(57)【要約】【課題】解析対象核酸の数が極少数であっても、簡便かつ高精度に解析することができる核酸解析方法の提供。【解決手段】特定コピー数の標準核酸と、解析対象核酸とを同一系内に含むライブラリーを調製するライブラリー調製工程と、特定コピー数の前記標準核酸のコピー数に基づき検量線データを作成する検量線データ作成工程と、前記解析対象核酸の塩基配列を特定するとともに、前記検量線データを用いて前記解析対象核酸の塩基配列の数を特定する解析対象核酸解析工程と、を含む核酸解析方法である。【選択図】図２６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定コピー数の標準核酸と、解析対象核酸とを同一系内に含むライブラリーを調製するライブラリー調製工程と、
特定コピー数の前記標準核酸のコピー数に基づき検量線データを作成する検量線データ作成工程と、
前記解析対象核酸の塩基配列を特定するとともに、前記検量線データを用いて前記解析対象核酸の塩基配列の数を特定する解析対象核酸解析工程と、を含むことを特徴とする核酸解析方法。
【請求項２】
異なる塩基配列を有する標準核酸を、同一系内において、互いに異なる特定コピー数で含む請求項１に記載の核酸解析方法。
【請求項３】
前記標準核酸を、２以上の異なる系内において、互いに異なる特定コピー数で含み、
取得する前記標準核酸の前記検量線データを正規化し合一する請求項１に記載の核酸解析方法。
【請求項４】
前記標準核酸が、ＤＮＡである請求項１から３のいずれかに記載の核酸解析方法。
【請求項５】
前記解析対象核酸が、ＤＮＡ及びｃＤＮＡの少なくともいずれかである請求項１から４のいずれかに記載の核酸解析方法。
【請求項６】
前記ライブラリーの調製が、前記標準核酸及び前記解析対象核酸に対して同一のプライマーを用いて行われる請求項１から５のいずれかに記載の核酸解析方法。
【請求項７】
前記ライブラリーの調製が、前記標準核酸及び前記解析対象核酸に対して異なるプライマーを用いて行われる請求項１から５のいずれかに記載の核酸解析方法。
【請求項８】
同一系内に特定コピー数の標準核酸と、解析対象核酸とが調製されたライブラリーに対して、
検量線データ作成手段により、特定コピー数の前記標準核酸のコピー数に基づき、前記標準核酸の検量線データを作成させ、
解析対象核酸解析手段により、前記解析対象核酸の塩基配列を特定するとともに、前記検量線データを用いて前記解析対象核酸の塩基配列の数を特定させる、処理をコンピュータに実行させることを特徴とする核酸解析プログラム。
【請求項９】
請求項１から７のいずれかに記載の核酸解析方法に用いられるライブラリー調製用デバイスであって、
特定コピー数の標準核酸を有することを特徴とするライブラリー調製用デバイス。
【請求項１０】
前記標準核酸が前記特定コピー数である不確かさを平均特定コピー数で除した変動係数ＣＶ値と、前記標準核酸の平均特定コピー数ｘとにより表される、次式、ＣＶ＜１／√ｘを満たす請求項９に記載のライブラリー調製用デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸解析方法及び核酸解析プログラム、並びに、ライブラリー調製用デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡの塩基配列を解読する技術において、検体試料から抽出したＤＮＡから大量の塩基配列データを取得できることから、次世代シーケンサ（ＮＧＳ）が遺伝子検査等に広く使用されている。特に、近年、次世代シーケンサを用いた極微量のサンプルを高精度で検出するための研究が隆盛している。
【０００３】
例えば、微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を精度よく定量するために、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅するプライマーにより増幅可能であるが、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子とは明確に識別可能な塩基配列を有する内部標準核酸試料が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、解析対象核酸の数が極少数であっても、簡便かつ高精度に解析することができる核酸解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するための手段としての本発明の核酸解析方法は、特定コピー数の標準核酸と、解析対象核酸とを同一系内に含むライブラリーを調製するライブラリー調製工程と、特定コピー数の前記標準核酸のコピー数に基づき検量線データを作成する検量線データ作成工程と、前記解析対象核酸の塩基配列を特定するとともに、前記検量線データを用いて前記解析対象核酸の塩基配列の数を特定する解析対象核酸解析工程と、を含む。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によると、解析対象核酸の数が極少数であっても、簡便かつ高精度に解析することができる核酸解析方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明のデバイスの一例を示す斜視図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明のデバイスの他の一例を示す斜視図である。
【図２】図２は、本発明のデバイスの一例を示す側面図である。
【図３】図３は、本発明のデバイスにおける核酸を充填するウェルの位置の一例を示す図である。
【図４】図４は、本発明のデバイスにおける核酸を充填するウェルの位置の他の一例を示す図である。
【図５】図５は、ＤＮＡ複製済みの細胞の頻度と、蛍光強度との関係の一例を示すグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、電磁バルブ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ピエゾ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、図６Ｂにおけるピエゾ方式の吐出ヘッドの変形例の模式図である。
【図７Ａ】図７Ａは、圧電素子に印加する電圧の一例を示す模式図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、圧電素子に印加する電圧の他の一例を示す模式図である。
【図８Ａ】図８Ａは、液滴の状態の一例を示す模式図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、液滴の状態の一例を示す模式図である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、液滴の状態の一例を示す模式図である。
【図９】図９は、ウェル内に順次液滴を着弾させるための分注装置の一例を示す概略図である。
【図１０】図１０は、液滴形成装置の一例を示す模式図である。
【図１１】図１１は、図１０の液滴形成装置の制御手段のハードウェアブロックを例示する図である。
【図１２】図１２は、図１０の液滴形成装置の制御手段の機能ブロックを例示する図である。
【図１３】図１３は、液滴形成装置の動作の一例を示すフローチャートである。
【図１４】図１４は、液滴形成装置の変形例を示す模式図である。
【図１５】図１５は、液滴形成装置の他の変形例を示す模式図である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、飛翔する液滴に２個の蛍光粒子が含まれる場合を例示する図である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、飛翔する液滴に２個の蛍光粒子が含まれる場合を例示する図である。
【図１７】図１７は、粒子同士の重なりが生じない場合の輝度値Ｌｉと、実測される輝度値Ｌｅとの関係を例示する図である。
【図１８】図１８は、液滴形成装置の他の変形例を示す模式図である。
【図１９】図１９は、液滴形成装置の他の一例を示す模式図である。
【図２０】図２０は、マイクロ流路中を通過してきた細胞をカウントする方法の一例を示す模式図である。
【図２１】図２１は、吐出ヘッドのノズル部近傍の画像を取得する方法の一例を示す模式図である。
【図２２】図２２は、確率Ｐ（＞２）と平均細胞数の関係を表すグラフである。
【図２３】図２３は、ポアソン分布に基づくばらつきを持ったコピー数と変動係数ＣＶとの関係を示すグラフである。
【図２４】図２４は、核酸解析装置のハードウェア構成の一例を示すブロック図である。
【図２５】図２５は、核酸解析装置の機能構成の一例を示す図である。
【図２６】図２６は、核酸解析プログラム処理の一例を示すフローチャートである。
【図２７】図２７は、実施例の結果の一例を示すグラフである。
【図２８】図２８は、実施例の結果の他の一例を示すグラフである。
【図２９】図２９は、実施例の結果の他の一例を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（核酸解析方法及び核酸解析プログラム）
本発明の核酸解析方法は、特定コピー数の標準核酸と、解析対象核酸とを同一系内に含むライブラリーを調製するライブラリー調製工程と、特定コピー数の前記標準核酸のコピー数に基づき検量線データを作成する検量線データ作成工程と、前記解析対象核酸の塩基配列を特定するとともに、前記検量線データを用いて前記解析対象核酸の塩基配列の数を特定する解析対象核酸解析工程と、を含み、さらに必要に応じてその他の工程を含む。
本発明の核酸解析プログラムは、同一系内に特定コピー数の標準核酸と、解析対象核酸とが調製されたライブラリーに対して、検量線データ作成手段により、特定コピー数の前記標準核酸のコピー数に基づき、前記標準核酸の検量線データを作成させ、解析対象核酸解析手段により、前記解析対象核酸の塩基配列を特定するとともに、前記検量線データを用いて前記解析対象核酸の塩基配列の数を特定させる、処理をコンピュータに実行させる、更に必要に応じてその他の処理を実行させる。
核酸解析方法は核酸解析方法に係る核酸解析装置により好適に行うことができ、ライブラリー調製工程はライブラリー調製手段により好適に行うことができ、検量線データ取得工程は検量線データ取得手段により好適に行うことができ、解析対象核酸解析工程は解析対象核酸解析手段により好適に行うことができその他の工程はその他の手段により行うことができる。
【０００９】
本発明者らは、解析対象核酸が、複数種かつ数が極少数であっても、簡便かつ高精度に解析することができる核酸解析方法について検討したところ、以下の知見を得た。
従来技術では、既知の濃度の試料は核酸そのものの濃度を計測した値であって、使用時には、段階希釈をすることで定量解析における標準試料を作製していたため、希釈倍率が高い（希釈回数の多い）極少量の標準試料においては、正確に目的のコピー数の希釈溶液が作製されている保証がなく、解析対象核酸が極少量の場合における正確な定量を行うことが困難であった。本発明は上記の知見に基づくものである。
さらに、微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子定量用内部標準遺伝子については、解析対象核酸が極少量の場合において正確な定量を行うことができるか否かが不明であるという知見に基づくものである。
【００１０】
本発明の核酸解析方法に係る核酸解析装置は、本発明の核酸解析プログラムを読み出して実行することで、本発明の核酸解析方法を実行する装置として動作する。すなわち、本発明の核酸解析方法に係る核酸解析装置は、本発明の核酸解析方法と同様の機能をコンピュータに実行させる本発明の核酸解析プログラムを有する。なお、本発明の核酸解析プログラムは、本発明の核酸解析方法に係る核酸解析装置によって実行されることに限定されるものではない。例えば、本発明の核酸解析プログラムは、他のコンピュータ又はサーバによって実行されてもよく、本発明の核酸解析方法に係る核酸解析装置、他のコンピュータ、及びサーバのいずれかが協働して実行されてもよい。
つまり、本発明の核酸解析方法に係る核酸解析装置は、本発明の核酸解析方法を実施することと同義であるので、主に本発明の核酸解析方法の説明を通じて本発明の核酸解析方法に係る核酸解析装置の詳細についても明らかにする。また、本発明の核酸解析プログラムは、ハードウェア資源としてのコンピュータ等を用いることにより、本発明の核酸解析方法に係る核酸解析方法として実現させることから、本発明の核酸解析方法の説明を通じて本発明の核酸解析プログラムの詳細についても明らかにする。
【００１１】
＜ライブラリー調製工程及びライブラリー調製手段＞
ライブラリー調製工程は、特定コピー数の標準核酸と、解析対象核酸とを同一系内に配し、ライブラリーを調製する工程である。ライブラリー調製工程は、ライブラリー調製手段により好適に実行される。
【００１２】
ライブラリーとは、解析対象核酸を核酸解析が可能な状態に処理した核酸を含むものを意味する。ライブラリーに含まれる解析対象核酸としては、１以上が好ましく、２以上がより好ましい。ライブラリーに含まれる解析対象核酸が２以上であると、例えば、生物種を特定する環境調査において好適に使用することができる。
【００１３】
標準核酸とは、核酸の解析において、後述する検量線データを取得するために用いる特定コピー数の核酸を意味する。解析とは、塩基配列を特定すること、塩基配列ごとのコピー数を特定することを含むことを意味する。なお、特定コピー数については、後述する本発明の核酸解析方法に用いられるデバイスの説明にて詳細に行うため、説明を省略する。
解析対象核酸とは、試料である解析の対象となる核酸（塩基配列）を意味し、その種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。また、その数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
解析対象核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなどが挙げられる。解析対象核酸には、異なる塩基配列を有する核酸（断片）が２以上含まれていてもよい。
【００１４】
核酸解析が可能な状態に、解析対象核酸を処理するとは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アダプター配列を結合させる処理、核酸増幅を行う処理などが挙げられる。
【００１５】
アダプター配列を結合させる処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、解析対象核酸の５’末端及び３’末端の少なくともいずれかにオリゴヌクレオチドを結合させる処理、解析対象核酸の５’末端及び３’末端の少なくともいずれかに結合させるオリゴヌクレオチドを結合させる処理、ペプチド又はタンパク質を結合させる処理などが挙げられる。
オリゴヌクレオチドを結合させる処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、標準核酸及び解析対象核酸に対して同一のプライマーを用いてライブラリーを調製する方法、標準核酸及び解析対象核酸に対して異なるプライマーを用いてライブラリーを調製する方法などが挙げられる。標準核酸及び解析対象核酸に対して同一のプライマーを用いてライブラリーを調製する方法を用いることによって、増幅効率の差をほとんど無視することができる。さらに、標準核酸及び解析対象核酸に対して異なるプライマーを用いてライブラリーを調製する方法を用いることによって解析対象核酸の塩基配列に依存せずに、プライマーを選択することができるため、汎用性を向上させることができる。
その他のオリゴヌクレオチドを結合させる処理としては、例えば、トランスポゾンを使用する方法、ライゲースを使用する方法、相同組み換えを使用する方法などがあげられる。その他のオリゴヌクレオチドを結合させる処理としては、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐｉｂｉｏ．ｃｏｍ／ｄｏｃｓ／ｄｅｆａｕｌｔ−ｓｏｕｒｃｅ／ｆｏｒｕｍ−ａｒｃｈｉｖｅ／ｆｏｒｕｍ−１６−３−−−ｎｅｘｔｅｒａ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｆｏｒ−ｎｇｓ−ｄｎａ−ｌｉｂｒａｒｙ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ−−−ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ−ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ−ａｎｄ−ｔａｇｇｉｎｇ−ｂｙ−ｉｎ−ｖｉｔｒｏ−ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ．ｐｄｆ？ｓｆｖｒｓｎ＝４に記載の方法などを好適に用いることができる。
【００１６】
ペプチド又はタンパク質を結合させる処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＭｉｎＩＯＮ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）のＲａｐｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔなどが挙げられる。
ペプチド又はタンパク質を結合させる処理としては、例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｓｔｏｒｅ．ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｖｉｅｗ／ｉｄ／２１９／ｓ／ｒａｐｉｄ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｋｉｔ／ｃａｔｅｇｏｒｙ／２８／に記載の方法などを好適に用いることができる。
アダプター配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１７】
核酸増幅を行う処理としては、試料中に含まれる解析対象核酸のなかで、着目する特定の塩基配列（例えば、遺伝子など）を増幅することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１８】
本発明の核酸解析方法においては、標準核酸及び解析対象核酸を同一系内で増幅することにより、標準核酸の数が特定されているため、解析対象核酸の結果の信頼性を向上させることができる。
ここで、標準核酸及び解析対象核酸を同一系内に含む場合には、異なる塩基配列を有する標準核酸を同一系内に含む態様と、同一の塩基配列を有する標準核酸を異なる系内に含む態様が挙げられる。
異なる塩基配列を有する標準核酸を同一系内に含む態様においては、異なる塩基配列を有する標準核酸を、同一系内において、互いに異なる特定コピー数で含む、即ち、同一系内に２種類以上の標準核酸を、互いに異なる特定コピー数で含むことを意味し、解析対象核酸の解析結果の信頼性を向上させることができる。同一系内において、互いに異なる特定コピー数で含むとは、例えば、互いに異なる塩基配列であるＡ、Ｂ、及びＣにおいて、塩基配列Ａは１個（コピー）、塩基配列Ｂは１０個（コピー）、塩基配列Ｃは５０個（コピー）の３水準を同一系内で増幅することなどが挙げられる。「水準」とは、ある特定コピー数を「１」としたとき、他の特定コピー数を「１０」、その他の特定コピー数を「５０」としたとき、「３水準」と表現することを意味する。
同一の塩基配列を有する標準核酸を異なる系内に含む態様においては、同一の塩基配列を有する標準核酸を用いること、即ち、標準核酸の水準毎（特定コピー数毎）に系が存在し、各系内に同一の解析対象核酸が含むことを意味している。同一の塩基配列を有する標準核酸を用いることにより、使用する標準核酸の種類を少なくすることができる。
【００１９】
なお、ライブラリー調製工程については、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｉｌｌｕｍｉｎａ社が公開している次世代シークエンサにおける解析方法（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｒｅｓ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｎｅｗｓ／ＮＧＳ１．ｐｄｆ）、非特許文献１、ナノポアデバイスを用いたシークエンスにおける解析方法（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．）、ＰａｃＢｉｏ  ＲＳ  ＩＩ／Ｓｅｑｕｅｌ  システムを用いたシークエンスにおける解析方法（Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｉｏｎ  ＴｏｒｒｅｎｔＴＭ半導体シーケンスシステムシリーズにおける解析方法（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）などを参照することができる。
【００２０】
ここで、本発明の核酸解析方法において標準核酸の特定コピー数が特定されていることについて、詳細に説明する。本発明の核酸解析方法においては、標準核酸の特定コピー数が特定されているデバイスを用いることを前提としている。
【００２１】
−デバイス−
本発明の核酸解析方法に用いられるデバイスは、少なくとも１つの充填部位を有し、少なくとも１つの前記充填部位内の標準核酸が特定コピー数含まれる。
【００２２】
本発明の核酸解析方法に用いられるデバイスを用いると、解析対象核酸の数が極少数であっても、高精度に解析（定量）することができる。なお、本発明において「極少量」とは、核酸の「数が極めて少ないこと」を意味し、例えば、１，０００以下を意味する。
【００２３】
特定コピー数とは、前記充填部位に含まれる標準核酸中の標的もしくは特定の核酸（又は塩基配列）の数を意味している。
標的の塩基配列とは、少なくともプライマー領域の塩基配列が決まっているものを指し、特に、塩基配列の全長が定められているものを特定の塩基配列とも呼称する。
特定の数とは、核酸（塩基配列）の数のうち、標的の核酸（塩基配列）の数が一定以上の精度で特定されていることを意味する。
すなわち、実際に充填部位に含まれている標的の核酸（塩基配列）の数として既知ということができる。つまり、本願における特定コピー数は、従来の系列希釈により得られる所定の数（算出推定値）よりも、数としての精度、信頼性が高く、特に、１，０００以下の極少量領域であってもポアソン分布によらない制御された値となる。制御された値は、概ね、不確かさを表す変動係数ＣＶが平均特定コピー数ｘに対し、ＣＶ＜１／√ｘもしくはＣＶ≦２０％のどちらかの値の大きさの中に収まっていることが好ましい。それゆえ、当該特定コピー数の標的の核酸（塩基配列）を含む充填部位を有するデバイスを用いることで、従来よりも正確に標的の核酸（塩基配列）を有する試料の定性的、定量的な検査を行うことが可能となる。
なお、ここで標的の塩基配列ごとのコピーの数とその配列を有する核酸の分子数とが一致する場合には、「特定コピー数」は、「分子数」が対応付けられる場合もある。
具体的には、例えば、ノロウイルスの場合は、ウイルスの個数＝１なら核酸分子数＝１、コピー数＝１で、ＧＩ期の酵母の場合は、酵母数＝１なら核酸分子数（同一の染色体数）＝１、コピー数＝１で、Ｇ０／ＧＩ期のヒト細胞の場合は、ヒト細胞数＝１なら核酸分子数（同一の染色体数）＝２、コピー数＝２である。
さらに、標的の塩基配列を２箇所に導入したＧＩ期の酵母の場合は、酵母数＝１なら核酸分子数（同一の染色体数）＝１、コピー数＝２となる。
また、本発明においては、核酸の特定コピー数は、核酸の所定数又は絶対数と称することもある。
核酸の特定コピー数は、１（コピー）以上１，０００（コピー）以下が好ましく、１００（コピー）以下が好ましく、２０（コピー）以下がより好ましく、１０（コピー）以下がさらに好ましい。
核酸の特定コピー数は、異なる２種類以上の整数であることが好ましい。
核酸の特定コピー数の組み合わせとしては、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の場合、１、３、５、７、９の場合、２、４、６、８、１０の場合などが挙げられる。
また、核酸の特定コピー数の組み合わせは、例えば、１、１０、１００、１,０００の４水準の場合、１、１０、５０、１００、５００としてもよい。複数の異なる特定コピー数の組み合わせによる本発明の核酸解析方法におけるデバイスを用いて、検量線の作成を行うことができる。
複数の異なる特定コピー数の核酸を含む充填部位は同一であってもよいし、異なっていてもよい。ただし、核酸を含む充填部位が複数存在する場合には、各充填部位に同一の解析対象核酸を添加する必要がある。
【００２４】
なお、ライブラリー調製工程にて調製したライブラリーを、特定コピー数の標準核酸を有するデバイスに配する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ライブラリーの系列希釈によって作製された複数水準の溶液・分散液を規定量充填するか、前記微小領域内の核酸分子数が既知である微小領域及び担体の個数計測に基づいて充填することが好ましいい。これらの選択は、各水準に求められる充填精度や充填時間によって最良の方法を選択することが好ましい。各充填部位に値付けられる不確かさは、前述の充填方法や系列希釈の作製方法によって適切に算出されることが好ましい。
【００２５】
核酸の特定コピー数に関する情報としては、デバイスにおける核酸に関わる情報であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、不確かさの情報、後述する担体の情報、核酸の情報などが挙げられる。
【００２６】
「不確かさ」とは、「測定の結果に付随した、合理的に測定量に結びつけられ得る値のばらつきを特徴づけるパラメータ」であるとＩＳＯ／ＩＥＣ  Ｇｕｉｄｅ９９：２００７［国際計量計測用語−基本及び一般概念並びに関連用語（ＶＩＭ）］に定義されている。
ここで、「合理的に測定量に結びつけられ得る値」とは、測定量の真の値の候補を意味する。即ち、不確かさとは、測定対象の製造に係る操作、機器などに起因する測定結果のばらつきの情報を意味する。不確かさが大きいほど、測定結果として予想されるばらつきが大きくなる。
不確かさとしては、例えば、測定結果から得られる標準偏差であってもよく、真の値が所定の確率以上で含まれている値の幅として表す信頼水準の半分の値としてもよい。
不確かさを算出する方法としては、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ  ｉｎ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ（ＧＵＭ：ＩＳＯ／ＩＥＣ  Ｇｕｉｄｅ９８−３）、及びＪａｐａｎ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  Ｂｏａｒｄ  Ｎｏｔｅ  １０  試験における測定の不確かさに関するガイドラインなどに基づき算出することができる。不確かさを算出する方法としては、例えば、測定値などの統計を用いたタイプＡ評価法と、校正証明書、製造者の仕様書、公表されている情報などから得られる不確かさの情報を用いたタイプＢ評価法の２つの方法を適用することができる
不確かさは、操作及び測定などの要因から得られる不確かさを全て標準不確かさに変換することにより、同じ信頼水準で表現することができる。標準不確かさとは、測定値から得られた平均値のばらつきを示す。
不確かさを算出する方法の一例としては、例えば、不確かさを引き起こす要因を抽出し、それぞれの要因の不確かさ（標準偏差）を算出する。さらに、算出したそれぞれの要因の不確かさを平方和法により合成し、合成標準不確かさを算出する。合成標準不確かさの算出において、平方和法を用いるため、不確かさを引き起こす要因の中で不確かさが十分に小さい要因については無視することができる。
【００２７】
さらに、本発明のデバイスにおいては、不確かさの情報としては、充填部位内に充填される核酸の変動係数を用いてもよい。
変動係数とは、核酸を凹部に充填する際に生じる各凹部に充填される核酸数のばらつきの相対値を意味する。即ち、変動係数とは、凹部に充填した核酸の数の充填精度を意味する。変動係数とは、標準偏差σを核酸の数の平均値ｘで除した値である。ここでは、標準偏差σを核酸の数の平均コピー数（平均充填コピー数）ｘで除した値を変動係数ＣＶとすると、下記式１の関係式になる。
【００２８】
【数１】
2020096578.tif 000003
【００２９】
一般的に、核酸は分散液中でポアソン分布のランダムな分布状態を取っている。そのため、段階希釈法、即ち、ポアソン分布におけるランダムな分布状態では、標準偏差σは、核酸の数の平均コピー数ｘと下記式２の関係式を満たすとみなすことができる。これより、核酸の分散液を段階希釈法により希釈した場合、標準偏差σと核酸の数の平均コピー数ｘとから核酸の数の平均コピー数ｘの変動係数ＣＶ（ＣＶ値）を、上記式１及び式２から導出された下記式３を用いて求めると、表１及び図２３に示すようになる。なお、ポアソン分布に基づくばらつきを持ったコピー数の変動係数のＣＶ値は図２３から求めることができる。
【００３０】
【数２】
2020096578.tif 000004
【００３１】
【数３】
2020096578.tif 000005
【００３２】
【表１】
2020096578.tif 000006
【００３３】
表１及び図２３の結果から、例えば、充填部位に１００（コピー数）の核酸を段階希釈法により充填する場合には、最終的に反応溶液中に充填される標準核酸（塩基配列）の平均コピー数はその他の精度を無視しても、少なくとも１０％の変動係数（ＣＶ値）を持つことがわかる。
【００３４】
核酸の特定コピー数としては、変動係数のＣＶ値と、核酸の平均特定コピー数ｘとが、次式、ＣＶ＜１／√ｘを満たすことが好ましく、ＣＶ＜１／２√ｘを満たすことがより好ましい。
【００３５】
不確かさの情報としては、核酸を含むウェルが複数存在し、充填部位に含まれる核酸の特定コピー数に基づく、デバイス全体としての不確かさの情報を有することが好ましい。
【００３６】
不確かさを引き起こす要因としてはいくつか考えられ、例えば、目的の核酸を細胞に導入して当該細胞を計数及び分注して作製する場合には、細胞内の核酸の数、細胞をデバイスに配置する手段（インクジェット装置、又はその装置の動作のタイミングなどの装置における各部位の動作による結果を含む。）、細胞がデバイスの適切な位置に配置された頻度、細胞が細胞懸濁液中で破壊されることにより核酸が細胞懸濁液中に混入することによるコンタミネーション（夾雑物の混入、以下、「コンタミ」と記載することがある）などが挙げられる。
【００３７】
核酸の情報としては、例えば、核酸の数に関する情報としては、デバイスに含まれる核酸の数の不確かさの情報などが挙げられる。
【００３８】
＜充填部位＞
充填部位は、その形状、数、容積、材質、色などについては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。充填部位は、ウェルと同義と扱われることもある。
充填部位の形状としては、核酸などを配することができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平底、丸底、Ｕ底、Ｖ底等の凹部、基板上の区画などが挙げられる。充填部位の形状としては、一般的なサーマルサイクラーの金型の形状に一致することが好ましい。
充填部位の数は、少なくとも１つであり、２以上の複数であることが好ましく、５以上がより好ましく、５０以上が更に好ましい。
充填部位の数が１つであるものとしては、例えば、ＰＣＲチューブなどが挙げられる。
充填部位の数が２以上であるものとしては、例えば、マルチウェルプレートが好適に用いられる。
マルチウェルプレートとしては、例えば、２４、４８、９６、３８４、又は１,５３６のウェルプレートが挙げられる。
充填部位の容積としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、一般的な核酸検査装置に用いられる試料量を考慮すると、１μＬ以上１,０００μＬ以下が好ましい。
充填部位の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ふっ素系樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレートなどが挙げられる。
充填部位の色としては、例えば、透明、半透明、着色、完全遮光などが挙げられる。
充填部位の濡れ性としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、撥水性であることが好ましい。充填部位の濡れ性が、撥水性であると、充填部位内壁への核酸の吸着を低減化できる。また、充填部位の濡れ性が、撥水性であると、充填部位内の核酸及びプライマー、増幅試薬を溶液状態で移動することができる。
充填部位内壁の撥水化の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ふっ素系樹脂被膜を形成する方法、ふっ素プラズマ処理、エンボス加工が挙げられる。特に、接触角が１００°以上となる撥水化処理を施すことで、液体の取りこぼしによる核酸の減少及び不確かさ（又は変動係数）の増大のリスクを抑えることができる。
【００３９】
＜基材＞
デバイスは、充填部位が基材に設けられたプレート状のものが好ましいが、８連チューブ等の連結タイプのウェルチューブ、連結されていないウェルを組合せたものであってもよい。
基材としては、その材質、形状、大きさ、構造などについて特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
基材の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、半導体、セラミックス、金属、ガラス、石英ガラス、プラスチックスなどが挙げられる。これらの中でも、プラスチックスが好ましい。
プラスチックスとしては、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ふっ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレートなどが挙げられる。
基材の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、板状、プレート状などが好ましい。
基材の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、単層構造であっても複数層構造であっても構わない。
【００４０】
＜識別手段＞
デバイスは、核酸の特定コピー数及びその不確かさの情報を識別可能な識別手段を有することが好ましい。
識別手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メモリ、ＩＣチップ、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、Ｒａｄｉｏ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（以下、「ＲＦＩＤ」とも称することがある）、色分け、印刷などが挙げられる。
識別手段を設ける位置及び識別手段の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
識別手段に記憶させる情報としては、核酸の特定コピー数及びその不確かさの情報以外にも、例えば、分析結果（活性値、発光強度等）、核酸の数（例えば、細胞の数）、細胞の生死、特定塩基配列のコピー数、複数の充填部位のうちどの充填部位に核酸が充填されているのか、核酸の種類、測定日時、測定者の氏名などが挙げられる。
識別手段に記憶された情報は、各種読取手段を用いて読み取ることができ、例えば、識別手段がバーコードであれば読取手段としてバーコードリーダーが用いられる。
【００４１】
識別手段に情報を書き込む方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、手入力、充填部位に核酸を分注する際に核酸の個数を計数する液滴形成装置から直接データを書き込む方法、サーバに保存されているデータの転送、クラウドに保存されているデータの転送などが挙げられる。
【００４２】
＜その他の部材＞
その他の部材としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、密閉部材などが挙げられる。
【００４３】
−密閉部材−
デバイスは、充填部位への異物混入は充填物の流出などを防ぐために、密閉部材を有することが好ましい。
密閉部材としては、少なくとも１つの充填部位を密閉可能であり、１つ１つの充填部位を個別に密閉乃至開封できるように、切り取り線により切り離し可能に構成することが好ましい。
密閉部材の形状としては、充填部位内壁径と一致するキャップ状、又はウェル開口部を被覆するフィルム状であることが好ましい。
密閉部材の材質としては、例えば、ポリオレフィン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアミド樹脂などが挙げられる。
密閉部材としては、全ての充填部位を一度に密閉可能なフィルム状であることが好ましい。また、使用者の誤使用を低減化できるように再開封が必要な充填部位と不必要な充填部位との接着強度が異なるように構成されていることが好ましい。
【００４４】
前記充填部位は、プライマー及び増幅試薬の少なくともいずれかを含むことが好ましい。
プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ)において、鋳型ＤＮＡに特異的な１８塩基〜３０塩基の相補的塩基配列を持つ合成オリゴヌクレオチドであり、増幅したい領域を挟むようにフォワードプライマーとリバースプライマーとの２か所（一対）設定される。
増幅試薬としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ)において、例えば、酵素としてＤＮＡポリメラーゼ、基質として４種の塩基（ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ）、Ｍｇ２＋（２ｍＭの塩化マグネシウム）、最適ｐＨ（ｐＨ７．５〜９．５）を保持するバッファーなどが挙げられる。
【００４５】
デバイスは、核酸が０コピーのネガティブコントロールの充填部位、核酸が１０コピー以上のポジティブコントロールの充填部位を有していることが好ましい。
ネガティブコントロールで検出が検知されたとき、及びポジティブコントロールで不検出が検知されたときは、検出系（試薬や装置）に異常があることが示唆される。ネガティブコントロール及びポジティブコントロールを設けておくことにより、問題が生じたときにユーザーは直ちにそれに気づくことができ、測定を中止して問題がどこにあるかの点検を行うことができる。
【００４６】
前記充填部位内の核酸、プライマー、及び増幅試薬の状態は、特に限定はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、溶液又は固体のいずれかの状態であってもよい。使用性の観点からは、特に、溶液状態であることが好ましい。溶液状態であると、使用者はすぐに試験に用いることができる。輸送上の観点からは、特に、固体状態であることが好ましく、乾燥状態がより好ましい。固体乾燥状態であると、分解酵素等による増幅試薬可能な試薬の分解の反応速度を低減化することができ、核酸、プライマー、及び増幅試薬の保存性を向上させることができる。
また、固体乾燥状態のデバイスの使用直前に、バッファーや水に溶解させることで、すぐに反応液として用いることができるよう、適正量の核酸、プライマー、及び増幅試薬が充填されていることが望ましい。
乾燥方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、凍結乾燥、加熱乾燥、熱風乾燥、真空乾燥、蒸気乾燥、吸引乾燥、赤外線乾燥、バレル乾燥、スピン乾燥などが挙げられる。
【００４７】
ここで、図１Ａは、本発明の核酸解析方法に係るデバイス（核酸試料充填容器と称することもある）１の一例を示す斜視図である。図１Ｂは、本発明の核酸解析方法に係るデバイス１の他の一例を示す斜視図である。図２は、図１Ｂのデバイス１の側面図である。デバイス１は、基材２に複数の充填部位（ウェル）３が設けられており、充填部位（ウェル）３内（充填部位（ウェル）を構成する充填部位（ウェル）壁面で囲まれる内側の空間領域）に核酸としての核酸４が特定コピー数で充填されている（核酸試料充填部位と称することもある）。このデバイス１は核酸の特定コピー数及び当該核酸の特定コピー数の不確かさの情報が関連付けられている。なお、図１Ｂ及び図２はデバイス１が、密閉部材５にて充填部位（ウェル）３の開口部が被われている例を示している。
例えば、図１Ｂ及び図２に示すように、各充填部位（ウェル）３に充填する試薬の数とその数の不確かさ（確からしさ）の情報、もしくはこれらの情報と関連付けられた情報を記憶するＩＣチップまたはバーコード（識別手段６）が、密閉部材５と基材２との間で且つ充填部位（ウェル）の開口部以外の位置に配置されている。これは、識別手段の意図しない改変等を防止するのに好適である。
また、デバイスが識別手段を有することで、識別手段を有しない一般の充填部位（ウェル）プレートとの区別可能である。このため、取り違えを防止することが可能である。
【００４８】
図３は、本発明の核酸解析方法に係るデバイスの核酸を充填する充填部位（ウェル）の位置の一例を示す図である。図３中の充填部位（ウェル）内の数字は核酸の特定コピー数を表す。図３中の数字が記載していない充填部位（ウェル）は試料やコントロール測定用の充填部位（ウェル）である。
図４は、本発明の核酸解析方法に係るデバイスの核酸を充填する充填部位（ウェル）の位置の他の一例を示す図である。図４中の充填部位（ウェル）内の数字は核酸の特定コピー数を表す。図４中の数字が記載していない充填部位（ウェル）は試料やコントロール測定用の充填部位（ウェル）である。
【００４９】
−核酸−
核酸とは、プリン又はピリミジンから導かれる含窒素塩基、糖、及びリン酸が規則的に結合した高分子の有機化合物を意味し、核酸の断片、あるいはこれら核酸又はその断片のアナログなども含まれる。
核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなどが挙げられる。
【００５０】
核酸又は核酸断片としては、生物から得られる天然物又はそれらの加工物であってもよく、また、遺伝子組換技術を利用して製造されたもの、化学的に合成された人工合成核酸などでもよい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。人工合成核酸とすることにより、不純物が少なくなり、低分子化することが可能となるため、初期反応効率を向上させることができる。
なお、人工合成核酸としては、天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡと同様の構成成分（塩基、デオキシリボース、リン酸）からなる核酸を人工的に合成した核酸を意味する。人工合成核酸としては、例えば、タンパク質をコードする塩基配列を有する核酸に限らず、任意の塩基配列を有する核酸を含む。
【００５１】
核酸又は核酸断片のアナログとしては、核酸又は核酸断片に非核酸成分を結合させたもの、核酸又は核酸断片を蛍光色素や同位元素等の標識剤で標識したもの（例えば、蛍光色素や放射線同位体で標識されたプライマーやプローブ）、核酸又は核酸断片を構成するヌクレオチドの一部の化学構造を変化させた人工核酸（例えば、ＰＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡなど）。
【００５２】
核酸の形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖核酸、一本鎖核酸、部分的に二本鎖又は一本鎖核酸などが挙げられ、環状又は直鎖状のプラスミドも使用することができる。
また、核酸は修飾又は変異されていてもよい。
【００５３】
核酸は、標的の塩基配列を有することが好ましい。
標的の塩基配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、感染症検査に用いられる塩基配列、自然界には存在しない非天然の塩基配列、動物細胞由来の塩基配列、植物細胞由来の塩基配列、真菌の細胞由来の塩基配列、細菌由来の塩基配列、ウイルス由来の塩基配列などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
非天然の塩基配列を用いる場合、ＧＣ含有率が標的の塩基配列の３０％以上７０％以下であることが好ましく、ＧＣ含量が一定であることが好ましい（例えば、配列番号６など参照）。
標的の塩基配列の塩基長としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、２０塩基対（又はｍｅｒ）以上１０，０００塩基対（又はｍｅｒ）以下の塩基長などが挙げられる。
感染症検査に用いられる塩基配列を用いる場合、その感染症特有の塩基配列を含んでいれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、公定法や通知法で指定されている塩基配列を含んでいることが好ましい。
【００５４】
核酸としては、使用する細胞由来の核酸であってもよく、遺伝子導入により導入された核酸であってもよい。核酸として、遺伝子導入により導入された核酸、及びプラスミドを使用する場合は、１細胞に１コピーの核酸が導入されていることを確認することが好ましい。１コピーの核酸が導入されていることの確認方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シーケンサ、ＰＣＲ法、サザンブロット法などを用いて確認することができる。
【００５５】
遺伝子導入により導入される標的の塩基配列を有する核酸の種類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。なお、遺伝子導入により導入される核酸の数が１種類の場合にも、目的に応じてタンデムに同様の塩基配列を導入してもよい。
【００５６】
遺伝子導入の方法としては、特定の核酸配列が狙いの場所に狙いのコピー数導入できれば特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ＴＡＬＥＮ、Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｆｌｉｐ−ｉｎ、Ｊｕｍｐ−ｉｎなどが挙げられる。これらの中でも、酵母菌の場合は、効率の高さ、及び制御のしやすさの点から、相同組換えが好ましい。
【００５７】
−担体−
核酸は、担体に担持された状態で扱われることが好ましい。なお、核酸が核酸である場合には、核酸が粒子形状をした担体(担体粒子）に担持（より好ましくは内包）されている態様などが好ましい。
担体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞、樹脂、リポソーム、マイクロカプセル、金属粒子、磁性粒子、セラミック粒子、高分子粒子、タンパク質粒子などが挙げられる。
【００５８】
−−細胞−−
細胞は、核酸（例えば、核酸）を有し、生物体を形成する構造的及び機能的単位を意味する。
細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、すべての細胞について使用することができる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００５９】
真核細胞としては、特に制限はなく、目的応じて適宜選択することができ、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌、藻類、原生動物などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、動物細胞、真菌が好ましい。
【００６０】
接着性細胞としては、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、組織や器官から直接採取した初代細胞を何代か継代させたものでもよく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分化した細胞、未分化の細胞などが挙げられる。
【００６１】
分化した細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞；星細胞；クッパー細胞；血管内皮細胞；類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；繊維芽細胞；骨芽細胞；砕骨細胞；歯根膜由来細胞；表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞；消化管上皮細胞；子宮頸部上皮細胞；角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞；ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞；腎細胞；膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞；骨細胞などが挙げられる。
【００６２】
未分化の細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞；単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞；ｉＰＳ細胞などが挙げられる。
【００６３】
真菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カビ、酵母菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞周期を調節することができ、１倍体を使用することができる点から、酵母菌が好ましい。
細胞周期とは、細胞が増えるとき、細胞分裂が生じ、細胞分裂で生じた細胞（娘細胞）が再び細胞分裂を行う細胞（母細胞）となって新しい娘細胞を生み出す過程を意味する。
【００６４】
酵母菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、Ｇ０／Ｇ１期に同調して同調培養され、Ｇ１期で固定されているものが好ましい。
また、酵母菌としては、例えば、細胞周期をＧ１期に制御するフェロモン（性ホルモン）の感受性が増加したＢａｒ−１欠損酵母が好ましい。酵母菌がＢａｒ−１欠損酵母であると、細胞周期が制御できていない酵母菌の存在比率を低くすることができるため、充填部位（ウェル）内に収容された細胞の特定の核酸の数の増加等を防ぐことができる。
【００６５】
原核細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真正細菌、古細菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００６６】
細胞としては、死細胞が好ましい。死細胞であると、分取後に細胞分裂が起こることを防ぐことができる。
細胞としては、光を受光したときに発光可能な細胞であることが好ましい。光を受光したときに発光可能な細胞であると、細胞の数を高精度に制御して充填部位（ウェル）内に着弾させることができる。
受光とは、光を受けることを意味する。
光学センサとは、人間の目で見ることができる可視光線と、それより波長の長い近赤外線や短波長赤外線、熱赤外線領域までの光のいずれかの光をレンズで集め、対象物である細胞の形状などを画像データとして取得する受動型センサを意味する。
【００６７】
−−光を受光したときに発光可能な細胞−−
光を受光したときに発光可能な細胞としては、光を受光したときに発光可能であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、蛍光色素によって染色された細胞、蛍光タンパク質を発現した細胞、蛍光標識抗体により標識された細胞などが挙げられる。
細胞における蛍光色素による染色部位、蛍光タンパク質の発現部位、又は蛍光標識抗体による標識部位としては、特に制限はなく、細胞全体、細胞核、細胞膜などが挙げられる。
【００６８】
−−蛍光色素−−
蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類が好ましく、エオシン、エバンスブルー、トリパンブルー、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミン１２３がより好ましい。
【００６９】
蛍光色素としては、市販品を用いることができ、市販品としては、例えば、商品名：ＥｏｓｉｎＹ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：エバンスブルー（和光純薬工業株式会社製）、商品名：トリパンブルー（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミン６Ｇ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミンＢ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミン１２３（和光純薬工業株式会社製）などが挙げられる。
【００７０】
−−蛍光タンパク質−−
蛍光タンパク質としては、例えば、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＦＰ１、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ、ＣＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＰＳ−ＣＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ２、Ｋａｅｄｅ、ＥｏｓＦＰ、ＫｉｋｕｍｅＧＲなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００７１】
−−蛍光標識抗体−−
蛍光標識抗体としては、蛍光標識されていれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰＥなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００７２】
細胞の体積平均粒径としては、遊離状態において、３０μｍ以下が好ましく、１０μｍ以下がより好ましく、７μｍ以下が特に好ましい。体積平均粒径が、３０μｍ以下であれば、インクジェット法やセルソーターなどの液滴吐出手段に好適に用いることができる。
【００７３】
細胞の体積平均粒径としては、例えば、下記の測定方法で測定することができる。
作製した染色済み酵母分散液から１０μＬ取り出してＰＭＭＡ製プラスチックスライドに載せ、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いることにより体積平均粒径を測定することができる。なお、細胞数も同様の測定方法により求めることができる。
【００７４】
細胞懸濁液における細胞の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５×１０４個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下が好ましく、５×１０４個／ｍＬ以上５×１０７個／ｍＬ以下がより好ましい。細胞数が、５×１０４個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下であると、吐出した液滴中に細胞を確実に含むことができる。細胞数としては、体積平均粒径の測定方法と同様にして、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定することができる。
【００７５】
核酸を有する細胞の細胞数は、複数であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７６】
−樹脂−
樹脂としては、核酸（例えば、核酸）を担持することができれば、その材質、形状、大きさ、構造については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７７】
−リポソーム−
リポソームとは、脂質分子を含む脂質二重層から形成される脂質小胞体であり、具体的には、脂質分子の疎水性基と親水性基の極性に基づいて生じる脂質二重層により外界から隔てられた空間を有する閉鎖された脂質を含む小胞体を意味する。
リポソームは、脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、その閉鎖小胞の空間内に水相（内水相）を有する。内水相には、水等が含まれる。リポソームはシングルラメラ（単層ラメラ、ユニラメラ、二重層膜が一重）であっても、多層ラメラ（マルチラメラ、タマネギ状の構造をした多数の二重層膜で、個々の層は水様の層で仕切られている）であってもよい。
リポソームとしては、核酸（例えば、核酸）を内包することのできるリポソームが好ましく、その形態は特に限定されない。「内包」とは、リポソームに対して核酸が内水相および膜自体に含まれる形態をとることを意味する。例えば、膜で形成された閉鎖空間内に核酸を封入する形態、膜自体に内包する形態などが挙げられ、これらの組合せでもよい。
リポソームの大きさ（平均粒子径）は、核酸（例えば、核酸）を内包することができれば特に限定されないが、球状またはそれに近い形態をとることが好ましい。
リポソームの脂質二重層を構成する成分（膜成分）は、脂質から選ばれる。脂質として、水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒に溶解するものであれば任意に使用することができる。脂質として、具体的には、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類及びそれらの誘導体等が挙げられる。これらの成分は、単一種又は複数種の成分から構成されてよい。
【００７８】
−マイクロカプセル−
マイクロカプセルとは、壁材と中空構造とを有する微小な粒体を意味し、中空構造に核酸（例えば、核酸）を内包することができる。
マイクロカプセルとしては、特に制限はなく、適宜目的に応じて、壁材、大きさ等を選択することができる。
マイクロカプセルの壁材としては、例えば、ポリウレタン樹脂、ポリ尿素、ポリ尿素−ポリウレタン樹脂、尿素−ホルムアルデヒド樹脂、メラミン−ホルムアルデヒド樹脂、ポリアミド、ポリエステル、ポリスルホンアミド、ポリカーボネート、ポリスルフィネート、エポキシリ、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、酢酸ビニル、ゼラチンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
マイクロカプセルの大きさとしては、核酸（例えば、核酸）を内包することができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
マイクロカプセルの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｉｎ−ｓｉｔｕ法、界面重合法、コアセルベーション法などが挙げられる。
【００７９】
その他の核酸の形態としては、前述の核酸分子の溶液又は微小領域によって微小区画化された分散液であってもよい。溶液又は分散液の媒質としては、水やエタノール、ＤＭＳＯ、アセトン、ＤＭＦといった水溶性の溶媒であることが好ましい。微小領域としては、例えば、ドロップレット、エマルジョンなどが挙げられる。
【００８０】
＜デバイスの製造方法＞
以下、核酸として特定の核酸を有する細胞を用いたデバイスの製造方法について説明する。
本発明の核酸解析方法に係るデバイスの製造方法は、特定の核酸を有する複数の細胞、及び溶剤を含む細胞懸濁液を生成する細胞懸濁液生成工程と、細胞懸濁液を液滴として吐出することによりプレートの充填部位（ウェル）内に液滴を順次着弾させる液滴着弾工程と、液滴の吐出後、かつ液滴の充填部位（ウェル）への着弾前に、前記液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数する細胞数計数工程と、充填部位（ウェル）内の細胞から核酸を抽出する核酸抽出工程と、を含み、各工程の不確かさを算出する工程、出力工程、記録工程を含むことが好ましく、更に必要に応じてその他の工程を含む。
【００８１】
＜＜細胞懸濁液生成工程＞＞
細胞懸濁液生成工程は、特定の核酸を有する複数の細胞、及び溶剤を含む細胞懸濁液を生成する工程である。
溶剤とは、細胞を分散させるために用いる液体を意味する。
細胞懸濁液における懸濁とは、細胞が溶剤中に分散して存在する状態を意味する。
生成とは、作り出すことを意味する。
【００８２】
−細胞懸濁液−
細胞懸濁液は、特定の核酸を有する複数の細胞、及び溶剤を含み、添加剤を含むことが好ましく、更に必要に応じてその他の成分を含む。
特定の核酸を有する複数の細胞については、上述したとおりである。
【００８３】
−−溶剤−−
溶剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、培養液、分離液、希釈液、緩衝液、有機物溶解液、有機溶剤、高分子ゲル溶液、コロイド分散液、電解質水溶液、無機塩水溶液、金属水溶液、及びこれらの混合液体などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、水、緩衝液が好ましく、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）がより好ましい。
【００８４】
−−添加剤−−
添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、界面活性剤、核酸、樹脂などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００８５】
界面活性剤は、細胞同士の凝集を防止し、連続吐出安定性を向上することができる。
【００８６】
界面活性剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、添加量にもよるが、タンパク質を変性及び失活させない点から、非イオン性界面活性剤が好ましい。
【００８７】
イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、脂肪酸ナトリウムが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）がより好ましい。
【００８８】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルグリコシド、アルキルポリオキシエチレンエーテル（Ｂｒｉｊシリーズ等）、オクチルフェノールエトキシレート（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘシリーズ、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡシリーズ、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐシリーズ、Ｎｉｋｋｏｌ  ＯＰシリーズ等）、ポリソルベート類（Ｔｗｅｅｎ２０等のＴｗｅｅｎシリーズなど）、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、アルキルマルトシド、ショ糖脂肪酸エステル、グリコシド脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリドなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、ポリソルベート類が好ましい。
【００８９】
界面活性剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、細胞懸濁液全量に対して、０．００１質量％以上３０質量％以下が好ましい。含有量が、０．００１質量％以上であると、界面活性剤の添加による効果を得ることができ、３０質量％以下であると、細胞の凝集を抑制することができるため、細胞懸濁液中の核酸のコピー数を厳密に制御することができる。
【００９０】
核酸としては、検出対象の核酸の検出に影響しないものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣｏｌＥ１  ＤＮＡなどが挙げられる。核酸であると、標的の塩基配列を有する核酸が、充填部位（ウェル）の壁面などに付着することを防ぐことができる。
【００９１】
樹脂としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンイミドなどが挙げられる。
【００９２】
−−その他の材料−−
その他の材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、架橋剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、分散剤などが挙げられる。
【００９３】
［細胞を分散する方法］
細胞を分散する方法としては、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ビーズミル等のメディア方式、超音波ホモジナイザー等の超音波方式、フレンチプレス等の圧力差を利用する方式などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞へのダメージが少ないことから超音波方式がより好ましい。メディア方式では、解砕能力が強く、細胞膜や細胞壁を破壊する可能性やメディアがコンタミネーションとして混入することがある。
【００９４】
［細胞のスクリーニング方法］
細胞のスクリーニング方法としては、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、湿式分級、セルソーター、フィルタによるスクリーニングなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞へのダメージが少ないことから、セルソーター、フィルタによるスクリーニングが好ましい。
【００９５】
細胞は、細胞の細胞周期を測定することにより、細胞懸濁液に含まれる細胞数から標的の塩基配列を有する核酸の数を推定することが好ましい。
細胞周期を測定するとは、細胞分裂による細胞数を数値化することを意味する。
核酸の数を推定するとは、細胞数から、核酸のコピー数を求めることを意味する。
【００９６】
計数対象が細胞数ではなく標的の塩基配列が何個入っているかであってもよい。通常は、標的の塩基配列は細胞１個につき１つの領域が入っているものを選択する、あるいは遺伝子組み換えにより導入するため、標的の塩基配列の数は細胞数と等しいと考えてよい。ただし、細胞は特定の周期で細胞分裂を起こすために細胞内で核酸の複製が行われる。細胞周期は細胞の種類によって異なるが、細胞懸濁液から所定量の溶液を抜き取り複数細胞の周期を測定することによって、細胞１個中に含まれる標的の塩基配列数に対する期待値及びその不確かさを算出することが可能である。これは、例えば、核染色した細胞をフローサイトメーターによって観測することによって可能である。
不確かさとは、測定対象の製造に係る操作、機器などに起因する測定結果のばらつきの情報を意味する。
算出とは、計算して求める数値を出すことを意味する。
【００９７】
図５は、ＤＮＡ複製済みの細胞の頻度と、蛍光強度との関係の一例を示すグラフである。図５に示すように、ヒストグラム上で標的の塩基配列の複製有無により２つのピークが現れるため、ＤＮＡ複製済みの細胞がどの程度の割合で存在するかを算出することが可能である。この算出結果から１細胞中に含まれる平均的な標的の塩基配列数を算出することが可能であり、前述の細胞数計数結果に乗じることにより、標的の塩基配列の推定数を算出することが可能である。
また、細胞懸濁液を作製する前に細胞周期を制御する処理を行うことが好ましく、前述のような複製が起きる前、又は後の状態に揃えることによって、標的の塩基配列の数を細胞数からより精度良く算出することが可能になる。
【００９８】
推定する特定コピー数は、不確かさを算出することが好ましい。不確かさを算出することにより、これらの数値に基づき不確かさを分散又は標準偏差として表現して出力することが可能である。複数因子の影響を合算する場合には、一般的に用いられる標準偏差の二乗和平方根を用いることが可能である。例えば、因子として吐出した細胞数の正答率、細胞内のＤＮＡ数、吐出された細胞が充填部位（ウェル）内に着弾する着弾率などを用いることができる。これらの中で影響の大きい項目を選択して算出することもできる。
【００９９】
＜＜液滴着弾工程＞＞
液滴着弾工程は、細胞懸濁液を液滴として吐出することによりデバイスの充填部位（ウェル）内に液滴を順次着弾させる工程である。
液滴とは、表面張力によりまとまった液体のかたまりを意味する。
吐出とは、細胞懸濁液を液滴として飛翔させることを意味する。
順次とは、次々に順序どおりにすることを意味する。
着弾とは、液滴を充填部位（ウェル）に到達させることを意味する。
【０１００】
吐出手段としては、細胞懸濁液を液滴として吐出する手段（以下、「吐出ヘッド」とも称することがある）を好適に用いることができる。
【０１０１】
細胞懸濁液を液滴として吐出する方式としては、例えば、インクジェット法におけるオンデマンド方式、コンティニュアス方式などが挙げられる。これらの中でもコンティニュアス方式の場合、安定的な吐出状態に至るまでの空吐出、液滴量の調整、充填部位（ウェル）間を移動する際にも連続的に液滴形成を行い続ける等の理由から、用いる細胞懸濁液のデッドボリュームが多くなる傾向にある。本発明では細胞数を調整する観点からデッドボリュームによる影響を低減させることが好ましく、そのため上記２つの方式では、オンデマンド方式の方がより好適である。
【０１０２】
オンデマンド方式としては、例えば、液体に圧力を加えることによって液体を吐出する圧力印加方式、加熱による膜沸騰によって液体を吐出するサーマル方式、静電引力によって液滴を引っ張ることによって液滴を形成する静電方式等の既知の複数の方式などが挙げられる。これらの中でも、以下の理由から、圧力印加方式が好ましい。
【０１０３】
静電方式は、細胞懸濁液を保持して液滴を形成する吐出部に対向して電極を設置する必要がある。本発明のプレート生成方法では、液滴を受けるためのプレートが対向して配置されており、プレート構成の自由度を上げるため電極の配置は無いほうが好ましい。
サーマル方式は、局所的な加熱が発生するため生体材料である細胞への影響や、ヒーター部への焦げ付き（コゲーション）が懸念される。熱による影響は、含有物やプレートの用途に依存するため、一概に除外する必要はないが、圧力印加方式は、サーマル方式よりヒーター部への焦げ付きの懸念がないという点から好ましい。
【０１０４】
圧力印加方式としては、ピエゾ素子を用いて液体に圧力を加える方式、電磁バルブ等のバルブによって圧力を加える方式などが挙げられる。細胞懸濁液の液滴吐出に使用可能な液滴生成デバイスの構成例を図６Ａ〜図６Ｃに示す。
図６Ａは、電磁バルブ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。電磁バルブ方式の吐出ヘッドは、電動機１３ａ、電磁弁１１２、液室１１ａ、細胞懸濁液３００ａ、及びノズル１１１ａを有する。
電磁バルブ方式の吐出ヘッドとしては、例えば、ＴｅｃｈＥｌａｎ社のディスペンサなどを好適に用いることができる。
また、図６Ｂは、ピエゾ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。ピエゾ方式の吐出ヘッドは、圧電素子１３ｂ、液室１１ｂ、細胞懸濁液３００ｂ、及びノズル１１１ｂを有する。
ピエゾ方式の吐出ヘッドとしては、Ｃｙｔｅｎａ社のシングルセルプリンターなどを好適に用いることができる。
これらの吐出ヘッドのいずれも用いることが可能であるが、電磁バルブによる圧力印加方式では高速に繰り返し液滴を形成することができないため、プレートの生成のスループットを上げるためにはピエゾ方式を用いることが好ましい。また、一般的な圧電素子１３ｂを用いたピエゾ方式の吐出ヘッドでは、沈降によって細胞濃度のムラが発生することや、ノズル詰まりが生じることが問題として生じることがある。
このため、より好ましい構成として図６Ｃに示した構成などが挙げられる。図６Ｃは、図６Ｂにおける圧電素子を用いたピエゾ方式の吐出ヘッドの変形例の模式図である。図６Ｃの吐出ヘッドは、圧電素子１３ｃ、液室１１ｃ、細胞懸濁液３００ｃ、及びノズル１１１ｃを有する。
図６Ｃの吐出ヘッドでは、図示していない制御装置からの圧電素子１３ｃに対して電圧印加することにより、紙面横方向に圧縮応力が加わりメンブレンを紙面上下方向に変形させることができる。
【０１０５】
オンデマンド方式以外の方式としては、例えば、連続的に液滴を形成させるコンティニュアス方式などが挙げられる。コンティニュアス方式では、液滴を加圧してノズルから押し出す際に圧電素子やヒーターによって定期的なゆらぎを与え、それによって微小な液滴を連続的に作り出すことができる。更に、飛翔中の液滴の吐出方向に電圧を印加することによって制御することにより、充填部位（ウェル）に着弾させるか、回収部に回収するかを選ぶことも可能である。このような方式は、セルソーター、又はフローサイトメーターで用いられており、例えば、ソニー株式会社製の装置名：セルソーターＳＨ８００を用いることができる。
【０１０６】
図７Ａは、圧電素子に印加する電圧の一例を示す模式図である。また、図７Ｂは、圧電素子に印加する電圧の他の一例を示す模式図である。図７Ａは、液滴を形成するための駆動電圧を示す。電圧（ＶＡ、ＶＢ、ＶＣ）の強弱により、液滴を形成することができる。図７Ｂは、液滴の吐出を行わずに細胞懸濁液を撹拌するための電圧を示している。
【０１０７】
液滴を吐出しない期間中に、液滴を吐出するほどには強くない複数のパルスを入力することによって、液質内の細胞懸濁液を撹拌することが可能であり、細胞沈降による濃度分布の発生を抑制することができる。
【０１０８】
本発明において使用することができる吐出ヘッドの液滴形成動作に関して、以下に説明する。
吐出ヘッドは、圧電素子に形成された上下電極に、パルス状の電圧を印加することにより液滴を吐出することができる。図８Ａ〜図８Ｃは、それぞれのタイミングにおける液滴の状態を示す模式図である。
図８Ａは、まず、圧電素子１３ｃに電圧を印加することにより、メンブレン１２ｃが急激に変形することによって、液室１１ｃ内に保持された細胞懸濁液とメンブレン１２ｃとの間に高い圧力が発生し、この圧力によってノズル部から液滴が外に押し出される。
次に、図８Ｂに示すように、圧力が上方に緩和するまでの時間、ノズル部からの液押し出しが続き液滴が成長する。
最後に、図８Ｃに示すように、メンブレン１２ｃが元の状態に戻る際に細胞懸濁液とメンブレン１２ｃとの界面近傍の液圧力が低下し、液滴３１０’が形成される。
【０１０９】
デバイスの製造方法では、充填部位（ウェル）が形成されたプレートを移動可能なステージ上に固定し、ステージの駆動と吐出ヘッドとからの液滴形成を組み合わせることにより、凹部に順次液滴を着弾させる。ここで、ステージの移動としてプレートを移動させる方法を示したが、当然のことながら吐出ヘッドを移動させてもよい。
【０１１０】
プレートとしては、特に制限はなく、バイオ分野において一般的に用いられる充填部位（ウェル）が形成されたものを用いることが可能である。
プレートにおける充填部位（ウェル）の数は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、単数であってもよく、複数であってもよい。
【０１１１】
図９は、プレートの充填部位（ウェル）内に順次液滴を着弾させるための分注装置４００の一例を示す概略図である。
図９に示すように、液滴を着弾させるための分注装置４００は、液滴形成装置４０１と、プレート７００と、ステージ８００と、制御装置９００とを有している。
【０１１２】
分注装置４００において、プレート７００は、移動可能に構成されたステージ８００上に配置されている。プレート７００には液滴形成装置４０１の吐出ヘッドから吐出された液滴３１０が着滴する複数の充填部位（ウェル）７１０（凹部）が形成されている。制御装置９００は、ステージ８００を移動させ、液滴形成装置４０１の吐出ヘッドとそれぞれの充填部位（ウェル）７１０との相対的な位置関係を制御する。これにより、液滴形成装置４０１の吐出ヘッドからそれぞれの充填部位（ウェル）７１０中に順次、蛍光染色細胞３５０を含む液滴３１０を吐出することができる。
【０１１３】
制御装置９００は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、メインメモリ等を含む構成とすることができる。この場合、制御装置９００の各種機能は、ＲＯＭ等に記録されたプログラムがメインメモリに読み出されてＣＰＵにより実行されることによって実現できる。ただし、制御装置９００の一部又は全部は、ハードウェアのみにより実現されてもよい。又、制御装置９００は、物理的に複数の装置等により構成されてもよい。
【０１１４】
吐出する液滴としては、充填部位（ウェル）内に細胞懸濁液を着弾させる際に、複数の水準を得るように液滴を充填部位（ウェル）内に着弾させることが好ましい。
複数の水準とは、標準となる複数の基準を意味する。
複数の水準としては、充填部位（ウェル）内に特定の核酸を有する複数の細胞が所定の濃度勾配を有することが好ましい。濃度勾配を有することにより、検量線用試薬として好適に使用することができる。複数の水準は、センサによって計数される値を用いて制御することができる。
【０１１５】
プレートとしては、１穴マイクロチューブ、８連チューブ、９６穴、３８４穴の充填部位（ウェル）プレートなどを用いることが好ましいが、充填部位（ウェル）が複数である場合には、これらのプレートにおける充填部位（ウェル）には同じ個数の細胞を分注することも可能であるし、異なる水準の個数を入れることも可能である。また、細胞が含まれない充填部位（ウェル）が存在していてもよい。例えば、細胞（又は核酸）が、おおよそ１個、２個、４個、８個、１６個、３２個、６４個の７水準で分注したプレートを作製することが考えられる。
【０１１６】
＜＜細胞数計数工程＞＞
細胞数計数工程は、液滴の吐出後、かつ液滴の充填部位（ウェル）への着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数する工程である。
センサとは、自然現象や人工物の機械的・電磁気的、熱的、音響的、又は化学的性質、或いはそれらにより示される空間情報・時間情報を、何らかの科学的原理を応用して、人間や機械が扱い易い別媒体の信号に置き換える装置を意味する。
計数とは、数を数えることを意味する。
【０１１７】
細胞数計数工程としては、液滴の吐出後、かつ液滴の充填部位（ウェル）への着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数すれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、吐出前に細胞を観測する処理、着弾後の細胞をカウントする処理を含んでもよい。
【０１１８】
液滴の吐出後、かつ液滴の充填部位（ウェル）への着弾前に、液滴に含まれる細胞数の計数としては、液滴がプレートの充填部位（ウェル）に確実に入ることが予測される充填部位（ウェル）開口部の直上の位置にあるタイミングにて液滴中の細胞を観測することが好ましい。
【０１１９】
液滴中の細胞を観測する方法としては、例えば、光学的に検出する方法、電気的・磁気的に検出方法などが挙げられる。
【０１２０】
−光学的に検出する方法−
図１０、図１４、及び図１５を用いて、光学的に検出する方法に関して以下に述べる。
図１０は、液滴形成装置４０１の一例を示す模式図である。図１４、及び図１５は、液滴形成装置４０１Ａ、４０１Ｂの他の一例を示す模式図である。図１０に示すように、液滴形成装置４０１は、吐出ヘッド（液滴吐出手段）１０と、駆動手段２０と、光源３０と、受光素子６０と、制御手段７０とを有する。
【０１２１】
図１０では、細胞懸濁液として細胞を特定の色素によって蛍光染色した後に所定の溶液に分散した液を用いており、吐出ヘッドから形成した液滴に光源から発せられる特定の波長を有する光を照射し細胞から発せられる蛍光を受光素子によって検出することによって計数を行う。このとき、蛍光色素によって細胞を染色する方法に加え、細胞中に元々含まれる分子が発する自家蛍光を利用してもよいし、細胞に蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ））を生産するための遺伝子を予め導入しておき細胞が蛍光を発するようにしておいてもよい。
光を照射とは、光をあてることを意味する。
【０１２２】
吐出ヘッド１０は、液室１１と、メンブレン１２と、駆動素子１３とを有しており、蛍光染色細胞３５０を懸濁した細胞懸濁液３００を液滴として吐出することができる。
【０１２３】
液室１１は、蛍光染色細胞３５０を懸濁した細胞懸濁液３００を保持する液体保持部であり、下面側には貫通孔であるノズル１１１が形成されている。液室１１は、例えば、金属やシリコン、セラミック等から形成することができる。蛍光染色細胞３５０としては、蛍光色素によって染色された無機微粒子や有機ポリマー粒子などが挙げられる。
【０１２４】
メンブレン１２は、液室１１の上端部に固定された膜状部材である。メンブレン１２の平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。
【０１２５】
駆動素子１３は、メンブレン１２の上面側に設けられている。駆動素子１３の形状は、メンブレン１２の形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン１２の平面形状が円形である場合には、円形の駆動素子１３を設けることが好ましい。
【０１２６】
駆動素子１３に駆動手段２０から駆動信号を供給することにより、メンブレン１２を振動させることができる。メンブレン１２の振動により、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０を、ノズル１１１から吐出させることができる。
【０１２７】
駆動素子１３として圧電素子を用いる場合には、例えば、圧電材料の上面及び下面に電圧を印加するための電極を設けた構造とすることができる。この場合、駆動手段２０から圧電素子の上下電極間に電圧を印加することによって紙面横方向に圧縮応力が加わり、メンブレン１２を紙面上下方向に振動させることができる。圧電材料としては、例えば、ジルコン酸チタン酸鉛（ＰＺＴ）を用いることができる。この他にも、ビスマス鉄酸化物、ニオブ酸金属物、チタン酸バリウム、或いはこれらの材料に金属や異なる酸化物を加えたもの等、様々な圧電材料を用いることができる。
【０１２８】
光源３０は、飛翔中の液滴３１０に光Ｌを照射する。なお、飛翔中とは、液滴３１０が液滴吐出手段１０から吐出されてから、着滴対象物に着滴するまでの状態を意味する。飛翔中の液滴３１０は、光Ｌが照射される位置では略球状となっている。又、光Ｌのビーム形状は略円形状である。
【０１２９】
ここで、液滴３１０の直径に対し、光Ｌのビーム直径が１０倍〜１００倍程度であることが好ましい。これは、液滴３１０の位置ばらつきが存在する場合においても、光源３０からの光Ｌを確実に液滴３１０に照射するためである。
【０１３０】
ただし、液滴３１０の直径に対し、光Ｌのビーム直径が１００倍を大きく超えることは好ましくない。これは、液滴３１０に照射される光のエネルギー密度が下がるため、光Ｌを励起光として発する蛍光Ｌｆの光量が低下し、受光素子６０で検出し難くなるからである。
【０１３１】
光源３０から発せられる光Ｌはパルス光であることが好ましく、例えば、固体レーザー、半導体レーザー、色素レーザー等が好適に用いられる。光Ｌがパルス光である場合のパルス幅は１０μｓ以下が好ましく、１μｓ以下がより好ましい。単位パルス当たりのエネルギーとしては、集光の有無等、光学系に大きく依存するが、概ね０．１μＪ以上が好ましく、１μＪ以上がより好ましい。
【０１３２】
受光素子６０は、飛翔中の液滴３１０に蛍光染色細胞３５０が含有されていた場合に、蛍光染色細胞３５０が光Ｌを励起光として吸収して発する蛍光Ｌｆを受光する。蛍光Ｌｆは、蛍光染色細胞３５０から四方八方に発せられるため、受光素子６０は蛍光Ｌｆを受光可能な任意の位置に配置することができる。この際、コントラストを向上するため、光源３０から出射される光Ｌが直接入射しない位置に受光素子６０を配置することが好ましい。
【０１３３】
受光素子６０は、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆを受光できる素子であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、液滴に特定の波長を有する光を照射して液滴内の細胞からの蛍光を受光する光学センサが好ましい。受光素子６０としては、例えば、フォトダイオード、フォトセンサ等の１次元素子が挙げられるが、高感度な測定が必要な場合には、光電子増倍管やアバランシェフォトダイオードを用いることが好ましい。受光素子６０として、例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、ゲートＣＣＤ等の２次元素子を用いてもよい。
【０１３４】
なお、光源３０が発する光Ｌと比較して蛍光染色細胞３５０の発する蛍光Ｌｆが弱いため、受光素子６０の前段（受光面側）に光Ｌの波長域を減衰させるフィルタを設置してもよい。これにより、受光素子６０において、非常にコントラストの高い蛍光染色細胞３５０の画像を得ることができる。フィルタとしては、例えば、光Ｌの波長を含む特定波長域を減衰させるノッチフィルタ等を用いることができる。
【０１３５】
また、前述のように、光源３０から発せられる光Ｌはパルス光であることが好ましいが、光源３０から発せられる光Ｌを連続発振の光としてもよい。この場合には、連続発振の光が飛翔中の液滴３１０に照射されるタイミングで受光素子６０が光を取り込み可能となるように制御し、受光素子６０に蛍光Ｌｆを受光させることが好ましい。
【０１３６】
制御手段７０は、駆動手段２０及び光源３０を制御する機能を有している。また、制御手段７０は、受光素子６０が受光した光量に基づく情報を入手し、液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数（ゼロである場合も含む）を計数する機能を有している。以下、図１１〜図１６を参照し、制御手段７０の動作を含む液滴形成装置４０１の動作について説明する。
【０１３７】
図１１は、図１０の液滴形成装置の制御手段のハードウェアブロックを例示する図である。図１２は、図１０の液滴形成装置の制御手段の機能ブロックを例示する図である。図１１は、液滴形成装置の動作の一例を示すフローチャートである。
【０１３８】
図１１に示すように、制御手段７０は、ＣＰＵ７１と、ＲＯＭ７２と、ＲＡＭ７３と、Ｉ／Ｆ７４と、バスライン７５とを有している。ＣＰＵ７１、ＲＯＭ７２、ＲＡＭ７３、及びＩ／Ｆ７４は、バスライン７５を介して相互に接続されている。
【０１３９】
ＣＰＵ７１は、制御手段７０の各機能を制御する。記憶手段であるＲＯＭ７２は、ＣＰＵ７１が制御手段７０の各機能を制御するために実行するプログラムや、各種情報を記憶している。記憶手段であるＲＡＭ７３は、ＣＰＵ７１のワークエリア等として使用される。また、ＲＡＭ７３は、所定の情報を一時的に記憶することができる。Ｉ／Ｆ７４は、液滴形成装置４０１を他の機器等と接続するためのインターフェイスである。液滴形成装置４０１は、Ｉ／Ｆ７４を介して、外部ネットワーク等と接続されてもよい。
【０１４０】
図１２に示すように、制御手段７０は、機能ブロックとして、吐出制御手段７０１と、光源制御手段７０２と、細胞数計数手段（細胞数検知手段）７０３とを有している。
【０１４１】
図１２及び図１３を参照しながら、液滴形成装置４０１の細胞数（粒子数）計数について説明する。まず、ステップＳ１１において、制御手段７０の吐出制御手段７０１は、駆動手段２０に吐出の指令を出す。吐出制御手段７０１から吐出の指令を受けた駆動手段２０は、駆動素子１３に駆動信号を供給してメンブレン１２を振動させる。メンブレン１２の振動により、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０が、ノズル１１１から吐出される。
【０１４２】
次に、ステップＳ１２において、制御手段７０の光源制御手段７０２は、液滴３１０の吐出に同期して（駆動手段２０から液滴吐出手段１０に供給される駆動信号に同期して）光源３０に点灯の指令を出す。これにより、光源３０が点灯し、飛翔中の液滴３１０に光Ｌを照射する。
【０１４３】
なお、ここで、同期するとは、液滴吐出手段１０による液滴３１０の吐出と同時に（駆動手段２０が液滴吐出手段１０に駆動信号を供給するのと同時に）発光することではなく、液滴３１０が飛翔して所定位置に達したときに液滴３１０に光Ｌが照射されるタイミングで、光源３０が発光することを意味する。つまり、光源制御手段７０２は、液滴吐出手段１０による液滴３１０の吐出（駆動手段２０から液滴吐出手段１０に供給される駆動信号）に対して、所定時間だけ遅延して発光するように光源３０を制御する。
【０１４４】
例えば、液滴吐出手段１０に駆動信号を供給した際に吐出する液滴３１０の速度ｖを予め測定しておく。そして、測定した速度ｖに基づいて液滴３１０が吐出されてから所定位置まで到達する時間ｔを算出し、液滴吐出手段１０に駆動信号を供給するタイミングに対して、光源３０が光を照射するタイミングをｔだけ遅延させる。これにより、良好な発光制御が可能となり、光源３０からの光を確実に液滴３１０に照射することができる。
【０１４５】
次に、ステップＳ１３において、制御手段７０の細胞数計数手段７０３は、受光素子６０からの情報に基づいて、液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数（ゼロである場合も含む）を計数する。ここで、受光素子６０からの情報とは、蛍光染色細胞３５０の輝度値（光量）や面積値である。
【０１４６】
細胞数計数手段７０３は、例えば、受光素子６０が受光した光量と予め設定された閾値とを比較して、蛍光染色細胞３５０の個数を計数することができる。この場合には、受光素子６０として１次元素子を用いても２次元素子を用いても構わない。
【０１４７】
受光素子６０として２次元素子を用いる場合は、細胞数計数手段７０３は、受光素子６０から得られた２次元画像に基づいて、蛍光染色細胞３５０の輝度値或いは面積を算出するための画像処理を行う手法を用いてもよい。この場合、細胞数計数手段７０３は、画像処理により蛍光染色細胞３５０の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、蛍光染色細胞３５０の個数を計数することができる。
【０１４８】
なお、蛍光染色細胞３５０は、細胞や染色細胞であってもよい。染色細胞とは、蛍光色素によって染色された細胞、又は、蛍光タンパク質を発現可能な細胞を意味する。
【０１４９】
染色細胞において、蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類、アゾ類などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、エオシン、エバンスブルー、トリパンブルー、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミン１２３がより好ましい。
蛍光タンパク質としては、例えば、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＦＰ１、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ、ＣＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＰＳ−ＣＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ２、Ｋａｅｄｅ、ＥｏｓＦＰ、ＫｉｋｕｍｅＧＲなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０１５０】
このように、液滴形成装置４０１では、蛍光染色細胞３５０を縣濁した細胞懸濁液３００を保持する液滴吐出手段１０に、駆動手段２０から駆動信号を供給して、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０を吐出させ、飛翔中の液滴３１０に光源３０から光Ｌを照射する。そして、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０が光Ｌを励起光として蛍光Ｌｆを発し、蛍光Ｌｆを受光素子６０が受光する。更に、受光素子６０からの情報に基づいて、細胞数計数手段７０３が、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を計数（カウント）する。
【０１５１】
つまり、液滴形成装置４０１では、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を実際にその場で観察するため、蛍光染色細胞３５０の個数の計数精度を従来よりも向上することが可能となる。又、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０に光Ｌを照射して蛍光Ｌｆを発光させて蛍光Ｌｆを受光素子６０で受光するため、高いコントラストで蛍光染色細胞３５０の画像を得ることが可能となり、蛍光染色細胞３５０の個数の誤計数の発生頻度を低減できる。
【０１５２】
図１４は、図１０の液滴形成装置４０１の変形例を示す模式図である。図１４に示すように、液滴形成装置４０１Ａは、受光素子６０の前段にミラー４０を配置した点が、液滴形成装置４０１（図１０参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
【０１５３】
このように、液滴形成装置４０１Ａでは、受光素子６０の前段にミラー４０を配置したことにより、受光素子６０のレイアウトの自由度を向上することができる。
【０１５４】
例えば、ノズル１１１と着滴対象物を近づけた際に、図１０のレイアウトでは着滴対象物と液滴形成装置４０１の光学系（特に受光素子６０）との干渉が発生するおそれがあるが、図１４のレイアウトにすることで、干渉の発生を回避することができる。
【０１５５】
図１４に示すように、受光素子６０のレイアウトを変更することにより、液滴３１０が着滴する着滴対象物とノズル１１１との距離（ギャップ）を縮めることが可能となり、着滴位置のばらつきを抑制することができる。その結果、分注の精度を向上することが可能となる。
【０１５６】
図２２は、図１０の液滴形成装置４０１の他の変形例を示す模式図である。図２２に示すように、液滴形成装置４０１Ｂは、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆ１を受光する受光素子６０に加え、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆ２を受光する受光素子６１を設けた点が、液滴形成装置４０１（図１０参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
【０１５７】
ここで、蛍光Ｌｆ１及びＬｆ２は、蛍光染色細胞３５０から四方八方に発せられる蛍光の一部を示している。受光素子６０及び６１は、蛍光染色細胞３５０から異なる方向に発せられる蛍光を受光できる任意の位置に配置することができる。なお、蛍光染色細胞３５０から異なる方向に発せられる蛍光を受光できる位置に３つ以上の受光素子を配置してもよい。又、各受光素子は同一仕様としてもよいし、異なる仕様としてもよい。
【０１５８】
受光素子が１つであると、飛翔する液滴３１０に複数個の蛍光染色細胞３５０が含まれる場合に、蛍光染色細胞３５０同士が重なることに起因して、細胞数計数手段７０３が液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を誤計数する（カウントエラーが発生する）おそれがある。
【０１５９】
図１６Ａ及び図１６Ｂは、飛翔する液滴に２個の蛍光染色細胞が含まれる場合を例示する図である。例えば、図１６Ａに示すように、蛍光染色細胞３５０１と３５０２とに重なりが発生する場合や、図１６Ｂに示すように、蛍光染色細胞３５０１と３５０２とに重なりが発生しない場合があり得る。受光素子を２つ以上設けることで、蛍光染色細胞が重なる影響を低減することが可能である。
【０１６０】
前述のように、細胞数計数手段７０３は、画像処理により蛍光粒子の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、蛍光粒子の個数を計数することができる。
【０１６１】
受光素子を２つ以上設置する場合，それぞれの受光素子から得られる輝度値或いは面積値のうち、最大値を示すデータを採択することで、カウントエラーの発生を抑制することが可能である。これに関して、図１７を参照して、より詳しく説明する。
【０１６２】
図１７は、粒子同士の重なりが生じない場合の輝度値Ｌｉと、実測される輝度値Ｌｅとの関係を例示する図である。図１７に示すように、液滴内の粒子同士の重なりがない場合には、Ｌｅ＝Ｌｉとなる。例えば、細胞１個の輝度値をＬｕとすると、細胞数／滴=１個の場合はＬｅ＝Ｌｕであり、粒子数／滴＝ｎ個の場合はＬｅ＝ｎＬｕである（ｎ：自然数）。
【０１６３】
しかし、実際には、ｎが２以上の場合には粒子同士の重なりが発生し得るため、実測される輝度値はＬｕ≦Ｌｅ≦ｎＬｕ（図１６Ａの網掛部分）となる。そこで、細胞数／滴＝ｎ個の場合、例えば閾値を（ｎＬｕ−Ｌｕ／２）≦閾値＜（ｎＬｕ＋Ｌｕ／２）と設定することができる。そして、複数の受光素子を設置する場合、それぞれの受光素子から得られたデータのうち最大値を示すものを採択することで、カウントエラーの発生を抑制することが可能となる。なお、輝度値に代えて面積値を用いてもよい。
【０１６４】
また、受光素子を複数設置する場合、得られる複数の形状データを基に、細胞数を推定するアルゴリズムにより粒子数を決定づけてもよい。
このように、液滴形成装置４０１Ｂでは、蛍光染色細胞３５０が異なる方向に発した蛍光を受光する複数の受光素子を有しているため、蛍光染色細胞３５０の個数の誤計数の発生頻度を更に低減できる。
【０１６５】
図１８は、図１０の液滴形成装置４０１の他の変形例を示す模式図である。図１８に示すように、液滴形成装置４０１Ｃは、液滴吐出手段１０が液滴吐出手段１０Ｃに置換された点が、液滴形成装置４０１（図１０参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
【０１６６】
液滴吐出手段１０Ｃは、液室１１Ｃと、メンブレン１２Ｃと、駆動素子１３Ｃとを有している。液室１１Ｃは、液室１１Ｃ内を大気に開放する大気開放部１１５を上部に有しており、細胞懸濁液３００中に混入した気泡を大気開放部１１５から排出可能に構成されている。
【０１６７】
メンブレン１２Ｃは、液室１１Ｃの下端部に固定された膜状部材である。メンブレン１２Ｃの略中心には貫通孔であるノズル１２１が形成されており、液室１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００はメンブレン１２Ｃの振動によりノズル１２１から液滴３１０として吐出される。メンブレン１２Ｃの振動の慣性により液滴３１０を形成するため、高表面張力（高粘度）の細胞懸濁液３００でも吐出が可能である。メンブレン１２Ｃの平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。
【０１６８】
メンブレン１２Ｃの材質としては特に限定はないが、柔らか過ぎるとメンブレン１２Ｃが簡単に振動し、吐出しないときに直ちに振動を抑えることが困難であるため、ある程度の硬さがある材質を用いることが好ましい。メンブレン１２Ｃの材質としては、例えば、金属材料やセラミック材料、ある程度硬さのある高分子材料等を用いることができる。
【０１６９】
特に、蛍光染色細胞３５０として細胞を用いる際には、細胞やタンパク質に対する付着性の低い材料であることが好ましい。細胞の付着性は一般的に材質の水との接触角に依存性があると言われており、材質の親水性が高い又は疎水性が高いときには細胞の付着性が低い。親水性の高い材料としては各種金属材料やセラミック（金属酸化物）を用いることが可能であり、疎水性が高い材料としてはフッ素樹脂等を用いることが可能である。
【０１７０】
このような材料の他の例としては、ステンレス鋼やニッケル、アルミニウム等や、二酸化ケイ素、アルミナ、ジルコニア等を挙げることができる。これ以外にも、材料表面をコーティングすることで細胞接着性を低下させることも考えられる。例えば、材料表面を前述の金属又は金属酸化物材料でコーティングすることや、細胞膜を模した合成リン脂質ポリマー（例えば、日油株式会社製、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ）によってコーティングすることが可能である。
【０１７１】
ノズル１２１は、メンブレン１２Ｃの略中心に実質的に真円状の貫通孔として形成されていることが好ましい。この場合、ノズル１２１の径としては特に限定はないが、蛍光染色細胞３５０がノズル１２１に詰まることを避けるため、蛍光染色細胞３５０の大きさの２倍以上とすることが好ましい。蛍光染色細胞３５０が例えば動物細胞、特にヒトの細胞である場合、ヒトの細胞の大きさは一般的に５μｍ〜５０μｍ程度であるため、ノズル１２１の径を、使用する細胞に合わせて１０μｍ以上が好ましく、１００μｍ以上がより好ましい。
【０１７２】
一方で、液滴が大きくなり過ぎると微小液滴を形成するという目的の達成が困難となるため、ノズル１２１の径は２００μｍ以下であることが好ましい。つまり、液滴吐出手段１０Ｃにおいては、ノズル１２１の径は、典型的には１０μｍ〜２００μｍの範囲となる。
【０１７３】
駆動素子１３Ｃは、メンブレン１２Ｃの下面側に形成されている。駆動素子１３Ｃの形状は、メンブレン１２Ｃの形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン１２Ｃの平面形状が円形である場合には、ノズル１２１の周囲に平面形状が円環状（リング状）の駆動素子１３Ｃを形成することが好ましい。駆動素子１３Ｃの駆動方式は、駆動素子１３と同様とすることができる。
【０１７４】
駆動手段２０は、メンブレン１２Ｃを振動させて液滴３１０を形成する吐出波形と、液滴３１０を形成しない範囲でメンブレン１２Ｃを振動させる撹拌波形とを駆動素子１３Ｃに選択的に（例えば、交互に）付与することができる。
【０１７５】
例えば、吐出波形及び撹拌波形を何れも矩形波とし、吐出波形の駆動電圧よりも撹拌波形の駆動電圧を低くすることで、撹拌波形の印加により液滴３１０が形成されないようにすることができる。つまり、駆動電圧の高低により、メンブレン１２Ｃの振動状態（振動の程度）を制御することができる。
【０１７６】
液滴吐出手段１０Ｃでは、駆動素子１３Ｃがメンブレン１２Ｃの下面側に形成されているため、駆動素子１３Ｃによりメンブレン１２が振動すると、液室１１Ｃの下部方向から上部方向への流れを生じさせることが可能である。
【０１７７】
この時、蛍光染色細胞３５０の動きは下から上への運動となり、液室１１Ｃ内で対流が発生して蛍光染色細胞３５０を含有する細胞懸濁液３００の撹拌が起きる。液室１１Ｃの下部方向から上部方向への流れにより、沈降、凝集した蛍光染色細胞３５０が液室１１Ｃの内部に均一に分散する。
【０１７８】
つまり、駆動手段２０は、吐出波形を駆動素子１３Ｃに加え、メンブレン１２Ｃの振動状態を制御することにより、液室１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００をノズル１２１から液滴３１０として吐出させることができる。又、駆動手段２０は、撹拌波形を駆動素子１３Ｃに加え、メンブレン１２Ｃの振動状態を制御することにより、液室１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００を撹拌することができる。なお、撹拌時には、ノズル１２１から液滴３１０は吐出されない。
【０１７９】
このように、液滴３１０を形成していない間に細胞懸濁液３００を撹拌することにより、蛍光染色細胞３５０がメンブレン１２Ｃ上に沈降、凝集することを防ぐと共に、蛍光染色細胞３５０を細胞懸濁液３００中にムラなく分散させることができる。これにより、ノズル１２１の詰まり、及び吐出する液滴３１０中の蛍光染色細胞３５０の個数のばらつきを抑えることが可能となる。その結果、蛍光染色細胞３５０を含有する細胞懸濁液３００を、長時間連続して安定的に液滴３１０として吐出することができる。
【０１８０】
また、液滴形成装置４０１Ｃにおいて、液室１１Ｃ内の細胞懸濁液３００中に気泡が混入する場合がある。この場合でも、液滴形成装置４０１Ｃでは、液室１１Ｃの上部に大気開放部１１５が設けられているため、細胞懸濁液３００中に混入した気泡を、大気開放部１１５を通じて外気に排出できる。これによって、気泡排出のために大量の液を捨てることなく、連続して安定的に液滴３１０を形成することが可能となる。
【０１８１】
即ち、ノズル１２１の近傍に気泡が混入した場合や、メンブレン１２Ｃ上に多数の気泡が混入した場合には吐出状態に影響を及ぼすため、長い時間安定的に液滴の形成を行うためには、混入した気泡を排出する必要がある。通常、メンブレン１２Ｃ上に混入した気泡は、自然に若しくはメンブレン１２Ｃの振動によって上方に移動するが、液室１１Ｃには大気開放部１１５が設けられているため、混入した気泡を大気開放部１１５から排出可能となる。そのため、液室１１Ｃに気泡が混入しても不吐出が発生することを防止可能となり、連続して安定的に液滴３１０を形成することができる。
【０１８２】
なお、液滴を形成しないタイミングで、液滴を形成しない範囲でメンブレン１２Ｃを振動させ、積極的に気泡を液室１１Ｃの上方に移動させてもよい。
【０１８３】
−電気的又は磁気的な検出する方法−
電気的又は磁気的な検出する方法としては、図１９に示すように、液室１１’から細胞懸濁液を液滴３１０’としてプレート７００’に吐出する吐出ヘッドの直下に、細胞数計数のためのコイル２００がセンサとして設置されている。細胞は特定のタンパク質によって修飾され細胞に接着することが可能な磁気ビーズによって覆うことにより、磁気ビーズが付着した細胞がコイル中を通過する際に発生する誘導電流によって、飛翔液滴中の細胞の有無を検出することが可能である。一般的に、細胞はその表面に細胞特有のタンパク質を有しており、このタンパク質に接着することが可能な抗体を磁気ビーズに修飾することによって、細胞に磁気ビーズを付着させることが可能である。このような磁気ビーズとしては既製品を用いることが可能であり、例えば、株式会社ベリタス製のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）が利用可能である。
【０１８４】
［吐出前に細胞を観測する処理］
吐出前に細胞を観測する処理としては、図２０に示すマイクロ流路２５０中を通過してきた細胞３５０’をカウントする方法や、図２１に示す吐出ヘッドのノズル部近傍の画像を取得する方法などが挙げられる。図２０はセルソーター装置において用いられている方法であり、例えば、ソニー株式会社製のセルソーターＳＨ８００を用いることができる。図２０では、マイクロ流路２５０中に光源２６０からレーザー光を照射して散乱光や蛍光を、集光レンズ２６５を用いて検出器２５５により検出することによって細胞の有無や、細胞の種類を識別しながら液滴を形成することが可能である。本方法を用いることによって、マイクロ流路２５０中に通過した細胞の数から所定の充填部位（ウェル）中に着弾した細胞の数を推測することが可能である。
また、図２１に示す吐出ヘッド１０’としては、Ｃｙｔｅｎａ社製のシングルセルプリンターを用いることが可能である。図２１では、吐出前において、ノズル部近傍のレンズ２６５’を介して、画像取得部２５５’において画像取得した結果からノズル部近傍の細胞３５０”が吐出されたと推定することや、吐出前後の画像から差分により吐出されたと考えられる細胞の数を推定することによって、所定の充填部位（ウェル）中に着弾した細胞の数を推測することができる。図２０に示すマイクロ流路中を通過してきた細胞をカウントする方法では、液滴が連続的に生成されるのに対して、図２１は、オンデマンドで液滴形成が可能であるため、より好ましい。
【０１８５】
［着弾後の細胞をカウントする処理］
着弾後の細胞をカウントする処理としては、プレートにおける充填部位（ウェル）を蛍光顕微鏡などにより観測することにより、蛍光染色した細胞を検出する方法を取ることが可能である。この方法は、例えば、Ｓａｎｇｊｕｎ  ｅｔ  ａｌ．,ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，Ｖｏｌｕｍｅ  ６（３），ｅ１７４５５などに記載されている。
【０１８６】
液滴の吐出前及び着弾後に、細胞を観測する方法では、以下に述べる問題があるが、生成するプレートの種類によっては吐出中の液滴内の細胞を観測することがもっとも好ましい。吐出前に細胞を観測する手法においては、流路中を通過した細胞数や吐出前（及び吐出後）の画像観測から、着弾したと思われる細胞数を計数するため、実際にその細胞が吐出されたのかどうかの確認は行われておらず、思いがけないエラーが発生することがある。例えば、ノズル部が汚れていることにより液滴が正しく吐出せず、ノズルプレートに付着し、それに伴い液滴中の細胞も着弾しない、といったケースが発生する。他にも、ノズル部の狭い領域に細胞が残留することや、細胞が吐出動作によって想定以上に移動し観測範囲外に出てしまうといった問題の発生も起こりうる。
また、着弾後のプレート上の細胞を検出する手法においても問題がある。まず、プレートとして顕微鏡観察が可能であるものを準備する必要がある。観測可能なプレートとして、一般的に底面が透明かつ平坦なプレート、特に底面がガラス製となっているプレートが用いられるが、特殊なプレートとなってしまうため、一般的な充填部位（ウェル）を使用することができなくなる問題がある。また、細胞数が数十個など多いときには、細胞の重なりが発生するため正確な計数ができなくなる問題もある。そのため、液滴の吐出後、かつ液滴の充填部位（ウェル）への着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサ及び粒子数（細胞数）計数手段によって計数することに加えて、吐出前に細胞を観測する処理、着弾後の細胞をカウントする処理を行うことが好ましい。
【０１８７】
また、受光素子としては１又は少数の受光部を有する受光素子、例えば、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管を用いることが可能であるし、その他に２次元アレイ状に受光素子が設けられたＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｐｕｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、ゲートＣＣＤなど二次元センサを用いることも可能である。
１又は少数の受光部を有する受光素子を用いる際には、蛍光強度から細胞が何個入っているかを予め用意された検量線を用いて決定することも考えられるが、主として飛翔液滴中の細胞有無を二値的に検出することが行われる。細胞懸濁液の細胞濃度が十分に低く、液滴中に細胞が１個又は０個しかほぼ入らない状態で吐出を行う際には、二値的な検出で十分精度よく計数を行うことが可能である。細胞懸濁液中で細胞はランダムに配置していることを前提とすれば、飛翔液滴中の細胞数はポアソン分布に従うと考えられ、液滴中に細胞数が２個以上入る確率Ｐ（＞２）は下記式（１）で表される。図２２は、確率Ｐ（＞２）と平均細胞数の関係を表すグラフである。ここで、λは液滴中の平均細胞数であり、細胞懸濁液中の細胞濃度に吐出液滴の体積を乗じたものになる。
Ｐ（＞２）＝１−（１＋λ）×ｅ−λ  ・・・  式（１）
【０１８８】
二値的な検出で細胞数計数を行う場合には、確率Ｐ（＞２）が十分小さい値であることが精度を確保する上では好ましく、確率Ｐ（＞２）が１％以下となるλ＜０．１５であることが好ましい。光源としては、細胞の蛍光を励起できるものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、水銀ランプやハロゲンランプなどの一般的なランプに特定の波長を照射するようにフィルタをかけたものや、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ）、レーザーなどを用いることが可能である。ただし、特に１ｎＬ以下の微小な液滴を形成するときには、狭い領域に高い光強度を照射する必要があるため、レーザーを用いるのが好ましい。レーザー光源としては、固体レーザーやガスレーザー、半導体レーザーなど一般的に知られている多種のレーザーを用いることが可能である。また、励起光源としては、液滴が通過する領域を連続的に照射したものであってもよいし、液滴の吐出に同期して液滴吐出動作に対して所定時間遅延を付けたタイミングでパルス的に照射するものであってもよい。
【０１８９】
＜＜不確かさ算出工程＞＞
不確かさ算出工程は、細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程、及び細胞数計数工程などそれぞれの工程における不確かさを算出する工程である。
当該不確かさの算出は、細胞懸濁液生成工程における不確かさと同様に算出することができる。
なお、不確かさの算出タイミングは、細胞数計数工程の次工程で、纏めて算出してもよいし、細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程、及び細胞数計数工程などの各工程の最後に算出し、細胞数計数工程の次工程で各不確かさを合成して算出してもよい。言い換えれば、上記各工程での不確かさは、合成算出までに適宜算出しておけばよい。
【０１９０】
＜＜出力工程＞＞
出力工程は、充填部位（ウェル）内に着弾した細胞懸濁液に含まれる細胞数を、センサにより測定された検出結果に基づいて粒子数計数手段にて計数された値を出力する工程である。
計数された値とは、センサにより測定された検出結果から、粒子数計数手段にて当該充填部位（ウェル）に含まれる細胞数を意味する。
出力とは、原動機、通信機、計算機などの装置が入力を受けて計数された値を外部の計数結果記憶手段としてのサーバに電子情報として送信することや、計数された値を印刷物として印刷することを意味する。
【０１９１】
出力工程は、プレートの生成時に、プレートにおける各充填部位（ウェル）の細胞数又は核酸数を観察又は推測し、観測値又は推測値、外部の記憶部に出力する。
出力は、細胞数計数工程と同時に行ってもよく、細胞数計数工程の後に行ってもよい。
【０１９２】
＜＜記録工程＞＞
記録工程は、出力工程において、出力された観測値又は推測値を記録する工程である。
記録工程は、記録部において好適に実施することができる。
記録は、出力工程と同時に行ってもよく、出力工程の後に行ってもよい。
記録とは、記録媒体に情報を付与することだけでなく、記録部に情報を保存することも含む意味である。
【０１９３】
＜＜核酸抽出工程＞＞
核酸抽出工程は、充填部位（ウェル）内の細胞から核酸を抽出する工程である。
抽出とは、細胞膜や細胞壁などを破壊し、核酸をぬき出すことを意味する。
【０１９４】
細胞から核酸を抽出する方法としては、９０℃〜１００℃で熱処置する方法が知られている。９０℃以下で熱処理するとＤＮＡが抽出されない可能性があり、１００℃以上で熱処理するとＤＮＡが分解される可能性がある。このとき界面活性剤を添加し熱処理することが好ましい。
【０１９５】
界面活性剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、添加量にもよるが、タンパク質を変性・失活させない点から、非イオン性界面活性剤が好ましい。
【０１９６】
イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、脂肪酸ナトリウムが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）がより好ましい。
【０１９７】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルグリコシド、アルキルポリオキシエチレンエーテル（Ｂｒｉｊシリーズ等）、オクチルフェノールエトキシレート（Ｔｏｔｉｔｏｎ  Ｘシリーズ、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡシリーズ、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐシリーズ、Ｎｉｋｋｏｌ  ＯＰシリーズ等）、ポリソルベート類（Ｔｗｅｅｎ２０等のＴｗｅｅｎシリーズなど）、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、アルキルマルトシド、ショ糖脂肪酸エステル、グリコシド脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリドなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、ポリソルベート類が好ましい。
【０１９８】
界面活性剤の含有量としては、充填部位（ウェル）中の細胞懸濁液全量に対して、０．０１質量％以上５．００質量％以下が好ましい。含有量が、０．０１質量％以上であると、ＤＮＡ抽出に対して効果を発揮でき、５．００質量％以下であると、ＰＣＲの際に増幅の阻害を防止することができるため、両方の効果を得られる数値範囲として上記０．０１質量％以上５．００質量％以下が好適である。
細胞壁を保有している細胞に関しては、上記の方法で十分にＤＮＡ抽出されないことがある。その場合、例えば、浸透圧ショック法、凍結融解法、酵素消化法、ＤＮＡ抽出用キットの使用、超音波処理法、フレンチプレス法、ホモジナイザーなどの方式などが挙げられる。これらの中でも、抽出ＤＮＡのロスが少ないことから、酵素消化法が好ましい。
【０１９９】
＜＜その他の工程＞＞
その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酵素失活工程などが挙げられる。
【０２００】
−酵素失活工程−
酵素失活工程は、酵素を失活させる工程である。
酵素としては、例えば、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、核酸抽出工程において核酸を抽出するために使用した酵素などが挙げられる。
酵素を失活させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の方法を好適に用いることができる。
【０２０１】
上述のような方法により、本発明の核酸解析方法に用いるデバイスを製造することができる。
【０２０２】
＜検量線データ作成工程及び検量線データ作成部＞
検量線データ作成工程は、特定コピー数の前記標準核酸のコピー数に基づき、前記標準核酸の検量線データを作成する工程である。検量線データ作成工程は、検量線データ作成部、及び検量線データ作成手段により好適に実行される。
検量線データとは、標準核酸の塩基配列の数（コピー数）に関するデータを意味しており、作成したデータそのものであってもよく、データから導き出される検量線そのものを含むことを意味する。
検量線とは、解析に用いる量及び活性などが予め既知の物質における量及び活性などのパラメータと、そのパラメータとは異なるパラメータとの関係式を意味する。パラメータとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、特定の塩基配列の「コピー数（コピー）」、特定の塩基配列の「リード数」などが挙げられる。
検量線データは、検量線データ作成手段により取得されたライブラリー中の標準核酸のコピー数のデータから作成することができる。検量線データとしては、後述する解析機器により取得されたライブラリー中の標準核酸のコピー数に関するデータであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。特定コピー数の標準核酸から検量線データを作成する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、特定コピー数の標準核酸を核酸増幅法に増幅し、その増幅結果ともとの特定コピー数との関係を関係式として表す方法などが挙げられる。
本発明の核酸解析方法は、検量線データ作成工程において、標準核酸の特定コピー数の標準核酸を用いることにより、解析対象核酸の数が極少数であっても、高精度に解析（定量）することができる。
【０２０３】
検量線データ作成工程においては、特定コピー数の標準核酸を、２以上の異なる系内において、互いに異なる特定コピー数で含み、取得する前記標準核酸の前記検量線データを正規化し合一して検量線を作成することが好ましい。特定コピー数の標準核酸を、２以上の異なる系内において、互いに異なる特定コピー数で含み、取得する前記標準核酸の前記検量線データを正規化し合一して検量線を作成することにより、使用する標準核酸の種類を少なくすることができる。
【０２０４】
＜解析対象核酸解析工程及び解析対象核酸解析部＞
解析対象核酸解析工程は、解析対象核酸の塩基配列を特定するとともに、解析対象核酸の塩基配列の数を特定する工程である。解析対象核酸解析工程は、解析対象核酸解析部により好適に実行される。
解析対象核酸の塩基配列を特定するとは、当該解析対象核酸の塩基配列を読取ること意味する。
解析対象核酸の塩基配列の数を特定するとは、解析対象核酸に含まれる塩基配列のコピー数を、前記検量線データ作成工程で作成した検量線を用いて解析対象核酸の測定値（リード数など）から計数することを意味する。解析対象核酸に、異なる塩基配列を有する核酸（断片）が２以上含まれている場合においては、解析対象核酸に含まれる塩基配列ごとに、塩基配列の特定、及び塩基配列の数の特定を行う。読み取った解析対象核酸のデータを、塩基配列ごとに「リード数」という単位で管理することもある。
解析対象核酸の数としては、「コピー数」、「分子数」などと称することがある。
なお、解析対象下記酸解析工程は、上述の検量線データ作成工程と並列して行う（処理する）こともできる。
【０２０５】
なお、解析対象核酸解析工程については、例えば、ｉｌｌｕｍｉｎａ社が公開している次世代シークエンサにおける解析方法（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｒｅｓ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｎｅｗｓ／ＮＧＳ１．ｐｄｆ）、非特許文献１、ナノポアデバイスを用いたシークエンスにおける解析方法（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．）、ＰａｃＢｉｏ  ＲＳ  ＩＩ／Ｓｅｑｕｅｌ  システムを用いたシークエンスにおける解析方法（Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｉｏｎ  ＴｏｒｒｅｎｔＴＭ半導体シーケンスシステムシリーズにおける解析方法（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）に記載の方法などを参照することができ、それぞれの解析方法に用いられる解析機器により行うことができる。
解析機器としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｉｌｌｕｍｉｎａ社製のシークエンサ、ナノポアデバイス、ＰａｃＢｉｏ社製の１分子シーケンサ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製のＩｏｎ  ＴｏｒｒｅｎｔＴＭ半導体シーケンサなどが挙げられる。解析機器としては、市販品を用いることができ、市販品としては、例えば、Ｍｉｓｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）；ＭｉＩＯＮ、ＧｒｉｄＩＯＮ、ＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮ、（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．製）；ＰａｃＢｉｏ  ＲＳ  ＩＩ（Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｉｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｓ５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）などが挙げられる。
【０２０６】
本発明の核酸解析プログラムによる処理は、核酸解析装置を構成する制御部を有するコンピュータを用いて実行することができる。
以下、核酸解析装置のハードウェア構成、及び機能構成について説明する。
【０２０７】
＜核酸解析装置のハードウェア構成＞
図２４は、核酸解析装置１００のハードウェア構成の一例を示すブロック図である。
図２４で示すように、核酸解析装置１００は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）１０１、主記憶装置１０２、補助記憶装置１０３、出力装置１０４、入力装置１０５の各部を有する。これらの各部は、バス１０６を介してそれぞれ接続されている。
ＣＰＵ１０１は、種々の制御や演算を行う処理装置である。ＣＰＵ１０１は、主記憶装置１０２などが記憶するＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）やプログラムを実行することにより、種々の機能を実現する。即ち、ＣＰＵ１０１は、本実施例では、核酸解析プログラムを実行することにより、核酸解析装置１００の制御部１３０として機能する。
また、ＣＰＵ１０１は、核酸解析装置１００全体の動作を制御する。尚、本実施例では、核酸解析装置１００全体の動作を制御する装置をＣＰＵ１０１としたが、これに限ることなく、例えば、ＦＰＧＡ（Ｆｉｅｌｄ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｇａｔｅ  Ａｒｒａｙ）などとしてもよい。
【０２０８】
核酸解析プログラムや各種データベースは、必ずしも主記憶装置１０２や、補助記憶装置１０３などに記憶されていなくともよい。インターネット、ＬＡＮ（Ｌｏｃａｌ  Ａｒｅａ  Ｎｅｔｗｏｒｋ）、ＷＡＮ（Ｗｉｄｅ  Ａｒｅａ  Ｎｅｔｗｏｒｋ）などを介して、核酸解析装置１００に接続される他の情報処理装置などに核酸解析プログラムや各種データベースを記憶させてもよい。核酸解析装置１００がこれら他の情報処理装置から核酸解析プログラムや各種データベースを取得して実行するようにしてもよい。
主記憶装置１０２は、各種プログラムを記憶し、各種プログラムを実行するために必要なデータ等を記憶する。
主記憶装置１０２は、図示しない、ＲＯＭ（Ｒｅｅｄ  Ｏｎｌｙ  Ｍｅｍｏｒｙ）と、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ）と、を有する。
ＲＯＭは、ＢＩＯＳ（Ｂａｓｉｃ  Ｉｎｐｕｔ／Ｏｕｔｐｕｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）等の各種プログラムなどを記憶している。
ＲＡＭは、ＲＯＭに記憶された各種プログラムがＣＰＵ１０１により実行される際に展開される作業範囲として機能する。ＲＡＭとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。ＲＡＭとしては、例えば、ＤＲＡＭ（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ）、ＳＲＡＭ（Ｓｔａｔｉｃ  Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ）などが挙げられる。
補助記憶装置１０３としては、各種情報を記憶できれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ソリッドステートドライブ、ハードディスクドライブなどが挙げられる。また、補助記憶装置１０３は、例えば、ＣＤ（Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｄｉｓｃ）ドライブ、ＤＶＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｄｉｓｃ）ドライブ、ＢＤ（Ｂｌｕ−ｒａｙ（登録商標）  Ｄｉｓｃ）ドライブなどの可搬記憶装置としてもよい。
【０２０９】
出力装置１０４は、ディスプレイやスピーカーなどを用いることができる。ディスプレイとしては、特に制限はなく、適宜公知のものを用いることができ、例えば、液晶ディスプレイ、有機ＥＬディスプレイが挙げられる。
入力装置１０５は、核酸解析装置１００に対する各種要求を受け付けることができれば、特に制限はなく、適宜公知のものを用いることができ、例えば、キーボード、マウス、タッチパネルなどが挙げられる。
以上のようなハードウェア構成によって、核酸解析装置１００の処理機能を実現することができる。
【０２１０】
＜核酸解析装置の機能構成＞
図２５は、核酸解析装置１００の機能構成の一例を示す図である。
この図２５に示すように、核酸解析装置１００は、入力部１１０、出力部１２０、制御部１３０、記憶部１４０、を有する。
制御部１３０は、ライブラリー調製部１３１、検量線データ作成部１３２と、解析対象核酸解析部１３３と、を有する。制御部１３０は、核酸解析装置１００全体を制御する。
記憶部１４０は、検量線データベース１４１と、解析対象核酸解析データベース１４２と、を有する。以下、「データベース」を「ＤＢ」と称することもある。なお、記憶部に保存するデータは、揮発性及び不揮発性のいずれのメモリに記憶してもよい。メモリは「Ｍ」と称することもあり、「ＤＢ」と同様の意味で用いることもある。
【０２１１】
ライブラリー調製部１３１は、入力部１１０から入力された解析対象核酸に関する情報に基づき、ライブラリー調製の反応条件を調節する。
検量線データ作成部１３２は、特定コピー数の標準核酸のコピー数のデータに基づき、標準核酸の検量線データを作成する。制御部１３０は、係る取得した検量線データを、検量線Ｍ１４１へ記憶する。
解析対象核酸解析部１３３は、解析対象核酸の塩基配列を記憶部１４０の解析対象核酸解析Ｍ１４２で記憶されている解析対象核酸解析のデータを用い、前記解析対象核酸解析の塩基配列を特定するとともに、前記解析対象核酸の塩基配列の数を検量線Ｍ１４１のデータと比較することによって分析する。
【０２１２】
次に、本発明の核酸解析プログラムの処理手順を示す。図２６は、核酸解析装置１００の制御部１３０における核酸解析プログラムの処理手順の一例を示すフローチャートである。
【０２１３】
ステップＳ１０１では、核酸解析装置１００の制御部１３０のライブラリー調製部１３１は、入力部１１０から入力された標準核酸及び解析対象核酸に関する情報に基づき、ライブラリー調製における反応条件を出力部１２０へ出力して調節し、処理をＳ１０２へ移行する。
ステップＳ１０２では、核酸解析装置１００の制御部１３０の検量線データ作成部１３２は、特定コピー数の前記標準核酸のコピー数に基づき、前記標準核酸の検量線データを作成し検量線Ｍ１４１に取得した結果を記録し、処理をＳ１０３へ移行する。検量線データとして、系内の標準核酸の「リード数」などを用いることができる。
ステップＳ１０３では、核酸解析装置１００の制御部１３０の解析対象核酸解析部１３３は、解析対象核酸の塩基配列を特定するとともに、検量線Ｍ１４１から取得した作成した検量線データを用いて前記解析対象核酸の塩基配列の数を特定し、解析対象核酸Ｍ１４２に解析したデータを記録し、本処理を終了する。
なお、Ｓ１０２及びＳ１０３の処理は、並列して行ってもよい。
【０２１４】
本発明の核酸解析方法に係るデバイスは、バイオ関連産業、ライフサイエンス産業、及び医療産業等において幅広く使用され、例えば、装置校正や検量線作成、検査装置の精度管理、ＰＣＲ装置の精度評価、塩基配列解析機器の精度管理などに好適に用いることができる。
デバイスとしては、感染症に対して実施する場合は公定法や通知法などに定められている方法に適用することができる。
【０２１５】
（ライブラリー調製用デバイス）
本発明のライブラリー調製用デバイスは、本発明の核酸解析方法に用いられるライブラリー調製用として特に好適に用いられ、特定コピー数の標準核酸を有する。
本発明のライブラリー調製用デバイスは、本発明の核酸解析方法に用いられるデバイスと同様のものであるため、説明を省略する。
本発明のライブラリー調製用デバイスは、次世代シークエンサを含む核酸解析において好適に用いることができる。
また、本発明のライブラリー調製用デバイスは、前記標準核酸が前記特定コピー数である不確かさを平均特定コピー数で除した変動係数ＣＶ値と、前記標準核酸の平均特定コピー数ｘとにより表される、次式、ＣＶ＜１／√ｘを満たすことが好ましい。
【実施例】
【０２１６】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【０２１７】
（実施例１）
＜ライブラリー調製用デバイスの作製＞
以下のようにして、ライブラリー調製用デバイスを作製した。
−標準核酸の調製−
−−人工塩基配列の設計−−
人工塩基配列として濃厚核酸試料  ＤＮＡ６００−Ｇ（国立研究開発法人産業技術総合研究所製、ＮＭＩＪ  ＣＲＭ  ６２０５−ａ、配列番号６参照）に、選択マーカーとしたＵＲＡ３がタンデムに並ぶように作出したプラスミドを作製した。
また、ＧＣ含有率を５０％、且つ、６０℃において高次構造を取らず、繰り返し配列をもたない１３０ｂｐの塩基配列の両末端にプライマーＭｉＦｉｓｈ−Ｕ（非特許文献１参照、製造会社名：ファスマック株式会社、配列番号７及び８参照）と相補的な塩基配列を有するように核酸合成した人工塩基配列（配列番号１〜５参照）を組み込んだプラスミドを作製した。このように、人工塩基配列の両末端にプライマーＭｉＦｉｓｈ−Ｕと相補的な塩基配列を有していることにより、解析対象核酸に含まれる魚類の１２Ｓ  ｒＲＮＡを解析する際に、同じ塩基配列を有するプライマーを用いて標準核酸及び解析対象核酸を解析することができる。
【０２１８】
−−遺伝子組換え酵母−−
出芽酵母ＹＩＬ０１５Ｗ  ＢＹ４７４１（ＡＴＣＣ社製、ＡＴＣＣ４００１４０８）を１コピーの特定核酸配列のキャリア細胞として組換え体の作製に使用した。作製した上述のプラスミドと、キャリア細胞のＢＡＲ１領域とを相同組換えにより、１コピーの特定人工核酸配列を酵母ゲノムＤＮＡに導入し、遺伝子組換え酵母を作製した。なお、ＤＮＡ６００−Ｇには、ＤＮＡ６００−Ｇの製品情報として、核酸濃度に関する不確かさ情報を有している。
【０２１９】
−−培養及び細胞周期制御−−
５０ｇ／ＬのＹＰＤ培地（タカラバイオ株式会社製、ＣＬＮ−６３０４０９）で培養した遺伝子組換え酵母を９０ｍＬ分取した三角フラスコに、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、１４１９０−１４４、以下、「ＤＰＢＳ」と称する）を用いて５００μｇ／ｍＬとなるように調製したα１−Ｍａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｃｅｔａｔｅ  ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｔ６９０１−５ＭＧ、以下、「αファクター」という）を９００μＬ添加した。
次いで、バイオシェイカー（タイテック株式会社製、ＢＲ−２３ＦＨ）を用いて、振盪速度：２５０ｒｐｍ、温度：２８℃にて２時間インキュベートし、酵母をＧ０／Ｇ１期に同調して酵母懸濁液を得た。
【０２２０】
−固定化−
同調確認済み酵母懸濁液を遠心管（アズワン株式会社製、ＶＩＯ−５０Ｒ）に４５ｍＬ移し、遠心分離機（株式会社日立製作所製、Ｆ１６ＲＮ）を用いて、回転速度：３０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上澄み液を除去して酵母ペレットを得た。
得られた酵母ペレットにホルマリン（和光純薬工業株式会社製、０６２−０１６６１）を４ｍＬ添加し、５分間静置後、遠心して上澄み液を除去し、エタノールを１０ｍＬ添加して懸濁させることにより、固定化済みの酵母懸濁液を得た。
【０２２１】
−核染色−
固定化済み酵母懸濁液を２００μＬ分取し、ＤＰＢＳで１回洗浄した後、４８０μＬのＤＰＢＳに再懸濁した。
次に、２０μＬの２０ｍｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ  Ａ（株式会社ニッポンジーン製、３１８−０６３９１）を添加後、バイオシェイカーを用いて３７℃で２時間インキュベートした。
次に、２５μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（タカラバイオ株式会社製、ＴＫＲー９０３４）を添加し、プチクール（ワケンビーテック株式会社製、プチクール  ＭｉｎｉＴ−Ｃ）を用いて、５０℃で２時間インキュベートした。
最後に、６μＬの５ｍＭ  ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔａｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、Ｓ７０２０）を加えて、遮光下で３０分間染色した。
【０２２２】
−分散−
染色済みの酵母懸濁液を超音波ホモジナイザー（ヤマト科学株式会社製、ＬＵＨ１５０）を用いて、出力：３０％、１０秒間分散処理して、酵母懸濁インクを得た。
【０２２３】
−分注及び細胞計測−
以下のようにして、液滴中の酵母菌の数を計数（カウント）して、各ウェルに１細胞ずつ吐出して細胞数が既知のプレートを作製した。具体的には、図１５に示す液滴形成装置を用いて、９６プレート（商品名：ＭｉｃｒｏＡｍｐ  ９６−ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｌａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）の各ウェルに、液滴吐出手段として圧電印加方式の吐出ヘッド（社内製）を用いて１０Ｈｚにて酵母懸濁インクを順次吐出した。
吐出された液滴中の酵母の受光手段としては高感度カメラ（東京インスツルメンツ株式会社製、ｓＣＭＯＳ  ｐｃｏ．ｅｄｇｅ）を用いて撮影した。光源としてはＹＡＧレーザー（スペクトラ・フィジックス社製、Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＯＮＥ−５３２−２００−ＫＥ）を用い、撮影した画像の粒子数計数手段として画像処理ソフトウェアであるＩｍａｇｅ  Ｊを用いて画像処理して細胞数を計数し、１細胞数の既知プレートを作製した。
【０２２４】
−核酸抽出−
Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）  Ｂｕｆｆｅｒを用いてＣｏｌＥ１  ＤＮＡ（和光純薬工業株式会社製、３１２−００４３４）を５ｎｇ／μＬとなるようにＣｏｌＥ１／ＴＥを調製し、ＣｏｌＥ１／ＴＥを用いてＺｙｍｏｌｙａｓｅ（Ｒ）  １００Ｔ（ナカライテスク株式会社製、０７６６５−５５）を１ｍｇ／ｍＬとなるようにＺｙｍｏｌｙａｓｅ溶液を調製した。
作製した細胞数既知プレートの各ウェルにＺｙｍｏｌｙａｓｅ溶液を４μＬ添加し、３７．２℃にて３０分間インキュベートすることにより、細胞壁溶解（核酸抽出）後、９５℃で２分間熱処理して、参照デバイス（ライブラリー調製用デバイス）を作製した。
【０２２５】
次に、細胞数既知プレートから得られる結果の信頼性を考慮するために、１細胞数既知プレートを製造し、１細胞数における不確かさを算出する。なお、特定コピー数毎に以下に示す方法を用いることにより、様々なコピー数における不確かさを算出することができる。
【０２２６】
−不確かさの算出−
本実施例では、不確かさの要因として、液滴中の細胞数、細胞中の核酸のコピー数、ウェル内の細胞数、コンタミネーションを用いた。
液滴中の細胞数は、吐出手段より吐出された液滴の画像を解析し計数した液滴中の細胞数と、吐出手段で吐出した液滴をスライドガラスに着弾させ着弾した液滴毎に顕微鏡観察し得られた細胞数とを用いた。
細胞中の核酸コピー数（細胞周期）は、細胞周期のＧ１期に該当する細胞の割合（９９．５％）、Ｇ２期に該当する細胞の割合（０．５％）とを用いて算出した。
ウェル内の細胞数は、吐出した液滴がウェル内に着弾する数を計数したが、９６サンプルの計数においてすべての液滴がウェル内に着弾していたため、ウェル内の細胞数の要因は不確かさの計算から除外した。
コンタミネーションは、インクのろ液４μＬをリアルタイムＰＣＲで細胞中の核酸以外の核酸がインク液中に混入していないか３回の試行を行い確認した。その結果、３回すべてにおいて検出下限値となったため、コンタミネーションの要因についても不確かさの掲載から除外した。
不確かさは各要因の測定値から標準偏差を求め、感度係数を乗じて測定量の単位に統一した標準不確かさを平方和法により合成標準不確かさを求める。合成標準不確かさでは、正規分布の約６８％の範囲の値しか含まれないため、合成標準不確かさを２倍した拡張不確かさとすることにより正規分布の約９５％の範囲を考慮した不確かさを得ることができる。下記表２のバジェットシートに結果を示す。
【０２２７】
【表２】
2020096578.tif 000007
【０２２８】
表２中、「記号」とは、不確かさの要因に対応付けた任意の記号を意味する。
表２中、「値（±）」とは、平均値の実験標準偏差であり、算出した実験標準偏差をデータの数の平方根の値で除したものである。
表２中、「確率分布」とは、不確かさの要因がもつ確率分布であり、Ａタイプの不確かさ評価の場合には空欄とし、Ｂタイプの不確かさ評価には、正規分布又は矩形分布のいずれかを記入する。本実施例においてはＡタイプの不確かさ評価のみを行っているため、確率分布の欄は空欄となっている。
表２中、「除数」とは、それぞれ要因から得られる不確かさを正規化する数を意味する。
表２中、「標準不確かさ」とは「値（±）」を「除数」で除した値である。
表２中、「感度係数」とは、測定量の単位に統一するために用いられる値を意味する。
【０２２９】
次に、ウェルに充填した標準核酸（塩基配列）の平均特定コピー数及び不確かさを算出した。結果を表３に示す。変動係数ＣＶ値は不確かさの値を平均特定コピー数で除することにより算出した。
【０２３０】
【表３】
2020096578.tif 000008
【０２３１】
インクジェット方式において、標準核酸の特定コピー数が１、即ち、１コピーの標準核酸（塩基配列）（１つの酵母）をウェルに分注する精度は、±０．１２８１コピーであることが得られた。ウェルに１コピー以上を充填する場合には、特定コピー数の標準核酸（塩基配列）が充填される精度は、この精度の積み重ねにより決定される。
【０２３２】
以上の結果から、得られた拡張不確かさを測定のばらつきの指標として、デバイスのデータとして記憶させることで、実験で使用する者が不確かさの指標をウェル毎の測定結果の信頼性の判断基準として用いることができる。上記の信頼性の判断基準を用いることにより、分析検査の性能評価を高精度に行うことができる。
【０２３３】
−各充填部位への不確かさの値付け-
前述の算出された不確かさ（又は変動係数）を各ウェルへ値付けした。
以上より、低濃度核酸試料系列の平均特定コピー数とその不確かさ及び変動係数を算出し、各ウェルへの値付けをすることができた。
【０２３４】
（実施例２）
＜核酸解析方法の実施１：魚類筋肉組織の１２Ｓ  ｒＲＮＡコピー数の算出＞
実施例２では、魚類筋肉組織より抽出したＤＮＡ試料を用いたＮＧＳ解析を行った。
まず、魚類筋肉組織としてマダイ（Ｐａｇｒｕｓ  ｍａｊｏｒ）、サーモン（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ）、マイワシ（Ｓａｒｄｉｎｏｐｓ  ｍｅｌａｎｏｓｔｉｃｔｕｓ）の３種を用意し、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＤＮＡを抽出した。これを解析対象核酸とした。
【０２３５】
−１ｓｔＰＣＲ反応−
ウェルに前記実施例１で設計した人工塩基配列（標準核酸）１〜３の魚類１２Ｓ  ｒＲＮＡ配列（配列番号１〜３参照）の３種類を用いて、核酸コピー数が１コピーのウェル（１個の酵母細胞を含む）と５コピーのウェル（５個の酵母細胞を含む）、１０コピーのウェル（１０個の酵母細胞を含む）、５０コピーのウェル（５０個の酵母細胞を含む）をそれぞれ用意した。それぞれのウェルには各３種ずつの人工塩基配列（以降、人工１２Ｓ配列と称することがある）を充填した。すなわち、核酸コピー数が１コピーのウェルには配列番号１を含む酵母細胞１個、配列番号２を含む酵母細胞１個、配列番号３を含む酵母細胞が１個、それぞれ含まれる。他のウェルも同様である。その後、前記解析対象核酸を、各前記試料充填用ウェルに５．０μＬ充填した。その後、前記解析対象核酸と前記人工塩基配列の魚類１２Ｓ  ｒＲＮＡ配列とを同一のウェル内で、ＰＣＲ法による増幅反応に供した。反応液の組成は、以下の通りである。
【０２３６】
［反応液組成］
・Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ                                  １．６μＬ
・ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ （２Ｘ）  １２．０μＬ
・１ｓｔＰＣＲ用プライマーＦ（１０μＭ）                          ０．７μＬ
・１ｓｔＰＣＲ用プライマーＲ（１０μＭ）                          ０．７μＬ
・魚類筋肉組織由来抽出ＤＮＡ（試料）                              ５．０μＬ
・酵母ＤＮＡ（人工塩基配列１〜３及びＺｙｍｏｌｙａｓｅ０．４Ｕを含む）４．０μＬ
計  ２４．０μＬ
【０２３７】
１ｓｔＰＣＲ用プライマーは、ＭｉＦｉｓｈ−Ｕ（非特許文献１参照）に２ｎｄＰＣＲ用のプライマーがアニーリング反応を行える配列を付加したものである。  核酸増幅はＴ１００ＴＭ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）を用い、ＰＣＲで行った。まず、９５℃で３分間のインキュベートを行った。その後、９８℃で２０秒間、６５℃で１５秒間、７２℃で１５秒間の３ステップからなる３５回の温度サイクルを行った。最後に７２℃で５分間インキュベートした後、４℃まで冷却し、反応を終了させた。  
【０２３８】
−２ｎｄＰＣＲ反応：アダプター配列の結合−  得られた１ｓｔＰＣＲの増幅産物の両端に、シーケンス用にサンプルを区別するタグと、シーケンス反応に供するためのアダプター配列を付加するＰＣＲ反応を行い、２ｎｄＰＣＲ反応産物を得た。反応液の組成は、以下の通りである。  
【０２３９】
［反応液組成］
・Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ                                    ６．０μＬ
・ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ（２Ｘ）     １２．０μＬ
・２ｎｄＰＣＲ用プライマーＦ（１０μＭ）                            １．０μＬ
・２ｎｄＰＣＲ用プライマーＲ（１０μＭ）                            １．０μＬ
・１ｓｔＰＣＲ産物                                                  ２．０μＬ
計２０．０μＬ
【０２４０】
核酸の増幅はＴ１００ＴＭ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）を用い、ＰＣＲで行った。まず、９５℃で３分間のインキュベートを行った。その後、９８℃で２０秒間、７２℃で１５秒間の２ステップからなる１２回の温度サイクルを行った。最後に７２℃で５分間インキュベートした後、４℃まで冷却し、反応を終了させた。  
【０２４１】
アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の精製  ２％アガロースゲルを用いて１００Ｖ、２０分間の電気泳動を行った。３３０〜４００ｂｐまでにみられたバンドを切り出し、ＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｇｅｌ／ＰＣＲ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス株式会社製）を用いてＰＣＲ産物の生成を行った。  
【０２４２】
−核酸試料の濃度測定−  バイオアナライザー２１００（アジレントテクノロジー社製）を用いて２ｎｄＰＣＲ産物の定量を行った。キットはＡｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ７５００キットを用いた。定量結果をもとに、２ｎｄＰＣＲ産物が１０ｎｇ/μＬになるようＴＥで希釈した。４つのウェルから得られた前記希釈した２ｎｄＰＣＲ産物を同一の反応液に混合した。  
【０２４３】
−次世代シークエンサ（ＮＧＳ）によるシーケンス反応−  次世代シークエンサ（装置名：Ｍｉｓｅｑ、ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて、得られた２ｎｄＰＣＲ産物を解析した。次世代シークエンサにより得られたデータを、配列処理によって解析し、塩基配列とリード数の情報を得た。得られたデータを表４に示す。表中の数値はリード数を示す。  
【０２４４】
【表４】
2020096578.tif 000009
【０２４５】
−リードの正規化−  前記人工１２Ｓ配列以外のリードの総和を１０万リードとして正規化したものを表５に示した。表中の数値はリード数を示す。    
【表５】
2020096578.tif 000010
【０２４６】
表５の人工１２Ｓ配列１、２、及び３のリード数をもとにコピー数（ｘ）と出力リード数（ｙ）の関係式を導くとｙ＝３１．３４３ｘという式を得た(決定計数Ｒ２＝０．９６１２)。この式をもとに各魚種のコピー数を推定し、表６を得た。表中の数値はコピー数を示す。    
【表６】
2020096578.tif 000011
【０２４７】
（実施例３）
＜核酸解析方法の実施２：環境ＤＮＡを用いた魚類相の計測＞
実施例３では、相模川における環境ＤＮＡを用いた魚類相の計測を行った。
まず、相模川より水のサンプルを採取し、フィルターを用いてろ過をした。ろ過したフィルターから、ＤＮＡ抽出キット（商品名：ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡ試料（解析対象核酸）はＱｕｂｉｔ  ３  フルオロメーター（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）を用いて核酸の濃度を定量した。
【０２４８】
−１ｓｔＰＣＲ反応−
ウェルに前記実施例１で設計した人工塩基配列（標準核酸）１〜５の魚類１２Ｓ  ｒＲＮＡ配列（配列番号１〜５参照）の５種類を用いて、人工塩基配列１である魚類１２Ｓ  ｒＲＮＡ配列（配列番号１参照）を含む酵母を１個（コピー）、人工塩基配列２である魚類１２Ｓ  ｒＲＮＡ配列（配列番号２参照）を含む酵母を１０個（コピー）、人工塩基配列３である魚類１２Ｓ  ｒＲＮＡ配列（配列番号３参照）を含む酵母を５０個（コピー）、人工塩基配列４である魚類１２Ｓ  ｒＲＮＡ配列（配列番号４参照）を含む酵母を１００個（コピー）、人工塩基配列５である魚類１２Ｓ  ｒＲＮＡ配列（配列番号５参照）を含む酵母を５００個（コピー）ずつ前記実施例１と同様の方法で充填した。相模川より水のサンプルから採取した、抽出したＤＮＡ試料を前記ウェルに２．０μＬ（０．２５ｎｇ／μＬ）充填し、５水準の標準核酸が配されたデバイスを作製した。その後、前記ウェル内で、前記抽出したＤＮＡ試料と、前記人工塩基配列１〜５とを同一のウェル内で、ＰＣＲ法による増幅反応に供した。反応液の組成は、以下の通りである。
【０２４９】
［反応液組成］
・Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ                                      １．６μＬ
・ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（２Ｘ）    １２．０μＬ
・１ｓｔＰＣＲ用プライマーＦ（１０μＭ）                              ０．７μＬ
・１ｓｔＰＣＲ用プライマーＲ（１０μＭ）                              ０．７μＬ
・相模川由来環境ＤＮＡ抽出物（試料）                                  ５．０μＬ
・酵母ＤＮＡ（人工塩基配列１〜５及びＺｙｍｏｌｙａｓｅ０．４Ｕを含む）４．０μＬ
計  ２４．０μＬ
【０２５０】
１ｓｔＰＣＲ用プライマーは、ＭｉＦｉｓｈ−Ｕ（非特許文献１参照）に２ｎｄＰＣＲ用のプライマーがアニーリング反応を行える配列を付加したものである。
標準核酸（人工塩基配列１〜５）の増幅は、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（装置名：Ｔ１００ＴＭ、Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を用い、ＰＣＲを行った。まず、９５℃で３分間のインキュベートを行った。その後、９８℃で２０秒間、６５℃で１５秒間、７２℃で１５秒間の３ステップからなる３５回の温度サイクルを行った。最後に７２℃で５分間インキュベートした後、４℃まで冷却し、反応を終了させた。
【０２５１】
−ビーズによるＰＣＲ産物の生成−
ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ試薬（ベックマン・コールター社）を用いてＰＣＲ産物の生成を行った。まず、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ試薬を使用前に３０分以上室温で静置した。ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ試薬を１分以上転倒混和したのち、ＰＣＲ反応を行った各ウェルに、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ試薬を２０μＬずつ加えた。ピペッティングを１０回繰り返し、ＰＣＲ反応溶液とＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ試薬を十分混和した。その後、室温で５分間静置した。ＰＣＲ反応を行った各ウェルをＭａｇｎｅｔ  Ｐｌａｔｅに設置し、２分間静置した。ＰＣＲ反応を行った各ウェルをＭａｇｎｅｔ  Ｐｌａｔｅに設置したまま、ＡＭ  Ｐｕｒｅ  ＸＰ試薬に含まれていた磁性ビーズに触れないようにピペットを用いてＰＣＲ反応溶液を取り除いた。各ウェルに２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒間静置した。エタノールを取り除き、磁性ビーズを洗浄した。前記洗浄工程をもう一度繰り返した。前記洗浄工程は各ウェルをＭａｇｎｅｔ  Ｐｌａｔｅに設置したまま行った。各ウェルをＭａｇｎｅｔ  Ｐｌａｔｅから外し、２０μＬの溶出バッファ（精製水、トリス酢酸ｐＨ  ８．０、又はＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ溶液）を各ウェルに添加し、ピペッティングを１０回繰り返し、磁性ビーズと溶出バッファを十分に混和した。各ウェルを  Ｍａｇｎｅｔ  Ｐｌａｔｅに設置し、１分間静置した。各ウェルをＭａｇｎｅｔ  Ｐｌａｔｅに設置したまま、溶出バッファを回収し、別の容器へ移し替えた。この際、次の工程のためにＰＣＲ反応容器に移し替えることが好ましい。
【０２５２】
−２ｎｄＰＣＲ反応：アダプター配列の結合−
得られた１ｓｔＰＣＲの増幅産物の両端に、シーケンス用にサンプルを区別するタグと、シーケンス反応に供するためのアダプター配列を付加するＰＣＲ反応を行い、２ｎｄＰＣＲ反応産物を得た。反応液の組成は、以下の通りである。
【０２５３】
［反応液組成］
・Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ                                    ６．０μＬ
・ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（２Ｘ）  １０．０μＬ
・２ｎｄＰＣＲ用プライマーＦ（１０μＭ）                            １．０μＬ
・２ｎｄＰＣＲ用プライマーＲ（１０μＭ）                            １．０μＬ
・１ｓｔＰＣＲ産物                                                  ２．０μＬ
計２０．０μＬ
【０２５４】
２ｎｄＰＣＲ産物の増幅はＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（装置名：Ｔ１００ＴＭ、Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を用いた。まず、９５℃で３分間のインキュベートを行った。その後、９８℃で２０秒間、７２℃で１５秒間の２ステップからなる１２回の温度サイクルを行った。最後に７２℃で５分間インキュベートした後、４℃まで冷却し、反応を終了させた。
【０２５５】
−ビーズによるＰＣＲ産物の精製−
１ｓｔＰＣＲ後に行った工程と同一であるため省略する。
【０２５６】
−核酸試料の濃度測定−
バイオアナライザー２１００（アジレントテクノロジー社製）を用いて２ｎｄＰＣＲ産物の定量を行った。キットはＡｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ７５００キットを用いた。定量結果をもとに、２ｎｄＰＣＲ産物が１０ｎｇ/μＬになるようＴＥで希釈した。
【０２５７】
−次世代シークエンサ（ＮＧＳ）によるシーケンス反応−
次世代シークエンサ（装置名：Ｍｉｓｅｑ、ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて、得られた２ｎｄＰＣＲ産物を解析した。次世代シークエンサにより得られたデータを、配列処理によって解析し、塩基配列とリード数の情報を得た。得られたデータを表７に示す。
【０２５８】
【表７】
2020096578.tif 000012
【０２５９】
−検量線の作成及び定量−
表７に示す標準核酸である人工配列（人工塩基配列）１〜５の増幅結果に基づき、検量線を作成した。作成した検量線を図２７に示す。図２７は、縦軸がＭｉｓｅｑのリード数、横軸が解析対象核酸及び標準核酸（ＤＮＡ）の数（コピー数／ウェル）を表す。四角で表した点は添加した人工配列であり、それぞれ１コピー、１０コピー、５０コピー、１００コピー、５００コピーである。この５点（５水準）をもとに検量線を作成した。丸で表した点は標準核酸から得られたリード数を前記検量線上にプロットしたものである。図２７に示すように、ヌマチチブが相模川の優占種であり、サンプル全体の７割のリードを占めていた。それ以外の魚種に関して、５００コピーのリード数である４７７８リードよりも少なく、内挿での定量が可能（検量線で用いた数値範囲を用いた信頼性のある定量が可能）であった。検量線から推定したそれぞれの魚種のコピー数は表７に記載した。
【０２６０】
（実施例４）
＜核酸解析方法の実施３：環境ＤＮＡを用いた魚類相の計測＞
実施例４では、相模川における環境ＤＮＡを用いた魚類相の計測を行った。
まず、相模川より水のサンプルを採取し、フィルターを用いてろ過をした。ろ過したフィルターから、ＤＮＡ抽出キット（商品名：ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡ試料（解析対象核酸）はＱｕｂｉｔ  ３  フルオロメーター（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）を用いて核酸の濃度を定量した。
【０２６１】
−１ｓｔＰＣＲ反応−
ウェルに前記実施例１で設計した人工塩基配列（標準核酸）１〜３の魚類１２Ｓ  ｒＲＮＡ配列（配列番号１〜３参照）の３種類を用いて、核酸コピー数が１コピーのウェル（１個の酵母細胞を含む）と５コピーのウェル（５個の酵母細胞を含む）、１０コピーのウェル（１０個の酵母細胞を含む）、５０コピーのウェル（５０個の酵母細胞を含む）をそれぞれ用意した。それぞれのウェルには各３種ずつの人工１２Ｓ配列を充填した。すなわち、核酸コピー数が１コピーのウェルには配列番号１を含む酵母細胞１個、配列番号２を含む酵母細胞１個、配列番号３を含む酵母細胞が１個、それぞれ含まれる。他のウェルも同様である。その後、前記解析対象核酸を、各前記試料充填用ウェルに５．０μＬ充填した。その後、前記解析対象核酸と前記人工１２Ｓとを同一のウェル内で、ＰＣＲ法による増幅反応に供した。反応液の組成は、以下の通りである。
【０２６２】
［反応液組成］
・Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ                                    １．６μＬ
・ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ  （２Ｘ）１２．０μＬ
・１ｓｔＰＣＲ用プライマーＦ（１０μＭ）                            ０．７μＬ
・１ｓｔＰＣＲ用プライマーＲ（１０μＭ）                            ０．７μＬ
・相模川由来環境ＤＮＡ抽出物（試料）                                ５．０μＬ
・酵母ＤＮＡ（人工塩基配列１〜３及びＺｙｍｏｌｙａｓｅ（登録商標）０．４Ｕを含む）４．０μＬ
計  ２４．０μＬ
【０２６３】
１ｓｔＰＣＲ用プライマーは、ＭｉＦｉｓｈ−Ｕ（非特許文献１参照）に２ｎｄＰＣＲ用のプライマーがアニーリング反応を行える配列を付加したものである。
核酸増幅はＴ１００ＴＭ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）を用い、ＰＣＲで行った。まず、９５℃で３分間のインキュベートを行った。その後、９８℃で２０秒間、６５℃で１５秒間、７２℃で１５秒間の３ステップからなる３５回の温度サイクルを行った。最後に７２℃で５分間インキュベートした後、４℃まで冷却し、反応を終了させた。
【０２６４】
−２ｎｄＰＣＲ反応：アダプター配列の結合−
得られた１ｓｔＰＣＲの増幅産物の両端に、シーケンス用にサンプルを区別するタグと、シーケンス反応に供するためのアダプター配列を付加するＰＣＲ反応を行い、２ｎｄＰＣＲ反応産物を得た。反応液の組成は、以下の通りである。
【０２６５】
［反応液組成］
・Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ                                    ６．０μＬ
・ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（２Ｘ）  １０．０μＬ
・２ｎｄＰＣＲ用プライマーＦ（１０μＭ）                            １．０μＬ
・２ｎｄＰＣＲ用プライマーＲ（１０μＭ）                            １．０μＬ
・１ｓｔＰＣＲ産物                                                  ２．０μＬ
計２０．０μＬ
【０２６６】
核酸の増幅はＴ１００ＴＭ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）を用い、ＰＣＲで行った。まず、９５℃で３分間のインキュベートを行った。その後、９８℃で２０秒間、７２℃で１５秒間の２ステップからなる１２回の温度サイクルを行った。最後に７２℃で５分間インキュベートした後、４℃まで冷却し、反応を終了させた。
【０２６７】
−アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の精製−
２％アガロースゲルを用いて１００Ｖ、２０分間の電気泳動を行った。３３０〜４００ｂｐまでにみられたバンドを切り出し、ＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｇｅｌ／ＰＣＲ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス株式会社）を用いてＰＣＲ産物の生成を行った。
【０２６８】
−核酸試料の濃度測定−
バイオアナライザー２１００（アジレントテクノロジー社製）を用いて２ｎｄＰＣＲ産物の定量を行った。キットはＡｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ７５００キットを用いた。定量結果をもとに、２ｎｄＰＣＲ産物が１０ｎｇ/μＬになるようＴＥで希釈した。４つのウェルから得られた前記希釈した２ｎｄＰＣＲ産物を同一の反応液に混合した。
【０２６９】
−次世代シークエンサ（ＮＧＳ）によるシーケンス反応−
次世代シークエンサ（装置名：Ｍｉｓｅｑ、ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて、得られた２ｎｄＰＣＲ産物を解析した。次世代シークエンサにより得られたデータを、配列処理によって解析し、塩基配列とリード数の情報を得た。得られたデータを表８に示す。表中の数値はリード数を示す。
【０２７０】
【表８】
2020096578.tif 000013
【０２７１】
−リードの正規化−
前記人工１２Ｓ以外のリードの総和を１０万リードとして正規化したものを表９に示した。表中の数値はリード数を示す。また、人工１２Ｓ配列１、２、及び３について平均値と変動係数ＣＶを計算したものを表１０に示した。表１０中の平均値、変動係数ＣＶを用いて適宜解析の精度管理を実施できる。
【０２７２】
【表９】
2020096578.tif 000014
【０２７３】
【表１０】
2020096578.tif 000015
【０２７４】
表９の人工１２Ｓ配列１、２、及び３のリード数をもとにコピー数（ｘ）と出力リード数（ｙ）の関係式を導くとｙ＝１２３９．９ｘという式を得た(決定係数Ｒ２＝０．９８８４)。この式をもとに各魚種のコピー数を推定し、表１２を得た。表中の数値はコピー数を示す。得られた検量線の決定係数Ｒ２を用いて適宜解析の精度管理を実施できる。また、作成した検量線を図２９に示した。なお、図２９に示した魚種は簡単のため、４つのウェルの平均を用い、１コピー以下と推定された魚種は除いてある。参考のため表１１に図２９作成時に用いた各魚種のリード数とコピー数を示した。
【０２７５】
【表１１】
2020096578.tif 000016
【表１２】
2020096578.tif 000017
【０２７６】
（実施例５）
＜核酸解析方法の実施４：微生物の混合ＤＮＡ試料を用いた微生物叢の計測＞
実施例５では、微生物の混合ＤＮＡ試料（ＺｙｍｏＢＩＯＭＩＣＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｃｈ社製））を用いた微生物叢の計測を行った。
実施例３では解析対象核酸である核酸試料を配したウェルと同一のウェル内に標準核酸である人工塩基配列１〜５を配したが、実施例５においては、異なるウェルに標準核酸であるＤＮＡ６００−Ｇの人工塩基配列を有する核酸を配し、その増幅結果を総合して検量線を作成した。
【０２７７】
−解析対象核酸（核酸試料）の準備−
ウェルに前記実施例１で作製したＤＮＡ６００−Ｇを含む酵母を前記実施例１と同様の方法で充填した。前記酵母を、４つのウェルにそれぞれ１個（コピー）、５個（コピー）、１０個（コピー）、５０個（コピー）ずつ４水準異なるウェルに分注した。次に、前記ＤＮＡ６００−Ｇの人工塩基配列を有する核酸が配されたウェルに、手技により前記微生物の混合ＤＮＡ試料を２．０μＬ（０．５ｐｇ／μＬ）ずつ充填した。その後、前記ウェル内で、前記微生物の混合ＤＮＡ試料と前記ＤＮＡ６００−Ｇとを同一のウェル内で、ＰＣＲ法による増幅反応に供した。反応液の組成は、以下の通りである。
【０２７８】
［反応液組成］
・Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ                                    ６．３μＬ
・１０ｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ                                ２．０μＬ
・ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）                                            １．６μＬ
・微生物１６Ｓ増幅用１ｓｔＰＣＲ用プライマーＦ（１０μＭ）          １．０μＬ
・微生物１６Ｓ増幅用１ｓｔＰＣＲ用プライマーＲ（１０μＭ）          １．０μＬ
・６００Ｇ増幅用１ｓｔＰＣＲ用プライマーＦ（１０μＭ）              １．０μＬ
・６００Ｇ増幅用１ｓｔＰＣＲ用プライマーＲ（１０μＭ）              １．０μＬ
・解析対象核酸（微生物の混合ＤＮＡ試料）                            ２．０μＬ
・Ｅｘ  Ｔａｑ（５ｕｎｉｔ／μＬ）                                  ０．１μＬ
・標準核酸（ＤＮＡ６００−Ｇ、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ０．４Ｕを含む）    ４．０μＬ
計２０．０μＬ
【０２７９】
解析対象核酸（微生物の混合ＤＮＡ試料）及び標準核酸（ＤＮＡ６００−Ｇ、人工配列６）の増幅はＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（装置名：Ｔ１００ＴＭ、Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を用い、ＰＣＲで行った。まず、９４℃で２分間のインキュベートを行った。その後、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の３ステップからなる２３回の温度サイクルを行った。最後に７２℃で５分間インキュベートした後、４℃まで冷却し、反応を終了させた。
【０２８０】
−ビーズによるＰＣＲ産物の生成−
ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ試薬（ベックマン・コールター社）を用いてＰＣＲ産物の生成を行った。まず、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ試薬を使用前に３０分以上室温で静置した。ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ試薬を１分以上転倒混和したのち、ＰＣＲ反応を行った各ウェルに２０μＬずつ加えた。ピペッティングを１０回繰り返し、ＰＣＲ反応溶液とＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ試薬を十分混和した。その後、室温で５分間静置した。ＰＣＲ反応を行った各ウェルをＭａｇｎｅｔ  Ｐｌａｔｅに設置し、２分間静置した。ＰＣＲ反応を行った各ウェルをＭａｇｎｅｔ  Ｐｌａｔｅに設置したまま、ＡＭ  Ｐｕｒｅ  ＸＰ試薬に含まれていた磁性ビーズに触れないようにピペットを用いてＰＣＲ反応溶液を取り除いた。各ウェルに２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒間静置した。エタノールを取り除き、磁性ビーズを洗浄した。前記洗浄工程をもう一度繰り返した。前記洗浄工程は各ウェルをＭａｇｎｅｔ  Ｐｌａｔｅに設置したまま行った。各ウェルをＭａｇｎｅｔ  Ｐｌａｔｅから外し、２０  ｕＬの溶出バッファ（精製水、トリス酢酸ｐＨ  ８．０、又はＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ溶液）を各ウェルに添加し、ピペッティングを１０回繰り返し、磁性ビーズと溶出バッファを十分に混和した。各ウェルを  Ｍａｇｎｅｔ  Ｐｌａｔｅに設置し、１分間静置した。各ウェルをＭａｇｎｅｔ  Ｐｌａｔｅに設置したまま、溶出バッファを回収し、別の容器へ移し替えた。この際、次の工程のためにＰＣＲ反応容器に移し替えることが好ましい。
【０２８１】
−２ｎｄＰＣＲ反応：アダプター配列の結合−
得られた１ｓｔＰＣＲの増幅産物の両端に、シーケンス用にサンプルを区別するタグと、シーケンス反応に供するためのアダプター配列を付加するＰＣＲ反応を行い、２ｎｄＰＣＲ反応産物を得た。反応液の組成は、以下の通りである。
【０２８２】
［反応液組成］
・Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ                                １０．３μＬ
・１０ｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ                              ２．０μＬ
・ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）                                          １．６μＬ
・２ｎｄＰＣＲ用プライマーＦ（１０μＭ）                          １．０μＬ
・２ｎｄＰＣＲ用プライマーＲ（１０μＭ）                          １．０μＬ
・１ｓｔＰＣＲ産物                                                ４．０μＬ
・Ｅｘ  Ｔａｑ（５ｕｎｉｔ／μＬ）                                ０．１μＬ
計２０．０μＬ
【０２８３】
２ｎｄＰＣＲ産物の増幅はＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（装置名：Ｔ１００ＴＭ、Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を用いた。まず、９４℃で２分間のインキュベートを行った。その後、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の３ステップからなる８回の温度サイクルを行った。最後に７２℃で５分間インキュベートした後、４℃まで冷却し、反応を終了させた。
【０２８４】
−ビーズによるＰＣＲ産物の精製−
１ｓｔＰＣＲ後に行った工程と同一であるため省略する。
【０２８５】
−核酸試料の濃度測定−
バイオアナライザー２１００（アジレントテクノロジー社製）を用いて２ｎｄＰＣＲ産物の定量を行った。キットはＡｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ７５００キットを用いた。定量結果をもとに、２ｎｄＰＣＲ産物が１０ｎｇ/μＬになるようＴＥで希釈した。４つのウェルから得られた２ｎｄＰＣＲ産物の希釈液を同一の反応液に混合した。
【０２８６】
−次世代シークエンサ（ＮＧＳ）によるシーケンス反応−
次世代シークエンサ（装置名：Ｍｉｓｅｑ、ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて、前記２ｎｄＰＣＲ産物を解析した。次世代シークエンサにより得られたデータを、配列処理によって解析し、塩基配列とリード数の情報を得た。前記リード数を、１００万リード得られたとして正規化した。４サンプルの正規化済リードの和を表１３に示す。
【０２８７】
【表１３】
2020096578.tif 000018
【０２８８】
−検量線の作成及び定量−
表１３に示す標準核酸であるＤＮＡ６００−Ｇ（人工配列６）の増幅結果に基づき、検量線を作成した。作成した検量線を図２８に示す。図２８は、縦軸が、Ｍｉｓｅｑのリード数を各ウェル１００万リード得られたとして正規化したリード数を４ウェル分足し合わせたリード数、横軸が、ＤＮＡの数（コピー数／４ウェル）を表す。四角で表した点は各ウェルに添加した人工配列であり、それぞれ１コピー、５コピー、１０コピー、５０コピーである。この４点(４水準)をもとに検量線を引いた。丸で表した点は核酸サンプルから得られたリードを正規化したリード数をもとに前記検量線上にプロットしたものである。解析対象核酸である微生物の混合ＤＮＡ試料に含まれる８種類の微生物に関して、５０コピーのリード数である９２９１９リードよりも少なく、内挿での定量が可能（検量線で用いた数値範囲を用いた信頼性のある定量が可能）であった。検量線から推定したそれぞれの微生物のコピー数は表１３に記載した。
【０２８９】
本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞  特定コピー数の標準核酸と、解析対象核酸とを同一系内に含むライブラリーを調製するライブラリー調製工程と、
特定コピー数の前記標準核酸のコピー数に基づき検量線データを作成する検量線データ作成工程と、
前記解析対象核酸の塩基配列を特定するとともに、前記検量線データを用いて前記解析対象核酸の塩基配列の数を特定する解析対象核酸解析工程と、を含むことを特徴とする核酸解析方法である。
＜２＞  異なる塩基配列を有する標準核酸を、同一系内において、互いに異なる特定コピー数で含む前記＜１＞に記載の核酸解析方法である。
＜３＞  前記標準核酸を、２以上の異なる系内において、互いに異なる特定コピー数で含み、
取得する前記標準核酸の前記検量線データを正規化し合一する前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の核酸解析方法である。
＜４＞  前記標準核酸が、ＤＮＡである前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の核酸解析方法である。
＜５＞  前記解析対象核酸が、ＤＮＡ及びｃＤＮＡの少なくともいずれかである前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の核酸解析方法である。
＜６＞  前記ライブラリーの調製が、前記標準核酸及び前記解析対象核酸に対して同一のプライマーを用いて行われる前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の核酸解析方法である。
＜７＞  前記ライブラリーの調製が、前記標準核酸及び前記解析対象核酸に対して異なるプライマーを用いて行われる前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の核酸解析方法である。
＜８＞  同一系内に特定コピー数の標準核酸と、解析対象核酸とが調製されたライブラリーに対して、
検量線データ作成手段により、特定コピー数の前記標準核酸のデータに基づき、前記標準核酸の検量線データを作成させ、
解析対象核酸解析手段により、前記解析対象核酸の塩基配列を特定するとともに、前記検量線データを用いて前記解析対象核酸の塩基配列の数を特定させる、処理をコンピュータに実行させることを特徴とする核酸解析プログラムである。
＜９＞  前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の核酸解析方法に用いられるライブラリー調製用デバイスであって、
特定コピー数の標準核酸を有することを特徴とするライブラリー調製用デバイスである。
＜１０＞  前記標準核酸が前記特定コピー数である不確かさを平均特定コピー数で除した変動係数ＣＶ値と、前記標準核酸の平均特定コピー数ｘとにより表される、次式、ＣＶ＜１／√ｘを満たす前記＜９＞に記載のライブラリー調製用デバイスである。
＜１１＞  前記特定コピー数の前記標準核酸がインクジェット方式により配される前記＜９＞から＜１０＞のいずれかに記載のライブラリー調製用デバイスである。
【０２９０】
前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の核酸解析方法、前記＜８＞に記載の核酸解析プログラム、及び前記＜９＞から＜１１＞のいずれかに記載のライブラリー調製用デバイスは、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。
【符号の説明】
【０２９１】
１  デバイス
２  基材
３  ウェル
４  核酸
５  密閉部材
【先行技術文献】
【特許文献】
【０２９２】
【特許文献１】特開２０１５−２０４８１３号公報
【非特許文献】
【０２９３】
【非特許文献１】ＭｉＦｉｓｈ，  ａ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｂａｒｃｏｄｉｎｇ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｆｉｓｈｅｓ：  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ２３０  ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ  ｍａｒｉｎｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｍｉｙａ，ｅｔ．  ａｌ．，２０１５
【図１Ａ】
2020096578.tif 000019
【図１Ｂ】
2020096578.tif 000020
【図２】
2020096578.tif 000021
【図３】
2020096578.tif 000022
【図４】
2020096578.tif 000023
【図５】
2020096578.tif 000024
【図６Ａ】
2020096578.tif 000025
【図６Ｂ】
2020096578.tif 000026
【図６Ｃ】
2020096578.tif 000027
【図７Ａ】
2020096578.tif 000028
【図７Ｂ】
2020096578.tif 000029
【図８Ａ】
2020096578.tif 000030
【図８Ｂ】
2020096578.tif 000031
【図８Ｃ】
2020096578.tif 000032
【図９】
2020096578.tif 000033
【図１０】
2020096578.tif 000034
【図１１】
2020096578.tif 000035
【図１２】
2020096578.tif 000036
【図１３】
2020096578.tif 000037
【図１４】
2020096578.tif 000038
【図１５】
2020096578.tif 000039
【図１６Ａ】
2020096578.tif 000040
【図１６Ｂ】
2020096578.tif 000041
【図１７】
2020096578.tif 000042
【図１８】
2020096578.tif 000043
【図１９】
2020096578.tif 000044
【図２０】
2020096578.tif 000045
【図２１】
2020096578.tif 000046
【図２２】
2020096578.tif 000047
【図２３】
2020096578.tif 000048
【図２４】
2020096578.tif 000049
【図２５】
2020096578.tif 000050
【図２６】
2020096578.tif 000051
【図２７】
2020096578.tif 000052
【図２８】
2020096578.tif 000053
【図２９】
2020096578.tif 000054
【配列表】
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