(57)【要約】【課題】PD-1等の免疫チェックポイント分子を標的とする新たなタンパク質の提供。【解決手段】細胞膜透過性ペプチド、PD-1（Programmed cell death 1）遺伝子の塩基配列に結合するDNA結合ペプチド及びDNAメチル化活性を有するペプチドを含む融合ポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜透過性ペプチド、PD-1（Programmed cell death 1）遺伝子の塩基配列に結合するDNA結合ペプチド及びDNAメチル化活性を有するペプチドを含む融合ポリペプチドであって、前記塩基配列が、配列番号７、８又は９に示される塩基配列である、融合ポリペプチド。
【請求項２】
DNAメチル化活性を有するペプチドが、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3AとDNMT3Lとの融合ペプチド又はDNMT3BとDNMT3Lとの融合ペプチドである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
細胞膜透過性ペプチドが配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１又は２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
DNA結合ペプチドが転写活性化因子様エフェクター（TALE:Transcription Activator Like Effector）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
DNA結合ペプチドが、配列番号１１、１３又は１５に示されるアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
細胞膜透過性ペプチドが配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むペプチドであり、DNA結合ペプチドが配列番号１１、１３又は１５に示されるアミノ酸配列を含むペプチドであり、かつDNAメチル化活性を有するペプチドがDNMT3AとDNMT3Lとの融合ペプチドを含むペプチドである、請求項５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号３９、４１又は４３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドを含む組成物。
【請求項９】
PD-1の発現抑制剤である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドが導入された細胞傷害性細胞。
【請求項１１】
請求項１０に記載の細胞傷害性細胞を含む組成物。
【請求項１２】
癌の治療又は予防用医薬組成物である、請求項１１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、PD-1の発現を抑制する新規の融合ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌免疫療法として、PD-1（Programmed cell death 1）やCTLA-4をはじめとする免疫チェックポイント分子に対するモノクローナル抗体を用いる方法が導入され、大きな注目を浴びている（特許文献１：国際公開第2004/004771号）。
PD-1は、細胞傷害性T細胞（CTL）やナチュラルキラー細胞（NK細胞）の表面に存在する分子である。PD-1が癌細胞上のリガンド（PD-L1など）と結合すると、癌細胞に対するCTLやNK細胞の細胞障害活性が抑制されることが知られている。このような機構において、PD-1に対するモノクローナル抗体は、PD-1とPD-L1との結合を阻害することにより、CTLやNK細胞の細胞障害活性の抑制を阻害し、結果として癌細胞を傷害し得ることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第2004/004771号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一方、癌免疫療法の可能性を広げるためには、抗体以外に、PD-1などの免疫チェックポイント分子を標的とする新たなタンパク質の開発が求められる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、細胞膜透過性ペプチド、PD-1遺伝子の塩基配列に結合するDNA結合ペプチド及びDNAメチル化活性を有するペプチドを含む融合ポリペプチドを作製した。そして、当該融合ポリペプチドを用いることにより、細胞傷害性細胞においてPD-1の発現を抑制することに成功し、さらには当該細胞の細胞傷害活性を投与後数日間持続させることに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）細胞膜透過性ペプチド、PD-1（Programmed cell death 1）遺伝子の塩基配列に結合するDNA結合ペプチド及びDNAメチル化活性を有するペプチドを含む融合ポリペプチドであって、前記塩基配列が、配列番号７、８又は９に示される塩基配列である、融合ポリペプチド。
（２）DNAメチル化活性を有するペプチドが、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3AとDNMT3Lとの融合ペプチド又はDNMT3BとDNMT3Lとの融合ペプチドである、上記（１）に記載の融合ポリペプチド。
（３）細胞膜透過性ペプチドが配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むペプチドである、上記（１）又は（２）に記載の融合ポリペプチド。
（４）DNA結合ペプチドが転写活性化因子様エフェクター（TALE:Transcription Activator Like Effector）である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
（５）DNA結合ペプチドが、配列番号１１、１３又は１５に示されるアミノ酸配列を含むペプチドである、上記（４）に記載の融合ポリペプチド。
（６）細胞膜透過性ペプチドが配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むペプチドであり、DNA結合ペプチドが配列番号１１、１３又は１５に示されるアミノ酸配列を含むペプチドであり、かつDNAメチル化活性を有するペプチドがDNMT3AとDNMT3Lとの融合ペプチドを含むペプチドである、上記（５）に記載の融合ポリペプチド。
（７）配列番号３９、４１又は４３に示されるアミノ酸配列を含む、上記（６）に記載の融合ポリペプチド。
（８）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の融合ポリペプチドを含む組成物。
（９）PD-1の発現抑制剤である、上記（８）に記載の組成物。
（１０）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の融合ポリペプチドが導入された細胞傷害性細胞。
（１１）上記（１０）に記載の細胞傷害性細胞を含む組成物。
（１２）癌の治療又は予防用医薬組成物である、上記（１１）に記載の組成物。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の融合ポリペプチドを用いることにより、細胞傷害性細胞においてPD-1の発現を抑制することができ、さらに、当該細胞の細胞傷害活性を投与後数日間持続させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】各種TALEの標的配列の位置及びDNAメチル化活性の解析手順を示す図である。
【図２Ａ】DNAメチル化活性の解析結果を示す図である。
【図２Ｂ】PD-1遺伝子の発現解析結果を示す図である。
【図３Ａ】本発明の融合ポリペプチドによりPD-1の遺伝子発現が抑制されたことを示す図である。
【図３Ｂ】本発明の融合ポリペプチドによりPD-1遺伝子プロモーター領域のDNAメチル化が誘導されたことを示す図である。
【図４Ａ】本発明の融合ポリペプチドにより、PBMCにおいてPD-1の遺伝子発現が抑制されたことを示す図である。
【図４Ｂ】本発明の融合ポリペプチドにより、PBMCにおいてPD-1のタンパク質発現が抑制されたことを示す図である。
【図４Ｃ】本発明の融合ポリペプチドにより、PBMCにおいてPD-1遺伝子プロモーター領域のDNAメチル化が誘導されたことを示す図である。
【図５】PBMCの細胞傷害活性に対する本発明の効果について、評価系を示す模式図である。
【図６Ａ】本発明の融合ポリペプチドを作用させたPBMCにより、アポトーシスを示す癌細胞（Annexin V 陽性細胞）が増加したことを示すヒストグラムである。
【図６Ｂ】本発明の融合ポリペプチドを作用させたPBMCにより、アポトーシスを示す癌細胞（Annexin V 陽性細胞）が増加したことを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
【０００９】
１．概要
近年、癌免疫療法として免疫チェックポイント分子に対する抗体を用いる方法が注目されているが、これとは異なる癌免疫療法の一つとして、「養子免疫療法」が知られている。この方法は、癌患者由来の癌細胞特異的な細胞傷害性細胞（CTLやNK細胞など）を一旦体外で培養して増殖させ、増殖させた当該細胞を同じ癌患者に投与する方法である。
養子免疫療法において、患者に投与された細胞傷害性細胞表面にPD-1（Programmed cell death 1）などの免疫チェックポイント分子が発現していると、細胞傷害性細胞は癌細胞上のPD-L1等のリガンドを介して結合し、癌細胞に対する細胞傷害性が抑制されてしまう。
また、PD-1に対する抗体の全身投与は、PD-1とPD-L1との結合を遮断することで免疫担当細胞の細胞傷害活性を増強していると考えられるが、一方、当該抗体が投与された患者において、腸炎、肺炎、心筋炎などの自己免疫疾患様症状が重篤な副作用として出現することが知られている（Wang DY et al., JAMA Oncol., 2018 Sep 13）。
一方、本発明は、PD-1遺伝子の塩基配列に結合するDNA結合ペプチド及びDNAメチル化活性を有するペプチドを含む融合ポリペプチドであり、免疫担当細胞に対してex vivoで細胞傷害活性を増強し得る点が有利な点の一つである。
本発明の融合ポリペプチドは、PD-1遺伝子のDNAをエピゲノム修飾（具体的にはメチル化）することが可能であり、これにより、PD-1の発現を抑制することができる。そして実際に、本発明によりPD-1の発現が抑制されたCTLやNK細胞を含む末梢血単核細胞（PBMC）は、対照と比較して癌細胞に対する細胞傷害活性が増強された（本明細書実施例２、図6A及び図6B）。さらに、驚くべきことに、このPD-1の発現抑制作用とCTLの細胞傷害活性は、本発明の融合ポリペプチドの投与を中止した後も数日間持続することができる。
【００１０】
このような効果を有する本発明の融合ポリペプチドを養子免疫療法に用いれば、患者から採取した免疫担当細胞を当該ポリペプチド存在下で培養する間のみならず、培養終了後（投与を中止した後）も数日間、PD-1の発現抑制作用及びCTLの細胞傷害活性を持続させることが可能である。すなわち、本発明を用いた養子免疫療法では、PD-1の発現抑制作用及び細胞傷害活性が増強又は維持された細胞傷害性細胞を患者に投与することができる。
さらに、本発明の融合ポリペプチドは、プラスミドDNAなどのようにゲノムに組み込まれる可能性が無いのに加えて、抗体の全身投与で認められる自己免疫疾患様症状の軽減も期待できるため、臨床上の安全性も高い。
このように、本発明の融合ポリペプチドは、抗体療法などの従来の免疫療法ではなし得なかった新たな癌免疫療法を可能にする極めて有用なものである。
【００１１】
２．融合ポリペプチド
（１）細胞膜透過性ペプチド
本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、PD-1遺伝子の塩基配列に結合するDNA結合ペプチド及びDNAメチル化活性を有するペプチドを含む融合ポリペプチドである。
本発明において、「細胞膜透過性ペプチド」は、細胞膜を通過できるペプチドである限り、そのアミノ酸配列は特に限定されない。被験ペプチドが細胞膜を通過できるか否かは、公知の細胞膜通過評価系を用いて確認することができる（国際公報第2008/108505号）。
【００１２】
本発明の融合ポリペプチドに含まれる細胞膜透過性ペプチドには、公知の細胞膜透過性ペプチドを使用することができる（国際公報第2008/108505号、Pharmacol. Ther.、2015、Vol.154、p.78-86、Database (Oxford)、2012、bas015）。例えば、本発明の融合ポリペプチドに含まれる細胞膜透過性ペプチドとして、アミノ酸配列RI、FI及びRIGCを含み、アミノ酸残基数が２５以下であるポリペプチドを使用することができる。１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドに含まれる細胞膜透過性ペプチドとしては、配列番号１に示されるアミノ酸配列（RILQQLLFIHFRIGCRHSRI）を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２に示されるアミノ酸配列（RILQQLLFIHFRIGCRH）を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３に示されるアミノ酸配列（RILQQLLFIHFRIGC）を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号５に示されるアミノ酸配列（RIFIHFRIGC）を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列（RIFIRIGC）を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。好ましくは、配列番号５に示されるアミノ酸配列（RIFIHFRIGC）を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるペプチドである。配列番号５に示されるアミノ酸配列（RIFIHFRIGC）をコードする塩基配列は配列番号４に示す。
【００１３】
（２）DNA結合ペプチド
本発明において、「PD-1遺伝子の塩基配列に結合するDNA結合ペプチド」とは、PD-1遺伝子の転写調節領域に結合するDNA結合ポリペプチドである。
転写調節領域としては、PD-1遺伝子の発現調節に関与する領域である限り特に限定されるものではなく、例えば、プロモーター領域及びエンハンサー領域が挙げられる。
【００１４】
本発明において、「PD-1遺伝子の塩基配列に結合するDNA結合ペプチド」としては、限定されるものではないが、例えば、配列番号７、８又は９に示される塩基配列に結合するDNA結合ペプチドが挙げられる。
【００１５】
本発明において、DNA結合ペプチドについて使用される「結合する」とは、標的の塩基配列のDNAに対して親和性を有することを意味する。また、「結合する」とは、標的の塩基配列に直接結合することだけでなく、標的の塩基配列に結合するポリヌクレオチドに結合することで間接的に標的の塩基配列に結合することも意味する。したがって、本発明の融合ポリペプチドに含まれるDNA結合ポリペプチドには、標的の塩基配列に直接結合するポリペプチドだけでなく、標的の塩基配列に結合するポリヌクレオチドに結合することで間接的に標的の塩基配列に結合するポリペプチドも含まれる。
【００１６】
標的の塩基配列に結合するポリヌクレオチドに結合することで間接的に標的の塩基配列に結合するDNA結合ペプチドとしては、例えば、CRISPR/CAS9（Science、2013、Vol.339、p.819-823）を使用することができる。CRISPR/CAS9を作製する技術は公知であるため、当業者であれば、当該技術に基づいて、標的の塩基配列に結合するように設計されたポリヌクレオチド、及び、当該ポリヌクレオチドに結合するペプチドを作製することができる（Science、2013、Vol.339、p.819-823、Science、2013、Vol.339、p.823-826）。
【００１７】
さらに、本明細書において、DNA結合ポリペプチドについて使用される「結合する」とは、実際に標的の塩基配列に結合することだけでなく、標的の塩基配列に結合するように設計されたことも意味する。したがって、本発明の融合ポリペプチドに含まれるDNA結合ポリペプチドには、実際に標的の塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドだけでなく、標的の塩基配列に結合するように設計されたDNA結合ポリペプチドも含まれる。
【００１８】
被験ペプチドが標的の塩基配列又は標的の塩基配列に結合するポリヌクレオチドに結合することができるか否かは、ゲルシフトアッセイやChIP（Chromatin immunoprecipitation）-seqアッセイなどの公知の結合活性測定方法を用いて確認することができる。
【００１９】
被験ペプチドが標的の塩基配列に結合するように設計されたか否かは、例えば、標的の塩基配列に結合することが報告されているアミノ酸配列を被験ペプチドが含むかどうかで確認することができる。標的の塩基配列に結合することが報告されているアミノ酸配列として、例えば、Science、2009、Vol.326、p.1509-1512、Nat.Biotechnol.、2011、Vol.29、p.143-148、特開2015/33365号、及び、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、1997、Vol.94、p.5525-5530に記載のアミノ酸配列が挙げられる。また、被験ペプチドが標的の塩基配列に結合するように設計されたか否かは、上記と同様、ゲルシフトアッセイやChIP-seqmアッセイなどの公知の結合活性測定方法を用いて、被験ペプチドが標的の塩基配列に実際に結合するかどうかを確認してもよい。
【００２０】
PD-1遺伝子の塩基配列に結合するように設計されたDNA結合ペプチドとしては、例えば、転写活性化因子様エフェクター（TALE）（Science、2009、Vol.326、p.1509-1512）又はZinc-fingerタンパク質（Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、1996、Vol.93、p.1156-1160）を使用することができる。TALE及びZinc-fingerタンパク質を作製する技術は公知であり（Nat. Biotechnol.、2011、Vol.29、p.143-148、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、1997、Vol.94、p.5525-5530）、TALEを作製する際には、塩基配列に対する高い結合活性を有するTALEを作製する方法を使用することができる（特開2015/33365号、Platinum Gate TALEN construction protocol（Yamamoto lab）Ver.1.0 ［2018年10月22日検索］、インターネット＜URL:https://www.addgene.org/static/cms/files/Platinum_Gate_protocol.pdf＞）。
TALEの結合領域（標的塩基配列）は、例えば、結合対象となる遺伝子の周辺配列を公知のデータベース（例えばEnsembl genome browserなど）で検索し、そのプロモーターやエンハンサーとして作用することが予想される当該遺伝子の転写開始点から上流（例えば、約1〜500ベースペア（bp）上流、約1〜50000bp上流）の遺伝子領域から、選択することができる。
【００２１】
本明細書で使用される「TALE」とは、３４アミノ酸からなる構造単位を１０〜３０個の繰り返し数で連結されたリピート構造（以下、「DNA結合リピート部分」ともいう）を含むペプチドを意味する。本発明において、TALEは、目的とするゲノム上の標的塩基配列に結合するように設計されたDNA結合リピート部分と、チミンに結合するように設計されたアミノ酸配列を含むアミノ末端領域とを含む（RCSB Protein Data Bank、 Molecule of the Month、2014、No.180、Nat. Biotechnol.、2011、Vol.29、p.143-148）。標的塩基配列に結合するように設計されたDNA結合リピート部分のアミノ酸配列及びチミンに結合するように設計されたアミノ酸配列を含むアミノ末端領域のアミノ酸配列としては、例えば、公知のアミノ酸配列を使用することができる（Science、2009、Vol.326、p.1509-1512、Nat. Biotechnol.、2011、Vol.29、p.143-148、特開2015/33365号）。
本発明において、上記「標的塩基配列に結合するように設計されたDNA結合リピート部分」のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１１、１３又は１５に示されるアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。
また、本発明において、上記「チミンに結合するように設計されたアミノ酸配列を含むアミノ末端領域」のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１７に示されるアミノ酸配列が挙げられるが、これに限定されない。
【００２２】
本発明において、「PD-1遺伝子の塩基配列に結合するDNA結合ペプチド」としては、限定されるものではないが、例えば、配列番号７、８又は９に示される塩基配列に結合するTALEが挙げられる。
【００２３】
本発明において、「PD-1遺伝子の塩基配列に結合するDNA結合ペプチド」としては、限定されるものではないが、例えば、配列番号１１、１３又は１５に示されるアミノ酸配列を含むTALEが挙げられ、好ましくは、配列番号１９、２１又は２３に示されるアミノ酸配列を含むTALEであり、より好ましくは、配列番号２５、２７又は２９に示されるアミノ酸配列を含む又はこのアミノ酸配列からなるTALEである。
配列番号１１、１３及び１５に示されるアミノ酸配列は、標的塩基配列に結合するように設計されたDNA結合リピート部分のアミノ酸配列である。
配列番号１９、２１又は２３に示されるアミノ酸配列は、(i) チミンに結合するように設計されたアミノ酸配列を含むアミノ末端領域と(ii)標的塩基配列に結合するように設計されたDNA結合リピート部分とを含むアミノ酸配列である。
配列番号２５、２７又は２９に示されるアミノ酸配列は、(i) チミンに結合するように設計されたアミノ酸配列を含むアミノ末端領域と(ii)標的塩基配列に結合するように設計されたDNA結合リピート部分と(iii) DNA結合リピート部分の下流のカルボキシル末端領域とを含むアミノ酸配列である。
【００２４】
（３）DNAメチル化活性を有するペプチド
本発明において、「DNAメチル化活性を有するペプチド」とは、PD-1遺伝子のDNAをメチル化する活性を有するペプチドを意味する。そのようなペプチドとしては、限定されるものではなく、例えば、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3AとDNMT3Lとの融合ペプチド（以下「DNMT3A/3L」）、DNMT3BとDNMT3Lとの融合ペプチド（以下「DNMT3B/3L」）などが挙げられ（Gowher H et al., J Biol Chem. 2005 Apr 8;280(14):13341-8. Epub 2005 Jan 24）、好ましくは、DNMT3A/3L、DNMT3B/3Lである。DNMT3A、DNMT3B及びDNMT3Lの塩基配列及びアミノ酸配列は公知であり、当業者であれば公知のデータベース（Genbank等）に基づいてDNAメチル化活性を有するペプチドを調製することができる。
本発明において、DNMT3A/3Lとしては、例えば、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。また、DNMT3A/3Lをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３０に示される塩基配列を含む若しくはこの塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
また、DNAメチル化活性の有無は、公知の方法を用いて解析することができる。例えば、メチル化の標的となり得るCpGアイランドを含むゲノムDNAをクローニングし、このDNAを基質として用いる。adenosylmethionine (NEB)存在下で、この基質と被験ペプチドとを反応させ、反応終了後、タンパク質を除いたDNAにおいて、バイサルファイト処理により非メチル化シトシンをウラシルに変換する。その後、処理したDNAについてシークエンス解析を行うことで、被験ペプチドがメチル化活性を有するかどうかを調べることができる。
【００２５】
本発明の融合ポリペプチドにおいて、細胞膜透過性ペプチド、PD-1遺伝子の塩基配列に結合するDNA結合ペプチド及びDNAメチル化活性を有するペプチドの位置は、PD-1遺伝子の発現を抑制する活性を有する限り限定されない。好ましくは、細胞膜透過性ペプチドは本発明の融合ポリペプチドのＮ末端側又はＣ末端側に位置する。より好ましくは、細胞膜透過性ペプチドは本発明の融合ポリペプチドのＮ末端側に位置する。１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、Ｎ末端側から、細胞膜透過性ペプチド、PD-1遺伝子の塩基配列に結合するDNA結合ペプチド及びDNAメチル化活性を有するペプチドの順に構成される。
【００２６】
本発明の融合ポリペプチドに含まれる、細胞膜透過性ペプチド、PD-1遺伝子の塩基配列に結合するDNA結合ペプチド及びDNAメチル化活性を有するペプチドが由来する生物種は、限定されるものではなく、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、サル、イヌ、ウシ、トリなどが挙げられるが、好ましくは、マウス、ラット、ヒト、サルであり、より好ましくはヒトである。
【００２７】
本発明の融合ポリペプチドは、PD-1の発現を抑制することができる限り、細胞膜透過性ペプチドとPD-1遺伝子の塩基配列に結合するDNA結合ペプチドとDNAメチル化活性を有するペプチドとの間にペプチドリンカー等のペプチドを含んでもよい。
【００２８】
また、本発明の融合ポリペプチドは、PD-1の発現を抑制することができる限り、本発明の融合ポリペプチドのN末端又はC末端にGlutathione S-transferase（GST）やヒスチジンタグ（Hisタグ）などのペプチドタグを含んでもよい。
本発明において、ヒスチジンタグとしては、例えば、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられるが、これに限定されない。
【００２９】
また、本発明の融合ポリペプチドは、PD-1の発現を抑制することができる限り、TEVプロテアーゼ認識配列、プレシジョンプロテアーゼ認識配列などのプロテアーゼ認識配列を含んでもよい。本発明の融合ポリペプチドにおけるプロテアーゼ認識配列の位置は限定されない。
本発明において、TEVプロテアーゼ認識配列としては、例えば、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられ、また、プレシジョンプロテアーゼ認識配列としては、例えば配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、(i) 配列番号５に示されるアミノ酸配列（RIFIHFRIGC）を含む若しくはこのアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、(ii) 配列番号１１、１３又は１５に示されるアミノ酸配列を含むTALE及び(iii) 配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるDNMT3A/3Lを含むものである。また、これに加えて、本発明の融合ポリペプチドは、(iv)配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むTEVプロテアーゼ認識配列、及び／又は(v)配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含むプレシジョンプロテアーゼ認識配列をさらに含むものであってもよい。
【００３１】
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号３９、４１又は４３に示されるアミノ酸配列を含む又はこのアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００３２】
また、本発明の融合ポリペプチドには、配列番号３９、４１又は４３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号３９、４１又は４３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつPD-1遺伝子の発現を抑制する作用を有するポリペプチドが含まれる。
上記配列番号３９、４１又は４３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列としては、例えば、
（ｉ）配列番号３９、４１又は４３に示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号３９、４１又は４３に示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号３９、４１又は４３に示されるアミノ酸配列中に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号３９、４１又は４３に示されるアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
【００３３】
本発明において、「PD-1遺伝子の発現を抑制する作用」とは、細胞においてPD-1遺伝子の発現量を減少させる作用を意味する。「PD-1遺伝子の発現を抑制する作用を有する」とは、被験融合ポリペプチドを添加していない培地で培養された細胞のPD-1遺伝子の発現量と比較して、被験融合ポリペプチドが10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、好ましくは、50%以上PD-1遺伝子の発現量を減少させる作用を有することを意味する。PD-1遺伝子の発現を抑制する作用は、例えば本発明の融合ペプチドを添加した培地で培養した細胞におけるPD-1遺伝子のmRNA量を、公知の方法、例えばReal-time PCRを用いて測定することにより、確認することができる。
【００３４】
また、本発明の融合ペプチドには、配列番号３９、４１又は４３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号３９、４１又は４３に示されるアミノ酸配列と約80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、又は99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつPD-1遺伝子の発現を抑制する作用を有するポリペプチドが含まれる。
【００３５】
本明細書における「同一性」とは、EMBOSS NEEDLE program（J.Mol.Biol.、1970、Vol.48、p.443-453）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Identityを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Gap penalty=10
Extend penalty=0.5
Matrix=EBLOSUM62
【００３６】
上記の変異を有するポリペプチドを調製するために、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。また、「Molecular Cloning、 A Laboratory Manual(4th edition)」(Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)）等に記載された部位特異的変異誘発法等の方法を用いることができる。
【００３７】
本発明の融合ポリペプチドは、本明細書に開示される、細胞膜透過性ペプチド、PD-1遺伝子に結合するDNA結合ペプチド及びDNAメチル化活性を有するペプチドの配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。本発明の融合ポリペプチドは、特に限定されるものではないが、例えば、後述の「７．融合ポリペプチドを生産する方法」に記載の方法に従い製造することができる。
【００３８】
３．ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドには、本発明の融合ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
本発明において、細胞膜透過性ペプチドをコードする塩基配列としては、例えば、配列番号４に示される塩基配列を含むものが挙げられ、TALEをコードする塩基配列としては、例えば、配列番号１０、１２又は１４に示される塩基配列を含むものが挙げられ、DNMT3A/3Lをコードする塩基配列としては、例えば、配列番号３０に示される塩基配列を含むものが挙げられるが、これに限定されない。また、TEVプロテアーゼ認識配列をコードする塩基配列、プレシジョンプロテアーゼ認識配列をコードする塩基配列としては、それぞれ、例えば、配列番号３４に示される塩基配列を含むもの、配列番号３６に示される塩基配列を含むものが挙げられるが、これに限定されない。
また、本発明の融合ポリペプチドをコードする塩基配列としては、例えば、配列番号３８、４０又は４２に示される塩基配列を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、本発明の融合ポリペプチドを発現する宿主の種類に応じて、そのコドンを最適化することができる。この最適化により、宿主における発現量を向上させることができる。
【００３９】
本発明のポリヌクレオチドは、その塩基配列に基づき、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。
【００４０】
４．発現ベクター
本発明の発現ベクターには、本発明の融合ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドを発現させるために用いる発現ベクターとしては、RNAポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液中で本発明の融合ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現し、コムギ胚芽抽出液中でこれらによりコードされるポリペプチドを産生できるものである限り、又は、真核細胞（例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母）及び／又は原核細胞（例えば、大腸菌）の各種の宿主細胞中で本発明の融合ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現し、これらによりコードされるポリペプチドを産生できるものである限り、特に制限されるものではない。このような発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、センダイウイルス）等が挙げられ、好ましくは、pEU-E01-MCS（セルフリーサイエンス社）、pColdTMベクター（タカラバイオ）を使用することができる。
【００４２】
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。RNAポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液中で発現させるためのプロモーターとしては、T3プロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーターなどが挙げられる。動物細胞で本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、Cytomegalovirus（CMV）、Rous sarcoma virus（RSV）、Simian virus 40（SV40）などのウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、EF（elongation factor）１αプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。細菌（例えば、エシェリキア属菌）で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、λPLプロモーター、tacプロモーター、T3プロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーターなどが挙げられる。また、酵母で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、GAL1プロモーター、GAL10プロモーター、PH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが挙げられる。
【００４３】
RNAポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液並びにコムギ胚芽抽出液を用いる場合、若しくは、宿主細胞として動物細胞、昆虫細胞、又は酵母を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン及び終止コドンを含み得る。この場合、本発明の発現ベクターは、エンハンサー配列、本発明の融合ポリペプチドをコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、あるいは複製可能単位などを含んでいてもよい。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域、及び複製可能単位を含み得る。この場合、本発明の発現ベクターは、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。
【００４４】
５．形質転換された宿主細胞
本発明の形質転換された宿主細胞には、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。
【００４５】
形質転換する宿主細胞としては、使用する発現ベクターに適合し、当該発現ベクターで形質転換されて、タンパク質を発現することができるものである限り、特に限定されるものではない。形質転換する宿主細胞としては、例えば、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞又は人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、動物細胞（例えば、CHO細胞）、昆虫細胞（例えば、Sf9）、細菌（エシェリキア属菌など）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）など）が挙げられ、好ましくは、細菌（エシェリキア属菌など）、CHO細胞、293細胞、NS0細胞等の培養細胞を使用することができる。
宿主細胞を形質転換する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸カルシウム法、電気穿孔法等を用いることができる。
【００４６】
６．融合ポリペプチドが導入された細胞傷害性細胞
本発明の融合ポリペプチドが導入された細胞傷害性細胞には、本発明の融合ポリペプチドが導入された細胞傷害活性を有する免疫担当細胞、例えば細胞傷害性T細胞、NK細胞などが含まれる。当該細胞傷害性細胞は、T細胞由来の細胞株（例えば、MOLT-4、 Jurkat、CEM）であってもよいし、ヒトから採取された末梢血由来単核球（PBMC）又はPBMCから単離された細胞傷害活性を有する免疫担当細胞（T細胞、NK細胞など）であってもよい。
被験細胞の細胞傷害活性については、公知の手法、例えばAnnexin-V陽性細胞数をFACS等によりカウントする手法などを用いて測定することができる。
【００４７】
７．融合ポリペプチドを生産する方法
本発明の融合ポリペプチドを生産する方法には、本発明の発現ベクターを用いて、RNAポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液中で合成したmRNAをコムギ胚芽抽出液と反応させて、融合ポリペプチドを発現させる工程、又は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、融合ポリペプチドを発現させる工程を包含する、融合ポリペプチドを生産する方法が含まれる。
当該方法で使用されるRNAポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液並びにコムギ胚芽抽出液としては、例えば、WEPRO7240G Expression Kit（セルフリーサイエンス社）に含まれる試薬が挙げられる。また、当該方法で使用される好ましい宿主細胞としては、上記５．において「形質転換する宿主細胞」として列挙した細胞が挙げられる。
【００４８】
形質転換された宿主細胞の培養は公知の方法により行うことができる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ及び培養時間は、適宜選択される。宿主細胞を培養することにより、本発明の融合ポリペプチドを生産することができる。
【００４９】
本発明の融合ポリペプチドを生産する方法は、本発明の発現ベクターを用いて、RNAポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液中でmRNAを合成する工程、並びに合成したmRNAをコムギ胚芽抽出液と反応させて、融合ポリペプチドを発現させる工程に加えて、さらには、融合ポリペプチドを回収、好ましくは単離又は精製する工程を含むことができる。単離又は精製方法としては、例えば、GSTタグと融合した本発明の融合ポリペプチドをグルタチオンセファロースビーズに結合させた後、過剰な還元型グルタチオンで溶出することによるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００５０】
また、本発明の融合ポリペプチドを生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、融合ポリペプチドを発現させる工程に加えて、さらには、当該形質転換された宿主細胞から融合ポリペプチドを回収、好ましくは単離又は精製する工程を含むことができる。単離又は精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。好ましくは、培養上清中に蓄積された融合ポリペプチドは、各種クロマトグラフィーにより精製することができる。
【００５１】
本発明の融合ポリペプチドには、本発明の融合ポリペプチドを生産する方法で生産された融合ポリペプチドも含まれる。
【００５２】
本発明の方法で使用される培地は、細胞培養の分野において通常使用される培地であれば特に限定されない。また、細胞の種類に応じて、血清を培地に添加することができる。
【００５３】
本発明の方法で使用される培養条件は、細胞の種類に応じて当業者が適宜選択することができる。
【００５４】
培地に添加される本発明の融合ポリペプチドの濃度は、細胞の種類や細胞数、融合ポリペプチドの転写調節活性等により異なるが、例えば、0.01nM〜10μM程度、好ましくは0.1nM〜5μM程度を用いることができる。
【００５５】
本発明の融合ポリペプチドを添加するタイミング及び回数は特に限定されない。本発明の融合ポリペプチドを培地に添加（投与）するタイミングは、例えば、培養開始時に添加してもよく、又は、培養開始後に添加してもよい。培養開始後に本発明の融合ポリペプチドを培地に添加する場合、培養開始から例えば1時間後、5時間後、10時間後、15時間後、24時間後（1日後）、36時間後、48時間後（2日後）、3日後、4日後、5日後に添加してもよい。
【００５６】
本発明の融合ポリペプチドは、細胞傷害性細胞の培養培地に数日間添加した後に添加を中止しても、細胞傷害性細胞のPD-1の発現を抑制し、さらに細胞傷害活性を増強又は維持することができる。
【００５７】
本発明の融合ポリペプチドがPD-1の発現を抑制することができるか否かは、公知の遺伝子発現量測定方法を用いて確認することができる。遺伝子発現量を測定する方法としては、例えば、Real-Time PCR等の方法が挙げられる。Real-Time PCRを用いる場合、例示的な方法において、TaqMan Fast Advanced Master Mix （サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用することによって、被験融合ポリペプチドがPD-1遺伝子の発現を抑制することができるか否かを確認することができる。遺伝子発現量の具体的な評価方法としては、例えば、後述する実施例２に記載されるような方法を用いることができる。
【００５８】
８．組成物
本発明の組成物は、細胞膜透過性ペプチド、PD-1遺伝子の塩基配列に結合するDNA結合ペプチド及びDNAメチル化活性を有するペプチドを含む融合ポリペプチドを含む。本発明の組成物に含まれる融合ポリペプチドについては、上記「２．本発明の融合ポリペプチド」に記載のとおりである。
本発明の融合ポリペプチドを含む組成物は、PD-1の発現を抑制することができるため、PD-1の発現抑制剤として使用することができる。
【００５９】
本発明の組成物は、細胞培養の培地に添加して使用することができる。また、本発明の組成物は、培地そのものとして使用することもできる。本発明の組成物を培地として使用する場合は、本発明の組成物は、本発明の融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのほか、炭素源、ビタミン、無機塩類などの栄養源、及び増殖因子など、通常の細胞培養に必要な成分を含むことができる。
【００６０】
また別の態様において、本発明の組成物は、本発明の融合ポリペプチドが導入された細胞傷害性細胞を含む。本発明の組成物に含まれる細胞傷害性については、上記「６．本発明の融合ポリペプチドが導入された細胞傷害性細胞」に記載のとおりである。
【００６１】
また、本発明の組成物は、本発明の融合ポリペプチド若しくは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は本発明の細胞傷害性細胞のほか、本発明の組成物に適する任意の担体（リポソーム、脂質小胞体、ミセル等）、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、緩衝剤、懸濁剤、潤滑剤、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存料、界面活性剤、着色料などを含んでもよい。
【００６２】
９．医薬組成物
本発明の組成物は、癌の治療又は予防用医薬組成物として使用することができる。
本発明の医薬組成物には、本発明の細胞傷害性細胞又は本発明の融合ポリペプチド及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。
本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、門脈内投与又は皮下投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。薬学的に許容される賦形剤としては、例えば、生理食塩水や緩衝液が挙げられる。また、必要に応じて、培養細胞の栄養源となる成分を含めることができる。
【００６３】
本発明の医薬組成物の治療又は予防の対象となる癌としては、PD-1を発現する免疫担当細胞（例えば細胞傷害性細胞）が標的とする癌であれば限定されるものではなく、例えば、PD-L1又はPD-L2を発現する癌が挙げられる。本発明において、癌としては、例えば、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸の癌、十二指腸癌、大腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
本発明には、本発明の細胞傷害性細胞又は本発明の融合ポリペプチドの治療有効量を投与する工程を包含する、癌を予防又は治療する方法が含まれる。また、本発明には、癌の予防又は治療に使用するための、本発明の細胞傷害性細胞又は本発明の融合ポリペプチドが含まれる。さらに、本発明には、癌の予防又は治療用医薬組成物の製造における、本発明の細胞傷害性細胞又は本発明の融合ポリペプチドの使用が含まれる。
【００６５】
本発明の細胞傷害性細胞を癌の予防又は治療に用いる場合において、患者に投与する細胞の個数は、当業者であれば患者の症状、性別、年齢等によって適宜設定することができるが、1回投与分の量として、例えば、約1×104〜1×1011個、好ましくは約1×106〜1×1010個である。
【００６６】
１０．試薬、キット
本発明の融合ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、融合ポリペプチドが導入された細胞傷害性細胞又はこれらのいずれかを含む組成物は、試薬又はキットの形態で使用することができる。例えば、本発明は、PD-1を発現する細胞の培養液に添加することで、当該細胞におけるPD-1の発現を抑制することができるため、PD-1の発現を抑制するための試薬又はキットとして使用することができる。また、本発明の融合ポリペプチド及びこれを含む組成物は、癌細胞に対する細胞傷害性細胞の細胞傷害活性を、対照と比較して増強又は維持することができるため、細胞傷害性細胞の培養に用いるための添加試薬又はキットとして使用することができる。
【００６７】
本発明の試薬又はキットには、本発明の融合ポリペプチド又はこれを含む組成物のほか、緩衝液、希釈用溶液、細胞培養用培地、培養用プレート、その他の細胞培養に必要な製品、使用説明書などを含めることができる。
【００６８】
本発明についてさらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
［実施例］
【００６９】
市販のキット又は試薬等を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。また、便宜上、濃度mol/LをMとして表す。
【実施例１】
【００７０】
NTP-GM（genome modulator）の作製
（１）NTP-GMをコードする発現プラスミドの作製
コムギ胚芽無細胞発現システムでのタンパク質調製に用いる発現ベクターとして、pEU-E01 ベクター（Cell Free Sciences Co., 以下CFS）を使用した。先行研究でpEU-E01 ベクターをもとに作製したpEU-E01-GST-NTP（Takahashi et al. Biomaterials, 2018）には、glutathione S transferase (GST)とNTPをコードするDNA配列が含まれている。TALEの3’側共通配列とDNAメチル化酵素であるDNMT3Aをコードする約1.2kbのDNA断片を合成し (Eurofin)、pEU-E01-GST-NTP に組み込み、得られたベクターをpEU-E01-GST-NTP-TALE-DNMT3aと命名した。そして、5’側及び3’側にそれぞれBstB1 と Nhe1 サイトを持つDNMT3L cDNA 断片を新たに合成し（Eurofin）、pEU-E01-GST-NTPに組み込んで得られたベクターをpEU-E01-GST-NTP-TALE-DNMT3a/3Lと命名した。
TALE cDNAについては、ヒトPD-1遺伝子プロモーター領域に位置する下記の配列を標的とする5種類の分子を作製し、それぞれ「C17」、「D17」、「L17」、「M17」及び「N17」と命名した。
C17の標的配列：tcccccagcactgcctc（配列番号７）
D17 の標的配列：tcccttcaacctgacct（配列番号８）
L17 の標的配列：tccaggcatgcagatcc（配列番号９）
M17 の標的配列：tccctccagacccctggctct（配列番号４４）
N17 の標的配列：tccctccagacccctgg（配列番号４５）
【００７１】
C17、D17及びL17はセンス配列、M17とN17はアンチセンス配列を認識する（図１参照）。
また、17個の塩基をランダムに並べたスクランブル配列（SCR：tggctcccacaccctcg（配列番号４６））を標的とするTALEを対照タンパク質として使用した。これら6つのTALE cDNA断片をそれぞれpEU-E01-GST-NTP-TALE-DNMT3A/3LのNTP配列とDNMT3A/3L配列との間に挿入し、得られた6つのコンストラクトDNAを総称してpEU-NTP-GMと命名した。
【００７２】
大腸菌でのタンパク質発現で用いる発現ベクターとしてpColdベクター（TAKARA）を用いた。このベクターでは、組み換えタンパク質の発現が厳格に制御され、37℃から15℃に温度シフトすることで初めて転写される。このベクターのマルチプルクローニングサイトにNTPとTALE 5’側配列（5’-CATGAGGATCTTCATCCACTTCCGGATCGGCTGTGAAAACCTGTATTTCCAATCTCTCGAGGATATCGTTTAAAC  -3’）（下線部がNTPをコードする配列）（配列番号４７））を導入し、その後、プレシジョンプロテアーゼ認識配列とHis6タグをコードするオリゴヌクレオチドDNA（5’-TTAGAGGTCTTGTTCCAGGGACCACACCACCACCATCATCAC（配列番号４８））を導入した。このベクターにpEU-NTP-GMから切り出したDNMT3A-DNMT3L cDNA 断片を挿入した。 
【００７３】
以上のようにして、コムギ胚芽無細胞発現システム及び大腸菌を用いてそれぞれNTP-GMを発現するプラスミドを作製した。
【００７４】
（２）NTP-GMタンパク質の調製
コムギ胚芽無細胞システムでのタンパク質発現は、WEPRO 7240G 発現システム (CFS)を用いた。まず、同キットに含まれるSP6ポリメラーゼでpEU-NTP-GM からmRNAを合成し、同じく同キットに含まれるコムギ胚芽抽出液と15℃ で一晩、反応させた。この反応液中に含まれる組み換えタンパク質をグルタチンビーズセファロース4B (GE Healthcare) に1時間4℃で反応させ、リン酸バッファー (PBS) で一回、リンスした後、20 mMのグルタチンを含むPBSで目的のタンパク質を溶出した。さらにGSTタグは、プレシジョンプロテアーゼ(GE healthcare) を4℃で16時間反応させることで、切断した。タグが切断されたタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム入りポリアクリルアミド電気泳動法後のクマシーブリリアントブルー染色で確認した。
【００７５】
大腸菌での発現は、BL21(DE3) (TAKARA) を用いた。pCold-NTP-GM プラスミドDNAを導入し、0.1mM IPTG （Nakarai）存在下に16時間15℃で培養した。誘導後、6000 rpm10分間遠心し、回収した大腸菌を溶解バッファー (20 mM sodium phosphate pH 7.6, 10% glycerol, 500 mM NaCl, 10 mM mercaptoethanol, 20 mM imidazole, 0.1% Nonidet P-40, 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride、1.5 mg/ml リゾチーム) に懸濁した。氷中、30分間反応させた後、ソニケーションで菌体を破壊し、可溶性タンパク質を18000 rpm、30分間遠心した後、上清を回収した。
【００７６】
次に、Ni-NTA カラム（Novagen） にアプライし、250 mMイミダゾールで溶出した。第二ステップでは、ヘパリンHPカラム (GE healthcare) を使用し、50 mM-1 M NaCl の濃度勾配法でタンパク質を溶出した。その際の基礎バッファーとしては、10% glycerol, Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM dithiothreitolを用いた。第三ステップは、αTALE抗体を用いたアフィニティー精製法を用いた。この際、先行研究で作製したαTALE抗体（Takashina et al. Biomaterials, 2018）を使用した。この抗体は、TALE分子のカルボキシル側に存在するTALE共通領域中のエピトープを認識する。αTALEを結合させた CNBrセファロースビーズ(GE Healthcare) に2時間4℃で反応させた後、0.1 M HEPES pH 2.5バッファーで溶出後、速やかに1 M HEPES pH 8.0で中和した。
このようにして、各種NTP-GMタンパク質を調製した。
【実施例２】
【００７７】
NTP-GMの機能評価
（１）細胞培養、NTP-GMタンパク質の添加及び統計解析
本実施例に用いる、ヒト急性リンパ芽球性白血病（T細胞）由来細胞株（MOLT-4）、ヒトT細胞性白血病由来細胞株（Jurkat）、ヒト急性リンパ芽球性白血病（Tリンパ球様）由来細胞株（CEM）及び ヒトミエローマ細胞株（RPMI8226）は、理研細胞バンクから供与を受け、10%牛胎児血清(FBS, Gibco) を含む RPMI1680 (Gibco)で維持した。培養は、100％湿度、37℃、5% CO2で行った。末梢血由来単核球（PBMC）は、同意を得た健常人男性から末梢血液の供与を受け、LYMPHOPREP（コスモバイオ）を用いて分離した。PBSで2回洗浄後、10% FCS入りIL-2 プラス KBM550 (KOHJIN BIO) 培地中、αCD3 (BD Bio science)をコートしたプレートで、培養した。
MOLT-4 細胞は、2 x 105 cells/mlの細胞密度で、96ウエルプレートに播種し、24 時間後、NTP-GMタンパク質を1、10又は20 nMの濃度で添加した。NTP-GM タンパク質を含む培養液は一日一回の頻度で交換し、5日間連続作用した。初回添加後6日目からは、NTP-GMタンパク質無しで培養を継続した。培養液は隔日で交換し、その都度、細胞密度を5 x 105 cells/mlに減じた。初回添加後4、6、9、12日に細胞を回収し、解析に供した。
実験データの評価は、Student‘s t-testを使用し、P値が0.05未満の場合を統計学的な有意差があると判定した。グラフには平均値±標準偏差値を示した。
【００７８】
（２）NTP-GMタンパク質の酵素活性評価（メチル化DNA解析）
PD-1 遺伝子の5’側発現制御領域には、メチル化の標的となり得る２つのCpG アイランドが存在し（Youngblood B. et al.Immunity, 2011）、それぞれC 、Bと命名されている（以下それぞれ「CR-C」及び「CR-B」(CpG region C とB)という）。
【００７９】
約2kbのPD-1 遺伝子の発現制御領域ゲノムDNA をクローニングし、これを基質として、
DNAメチル化誘導の有無を解析した（図１）。具体的には、ヒトPD-1遺伝子プロモーター領域を含む約2kb断片をpBluescript SK ベクター（Stratagene社）にクローニングした。このDNA断片をM13 forward/reverse プライマーを用いてPCR増幅し、基質として使用した。
80 μM S adenosylmethionine (NEB)存在下に、10 nMのNTP-GM タンパク質を1 nM DNA断片と3 時間37℃で反応させた。反応液は、50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl2, 1 mM DTTを用いた。反応終了後、フェノール・クロロフォルム溶液で除蛋白質後、エタノール沈殿で回収し、メチル化DNA解析に供した。
【００８０】
培養細胞からのゲノムDNAは、DNeasy Blood & Tissue キット(QIAGEN)を使用して得た。NTP-GMを反応させたDNAまたは培養細胞から回収したゲノムDNAについて、Cell to CpG Bisulfite Conversion キット(Applied biosystems)を用いて非メチル化シトシンをウラシルに変換した。次に、解析対象箇所であるヒトPD-1遺伝子プロモーター領域中のCR-C及びCR-B領域をKOD-Muti&Epi-(TOYOBO)酵素を用いてPCR増幅した。使用したプライマーの塩基配列を以下に示す。
CR-C Forward：GGGAGTGGTTTTTTGTTTATAAA（配列番号４９）
CR-C Reverse：AAAATCCAATACCTAAACCTAACTAAC（配列番号５０）
CR-B Forward：TTAATTTGATTTGGGATAGTTTTTTTT（配列番号５１）
CR-B Reverse：CCCTCCAAACCCCTAACTCTAAAAC（配列番号５２）
【００８１】
増幅したDNA断片をそれぞれ、pBluescript プラスミドDNAに組み込み、DH5aバクテリアに導入した後、アンピシリンにて選択することで、それぞれのクローニングを解析した。シークエンス反応は、Big dye  (Thermo Fisher Scientific) を用い、ABI3130xlで塩基配列を解読した。
その結果、5つのNTP-GMタンパク質のうち、C17、D17及びL17がメチル化活性を示した（図2A）。図2Aにおいて、●はメチル化活性を示したサンプル（ウェル）を示し、○はメチル化活性を示さなかったサンプルを示し、×はシークエンス解析で読み取ることができなかった塩基の活性を示す。
【００８２】
（４）遺伝子発現量の測定
また、NTP-GMタンパク質C17、D17 及びL17 を、ヒトT 細胞性白血病細胞株であるMOLT-4細胞株に1 nM の濃度で、５日間連続して作用した後、内在性遺伝子発現を解析した。具体的には、mRNA発現レベルは、逆転写後の定量的PCR法（ｑRT-PCR）で解析した。RNA抽出とcDNA 合成は、SuperPrep II Cell Lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO)を用いることで、連続的にワンチューブで行った。ｑRT-PCR は、CFX ConnectTM Real-Time PCR Detection System (BIO-RAD) とTB GreenTM Premix Ex TaqTM II (TAKARA)を用いて行った。mRNA 発現レベルは、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）ｍRNA の発現量を用いて標準化し、各サンプルを比較した。使用したプライマーの塩基配列を下記の表に示す。
【表１】
2020075882.tif 000002
その結果、３つのNTP-GMタンパク質のいずれもPD-1の発現抑制効果を示した。その中でも特にD17及びL17の効果が高かった（図2B）。
【００８３】
（５）NTP-GMタンパク質D17の機能評価
上記の実験においてPD-1に対し最も高い発現抑制効果を示したD17について、さらに機能評価を行った。
具体的には、NTP-GMタンパク質D17を上記の大腸菌発現系で発現させ、精製した組み換えタンパク質をMolt-4細胞に5日間連続して投与（細胞培養液に添加）し、最終投与後5日目にPD-1遺伝子の発現及びDNAメチル化を評価した。
その結果、PD-1遺伝子の発現が抑制され（図3A）、また、PD-1遺伝子プロモーターのCR-B 領域は顕著なメチル化状態が維持されていた（図3B）。
この結果から、本発明の融合ポリペプチドは、PD-1遺伝子のDNAメチル化と発現抑制を誘導し、さらにその効果は最終投与後5日間持続することが示された。
【００８４】
（６）ヒトPBMCに対するNTP-GMタンパク質D17の機能評価
MOLT-4細胞株を用いて得られた上記の効果が、ヒト末梢血単核球細胞（PBMC）においても認められるかどうかについて検討した。
PD-1遺伝子の発現抑制及びDNAメチル化は、上記MOLT-4細胞株を用いた方法と同様の手法を用いて評価した。具体的には、NTP-GMタンパク質D17を大腸菌発現系で発現させ、精製した組み換えタンパク質（20nM）をPBMCに5日間連続して投与し、最終投与後4日目にPD-1遺伝子の発現及びDNAメチル化を評価した。PD-1タンパク質の発現抑制は、フローサイトメトリー（FACS）を用いて評価した。フローサイトメトリー（FACS）解析において、培養細胞は 1500 rpm、10分間遠心し、回収後、PBSでリンスし、最後に0.5% BSA （Sigma）を含むPBSに懸濁した。αPD-1-PE 抗体 (1:100 BD Bio science)とαCD3-FITC 抗体 (1:100 BD Bio science)または、CD56-APC antibody (1:100 BioLegend) の二重染色を行った。氷中で1時間、反応させた後、PBSでリンス後、FACSVerse Flow cytometer (BD Bio science) で解析した。
その結果、NTP-GMタンパク質であるD17により、PBMCにおいてPD-1遺伝子の発現が抑制され（図4A）、また、PD-1遺伝子プロモーターのCR-B領域は顕著にメチル化された（図4C）。また、D17により、PBMCに含まれるT細胞（CD3陽性）及びNK細胞（CD56陽性）において、PD-1陽性細胞の数が減少した。この結果は、T細胞（CD3陽性）及びNK細胞（CD56陽性）においてPD-1タンパク質の発現が抑制されたことを示す（図4B）。
これらの結果から、本発明の融合ポリペプチドは、PD-1遺伝子のDNAメチル化及び発現抑制、並びにPD-1タンパク質の発現抑制を誘導し、さらにその効果は最終投与後4日間持続することが示された。
【００８５】
（７）細胞障害活性の評価
PD-1は、癌細胞に対するPBMCの殺傷効果を阻害することが知られている。そこで、本発明によるPD-1の発現抑制がPBMCの癌細胞に対する殺傷効果を増強させるかどうかを調べた。具体的には、PD-1陽性細胞を増幅させるため、PBMCを、IL-2、αCD3抗体及びαCD16 抗体(Biolegend)を添加した状態で、14日間培養した。このPBMC に対して、20 nMのNTP-GMタンパク質D17を5日間投与した後、投与を中止し、最終投与後2日目及び4日目に細胞障害活性を評価した。標的細胞としてRPMI8226細胞を用いた。その際、RPMI8226細胞を検出するため、まず、5μM 5-又は6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)fluorescein 3',6'-diacetate (CSFE) (DOJINDO)を暗所、 37℃で30分間、標識した。RPMI8226細胞(105cells)に対して、約3倍量のPBMC (3×105 cells) を加え、16 時間37℃で培養した。その後、細胞を回収し、Annexin-V binding buffer (10 mM HEPES pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl)の溶液中で、PerCP-CyTM5.5 Annexin V (1:20 BD Bio science)を反応させ、CSFE陽性細胞中のAnnexin-V陽性細胞数をFACSでカウントすることで、細胞傷害活性を評価した(図5)。
その結果、NTP-GMタンパク質であるD17により、アポトーシスを示す細胞（Annexin V 陽性細胞）の頻度が最終投与後2日目及び4日目のいずれにおいても増加した（図6A及び図6B）。
この結果から、本発明の融合ポリペプチドは、細胞傷害性細胞において細胞傷害活性を増強し、さらにその効果は最終投与後4日間持続することが示された。
【００８６】
本実施例により、本発明の融合ポリペプチドは、ヒトPBMCにおいて、PD-1遺伝子のDNAをメチル化することでPD-1遺伝子及びPD-1タンパク質の発現を抑制し、これにより癌細胞に対するヒトPBMCの細胞傷害活性を増強することが示された。
さらに、本発明の融合ポリペプチドは、最終投与後数日間、ヒトPBMCにおいてPD-1遺伝子のDNAメチル化及び発現抑制が持続し、さらに細胞傷害活性も持続することが示された。
したがって、本発明の融合ポリペプチドは、PD-1の発現抑制剤として有用であり、また、養子免疫療法などの癌免疫療法において極めて有用である。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の融合ポリペプチドは、細胞傷害性細胞においてPD-1の発現を抑制し、さらに当該細胞の細胞傷害活性を持続させることができる点で有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００８８】
配列番号１〜６０は、合成DNA又は合成ペプチドである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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