(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞培養培地における使用のためのポロキサマーを調製する方法の提供。【解決手段】細胞培養培地における使用のためのポロキサマーを調製する方法であって：（ａ）固体ポロキサマーを少なくとも約６０℃に加熱して液体ポロキサマーを形成するステップと；（ｂ）該液体ポロキサマーを約５０℃未満の温度に冷却して、固体の熱処理されたポロキサマーを形成するステップとを含み、該冷却が、プリル化またはミリング装置において行われず、該ポロキサマーが、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとのコポリマーを含む、方法。【選択図】図１１
2020103290.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養培地における使用のためのポロキサマーを調製する方法であって：
（ａ）固体ポロキサマーを少なくとも約６０℃に加熱して液体ポロキサマーを形成するステップと；
（ｂ）該液体ポロキサマーを約５０℃未満の温度に冷却して、固体の熱処理されたポロキサマーを形成するステップと
を含み、該冷却が、プリル化またはミリング装置において行われず、該ポロキサマーが、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとのコポリマーを含む、方法。
【請求項２】
熱処理されたポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率が、ステップ（ａ）の前のポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率と比較して増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）においてポロキサマーが、約６０℃と約１８５℃との間に加熱される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）においてポロキサマーが、約１５７℃と約１８５℃との間に加熱される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ポロキサマーが、約１５７℃と約１８５℃との間に、少なくとも１分間加熱される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ポロキサマーが、約１５７℃と約１８５℃との間に、１分と約２５０分との間で加熱される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）においてポロキサマーが、約１３４℃と約１５７℃との間に加熱される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
ポロキサマーが、約１３４℃と約１５７℃との間に、少なくとも１分間加熱される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ポロキサマーが、約１３４℃と約１５７℃との間に、１分と約２５０分との間で加熱される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）においてポロキサマーが、約１２０℃と約１３４℃との間に加熱される、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
ポロキサマーが、約１２０℃と約１３４℃との間に、少なくとも約６２分間加熱される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ポロキサマーが、約１２０℃と約１３４℃との間に、約６２分と約２５０分との間で加熱される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）においてポロキサマーが、約１００℃と約１２０℃との間に加熱される、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
ポロキサマーが、約１００℃と約１２０℃との間に、少なくとも約９８分間加熱される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ポロキサマーが、約１００℃と約１２０℃との間に、約９８分と約２５０分との間で加熱される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ａ）においてポロキサマーが、約８０℃と約１００℃との間に加熱される、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
ポロキサマーが、約８０℃と約１００℃との間に、少なくとも約１２２分間加熱される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ポロキサマーが、約８０℃と約１００℃との間に、約１２２分と約２５０分との間で加熱される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）においてポロキサマーが、約６０℃と約８０℃との間に加熱される、請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
ポロキサマーが、約６０℃と約８０℃との間に、少なくとも約１４３分間加熱される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
ポロキサマーが、約６０℃と約８０℃との間に、約１４３分と約２５０分との間で加熱される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
熱処理されたポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率が、ステップ（ａ）の前のポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率と比較して少なくとも１０％だけ増加する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
細胞生存率が、少なくとも約２０％だけ増加する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞生存率が、少なくとも約３０％だけ増加する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ａ）の前のポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率が、約３時間の細胞培養後、約８０％未満である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｂ）における液体ポロキサマーが、周囲温度、約２℃〜約８℃、または０℃未満で冷却される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ポロキサマーが、真空下で加熱される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
液体ポロキサマーが、少なくとも約２０分間冷却される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（ｂ）において生成した熱処理されたポロキサマーが、細胞培養培地に添加される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ａ）及び（ｂ）が、熱処理されたポロキサマーを前記細胞培養培地に添加する前に少なくとも１回繰り返される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
ポロキサマーが、ステップ（ａ）の前にプリル化プロセスによって処理されている、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
ポロキサマーが、ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｍ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎＨの式：式中、ｎが約６０〜約１５０であり、ｍが約２５〜約６０である；を有する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
ポロキサマーが、約５５℃の溶融温度を有する、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ポロキサマーが、約６，０００〜約１８，０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
ポロキサマーが、ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｍ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎＨの式：ｎが約８０の値を有し、ｍが約２７の値を有する；を有するコポリマーを含み、該ポロキサマーが、約７６８０〜約９５１０ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
ポロキサマーが、ポロキサマー１８８である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
細胞が、昆虫細胞である、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
細胞が、ポリペプチドを産生する、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法によって調製されるポロキサマー。
【請求項４２】
請求項４１に記載のポロキサマーを含む細胞培養培地。
【請求項４３】
細胞培地が、熱処理されたポロキサマーを約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌで含む、請求項４２に記載の細胞培養培地。
【請求項４４】
細胞培地が、熱処理されたポロキサマーを約０．１ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌで含む、請求項４３に記載の細胞培養培地。
【請求項４５】
細胞培地が、熱処理されたポロキサマーを約３ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌで含む、請求項４３に記載の細胞培養培地。
【請求項４６】
細胞培養物においてポリペプチドを産生する方法であって、ポリペプチドの産生に好適な条件下で細胞培養培地において該ポリペプチドを産生する細胞を培養するステップを含み、該細胞培養培地が、請求項４１に記載のポロキサマーを含む、方法。
【請求項４７】
細胞が、哺乳動物細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
細胞が、昆虫細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
細胞培地が、熱処理されたポロキサマーを約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌで含む、請求項４６〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
細胞培地が、熱処理されたポロキサマーを約０．１ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌで含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
細胞培地が、熱処理されたポロキサマーを約３ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌで含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項４６〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
細胞培養培地における使用のためのポロキサマーを調製する方法であって：
（ａ）ポロキサマーを約８０℃〜約１００℃に加熱して、液体ポロキサマーを形成するステップと；
（ｂ）該液体ポロキサマーを約５０℃未満の温度に冷却して、固体の熱処理されたポロキサマーを形成するステップと
を含み、該冷却が、プリル化またはミリング装置において行われず；
該ポロキサマーが、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとのコポリマーを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
本願は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年３月２５日に提出された米国仮特許出願第６１／９７０，２８１号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、（例えば、細胞培養培地における使用のための）ポロキサマーを調製する方法、本明細書に記載されているように調製されるポロキサマーを含有する細胞培養培地、及び本明細書に記載されている細胞培養培地を使用して細胞を培養し、ポリペプチドを産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞培養製造技術は、医薬製剤における使用のためのタンパク質系治療薬、例えば抗体の産生に広く使用されている。タンパク質系産生物、例えば抗体産生物の商業的産生は、細胞が多量のタンパク質産生物を産生して製造要求を満たすために、細胞培養パラメータの最適化を必要とする。タンパク質系産生物が工業規模で作製されるとき、タンパク質産生の効率及び原料（例えば、細胞培養培地中の成分）のコストなどの因子が非常に重要である。
【０００４】
ポロキサマーは、工業的なタンパク質産生において広く使用されている細胞培養培地中の成分である。ポロキサマーは、細胞培養培地に添加されて培養細胞の生存率を向上させる。その多くの機能のうちの１つは、界面活性物質として作用して、細胞培養培地における細胞と気泡との間の付着力を低減させ、気泡が破裂したときのダメージから細胞を保護することである。ポロキサマーはまた、細胞膜を強化し、培養物の泡層からの細胞の排出を改善し、また、気泡周波数及び速度を改変する場合もある。
【０００５】
あいにく、ポロキサマー性能の大幅なロット間変動が観察されている。細胞培養培地において使用されるとき、ポロキサマーのロットの不十分な実施は、細胞生存率及び細胞成長速度の低下を引き起こし得る。細胞生存率の低下は、タンパク質産生の低下に至る。培養を工業規模で実施するとき、この産生低下が、重篤な金銭的損失を結果としてもたらし得る。
【０００６】
そのため、特にロットの不十分な実施に関して、ポロキサマー変動を低減させ、かつ、ポロキサマー性能を改善するための簡単で安価な解決策に対する必要性が存在する。
【０００７】
本明細書に列挙されている全ての公開公報、特許及び特許出願は、これらの全体が全ての目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本明細書において提供される発明は、とりわけ、（例えば、細胞培養培地における使用のための）ポロキサマーを調製する方法を開示する。また、本明細書に記載されている方法によって調製されるポロキサマーも開示する。さらに、本明細書に記載されている方法によって調製されるポロキサマーを含有する細胞培養培地組成物を本明細書において開示する。さらに、本明細書に記載されている方法によって調製されるポロキサマーを含有する細胞培養培地においてポリペプチドを産生する細胞を培養することによって、細胞培養物においてポリペプチドを産生する方法を本明細書において開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、一態様において、細胞培養培地における使用のためのポロキサマーを調製する方法であって：（ａ）固体ポロキサマーを少なくとも約６０℃に加熱して液体ポロキサマーを形成するステップと；（ｂ）液体ポロキサマーを約５０℃未満の温度に冷却して、固体の熱処理されたポロキサマーを形成するステップとを含み、冷却が、プリル化またはミリング装置において行われず、ポロキサマーが、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとのコポリマーを含む、上記方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、熱処理されたポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率は、ステップ（ａ）の前のポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率と比較して増加している。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）におけるポロキサマーは、約６０℃と約１８５℃との間に加熱される。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）におけるポロキサマーは、約１５７℃と約１８５℃との間に加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約１５７℃と約１８５℃との間に、少なくとも１分間加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約１５７℃と約１８５℃との間に、１分と約２５０分との間で加熱される。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）におけるポロキサマーは、約１３４℃と約１５７℃との間に加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約１３４℃と約１５７℃との間に、少なくとも１分間加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約１３４℃と約１５７℃との間に、１分と約２５０分との間で加熱される。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）におけるポロキサマーは、約１２０℃と約１３４℃との間に加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約１２０℃と約１３４℃との間に、少なくとも約６２分間加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約１２０℃と約１３４℃との間に、約６２分と約２５０分との間で加熱される。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）におけるポロキサマーは、約１００℃と約１２０℃との間に加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約１００℃と約１２０℃との間に、少なくとも約９８分間加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約１００℃と約１２０℃との間に、約９８分と約２５０分との間で加熱される。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）におけるポロキサマーは、約８０℃と約１００℃との間に加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約８０℃と約１００℃との間に、少なくとも約１２２分間加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約８０℃と約１００℃との間に、約１２２分と約２５０分との間で加熱される。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）におけるポロキサマーは、約６０℃と約８０℃との間に加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約６０℃と約８０℃との間に、少なくとも約１４３分間加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約６０℃と約８０℃との間に、約１４３分と約２５０分との間で加熱される。いくつかの実施形態において、熱処理されたポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率は、ステップ（ａ）の前のポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率と比較して少なくとも１０％だけ増加する。いくつかの実施形態において、該細胞生存率は、少なくとも約２０％だけ増加する。いくつかの実施形態において、該細胞生存率は、少なくとも約３０％だけ増加する。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）の前のポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率は、約３時間の細胞培養後、約８０％未満である。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）における液体ポロキサマーは、周囲温度、約２℃〜約８℃、または０℃未満で冷却される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、真空下で加熱される。いくつかの実施形態において、液体ポロキサマーは、少なくとも約２０分間冷却される。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）において生成された熱処理されたポロキサマーは、細胞培養培地に添加される。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）及び（ｂ）は、熱処理されたポロキサマーを細胞培養培地に添加する前に少なくとも１回繰り返される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、ステップ（ａ）の前にプリル化プロセスによって処理されている。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｍ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎＨの式：式中、ｎが約６０〜約１５０であり、ｍが約２５〜約６０である；を有する。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約５５℃の溶融温度を有する。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約６，０００〜約１８，０００ダルトンの平均分子量を有する。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｍ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎＨの式：ｎが約８０の値を有し、ｍが約２７の値を有する；を有するコポリマーを含み、ポロキサマーは、約７６８０〜約９５１０ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、ポロキサマー１８８である。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、昆虫細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ポリペプチドを産生する。
【００１０】
別の態様において、上記及び本明細書に記載されている方法のいずれかによって調製されるポロキサマーを本明細書において提供する。
【００１１】
さらなる態様において、上記及び本明細書に記載されている方法のいずれかによって調製されるポロキサマーを含む細胞培養培地を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、細胞培地は、熱処理されたポロキサマーを約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌで含む。いくつかの実施形態において、細胞培地は、熱処理されたポロキサマーを約０．１ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌで含む。いくつかの実施形態において、細胞培地は、熱処理されたポロキサマーを約３ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌで含む。
【００１２】
なおさらなる態様において、細胞培養物においてポリペプチドを産生する方法であって、ポリペプチドの産生に好適な条件下で細胞培養培地においてポリペプチドを産生する細胞を培養するステップを含み、細胞培養培地が、上記及び本明細書に記載されている方法のいずれかによって生成されるポロキサマーを含む、上記方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、昆虫細胞である。いくつかの実施形態において、細胞培地は、熱処理されたポロキサマーを約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌで含む。いくつかの実施形態において、細胞培地は、熱処理されたポロキサマーを約０．１ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌで含む。いくつかの実施形態において、細胞培地は、熱処理されたポロキサマーを約３ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌで含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【００１３】
したがって、一態様において、（例えば、細胞培養培地における使用のための）ポロキサマーを調製する方法であって、（ａ）精製されたポロキサマーを約８０℃以上（例えば、約８０℃〜約１００℃）に加熱して液体ポロキサマーを形成するステップと、（ｂ）液体ポロキサマーを約５０℃以下の温度に冷却して固体の熱処理されたポロキサマーを形成するステップとを含み、冷却が、プリル化またはミリング装置において行われない、上記方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとのコポリマーを含む。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｍ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎＨの式：式中、ｎが約６０〜約１５０であり、ｍが約２５〜約６０である；を有する、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとのコポリマーを含む。いくつかの実施形態において、熱処理されたポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率は、ステップ（ａ）の前のポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率と比較して増加している。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、精製されたポロキサマーである。いくつかの実施形態において、精製されたポロキサマーは、別の治療的または薬学的化合物を含有しないポロキサマー組成物である。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）におけるポロキサマーは、別の治療的または薬学的化合物を含有しない。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）におけるポロキサマーは、約８５℃〜約９１℃に加熱される。本明細書におけるいくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約１０〜約１５分加熱される。本明細書におけるいくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）における液体ポロキサマーは、周囲温度、約２℃〜約８℃、または０℃未満で冷却される。本明細書におけるいくつかの実施形態において、液体ポロキサマーは、少なくとも約２０分間冷却される。本明細書におけるいくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）において生成された熱処理されたポロキサマーは、細胞培養培地に添加される。本明細書におけるいくつかの実施形態において、ステップ（ａ）及び（ｂ）は、熱処理されたポロキサマーを細胞培養培地に添加する前に少なくとも１回繰り返される。本明細書におけるいくつかの実施形態において、細胞生存率は、少なくとも約１０％だけ増加する。本明細書におけるいくつかの実施形態において、細胞生存率は、少なくとも約３０％だけ増加する。本明細書におけるいくつかの実施形態において、ステップ（ａ）の前のポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率は、約８０％未満である。本明細書におけるいくつかの実施形態において、ポロキサマーは、ステップ（ａ）の前にプリル化プロセスによって処理されている。本明細書におけるいくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約４５℃〜約６０℃の範囲の溶融温度を有する。本明細書におけるいくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約６，０００〜約１８，０００ダルトンの平均分子量を有する。本明細書におけるいくつかの実施形態において、ポロキサマーは、ポロキサマー１８８である。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｍ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎＨの式：ｎが約８０の値を有し、ｍが約２７の値を有する；を有するコポリマーを含み、ポロキサマーは、約７６８０〜約９５１０ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。本明細書におけるいくつかの実施形態において、ポロキサマーは、ポロキサマー２３７である。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｍ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎＨの式：ｎが、約６４の値を有し、ｍが、約３７の値を有する；を有するコポリマーを含む。本明細書におけるいくつかの実施形態において、ポロキサマーは、ポロキサマー３３８である。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｍ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎＨの式：ｎが、約１４１の値を有し、ｍが、約４４の値を有する；を有するコポリマーを含む。本明細書におけるいくつかの実施形態において、ポロキサマーは、ポロキサマー４０７である。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｍ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎＨの式：ｎが、約１０１の値を有し、ｍが、約５６の値を有する；を有するコポリマーを含む。本明細書におけるいくつかの実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞であってよい。いくつかの実施形態において、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であってよい。本明細書におけるいくつかの実施形態において、細胞は、昆虫細胞であってよい。本明細書におけるいくつかの実施形態において、細胞は、ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合フラグメントである。別の態様において、上記及び本明細書に記載されている方法のいずれかによって生成されるポロキサマーを本明細書において提供する。
【００１４】
別の態様において、上記及び本明細書に記載されている方法のいずれかによって生成されるポロキサマーを含む細胞培養培地を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、細胞培地は、熱処理されたポロキサマーを約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌで含む。いくつかの実施形態において、細胞培地は、熱処理されたポロキサマーを約０．１ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌで含む。いくつかの実施形態において、細胞培地は、熱処理されたポロキサマーを約３ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌで含む。
【００１５】
別の態様において、細胞培養物においてポリペプチドを産生する方法であって、ポリペプチドの産生に好適な条件下で細胞培養培地においてポリペプチドを産生する細胞を培養するステップを含み、上記及び本明細書に記載されている方法のいずれかによって生成されるポロキサマーを含む、上記方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、昆虫細胞である。いくつかの実施形態において、細胞培地は、熱処理されたポロキサマーを約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌで含む。いくつかの実施形態において、細胞培地は、熱処理されたポロキサマーを約０．１ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌで含む。いくつかの実施形態において、細胞培地は、熱処理されたポロキサマーを約３ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌで含む。いくつかの実施形態において、細胞によって産生されるポリペプチドは、抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【００１６】
本明細書に記載されている種々の実施形態の特性の１つ、いくつか、または全てが組み合わされて本発明の他の実施形態を形成してよいことが理解されるべきである。本発明のこれら及び他の態様は、当業者に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ポロキサマーの熱処理が、培養における細胞生存率に及ぼすその効果を改善することを示す。菱形プロットは、平均（中心線）及び上限下限９５％信頼区間（菱形の点）、ならびに各実験条件での細胞生存率の値（ドット）を示す。各実験は、ｘ軸において示されているように、良または不良（「疑」）ポロキサマーロットからの未処理及び熱処理された（ＨＴ）ポロキサマーを比較する。矢印は、不良ロットの熱処理の際の細胞生存率の改善を示す。熱処理により、良ロットの細胞生存率が、およそ８５％の平均値からおよそ９５％の値まで改善されたことにも注意されたい。
【図２】図２は、未処理及び熱処理された（＿ＨＴ）ポロキサマーサンプルＡ、Ｂ、及びＣに関する高剪断振とうフラスコモデル（ＨＳＳＦ）試験における細胞生存率（％）を示す（表２も参照されたい）。
【図３】図３は、オーブンにおいて試験した条件の応答表面設計を示す。各条件を、フォーマット「時間、温度」において標識付ける。「◆」マークが付された条件をＨＳＳＦにおいて試験した。「◇」マークが付された条件をオーブンにおいて準備したが、ＨＳＳＦにおいて試験しなかった。温度（℃）は、オーブンの設定温度を表し、一方で、時間（分）は、ポロキサマーサンプルがオーブン中にあった時間を表す。
【図４】図４は、陽性（「良ロット」）ならびに陰性（「未処理の不良ロット」）対照（それぞれＤ及びＣ）と比較したときの、表示条件下でオーブンにおいて熱処理したＣポロキサマーのサンプルについての細胞生存率（％）の改善（Ｖｆ（処理）−Ｖｆ（未処理））を示す。エラーバーは、１つの標準偏差を表示する。
【図５】図５は、細胞培養におけるポロキサマー性能に及ぼす種々の熱処理条件の効果を調査する完全実験計画法（ＤＯＥ）からの等高線図を示す。ＨＳＳＦ試験における生存率の改善（Ｖｆ（処理）−Ｖｆ（未処理））を、時間及び温度の関数として示す。ドットは、試験したサンプル条件を示す。
【図６】図６は、３つの不良ロット（Ｈ、Ｆ、及びＧ）ならびに表示条件下で熱処理した１つの良ロット（Ｅ）からのポロキサマーサンプルについてのＨＳＳＦ試験における細胞生存率（％）の改善（Ｖｆ（処理）−Ｖｆ（未処理））を示す。
【図７】図７は、低温（６０〜８０℃）で長時間（１２０分）処理した不良ポロキサマーロット（Ｈ及びＧ）についての細胞生存率（％）の改善（Ｖｆ（処理）−Ｖｆ（未処理））の比較を示す。＊ＨＳＳＦモデルは、重複して行う。
【図８】図８は、未処理のものと比較したときの、真空条件下で熱処理したポロキサマーサンプル（Ｈ及びＧ）についてのＨＳＳＦ試験における細胞生存率（％）の改善（Ｖｆ（処理）−Ｖｆ（未処理））を示す。
【図９】図９は、オーブンにおけるポロキサマー材料の加熱及び冷却プロファイルを示す。３つの温度：１４０℃、１５５℃、及び１７０℃を試験した。読み取った温度が一旦安定化し始めたら、材料をオーブンから除去し、室温で冷却した。プロファイルはポロキサマーの融点付近の４０℃で横ばいになった。
【図１０】図１０は、陽性対照（Ｄ）及び未処理の材料と比較した、熱処理された各ポロキサマーロットについてのスチューデントｔ−検定結果を示す。中間の菱形は、各設定データについての９５％信頼区間（上限及び下限点）ならびに平均（中心線）を示す。
【図１１】図１１は、ポロキサマー熱処理条件についての広い動作範囲を示す応答表面及び完全ＤＯＥ実験からのデータに関する等高線図を示す。各実験空間についての細胞生存率（％）の変化を示す。ＨＳＳＦ試験における生存率の改善（Ｖｆ（処理）−Ｖｆ（未処理））を時間及び温度の関数として示す。応答表面データは、目標温度に達するのに必要とされる時間について補正されたインキュベーション時間及び温度を反映している。ドットは、試験したサンプル条件を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本願の発明者らは、ポロキサマーの熱処理が、ポロキサマーが細胞培養において生存率を支持する能力を改善することを実証した。本願におけるデータは、熱処理されたポロキサマーによる細胞培養培地の使用が、熱処理を伴わない細胞培養培地の使用と比較して、細胞生存率を改善することを示す。本発明者らは、異なるポロキサマーロットが、細胞培養培地に添加されたとき、劇的に異なる効果を細胞生存率に及ぼすこと、ならびに、本明細書に記載されている熱処理が、良及び不良の両方のポロキサマーロットについての細胞生存率に及ぼす効果を改善することを実証した。
【００１９】
一態様において、ポロキサマーを加熱し、該ポロキサマーを冷却することによってポロキサマーを調製するための方法であって、冷却が、プリル化またはミリング装置において行われない、上記方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、該方法は、ポロキサマーを約８０℃以上（例えば、約１００℃）に加熱して液体ポロキサマーを形成し、液体ポロキサマーを約５０℃未満の温度に冷却して固体の熱処理されたポロキサマーを形成することによってポロキサマーを調製することを含み、冷却が、プリル化またはミリング装置において行われず、また、ポロキサマーが、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとのコポリマーを含有する。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｍ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎＨの式：式中、ｎが約６０〜約１５０であり、ｍが約２５〜約６０である；を有する、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとのコポリマーを含有する。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、加熱及び冷却プロセス前の固体ポロキサマーである。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、加熱及び冷却プロセスの前の室温での液体ポロキサマーである。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、加熱及び冷却プロセスの前の液体または水溶液に溶解された固体ポロキサマーである。例えば、本明細書において提供される方法は、細胞培養物または細胞培養培地における使用のためのポロキサマーを調製するのに使用されてよい。
【００２０】
別の態様において、熱処理されたポロキサマーを含む、細胞培養のための組成物を本明細書において提供する。別の態様において、細胞培養培地に熱処理されたポロキサマーを含有する、細胞培養のための組成物を本明細書において提供する。
【００２１】
別の態様において、ポリペプチドの産生に好適な条件下で、熱処理されたポロキサマーを含有する細胞培養培地においてポリペプチドを産生する細胞を培養することによって、細胞培養物においてポリペプチドを産生するための方法を本明細書において提供する。
【００２２】
Ｉ．定義
本発明を詳細に記載する前に、本発明が、当然ながら変動し得る特定の組成物または生体系に限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書において使用されている用語が、特定の実施形態のみを記載する目的であること、及び限定的でないことも理解されるべきである。
【００２３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されているとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に示していない限り、複数形を含む。そのため、例えば、「１つの分子」に対する言及は、２以上のかかる分子の組み合わせなどを場合により含む。
【００２４】
用語「約（およそ）」は、本明細書において使用されているとき、本技術分野において当業者に容易に知られる各値の通常の誤差範囲を称する。本明細書において「約（およそ）」が付された値またはパラメータに対する言及は、当該値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（及び記載する）。
【００２５】
本明細書に記載されている本発明の態様及び実施形態は、態様及び実施形態を「含む」、態様及び実施形態「からなる」、ならびに態様及び実施形態「から本質的になる」と理解される。
【００２６】
用語「ポロキサマー」は、ポリオキシエチレン（用語「エチレンオキシド」が本明細書において互換的に使用されてよい）の２つの鎖の側に配置されているポリオキシプロピレン（用語「プロピレンオキシド」が本明細書において互換的に使用されてよい）の鎖からできているブロックコポリマーを称する。ポロキサマーは、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）（ＢＡＳＦ）、ＫＯＬＬＩＰＨＯＲ（登録商標）（ＢＡＳＦ）、ＬＵＴＲＯＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ）、及びＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ（登録商標）（Ｃｒｏｄａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を含めた商品名で販売されていてよい。具体的なポロキサマー種が特定されていない限り、「ポロキサマー」に対する言及は、複数のポロキサマー種を総称してよい。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、精製されたポロキサマーである。用語「精製されたポロキサマー」は、他の化合物を実質的に含まないポロキサマー組成物を称する。精製されたポロキサマーは、例えば、技術グレードまたはそれより高いグレードの市販のポロキサマーを含んでいてよい。技術グレードまたはそれより高いグレードの例は、技術グレード、精製グレード、Ｎ．Ｆ．グレード（ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ）、Ｕ．Ｓ．Ｐ．グレード（ＵＳ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）、試薬グレード、及びＡ．Ｃ．Ｓ．グレード（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）を含んでいてよい。精製されたポロキサマーは、別の化合物と混合されていないものを称する。例えば、精製されたポロキサマーは、例えば製剤の一部としての治療的または薬学的化合物と混合されていないものを称してよい。いくつかの実施形態において、精製されたポロキサマーは、ポロキサマー合成プロセスまたは反応を通して生じた未反応の反応体、触媒または他の生成物を実質的に含まない、またはこれらと混合されていないものである。
【００２８】
用語「熱処理されたポロキサマー」は、本明細書において提供される方法によって少なくとも１回熱処理されたポロキサマーを称する。
【００２９】
用語「培地」及び「細胞培養培地」は、細胞を成長させるまたは維持するのに使用される栄養源を称する。当業者に理解されているように、栄養源は、成長及び／若しくは生存のために細胞に必要とされる成分を含有していてよく、または、細胞成長及び／若しくは生存を補助する成分を含有していてよい。ビタミン、必須または非必須アミノ酸、微量元素、及び界面活性物質（例えば、ポロキサマー）は、培地成分の例である。本明細書において提供されるいずれの培地にも、インスリン、植物加水分解物及び動物加水分解物のうちいずれか１つ以上が補充されていてもよい。
【００３０】
細胞を「培養する」とは、細胞の生存率及び／または成長及び／または増殖に好適な条件下で細胞を細胞培養培地と接触させることを称する。
【００３１】
「回分培養」は、細胞培養のための全ての成分（細胞ならびに全ての培養栄養物及び成分を含む）が培養プロセスの開始時に培養器に供給される培養を称する。
【００３２】
句「流加回分細胞培養」は、本明細書において使用されているとき、細胞及び培養培地が最初に培養器に供給され、さらなる培養栄養物が、培養の終了前の周期的な細胞及び／若しくは産生物の収穫を伴いまたは伴わずに、培養プロセスの際に培養物に連続的にまたは別々の増分で付与される回分培養を称する。
【００３３】
「灌流培養」は、細胞が、例えば、ろ過、カプセル封入、マイクロキャリアへの固着などによって培養物に拘束され、培養培地が連続的にまたは間欠的に培養器に導入されまたはこれから除去される培養である。
【００３４】
「培養器」は、細胞を培養するのに使用される容器を称する。培養器は、細胞の培養に有用である限り、いずれのサイズであることもできる。
【００３５】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、あらゆる長さのアミノ酸のポリマーを称するのに本明細書において互換的に使用される。ポリマーは線状であっても分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでいてよく、非アミノ酸によって中断されていてよい。該用語はまた、天然でまたは介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または他のいずれかのマニピュレーション若しくは修飾、例えば、標識化成分とのコンジュゲーション；によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。また、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１以上のアナログを含有するポリペプチド、ならびに当該分野において公知の他の修飾物も定義に含まれる。本明細書における定義内に包含されるポリペプチドの例として、哺乳動物タンパク質、例えば、レニンなど；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含めた成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、及びフォンヴィルブラント因子；抗凝固因子、例えばタンパク質Ｃ；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性物質；プラスミノーゲンアクチベーター、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿若しくは組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−α及びβ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化正常Ｔ細胞発現及び分泌時の調節）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；Ｍｕｅｌｌｅｒｉａｎ−阻害性物質；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、β−ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔ−リンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ−４；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子の受容体；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、若しくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、若しくはＮＴ−６）、または神経成長因子、例えばＮＧＦ−ｂ；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；繊維芽細胞成長因子、例えばａＦＧＦ及びｂＦＧＦ；表皮成長因子（ＥＧＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含む）；インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＣＤ２０；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−β、及び−ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ��ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの部分など；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えばＣＡ１２５（卵巣がん抗原）またはＨＥＲ２、ＨＥＲ３若しくはＨＥＲ４受容体；イムノアドヘシン；ならびに上記に列挙したあらゆるタンパク質のフラグメント及び／または変異体、ならびに、例えば、上記に列挙したあらゆるタンパク質を含めたタンパク質に結合する抗体フラグメントを含めた抗体が挙げられる。
【００３６】
用語「力価」は、本明細書において使用されているとき、所与の培地体積量によって除算された、細胞培養によって産生された組み換え発現抗体の合計量を称する。力価は、培地１ｍＬ当たりの抗体のｍｇ単位で典型的には表される。力価は、相対測定の観点で、例えば、異なる培養条件下でタンパク質産生物を得るときと比較したときの力価の百分率増加で表されまたは評価され得る。
【００３７】
用語「抗体」は、本明細書において、非常に広範な意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメントをカバーする。抗体は、ヒト、ヒト化、及び／または親和成熟であり得る。
【００３８】
用語「全長抗体」、「無傷抗体」及び「全抗体」は、以下に定義されているように、抗体フラグメントではなく、実質的に無傷の形態の抗体を称するのに、本明細書において互換的に使用される。該用語は、Ｆｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を特に称する。
【００３９】
「抗体フラグメント」は、無傷抗体の部分を含み、その抗原結合領域（用語「抗原結合フラグメント」が互換的に使用されてよい）を好ましくは含む。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多特異性抗体が挙げられる。
【００４０】
ＩＩ．ポロキサマーを調製する方法
例えば、細胞培養培地における使用のためのポロキサマーを調製する方法を本明細書において提供する。
【００４１】
加熱
いくつかの態様において、本明細書において提供される、細胞培養培地における使用のためのポロキサマーを調製する方法は、ポロキサマー（例えば、精製されたポロキサマー）を加熱して、液体ポロキサマーを形成することを含む。例えば、固相における精製されたポロキサマーは、加熱されて溶融することにより、液体ポロキサマーを形成してよい。ポロキサマーが加熱される温度は、使用される具体的なポロキサマー種の溶融温度に基づいて調整されてよい。いくつかの実施形態において、精製されたポロキサマーは、約４５℃〜約６０℃の範囲の溶融温度を有する。いくつかの実施形態において、精製されたポロキサマーは、約５０℃〜約５５℃の範囲の溶融温度を有する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される、細胞培養培地における使用のためのポロキサマーを調製する方法は、固体ポロキサマーを少なくとも約６０℃に加熱して液体ポロキサマーを形成することと、液体ポロキサマーを約５０℃未満の温度に冷却して固体の熱処理されたポロキサマーを形成することとを含み、ここで、冷却が、プリル化またはミリング装置において行われず、ポロキサマーが、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとのコポリマーを含む。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、精製されたポロキサマーである。いくつかの実施形態において、精製されたポロキサマーは、別の治療的または薬学的化合物を含有しないポロキサマー組成物である。
【００４３】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー（例えば、精製されたポロキサマー）は、以下の温度（℃）：６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、または１８５；の少なくともおよそいずれかに加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマー（例えば、精製されたポロキサマー）は、少なくとも１分間加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、少なくとも約１分、少なくとも約２分、少なくとも約３分、少なくとも約４分、少なくとも約５分、少なくとも約６分、少なくとも約７分、少なくとも約８分、少なくとも約９分、少なくとも約１０分、少なくとも約１５分、少なくとも約２０分、少なくとも約２５分、少なくとも約３０分、少なくとも約３５分、少なくとも約４０分、少なくとも約４５分、少なくとも約５０分、少なくとも約５５分、少なくとも約６０分、少なくとも約６５分、少なくとも約７０分、少なくとも約７５分、少なくとも約８０分、少なくとも約８５分、少なくとも約９０分、少なくとも約１００分、少なくとも約１１０分、少なくとも約１２０分、少なくとも約１３０分、少なくとも約１４０分、少なくとも約１５０分、少なくとも約１６０分、少なくとも約１７０分、少なくとも約１８０分、少なくとも約１９０分、少なくとも約２００分、少なくとも約２１０分、少なくとも約２２０分、少なくとも約２３０分、または少なくとも約２４０分間加熱される。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー（例えば、精製されたポロキサマー）は、約６０℃と約１８５℃との間に加熱される。本明細書に記載されているいずれの温度範囲も、別途明確に記述されていない限り、包含的であることを意味することに注意されるべきである。例えば、約６０℃と約１８５℃との間の温度範囲は、約６０℃及び約１８５℃を該範囲内にあるとして含む。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、以下の温度（℃）：１８５、１８０、１７５、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、または６５；のおよそいずれか未満の温度に加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、以下の温度（℃）：６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、または１８０；のおよそいずれかを超える温度に加熱される。すなわち、ポロキサマーは、下限値が上限値未満である、１８５、１８０、１７５、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、または６５の上限値と、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、または１８０の独立して選択される下限値とを有する温度範囲における温度に加熱されてよい。いくつかの実施形態において、ポロキサマー（例えば、精製されたポロキサマー）は、約６０℃と約１８５℃との間に、少なくとも１分間加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、少なくとも約１分、少なくとも約２分、少なくとも約３分、少なくとも約４分、少なくとも約５分、少なくとも約６分、少なくとも約７分、少なくとも約８分、少なくとも約９分、少なくとも約１０分、少なくとも約１５分、少なくとも約２０分、少なくとも約２５分、少なくとも約３０分、少なくとも約３５分、少なくとも約４０分、少なくとも約４５分、少なくとも約５０分、少なくとも約５５分、少なくとも約６０分、少なくとも約６５分、少なくとも約７０分、少なくとも約７５分、少なくとも約８０分、少なくとも約８５分、少なくとも約９０分、少なくとも約１００分、少なくとも約１１０分、少なくとも約１２０分、少なくとも約１３０分、少なくとも約１４０分、少なくとも約１５０分、少なくとも約１６０分、少なくとも約１７０分、少なくとも約１８０分、少なくとも約１９０分、少なくとも約２００分、少なくとも約２１０分、少なくとも約２２０分、少なくとも約２３０分、または少なくとも約２４０分間加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約６０℃と約１８５℃との間に、約１分と約２５０分との間で加熱される。本明細書に記載されているいずれの時間範囲も、別途明確に記述されていない限り、包含的であることを意味することに注意されるべきである。例えば、約１分と約２５０分との間の時間範囲は、約１分及び約２５０分を該範囲内にあるとして含む。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、以下の時間（分）：２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２；のおよそいずれか未満の間加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、以下の時間（分）：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、または２４０；のおよそいずれかを超える間加熱される。すなわち、ポロキサマーは、下限値が上限値未満である、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２の上限値と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、または２４００の独立して選択される下限値とを有する時間範囲の時間で加熱されてよい。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー（例えば、精製されたポロキサマー）は、約１５７℃と約１８５℃との間に加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、以下の温度（℃）：１８５、１８０、１７５、１７０、１６５、または１６０；のおよそいずれか未満の温度に加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、以下の温度（℃）：１５７、１６０、１６５、１７０、１７５、または１８０；のおよそいずれかを超える温度に加熱される。すなわち、ポロキサマーは、下限値が上限値未満である、１８５、１８０、１７５、１７０、１６５、または１６０の上限値と、１５７、１６０、１６５、１７０、１７５、または１８０の独立して選択される下限値とを有する温度範囲の温度に加熱されてよい。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約１５７℃と約１８５℃との間に、少なくとも約１分、少なくとも約２分、少なくとも約３分、少なくとも約４分、少なくとも約５分、少なくとも約６分、少なくとも約７分、少なくとも約８分、少なくとも約９分、少なくとも約１０分、少なくとも約１５分、少なくとも約２０分、少なくとも約２５分、少なくとも約３０分、少なくとも約３５分、少なくとも約４０分、少なくとも約４５分、少なくとも約５０分、少なくとも約５５分、少なくとも約６０分、少なくとも約６５分、少なくとも約７０分、少なくとも約７５分、少なくとも約８０分、少なくとも約８５分、少なくとも約９０分、少なくとも約１００分、少なくとも約１１０分、少なくとも約１２０分、少なくとも約１３０分、少なくとも約１４０分、少なくとも約１５０分、少なくとも約１６０分、少なくとも約１７０分、少なくとも約１８０分、少なくとも約１９０分、少なくとも約２００分、少なくとも約２１０分、少なくとも約２２０分、少なくとも約２３０分、または少なくとも約２４０分間加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約１５７℃と約１８５℃との間に、２５０分以下の間加熱される。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー（例えば、精製されたポロキサマー）は、約１３４℃と約１５７℃との間に加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、以下の温度（℃）：１５７、１５５、１５０、１４５、１４０、または１３５；のおよそいずれか未満の温度に加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、以下の温度（℃）：１３４、１３５、１４０、１４５、１５０、または１５５；のおよそいずれかを超える温度に加熱される。すなわち、ポロキサマーは、下限値が上限値未満である、１５７、１５５、１５０、１４５、１４０、または１３５の上限値と、１３４、１３５、１４０、１４５、１５０、または１５５の独立して選択される下限値とを有する温度範囲の温度に加熱されてよい。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約１３４℃と約１５７℃との間に、少なくとも約１分、少なくとも約２分、少なくとも約３分、少なくとも約４分、少なくとも約５分、少なくとも約６分、少なくとも約７分、少なくとも約８分、少なくとも約９分、少なくとも約１０分、少なくとも約１５分、少なくとも約２０分、少なくとも約２５分、少なくとも約３０分、少なくとも約３５分、少なくとも約４０分、少なくとも約４５分、少なくとも約５０分、少なくとも約５５分、少なくとも約６０分、少なくとも約６５分、少なくとも約７０分、少なくとも約７５分、少なくとも約８０分、少なくとも約８５分、少なくとも約９０分、少なくとも約１００分、少なくとも約１１０分、少なくとも約１２０分、少なくとも約１３０分、少なくとも約１４０分、少なくとも約１５０分、少なくとも約１６０分、少なくとも約１７０分、少なくとも約１８０分、少なくとも約１９０分、少なくとも約２００分、少なくとも約２１０分、少なくとも約２２０分、少なくとも約２３０分、または少なくとも約２４０分間加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約１３４℃と約１５７℃との間に、２５０分以下の間加熱される。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー（例えば、精製されたポロキサマー）は、約１２０℃と約１３４℃との間に加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、以下の温度（℃）：１３４、１３０、または１２５；のおよそいずれか未満の温度に加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、以下の温度（℃）：１２０、１２５、または１３０；のおよそいずれかを超える温度に加熱される。すなわち、ポロキサマーは、下限値が上限値未満である、１３４、１３０、または１２５の上限値と、１２０、１２５、または１３０の独立して選択される下限値とを有する温度範囲の温度に加熱されてよい。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約１２０℃と約１３４℃との間に、少なくとも約２０分、少なくとも約３０分、少なくとも約４０分、少なくとも約５０分、または少なくとも約６０分間加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約１２０℃と約１３４℃との間に、少なくとも約６２分、少なくとも約６５分、少なくとも約７０分、少なくとも約７５分、少なくとも約８０分、少なくとも約８５分、少なくとも約９０分、少なくとも約１００分、少なくとも約１１０分、少なくとも約１２０分、少なくとも約１３０分、少なくとも約１４０分、少なくとも約１５０分、少なくとも約１６０分、少なくとも約１７０分、少なくとも約１８０分、少なくとも約１９０分、少なくとも約２００分、少なくとも約２１０分、少なくとも約２２０分、少なくとも約２３０分、または少なくとも約２４０分間加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約１２０℃と約１３４℃との間に、２５０分以下の間加熱される。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー（例えば、精製されたポロキサマー）は、約１００℃と約１２０℃との間に加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、以下の温度（℃）：１２０、１１５、１１０、または１０５；のおよそいずれか未満の温度に加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、以下の温度（℃）：１００、１０５、１１０、または１１５；のおよそいずれかを超える温度に加熱される。すなわち、ポロキサマーは、下限値が上限値未満である、１２０、１１５、１１０、または１０５の上限値と、１００、１０５、１１０、または１１５の独立して選択される下限値とを有する温度範囲の温度に加熱されてよい。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約１００℃と約１２０℃との間に、少なくとも約２０分、少なくとも約３０分、少なくとも約４０分、少なくとも約５０分、または少なくとも約６０分、少なくとも約７０分、少なくとも約８０分、または少なくとも約９０分間加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約１００℃と約１２０℃との間に、少なくとも約９８分、少なくとも約１００分、少なくとも約１１０分、少なくとも約１２０分、少なくとも約１３０分、少なくとも約１４０分、少なくとも約１５０分、少なくとも約１６０分、少なくとも約１７０分、少なくとも約１８０分、少なくとも約１９０分、少なくとも約２００分、少なくとも約２１０分、少なくとも約２２０分、少なくとも約２３０分、または少なくとも約２４０分間加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約１００℃と約１２０℃との間に２５０分以下の間加熱される。
【００４９】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー（例えば、精製されたポロキサマー）は、約８０℃と約１００℃との間に加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、以下の温度（℃）：１００、９５、９０、または８５；のおよそいずれか未満の温度に加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、以下の温度（℃）：８０、８５、９０、または９５；のおよそいずれかを超える温度に加熱される。すなわち、ポロキサマーは、下限値が上限値未満である、１００、９５、９０、または８５の上限値と、８０、８５、９０、または９５の独立して選択される下限値とを有する温度範囲の温度に加熱されてよい。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約８０℃と約１００℃との間に、少なくとも約２０分、少なくとも約３０分、少なくとも約４０分、少なくとも約５０分、または少なくとも約６０分、少なくとも約７０分、少なくとも約８０分、または少なくとも約９０分、少なくとも約１００分、少なくとも約１１０分、または少なくとも約１２０分間加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約８０℃と約１００℃との間に、少なくとも約１２２分、少なくとも約１３０分、少なくとも約１４０分、少なくとも約１５０分、少なくとも約１６０分、少なくとも約１７０分、少なくとも約１８０分、少なくとも約１９０分、少なくとも約２００分、少なくとも約２１０分、少なくとも約２２０分、少なくとも約２３０分、または少なくとも約２４０分間加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約８０℃と約１００℃との間に、２５０分以下の間加熱される。
【００５０】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー（例えば、精製されたポロキサマー）は、約６０℃と約８０℃との間に加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、以下の温度（℃）：８０、７５、７０、または６５；のおよそいずれか未満の温度に加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、以下の温度（℃）：６０、６５、７０、または７５；のおよそいずれかを超える温度に加熱される。すなわち、ポロキサマーは、下限値が上限値未満である、８０、７５、７０、または６５の上限値と、６０、６５、７０、または７５の独立して選択される下限値とを有する温度範囲の温度に加熱されてよい。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約６０℃と約８０℃との間に、少なくとも約２０分、少なくとも約３０分、少なくとも約４０分、少なくとも約５０分、または少なくとも約６０分、少なくとも約７０分、少なくとも約８０分、または少なくとも約９０分、少なくとも約１００分、少なくとも約１１０分、少なくとも約１２０分、少なくとも１３０分、または少なくとも１４０分間加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約６０℃と約８０℃との間に、少なくとも約１４３分、少なくとも約１５０分、少なくとも約１６０分、少なくとも約１７０分、少なくとも約１８０分、少なくとも約１９０分、少なくとも約２００分、少なくとも約２１０分、少なくとも約２２０分、少なくとも約２３０分、または少なくとも約２４０分間加熱される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約６０℃と約８０℃との間に、２５０分以下の間加熱される。
【００５１】
いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、真空下で加熱される。例えば、ポロキサマーは、真空適用下、真空オーブンにおいて加熱されてよい。以下に記載されているように、真空適用下、本明細書に記載されている温度でポロキサマーを加熱することにより、ポロキサマー性能を結果として改善することが予想外に見出された（例えば、実施例７を参照されたい）。別の言い方をすれば、加熱の際にポロキサマーに真空を適用することで、例えば細胞培養における後のポロキサマー性能に及ぼす、加熱による有益な効果が無効とならない。
【００５２】
他の実施形態において、ある期間ポロキサマーを目標温度に加熱することは、ポロキサマーが特定の温度にある間の時間を称してよい。すなわち、時間＝０は、ポロキサマーが目標温度に達する時間を示してよい。例えば、ポロキサマーを１４０℃に５分間加熱することは、１４０℃の温度に達した後にポロキサマーを５分間加熱することを示してよい。例えば、ポロキサマー（例えば、精製されたポロキサマー）を約６０℃と約１８５℃との間に、少なくとも１分間加熱することは、ポロキサマーが目標温度（例えば、約６０℃と約１８５℃との間）に少なくとも１分間達していることを示す。
【００５３】
いくつかの実施形態において、加熱プロセスの際の精製されたポロキサマーの温度は、約１２０℃を超えない。いくつかの実施形態において、精製されたポロキサマーは、加熱プロセスの前に液体または水溶液に溶解されてよい。いくつかの実施形態において、液体または水溶液に溶解された、精製されたポロキサマーは、固体ポロキサマーに使用されるよりも高い温度に加熱されてよい。いくつかの実施形態において、精製されたポロキサマーは、加熱プロセスの前に固体ポロキサマーである。いくつかの実施形態において、精製されたポロキサマーは、加熱プロセスの前に室温で液体ポロキサマーである。
【００５４】
いくつかの実施形態において、精製されたポロキサマーは、約８０℃〜約１００℃の温度に加熱される。いくつかの実施形態において、精製されたポロキサマーは、約８５℃〜約９１℃の温度に加熱される。いくつかの実施形態において、精製されたポロキサマーは、以下の温度（℃）：１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、または８１；のおよそいずれか未満の温度に加熱される。いくつかの実施形態において、精製されたポロキサマーは、以下の温度（℃）：８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９；のおよそいずれかを超える温度に加熱される。すなわち、精製されたポロキサマーは、下限値が上限値未満である、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、または８１の上限値と、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９の独立して選択される下限値とを有する温度範囲の温度に加熱されてよい。いくつかの実施形態において、精製されたポロキサマーは、約１２０℃未満の温度に加熱される。いくつかの実施形態において、精製されたポロキサマーは、１０１℃、１０２℃、１０３℃、１０４℃、１０５℃、１０６℃、１０７℃、１０８℃、１０９℃、１１０℃、１１１℃、１１２℃、１１３℃、１１４℃、１１５℃、１１６℃、１１７℃、１１８℃、及び１１９℃のおよそいずれか未満の温度に加熱される。
【００５５】
精製されたポロキサマーは、いずれの所望の期間加熱されてもよい。いくつかの実施形態において、精製されたポロキサマーは、約１０〜約１５分間加熱される。加熱時間は、熱がポロキサマーに適用されている間の合計時間を称してよく、そのため、加熱時間は、ポロキサマーが所望の温度に達している間の時間に限定されない。いくつかの実施形態において、精製されたポロキサマーは、約１０と約１５分との間の合計時間量で加熱され、該加熱は、ポロキサマーが、所望の最高温度、例えば、約８０℃〜約１００℃に達したときに停止される。
【００５６】
当該分野において公知のいずれの好適な加熱装置が、精製されたポロキサマーの加熱に使用されてもよい。非限定例として、固体ポロキサマーは、標準の実験室用加熱プレート（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）、またはＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）によって販売されている撹拌ホットプレート）において加熱されるガラス容器（例えば、ＰＹＲＥＸ（登録商標）ビーカー、フラスコ、または他の開放容器）において加熱されてよい。代替的には、ポロキサマーは、真空オーブンにおいて加熱されてよい。
【００５７】
当該分野において公知のいずれの好適な温度測定ツールが、熱処理の間／後のポロキサマーの温度の測定に使用されてもよい、ただし、温度測定ツールが、（例えば、製造業者の使用説明書にしたがって）ポロキサマー温度の正確な測定がなされるように使用されることを条件とする。好適な温度測定ツールの非限定例として、限定されることなく、温度計（例えば、ガラス内液式温度計）、熱電対（例えば、以下に記載されている）、抵抗温度検出器（ＲＴＤ）、及び／またはサーミスタが挙げられる。いくつかの実施形態において、温度測定ツールは、加熱に使用される機器に固有のものであってよい。
【００５８】
冷却
いくつかの態様において、本明細書に記載されている細胞培養培地における使用のためのポロキサマーを調製する方法は、加熱された、精製されたポロキサマーを冷却して、固体の熱処理されたポロキサマーを形成することを含む。いくつかの実施形態において、液体ポロキサマーは、約５０℃未満の温度に冷却される。液体ポロキサマーが冷却される温度は、その凍結温度未満のいずれの温度であってもよく、使用される具体的なポロキサマーに応じて変動してよい。例えば、ポロキサマー１８８は、約５２℃の凍結温度を有し、そのため、このポロキサマーは、約５２℃未満のいずれの温度に冷却されて固体の熱処理されたポロキサマーを形成してもよい。
【００５９】
加熱された液体ポロキサマーは、ポロキサマーが凍結するのに十分ないずれの温度に冷却されてもよい。いくつかの実施形態において、加熱された液体ポロキサマーは、周囲温度で冷却される。いくつかの実施形態において、加熱された液体ポロキサマーは、約２℃〜約８℃で冷却される。いくつかの実施形態において、加熱された液体ポロキサマーは、約０℃未満、例えば、約−２０℃または約−７０℃で冷却される。
【００６０】
加熱された液体ポロキサマーは、加熱された液体ポロキサマーが上記冷却温度で凍結するのに十分ないずれの所望の継続時間にわたって冷却されてもよい。いくつかの実施形態において、液体ポロキサマーは、約２０分間冷却される。冷却時間は、ポロキサマーが加熱された温度及び／または冷却温度に依存してよい。冷却温度及び時間は、（所与の温度に所与の時間量で加熱された）液体ポロキサマーが特定の冷却温度で凍結するのに要する時間を観察することによって実験的に求められてよい。
【００６１】
プリル化またはミリング装置を除く、当該分野において公知のいずれの好適な冷却装置が、加熱された液体ポロキサマーを冷却するのに使用されてもよい。例えば、加熱された液体ポロキサマーは、上記に記載されている十分な冷却温度で維持された冷蔵室、冷凍室、または低温室に置かれてよい。代替的には、特定の冷却装置が使用されなくてもよいが、代わりに、加熱された液体ポロキサマーは、加熱装置が止められたまたは加熱を停止するようにプログラミングされた後に該装置において冷却されてよい。この場合、加熱された液体ポロキサマーは、周囲温度で冷却させる。例えば、ポロキサマーがホットプレートにおいて加熱されるとき、加熱された液体ポロキサマーは、ホットプレートの加熱機能が止められた後にホットプレートに放置されることによって簡単に冷却されてよい。代替的には、ポロキサマーは、真空オーブンにおいて冷却されてよい。いくつかの実施形態において、加熱された液体ポロキサマーを冷却することは、液体窒素を使用することを含まない。いくつかの実施形態において、加熱された液体ポロキサマーを冷却することは、加熱された液体ポロキサマーを、特定の温度で維持された気体によってスプレーまたは噴霧することを含まない。いくつかの実施形態において、加熱された液体ポロキサマーを冷却することは、ポロキサマーを特定のまたは均一なサイズ及び／または形状の粒子または微粒子に成形することを含まない。
【００６２】
プリル化／ミリング
いくつかの実施形態において、冷却は、プリル化またはミリング装置において行われない。ポロキサマーは、特定の均一なポロキサマー粒子径及び／または形状を得るためのプリル化またはミリングによって当該分野において調製されていた（ポロキサマーのプリル化及びミリングを記載している例については、欧州特許ＥＰ１６６１５５８Ｂ１号または米国特許第７，８８７，８４４号を参照されたい）。ポロキサマーのプリル化は、液体ポロキサマーを噴霧器に通して液体ポロキサマー粒子を作り出すこと、及びこれらの粒子を冷却培地、例えば、特定の温度で維持された気体、または液体窒素において冷却することを含む。冷却培地の温度は、ポロキサマー粒子の最終的なサイズ及び形状に影響する、ポロキサマーの凍結速度を決定すると考えられる。プリル化装置の例は、限定されることなく、プリル化塔を含んでよい。プリル化塔において、噴霧されたポロキサマーは、塔の頂部から放出され、気体または液体冷却培地（例えば、周囲空気、特定の温度で維持された空気、または液体窒素）を通して落下しながら、凍結して粒子となる。
【００６３】
ポロキサマーのミリング（またはマイクロミリング）は、ある一定のサイズのポロキサマー粒子が生成されるまで、固体ポロキサマーを粉砕すること、またはノズルを通して高圧によって固体ポロキサマーを押し進めることを含む。ミリングが熱を生じる場合があり、また、ポロキサマーが比較的低い溶融温度を有するため、ポロキサマーは、多くの場合、例えば、冷却された空気または液体窒素によって冷やすことによって、ミリングプロセスの際に冷却されて、固相を維持する。ポロキサマーは、ミリングの前に冷却されてもよく、ポロキサマーが溶融するのに十分な期間にわたってミリングされてもよい。ミリング装置の例は、限定されることなく、空気ジェットミル、ボールミル、及び冷凍室ミル（例えば、ＳＰＥＸ  ＳａｍｐｌｅＰｒｅｐ（登録商標）Ｆｒｅｅｚｅｒ／Ｍｉｌｌ（登録商標））を含んでよい。
【００６４】
プリル化及びミリングは、例えば、製剤化の一部としての、ポロキサマーの粒子径及び形状に関する厳格な基準を必要とするプロセスに有用である。ポロキサマーは、溶解性を援助しかつ薬剤放出に影響する、製剤中の成分として当該分野において公知である。これらの製剤において、ポロキサマー粒子は、製剤の所望の薬物速度論的特性を付与しかつ厳密な薬物安全性及び再現性基準を忠実に守るために、基準の特徴を維持しなければならない。本明細書に記載されている方法は、ポロキサマーに関するかかる厳密または正確な基準を必要とせず、そのため、これらのプリル化またはミリング方法が使用されないことに注意されたい。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、本明細書に記載されているように加熱される前にプリル化プロセスによって処理されている。細胞培養における使用のための多くの市販のポロキサマー（例えば、ＢＡＳＦ（登録商標）によって販売されているＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８  ＮＦ  Ｐｒｉｌｌポロキサマー１８８）は、製造の際にプリル化またはマイクロプリル化プロセスを経ている。本明細書に記載されている方法に含まれる加熱及び冷却ステップは、プリル化を含まない。むしろ、これらのステップは、既にプリル化またはマイクロプリル化されているポロキサマーに適用されてよい。本開示の発見では、細胞培養における市販のポロキサマー（例えば、プリル化またはマイクロプリル化されたポロキサマー）の性能が、本明細書に記載されているような加熱及び冷却によって改善されてよい。
【００６６】
いくつかの態様において、本明細書に記載されている、細胞培養培地における使用のためのポロキサマーを調製する方法は、熱処理されたポロキサマーを細胞培養培地内に添加することを含む。加熱及び冷却後、固体の熱処理されたポロキサマーは、当該分野において公知のいずれの方法によって細胞培養培地に溶解されてもよい。例えば、ポロキサマーが開放ガラス容器において加熱及び冷却されるとき、得られる固体の熱処理されたポロキサマーは、細胞培養培地に添加する適量（重量基準）で簡単に擦られまたは薄片化されてよい。熱処理されたポロキサマーは、直ちに細胞培養培地に添加されてよく、または、後の時間（例えば、熱処理後、約１日超、約１ヶ月超、若しくは約１年超）において細胞培養培地に保存及び添加されてよい。
【００６７】
いくつかの実施形態において、上記に記載されている加熱及び冷却ステップは、それぞれ、熱処理されたポロキサマーを細胞培養培地内に添加する前に一旦実施される。いくつかの実施形態において、上記に記載されている加熱及び冷却ステップは、熱処理されたポロキサマーを細胞培養培地に添加する前に少なくとも１回繰り返される。
【００６８】
ＩＩＩ．ポロキサマー及びポロキサマーの特性
ポロキサマーを調製するための方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、該方法によって生成されるポロキサマーは、細胞培養培地における使用のためのものである。
【００６９】
用語「ポロキサマー」は、多くの異なった化合物を包含してよい、なぜなら、ポリオキシプロピレン及びポリオキシエチレン鎖について異なる長さが組み合わせて使用されてよいからである。ポロキサマーに存在するポリオキシプロピレン及びポリオキシエチレン鎖の特定の組み合わせは、特定の化学的及び／または生物物理的特性を生じさせる場合がある。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｍ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎＨの化学式を有する。いくつかの実施形態において、ｎ（すなわち、ポリオキシエチレン鎖長）は、約６０〜約１５０の値を有する。いくつかの実施形態において、ｍ（すなわち、ポリオキシプロピレン鎖長）は、約２５〜約６０の値を有する。
【００７０】
ポロキサマーは、多くの場合、ポリオキシエチレン分の概算の分子量及び百分率を表記する数体系によって記載される。これらの値は、組成物における各ポロキサマー分子の絶対値よりもむしろ、ポロキサマー組成物における平均値を称してよい。この系では、最初の２桁に１００を乗算して、ポリオキシプロピレンブロックの概算の分子量を付与し、第３桁に１０を乗算して、ポリオキシエチレンブロックの重量基準の百分率を付与する。例えば、ポロキサマー１８８（ＣＡＳ登録番号９００３−１１−６）は、上記で示した式におけるように、ｎが約８０の値を有し、ｍが約２７の値を有するポロキサマーを称してよい。ポロキサマー２３７は、ｎが約６４の値を有し、ｍが約３７の値を有するポロキサマーを称してよい。ポロキサマー３３８は、ｎが約１４１の値を有し、ｍが約４４の値を有するポロキサマーを称してよい。ポロキサマー４０７は、ｎが約１０１の値を有し、ｍが約５６の値を有するポロキサマーを称してよい。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約６，０００〜約１８，０００ダルトンの平均分子量を有する。いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、上記で示した式におけるように、ｎが約８０の値を有し、ｍが約２７の値を有するポロキサマーを称してよく、該ポロキサマーは、約７６８０〜約９５１０ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有している。いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、上記で示した式におけるように、ｎが約８０の値を有し、ｍが約２７の値を有するポロキサマーを称してよく、該ポロキサマーは、約７０００〜約１００００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有している。
【００７１】
商品名、例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）で販売されているポロキサマーは、異なる系で命名されてもよい。物理状態を示すのに文字が使用されてもよい（例えば、固体ではＦ、ペーストではＰ、または液体ではＬ）。化学的特性を示すのに２または３桁の数が使用されてもよい。最初の１または２桁を３００で乗算して、ポリオキシプロピレンブロックの概算の分子量を付与し、第３桁を１０で乗算して、ポリオキシエチレンブロックの重量百分率を付与する。例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８は、上記で示した式におけるように、ｎが約８０の値を有し、ｍが約２７の値を有する固体ポロキサマーを称してよい。ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ８７は、ｎが約６４の値を有し、ｍが約３７の値を有する固体ポロキサマーを称してよい。ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ１０８は、ｎが約１４１の値を有し、ｍが約４４の値を有する固体ポロキサマーを称してよい。ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ１２７は、ｎが約１０１の値を有し、ｍが約５６の値を有する固体ポロキサマーを称してよい。
【００７２】
ポロキサマーは、種々の長さの、疎水性（ポリオキシプロピレン）及び親水性（ポリオキシエチレン）の両方の部位を有するため、異なるポロキサマーが異なる親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有していてよい。化合物のＨＬＢは、親水性または親油性である化合物の相対割合を算出することによって求められ、ＨＬＢ値は、化合物の界面活性物質の特性を予測するのに使用される。例えば、１０未満のＨＬＢを有する化合物は、水不溶性であると予測され、１０超のＨＬＢを有する化合物は、水溶性であると予測される。好ましい実施形態において、細胞培養における使用のためのポロキサマーは、２４以上のＨＬＢを有する。ポロキサマーのＨＬＢは、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｗ．Ｃ．（１９５４）Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  ５（４）：２４９−５６及びＤａｖｉｅｓ、Ｊ．Ｔ．（１９５７）Ｇａｓ／Ｌｉｑｕｉｄ  ａｎｄ  Ｌｉｑｕｉｄ／Ｌｉｑｕｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ：Ｐｒｏｃ．ｏｆ  ２ｎｄ  Ｉｎｔｌ．Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ（Ｌｏｎｄｏｎ）：４２６−３８に記載されている方法を含めた、当該分野において周知の方法に従って算出されてよい。
【００７３】
いくつかの実施形態において、ポロキサマーの物理的及び／または化学的特性が測定されてよい。例えば、ポロキサマーの物理的及び／または化学的特性は、熱処理されたポロキサマーに関連する特性を同定するために本明細書に記載されている熱処理の前後に測定されてよい。別の例として、本明細書に記載されている良ポロキサマーロット及び不良ポロキサマーロットの物理的及び／または化学的特性は、良ポロキサマーロットに関連する特性を同定するのに測定されてよい。
【００７４】
物理的及び／または化学的特性を測定するためのアッセイの例は、限定されることなく、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ゲル浸透クロマトグラフィー、粉体ＸＲＤ、準弾性光散乱、及び固体ＮＭＲを含んでよい。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリクス支援レーザー脱離／イオン化質量分析）は、化合物を、例えば、その分子の質量及び電荷によって分析、定量化、または同定するための技術として当該分野において公知である。非限定例として、ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、熱処理されたポロキサマーまたは良ポロキサマーロットと比較して、熱処理前のポロキサマーロットまたは不良ポロキサマーロットと優位に関連するまたはこれに存在する化合物（例えば、不純物）を同定するのに使用されてよい。ゲル浸透クロマトグラフィーは、化合物をサイズによって分離するための技術として当該分野において公知である。非限定例として、ゲル浸透クロマトグラフィーは、熱処理されたポロキサマーまたは良ポロキサマーロットと比較して、熱処理前のポロキサマーロットまたは不良ポロキサマーロットと優位に関連するまたはこれに存在する化合物（例えば、不純物）を単離するのに使用されてよい。粉体ＸＲＤ（粉体Ｘ線回折）は、化合物の構造を特徴付けるための技術として当該分野において公知であり、化合物（複数のランダム配向晶子を含有する）の粉末サンプルを生じさせるステップと、Ｘ線回折を使用して該晶子の構造的特徴を分析するステップとを含んでよい。非限定例として、粉体ＸＲＤは、例えば、熱処理前のポロキサマーまたは不良ポロキサマーロットと比較して、熱処理されたポロキサマーまたは良ポロキサマーロットの構造的特性を特徴付けるのに使用されてよい。準弾性光散乱（ａ．ｋ．ａ．動的光散乱及び光子相関分光法）は、溶液または懸濁液における粒子のサイズ分布プロファイルを決定するための技術として当該分野において公知である。非限定例として、準弾性光散乱は、熱処理されたポロキサマーまたは良ポロキサマーロットと比較して、熱処理前のポロキサマーロットまたは不良ポロキサマーロットと優位に関連するまたはこれに存在する化合物（例えば、不純物）をその粒子径によって同定するのに使用されてよい。
【００７５】
固体ＮＭＲ（核磁気共鳴、またはＳＳＮＭＲ）は、化合物の種々の構造的特徴を決定するための技術として当該分野において公知である。例えば、固体ＮＭＲは、化合物の分子配座、配列、化学シフト、または多形的性質を特徴付けるのに使用されてよい。非限定例として、固体ＮＭＲは、熱処理前のポロキサマーまたは不良ポロキサマーロットと比較して、熱処理されたポロキサマーまたは良ポロキサマーロットの構造的特性を特徴付けるのに使用されてよい。いくつかの実施形態において、固体ＮＭＲによって決定される構造的特性は、ポロキサマーサンプルにおける結晶対アモルファスポロキサマーの比を含んでよい。別の非限定例として、固体ＮＭＲは、１以上のポロキサマー多形体を分割またはプロファイリングすることができるスペクトルを付与するのに使用されてよい。いくつかの実施形態において、固体ＮＭＲは、不良ポロキサマーロットまたは熱処理前のポロキサマーに存在するポロキサマー多形体と比較して、良ポロキサマーロットまたは熱処理されたポロキサマーにおける１以上のポロキサマー多形体を分割するのに使用されてよい。いくつかの実施形態において、固体ＮＭＲによって生じたポロキサマースペクトルは、例えば、不良ポロキサマーロットまたは熱処理前のポロキサマーを含有する細胞培養培地において成長した細胞培養物の細胞生存率と比較して、良ポロキサマーロットまたは熱処理されたポロキサマーを含有する細胞培養培地において成長した細胞培養物の細胞生存率を測定することによって、細胞培養培地におけるポロキサマーの性能と関連付けられてよい。
【００７６】
ＩＶ．細胞培養におけるポロキサマーの使用及びポリペプチドの産生
本明細書において提供される、熱処理されたポロキサマーは、方法（例えば、本開示の熱処理されたポロキサマーを含有する培養培地を使用して、細胞を培養し、ポリペプチドを産生する）における、及び組成物（例えば、本開示の熱処理されたポロキサマーを含有する細胞培養培地）における使用を見出してよい。
【００７７】
細胞培養におけるポロキサマーの使用
ポロキサマーは、当該分野において公知の細胞培養培地への添加剤として使用され得る。理論に拘束されることを望まないが、ポロキサマーは、細胞をダメージから保護して細胞生存率を向上させる場合がある細胞培養培地において多くの機能を有すると考えられる。例えば、ポロキサマーは、細胞に対する剪断保護剤として作用してよい。ポロキサマーは、気泡が破裂するときの細胞−気泡付着を低減し及び／または衝撃を低減することにより、細胞のダメージを防止してよい。ポロキサマーは、気泡の速度及び頻度を改変し、泡層からの細胞の排出を改善し、ならびに／または細胞膜を強化してもよい。例えば、Ｍｅｉｅｒ，Ｓ．Ｊ．，ら．（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６２（４）：４６８−７８；Ｃｈｉｓｔｉ，Ｙ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（１０）：４２０−３２；及びＴｈａｒｍａｌｉｎｇａｍ，Ｔ．，ら．（２００８）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９（２）：１６７−７７を参照されたい。
【００７８】
本明細書に記載されている熱処理ポロキサマーは、ポロキサマーに典型的に使用されるいずれの濃度で細胞培養培地に添加されてもよい。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、熱処理されたポロキサマーを約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌで含む。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、熱処理されたポロキサマーを約０．１ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌで含む。いくつかの実施形態、細胞培養培地は、熱処理されたポロキサマーを約３ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌで含む。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、熱処理されたポロキサマーを約０．１ｇ／Ｌで、約０．２ｇ／Ｌで、約０．３ｇ／Ｌで、約０．４ｇ／Ｌで、約０．５ｇ／Ｌで、約０．６ｇ／Ｌで、約０．７ｇ／Ｌで、約０．８ｇ／Ｌで、約０．９ｇ／Ｌで、約１ｇ／Ｌで、約２ｇ／Ｌで、約３ｇ／Ｌで、約４ｇ／Ｌで、約５ｇ／Ｌで、約６ｇ／Ｌで、約７ｇ／Ｌで、約８ｇ／Ｌで、約９ｇ／Ｌで、または約１０ｇ／Ｌで含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているように調製された熱処理されたポロキサマーは、所望の細胞生存率レベルを得るために、細胞培養培地において、熱処理前のポロキサマーよりも低い濃度で使用されてよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているように調製された熱処理されたポロキサマーは、所望の細胞生存率レベルを得るために、細胞培養培地において、熱処理前のポロキサマーよりも一貫性のあるまたは画一化された濃度で使用されてよい。
【００７９】
界面活性物質、例えばポロキサマーは、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）と呼ばれている、溶液中での限界値を有し、これを超えると、添加されるさらなる界面活性物質の分子が、溶液中に溶解するよりもむしろミセル中に取り込まれ始める。ＣＭＣより高い濃度では、溶液の表面張力は、界面活性物質の濃度に比例した同じ速度ではもはや減少しない。好ましい実施形態において、熱処理されたポロキサマーは、そのＣＭＣより低い濃度で細胞培養培地に添加される。例えば、ポロキサマー１８８のＣＭＣは、１００ｍｇ／ｍＬであると決定されている（Ｋａｂａｎｏｖ，Ａ．Ｖ．，ら．（１９９５）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２８（７）：２３０３−１４）。ポロキサマーのＣＭＣは、ポロキサマーが添加されている間、溶液の表面張力を測定することによって決定されてよい。ポロキサマー濃度の増加が表面張力の増加をもはや生じさせない濃度が、該ポロキサマーについてのＣＭＣである。表面張力は、例えば、限定されることなく、張力計（例えば、Ａｔｔｅｎｓｉｏｎ製Ｓｉｇｍａ７００／７０１張力計）を使用して測定されてよい。
【００８０】
細胞培養培地
本開示のある特定の態様は、細胞培養培地において細胞を培養することに関する。所望のタイプの細胞及び／またはポリペプチド産生物に好適な、当該分野において公知のいずれの細胞培養培地が使用されてもよい。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、化学的に定義された培地である。他の実施形態において、細胞培養培地は、化学的に定義されていない培地である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている熱処理されたポロキサマーは、基底細胞培養培地に添加される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている熱処理されたポロキサマーは、流加または流加回分細胞培養培地に添加される。
【００８１】
例えば、限定されないが、ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（［ＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、ダルベッコ改変イーグル培地（［ＤＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）、ルリアブロス（ＬＢ）、及びテリフィックブロス（ＴＢ）を含めた市販の培地が使用されてよく、これらのいずれの培地にも、本明細書に詳述されているいずれの培地成分（例えば、熱処理されたポロキサマー）が補充されてよい。また、全ての開示内容がその全体において参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｍ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ及びＳａｔｏ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０２：２５５（１９８０）、Ｖｉｊａｙａｓａｎｋａｒａｎら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．，６：６０５：６１１（２００５）、Ｐａｔｋａｒら、Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９３：２１７−２２９（２００２）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；若しくは同第４，５６０，６５５号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；米国再発行特許第３０，９８５号；または米国特許第５，１２２，４６９号に記載されているいずれの培地にも、本明細書に詳述されているいずれの培地成分（例えば、熱処理されたポロキサマー）が補充されてよい。
【００８２】
本明細書において提供されるいずれの培地にも、必要に応じて、ホルモン及び／若しくは他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、または表皮成長因子）、イオン（例えばナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、及びホスフェート）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシン及びチミジン）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義されている）、界面活性物質、例えばポロキサマー、ならびにグルコースまたは他の等価のエネルギー源が補充されてよい。いくつかの態様において、本明細書において提供される細胞培養培地は、植物または動物に由来するタンパク質を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される細胞培養物は、植物または動物に由来するタンパク質を含まない。あらゆる他の必要な補充物が、当業者に公知の適切な濃度で含まれていてもよい。
【００８３】
細胞生存率
いくつかの実施形態において、熱処理されたポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率は、未処理のポロキサマー（または熱処理前のポロキサマー）を含む細胞培養培地における細胞生存率と比較して増加している。本開示の発見によると、本明細書に記載されているポロキサマーの調製により、熱処理されたポロキサマーが細胞培養培地において使用されるときの細胞生存率が、未処理のポロキサマーが同じ細胞培養培地において使用されるときと比較して結果として増加する。細胞生存率を試験する方法は、当該分野において公知である。いくつかの実施形態において、細胞生存率は、本明細書において提供される実施例において詳細に記載されているように測定される。いくつかの実施形態において、細胞培養培地における細胞生存率は、約１時間後、約２時間後、または約３時間後（例えば、以下に記載されている）に測定されてよい。
【００８４】
細胞生存率は、本明細書において使用されているとき、溶液中の生細胞の百分率（すなわち、細胞の合計数で除算した生細胞の数）として定量化される。当該分野において公知のいずれの好適な方法が、細胞生存率を測定するのに使用されてもよい。細胞が生きているまたは死んでいるとき、細胞生存率は、死細胞または生細胞のいずれかを定量化することによって求められてよい。１つの好適な方法は、トリパンブルー排除である。この方法では、細胞のサンプルを細胞培養から得る。トリパンブルーの溶液をサンプルに添加する。非生存細胞のみがトリパンブルーを取り込み、これらが、その後染色された青色となる。そのため、青色細胞の数をカウントし、細胞の合計数で減算して生細胞の数を得、この数を細胞の合計数で除算して細胞生存率を得る。細胞を、血球計を用いて手動でカウントしても、例えばＶｉ−Ｃｅｌｌ（登録商標）生存率分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて自動的にカウントしてもよい。細胞生存率を決定するための他のアッセイは、限定されることなく、ヨウ化プロピジウム染色、ＴＵＮＥＬ、レザズリン、メチルバイオレット、乳酸脱水素酵素、フルオレセインジアセテート加水分解、ＭＴＴ、カスパーゼ、及びＡＴＰアッセイを含んでよい。
【００８５】
熱処理されたポロキサマーの効果は、例えば、熱処理されたポロキサマーを含有する細胞培養培地において成長した細胞培養物における細胞生存率を測定すること、及び、これを、同濃度の未処理のポロキサマーを含有する細胞培養培地において成長した細胞培養物における細胞生存率と比較することによって決定されてよい。いくつかの実施形態において、細胞培養物を、バッフル付き振とうフラスコにおいて成長させてよい。いくつかの実施形態において、未処理のポロキサマーと比較して、熱処理されたポロキサマーの使用は、少なくとも約１０％だけ細胞生存率を増加させる。いくつかの実施形態において、熱処理されたポロキサマーの使用は、未処理のポロキサマーと比較して、少なくとも約１５％だけ細胞生存率を増加させる。いくつかの実施形態において、熱処理されたポロキサマーの使用は、未処理のポロキサマーと比較して、少なくとも約２０％だけ細胞生存率を増加させる。いくつかの実施形態において、熱処理されたポロキサマーの使用は、未処理のポロキサマーと比較して、少なくとも約２５％だけ細胞生存率を増加させる。いくつかの実施形態において、熱処理されたポロキサマーの使用は、未処理のポロキサマーと比較して、少なくとも約３０％だけ細胞生存率を増加させる。いくつかの実施形態において、熱処理されたポロキサマーの使用は、未処理のポロキサマーと比較して、少なくとも約３５％だけ細胞生存率を増加させる。いくつかの実施形態において、熱処理されたポロキサマーの使用は、未処理のポロキサマーと比較して、少なくとも約４０％だけ細胞生存率を増加させる。いくつかの実施形態において、熱処理されたポロキサマーの使用は、未処理のポロキサマーと比較して、少なくとも約４５％だけ細胞生存率を増加させる。いくつかの実施形態において、熱処理されたポロキサマーの使用は、未処理のポロキサマーと比較して、少なくとも約５０％だけ細胞生存率を増加させる。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本開示の熱処理されたポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率は、熱処理前のポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率と比較して少なくとも１０％だけ増加する。いくつかの実施形態において、該細胞生存率は、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％、少なくとも約２６％、少なくとも約２７％、少なくとも約２８％、少なくとも約２９％、少なくとも約３０％、少なくとも約３１％、少なくとも約３２％、少なくとも約３３％、少なくとも約３４％、少なくとも約３５％、少なくとも約３６％、少なくとも約３７％、少なくとも約３８％、少なくとも約３９％、または少なくとも約４０％だけ増加する。
【００８７】
熱処理されたポロキサマーは、細胞培養培地に添加されたとき満足する細胞生存率を付与しないポロキサマー（例えば、特定のロットの所望のポロキサマー）の性能を改善するのに特に有用であってよい。いくつかの実施形態において、未処理のポロキサマーによる細胞培養培地における細胞生存率は、約８０％未満である。いくつかの実施形態において、未処理のポロキサマーによる細胞培養培地における細胞生存率は、約７０％未満である。いくつかの実施形態において、未処理のポロキサマーによる細胞培養培地における細胞生存率は、約６０％未満である。いくつかの実施形態において、未処理のポロキサマーによる細胞培養培地における細胞生存率は、約５０％未満である。いくつかの実施形態において、未処理のポロキサマーによる細胞培養培地における細胞生存率は、約４０％未満である。
【００８８】
細胞成長及びポリペプチド産生
いくつかの実施形態において、本開示の細胞（例えば、本明細書に記載されている細胞培養培地において培養される細胞）は、対象のポリヌクレオチド（例えば、対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または対象のポリヌクレオチド自体）を含有してよい。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、対象のポリヌクレオチドを含むようにトランスフェクトされ、形質転換され、または他の場合には遺伝子操作されてよい。種々の細胞をトランスフェクトまたは形質転換するのに好適な方法は、当該分野において広く知られている。ポリペプチド産生に関する例示的な参照文献を以下に付与する；当業者は、本明細書に開示の方法がポリペプチド産生に限定されないことを認識する。
【００８９】
一般に、細胞は、細胞成長、維持ならびに／またはポリヌクレオチド及び／若しくはポリペプチド産生のいずれかを促進する１以上の条件下で本明細書に記載されている細胞培養培地と合わされる（接触する）。細胞を培養し、ポリペプチドを産生する方法は、細胞及び細胞培養培地を含有するための培養器（バイオリアクター）を用いる。培養器は、ガラス、プラスチックまたは金属を含めた、細胞を培養するのに好適ないずれの材料から構成されていてもよい。典型的には、培養器は、少なくとも１Ｌであり、１０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、２５，０００Ｌ以上であってもよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞によって先に使用されたものであり、当業者に明らかである。培養プロセスの際に調整されてよい培養条件として、限定されないが、ｐＨ及び温度が挙げられる。
【００９０】
細胞培養物は、細胞培養物の生存、成長、生存率（維持）、及びポリペプチド産生の可能性を促す条件下で維持されてよい。正確な条件は、細胞のタイプ、細胞が誘導される有機体、ならびに発現するポリペプチドの性質及び特徴に応じて変動する。ポリペプチド産生期の間、細胞培養物は、（初期の成長期と比較して）細胞培養の生存及び生存率を促しかつ所望のポリペプチドの発現に適切な第２の培養条件設定下で場合により維持されてよい。
【００９１】
ある特定の場合において、細胞培養物に、細胞によって枯渇または代謝された栄養物または他の培地成分を補充することが有益または必要であることがある。例えば、細胞培養物のモニタリングの際に枯渇されたと観察される栄養物または他の培地成分を補充することが有利である。代替的または付加的には、産生期の前の細胞培養物に補充することが有益または必要であることがある。非限定例として、細胞培養物に、ホルモン及び／若しくは他の成長因子、特定のイオン（例えばナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、及びホスフェート）、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシド若しくはヌクレオチド、微量元素（非常に低い最終濃度で通常は存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、若しくはグルコースまたは他のエネルギー源を補充することが有益または必要であることがある。
【００９２】
本明細書に詳述されている細胞培養培地は、細胞を培養して、抗体を含めたポリペプチドを産生する方法において使用され得る。該培地は、回分培養、流加回分培養または灌流培養によってのいずれかで細胞を培養する方法において使用されてよく、本明細書に記載されているポリペプチドのいずれの態様または実施形態も含めたいずれのポリペプチドを産生する方法においても使用され得る。本明細書に詳述されている（例えば、本開示の熱処理されたポロキサマーを含有する培養培地を使用して細胞を培養しポリペプチドを産生する）方法によって産生されるポリペプチドは、宿主細胞に対して相同性であってよく、または、好ましくは、外生的であってよく、このことは、該ポリペプチドが、利用される宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞によって産生されるヒトタンパク質、または哺乳動物細胞によって産生される酵母ポリペプチドに対して非相同性、すなわち、異物であることを意味している。一変形例において、ポリペプチドは、宿主細胞によって培地内に直接分泌される哺乳動物ポリペプチド（例えば、抗体）である。別の変形例において、ポリペプチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞の溶解によって培地内に放出される。
【００９３】
宿主細胞において発現可能であるあらゆるポリペプチドが、本開示に従って産生されてもよく、提供される組成物に存在していてもよい。ポリペプチドは、宿主細胞に対して内生的である遺伝子から、または、遺伝子操作を通して宿主細胞内に導入される遺伝子から発現されてよい。ポリペプチドは、天然に存在するものであってよく、または、代替的には、人間の手によって操作または選択された配列を有していてよい。操作されたポリペプチドは、自然に個々に存在する他のポリペプチドセグメントから組み立てられてよく、または、自然に存在しない１以上のセグメントを含んでいてよい。
【００９４】
本発明に従って望ましくは発現されてよいポリペプチドは、対象とする生物学的または化学的活性に基づいて選択される。例えば、本発明は、あらゆる薬学的または商業的に関連する酵素、受容体、抗体、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤などを発現するのに用いられてよい。
【００９５】
細胞培養においてポリペプチド、例えば、抗体を産生するための方法は、当該分野において周知されている。細胞培養において抗体（例えば、全長抗体、抗体フラグメント及び多特異性抗体）を産生するための非限定的な例示的方法を本明細書において提供する。本明細書における方法は、当業者によって、他のタンパク質、例えば、タンパク質系インヒビターの産生に適合され得る。全体が参照により全て本明細書に組み込まれる、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）の産生のために一般によく理解されておりかつ一般的に用いられている技術及び手順に関しては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第４版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２０１２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００３）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，２００２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、（Ｈｏｒｓｗｉｌｌら、２００６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ編、１９８８）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、第６版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２０１０）を参照されたい。
【００９６】
ポリペプチドの産生に好適な条件は、種々の宿主細胞のタイプ及びポリペプチドについて当該分野において公知である。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞によって先に使用されたものであり、当業者に明らかである。
【００９７】
細胞培養物は、栄養物の酸素化及び細胞への分散を増加させるために、細胞培養の際に撹拌または振とうされてよい。ポロキサマーの使用は、細胞を潜在的に損傷する剪断力のため、撹拌される細胞培養物において特に有利であることがある。本発明により、当業者は、限定されないが、ｐＨ、温度、酸素化などを含めた、初期の成長期の際のバイオリアクターのある特定の内部条件を制御または調節することが有益であり得ることを理解する。例えば、ｐＨは、適量の酸または塩基を供給することによって制御され得、酸素化は、当該分野において周知の散布装置によって制御され得る。
【００９８】
細胞
培養培地において培養し、ポリペプチドを産生するのに好適な細胞は、原核、酵母、または高等真核（例えば、哺乳動物）細胞を含んでいてよい。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞が使用される。いくつかの実施形態において、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が使用される。
【００９９】
哺乳動物細胞が培養されてよく、培養（組織培養）における哺乳動物細胞の増殖は、常套的手順となっている。哺乳動物宿主細胞株の例は、限定されることなく、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓細胞株（懸濁液培養における成長についてサブクローニングした２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳がん（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝がん細胞株（ＨｅｐＧ２）を含んでいてよい。他の有用な哺乳動物宿主細胞株として、骨髄腫細胞株、例えばＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。抗体産生に好適なある特定の哺乳動物宿主細胞株のレビューについては、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）、２５５〜２６８頁を参照されたい。
【０１００】
いくつかの実施形態において、ＣＨＯ細胞が培養されてよい。ＣＨＯ細胞は、周知であり、細胞培養におけるポリペプチド、例えば抗体を産生するのに当該分野において常套的に使用される。ＣＨＯ細胞は、限定されないが、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０））、例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６を含んでいてよい。
【０１０１】
この目的に好適な原核細胞として、真正細菌、例えば、グラム陰性またはグラム陽性微生物、例えば、腸内細菌、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、大腸菌、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢａｃｉｌｌｉ、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日に発行されたＤＤ２６６，７１０に開示されているＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ４１Ｐ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、例えばＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、他の菌株、例えば大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）が好適である。これらの例は、限定的であるよりもむしろ説明的なものである。
【０１０２】
原核生物に加えて、真核微生物、例えば糸状菌または酵母は、抗体コードベクターに好適なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または一般的なパン用酵母は、下等な真核宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかし、多数の他の属、種、及び菌株、例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主、例えば、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、及びＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２，２２６）など；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、例えばＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ；ならびに糸状菌、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主など、例えばＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ及びＡ．ｎｉｇｅｒが一般的に利用可能であり、また、本明細書において有用である。治療用タンパク質の産生のための酵母及び糸状菌の使用を議論しているレビューについては、例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）を参照されたい。
【０１０３】
グリコシル化経路が「ヒト化されている」ある特定の菌類及び酵母菌株が選択されて部分的または完全にヒトグリコシル化されたパターンを有する抗体の産生を結果として生じさせてよい。例えば、Ｌｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるグリコシル化経路のヒト化を記載している）；及びＧｅｒｎｇｒｏｓｓら（上記を参照）を参照されたい。
【０１０４】
グリコシル化された抗体の発現に好適な宿主細胞もまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞として、植物及び昆虫細胞が挙げられる。宿主からの多数のバキュロウイルス菌株及び変異体ならびに昆虫細胞、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ミバエ）、及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉが同定されている。トランスフェクトのための種々のウイルス菌株、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１変異体及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、かかるウイルスは、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクトに、本発明に従って、本明細書におけるウイルスとして使用されてよい。昆虫細胞の例は、限定されることなく、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞（例えば、Ｓ２細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞（例えば、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）細胞）、及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（例えば、Ｓｆ２１またはＳｆ９細胞）を含んでいてよい。
【０１０５】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ツクバネアサガオ、トマト、ウキクサ（Ｌｅｎｉｎａｃｅａｅ）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、及びタバコの植物細胞培養物も宿主として利用され得る。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生させるためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。
【０１０６】
抗体産生
いくつかの実施形態において、熱処理されたポロキサマーを含有する細胞培養培地において培養される細胞は、抗体を産生するのに使用される。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られるとしての抗体の特徴を示しており、いずれかの特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されてはならない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−９７（１９７５）；Ｈｏｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３−２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）、ならびにヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座または遺伝子の部分または全てを有する動物においてヒトまたはヒト様抗体を産生する技術（例えば、ＷＯ１９９８／２４８９３；ＷＯ１９９６／３４０９６；ＷＯ１９９６／３３７３５；ＷＯ１９９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；及び同第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）；ならびにＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照されたい）を含めた種々の技術によって作製されてよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている方法によって産生さ��る抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ライブラリ由来抗体、または多特異性抗体である。
【０１０８】
抗体は、例えば、ＣＨＯ細胞を使用する抗体の産生において、組み換え方法を使用して産生されてよい。抗−抗原抗体の組み換え産生では、抗体をコードする核酸が単離されて、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のため、または発現のために複製可能なベクターに挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順（例えば、抗体の重及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）を使用して容易に単離及び配列決定されてよい。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分として、限定されないが、以下：シグナル配列、複製起点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列の１以上を一般に含む。
【０１０９】
本発明の抗体は、直接組み換え産生されてよいだけでなく、好ましくはシグナル配列または成熟タンパク質若しくはポリペプチドのＮ−末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである、非相同ポリペプチドを有する融合ポリペプチドとしても組み換え産生されてよい。選択される非相同シグナル配列は、宿主細胞によって認識及びプロセシングされる（例えば、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものが好ましい。ネイティブ抗体シグナル配列を認識及びプロセシングしない原核宿主細胞では、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーからなる群から選択される原核シグナル配列によって置換される。酵母分泌では、ネイティブシグナル配列は、例えば、酵母インベターゼリーダー、因子リーダー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓのα−因子リーダーを含む）、若しくは酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ９０／１３６４６に記載されているシグナルによって置換されてよい。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
【０１１０】
抗体は、細胞周辺腔において細胞内に産生され、または培地内に直接分泌され得る。抗体が第１ステップとして細胞内に産生されると、粒子状残屑、宿主細胞または溶解フラグメントのいずれかが、例えば、遠心分離または限外ろ過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）には、大腸菌の細胞周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順が記載されている。簡単には、細胞ペーストは、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下に約３０分にわたって解凍される。細胞残屑は、遠心分離によって除去され得る。抗体が培地内に分泌される場合、かかる発現系からの上清は、まず、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えば、アミコンまたはミリポアペリコン限外ろ過ユニットを使用して一般に濃縮される。プロテアーゼインヒビター、例えばＰＭＳＦが、タンパク質分解を阻害するために上記ステップのいずれかに含まれてもよく、抗生剤が、偶発的汚染物質の成長を防止するために含まれてよい。
【０１１１】
抗体は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され得、アフィニティークロマトグラフィーが、典型的に好ましい精製ステップの１つである。親和性リガンドとしてのタンパク質Ａの好適性は、抗体に存在するあらゆる免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。タンパク質Ａは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖をベースとする抗体を精製するのに使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。タンパク質Ｇは、全てのマウスアイソタイプ、及びヒトγ３を対象としている（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリクスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリクスも利用可能である。機械的に安定なマトリクス、例えば制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースによって達成され得るよりも高い流量及び短いプロセシング時間を可能にする。抗体がＣＨ３領域を含むとき、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えばイオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカにおけるクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）におけるクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）におけるクロマトグラフィー、クロマト分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫安沈殿も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、その抗原結合フラグメントである。抗原結合フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多特異性抗体が挙げられる。Ｆａｂフラグメントは、重及び軽鎖可変領域を含有し、軽鎖の定常領域及び重鎖の第１定常領域（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端におけるいくつかの残基の添加によって、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常領域のシステイン残基が遊離チオール基を担持するＦａｂ’の本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメント対として元々は産生されたものである。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られている。「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含有する最小の抗体フラグメントである。「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨ及びＶＬ領域を含んでおり、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能にする、ＶＨ及びＶＬ領域間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖのレビューについては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈuｎ（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，第１１３巻）、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４）、２６９〜３１５頁を参照されたい。上記の、抗体を精製するための方法の多くが、抗原結合抗体フラグメントを精製するのに好適に適合されてよい。
【０１１３】
一般に、研究、試験及び臨床に使用される抗体を調製するための種々の方法が、当該分野において確立されており、上記の方法と一致しており、及び／または対象の特定の抗体について当業者によって適切であるとされている。
【実施例】
【０１１４】
本発明は、以下の実施例を参照することによって、より完全に理解される。しかし、該実施例は、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本明細書に記載されている実施例及び実施形態は、単に説明目的であること、ならびにこれらを考慮して種々の修飾または変更が当業者に提案され、本願の精神及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
【０１１５】
実施例１：熱処理は細胞培養のためのポロキサマー性能を改善する
ポロキサマーは、細胞を散布及び／または気泡関連のダメージから保護する界面活性物質として細胞培養において一般的に使用されている。あいにく、ロット間変動は、有効性を損ねて、組み換え産生物収量の低下を結果として生じさせる。例えば、ポロキサマーの不良ロットは、細胞生存率を低下させて、最大で４５％の産生物力価の減少を引き起こすことがある。大規模な一連の調査の後、不良ポロキサマーロットは、産生物収量の有意な低下及びそれに続く工業的タンパク質産生での金銭的損失の源であることが分かった。そのため、ポロキサマー性能を改善する方法がかなり有益である。
【０１１６】
驚くべきことに、単一の熱処理が細胞培養におけるポロキサマー性能を増大させることができることが見出された。重要なことには、この熱処理は、不良ポロキサマーロットの性能を改善するだけでなく、良ロットの性能もさらに向上させることができることである。ポロキサマーを処理して細胞培養補充物としてのその性能を改善するための方法を本明細書において記載する。
【０１１７】
方法
ポロキサマー処理
１５ｇのポロキサマー１８８（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８ＮＦ  Ｐｒｉｌｌ  Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ１８８、ＢＡＳＦ）を標準の撹拌プレートにおいて１０〜１２分間加熱した。ポロキサマーが８６〜９１℃の温度に達したときに加熱を停止した。次いでポロキサマーを室温、２〜８℃、または−７２℃でおよそ２０分間冷却した。次いで固体ポロキサマーを薄片化し、試験用細胞培養培地に添加した。
【０１１８】
細胞培養試験モデル
上記のように熱処理したポロキサマー１８８を、標準の無血清ＣＨＯ細胞培地に１ｇ／Ｌの最終濃度で添加した。ＣＨＯ細胞を、５％ＣＯ２中１．５×１０６細胞／ｍＬの濃度で２５０ｍＬのバッフル付き振とうフラスコにおいて２５〜７５ｍＬの細胞培養培地中３７℃で成長させた。細胞培養の際、フラスコを２５０ｒｐｍと３５０ｒｐｍの間で軌道振とう器において回転させた。バッフル付き振とうフラスコの使用により、培養において多量の連行気泡を作り出した。細胞生存率を、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（登録商標）生存率分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してトリパンブルー排除によって測定した。３００μＬの細胞培養物をサンプリングし、細胞生存率の百分率を、生存細胞数（すなわち、トリパンブルーを取り込まなかったもの）をサンプルにおける合計細胞数で除算することによって算出した。
【０１１９】
結果
簡単なスクリーニングモデルを発育させ、工業規模よりもむしろ実験室規模での細胞培養生存率に及ぼすポロキサマーの効果をシミュレーションした。簡潔には、ＣＨＯ細胞を上記のように２５０ｍＬのフラスコにおいて成長させた。ポロキサマーの良及び不良ロットにより生じる細胞生存率の差を最大にするために、細胞培養培地の体積、及び振とう速度を試験した。細胞を２５、５０、または７５ｍＬの培地において成長させ、軌道振とう器の台において２５０、３００、または３５０ｒｐｍで振とうさせた。培地の体積は、Δ生存率（すなわち、ポロキサマーの既知の良ロットと既知の不良ロットとの間の百分率としての細胞生存率差）に効果を及ぼさなかったが、より高い振とう速度がΔ生存率の増大を示した。
【０１２０】
図１に示すように、ポロキサマーの熱処理（方法を参照されたい）が細胞培養におけるポロキサマーの性能を有意に改善することが見出された。種々のポロキサマーロットを、上記スクリーニングモデルを使用して細胞生存率に及ぼす効果について試験した。いくつかのロットは、良好に機能することが知られており、その他は、良好に機能しないことが疑われた。各ロットについて、未処理及び熱処理された（ＨＴ）回分を試験用細胞培養培地に添加した。未処理のポロキサマーと比較して、熱処理されたポロキサマーは、試験した全てのロットにおいて細胞生存率を改善することが見出された（図１）。いくつかの場合において、熱処理されたポロキサマーは、４５％から９０％近くまで生存率を倍増させることができた。重要なことには、熱処理されたポロキサマーは、高性能を既に実証したロットについて生存率を改善することができた（例えば、図１における「良４」を参照されたい）。
【０１２１】
これらの結果は、ポロキサマーの熱処理が、細胞培養における生存率に及ぼす効果を改善することができることを実証している。熱処理は、不良ポロキサマーロットの性能を劇的に改善することができ、また、良ロットの性能をさらに向上させることができ、ポロキサマー熱処理の実施が、ポロキサマーロットの変動の課題を有意に低減する場合があることを示唆している。
【０１２２】
実施例２：ＲＴＤ温度計によって測定されるポロキサマーの熱処理
実施例１に記載した実験をホットプレートにおいて行った。これらの実験は、１０分にわたって（ＲＴＤによって測定される）およそ８０〜１００℃にポロキサマーを加熱することを含んだ。これらの実験を１００℃超（すなわち、１２４℃）に加熱したサンプルの添加によって繰り返した。
【０１２３】
方法
ポロキサマー１８８製造業者及びロット
ポロキサマー１８８材を使用した。識別子及び関連する細胞培養性能（高剪断振とうフラスコ試験における性能によって決定される、ＨＳＳＦ）を表１に列挙する。
表１．識別子（後の実施例全体にわたってロットを称するのに使用される）及びＨＳＳＦデータからの関連する細胞培養性能。
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【０１２４】
熱処理方法
ポロキサマー熱処理プロセスを評価するために、いくつかの熱処理方法を評価した：ホットプレート上での、オーブン内での、またはオートクレーブ内での加熱。
【０１２５】
ホットプレート
５〜１５ｇのポロキサマーをガラスビーカー（１００〜４００ｍＬ）に入れ、連続的に撹拌しながらホットプレート上で加熱した。ポロキサマーの温度を熱電対（Ｋａｙｅ７３１  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｕｐｌｅ）または抵抗温度検出器（ＲＴＤ）（Ｆｌｕｋｅ５６２７Ａ−１２  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＲＴＤ  Ｐｒｏｂｅ）を使用して測定した。ポロキサマーを目標温度に達するまで（およそ５〜１０分）加熱し、次いで熱源から直ちに取り除いた。溶融したポロキサマーを室温で冷却させた。
【０１２６】
オーブン
５ｇのポロキサマーを２０ｍＬのシンチレーションガラスバイアルにおいて秤量した。熱電対を、先端が乾燥ポロキサマーに浸漬されるようにバイアルに固定した。次いでポロキサマー及び熱電対を既に目標温度のオーブン（Ｙａｍａｔｏ  ＡＤＰ２１  Ｖａｃｕｕｍ  Ｄｒｙｉｎｇ  Ｏｖｅｎ）に入れた。別途特定しない限り、オーブンを、真空機能を用いずに（大気圧で）操作した。ポロキサマーを目標温度（熱電対によって測定したとき＋／−３℃）に到達させ、ポロキサマーがこの目標温度に達した時間を時間＝０とマーキングした。所望のインキュベーション時間後、僅かな真空を１０〜３０秒間適用し、オーブンに放出されたいずれの揮発物質も吸い出した。通気後、ガラスバイアルをオーブンから除去し、室温で冷却させた（蓋を外した）。
【０１２７】
ＣＨＯ細胞培養物及び培地
１つの注記すべき例外：Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を培地から除外した；を有して、標準の無血清ＣＨＯ細胞培地を全ての実験に使用した。この研究をサポートするために、２つのＣＨＯ細胞株の解凍物をシードトレインバイオリアクター（ＳＴＢ）において維持した。
【０１２８】
高剪断細胞培養振とうフラスコ方法
細胞培養培地へのポロキサマーサンプルの添加
培地を、サンプル当たり２５０ｍＬの標準の無血清ＣＨＯ細胞培地（ポロキサマーを含まない）をＰＥＴＧ容器内にアリコートし、各アリコートに０．２５ｇのポロキサマーサンプルを添加することによって調製した。ポロキサマーを培地に完全に溶解させるために、培地を１５０ｒｐｍで少なくとも５分間かき混ぜた。次いで培地を０．２２μｍのＰＥＳフィルターユニットを使用してバイオセーフティキャビネット（ＢＳＣ）において真空ろ過した。培地を３７℃で貯蔵して２４時間以内に使用した。
【０１２９】
培地の交換及び細胞培養アッセイ
細胞培養サンプルを各アリコートがおよそ７．５×１０Ｅ７の細胞を含有するように５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ内に移した。細胞を８３０×ｇで１０分間遠心分離し、ペレットを形成した。上清を除去し、細胞を、ポロキサマーサンプルを含有する培地において再懸濁させて試験し、次いで、２５０ｍＬの通気式バッフル付き振とうフラスコ内に移した。初期の合計細胞密度（ＴＣＤ）及び生存率を、フラスコを１５０ｒｐｍで数分間振とうして細胞を均一に分布させた後にＮＯＶＡ  Ｆｌｅｘを使用して測定した。次いで、振とうフラスコを、５％ＣＯ２、８０％の湿度及び３７℃のインキュベーターに入れ、３００ｒｐｍで３時間振とうした。ＴＣＤ及び生存率の測定値を１時間、２時間、及び３時間のインキュベーション後に採取し、元のＴＣＤ及び生存率と比較した。
【０１３０】
結果
良ロットのポロキサマー（Ａ）ならびに２つの不良ロット（Ｂ及びＣ）のサンプルを、およそ１００℃に熱処理した。さらなるサンプルのＣを１２４℃に熱処理した。熱処理後、サンプルをＨＳＳＦ試験において試験した。
【０１３１】
（ＲＴＤによって測定したとき）１００℃に処理した全てのポロキサマーサンプルは、同じロットの未処理材料に対する改善を示さなかった（図２）。しかし、１２４℃に熱処理されたＣは、未処理のＣと比較して最終生存率において１９％の増加を実証した。加えて、熱処理されたＣに関する生存率（すなわち、最終生存率％、Ｖｆ−初期生存率％、Ｖ０）の全体変化は−２７．４％であり、未処理のＣと比較して２１％増加した（表２）。
表２．熱処理されたポロキサマーサンプル、条件、未処理ロットに対する生存率の改善、及びＨＳＳＦ試験における最終生存率。
2020103290.tif 000004
Ｎ＝１で行った高剪断振とうフラスコモデル
【０１３２】
これらの結果により、熱処理が細胞培養におけるポロキサマー性能を改善し、有効温度及び処理継続時間の予備的指示を付与することが確認された。しかし、これらの結果は、１００℃より高い温度が、細胞培養のためのポロキサマーの熱処理においてより有効である場合があることを示唆している。温度測定における差（例えば、ポロキサマーの温度を測定するのに使用した温度計のタイプ）は、ポロキサマー熱処理に関して異なる有効範囲を結果として生じる場合があると考えられる（さらなるデータ及び考察については実施例８を参照されたい）。
【０１３３】
実施例３：オーブンへの伝熱処理
ベンチトップ乾燥オーブンを代替の加熱機構として使用し、温度制御及び再現性を付与した。加えて、真空機能は、オーブンを開放する前に、溶融ポロキサマーによって放出された煙をオーブンから吸い出し、熱処理されたポロキサマーを除去することを可能にした。オーブン実験を実施例２に記載の方法によって実施した。
【０１３４】
オーブンにおける初期実験は、最小の所要サンプル数で広範な条件を試験するために応答表面設計を使用した（図３）。温度は、９２〜１４８℃の範囲であり、インキュベーション時間は１０〜１２０分であった。不良ロット（Ｃ）のサンプルを特定の条件でオーブンにおいて熱処理した。次いで、得られたサンプルをＨＳＳＦモデルにおいて試験し、細胞培養性能の改善を決定した。
【０１３５】
オーブンにおいて１４０℃で６０分間及び１５０℃で３５分間加熱した良好に機能しないポロキサマーは、最終生存率の実質的増加を示し、これは、ＨＳＳＦ試験における陽性対照のものと等価であった（図４及び表３）。
表３．オーブンにおいて加熱したポロキサマーの生存率。
2020103290.tif 000005
＊ＨＳＳＦモデルを重複して行う
【０１３６】
しかし、これらの実験において、１４０℃未満及び／または６０分未満の条件で熱処理したポロキサマーは、性能の改善を示さなかった。これらのデータは、ポロキサマー性能を改善する熱処理の最小温度が、試験した継続時間においておよそ１４０℃であったことを示した。加熱の温度及び継続時間のより大規模な試験を、例えば、以下の実施例５に記載する。
【０１３７】
実施例４：オーブン熱処理ＤＯＥ
オーブンにおける熱処理条件についての一次応答表面マップは、試験した条件下での有効な熱処理のための最低温度がおよそ１４０℃であったことを示した。完全な実験計画（ＤＯＥ）を実施例２の方法に従ってオーブンにおいて実施し、非常に高い温度及び長いインキュベーション時間まで進むことによって動作範囲を決定した。試験した最高温度は１８５℃であり、各温度について試験した最大インキュベーション時間は１２０分であった。ポロキサマーの不良ロット（Ｇ）を、ラテン方格法を使用して分割した６サンプルブロックにおいて処理及び試験した。合計で、３つのサンプルブロック及び対象の条件のさらなる６サンプルを試験した（表４）。次いで、これらのサンプルをＨＳＳＦ試験において試験し、細胞培養性能を決定した。
表４．オーブンにおいて完全ＤＯＥで評価した熱処理条件。温度は１１０〜１８５℃の範囲であり、継続時間は１〜１２０分の範囲であった。文字でマーキングしたボックス（表５におけるブロックに相当）は、表５に列挙するように、試験した処理条件を示す。
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【０１３８】
ＤＯＥの原データを表５に示す。完全ＤＯＥの結果は、等高線図でマッピングされているとき、ポロキサマー性能を改善する広範な動作範囲の熱処理条件を示している（図５）。
表５：完全ＤＯＥ実験からの原データ。
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【０１３９】
全てのインキュベーション時間について１５５℃以上で熱処理されたサンプルは、細胞培養性能の劇的な改善を結果として生じた。ＨＳＳＦ試験において、これらのサンプルは、３時間後に１０％未満の生存率変化を有した。１４０℃において、熱処理は、インキュベーション時間が３０分以上までは有効でなかった。加えて、試験した最低温度は１２５℃及び１１０℃であり、サンプルを２時間インキュベートするまで有効でなかった。
【０１４０】
実施例５：熱処理の堅牢性及び再現性
図５に示した熱処理設計空間の再現性及び堅牢性を実証するために、完全ＤＯＥからの重要な処理条件を実施例２に記載の方法に従ってさらなるポロキサマーロットを使用して複製した。これらの条件のうち２つを、再現性に対処するために重複して行った。選択した条件は、動作範囲内またはその端にあった。合計で、３つの不良ロットを処理した（ＤＯＥについて先に使用したＧを含む）（表６）。熱処理が、良ロットにおいて実施するときに有害でないことを確実にするために、１つの良ロットも処理した（Ｅ）。
表６．４つのポロキサマーロットにわたって試験した重要な熱処理条件についての複製の数。
2020103290.tif 000008
【０１４１】
繰り返した処理条件についてのＨＳＳＦ試験結果は、元のＤＯＥからの結果とほとんど同等であった（表７及び８）；しかし、不良ロットにわたっての最適な処理条件では観察可能な変動があった（図６）。
表７．４つのポロキサマーロット：Ｅ（良ロット）、Ｆ（不良ロット）、Ｈ（不良ロット）、及びＧ（完全ＤＯＥ実験において使用した不良ロット）；においてＨＳＳＦ試験で試験した熱処理条件についての最終細胞生存率。
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表８．４つの異なるポロキサマーロット：Ｅ（良ロット）、Ｆ（不良ロット）、Ｈ（不良ロット）、及びＧ（完全ＤＯＥ実験において使用した不良ロット）；において試験した熱処理条件についてのＨＳＳＦ試験における細胞生存率の変化（Ｖｆ（処理）−Ｖｆ（未処理））。
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Ｎ＝１で行った高剪断振とうフラスコモデル
【０１４２】
ロットＧ及びＦは、１５５℃で１分間または１４０℃で１分間処理したとき、細胞培養性能の有意な増加を実証した。しかし、ロットＨは、１４０℃で１分間の処理では改善を示さず、１５５℃で１分間の処理によって限界（＜１０％）のみの改善を示した。このロットでの全ての他の処理条件は、細胞培養における有意な改善を示した。これらの結果は、ロットが、熱処理の最小温度及びインキュベーション時間において僅かな差を有することを実証している。
【０１４３】
実施例６：低温及び長い継続時間の評価
実施例２〜５に記載した熱処理条件は、ポロキサマーの融点を優に上回った。ポロキサマーの融点を僅かにのみ超える温度（約５０℃）が細胞培養生存率に効果を及ぼし得るかどうかを決定するために、ポロキサマーの２つの不良ロット（Ｈ及びＧ）のサンプルをオーブンにおいて６０℃及び８０℃で１２０分間処理し、次いで、実施例２に従ってＨＳＳＦ法において試験した。
【０１４４】
熱処理したサンプルについての結果は、温度に関わらず、未処理のポロキサマーと比較して有意な性能改善を実証しなかった（図７）。理論に拘束されることを望まないが、より長いインキュベーション時間が、改善されたポロキサマーを得るためにこれらの低温で必要とされる場合があることが仮定される。
【０１４５】
実施例７：真空中での熱処理
ポロキサマー熱処理への酸素の影響を決定するために、ポロキサマーの２つの不良ロット（Ｈ及びＧ）のサンプルを、実施例２における方法に従ってオーブンにおいて僅かな真空下で１４０℃に熱処理した。ある特定のインキュベーション時間後、真空からサンプルを除去するよりもむしろ、ポロキサマーをオーブンにおいて室温に至るまで真空下で冷却し、ポロキサマーが目標温度にある間、外的酸素曝露がないことを確実にした。
表９．真空において試験したサンプルについてのポロキサマー熱処理条件及びＨＳＳＦ結果。
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＊Ｎ＝２で行った高剪断振とうフラスコモデル
【０１４６】
真空において処理したポロキサマーは、細胞培養において未処理のポロキサマーに対する有意な改善（最終生存率が＞２０％増加）を実証した（図８、表９）。これらの結果は、ポロキサマーの熱処理の際の外的酸素曝露が、改善されたポロキサマーを生成するのに必要とされない場合があることを実証した。
【０１４７】
実施例８：ワイヤ熱電対と対比してＲＴＤを使用した温度測定
先のデータは、熱処理プロセスについて８０〜１００℃の温度範囲をサポートした。しかし、完全ＤＯＥ（例えば、図５に示すように）は、１４０℃以上の操作範囲をサポートした。
【０１４８】
熱処理の際のポロキサマー温度を測定するのに使用される２つの異なる温度計を調査する実験を行った。実施例１に記載されている実験はＲＴＤを使用したが、全てのオーブン実験においてはワイヤ熱電対を使用した。使用したＲＴＤは、正確な温度測定のために４インチの浸漬深さを必要とする。逆に、ワイヤ熱電対は、その先端で温度を正確に測定するように設計されており、たった数ｍｍのポロキサマーに浸漬しながら温度を正確に測定することを可能にする。
【０１４９】
実施例２における方法に従ってホットプレートにおいてポロキサマーを熱処理しながら、対照比較を実施した。ワイヤ熱電対は、１５２．６℃の温度指示値を付与したが、一方で、ＲＴＤ温度計は、８１．６５℃の指示値を付与した。このように、ＲＴＤは、熱電対と比較したとき、有意な測定中温度（＞７０℃）を示した。これらの結果は、異なるポロキサマー温度指示値が、改善されたポロキサマーを生成するのに十分な有効温度範囲の差の根拠となることを実証している。
【０１５０】
実施例９：オーブンにおける加熱傾斜及び冷却速度の特性決定
オーブンに一旦入れたポロキサマーサンプルは、直ぐには目標温度に到達しない。ＤＯＥにおいて使用する３つの温度についての加熱及び冷却プロファイルを実施例２における方法に従ってオーブンにおいて評価した。
【０１５１】
サンプルは、オーブンにおいて目標温度（＋／−３℃）に到達するのに平均１８分を要し、標準偏差が５．８分であった（図９）。加熱時間の変動にもかかわらず、冷却速度は相対的に同様であった。サンプルがポロキサマーの溶融温度（約４０℃）に到達する平均時間は７分であり、標準偏差が０．８分であった。冷却速度が、ほとんど線状であるとすると、１７０C、１５５C、及び１４０Cに加熱したサンプルの冷却速度は、それぞれ、およそ−１９℃／分、−１９．５℃／分、及び−１８℃／分であった。
【０１５２】
実施例１０：生存率及びポロキサマー熱処理の統計的有意性
スチューデントｔ−検定を使用して、ＨＳＳＦ試験におけるポロキサマー対照ロットの性能の差と、細胞培養性能の観察された改善の有意性とを決定した。オーブンＤＯＥからの全てのＨＳＳＦ対照の結果をデータセットに含んだ。熱処理したサンプルでは、動作範囲内のサンプルのみを使用して、熱処理後の細胞生存率の平均変化を算出した。動作範囲を、ＨＳＳＦ試験における生存率の変化が１５％未満であった条件であると定義した。
【０１５３】
処理後及び未処理のポロキサマーを、スチューデントｔ−検定（α＝０．０５）を使用して比較し、統計的に有意な平均差を決定した。加えて、処理後の材料の結果を陽性対照（Ｄ）の結果と比較した。
表１０：試験したロットの処理後及び未処理のポロキサマー材料についてのＨＳＳＦ試験における平均Δ生存率（Ｖｆ（処理）−Ｖｆ（未処理））。
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【０１５４】
０．０５のアルファレベルにより、ポロキサマーの未処理の不良ロットと陽性対照ロット（Ｄ）との平均の比較は、有意な差を実証した（表１０）。熱処理後、全てのロットは、同等であるＨを除いて、陽性対照ロットよりも良好に有意に機能した。良ロットであるロットＥは、ｐ値＞０．０５を有し、その性能が、陽性対照ロットと有意に異ならないことを示した。しかし、ロットＥからの熱処理したポロキサマーは、ＨＳＳＦ試験において陽性対照（ｐ値＝０．０００５）よりも良好に有意に機能し、熱処理プロセスが、既に許容可能なロットを改善したことを実証した。
【０１５５】
これらの結果を図１０に示し、図１０は、陽性対照データセット全体と比較した処理後及び未処理の各ロットの結果を表示している。例えば、図１０は、不良ロットＧについて、未処理のＧ、陽性対照の良ロットＤ、及び熱処理したＧが、全て、統計的に区別可能であって、熱処理したＧロットが、陽性対照の良ロット（Ｄ）または未処理のＧの不良ロットのいずれかと比較して、有意に改善された生存率を示していることを示す。
【０１５６】
この分析に基づくと、熱処理プロセスを成功と見なしたケースは、未処理の材料に対して１８％の改善を実証した。さらに、処理後の材料は、全体的に、これらの実験において使用する陽性対照のロットと、少なくとも同様に機能した。
【０１５７】
細胞培養培地における使用の前のポロキサマーの不良ロットの熱処理は、細胞保護性能を改善する有効な方法であった。熱処理は、温度及び継続時間の広い範囲で有効であった；しかし、温度が低いほど、必要な処理時間が長かった。このプロセスは堅牢であって、いくつかのポロキサマーロットにわたって同様の結果を実証し、また、再現可能であった。ここで提示した結果は、オーブンにおいて行った実験からのものであったが、該プロセスは、より大規模な機器に伝達され得る。本明細書に記載されている熱処理プロセスは、必要温度で所要の継続時間にわたって一貫したポロキサマー加熱を確保するいずれの処理方法にも伝達され得る。
【０１５８】
実施例１１：ＤＯＥ試験データの統計的分析
上記の実施例は、細胞培養におけるその後の性能（例えば、細胞生存率）に及ぼすポロキサマー熱処理の効果を実証する。次に、２つの従変数（温度及び時間）の関数としてのアウトプット（振とうフラスコモデルにおける３時間での生存率）の数学的モデルである、伝達関数を生じさせるための分析を企図した。
【０１５９】
変数として温度及び時間を用いてオーブンにおいて収集したＤＯＥ試験データ（表１２に記載）を、応答曲面回帰法によってＭｉｎｉｔａｂにおいて分析した。既知のポロキサマー不良ロット（Ｇ）をＤＯＥ試験計画毎に熱処理し、剪断保護剤の機能性のために代理として使用した高剪断振とうフラスコモデルにおいて試験した。３時間の試験の終わりの生存率が高いほど、ポロキサマーの性能が良好であることを示す。同様に、未処理のサンプル（陰性対照）と比較して性能を改善するように処理した同じポロキサマーロット間の評価を実施した。良好に機能しないロットにおいて観察されるロット内変動を説明するために、６つのＧ対照の平均最終生存率をベースラインとして使用して、各試験ケースで観察される生存率改善の百分率を算出した。３時間での生存率（％）、及び未処理ロットに対する処理ロットの差（％）は応答変数であった。当該結果は、この良好に機能しないロットの質が、生存率の増加によって測定されるように改善され得ることを示している。生存率の陽性変化（処理ロット−未処理ロット）の所望の生存率の目標は、種々の温度及び時間の処理で達成され得る。
【０１６０】
３時間での生存率変化（処理ロット−未処理ロット）を用いて分析を実施した。良好に機能しないロットの１つの平均最終生存率を応力状態下で検討したため、Ｇは、７９．７＋／−５．０％であると見出され、１０％または２０％の生存率増加を、等高線図のため、及び指定の温度で最小の熱処理継続時間を確立するための目標とした。別の良好に機能しないＣの場合には、Ｇで見られたよりも低い生存率（４４．８＋／−７．８％）が未処理対照について予期される場合があることにも注意されるべきである。そのため、Ｃについての＞３５％の生存率改善が、ロットＧで２０％の増大が達成された条件で予期される場合がある。これらの結果は、温度及び時間の線形効果、温度及び時間の相互作用が存在することを示している。モデルにおける項は、Ｐ値＜０．０５の９５％信頼水準において統計的に有意である。モデルにおける最適な操作範囲及び因数の同定は予期されないものであり、新規の所見である。
表１２．ロットＧの熱処理に関するデータセット。
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ＨＳＳＦモデルを重複して行う
【０１６１】
分析ソフトウエアに、Ｍｉｎｉｔａｂバージョン１７．１（Ｍｉｎｉｔａｂ．ｃｏｍ、Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ＰＡ）を使用した。分析は回帰分析（ＲＳＲｅｇｒｅｓｓ）であった。応答表面回帰を使用して時間（分）及び温度（℃）に対する生存率改善（未処理ロットに対する）を分析した。
【０１６２】
分散の分析、モデルの概要、及びコード化係数を以下の表１３〜１５に付与する。
表１３．分散の分析。
2020103290.tif 000014
表１４．モデルの概要。
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表１５．コード化係数。
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【０１６３】
これらの結果に基づいて、（非コード化単位における）回帰方程式を決定した：（未処理ロットに対する）生存率の改善％＝−１１３．５＋０．４８６＊（時間、分）＋１．２３８＊（温度、C）＋０．０００４７＊（時間、分）２−０．００２８６＊（温度、C）２−０．００３３３＊（時間、分）＊（温度、C）
【０１６４】
上記に示した伝達関数は、熱処理温度及び継続時間の関数としての未処理対照に対するロットＧの生存率の改善を予測する。該関数は、また、温度及び時間ならびにこれらの相互作用に関与する二次の項も含有する。上記モデルを使用して、試験ケースで予期された生存率（経験的に誘導されるものではない）が得られ得る。サンプルアウトプットの予測を１５７℃及び１分の試験条件で以下に示す：
生存率の改善＝−１１３．５＋（０．４８６＊１）＋（１．２３８＊１５７）＋０．０００４７＊１＾２）−（０．００２８６＊１５７＾２）−（０．００３３３＊１＊１５７）＝１０．３％
【０１６５】
実験データを使用して図１１に示す等高線図を生じさせた（黒丸で示した経験的データ）。回帰によって生じたモデルに基づいて、５点を数学的に推測することができる。
【０１６６】
第１に、処理応答を、３つの温度帯（１５７℃〜１８５℃）、（１３４℃〜１５７℃）及び（６０℃〜１３４℃）に分類することができる。
【０１６７】
第２に、１５７℃〜１８５℃の高温帯において、熱処理されたロットの生存率を１分の最小の熱処理中に１〜２０％に改善することができる。
【０１６８】
第３に、１３４℃〜１５７℃の中間温度帯において、熱処理されたロットの生存率を１分の最小の熱処理継続時間内に１〜１０％の間に改善することができる。生存率を１２０分の最小の熱処理継続時間内に最大２０％まで向上することができる。
【０１６９】
第４に、６０℃〜１３４℃の低温帯において、熱処理されたロットの生存率を、１４０分の熱処理継続時間内に最大１０％まで改善することができる。生存率を１６４分の最小の熱処理継続時間内に最大２０％まで向上することができる。中間帯及び低温帯について記載した継続時間は、簡素化されたガイドラインであることに注意されるべきである。例えば、図１１に示すように、低温帯内の６０℃、８０℃、１２０℃は、少なくとも１０％の生存率改善を達成するのに、それぞれ、１６４分、１４７分、及び１１５分を必要とする。例示的な値を以下の表１６に記載する。
表１６．例示的な温度、時間、及び対応する生存率改善。
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【０１７０】
第５に、上記のモデルをロットＧによって生じたデータから誘導した。未処理対照が７９％のより高いベースライン生存率を有したため、生存率の改善は最大２０％まで実現され得る。しかし、例えば、未処理ロットが４５％のかなり低い生存率を有したＣのロットでは、より高レベルの改善が実現され得る。例えば、１３４℃〜１５７℃の中間温度帯では、生存率は、ロットＣについて１５分の熱処理継続時間内に４２％だけ改善され得る。ロットＣ及びＧ間の観測された性能差を以下の表１７にまとめる。
表１７．Ｃ及びＧの性能の概要
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【０１７１】
そのため、熱処理値は、ロット、例えばＣにおいて、より明白である。このロットについての完全なデータセットは、全実験セットを行う原料の欠失に起因して実施できなかった。Ｇは、限界まで良好に機能しないロットを表しており、上記で予測したモデルを控えめであると考えることができる。ロットＣ及びＧを使用して生じたデータは、ポロキサマーの熱処理が、ここで試験していない他のポロキサマーロットの性能を改善する場合があることを実証している。性能の改善は、上記のように時間及び温度によって影響される場合がある。上記の結果は、温度の増加がポロキサマー性能を改善するのに必要とされる熱処理の継続時間を短縮すること、及びより長い継続時間にわたってポロキサマー性能を改善するのに低温が使用されてよいことを実証している。理論に拘束されることを望まないが、熱処理の際に観察された生存率の改善の正確な百分率は、熱処理前の特定のポロキサマーロットについて観察されたベースライン生存率に依存すると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月4日(2020.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
そのため、熱処理値は、ロット、例えばＣにおいて、より明白である。このロットについての完全なデータセットは、全実験セットを行う原料の欠失に起因して実施できなかった。Ｇは、限界まで良好に機能しないロットを表しており、上記で予測したモデルを控えめであると考えることができる。ロットＣ及びＧを使用して生じたデータは、ポロキサマーの熱処理が、ここで試験していない他のポロキサマーロットの性能を改善する場合があることを実証している。性能の改善は、上記のように時間及び温度によって影響される場合がある。上記の結果は、温度の増加がポロキサマー性能を改善するのに必要とされる熱処理の継続時間を短縮すること、及びより長い継続時間にわたってポロキサマー性能を改善するのに低温が使用されてよいことを実証している。理論に拘束されることを望まないが、熱処理の際に観察された生存率の改善の正確な百分率は、熱処理前の特定のポロキサマーロットについて観察されたベースライン生存率に依存すると考えられる。
＜さらなる実施態様＞
［実施態様１］細胞培養培地における使用のためのポロキサマーを調製する方法であって：
（ａ）固体ポロキサマーを少なくとも約６０℃に加熱して液体ポロキサマーを形成するステップと；
（ｂ）該液体ポロキサマーを約５０℃未満の温度に冷却して、固体の熱処理されたポロキサマーを形成するステップと
を含み、該冷却が、プリル化またはミリング装置において行われず、該ポロキサマーが、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとのコポリマーを含む、方法。
［実施態様２］熱処理されたポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率が、ステップ（ａ）の前のポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率と比較して増加する、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］ステップ（ａ）においてポロキサマーが、約６０℃と約１８５℃との間に加熱される、実施態様１または実施態様２に記載の方法。
［実施態様４］ステップ（ａ）においてポロキサマーが、約１５７℃と約１８５℃との間に加熱される、実施態様３に記載の方法。
［実施態様５］ポロキサマーが、約１５７℃と約１８５℃との間に、少なくとも１分間加熱される、実施態様４に記載の方法。
［実施態様６］ポロキサマーが、約１５７℃と約１８５℃との間に、１分と約２５０分との間で加熱される、実施態様５に記載の方法。
［実施態様７］ステップ（ａ）においてポロキサマーが、約１３４℃と約１５７℃との間に加熱される、実施態様３に記載の方法。
［実施態様８］ポロキサマーが、約１３４℃と約１５７℃との間に、少なくとも１分間加熱される、実施態様７に記載の方法。
［実施態様９］ポロキサマーが、約１３４℃と約１５７℃との間に、１分と約２５０分との間で加熱される、実施態様８に記載の方法。
［実施態様１０］ステップ（ａ）においてポロキサマーが、約１２０℃と約１３４℃との間に加熱される、実施態様３に記載の方法。
［実施態様１１］ポロキサマーが、約１２０℃と約１３４℃との間に、少なくとも約６２分間加熱される、実施態様１０に記載の方法。
［実施態様１２］ポロキサマーが、約１２０℃と約１３４℃との間に、約６２分と約２５０分との間で加熱される、実施態様１１に記載の方法。
［実施態様１３］ステップ（ａ）においてポロキサマーが、約１００℃と約１２０℃との間に加熱される、実施態様３に記載の方法。
［実施態様１４］ポロキサマーが、約１００℃と約１２０℃との間に、少なくとも約９８分間加熱される、実施態様１３に記載の方法。
［実施態様１５］ポロキサマーが、約１００℃と約１２０℃との間に、約９８分と約２５０分との間で加熱される、実施態様１４に記載の方法。
［実施態様１６］ステップ（ａ）においてポロキサマーが、約８０℃と約１００℃との間に加熱される、実施態様３に記載の方法。
［実施態様１７］ポロキサマーが、約８０℃と約１００℃との間に、少なくとも約１２２分間加熱される、実施態様１６に記載の方法。
［実施態様１８］ポロキサマーが、約８０℃と約１００℃との間に、約１２２分と約２５０分との間で加熱される、実施態様１７に記載の方法。
［実施態様１９］ステップ（ａ）においてポロキサマーが、約６０℃と約８０℃との間に加熱される、実施態様３に記載の方法。
［実施態様２０］ポロキサマーが、約６０℃と約８０℃との間に、少なくとも約１４３分間加熱される、実施態様１６に記載の方法。
［実施態様２１］ポロキサマーが、約６０℃と約８０℃との間に、約１４３分と約２５０分との間で加熱される、実施態様１７に記載の方法。
［実施態様２２］熱処理されたポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率が、ステップ（ａ）の前のポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率と比較して少なくとも１０％だけ増加する、実施態様１または実施態様２に記載の方法。
［実施態様２３］細胞生存率が、少なくとも約２０％だけ増加する、実施態様２２に記載の方法。
［実施態様２４］細胞生存率が、少なくとも約３０％だけ増加する、実施態様２２に記載の方法。
［実施態様２５］ステップ（ａ）の前のポロキサマーを含む細胞培養培地における細胞生存率が、約３時間の細胞培養後、約８０％未満である、実施態様１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２６］ステップ（ｂ）における液体ポロキサマーが、周囲温度、約２℃〜約８℃、または０℃未満で冷却される、実施態様１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２７］ポロキサマーが、真空下で加熱される、実施態様１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２８］液体ポロキサマーが、少なくとも約２０分間冷却される、実施態様１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２９］ステップ（ｂ）において生成した熱処理されたポロキサマーが、細胞培養培地に添加される、実施態様１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様３０］ステップ（ａ）及び（ｂ）が、熱処理されたポロキサマーを前記細胞培養培地に添加する前に少なくとも１回繰り返される、実施態様１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様３１］ポロキサマーが、ステップ（ａ）の前にプリル化プロセスによって処理されている、実施態様１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様３２］ポロキサマーが、ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｍ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎＨの式：式中、ｎが約６０〜約１５０であり、ｍが約２５〜約６０である；を有する、実施態様１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様３３］ポロキサマーが、約５５℃の溶融温度を有する、実施態様１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様３４］ポロキサマーが、約６，０００〜約１８，０００ダルトンの平均分子量を有する、実施態様１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様３５］ポロキサマーが、ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｍ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎＨの式：ｎが約８０の値を有し、ｍが約２７の値を有する；を有するコポリマーを含み、該ポロキサマーが、約７６８０〜約９５１０ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する、実施態様１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様３６］ポロキサマーが、ポロキサマー１８８である、実施態様１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様３７］細胞が、哺乳動物細胞である、実施態様１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様３８］細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、実施態様３７に記載の方法。
［実施態様３９］細胞が、昆虫細胞である、実施態様１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様４０］細胞が、ポリペプチドを産生する、実施態様１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様４１］実施態様１〜４０のいずれか１項に記載の方法によって調製されるポロキサマー。
［実施態様４２］実施態様４１に記載のポロキサマーを含む細胞培養培地。
［実施態様４３］細胞培地が、熱処理されたポロキサマーを約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌで含む、実施態様４２に記載の細胞培養培地。
［実施態様４４］細胞培地が、熱処理されたポロキサマーを約０．１ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌで含む、実施態様４３に記載の細胞培養培地。
［実施態様４５］細胞培地が、熱処理されたポロキサマーを約３ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌで含む、実施態様４３に記載の細胞培養培地。
［実施態様４６］細胞培養物においてポリペプチドを産生する方法であって、ポリペプチドの産生に好適な条件下で細胞培養培地において該ポリペプチドを産生する細胞を培養するステップを含み、該細胞培養培地が、実施態様４１に記載のポロキサマーを含む、方法。
［実施態様４７］細胞が、哺乳動物細胞である、実施態様４６に記載の方法。
［実施態様４８］細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、実施態様４６に記載の方法。
［実施態様４９］細胞が、昆虫細胞である、実施態様４６に記載の方法。
［実施態様５０］細胞培地が、熱処理されたポロキサマーを約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌで含む、実施態様４６〜４９のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様５１］細胞培地が、熱処理されたポロキサマーを約０．１ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌで含む、実施態様５０に記載の方法。
［実施態様５２］細胞培地が、熱処理されたポロキサマーを約３ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌで含む、実施態様５０に記載の方法。
［実施態様５３］ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合フラグメントである、実施態様４６〜５２のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様５４］細胞培養培地における使用のためのポロキサマーを調製する方法であって：
（ａ）ポロキサマーを約８０℃〜約１００℃に加熱して、液体ポロキサマーを形成するステップと；
（ｂ）該液体ポロキサマーを約５０℃未満の温度に冷却して、固体の熱処理されたポロキサマーを形成するステップと
を含み、該冷却が、プリル化またはミリング装置において行われず；
該ポロキサマーが、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとのコポリマーを含む、方法。
【外国語明細書】
2020103290000001.pdf