(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、微量な目的細胞と多量な夾雑細胞とを含む試料から、前記目的細胞を精度よく採取する方法を提供することにある。【解決手段】  試料中に含まれる目的細胞に磁性粒子を結合させた後、前記目的細胞を保持部に保持する工程、または、試料中に含まれる目的細胞を保持部に保持した後、前記目的細胞に磁性粒子を結合させる工程のいずれかと、前記保持部に保持された前記目的細胞に磁性体を近接させて前記目的細胞を採取する工程と、を含んでなる細胞の採取方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれる目的細胞に磁性粒子を結合させた後、前記目的細胞を保持部に保持する工程、または、
試料中に含まれる目的細胞を保持部に保持した後、前記目的細胞に磁性粒子を結合させる工程のいずれかと、
前記保持部に保持された前記目的細胞に磁性体を近接させて前記目的細胞を採取する工程と、
を含んでなる細胞の採取方法。
【請求項２】
前記目的細胞を採取する前に標識を行い、前記標識に基づき前記目的細胞を検出する工程を、さらに含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
磁性粒子が目的細胞に特異的に結合可能な物質を修飾した粒子である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
試料が血液試料であり、目的細胞が腫瘍細胞または白血球である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれる目的細胞を精度よく採取する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血液などの体液や、臓器などの組織を溶液に懸濁もしくは分散して得られる組織標本試料や、細胞培養液などから細胞を選択的に分離回収し、当該分離回収した細胞を基礎研究や臨床診断、治療へ応用する研究が進められている。例えば、がん患者より採取した血液から腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ、以下ＣＴＣ）を採取し、当該細胞について形態学的分析、組織型分析や遺伝子分析を行ない、これら分析により得られた知見に基づき治療方針を判断する研究が進められている。
【０００３】
がん患者より得られる血液試料中に含まれるＣＴＣ数は、赤血球や白血球などの血球細胞と比較して非常に少ないため、当該血球細胞を除去する前処理が必須であり、操作が簡易な磁力を用いた濃縮（富化）等が行なわれている。例えば、特許文献１では、ＣＴＣ表面に発現が見られる上皮系マーカーに対する抗体を結合した磁性粒子を用いる方法を開示している。しかしながら、この方法では、血液試料中に存在するＣＴＣ以外の夾雑細胞を巻き込んだ状態で吸引するおそれがあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−０１０１７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、微量な目的細胞と多量な夾雑細胞とを含む試料から、前記目的細胞を精度よく採取する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。
すなわち本発明の第一の態様は、
試料中に含まれる目的細胞に磁性粒子を結合させた後、前記目的細胞を保持部に保持する工程、または、
試料中に含まれる目的細胞を保持部に保持した後、前記目的細胞に磁性粒子を結合させる工程のいずれかと、
前記保持部に保持された前記目的細胞に磁性体を近接させて前記目的細胞を採取する工程と、
を含んでなる細胞の採取方法である。
また、本発明の第二の態様は、
前記目的細胞を採取する前に標識を行い、前記標識に基づき前記目的細胞を検出する工程を、上述の方法にさらに含んでなる。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
試料とは、後述する目的細胞と夾雑細胞とを少なくとも含む試料であればよく、具体的には、血液（全血）、希釈血液、血清、血漿、髄液、臍帯血、成分採血液などの血液試料や、尿、唾液、精液、糞便、痰、羊水、腹水などの生体試料や、肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚、腫瘍、リンパ節などの組織の一片を懸濁させた液や、前記生体試料や前記組織懸濁液より分離して得られる、前記生体試料または前記組織由来の細胞を含む画分や、あらかじめ単離した細胞の培養液や、培養細胞などが挙げられる。中でも本発明の方法は、前述した血液試料からの目的細胞の採取に好適である。
【０００９】
目的細胞は、前述した試料中に含まれる細胞であれば特に限定はないが、試料中に含まれる夾雑細胞数に対して極めて少ない数しか存在しない細胞を目的細胞とすると好ましい。例えば、試料中に含まれる夾雑細胞数に対して０．１％〜１０％または０．１％未満しか存在しないような細胞であり、試料が血液試料、夾雑細胞が好中球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球などの白血球である場合における、特定の特徴を有した白血球、血液循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの腫瘍細胞、循環血液内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血管内皮細胞（ＣＥＰ）、循環胎児細胞（ＣＦＣ）、各種幹細胞、Ｂ細胞が目的細胞として例示できる。
【００１０】
磁性粒子は、永久に帯磁可能な粒子、強磁性体粒子、磁性を有した材料を内包または被覆したポリマー粒子、磁場に置かれた場合にのみ磁性挙動（超常磁性）を示す粒子が挙げられるが、超常磁性を示す粒子が、目的細胞の採取操作が容易な点で好ましい。超常磁性を示す材料の一例として、マグネタイトに代表される酸化鉄が挙げられる。磁性粒子の大きさは、目的細胞と同程度またはそれ以下の径であると磁性粒子による細胞観察への影響が抑えられるため好ましい。例えば、目的細胞が細胞径５μｍから２５μｍであるＣＴＣの場合、磁性粒子の平均粒子径は１０ｎｍ以上３０μｍ以下が好ましく、２０ｎｍ以上２５μｍ以下がより好ましく、３０ｎｍ以上５μｍ以下がさらに好ましい。
【００１１】
目的細胞に磁性粒子を結合させる際、磁性粒子を目的細胞および夾雑細胞の両方に結合させる、または目的細胞に特異的に結合可能な物質を修飾した磁性粒子で目的細胞のみに結合させてもよい。目的細胞および夾雑細胞の両方に磁性粒子を結合させる場合、目的細胞を標識すれば、前記標識に基づき目的細胞を検出可能である。目的細胞を標識する工程を追加すると、採取前後での目的細胞の有無が確認でき、目的細胞の存在位置を特定できる点で好ましい。目的細胞を標識するタイミングとしては、後述する目的細胞を採取する工程より前であれば問題なく、すなわち目的細胞に磁性粒子を結合させる前、目的細胞を保持部に保持する前、目的細胞を保持部に保持してから前記目的細胞を採取するまでの間のいずれであってもよい。
【００１２】
目的細胞の標識方法に特に限定はなく、目的細胞を直接、呈色試薬や蛍光試薬で標識してもよいし、目的細胞に含まれるタンパク質に対する標識化抗体を用いて標識してもよいし、目的細胞に含まれる核酸に結合可能な色素を用いて標識してもよい。中でも当該タンパク質に対する標識化抗体を用いた標識方法は、当該タンパク質を簡便、高感度、かつ特異的に検出できる点で、好ましい。なお、抗体に標識する物質も特に限定はなく、一例としてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商品名）などの蛍光物質が挙げられる。標識した細胞の検出は、顕微鏡や光学検出器など、標識に適した手段を用いて行なえばよい。例えば、蛍光色素を用いて標識した場合は、蛍光顕微鏡を用いるとよい。
【００１３】
目的細胞および夾雑細胞の両方に磁性粒子を結合させるためには、例えば、両細胞に共通したタンパク、糖、脂質、官能基に対して結合可能な物質を磁性粒子に修飾すればよく、目的細胞にのみ磁性粒子を結合させるには、夾雑細胞と比較して目的細胞での発現の高いタンパク質、糖、脂質、官能基に対して結合可能な物質（目的細胞に特異的に結合可能な物質）を磁性粒子に修飾すればよい。具体例として、目的細胞が血液試料中に含まれるＣＴＣの場合、目的細胞に特異的に結合可能な物質としてサイトケラチン（ＣＫ）やＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）が例示でき、目的細胞が白血球の場合、目的細胞に特異的に結合可能な物質として白血球マーカーであるＣＤ４５が例示できる。
【００１４】
保持部とは、目的細胞を保持・収納可能な態様であればよく、前記細胞を収納可能な凹部もしくは貫通孔や、前記物質を固定可能な材料（例えば、ポリ−Ｌ−リジンやＢＡＭ（Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ａｎｃｈｏｒ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ））で覆われた面が挙げられる。なお、保持部を目的細胞が収納可能な凹部または貫通孔の態様とすると、目的細胞の採取が容易に行なえる点で好ましい。保持部を凹部とした場合、一端が細胞の全て、またはその一部を保持可能な大きさの開口部を有しており他端が底部を形成している態様とするとよく、保持部を貫通孔とした場合、一端が細胞の全て、またはその一部を保持可能な大きさの開口部を有し他端が当該開口部よりも狭い開口部とするか、両端が細胞の一部を保持可能な大きさの開口部である態様とするとよい。保持部の大きさ（径）は試料中に含まれる細胞を一つだけ保持可能な大きさとすると、単一または特定の細胞の採取が容易に行なえる点で好ましい。例えば、目的細胞が細胞径５μｍから２５μｍであるＣＴＣの場合、保持部は直径３０μｍ、深さ３０μｍの凹部などが好ましい。
【００１５】
保持部を有した細胞保持装置のうち、目的細胞を含む試料を収容する領域については、目的細胞が保持部以外に吸着することを防ぐ目的で親水化してもよい。親水化を行なう方法として、コロナ放電処理、プラズマ処理、光触媒コーティング、シランカップリング剤等による化学修飾、タンパク修飾などが挙げられるが、特に細胞保持装置を構成する基材を極短時間で簡便に親水化可能なタンパク修飾が好ましい。タンパク修飾による親水化はタンパク質含有溶液に、前記基材を浸漬または接触させればよい。親水化に用いるタンパク質に特に制限はないが一般的には、血清、乳汁、卵の白身などに含まれる可溶性タンパク質であるＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＯＶＡ（オボアルブミン）等が好ましい。
【００１６】
目的細胞を保持部に保持させる際、重力沈降や振盪により保持させてもよいが、誘電泳動力を用いると、保持部に目的細胞を効率的に保持できる点で好ましい。誘電泳動力を用いる場合、具体的には、交流電圧を印加することで誘電泳動を発生させ、保持部内へ目的細胞を導入すればよい。印加する交流電圧は、保持部内の細胞の充放電が周期的に繰り返される波形を有した交流電圧であると好ましく、周波数を１００ｋＨｚから３ＭＨｚの間とし、電界強度を１×１０５から５×１０５Ｖ／ｍの間とすると特に好ましい（ＷＯ２０１１／１４９０３２号および特開２０１２−０１３５４９号公報参照）。
【００１７】
保持部へ保持された細胞に対して、保存および膜透過処理を施してもよい。保存処理剤としては、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒドドナー化合物（加水分解を受けることでホルムアルデヒドを放出可能な化合物）、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド類や、メタノール、エタノールなどのアルコール類や、重金属を含む溶液が例示できる。細胞膜透過処理剤としては、メタノール、エタノールなどのアルコール類や、サポニンなどの界面活性剤が例示できる。また、抗体による非特異的な反応を防ぐため、保存および膜透過処理後の目的細胞を保持した保持部に対し、タンパク質によるブロッキング処理を施してもよく、その後さらに蛍光基が修飾された目的細胞が発現するタンパク質に対する抗体や細胞核を蛍光染色させる標識試薬（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）やＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（商品名）など）を添加してもよい。
【００１８】
磁性粒子と細胞との結合は、保持部へ細胞を保持させる前に行なってもよく、保持部へ細胞を保持させた後に行なってもよい。保持部へ細胞を保持させる前に磁性粒子と細胞との結合を行なうと、試料と磁性粒子との懸濁液中で磁性粒子と細胞との結合が行なえるため、高効率に結合できる。一方、保持部へ細胞を保持させた後に磁性粒子と細胞との結合を行なうと、すでに細胞が保持部に保持されているため、磁性粒子との結合工程における細胞のロス率は低下する利点がある。
【００１９】
保持部に目的細胞を保持した後、目的細胞に結合した磁性粒子が保持された保持部に、磁性体を近接させて目的細胞を採取する。夾雑細胞にも磁性粒子を結合させた場合は、目的細胞を標識した後、当該標識に基づいて目的細胞を検出して、磁性体を近接させて目的細胞を採取する。本発明の方法では、磁性体と目的細胞の間には夾雑細胞が存在しないため、夾雑細胞を巻き込まず、精度よく目的細胞を採取できる。
【００２０】
磁性体は、近接することで目的細胞を結合した磁性粒子を吸引可能な磁力を有した永久磁石または電磁石であればよい。永久磁石であれば磁力の強いネオジム磁石が好ましいが、吸引した磁性粒子を適切な位置で脱離させたいのであれば、電流の印可の有無により磁力の発生をコントロールできる電磁石が好ましい。磁性体の大きさは用途に合わせて適時変えればよく、目的細胞を一細胞単位で採取したい場合は、磁性体の大きさを細胞または後述する保持部と同等の大きさにすれば精度高い採取が可能となる。一方、複数の目的細胞を同時に採取したい場合は、一細胞単位で採取するときよりも径および／または磁力の大きな磁性体を用いればよい。
【００２１】
本発明の方法で採取した目的細胞は、その性状を解析（採取した細胞の培養を含む）できる。なお、目的細胞が結合した磁性粒子に磁性体が結合したままの状態で性状解析してもよく、当該磁性体から剥がした後に性状解析してもよい。性状解析の例として、形態学的解析、組織型解析、遺伝子解析があげられる。
【００２２】
以下、試料の調製方法の一例について説明する。
（１）がんの疑いのある患者またはがん患者から血液を採取する。なお、血液を採取する際、クエン酸、ヘパリン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの抗凝固剤を添加してもよい。必要に応じ、採取した血液を生理食塩水などで希釈してもよい。
（２）採取した血液（または希釈した血液）に対して密度勾配遠心を用いて、目的細胞を含む画分を取得する。なお、密度勾配遠心を行なう前に、採取した血液（または希釈した血液）に、夾雑細胞と結合可能な結合剤（例えば、夾雑細胞が赤血球や白血球の場合、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））を添加してもよい。
（３）（２）で得られた目的細胞を含む画分に、当該目的細胞に特異的に結合可能な抗体を修飾した磁性粒子を添加することで、目的細胞に磁性粒子を結合させる。なお、（２）で得られた画分を遠心し、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）に置換した後、磁性粒子を添加すると目的細胞と磁性粒子との反応効率が上がるため好ましい。
（４）（３）で得られた磁性粒子と結合した目的細胞を含む画分に塩化アンモニウムを含む溶液を添加し撹拌することで、当該画分に混入した夾雑細胞である赤血球を溶血させる。本操作により、分離回収した目的細胞の観察が良好になる。
（５）（４）で得られた溶血処理後の目的細胞を含む溶液を遠心分離することで夾雑細胞である血液成分を除去し、当該細胞をペレット状にして回収する。必要に応じ、回収したペレットを溶液に再度懸濁させ、遠心分離する工程を追加してもよい。なお、誘電泳動を用いて目的細胞を保持部へ捕捉させる場合には、等張に調整した糖溶液で懸濁させるとよい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、目的細胞と多量な夾雑細胞とを含む試料から、前記目的細胞を精度よく採取でき、複数の目的細胞を磁性粒子を介して一度に採取できるため、採取に必要な時間を短縮できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の検出方法で利用可能な、保持部を有した細胞保持装置の一例を示す図である。
【図２】図１に示す装置の正面図である。
【図３】実施例１の手順を示した図である。
【図４】実施例１の結果のうち、保持部に目的細胞（白血球）が１つ保持されたときの結果である。（Ａ）が明視野像、（Ｂ）がＤＡＰＩ蛍光像である。また点線で囲まれた領域が採取対象保持部の領域である。
【図５】実施例１の結果のうち、保持部に目的細胞（白血球）が２つ保持されたときの結果である。点線が囲んだ領域が採取対象保持部の領域である。
【実施例】
【００２５】
以下、血液試料中に含まれる白血球の検出に係る実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。
【００２６】
実施例１
（１）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に３ｍＬ採血後、前記採血管に３ｍＬの生理食塩水を添加することで、希釈血液試料を調製した。
（２）調製した希釈血液試料を、密度１．０９１ｇ／ｍＬの密度勾配溶液に重層し、２０００×ｇで１０分間、室温にて遠心した。
（３）遠心後の上清を回収後、３００×ｇで５分間、室温にて遠心分離し、上清を除去した。上清を除去後、分離回収した細胞を含むペレットを、ＰＢＳ９００μＬおよび抗ＣＤ４５抗体修飾磁性粒子懸濁液（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ４５、粒子径４．５μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）１００μＬで再懸濁し、室温で５分間回転撹拌した。当該操作により目的細胞である白血球に対して磁性粒子が結合する。
（４）磁性粒子を含む細胞懸濁液に、０．９％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウムと０．１％（ｗ／ｖ）炭酸水素カリウムと含む溶血液で３０ｍＬまでメスアップし、３００×ｇで１０分間、室温にて遠心分離した。当該操作により細胞懸濁液に混入した赤血球が破壊され、分離回収した目的細胞の観察が良好になる。
（５）上清を除去後、分離回収した細胞を含むペレットを、３００ｍＭマンニトールを含む溶液３０ｍＬで再懸濁し、３００×ｇで５分間、室温にて遠心分離後、上清を除去した。再度３００ｍＭマンニトールを含む溶液３０ｍＬで再懸濁した後、３００×ｇで５分間、室温にて遠心分離し、上清を除去した。当該操作は、希釈血液試料中に含まれる夾雑細胞を除去し、目的細胞を濃縮するための操作である。
【００２７】
（６）（５）で上清を除去した細胞を含む懸濁液を図１および２に示す細胞保持装置１００に導入し、信号発生器４０から導線３０を介して電極基板２１・２２に交流電圧（１ＭＨｚ、２０Ｖｐ−ｐ）を３分間印加する（誘電泳動力７０を作用させる）ことで前記装置が有する保持部５０に細胞を保持させた。本実施例で用いた細胞保持装置１００に備える細胞保持チップ１０は、直径３０μｍの貫通孔１２ａを複数有した絶縁体１２と直径３０μｍの貫通孔１１ａを複数有した遮光性のクロム膜（遮光部材１１）と電極基板２１とを上から絶縁体１２−遮光部材１１−電極基板２１の順に密着して設け、さらに絶縁体１２の上面に試料の導入口１３ａ、排出口１３ｂおよび貫通部１３ｃを有する厚さ１ｍｍのスペーサー１３を、スペーサー１３の上面に電極基板２２を、それぞれ密着して設けてなる装置である。なお貫通孔１１ａ／１２ａおよび電極基板２１により、直径３０μｍ、深さ３０μｍからなる細胞６０を保持可能な保持部５０が形成されている（図３（１）参照）。
（７）（６）の条件で交流電圧を印加しながら、０．０１（ｗ／ｖ）％のポリ−Ｌ−リジン（接着物質８０）を含む３００ｍＭマンニトール水溶液を導入し、３分間静置後、前記交流電圧の印加を停止し、前記水溶液を吸引除去した（図３（２）参照）。
（８）５０％（ｖ／ｖ）エタノールと１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドを含む水溶液（以下、細胞膜透過試薬）を導入し、１０分間静置することで、細胞膜を透過させ、保持部に導入した細胞を標本化した（図３（３）参照）。
（９）細胞膜透過試薬を吸引除去し、ＰＢＳを導入することで、残留した細胞膜透過試薬を洗浄した。
（１０）細胞核を標識する蛍光試薬（ＤＡＰＩ：４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を含む水溶液（以下、標識試薬）を導入し、３０分間静置した（図３（４）参照）。
（１１）標識試薬を吸引除去し、ＰＢＳを導入することで、残留した標識試薬を除去した。
（１２）標識化細胞６１を含む細胞保持チップ１０を蛍光顕微鏡（光学検出器２００）のステージ上に載置した後、保持孔に保持された細胞を観察するために撮像した。これにはコンピューター制御式電動ステージ、電子増倍型冷却ＣＣＤカメラ（ＥＭＣＣＤ）（ＦＬＯＶＥＬ社製ＡＤＴ−１００）を装備した蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＩＸ７１）を用いた。画像取得および解析ソフトウェアにはＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いた（図３（５）参照）。
（１３）（１２）で撮像した画像を基に、採取するための目的細胞を定め、当該目的細胞が保持された保持部５０の直上に、ネオジム磁石により磁気を帯びた直径５０μｍの鉄線（磁性体３００）を降下させることで、当該目的細胞を採取した（図３（６）参照）。前記目的細胞を採取した後、当該細胞が保持されていた保持部５０周辺を撮像した。
【００２８】
結果を図４および５に示す。図４は保持部（点線で囲われた領域）に目的細胞である白血球が１つ保持されたときの採取前後における明視野像（図４（Ａ））およびＤＡＰＩ蛍光像（図４（Ｂ））であり、図５は保持部（点線で囲われた領域）に目的細胞である白血球が２つ保持されたときの採取前後におけるＤＡＰＩ蛍光像である。図４より、目的細胞が保持された保持部に磁性体を近接させることで白血球を吸引採取できることがわかる。図５より、保持部に複数の目的細胞が保持されていても、当該保持部に磁性体を近接させることで当該複数の目的細胞を同時に吸引採取できる一方、他の保持部に保持された細胞は吸引採取されないことがわかる。以上の結果より、本発明の方法は目的細胞を精度よく採取できることがわかる。
【符号の説明】
【００２９】
１００：細胞保持装置
２００：光学検出器
３００：磁性体
１０：細胞保持チップ
１１：遮光部材
１２：絶縁体
１１ａ、１２ａ：貫通孔
１３：スペーサー
１３ａ：導入口
１３ｂ：排出口
１３ｃ：貫通部
２１・２２：電極基板
３０：導線
４０：信号発生器
５０：保持部
６０：細胞
６１：標識化細胞（目的細胞）
７０：誘電泳動力
８０：接着物質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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