(57)【要約】      （修正有）【課題】抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する工程と、得られた培養物中に含まれる前記哺乳動物細胞が発現した抗体を回収する工程とを含む、抗体の製造方法において、高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体を製造する方法を提供すること。【解決手段】抗体を発現可能な哺乳動物細胞の培養工程を、０．０１μＭから５０μＭのマンガンイオンを添加した培地で行なうことで、前記課題を解決する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する工程と、得られた培養物中に含まれる前記哺乳動物細胞が発現した抗体を回収する工程とを含む、抗体の製造方法において、
前記培養工程を０．０１μＭから５０μＭのマンガンイオンを添加した培地で行なうことで、抗体依存性細胞傷害活性が向上した抗体を製造する方法。
【請求項２】
抗体がヒトＦｃ領域を含む抗体である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
請求項２に記載の製造方法で得られた抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性を評価することで、請求項２に記載の製造方法における培養工程をモニタリングする方法。
【請求項４】
請求項２に記載の製造方法で得られた抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性を評価することで、請求項２に記載の製造方法における培地成分を評価する方法。
【請求項５】
請求項２に記載の製造方法で得られた抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性評価を、請求項２に記載の製造方法で得られた抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化分離剤との結合力に基づき行なう、請求項３または請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有した抗体を製造する方法に関する。より詳しくは、抗体を発現可能な宿主を培養する工程を最適化することで、当該宿主が発現する抗体が有するＡＤＣＣ作用を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、組換えタンパク質は幅広い分野で使用されている。近年の抗体医薬品に代表されるバイオ医薬品の成長によりその重要性はさらに高まっている。組換えタンパク質は主に大腸菌、酵母、昆虫細胞、哺乳細胞を宿主として製造されているが、発現させた組換えタンパク質の立体構造や、糖鎖付加といった翻訳後修飾等の理由から哺乳動物細胞を宿主として用いた組換えタンパク質発現系の重要性が増している。特にチャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞）は多くの組換えタンパク質発現の宿主として用いられる。また組換えＣＨＯ細胞由来の組換えタンパク質は、医薬品として使用できる安全性が確認されていることから、抗体医薬品を製造する際の宿主として最もよく使用される哺乳動物細胞である。
【０００３】
抗体医薬品はモノクローナル抗体を主成分とした医薬品であるが、その治療効果には信号伝達阻害、細胞死（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の誘導、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）作用や補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）作用などがある。このうちＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性はエフェクター機能と呼ばれており免疫メカニズムを誘導することで癌等の目的細胞を傷害するため重要である。特にＡＤＣＣ活性は抗体医薬品の細胞傷害作用には重要な活性である。
【０００４】
抗体が有するＡＤＣＣ活性を向上させる方法として、抗体のＦｃ領域にある特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する方法と、抗体のＦｃ領域に付加する糖鎖を改変する方法に大別される。抗体のＦｃ領域に付加する糖鎖には、特定のアミノ酸配列（例えば、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）（Ｘは任意のアミノ酸残基を示す）のアスパラギン（Ａｓｎ）基の側鎖に付加するＮ型糖鎖と、セリン（Ｓｅｒ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）残基の側鎖に結合するＯ型糖鎖がある。このうちＮ型糖鎖のコアフコースを欠損させることでＡＤＣＣ活性が向上する報告がされている（非特許文献１）。
【０００５】
抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養し、得られた培養物中に含まれる前記哺乳動物細胞が発現した抗体を回収することで、前記抗体を製造する際、前記哺乳動物細胞の培養条件を変化させると、前記抗体のＦｃ領域に付加するＮ型糖鎖の構造が変化することが知られている（特許文献１）。しかしながら、実際に抗体のＦｃ領域へ付加する糖鎖は不均一であり、前記糖鎖の構造とＡＤＣＣ活性との関係を完全に結び付けることは難しい。従って、糖鎖構造を制御してＡＤＣＣ活性の高い抗体を製造する条件、特に前記抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する条件の構築は困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１７ー５０６５１５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｏｒｉ．Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５５，１０９−１１４（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する工程と、得られた培養物中に含まれる前記哺乳動物細胞が発現した抗体を回収する工程とを含む、抗体の製造方法において、高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する工程において、前記哺乳動物細胞を一定量のマンガンイオンを添加した培地で培養することで、得られた培養物中に含まれる前記哺乳動物細胞が発現した抗体の抗体依存性細胞傷害が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下に記載の態様を包含する。
【００１１】
（１）抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する工程と得られた培養物中に含まれる前記哺乳動物細胞が発現した抗体を回収する工程とを含む抗体の製造方法において、前記培養工程を０．０１μＭから５０μＭのマンガンイオンを添加した培地で行なうことで、抗体依存性細胞傷害活性が向上した抗体を製造する方法。
【００１２】
（２）抗体がヒトＦｃ領域を含む抗体である、（１）に記載の製造方法。
【００１３】
（３）（２）に記載の製造方法で得られた抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性を評価することで、（２）に記載の製造方法における培養工程をモニタリングする方法。
【００１４】
（４）（２）に記載の製造方法で得られた抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性を評価することで、（２）に記載の製造方法における培地成分を評価する方法。
【００１５】
（５）（２）に記載の製造方法で得られた抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性評価を、（２）に記載の製造方法で得られた抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化分離剤との結合力に基づき行なう、（３）または（４）に記載の方法。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明の製造方法は、抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する際、０．０１μＭから５０μＭのマンガンイオンを培地に添加して培養することを特徴としている。培地中のマンガンイオンが前述した濃度範囲であれば、細胞の増殖性や抗体の生産性が著しく阻害されることはない。マンガンイオンの培地への添加は、水溶液中でマンガンイオンとして存在可能なマンガン化合物を添加すればよい。前記マンガン化合物の例として、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）や硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４）が例示できる。マンガン化合物の添加量は、培地中のマンガンイオンが前述した濃度範囲となるよう添加すればよく、０．０３μＭから３０μＭとなるよう添加すると好ましく、０．１μＭから１０μＭとなるよう添加するとより好ましく、１μＭから１０μＭとなるよう添加するとさらにより好ましい。
【００１８】
本発明の製造方法で使用する哺乳動物細胞は、製造対象抗体を発現可能な細胞であれば特に制限はない。一例を示すと、ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ＤＧ４４およびＣＨＯ−ＤＸＢ１１）、マウス骨髄腫由来細胞（ＳＰ２／０、ＮＳ０）、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ細胞）、ヒト白血病細胞由来細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト子宮頸癌由来細胞（ＨｅＬａ細胞）およびアフリカミドリザルの腎細胞由来細胞（ＣＯＳ細胞）があげられる。中でも組換え抗体製造に汎用されるＣＨＯ細胞の使用が好ましい。
【００１９】
本発明の製造方法で使用する培地は、０．０１μＭから５０μＭのマンガンイオンを含み、かつ宿主である哺乳動物細胞が生育し抗体を発現可能な培地であれば、特に限定はない。一例を示すと、動物由来の血清が必要な培地（ＲＰＭＩ１６４０、Ｄ−ＭＥＭ等）や化学的に成分が決定されている培地（ＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ［Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社］、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＭｅｄｉｕｍＣＤ［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社］、ＯｐｔｉＣＨＯ［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社］、ＥＸ−ＣＥＬＬ  ＣＤ  ＣＨＯ  Ｆｕｓｉｏｎ／ＥＸ−ＣＥＬＬ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣＨＯ  Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  Ｍｅｄｉｕｍ［Ｍｅｒｃｋ社］およびＣＨＯｇｒｏ［Ｍｉｒｕｓ社］）に前述した濃度のマンガンイオンを添加した培地があげられる。さらに前述した培地に、栄養素、ホルモン、成長因子、特定イオン（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等）、ビタミン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、グルタミンのようなアミノ酸、無機塩（銅、亜鉛、コバルト、ニッケル等）、脂質、グルコースをはじめとする培地構成成分が含まれていてもよい。またＧ４１８、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、カナマイシン、アンピシリンなどの抗生物質をさらに添加してもよい。
【００２０】
本発明の製造方法における培養工程は、宿主として用いる哺乳動物細胞や前記細胞で発現させる抗体に応じて適宜行なえばよい。一例として、
前述した濃度のマンガンイオンを添加した培地を入れたフラスコに、抗体を発現可能な哺乳動物細胞を接種後、当該フラスコを振盪させて培養してもよく、
前述した濃度のマンガンイオンを添加した培地を入れたバイオリアクターに、抗体を発現可能な哺乳動物細胞を接種後、回分培養、半回分培養（流加培養ともいう）、潅流培養またはそれらの組合せにより培養してもよい。
哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞の場合、５％から８％のＣＯ２存在下、温度３０℃から３７℃
、ｐＨ６．８から７．４で培養することが好ましい。
【００２１】
本発明の方法で製造する抗体の一例として、ヒトＦｃ領域を含む抗体があげられる。具体的には、ヒト抗体、ヒト化抗体、ヒトと他の動物（マウスなど）とのキメラ抗体、ヒトＦｃ融合タンパク質などがあげられる。ヒトＦｃ領域を含む抗体がイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）の場合、４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）が知られているが、このうちＩｇＧ１とＩｇＧ３は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性が高い点で、本発明の方法で製造する抗体の好ましい態様といえる。さらにＩｇＧ１はＡＤＣＣ活性が特に高く、本発明の方法で製造する抗体の特に好ましい態様といえる。
【００２２】
本発明の製造方法で使用する、抗体を発現可能な哺乳動物細胞は、前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで、前記哺乳動物細胞を形質転換し、作製すればよい。前記発現ベクターには、プロモーターおよび前記抗体をコードするポリヌクレオチドの他に、ポリＡや、組換え抗体の分泌発現に必要な分泌シグナルや、遺伝子増幅マーカー遺伝子や、宿主選択に用いる抗生物質耐性遺伝子や、遺伝子組換えのために用いる哺乳動物細胞以外の宿主での複製開始点等をさらに含んでもよい。
【００２３】
前記ポリＡはターミネーションシグナルを含んでいれば特に制限はなく、一例として、発現させる抗体由来のポリＡ、ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のポリＡ、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼのポリＡ、ウシ成長ホルモン由来のポリＡ、ウサギのβーグロビン遺伝子由来のポリＡがあげられる。
【００２４】
前記分泌シグナルは発現抗体を分泌すれば特に制限はなく、その一例としては、発現させる組換え抗体由来の分泌シグナル、ヒトインターロイキン２（ＩＬー２）の分泌シグナル、アズロシジン前駆体の分泌シグナル、ヒト血清アルブミンの分泌シグナルがあげられる。
【００２５】
前記遺伝子増幅マーカー遺伝子は、遺伝子増幅させる方法に適した遺伝子を用いればよい。例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）／メトトレキサート（ＭＴＸ）法を用いる場合はｄｈｆｒ遺伝子を、グルタミン合成酵素（ＧＳ）／メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）法を用いる場合はＧＳ遺伝子を、それぞれ用いればよい。
【００２６】
前記抗生物質耐性遺伝子は、宿主選択に用いる抗生物質に対応した耐性遺伝子を選択すればよく、一例として、Ｇ４１８耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、フレオマイシン耐性遺伝子があげられる。
【００２７】
前記複製開始点は、哺乳動物細胞以外の宿主が大腸菌である場合、大腸菌内でのコピー数が高くプラスミドＤＮＡの収量が多い、ＣｏｌＥ１が例示できる。
【００２８】
さらに前記発現ベクターには、プロモーターの働きを強めるためのエンハンサーをさらに含んでもよい。使用するエンハンサーに特に制限はなく、発現させる抗体や哺乳動物細胞を考慮し、適宜選択すればよい。一例としてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のエンハンサーがあげられる。
【００２９】
また哺乳動物に導入した遺伝子（抗体をコードするポリヌクレオチド）が発現しやすくするために、前記発現ベクターにＬｏｘＰ遺伝子をさらに含ませてもよい。ゲノム中にＬｏｘＰ遺伝子を含んだ宿主細胞へ発現ベクターを導入する際に、Ｃｒｅリコンビナーゼによる相同組換えを行なうことで宿主細胞のゲノムへ部位特異的に組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入することができる。また、宿主細胞のゲノムへ部位特異的に組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入する方法としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などを用いることもできる。
【００３０】
前記発現ベクターで哺乳動物細胞を形質転換するには、エレクトロポレーションやカチオニックリポソームを用いたリポフェクションなど、当業者が通常用いる形質転換法の中から、宿主として使用する哺乳動物細胞に合わせて適宜選択すればよい。
【００３１】
前述した方法で抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養後、得られた培養物中に含まれる前記哺乳動物細胞が発現した抗体を回収することで、ＡＤＣＣ活性が向上した抗体を製造する。抗体の回収方法の一例として、前記得られた培養物から、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーによる精製操作を単独または組み合わせて抗体を回収する方法があげられる。前記方法は抗体を高効率かつ高純度に回収できる点で好ましい。
【００３２】
本発明で製造する抗体が、ヒトＦｃ領域を含む抗体である場合、前記抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性を評価することで、抗体を発現可能な哺乳動物細胞の培養状態（培養工程）をモニタリングできる。ヒトＦｃ領域を含む抗体に付加するＮ型糖鎖を欠損させると前記抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性が著しく低下する。またヒトＦｃ領域を含む抗体が有するＡＤＣＣ活性は、当該Ｆｃ領域と免疫細胞表面上のヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性（結合性）と関連することが知られている（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ．Ｊ，Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３，６，（２０１１））。従って、ヒトＦｃ領域を含む抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性を評価することで、製造する抗体が有するＡＤＣＣ活性をモニタリングでき、抗体を発現可能な哺乳細胞の培養工程をモニタリングできる。一例として、得られたヒトＦｃ領域を含む抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性が低下した場合、当該抗体が有するＡＤＣＣ活性が低下しているため、当該抗体が有するＡＤＣＣ活性を向上すべく、マンガンイオン濃度などの培地成分や培養条件（二酸化炭素濃度、温度、ｐＨ、時間など）を適宜調整する。
【００３３】
ヒトＦｃ領域を含む抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性評価の好ましい態様として、ヒトＦｃ領域を含む抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化分離剤との結合力に基づく評価があげられる。ヒトＦｃγＲＩＩＩａを担体に固定化して得られるヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化分離剤を充填したカラムに、ヒトＦｃ領域を含む抗体をアプライすると、前記抗体が付加した糖鎖構造の違いに基づき分離され（特開２０１５−０８６２１６号公報、ＷＯ２０１８／１５０９７３号）、かつ前記抗体が有するＡＤＣＣ活性の違いに基づき分離される（特開２０１６−０２３１５２号公報、ＷＯ２０１８／１５０９７３号）。従って、前記分離パターンの形状に基づき、本発明における、抗体を発現可能な哺乳動物細胞の培養状態（培養工程）のモニタリングができる。具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化分離剤を充填したカラムを用いてヒトＦｃ領域を含む抗体を分離すると、ＡＤＣＣ活性が高い抗体がＡＤＣＣ活性が低い抗体よりも遅れて溶出される（すなわちヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化分離剤との結合力が強い）。従って、前記分離により得られた溶出パターンのピーク面積またはピーク高さから、ＡＤＣＣ活性が高い抗体が溶出されるピーク（画分）の量および／または割合を算出し、当該量および／または割合が低下した場合、当該抗体が有するＡＤＣＣ活性が低下しているため、当該抗体が有するＡＤＣＣ活性を向上すべく、マンガンイオン濃度などの培地成分や培養条件（二酸化炭素濃度、溶存酸素濃度、温度、ｐＨ、時間など）を適宜調整する。
【００３４】
また、培養条件や細胞株を同条件とし培地成分のみを変えて培養を行なうことで、よりＡＤＣＣ活性が高くなる培地成分の評価を行なうことができる。具体的には異なる培地で培養することで得られた抗体を前記ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化分離剤により評価を行ない、得られた分離パターンの形状やピーク（画分）の量および／または割合に基づき得られた抗体のＡＤＣＣ活性を比較することで培地の抗体に対する評価を行なう。
【００３５】
なお本明細書においてヒトＦｃγＲＩＩＩａとは、
（Ａ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０８６３７）のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含む、Ｆｃ結合性タンパク質、または
（Ｂ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０８６３７）のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、１以上のアミノ酸残基が欠失、他のアミノ酸残基に置換、または付加されたポリペプチドを含む、Ｆｃ結合性タンパク質、
のことを意味する。また前記（Ｂ）の好ましい態様として、
特開２０１５−０８６２１６号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１６−１６９１９７号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１７−１１８８７１号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
ＷＯ２０１８／１５０９７３号で開示のＦｃ結合性タンパク質、
ＷＯ２０１９／０８３０４８号で開示のＦｃ結合性タンパク質、
があげられる。
【００３６】
また本発明において、ＡＤＣＣ活性が向上した抗体とは、例えば、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化分離剤を充填したカラムを用いた分離により得られた結果（溶出パターン）のうち、ＡＤＣＣ活性の高い抗体が位置するピーク面積またはピーク高さの割合が、マンガンイオン無添加培地で培養したときの前記割合と比較し、２％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上、さらにより好ましくは２０％以上向上した抗体のことを意味する。
【発明の効果】
【００３７】
本発明は、抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する工程と得られた培養物中に含まれる前記哺乳動物細胞が発現した抗体を回収する工程とを含む抗体の製造方法において、前記培養工程を０．０１μＭから５０μＭのマンガンイオンを添加した培地で行なうことを特徴としている。本発明により、抗癌剤など抗体依存性細胞障害活性を必要とする抗体を効率的に製造できる。
【００３８】
また本発明で製造する抗体がヒトＦｃ領域を含む抗体の場合、前記抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの親和性を評価することで、本発明の製造方法における培養工程のモニタリングや培地成分の評価が行なえる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】哺乳動物用発現プラスミドｐＥＦｄのプラスミドマップを示している。
【図２】０．０１μＭから５０μＭのマンガンイオンを添加した、またはマンガンイオン未添加のＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍで抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞をフラスコ培養したときの抗体生産性の推移を示している。
【図３】０．０１μＭから５０μＭのマンガンイオンを添加した、またはマンガンイオン未添加のＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍで抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞をフラスコ培養したときの生細胞数の推移を示している。
【図４】０．０１μＭから５０μＭのマンガンイオンを添加した、またはマンガンイオン未添加のＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍで抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞をフラスコ培養したときに得られた抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラム分析の結果を示している。
【図５】０．０１μＭから５０μＭのマンガンイオンを添加した、またはマンガンイオン未添加のＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍで抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体発現細胞をフラスコ培養したときの抗体生産性の推移を示している。
【図６】０．０１μＭから５０μＭのマンガンイオンを添加した、またはマンガンイオン未添加のＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍで抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体発現細胞をフラスコ培養したときの生細胞数の推移を示している。
【図７】０．０１μＭから５０μＭのマンガンイオンを添加した、またはマンガンイオン未添加のＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍで抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体発現細胞をフラスコ培養したときに得られた抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラム分析の結果を示している。
【図８】０．０１μＭから５０μＭのマンガンイオンを添加した、またはマンガンイオン未添加のＣＤ  Ｏｐｔｉ  ＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍで抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞をフラスコ培養したときの抗体生産性の推移を示している。
【図９】０．０１μＭから５０μＭのマンガンイオンを添加した、またはマンガンイオン未添加のＣＤ  Ｏｐｔｉ  ＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍで抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞をフラスコ培養したときの生細胞数の推移を示している。
【図１０】０．０１μＭから５０μＭのマンガンイオンを添加した、またはマンガンイオン未添加のＣＤ  Ｏｐｔｉ  ＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍで抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞をフラスコ培養したときに得られた抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラム分析の結果を示している。
【図１１】０．０１μＭから５０μＭのマンガンイオンを添加した、またはマンガンイオン未添加のＣＤ  Ｏｐｔｉ  ＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍで抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体発現細胞をフラスコ培養したときの抗体生産性の推移を示している。
【図１２】０．０１μＭから５０μＭのマンガンイオンを添加した、またはマンガンイオン未添加のＣＤ  Ｏｐｔｉ  ＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍで抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体発現細胞をフラスコ培養したときの生細胞数の推移を示している。
【図１３】０．０１μＭから５０μＭのマンガンイオンを添加した、またはマンガンイオン未添加のＣＤ  Ｏｐｔｉ  ＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍで抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体発現細胞をフラスコ培養したときに得られた抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラム分析の結果を示している。
【図１４】５μＭのマンガンイオンを添加した（実施例６）、またはマンガンイオン未添加（比較例１）のＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍを用いて抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞をバイオリアクターでバッチ培養したときの抗体生産性の推移を示している。図中、四角がマンガンイオン添加時（実施例６）の、ひし形がマンガンイオン未添加時（比較例１）の、それぞれ結果である。
【図１５】５μＭのマンガンイオンを添加した（実施例６）、またはマンガンイオン未添加（比較例１）のＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍを用いて抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞をバイオリアクターでバッチ培養したときの抗体の生細胞数の推移を示している。図中、四角がマンガンイオン添加時（実施例６）の、ひし形がマンガンイオン未添加時（比較例１）の、それぞれ結果である。
【図１６】５μＭのマンガンイオンを添加した（実施例６）、またはマンガンイオン未添加（比較例１）のＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍ（比較例１）を用いて、抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞をバイオリアクターによるバッチ培養したときに得られた抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラム分析の結果を示している。
【図１７】１μＭから１０μＭのマンガンイオンを添加した（実施例７）、またはマンガンイオン未添加（比較例２）のＥＸ−ＣＥＬＬ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣＨＯ  Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  Ｍｅｄｉｕｍを用いて、抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞をバイオリアクターによりバッチ培養したときの抗体生産性の推移を示している。
【図１８】１μＭから１０μＭのマンガンイオンを添加した（実施例７）、またはマンガンイオン未添加（比較例２）のＥＸ−ＣＥＬＬ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣＨＯ  Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  Ｍｅｄｉｕｍを用いて、抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞をバイオリアクターによりバッチ培養したときの生細胞密度の推移を示している。
【図１９】１μＭから１０μＭのマンガンイオンを添加した（実施例７）、またはマンガンイオン未添加（比較例２）のＥＸ−ＣＥＬＬ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣＨＯ  Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  Ｍｅｄｉｕｍを用いて、抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞をバイオリアクターによりバッチ培養したときに得られた抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラム分析によるクロマトグラムおよび各ピークの面積割合を示している。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例および比較例を用いて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。
【００４１】
実施例１  抗インターロイキン６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）抗体発現細胞の構築
（１）以下の方法で抗ＩＬ−６Ｒ抗体を哺乳動物細胞で発現可能なベクターを構築した。
（１−１）配列番号１に記載のジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ｄｈｆｒ）およびＳＶ４０のＰｏｌｙＡをコードする遺伝子に制限酵素ＳａｃＩＩ認識配列列（ＣＣＧＣＧＧ）を５’末端および３’末端の両方に付加した遺伝子を全合成し（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に委託）プラスミドにクローニングした。
（１−２）（１−１）で作製したプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を培養し、プラスミドを抽出したのち、制限酵素ＳａｃＩＩで消化することで、ｄｈｆｒ−ＳＶ４０ＰｏｌｙＡをコードする遺伝子を調製しｄｈｆｒ−Ｐ１と命名した。
（１−３）ｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型として、配列番号２（５’−ＴＣＣ［ＣＣＧＣＧＧ］ＧＣＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＡＴＧＡＣＣＧ−３’）および配列番号３（５’−ＴＣＣ［ＣＣＧＣＧＧ］ＧＧＴＧＧＣＴＣＴＡＧＣＣＴＴＡＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号２および３中の角かっこは制限酵素ＳａｃＩＩ認識配列を示している）を用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表１に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で３０秒間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル繰り返ことで実施した。このＰＣＲにより、ｐＩＲＥＳベクターのうちネオマイシン耐性遺伝子を除いた領域を増幅した。
【００４２】
【表１】
2020103280.tif 000003
【００４３】
（１−４）（１−３）で作製したＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＳａｃＩＩで消化し、（１−２）で調製したｄｈｆｒ−Ｐ１とライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することでｄｈｆｒ遺伝子を含んだ発現ベクターｐＩＲＥＳ−ｄｈｆｒを得た。
【００４４】
（２）（１）で作製したｐＩＲＥＳ−ｄｈｆｒを鋳型として配列番号４（５’−ＴＴＴＡＡＡＴＣＡ［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＧＣＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＡＡＡＴＡＡＣＣＴＣＴＧ−３’）および配列番号５（５’−ＧＣＡＡＧＴＡＡＡＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＴＡＡＡ［ＣＧＡＴＣＧ］ＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴー３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号４中の角かっこは制限酵素ＮｏｔＩ認識配列を、配列番号５中の角かっこは制限酵素ＰｖｕＩ認識配列を、それぞれ示している）を用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で１分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより増幅したＰＣＲ産物（ＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒ、ＳＶ４０のＰｏｌｙＡまでの領域を）をｄｈｆｒ−Ｐ２と命名した。
【００４５】
【表２】
2020103280.tif 000004
【００４６】
（３）ヒト抗体の重鎖定常領域を含んだｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）、ヒト抗体の軽鎖定常領域を含んだｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）および（２）で作製したｄｈｆｒ−Ｐ２をそれぞれ制限酵素ＮｏｔＩおよびＰｖｕＩで消化した後、精製しライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することでＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒ、ＳＶ４０のＰｏｌｙＡを含んだｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１およびｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋを得た。ｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１にＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒおよびＳＶ４０のＰｏｌｙＡを組込んだプラスミドをｐＦＵ−ＣＨＩｇ−ｄｈｆｒと命名し、ｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋにＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒおよびＳＶ４０のＰｏｌｙＡを組込んだプラスミドをｐＦＵ−ＣＬＩｇ−ｄｈｆｒと命名した。
【００４７】
（４）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる抗インターロイキン６レセプター（以下、ＩＬ−６Ｒ）抗体の重鎖可変領域をコードする配列番号７に記載のポリヌクレオチドの５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）とフレームシフト抑制のためグアニン（Ｇ）を付加し、３’末端に制限酵素ＮｈｅＩ認識配列（ＧＣＴＡＧＣ）を付加した遺伝子を全合成しプラスミドにクローニングした（ＦＡＳＭＡＣ社に委託）。作製したプラスミドをｐＵＣ−ＶＨ６Ｒと命名した。また、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる抗ＩＬ−６Ｒ抗体の軽鎖可変領域をコードする配列番号９に記載のポリヌクレオチドの５‘末端に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）とフレームシフト抑制のためグアニン（Ｇ）を付加し、３’末端に制限酵素ＢｓｉＷＩ認識配列（ＣＧＴＡＣＧ）を付加した遺伝子を全合成しプラスミドにクローニングした（ＦＡＳＭＡＣ社に委託）。作製したプラスミドをｐＵＣ−ＶＬ６Ｒと命名した。
【００４８】
（５）（４）で作製したｐＵＣ−ＶＨ６Ｒおよび（３）で作製したｐＦＵ−ＣＨＩｇ−ｄｈｆｒをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｈｅＩで消化後、精製し、ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで、抗ＩＬ−６Ｒ抗体の重鎖（Ｈ鎖）を発現するプラスミドｐＦＵ−６ＲＨ−ｄｈｆｒを得た。また（４）で作製したｐＵＣ−ＶＬ６Ｒおよび（３）で作製したｐＦＵ−ＣＬＩｇ−ｄｈｆｒをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩで消化後、精製し、ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで、抗ＩＬ−６Ｒ抗体の軽鎖（Ｌ鎖）を発現するプラスミドｐＦＵ−６ＲＬ−ｄｈｆｒを得た。
【００４９】
実施例２  抗ＩＬ−６Ｒ抗体高発現細胞の構築
（１）実施例１で作製したｐＦＵ−６ＲＨ−ｄｈｆｒおよびｐＦＵ−６ＲＬ−ｄｈｆｒを、ＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株）にＮｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて遺伝子導入した。その後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、４０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含んだＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で形質転換細胞を培養抗ＩＬ−６Ｒ抗体発現細胞を得た。その後、培地に５０ｎｇ／ｍＬのメトトレキサート
（ＭＴＸ）を添加することで遺伝子増幅を行なった。
【００５０】
（２）（１）でＭＴＸ処理をした細胞を限外希釈法により単クローン化し、下記に記載のＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）を用いて、抗ＩＬ−６Ｒ抗体を安定的に高生産可能な細胞を選択した。
（２−１）抗ヒトＦａｂ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌで固定化した（４℃で一晩）。固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ  ＭＩＬＫ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）および１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）によりブロッキングした。
（２−２）洗浄緩衝液（０．０５％［ｗ／ｖ］のＴｗｅｅｎ  ２０（商品名）と１５０ｍＭのＮａＣｌとを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、抗体を含んだ培養上清を添加し、抗体と固定化タンパク質とを反応させた（３０℃で１時間）。
（２−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したペルオキシターゼで標識された抗ヒトＦｃ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（２−４）３０℃で１時間反応し、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。その後、１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定し、測定値の高い抗ＩＬ−６Ｒ抗体高生産細胞株を選択した。
【００５１】
（３）ＭＴＸ濃度を段階的（５０ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、４μＭ、８μＭ、１６μＭ、３２μＭ、６４μＭ）に上昇させながら、限外希釈を行ない（２）に記載のＥＬＩＳＡでクローン選択を行なうことを繰り返した。その結果、抗ＩＬ−６Ｒ抗体高生産細胞株を得た。
【００５２】
実施例３  抗ヒトｇｐ１３０受容体（ｇｐ１３０Ｒ）抗体高発現細胞の構築
（１）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなる抗ヒトｇｐ１３０受容体（ｇｐ１３０Ｒ）抗体の重鎖可変領域をコードする配列番号１１に記載のポリヌクレオチドの５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）とフレームシフト抑制のためグアニン（Ｇ）を付加し、３’末端に制限酵素ＮｈｅＩ認識配列（ＧＣＴＡＧＣ）を付加した遺伝子を全合成しプラスミドにクローニングした（ＦＡＳＭＡＣ社に委託）。作製したプラスミドをｐＵＣ−ＶＨｇｐ１３０と命名した。また、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体の軽鎖可変領域をコードする配列番号１３に記載のポリヌクレオチドの５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）とフレームシフト抑制のためグアニン（Ｇ）を付加し、３’末端に制限酵素ＢｓｉＷＩ認識配列（ＣＧＴＡＣＧ）を付加した遺伝子を全合成しプラスミドにクローニングした（ＦＡＳＭＡＣ社に委託）。作製したプラスミドをｐＵＣ−ＶＬｇｐ１３０と命名した。
【００５３】
（２）（１）で作製したｐＵＣ−ＶＨｇｐ１３０および実施例１（３）で作製したｐＦＵ−ＣＨＩｇ−ｄｈｆｒをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｈｅＩで消化後、精製し、ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで、抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体の重鎖（Ｈ鎖）を発現するプラスミドｐＦＵ−ｇｐ１３０Ｈ−ｄｈｆｒを得た。また（１）で作製したｐＵＣ−ＶＬｇｐ１３０および実施例１（３）で作製したｐＦＵ−ＣＬＩｇ−ｄｈｆｒをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩで消化後、精製し、ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで、抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体の軽鎖（Ｌ鎖）を発現するプラスミドｐＦＵ−ｇｐ１３０Ｌ−ｄｈｆｒを得た。
【００５４】
（３）（２）で得られたｐＦＵ−ｇｐ１３０Ｌ−ｄｈｆｒを鋳型として、配列番号１４（５’−ＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＧＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣ−３’）および配列番号１５（５’−ＡＡＴ［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＴＡＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣ−３’）（配列番号１５中の角かっこは制限酵素ＮｏｔＩ認識配列を示している）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表３に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体のＬ鎖全長をコードする遺伝子を増幅し、精製後に得られたＰＣＲ産物をｈｇｐ１３０−Ｌ１と命名した。
【００５５】
【表３】
2020103280.tif 000005
【００５６】
（４）（３）で得られたｈｇｐ１３０−Ｌ１を鋳型として、配列番号１６（５’−ＣＴＡ［ＧＡＡＴＴＣ］ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣ−３’）（配列番号１６中の角かっこは制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列を示している）および配列番号１５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるシグナル配列（ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ）を付加するため、配列番号１７に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号１８（５’−ＡＴＧＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＧＣＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣ−３’）に記載のポリヌクレオチドを添加してＰＣＲを行なった。具体的には、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体のＬ鎖全長をコードする遺伝子に配列番号１７に記載のシグナル配列をコードする遺伝子を付加した遺伝子を増幅し、精製後に得られたＰＣＲ産物をｈｇｐ１３０−Ｌ２と命名した。
【００５７】
【表４】
2020103280.tif 000006
【００５８】
（５）（４）で得られたｈｇｐ１３０−Ｌ２および図１に記載の発現ベクターｐＥＦｄをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、精製後ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで哺乳動物細胞において抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体のＬ鎖を発現可能なｐＥＦｄ−ｇｐ１３０Ｌを得た。なお、図１に記載のｐＥＦｄベクターは配列番号１９に記載のＥＦ１αプロモーターのうち６２１番目のグアニンから７９８番目のグアニンまでのヌクレオチドが欠損しているプロモーター（ＥＦｄ  ｐｒｏ）を有しており、ＳＶ４０のｐｏｌｙＡおよびｄｈｆｒ遺伝子も有している（特開２０１９−１０６９７６号公報）。
【００５９】
（６）（２）で得られたｐＦＵ−ｇｐ１３０Ｈ−ｄｈｆｒを鋳型として、配列番号２０（５’−ＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＧ−３’）および配列番号２１（５’−ＡＡＴ［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＴＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ−３’）（配列番号２１中の角かっこは制限酵素ＮｏｔＩ認識配列を示している）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表３に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体のＨ鎖全長をコードする遺伝子を増幅し精製後に得られたＰＣＲ産物をｈｇｐ１３０−Ｈ１と命名した。
【００６０】
（７）（６）で得られたｈｇｐ１３０−Ｈ１を鋳型として、配列番号１６および配列番号２１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるシグナル配列を付加するため、配列番号１８に記載のポリヌクレオチドを添加してＰＣＲを行なった。具体的には、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体のＨ鎖全長をコードする遺伝子に配列番号１７に記載のシグナル配列をコードする遺伝子を付加した遺伝子を増幅し、精製後に得られたＰＣＲ産物をｈｇｐ１３０−Ｈ２と命名した。
【００６１】
（８）（７）で得られたｈｇｐ１３０−Ｈ２および図１に記載の発現ベクターｐＥＦｄをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、精製後ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで哺乳動物細胞において抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体を発現可能なｐＥＦｄ−ｇｐ１３０Ｈを得た。
【００６２】
（９）（５）で得られたｐＥＦｄ−ｇｐ１３０Ｌ、（８）で得られたｐＥＦｄ−ｇｐ１３０Ｈを用いた以外は実施例２と同様の方法で高発現細胞の構築を行ない、ＭＴＸ濃度を５０ｎＭ、２５０ｎＭ、１μＭと段階的にあげることで抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体高発現細胞を構築した。
【００６３】
実施例４  フラスコ培養におけるマンガンイオン添加の効果（その１）
（１）実施例２で得られた抗ＩＬ−６Ｒ抗体高発現細胞または実施例３で得られた抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体高発現細胞を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、４０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含む２０ｍＬのＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を入れた１２５ｍＬの三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に接種し、１３０ｒｐｍ、３７℃、８％ＣＯ２の条件下で振盪培養した。
【００６４】
（２）細胞数が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上になったところで、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、４０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸを含んだＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍに０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように前記細胞を接種し、フィルター滅菌した５０ｍＭの硫酸マンガンを終濃度で０μＭ（添加せず）、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭもしくは５０μＭとなるように添加し、総量を２０ｍＬに調製して１２５ｍＬの三角フラスコで、１３０ｒｐｍ、３７℃、８％ＣＯ２の条件下で１０日間、振盪培養した。培養途中で培養液をサンプリングし、生細胞数をＣｏｕｎｔｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用して測定し、抗体生産性はヒトＩｇＧ１（シグマ社製）を標準品とした検量線に基づき実施例２（２）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定した。
【００６５】
（３）培養終了後の培養液を遠心分離によって細胞および不純物を除去し、得られた上清を、１．０ｍＬのＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ（ＧＥヘルスケア社製）をオープンカラムに詰めて作製した分離カラム（１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化済）にアプライした。
【００６６】
（４）前記平衡化に用いた緩衝液１０ｍＬで前記分離カラムを洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）４ｍＬで前記分離カラムに吸着した抗体を溶出した。溶出液に１ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えることでｐＨを中性領域に戻し、限外ろ過膜で濃縮しながら５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に緩衝液交換することで、培地に添加したマンガンイオン濃度が異なる、高純度な抗ＩＬ−６Ｒ抗体および抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体を得た。
【００６７】
（５）ヒトＦｃγＲＩＩＩａを固定化した担体（分離剤）を詰めたカラム（ＦｃＲ９＿Ｆカラム、ＷＯ２０１８／１５０９７３号の実施例５に記載）を用いて、下記の方法により（４）で得られた抗ＩＬ−６Ｒ抗体および抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体を分析した。
（５−１）ＦｃＲ９＿Ｆカラムを高速液体クロマトグラフィー装置（島津製作所社製）に接続し、カラムオーブンで前記カラムを２５℃の恒温状態に維持し、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで１０分間流すことにより前記カラムを平衡化した。
（５−２）（４）で得た抗ＩＬ−６Ｒ抗体および抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体を（５−１）で用いた緩衝液で１．０ｍｇ／ｍＬに希釈し、当該希釈抗体溶液を流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ
にて１０μＬ添加した。
（５−３）（５−１）で用いた緩衝液を流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで２分間流した後、５０
ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）によるｐＨグラジエント（１８分間で５０ｍＭのク
エン酸緩衝液（ｐＨ４．５）が１００％となるグラジエント）でＦｃＲ９＿Ｆカラムに吸
着した抗体を溶出した。
【００６８】
培地中に添加したマンガンイオン濃度の違いによる、抗ＩＬ−６Ｒ抗体の生産性を比較した結果を図２に、抗ＩＬ−６Ｒ抗体高発現細胞数（生細胞数）の推移を図３に、抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラムによる分析結果を図４に、抗ｇｐ１３０Ｒ抗体の生産性を比較した結果を図５に、抗ｇｐ１３０Ｒ抗体高発現細胞数（生細胞数）の推移を図６に、抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラムによる分析結果を図７に、それぞれ示す。また図４に記載の分析結果にある各ピークの面積割合を表５に、図７に記載の分析結果にある各ピークの面積割合を表６に、それぞれ示す。
【００６９】
表５および表６より、抗ＩＬ−６Ｒ抗体高発現細胞、抗ｇｐ１３０Ｒ抗体高発現細胞数とも、培地に０．０１μＭから５０μＭのマンガンイオンを添加して培養すると、マンガンイオン未添加時と比較し、ＦｃＲ９＿Ｆカラムとの結合力が強いピーク（ピーク３）の割合が増加していることがわかる。ＡＤＣＣ活性の高い抗体ほど、ＦｃγＲＩＩＩａ固定化分離剤との結合力が強まる（特開２０１６−０２３１５２号公報、ＷＯ２０１８／１５０９７３号）。すなわち図４および図７におけるピーク３の示す割合が増加する。このことから、抗体を発現可能な哺乳動物細胞を培養する際、０．０１μＭから５０μＭ（特に０．１μＭから５０μＭ）のマンガンイオンを添加した培地で培養することで、前記哺乳細胞が発現する抗体が有するＡＤＣＣ活性が向上することがわかる。
【００７０】
【表５】
2020103280.tif 000007
【００７１】
【表６】
2020103280.tif 000008
【００７２】
実施例５  フラスコ培養におけるマンガンイオン添加の効果（その２）
使用した培地をＣＤ  Ｏｐｔｉ  ＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）とし、培養期間を１１日間とした他は、実施例４と同様の方法を用いて、実施例２で得られた抗ＩＬ−６Ｒ抗体高発現細胞、および実施例３で得られた抗ヒトｇｐ１３０Ｒ抗体高発現細胞を培養し、抗体生産性および生細胞数の測定、ならびに得られた培養物中に含まれる前記細胞が発現した抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラムによる分析を行なった。
【００７３】
培地中に添加したマンガンイオン濃度の違いによる、抗ＩＬ−６Ｒ抗体の生産性を比較した結果を図８に、抗ＩＬ−６Ｒ抗体高発現細胞数（生細胞数）の推移を図９に、抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラムによる分析結果を図１０に、抗ｇｐ１３０Ｒ抗体の生産性を比較した結果を図１１に、抗ｇｐ１３０Ｒ抗体高発現細胞数（生細胞数）の推移を図１２に、抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラムによる分析結果を図１３に、それぞれ示す。また図１０に記載の分析結果にある各ピークの面積割合を表７に、図１３に記載の分析結果にある各ピークの面積割合を表８に、それぞれ示す。
【００７４】
表７および表８より、培地としてＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍを用いたとき（実施例４）と同様、抗ＩＬ−６Ｒ抗体高発現細胞、抗ｇｐ１３０Ｒ抗体高発現細胞数とも、培地に０．０１μＭから５０μＭのマンガンイオンを添加して培養すると、マンガンイオン未添加時と比較し、ＦｃＲ９＿Ｆカラムとの結合力が強いピーク（ピーク３）の割合が増加していることがわかる。なお培地に５０μＭのマンガンイオンを添加して培養したときは、ＦｃγＲＩＩＩａ固定化分離剤との結合力がさらに弱い（すなわちＡＤＣＣ活性が非常に弱い抗体に相当する）ピーク（ピーク０）が確認された（図１０および図１３）。
【００７５】
【表７】
2020103280.tif 000009
【００７６】
【表８】
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【００７７】
実施例６  バイオリアクターを用いたバッチ培養におけるマンガンイオン添加の効果（その１）
（１）５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、４０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含んだ１００ｍＬのＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍを入れた５００ｍＬの三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に、実施例２で作製した抗ＩＬ−６Ｒ抗体高発現細胞を接種し、１３０ｒｐｍ、３７℃、８％ＣＯ２の条件下で振盪培養した。
【００７８】
（２）校正したｐＨ計、溶存酸素（ＤＯ）計をセットした２Ｌの滅菌済ジャーファーメンター（バイオット社製）に、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、４０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸを含んだ９００ｍＬのＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ  ｍｅｄｉｕｍを入れ、（１）で培養した抗ＩＬ−６Ｒ抗体高発現細胞を０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう接種後、全量を１Ｌとなるよう前述の培地を追加した。前記培地には終濃度で５μＭとなるよう硫酸マンガンを添加している。
【００７９】
（３）培地および細胞を入れたジャーファーメンターを制御装置（ＢＣＰ：バイオット社製）にセットし、８％ＣＯ２を１００ｍＬ／分で流しながら、３７℃、１００ｒｐｍで１０日間バッチ培養した。なお培養中、ｐＨはＣＯ２と０．５Ｍの炭酸水素ナトリウム水溶液を添加することで制御し、ＤＯは３７℃での飽和溶存酸素量の５０％量を保つよう制御した。培養途中で培養液を４０から８０ｍＬサンプリングし、生細胞数をＣｏｕｎｔｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用して測定し、抗体生産性を実施例２（２）に記載のＥＬＩＳＡ法（検量線作成のための標準品としてヒトＩｇＧ１（シグマ社製）を使用）にて測定した。また前記サンプリングした培養液から、実施例４（３）から（４）に記載の精製方法を用いて抗体を精製し、実施例４（５）に記載の方法でＦｃＲ９＿Ｆカラムによる抗体分析を行なった。
【００８０】
比較例１
実施例６（２）で硫酸マンガンを添加しないこと、および実施例６（３）での培養期間が９日間であること以外は、実施例６と同様な方法で培養し、生細胞数および抗体生産性の測定ならびにＦｃＲ９＿Ｆカラムによる抗体分析を行なった。
【００８１】
実施例６および比較例１における抗体生産性の推移を図１４に、生細胞数の推移を図１５に、それぞれ示す。図１４および図１５の結果より、培地へのマンガンイオンの添加による、抗体生産性および細胞増殖への影響はないといえる。
【００８２】
比較例１で得られた培養９日目の抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラムによる分析結果および、実施例６で得られた培養１０日目の抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラムによる分析結果を図１６に示す。また図１６に記載の分析結果にある各ピークの面積割合を表９に示す。培地にマンガンイオンを添加して培養（実施例６）すると、マンガンイオン未添加時（比較例１）と比較し、ＦｃＲ９＿Ｆカラムとの結合力が強いピーク（ピーク３）の割合が増加していることがわかる（比較例１：２７．９％［培養９日後の培養液］、実施例６：３４．７％［培養１０日後の培養液］）。
【００８３】
以上の結果から、ジャーファーメンターでのバッチ培養においても、フラスコ培養のときと同様、培地にマンガンイオンを添加することで、抗体を発現可能な哺乳動物細胞が発現した抗体が有するＡＤＣＣ活性が向上することがわかる。
【００８４】
【表９】
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【００８５】
実施例７  バイオリアクターを用いたバッチ培養におけるマンガンイオン添加の効果（その２）
（１）５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、３０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含んだ５０ｍＬのＥＸ−ＣＥＬＬ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣＨＯ  Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  Ｍｅｄｉｕｍを加えた２５０ｍＬの三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に、実施例２で作製した抗ＩＬ−６Ｒ抗体高発現細胞を接種し、１３０ｒｐｍ、３７℃、８％ＣＯ２の条件下で振盪培養した。
【００８６】
（２）校正したｐＨ計、溶存酸素（ＤＯ）計をセットした３器の２５０ｍＬのジャーファーメンター（バイオット社製）に、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、３０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸを含んだ１００ｍＬのＥＸ−ＣＥＬＬ  Ａｄｖｅｎｃｅｄ  ＣＨＯ  Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  Ｍｅｄｉｕｍをそれぞれ加え、（１）で培養した抗ＩＬ−６Ｒ抗体高発現細胞を０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう各リアクターに接種した後、全量を１１０ｍＬとなるよう前述の培地をそれぞれ追加した。前記培地には終濃度でそれぞれ１μＭ、５μＭ、１０μＭとなるよう硫酸マンガンを添加している。
【００８７】
（３）培地および細胞を加えたジャーファーメンターを制御装置（Ｂｉｏ  Ｊｒ．８：バイオット社製）にセットし、８％ＣＯ２を１００ｍＬ／分で流しながら、３７℃、１３０ｒｐｍで１０日間バッチ培養した。なお培養中、ｐＨはＣＯ２と０．５Ｍの炭酸水素ナトリウム水溶液を添加することでｐＨ７．１を保つよう制御し、ＤＯは３７℃での飽和溶存酸素量の５０％量を保つよう制御した。培養途中で培養液を１から２ｍＬサンプリングし、生細胞数をＶｉ−ＣＥＬＬ  ＸＲ（ベックマン・コールター社製）を使用して測定し、抗体生産性をＣｅｄｅｘ  Ｂｉｏ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を使用して測定した。また培養終了後の培養液から、実施例４（３）から（４）に記載の精製方法を用いて抗体を精製し、実施例４（５）に記載の方法でＦｃＲ９＿Ｆカラムによる抗体分析を行なった。
【００８８】
比較例２
実施例７（２）で硫酸マンガンを添加しないこと以外は、実施例７と同様の方法で培養し、生細胞数および抗体生産性の測定ならびにＦｃＲ９＿Ｆカラムによる抗体分析を行なった。
【００８９】
実施例７および比較例２における抗体生産性の推移を図１７に、生細胞数の推移を図１８に、それぞれ示す。図１７および図１８の結果より、培地へのマンガンイオンの添加による、抗体生産性および細胞増殖への影響はないといえる。
【００９０】
比較例２および実施例７で得られた培養１０日目の抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＦｃＲ９＿Ｆカラムによる分析結果を図１９に示す。また図１９に記載の分析結果にある各ピークの面積割合を表１０に示す。培地にマンガンイオンを添加して培養（実施例７）すると、マンガンイオン未添加時（比較例２）と比較し、ＦｃＲ９＿Ｆカラムとの結合力が強いピーク（ピーク３）の割合が増加しており、さらにマンガンイオン濃度が高いほどピーク３の割合が増加していることがわかる（比較例２：３５．９％、実施例７：３６．５％（１μＭマンガンイオン添加）、３８．４％（５μＭマンガンイオン添加）、４１．０％（１０μＭマンガンイオン添加））。
【００９１】
以上の結果から、ジャーファーメンターでのバッチ培養において、培地に添加したマンガンイオンの濃度が高いほど、抗体を発現可能な哺乳動物細胞が発現した抗体が有するＡＤＣＣ活性が向上することがわかる。一方で、実施例４の結果（図３と図６）および実施例５の結果（図９と図１２）から、より高濃度のマンガンイオン（５０μＭ）を添加すると細胞増殖が阻害され、抗体生産量が低下することがわかる。このことから、細胞増殖を阻害しない程度の濃度（０．０３μＭから３０μＭ、好ましくは０．１μＭから１０μＭ、より好ましくは１μＭから１０μＭ）のマンガンイオンを添加すれば、抗体産生量を低下させずに高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を発現できるといえる。
【００９２】
【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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