(57)【要約】      （修正有）【課題】自己免疫障害及び炎症状態の処置のためのＴ細胞の活性を調整し得る新規分子の提供。【解決手段】ＶＩＳＴＡ及びＩｇ  Ｆｃポリペプチドに介入する可動性リンカーも含有する、制御Ｔ細胞タンパク質、ＶＩＳＴＡ［Ｔ細胞活性化のＶ−ドメイン免疫グロブリン抑制因子（ＶＩＳＴＡ）又はＰＤ−Ｌ３］及び免疫グロブリンタンパク質（Ｉｇ）を具備する融合タンパク質に関する。また、自己免疫疾患、アレルギー及び炎症状態、特に狼瘡、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患及び１型又は２型糖尿病の処置のための、ＶＩＳＴＡポリペプチド、多量体ＶＩＳＴＡポリペプチド、ＶＩＳＴＡ−複合物（例えばＶＩＳＴＡ−Ｉｇ）及びＶＩＳＴＡアンタゴニストの使用も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ヒト又はマウスＶＩＳＴＡの細胞外領域又は少なくとも５０アミノ酸であるその断片と少なくとも８０％の配列同一性を具備する少なくとも１つのポリペプチドと、（ｉｉ）少なくとも５アミノ酸を具備する少なくとも１つのリンカーペプチドと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのＩｇタンパク質、好ましくはＩｇ  Ｆｃ領域又はその断片もしくは変異体と、を具備する単離又は組み換えＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質であって、前記ペプチドリンカーがＶＩＳＴＡポリペプチド（ｉ）及びＩｇタンパク質に介入し、得られるＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質がインビボで前記リンカーを欠く同一融合タンパク質よりも強力な免疫抑制活性を引き出す、単離又は組み換えＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項２】
配列番号２、４、５、１６から２５、３６、３７、６８、６９、７２又は７３又は７５におけるＶＩＳＴＡポリペプチド配列の細胞外ドメイン又は少なくとも５０アミノ酸を具備するその断片に対して少なくとも約８０％の配列同一性がある少なくとも１つのポリペプチドと、（ｉｉ）少なくとも５アミノ酸を具備する少なくとも１つのリンカーと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのＩｇ  Ｆｃタンパク質又はその断片と、を具備する単離ＶＩＳＴＡ融合タンパク質であって、前記リンカーがＶＩＳＴＡポリペプチド及びＩｇ  Ｆｃタンパク質に介入し、得られるＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質が、インビボで前記リンカーを欠く同一融合タンパク質よりも強力な免疫抑制活性を引き出す、単離ＶＩＳＴＡ融合タンパク質。
【請求項３】
前記ポリペプチド（ｉ）が、ヒト又はマウスＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン又は少なくとも５０アミノ酸であるその断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１つのポリペプチドを具備する、請求項１又は２に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項４】
ヒト又はマウスＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン又は少なくとも５０アミノ酸であるその断片に対して少なくとも９５％の配列同一性を具備する少なくとも１つのポリペプチド（ｉ）を具備する、請求項１又は２に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、ヒト又はマウスＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン全体又は少なくとも１００アミノ酸であるその断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１つのポリペプチド（ｉ）を具備する、請求項１又は２に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、ヒト又はマウスＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン全体又は少なくとも５０アミノ酸であるその断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１つのポリペプチド（ｉ）を具備する、請求項１又は２に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、ヒト又はマウスＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン全体又は少なくとも２００アミノ酸であるその断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１つのポリペプチド（ｉ）を具備する、請求項１又は２に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、ヒト又はマウスＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン全体又は少なくとも２５０アミノ酸であるその断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１つのポリペプチド（ｉ）を具備する、請求項１又は２に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、ヒト又はマウスＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン全体又は少なくとも２５０から３００アミノ酸であるその断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１つのポリペプチド（ｉ）を具備する、請求項１又は２に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ヒト又はマウスＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン全体又は少なくとも３１０又は３１１アミノ酸であるその断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１つのポリペプチド（ｉ）を具備する、請求項１又は２に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項１１】
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域又はその断片もしくは変異体を具備する、請求項１から１０の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項１２】
少なくとも１つのＩｇＧ１  Ｆｃ領域又はその断片もしくは変異体を具備する、請求項１１に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項１３】
補体結合及び／又はＦｃＲ結合を調整する（増加又は減少させる）１以上の修飾を具備する少なくとも１つのＦｃ領域を含有する、請求項１から１２の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項１４】
ＦｃＲ結合を減少させるか又は排除する１以上の修飾を具備する少なくとも１つのＦｃ領域を含有する、請求項１から１２の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項１５】
ＦｃＲ結合を増加させる１以上の修飾を具備する少なくとも１つのＦｃ領域を含有する、請求項１から１３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項１６】
補体結合を減少させるか又は排除する１以上の修飾を具備する少なくとも１つのＦｃ領域を含有する、請求項１から１５の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項１７】
補体結合を増加させる１以上の修飾を具備する少なくとも１つのＦｃ領域を含有する、請求項１から１２の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項１８】
グリコシル化もしくはエフェクター機能を調整する（増加、減少又は変化させる）か又はＦｃＲ結合を減少させるかもしくは排除する１以上の修飾を具備する少なくとも１つのＦｃ領域を含有する、請求項１から１２の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項１９】
少なくとも４個のグリシン残基を具備する少なくとも１つのリンカーを含有する、請求項１から１８の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項２０】
少なくとも５個のグリシン残基を具備する少なくとも１つのリンカーを含有する、請求項１から１８の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項２１】
少なくとも６個のグリシン残基を具備する少なくとも１つのリンカーを含有する、請求項１から１８の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項２２】
少なくとも７個のグリシン残基を具備する少なくとも１つのリンカーを含有する、請求
項１から１８の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項２３】
少なくとも８個のグリシン残基を具備する少なくとも１つのリンカーを含有する、請求項１から１８の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項２４】
少なくとも９個のグリシン残基を具備する少なくとも１つのリンカーを含有する、請求項１から１８の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項２５】
少なくとも１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のグリシン残基を具備する少なくとも１つのリンカーを含有する、請求項１から１８の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項２６】
ＦｃＲ結合を減少させるか又は排除する１以上の修飾を具備する少なくとも１つのＦｃ領域を含有する、請求項１９から２５の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項２７】
少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５アミノ酸残基を具備する少なくとも１つのリンカーを含有する、請求項１から２６の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項２８】
少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０アミノ酸残基を具備する少なくとも１つのリンカーを含有する、請求項１から２６の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項２９】
少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５又は５０アミノ酸残基を具備する少なくとも１つのリンカーを含有する、請求項１から２６の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項３０】
配列番号２、４、５、１６から２５、３６もしくは３７のポリペプチド配列の細胞外ドメイン又は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００アミノ酸を具備するその断片に対してそれぞれが少なくとも約８０％の配列同一性を保持する少なくとも２、３又は４個のポリペプチドを具備する、請求項１から２９の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項３１】
配列番号２、４、５、１６から２５、３６又は３７のポリペプチド配列の細胞外ドメイン又は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００アミノ酸を具備するその断片に対してそれぞれが少なくとも約９０％の配列同一性を保持する少なくとも２、３又は４個のポリペプチドを具備する、請求項１から２９の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項３２】
配列番号２、４、５、１６から２５、３６又は３７のポリペプチド配列の細胞外ドメイン又は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００アミノ酸を具備するその断片に対してそれぞれが少なくとも約９５％の配列同一性を保持する少なくとも２、３又は４個のポリペプチドを具備する、請求項１から２９の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項３３】
配列番号２、４、５、１６から２５、３６又は３７のポリペプチド配列の細胞外ドメイン又は少なくとも１００アミノ酸を具備するその断片に対してそれぞれが少なくとも約９０％の配列同一性を保持する少なくとも２、３又は４個のポリペプチドを具備する、請求
項１から２９の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項３４】
少なくとも３０％がグリシン及び／又はセリン残基から構成される少なくとも１つのリンカーを具備する、請求項１から３３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項３５】
少なくとも４０％がグリシン及び／又はセリン残基から構成される少なくとも１つのリンカーを具備する、請求項１から３３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項３６】
少なくとも５０％がグリシン及び／又はセリン残基から構成される少なくとも１つのリンカーを具備する、請求項１から３３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項３７】
少なくとも６０％がグリシン及び／又はセリン残基から構成される少なくとも１つのリンカーを具備する、請求項１から３３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項３８】
少なくとも７０％がグリシン及び／又はセリン残基から構成される少なくとも１つのリンカーを具備する、請求項１から３３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項３９】
少なくとも９０％がグリシン及び／又はセリン残基から構成される少なくとも１つのリンカーを具備する、請求項１から３３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項４０】
少なくとも１つのヒト又はマウスＦｃ領域を具備する、請求項１から３９の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項４１】
少なくとも１つのヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域又はマウスＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ定常領域を具備する、請求項１から４０の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項４２】
少なくとも１つのヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３  Ｆｃ領域を具備する、請求項１から４０の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項４３】
グリコシル化、ＦｃＲ結合、補体結合又はエフェクター機能を調整する（増加もしくは減少させる）か又は変化させるために突然変異されている少なくとも１つのＦｃ領域を具備する、請求項１から４２の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項４４】
Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、前記少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも３０％高い免疫抑制活性を示す、請求項１から４３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項４５】
Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、前記少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも４０％高い免疫抑制活性を示す、請求項１から４３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項４６】
Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、前記少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも５０％高い免疫抑制活性を示す、請求項
１から４３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項４７】
Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、前記少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも６０％高い免疫抑制活性を示す、請求項１から４３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項４８】
Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、前記少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも７０％高い免疫抑制活性を示す、請求項１から４３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項４９】
Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、前記少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも８０％高い免疫抑制活性を示す、請求項１から４３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項５０】
Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、前記少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも１００％高い免疫抑制活性を示す、請求項１から４３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項５１】
Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、前記少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも１．１から１．５倍高い免疫抑制活性を示す、請求項１から４３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項５２】
Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、前記少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも１．０から２．０倍高い免疫抑制活性を示す、請求項１から４３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項５３】
Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、前記少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも２．０から３．０倍高い免疫抑制活性を示す、請求項１から４３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項５４】
Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、前記少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも３．０から４．０倍高い免疫抑制活性を示す、請求項１から４３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項５５】
Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、前記少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも４．０から５．０倍高い免疫抑制活性を示す、請求項１から４３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項５６】
Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、前記少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも５．０から６．０倍高い免疫抑制活性を示す、請求項１から４３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項５７】
Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、前記少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも６．０から７．０倍高い免疫抑制活性を示す、請求項１から４３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項５８】
Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、前記少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも７．０から８．０倍高い免疫抑制活性を示す、請求項１から４３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項５９】
Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、前記少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも８．０から９．０倍高い免疫抑制活性を示す、請求項１から４３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項６０】
Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、前記少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも９．０から１０．０倍高い免疫抑制活性を示す、請求項１から４３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項６１】
Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、前記少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも１０．０倍高い免疫抑制活性を示す、請求項１から４３の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。
【請求項６２】
配列番号２、４、５、１６から２５、３６もしくは３７のポリペプチド配列又は少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸を具備する断片に対する少なくとも約９０から５％の配列同一性を有する少なくとも１つのＶＩＳＴＡポリペプチドを具備する、請求項１から６１の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質。
【請求項６３】
少なくとも１つのＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＡを具備する、請求項１から６２の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質。
【請求項６４】
ヒトＩｇＧ１の定常及びヒンジ領域を具備する少なくとも１つのＩｇタンパク質を具備する、請求項１から６２の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質。
【請求項６５】
アミノ酸残基３２から１９０を具備する少なくとも１つのＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン又はアミノ酸１６から１９４を具備するＶＩＳＴＡの細胞外ＩｇＶドメインを具備する、請求項１から６１の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質。
【請求項６６】
少なくとも２コピーのＶＩＳＴＡタンパク質又は少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸を具備するその断片と、少なくとも２コピーのＶＩＳＴＡタンパク質と、ＩｇＧ１  Ｆｃ又は非ＦｃＲ−結合ＩｇＧ１と、を具備する、請求項１から６５の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質。
【請求項６７】
少なくとも３、４、５、６、７、８以上のコピーのＶＩＳＴＡタンパク質又は少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸を具備するその断片と、少なくとも１つのＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａと、を具備する、請求項１から６６の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質。
【請求項６８】
少なくとも３又は４コピーのＶＩＳＴＡタンパク質又は少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸を具備するその断片と、少なくとも１つのＦｃ又は非ＦｃＲ−結合ＩｇＧ１と、を具備する、請求項１から６６の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質。
【請求項６９】
少なくとも２コピーのＶＩＳＴＡタンパク質又はそれぞれが少なくとも、配列番号２、４又は２５のポリペプチド配列を具備する細胞外ドメイン又は少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸を具備するその断片に対して約９０、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を保持するその断片を具備する、請求項１から６８の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質。
【請求項７０】
オリゴマー化ドメインのＮ−末端に連結される、少なくとも１つの細胞外ドメイン又はＶＩＳＴＡの断片を具備する、請求項１から６９の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質。
【請求項７１】
前記オリゴマー化ドメインが、ＧＣＮ４、ＣＯＭＰ、ＳＮＡＲＥ、ＣＭＰ、ＭＡＴ、１個のＮＬＲＣを含有するＬＬＲ、ＮＯＤ２ヌクレオチド−結合ＮＬＲＣ２、１個のＮＬＲＣを含有するＬＲＲ、ＮＯＤ２ヌクレオチド−結合ＮＬＲＣ２又はＰＳＯＲＡＳ１である、請求項７０に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質。
【請求項７２】
請求項１から７１の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を発現する組み換え細胞。
【請求項７３】
酵母、細菌、真菌、昆虫、鳥類、ツメガエル又は哺乳動物細胞である、請求項７２に記載の細胞。
【請求項７４】
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−２、ＰＤ−Ｌ２タンパク質もしくは融合タンパク質又は、前述の何れかに特異的に結合する抗体もしくは抗体断片をさらに発現する、請求項７２に記載の細胞。
【請求項７５】
請求項１から７４の何れか１項に記載の、治療的有効量のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又は細胞を含有する、医薬的に許容可能な組成物。
【請求項７６】
非経口、静脈内、皮下、経皮、経口、筋肉内、膣内、口内、肛門又は鼻腔投与に対して採用される、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
請求項１から７１及び７５から７６に記載又はその何れかに記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又は組成物の投与を具備する、Ｔ細胞及び／又は好中球及び／又は単球及び／又は白血球増殖の阻害を必要とする対象においてＴ細胞及び／又は好中球及び／又は単球及び／又は白血球増殖を阻害する方法。
【請求項７８】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞メモリー細胞及び／又はエフェクター細胞の１以上を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記Ｔ細胞が休止Ｔ細胞である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記Ｔ細胞が活性化Ｔ細胞である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
請求項１から７１及び７５から７６の何れかに記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又は組成物の投与を具備する、Ｔ細胞活性化の阻害を必要とする対象においてＴ細胞活性化を阻害する方法。
【請求項８２】
前記投与が、１以上の活性化マーカーの発現を阻害する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記マーカーが、ＣＤ６９、ＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
請求項１から７１及び７５から７６の何れかに記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又は組成物の投与を具備する、Ｔ細胞上のＦｏｘｐ３の発現誘導を必要とする対象においてＴ細胞上のＦｏｘｐ３の発現を誘導する方法。
【請求項８５】
請求項１から７１及び７５から７６の何れかに記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又は組成物の投与を具備する、濾胞過形成の阻害を必要とする対象において濾胞過形成を阻害する方法。
【請求項８６】
請求項１から７１及び７５から７６の何れかに記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又は組成物の投与を具備する、骨髄造血の阻害を必要とする対象において骨髄造血を阻害する方法。
【請求項８７】
前記対象が白血病又はリンパ腫などのＴ細胞障害を有する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記対象が、骨髄性白血病、血液リンパ系腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞、Ｔ細胞前リンパ球性白血病及び若年性骨髄単球性白血病から選択される白血病を有する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記対象が、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ−細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫（ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症など）、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞新生物、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、モノクローナル免疫グロブリン沈着症、重鎖疾患、ＭＡＬＴリンパ腫とも呼ばれる節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大Ｂ細胞リンパ腫、血管内大Ｂ細胞リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、成熟Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞新生物、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大型顆粒リンパ球性白血病、侵襲性ＮＫ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、芽細胞性ＮＫ細胞リンパ腫、菌状息肉腫／セザリー症候群、原発性皮膚ＣＤ３０−陽性Ｔ細胞リンパ増殖性障害、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、血管免疫芽細胞性芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、詳細不明、未分化大細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、メイン・アーティクル：ホジキンリンパ腫、古典的ホジキンリンパ腫、結節硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型又はリンパ球減少型又は非減少型、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫から選択されるリンパ腫又は白血病を有する、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
請求項１から７１及び７５から７６の何れかに記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又は組成物の投与を具備する、Ｔ細胞浸潤及び／又はＴｈ１７細胞増殖の阻害を必要とする対象においてＴ細胞浸潤及び／又はＴｈ１７細胞増殖を阻害する方法。
【請求項９１】
前記対象が、自己免疫、炎症性又はアレルギー性障害を有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記対象がＴ細胞癌を有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記対象が、リンパ腫又は白血病から選択されるＴ細胞癌を有する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記対象が、骨髄性白血病、血液リンパ系腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞、Ｔ細胞前リンパ球性白血病及び若年性骨髄単球性白血病から選択される白血病を有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
前記対象が、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ−細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫（ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症など）
、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞新生物、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、モノクローナル免疫グロブリン沈着症、重鎖疾患、ＭＡＬＴリンパ腫とも呼ばれる節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大Ｂ細胞リンパ腫、血管内大Ｂ細胞リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、成熟Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞新生物、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大型顆粒リンパ球性白血病、侵襲性ＮＫ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、芽細胞性ＮＫ細胞リンパ腫、菌状息肉腫／セザリー症候群、原発性皮膚ＣＤ３０−陽性Ｔ細胞リンパ増殖性障害、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、血管免疫芽細胞性芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、詳細不明、未分化大細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、メイン・アーティクル：ホジキンリンパ腫、古典的ホジキンリンパ腫、結節硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型又はリンパ球減少型又は非減少型、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫から選択されるリンパ腫又は白血病を有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９６】
実質的にアポトーシスを促進しない、請求項７７から９５の何れか１項に記載の方法。
【請求項９７】
実質的にＢ細胞増殖を阻害しない、請求項７７から９５の何れか１項に記載の方法。
【請求項９８】
Ｔ細胞免疫性の抑制を必要とする対象においてＴ細胞免疫性を抑制するために、請求項１から７６の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質、細胞又は組成物を使用する方法。
【請求項９９】
炎症抑制を必要とする対象において炎症を抑制するために、請求項１から７６の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質、細胞又は組成物を使用する方法。
【請求項１００】
ＩＬ−６、ＣＲＰ、ＴＮＦ．ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＧＮ−γ、エオタキシン、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１及びＭＩＧなどの炎症マーカーの低下をもたらす、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
自己免疫性の抑制を必要とする対象において自己免疫性を抑制するために、請求項１から７６の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質、細胞又は組成物を使用する方法。
【請求項１０２】
アレルギー性反応の抑制を必要とする対象においてアレルギー性反応を抑制するために、請求項１から７６の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質、細胞又は組成物を使用する方法。
【請求項１０３】
少なくとも１つのＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４又はＩＣＯＳタンパク質又は、細胞外領域全体もしくは少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００アミノ酸である前記細胞外領域の断片又は１つのＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４もしくはＩＣＯＳの細胞外領域の何れかに対して又は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００アミノ酸であるその断片に対して少なくとも８０から９０もしくは９５％の配列同一性を保持する変異体を具備する少なくとも１つのＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４又はＩＣＯＳ融合タンパク質又は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４又はＩＣＯＳの何れかに対して特異的な抗体もしくは抗体断片の投与をさらに具備する、請求項７７から１０２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は請求項１から７４の何れかに記載のとおり発現する細胞を含有す
る組成物であって、前記医薬組成物が、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、アジュバント又は溶液を具備する、組成物。
【請求項１０５】
少なくとも１つの免疫抑制剤をさらに具備する、請求項１０４に記載の組成物。
【請求項１０６】
前記免疫抑制剤が、１つのＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４又はＩＣＯＳタンパク質又は、細胞外領域全体もしくは少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００アミノ酸である前記細胞外領域の断片又は１つのＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４もしくはＩＣＯＳの細胞外領域の何れかに対して又は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００アミノ酸であるその断片に対して少なくとも８０から９０もしくは９５％の配列同一性を保持する変異体を具備する少なくとも１つのＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４又はＩＣＯＳ融合タンパク質、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４又はＩＣＯＳの何れかに対して特異的な抗体もしくは抗体断片、又は抗ＩＬ−６抗体もしくは他のＩＬ−６抗体断片である、請求項１０５に記載の組成物。
【請求項１０７】
有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質を投与することを具備する、炎症又は自己免疫性又はアレルギーの処置又は予防を必要とする患者において炎症又は自己免疫性又はアレルギーを処置又は予防する方法。
【請求項１０８】
前記多量体ＶＩＳＴＡタンパク質が、少なくとも２、３、４、５、６、７もしくは８コピーの、ヒト、非ヒト霊長類もしくはげっ歯類ＶＩＳＴＡタンパク質の細胞外領域全体又は少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸を含有するその断片又は、ヒト、非ヒト霊長類もしくはげっ歯類ＶＩＳＴＡタンパク質の前記細胞外領域全体又はヒト、非ヒト霊長類もしくはげっ歯類ＶＩＳＴＡタンパク質の前記細胞外領域の少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸を含有するその断片に対して少なくとも８０から９０又は９５％の配列同一性を保持する変異体を具備する、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質が請求項１から７１の何れか１項に記載のものである、請求項１０７又は１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記炎症性、アレルギー性又は自己免疫状態が、酸逆流／胸焼け、ざ瘡、尋常性ざ瘡、アレルギー及び過敏症、アルツハイマー病、喘息、アテローム性動脈硬化症及び血管閉塞性疾患、場合によってはアテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患、心筋梗塞、脳卒中、末梢血管疾患又は血管ステント再狭窄、自己免疫疾患、気管支炎、癌、心炎、白内障、セリアック病、慢性痛、慢性前立腺炎、肝硬変、大腸炎、結合組織疾患、場合によっては全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎又はシェーグレン症候群、角膜疾患、クローン病、結晶性関節症、場合によっては痛風、偽痛風、ピロリン酸カルシウム結晶沈着症、認知症、皮膚炎、糖尿病、ドライアイ、湿疹、浮腫、肺気腫、線維筋痛症、胃腸炎、歯肉炎、糸球体腎炎、心疾患、肝炎、高血圧、超過敏症、炎症性腸疾患、外傷又は虚血の結果を含む炎症状態、インスリン抵抗性、間質性膀胱炎、虹彩毛様体炎、虹彩炎、関節痛、関節炎、関節リウマチ、ライム病、メタボリックシンドローム（シンドロームＸ）、多発性硬化症、筋炎、腎炎、肥満、ブドウ膜炎を含む眼疾患、骨減少、骨粗しょう症、パーキンソン病、骨盤炎症性疾患、歯周病、多発動脈炎、多発性軟骨炎、リウマチ性多発筋痛、乾癬、再かん流傷害、関節リウマチ、リウマチ性疾患、場合によっては関節リウマチ、変形性関節症又は乾癬性関節炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、副鼻腔炎、シェーグレン症候群、けいれん性結腸、脊椎関節症、場合によっては強直性脊椎炎、
反応性関節炎又はライター症候群、全身性カンジダ症、腱炎、移植拒絶、ＵＴＩ’ｓ、膣炎、アテローム性動脈硬化性の血管疾患を含む血管疾患、血管炎、場合によっては結節性多発動脈炎、ヴェーゲナー肉芽腫、チャーグ・ストラウス症候群又は脈管炎から選択される、請求項１０７から１０９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
自己免疫、炎症性又はアレルギー性疾患の処置又は予防を必要とする対象に有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質を投与することを具備する、自己免疫、炎症性又はアレルギー性疾患を処置又は予防する方法。
【請求項１１２】
前記ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質が、請求項１から７１の何れか１項に記載のものである、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
自己免疫炎症性又はアレルギー性疾患の処置又は予防の薬剤の製造のための、有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質の使用。
【請求項１１４】
前記ＶＩＳＴＡ−Ｉｇが、請求項１から７６の何れかに記載のもの又は含有する、細胞、複合物又は組成物である、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１１５】
前記自己免疫疾患が、細胞介在性又は抗体介在性自己免疫疾患である、請求項１０７から１１４の何れか１項に記載の、方法、組成物又は使用。
【請求項１１６】
前記細胞介在性自己免疫疾患が、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、卵巣炎又は甲状腺炎である、請求項１１５に記載の、方法、組成物又は使用。
【請求項１１７】
前記自己免疫疾患が、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、後天性脾臓委縮症、急性前部ブドウ膜炎、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性痛風性関節炎、急性壊死性出血性白質脳炎、急性又は慢性副鼻腔炎、急性化膿性髄膜炎（又は他の中枢神経系炎症性障害）、急性の重篤な炎症、アジソン病、副腎炎、成人発症糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、成人発症特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、無ガンマグロブリン血症、無顆粒球症、脈管炎、場合によっては大血管脈管炎を含む血管炎、場合によっては、リウマチ性多発筋痛及び巨細胞（高安）関節炎、アレルギー性状態、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、アレルギー性超過敏性疾患、アレルギー性神経炎、アレルギー反応、円形脱毛症、全頭脱毛症、アルポート症候群、肺胞炎、場合によってはアレルギー性肺胞炎又は線維性肺胞炎、アルツハイマー病、アミロイドーシス、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリック病）、好酸球関連障害、場合によっては好酸球増加症、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、血管拡張症、抗体介在性腎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗原−抗体複合体介在性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、アフタ、アフタ性口内炎、再生不良性貧血、不整脈、動脈硬化症、動脈硬化性障害、関節炎、場合によっては関節リウマチ、例えば急性関節炎又は慢性関節リウマチ、進行性慢性関節炎、変形性関節炎、回虫症、アスペルギルス腫、好酸球を含有する肉芽腫、アスペルギルス症、アスペルミオジェネス、喘息、場合によっては気管支喘息、気管支の喘息又は自己免疫喘息、毛細血管拡張性運動失調、失調性硬化症、アテローム性動脈硬化症、自閉症、自己免疫血管浮腫、自己免疫再生不良性貧血、自己免疫萎縮性胃炎、自己免疫糖尿病、自己免疫精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫疾患、膠原病が関連する自己免疫障害、自己免疫自律神経障害、自己免疫耳疾患、場合によっては自己免疫内耳疾患（ＡＧＥＤ）、自己免疫甲状腺炎などの甲状腺炎を含む自己免疫内分泌疾患、自己免疫消化器症候群、自己免疫性腺機能不全、自己免疫難聴、自己免疫溶血、自己免疫肝炎、自己免疫肝臓病学的障害、自己免疫高脂血症、自己免疫不全症、自
己免疫内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫心筋炎、自己免疫好中球減少症、自己免疫膵炎、自己免疫多腺性内分泌障害、自己免疫多腺性症候群Ｉ型、自己免疫網膜症、自己免疫血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫甲状腺疾患、自己免疫蕁麻疹、自己免疫介在性胃腸疾患、軸索及びニューロンのニューロパチー、バロー病、ベーチェット病、良性家族性及び虚血−再かん流傷害、良性リンパ球性血管炎、ベルガー病（ＩｇＡ腎症）、愛鳥家肺、失明、ベック病、細気管支炎閉塞性（非移植）ｖｓ  ＮＳＩＰ、気管支炎、気管支肺アスペルギルス症、バートン症候群、水疱性類天疱瘡、カプラン症候群、心筋症、心血管系虚血、キャッスルマン病、セリアック病、セリアックスプルー（グルテン腸症）、小脳変性症、脳虚血及び血管新生を伴う疾患、シャーガス病、チャネル病、場合によってはてんかん、ＣＮＳのチャネル病、脈絡網膜炎、脈絡膜炎、自己免疫血液障害、慢性活動性肝炎又は自己免疫慢性活動性肝炎、慢性接触皮膚炎、慢性好酸球性肺炎、慢性疲労症候群、慢性肝炎、慢性超過敏性肺臓炎、慢性炎症性関節炎、慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性難治性炎症、慢性粘膜皮膚性カンジダ症、慢性ニューロパチー、場合によってはＩｇＭ多発性ニューロパチー又はＩｇＭ介在性ニューロパチー、慢性閉塞性気道疾患、慢性肺炎症性疾患、慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）又は亜急性甲状腺炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、ＣＮＳ炎症性障害、ＣＮＳ脈管炎、セリアック病、コーガン症候群、クリオグロブリン血症、ポリープ性大腸炎、大腸炎、例えば潰瘍性の大腸炎、潰瘍性大腸炎、膠原線維性大腸炎、Ｔ細胞浸潤を含む状態及び慢性炎症反応、先天性心臓ブロック、先天性風疹感染、クームス陽性貧血、冠動脈疾患、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着、レイノー現象）、クローン病、クリオグロブリン血症、クッシング症候群、毛様体炎、場合によっては慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、虹彩毛様体炎又はフックス毛様体炎、嚢胞性線維症、サイトカイン誘導性毒性、聴覚消失、変形性関節炎、脱髄性疾患、場合によっては自己免疫脱髄性疾患、脱髄性ニューロパチー、デング熱、ヘルペス状皮膚炎及びアトピー性皮膚炎、接触皮膚炎を含む皮膚炎、皮膚筋、急性炎症性要因を伴う皮膚炎、デビック病（視神経脊髄炎）、糖尿病性大動脈障害、糖尿病性ニューロパチー、糖尿病性網膜症、ダイアモンド・ブラックファン貧血、びまん性間質性肺線維症、拡張型心筋症、円板状狼瘡、白血球漏出を含む疾患、ドレスラー症候群、デュプュイトラン拘縮、エコーウイルス感染、アレルギー性又はアトピー性湿疹を含む湿疹、脳炎、例えばラスムッセン脳炎及び辺縁系及び／又は脳幹脳炎、脳脊髄炎、場合によってはアレルギー性脳脊髄炎又はアレルギー性脳脊髄炎及び実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、動脈内過形成、心内膜炎、内分泌性眼障害、子宮内膜症、心内膜心筋線維症、水晶体過敏性眼内炎、眼内炎、アレルギー性腸炎、好酸球増加症−筋痛症候群、好酸球性筋膜炎、流行性角結膜炎、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、上強膜、上強膜炎、エプスタイン−バーウイルス感染、持続性隆起性���斑、多形性紅斑、癩性結節性紅斑、結節性紅斑、胎児赤芽球症、食道運動不全、本態性混合型クリオグロブリン血症、篩骨、エバンス症候群、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、農夫肺、フェブリスリウマチ、フェルティー症候群、線維筋痛症、線維性肺胞炎、フィラリア症、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、食中毒、前頭骨、胃萎縮、巨細胞関節炎（側頭関節炎）、巨細胞肝炎、巨細胞多発性筋痛、糸球体腎炎、慢性又は急性糸球体腎炎（例えば原発性ＧＮ）などのネフローゼ症候群を伴うか又は伴わない糸球体腎炎（ＧＮ）、グッドパスチャー症候群、痛風性関節炎、顆粒球輸血関連症候群、リンパ腫様肉芽腫症を含む肉芽腫症、多発性血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ）、肉芽腫様ブドウ膜炎、グレーブズ病、ギラン・バレー症候群、滴状乾癬、血色素尿症発作、ハーマン＝リッチ症候群、橋本病、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、ヘモクロマトーシス、溶血性貧血又は自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む免疫性溶血性貧血、溶血性貧血、血友病Ａ、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、痛覚過敏、低ガンマグロブリン血症、性腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、特発性尿崩症、特発性顔面麻痺、特発性甲状腺機能低下症、特発性ＩｇＡ腎症、特発性膜性ＧＮ又は特発性膜性腎症、特発性ネフローゼ症候群、特発性肺線維症、特発性スプルー、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＥ介在性疾患
、場合によってはアナフィラキシー及びアレルギー性又はアトピー性鼻炎、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、回腸炎レジオナリス、免疫複合体腎炎、サイトカイン及びＴ−リンパ球が介在する急性及び遅発性超過敏性を伴う免疫反応、免疫介在性ＧＮ、成人又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、感染性関節炎、抗精子抗体による不妊症、ブドウ膜全体又は一部の炎症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）炎症性過剰増殖皮膚疾患、炎症性ミオパチー、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）、膵島炎、間質性膀胱炎、間質性肺疾患、間質性肺線維症、虹彩炎、虚血再かん流障害、関節の炎症、若年性関節炎、若年性皮膚筋炎、若年性糖尿病、小児インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を含む若年性発症（Ｉ型）糖尿病、若年発症関節リウマチ、若年発症関節リウマチ、川崎病、乾性角結膜炎、キパノソミアシス、ランバート−イートン症候群、リーシュマニア症、ハンセン病、白血球減少症、白血球接着欠乏症、白血球破砕性脈管炎、白血球減少症、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、直鎖状ＩｇＡ皮膚炎、直鎖状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、レフラー症候群、ルポイド肝炎、狼瘡（腎炎、脳炎、小児、非腎臓、腎臓外、円板状、脱毛症を含む。）、狼瘡（ＳＬＥ）、播種性紅斑性狼瘡、ライム関節炎、ライム病、リンパ球様間質性肺臓炎、マラリア、男性及び女性自己免疫不妊症、上顎、中間型血管炎（川崎病及び結節性多発動脈炎を含む。）、Ｉ型及びＩＩ型を含む膜状−又は膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）及び急速進行性ＧＮ、膜性ＧＮ（膜性腎症）、メニエール病、髄膜炎、顕微鏡的大腸炎、顕微鏡的多発性血管炎、偏頭痛、微小変化型腎症、混合結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、伝染性単核球症、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多巣性運動ニューロパチー、多発性内分泌機能不全、多臓器損傷症候群、例えば敗血症、外傷又は出血に続発するもの、多臓器損傷症候群、多発性硬化症（ＭＳ）、例えば脊椎−眼ＭＳ、多発性硬化症、流行性耳下腺炎、筋障害、重症筋無力症、例えば胸腺腫を伴う重症筋無力症、重症筋無力症、心筋炎、筋炎、ナルコレプシー、壊死性腸炎及び貫壁性大腸炎及び自己免疫炎症性腸疾患、壊死性、皮膚性又は超過敏性脈管炎、新生児狼瘡症候群（ＮＬＥ）、ネフローゼ、ネフローゼ症候群、神経性疾患、視神経脊髄炎（デビック病）、視神経脊髄炎、神経性筋緊張病、好中球減少症、非癌性リンパ球増加症、非肉芽腫性ブドウ膜炎、非悪性胸腺腫、眼及び眼窩炎症性障害、眼瘢痕性類天疱瘡、卵巣炎、交感性眼炎、眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、眼球クローヌス又は眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）及び感覚ニューロパチー、視神経炎、肉芽腫性精巣炎、変形性関節症、回帰性リウマチ、膵炎、汎血球減少症、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌が関連する小児自己免疫精神神経疾患）、傍腫瘍性小脳変性症、腫瘍随伴症候群、傍腫瘍性神経症候群を含む腫瘍随伴症候群、場合によってはランバート・イートン症候群又はイートン・ランバート症候群、寄生虫症、例えばリーシュマニア、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク症候群、毛様体扁平部炎（末梢ブドウ膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群、パルボウイルス感染、類天疱瘡、例えば水疱性類天疱瘡及び皮膚類天疱瘡、天疱瘡（尋常性天疱瘡を含む。）、紅斑性天疱瘡、落葉状天疱瘡、粘膜類天疱瘡、天疱瘡、消化性潰瘍、周期性四肢麻痺、末梢ニューロパチー、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血（悪性の貧血）、悪性貧血、水晶体抗原性ブドウ膜炎、肺線維症、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型、多発性関節炎慢性プリマリア、多発性軟骨炎（例えば難治性又は再発性多発性軟骨炎）、多内分泌自己免疫疾患、多内分泌不全、多腺性症候群、場合によっては自己免疫多腺性症候群（又は多腺性内分泌障害症候群）、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性ニューロパチー、急性多発性神経根炎、開心術後症候群、後部ブドウ膜炎又は自己免疫ブドウ膜炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、連鎖球菌感染後腎炎、ワクチン接種後症候群、初老期認知症、原発性胆汁性肝硬変、原発性甲状腺機能低下症、原発性特発性粘液水腫、単クローン性Ｂ細胞リンパ球増加症を含む原発性リンパ球増加症、場合によっては良性単クローン性高ガンマグロブリン血症及び意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、ＭＧＵＳ、原発性粘液水腫、原発性進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）及び再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、進行性全身性硬化症、増殖性関節炎、乾癬、例えばプラーク性乾癬、乾癬、乾癬性関節炎、肺胞タンパク質症、肺浸潤好酸球増加症、赤芽球貧血又は癆（ＰＲＣＡ）、赤
芽球癆、化膿性又は非化膿性副鼻腔炎、膿疱性乾癬及び爪の乾癬、腎盂炎、壊疽性膿皮症、ケルバン甲状腺炎、レイノー現象、反応性関節炎、習慣性流産、血圧反応の低下、反射性交感神経性ジストロフィー、難治性スプルー、ロイター病又は症候群、再発性多発性軟骨炎、
心筋又は他の組織の再かん流傷害、再かん流傷害、呼吸窮迫症候群、むずむず脚症候群、網膜自己免疫性、後腹膜線維症、レイノー症候群、リウマチ性疾患、リウマチ熱、リウマチ、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、風疹ウイルス感染、サンプター症候群、サルコイドーシス、住血吸虫症、シュミット症候群、ＳＣＩＤ及びエプスタイン−バーウイルス関連疾患、強膜、強膜炎、肢端硬化、強皮症、場合によっては全身性強皮症、硬化性胆管炎、播種性硬化症、硬化症、例えば全身性硬化症、感音性難聴、血清反応陰性脊椎関節炎、シーハン症候群、シャルマン症候群、珪肺症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫性、蝶形骨洞炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、スティッフ・マン（又はスティッフ・パーソン）症候群、亜急性細菌心内膜炎（ＳＢＥ）、亜急性皮膚性紅斑性狼瘡、突発性難聴、スザック症候群、シドナム舞踏病、交感性眼炎、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）又は全身性紅斑性狼瘡、皮膚性ＳＬＥ、全身性壊死性脈管炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、場合によってはチャーグ・ストラウス血管炎又は症候群（ＣＳＳ）、脊髄癆、高安動脈炎、毛細血管拡張症、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、閉塞性血栓性血管炎、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）及び自己免疫又は免疫介在性血小板減少症を含む、血小板減少症、例えば慢性又は急性特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）を含む特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、甲状腺中毒症、組織損傷、トローザ・ハント症候群、中毒性表皮剥離症、毒性ショック症候群、輸血反応、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、横断性脊髄炎、横断性の脊髄炎、熱帯性肺好酸球増加症、結核、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、蕁麻疹、場合によっては慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性自己免疫蕁麻疹を含む慢性特発性蕁麻疹、ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、網膜ブドウ膜炎、弁膜炎、血管機能不全、脈管炎、椎間体性関節炎、小水疱水疱性皮膚炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫（多発性血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ））、ウィスコット・アルドリッチ症候群又はＸ連鎖高ＩｇＭ症候群である、請求項１０７から１１６の何れか１項に記載の、方法、組成物又は使用。
【請求項１１８】
別の免疫調節物質及び／又は抗原の投与をさらに具備する、請求項１０７から１１７の何れか１項に記載の、方法、組成物又は使用。
【請求項１１９】
ＴＬＲアゴニスト（ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１アゴニスト）、１型インターフェロン、場合によってはαインターフェロン又はβインターフェロン、ＣＤ４０アゴニスト、ＴＮＦアンタゴニスト又はＩＬ−６アンタゴニストから選択される別の免疫調節物質の投与をさらに具備する、請求項１０７から１１８の何れか１項に記載の、方法、組成物又は使用。
【請求項１２０】
有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質を投与することを具備する、炎症性障害を処置する方法。
【請求項１２１】
前記ＶＩＳＴＡ−Ｉｇが請求項１から７５の何れか１項に記載のタンパク質である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
処置される障害が、１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ性疾患、アレルギー性障害、喘息、アレルギー性鼻炎、皮膚障害、クローン病、潰瘍性大腸炎、移植拒絶、移植片対宿主病、連鎖球菌感染後及び自己免疫腎不全、敗血症性ショック、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）及び毒物注入；自己炎症性疾患、変形性関節症、結晶性関節炎、関節包炎、関節
症、腱炎、靱帯炎又は外傷性関節損傷から選択される、請求項１０７から１２１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２３】
処置される障害が、多発性硬化症、狼瘡又は関節リウマチである、請求項１０７から１２２の何れか１項に記載の、方法、組成物又は使用。
【請求項１２４】
有効量の有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質の投与を具備する、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置する方法。
【請求項１２５】
前記ＶＩＳＴＡ融合タンパク質が、請求項１から７１の何れか１項に記載のものである、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置用の薬剤の製造における、有効量の有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質の使用。
【請求項１２７】
前記ＶＩＳＴＡ融合タンパク質が請求項１から７１の何れか１項に記載のものである、請求項１２６に記載の使用。
【請求項１２８】
前記移植片対宿主病が、急性移植片対宿主病、慢性移植片対宿主病、幹細胞移植に伴う急性移植片対宿主病、幹細胞移植に伴う慢性移植片対宿主病、骨髄移植に伴う急性移植片対宿主病、同種血液幹細胞移植（ＨＳＣＴ）に伴う急性移植片対宿主病又は骨髄移植に伴う慢性移植片対宿主病である、請求項１２４から１２７の何れか１項に記載の、方法又は使用。
【請求項１２９】
処置される患者が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の少なくとも１つの症状を有し、場合によっては前記患者が、腹痛、腹部けいれん、下痢、発熱、黄疸、皮膚発疹、嘔吐及び体重減少を含むが限定されない、急性ＧＶＨＤを呈する、請求項１２４から１２８の何れか１項に記載の、方法、組成物又は使用。
【請求項１３０】
処置される患者が、ドライアイ、ドライマウス、脱毛、肝炎、肺障害、消化管障害、皮膚発疹及び皮膚肥厚を含むが限定されない慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の少なくとも１つの症状を有する、請求項１２４から１２９の何れか１項に記載の、方法、組成物又は使用。
【請求項１３１】
前記患者が、同種幹細胞又は骨髄移植を有するか又は受けようとしている、請求項１２４から１３０の何れか１項に記載の、方法、組成物又は使用。
【請求項１３２】
前記患者が、自己幹細胞又は骨髄移植を有するか又は受けようとしている、請求項１２４から１３１の何れか１項に記載の、方法、組成物又は使用。
【請求項１３３】
有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質を投与することを具備する、アレルギー性障害を有する個体を処置する方法。
【請求項１３４】
前記ＶＩＳＴＡ融合タンパク質が請求項１から７１の何れか１項に記載のものである、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
アレルギー性、炎症性又は自己免疫障害の処置用の薬剤の製造のための、有効量のＶＩ
ＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質の使用。
【請求項１３６】
前記ＶＩＳＴＡ融合タンパク質が請求項１から７１の何れか１項に記載のものである、請求項１３３又は１３５に記載の方法又は使用。
【請求項１３７】
前記アレルギー性、炎症性又は自己免疫障害が、乾癬、皮膚炎、アトピー性皮膚炎；全身性強皮症、硬化症；クローン病、潰瘍性大腸炎；呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群；ＡＲＤＳ）；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；湿疹、喘息、アテローム性動脈硬化症；白血球接着欠乏症；関節リウマチ；全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）；糖尿病、場合によってはＩ型糖尿病又はインスリン依存性糖尿病；多発性硬化症；レイノー症候群；自己免疫甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年性発症糖尿病；結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症及び脈管炎；悪性貧血（アジソン病）；移植片拒絶疾患、ＧＶＨＤ、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害；多臓器損傷症候群；溶血性貧血、クリオグロブリン血症又はクームス陽性貧血；重症筋無力症；抗原−抗体複合体介在性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブズ病；ランバート・イートン筋無力症候群；水疱性類天疱瘡；天疱瘡；自己免疫多腺性内分泌障害；ロイター病；スティッフ・マン症候群；ベーチェット病；巨細胞動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発性ニューロパチー；免疫血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）及び自己免疫血小板減少症から選択される、請求項７７から１３６の何れか１項に記載の方法又は使用。
【請求項１３８】
前記疾患が、関節炎、関節リウマチ、急性関節炎、慢性関節リウマチ、痛風性関節炎、急性痛風性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節炎、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、椎間体性関節炎及び若年発症関節リウマチ、変形性関節症、進行性慢性関節炎、変形性関節炎、多発性関節炎慢性プリマリア、反応性関節炎及び強直性脊椎炎）、炎症性過剰増殖皮膚疾患、乾癬、例えばプラーク性乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬及び爪の乾癬、接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、ヘルペス状皮膚炎及びアトピー性皮膚炎を含む皮膚炎、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、蕁麻疹、例えば慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性自己免疫蕁麻疹を含む慢性特発性蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性表皮剥離症、強皮症、全身性強皮症、硬化症、全身性硬化症、多発性硬化症（ＭＳ）、脊椎−眼ＭＳ、原発性進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）、再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、播種性硬化症及び失調性硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎、潰瘍性の大腸炎、潰瘍性大腸炎、顕微鏡的大腸炎、膠原線維性大腸炎、ポリープ性大腸炎、壊死性腸炎、貫壁性大腸炎、自己免疫炎症性腸疾患、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、上強膜炎、呼吸窮迫症候群、成人又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、ブドウ膜全体又は一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫血液障害、リウマチ性脊椎炎、突発性難聴、ＩｇＥ介在性疾患、例えばアナフィラキシー及びアレルギー性及びアトピー性鼻炎、脳炎、ラスムッセン脳炎、辺縁系及び／又は脳幹脳炎、ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、急性前部ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、自己免疫ブドウ膜炎、糸球体腎炎（ＧＮ）、特発性膜性ＧＮ又は特発性膜性腎症、膜状−又は膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）、急速進行性ＧＮ、アレルギー性状態、自己免疫心筋炎、白血球接着欠乏症、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）又は全身性紅斑性狼瘡、例えば皮膚性ＳＬＥ、亜急性皮膚性紅斑性狼瘡、新生児狼瘡症候群（ＮＬＥ）、播種性紅斑性狼瘡、狼瘡（腎炎、脳炎、小児、非腎臓、腎臓外、円板状、脱毛症を含む。）、小児インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を含む若年性発症（Ｉ型）糖尿病、成人発症糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、自己免疫糖尿病、特発性尿崩症、サイトカイン及びＴ−リンパ球が介在する急性及び遅発性超過敏性を伴う免疫反応、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、リンパ腫様肉芽腫症、ヴェーゲナー肉芽腫、無顆粒
球症、脈管炎を含む血管炎、大血管炎、リウマチ性多発筋痛、巨細胞（高安）動脈炎、中間型血管炎、川崎病、結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発動脈炎、ＣＮＳ脈管炎、壊死性、皮膚性、超過敏性脈管炎、全身性壊死性脈管炎及びＡＮＣＡ関連血管炎、例えばチャーグ・ストラウス血管炎又は症候群（ＣＳＳ）、側頭動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫再生不良性貧血、クームス陽性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、溶血性貧血又は自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む免疫性溶血性貧血、悪性貧血（悪性の貧血）、アジソン病、赤芽球癆貧血又は形成不全（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外漏出を含む疾患、ＣＮＳ炎症性障害、多臓器損傷症候群、例えば敗血症、外傷又は出血に続発するもの、抗原−抗体複合体介在性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット又はベーチェット病、キャッスルマン病、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、類天疱瘡、例えば水疱性類天疱瘡及び皮膚類天疱瘡、天疱瘡、場合によっては尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、粘膜類天疱瘡、紅斑性天疱瘡、自己免疫多腺性内分泌障害、ロイター病又は症候群、免疫複合体腎炎、抗体介在性腎炎、視神経脊髄炎、多発性ニューロパチー、慢性ニューロパチー、ＩｇＭ多発性ニューロパチー、ＩｇＭ介在性ニューロパチー、血小板減少症、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、自己免疫精巣炎及び卵巣炎、原発性甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）；亜急性甲状腺炎、自己免疫甲状腺疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブズ病、多腺性症候群、例えば自己免疫多腺性症候群（又は多腺性内分泌障害症候群）、傍腫瘍性神経症候群を含む腫瘍随伴症候群、例えばランバート・イートン筋無力症候群又はイートン・ランバート症候群、スティッフ・マン又はスティッフ・パーソン症候群、脳脊髄炎、アレルギー性脳脊髄炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、重症筋無力症、胸腺腫を伴う重症筋無力症、小脳変性症、神経性筋緊張病、眼球クローヌス又は眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）及び感覚ニューロパチー、多巣性運動ニューロパチー、シーハン症候群、自己免疫肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎又は自己免疫慢性活動性肝炎、リンパ球様間質性肺臓炎、細気管支炎閉塞性（非移植）ｖｓ  ＮＳＩＰ、ギラン・バレー症候群、ベルガー病（ＩｇＡ腎症）、特発性ＩｇＡ腎症、直鎖状ＩｇＡ皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、肺線維症、自己免疫消化器症候群、セリアック病、セリアック病、セリアックスプルー（グルテン腸症）、難治性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリック病）、冠動脈疾患、自己免疫耳疾患、例えば自己免疫内耳疾患（ＡＧＥＤ）、自己免疫難聴、眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、多発性軟骨炎、例えば難治性又は再発性多発性軟骨炎、肺胞タンパク質症、アミロイドーシス、強膜炎���非癌性リンパ球増加症、単クローン性Ｂ細胞リンパ球増加症を含む原発性リンパ球増加症、場合によっては良性単クローン性高ガンマグロブリン血症又は意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、ＭＧＵＳ、末梢ニューロパチー、腫瘍随伴症候群、チャネル病、例えばてんかん、偏頭痛、不整脈、筋障害、聴覚消失、失明、周期性四肢麻痺及びＣＮＳのチャネル病、自閉症、炎症性ミオパチー、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、内分泌性眼症、網膜ブドウ膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫肝臓病学的障害、線維筋痛症、多発性内分泌機能不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期認知症、脱髄性疾患、例えば自己免疫脱髄性疾患、糖尿病性ニューロパチー、ドレスラー症候群、円形脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着、レイノー現象、食道運動不全、肢端硬化）及び毛細血管拡張症）、男性及び女性自己免疫不妊症、混合結合組織疾患、シャーガス病、リウマチ熱、習慣性流産、農夫肺、多形性紅斑、開心術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性血管炎、良性リンパ球性血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えばアレルギー性肺胞炎及び線維性肺胞炎、間質性肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソミアシス、住血吸虫症、回虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症、びまん性間質性肺線維症、間質性肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、眼内炎、持続性隆
起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シャルマン症候群、フェルティー症候群、フィラリア症、毛様体炎、例えば慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、虹彩毛様体炎又はフックス毛様体炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、エコーウイルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウイルス感染、風疹ウイルス感染、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染、エプスタイン−バーウイルス感染、流行性耳下腺炎、エバンス症候群、自己免疫性腺機能不全、シドナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞多発性筋痛、内分泌性眼障害、慢性超過敏性肺臓炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性ネフローゼ症候群、微小変化型腎症、良性家族性及び虚血−再かん流傷害、網膜自己免疫性、関節の炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化性障害、アスペルミオジェネス、自己免疫溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュプュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、アレルギー性腸炎、癩性結節性紅斑、特発性顔面麻痺、慢性疲労症候群、フェブリスリウマチ、ハーマン＝リッチ症候群、感音性難聴、血色素尿症発作、性腺機能低下症、回腸炎レジオナリス、白血球減少症、伝染性単核球症、横断性の脊髄炎、原発性特発性粘液水腫、ネフローゼ、交感性眼炎、肉芽腫性精巣炎、膵炎、急性多発性神経根炎、壊疽性膿皮症、ケルバン甲状腺炎、後天性脾臓委縮症、抗精子抗体による不妊症、非悪性胸腺腫、白斑、ＳＣＩＤ及びエプスタイン−バーウイルス関連疾患、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、寄生虫症、例えばリーシュマニア、毒性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤を含む状態、白血球−接着欠乏症、サイトカイン及びＴ−リンパ球が介在する急性及び遅発性超過敏性を伴う免疫反応、白血球血管外漏出を含む疾患、多臓器損傷症候群、抗原−抗体複合体介在性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合結合組織疾患、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌不全、末梢ニューロパチー、自己免疫多腺性症候群Ｉ型、成人発症特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、全頭脱毛症、拡張型心筋症、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性又は非化膿性副鼻腔炎、急性又は慢性副鼻腔炎、篩骨、前頭骨、上顎又は蝶形骨洞炎、好酸球関連障害、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加症−筋痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸球性肺炎、熱帯性肺好酸球増加症、気管支肺アスペルギルス症、アスペルギルス腫又は好酸球を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清反応陰性脊椎関節炎、多内分泌自己免疫疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性粘膜皮膚性カンジダ症、バートン症候群、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調、膠原病に伴う自己免疫障害、リウマチ、神経性疾患、虚血再かん流障害、血圧反応の低下、血管機能不全、血管拡張症、組織損傷、心血管系虚血、痛覚過敏、脳虚血及び血管新生を伴う疾患、アレルギー性超過敏性疾患、糸球体腎炎、再かん流傷害、心筋又は他の組織の再かん流傷害、急性炎症性要素を伴う皮膚疾患、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系炎症性障害、眼及び眼窩炎症性障害、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘導性毒性、急性の重篤な炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺線維症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈障害、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎及び子宮内膜症から選択される、請求項７７から１３６の何れか１項に記載の、方法又は使用。
【請求項１３９】
少なくとも１つの他の免疫抑制剤をさらに含み、場合によっては前記他の免疫抑制剤が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４もしくはＩＣＯＳタンパク質又は、ヒトもしくは非ヒト霊長類もしくはげっ歯類ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４もしくはＩＣＯＳタンパク質の細胞外領域全体又は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００アミノ酸であるＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４もしくはＩＣＯＳタンパク質の前記細胞外領域タンパク質の断片又は１つのＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４もしくはＩＣＯＳの細胞外領域に対して又は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００アミノ酸であるその断片に対して少なくとも８０から９０もしくは９５％の配列同一性を保持する変異体を具備す
る少なくとも１つのＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４もしくはＩＣＯＳ融合タンパク質又は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４もしくはＩＣＯＳの何れかに特異的な抗体もしくは抗体断片である、請求項７７から１３８の何れか１項に記載の、方法、組成物又は使用。
【請求項１４０】
有効量の単離ＶＩＳＴＡアンタゴニストを投与することを具備する、炎症又はアレルギーの処置又は予防を必要とする対象において炎症又はアレルギーを処置又は予防する方法であって、前記アゴニストが、抗体もしくはその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせである、方法。
【請求項１４１】
有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニストを投与することを具備する、自己免疫又はアレルギー性疾患を処置する方法であって、前記アンタゴニストが、抗体もしくはその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせである、方法。
【請求項１４２】
有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニストを投与することを具備する、炎症性又はアレルギー性障害を処置する方法であって、前記アンタゴニストが、抗体もしくはその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせである、方法。
【請求項１４３】
有効量の有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニストの投与を具備する、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置する方法であって、前記アンタゴニストが、抗体もしくはその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせである、方法。
【請求項１４４】
有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニストを投与することを具備する、アレルギー性、炎症性又は自己免疫障害を有する個体を処置する方法であって、前記アゴニストが、抗体もしくはその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせである、方法。
【請求項１４５】
自己免疫疾患の処置用の薬剤の製造のための、有効量の有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニストの使用であって、前記アゴニストが、抗体もしくはその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせである、使用。
【請求項１４６】
炎症性障害の処置用の薬剤の製造のための、有効量の有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニストの使用であって、前記アゴニストが、抗体もしくはその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせである、使用。
【請求項１４７】
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置用の薬剤の製造のための、有効量の有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニストの使用であって、前記アンタゴニストが、抗体もしくはその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせである、使用。
【請求項１４８】
アレルギー性、炎症性又は自己免疫障害の処置用の薬剤の製造のための、有効量の有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニストの使用であって、前記アゴニストが、抗体もしくはその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせである、使用。
【請求項１４９】
配列番号３８から６７の何れか１つの核酸配列を具備するＶＩＳＴＡを標的とする単離ｓｉＲＮＡ。
【請求項１５０】
配列番号３８から６７の何れか１つの核酸配列からなるＶＩＳＴＡを標的とする単離ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１５１】
配列番号３８から４７の何れか１つのアミノ酸配列を具備するＶＩＳＴＡのＯＲＦ又はＵＴＲ領域の何れかを標的とする単離ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１５２】
配列番号３８から４７の何れか１つの核酸配列からなるＶＩＳＴＡのＯＲＦ又はＵＴＲ領域の何れかを標的とする単離ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１５３】
配列番号４８から５７の何れか１のアミノ酸配列を具備するＶＩＳＴＡのＵＴＲ領域のみを標的とする単離ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１５４】
配列番号４８から５７の何れか１のアミノ酸配列からなるＶＩＳＴＡのＵＴＲ領域のみを標的とする単離ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１５５】
配列番号５８から６７の何れか１つのアミノ酸配列を具備するＶＩＳＴＡのＯＲＦ領域のみを標的とする単離ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１５６】
請求項１４９から１５５の何れか１項に記載の少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子を具備する組成物。
【請求項１５７】
請求項１４９から１５５の何れか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子を具備する、アレルギー性又は炎症性障害を処置するための組成物。
【請求項１５８】
請求項１４９から１５５の何れか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子の投与を具備する、自己免疫障害を処置するための方法。
【請求項１５９】
請求項１４９から１５５の何れか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子の投与を具備する、アレルギー性又は炎症性障害を処置するための方法。
【請求項１６０】
請求項１４９から１５５の何れか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子の投与を具備する、移植片対宿主病を処置するための方法。
【請求項１６１】
自己免疫疾患の処置用の薬剤の製造のための、請求項１４９から１５５の何れか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子の使用。
【請求項１６２】
炎症性疾患の処置用の薬剤の製造のための、請求項１４９から１５５の何れか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子の使用。
【請求項１６３】
移植片対宿主病の処置用の薬剤の製造のための、請求項１４９から１５５の何れか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子の使用。
【請求項１６４】
治療的又は予防的有効量のＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質を投与することを具備する、狼瘡を処置又は予防する方法。
【請求項１６５】
前記対象が狼瘡の兆候を有するか又は遺伝的に狼瘡を発症し易い、請求項１６４に記載
の方法。
【請求項１６６】
治療的又は予防的有効量のＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質を投与することを具備する、狼瘡に伴う脾腫を処置又は予防する方法。
【請求項１６７】
治療的又は予防的有効量のＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質を投与することを具備する、狼瘡に伴う蛋白尿を処置又は予防する方法。
【請求項１６８】
治療的又は予防的有効量のＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質を投与することを具備する、狼瘡に伴う腎臓傷害を回復させる方法。
【請求項１６９】
前記ＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質が請求項１から７５の何れか１項に記載のものである、請求項１６４から１６８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７０】
前記ＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質が多量体である、請求項１６４から１６９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７１】
治療的又は予防的有効量のＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質を投与することを具備する、腎臓機能喪失又は腎臓へのマクロファージ浸潤を含む狼瘡の症状の１以上を処置又は予防する方法。
【請求項１７２】
前記ＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質が請求項１から７５の何れか１項に記載のものである、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
前記症状又は副作用が、糸球体でのＩｇ沈着、蛋白尿、プロ炎症性サイトカイン産生上昇、体重減少又は腎臓機能悪化のうち１以上を含む、請求項１７１又は１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
前記ＶＩＳＴＡ−Ｉｇが、少なくとも１つのＩｇＧ１、ＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２、ＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ３及びＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ４を具備する、請求項１６４から１７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７５】
前記ＶＩＳＴＡ−Ｉｇがクチオフィリックである、請求項１６４から１７４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７６】
前記ＶＩＳＴＡ−Ｉｇが非クチオフィリックである、請求項１６４から１７４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７７】
前記ＶＩＳＴＡ−Ｉｇが多量体である、請求項１６４から１７６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７８】
狼瘡を処置するための別の薬物の投与をさらに含む、請求項１４０から１４４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７９】
前記狼瘡薬が、ナプロキセン、イブプロフェンなどの非ステロイド性抗炎症薬、ヒドロキシクロロキン（プラケニル）などの抗マラリア薬、プレドニゾンなどのコルチコステロイド、シクロホスファミド（サイトキサン）などの免疫抑制剤、アザチオプリン（イムラン、アザサン）、ミコフェノール酸（セルセプト）、レフルノミド（アラバ）、メトトレキサート（トレキサル）などである、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
別の免疫抑制薬又は腎臓機能を改善する薬剤の投与をさらに含む、請求項１６８から１７９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８１】
前記の免疫抑制剤が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４又はＩＣＯＳタンパク質又は、細胞外領域全体もしくは少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００アミノ酸である前記細胞外領域の断片又は１つのＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４もしくはＩＣＯＳの細胞外領域の何れかに対して又は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００アミノ酸であるその断片に対して少なくとも８０から９０又は９５％の配列同一性を保持する変異体を具備する少なくとも１つのＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４もしくはＩＣＯＳ融合タンパク質、又はＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４もしくはＩＣＯＳの何れかに対して特異的な抗体もしくは抗体断片である、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
関節リウマチ、急性関節炎、慢性関節リウマチ、痛風又は痛風性関節炎、急性痛風性関節炎、急性免疫性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節炎、ＩＩ型コラーゲン誘発性関節炎、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、スティル病、椎間体性関節炎、若年発症関節リウマチ、変形性関節症、進行性慢性関節炎、変形性関節炎、多発性関節炎慢性プリマリア、反応性関節炎及び強直性脊椎炎を含む、関節炎；炎症性過剰増殖皮膚疾患；乾癬、例えばプラーク性乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬及び爪の乾癬；例えば枯草熱及びヨブ症候群などのアトピー性疾患を含むアトピー；接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、剥離性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、ヘルペス状皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激性接触皮膚炎及びアトピー性皮膚炎を含む皮膚炎；Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群；アレルギー性眼内炎症性疾患；蕁麻疹、例えば慢性アレルギー性蕁麻疹、慢性特発性蕁麻疹及び慢性自己免疫蕁麻疹；筋炎；多発性筋炎／皮膚筋炎；若年性皮膚筋炎；中毒性表皮剥離症；全身性強皮症を含む強皮症；硬化症、例えば全身性硬化症、多発性硬化症（ＭＳ）、脊椎−眼ＭＳ、原発性進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）、再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、播種性硬化症及び失調性硬化症；視神経脊髄炎（ＮＭＯ）；クローン病、自己免疫介在性胃腸疾患、大腸炎、潰瘍性の大腸炎、潰瘍性大腸炎、顕微鏡的大腸炎、膠原線維性大腸炎、ポリープ性大腸炎、壊死性腸炎、貫壁性大腸炎及び自己免疫炎症性腸疾患を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；腸の炎症；壊疽性膿皮症；結節性紅斑；原発性硬化性胆管炎；成人又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む呼吸窮迫症候群；髄膜炎；ブドウ膜全体又は一部の炎症；虹彩炎；脈絡膜炎；自己免疫血液障害；リウマチ性脊椎炎；リウマチ滑膜炎；先天的血管浮腫；髄膜炎などにおける脳神経損傷；妊娠性疱疹；妊娠性類天疱瘡；陰嚢掻痒；自己免疫早発卵巣不全；自己免疫状態による突発性難聴；ＩｇＥ介在性疾患、例えばアナフィラキシー及びアレルギー性及びアトピー性鼻炎；脳炎、例えばラスムッセン脳炎及び辺縁系及び／又は脳幹脳炎；ブドウ膜炎、例えば前部ブドウ膜炎、急性前部ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎又は自己免疫ブドウ膜炎；ネフローゼ症候群を伴うか又は伴わない糸球体腎炎（ＧＮ）、例えば慢性又は急性糸球体腎炎、原発性ＧＮ、免疫介在性ＧＮ、膜性ＧＮ（膜性腎症）、特発性膜性ＧＮ又は特発性膜性腎症、Ｉ型及びＩＩ型を含む膜状又は膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）及び急速進行性ＧＮ；増殖性腎炎；自己免疫多腺性内分泌不全；形質細胞限局性亀頭炎を含む亀頭炎；亀頭包皮炎；遠心性環状紅斑；色素異常性固定性紅斑；多形紅斑；環状肉芽腫；光沢苔癬；硬化性萎縮性苔癬；慢性単純性苔癬；棘状苔癬；扁平苔癬；層状魚鱗癬；表皮剥離性角化症；前がん性角化症；壊疽性膿皮症；アレルギー性状態及び反応；アレルギー反応；アレルギー性又はアトピー性湿疹、乾皮性湿疹、発汗異常性湿疹及び汗疱を含む、湿疹；喘息、例えば、気管支喘息、気管支の喘息及び自己免疫喘息；Ｔ細胞浸潤及び慢性炎症反応を含む状態；妊娠中の胎児Ａ−Ｂ−Ｏ血液群などの外来性抗原に対する免疫反応；慢性肺炎症性疾患；自己免疫心筋炎；白血球接着欠乏症；狼瘡腎炎、狼瘡脳炎、小児狼瘡、非腎臓狼瘡、腎臓外狼瘡、円板状狼瘡及び円板状紅
斑性狼瘡、脱毛症狼瘡、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、皮膚性ＳＬＥ、亜急性皮膚性ＳＬＥ、新生児狼瘡症候群（ＮＬＥ）及び播種性紅斑性狼瘡を含む狼瘡；小児インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を含む若年性発症（Ｉ型）糖尿病、成人発症糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、自己免疫糖尿病、特発性尿崩症、糖尿病性網膜症、糖尿病性ニューロパチー及び糖尿病性大動脈障害；サイトカイン及びＴ−リンパ球が介在する急性及び遅発性超過敏性を伴う免疫反応；結核；サルコイドーシス；リンパ腫様肉芽腫症を含む肉芽腫症；ヴェーゲナー肉芽腫；無顆粒球症；脈管炎、大型血管炎、リウマチ性多発筋痛及び巨細胞（高安）動脈炎、中型血管炎、川崎病、結節性多発動脈炎／結節性動脈周囲炎、顕微鏡的多発動脈炎、免疫血管炎、ＣＮＳ脈管炎、皮膚性脈管炎、超過敏性脈管炎、壊死性脈管炎、全身性壊死性脈管炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、チャーグ・ストラウス血管炎又は症候群（ＣＳＳ）及びＡＮＣＡ関連小血管炎を含む血管炎；側頭動脈炎；再生不良性貧血；自己免疫再生不良性貧血；クームス陽性貧血；ダイアモンド・ブラックファン貧血；自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、悪性貧血（悪性の貧血）を含む、溶血性貧血又は免疫性溶血性貧血；アジソン病；赤芽球癆貧血又は形成不全（ＰＲＣＡ）；第ＶＩＩＩ因子欠乏症；血友病Ａ；自己免疫好中球減少症；汎血球減少症；白血球減少症；白血球血管外漏出を含む疾患；ＣＮＳ炎症性障害；多臓器損傷症候群、例えば敗血症、外傷又は出血に続発するもの；抗原−抗体複合体介在性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質抗体症候群；アレルギー性神経炎；ベーチェット病／症候群；キャッスルマン症候群；グッドパスチャー症候群；レイノー症候群；シェーグレン症候群；スティーブンス・ジョンソン症候群；類天疱瘡、例えば水疱性類天疱瘡及び皮膚類天疱瘡、天疱瘡、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、粘膜類天疱瘡及び紅斑性天疱瘡；自己免疫多腺性内分泌障害；ロイター病又は症候群；熱傷；子癇前症；免疫複合体障害、例えば免疫複合体腎炎及び抗体介在性腎炎；多発性ニューロパチー；慢性ニューロパチー、例えばＩｇＭ多発性ニューロパチー及びＩｇＭ介在性ニューロパチー；血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、輸血後紫斑病（ＰＴＰ）、ヘパリン誘発性血小板減少症、自己免疫又は免疫介在性血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）及び慢性又は急性ＩＴＰを含む血小板減少症（例えば心筋梗塞患者に発症する場合）；強膜炎、例えば特発性角膜強膜炎及び上強膜炎；自己免疫精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫疾患；原発性甲状腺機能低下症；副甲状腺機能低下症；甲状腺炎、自己免疫甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）又は亜急性甲状腺炎、自己免疫甲状腺疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブズ病、多腺性症候群、自己免疫多腺性症候群及び多腺性内分泌障害症候群を含む自己免疫内分泌疾患；傍腫瘍性神経症候群を含む腫瘍随伴症候群；ランバート・イートン筋無力症候群又はイートン・ランバート症候群；スティッフ・マン又はスティッフ・パーソン症候群；脳脊髄炎、例えばアレルギー性脳脊髄炎、アレルギー性脳脊髄炎及び実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）；重症筋無力症、例えば胸腺腫を伴う重症筋無力症；小脳変性症；神経性筋緊張病；眼球クローヌス又は眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）；感覚ニューロパチー；多巣性運動ニューロパチー；シーハン症候群；自己免疫肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎及び自己免疫慢性活動性肝炎を含む肝炎；リンパ球様間質性肺臓炎（ＬＩＰ）；細気管支炎閉塞性（非移植）ｖｓ  ＮＳＩＰ；ギラン・バレー症候群；バージャー病（ＩｇＡ腎症）；特発性ＩｇＡ腎症；直鎖状ＩｇＡ皮膚炎；急性発熱性好中球皮膚炎；角層下膿疱性皮膚炎；一過性棘融解性皮膚炎；肝硬変、例えば原発性胆汁性肝硬変及び肺線維症；自己免疫消化器症候群；セリアック又はセリアック病；セリアックスプルー（グルテン腸症）；難治性スプルー；特発性スプルー；クリオグロブリン血症；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリック病）；冠動脈疾患；自己免疫耳疾患、例えば自己免疫内耳疾患（ＡＩＥＤ）；自己免疫難聴；多発性軟骨炎、例えば難治性又は再燃性又は再発性多発性軟骨炎；肺胞タンパク質症；コーガン症候群／非梅毒性間質性角膜炎；ベル麻痺；スイート病／症候群；酒さ自己免疫；帯状疱疹関連痛；アミロイドーシス；非癌性リンパ球増加症；単クローン性Ｂ細胞リンパ球増加症を含む原発性リンパ球増加症（例えば良性単クローン性高ガンマグロブリン血症及び意義不明のモノクローナル免疫グロブリン異常症、ＭＧＵＳ）；末梢ニューロパチー；チャネル病、例えばてんかん、偏頭痛、不整脈、筋
障害、聴覚消失、失明、周期性四肢麻痺及びＣＮＳのチャネル病；自閉症；炎症性ミオパチー；巣状又は分節性又は巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）；内分泌性眼症；網膜ブドウ膜炎；脈絡網膜炎；自己免疫肝臓病学的障害；線維筋痛症；多発性内分泌機能不全；シュミット症候群；副腎炎；胃萎縮；初老期認知症；脱髄性疾患、例えば自己免疫脱髄性疾患及び慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパチー；ドレスラー症候群；円形脱毛症；全頭脱毛症；ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着、レイノー現象、食道運動不全、手指硬化症及び毛細血管拡張症）；男性及び女性自己免疫不妊症（例えば抗精子抗体による。）；混合結合組織疾患；シャーガス病；リウマチ熱；習慣性流産；農夫肺；多形性紅斑；開心術後症候群；クッシング症候群；愛鳥家肺；アレルギー性肉芽腫性血管炎；良性リンパ球性血管炎；アルポート症候群；肺胞炎、例えばアレルギー性肺胞炎及び線維性肺胞炎；間質性肺疾患；輸血反応；ハンセン病；マラリア；サンター症候群；カプラン症候群；心内膜炎；心内膜心筋線維症；びまん性間質性肺線維症；間質性肺線維症；肺線維症；特発性肺線維症；嚢胞性線維症；眼内炎；持続性隆起性紅斑；胎児赤芽球症；好酸球性筋膜炎；シャルマン症候群；フェルティー症候群；フィラリア症；毛様体炎、例えば慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、虹彩毛様体炎（急性又は慢性）又はフックス毛様体炎；ヘノッホ・シェーンライン紫斑病；敗血症；内毒素血；膵炎；甲状腺中毒症；エバンス症候群；自己免疫性腺機能不全；シデナム舞踏病；連鎖球菌感染後腎炎；閉塞性血栓性血管炎；甲状腺中毒症；脊髄癆；脈絡膜炎；巨細胞多発性筋痛；慢性超過敏性肺臓炎；乾性角結膜炎；流行性角結膜炎；特発性ネフローゼ症候群；微小変化型腎症；良性家族性及び虚血−再かん流傷害；移植臓器再かん流；網膜自己免疫性；関節の炎症；気管支炎；慢性閉塞性気道／肺疾患；珪肺症；アフタ；アフタ性口内炎；動脈硬化性障害；アスペルミオジェネス；自己免疫溶血；ベック病；クリオグロブリン血症；デュピュイトラン拘縮；水晶体過敏性眼内炎；アレルギー性腸炎；癩性結節性紅斑；特発性顔面麻痺；フェブリスリウマチ；ハマンリッチ症候群；感音性難聴；血色素尿症発作；性腺機能低下症；回腸炎レジオナリス；白血球減少症；伝染性単核球症；横断性の脊髄炎；原発性特発性粘液水腫；ネフローゼ；交感性眼炎；肉芽腫性精巣炎；膵炎；急性多発性神経根炎；壊疽性膿皮症；ケルバン甲状腺炎；後天性脾臓委縮症；非悪性胸腺腫；白斑；毒性ショック症候群；食中毒；Ｔ細胞浸潤を含む状態；白血球−接着欠乏症；サイトカイン及びＴ−リンパ球が介在する急性及び遅発性超過敏性を伴う免疫反応；白血球血管外漏出を含む疾患；多臓器損傷症候群；抗原−抗体複合体介在性疾患；抗糸球体基底膜疾患；アレルギー性神経炎；自己免疫多腺性内分泌障害；卵巣炎；原発性粘液水腫；自己免疫萎縮性胃炎；交感性眼炎；リウマチ性疾患；混合結合組織疾患；ネフローゼ症候群；膵島炎；多内分泌不全；自己免疫多腺性症候群Ｉ型；成人発症特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）；心筋症、例えば拡張型心筋症；後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）；ヘモクロマトーシス；心筋炎；ネフローゼ症候群；原発性硬化性胆管炎；化膿性又は非化膿性副鼻腔炎；急性又は慢性副鼻腔炎；篩骨、前額、上顎又は蝶形骨洞炎；好酸球関連障害、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加症−筋痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸球性肺炎、熱帯性肺好酸球増加症、気管支肺アスペルギルス症、アスペルギルス腫又は好酸球を含有する肉芽腫；アナフィラキシー；血清反応陰性脊椎関節炎；多内分泌自己免疫疾患；硬化性胆管炎；慢性粘膜皮膚性カンジダ症；ブルトン症候群；乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症；ウィスコット・アルドリッチ症候群；毛細血管拡張性運動失調症候群；血管拡張；
膠原病に伴う自己免疫障害、リウマチ、神経性疾患、リンパ節炎、血圧反応の低下、血管機能不全、組織損傷、心血管系虚血、痛覚過敏、腎臓虚血、脳虚血及び血管新生を伴う疾患；アレルギー性超過敏性疾患；糸球体腎炎；再かん流傷害；虚血再かん流障害；心筋又は他の組織の再かん流傷害；リンパ腫気管気管支炎；炎症性皮膚疾患；急性炎症性要素を伴う皮膚疾患；多臓器不全；水疱症；腎臓皮質壊死；急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系炎症性障害；眼及び眼窩炎症性障害；顆粒球輸血関連症候群；サイトカイン誘導性毒性；ナルコレプシー；急性の重篤な炎症；慢性難治性炎症；腎盂炎；動脈内過形成；消化性潰瘍；弁膜炎；及び子宮内膜症から選択される状態を有する者を処置するために使用される、請求項１から１８１の何れかに記載の、方法又は使用。
【請求項１８３】
前記状態が、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、クローン病、甲状腺炎、関節リウマチ、多発性硬化症又はアレルギー性現象に関与するＩＶ型超過敏性を含むＩＶ型超過敏性及び、慢性炎症性疾患の、及び病原体の感染により生じる病態、例えばハンセン病、結核、リーシュマニア症又はリステリア症である、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
配列番号２、４、５、１６から２５、３６又は３７のポリペプチド配列の細胞外ドメインに対して少なくとも約９０％の配列同一性がある少なくとも１つのポリペプチドと、免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質と、を具備する、請求項１から７１の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ融合タンパク質。
【請求項１８５】
前記ポリペプチドが、配列番号２、４、５、１６から２５、３６もしくは３７のポリペプチド配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有する、請求項１８４に記載のタンパク質。
【請求項１８６】
前記Ｉｇタンパク質が、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＡである、請求項１８４又は１８５に記載の融合タンパク質。
【請求項１８７】
前記Ｉｇが、補体結合及び／又はＦｃＲ結合を減少させるか又は排除するように突然変異されている、請求項１８６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８８】
前記Ｉｇが、補体結合及び／又はＦｃＲ結合を増加させるか又は変化させるように突然変異されている、請求項１８６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８９】
前記Ｉｇタンパク質が、ヒトＩｇＧ１の定常及びヒンジ領域を具備する、請求項１８６から１８８の何れか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１９０】
予防的又は治療的有効量のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を投与することを具備する、多発性硬化症の処置又は予防を必要とする対象において多発性硬化症を処置するか又は予防する方法。
【請求項１９１】
前記ＶＩＳＴＡ−Ｉｇが多量体であり、及び／又は請求項１から７１の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇを具備する、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９２】
前記対象が多発性硬化症と診断されており、及び／又は遺伝的に多発性硬化症を発現するリスクがある、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９３】
予防的又は治療的有効量のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を投与することを具備する、アレルギー性呼吸器障害の処置又は予防を必要とする対象においてアレルギー性呼吸器障害を処置又は予防する方法。
【請求項１９４】
前記ＶＩＳＴＡ−Ｉｇが多量体であり、及び／又は請求項１から７１の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇを具備する、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
前記対象が、アレルギー性呼吸器障害と診断されており、及び／又は遺伝的に遺伝子型及び／又は家族歴に基づいて多発性硬化症を発現するリスクがある、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９６】
前記呼吸器障害が喘息である、請求項１９３から１９５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９７】
処置される対象が、アトピー性疾患、例えばアトピー性鼻炎又はアトピー性湿疹の病歴を有するか、βブロッカーで処置されたことがあるか、喫煙者であるか、又は、ホルムアルデヒド、煙吸入、ＲＳＶ又はライノウイルス感染、内毒素曝露又はフタル酸など、アレルギー性呼吸器障害及び／又は喘息の発症と相関する環境因子もしくは感染体に曝露されたことがあるか、又は以前枯草熱、蕁麻疹、脈管炎もしくはチャーグ・ストラウス症候群に罹患したことがある、請求項１９３から１９６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９８】
前記処置される対象が、喘息発症に相関する遺伝子又はタンパク質発現プロファイルを有する、請求項１９３から１９６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９９】
前記遺伝子又はタンパク質が、ＧＳＴＭ１、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ−４、ＳＰＩＮＫ５、ＬＴＣ４Ｓ、ＩＬ４Ｒ及びＡＤＡＭ３３を含む、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２００】
喘息を処置又は予防するために及び／又は喘息発作の発症又は重症度を軽減するために使用される別の薬物の投与をさらに含む、請求項１９３から１９９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０１】
前記喘息薬又は処置が、プロピオン酸フルチカゾン、コルチコステロイド、例えばベクロメタゾン、長時間作用型β−アドレナリン受容体アゴニスト（ＬＡＢＡ）、例えばサルメテロール又はホルモテロール、場合によっては吸入コルチコステロイドと併用、ロイコトリエンアンタゴニスト、例えばモンテルカスト又はザフィルルカスト、場合によってはＬＡＢＡと併用、肥満細胞安定化剤、例えばクロモリンナトリウム又はβ−２−アドレナリン受容体アゴニスト（ＳＡＢＡ）、例えばサルブタモール、エピネフリン、抗コリン薬、例えば臭化イプラトロピウムから選択される吸入器又は薬物である、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０２】
有効量のＶＩＳＴＡポリペプチド又は融合タンパク質の投与を具備する、自己抗原又は外来抗原又はアレルゲンに対する耐性を誘導する方法。
【請求項２０３】
Ｆｏｘｐ３＋細胞の誘導が起こる、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０４】
吸入アレルゲンに対する耐性を誘導するために使用される、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０５】
アレルギー性又は炎症性呼吸器障害を処置するために使用される、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０６】
前記ＶＩＳＴＡポリペプチド又は融合物が、注射、経口的に、経皮的に、鼻腔内に又は吸入、例えば噴霧器などにおいて、又は吸入薬を介して投与される、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０７】
喘息、ＲＳＶ感染、インフルエンザ感染又は別の肺感染性状態を処置するために使用される、請求項２０２から２０６に記載の方法。
【請求項２０８】
配列番号６８、６９、７２又は７３におけるＶＩＳＴＡポリペプチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を保持する、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物。
【請求項２０９】
配列番号６８、６９、７２又は７３におけるＶＩＳＴＡポリペプチドに対して少なくと
も９５％の配列同一性を保持する１以上のポリペプチドを含有する、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物。
【請求項２１０】
配列番号６８、６９、７２、７３又は７５におけるＶＩＳＴＡポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を保持する１以上のポリペプチドを含有する、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物。
【請求項２１１】
配列番号６８、６９、７２、７３又は７５におけるＶＩＳＴＡポリペプチドに対して少なくとも９８％の配列同一性を保持する１以上のポリペプチドを含有する、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物。
【請求項２１２】
配列番号６８、６９、７２、７３又は７５におけるＶＩＳＴＡポリペプチドに対して少なくとも９８％の配列同一性を保持する１以上のポリペプチドを含有する、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物。
【請求項２１３】
ＶＩＳＴＡ−Ｉｇポリペプチドの投与によってＴ細胞、ＮＫ細胞及び／又は骨髄細胞を特異的に標的とすることを必要とする患者においてＴ細胞、ＮＫ細胞及び／又は骨髄細胞を特異的に標的とする方法。
【請求項２１４】
アレルギー性、自己免疫又は炎症性障害を処置するための、請求項２０７から２１０の何れか１項に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇの使用。
【請求項２１５】
ＥＲＫ１／ＥＲＫ２活性化を調節するための、ＶＩＳＴＡアゴニスト又はアンタゴニストの使用。
【請求項２１６】
Ｒａｆキナーゼ阻害剤又はＭＥＫ、ｍＴＯＲ、ＨＳＰ９０、ＡＫＴ、ＰＩ３Ｋ、ＣＤＫ９、ＰＡＫ、タンパク質キナーゼＣ、ＭＡＰキナーゼ、ＭＡＰＫキナーゼ又はＥＲＫの阻害剤であるさらなる治療剤を含む、請求項２１５に記載の使用。
【請求項２１７】
タンパク質キナーゼＥｒｋ１／２の活性化が介在する疾患を処置するために使用される、請求項２１５又は２１６に記載の使用。
【請求項２１８】
前記疾患が神経変性病である、請求項２１７に記載の使用。
【請求項２１９】
前記疾患が、アルツハイマー病及び関連認知症、てんかん、パーキンソン病、ハンチントン病又は脳卒中の群から選択される病気である、請求項２１８に記載の使用。
【請求項２２０】
ＳＬＥ、乾癬、乾癬性関節炎、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患又は１型又は２型糖尿病を処置するために使用される、請求項１から２１９の何れかに記載の方法又は組成物。
【請求項２２１】
Ｅ２６９Ｒ、Ｅ２３３Ｐ、Ｄ２６５Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３３１Ｇ及びＰ３３１／Ｋ３２２Ａ突然変異のうち１又は２以上を導入するように突然変異させられているヒトＩｇＧ１
Ｆｃ領域を具備する、請求項１から２２０の何れかに記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇポリペプチド又は使用方法。
【請求項２２２】
前記Ｆｃ領域が、Ｅ２６９Ｒ及び／又はＥ２３３Ｐ突然変異を導入するように突然変異されている、請求項２２１に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇポリペプチド又は使用方法。
【請求項２２３】
前記Ｆｃ領域が、Ｃｌｑ活性を排除するか又は実質的に低下させるように突然変異され
ている、請求項２２１に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇポリペプチド又は使用方法。
【請求項２２４】
前記Ｃｌｑ突然変異がＫ３２２Ａ及び／又はＰ３３１Ｇを含む、請求項２２２に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇポリペプチド又は使用方法。
【請求項２２５】
前記Ｆｃ領域が、エフェクター機能又はグリコシル化に影響を与える１以上の他の突然変異を導入するように突然変異されている、請求項２２１に記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇポリペプチド又は使用方法。
【請求項２２６】
前記Ｆｃ領域が、Ｃｌｑ活性を排除するか又は実質的に低下させるように突然変異されている、請求項１から２２５の何れかに記載のＶＩＳＴＡ−Ｉｇポリペプチド又は使用方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本願は、２０１２年６月２２日提出の、題名「ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」の米国仮出願第６１／６６３，４３１号、２０１２年６月２５日提出の、題名「ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」の米国仮出願第６１／６６３，９６９号、２０１２年１２月１１日提出の、題名「ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」の米国仮出願第６１／７３５，７９９号、２０１３年３月１１日提出の、題名「ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」の米国仮出願第６１／７７６，２３４号、及び２０１３年４月１日提出の、題名「ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」の、米国仮出願第６１／８０７，１３５号に対する優先権を主張し、これらの仮出願の全ての内容が、それらの全体において参照により組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
発明の分野
ＶＩＳＴＡ［Ｔ細胞活性化のＶ領域免疫グロブリン含有抑制因子（ＶＩＳＴＡ）又はＰＤ−Ｌ３］は、免疫性を負の方向に制御する分子である。本発明は、自己免疫、アレルギー性及び炎症状態の処置及び／又は予防を必要とする対象において自己免疫、アレルギー性及び炎症状態を処置及び／又は予防するために全身的に投与され得る高い効力を保持するリンカーポリペプチドを具備する多量体型を含む、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇの最適化形態を含むＶＩＳＴＡ（例えばＶＩＳＴＡ−Ｉｇ）の可溶性形態の使用に関する。代表的な状態としては、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、狼瘡障害、例えば全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、円板状狼瘡、薬物誘発性狼瘡及び新生児狼瘡及びアレルギー性又は炎症性呼吸器障害、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、枯草熱、蕁麻疹、脈管炎及びチャーグ・ストラウス症候群ならびに他のアレルギー性、炎症性及び自己免疫状態、例えば上記で開示されるようなものが挙げられる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
免疫系は、同時刺激及び同時阻害性リガンド及び受容体によって厳しく調節されている。これらの分子は、自己に対する免疫性を制限しながら感染に対する免疫反応を最大化するために、Ｔ細胞活性化に対する第二のシグナルだけでなく、正及び負のシグナルのバランスの取れたネットワークも提供する。
【０００４】
免疫反応の誘導には、Ｔ細胞拡大、分化、縮小及びＴ細胞メモリーの確立が必要である。Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と遭遇し、ＡＰＣにおいてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）／主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）相互作用を介して連絡しなければならない。ＴＣＲ／ＭＨＣ相互作用が確立されたら、他の一連の受容体−リガンドがＴ細胞間で接触し、ＡＰＣ即ちＣＤ１５４／ＣＤ４０及びＣＤ２８／Ｂ７．１−Ｂ７．２を介した同時刺激が必要となる。これらの接触の間の相乗作用の結果、増殖性の免疫反応が病原体及び腫瘍を排除可能となり、自己免疫性を誘導できるようになり得る。
【０００５】
別のレベルの調節、即ち制御Ｔ細胞（Ｔreg）が同定されている。この特異的なＴ細胞
のサブセットは胸腺で産生され、末梢に運ばれ、Ｔ細胞反応の定常的及び誘導性調節が可能となる。Ｓａｋａｇｕｃｈｉ（２０００）Ｃｅｌｌ  １０１（５）：４５５−８；Ｓｈｅｖａｃｈ（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：４２３−４９；Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ及びＡｂｂａｓ（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３（３）：２５３−７。Ｔregは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋表現型により表され、高レベルの細胞毒性
Ｔリンパ球−関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ及びグルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体−関連タンパク質（ＧＩＴＲ）も発現する。ＭｃＨｕｇｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６（２）：３１１−２３；Ｓｈｉｍｉｚｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎ．３（２）：１３５−４２。５日齢新生児胸腺摘出又は抗ＣＤ２５を用いた抗体枯渇によるＴreg細胞の排出の結果、抗腫瘍反応
増大を含め、外来及び自己抗原に対するＴ細胞反応の自己免疫病変及び悪化の誘導が起こる。Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６１（１）：７２−８７；Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（３）：１１５１−６４；Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ．２：１。さらに、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体でのＴregの枯渇の結果、移
植寛容が消失し、急速に移植片拒絶が起こるので、Ｔregはまた、移植寛容の誘導及び維
持にも関連付けられている。Ｊａｒｖｉｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７６：１３７５−９。アゴニスト性のモノクローナル抗体とＴｒｅｇ表面上のＧＩＴＲを連結するとＴreg活性が急速に停止し、その結果、自己免疫病変が
生じ、移植寛容がなくなるので、Ｔregにより発現される受容体の中でもＧＩＴＲは重要
な構成要素であると思われる。
【０００６】
同時刺激及び同時阻害性リガンド及び受容体は、Ｔ細胞活性化に対する「第二のシグナル」を提供するだけでなく、自己に対する免疫性を制限しながら感染に対する免疫反応を最大化するために正及び負のシグナルのバランスの取れたネットワークも提供する。最もよく特徴が分かっている同時刺激リガンドはＢ７．１及びＢ７．２であり、これらは専門的なＡＰＣにより発現され、これらの受容体はＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４である。Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３，５１５−５４８；Ｓｈａｒｐｅ及びＦｒｅｅｍａｎ（２００２）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２，１１６−１２６。ＣＤ２８は、ナイーブ及び活性化Ｔ細胞により発現され、最適なＴ細胞活性化に非常に重要である。一方、ＣＴＬＡ−４はＴ細胞活性化時に誘導され、Ｂ７．１／Ｂ７．２に対する結合によってＴ細胞活性化を阻害し、このようにしてＣＤ２８介在性同時刺激が損なわれる。ＣＴＬＡ−４はまた、その細胞質ＩＴＩＭモチーフを通じて負のシグナルも伝達する。Ｔｅｆｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４，６５−９７。Ｂ７．１／Ｂ７．２  ＫＯマウスは適応免疫反応が損なわれており（Ｂｏｒｒｉｅｌｌｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６，３０３−３１３；Ｆｒｅｅｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２，９０７−９０９）、一方で、ＣＴＬＡ−４  ＫＯマウスは、炎症を正しく調節することができず、全身性の自己免疫疾患を発現する。Ｃｈａｍｂｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７，８８５−８９５；Ｔｉｖｏｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３，５４１−５４７；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０，９８５−９８８。Ｂ７ファミリーリガンドは、拡大し、同時刺激Ｂ７−Ｈ２（ＩＣＯＳリガンド）及びＢ７−Ｈ３、ならびに同時阻害Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ４（Ｂ７Ｓ１又はＢ７ｘ）及びＢ７−Ｈ６を含むようになっている。Ｂｒａｎｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０６，１４９５−１５０３；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：５１５−５４８参照。
【０００７】
誘導性同時刺激（ＩＣＯＳ）分子は、活性化Ｔ細胞上で発現され、Ｂ７−Ｈ２と結合する。Ｙｏｓｈｉｎａｇａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４０２，８２７−８
３２参照。ＩＣＯＳは、Ｔ細胞活性化、分化及び機能に重要であり、また、Ｔヘルパー細胞誘導性Ｂ細胞活性化、Ｉｇクラススイッチング及び胚中心（ＧＣ）形成に必須である。Ｄｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９，９７−１０１；Ｔａｆｕｒｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９，１０５−１０９；Ｙｏｓｈｉｎａｇａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４０２，８２７−８３２。一方でプログラム細胞死１（ＰＤ−１）はＴ細胞反応を負に制御する。ＰＤ−１  ＫＯマウスは、遺伝的背景によって、狼瘡様の自己免疫疾患又は自己免疫拡張型心筋症を発現する。Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１，１４１−１５１。Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：３１９−３２２。自己免疫性はおそらくは、両リガンドＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２によるシグナル伝達喪失の結果であると思われる。最近、ＣＤ８０が、阻害シグナルをＴ細胞に伝達するＰＤ−Ｌ１に対する第二の受容体として同定された。Ｂｕｔｔｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２７：１１１−１２２。Ｂ７−Ｈ３及びＢ７−Ｈ４に対する受容体は未だ不明である。
【０００８】
最もよく特徴が分かっている同時刺激リガンドはＢ７．１及びＢ７．２であり、これらはＩｇスーパーファミリーに属し、専門的なＡＰＣ上で発現され、これらの受容体はＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４である。Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｎｎｕ
Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：５１５−５４８。ＣＤ２８はナイーブ及び活性化Ｔ細胞により発現され、最適なＴ細胞活性化に非常に重要である。一方、ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞活性化時に誘導され、Ｂ７．１／Ｂ７．２への結合によってＴ細胞活性化を阻害し、ＣＤ２８介在性同時刺激が損なわれる。Ｂ７．１及びＢ７．２ＫＯマウスは適応免疫反応を損なっており（Ｂｏｒｒｉｅｌｌｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６：３０３−３１３）、一方でＣＴＬＡ−４  ＫＯマウスは炎症を正しく調節することができず、全身性自己免疫疾患を発現する。Ｔｉｖｏｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：５４１−５４７；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：９８５−９８８；Ｃｈａｍｂｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：８８５−８９５。
【０００９】
Ｂ７ファミリーリガンドは拡大しており、同時刺激Ｂ７−Ｈ２（誘導性Ｔ細胞同時刺激物質［ＩＣＯＳ］リガンド）及びＢ７−Ｈ３、ならびに同時阻害Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ４（Ｂ７Ｓ１又はＢ７ｘ）及びＢ７−Ｈ６を含むようになっている。Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：５１５−５４８；Ｂｒａｎｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０６：１４９５−１５０３。従って、さらなるＣＤ２８ファミリー受容体が同定された。ＩＣＯＳは、活性化Ｔ細胞上で発現され、Ｂ７−Ｈ２に結合する。ＩＣＯＳは、正の同時制御因子であり、Ｔ細胞活性化、分化及び機能に重要である。Ｙｏｓｈｉｎａｇａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：８２７−８３２；Ｄｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８１：２８１−２８７。一方、ＰＤ−１（プログラム死１）はＴ細胞反応を負に制御する。ＰＤ−１ＫＯマウスは狼瘡様自己免疫疾患又は自己免疫拡張型心筋症を発現した。Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１：１４１−１５１；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：３１９−３２２。自己免疫性はおそらくは、両リガンドＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２によるシグナル伝達喪失の結果であると思われる。最近、ＣＤ８０が、阻害シグナルをＴ細胞に伝達するＰＤ−Ｌ１に対する第二の受容体として同定された。Ｂｕｔｔｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２７：１１１−１２２。
【００１０】
この２つの阻害Ｂ７ファミリーリガンド、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２の発現パターンは異なる。ＰＤ−Ｌ２はＤＣ及びマクロファージ上で誘導性に発現され、一方でＰＤ−Ｌ１
は、造血細胞及び非造血細胞型の両方で広く発現される。Ｏｋａｚａｋｉ及びＨｏｎｊｏ（２００６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（４）：１９５−２０１；Ｋｅｉｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：６７７−７０４。ＰＤ−１受容体の免疫抑制的な役割と一致して、ＰＤ−Ｌ１-/-及びＰＤ−Ｌ２-/-マウスを用いた研究から、両リガンドがＴ細胞増殖及びサイトカイン産生の阻害において重複する役割を有することが示されている。Ｋｅｉｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５（１１）：７３７２−９。ＰＤ−Ｌ１欠乏症は、自己免疫糖尿病の非肥満糖尿病性モデル及び多発性硬化症（実験的自己免疫脳脊髄炎［ＥＡＥ］）のマウスモデルの両方において疾患進行を促進する。Ａｎｓａｒｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８：６３−６９；Ｓａｌａｍａ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８：７１−７８；Ｌａｔｃｈｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０１：１０６９１−１０６９６。ＰＤ−Ｌ１-/-Ｔ細胞は、両疾患モデルにおいてプロ炎症性サイトカインレベルを上昇させる。さらに
、ＢＭキメラ実験から、ＰＤ−Ｌ１の組織発現（即ち膵臓内）が、炎症を局所性に調節するその能力に唯一寄与することが明らかになっている。Ｋｅｉｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３：８８３−８９５；Ｋｅｉｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：５０６４−５０７０；Ｇｒａｂｉｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１６：２０６２−２０７１。ＰＤ−Ｌ１はまた、胎盤合胞体栄養細胞上で高度に発現され、同種胎児に対する母子免疫反応を慎重に調節する。Ｇｕｌｅｒｉａ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２：２３１−２３７。
【００１１】
その免疫抑制的な役割と一致して、ＰＤ−Ｌ１は、抗腫瘍免疫反応を強力に抑制し、腫瘍が免疫監視を逃れるのを促す。ＰＤ−Ｌ１は、高レベルのＰＤ−１を発現する、浸潤性の細胞毒性ＣＤ８+Ｔ細胞のアポトーシスを誘導し得る。Ｄｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０
０２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７９３−８００；Ｄｏｎｇ及びＣｈｅｎ（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８１：２８１−２８７。他の免疫療法と組み合わせてＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１シグナル伝達経路を遮断することにより、抗腫瘍ＣＴＬ活性及びサイトカイン産生を促進することによって腫瘍進行が阻止される。Ｉｗａｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１２２９３−１２２９７；Ｂｌａｎｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：１１４０−１１４５；Ｂｌａｎｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５４：３０７−３１４；Ｇｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １１８：２６５７−２６６４。ＤＣ上でのＰＤ−Ｌ１発現は、適応Ｆｏｘｐ３+ＣＤ
４+制御Ｔ細胞（Ｔreg細胞）の誘導を促進し、ＰＤ−Ｌ１は、腫瘍微小環境内でのＴreg
細胞の強力な誘導因子である。Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：９３３１−９３３６。Ｂ７ファミリー制御分子を標的とすることにおける最近の進歩は、自己免疫性などの免疫関連疾患及び癌の処置における明るい見通しを示す。Ｋｅｉｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：６７７−７０４；Ｚｏｕ及びＣｈｅｎ（２００８）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：４６７−４７７。
【００１２】
自己免疫疾患
〔0012〕  自己免疫障害は、免疫系が誤って健康な身体組織を攻撃し、破壊する際に起こる状態である。８０を超える様々なタイプの自己免疫障害がある。通常、免疫系の白血球は、抗原と呼ばれる有害物質からの身体の防御を助ける。抗原の例としては、細菌、ウイルス、毒素、癌細胞及び別の人間もしくは種からの血液もしくは組織が挙げられる。免疫系は、これらの有害物質を破壊する抗体を産生する。しかし自己免疫障害がある患者において、免疫系は、自己と非自己（例えば健康な組織と外来抗原）とを区別できない。その結果、正常な身体組織を免疫反応が破壊する。この反応は、アレルギー性状態における反
応と同様の超過敏性反応である。アレルギーにおいて、免疫系は、それが通常は無視する外部物質に反応する。自己免疫障害により、免疫系は、それが通常は無視する正常身体組織に反応し、その原因は不明である。
【００１３】
自己免疫障害の結果、１以上の型の身体組織の破壊、器官の異常な成長及び器官機能の変化が起こり得、１以上の器官又は組織型に影響を与え得る。自己免疫障害により一般に影響を受ける器官及び組織としては、血管、結合組織、内分泌腺（例えば甲状腺又は膵臓）、関節、筋肉、赤血球細胞及び皮膚が挙げられる。ヒトは同時に複数の自己免疫障害を有し得る。
【００１４】
自己免疫疾患の症状は、疾患及び異常な免疫反応の位置に基づき変動する。自己免疫疾患に伴い生じることが多い一般的な症状としては、疲労、発熱及び全身違和感（不快感）が挙げられる。自己免疫障害を診断するために行われ得る検査としては、抗核抗体検査、自己抗体検査、ＣＢＣ、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）及び赤血球沈降速度（ＥＳＲ）が挙げられ得る。
【００１５】
免疫系の反応を調節するか又は低下させるために、薬物が処方されることが多い。これらは、免疫抑制薬と呼ばれることが多い。このような薬剤としては、コルチコステロイド（プレドニゾンなど）及びアザチオプリン、シクロホスファミド、ミコフェノール酸、シロリムス又はタクロリムスなどの非ステロイド薬が挙げられる。
【００１６】
合併症は普通であり、疾患に依存する。免疫系を抑制するために使用される薬物の副作用は重篤であり得、例えば調節困難であり得る感染などである。「Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ
ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．」ＭｅｄｌｉｎｅＰｌｕｓ−Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１２年４月１９日）。
【００１７】
炎症状態
〔0017〕  炎症は、病原体、損傷細胞又は刺激などの有害刺激に対する血管組織の複雑な生体反応の一部である。炎症は、有害な刺激を除去し、治癒過程を開始するための生物による防御的な試みである。炎症なくしては創傷及び感染は治癒しない。同様に、組織の進行性の破壊により生物を生命の危険にさらす。しかし、慢性炎症は、枯草熱、歯周炎、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ及びさらに癌（例えば膀胱癌）など、多くの疾患へともつながり得る。
【００１８】
炎症は、急性又は慢性の何れかに分類され得る。急性炎症は有害刺激に対する身体の最初の反応であり、血液から損傷組織への血漿及び白血球（特に顆粒球）の移動の増加により達成される。生化学的事象のカスケードは、損傷組織内の局所の血管系、免疫系及び様々な細胞を伴う炎症反応を伝搬させ、成熟させる。慢性炎症として知られる長引く炎症は、炎症部位に存在する細胞型における進行性の変遷につながり、炎症性過程からの組織の同時に起こる破壊及び治癒を特徴とする。Ｋｉｎｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ［６th  Ｅｄ．］。
【００１９】
Ｔ細胞は、炎症の広がりに関与する。ナイーブＴ細胞の分化は、様々な免疫機能を発揮するためにそれぞれが異なるサイトカイン発現プロファイルを保持するＴ細胞サブセットの産生につながる。個々のシグナル伝達経路の活性化を通じて、この過程の結果、Ｔｈ１、Ｔｈ２及びＴｈ１７と呼ばれる分化したヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞が生じ、Ｔｈ細胞を抑制する制御Ｔ細胞が誘導される。これらの異なる細胞は、感染性疾患及び癌に対処するために重要であるが；異常である場合、これらは慢性炎症性疾患の原因となり得る。あるこのような疾患が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）であり、各Ｔ細胞サブセットが疾患において役割を有し得る。Ｚｅｎｅｗｉｃｚ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １５（５）：１９９−２０７。従って、Ｔ細胞は、自己免疫障害及び炎症状態の両方に関与し、当技術分野で自己免疫障害及び炎症状態の処置のためのＴ細胞の活性を調整し得る新規分子が必要とされている。
【発明の概要】
【００２０】
本発明は、自己免疫、アレルギー性及び炎症状態の処置及び／又は予防を必要とする対象において自己免疫、アレルギー性及び炎症状態を処置及び／又は予防するために全身的に投与され得る高い効力を保持するリンカーポリペプチドを具備する多量体型を含む、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇの最適化形態を含むＶＩＳＴＡ（例えばＶＩＳＴＡ−Ｉｇ）の可溶性形態の使用に関する。代表的な状態としては、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、狼瘡障害、例えば全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、円板状狼瘡、薬物誘発性狼瘡及び新生児狼瘡及びアレルギー性又は炎症性呼吸器障害、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、枯草熱、蕁麻疹、脈管炎及びチャーグ・ストラウス症候群ならびに他のアレルギー性、炎症性及び自己免疫状態、例えば上記で開示されるものなどが挙げられる。
【００２１】
本発明はまた、１以上の（即ち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上のコピーの、配列番号２、４、５、１６から２５、３６又は３７のポリペプチド配列の細胞外ドメイン又は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸である断片に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチドと、１以上の免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質と、場合によっては、融合ポリペプチド中でＶＩＳＴＡポリペプチドに介入するリンカーペプチドと、別のポリペプチド、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域などのＩｇポリペプチド又はＩｇポリペプチドが場合によっては補体結合及び／又はＦｃＲ結合を変化（増加、変化又は減少）させるように突然変異されているものであり得る断片と、を具備する、改善されたＶＩＳＴＡ融合タンパク質も提供する。
【００２２】
ある実施形態において、本ポリペプチドは、配列番号２、４、５、１６から２５、３６もしくは３７のポリペプチド配列又は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸である断片に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有し得る。
【００２３】
ある実施形態において、Ｉｇタンパク質は、場合によっては補体結合及び／又はＦｃＲ結合を変化（増加、変化又は減少）させるように突然変異されているものであり得る、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＡであり得る。ある実施形態において、Ｉｇタンパク質は、ヒトＩｇＧ１の定常及びヒンジ領域であり得、場合によっては補体結合及び／又はＦｃＲ結合を変化（増加、変化又は減少）させるように突然変異されているものであり得る。
【００２４】
ある実施形態において、融合ポリペプチド中のＶＩＳＴＡの細胞外ドメインは、アミノ酸残基３２から１９０に対して又はアミノ酸１６から１９４を具備し得るＶＩＳＴＡの細胞外ＩｇＶドメインに対して少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％同一であるポリペプチドを具備する。ある実施形態において、本融合タンパク質は、少なくとも２コピーのＶＩＳＴＡタンパク質又は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸である断片と、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａと、を具備する。別の実施形態において、本融合タンパク質は、場合によってはペプチドリンカー、例えば得られる融合ポリペプチドの効力を向上させるセリン及び／又はグリシン残基を具備するリンカーにより介入される、少なくとも３又は４コピーのＶＩＳＴＡタンパク質及びＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａを具備する。
【００２５】
ある実施形態において、本融合タンパク質は少なくとも２コピーのＶＩＳＴＡタンパク
質と、ＩｇＧ１  Ｆｃ又は非ＦｃＲ−結合ＩｇＧ１と、を具備する。ある実施形態において、本融合タンパク質は、少なくとも４、５又は６コピーのＩＳＴＡタンパク質と、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａと、を具備する。ある実施形態において、本融合タンパク質は、少なくとも４コピーのＶＩＳＴＡタンパク質と、ＩｇＧ１  Ｆｃ又は非ＦｃＲ−結合ＩｇＧ１と、を具備する。
【００２６】
ある実施形態において、単離多量体ＶＩＳＴＡタンパク質は、配列番号２、４又は２５のポリペプチド配列を具備し得る細胞外ドメイン又は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸である断片に対して少なくとも約９０％の配列同一性である、少なくとも２コピーのポリペプチドを具備し得る。別の実施形態において、本ポリペプチドは、配列番号２、４、５、１６から２５、３６もしくは３７のポリペプチド配列又は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸である断片に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有し得る。別の実施形態において、本ポリペプチドは、少なくとも５０アミノ酸長であり得る、このＶＩＳＴＡポリペプチドの細胞外ドメインの断片又は少なくとも７５、１００、１５０、２００、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸である断片に対して、少なくとも約９０％の配列同一性を有し得る。
【００２７】
別の実施形態において、本ＶＩＳＴＡポリペプチドの細胞外ドメインの断片は、少なくとも約７５アミノ酸長であり得る。別の実施形態において、本ＶＩＳＴＡポリペプチドの細胞外ドメインの断片は、少なくとも約１００アミノ酸長であり得る。別の実施形態において、本ＶＩＳＴＡポリペプチドの細胞外ドメインの断片は、少なくとも約１２５アミノ酸長であり得る。
【００２８】
別の実施形態において、多量体ＶＩＳＴＡタンパク質は、少なくとも３コピーの本細胞外ドメイン又はその断片を具備する。別の実施形態において、多量体ＶＩＳＴＡタンパク質は、少なくとも４コピーの本細胞外ドメイン又はその断片を具備する。別の実施形態において、多量体ＶＩＳＴＡタンパク質は、少なくとも５コピーの本細胞外ドメイン又はその断片を具備する。別の実施形態において、多量体ＶＩＳＴＡタンパク質は、少なくとも６コピーの細胞外ドメイン又はその断片を具備する。
【００２９】
別の実施形態において、細胞外ドメイン又はＶＩＳＴＡの断片は、オリゴマー化ドメインのＮ−末端に連結され得る。別の実施形態において、オリゴマー化ドメインは、ＧＣＮ４、ＣＯＭＰ、ＳＮＡＲＥ、ＣＭＰ、ＭＡＴ、１個のＮＬＲＣを含有するＬＬＲ、ＮＯＤ２ヌクレオチド−結合ＮＬＲＣ２、１個のＮＬＲＣを含有するＬＲＲ  ＮＯＤ２ヌクレオチド−結合ＮＬＲＣ２又はＰＳＯＲＡＳ１である。
【００３０】
ある実施形態において、組成物は、ＶＩＳＴＡ融合タンパク質を具備し得る。ある実施形態において、組成物は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質を具備し得る。別の実施形態において、本組成物は医薬組成物であり得る。別の実施形態において、本医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、アジュバント又は溶液を具備し得る。別の実施形態において、本組成物は、少なくとも１つの他の免疫抑制剤をさらに具備し得る。別の実施形態において、本免疫抑制剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳタンパク質又は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸である断片又は前述のものの何れかに特異的な抗体であり得る。
【００３１】
ある実施形態において、炎症の処置又は予防を必要とする対象において炎症を処置又は予防する方法は、有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質を投与することを具備し得る。
【００３２】
ある実施形態において、炎症を処置又は予防するための組成物は、有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質を投与することを具備し得る。
【００３３】
別の実施形態において、炎症を処置するための薬剤の製造のための有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質の使用。
【００３４】
別の実施形態において、対象は炎症性状態を有し得る。
【００３５】
別の実施形態において、炎症性状態は、酸逆流／胸焼け、ざ瘡、尋常性ざ瘡、アレルギー及び過敏症、アルツハイマー病、喘息、アテローム性動脈硬化症及び血管閉塞性疾患、場合によってはアテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患、心筋梗塞、脳卒中、末梢血管疾患又は血管ステント再狭窄、自己免疫疾患、気管支炎、癌、心炎、白内障、セリアック病、慢性痛、慢性前立腺炎、肝硬変、大腸炎、結合組織疾患、場合によっては全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎又はシェーグレン症候群、角膜疾患、クローン病、結晶性関節症、場合によっては痛風、偽痛風、ピロリン酸カルシウム結晶沈着症、認知症、皮膚炎、糖尿病、ドライアイ、湿疹、浮腫、肺気腫、線維筋痛症、胃腸炎、歯肉炎、糸球体腎炎、心疾患、肝炎、高血圧、超過敏症、炎症性腸疾患、外傷又は虚血の結果を含む炎症状態、インスリン抵抗性、間質性膀胱炎、虹彩毛様体炎、虹彩炎、関節痛、関節炎、関節リウマチ、ライム病、メタボリックシンドローム（シンドロームＸ）、多発性硬化症、筋炎、腎炎、肥満、ブドウ膜炎を含む眼疾患、骨減少、骨粗しょう症、パーキンソン病、骨盤炎症性疾患、歯周病、多発動脈炎、多発性軟骨炎、リウマチ性多発筋痛、乾癬、再かん流傷害、関節リウマチ、リウマチ性疾患、場合によっては関節リウマチ、変形性関節症又は乾癬性関節炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、副鼻腔炎、シェーグレン症候群、けいれん性結腸、脊椎関節症、場合によっては強直性脊椎炎、反応性関節炎又はライター症候群、全身性カンジダ症、腱炎、移植拒絶、ＵＴＩ’ｓ、膣炎、アテローム性動脈硬化性の血管疾患を含む血管疾患、血管炎、場合によっては結節性多発動脈炎、ヴェーゲナー肉芽腫、チャーグ・ストラウス症候群又は脈管炎であり得る。
【００３６】
ある実施形態において、自己免疫疾患を処置する方法は、有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質を投与することを具備し得る。
【００３７】
ある実施形態において、自己免疫疾患を処置するための組成物は、有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質を投与することを具備し得る。
【００３８】
別の実施形態において、自己免疫疾患の治療の薬剤の製造のための有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質の使用。
【００３９】
別の実施形態において、自己免疫疾患は細胞介在性自己免疫疾患であり得る。
【００４０】
別の実施形態において、細胞介在性自己免疫疾患は、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、卵巣炎又は甲状腺炎であり得る。
【００４１】
別の実施形態において、自己免疫疾患は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、後天性脾臓委縮症、急性前部ブドウ膜炎、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性痛風性関節炎、急性壊死性出血性白質脳炎、急性又は慢性副鼻腔炎、急性化膿性髄膜炎（又は他の中枢
神経系炎症性障害）、急性の重篤な炎症、アジソン病、副腎炎、成人発症糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、成人発症特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、無ガンマグロブリン血症、無顆粒球症、血管炎を含む脈管炎、場合によっては大血管脈管炎、場合によってはリウマチ性多発筋痛及び巨細胞（高安）関節炎、アレルギー性状態、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、アレルギー性超過敏性疾患、アレルギー性神経炎、アレルギー反応、円形脱毛症、全頭脱毛症、アルポート症候群、肺胞炎、場合によってはアレルギー性肺胞炎又は線維性肺胞炎、アルツハイマー病、アミロイドーシス、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリック病）、好酸球関連障害、場合によっては好酸球増加症、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、血管拡張症、抗体介在性腎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗原−抗体複合体介在性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、アフタ、アフタ性口内炎、再生不良性貧血、不整脈、動脈硬化症、動脈硬化性障害、関節炎、場合によっては関節リウマチ、例えば急性関節炎又は慢性関節リウマチ、進行性慢性関節炎、変形性関節炎、回虫症、アスペルギルス腫、好酸球を含有する肉芽腫、アスペルギルス症、アスペルミオジェネス、喘息、場合によっては気管支喘息、気管支の喘息又は自己免疫喘息、毛細血管拡張性運動失調、失調性硬化症、アテローム性動脈硬化症、自閉症、自己免疫血管浮腫、自己免疫再生不良性貧血、自己免疫萎縮性胃炎、自己免疫糖尿病、自己免疫精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫疾患、膠原病に伴う自己免疫障害、自己免疫自律神経障害、自己免疫耳疾患、場合によっては自己免疫内耳疾患（ＡＧＥＤ）、甲状腺炎、例えば自己免疫甲状腺炎を含む自己免疫内分泌疾患、自己免疫消化器症候群、自己免疫性腺機能不全、自己免疫難聴、自己免疫溶血、自己免疫肝炎、自己免疫肝臓病学的障害、自己免疫高脂血症、自己免疫不全症、自己免疫内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫心筋炎、自己免疫好中球減少症、自己免疫膵炎、自己免疫多腺性内分泌障害、自己免疫多腺性症候群Ｉ型、自己免疫網膜症、自己免疫血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫甲状腺疾患、自己免疫蕁麻疹、自己免疫介在性胃腸疾患、軸索及びニューロンのニューロパチー、バロー病、ベーチェット病、良性家族性及び虚血−再かん流傷害、良性リンパ球性血管炎、ベルガー病（ＩｇＡ腎症）、愛鳥家肺、失明、ベック病、細気管支炎閉塞性（非移植）ｖｓ  ＮＳＩＰ、気管支炎、気管支肺アスペルギルス症、バートン症候群、水疱性類天疱瘡、カプラン症候群、心筋症、心血管系虚血、キャッスルマン病、セリアック病、セリアックスプルー（グルテン腸症）、小脳変性症、脳虚血及び血管新生を伴う疾患、シャーガス病、チャネル病、場合によってはてんかん、ＣＮＳのチャネル病、脈絡網膜炎、脈絡膜炎、自己免疫血液障害、慢性活動性肝炎又は自己免疫慢性活動性肝炎、慢性接触皮膚炎、慢性好酸球性肺炎、慢性疲労症候群、慢性肝炎、慢性超過敏性肺臓炎、慢性炎症性関節炎、慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性難治性炎症、慢性粘膜皮膚性カンジダ症、慢性ニューロパチー、���合によってはＩｇＭ多発性ニューロパチー又はＩｇＭ介在性ニューロパチー、慢性閉塞性気道疾患、慢性肺炎症性疾患、慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）又は亜急性甲状腺炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、ＣＮＳ炎症性障害、ＣＮＳ脈管炎、セリアック病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、ポリープ性大腸炎、大腸炎、例えば潰瘍性の大腸炎、潰瘍性大腸炎、膠原線維性大腸炎、Ｔ細胞浸潤及び慢性炎症反応を含む状態、先天性心臓ブロック、先天性風疹感染、クームス陽性貧血、冠動脈疾患、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着、レイノー現象）、クローン病、クリオグロブリン血症、クッシング症候群、毛様体炎、場合によっては慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、虹彩毛様体炎又はフックス毛様体炎、嚢胞性線維症、サイトカイン誘導性毒性、聴覚消失、変形性関節炎、脱髄性疾患、場合によっては自己免疫脱髄性疾患、脱髄性ニューロパチー、デング熱、ヘルペス状皮膚炎及びアトピー性皮膚炎、接触皮膚炎を含む皮膚炎、皮膚筋炎、急性炎症性要素を伴う皮膚疾患、デビック病（視神経脊髄炎）、糖尿病性大動脈障害、糖尿病性ニューロパチー、糖尿病性網膜症、ダイアモンド・ブラックファン貧血、びまん性間質性肺線維症、拡張型心筋症、円板状狼瘡、白血球血管外漏出を含む疾患、ドレスラー症候群、デュプュイトラン拘縮、エコーウイルス感染、アレルギー性又はアトピー性湿疹を含む湿疹、脳炎、
例えばラスムッセン脳炎及び辺縁系及び／又は脳幹脳炎、脳脊髄炎、場合によってはアレルギー性脳脊髄炎又はアレルギー性脳脊髄炎及び実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、動脈内過形成、心内膜炎、内分泌性眼障害、子宮内膜症、心内膜心筋線維症、水晶体過敏性眼内炎、眼内炎、アレルギー性腸炎、好酸球増加症−筋痛症候群、好酸球性筋膜炎、流行性角結膜炎、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、上強膜、上強膜炎、エプスタイン−バーウイルス感染、持続性隆起性紅斑、多形性紅斑、癩性結節性紅斑、結節性紅斑、胎児赤芽球症、食道運動不全、本態性混合型クリオグロブリン血症、篩骨、エバンス症候群、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、農夫肺、フェブリスリウマチ、フェルティー症候群、線維筋痛症、線維性肺胞炎、フィラリア症、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、食中毒、前頭骨、胃萎縮、巨細胞関節炎（側頭関節炎）、巨細胞肝炎、巨細胞多発性筋痛、糸球体腎炎、ネフローゼ症候群を伴う、及び伴わない糸球体腎炎（ＧＮ）、例えば慢性又は急性糸球体腎炎（例えば原発性ＧＮ）、グッドパスチャー症候群、痛風性関節炎、顆粒球輸血関連症候群、リンパ腫様肉芽腫症を含む肉芽腫症、多発性血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ）、肉芽腫性ブドウ膜炎、グレーブズ病、ギラン・バレー症候群、滴状乾癬、血色素尿症発作、ハーマン＝リッチ症候群、橋本病、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、ヘモクロマトーシス、溶血性貧血又は自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む免疫性溶血性貧血、溶血性貧血、血友病Ａ、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、痛覚過敏、低ガンマグロブリン血症、性腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、特発性尿崩症、特発性顔面麻痺、特発性甲状腺機能低下症、特発性ＩｇＡ腎症、特発性膜性ＧＮ又は特発性膜性腎症、特発性ネフローゼ症候群、特発性肺線維症、特発性スプルー、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＥ介在性疾患、場合によってはアナフィラキシー及びアレルギー性又はアトピー性鼻炎、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、回腸炎レジオナリス、免疫複合体腎炎、サイトカイン及びＴ−リンパ球が介在する急性及び遅発性超過敏性を伴う免疫反応、免疫介在性ＧＮ、成人又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、感染性関節炎、抗精子抗体による不妊症、ブドウ膜全体又は一部の炎症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）炎症性過剰増殖皮膚疾患、炎症性ミオパチー、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）、膵島炎、間質性膀胱炎、間質性肺疾患、間質性肺線維症、虹彩炎、虚血再かん流障害、関節の炎症、若年性関節炎、若年性皮膚筋炎、若年性糖尿病、小児インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を含む若年性発症（Ｉ型）糖尿病、若年発症関節リウマチ、川崎病、乾性角結膜炎、キパノソミアシス、ランバート−イートン症候群、リーシュマニア症、ハンセン病、白血球減少症、白血球接着欠乏症、白血球破砕性脈管炎、白血球減少症、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、直鎖状ＩｇＡ皮膚炎、直鎖状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、レフラー症候群、ルポイド肝炎、狼瘡（腎炎、脳炎、小児、非腎臓、腎臓外、円板状、脱毛症を含む。）、狼瘡（ＳＬＥ）、播種性紅斑性狼瘡、ライム関節炎、ライム病、リンパ球様間質性肺臓炎、マラリア、男性及び女性自己免疫不妊症、上顎、中間型血管炎（川崎病及び結節性多発動脈炎を含む。）、Ｉ型及びＩＩ型を含む膜状−又は膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）及び急速進行性ＧＮ、膜性ＧＮ（膜性腎症）、メニエール病、髄膜炎、顕微鏡的大腸炎、顕微鏡的多発性血管炎、偏頭痛、微小変化型腎症、混合結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、伝染性単核球症、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多巣性運動ニューロパチー、多発性内分泌機能不全、多臓器損傷症候群、例えば敗血症、外傷又は出血に続発するもの、多臓器損傷症候群、多発性硬化症（ＭＳ）、例えば脊椎−眼ＭＳ、多発性硬化症、流行性耳下腺炎、筋障害、重症筋無力症、例えば胸腺腫を伴う重症筋無力症、重症筋無力症、心筋炎、筋炎、ナルコレプシー、壊死性腸炎及び貫壁性大腸炎及び自己免疫炎症性腸疾患、壊死性、皮膚性又は超過敏性脈管炎、新生児狼瘡症候群（ＮＬＥ）、ネフローゼ、ネフローゼ症候群、神経性疾患、視神経脊髄炎（デビック病）、視神経脊髄炎、神経性筋緊張病、好中球減少症、非癌性リンパ球増加症、非肉芽腫性ブドウ膜炎、非悪性胸腺腫、眼及び眼窩炎症性障害、眼瘢痕性類天疱瘡、卵巣炎、交感性眼炎、眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、眼球クローヌス又は眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）及び感覚ニューロパチー、視神経炎、肉芽腫性精巣炎、変形性関節症、回帰性リウ
マチ、膵炎、汎血球減少症、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌が関連する小児自己免疫精神神経疾患）、傍腫瘍性小脳変性症、腫瘍随伴症候群、傍腫瘍性神経症候群を含む腫瘍随伴症候群、場合によってはランバート・イートン筋無力症候群又はイートン・ランバート症候群、寄生虫症、例えばリーシュマニア、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク症候群、毛様体扁平部炎（末梢ブドウ膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群、パルボウイルス感染、類天疱瘡、例えば水疱性類天疱瘡及び皮膚類天疱瘡、天疱瘡（尋常性天疱瘡を含む。）、紅斑性天疱瘡、落葉状天疱瘡、粘膜類天疱瘡、天疱瘡、消化性潰瘍、周期性四肢麻痺、末梢ニューロパチー、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血（悪性の貧血）、悪性貧血、水晶体抗原性ブドウ膜炎、肺線維症、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ型多発性関節炎慢性プリマリア、多発性軟骨炎（例えば難治性又は再発性多発性軟骨炎）、多内分泌自己免疫疾患、多内分泌不全、多腺性症候群、場合によっては自己免疫多腺性症候群（又は多腺性内分泌障害症候群）、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性ニューロパチー、急性多発性神経根炎、開心術後症候群、後部ブドウ膜炎又は自己免疫ブドウ膜炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、連鎖球菌感染後腎炎、ワクチン接種後症候群、初老期認知症、原発性胆汁性肝硬変、原発性甲状腺機能低下症、原発性特発性粘液水腫、単クローン性Ｂ細胞リンパ球増加症を含む原発性リンパ球増加症、場合によっては良性単クローン性高ガンマグロブリン血症及び意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、ＭＧＵＳ、原発性粘液水腫、原発性進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）及び再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、進行性全身性硬化症、増殖性関節炎、乾癬、例えばプラーク性乾癬、乾癬、乾癬性関節炎、肺胞タンパク質症、肺浸潤好酸球増加症、赤芽球癆貧血又は形成不全（ＰＲＣＡ）、赤芽球癆形成不全、化膿性又は非化膿性副鼻腔炎、膿疱性乾癬及び爪の乾癬、腎盂炎、壊疽性膿皮症、ケルバン甲状腺炎、レイノー現象、反応性関節炎、習慣性流産、血圧反応の低下、反射性交感神経性ジストロフィー、難治性スプルー、ロイター病又は症候群、再発性多発性軟骨炎、
心筋又は他の組織の再かん流傷害、再かん流傷害、呼吸窮迫症候群、むずむず脚症候群、網膜自己免疫性、後腹膜線維症、レイノー症候群、リウマチ性疾患、リウマチ熱、リウマチ、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、風疹ウイルス感染、サンプター症候群、サルコイドーシス、住血吸虫症、シュミット症候群、ＳＣＩＤ及びエプスタイン−バーウイルス関連疾患、強膜、強膜炎、肢端硬化、強皮症、場合によっては全身性強皮症、硬化性胆管炎、播種性硬化症、硬化症、例えば全身性硬化症、感音性難聴、血清反応陰性脊椎関節炎、シーハン症候群、シャルマン症候群、珪肺症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫性、蝶形骨洞炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、スティッフ・マン（又はスティッフ・パーソン）症候群、亜急性細菌心内膜炎（ＳＢＥ）、亜急性皮膚性紅斑性狼瘡、突発性難聴、スザック症候群、シドナム舞踏病、交感性眼炎、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）又は全身性紅斑性狼瘡、皮膚性ＳＬＥ、全身性壊死性脈管炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、場合によってはチャーグ・ストラウス血管炎又は症候群（ＣＳＳ）、脊髄癆、高安動脈炎、毛細血管拡張症、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、閉塞性血栓性血管炎、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）及び自己免疫又は免疫介在性血小板減少症を含む、血小板減少症、例えば慢性又は急性特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）を含む特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、甲状腺中毒症、組織損傷、トローザ・ハント症候群、中毒性表皮剥離症、毒性ショック症候群、輸血反応、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、横断性脊髄炎、横断性の脊髄炎、熱帯性肺好酸球増加症、結核、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、蕁麻疹、場合によっては慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性自己免疫蕁麻疹を含む慢性特発性蕁麻疹、ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、網膜ブドウ膜炎、弁膜炎、血管機能不全、脈管炎、椎間体性関節炎、小水疱水疱性皮膚炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫（多発性血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ））、ウィスコット・アルドリッチ症候群又はＸ連鎖高ＩｇＭ症候群であり得る。
【００４２】
さらなる実施形態において、本方法、使用又は組成物は、別の免疫調節物質及び／又は
抗原の投与をさらに具備し得る。別の実施形態において、本免疫調節物質は、ＴＬＲアゴニスト（ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１アゴニスト）であり得、１型インターフェロン、場合によってはαインターフェロン又はβインターフェロン又はＣＤ４０アゴニスト又はＩＬ−６アンタゴニスト又はＴＮＦアンタゴニスト、例えば前述のものの何れかに特異的な抗体又は抗体断片であり得る。
【００４３】
ある実施形態において、炎症性障害を処置するための方法は、有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質を投与することを具備し得る。
【００４４】
ある実施形態において、炎症性障害を処置するための組成物は、有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質を具備し得る。
【００４５】
ある実施形態において、炎症性障害の処置用の薬剤の製造のための有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質の使用。
【００４６】
ある実施形態において、処置される障害は、１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ性疾患、アレルギー性障害、喘息、アレルギー性鼻炎、皮膚障害、クローン病、潰瘍性大腸炎、移植拒絶、移植片対宿主病、連鎖球菌感染後及び自己免疫腎不全、敗血症性ショック、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）及び毒物注入；自己炎症性疾患、変形性関節症、結晶性関節炎、関節包炎、関節症、腱炎、靱帯炎又は外傷性関節損傷から選択され得る。
【００４７】
ある実施形態において、処置される障害は、多発性硬化症、ＳＬＥなどの狼瘡状態、呼吸器障害、例えば喘息、蕁麻疹、脈管炎、チャーグ・ストラウス症候群、乾癬性関節炎又は関節リウマチであり得る。
【００４８】
ある実施形態において、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置する方法は、有効量の有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質の投与を具備し得る。
【００４９】
ある実施形態において、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置するための組成物は、有効量の有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質の投与を具備し得る。
【００５０】
ある実施形態において、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置用の薬剤の製造における有効量の有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質の使用。
【００５１】
ある実施形態において、移植片対宿主病は、急性移植片対宿主病、慢性移植片対宿主病、幹細胞移植に伴う急性移植片対宿主病、幹細胞移植に伴う慢性移植片対宿主病、骨髄移植に伴う急性移植片対宿主病、同種血液幹細胞移植（ＨＳＣＴ）に伴う急性移植片対宿主病又は骨髄移植に伴う慢性移植片対宿主病であり得る。
【００５２】
ある実施形態において、処置される患者は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の少なくとも１つの症状を有し得、場合によっては、この患者は、腹痛、腹部けいれん、下痢、発熱、黄疸、皮膚発疹、嘔吐及び体重減少を含むが限定されない急性ＧＶＨＤを示す。ある実施
形態において、処置される患者は、ドライアイ、ドライマウス、脱毛、肝炎、肺障害、消化管障害、皮膚発疹及び皮膚肥厚を含むが限定されない慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の少なくとも１つの症状を有し得る。ある実施形態において、本患者は、同種幹細胞又は骨髄移植を有するか又はこれを受けようとしている。
【００５３】
ある実施形態において、患者は自己幹細胞又は骨髄移植を有し得るか又はこれを受けようとしている。
【００５４】
ある実施形態において、アレルギー性、炎症性又は自己免疫障害がある個体を処置する方法は、有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質を投与することを具備し得る。
【００５５】
ある実施形態において、アレルギー性、炎症性又は自己免疫障害を有する個体を処置するための組成物は、有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質を投与することを具備し得る。
【００５６】
ある実施形態において、アレルギー性、炎症性又は自己免疫障害の処置用の薬剤の製造のための有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質の使用。
【００５７】
別の実施形態において、アレルギー性、炎症性又は自己免疫障害は、乾癬、皮膚炎、アトピー性皮膚炎；全身性強皮症、硬化症；クローン病、潰瘍性大腸炎；呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群；ＡＲＤＳ）；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；湿疹、喘息、アテローム性動脈硬化症；白血球接着欠乏症；関節リウマチ；全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）；糖尿病、場合によってはＩ型糖尿病又はインスリン依存性糖尿病；多発性硬化症；レイノー症候群；自己免疫甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年性発症糖尿病；結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症及び脈管炎；悪性貧血（アジソン病）；移植片拒絶疾患、ＧＶＨＤ、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害；多臓器損傷症候群；溶血性貧血、クリオグロブリン血症又はクームス陽性貧血；重症筋無力症；抗原−抗体複合体介在性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブズ病；ランバート・イートン筋無力症候群；水疱性類天疱瘡；天疱瘡；自己免疫多腺性内分泌障害；ロイター病；スティッフ・マン症候群；ベーチェット病；巨細胞動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発性ニューロパチー；免疫血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）及び自己免疫血小板減少症から選択され得る。
【００５８】
別の実施形態において、疾患は、関節炎、関節リウマチ、急性関節炎、慢性関節リウマチ、痛風性関節炎、急性痛風性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節炎、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、椎間体性関節炎及び若年発症関節リウマチ、変形性関節症、進行性慢性関節炎、変形性関節炎、多発性関節炎慢性プリマリア、反応性関節炎及び強直性脊椎炎）、炎症性過剰増殖皮膚疾患、乾癬、例えばプラーク性乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬及び爪の乾癬、接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、ヘルペス状皮膚炎及びアトピー性皮膚炎を含む皮膚炎、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、蕁麻疹、例えば慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性自己免疫蕁麻疹を含む慢性特発性蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性表皮剥離症、強皮症、全身性強皮症、硬化症、全身性硬化症、多発性硬化症（ＭＳ）、脊椎−眼ＭＳ、原発性進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）、再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、播種性硬化症及び失調性硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎、潰瘍性の大腸炎、潰瘍性大腸炎、顕微鏡的大腸炎、膠原線維性大腸炎、ポリープ性大腸炎、壊死性腸炎、貫壁性大腸炎、自己免疫炎症性腸疾患、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、上強膜炎、呼吸窮迫症候群、成人又は急性
呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、ブドウ膜全体又は一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫血液障害、リウマチ性脊椎炎、突発性難聴、ＩｇＥ介在性疾患、例えばアナフィラキシー及びアレルギー性及びアトピー性鼻炎、脳炎、ラスムッセン脳炎、辺縁系及び／又は脳幹脳炎、ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、急性前部ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、自己免疫ブドウ膜炎、糸球体腎炎（ＧＮ）、特発性膜性ＧＮ又は特発性膜性腎症、膜状−又は膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）、急速進行性ＧＮ、アレルギー性状態、自己免疫心筋炎、白血球接着欠乏症、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）又は全身性紅斑性狼瘡、例えば皮膚性ＳＬＥ、亜急性皮膚性紅斑性狼瘡、新生児狼瘡症候群（ＮＬＥ）、播種性紅斑性狼瘡、狼瘡（腎炎、脳炎、小児、非腎臓、腎臓外、円板状、脱毛症を含む。）、小児インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を含む若年性発症（Ｉ型）糖尿病、成人発症糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、自己免疫糖尿病、特発性尿崩症、サイトカイン及びＴ−リンパ球が介在する急性及び遅発性超過敏性を伴う免疫反応、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、リンパ腫様肉芽腫症、ヴェーゲナー肉芽腫、無顆粒球症、脈管炎を含む血管炎、大血管炎、リウマチ性多発筋痛、巨細胞（高安）動脈炎、中間型血管炎、川崎病、結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発動脈炎、ＣＮＳ脈管炎、壊死性、皮膚性、超過敏性脈管炎、全身性壊死性脈管炎及びＡＮＣＡ関連血管炎、例えばチャーグ・ストラウス血管炎又は症候群（ＣＳＳ）、側頭動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫再生不良性貧血、クームス陽性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、溶血性貧血又は自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む免疫性溶血性貧血、悪性貧血（悪性の貧血）、アジソン病、赤芽球癆貧血又は形成不全（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外漏出を含む疾患、ＣＮＳ炎症性障害、多臓器損傷症候群、例えば敗血症、外傷又は出血に続発するもの、抗原−抗体複合体介在性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット又はベーチェット病、キャッスルマン病、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、類天疱瘡、例えば水疱性類天疱瘡及び皮膚類天疱瘡、天疱瘡、場合によっては尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、粘膜類天疱瘡、紅斑性天疱瘡、自己免疫多腺性内分泌障害、ロイター病又は症候群、免疫複合体腎炎、抗体介在性腎炎、視神経脊髄炎、多発性ニューロパチー、慢性ニューロパチー、ＩｇＭ多発性ニューロパチー、ＩｇＭ介在性ニューロパチー、血小板減少症、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、自己免疫精巣炎及び卵巣炎、原発性甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）；亜急性甲状腺炎、自己免疫甲状腺疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブズ病、多腺性症候群、例えば自己免疫多腺性症候群（又は多腺性内分泌障害症候群）、傍腫瘍性神経症候群を含む腫瘍随伴症候群、例えばランバート・イートン筋無力症候群又はイートン・ランバート症候群、スティッフ・マン又はスティッフ・パーソン症候群、脳脊髄炎、アレルギー性脳脊髄炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、重症筋無力症、胸腺腫を伴う重症筋無力症、小脳変性症、神経性筋緊張病、眼球クローヌス又は眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）及び感覚ニューロパチー、多巣性運動ニューロパチー、シーハン症候群、自己免疫肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎又は自己免疫慢性活動性肝炎、リンパ球様間質性肺臓炎、細気管支炎閉塞性（非移植）ｖｓ  ＮＳＩＰ、ギラン・バレー症候群、ベルガー病（ＩｇＡ腎症）、特発性ＩｇＡ腎症、直鎖状ＩｇＡ皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、肺線維症、自己免疫消化器症候群、セリアック病、セリアック病、セリアックスプルー（グルテン腸症）、難治性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリック病）、冠動脈疾患、自己免疫耳疾患、例えば自己免疫内耳疾患（ＡＧＥＤ）、自己免疫難聴、眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、多発性軟骨炎、例えば難治性又は再発性多発性軟骨炎、肺胞タンパク質症、アミロイドーシス、強膜炎、非癌性リンパ球増加症、単クローン性Ｂ細胞リンパ球増加症を含む原発性リンパ球増加症、場合によっては良性単クローン性高ガンマグロブリン血症又は意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、ＭＧＵＳ、末梢ニューロパチー
、腫瘍随伴症候群、チャネル病、例えばてんかん、偏頭痛、不整脈、筋障害、聴覚消失、失明、周期性四肢麻痺及びＣＮＳのチャネル病、自閉症、炎症性ミオパチー、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、内分泌性眼症、網膜ブドウ膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫肝臓病学的障害、線維筋痛症、多発性内分泌機能不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期認知症、脱髄性疾患、例えば自己免疫脱髄性疾患、糖尿病性ニューロパチー、ドレスラー症候群、円形脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着、レイノー現象、食道運動不全、肢端硬化）及び毛細血管拡張症）、男性及び女性自己免疫不妊症、混合結合組織疾患、シャーガス病、リウマチ熱、習慣性流産、農夫肺、多形性紅斑、開心術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性血管炎、良性リンパ球性血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えばアレルギー性肺胞炎及び線維性肺胞炎、間質性肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソミアシス、住血吸虫症、回虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症、びまん性間質性肺線維症、間質性肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、眼内炎、持続性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シャルマン症候群、フェルティー症候群、フィラリア症、毛様体炎、例えば慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、虹彩毛様体炎又はフックス毛様体炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、エコーウイルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウイルス感染、風疹ウイルス感染、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染、エプスタイン−バーウイルス感染、流行性耳下腺炎、エバンス症候群、自己免疫性腺機能不全、シドナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞多発性筋痛、内分泌性眼障害、慢性超過敏性肺臓炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性ネフローゼ症候群、微小変化型腎症、良性家族性及び虚血−再かん流傷害、網膜自己免疫性、関節の炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化性障害、アスペルミオジェネス、自己免疫溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュプュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、アレルギー性腸炎、癩性結節性紅斑、特発性顔面麻痺、慢性疲労症候群、フェブリスリウマチ、ハーマン＝リッチ症候群、感音性難聴、血色素尿症発作、性腺機能低下症、回腸炎レジオナリス、白血球減少症、伝染性単核球症、横断性の脊髄炎、原発性特発性粘液水腫、ネフローゼ、交感性眼炎、肉芽腫性精巣炎、膵炎、急性多発性神経根炎、壊疽性膿皮症、ケルバン甲状腺炎、後天性脾臓委縮症、抗精子抗体による不妊症、非悪性胸腺腫、白斑、ＳＣＩＤ及びエプスタイン−バーウイルス関連疾患、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、寄生虫症、例えばリーシュマニア、毒性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤を含む状態、白血球−接着欠乏症、サイトカイン及びＴ−リンパ球が介在する急性及び遅発性超過敏性を伴う免疫反応、白血球血管外漏出を含む疾患、多臓器損傷症候群、抗原−抗体複合体介在性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合結合組織疾患、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌不全、末梢ニューロパチー、自己免疫多腺性症候群Ｉ型、成人発症特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、全頭脱毛症、拡張型心筋症、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性又は非化膿性副鼻腔炎、急性又は慢性副鼻腔炎、篩骨、前頭骨、上顎又は蝶形骨洞炎、好酸球関連障害、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加症−筋痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸球性肺炎、熱帯性肺好酸球増加症、気管支肺アスペルギルス症、アスペルギルス腫又は好酸球を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清反応陰性脊椎関節炎、多内分泌自己免疫疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性粘膜皮膚性カンジダ症、バートン症候群、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調、膠原病に伴う自己免疫障害、リウマチ、神経性疾患、虚血再かん流障害、血圧反応の低下、血管機能不全、血管拡張症、組織損傷、心血管系虚血、痛覚過敏、脳虚血及び血管新生を伴う疾患、アレルギー性超過敏性疾患、糸球体腎炎、再かん流傷害、心筋又は他の組織の再かん流傷害、急性炎症性要素を伴う皮膚疾患、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系炎症性障害、眼及び眼窩炎症性障害、顆粒球輸血
関連症候群、サイトカイン誘導性毒性、急性の重篤な炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺線維症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈障害、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎及び子宮内膜症から選択され得る。
【００５９】
ある実施形態において、抗体を作製する方法は、ＶＩＳＴＡエピトープで動物に免疫付与し、この動物の脾臓を摘出し、単一の細胞懸濁液を調製し、脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させ、融合後細胞をハイブリドーマ選択培地中で培養し、得られるハイブリドーマを培養し、特異的な抗体産生についてスクリーニングし、所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択することを具備し得る。
【００６０】
別の実施形態において、ＶＩＳＴＡエピトープで動物に免疫付与し、この動物の脾臓を摘出し、単一の細胞懸濁液を調製し、脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させ、融合後細胞をハイブリドーマ選択培地中で培養し、得られるハイブリドーマを培養し、特異的な抗体産生についてスクリーニングし、所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択することを具備する方法により産生される抗ＶＩＳＴＡ又はその抗体断片。
【００６１】
別の実施形態において、抗ＶＩＳＴＡ又はその抗体断片はヒト化、キメラ又は１本鎖変異体であり得る。
【００６２】
ある実施形態において、単離ＶＩＳＴＡアンタゴニストは、抗体又はその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせであり得る。
【００６３】
ある実施形態において、炎症の処置又は予防を必要とする対象において処置又は予防する方法は、有効量の単離ＶＩＳＴＡアンタゴニストを投与することを具備し得、このアンタゴニストは、抗体又はその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせであり得る。
【００６４】
ある実施形態において、自己免疫疾患を処置する方法は、有効量の単離ＶＩＳＴＡアンタゴニストを投与することを具備し得、このアンタゴニストは、抗体又はその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせであり得る。
【００６５】
ある実施形態において、炎症性障害を処置する方法は、有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニスト又はアンタゴニストを投与することを具備し得、このアゴニスト又はアンタゴニストは、抗体又はその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせであり得る。
【００６６】
ある実施形態において、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置する方法は、有効量の有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニスト又はアンタゴニストの投与を具備し得、このアゴニスト又はアンタゴニストは、抗体又はその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせであり得る。
【００６７】
ある実施形態において、アレルギー性、炎症性又は自己免疫障害を有する個体を処置する方法は、有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニスト又はアンタゴニストを投与することを具備し得、このアゴニスト又はアンタゴニストは、抗体又はその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせであり得る。
【００６８】
ある実施形態において、炎症の処置又は予防を必要とする対象において炎症を処置又は予防するための組成物は、有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニスト又はアンタゴニストを投与することを具備し得、このアゴニスト又はアンタゴニストは、抗体又はその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせであり得る。
【００６９】
ある実施形態において、自己免疫疾患を処置するための組成物は、有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニスト又はアンタゴニストを投与することを具備し得、このアンタゴニストは、抗体又はその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせであり得る。
【００７０】
ある実施形態において、炎症性障害を処置するための組成物は、有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニスト又はアンタゴニストを投与することを具備し得、このアンタゴニストは、抗体又はその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせであり得る。
【００７１】
ある実施形態において、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置するための組成物は、有効量の有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニスト又はアンタゴニストの投与を具備し得、このアンタゴニストは、抗体又はその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせであり得る。
【００７２】
ある実施形態において、アレルギー性、炎症性又は自己免疫障害を有する個体を処置するための組成物は、有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニスト又はアンタゴニストを投与することを具備し得、このアンタゴニストは、抗体又はその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせであり得る。
【００７３】
ある実施形態において、炎症を処置又は予防するための薬剤の製造のための、有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニスト又はアンタゴニストの使用であって、このアンタゴニストは、抗体又はその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせであり得る。
【００７４】
ある実施形態において、自己免疫疾患の処置用の薬剤の製造のための、有効量の有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニスト又はアンタゴニストの使用であって、このアンタゴニストは、抗体又はその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせであり得る。
【００７５】
ある実施形態において、炎症性障害の処置用の薬剤の製造のための、有効量の有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニスト又はアンタゴニストの使用であって、このアンタゴニストは、抗体又はその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせであり得る。
【００７６】
ある実施形態において、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置用の薬剤の製造のための、有効量の有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニスト又はアンタゴニストの使用であって、このアゴニスト又はアンタゴニストは、抗体又はその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせであり得る。
【００７７】
ある実施形態において、アレルギー性、炎症性又は自己免疫障害の処置用の薬剤の製造のための、有効量の有効量の単離ＶＩＳＴＡアゴニスト又はアンタゴニストの使用であって、このアンタゴニストは、抗体又はその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせであり得る。
【００７８】
ある実施形態において、試料中でＶＩＳＴＡを検出するための方法は、試料を抗ＶＩＳＴＡ抗体又は抗体断片と接触させ、抗ＶＩＳＴＡ抗体−ＶＩＳＴＡ複合物を検出することを具備し得る。別の実施形態において、試料は生体試料であり得る。別の実施形態において、抗ＶＩＳＴＡ抗体は配列番号２、３又は５のアミノ酸配列に結合する。
【００７９】
別の実施形態において、治療用、診断又は免疫調節の使用のための組成物は、配列番号２、４又は５で示されるヒト又はマウスＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドに対して好ましくは少なくとも７０から９０％同一であり得るアミノ酸配列、オルソログ又はインビボでＶＩＳＴＡを調整する配列番号１もしくは３に対して特異的にハイブリッド形成する遺伝子によりコードされるその断片を具備し得る、単離可溶性ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質又はＶＩＳＴＡ融合タンパク質（例えば可溶性ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質）と、医薬的に許容可能な担体と、を具備し得る。いくつかの実施形態において、可溶性又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質は、異種（非ＶＩＳＴＡ）タンパク質に直接又は間接的に連結され得るか、又はウイルスベクター又は含有する細胞（例えばＴ細胞などの遺伝子移入された免疫細胞）によって発現され得る。
【００８０】
実施形態において、単離又は組み換えＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド（例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又はその断片もしくは一部分又は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸である断片又は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸である断片）。ある実施形態において、単離ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）融合タンパク質は、次のドメイン：シグナルペプチドドメイン、ＩｇＶドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン又は細胞質ドメインのうち少なくとも１つを具備する。
【００８１】
実施形態において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドは、次のドメイン：シグナルペプチドドメイン、ＩｇＶドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン又は細胞質ドメインのうち少なくとも１つを具備し、配列番号２、４又は５のアミノ酸配列に対して少なくとも約７１％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を具備する。別の実施形態において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドは、次のドメイン：シグナルペプチドドメイン、ＩｇＶドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン又は細胞質ドメインのうち少なくとも１つを具備し、（本明細書中で記載のような）ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を有し得る。
【００８２】
ある実施形態において、単離ＶＩＳＴＡタンパク質は、配列番号２、４、５、１６から２５、３６又は３７のポリペプチド配列の細胞外ドメインに対して少なくとも約９０％の配列同一性があるポリペプチドを具備し得る。さらなる実施形態において、本ポリペプチドは、配列番号２、４、５、１６から２５、３６又は３７のポリペプチド配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有し得る。
【００８３】
別の実施形態において、ＶＩＳＴＡポリペプチドは、次のドメイン：シグナルペプチドドメイン、ＩｇＶドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン又は細胞質ドメインのうち少なくとも１つを具備し、配列番号１又は３のヌクレオチド配列を具備し得る核酸分子の
相補体に対してストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされ得る。
【００８４】
別の実施形態において、本ポリペプチドの断片又は一部分は、配列番号２、４又は５のアミノ酸配列を具備し得、この断片は、配列番号２又は４のアミノ酸配列の少なくとも１５アミノ酸（即ち連続アミノ酸）を具備する。別の実施形態において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドは、配列番号２、４又は５のアミノ酸配列又は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸である断片を具備するか又はこれらからなる。別の実施形態において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドは、配列番号１又は３のヌクレオチド配列又はその相補体に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるヌクレオチド配列を具備し得る核酸分子によりコードされ得る。核酸分子の相補体に対してストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列からなる核酸分子によりコードされ得るＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドは、配列番号１又は３のヌクレオチド配列を具備し得る。
【００８５】
ある実施形態において、ＶＩＳＴＡポリペプチドは、これらが特にＴ細胞免疫性の抑制を誘導するアゴニストであり得る。別の実施形態において、ＶＩＳＴＡポリペプチドは、これらが抑制を妨害するアンタゴニストであり得る。
【００８６】
本発明のポリペプチド又はその一部分、例えば生物学的に活性のあるその一部分は、非ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド（例えば異種アミノ酸配列）に作動可能に連結され、融合ポリペプチドを形成し得る。
【００８７】
ある実施形態において、発現ベクターは、場合によってはＩｇポリペプチド（例えばＦｃ領域）又はレポーター分子などの別のタンパク質をコードする配列と融合させ得る、配列番号２、４又は５で示されるヒト又はマウスＶＩＳＴＡアミノ酸配列に対して少なくとも約７０から９９％同一であり得るＶＩＳＴＡタンパク質又はその断片もしくはオルソログ又は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸である断片をコードする単離核酸；及びそのベクターを含有する宿主細胞を具備し得る。
【００８８】
別の実施形態において、ＶＩＳＴＡポリペプチドをコードする、好ましくは可溶性融合タンパク質及び多量体ＶＩＳＴＡタンパク質をコードする単離核酸分子ならびに、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）をコードする核酸の検出のためのプライマー又はハイブリッド形成プローブとして適切な核酸断片。ある実施形態において、本発明のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）核酸分子は、配列番号１又は３におけるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）をコードするヌクレオチド配列（例えばヌクレオチド配列の全長に対して）又はその相補体に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であり得る。
【００８９】
別の実施形態において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）核酸分子は、配列番号２、４又は５のアミノ酸配列に対して特定の％同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を具備する。実施形態において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）核酸分子は、配列番号２、４又は５のアミノ酸配列の全長に対して又はその細胞外ドメインに対して少なくとも約７１％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を具備する。
【００９０】
別の実施形態において、単離核酸分子は、ヒト又はマウス又はＶＩＳＴＡ又は保存的領
域又はその中の機能ドメインのアミノ酸配列をコードする。また別の実施形態において、核酸分子は、配列番号２、４又は５のアミノ酸配列を具備し得るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を具備する。また別の実施形態において、本核酸分子は、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０ヌクレオチド長であり得る。さらなる実施形態において、本核酸分子は、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０ヌクレオチド長であり得、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を有するか又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）機能を調整するポリペプチドをコードする。
【００９１】
別の実施形態は、非ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドをコードする核酸分子に対してＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）核酸分子を特異的に検出する核酸分子、好ましくはＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）核酸分子を取り上げる。例えば、ある実施形態において、核酸分子は少なくとも約８８０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０ヌクレオチド長であり得、配列番号２、４又は５で示されるポリペプチドをコードする核酸分子又はその相補体に対してストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する。別の実施形態において、核酸分子は、少なくとも２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００ヌクレオチド長であり得、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の断片をコードする核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリッド形成し、例えば、少なくとも約２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０ヌクレオチド長を具備し得、配列番号２、４又は５におけるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドをコードする配列番号１及び３における開示される核酸配列又はその相補体のうち少なくとも１５（即ち１５連続）ヌクレオチドを具備し、配列番号１又は３で示されるヌクレオチド配列を具備し得る核酸分子又はその相補体に対してストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する。
【００９２】
ある実施形態において、本核酸分子は、配列番号２、４又は５のアミノ酸配列を具備し得るポリペプチドの天然の対立遺伝子変異体をコードし、この核酸分子は、ストリンジェントな条件下で配列番号１又は３を具備し得る核酸分子の相補体又はその相補体に対してハイブリッド形成する。
【００９３】
本発明の別の実施形態は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）核酸分子に対する単離アンチセンス（例えば配列番号１又は３のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）核酸分子のコード鎖に対するアンチセンス）を提供する。
【００９４】
本発明の別の態様は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）核酸分子を具備し得るベクターを提供する。ある一定の実施形態において、このベクターは組み換え発現ベクターであり得る。
【００９５】
別の実施形態において、宿主細胞は、本発明のベクターを具備する。また別の実施形態において、宿主細胞は、本発明の核酸分子を具備する。本発明はまた、ポリペプチドが産生され得るように、適切な培地中で宿主細胞、例えば組み換え発現ベクターを含有する、本発明の非ヒト哺乳動物細胞などの哺乳動物宿主細胞を培養することによってポリペプチド、好ましくはＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドを作製するための方法も提供する。
【００９６】
ある実施形態において、ＶＩＳＴＡ  ＤＮＡから転写されるＶＩＳＴＡ  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、配列番号１又は３の核酸配列を具備し得る。別の実施形態に
おいて、配列番号２、４又は５で示されるアミノ酸配列をコードするＶＩＳＴＡ  ＤＮＡから転写されるＶＩＳＴＡ  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子。さらなる実施形態において、ＶＩＳＴＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、配列番号３８から６７の何れか１つの核酸配列を具備し得る。別の実施形態において、ＶＩＳＴＡのＯＲＦ又はＵＴＲ領域の何れかを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、配列番号３８から４７のうち何れか１つのアミノ酸配列を具備し得る。別の実施形態において、ＶＩＳＴＡのＵＴＲ領域のみを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、配列番号４８から５７の何れか１つのアミノ酸配列を具備し得る。別の実施形態において、ＶＩＳＴＡのＯＲＦ領域のみを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、配列番号５８から６７の何れか１つのアミノ酸配列を具備し得る。ある実施形態において、ＶＩＳＴＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、配列番号３８から６７の何れか１つの核酸配列からなり得る。ある実施形態において、ＶＩＳＴＡのＯＲＦ又はＵＴＲ領域の何れかを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、配列番号３８から４７のうち何れか１つのアミノ酸配列からなり得る。ある実施形態において、ＶＩＳＴＡのＵＴＲ領域のみを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、配列番号４８から５７の何れか１つのアミノ酸配列からなり得る。ある実施形態において、ＶＩＳＴＡのＯＲＦ領域のみを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、配列番号５８から６７の何れか１つのアミノ酸配列からなり得る。
【００９７】
さらなる実施形態において、組成物は、配列番号３８から６７の何れか１つの核酸配列を具備するｓｉＲＮＡ分子を具備し得る。さらなる実施形態において、組成物は、配列番号３８から６７の何れか１つの核酸配列からなるｓｉＲＮＡ分子を具備し得る。さらなる実施形態において、組成物は医薬組成物であり得る。
【００９８】
ある実施形態において、自己免疫障害を処置するための方法は、配列番号３８から６７の何れか１つの核酸配列を具備するＶＩＳＴＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子タンパク質の投与を具備し得る。ある実施形態において、自己免疫障害を処置するための方法は、配列番号３８から６７の何れか１つの核酸配列からなるＶＩＳＴＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子タンパク質の投与を具備し得る。さらなる実施形態において、自己免疫障害を処置するための組成物は、配列番号３８から６７の何れか１つの核酸配列を具備するｓｉＲＮＡ分子を具備し得る。さらなる実施形態において、自己免疫障害を処置するための組成物は、配列番号３８から６７の何れか１つの核酸配列からなるｓｉＲＮＡ分子を具備し得る。さらなる実施形態において、自己免疫疾患の処置用の薬剤の製造用の、配列番号３８から６７の核酸配列の何れか１つを具備するｓｉＲＮＡ分子の使用。さらなる実施形態において、自己免疫疾患の処置用の薬剤の製造のための、配列番号３８から６７の核酸配列の何れか１つからなるｓｉＲＮＡ分子の使用。
【００９９】
ある実施形態において、炎症性障害を処置するための方法は、配列番号３８から６７の何れか１つの核酸配列を具備するＶＩＳＴＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子タンパク質の投与を具備し得る。ある実施形態において、炎症性障害を処置するための方法は、配列番号３８から６７の何れか１つの核酸配列からなるＶＩＳＴＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子タンパク質の投与を具備し得る。さらなる実施形態において、炎症性障害を処置するための組成物は、配列番号３８から６７の何れか１つの核酸配列を具備するｓｉＲＮＡ分子を具備し得る。さらなる実施形態において、炎症性障害を処置するための組成物は、配列番号３８から６７の何れか１つの核酸配列からなるｓｉＲＮＡ分子を具備し得る。さらなる実施形態において、炎症性疾患の処置用の薬剤の製造のための、配列番号３８から６７の核酸配列の何れか１つを具備するｓｉＲＮＡ分子の使用。さらなる実施形態において、炎症性疾患の処置用の薬剤の製造のための、配列番号３８から６７の核酸配列の何れか１つからなるｓｉＲＮＡ分子の使用。
【０１００】
ある実施形態において、移植片対宿主病を処置するための方法は、配列番号３８から６７の何れか１つの核酸配列を具備するＶＩＳＴＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子タンパク質
の投与を具備し得る。ある実施形態において、移植片対宿主病を処置するための方法は、配列番号３８から６７の何れか１つの核酸配列からなるＶＩＳＴＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子タンパク質の投与を具備し得る。さらなる実施形態において、移植片対宿主病を処置するための組成物は、配列番号３８から６７の何れか１つの核酸配列を具備するｓｉＲＮＡ分子を具備し得る。さらなる実施形態において、移植片対宿主病を処置するための組成物は、配列番号３８から６７の何れか１つの核酸配列からなるｓｉＲＮＡ分子を具備し得る。さらなる実施形態において、移植片対宿主病の処置用の薬剤の製造のための、配列番号３８から６７の核酸配列の何れか１つを具備するｓｉＲＮＡ分子の使用。さらなる実施形態において、移植片対宿主病の処置用の薬剤の製造のための、配列番号３８から６７の核酸配列の何れか１つからなるｓｉＲＮＡ分子の使用。
【０１０１】
ある実施形態において、アンタゴニストは、配列番号２、４又は５で示されるアミノ酸配列を具備し得るＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質又はその変異体、断片もしくはオルソログに特異的に結合し得る。実施形態において、結合物質はＶＩＳＴＡ活性をインビトロ又はインビボで調整する（刺激又は拮抗する）。
【０１０２】
ある実施形態において、ＶＩＳＴＡアンタゴニストはＶＩＳＴＡリガンドであり得る。別の実施形態において、ＶＩＳＴＡリガンドはタンパク質であり得る。別の実施形態において、ＶＩＳＴＡアンタゴニストは、抗体又はその抗体断片、ペプチド、グリコアルコイド、アンチセンス核酸、リボザイム、レチノイド、アベミール、低分子又は何らかのそれらの組み合わせであり得る。
【０１０３】
ある実施形態において、ＶＩＳＴＡアンタゴニストは、ＴＣＲ活性化におけるそのタンパク質の抑制効果、抗ＣＤ３に対するＣＤ４  Ｔ細胞増殖反応におけるそのタンパク質の抑制効果、同種ＣＤ４  Ｔ細胞の抗原特異的な増殖反応の抑制、特異的なサイトカイン（例えばＩＬ−２及びγインターフェロン）の発現におけるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の抑制効果など、免疫性においてＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の特異的効果を調整することを含むが限定されない機能特性を有し得る。
【０１０４】
ある実施形態において、ＶＩＳＴＡポリペプチド、多量体ＶＩＳＴＡポリペプチド又はＶＩＳＴＡ融合タンパク質に特異的に結合する、アンタゴニスト、場合によってはタンパク質性アンタゴニスト。別の実施形態において、アンタゴニスト、場合によってはタンパク質性アンタゴニストは、抗腫瘍又は抗転移活性を示し得る。別の実施形態において、アンタゴニスト、場合によってはタンパク質性アンタゴニストは、残基１から２０、２０から４０、３０から５０、６０から８０、７０から９０、８０から１００又は９０から１１０中に具備されるエピトープに特異的に結合し得る。別の実施形態において、アンタゴニスト、場合によってはタンパク質性アンタゴニストは、ＩｇＶ、ＶＩＳＴＡタンパク質のストーク領域、細胞質領域又は膜貫通領域中に具備されるエピトープに結合し得る。別の実施形態において、アンタゴニスト、場合によってはタンパク質性アンタゴニストは、次の活性：（ａ）サイトカインの上方制御；（ｂ）Ｔ細胞拡大の誘導、（ｃ）抗原性特異的Ｔ細胞免疫性の促進；又は（ｄ）ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞活性化の促進のうち少なくとも１つを引き出し得る。
【０１０５】
別の実施形態において、単離結合物質、好ましくは抗体又は抗体断片は、配列番号２、４又は５で示されるアミノ酸配列を具備し得るＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質又はその変異体、断片もしくはオルソログに特異的に結合し得る。実施形態において、結合物質は、インビトロ又はインビボでＶＩＳＴＡ活性を調整する（刺激又は拮抗する）。ある実施形態において、結合物質は、アゴニスト性又はアンタゴニスト性の抗ＶＩＳＴＡ抗体であり得る。
【０１０６】
ある実施形態において、抗ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）抗体は、ＴＣＲ活性化におけるそのタンパク質の抑制効果、抗ＣＤ３に対するＣＤ４  Ｔ細胞増殖反応におけるそのタンパク質の抑制効果、同種ＣＤ４  Ｔ細胞の抗原特異的な増殖反応の抑制、特異的なサイトカイン（例えばＩＬ−２及びγインターフェロン）の発現におけるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の抑制効果など、免疫性においてＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の特異的効果を調整することを含むが限定されない機能特性を有し得る。
【０１０７】
さらなる実施形態において、抗体、場合によってはモノクローナル又はポリクローナル抗体は、ヒトＶＩＳＴＡポリペプチドを含むＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドに特異的に結合し得る。
【０１０８】
ある実施形態において、ＶＩＳＴＡポリペプチド、多量体ＶＩＳＴＡポリペプチド又はＶＩＳＴＡ融合タンパク質に特異的に結合する単離抗体又はその抗体断片。別の実施形態において、この抗体又はその抗体断片は、抗腫瘍又は抗転移活性を示し得る。別の実施形態において、この抗体又はその抗体断片は、残基１から２０、２０から４０、３０から５０、６０から８０、７０から９０、８０から１００又は９０から１１０中に具備されるエピトープに特異的に結合し得る。別の実施形態において、この抗体又はその抗体断片は、ＩｇＶ、ＶＩＳＴＡタンパク質のストーク領域、細胞質領域又は膜貫通領域中に具備されるエピトープに特異的に結合し得る。別の実施形態において、この抗体又はその抗体断片は、次の活性：（ａ）サイトカインの上方制御；（ｂ）Ｔ細胞拡大の誘導、（ｃ）抗原性特異的Ｔ細胞免疫性の促進；又は（ｄ）ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞活性化の促進のうち少なくとも１つを引き出し得る。別の実施形態において、この抗体又は断片は組み換え体であり得る。別の実施形態において、この抗体又は断片は、抗腫瘍活性を有し得る。別の実施形態において、この抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＣＤＲ、パラトープ又は本抗原に結合可能である抗体の一部分であり得る。別の実施形態において、この抗体は、キメラ、ヒト化、抗イディオタイプ、１本鎖、二機能性又は同時特異性であり得る。別の実施形態において、この抗体又は断片は、標識、細胞毒性剤、治療剤又は免疫抑制剤に直接又は間接的に複合化され得る。さらなる実施形態において、化学発光標識、常磁性標識、ＭＲＩ造影剤、蛍光標識、生物発光標識又は放射性標識であり得る。
【０１０９】
ある実施形態において、本発明は、抗ＶＩＳＴＡ抗体及びその抗体断片を提供する。ある実施形態において、この抗体断片はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ及びｓｃ
Ｆｖ断片である。ある実施形態において、この抗体又はその抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ＩｇＮＡＲ、ＳＭＩＰ、キャ
メルボディー又はナノボディーを具備し得る。別の実施形態において、組み換えタンパク質は、抗ＶＩＳＴＡ抗体の超可変領域を具備し得、ＶＩＳＴＡに選択的に結合する。別の実施形態において、この抗体断片は、配列番号２、４又は５のアミノ酸配列を具備し得るＶＩＳＴＡに選択的に結合し得る。
【０１１０】
さらに、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド（又は生物学的に活性のあるその一部分）又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）分子の調節物質（例えば抗ＶＩＳＴＡ抗体）は、場合によっては医薬的に許容可能な担体を具備し得る医薬組成物に組み込まれ得る。
【０１１１】
別の実施形態において、本発明は、抗原及びＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を調整する（促進するか又は阻害する）薬剤を具備し得るワクチンを提供する。実施形態において、ワクチンは、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの間の相互作用を阻害する。別の実施形態において、ワクチンは、抗原及びＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの間の相互作用を阻害する薬剤を具備し得る。別の実施形態において、ワクチンは、抗原及びＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーと
の間の相互作用を促進する薬剤を具備し得る。ある実施形態において、このワクチンは、賦形剤、アジュバント又は担体を具備する。
【０１１２】
ある実施形態において、キットはＶＩＳＴＡ融合タンパク質を具備し得る。別の実施形態において、キットは多量体ＶＩＳＴＡタンパク質を具備し得る。さらなる実施形態において、ＶＩＳＴＡ融合タンパク質又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質は、直接又は間接的に固相支持体に固定され得る。さらなる実施形態において、固相支持体は、ビーズ、試験管、シート、培養皿又は試験片であり得る。別の実施形態において、固相支持体はアレイであり得る。
【０１１３】
別の実施形態において、免疫細胞は活性化され得、免疫細胞をＶＩＳＴＡポリペプチド、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又は抗ＶＩＳＴＡ抗体と接触させることを具備し得る。別の実施形態において、免疫細胞はＴ細胞、Ｂ細胞又は抗原提示細胞であり得る。本発明の方法により活性化される免疫細胞は、続いてエクスビボで拡大させ得、様々な疾患の処置及び予防において使用され得；例えばインビトロでクローン化し、拡大させたヒトＴ細胞はそれらの制御活性を維持する。拡大前に、対象（例えば哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット又はそれらのトランスジェニック種など）からＴ細胞源を得ることができる。Ｔ細胞は、末梢血液単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織及び感染部位由来の組織、脾臓組織、腫瘍又はＴ細胞株を含む多くの源から得ることができる。Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）分離など、当業者にとって公知の何らかの様々な技術を用いて対象から回収された血液単位から得ることができる。
【０１１４】
別の実施形態において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を調整するための方法は、その細胞中のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性が調節され得るように、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を調節する薬剤、好ましくは抗ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）抗体とＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）を発現可能な細胞を接触させることを具備し得る。ある実施形態において、本薬剤はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を阻害する。別の実施形態において、本薬剤は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を刺激する。さらなる実施形態において、本薬剤は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドとその天然の結合パートナーとの間の相互作用を妨害又は促進する。ある実施形態において、本薬剤は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドに特異的に結合する抗体であり得る。別の実施形態において、本薬剤は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドに結合する、ペプチド、ペプチド模倣物又は他の低分子であり得る。
【０１１５】
別の実施形態において、本薬剤は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）遺伝子の転写、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ｍＲＮＡの翻訳又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドの翻訳後修飾を調整することによってＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の発現を調整する。別の実施形態において、本薬剤は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ｍＲＮＡ又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）遺伝子のコード鎖に対してアンチセンスであり得るヌクレオチド配列を有する核酸分子であり得る。さらなる実施形態において、本薬剤は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子であり得る。
【０１１６】
ある実施形態において、自己免疫障害又は炎症性状態を処置するための方法は、対象に対してＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）調節物質であり得る薬剤を投与することを具備し得る。ある実施形態において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）調節物質は、上述のような、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド、好ましくは可溶性融合タンパク質又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質又は抗ＶＩＳＴＡ抗体であり得る。別の実施形態において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）調節物質は、例えばアデノウイルスベクター中のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）核酸分子であり得る。別の実施形態において、本発明は、免疫反応を調整するさらなる薬剤で対象を処置することをさらに提供する。
【０１１７】
ある実施形態において、免疫細胞におけるその天然の結合パートナーとのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の相互作用を調整するための方法は、免疫細胞におけるその天然の結合パートナーとのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の相互作用が調整され得るように、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の形態及びその天然の結合パートナーの相互作用を調整する薬剤からなる群から選択される薬剤とＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）を発現する抗原提示細胞を接触させ、ＶＩＳＴＡとその天然の結合パートナーとの相互作用を評価することを具備し得る。実施形態において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）及びその天然の結合パートナーの相互作用を調整する薬剤は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）に特異的に結合する抗体であり得る。ある実施形態において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの相互作用は未制御であり得る。別の実施形態において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの相互作用は下方制御され得る。ある実施形態において、本方法は、免疫反応を調整するさらなる薬剤と免疫細胞又は抗原提示細胞を接触させることをさらに具備する。ある実施形態において、接触させる段階はインビトロで行われ得る。別の実施形態において、接触させる段階はインビボで行われ得る。ある実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞及び骨髄細胞からなる群から選択され得る。
【０１１８】
ある実施形態において、免疫細胞において活性化を阻害するための方法は、免疫細胞活性化が阻害され得るように細胞においてＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の活性又は発現を阻害することを具備し得る。ある実施形態において、免疫細胞において活性化を向上させるための方法は、免疫細胞活性化が向上され得るように細胞においてＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の活性又は発現を向上させることを具備し得る。
【０１１９】
別の実施形態において、免疫反応を上方制御するための方法は、免疫細胞においてＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの間の相互作用を阻害する薬剤を投与することを具備し得る。ある実施形態において、本薬剤は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）に結合し、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの間の相互作用を阻害する遮断抗体又は低分子を具備する。別の実施形態において、本方法は、対象に対して免疫反応を上方制御する第二の薬剤を投与することをさらに具備する。別の実施形態において、免疫反応を下方制御するための方法は、免疫細胞におけるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの間の相互作用を刺激する薬剤を投与することを具備し得る。
【０１２０】
ある実施形態において、腫瘍、病原性感染、炎症性免疫反応又は状態、好ましくはあまりはっきりしない炎症状態又は免疫抑制性疾患からなる群から選択される状態を処置するための方法は、有効量のＶＩＳＴＡポリペプチド又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質タンパク質の投与を具備し得る。具体例としては、多発性硬化症、甲状腺炎、関節リウマチ、ＩＩ型及びＩ型糖尿病及びＶＩＳＴＡが有効な抗腫瘍反応を抑制する転移性癌を含む進行及び初期型の両方の癌（例えば膀胱癌、卵巣癌、メラノーマ、肺癌）が挙げられる。抗ＶＩＳＴＡ抗体又はＶＩＳＴＡ融合タンパク質をコードする核酸を発現する細胞又はウイルスベクターを対象に投与し得る。
【０１２１】
ある実施形態において、移植、アレルギー、感染性疾患、癌及び炎症性又は自己免疫障害（例えば炎症性免疫障害）からなる群から選択される状態を処置するための方法は、有効量のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質、結合物質又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）アンタゴニスト又はアゴニストタンパク質の投与を具備し得る。別の実施形態において、１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ性疾患、アレルギー性障害、喘息、アレルギー性鼻炎、皮膚障害、胃腸障害、例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎、移植拒絶、連鎖球菌感染後及び自己免疫腎不全、敗血症性ショッ
ク、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）及び毒物注入；自己炎症性疾患ならびに、変形性関節症、結晶性関節炎及び関節包炎及び他の関節症を含む変形性骨及び関節疾患を処置し得、有効量のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質、結合物質又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）アンタゴニスト又はアゴニストタンパク質の投与を具備し得る。さらに、本方法及び組成物は、腱炎、靱帯炎及び外傷性関節損傷を処置するために使用され得る、有効量のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質、結合物質又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）アンタゴニスト又はアゴニストを具備し得る。ある実施形態において、薬剤は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの間の相互作用を刺激する抗体又は低分子を具備する。別の実施形態において、本方法は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２又はＣＴＬＡ−４融合タンパク質又はそれらに特異的な抗体など、対象に免疫反応を下方制御する第二の薬剤を投与することをさらに具備する。
【０１２２】
実施形態において、対象ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質、核酸及びＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）に特異的なリガンド、好ましくはＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）機能において所望の効果を有する抗体は、癌、自己免疫疾患、アレルギー、炎症性障害又は感染及びより具体的には免疫系障害、例えば、重症の複合型免疫不全、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、Ｉ型糖尿病、リンパ増殖性症候群、炎症性腸疾患、アレルギー、喘息、移植片対宿主病及び移植拒絶；細菌及びウイルスなどの感染性病原体に対する免疫反応；及び免疫系癌、例えばリンパ腫及び白血病含むが限定されない状態を処置するために使用され得る。ある実施形態において、ＶＩＳＴＡの活性を調整する薬剤は、Ｔ細胞消耗を軽減し、感染性疾患に対する免疫性を促進し得る。
【０１２３】
ある実施形態において、癌の処置を必要とする患者において癌を処置する方法は、有効量のＶＩＳＴＡタンパク質、多量体ＶＩＳＴＡタンパク質、ＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を投与することを具備し得、このＶＩＳＴＡタンパク質、多量体ＶＩＳＴＡタンパク質及び／又はＶＩＳＴＡ融合タンパク質は、骨髄樹状サプレッサー細胞により発現されるＶＩＳＴＡの免疫抑制活性を抑制することによって抗腫瘍免疫性を促進する。さらなる実施形態において、処置前の患者は、免疫細胞において高レベルのＶＩＳＴＡタンパク質を発現することが認められ得る。
【０１２４】
ある実施形態において、放射線療法、化学療法又は抗癌生物剤の有効性を促進する方法は、放射線療法、化学療法又は抗癌生物剤の投与を含む治療計画において、有効量のＶＩＳＴＡタンパク質、多量体ＶＩＳＴＡタンパク質、ＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を投与することを具備し得る。さらなる実施形態において、処置前の患者は、前記の放射線療法、化学療法又は抗癌生物剤に反応しない癌を有し得る。
【０１２５】
ある実施形態において、膀胱、卵巣又はメラノーマ癌を処置する方法は、有効量のＶＩＳＴＡタンパク質、多量体ＶＩＳＴＡタンパク質、ＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を投与することを具備し得、この癌は、初期（非転移性）又は転移型であり、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇは、その受容体との相互作用を遮断する。
【０１２６】
ある実施形態において、免疫細胞反応を調整するための方法は、免疫細胞の反応が調整されるように一次シグナルの存在下で有効量のＶＩＳＴＡタンパク質、多量体ＶＩＳＴＡタンパク質、ＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質と免疫細胞を接触させることを具備し得る。
【０１２７】
ある実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞の調整を必要とする対象においてＴｒｅｇ細胞を調整する方法は、有効量のＶＩＳＴＡタンパク質、多量体ＶＩＳＴＡタンパク質、ＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を投与することを
具備し得る。
【０１２８】
ある実施形態において、免疫性においてＶＩＳＴＡの抑制効果を解除させる方法は、有効量のＶＩＳＴＡタンパク質、多量体ＶＩＳＴＡタンパク質、ＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を投与することを具備し得る。別の実施形態において、処置される患者は、処置前に高レベルのＶＩＳＴＡを発現することが認められ得る。別の実施形態において、ＶＩＳＴＡレベルは、免疫反応が促進されてい得ることを評価するために処置後に監視され得る。
【０１２９】
ある実施形態において、細胞介在性追加免疫を必要とする対象において細胞介在性免疫を促進する方法は、有効量のＶＩＳＴＡタンパク質、多量体ＶＩＳＴＡタンパク質、ＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を投与することを具備し得る。
【０１３０】
ある実施形態において、免疫細胞反応を調整するための方法は、免疫細胞の反応が調整されるように一次シグナルの存在下で免疫細胞を有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質と接触させることを具備し得、投与することを具備し得る。別の実施形態において、接触は、インビトロ、インビボ又はエクスビボで行われ得る。
【０１３１】
ある実施形態において、Ｔ細胞と骨髄由来ＡＰＣとの間での同種相互作用中にＴ細胞反応を制御する方法は、有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質を投与することを具備し得る。
【０１３２】
ある実施形態において、免疫抑制の引き出しを必要とする個体において免疫抑制を引き出す方法は、有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質を投与することを具備し得る。
【０１３３】
別の実施形態において、免疫細胞活性化を低下させるための方法は、有効量のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を対象に投与することを具備し得、このＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、免疫細胞活性化を減少させるための阻害シグナルとして作用する。ある実施形態において、免疫細胞活性化が阻害される。別の実施形態において、免疫細胞活性化が顕著に低下する。ある実施形態において、阻害シグナルは、免疫細胞において阻害受容体（例えばＣＴＬＡ−４又はＰＤ−１）に結合し、それによって活性化受容体に（例えばＴＣＲ、ＣＤ３、ＢＣＲ又はＦｃポリペプチドを介して）結合する一次シグナルに拮抗する。ある実施形態において、ＶＩＳＴＡポリペプチド又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、第二のメッセンジャー生成を阻害し；免疫細胞増殖を阻害し；免疫細胞においてエフェクター機能を阻害する（例えば食作用低下、抗体産生減少、細胞毒性減少、免疫細胞のメディエーター（サイトカイン（例えばＩＬ−２）及び／又はアレルギー性反応のメディエーター）生成不能；又はアネルギーの発生）。
【０１３４】
ある実施形態において、一次シグナルは、ＴＣＲに結合し、一次刺激シグナルを開始させるリガンド（例えばＣＤ３又は抗ＣＤ３）であり得る。ＴＣＲリガンドとしては、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３及び抗ＣＤ３モノクローナル抗体Ｇ１９−４が挙げられるが限定されない。ある実施形態において、一次シグナルは、タンパク質キナーゼＣ活性化因子、例えばホルボールエステル（例えばホルボールミリスチン酸アセテート）及びカルシウムイオン透過孔（例えば細胞質カルシウム濃度を上昇させるイオノマイシン）を含む他の機構を通じてＴ細胞に送達され得る。このような薬剤の使用は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を迂回するが、刺激性シグナルをＴ細胞に送達する。原発性シグナルとして作用する他の薬剤として
は、天然及び合成リガンドが挙げられ得る。天然のリガンドは、ペプチド提示があるか又はないＭＨＣを具備し得る。他のリガンドとしては、ペプチド、ポリペプチド、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、糖ペプチド、可溶性受容体、ステロイド、ホルモン、マイトジェン（例えばＰＨＡ）又は他のスーパー抗原、ペプチド−ＭＨＣ四量体及び可溶性ＭＨＣ二量体が挙げられ得るが限定されない。
【０１３５】
別の実施形態において、生体試料中のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）核酸分子、タンパク質又はポリペプチドの存在を検出するための方法は、生体試料中でＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）核酸分子、タンパク質又はポリペプチドの存在が検出され得るように、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）核酸分子、タンパク質又はポリペプチドを検出可能な薬剤と生体試料を接触させることを具備する。このＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現は、炎症部位など、ある一定の疾患部位を検出するために使用され得る。
【０１３６】
別の実施形態において、生体試料中のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性の存在を検出するための方法は、生体試料中でＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性の存在が検出されるように、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性の指標を検出可能な薬剤と生体試料を接触させることを具備する。さらなる実施形態において、生体試料中の可溶性ＶＩＳＴＡを検出するための方法は、生体試料中のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性の存在が検出され得るように、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性の指標を検出可能な薬剤と生体試料を接触させることを具備し得る。別の実施形態において、生体試料中の可溶性ＶＩＳＴＡを検出するための方法は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）と結合可能な薬剤、場合によっては抗ＶＩＳＴＡ抗体又は抗体断片と生体試料を接触させ、ＶＩＳＴＡ−抗体複合体の存在を検出することを具備し得る。さらなる実施形態において、測定は定量的、場合によってはウエスタンブロットデンシトメトリー、比色分析又は蛍光定量的であり得る。
【０１３７】
別の実施形態において、ＶＩＳＴＡ遺伝子における遺伝子変異の有無を同定するための診断アッセイは、核酸を具備し得る試料を入手し、試料をアッセイすることを具備し、この遺伝子変異は、（ｉ）ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドをコードする遺伝子の異常な修飾又は突然変異；（ｉｉ）遺伝子の誤制御；及び（ｉｉｉ）ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドの異常な翻訳後修飾のうち少なくとも１つを特徴とし、この遺伝子の野生型は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性があるポリペプチドをコードする。ある実施形態において、核酸はＤＮＡ又はｍＲＮＡであり得る。
【０１３８】
ある実施形態において、治療又は免疫調節剤として使用できる可能性について抗ＶＩＳＴＡ抗体に対して選択する方法は、（ａ）ＶＩＳＴＡタンパク質、その免疫原性断片又は複合物を用いて免疫細胞又は宿主に免疫付与し；（ｂ）ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体を発現するリンパ系細胞を選択し；（ｃ）抗ＶＩＳＴＡ抗体又はその抗体断片を選択し；（ｄ）次のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡの活性のうち少なくとも１つを阻害又は促進する能力：（ｉ）Ｔ細胞活性化又は分化の抑制；（ｉｉ）ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の抑制又はＴ細胞によるサイトカイン産生の抑制、についてこの抗ＶＩＳＴＡ抗体又はその抗体断片をスクリーニングすることを具備し得、（ｉｉｉ）（ｄ）の活性のうち少なくとも１つを有する抗体又はその抗体断片は、治療又は免疫調節剤として利用できる可能性がある。
【０１３９】
さらなる実施形態において、所望の機能特性を有する抗ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）抗体を選択する方法は、ＴＣＲ活性化におけるそのタンパク質の抑制効果、抗ＣＤ３に対するＣＤ４  Ｔ細胞増殖反応におけるそのタンパク質の抑制効果、同種ＣＤ４  Ｔ細胞の抗原特異的な増殖反応の抑制、特異的なサイトカイン（例えばＩＬ−２及びγインターフェロン）の発現におけるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の抑制効果など、免疫性においてＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の特異的効果を調整することを含む所望の機能特性に基づいてこのタン
パク質又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇ融合タンパク質に対して作製されるモノクローナル抗体のパネルをスクリーニングし、所望の抗体を選択することを具備し得る。
【０１４０】
別の実施形態において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドに結合するか又はその活性を調整する化合物を同定するための方法は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を有するＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドを具備し得る指標組成物を提供し、指標組成物を試験化合物と接触させ、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドの活性を調整する化合物を同定するために指標組成物においてＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性における試験化合物の効果を決定することを具備し得る。
【０１４１】
別の実施形態において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の活性を調整する化合物をスクリーニングするための細胞に基づくアッセイは、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）標的分子を発現する細胞を試験化合物と接触させ、試験化合物がＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）標的分子の活性を調整する能力を決定することを具備し得る。
【０１４２】
別の実施形態において、標的分子に対するＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の結合を調整する化合物についてスクリーニングするための細胞不含アッセイは、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド又は生物学的に活性のあるその一部分を試験化合物と接触させ、試験化合物がＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド又は生物学的に活性のあるその一部分に結合する能力を決定することを具備し得る。
【０１４３】
別の実施形態において、化合物、例えばＴ細胞活性化又はサイトカイン産生においてＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の効果を調整する抗ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）抗体を第一及び第二の抗原濃度で同定する方法は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）標的分子を発現するＴ細胞を第一の抗原濃度の試験化合物と接触させ、試験化合物が第一の抗原濃度でＴ細胞増殖又はサイトカイン産生を調整する能力を決定し、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）標的分子を発現するＴ細胞を第二の抗原濃度の試験化合物と接触させ、試験化合物が第二の抗原濃度でＴ細胞増殖又はサイトカイン産生を調整する能力を決定し、それによって第一及び第二の抗原濃度でＴ細胞活性化又はサイトカイン産生を調整する化合物を同定することを具備し得る。
【０１４４】
他の実施形態において、抗ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）抗体及びＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質のパネルは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞分化、増殖及び／又はサイトカイン産生において抗ＶＩＳＴＡ抗体がＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の効果を阻害又は促進することに基づきスクリーニング及び選択され得る。さらなる実施形態において、免疫性の制御における抗ヒトＶＩＳＴＡ抗体の機能を試験するために、ヒトＶＩＳＴＡを発現するように改変されているマウスが使用され得る。
【０１４５】
別の実施形態において、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置する方法は、有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質タンパク質の投与を具備し得る。別の実施形態において、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、急性移植片対宿主病、慢性移植片対宿主病、幹細胞移植に伴う急性移植片対宿主病、幹細胞移植に伴う慢性移植片対宿主病、骨髄移植に伴う急性移植片対宿主病、同種血液幹細胞移植（ＨＳＣＴ）に伴う急性移植片対宿主病又は骨髄移植に伴う慢性移植片対宿主病を処置するための方法は、有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質を投与することを具備し得る。
【０１４６】
別の実施形態において、本発明は、（ｉ）ヒト又はマウスＶＩＳＴＡの細胞外領域又は少なくとも５０アミノ酸であるその断片と少なくとも８０％の配列同一性を具備する少な
くとも１つのＶＩＳＴＡポリペプチドと、（ｉｉ）少なくとも５アミノ酸を具備する少なくとも１つのリンカーペプチドと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのＩｇタンパク質、好ましくはＩｇ  Ｆｃ領域又はその断片もしくは変異体と、を具備する、単離又は組み換えＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又はコード核酸を提供し、このペプチドリンカーは、ＶＩＳＴＡポリペプチド及びＩｇタンパク質に介入し、得られるＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、インビボでそのリンカーを欠く同一融合タンパク質より強力な免疫抑制活性を引き出す。代表的な実施形態において、単離ＶＩＳＴＡ融合タンパク質は、配列番号２、４、５、１６から２５、３６又は３７のポリペプチド配列の細胞外ドメイン又は少なくとも５０アミノ酸を具備するその断片に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有する少なくとも１つのポリペプチドと、（ｉｉ）少なくとも５アミノ酸を具備する少なくとも１つのリンカーと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのＩｇ  Ｆｃタンパク質又はその断片と、を具備し得、このリンカーは、ＶＩＳＴＡポリペプチド及びＩｇ  Ｆｃタンパク質に介入し、得られるＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、インビボでそのリンカーを欠く同一融合タンパク質よりも強力な免疫抑制活性を引き出す。
【０１４７】
別の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、ヒト又はマウスＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン又は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００アミノ酸であるその断片に対して少なくとも９０又は９５％の配列同一性を有する少なくとも１つのポリペプチドを具備し得る。
【０１４８】
別の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域又はその断片もしくは場合によっては補体結合及び／又はＦｃＲ結合又はエフェクター機能を調整する（増加、変化又は減少させる）１以上の修飾を具備する少なくとも１つのＦｃ領域を含有する変異体を具備する。
【０１４９】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、ＶＩＳＴＡポリペプチドに介入する少なくとも１つのリンカーと、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４又は１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、５０以上のグリシンアミノ酸残基を具備するＩｇポリペプチドと、を具備し得、この融合物は、配列番号２、４、５、１６から２５、３６又は３７のポリペプチド配列の細胞外ドメイン又は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００アミノ酸を具備するその断片に対してそれぞれが少なくとも約８０％の配列同一性を保持する少なくとも２、３又は４個のポリペプチドを具備し得る。
【０１５０】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、ＶＩＳＴＡポリペプチドに介入する少なくとも１つのリンカーと、Ｉｇポリペプチドと、を具備し得、このリンカーのうち少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％を具備するリンカー残基のうち少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５％又は全てが、グリシン及び／又はセリン残基から構成され、好ましくは少なくとも１つのヒト又はマウスＦｃ領域、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ｉｇＧ３もしくはＩｇＧ４  Ｆｃ領域又はマウスＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ２ｂ定常もしくはＦｃ領域を具備し、場合によっては、これは、グリコシル化、ＦｃＲ結合、補体結合又はエフェクター機能を調整する（増加又は減少させる）又は変化させるように突然変異している。
【０１５１】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、ＶＩＳＴＡポリペプチドに介入する少なくとも１つのリンカーと、Ｉｇポリペプチドと、を具備し得、このＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、この少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも３０％高い免疫抑制性活性を示す。
【０１５２】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、ＶＩＳＴＡポリペプチドに介入する少なくとも１つのリンカーと、Ｉｇポリペプチドと、を具備し得、このＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、この少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも４０％高い免疫抑制性活性を示す。
【０１５３】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、ＶＩＳＴＡポリペプチドに介入する少なくとも１つのリンカーと、Ｉｇポリペプチドと、を具備し得、このＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、この少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも５０％高い免疫抑制性活性を示す。
【０１５４】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、ＶＩＳＴＡポリペプチドに介入する少なくとも１つのリンカーと、Ｉｇポリペプチドと、を具備し得、このＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、この少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも６０％高い免疫抑制性活性を示す。
【０１５５】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、ＶＩＳＴＡポリペプチドに介入する少なくとも１つのリンカーと、Ｉｇポリペプチドと、を具備し得、このＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、この少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも７０％高い免疫抑制性活性を示す。
【０１５６】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、ＶＩＳＴＡポリペプチドに介入する少なくとも１つのリンカーと、Ｉｇポリペプチドと、を具備し得、このＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、この少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも３０％高い免疫抑制性活性を示す。
【０１５７】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、ＶＩＳＴＡポリペプチドに介入する少なくとも１つのリンカーと、Ｉｇポリペプチドと、を具備し得、このＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、この少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも８０％高い免疫抑制性活性を示す。
【０１５８】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、ＶＩＳＴＡポリペプチドに介入する少なくとも１つのリンカーと、Ｉｇポリペプチドと、を具備し得、このＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、この少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも９０％高い免疫抑制性活性を示す。
【０１５９】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、ＶＩＳＴＡポリペプチドに介入する少なくとも１つのリンカーと、Ｉｇポリペプチドと、を具備し得、このＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、この少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも１００％高い免疫抑制性活性を示す。
【０１６０】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、ＶＩＳＴＡポリペ
プチドに介入する少なくとも１つのリンカーと、Ｉｇポリペプチドと、を具備し得、このＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、この少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも１．１から２倍高い免疫抑制性活性を示す。
【０１６１】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、ＶＩＳＴＡポリペプチドに介入する少なくとも１つのリンカーと、Ｉｇポリペプチドと、を具備し得、このＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、この少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも２から３倍高い免疫抑制性活性を示す。
【０１６２】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、ＶＩＳＴＡポリペプチドに介入する少なくとも１つのリンカーと、Ｉｇポリペプチドと、を具備し得、このＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、この少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも３から４倍高い免疫抑制性活性を示す。
【０１６３】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、ＶＩＳＴＡポリペプチドに介入する少なくとも１つのリンカーと、Ｉｇポリペプチドと、を具備し得、このＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、Ｔ細胞増殖を検出するアッセイにおいて、この少なくとも１つのリンカーを欠く同一ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも少なくとも４から５、６から７、８から９、９から１０又は少なくとも１０倍高い免疫抑制性活性を示す。
【０１６４】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、配列番号２、４、５、１６から２５、３６もしくは３７のポリペプチド配列又は、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸を具備し、場合によっては少なくとも１つのＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＡポリペプチド、例えばヒトＩｇＧ１の定常及びヒンジ領域を具備する少なくとも１つのＩｇタンパク質、を含有し、場合によってはアミノ酸残基３２から１９０を具備するＶＩＳＴＡの少なくとも１つの細胞外ドメイン又はアミノ酸１６から１９４を具備するＶＩＳＴＡの細胞外ＩｇＶドメインを具備する断片に対して、少なくとも約９０から９５％の配列同一性を有する少なくとも１つのＶＩＳＴＡポリペプチドを具備する。
【０１６５】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、少なくとも２コピーの、ＶＩＳＴＡタンパク質又は少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸を具備するその断片と、少なくとも２コピーのＶＩＳＴＡタンパク質と、ＩｇＧ１  Ｆｃ又は非ＦｃＲ−結合ＩｇＧ１と、を具備する。
【０１６６】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、少なくとも３、４、５、６、７、８以上のコピーの、ＶＩＳＴＡタンパク質又は少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸を具備するその断片と、少なくとも１つのＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａと、を具備する。
【０１６７】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、少なくとも３、４、５、６、７、８以上のコピーの、ＶＩＳＴＡタンパク質又は少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５もしくは３００アミノ酸を具備するその断片と、少なくとも１つのＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａと、を具備する。
【０１６８】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、オリゴマー化ドメインのＮ−末端に連結される、少なくとも１つの細胞外ドメイン又はＶＩＳＴＡの断片を具備し、例えばこのオリゴマー化ドメインは、ＧＣＮ４、ＣＯＭＰ、ＳＮＡＲＥ、ＣＭＰ、ＭＡＴ、１個のＮＬＲＣを含有するＬＬＲ、ＮＯＤ２ヌクレオチド−結合ＮＬＲＣ２、１個のＮＬＲＣを含有するＬＲＲ、ＮＯＤ２ヌクレオチド−結合ＮＬＲＣ２又はＰＳＯＲＡＳ１である。
【０１６９】
他の代表的な実施形態において、酵母、細菌、真菌、昆虫、鳥類、ツメガエル又は哺乳動物細胞などの組み換え細胞において上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物が発現される。
【０１７０】
他の代表的な実施形態において、上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−２、ＰＤ−Ｌ２タンパク質もしくは融合タンパク質又は前述のもののうち何れかに特異的に結合する抗体もしくは抗体と併用して、又は同時に投与される。
【０１７１】
他の代表的な実施形態において、非経口、静脈内、皮下、経皮、経口、筋肉内、膣内、口内、肛門又は鼻腔投与に適し得る治療的有効量の本発明によるＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又は細胞を含有する医薬的に許容可能な組成物中に上述のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物が含有される。
【０１７２】
代表的な実施形態において、既に特定されたものなどの様々なアレルギー性、炎症性又は自己免疫障害を処置又は予防するためにこれらの組成物が使用される。好ましい例としては、ＧＶＨＤ、狼瘡状態、例えばＳＬＥ、薬物誘発性狼瘡、乾癬性関節リウマチ及び多発性硬化症、呼吸アレルギー及び炎症状態、例えば喘息、鼻炎、脈管炎及びチャーグ・ストラウス症候群が挙げられる。
【０１７３】
ある実施形態において、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、急性移植片対宿主病、慢性移植片対宿主病、幹細胞移植に伴う急性移植片対宿主病、幹細胞移植に伴う慢性移植片対宿主病、骨髄移植に伴う急性移植片対宿主病、同種血液幹細胞移植（ＨＳＣＴ）に伴う急性移植片対宿主病又は骨髄移植に伴う慢性移植片対宿主病であり得る。別の実施形態において、処置される患者は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の少なくとも１つの症状を有し、場合によってはこの患者は、腹痛、腹部けいれん、下痢、発熱、黄疸、皮膚発疹、嘔吐及び体重減少を含むが限定されない急性ＧＶＨＤを呈する。別の実施形態において、処置される患者は、ドライアイ、ドライマウス、脱毛、肝炎、肺障害、消化管障害、皮膚発疹及び皮膚肥厚を含むが限定されない慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の少なくとも１つの症状を有する。別の実施形態において、この患者は、同種幹細胞又は骨髄移植を有するか又は受けようとしている。別の実施形態において、この患者は、自己幹細胞又は骨髄移植を有するか又は受けようとしている。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１Ａ】図１Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは配列分析を示す。（Ａ）マウスＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の全長アミノ酸配列（配列番号１７）。（Ｂ）マウスＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）（配列番号２５）と、Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）（配列番号２６）、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）（配列番号２７）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）（配列番号２８）及びＢ７−Ｈ４（Ｂ７Ｓ１）（配列番号２９）を含む選択されたＢ７ファミリーリガンドとの間の細胞外Ｉｇドメインのアミノ酸配列アラインメント。（Ｃ）ＰＤ−１（配列番号３１）、ＣＴＬＡ−４（配列番号３２）、ＣＤ２８（配列番号３３）、ＢＴＬＡ（配列番号３４）及びＩＣＯＳ（配列番号３５）を含むＢ７ファミリー受容体との、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）（配列番号３０）Ｉｇドメインのアラインメント。Ｉｇ−ｖドメイン、「．」；Ｉｇ−ｃドメイン、「＿」。ＭＵＳＣＬＥアルゴリズム（ログ期待値による多重配列比較）を用いてアラインメントを行った。（Ｄ）ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムを用いて、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）と他のＢ７ファミリーリガンド及び受容体との間のＩｇ−Ｖドメインの配列同一性（％）を計算する。（Ｅ）ヒト（配列番号３７）とマウスＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）（配列番号３６）との間の配列相同性を示すための配列アラインメント。同一残基に黒い影を付す。保存性が高い及び半保存的残基にそれぞれ暗色及び明色の影を付す。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【図１Ｄ】同上。
【図１Ｅ】同上。
【図２】図２は、他の免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーメンバーとのマウスＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）のヒロジェニック分析を示す。ＰｈｙＭＬアルゴリズム（系統発生学的最尤法）を用いて、マウスＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）及びＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＢＴＮＬ２、ＢＴＮ３Ａ３、ＢＴＮ２Ａ２及びＢＴＮ１Ａ１を含む他のＩｇスーパーファミリーメンバーの全長配列を分析した。系統樹の分岐点で分岐距離を示した。
【図３】図３Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧは、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の組織発現及び造血細胞発現パターンを示す。Ａ．マウス組織からの全長ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）のＲＴ−ＰＣＲ。レーン：（１）筋肉（２）心臓（３）眼（４）胸腺（５）脾臓（６）小腸（７）腎臓（８）肝臓（９）脳（１０）乳腺（１１）肺（１２）卵巣（１３）骨髄。Ｂ．精製造血細胞型からの全長ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）のＲＴ−ＰＣＲ。レーン（１）腹膜マクロファージ（２）脾臓ＣＤ１１ｂ＋単球（３）脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ（４）脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞（５）脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞（６）脾臓Ｂ細胞。Ｃ−Ｅ．胸腺及び脾臓（Ｃ）、ＣＤ１１ｂ＋単球（Ｄ）及び脾臓及び腹膜腔からのＣＤ１１ｃ＋ＤＣサブセット（Ｅ）における、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現のフローサイトメトリー分析。（Ｆ）脾臓Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び顆粒球も分析する。（Ｇ）腸間膜ＬＮ、末梢ＬＮ、脾臓、血液及び腹膜腔を含む様々な組織部位からの造血細胞におけるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の差次的発現。少なくとも３回の独立した実験からの代表的データを示す。
【図４】図４は、ＶＩＳＴＡ、新規及び構造的に区別される、Ｉｇ−スーパーファミリー阻害性リガンドを示し、この細胞外ドメインは、他のＣＤ及びＢ７ファミリーメンバーと一緒に抗原提示細胞上で示されるように、Ｂ７ファミリーリガンドＰＤ−Ｌ１に対して最大の相同性を有する。ＶＩＳＴＡは、可能性のあるタンパク質キナーゼＣ結合部位を除き明白なシグナル伝達モチーフがない、９３ａａ細胞質ドメインを有する。
【図５】図５は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ハムスターモノクローナル抗体の特異性を示す。ハイブリドーマ培養物からの上清を用いてＲＦＰと融合させたＰＤ−Ｌ１又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の何れかを過剰発現するマウスＥＬ４細胞株を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。２つの代表的陽性クローン、８Ｄ８及び６Ｅ７を示す。
【図６】図６は、インビトロ培養脾臓細胞での他のＢ７ファミリーリガンドとのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現の比較を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ１１ｂｈｉ単球及びＣＤ１１ｃ＋ＤＣを含む造血細胞型でのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）及び他のＢ７ファミリーリガンド（即ちＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３及びＢ７−Ｈ４）の発現を比較した。細胞は、活性化して、及び活性化せずに、新鮮単離したか又はインビトロで２４時間培養した。プレート結合αＣＤ３（５μｇ／ｍＬ）でＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化し、ＩＦＮα（２０ｎｇ／ｍＬ）及びＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍＬ）でＣＤ１１ｂｈｉ単球及びＣＤ１１ｃ＋ＤＣを活性化した。３回の独立した実験からの代表的結果を示す。
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、免疫付与中のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）及び他のＢ７ファミリーリガンドのインビボ発現パターンの比較を示す。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化させたニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）を用いてＤＯ１１．１０  ＴＣＲトランスジェニックマウスの側腹部に免疫付与した。免疫付与から２４時間後に流入領域及び非流入領域リンパ節細胞を回収し、フローサイトメトリーによってＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２の発現について分析した。少なくとも４回の独立した実験からの代表的結果を示す。（Ａ）流入領域リンパ節内でＣＦＡ単独ではなくＣＦＡ／ＯＶＡでの免疫付与から２４時間後に高レベルのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）を発現するＣＤ１１ｂ＋細胞集団が誘導された。これらの細胞は、Ｆ４／８０＋マクロファージ及びＣＤ１１Ｃ＋樹状細胞の混合表現型のものである。（Ｂ）ＣＤ１１ｂｈｉ単球、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ及びＣＤ４＋Ｔ細胞でのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２の発現を免疫付与から２４時間後に分析した。
【図８】図８は、免疫付与に対する反応における、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ１１ｂ+及びＣＤ１１ｃ+細胞でのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現の喪失を示す。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化させたニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）を用いてＤＯ１１．１０マウスの側腹部に免疫付与した。免疫付与から４８時間後に、流入領域及び非流入領域リンパ節細胞を回収し、フローサイトメトリーによってＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現について分析した。２回の独立した実験から代表的結果を示す。
【図９Ａ】図９Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、固定化されたＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇ融合タンパク質がＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を阻害したことを示す。（Ａ）同時吸収ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇあり又はなしでプレート結合αＣＤ３によって、ＣＦＳＥ標識されるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激した。ＣＦＳＥ−低細胞のパーセンテージを定量し、（Ｂ）で示した。（Ｃ）ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇによって、ＰＤ−１  ｋｏマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞も抑制された。（Ｄ）ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇ介在性抑制は持続的であり、遅発型に作用する。７２時間（ｉ）又は２４時間（ｉｉ、ｉｉｉ及びｉｖ）の何れかに、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇ又は対照−Ｉｇ存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化した。２４時間予め活性化した細胞を回収し、さらに４８時間、特定の条件下で再刺激した。７２時間の培養終了時に細胞増殖を分析した。（ｉｉ）ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇでの予活性化及び抗ＣＤ３での再刺激；（ｉｉｉ）抗ＣＤ３での予活性化及びＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇでの再刺激。（ｉｖ）ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇでの予活性化及びＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇでの再刺激。全条件に対して２つ組のウェルを分析した。４回の実験から代表的結果を示す。
【図９Ｂ】同上。
【図９Ｃ】同上。
【図１０】図１０は、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖におけるＰＤ−Ｌ１−Ｉｇ及びＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇ融合タンパク質の同様の阻害効果を示す。バルク精製したＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＦＳＥ標識し、滴定量のＰＤ−Ｌ１−Ｉｇ又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇ融合タンパク質と一緒にプレート結合αＣＤ３で刺激した。７２時間の時点でＣＦＳＥ希釈液を分析し、ＣＦＳＥｌｏｗ細胞の％を定量した。２つ組のウェルを全条件について分析した。２回の独立した実験からの代表的結果を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ及び１１Ｂは、ナイーブ及びメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖におけるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇの抑制性の影響を示す。（Ａ）ナイーブ（ＣＤ２５−ＣＤ４４ｌｏｗＣＤ６２Ｌｈｉ）及びメモリー（ＣＤ２５−ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏｗ）ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットを選別し、ＣＦＳＥ標識し、指定の比率でＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇ又は対照−Ｉｇと一緒にプレート結合抗ＣＤ３（２．５μｇ／ｍＬ）で刺激した。ＣＦＳＥ分裂プロファイルを調べることによって、７２時間の時点で細胞増殖を分析した。ＣＦＳＥｌｏｗ細胞の％により決定した場合の増殖細胞の％を計算し、（Ｂ）で示す。全条件について２つ組のウェルを分析した。２回の独立した実験からの代表的結果を示す。
【図１１Ｂ】同上。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは、早期ＴＣＲ活性化及び細胞増殖を抑制したがアポトーシスを直接誘導しなかったＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇ融合タンパク質を示す。１−２の比率で（それぞれ２．５μｇ／ｍＬ及び５μｇ／ｍＬ）ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇ又は対照−Ｉｇと一緒にバルク精製ＣＤ４＋Ｔ細胞をプレート結合抗ＣＤ３で刺激した。フローサイトメトリーによって２４時間及び４８時間の時点でＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４４の発現について細胞を分析した。細胞を初期アポトーシスマーカーアネキシン−Ｖ及び細胞死マーカー７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）に対しても染色した。２回の独立した実験からの代表的結果を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、ＶＩＳＴＡ−ＩｇがＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生を阻害したことを示す。（Ａ）及び（Ｂ）指定の比率でバルク精製ＣＤ４＋Ｔ細胞をプレート結合抗ＣＤ３及びＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は対照−Ｉｇで刺激した。２４時間及び４８時間後に培養上清を回収した。ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２及びＩＦＮγレベルを分析した。（Ｃ−Ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞をナイーブ（ＣＤ２５−ＣＤ４４ｌｏｗＣＤ６２Ｌｈｉ）及びメモリー（ＣＤ２５−ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏｗ）細胞集団に選別した。１：２の比率でプレート結合αＣＤ３及びＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇ又は対照−Ｉｇで細胞を刺激した。培養上清を４８時間の時点で回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２及びＩＦＮγのレベルについて分析した。（Ｅ）指定の比率でバルク精製ＣＤ８＋Ｔ細胞をプレート結合αＣＤ３及びＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇ又は対照−Ｉｇで刺激した。ＥＬＩＳＡによって培養上清中のＩＦＮγを分析した。全条件に対して、６組の２つ組のウェルに対する上清をＥＬＩＳＡ分析のため集めた。３回の実験からの代表的結果を示す。
【図１３Ｂ】同上。
【図１３Ｃ】同上。
【図１３Ｄ】同上。
【図１３Ｅ】同上。
【図１４−１】図１４Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ介在性抑制が、ＣＤ２８によってもたらされる中レベルの同時刺激を克服し得るが、高レベルの同時刺激によって完全に逆転され、外因性ＩＬ−２（（Ａ）及び（Ｂ））によって部分的にレスキューされたことを示す。１−１の比率及び１−２の比率でＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇ又は対照−Ｉｇの何れかと一緒にマウスＣＤ４＋Ｔ細胞をプレート結合αＣＤ３によって活性化した。サイトカインレスキューの場合、可溶性ｍＩＬ−２、ｍＩＬ７、ｍＩＬ１５及びｍＩＬ−２３（全て４０ｎｇ／ｍＬ）を細胞培養物に添加した（Ａ）。同時刺激の効果を調べるために、指定の比率でαＣＤ３及びＩｇタンパク質と一緒にαＣＤ２８（１μｇ／ｍＬ）を固定化した（Ｂ）。ＣＦＳＥ分裂プロファイルを調べることによって、細胞増殖を７２時間の時点で分析した。Ｃ−Ｄ．低レベルの同時刺激存在下でのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の抑制性活性を調べるために、抗ＣＤ３（２．５μｇ／ｍＬ）及びＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又は対照−Ｉｇ融合タンパク質（１０μｇ／ｍＬ）と一緒に滴定量のαＣＤ２８で被覆して、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を刺激した。細胞増殖を７２時間の時点で分析した。増殖したＣＦＳＥｌｏｗ細胞の％を定量し、Ｄで示した。２つ組のウェルを全条件について分析した。３回の独立した実験からの代表的ＣＦＳＥプロファイルを示す。
【図１４−２】次１４Ｄ。
【図１５Ａ】図１５Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、抗原提示細胞で発現されるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）がＣＤ４  Ｔ細胞増殖を抑制したことを示す（（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）。ＭＨＣＩＩ分子Ｉ−Ａｄ及び同時刺激分子Ｂ７−２を安定に発現するＣＨＯ細胞株を親細胞株として使用した。ＶＩＳＴＡ−ＲＦＰ又はＲＦＰ対照分子の何れかを発現するレトロウイルスで細胞に対して形質導入した。形質導入細胞を選別し、発現が均一レベルになるようにした。抗原提示細胞としてのその能力を試験するために、ＣＨＯ−ＶＩＳＴＡ又はＣＨＯ−ＲＦＰ細胞をマイトマイシンＣ処理し、滴定量のＯＶＡペプチド存在下でＯＶＡ特異的なトランスジェニックＣＤ４＋Ｔ細胞Ｄ０１１．１０と混合した。ＣＦＳＥ分裂プロファイル（Ａ−Ｂ）によるか又はトリチウム取り込み（Ｃ）によるかの何れかでＤＯ１１細胞の増殖を７２時間の時点で分析した。（Ｄ）１０日培養期間中にＲＦＰ又はＢ７Ｂ−Ｈ５−ＲＦＰレトロウイルスを用いて骨髄由来樹状細胞に対して形質導入を行った。形質導入ＣＤ１１ｃ＋ＲＦＰ＋ＤＣ及び非形質導入ＣＤ１１ｃ＋ＲＦＰ−ＤＣを選別し、滴定量のＯＶＡペプチド存在下でＯＶＡ特異的なトランスジェニック  ＣＤ４＋Ｔ細胞ＯＴＩＩを刺激するために使用した。ＣＦＳＥ分裂を調べることによって、第３日に細胞増殖を分析した。全実験に対して、２つ組のウェルを全条件について分析し、３回の独立した実験からの代表的結果を示す。
【図１５Ｂ】同上。
【図１５Ｃ】同上。
【図１５Ｄ】同上。
【図１６】図１６は、レトロウイルスで形質導入した骨髄由来ＤＣにおけるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の表面発現レベルを示す。骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）をＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｍＬ）の存在下で培養し、本明細書中で記載のようにＲＦＰ又はＶＩＳＴＡ−ＲＦＰレトロウイルスの何れかを用いて形質導入した。第１０日に、培養ＢＭＤＣにおいてＶＩＳＴＡの表面発現レベルを分析し、新鮮単離腹膜マクロファージと比較した。
【図１７】図１７Ａ及びＢは、抗ＰＤＬ３モノクローナル抗体が受動伝達ＥＡＥモデルにおいて有効性を示すことを示す。この養子免疫伝達ＥＡＥモデルにおいて、ＣＦＡ及びＰＬＰペプチドでドナーＳＪＬマウスに免疫付与した。第１０日に、流入領域ＬＮからの全リンパ球を単離し、インビトロでＰＬＰペプチド、ＩＬ−２３（２０ｎｇ／ｍＬ）及び抗ＩＦＮｇ（１０μｇ／ｍＬ）とともに４日間培養した。次に、拡大ＣＤ４  Ｔ細胞を精製し、ナイーブ受容マウスに養子免疫伝達した。疾患進行を監視し、０、疾患なし；０．５  尾部緊張喪失；１：尾部引きずり；２：尾部引きずり＋後肢不全麻痺；２．５：片側後肢麻痺；３：両後肢麻痺；３．５：前肢脱力；４：後肢麻痺＋一側性前肢麻痺でスコア化した。疾患スコアが４に到達したらマウスを屠殺した。*、マウスを屠殺した。
【図１８】図１８は、抗原提示細胞において発現されるＶＩＳＴＡがＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を抑制したことを示す。
【図１９】図１９は、ＭＢ４９腫瘍細胞が移植されたマウスにおいて抗ＶＩＳＴＡ抗体が腫瘍成長を阻害したことを示す。
【図２０Ａ】図２０Ａ、Ｂ  Ｃ、Ｄ及びＥは、４匹の異なるマウス抗腫瘍モデル（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）におけるＶＩＳＴＡモノクローナル抗体の抗腫瘍効果を示す。図２１Ｅは、ＩＤ８モデルの異なる細胞上でのＶＩＳＴＡの発現を示す。異なる解剖学的位置において骨髄樹状細胞における非常に高い発現。見られ得るように、腫瘍が成長し、白血球が浸潤する部位である腹水細胞中の骨髄樹状細胞において非常に高レベル。
【図２０Ｂ】同上。
【図２０Ｃ】同上。
【図２０Ｄ】同上。
【図２０Ｅ】同上。
【図２１】図２１は、ＣＤ４０／ＴＬＲアゴニストワクチン（アゴニスト性のαＣＤ４０  ｍａｂ、ＴＬＲアゴニスト及びＯＶＡペプチドを使用することからなる。）の有効性におけるＶＩＳＴＡモノクローナル抗体の増強効果を示す。
【図２２】図２２は、健常マウスにおけるか又はＥＡＥを発現しているマウスにおけるＣＮＳ細胞上でのＶＩＳＴＡ発現を示す。
【図２３Ａ】図２３Ａ、Ｂ及びＣは、ＶＩＳＴＡの配列及び構造分析を示す。（Ａ）それぞれ太字、斜字体及びＴｉｍｅｓ  Ｎｅｗ  Ｒｏｍａｎで強調したＩｇ−Ｖドメイン、スタークセグメント及び膜貫通領域があるマウスＶＩＳＴＡの一次アミノ酸配列。外部ドメイン領域のシステインは下線により示す。（Ｂ）鋳型としてＰＤ−Ｌ１（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ受託番号３ＢＩＳ）を用いたマウスＶＩＳＴＡの比較タンパク質構造モデル。Ｉｇ−Ｖドメインにおける５個のシステイン残基をスティックとして示す。このモデルに基づき、ＶＩＳＴＡ  Ｉｇ−Ｖドメインは、ＢとＦ鎖との間の基準のジスルフィド結合ならびに３個のさらなるシステインを有し、このうち一部は、分子間及び分子内ジスルフィド結合を形成する可能性があり得る。Ｇ鎖（示さない。）の後にストーク領域にさらなるインバリアントなシステインが存在する。β鎖（Ａ−Ｇ）を平らな矢印として示す。Ｃ”−Ｄループに矢印を付す。（Ｃ）いくつかのＢ７ファミリーメンバーのＩｇ−Ｖドメイン及びＶＩＳＴＡの多重配列アラインメント。予想される二次構造（鎖、へリックス及びβ−ターンに対してそれぞれ、矢印、スプリング及び「Ｔ］を使用）アラインメント上に示し、ＶＩＳＴＡ構造モデルに基づく。ＶＩＳＴＡ（配列番号１５）、ＰＤ１Ｌ１（配列番号１１）、ＰＤ１Ｌ２（配列番号１２）、Ｂ７Ｈ４（配列番号１３）及びＢ７Ｈ３（配列番号１４）。（Ｄ）ＶＩＳＴＡオルソログの多重配列アラインメント。インバリアントな残基を赤い背景により示し、物理化学的保存的位置を赤字で示す。保存的アミノ酸を青いボックスで示す。３６種類のＶＩＳＴＡオルソログタンパク質に基づき保存性を計算するが、９種類の代表的なもののみを示す。殆ど全てのＩｇスーパーファミリーメンバーにおいて保存的である基準のシステイン対（Ｂ及びＦ鎖）を赤丸で強調し、一方でＶＩＳＴＡに対して特異的であるシステインに青丸を付す。特有のＶＩＳＴＡシステインパターンは、マウス（配列番号１７）、ヒト（配列番号１６）、カンガルー（配列番号１８）、イルカ（配列番号１９）、ニワトリ（配列番号２０）、ツメガエル（配列番号２１）、キンカチョウ（配列番号２２）、ゼブラフィッシュ及びフグ（配列番号２３）からの全オルソログで保存される。
【図２３Ｂ】同上。
【図２３Ｃ】同上。
【図２４Ａ】図２４Ａ及びＢは、腫瘍細胞上でのＶＩＳＴＡ過剰発現が、防御的な抗腫瘍免疫性を克服することを示す。レトロウイルス形質導によってＶＩＳＴＡ又はＲＦＰ対照タンパク質を過剰発現するＭＣＡ１０５腫瘍細胞を作製し、均一性について選別した。防御的免疫性を生成させるために、放射線照射したＭＣＡ１０５腫瘍細胞を用いてナイーブマウスの左側腹部の皮下にワクチン接種した。（Ａ）１４日後、ワクチン接種マウスの右側腹部の皮下に生ＭＣＡ１０５ＶＩＳＴＡ又はＭＣＡ１０５ＲＦＰ腫瘍細胞を負荷した。腫瘍成長を２日ごとに監視した。腫瘍サイズは平均±ＳＥＭとして示す。３回の独立した反復から代表的結果を示す。（Ｂ）ワクチン接種マウスを処置しないか、又は生腫瘍負荷前にモノクローナル抗体によってＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞の両方を欠乏させた。Ａと同じように腫瘍サイズを監視し、それを平均±ＳＥＭとして示した。２回の独立した反復から代表的結果を示す。全実験について、比率は、群あたりのマウス総数中の腫瘍保有マウス数を示す。対応のないマン−ホイットニー検定で統計学的差（ｐ−値）を評価した。
【図２４Ｂ】同上。
【図２５−１】図２５Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、特異的なモノクローナル抗体を用いたＶＩＳＴＡ遮断がインビトロ及びインビボでＣＤ４+Ｔ細胞反応を促進したことを示す。（Ａ）モノクローナル抗体クローン１３Ｆ３はインビトロでＶＩＳＴＡ介在性抑制を中和した。同種ＯＶＡペプチド存在下で、ＣＦＳＥ−標識されるＤＯ１１．１０  ＣＤ４+Ｔ細胞を刺激するために、Ａ２０−ＲＦＰ及びＡ２０−ＶＩＳＴＡ細胞を使用した。２０μｇ／ｍＬのＶＩＳＴＡ特異的なモノクローナル抗体１３Ｆ３又は対照−Ｉｇを指定されるとおり添加した。７２時間後、ＣＦＳＥ希釈液を分析し、ＣＦＳＥlow細胞の％を平均±ＳＥＭとして示す。２つ組のウェルを全条件について分析した。（Ｂ及びＣ）ナイーブ脾臓細胞から選別した、総ＣＤ１１ｂhi骨髄細胞（Ｂ）又はＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ-単球（Ｃ）及びＣＤ１１ｂhiＣＤ１１ｃ+骨髄ＤＣ（Ｄ）に放射線照射し、ＯＶＡペプチドの存在下でＣＦＳＥ標識されるＯＴ−ＩＩトランスジェニックＣＤ４+Ｔ細胞を刺激するために使用した。７２時間の培養期間のうち最後の８時間中のトリチウム化チミジンの取り込みによって、細胞増殖を測定し、平均±ＳＥＭとして示した。全条件において３つ組のウェルを分析した。
【図２５−２】図２５Ｂ。
【図２５−３】図２５Ｃ、Ｄ。
【図２６】図２６は、ＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａが実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）（多発性硬化症のモデル）進行を軽減することを示す。活動性ＥＡＥを誘発するために１７５μｇ  ＭＯＧ／ＣＦＡ及び百日咳毒素（ＰＴ）３００ｎｇ（第０、２日）を用いてマウスに免疫付与した。第１４、１７及び２０日に、１５０μｇ  ＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａ（ｎ＝８）又は１５０μｇ対照ＩｇＧ２ａ（ｎ＝８）を投与した。平均±ＳＥＭとしてデータを示す。
【図２７】図２７は、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）進行におけるＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ１及びＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａの治療効果を示す。活動性ＥＡＥを誘発するために１７５μｇ  ＭＯＧ／ＣＦＡ及び百日咳毒素（ＰＴ）３００ｎｇ（第０、２日）を用いてマウスに免疫付与した。第６日に、１５０μｇ対照ＩｇＧ１（ｎ＝３）、１５０μｇ対照ＩｇＧ２ａ（ｎ＝６）、１５０μｇ  ｍＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ１（ｎ＝３）又は１５０μｇ  ｍＶＩＳＴＡ  ＩｇＧ２ａ（ｎ＝６）で週に３回、マウスを処置した（全２週間）。データは平均±ＳＥＭとして示す。
【図２８】図２８は、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）進行におけるＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａ融合タンパク質の治療効果を示す。活動性ＥＡＥを誘発するために１７５μｇ  ＭＯＧ／ＣＦＡ及び百日咳毒素（ＰＴ）３００ｎｇ（第０、２日）を用いてマウスに免疫付与した。第１４日に、ＰＢＳ（ｎ＝６）、１００μｇ対照ＩｇＧ２ａ（ｎ＝６）、３００μｇ対照ＩｇＧ２ａ（ｎ＝６）、１００μｇ  ＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａ（ｎ＝６）又は３００μｇ  ｍＶＩＳＴＡ  ＩｇＧ２ａ（ｎ＝６）で週に３回、マウスを処置した（全２週間）。データは平均±ＳＥＭとして示す。
【図２９】図２９Ａ及びＢは、ＶＩＳＴＡ健常ヒト組織の発現をｃＤＮＡ組織パネル（Ｏｒｉｇｅｎｅ）のリアルタイムＰＣＲ分析によって調べたことを示す。（Ａ）ＶＩＳＴＡは主に造血組織において又は大量の造血組織を含有する組織において発現された。これは、免疫関連機能におけるＶＩＳＴＡの重要性と一致する。（Ｂ）発現の発現パターンは、ＶＩＳＴＡの最も近縁の相同ＰＤ−Ｌ１の場合と同様の傾向を辿ることが分かった。
【図３０】図３０は、単球、樹状細胞における、及びＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のおよそ２０％によるＶＩＳＴＡタンパク質発現を示す。血液単球の「巡回性」（ＣＤ１４dimＣＤ１６+）及び「炎症性」（ＣＤ１４+ＣＤ１６+/-）サブセットの両方内で、及び樹状細胞のリンパ系及び骨髄サブセットの両方内でＶＩＳＴＡ発現が観察された。
【図３１】図３１Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、バルク精製ＣＤ４（図３１Ａ）及びＣＤ８（図３１Ｂ）Ｔ細胞のＣＦＳＥ希釈液の抑制を示す。ＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン及びＦｃ受容体結合を減少させるための突然変異を含有するヒトＩｇＧのＦｃ領域からなるＩｇ融合タンパク質を作製した。２．５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）と一緒に１０μｇ／ｍＬのＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は対照Ｉｇをプレート上に固定化し、次いでＣＦＳＥ希釈によって増殖を測定した。
【図３２】図３２Ａ及び３２Ｂは、様々なＯＫＴ３濃度にわたるヒトＶＩＳＴＡ−Ｉｇ及びヒトＶＩＳＴＡ−Ｉｇの滴定を示し、これは、より高いＯＫＴ３濃度がより高いＶＩＳＴＡ濃度により克服され得ることを示す。
【図３３−１】図３３Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇの存在下又は非存在下での活性化後、細胞の状況を調べたことを示す。培養２日間中、初期活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９の抗ＣＤ３による上方制御がＶＩＳＴＡ−Ｉｇにより遮断された（図３３Ａおよび３３Ｂ）。同様に、培養５日後、抗原経験を示す、ＣＤ４５ＲＡからＣＤ４５ＲＯへの発現のシフトが妨げられた（図３３Ｃ）。ＶＩＳＴＡは、細胞生存能に対して影響がなかった。図３４Ｄは、ＶＩＳＴＡ−ＩｇがＦｏｘＰ３変換を増加させたことを示す。
【図３３−２】図３３Ｄ。
【図３４】図３４Ａ及びＢは、ＶＩＳＴＡにより誘導される抑制を示し、細胞を抗ＣＤ３及びＶＩＳＴＡ−Ｉｇ上で２日間培養し、次いで抗ＣＤ３のみの上に移して３日間培養した。このさらなる刺激は、抑制をレスキューできなかった（図３４Ａ及び３４Ｂ）。
【図３５】図３５Ａ及びＢは、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇが、ＣＤ４（図３５Ａ）及びＣＤ８（図３５Ｂ）Ｔ細胞によるＩＬ−１０、ＴＮＦα及びＩＦＮγの産生を顕著に低下させ、ＩＬ−１７産生の穏やかな減少の傾向があったことを示す。
【図３６】図３６Ａ、Ｂ及びＣは、抗ＣＤ２８アゴニスト性抗体がＴ細胞に対して強力な同時刺激をもたらすので、ＶＩＳＴＡ抑制を誘発するために培養物に滴定したことを示す。
【図３７】図３７は、上記実施例３２で使用したフローゲーティングアッセイを示す。
【図３８】図３８は、上記実施例３２で使用したインビトロＴ細胞増殖アッセイの結果を示す。
【図３９】図３９Ａ、Ｂ及びＣは、２．５μｇ／ｍＬプレート結合抗ＣＤ３及び対照Ｉｇ又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇの何れかの存在下で５日間培養したＣＦＳＥ標識ヒトＴ細胞におけるＶＩＳＴＡ−Ｉｇ活性に対するリンカーフレキシビリティーの影響を示す。ａ）配列１からのｈｕＶＩＳＴＡ−Ｉｇ。ｂ）可動性リンカーを欠く配列２からのｈｕＶＩＳＴＡ−Ｉｇ。ｃ）セリン／グリシンリンカーを有する配列３からのｈｕＶＩＳＴＡ−Ｉｇ。
【図４０】図４０Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、１日おきにＰＢＳ、１５０μｇ対照−ＩｇＧ２ａ又はｍＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａでＮＺＢＷＦ１雌マウスを８週齢から処置した予防研究を含有する。治療研究の場合は第２４週に処置を開始した。体重減少及び蛋白尿によって疾患重症度を毎週監視した。データは平均±ＳＥＭとして示す。対照−ＩｇＧ２ａとｍＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａとの間で統計学的有意差を決定し；対応のないマン・ホイットニー検定によりｐ＝０．００２７（予防）及びｐ＝０．０１５６（治療）となった。
【図４１】図４１Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、Ａからの個々の糸球体の腎臓の代表的なＨ＆Ｅ染色の高倍率切片を含有する。組織学的に正常なＢＷ糸球体。Ｂ．中等度の糸球体炎症があるＶＩＳＴＡ−Ｉｇ−処置マウス；Ｃ．強い炎症及びうっ滞がある対照Ｉｇ−処置マウス；Ｄ．糸球体の完全に近い閉塞がある別の対照Ｉｇ−処置マウス。
【図４２】図４２は、活動性ＥＡＥにおけるＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａの治療効果を示すＥＡＥ動物モデルにおける実験の結果を含有する。
【図４３】図４３Ａ及びＢは、ＳＬＥ発症を予防することにおけるｍＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａの予防効果を示すＳＬＥ動物モデルにおける実験の結果を含有する。
【図４４】図４４Ａ及びＢは、ｍＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａの予防的投与が蛋白尿を減少させ、生存を促進することを示す、ＳＬＥ動物モデルにおける実験の結果を含有する。
【図４５】図４５は、ＴＣＲ  Ｔｇ／ＶＩＳＴＡ−／−マウスにおけるＥＡＥに対する易罹患性を向上させることを示すデータを含有する。
【図４６】図４６は、雌ＶＩＳＴＡ  ＫＯマウスにおけるＩｇＧ自己抗体上昇を示すデータを含有する。
【図４７】図４７は、ＲＡＧ−／−ＶＩＳＴＡ−／−マウスにおける骨髄造血向上を示す実験データを含有する。
【図４８】図４８は、ＶＩＳＴＡ−／−マウスの炎症性表現型を示す実験データを含有する。
【図４９】図４９は、ＯＶＡに対する寛容性および感作の両方が、標的組織においてＦｏｘｐ３+Ｔｒｅｇを上昇させ、流入領域リンパ節でＴｒｅｇを活性化することを示す。ＯＶＡ／ミョウバンアジュバント、ある一定のＯＶＡ単独（寛容化）又はＰＢＳ処置でマウスを感作した。第７、１０、１１及び１２日に、５０μｇ  ＯＶＡ又はＰＢＳを用いて鼻腔内投与を行った。第１３日に、ｎ＝５で、肺及び流入領域リンパ節細胞を核内Ｆｏｘｐ３又は表面ＧＡＲＰについて染色した。
【図５０】図５０は、肺Ｔｒｅｇはアレルゲンに対して無反応であることを示す。全体を通して図４９におけるように、ＯＶＡ／ミョウバンアジュバント（感作）、ＯＶＡ単独（寛容化）又はＰＢＳ処置によりマウスに免疫付与した。第１３日に、肺及び流入領域リンパ節細胞をＣＦＳＥで標識し、アレルゲンの存在下で４日間培養し、続いて核内Ｆｏｘｐ３染色を行った。いくつかの独立した実験で同様のデータが得られた。
【図５１】図５１は、Ｆｏｘｐ３+Ｔｒｅｇにおけるヘリオス発現が炎症性組織で減少するが、流入領域リンパ節では減少しないことを示す。図２におけるように、核内ヘリオス発現について肺及びリンパ節細胞を染色した。
【図５２】図５２は、寛容性誘導中及びアレルゲン感作中の両方で肺胞マクロファージ上でＶＩＳＴＡが高発現されることを示す。肺の炎症を誘発するために、マウスにアレルゲン単独（ＯＶＡ、寛容化）又はアレルゲン＋粘膜アジュバント（ＯＶＡ＋ＴＮＦ−α）の４回のｉ．ｎ．投与を行った。最終負荷２４時間後に、モノクローナルＶＩＳＴＡ  Ａｂで、マクロファージ／ＤＣ（Ｉ−Ａｂ+ＣＤ１１ｃ+）又はリンパ球（ＣＤ３+／Ｂ２２０+）のマーカーについて、ＢＡＬ又は肺組織細胞を染色した。２回の独立した実験で同様のデータが得られた。
【図５３】図５３は、固定化されたＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質がインビトロでのＦｏｘｐ３−発現ＴｒｅｇのＴＧＦ−β介在性誘導を促進することを示す。指定されるように、プレート結合抗ＣＤ３（５μｇ／ｍＬ）±ＴＧＦ−β（１ｎｇ／ｍＬ）及び対照−Ｉｇ又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇ（２．５μｇ／ｍＬ）の何れかとともに、Ｆｏｘｐ３−レポーターマウスからの選別Ｆｏｘｐ３ＧＦＰ−ＣＤ２５−ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を培養した。Ｆｏｘｐ３発現細胞の誘導について７２時間後に細胞を調べた。
【図５４】図５４は、様々なシグナル伝達経路におけるＶＩＳＴＡの影響をアッセイするために使用されるホスホブロットアッセイを図式的に示す。
【図５５】図５５は、ＣＤ３刺激後の様々な時間点でのｐＥＲＫ活性のホスホブロットを含有する。
【図５６】図５６は、図５５と同じ時間点でのローディング対照を含有する。
【図５７】図５７は、ＶＩＳＴＡがＥＲＫ１／２活性化を選択的に阻害することを示すデータを含有する。
【図５８】図５８は、ＶＩＳＴＡがＪＮＫ活性化を阻害しないことを示すデータを含有する。
【図５９】図５９は、ヒト及びマウスＶＩＳＴＡ−Ｉｇの両方がヒト及びマウスＭＬＲ反応を抑制することを示す、ヒト及びマウスＭＬＲ実験の結果を含有する。
【図６０】図６０は、ＮＺＢＷＦ１マウスにおけるＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａの投与が、炎症性単球及びＴ細胞の細胞頻度を変化させないことを示すデータを含有する。
【図６１】図６１は、ＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａで処置される２０週ＮＺＢＷＦ１マウスにおけるＩｌ−１７レベルを示すことを含有する。
【図６２】図６２及び６３は、ＳＬＥ治療研究における２４週齢ＮＺＢＷＦ１マウスのサイトカインプロファイルを含有する。
【図６３】図６２及び６３は、ＳＬＥ治療研究における２４週齢ＮＺＢＷＦ１マウスのサイトカインプロファイルを含有する。
【発明を実施するための形態】
【０１７５】
〔0203〕  本明細書中で記載する発明が完全に理解され得るようにするために、次の詳細な説明を示す。本発明の様々な実施形態を詳細に記載し、提供される実施例によりさらに説明し得る。
【０１７６】
定義
〔0204〕  別段の定めがない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載のものと同様又は同等の方法及び材料を本発明又は本発明の試験において使用し得るものの、適切な方法及び材料を本明細書中に記載する。材料、方法及び実施例は単なる説明であり、限定するものではない。
【０１７７】
〔0205〕  本明細書中の記載で、及び続く特許請求の範囲を通じて使用される場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」の意味は、文脈から明らかに別段示されない限り、複数への言及を含む。
【０１７８】
〔0206〕  「活性化受容体」は、本明細書中で使用される場合、抗原、複合抗原（例えばＭＨＣ分子の場合）、Ｉｇ−融合タンパク質、リガンド又は抗体に結合する免疫細胞受容体を広く指す。しかし活性化受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、サイトカイン受容体、ＬＰＳ受容体、補体受容体及びＦｃ受容体に限定されない。
例えば、Ｔ細胞受容体はＴ細胞上に存在し、ＣＤ３分子と会合する。Ｔ細胞受容体は、ＭＨＣ分子の場合、抗原により（ならびにポリクローナルＴ細胞活性化試薬により）刺激される。ＴＣＲを介したＴ細胞活性化の結果、数多くの変化、例えばタンパク質リン酸化、膜脂質の変化、イオン流動、環状ヌクレオチド改変、ＲＮＡ転写変化、タンパク質合成変化及び細胞体積変化が起こる。
【０１７９】
〔0207〕  「抗原提示細胞」は、本明細書中で使用される場合、専門的な抗原提示細胞（例えばＢリンパ球、単球、樹状細胞及びランゲルハンス細胞）ならびに他の抗原提示細胞（例えば角化細胞、内皮細胞、星状膠細胞、線維芽細胞及び乏突起膠細胞）を広く指す。
【０１８０】
〔0208〕  「アミノ酸」は、本明細書中で使用される場合、天然及び合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を広く指す。天然アミノ酸は、遺伝コードによりコードされるものならびに、後に修飾されるアミノ酸である（例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸及びＯ−ホスホセリン）。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物（即ち、水素、カルボキシル基、アミノ基と結合する炭素）を指し、Ｒ基（例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）類似体は、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）又は修飾されたペプチドバックボーンを有し得るが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化学的化合物を指す。
【０１８１】
〔0209〕  「アネルギー」又は「寛容性」は、本明細書中で使用される場合、受容体介在性刺激の活性化に対するレフラクティビティーを広く指す。レフラクティビティーは、一般に抗原特異的であり、寛容化抗原への曝露が停止された後、持続する。
【０１８２】
〔0210〕  「抗体」は、本明細書中で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」（「抗体部分」、「抗原−結合断片」、「抗体断片」と交換可能にも使用される。）ならびに抗体分子全体を広く指す。「抗原結合部分」という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原（例えばＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３））への特異的結合能を保持する抗体の１以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって発揮され得る。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される抗原結合断片の例としては、（ａ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｂ）Ｆ（ａｂ’）2断片、ヒン
ジ領域でジスルフィド架橋により連結される２つのＦａｂ断片を具備する二価断片；（ｃ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｄ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｅ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；及び（ｆ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは個別の遺伝子によりコードされるにも関わらず、これらは、組み換え法を用いて、それらを、ＶＬ及びＶＨ領域が対形成して一価分子を形成する単一の蛋白質鎖として作製できるようにする合成リンカーにより連結され得る（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）としても知られる。例えばＢｉｒｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８５：５８７９−５８８３；及びＯｓｂｏｕｒｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７７８を参照。１本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されるものとする。完全ＩｇＧ分子又は他のアイソタイプをコードする発現ベクターを作製するために、特異的なｓｃＦｖの何らかのＶＨ及びＶＬ配列をヒト免疫グロブリン定常領域ｃＤＮＡ又はゲノム配列に連結させ得る。タンパク質化学又は組み換えＤＮＡ技術の何れかを用いた免疫グロブリンのＦａｂ、Ｆｖ又は他の断片の作製においても、ＶＨ及びＶｌを使用し得る。１本鎖抗体の他の形態、例えばダイアボディー
も包含される。ダイアボディーは、１本のポリペプチド鎖上で、しかし同じ鎖上のＶＨ及びＶＬドメインの２つのドメイン間での対形成を可能にするには短すぎ、それによってそのドメインを別の鎖の相補的ドメインに強制的に対形成させ、２か所の抗原結合部位を生成させるリンカーを用いて、ＶＨ及びＶＬドメインが発現される、二価、二特異性抗体である。例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照。
【０１８３】
〔0211〕  またさらに、抗体又はその抗原結合部分（抗原結合断片、抗体断片、抗体部分）は、１以上の他のタンパク質又はペプチドとの抗体又は抗体部分の共有又は非共有結合により形成される、より大きな免疫接着分子の一部であり得る。免疫接着分子の例としては、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）及び二価及びビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用が挙げられる。Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８。抗体全体のそれぞれパパイン又はペプシン消化などの従来技術を用いて、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分を抗体全体から調製し得る。さらに、本明細書中で記載のように標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて抗体、抗体部分及び免疫接着分子を得ることができる。
【０１８４】
〔0212〕  抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、異種、同種、同系又はその修飾型、例えばヒト化、キメラであり得る。好ましくは、本発明の抗体は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）分子に特異的に又は実質的に特異的に結合する。「モノクローナル抗体」及び「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原の特定のエピトープと免疫反応可能な１種の抗原結合部位のみを含有する抗体分子の集団を指し、一方で「ポリクローナル抗体」及び「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、特定の抗原と相互作用可能な複数種の抗原結合部位を含有する抗体分子の集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、一般的に、それが免疫反応する特定の抗原に対して単一の結合親和性を示す。
【０１８５】
〔0213〕  「抗原」は、本明細書中で使用される場合、その抗原のエピトープに結合可能な抗体を産生するように動物をさらに誘導可能である抗体により結合可能な分子又は分子の一部分を広く指す。抗原は１つのエピトープを有し得るか又は複数のエピトープを有し得る。本明細書中で言及される特異的反応は、抗原が非常に選択的にその対応する抗体と反応し、他の抗原により惹起され得る多数の他の抗体とは反応しないことを示す。関心のある特定の抗原に対する所望の免疫反応促進の場合、防御的な免疫反応が引き出され得る感染性疾患抗原を含むが限定されない抗原が代表的である。
【０１８６】
〔0214〕  「アレルギー性疾患」は、本明細書中で使用される場合、アレルギー反応を含む疾患を広く指す。より具体的には、「アレルギー性疾患」は、アレルゲンが同定される疾患として定義され、そこにはアレルゲンへの曝露と病理学的変化の発症との間に強い相関があり、その病理学的変化は、免疫学的機構を有することが証明されている。本明細書中で、免疫学的機構は、白血球がアレルゲン刺激に対する免疫反応を示すことを意味する。
【０１８７】
〔0215〕  「アンチセンス核酸分子」は、本明細書中で使用される場合、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的（例えば２本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的）である、ｍＲＮＡ配列に相補的、又は遺伝子のコード鎖に相補的である、ヌクレオチド配列を広く指す。従って、アンチセンス核酸分子はセンス核酸分子に水素結合し得る。
【０１８８】
〔0216〕  「喘息」は、本明細書中で使用される場合、炎症、気道狭窄及び吸入性物質に対する気道の反応性の上昇を特徴とする呼吸器系の障害を広く指す。喘息は頻繁に、排他的でないものの、アトピー性又はアレルギー性症状と関連がある。
【０１８９】
〔0217〕  「アポトーシス」は、本明細書中で使用される場合、当技術分野で公知の技術を用いて特徴評価され得るプログラム細胞死を広く指す。アポトーシス細胞死は、細胞の縮み、膜ブレビング及びクロマチン凝縮、その結果としての細胞断片化を特徴とし得る。アポトーシスが起こっている細胞はまた、ヌクレオソーム間のＤＮＡ切断の特徴的パターンも示す。
【０１９０】
〔0218〕  「自己免疫性」又は「自己免疫疾患又は状態」は、本明細書中で使用される場合、個体それ自身の組織から生じ、それを対象とする疾患又は障害、又はその同時分離もしくは出現又はそこから生じる状態を広く指す。
【０１９１】
〔0219〕  「Ｂ細胞受容体」（ＢＣＲ）は、本明細書中で使用される場合、Ｂ細胞で見られる膜Ｉｇ（ｍＩｇ）と他の膜貫通ポリペプチド（例えばＩｇα及びＩｇβ）との間の複合体を広く指す。ｍＩｇのシグナル形質導入機能は、オリゴマー性又は多量体抗原による受容体分子の架橋により誘発される。Ｂ細胞はまた、抗免疫グロブリン抗体によっても活性化され得る。ＢＣＲ活性化時に、チロシンリン酸化を含め、Ｂ細胞で数多くの変化が起こる。
【０１９２】
〔0220〕  「癌」は、本明細書中で使用される場合、悪性の成長又は腫瘍（例えば無制御の細胞増殖）を生じさせる異常で無制御の細胞分裂を特徴とする、何らかの（浸潤性であれ又は転移性であれ）新生物疾患を広く指す。
【０１９３】
〔0221〕  「キメラ抗体」は、本明細書中で使用される場合、抗原結合部位（可変領域）が、異なるか又は改変されたクラスの定常領域、エフェクター機能及び／又は種、又はキメラ抗体に新しい特性を付与する完全に異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物に連結されるように、定常領域又はその一部分が改変、置換又は交換されており、可変領域又はその一部分が、抗原特異性が異なるか又は改変されている可変領域で改変、置換又は交換されている抗体分子を広く指す。
【０１９４】
〔0222〕  「コード領域」は、本明細書中で使用される場合、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを具備するヌクレオチド配列の領域を広く指し、一方で「非コード領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域（例えば５’及び３’非翻訳領域）を指す。
【０１９５】
〔0223〕  「保存的に修飾された変異体」は、本明細書中で使用される場合、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用され、特定の核酸配列に対して、同一であるか又は基本的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、又はこの核酸は、基本的に同一である配列に対するアミノ酸配列をコードしない、保存的に修飾された変異体を広く表す。遺伝コードの縮重のために、多数の機能的に同一である核酸が所定のタンパク質をコードする。「サイレントな変異」は、ある種の保存的に修飾された核酸変異も指す。ポリペプチドをコードする本明細書中の全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能性のあるサイレントな変異も表す。当業者は、核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ及び通常はトリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧコドンを除く。）は、機能的に同一である分子を得るために修飾され得ることを認識するであろう。
【０１９６】
〔0224〕  「相補性決定領域」、「超可変領域」又は「ＣＤＲ」は、本明細書中で使用
される場合、抗体の軽又は重鎖の可変領域で見出される超可変又は相補性決定領域（ＣＤＲ）の１以上を広く指す。Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．を参照。これらの発現は、Ｋａｂａｔ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓで定義されるような超可変領域又は抗体の３次元構造の超可変ループを含む。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によって、および他の鎖からのＣＤＲと、近接近して保持され、抗原結合部位の形成に関与する。ＣＤＲ内で、抗体抗原相互作用においてＣＤＲにより使用される重要な接触残基に相当する選択性決定領域（ＳＤＲ）として記載されている選択アミノ酸がある。Ｋａｓｈｍｉｒｉ（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４。
【０１９７】
〔0225〕  「対照量」は、本明細書中で使用される場合、マーカーが、マーカーの試験量に対して比較しようとする何らかの量又は範囲であり得ることを広く指す。例えば、マーカーの対照量は、特定の疾患もしくは状態がある患者又はこのような疾患もしくは状態がない者におけるマーカーの量であり得る。対照量は、絶対量（例えばマイクログラム／ｍＬ）又は相対量（例えばシグナルの相対強度）の何れかであり得る。
【０１９８】
〔0226〕  「同時刺激受容体」は、本明細書中で使用される場合、例えばＣＤ２８又はＩＣＯＳといった、免疫細胞に同時刺激シグナルを伝達する受容体を広く指す。本明細書中で使用される場合、「阻害受容体」という用語は、負のシグナルを免疫細胞に伝達する受容体を含む。
【０１９９】
〔0227〕  「同時刺激」は、本明細書中で使用される場合、同時刺激分子が増殖又はエフェクター機能を誘導する第二の非活性化受容体介在性シグナル（「同時刺激シグナル」）を提供する能力を広く指す。例えば、同時刺激シグナルの結果、（例えばＴ細胞−受容体介在性シグナルを受け取ったＴ細胞において）サイトカイン分泌が起こり得る。（例えば活性化受容体を介して）細胞受容体介在性シグナルを受け取った免疫細胞は、本明細書中で、「活性化された免疫細胞」と呼ばれ得る。
【０２００】
〔0228〕  「細胞質ドメイン」は、本明細書中で使用される場合、細胞の細胞質に伸びるタンパク質の部分を広く指す。
【０２０１】
〔0229〕  「診断」は、本明細書中で使用される場合、病的状態の存在又はその性質を同定することを広く指す。診断方法はその感度及び特異性が異なる。診断アッセイの「感度」は、試験で陽性となる病的個体の％（「真の陽性」の％）である。アッセイにより検出されない病的個体は、「偽陰性」である。疾患がなく、アッセイにおいて陰性となる対象は、「真の陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異性」は、１−偽陽性率であり、「偽陽性」率は、試験で陽性となる疾患のない者の割合として定義される。特定の診断方法が、状態の確定診断を提供し得ない一方で、方法が診断に役立つ陽性の指標を提供すれば十分である。
【０２０２】
〔0230〕  「診断する」は、本明細書中で使用される場合、疾患又は症状を分類し、疾患の重症度を決定し、疾患進行を監視し、疾患の転帰及び／又は回復の見込みを予想することを広く指す。「検出すること」という用語は、場合によってはまた、前述のもののうち何れかを包含する。本発明による疾患の診断は、いくつかの実施形態において、対象から得られる生体試料中の本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドのレベルを決定する
ことにより影響を受け得、決定されたレベルは、疾患に対する傾向又は疾患の有無と相関させ得る。なお、「対象から得られる生体試料」はまた、場合によっては対象から物理的に摘出されていない試料も具備し得る。
【０２０３】
〔0231〕  「有効量」は、本明細書中で使用される場合、疾患を処置するために患者に投与される場合、疾患に対するこのような処置を有効にするのに十分である、化合物、抗体、抗原又は細胞の量を広く指す。有効量は、予防法に有効な量及び／又は予防に有効な量であり得る。有効量は、兆候／症状を軽減するために有効な量、兆候／症状の発症を予防するために、兆候／症状の発症の重症度を軽減するために、兆候／症状の発症を排除するために、兆候／症状の発症の発現を遅延させるために、兆候／症状の発症の発現を予防するために及び／又は兆候／症状の発症の有効な予防のために、有効な量であり得る。「有効量」は、処置しようとする患者の疾患及びその重症度及び年齢、体重、病歴、易罹患性及び既存の状態によって変動し得る。「有効量」という用語は、本発明の目的に対して「治療的有効量」と同義語である。
【０２０４】
〔0232〕  「細胞外ドメイン」は、本明細書中で使用される場合、細胞の表面から伸びるタンパク質の一部を広く指す。
【０２０５】
〔0233〕  「発現ベクター」は、本明細書中で使用される場合、原核、酵母、真菌、植物、昆虫又は哺乳動物細胞を含む何らかの細胞中で構成的に又は誘導性にインビトロ又はインビボで本発明の核酸配列を発現する目的のための何らかの組み換え発現系を広く指す。この用語は直鎖状又は環状発現系を含む。この用語は、エピソーム性のままであるか又は宿主細胞ゲノムに組み込まれる発現系を含む。発現系は、自己複製能を有し得るか又は有しない、つまり、細胞で一過性発現のみを駆動する。この用語は、組み換え核酸の転写に必要な最小エレメントのみを含有する組み換え発現カセットを含む。
【０２０６】
〔0234〕  「ファミリー」は、本明細書中で使用される場合、本発明のポリペプチド及び核酸分子が、共通の構造ドメイン又はモチーフを有し、本明細書中で定義されるような十分なアミノ酸又はヌクレオチド配列相同性を有する２以上のポリペプチド又は核酸分子を意味することを広く指す。ファミリーメンバーは天然又は非天然であり得、同じ又は異なる種の何れか由来であり得る。例えば、ファミリーは、ヒト起源の第一のポリペプチドならびに他の、異なる、ヒト起源のポリペプチドを含有し得るか、又はあるいは、非ヒト起源の相同体（例えばサルポリペプチド）を含有し得る。ファミリーのメンバーは共通の機能特性も有し得る
【０２０７】
〔0235〕  「Ｆｃ受容体」（ＦｃＲ）は、本明細書中で使用される場合、免疫グロブリン分子（Ｉｇ）のＦｃ部分に対する細胞表面受容体を広く指す。Ｆｃ受容体は、免疫反応に関与する多くの細胞で見られる。今までのところ同定されているヒトＦｃＲの中でも、ＩｇＧを認識するもの（ＦｃγＲと呼ばれる。）、ＩｇＥを認識するもの（ＦｃεＲ１）、ＩｇＡを認識するもの（ＦｃαＲ）及び重合化ＩｇＭ／Ａを認識するもの（ＦｃμαＲ）がある。ＦｃＲは、次の細胞タイプで見られる：ＦｃεＲ１（肥満細胞）、ＦｃεＲＩＩ（多くの白血球）、ＦｃαＲ（好中球）及びＦｃμαＲ（腺上皮、肝細胞）。Ｈｏｇｇ（１９８８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ９：１８５−８６。広く研究されているＦｃγＲは、細胞免疫防御の中心であり、自己免疫疾患の病変形成に関与する炎症及び加水分解酵素のメディエーター放出を刺激することに関わる。Ｕｎｋｅｌｅｓｓ（１９８８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２５１−８７。マクロファージ／単球、多形核白血球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞ＦｃγＲが、ＩｇＧが介在する特異的な認識のエレメントを付与するので、ＦｃγＲＩＩは、エフェクター細胞とＩｇを分泌するリンパ球との間の決定的なつながりをもたらす。ヒト白血球は、ＩｇＧに対する少なくとも３種類の異なる受容体を有する：ｈＦｃγＲＩ（単球／マクロファージで見られる。）、ｈＦｃ
γＲＩＩ（単球、好中球、好酸球、血小板、おそらくＢ細胞及びＫ５６２細胞株上）及びｈＦｃγＲＩＩＩ（ＮＫ細胞、好中球、好酸球及びマクロファージ上）。
【０２０８】
〔0236〕  Ｔ細胞に関して、Ｔ細胞への同時刺激シグナルの伝達は、シクロスポリンＡにより阻害されないシグナル伝達経路を伴う。さらに、同時刺激シグナルは、Ｔ細胞においてサイトカイン分泌（例えばＩＬ−２及び／又はＩＬ−１０）を誘導し得、及び／又はＴ細胞での抗原の無反応性の誘導、アネルギー誘導又は細胞死誘導を妨害し得る。
【０２０９】
〔0237〕  「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」は、本明細書中で使用される場合、抗体の軽及び重鎖の可変領域内のフレームワーク領域の１以上を広く指す。Ｋａｂａｔら（１９８７）“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照。これらの発現は、抗体の軽及び重鎖の可変領域内でＣＤＲ間に挿入されるアミノ酸配列領域を含む。
【０２１０】
〔0238〕  「異種」は、本明細書中で使用される場合、核酸が天然では互いに同じ関係では見られない２以上のサブ配列を具備することを示す核酸の一部を広く指す。例えば、この核酸は、一般的には組み換え産生され、新しい機能的核酸機能を生み出すように編成される無関係の遺伝子からの２以上の配列を有する（例えばある１つの起源からのプロモーター及び別の起源からのコード領域）。同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が天然では互いに同じ関係では見られない２以上のサブ配列を具備することを示す（例えば融合タンパク質）。
【０２１１】
〔0239〕  「高親和性」は、本明細書中で使用される場合、標的抗原に対して、少なくとも１０-8Ｍ、より好ましくは少なくとも１０-9Ｍ及びさらにより好ましくは少なくとも１０-10ＭであるＫＤを有する抗体を広く指す。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体
アイソタイプに対して変動し得る。例えばＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合は、少なくとも１０-7Ｍ、より好ましくは少なくとも１０-8ＭのＫＤを有する抗体を指す。
【０２１２】
〔0240〕  「相同性」は、本明細書中で使用される場合、核酸配列と参照核酸配列との間又はポリペプチド配列と参照ポリペプチド配列との間の類似性の程度を広く指す。相同性は、部分的又は完全なものであり得る。完全相同性は、核酸又はアミノ酸配列が同一であることを示す。部分的に相同の核酸又はアミノ酸配列は、参照核酸又はアミノ酸配列に対して同一ではないものである。相同性の程度は、配列比較によって決定され得る。「配列同一性」という用語は、「相同性」と交換可能に使用され得る。
【０２１３】
〔0241〕  「宿主細胞」は、本明細書中で使用される場合、本発明の組み換え発現ベクターなどの本発明の核酸分子が導入されている細胞を広く指す。宿主細胞は、原核細胞（例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））又は真核細胞、例えば酵母、昆虫（例えばＳＦ９）、両生類又は、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ−２９３などの哺乳動物細胞、例えば培養細胞、外植片及びインビボの細胞であり得る。「宿主細胞」及び「組み換え宿主細胞」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫又は潜在的な子孫も指すことを理解されたい。突然変異又は環境の影響の何れかにより世代が続くとともにある種の修飾が起こり得るので、子孫は実際には親細胞と同一でない場合があるが、本明細書中で使用される場合、この用語の範囲内に依然として含まれる。
【０２１４】
〔0242〕  「ヒト化抗体」は、本明細書中で使用される場合、ヒト細胞により産生されるより密接に類似する抗体に改変されている可変及び定常領域を有する非ヒト細胞により
産生される抗体を含むことを広く指す。例えば、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンで見られる配列アミノ酸を組み込むために非ヒト抗体アミノ酸配列を改変することによって。本発明のヒト化抗体は、例えばＣＤＲにおいてヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えばインビトロでのランダム又は部位特異的突然変異誘発によって又はインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）。「ヒト化抗体」という用語はまた、本明細書中で使用される場合、マウスなど、別の哺乳動物種の生殖細胞系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体も含む。
【０２１５】
〔0243〕  「ハイブリッド形成」は、本明細書中で使用される場合、鎖が互いに逆平衡に並べられる場合、相補的ヌクレオチド間での水素結合形成による相補的（部分的に相補的であるものを含む。）ポリヌクレオチド鎖の物理的相互作用を広く指す。
【０２１６】
〔0244〕  「ＩｇＶドメイン」及び「ＩｇＣドメイン」は、本明細書中で使用される場合、Ｉｇスーパーファミリーメンバードメインを広く指す。これらのドメインは、Ｉｇフォールドと呼ばれる別個の折り畳みパターンを有する構造単位に対応する。Ｉｇフォールドは、殆どであるが全てではないドメインで２個のシート間に保存的ジスルフィド結合がある、それぞれ５から１０アミノ酸の逆平行β鎖からなる２個のβシートのサンドイッチから構成される。Ｉｇ、ＴＣＲ及びＭＨＣ分子のＩｇＣドメインは、同じタイプの配列パターンを共有し、Ｉｇスーパーファミリー内でＣ１セットと呼ばれる。他のＩｇＣドメインは、他のセット内に入る。ＩｇＶドメインはまた配列パターンも共有し、Ｖセットドメインと呼ばれる。ＩｇＶドメインは、Ｃ−ドメインより長く、β鎖のさらなる対を形成する。
【０２１７】
〔0245〕  「免疫細胞」は、本明細書中で使用される場合、造血系起源であり、免疫反応に関与する細胞を広く指す。免疫細胞としては、リンパ球、例えばＢ細胞及びＴ細胞；ナチュラルキラー細胞；及び骨髄細胞、例えば単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球及び顆粒球が挙げられる。
【０２１８】
〔0246〕  「免疫アッセイ」は、本明細書中で使用される場合、抗原に特異的に結合する抗体を使用するアッセイを広く指す。免疫アッセイは、抗原を単離し、標的とし、及び／又は定量するための、特定の抗体の特異的な結合特性の使用を特徴とし得る。
【０２１９】
〔0247〕  「免疫反応」は、本明細書中で使用される場合、Ｔ細胞同時刺激の調整により影響を受けるＴ細胞介在性及び／又はＢ細胞介在性免疫反応を広く指す。代表的な免疫反応としては、Ｂ細胞反応（例えば抗体産生）Ｔ細胞反応（例えばサイトカイン産生及び細胞毒性）及びサイトカイン反応性細胞、例えばマクロファージの活性化が挙げられる。本明細書中で使用される場合、免疫反応に関して「下方調整」という用語は、何らかの１以上の免疫反応の低減を含み、一方で免疫反応に関して「上方調整」という用語は、何らかの１以上の免疫反応の上昇を含む。あるタイプの免疫反応の上方調整は、別のタイプの免疫反応における対応する下方調整につながり得ることを理解されたい。例えば、ある種のサイトカイン（例えばＩＬ−１０）産生の上方調整は、細胞性免疫反応の下方調整につながり得る。
【０２２０】
〔0248〕  「炎症状態又は炎症性疾患」は、本明細書中で使用される場合、慢性又は急性炎症性疾患を広く指す。
【０２２１】
〔0249〕  「阻害シグナル」は、本明細書中で使用される場合、免疫細胞上の阻害受容体分子を介して伝達されるシグナルを広く指す。シグナルは、受容体の活性化を介して（例えばＴＣＲ、ＣＤ３、ＢＣＲ又はＦｃ分子を介して）シグナルに拮抗し、その結果、例
えば、第二のメッセンジャー産生；増殖；又は免疫細胞におけるエフェクター機能の阻害、例えば食作用、抗体産生もしくは細胞毒性の低下又は免疫細胞のメディエーター（例えばサイトカイン（例えばＩＬ−２）及び／又はアレルギー性反応のメディエーター）産生失敗；又はアネルギーの発現が起こり得る。
【０２２２】
〔0250〕  「単離」は、本明細書中で使用される場合、それが天然に生じるその起源環境から物質を除去し、従ってその天然の環境から人為的に変化させられていることを広く指す。単離物質は、例えば、ベクター系に含まれる外来核酸、宿主細胞内に含有される外来核酸又はその元の環境から除去されており、従って人為的に変化させられている何らかの物質であり得る（例えば「単離抗体」）。例えば、「単離」又は「精製」は、本明細書中で使用される場合、細胞性物質又はその生物学的物質が由来する細胞又は組織起源からの他の夾雑タンパク質を実質的に含まない、又は化学合成された場合は化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない、タンパク質、ＤＮＡ、抗体、ＲＮＡ又は生物学的に活性のあるその一部を広く指す。「実質的に細胞性物質を含まない」という句は、タンパク質が、それが単離されるか又は組み換え産生される細胞の細胞要素から分離されている、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質の調製を含む。
【０２２３】
〔0251〕  「Ｋ−ａｓｓｏｃ」又は「Ｋa」は、本明細書中で使用される場合、特定の
抗体−抗原相互作用の会合速度を広く指し、「Ｋdiss」又は「Ｋd」という用語は、本明
細書中で使用される場合、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。「ＫD」という
用語は、本明細書中で使用される場合、解離定数を指すものとし、これは、Ｋaに対する
Ｋdの比（即ちＫd／Ｋa）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体に対するＫD値は、当技術分野でよく確立されている方法を用いて決定され得る。
【０２２４】
〔0252〕  「標識」又は「検出可能部分」は、本明細書中で使用される場合、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的又は他の物理学的手段によって検出可能な組成物を広く指す。
【０２２５】
〔0253〕  本明細書中での「リンカー」は、一般に、場合によってはＦｃＲ結合及び／又は補体結合及び／又は他のエフェクター機能を増減させるために修飾され得る、ＶＩＳＴＡポリペプチド及び別の部分、一般的にはＩｇタンパク質、最も一般的にはＩｇ  Ｆｃ領域、例えばヒト又はマウスＩｇのＩｇ  Ｆｃ領域、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のものに介入するペプチド配列を指す。代表的な実施形態において、本リンカーは、ＶＩＳＴＡが直接Ｉｇポリペプチドに連結されているＶＩＳＴＡ融合物と比べて、ＶＩＳＴＡ融合物の免疫抑制活性を強化する。本リンカーは、少なくとも約５アミノ酸、より一般的には少なくとも１０から１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５．４０以上のアミノ酸のサイズの範囲であり得る。代表的な実施形態におけるリンカーは、グリシン及びセリン残基を具備し、このようなグリシン／セリン残基の数は、リンカーを構成する残基の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％を具備し得る。代表的なリンカー配列は上記で開示される。
【０２２６】
〔0254〕  「低ストリンジェンシー」、「中度ストリンジェンシー、」「高ストリンジェンシー」又は「非常に高いストリンジェンシー条件」は、本明細書中で使用される場合、核酸ハイブリッド形成及び洗浄に対する条件を広く指す。ハイブリッド形成反応を行うための指針は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（５thＥｄ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ
＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹで見出すことができる。代表的な具体的ハイブリッド形成条件としては、（１）約４５℃で６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）での低ストリンジェンシーハイブリッド形成条件、続いて少なくとも５０℃での０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、２回の洗浄（低ストリンジェンシー条件の場合、洗浄温度を５５℃に上
昇させ得る。）；（２）約４５℃での６ＸＳＳＣ中で中度ストリンジェンシーハイブリッド形成条件、続いて０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６０℃で１回以上の洗浄；（３）約４５℃での６ＸＳＳＣ中の高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件、続いて６５℃で０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄；及び（４）非常に高いストリンジェンシーハイブリッド形成条件は、６５℃で０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、続いて６５℃で０．２ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄が挙げられるが限定されない。
【０２２７】
〔0255〕  「哺乳動物」は、本明細書中で使用される場合、皮膚が毛で覆われ、雌では幼若仔に栄養を与えるための乳汁産生乳腺があることを特徴とする、ヒトを含む、哺乳類の何らか及び全ての温血脊椎動物を広く指す。哺乳動物の例としては、アルパカ、アルマジロ、カピバラ、ネコ、ラクダ、チンパンジー、チンチラ、ウシ、イヌ、ヤギ、ゴリラ、ハムスター、ウマ、ヒト、キツネザル、ラマ、マウス、非ヒト霊長類、ブタ、ラット、ヒツジ、トガリネズミ、リス、バク及びハタネズミが挙げられるが限定されない。哺乳動物としては、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、マウス、ヒツジ、ブタ、霊長類及びげっ歯類種が挙げられるが限定されない。哺乳動物としてはまた、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｕｓｅｕｍ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈｉｓｔｏｒｙ，Ｓｍｉｔｈｓｏｎｉａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎにより維持されているＭａｍｍａｌ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄで列挙されるあらゆる全てのものが挙げられる。
【０２２８】
〔0256〕  「天然の核酸分子」は、本明細書中で使用される場合、天然で生じる（例えば天然タンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡ又はＤＮＡ分子を広く指す。
【０２２９】
〔0257〕  「核酸」又は「核酸配列」は、本明細書中で使用される場合、１本又は２本鎖型の何れかのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドオリゴヌクレオチドを広く指す。この用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する、核酸、即ちオリゴヌクレオチドを包含する。この用語はまた、合成バックボーンがある核酸様構造も包含する。別段の断りがない限り、特定の核酸配列はまた、暗黙的に、保存的に修飾されたその変異体（例えば縮重コドン置換）及び相補的配列、ならびに明確に指示される配列も包含する。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドと交換可能に使用される。
【０２３０】
〔0258〕  「オリゴマー化ドメイン」は、本明細書中で使用される場合、ＶＩＳＴＡ細胞外ドメイン又はその断片と連結される場合、オリゴマー化を促進するドメインを広く指す。このオリゴマー化ドメインは、さらなるジスルフィド結合によりさらに安定化され得る、自己会合性α−へリックス、例えばロイシンジッパーを具備する。本ドメインは、機能的結合タンパク質へのポリペプチドのインビボでの折り畳みを促進すると考えられている過程である、膜を横切る一定方向の折り畳みと適合するように設計される。その例は当技術分野で公知であり、例としてコイルドＧＣＮ４及びＣＯＭＰが挙げられる。
【０２３１】
〔0259〕  α−へリックスコイルドコイルは、おそらくタンパク質で見られる最も幅広く存在するサブユニットオリゴマー化モチーフである。従って、コイルドコイルは、様々な異なる機能を果たす。いくつかの転写活性化因子ファミリーにおいて、例えば，短いロイシンジッパーは、ＤＮＡ上のＤＮＡ−結合領域の位置決定において重要な役割を果たす。Ｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１：１２２３−１２３７。コイルドコイルはまた、中間径フィラメントタンパク質のオリゴマーを形成させるために使用される。コイルドコイルタンパク質は、さらに小胞及びウイルス性膜融合の両方で重要な役割を果たすと思われる。Ｓｋｅｈｅｌ及びＷｉｌｅｙ（１９９８）Ｃｅｌｌ
９５：８７１−８７４。両ケースにおいて、融合させようとする膜に埋没している疎水
性配列は、長いα−へリックスの束から構成される棒状の複合体の同じ端部に局在する。この分子配置は、複合体は膜融合のために組み立てられるので、密接した膜並置を生じさせると思われる。コイルドコイルは、オリゴマー化を調節するために使用されることが多い。転写因子を含む多くのタイプのタンパク質において、中でもＧＣＮ４、ウイルス性融合ペプチド、ＳＮＡＲＥ複合体及びある種のｔＲＮＡシンテターゼが挙げられるが、限定されないことが分かっている。非常に長いコイルドコイルは、トロポミオシン、中間径フィラメント及び紡錘極体構成要素などのタンパク質中で見出される。コイルドコイルは、平行又は逆平行方向で会合する非常に組織化された方式で互いの周囲で超らせんが形成される多くのα−へリックスを伴うが、二量体及び三量体が最も一般的である。へリックスは、同じ又は異なるタンパク質由来であり得る。コイルドコイルは、要素となるへリックスがまとまってそれらの疎水性の溝を埋め込むことにより形成される。疎水性の溝は各へリックスの周囲でねじれるので、へリックスも互いの周囲でねじれてらせん状になり、疎水性の溝を埋め込み、超らせんを形成する。これは、コイルドコイルとして構造を定める、ノブ−ホール・パッキングとして知られる隣接へリックス間の側鎖の特徴的な嵌合である。へリックスは、このタイプの相互作用が起こるために同じ方向に向かう必要はないが、平行立体構造がより一般的である。逆平行立体構造は、三量体では非常に稀であり、五量体では未知であるが、分子内二量体ではより一般的であり、この２つのへリックスは短いループにより連結されることが多い。細胞外空隙において、ヘテロ三量体コイルドコイルタンパク質ラミニンは、基底膜の形成に重要な役割を果たす。他の例は、３（トロンボスポンジン１及び２）又は５（トロンボスポンジン３、４及びＣＯＭＰ）本の鎖が連結されている、トロンボスポンジン及び軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質（ＣＯＭＰ）である。これらの分子は花束型の外観を有し、それらのオリゴマー構造の理由は、おそらく、細胞受容体とのＣ末端ドメインの多価相互作用である。酵母転写活性化因子ＧＣＮ４は、塩基性領域ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）ＤＮＡ−結合モチーフを含有する３０を超える同定真核タンパク質の１つである。Ｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１：１２２３−１２３７。ｂＺＩＰ二量体は、そのカルボキシ末端３４残基にわたり平行コイルドコイルを形成し、それらのアミノ末端に向かって徐々に分岐してＤＮＡ結合部位の大きな溝を通過する、連続αへリックスの対である。コイルドコイル二量体化界面は、ＤＮＡ軸に対して殆ど垂直に向けられ、複合体がＴ字の外観になる。ｂＺＩＰは、平行α−へリックスコイルドコイルにおいて一緒に密に詰められる、疎水性及び非極性残基の４から３回の７アミノ酸反復を含有する。Ｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１：１２２３−１２３７。二量体の安定性は、ＧＣＮ４ロイシンジッパーペプチドの結晶構造において示される、７アミノ酸反復の位置ａおよびｄでのロイシン及び非極性残基の互いのパッキング、ならびに限られた数のへリックス内及びへリックス��の塩架橋によるものである。Ｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１：１２２３−１２３７。別の例は、Ｍｒ５２，０００のサブユニットのホモ三量体としてウシ気管軟骨から単離されるＣＭＰ（マトリリン−１）であり（Ｐａｕｌｓｓｏｎ及びＨｅｉｎｅｇａｒｄ（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９７：３６７−３７５）、ここでは、各サブユニットがｖＷＦＡ１モジュール、単一のＥＧＦドメイン、ｖＷＦＡ２モジュール及び５回の７アミノ酸反復に広がるコイルドコイルドメインからなる。Ｋｉｓｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８１２６−８１３４；Ｈａｕｓｅｒ及びＰａｕｌｓｓｏｎ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５７４７−２５７５３。精製ＣＭＰの電子顕微鏡から、各サブユニットがコイルドコイルに対応する共通点から出現する楕円体を形成する、花束型三量体構造が示された。Ｈａｕｓｅｒ及びＰａｕｌｓｓｏｎ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５７４７−２５７５３。マトリリン−１におけるコイルドコイルドメインはよく研究されている。この三量体構造は、非変性条件下での鎖間ジスルフィド結合の完全還元後に保持される。Ｈａｕｓｅｒ及びＰａｕｌｓｓｏｎ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５７４７−２５７５３。また別の例は、軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質（ＣＯＭＰ）である。非膠原線維性糖タンパク質、ＣＯＭＰは、軟骨において最初に
同定された。Ｈｅｄｂｏｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：６１３２−６１３６。このタンパク質は、Ｎ末端７アミノ酸反復領域（ｃｃ）とそれに続く４個の上皮成長因子（ＥＧＦ）−様ドメイン（ＥＦ）、７個のカルシウム−結合ドメイン（Ｔ３）及びＣ末端球状ドメイン（ＴＣ）からなる５個のサブユニットの５２４ｋＤａのホモ五量体である。このドメイン組織化に従い、ＣＯＭＰはトロンボスポンジンのファミリーに属する。位置ａおよびｄで優先的に疎水性である残基を伴う７アミノ酸繰り返し（ａｂｃｄｅｆｇ）nはへリックスコイルドコイルドメインを形成する。Ｃｏｈｅｎ及
びＰａｒｒｙ（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：４８８−４８９。最近、ＣＯＭＰの組み換え５本鎖コイルドコイルドメイン（ＣＯＭＰｃｃ）が結晶化され、０．２ｎｍ解像度でその構造が解析された。Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：７６１−７６５。
【０２３２】
〔0260〕  「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、本明細書中で使用される場合、２個のＤＮＡ断片が、その２個のＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように連結される場合を広く指す。
【０２３３】
〔0261〕  「パラトープ」は、本明細書中で使用される場合、抗原を認識する抗体の一部（例えば抗体の抗原結合部位）を広く指す。パラトープは、抗体のＦｖ領域の小さな領域（例えば１５から２２アミノ酸）であり得、抗体の重及び軽鎖の一部を含有し得る。Ｇｏｌｄｓｂｙ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｇｅｎｓ（Ｃｈａｐｔｅｒ  ３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（５th  Ｅｄ．）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ及びＣｏｍｐａｎｙ，５７−７５頁を参照。
【０２３４】
〔0262〕  「患者」又は「対象」は、本明細書中で使用される場合、疾患状態を改善するか又は疾患状態の発症もしくは再発を予防するための何れかの処置を必要とする何らかの動物を広く指す。また、「患者」は、本明細書中で使用される場合、リスク因子、病歴、易罹患性、症状、兆候がある、以前疾患の診断を受けた、疾患のリスクがある、又は疾患の患者集団の一員である、何らかの動物を広く指す。患者は、ヒトなどの臨床患者又は、愛玩動物、ペット、家畜、外来動物又は動物園の動物などの患畜であり得る。「対象」という用語は、「患者」という用語と交換可能に使用され得る。
【０２３５】
〔0263〕  「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを広く指す。この用語は、１以上のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の類似体又は模倣体であるアミノ酸ポリマーならびに天然のアミノ酸ポリマーに適用される。この用語は、１以上のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工の化学模倣体であるアミノ酸ポリマーならびに天然のアミノ酸ポリマー及び非天然のアミノ酸ポリマーに適用される。ポリペプチドは、例えば、糖タンパク質を形成させるための炭水化物残基の付加によって修飾され得る。「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、糖タンパク質ならびに非糖タンパク質を含む。
【０２３６】
〔0264〕  「プロモーター」は、本明細書中で使用される場合、核酸の転写を支配する一連の核酸配列を広く指す。本明細書中で使用される場合、プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合はＴＡＴＡエレメントの場合など、転写開始部位の付近に必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた、場合によっては、遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントも含み、これらは、転写開始部位から数千塩基対程度のところに位置し得る。「構成的」プロモーターは、殆どの環境及び発生条件下で活性があるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境又は発生制御下で活性があるプロモーターである。
【０２３７】
〔0265〕  「予防的有効量」は、本明細書中で使用される場合、疾患の予防又は疾患再
発の予防のために患者に投与された場合に、疾患又は再発に対してこのような予防効果を発揮するのに十分な化合物の量を広く指す。予防的有効量は、兆候及び／又は症状の発生を予防するのに有効な量であり得る。「予防的有効量」は、処置しようとする患者の、疾患及びその重症度及び年齢、体重、病歴、状態になりやすい傾向、既に存在する状態に依存して変動し得る。
【０２３８】
〔0266〕  「予防」は、本明細書中で使用される場合、兆候及び／又は症状が患者において存在しないか、寛解期であるか又は患者において依然存在した場合の、一連の治療を広く指す。予防は、患者において疾患の処置の後に起こる疾患の予防を含む。さらに、予防は、疾患を発症する可能性があり得る患者、特にその疾患に罹患し易い患者（例えば親集団のメンバー、リスク因子があるか又は疾患発症のリスクがある者）を処置することを含む。
【０２３９】
〔0267〕  「組み換え」は、本明細書中で使用される場合、生成物に対して、例えば細胞又は核酸、タンパク質又はベクターを広く指し、異種核酸もしくはタンパク質又はネイティブ核酸もしくはタンパク質の改変の導入によって細胞、核酸、タンパク質又はベクターが修飾されていること又は細胞がそのように修飾された細胞由来であることを示す。従って、例えば、組み換え細胞は、細胞のネイティブ（非組み換え）型内では見られない遺伝子を発現するか又は、その他の点では異常に発現されるか、発現が低いか又は全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。
【０２４０】
〔0268〕  「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」は、本明細書中で使用される場合、分泌性及び膜結合ポリペプチドのＮ末端で起こり、多数の疎水性アミノ酸残基を含有する、約１５以上のアミノ酸を含有するペプチドを広く指す。例えば、シグナル配列は、少なくとも約１０から３０アミノ酸残基、好ましくは約１５から２５アミノ酸残基、より好ましくは約１８から２０アミノ酸残基及びさらにより好ましくは約１９アミノ酸残基を含有し、少なくとも約３５から６５％、好ましくは約３８から５０％及びより好ましくは約４０から４５％疎水性アミノ酸残基（例えばバリン、ロイシン、イソロイシン又はフェニルアラニン）を有する。「シグナル配列」はまた、当技術分野で「シグナルペプチド」とも呼ばれ、脂質二重層へとこのような配列を含有するポリペプチドを向けるように作用し、分泌性及び膜結合ポリペプチドにおいて切断される。
【０２４１】
〔0269〕  抗体に「特異的に（又は選択的に）結合する」又は「との特異的（又は選択的）免疫反応性」又は「特異的に相互作用又は結合する」は、本明細書中で使用される場合、タンパク質又はペプチド（又は他のエピトープ）を広く指し、いくつかの実施形態においては、タンパク質及び他の生体物質の不均一集団中のタンパク質の存在の決定要因である結合反応を指す。例えば、指定の免疫アッセイ条件下で、指定の抗体は、バックグラウンド（非特異的シグナル）よりも少なくとも２倍多く特定のタンパク質に結合し、試料中に存在する他のタンパク質とは顕著な量では実質的に結合しない。一般的には、特異的又は選択的反応は、バックグラウンドシグナル又はノイズの少なくとも２倍、及びより一般的にはバックグラウンドの約１０から１００倍超である。
【０２４２】
〔0270〕  「特異的にハイブリッド形成可能な」及び「相補的」は、本明細書中で使用される場合、核酸が、古典的なワトソン−クリック又は他の非古典的なタイプの何れかによって別の核酸配列と水素結合を形成し得ることを広く指す。ある核酸分子の相補的配列とその核酸分子に対する結合自由エネルギーは、核酸の関連機能、例えばＲＮＡｉ活性を開始するのに十分である。核酸分子に対する結合自由エネルギーの決定は当技術分野で周知である。例えばＴｕｒｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＣＳＨ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ：１２３−３３；Ｆｒｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＰＮＡＳ
８３：９３７３−７７；Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ
．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−８５を参照。％相補性は、第二の核酸配列と水素結合（例えばワトソン−クリック塩基対形成）を形成し得る核酸分子中の連続残基の％（例えば、１０のうち約少なくとも５、６、７、８、９、１０とは、約少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％相補的である。全てを含む。）を示す。「完全に相補性」又は１００％相補性は、核酸配列の連続残基全てが第二の核酸配列中の同じ数の連続残基と水素結合することを広く指す。「実質的な相補性」は、ポリヌクレオチド鎖が、非相補的となるように選択される突出部などのポリヌクレオチド鎖の領域を除き、少なくとも約９０％相補性を示すことを指す。特異的な結合は、特異的な結合が所望される条件下で、即ち、インビボアッセイ又は治療的処置の場合は生理的条件下で、又はインビトロアッセイの場合はアッセイが行われる条件下で、非標的配列に対するオリゴマー性化合物の非特異的な結合を回避するために、十分な程度の相補性を必要とする。非標的配列は、一般的には少なくとも５ヌクレオチド異なり得る。
【０２４３】
〔0271〕  疾患の「兆候」は、本明細書中で使用される場合、疾患の主観的指標である症状とは逆の、疾患の客観的指標である、患者の検査で発見可能な疾患を示す何らかの異常を広く指す。
【０２４４】
〔0272〕  「固体支持体」、「支持体」及び「基板」は、本明細書中で使用される場合、平滑な支持体（例えば金属、ガラス、プラスチック、シリコン及びセラミック面）ならびに凹凸がある、及び多孔質の材料を含むが限定されない、別の材料が連結され得る固体又は半固体構造を提供する何らかの材料を広く指す。
【０２４５】
〔0273〕  「対象」は、本明細書中で使用される場合、鳥類及び哺乳動物対象を含むが限定されない、本発明により処置するのに適切な何れかの者を広く指し、好ましくは哺乳動物である。本発明により処置することを必要とするあらゆる哺乳動物対象が適切である。男女両方及びあらゆる発生段階（即ち新生児、幼児、若年、青年、成人）のヒト対象を本発明により処置し得る。本発明はまた、動物対象、特に獣医学的目的に対する、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ヒツジ及びウマなどの哺乳動物対象においても、薬物スクリーニング及び薬物開発目的のためにも行い得る。「対象」は、「患者」と交換可能に使用される。
【０２４６】
〔0274〕  「実質的に化学的前駆体又は他の化学物質不含」は、本明細書中で使用される場合、ＶＩＳＴＡタンパク質合成に関与する化学的前駆体又は他の化学物質からＶＩＳＴＡタンパク質が分離されている、ＶＩＳＴＡタンパク質の調製を広く指す。ある実施形態において、「実質的に化学的前駆体又は他の化学物質不含」という語は、約３０％（乾燥重量）未満の化学的前駆体又は非ＶＩＳＴＡ化学物質、より好ましくは約２０％未満の化学的前駆体又は非ＶＩＳＴＡ化学物質、さらにより好ましくは約１０％未満の化学的前駆体又は非ＶＩＳＴＡ化学物質及び最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体又は非ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）化学物質を有するＶＩＳＴＡタンパク質の調製を含む。
【０２４７】
〔0275〕  疾患の「症状」は、本明細書中で使用される場合、何らかの病的兆候又は、患者が経験し、疾患を示す、構造、機能もしくは感覚の正常な状態からの逸脱を広く指す。
【０２４８】
〔0276〕  「Ｔ細胞」は、本明細書中で使用される場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を広く指す。Ｔ細胞という用語はまた、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞及びＴヘルパー２型Ｔ細胞の両方も含む。
【０２４９】
〔0277〕  「治療」、「治療的」、「を処置する」又は「処置」は、本明細書中で使用される場合、疾患を処置すること、疾患もしくはその臨床症状の発現を阻止又は低下させ
ること、及び／又は疾患を軽減すること、疾患又はその臨床症状の軽減を引き起こすことを広く指す。治療は、疾患、兆候及び／又は疾患の症状の、予防、処置、療法、軽減、改善及び／又はその緩和を包含する。治療は、疾患兆候及び／又は症状（例えば炎症、疼痛）が継続している患者における兆候及び／又は症状の改善を包含する。治療はまた、「予防」も包含する。「軽減させる」という用語は、治療の目的に対して、兆候及び／又は症状の臨床的に意義のある軽減を広く指す。治療は、再燃又は再発性の兆候及び／又は症状（例えば炎症、疼痛）を処置することを含む。治療は、いつも兆候及び／又は症状の出現が起こらないようにすることならびに既存の兆候及び／又は症状を軽減すること及び既存の兆候及び／又は症状を排除することを包含するが限定されない。治療は、慢性疾患（「維持」）及び急性疾患を処置することを含む。例えば、処置は、兆候及び／又は症状（例えば炎症、疼痛）の再燃又は再発を処置又は予防することを含む。
【０２５０】
〔0278〕  「膜貫通ドメイン」は、本明細書中で使用される場合、形質膜を貫通する約１５アミノ酸残基長のアミノ酸配列を広く指す。より好ましくは、膜貫通ドメインは、約少なくとも２０、２５、３０、３５、４０又は４５アミノ酸残基を含み、形質膜を貫通する。膜貫通ドメインは疎水性残基に富み、一般的にα−へリックス構造を有する。実施形態において、膜貫通ドメインの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上のアミノ酸が疎水性、例えばロイシン、イソロイシン、チロシン又はトリプトファンである。膜貫通ドメインは、例えば、Ｚａｇｏｔｔａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：２３５−２６３に記載されている。
【０２５１】
〔0279〕  「トランスジェニック動物」は、本明細書中で使用される場合、動物の細胞の１以上が「導入遺伝子」を含む、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスを広く指す。「導入遺伝子」という用語は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれ、成熟動物のゲノム中に残る、外来性ＤＮＡを指し、例えばトランスジェニック動物の１以上の細胞型又は組織におけるコードされる遺伝子産物の発現を支配する。
【０２５２】
〔0280〕  「腫瘍」は、本明細書中で使用される場合、一般に成長が多かれ少なかれ特異的な細胞及び組織機能の顕著な喪失を付随する、内在組織の、多かれ少なかれ脱抑制される、組織新生物の形態の、特に自然発生的な、自律的な及び可逆的な過剰成長の形態の、少なくとも１つの細胞又は細胞塊を広く指す。この細胞又は細胞塊は、例えばメラノーマ又は癌腫など、その増殖についてそれ自身により又は宿主生物の制御機構により効果的に阻害されない。腫瘍抗原は、悪性腫瘍細胞それ自身中又はその上に存在する抗原を含むだけでなく、内皮細胞及び他の血管構成要素を含む腫瘍の間質支持組織上に存在する抗原も含む。
【０２５３】
〔0281〕  「無反応」は、本明細書中で使用される場合、刺激、例えば活性化受容体又はサイトカインを介した刺激に対する免疫細胞のレフラクティビティーを広く指す。例えば免疫抑制剤又は高用量の抗原への曝露によって無反応となり得る。
【０２５４】
〔0282〕  「可変領域」又は「ＶＲ」は、本明細書中で使用される場合、抗体を抗原に結合させることに直接関与する抗体中の軽及び重鎖の各対内のドメインを広く指す。各重鎖は、片側端で、可変ドメイン（ＶH）とそれに続く多くの定常ドメインを有する。各軽
鎖は、片側端の可変ドメイン（ＶL）及び、他方の端の定常ドメインを有し；軽鎖の定常
ドメインは、重鎖の最初の定常ドメインと並び、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並ぶ。
【０２５５】
〔0283〕  「ベクター」は、本明細書中で使用される場合、それが連結されている別の核酸分子を輸送可能な核酸分子を広く指す。ベクターのある１つのタイプは、さらなるＤ
ＮＡセグメントが連結され得る環状２本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。ベクターの別のタイプはウイルス性ベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントがウイルス性ゲノムに連結され得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律的複製可能である（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに統合され、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を支配可能である。ベクターは、本明細書中で、「組み換え発現ベクター」又は単純に「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組み換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書中で、プラスミドは最も一般的に使用される形態のベクターであるので、「プラスミド」及び「ベクター」は交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、同等の機能を果たす、このような他の形態の発現ベクター、例えばウイルス性ベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）を含むものとする。技術及び手順は、全般的に、当技術分野で周知の、本願を通じて引用し、論じる様々な一般的及びより特定の参考文献に記載されるとおりの、従来の方法に従い行われる。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂ．Ｍａｎｕａｌ［３rd  Ｅｄ］Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照。組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成及び組織培養及び形質転換（例えばエレクトロポレーション、リポフェクション）に対して標準的な技術が使用され得る。酵素性反応及び精製技術は、製造者の仕様書に従い、又は当技術分野で一般に遂行されるように、又は本明細書中で記載のように行われ得る。
【０２５６】
〔0284〕  本明細書中に記載の分析化学、合成有機化学及び医薬及び製薬化学の実験手順及び技術と関連して使用される命名法は、当技術分野で周知のものであり、一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬調製、処方及び送達及び患者の処置に対しては、標準的な技術を使用し得る。
【０２５７】
ＶＩＳＴＡ又はＰＤ−Ｌ３
〔0285〕  本願は、造血細胞で選択的に発現される、Ｔ細胞活性化のＶ領域免疫グロブリン含有抑制因子（ＶＩＳＴＡ）又はＰＤ−Ｌ３と呼ばれる、新規の構造的に異なるＩｇ−スーパーファミリー阻害性リガンドに関する。細胞外ドメインは、Ｂ７ファミリーリガンドＰＤ−Ｌ１に対して相同性を有し、ＰＤ−Ｌ１のように、ＶＩＳＴＡは免疫性に強い影響を有する。しかし、ＰＤ−Ｌ１とは異なり、ＶＩＳＴＡは、造血区画内で選択的に発現される。発現は骨髄抗原提示細胞（ＡＰＣ）で最も強いが、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞での発現及びＦｏｘｐ３＋制御Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のサブセットでのさらに強い発現も非常に興味深い。ＡＰＣにおける可溶性ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又はＶＩＳＴＡ発現は、インビトロでＴ細胞増殖、サイトカイン産生を強力に阻害し、Ｔ細胞においてＦｏｘｐ３発現を誘導する。逆に、新規に開発された抗ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体は、インビトロでＶＩＳＴＡ＋ＡＰＣによるＴ細胞反応のＶＩＳＴＡ−誘発性免疫抑制を妨害した。さらに、インビボで抗ＶＩＳＴＡは、Ｔ細胞介在性自己免疫疾患実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の発現を増強し、防御的な腫瘍特異的免疫反応の発現を促進し、続いて腫瘍の寛解が起こった。ＶＩＳＴＡ−／−マウスの最初の研究は、自然発生的な炎症性疾患の初期兆候を明らかにし、例えばＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７Ｆ、エオタキシン、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１及びＭＩＧ及びＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のレベル上昇を特徴とする炎症性表現型を示し、これらは、ＥＡＥなどの自己免疫性に対する易罹患性の傾向向上、ＩｇＧ自己抗体の発現上昇、骨髄造血増加を示す。また、ＶＩＳＴＡノックアウトは、肺、肝臓及び膵臓でのリンパ球浸潤、肺及び脾臓での濾胞過形成、胃での好中球浸潤の増加を示し、腎臓、副腎、食道、小腸及び結腸では明確な変化は全く示されない。
【０２５８】
〔0286〕  全ての他のＰＤ−リガンド関連分子（例えばＢ７−Ｈ３、Ｈ４、Ｈ６）とは
異なり、ＶＩＳＴＡは、その強い抑制性の活性及び特有の構造特性と一緒に、造血細胞で選択的に発現され、これは、ＶＩＳＴＡが新規の機能的に重複しない中心となる免疫性の負の制御因子であり、その発現が、主にＴ細胞及び骨髄に限定されるものであることを説明する。ＷＯ２０１１／１２００１３を参照。
【０２５９】
〔0287〕  最もよく特徴が分かっている同時刺激リガンドはＢ７．１及びＢ７．２であり、これらは、Ｂ７ファミリーリガンド及び受容体などの多くの非常に重要な免疫制御因子からなるＩｇスーパーファミリーに属する。Ｉｇスーパーファミリーメンバーは、専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）で発現され、それらの受容体はＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４である。ＣＤ２８は、ナイーブ及び活性化Ｔ細胞により発現され、最適Ｔ細胞活性化に非常に重要である。一方、ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞活性化後に誘導され、Ｂ７．１／Ｂ７．２への結合によってＴ細胞活性化を阻害し、ＣＤ２８介在性同時刺激が損なわれる。Ｂ７．１及びＢ７．２ノックアウト（ＫＯ）マウスは適応免疫反応が損なわれており、一方でＣＴＬＡ−４  ＫＯマウスは炎症を的確に調節できず、全身性自己免疫疾患を発現する。時間とともに、Ｂ７ファミリーリガンドは、Ｂ７−Ｈ２（ＩＣＯＳリガンド）及びＢ７−Ｈ３などの同時刺激リガンド及びＢ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ４（Ｂ７Ｓ１又はＢ７ｘ）及びＢ７−Ｈ６などの同時阻害性リガンドを含むように拡大してきた。従って、さらなるＣＤ２８ファミリー受容体が同定されている。ＩＣＯＳは、活性化Ｔ細胞上で発現され、Ｂ７−Ｈ２に結合する。ＩＣＯＳは、Ｔ細胞活性化、分化及び機能に重要な正の同時制御因子である。一方で、プログラム死１（ＰＤ−１）は、Ｔ細胞反応を負に制御する。ＰＤ−１  ＫＯマウスは、狼瘡様自己免疫疾患又はＴ拡張型心筋症を発現した。ＶＩＳＴＡとは逆に、この２つの阻害性Ｂ７ファミリーリガンド、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２は、異なる発現パターンを有する。ＰＤ−Ｌ２は、ＤＣ及びマクロファージで誘導性に発現され、一方、ＰＤ−Ｌ１は造血細胞及び非造血細胞型の両方で広く発現される。ＰＤ−１受容体の免疫抑制的な役割と一致して、ＰＤ−Ｌ１−／−及びＰＤ−Ｌ２−／−マウスを使用した研究から、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生の阻害において両リガンドが重複する役割を有することが示された。ＰＤ−Ｌ１欠乏症は、自己免疫糖尿病の非肥満糖尿病性（ＮＯＤ）モデル及び多発性硬化症（実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）のマウスモデルの両方において疾患進行を促進する。ＰＤ−Ｌ１−／−Ｔ細胞は、両疾患モデルにおいて、プロ炎症性サイトカインレベルが上昇する。さらに、ＮＯＤマウスでの研究から、ＰＤ−Ｌ１の組織発現（即ち膵臓内）が炎症を領域的に調節するその能力に一意的に関与することが明らかになった。ＰＤ−Ｌ１はまた胎盤合胞体栄養細胞でも高く発現され、これは同種胎仔に対する母子免疫反応を強く調節する。
【０２６０】
〔0288〕  抗ＣＴＬＡ−４抗体は、メラノーマのマウスモデル及び臨床治験において高い治療的有用性を示す。Ｂ１６−ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｖａｘ）でワクチン接種されたマウスは、ＣＴＬＡ−４の抗体遮断と組み合わせた場合、Ｂ１６メラノーマの拒絶を促進する。ＰＤ−１ならびにＰＤ−Ｌ１に対する抗体もまた、多岐にわたるマウス腫瘍モデルにおいて抗腫瘍免疫性及び宿主生存性向上を明らかにする。最後に、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１は、同じ同時阻害分子ファミリーに属するものの、Ｔ細胞活性化を阻害するためにそれらが異なる重複しない機構を使用することを示唆する証拠があり、併用した場合、マウスメラノーマで、宿主生存性促進能において抗ＣＴＬＡ−４及び抗ＰＤ−１／Ｌ１の相乗効果がある。
【０２６１】
〔0289〕  免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーは、Ｂ７ファミリーリガンド及び受容体を含む多くの非常に重要な免疫制御因子からなる。ＶＩＳＴＡは、新規の構造的に異なるＩｇスーパーファミリー阻害性リガンドであり、その細胞外ドメインは、Ｂ７ファミリーリガンドＰＤ−Ｌ１に対して相同性を有する。この分子は、Ｔ細胞活性化のＶ−ドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）と呼ばれる。ＶＩＳＴＡは主に造血細胞で発現され、ＶＩＳＴＡ発現は、骨髄抗原提示細胞（ＡＰＣ）及びＴ細胞で高度に制御される。ＡＰ
Ｃでの可溶性ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又はＶＩＳＴＡ発現は、インビトロでＴ細胞増殖及びサイトカイン産生を阻害する。ＶＩＳＴＡ特異的なモノクローナル抗体は、インビトロでＶＩＳＴＡ発現ＡＰＣによってＴ細胞反応のＶＩＳＴＡ−誘導性抑制を妨害する。さらに、抗ＶＩＳＴＡ処置は、マウスでのＴ細胞介在性自己免疫疾患の実験的自己免疫脳脊髄炎の発現を悪化させる。最後に、腫瘍細胞でのＶＩＳＴＡ過剰発現は、マウスにおいてインビボで防御的な抗腫瘍免疫性を妨害する。これらの知見から、新規免疫制御分子であるＶＩＳＴＡが、他のＩｇスーパーファミリーメンバーと重複しない機能活性を有し、癌における自己免疫性及び免疫監視の発現に関与し得ることが示される。Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０８（３）：５７７−９２を参照。
【０２６２】
〔0290〕  ヒトＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡは、Ｔ細胞転写プロファイリングスクリーニングにおいて上方制御される分子として同定された。マウスＣＤ４+Ｔ細
胞ｃＤＮＡライブラリから回収された同一である９３０ｂｐ遺伝子産物の発明者らの特徴評価から、そのサイズ及び配列が確認された。シリコ−配列及び構造分析から、成熟時に３０９アミノ酸のＩ型膜貫通タンパク質が予想される。その細胞外ドメインは、２３アミノ酸ストーク領域と連結される１３６アミノ酸の１個の細胞外Ｉｇ−Ｖドメイン、２１残基膜貫通セグメント及び９７アミノ酸細胞質ドメインを含有する。ＶＩＳＴＡの細胞質テールは、シグナル伝達ドメインを含有しない。ＶＩＳＴＡ  Ｉｇ−ＶドメインとのＢＬＡＳＴ配列検索から、境界域の有意性ｅ−値スコアで進化的に最も近縁の関連タンパク質としてＢ７ファミリーのＰＤ−Ｌ１が同定された。Ｂ７ファミリーメンバー、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３及びＢ７−Ｈ４とのＶＩＳＴＡの構造に基づく配列アラインメントから、全てのＩｇ−Ｖドメインタンパク質において系統的に保存的であるいくつかのアミノ酸が強調される。
【０２６３】
〔0291〕  ＶＩＳＴＡの発現は、造血区画で選択的に発現されると思われ、このタンパク質は、成熟骨髄細胞（ＣＤ１１ｂbright）上では高度に発現され、ＣＤ４+Ｔ細胞、Ｔreg及びＣＤ８+Ｔ細胞上では発現レベルが低い。ＡＰＣでの可溶性ＶＩＳＴＡタンパク質
、例えば可溶性ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又はＶＩＳＴＡ発現は、インビトロでＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生を抑制する。抗ＶＩＳＴＡ抗体、例えば抗ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体（１３Ｆ３）がインビトロでＶＩＳＴＡ+ＡＰＣによ
るＴ細胞反応のＶＩＳＴＡ誘導性抑制を遮断したことも観察される。また、抗ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体がＥＡＥを悪化させ、インビボで脳炎誘発性のＴｈ１７の頻度を上昇させたことも発見されている。またさらに、発明者らは、驚くべきことに、抗ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体が複数のマウス腫瘍モデルにおいて腫瘍寛解を誘発することを発見した。これらのモデルにおける骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）でのＶＩＳＴＡ発現は非常に高く、このことから、ＶＩＳＴＡ+ＭＤＳＣが腫瘍特異的な免疫性を抑制することが示唆
される。ＶＩＳＴＡは、マウスにおいてインビトロ及びインビボの両方で、及びヒト（インビトロのみ）において、Ｔ細胞で免疫抑制活性を発揮し、自己免疫性及び癌に対する免疫反応の発現を調節することにおいて重要なメディエーターである。具体的に、このデータは、ＶＩＳＴＡがＩｇスーパーファミリーの新しいメンバーであり、ＰＤ−Ｌ１と同様に遠位配列とともにＩｇ−Ｖドメインを含有することを示す。ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又は、人工ＡＰＣで過剰発現される場合、ＶＩＳＴＡは、マウス及びヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生の両方を阻害する。さらに、骨髄ＡＰＣでのＶＩＳＴＡ発現は、インビトロでのＴ細胞反応に対して阻害性である。
【０２６４】
〔0292〕  腫瘍微小環境におけるＭＤＳＣ上でのＶＩＳＴＡ発現は非常に高い。多くの細胞表面分子の表現型及び機能分析から、以前、Ｔ細胞のＭＤＳＣ介在性抑制に関与することが示唆され：ＭＤＳＣによってＣＤ１１５、ＣＤ１２４、ＣＤ８０、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２が発現されたが、ＭＤＳＣと免疫抑制性の活性を欠く腫瘍のないマウス由来の
細胞との間で、それらの発現レベル又は陽性細胞の割合に差がないことが見出された。従ってＶＩＳＴＡは、ＭＤＳＣ上での一次Ｂ７陰性制御因子である。
【０２６５】
抗体介在性ＶＩＳＴＡ遮断は、自己腫瘍に対する防御的な免疫性を誘導する。
【０２６６】
〔0293〕  ＶＩＳＴＡは、防御的な抗腫瘍免疫性の発現を妨害するＭＤＳＣ上の優性阻害免疫制御分子である。従って、抗ＶＩＳＴＡ抗体でこの分子の活性を遮断することは、哺乳動物（例えばヒト）において防御的な抗腫瘍免疫性を誘導するために使用され得る。
【０２６７】
〔0294〕  複数コピーのＶＩＳＴＡ細胞外ドメイン又はその断片及び、免疫調節物質として及び様々な癌、例えば膀胱、卵巣及びリンパ腫、自己免疫疾患、アレルギー、感染及び炎症状態、例えば多発性硬化症及び関節炎の処置のために、ＶＩＳＴＡに結合するか又はＶＩＳＴＡの活性を調整する（刺激するか又は拮抗する）、ＶＩＳＴＡ結合物質、例えば低分子及び抗体又はその断片を具備する、可溶性ＶＩＳＴＡタンパク質、例えば融合タンパク質及び多量体ＶＩＳＴＡタンパク質を使用する方法。
【０２６８】
〔0295〕  ＶＩＳＴＡは、細胞外Ｉｇ−Ｖドメインは、２つの既知のＢ７ファミリーリガンドプログラム死リガンド１及び２（ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２）に対して相同性を有し、ＡＰＣ及びＴ細胞のサブセット上でインビトロ及びインビボで特有の配列特性及び特徴的な発現パターンを示す（これは、ＰＤ−Ｌ３又はＶＩＳＴＡと他のＢ７ファミリーリガンドを区別する。）、新規阻害性リガンドである。ＶＩＳＴＡは、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞増殖及び分化に対して機能的影響を有する（ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞増殖、ならびにサイトカイン産生を抑制する。）。Ｔ細胞上でのその発現パターン及び阻害的影響に基づき、ＰＤ−Ｌ３又はＶＩＳＴＡは、Ｔ細胞と骨髄由来ＡＰＣとの間の同種相互作用の間、Ｔ細胞反応を負に制御する制御リガンドとして明らかに機能する。
【０２６９】
〔0296〕  ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）はリガンドのＢ７ファミリーのメンバーであると思われるものの、他のＢ７ファミリーリガンドとは異なり、この分子は、Ｉｇ−ＣドメインはなくＩｇ−Ｖドメインのみを含有し、Ｂ７ファミリー受容体プログラム死−１（ＰＤ−１）に系統発生的により近い。それに基づくと、Ｔ細胞活性化及び分化を制御し、より広くは免疫反応を調節する制御ネットワークを調整するために、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）及びそれに特異的なアゴニスト又はアンタゴニストを使用することができる。特にＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質及びＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）アゴニスト又はアンタゴニスト、好ましくはＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）に特異的な抗体は、自己免疫性、炎症反応及び疾患、アレルギー、癌、感染性疾患及び移植における免疫反応の調整において有用である。
【０２７０】
〔0297〕  Ｔ細胞でのアネルギー（無反応とは対照的に）は、サイトカイン産生、例えばＩＬ−２を欠くことを特徴とする。Ｔ細胞が抗原に曝露され、第二のシグナル（同時刺激シグナル）の非存在下で最初のシグナル（Ｔ細胞受容体又はＣＤ−３介在性シグナル）を受容するときにＴ細胞アネルギーが起こる。これらの条件下で、同じ抗原への細胞の再曝露（同時刺激分子の存在下で再曝露が起こる場合でも）の結果、サイトカインを産生することができず、従って増殖できない。しかし、アネルギーＴ細胞は、無関係の抗原に対して反応を開始し得、サイトカイン（例えばＩＬ−２）とともに培養される場合、増殖し得る。例えば、Ｔ細胞アネルギーはまた、ＥＬＩＳＡによって又は指標細胞株を用いた増殖アッセイによって測定される場合、Ｔリンパ球によるＩＬ−２産生の欠損によっても観察され得る。あるいは、レポーター遺伝子コンストラクトを使用し得る。例えば、アネルギーＴ細胞は、５’ＩＬ−２遺伝子エンハンサーの調節下で異種プロモーターにより、又はエンハンサー内で見られ得るＡＰ１配列の多量体により誘導されるＩＬ−２遺伝子転写を開始できない。Ｋａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１１３
４。
【０２７１】
〔0298〕  本発明のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）分子は、ポリペプチド又は対応する核酸分子中での「細胞外ドメイン」の存在に基づき同定される。別の実施形態において、本発明のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）分子は、ポリペプチド又は対応する核酸分子中での「細胞質ドメイン」の存在に基づき同定される。
【０２７２】
〔0299〕  「免疫細胞反応を調整するための方法」は、本明細書中で、免疫細胞の反応が調整されるように、一次シグナルの存在下でインビトロ又はインビボで免疫細胞をＶＩＳＴＡタンパク質又はそれに特異的な結合物質と接触させることを意味する。（ＶＩＳＴＡ又はその調節物質の相互作用は、免疫細胞へシグナルを伝達し、免疫反応を制御する。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質は、骨髄樹状細胞（ＤＣ）及びマクロファージを含む骨髄抗原提示細胞において高レベルに発現され、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞ではより低密度である。免疫活性化時、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現は、骨髄ＡＰＣ上で上方制御されるが、ＣＤ４＋Ｔ細胞上では下方制御される。）。従って、本発明のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）核酸及びポリペプチド及びそのアゴニスト又はアンタゴニストは、例えば免疫反応を調整することにおいて有用である。
【０２７３】
〔0300〕  本明細書中で交換可能に使用される場合、「ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性」、「ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の生物学的活性」又は「ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の機能的活性」は、標準的な技術に従いインビボ又はインビトロで調べた場合に、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−反応性細胞又は組織上で又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド結合パートナー上で、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質、ポリペプチド又は核酸分子により発揮される活性を指す。これらの活性は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生を調整することを示す。別の実施形態において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）結合パートナーとの会合など、直接的な活性である。本明細書中で使用される場合、「標的分子」又は「結合パートナー」は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）介在性機能が達成されるように、天然でＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドが結合するか又は相互作用する、即ちＴ細胞上で発現される分子である。あるいは、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドが介在する細胞シグナル伝達活性など、間接的な活性である。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の生物学的な活性は、本明細書中に記載されている。例えば、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド及び本発明のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）アゴニスト又はアンタゴニストは、次の活性のうち１以上を有し得る：（１）ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞ならびにメモリー及びエフェクター細胞の増殖を抑制又は促進する、（２）サイトカイン産生を抑制又は促進し、特に炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−６、ＴＮＦ−α、γインターフェロン、ＭＣＰ−１、エオタキシン、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、ＩＬ−１７など抑制する、（３）Ｔ細胞と骨髄由来ＡＰＣとの間の同種相互作用中にＴ細胞反応を負に制御する制御リガンドとして機能する、（４）初期ＴＣＲ活性化を抑制し、細胞分裂を停止させることによってＣＤ４＋Ｔ細胞反応を負に制御するが、アポトーシスに対する直接的な影響は最小限である、（５）ＡＰＣとＴ細胞との間の同種相互作用中に抗原特異的なＴ細胞活性化を抑制又は促進する、及び／又は（６）Ｔ細胞介在性免疫反応を抑制又は促進する、（７）免疫細胞、例えばＴリンパ球の活性化を調整する（増加又は減少させる）、（８）生物、例えばマウス又はヒト生物の免疫反応、例えば炎症性又は自己免疫又はアレルギー性免疫反応を調整する（増加又は減少させる）、（９）ＣＤ４４など、Ｔ細胞における活性化マーカーの発現を増加又は減少させる、（１０）骨髄造血を増加又は減少させる、及び（１１）Ｔ細胞又は好中球浸潤及びＴｈ１７を阻害又は増加させる、（１１）Ｆｏｘｐ３＋細胞を誘導するか又は阻害する、（１２）濾胞過形成を阻害するか又は増加させる。一方、ＶＩＳＴＡ−ＩｇなどのＶＩＳＴＡアゴニストは、Ｂ細胞増殖に影響を与えない。
【０２７４】
〔0301〕  「１以上のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を調整する単離ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質及びポリペプチド」。これらのポリペプチドは、次のドメイン：シグナルペプチドドメイン、ＩｇＶドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインの１以上を有するＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド及び好ましくはＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を含む。
【０２７５】
〔0302〕  同時刺激シグナルの調整の結果、免疫細胞のエフェクター機能の調整が起こり得る。従って、「ＶＩＳＴＡ活性」という用語は、ＶＩＳＴＡポリペプチドがその天然の結合パートナーと結合する能力、免疫細胞同時刺激又は阻害シグナルを調整する能力及び免疫反応を調整する能力を含む。
【０２７６】
〔0303〕  免疫細胞における阻害シグナルの調整の結果、免疫細胞による増殖及び／又はサイトカイン分泌の調整が起こる。例えば、本発明のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドのファミリーは、好ましくは、少なくとも１つの「シグナルペプチドドメイン」を具備する。上述のように、ネイティブヒトＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）のアミノ酸配列においてシグナル配列が同定され、ネイティブマウスＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）のアミノ酸配列においても同定された。
【０２７７】
〔0304〕  ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性の刺激は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）が異常に下方制御される、及び／又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性上昇が有用な効果を有すると思われる状況において望ましい。同様に、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性の阻害は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）が異常に上方制御される、及び／又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性低下が有用な効果を有すると思われる状況において望ましい。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）を下方調整するのに使用するための代表的な物質（即ちＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）アンタゴニスト）としては、例えばアンチセンス核酸分子、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）を認識し、遮断する抗体、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）を認識し、遮断する抗体の組み合わせ及びＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の逆受容体を認識し、遮断する抗体及び免疫細胞上でＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの相互作用を遮断する化合物（例えば可溶性、一価ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）分子；抗原提示細胞上でＦｃ受容体に結合しないＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）分子の可溶性型；ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）結合パートナーの可溶性型；及び対象スクリーニングアッセイにおいて同定される化合物）が挙げられる。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）を上方調整するのに使用するための代表的な物質（即ちＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）アゴニスト）としては、例えば、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドをコードする核酸分子、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の多価型、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の発現を向上させる化合物、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの相互作用を促進する化合物及びＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）を発現する細胞が挙げられる。
【０２７８】
〔0305〕  受容体に結合するＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）分子の形態に依存して、シグナルは、例えば受容体への結合についてＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）分子の活性化型と競合することによって、（例えば、その結果、受容体の架橋が起こるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）分子の多価型によって、又は抗原提示細胞上でＦｃ受容体に結合するＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の可溶性型によって）伝達され得るか、又は（例えば、抗原提示細胞上でＦｃ受容体に結合しないように当技術分野で公知の方法を用いて改変されている、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）分子の可溶性の一価型又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の可溶性型によって）阻害され得るかの何れかである。しかし、可溶性分子が刺激性であり得る例がある。様々な調節物質の効果は、本明細書中で記載のような通常のスクリーニングアッセイを用いて容易に明らかにされ得る。
【０２７９】
免疫反応の下方制御
〔0306〕  ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドの阻害機能の上方制御は、免疫反応を下方制御するために使用され得る。下方制御は、既に進行している免疫反応を阻害するか又は遮断する形態であり得るか、又は免疫反応の誘導を予防することを伴い得る。活性化された免疫細胞の機能は、免疫細胞反応を下方制御することにより、又は免疫細胞において特異的なアネルギーを誘導することにより、又は両方により阻害され得る。例えば、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）は、阻害受容体に結合し得、阻害受容体に結合するＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の形態、例えば細胞表面上の多価ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）は、免疫反応を下方調整するために使用され得る。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を刺激するために使用され得る活性化抗体は、二特異性抗体である。例えば、このような抗体は、免疫細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞又は骨髄細胞上の細胞表面受容体を標的とするＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）結合部位及び別の結合部位を具備し得る。このような抗体は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）結合部位を具備することに加えて、特異的な細胞集団にその分子を標的化するための、Ｂ細胞抗原受容体、Ｔ細胞抗原受容体又はＦｃ受容体に結合する結合部位をさらに具備し得る。二特異性抗体に対するこの第二の抗原の選択によって、阻害のために標的としようとする細胞集団の選択において柔軟性がもたらされる。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を促進するか、又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの相互作用を促進する薬剤（例えばＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性化抗体又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性化低分子）は、その免疫細胞増殖及び／又はエフェクター機能阻害能又は、インビトロアッセイに添加した場合のアネルギー誘導能により同定され得る。例えば、活性化受容体を介してシグナル伝達を刺激する薬剤の存在下で細胞を培養し得る。例えば活性化物質の存在下で細胞増殖又はエフェクター機能（例えば抗体産生、サイトカイン産生、食作用）を測定するために、細胞活性化の当技術分野で認められている多くのリードアウトを使用し得る。試験物質のこの活性化の阻害能は、その物質が、測定されている増殖又はエフェクター機能の低下に影響を与える能力を測定することによって、容易に決定され得る。ある実施形態において、低抗原濃度で、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）免疫細胞相互作用は、強いＢ７−ＣＤ２８シグナルを阻害する。別の実施形態において、高抗原濃度でＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）免疫細胞相互作用はサイトカイン産生を低下させ得るが、Ｔ細胞増殖を阻害しない。従って、試験化合物の活性化遮断能は、抗原の様々な濃度でサイトカイン産生及び／又は増殖を測定することによって決定され得る。
【０２８０】
〔0307〕  寛容性は、抗原をＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）アゴニストと同時投与することによって、特異的な抗原に対して誘導され得る。例えば、寛容性は、特異的なポリペプチドに対して誘導され得る。免疫反応が好ましくないアレルゲン又は外来ポリペプチドに対する免疫反応が阻害され得る。例えば、第ＶＩＩＩ因子を与えられる患者は頻繁に、この凝固因子に対して抗体を産生する。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はその天然の結合パートナーとの相互作用を刺激する薬剤と組み換え第ＶＩＩＩ因子（又は例えば架橋により第ＶＩＩＩ因子に物理的に連結されるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３））の同時投与の結果、免疫反応が下方調整され得る。
【０２８１】
〔0308〕  免疫反応を下方調整するために、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）アゴニスト及び免疫細胞上で同時刺激受容体の活性を遮断し得る別の薬剤を使用し得る。代表的な分子としては、他のＰＤリガンドのアゴニスト形態、ＣＴＬＡ−４、抗Ｂ７−１抗体、抗Ｂ７−２抗体の可溶性型又はそれらの組み合わせが挙げられる。あるいは、対象において免疫細胞介在性免疫反応を下方制御するために、２個の個別のペプチド（例えば、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドとＢ７−２及び／又はＢ７−１ポリペプチドの遮断形態と）又は抗体（例えばＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）に対する活性化抗体と遮断抗Ｂ７−２及び／又は抗Ｂ７−１モノクローナル抗体）ポリペプチドの組み合わせを単一の組成物として合わせ得るか、又は個別に（同時に又は連続的に）投与し得る。さらに、免疫反応に影響を及ぼすために、他の下方調整試薬と組み合わせて、Ｂ７−１及び／又はＢ７−１活性を有する１以上のポリペプチドとともに、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド活性を有する
、治療的活性量の１以上のペプチドを使用し得る。他の免疫調整試薬の例としては、同時刺激シグナルを遮断する抗体（例えばＣＤ２８又はＩＣＯＳに対するもの）、ＣＴＬＡ４を介して阻害シグナルを活性化する抗体及び／又は他の免疫細胞マーカーに対する抗体（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド又はサイトカインに対するもの）、融合タンパク質（例えばＣＴＬＡ４−Ｆｃ又はＰＤ−１−Ｆｃ）及び免疫抑制薬（例えばラパマイシン、シクロスポリンＡ又はＦＫ５０６）が挙げられる。細胞の破壊により免疫細胞機能を遮断する治療剤の構築においてもまた、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドは有用であり得る。例えば、それが結合する細胞の破壊を誘発可能な細胞毒性剤を作製するために、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドの一部分を毒素と連結させ得る。
【０２８２】
〔0309〕  このような細胞毒性剤（例えばＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）リシン（単独又はＰＤ−Ｌ１−リシンとの組み合わせ）のうち１つ又はその組み合わせの患者への点滴の結果、特に、活性化された免疫細胞がより高量のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）結合パートナーを発現するという事実を踏まえると、免疫細胞死が起こり得る。例えば、活性化されたリンパ球の表面上でＰＤ−１が誘導されるので、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドは、Ｆｃ−Ｒ依存性機構によって、又はＶＩＳＴＡに対する受容体を発現する細胞を死滅させるための、細胞毒性薬（例えばリシン、サポリン又はカリケアマイシン）とＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドとの複合化による消失によって、これらの特異的な細胞の枯渇を標的化するために使用し得る。死滅ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現抗原提示細胞を標的とするために、抗ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）抗体に毒素を複合化し得る。さらなる実施形態において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−抗体−毒素は二特異性抗体であり得る。このような二特異性抗体は、例えばある一定のタイプの細胞、例えばＢリンパ球、単球、樹状細胞又はランゲルハンス細胞でのみ見られるマーカーを使用して特異的な細胞集団を標的化するために有用である。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−免疫細胞相互作用を活性化すること（及び、従ってＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の負のシグナル伝達機能を刺激すること）によって免疫反応を下方制御することは、例えば、組織、皮膚及び臓器移植の状況で、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）もしくはアレルギーで、又は自己免疫疾患、例えば全身性紅斑性狼瘡及び多発性硬化症で、免疫反応を下方調整することにおいて有用である。例えば、免疫細胞機能の遮断の結果、組織移植において組織破壊が減少する。一般的には、組織移植において、免疫細胞による外来物としてのその認識とそれに続く移植片を破壊する免疫反応を通じて移植片の拒絶が開始される。移植前又は移植時の、免疫細胞上でのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの相互作用を促進する分子（ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドの可溶性、多量体型など）単独の又は別の下方調整物質と併用した投与によって、同時刺激シグナルの産生が阻害され得る。さらに、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性の促進はまた、免疫細胞をアネルギー化し、それによって対象での寛容性を誘導するためにも十分であり得る。
【０２８３】
〔0310〕  対象において十分な免疫抑制又は寛容性を達成するために、他の分子の同時刺激機能を遮断することも所望され得る。例えば、移植前又は移植時に、これらの抗原のそれぞれの活性を有するペプチド又はこれらの抗原に対する遮断抗体の組み合わせの可溶性型を投与することによって（個別に又は単一組成物中で一緒に）、Ｂ７−１及びＢ７−２の機能を遮断することが所望され得る。あるいは、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の阻害活性を促進し、Ｂ７−１及び／又はＢ７−２の同時刺激活性を阻害することが所望され得る。本発明の下方調整法と組み合わせて使用され得る他の下方調整剤としては、例えば、ＣＴＬＡ４を介して阻害シグナルを伝達する薬剤、ＣＴＬＡ４の可溶性型、ＣＴＬＡ４を介して阻害シグナルを活性化する抗体、他の免疫細胞マーカーに対する遮断抗体又は他の受容体リガンド対の可溶性型（例えばＣＤ４０とＣＤ４０リガンドとの間の相互作用を破壊する薬剤（例えば抗ＣＤ４０リガンド抗体））、サイトカインに対する抗体又は免疫抑制薬が挙げられる。例えば、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）
とその天然の結合パートナーとの相互作用を活性化することは、自己免疫疾患を処置することにおいて有用である。多くの自己免疫障害は、自己組織に対して反応性となり、サイトカイン及び疾患の病変に関与する自己抗体の産生を促進する、免疫細胞の不適切な活性化の結果である。自己反応性免疫細胞の活性化の予防によって、疾患症状が軽減又は排除され得る。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）（ＰＤ−Ｌ３）の活性又はＶＩＳＴＡとその天然の結合パートナーとの相互作用を促進する薬剤の投与により、疾患からの長期にわたる緩和に導き得る自己反応性免疫細胞の抗原特異的な寛容性が誘導され得る。さらに、Ｂ７分子と同時刺激受容体との受容体−リガンド相互作用を破壊することにより免疫細胞の同時刺激を遮断する薬剤の同時投与は、疾患進行に関与し得る自己抗体又はサイトカイン産生を防ぐために免疫細胞活性化を阻害することにおいて有用であり得る。自己免疫障害を防ぐか又は緩和することにおける試薬の有効性は、ヒト自己免疫疾患の、多くの特徴がよく分かっている動物モデルを用いて決定され得る。例としては、マウス実験的自己免疫脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウス又はＮＺＢハイブリッドマウスにおける全身性紅斑性狼瘡、マウス自己免疫コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウス及びＢＢラットにおける糖尿病及びマウス実験的重症筋無力症が挙げられる。Ｐａｕｌ  ｅｄ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９，８４０−８５６頁を参照。
【０２８４】
〔0311〕  免疫細胞活性化の阻害は、例えばＩｇＥ産生を阻害することによって、アレルギー及びアレルギー反応の処置において治療的に有用である。対象において免疫細胞介在性アレルギー性反応を阻害するために、アレルギー性対象に、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの相互作用を促進する薬剤を投与し得る。刺激ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はその天然の結合パートナーとの相互作用は、適切なＭＨＣ分子と組み合わせてアレルゲンへの曝露とともに行われ得る。アレルギー反応は、実際は、アレルゲン侵入経路及び肥満細胞又は好塩基球でのＩｇＥ蓄積パターンに依存して、全身性又は局所性であり得る。従って、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−免疫細胞相互作用を促進する薬剤の投与によって、免疫細胞介在性アレルギー性反応が局所的又は全身的に阻害され得る。
【０２８５】
〔0312〕  ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの相互作用の刺激を介した免疫反応の下方制御はまた、自己組織の自己免疫攻撃を処置することにおいても有用であり得る。従って、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はその天然の結合パートナーへのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）結合を向上させることによって、自己免疫攻撃によって引き起こされるか又は悪化する状態（例えば心疾患、心筋梗塞又はアテローム性動脈硬化症）を良くするか又は改善させ得る。従って、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその逆受容体との相互作用を刺激することによって、自己免疫攻撃により悪化する状態、例えば自己免疫障害（ならびに心疾患、心筋梗塞及びアテローム性動脈硬化症などの状態）を調整することは、本発明の範囲内である。
【０２８６】
免疫反応の上方制御
〔0313〕  免疫反応を上方制御する手段としての、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの相互作用の阻害も、治療において有用である。免疫反応の上方制御は、既存の免疫反応を促進するか又は最初の免疫反応を引き出す形態であり得る。例えば、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性の阻害を通じて免疫反応を促進することは、微生物、例えば細菌、ウイルスもしくは寄生生物の感染の場合に、又は免疫抑制の場合に有用である。例えば、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を阻害する薬剤、例えばＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）に対する非活性化抗体（即ち遮断抗体）又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の可溶性型は、抗体及び細胞介在性反応の上方制御の結果、より迅速又は完全にウイルス、細菌又は寄生生物が排除され、有益である状況において、治療的
に有用である。これらの状態としては、ウイルス性皮膚疾患、例えばヘルペス又は帯状疱疹が挙げられ、この場合、このような薬剤は皮膚に局所的に送達され得る。さらに、このような薬剤の全身的投与によって、全身性ウイルス性疾患、例えばインフルエンザ、一般的な風邪及び脳炎が緩和され得る。ある一定の例において、免疫反応をさらに増大させるために、免疫反応を上方制御する他の物質、例えば、同時刺激受容体を介してシグナルを伝達する、Ｂ７ファミリーメンバーの形態をさらに投与することが所望され得る。
【０２８７】
〔0314〕  患者から免疫細胞を取り出し、インビトロでＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの相互作用を阻害する薬剤と免疫細胞を接触させ、インビトロで刺激された免疫細胞を患者に再導入することによって、感染患者において免疫反応が促進され得る。別の実施形態において、免疫反応を促進する方法は、感染細胞、例えばウイルス感染細胞、を患者から単離し、細胞がそれらの表面上でＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）分子の全て又は一部を発現するように、それらにその天然の結合パートナーと結合できないＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の形態をコードする核酸分子を遺伝子移入し、遺伝子移入細胞を患者に再導入することを伴う。遺伝子移入細胞は、インビボで阻害シグナルを妨害し、それによって免疫細胞を活性化することが可能であり得る。
【０２８８】
〔0315〕  ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの相互作用を阻害する薬剤は、様々なポリペプチド、例えば病原体由来のポリペプチドに対するワクチンにおいて予防的に使用され得る。適切なアジュバント中でＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を阻害する薬剤と一緒にウイルス性ポリペプチドをワクチン接種することによって、病原体、例えばウイルスに対する免疫性が誘導され得る。交互に、病原性抗原及び免疫細胞とのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）相互作用を遮断するＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の形態の両方をコードする遺伝子を具備するベクターをワクチン接種のために使用し得る。核酸ワクチンは、様々な手段、例えば注射（例えば皮膚に粒子を注入するために粒子加速物質又は圧縮ガスを使用する遺伝子銃での、表皮へのＤＮＡ被覆金粒子の、筋肉内、皮内又は微粒子銃注射によって、投与され得る。（Ｈａｙｎｅｓ，ｅｔ
ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４：３７．）。あるいは、非侵襲性手段によって核酸ワクチンを投与し得る。例えば、ＤＮＡの経口送達によって、純粋な、又は脂質処方ＤＮＡを呼吸器系又は他の標的、例えばパイエル板に送達させ得る。Ｓｃｈｕｂｂｅｒｔ（１９９７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：９６１。粘膜表面への送達のために弱毒化微生物を使用し得る。Ｓｉｚｅｍｏｒｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：２９。
【０２８９】
〔0316〕  ワクチンにおける抗原は自己抗原であり得る。このようなワクチンは、生物における寛容性の調整において有用である。自己抗原及びＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの相互作用を遮断する薬剤での免疫付与は、寛容性を破壊（即ち自己抗原の寛容性を妨害）し得る。このようなワクチンはまた、ミョウバン又はサイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、Ｂ７−１又はＢ７−２）などのアジュバントも含み得る。ある実施形態において、例えば、Ｔ細胞を活性化し、感染から免疫性をもたらすために、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド又は遮断抗体及びＭＨＣクラスＩα鎖ポリペプチド及びβ２ミクログロブリンを同時発現するように遺伝子移入された細胞によって、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの相互作用を阻害する薬剤をクラスＩ  ＭＨＣポリペプチドとともに投与し得る。例えば、ワクチンが有用であるウイルス性病原体としては、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、結核、マラリア及び住血吸虫症が挙げられる。
【０２９０】
〔0317〕  ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の
結合パートナーとの相互作用の阻害は、腫瘍免疫性の処置において有用であり得る。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を阻害する核酸分子を腫瘍細胞（例えば肉腫、メラノーマ、リンパ腫、白血病、神経芽腫又は癌腫）に遺伝子移入し得る。これらの分子は、例えばＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）に対してアンチセンスである核酸分子であり得るか、又は非活性化抗ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）抗体をコードし得る。これらの分子はまた、抗ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）抗体の可変領域でもあり得る。必要に応じて、同時刺激を活性化する他のポリペプチド（例えばＢ７−１又はＢ７−２）ともに腫瘍細胞に遺伝子移入することもできる。遺伝子移入された腫瘍細胞は患者に戻され、その結果、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性の阻害（例えば局所的阻害）が起こるか、あるいは、インビボでの遺伝子移入のために腫瘍細胞を標的化するために遺伝子治療技術を使用し得る。
【０２９１】
〔0318〕  腫瘍細胞に対する免疫反応の刺激は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの相互作用を阻害することによって、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの相互作用を阻害する薬剤で患者を処置することによっても達成され得る。このような薬剤の好ましい例としては、例えばアンチセンス核酸分子、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）を認識し、遮断する抗体及び、免疫細胞上でＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの相互作用を遮断する化合物（例えば可溶性、一価ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）分子；抗原提示細胞上でＦｃ受容体と結合しないＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）分子の可溶性型；ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）結合パートナーの可溶性型；及び対象スクリーニングアッセイにおいて同定される化合物）が挙げられる。さらに、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子を欠くか、又は十分な量のＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子を発現できない腫瘍細胞に、ＭＨＣクラスＩα鎖ポリペプチド及びβ２ミクログロブリンポリペプチド又はＭＨＣクラスＩＩα鎖ポリペプチド及びＭＨＣクラスＩＩ、β鎖ポリペプチドの全て又は一部（例えば細胞質−ドメイン短縮部）をコードする核酸を遺伝子移入し、それにより細胞表面上にＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩポリペプチドを発現させることができる。ポリペプチド又はアンチセンス核酸を阻害するＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）と組み合わせた適切なクラスＩ又はクラスＩＩ  ＭＨＣの発現は、遺伝子移入腫瘍細胞に対してＴ細胞介在性免疫反応を誘導する。場合によっては、インバリアント鎖など、ＭＨＣクラスＩＩ−関連ポリペプチドの発現を遮断するアンチセンスコンストラクトをコードする遺伝子も、腫瘍関連抗原の提示を促進し、腫瘍特異的な免疫性を誘導するために、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）阻害ポリペプチド又はアンチセンス核酸をコードするＤＮＡとともに同時遺伝子移入され得る。Ｂ７−陰性マウス腫瘍細胞によるＢ７−１の発現は、腫瘍拒絶に付随するＴ細胞介在性の特異的免疫性及びマウスでの腫瘍負荷に対する長期の防御を誘導することが示されている。Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１：１０９３−１１０２；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ及びＡｌｌｉｓｏｎ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：３６８−３７０；Ｂａｓｋａｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：５６８７−５６９０。従って、ヒト対象における免疫細胞介在性免疫反応の誘導は、対象において腫瘍特異的な寛容性を克服するのに十分であり得る。別の実施形態において、既に存在する寛容性が克服されるように、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの相互作用の阻害によって免疫反応を刺激し得る。例えば、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）のその天然の結合パートナーへの結合能を阻害する薬剤を投与することによって、対象が顕著な免疫反応を開始できない抗原、例えば腫瘍特異的な抗原に対する免疫反応が誘導され得、能動的な免疫付与の過程において外来抗原への反応を強化するためにアジュバン���として使用され得る。
【０２９２】
〔0319〕  対象から免疫細胞を得て、免疫細胞集団を拡大するために、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの相互作用を阻害する薬剤の存在下でエクスビボで培養し得る。さらなる実施形態において、次に、
免疫細胞を対象に投与する。当技術分野で公知であるように、例えば一次活性化シグナル及び同時刺激シグナルを免疫細胞にもたらすことによって、インビトロで増殖させるために免疫細胞を刺激し得る。免疫細胞の増殖を同時刺激するために、様々な形態のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を阻害する薬剤も使用され得る。ある実施形態において、ＷＯ９４／２９４３６に記載の方法に従い、免疫細胞がエクスビボで培養される。同時刺激分子は、可溶性であり、細胞膜に連結されるか、又はビーズなどの固体表面に連結され得る。
【０２９３】
〔0320〕  本明細書中に記載の方法の何れかを行うことにおいて、１以上のさらなる薬剤を投与することによって免疫反応を上方制御することは、本発明の範囲内である。例えば、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの相互作用を阻害する薬剤と組み合わせて、サイトカイン、アジュバント又は同時刺激分子の刺激性型又はそれらのリガンドなど、免疫反応を刺激することが知られている他の薬剤の使用を使用し得る。
【０２９４】
Ｔ細胞上でのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその逆受容体との相互作用の調整により調節されるサイトカインの同定
〔0321〕  ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの相互作用の調整に対する反応において、免疫細胞により産生されるか又は免疫細胞においてその産生が促進もしくは阻害されるサイトカインを同定するために、本明細書中に記載のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）分子を使用し得、一次活性化シグナルで免疫細胞がインビトロで準最適に刺激され得、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子とともに、Ｔ細胞をホルボールエステル、抗ＣＤ３抗体又は好ましくは抗原で、及び同時刺激シグナルを考えると、例えばＢ７ファミリー抗原の刺激型により、例えばＢ７ポリペプチドをコードする核酸を遺伝子移入し、その表面上でそのペプチドを発現する細胞により、又はそのペプチドの可溶性の刺激性型により、Ｔ細胞を刺激し得る。次に、この細胞と、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）（例えばＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）に対する抗体）を発現する細胞とを接触させ得る。ＥＬＩＳＡによって又はサイトカインを遮断して、サイトカインにより誘導される免疫細胞増殖又は他の細胞型の増殖を阻害するという抗体の能力によって、培地に放出される既知のサイトカインを同定し得る。例えば、ＩＬ−４ＥＬＩＳＡキットは、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ．）より、ＩＬ−７遮断抗体であるものとして入手可能である。ＩＬ−９及びＩＬ−１２に対する遮断抗体は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ．）より入手可能である。次に、サイトカインプロファイルにおいてＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその結合パートナーとの相互作用を刺激又は遮断する効果を決定し得る。上記のとおり、及び実施例で示されるように、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）は、明らかに免疫細胞によるＩＬ−２及びγインターフェロンの発現を抑制する。
【０２９５】
〔0322〕  ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性の調整によって調整され得る新規サイトカインを同定するための方法においても、上述のようなインビトロでの免疫細胞同時刺激アッセイが使用され得る。例えば、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路の刺激がＩＬ−２分泌を促進すると思われる場合、ＩＣＯＳ経路の刺激は、ＩＬ−１０分泌を促進すると思われる。Ｈｕｔｌｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９７：２６３。特定の活性が同時刺激時に誘導される場合、例えば、既知のサイトカインの遮断抗体の添加によって免疫細胞増殖を阻害することができず、この活性は、未知のサイトカインの作用によるものであり得る。同時刺激後、従来の方法によって培地からこのサイトカインを精製し、その免疫細胞増殖誘導能によってその活性を測定し得る。
【０２９６】
〔0323〕  寛容性誘導に関わり得るサイトカインを同定するために、上記のようなインビトロＴ細胞同時刺激アッセイを使用し得る。この場合、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを
与え、選択したサイトカインと接触させるが、同時刺激シグナルは与えない。免疫細胞を洗浄し、休止させた後、一次活性化シグナル及び同時刺激シグナルの両方を細胞に再負荷する。免疫細胞が反応（例えば増殖又はサイトカインを産生）しない場合、これらは、寛容化されており、サイトカインは寛容性誘導を妨げていない。しかし、免疫細胞が反応する場合、寛容性の誘導がサイトカインにより妨げられている。寛容性誘導を防御可能なサイトカインは、移植受容者又は自己免疫疾患対象での寛容性を誘導するためのより効率的な手段として、Ｂリンパ球抗原を遮断する試薬と組み合わせて、インビボで遮断に対する標的となり得る。例えば、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）と結合パートナーとの相互作用を促進する薬剤と一緒に対象にサイトカイン遮断抗体を投与し得る。
【０２９７】
〔0324〕  従って、まとめると、今回、Ｔｒｅｇ細胞によって発現されるプログラム死リガンド（ＰＤＬ）ファミリーの新規メンバーが同定された。この新規タンパク質はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）と名付けられた。このＰＤ−Ｌファミリーの受容体は、単一ＩｇＶドメインを含有するＩ型膜貫通タンパク質であり、一方でリガンドはＩｇＶ及びＩｇＣ細胞外ドメインの両方を発現するＩ型膜貫通タンパク質である。ＰＤＬファミリーの他のメンバーと同様に、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）は、インビトロでＴ細胞のαＣＤ３増殖を同時刺激する。さらに、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の発現は、αＣＤ３活性化Ｔｒｅｇにおいて上昇し、αＧＩＴＲの存在下で減少する。
【０２９８】
〔0325〕  第二の、ＴＮＦ−様のタンパク質もαＣＤ３／αＧＩＴＲ刺激時に上方制御されるものと同定された。このタンパク質はＴｒｅｇ−ｓＴＮＦと名付けられた。これらのタンパク質は、免疫性の接触依存性及び傍分泌抑制に関与し得、従って、免疫反応を調整する（例えば阻害する又は刺激する）ために、及びＴｒｅｇシグナル伝達を伴う疾患及び状態の処置において有用である。例えば、免疫細胞活性化を刺激又は促進するために、同時刺激シグナルとしてＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質を使用し得る。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質及びＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）結合物質及びＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）アゴニスト及びアンタゴニストは、Ｔ細胞免疫性の制御、例えばＴ細胞活性化、分化及び増殖の調整、及び特にＴ細胞と骨髄由来ＡＰＣとの間の同種相互作用中のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生及びＴ細胞反応の調整、同種相互作用が所望される免疫状態を処置することにおいて特に有用である。
【０２９９】
ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチド
〔0326〕  本発明は、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドを提供する。発明者らは、驚くべきことにＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドが負の免疫調節物質として作用することを発見した。代表的なＶＩＳＴＡポリペプチドは配列番号２、４及び５で提供される。本発明のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）分子は、次のドメイン：シグナルペプチドドメイン、ＩｇＶドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン又は細胞質ドメインのうち少なくとも１以上を含む。本発明の単離ポリペプチド、好ましくはＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドは、配列番号２、４もしくは５のアミノ酸配列に対して十分に同一であるか、又は配列番号１もしくは３に対して十分に同一であるヌクレオチド配列又はその断片もしくは相補体によりコードされるアミノ酸配列を具備し得る。本明細書中で使用される場合、「十分に同一である」という用語は、第一及び第二のアミノ酸又はヌクレオチド配列が共通の構造ドメイン又はモチーフ及び／又は共通の機能活性を共有するように、第一のアミノ酸又はヌクレオチド配列が、第二のアミノ酸又はヌクレオチド配列に対して、十分な又は最小数の同一又は同等のアミノ酸残基（例えば同様の側鎖を有するアミノ酸残基）又はヌクレオチドを含有することを指す。例えば、そのドメインのアミノ酸配列にわたり、少なくとも３０％、４０％又は５０％相同性、好ましくは６０％相同性、より好ましくは７０から８０％、及びさらにより好ましくは９０から９５％の相同性を有し、少なくとも１及び好ましくは２つの構造ドメイン又はモチーフを含有する、共通構造ドメイ
ンを共有するアミノ酸又はヌクレオチド配列は、本明細書中で十分に同一であると定義される。さらに、少なくとも３０％、４０％又は５０％、好ましくは６０％、より好ましくは７０から８０％又は９０から９５％の相同性を共有し、共通の機能活性を共有するアミノ酸又はヌクレオチド配列は、本明細書中で十分に同一であると定義される。ＶＩＳＴＡポリペプチドの細胞外ドメインは、ＩｇＶドメインを具備し得、シグナルペプチドドメインを含み得る。図ＡからＥ１及び２３ＡからＣを参照。
【０３００】
〔0327〕  ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドは、少なくとも１つの細胞外ドメイン及びシグナルペプチドドメイン、ＩｇＶドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインのうち１以上を有し得、好ましくは、本明細書中の配列番号１又は３のヌクレオチド配列の相補体を具備する核酸分子とストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる。代表的な単離ヒト及びマウスＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列及びヒトＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドの予想アミノ酸配列は、本明細書中で列挙される配列に含有される。
【０３０１】
〔0328〕  本発明のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドは、「膜貫通ドメイン」の存在に基づき同定され得る。ＰＤＬ３の膜貫通ドメイン領域が本明細書中で同定される。例えば図１Ａ−Ｅ及び２３Ａ−Ｃを参照。本発明のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）分子は、ポリペプチド又は対応する核酸分子において、「ＩｇＣドメイン」がないこと及び「ＩｇＶドメイン」があることに基づき同定され得る。ＩｇＶドメインを構成するネイティブヒト及びマウスＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドのアミノ酸残基は、図１Ａ−Ｅ及び２３Ａ−Ｃで見ることができる。ＩｇＶドメインの存在は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）のその天然の結合パートナーに対する結合に必要であると思われる。
【０３０２】
〔0329〕  ＶＩＳＴＡポリペプチドをコードする核酸は、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物の特異的な抗原性（例えばＶＩＳＴＡポリペプチドが抗ＶＩＳＴＡ抗体により結合される。）を保持する、アミノ酸配列における欠失、付加及び置換を含むが限定されない、少なくとも１つのＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を具備する変異体ポリペプチドが得られる標準的な分子生物学的技術を用いて修飾され得る。さらに、少なくとも１つのＶＩＳＴＡポリペプチドを具備する変異体ポリペプチドはまた、ＶＩＳＴＡポリペプチドの抗原性も保持し得る（例えば対象での免疫付与時にそれぞれＶＩＳＴＡポリペプチド及び変異体ＶＩＳＴＡポリペプチドに対して特異的な免疫反応を生じさせる。）。「癌ワクチン」（例えば対象における免疫付与後に、抗腫瘍抗体を産生させる、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物に対する特異的な免疫反応を引き出す医薬組成物）として有用な抗原組成物を製造するために、医薬担体とともにＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドを処方し得る。本明細書中に記載のＶＩＳＴＡポリペプチド及びＶＩＳＴＡ複合物は、自己免疫障害及び炎症性疾患を処置するために使用され得る。
【０３０３】
ポリペプチド誘導体及び類似体
〔0330〕  当然のことながら、本明細書中に記載のポリペプチドは、分解産物、合成ペプチド又は組み換えペプチドならびにペプチド模倣物、合成ペプチド、ペプトイド及びセミペプトイド（例えば、体内ではペプチドをより安定させるか、又は細胞への浸透能をより高くする修飾を有し得るペプチド類似体）であり得る。本明細書中に記載のＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドの修飾としては、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾（例えばＣＨ2−ＮＨ、ＣＨ2−Ｓ、ＣＨ2−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ2−Ｏ、ＣＨ2−ＣＨ2、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ又はＣＦ＝ＣＨ）、バックボーン修飾及び残基修飾が挙げられるが限定されない。ペプチド模倣化合物を調製するための方法は当技術分野で周知である。Ｍａｒｔｉｎ，（２０１０）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ａ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［２nd  Ｅｄ．］ＣＲＣ  Ｐ
ｒｅｓｓ。
【０３０４】
〔0331〕  ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えばＮ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ
−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは何らかのアルキル、例えばメチル、カルバ結合（−ＣＨ2−ＮＨ−）、
ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ
−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ2−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子上に天然で提示
される「正常」側鎖である。）である。）で置換され得る。これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合の何れか、及び、同時にいくつか（２から３）でも起こり得る。
【０３０５】
〔0332〕  天然の芳香族アミノ酸、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＰｈｅは、合成非天然酸、例えばフェニルグリシン、ＴＩＣ、ナフチルエラニン（Ｎｏｌ）、フェニルアラニンの環−メチル化誘導体、フェニルアラニンのハロゲン化誘導体又はｏ−メチル−チロシンによって置換され得る。上記に加えて、本発明のポリペプチドはまた、１以上の修飾アミノ酸又は１以上の非アミノ酸単量体（例えば脂肪酸、複合糖質）、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリン及びホスホスレオニン；及び、２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノル−バリン、ノル−ロイシン及びオルニチンを含むが限定されない他の通常のものではないアミノ酸も含む。さらに、「アミノ酸」という用語は、Ｄ−及びＬ−アミノ酸の両方を含む。
【０３０６】
〔0333〕  本発明のポリペプチドは好ましくは、ペプチドが可溶性型であることが必要な治療薬において利用されるので、本発明のポリペプチドは、それらのヒドロキシル含有側鎖ゆえにペプチド溶解度を上昇させることが可能なセリン及びスレオニン含むが限定されない１以上の非天然又は天然の極性アミノ酸を具備し得る。
【０３０７】
〔0334〕  本発明のポリペプチドは直鎖状の形態であり得るが、当然のことながら、場合により利用され得る。
【０３０８】
〔0335〕  本明細書中に記載のＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドは、それを発現させるために改変されている（例えば組み換え）細胞から精製され得る。ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、発現ベクターに挿入され、次いで適切な宿主細胞において形質転換され（又は遺伝子移入され）、及び／又はトランスジェニック動物で発現され得る。次いで、当技術分野で公知の方法によって、そのように発現されるＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドが単離され得る。例えばＭａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ［３rdＥｄ．］Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照。
【０３０９】
〔0336〕  本発明のポリペプチドは、標準的な固相技術を使用することなどによって、生化学的に合成され得る。これらの方法としては、排他的固相合成、部分的固相合成方法、断片濃縮、古典的溶液合成が挙げられる。これらの方法は、好ましくは、ペプチドが比較的短い（即ち１０ｋＤａ）場合、及び／又はそれが組み換え技術により産生され得ない場合（即ち核酸配列によりコードされない。）に使用され、従って、様々な化学を伴う。固相ペプチド合成手順は当技術分野で周知であり、Ｓｔｅｗａｒｔ（１９８４）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ［２nd  Ｅｄ．］Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ及びＢｅｎｏｉｔｏｎ（２００５）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓによってさらに記載される。合成ペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィーにより精製され得、この組
成物はアミノ酸配列決定を介して確認され得る。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９９２）［２nd
Ｅｄ．］Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ及びＣｏｍｐａｎｙ；Ａｇｕｉｌａｒ（２００４）［Ｅｄ．］ＨＰＬＣ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｉｍｐｓｏｎ（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ［２nd  Ｅｄ．］Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓを参照。
【０３１０】
〔0337〕  大量の本発明のポリペプチドが所望される場合、本発明のポリペプチドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（２００２）“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＢＥＶｓ）ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ；Ｈａｔｔｉ−Ｋａｕｌ及びＭａｔｔｉａｓｓｏｎ（２００３）［Ｅｄｓ］Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ａｈｍｅｄ（２００４）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓにより記載されるものなどの組み換え技術を用いて作製され得る。例えば、Ｂｉｔｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４，Ｓｔｕｄｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９，Ｂｒｉｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：５１１−５１４，Ｔａｋａｍａｔｓｕ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７−３１１，Ｃｏｒｕｚｚｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０及びＢｒｏｇｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３，Ｇｕｒｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．６：５５９−５６５及びＷｅｉｓｓｂａｃｈ及びＷｅｉｓｓｂａｃｈ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，４２１−４６３頁により記載されるものなどのさらなる組み換え技術。
【０３１１】
ポリペプチド配列変異体
〔0338〕  本明細書中に記載の何らかのＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物配列の場合、より長いか又はより短いペプチドを作製するためにアミノ酸残基を系統的に付加するか又は除去するかの何れかを行い、その点から抗原を上下する、より長いか又はより短いサイズの枠を歩行することによりこれら及び作製される配列を試験することによって、さらなる特徴評価又は最適化が達成され得る。当技術分野で公知又は本明細書中で記載のように、免疫原性アッセイにおいて配列に基づき抗原性分子の有効性について試験することと新しい候補標的を作製することに対するこのアプローチを組み合わせることは、抗原のさらなる操作につながり得る。さらにまた、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物をさらに最適化するために（例えば血清安定性上昇又は循環半減期延長、熱安定性向上、送達促進、免疫原性促進，溶解度上昇、特定のインビボ位置又は細胞型に対する標的化）、当技術分野で公知であり、及び／又は本明細書中で論じられるように、例えば付加、欠失又は他の突然変異によって、このような最適化配列を調整し得る。
【０３１２】
〔0339〕  本明細書中に記載のＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドは、保存的置換突然変異、（即ち同様のアミノ酸による１以上のアミノ酸の置換）を具備し得る。例えば、保存的置換は、同じ一般クラス内の別のものによるアミノ酸の置換、例えばある酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸で、ある塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で、又はある中性アミノ酸を別の中性アミノ酸で置換するもの、を指す。
【０３１３】
〔0340〕  ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチド配列は、配列番号２、４又は５
のポリペプチド配列のうち何らかの１以上に対して少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列相同性を有し得る。より好ましくは、本発明は、配列番号２、４又は５のＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチド配列のポリペプチド配列の何れか１以上に対して、少なくとも約９５％の配列相同性、さらにより好ましくは少なくとも約９８％の配列相同性及びさらにより好ましくは少なくとも約９９％の配列相同性を有するポリペプチド配列を企図する。アミノ酸配列、ならびに核酸配列間で相同性を決定するための方法は、当業者にとって周知である。例えばＮｅｄｅｌｋｏｖ及びＮｅｌｓｏｎ（２００６）Ｎｅｗ  ａｎｄ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓを参照。
【０３１４】
〔0341〕  従って、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドは、ポリペプチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列相同性を有し得る。例えば、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドは、配列番号２、４又は５と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列相同性を有し得る。
【０３１５】
〔0342〕  相同性又は同一性という用語は、％で表される、他のタンパク質と一致するアミノ酸の数（同一性）を意味するものと理解される。同一性は、好ましくは、コンピュータプログラムを利用してある配列を他のタンパク質と比較することによって決定される。互いに比較される配列の長さが異なる場合、同一性は、短い配列がより長い配列と共有するアミノ酸数が％同一性を決定するようにして決定されるものである。同一性は、例えばＣｌｕｓｔａｌＷなど、公開されている既知のコンピュータプログラムの手段によって通常決定され得る。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：４６７３−４６８０。ＣｌｕｓｔａｌＷは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから公開されており、様々なインターネットページ、とりわけＩＧＢＭＣ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｄｅ  Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ  ｅｔ  ｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ  ｅｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｉｒｅ）及びＥＢＩ及び全てのミラーＥＢＩインターネットページ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からダウンロードされ得る。例えば本願の参照タンパク質と他のタンパク質との間の同一性を決定するためにＣｌｕｓｔａｌＷコンピュータプログラムＶｅｒｓｉｏｎ  １．８を使用する場合、次のパラメーターを設定するものとする：ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＴＯＰＤＩＡＧ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝５、ＰＡＩＲＧＡＰ＝３、ＧＡＰＯＰＥＮ＝１０、ＧＡＰＥＸＴＥＮＤ＝０．０５、ＧＡＰＤＩＳＴ＝８、ＭＡＸＤＩＶ＝４０、ＭＡＴＲＩＸ＝ＧＯＮＮＥＴ、ＥＮＤＧＡＰＳ（ＯＦＦ）、ＮＯＰＧＡＰ、ＮＯＨＧＡＰ。オンラインで入手可能なＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）ツールボックス及びＳｍｉｔｈ（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ［２nd  Ｅｄ．］Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓも参照のこと。
【０３１６】
〔0343〕  同様の配列を見出すある可能性は、配列データベース検索を行うことである。ここで、１以上の配列をクエリーとして知られているのものとして入れ得る。次に、統計学的コンピュータプログラムを用いて、このクエリー配列を、選択データベース中に存在する配列と比較する。このようなデータベースクエリー（ｂｌａｓｔ検索）は当業者にとって公知であり、様々な供給者で実行され得る。例えばＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）においてこのようなデータベースクエリーが実行される場合、個々の比較クエリーに対する標準
的な設定を使用すべきである。タンパク質配列比較（ｂｌａｓｔｐ）の場合、これらの設定は、Ｌｉｍｉｔ  ｅｎｔｒｅｚ＝作動させず；フィルター＝低演算量作動；期待値＝１０；語長＝３；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１である。このようなクエリーの結果は、パラメーターの中でもとりわけ、クエリー配列とデータベースで見られる同様の配列との間の同一性の程度である。
【０３１７】
〔0344〕  ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物は、そのポリペプチドの機能断片を含む。そのポリペプチドの「機能断片」は、このＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物をコードする遺伝子又はｃＤＮＡの断片を含み、この断片は、免疫反応（例えば液性又は細胞性免疫反応）を引き出すことが可能である。従って、例えば、抗原及びその断片の免疫原性に関与するアミノ酸残基に対応する、本発明によるＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物の断片は、免疫反応（例えば液性又は細胞性免疫反応）を引き出すため、抗原として機能するために作用し得る。本発明のこの態様はまた、本発明によるポリペプチドの、差次的にスプライシングされたアイソフォーム及び転写開始も含む。本発明によるポリペプチドはまた、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物の断片、誘導体及び対立遺伝子変異体も具備し得る。ＶＩＳＴＡの断片及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドを作製するための方法及び材料は当技術分野で周知である。例えばＭａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ［３rd  Ｅｄ．］（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照。
【０３１８】
〔0345〕  変異体ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドは、それらの個々の抗体を結合させる（例えば変異体ＶＩＳＴＡポリペプチドと抗ＶＩＳＴＡ抗体が結合させられる。）ために、それらの抗原性特異性を保持し得る。完全に抗原性の変異体は、保存的変化又は重要でない残基もしくは重要でない領域における変化のみを含有し得る。抗原変異体はまた、抗原性を変化させないか又は顕著に変化させない同様のアミノ酸の置換も含有し得る。あるいは、このような置換は、ある程度まで抗原性に正又は負に影響を与え得る。非抗原性変異体は、一般的に、エピトープの重要な残基又は重要な領域において、１以上の非保存的アミノ酸置換、欠失、挿入、転位もしくは短縮化又は置換、挿入、転位もしくは欠失を含有する。それらの個々の抗体に対するポリペプチドの特異的な抗原性を保存しながらＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドを修飾するための分子生物学及び生化学技術は当技術分野で周知である。例えばＨｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ  ７７（１）：５１−５９；Ｌａｎｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９６（１）：１２５−１２８；Ｈｏｐｐ及びＷｏｏｄｓ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８（６）：３８２４−３８２８；Ｋｏｌａｓｋａｒ及びＴｏｎｇａｏｎｋａｒ（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２７６（１−２）：１７２−１７４；及びＷｅｌｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １８８（２）：２１５−２１８を参照。
【０３１９】
〔0346〕  「ＶＩＳＴＡアゴニスト（模倣体）又はＶＩＳＴＡアンタゴニストの何れかとして機能するＶＩＳＴＡポリペプチドの変異体」。
【０３２０】
〔0347〕  ＶＩＳＴＡポリペプチドの変異体は、突然変異誘発、例えばＶＩＳＴＡポリペプチドの別々の点突然変異又は短縮化によって作製され得る。ＶＩＳＴＡポリペプチドのアゴニストは、ＶＩＳＴＡポリペプチドの天然型の生物学的活性の実質的に同じもの又はサブセットを保持し得る。ＶＩＳＴＡポリペプチドのアンタゴニストは、例えば競合的にＶＩＳＴＡポリペプチドのＶＩＳＴＡ介在性活性を調整することによって、ＶＩＳＴＡポリペプチドの天然型の活性のうち１以上を阻害し得る。従って、特異的な生物学的効果は、限定機能の変異体での処置によって引き出され得る。例えば、ＶＩＳＴＡポリペプチドの天然型での処置に関して対象においてあまり副作用がない、ポリペプチドの天然型の生
物学的活性のサブセットを有する変異体で対象を処置し得る。
【０３２１】
〔0348〕  ＶＩＳＴＡアゴニスト（模倣体）又はＶＩＳＴＡアンタゴニストの何れかとして機能するＶＩＳＴＡポリペプチドの変異体は、ＶＩＳＴＡポリペプチドアゴニスト又はアンタゴニスト活性に対してＶＩＳＴＡポリペプチドの突然変異体、例えば短縮化突然変異体、のコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって同定され得る。対象ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）結合物質で処置可能な疾患は既に同定されており、様々な炎症性、自己免疫、癌、アレルギー性及び感染性障害を含む。特に好ましい適応症は多発性硬化症である。
【０３２２】
ペプチド模倣物
〔0349〕  天然のアミノ酸のみからなるＶＩＳＴＡポリペプチドに加えて、ＶＩＳＴＡペプチド模倣物も提供される。ペプチド類似体は、鋳型ペプチドの特性と類似した特性を有する非ペプチド薬として医薬工業において一般的に使用される。これらのタイプの非ペプチド化合物は「ペプチド模倣体」又は「ペプチド模倣物」と呼ばれ（Ｆａｕｃｈｅｒｅ（１９８６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ（Ｖｏｌｕｍｅ  ２）Ａｎｄｒｅｗ  Ａｂｅｌｌ（Ｅｄ．）（１９９９）ＪＡＩ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．及びＥｖａｎｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ３０：１２２９）、通常、コンピュータ化分子モデリングを利用して開発される。治療的に有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣体は、同等の治療的又は予防効果を生じさせるために使用され得る。一般に、ペプチド模倣物は、ヒト又はマウスＶＩＳＴＡなど、パラダイムのポリペプチド（即ち生物学的又は薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似するが、当技術分野で公知であり、次の参考文献中でさらに記載される方法によって、−ＣＨ2ＮＨ−、−ＣＨ2Ｓ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ2−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−及び−ＣＨ2ＳＯ−からなる群から選択される連
結により場合によっては置換される１以上のペプチド連結を有する：Ｓｐａｔｏｌａ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ  １９８３），Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ  ３，“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ”；Ｍｏｒｌｅｙ（１９８０）Ｔｒｅｎｄｓ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．ｐｐ．４６３−４６８；Ｈｕｄｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１４：１７７−１８５（−ＣＨ2ＮＨ−、ＣＨ2ＣＨ2−）；Ｓｐａｔｏｌａ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６
）Ｌｉｆｅ．Ｓｃｉ．３８：１２４３−１２４９（−ＣＨ２−Ｓ）；Ｈａｎｎ，（１９８２）Ｊ．Ｃｈｅｍ．ＳｏＣ  Ｐｅｒｋｉｎ．Ｔｒａｎｓ．Ｉ  ３０７−３１４（−ＣＨ−ＣＨ−、シス及びトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（−ＣＯＣＨ2−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉ
ｔｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２３：２５３３（−ＣＯＣＨ2−）；（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−）；Ｈｏｌｌａｄａｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ．２４：４４０１−４４０４（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ2−）；及びＨｒｕｂｙ（１９８２）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３１：１８９−１９９（−Ｃ
Ｈ2−Ｓ−）。特に好ましい非ペプチド連結は、−ＣＨ2ＮＨ−である。このようなペプチド模倣体は、例えばより経済的な産生、より高い化学安定性、薬理特性向上（半減期、吸収、効力及び有効性）、特異性の変化（例えば広域スペクトルの生物学的活性）、抗原性低下などを含む、ポリペプチド実施形態を上回る重要な長所を有し得る。ペプチド模倣物の標識付加は通常、定量的構造−活性データ及び／又は分子モデリングにより予想されるペプチド模倣物上の非干渉位置に対する、直接的又はスペーサー（例えばアミド基）を通じた、１以上の標識の共有結合を伴う。このような非干渉位置は、一般にペプチド模倣物
が結合して治療効果を生じさせる巨大分子との直接的接触を形成しない位置である。ペプチド模倣物の誘導体化（例えば標識付加）は、ペプチド模倣物の所望の生物学的又は薬理学的活性に実質的に干渉すべきではない。
【０３２３】
〔0350〕  より安定的なペプチドを生成させるために、同じタイプのＤ−アミノ酸でのＶＩＳＴＡアミノ酸配列の１以上のアミノ酸の系統的置換（例えばＬ−リジンの代わりにＤ−リジン）を使用し得る。さらに、ＶＩＳＴＡアミノ酸配列又は実質的に同一である配列変異を具備する拘束ペプチドは、当技術分野で公知の方法により（Ｒｉｚｏ及びＧｉｅｒａｓｃｈ（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７）、例えばペプチドを環状化させる分子内ジスルフィド架橋を形成可能な内部システイン残基を付加することによって、作製され得る。本明細書中で同定されるＶＩＳＴＡポリペプチドのアミノ酸配列によって、当業者はＶＩＳＴＡペプチド配列及びその配列変異体に対応するポリペプチドを作製できるようになる。このようなポリペプチドは、ＶＩＳＴＡペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの発現によって、多くはより大きいポリペプチドの一部として、原核又は真核宿主細胞中で産生され得る。あるいは、このようなペプチドは、化学的方法によって合成され得る。組み換え宿主中での異種ポリペプチドの発現のための方法、ポリペプチドの化学合成及びインビトロ翻訳は当技術分野で周知である。ある種のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端修飾及び／又はコア配列に対するペプチド伸長によって、有益な物理学的、化学的、生化学的及び薬理学的特性、例えば安定性向上、効力及び／又は有効性増強、血清プロテアーゼに対する耐性、所望の薬物動態学的特性などがもたらされる。例えば患者において同時刺激を変化させることによって、疾患を処置するためにペプチドを治療的に使用し得る。
【０３２４】
〔0351〕  部位特異的突然変異誘発又はアラニン−スキャニング突然変異誘発など、当技術分野で公知の方法によって、機能に必須であるアミノ酸が同定され得る。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉ．２４４：１０８１−８５。後者の手順は、分子中の全残基で１個のアラニン突然変異を導入する。次に、エピトープ結合又はインビトロＡＤＣＣ活性などの生物学的活性について、得られる突然変異体分子を試験する。リガンド−受容体結合に重要である部位はまた、結晶学、核磁気共鳴又は光親和性標識などの構造分析によっても決定され得る。Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４；ｄｅ  Ｖｏｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉ．２５５：３０６−１２。
【０３２５】
〔0352〕  例えば、あるクラスの置換は、保存的アミノ酸置換である。このような置換は、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチド中のある種のアミノ酸を特徴が似ている別のアミノ酸で置換するものである。一般的には保存的置換として見られるものは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅの中であるものを別のもので置換すること；ヒドロキシル残基Ｓｅｒ及びＴｈｒの互換、酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎとの間の置換、塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇの交換、芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの中での置き換えである。アミノ酸変化が表現型の面で変化しないと思われることに関する指針は、例えば、Ｂｏｗｉｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉ．２４７：１３０６−１０で見出される。ゆえに、当業者にとって当然のことながら、発明者らは、特異的な変異体全ての描写なく、ペプチド変異体を保持する。アミノ酸配列に関して、コードされる配列中の、１個のアミノ酸、アミノ酸の小さい割合を変化させるか、付加するか又は欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失又は付加は、変化の結果、アミノ酸の化学的に類似したアミノ酸での置換が起こる、「保存的に修飾された変異体」であることを当業者は認めるであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は当技術分野で周知である。このような保存的に修飾された変異体は、さらに、及び本発明の、多型性変異体、種間相同体及び対立遺伝子を排除しない。例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９９２），Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［２nd  Ｅｄ．］Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎを参照。
【０３２６】
〔0353〕  さらに、ポリペプチドは、２０種類の「天然」アミノ酸以外のアミノ酸を含有することが多い。さらに、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、プロセシング及び他の翻訳後修飾などの天然の過程により、又は当技術分野で周知の化学修飾技術により、修飾され得る。既知の修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ｇ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化などのタンパク質へのアミノ酸のトランスファー−ＲＮＡ介在性付加及びユビキチン化が挙げられるが限定されない。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［２nd  Ｅｄ．］及びＬｕｎｄｂｌａｄ（１９９５）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ［１st  Ｅｄ．］を参照。多くの詳細な概説がこの対象において利用可能である。例えばＷｏｌｄ（１９８３）Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｓｅｉｆｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−４６；及びＲａｔｔａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２を参照。
【０３２７】
断片
〔0354〕  ＶＩＳＴＡポリペプチドの生物学的活性部分は、ＶＩＳＴＡ分子と非ＶＩＳＴＡ分子、例えばＶＩＳＴＡの天然のリガンドとの間の相互作用に関与するＶＩＳＴＡポリペプチドの断片を含む。ＶＩＳＴＡポリペプチドの生物学的活性部分は、全長ＶＩＳＴＡポリペプチドよりも少ないアミノ酸を含み、ＶＩＳＴＡポリペプチドの少なくとも１つの活性を示す、ＶＩＳＴＡポリペプチドのアミノ酸配列に対して十分に同一であるか又はそれ由来であるアミノ酸配列、例えば配列番号２、４又は５で示されるアミノ酸配列を具備するペプチドを含む。一般的には、生物学的活性部分は、少なくとも１つのＶＩＳＴＡポリペプチドの活性、例えば、抗ＣＤ３に対するＣＤ４Ｔ細胞増殖反応を調整する（抑制する）、抗原特異的な方式での同種ＣＤ４Ｔ細胞の増殖反応の抑制、特異的なサイトカインの発現に対して影響があるドメイン又はモチーフを具備する。ＶＩＳＴＡポリペプチドの生物学的活性部分は、例えば、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５以上のアミノ酸長であるポリペプチドであり得る。ＶＩＳＴＡポリペプチドの生物学的活性部分は、ＶＩＳＴＡ介在性活性、例えば免疫細胞活性化を調整する薬剤を開発するための標的として使用され得る。
【０３２８】
〔0355〕  ＶＩＳＴＡポリペプチドの生物学的活性部分は、細胞外ドメインの少なくとも一部分を具備し得る。ＶＩＳＴＡポリペプチドの生物学的活性部分は、細胞外ドメイン少なくとも一部分（例えばＩｇＶを具備する。）及び次のドメインのうち１以上：シグナルペプチドドメイン、膜貫通ドメイン又は細胞質ドメインを含有し得る。さらに、組み換え技術によってポリペプチドの他の領域が欠失している他の生物学的活性部分を調製し、ネイティブＶＩＳＴＡポリペプチドの機能活性の１以上について評価し得る。
【０３２９】
〔0356〕  ＶＩＳＴＡポリペプチドは、配列番号２、４又は５において示されるアミノ酸配列を有し得る。本明細書中で記載のように、ＶＩＳＴＡポリペプチドは、配列番号２、４又は５に対して実質的に同一であり得、配列番号２、４又は５のポリペプチドの機能
活性を保持し、さらに、天然の対立遺伝子変異又は突然変異誘発ゆえにアミノ酸配列が異なる。
【０３３０】
融合タンパク質
〔0357〕  ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドを具備する融合物もまた、本発明の範囲内である。例えば、この融合タンパク質は、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチド配列がＧＳＴ配列のＣ−末端に融合されているＧＳＴ融合タンパク質に連結され得る。このような融合タンパク質は、組み換えＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドの精製を容易にし得る。あるいは、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドは、Ｂ細胞濾胞に結合し、従って液性免疫反応及びＴ細胞活性化の両方を開始させるタンパク質と融合させ得る。Ｂｅｒｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：８５１−６０。あるいは、例えば、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドは、免疫系に抗原を送達し、細胞性免疫反応を刺激するために、抗樹状細胞抗体と遺伝学的にカップリングさせ得る。Ｈｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：１９２０−２７。標準的な組み換えＤＮＡ技術によって本発明のキメラ又は融合タンパク質を作製し得る。例えば、従来技術に従い、例えばライゲーションのための平滑末端化又は突出末端化、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて付着末端の充填、不要な連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理及び酵素ライゲーションを利用することによって、様々なポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片がインフレームで一緒に連結される。自動ＤＮＡ合成装置を含む従来技術によって融合遺伝子を合成し得る。
【０３３１】
〔0358〕  融合タンパク質は、Ｃ末端又はＮ末端転座配列を含み得る。さらに、融合タンパク質は、例えばタンパク質検出、精製又は他の適用のために、さらなるエレメントを具備し得る。検出及び精製を促進するドメインとしては、金属キレートペプチド、例えばポリヒスチジントラクト、ヒスチジン−トリプトファンモジュール又は固定化金属上での精製を可能とする他のドメイン；マルトース結合タンパク質；固定化免疫グロブリン上での精製を可能とするプロテインＡドメイン；又はＦＬＡＧ伸長／親和性精製系において利用されるドメイン（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ，Ｓｅａｔｔｌｅ  ＷＡ．）が挙げられるが限定されない。
【０３３２】
〔0359〕  融合タンパク質は、免疫グロブリンの定常領域を具備する免疫グロブリンの一部分との融合によって本発明のタンパク質から調製され得る。より好ましくは、この免疫グロブリンの一部分は、場合によっては及びより好ましくはヒト重鎖定常領域である重鎖定常領域を具備する。重鎖定常領域は、最も好ましくはＩｇＧ重鎖定常領域であり、場合によっては及び最も好ましくはＦｃ鎖であり、最も好ましくはＣＨ２及びＣＨ３ドメインを具備するＩｇＧ  Ｆｃ断片である。あらゆるＩｇＧサブタイプを場合によっては使用し得るものの、ＩｇＧ１サブタイプが好ましい。Ｆｃ鎖は、場合によっては既知の又は「野生型」Ｆｃ鎖であり得るか、又はあるいは突然変異されているものであり得る。例えば米国特許出願公開第２００６／００３４８５２号を参照。「Ｆｃ鎖」という用語はまた、場合によってはあらゆるタイプのＦｃ断片も具備する。ＩｇＧサブクラスにおける抗体定常領域介在性活性に関与する特異的なアミノ酸残基のいくつかが同定されている。従って、これらの特異的なアミノ酸の組み入れ、置換又は排除によって、特異的な免疫グロブリン定常領域介在性活性の組み入れ又は排除が可能となる。さらに、特異的な変化の結果、例えばアグリコシル化及び／又はＦｃ鎖に対する他の所望の変化が起こり得る。少なくとも一部の変化は、場合によっては、好ましくない免疫系効果など、好ましくないと考えられるＦｃの機能を遮断するために行われ得る。ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅｄｓ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照。
【０３３３】
〔0360〕  転座ドメイン（効率的な形質膜発現のため）と新規翻訳ポリペプチドの残りの部分との間の、第Ｘａ因子などの切断可能なリンカー配列の組み入れ（例えばＯｔｔａｖｉ，（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８０：２８９−９３を参照）、スブチリシンプロテアーゼ認識モチーフ（例えばＰｏｌｙａｋ（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０：６１５−１９を参照）；エンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）は、精製を容易にするために有用であり得る。例えば、あるコンストラクトは、チオレドキシンが続く６個のヒスチジン残基に連結される核酸配列をコードするポリペプチド、エンテロキナーゼ切断部位（例えばＷｉｌｌｉａｍｓ（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１７８７−９７を参照）及びＣ末端転座ドメインを含み得る。ヒスチジン残基は、検出及び精製を容易にし、一方でエンテロキナーゼ切断部位は、所望のタンパク質を融合タンパク質の残りの部分から精製するための手段を提供する。融合タンパク質をコードするベクター及び融合タンパク質の適用に属する技術は、科学文献及び特許文献で詳細に記載されている。例えばＫｒｏｌｌ（１９９３）ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：４４１−５３を参照。
【０３３４】
〔0361〕  融合タンパク質は、ＶＩＳＴＡ配列がＧＳＴ配列のＣ−末端に融合されているＧＳＴ−ＶＩＳＴＡ融合タンパク質であり得る。このような融合タンパク質は、組み換えＶＩＳＴＡの精製を促進し得る。別の実施形態において、融合タンパク質は、そのＮ−末端に異種シグナル配列を含有するＶＩＳＴＡポリペプチドである。ある種の宿主細胞（例えば哺乳動物宿主細胞）において、異種シグナル配列の使用を通じてＶＩＳＴＡの発現及び／又は分泌を向上させ得る。実施形態において、融合タンパク質は、ＶＩＳＴＡ配列がＩｇ分子の一部分に融合されているＩｇ−ＶＩＳＴＡ融合タンパク質である。融合タンパク質のＩｇ部は、免疫グロブリン定常領域、例えばヒトＣγ１ドメイン又はＣγ４ドメイン（例えばヒトＩｇＣγ１又はヒトＩｇＣγ４の、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域（例えば米国特許第５，１１６，９６４号；同第５，５８０，７５６号；同第５，８４４，０９５号を参照）を含み得る。得られる融合タンパク質は、ＶＩＳＴＡ溶解度、結合親和性、安定性及び／又は結合価（即ち分子あたりの結合部位数）が変化している場合があり、タンパク質精製の効率が上昇し得る。
【０３３５】
〔0362〕  特に好ましいＶＩＳＴＡ  Ｉｇ融合タンパク質は、免疫グロブリン定常領域（例えばＦｃ領域）にカップリングされたＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン部分を含む。免疫グロブリン定常領域は、免疫グロブリン構造に固有のエフェクター活性を低下させるか又は排除する遺伝子修飾を含有し得る。例えば、ＶＩＳＴＡポリペプチドの細胞外部分をコードするＤＮＡは、例えばＷＯ９７／２８２６７で教示されるように、部位特異的突然変異誘発により修飾されているヒトＩｇＧγ１及び／又はＩｇＧγ４のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域をコードするＤＮＡに連結され得る。本発明のＶＩＳＴＡ融合タンパク質は、医薬組成物に組み込まれ、インビボで対象に投与され得る。ＶＩＳＴＡ融合タンパク質は、ＶＩＳＴＡ結合パートナーのバイオアベイラビリティに影響を及ぼすために使用され得る。ＶＩＳＴＡ融合タンパク質の使用は、免疫反応の調整から恩恵を受ける状態又は障害の処置に対して治療的に有用であり得る。さらに、本発明のＶＩＳＴＡ−融合タンパク質は、対象において抗ＶＩＳＴＡ抗体を産生させるために、ＶＩＳＴＡ−結合タンパク質を精製するために、及びＶＩＳＴＡとその天然の結合パートナーとの相互作用を阻害する分子を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて、免疫原として使用され得る。
【０３３６】
複合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）
〔0363〕  ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物に結合する抗体及びそれらの断片を他の部分と複合化させ得る。このような複合物は、ワクチンの調製において使用されることが多い。ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドを、樹状細胞及びマクロファージ上に存在するマンノース受容体により認識される炭水化物（例えばマンノース、フコース、グルコース、ＧｌｃＮＡ、マルトース）に対して複合化させ
得る。結果として生じる結合、凝集及び受容体介在性エンドサイトーシス及び食作用機能により、自然及び適応免疫性が促進される。Ｍａｈｎｋｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５１：６７３−８４；Ｄｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｏｎｏｌ．１６３：５４２７−３４を参照。
【０３３７】
〔0364〕  免疫反応を引き出すための複合化に適切な他の部分としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、ジフテリアトキソイド、コレラトキソイド、シュードモナスエキソプロテインＡ及び細菌外膜タンパク質（ＯＭＰＳ）が挙げられるが限定されない。
【０３３８】
ポリペプチド単離
〔0365〕  本発明はまた、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドの単離のための方法も提供する。例えば、関連細胞株又は腫瘍試料を癌患者から入手し得る。界面活性剤中でのホモジェナイズ処理及び可溶化後、抗原をクロマトグラフィーにより精製する。このためにサイズ排除又はアフィニティークロマトグラフィーを使用し得、抗ＶＩＳＴＡ及び抗ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ複合抗体と合わせて使用し得る。例えば、抗ＶＩＳＴＡ又は抗ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ複合抗体は、単純な抗原吸着、洗浄及び固体支持体からの溶出のために、固体支持体上に固定化（例えばレジン、磁気ビーズにカップリング）され得る。次に、溶出されたタンパク質をさらに抗原の存在、特徴評価及び同一性について決定する。Ｗａｌｋｅｒ（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ［２nd  Ｅｄ．］Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（２００３）［Ｅｄ．］Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓを参照。
【０３３９】
〔0366〕  このようにして単離された抗原は、従来の医薬賦形剤及び担体物質を使用して医薬を調製するために使用され得る。例えば、生理的ＮａＣｌ溶液中での精製抗原のインビボ投与。
【０３４０】
〔0367〕  さらに、本発明によるＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドは、ハイスループットスクリーニングの一部としての活性の同定において抗原となり得る。ハイスループットスクリーニング法は当業者にとって公知である。Ｗｅｌｌｓ（２００２）Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ。
【０３４１】
ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物をコードするポリヌクレオチド
〔0368〕  本発明はまた、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物をコードするヌクレオチドも提供する。本発明はまた、ＶＩＳＴＡポリペプチドをコードする配列番号１及び３の核酸配列を具備するポリヌクレオチドも提供する。本発明はまた、断片、本明細書中に記載のポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能であり、本明細書中に記載のポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列相同性を有する配列も提供する。
【０３４２】
〔0369〕  本発明はまた、様々なコドン使用がある類似のポリペプチドをコードする少なくとも１つのＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物配列、無作為に又は標的を定めての何れかの、天然の又は人工的に誘導したかの何れかの１以上のヌクレオチドの欠失、挿入又は置換など、突然変異を特徴とする改変配列を具備するポリヌクレオチドも提供する。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドに特有である配列領域を含む、（例えば本発明のポリヌクレオチド配列の一部を形成する）相同核酸配列も包含する。
【０３４３】
〔0370〕  本発明はまた、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドの相同体をコードする核酸も包含し、このような相同体は、初期設定パラメーターを使用して、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを用いて決定され得る場合、本明細書中で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一相同性があり得る。本発明はまた、無作為に又は標的を定めての何れかの、天然の又は人工的に誘導したかの何れかの、１以上の核酸の欠失、挿入又は置換など、突然変異を有する上記のポリヌクレオチド及びポリペプチドの断片も包含する。
【０３４４】
〔0371〕  核酸分子は、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物又はこの核酸分子の機能断片をコードし得る。この核酸の「機能断片」としては、このＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物をコードする遺伝子又はｃＤＮＡの断片が挙げられ、この断片は、免疫反応（例えばＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物に選択的に結合する抗体）を引き出すことが可能であるＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を産生させるために発現させることが可能である。従って、例えば、抗原の免疫原性に寄与するアミノ酸残基に対応する、及び、断片が、免疫反応（例えば液性又は細胞性免疫反応）を引き出すために抗原として機能するために役立ち得る、本発明によるＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物の断片。本発明のこの態様はまた、本発明による核酸の、差次的にスプライシングされるアイソフォーム及び転写開始も含む。本発明による核酸分子は、本発明によるＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物をコードする上記の核酸分子の断片、誘導体及び対立遺伝子変異体も具備する。ＶＩＳＴＡの断片及びＶＩＳＴＡ複合物をコードする核酸を作製するための方法及び材料は、当技術分野で周知である。例えばＭａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ［３rd  Ｅｄ．］Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照。
【０３４５】
〔0372〕  配列番号１、２、３、４又は５の配列に基づき設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、配列番号１、３又はオルソログ又は変異体の全て又は一部を包含する核酸分子を単離し得る。
【０３４６】
〔0373〕  標準的なＰＣＲ増幅技術に従い、鋳型及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又は、あるいはゲノムＤＮＡを用いて本発明の核酸分子を増幅させ得る。このように増幅された核酸分子を適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析によって特徴評価し得る。さらに、標準的な合成技術によって、例えば自動ＤＮＡ合成装置を用いて、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを調製し得る。
【０３４７】
〔0374〕  一実施形態において、本発明の単離ＶＩＳＴＡコード核酸分子は、配列番号１又は３で示されるヌクレオチド配列又はその断片を具備する。別の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号１又は３で示されるヌクレオチド配列の相補体又はこれらのヌクレオチド配列の何れかの一部分である核酸分子を具備する。配列番号１又は３で示されるヌクレオチド配列と相補的である核酸分子は、それが、それぞれ配列番号１又は３で示されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成し、それにより安定な２本鎖を形成し得るように、配列番号１又は３で示されるヌクレオチド配列に対して十分に相補的であるものである。
【０３４８】
〔0375〕  別の実施形態において、本発明の単離核酸分子は、配列番号１又は３で示されるヌクレオチド配列の全長又はこれらのヌクレオチド配列の何れかの一部分と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％同一であるヌクレオチド配列を具備する。
【０３４９】
〔0376〕  さらに、本発明の核酸分子は、配列番号１又は３の核酸配列の一部のみ、例えばプローブ又はプライマーとして使用され得る断片、又はＶＩＳＴＡポリペプチドの一部、例えばＶＩＳＴＡ−ポリペプチドの生物学的活性部分をコードする断片のみを具備し得る。ヒトＰＤ−Ｌ２遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列によって、他のＰＤ−Ｌ２ファミリーメンバーならびに他の種由来のＶＩＳＴＡ相同体を同定し及び／又はクローニングすることにおける使用のために設計されるプローブ及びプライマーの作製が可能となる。プローブ／プライマーは、一般的に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを具備する。オリゴヌクレオチドは、一般的に、配列番号１又は３のセンス配列；配列番号１、３又は、配列番号１又は３の天然の対立遺伝子変異体もしくは突然変異体のアンチセンス配列の少なくとも約１２又は１５、好ましくは約２０又は２５、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５又は７５連続ヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列の領域を具備する。
【０３５０】
〔0377〕  ある実施形態において、本発明の核酸分子は、約５０から１００、１００から１５０、１５０から２００、２００から２５０、２５０から３００、３００から３５０、３５０から４００、４００から４５０、４５０から５００、５００から５５０、５５０から６００、６００から６５０、６５０から７００、７００から７５０、７５０から８００、８００から８５０、８５０から９００、９００から９５０以上のヌクレオチド長より長いヌクレオチド配列を具備し、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号１又は３の核酸分子又はその相補体とハイブリッド形成する。さらなる実施形態において、本発明の核酸分子は、約８８０から９００、９００から９５０、９５０から１０００、１０００から１０５０、１０５０から１１００、１１００から１１５０以上のヌクレオチド長より長く、配列番号１又は３の核酸分子又はその相補体とストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、ヌクレオチド配列を具備する。また別の実施形態において、本発明の核酸分子は、５０から１００、１００から１５０、１５０から２００、２００から２５０、２５０から３００以上のヌクレオチド長より長く、配列番号１又は３におけるコード領域を具備する核酸分子又はその相補体とストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、ヌクレオチド配列を具備する。またさらなる実施形態において、本発明の核酸分子は、約５０から１００、１００から１５０、１５０から２００、２００から２５０、２５０から３００、３００から３５０、３５０から４００、４００から４５０、４５０から５００、５００から５５０、５５０から６００、６００から６５０、６５０から７００、７００から７５０、７５０から８００、８５０から９００、９００から９５０以上のヌクレオチド長より長いヌクレオチド配列を具備し、配列番号１又は３のコード領域を具備する配列又はその相補体の少なくとも約１５（即ち１５連続）ヌクレオチドを含み、配列番号１又は３で示されるヌクレオチド配列を具備する核酸分子、その相補体とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する。
【０３５１】
〔0378〕  転写産物又はそれと同じもしくは相同のポリペプチドをコードするゲノム配列を検出するために、ＶＩＳＴＡヌクレオチド配列に基づくプローブを使用し得る。実施形態において、このプローブは、それに連結される標識基をさらに具備し、例えば標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素又は酵素補因子であり得る。このようなプローブは、対象からの細胞試料中のＶＩＳＴＡコード核酸のレベルを測定する、例えばＶＩＳＴＡ
ｍＲＮＡレベルを検出するか又はゲノムＶＩＳＴＡ遺伝子に突然変異があるか又は欠失しているか否かを決定することなどによって、ＶＩＳＴＡポリペプチドを誤って発現する細胞又は組織を同定するための診断検査キットの一部として使用され得る。
【０３５２】
〔0379〕  配列番号１及び３のＶＩＳＴＡヌクレオチド配列に加えて、当業者にとって
当然のことながら、集団（例えばヒト集団）内には、ＶＩＳＴＡポリペプチドのアミノ酸配列の変化につながるＤＮＡ配列多型性が存在し得る。ＶＩＳＴＡ遺伝子におけるこのような遺伝子多型性は、天然の対立遺伝子変異により集団内の個体間で存在し得る。本明細書中で使用される場合、「遺伝子」及び「組み換え遺伝子」という用語は、ＶＩＳＴＡポリペプチド、好ましくは哺乳動物ＶＩＳＴＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指し、非コード制御配列及びイントロンをさらに含み得る。
【０３５３】
〔0380〕  ヒト又はマウスＶＩＳＴＡの対立遺伝子変異体は、機能的及び非機能的ＶＩＳＴＡポリペプチドの両方を含む。機能対立遺伝子変異体は、天然のＶＩＳＴＡ結合パートナーへの結合能及び／又はＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生及びリンパ球活性化の調節能を維持する、ヒト又はマウスＶＩＳＴＡポリペプチドの天然アミノ酸配列変異体である。機能的対立遺伝子変異体は、一般に配列番号２、４又は５の１以上のアミノ酸の保存的置換又は、そのポリペプチドの重要でない領域の重要でない残基の置換、欠失もしくは挿入のみを含有する。
【０３５４】
〔0381〕  非機能的対立遺伝子変異体は、天然のＶＩＳＴＡ結合パートナーへの結合能及び／又は本明細書中に記載のＶＩＳＴＡ活性の何れかの調節能の何れも持たない、ヒト又はマウスＶＩＳＴＡポリペプチドの天然アミノ酸配列変異体である。非機能的対立遺伝子変異体は、一般に配列番号２、４又は５のアミノ酸配列の、非保存的置換、欠失もしくは挿入又は未成熟の短縮化又は、そのポリペプチドの重要な残基又は重要な領域、例えばＩｇＶドメインにおける、置換、挿入又は欠失を含有する。
【０３５５】
〔0382〕  本発明は、ヒト又はマウスＶＩＳＴＡポリペプチドの非ヒト、非マウスオルソログをさらに提供する。ヒト又はマウスＶＩＳＴＡポリペプチドのオルソログは、非ヒト、非マウス生物から単離され、本明細書中で開示されるヒト及びマウスＶＩＳＴＡポリペプチドと同じ結合活性及び／又はリンパ球活性化−調整活性及びＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生の調整能を保持するポリペプチドである。ヒト又はマウスＰＤ−Ｌ３ポリペプチドのオルソログは、配列番号２、４又は５と実質的に同一であるアミノ酸配列を具備するので容易に同定され得る。
【０３５６】
〔0383〕  天然のＶＩＳＴＡ結合パートナーとの結合能及び／又は天然のＶＩＳＴＡ結合パートナーの活性調節能、細胞内又は細胞間シグナル伝達調整能、Ｔリンパ球の活性化調整能及び／又は生物の免疫反応調整能について突然変異体ＶＩＳＴＡポリペプチドをアッセイし得る。
【０３５７】
〔0384〕  ＶＩＳＴＡ又はＶＩＳＴＡ融合タンパク質をコードする単離核酸分子。少なくとも、非ＶＩＳＴＡタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列に作動可能に連結されるＶＩＳＴＡ又はＶＩＳＴＡタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列を具備するこのような核酸分子は標準的な組み換えＤＮＡ技術によって調製され得る。
【０３５８】
〔0385〕  さらに、同一性は、関心のある核酸分子又はそれらによりコードされるタンパク質間に存在する機能的及び／又は構造的同等性を広く指す。上記の分子及びこれらの分子の構成誘導体と相同である核酸分子は、一般に、同じ生物学的機能を排除する修飾を構成するこれらの分子の変異体である。同時に、変異が天然に起こり得、例えばこれらは他の種からの配列であり得るか、又はこれらは突然変異体であり得、これらの突然変異体は、天然に生じたものであり得るか、又は目的とする突然変異誘発により誘導されたものであり得る。変異はまた合成により作製された配列でもあり得る。対立遺伝子変異体は、天然の変異体及びまた合成により作製された変異体の両方又は組み換えＤＮＡ技術により
作製された変異体であり得る。遺伝コードの縮重により本発明による核酸分子から逸脱する核酸分子は、誘導体の特別な型を構成する。
【０３５９】
〔0386〕  ＶＩＳＴＡ及びそのＶＩＳＴＡ複合物のアミノ酸配列をコードする何らかのヌクレオチド配列も、本発明の範囲内に含まれる。遺伝コードが縮重しているので、特定のアミノ酸をコードするために複数のコドンが使用され得る。遺伝コードを用いて、それぞれがアミノ酸をコード可能である、１以上の様々なヌクレオチドを同定し得る。特定のヌクレオチドが実際に実際のコドンコード配列を構成する可能性は、異常な塩基対形成関係及びＶＩＳＴＡ及びそのＶＩＳＴＡ複合物を発現する真核又は原核細胞において（特定のアミノ酸をコードするために）特定のコドンが実際に使用される頻度を考慮することにより推定され得る。このような「コドン使用規則」は、Ｌａｔｈｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１８３：１−１２により開示される。
【０３６０】
修飾ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリヌクレオチド
〔0387〕  本発明のヌクレオチドは、修飾ポリヌクレオチドであり得る。一部の適用において、非修飾ヌクレオチドは最適性が低いことが多く、例えば細胞性ヌクレアーゼにより分解され易い傾向がある。オリゴヌクレオチドのサブユニットの１以上に対する化学的修飾は、特性向上を付与し得、例えばポリヌクレオチドをヌクレアーゼに対してより安定にし得る。典型的なオリゴヌクレオチド修飾は当技術分野で周知であり、（ｉ）改変、例えば、ホスホジエステル糖間結合における、非連結リン酸酸素の一方又は両方の及び／又は連結リン酸酸素の１以上の置き換え；（ｉｉ）改変、例えばリボース糖の成分の置き換え、例えばリボース糖上の２’ヒドロキシルの修飾又は置き換え；（ｉｉｉ）リン酸部分の大規模な置き換え；（ｉｖ）非天然塩基での天然塩基の修飾又は置き換え；（ｖ）例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）でのリボース−リン酸バックボーンの置き換え又は修飾；（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端の修飾；及び（ｖｉｉ）糖、例えば六員環の修飾のうち１以上を含み得る。本発明に従い使用されるポリヌクレオチドは、当技術分野で周知のあらゆる多くの手段により合成され得るか、又は様々な市販業者から購入し得る（ＬＣ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。
【０３６１】
アンチセンス
〔0388〕  上記のＶＩＳＴＡポリペプチドをコードする核酸分子に加えて、本発明の別の実施形態は、それに対してアンチセンスである単離核酸分子に属する。「アンチセンス」核酸は、ポリペプチドをコードする「センス」核酸に相補的である、例えば２本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的である、又はｍＲＮＡ配列に相補的である、ヌクレオチド配列を具備する。従って、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合し得る。アンチセンス核酸は、ＶＩＳＴＡコード鎖全体に、又はその一部にのみ相補的であり得る。ある実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ＶＩＳＴＡをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを具備するヌクレオチド配列の領域を指す。別の実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ＰＤ−Ｌをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。「非コード領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されないコード領域（５’及び３’非翻訳領域とも呼ばれる。）に隣接する５’及び３’配列を指す。ヒト又はマウスＶＩＳＴＡ又は本明細書中で開示されるＶＩＳＴＡをコードするコード鎖配列を考えると、ワトソン及びクリック塩基対形成の規則に従い、本発明のアンチセンス核酸を設計し得る。アンチセンス核酸分子は、ＶＩＳＴＡ  ｍＲＮＡのコード領域全体に対して相補的であり得るが、より好ましくは、ＶＩＳＴＡ  ｍＲＮＡのコード又は非コード領域の一部に対してのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＶＩＳＴＡ又はＶＩＳＴＡ  ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域に対して相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸分子は、当技術分野で公知の手順を使用して、化学合成及び酵素性ライゲーション反応を用いて構築され得る。例えば、天然のヌクレオチド又は、分子の生物学的安定性を向上させるために、もしくはアンチセンスとセンス核酸との間で形成される２本鎖の物理学的安定性を向上させるために設計された、様々に修飾されたヌクレオチドを用いて、アンチセンス核酸分子（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）が化学的に合成され得、例えばホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドを使用し得る。アンチセンス核酸を作製するために使用され得る修飾ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン−ｅ、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ及び２，６−ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされている（即ち挿入された核酸から転写されるＲＮＡは関心のある標的核酸のアンチセンス方向のものである。次のサブセクションでさらに記載）発現ベクターを用いて生物学的に産生され得る。
【０３６２】
〔0389〕  本発明のアンチセンス核酸分子は、一般的に、対象に対して投与されるか、又はそれらがＶＩＳＴＡ又はＶＩＳＴＡポリペプチドをコードする細胞性ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡとハイブリッド形成するか又は結合するようにインシトゥで作製され、それにより、例えば転写及び／又は翻訳を阻害することによってポリペプチドの発現を阻害する。ハイブリッド形成は、安定的な２本鎖を形成するための従来のヌクレオチド相補性によるもの、又は、例えばＤＮＡ２本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主溝における特異的な相互作用を通じたものであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位への直接的な注射が挙げられる。あるいは、選択細胞を標的とするためにアンチセンス核酸分子を修飾し、次いで全身的に投与し得る。例えば、全身性投与の場合、例えばアンチセンス核酸分子を、細胞表面受容体又は抗原に結合するペプチド又は抗体と連結させることによって、アンチセンス分子が選択された細胞の表面上で発現される受容体又は抗原に特異的に結合するように、アンチセンス分子を修飾し得る。本明細書中に記載のベクターを用いてアンチセンス核酸分子を細胞に送達することもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、強いｐｏｌ
ＩＩ又はｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの調節下にアンチセンス核酸分子が置かれるベクターコンストラクトが好ましい。
【０３６３】
〔0390〕  ＶＩＳＴＡアンチセンス核酸分子はα−アノマー核酸分子であり得る。α−アノマー核酸分子は、通常のβ−ユニットと異なり、鎖が互いに平行に伸びる相補的ＲＮＡと特異的な２本鎖ハイブリッドを形成する。Ｇａｕｌｔｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１。アンチセンス核酸分子はまた、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）又はキメラＲＮ
Ａ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）も具備し得る。
【０３６４】
〔0391〕  ＶＩＳＴＡアンチセンス核酸はリボザイムであり得る。リボザイムは、それらが相補的領域を有する１本鎖核酸、例えばｍＲＮＡなど、を切断可能であるリボヌクレアーゼ活性がある触媒性ＲＮＡ分子である。従って、ＶＩＳＴＡ  ｍＲＮＡ転写産物を触媒的に切断し、それによりＶＩＳＴＡ  ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために、リボザイム（例えばハンマーヘッド型リボザイム（Ｈａｓｅｌｏｆｆ及びＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１において記載））を使用し得る。本明細書中で開示されるＶＩＳＴＡ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（即ち配列番号１又は３）に基づき、ＶＩＳＴＡコード核酸に対する特異性を有するリボザイムを設計し得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＶＩＳＴＡコードｍＲＮＡにおいて切断されるべきヌクレオチド配列に対して相補的である、テトラヒメナＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を構築し得る。例えば米国特許第４，９８７，０７１号及び米国特許第５，１１６，７４２号を参照。あるいは、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡを選択するために、ＶＩＳＴＡ  ｍＲＮＡを使用し得る。例えばＢａｒｔｅｌ及びＳｚｏｓｔａｋ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８を参照。
【０３６５】
〔0392〕  あるいは、ＶＩＳＴＡの制御領域（例えばＶＩＳＴＡプロモーター及び／又はエンハンサー）に対して相補的なヌクレオチド配列を標的化して標的細胞においてＰＤ−Ｌ３遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を形成させることによって、ＶＩＳＴＡ遺伝子発現を阻害し得る。全般的に、Ｈｅｌｅｎｅ（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６（６）：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；及びＭａｈｅｒ、Ｌ．Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  １４（１２）：８０７−１５を参照。
【０３６６】
ペプチド核酸
〔0393〕  また別の実施形態において、例えば分子の、安定性、ハイブリッド形成又は溶解度を向上させるために、塩基部分、糖部分又はリン酸バックボーンにおいて本発明のＶＩＳＴＡ核酸分子を修飾し得る。例えば、ペプチド核酸を作製するために、核酸分子のデオキシリボースリン酸バックボーンを修飾し得る。Ｈｙｒｕｐ及びＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４（１）：５−２３を参照。本明細書中で使用される場合、「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」という用語は、デオキシリボースリン酸バックボーンがシュードペプチドバックボーンにより置き換えられ、４個の天然の核酸塩基のみが保持される、核酸模倣物、例えばＤＮＡ模倣物を指す。ＰＮＡの中性バックボーンは、低イオン強度の条件下でＤＮＡ及びＲＮＡとの特異的なハイブリッド形成を可能にすることが示された。Ｈｙｒｕｐ及びＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）上出及びＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４６７０−６７５に記載のような標準的な固相ペプチド合成プロトコールを用いてＰＮＡオリゴマーの合成を行い得る。
【０３６７】
〔0394〕  治療及び診断適用においてＶＩＳＴＡ核酸分子のＰＮＡを使用し得る。例えば、例えば転写又は翻訳停止を誘導するか又は複製を阻害することによって、遺伝子発現の配列特異的な調整のために、アンチセンス又は抗原物質としてＰＮＡスキャンを使用し得る。ＶＩＳＴＡ核酸分子のＰＮＡは、他の酵素（例えばＳ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合、「人工的制限酵素」として（Ｈｙｒｕｐ及びＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）上出））；又はＤＮＡ配列決定又はハイブリッド形成のためのプローブ又はプライマーとして（Ｈｙｒｕｐ及びＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）上出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）上出）、遺伝子における１塩基対突然変異の分析（例えばＰＮＡに対するＰＣＲクランピングによって）においても使用し得る。
【０３６８】
〔0395〕  脂溶性又は他のヘルパー基をＰＮＡに連結することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、又は当技術分野で公知の薬物送達のリポソームもしくは他の技術の使用によって、ＶＩＳＴＡのＰＮＡを修飾し得る（例えばそれらの安定性又は細胞性取り込みを促進するために）。例えば、ＰＮＡ及びＤＮＡの有利な特性を組み合わせ得るＶＩＳＴＡ核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラを作製し得る。このようなキメラは、ＰＮＡ部分が高い結合親和性及び特異性を提供しながら、ＤＮＡ認識酵素（例えばＲＮＡｓｅ  Ｈ及びＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用することを可能とする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタック、核酸塩基間の結合数及び方向に関して選択される適切な長さのリンカーを用いて連結され得る（Ｈｙｒｕｐ及びＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）上出）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ及びＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）上出及びＦｉｎｎ  Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（１７）：３３５７−６３に記載のように行われ得る。例えば、標準的なホスホラミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上でＤＮＡ鎖を合成し得、修飾ヌクレオチド類似体、例えば５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホラミダイトをＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間で橋として使用し得る（Ｍａｇ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：５９７３−８８）。次に、５’ＰＮＡセグメント及び３’ＤＮＡセグメントを用いてキメラ分子を作製するために、段階的にＰＮＡ単量体をカップリングする（Ｆｉｎｎ  Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）上出）。あるいは、５’ＤＮＡセグメント及び３’ＰＮＡセグメントを用いてキメラ分子を合成し得る（Ｐｅｔｅｒｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．５：１１１９−１１１２４）。
【０３６９】
オリゴヌクレオチド
〔0396〕  オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えばインビボで宿主細胞受容体を標的化するため）又は細胞膜（例えばＬｅｔｓｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照）又は脳血管関門（例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照）を横切る輸送を促進する薬剤などの他の追加基を含み得る。さらに、ハイブリッド形成を誘発する切断剤（例えばＫｒｏｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ６：９５８−９７６を参照）又は挿入剤（例えばＺｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照）でオリゴヌクレオチドを修飾し得る。この目的のために、別の分子（例えばペプチド、ハイブリッド形成誘発架橋剤、輸送剤又はハイブリッド形成誘発切断剤）にオリゴヌクレオチドを複合化し得る。
【０３７０】
ｓｉＲＮＡ
〔0397〕  低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、特異的なｍＲＮＡに結合し、それをｍＲＮＡ分解に向け、従って遺伝子の転写（例えば発現）を抑制する、通常約２０から２５ヌクレオチド長の２本鎖ＲＮＡ分子のクラスである。Ｈａｍｉｌｔｏｎ及びＢａｕｌｃｏｍｂｅ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６（５４４１）：９５０−２及びＥｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１（６８３６）：４９４−８を参照。メッセンジャーＲＮＡを破壊することによって遺伝子が機能タンパク質を産生するのを阻止する、リボザイム又はＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ）技術を利用することも可能である。ｓｉＲＮＡ分子は、配列番号１又は３の核酸配列を具備するＶＩＳＴＡ  ＤＮＡから転写されるＶＩＳＴＡ  ｍＲＮＡに結合し得る。ｓｉＲＮＡ分子は、配列番号２、４又は５で示されるアミノ酸配列をコードするＶＩＳＴＡ  ＤＮＡから転写されるＶＩＳＴＡ  ｍＲＮＡに結合し得る。
【０３７１】
〔0398〕  ＶＩＳＴＡ  ＤＮＡから転写されるＶＩＳＴＡ  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、配列番号１又は３の核酸配列を具備し得る。配列番号２、４又は５で示されるアミノ酸配列をコードするＶＩＳＴＡ  ＤＮＡから転写されるＶＩＳＴＡ  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子。ＶＩＳＴＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、配列番号３８から６７の何れか１つの核酸配列を具備し得る。ＶＩＳＴＡのＯＲＦ又はＵＴＲ領域の何れかを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、配列番号３８から４７の何れか１つのアミノ酸配列を具備し得る。ＶＩＳＴＡのＵＴＲ領域のみを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、配列番号４８から５７の何れか１つのアミノ酸配列を具備し得る。ＶＩＳＴＡのＯＲＦ領域のみを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、配列番号５８から６７の何れか１つのアミノ酸配列を具備し得る。ＶＩＳＴＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、配列番号３８から６７の何れか１つの核酸配列からなり得る。ＶＩＳＴＡのＯＲＦ又はＵＴＲ領域の何れかを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、配列番号３８から４７の何れか１つのアミノ酸配列からなり得る。ＶＩＳＴＡのＵＴＲ領域のみを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、配列番号４８から５７の何れか１つのアミノ酸配列からなり得る。ＶＩＳＴＡのＯＲＦ領域のみを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、配列番号５８から６７の何れか１つのアミノ酸配列からなり得る。
【表１】
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発現
〔0399〕  本発明のＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物の単離及び発現は、本願で開示されるＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物核酸配列に基づいて構築されるプローブ又はプライマーを用いて確立したクローニング手順によってなされ得る。本明細書中で開示される配列及び既知のコンピュータに基づく検索技術、例えばＢＬＡＳＴ配列検索を使用して、ヒト又は他の種のゲノムデータベースから、関連ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物配列も同定され得る。機能対立遺伝子又は関連遺伝子を同定するために、本明細書中で開示される偽遺伝子を使用し得る。
【０３７２】
〔0400〕  次に、これらの配列の機能発現のために宿主細胞に感染させるか又は遺伝子移入するために、発現ベクターを使用し得る。これらの遺伝子及びベクターをインビトロ又はインビボで作製し、発現させ得る。本発明のベクター内の遺伝子及び核酸（例えばプロモーター、エンハンサー）の発現又は活性を調整することによって、核酸発現を改変し、調節するための所望の表現型を得ることができることを当業者は認めるであろう。発現又は活性を増減させるために記載されるあらゆる公知の方法を使用し得る。
【０３７３】
〔0401〕  別の実施形態において、組み換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において選択的に核酸の発現を支配可能である（例えば組織特異的な制御エレメントを使用して、核酸を発現させる。）。組織特異的な制御エレメントは当技術分野で公知である。適切な組織特異的なプロモーターの非限定例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ及びＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、Ｔ細胞受容体（Ｗｉｎｏｔｏ及びＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）及び免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ及びＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）の特定のプロモーター、ニューロン特異的なプロモーター（例えば神経フィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ及びＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的なプロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）及び乳腺特異的なプロモーター（例えば乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に制御されるプロモーターはまた、例えばマウスホックスプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ及びＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）及びα−フェトタンパク質プロモーター（Ｃａｍｐｅｓ及びＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）によっても包含される。
【０３７４】
〔0402〕  本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列は、酵素性合成又は固相合成など、当技術分野で公知の何らかのオリゴヌクレオチド合成方法に従い作製され得る。固相合成を実行するための装置及び試薬は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。このような合成のための何らかの他の手段も使用し得；ポリヌクレオチドの実際の合成は十分に当業者の能力の範囲内である。例えばＭａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ［３rd  Ｅｄ．］Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｗａｍｙ（２００８）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒａｓｔｏｇｉ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ（２００５）［Ｅｄ．］Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇ：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２８８  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；及びＲａｐｌｅｙ（２０００）［Ｅｄ．］Ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓを参照。次に、相補鎖
を合成し、適切な条件下でその鎖を一緒にアニーリングするか又は適切なプライマー配列を用いてＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を付加するかの何れかによって、２本鎖ＤＮＡ断片を得ることができる。
【０３７５】
〔0403〕  核酸の操作のための、例えば配列において突然変異を生成させる、サブクローニング、プローブへの標識付加、配列決定、ハイブリッド形成のための技術は科学文献及び特許文献で詳細に記載されている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）（Ｅｄｓ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３rd  Ｅｄ．）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）［Ｅｄ．］Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹを参照。
【０３７６】
〔0404〕  ハイブリッド形成及びハイブリッド形成強度（例えばポリヌクレオチド間の会合強度）は、塩濃度、他の要素の存在（例えばポリエチレングリコールの有無）、ハイブリッド形成鎖のモル濃度及びポリヌクレオチド鎖のＧ＋Ｃ含量などの条件によって影響を受ける、ポリヌクレオチド間の相補性の度合い及び、関与する条件のストリンジェンシー含む当技術分野で周知の多くの要因により影響を及ぼされ得、これらの要因全てから、形成されるハイブリッドの特徴となる溶融温度（Ｔm）がもたらされる。核酸ハイブリッ
ド形成の技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）（Ｅｄｓ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ［３rd  Ｅｄ．］Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ及びＨａｙｒｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，ＤＣ）によって開示される。ハイブリッド形成洗浄条件としては、０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの洗浄溶液及び室温で１０分間の回転を伴う温置（低ストリンジェンシー洗浄）、予め温めた（４２℃）０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの洗浄溶液及び４２℃で１５分間の回転を伴う温置（中程度のストリンジェンシー洗浄）及び予め温めた（６８℃）０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの洗浄溶液及び６８℃で１５分間の回転を伴う温置（高ストリンジェンシー洗浄）が挙げられ得る。Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）［Ｅｄ．］Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃを参照。
【０３７７】
〔0405〕  ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物をコードする核酸を増幅するために、オリゴヌクレオチドプライマーを使用し得る。増幅技術を用いて本明細書中に記載の核酸をクローニング又は定量的に測定することもできる。増幅方法は当技術分野で周知であり、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｉｎｎｉｓ（１９９０）［Ｅｄ．］ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ．；Ｉｎｎｉｓ（１９９５）［Ｅｄ．］ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ．）；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９：１１７）；転写増幅（Ｋｗｏｈ（１９８９）ＰＮＡＳ  ８６：１１７３）；自律的配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ（１９９０）ＰＮＡＳ  ８７：１８７４）；Ｑ  βレプリカ−ゼ増幅（Ｓｍｉｔｈ（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：１４７７−９１））；自動化Ｑ−βレプリカ−ゼ増幅アッセイ（Ｂｕｒｇ（１９
９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  １０：２５７−７１）；及び他のＲＮＡポリメラーゼ介在技術（例えばＮＡＳＢＡ，Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）が挙げられる。Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３０７−１６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）（Ｅｄｓ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３rd  Ｅｄ．）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）［Ｅｄ．］Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ［３rd  Ｅｄ．］Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号；Ｓｏｏｋｎａｎａｎ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３−６４も参照。
【０３７８】
〔0406〕  変性プライマー対を設計するためのパラダイムは当技術分野で周知である。例えば、共通縮重ハイブリッドオリゴヌクレオチドプライマー（ＣＯＤＥＨＯＰ）ストラテジーコンピュータプログラムは容易に利用可能であり、本明細書中で提供されるＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物配列など、一連の関連タンパク質配列で開始して、ハイブリッドプライマー予測のためにＢｌｏｃｋＭａｋｅｒ多重配列アラインメントサイトから直接リンクする。例えばＲｏｓｅ（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１６２８−３５；Ｓｉｎｇｈ（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：３１８−１９を参照。
【０３７９】
〔0407〕  上記の核酸プローブを用いて、本明細書中で開示されるＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物と実質的に同一である、多型性変異体、対立遺伝子及び種間相同体を単離し得る。あるいは、ＶＩＳＴＡ又はＶＩＳＴＡ複合物相同体も認識し、それと選択的に結合する、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物に対して作製された抗血清又は精製抗体を用いて免疫学的に発現される相同体を検出することによって、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物及び、その多型性変異体、対立遺伝子及び種間相同体をクローニングするために、発現ライブラリを使用し得る。
【０３８０】
〔0408〕  適切な（完全又は縮重）プライマー対を用いて適切な核酸配列の増幅（例えばＰＣＲ）によって、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物をコードする核酸を作製し得る。増幅された核酸は、何らかの細胞もしくは組織由来のゲノムＤＮＡ又は、ＶＩＳＴＡ又はＶＩＳＴＡ複合物発現細胞由来のｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡであり得る。宿主細胞中での異種配列の発現のための方法は当技術分野で周知である。例えばＭａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ
ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ［３rd  Ｅｄ．］Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照。
【０３８１】
ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を具備する融合プロテイン
〔0409〕  転座配列に融合されたＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物をコードする核酸を具備するハイブリッドタンパク質コード配列を構築し得る。モチーフ及び抗原性領域を具備するハイブリッドＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物も提供される。これらの核酸配列は、転写又は翻訳調節エレメント、例えば転写及び翻訳開始配列、プロモーター及びエンハンサー、転写及び翻訳終結因子、ポリアデニル化配列及びＤＮＡをＲＮＡに転写するのに有用な他の配列に作動可能に連結され得る。組み換え発現カセットの構築において、全ての所望の細胞又は組織における所望の核酸の発現を支配するために、ベクター及びトランスジェニック、プロモーター断片を使用し得る。
【０３８２】
〔0410〕  融合タンパク質は、Ｃ末端又はＮ末端転座配列を具備し得る。さらに、融合タンパク質は、例えばタンパク質検出、精製又は他の適用のための付加的エレメントを具備し得る。検出及び精製を容易にするドメインとしては、例えば金属キレートペプチド、例えばポリヒスチジントラクト、ヒスチジン−トリプトファンモジュール又は固定化金属上での精製を可能にする他のドメインなど；マルトース結合タンパク質；固定化免疫グロブリン上での精製を可能とするプロテインＡドメイン；又はＦＬＡＧ伸長／親和性精製系において利用されるドメイン（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ，Ｓｅａｔｔｌｅ  ＷＡ．）が挙げられる。
【０３８３】
〔0411〕  転座ドメイン（効率的な形質膜発現のため）と新規翻訳ポリペプチドの残りの部分との間の、第Ｘａ因子などの切断可能なリンカー配列の組み入れ（例えばＯｔｔａｖｉ，（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８０：２８９−９３を参照）、スブチリシンプロテアーゼ認識モチーフ（例えばＰｏｌｙａｋ（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０：６１５−１９を参照）；エンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）は、精製を容易にするために有用であり得る。例えば、あるコンストラクトは、チオレドキシンが続く６個のヒスチジン残基に連結される核酸配列をコードするポリペプチド、エンテロキナーゼ切断部位（例えばＷｉｌｌｉａｍｓ（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１７８７−９７を参照）及びＣ末端転座ドメインを含み得る。ヒスチジン残基は、検出及び精製を容易にし、一方でエンテロキナーゼ切断部位は、所望のタンパク質を融合タンパク質の残りの部分から精製するための手段を提供する。融合タンパク質をコードするベクター及び融合タンパク質の適用に属する技術は、科学文献及び特許文献で詳細に記載されている。例えばＫｒｏｌｌ（１９９３）ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：４４１−５３を参照。
【０３８４】
ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物の組み換え発現のための系
〔0412〕  リガンド−結合領域コード配列を具備する、個別の発現ベクターとして、又は発現ベクターのライブラリとしての何れかの発現ベクターは、科学文献及び特許文献において詳細に記載されている様々な従来技術によって、ゲノム又は細胞質又は細胞核に導入され、発現され得る。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）［Ｅｄｓ．］Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３rd
Ｅｄ．）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）［Ｅｄ．］Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｌｏｇｙＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照。
【０３８５】
〔0413〕  細胞において安定して又は一過性に発現される発現カセット、ベクター又はウイルスにおいて、核酸を発現させ得る（例えばエピソーム性発現系）。形質転換された細胞及び配列に選択可能な表現型を付与するために、発現カセット及びベクターに選択マーカーが組み込まれ得る。例えば、宿主ゲノムへの統合が必要でないように、選択マーカーは、エピソーム維持及び複製をコードし得る。例えば、マーカーは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の選択を可能にするために、抗生物質耐性（例えばクロラムフェニコール、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン）又は除草剤耐性（例えばクロロスルフロン又はＢａｓｔａ）をコードし得る。例えばＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）［Ｅｄ．］Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；及びＷａｌｋｅｒ及びＰａｐｌｅｙ（２００９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［５th  Ｅｄ．］Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを参照。ネオマイシン又はハイグロマイシンのような基質に耐性を付与する選択可能マーカー遺伝子は組織培養でのみ利用され得るので、インビトロ及びインビボで選択可能マーカーとして化学療法耐性遺伝子も使用される。
【０３８６】
〔0414〕  本発明のポリヌクレオチドの細胞性発現を可能にするために、上記核酸配列のうち１つの少なくともコード領域を含み、さらに少なくとも１つのシス作用性制御エレメントを含む本発明による核酸コンストラクトを使用し得る。好ましくは、本発明の核酸コンストラクトにより利用されるプロモーターは、形質転換された特異的な細胞集団において活性がある。細胞型特異的な及び／又は組織特異的なプロモーターの例は、当技術分野で周知である。Ｂｅｒｎａｒｄｉ（２００３）［Ｅｄ．］Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ
ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３８  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂ．Ｖ．を参照。本発明の核酸コンストラクトは、プロモーター配列に隣接するか又は遠位にあり得、そこからの転写を上方制御することにおいて機能し得るエンハンサーをさらに含み得る。
【０３８７】
〔0415〕  本発明の核酸コンストラクトは、好ましくは適切な選択可能マーカー及び／また複製起点をさらに含む。好ましくは、利用される核酸コンストラクトは、（コンストラクトが適切な選択可能マーカー及び複製起点を具備する）Ｅ．コリにおいて両方を増殖させ得、細胞における増殖又は遺伝子における統合及び最適の組織に適合性であり得る、シャトルベクターである。本発明によるコンストラクトは、例えば、プラスミド、バクミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルス又は人工染色体であり得る。
【０３８８】
〔0416〕  適切なコンストラクトの例としては、それぞれＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．）から市販されているｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ＰｚｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏが挙げられるが限定されない。レトロウイルスベクター及びパッケージング系の例は、多重クローニング部位へのクローニングを可能にするＲｅｔｒｏ−ＸベクターｐＬＮＣＸ及びｐＬＸＳＮを含め、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）により販売されるものであり、導入遺伝子はＣＭＶプロモーターから転写される。導入遺伝子が５’ＬＴＲプロモーターから転写される、ｐＢａｂｅなど、Ｍｏ−ＭｕＬＶ由来のベクターも挙げられる。
【０３８９】
〔0417〕  本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に適切な形態の本発明の核酸を具備し、これは、組み換え発現ベクターが、発現させようとする核酸配列に作動可能に連結される、発現のために使用しようとする宿主細胞に基づき選択される、１以上の制御配列を含むことを意味する。組み換え発現ベクター内で、「作動可能に連結される」は、（例えば、ベクターが宿主細胞に導入されるとき、インビトロ転写／翻訳系において又は宿主細胞において、）ヌクレオチド配列の発現を可能にするように、関心のあるヌクレオチド配列が制御配列に連結されることを意味するものとする。
【０３９０】
〔0418〕  「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現調節エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を含むものとする。このような制御配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ（１９９０）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡに記載されている。制御配列としては、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を支配するもの及びある一定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を支配するもの（例えば組織特異的な制御配列）が挙げられる。当業者にとって当然のことながら、発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に依存し得る。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって、本明細書中で記載のような核酸によりコードされる融合タンパク質又はペプチドを含め、タンパク質又はペプチドを産生させ得る。
【０３９１】
〔0419〕  原核又は真核細胞における変異体タンパク質の産生のために、本発明の組み換え発現ベクターを設計し得る。例えば、本発明のタンパク質は、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、昆虫細胞（例えばバキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞又は哺乳動物細胞で発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡでさらに論じられている。あるいは、例えばＴ７プロモーター制御配列及びＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで組み換え発現ベクターを転写し、翻訳させ得る。
【０３９２】
〔0420〕  原核生物におけるタンパク質の発現は、融合又は非融合タンパク質の何れかの発現を支配する構成的又は誘導性プロモーターを含有するベクターを用いてエスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）で行われることが最も多い。融合ベクターは、そこにおいてコードされるタンパク質に対して、組み換えタンパク質のアミノ又はＣ末端に、多くのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは一般的に３つの目的に役立つ：（ｉ）組み換えタンパク質の発現を上昇させること；（ｉｉ）組み換えタンパク質の溶解度を向上させること；及び（ｉｉｉ）親和性精製においてリガンドとして作用することにより組み換えタンパク質の精製に役立つこと。しばしば、融合発現ベクターにおいて、融合タンパク質の精製の後、融合部から組み換えタンパク質を分離可能にするために、融合部及び組み換えタンパク質の接合部にタンパク質分解性切断部位が導入される。このような酵素及びそれらの同種認識配列としては、第Ｘａ因子、トロンビン、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ、ＴＥＶ及びエンテロキナーゼが挙げられる。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質又はプロテインＡをそれぞれ標的組み換えタンパク質に融合させる、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ及びＪｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ．）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０３９３】
〔0421〕  組み換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型にあり得る核酸の発現を支配可能である（例えば、核酸を発現させるために組織特異的な制御エレメントが使用される。）。組織特異的な制御エレメントは当技術分野で公知である。タンパク質の効率的な産生のために、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を所望の宿主での発現に対して最適化された発現調節配列の調節下に置くことが好ましい。例えば、この配列は、最適化された転写及び／又は翻訳制御配列（例えば改変コザック配列）を含み得る。
【０３９４】
〔0422〕  Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において組み換えタンパク質発現を最大化するためのあるストラテジーは、組み換えタンパク質をタンパク質分的に切断能が欠損している宿主細菌中でタンパク質を発現させることである。例えばＧｏｔｔｅｓｍａｎ（１９９０）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．１８５：１１９−１２８を参照。別のストラテジーは、各アミノ酸に対する個々のコドンがＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で選択的に利用されるものであるように、発現ベクターに挿入しようとする核酸の核酸配列を改変することである。例えばＷａｄａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８を参照。本発明の核酸配列のこのような改変は、標準的なＤＮＡ合成技術によって行い得る。コドンバイアスを解決するための別のストラテジーは、ＢＬ２１−コドン＋細菌株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はＲｏｓｅｔｔａ細菌株（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用することによるものであり、これらの株は、稀少なＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔＲＮＡ遺伝子の余分なコピーを含有する。
【０３９５】
〔0423〕  本発明のタンパク質をコードする発現ベクターは酵母発現ベクターであり得る。酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）及びｐｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）が挙げられる。
【０３９６】
〔0424〕  あるいは、本発明のポリペプチドは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で産生され得る。培養昆虫細胞（例えばＳＦ９細胞）でのタンパク質発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が挙げられる。また別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＵＢ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。哺乳動物細胞で使用される場合、ウイルス性制御エレメントによって発現ベクターの調節機能が与えられることが多い。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、ラウス肉腫ウイルス及びサルウイルス４０由来である。原核及び真核細胞の両方に対する他の適切な発現系については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）（Ｅｄｓ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３rd  Ｅｄ．）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照。
【０３９７】
〔0425〕  宿主細胞は何らかの原核又は真核細胞であり得る。例えば、本発明のタンパク質は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、昆虫細胞、酵母、植物又は哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３細胞）において産生され得る。他の適切な宿主細胞は当業者にとって公知である。
【０３９８】
〔0426〕  従来の形質転換又は遺伝子移入技術を介して原核又は真核細胞にベクターＤＮＡを導入し得る。本明細書中で使用される場合、「形質転換」及び「遺伝子移入」という用語は、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性遺伝子移入、リポフェクション又はエレクトロポレーションを含め、外来核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための様々な当技術分野で認められている技術を指すものとする。宿主細胞に形質転換又は遺伝子移入するための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）［Ｅｄｓ．］Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３rd  Ｅｄ．）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ及び他の実験マニュアルで見出すことができる。
【０３９９】
〔0427〕  外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するために周知の手順の何れをも使用し得る。これらには、リン酸カルシウム遺伝子移入、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルス性ベクター及びクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するための他の周知の方法の何れかの使用が挙げられる。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）（Ｅｄｓ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３rd  Ｅｄ．）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ及びＷａｌｋｅｒ及びＰａｐｌｅｙ（２００９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［５th  Ｅｄ．］Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを参照。使用される特定の遺伝子操作手順が、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物、断片又は関心のある変異体を発現可能な宿主細胞に少なくとも１つの核酸分子を首尾よく導入可能であることのみ必要である。
【０４００】
〔0428〕  哺乳動物細胞の安定的な遺伝子移入の場合、使用される発現ベクター及び遺伝子移入技術に依存して、それらのゲノムに外来ＤＮＡを組み込み得る細胞はごく一部であることが知られている。これらの組み込み体を同定し、選択するために、一般に関心のある遺伝子とともに選択可能マーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が宿主細胞に導入される。様々な選択可能マーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン及びメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる。本発明のタンパク質をコードするものと同じベクター上で選択可能マーカーをコードする核酸を宿主細胞に導入し得るか、又は別個のベクター上で導入し得る。導入核酸で安定的に遺伝子移入された細胞は、薬物選択により同定され得る。（例えば選択可能マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存し、一方で他の細胞は死滅）。
【０４０１】
〔0429〕  本発明のタンパク質を産生させる（即ち発現させる）ために、培養中の原核又は真核宿主細胞などの本発明の宿主細胞を使用し得る。従って、本発明は、本発明の宿主細胞を用いて本発明のタンパク質を産生させるための方法をさらに提供する。ある実施形態において、本方法は、本発明のタンパク質が産生されるように適切な培地中で（本発明のタンパク質をコードする組み換え発現ベクターが導入されている）本発明の宿主細胞を培養することを具備する。別の実施形態において、本方法は、本発明のタンパク質を培地又は宿主細胞から単離することをさらに具備する。
【０４０２】
〔0430〕  細胞に発現ベクターを導入した後、受容体、断片又は関心のある変異体の発現に都合がよい条件下で遺伝子移入された細胞を培養し、次いで標準的な技術を用いてこれを培養物から回収する。このような技術の例は当技術分野で周知である。例えばＷＯ００／０６５９３を参照。
【０４０３】
ＶＩＳＴＡ又はＶＩＳＴＡ複合物に結合する抗体
〔0431〕  本発明はまた、モノクローナル及びヒト化モノクローナル抗体を含むが限定されないＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を選択的に結合する抗体も提供する。ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物に選択的に結合する抗体は、組成物中で医薬担体及びさらなる抗体（例えば抗ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２又はＣＴＬＡ−４抗体）と混合され得る。
【０４０４】
〔0432〕  ポリクローナル及びモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を用いてＶＩＳＴＡに結合する抗体を作製するために、免疫原として単離ＶＩＳＴＡポリペプチド又はそれらの一部もしくは断片を使用し得る。全長ＶＩＳＴＡポリペプチドが使用され得るか又は、あるいは、本発明は、免疫原としての使用のために、ＶＩＳＴＡの抗原性ペプチド断片を提供する。ある実施形態において、ＶＩＳＴＡの抗原性ペプチドは、配列番号２、４又は５で示されるアミノ酸配列の少なくとも８アミノ酸残基を具備し、ペプチドに対して産生された抗体がＶＩＳＴＡポリペプチドと特異的な免疫複合体を形成するように、ＶＩＳＴＡのエピトープを包含する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５アミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基及び最も好ましくは少なくとも３０アミノ酸残基を具備する。本抗原性ペプチドにより包含される好ましいエピトープは、本ポリペプチドの細胞外ドメイ
ンに位置するＶＩＳＴＡの領域、例えば親水性領域ならびに高抗原性がある領域である。
【０４０５】
〔0433〕  一般的に、適切な対象（例えばウサギ、ヤギ、マウス又は他の哺乳動物）に免疫原で免疫付与することによって、抗体を調製するためにＶＩＳＴＡ免疫原が使用される。適切な免疫原性調製物は、例えば、組み換え発現ＶＩＳＴＡポリペプチド又は化学合成ＶＩＳＴＡポリペプチドを含有し得る。この調製物は、アジュバント、例えばフロイント完全又は不完全アジュバント又は同様の免疫賦活剤などをさらに含み得る。免疫原性ＶＩＳＴＡ調製物による適切な対象の免疫付与は、ポリクローナル抗ＶＩＳＴＡ抗体反応を誘導する。
【０４０６】
〔0434〕  抗体は、分子量およそ２３，０００ダルトンの２本の同一の軽ポリペプチド鎖（「軽鎖」）及び分子量５３，０００から７０，０００の２本の同一の重鎖（「重鎖」）を具備し得る。Ｅｄｅｌｍａｎ（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：５を参照。この４本の鎖は、「Ｙ」字型の入り口から伸びる重鎖を軽鎖が取り囲む「Ｙ」字型でジスルフィド結合によって連結される。「Ｙ」字型の「分枝」部分はＦab領域と呼ばれ；「Ｙ」字型の幹部分はＦC領域と呼ばれる。アミノ酸配列方向は、「Ｙ」字型の
最上部のＮ末端から各鎖の下部のＣ末端へ向かう。Ｎ末端は、それを引き出した抗原に対する特異性を有し、約１００アミノ酸長である可変領域を有し、抗体ごとに軽鎖と重鎖との間に僅かな変異がある。
【０４０７】
〔0435〕  可変領域は、各鎖において、その鎖の残りの長さを伸ばし、特定の抗体クラス内で抗体の特異性（即ちそれを引き出す抗原）に伴って変動しない定常領域に連結される。免疫グロブリン分子のクラスを決定する、５種類の既知の主要な定常領域クラスがある（例えばγ、μ、α、δ及びε重鎖定常領域に対応するＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ）。定常領域又はクラスは、補体の活性化（Ｋａｂａｔ（１９７６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ［２nd  Ｅｄ．］４１３−４３６頁；Ｈｏｌｔ，Ｒｉｎｅｈａｒｔ，Ｗｉｎｓｔｏｎ）及び他の細胞性反応（Ａｎｄｒｅｗｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  １−１８；Ｋｏｈｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４８：１８７）を含む、抗体の続くエフェクター機能を決定し、一方で可変領域は、それが反応する抗原を決定する。軽鎖は、κ（カッパ）又はλ（ラムダ）の何れかとして分類される。各重鎖クラスは、κ又はλ軽鎖の何れかとともに調製され得る。軽及び重鎖は互いに共有結合され、２本の重鎖の「テール」部は、ハイブリドーマ又はＢ細胞の何れかにより免疫グロブリンが産生されるとき、共有ジスルフィド結合により互いに結合される。
【０４０８】
〔0436〕  このような条件下での抗体に対する特異的な結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択される抗体を必要とし得る。例えば、精子塩基性タンパク質に特異的に免疫反応性であり、精子塩基性タンパク質の多型性変異体及び対立遺伝子を除き、他のタンパク質には反応性でないポリクローナル抗体のみを得るために、ラット、マウス又はヒトなどの特異的な種由来の精子塩基性タンパク質に対して産生されるポリクローナル抗体を選択し得る。この選択は、他の種からの精子塩基性タンパク質分子と交差反応する抗体を除くことにより達成され得る。特定のタンパク質と特異的な免疫反応性がある抗体を選択するために、様々な免疫アッセイ方式を使用し得る。例えば、タンパク質と特異的な免疫反応性がある抗体を選択するために、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが通常のように使用される。免疫アッセイ方式の説明及び特異的な免疫反応性を決定するために使用することができる条件については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９９８）ＵＳＩＮＧ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照。一般的には、特異的又は選択的反応は、バックグラウンドシグナル又はノイズの少なくとも２倍、より一般的には
バックグラウンドの約１０から１００倍を超える。
【０４０９】
〔0437〕  例えばＩｇＶドメイン又は他の特異的なドメインにおけるＶＩＳＴＡの特異的エピトープに結合するものを同定するために、及び／又はＶＩＳＴＡタンパク質に対する高親和性及び結合力を保持する抗体を選択するために、抗体をスクリーニングし得る。さらに、インビトロ及びインビボでの免疫性及び免疫細胞上でのＶＩＳＴＡの特異的な機能及び効果を調節するものを同定するために、これらの抗体をスクリーニングする。例えば、もしあれば、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生、ＣＤ２８同時刺激、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖及びナイーブ及びメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖などを含むＶＩＳＴＡにより負の方向に制御される免疫機能における特定の抗ＶＩＳＴＡ抗体の調節性の効果を確認するために、アッセイを行い得る。実施形態において、これらの抗ＶＩＳＴＡ抗体はインビボで逆の挙動を示すので、インビトロで、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇの存在がＶＩＳＴＡ−Ｉｇによる抑制を促進する場合、即ちこれらが免疫抑制性である、潜在的な治療用抗ＶＩＳＴＡ抗体を同定するためにアッセイを行い得る。本発明は、１３６アミノ酸細胞外ドメインに、例えばアミノ酸１から５０、５０から１００、１００から１３６に特異的に結合する抗ＶＩＳＴＡ抗体及びその使用、ＩｇＶに特異的に結合する抗体、ストーク領域に特異的に結合する抗体、膜貫通領域に特異的に結合する抗体及びＶＩＳＴＡの細胞質領域に特異的に結合する抗体を包含する。本適用においてこれらの特異的な領域が同定される。
【０４１０】
〔0438〕  別の実施形態において、本組み換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において選択的に核酸の発現を支配可能である（例えば、核酸を発現するために、組織特異的な制御エレメントを使用する。）。組織特異的な制御エレメントは当技術分野で公知である。適切な組織特異的なプロモーターの非限定例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ系特異的なプロモーター（Ｃａｌａｍｅ及びＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、Ｔ細胞受容体の特定のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ及びＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）及び免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ及びＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば神経フィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ及びＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的なプロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ  ，ｅｔ
ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）及び乳腺特異的なプロモーター（例えば乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に制御されるプロモーターはまた、例えばマウスホックスプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ及びＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）及びα−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ及びＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）によっても包含される。
【０４１１】
ポリクローナル抗体
〔0439〕  ポリクローナル抗体は、抗原を用いて免疫付与した動物の血清由来の抗体分子の不均一集団である。ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物に選択的に結合するポリクローナル抗体は、当技術分野で周知の方法によって作製され得る。例えばＨｏｗａｒｄ及びＫａｓｅｒ（２００７）Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓを参照。
【０４１２】
モノクローナル抗体
〔0440〕  モノクローナル抗体は、抗原に特異的な抗体の実質的に均一な集団を含有し、
この集団は、実質的に同様のエピトープ結合部位を含有する。モノクローナル抗体は、当業者にとって公知の方法によって入手され得る。例えばＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７；米国特許第４，３７６，１１０号；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．［Ｅｄｓ．］（２０１１）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．及びＷｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ．；及びＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９９８）ＵＳＩＮＧ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）［Ｅｄｓ．］Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤ及びその何らかのサブクラスを含め、何らかの免疫グロブリンクラスのものであり得る。本発明の抗体を産生するハイブリドーマはインビトロ、インシトゥ又はインビボで培養され得る。
【０４１３】
キメラ抗体
〔0441〕  キメラ抗体は、適用において免疫原性を低下させ、産生において収量を増加させるために最初に使用される、マウス抗体由来の可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなど、その異なる部分が異なる動物種由来である分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体は、ハイブリドーマからより高い収量があるが、ヒトにおいて免疫原性がより高いので、ヒトマウスキメラモノクローナル抗体が使用される。キメラ抗体及びそれらの産生のための方法は当技術分野で公知である。Ｃａｂｉｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３２７３−３２７７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５、Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３−６４６；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８−２７０；欧州特許出願第１７３４９４号（１９８６）；ＷＯ８６／０１５３３（１９８６）；欧州特許出願第１８４１８７号（１９８６）；欧州特許出願第７３４９４号（１９８６）；Ｓａｈａｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０６６−１０７４；Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３；Ｓｕｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；Ｂｅｔｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；及びＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９９８）ＵＳＩＮＧ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；米国特許第５，６２４，６５９号を参照。
【０４１４】
ヒト化抗体
〔0442〕  ヒト化抗体は、さらにいっそうヒト様である免疫グロブリンドメインを含有し、動物由来抗体の相補性決定領域のみを組み込むように操作される。これは、モノクローナル抗体の可変領域の超可変ループの配列を調べ、それらをヒト抗体鎖の構造に合わせることにより遂行され得る。例えば米国特許第６，１８７，２８７号を参照。同様に、ヒト化抗体を作製する他の方法が現在、当技術分野で周知である。例えば米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号；同第６，０５４，２９７号；同第６，１８０，３７０号；同第６，４０７，２１３号；同第６，５４８，６４０号；同第６，６３２，９２７号；及び同第６，６３９，０５５号；Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−３６；及びＺｈｉｑｉａｎｇ  Ａｎ（２００９）［Ｅｄ．］Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉ
ｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂｅｎｃｈ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照。
【０４１５】
抗体断片
〔0443〕  免疫グロブリン全体（又はそれらの組み換え対応物）に加えて、エピトープ結合部位を具備する免疫グロブリン断片（例えばＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2又は他の断片）
を合成し得る。「断片」又は最小免疫グロブリンは、組み換え免疫グロブリン技術を利用して設計し得る。例えば、融合可変軽鎖領域及び可変重鎖領域を合成することによって、本発明における使用のための「Ｆｖ」免疫グロブリンを作製し得る。抗体の組み合わせ、例えば２つの異なるＦｖ特異性を具備するダイアボディーにも関心がある。免疫グロブリンの抗原−結合断片としては、ＳＭＩＰ（低分子免疫薬）、キャメルボディー、ナノボディー及びＩｇＮＡＲが挙げられるが限定されない。
【０４１６】
抗イディオタイプ抗体
〔0444〕  抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体は、一般に抗体の抗原−結合部位と会合させられる特有の決定基を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄが調製されている抗体を用いて、抗体の供給源と同じ種及び遺伝子型の動物（例えばマウス系統）に対して免疫付与を行うことによって調製され得る。免疫付与動物は、イディオタイプ決定基に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を産生することによって、免疫付与抗体のイディオタイプ決定基を認識し、それに反応する。例えば米国特許第４，６９９，８８０号を参照。抗Ｉｄ抗体はまた、また別の動物において免疫反応を誘導し、いわゆる抗抗Ｉｄ抗体を産生させるために「免疫原」としても使用され得る。抗抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導した元の抗体とエピトープ的に同一であり得る。従って、抗体のイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することによって、同一である特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することができる。
【０４１７】
操作及び修飾抗体
〔0445〕  修飾抗体を操作するために、抗体出発材料由来のＶＨ及び／又はＶＬ配列の１以上を有する抗体を用いて本発明の抗体をさらに調製し得、この修飾抗体は、出発抗体から特性が変更されているものであり得る。一方又は両方の可変領域（即ちＶＨ及び／又はＶＬ）内、例えば１以上のＣＤＲ領域内及び／又は１以上のフレームワーク領域内、の１以上の残基を修飾することによって、抗体を操作し得る。さらに又はあるいは、例えば抗体のエフェクター機能を変化させるために、定常領域内の残基を修飾することによって抗体を操作し得る。
【０４１８】
〔0446〕  行われ得る可変領域操作のあるタイプは、ＣＤＲ移植である。抗体は、主に、６個の重及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を通じて標的抗原と相互作用する。このために、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体間で多様である。ＣＤＲ配列は殆どの抗体−抗原相互作用に関与するので、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列上に移植された特異的な天然抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特異的な天然の抗体の特性を模倣する組み換え抗体を発現させることが可能である。例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｑｕｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号；及び同第６，１８０，３７０号を参照。
【０４１９】
〔0447〕  生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベース又は公開参考文献から、適切なフレームワーク配列を得ることができる。例えば、ヒト重及び軽鎖可変領域遺伝子に対する生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列配列デー
タベース（インターネットで利用可能）、ならびにＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ［５ｔｈ  Ｅｄ．］Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）“Ｔｈｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａｂｏｕｔ  Ｆｉｆｔｙ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｌｏｏｐｓ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；及びＣｏｘ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６で見出すことができる。
【０４２０】
〔0448〕  別のタイプの可変領域修飾は、それによって関心のある抗体の１以上の結合特性（例えば親和性）を向上させるために、ＶＨ及び／又はＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３領域内でアミノ酸残基を成熟させることである。突然変異を導入するために、部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ介在性突然変異誘発を行い得、適切なインビトロ又はインビボアッセイにおいて抗体結合又は関心のある他の機能特性における影響を評価し得る。好ましくは（本明細書中で論じるような）保存的修飾を導入し得る。この突然変異は、アミノ酸置換、付加又は欠失であり得るが、好ましくは置換である。さらに、一般に、ＣＤＲ領域内の、１、２、３、４又は５残基を超えないものが改変される。
【０４２１】
〔0449〕  本発明の改変抗体には、例えば抗体の特性を向上させるために、ＶＨ及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基に対して修飾がなされているものが含まれる。一般に、抗体の免疫原性を低下させるために、このようなフレームワーク修飾がなされる。例えば、あるアプローチは、対応する生殖細胞系列配列に対して１以上のフレームワーク残基を「復帰突然変異」させることである。より具体的に、体細胞突然変異が起こった抗体は、抗体が由来するものからの生殖細胞系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列をその抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することによって同定され得る。
【０４２２】
〔0450〕  フレームワーク又はＣＤＲ領域内でなされた修飾に加えて又はその代わりに、一般には抗体の１以上の機能特性、例えば血清半減期、補体結合反応、Ｆｃ受容体結合及び／又は抗原依存性細胞毒性など、を変化させるために、Ｆｃ領域内で修飾を含むように本発明の抗体を操作し得る。さらに、本発明の抗体を化学的に修飾するか（例えば１以上の化学部分を抗体に連結し得る。）、又はそのグリコシル化を変化させるために、繰り返すが、抗体の１以上の機能特性を変化させるために修飾し得る。このような実施形態は下記で詳述する。Ｆｃ領域中の残基の付番は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。
【０４２３】
〔0451〕  ヒンジ領域中のシステイン残基数が変化するように、例えば増減するように、ＣＨ１のヒンジ領域を修飾し得る。米国特許第５，６７７，４２５号を参照。例えば、軽及び重鎖の組み立てを促進するために、又は抗体の安定性を向上させるかもしくは低下させるために、ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基数を変化させ得る。
【０４２４】
〔0452〕  抗体の生物学的半減期を短縮するために、抗体のＦｃヒンジ領域を成熟させ得る。より具体的には、ネイティブＦｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して、その抗体がブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合を損なうように、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に１以上のアミノ酸突然変異を導入し得る。例えば米国特許第６，１６５，７４５号を参照。
【０４２５】
〔0453〕  その生物学的半減期を延長させるために抗体を修飾し得る。様々なアプロー
チが可能である。例えば、次の突然変異のうち１以上を導入し得る：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。米国特許第６，２７７，３７５号を参照。あるいは、生物学的半減期を延長させるために、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２本ループから取られるサルベージ受容体結合エピトープを含有させるため、抗体をＣＨ１又はＣＬ領域内で改変し得る。米国特許第５，８６９，０４６号及び同第６，１２１，０２２号参照。
【０４２６】
〔0454〕  抗体のエフェクター機能を変化させるために少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることによって、Ｆｃ領域を改変し得る。例えば、エフェクターリガンドに対する抗体の親和性が変化するが、親抗体の抗原−結合能を保持するように、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０及び３２２から選択される１以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換え得る。親和性が変化させられ得るエフェクターリガンドは、例えばＦｃ受容体又は補体のＣ１成分であり得る。米国特許第５，６２４，８２１号及び同第５，６４８，２６０号を参照。
【０４２７】
〔0455〕  抗体のグリコシル化を修飾し得る。例えば、アグリコシル化抗体（即ち抗体がグリコシル化を欠く。）を作製し得る。例えば抗原に対する抗体の親和性を向上させるために、グリコシル化を変化させ得る。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１以上の部位を変化させることによって遂行され得る。例えば、１以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位が除去され、それによってその部位のグリコシル化を排除することになる１以上のアミノ酸置換をなし得る。このようなアグリコシル化によって、抗原に対する抗体の親和性が向上し得る。例えば米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，３５０，８６１号を参照。
【０４２８】
〔0456〕  さらに又はあるいは、フコシル残基の量が減少している低フコシル化抗体又は２分されるＧｌｃＮａｃ構造が増加している抗体など、グリコシル化のタイプが変化している抗体を作製し得る。このようなグリコシル化パターンの変化によって、抗体のＡＤＣＣ能が上昇することが明らかになっている。例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞において抗体を発現させることによって、このような炭水化物修飾を遂行し得る。グリコシル化機構が変化した細胞は、当技術分野で記載されており、それによってグリコシル化が変化した抗体を産生させるために本発明の組み換え抗体を発現する宿主細胞として使用され得る。米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号及びＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４−２２；ＥＰ１，１７６，１９５；ＷＯ２００３／０３５８３５；Ｓｈｉｅｌｄｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；ＷＯ９９／５４３４２；Ｕｍａｎａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０；及びＴａｒｅｎｔｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６−２３を参照。
【０４２９】
〔0457〕  例えば抗体の生物学的（例えば血清）半減期を延長させるために、抗体をペグ化し得る。抗体をペグ化するために、一般的には、１以上のＰＥＧ基が抗体又は抗体断片に連結するようになる条件下で、抗体又はその断片を、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体など、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応させる。好ましくは、反応性ＰＥＧ分子（又は類似した反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を介してＰＥＧ化が行われる。
【０４３０】
〔0458〕  本発明はまた、本明細書中で示される、抗体、抗体断片、ダイアボディー、ＳＭＩＰ、キャメルボディー、ナノボディー、ＩｇＮＡＲ、ポリペプチド、可変領域及びＣＤＲに実質的に相同である変異体及び同等物も提供する。これらは、例えば保存的置換突然変異（即ち１以上のアミノ酸の同様のアミノ酸による置換）を含有し得る。例えば、保存的置換は、同じ一般クラス内の別のものでのアミノ酸の置換、例えばある酸性アミノ
酸を別の酸性アミノ酸で、ある塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で、又はある中性アミノ酸を別の中性アミノ酸で置換することを指す。
【０４３１】
抗体複合物
〔0459〕  さらに、細胞毒素、治療剤又は放射性金属イオンなどの治療的部分に抗体（又はその断片）を複合化し得る。細胞毒素又は細胞毒性剤としては、細胞に対して有害である何らかの薬剤が挙げられる。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン及びその類似体又は相同体が挙げられる。治療剤としては、代謝拮抗剤（例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパ・クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（旧名ダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（旧名アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミスラマイシン及びアントラマイシン（ＡＭＣ））及び抗有糸分裂薬（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）が挙げられるが限定されない。
【０４３２】
抗体を操作する方法
〔0460〕  ＶＨ及び／又はＶＬ配列又はそれに連結される定常領域を修飾することによって、新規の変異体抗体を作製するために、本明細書中で開示されるＶＨ及びＶＬ配列を有する抗体を使用し得る。従って、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物への結合など、少なくとも１つの本発明の抗体の機能特性を保持する構造的に関連のある変異体抗体を作製するために、本発明の変異体抗体の構造特性を使用する。例えば、本明細書中で論じられるように、さらなる組み換え操作された、本発明の抗ＶＩＳＴＡ又は抗ＶＩＳＴＡ複合物抗体（例えばＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物に結合する抗体）を作製するために、１つの抗ＶＩＳＴＡ変異体抗体又は抗ＶＩＳＴＡ複合物変異体抗体又はその突然変異の１以上のＣＤＲ領域を既知のフレームワーク領域及び／又は他のＣＤＲと組み換えにより組み合わせ得る。本操作方法に対する出発材料は、本明細書中で提供されるＶＨ及び／又はＶＫ配列の１以上又はその１以上のＣＤＲ領域であり得る。改変抗体を作製するために、本明細書中で提供されるＶＨ及び／又はＶＫ配列の１以上又は１以上のそのＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（即ちタンパク質として発現させる）必要はない。むしろ、元の配列由来の「第二世代」配列を作製するために、出発材料として配列中に含有される情報を使用し、次に「第二世代」配列を調製し、タンパク質として発現させる。改変抗体配列を調製し、発現させるために、標準的な分子生物学技術を使用し得る。
【０４３３】
〔0461〕  改変抗体配列によりコードされる抗体は、本明細書中で提供される方法によって、及び配列を用いて産生される抗ＶＩＳＴＡ又は抗ＶＩＳＴＡ複合物抗体の機能特性のうち１つ、一部又は全てを保持し得、この機能特性としては、特異的なＫＤレベル以下での変異体ＶＩＳＴＡ又は変異体ＶＩＳＴＡ複合物に対する結合及び／又は免疫細胞活性の調整及び／又は例えば、結腸直腸癌腫、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、卵巣癌、胃癌及び肝臓癌など所望の標的細胞への選択的な結合が挙げられる。当技術分野で利用可能であり、及び／又は本明細書中に記載の標準的なアッセイを用いて、改変抗体の機能特性を評価し得る。
【０４３４】
〔0462〕  抗ＶＩＳＴＡ又は抗ＶＩＳＴＡ複合物抗体コード配列の全て又は一部に沿っ
て、突然変異を無作為に又は選択的に導入し得、得られる修飾抗ＶＩＳＴＡ又は抗ＶＩＳＴＡ複合物抗体を結合活性及び／又は他の所望の機能特性についてスクリーニングし得る。ＷＯ２０１１／１２００１３を参照。
【０４３５】
ＶＩＳＴＡ又はＶＩＳＴＡ複合物に選択的に結合する抗体をコードする核酸
〔0463〕  本発明の別の実施形態は、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物に結合する本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。この核酸は全細胞で、細胞溶解液中で、又は部分的に精製されているか又は実質的に純粋な形態で存在し得る。アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当技術分野で周知の他のものを含む標準的な技術により、精製によって核酸を他の細胞性構成要素又は他の夾雑物（例えば他の細胞性核酸又はタンパク質）から単離し得る。Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得、イントロン配列を含有していても、又はしていなくてもよい。本核酸はｃＤＮＡ分子であり得る。
【０４３６】
〔0464〕  標準的な分子生物学技術を用いて本発明の核酸を得ることができる。ハイブリドーマ（例えば下記でさらに記載するヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ）により発現される抗体に対して、標準的なＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術によって、ハイブリドーマにより作製された抗体の軽及び重鎖をコードするｃＤＮＡを得ることができる。（例えばファージディスプレイ技術を用いて）免疫グロブリン遺伝子ライブラリから得られる抗体に対して、抗体をコードする核酸をライブラリから回収し得る。
【０４３７】
〔0465〕  具体的に、例えば、１以上の選択コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって、縮重コドン置換を達成し得る。Ｂａｔｚｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−０８；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８。
【０４３８】
〔0466〕  ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片を得たら、例えば可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子に又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準的な組み換えＤＮＡ技術によってこれらのＤＮＡ断片をさらに操作し得る。これらの操作において、ＶＬ−又はＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域又は可動性リンカーなど別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。
【０４３９】
〔0467〕  ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡを全長重鎖遺伝子に変換し得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で公知であり（例えばＫａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子に対して、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。
【０４４０】
〔0468〕  軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子にＶＬをコードするＤＮＡを作動可能に連結することによって、ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡを全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換し得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で公知であり（例えばＫａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域はκ又はλ定常領域であり得るが、最も好ましくはκ定常領域である。
【０４４１】
〔0469〕  ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨ及びＶＬ配列が、可動性リンカーにより連結されるＶＬ及びＶＨ領域とともに連続１本鎖タンパク質として発現され得るように、可動性リンカーをコードする、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）3をコード
する別の断片に、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ断片を作動可能に連結する。例えばＢｉｒｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ
３４８：５５２−５５４を参照。
【０４４２】
抗体及びその断片を作製する方法
〔0470〕  本発明はまた、抗体及びその断片を作製するための方法も提供する。抗体を作製する方法は当業者にとって周知である。例えば、キメラ抗体を作製する方法は現在、当技術分野で周知である。例えば米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８１：８６５１−５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８−２７０；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３−４６を参照。
【０４４３】
〔0471〕  例えば、遺伝子操作によって抗体又は抗原結合断片を作製し得る。この技術において、他の方法と同様に、抗体産生細胞を所望の抗原又は免疫原に感作させる。ＰＣＲ増幅を用いてｃＤＮＡを作製するために、抗体産生細胞から単離されるメッセンジャーＲＮＡを鋳型として使用する。増幅した免疫グロブリンｃＤＮＡの適切なセクションを発現ベクターに挿入することによって、それぞれが最初の抗原特異性を保持する１つの重鎖遺伝子及び１つの軽鎖遺伝子を含有するベクターのライブラリを作製する。重鎖遺伝子ライブラリを軽鎖遺伝子ライブラリと組み合わせることによって、コンビナトリアルライブラリを構築する。この結果、重及び軽鎖（抗体分子のＦａｂ断片又は抗原結合断片と類似する。）を同時発現するクローンのライブラリが得られる。これらの遺伝子を担持するベクターを宿主細胞に同時遺伝子移入する。遺伝子移入宿主において抗体遺伝子合成が誘導される場合、重及び軽鎖タンパク質が自己集合して、抗原又は免疫原を用いてスクリーニングにより検出され得る活性のある抗体が産生される。
【０４４４】
〔0472〕  本発明の抗体及びその断片はまた、当業者にとって周知の従来技術を用いて、オペロン及び、抗体特異性に必要とされるＣＤＲをコードするＤＮＡ配列が非ヒト細胞源由来であり、一方で抗体鎖の残りの部分をコードするＤＮＡ配列がヒト細胞源由来である抗体重鎖をコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを構築することによって作製することもできる。さらに、本発明は、上述の本発明の核酸分子を含有するベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ及び遺伝子操作で一般的な他のベクターに関する。ベクターに含有される核酸分子は、原核及び真核細胞における転写を確実にする制御エレメントに連結され得る。
【０４４５】
〔0473〕  ベクターは、標的宿主細胞内での外来タンパク質の発現のための操作を容易にするエレメントを含有する。都合よく、形質転換用のＤＮＡの配列及び産生の操作は最初に細菌宿主（例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））において行われ、通常、ベクターは、細菌複製起点及び適切な細菌選択マーカーを含め、このような操作を容易にするための配列を含む。選択マーカーは、選択培地中で増殖させられる形質転換宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞はその培地中で生存しない。典型的な選択遺伝子は、抗生物質に対する耐性又は他の毒素、補完的栄養要求性欠損を付与するか又は複合培地から入手できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。酵母の形質転換のための代表的なベクター及び方法は当技術分野で記載される。例えばＢｕｒｋｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照。
【０４４６】
〔0474〕  関心のあるポリペプチドコード配列は、酵母細胞中でのポリペプチドの発現を提供する転写及び翻訳制御配列に作動可能に連結され得る。これらのベクター構成要素としては、次のもののうち１以上が含まれ得るが限定されない：エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列。ポリペプチドの分泌のための配列も含まれ得る（例えばシグナル配列）。
【０４４７】
〔0475〕  核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、「作動可能に連結される」。例えば、シグナル配列のためのＤＮＡは、それがポリペプチド分泌に関与するタンパク質前駆体として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結される」は、連続する連結される、及び分泌性リーダーの場合、連続し、読み枠どおりに連結される、ＤＮＡ配列を広く指す。しかし、エンハンサーは連続する必要はない。
【０４４８】
〔0476〕  プロモーターは、それらが作動可能に連結される特定の核酸配列の転写及び翻訳を調節する、構造遺伝子の開始コドンに対して上流（５’）にある非翻訳配列（一般に約１００から１０００ｂｐ内）である。このようなプロモーターはいくつかのクラスに分類される：誘導性、構成的及び抑制性プロモーター（例えばリプレッサーがないことに対して反応して転写レベルを上昇させる。）。誘導性プロモーターは、培養条件（例えば栄養素の有無又は温度変化）におけるある程度の変化に反応してそれらの調節下でＤＮＡからの転写レベル上昇を開始し得る。
【０４４９】
〔0477〕  当業者にとって周知の同じ従来の手段を用いて、第二の発現ベクターを作製し得、この発現ベクターは、オペロン及び、抗体特異性に必要とされるＣＤＲをコードするＤＮＡ配列が非ヒト細胞源、好ましくはウサギＢ細胞源由来であり、一方で抗体鎖の残りの部分をコードするＤＮＡ配列がヒト細胞源由来である、抗体軽鎖をコードするＤＮＡ配列を含有する。
【０４５０】
〔0478〕  遺伝子移入宿主細胞を作製するために、当業者にとって周知の従来技術によって発現ベクターを宿主細胞に遺伝子移入し、当業者にとって周知の従来技術によってこの遺伝子移入宿主細胞培養物にこの抗体ポリペプチドを産生させる。
【０４５１】
〔0479〕  上記の２つの発現ベクター、オペロン及び軽鎖由来ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する第一の発現ベクター及びオペロン及び重鎖由来ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する第二のベクターを宿主細胞に同時遺伝子移入し得る。この２つのベクターは、異なる選択可能マーカーを含有するが、好ましくは重及び軽鎖ポリペプチドの実質的に同等の発現を達成する。あるいは、単一ベクター、重及び軽鎖ポリペプチドの両
方をコードするＤＮＡを含むベクターを使用し得る。重及び軽鎖のためのコード配列は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は両方を具備し得る。
【０４５２】
〔0480〕  抗体及びその断片を発現させるために使用される宿主細胞は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞又は真核細胞の何れかであり得る。この目的のための明確に定義されたタイプの哺乳動物細胞、例えば骨髄腫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＮＳＯ又はＨＥＫ２９３細胞株などを使用し得る。
【０４５３】
〔0481〕  ベクターを構築し得る一般的方法、宿主細胞を作製するために必要な遺伝子移入方法及びその宿主細胞から抗体及びその断片を作製するために必要な方法は全て従来技術を含む。好ましくは抗体を作製するために使用される細胞株は哺乳動物細胞株であるものの、何らかの他の適切な細胞株、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来細菌株などの細菌細胞株又は酵母細胞株などを使用し得る。
【０４５４】
〔0482〕  同様に、抗体が作製されたら、例えばクロスフローろ過、硫酸アンモニウム沈殿及びアフィニティーカラムクロマトグラフィーなど、当技術分野の標準的な手順に従い精製し得る。
【０４５５】
動物を用いたＶＩＳＴＡ又はＶＩＳＴＡ複合物に結合する抗体の作製
〔0483〕  ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物に選択的に結合する本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体であり得る。ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物に対するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニック又はトランスクロモソミックマウスを用いて作製され得る。これらのトランスジェニック及びトランスクロモソミックマウスとしては、本明細書中でそれぞれＨｕＭＡｂマウス（登録商標）及びＫＭマウス（登録商標）と呼ばれるマウスが挙げられ、本明細書中でまとめて「ヒトＩｇマウス」と呼ぶ。ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、内因性μ及びκ鎖遺伝子座を不活性化する標的とされる突然変異と一緒に非再編成ヒト重（μ及びγ）及びκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含有する。例えばＬｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９を参照。従って、このマウスは、マウスＩｇＭ又はκの発現低下を示し、免疫付与に対する反応が低下し、導入されたヒト重及び軽鎖導入遺伝子でクラススイッチング及び体細胞突然変異が起こり、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルが産生される。Ｌｏｎｂｅｒｇ（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１；Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３及びＨａｒｄｉｎｇ及びＬｏｎｂｅｒｇ（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６。ＨｕＭａｂマウス（登録商標）の調製及び使用ならびにこのようなマウスにより担持されるゲノム修飾は、Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３７２０−３７２４；Ｃｈｏｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７−１２３；Ｃｈｅｎ，ｅｔ
ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８２１−８３０；Ｔｕａｉｌｌｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０；Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１；及びＦｉｓｈｗｉｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１でさらに記載される。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８７７，３９７号；同第５，
６６１，０１６号；５，８１４，３１８号；同第５，８７４，２９９号；同第５，７７０，４２９号；及び同第５，５４５，８０７号；ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５；ＷＯ９７／１３８５２；ＷＯ９８／２４８８４；ＷＯ９９／４５９６２；及びＷＯ０１／１４４２４を参照。
【０４５６】
〔0484〕  ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入染色体を担持するマウスなど、導入遺伝子及び導入染色体上でヒト免疫グロブリン配列を担持するマウスを用いて、本発明のヒト抗ＶＩＳＴＡ及び抗ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ複合物抗体（例えばＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物に選択的に結合する抗体）を産生させ得る。このようなマウスは、本明細書中で「ＫＭマウス（登録商標）」と呼ばれ、ＷＯ０２／４３４７８で詳述される。
【０４５７】
〔0485〕  またさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランスジェニック動物系は当技術分野で利用可能であり、本発明の抗ＶＩＳＴＡ及び抗ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ複合物抗体を産生させるために使用され得る。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と呼ばれる代替トランスジェニック系を使用し得；このようなマウスは、例えば米国特許第５，９３９，５９８号；同第６，０７５，１８１号；同第６，１１４，５９８号；同第６，１５０，５８４号及び同第６，１６２，９６３号に記載される。
【０４５８】
〔0486〕  さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替導入染色体動物系は当技術分野で利用可能であり、本発明の抗ＶＩＳＴＡ及び抗ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ複合物抗体を産生させるために使用され得る。例えば、「ＴＣマウス」と呼ばれるヒト重鎖導入染色体及びヒト軽鎖導入染色体の両方を担持するマウスが使用され得る。Ｔｏｍｉｚｕｋａ，ｅｔ
ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７を参照。さらに、ヒト重及び軽鎖導入染色体を担持するウシが当技術分野で記載されており（Ｋｕｒｏｉｗａ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９−８９４）、本発明の抗ＶＩＳＴＡ及び抗ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ複合物抗体を産生させるために使用され得る。
【０４５９】
〔0487〕  本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のスクリーニングライブラリに対してファージディスプレイ法を使用して調製することもできる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は当技術分野で確立されている。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号同第５，５８０，７１７号；同第５，９６９，１０８号；同第６，１７２，１９７号；同第５，８８５，７９３号；同第６，５２１，４０４号；同第６，５４４，７３１号；同第６，５５５，３１３号；同第６，５８２，９１５号及び同第６，５９３，０８１号を参照。
【０４６０】
〔0488〕  本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫付与時にヒト抗体反応を生じさせ得るように、ヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを使用して調製することもできる。例えば米国特許第５，４７６，９９６号及び同第５，６９８，７６７号を参照。
【０４６１】
〔0489〕  本発明のヒト抗体を産生させるためにヒトＩｇマウスを使用する場合、Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１；ＷＯ９８／２４８８４及びＷＯ０１／１４４２４に記載のように、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合ポリペプチドの精製又は濃縮調製物でこのようなマウスに免疫付与し得る。好ましくは、マウスは、最初の注入時に６から１６週齢である。例えば、ヒトＩｇでマウス腹腔内に免疫付与するために、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物の精製又は組み換え調製物（５から５０μｇ）を使用し得る。
【０４６２】
〔0490〕  他者による様々な抗原での以前の経験から、最初に完全フロイントアジュバント中で腹腔内に（ＩＰ）免疫付与し、続いて隔週で不完全フロイントアジュバント中で抗原でＩＰ免疫付与（全部で６回以下）した際にトランスジェニックマウスが反応することが示されている。しかし、フロイント以外のアジュバントもまた有効であることが分かっている。さらに、アジュバント非存在下で全細胞は免疫原性が非常に高いことが分かっている。後眼窩出血により得られた血漿試料を用いて、一連の免疫付与プロトコールにわたり、免疫反応を監視し得る。（下記のように）ＥＬＩＳＡによって血漿をスクリーニングし得、抗ＶＩＳＴＡ又は抗ＶＩＳＴＡ−Ｉｇヒト免疫グロブリンの十分な力価があるマウスを注射のために使用し得る。屠殺及び脾臓摘出の３日前に抗原を用いて静脈内からマウスに追加免疫し得る。各免疫付与に対して２から３回の注射を行う必要があり得ると予想される。一般的には各抗原に対して６から２４匹のマウスに免疫付与する。通常、ＨＣｏ７及びＨＣｏ１２系統の両方を使用する。さらに、２種類の異なるヒト重鎖導入遺伝子（ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２）を有する１匹のマウスにＨＣｏ７及びＨＣｏ１２導入遺伝子の両方を一緒に生成させ得る。あるいは又はさらに、ＫＭマウス（登録商標）系統を使用し得る。
【０４６３】
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
〔0491〕  本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫付与マウスから脾臓細胞及び／又はリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適切な不死化細胞株に融合させ得る。抗原特異的な抗体の産生について、得られたハイブリドーマをスクリーニングし得る。例えば、免疫付与マウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を５０％ＰＥＧを用いてＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌性マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  １５８０）数の６分の１と融合させ得る。平底マイクロタイタープレート中におよそ２Ｘ１０-5個の細胞を播種し、続いて２０％胎児クローン血清、１８％「６５３」馴化培地、５％オリジェン（ＩＧＥＮ）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍＬペニシリン、５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン及び１Ｘ  ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ；融合から２４時間後にＨＡＴを添加）を含有する選択培地中で２週間温置し得る。およそ２週間後、ＨＡＴをＨＴで置き換えた培地中で細胞を培養し得る。次に、ヒトモノクローナルＩｇＭ及びＩｇＧ抗体に対して、ＥＬＩＳＡによって個々のウェルをスクリーニングし得る。大規模なハイブリドーマ増殖が起こったら、通常１０から１４日後に培地を観察し得る。抗体分泌ハイブリドーマを再び播種し、再びスクリーニングし得、ヒトＩｇＧに対して陽性のままである場合、モノクローナル抗体を限界希釈により少なくとも２倍にサブクローニングし得る。次に、特徴評価のために組織培養液中で少量の抗体を産生させるために、安定的なサブクローンをインビトロで培養し得る。
【０４６４】
〔0492〕  ヒトモノクローナル抗体を精製するために、モノクローナル抗体精製用の２Ｌスピナーフラスコ中で選択されたハイブリドーマを増殖させ得る。プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）でのアフィニティークロマトグラフィー前に、上清をろ過し、濃縮し得る。純度を確保するために、ゲル電気泳動及び高速液体クロマトグラフィーによって、溶出させたＩｇＧを決定し得る。緩衝溶液をＰＢＳに交換し得、１．４３という吸光係数を用いて、ＯＤ２８０で濃度を測定し得る。モノクローナル抗体を分注し、−８０℃で保存し得る。
【０４６５】
トランスジェニック動物
〔0493〕  本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するためにも使用され得る。例えば、ある実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＶＩＳＴＡ−コード配列が導入されている受精卵又は胚幹細胞である。次に、外来性ＶＩＳＴＡ配列がそれ
らのゲノムに導入されている非ヒトトランスジェニック動物又は内在性ＶＩＳＴＡ配列が改変されている相同組み換え動物を作製するために、このような宿主細胞を使用し得る。このような動物は、ＶＩＳＴＡの機能及び／又は活性を研究するために、及びＶＩＳＴＡ活性の調節物質を同定及び／又は評価するために有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、動物の細胞の１以上が導入遺伝子を含む、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラット又はマウスなどのげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれ、成熟動物のゲノムに残り、それによりトランスジェニック動物の１以上の細胞型又は組織におけるコードされる遺伝子産物の発現を支配する外来性ＤＮＡである。本明細書中で使用される場合、「相同組み換え動物」は、内在性遺伝子と動物の発生前に動物の細胞、例えば動物の胚性細胞、に導入される外来性ＤＮＡ分子との間での相同組み換えによって内在性ＶＩＳＴＡ遺伝子が改変されている、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスである。ＶＩＳＴＡをコードする核酸を受精卵の雄性前核に導入することによって、例えばマイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、本発明のトランスジェニック動物を作製し得、これにより卵母細胞が偽妊娠雌代理母動物中で発生できるようになる。非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として配列番号１又は４のＶＩＳＴＡ  ｃＤＮＡ配列を導入し得る。あるいは、サル又はラットＶＩＳＴＡ遺伝子など、ヒトＶＩＳＴＡ遺伝子の非ヒト相同体を導入遺伝子として使用し得る。あるいは、配列番号１又は３のＶＩＳＴＡ  ｃＤＮＡ配列に対するハイブリッド形成に基づき、別のＶＩＳＴＡファミリーメンバーなど、ＶＩＳＴＡ遺伝子相同体を単離し、導入遺伝子として使用し得る。導入遺伝子の発現効率を向上させるために、導入遺伝子においてイントロン配列及びポリアデニル化シグナルも含まれ得る。特定の細胞に対してＶＩＳＴＡポリペプチドの発現を支配するために、ＶＩＳＴＡ導入遺伝子に組織特異的な制御配列を作動可能に連結し得る。胚操作を介したトランスジェニック動物を作製するための方法及びマイクロインジェクション、特にマウスなどの動物は、当技術分野で通常のものとなっており、例えば、Ｌｅｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．による、米国特許第４，７３６，８６６号及び同第４，８７０，００９号、Ｗａｇｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．による米国特許第４，８７３，１９１号、及びＨｏｇａｎ，Ｂ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）に記載されている。他のトランスジェニック動物の作製のために、同様の方法が使用される。トランスジェニック樹立動物は、そのゲノムにおけるＶＩＳＴＡ導入遺伝子の存在及び／又は動物の組織又は細胞におけるＶＩＳＴＡｍＲＮＡの発現に基づき同定され得る。次に、導入遺伝子を担持するさらなる���物を繁殖させるために、トランスジェニック樹立動物を使用し得る。さらに、ＶＩＳＴＡポリペプチドをコードする導入遺伝子を担持するトランスジェニック動物を他の導入遺伝子を担持する他のトランスジェニック動物とさらに交配させ得る。
【０４６６】
〔0494〕  相同組み換え動物を作製するために、それによりＶＩＳＴＡ遺伝子を改変する、例えば機能的に破壊するために欠失、付加又は置換が導入されているＶＩＳＴＡ遺伝子の少なくとも一部を含有するベクターを調製する。ＶＩＳＴＡ遺伝子は、ヒト又はマウス遺伝子（例えば配列番号１又は３のｃＤＮＡ）であり得る。
【０４６７】
〔0495〕  別の実施形態において、導入遺伝子の制御された発現を可能にする選択された系を含有するトランスジェニック非ヒト動物を作製し得る。このような系の一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の説明については、例えばＬａｋｓｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２−６２３６を参照。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：
１３５１−１３５５）。導入遺伝子の発現を制御するためにｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を使用する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ及び選択されたポリペプチドの両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要である。このような動物は、例えば、１匹は選択されるポリペプチドをコードする導入遺伝子を含有し、他方はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有する、２匹のトランスジェニック動物を交配することによって、「二重」トランスジェニック動物の構築を通じて提供され得る。
【０４６８】
〔0496〕  本明細書中に記載の非ヒトトランスジェニック動物のクローンは、Ｗｉｌｍｕｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３；ＷＯ９７／０７６６８；及びＷＯ９７／０７６６９において記載の方法によっても作製され得る。簡潔に述べると、トランスジェニック動物からの細胞、例えば体細胞を単離し、増殖サイクルから出てＧ０期に入るように誘導し得る。次に、例えば電気パルスの使用を通じて、休止細胞を、休止細胞が単離される同じ種の動物からの除核卵母細胞に融合させ得る。次いで、再構築された卵母細胞を、その細胞が桑実胚又は胚盤胞段階まで発生するように培養し、次に偽妊娠雌代理母動物に移す。この雌代理母動物から生まれた子孫は、細胞、例えば体細胞が単離される動物のクローンである。
【０４６９】
標識
〔0497〕  化学リンカーなどのエフェクター部分、例えば蛍光色素などの検出可能部分、酵素、基質、生物発光物質、放射性物質、化学発光部分、細胞毒性剤、放射性物質又は機能部分を付加するために、本明細書中に記載のポリペプチド、複合物及び抗体を翻訳後に修飾し得る。
【０４７０】
〔0498〕  当技術分野で公知のようにオリゴヌクレオチドに多岐にわたる部分、例えばリガンドをカップリングし得る。リガンドとしては、天然の分子又は組み換えもしくは合成分子が挙げられ得る。代表的なリガンドとしては、アバジン、ビオチン、ペプチド、ペプチド模倣物、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｍＰＥＧ、陽イオン基、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤  プロテインＡ、ムチン、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、アプタマー、免疫グロブリン（例えば抗体）、インスリン、トランスフェリン、アルブミン、糖、脂溶性分子（例えばステロイド、胆汁酸、コレステロール、コール酸及び脂肪酸）、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、ビタミン補因子、リポ多糖、ホルモン及びホルモン受容体、レクチン、炭水化物、多価炭水化物、放射性マーカー、蛍光色素及びその誘導体が挙げられるが限定されない。例えば米国特許第６，１５３，７３７号；同第６，１７２，２０８号；同第６，３００，３１９号；同第６，３３５，４３４号；同第６，３３５，４３７号；同第６，３９５，４３７号；同第６，４４４，８０６号；同第６，４８６，３０８号；同第６，５２５，０３１号；同第６，５２８，６３１号；及び同第６，５５９，２７９号を参照。
【０４７１】
〔0499〕  さらに、インビボで（例えば血流からの排除までの時間を延長させることにより）半減期を延長させるための部分を抗原又はエピトープに付加し得る。このような技術としては、例えば、ＰＥＧ部分を付加すること（ペグ付加とも呼ばれる。）が挙げられ、当技術分野で周知である。米国特許出願公開第２００３／００３１６７１号を参照。
【０４７２】
〔0500〕  非ランダム化学又は物理学的相互作用を通じてそれが固体標識と会合させられている場合、本明細書中に記載の抗原、抗体又はその抗原結合断片を基板に「連結」させ得る。この連結は共有結合を通じ得る。しかし、連結は共有又は永久的である必要はない。「スペーサー分子」又は「リンカー基」を通じて標識に物質を連結させ得る。このようなスペーサー分子は、生体物質に連結する第一の部分と標識に連結する第二の部分とを
有する分子である。従って、標識に連結される場合、スペーサー分子は、標識と生体物質とを分離するが、両方に連結される。生体物質（例えば標識）を標識に連結する方法は当技術分野で周知であり、化学カップリングが挙げられるが限定されない。
【０４７３】
検出可能標識
〔0501〕  化学リンカーなどのエフェクター部分、例えば蛍光色素などの検出可能標識、酵素、基質、生物発光物質、放射性物質及び化学発光標識又は例えばストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、細胞毒、細胞毒性剤及び放射性物質などの機能部分を付加するために、本明細書中に記載のＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を翻訳後に修飾し得る。さらなる代表的な酵素としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びルシフェラーゼが挙げられるが限定されない。さらなる代表的な蛍光物質としては、ローダミン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ウンベリフェロン、ジクロロトリアジニルアミン、フィコエリスリン及び塩化ダンシルが挙げられるが限定されない。さらなる代表的な化学発光標識としては、ルミノールが挙げられるが限定されない。さらなる代表的な生物発光物質としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンが挙げられるが限定されない。さらなる代表的な放射性物質としては、ビスマス−２１３（213Ｂｓ）、炭素−１
４（14Ｃ）、炭素−１１（11Ｃ）、塩素−１８（Ｃｌ18）、クロミウム−５１（51Ｃｒ）、コバルト−５７（57Ｃｏ）、コバルト−６０（60Ｃｏ）、銅−６４（64Ｃｕ）、銅−６７（67Ｃｕ）、ジスプロシウム−１６５（165Ｄｙ）、エルビウム−１６９（169Ｅｒ）、フッ素−１８（18Ｆ）、ガリウム−６７（67Ｇａ）、ガリウム−６８（68Ｇａ）、ゲルマニウム−６８（68Ｇｅ）、ホルミウム−１６６（166Ｈｏ）、インジウム−１１１（111Ｉｎ）、ヨウ素−１２５（125Ｉ）、ヨウ素−１２３（124Ｉ）、ヨウ素−１２４（124Ｉ）
、ヨウ素−１３１（131Ｉ）、イリジウム−１９２（192Ｉｒ）、鉄−５９（59Ｆｅ）、クリプトン−８１（81Ｋｒ）、鉛−２１２（212Ｐｂ）、ルテチウム−１７７（177Ｌｕ）、モリブデン−９９（99Ｍｏ）、窒素−１３（13Ｎ）、酸素−１５（15Ｏ）、パラジウム−１０３（103Ｐｄ）、リン−３２（32Ｐ）、カリウム−４２（42Ｋ）、レニウム−１８６
（186Ｒｅ）、レニウム−１８８（188Ｒｅ）、ルビジウム−８１（81Ｒｂ）、ルビジウム−８２（82Ｒｂ）、サマリウム−１５３（153Ｓｍ）、セレニウム−７５（75Ｓｅ）、ナ
トリウム−２４（24Ｎａ）、ストロンチウム−８２（82Ｓｒ）、ストロンチウム−８９（89Ｓｒ）、イオウ３５（35Ｓ）、テクネチウム−９９ｍ（99Ｔｃ）、タリウム−２０１（201Ｔｌ）、トリチウム（3Ｈ）、キセノン−１３３（133Ｘｅ）、イッテルビウム−１６
９（169Ｙｂ）、イッテルビウム−１７７（177Ｙｂ）及びイッテリウム−９０（90Ｙ）が挙げられるが限定されない。
【０４７４】
細胞毒性剤
〔0502〕  細胞毒性剤を作製するために、当技術分野で公知の技術を用いて、本発明のＶＩＳＴＡポリペプチド及びＶＩＳＴＡ複合物を毒素に連結又は作動可能に連結させ得る。本発明のポリペプチド又は抗体に複合化させ得る多岐にわたる毒素が知られている。例としては、多くの有用な植物、真菌又はさらに細菌由来の毒素が挙げられ、この例として、様々なＡ鎖毒素、特にリシンＡ鎖；リボソーム不活性化タンパク質、例えばサポリン又はゲロニン；α−サルシン；アスペルギリン；レストリクトシン；及びリボヌクレアーゼ、例えば胎盤リボヌクレアーゼ、血管新生の、ジフテリア毒素又はシュードモナス外毒素が挙げられる。本発明と関連する使用のための好ましい毒素部分は、炭水化物残基、脱グリコシル化されたＡ鎖を修飾又は除去するために処理されている毒素Ａ鎖である。米国特許第５，７７６，４２７号。
【０４７５】
〔0503〕  本明細書中に記載のＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物は、メトトレキサート、アミノプテリン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン；アルキル化剤、例えばメクロレタミン、チオエパ  クロラムブ
シル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、マイトマイシンＣ、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、１−メチルニトロソウレア、シクロトスファミド、メクロレタミン、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、シス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン及びカルボプラチン（パラプラチン）；ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、デトルビシン、カルミノマイシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン及びビスアントレンを含む、アントラサイクリン；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ブレオマイシン、カリケアマイシン、ミスラマイシン及びアントラマイシン（ＡＭＣ）を含む抗生物質；及びアンチマイトティック剤、例えばビンカアルカロイド、ビンクリスチン及びビンブラスチンなどを含むが限定されない細胞毒性剤と複合化させ得る。他の細胞毒性剤としては、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、リシン、シュードモナス外毒素、ゲムシタビン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、エトポシド、テノポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアントラセンジオン、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、コルチコステロイド、ミトタン（Ｏ，Ｐ’−（ＤＤＤ））、インターフェロン及びこれらの細胞毒性剤の混合物が挙げられる。
【０４７６】
〔0504〕  さらなる細胞毒性剤としては、化学療法剤、例えば、カルボプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ゲムシタビン、カリケアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＥＧＦＲアンタゴニスト、プラチン、タキソール、イリノテカン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ロイコボリン、ステロイド、シクロホスファミド、メルファラン、ビンカアルカロイド（例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビン）、ムスチン、チロシンキナーゼ阻害剤、放射線療法、性ホルモンアンタゴニスト、選択的アンドロゲン受容体調節物質、選択的エストロゲン受容体調節物質、ＰＤＧＦアンタゴニスト、ＴＮＦアンタゴニスト、ＩＬ−１アンタゴニスト、インターロイキン（例えばＩＬ−１２又はＩＬ−２）、ＩＬ−１２Ｒアンタゴニスト、毒素複合化モノクローナル抗体、腫瘍抗原特異的なモノクローナル抗体、アービタックス（登録商標）、アバスチン（登録商標）、ペルツズマブ、抗ＣＤ２０抗体、リツキサン（登録商標）、オクレリズマブ、オファツムマブ、ＤＸＬ６２５、ハーセプチン（登録商標）又は何らかのそれらの組み合わせが挙げられるが限定されない。細胞型特異的な死滅試薬を作製するために、リシン、ジフテリア毒素及びシュードモナス毒素などの植物及び細菌からの毒性酵素をヒト化抗体又はその結合断片に対して複合化し得る。Ｙｏｕｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：５４８３；Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４５３９；Ｋｒｏｌｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：５４１９。他の細胞毒性剤としては、細胞毒性リボヌクレアーゼが挙げられる。米国特許第６，６５３，１０４号を参照。
【０４７７】
〔0505〕  α又はβ粒子を放射する放射性核種に対して本明細書中に記載のＶＩＳＴＡタンパク質を複合化させ得る（例えば放射免疫複合体）。このような放射性同位体としては、β−放射体、例えば、リン−３２（32Ｐ）、スカンジウム−４７（47Ｓｃ）、銅−６７（67Ｃｕ）、ガリウム−６７（67Ｇａ）、イットリウム−８８（88Ｙ）、イットリウム−９０（90Ｙ）、ヨウ素−１２５（125Ｉ）、ヨウ素−１３１（131Ｉ）、サマリウム−１５３（153Ｓｍ）、ルテチウム−１７７（177Ｌｕ）、レニウム−１８６（186Ｒｅ）、レ
ニウム−１８８（188Ｒｅ）など、及びα−放射体、例えば、アスタチン−２１１（211Ａｔ）、鉛−２１２（212Ｐｂ）、ビスマス−２１２（212Ｂｉ）、ビスマス−２１３（213
Ｂｉ）又はアクチニウム−２２５（225Ａｃ）が挙げられるが限定されない。
【０４７８】
〔0506〕  本明細書中に記載のＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を標識に複合化させるための方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｈｕｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ  １４４：９４５；Ｄａｖｉｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４；Ｐａｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９；及びＮｙｇｒｅｎ（１９８２）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，３０：４０７により記載されている方法である。
【０４７９】
基板
〔0507〕  本明細書中に記載のＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物は基板に連結され得る。当技術分野で公知の多くの基板（例えば固体支持体）が本明細書中に記載のＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物との使用に適切である。チャネル又は他の構造を含有するように基板を修飾し得る。Ｆｕｎｇ（２００４）［Ｅｄ．］Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ及びＫａｍｂｈａｍｐａｔｉ（２００４）［Ｅｄ．］Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓを参照。
【０４８０】
〔0508〕  基板材料としては、アクリル、アガロース、ホウケイ酸ガラス、炭素（例えば炭素ナノ繊維シート又はペレット）、酢酸セルロース、セルロース、セラミック、ゲル、ガラス（例えば無機、コントロールド・ポア、修飾、ソーダ石灰又は官能性ガラス）、ラテックス、磁気ビーズ、膜、金属、半金属、ニトロセルロース、ＮＹＬＯＮ（登録商標）、光ファイバー束、有機ポリマー、紙、プラスチック、ポリアクリロイルモルホリド、ポリ（４−メチルブテン）、ポリ（エチレンテレフタル酸）、ポリ（ビニルブチレート）、ポリアクリルアミド、ポリブチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリエチレングリコールテレフタル酸、ポリホルムアルデヒド、ポリメタクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリプロピレン、多糖類、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリビニルアセテート、ポリビニルクロリド、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、ポリビニルピロリジノン、レーヨン、レジン、ゴム、半導体材料、セファロース（登録商標）、シリカ、シリコン、スチレンコポリマー、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）及び様々な他のポリマーが挙げられるが限定されない。
【０４８１】
〔0509〕  基板は平板である必要はなく、球状（例えばビーズ）又は円筒状（例えば繊維）を含むあらゆるタイプの形状を含み得る。固体支持体に連結される材料を固体支持体の何らかの部分に連結し得る（例えば多孔性の固体支持体材料の内部に連結し得る。）。
【０４８２】
〔0510〕  基板本体は、ビーズ、箱、カラム、シリンダー、ディスク、皿（例えばガラス皿、ＰＥＴＲＩ皿）、繊維、フィルム、フィルター、マイクロタイタープレート（例えば９６ウェルマイクロタイタープレート）、多翼型の棒、ネット、ペレット、プレート、環、ロッド、ロール、シート、スライド、スティック、トレイ、チューブ又はバイアルの形態であり得る。基板は、単数の個別の本体（例えば単一チューブ、単一ビーズ）、あらゆる数の複数の基板本体（例えば一組１０本のチューブ、数個のビーズ）又はその組み合わせ（例えば複数のマイクロタイタープレートを具備するトレイ、ビーズが充填されたカラム、ビーズが充填されたマイクロタイタープレート）であり得る。
【０４８３】
〔0511〕  非ランダム化学又は物理学的相互作用を通じてＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物が固体基板と会合させられる場合、基板にＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を「連結」し得る。この連結は共有結合を通じ得る。しかし、連結は共有又は永久的である必要はない。「スペーサー分子」又は「リンカー基」を通じて基板に材料を連結させ得る。このようなスペーサー分子は、生体物質に連結される第一の部分と基板に連結される第二の部分とを有する分子である。従って、基板に連結される場合、スペーサー分子は、基板及び
生体物質を分離するが、両方に連結される。生体物質（例えば標識）を基板に連結する方法は当技術分野で周知であり、化学カップリングが挙げられるが限定されない。
【０４８４】
〔0512〕  固相合成反応のために固相を支持し、含有するマイクロタイタープレートなどのプレートを使用し得る。マイクロタイタープレートは、固相として使用されるビーズを収容し得る。本明細書中で「粒子」又は「微粒子」又は「ナノ粒子」又は「ビーズ」又は「マイクロビーズ」又は「ミクロスフェア」は、何らかの様々な形状又はサイズを有する微粒子材料であるものとする。この形状は、一般に球状であり得るが、球状である必要はなく、例えば円筒状又は多面体であり得る。当業者にとって当然であるように、この粒子は、それらの使用に依存して、架橋デンプン、デキストラン、セルロース、タンパク質、ポリスチレン及びメチルスチレンならびに他のスチレンコポリマーなどのスチレンポリマーを含む有機ポリマー、プラスチック、ガラス、セラミック、アクリルポリマー、磁気反応性材料、コロイド、トリアゾール、炭素グラファイト、二酸化チタン、ナイロン、ラテックス及びＴＥＦＬＯＮ（登録商標）を含むが限定されない多岐にわたる材料を具備し得る。例えばＢａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮからの“Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ”を参照。
【０４８５】
〔0513〕  本明細書中に記載の何らかの形態の基板（例えばビーズ、箱、カラム、シリンダー、ディスク、皿（例えばガラス皿、ペトリ皿）、繊維、フィルム、フィルター、マイクロタイタープレート（例えば９６ウェルマイクロタイタープレート）、多翼型の棒、ネット、ペレット、プレート、環、ロッド、ロール、シート、スライド、スティック、トレイ、チューブ又はバイアル）上に本明細書中に記載のＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を連結させ得る。特に、粒子又はビーズは、ゲル化材料の成分であり得るか又は様々な合成プラスチック（例えばポリスチレン）製のラテックスビーズなどの別個の成分であり得る。標識（例えばストレプトアビジン）を基板（例えばビーズ）に結合させ得る。
【０４８６】
医薬組成物
〔0514〕  「医薬組成物」は、哺乳動物への投与に適切である化学又は生物学的組成物を指す。このような組成物は、口内、表皮性、硬膜外、吸入、動脈内、心臓内、脳室内、皮内、筋肉内、鼻腔内、眼内、腹腔内、髄腔内、くも膜下腔内、静脈内、経口、非経口、浣腸又は坐剤を介して直腸に、皮下、真皮下、舌下、経皮及び経粘膜を含むが限定されない多くの経路のうち１以上を介した投与に対して具体的に処方され得る。さらに、注射、粉末、液体、ゲル、ドロップ又は他の投与手段によって投与が行われ得る。
【０４８７】
〔0515〕  「医薬賦形剤」又は「医薬的に許容可能な賦形剤」は、活性治療剤が処方される担体、通常は液体である。本発明のある実施形態において、活性治療剤は、本明細書中に記載のヒト化抗体又は１以上のその断片である。賦形剤は通常、処方物に薬理学的活性を何らもたらさないが、化学及び／又は生物学的安定性及び放出特性をもたらし得る。代表的な処方物は例えばＧｒｅｎｎａｒｏ（２００５）［Ｅｄ．］Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ［２１st
Ｅｄ．］で見出され得る。
【０４８８】
〔0516〕  医薬組成物は一般的に、製造及び保存条件下で滅菌性及び安定でなければならない。本発明は、医薬組成物が凍結乾燥形態で存在することを企図する。本組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム又は高薬物濃度に適切な他の秩序構造として処方され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）及び適切なその混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。本発明はさらに、医薬組成物中への安定化剤の組み入れを企図する。
【０４８９】
〔0517〕  様々な剤形の医薬組成物に本明細書中に記載のポリペプチド、複合物及び抗体を処方し得る。本発明の医薬組成物を調製するために、製剤処方の技術分野の熟練者にとって周知の技術に従い、活性成分としての少なくとも１つのＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を適切な担体及び添加物と完全に混合し得る。Ｇｒｅｎｎａｒｏ（２００５）［Ｅｄ．］Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ
Ｐｈａｒｍａｃｙ［２１st  Ｅｄ．］を参照。例えば、ｐＨ７．２のリン酸緩衝塩水中で本明細書中に記載の抗体を処方し、５．０ｍｇ／ｍＬの無色透明の液体溶液として供給し得る。
【０４９０】
〔0518〕  同様に、液体製剤のための組成物としては、水、アルコール、油、グリコール、保存剤、香味剤、着色剤及び懸濁化剤を含むが限定されない適切な担体及び添加物を伴う、溶液、乳液、分散液、懸濁液、シロップ剤及びエリキシルが挙げられる。非経口投与のための典型的な製剤は、滅菌水又は、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、レシチン、ラッカセイ油又はゴマ油を含むが限定されない非経口投与的に許容可能な油などの担体とともに活性成分を具備し、溶解度又は保存性を促進するための他の添加剤も含まれ得る。溶液の場合、凍結乾燥させて粉末にし、次いで使用直前に再構成し得る。分散液及び懸濁液の場合、適切な担体及び添加剤としては、水性ゴム、セルロース、ケイ酸塩又は油が挙げられる。
【０４９１】
〔0519〕  列挙した実施形態のそれぞれに対して、様々な剤形によってＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を投与し得る。当業者にとって公知の何らかの生物学的に許容可能な投与形態及びそれらの組み合わせを企図する。このような剤形の例としては、再構成可能な粉末、エリキシル、液体、溶液、懸濁液、乳液、粉末、顆粒剤、粒子、微粒子、分散性顆粒剤、カシェ剤、吸入剤、エアロゾル吸入剤、パッチ剤、粒子吸入剤、インプラント、デポーインプラント、注射剤（皮下、筋肉内、静脈内及び皮内を含む。）、点滴及びそれらの組み合わせが挙げられるが限定されない。
【０４９２】
〔0520〕  多くの場合において、等張剤、例えば組成物中の、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール又は塩化ナトリウム含むことが望ましい。組成物中に吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを含むことによって、注射用組成物の長時間吸収を行い得る。さらに、時間放出処方物において、例えば遅延放出ポリマーを含む組成物において、本明細書中に記載の化合物を処方し得る。インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含め、制御放出処方など、急速な放出から化合物を保護する担体とともに、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を調製し得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸及びポリ乳酸、ポリグリコールコポリマー（ＰＬＧ）などの生体分解性の生体適合性ポリマーを使用し得る。このような処方物の調製のための多くの方法が当業者にとって公知である。
【０４９３】
〔0521〕  本組成物に補充性活性化合物も組み込まれ得る。
【０４９４】
〔0522〕  組成物は、例えば、所望の抗原、例えば腫瘍抗原又は他の免疫調節性化合物、例えばＴｏｌｌ様受容体アゴニストなど、１型インターフェロン、例えばα及びβインターフェロンなど及びＣＤ４０アゴニスト、例えばアゴニスト性のＣＤ４０抗体及び抗体断片など、好ましくは抗ヒトＣＤ４０アゴニスト性抗体及び抗体断片又は他の免疫エンハンサー又は抑制因子、例えばＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４融合タンパク質及びそれに特異的な抗体などをさらに具備し得る。
【０４９５】
〔0523〕  ＶＩＳＴＡを具備する組成物は、抗原又は他の免疫アゴニストをさらに具備し得る。その組み合わせの他の成分と組み合わせて、抗原に対して免疫反応を生じさせるのに有効な量で抗原を投与し得る。例えば、約１００μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ
の量で抗原を投与し得る。いくつかの実施形態において、約１０μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの量で抗原を投与し得る。いくつかの実施形態において、約１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇの量で抗原を投与し得る。しかし、免疫反応を生じさせるのに有効な量を構成する抗原の特定の量は、例えば投与されている特定の抗原；投与されている特定のアゴニスト及びその量；投与されている特定のアゴニスト及びその量；免疫系の状態；アゴニスト及び抗原の投与の方法及び順序；処方物が投与されている種；及び所望の治療結果など、ある種の因子にある程度依存する。従って、一般に、抗原の有効量を構成する量を示すことは実践的ではない。しかし、当業者は、このような因子を考慮の上、適切な量を容易に決定し得る。
【０４９６】
〔0524〕  抗原は、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞反応、ＮＫ  Ｔ細胞反応、γ／δＴ細胞反応又はＴｈ１抗体反応の１以上を含み得る、Ｔｈ１免疫反応を生じさせることが可能な何らかの物質であり得る。適切な抗原としては、ペプチド；ポリペプチド；脂質；糖脂質；多糖類；炭水化物；ポリヌクレオチド；プリオン；生又は不活性化細菌、ウイルス又は真菌；及び細菌、ウイルス、真菌、原生動物、腫瘍由来又は生物由来抗原、毒素又はトキソイドが挙げられるが限定されない。
【０４９７】
〔0525〕  さらに、本発明のアジュバントの組み合わせと関連して、ある種の最新の実験的抗原、特に強い免疫反応を生じさせない組み換えタンパク質、糖タンパク質及びペプチドなどの物質を使用し得る。代表的な実験的サブユニット抗原としては、ウイルス性疾患、例えばアデノウイルス、ＡＩＤＳ、水疱瘡、サイトメガロウイルス、デング熱、ネコ白血病、家禽ペスト、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ブタコレラ、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、日本脳炎、麻疹、パラインフルエンザ、狂犬病、呼吸器合胞体ウイルス、ロタウイルス、イボ及び黄熱病に関連するものが挙げられる。
【０４９８】
〔0526〕  抗原は、癌抗原又は腫瘍抗原であり得る。癌抗原及び腫瘍抗原という用語は、交換可能に使用され、癌細胞によって差次的に発現される抗原を指す。従って、癌抗原は、差次的に癌細胞に対する免疫反応を標的にするために活用され得る。従って、癌抗原は、腫瘍特異的な免疫反応を潜在的に刺激し得る。ある種の癌抗原は、必ず発現されるわけではないが、正常細胞によりコードされる。これらの抗原の一部は、正常細胞で通常サイレント（即ち発現されない）であること、ある一定の分化段階でのみ発現されるもの及び一次的に発現されるもの（例えば胚性及び胎児性抗原）として特徴付けられ得る。例えば、他の癌抗原は、突然変異体細胞性遺伝子、例えば癌遺伝子（例えば活性化ｒａｓ癌遺伝子）、抑制因子遺伝子（例えば突然変異体ｐ５３）などによってコードされ得るか、又は内部欠失もしくは染色体転座の結果生じる融合タンパク質であり得る。さらに他の癌抗原が、ＲＮＡ及びＤＮＡ腫瘍ウイルスにより担持されるものなどのウイルス性遺伝子によってコードされ得る。
【０４９９】
〔0527〕  腫瘍抗原の例としては、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ジぺプチジルぺプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＵＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児抗原（ＣＥＡ）及びその抗原性エピトープＣＡＰ−１及びＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍ１１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）及びその抗原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２及びＰＳＡ−３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ζ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥファミリー（例えばＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、腫瘍抗原のＧＡＧＥ−ファミリー（例えばＧＡ
ＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、ε−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、γ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１０．ｓｕｐ．Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、腺腫様多発結腸ポリープタンパク質（ＡＰＣ）、ホドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ウイルス性産物、例えばヒトパピローマウイルスタンパク質など、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、Ｉｍｐ−１、ＰＩＡ、ＥＢＶにコードされる核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１及びＣＴ−７及びｃ−ｅｒｂＢ−２が挙げられる。
【０５００】
〔0528〕  癌又は腫瘍及びこのような腫瘍に関連する特異的な腫瘍抗原としては、急性リンパ芽球性白血病（ｅｔｖ６、ａｍｌ１、シクロフィリンｂ）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｉｇ−イディオタイプ）、神経膠腫（Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、γ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ）、膀胱癌（ｐ２１ｒａｓ）、胆道癌（ｐ２１ｒａｓ）、乳癌（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、子宮頸癌（ｐ５３、ｐ２１ｒａｓ）、結腸癌（ｐ２１ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＭＵＣファミリー）、結腸直腸癌（結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−ＣＯ１７−１Ａ／ＧＡ７３３、ＡＰＣ）、絨毛癌（ＣＥＡ）、上皮細胞癌（シクロフィリンｂ）、胃癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｇａ７３３糖タンパク質）、肝細胞性癌（α−フェトプロテイン）、ホジキンリンパ腫（Ｉｍｐ−１、ＥＢＮＡ−１）、肺癌（ＣＥＡ、ＭＡＧＥ−３、ＮＹ−ＥＳＯ−１）、リンパ系細胞由来白血病（シクロフィリンｂ）、メラノーマ（ｐ５タンパク質、ｇｐ７５、癌胎児性抗原、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ｃｄｃ２７、ＭＡＧＥ−３、ｐ２１ｒａｓ、ｇｐ１００．ｓｕｐ．Ｐｍｅｌ１１７）、骨髄腫（ＭＵＣファミリー、ｐ２１ｒａｓ）、非小細胞肺癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、鼻咽頭癌（Ｉｍｐ−１、ＥＢＮＡ−１）、卵巣癌（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、前立腺癌（前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）及びその抗原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２及びＰＳＡ−３、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｇａ７３３糖タンパク質）、腎臓癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、子宮頸部及び食道の扁平上皮細胞癌（ヒトパピローマウイルスタンパク質などのウイルス性産物）、精巣腫瘍（ＮＹ−ＥＳＯ−１）及びＴ細胞白血病（ＨＴＬＶ−１エピトープ）が挙げられる（しかし排他的ではない。）。
【０５０１】
〔0529〕  当業者は、通常の実験を通じて、例えば本明細書中の開示及びＧｏｏｄｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｇｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ［１２th  Ｅｄ．］；Ｈｏｗｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ’ｓ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ［２nd  Ｅｄ．］；及びＧｏｌａｎ，（２００８）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔｈｅｒａｐｙ［２nd  Ｅｄ．］における教示を指針として、有効な投与量及び投与頻度を決定することができる。Ｇｒｅｎｎａｒｏ（２００５）［Ｅｄ．］Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ［２１st  Ｅｄ．］も参照。
【０５０２】
投与経路
〔0530〕  次の経路何れかにおいて、本明細書中に記載の組成物を投与し得る：口内、表皮、硬膜外、点滴、吸入、動脈内、心臓内、脳室内、皮内、筋肉内、鼻腔内、眼内、腹腔
内、髄腔内、くも膜下腔内、静脈内、経口、非経口、肺、浣腸又は坐剤を介して直腸に、皮下、真皮下、舌下、経皮及び経粘膜。好ましい投与経路は静脈内注射又は点滴である。投与は、局所であり得、この場合、本組成物が、疾患部位、例えば腫瘍に直接、その近接部に、局所的に、付近に、そこに、その周囲に、又はその近くに投与され、又は全身的、この場合、本組成物が、患者に与えられ、広く全身を通過し、それにより疾患部位に到達する。局所投与（例えば注射）は、疾患を包含し、及び／又は疾患により影響を受ける、及び／又は疾患兆候及び／又は症状が活動性であるか又は起こっていると思われる、細胞、組織、疾患、器官及び／又は器官系（例えば腫瘍部位）への投与により遂行され得る。投与は、その作用が所望される、組成物が直接適用される局所効果がある局所（例えば腫瘍部位）であり得る。
【０５０３】
〔0531〕  列挙される各実施形態に対して、当技術分野で公知のような様々な剤形により本化合物を投与し得る。当業者にとって公知の何らかの生物学的に許容可能な剤形及びそれらの組み合わせが企図される。このような剤形の例としては、咀嚼錠、速溶性錠剤、発泡錠、再構成可能な粉末、エリキシル、液剤、溶液剤、懸濁液、乳液、錠剤、多層錠、二層錠、カプセル、軟ゼラチンカプセル、硬ゼラチンカプセル、カプレット、薬用キャンディー、チュアブル薬用キャンディー、ビーズ、粉末、ガム、顆粒剤、粒子、微粒子、分散性顆粒剤、カシェ剤、注水器、坐剤、クリーム、局所剤、吸入剤、エアロゾル吸入剤、パッチ剤、粒子吸入剤、インプラント、デポーインプラント、経口摂取剤、注射用（皮下、筋肉内、静脈内及び皮内を含む。）、点滴及びそれらの組み合わせが挙げられるが限定されない。
【０５０４】
〔0532〕  混合により含まれ得る他の化合物は、例えば医学的に不活性の成分（例えば固体及び液体希釈剤）、例えば、錠剤又はカプセル用の、ラクトース、デキストロースサッカロース、セルロース、デンプン又はリン酸カルシウム、軟カプセル用のオリーブ油又はオレイン酸エチル及び懸濁液又は乳液用の水又は植物油；滑沢剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム又はカルシウム及び／又はポリエチレングリコールなど；ゲル化剤、例えばコロイド粘土など；増粘剤、例えばトラガカントガム又はアルギン酸ナトリウムなど、結合剤、例えばデンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルピロリドンなど；崩壊剤、例えばデンプン、アルギン酸、アルギン酸塩又はデンプングリコール酸ナトリウムなど；発泡性混合物；色素；甘味料；湿潤剤、例えばレシチン、ポリソルベート又はラウリル硫酸塩など；及び、このような処方物に対する公知の添加物である、他の治療的に許容可能な補助成分、例えば保湿剤、保存剤、緩衝剤及び抗酸化剤などである。
【０５０５】
〔0533〕  経口投与のための分散液は、シロップ剤、乳液、溶液又は懸濁液であり得る。シロップ剤は、担体として、例えば、サッカロース又はグリセロールとサッカロース及び／又はマンニトール及び／又はソルビトールを含有し得る。懸濁液及び乳液は、担体、例えば天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルアルコールを含有し得る。
【０５０６】
〔0534〕  さらなる実施形態において、本発明は、有効量の１以上の本発明の抗体及びその断片を具備する医薬投与単位を具備する１以上の容器を含むキットを提供する。キットは、説明書、指示書、ラベル、販売情報、警告又は情報パンフレットを含み得る。
【０５０７】
投与量
〔0535〕  本発明の何れかの実施形態による治療組成物中のＶＩＳＴＡ又はＶＩＳＴＡ複合物の量は、疾患状態、年齢、性別、体重、病歴、リスク因子、疾病素因、投与経路、既存の治療計画（例えば他の投薬との可能性のある相互作用）及び個体重量などの因子に従い変動し得る。投与計画は、最適な治療反応をもたらすために調整され得る。例えば、
単ボーラスを投与し得るか、ある期間にわたり数回の分割用量を投与し得るか、又は用量は、治療状況の要件により示されるように、比例的に増減させ得る。
【０５０８】
〔0536〕  投与を容易にし、投与量を均一にするために、単位剤形で非経口組成物を処方することは、特に有利である。単位剤形は、本明細書中で使用される場合、処置しようとする哺乳動物対象に対する単位投与量として適している物理的に個別の単位を指し；各単位は、必要な医薬担体とともに所望の治療効果を生じさせるために計算される、所定量の抗体及びその断片を含有する。本発明の単位剤形に対する規格は、個体における感受性の処置のための、抗体及びその断片の特有の特徴及び達成しようとする特定の治療効果及びこのような抗体及びその断片を作製する技術分野に特有の制限によって決定され、それに直接依存する。本発明の抗体及びその断片又はその適切な医薬組成物が効果的である哺乳動物（例えばヒト）における状態の処置のための治療的用途において、本発明の抗体及びその断片を有効量で投与し得る。本発明に対する必要に応じた投薬は、本明細書中に記載の、組成物、医薬組成物又は何らかの他の組成物であり得る。
〔0537〕  単回投与、２回投与、３回投与、４回投与及び／又は５回投与として投与量が投与され得る。単回で、同時に及び連続的に投与量が投与され得る。
〔0538〕  剤形は、当業者にとって公知の放出の何らかの形態であり得る。活性成分の即時放出又は活性成分の持続もしくは制御放出を提供するために、本発明の組成物を処方し得る。持続放出又は制御放出調製物において、長時間にわたり（例えば４から２４時間）、血液レベルが治療範囲内に維持されるが、毒性レベルを下回るような速度で活性成分の放出が起こり得る。好ましい剤形としては、即時放出、徐放、パルス放出、可変放出、制御放出、持続的放出、持続放出、遅延放出、長時間作用及びそれらの組み合わせが挙げられ、これらは当技術分野で公知である。
〔0539〕  本明細書中で定められるとおり、治療的有効量のタンパク質又はポリペプチド（即ち有効投与量）は、約０．００１から３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１から２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１から２０ｍｇ／ｋｇ体重及びさらにより好ましくは約１から１０ｍｇ／ｋｇ、２から９ｍｇ／ｋｇ、３から８ｍｇ／ｋｇ、４から７ｍｇ／ｋｇ又は５から６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。当業者にとって当然のことながら、疾患又は障害の重症度、以前の処置、対象の総体的健康状態及び／又は年齢及び存在する他の疾患を含むが限定されないある種の因子は、対象を効果的に処置するのに必要とされる投与量に影響を与え得る。さらに、治療的有効量のタンパク質、ポリペプチド又は抗体での対象の処置は、単回処置を含み得るか、又は好ましくは、一連の処置を含み得る。
【０５０９】
〔0540〕  好ましい例において、約１から１０週間、好ましくは２から８週間、より好ましくは約３から７週間及びさらにより好ましくは約４、５又は６週間にわたり、週に１回、約０．１から２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の抗体、タンパク質又はポリペプチドで対象を処置する。これも当然のことながら、処置のために使用される抗体、タンパク質又はポリペプチドの有効な投与量は、一連の特定の処置にわたり増減させ得る。投与量の変化が起こり、本明細書中で記載のように診断アッセイの結果から明らかになり得る。
【０５１０】
〔0541〕  当然のことながら、当技術分野で公知である標準的な薬理学的モデルを用いて本組成物の薬理学的活性を監視し得る。さらに、当然のことながら、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物、抗体又はその抗原結合断片を具備する組成物は、部位特異的な送達に適切なポリマーマトリクス又は膜中に組み込まれるかもしくは封入され得るか、又は部位特異的な送達に影響を与え得る特異的な標的化剤で官能化され得る。これらの技術、ならびに他の薬物送達技術は当技術分野で周知である。特定の状況に対する最適投与量の決定は、当業者の能力内である。例えばＧｒｅｎｎａｒｏ（２００５）［Ｅｄ．］Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ［２１st  Ｅｄ．］を参照。
【０５１１】
処置の方法
〔0542〕  本明細書中に記載のＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物は、炎症性障害、自己免疫疾患を処置することを必要とする対象に有効量のＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を投与することを具備する、ＣＤ４+Ｔ細胞増殖を抑制する、ＣＤ８+Ｔ細胞増殖を抑制する、ＣＤ４+Ｔ細胞サイトカイン産生を抑制する、及びＣＤ８+Ｔ細胞サイトカイン産生を抑制する、炎症性障害、自己免疫疾患を処置するための方法において使用され得る。さらに、本明細書中に記載のＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物は、有効量の本明細書中に記載のＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を具備する、ＣＤ４+Ｔ細胞増殖を抑制する、ＣＤ８+Ｔ細胞増殖を抑制する、ＣＤ４+Ｔ細胞サイトカイン産生を抑制する、及びＣＤ８+Ｔ細胞サイトカイン産生を抑制する、自己免疫疾患を処置することにおける使用のための薬剤を製造するために使用され得る。有効量の本明細書中に記載のＶＩＳＴＡ又はＶＩＳＴＡ複合物を具備する、ＣＤ４+Ｔ細胞増殖を抑制する、ＣＤ８+Ｔ細胞増殖を抑制する、ＣＤ４+Ｔ
細胞サイトカイン産生を抑制する、及びＣＤ８+Ｔ細胞サイトカイン産生を抑制する、自
己免疫疾患を処置するための組成物を製造するために、本明細書中に記載のＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を医薬的に許容可能な担体と混合し得る。
【０５１２】
〔0543〕  本明細書中に記載の治療方法は、細胞外ドメインがＢ７ファミリーリガンドＰＤ−Ｌ１に対する相同性を有する、新規及び構造的に区別される、Ｉｇ−スーパーファミリー阻害性リガンドである、ＰＤ−Ｌ３又はＶＩＳＴＡの投与を具備し得る。この分子は、交換可能に本明細書中でＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ、又はＴ細胞活性化のＶ−ドメイン免疫グロブリン抑制因子（ＶＩＳＴＡ）と呼ばれる。ＶＩＳＴＡは、主に造血区画内で発現され、骨髄ＡＰＣ及びＴ細胞において高度に制御される。ＶＩＳＴＡ阻害経路の治療的介入は、多岐にわたる癌の処置のためにＴ細胞介在性免疫性を調整するための新規アプローチに相当する。ＶＩＳＴＡポリペプチド、複合物、核酸、リガンド及びその調節物質は、自己免疫障害及び炎症性障害の処置のために、免疫性、特にＴ細胞免疫性を制御することにおいて有用であり得る。
【０５１３】
〔0544〕  膀胱癌、卵巣癌及びメラノーマ、自己免疫障害及び炎症性障害を含むが限定されない癌を処置するためのＶＩＳＴＡ、ＶＩＳＴＡ−複合物（例えばＶＩＳＴＡ−Ｉｇ）及び抗ＶＩＳＴＡ抗体の使用。さらに、本発明は、特に、アレルギー、自己免疫障害及び炎症状態など、免疫抑制が治療的に所望される状態を処置するための、ＶＩＳＴＡタンパク質、特に多量体ＶＩＳＴＡタンパク質及び、これらを発現するウイルス性ベクター（例えばアデノウイルス）の使用に関する。
【０５１４】
〔0545〕  患者は、自己免疫疾患の症状を発現し得るか、又は患者は症状がない。インビトロ又はエクスビボで、細胞、例えばヒト細胞において本明細書中に記載の方法を使用し得る。あるいは、インビボ（例えば治療的）プロトコールの一部として、対象に存在する細胞において本方法を行い得る。
【０５１５】
〔0546〕  本発明は、不十分又は過剰なＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質産生又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）野生型タンパク質と比較して活性が低下しているか又は異常なＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質型の産生を特徴とする障害に対してリスクのある（又は罹患し易い）対象を処置するための予防及び治療の両方法を提供する。さらに、例えばＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）のその逆受容体との相互作用を調整することによって、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質を検出及び単離し、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質のバイオアベイラビリティを制御し、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を調整するために、本発明の抗ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）抗体を使用し得る。
【０５１６】
本発明の使用及び方法
〔0547〕  次の方法の１以上において、本明細書中に記載の、ＶＩＳＴＡ分子、例えばＶＩＳＴＡ核酸分子、ポリペプチド、ポリペプチド相同体及び抗体及び抗体断片を使用し得る：ａ）スクリーニングアッセイ；ｂ）予測的医薬（例えば診断アッセイ、予後アッセイ及び臨床治験のモニタリング）；及びｃ）処置方法（例えば免疫反応を上方又は下方調整することによる、例えば治療及び予防）。本明細書中に記載のように、本発明のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドは、次の活性の１以上を有する：１）その天然の結合パートナーに結合する、及び／又はその活性を調節する、２）細胞内又は細胞間シグナル伝達を調整する、３）Ｔリンパ球活性化を調整する、４）生物、例えばマウス又はヒトなどの哺乳動物生物の免疫反応を調整する。下記でさらに述べるように、例えば、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドを発現させる（例えば遺伝子治療適用における宿主細胞中の組み換え発現ベクターを介して）、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ｍＲＮＡ（例えば生体試料中）又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）遺伝子中の遺伝子変異を検出する、及びＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を調整するために、本発明の単離核酸分子を使用し得る。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドの不十分もしくは過剰な産生又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）阻害剤の産生を特徴とする状態又は障害を処置するために、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドを使用し得る。さらに、天然のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）結合パートナーについてスクリーニングする、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を調整する薬物又は化合物についてスクリーニングする、ならびに、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドの不十分もしくは過剰な産生又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）野生型ポリペプチドと比較して活性が低下しているか、異常か又は好ましくないＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質型の産生を特徴とする状態又は障害（例えば免疫系障害、例えば重症複合型免疫不全症、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、Ｉ型糖尿病、リンパ増殖性症候群、炎症性腸疾患、アレルギー、喘息、移植片対宿主病及び移植拒絶；細菌及びウイルスなどの感染性病原体に対する免疫反応；及びリンパ腫及び白血病などの免疫系癌）を処置するために、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドを使用し得る。さらに、例えばＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその天然の結合パートナーとの間の相互作用を調整することによって、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドを検出及び単離する、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドのバイオアベイラビリティを制御する、及びＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を調整するために、本発明の抗ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）抗体を使用し得る。
【０５１７】
〔0548〕  可溶性ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−タンパク質（例えばＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇ融合タンパク質）の存在下で、抗ＶＩＳＴＡ抗体がＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）関連免疫機能におけるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の抑制効果を促進するという事実に基づき、治療薬としての使用のための抗ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）抗体を選択し得る。これらの抗ＶＩＳＴＡ抗体はインビボで、免疫性におけるそれらのインビトロでの効果から予想されるものと逆の挙動をとるので（即ちこれらの抗ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体は免疫抑制性である。）、これは、全く予想外である。
【０５１８】
〔0549〕  本発明の重要な態様は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現もしくは活性又はその天然の結合パートナーとの相互作用を調整する方法に関する。治療に関連して、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）は、ＣＤ２８同時刺激を阻害すること、免疫細胞のＴＣＲ活性化を阻害すること、活性化された免疫細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞）の増殖を阻害すること、Ｔ細胞によるサイトカイン産生（ＩＬ−２、γインターフェロン）を阻害すること及び阻害シグナルを免疫細胞に伝達することが明らかになっている。従って、免疫反応を調整するために、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の活性及び／又は発現、ならびにＴ細胞におけるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）とその結合パートナーとの間の相互作用を調整し得る。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）は、（Ｔ細胞上で）阻害受容体に結合するので、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性の上方制御の結果、免疫反応の下方制御が起こるはずであり、一方で、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性の下方制御の結果、免疫反応の上方制御が起こるはずである。実施形態において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）は阻害受容体に結合する。既に記されてい
るように、直観に反して、インビトロで（ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇの存在下で）抑制性のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇ融合タンパク質の活性を促進する、出願者により作製されるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）特異的な抗体は（即ちこれらの抗体は、サイトカイン産生、Ｔ細胞増殖、分化又は活性化及び既に記した他の機能におけるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の効果など、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）関連活性の抑制を促進する。）、インビボで予想されることとは逆の挙動をとり、即ちこれらの抗体はインビボで免疫抑制性であることが分かった。
【０５１９】
〔0550〕  本発明の調整方法は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド又は細胞と関連するＶＩＳＴＡの活性（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド活性の１以上を調整する薬剤、例えばＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の発現又は活性を調整する、及び／又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）及びその天然の結合パートナーの相互作用を調整する薬剤と細胞を接触させることを伴う。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド活性を調整する薬剤は、本明細書中で記載のような物質、例えば核酸又はポリペプチド、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドの天然の結合パートナー、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）抗体、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）アゴニスト又はアンタゴニスト、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）アゴニスト又はアンタゴニストのペプチド模倣物、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ペプチド模倣物又は他の低分子であり得る。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）のその天然の結合パートナー又はリガンドの何れかとの結合を妨害するために、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の可溶型も使用し得る。
【０５２０】
〔0551〕  ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の発現を調整する薬剤は、例えばアンチセンス核酸分子、３本鎖オリゴヌクレオチド、リボザイム又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドの発現のための組み換えベクターである。例えば、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド翻訳開始部位の周囲の領域に相補的なオリゴヌクレオチドを合成し得る。１以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを一般的には２００μｇ／ｍＬで細胞培地に添加し得るか、又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドの合成を妨げるために患者に投与し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞により取り込まれ、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ｍＲＮＡとハイブリッド形成して翻訳を妨げる。あるいは、２本鎖ＤＮＡに結合して、３本鎖コンストラクトを形成してＤＮＡの巻き戻し及び転写を妨げるオリゴヌクレオチドを使用し得る。何れかの結果として、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドの合成が遮断される。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現が調整される場合、好ましくはこのような調整は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）遺伝子をノックアウトすることによる以外の手段により起こる。
【０５２１】
〔0552〕  細胞中のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の量を調節するということにより発現を調整する薬剤はまた、細胞中のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性の総量を調整する。ある実施形態において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）を調整する薬剤は、１以上のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を刺激する。このような刺激剤の例としては、活性ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド及び細胞に導入されたＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）をコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この薬剤は、１以上のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を阻害する。このような阻害剤の例としては、アンチセンスＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）核酸分子、抗ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）抗体、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）阻害剤及び対象スクリーニングアッセイにおいて同定される化合物が挙げられる。さらなる実施形態において、阻害剤は、抗ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１又は抗ＰＤ−Ｌ２抗体の組み合わせである。これらの調整方法は、インビトロで（例えば細胞をこの物質と接触させることにより）又は、あるいはインビボで細胞とこの薬剤を接触させることにより（例えば対象にこの薬剤を投与することにより）行い得る。そのようなものとして、本発明は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドの上方又は下方調整から恩恵を受ける状態又は障害、例えばＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド又は核酸分子の好ましくない、不十分な又は異常な発現又は活性を特徴とする障害、に罹患している個体を処置するた
めの方法を提供する。ある実施形態において、本方法は、薬剤（例えば本明細書中に記載のスクリーニングアッセイにより同定された薬剤）又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現又は活性を調整する（例えば上方制御する又は下方制御する）薬剤の組み合わせを投与することを伴う。別の実施形態において、本方法は、低下した、異常な又は好ましくないＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現又は活性を補うための治療としてＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド又は核酸分子を投与することを伴う。
【０５２２】
〔0553〕  本発明は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現もしくは少なくとも１つのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）活性を調整する薬剤を対象に投与することにより、異常な又は好ましくないＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現又は活性と関連する疾患又は状態を対象において予防するための方法を提供する。異常な又は好ましくないＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現又は活性により引き起こされるか又はそれが関与する疾患又は障害に対するリスクがある対象は、例えば本明細書中で記載のような診断又は予後アッセイの何れか又は組み合わせによって同定し得る。予防用薬剤の投与は、疾患又は障害が予防されるか又は、あるいはその進行が遅くなるように、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）異常の症状特性の出現前に行い得る。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）異常のタイプに依存して、対象を処置するために、例えばＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチド、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）アゴニスト又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）アンタゴニスト（例えば抗ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）抗体）剤を使用し得る。本明細書中に記載のスクリーニングアッセイに基づいて、適切な薬剤を決定し得る。
【０５２３】
〔0554〕  ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物をさらなる化学療法剤、細胞毒性剤、抗体（例えば抗ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２又はＣＴＬＡ−４抗体）、リンホカイン又は造血成長因子と混合し得る。ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物はまた、別の抗体、リンホカイン、細胞毒性剤（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質合成を阻害する部分、放射性核種又はリボソーム阻害タンパク質、例えば212Ｂｉ、131Ｉ、188Ｒｅ、90Ｙ、ビンデシン、メト
トレキサート、アドリアマイシン、シスプラチン、ヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質、シュードモナス外毒素Ａ、リシン、ジフテリア毒素、リシンＡ鎖又は細胞毒性ホスホリパーゼ酵素）、免疫抑制剤（例えばシクロスポリン、レフルノミド、メトトレキサート、アゾチプリン、メルカプトプリン、ダクチノマイシン、タクロリムス又はシロリムス）又は造血成長因子と組み合わせて投与することもできる。化学発光標識、常磁性標識（例えばアルミニウム、マンガン、白金、酸素、ランタン、ルテチウム、スカンジウム、イットリウム又はガリウム）、ＭＲＩ造影剤、蛍光標識、生物発光標識又は放射性標識でＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を標識し得る。本明細書中に記載の方法において、抗体と同時に又は連続的に第二の薬剤を投与し得る。例えば、第二の薬剤は、免疫反応を下方制御する薬剤（例えばＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２又はＣＴＬＡ−４融合タンパク質又はそれに特異的な抗体）であり得る。
【０５２４】
〔0555〕  ある実施形態において、自己免疫疾患がある対象を処置する方法は、二次療法を受容し得る対象にＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を投与することを具備する。二次療法の例としては、化学療法、放射線療法、免疫療法、光療法、寒冷療法、毒素療法、ホルモン療法又は外科手術が挙げられる。従って、本発明は、標準的な抗癌療法と組み合わせた方法及び組成物の使用を企図する。処置しようとする患者はあらゆる年齢であり得る。当業者は、ＶＩＳＴＡ又はＶＩＳＴＡ複合物との複合化において使用され得る他の抗癌療法の存在及び開発を認めるであろう。
【０５２５】
〔0556〕  用量の決定は、当業者のレベル内である。急性処置のために、１週間以下、多くの場合は１から３日間、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を投与し得るか、又は数カ月又は数年間にわたり慢性治療において使用し得る。一般に、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物の治療的有効量は、自己免疫疾患において臨床的に意義のある変化を生じさせるの
に十分な量である。
【０５２６】
〔0557〕  阻害受容体により形質導入されるような阻害シグナルは、同時刺激受容体（例えばＣＤ２８又はＩＣＯＳ）が免疫細胞上に存在しない、従って単純に阻害受容体と同時刺激受容体との間の、同時刺激分子の結合に対する競合の機能ではない場合でも生じ得る（Ｆａｌｌａｒｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２０５）。免疫細胞への阻害シグナルの伝達の結果、免疫細胞において無反応、アネルギー又はプログラム化細胞死が起こり得る。好ましくは、阻害シグナルの伝達は、アポトーシスを伴わない機構を通じて操作する。
【０５２７】
自己免疫疾患
〔0558〕  自己免疫の処置のための、組成物、使用及び方法において、本明細書中に記載の、ＶＩＳＴＡポリペプチド、多量体ＶＩＳＴＡポリペプチド、ＶＩＳＴＡ融合タンパク質（例えばＶＩＳＴＡ−Ｉｇ）及び抗ＶＩＳＴＡ抗体を使用し得る。
【０５２８】
〔0559〕  Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリン含有抑制因子（ＶＩＳＴＡ）は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに関連するファミリーのメンバーであり、免疫系において顕著な影響を発揮する。Ｉｇスーパーファミリーは、多くの重要な免疫制御因子、例えばＢ７ファミリーリガンド及び受容体からなる。最もよく特徴が分かっている同時刺激リガンドは、Ｉｇスーパーファミリーに属する、Ｂ７．１及びＢ７．２であり、専門的なＡＰＣ上で発現され、その受容体はＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４である。
【０５２９】
〔0560〕  Ｂ７ファミリーリガンドは、同時刺激Ｂ７−Ｈ２（ＩＣＯＳリガンド）及びＢ７−Ｈ３、ならびに同時阻害Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ４（Ｂ７Ｓ１又はＢ７ｘ）及びＢ７−Ｈ６を含むように拡張した。Ｂｒａｎｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０６，１４９５−１５０３；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：５１５−５４８。従って、さらなるＣＤ２８ファミリー受容体が同定されている。ＩＣＯＳは、活性化Ｔ細胞上で発現され、Ｂ７−Ｈ２に結合する。ＩＣＯＳは、Ｔ細胞活性化、分化及び機能に重要な陽性同時制御因子である。Ｄｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９、９７−１０１。一方で、プログラム死１（ＰＤ−１）はＴ細胞反応を負に制御する。ＰＤ−１-/-マウスは、狼瘡様自己免疫疾患又は自己免疫拡張型心筋症を
発現する。Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：３１９−３２２。最近、ＣＤ８０がＴ細胞に阻害シグナルを伝達するＰＤ−Ｌ１に対する第二の受容体として同定された。Ｂｕｔｔｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ
２７，１１１−１２２。この２つの阻害Ｂ７ファミリーリガンド、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２は異なる発現パターンを有する。ＰＤ−Ｌ２は、ＤＣ及びマクロファージ上で誘導性に発現され、一方でＰＤ−Ｌ１は、造血細胞及び非造血細胞型の両方で広く発現される。ＰＤ−１受容体の免疫抑制的な役割と一致して、ＰＤ−Ｌ１-/-及びＰＤ−Ｌ２-/-マウスを用いた研究から、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生の阻害において重複する役割を有することが示されている。このとき、ＶＩＳＴＡは、造血細胞において選択的に発現されると思われ、これにより分布においてＰＤ−Ｌ１とは区別され、自己免疫疾患の発現を負に制御することにおいて重要な役割を果たすと思われる。
【０５３０】
〔0561〕  細胞外ドメインがＢ７ファミリーリガンドＰＤ−Ｌ１に対して最大の相同性を有する、新規及び構造的に区別されるＩｇ−スーパーファミリー阻害性リガンド。その最も近縁のものが系統的にＰＤ−Ｌ１であるものの、これは、類似性レベルが中程度（２０％）であるがゆえにＰＤ−Ｌの名称が与えられなかった。これは、可能性のあるタンパク質キナーゼＣ結合部位を除き明白なシグナル伝達モチーフはなく、９３ａａ細胞質ドメインを有する。図４参照。ＶＩＳＴＡは負の制御リガンドであり、これは次の事実に基づ
く：
【０５３１】
〔0562〕  可溶性ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、インビトロでＣＤ４+及びＣＤ
８+Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生を抑制する。ＰＤ−１-/-Ｔ細胞を用いて抑制が観察され、これはＰＤ−１がＶＩＳＴＡ受容体ではないことを示す。
【０５３２】
〔0563〕  ＡＰＣにおけるＶＩＳＴＡの過剰発現は、インビトロでＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞増殖を抑制する。
【０５３３】
〔0564〕  腫瘍細胞上でのＶＩＳＴＡ過剰発現は、腫瘍ワクチン接種宿主において防御的な抗腫瘍免疫性を損なわせる。
【０５３４】
〔0565〕  ＶＩＳＴＡ-/-マウスは、炎症性表現型を発現し、これはＶＩＳＴＡが免疫
抑制性機能を有することを裏付ける。ＶＩＳＴＡ-/-ＤＣは、ＷＴ  ＤＣよりも強くＴ細
胞増殖を刺激する。
【０５３５】
〔0566〕  抗ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体（１３Ｆ３）は、インビトロでＶＩＳＴＡ+ＡＰＣによるＴ細胞反応のＶＩＳＴＡ誘導性抑制を遮断し、Ｔ細胞活性化を促進する。
【０５３６】
〔0567〕  抗ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体は、インビボでＥＡＥを悪化させ、脳炎誘発性Ｔｈ１７の頻度を増加させた。
【０５３７】
〔0568〕  抗ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体は、複数の（６種類の）マウス腫瘍モデルにおける腫瘍寛解を誘導し、これらのモデルでの骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）におけるＶＩＳＴＡ発現は非常に高く、これは、ＶＩＳＴＡ+ＭＤＳＣが腫瘍特異的な免疫性を抑
制することを示唆する。
【０５３８】
〔0569〕  自己免疫疾患又は障害の処置のための、組成物、使用及び方法において、本明細書中に記載の、ＶＩＳＴＡポリペプチド、多量体ＶＩＳＴＡポリペプチド、ＶＩＳＴＡ融合タンパク質（例えばＶＩＳＴＡ−Ｉｇ）、核酸配列の配列番号３８から６７の何れか１つからなるｓｉＲＮＡ分子及び抗ＶＩＳＴＡ抗体を使用し得る。自己免疫疾患又は障害の例としては、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、後天性脾臓委縮症、急性前部ブドウ膜炎、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性痛風性関節炎、急性壊死性出血性白質脳炎、急性又は慢性副鼻腔炎、急性化膿性髄膜炎（又は他の中枢神経系炎症性障害）、急性の重篤な炎症、アジソン病、副腎炎、成人発症糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、成人発症特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、無ガンマグロブリン血症、無顆粒球症、脈管炎（（リウマチ性多発筋痛及び巨細胞（高安）関節炎を含む）大血管炎を含む。）を含む血管炎、アレルギー性状態、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、アレルギー性超過敏性疾患、アレルギー性神経炎、アレルギー反応、円形脱毛症、全頭脱毛症、アルポート症候群、肺胞炎（例えばアレルギー性肺胞炎及び線維性肺胞炎）、アルツハイマー病、アミロイドーシス、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリック病）、好酸球関連障害（例えば好酸球増加症）、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、血管拡張症、抗体介在性腎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗原−抗体複合体介在性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、アフタ、アフタ性口内炎、再生不良性貧血、不整脈、動脈硬化症、動脈硬化性障害、関節炎（例えば関節リウマチ、例えば急性関節炎、慢性関節リウマチ）、進行性慢性関節炎、変形性関節炎、回虫症、アスペルギルス腫（又は好酸球を含有する肉芽腫）、アスペルギルス症、アスペルミオジェネス、喘息（例えば気管支喘息、気管支の喘息及び自己免疫喘息）、毛細血管拡張性運動失調、失調性硬化症、アテローム性動脈硬化症、自閉症、自己免疫血管浮腫、自己免疫再生不良性貧血、自己免疫萎縮性胃炎、自己免疫糖尿病、自己免疫精巣炎
及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫疾患、膠原病に伴う自己免疫障害、自己免疫自律神経障害、自己免疫耳疾患（例えば自己免疫内耳疾患（ＡＧＥＤ））、甲状腺炎、例えば自己免疫甲状腺炎を含む自己免疫内分泌疾患、自己免疫消化器症候群、自己免疫性腺機能不全、自己免疫難聴、自己免疫溶血、自己免疫肝炎、自己免疫肝臓病学的障害、自己免疫高脂血症、自己免疫免疫不全症、自己免疫内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫心筋炎、自己免疫好中球減少症、自己免疫膵炎、自己免疫多腺性内分泌障害、自己免疫多腺性症候群Ｉ型、自己免疫網膜症、自己免疫血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫甲状腺疾患、自己免疫蕁麻疹、自己免疫介在性胃腸疾患、軸索及びニューロンのニューロパチー、バロー病、ベーチェット病、良性家族性及び虚血−再かん流傷害、良性リンパ球性血管炎、ベルガー病（ＩｇＡ腎症）、愛鳥家肺、失明、ベック病、細気管支炎閉塞性（非移植）ｖｓ
ＮＳＩＰ、気管支炎、気管支肺アスペルギルス症、バートン症候群、水疱性類天疱瘡、カプラン症候群、心筋症、心血管系虚血、キャッスルマン病、セリアック病、セリアックスプルー（グルテン腸症）、小脳変性症、脳虚血及び血管新生を伴う疾患、シャーガス病、チャネル病（例えばてんかん）、ＣＮＳのチャネル病、脈絡網膜炎、脈絡膜炎、自己免疫血液障害、慢性活動性肝炎又は自己免疫慢性活動性肝炎、慢性接触皮膚炎、慢性好酸球性肺炎、慢性疲労症候群、慢性肝炎、慢性超過敏性肺臓炎、慢性炎症性関節炎、慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性難治性炎症、慢性粘膜皮膚性カンジダ症、慢性ニューロパチー（例えばＩｇＭ多発性ニューロパチー又はＩｇＭ介在性ニューロパチー）、慢性閉塞性気道疾患、慢性肺炎症性疾患、慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）又は亜急性甲状腺炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、ＣＮＳ炎症性障害、ＣＮＳ脈管炎、セリアック病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、ポリープ性大腸炎、大腸炎、例えば潰瘍性の大腸炎、潰瘍性大腸炎、膠原線維性大腸炎、Ｔ細胞浸潤及び慢性炎症反応を含む状態、先天性心臓ブロック、先天性風疹感染、クームス陽性貧血、冠動脈疾患、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着、レイノー現象）、クローン病、クリオグロブリン血症、クッシング症候群、毛様体炎（例えば慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、虹彩毛様体炎又はフックス毛様体炎）、嚢胞性線維症、サイトカイン誘導性毒性、聴覚消失、変形性関節炎、脱髄性疾患（例えば自己免疫脱髄性疾患）、脱髄性ニューロパチー、デング熱、ヘルペス状皮膚炎及びアトピー性皮膚炎、接触皮膚炎を含む皮膚炎、皮膚筋炎、急性炎症性要素を伴う皮膚疾患、デビック病（視神経脊髄炎）、糖尿病性大動脈障害、糖尿病性ニューロパチー、糖尿病性網膜症、ダイアモンド・ブラックファン貧血、びまん性間質性肺線維症、拡張型心筋症、円板状狼瘡、白血球血管外漏出を含む疾患、ドレスラー症候群、デュプュイトラン拘縮、エコーウイルス感染、アレルギー性又はアトピー性湿疹を含む湿疹、脳炎、例えばラスムッセン脳炎及び辺縁系及び／又は脳幹脳炎、脳脊髄炎（例えばアレルギー性脳脊髄炎又はアレルギー性脳脊髄炎及び実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ））、動脈内過形成、心内膜炎、内分泌性眼障害、子宮内膜症、心内膜心筋線維症、水晶体過敏性眼内炎、眼内炎、アレルギー性腸炎、好酸球増加症−筋痛症候群、好酸球性筋膜炎、流行性角結膜炎、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、上強膜、上強膜炎、エプスタイン−バーウイルス感染、持続性隆起性紅斑、多形性紅斑、癩性結節性紅斑、結節性紅斑、胎児赤芽球症、食道運動不全、本態性混合型クリオグロブリン血症、篩骨、エバンス症候群、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、農夫肺、フェブリスリウマチ、フェルティー症候群、線維筋痛症、線維性肺胞炎、フィラリア症、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、食中毒、前頭骨、胃萎縮、巨細胞関節炎（側頭関節炎）、巨細胞肝炎、巨細胞多発性筋痛、糸球体腎炎、ネフローゼ症候群を伴う、及び伴わない糸球体腎炎（ＧＮ）、例えば慢性又は急性糸球体腎炎（例えば原発性ＧＮ）、グッドパスチャー症候群、痛風性関節炎、顆粒球輸血関連症候群、リンパ腫様肉芽腫症を含む肉芽腫症、多発性血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ）、肉芽腫性ブドウ膜炎、グレーブズ病、ギラン・バレー症候群、滴状乾癬、血色素尿症発作、ハーマン＝リッチ症候群、橋本病、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、ヘモクロマトーシス、溶血性貧血又は自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む免疫性溶血性貧血、溶血性貧血、血友病Ａ、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、ヒト
免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、痛覚過敏、低ガンマグロブリン血症、性腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、特発性尿崩症、特発性顔面麻痺、特発性甲状腺機能低下症、特発性ＩｇＡ腎症、特発性膜性ＧＮ又は特発性膜性腎症、特発性ネフローゼ症候群、特発性肺線維症、特発性スプルー、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＥ介在性疾患（例えばアナフィラキシー及びアレルギー性及びアトピー性鼻炎）、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、回腸炎レジオナリス、免疫複合体腎炎、サイトカイン及びＴ−リンパ球が介在する急性及び遅発性超過敏性を伴う免疫反応、免疫介在性ＧＮ、成人又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、感染性関節炎、抗精子抗体による不妊症、ブドウ膜全体又は一部の炎症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）炎症性過剰増殖皮膚疾患、炎症性ミオパチー、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）、膵島炎、間質性膀胱炎、間質性肺疾患、間質性肺線維症、虹彩炎、虚血再かん流障害、関節の炎症、若年性関節炎、若年性皮膚筋炎、若年性糖尿病、小児インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を含む若年性発症（Ｉ型）糖尿病、若年発症関節リウマチ、川崎病、乾性角結膜炎、キパノソミアシス、ランバート−イートン症候群、リーシュマニア症、ハンセン病、白血球減少症、白血球接着欠乏症、白血球破砕性脈管炎、白血球減少症、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、直鎖状ＩｇＡ皮膚炎、直鎖状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、レフラー症候群、ルポイド肝炎、狼瘡（腎炎、脳炎、小児、非腎臓、腎臓外、円板状、脱毛症を含む。）、狼瘡（ＳＬＥ）、播種性紅斑性狼瘡、ライム関節炎、ライム病、リンパ球様間質性肺臓炎、マラリア、男性及び女性自己免疫不妊症、上顎、中間型血管炎（川崎病及び結節性多発動脈炎を含む。）、Ｉ型及びＩＩ型を含む膜状−又は膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）及び急速進行性ＧＮ、膜性ＧＮ（膜性腎症）、メニエール病、髄膜炎、顕微鏡的大腸炎、顕微鏡的多発性血管炎、偏頭痛、微小変化型腎症、混合結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、伝染性単核球症、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多巣性運動ニューロパチー、多発性内分泌機能不全、多臓器損傷症候群、例えば敗血症、外傷又は出血に続発するもの、多臓器損傷症候群、多発性硬化症（ＭＳ）、例えば脊椎−眼ＭＳ、多発性硬化症、流行性耳下腺炎、筋障害、重症筋無力症、例えば胸腺腫を伴う重症筋無力症、重症筋無力症、心筋炎、筋炎、ナルコレプシー、壊死性腸炎及び貫壁性大腸炎及び自己免疫炎症性腸疾患、壊死性、皮膚性又は超過敏性脈管炎、新生児狼瘡症候群（ＮＬＥ）、ネフローゼ、ネフローゼ症候群、神経性疾患、視神経脊髄炎（デビック病）、視神経脊髄炎、神経性筋緊張病、好中球減少症、非癌性リンパ球増加症、非肉芽腫性ブドウ膜炎、非悪性胸腺腫、眼及び眼窩炎症性障害、眼瘢痕性類天疱瘡、卵巣炎、交感性眼炎、眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、眼球クローヌス又は眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）及び感覚ニューロパチー、視神経炎、肉芽腫性精巣炎、変形性関節症、回帰性リウマチ、膵炎、汎血球減少症、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌が関連する小児自己免疫精神神経疾患）、傍腫瘍性小脳変性症、腫瘍随伴症候群、傍腫瘍性神経症候群を含む腫瘍随伴症候群（例えばランバート・イートン筋無力症候群又はイートン・ランバート症候群）、寄生虫症、例えばリーシュマニア、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク症候群、毛様体扁平部炎（末梢ブドウ膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群、パルボウイルス感染、類天疱瘡、例えば水疱性類天疱瘡及び皮膚類天疱瘡、天疱瘡（尋常性天疱瘡を含む。）、紅斑性天疱瘡、落葉状天疱瘡、粘膜類天疱瘡、天疱瘡、消化性潰瘍、周期性四肢麻痺、末梢ニューロパチー、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血（悪性の貧血）、悪性貧血、水晶体抗原性ブドウ膜炎、肺線維症、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ型、多発性関節炎慢性プリマリア、多発性軟骨炎（例えば難治性又は再発性多発性軟骨炎）、多内分泌自己免疫疾患、多内分泌不全、多腺性症候群（例えば自己免疫多腺性症候群（又は多腺性内分泌障害症候群））、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性ニューロパチー、急性多発性神経根炎、開心術後症候群、後部ブドウ膜炎又は自己免疫ブドウ膜炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、連鎖球菌感染後腎炎、ワクチン接種後症候群、初老期認知症、原発性胆汁性肝硬変、原発性甲状腺機能低下症、原発性特発性粘液水腫、単クローン性Ｂ細胞リンパ球増加症を含む原発性リンパ球増加症（例えば良性単クローン性高ガンマグロブリン血症及び意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血
症、ＭＧＵＳ）、原発性粘液水腫、原発性進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）及び再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、進行性全身性硬化症、増殖性関節炎、
乾癬、例えばプラーク性乾癬、乾癬、乾癬性関節炎、肺胞タンパク質症、肺浸潤好酸球増加症、赤芽球癆貧血又は形成不全（ＰＲＣＡ）、赤芽球癆形成不全、化膿性又は非化膿性副鼻腔炎、膿疱性乾癬及び爪の乾癬、腎盂炎、壊疽性膿皮症、ケルバン甲状腺炎、レイノー現象、反応性関節炎、習慣性流産、血圧反応の低下、反射性交感神経性ジストロフィー、難治性スプルー、ロイター病又は症候群、再発性多発性軟骨炎、心筋又は他の組織の再かん流傷害、再かん流傷害、呼吸窮迫症候群、むずむず脚症候群、網膜自己免疫性、後腹膜線維症、レイノー症候群、リウマチ性疾患、リウマチ熱、リウマチ、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、風疹ウイルス感染、サムプター症候群、サルコイドーシス、住血吸虫症、シュミット症候群、ＳＣＩＤ及びエプスタイン−バーウイルス関連疾患、強膜、強膜炎、肢端硬化、強皮症（全身性強皮症を含む。）、硬化性胆管炎、播種性硬化症、硬化症、例えば全身性硬化症、感音性難聴、血清反応陰性脊椎関節炎、シーハン症候群、シャルマン症候群、珪肺症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫性、蝶形骨洞炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、スティッフ・マン（又はスティッフ・パーソン）症候群、亜急性細菌心内膜炎（ＳＢＥ）、亜急性皮膚性紅斑性狼瘡、突発性難聴、スザック症候群、シドナム舞踏病、交感性眼炎、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）又は全身性紅斑性狼瘡（例えば皮膚性ＳＬＥ）、全身性壊死性脈管炎及びＡＮＣＡ関連血管炎、例えばチャーグ・ストラウス血管炎又は症候群（ＣＳＳ））、脊髄癆、高安動脈炎、毛細血管拡張症、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、閉塞性血栓性血管炎、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）及び自己免疫又は免疫介在性血小板減少症を含む血小板減少症（例えば心筋梗塞患者により発現される場合）、例えば慢性又は急性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）を含む特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、甲状腺中毒症、組織損傷、トローザ・ハント症候群、中毒性表皮剥離症、毒性ショック症候群、輸血反応、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、横断性脊髄炎、横断性の脊髄炎、熱帯性肺好酸球増加症、結核、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、蕁麻疹（例えば慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性自己免疫蕁麻疹を含む慢性特発性蕁麻疹）、ブドウ膜炎（例えば前部ブドウ膜炎）、網膜ブドウ膜炎、弁膜炎、血管機能不全、脈管炎、椎間体性関節炎、小水疱水疱性皮膚炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫（現在、多発性血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる。）、ウィスコット・アルドリッチ症候群及びＸ連鎖高ＩｇＭ症候群が挙げられるが限定されない。
【０５３９】
癌の治療（処置）
〔0570〕  本明細書中に記載の、ＶＩＳＴＡポリペプチド、多量体ＶＩＳＴＡポリペプチド、ＶＩＳＴＡ融合タンパク質（例えばＶＩＳＴＡ−Ｉｇ）、配列番号３８から６７の核酸配列の何れか１つからなるｓｉＲＮＡ分子及び抗ＶＩＳＴＡ抗体は、癌（例えば腫瘍）の処置のための、組成物、使用及び方法において使用され得る。
【０５４０】
〔0571〕  癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が挙げられるが限定されない。このような癌のより特定の例としては、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌を含む。）、腹膜癌、肝細胞性癌、胃部又は胃癌（胃腸癌を含む。）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎又は腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌腫及び様々なタイプの頭頸部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球細胞性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症を含む。）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病
（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；多発性骨髄腫及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）が挙げられる。
【０５４１】
〔0572〕  本発明による処置に受け入れられる癌という用語としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病又はリンパ系悪性腫瘍が挙げられるが限定されない。このような癌のより特定の例としては、膀胱、卵巣、メラノーマ、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌を含む。）、腹膜癌、肝細胞性癌、胃部又は胃癌（胃腸癌を含む。）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌腫、腎臓又は腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌腫及び様々なタイプの頭頸部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球細胞性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症を含む。）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびにファコマトーセスに伴う異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に付随するものなど）及びメイグス症候群が挙げられる。好ましくは、癌は、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎臓細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、軟組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、中皮腫及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。癌は、初期進行（転移性を含む。）膀胱、卵巣又はメラノーマであり得る。癌は結腸直腸癌であり得る。本発明の処置に受け入れられる癌状態としては、骨髄由来抑制細胞によるＶＩＳＴＡ発現が抗腫瘍反応及び抗浸潤性免疫反応を抑制する、転移性癌が挙げられる。本発明の方法は、血管新生が起こる腫瘍の処置に特に適切である。
【０５４２】
〔0573〕  本発明はまた、化学療法又は放射線療法又は他の生物製剤と併用して、及びその活性を促進するために、即ち骨髄由来抑制細胞によるＶＩＳＴＡ発現が、抗腫瘍反応及び化学療法又は放射線療法又は生物製剤の有効性を抑制する個体において、癌の処置にも適切である。本発明に従い、抗癌活性を示すあらゆる化学療法剤を使用し得る。好ましくは、化学療法剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体及び関連阻害剤、ビンカアルカロイド、エピポドピロ毒素、抗生物質、Ｌ−アスパラギナーゼ、トポイソメラーゼ阻害剤、インターフェロン、白金配位複合体、アントラセンジオン置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アドレノコルチコステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン、アンドロゲン、抗アンドロゲン及び性腺刺激ホルモン放出ホルモン類似体からなる群から選択され得る。より好ましくは、化学療法剤は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン（ＬＶ）、イリノテカン、オキサリプラチン、カペシタビン、パクリタキセル及びドキセタキセルからなる群から選択され得る。抗ＶＥＧＦ抗体の投与と組み合わせて投与しようとするカクテル中で２以上の化学療法剤を使用し得る。ある好ましい併用化学療法は、５−ＦＵ及び１以上の他の化学療法剤を具備する、フルオロウラシルに基づくものである。併用化学療法の適切な投与計画は当技術分野で公知であり、例えば、Ｓａｌｔｚ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ  ＡＳＣＯ  １８：２３３ａ及びＤｏｕｉｌｌａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｌａｎｃｅｔ  ３５５：１０４１−７に記載されている。生物製剤は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４融合タンパク質に対する抗体ならびにサイトカイン、成長因子アンタゴニスト及びアゴニスト、ホルモン及び抗サイトカイン抗体などの別の免疫増強剤であり得る。
【０５４３】
アレルギー
〔0574〕  本明細書中に記載の、ＶＩＳＴＡポリペプチド、多量体ＶＩＳＴＡポリペプチ
ド、ＶＩＳＴＡ融合タンパク質（例えばＶＩＳＴＡ−Ｉｇ）及び抗ＶＩＳＴＡ抗体は、アレルギー（例えばアレルゲンに対するアレルギー反応）の処置のための、組成物、使用及び方法において使用され得る。
【０５４４】
〔0575〕  アレルゲンの例としては、ダニ抗原及び花粉抗原が挙げられる。
【０５４５】
〔0576〕  代表的アレルギー性疾患としては、気管支の喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎及び花粉及び昆虫アレルギーが挙げられる。アレルギー性素因は、アレルギーを有する親の子に遺伝し得る遺伝因子である。家族性アレルギー性疾患は、アトピー性疾患とも呼ばれ、原因となる遺伝的に受け継がれる因子は、アトピー性素因である。「アトピー性皮膚炎」は、アトピー性疾患、特に皮膚炎症状を伴う疾患の一般名である。アレルギー性状態を含む好ましい例は、湿疹、アレルギー性鼻炎、枯草熱、蕁麻疹及び食物アレルギーからなる群から選択される。アレルギー性状態としては、湿疹、アレルギー性鼻炎又はコリーザ、枯草熱、気管支の喘息、蕁麻疹（発疹）及び食物アレルギー及び他のアトピー性状態が挙げられる。
【０５４６】
炎症状態及び炎症性疾患
〔0577〕  本明細書中に記載の、ＶＩＳＴＡポリペプチド、多量体ＶＩＳＴＡポリペプチド、ＶＩＳＴＡ融合タンパク質（例えばＶＩＳＴＡ−Ｉｇ）、配列番号３８から６７の核酸配列の何れか１つからなるｓｉＲＮＡ分子及び抗ＶＩＳＴＡ抗体は、炎症状態及び炎症性疾患の処置のための、組成物、使用及び方法において使用し得る。
【０５４７】
〔0578〕  炎症状態及び炎症性疾患としては、リウマチ性疾患（例えば関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎）脊椎関節症（例えば強直性脊椎炎、反応性関節炎、ライター症候群）、結晶性関節症（例えば痛風、偽痛風、ピロリン酸カルシウム結晶沈着症）、多発性硬化症、ライム病、リウマチ性多発筋痛；結合組織疾患（例えば全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群）；血管炎（例えば結節性多発動脈炎、ヴェーゲナー肉芽腫、チャーグ・ストラウス症候群）；外傷又は虚血の結果を含む炎症状態、サルコイドーシス；アテローム性動脈硬化性の血管疾患を含む血管疾患、アテローム性動脈硬化症及び血管閉塞性疾患（例えばアテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患、心筋梗塞、脳卒中、末梢血管疾患）及び血管ステント再狭窄；ブドウ膜炎を含む眼疾患、角膜疾患、虹彩炎、虹彩毛様体炎及び白内障が挙げられるが限定されない。
【０５４８】
〔0579〕  炎症状態としてはまた、酸逆流／胸焼け、ざ瘡、尋常性ざ瘡、アレルギー及び過敏症、アルツハイマー病、喘息、アテローム性動脈硬化症及び血管閉塞性疾患（例えばアテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患、心筋梗塞、脳卒中、末梢血管疾患）及び血管ステント再狭窄、自己免疫疾患、気管支炎、癌、心炎、白内障、セリアック病、慢性痛、慢性前立腺炎、肝硬変、大腸炎、結合組織疾患（例えば全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群）、角膜疾患、クローン病、結晶性関節症（例えば痛風、偽痛風、ピロリン酸カルシウム結晶沈着症）、認知症、皮膚炎、糖尿病、ドライアイ、湿疹、浮腫、肺気腫、線維筋痛症、胃腸炎、歯肉炎、糸球体腎炎、心疾患、肝炎、高血圧、超過敏症、炎症性腸疾患、外傷又は虚血の結果を含む炎症状態、インスリン抵抗性、間質性膀胱炎、虹彩毛様体炎、虹彩炎、関節痛／関節炎／関節リウマチ、ライム病、メタボリックシンドローム（シンドロームＸ）、多発性硬化症、筋炎、腎炎、肥満、ブドウ膜炎を含む眼疾患、骨減少、骨粗しょう症、パーキンソン病、骨盤炎症性疾患、歯周病、多発動脈炎、多発性軟骨炎、リウマチ性多発筋痛、乾癬、再かん流傷害、関節リウマチ、リウマチ性疾患（例えば関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎）、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、副鼻腔炎、シェーグレン症候群、けいれん性結腸、脊椎関節症（例えば強直性脊椎炎、反応性関節炎、ライター症候群）、全身性カンジダ症、腱炎、移植拒絶、ＵＴＩ’ｓ、膣炎、アテローム性動脈硬化性の血管疾患を含む血管疾
患、血管炎（例えば結節性多発動脈炎、ヴェーゲナー肉芽腫、チャーグ・ストラウス症候群）及び脈管炎も挙げられるが限定されない。
【０５４９】
移植片対宿主病
〔0580〕  本明細書中に記載の、ＶＩＳＴＡポリペプチド、多量体ＶＩＳＴＡポリペプチド、ＶＩＳＴＡ融合タンパク質（例えばＶＩＳＴＡ−Ｉｇ）、配列番号３８から６７の核酸配列の何れか１つからなるｓｉＲＮＡ分子及び抗ＶＩＳＴＡ抗体は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置のための、組成物、使用及び方法において使用され得る。
【０５５０】
〔0581〕  本発明はまた、有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質の投与を具備する、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置する方法も提供する。移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、急性移植片対宿主病、慢性移植片対宿主病、幹細胞移植に伴う急性移植片対宿主病、幹細胞移植に伴う慢性移植片対宿主病、骨髄移植に伴う急性移植片対宿主病、同種血液幹細胞移植（ＨＳＣＴ）に伴う急性移植片対宿主病又は骨髄移植に伴う慢性移植片対宿主病を処置するための方法は、有効量のＶＩＳＴＡ融合タンパク質、場合によってはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質又は多量体ＶＩＳＴＡタンパク質を投与することを具備し得る。
【０５５１】
〔0582〕  移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、急性移植片対宿主病、慢性移植片対宿主病、幹細胞移植に伴う急性移植片対宿主病、幹細胞移植に伴う慢性移植片対宿主病、骨髄移植に伴う急性移植片対宿主病、同種血液幹細胞移植（ＨＳＣＴ）に伴う急性移植片対宿主病又は骨髄移植に伴う慢性移植片対宿主病であり得る。処置しようとする処置される患者は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の少なくとも１つの症状を有し得、場合によっては患者は、腹痛、腹部けいれん、下痢、発熱、黄疸、皮膚発疹、嘔吐及び体重減少を含むが限定されない急性ＧＶＨＤを示す。患者は、ドライアイ、ドライマウス、脱毛、肝炎、肺障害、消化管障害、皮膚発疹及び皮膚肥厚を含むが限定されない慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のうち少なくとも１つの症状を有し得る。患者は、同種幹細胞又は骨髄移植を有し得るか又はこれを受けようとしているものであり得る。患者は、自己幹細胞又は骨髄移植を有するか又はこれを受けようとしているものであり得る。
【０５５２】
診断方法
〔0583〕  ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物の有無を検出するための診断方法において、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物に選択的に結合する、抗ＶＩＳＴＡ及び抗ＶＩＳＴＡ複合物抗体、配列番号３８から６７の核酸配列の何れか１つからなるｓｉＲＮＡ分子及びその抗原−結合断片を使用し得る。（ａ）ＶＩＳＴＡ又はＶＩＳＴＡ複合物と結合する抗体又はその断片と試験試料を接触させ、（ｂ）抗体−エピトープ複合体についてアッセイすることを具備する方法において、抗ＶＩＳＴＡ及び抗ＶＩＳＴＡ複合物抗体が使用され得る。ウエスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈殿反応、ゲル内拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、凝集反応アッセイ、補体結合反応アッセイ、免疫組織化学アッセイ、蛍光免疫アッセイ及びプロテインＡ免疫アッセイによって、抗体−エピトープ複合体が検出され得る。この試料は、組織生検、リンパ液、尿、脳脊髄液、羊水、炎症性滲出液、血液、血清、糞便又は結腸直腸管から回収される液体である試料であり得る。
【０５５３】
〔0584〕  ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物に選択的に結合する抗体は、組み換え体であり得る。ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物に選択的に結合する抗体の断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＣＤＲ、パラトープ又は本抗原に結合可能である抗体の一部分であり得る。ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物に選択的に結合する抗体は、キメラ、ヒト化、抗イディオタイプの、１本鎖、二機能性又は同時特異的であり得る。ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物に選択的に結合する抗体は、又は化学発光標識、常磁性標識（
例えばアルミニウム、マンガン、白金、酸素、ランタン、ルテチウム、スカンジウム、イットリウム又はガリウム）、ＭＲＩ造影剤、蛍光標識、生物発光標識又は放射性標識を含むが限定されない標識に複合化される断片であり得る。
【０５５４】
〔0585〕  さらに、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物に選択的に結合する抗体及びその抗原結合断片は、固体支持体（例えばビーズ、試験管、シート、培養皿又は試験片）、例えばアレイなどに連結され得る。
【０５５５】
〔0586〕  本方法は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、ＣＣＤ微光監視システム、Ｘ線、ＣＴスキャン、シンチグラフィー、光音響イメージング、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、超音波、常磁性画像法及び内視鏡的光コヒーレンストモグラフィーによって、ＶＩＳＴＡポリペプチド又はＶＩＳＴＡ複合物を画像化することを具備し得る。
【０５５６】
スクリーニングアッセイ
〔0587〕  本発明は、調節物質を同定するための方法（「スクリーニングアッセイ」）を提供し、即ちＶＩＳＴＡポリペプチドに結合する候補又は試験化合物又は薬剤（例えばペプチド、ペプチド模倣物、低分子又は他の薬物）は、例えば、ＶＩＳＴＡ発現又はＶＩＳＴＡ活性に対して刺激もしくは阻害効果を有するか、又はＶＩＳＴＡとその天然の結合パートナーとの相互作用に対して刺激もしくは阻害効果を有する。
【０５５７】
〔0588〕  ＶＩＳＴＡポリペプチド又はその生物学的活性部分に結合する、例えばＶＩＳＴＡポリペプチドのその天然の結合パートナーとの相互作用能を調整する、候補又は試験化合物をスクリーニングするためのアッセイは、候補化合物をＶＩＳＴＡポリペプチドと接触させ、ＶＩＳＴＡポリペプチドのその天然の結合パートナーとの相互作用能の調整について試験することを具備し得る。ＶＩＳＴＡタンパク質又はポリペプチド又はその生物学的活性部分と結合するか、又はその活性を調整する候補又は試験化合物をスクリーニングためのアッセイは、ＶＩＳＴＡポリペプチドを接触させ、ＶＩＳＴＡポリペプチドと候補薬剤との間の結合について試験することを具備し得る。ＶＩＳＴＡにより負に制御される免疫機能に対して刺激又は阻害効果を有する候補又は試験化合物をスクリーニングするためのアッセイは、本明細書中で同定されるか、又はＶＩＳＴＡとその天然の結合パートナーとの間の相互作用に対するその効果に基づく。これらのＶＩＳＴＡ関連機能は、例として、サイトカイン産生を阻害する（例えばＴ細胞によるＩｌ−２、γインターフェロン、中程度のＣＤ２８同時刺激を抑制する、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を阻害する、ナイーブ及びメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制する、及びアポトーシスを誘導せずにＴＣＲ活性化を抑制する。）。生物学的ライブラリ；空間的に処理可能な平行固相又は液相ライブラリ；逆重畳積分を必要とする合成ライブラリ法；「１−ビーズ１−化合物」ライブラリ法；及びアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリ法を含む、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリ法における多くのアプローチの何れかを使用して、本発明の試験化合物を得ることができる。生物学的ライブラリアプローチはペプチドライブラリに限定され、一方で、他の４種類のアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の低分子ライブラリに適用可能である。Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５。
【０５５８】
〔0589〕  アッセイは、試験化合物とＶＩＳＴＡポリペプチド又はその生物学的活性部分を接触させ、試験化合物のＶＩＳＴＡ活性調節能を決定することを具備する、細胞がＶＩＳＴＡポリペプチド又はその生物学的活性部分を発現する細胞に基づくアッセイであり得る。試験化合物のＶＩＳＴＡ活性調整能を決定することは、例えばＶＩＳＴＡのその天然の結合パートナーとの結合能及び免疫細胞活性調整能を監視することにより達成され得る。免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞又は骨髄細胞であり得る。試験化合物の、その逆受容体
へのＶＩＳＴＡ結合調整能を決定することは、例えば、放射性同位体又は酵素性標識とＶＩＳＴＡをカップリングし、試験化合物の、ＶＩＳＴＡ逆受容体を発現するＴ細胞へのＶＩＳＴＡ結合調整能を監視することによって遂行され得る。試験化合物のＶＩＳＴＡ結合能を決定することは、例えば、ＶＩＳＴＡへの化合物の結合が複合体中の標識化ＶＩＳＴＡ化合物を検出することにより決定され得るように、化合物を放射性同位体又は酵素性標識とカップリングすることによって、遂行され得る。
【０５５９】
〔0590〕  相互作用物の何れの標識もなしで化合物のＶＩＳＴＡとの相互作用能を決定するために、アッセイを使用し得る。例えば、化合物又はＶＩＳＴＡの何れの標識もなくＶＩＳＴＡとの化合物の相互作用を検出するために、マイクロフィジオメーターが使用され得る。ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ、Ｈ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１９０６−１９１２。マイクロフィジオメーター（例えば細胞センサー）は、光アドレス電位差センサー（ＬＡＰＳ）を用いて細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化を化合物とＶＩＳＴＡとの間の相互作用の指標として使用し得る。
【０５６０】
〔0591〕  アッセイは、ＶＩＳＴＡ結合パートナーを発現するＴ細胞を試験化合物と接触させ、試験化合物の、ＶＩＳＴＡ結合パートナー活性調整能（例えば刺激又は阻害）を決定することを具備する、細胞に基づくアッセイであり得る。試験化合物のＶＩＳＴＡ結合パートナー活性調整能を決定することは、例えば、ＶＩＳＴＡポリペプチドのＶＩＳＴＡ結合パートナーとの結合能又は相互作用能を決定することによって遂行され得る。
【０５６１】
〔0592〕  ＶＩＳＴＡポリペプチド又はその生物学的活性断片の、ＶＩＳＴＡ結合パートナーとの結合能又は相互作用能を決定することは、直接的結合を決定するための上記の方法のうち１つによって遂行され得る。実施形態において、ＶＩＳＴＡポリペプチドの、ＶＩＳＴＡ結合パートナーとの結合能又は相互作用能を決定することは、結合パートナーの活性を決定することによって遂行され得る。例えば、結合パートナーの活性は、細胞の第二のメッセンジャー（例えばチロシンキナーゼ又はホスファターゼ活性）の誘導を検出するか、適切な基質の触媒性／酵素性活性を検出するか、（検出可能なマーカー、例えばルシフェラーゼをコードする核酸に作動可能に連結される標的反応性の制御エレメントを具備する）レポーター遺伝子の誘導を検出するか、又は標的により制御される細胞性反応を検出することによって決定され得る。例えば、ＶＩＳＴＡポリペプチドの、天然のＶＩＳＴＡ結合パートナーとの結合能又は相互作用能を決定することは、化合物の、増殖アッセイにおける免疫細胞同時刺激又は阻害の調整能を測定することによって、又はＶＩＳＴＡポリペプチドの、ＶＩＳＴＡポリペプチドの一部分を認識する抗体への結合能を妨害することによって、遂行され得る。ある実施形態において、Ｔ細胞活性化を調整する化合物は、化合物の、Ｔ細胞増殖又はサイトカイン産生調整能を決定することによって同定され得る。実施形態において、Ｔ細胞活性化を調整する化合物は、化合物の、複数の抗原濃度でのＴ細胞増殖又はサイトカイン産生調整能を決定することによって同定され得る。
【０５６２】
〔0593〕  アッセイは、ＶＩＳＴＡポリペプチド又はその生物学的活性部分を試験化合物と接触させ、試験化合物の、ＶＩＳＴＡポリペプチド又はその生物学的活性部分への結合能を決定する、細胞不含アッセイであり得る。本発明のアッセイにおいて使用しようとするＶＩＳＴＡポリペプチドの好ましい生物学的活性部分は、非ＶＩＳＴＡ分子との相互作用に関与する断片、例えばＶＩＳＴＡ結合パートナーに結合する細胞外ドメインの少なくとも一部を含む。ＶＩＳＴＡポリペプチドへの試験化合物の結合は、上記のように直接又は間接的の何れかであり得る。
【０５６３】
〔0594〕  アッセイは、ＶＩＳＴＡポリペプチド又はその生物学的活性部分を試験化合物と接触させ、試験化合物の、ＶＩＳＴＡポリペプチド又はその生物学的活性部分の活性
調整能（例えば刺激又は阻害）を決定する、細胞不含アッセイであり得る。試験化合物の、ＶＩＳＴＡポリペプチド活性調整能を決定することは、例えば、直接的結合を決定するための上記の方法のうち１つによりＶＩＳＴＡポリペプチドの、ＶＩＳＴＡ結合パートナーへの結合能を決定することによって遂行され得る。本発明の細胞不含アッセイは、可溶性及び／又は膜結合型のポリペプチド（例えばＶＩＳＴＡポリペプチド又はその生物学的活性部分又はＶＩＳＴＡが結合する結合パートナー）の両方の使用に適している。膜結合型ポリペプチドが使用される細胞不含アッセイの場合（例えば細胞表面ＶＩＳＴＡ）、膜結合型のポリペプチドが溶液中で維持されるように、可溶化剤を利用することが所望され得る。このような可溶化剤の例としては、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、テシット、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアムミニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアムミニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）又はＮ−ドデシル．ｄｂｄ．Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０５６４】
〔0595〕  アッセイ法において、ポリペプチドの一方又は両方の、非複合化型からの複合化型の分離を促進するために、ならびにアッセイ自動化に適応させるために、ＶＩＳＴＡ又はその結合パートナーの何れかを固定化することが所望され得る。候補化合物の存在下又は非存在下におけるＶＩＳＴＡポリペプチドへの試験化合物の結合又はＶＩＳＴＡポリペプチドとその結合パートナーとの相互作用は、反応物を含有するのに適切な何らかの容器中で行われ得る。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管及び微小遠心管が挙げられる。ある実施形態において、ポリペプチドの一方又は両方をマトリクスに結合できるようにするドメインを付加する融合タンパク質が提供され得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＶＩＳＴＡ融合タンパク質又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／結合パートナー融合タンパク質をグルタチオンセファロース（登録商標）ビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いでこれを試験化合物又は試験化合物及び非吸着結合パートナーポリペプチド又はＶＩＳＴＡポリペプチドの何れかと合わせ、複合体形成させる条件下で混合物を温置する（例えば塩及びｐＨに対して、生理的条件で）。温置後、ビーズ又はマイクロタイタープレートウェルを洗浄して未結合成分を全て除去し、ビーズの場合はマトリクスを固定化し、例えば上記のように、直接的又は間接的の何れかで複合体形成を決定する。あるいは、マトリクスから複合体を解離させ得、標準的な技術を用いてＶＩＳＴＡ結合又は活性レベルを決定し得る。本発明のスクリーニングアッセイにおいて、ポリペプチドをマトリクス上に固定化するための他の技術も使用し得る。試験化合物の、ＶＩＳＴＡポリペプチド活性の調整能を決定することは、試験化合物の、ＶＩＳＴＡ下流で機能する分子の活性調整能を決定することによって、例えばＶＩＳＴＡ結合パートナーの細胞質ドメインと相互作用させることによって、遂行され得る。例えば、第二のメッセンジャーレベル、適切な標的上での相互作用分子の活性又は適切な標的への相互作用物質の結合を既に記載のように決定し得る。
【０５６５】
〔0596〕  細胞を候補化合物と接触させ、細胞でのＶＩＳＴＡ  ｍＲＮＡ又はポリペプチドの発現を決定する方法において、ＶＩＳＴＡ発現の調節物質を同定し得る。候補化合物存在下でのＶＩＳＴＡ  ｍＲＮＡ又はポリペプチドの発現レベルを候補化合物非存在下でのＶＩＳＴＡ  ｍＲＮＡ又はポリペプチドの発現レベルと比較する。次に、変化が統計学的に有意である場合、この比較に基づいて、ＶＩＳＴＡ発現の調節物質として候補化合物を同定し得る。
【０５６６】
〔0597〕  ＶＩＳＴＡと結合又は相互作用し（「ＶＩＳＴＡ結合タンパク質」、「ＶＩ
ＳＴＡ結合パートナー」又は「ＶＩＳＴＡ−ｂｐ」）、ＶＩＳＴＡ活性に関与する他のポリペプチドを同定するために、２ハイブリッドアッセイ又は３ハイブリッドアッセイにおいて「ベイトタンパク質」としてＶＩＳＴＡポリペプチドを使用し得る（例えば米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；及びＷＯ９４／１０３００を参照）。このようなＶＩＳＴＡ−結合プロテインも、ＶＩＳＴＡポリペプチド又は例えばＶＩＳＴＡ介在性シグナル伝達経路の下流エレメントとしてＶＩＳＴＡ標的によるシグナル拡大に関与すると思われる。あるいは、このようなＶＩＳＴＡ−結合ポリペプチドはＶＩＳＴＡ阻害剤であり得る。２ハイブリッド系は、分離可能なＤＮＡ−結合及び活性化ドメインからなる、殆どの転写因子のモジュラー的性質に基づく。簡潔に述べると、本アッセイは、２つの異なるＤＮＡコンストラクトを利用する。１つのコンストラクトにおいて、ＶＩＳＴＡポリペプチドをコードする遺伝子を既知の転写因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他のコンストラクトにおいて、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に、未確認のポリペプチド「プレイ」又は「試料」をコードする、ＤＮＡ配列のライブラリからのＤＮＡ配列を融合させる。「ベイト」及び「プレイ」ポリペプチドは、インビボで、ＶＩＳＴＡ依存性複合体を形成する相互作用可能であり、転写因子のＤＮＡ−結合及び活性化ドメインを近接近させる。この近接近によって、転写因子に応答する転写制御部位に作動可能に連結されるレポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写が可能になる。レポーター遺伝子の発現が検出され得、機能的転写因子を含有する細胞コロニーが単離され、ＶＩＳＴＡポリペプチドと相互作用するポリペプチドをコードするクローン化遺伝子を得るために使用され得る。
【０５６７】
〔0598〕  本明細書中に記載のアッセイのうち２以上の組み合わせ。例えば、細胞に基づく又は細胞不含アッセイを用いて調整剤が同定され得、その薬剤のＶＩＳＴＡポリペプチド活性調整能がインビボで、例えば細胞性形質転換及び／又は腫瘍形成に対する動物モデルなどの動物において確認され得る。
【０５６８】
〔0599〕  本発明はさらに、上記スクリーニングアッセイにより同定される新規薬剤に関する。適切な動物モデルで本明細書中に記載の方法において同定されるような薬剤。例えば、本明細書中で記載のように同定される薬剤（例えばＶＩＳＴＡ調整剤、アンチセンスＶＩＳＴＡ核酸分子、ＶＩＳＴＡ特異的な抗体又はＶＩＳＴＡ結合パートナー）での処置の有効性、毒性又は副作用を決定するために、動物モデルにおいて、このような薬剤が使用され得る。あるいは、動物モデルにおいて本明細書中で記載のように同定される薬剤の作用機構を調べるために、動物モデルにおいてこのような薬剤が使用され得る。さらに、本発明は、本明細書中で記載のような処置に対する上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規薬剤の使用に関する。
【０５６９】
検出アッセイ
〔0600〕  ポリヌクレオチド試薬として多くの方法において、本明細書中で同定されるｃＤＮＡ配列の一部分又は断片（及び対応する完全遺伝子配列）が使用され得る。例えば、これらの配列を使用して、（ｉ）染色体上でそれらの個々の遺伝子をマッピングし；従って遺伝疾患に関連する遺伝子領域を探し；（ｉｉ）微小な生体試料から個々を同定し（組織タイピング）；（ｉｉｉ）生体試料の法鑑定に役立たせ得る。これらの適用は、下記のサブセクションに記載する。
【０５７０】
染色体マッピング
〔0601〕  遺伝子の配列（又は配列の一部分）が単離されたら、染色体上で遺伝子の位置
をマッピングするためにこの配列が使用され得る。この過程を染色体マッピングと呼ぶ。従って、染色体上でＶＩＳＴＡ遺伝子の位置をマッピングするために、本明細書中に記載のＶＩＳＴＡヌクレオチド配列の一部分又は断片が使用され得る。染色体に対するＶＩＳＴＡ配列のマッピングは、これらの配列を疾患と関連する遺伝子と相関させることにおいて重要な第一段階である。簡潔に述べると、ＶＩＳＴＡヌクレオチド配列からＰＣＲプライマー（好ましくは１５から２５ｂｐ長）を調製することによって、染色体に対してＶＩＳＴＡ遺伝子をマッピングし得る。ゲノムＤＮＡの１個のエクソンを超えて広がらないプライマーを予想するために、ＶＩＳＴＡ配列のコンピュータ分析が使用され得、従って増幅過程が複雑になる。次に、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに対して、これらのプライマーを使用し得る。ＶＩＳＴＡ配列に対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが増幅断片を生じる。異なる哺乳動物からの体細胞（例えばヒト及びマウス細胞）を融合させることによって、体細胞ハイブリッドを調製する。ヒト及びマウス細胞のハイブリッドが増殖し、分裂する際、これらは徐々に無作為な順序でヒト染色体を失うが、マウス染色体を保持する。マウス細胞が特定の酵素を欠くためにマウス細胞が増殖できないがヒト細胞は増殖できる培地を用いることによって、必要とされる酵素をコードする遺伝子を含有する１つのヒト染色体が保持される。様々な培地を用いることによって、ハイブリッド細胞株のパネルを確立し得る。パネル中の各細胞株は、単一のヒト染色体又は少数のヒト染色体の何れか及びマウス染色体のフルセットを含有し、それにより特異的なヒト染色体に対する個々の遺伝子のマッピングが容易になる。Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：９１９−９２４。ヒト染色体の断片のみを含有する体細胞ハイブリッドはまた、転座及び欠失を有するヒト染色体を用いることによっても作製され得る。
【０５７１】
〔0602〕  体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に対して特定の配列を割り当てるための迅速な手順である。１台のサーマルサークラーを用いて１日に３以上の配列を割り当て得る。オリゴヌクレオチドプライマーを設計するためにＶＩＳＴＡヌクレオチド配列を用いて、特異的な染色体からの断片のパネルにより、亜局在化を達成し得る。その染色体にＶＩＳＴＡ配列をマッピングするために同様に使用され得る他のマッピングストラテジーとしては、インシトゥハイブリッド形成（Ｆａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６２２３−２７に記載）、標識されたフロー選別染色体でのプレスクリーニング及び染色体特異的なｃＤＮＡライブラリに対するハイブリッド形成によるプレ選択が挙げられる。
【０５７２】
〔0603〕  ある段階において的確な染色体の位置を提供するために、分裂中期染色体スプレッドに対するＤＮＡ配列の蛍光インシトゥハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）がさらに使用され得る。紡錘体を破壊するコルセミドなどの化学物質により分裂中期で分裂が遮断された細胞を用いて、染色体スプレッドが作製され得る。トリプシンで染色体を短時間処理し、次いでギムザで染色し得る。染色体が個々に同定され得るように、明暗バンドのパターンが各染色体で発色する。５００又は６００塩基という短いＤＮＡ配列を用いてＦＩＳＨ技術を使用し得る。しかし、１，０００塩基より大きいクローンは、単純な検出のために十分なシグナル強度で特有の染色体位置に結合する可能性がより高い。好ましくは１，０００塩基及びより好ましくは２，０００塩基は、理にかなった時間量で良好な結果を得るのに十分であろう。この技術の概説として、Ｖｅｒｍａ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８８）を参照。１つの染色体又は染色体上の１つの部位をマークするために染色体マッピング用の試薬を個々に使用し得るか、又は複数部位及び／又は複数染色体をマークするために試薬のパネルを使用し得る。遺伝子の非コード領域に対応する試薬は実際にマッピング目的に好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内で保存的である可能性がより高く、従って染色体マッピング中に交差ハイブリッド形成の機会が増加する。
【０５７３】
〔0604〕  的確な染色体位置に配列がマッピングされたら、染色体上のその配列の物理的位置を遺伝マップデータと相関させ得る。最終的に、突然変異の存在を確認するために、及び多型性からの突然変異を区別するために、いくつかの個体からの遺伝子の完全配列決定を行い得る。
【０５７４】
組織タイピング
〔0605〕  微小な生体試料から個体を同定するためにも、本発明のＶＩＳＴＡ配列が使用され得る。さらに、個体のゲノムの選択部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を決定する代替技術を提供するために、本発明の配列が使用され得る。従って、本明細書中に記載のＶＩＳＴＡヌクレオチド配列は、配列の５’及び３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製するために使用され得る。次に、個体のＤＮＡを増幅するためにこれらのプライマーを使用し、続いてそれを配列決定し得る。
【０５７５】
〔0606〕  各個体が対立遺伝子の差異ゆえに特有の一連のこのようなＤＮＡ配列を有するので、このようにして調製される個体からの対応するＤＮＡ配列のパネルは、特有の個々の同定を提供し得る。個体から、及び組織から、このような同定配列を得るために、本発明の配列が使用され得る。本発明のＶＩＳＴＡヌクレオチド配列は独自にヒトゲノムの一部分に相当する。これらの配列のコード領域においてある程度まで対立遺伝子変異が起こり、非コード領域においてより大きい度合いで変異が起こる。個々のヒトの間の対立遺伝子変異が各５００塩基あたり約１個の頻度で起こると推定される。同定目的のために個体からのＤＮＡを比較し得る標準物質として本明細書中に記載の配列のそれぞれをある程度まで使用し得る。より多数の多型性が非コード領域で起こるので、個体を識別するために必要であるのはより少ない配列である。配列番号１又は４の非コード配列は、それぞれが１００塩基の非コード増幅配列を生じるおそらく１０から１，０００プライマーのパネルを用いて陽性個体の識別を十分に提供し得る。配列番号３又は６の配列など、予想されるコード配列が使用される場合、陽性個体の同定に対してより適切な数のプライマーは５００から２０００である。
【０５７６】
〔0607〕  個体に対する一意的な同定データベースを作製するために本明細書中に記載のＶＩＳＴＡヌクレオチド配列からの試薬のパネルが使用される場合、その個体からの組織を同定するために、これらの同じ試薬が後に使用され得る。一意的な同定データベースを用いて、非常に小さい組織試料から、生存しているか又は死亡している個体の陽性同定が行われ得る。
【０５７７】
法生物学におけるＶＩＳＴＡ配列の使用
〔0608〕  法生物学においてもＤＮＡに基づく同定技術が使用され得る。ヒトゲノムにおける特異的な遺伝子座に標的化される、ポリヌクレオチド試薬、例えばＰＣＲプライマーを提供するために、本発明の配列が使用され得、これは、例えば別の「同定マーカー」（即ち特定の個体に特有である別のＤＮＡ配列）を提供することによって、ＤＮＡに基づく法鑑定の信頼性を促進し得る。上述のように、制限酵素産生断片により形成されるパターンに対する的確な代替物として、同定のために、実際の塩基配列情報が使用され得る。配列番号１又は３の非コード領域に標的化された配列は、非コード領域でより多数の多型性が起こるので、この使用に特に適切であり、これにより、この技術を用いて個体を識別することがより容易になる。ポリヌクレオチド試薬の例としては、ＶＩＳＴＡヌクレオチド配列又はその一部分、例えば少なくとも２０塩基、好ましくは少なくとも３０塩基の長さを有する配列番号１又は３の非コード領域由来の断片が挙げられる。具体的な組織、例えばリンパ球を同定するために例えばインシトゥハイブリッド形成技術において使用され得る、ポリヌクレオチド試薬、例えば標識される又は標識可能プローブを提供するために、本明細書中に記載のＶＩＳＴＡヌクレオチド配列がさらに使用され得る。これは、法医学
病理医に未知の起源の組織が与えられる場合、非常に有用であり得る。このようなＶＩＳＴＡプローブのパネルは、種により及び／又は器官型により組織を同定するために使用され得る。同様の方式で、夾雑について組織培養物をスクリーニング（即ち培養物中の異なる型の細胞の混合物の存在についてのスクリーニング）するために、これらの試薬、例えばＶＩＳＴＡプライマー又はプローブが使用され得る。
【０５７８】
診断アッセイ
〔0609〕  生体試料中のＶＩＳＴＡポリペプチド又は核酸の有無を検出するための代表的な方法は、試験対象から生体試料を得て、生体試料中でＶＩＳＴＡポリペプチド又は核酸の存在が検出されるように、生体試料と、ＶＩＳＴＡポリペプチドをコードするＶＩＳＴＡポリペプチド又は核酸（例えばｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ）を検出可能な化合物又は薬剤を接触させることを伴う。ＶＩＳＴＡ  ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを検出する好ましい薬剤は、ＶＩＳＴＡ  ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡにハイブリッド形成可能である、標識化核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号１又は３で示されるＶＩＳＴＡ核酸又はその一部分、例えば少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０又は５００ヌクレオチド長の、及びストリンジェントな条件下でＶＩＳＴＡ  ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡに特異的にハイブリッド形成するために十分なオリゴヌクレオチドなどであり得る。本発明の診断アッセイでの使用のための他の適切なプローブは、本明細書中に記載されている。ＶＩＳＴＡポリペプチドを検出するための好ましい薬剤は、ＶＩＳＴＡポリペプチドに結合可能な抗体、好ましくは検出可能な標識がある抗体である。抗体は、ポリクローナル又はより好ましくはモノクローナルであり得る。無傷抗体又はその断片（例えばＦａｂ又はＦ（ａｂ’）2）を使用し得る。プローブ又は抗体に関して「標識される」という用
語は、プローブ又は抗体に検出可能な物質をカップリング（即ち物理的に連結）することによるプローブ又は抗体の直接的標識ならびに、直接的に標識される別の試薬との反応性によるプローブ又は抗体の間接的標識を包含するものとする。間接的標識の例としては、それが蛍光標識されるストレプトアビジンで検出され得るように蛍光標識される二次抗体及びビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識を用いた、一次抗体の検出が挙げられる。「生体試料」という用語は、対象から単離される、組織、細胞及び体液ならびに対象内に存在する、組織、細胞及び液体を含むものとする。即ち、インビトロならびにインビボで生体試料中でＶＩＳＴＡ  ｍＲＮＡ、ポリペプチド又はゲノムＤＮＡを検出するために、本発明の検出方法が使用され得る。例えば、ＰＤ−Ｌ２  ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリッド形成及びインシトゥハイブリッド形成が挙げられる。ＶＩＳＴＡポリペプチドの検出のためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降及び免疫蛍光が挙げられる。ＶＩＳＴＡゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、サザンハイブリッド形成が挙げられる。さらに、ＶＩＳＴＡポリペプチドの検出のためのインビボ技術としては、標識される抗ＶＩＳＴＡ抗体を対象に導入することが挙げられる。例えば、標準的なイメージング技術によって対象における存在及び位置を検出することができる放射性マーカーで本抗体が標識され得る。ある実施形態において、生体試料は、試験対象からのポリペプチド分子を含有する。あるいは生体試料は、試験対象からのｍＲＮＡ分子又は試験対象からのゲノムＤＮＡ分子を含有し得る。好ましい生体試料は、対象から従来の手段により単離された血清試料である。別の実施形態において、本方法は、対照対象から対照生体試料を得て、生体試料中でＶＩＳＴＡポリペプチド、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの存在が検出されるように、ＶＩＳＴＡポリペプチド、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを検出可能な化合物又は薬剤に対照試料を接触させ、対照試料中のＶＩＳＴＡポリペプチド、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの存在を試験試料中でのＶＩＳＴＡポリペプチド、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの存在と比較することをさらに伴う。
【０５７９】
〔0610〕  本発明はまた、生体試料中でのＶＩＳＴＡの存在を検出するためのキットも包含する。例えば、本キットは、生体試料中のＶＩＳＴＡポリペプチド又はｍＲＮＡを検
出可能な、標識される化合物又は薬剤；生体試料中で検出可能な薬剤；試料中のＶＩＳＴＡの量を決定するための手段；及び試料中のＶＩＳＴＡの量を標準物質と比較するための手段を具備し得る。適切な容器中で本化合物又は薬剤をパッケージ化し得る。本キットは、ＶＩＳＴＡポリペプチド又は核酸を検出するためのキットを使用するための説明書をさらに具備し得る。
【０５８０】
予後アッセイ
〔0611〕  異常な又は好ましくないＶＩＳＴＡ発現又は活性と関連する疾患又は障害を有するか又は発現するリスクがある対象を同定するために、本明細書中に記載の診断方法がさらに利用され得る。本明細書中で使用される場合、「異常な」という用語は、野生型ＶＩＳＴＡ発現又は活性から逸脱するＶＩＳＴＡ発現又は活性を含む。異常な発現又は活性は、発現又は活性の増減ならびに、発現の野生型発生パターン又は発現のサブ細胞性パターンに従わない発現又は活性を含む。例えば、異常なＶＩＳＴＡ発現又は活性は、ＶＩＳＴＡ遺伝子における突然変異により、ＶＩＳＴＡ遺伝子が下方発現又は過剰発現されるケース及び非機能ＶＩＳＴＡポリペプチド又はこのような突然変異の結果、野生型のように機能しないポリペプチド、例えばＶＩＳＴＡ結合パートナーと相互作用しないポリペプチド又は非ＶＩＳＴＡ結合パートナーと相互作用するものが生じる状況を含むものとする。本明細書中で使用される場合、「好ましくない」という用語は、免疫細胞活性化などの生物学的反応に関与する好ましくない現象を含む。例えば、好ましくないという用語は、対象において好ましくないＶＩＳＴＡ発現又は活性を含む。
【０５８１】
〔0612〕  自己免疫障害、免疫不全症障害、自己免疫性などの免疫系障害、アレルギー性又は炎症性障害又は癌など、ＶＩＳＴＡポリペプチド活性又は核酸発現の誤制御と関連する障害を有するか又はその発現リスクがある対象を同定するために、先行する診断アッセイ又は次のアッセイなど、本明細書中に記載のアッセイが利用され得る。従って、本発明は、試験試料が対象から得られ、ＶＩＳＴＡポリペプチド又は核酸（例えばｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ）が検出される、異常な又は好ましくないＶＩＳＴＡ発現又は活性が関連する疾患又は障害を同定するための方法を提供し、ＶＩＳＴＡポリペプチド又は核酸の存在は、異常な又は好ましくないＶＩＳＴＡ発現又は活性と関連する疾患又は障害を有するか又はその発現リスクがある対象に対する診断である。本明細書中で使用される場合、「試験試料」は、関心のある対象から得られる生体試料を指す。例えば、試験試料は体液（例えば脳脊髄液又は血清）、細胞試料又は組織であり得る。
【０５８２】
〔0613〕  さらに、異常な又は好ましくないＶＩＳＴＡ発現又は活性と関連する疾患又は障害を処置するために対象に薬剤（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、ポリペプチド、ペプチド、核酸、低分子又は他の薬物候補）が投与され得るか否かを決定するために、本明細書中に記載の予後アッセイが使用され得る。例えば、対象が自己免疫障害、免疫不全症障害、免疫系癌又はアレルギー性又は炎症性障害のための薬剤で効果的に処置され得るか否かを決定するためにこのような方法が使用され得る。従って、本発明は、試験試料が得られ、ＶＩＳＴＡポリペプチド又は核酸発現又は活性が検出される対象が、異常な又は好ましくないＶＩＳＴＡ発現又は活性が関連する障害に対する薬剤で効果的に処置され得るか否かを決定するための方法を提供する（例えばＶＩＳＴＡポリペプチド又は核酸発現又は活性の存在量は、異常な又は好ましくないＶＩＳＴＡ発現又は活性が関連する障害を処置するための薬剤を投与され得る対象に対する診断である。）。本発明の方法はまた、ＶＩＳＴＡ遺伝子における遺伝子変異を検出し、それによって改変遺伝子がある対象が、自己免疫障害、免疫不全症障害、免疫系癌、アレルギー性障害又は炎症性障害など、ＶＩＳＴＡポリペプチド活性又は核酸発現での誤制御を特徴とする障害に対するリスクがあるか否かを決定するためにも使用され得る。例えば、例えばＶＩＳＴＡ遺伝子を伴う疾患もしくは疾病の症状又は家族歴を示す患者を診断するための臨床設定において、都合よく使用され得る、少なくとも１つのプローブ核酸又は本明細書中に記載の
抗体試薬を具備する予めパッケージ化された診断キットを利用することによって、本明細書中に記載の方法を行い得る。さらに、ＶＩＳＴＡが発現されるあらゆる細胞型又は組織が本明細書中に記載の予後アッセイにおいて利用され得る。
【０５８３】
免疫アッセイ
〔0614〕  試料中のマーカーを質的又は定量的に検出し、分析するための免疫アッセイにおいて、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物に結合する抗体及び抗原結合断片が使用され得る。この方法は、ＶＩＳＴＡ又はＶＩＳＴＡ複合物に特異的に結合する抗体を提供し：試料を抗体と接触させ；試料中でマーカーと結合した抗体の複合体の存在を検出することを具備する。
【０５８４】
〔0615〕  よく認められている免疫学的結合アッセイの多くのうち何れかを用いてＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を検出及び／又は定量し得る。有用なアッセイとしては、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロットアッセイ又はスロットブロットアッセイが挙げられる。例えば米国特許第４，３６６，２４１号；同第４，３７６，１１０号；同第４，５１７，２８８号；及び同第４，８３７，１６８号を参照。一般に、対象から得られる試料をＶＩＳＴＡ又はＶＩＳＴＡ複合物と特異的に結合する抗体と接触させ得る。
【０５８５】
〔0616〕  場合によっては、抗体を試料と接触させる前に、洗浄及び続く複合体の単離を促進するために、本抗体を固体支持体に固定し得る。固体支持体の例としては、例えばマイクロタイタープレート、スティック、ビーズ又はマイクロビーズの形態のガラス又はプラスチックが挙げられるが限定されない。抗体を固体支持体に連結させ得る。
【０５８６】
〔0617〕  試料を抗体と温置した後、混合物を洗浄し、形成された抗体−マーカー複合体を検出し得る。洗浄した混合物を検出試薬と温置することによって、これを遂行し得る。あるいは、例えば、結合マーカー特異的な抗体を検出するために第二の標識された抗体が使用される間接的アッセイを用いて及び／又は、例えばマーカーの異なるエピトープに結合するモノクローナル抗体を混合物と同時に温置する競合又は阻害アッセイにおいて、試料中のマーカーを検出し得る。
【０５８７】
〔0618〕  アッセイを通して、試薬の各組み合わせ後に温置及び／又は洗浄段階を必要とし得る。温置段階は、約５秒間から数時間、好ましくは約５分間から約２４時間まで変動し得る。しかし、温置時間は、アッセイ方式、マーカー、溶液の体積、濃度に依存する。通常、アッセイは周囲温度で行われるが、ある範囲の温度（例えば１０℃から４０℃）にわたりこれらを行い得る。
【０５８８】
〔0619〕  対象からの試料中のマーカーの試験料を決定するために、免疫アッセイが使用され得る。最初に、試料中のマーカーの試験量は、上記の免疫アッセイ法を用いて検出され得る。試料中にマーカーが存在する場合、これは、上記の適切な温置条件下でマーカーと特異的に結合する抗体とともに抗体−マーカー複合体を形成する。抗体−マーカー複合体の量は、場合によっては、標準物質と比較することによって決定され得る。測定単位が対照量及び／又はシグナルに対して比較され得る限り、上記のように、絶対単位でマーカーの試験量を測定する必要はない。いくつかの免疫アッセイが当技術分野で公知であり、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、磁気免疫アッセイ、免疫ブロット、ウエスタンブロット、免疫沈降アッセイ、免疫組織化学分析及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含むが限定されないこのような免疫アッセイにおいて、本明細書中に記載のＶＩＳＴＡポリペプチド又はＶＩＳＴＡ複合物が使用され得る。Ｗｉｌｄ、（２００８）［Ｅｄ．］Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ［３rd  Ｅｄ．］Ｅｌｓｅｖｉｅｒを参照。
【０５８９】
放射線イメージング法
〔0620〕  膵臓及び結腸直腸癌を含む癌を診断するために又は腫瘍の進行を監視するために、放射線イメージング法においてＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物が使用され得る。これらの方法としては、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）が挙げられるが限定されない。これらの技術は両方とも非侵襲性であり、多岐にわたる組織事象及び／又は機能を検出及び／又は測定するために、例えば癌性細胞を検出するなどのために、使用され得る。場合によっては同時に２種類の標識を用いてＳＰＥＣＴが使用され得る。米国特許第６，６９６，６８６号を参照。
【０５９０】
実用化及び方法
〔0621〕  本発明は、市販量に到達させるためのＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物の産生をさらに提供する。ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を大規模で作製し、必要に応じて保存し、病院、臨床医又は他の医療施設に供給し得る。
【０５９１】
〔0622〕  本明細書中で開示される方法によって、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物の生産、保存及び分布の方法を作製し得る。生産後、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を回収し、精製し、場合によっては患者の処置前に保存し得る。例えば患者が例えば癌、自己免疫疾患又は炎症性状態などの適応症を呈したら、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物が適時に注文され、提供され得る。従って、本発明は、市販規模で抗体を得るためにＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を生産する方法、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物に選択的に結合する抗体及びその抗原結合断片を具備する医薬組成物、ならびに病院及び臨床医にＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物を提供する（即ち生産する、場合によっては保存し、販売する）方法に関する。市販の使用のためにＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ複合物の生産規模を拡大し得る。
【０５９２】
〔0623〕  本発明はまた、販売のために調製物を流通させるための流通系を確立することを具備する、医薬ビジネスを行う方法も提供するか、又は医薬調製物を市販するための販売グループを確立することを含み得る。
【０５９３】
核酸のライブラリ
〔0624〕  核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発によって、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）変異体の変化に富むライブラリが作製され得、これは、変化に富む遺伝子ライブラリによりコードされ得る。例えば、潜在的なＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして又はあるいは、そこに一連のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）配列を含有する一連の１つのより大きな融合タンパク質（例えばファージディスプレイ用）として発現可能なように、酵素により合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に連結することによって、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）変異体の変化に富む遺伝子ライブラリが作製され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）変異体のライブラリを作製するために使用し得る様々な方法がある。自動ＤＮＡ合成装置において縮重遺伝子配列の化学合成を行い得、次に合成遺伝子を適切な発現ベクターに連結する。遺伝子の縮重セットの使用によって、１つの混合物中で潜在的なＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）配列の所望のセットをコードする配列全てを提供できるようになる。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当技術分野で公知である。例えばＮａｒａｎｇ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照。
【０５９４】
〔0625〕  さらに、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドの変異体のスクリーニング及
び続く選択のためのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）断片の変化に富む集団を作製するために、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドコード配列の断片のライブラリが使用され得る。分子あたり約１回のみニック生成が起こる条件下でヌクレアーゼによりＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）コード配列の２本鎖ＰＣＲ断片を処理し、２本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを復元して様々なニック入り生成物からのセンス／アンチセンス対を含み得る２本鎖ＤＮＡを形成させ、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理によって再形成２本鎖から１本鎖部分を除去し、得られた断片ライブラリを発現ベクターに連結することによって、コード配列断片のライブラリが作製され得る。この方法によって、発現ライブラリは、Ｎ末端、Ｃ末端及びＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドの様々なサイズの内部断片をコードするもの由来のものとなり得る。
【０５９５】
〔0626〕  点突然変異又は短縮化により作製されるコンビナトリアルライブラリの遺伝子産物をスクリーニングするために、及び選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために、いくつかの技術が当技術分野で公知である。このような技術は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）ポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発により作製される遺伝子ライブラリの迅速なスクリーニングに適応可能である。大きな遺伝子ライブラリをスクリーニングするためのハイスループット分析に適している、最も広く使用される技術は、一般に、遺伝子ライブラリを複製可能な発現ベクターにクローニングすること、得られたベクターライブラリで適切な細胞を形質転換すること及び所望の活性の検出が、生成物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離を促進する条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）変異体を同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて、ライブラリにおける機能突然変異体の頻度を向上させる新しい技術であるリカーシブアンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）を使用し得る。Ａｒｋｉｎ及びＹｏｕｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌａｇｒａｖｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．６（３）：３２７−３３１。
【０５９６】
予測医療
〔0627〕  本発明はまた、それにより個体を予防的に処置するための予後診断（予測）目的のために診断アッセイ、予後アッセイ及びモニタリング臨床治験が使用される予測医療の分野にも関する。従って、本発明のある態様は、生体試料（例えば血液、血清、細胞又は組織）に関してＶＩＳＴＡポリペプチド及び／又は核酸発現ならびにＶＩＳＴＡ活性を決定し、それにより個体が、異常な又は好ましくないＶＩＳＴＡ発現又は活性が関連する疾患又は障害に罹患しているか否か、又はそのような障害を発現するリスクがあるか否かを決定するための診断アッセイに関する。本発明はまた、個体が、ＶＩＳＴＡポリペプチド、核酸発現又は活性が関連する障害を発現するリスクがあるか否かを決定するための予後（又は予測）アッセイも提供する。例えば、生体試料中でＶＩＳＴＡ遺伝子中の突然変異をアッセイし得る。ＶＩＳＴＡポリペプチド、核酸発現又は活性を特徴とするかそれが関連する障害の発症前にそれにより個体を予防的に処置するための予後又は予測目的のために、このようなアッセイを使用し得る。
【０５９７】
〔0628〕  本発明の別の実施形態は、臨床治験でＶＩＳＴＡの発現又は活性における薬剤（例えば薬物、化合物）の影響を監視することに関する。これら及び他の薬剤は、次のセクションでさらに詳細に記載する。
【０５９８】
臨床治験中の効果の監視
〔0629〕  ＶＩＳＴＡポリペプチドの発現又は活性における薬剤（例えば薬物）の影響を監視すること（例えば細胞増殖及び／又は遊走の調整）は、基礎的な薬物スクリーニングだけでなく臨床治験にも適用され得る。例えば、ＶＩＳＴＡ遺伝子発現、ポリペプチドレベル低下を示すか又はＶＩＳＴＡ活性が下方制御されている対照の臨床治験において、Ｖ
ＩＳＴＡ遺伝子発現、ポリペプチドレベルを上昇させるか又はＶＩＳＴＡ活性を上方制御するための本明細書中で記載のようなスクリーニングアッセイにより決定される薬剤の有効性を監視し得る。あるいは、ＶＩＳＴＡ遺伝子発現、ポリペプチドレベル又はＶＩＳＴＡ活性上昇を示す対照の臨床治験において、ＶＩＳＴＡ遺伝子発現、ポリペプチドレベルを低下させるか又はＶＩＳＴＡ活性を下方制御するためのスクリーニングアッセイにより決定される薬剤の有効性を監視し得る。述べられるように、ＶＩＳＴＡは、ＡＰＣ（マクロファージ及び骨髄樹状細胞）及びＣＤ４＋Ｔ細胞を含む多くの造血細胞型において発現され、より具体的には、ＣＤ１１ｃ+ＤＣ、ＣＤ４+Ｔ細胞（Ｆｏｘｐ３-エフェクターＴ
細胞及びＦｏｘｐ３+ｎＴｒｅｇｓの両方を含む。）、ＣＤ８+Ｔ細胞及びＧｒ１+顆粒球
において発現され、Ｂ細胞及びＮＫ細胞では低レベルで発現される。このような臨床治験において、ＶＩＳＴＡ遺伝子及び好ましくは例えばＶＩＳＴＡ−関連障害に関わっている他の遺伝子の発現又は活性は、「読み出し情報」又は特定細胞の表現型のマーカーとして使用され得る。
【０５９９】
〔0630〕  例えば、限定するものではないが、ＶＩＳＴＡ活性を調整する薬剤（例えば化合物、薬物又は低分子）（例えば本明細書中で記載のようなスクリーニングアッセイで同定される。）での処理により細胞中で調整されるＶＩＳＴＡを含む遺伝子が同定され得る。従って、ＶＩＳＴＡ関連障害における薬剤の効果を試験するために、例えば臨床治験において、細胞を単離し、ＲＮＡを調製し、ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ関連障害に関わる他の遺伝子の発現レベルについてそれぞれ分析し得る。本明細書中で記載のようなノーザンブロット分析又はＲＴ−ＰＣＲによって、又はあるいは本明細書中で記載のような方法のうち１つにより、産生されるポリペプチド量を測定することによって、又はＶＩＳＴＡ又は他の遺伝子の活性レベルを測定することによって、遺伝子発現レベル（例えば遺伝子発現パターン）を定量し得る。このようにして、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理的反応を示す、マーカーとなり得る。従って、この反応状態は、薬剤での個体の処置前、処置中の様々な時点で決定され得る。実施形態において、本発明は、（ｉ）薬剤投与前に対象から投与前試料を入手し；（ｉｉ）投与前試料中の、ＶＩＳＴＡポリペプチド、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの発現レベルを検出し；（ｉｉｉ）対象から１以上の投与後試料を入手し；（ｉｖ）投与後試料中のＶＩＳＴＡポリペプチド、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの発現又は活性レベルを検出し；（ｖ）投与前試料中のＶＩＳＴＡポリペプチド、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの発現又は活性レベルを投与後試料中のＶＩＳＴＡポリペプチド、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡと比較し；（ｖｉ）それに従い対象への薬剤の投与を変更する段階を含む、薬剤（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、ポリペプチド、ペプチド、核酸、低分子又は本明細書中に記載のスクリーニングアッセイにより同定される他の薬物候補）での対象の処置の有効性を監視するための方法を提供する。例えば、薬剤投与の増加は、ＶＩＳＴＡの発現又は活性を検出レベルよりも高いレベルに向上させるために、即ち、薬剤の有効性を向上させるために所望され得る。あるいは、薬剤投与の減少は、ＶＩＳＴＡの発現又は活性を検出レベルよりも低いレベルに低下させるために、即ち薬剤の有効性を低下させるために所望され得る。このような実施形態に従うと、観察可能な表現型反応の非存在下でも薬剤の有効性の指標としてＶＩＳＴＡ発現又は活性が使用され得る。
【０６００】
〔0631〕  本願で言及される全ての刊行物（例えば非特許文献）、特許、特許出願公開及び特許出願は、本発明が属する技術分野の当業者の技術レベルを示す。本願で言及される、このような刊行物（例えば非特許文献）、特許、特許出願公開及び特許出願は全て、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願公開又は特許出願が具体的に及び個々に参照により組み込まれることを示すように、参考により同程度に本明細書中に組み込まれる。
【実施例】
【０６０１】
〔0632〕  本発明を広く説明してきたが、単に本発明のある一定の態様及び実施形態の
説明のために含まれるものであり、本発明を限定するものではない次の実施例を参照することによってより容易に理解される。
【０６０２】
実施例１
ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）のクローニング及び配列分析
〔0633〕  休止Ｔｒｅｇ、αＣＤ３により活性化されたＴｒｅｇ及びαＣＤ３／αＧＩＴＲにより活性化されたＴｒｅｇの網羅的な転写プロファイリングによって、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）及びＴｒｅｇ−ｓＴＮＦを同定した。Ｔｒｅｇ上でのＧＩＴＲの誘発が、それらの接触依存性抑制の活性を消滅されることが示されているので、この分析のためにαＧＩＴＲを選択した（Ｓｈｉｍｉｚｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）上出）。それらの特有の発現パターンに基づき、ＡＦＦＩＭＥＴＲＩＸ（登録商標）ＤＮＡアレイにおいて、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）及びＴｒｅｇ−ｓＴＮＦを同定した（表２）。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）は、αＣＤ３活性化Ｔｒｅｇでの発現の上昇を示し、αＧＩＴＲの存在下で発現が低下し；Ｔｒｅｇ−ｓＴＮＦは、αＣＤ３／αＧＩＴＲ依存性の発現上昇を示した。
〔0634〕  一晩培養中に、精製ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を刺激しないか、又はαＣＤ３もしくはαＣＤ３／αＧＩＴＲで刺激し、リアルタイムＰＣＲ分析のためにＲＮＡを単離した。列挙される発現はアクチンに対するものである。
【表２】
2020096628.tif 000003
〔0635〕  活性化と休止ＣＤ２５＋ＣＤ４＋ｎＴｒｅｇｓとのＡＦＦＩＭＥＴＲＩＸ（登録商標）分析から、機能は未知であるが、Ｉｇスーパーファミリーに対して配列相同性がある遺伝子産物（ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ４６３２４２８Ｎ０５又は４６３２４２８Ｎ０５Ｒｉｋ）の発現が明らかになった。
【０６０３】
〔0636〕  より具体的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリから９３０ｂｐ遺伝子産物をクローニングし、これは予想サイズ及び配列と一致した。シリコ−配列及び構造分析から、成熟時に３０９アミノ酸の、１５９アミノ酸の細胞外ドメイン、２２アミノ酸の膜貫通ドメイン及び９５アミノ酸の細胞質テールがある膜貫通タンパク質が予測される（図１Ａ）。アミノ酸配列アラインメントから、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３及びＢ７−Ｈ４などのＢ７ファミリーリガンドならびにＢ７ファミリー受容体（即ちＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ）と相同の細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）−Ｖ様ドメインが明らかとなる（図１Ｂ−Ｃ）。一般にＢ７ファミリーリガンドと受容体との間のＩｇ−Ｖドメインの配列同一性はあまり高くない（＜４０％）ものの、４６３２４２８Ｎ０５ＲｉｋのＩｇ−Ｖドメインは、Ｂ７ファミリーリガンドＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２と最大の相同性を有する。配列アラインメントはまた、Ｂ７ファミリーリガンドの特徴である、鎖内ジスルフィド結合形成に重要であるいくつかの非常に保存的なシステインも明らかにする（図１Ｂ）。図２３ＡからＣ；Ｓｉｃａ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：８４９−８６１も参照。
【０６０４】
〔0637〕  ４６３２４２８Ｎ０５Ｒｉｋの細胞外ドメインは、Ｉｇ−Ｖドメインのみを含有するが、Ｉｇ−Ｃドメインを欠く（図１ＢからＣ）。この特有の特性はＢ７ファミリー受容体の特徴であり、これによって、Ｉｇ−Ｖ及びＩｇ−Ｃドメインの両方を含有する全ての他のＢ７ファミリーリガンドから４６３２４２８Ｎ０５Ｒｉｋが区別される。Ｆｒｅｅｍａｎ（２００８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５：１０２７５−１０２７６；Ｌａｚａｒ−Ｍｏｌｎａｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ  
Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５：１０４８３−１０４８８；Ｌｉｎ，ｅｔ
ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５：３０１１−３０１６；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：６０４−６０８；Ｓｔａｍｐｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：６０８−６１。一貫して、ＰｈｙＭＬアルゴリズム（系統発生学的最尤法）を用いた系統学的分析によって、４６３２４２８Ｎ０５Ｒｉｋは、Ｂ７ファミリーリガンドよりも、Ｂ７ファミリー受容体、特にＰＤ−１と近い進化距離に置かれた（図２）。Ｇｕｉｎｄｏｎ及びＧａｓｃｕｅｌ（２００３）Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  ５２：６９６−７０４。しかし、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の細胞質テールは、Ｂ７ファミリー受容体の特徴的なドメインであるシグナル伝達ドメイン（例えばＩＴＩＭ、ＩＴＡＭ又はＩＴＳＭ）を全く含有しない。Ｓｈａｒｐｅ及びＦｒｅｅｍａｎ（２００２）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１１６−１２６。阻害受容体ＰＤ−１とのその近い進化的関係にも関わらず、４６３２４２８Ｎ０５Ｒｉｋは、Ｂ７リガンドファミリーの新規メンバーに相当する。これらの構造及び系統学的特徴に基づき、この分子をリガンドとしてＰＤ−１−ｅＸｐｒｅｓｓｅｄ（ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３））と名付けた。マウスとヒトオルソログとの間でＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）もまた非常に保存性が高く、７７％の配列同一性を有する（図１Ｄ）。
【０６０５】
〔0638〕  マウスＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）をコードする核酸配列は、本明細書中で配列番号１として示され、マウスＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質配列は配列番号２として示される。
【０６０６】
〔0639〕  ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）のヒト相同体は染色体１０（７２．９Ｍｂ）に位置し、６個のエクソンから構成され、それによって３１１残基タンパク質をコードする４６８９塩基長の転写産物が生成される。ヒト相同体ｍＲＮＡコード配列はＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿０２２１５３で提供され、タンパク質配列はＮＰ＿０７１４３６として与える。ヒトＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）をコードする核酸配列は本明細書中で配列番号３として示され、ヒトＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質配列は配列番号４として示される。マウス及びヒト遺伝子は７４％相同性を共有し、タンパク質レベルで６８％同一である。染色体２０上でラットゥス・ノルベジクス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（２７．７Ｍｂ；ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＢＣ０９８７２３）ならびにフグ・ルブリぺス（Ｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ）及びダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）においも相同体が同定された。ある実施形態において、本発明のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質は、配列番号５で示される共通のアミノ酸配列を共有する。ＶＩＳＴＡのさらなるオルソログが同定されており、図２３Ｃにおいて例えば（配列番号１７）、ヒト（配列番号１６）、カンガルー（配列番号１８）、イルカ（配列番号１９）、ニワトリ（配列番号２０）、ツメガエル（配列番号２１）、キンカチョウ（配列番号２２）、ゼブラフィッシュ及びフグ（配列番号２３）で示される。
【０６０７】
実施例２
ＲＴ−ＰＣＲ分析及びフローサイトメトリーによるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の発現実験
〔0640〕  マウス組織においてＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）のｍＲＮＡ発現パターンを決定するために、ＲＴ−ＰＣＲ分析を使用した（図３Ａ）。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）は、造血組織（脾臓、胸腺、骨髄）又は豊富な白血球浸潤がある組織（即ち肺）で殆ど発現される。非造血組織（即ち心臓、腎臓、脳及び卵巣）でも弱い発現が検出された。いくつかの造血細胞型の分析から、腹膜マクロファージ、脾臓ＣＤ１１ｂ＋単球、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の発現が明らかになるが、Ｂ細胞上では発現レベルがより低い（図３Ｂ）。この発現パターンはまた、ＧＮＦ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）遺伝子アレイデータベース、ならびにＮＣＢＩ  ＧＥＯ（遺伝子発現オムニバス）データベースとも大部分一致する（図３ＡからＤ）。Ｓｕ，ｅｔ
ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：４４６５−４４７０を参照。
【０６０８】
〔0641〕  タンパク質発現を研究するために、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）特異的なハムスター８Ｄ８及び６Ｅ７モノクローナル抗体を作製した。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−過剰発現マウスＥＬ４  Ｔ細胞上での染色が陽性であるがＰＤ−Ｌ１−過剰発現ＥＬ４  Ｔ細胞上での染色が陰性であることによって特異性が明らかになる（図５）。
【０６０９】
〔0642〕  ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）に対してポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方を産生させた。ウサギ抗ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）抗体を用いたところ、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）タンパク質はリンパ系器官に局在化し、脳組織で顕著に見られた。同定されたモノクローナル抗体のうち、αＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）クローン８Ｄ８の特異性をさらに評価した。この分析において、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）及びｈｌｇを含むＰＤ−Ｌ様−Ｉｇ融合タンパク質分子のパネルに対する結合についてクローン８Ｄ８を試験した。この分析の結果から、８Ｄ８αＰＤＬ−３がＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）に対して非常に特異的であることが示された。
【０６１０】
〔0643〕  具体的に、抗ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）モノクローナル抗体クローン８Ｄ８を用いて、フローサイトメトリーにより、造血細胞上でＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現を分析した。ＣＤ４＋ｎＴｒｅｇｓを区別するために、Ｆｏｘｐ３ＧＦＰノックインレポーターマウスを使用した。末梢リンパ系器官（脾臓及びリンパ節）において、全てのＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット上で顕著な発現が見られ（総ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＦｏｘｐ３−ナイーブＴ細胞及びＦｏｘｐ３＋ｎＴｒｅｇ細胞及びメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞を参照）、一方でＣＤ８＋Ｔ細胞が発現する表面ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）量は非常に低い（図３Ｃ）。胸腺において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性胸腺細胞上で陰性であり、ＣＤ４単陽性細胞上では低く、ＣＤ８単陽性細胞上で検出可能である。次に、Ｆ４／８０マクロファージ及び骨髄ＣＤ１１ｃ＋ＤＣの両方を含む、脾臓及び腹膜細胞の両方に対して、高ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現とＣＤ１１ｂマーカーとの強い相関が見られ得る（図３ＤからＥ）。一方で、Ｂ細胞及びＮＫ細胞は、殆どＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現に対して陰性である。Ｇｒ−１＋顆粒球のうちごく一部もＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）を発現する（図３Ｆ）。
【０６１１】
〔0644〕  異なるリンパ系器官からの同じ系列の細胞において差次的発現パターンが示される（図３Ｇ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ１１ｂ中間型単球の場合、発現レベルは、腸間膜リンパ節＞末梢ＬＮ及び脾臓＞腹膜腔及び血液のパターンに従う。このパターンは、ＣＤ１１ｂｈｉ細胞に対してはあまり顕著ではない。このデータは、ある種の細胞型でのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現が細胞成熟及び／又は組織微小環境により制御され得ることを示唆する。
【０６１２】
〔0645〕  新鮮単離細胞に加えて、活性化するか又は活性化せずに、インビトロ培養において脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ１１ｂｈｉ単球及びＣＤ１１ｃ＋ＤＣ上でＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現を分析した（図６）。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）及び他のＢ７ファミリーリガンド（例えばＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３及びＢ７−Ｈ４）の発現に対して分析する前に２４時間、培地とともに、又は抗ＣＤ３とともに（Ｔ細胞活性化のため）、又はＩＦＮγ及びＬＰＳとともに（単球及びＤＣ活性化のため）、脾臓細胞を培養した。この比較から、これらの分子間での特徴的な発現パターンが明らかとなった。活性化状況に関わらず、インビトロ培養時に全細胞型でＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現が急速に失われる。その一方、ＰＤ−Ｌ１発現は、刺激時にＣＤ４＋Ｔ細胞上で、又は培地単独中での培養時にＣＤ１１ｂｈｉ単球及びＣＤ１１ｃ＋ＤＣ上で、上方制御され、刺激があると
さらに促進された。ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３及びＢ７−Ｈ４の発現は、使用した培養条件下で顕著ではない。インビトロでのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現の喪失は、他のＢ７ファミリーリガンドと比較した場合に特有であるが、組織微小環境を模倣できない非最適培養条件を反映し得る。
【０６１３】
〔0646〕  インビボでＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現がどのように制御され得るかということに対処するために、ＣＤ４  ＴＣＲトランスジェニックマウスＤＯ１１．１０に完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化させた同種抗原ニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）を用いて免疫付与した。免疫付与から２４時間後、流入領域リンパ節からの細胞をＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現について分析した（図７Ａ）。アジュバント単独ではない抗原（ＣＦＡ／ＯＶＡ）での免疫付与は、Ｆ４／８０＋マクロファージ及びＣＤ１１ｃ＋ＤＣの混合集団を含有したＣＤ１１ｂ＋ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）＋骨髄細胞集団を劇的に増加させた。ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２とのさらなる比較から、ＰＤ−Ｌ１が最大の構成的発現レベルを有しても、炎症性免疫反応中にＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）が最もよく上方制御されることが明らかになる（図７Ｂ）。まとめると、これらのデータは、免疫反応を調節し、Ｔ細胞免疫性を制御することにおけるその役割に関与し得る免疫系により、骨髄ＡＰＣ上でのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の発現が厳しく制御されることを強く示唆する。
【０６１４】
〔0647〕  ＡＰＣ上でのその発現上昇とは対照的に、免疫付与時のより後の時点（即ち２４時間ではなく４８時間後）で、活性化ＤＯ１１．１０  ＣＤ４＋Ｔ細胞上でＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現が低下する（図８）。この結果は、能動的な免疫反応中のその活性化状況及びサイトカイン微小環境により、インビボでのＣＤ４  Ｔ細胞上でのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）発現が制御され得ることを示唆する。
【０６１５】
実施例３
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞反応におけるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）シグナル伝達の機能的影響
〔0648〕  ＣＤ４＋Ｔ細胞反応におけるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の制御的役割を調べるために、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇ融合タンパク質を作製した。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇ融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に融合されたＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）の細胞外ドメインを含有する。マイクロプレート上に固定化された場合、対照ＩｇでなくＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇは、細胞分裂停止により決定すると、プレート結合抗ＣＤ３刺激に反応して、バルク精製ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制した（図９ＡからＢ）。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）Ｉｇ融合タンパク質は、ＥＬＩＳＡによって決定した場合、プラスチックウェルに対する抗ＣＤ３抗体の吸収に影響を与えず、従って非特異的な阻害効果の可能性が除外される。ＰＤ−１  ＫＯ  ＣＤ４＋Ｔ細胞もまた抑制され（図９Ｃ、Ｄ）、このことからＰＤ−１がＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）に対する受容体ではないことが示される。ＰＤ−Ｌ１−Ｉｇ及びＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇの阻害効果も直接比較した（図１０）。ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激するためにＩｇ融合タンパク質の滴定量がαＣＤ３と一緒にマイクロプレートに吸収された場合、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇは、ＰＤ−Ｌ１−Ｉｇ融合タンパク質と同様の阻害有効性を示した。
【０６１６】
〔0649〕  バルク精製ＣＤ４＋Ｔ細胞は様々なサブセットを含有するので、選別されたナイーブ（ＣＤ２５−ＣＤ４４ｌｏｗＣＤ６２Ｌｈｉ）及びメモリー（ＣＤ２５−ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏｗ）ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットにおけるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇの影響を評価した（図１１Ａ及び１１Ｂ）。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）は、メモリー細胞においては有効性がより非常に低いものの、両サブセットの増殖を抑制し得る。
【０６１７】
〔0650〕  ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）介在性抑制の機構をさらに理解するために、ＶＩ
ＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇの存在下又は非存在下で、細胞活性化後、初期ＴＣＲ活性化マーカー及びアポトーシスの発現を測定した。細胞増殖における負の影響と一致して、初期活性化マーカーＣＤ６９、ＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌの発現において網羅的な抑制がある（追加図１２Ａ）。一方で、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）−Ｉｇ融合タンパク質はアポトーシスを誘導しなかった。それどころか、ＴＣＲ活性化の初期（２４時間）及びさらに後（４８時間）の両段階で、（アネキシンＶ＋７ＡＡＤ−細胞の％により決定した場合）ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇの存在下でアポトーシスが見られたのはＩｇ対照よりも少なかった（図１２Ｂ）。例えば、２４時間の時点で総「非ゲーティング」集団において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇの存在下で〜２７％細胞がアポトーシス性であったが〜３９％の対照細胞がアポトーシス性であった。生細胞Ｒ１ゲート内で細胞を調べた場合、約７２．６％の対照細胞がアポトーシス性になり、一方でＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇで処理した場合は僅か４３．５％の細胞がアポトーシス性であったので、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇが活性化−誘導性−細胞死（ＡＣＩＤ）を強く阻害したことが明らかである。４８時間の時点で同様の結果が見られた。従って、初期ＴＣＲ活性化を抑制し、細胞分裂を停止させることによって、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡがＣＤ４＋Ｔ細胞反応を負に制御することは明らかであるが、アポトーシスに対する直接的影響は最小限である。この抑制機構は、Ｂ７−Ｈ４の場合と同様である。Ｓｉｃａ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：８４９−８６１。
【０６１８】
〔0651〕  ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇが予め活性化されたＣＤ４
Ｔ細胞を抑制し得るか否か、及びその抑制効果がどの程度持続性であるかを決定するために、２−段階アッセイを開発した。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質の抑制効果は、活性化後２４時間でそれを除去した後、持続することが示される（図９Ｄ）。さらに、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇによって、ナイーブ及び予め活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞の両方が抑制され得た。図９Ｄ（ｉ）、９Ｄ（ｉｉｉ）及び９Ｄ（ｉｖ）を参照。
【０６１９】
〔0652〕  次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞サイトカイン産生におけるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇの影響を分析した。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇは、バルク精製ＣＤ４＋Ｔ細胞培養物からのＴｈ１サイトカインＩＬ−２及びＩＦＮαの産生を抑制した（図１３Ａ−Ｂ）。別個のナイーブ（ＣＤ２５−ＣＤ４４ｌｏｗＣＤ６２Ｌｈｉ）及びメモリー（ＣＤ２５−ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏｗ）ＣＤ４＋Ｔ細胞集団上でＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡの影響をさらに試験した。メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞区画内でサイトカイン産生に対する主要な源であり、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡがこの産生を抑制し得ることが示される（図１３ＣからＤ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮα産生に対するＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡの同様の阻害効果も示された（図１３Ｅ）。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生におけるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡのこの阻害効果は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡが、免疫反応を下方制御する阻害性リガンドであるという仮説と一致する。
【０６２０】
〔0653〕  次に、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡの阻害効果を克服可能である因子を決定するために実験を設計した。ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡがＩＬ−２産生を抑制し、ＩＬ−２がＴ細胞生存及び増殖に重要であると仮定すると、ＩＬ−２はＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡの阻害活性を回避し得る。図１４Ａで示されるように、細胞増殖において、ＩＬ−１５、ＩＬ−７又はＩＬ−２３ではなく外来性ＩＬ−２は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇの抑制効果を部分的に逆転させた。高レベルのＩＬ−２による不完全なレスキューから、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡシグナル伝達が、単純にＩＬ−２産生よりも幅広いＴ細胞活性化経路を標的
とすることが示される。一方で、抗ＣＤ２８アゴニスト性抗体によりもたらされる強力な同時刺激シグナルは、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇ介在性の抑制を完全に逆転させ（図１４Ｂ）、一方で、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡシグナル伝達によって中間レベルの同時刺激が依然として抑制される（図１４Ｃ）。この結果は、炎症状態が少ない状態下ほど、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ介在性免疫抑制が有効となるが、強い陽性同時刺激シグナルによって必然的に抑え込まれることを示唆する。この点において、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡは、ＰＤ−Ｌ１及びＢ７−Ｈ４などの他の抑制性のＢ７ファミリーリガンドとこの特性を共有する。Ｓｉｃａ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：８４９−８６１；Ｃａｒｔｅｒ，ｅｔ
ａｌ．（２００２）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：６３４−６４３。
【０６２１】
〔0654〕  ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質に加えて、ＡＰＣ上で発現されるＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡが、ＡＰＣとＴ細胞との間の同種相互作用中に抗原特異的なＴ細胞活性化を抑制し得ることを確認する必要がある。この目的のために、ＭＨＣＩＩ及びＢ７−２分子を安定的に発現する人工的な抗原提示細胞株（ＣＨＯ−ＡＰＣ）においてレトロウイルス形質導入を介してＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ−ＲＦＰ又はＲＦＰ対照タンパク質を過剰発現させた。Ｌａｔｃｈｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２６１−２６８。ＣＨＯにおいてＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡを発現させることにおけるある問題は、おそらくＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ表面局在に対する支持を欠く異質な環境ゆえに、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡの大部分が細胞表面に局在できないことである。制御方式を示唆する、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡの細胞質テール上に存在する明確なモチーフがないものの、このテールはその細胞内局在に関与し得る。結果的に、テールのないＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ突然変異体を設計し、ＣＨＯ細胞表面にうまく局在することが分かった。
【０６２２】
〔0655〕  Ｔ細胞反応を刺激するために、抗原性ＯＶＡペプチドの存在下でＣＨＯ−ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ又はＣＨＯ−ＲＦＰ細胞をＤＯ１１．１０  ＣＤ４＋Ｔ細胞と一緒に温置した。図１５ＡからＤで示されるように、ＣＨＯ−ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡは、ＣＨＯ−ＲＦＰ細胞よりもＤＯ１１．１０細胞の増殖誘導が少なかった。より強い刺激性シグナルがＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡの抑制効果を克服するという考えと一致して、この抑制効果はより低いペプチド濃度でより顕著である。
【０６２３】
〔0656〕  さらに、天然のＡＰＣ上での全長ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡの阻害効果を確認した。インビトロ培養した骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）は、高レベルのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡを発現しない（図１６）。１０日間の培養期間中に、レトロウイルス形質導入によってＢＭＤＣでＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ−ＲＦＰ又はＲＦＰを発現させた。ＲＦＰ発現に基づいて形質導入細胞を均一性について選別した。抗ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡモノクローナル抗体で染色することによって、形質導入ＤＣ上でのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡの発現レベルを推定し、新鮮単離腹膜マクロファージ上で、従って生理的発現範囲内でのレベルと、同様であることが分かった（図１６）。次に、ＯＶＡペプチドの存在下で、ＯＶＡ特異的なトランスジェニックＣＤ４＋Ｔ細胞（ＯＴＩＩ）を刺激するために、選別したＢＭＤＣを使用した（図１５Ｄ）。ＢＭＤＣ上でのＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡの発現は、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖性反応を抑制した。この結果は、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質及びＣＨＯ−ＡＰＣ細胞を用いた以前のデータと一致し、これは、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡがＴ細胞介在性免疫反応を抑制し得ることを示唆する。
【０６２４】
実施例４
多発性硬化症動物モデル（ＥＡＥ）における抗ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ抗体の評価
〔0657〕  αＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡモノクローナル抗体はインビボでＴ細胞反応を抑制すると思われたので、αＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡがＴ細胞介在性自己免疫疾患を阻害し得るか否かを評価するために、αＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡを試験した。実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルを用いて、炎症性疾患におけるαＰＤＬ−Ｌ３モノクローナル抗体の機能的影響を決定した。ＥＡＥは、広く使用される、ヒト自己免疫疾患多発性硬化症のマウスモデルである。アジュバント中のミエリン抗原での免疫付与によるか又はミエリン特異的なＴ細胞の養子免疫伝達よるかの何れかでＥＡＥを誘導し得、その結果、様々なエフェクターＴ細胞及びＢ細胞及びマクロファージの炎症性浸潤する及び中枢神経系の脱髄が起こる。
【０６２５】
〔0658〕  外来抗原としての大量のモノクローナル抗体の注射によるアナフィラキシーの誘導を回避するために、受動的ＥＡＥモデルにおいてαＰＤＬ−Ｌ３モノクローナル抗体を試験した。この養子免疫伝達ＥＡＥモデルにおいて、ＣＦＡ及びＰＬＰペプチドを用いてドナーＳＪＬマウスに免疫付与した。第１０日に、流入領域ＬＮからの全リンパ球を単離し、インビトロでＰＬＰペプチド、ＩＬ−２３（２０ｎｇ／ｍＬ）及び抗ＩＦＮγ（１０μｇ／ｍＬ）とともに４日間培養した。次に、拡大させたＣＤ４  Ｔ細胞を精製し、ナイーブ受容マウスに養子性に移した。この分析から、αＰＤＬ−Ｌ３モノクローナル抗体が疾患発症を遅延させ、疾患重症度が軽減し、それによって疾患進行曲線が著しく変化したことが示される（Ａ、Ｂｕｒｅ  １７）。さらに、これは、マウスのかなりの割合で重症度を低下させ、生存率を２２％前後から７５％超まで大きく向上させた。このことから、ＥＡＥでのαＰＤＬ−Ｌ３モノクローナル抗体の活性がインビトロデータと一致することが明らかとなり、様々な炎症性疾患における新規免疫制御試薬としてのこの試薬の使用が立証される。
【０６２６】
実施例５
活動性ＥＡＥマウスにおけるＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２Ａの治療効果
〔0659〕  多発性硬化症を処置するためのＶＩＳＴＡ融合ポリペプチドの推定有効性を評価するために、前の実施例に記載のように作製した活動性ＥＡのマウスを評価した。これらの実験において、６匹のＥＡＥマウス群をＰＢＳ（対照）、１００μｇの対照ＩｇＧ２ａポリペプチド、３００ｍｇの対照ＩｇＧ２ａポリペプチド、１００μｇのｍＶＩＳＴＡ  ＩｇＧ２ａポリペプチド、３００μｇのｍＶＩＳＴＡ  ＩｇＧ２ａポリペプチドで処置した。図４２のスコアにより示されるように、ｍＶＩＳＴＡ−Ｉｇ処置マウスは、試験した両用量で顕著で及び統計学的に有意な治療効果があった（低及び高用量でｐ＝０．００５１及び０．００４３）。
【０６２７】
〔0660〕  発明者らはまた、ＥＡＥにおけるＴ細胞の運命及び機能におけるＶＩＳＴＡの効果をアッセイする実験を行った。発明者らは、ＶＩＳＴＡが、病原性の発現、脳炎誘発性のＴ細胞、クローン性Ｔ細胞拡大、Ｔ細胞極性、寿命及びＴｅｆｆからＴｒｅｇへの変換を変化させるか否かを評価することを望んだ。発明者らは、ＥＡＥでのＴ細胞運命におけるＶＩＳＴＡ遮断の影響を試験した。より高い疾患スコアと一致して、疾患進行の終点でのＣＮＳの分析から、１３Ｆ３（αＶＩＳＴＡ）処置群において、有意に多いＩＬ１７Ａ−産生ＣＤ４＋Ｔ細胞浸潤（０．６６から１１％）が確認された。
【０６２８】
実施例６
狼瘡の予防のためのＶＩＳＴＡ−Ｉｇの評価
〔0661〕  予防実験のために、８週齢からＰＢＳ、１５０μｇの対照−ＩｇＧ２ａ又はｍＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａで１日おきにＮＺＢＷＦ１雌マウスを処置した。体重減少及び
蛋白尿により疾患重症度を毎週監視した。図４３Ａ及びＢで示されるように、データを平均＋／＿ＳＥＭとして示した。対照ＩｇＧ２ａとｍＶＩＳＴＡ−ＩｈＧｇ２ａとの間の統計学的有意差を決定した。ｐ値を計算したところ、０．００２７となり（対応のないマン・ホイットニー検定による）、ＶＩＳＴＡ融合物が対照と比較してＳＬＥの発症を予防したことが示された。
【０６２９】
実施例７
ＶＩＳＴＡ−Ｉｇは狼瘡において生存を促進する
〔0662〕  図４４Ａ及びＢでさらに示されるように、８週齢のときに、ＮＺＢＷＦ１雌マウスにＰＢＳ、１５０μｇの対照−ＩｇＧ２ａ又はｍＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａを１日おきに投与し、蛋白尿減少により証明されるように、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ処置マウスの疾患重症度が軽減した。繰り返すが、データは平均レベル＋／−ＳＥＭとして示し、これは実験の代表例である。対応のないマン・ホイットニー検定によるｐ値により決定されるような統計学的有意差は０．０００９であることが分かった。＄＄ｂの生存曲線及び４４Ａの蛋白尿データの結果は、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇポリペプチドが、狼瘡患者において生存を促進し、その腎臓傷害を緩和するか又は予防し得ることを示す。
【０６３０】
実施例８
ＥＡＥモデルにおけるＶＩＳＴＡの効果の評価
〔0663〕  αＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡモノクローナル抗体はインビボでＴ細胞反応を抑制すると思われたので、αＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡがＴ細胞介在性自己免疫疾患を阻害し得るか否かを評価するためにαＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡを試験した。実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルを用いて、炎症性疾患におけるαＰＤＬ−Ｌ３モノクローナル抗体の機能的影響を決定した。ＥＡＥは、ヒト自己免疫疾患多発性硬化症の広く使用されるマウスモデルである。アジュバント中のミエリン抗原での免疫付与によるか又はミエリン特異的なＴ細胞の養子免疫伝達によるかの何れかでＥＡＥを誘導し得、その結果、様々なエフェクターＴ細胞及びＢ細胞及びマクロファージの炎症性浸潤及び中枢神経系の脱髄が起こる。
【０６３１】
実施例９
ＣＮＳにおけるＶＩＳＴＡの発現
〔0664〕  ＣＮＳにおけるＶＩＳＴＡの発現も実施した。これらのアッセイは、ＶＩＳＴＡの喪失が炎症促進可能であり得るという仮説と一致して、疾患マウスにおいて、ＣＤ１１ｂ＋細胞上でＶＩＳＴＡ発現が著しく減少する（７６％から３３％）ことを明らかにした（図２２）。これは興味深く、発明者らが本明細書中で、非常に高レベルのＶＩＳＴＡを発現する腫瘍におけるＭＤＳＣと炎症性骨髄細胞を対比させる場合、機能的に重要であると思われる。ＥＡＥマウスが、Ｔ細胞活性化に対して強力に抑制性であり、疾患を和らげ得る脾臓の骨髄由来抑制細胞（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ−６Ｃｈｉｇｈ  ＭＤＳＣ）数を上昇させたことが報告されている３２。発明者らのデータは、ＶＩＳＴＡがＥＡＥにおいて骨髄介在性抑制に関与し得ることを強く示唆する。
【０６３２】
実施例１０
ＥＡＥでのＴ細胞の運命及び機能におけるＶＩＳＴＡの影響
〔0665〕  発明者らはまた、ＥＡＥでのＴ細胞の運命及び機能におけるＶＩＳＴＡの効果をアッセイする実験を行った。発明者らは、ＶＩＳＴＡが、病原性の発現、脳炎誘発性のＴ細胞、クローン性Ｔ細胞拡大、Ｔ細胞極性、寿命及びＴｅｆｆからＴｒｅｇへの変換を変化させるか否かを評価することを望んだ。発明者らは、ＥＡＥでのＴ細胞運命におけるＶＩＳＴＡ遮断の影響を試験した。より高い疾患スコアと一致して、疾患進行の終点でのＣＮＳの分析から、１３Ｆ３（αＶＩＳＴＡ）処置群において、有意に多いＩＬ１７Ａ−産生ＣＤ４＋Ｔ細胞浸潤（０．６６から１１％）が確認された。
【０６３３】
実施例１１
ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡトランスジェニック及びノックアウトマウス
〔0666〕  胚のレンチウイルス性感染を用いて、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡをユビキタスに発現する４匹のトランスジェニックマウスを作製した。これらのマウスは、ヒト伸長因子１プロモーターの調節下で全長ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡを発現する。レンチウイルス性ベクターｐＷＰＴを用いてこれらのマウスを作製した。他のＰＤ−Ｌ１ファミリーメンバーと同様に（Ａｐｐａｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：５９５４−８）、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡが、インビトロでαＣＤ３Ｔ細胞増殖を同時刺激するように機能しながら、インビボで負の制御因子として機能することが企図される。この点において、これらのマウスは、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡトランスジェニックマウスにおいて自然発生的に自己免疫性及びインビボ免疫反応（即ち液性免疫反応、Ｔ細胞刺激）を発現すると予想され、全身性自己免疫疾患発現を評価するために測定される。
【０６３４】
〔0667〕  ノックアウトマウスの場合、相同組み換えによりＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡを不活性化する。全長ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ配列を含有するＢＡＣクローンをＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。ネオマイシン遺伝子の上流のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ遺伝子の第二のエクソンの５’側にある１．６ｋｂ断片及びネオマイシン遺伝子の下流のＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ遺伝子の第三のエクソンの３’側にある５ｋｂ断片を挿入することによって、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ標的ベクターを作製した。Ｂ６由来の胚幹（ＥＳ）細胞をＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ標的ベクターとともに電気穿孔処理し、組み換えクローンを選択する。次に、選択したクローンをＣ５７ＢＬ／６胚盤胞に注入し、得られたキメラ雄子孫をＦＬＰデリーターマウスと交配させてネオマイシンカセットを除去する。子孫における標的化対立遺伝子の伝達は、ゲノムＤＮＡからのＰＣＲにより決定する。第二及び第三のエクソンは、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡドメインを含有し、従って得られるマウスはＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ分子の不活性化型のみを有する。
【０６３５】
〔0668〕  ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ欠損マウスの全体的な免疫能は、抗原に対するＴ細胞反応、液性免疫反応、顕性の自己免疫性（例えば全身性紅斑性狼瘡、炎症性腸疾患）及び誘導性自己免疫疾患（実験的自己免疫脳脊髄炎）に対する易罹患性向上の評価を含め、他のＰＤ−Ｌ−／−マウスのように決定する（Ｃｈｅｎ（２００４）上出）。
【０６３６】
〔0669〕  実質的に上述のように作製したＶＩＳＴＡ−／−マウスを得て、それらの表現型及び免疫機能を評価した。表現型の面で、これらのマウスを観察したところ、肺、肝臓及び膵臓でリンパ球性浸潤が増加していた。その上、これらのマウスは、肺及び脾臓において濾胞過形成があった。また、これらは胃において好中球浸潤があった。一方で、これらの腎臓、副腎、食道、小腸及び結腸は、正常の動物と感知できる違いは示さなかった。
【０６３７】
〔0670〕  免疫学的に、これらのマウスはＥＡＥに対する易罹患性が高くなり、雌においてＩｇＧ自己抗体産生が増大していた（図４５及び図４６）。また、これらのマウスは、対照動物と比較して、骨髄造血増加を示した（図４７）。これらのマウスはまた炎症性表現型も示し、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞数が増加しており、サイトカイン及びエオタキシン、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、Ｍ１Ｇ、γインターフェロン、ＩＬ−１７Ｆ及びＴＮＦαなどの他のポリペプチドの発現レベルが上昇又は変化していた（図４８）。
【０６３８】
実施例１２
コラーゲン誘発性関節炎動物モデルにおいて試験したＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｌ３）又はＶＩＳＴＡ特異的な抗体
〔0671〕  雄ＤＢＡ／１Ｊマウスの尾基部にＣＦＡ（ミコバクテリウム・ツベクローシス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）３．５ｍｇ／ｍＬ）中の１００μｇニワトリＩＩ型コラーゲン（Ｃ−ＩＩ）を含有する１００μＬの乳液で免疫付与し、免疫付与後第２１日にＩＰで１００μｇ  Ｃ−ＩＩ水により追加免疫した。各処置群のマウス（ｎ＝６）は、指示どおり、処置を行わないか（ＮＴ−黒丸）、３００μｇハムスターＩｇＧ（ＨａｍＩｇ−黒四角）を注射したか、又は３００μｇのモノクローナル抗体「７ｃ９」（赤三角）又は「１３Ｆ３」（緑三角）を注射した。注射は２日ごとに行った。指示された日に各マウスの各肢に対して関節腫脹を０から４でスコア化した。示される関節炎スコアは、各処置群におけるマウスの全肢の総スコアをその群のマウス数で除したものである。
【０６３９】
実施例１３
特異的なＶＩＳＴＡモノクローナル抗体によるＶＩＳＴＡ遮断はインビトロでＴ細胞反応を促進する
〔0672〕  ＶＩＳＴＡ介在性抑制を中和する、ＶＩＳＴＡ特異的なモノクローナル抗体（１３Ｆ３）を同定した（図１８）。１３Ｆ３の存在下又は非存在下でＯＴ−ＩＩトランスジェニックＣＤ４+Ｔ細胞を刺激するためにＣＤ１１ｂhi骨髄ＡＰＣをナイーブマウス
から精製した。その中和効果と一致して、１３Ｆ３は、ＣＤ１１ｂhi骨髄細胞により刺激されるＴ細胞増殖を促進し、高レベルのＶＩＳＴＡを発現することが分かった。
【０６４０】
実施例１４
抗ＶＩＳＴＡは抗腫瘍免疫性を促進する
〔0673〕  抗ＶＩＳＴＡのＴ細胞活性化促進能ゆえに、抗ＶＩＳＴＡが免疫原性腫瘍に対する防御的な免疫反応を促進するか否かを評価した。発明者らが豊富な経験を有するモデルは、膀胱癌、ＭＢ４９である。ＭＢ４９は雄性抗原を発現し、従ってこれは雌マウスでは中程度に免疫原性であるが、免疫介入がない場合、それが成長し、雌マウスは死亡する。αＶＩＳＴＡ療法の有効性を試験するために、雌マウスの皮下（ｓｑ）にＭＢ４９腫瘍細胞を投与し、αＶＩＳＴＡで処置した。その何日か後、マウスを安楽死させるまで腫瘍サイズを測定した。図１９は、抗ＶＩＳＴＡ療法が腫瘍成長を大幅に減弱させることを示す。これは、抗ＶＩＳＴＡの、細胞介在性免疫（ＣＭＩ）反応強化能によるものである。
【０６４１】
実施例１５
４種類のマウス腫瘍モデルでの腫瘍退縮における抗ＶＩＳＴＡの効果
〔0674〕  免疫原性膀胱癌腫瘍ＭＢ４９における実験は、モノクローナル抗体１３Ｆ３を用いたＶＩＳＴＡの中和及び宿主での腫瘍成長を防ぐことを示した。このデータは、腫瘍の微小環境においてＶＩＳＴＡが、その非常に高いＭＤＳＣ発現のために、相当な負の免疫制御因子的役割を有することを示す。免疫原性（ＭＢ４９）及び高度に非免疫原性である（Ｂ１６）腫瘍モデルの成長における抗マウスＶＩＳＴＡの影響を調べる実験から、αＶＩＳＴＡ療法の有効性がさらに確認され、作用機構が明らかとなり、最適用量及びタイミングを選択するための基準が提供される。各腫瘍モデルに対する論理的根拠は下記で詳述する。
【表３】
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〔0675〕  雌マウスにおけるＭＢ４９：このマウスモデルにおける有効性が明らかになった。このモデルにおけるＭＤＳＣもまた、ＶＩＳＴＡ発現レベルが上昇している。このモデルにおいて、Ｈ−Ｙ抗原の存在ゆえに、ＭＢ４９腫瘍は中程度に免疫原性である。発明者らは抗ＶＩＳＴＡ療法が有効であることを知っているので、抗ＶＩＳＴＡ療法の用量（１から１００μｇ／マウス）；及びタイミング（腫瘍接種日又は腫瘍後４、７、１０日；治療介入）を決定するために、このモデルは「陽性」対照となろう。
【０６４２】
〔0676〕  雄マウスにおけるＭＢ４９：雌マウスで有効な用量及びタイミングを使用して、雄マウスでの抗ＶＩＳＴＡ療法（腫瘍の免疫原性がより低い。）の有効性を決定する。
【０６４３】
〔0677〕  Ｂ１６メラノーマ：抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体は、このモデルにおいて非常に有効であることが示され、このマウスモデルは、ヒトでの成功を予想するのに有益な非免疫原性腫瘍となる。投与計画及びタイミングは、ＭＢ４９モデルで有効であることが示されるものと同様である。
【０６４４】
〔0678〕  ＩＤ８卵巣癌：このモデルにおいて、ＶＩＳＴＡ発現がＭＤＳＣにおいて極めて高いことが示されている。腫瘍接種時に又は接種後第５、１５、２５日にＩＤ８腫瘍を担持するマウスをαＶＩＳＴＡで処置する。
【０６４５】
〔0679〕  方法：記される全マウス腫瘍モデルの寛解のための抗ＶＩＳＴＡ処置の最適用量及びタイミングを決定するために、Ｂ６  ＷＴマウスを使用する。使用しようとするモデルを表３で列挙する。
【０６４６】
〔0680〕  この用量及びタイミングアッセイ対する読み出し情報は腫瘍成長速度である。ＭＢ４９及びＢ１６実験の場合、皮内（ｉ．ｄ．）接種を介して全腫瘍実験を行い、従って腫瘍サイズを容易に測定し得る。キャリパーを用いて腫瘍測定を２から３日ごとに収集する。これらのモデルのそれぞれにおいて、抗ＶＩＳＴＡ又は対照抗体の腫瘍成長遅延能又は腫瘍退縮促進能について抗ＶＩＳＴＡ又は対照抗体の影響を試験する。ルシフェラーゼ形質導入ＩＤ８及びＩＶＩＳワークステーションを使用した全身イメージングを用いて、ＩＤ８の成長を追跡する。さらに、宿主生存も決定する。
【０６４７】
〔0681〕  腫瘍成長におけるデータは平均腫瘍体積±ＳＥＭとして表し、両側ＡＮＯＶＡによって群間の差を分析する。０．０５未満の確率（ｐ）値は統計学的に有意とみなされる。群間の生存の差の有意性を確認するために使用されるウィルコクソンの順位検定およびログランク検定とともにカプラン−マイヤー法を使用して生存データを分析する。Ｂ１６モデルにおいて白斑を発現するマウスの頻度を決定する。
【０６４８】
〔0682〕  これらの方法を用いて、非免疫原性腫瘍モデルのうちいくつかにおいて、対照ａｂで処置したマウスと比較した場合、抗ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体で処置したマウスにおける腫瘍成長遅延及び／又は腫瘍退縮が得られる。抗ＶＩＳＴＡ処置が免疫原性
腫瘍モデルにおいて腫瘍成長を遅延させることは既に示されている。これらの腫瘍モデルのそれぞれはそれら自身の特定の成長速度を有し、腫瘍成長を付与し、免疫性を抑制するためのＶＩＳＴＡへの依存が見込まれるので、腫瘍接種時に又はその後の時点でマウスにモノクローナル抗体を投与する。さらに、治療的有用性に対する最適用量を決定するために、少なくとも３つの異なる濃度の抗ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体を試験する。
【０６４９】
〔0683〕  図２０ＡからＥで示されるように、ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体処置は、（Ａ）ＭＢ４９、（Ｂ）ＭＣＡ１０５、（Ｃ）ＥＧ７腫瘍細胞をマウスの皮下に（ｓｑ）、又はＩＤ８−ルシフェラーゼ腫瘍細胞を（Ｄ）マウスの腹腔内（ｉｐ）に接種し、第＋１日に開始して１日おきに（３００μｇ）ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体１３Ｆ３で処置した４種類のこれらの腫瘍モデル全てで腫瘍成長を低下させた。皮下腫瘍成長を監視した。ＩＤ８−ルシフェラーゼ腫瘍に対して、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳを用いて第３０日にマウスの画像を得た。（Ｅ）腫瘍担持マウスにおける骨髄白血球上でのＶＩＳＴＡ発現も調べた。ＶＩＳＴＡ発現について流入領域ＬＮ及び腫瘍組織（腹水）を分析した。これらの知見は、ＭＤＳＣ上で発現されたＶＩＳＴＡが、防御的な抗腫瘍免疫性の発現を妨害する主要な抑制性分子であり、αＶＩＳＴＡが免疫介入を可能にし、腫瘍の成長を遅延させるこの抑制性活性を軽減することを示す。これらの知見はまた、炎症の程度を制御することにおいて自己免疫疾患において骨髄細胞上でのＶＩＳＴＡが中枢的機能を果たすという結論も裏付ける。
【０６５０】
実施例１６
自己免疫性の処置に有用なオリゴマー性ＶＩＳＴＡ及びＶＩＳＴＡ融合タンパク質の合成
〔0684〕  インビトロでの可溶性ＶＩＳＴＡ−Ｉｇは抑制性ではなく、細胞へのその結合も容易に検出し得ない。一方、プラスチックに結合させられたこの分子は、顕著に抑制性である。さらに、インビボでＶＩＳＴＡ−Ｉｇを用いた実験は顕在的な活性を示さなかった。これらの実験に対して、作製されたＶＩＳＴＡ−Ｉｇは、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインにおいてＦｃＲ結合を除外する突然変異を有し、従ってインビボでは細胞親和性ではない。最近の研究は、四量体ＰＤ−Ｌ１が単量体のＰＤ−Ｌ１よりもＰＤ−１に対して１００倍高く結合し（Ｋd  ６ｘ１０-8Ｍ）２６、細胞への結合が容易に検出可能であったこと
を示している。四量体ＰＤ−Ｌ１はインビボで試験しなかったが、インビトロでネイティブＰＤ−Ｌ１による機能抑制を遮断することが示された。同様の方法を用いて、インビトロ及びインビボで、ＶＩＳＴＡ経路を標的とし、強力な免疫抑制活性を引き出すオリゴマーを作製する。
【０６５１】
〔0685〕  細胞外ドメイン又はその一部分がオリゴマーに対する構成単位として使用される、単量体のＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン又はその断片、例えば少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５又は２００アミノ酸長を用いて、このようなオリゴマーを構築する。これらの方法において、発明者らは確立したＭＨＣ四量体技術を利用する。これらの方法において、２価から７価にわたる価数を有する一連のＶＩＳＴＡ複合体を作製するために、（本明細書中で同定される）様々なオリゴマー化ドメインのＮ−末端にＶＩＳＴＡ細胞外ドメインコンストラクト又は断片を連結させる。
【０６５２】
〔0686〕  それによって、二量体、三量体、四量体、五量体及び七量体集合体の安定的な形成を支配する高親和性コイルドコイルドメインに基づいて、一連の非共有オリゴマーを作製する。宿主細胞（例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））においてこれらのオリゴマー性コンストラクトが発現される。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現が実施される場合、発現されるオリゴマーが次に再折り畳みされ、標準的な実験プロトコールを用いて封入体から精製される。このアプローチは、通常的に、ＭＨＣ−ペプチド複合体及び三量体ＧＩＴＲＬを含む、生物学的及び構造分析に対して高品質の物質を作製している６６。次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分析的ゲルろ過、分析的超遠心分離法及び質量分析によって、単離オリ
ゴマータンパク質を評価する。これらの品質管理基準は、インビトロ及びインビボ実験に対して、均一でよく特徴付けられた物質の利用を確実にする。これらのコンストラクトの並行構成の結果、それぞれの個々のＶＩＳＴＡ複合体が細胞表面結合ＶＩＳＴＡ受容体と増殖性に相互作用するように配置されるので、結合価がオリゴマー性の状態と同等である分子が得られる。上述のコンストラクトは、オリゴマー性状態の高度の安定性及び均一性を保持する（非共有コイルドコイルオリゴマー化ドメインは、一般に、９５℃の溶融温度を示す七量体配列を除き、１００℃を超える溶融温度を示す。）。
【０６５３】
〔0687〕  さらに二量体のＶＩＳＴＡ−Ｉｇを細胞親和性又は非細胞親和性の何れかである四量体にする。ＩｇＧ１  Ｆｃ（野生型ＩｇＧ１及び既存の非ＦｃＲ−結合ＩｇＧ１の両方）を有するインフレームのＶＩＳＴＡのＦｃ融合コンストラクトを酵素的ビオチン化のためにＮ末端ＢｉｒＡ部位で修飾し、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクターにクローニングする。酵素的ビオチン化は、アビジン多量体化における特異的な、単一残基修飾及び配向を可能とする。Ｂ７−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２及びＴＩＭ−３を含め、多くのＩｇ−融合タンパク質の作製のためにこのアプローチが使用されてきた。次に、発現されたタンパク質をインビトロで酵素的にビオチン化し、サイズ排除ＨＰＬＣにより精製し、ＰＥ−アビジンを用いて四量体化する。細胞親和性又は非細胞親和性であり得る得られた四量体の活性をインビボで評価する。
【０６５４】
〔0688〕  これらの改変多量体ＶＩＳＴＡタンパク質は、ＶＩＳＴＡ経路及び免疫抑制への介入が治療的に正当である自己免疫性及び他の状態を処置することにおいて有用である。
【０６５５】
実施例１７
免疫抑制を誘導するためのＶＩＳＴＡアデノウイルスベクター
〔0689〕  組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いた遺伝子の移入により、遺伝子治療における大きな技術的発展があった。具体的に、ＰＤ−Ｌ１遺伝子又はＣＴＬＡ４−Ｉｇ及びＣＤ４０−ＩｇのＡＡＶ介在性遺伝子送達によって、狼瘡ＥＮＲＥＦ＿６９及び心臓移植の自己免疫疾患モデルにおいて治療的有効性が得られた。全長ＶＩＳＴＡ又はオリゴマー性ＶＩＳＴＡ細胞外ドメインの何れかを送達するために、これらの方法が使用され、ＥＡＥモデルにおいてそれらの治療効果を評価する。製造者の説明書に従い、アデノ−ＸＴＭ発現系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、全長マウスＶＩＳＴＡ又はオリゴマー性ＶＩＳＴＡ細胞外ドメインの何れかを発現する組み換えアデノウイルスベクターを作製する。簡潔に述べると、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの調節下のＥ１及びＥ３−欠失、ｐＡｄＤＥＳＴに基づく発現ベクターにＶＩＳＴＡをクローニングする。次に、ＶＩＳＴＡ及び対照ｌａｃＺ発現アデノウイルスを細胞溶解液から精製する。ＶＩＳＴＡの全身性過剰発現に対して、免疫付与を介した疾患誘導前又はその直後、又は疾患発症後の何れかに、アデノウイルスをマウス尾静脈に静脈内注射（１ｘ１０9プラー
ク形成単位［Ｐｆｕ］）によって投与する。対照マウスには１００μＬ  ＰＢＳを投与する。異なる疾患進行パターンを示し、ヒトＭＳ患者の臨床症状の２種類の異なる型に相当するＳＪＬマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスの両方において疾患発現及び変化を監視する。
【０６５６】
実施例１８
改変タンパク質及びアデノウイルスベクターを用いた機能研究
〔0690〕  マウスにまた、改変ＶＩＳＴＡ及び／又はアデノウイルスベクターも投与する（５から１００μｇのタンパク質／マウスｘ週に３回）。投与後、Ｔ細胞拡大、分化ならびにＥＡＥ発現を決定する。
【０６５７】
実施例１９
ＶＩＳＴＡにおける構造研究及びＶＩＳＴＡ機能の分子決定基の決定
〔0691〕  組織化されたシグナル伝達複合体の親和性、特異性、オリゴマー性状態及び形成及び局在化は、免疫機能に対する重要な寄与因子である。受容体−リガンド細胞外ドメインの組織化が非共有結合細胞質シグナル伝達及び足場分子の、動員、組織化及び機能を直接調節するので、これらの特性全てが、シグナル伝達及び免疫制御に影響を与える。細菌、昆虫及び哺乳動物発現系ならびにハイスループット結晶化及び構造決定アプローチを含む技術を用いてＶＩＳＴＡの高分解能結晶構造を決定する。結晶学的に観察されるジスルフィド結合パターンを検証するために、ＴＩＭ−３及びヒトＤｃＲ３５９の試験を首尾よく裏付けたアプローチを用いる高分解能質量分析を使用する。これらの構造の結果に基づき、改変オリゴマー特性を有する一連の突然変異体ならびにＶＩＳＴＡ  ＩｇＶドメインの何らかの不安定領域の近くの突然変異体を設計する。これらの突然変異体タンパク質は、ＶＩＳＴＡ機能に対してさらなる直接的な機構的洞察を提供し、本明細書中で同定される、自己免疫、アレルギー性及び炎症性疾患などの免疫抑制が所望される治療において有用となるはずである。これらの突然変異体、特にオリゴマーをインビトロ系で試験し、疾患進行、疾患寛解における、又は自己免疫又は炎症性状態を発現しないように動物において予防することにおける、免疫抑制効果を評価するために動物自己免疫及び炎症性疾患モデルで評価する。
【０６５８】
〔0692〕  これらのオリゴマーＶＩＳＴＡタンパク質は、自己免疫性における免疫介入の標的としてＶＩＳＴＡ経路及び機能を活性化する。この介入は、免疫性を抑制し、自己免疫疾患及び自己免疫抑制が所望される他の状態において治療的有用性を発揮する。これは、ＥＡＥ及びコラーゲン誘発性関節炎動物モデルなどの様々な自己免疫及び炎症性モデルにおいてオリゴマー化ＶＩＳＴＡタンパク質を投与することによって遂行される。さらに、上記で論じられるように、全長ＶＩＳＴＡ又はＶＩＳＴＡオリゴマーを過剰発現するアデノウイルスベクターを構築し、インビボで試験する。これらの研究から、ＶＩＳＴＡオリゴマーの免疫抑制効果が確認される。
【０６５９】
実施例２０
条件的過剰発現ＶＩＳＴＡトランスジェニックマウス系統（ＶＩＳＴＡトランスジェニックマウス系統：Ｒ２６ＳＴＯＰＦＬ  ＶＩＳＴＡ（ＶＩＳＴＡ）を用いた実験
〔0693〕  ｌｏｘＰ−隣接ＳＴＯＰカセットが先行するＶＩＳＴＡの全長ｃＤＮＡを含有する標的化コンストラクトは、ユビキタスに発現されるＲＯＳＡ２６遺伝子座に標的化されている。複数の正しく標的化されたＲ２６ＳｔｏｐＦＬ／−ＶＩＳＴＡ仔が誕生し、ＣＭＶ−Ｃｒｅデリーター系統と交配させて繁殖させた６０。ＶＩＳＴＡ  ｘ  ＣＭＶ−ｃｒｅにおける予備的データから、ＧＦＰ及びＶＩＳＴＡ発現向上が確認される。これらのマウスの免疫状況（抗原に対するＴ細胞反応、抗体力価）における研究から、抑制性の表現型が確認される。ＶＩＳＴＡ系統をＣＤ４−ｃｒｅ、ＣＤ１１ｃ−ｃｒｅ及びＬｙｓ−Ｃｒｅと交配させ、ＶＩＳＴＡ発現の系統位置が抑制に影響するか否かを決定する。Ｔ細胞の表現型及び機能も決定し、ＶＩＳＴＡの過剰発現の結果、Ｔｒｅｇが生成するか否かも決定する。これらの実験において、ＯＶＡ−免疫ｃｒｅ  ｘ  ＶＩＳＴＡ系統からのＴｒｅｇをＷＴ宿主に養子的に移入して、過剰発現ＶＩＳＴＡの存在下での抗原免疫付与が抗原特異的なＴｒｅｇを誘導するか否かを見る。これにより、ＶＩＳＴＡがＴｒｅｇ分化に影響を与えることが検証されるはずである。
【０６６０】
〔0694〕  さらに、ＥＡＥモデルにおいて研究を実施し、これにより疾患発現に関する異なる系列（ＣＤ４−、ＣＤ１１ｃ−、Ｌｙｓ−ｃｒｅと交配させることによる。）のＶＩＳＴＡタンパク質の影響を評価する。ＶＩＳＴＡ突然変異体の系列限定的過剰発現により又はＣＭＶ  ｘ  ＶＩＳＴＡ突然変異体において、疾患が抑制され得ることを想定して、疾患発現の時間的調節もＣｒｅ−ＥＲＴ２ｘ  ＶＩＳＴＡηを使用している。タモキシフェン投与を通じて、発明者らは、免疫性の誘導及び／又はエフェクター相においてＶＩ
ＳＴＡが影響を与え得るか否かを判断するために、疾患開始前、疾患開始時又はピーク疾患時にＶＩＳＴＡの過剰発現を誘導し得る。ＢＭキメラマウスを用いて、時間的に限定されたＶＩＳＴＡ過剰発現を造血区画に限定し得る。時間枠の調節の判断のために、ＶＩＳＴＡを過剰発現させ、ＶＩＳＴＡを遺伝子の面でスイッチオンにし、次いで抗ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体の投与によって血清学的にスイッチオフにする。これらの研究から、ＶＩＳＴＡがどこでいつ、自己免疫疾患の発現及び進行を調節するように作用しなければならないかが決定される。
【０６６１】
実施例２１
抗ＶＩＳＴＡ抗体ＣＤ４０／ＴＬＲアゴニストワクチンの効果
〔0695〕  図２１で示されるように、ワクチン有効性に対する抗ＶＩＳＴＡ抗体の効果をアッセイする実験を行った。これらの結果は、抗ＶＩＳＴＡがＣＤ４０／ＴＬＲワクチンの治療的有効性を促進することを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対して１Ｘ１０５  転移性Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマ細胞ｓ．ｑ．を負荷した。４日後に、抗ＶＩＳＴＡ（２００μｇ  ｘ  ３／週）とともに、又はこれなしで、１００μｇの腫瘍関連抗原ΔＶ、１００μｇのαＣＤ４０  ＦＧＫ４５（ＣＤ４０アゴニスト性の抗体）及び１００μｇのＳ−２７６０９（ＴＬＲ７アゴニスト）でマウスにワクチン接種した。キャリパー測定により腫瘍の成長を監視した。
【０６６２】
実施例２２
発現プロファイリング
〔0696〕  Ｔｒｅｇ細胞の確立されている発現プロファイルとの比較を容易にするために、標準的な成長及び活性化条件を使用した（ＭｃＨｕｇｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）上出）。簡潔に述べると、抗ＧＩＴＲ（ＤＴＡ−１）とともに又はこれなしで抗ＣＤ３で予め被覆した２４ウェルプレート中の１０％ウシ胎仔血清及び１００単位ＩＬ−２が補給されている完全ＲＰＭＩ培地に新鮮単離Ｔｒｅｇ細胞（〜９６％陽性）を１０６／ｍＬで接種した（Ｓｈｉｍｉｚｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）上出）。細胞を３７℃で０及び１２時間培養し、ＲＮＡを精製し、続いてＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）マウスゲノムＡ４３０オリゴヌクレオチドアレイを用いて分析した。
【０６６３】
〔0697〕  休止又は活性化ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞群からのデータを比較することによって、遺伝子発現パターンが、当技術分野で確立されたものと同様であることが分かった（Ｇａｖｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）上出；ＭｃＨｕｇｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）上出）。ＧＩＴＲシグナル伝達により制御される遺伝子を同定するために、抗ＧＩＴＲ処理あり又はなしで、様々な細胞集団間で遺伝子発現プロファイルを比較した。以前特徴が分かっていなかったＶＩＳＴＡ及びＴｒｅｇ−ｓＴＮＦを含め、既知ならびに未知の遺伝子のリストを編集した。
【０６６４】
実施例２３
ＶＩＳＴＡの分子クローニング、レトロウイルス産生及び細胞のレトロウイルス形質導入〔0698〕  精製マウスＣＤ４＋Ｔ細胞から全長ＶＩＳＴＡをクローニングした。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｍｉｎｉキットを用いてトータルＲＮＡをＣＤ４＋Ｔ細胞から単離した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＳｃｒｉｐｔＴＭ  ｃＤＮＡ合成キットを用いてｃＤＮＡを作製した。全長ＶＩＳＴＡを増幅し、ＩＲＥＳ−ＧＦＰ断片がＲＦＰにより置き換えられたレトロウイルスベクターｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＥＣｏｒＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングし（Ｚｈａｎｇ及びＲｅｎ（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：３８２９−３８４０）、従ってその結果、ＲＦＰのＮ−末端にＶＩＳＴＡが融合された融合タンパク質が得られた。エコトロフィックパッケージングベクターｐＣＬ−Ｅｃｏ（ＩＭＧＥＮＥＸ  Ｃｏｒｐ．）を一緒に用いて、ＶＩＳＴＡ−ＲＦＰレトロウイルスベクターの一過性遺伝子移入により、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてヘルパー不含レトロウイルスを作製した。８μｇ／ｍＬ
ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）存在下で、ＲＴで４５分間、２０００ｒｐｍでのスピンインフェクションによって、マウスＴ細胞株ＥＬ４細胞又は骨髄由来ＤＣのレトロウイルス形質導入を行った。
【０６６５】
実施例２４
ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質の作製
〔0699〕  ＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン（アミノ酸３２−１９０）を増幅し、親ベクターＣＤＭ７ＢのＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８８：１−７。このベクターは、Ｆｃ受容体への結合を大きく低下させている、ヒトＩｇＧ１の定常及びヒンジ領域の突然変異体型を含有する。得られたベクターＣＤＭ７Ｂ−ＶＩＳＴＡをＤＨＦＲ発現ベクターｐＳＶ−ｄｈｆｒ（ＭｃＩｖｏｒ及びＳｉｍｏｎｓｅｎ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８：７０２５−７０３２）とともにＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−９０９６）に同時遺伝子移入した。ヌクレオチドなしの培地ＭＥＭ−α（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標））中でＶＩＳＴＡ−Ｉｇを発現する安定的なＣＨＯ細胞クローンを選択した。０．５から１μＭのメトトレキサート（ＳＩＧＭＡ（登録商標）Ｍ９９２９）を用いたさらなる増幅により、高レベルの可溶性ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を発現するクローンが得られた。標準的なプロテイン−Ｇカラムアフィニティークロマトグラフィーを用いて、融合タンパク質を培養上清からさらに精製した。
【０６６６】
実施例２５
ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体の作製
〔0700〕  アルメニアンハムスターにＶＩＳＴＡ−ＲＦＰを過剰発現するＥＬ４細胞で毎週４回免疫付与し、次いでＣＦＡ中で乳化させたＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を用いて追加免疫を行った。追加免疫から４週間後、ハムスターに可溶性ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を用いて再び追加免疫を行った。最後の追加免疫から４日後、ハムスター脾臓細胞を回収し、標準的なハイブリドーマ融合技術を用いて骨髄腫細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５８１）に融合させた。Ｓｈｕｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７６：２６９−２７０。限界希釈後にＶＩＳＴＡ  特異的な抗体を分泌するハイブリドーマクローンを選択し、ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリー法の両方によりスクリーニングした。
【０６６７】
実施例２６
ＶＩＳＴＡの阻害活性
〔0701〕  ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞抗原受容体トランスジェニックＴ細胞及び抗原刺激とともにインビトロでＰＤ−Ｌ１を過剰発現する抗原提示細胞を使用することによって、ＰＤ−Ｌ１の阻害活性が明らかになった（Ｃａｒｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：６３４−４３）。同様に、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）及びクラスＩ  ＭＨＣを発現する細胞株に、全長ＶＩＳＴＡを発現する本明細書中で開示されるレンチベクターを形質導入する。空のベクター形質導入又はＶＩＳＴＡ形質導入抗原提示細胞により提示される抗原に対するＴＥａ  Ｔｇ又は２ＣトランスジェニックＴ細胞の反応を確立された方法に従い決定する。
【０６６８】
実施例２７
モノクローナル抗体産生
〔0702〕  マウスＢ細胞株Ａ２０においてＶＩＳＴＡを過剰発現させ、アルメニアンハムスターに免疫付与するために組み換え細胞株を使用した。５回の細胞免疫付与後、ＣＦＡ中で乳化させた精製ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を用いてハムスターに対して追加免疫を行った。４週間後、可溶性ＶＩＳＴＡ−Ｉｇで最終追加免疫を与えた。続いて、第４
日にハムスター脾臓細胞とＳＰ２／０細胞との融合を行った。ＥＬＩＳＡによってＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を認識し、ＶＩＳＴＡを染色したが、マウスＴ細胞株ＥＬ４上で過剰発現されたＰＤ−Ｌ１が染色されなかった１６個の異なるクローンを同定した。クローンのうち１１種類のサブクローニングに成功し、それらの細胞及び組織上での内在性ＶＩＳＴＡ染色能及びＶＩＳＴＡ機能遮断能の評価のために調製した。
【０６６９】
実施例２８
ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ複合物はＴ細胞反応を負に制御する。
材料及び方法
〔0703〕  マウス。Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＯＴ−ＩＩ  ＣＤ４トランスジェニックマウス及びＳＪＬ／Ｊマウスを購入した。ＦｏｘＰ３−ＧＦＰレポーターマウスは以前記載のとおりであり（Ｆｏｎｔｅｎｏｔ，ｅｔ  ａｌ．２００５）、Ａ．Ｒｕｄｅｎｓｋｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）により提供された。ＰＤ−１  ＫＯマウスはＴ．Ｈｏｎｊｏ（Ｋｙｏｔｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．１９９９、２００１）により提供された。Ｄａｒｔｍｏｕｔｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌの病原体フリーの施設で全動物を維持した。全ての動物プロトコールは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｄａｒｔｍｏｕｔｈ
Ｃｏｌｌｅｇｅにより承認された。
【０６７０】
〔0704〕  抗体、細胞株及び試薬。抗体α−ＣＤ３（２Ｃ１１）、α−ＣＤ２８（ＰＶ−１）、α−ＣＤ４（ＧＫ１．５）、α−ＣＤ８（５３−６．７）、α−ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、α−Ｆ４／８０（ＢＭ８）、α−ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、α−ＮＫ１．１（ＰＫ１３６）、α−Ｇｒ１（ＲＢ６−８Ｃ５）、α−ＰＤ−Ｌ１（ＭＩＮ５）、α−ＰＤ−Ｌ２（ＴＹ２５）、α−Ｂ７−Ｈ３（Ｍ３．２Ｄ７）及びα−Ｂ７−Ｈ４（１８８）はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、組み換えマウスＩＦＮ−γ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ヒトＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）及び可溶性ＰＤ−Ｌ１−Ｉｇ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）は指示される濃度で使用した。ＣＦＡ及びニワトリＯＶＡはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｂ細胞リンパ腫細胞株Ａ２０（ＢＡＬＢ／ｃ起源）はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。
【０６７１】
〔0705〕  ＶＩＳＴＡの分子クローニング、レトロウイルス産生及び細胞のレトロウイルス形質導入。
全長ＶＩＳＴＡを精製マウスＣＤ４+Ｔ細胞からクローニングした。ＲＮＡｍｉｎｉキッ
ト（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてトータルＲＮＡをＣＤ４+Ｔ細胞から単離した。ｉＳｃｒｉ
ｐｔＴＭ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてｃＤＮＡを作製した。全長ＶＩＳＴＡを増幅し、ＩＲＥＳ−ＧＦＰ断片がＲＦＰにより置き換えられているレトロウイルスベクターｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＥＣＯＲＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングし（Ｚｈａｎｇ及びＲｅｎ，１９９８）、従ってその結果、ＲＦＰのＮ−末端にＶＩＳＴＡが融合された融合タンパク質が得られた。エコトロフィックパッケージングベクターｐＣＬ−Ｅｃｏ（ＩＭＧＥＮＥＸ  Ｃｏｒｐ．）を一緒に用いて、ＶＩＳＴＡ−ＲＦＰレトロウイルスベクターの一過性遺伝子移入により、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてヘルパー不含レトロウイルスを作製した。８μｇ／ｍＬポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）存在下での、室温で４５分間、２０００ｒｐｍでのスピンインフェクションによって、マウスＴ細胞株ＥＬ４細胞又はＢＭＤＣのレトロウイルス形質導入を行った。
【０６７２】
〔0706〕  ＶＩＳＴＡのバイオインフォマティクス分析。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによ
ってＶＩＳＴＡ  Ｉｇ−Ｖ配列に進化的に関連付けられるタンパク質を同定した（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．１９９０）。ｍＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲアルゴリズム（Ｌｏｂｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．２００９）を用いてタンパク質データバンク（Ｂｅｒｍａｎ，ｅｔ
ａｌ．２０００）からの最も適切な構造鋳型を同定した。最高スコアを記録したものの１つであるＰＤ−Ｌ１（タンパク質データバンク受託番号３ＢＩＳ）を比較タンパク質構造モデリングに対する鋳型として選択した。２つのアラインメント方法、ＭＵＳＣＬＥ及びＨＨａｌｉｇｎ（Ｒａｉ及びＦｉｓｅｒ，２００６；Ｒａｉ，ｅｔ  ａｌ．２００６）の最適な組み合わせを用いて、ＭＭＭサーバーによりＶＩＳＴＡの構造モデルを構築した。３６種類のＶＩＳＴＡオルソログタンパク質をＥＮＳＥＭＢＬデータベース（Ｆｌｉｃｅｋ，ｅｔ  ａｌ．２００８）から収集した。それぞれＤＡＬＩ（Ｈｏｌｍ及びＰａｒｋ、２０００）及びＣｌｕｓｔａｌｗ（Ｌａｒｋｉｎ，ｅｔ  ａｌ．２００７）により、構造及び配列アラインメントを計算し、ＥＳＰｒｉｐｔ  ２．２サーバー（Ｇｏｕｅｔ，ｅｔ  ａｌ．１９９９）を用いて提示した。以前に記載のように（Ａｔｋｉｎｓｏｎ，ｅｔ
ａｌ．２００９）ＢＬＡＳＴペアワイズ比較ネットワークを構築し、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ（Ｓｈａｎｎｏｎ，ｅｔ  ａｌ．２００３）を用いて分析した。
【０６７３】
〔0707〕  ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質の産生。ＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン（ａａ３２−１９０）を増幅させ、親ベクターＣＤＭ７ＢのＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングした（Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ，ｅｔ  ａｌ．１９９５）。このベクターは、Ｆｃ受容体への結合を大きく低下させている、ヒトＩｇＧ１の定常及びヒンジ領域の突然変異体型を含有する。得られたベクターＣＤＭ７Ｂ−ＶＩＳＴＡをジヒドロ葉酸レダクターゼ発現ベクターｐＳＶ−ｄｈｆｒ（ＭｃＩｖｏｒ及びＳｉｍｏｎｓｅｎ，１９９０）とともにチャイニーズハムスター卵巣（ｄｈｆｒ-）細胞株（＃ＣＲＬ−９０９６；Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に同時遺伝子移入した。ヌクレオチドなしの培地ＭＥＭ−α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でＶＩＳＴＡ−Ｉｇを発現する安定的なチャイニーズハムスター卵巣細胞クローンを選択した。０．５から１μＭのメトトレキサート（Ｍ９９２９；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いたさらなる増幅により、高レベルの可溶性ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を発現するクローンが得られた。標準的なプロテイン−Ｇカラムアフィニティークロマトグラフィーを用いて、融合タンパク質を培養上清からさらに精製した。
【０６７４】
〔0708〕  ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の作製。アルメニアンハムスターにＶＩＳＴＡ−ＲＦＰを過剰発現するＥＬ４細胞で免疫付与し、次いでＣＦＡ中で乳化させたＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を用いて追加免疫を行った。追加免疫から４週間後、ハムスターに可溶性ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を用いて再び追加免疫を行った。最後の追加免疫から４日後、ハムスター脾臓細胞を回収し、標準的なハイブリドーマ融合技術（Ｓｈｕｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．１９７８）を用いて骨髄腫細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４（＃ＣＲＬ−１５８１；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に融合させた。限界希釈後にＶＩＳＴＡ特異的な抗体を分泌するハイブリドーマクローンを選択し、ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリー法の両方によりスクリーニングした。
【０６７５】
〔0709〕  ＲＮＡ及びＲＴ−ＰＣＲ。業者の説明書に従い、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて様々なマウス組織試料又は精製造血細胞型からのトータルＲＮＡを回収した。ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いることによってｃＤＮＡを調製した。全長ＶＩＳＴＡを増幅するためにＲＴ−ＰＣＲ反応に対して等量の組織ｃＤＮＡ（１０ｎｇ）を使用した。１％アガロースゲルに流した後、ＰＣＲ産物を観察した。
【０６７６】
〔0710〕  フローサイトメトリー及び分析。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ）
を用いてＦＡＣＳｃａｎ上でフローサイトメトリー分析を行った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）を用いてデータ分析を行った。細胞増殖を定量するために、ＣＦＳＥ分裂のヒストグラムプロファイルを分析し、Ｐｒｉｓｍ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて増殖性ＣＦＳＥlow細胞の％をグラ
フ化した。
【０６７７】
〔0711〕  細胞調製。トータルＣＤ４+Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏ
ｔｅｃ）を用いて、トータルＣＤ４+Ｔ細胞をナイーブマウスから単離した。指示がある
場合、富化ＣＤ４+Ｔ細胞をナイーブ（ＣＤ４４lowＣＤ２５-ＣＤ６２Ｌhi）及びメモリ
ー（ＣＤ４４hiＣＤ２５-ＣＤ６２Ｌlow）集団にフロー選別した。インビトロ増殖アッセイの場合、３７℃にて５μＭ  ＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１０分間、ＣＤ４+
Ｔ細胞を標識し、刺激する前に２回洗浄した。
【０６７８】
〔0712〕  Ａ２０アッセイの場合、Ａ２０−ＲＦＰ又はＡ２０−ＰＤ−ＸＬ細胞（２０，０００）を１００μｇ／ｍＬマイトマイシンＣ（１ｈ）で予め処理し、次いでＯＶＡペプチドの存在下でＣＦＳＥ−標識ＤＯ１１．１０  ＣＤ４+Ｔ細胞（１００，０００）と
ともに温置した。対照−Ｉｇ又は１３Ｆ３モノクローナル抗体を指示どおり添加した。ＣＦＳＥ希釈により７２時間で細胞増殖を分析した。ＣＤ１１ｂhi骨髄ＡＰＣ選別の場合、ＣＤ１１ｂ磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてナイーブ脾臓細胞からＣＤ１１ｂ+単球を濃縮した。トータルＣＤ１１ｂhi骨髄ＡＰＣ又はＣＤ１１ｂhiＣＤ
１１ｃ-単球及びＣＤ１１ｂhiＣＤ１１ｃ+骨髄ＤＣを選別し、照射し（２，５００ｒａｄ）、ＯＶＡペプチドの存在下でＯＴ−ＩＩトランスジェニックＣＤ４+Ｔ細胞を刺激する
ために使用した。指示どおり、対照−Ｉｇ又は１３Ｆ３モノクローナル抗体を添加した。７２時間のアッセイのうち最後の８時間中に、トリチウム取り込みにより細胞増殖を測定した。
【０６７９】
〔0713〕  インビトロでのプレート結合Ｔ細胞活性化アッセイ。指示された濃度比の抗ＣＤ３（クローン２Ｃ１１）及びＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は対照−Ｉｇの何れかの存在下で９６ウェル平底プレートに中で精製ＣＤ４+Ｔ細胞（ウェルあたり１００，０００細胞）を
培養した。例えば全範囲滴定の場合、９６ウェルプレートを４℃にてＰＢＳ中で一晩、１．２５μｇ／ｍＬ（比率２：１）、２．５μｇ／ｍＬ（比率１：１）、５μｇ／ｍＬ（比率１：２）又は１０μｇ／ｍＬ（比率１：４）ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は対照−Ｉｇタンパク質と一緒に混合した２．５μｇ／ｍＬのα−ＣＤ３で被覆した。ＣＤ４+Ｔ細胞添加前に
、ウェルを３回、ＰＢＳで洗浄した。１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５０μＭ  β−ＭＥ及びペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミンを補給した完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で複製培養を行った。指示される場合、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇの阻害効果をレスキューするために、α−ＣＤ３と一緒に１００Ｕ／ｍＬヒトＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）又は滴定量のα−ＣＤ２８（クローンＰＶ−１；Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ）の何れかで被覆した。ＣＦＳＥプロファイルについて第３日に、又は指示されるとおりの時間コースに従い、培養物を分析した。
【０６８０】
〔0714〕  ＢＭＤＣの培養、レトロウイルス形質導入及びトランスジェニックＣＤ４+
Ｔ細胞の刺激。以前に記載のとおり（Ｌｕｔｚ，ｅｔ  ａｌ．１９９９；Ｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．２００２）、幾分かの改変を行い、ＢＭＤＣを作製した。簡潔に述べると、第０日に、２７−ゲージ針でフラッシュすることによりＢＭ細胞を脛骨及び大腿骨から単離した。赤血球細胞溶解後、２０ｎｇ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を含有する１ｍＬ完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で１から２ｘ１０6個のＢＭ細胞を再懸濁した。８μ
ｇ／ｍＬポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で細胞にＲＦＰ又はＶＩＳＴＡ−ＲＦＰレトロウイルスを感染させた。プレートを室温にて２，０００ｒｐｍで４５分間回転させることによって感染を行った。次に、新鮮培地を添加する前にさらに２時間
、細胞を培養した。第１、３及び５日に同様の感染手順を繰り返した。第１０日に緩く付着した細胞（９０％がＣＤ１１ｃ+）を回収し、ＣＤ１１ｃ+ＲＦＰ+−二重陽性細胞を選
別し、ＯＴ−ＩＩトランスジェニックＣＤ４+Ｔ細胞を刺激するために使用した。ＯＴ−
ＩＩ  Ｔ細胞増殖アッセイの場合、滴定量の合成ＯＶＡ323-339ペプチド（ＡｎａＳｐｅ
ｃ）と一緒に、３０，０００個の選別ＲＦＰ+又はＶＩＳＴＡ−ＲＦＰ+ＢＭＤＣとともに１００，０００個のＣＦＳＥ−標識化ＯＴ−ＩＩ  ＣＤ４+Ｔ細胞を９６ウェル丸底プレ
ート中で培養した。ＣＦＳＥプロファイルを調べることによって７２時間でＯＴ−ＩＩ  Ｔ細胞の増殖を分析した。
【０６８１】
〔0715〕  腫瘍実験。ＶＩＳＴＡ−ＲＦＰ又はＲＦＰ対照を用いて親ＭＣＡ１０５腫瘍細胞に対してレトロウイルスで形質導入を行い、ＲＦＰ発現に基づき均一性について選別した。腫瘍ワクチン接種の場合、１，０００，０００個の照射済みＭＣＡ１０５（１０，０００ｒａｄ）細胞を用いてナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスの左側腹部の皮下に接種して免疫付与した。第１４日に、ワクチン接種マウスに対して、右側腹部の皮下に接種して生ＭＣＡ１０５腫瘍細胞を負荷した。２日ごとに腫瘍成長を監視した。腫瘍サイズが１５０ｍｍ2に到達した際にマウスを安楽死させた。Ｔ細胞枯渇の場合、生腫瘍細胞負荷の２日
前に、（２５０μｇ）ＣＤ４+Ｔ細胞（クローンＧＫ１．５）及びＣＤ８+Ｔ細胞（クローン５３．６．７２）に特異的なモノクローナル抗体でワクチン接種マウスの腹腔内に前処置し、実験終了まで３から４日ごとに処置を繰り返した。腫瘍サイズが１６０ｍｍ2に到
達した際にマウスを安楽死させた。
【０６８２】
〔0716〕  ＥＡＥの受動的誘導及び中枢神経系−浸潤性のＣＤ４+Ｔ細胞の特徴評価。
受動伝達ＥＡＥの場合、４００μｇのミコバクテリウム・ツベクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒａ及び１００μｇのＰＬＰペプチドを含有する２００μＬの乳液を用いて雌ＳＪＬマウス（６週齢）の皮下に免疫付与した。インビトロ刺激のために第１０日に流入領域ＬＮ細胞を回収した。赤血球細胞を溶解させた。１０％ＦＢＳ、５０μＭ  ２−ＭＥ、１ｍＭグルタミン、１％ペニシリン／ストレプトアビジン、１ｍＭ非必須アミノ酸、２０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−２３、１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−６、１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−１β、２０μｇ／ｍＬ抗ＩＦＮ−γ及び２０μｇ／ｍＬ  ＰＬＰペプチド入りの完全ＩＭＤＭ培地中で単一の細胞懸濁液（１０，０００，０００個／マイクロタイター）を培養した。第４日に、細胞を回収し、ＣＤ４磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて生ＣＤ４Ｔ細胞を精製した。ＥＡＥを誘発するために、１，５００，０００から２，０００，０００個の精製生ＣＤ４Ｔ細胞をナイーブＳＪＬマウスに養子的に移入した。非特異的ハムスター対照−Ｉｇ又は４００μｇＶＩＳＴＡ特異的なモノクローナル抗体の何れかで３日ごとにマウスを処置した。次のように疾患をスコア化した：０、疾患なし；１、後肢脱力又は尾部緊張喪失；２、尾部弛緩及び後肢不全麻痺；２．５、一方の後肢の麻痺；３、両後肢麻痺；４、前肢脱力；５、瀕死状態。スコア４でマウスを安楽死させた。
【０６８３】
ＶＩＳＴＡのクローニング並びに配列及び構造分析
〔0717〕  活性化対休止状態のマウスＣＤ２５+ＣＤ４+天然Ｔreg細胞（ｎＴreg細胞）のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）分析から、機能が未知であるが、Ｉｇスーパーファミリーと配列相同性がある遺伝子産物（ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ４６３２４２８Ｎ０５又は４６３２４２８Ｎ０５Ｒｉｋ）の発現が明らかになった。予想サイズ及び配列と一致する９３０ｂｐ遺伝子産物をマウスＣＤ４+Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリからクローニングした
。シリコ配列及び構造分析から、成熟時に３０９ａａのＩ型膜貫通タンパク質が予想される。その細胞外ドメインは、１３６ａａの１個の細胞外Ｉｇ−Ｖドメインを含有し、これは、２３ａａストーク領域、２１残基膜貫通セグメント及び９７ａａ細胞質ドメインと連結される（図２３Ａ）。４６３２４２８Ｎ０５Ｒｉｋの細胞質テールは、シグナル伝達ドメインを含有しない。本明細書中で示されるＩｇ−Ｖドメインの構造特性及びその免疫抑
制的な機能に基づき、この分子をＶＩＳＴＡと名付けた。
【０６８４】
〔0718〕  ＶＩＳＴＡ  Ｉｇ−ＶドメインでのＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．１９９０）配列検索から、１０-4の境界性の有意なｅ−値スコア及び２４％の配列同一性で、Ｂ７ファミリーのＰＤ−Ｌ１が最も近縁の進化的に関連したタンパク質として同定された。
【０６８５】
〔0719〕  Ｂ７ファミリーメンバーＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３及びＢ７−Ｈ４とのＶＩＳＴＡの構造に基づく配列アラインメントは、全てのＩｇ−Ｖドメインタンパク質において体系的に保存的であることが知られ、Ｉｇ−Ｖフォールドの安定性に重要であると考えられるいくつかのアミノ酸を強調する（図２３Ｃ）。例としては、Ｉｇスーパーファミリータンパク質の顕著な特性である、２つのβシート間のジスルフィド結合を形成するＢ及びＦβ鎖の２個のシステインが挙げられる（図２３Ｃ）。この多配列アラインメントはまた、ＶＩＳＴＡに特有のさらなる配列特性も明らかにする。
【０６８６】
〔0720〕  ＲＴ−ＰＣＲ分析及びフローサイトメトリーによるＶＩＳＴＡの発現実験。マウス組織におけるＶＩＳＴＡのメッセンジャーＲＮＡ発現パターンを決定するために、ＲＴ−ＰＣＲ分析を使用した（図３Ａ）。ＶＩＳＴＡは、造血組織（脾臓、胸腺及びＢＭ）又は豊富な白血球浸潤がある組織（即ち肺）で殆ど発現される。非造血組織（即ち心臓、腎臓、脳及び卵巣）でも弱い発現が検出された。いくつかの造血細胞型の分析から、腹膜マクロファージ、脾臓ＣＤ１１ｂ+単球、ＣＤ１１ｃ+ＤＣ、ＣＤ４+Ｔ細胞及びＣＤ８+Ｔ細胞上でのＶＩＳＴＡの発現が明らかになったが、Ｂ細胞上では発現レベルが低かった（図３Ｂ）。この発現パターンはまた、ＧＮＦ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）遺伝子アレイデータベース（ｓｙｍｂｏｌ  ４６３２４２８Ｎ０５Ｒｉｋ；Ｓｕ，ｅｔ  ａｌ．２００２）ならびにＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＧＥＯ（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ）データベース（受託番号ＧＤＳ８６８）とも大きく一致する。
【０６８７】
〔0721〕  タンパク質発現を研究するために、ＶＩＳＴＡ特異的なハムスターモノクローナル抗体を作製した。ＶＩＳＴＡ−過剰発現マウスＥＬ４  Ｔ細胞で陽性染色であるが、ＰＤ−Ｌ１−過剰発現ＥＬ４細胞では染色が陰性になることによって特異性が明らかになる。
【０６８８】
〔0722〕  α−ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体クローン８Ｄ８を用いて、フローサイトメトリーにより造血細胞上でＶＩＳＴＡ発現を分析した。ＣＤ４+ｎＴreg細胞を区別するために、Ｆｏｘｐ３ＧＦＰノックインレポーターマウスを使用した（Ｆｏｎｔｅｎｏｔ，ｅｔ  ａｌ．２００５）。末梢リンパ系器官（脾臓及びＬＮ）において、全てのＣＤ４+
Ｔ細胞サブセットで顕著な発現が見られ（総ＣＤ４+Ｔ細胞又はＦｏｘｐ３-ナイーブＴ細胞及びＦｏｘｐ３+ｎＴreg細胞及びメモリーＣＤ４+Ｔ細胞を参照）、一方でＣＤ８+Ｔ細胞が発現する表面ＶＩＳＴＡ量は非常に低かった（図３Ｃ）。胸腺において、ＶＩＳＴＡ発現は、ＣＤ４+ＣＤ８+二重陽性胸腺細胞上で陰性であり、ＣＤ４単陽性細胞では低く、ＣＤ８単陽性細胞で検出可能であった。次に、Ｆ４／８０マクロファージ及び骨髄ＣＤ１１ｃ+ＤＣの両方を含む、脾臓及び腹膜細胞の両方に対して、高ＶＩＳＴＡ発現とＣＤ１
１ｂ  マーカーとの強い相関が見られた（図３Ｄ及び３Ｅ）。一方で、Ｂ細胞及びＮＫ細胞は、殆どＶＩＳＴＡ発現に対して陰性であった。Ｇｒ−１+顆粒球のうちごく一部もＶ
ＩＳＴＡを発現した（図３Ｆ）。
【０６８９】
〔0723〕  異なるリンパ系器官からの同じ系列の細胞上で差次的発現パターンが示された（図３Ｇ）。ＣＤ４+Ｔ細胞及びＣＤ１１ｂintermediate単球の場合、発現レベルは、
腸間膜ＬＮ＞末梢ＬＮ及び脾臓＞腹膜腔及び血液のパターンに従った。このパターンは、ＣＤ１１ｂhi細胞に対してはあまり顕著ではなかった。これらのデータから、ある種の細胞型上でのＶＩＳＴＡ発現が細胞成熟及び／又は組織微小環境により制御され得ることが示唆される。
【０６９０】
〔0724〕  新鮮単離細胞に加えて、活性化あり又はなしで、インビトロ培養において脾臓ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ１１ｂhi単球及びＣＤ１１ｃ+ＤＣ上でＶＩＳＴＡ発現を分析した（図６）。ＶＩＳＴＡ及び他のＢ７ファミリーリガンド（例えばＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３及びＢ７−Ｈ４）の発現分析前に２４時間、培地とともに、α−ＣＤ３（Ｔ細胞活性化の場合）とともに、又はＩＦＮγ及びＬＰＳとともに（単球及びＤＣ活性化の場合）、脾臓細胞を培養した。この比較から、これらの分子間での特徴的な発現パターンが明らかとなった。活性化状況に関わらず、インビトロ培養時に全細胞型でＶＩＳＴＡ発現が急速に失われた。一方、ＰＤ−Ｌ１発現は、培地単独中での培養後、活性化ＣＤ４+
Ｔ細胞上で又はＣＤ１１ｂhi単球及びＣＤ１１ｃ+ＤＣ上で上方制御され、刺激時にさら
に促進された。ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３及びＢ７−Ｈ４の発現は、使用した培養条件下で顕著ではなかった。インビトロでのＶＩＳＴＡ発現の喪失は、他のＢ７ファミリーリガンドと比較した場合に特有であるが、組織微小環境を模倣できない非最適培養条件を反映し得る。
【０６９１】
〔0725〕  インビボでＶＩＳＴＡ発現がどのように制御され得るかということに対処するために、ＣＤ４  ＴＣＲトランスジェニックマウスＤＯ１１．１０にＣＦＡ中で乳化させた同種抗原ニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）を用いて免疫付与した。免疫付与から２４時間後、流入領域ＬＮからの細胞をＶＩＳＴＡ発現について分析した（図７Ａ）。アジュバント単独ではない抗原（ＣＦＡ／ＯＶＡ）での免疫付与によって、Ｆ４／８０+マク
ロファージ及びＣＤ１１ｃ+ＤＣの混合集団を含有したＣＤ１１ｂ+ＶＩＳＴＡ+骨髄細胞
集団が劇的に増加した。ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２とのさらなる比較から、ＰＤ−Ｌ１が最大の構成的発現レベルを有しても、このような炎症性免疫反応中にＶＩＳＴＡが最もよく上方制御されることが明らかになった（図７Ｂ）。まとめると、これらのデータは、免疫反応を調節することにおけるその役割に関与し得る免疫系により、骨髄ＡＰＣ上でのＶＩＳＴＡの発現が厳しく制御されることを強く示唆する。ＡＰＣ上でのその発現上昇について、免疫付与時のより後の時点（即ち２４時間ではなく４８時間後）で活性化ＤＯ１１．１０  ＣＤ４+Ｔ細胞上でのＶＩＳＴＡ発現が低下した。
【０６９２】
〔0726〕  インビトロでのＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞反応におけるＶＩＳＴＡシグナル伝達の機能的影響。ＣＤ４+Ｔ細胞反応におけるＶＩＳＴＡの制御的役割を調べるために
、ＶＩＳＴＡ  Ｉｇ融合タンパク質（ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ）を作製した。ＶＩＳＴＡ−Ｉｇは、ヒトＩｇＧ1Ｆｃ領域に融合されたＶＩＳＴＡの細胞外ドメインを含有した。マイク
ロプレート上に固定化された場合、対照ＩｇでなくＶＩＳＴＡ−Ｉｇは、α−ＣＤ３刺激に反応してバルク精製ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を抑制した（図９Ａ及び９Ｂ）。ＶＩＳＴＡ−Ｉｇは、ＥＬＩＳＡによって決定した場合、プラスチックウェルに対する抗ＣＤ３抗体の吸収に影響を与えず、従って非特異的な阻害効果の可能性が除外された。ＰＤ−Ｌ１−Ｉｇ及びＶＩＳＴＡ−Ｉｇの阻害効果を直接比較した。Ｉｇ融合タンパク質の滴定量がＣＤ４+Ｔ細胞を刺激するためにα−ＣＤ３と一緒にマイクロプレートに吸収さ
れた場合、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇは、ＰＤ−Ｌ１−Ｉｇ融合タンパク質と同様の強力な阻害有効性を示した。ＰＤ−１  ＫＯ  ＣＤ４+Ｔ細胞も抑制され（図９Ｃ）、このことから、
ＰＤ−１がＶＩＳＴＡに対する受容体ではないことが示される。
【０６９３】
〔0727〕  バルク精製ＣＤ４+Ｔ細胞は様々なサブセットを含有するので、選別された
ナイーブ（ＣＤ２５-ＣＤ４４lowＣＤ６２Ｌhi）及びメモリー（ＣＤ２５-ＣＤ４４hiＣ
Ｄ６２Ｌlow）ＣＤ４+Ｔ細胞サブセット上でのＶＩＳＴＡ−Ｉｇの影響を評価した。ＶＩ
ＳＴＡは、メモリー細胞においては有効性がかなり低いものの、両サブセットの増殖を抑制した。
【０６９４】
〔0728〕  ＶＩＳＴＡ介在性抑制の機構をさらに理解するために、細胞活性化後、初期ＴＣＲ活性化マーカーの発現及びアポトーシスを測定した。細胞増殖における負の影響と一致して、初期活性化マーカーＣＤ６９、ＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌの発現において網羅的な抑制があった（図１２Ａ）。一方で、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇはアポトーシスを誘導しなかった。ＴＣＲ活性化の初期（２４時間）及びさらに後（４８時間）の両段階で、（アネキシンＶ+７ＡＡＤ-細胞の％により決定した場合）ＶＩＳＴＡ−Ｉｇの存在下ではアポトーシスが見られたのはＩｇ対照よりも少なかった（図１２Ｂ）。例えば、２４時間の時点で総「非ゲーティング」集団のうち、ＶＩＳＴＡの存在下で〜２７％細胞がアポトーシス性であったが、対照Ｉｇでは〜３９％の対照細胞がアポトーシス性であった。同様に、生細胞Ｒ１ゲート内の細胞のうち、対照Ｉｇでは〜７２．６％の細胞がアポトーシス性になり、一方でＶＩＳＴＡ−Ｉｇの存在下では僅か〜４３．５％細胞がアポトーシス性であった。４８時間の時点で同様の結果が見られた。従って、初期ＴＣＲ活性化を抑制し、細胞分裂を停止させることによって、ＶＩＳＴＡがＣＤ４+Ｔ細胞反応を負に制御することは明ら
かであるが、アポトーシスに対する直接的影響は最小限であった。この抑制機構は、Ｂ７−Ｈ４の場合と同様である（Ｓｉｃａ，ｅｔ  ａｌ．２００３）。
【０６９５】
〔0729〕  ＶＩＳＴＡ−Ｉｇが予め活性化されたＣＤ４  Ｔ細胞を抑制し得るか否か、及びその抑制効果がどの程度持続性であるかを決定するために、２−段階アッセイを開発した。ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質の抑制効果は、活性化後２４時間でそれを除去した後、持続した（図９Ｄ、ｉｉ）。さらに、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇによって、ナイーブ及び予め活性化したＣＤ４+Ｔ細胞の両方が抑制された（図９Ｄ、ｉ、ｉｉｉ及びｉｖ）。
【０６９６】
〔0730〕  次に、ＣＤ４+Ｔ細胞サイトカイン産生におけるＶＩＳＴＡ−Ｉｇの影響を
分析した。ＶＩＳＴＡ−Ｉｇは、バルク精製ＣＤ４+Ｔ細胞培養物からのＴｈ１サイトカ
インＩＬ−２及びＩＦＮγの産生を抑制した（図１３Ａ及び１３Ｂ）。別個のナイーブ（ＣＤ２５-ＣＤ４４lowＣＤ６２Ｌｈｉ）及びメモリー（ＣＤ２５-ＣＤ４４hiＣＤ６２Ｌlow）ＣＤ４+Ｔ細胞集団において、ＶＩＳＴＡの影響をさらに試験した。メモリーＣＤ４+Ｔ細胞は、ＣＤ４+Ｔ細胞区画内でサイトカイン産生に対する主要な源であり、ＶＩＳＴ
Ａはこの産生を抑制した（図１３Ｃ及び１３Ｄ）。ＣＤ８+Ｔ細胞からのＩＦＮγ産生も
ＶＩＳＴＡ−Ｉｇによって阻害された（図１３Ｅ）。ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞によるサイトカイン産生におけるＶＩＳＴＡのこの阻害効果は、ＶＩＳＴＡがＴ細胞介在性免疫反応を下方制御する阻害性リガンドであるという仮説と一致する。
【０６９７】
〔0731〕  ＶＩＳＴＡの阻害効果を克服可能である因子を決定するために、さらなる実験を設計した。ＶＩＳＴＡがＩＬ−２産生を抑制し、ＩＬ−２がＴ細胞生存及び増殖に重要であると仮定して、発明者らは、ＩＬ−２はＶＩＳＴＡの阻害活性を回避し得るという仮説を立てた。図１４Ａで示されるように、ＩＬ−１５、ＩＬ−７又はＩＬ−２３ではなく、外来性ＩＬ−２は、細胞増殖におけるＶＩＳＴＡの抑制効果を部分的に逆転させた。高レベルのＩＬ−２による不完全なレスキューから、ＶＩＳＴＡシグナル伝達が、単純にＩＬ−２産生よりも幅広いＴ細胞活性化経路を標的とすることが示される。一方で、α−ＣＤ２８アゴニスト性抗体によりもたらされる強力な同時刺激シグナルは、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ介在性の抑制を完全に逆転させ（図１４Ｂ）、一方で、ＶＩＳＴＡシグナル伝達によって中間レベルの同時刺激が抑制され続けた（図１４Ｃ）。この点において、ＶＩＳＴＡは、ＰＤ−Ｌ１及びＢ７−Ｈ４などの他の抑制性のＢ７ファミリーリガンドとこの特性を共有する（Ｃａｒｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．２００２；Ｓｉｃａ，ｅｔ  ａｌ．２００３）。
【０６９８】
〔0732〕  ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質に加えて、ＡＰＣ上で発現されるＶＩＳＴ
Ａが、ＡＰＣとＴ細胞との間の同種相互作用中に抗原特異的なＴ細胞活性化を抑制し得ることを確認する必要があった。発明者らは、この問いに対処するために２種類の独立した細胞系を使用してきた。最初に、Ｂ細胞株Ａ２０においてレトロウイルス形質導入を介してＶＩＳＴＡ−ＲＦＰ又はＲＦＰ対照タンパク質を過剰発現させた。蛍光顕微鏡によってＶＩＳＴＡ−ＲＦＰ融合タンパク質の正しい細胞表面局在化を確認した。Ｔ細胞反応を刺激するために、抗原性ＯＶＡペプチドの存在下でＤＯ１１．１０  ＣＤ４+Ｔ細胞と一緒
にＡ２０−ＶＩＳＴＡ又はＡ２０−ＲＦＰ細胞を温置した。図１５Ａ及びＣ）で示されるように、Ａ２０−ＶＩＳＴＡは、ＤＯ１１．１０細胞の増殖の誘導がＡ２０−ＲＦＰ細胞よりも少なかった。より強い刺激性シグナルがＶＩＳＴＡの抑制効果を克服するという考えと一致して、この抑制効果はより低いペプチド濃度でより顕著である。
【０６９９】
〔0733〕  第二に、天然のＡＰＣにおける全長ＶＩＳＴＡの阻害効果を確認した。インビトロ培養した骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）は、高レベルのＶＩＳＴＡを発現しなかった（図１６）。１０日の培養期間中に、レトロウイルス形質導入によってＢＭＤＣでＶＩＳＴＡ−ＲＦＰ又はＲＦＰが発現された。ＲＦＰ発現に基づいて形質導入細胞を均一性について選別した。α−ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体で染色することによって、形質導入ＤＣ上でのＶＩＳＴＡの発現レベルを推定し、新鮮単離腹膜マクロファージ上で、従って生理的発現範囲内でのレベルと同様であることが分かった（図１６）。次に、ＯＶＡペプチドの存在下で、ＯＶＡ特異的なトランスジェニックＣＤ４+Ｔ細胞（ＯＴ−ＩＩ）を刺
激するために、選別したＢＭＤＣを使用した。ＢＭＤＣ上でのＶＩＳＴＡの発現は、同種ＣＤ４+Ｔ細胞増殖を抑制した（図１５Ｄ）。この結果は、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパ
ク質又はＶＩＳＴＡ−発現Ａ２０細胞を用いたデータ（図５）と一致し、これは、ＡＰＣ上で発現されるＶＩＳＴＡがＴ細胞介在性免疫反応を抑制し得ることを示唆する。
【０７００】
〔0734〕  インビボでのＶＩＳＴＡ発現の影響を検証するために、腫瘍細胞上でのＶＩＳＴＡ過剰発現が抗腫瘍免疫反応を損なわせ得るか否かを調べた。ＭＣＡ１０５（メチルコラントレン１０５）線維肉腫はＶＩＳＴＡを発現しない。ＶＩＳＴＡ−ＲＦＰ又はＲＦＰ対照ウイルスの何れかを用いてレトロウイルス形質導入によって２種類のＭＣＡ１０５腫瘍株を確立した。ＭＣＡ１０５腫瘍は免疫原性であり、照射済みＭＣＡ１０５細胞を用いて予め免疫付与された宿主において容易に調節され得るので（Ｍａｃｋｅｙ，ｅｔ  ａｌ．１９９７）、発明者らは、このような防御的な免疫性における腫瘍ＶＩＳＴＡ発現の影響を調べた。図２４Ａで示されるように、ＶＩＳＴＡ発現ＭＣＡ１０５は、ワクチン接種した宿主において活発に増殖し、一方で対照腫瘍は育たなかった。Ｔ細胞介在性抗腫瘍免疫性の非存在下で腫瘍増殖速度において本質的相違がないことを確認するために、モノクローナル抗体を用いてＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞の両方を枯渇させたワクチン接種動物において腫瘍を接種した。図２４Ｂで示されるように、Ｔ細胞枯渇時に、ＭＣＡ１０５ＲＦＰ及びＭＣＡ１０５ＶＩＳＴＡ腫瘍の両方が同等の速度で及び非Ｔ−枯渇宿主よりもかなり急速に成長した。まとめると、これらのデータは、腫瘍細胞上でのＶＩＳＴＡ発現が宿主において防御的な抗腫瘍免疫性を妨害し得ることを示す。
【０７０１】
特異的なモノクローナル抗体によるＶＩＳＴＡ遮断は、インビトロ及びインビボでＴ細胞反応を促進した。
〔0735〕  Ａ２０−ＤＯ１１．１０アッセイ系においてＶＩＳＴＡ介在性抑制を中和するために、ＶＩＳＴＡ特異的なモノクローナル抗体（１３Ｆ３）を同定した（図２５Ａ）。Ｔ細胞反応における１３Ｆ３の影響をさらに確認するために、ナイーブマウスからＣＤ１１ｂhi骨髄ＡＰＣを精製して、１３Ｆ３の存在下又は非存在下でＯＴ−ＩＩトランスジェニックＣＤ４+Ｔ細胞を刺激した（図２５Ｂ）。その中和効果と一致して、１３Ｆ３は、
高レベルのＶＩＳＴＡを発現することが示されたＣＤ１１ｂhi骨髄細胞により刺激されたＴ細胞増殖を促進した（図３）。ＣＤ１１ｂhiＣＤ１１ｃ+骨髄ＤＣ及びＣＤ１１ｂhiＣ
Ｄ１１ｃ-単球の両方で１３Ｆ３の同様の効果を見ることができた（図２５Ｃ−Ｄ）。
【０７０２】
〔0736〕  次に、ヒト多発性硬化症に対するマウス自己免疫炎症性疾患モデルであるＥＡＥの受動伝達モデルにおいて、モノクローナル抗体によるＶＩＳＴＡ遮断の影響を調べた（Ｓｔｒｏｍｎｅｓ及びＧｏｖｅｒｍａｎ，２００６）。プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）ペプチドを用いて能動的免疫付与によって、ドナーマウスにおいて脳炎誘発性のＣＤ４+Ｔ細胞を刺激し、ナイーブマウスに養子的に移入した。α−ＶＩＳＴＡの疾患悪
化能を慎重に評価するために、α−ＶＩＳＴＡ又は対照−Ｉｇで処置したナイーブ宿主に滴定数の活性化脳炎誘発性Ｔ細胞を受動的に移入し、ＥＡＥの発現を監視した。１３Ｆ３は、疾患発症を顕著に加速化し、最適以下のＴ細胞移入投与量下で疾患重症度を悪化させることが分かった。１３Ｆ３処置群は、第１４日までに１００％疾患発症率に到達し、一方で、対照抗体で処置したマウスは、実験期間中に１００％疾患発症率に到達しなかった。平均疾患スコアは、疾患コースを通じて対照群よりも１３Ｆ３処置群において有意に高かった。より高い疾患スコアと一致して、疾患経過の終了時の中枢神経系の分析から、１３Ｆ３処置群においてＩＬ−１７Ａ−産生ＣＤ４+Ｔ細胞浸潤が有意に高いことが確認さ
れた。
【０７０３】
考察
〔0737〕  ＶＩＳＴＡは、インビトロ及びインビボの両方でＴ細胞上で免疫抑制活性を発揮し、自己免疫性及び癌に対する免疫反応の発現を調節することにおいて重要なメディエーターである、Ｉｇスーパーファミリーネットワークの新規メンバーである。与えられるデータから、（ａ）ＶＩＳＴＡが、ＰＤ−Ｌ１に対して配列類似性が低いＩｇ−Ｖドメインを含有するＩｇスーパーファミリーの新規メンバーであり、（ｂ）Ｉｇ融合タンパク質として産生されるか又は人工ＡＰＣ上で過剰発現される場合、それがＣＤ４及びＣＤ８+
Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生の両方を阻害する、（ｃ）骨髄ＡＰＣ上のＶＩＳＴＡ発現は、インビトロでＴ細胞反応に対して阻害性である、（ｄ）腫瘍細胞上での過剰発現は、ワクチン接種マウスにおいて防御的な抗腫瘍免疫性を損なわせる、及び（ｅ）抗体介在性ＶＩＳＴＡ遮断が、Ｔ細胞介在性自己免疫疾患、ＥＡＥの発現を増悪させることが示唆される。
【０７０４】
〔0738〕  ＶＩＳＴＡ  Ｉｇ−Ｖドメインのバイオインフォマティクス分析から、Ｂ７−ブチロフィリンファミリーメンバー、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２及びＭＯＧ、ならびに非Ｂ７ファミリーＣＡＲ及びＶＣＢＰ３が、ＶＩＳＴＡの最も近縁の進化的近縁種であることが示唆される（図Ａ、Ｂ及びＣ）。しかし、一次配列符号の精密な試験から、全てのＶＩＳＴＡオルソログが特有の及び保存的な配列モチーフを共有し、ＶＩＳＴＡがおそらく、Ｉｇスーパーファミリーの構造的及び機能的に新規のメンバーに相当することが示唆される。具体的に、ＶＩＳＴＡ細胞外ドメインに特有である４個のインバリアントなシステインの存在（３個はＩｇ−Ｖドメインにあり、１個はスタークにある。）は、その機能に影響を与える新規構造特性に寄与し得る。それらの厳格な不変性を仮定すると、全４個のＶＩＳＴＡ特異的なシステインがジスルフィド結合に関与するということは妥当である。この観察から、４個のシステインが、（ａ）２個の分子内ジスルフィド結合を形成する、（ｂ）二量体接触面で４個の分子間ジスルフィド結合を形成する、及び（ｃ）１個の分子内及び２個の分子間ジスルフィド結合を形成することを含め、いくつかの可能性が示唆される。これらのシナリオのうち何れかは、新規ジスルフィド結合パターンに相当し、典型的なＩｇスーパーファミリーメンバーと比較して、特有の三次及び／又は四次構造につながる。さらに、網羅的な配列比較から、ＶＩＳＴＡがＩｇスーパーファミリー内の何れの既知の機能群のメンバーでもないことが示唆される。
【０７０５】
〔0739〕  ＶＩＳＴＡの発現パターンは、ＶＩＳＴＡを他のＢ７ファミリーリガンドとさらに区別する。このデータは、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２とＶＩＳＴＡとの間の配列相同性がより高く、Ｔ細胞活性化に対してそれらが同様の阻害機能を有するので、ＰＤ−Ｌ
１及びＰＤ−Ｌ２とは殆ど対照をなしている。ＶＩＳＴＡの定常状態発現は、造血細胞上で選択的に発現され、ＡＰＣ（マクロファージ及び骨髄ＤＣ）及びＣＤ４+Ｔリンパ球の
両方の上で最も高く発現される。この文脈において、ＰＤ−Ｌ１は造血及び非造血細胞の両方の上で広い発現を有し、一方でＰＤ−Ｌ２はＤＣ及びマクロファージ上に限定されている（Ｋｅｉｒ，ｅｔ  ａｌ．２００６，２００８）。インビトロ培養時及び活性化時にＡＰＣ上でＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２の両方が上方制御されるにも関わらず（Ｙａｍａｚａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．２００２；Ｌｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．２００３；Ｋｅｉｒ，ｅｔ  ａｌ．２００８）、何らかの刺激が存在したか否かに依らず、短時間のインビトロ培養後、骨髄細胞及びＴ細胞上でのＶＩＳＴＡ発現が失われる（図６）。このような喪失は、インビボでのＶＩＳＴＡ発現を維持又は制御するための、リンパ系組織微小環境の必要な役割を反映し得る。この仮説と一致して、定常状態でも、異なる組織部位でＶＩＳＴＡは差次的に発現される（即ち腸間膜ＬＮで末梢リンパ系組織よりも高く、血液中で最低である。）。発明者らは、このような異なる発現レベルが特定の組織部位でのＶＩＳＴＡの異なる抑制機能を反映し得ると推測する。
【０７０６】
〔0740〕  インビボでのＶＩＳＴＡ発現は能動的な免疫反応中に高度に制御される。ＴＣＲトランスジェニックマウスにおけるアジュバント単独（ＣＦＡ）ではなくアジュバント＋抗原（ＯＶＡ／ＣＦＡ）での免疫付与は、流入領域ＬＮ内でＶＩＳＴＡhi骨髄ＡＰＣ集団を誘導した（図７）。抗原に対する必要性から、ＡＰＣ上でのＶＩＳＴＡ上方制御が、Ｔ細胞活性化の結果であり得ることが示唆される。ＶＩＳＴＡと比較して、免疫付与に反応して骨髄ＡＰＣ上でＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２も上方制御されたが、その程度は非常に低かった。発明者らは、ＶＩＳＴＡ+骨髄ＡＰＣの誘導が、進行中の免疫反応を短縮す
るために自己制御機構を構成すると推測する。この仮説と一致して、ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体の中和は、ＶＩＳＴＡ発現骨髄ＡＰＣにより刺激された場合、インビトロでのＴ細胞増殖性反応を促進した（図２５Ａ−Ｄ）。
【０７０７】
〔0741〕  骨髄細胞における発現パターンとは対照的に、インビボ活性化ＣＤ４+Ｔ細
胞においてＶＩＳＴＡ発現が縮小される。この結果は、能動的な免疫反応中のその活性化状況及びサイトカイン微小環境によって、インビボでのＣＤ４  Ｔ細胞上でのＶＩＳＴＡ発現が制御され得ることを示唆する。このような下方制御は特有なものであり、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２及びＢ７−Ｈ４などの他の阻害性Ｂ７ファミリーリガンドに対しては見られていない。ＣＤ４+Ｔ細胞上でのＶＩＳＴＡ発現の機能的意味は現在のところ不明であ
るものの、それらの同種相互作用中のＴ細胞からＡＰＣへの逆シグナル伝達の可能性を将来の研究で決定する。
【０７０８】
〔0742〕  ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質、ＶＩＳＴＡを発現するＡＰＣ及びＶＩＳＴＡを過剰発現する腫瘍ならびにインビトロ及びインビボ両方での中和モノクローナル抗体を用いて、ＶＩＳＴＡの阻害性リガンド機能を詳述した。ＶＩＳＴＡ−過剰発現腫瘍は、ワクチン接種宿主において強力な防御的免疫性を克服し得る。ＥＡＥモデルにおけるＶＩＳＴＡモノクローナル抗体の強い促進効果から、ＶＩＳＴＡがインビボで阻害性リガンドであるという仮説がさらに実証される。他のＢ７ファミリーリガンドの機能の特性評価を行うために、同様のアプローチが使用されてきた（Ｓｉｃａ，ｅｔ  ａｌ．２００３；Ｋｅｉｒ，ｅｔ  ａｌ．２００８）。ＶＩＳＴＡが、ＰＤ−１と異なる受容体に会合することによりその抑制機能を発揮することに留意することは重要である（図９）。ＶＩＳＴＡ経路の遮断がＥＡＥを悪化させるという事実から、その機能がＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２と重複しないことが確認される。それどころか、発明者らは、ＶＩＳＴＡが、その特有の構造特性、発現パターン及び動態により反映されるように免疫反応を調節すると推測する。その未知の受容体の同定により、ＶＩＳＴＡ介在性抑制の機構がさらに浮彫りになろう。
【０７０９】
〔0743〕  まとめると、新規の免疫抑制的なリガンドとしてＶＩＳＴＡが同定された。ＡＰＣ上でのＶＩＳＴＡの発現は、Ｔ細胞とＡＰＣとの間の同種相互作用中にまだ同定されていないその逆受容体をＴ細胞上で会合させることによって、Ｔ細胞反応を抑制する。ＶＩＳＴＡ遮断は、自己免疫疾患モデルにおいてＴ細胞介在性免疫性を促進し、これは、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２などの他の阻害Ｂ７ファミリーリガンドと比較した場合、自己免疫性を調節することにおけるその特有の及び重複しない役割を示唆する。免疫活性化の初期段階でのその高度に制御された発現パターンはまた、Ｔ細胞免疫性を下方制御し、炎症反応を減弱させるためのフィードバック調節経路も示し得る。この点において、ＶＩＳＴＡ阻害経路の治療介入は、疾患、例えばウイルス性感染及び癌などを処置するためにＴ細胞介在性免疫性を調節するための新規アプローチに相当する。
【０７１０】
実施例２９
自己免疫性における免疫介入の標的としてのＶＩＳＴＡ経路
〔0744〕  これらの研究の目的は、可溶性ＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質がインビボで免疫反応を抑制し得るか否かを決定することである。インビボでマウスＶＩＳＴＡ−ｍＩＧｇ２ａを使用した研究から、第１４日という遅い時期の治療処置がＥＡＥでの臨床疾患スコアにおいて有益な効果を有したことが示された。これらの進行中の実験は、非常に興味をかき立てられるようなものであり、即ち発明者らは、自己免疫疾患介入における新しい中心軸を同定した可能性がある（図２６）。この成功により、発明者らは、それらの細胞親和性能を引き出すために、マウスＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａバックボーン上でマウスＶＩＳＴＡを用いて研究を拡張してきた。ＩｇＧ１  Ｆｃ（野生型ＩｇＧ１及び既存の非ＦｃＲ−結合ＩｇＧ１の両方）とのインフレームのＶＩＳＴＡのＦｃ融合コンストラクトを作製した。これらの可溶性ＶＩＳＴＡ分子がＥＡＥを抑制し得るか否かを決定するためにこれらの可溶性ＶＩＳＴＡ分子それぞれを試験し、ＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ１及びＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａの両方がＥＡＥの発現及び進行を抑制することが示される（図２７）。これらの結果は、二量体の細胞親和性ＶＩＳＴＡがインビボで活性を有することを示唆する。これらの結果に基づき、ＶＩＳＴＡの他の多量体型が同様の活性を保持することがさらに予想される。例えば、ＶＩＳＴＡは、部位特異的なビオチン化及び多量体化に対するアビジンとの複合化を用いて四量体化され得る。インビトロで、特にＥＡＥ及び他の自己免疫炎症性及びアレルギー性障害の関連において、Ｔ細胞機能を調節するために、これらの多量体を使用し得る。最後に、発明者らは、この提案に記載の取り組みが、新規治療計画の開発に対してかなり有望であり、全般的に自己免疫性及びＴ細胞機能に関心があるコミュニティー全体に非常に大きな有益性があると考えている。
【０７１１】
実施例３０
ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ複合物はＥＡＥ進行を低下させる。
〔0745〕  実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症のモデルである。１７５μｇのＭＯＧ／ＣＦＡ及び百日咳毒素（ＰＴ）３００ｎｇ（第０、２日）でマウスに免疫付与することによってＥＡＥを誘発した。第１４、１７及び２０日に、１５０μｇ  ＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ  ２ａ（ｎ＝８）又は１５０ｇ対照ＩｇＧ２ａ（ｎ＝８）を投与した。データは平均±ＳＥＭとして図２６で示す。別の実験において、第６日に、１５０μｇの対照ＩｇＧ１（ｎ＝３）、１５０μｇの対照ＩｇＧ２ａ（ｎ＝６）、１５０μｇのｍＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ１（ｎ＝３）又は１５０μｇのｍＶＩＳＴＡ  ＩｇＧ２ａ（ｎ＝６）で週に３回、マウスを処置した（全２週間）。データは平均±ＳＥＭとして図２７で示す。別の実験において、第１４日に、ＰＢＳ（ｎ＝６）、１００μｇの対照ＩｇＧ２ａ（ｎ＝６）、３００μｇの対照ＩｇＧ２ａ（ｎ＝６）、１００μｇのＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａ（ｎ＝６）又は３００μｇのｍＶＩＳＴＡ  ＩｇＧ２ａ（ｎ＝６）で週に３回、マウスを処置した（全２週間）。データを平均±ＳＥＭとして図２８で示す。従って、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、炎症性状態、例えば多発性硬化症において治療効果を有する。
【０７１２】
実施例３１
ヒト細胞におけるＶＩＳＴＡ発現の分析及びＶＩＳＴＡ−Ｉｇによる抑制
〔0746〕  ヒト細胞試料において、ＶＩＳＴＡの発現パターン及びＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質の投与によるその抑制を調べた。
【０７１３】
材料及び方法
〔0747〕  ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質の産生−ヒトＶＩＳＴＡの細胞外ＩｇＶドメインからのアミノ酸１６−１９４及びＦｃ受容体の低結合のために突然変異させたヒトＩｇＧ１型からなる融合タンパク質を作製した。ベクターＣＤＭ７ＢのＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ部位にＶＩＳＴＡ配列をクローニングした。製造者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ遺伝子移入試薬及びタンパク質不含Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉａを用いてＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ＣＨＯ細胞の一過性遺伝子移入によってタンパク質を産生させた。増殖５日後に上清を回収し、プロテインＧアフィニティーカラムにより精製した。１０Ｋ  ＭＷＣＯスピンカラム（Ａｍｉｃｏｎ）を用いてタンパク質を濃縮した。
【０７１４】
〔0748〕  細胞調製−未確認の健康なヒトドナーからヒトアフェレーシス試料を得た。培養実験に対して、血液をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＰＡＡ）に重ね、密度勾配遠心によって単離した。界面細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次に、製造者の説明書に従い、ＭｉｌｔｅｎｙｉＣＤ４  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ＩＩ、ＣＤ８  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ又はＣＤ４メモリーＴ細胞選択キットを用いて磁気ビーズ選択を行う前にＭＡＣＳ緩衝液中で１回洗浄した。エフェクター細胞単離に対しては、続いて、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣＤ２７陽性選択ビーズを用いてＣＤ４  Ｔ細胞に対してＣＤ２７+細胞型を枯渇させた。
【０７１５】
〔0749〕  培養−抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）及びＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は対照−Ｉｇ（ＺＺ、Ｒ＆Ｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の何れかで被覆した９６ウェル平底プレートにおいてウェルあたり２ｘ１０5細胞でＴ細胞を播種した。別段の断り
がない限り、ＰＢＳ中で１０μｇ／ｍＬ（比率１：４）ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は対照−Ｉｇタンパク質と一緒に混合して２．５μｇ／ｍＬで４℃にて一晩抗ＣＤ３で被覆した。細胞を添加する前に完全培地でウェルを２回洗浄した。指示される場合、被覆混合液中に滴定量の抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含んだか、又は５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７又はＩＬ−１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を培地に添加した。第２日に初期活性化マーカーについて、第５日に後期活性化マーカー又はＣＦＳＥプロファイルについて培養物を分析した。
【０７１６】
〔0750〕  フローサイトメトリー−培養後の染色については、細胞を回収し、Ｖ底９６ウェルプレートに移した。細胞を洗浄し、抗体（ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４５ＲＡ；ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び近赤外定着性ライブ−デッド色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＨＢＳＳ／５％ＢＣＳ染色緩衝液中で染色した。細胞を洗浄し、分析前にＢＤ固定緩衝液で固定した。
【０７１７】
〔0751〕  ＶＩＳＴＡ発現に対する染色については、全血を洗浄し、細胞外マーカーに対する抗体を含有するＰＢＡ緩衝液（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．１％アジ化ナトリウム）で染色した。ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１４及びＣＤ１６に対する抗体はＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、抗ＶＩＳＴＡは本明細書中で記載のように作製した。ＦｏｘＰ３を細胞内染色するために、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＦｏｘｐ３固定／透過処理濃縮液及び希釈キット及びＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの抗ＦｏｘＰ３抗体を使用した。図３３Ｄを参照。
【０７１８】
〔0752〕  ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアｖ６．１．２（Ｂｅｃｔｏｎ及びＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてＬＳＲＩＩ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Ｂｅｃｔｏｎ及びＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）上で試料を取得して、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）で分析した。Ｐｒｉｓｍ  ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いてグラフドを用いて、グラフを作成した。
【０７１９】
結果
〔0753〕  ヒトＶＩＳＴＡタンパク質−ヒトゲノムに対するマウスＶＩＳＴＡ配列のＢＬＡＳＴによって、８ｅ−１６５のｅ−値及び７７％同一性で、染色体１０オープンリーディングフレーム５４（Ｃ１０ｏｒｆ５４又は血小板受容体Ｇｉ２４前駆体、遺伝子ＩＤ：６４１１５）が同定される。マウスＶＩＳＴＡと共通して、このタンパク質は、１個の細胞外ＩｇＶドメインを有するＩ型膜貫通タンパク質をコードすると予想される。ヒトＶＩＳＴＡは、３１１アミノ酸（ａａ）長であり、３２ａａシグナルペプチド、１３０ａａ細胞外ＩｇＶドメイン、３３ａａストーク領域、２０ａａ膜貫通ドメイン及び長い９６ａａ細胞質テールからなる。配列番号１６のアミノ酸配列を参照。
【０７２０】
〔0754〕  ＶＩＳＴＡ発現分析−ｃＤＮＡ組織パネルのリアルタイムＰＣＲ分析によって健康なヒト組織のＶＩＳＴＡ発現を調べた（Ｏｒｉｇｅｎｅ）図２９Ａ）。マウス組織と同様に、ＶＩＳＴＡは主に造血組織又は大量の造血組織を含有する組織で発現された。これは、免疫関連機能におけるＶＩＳＴＡの重要性と一致する。興味深いことに、ＶＩＳＴＡの発現はヒト胎盤において特に高く、このことから、妊娠の同種間の環境に対する寛容性の維持における、ＶＩＳＴＡに対する機能的役割が示され得る。この発現パターンは、ＶＩＳＴＡの最も近縁の相同体ＰＤ−Ｌ１の場合と同様の傾向に従うことが分かった（図２９Ｂ）。
【０７２１】
〔0755〕  次に、フローサイトメトリーにより造血区画内でＶＩＳＴＡタンパク質発現を調べた。ＰＢＭＣを末梢血液から単離し、抗ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体ＧＡ１で染色した。単球、樹状細胞の殆どによって、ならびにＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のおよそ２０％によって、ＶＩＳＴＡが高度に発現された（図３０）。血液単球の「巡回性」（ＣＤ１４dimＣＤ１６+）及び「炎症性」（ＣＤ１４+ＣＤ１６+/-）サブセットの両方内で及び樹状細胞のリンパ系及び骨髄サブセットの両方内でＶＩＳＴＡ発現を観察した。
【０７２２】
〔0756〕  Ｔ細胞機能におけるＶＩＳＴＡの機能的影響−ＶＩＳＴＡは、マウスＴ細胞免疫反応において負の影響を有することが以前に明らかになっている（Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１−１６頁）。ヒト細胞介在性免疫反応においてＶＩＳＴＡが同じ役割を有するか否かを調べた。ＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン及びＦｃ受容体結合を低下させるための突然変異を含有するヒトＩｇＧのＦｃ領域からなるＩｇ融合タンパク質を作製した。２．５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）とともにプレート上に１０μｇ／ｍＬのＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は対照Ｉｇを固定化し、次いでＣＦＳＥ希釈によって増殖を測定した。ＶＩＳＴＡは、バルク精製ＣＤ４（図３１Ａ）及びＣＤ８（図３１Ｂ）Ｔ細胞のＣＦＳＥ希釈を抑制することが分かった。ＶＩＳＴＡによる抑制は、ＰＤ−Ｌ１−Ｉｇ（Ｒ＆Ｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により誘導されるものと同等である。さらに、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇは、メモリー（ＣＤ４５ＲＯ+、図３１Ｃ）及びエフェクター（Ｃ
Ｄ２７-、図３１Ｄ）サブセットの抑制において有効であった。ヒトＣＤ４Ｔ細胞上での
マウスＶＩＳＴＡ及びヒトＶＩＳＴＡの比較から、ＶＩＳＴＡが種を越えて交差反応性であることが明らかになった。様々な濃度のＯＫＴ３にわたるヒトＶＩＳＴＡ−Ｉｇ及びヒトＶＩＳＴＡ−Ｉｇの滴定から、ＯＫＴ３の濃度が高いほど、克服するためのＶＩＳＴＡ濃度が高くなり得ることが示された（図３２Ａ及び３２Ｂ）。
【０７２３】
〔0757〕  抑制の機構に対するある程度の洞察を得るために、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇの存在下又は非存在下での活性化後に細胞の状況を調べた。２日の培養中、初期活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９の抗ＣＤ３による上方制御がＶＩＳＴＡ−Ｉｇにより遮断された（図３３Ａ及び３３Ｂ）。同様に、培養５日後、抗原経験を示すＣＤ４５ＲＡからＣＤ４５ＲＯへの発現シフトが妨げられた（図３３Ｃ）。ＶＩＳＴＡは、細胞生存能に対して影響がなかった。増殖の遮断と一致して、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇで処置した細胞は、ＯＫＴ３単独で見られるブラスティング細胞ではなく未刺激細胞と同様に前方及び側方散乱プロファイルがあった。ＶＩＳＴＡにより誘導される抑制が安定であるか否かを決定するために、抗ＣＤ３及びＶＩＳＴＡ−Ｉｇ上で２日間、細胞を培養し、次いで３日間、抗ＣＤ３単独上に移した。このさらなる刺激は、図３４Ａ及び３４Ｂで示されるように抑制をレスキューすることができなかった。
【０７２４】
〔0758〕  次に、サイトカイン産生におけるＶＩＳＴＡ−Ｉｇの影響を調べた。ＶＩＳＴＡ−Ｉｇの漸増量の存在下で細胞をプレート結合ＯＫＴ３で５日間刺激し、次いで、サイトメトリックビーズアレイによって培養上清中で様々なサイトカインの濃度を測定した。検出されたのは痕跡量レベルのＩＬ−２、ＩＬ−４又はＩＬ−６のみであり（＜５ｐｇ／ｍＬ）、差は観察されなかった。しかし、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇは、ＣＤ４（図３５Ａ）及びＣＤ８（図３５Ｂ）Ｔ細胞によるＩＬ−１０、ＴＮＦα及びＩＦＮ□の産生を顕著に減少させ、ＩＬ−１７産生が中程度に増加するという傾向があった。
【０７２５】
〔0759〕  Ｔ細胞のＶＩＳＴＡ誘導性抑制を克服することができた因子も調べた。抗ＣＤ２８アゴニスト性抗体は、Ｔ細胞に対して強力な同時刺激をもたらすので、ＶＩＳＴＡ抑制を負荷するために培養物に滴定する（図３６Ａ−Ｃ）。より低量の抗ＣＤ２８ではＶＩＳＴＡを克服できなかったものの、１□ｇ／ｍＬ  ＶＩＳＴＡの被覆濃度で抗ＣＤ２８が含まれた場合、増殖を遮断できなかった。同様に、低濃度のＶＩＳＴＡがＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５などのサイトカインの添加により克服され得た一方で、より高濃度のＶＩＳＴＡは、５０ｎｇ／ｍＬの生理的に高い濃度のサイトカインがあっても依然として抑制性であった。
【０７２６】
実施例３２
ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ複合物の効果、ＣＦＳＥ  ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖アッセイにおける、健常対象及び狼瘡対象のＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖
実験プロトコールで使用した材料
必要な試薬
１．蓋付きのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡクリア平底  ポリスチレンＨｉｇｈ  Ｂｉｎｄマイクロプレート、蓋付き、滅菌（製品番号３３６１）。
２．ＢｉｏＸＣｅｌｌ、抗ヒトＣＤ３、カタログ番号ＢＥ０００１−２、クローン：ＯＫＴ３、種：マウスＩｇＧ２ａ
３．Ｒ＆Ｄ、組み換えヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（対照Ｉｇ）、ＣＦ、ヒトＩｇＧ１、カタログ番号：１１０−ＨＧ−１００
４．ＰａｎＴ細胞単離キットＩＩ、カタログ番号：１３０−０９１−１５６
５．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ、４０５ｎｍ励起用、カタログ番号：Ｌ３４９５５
６．Ｓｉｇｍａ、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７、ろ過滅菌済み、密度：１．０７７ｇ／ｍＬ、カタログ番号１０７７１−５００ＭＬ
７．Ｃｅｌｌｇｒｏ、ＲＰＭＩ１６４０、カタログ番号：１０−０４０−ＣＶ、１０％熱不活性化ＦＢＳ／ペニシリン／ストレプトマイシン／５０μＭ  ２−ＭＥ、
１．牛胎仔血清：ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号：ＳＨ３０９１０．０３
１．ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ、固定緩衝液、カタログ番号：５５４６５５
８．Ｃｅｌｌｇｒｏ、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）、１Ｘ、滅菌、カルシウム及びマグネシウム不含、カタログ番号：２１−０４０−ＣＶ
９．Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ホルムアルデヒド、カタログ番号：０４０１８
１０．Ｓｉｇｍａ、ヒトＩｇ、カタログ番号：Ｇ４３８６−１Ｇ、１．２５ｍｇ／ｍＬの最終濃度で使用
１１．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ＣＦＳＥ細胞増殖キット、フローサイトメトリー用、カタログ番号：Ｃ３４５５４
１２．ヒトＶＩＳＴＡ−Ｉｇ（Ｌｏｔ番号１００９１２、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ＣＨＯより）
【０７２７】
実験プロトコール
〔0760〕  第−１日：ウェルあたり１００ｍＬ  ＰＢＳ中の抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３
２．５ｍｇ／ｍＬ）＋対照Ｉｇ又はＶＩＳＴＡ  Ｉｇ（１０ｍｇ／ｍＬ）で９６ウェルフラットプレートを被覆する。４℃で一晩、又は３７℃で３時間、プレートを温置する。〔0761〕  第０日：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃの説明書に従い、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、ＣＦＳＥで細胞を標識する。被覆した９６ウェルプレートにおいてウェルあたり細胞２００，０００個で細胞を播種する。
〔0762〕  第３から４日に、細胞を回収し、ＣＤ４＋細胞の増殖レベルを決定するためにフローサイトメトリーを用いてＣＦＳＥ標識により分析する。特に、フローサイトメトリーは、図３７に含有されるフローゲーティングストラテジーを用いて行う。
〔0763〕  ＣＦＳＥ増殖アッセイの結果は図３８に含有される。このことから、ＶＩＳＴＡ  Ｉｇが、対照Ｆｃ群と比較した場合、ヒト対照対象及び狼瘡対象の両方によって、１０μｇ／ｍＬでヒトＣＤ４  Ｔ細胞において最大の抑制を示すことが分かり得る。
【０７２８】
実施例３３
ＶＩＳＴＡ  Ｉｇタンパク質のインビトロ効力における様々なリンカーの影響
〔0764〕  ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合したヒトＶＩＳＴＡタンパク質は、インビトロで抗ＣＤ３誘導性Ｔ細胞反応を抑制することにおいて強力な活性を示した。このデータの殆どは、ＣＤＭ８由来のコンストラクトを用いて生成された。このタンパク質に対する部分的アミノ酸配列データを下記の配列で与える。この配列において、ＶＩＳＴＡタンパク質を緑色で強調し、ヒトＩｇＧ１を黄色で強調する。ｈｕＶＩＳＴＡ配列に先行する配列のうち色が付いていない部分は、シグナルペプチド配列である。ＶＩＳＴＡ及びヒトＩｇＧ１配列に介入し、配列のうち星印を付した部分に介入する配列のうち色が付いていない部分は、１９アミノ酸残基を具備するリンカーペプチドである。
【０７２９】
〔0765〕  ２．５μｇ／ｍＬプレート結合抗ＣＤ３及び対照Ｉｇ又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇの何れかの存在下で５日間培養したＣＦＳＥ標識ヒトＴ細胞を用いて、このポリペプチドのインビトロ抑制活性をアッセイした。下記配列のポリペプチド。（配列番号６８）。このアッセイの結果を図３９Ａで示す。
配列１：ｈｕＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ１−ＣＤＭ８−由来
MSLLFALFLAASLGPVAA*FKVATPYS LYVCPEGQNV TLTCRLLGPV DKGHDVTFYK TWYRXSXGEV QTCSERRPIR NLTFQDLHLH HGGHQAANTS HDLAQRHGLE SASDHHGNFS ITMRNLTLLD SGLYCCLVVE IRHHHSEHRV HGAMELQVQT GKDAPSNCVV YPSSSQESEN ITAA***DPGGGG GRLVPRGFGT GD***PXPXSSDK THT**CPPCPAP DSRVHRQSSS SPKTKDTLMI SRXPEVTCVV VDVSQEDPEV KFXWYVDGVE MHRXKTKPRE EXXNXXLXMG XXLTXXQQDW LNXKDYKFKV SNKKQXNPFE KTXSKSKRQT REPXVYNLPP SRXELTKIQV SLTXXVKXFX PSDXAVEWES NGQPENXYKX TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGKGSAGGS GGLNDIFEAQ KIEWHESRGS L
（配列番号６８）
〔0766〕  ＩｎｖｉｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１ｅ３−Ｆｃ２ベクターを用いて第二のヒトＶＩＳＴＡ−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃコンストラクトを作製した。同
様に、この配列において、ＶＩＳＴＡタンパク質を緑色で強調し、ヒトＩｇＧ１を黄色で強調する。ｈｕＶＩＳＴＡ配列に先行する配列のうち色が付いていない部分は、シグナルペプチド配列である。ＶＩＳＴＡ及びヒトＩｇＧ１配列に介入し、配列のうち星印を付した部分にさらに介入する配列のうち色が付いていない部分は、１９アミノ酸残基を具備するリンカーペプチドである。（また、この配列のうち異なる部分をまた星印で分離する。）。
【０７３０】
〔0767〕  この第二のＶＩＳＴＡ  Ｉｇ融合ポリペプチドに対するアミノ酸配列は、下記で示される配列２である（配列番号６９）。２．５μｇ／ｍＬプレート結合抗ＣＤ３及び対照Ｉｇ又は配列２の前記ＶＩＳＴＡ−Ｉｇポリペプチドの何れかの存在下で５日間培養したＣＦＳＥ標識ヒトＴ細胞を用いて、このポリペプチドのインビトロでの抑制活性を再びアッセイした。このアッセイの結果を図３９Ｂで示す。図３９Ｂでの結果に基づき、このタンパク質のビトロ活性が、配列番号６８のＶＩＳＴＡ  Ｉｇポリペプチドよりも大幅に低かったことが分かり得る。
配列２：ｈｕＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ１−ｐＦＵＳＥ由来
シグナル配列
MYRMQLLSCIALSLALVTNS**FKVATPYSLYVCPEGQNVTLTCRLLGPVDKGHDVTFYKTWYRSSRGEVQTCSERRPIRNLTFQDLHLHHGGHQAANTSHDLAQRHGLESASDHHGNFSITMRNLTLLDSGLYCCLVVEIRHHHSEHRVHGAMELQV**QTGKDAPSNCVVYPSSSQDSENITAAA***RSISAMVRSVE***CPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK-
（配列番号６９）
〔0768〕  これらの異質な結果に基づき、これらの２種類のＶＩＳＴＡ  Ｉｇ融合物の免疫抑制活性の相違がＶＩＳＴＡ融合タンパク質のＦｃ領域での配列変異によって潜在的に説明され得ることが推測された。従って、配列１及び２のＦｃドメイン（黄色）の配列決定を行い、比較した。この配列比較は下記のアラインメントで示されるとおりである。検査時、発明者らは配列の相違に気付いたが、これらのポリペプチドの免疫抑制活性における実質的な相違に対する説明を提供する突然変異には気付かなかった。
Ｆｃのアラインメント：
スコア＝３１５ビット（８０８）、期待値＝２ｅ−１０９、方法：Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔ．
同一性＝１５８／２０３（７８％）、ポジティブ＝１６４／２０３（８１％）、ギャップ＝０／２０３（０％）
【化１】
2020096628.tif 000005
〔0769〕  次に、活性の相違は、グリコシル化の相違の結果であり得るか又はおそらく融合タンパク質のＶＩＳＴＡ及びＩｇドメインに介入するリンカーのサイズ又は性質の影響によると推測した。特に、配列決定時に、配列１のＶＩＳＴＡタンパク質及びＦｃドメインに介入するスペーサー又はリンカーは、かなり多数が可動性グリシン残基を具備する１９アミノ酸を具備することが観察された。一方、配列２においてＶＩＳＴＡポリペプチド及びＩｇＧ１ポリペプチドに介入するリンカー（配列番号７３）は１１アミノ酸長のみであり、グリシン残基を具備しない。
【０７３１】
〔0770〕  この観察に基づき、より多くの可動性リンカーの組み入れが、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇの活性をさらに向上させ得ることが推測された。これに関して、それらの可動性及び既知の免疫原性リスクがないことから、抗体操作分野で様々なドメインを連結するためにグリシン−セリンリンカーが使用される。しかし、本例において、このようなリンカーが顕著に活性に影響を与えるか否かは不明であった。例えば、ＶＩＳＴＡは、活性のために二量体化を必要としない一部の他のタンパク質と同様の構造を保持する。
【０７３２】
〔0771〕  従って、この仮説に基づき、発明者らは、配列１及び配列２においてＶＩＳＴＡ  Ｉｇ融合ポリペプチドの免疫抑制活性を別の可動性リンカー、即ちセリン−グリシンリンカーを具備する第三のＶＩＳＴＡ  Ｉｇ配列と比較することにした。特に選択されたリンカーはＧＴＳＧＳＳＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＧＧ（配列番号７１）であった。配列３（配列番号７２）に含有されるＶＩＳＴＡ  Ｉｇタンパク質を作製するために、ヒトＶＩＳＴＡとｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１ｅ３−Ｆｃ２  Ｆｃドメインとの間のリンカーとしてこの配列を使用した。
配列：Ｓｅｒ／Ｇｌｙリンカーを用いて得られた３ｈｕＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ１−ｐＦＵＳＥ
シグナルペプチド  ＶＩＳＴＡ配列の開始
MYRMQLLSCIALSLALVTNS***FKVATPYSLYVCPEGQNVTLTCRLLGPVDKGHDVTFYKTWYRSSRGEVQTCSERRPIRNLTFQDLHLHHGGHQAANTSHDLAQRHGLESASDHHGNFSITMRNLTLLDSGLYCCLVVEIRHHHSEHRVHGAMELQVQTGKDAPSNCVVYPSSSQDSENITAAA***GTSGSSGSGSGGSGSGGGG***RSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
（配列番号７２）
【０７３３】
〔0772〕  配列３において、ＶＩＳＴＡタンパク質を再び緑色で強調し、ヒトＩｇＧ１を黄色で強調する。ｈｕＶＩＳＴＡ配列に先行する配列のうち色が付いていない部分は、繰り返すがシグナルペプチド配列である。ＶＩＳＴＡ及びヒトＩｇＧ１配列に介入し、配列のうち星印を付した部分にさらに介入する配列の部分は、セリン又はグリシンアミノ酸残基である１９アミノ酸残基を具備するリンカーペプチドである。（また、配列の異なる部分を星印によって分離する。）。
【０７３４】
〔0773〕  図３９Ｃでの結果から見られ得るように、このリンカーを含有するＶＩＳＴＡ  Ｉｇポリペプチドは、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質より大きい免疫抑制活性を有した。具体的に、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーを含有するＶＩＳＴＡ  Ｉｇ融合物は、配列１におけるＶＩＳＴＡ  Ｉｇ融合物よりも約１０％大きい免疫抑制活性を示し、配列２（配列番号６９）よりも約９倍大きかった。発明者らにより構築された別のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ配列を下記で示す（配列番号７３）。ＭＬＲ実験及び本願に記載の他のｈＶＩＳＴＡ−Ｉｇ実験においてこの配列を使用した。Ｎ末端からＣ末端の配列の異なる部分を下記で同定し、配列中で星印によりさらに分離する。
赤＝シグナルペプチド太字
緑＝ｖｉｓｔａ
青＝ビオチン化アクセプターペプチド
紫＝リンカー
橙＝ＩｇＧ１  Ｆｃ
下線付き＝Ｆｃ突然変異
（また、配列の異なる部分を星印によっても分離する。）。
細胞外
MPMGSLQPLATLYLLGMLVASCLGTSMSLLFALFLAASLGPVAA**FKVATPYSLYVCPEGQNVTLTCRLLGPVDKGHDVTFYKTWYRSSRGEVQTCSERRPIRNLTFQDLHLHHGGHQAANTSHDLAQRHGLESASDHHGNFSITMRNLTLLDSGLYCCLVVDIRHHHSEHRVHGAMELQVQTGKDAPSNCVVYPSSSQESENITAA**DPGGGGGRLVPRGFGTGDP**EPKSSDKTHTCPPCPAPEFEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPTPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK**GSAGGSG** GLNDIFEAQKIEWHE**SRGSL
（配列番号７３）
ベクターＦｃとのヒトＩｇＧ１のアラインメント
【化２】
2020096628.tif 000006
〔0774〕  これらの結果から、特異的な長さ及び／又は可動性のリンカーの組み込みに
より、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質、単量体及び多量体ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物の両方の免疫抑制活性が顕著に強化され得ることが示される。
【０７３５】
実施例３４
ｍＶＩＳＴＡ−Ｉｇでのマウスの処置は、マウス狼瘡モデルにおいて疾患を抑制する。
〔0775〕  特徴がよく分かっているマウス系統ＮＺＢＷ−Ｆ１（「ＢＷ」雌のみ）及びＮＺＭ２４１０（ＮＺＭ雄及び雌）は、ＳＬＥのヒトで見られるものと同様の自己免疫疾患狼瘡の複数の症状を発現する。これらには、自己反応性抗体の発現、糸球体における免疫複合体沈着、蛋白尿、プロ炎症性サイトカイン産生の増加及び体重減少が含まれる。究極的には、マウスは１年齢未満で腎不全で死亡する。ｍＶＩＳＴＡ−Ｉｇが全身性自己免疫疾患を抑制し得るか否かを決定するために、発明者らは、ＢＷマウスを８週で予防的に、及びＢＷ及びＮＺＭマウスを治療的に２４週でｍＶＩＳＴＡ−Ｉｇにより処置した。ＶＩＳＴＡ−Ｉｇでの処置は、総白血球数の変化を何ら引き出さず、この薬剤が明白にＴ細胞を枯渇させないことを示す（データは示さない。）。ＶＩＳＴＡ−Ｉｇでの予防的処置は、体重減少及び蛋白尿の両方を予防し、治療的処置は、これらのマウスにおいて蛋白尿から回復させた。結果は図４０に含有される。また、２４週で処置したＮＺＭマウスにおいて同様の結果が観察された（データは示さない。）。
【０７３６】
〔0776〕  図４１Ａ−Ｄで示されるように、マウスが発病したとき又は３０週齢の時点で、実験的ＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａ又は対照ＩｇＧ２ａの何れかを投与された２匹のＮＺＢＷ  Ｆ１（ＢＷ）及び３匹のＮＺＭマウスから採取した腎臓切片においてヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。ＢＷは８週齢で処置を開始し、ＮＺＭは疾患発症から長時間経過してから２４週齢で開始した。全５匹のＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａ−処置マウスからの切片は、最小から軽度の糸球体腎炎を示し、間質性疾患及び糸球体瘢痕化はなかった（図４０Ｂ）。一方、全５匹の対照ＩｇＧ２ａ投与マウスは、重症の増殖性糸球体腎炎の証拠を有し、５匹のうち３匹で顕著な瘢痕化が明らかであり、このうち１匹は糸球体が全て閉塞した最終段階の腎臓病であった（図４１Ｃ、Ｄ）。５匹のうち２匹のマウスでも間質性炎症が見られた（データは示さない。）。総ＩｇＧ  ｄｓＤＮＡ力価の全体的評価から、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ処置の効果は何も示されなかったが、ここで、このマウスモデルにおける幾分かの自己特異性は寿命が長い形質細胞由来であり、一部は短命の形質細胞由来であることが明らかである。従って、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇが抗ｅｌｆ抗体力価に何の影響を有するかを結論付ける前に、抗ＳＬＥ抗体の全アイソタイプ及びこれらの抗体の優れた特異性に対するＶＩＳＴＡ−Ｉｇの影響のより完全な分析を評価する必要がある。既に記載のように、□ｄｓＤＮＡ抗体力価に影響がない抗ＣＤ４０ＬでのＢＷ及びＮＺＭマウスの後期処置もまた、疾患を改善し得る。そのようなものとして、抗ＣＤ４０Ｌ及びＶＩＳＴＡ−Ｉｇは代わりに、腎臓レベルでの過剰なＴ細胞介在性炎症及び組織損傷などのさらなる過程を制御し得る。重要なこととして、機構に関わらず、これらの予備的結果から、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ処置がまた治療的にも作用し、２４週での投与開始の結果、ＩｇＧ２ａ対照処置動物と比較して、蛋白尿レベルの低下及び糸球体障害の減少が起こることが示される。従って、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇは、確立された疾患において進行中の免疫介在性損傷を無効にし得、ヒトＳＬＥの処置に対して明らかにより意味がある効果である。
【０７３７】
〔0777〕  図６０の実験で示されるように、１日おきにＰＢＳ、１５０μｇ対照ＩｇＧ２ａ、ｍＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａを投与して処置した２０週齢のＮＺＢＷＦ１マウスから全血を回収した。（ａ）炎症性単球ｍａｄ（ｂ）Ｔ細胞の存在及び数を同定するために蛍光複合化抗体で全血を染色し、フローサイトメトリー分析によって細胞集団を調べた。この図における結果は、この処置が炎症性単球及びＴ細胞の細胞頻度を変化させなかったことを示した。
【０７３８】
〔0778〕  図６１の実験で示されるように、ＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａで処置した２０週
ＮＺＢＷＦ１マウスの血液中でＩＬ−１７レベルがさらに検出された。この結果は、処置によって炎症性サイトカインの発現が低下したことを示す。
【０７３９】
〔0779〕  図６２及び６３の実験で示されるように、対照ＩｇＧ２ａ又はＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａで処置した２４週齢ＮＺＢＷＦ１マウスのサイトカインプロファイルも比較した。この結果は、ＶＩＳＴＡ−ＩｇＧ２ａでの処置が、そこでの炎症反応の軽減と一致するように、ＩＬ−２、ＩＬ−１０．ＣＸＣＬ１、ＩＬ−５、ＩＬ−４、ＩＬ−１２及びＩｌ−１−βを含む炎症と関連するサイトカインの発現を低下させたか又はそれに影響を与えたことを示す。一方、ｄｓＤＮＡ抗体レベルは統計学的には影響を受けなかった（結果は示さない。）。
【０７４０】
〔0780〕  この結果は、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇが、抗体レベル又は免疫複合体沈着に影響を与えずにＳＬＥに治療的に介入することを示し、それが非Ｂ細胞機構を通じて介入することを示唆する。むしろ、ＶＩＳＴＡ−ＩｇはＴｒｅｇの痕跡を促進し、腎臓でＴ細胞サイトカインを減少させ、これは、Ｔ細胞活性化に対する直接的影響を示唆する。また、この結果は、腎臓においてＶＩＳＴａ−Ｉｇ投与が著しく骨髄浸潤を減少させ、疾患消散となるはずであることを明らかにする。
【０７４１】
〔0781〕  従って、前述のことに基づき、炎症又は自己免疫性又はアレルギーの負の制御因子としてＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を使用し得る。示されるように、このようなポリペプチドは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＬ−１０、ＴＮＦα及びＩＦＮγの産生を顕著に減少させ得る。これは、同様に、免疫反応の治療的な下方制御につながり、自己免疫、アレルギー性又は炎症性障害からの回復をもたらすはずである。
【０７４２】
実施例３５
〔0155〕喘息などの呼吸器障害の処置におけるＶＩＳＴＡ−Ｉｇの使用
〔0154〕  制御Ｔ細胞及び寛容性：ＣＤ４  Ｆｏｘｐ３−発現Ｔｒｅｇは、最もよく特徴が分かっているＴｒｅｇサブセットであり、自己及び外来抗原の両方に対する寛容性を維持するために欠かせない。Ｆｏｘｐ３突然変異のある患者はアレルギー性症状７を示し得、喘息性気道からのＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの抑制活性が損なわれる６。Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３−誘導性の転写プログラムは、近隣のＴ細胞及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）活性化の抑制能を付与する。ＴＧＦ−β及びＩＬ−２の存在下でＦｏｘｐ３−発現Ｔｒｅｇもまたナイーブ末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞から誘導され得、これは、全−トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）によってさらに促進される８。末梢ＣＤ４  Ｔ細胞からの消化管におけるＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの誘導は、ＴＧＦ−β及びレチノイン酸の産生に依存する９。Ｆｏｘｐ３＋又はＦｏｘｐ３−表現型を有するＩＬ−１０産生Ｔｒｅｇに対する重要な役割もまた、呼吸器の寛容性において確立されている１０、１１、１２。Ｔｒｅｇ数を拡大する新規ストラテジーは、アレルゲンに対するそれらの特異性を向上させるか又は肺組織でそれらの抑制活性を回復させ、従って、喘息における潜在的な疾患修飾性の免疫療法として非常に有望である。
【０７４３】
〔0155〕  発明者らは、アレルギー性の肺の炎症及び寛容性の一連のマウスモデルを開発し、これは、アレルギー性感作後のＣＤ４反応が混合型のＴｈ２＋Ｔｈ１７反応からなることを示した１３。アレルギー性感作及び寛容性誘導の両方とも、流入領域リンパ節ではなく肺組織における総Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４集団の増加が伴う（図４９）。しかし機能的に関連するＴｒｅｇ活性化マーカー１４であるＧＡＲＰの発現が、肺及びリンパ節の両方において上方制御された（図４９）。興味深いことに、寛容性マウスにおいて粘膜組織中のＴｒｅｇがアレルゲンに反応して増殖したが、炎症が存在した場合にそのようにならなかった（図５０）。炎症性の肺におけるこのＴｒｅｇの「麻痺した」状態には、ヘリオス発現の低下が付随した（図５１）。ヘリオスは、Ｆｏｘｐ３プロモーターに結合する転写
因子であり、Ｔｒｅｇ活性に関与し得る１５。さらに、寛容性であるが未感作の動物においてＩＬ−１０及びＩＦＮ−□産生Ｔ細胞の刺激が明らかとなった。
【０７４４】
〔0156〕  ＶＩＳＴＡに対するモノクローナル抗体を用いて、発明者らは、肺胞マクロファージが通常、肺ＤＣ及び間質性マクロファージを含む肺における他細胞型と比較して、細胞表面ＶＩＳＴＡの高いベースライン発現を有することを示した（図５２）。これは、気道内の特有の環境が、抑制的であることが知られている、肺胞マクロファージ上での高ＶＩＳＴＡ発現を維持することを示唆する。寛容性及び炎症の両方との関連におけるアレルゲンの吸入は、気道マクロファージ上でＶＩＳＴＡの発現をさらに増加させ、これは、免疫誘発が、炎症を防ぎ得る、流入するＴ細胞に対する負のシグナルの送達を促進する環境を作ることを示唆する。気道リンパ球は、肺胞マクロファージよりもかなり低いレベルのＶＩＳＴＡを発現した。寛容性中にはリンパ球ＶＩＳＴＡ発現が増加し、アレルゲンにより誘発された炎症中はより低かった（図５２）。しかし、上皮機能が制御不全になった場合の、慢性アレルゲン誘発後のＶＩＳＴＡの発現パターン及び呼吸器寛容性におけるＶＩＳＴＡの機能的役割は不明である。発明者らは、ＶＩＳＴＡがナイーブＣＤ４  Ｔ細胞のＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇへの変換を促進し得ることを明らかにし、これは、末梢寛容性機構におけるＶＩＳＴＡに対する重要な役割を示す（図５３）。
【０７４５】
〔0157〕  従って、前述のことに基づき、ＶＩＳＴＡは、肺における吸入された抗原性及び微生物物質に対する免疫性の非常に重要なチェックポイント制御因子なので、ＶＩＳＴＡ中和は、アレルゲン吸入後、アレルゲン感作、Ｔ細胞サブセット発生及び肺の炎症を緩和するはずである。
【０７４６】
〔0158〕  また、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇは、呼吸器寛容性誘導中の制御Ｔ細胞の発生、分化及び活性を調節するはずであり、肺胞マクロファージ、肺ＤＣ、Ｔ細胞及び制御Ｔ細胞に影響を与え、呼吸器寛容性を緩和するはずである。
【０７４７】
〔0159〕  喘息性の肺において、これは、大部分、慢性炎症に介在する免疫性のＴｈ２及びＴｈ１７構成要素であり、一方でＴｈ１及びＴｒｅｇ反応はアレルギーを阻害し、寛容性を促進する。肺の炎症は、上皮のバリア機能を低下させ、複数のアレルゲンに対するアレルギー性感受性を促進すると考えられる。
【０７４８】
〔0160〕  喘息動物モデル：寛容性誘導中のＶＩＳＴＡ活性の中和
〔0161〕  発明者らのデータは、肺において、特に、吸入された物質に遭遇する最初の細胞である肺胞マクロファージ上でＶＩＳＴＡが強く発現され、呼吸器寛容性及び炎症中に上方制御されることを示す。喘息の処置におけるＶＩＳＴＡ−Ｉｇの可能性を確認するために、５０μｇのＯＶＡを４回、鼻腔内投与により負荷して、吸入ＯＶＡに対してＣ５７ＢＬ／６マウスを寛容性にした１３。持続性の寛容性の発現は、２週間後のＯＶＡ＋ＴＮＦ−α（１μｇ）とそれに続くＯＶＡでの再負荷による動物の粘膜感作及び気道での炎症性細胞の評価及び細胞内サイトカイン分析によるＴ細胞サブセットの特徴評価によって確認される。
【０７４９】
〔0162〕  寛容性誘導におけるＶＩＳＴＡの役割を決定するために、３００μｇの抗ＶＩＳＴＡ  １３Ｆ３中和抗体又は対照ＩｇＧでの処置下（ｉ．ｐ．１日おきに）にある間にマウス（ｎ＝６）の群をＯＶＡで同時に寛容化する。抗ＶＩＳＴＡ処置後、能動的寛容性の発現及びアレルゲン反応性のＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ、ＩＬ−１０分泌Ｔ細胞の存在及びＴｒｅｇ上でのヘリオス及びＧＡＲＰ発現を評価する。次に、能動的寛容性の発現を上記のように決定する。ＶＩＳＴＡ中和が既に確立された寛容性を破壊し得るか否かを決定するために、寛容化後２週間から開始して、ＯＶＡ  ｉ．ｎ．負荷（週に３回）の繰り返しとともに、寛容化動物を抗ＶＩＳＴＡ又は対照ＩｇＧで処置する。２週間後、気道炎症
、肺Ｔｈ１／２／１７  ＣＤ４細胞及び制御Ｔ細胞反応を決定する。既に記載のように、対照又は抗ＶＩＳＴＡ処置動物の反復ＯＶＡ負荷とそれに続く、噴霧メタコリン吸入後の肺耐性及びコンプライアンスの測定によって、気道過敏活性の調節におけるＶＩＳＴＡの役割を決定する。
【０７５０】
〔0163〕  ＶＩＳＴＡ−／−マウスにおける気道ホメオスタシスの特徴評価
〔0164〕  発明者らの実験室で通常行われるように、ＢＡＬ細胞のフローサイトメトリーによって、未処置Ｃ５７ＢＬ／６−ＶＩＳＴＡ−／−マウス及び齢が一致した対照、ＶＩＳＴＡ＋／−子孫において多くの気道及び肺マクロファージ／ＤＣ、Ｔ細胞、好中球、好酸球及びＢ細胞を調べる１６。マルチカラーフローサイトメトリーによって、様々な気道細胞集団上でのＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０／８６、ＣＤ４０、阻害受容体ＣＤ２００Ｒ及びＰＤ−１ならびにＶＩＳＴＡの表面発現を評価する。ＬｕｍｉｎｅｘサイトカインビーズアレイによってＢＡＬ上清中のサイトカインの休止レベルを決定する。次に、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）＋ＩＦＮ−□（５０ｎｇ／ｍＬ）での刺激から２４時間後に、ＶＩＳＴＡ−／−及び対照ＢＡＬから精製された肺胞マクロファージからのサイトカインの誘導性分泌を決定する。ＯＶＡ−Ａｌｅｘａ４８８標識アレルゲンの鼻腔内滴下によって、続いて６時間後の肺組織細胞の洗浄、抽出及び組織常在細胞によるアレルゲンの取り込みに対するフローサイトメトリーによって、呼吸器上皮のバリア機能を決定する。炎症性事象による肺ホメオスタシスの動揺の結果、上皮を横切るアレルゲン取り込みが増加する。
【０７５１】
〔0165〕  アレルギー性気道疾患の２種類のモデルが使用される（ｉ）上記のようなＯＶＡ±ＴＮＦ−α  ｉ．ｎ．での粘膜感作と、それに続く５０μｇのＯＶＡでの反復負荷及び（ｉｉ）ハウスダストダニでの反復処置（ＨＤＭ、Ａｌｌｅｒｇｏｎ、２５μｇ  ｉ．ｎ．，記載のように週に３回）１７。ＨＤＭは固有のアジュバント活性を有し、英国で喘息において観察される最も顕著な感作であるので、より臨床的に意義のあるモデルとなり得る。しかし、誘導される反応のアレルゲン特異性を確認することは困難である。両モデルを用いてＶＩＳＴＡ−／−及び対照子孫において急性アレルギー性気道炎症を誘導し、気道への炎症性細胞の浸潤及び肺Ｔ細胞サイトカインプロファイルを記載のように決定する。以前のような肺機能試験によって気道機能亢進を評価する。発明者らの実験室で通常使用されるように、アレルゲン特異的なＩｇ  ＥＬＩＳＡ又は総ＩｇＥ  ＥＬＩＳＡによって、循環ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＡ血清反応の発現を測定する。ＢＡＬ液性ＩｇＡレベルも決定する。最後に、発明者らは、疾患の急性期と比較してＡＨＲ及び炎症が軽減される場合、ＶＩＳＴＡがマウスの慢性アレルゲン負荷後に現れる気道リモデリングを下方制御するか否かを決定する。ＶＩＳＴＡ−／−又は対照マウスを上述のように感作するが、ｉ．ｎ．負荷は５週間継続する。以前のように気道炎症を決定し、組織学により気道壁肥厚、コラーゲン沈着及び平滑筋細胞肥厚化について肺切片を分析する。
【０７５２】
〔0166〕  肺での限定された白血球サブセットにおけるＶＩＳＴＡの制御的役割
〔0167〕  発明者らは、現在、限定された系列の造血細胞においてＶＩＳＴＡが条件的に欠失させられる新規のマウス系統を開発している。別の研究の一部として、Ｔ細胞増殖性反応、Ｔｒｅｇの抑制性の活性及びＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７及びＣＤ８  Ｔ細胞の分化における様々な細胞型上でのＶＩＳＴＡに対する役割の詳細な特徴評価は進行中である。予備的データは、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ上で発現されるＶＩＳＴＡがそれらの抑制活性に寄与することを示す。それぞれＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞、ＤＣ、骨髄細胞及びＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇに対する突然変異を標的とするために、次の系列特異的なプロモーター：Ｌｃｋ、ＣＤ１１ｃ、ＬｙｚＭ及びＦｏｘｐ３下でＣｒｅリコンビナーゼを発現する動物とＶＩＳＴＡ  ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスを交配させる。ＶＩＳＴＡ−／−動物で上記で決定されたように、休止気道集団の何らかの異常について、及び以前のように呼吸器寛容性の欠如について、得られたコロニーからＰＣＲ−スクリーニングされた子孫を試験する。次に、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合物を用いて呼吸器寛容性誘導についてこれらの群を試験する
。
【０７５３】
〔0168〕  アレルギー性気道疾患におけるＶＩＳＴＡ経路の治療的標的化
〔0169〕  可溶性型のＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、インビトロで抑制性ではないが、プラスチックと結合させた場合、Ｔ細胞反応を阻害する６。可溶性ＶＩＳＴＡ−ＩｇはＦｃＲに対する結合ドメインを欠くので、これはインビボでＡＰＣに結合しないか又は抑制効果を発揮しない。従って、別個に援助を受けたプロジェクトにおいて、発明者らは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現され、再折り畳みされ、封入体から精製されているコンストラクトを用いてＶＩＳＴＡ細胞外ドメインの非共有オリゴマーを開発している。Ｔ細胞増殖及びＴｒｅｇ分化アッセイにおいて、免疫抑制活性についてＶＩＳＴＡの四量体、五量体又は七量体を試験する。これらの試薬が入手可能になったら、発明者らは、ＶＩＳＴＡ経路を治療的介入に対して標的化することが喘息であるか否かが実行可能であることを試験する。上記のようにＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて急性アレルギー性気道炎症を誘導し、アレルゲン負荷と並んで動物群を５から１００μｇの選択されたＶＩＳＴＡオリゴマー（又は負の対照としてのＶＩＳＴＡ−Ｉｇ）でｉ．ｎ．処置する。気道炎症及びＴｒｅｇ介在性免疫寛容原性反応を決定する。ＶＩＳＴＡオリゴマーが炎症を阻害するか又は寛容性を誘導する場合、気道機能亢進及びＨＤＭ誘導性炎症のさらなる研究を行う。最終的に、発明者らは、このような治療が確立された炎症を消散させ得るか否かを決定するために疾患の急性期の後までＶＩＳＴＡ−オリゴマー処置を遅らせる。慢性期までアレルゲン負荷とともにＶＩＳＴＡオリゴマーを与え、対照及びＶＩＳＴＡ標的化マウスにおいて気道炎症及びリモデリングを評価する。
【０７５４】
実施例３６
〔0156〕  シグナル伝達経路上でのＶＩＳＴＡの効果
〔0154〕  ＴＣＲ誘導性ＥＲＫ及び他のシグナル伝達経路分子におけるＶＩＳＴＡの影響を評価するために、実験を行った。これらの実験は、癌及び自己免疫疾患の処置において適応がある、ある一定のシグナル伝達経路の調整として行った。例えば、ＣＭＬの処置のために使用されるイマチニブは、癌に影響を与えるシグナル伝達経路におけるその影響ゆえに臨床的に有効である抗体の実例となるものである。
【０７５５】
〔0155〕  これらの実験において、２．５μｇ／ウェルの抗ＣＤ３抗体（２Ｃ１１）＋１０μｇの対照ＩｇＧ又はＶＩＳＴＡ−Ｉｇの何れか（１：４の比率）で２４ウェルプレートを被覆し、ウェルを４０℃で一晩温置した。次に血清飢餓精製マウスＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて様々な時間にわたり３７℃でウェルを刺激した。
【０７５６】
〔0156〕  この細胞を回収し、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、ＺＡＰ７０、ＬＡＴ、ＧＲＢ２、Ｖａｖ、Ｒａｓ、Ｐ３８、ＪＮＫ、ＥＲＫ１／２を含むＴＣＲシグナル伝達経路におけるリン酸化タンパク質についてウエスタンブロットを介して規定の時間点でＴＣＲシグナル伝達カスケードにおける影響を評価した。これらの実験を図５４で図示する。
【０７５７】
〔0157〕  図５５のブロットは、ＣＤ３刺激後の様々な時間点でのｐＥｒｋレベルを示す（ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ又は対照ＩｇＧなし：活性化時間経過）。ローディング対照は、図５６に含有される。
【０７５８】
〔0158〕  図５７のデータにより示されるように、ＶＩＳＴＡはＥＲＫ１／２活性化を阻害する。一方、図５８のデータにより示されるように、ＶＩＳＴＡはｐＪＮＫ活性化に影響を与えない。特に、これらの実験の結果は、１０分後にＶＩＳＴＡが選択的にＴＣＲ誘導性ｐ−ＥＲＫを抑制したことを示す。従って、ｐ−ＥＲＫ発現及びシグナル伝達経路を調整するために、ＶＩＳＴＡアゴニスト及びアンタゴニストを使用し得る。
【０７５９】
実施例３７：ＭＬＲの抑制におけるＶＩＳＴＡ−Ｉｇの使用
ＭＬＲ実験で使用される材料及び方法
〔0159〕  方法：Ａ）健康なヒト血液ドナーからのＰＢＭＣを用いてヒトＭＬＲを９６ウェルＵ底プレートに用意した。精製ヒト又はマウスＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質でプレートを４℃で一晩被覆した。
【０７６０】
〔0160〕  刺激装置である細胞に４０００ｒａｄで放射線照射した。ＶＩＳＴＡ−Ｉｇの存在下及び非存在下で各ウェルで１０＾５「反応物」細胞を１０＾５「刺激装置」細胞と混合した。
【０７６１】
〔0161〕  ヒト及びマウスＶＩＳＴＡ−ＩｇコンストラクトによるＭＬＲの抑制
〔0162〕  ヒト及びマウスＭＬＲ実験の結果はそれぞれ５９Ａ及び５９（Ｂ）に含有される。この実験において、上記のように健康なヒトドナーからのＰＢＭＣを用いて標識（Ａ）ヒトＭＬＲを９６ウェルＵ底プレートに用意した。精製ヒト又はマウスＶＩＳＴＡ−Ｉｇタンパク質でプレートを４℃で一晩被覆した。刺激装置である細胞に４００ｒａｄで放射線照射した。ヒト又はマウスＶＩＳＴＡ−Ｉｇの存在下及び非存在下で各ウェルで１０＾５「反応物」細胞を１０＾５「刺激装置」細胞と混合した。３Ｈ−チミジンを用いて細胞増殖を測定した。図５９（Ｂ）で示されるマウスＭＬＲ実験において、マウス脾臓細胞を用いたことを除き実質的に同様に実験を行った。
【０７６２】
〔0163〕  これらの実験において、図５９（Ａ）及び（Ｂ）で示される指示された濃度でｈＶ−Ｉｇ（ヒトＶＩＳＴＡ−Ｉｇ）、ｍＶ−Ｉｇ（マウスＶＩＳＴＡ−Ｉｇ）をＭＬＲに添加した。これらの実験で使用したヒトＶＩＳＴＡ−Ｉｇコンストラクトに対する配列は下記でさらに提供される。
〔0164〕FKVATPYSLYVCPEGQNVTLTCRLLGPVDKGHDVTFYKTWYRSSRGEVQTCSERRPIRNLTFQDLHLHHGGHQAANTSHDLAQRHGLESASDHHGNFSITMRNLTLLDSGLYCCLVVDIRHHHSEHRVHGAMELQVQTGKDAPSNCVVYPSSSQESENITAADPGGGGGRLVPRGFGTGDPEPKSSDKTHTCPPCPAPEFEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPTPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK （配列番号７５）
〔0165〕  結果
〔0166〕  図５９（Ａ）及び（Ｂ）で示されるように、試験した組み換えヒトＶＩＳＴＡ−Ｉｇ及びマウスＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質の両方が、ヒト及びマウス混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の両方を実質的に抑制した。この図での結果は、試験した組み換えヒトＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質が、マウスＭＬＲを抑制することにおいて組み換えマウスＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質よりも強力であることを示す（Ｂの実験）。一方、マウスＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、ヒトＭＬＲを抑制することにおいてマウスＭＬＲよりも強力である。これらの結果は、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇが、アレルギー性反応の処置又は予防を必要とする対象におけるアレルギー性反応の処置又は予防に非常に適しているはずであることをさらに示唆する。
〔0167〕  本発明及び代表的な実施形態を詳細に説明してきたが、続く特許請求の範囲によって本発明がさらに定義される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月18日(2020.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ヒト又はマウスＶＩＳＴＡの細胞外領域又は少なくとも５０アミノ酸であるその断片と少なくとも８０％の配列同一性を具備する少なくとも１つのポリペプチドと、
（ｉｉ）少なくとも５アミノ酸を具備する少なくとも１つのリンカーペプチドと、
（ｉｉｉ）少なくとも１つのＩｇタンパク質、好ましくはＩｇ  Ｆｃ領域又はその断片もしくは変異体と、
を具備する単離又は組み換えＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質であって、
前記ペプチドリンカーがＶＩＳＴＡポリペプチド（ｉ）及びＩｇタンパク質に介入し、得られるＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質がインビボで前記リンカーを欠く同一融合タンパク質よりも強力な免疫抑制活性を引き出す、単離又は組み換えＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質。