期（例えば最初の２０分以内）に達成され、一方、これらの分析対象の結合曲線がシステムで見える場合に、超低濃度分析物は、アッセイプロセスの後期（例えば３０分後）に検出／測定される、使用。
［項目１９］
項目１５に記載のアッセイシステムを使用して分析物濃度を計算する方法であって、
各結合部位の結合曲線の勾配、又は非線形のデータの場合には特定の分析時間における勾配（１次微分又は接線）を計算することにより結合速度のデータ（初速度）を得て、次にその結合速度のデータを酵素触媒作用型の反応方程式に適用して、これらの分析物のための前もって又は同時に開発された既知の標準物質に関する速度に基づく結合曲線と比較する、方法。
［項目２０］
項目１５に記載のアッセイシステムを使用して結合部位中における標的分析物の捕捉剤に対する特異的結合から非特異的結合を区別する方法であって、
結合曲線の形状が、観察された結果又はシグナルが特異的捕捉剤の標的分析物に対する結合事象の結果であるか又は捕捉剤の１種以上の非標的分析物に対する非特異的相互作用の結果であるかを知るために使用される、方法。
［項目２１］
特異的結合と非特異的結合との区別が、選択された結合部位の初期結合速度（最初の２又は３回の検出／測定事象から計算される）を、その後の検出又は測定事象から（３又は４回の検出若しくは測定後、及び／又は１０〜１５分後の検出又は測定事象から）計算された結合速度と比較することにより行われ、３又は４回の事象後、及び／又は１０〜１５分後の検出又は測定事象の後に変化する（非線形になる）結合速度が、非特異的結合を表している可能性が高い、項目２０に記載の方法。
［項目２２］
項目１５に記載のアッセイシステムを使用して結合部位中における標的分析物の捕捉剤に対する非特異的結合から特異的結合を区別する方法であって、
シグナルが非特異的相互作用の比較的高い濃度の結果である場合に、初速度が早期の時点で非常に高く、後期の時点でゼロに近づくことが観察される、方法。
［項目２３］
項目１５に記載のアッセイシステムを使用して結合部位中における標的分析物の捕捉剤に対する特異的結合から非特異的結合を区別する方法であって、
特異的結合のシグナルと非特異的結合のシグナルとの区別が、未知の分析物の存在及び濃度を用いた所与の実験からの結合曲線と、既知の存在及び濃度を用いた標準分析物の結合曲線との比較分析により達成される、方法。
［項目２４］
項目１５に記載のアッセイシステムを使用して結合部位中における標的分析物の捕捉剤に対する特異的結合から非特異的結合を区別する方法であって、
アッセイ実行の終了時に、試験試料及び検出試薬を、ある濃度の捕捉剤を含有する第１のアッセイ緩衝液及び第２のアッセイ緩衝液で置き換えるステップ、又は
アッセイ実行の終了時に、試験試料及び検出試薬を、ある濃度の検出試薬を含有する第１のアッセイ緩衝液及び第２のアッセイ緩衝液で置き換えるステップ、又は
アッセイ実行の終了時に、試験試料及び検出試薬を、ある濃度の少なくとも１つの標的分析物を含有する第１のアッセイ緩衝液及び第２のアッセイ緩衝液で置き換えるステップと、
第１のアッセイ緩衝液及び第２のアッセイ緩衝液の反復する流れを数サイクル実行するステップと、
カートリッジのアッセイ部分を撮像するステップと
を含み、
特異的結合であれば、シグナルが減少するため、その場合、シグナル及び関係する結合曲線が標的分析物からの特異的シグナルであると推定でき、
シグナルが事実上非特異的であれば、その場合、シグナルが目的の分析物（標的分析物）の存在に依存しないので実質的に安定なままであり、シグナル及び関係する結合曲線が、試料中の非標的物質からの非特異的シグナルであると推定できる、方法。
［項目２５］
項目１５に記載のアッセイシステムを使用して結合部位中における標的分析物の捕捉剤に対する特異的結合から非特異的結合を区別する方法であって、
非特異的シグナルが捕捉物と検出抗体との異好性抗体の架橋により生ずる場合について、少なくとも１つのアッセイで使用される捕捉剤（この例では捕捉抗体）と同じ種であるが、少なくとも１つのアッセイで測定される標的分析物のいずれにも向けられていない抗体（ヤギ、ウサギ、マウス、その他）の混合物を含有する「陰性対照」スポット（結合部位）が、カートリッジのアッセイ部分に加えられ、そして
どの試料が異好性の抗体を含有するかを、「陰性対照スポット」が試料に依存する様式でシグナルを生じるか否かの観察から推定して、ここで生じるのであれば、該シグナルが非特異的成分を含むと考え、又は
「陰性対照スポット」からのシグナルを使用して分析物に特異的なスポット（結合部位）におけるシグナルを調整して、存在する異好性の抗体の「濃度」を考慮に入れ、したがって、標的分析物濃度のより正確な測定を提供する、方法。
［項目２６］
項目１５に記載のアッセイシステムを使用して、薬剤開発、薬剤発見、診断の又は他の用途のための新しい候補バイオマーカーを発見する方法であって、
各結合部位を特異的対非特異的結合シグナルについて分析し、特異的シグナルをもたらす結合部位のみが、追加の分画及び／若しくは質量分析法又はどの分析物がこれらの結合部位に存在する（により捕捉された）かを確認するために使える別の技法によりさらに分析される、方法。
［項目２７］
結合部位が、分画された細胞溶解物、組織又は他の生物学的試料を含有し、特定の疾患又は状態を有する１名又は複数の対象から採取され、アッセイ中に処理される流体の１つが、健常な対照又は前記特定の疾患又は状態を有する対象のいずれか由来であり、
健常な対照からの流体で実行したアッセイからのデータが、前記特定の疾患又は状態を有する対象からの流体で実行したアッセイからのデータと比較されて、特定の疾患又は状態を有する対象からの流体で特異的結合のシグナルを示し、健常な対照からの流体で特異的結合のシグナルを示さない上記の結合部位が、その後の分画及び／若しくは質量分析法又は前記特異的結合のシグナルを生じさせる候補バイオマーカーを単離して同定する他の分析手順のいずれかによりさらに分析される、項目２６に記載の方法。
［項目２８］
流速が、カートリッジの出口又は該出口付近にあるカートリッジの前記アッセイ部分に続く流速センサーからのフィードバックに基づいて圧力を動的に調整することにより制御され得る、項目１５に記載のアッセイシステム。
［項目２９］
レーザー又は他の標識刺激／相互作用プロセスが作用しておらず、使用者が流体の移動を見て、カートリッジが、適切に流れていること及び泡又は他の可視的汚染物質のないことを視覚的に確認することを可能にするのに十分透明である場合に、前記カートリッジが後方から照明され得る、項目１５に記載のアッセイシステム。
［項目３０］
取り外し可能な廃棄物容器が、カートリッジにより処理された全ての流体を集めるシステムに組み込まれていてもよく、前記廃棄物容器が満杯に近く空にすべきときに使用者に知らせるセンサーを備えていてもよい、項目１５に記載のアッセイシステム。
［項目３１］
取り外し可能なタブレットがアッセイを遂行してモニターするために遠隔で使用できるように、取り外し可能なタブレットコンピューターが、アッセイを設定して遂行する指示を提供して、分析及び結果の詳細を提供するユーザーインターフェースとして使用される、項目１５に記載のアッセイシステム。
［項目３２］
着色光がユーザーインターフェース及びシステム自体の両方で使用されて、アッセイを設定して遂行するために関係するステップを通して使用者を導く、例えばインターフェースがカートリッジの視覚的表示を示して、使用者に前記リザーバが緑色（又は他の色）の光等で点灯されたときに、流体１をリザーバ１に挿入するように依頼する、項目１５に記載のアッセイシステム。
［項目３３］
項目１５、２８〜３２のいずれか一項に記載のアッセイシステムが実験室、介護の近く又は介護環境の場で診断用のバイオマーカーの検出及び測定のために使用される、項目１５、２８〜３２のいずれか一項に記載のアッセイシステムの使用。
［項目３４］
流体用のカートリッジを受けるための受け部であって、前記カートリッジは、前記カートリッジ中の１つ以上のリザーバからの１種以上の流体の流速を制御するためのインターフェースを有する、受け部と、
流体を含有する１つ又は２つ以上のリザーバを有する流体用のカートリッジであって、前記流体の１つ以上は１種以上の標的分析物を含有し得る分析しようとする流体であり、１つ以上の前記流体が蛍光、発光又は比色標識を含有し、該カートリッジはさらに、１種以上の流体をコンピューター制御下で該カートリッジの１つの区画から別の１つ以上の区画へ移すことができる流体チャネルを備え、該カートリッジのアッセイ部分は、１種以上の特異的捕捉剤を各々含有する２箇所以上の結合部位のアレイを備える、カートリッジと、
蛍光又は発光又は比色標識と相互作用して及び／又は刺激して、蛍光又は発光又は比色シグナルの強度を、各々のそのような部位において時系列で測定するためのデバイスと、
そのような時系列の測定を取り入れて、結合部位中における非標的物質／分子／分析物と捕捉剤又は他の物質との間の動的又は速度論的結合曲線の表示を作製するためのデバイスと
を具備するシステム。
［項目３５］
前記リザーバが、該リザーバ中の流体を封じる薄膜により覆われて、該薄膜が皮下注射用の針又は類似のデバイスにより穴を開けられて、該リザーバからの流体を添加又は引き出しが可能である、項目３４に記載のシステム。
［項目３６］
流体の１種が、１種以上の促進剤分子又は実体を含有し、検出用試薬に追加の結合部位を提供して、蛍光、発光又は比色シグナルの強度の増大を促進し、及び／又は増幅することを助長する、項目３４に記載のシステム。
［項目３７］
前記１種以上の促進剤分子又は実体が、ストレプトアビジン、アビジン、色素標準型のストレプトアビジン、アビジン；二量化ビオチン分子、ビオチンで部分的に若しくは完全に標識されたＰＡＭＡＭデンドリマー、又はビオチン−アビジンネットワークを形成し得る任意のビオチンを含有する分子若しくは高分子、ビオチン化タンパク質、ビオチン化抗体、ビオチン化ペプチド、ＤＮＡのビオチン化ストランド、ビオチン化デンドリマー、抗種抗体、及び分析物とは独立した様式で捕捉された活性物質と検出試薬とを架橋させることができる任意の活性物質を含む群から選択される、項目３６に記載のシステム。
［項目３８］
増幅の効果が、少なくとも１種の促進剤、少なくとも１種の分析物及び少なくとも１種の検出用試薬の循環的処理によって得ることができ、一部の促進剤が、一部の検出試薬に結合して、さらなる検出試薬が結合する多数の追加の部位を提供することにより、促進されたシグナル効果がもたらされる、項目３６及び３７に記載のシステム。
［項目３９］
結合部位が、以下の実体の１つ又は複数、すなわち
タンパク質、ホルモン、抗体、抗原、ウイルス、抗体複合体、抗体断片、ペプチド、細胞、細胞断片、アプタマー、細胞溶解物、分画された細胞溶解物、分画された細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、遺伝子、遺伝子発現生成物などの生物学的実体と、
化学元素、化合物、薬学的に活性な化合物若しくはそれらの代謝物、鉱物、又は汚染物質などの化学的実体と
の１種又は複数を含有する、項目３４〜３８のいずれか一項に記載のシステム。
［項目４０］
動的又は速度論的結合曲線の表示が、１種以上の標的分析物濃度を計算するために使用される、項目３９に記載のシステム。
［項目４１］
動的又は速度論的結合曲線の表示が、結合部位中における標的分析物と捕捉剤との特異的相互作用から生ずるシグナルを、非特異的相互作用から生ずるシグナルから区別するために使用される、項目３９に記載のシステム。
［項目４２］
項目３９に記載のシステムの使用であって、
時間依存性の結合曲線及び関係する速度の分析による流体中の分析物濃度の決定は、分析物の超高濃度（例えば５００，０００ｐｇ／ｍＬを超える）と同じ試験及び同じカートリッジで、分析物の超低濃度（例えば１０ｐｇ／ｍＬ未満）を流体から検出及び／又は測定することを可能にし、該決定は、超高濃度分析物の結合曲線の分析によりアッセイプロセスにおける初期（例えば最初の２０分以内）に達成され、一方、これらの分析対象の結合曲線がシステムで見える場合に、超低濃度分析物は、アッセイプロセスの後期（例えば３０分後）に検出／測定される、使用。
［項目４３］
項目３９に記載のシステムを使用して分析物濃度を計算する方法であって、
各結合部位の結合曲線の勾配、又は非線形のデータの場合には特定の分析時間における勾配（１次微分又は接線）を計算することにより結合速度のデータ（初速度）を得て、次にそのデータを酵素触媒作用型の反応方程式に適用して、これらの分析物のために前もって又は同時に開発された既知の標準物質に関する速度に基づく結合曲線と比較する、方法。
［項目４４］
項目３９に記載のシステムを使用して結合部位中における標的分析物の捕捉剤に対する特異的結合から非特異的結合を区別する方法であって、結合曲線の形状は、観察又は測定されたシグナルが特異的捕捉剤の標的分析物に対する結合事象の結果であるか又は捕捉剤の１種以上の非標的分析物に対する非特異的相互作用の結果であるかを知るために使用される、方法。
［項目４５］
特異的結合と非特異的結合との区別が、選択された結合部位の初期結合速度（最初の２又は３回の検出又は測定事象から計算される）を、その後の検出又は測定事象から（３又は４回の後、及び／又は１０〜１５分後の検出／測定事象から）計算された結合速度と比較することにより行われ、３又は４回の事象後、及び／又は１０〜１５分後の検出事象後に変化する（非線形になる）結合速度が、非特異的結合を表している可能性が高い、項目４４に記載の方法。
［項目４６］
項目３９に記載のシステムを使用して結合部位中における標的分析物の捕捉剤に対する特異的結合から非特異的結合を区別する方法であって、
シグナルが非特異的相互作用の比較的高い濃度の結果である場合に、初速度が早期の時点で非常に高く、後期の時点でゼロに近づくことが観察される、方法。
［項目４７］
項目３９に記載のシステムを使用して結合部位中における標的分析物の捕捉剤に対する特異的結合から非特異的結合を区別する方法であって、真のシグナルと真でないシグナルとの区別が、未知の分析物の存在及び濃度を用いた所与の実験からの結合曲線と、既知の存在及び濃度を用いた標準分析物の結合曲線との比較分析により達成される、方法。
［項目４８］
項目３９に記載のシステムを使用して結合部位中における標的分析物の捕捉剤に対する特異的結合から非特異的結合を区別する方法であって、
アッセイ実行の終了時に、試験試料及び検出試薬を、ある濃度の捕捉剤を含有する第１のアッセイ緩衝液及び第２のアッセイ緩衝液で置き換えるステップ、又は
アッセイ実行の終了時に、試験試料及び検出試薬を、ある濃度の検出試薬を含有する第１のアッセイ緩衝液及び第２のアッセイ緩衝液で置き換えるステップ、又は
アッセイ実行の終了時に、試験試料及び検出試薬を、ある濃度の少なくとも１つの標的分析物を含有する第１のアッセイ緩衝液及び第２のアッセイ緩衝液で置き換えるステップと、
第１のアッセイ緩衝液及び第２のアッセイ緩衝液の反復する流れを数サイクル実行するステップと、
カートリッジのアッセイ部分を撮像するステップと
を含み、
特異的結合であれば、シグナルが減少するため、その場合、シグナル及び関係する結合曲線が標的分析物からの特異的シグナルであると推定でき、
シグナルが事実上非特異的であれば、その場合、シグナルが目的の分析物（標的分析物）の存在に依存しないので実質的に安定なままであり、シグナル及び関係する結合曲線が、試料中の非標的物質からの非特異的シグナルであると推定できる、方法。
［項目４９］
項目３９に記載のシステムを使用して結合部位中における標的分析物の捕捉剤に対する特異的結合から非特異的結合を区別する方法であって、
非特異的シグナルが捕捉物と検出抗体との異好性の抗体架橋により生ずる場合について、少なくとも１つのアッセイで使用される捕捉剤（この例では捕捉抗体）と同じ種であるが、少なくとも１つアッセイで測定される標的分析物のいずれにも向けられていない抗体（ヤギ、ウサギ、マウス、その他）の混合物を含有する「陰性対照」スポット（結合部位）が、カートリッジのアッセイ部分に加えられて、
どの試料が異好性の抗体を含有するかを、「陰性対照スポット」が試料に依存する様式でシグナルを生じるか否かの観察から推定して、ここで生じるのであれば、該シグナルが非特異的成分を含むと考え、又は
「陰性対照スポット」からのシグナルを使用して分析物に特異的なスポット（結合部位）におけるシグナルを調整して、存在する異好性の抗体の「濃度」を考慮に入れ、したがって、標的分析物濃度のより正確な測定を提供する、方法。
［項目５０］
項目３９に記載のシステムを使用して、薬剤開発、薬剤発見、診断の又は他の用途のための新しい候補バイオマーカーを発見する方法であって、
各結合部位を特異的対非特異的結合シグナルについて分析し、特異的シグナルをもたらす結合部位のみが、追加の分画及び／若しくは質量分析法又はどの分析物がこれらの結合部位に存在する（により捕捉された）かを確認するために使える別の技法によりさらに分析される、方法。
［項目５１］
結合部位が、分画された細胞溶解物、組織又は他の生物学的試料を含有し、特定の疾患又は状態を有する１名又は複数の対象から採取され、アッセイ中に処理される流体の１つが、健常な対照又は前記特定の疾患又は状態を有する対象のいずれか由来であり、
健常な対照からの流体で実行したアッセイからのデータが、前記特定の疾患又は状態を有する対象からの流体で実行したアッセイからのデータと比較されて、特定の疾患又は状態を有する対象からの流体で特異的結合のシグナルを示し、健常な対照からの流体で特異的結合のシグナルを示さない上記の結合部位が、その後の分画及び／若しくは質量分析法又は前記特異的結合のシグナルを生じさせる候補バイオマーカーを単離して同定する他の分析手順のいずれかによりさらに分析される、項目５０に記載の方法。
［項目５２］
圧力が、カートリッジを出る流体の流速のモニタリングにより、及び所望の流速を設定するのに必要な圧力を確立させるフィードバックにより制御され得る、項目３９に記載のシステム。
［項目５３］
レーザー又は他の標識刺激／相互作用プロセスが作用しておらず、使用者が流体の移動を見て、カートリッジが、適切に流れていること及び泡又は他の可視的汚染物質のないことを視覚的に確認することを可能にするのに十分透明である場合に、カートリッジを後方から照明することができる、項目３９に記載のシステム。
［項目５４］
取り外し可能な廃棄物容器がカートリッジにより処理された全ての流体を集めるためにシステムに組み込まれていてもよい、項目３９に記載のシステム。
［項目５５］
取り外し可能なタブレットがアッセイを遂行してモニターするために遠隔で使用できるように、取り外し可能なタブレットコンピューターが、アッセイを設定して遂行する指示を提供して、分析及び結果の詳細を提供するユーザーインターフェースとして使用される、項目３９に記載のシステム。
［項目５６］
着色光がユーザーインターフェース及びシステム自体の両方で使用されて、アッセイを設定して遂行するために関係するステップを通して使用者を導く、例えばインターフェースがカートリッジの視覚的表示を示して、使用者に前記リザーバが緑色（又は他の色）の光等で点灯されたときに、流体１をリザーバ１に挿入するように依頼する、項目３９に記載のシステム。
［項目５７］
項目３９及び５２〜５６のいずれか一項に記載のシステムが実験室、介護の近く又は介護環境の場で診断用のバイオマーカーの検出及び測定のために使用される、項目３９及び５２〜５６のいずれか一項に記載のシステムの使用。
［項目５８］
アッセイにおいて特異的結合と非特異的結合を識別する方法であって、
複数のシグナル強度測定の各々が、分析される試料と分析される試料中の標的分析物の捕捉剤との反復する相互作用の間に行われて、分析される試料の複数のシグナル強度測定値を得るステップと、
複数のシグナル強度測定値を分析される試料と捕捉剤の相互作用の累積持続時間の関数としてプロットするステップと、
プロットされたシグナル強度測定値が既知の標準物質の特性を示している場合に、シグナル強度測定値が標的分析物と捕捉剤の特異的結合を示していると判定するステップと
を含む、方法。
［項目５９］
分析物を含有する試料中の分析物濃度を計算する方法であって、
試料の成分の分析物に結合することができる捕捉剤への結合を表す複数のシグナル強度測定値を得るステップであって、複数のシグナル強度測定が既知の時間間隔で試料と捕捉剤の間の相互作用の既知の持続時間の間に行われるステップと、
複数のシグナル強度測定値を試料と捕捉剤の相互作用の累積持続時間の関数としてプロットするステップと、
プロットされたシグナル強度測定値に対する１つ以上の１次微分又は接線（初速度）を計算するステップであって、１つ以上の１次微分又は接線（初速度）の各々が近接してプロットされたシグナル強度測定値を使用して計算されるステップと
を含み、
１つ以上の標準分析物濃度についての１次微分又は接線（初速度）は、後で逆算曲線の適合を決定するために使用することができ、酵素基質複合体が反応に先立って形成される場合、逆算の適合は、酵素触媒モデルに基づき、未知の試料の１次微分又は接線（初速度）が、１つ以上の標準物質の分析濃度から濃度を逆算するために使用される、方法。
［項目６０］
１種以上の流体を保持するための１つ以上のリザーバ部分と、
前記１つ以上のリザーバ部分からの１種以上の流体を受けるための１つ以上のアッセイ部分であって、該アッセイ部分の上に流体が流される複数の結合部位を有し、流体チャネル又は配管を通して前記１つ以上のリザーバ部分に接続された、１つ以上のアッセイ部分と
を備えるカートリッジデバイス。
［項目６１］
流体を漏洩することなく前記アッセイ部分に入る流体のための出口を提供するチャネルをさらに備える、項目６０に記載のカートリッジデバイス。
［項目６２］
前記リザーバ部分の各々における上部の空気の圧力の制御で該リザーバ部分から出て当該カートリッジデバイスの前記１つ以上のアッセイ部分を通る流体の流れを直接制御するように、前記リザーバ部分の各々の周縁部の周りに気密シールを形成する機構をさらに備える、項目６１に記載のカートリッジデバイス。
［項目６３］
前記リザーバ部分から当該カートリッジデバイスの前記アッセイ部分を通る流体の制御された反復する流れを可能にするために、前記リザーバ部分の各々にかけられる圧力を変化させることができる機構に対する１つ以上の取り付け箇所をさらに備える、項目６２に記載のカートリッジデバイス。
［項目６４］
当該カートリッジデバイスの前記アッセイ部分中に、分析しようとする流体から標的の分析物を選択するために特異的な選択された捕捉剤を含有する複数の結合部位をさらに備える、項目６０に記載のカートリッジデバイス。
［項目６５］
結合部位を越える流体の制御された反復する流れが、結合部位中においてこれらの捕捉剤と結合する流体中のこれらの分析物の速度論的結合曲線の表示を形成するために使用され得る、項目６０に記載のカートリッジデバイス。
［項目６６］
当該カートリッジデバイスが、
捕捉剤を含有する結合部位が上に所在し得るベース部と、
前記リザーバ部分、前記流体チャネル及び前記アッセイ部分を備える当該カートリッジデバイスの上部又は本体部と
を具備する、項目６０に記載のカートリッジデバイス。
［項目６７］
前記ベース部が、以下の材料：
ガラス、ＰＤＭＳ、化学処理されたガラス、ナノ粒子で覆われたガラス、金属でコートされたガラス、他の形態の材料で処理されたガラス、炭素（全ての形態）、ケイ素、ゴム、プラスチック、金属、結晶類、ポリマー、半導体、有機材料又は無機材料
の１つ又は複数からなる、項目６６に記載のカートリッジデバイス。
［項目６８］
当該カートリッジデバイスの前記上部又は前記本体部が、以下の材料：
ガラス、ＰＤＭＳ、化学処理されたガラス、ナノ粒子で覆われたガラス、金属でコートされたガラス、他の形態の材料で処理されたガラス、炭素（全ての形態）、ケイ素、ゴム、プラスチック、金属、結晶類、ポリマー、半導体、有機材料又は無機材料の１つ又は複数からなる、項目６６に記載のカートリッジデバイス。
［項目６９］
前記ベース部が疎水性であり、
前記ベース部が、所望の捕捉剤又は活性物質を含有する結合部位のアレイを含み、
前記結合部位のアレイを備える前記ベース部が、プラズマでエッチングされており、
前記本体部が、成形された材料、又は、前記流体チャネル、前記アッセイ部分及び前記リザーバ部分を含むように構築された材料から構成され、
前記本体部が前記ベース部と位置を調整して結合されている、
請求項６６に記載のカートリッジデバイス。
［項目７０］
前記リザーバ部分の各々における上部の周縁部周りの前記気密シールが、前記周縁部の周りの上に置かれた隆起したリングにより達成され、そのシールが、圧力をかける任意の気体又は他の形態の流体の洩れを防止するシールを有する該リザーバ部分の上部に圧力を提供するインターフェースデバイスとかみ合う、項目６２に記載のカートリッジデバイス。
［項目７１］
前記リザーバ部分の各々における上部を覆って封じる薄膜をさらに備え、
該薄膜は、流体を当該カートリッジデバイスに漏洩を生ずることなく予め充填できて、皮下注射用の針の付いた又は同様な装置により、流体を任意の保存中に容易に挿入し又はそこから取り出すことができるように、かつ、当該カートリッジデバイスをシステムに挿入するとこのシールが自動的に破れて流体が適用された圧力の制御下で流れることを可能にするように、リザーバの周縁部の周りを封じている、項目６０に記載のカートリッジデバイス。
［項目７２］
当該カートリッジデバイスが透明な材料で作製されており、当該カートリッジデバイスが挿入されるシステムが、可視性のバックライトを提供して、この点灯がアッセイ中に結合事象の検出及び測定に干渉しない場合、使用者が当該カートリッジデバイスを通る流体の移動を見て、流れに勢いがあることを視覚で判定し、泡又は他の汚染物質などの任意の潜在的な不規則性を観察することを可能にする、項目６０に記載のカートリッジデバイス。
［項目７３］
当該カートリッジデバイスを通る液体の流速を、当該カートリッジデバイスにおける前記アッセイ部分の後ろ又は当該カートリッジデバイスの出口の後ろで、当該カートリッジデバイスが挿入されるシステム内に置かれた又はそれ以外で接続された流れセンサーにより測定することができる、項目６０に記載のカートリッジデバイス。
［項目７４］
前記アッセイ部分が高さ１５０ミクロン以下、及び好ましくは５０ミクロン以下となるサイズである、項目６０に記載のカートリッジデバイス。
［項目７５］
前記アッセイ部分が流体の乱流を生じさせる、項目６０に記載のカートリッジデバイス。
【図１】
2020098202.tif 000004
【図２】
2020098202.tif 000005
【図３】
2020098202.tif 000006
【図４】
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【図５】
2020098202.tif 000008
【図６】
2020098202.tif 000009
【図７】
2020098202.tif 000010
【図８】
2020098202.tif 000011
【図９】
2020098202.tif 000012
【図１０】
2020098202.tif 000013
【図１１】
2020098202.tif 000014
【図１２】
2020098202.tif 000015
【図１３】
2020098202.tif 000016
【図１４】
2020098202.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月29日(2020.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カートリッジデバイスを備えるアッセイシステムであって、
前記カートリッジデバイスが、
・試料のリザーバと、
・試薬のリザーバと、
・前記試料のリザーバからの流体を受けるためのアッセイ部分であり、
前記流体を該アッセイ部分に導入するよう、前記試料のリザーバに接続された導入部と、
該アッセイ部分から前記流体を排出する排出部と、
前記導入部と前記排出部との間に設けられた複数の結合部位であり、該結合部位を経て前記流体が前記導入部から前記排出部に繰り返し流され得る、結合部位と
を有する、アッセイ部分と、
・前記流体中の１種以上の分析物の前記複数の結合部位への結合を、前記導入部から前記排出部への前記流体の複数の流れの各々の後に、測定するための測定装置と
を含む、アッセイシステム。
【請求項２】
前記カートリッジデバイスが受け入れられたり取り出されたりするインターフェースであって、前記試料のリザーバから前記アッセイ部分を通る前記流体の流れ又は移動を制御するための装置を含む、インターフェースをさらに備え、
前記流体の流れを制御するための前記装置が、以下の事項の少なくとも１つ、すなわち
前記アッセイ部分を横切る前記流体の流速、
前記アッセイ部分を横切る前記流体の流れの持続時間、及び、
ある量の前記流体が、前記アッセイ部分を通って流される回数
の少なくとも１つを独立に制御することができる、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項３】
流速センサーをさらに備え、
前記インターフェースが、前記流速センサーからの出力に基づいて、前記アッセイ部分を横切る前記流体の流速と持続時間の少なくとも一方を制御する可変の陽圧と可変の陰圧の両方又はその一方を提供する、請求項２に記載のアッセイシステム。
【請求項４】
前記流体が、蛍光標識、発光標識、及び比色標識からなる群から選択される１種以上の標識を含む液体であり、
前記測定装置が、蛍光測定装置、発光測定装置、及び比色測定装置からなる群から選択される、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項５】
前記測定装置が、コンピューター制御下で、レーザー又は他の形態の標識刺激を、前記カートリッジデバイスの前記アッセイ部分に向けることができるように、かつ、続いて蛍光、発光又は比色シグナルの検出及び／又は測定を実施できるように、当該アッセイシステムに構成されている、請求項４に記載のアッセイシステム。
【請求項６】
コンピューターソフトウェアをさらに備え、
該コンピューターソフトウェアは、実行されると、
前記アッセイ部分中における前記複数の結合部位の１つ又は複数に結合する１種以上の分析物の１つ以上の結合曲線の表示を分析し、
前記１種以上の分析物について該分析を１つ以上の既知の標準物質の時間経過結合曲線と比較し、
前記流体中の前記１種以上の分析物の存在と濃度の少なくとも一方を決定する
ように動作する、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項７】
前記リザーバの一部が、前記試料のリザーバ内の流体を封じる薄い膜により覆われている、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項８】
前記流体が、
ストレプトアビジン、アビジン及び色素標識型のストレプトアビジンを含むストレプトアビジン種、
二量化ビオチン分子、ビオチンで部分的に若しくは完全に標識されたＰＡＭＡＭ（ポリアミドアミン）デンドリマー、又はビオチン−アビジンネットワークを形成し得る任意のビオチン含有分子若しくは高分子、ビオチン化タンパク質、ビオチン化抗体、ビオチン化ペプチド、ＤＮＡのビオチン化ストランド、及びビオチン化デンドリマーを含むビオチン化種、又は、
分析物とは独立した態様で、捕捉された活性物質と検出試薬とを架橋させることができる任意の活性物質及び抗種抗体
のうち少なくとも１つを含む液体である、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項９】
前記複数の結合部位の少なくとも１つが、生物学的実体と化学的実体の一方又は両方を含む、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項１０】
前記生物学的実体が、タンパク質、ホルモン、抗体、抗原、ウイルス、抗体複合体、機能的抗体断片、ペプチド、細胞、細胞断片、アプタマー、細胞溶解物、分画された細胞溶解物、分画された細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、遺伝子、及び遺伝子発現生成物からなる群から選択され、
前記化学的実体が、化学元素、化合物、薬学的に活性な化合物又はそれらの代謝物、鉱物、及び汚染物質からなる群から選択される、請求項９に記載のアッセイシステム。
【請求項１１】
前記カートリッジデバイスが、前記排出部に接続された廃棄物チャンバーをさらに備える、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項１２】
試料のリザーバと、
試薬のリザーバと、
前記試料のリザーバからの流体を受けるためのアッセイ部分であって、
前記流体を該アッセイ部分に導入するよう、前記試料のリザーバに接続された導入部と、
該アッセイ部分から前記流体を排出する排出部と、
前記導入部と前記排出部との間に設けられた複数の結合部位であり、該結合部位を経て前記流体が前記導入部から前記排出部に繰り返し流され得る、結合部位と
を有する、アッセイ部分と、
を備えるカートリッジデバイス。
【請求項１３】
前記排出部に接続された廃棄物チャンバーをさらに備える、請求項１２に記載のカートリッジデバイス。
【外国語明細書】
2020098202000001.pdf