(57)【要約】      （修正有）【課題】プロテアーゼにより活性化可能な二重特異性タンパク質(PABP)、PABPをコードする核酸、PABPを作製する方法、およびPABPを使用する方法の提供。【解決手段】活性化された場合に、エフェクター細胞による標的細胞の細胞溶解を媒介し得る、プロテアーゼにより活性化可能なタンパク質(PABP)、PABPをコードする核酸、ならびにPABPを作製および使用する方法で、そのようなPABPは、少なくとも、標的細胞に結合する部分、エフェクター細胞に結合する部分、およびプロテアーゼ切断部位を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 標的細胞に結合し、かつIgGまたはscFv抗体の一部である場合に標的細胞に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の第1対（VH1およびVL1）を含む、1つまたは複数のポリペプチド鎖、
(b) エフェクター細胞に結合し、かつIgGまたはscFv抗体の一部である場合にエフェクター細胞に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の第2対（VH2およびVL2）を含む、1つまたは複数のポリペプチド鎖、
(c) 第3ポリペプチド；ならびに
(d) (c) の第3ポリペプチドをタンパク質の残りの部分に連結する、プロテアーゼ切断部位を含むリンカー
を含むタンパク質であって、
該タンパク質の第1ポリペプチド鎖が、式：VH1-L1-VL1-L2-VH2-L3-VL2-X1を有するアミノ酸配列を含み、式中、L1、L2、およびL3がリンカーであり、L3は存在してもよくまたは存在しなくてもよく、X1が半減期延長部分であり、
該タンパク質の第2ポリペプチド鎖が、式：Y-L4-X2を有するアミノ酸配列を含み、式中、Yが (c) のポリペプチドであり、L4が (d) のプロテアーゼ切断部位を含むリンカーであり、X2が半減期延長部分であり、かつ
プロテアーゼ切断部位が本質的に完全に切断される場合には、プロテアーゼ切断部位が切断されない場合に観察される結合と比較して、該タンパク質がより効果的に標的細胞に結合するか、またはより効果的にエフェクター細胞に結合するかのいずれかである、
前記タンパク質。
【請求項２】
(c) の第3ポリペプチドが、前記タンパク質のエフェクター細胞への結合を阻害する、請求項1記載のタンパク質。
【請求項３】
(a) 標的細胞に結合し、かつIgGまたはscFv抗体の一部である場合に標的細胞に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の第1対（VH1およびVL1）を含む、1つまたは複数のポリペプチド鎖、
(b) エフェクター細胞に結合し、かつIgGまたはscFv抗体の一部である場合にエフェクター細胞に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の第2対（VH2およびVL2）を含む、1つまたは複数のポリペプチド鎖、
(c) 細胞の細胞溶解アッセイにおけるタンパク質の細胞溶解活性を阻害する第3ポリペプチド；ならびに
(d) (c) の第3ポリペプチドをタンパク質の残りの部分に連結する、プロテアーゼ切断部位を含むリンカー
を含むタンパク質であって、
該タンパク質の第1ポリペプチド鎖が、式：VH1-L1-VL1-L2-VH2-L3-VL2-X1を有するアミノ酸配列を含み、式中、L1、L2、およびL3がリンカーであり、L3は存在してもよくまたは存在しなくてもよく、X1が半減期延長部分であり、
該タンパク質の第2ポリペプチド鎖が、式：Y-L4-X2を有するアミノ酸配列を含み、式中、Yが (c) のポリペプチドであり、L4が (d) のプロテアーゼ切断部位を含むリンカーであり、X2が半減期延長部分であり、かつ
プロテアーゼ切断部位が本質的に完全に切断される場合の、細胞の細胞溶解アッセイにおける該タンパク質のEC50が、プロテアーゼ切断部位が切断されていない場合の、同じアッセイにおける該タンパク質のEC50の1/5以下である、
前記タンパク質。
【請求項４】
エフェクター細胞がT細胞である、請求項1〜3のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項５】
エフェクター細胞がNK細胞である、請求項1〜3のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項６】
VH2およびVL2が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に、TCR-CD3複合体の一部であるポリペプチドに結合する、請求項4記載のタンパク質。
【請求項７】
TCR-CD3複合体の一部であるポリペプチドがヒトCD3εである、請求項6記載のタンパク質。
【請求項８】
VH2が、それぞれSEQ ID NO: 42、43、および44のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含み、VL2が、それぞれSEQ ID NO: 47、48、および49のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、請求項7記載のタンパク質。
【請求項９】
VH2およびVL2が、それぞれSEQ ID NO: 40および45のアミノ酸配列を含む、請求項8記載のタンパク質。
【請求項１０】
プロテアーゼ切断可能部位が、MMP-2、MMP-9、またはMMP-11によって切断され得る、請求項1〜9のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項１１】
プロテアーゼ切断可能部位が、
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からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項10記載のタンパク質。
【請求項１２】
X1およびX2がFcポリペプチド鎖である、前記請求項のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項１３】
第1ポリペプチド鎖がSEQ ID NO:30のアミノ酸配列を含み、第2ポリペプチド鎖がSEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:38のアミノ酸配列を含む、請求項12記載のタンパク質。
【請求項１４】
標的細胞が癌細胞である、前記請求項のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項１５】
VH1およびVL1が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に、以下のタンパク質：上皮成長因子受容体 (EGFR)、EGFRvIII、メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン (MCSP)、メソテリン (MSLN)、葉酸受容体1 (FOLR1)、CD33、CDH19、または上皮成長因子2 (HER2) のうちの1つに結合する、請求項14記載のタンパク質。
【請求項１６】
以下のポリペプチド鎖の対：
(a) (i) 次式：VH1-CH1-L1-VH2-CH1を有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、VH1およびVH2が免疫グロブリン重鎖可変領域であり、CH1が第1重鎖定常領域であり、L1がプロテアーゼ切断可能部位を含むリンカーである、第1ポリペプチド鎖、ならびに
(ii) 次式：VL1-CL-L2-VL2-CLを有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、VL1およびVL2が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、CLが軽鎖定常領域であり、L2がプロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーである、第2ポリペプチド鎖、または
(b) (i) 次式：VH1-CH1-L1-VL2-CLを有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、VH1が免疫グロブリン重鎖可変領域であり、VL2が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、CH1が第1重鎖定常領域であり、CLが軽鎖定常領域であり、L1がプロテアーゼ切断部位を含むリンカーである、第1ポリペプチド鎖、ならびに
(ii) 次式：VL1-CL-L2-VH2-CH1を有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、VL1が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、VH2が免疫グロブリン重鎖可変領域であり、L2がプロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーであり、CH1が第1重鎖定常領域である、第2ポリペプチド鎖、または
(c) (i) 次式：VL1-CL-L1-VL2-CLを有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、VL1およびV2が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、CLが軽鎖定常領域であり、L1がプロテアーゼ切断部位を含むリンカーである、第1ポリペプチド鎖、ならびに
(ii) 次式：VH1-CH1-L2-VH2-CH1を有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、VH1およびVH2が重鎖可変領域であり、L2がプロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーであり、CH1が第1重鎖定常領域である、第2ポリペプチド鎖、または
(d) (i) 次式：VL1-CL-L1-VH2-CH1を有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、VH2が免疫グロブリン重鎖可変領域であり、VL1が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、CH1が第1重鎖定常領域であり、CLが軽鎖定常領域であり、L1がプロテアーゼ切断可能リンカーである、第1ポリペプチド鎖、ならびに
(ii) 次式：VH1-CH1-L2-VL2-CLを有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、VL2が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、VH1が免疫グロブリン重鎖可変領域であり、L2がプロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーであり、CH1が第1重鎖定常領域であり、CLが軽鎖定常領域である、第2ポリペプチド鎖
のうちの1つを含むタンパク質であって、
VL1およびVH1が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に標的細胞に結合し、VL2およびVH2が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合にエフェクター細胞に結合する、
前記タンパク質。
【請求項１７】
エフェクター細胞がT細胞である、請求項16記載のタンパク質。
【請求項１８】
VH2およびVL2が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に、TCR-CD3複合体の一部であるタンパク質に結合する、請求項17記載のタンパク質。
【請求項１９】
VH2およびVL2がヒトCD3εに結合する、請求項17記載のタンパク質。
【請求項２０】
VH2およびVL2が、それぞれSEQ ID NO: 42、43、および44のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにそれぞれSEQ ID NO: 47、48、および49のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、請求項19記載のタンパク質。
【請求項２１】
VH2およびVL2が、それぞれSEQ ID NO: 40および45のアミノ酸配列を含む、請求項20記載のタンパク質。
【請求項２２】
プロテアーゼ切断部位が、
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からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項16〜21のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項２３】
標的細胞が癌細胞である、請求項16〜22のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項２４】
VH1およびVL1が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に、上皮成長因子受容体 (EGFR)、EGFRvIII、メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン (MCSP)、メソテリン (MSLN)、葉酸受容体1 (FOLR1)、CD33、CDH19、または上皮成長因子2 (HER2) に結合する、請求項23記載のタンパク質。
【請求項２５】
請求項1〜24のいずれか一項記載のタンパク質のいずれかをコードする核酸。
【請求項２６】
請求項25記載の核酸を含有するベクター。
【請求項２７】
請求項26記載の核酸を含有する宿主細胞。
【請求項２８】
請求項1〜24のいずれか一項記載のタンパク質を作製する方法であって、
該タンパク質が発現されるような条件下で、該タンパク質をコードする核酸を含有する宿主細胞を培養する段階、および
培養液または細胞集団から該タンパク質を回収する段階
を含む、前記方法。
【請求項２９】
請求項1〜24のいずれか一項記載のタンパク質の治療有効用量を投与する段階を含む、癌患者を処置するための方法。
【請求項３０】
前記タンパク質の前に、後に、またはそれと同時に、放射線照射、化学療法剤、および／または非化学療法的抗新生物剤を投与する段階をさらに含む、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
患者の癌細胞が、プロテアーゼ切断部位を切断し得るプロテアーゼを発現する、請求項29または30記載の方法。
【請求項３２】
請求項1〜12および16〜22のいずれか一項記載のタンパク質の治療有効用量を投与する段階を含む、感染症、線維性疾患、神経変性疾患、または自己免疫疾患もしくは炎症性疾患に罹患している患者を処置するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本発明は、タンパク質工学の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
背景
二重特異性抗体は、癌治療剤としての見込みを示している。例えば、Bispecific T cell Engager（BiTE（登録商標））形式でCD3およびCD19の両方を標的とする二重特異性抗体は、低用量で目覚ましい有効性を示している。Bargou et al. (2008), Science 321 : 974-978（非特許文献1）。BiTE（登録商標）形式は、本質的に、リンカーによって連結された2つのscFvからなり、その一方はCD3を標的とし、そのもう一方は腫瘍抗原を標的とする。結果として得られた抗体はインビボ半減期が短く、そのため持続注入による投薬を必要とする。薬物動態特性が改善された二重特異性形式は、持続投薬の必要性を排除するために望ましいと考えられる。しかしながら、CD3の結合はT細胞活性化を引き起こすため、半減期がより長い形式は、容易に想像できるように、T細胞活性化の延長および不十分な局在化を引き起こし、望ましくない副作用をもたらし得る。Tsoukas et al. (1985), J. Immunol. 135(3): 1719-1723（非特許文献2）。したがって、当技術分野において、適度に長い半減期を有するが、疾患微小環境において、例えば腫瘍の近傍で、特異的に活性化される二重特異性抗体形式の必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Bargou et al. (2008), Science 321 : 974-978
【非特許文献２】Tsoukas et al. (1985), J. Immunol. 135(3): 1719-1723
【発明の概要】
【０００４】
概要
概して、プロテアーゼにより活性化可能な二重特異性タンパク質 (PABP)、PABPをコードする核酸、PABPを作製する方法、およびPABPを使用する方法が、本明細書において記載される。そのようなPABPは、少なくとも、標的細胞に結合する部分、エフェクター細胞に結合する部分、およびプロテアーゼ切断部位を含む。
【０００５】
より詳細には、(a) 標的細胞に結合する1つまたは複数のポリペプチド鎖；(b) エフェクター細胞に結合する1つまたは複数のポリペプチド鎖；(c) 第3ポリペプチド；および (d) (c) の第3ポリペプチドをタンパク質の残りの部分に連結する、プロテアーゼ切断部位を含むリンカーを含むタンパク質が、本明細書において記載され、ここで、プロテアーゼ切断部位が本質的に完全に切断される場合には、プロテアーゼ切断部位が切断されない場合に観察される結合と比較して、該タンパク質はより効果的に標的細胞に結合するか、もしくは該タンパク質はより効果的にエフェクター細胞に結合するかのいずれかであり、および／またはプロテアーゼ切断部位が本質的に完全に切断される場合の、細胞の細胞溶解アッセイにおける該タンパク質のEC50は、プロテアーゼ切断部位が切断されていない場合の、同じアッセイにおける該タンパク質のEC50の1/5以下である。(a) のポリペプチド鎖は、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に標的細胞に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の第1対（VH1およびVL1）を含み得、(b) のポリペプチド鎖は、IgGまたはscFv抗体の一部である場合にエフェクター細胞に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の第2対（VH2およびVL2）を含み得る。エフェクター細胞は、T細胞またはNK細胞であってよい。VH2およびVL2は、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に、TCR-CD3複合体の一部であるポリペプチド、例えばヒトCD3εに結合し得る。VH2は、それぞれSEQ ID NO: 42、43、および44のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含み得、VL2は、それぞれSEQ ID NO: 47、48、および49のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含み得る。VH2およびVL2は、それぞれSEQ ID NO: 40および45のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの態様において、プロテアーゼ切断可能部位は、MMP-2、MMP-9、またはMMP-11によって切断され得る。いくつかの態様において、プロテアーゼ切断可能部位は、
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からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み得る。
【０００６】
1つの局面において、タンパク質は、式：VH1-L1-VL1-L2-VH2-L3-VL2-X1を有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、L1、L2、およびL3はリンカーであり、L3は存在してもよいし、または存在しなくてもよく、X1は半減期延長部分、例えばFcポリペプチド鎖である、第1ポリペプチド鎖、ならびに式：Y-L4-X2を有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、Yは上記 (c) のポリペプチドであり、L4は上記 (d) のプロテアーゼ切断部位を含むリンカーであり、X2は半減期延長部分、例えばFcポリペプチド鎖である、第2ポリペプチド鎖、を含み得る。第1ポリペプチド鎖は、SEQ ID NO:30のアミノ酸配列を含み得、第2ポリペプチド鎖は、SEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:38のアミノ酸配列を含み得る。
【０００７】
別の局面において、タンパク質は、式VH1-L4-VL2-L5-CL-X1を有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、L4およびL5はリンカーであり、存在してもよいし、または存在しなくてもよく、CLは軽鎖定常領域であり、X1は半減期延長部分であり、存在してもよいし、または存在しなくてもよい、第1ポリペプチド鎖、ならびに式Y-L1-VH2-L2-VL1-L3-CH1-X2を有する第2ポリペプチド鎖であって、式中、Yは上記 (c) のポリペプチドであり、L1は上記 (d) のプロテアーゼ切断部位を含むリンカーであり、L2およびL3はリンカーであり、存在してもよいし、または存在しなくてもよく、CH1は第1重鎖定常領域であり、X2は半減期延長部分であり、存在してもよいし、または存在しなくてもよい、第2ポリペプチド鎖、を含み得る。X1およびX2はFcポリペプチド鎖であってよく、両方とも存在し得る。第1ポリペプチド鎖は、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含み得、第2ポリペプチド鎖は、SEQ ID NO: 10、12、14、16、または18のアミノ酸配列を含み得る。
【０００８】
さらなる局面において、タンパク質は、式VH1-L4-VL1-L5-X1またはVL1-L4-VH1-L5-X1を有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、L4およびL5はリンカーであり、存在してもよいし、または存在しなくてもよく、X1はFcポリペプチド鎖である、第1ポリペプチド鎖、ならびに式Y-L1-VH2-L2-VL2-L3-X2またはY-L1-VL2-L2-VH2-L3-X2を有するアミノ酸を含む第2ポリペプチドであって、式中、Yは上記 (c) のポリペプチドであり、L1は上記 (d) のプロテアーゼ切断部位を含むリンカーであり、L2およびL3はリンカーであり、存在してもよいし、または存在しなくてもよく、X2はFcポリペプチド鎖である、第2ポリペプチド、を含み得る。第1ポリペプチド鎖は、SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含み得、第2ポリペプチド鎖は、SEQ ID NO: 24、26、または28のアミノ酸配列を含み得る。
【０００９】
本明細書において記載されるPABPのいずれかの標的細胞は、癌細胞であってよい。この場合、VH1およびVL1は、scFvまたはIgG抗体の一部である場合に、上皮成長因子受容体 (EGFR)、EGFRvIII、メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン (MCSP)、メソテリン (MSLN)、葉酸受容体1 (FOLR1)、CD33、CDH19、および上皮成長因子2 (HER2) からなる群より選択されるタンパク質に結合し得る。
【００１０】
いくつかの態様において、本明細書において記載されるタンパク質は、以下のポリペプチド鎖の対：(a) 次式：VH1-CH1-L1-VH2-CH1を有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、VH1およびVH2は免疫グロブリン重鎖可変領域であり、CH1は第1重鎖定常領域であり、L1はプロテアーゼ切断可能部位を含むリンカーである、第1ポリペプチド鎖、ならびに次式：VL1-CL-L2-VL2-CLを有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、VL1およびVL2は免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、CLは軽鎖定常領域であり、L2はプロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーである、第2ポリペプチド鎖；(b) 次式：VH1-CH1-L1-VL2-CLを有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、VH1は免疫グロブリン重鎖可変領域であり、VL2は免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、CH1は第1重鎖定常領域であり、CLは軽鎖定常領域であり、L1はプロテアーゼ切断部位を含むリンカーである、第1ポリペプチド鎖、ならびに次式：VL1-CL-L2-VH2-CH1を有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、VL1は免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、VH2は免疫グロブリン重鎖可変領域であり、L2はプロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーであり、CH1は第1重鎖定常領域である、第2ポリペプチド鎖；(c) 次式：VL1-CL-L1-VL2-CLを有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、VL1およびV2は免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、CLは軽鎖定常領域であり、L1はプロテアーゼ切断部位を含むリンカーである、第1ポリペプチド鎖、ならびに次式：VH1-CH1-L2-VH2-CH1を有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、VH1およびVH2は重鎖可変領域であり、L2はプロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーであり、CH1は第1重鎖定常領域である、第2ポリペプチド鎖；(d) 次式：VL1-CL-L1-VH2-CH1を有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、VH2は免疫グロブリン重鎖可変領域であり、VL1は免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、CH1は第1重鎖定常領域であり、CLは軽鎖定常領域であり、L1はプロテアーゼ切断可能リンカーである、第1ポリペプチド鎖、ならびに次式：VH1-CH1-L2-VL2-CLを有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、VL2は免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、VH1は免疫グロブリン重鎖可変領域であり、L2はプロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーであり、CH1は第1重鎖定常領域であり、CLは軽鎖定常領域である、第2ポリペプチド鎖、のうちの1つを含み得；ここで、VL1およびVH1は、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に標的細胞に結合し、VL2およびVH2は、IgGまたはscFv抗体の一部である場合にエフェクター細胞に結合する。エフェクター細胞は、T細胞であってよい。VH2およびVL2は、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に、TCR-CD3複合体の一部であるタンパク質、例えばヒトCD3εに結合し得る。VH2およびVL2は、それぞれSEQ ID NO: 42、43、および44のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにそれぞれSEQ ID NO: 47、48、および49のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含み得る。VH2およびVL2は、それぞれSEQ ID NO: 40および45のアミノ酸配列を含み得る。プロテアーゼ切断部位は、
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からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み得る。標的細胞は、癌細胞であってよい。VH1およびVL1は、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に、上皮成長因子受容体 (EGFR)、EGFRvIII、メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン (MCSP)、メソテリン (MSLN)、葉酸受容体1 (FOLR1)、CD33、CDH19、または上皮成長因子2 (HER2) に結合し得る。
【００１１】
別の局面において、上記または下記のPABPのいずれかをコードする核酸が、本明細書において記載される。そのような核酸を含有するベクターおよび宿主細胞もまた提供される。PABPをコードする例示的な核酸の対には、非限定的に、以下の配列： SEQ ID NO:7および11；SEQ ID NO:7および13；SEQ ID NO:7および15；SEQ ID NO:7および17；SEQ ID NO:7および19；SEQ ID NO:21および25；SEQ ID NO:21および27；SEQ ID NO:21および29；SEQ ID NO:31および37；ならびにSEQ ID NO:31および39を含む核酸が含まれる。PABPが発現されるような条件下で、PABPをコードする核酸を含有する宿主細胞を培養する段階、および培養液または細胞集団からPABPを回収する段階を含む、本明細書において記載されるPABPのいずれかを作製する方法もまた、本明細書において記載される。
【００１２】
さらなる局面において、本明細書において記載されるPABPの治療有効用量を投与する段階を含む、癌患者を処置するための方法が、本明細書において記載される。この方法は、いくつかの態様において、PABPの投与の前の、後の、および／またはそれと同時の、放射線照射、化学療法剤、および／または非化学療法的抗新生物剤の投与を含む。患者の癌細胞は、PABPの一部であるプロテアーゼ切断部位を切断することができるプロテアーゼを発現し得る。
【００１３】
別の局面において、本明細書において記載されるPABPの治療有効用量を投与する段階を含む、感染症、線維性疾患、神経変性疾患、または自己免疫疾患もしくは炎症性疾患に罹患している患者を処置するための方法が、本明細書において記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】プロテアーゼにより活性化可能な二重特異性タンパク質 (PABP) の例示的な略図を示す。番号付けされた物品は、以下のような意味を表す：「1」と表示される楕円形は、本明細書において定義される標的分子に結合する成分1を表す；「2」と表示される楕円形は、本明細書において定義されるエフェクター細胞分子に結合する成分2を表す；「3」と表示される楕円形は、成分1または2に結合し、成分1または2がそれぞれ標的細胞またはエフェクター細胞に結合するのを阻止する、任意の部分、任意にポリペプチドである成分3を表す；「4」と表示される点線は、プロテアーゼによって切断可能なアミノ酸配列、成分4を表し、これはさらなるリンカー配列を含み得る；「5」と表示される長方形は、任意の半減期延長部分である成分5を表し、これは任意にポリペプチドであってよい。「3」と表示される楕円形から伸びている実線の曲線は、例えばポリペプチドであってよい非切断可能リンカーである。
【図２】PABPの1つの態様の略図を示す。VH1およびVL1と表示される楕円形は、示されるように成分1を構成し、それらがIgGまたはscFv抗体の一部である場合に標的細胞に結合する、それぞれ免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変（VHおよびVL）領域を表す。VH2およびVL2と表示される楕円形は、それらがIgGまたはscFv抗体の一部である場合にCD3εに結合し、かつ示されるように成分2を構成する、それぞれVH領域およびVL領域を表す。「CD3ε」と表示される、より小さな楕円形は、CD3εの全体または一部であり、これは示されるように成分3を表す。CH2およびCH3と表示される楕円形は、IgG抗体のそれぞれ第2および第3定常ドメインを表す。ヒンジ領域の一部または全体と共に、これら2つのドメインはFcポリペプチド鎖を形成する。2つのFcポリペプチド鎖は、示されるように成分5を表す。「4」と表示される点線は、示されるように成分4を表し、これはプロテアーゼ切断部位を含む。実線は、ペプチドリンカー（曲線）またはヒンジ領域（直線）を表す。
【図３】PABPの1つの態様の略図を示す。表示された楕円形ならびに実線および破線はすべて、図2中の意味と同じ意味を有する。「CH1」および「CL」と表示される長方形は、免疫グロブリンCH1領域およびCL領域を表す。
【図４】PABPの1つの態様の略図を示す。表示された楕円形ならびに実線および破線はすべて、図2中の意味と同じ意味を有する。
【図５】図5Aは、PABPの1つの態様の略図を示す。表示された楕円形ならびに実線および破線はすべて、図2および図3中の意味と同じ意味を有する。図5Bは、PABPの1つの態様の略図を示す。表示された楕円形ならびに実線および破線はすべて、図2および図3中の意味と同じ意味を有する。
【図６】MMP-2によるPABPおよび対照分子の消化を示す。方法は実施例2に記載されており、消化産物を還元条件下にてSDS-PAGEゲルで泳動した。レーンは以下の試料を含有する：1) CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2なし；2) CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2あり；3) CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2なし；4) CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2あり；5) CD3ε(1-27)-フューリンcsV1-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2なし；6) CD3ε(1-27)-フューリンcsV1-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2あり；7) CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2なし；8) CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2あり；9) CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2なし；10) CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2あり；11) CD3ε(1-27)-MMP-2csV3-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2なし；および12) 11) CD3ε(1-27)-MMP-2csV3-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2あり。レーン上の「+」は、MMP2で処理された試料を示す。
【図７】MMP-2によるPABPおよび対照分子の消化を示す。方法は実施例2に記載されており、消化産物を還元条件下にてSDS-PAGEゲルで泳動した。レーンは以下の試料を含有する：1) CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-mxb、MMP-2なし；2) CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-mxb、MMP-2あり；3) CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-mxb、MMP-2なし；4) CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-mxb、MMP-2あり；5) CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-mxb、MMP-2なし；6) CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2あり；7) CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2なし；および8) CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2あり。レーン上の「+」は、MMP2で処理された試料を示す。
【図８】MMP-9によるPABPおよび対照分子の消化を示す。方法は実施例2に記載されており、消化産物を還元条件下にてSDS-PAGEゲルで泳動した。レーンは以下の試料を含有する：1) CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2なし；2) CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2あり；3) CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2なし；4) CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2あり； 5) CD3ε(1-27)-フューリンcsV1-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2なし；6) CD3ε(1-27)-フューリンcsV1-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2あり；7) CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2なし；8) CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2あり；9) CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2なし；10) CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2あり；11) CD3ε(1-27)-MMP-2csV3-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2なし；12) CD3ε(1-27)-MMP-2csV3-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2あり；13) CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-mxb、MMP-2なし；14) CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-mxb、MMP-2あり；15) CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-mxb、MMP-2なし；16) CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-mxb、MMP-2あり；17) CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-mxb、MMP-2なし；18) CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-mxb、MMP-2あり；19) CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-mxb、MMP-2なし；および20) CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-mxb、MMP-2あり。レーン上の「+」は、MMP2で処理された試料を示す。
【図９】図9Aは、汎T細胞および対照分子の存在下におけるSKOV-3細胞の溶解を示す。方法は実施例3に記載されている。x軸は、アッセイに添加された対照分子の濃度を表し、y軸は、溶解された細胞の割合を表す。記号は、以下のタンパク質を用いて行われたアッセイのデータを表す：実線付きの黒丸、aCD3-aHER2-Xbody；および実線付きの黒四角、aCD3-aHER2-mxb。図9Bは、CD25を発現しているT細胞の割合を示す。方法は実施例3に記載されている。x軸は、アッセイに添加された対照分子の濃度を表し、y軸は、CD25を発現している細胞の割合を表す。記号は、図9Aと同様の意味を表す。
【図１０】図10Aは、汎T細胞およびPABPまたは対照分子の存在下におけるSKOV-3細胞の溶解を示す。方法は実施例3に記載されている。x軸は、アッセイに添加されたPABPまたは対照分子の濃度を表し、y軸は、溶解された細胞の割合を表す。記号は、以下のタンパク質を用いて行われたアッセイのデータを表す：実線付きの黒四角、CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-Xbody、未消化；実線付きの白四角、CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2による消化済み；実線付きの黒三角、CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-Xbody、未消化；実線付きの白三角、CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2による消化済み；実線付きの黒丸、CD3ε(1-27)-フューリンcsV1-aCD3-aHER2-Xbody、未消化；および実線付きの白丸、CD3ε(1-27)-フューリンcsV1-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2による消化済み。図10Bは、CD25を発現しているT細胞の割合を示す。方法は実施例3に記載されている。x軸は、アッセイに添加された対照分子またはPABPの濃度を表し、y軸は、CD25を発現している細胞の割合を表す。記号は、図10Bと同様の意味を表す。
【図１１】図11Aは、汎T細胞およびPABPの存在下におけるSKOV-3細胞の溶解を示す。方法は実施例3に記載されている。x軸は、アッセイに添加されたPABPまたは対照分子の濃度を表し、y軸は、溶解された細胞の割合を表す。記号は、以下のタンパク質を用いて行われたアッセイのデータを表す：実線付きの黒四角、CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-Xbody、未消化；実線付きの白四角、CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2による消化済み；実線付きの黒三角、CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-Xbody、未消化；実線付きの白三角、CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2による消化済み；実線付きの黒丸、CD3ε(1-27)-MMP-2csV3-aCD3-aHER2-Xbody、未消化；および実線付きの白丸、CD3ε(1-27)-MMP-2csV3-aCD3-aHER2-Xbody、MMP-2による消化済み。図11Bは、CD25を発現しているT細胞の割合を示す。方法は実施例3に記載されている。x軸は、アッセイに添加された対照分子またはPABPの濃度を表し、y軸は、CD25を発現している細胞の割合を表す。記号は、図11Bと同様の意味を表す。
【図１２】図12Aは、汎T細胞およびPABPまたは対照分子の存在下におけるSKOV-3細胞の溶解を示す。方法は実施例3に記載されている。x軸は、アッセイに添加されたPABPまたは対照分子の濃度を表し、y軸は、溶解された細胞の割合を表す。記号は、以下のタンパク質を用いて行われたアッセイのデータを表す：実線付きの黒四角、CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-mxb、未消化；実線付きの白四角、CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-mxb、MMP-2による消化済み；実線付きの上向き黒三角、CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-mxb、未消化；実線付きの上向き白三角、CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-mxb、MMP-2による消化済み；実線付きの黒丸、CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-mxb、未消化；実線付きの白丸、CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-mxb、MMP-2による消化済み；実線付きの黒菱形、CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-mxb；および実線付き白菱形、CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-mxb。図12Bは、CD25を発現しているT細胞の割合を示す。方法は実施例3に記載されている。x軸は、アッセイに添加された対照分子またはPABPの濃度を表し、y軸は、CD25を発現している細胞の割合を表す。記号は、図12Bと同様の意味を表す。
【図１３】PABPおよび対照分子のT細胞への結合を示す。方法は実施例5に記載されている。x軸は、相対蛍光強度（平均蛍光強度 (MFI)）を表す。Y軸は細胞数を表す。各トレースを数字で示し、その数字は、以下のようにT細胞と共にインキュベートされたタンパク質を示す：1, 添加タンパク質を含有しない陰性対照；2, 抗CD3 IgG抗体；3, aCD3-aHER2-Bi-Fc；4, CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-BiFc、切断可能ではない；5, CD3ε(1-27)-MMP-2cs-aCD3-aHER2-BiFc、未消化；および6, CD3ε(1-27)-フューリンcs-aCD3-aHER2-BiFc、おそらくはそれが作製されたHEK-293細胞内で消化された。
【図１４】汎T細胞およびPABPまたは対照分子の存在下におけるJIMT-1細胞の溶解を示す。方法は実施例5に記載されている。x軸は、アッセイ中に含めたタンパク質の濃度 (pM) を示し、y軸は、溶解された標的細胞（JIMT-1細胞）の割合を示す。図13について上記で説明した番号付けと同じものを用いて、各線を番号付けして、アッセイに使用されたタンパク質を示す。
【００１５】
配列リストの簡単な説明
2020188772.tif 000005
2020188772.tif 000006
2020188772.tif 000007
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な説明
タンパク質分解切断によって活性化され得る二重特異性タンパク質、任意に二重特異性抗体のいくつかの形式が、本明細書において記載される。これらのタンパク質は、本明細書において、プロテアーゼにより活性化可能な二重特異性タンパク質 (PABP) と称される。PABPは、1種または複数種のプロテアーゼが局所的な疾患微小環境において大量に存在する疾患状態において、例えば、様々な癌、炎症性疾患、線維性疾患、およびアルツハイマー病などの神経変性疾患において、用途を見出し得る。例えば、Broder and Becker-Pauly (2013), Biochem. J. 450: 253-264を参照されたい。そのような状況において、二重特異性タンパク質は、疾患細胞の存在下で活性化され得るが、疾患細胞の非存在下では活性化され得ない。したがって、本明細書において記載される二重特異性タンパク質は、疾患微小環境において特異的に活性化され得、身体の他の部位では活性がより低いかまたは不活性であり得る。
【００１７】
図1に図示されるPABPは、本質的に3つの成分を含有し、2つの付加的な任意の成分を含有し得る。この分子の様々な成分は、図1の通りの順序である必要はない。成分1（図1中の「1」と表示される楕円形）は、病原体、感染細胞、または疾患を媒介する細胞の表面上に発現される標的分子に結合し得る。成分2（「2」と表示される楕円形）は、細胞死滅において役割を果たすエフェクター細胞、例えばT細胞の表面上に発現されるエフェクター細胞分子に結合し得る。成分3（「3」と表示される、より小さな楕円形）は、任意の成分であり、成分1または2に結合することができ、それによって成分1または2がそれぞれ標的分子またはエフェクター細胞分子に結合するのを阻止する。したがって、例えば、成分3が成分2に結合している場合、二重特異性分子は効果的に単一特異性であるか、またはエフェクター細胞分子との結合において少なくとも効果がより低い。いくつかの態様は成分3を欠いてもよく、その場合、成分1または成分2のそれぞれ標的分子またはエフェクター細胞分子への結合は、PABPの三次元構造によって阻止または阻害され得る。成分4（「4」で示された破線によって表される）は、プロテアーゼ切断部位を含むリンカーであり、これは、この部位での切断によって、成分1および2の両方がそれら各々の結合パートナーに結合できるようになるように位置している。いくつかの態様では、切断によって、成分3がPABPの残りの部分から分離され、それによって分子が活性化され、すなわち分子が完全に二重特異性となる。他の態様では、切断によって、成分1または2がより接近可能となり得、したがって活性がより高くなり得る。いくつかの態様において、PABPは、半減期を延長する成分5（「5」と表示される長方形）をさらに含み得る。成分5は、例えば、Fcポリペプチド鎖、血清アルブミンタンパク質の全体もしくは一部、またはインビボ半減期を延長し得る他のポリペプチドであってよい。
【００１８】
定義
本明細書において意味される「抗体」は、少なくとも1つの免疫グロブリン重鎖可変領域 (VH) または軽鎖可変領域 (VL)、多くの場合にはVHおよびVLを含有するタンパク質である。したがって、「抗体」という用語は、一本鎖Fv抗体（scFv、リンカーによって連結されたVH領域およびVL領域を含有する）、Fab、F(ab)2'、Fab'、scFv:Fc抗体（Carayannopoulos and Capra, Ch. 9 in FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 3rd ed., Paul, ed., Raven Press, New York, 1993, pp. 284-286記載されている）、または哺乳動物に見られる天然IgG抗体などの2つの全長重鎖および2つの全長軽鎖を含有する全長抗体を含む、種々の形式を有する分子を包含する。同上。本明細書において「IgG抗体」と称されるそのような全長抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4アイソタイプのものであってよく、ヒト抗体であってよい。抗体の構造を記載しているCarayannopoulos and Capraの部分は、参照により本明細書に組み入れられる。さらに、「抗体」という用語は、ラクダおよび他のヒトコブラクダ種ならびにサメに見られる天然抗体のような、2つの重鎖を含有し軽鎖を含有しない二量体抗体を含む。例えば、Muldermans et al., 2001, J. Biotechnol. 74:277-302；Desmyter et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:26285-90；Streltsov et al. (2005), Protein Science 14: 2901-2909を参照されたい。抗体は、「単一特異性」（すなわち、1種の抗原にのみ結合する）、「二重特異性」（すなわち、2種の異なる抗原に結合する）、または「多重特異性」（すなわち、2種以上の異なる抗原に結合する）であってよい。さらに、抗体は、一価、二価、または多価であってよく、これは、抗体が一度にそれぞれ1つ、2つ、または複数の抗原分子に結合し得ることを意味する。
【００１９】
本明細書において意味される「免疫グロブリン重鎖」は、本質的に、この順序でVH、第1重鎖定常領域 (CH1)、ヒンジ領域、第2重鎖定常領域 (CH2)、第3重鎖定常領域 (CH3)、および任意にいくつかのアイソタイプではCH3の下流の領域からなる。公知または天然の免疫グロブリン重鎖アミノ酸配列と比べて、アミノ酸100個当たり10個以下の単一アミノ酸のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含有する、免疫グロブリン重鎖の近縁変種は、免疫グロブリン重鎖によって意味されるものに包含される。
【００２０】
本明細書において意味される「免疫グロブリン軽鎖」は、本質的に、VLおよび軽鎖定常ドメイン (CL) からなる。公知または天然の免疫グロブリン軽鎖アミノ酸配列と比べて、アミノ酸100個当たり10個以下の単一アミノ酸のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含有する、免疫グロブリン軽鎖の近縁変種は、免疫グロブリン軽鎖によって意味されるものに包含される。
【００２１】
本明細書において意味される「免疫グロブリン可変領域」は、VH、VL、またはそれらの変種である。公知または天然の免疫グロブリン可変領域アミノ酸配列と比べて、アミノ酸100個当たり10個以下の単一アミノ酸のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含有する、免疫グロブリン可変領域の近縁変種は、免疫グロブリン可変領域によって意味されるものに包含される。例えば、Kabat et al. in SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991に開示されたもののような、VHおよびVLの多くの例が当技術分野において公知である。VHおよびVLの可変性がより小さな部分における広範な配列共通性、可変性がより大きな領域の配列内の位置、ならびに予測される三次構造に基づき、当業者は、その配列により免疫グロブリン可変領域を認識することができる。例えば、Honegger and Plueckthun (2001), J. Mol. Biol. 309: 657-670を参照されたい。
【００２２】
免疫グロブリン可変領域は、相補性決定領域1 (CDR1)、相補性決定領域2 (CDR2)、および相補性決定領域3 (CDR3) として公知の3つの超可変領域を含有する。これらの領域は、抗体の抗原結合部位を形成する。CDRは、可変性がより小さなフレームワーク領域（FR1〜FR4）内に埋め込まれている。免疫グロブリン可変領域内のこれらの小領域の順序は、以下の通りである：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫グロブリン可変領域の多数の配列が、当技術分野において公知である。例えば、Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991を参照されたい。
【００２３】
CDRは、以下の方法でVH領域配列中に位置し得る。CDR1は、成熟VH領域のおよそ31残基目から始まり、通常は約5〜7アミノ酸長であり、CDR1には、ほぼ常にCys-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx (SEQ ID NO: )（式中、「Xxx」は任意のアミノ酸である）が先行する。重鎖CDR1に続く残基は、ほぼ常にトリプトファンであり、Trp-Val、Trp-Ile、またはTrp-Alaである場合が多い。ほぼ常に、CDR1中の最終残基とCDR2中の最初の残基との間に14アミノ酸があり、CDR2は典型的に16〜19アミノ酸を含有する。CDR2の直前にはLeu-Glu-Trp-Ile-Gly (SEQ ID NO: ) が先行してよく、直後にはLys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Alaが後続してよい。他のアミノ酸がCDR2に先行または後続してもよい。ほぼ常に、CDR2中の最終残基とCDR3中の最初の残基との間に32アミノ酸があり、CDR3は約3〜25残基長であってよい。Cys-Xxx-Xxxがほぼ常にCDR3の直前に先行し、Trp-Gly-Xxx-Gly (SEQ ID NO: ) がほぼ常にCDR3に後続する。
【００２４】
軽鎖CDRは、以下の方法でVL領域中に位置し得る。CDR1は、成熟抗体のおよそ24残基目から始まり、通常は約10〜17残基長である。CDR1には、ほぼ常にCysが先行する。ほぼ常に、CDR1の最終残基とCDR2の最初の残基との間に15アミノ酸が存在し、CDR2はほぼ常に7残基長である。CDR2には、典型的にIle-Tyr、Val-Tyr、Ile-Lys、またはIle-Pheが先行する。ほぼ常に、CDR2とCDR3との間に32残基が存在し、CDR3は通常は約7〜10アミノ酸長である。CDR3には、ほぼ常にCysが先行し、通常はPhe-Gly-Xxx-Gly（SEQ ID NO: ）が後続する。
【００２５】
VHおよび／またはVLが、「それがIgGおよび／またはscFv抗体の一部である場合に」、標的細胞または免疫エフェクター細胞に「結合する」と言われる場合、指定されたVHおよびVLを含有するIgGまたはscFv抗体が、標的細胞および／または免疫エフェクター細胞に結合し得ることが意味される。実施例5に記載される結合アッセイを用いて、結合を評価することができる。
【００２６】
ポリペプチドが、「ポリペプチド鎖の標的細胞またはエフェクター細胞への結合を阻害する」と言われる場合、結合の阻害は、実施例5に記載される蛍光活性化細胞選別 (FACS) を用いる結合アッセイによって決定され、その結果は図13に示される。同様に、「ポリペプチド鎖は、プロテアーゼ切断部位が本質的に完全に切断される場合に、より効果的に標的細胞またはエフェクター細胞に結合する」と言われる場合、結合の改善は同じアッセイによって評価される。プロテアーゼ切断部位の本質的に完全な切断は、実施例2において説明されるようにウェスタンブロットによって評価され、図6〜8に示される。例えば、図6中のレーン4、8〜10、および12は、本質的に完全な切断を示すが、それは、これらの消化試料において、消化していない場合に見える上部のバンドが、あるとしてもほとんど検出できないためである。図6のレーン4および8にはこの上部バンドがごく微量に存在している可能性があるが、そのような少量の非切断種を含有する試料は、本明細書において意味されるところの、本質的に完全に切断されたと見なされることに留意されたい。対照的に、図7中のレーン4および6は部分的切断を示す。切断の欠如は、同じ方法によって評価することができる。例えば、図7中のレーン2は、MMP2で消化されなかったレーン1と本質的に同一であるように見えるため、これは切断の完全な欠如を示す。さらに、「プロテアーゼ切断部位が本質的に完全に切断される場合の、細胞の細胞溶解アッセイにおけるタンパク質のEC50は、プロテアーゼ切断部位が切断されていない場合の、同じアッセイにおけるEC50の1/5以下である」と言われる場合にも、本質的に完全な切断のこの同じ定義が当てはまる。
【００２７】
本明細書において意味される「癌細胞抗原」は、癌細胞の表面上に発現される分子、任意にタンパク質である。いくつかの癌細胞抗原は、いくつかの正常細胞上にも発現され、いくつかは癌細胞に特異的である。癌細胞抗原は、癌細胞の表面上に高度に発現され得る。多種多様な癌細胞抗原が存在する。癌細胞抗原の例には、非限定的に、数ある中でもとりわけ以下のヒトタンパク質：上皮成長因子受容体 (EGFR)、EGFRvIII（変異型のEGFR）、メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン (MCSP)、メソテリン (MSLN)、葉酸受容体1 (FOLR1)、CD33、CDH19、および上皮成長因子2 (HER2) が含まれる。
【００２８】
本明細書で用いられる「化学療法」は、癌細胞に対して細胞傷害効果または細胞増殖抑制効果を有する「化学療法剤」による癌患者の処置を意味する。「化学療法剤」は、細胞分裂に関与している細胞を特異的に標的とし、細胞分裂に関与していない細胞を標的としない。化学療法剤は、例えば、DNA複製、RNA合成、タンパク質合成、紡錘体の集合、分散、もしくは機能などの、細胞分裂に密接に関係している過程、および／またはこれらの過程において役割を果たす、ヌクレオチドもしくはアミノ酸などの分子の合成もしくは安定性を直接妨げる。したがって化学療法剤は、癌細胞および細胞分裂に関与している他の細胞の両方に対して細胞傷害効果または細胞増殖抑制効果を有する。化学療法剤は当技術分野において周知であり、これには、当技術分野において公知の多くのものの中でもとりわけ、例えば：アルキル化剤（例えば、ブスルファン、テモゾロミド、シクロホスファミド、ロムスチン (CCNU)、メチルロムスチン、ストレプトゾトシン、cis-ジアンミンジクロロ白金、アジリジニルベンゾキノン、およびチオテパ）；無機イオン（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；ナイトロジェンマスタード（例えば、メルファラン塩酸塩、イホスファミド、クロラムブシル、およびメクロレタミンHCl）；ニトロソウレア（例えば、カルムスチン (BCNU)）；抗新生物抗生物質（例えば、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ダウノマイシン、マイトマイシンC、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、およびブレオマイシン）；植物誘導体（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンデシン、VP-16、およびVM-26）；代謝拮抗物質（例えば、ロイコボリン併用または非併用のメトトレキサート、ロイコボリン併用または非併用の5-フルオロウラシル、5-フルオロデオキシウリジン、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン、ゲムシタビン、およびフルダラビン）；ポドフィロトキシン（例えば、エトポシド、イリノテカン、およびトポテカン）；ならびにアクチノマイシンD、ダカルバジン (DTIC)、mAMSA、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、L-アスパラギナーゼ、およびミトキサントロンが含まれる。例えば、関連部分が参照により本明細書に組み入れられる、Cancer: Principles and Practice of Oncology, 4th Edition, DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA (1993) を参照されたい。アルキル化剤およびナイトロジェンマスタードは、DNAをアルキル化することによって作用し、それが鎖の巻き戻しおよび複製を制限する。メトトレキサート、シタラビン、6-メルカプトプリン、5-フルオロウラシル、およびゲムシタビンは、ヌクレオチド合成を妨げる。パクリタキセルおよびビンブラスチンなどの植物誘導体は、紡錘体毒である。ポドフィロトキシンは、トポイソメラーゼを阻害することでDNA複製を妨げる。抗生物質であるドキソルビシン、ブレオマイシン、およびマイトマイシンは、それぞれDNAの塩基の間にインターカレートする（巻き戻しを阻害する）こと、鎖切断を引き起こすこと、およびDNAをアルキル化することによって、DNA合成を妨げる。他の作用機序には、アミノ酸���カルバモイル化（ロムスチン、カルムスチン）、およびアスパラギンプールの枯渇（アスパラギナーゼ）が含まれる。Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17th Edition, Section 11, Hematology and Oncology, 144. Principles of Cancer Therapy, Table 144-2 (1999)。化学療法剤の中に具体的に含まれるのは、上掲の化学療法剤、および上掲の化学療法剤によって直接影響を受けるのと同じ細胞過程に直接影響を及ぼす化学療法剤である。
【００２９】
薬物または処置は、それが本明細書において意味されるPABPと同じ全般的時間枠内で、任意に継続的に投与されるならば、PABPと「同時に」投与されることになる。例えば、患者が薬物Aを1週間に1回継続的に、およびPABPを6ヶ月に1回継続的に摂取するのであれば、薬物AおよびPABPが同じ日に投与されようと投与されなかろうと、それらは同時に投与されることになる。同様に、PABPが1週間に1回継続的に摂取され、薬物Aが1日に1回または数回だけ投与されるならば、薬物AおよびPABPは、本明細書において意味されるところでは同時に投与されることになる。同様に、薬物AおよびPABPの両方が、1ヶ月以内に1回または複数回のいずれかで短期間投与されるならば、両方の薬物が同じ月内に投与される限り、それらは本明細書において意味されるところでは同時に投与されることになる。
【００３０】
本明細書において意味される「保存的アミノ酸置換」は、類似の特性を有する別のアミノ酸によるアミノ酸の置換である。考慮される特性には、電荷および疎水性などの化学的特性が含まれる。以下の表1に、本明細書において意味される保存的置換であると見なされる、各アミノ酸についての置換を収載する。
【００３１】
（表１）保存的アミノ酸置換
2020188772.tif 000008
【００３２】
本明細書において意味される「エフェクター細胞」は、例えば、T細胞、NK細胞、単球、マクロファージ、または好中球を含む、細胞溶解性免疫応答の媒介に関与する細胞である。本明細書において記載されるプロテアーゼにより活性化可能な二重特異性抗体は、エフェクター細胞の表面上に発現される分子に結合する。そのようなタンパク質は、本明細書において「エフェクター細胞分子」と称される。
【００３３】
本明細書において意味される場合、「Fc領域」は、1つまたは複数のジスルフィド結合によって連結された2つのポリペプチド鎖からなる二量体であり、各鎖は、ヒンジドメインの一部または全体に加えてCH2およびCH3を含む。ポリペプチド鎖の各々は、「Fcポリペプチド鎖」と称される。2つのFcポリペプチド鎖を区別するために、場合により、一方は本明細書において「A鎖」と称され、もう一方は「B鎖」と称される。より具体的には、本発明との使用のために企図されるFc領域は、IgG Fc領域であり、これは、哺乳動物、例えばヒトのIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4 Fc領域であってよい。ヒトIgG1 Fc領域の中で、少なくとも2つの対立遺伝子型が公知である。他の態様において、2つのFcポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、哺乳動物Fcポリペプチドのアミノ酸配列と比べて、配列のアミノ酸100個当たり10個以下の単一アミノ酸の置換、挿入、および／または欠失により、哺乳動物Fcポリペプチドのアミノ酸配列と異なり得る。いくつかの態様において、そのような変動は、ホモ二量体よりもヘテロ二量体の形成を促進する「ヘテロ二量体化改変」、半減期を延長するFc改変、Fcγ受容体 (FcγR) 結合を阻害する改変、および／またはFcγ受容体の結合を増強し、かつADCCを増強する改変であってよい。
【００３４】
本明細書において意味される「半減期を延長するFc改変」は、改変を含有しないこと以外は同一のFcポリペプチドを含有する類似タンパク質の半減期と比較して、改変されたFcポリペプチド鎖を含有するタンパク質のインビボ半減期を延長する、Fcポリペプチド鎖内の改変である。そのような改変は、本明細書において記載されるPABPの一部であるFcポリペプチド鎖中に含まれ得る。改変M252Y、S254T、およびT256E（252位のメチオニンがチロシンに変化；254位のセリンがスレオニンに変化；256位のスレオニンがグルタミン酸に変化；表2に示されるEU番号付けによる番号付け）は、半減期を延長するFc改変であり、共に、別々に、または任意の組み合わせで使用され得る。これらの改変およびいくつかの他の改変は、米国特許第7,083,784号に詳細に記載されている。そのような改変を記載している米国特許第7,083,784号の部分は、参照により本明細書に組み入れられる。同様に、M428LおよびN434Sも、半減期を延長するFc改変であり、共に、別々に、または任意の組み合わせで使用され得る。これらの改変およびいくつかの他の改変は、米国特許出願公開第2010/0234575号および米国特許第7,670,600号に詳細に記載されている。そのような改変を記載している米国特許出願公開第2010/0234575号および米国特許第7,670,600号の部分は、参照により本明細書に組み入れられる。加えて、以下の部位うちの1つにおける任意の置換は、本明細書において意味される、半減期を延長するFc改変と見なすことができる：250、251、252、259、307、308、332、378、380、428、430、434、436。これらの改変の各々またはこれらの改変の組み合わせを用いて、本明細書において記載されるPABPの半減期を延長することができる。半減期を延長するために使用され得る他の改変は、2012年12月17日に出願された国際出願PCT/US2012/070146に詳細に記載されている。そのような改変を記載しているこの出願の部分は、参照により本明細書に組み入れられる。この出願に記載されているいくつかの具体的な態様は、とりわけ以下のアミノ酸配列：
2020188772.tif 000009
を含む、384位と385位（表2に示されるEU番号付け）との間の半減期を延長する挿入物を含む。そのような挿入物を含有するPABPが企図される。
【００３５】
本明細書において意味される「半減期延長部分」は、半減期延長部分のないタンパク質のインビボ半減期と比較して、それを付着させたタンパク質のインビボ半減期を延長する分子である。半減期を測定するための方法は、当技術分野において周知である。半減期を確認するための方法は、例えばWO 2013/096221に開示されており、その関連部分は参照により本明細書に組み入れられる。本質的に、分子は公知の投与量で動物またはヒトに投与され、血中の分子の量は投与後に継時的にアッセイされる。半減期延長部分は、ポリペプチド、例えばFcポリペプチド鎖、またはアルブミンに結合し得るポリペプチドであってよい。アルブミンに結合するように操作されたヒトフィブロネクチンIII型 (Fn3) ドメインのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:83に提供され、様々なヒトIgG Fcポリペプチド配列は、SEQ ID NO:84〜87に示される。Fcポリペプチドは、例えば、未修飾のFcポリペプチド鎖よりも半減期を延長するのにより効果的であるように修飾することができる。そのような修飾には、例えば、「半減期を延長するFc改変」として上記されたものが含まれる。代替の態様において、半減期延長部分は非ポリペプチド分子であってよい。例えば、ポリエチレングリコール (PEG) 分子は、半減期延長部分であってよい。種々のポリペプチドを含む他の半減期延長部分が企図される。
【００３６】
本明細書意において意味される「ヘテロ二量体」は、異なるアミノ酸配列を有する2つのポリペプチド鎖を含む二量体である。
【００３７】
「ヘテロ二量体化改変」は、一般に、ヘテロ二量体Fc領域、すなわちFc領域のA鎖およびB鎖が同一のアミノ酸配列を有さないFc領域の形成を促進する、Fc領域のA鎖およびB鎖における改変を指す。そのような改変は、本明細書において記載されるPABPの一部であるFcポリペプチド鎖中に含まれ得る。ヘテロ二量体化改変は非対称性であってよく、すなわち、ある特定の改変を有するA鎖は、異なる改変を有するB鎖と対形成し得る。これらの改変は、ヘテロ二量体化を促進し、かつホモ二量体化に不利に作用する。ヘテロ二量体が形成されたかまたはホモ二量体が形成されたかは、場合によってはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定されるサイズの差によって、または分子タグを含むヘテロ二量体のある特定の部分を認識する抗体もしくは他の分子による結合を含む、異なる電荷もしくは生物物理学的特性などの他の適切な手段によって評価することができる。そのような対のヘテロ二量体化改変の一例は、いわゆる「ノブ (knob) およびホール (hole)」置換である。例えば、そのような変異を記載している部分が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第7,695,936号および米国特許出願公開第2003/0078385号を参照されたい。本明細書において意味される場合、1対のノブおよびホール置換を含有するFc領域は、A鎖中に1つの置換を含有し、B鎖中に別の置換を含有する。例えば、IgG1 Fc領域のA鎖およびB鎖における以下のノブおよびホール置換は、未修飾のA鎖およびB鎖で見られるものと比較して、ヘテロ二量体形成を増大させることが見出されている：1) 一方の鎖中のY407Tおよびもう一方の鎖中のT366Y；2) 一方の鎖中のY407Aおよびもう一方の鎖中のT366W；3) 一方の鎖中のF405Aおよびもう一方の鎖中のT394W；4) 一方の鎖中のF405Wおよびもう一方の鎖中のT394S；5) 一方の鎖中のY407Tおよびもう一方の鎖中のT366Y；6) 一方の鎖中のT366YおよびF405Aならびにもう一方の鎖中のT394WおよびY407T；7) 一方の鎖中のT366WおよびF405Wならびにもう一方の鎖中のT394SおよびY407A；8) 一方の鎖中のF405WおよびY407Aならびにもう一方の鎖中のT366WおよびT394S；ならびに9) Fcの一方のポリペプチド中のT366WならびにFcのもう一方のポリペプチド中のT366S、L368A、およびY407V。この変異表記方法は、以下のように説明することができる。EU番号付けシステム（Edelman et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. 63:78-85に提示されている；以下の表2も参照されたい）を用いて、CH3領域中の所与の位置に通常存在するアミノ酸（一文字コードを使用）にEU位置が続き、これにその位置に存在する代替のアミノ酸が続く。例えば、Y407Tは、通常、EU407位に存在するチロシンがスレオニンによって置換されていることを意味する。あるいはまたはそのような改変に加えて、新たなジスルフィド架橋を創出する置換が、ヘテロ二量体形成を促進し得る。例えば、そのような変異を記載している部分が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2003/0078385号を参照されたい。IgG1 Fc領域におけるそのような改変には、例えば、以下の置換が含まれる：一方のFcポリペプチド鎖中のY349Cおよびもう一方のFcポリペプチド鎖中のS354C；一方のFcポリペプチド鎖中のY349Cおよびもう一方のFcポリペプチド鎖中のE356C；一方のFcポリペプチド鎖中のY349Cおよびもう一方のFcポリペプチド鎖中のE357C；一方のFcポリペプチド鎖中のL351Cおよびもう一方のFcポリペプチド鎖中のS354C；一方のFcポリペプチド鎖中のT394Cおよびもう一方のFcポリペプチド鎖中のE397C；または一方のFcポリペプチド鎖中のD399Cおよびもう一方のFcポリペプチド鎖中のK392C。同様に、例えばCH3-CH3界面における、1つまたは複数の残基の電荷を変更する置換は、WO 2009/089004に説明されているようにヘテロ二量体形成を増強することができ、そのような置換を記載している該公報の部分は、参照により本明細書に組み入れられる。そのような置換は、本明細書において「電荷対置換」と称され、1対の電荷対置換を含有するFc領域は、A鎖中に1つの置換を含有し、B鎖中に異なる置換を含有する。電荷対置換の一般的な例には、以下のものが含まれる：1) 一方の鎖中のK409DまたはK409Eに加えてもう一方の鎖中のD399KまたはD399R；2) 一方の鎖中のK392DまたはK392Eに加えてもう一方の鎖中のD399KまたはD399R；3) 一方の鎖中のK439DまたはK439Eに加えてもう一方の鎖中のE356KまたはE356R；および4) 一方の鎖中のK370DまたはK370Eに加えてもう一方の鎖中のE357KまたはE357R。加えて、両方の鎖中の置換R355D、R355E、K360D、またはK360Rは、他のヘテロ二量体化改変と共に用いられる場合に、ヘテロ二量体を安定化し得る。特定の電荷対置換は、単独で、または他の電荷対置換と共に使用することができる。単一対の電荷対置換およびその組み合わせの具体例には、以下のものが含まれる：1) 一方の鎖中のK409Eに加えてもう一方の鎖中のD399K；2) 一方の鎖中のK409Eに加えてもう一方の鎖中のD399R；3) 一方の鎖中のK409Dに加えてもう一方の鎖中のD399K；4) 一方の鎖中のK409Dに加えてもう一方の鎖中のD399R；5) 一方の鎖中のK392Eに加えてもう一方の鎖中のD399R；6) 一方の鎖中のK392Eに加えてもう一方の鎖中のD399K；7) 一方の鎖中のK392Dに加えてもう一方の鎖中のD399R；8) 一方の鎖中のK392Dに加えてもう一方の鎖中のD399K；9) 一方の鎖中のK409DおよびK360Dに加えてもう一方の鎖中のD399KおよびE356K；10) 一方の鎖中のK409DおよびK370Dに加えてもう一方の鎖中のD399KおよびE357K；11) 一方の鎖中のK409DおよびK392Dに加えてもう一方の鎖中のD399K、E356K、およびE357K；12) 一方の鎖上のK409DおよびK392Dならびにもう一方の鎖上のD399K；13) 一方の鎖上のK409DおよびK392Dに加えてもう一方の鎖上のD399KおよびE356K；14) 一方の鎖上のK409DおよびK392Dに加えてもう一方の鎖上のD399KおよびD357K；15) 一方の鎖上のK409DおよびK370Dに加えてもう一方の鎖上のD399KおよびD357K；16) 一方の鎖上のD399Kに加えてもう一方の鎖上のK409DおよびK360D；ならびに17) 一方の鎖上のK409DおよびK439Dに加えてもう一方の鎖上のD399KおよびE356K。これらのヘテロ二量体化改変のいずれかを、本明細書において記載されるヘテロ二量体二重特異性抗体のFc領域において使用することができる。
【００３８】
本明細書において意味される「FcγRの結合を阻害する改変」は、例えばALPHALISA（登録商標）に基づく競合結合アッセイ（PerkinElmer、Waltham, MA）により測定して、FcγRIIA、FcγRIIB、および／またはFcγRIIIAの結合を阻害する、Fcポリペプチド鎖内の1つまたは複数の挿入、欠失、または置換である。そのような改変は、本明細書において記載されるPABPの一部であるFcポリペプチド鎖中に含まれ得る。より具体的には、Fcγ受容体 (FcγR) 結合を阻害する改変には、L234A、L235A、またはN297における任意の置換を含む、N297におけるグリコシル化を阻害する任意の改変が含まれる。加えて、N297におけるグリコシル化を阻害する改変と共に、付加的なジスルフィド架橋を創出することによって二量体Fc領域を安定化する付加的な改変もまた企図される。FcγRの結合を阻害する改変のさらなる例には、一方のFcポリペプチド鎖中のD265A改変およびもう一方のFcポリペプチド鎖中のA327Q改変が含まれる。
【００３９】
本明細書において意味される「ADCCを増強する改変」は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害 (ADCC) を増強する、Fcポリペプチド鎖内の1つまたは複数の挿入、欠失、または置換である。そのような改変は、本明細書において記載されるPABPの一部であるFcポリペプチド鎖中に含まれ得る。多くのそのような改変が、国際特許出願公開WO 2012/125850に記載されている。そのような改変を記載しているこの出願の部分は、参照により本明細書に組み入れられる。そのような改変は、本明細書において記載されるPABPの一部であるFcポリペプチド鎖中に含まれ得る。ADCCアッセイは、以下のように行うことができる。細胞表面上に大量およびより少量の癌細胞抗原を発現する細胞株を、標的細胞として使用することができる。これらの標的細胞を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル (CFSE) で標識し、次にリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で1回洗浄し、その後V形状のウェルを有する96ウェルマイクロタイタープレート中に堆積させることができる。精製された免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞、NK細胞、マクロファージ、単球、または末梢血単核細胞 (PBMC) を、各ウェルに添加することができる。癌抗原に結合し、かつ被験改変を含有する単一特異性抗体、およびアイソタイプが一致する対照抗体を、1:3系列で希釈してウェルに添加することができる。細胞を5% CO2と共に37℃で3.5時間インキュベートすることができる。細胞を遠心沈殿させ、死細胞を染色する色素TO-PRO（登録商標）-3ヨウ化物（Molecular Probes, Inc. Corporation、Oregon, USA）を含む1×FACS緩衝液（0.5%ウシ胎児血清 (FBS) を含有する1×リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)）中に再懸濁し、その後、蛍光活性化細胞選別 (FACS) によって解析することができる。以下の式を用いて、細胞死滅の割合を算出することができる：
（二重特異性の存在下での腫瘍細胞の溶解率−二重特異性の非存在下での腫瘍細胞の溶解率）／（総細胞溶解率−二重特異性の非存在下での腫瘍細胞の溶解率）
総細胞溶解は、二重特異性分子を伴わずに、エフェクター細胞および標識標的細胞を含有する試料を、80%冷メタノールを用いて溶解することによって決定される。ADCCを増強する例示的な改変には、Fc領域のA鎖およびB鎖中の以下の改変が含まれる：(a) A鎖がQ311MおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、E294L、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である；(b) A鎖がE233L、Q311M、およびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、E294L、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である；(c) A鎖がL234I、Q311M、およびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、E294L、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である；(d) A鎖がS298TおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である；(f) A鎖がA330MおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である；(f) A鎖がA330FおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である；(g) A鎖がQ311M、A330M、およびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、E294L、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である；(h) A鎖がQ311M、A330F、およびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、E294L、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である；(i) A鎖がS298T、A330M、およびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である；(j) A鎖がS298T、A330F、およびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である；(k) A鎖がS239D、A330M、およびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である；(l) A鎖がS239D、S298T、およびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である；(m) A鎖がK334V置換を含み、かつB鎖がY296WおよびS298C置換を含むか、もしくはその逆である；(n) A鎖がK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、Y296W、およびS298C置換を含むか、もしくはその逆である；(o) A鎖がL235S、S239D、およびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である；(p) A鎖がL235S、S239D、およびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、Y296W、およびS298C置換を含むか、もしくはその逆である；(q) A鎖がQ311MおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、F243V、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である；(r) A鎖がQ311MおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K296W、およびS298C置換を含むか、もしくはその逆である；(s) A鎖がS239DおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である；(t) A鎖がS239DおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、Y296W、およびS298C置換を含むか、もしくはその逆である；(u) A鎖がF243VおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である；(v) A鎖がF243VおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、Y296W、およびS298C置換を含むか、もしくはその逆である；(w) A鎖がE294LおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である；(x) A鎖がE294LおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、Y296W、およびS298C置換を含むか、もしくはその逆である；(y) A鎖がA330MおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234YおよびY296W置換を含むか、もしくはその逆である；または(z) A鎖がA330MおよびK334V置換を含み、かつB鎖がK290YおよびY296W置換を含むか、もしくはその逆である。
【００４０】
本明細書において意味される「リンカー」は、例えば、PABPとの関連で2つの免疫グロブリン可変領域であってよい2つのポリペプチドを連結するペプチドである。リンカーは、2〜30アミノ酸長であってよい。いくつかの態様において、リンカーは、2〜40、2〜40、または3〜18アミノ酸長であってよい。いくつかの態様において、リンカーは、40、30、20、14、13、12、11、10、9、8、7、6、または5アミノ酸長以下のペプチドであってよい。他の態様において、リンカーは、5〜40、5〜15、4〜11、10〜20、または20〜40アミノ酸長であってよい。他の態様において、リンカーは、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30アミノ酸長であってよい。例示的なリンカーには、数ある中でもとりわけ、例えば、アミノ酸配列 (GGGGS)n（式中、nは1〜10の任意の整数である；SEQ ID NO:88）、
2020188772.tif 000010
、およびAAAが含まれる。
【００４１】
本明細書において記載される細胞の細胞溶解アッセイに0.001 pM〜20000 pMの量のPABPを添加すると、標的細胞の細胞溶解が効果的に誘発される場合に、PABPは、本明細書において意味されるところの、「免疫エフェクター細胞による標的細胞の細胞溶解を媒介する」。細胞溶解アッセイは、実施例3に記載されている。
【００４２】
「非化学療法的抗新生物剤」は、化学療法剤以外の、癌細胞に対して細胞傷害効果または細胞増殖抑制性効果を有する化学薬剤、化合物、または分子である。しかしながら、非化学療法的抗新生物剤は、ホルモンまたは成長因子に対する受容体を含む細胞表面受容体などの、細胞分裂に間接的に影響を及ぼす分子と直接相互作用することを標的とし得る。しかしながら、非化学療法的抗新生物剤は、例えば、DNA複製、RNA合成、タンパク質合成、または紡錘体の機能、集合、もしくは分散などの、細胞分裂に密接に関連している過程を直接妨げない。非化学療法的抗新生物剤の例には、多くの可能な非化学療法的抗新生物剤の中でもとりわけ、Bcl2阻害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、タモキシフェンなどの抗エストロゲン剤、抗アンドロゲン化合物、インターフェロン、ヒ素、レチノイン酸、レチノイン酸誘導体、腫瘍特異抗原を標的とした抗体、およびBcr-Ablチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、Novartis、New York and New Jersey, USA、およびBasel, Switzerland）によって商品名GLEEVEC（商標）で販売されている小分子STI-571）が含まれる。
【００４３】
本明細書において意味される「非切断可能なリンカー」は、プロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーである。
【００４４】
本明細書において意味される「プロテアーゼ切断部位」は、本明細書において明確に開示されている（表2中）すべての切断部位、および任意の他の切断部位を含む、プロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列を含む。
【００４５】
本明細書において意味される「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結された少なくとも30アミノ酸のポリペプチド鎖を含み、複数のポリペプチド鎖を含み得る。タンパク質は、例えば糖などの、翻訳後修飾によって付加された付加的な部分をさらに含み得る。
【００４６】
「標的細胞」は、本明細書において記載されるPABPが結合し、かつ疾患の媒介に関与する細胞である。場合により、標的細胞は、通常は免疫応答の媒介に関与するが、疾患の媒介にも関与する細胞であってよい。例えばB細胞リンパ腫においては、通常は免疫応答の媒介に関与するB細胞が、標的細胞となり得る。いくつかの態様において、標的細胞は、癌細胞、病原体に感染している細胞、または自己免疫疾患もしくは炎症性疾患の媒介に関与する細胞である。PABPは、標的細胞の表面上に提示される、例えばタンパク質または糖であってよい「標的分子」、おそらくは高度に発現されるタンパク質、または体内の他の種類の細胞もしくは組織に比べて標的細胞において豊富である制限的な発現パターンを有するタンパク質への結合を介して、標的細胞に結合し得る。標的分子はまた、例えば、特定の種類の糖分子であってもよい。
【００４７】
本明細書において記載されるPABPの「治療有効量」は、例えば、癌患者の腫瘍量を減少させるもしくは除去する、またはそのタンパク質が処置のために使用される任意の疾患状態の症状を減少させるもしくは除去する効果を有する量である。治療有効量は、その状態のすべての症状を完全に除去する必要はないが、1つもしくは複数の症状の重症度を低下させ得るか、または状態が処置された後にいくらかの頻度で発生する可能性がある、より重篤な症状もしくはより重篤な疾患の発症を遅らせ得る。
【００４８】
本明細書において言及される任意の疾患の「処置」は、疾患の少なくとも1つの症状の軽減、疾患の重症度の低下、または場合によりその疾患に付随し得るもしくは少なくとも1つの他の疾患をもたらし得る、より重篤な症状への疾患進行の遅延もしくは予防を包含する。処置は、疾患が完全に治癒されることを意味しなくてもよい。有用な治療剤は、疾患の重症度を低下させるか、疾患もしくはその処置に関連する1つもしくは複数の症状の重症度を低下させるか、または状態が処置された後にいくらかの頻度で発生する可能性がある、より重篤な症状もしくはより重篤な疾患の発症を遅らせさえすればよい。
【００４９】
免疫グロブリン可変領域の指定されたVH/VL対が、「それらがIgGまたはscFv抗体の一部である場合に」、標的細胞または免疫エフェクター細胞に結合し得ると言われる場合、両方の重鎖中に指定されたVH領域および両方の軽鎖中に指定されたVL領域を含有するIgG抗体、またはVH/VL対を含有するscFvが、標的細胞または免疫エフェクター細胞に結合し得ることが意味される。結合アッセイは、実施例5に記載されている。当業者は、当技術分野における知識を考慮すれば、所望の配列を含有するIgGまたはscFv抗体を構築することができる。
【００５０】
成分1および標的分子
上記で説明されたように、PABPの成分1は、病原体または内因性の疾患媒介細胞の表面に発現される標的分子に結合し得る、PABPの部分である。病原体は、例えば、ウイルス、細菌、または原生動物であってよい。いくつかの態様において、成分1は、標的分子に結合し得る重鎖および軽鎖可変（VHおよびVL）領域を共に含む。VH領域およびVL領域は、同じまたは異なるポリペプチド鎖上にあってよい。他の態様において、成分1は、VH領域またはVL領域が単独で疾患媒介細胞または病原体に結合し得る限り、VH領域またはVL領域であってよい。そのような単一可変ドメイン抗体は、例えばUS 2008/0008713に記載されており、その関連部分は参照により本明細書に組み入れられる。これらのVH領域および／またはVL領域のいずれも、哺乳動物起源のもの、例えばヒトVH領域および／またはVL領域であってよい。他の態様において、成分1は、抗体の一部ではないポリペプチドであってよい。例えば、標的分子がメソテリンである場合、成分1は、メソテリンに結合するポリペプチドの全体もしくは一部、またはメソテリンと結合するその能力によって選択された短いペプチドであってよい。
【００５１】
疾患を媒介する細胞または病原体は、その表面上に標的分子を発現し得る。そのような細胞には、例えば、癌、自己免疫疾患もしくは炎症性疾患、線維性疾患、神経変性疾患、または感染症を媒介する内因性の細胞が含まれる。例えば、多くのタンパク質は、癌細胞、自己免疫もしくは炎症状態を媒介する細胞、または感染病原体もしくは感染細胞上に高レベルで特異的に発現されることが公知である。そのようなタンパク質は、本明細書において記載されるPABPの潜在的標的分子である。
【００５２】
上記で説明されたように、本明細書において記載されるPABPは、エフェクター細胞分子および標的分子に結合する。標的分子は、例えば、癌細胞（すなわち、癌細胞抗原）、病原体に感染している細胞、または炎症状態、自己免疫状態、もしくは線維性状態を媒介する細胞の表面上に発現され得る。いくつかの態様において、標的分子は、標的細胞上に高度に発現され得るが、この必要はない。
【００５３】
標的細胞が癌細胞である場合、PABPは、本明細書において上記で定義された癌細胞抗原に結合し得る。癌細胞抗原は、ヒトタンパク質、および／または別の種由来のタンパク質であってよい。例えば、PABPは、数ある中でもとりわけ、マウス、ラット、ウサギ、新世界ザル、および／または旧世界ザル種由来の、タンパク質であってよい標的分子に結合し得る。そのような種には、非限定的に、以下の種：ヒト (Homo sapiens)、ハツカネズミ (Mus musculus)；クマネズミ (Rattus rattus)；ドブネズミ (Rattus norvegicus)；カニクイザル、Macaca fascicularis；マントヒヒ、Papio hamadryas；ギニアヒヒ、Papio papio；アヌビスヒヒ、Papio anubis；キイロヒヒ、Papio cynocephalus；チャクマヒヒ、Papio ursinus、コモンマーモセット (Callithrix jacchus)、ワタボウシタマリン (Saguinus Oedipus)、およびリスザル (Saimiri sciureus) が含まれる。
【００５４】
いくつかの例において、標的分子は、感染細胞上に選択的に発現されるタンパク質であってよい。例えば、B型肝炎ウイルス (HBV) またはC型肝炎ウイルス (HCV) 感染症の場合、標的分子は、感染細胞の表面上に発現されるHBVまたはHCVのエンベロープタンパク質であってよい。他の態様において、標的分子は、ヒト免疫不全ウイルス (HIV) によってコードされる、HIV感染細胞上に発現されるgp120であってよい。同様に、標的分子は、例えば、ウイルス、細菌（多くの他の種の中でもとりわけ、ボレリア属、スタフィロコッカス属、エシェリキア属の種を含む）、真菌（酵母を含む）、ジアルジア、アメーバ、プラスモディウム属の真核原生生物、繊毛虫、トリパノソーマ、線虫、および他の真核寄生生物を含む病原体の表面上に発現される分子であってよい。
【００５５】
癌または感染症などの、制御性T細胞を枯渇させることが望ましい状態においては、制御性T細胞が標的細胞となり得る。その場合、CCR4が標的分子であってよい。
【００５６】
他の局面において、標的細胞は、自己免疫疾患または炎症性疾患を媒介する細胞であってよい。例えば、喘息におけるヒト好酸球は標的細胞となり得、その場合、例えばEGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体1 (EMR1) が標的分子であってよい。あるいは、全身性エリテマトーデス患者における過剰なヒトB細胞は標的細胞となり得、その場合、例えばCD19またはCD20が標的分子であってよい。他の自己免疫状態においては、過剰なヒトTh2 T細胞が標的細胞となり得、その場合、例えばCCR4が標的分子であってよい。同様に、標的細胞は、アテローム動脈硬化症、慢性閉塞性肺疾患 (COPD)、肝硬変、強皮症、腎臓移植線維症、腎臓同種移植腎症、または特発性肺線維症および／もしくはイディオタイプ (idiotypic) 肺高血圧症を含む肺線維症などの疾患を媒介する線維細胞であってよい。そのような線維性状態に関して、例えば線維芽細胞活性化タンパク質α (FAPα) が標的分子であってよい。
【００５７】
成分1の具体例には、例えば、癌細胞抗原に結合するVH/VL対、例えば、SEQ ID NO:6のアミノ酸20〜140およびSEQ ID NO:8のアミノ酸197〜303のアミノ酸配列を含むVH/VL対が含まれる。
【００５８】
成分2およびエフェクター細胞分子
成分2は、エフェクター細胞分子に結合し得る。それは、VH領域およびVL領域を含み得る。いくつかの態様において、成分2は、単独でエフェクター細胞分子に結合し得るVH領域またはVL領域を含み得る。これらのVH領域および／またはVL領域のいずれも、哺乳動物起源のもの、例えばヒトVH領域および／またはVL領域であってよい。あるいは、成分2は、エフェクター細胞分子に結合し得る非抗体ポリペプチドであってよい。成分2は、エフェクター細胞の表面上に発現される、タンパク質であってよい分子に結合し得る。エフェクター細胞は、例えば、T細胞、NK細胞、単球、マクロファージ、または好中球であってよい。
【００５９】
いくつかの態様において、エフェクター細胞分子は、T細胞受容体 (TCR)-CD3複合体中に含まれるタンパク質である。少なくとも3種類のTCRが存在する。αβTCR複合体は、TCRαおよびTCRβからなるヘテロ二量体 (αβTCR)、2つのCD3ζタンパク質からなるホモ二量体 (CD3ζζ)、CD3δおよびCD3εからなるヘテロ二量体 (CD3δε)、およびCD3γおよびCD3εからなるヘテロ二量体 (CD3γε) を含有する。γδTCR複合体は、TCRγおよびTCRδからなるヘテロ二量体 (γδTCR) に加えて、CD3δεおよびCD3γεヘテロ二量体ならびにCD3ζζホモ二量体を含有する。pTCRは、pTαおよびTCRβからなるヘテロ二量体に加えて、CD3δεおよびCD3γεヘテロ二量体ならびにCD3ζζホモ二量体からなる。例えば、その関連部分が参照により本明細書に組み入れられる、Kuhns and Badgandi (2012), Immunological Rev. 250: 120-143を参照されたい。成分2は、TCR-CD3複合体中に含まれるタンパク質のいずれかに結合し得る。
【００６０】
いくつかの態様において、PABPは、多量体タンパク質の一部であってよいヒトCD3ε鎖（その成熟アミノ酸配列は、SEQ ID NO:50に開示される）に結合し得る。あるいは、エフェクター細胞分子は、ヒトおよび／またはカニクイザルのTCRα、TCRβ、TCRδ、TCRγ、CD3β、CD3γ、CD3δ、またはCD3ζであってよい。
【００６１】
いくつかの態様において、PABPは、マウス、ラット、ウサギ、新世界ザル、および／または旧世界ザル種などの別の種由来のCD3ε鎖に結合し得る。そのような種には、非限定的に、以下の哺乳動物種：ハツカネズミ；クマネズミ；ドブネズミ；カニクイザル、Macaca fascicularis；マントヒヒ、Papio hamadryas；ギニアヒヒ、Papio papio；アヌビスヒヒ、Papio anubis；キイロヒヒ、Papio cynocephalus；チャクマヒヒ、Papio ursinus；コモンマーモセット；ワタボウシタマリン；およびリスザルが含まれる。カニクイザルのCD3ε鎖の成熟アミノ酸配列は、SEQ ID NO:51に提供される。タンパク質治療剤の開発の分野において公知のように、ヒトならびに前臨床試験のために通常使用されるマウスおよびサルなどの種において同等の活性を有し得る治療剤を有することは、医薬品開発を簡略化し、促進することができる。薬物を市場に橋渡しする長く高価な工程において、そのような利点は重大であり得る。
【００６２】
より具体的な態様において、PABPは、ヒトCD3ε鎖であってよい、または異なる種、特に上掲の哺乳動物種のうちの1つに由来するCD3ε鎖であってよいCD3ε鎖の、最初の27アミノ酸内のエピトープに結合し得る。抗体が結合するエピトープは、SEQ ID NO:52およびSEQ ID NO:53からなる群より選択されるアミノ酸配列の一部であってよい。エピトープは、アミノ酸配列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (SEQ ID NO:54) を含有し得る。このアミノ酸配列に結合するタンパク質の利点は、米国特許出願公開第2010/183615号に詳細に説明されており、その関連部分は参照により本明細書に組み入れられる。抗体またはタンパク質が結合するタンパク質の部分は、アラニンスキャニングによって決定することができ、それは例えば米国特許出願公開第2010/183615号に記載されており、その関連部分は参照により本明細書に組み入れられる。
【００６３】
NK細胞または細胞傷害性T細胞が免疫エフェクター細胞である場合、NKG2D、CD352、NKp46、またはCD16aが、成分2が結合し得るエフェクター細胞分子であってよい。CD8+ T細胞が免疫エフェクター細胞である場合、4-1BB、OX40、GITR、CD28、CD27、またはICOSが、成分2が結合し得るエフェクター細胞分子であってよい。あるいは、PABPは、T細胞、NK細胞、マクロファージ、単球、または好中球上に発現される他の抗原に結合し得る。
【００６４】
PABPの成分2として使用され得るVH領域およびVL領域には、CD3εまたはTCR-CD3複合体の他の成分に結合し得るもの、例えば、SEQ ID NO: 40および45のアミノ酸配列を含むものが含まれる。CD3ε、またはT細胞、NK細胞、マクロファージ、単球、もしくは好中球上に発現される他のエフェクター細胞分子に結合し得る他のVH/VL対もまた、成分2として使用され得る。
【００６５】
成分3
任意の成分である成分3は、成分1または2に結合し得るポリペプチドであって、結合した場合に、成分1または2がエフェクター細胞または標的細胞に結合するのを阻止または阻害し得るポリペプチドである。いくつかの態様において、成分3は、成分1が結合し得る標的分子または成分2が結合し得るエフェクター細胞分子の一部または全体である。例えば、エフェクター細胞がT細胞である場合、成分3は、TCRα、TCRβ、TCRδ、TCRγ、pTα、CD3β、CD3γ、CD3δ、CD3ε、またはCD3ζなどの、TCR-CD3複合体の一部であるポリペプチドの一部または全体であってよい。あるいは、エフェクター細胞がNK細胞または細胞傷害性T細胞である場合、成分3は、NKG2D、CD352、NKp46、またはCD16aの一部または全体であってよい。同様に、エフェクター細胞がCD8+ T細胞である場合、4-1BB、OX40、GITR、CD28、CD27、またはICOSの一部または全体が、成分3であってよい。いくつかの態様において、成分3はCD3εの一部を含む。例えば、成分3は、成熟ヒトCD3ε (SEQ ID NO:50) であってよい、または異なる種、特にカニクイザル (SEQ ID NO:51) などの上掲の哺乳動物種のうちの1つに由来するCD3εであってよいCD3εの、最初の27アミノ酸を含み得る。
【００６６】
いくつかの態様において、成分3はインビトロで選択されたペプチドを含んでよく、該ペプチドは、それがPABPの一部である場合には、プロテアーゼ切断によって成分3がPABPの残りの部分から分離された場合の、同じPABPを用いて観察される結合と比較して、PABPのエフェクター細胞または標的細胞への結合を阻止または阻害し得る。あるいはまたは加えて、そのようなインビトロで選択されたペプチドを含む成分3は、それがPAPBの一部である場合に、プロテアーゼ切断によって成分3がPABPの残りの部分から分離された場合の、同じエフェクター細胞およびPABPの存在下で観察される細胞溶解と比較して、エフェクター細胞およびPABPの存在下において標的細胞の細胞溶解を阻害し得る。
【００６７】
成分4
成分4は、プロテアーゼ切断部位を含む。切断部位は、病原体、病原体に感染した細胞、または疾患を媒介する細胞、例えば癌細胞の物理的近傍で特異的に発現されるプロテアーゼによって切断され得る。プロテアーゼは、数ある中でもとりわけ、例えば、メタロプロテイナーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ (MMP)、例えば、MMP2、MMP9、もしくはMMP11など、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、フューリン、プラスミン、またはプラスミノーゲン活性化因子（ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子 (u-PA) または組織プラスミノーゲン活性化因子 (tPA) など）、線維芽細胞活性化タンパク質α (FAPα) であってよい。
【００６８】
これらのプロテアーゼ切断部位には、例えば、プラスミンによって切断される部位が含まれ得る。酵素前駆体プラスミノーゲンは、u-PAによるタンパク質分解切断によって活性化され、活性酵素、プラスミンへと変換される。セリンプロテアーゼであるプラスミンは、その細胞外基質の分解、および他の酵素、例えばIV型コラゲナーゼのその活性化に起因して、転移において役割を果たし得る。例えば、その関連部分が参照により本明細書に組み入れられる、Kaneko et al. (2003), Cancer Sci. 94(1): 43-39を参照されたい。
【００６９】
そのようなプロテアーゼ切断部位には、例えば、ある特定の癌、炎症性腸疾患、嚢胞性線維症、腎疾患、糖尿病性腎症、および皮膚線維性腫瘍などの疾患に関与し得る、メタロプロテアーゼ、メプリンαおよびメプリンβの切断部位もまた含まれる。メプリンαおよびβの切断部位は、これらプロテアーゼの各々に関して、単一の規定配列に限定されない。しかしながら、切断部位に対するある特定のアミノ酸位置において、1つまたは少数の特定のアミノ酸に対する強い選択性が存在する。例えば、補足の資料を含め、特定の切断部位を記載しているその部分が参照により本明細書に組み入れられる、Becker-Pauly et al. (2011), Molecular and Cellular Proteomics 10(9):M111.009233. DOI:10.1074/mcp.M111.009233を参照されたい。メプリンαおよびメプリンβを含む様々なプロテアーゼの公知の切断部位の少数の選択物が、以下の表2に提供される。本明細書において記載される本発明の成分4は、非限定的に、表2に収載される切断部位のいずれかを含む、メプリンαおよびメプリンβを含む任意のメタロプロテアーゼの切断部位を含有し得る。
【００７０】
同様に、マトリックスメタロプロテイナーゼ (MMP)、MMP-2およびMMP-9は、卵巣腫瘍、乳房腫瘍、および前立腺腫瘍を含む種々のヒト腫瘍において、ならびにメラノーマにおいて過剰発現される。さらに、侵襲性の腫瘍成長と高レベルのMMP-2および／またはMMP-9との間の関連性が、臨床研究および実験研究の両方において観察されている。例えば、Roomi et al. (2009), One. Rep. 21: 1323-1333を参照されたい。MMP-2またはMMP-9の切断部位は、P4-P3-P2-P1|P1'-P2'-P3'-P4'として表すことができ、式中、P1〜P4およびP1'〜P4'はアミノ酸であり、垂直線は切断部位を表す。MMP-2切断部位について、いくらかの一般化がなされ得る。P1は、グリシンまたはプロリンである可能性が最も高い。P2は、プロリンである可能性が最も高く、アラニン、バリン、またはイソロイシンである可能性が幾分低い。P3は、アラニン、セリン、またはアルギニンである可能性が最も高い。P4は、アラニン、グリシン、アスパラギン、またはセリンである可能性が最も高い。P1'は、ロイシンである可能性が最も高く、イソロイシン、フェニルアラニン、またはチロシンである可能性が幾分低い。P2'は、リジンである可能性が最も高く、アラニン、バリン、イソロイシン、またはチロシンである可能性が幾分低い。P3'は、アラニン、セリン、またはグリシンである可能性が最も高い。P4'は、アラニン、リジン、またはアスパラギン酸である可能性が最も高い。MMP-9切断部位に関して、幾分より明白な選択性が存在する。P4は、グリシンである可能性が最も高い。P3は、プロリンである可能性が最も高い。P2は、リジンである可能性が最も高い。P1は、グリシンまたはプロリンである可能性が最も高い。P1'は、ロイシンである可能性が最も高く、イソロイシンである可能性が幾分低い。P2'は、リジンである可能性が最も高い。P3'は、グリシンまたはアラニンである可能性が最も高い。P4'は、アラニン、プロリン、またはチロシンである可能性が最も高い。表2において、または例えばその関連部分が参照により本明細書に組み入れられる、Prudova et al. (2010), Mol. Cell. Proteomics 9(5): 894-911において開示されるものを含む、任意のMMP-2またはMMP-9切断部位が、本明細書において記載される本発明の成分4中に含有され得る。
【００７１】
正常よりも高レベルのu-PAは、例えば、結腸直腸癌、乳癌、単球性および骨髄性白血病、膀胱癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌、ならびに莢膜、肺、膵臓、卵巣、および頭頸部の癌を含む様々な癌と関連していることが公知である。例えば、Skelly et al. (1997), Clin. Can. Res. 3: 1837-1840；Han et al. (2005), Oncol. Rep. 14(1): 105-112；Kaneko et al. (2003), Cancer Sci. 94(1): 43-49；Liu et al. (2001), J. Biol. Chem. 276(21): 17976-17984を参照されたい。以下の表2に、u-PAによって切断され得る部位の小標本が報告されている。本明細書において記載される本発明の成分4は、表2に収載される切断部位のいずれかを含む、u-PAおよび組織プラスミノーゲン活性化因子 (tPA) を含む任意のセリンプロテアーゼの切断部位を含有し得る。
【００７２】
カテプシンBなどのいくつかのシステインプロテアーゼは、腫瘍組織において過剰発現されることが見出されており、いくつかの癌において原因となる役割を果たす可能性が高い。例えば、Emmert-Buck et al. (1994), Am. J. Pathol. 145(6): 1285-1290；Biniosseek et al. (2011), J. Proteome Res. 10: 5363-5373を参照されたい。プロテアーゼ切断部位を記載しているこれらの参考文献の部分は、参照により本明細書に組み入れられる。メプリンαおよびメプリンβの切断部位と同様に、カテプシンB切断部位には多くの不均一性が存在する。カテプシンB（および他のプロテアーゼ）の切断部位は、P3-P2-P1|P1'-P2'-P3'として表すことができ、式中、P1〜P3およびP1'〜P3'はすべてアミノ酸であり、垂直線は切断部位を表す。いくらかの一般化が、カテプシンB切断部位に適用される。P3は、最も多くの場合にG、F、L、またはPである（アミノ酸の一文字コードを使用）。P2は、最も多くの場合にA、V、Y、F、またはIである。P1は、最も多くの場合にG、A、M、Q、またはTである。P1'は、最も多くの場合にF、G、I、V、またはLである。P2'は、最も多くの場合にV、I、G、T、またはAである。P3'は、最も多くの場合にGである。さらに、いくらかのサブ部位協同性が存在する。例えば、P2がFであるならば、P3はGである可能性が最も高く、Lである可能性が最も低く、かつP1'はFである可能性が最も高く、Lである可能性が最も低い。サブ部位協同性のこの例および他の例は、Biniossek et al. (2011), J. Proteome Res. 10: 5363-5373に詳細に記載されている。Biniossekの図3および図5、ならびに添付の文章、それに加えて捕捉の表1は、参照により本明細書に組み入れられる。非限定的に表2中のものを含む、すべてのカテプシンB切断部位が、本明細書において記載される本発明の成分4中に含有され得る。
【００７３】
（表２）プロテアーゼ切断部位の例
2020188772.tif 000011
*垂直線は予測される切断部位を表す
【００７４】
PABPの成分4および他の部分は、プロテアーゼ切断可能ではない「リンカー」配列を含有し得る。例えば、成分4は、プロテアーゼ切断部位、および切断可能ではない他のリンカー配列を含有し得る。あるいは、成分4はプロテアーゼ切断部位のみを含有してもよい。これらの非切断可能リンカーには、例えば(G4S)n、式中、nは例えば1、2、3、4、5、6、7、または8であってよい、などのアミノ酸配列が含まれ得る。G4Sは、SEQ ID NO:88として収載されている。他の例示的なリンカーには、数ある中でもとりわけ、例えば、アミノ酸配列、
2020188772.tif 000012
、およびAAAが含まれる。
【００７５】
成分5
半減期延長部分は、例えば、Fcポリペプチド、アルブミン、アルブミン断片、アルブミンもしくは胎児性Fc受容体 (FcRn) に結合する部分、アルブミンもしくはその断片に結合するように操作されたフィブロネクチンの誘導体、ペプチド、単一ドメインタンパク質断片、または血清中半減期を増大させ得る他のポリペプチドであってよい。代替の態様において、半減期延長部分は、例えばポリエチレングリコール (PEG) などの非ポリペプチド分子であってよい。使用され得るヒトIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4 Fcポリペプチドの配列は、SEQ ID NO:84〜87に提供される。1つもしくは複数のヘテロ二量体化改変、半減期を延長する1つもしくは複数のFc改変、ADCCを増強する1つもしくは複数の改変、および／またはFcγ受容体 (FcγR) 結合を阻害する1つもしくは複数の改変を含有するこれらの配列の変種もまた、配列のアミノ酸100個あたり10個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入、または置換を含有する他の近縁変種として企図される。
【００７６】
アルブミンと結合するように操作されたヒトフィブロネクチンIII型 (Fn3) の誘導体の配列は、SEQ ID NO:83に提供される。当技術分野において公知のように、ヒトフィブロネクチンIII型 (Fn3) ドメインのループは、他の標的に結合するように操作することができる。Koide (1998), J Mol Biol.: 284(4): 1141-51。
【００７７】
半減期延長部分は、抗体のFc領域であってよい。その場合、第1ポリペプチド鎖は、CH1領域の後にFcポリペプチド鎖を含有し得、第2ポリペプチド鎖は、CL領域の後にFcポリペプチド鎖を含有し得る。あるいは、一方のポリペプチド鎖のみが、Fcポリペプチド鎖を含有し得る。CH1領域とFc領域との間、および／またはCL領域とFc領域との間にリンカーが存在し得るが、その必要性はない。上記で説明されたように、Fcポリペプチド鎖は、ヒンジ領域の全体または一部に続いてCH2およびCH3領域を含む。Fcポリペプチド鎖は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒトコブラクダ、または新世界もしくは旧世界ザル）、鳥類、またはサメ起源のものであってよい。加えて、上記で説明されたように、Fcポリペプチド鎖は、限られた数の改変を含み得る。例えば、Fcポリペプチド鎖は、1つもしくは複数のヘテロ二量体化改変、FcγRへの結合を阻害もしくは増強する1つもしくは複数の改変、またはFcRnへの結合を増大させる1つまたは複数の改変を含み得る。
【００７８】
いくつかの態様において、Fcポリペプチドのアミノ酸配列は、哺乳動物、例えばヒトのアミノ酸配列であってよい。Fcポリペプチドのアイソタイプは、IgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4などのIgG、IgA、IgD、IgE、またはIgMであってよい。以下の表2は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4 Fcポリペプチド鎖のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【００７９】
（表２）ヒトIgG Fcポリペプチド鎖のアミノ酸配列
2020188772.tif 000013
【００８０】
表2に示される番号付けは、IgG1抗体の定常領域の連続的な番号付けに基づくEU番号付けシステムに従っている。Edelman et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. 63: 78-85。したがって、この番号付けは、IgG3ヒンジの付加的な長さには十分には対応していない。それにもかかわらず、この番号付けは、Fc領域中の位置を指すために当技術分野においてまだ一般に使用されているという理由で、本明細書においてFc領域中の位置を指定するために使用される。IgG1、IgG2、およびIgG4 Fcポリペプチドのヒンジ領域は、約216位から約230位に及ぶ。IgG2およびIgG4のヒンジ領域がIgG1ヒンジよりもそれぞれ3アミノ酸短いことが、アライメントから明らかである。IgG3ヒンジははるかにより長く、上流に付加的な47アミノ酸が伸びている。CH2領域は約231位から340位に及び、CH3領域は約341位から447位に及ぶ。
【００８１】
Fcポリペプチドの天然アミノ酸配列は、わずかに変動し得る。そのような変動は、天然Fcポリペプチド鎖の配列のアミノ酸100個あたり10個以下の単一アミノ酸の挿入、欠失、または置換を含み得る。置換がある場合、それらは、上記で定義された保存的アミノ酸置換であってよい。第1ポリペプチド鎖および第2ポリペプチド鎖上のFcポリペプチドは、アミノ酸配列が異なり得る。いくつかの態様において、それらは、ヘテロ二量体形成を促進する「ヘテロ二量体化改変」、例えば上記で定義された電荷対置換を含み得る。さらに、PABPのFcポリペプチド部分はまた、FcγR結合を阻害または増強する改変を含有し得る。そのような変異は、上記に、およびXu et al. (2000), Cell Immunol. 200(1): 16-26に記載されており、その関連部分は参照により本明細書に組み入れられる。Fcポリペプチド部分はまた、例えば、米国特許第7,037,784号、第7,670,600号、および第7,371,827号、米国特許出願公開第2010/0234575号、ならびに国際出願PCT/US2012/070146に記載されたものを含む、上記の「半減期を延長するFc改変」を含み得、それらすべての関連部分は参照により本明細書に組み入れられる。さらに、Fcポリペプチドは、上記で定義された「ADCCを増強する改変」を含み得る。
【００８２】
プロテアーゼにより活性化可能な二重特異性分子の様々な態様
図2は、本明細書において記載されるPABPの例の略図である。「VH1」および「VL1」と表示される楕円形は、疾患媒介細胞上に発現される標的分子、例えば癌細胞抗原、または感染細胞もしくは病原体上に発現される標的分子に共に結合し得る重鎖および軽鎖可変（VHおよびVL）領域を表す。示されるように、VH1およびVL1は、図1に関連して上記で考察された成分1を共に構成する。示されるように、「VH2」および「VL2」と表示される楕円形は、共にCD3εに結合し得、かつ成分2を構成するVH領域およびVL領域を表す。「CD3ε」と表示される、より小さな楕円形は、VH2およびVL2が結合するCD3εの一部を表し、したがって上記で定義された成分3を構成する。成分2および3に関連して上記で考察されたように、成分3は、T細胞、NK細胞、単球、マクロファージ、または好中球上に発現される、CD3ε以外のタンパク質であってもよい。「4」で示される破線および矢印は、プロテアーゼ切断部位（上記で考察された成分4に相当する）を表す。他の曲線は、非切断可能なリンカーを表す。水平線によって連結された、CH2領域から上方へ伸びる直線は、ジスルフィド結合されたヒンジ領域である。「CH2」および「CH3」と表示される楕円形は、ヒンジ領域の一部または全体と併せて、半減期を延長し得るFcポリペプチド鎖を表す。示されるように、Fc領域は成分5と見なされる。
【００８３】
別の態様は、図3に図示される。示されるように、一方のポリペプチド鎖は、CD3εの断片（成分3）に続いて、VH2、リンカー、VL1、CH1、およびFcポリペプチド鎖を含む。他方のポリペプチド鎖は、VH1に続いて、リンカー、VL2、CL、およびFcポリペプチド鎖を含む。VH2およびVL2は、CD3εに結合し得る。示されるように、破線の曲線はプロテアーゼ切断部位（成分4）を表し、直線および曲線は、上記で示されたようにヒンジ領域およびリンカーを表す。
【００８４】
さらなる態様は、図4に図示される。一方のポリペプチド鎖は、標的細胞分子に結合する抗体に由来するVH1およびVL1（「VH1」および「VL1」と表示される楕円形）、任意のリンカー、およびFcポリペプチド鎖（ヒンジ、ならびに「CH2」および「CH3」と表示される楕円形）を含むscFvを含む。他方のポリペプチド鎖は、示されるようにPABPの成分3である、CD3εの一部を含む。CD3εに結合する抗体に由来するVH2およびVL2に続いて、任意のリンカーおよびFcポリペプチド鎖を含むscFvが、これに続く。破線は、プロテアーゼ切断部位、すなわち示されるように成分4を表す。曲線はリンカー配列を示す。水平線によって連結された、CH2領域から上方へ伸びる真っすぐな垂直線は、ジスルフィド結合によって連結されたヒンジ領域を表す。図2に関連して説明されたように、成分3は、CD3ε以外のタンパク質であってもよく、VL2およびVH2はそれに結合し得る。
【００８５】
さらなる他の態様が、図5Aおよび5Bに示される。図5Aは、一方のポリペプチドが、VH1に続いてプロテアーゼ切断部位（成分4）、それに続いてVH2およびCH1を含む場合のタンパク質を表す。他方のポリペプチドは、VL1に続いて、リンカー、VL2、およびCLを含む。示されるように、VH1およびVL1は成分1を表し、VH2およびVL2は成分2を表す。
【００８６】
図5Bは、VH2に続いてCH1、プロテアーゼ切断部位（成分4）、VH1、およびCH1を含むポリペプチドを含むタンパク質を表す。他方のポリペプチドは、VL2、CL、リンカー、VL1、およびCLを含む。示されるように、VH1およびVL1は成分1を表し、VH2およびVL2は成分2を表す。
【００８７】
PABPをコードする核酸
本明細書において記載されるPABPをコードする核酸が提供される。VH、VL、ヒンジ、CH1、CH2、CH3、およびCH4領域を含む免疫グロブリン領域をコードする多数の核酸配列が、当技術分野において公知である。例えば、Kabat et al. in SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991を参照されたい。本明細書において提供される指針を用いて、当業者は、そのような核酸配列および／または当技術分野において公知の他の核酸配列を組み合わせて、本明細書において記載されるPABPをコードする核酸配列を創出することができる。
【００８８】
加えて、本明細書において記載されるPABPをコードする核酸配列は、本明細書において提供されたアミノ酸配列および当技術分野における知識に基づき、当業者が決定することができる。特定のアミノ酸配列をコードするクローン化DNAセグメントを生成する、より伝統的な方法以外に、とりわけDNA2.0 (Menlo Park, CA, USA) およびBlueHeron (Bothell, WA, USA) などの企業が、現在、化学合成され、遺伝子サイズが調整された任意の所望の配列のDNAを注文に応じて日常的に生産することで、そのようなDNAの生産工程を合理化している。
【００８９】
PABPを作製する方法
本明細書において記載されるPABPは、当技術分野において周知の方法を用いて作製することができる。例えば、PABPの2つのポリペプチド鎖をコードする核酸は、例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、核酸をコーティングした微粒子を用いた微粒子銃等などの種々の公知の方法によって、培養宿主細胞中に導入することができる。いくつかの態様において、PABPをコードする核酸は、宿主細胞中に導入される前に、宿主細胞における発現に適切なベクター中に挿入することができる。典型的には、そのようなベクターは、挿入された核酸の発現をRNAおよびタンパク質レベルで可能にする配列エレメントを含有し得る。そのようなベクターは、当技術分野において周知であり、多くが市販されている。核酸を含有する宿主細胞は、細胞による核酸の発現を可能にするような条件下で培養することができ、結果として得られたPABPは、細胞集団または培養液から収集することができる。あるいは、PABPは、インビボで、例えば、植物の葉（例えば、Scheller et al. (2001), Nature Biotechnol. 19: 573-577、およびその中に引用された参考文献を参照されたい）、鳥の卵（例えば、Zhu et al. (2005), Nature Biotechnol. 23: 1159-1169、およびその中に引用された参考文献を参照されたい）、または哺乳動物の乳汁（例えば、Laible et al. (2012), Reprod. Fertil. Dev. 25(1): 315を参照されたい）の中で生成することができる。
【００９０】
数ある中でもとりわけ、例えば、大腸菌 (Escherichia coli) もしくはバチリス・ステオロサーモフィルス (Bacilis steorothermophilus) などの細菌細胞、サッカロミセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) もしくはピキア・パストリス (Pichia pastoris) などの真菌細胞、ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）細胞を含む鱗翅目昆虫細胞などの昆虫細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞、ベビーハムスター腎臓 (BHK) 細胞、サル腎臓細胞、HeLa細胞、ヒト肝細胞癌細胞、もしくは293細胞などの哺乳動物細胞を含む、種々の培養宿主細胞を使用することができる。
【００９１】
治療法および組成物
本明細書において記載されるPABPは、例えば、様々な形態の癌、感染症、線維性疾患、および／または自己免疫もしくは炎症状態を含む、多種多様な状態を処置するために使用することができる。
【００９２】
本明細書において、本明細書において記載されるPABPを含む薬学的組成物が提供される。そのような薬学的組成物は、本明細書において記載されるPABPの治療有効量に加えて、生理学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤などの1種または複数種の付加的な成分を含む。そのような付加的な成分には、多くの可能なものの中でもとりわけ、緩衝剤、炭水化物、ポリオール、アミノ酸、キレート剤、安定剤、および／または保存剤が含まれ得る。
【００９３】
いくつかの態様において、本明細書において記載されるPABPは、新たな領域に癌細胞を浸潤、すなわち転移させ得る隣接組織の破壊および新生血管の成長がしばしば付随する、未制御のおよび／または不適切な細胞増殖を伴う、癌を含む細胞増殖性疾患を処置するために使用することができる。これらの状態には、血液悪性腫瘍および固形悪性腫瘍が含まれる。本明細書において記載されるPABPで処置可能な状態に含まれるのは、結腸直腸ポリープ、脳虚血、肉眼的嚢胞性疾患、多発性嚢胞腎疾患、良性前立腺肥大症、および子宮内膜症を含む、不適切な細胞成長を伴う非悪性状態である。本発明のPABPを使用して処置できる他の細胞増殖性疾患は、例えば、中皮腫、扁平上皮癌、骨髄腫、骨肉腫、神経膠芽腫、神経膠腫、癌腫、腺癌、メラノーマ、肉腫、急性および慢性白血病、リンパ腫、ならびに髄膜腫、ホジキン病、セザリー症候群、多発性骨髄腫、ならびに肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、咽頭癌、乳癌、頭頸部癌、膀胱癌、卵巣癌、皮膚癌、前立腺癌、子宮頸癌、膣癌、胃癌、腎細胞癌、腎臓癌、膵臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、および食道癌、肝胆道癌、骨癌、皮膚癌、および血液癌を含む癌、ならびに鼻腔および副鼻腔、鼻咽頭、口腔、中咽頭、喉頭、下喉頭、唾液腺、縦隔、胃、小腸、結腸、直腸および肛門領域、尿管、尿道、陰茎、精巣、外陰部、内分泌系、中枢神経系、および形質細胞の癌である。
【００９４】
癌治療のための指針を提供している教科書の1つに、Cancer, Principles and Practice of Oncology, 4th Edition, DeVita et al., Eds. J. B. Lippincott Co., Philadelphia, PA (1993) がある。適切な治療アプローチは、関連分野において認識されているように、癌の特定の型、および患者の全身状態などの他の要因に応じて選択される。癌患者の処置において、本明細書において記載されるPABPを、他の抗新生物剤および／または処置を使用する治療計画に加えることができる。
【００９５】
いくつかの態様において、PABPは、例えば、化学療法剤、非化学療法的抗新生物剤、および／または放射線照射などの、癌処置に広く採用されている種々の薬物および処置と同時に、その前に、またはその後に投与することができる。例えば、化学療法および／または放射線照射は、本明細書において記載される処置のいずれかの前、間、および／または後に行うことができる。化学療法剤の例は上記で考察されており、これには、シスプラチン、タキソール、エトポシド、ミトキサントロン（Novantrone（登録商標））、アクチノマイシンD、シクロヘキシミド、カンプトテシン（またはその水溶性誘導体）、メトトレキサート、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンC）、ダカルバジン (DTIC)、アドリアマイシン（ドキソルビシン）およびダウノマイシンのなどの抗新生物抗生物質、ならびに上記で言及されたすべての化学療法剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
本明細書において記載されるPABPはまた、感染症、数ある中でもとりわけ、例えば、慢性B型肝炎ウイルス (HBV) 感染症、C型肝炎ウイルス (HPC) 感染症、ヒト免疫不全ウイルス (HIV) 感染症、エプスタイン-バーウイルス (EBV) 感染症、またはサイトメガロウイルス (CMV) 感染症を処置するために使用することができる。
【００９７】
本明細書において記載されるPABPは、ある特定の細胞型を枯渇させることが有益である他の種類の状態においてさらなる用途を見出し得る。例えば、喘息におけるヒト好酸球、全身性エリテマトーデスにおける過剰なヒトB細胞、自己免疫状態における過剰なヒトTh2 T細胞、または感染症における病原体感染細胞の枯渇は、有益であり得る。特発性肺線維症 (IPF) などの肺線維症、または腎臓もしくは肝臓線維症のような線維性状態における筋線維芽細胞または他の病的細胞の枯渇は、PABPのさらなる用途である。
【００９８】
本明細書において記載されるPABPの治療有効用量を投与することができる。治療用量を構成する抗体の量は、処置される適応症、患者の体重、患者の算出された皮膚表面積に応じて変動し得る。本明細書において記載されるPABPの投薬は、所望の効果を達成するように調整することができる。多くの場合、反復投薬が必要となり得る。例えば、本明細書において記載されるPABPは、1週間に3回、1週間に2回、1週間に1回、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10週間に1回、または2、3、4、5、もしくは6ヶ月に1回投薬することができる。毎日投与されるPABPの量は、約0.0036 mg〜約450 mgであってよい。あるいは、用量は患者の推定皮膚表面に応じて較正することができ、各用量は約0.002 mg/m2〜約250 mg/m2であってよい。別の選択肢において、用量は患者の体重に応じて較正することができ、各用量は約0.000051 mg/kg〜約6.4 mg/kgであってよい。
【００９９】
PABPまたはこれらの分子を含有する薬学的組成物は、任意の実行可能な方法によって投与することができる。経口投与は、ある特定の製剤または状況の非存在下では、胃の酸性環境中でタンパク質の加水分解を引き起こすため、タンパク質治療剤は通常、非経口経路によって、例えば注射によって投与される。皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、病巣内、または腹膜注射が、可能な投与経路である。PABPはまた、注入、例えば静脈内または皮下注入によって投与することもできる。特に皮膚に影響を及ぼす疾患に関しては、局所投与も可能である。あるいは、PABPは、粘膜との接触を通じて、例えば、鼻腔内、舌下、膣、もしくは直腸投与、または吸入剤としての投与によって投与することができる。あるいは、PABPを含む特定の適切な薬学的組成物を経口投与することができる。
【０１００】
上記で本発明を一般的な用語で説明したが、以下の実施例を限定ではなく例示として提供する。
【実施例】
【０１０１】
実施例1：PABPおよび対照タンパク質の構築および生成
PABPは、成熟ヒトCD3εのアミノ酸1〜27をコードするDNAに加えて、リンカー、すなわち (G4S)3、および／またはプロテアーゼ切断部位を既存のDNA構築物に導入することにより作製した。例えば、CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-フューリンcsV1-aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-MMP-2csV3-aCD3-aHER2-Xbodyの場合、既存のDNA構築物は、SEQ ID NO:6および93のアミノ酸配列を含む二重特異性タンパク質（aCD3-aHER2-Xbodyと称される）をコードし、これは国際出願PCT/US/2014/026658に記載されており、その関連部分は参照により本明細書に組み入れられる。CD3ε断片ならびにリンカーおよび／またはプロテアーゼ切断部位を含む挿入物は、適切なプライマーを用いてPCRにより導入し、構築物は、Gibson et al. (2009), Nature Methods 6(5): 343-343に説明されているようにGibsonアッセンブリーによって完成させた。この方法がどのように実施されるのかを説明しているこの参考文献の部分は、参照により本明細書に組み入れられる。簡潔に説明すると、末端上に重複配列を有する二本鎖DNA断片を、T5エキソヌクレアーゼ（二本鎖DNAを5'末端側から後退させる）、PHUSION（登録商標）DNAポリメラーゼ (New England Biolabs)、およびTaqリガーゼと共に50℃でインキュベートし、その後これを用いて大腸菌を形質転換し、所望の配列を有するDNA構築物を含有するコロニーを得た。
【０１０２】
PABPであるCD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-mxb、CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-mxb、CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-mxb、およびCD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-mxbをコードするDNA構築物は、SEQ ID NO:20および94のアミノ酸配列を含むaCD3-aHER2-mxbをコードするDNA構築物から開始して、同様の方法で構築した。
【０１０３】
同様に、CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-BiFc、CD3ε(1-27)-MMP-cs-aCD3-aHER2-BiFc、およびCD3ε(1-27)-フューリンcs-aCD3-aHER2-BiFcをコードするDNA構築物は、SEQ ID NO:30および32のアミノ酸配列を含むaCD3-aHER2-Bi-FcをコードするDNA構築物から開始して、作製した。
【０１０４】
HEK 293-6e細胞への一過性トランスフェクションによってタンパク質を生成し、馴化培地からタンパク質を精製した。
【０１０５】
実施例2：MMP切断部位はインビトロで消化され得る
MMP-2による様々なPABPの切断を評価するため、アッセイしようとするタンパク質を、30μM ZnCl2を含むリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で100 ng/μlに希釈した。PABPを含有する溶液20μl（2000 ngを含有する）に、MMP-2プロテアーゼ (Calbiochem (Cat#PF023)) を添加し（0.1 mg/mlで0.5μl）、37℃で一晩インキュベートした。その後、プロテアーゼ反応物（0.5 ul (50ng)）からの消化タンパク質、それに加えて非消化タンパク質を、NUPAGE（登録商標）NOVEX（登録商標） 4〜12% Bis-Trisゲル（Life Technologies、Grand Island, New York）に負荷し、MES緩衝液で還元条件下にて泳動した。ウェスタンブロットによりゲルを転写し、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 結合抗ヒトFc抗体を用いて二重特異性タンパク質を検出した。
【０１０６】
図6は、図3に示される一般形式を有する構築物に関する、これらの結果のうちのいくつかを示す。各ヘテロ二量体PABPの2つのポリペプチド鎖は、サイズの近い2本のバンドとして見える。MMP2切断部位を欠いている抗体は、そのうちのいくつかはフューリン切断部位を含有しているが、MMP2で消化した場合にサイズが変化しない。レーン1および2、5および6、ならびに9および10を参照されたい。MMP2切断部位を含有するPABPでは、MMP2で消化すると、2つのポリペプチド鎖のうちの一方のサイズが減少する。レーン3および4、7および8、ならびに11および12を参照されたい。加えて、フューリン切断部位を含有するPABPは、完全に切断されたタンパク質（CD3ε-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-Xbody；レーン9および10）または部分的に切断されたタンパク質（CD3ε-フューリンcsV1-aCD3-aHER2-Xbody；レーン5および6）として、馴化培地から回収される。当技術分野において公知のように、HEK-293細胞は細胞内にフューリンプロテアーゼを発現し、これはHEK-293細胞において産生された組換えタンパク質を切断することが観察されている。例えば、Wu et al. (2003), J. Biol. Chem. 278: 25847-25852を参照されたい。おそらくは、これらの細胞内フューリンが、フューリン切断部位を含有するPABPの切断の原因である。
【０１０７】
同様の実験を実施して、図4に示される一般形式を有する二重特異性scFv-Fc PABP中のMMP2切断部位が、インビトロで切断され得るかどうかを判定した。MMP2による消化およびゲル電気泳動は、上記の通りに実施した。フューリン部位を含有する1つ（CD3ε-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-mxb；図7、レーン7および8）を除いた、抗体の大部分は、サイズの近い2本の異なるバンドとして見える。CD3ε-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-mxbは、単一のバンドとして見え、フューリン切断部位が切断されたことが示される。MMP2切断部位を含有しないPABPは、MMP2による消化によってサイズが変化しなかった。図7、レーン1および2ならびにレーン7および8を参照されたい。MMP2部位を含有する抗体では、上方のバンドはMMP2消化によってより弱くなり、下方のバンドは上方のバンドと比べてより強くなり、MMP2切断部位が部分的に切断されことが示唆された。図7、レーン3および4ならびにレーン5および6を参照されたい。
【０１０８】
上記のPABPを使用して、付加的な実験を行い、これらのPABP中のMMP2切断部位がインビトロでMMP9によって切断され得るかどうかを判定した。MMP2切断部位を含有するPABPは、MMP9による消化によって切り離された。図8、レーン3および4、7および8、11および12、15および16、ならびに17および18を参照されたい。加えて、フューリン切断部位を含有するPABPは、MMP9によって少なくとも部分的に切断されたように見え（図8、レーン5および6）、いくつかのMMP9消化は、より小さなバンドを生じた（図8、レーン2、4、10、14、16、18、および20）。これらのデータから、MMP9がMMP2よりも選択性が低い可能性があることが示唆される。
【０１０９】
実施例3：ヘテロ二量体二重特異性PABPの細胞溶解活性および該PABPによるT細胞活性化
以下の実験では、図3に図示される一般式を有する、プロテアーゼ消化PABPおよびプロテアーゼ未消化PABPの、インビトロ細胞溶解活性（T細胞依存性細胞溶解 (TDCC)）、およびT細胞を活性化するそれらの能力（CD25の発現として測定）を試験した。
【０１１０】
TDCCアッセイは、標的細胞として、HER2を発現している腫瘍細胞、具体的にはSKOV-3細胞を使用した（図9A、10A、11A、および12A）。SKOV-3細胞は、細胞1個当たり約530,000分子のHER2タンパク質を発現する。簡潔に説明すると、Pan T Cell Isolation Kit II, human（Miltenyi Biotec、Auburn, CA）を使用して、健常ヒトドナーから汎T細胞を単離した。図9A、10A、11A、および12Aに示されるように、様々な濃度のPABPの存在下または非存在下で、T細胞をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル (CFSE) 標識腫瘍標的細胞と共に10:1の比でインキュベートした。陰性対照として、いくつかの試料はT細胞および腫瘍標的細胞を含有したが、二重特異性タンパク質を含有しなかった。
【０１１１】
40時間のインキュベーション後に、細胞を回収し、二本鎖核酸を染色する7-アミノ-アクチノマイシンD (7-AAD) の取り込みによって、腫瘍細胞の溶解率をモニターした。無傷細胞が7-AADを排除するのに対して、7-AADは死細胞または瀕死細胞の膜を透過し、これらの細胞内部の二本鎖核酸を染色し得る。特異的溶解率は、以下の式に従って算出した：
2020188772.tif 000014
【０１１２】
T細胞活性化は、T細胞によるCD25の発現に基づいて評価した。Pan T Cell Isolation Kit II, human（Miltenyi Biotec、Auburn, CA）を使用して、健常ヒトドナーから汎T細胞を単離した。これらのT細胞を、T細胞：腫瘍細胞比10:1のHT-29細胞（HER2を発現する腫瘍由来細胞である）の存在下で、上記のPABPと共にインキュベートした。40時間のインキュベーション後に、非接着細胞をウェルから除去した。すべての試料を、T細胞活性化のマーカーであるアロフィコシアニン (APC) 結合抗CD25抗体で染色し、FACSによって解析した。
【０１１３】
図9Aおよび図9Bは、aCD3-aHER2-XbodyおよびaCD3-aHER2-mxbのTDCCアッセイおよびT細胞活性化アッセイである、陽性対照実験の結果を示す。これらの分子は、CD3ε(1-27) ペプチド（成分3）、およびそれを分子の残りの部分に連結する、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーを欠いていることを除いて、それぞれ図3および図4に図示される一般構造を有する。それらは、プロテアーゼ切断なしに活性化されると予測される。両分子とも、SKOV-3細胞に対する強力な細胞溶解活性を有し、このアッセイにおいて1 ng/mL未満のEc50を有する。図9A；以下の表3を参照されたい。さらに、いずれの分子の添加によっても、濃度依存的様式で活性化T細胞の割合が増加した。図9B。
【０１１４】
さらなる試料において、CD3ε(1-27) 断片を含む抗CD3ε/HER2 PABPを、MMP2により消化しておよび消化せずに、細胞溶解活性およびT細胞活性化について試験した。図10A、10B、11A、および11Bにおいて、すべてのデータは、図3に示される一般構造、およびCD3ε断片を分子の残りの部分に連結するリンカーを除いて同一のアミノ酸配列を有するPABPを用いたアッセイによるものである。PABPは、CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-Xbody（MMP2切断部位を含有するリンカー）、CD3ε(1-27)-フューリンcsV1-aCD3-aHER2-Xbody（フューリン切断部位を含有するリンカー）、CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-Xbody（非切断可能リンカー）、CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-Xbody（MMP2切断部位を含有するリンカー）、CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-Xbody（フューリン切断部位を含有するリンカー）、およびCD3ε(1-27)-MMP-2csV3-aCD3-aHER2-Xbody（MMP2切断部位を含有するリンカー）である。これらのタンパク質は、細胞内にフューリンを産生するHEK-293中で作製されたため、CD3ε(1-27)-フューリンcsV1-aCD3-aHER2-XbodyおよびCD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-Xbodyは、HEK-293細胞による産生中に切断された可能性が高い。
【０１１５】
CD3ε(1-27)-フューリンcsV1-aCD3-aHER2-XbodyおよびCD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-Xbodyは、MMP2で消化されたか否かにかかわらず、TDCCアッセイにおいて1 ng/mL未満のEC50を有した。図10Aおよび11A；表3。対照的に、CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-Xbody、およびCD3ε(1-27)-MMP-2csV3-aCD3-aHER2-Xbodyは、MMP2で消化されなかった場合にはより高いEC50を有し、MMP2で消化された場合には1 ng/mL未満のEC50を有した。図10Aおよび11A；表3。図7および図8に示されるデータと一致して、これらのデータから、フューリン切断部位を含有するPABPは、予測通りHEK-293細胞によって切断されたこと、およびMMP2切断部位を含有するPABPは、MMP2消化によって切断されたことが示唆される。非切断可能CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-Xbodyは、それがMMP2で消化されたかどうかにかかわらず、未消化のCD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-XbodyのEC50に匹敵するEC50を有した。まとめると、これらのデータから、CD3ε(1-27) 断片の存在が、TDCCアッセイおよびT細胞活性化アッセイにおいてPABPの活性を低下させること、ならびにプロテアーゼ消化によるCD3ε断片の遊離が、TDCCおよびT細胞活性化を誘導するPABPの能力を増大させたことが強く示唆される。
【０１１６】
（表３）EC50
2020188772.tif 000015
【０１１７】
実施例4：scFv-Fc PABPの細胞溶解活性および該PABPによるT細胞活性化
図4に示される一般構造を有する抗HER2/CD3 PABPのTDCCアッセイおよびT細胞活性化アッセイもまた実施した。これらのPABPは、CD3ε断片と分子の残りの部分との間のリンカーを除いて同一のアミノ酸配列を有し、これらのPABPには以下のものが含まれた：CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-mxb（MMP2切断部位を伴うリンカーを含む）、CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-mxb（異なるMMP2切断部位を伴うリンカーを含む）、CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-mxb（フューリン切断部位を伴うリンカーを含む）、およびCD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-mxb（非切断可能リンカーを含む）。結果を図12Aおよび12Bに示す。
【０１１８】
切断されないままであり、したがってCD3ε断片を保持すると予測されるPABPの試料は、細胞溶解アッセイにおいて低活性を示し、T細胞活性化アッセイにおいて検出可能な程度の活性はなかった。これらの試料には、消化されたおよび未消化のCD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-mxb、ならびに未消化のCD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-mxbおよびCD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-mxbが含まれた。図12Aおよび12B。対照的に、切断され、したがってCD3ε断片を欠くと予測されるPABPの試料は、両アッセイにおいてはるかにより活性が高かった。これらの試料には、消化されたCD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-mxbおよびCD3ε(1-27)-MMP- 2csV2-aCD3-aHER2-mxb、ならびに消化されたおよび未消化のCD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-mxbが含まれた。図12Aおよび12B。これらのデータから、これらのPABP上のCD3ε(1-27) 断片の存在が、TDCCアッセイおよびT細胞活性化アッセイにおいてPABPの活性を低下させること、ならびにCD3ε(1-27) 断片を除去するタンパク質分解切断によってこれらの活性が回復し得ることが示される。
【０１１９】
実施例5： Bi-Fc PABPのT細胞への結合および細胞溶解活性
図2に図示される形式を有するPABPを、T細胞への結合およびTDCCアッセイにおける活性について試験した。細胞溶解活性は、標的細胞が、細胞1個当たり約181,000分子のHER2タンパク質を発現するJIMT-1細胞であることを除いて、実施例3に記載されるように決定した。T細胞への結合は、蛍光活性化細胞選別 (FACS) 解析によって評価した。
【０１２０】
1つのPABP（CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-BiFc）は非切断可能リンカーを含有し、1つ（CD3ε(1-27)-MMP-2cs-aCD3-aHER2-BiFc）はMMP2切断部位を含有し、および1つ（CD3ε(1-27)-フューリンcs-aCD3-aHER2-BiFc）は、そのタンパク質を生成するために使用されたHEK-293細胞において細胞内で切断されると予測されるフューリン切断部位を含有した。対照タンパク質 (aCD3-aHER2-BiFc) は、CD3εの断片を含有しないことを除いて、図2に示される形式を有した。この分子は、T細胞に結合し、かつ細胞溶解活性を有すると予測された。抗CD3 IgG抗体を結合アッセイにおける陽性対照として使用し、添加タンパク質を含有しない試料を陰性対照として使用した（それぞれ図13の線2および線1に示される結合データ）。
【０１２１】
図13中のデータから、CD3ε(1-27)-フューリンcs-aCD3-aHER2-BiFc（6と表示された線）がT細胞に結合し、陽性対照aCD3-aHER2-BiFc（3と表示された線）および抗CD3抗体（2と表示された線）もT細胞に結合することが示される。CD3ε(1-27)-MMP-2cs-aCD3-aHER2-BiFc（5と表示された線）もCD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-BiFc（4と表示された線）も、結合を示さなかった。CD3ε(1-27)-フューリンcs-aCD3-aHER2-BiFcは切断されると予測されたのに対し、CD3ε(1-27)-MMP-2cs-aCD3-aHER2-BiFcおよびCD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-BiFcはそのように予測されなかったため、これらのデータから、プロテアーゼ切断によるCD3ε断片の遊離によって、T細胞への結合が可能になったことが示唆される。
【０１２２】
これらの結果と一致して、図14中のデータにより、CD3ε(1-27)-フューリンcs-aCD3-aHER2-BiFcおよびaCD3-aHER2-BiFc（それぞれ図14の線6および線3）が強力な細胞溶解活性を有するのに対して、CD3ε(1-27)-MMP-2cs-aCD3-aHER2-BiFcおよびCD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-BiFc（それぞれ図14の線5および線4）は活性がかなり低いことが示される。これらのデータから、CD3εの断片の存在が、これらPABPのT細胞への結合を妨げ、細胞溶解活性を実質的に阻害し得ることが示唆される。
【０１２３】
配列リスト
SEQ ID NO:1  MMP-2切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000016
SEQ ID NO:2  MMP-2切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000017
SEQ ID NO:3  MMP-2切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000018
SEQ ID NO:4  フューリン切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000019
SEQ ID NO:5  フューリン切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000020
SEQ ID NO:6  aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-MMP-2csV3-aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-フューリンcsV1-aCD3-aHER2-Xbody、またはCD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-Xbodyの第1ポリペプチド鎖のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）
2020188772.tif 000021
SEQ ID NO:7  SEQ ID NO:6をコードする核酸配列
2020188772.tif 000022
SEQ ID NO:8  CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-Xbodyの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）
2020188772.tif 000023
SEQ ID NO:9  SEQ ID NO:8をコードする核酸配列
2020188772.tif 000024
2020188772.tif 000025
SEQ ID NO:10  CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-Xbodyの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
2020188772.tif 000026
SEQ ID NO:11  SEQ ID NO:10をコードする核酸配列
2020188772.tif 000027
2020188772.tif 000028
SEQ ID NO:12  CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-Xbodyの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
2020188772.tif 000029
SEQ ID NO:13  SEQ ID NO:12をコードする核酸配列
2020188772.tif 000030
2020188772.tif 000031
SEQ ID NO:14  CD3ε(1-27)-MMP-2csV3-aCD3-aHER2-Xbodyの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
2020188772.tif 000032
SEQ ID NO:15  SEQ ID NO:14をコードする核酸配列
2020188772.tif 000033
2020188772.tif 000034
SEQ ID NO:16  CD3ε(1-27)-フューリンcsV1-aCD3-aHER2-Xbodyの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
2020188772.tif 000035
SEQ ID NO:17  SEQ ID NO:16をコードする核酸配列
2020188772.tif 000036
2020188772.tif 000037
SEQ ID NO:18  CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-Xbodyの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
2020188772.tif 000038
SEQ ID NO:19  SEQ ID NO:18をコードする核酸配列
2020188772.tif 000039
2020188772.tif 000040
2020188772.tif 000041
SEQ ID NO:20  aCD3-aHER2-mxb、CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-mxb、CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-mxb、CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-mxbの第1ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
2020188772.tif 000042
SEQ ID NO:21  SEQ ID NO:20をコードする核酸配列
2020188772.tif 000043
2020188772.tif 000044
SEQ ID NO:22  CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-mxbの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
2020188772.tif 000045
SEQ ID NO:23  SEQ ID NO:22をコードする核酸配列
2020188772.tif 000046
2020188772.tif 000047
SEQ ID NO:24  CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-mxbの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
2020188772.tif 000048
SEQ ID NO:25  SEQ ID NO:24をコードする核酸
2020188772.tif 000049
2020188772.tif 000050
SEQ ID NO:26  CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-mxbの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
2020188772.tif 000051
SEQ ID NO:27  SEQ ID NO:26をコードする核酸配列
2020188772.tif 000052
2020188772.tif 000053
SEQ ID NO:28  CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-mxbの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
2020188772.tif 000054
SEQ ID NO:29  SEQ ID NO:28をコードする核酸配列
2020188772.tif 000055
2020188772.tif 000056
SEQ ID NO:30  aCD3-aHER2-Bi-Fc、CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-Bi-Fc、CD3ε(1-27)-MMP-2cs-aCD3-aHER2-Bi-Fc、およびCD3ε(1-27)-フューリンcs-aCD3-aHER2-Bi-Fcの第1ポリペプチド鎖のアミノ酸配列（シグナル配列を伴う）
2020188772.tif 000057
SEQ ID NO:31  SEQ ID NO:30をコードする核酸配列
2020188772.tif 000058
2020188772.tif 000059
SEQ ID NO:32  aCD3-aHER2-Bi-Fcの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列（シグナル配列を伴う）
2020188772.tif 000060
SEQ ID NO:33  SEQ ID NO:32をコードする核酸配列
2020188772.tif 000061
SEQ ID NO:34  CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-Bi-Fcの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列（シグナル配列を伴う）
2020188772.tif 000062
SEQ ID NO:35  SEQ ID NO:34をコードする核酸配列
2020188772.tif 000063
SEQ ID NO:36  CD3ε(1-27)-MMP-2cs-aCD3-aHER2-Bi-Fcの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列（シグナル配列を伴う）
2020188772.tif 000064
SEQ ID NO:37  SEQ ID NO:36をコードする核酸配列
2020188772.tif 000065
SEQ ID NO:38  CD3ε(1-27)-フューリンcs-aCD3-aHER2-Bi-Fcの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列（シグナル配列を伴う）
2020188772.tif 000066
SEQ ID NO:39  SEQ ID NO:38をコードする核酸配列
2020188772.tif 000067
SEQ ID NO:40  抗CD3ε VH領域のアミノ酸配列
2020188772.tif 000068
SEQ ID NO:41  SEQ ID NO:40をコードする核酸配列
2020188772.tif 000069
SEQ ID NO:42  SEQ ID NO:40の重鎖CDR1のアミノ酸配列
2020188772.tif 000070
SEQ ID NO:43  SEQ ID NO:40の重鎖CDR2のアミノ酸配列
2020188772.tif 000071
SEQ ID NO:44  SEQ ID NO:40の重鎖CDR3のアミノ酸配列
2020188772.tif 000072
SEQ ID NO:45  抗CD3ε VL領域のアミノ酸配列
2020188772.tif 000073
SEQ ID NO:46  SEQ ID NO:45をコードする核酸配列
2020188772.tif 000074
SEQ ID NO:47  SEQ ID NO:45の軽鎖CDR1のアミノ酸配列
2020188772.tif 000075
SEQ ID NO:48  SEQ ID NO:45の軽鎖CDR2のアミノ酸配列
2020188772.tif 000076
SEQ ID NO:49  SEQ ID NO:45の軽鎖CDR3のアミノ酸配列
2020188772.tif 000077
SEQ ID NO:50  成熟ヒトCD3εのアミノ酸配列
2020188772.tif 000078
SEQ ID NO:51  カニクイザルの成熟CD3εのアミノ酸配列
2020188772.tif 000079
SEQ ID NO:52  ヒトCD3εの細胞外ドメインのアミノ酸配列
2020188772.tif 000080
SEQ ID NO:53  ヒトCD3εのアミノ酸1〜27
2020188772.tif 000081
SEQ ID NO:54  ヒトCD3ε由来のペプチド配列
2020188772.tif 000082
SEQ ID NO:55  メプリンαまたはメプリンβ切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000083
SEQ ID NO:56  メプリンαまたはメプリンβ切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000084
SEQ ID NO:57  メプリンαまたはメプリンβ切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000085
SEQ ID NO:58  メプリンαまたはメプリンβ切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000086
SEQ ID NO:59  u-PA切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000087
SEQ ID NO:60  u-PA切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000088
SEQ ID NO:61  u-PA切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000089
SEQ ID NO:62  u-PA切断部位のアミノ酸配列
SGRSS
SEQ ID NO:63  u-PA切断部位のアミノ酸配列
SGRRA
SEQ ID NO:64  u-PA切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000090
SEQ ID NO:65  u-PA切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000091
SEQ ID NO:66  tPA切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000092
SEQ ID NO:67  カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000093
SEQ ID NO:68  カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000094
SEQ ID NO:69  カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000095
SEQ ID NO:70  カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000096
SEQ ID NO:71  カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000097
SEQ ID NO:72  カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000098
SEQ ID NO:73  カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000099
SEQ ID NO:74  カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000100
SEQ ID NO:75  カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
LAAANP
SEQ ID NO:76  カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000101
SEQ ID NO:77  カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000102
SEQ ID NO:78  カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000103
SEQ ID NO:79  カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000104
SEQ ID NO:80  カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000105
SEQ ID NO:81  カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000106
SEQ ID NO:82  フューリン切断部位のアミノ酸配列
2020188772.tif 000107
SEQ ID NO:83  ヒトフィブロネクチンの断片のアミノ酸配列
2020188772.tif 000108
SEQ ID NO:84  ヒトIgG1 Fcポリペプチド鎖のアミノ酸配列
2020188772.tif 000109
SEQ ID NO:85  ヒトIgG2 Fcポリペプチド鎖のアミノ酸配列
2020188772.tif 000110
SEQ ID NO:86  ヒトIgG3 Fcポリペプチド鎖のアミノ酸配列
2020188772.tif 000111
SEQ ID NO:87  ヒトIgG4 Fcポリペプチド鎖のアミノ酸配列
2020188772.tif 000112
SEQ ID NO:88  リンカーのアミノ酸配列
2020188772.tif 000113
（式中、nは1〜10の任意の整数である）
SEQ ID NO:89  リンカーのアミノ酸配列
2020188772.tif 000114
SEQ ID NO:90  リンカーのアミノ酸配列
2020188772.tif 000115
SEQ ID NO:91  リンカーのアミノ酸配列
2020188772.tif 000116
SEQ ID NO:92  リンカーのアミノ酸配列
2020188772.tif 000117
SEQ ID NO:93  aCD3-aHER2-Xbodyの第2ポリペプチドのアミノ酸配列（シグナル配列を含まない）
2020188772.tif 000118
2020188772.tif 000119
2020188772.tif 000120
SEQ ID NO:94  aCD3-aHER2-mxbの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
2020188772.tif 000121
2020188772.tif 000122
2020188772.tif 000123
【図１】
2020188772.tif 000126
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月1日(2020.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
別の局面において、本明細書において記載されるPABPの治療有効用量を投与する段階を含む、感染症、線維性疾患、神経変性疾患、または自己免疫疾患もしくは炎症性疾患に罹患している患者を処置するための方法が、本明細書において記載される。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
(a) 標的細胞に結合し、かつIgGまたはscFv抗体の一部である場合に標的細胞に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の第1対（VH1およびVL1）を含む、1つまたは複数のポリペプチド鎖、
(b) エフェクター細胞に結合し、かつIgGまたはscFv抗体の一部である場合にエフェクター細胞に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の第2対（VH2およびVL2）を含む、1つまたは複数のポリペプチド鎖、
(c) 第3ポリペプチド；ならびに
(d) (c) の第3ポリペプチドをタンパク質の残りの部分に連結する、プロテアーゼ切断部位を含むリンカー
を含むタンパク質であって、
該タンパク質の第1ポリペプチド鎖が、式：VH1-L1-VL1-L2-VH2-L3-VL2-X1を有するアミノ酸配列を含み、式中、L1、L2、およびL3がリンカーであり、L3は存在してもよくまたは存在しなくてもよく、X1が半減期延長部分であり、
該タンパク質の第2ポリペプチド鎖が、式：Y-L4-X2を有するアミノ酸配列を含み、式中、Yが (c) のポリペプチドであり、L4が (d) のプロテアーゼ切断部位を含むリンカーであり、X2が半減期延長部分であり、かつ
プロテアーゼ切断部位が本質的に完全に切断される場合には、プロテアーゼ切断部位が切断されない場合に観察される結合と比較して、該タンパク質がより効果的に標的細胞に結合するか、またはより効果的にエフェクター細胞に結合するかのいずれかである、
前記タンパク質。
［２］
(c) の第3ポリペプチドが、前記タンパク質のエフェクター細胞への結合を阻害する、［1］のタンパク質。
［３］
(a) 標的細胞に結合し、かつIgGまたはscFv抗体の一部である場合に標的細胞に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の第1対（VH1およびVL1）を含む、1つまたは複数のポリペプチド鎖、
(b) エフェクター細胞に結合し、かつIgGまたはscFv抗体の一部である場合にエフェクター細胞に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の第2対（VH2およびVL2）を含む、1つまたは複数のポリペプチド鎖、
(c) 細胞の細胞溶解アッセイにおけるタンパク質の細胞溶解活性を阻害する第3ポリペプチド；ならびに
(d) (c) の第3ポリペプチドをタンパク質の残りの部分に連結する、プロテアーゼ切断部位を含むリンカー
を含むタンパク質であって、
該タンパク質の第1ポリペプチド鎖が、式：VH1-L1-VL1-L2-VH2-L3-VL2-X1を有するアミノ酸配列を含み、式中、L1、L2、およびL3がリンカーであり、L3は存在してもよくまたは存在しなくてもよく、X1が半減期延長部分であり、
該タンパク質の第2ポリペプチド鎖が、式：Y-L4-X2を有するアミノ酸配列を含み、式中、Yが (c) のポリペプチドであり、L4が (d) のプロテアーゼ切断部位を含むリンカーであり、X2が半減期延長部分であり、かつ
プロテアーゼ切断部位が本質的に完全に切断される場合の、細胞の細胞溶解アッセイにおける該タンパク質のEC50が、プロテアーゼ切断部位が切断されていない場合の、同じアッセイにおける該タンパク質のEC50の1/5以下である、
前記タンパク質。
［４］
エフェクター細胞がT細胞である、［1］〜［3］のいずれかのタンパク質。
［５］
エフェクター細胞がNK細胞である、［1］〜［3］のいずれかのタンパク質。
［６］
VH2およびVL2が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に、TCR-CD3複合体の一部であるポリペプチドに結合する、［4］のタンパク質。
［７］
TCR-CD3複合体の一部であるポリペプチドがヒトCD3εである、［6］のタンパク質。
［８］
VH2が、それぞれSEQ ID NO: 42、43、および44のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含み、VL2が、それぞれSEQ ID NO: 47、48、および49のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、［7］のタンパク質。
［９］
VH2およびVL2が、それぞれSEQ ID NO: 40および45のアミノ酸配列を含む、［8］のタンパク質。
［１０］
プロテアーゼ切断可能部位が、MMP-2、MMP-9、またはMMP-11によって切断され得る、［1］〜［9］のいずれかのタンパク質。
［１１］
プロテアーゼ切断可能部位が、
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からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、［10］のタンパク質。
［１２］
X1およびX2がFcポリペプチド鎖である、前記［1］〜［11］のいずれかのタンパク質。
［１３］
第1ポリペプチド鎖がSEQ ID NO:30のアミノ酸配列を含み、第2ポリペプチド鎖がSEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:38のアミノ酸配列を含む、［12］のタンパク質。
［１４］
標的細胞が癌細胞である、前記［1］〜［13］のいずれかのタンパク質。
［１５］
VH1およびVL1が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に、以下のタンパク質：上皮成長因子受容体 (EGFR)、EGFRvIII、メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン (MCSP)、メソテリン (MSLN)、葉酸受容体1 (FOLR1)、CD33、CDH19、または上皮成長因子2 (HER2) のうちの1つに結合する、［14］のタンパク質。
［１６］
以下のポリペプチド鎖の対：
(a) (i) 次式：VH1-CH1-L1-VH2-CH1を有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、VH1およびVH2が免疫グロブリン重鎖可変領域であり、CH1が第1重鎖定常領域であり、L1がプロテアーゼ切断可能部位を含むリンカーである、第1ポリペプチド鎖、ならびに
(ii) 次式：VL1-CL-L2-VL2-CLを有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、VL1およびVL2が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、CLが軽鎖定常領域であり、L2がプロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーである、第2ポリペプチド鎖、または
(b) (i) 次式：VH1-CH1-L1-VL2-CLを有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、VH1が免疫グロブリン重鎖可変領域であり、VL2が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、CH1が第1重鎖定常領域であり、CLが軽鎖定常領域であり、L1がプロテアーゼ切断部位を含むリンカーである、第1ポリペプチド鎖、ならびに
(ii) 次式：VL1-CL-L2-VH2-CH1を有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、VL1が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、VH2が免疫グロブリン重鎖可変領域であり、L2がプロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーであり、CH1が第1重鎖定常領域である、第2ポリペプチド鎖、または
(c) (i) 次式：VL1-CL-L1-VL2-CLを有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、VL1およびV2が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、CLが軽鎖定常領域であり、L1がプロテアーゼ切断部位を含むリンカーである、第1ポリペプチド鎖、ならびに
(ii) 次式：VH1-CH1-L2-VH2-CH1を有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、VH1およびVH2が重鎖可変領域であり、L2がプロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーであり、CH1が第1重鎖定常領域である、第2ポリペプチド鎖、または
(d) (i) 次式：VL1-CL-L1-VH2-CH1を有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、VH2が免疫グロブリン重鎖可変領域であり、VL1が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、CH1が第1重鎖定常領域であり、CLが軽鎖定常領域であり、L1がプロテアーゼ切断可能リンカーである、第1ポリペプチド鎖、ならびに
(ii) 次式：VH1-CH1-L2-VL2-CLを有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、VL2が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、VH1が免疫グロブリン重鎖可変領域であり、L2がプロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーであり、CH1が第1重鎖定常領域であり、CLが軽鎖定常領域である、第2ポリペプチド鎖
のうちの1つを含むタンパク質であって、
VL1およびVH1が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に標的細胞に結合し、VL2およびVH2が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合にエフェクター細胞に結合する、
前記タンパク質。
［１７］
エフェクター細胞がT細胞である、［16］のタンパク質。
［１８］
VH2およびVL2が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に、TCR-CD3複合体の一部であるタンパク質に結合する、［17］のタンパク質。
［１９］
VH2およびVL2がヒトCD3εに結合する、［17］のタンパク質。
［２０］
VH2およびVL2が、それぞれSEQ ID NO: 42、43、および44のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにそれぞれSEQ ID NO: 47、48、および49のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、［19］のタンパク質。
［２１］
VH2およびVL2が、それぞれSEQ ID NO: 40および45のアミノ酸配列を含む、［20］のタンパク質。
［２２］
プロテアーゼ切断部位が、
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からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、［16］〜［21］のいずれかのタンパク質。
［２３］
標的細胞が癌細胞である、［16］〜［22］のいずれかのタンパク質。
［２４］
VH1およびVL1が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に、上皮成長因子受容体 (EGFR)、EGFRvIII、メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン (MCSP)、メソテリン (MSLN)、葉酸受容体1 (FOLR1)、CD33、CDH19、または上皮成長因子2 (HER2) に結合する、［23］のタンパク質。
［２５］
［1］〜［24］のいずれかのタンパク質のいずれかをコードする核酸。
［２６］
［25］の核酸を含有するベクター。
［２７］
［26］の核酸を含有する宿主細胞。
［２８］
［1］〜［24］のいずれかのタンパク質を作製する方法であって、
該タンパク質が発現されるような条件下で、該タンパク質をコードする核酸を含有する宿主細胞を培養する段階、および
培養液または細胞集団から該タンパク質を回収する段階
を含む、前記方法。
［２９］
［1］〜［24］のいずれかのタンパク質の治療有効用量を投与する段階を含む、癌患者を処置するための方法。
［３０］
前記タンパク質の前に、後に、またはそれと同時に、放射線照射、化学療法剤、および／または非化学療法的抗新生物剤を投与する段階をさらに含む、［29］の方法。
［３１］
患者の癌細胞が、プロテアーゼ切断部位を切断し得るプロテアーゼを発現する、［29］または［30］の方法。
［３２］
［1］〜［12］および［16］〜［22］のいずれかのタンパク質の治療有効用量を投与する段階を含む、感染症、線維性疾患、神経変性疾患、または自己免疫疾患もしくは炎症性疾患に罹患している患者を処置するための方法。