(57)【要約】      （修正有）【課題】様々な腫瘍に対する免疫療法で使用される新規ペプチドおよびペプチドの組み合わせの提供。【解決手段】特定の配列、およびその配列と少なくとも８８％相同的なその変異配列の群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドであって、前記変異体が主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と結合し、および／またはＴ細胞を前記変異体ペプチドおよびその薬学的に許容可能な塩と交差反応させ、前記ペプチドが完全長ポリペプチドでない、ペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜配列番号２８８、および配列番号１〜配列番号２８８と少なくとも８８％相同的なその変異配列の群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドであって、前記変異体が主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と結合し、および／またはＴ細胞を前記変異体ペプチドおよびその薬学的に許容可能な塩と交差反応させ；前記ペプチドが完全長ポリペプチドでない、ペプチド。
【請求項２】
ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力を有し、前記ＭＨＣに結合すると、ＣＤ４および／またはＣＤ８Ｔ細胞によって認識されることができるようになる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
そのアミノ酸配列が、配列番号１〜配列番号２８８の１つのいずれか一項に記載の一続きのアミノ酸を含んでなる、請求項１または２に記載のペプチドまたはその変異体。
【請求項４】
前記ペプチドまたはその変異体が、８〜１００、好ましくは８〜３０、より好ましくは８〜１００のアミノ酸の全長を有し、最も好ましくは前記ペプチドが、配列番号１〜配列番号２８８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体。
【請求項５】
前記ペプチドが、修飾され、および／または非ペプチド結合を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体。
【請求項６】
前記ペプチドが、特にＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸を含んでなる、融合タンパク質の一部である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体をエンコードする核酸であって、任意選択的に異種プロモーター配列と結合する、核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸を発現する、発現ベクター。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド、請求項７に記載の核酸または請求項８に記載の発現ベクターを含んでなり、好ましくは樹状細胞などの抗原提示細胞である、組換え宿主細胞。
【請求項１０】
医療で使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、または請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドを提示する、または請求項７に記載の核酸を発現する、または請求項８に記載の発現ベクターを含んでなる、請求項９に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記ペプチドまたはその変異体を前記宿主細胞またはその培養液から単離するステップとを含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体を製造する方法。
【請求項１２】
Ｔ細胞を、適切な抗原提示細胞の表面に、または抗原提示細胞を模倣する人工コンストラクトの表面に発現される抗原負荷ヒトクラスＩまたはＩＩ  ＭＨＣ分子に、前記Ｔ細胞を抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり、生体外で接触させるステップを含んでなり、前記抗原が、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドである、活性化Ｔリンパ球を製造するインビトロ法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを提示する細胞を選択的に認識する、請求項１２に記載の方法によって製造される活性化Ｔリンパ球。
【請求項１４】
請求項１３で定義される活性Ｔ細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる、その標的細胞が、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを提示する患者において、標的細胞を死滅させる方法。
【請求項１５】
ＭＨＣ分子と結合すると、好ましくは請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体を特異的に認識する、特に可溶性または膜結合抗体である、抗体。
【請求項１６】
がんの診断および／または治療で使用される、またはがんに対する薬剤の製造で使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、請求項９に記載の細胞、請求項１３に記載の活性化Ｔリンパ球または請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
がんが、ペプチド配列番号１〜配列番号２８８がそれに由来するタンパク質の過剰発現を示す、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、神経膠芽腫（ＧＢ）、胃がん（ＧＣ）、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん（ＰＣ）、腎細胞がん（ＲＣＣ）、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）、前立腺がん（ＰＣＡ）、卵巣がん（ＯＣ）、メラノーマ、乳がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢がんおよび胆管細胞がん（ＧＢＣ、ＣＣＣ）、膀胱がん（ＵＢＣ）、子宮がん（ＵＥＣ）、およびその他の腫瘍の群から選択される、請求項１６に従って使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、請求項９に記載の細胞、請求項１３に記載の活性化Ｔリンパ球または請求項１５に記載の抗体。
【請求項１８】
ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド変異体、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、請求項１０に記載の細胞、請求項１３に記載の活性化Ｔリンパ球、または請求項１５に記載の抗体を含有する医薬組成物を溶液または凍結乾燥形態で含んでなる容器；
ｂ）任意選択的に、前記凍結乾燥製剤のための希釈剤または再構成溶液を含有する第２の容器；
ｃ）任意選択的に、配列番号１〜配列番号２８８からなる群から選択される少なくとももう１つのペプチド、および
ｄ）任意選択的に、（ｉ）前記溶液の使用、または（ｉｉ）前記凍結乾燥製剤の再構成および／または使用のための取扱説明書
を含んでなるキット。
【請求項１９】
（ｉｉｉ）緩衝液、（ｉｖ）希釈剤、（Ｖ）フィルター、（ｖｉ）針、または（Ｖ）シリンジの１つまたは複数をさらに含んでなる、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記ペプチドが、配列番号１〜配列番号２８８からなる群から選択される、請求項１８または１９に記載のキット。
【請求項２１】
ａ）前記個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される、腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を同定するステップと；
ｂ）ａ）で同定された前記ペプチドを、正常組織との比較で腫瘍内の免疫原性および／または過剰提示について予備選別されたペプチド貯蔵庫と比較するステップと；
ｃ）前記患者において同定されたＴＵＭＡＰと一致する前記貯蔵庫から、少なくとも１つのペプチドを選択するステップと；
ｄ）ステップｃ）に基づいて、個別化ワクチンを）調合するステップと
を含んでなる、個別化抗がんワクチンを製造する方法。
【請求項２２】
前記ＴＵＭＡＰが、
ａ１）前記腫瘍サンプルからの発現データを、前記腫瘍サンプルの組織型に相当する正常組織サンプルからの発現データと比較して、前記腫瘍サンプル中で過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質を同定するステップと；
ａ２）前記発現データを、前記腫瘍サンプル中のＭＨＣクラスＩ／またはクラスＩＩ分子と結合するＭＨＣリガンドの配列と相関させて、前記腫瘍によって過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質に由来するＭＨＣリガンドを同定するステップと
によって同定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
結合ペプチドを前記腫瘍サンプルから単離されたＭＨＣ分子から溶出させて、前記溶出したリガンドを配列決定することで、ＭＨＣリガンドの配列が同定される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記腫瘍サンプルの組織型に対応する前記正常組織が、前記同一患者から得られる、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記貯蔵庫に包含されるペプチドが、
ａａ．正常組織または組織群と比較して悪性組織で過剰発現される遺伝子を同定するステップを含んでなる、マイクロアレイまたは配列決定ベース発現プロファイリングなどの高度並列法によって、ゲノム規模メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）発現解析を実施するステップと；
ａｂ．ステップａａで検出された、選択的に発現されまたは過剰発現される遺伝子によってコードされる、ペプチドを選択するステップと；
ａｃ．健常ドナーまたは前記患者からのヒトＴ細胞を使用する生体外免疫原性アッセイを含んでなる、前記選択されたペプチドによる生体内Ｔ細胞応答の誘導を判定するステップと；または
ｂａ．質量分析を使用して、前記腫瘍サンプルからＨＬＡリガンドを同定するステップと；
ｂｂ．正常組織または組織群と比較して悪性組織で過剰発現される遺伝子を同定するステップを含んでなる、マイクロアレイまたは配列決定ベース発現プロファイリングなどの高度並列法によって、ゲノム規模メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）発現解析を実施するステップと；
ｂｃ．前記同定されたＨＬＡリガンドを前記遺伝子発現データと比較するステップと；
ｂｄ．ステップｂｃで検出された、選択的に発現されまたは過剰発現される遺伝子によってコードされる、ペプチドを選択するステップと；
ｂｅ．ステップｂｄから選択されたＴＵＭＡＰを腫瘍組織上で再検出し、健常組織上の検出欠如またはまれな検出が、ｍＲＮＡレベルにおける過剰発現の関連性を確認するステップと；
ｂｆ．健常ドナーまたは前記患者からのヒトＴ細胞を使用する生体外免疫原性アッセイを含んでなる、前記選択されたペプチドによる生体内Ｔ細胞応答の誘導を判定するステップと
に基づいて同定される、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記貯蔵庫に包含される前記ペプチドの免疫原性が、生体外免疫原性アッセイ、個々のＨＬＡ結合についての患者免疫モニタリング、ＭＨＣ多量体染色、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよび／または細胞内サイトカイン染色を含んでなる方法によって判定される、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記貯蔵庫が、配列番号１〜配列番号２８８からなる群から選択される複数のペプチドを含んでなる、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記個々の患者からの正常な対応する組織と比較して前記腫瘍サンプルに特有の少なくとも１つの変異を同定するステップと、前記ワクチンに包含するために、または細胞療法を作成するために、前記変異と関連があるペプチドを選択するステップとをさらに含んでなる、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの変異が、全ゲノム配列決定によって同定される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＨＬＡリガンドと反応性である、好ましくは組換え可溶性または膜結合Ｔ細胞受容体であるＴ細胞受容体であって、前記リガンドが、配列番号１〜配列番号２８８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有する、Ｔ細胞受容体。
【請求項３１】
前記アミノ酸配列が、配列番号１〜配列番号２８８と少なくとも８８％同一である、請求項３０に記載のＴ細胞受容体。
【請求項３２】
前記アミノ酸配列が、配列番号１〜配列番号２８８のいずれかからなる、請求項３０または３１に記載のＴ細胞受容体。
【請求項３３】
前記Ｔ細胞受容体が可溶性分子として提供され、任意選択的に、免疫刺激ドメインまたは毒素などのさらなるエフェクター機能を保有する、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体。
【請求項３４】
請求項３０〜３３のいずれか一項に記載のＴＣＲをエンコードする核酸であって、任意選択的に異種プロモーター配列と結合する、核酸。
【請求項３５】
請求項３４に記載の核酸を発現する、発現ベクター。
【請求項３６】
請求項３４に記載の核酸、または請求項１５に記載の抗体をコードする核酸、または請求項３５に記載の発現ベクターを含んでなる、好ましくはＴ細胞またはＮＫ細胞である、組換え宿主細胞。
【請求項３７】
請求項３６に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記Ｔ細胞受容体を前記宿主細胞および／またはその培養液から単離するステップとを含んでなる、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体を製造する方法。
【請求項３８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体、好ましくはＭＨＣ分子と結合する請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体を特異的に認識する、アプタマー。
【請求項３９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、請求項９に記載の細胞、請求項１３に記載の活性化Ｔリンパ球または請求項１５に記載の抗体または請求項３０〜３２のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体または請求項３８に記載のアプタマーからなる群から選択される、少なくとも１つの活性成分と、薬学的に許容できる担体と、任意選択的に、追加的な薬学的に許容可能な賦形剤および／または安定剤とを含んでなる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法で使用するためのペプチド、タンパク質、核酸、および細胞に関する。特に、本発明は、がんの免疫療法に関する。本発明は、単独のまたはその他の腫瘍関連ペプチドと併用される、腫瘍関連Ｔ細胞ペプチドエピトープにさらに関し、それは、例えば、抗腫瘍免疫応答を刺激し、または生体外でＴ細胞を刺激して患者に移入する、ワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。ペプチドは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子と結合し、またはペプチドそれ自体が、抗体、可溶性Ｔ細胞受容体、およびその他の結合分子の標的にもなり得る。
【０００２】
本発明は、ヒト腫瘍細胞のＨＬＡクラスＩ分子に由来する、いくつかの新規ペプチド配列およびそれらの変異型に関し、それらは抗腫瘍免疫応答を引き起こすためのワクチン組成物中で、または薬理的／免疫学的活性化合物および細胞の開発標的として、使用され得る。
【背景技術】
【０００３】
世界保健機関（ＷＨＯ）によると、がんは、２０１２において世界の４つの主要な非伝染性致死性疾患の１つであった。同じ年、結腸直腸がん、乳がん、および気道がんは、高所得国における１０大死亡原因の１つに挙げられた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｍｅｄｉａｃｅｎｔｒｅ／ｆａｃｔｓｈｅｅｔｓ／ｆｓ３１０／ｅｎ／）。
【０００４】
疫学
２０１２年には、１４１０万件の新規がん症例、３２６０万人のがん患者（診断の５年以内）、および８２０万件のがん死亡が世界的に推定された（Ｆｅｒｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｂｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０００５】
脳腫瘍、白血病、および肺がん群の内、本発明は、神経膠芽腫（ＧＢ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、非小細胞細胞および小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣ）にそれぞれ特に重点を置く。
【０００６】
ＧＢは、最も一般的な中枢神経系悪性病変であり、米国内の１０万人あたり３．１９人の年齢調整罹患率を有する。ＧＢは、予後が非常に不良であり、１年生存率は３５％であり、５年生存率は５％を下回る。男性、高齢、および民族性が、ＧＢのリスク因子であるように見える（Ｔｈａｋｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０００７】
ＣＬＬは、西欧諸国で最も頻度の高い白血病であり、全ての白血病の約３分の１を構成する。発生率は、米国および欧州で同様であり、新規症例の推定数は年間約１６，０００件である。ＣＬＬは、アフリカ系よりも白人でより一般的であり、ヒスパニックおよび北米先住民ではより希で、アジア系ではほとんど見られない。アジア系の人々の中では、ＣＬＬ発生率は白人の３分の１である（Ｇｕｎａｗａｒｄａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＣＬＬがある患者の５年全生存率は、約７９％である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｎｅｔ／ｃａｎｃｅｒ−ｔｙｐｅｓ／ｌｅｕｋｅｍｉａ−ｃｈｒｏｎｉｃ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ−ｃｌｌ／ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）。
【０００８】
肺がんは世界で最も一般的ながん型であり、多くの国々でがんによる主な死亡原因である。肺がんは、小細胞肺がんと非小細胞肺がんに細分される。ＮＳＣＬＣは、腺がん、扁平上皮がん、および大細胞がんの組織型を含み、米国における全ての肺がんの８５％を占める。ＮＳＣＬＣの発生率は、現在および過去の喫煙者を含めた喫煙率と綿密に相関し、５年生存率は１５％と報告された（Ｗｏｒｌｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｐｏｒｔ，２０１４；Ｍｏｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０００９】
治療法
乳がん
乳がん患者の標準的治療は、腫瘍病期、ホルモン受容体状態、およびＨＥＲ２発現パターンの異なるパラメータに左右される。標準的治療としては、腫瘍の完全な外科的切除と、それに続く放射線療法が挙げられる。主にアントラサイクリンおよびタキサンによる化学療法が、切除前または後に開始されてもよい。ＨＥＲ２陽性腫瘍がある患者には、化学療法薬に加えて、抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブが投与される（Ｓ３−Ｌｅｉｔｌｉｎｉｅ  Ｍａｍｍａｋａｒｚｉｎｏｍ，２０１２）。乳がんは免疫原性がん実体であり、原発性腫瘍内の浸潤性免疫細胞の異なる型は、特徴的な予後および予測的有意性を示す。多数の初期免疫療法治験が、乳がん患者において実施されている。乳がん患者における、イピリムマブおよびその他のＴ細胞活性化抗体による免疫チェックポイント調節の効果に関する臨床データが、浮上している（Ｅｍｅｎｓ，２０１２）。
【００１０】
慢性リンパ球性白血病
ＣＬＬは現在治療可能ではないが、多くの患者は、遅い疾患進行または症状悪化のみを示す。症候性のまたは迅速に進行する疾患がある患者に対しては、いくつかの治療選択肢が利用できる。これらとしては、化学療法；標的療法；モノクローナル抗体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、および能動的免疫療法のような免疫ベース治療法；および幹細胞移植が挙げられる。
【００１１】
いくつかの完了したおよび進行中の治験は、ＣＤ１９特異性がある、遺伝子操作自己由来キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾Ｔ細胞に基づく（Ｍａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。これまでのところ、少数の患者のみが、検出可能なまたは持続性のＣＡＲを示した。１例の部分寛解（ＰＲ）および２例の完全寛解（ＣＲ）が、Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．およびＫａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．によるＣＡＲ  Ｔ細胞治験で検出されている（Ｋａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００１２】
活性免疫療法としては、遺伝子治療、全修飾腫瘍細胞ワクチン、ＤＣベースのワクチン、および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来ペプチドワクチンのストラテジーが挙げられる。
【００１３】
いくつかのＴＡＡはＣＬＬにおいて過剰発現され、ワクチン接種に適する。これらとしては、フィブロモジュリン（Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、ＲＨＡＭＭ／ＣＤ１６８（Ｇｉａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、ＭＤＭ２（Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、ｈＴＥＲＴ（Ｃｏｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、がん胎児性抗原未熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡｉＬＲＰ）（Ｓｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、アディポフィリン（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、サバイビン（Ｇｒａｎｚｉｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ＫＷ１からＫＷ１４（Ｋｒａｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、および腫瘍由来ＩｇＶＨＣＤＲ３領域（Ｈａｒｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｃａｒｂａｌｌｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）が挙げられる。第Ｉ相臨床試験は、ワクチンとしてＲＨＡＭＭ由来Ｒ３ペプチドを使用して実施された。６人の患者の内５人が、検出可能なＲ３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を有した（Ｇｉａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００１４】
結腸直腸がん
結腸直腸がん（ＣＲＣ）の病期次第で、異なる標準的治療法が、結腸および直腸がんに対して利用できる。標準手順としては、外科手術、放射線療法、化学療法、およびＣＲＣ標的療法が挙げられる（Ｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５ａ；Ｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５Ｂ）。
【００１５】
最新の臨床試験は、能動免疫療法をＣＲＣに対する治療選択肢として分析する。これらのストラテジーとしては、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来ペプチド、全腫瘍細胞、樹状細胞（ＤＣ）ワクチン、およびウイルスベクターによるワクチン接種が挙げられる（Ｋｏｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００１６】
ペプチドワクチンは、これまでに、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１、ＥＧＦＲ、Ｔ細胞３（ＳＡＲＴ３）によって認識される扁平上皮がん抗原、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（β−ｈＣＧ）、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ１）、サバイビン−２Ｂ、ＭＡＧＥ３、ｐ５３、リングフィンガータンパク質４３、およびミトコンドリア外膜３４（ＴＯＭＭ３４）のトランスロカーゼ、または変異ＫＲＡＳに向けられている。いくつかの第ＩおよびＩＩ相臨床試験において、患者は、抗原特異的ＣＴＬ応答または抗体産生を示した。免疫学的応答とは対照的に、多くの患者は、臨床的レベルで、ペプチドワクチンから恩恵を被らなかった（Ｋｏｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｍｉｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｍｏｕｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｏｋｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００１７】
樹状細胞ワクチンは、ＴＡＡ由来ペプチド、腫瘍細胞溶解産物、アポトーシス腫瘍細胞、または腫瘍ＲＮＡまたはＤＣ腫瘍細胞融合産物のいずれかでパルス処理されたＤＣを含んでなる。第Ｉ／ＩＩ相試験にある多くの患者が、特異的免疫学的応答を示した一方で、少数のみが臨床上の便益を有した（Ｋｏｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００１８】
食道がん
食道がんの一次治療ストラテジーは、腫瘍病期と部位、組織型、および患者の医学的状態に左右される。化学療法薬措置としては、オキサリプラチンとフルオロウラシル、カルボプラチンとパクリタキセル、シスプラチンとフルオロウラシル、ＦＯＬＦＯＸ、およびシスプラチンとイリノテカンが挙げられる。食道がんにおける標的療法の無作為化データは非常に限られているので、ＨＥＲ２陽性腫瘍がある患者は、胃がんに関する指針に従って治療されるべきである（Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００１９】
非常に限られた数の初期臨床試験のみが実施されていることから、食道がんにおける免疫療法アプローチに関するデータは乏しい。３つの異なるがん精巣抗原（ＴＴＫタンパク質キナーゼ、リンパ球抗原６複合遺伝子座Ｋ、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）−ＩＩｍＲＮＡ結合タンパク質３）から誘導される、３つのペプチドからなるワクチンが、第Ｉ相試験において、進行した食道がんがある患者に投与され、中程度の成績が得られた。自己由来悪性細胞を用いた生体外攻撃後における、活性化Ｔ細胞の腫瘍内注射は、第Ｉ／ＩＩ相試験にある１１人の患者の内４人で、完全または部分的腫瘍応答を誘導した（Ｔｏｏｍｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００２０】
胃がん
胃がん（ＧＣ）は、粘膜層を覆う細胞中で始まり、増殖するにつれて外層を通して広がる。４種類の標準治療法が、使用される。胃がんの治療は、内視鏡的または外科的切除、化学療法、放射線療法または化学放射線治療を伴ってもよい（Ｌｅｉｔｌｉｎｉｅ  Ｍａｇｅｎｋａｒｚｉｎｏｍ，２０１２）。
【００２１】
進行したＧＣに対する現行の薬剤投与計画は有効性に劣り、低い５年生存率をもたらす。免疫療法は、ＧＣ患者の生存率を改善する代替アプローチであるかもしれない。腫瘍関連リンパ球およびサイトカイン誘導キラー細胞の養子免疫伝達；ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ−３または血管内皮成長因子受容体１および２を標的とするペプチドベースのワクチン；およびＨＥＲ２／ｎｅｕを標的とする樹状細胞ベースのワクチンが、臨床ＧＣ治験において有望な結果を示した。免疫チェックポイント阻害および遺伝子操作Ｔ細胞は、追加的な治療の選択肢に相当するかもしれず、それは現在前臨床および臨床試験で評価中である（Ｍａｔｓｕｅｄａ  ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ，２０１４）。
【００２２】
神経膠芽腫
神経膠芽腫（ＷＨＯ等級ＩＶ）に対する療の選択肢は、非常に限られている。ＧＢの治療のために、免疫チェックポイント阻害、ワクチン接種、および遺伝子操作Ｔ細胞の養子免疫伝達をはじめとする、異なる免疫療法のアプローチが研究されている。
【００２３】
ペプチドベースのワクチン、熱ショックタンパク質ワクチン、自己由来腫瘍細胞ワクチン、樹状細胞ベースのワクチン、およびウイルスタンパク質ベースのワクチンをはじめとする、ＧＢ患者のための異なるワクチン接種ストラテジーが、現在研究されている。これらのアプローチでは、自己由来腫瘍細胞溶解産物またはサイトメガロウイルス成分を用いてパルス処理された、上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）または熱ショックタンパク質または樹状細胞のようなＧＢ関連タンパク質から導かれるペプチドが適用されて、ＧＢ患者において抗腫瘍免疫応答が誘導される。これらの研究のいくつかは、優れた安全性および耐容性プロファイル、ならびに有望な有効性データを示す。
【００２４】
遺伝子修飾されたＴ細胞の養子免疫伝達は、ＧＢ治療のための追加的な免疫療法のアプローチである。異なる臨床試験が、現在ＨＥＲ２、ＩＬ−１３受容体α２、およびＥＧＦＲｖＩＩＩに向けられた、キメラ抗原受容体を有するＴ細胞の安全性および有効性を評価している（Ａｍｐｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【００２５】
肝臓がん
疾病管理は、診断時の腫瘍段階、および肝臓の全体的な状態に左右される。ＨＣＣに対する化学療法としては、全身療法のためのドキソルビシン、５−フルオロウラシル、およびシスプラチンの組み合わせ、そして肝動脈輸液のためのドキソルビシン、フロクスウリジン、およびマイトマイシンＣの組み合わせが挙げられる。しかし、ほとんどのＨＣＣは、化学療法薬に対して高耐性を示す（Ｅｎｇｕｉｔａ−Ｇｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｆｏｒｔｅｓ，２０１４）。
【００２６】
進行した切除不能ＨＣＣにおける治療の選択肢は、マルチチロシンキナーゼ阻害剤であるソラフェニブに限定される（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｗｉｌｈｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ソラフェニブは、生存期間を約３ヶ月間増大させることが確認された唯一の全身薬物であり、目下このような患者に対する唯一の実験的治療の選択肢に相当する（Ｃｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｌｌｏｖｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００２７】
最近、ＨＣＣのための限定数の免疫療法治験が実施されている。免疫細胞のサブセットを活性化し、および／または腫瘍免疫原性を増大させるために、サイトカインが使用されている（Ｒｅｉｎｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓａｎｇｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。その他の治験は、腫瘍浸潤性リンパ球または活性化末梢血リンパ球の輸液に焦点を合わせている（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｔａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｔａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【００２８】
これまでに、少数の治療用ワクチン接種治験が実行されている。Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．は、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）に由来するペプチドをワクチンとして、または生体外でＡＦＰペプチドが負荷されたＤＣを使用して、２つの治験を実施した（Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。２つの異なる研究において、自己由来腫瘍溶解産物（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、または肝芽細胞腫細胞株ＨｅｐＧ２の溶解産物（Ｐａｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）を用いて、自己由来樹状細胞（ＤＣ）が生体外パルス処理された。これまでに、ワクチン接種治験は、臨床転帰の限定的改善のみを示している。
【００２９】
メラノーマ
メラノーマの標準的治療は、周囲の健康な組織を含めた完全外科的切除である。治療の選択肢としては、単剤化学療法、多剤化学療法、および特異的阻害剤による標的療法が挙げられる（Ｓ３−Ｌｅｉｔｌｉｎｉｅ  Ｍｅｌａｎｏｍ，２０１３）。
【００３０】
いくつかの異なるワクチン接種アプローチが、進行性メラノーマがある患者において既に評価されている。これまでのところ、第ＩＩＩ相試験では、かなり期待外れの結果が明らかになり、ワクチン接種ストラテジーには明らかに改善の必要がある。そのため、ＯｎｃｏＶＥＸ  ＧＭ−ＣＳＦ治験またはＤＥＲＭＡ治験のような新規臨床試験は、耐容性を低下させることなく臨床効果を改善することを目指す（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｕｋ．ｏｒｇ）。
【００３１】
養子Ｔ細胞移入は、進行期メラノーマ治療のために極めて有望である。生体外増殖された自己由来腫瘍浸潤性リンパ球、ならびにがん精巣抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する高親和性Ｔ細胞受容体を有するＴ細胞は、メラノーマ患者への移入時に、有意な有益かつ低毒性の効果を有した。不運にも、メラノサイト特異的抗原ＭＡＲＴ１およびｇｐ１００およびがん精巣抗原ＭＡＧＥＡ３に対する高親和性Ｔ細胞受容体があるＴ細胞は、臨床試験においてかなりの毒性効果を引き起こした。したがって、養子Ｔ細胞移入は、高い治療的可能性を有するが、これらの治療の安全性と耐容性をさらに高める必要がある（Ｐｈａｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，２０１３；Ｈｉｎｒｉｃｈｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｔｉｆｏ，２０１３）。
【００３２】
非小細胞肺がん
治療選択肢は、がん型（小細胞または非小細胞）および病期によって決定され、外科手術、放射線療法、化学療法、およびベバシズマブやエルロチニブやゲフィチニブなどの標的生物学的療法が挙げられる（Ｓ３−Ｌｅｉｔｌｉｎｉｅ  Ｌｕｎｇｅｎｋａｒｚｉｎｏｍ，２０１１）。
【００３３】
ＮＳＣＬＣに対する治療の選択肢を拡大するために、異なる免疫療法アプローチが試験されており、あるいはなおも研究中である。Ｌ−ＢＬＰ２５またはＭＡＧＥＡ３を用いたワクチン接種は、ＮＳＣＬＣ患者においてワクチン媒介性延命効果を実証できなかった一方で、同種異系細胞株由来ワクチンは、有望な臨床試験結果を示した。それに加えて、上皮成長因子受容体であるガングリオシドと、いくつかのその他の抗原とを標的とするさらなるワクチン接種治験が現在進行中である。患者の抗腫瘍Ｔ細胞応答を高める代案のストラテジーは、特異的抗体によって阻害Ｔ細胞受容体またはそれらのリガンドをブロックすることからなる。ＮＳＣＬＣにおける、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、およびＭＥＤＩ−４７３６をはじめとする、これらの抗体のいくつかの治療的可能性が、現在臨床試験で評価されている（Ｒｅｉｎｍｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【００３４】
卵巣がん
外科的切除は、早期ならびに進行期卵巣がんにおける一次治療である（Ｓ３−Ｌｅｉｔｌｉｎｉｅ  ｍａｌｉｇｎｅ  Ｏｖａｒｉａｌｔｕｍｏｒｅ，２０１３）。
【００３５】
炎症促進性腫瘍浸潤性リンパ球、特にＣＤ８陽性Ｔ細胞の存在は、予後良好と関連があり、腫瘍関連抗原に対して特異的なＴ細胞が、がん組織から単離され得るので、免疫療法は、卵巣がん患者の治療を改善する有望なストラテジーのようである。
【００３６】
したがって、卵巣がんにおける種々の免疫療法の研究に、多くの科学的努力がなされている。かなりの数の前臨床および臨床試験が既に実施済みであり、さらなる研究が現在進行中である。サイトカイン療法、ワクチン接種、モノクローナル抗体治療、養子細胞移入、および免疫調節に関する臨床データが利用できる。
【００３７】
いくつかの腫瘍関連タンパク質（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ５３、ウィルムス腫瘍−１）に由来する単一または複数のペプチド、または自己由来腫瘍細胞に由来する全腫瘍抗原を使用した、第ＩおよびＩＩ相ワクチン接種研究は、優れた安全性および耐容性プロファイルを明らかにしたが、低〜中程度の臨床効果しか示さなかった。
【００３８】
免疫細胞の養子免疫伝達は、臨床試験において不均一な結果を達成した。自己由来の生体外増幅腫瘍浸潤性Ｔ細胞の養子免疫伝達は、パイロット試験において、有望なアプローチであることが示された。対照的に、葉酸受容体に対して特異的なキメラ抗原受容体を有するＴ細胞の移入は、第Ｉ相試験において有意な臨床的奏効を誘導しなかった。腫瘍細胞溶解産物または腫瘍関連タンパク質を用いて生体外でパルス処理された樹状細胞は、移入時に抗腫瘍Ｔ細胞応答を促進することが示されたが、Ｔ細胞活性化の程度は臨床効果と相関しなかった。ナチュラルキラー細胞の移入は、第ＩＩ相試験において有意な毒性を引き起こした。
【００３９】
内在性抗腫瘍免疫ならびに免疫療法は、免疫抑制的な腫瘍微小環境によって妨げられる。この障害を克服するために、シクロホスファミド、抗ＣＤ２５抗体、およびＰＥＧ化リポソーム性ドキソルビシンのような免疫調節薬が、免疫療法との組み合わせで試験される。最も信頼できるデータは、Ｔ細胞活性を高める抗ＣＴＬＡ４抗体であるイピリムマブに関して、現在利用できる。イピリムマブは、卵巣がん患者において有意な抗腫瘍効果を発揮することが示された（Ｍａｎｔｉａ−Ｓｍａｌｄｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【００４０】
膵臓がん
膵臓がん患者のための治療の選択肢は、非常に限られている。効果的治療のための１つの大きな問題は、診断時における典型的に進行した腫瘍病期である。
【００４１】
ワクチン接種ストラテジーは、膵臓がんの治療のためのさらに革新的で有望な代案として研究されている。ＫＲＡＳ変異体、反応性テロメラーゼ、ガストリン、サバイビン、ＣＥＡ、およびＭＵＣ１を標的とするペプチドベースのワクチンが、臨床試験で既に評価され、ある程度有望な結果が得られている。さらに、膵臓がん患者における、樹状細胞ベースのワクチン、同種異系ＧＭ−ＣＳＦ分泌ワクチン、およびアルゲンパンツセル−Ｌの臨床試験もまた、免疫療法の有益な効果を明らかにした。異なるワクチン接種プロトコルの効率をさらに調査する追加的な臨床試験が、現在進行中である（Ｓａｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００４２】
前立腺がん
前立腺がんのための治療ストラテジーは、主にがん病期に左右される。局所的に限定された非転移性前立腺がんでは、治療選択肢としては、積極的サーベイランス（待機および監視）、前立腺の完全外科的切除、および近接照射療法存在下または不在下における局所高用量放射線療法が挙げられる（Ｓ３−Ｌｅｉｔｌｉｎｉｅ  Ｐｒｏｓｔａｔａｋａｒｚｉｎｏｍ，２０１４）。
【００４３】
樹状細胞ベースのワクチンであるシプロイセルＴは、ＦＤＡによって認可された最初の抗がんワクチンであった。ＣＲＰＣがある患者の生存期間に対するその好ましい効果のために、さらなる免疫療法の開発に向けた多大な努力がなされている。ワクチン接種ストラテジーについては、ペプチドワクチンである前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）−ＴＲＩＣＯＭ、個別化ペプチドワクチンであるＰＰＶ、ＤＮＡワクチンであるｐＴＶＧ−ＨＰ、およびＧＭ−ＣＳＦ発現全細胞ワクチンであるＧＶＡＸが、異なる臨床試験で有望な結果を示した。さらに、シプロイセルＴ以外の樹状細胞ベースのワクチン、すなわちＢＰＸ−１０１およびＤＣＶＡＣ／Ｐａは、前立腺がん患者において、臨床的奏効を引き起こすことが示された。イピリムマブおよびニボルマブのような免疫チェックポイント阻害物質が、単剤療法として、ならびにアンドロゲン奪取療法、局所放射線療法、ＰＳＡ−ＴＲＩＣＯＭ、およびＧＶＡＸをはじめとするその他の治療法との併用で、現在臨床試験で評価されている。第ＩＩ相試験で進行を有意に遅延させ、無憎悪生存期間を延長させた免疫調節物質タスキニモドは、現在第ＩＩＩ相試験でさらに研究されている。もう一つの免疫修飾物質であるレナリドミドは、初期臨床試験で有望な効果をもたらしたが、第ＩＩＩ相試験では生存率を改善できなかった。これらの期待外れな結果にもかかわらず、さらなるレナリドミド治験が継続されている（Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【００４４】
腎細胞がん
初期治療は、最も一般的には、罹患した腎臓の部分的または完全除去のどちらかであり、依然として根治的治療の主流である（Ｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。予後スコアの悪い患者の第一選択治療として、いくつかのがん団体および協会によって作成された指針は、受容体チロシンキナーゼ阻害物質（ＴＫＩ）であるスニチニブとパゾパニブ、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）と組み合わされたモノクローナル抗体であるベバシズマブ、およびｍＴＯＲ阻害剤であるテムシロリムスを推奨する。米国ＮＣＣＮならびに欧州ＥＡＵおよびＥＳＭＯによって作成された指針に基づいて、サイトカイン（ＩＦＮ−α、ＩＬ−２）による先行治療法が失敗したＲＣＣ患者では、ＴＫＩであるソラフェニブ、パゾパニブまたは最近ではアキシチニブが、第二選択治療として推奨される。ＮＣＣＮ指針は、この状況（ＮＣＣＮカテゴリーＩによる高レベルの証拠）において、スニチニブもまた勧める。
【００４５】
ＲＣＣの既知の免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｔｙ）は、進行したＲＣＣにおける免疫療法およびがんワクチンの使用を支持する基礎に相当する。リンパ球ＰＤ−１発現とＲＣＣの進行期、等級、および予後との間の興味深い相関、ならびにＲＣＣ腫瘍細胞による選択的ＰＤ−Ｌ１発現と、より芳しくない臨床転帰との可能な関連性は、単独のまたは抗血管新生薬またはその他の免疫療法アプローチと併用される、ＲＣＣ治療のための新規抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１薬の開発をもたらした（Ｍａｓｓａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。進行したＲＣＣでは、ＴＲＩＳＴ試験と称される第ＩＩＩ相がんワクチン治験が、第一選択標準的治療に追加された、ＴｒｏＶａｘ（ポックスウイルスベクターと共に腫瘍関連抗原である５Ｔ４を使用するワクチン）が、局所的進行またはｍＲＣＣがある患者の生存期間を延長するかどうかを評価する。いずれの群でも生存期間中央値に達しておらず、３９９人の患者（５４％）が試験に残っているが、データの解析は、ＴｒｏＶａｘが免疫学的に活性であり、５Ｔ４特異的抗体応答の強度と改善された生存期間との間に相関があることの双方を実証する、以前の臨床結果を裏付ける。さらにＲＣＣにおいて過剰発現されるエピトープを使用してペプチドワクチンを検索する、いくつかの研究がある。
【００４６】
腫瘍ワクチンの様々なアプローチが、研究されている。腫瘍細胞溶解産物、樹状細胞と腫瘍細胞の融合物、または全腫瘍ＲＮＡをはじめとする、全腫瘍アプローチを使用した研究が、ＲＣＣ患者において実施され、これらの治験のいくつかで腫瘍病変の寛解が報告された（Ａｖｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｈｏｌｔｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｍａｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｗｉｔｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００４７】
小細胞肺がん
ＳＣＬＣの治療および予後は、診断されたがん病期に大きく左右される。臨床結果に基づくＳＣＬＣの進行度診断の方が、病的進行度診断よりも一般的である。臨床進行度診断は、理学的検査、様々な画像検査、および生検の結果を利用する。ＳＣＬＣの標準的化学療法は、エトポシドまたはイリノテカンのどちらかと、シスプラチンまたはカルボプラチンのどちらかとの組み合わせを使用する（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０１５；Ｓ３−Ｌｅｉｔｌｉｎｉｅ  Ｌｕｎｇｅｎｋａｒｚｉｎｏｍ，２０１１）。
【００４８】
免疫療法は、過度に研究されたがん療法の分野に相当する。ＳＣＬＣの治療には、様々なアプローチが点在する。アプローチの１つは、天然ヒト免疫抑制剤であるＣＴＬＡ−４のブロックを標的とする。ＣＴＬＡ−４の阻害は、がんと戦うために免疫系を増強することを意図する。近年、ＳＣＬＣの治療のための有望な免疫チェックポイント阻害剤の開発が始まっている。もう一つのアプローチは抗がんワクチンに基づき、それは現在臨床試験においてＳＣＬＣ治療のために利用できる（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０１５；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２０１５）。
【００４９】
急性骨髄性白血病
ＡＭＬ治療は、導入療法と寛解後／「地固め療法」との２つの段階に分類される。導入療法は寛解を誘導するために投与され、併用化学療法からなる。地固め療法は、追加的な化学療法または造血細胞移植（ＨＣＴ）からなる（Ｓｈｏｗｅｌ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｓ，２０１４）。
【００５０】
臨床試験は、好ましくないおよび中等度２の予後集団に属する患者に推奨される。治療選択肢は、アザシチジンまたはデシタビンとしての低メチル化剤、１：５の「最適」モル比にあるダウノルビシンとシタラビンのリポソーム製剤であるＣＰＸ−３５１、およびポロキナーゼ阻害剤であるボラセルチブを含む。ボラセルチブは、ＬＤＡＣ（低用量シタラビン）との併用で投与される。ＦＬＴ３変異の場合は、いくつかの異なるＦＬＴ３阻害剤が投与され得る。これらとしては、３＋７の組み合わせで投与されるソラフェニブ、ＦＬＴ３  ＩＴＤのより選択的な阻害剤でＣＫＩＴもまた阻害するキザルチニブ、クレノラニブ、および無差別ＦＬＴ３  ＩＴＤ阻害剤であるミドスタウリンが挙げられる。もう一つの治療選択肢は、抗体薬物コンジュゲート（抗ＣＤ３３＋カレキアマイシン、ＳＧＮ−ＣＤ３３ａ、抗ＣＤ３３＋アクチニウム−２２５）、二重特異性抗体（ＣＤ３３＋ＣＤ３（ＡＭＧ３３０）またはＣＤ３３＋ＣＤ１６の認識）、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いて、ＣＤ３３を標的化する（Ｅｓｔｅｙ，２０１４）。
【００５１】
非ホジキンリンパ腫
ＮＨＬは、６０を超えるサブタイプを有する。最も一般的な３つのサブタイプは、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ、最も一般的なサブタイプ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ、２番目に一般的なサブタイプ）、および小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ／ＣＬＬ、３番目に一般的なサブタイプ）である。ＤＬＢＣＬ、ＦＬ、およびＳＬＬ／ＣＬＬは、ＮＨＬの約８５％を占める（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＮＨＬの治療は、組織型および病期に左右される（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２０１５）。
【００５２】
リンパ腫患者では、自然腫瘍退縮が観察され得る。したがって、能動免疫療法が治療選択肢である（Ｐａｌｏｍｂａ，２０１２）。
【００５３】
重要なワクチン接種選択肢としては、Ｉｄワクチンが挙げられる。Ｂリンパ球は、それらの重鎖および軽鎖の可変領域内に、各細胞クローンに特有の（＝イディオタイプ、Ｉｄ）特異的アミノ酸配列がある、表面免疫グロブリンを発現する。イディオタイプは、腫瘍関連抗原として機能する。
【００５４】
活性免疫化としては、免疫アジュバントとしてＧＭ−ＣＳＦと共に投与される、アジュバント（ＫＬＨ）にコンジュゲートされた、組換えタンパク質（Ｉｄ）の注射が挙げられる。腫瘍特異的Ｉｄは、ハイブリドーマ培養によって、または細菌、昆虫または哺乳類細胞培養による組換えＤＮＡ技術（プラスミド）を使用して、製造される。
【００５５】
子宮がん
子宮内膜がんの８０％以上は、類内膜腺がん（Ｉ型）として発生し、これはエストロゲン曝露と関連する高度から中等度に分化した形態である。子宮内膜がんおよび子宮頸がんの治療は、病期依存性である（Ｗｏｒｌｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｐｏｒｔ，２０１４）。
【００５６】
いくつかの免疫療法アプローチもまた、現在試験されている。第Ｉ／ＩＩ相臨床試験では、子宮がんに罹患している患者が、ウィルムス腫瘍遺伝子１（ＷＴ１）ｍＲＮＡによって電気穿孔された自己由来樹状細胞（ＤＣ）で、ワクチン接種された。アジュバントに対する局所アレルギー反応の１症例を除いて有害な副作用は観察されず、６人の患者の内３人が免疫学的応答を示した（Ｃｏｏｓｅｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００５７】
胆嚢腺がんおよび胆管細胞がん
胆管細胞がん（ＣＣＣ）は、治療が困難であり、通常は致死性である。唯一の根治的治療選択肢は、完全切除術（Ｒ０）である。胆管がんにおける生物学的療法の有効性は、相反している。ソラフェニブ、ベバシズマブ、パゾパニブ、およびレゴラフェニブなどの血管増殖を標的とする薬物が、現在ＣＣＣ治療のために試験されている。さらに、セツキシマブおよびパニツマブなどのＥＧＦＲを標的とする薬物が、化学療法と組み合わせて臨床試験で使用される（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０１５）。これまでに試験されたほとんどの薬物では、疾患制御および全生存期間は、有意に改善されなかったが、さらなる臨床試験が進行中である。
【００５８】
胆嚢がん（ＧＢＣ）は、世界的に最も頻度が高く悪性度が高い、胆管の病変である。一般に胆管のがん腫はまれであることから、ＧＢＣまたはＣＣＣに特有の少数の研究のみがある一方で、それらのほとんどは全ての胆管がんを含む。これが、過去数十年にわたり治療法が改善されていない理由であり、Ｒ０切除術が依然として唯一の根治的治療選択肢である。
【００５９】
膀胱がん
膀胱がんの標準的治療法としては、外科手術、放射線療法、化学療法、および免疫療法が挙げられる（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２０１５）。
【００６０】
効果的免疫療法アプローチが、高悪性度の筋層非浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ）の治療において確立されている。その方法によって、弱毒化形態の細菌、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）（カルメット・ゲラン桿菌＝ＢＣＧ）が、膀胱内溶液として適用される。ＢＣＧ処置の主要な効果は、がん再発からの有意な長期（最大１０年間）保護と、進行速度の低下である。原則的に、ＢＣＧによる処置は局所炎症応答を誘導し、それが細胞性免疫応答を刺激する。ＢＣＧの免疫応答は、以下の主要ステップに基づく：ＢＣＧによる尿路上皮および膀胱がん細胞の感染と、それに続く抗原提示分子の発現増大、サイトカイン放出が媒介する免疫応答の誘導、様々な免疫細胞（その下に細胞傷害性Ｔリンパ球、好中球、ナチュラルキラー細胞、およびマクロファージ）の関与を通じた抗腫瘍活性の誘導（Ｆｕｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｇａｎｄｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００６１】
がん治療に関連する重篤な副作用および費用を考慮すると、がん治療全般、特に、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、神経膠芽腫（ＧＢ）、胃がん（ＧＣ）、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん（ＰＣ）、腎細胞がん（ＲＣＣ）、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）、前立腺がん（ＰＣＡ）、卵巣がん（ＯＣ）、メラノーマ、乳がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢がんおよび胆管細胞がん（ＧＢＣ、ＣＣＣ）、膀胱がん（ＵＢＣ）、子宮がん（ＵＥＣ）で使用され得る要素を同定する必要性がある。がんのより良い診断、予後の評価、および治療成功の予測につながる、がん全般、特に上述のがん型のためのバイオマーカーに相当する要素を同定する必要性もまたある。
【００６２】
がんの免疫療法は、がん細胞を特異的に標的化しながら副作用を最小化する、選択肢に相当する。がん免疫療法は、腫瘍関連抗原の存在を利用する。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の現行の分類は、次の主要群を含んでなる：
ａ）がん精巣抗原：Ｔ細胞によって認識され得る、これまでに同定された最初のＴＡＡは、このクラスに属し、元々はがん精巣（ＣＴ）抗原と称されたが、それは、そのメンバーが組織学的に異なるヒト腫瘍で発現し、正常組織では、精巣の精母細胞／精原細胞のみに存在し、時として胎盤に存在するためであった。精巣の細胞は、クラスＩおよびＩＩ  ＨＬＡ分子を発現しないので、これらの抗原は正常組織のＴ細胞によって認識され得ず、したがって免疫学的に腫瘍特異的と見なされる。ＣＴ抗原の周知の例は、ＭＡＧＥファミリーメンバーおよびＮＹ−ＥＳＯ−１である。
ｂ）分化抗原：これらのＴＡＡは、腫瘍と、それから腫瘍が生じる正常組織との間で共有される。既知の分化抗原のほとんどは、メラノーマおよび正常メラノサイトに見られる。これらのメラノサイト系関連タンパク質の多くは、メラニン生合成に関与し、したがって腫瘍特異的でないが、それでもなおがん免疫療法のために広く利用されている。例としては、メラノーマに対するチロシナーゼとＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、または前立腺がんに対するＰＳＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｃ）過剰発現ＴＡＡ：広範に発現されるＴＡＡをエンコードする遺伝子は、組織学的に異なる型の腫瘍で検出され、ならびに多数の正常組織で概してより低い発現レベルで検出されている。正常組織によってプロセスされて潜在的に提示され得るエピトープの多くは、Ｔ細胞認識の閾値レベル未満であり得る一方で、腫瘍細胞内におけるそれらの過剰発現は、先に確立された免疫寛容の破壊による抗がん応答を始動し得る。このクラスのＴＡＡの顕著な例は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、サバイビン、テロメラーゼまたはＷＴ１である。
ｄ）腫瘍特異的抗原：これらのユニークなＴＡＡは、正常な遺伝子（β−カテニン、ＣＤＫ４など）の変異から生じる。これらの分子変化のいくつかは、腫瘍性形質転換および／または進行に関連する。腫瘍特異的抗原は、通常、正常組織に対する自己免疫反応のリスクなしに、強力な免疫応答を誘導できる。他方、これらのＴＡＡは、ほとんどの場合、その上でそれらが同定されたまさにその腫瘍のみと関係があり、通常は、多くの個々の腫瘍間で共有されない。腫瘍特異的（関連）イソ型があるタンパク質では、ペプチドの腫瘍特異性（または関連性）はまた、ペプチドが腫瘍（関連）エクソンに由来する場合に生じてもよい。
ｅ）異常な翻訳後修飾から生じるＴＡＡ：このようなＴＡＡは、特異的でなく腫瘍で過剰発現もされないタンパク質から生じてもよいが、それでもなお、腫瘍で主に活性である翻訳後プロセスによって、腫瘍関連になる。このクラスの例は、腫瘍でＭＵＣ１のような新規エピトープをもたらす改変グリコシル化パターンから、または腫瘍特異的であってもなくてもよい分解中のタンパク質スプライシング事象から生じる。
ｆ）オンコウイルスタンパク質：これらのＴＡＡはウイルスタンパク質であり、それらは発がん過程で重要な役割を果たしてもよく、外来性である（ヒト由来でない）ため、それらはＴ細胞応答を誘起し得る。このようなタンパク質の例は、ヒト乳頭腫１６型ウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７であり、これらは子宮頸がんで発現される。
【００６３】
Ｔ細胞ベースの免疫療法は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子によって提示される、腫瘍関連または腫瘍特異的タンパク質由来ペプチドエピトープを標的とする。腫瘍特異的Ｔリンパ球によって認識される抗原、すなわちそれらのエピトープは、酵素、受容体、転写因子などの全てのタンパク質クラスに由来する分子であり得て、それはそれぞれの腫瘍細胞で発現されて、同一起源の非改変細胞と比較して、通常、上方制御される。
【００６４】
ＭＨＣ分子には、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの２つのクラスがある。ＭＨＣクラスＩ分子はα重鎖およびβ２ミクログロブリンから構成され、ＭＨＣクラスＩＩ分子はαおよびβ鎖から構成される。それらの三次元立体構造は結合溝をもたらし、それはペプチドとの非共有結合相互作用のために使用される。
【００６５】
ＭＨＣクラスＩ分子は、ほとんどの有核細胞上に見られる。それらは、主に内在性タンパク質、欠陥リボソーム産物（ＤＲＩＰ）、およびより大型のペプチドのタンパク質切断から得られる、ペプチドを提示する。しかし、エンドソームコンパートメントまたは外来性起源に由来するペプチドもまた、ＭＨＣクラスＩ分子上に頻繁に見られる。この非古典的様式のクラスＩ提示は、文献中で交差提示と称される（Ｂｒｏｓｓａｒｔ  ａｎｄ  Ｂｅｖａｎ，１９９７；Ｒｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、主にプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に見られ、例えば、エンドサイトーシス中にＡＰＣに取り込まれて引き続きプロセシングされる、外来性または膜貫通タンパク質のペプチドを主に提示する。
【００６６】
ペプチドとＭＨＣクラスＩの複合体が、適切なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される一方で、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲを有するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞によって認識される。その結果、ＴＣＲ、ペプチド、およびＭＨＣは、化学量論的に１：１：１の量で存在することが良く知られている。
【００６７】
ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞は、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞による、効果的な応答の誘導と維持に重要な役割を果たす。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープの同定は、抗腫瘍免疫応答を始動させる医薬品の開発に非常に重要である（Ｇｎｊａｔｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。腫瘍部位では、Ｔヘルパー細胞が、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）親和的サイトカイン環境を維持して（Ｍｏｒｔａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、例えば、ＣＴＬ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、および顆粒球などのエフェクター細胞を引きつける（Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００６８】
炎症不在下では、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、免疫系細胞、特に、例えば、単球、単球由来細胞、マクロファージ、樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に主に限定される。がん患者では、腫瘍細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現することが発見されている（Ｄｅｎｇｊｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【００６９】
伸長された本発明のペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ活性エピトープとして作用し得る。
【００７０】
ＭＨＣクラスＩＩエピトープによって活性化されたＴヘルパー細胞は、抗腫瘍免疫におけるＣＴＬのエフェクター機能を統合する上で、重要な役割を果たす。ＴＨ１型のＴヘルパー細胞応答を始動するＴヘルパー細胞エピトープは、し、それらの細胞表面に腫瘍関連ペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する腫瘍細胞に向けられた、細胞傷害機能をはじめとする、ＣＤ８陽性キラーＴ細胞のエフェクター機能を支持する。このようにして腫瘍関連Ｔヘルパー細胞ペプチドエピトープは、単独で、またはその他の腫瘍関連ペプチドとの組み合わせで、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。
【００７１】
例えば、マウスなどの哺乳類動物モデルにおいて、ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の不在下であっても、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）の分泌による血管新生阻害を通じて腫瘍発現を阻害するには、ＣＤ４陽性Ｔ細胞で十分であることが示された（Ｂｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，２００１；Ｍｕｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＣＤ４  Ｔ細胞が、直接抗腫瘍エフェクターであるという証拠がある（Ｂｒａｕｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【００７２】
ＨＬＡクラスＩＩ分子の構成的発現は、通常、免疫細胞に限定されるので、原発性腫瘍からクラスＩＩペプチドを直接単離する可能性があり得るとは、これまで考えられなかった。しかしＤｅｎｇｊｅｌ  ｅｔ  ａｌ．は、いくつかのＭＨＣクラスＩＩエピトープを腫瘍から、直接同定することに成功した（国際公開第２００７／０２８５７４号パンフレット、欧州特許第１７６００８８Ｂ１号明細書）。
【００７３】
ＣＤ８およびＣＤ４依存性の双方のタイプの応答は、抗腫瘍効果に共同して相乗的に寄与するので、ＣＤ８＋Ｔ細胞（リガンド：ＭＨＣクラスＩ分子＋ペプチドエピトープ）、またはＣＤ４陽性Ｔヘルパー細胞（リガンド：ＭＨＣクラスＩＩ分子＋ペプチドエピトープ）のどちらかによって認識される、腫瘍関連抗原の同定および特性解析は、腫瘍ワクチンの開発にとって重要である。
【００７４】
ＭＨＣクラスＩペプチドが、細胞性免疫応答を始動（惹起）するためには、それはまた、ＭＨＣ分子に結合しなくてはならない。この過程は、ＭＨＣ分子の対立遺伝子と、ペプチドのアミノ酸配列の特定の多形性とに依存する。ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドは、通常は８〜１２アミノ酸残基長であり、通常は、ＭＨＣ分子の対応する結合溝と相互作用するそれらの配列中に、２つの保存残基（「アンカー」）を含有する。このようにして、各ＭＨＣ対立遺伝子は、どのペプチドが結合溝と特異的に結合し得るかを決定する、「結合モチーフ」を有する。
【００７５】
ＭＨＣクラスＩ依存免疫反応では、ペプチドは腫瘍細胞によって発現される特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合できるだけでなく、それらはまた、引き続いて特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞によって認識されなくてはならない。
【００７６】
タンパク質が、Ｔリンパ球によって腫瘍特異的または腫瘍関連抗原として認識され、治療で利用されるためには、特定の必要条件が満たされなくてはならない。抗原は、主に腫瘍細胞によって発現され、健常組織によって発現されず、または比較的少量発現されるべきである。好ましい実施形態では、ペプチドは、腫瘍細胞によって、健常組織と比較して過剰提示されるべきである。それぞれの抗原は、ある種の腫瘍内に存在するだけでなく、高い濃度（すなわち、それぞれのペプチド細胞あたりのコピー数）で存在することもさらに望ましい。腫瘍特異的および腫瘍関連抗原は、例えば、細胞周期制御またはアポトーシス抑制における機能のために、正常細胞から腫瘍細胞への形質転換に直接関与するタンパク質に、由来することが多い。さらに、形質転換の直接原因となるタンパク質の下流標的が、上方制御されてもよく、（ｕｎｄ）したがって間接的に腫瘍関連であってもよい。このような間接的腫瘍関連抗原もまた、ワクチン接種アプローチの標的であってもよい。（Ｓｉｎｇｈ−Ｊａｓｕｊａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。このようなペプチド（「免疫原性ペプチド」）が、腫瘍関連抗原に由来して、生体外または生体内Ｔ細胞応答をもたらすことを確実にするためには、抗原のアミノ酸配列内にエピトープが存在することが必須である。
【００７７】
基本的に、ＭＨＣ分子に結合できるあらゆるペプチドが、Ｔ細胞エピトープとして機能してもよい。生体外または生体内Ｔ細胞応答誘導のための必要条件は、対応するＴＣＲがあるＴ細胞の存在、およびこの特定のエピトープに対する免疫寛容の不在である。
【００７８】
したがって、ＴＡＡは、腫瘍ワクチンをはじめとするが、これに限定されるものではない、Ｔ細胞ベースの治療法開発の出発点である。ＴＡＡを同定し特性決定する方法は、通常は、患者または健常者から単離され得るＴ細胞の使用に基づき、またはそれらは、腫瘍および正常組織間の差次的転写プロファイル、または差次的ペプチド発現パターンの生成に基づく。しかし、腫瘍組織またはヒト腫瘍細胞系で過剰発現され、またはこのような組織または細胞系で選択的に発現される遺伝子の同定は、免疫療法においてこれらの遺伝子から転写される抗原の使用に関する、正確な情報を提供しない。これは、これらの抗原のエピトープの個々の亜集団のみが、このような用途に適するためであり、その理由は、対応するＴＣＲがあるＴ細胞が存在しなくてはならず、この特定のエピトープに対する免疫寛容が不在または最小でなくてはならないからである。したがって本発明の非常に好ましい実施形態では、それに対する機能性および／または増殖性Ｔ細胞がある、過剰にまたは選択的に提示されるペプチドのみを選択することが、重要である。このような機能性Ｔ細胞は、Ｔ細胞と定義され、それは特異的抗原による刺激時にクローン増殖され得て、エフェクター機能を果たすことができる（「エフェクターＴ細胞」）。
【００７９】
本発明による、特異的ＴＣＲ（例えば、可溶性ＴＣＲ）および抗体またはその他の結合分子（スキャフォールド）によるペプチドＭＨＣの標的化の場合、基礎となるペプチドの免疫原性は二次的である。これらの場合には、提示が決定要因である。
【課題を解決するための手段】
【００８０】
本発明の第１の態様では、本発明は、配列番号１〜配列番号２８８、または配列番号１〜配列番号２８８と少なくとも７７％、好ましくは少なくとも８８％相同的な（好ましくは少なくとも７７％または少なくとも８８％同一の）その変異配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関し、前記変異体は、ＭＨＣと結合し、および／またはＴ細胞を前記ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩と交差反応させ、前記ペプチドは、基礎となる完全長ポリペプチドでない。
【００８１】
ペプチドが、がん療法標的として機能するための最重要基準は、正常組織と比較した原発性腫瘍組織上のその過剰提示である一方で、対応遺伝子のＲＮＡ発現プロファイルもまた、適切なペプチドを選択するのを助け得る。特に、いくつかのペプチドは、それらの化学的特性または細胞上のそれらの低コピー数のどちらかのために、質量分析によって検出するのが困難であり、ペプチド提示の検出に重点を置くスクリーニングアプローチは、これらの標的を同定できないこともある。しかし、これらの標的は、正常組織中の遺伝子発現の解析から開始して、腫瘍におけるペプチド提示および遺伝子発現を二次的に評価する、代案のアプローチによって検出されてもよい。このアプローチは、公的に利用可能なデータベース（Ｌｏｎｓｄａｌｅ，２０１３）からのｍＲＮＡデータを使用して、さらなる遺伝子発現データ（腫瘍サンプルを含む）、ならびにペプチド提示データと組み合わせて、本発明で実現化された。遺伝子のｍＲＮＡが、正常組織、特に生命臓器系にほとんど存在しなければ、非常に強力なストラテジー（二重特異性親和性最適化抗体またはＴ細胞受容体など）によって、対応するペプチドを標的化することでさえ、安全である可能性が高い。このようなペプチドは、たとえ腫瘍組織の小さな割合でしか同定されないとしても、興味深い標的に相当する。通例の質量分析法は、標的カバー度をペプチドレベルで評価するには、感度が十分でない。むしろ、腫瘍ｍＲＮＡ発現が、カバー度を評価するために使用され得る。ペプチドそれ自体の検出のためには、通例のスクリーニングよりも、感度の高い標的化質量分析アプローチが必要であってもよく、ペプチド提示レベルでカバー度のより良い推定がもたらされてもよい。
【００８２】
本発明は、配列番号１〜配列番号２８８、または配列番号１〜配列番号２８８と少なくとも７７％、好ましくは少なくとも８８％相同的な（好ましくは少なくとも７７％または少なくとも８８％同一の）その変異体からなる群から選択される配列を含んでなる、本発明のペプチドにさらに関し、前記ペプチドまたはその変異型は、８〜１００、好ましくは８〜３０、最も好ましくは８〜１４アミノ酸の全長を有する。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
続く表は、本発明によるペプチド、それらの各配列番号、およびそれらのペプチドの予期される起源（基礎）遺伝子を示す。表１および表２の全てのペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２に結合する。表２のペプチドは、高い誤り率があるまたはアルゴリズムを使用して計算された、ハイスループットスクリーニングの結果としての大きなリストで以前開示されているが、これまでがんとは全く関連付けられていなかった。
【００８４】
表1:本発明によるペプチド
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【００８５】
表2:本発明による追加的ペプチド
【表２−１】
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【表２−２】
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【００８６】
特に好ましいのは、配列番号１〜配列番号２８８からなる群から選択される、本発明による単独のまたは組み合わせのペプチドである。より好ましいのは、配列番号１〜配列番号１２６（表１を参照されたい）からなる群から選択される単独のまたは組み合わせのペプチド、および肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、神経膠芽腫（ＧＢ）、胃がん（ＧＣ）、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん（ＰＣ）、腎細胞がん（ＲＣＣ）、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）、前立腺がん（ＰＣＡ）、卵巣がん（ＯＣ）、メラノーマ、乳がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢がんおよび胆管細胞がん（ＧＢＣ、ＣＣＣ）、膀胱がん（ＵＢＣ）、子宮がん（ＵＥＣ）の免疫療法における、それらの使用である。
【００８７】
最も好ましいのは、配列番号２７４、１４、２１、２３、２５、１５７、１６８、１１、２５３、８５、８９、４０、２６４、１５５、２３３、および２４５（表１、２、および１０を参照されたい）からなる群から選択される単独のまたは組み合わせのペプチド、およびＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、およびＣＬＬの免疫療法における、それらの使用である。
【００８８】
本発明は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子に結合する能力、または長さ変異体などの伸長形態ではＭＨＣクラスＩＩに結合する能力を有する、本発明によるペプチドにさらに関する。
【００８９】
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは（それぞれ）配列番号１〜配列番号２８８に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる。
【００９０】
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、修飾され、および／または非ペプチド結合を含む。
【００９１】
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、特にＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸に融合した、または例えば樹状細胞に対して特異的な抗体などの抗体（またはその配列中）に融合した、融合タンパク質の一部である。
【００９２】
本発明は、本発明によるペプチドをエンコードする核酸にさらに関する。本発明は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである、本発明による核酸にさらに関する。
【００９３】
本発明は、本発明による核酸を発現でき、および／または発現する、発現ベクターにさらに関する。
【００９４】
本発明は、疾患の治療で、および医療で、特にがんの治療で使用される、本発明によるペプチド、本発明による核酸または本発明による発現ベクターにさらに関する。
【００９５】
本発明は、本発明によるペプチドに特異的に対抗する抗体、または前記本発明によるペプチドとＭＨＣの複合体、およびこれらを製造する方法にさらに関する。
【００９６】
本発明は、自己由来または同種異系Ｔ細胞に組み込まれた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、特に可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）、およびクローン化ＴＣＲ、そしてこれらを製造する方法、ならびに前記ＴＣＲを有するまたは前記ＴＣＲと交差反応する、ＮＫ細胞またはその他の細胞を製造する方法にさらに関する。
【００９７】
抗体およびＴＣＲは、本発明によるペプチドの免疫療法用途の追加的な実施形態である。
【００９８】
本発明は、前述のような本発明による核酸または発現ベクターを含んでなる、宿主細胞にさらに関する。本発明は、抗原提示細胞であり、好ましくは樹状細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。
【００９９】
本発明は、本発明による宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、本発明によるペプチドを製造する方法にさらに関する。
【０１００】
本発明は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞または人工抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩ  ＭＨＣ分子上に、抗原が負荷される、本発明による方法にさらに関する。
【０１０１】
本発明は、抗原提示細胞が、配列番号１〜配列番号２８８を含有し、好ましくは配列番号１〜配列番号１２６、または変異アミノ酸配列を含有する、前記ペプチドを発現できまたは発現する、発現ベクターを含んでなる、本発明による方法にさらに関する。
【０１０２】
本発明は、本発明による方法によって製造される活性化Ｔ細胞にさらに関し、前記Ｔ細胞は、本発明によるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを発現する細胞を選択的に認識する。
【０１０３】
本発明は、本発明によって製造されるＴ細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる、患者において、本発明による任意のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する標的細胞を死滅させる方法にさらに関する。
【０１０４】
本発明は、薬剤としてのまたは薬剤の製造における、記載される任意のペプチド、本発明による核酸、本発明による発現ベクター、本発明による細胞、本発明による活性化Ｔリンパ球、Ｔ細胞受容体または抗体またはその他のペプチド−および／またはペプチド−ＭＨＣ−結合分子の使用にさらに関する。好ましくは、前記薬剤は、がんに対して有効である。
【０１０５】
好ましくは、前記薬剤は、細胞療法、ワクチン、または可溶性ＴＣＲまたは抗体ベースのタンパク質に適しており、使用される。
【０１０６】
本発明は、本発明による使用にさらに関し、前記がん細胞は、ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、またはＣＬＬ細胞である。
【０１０７】
本発明は、がん、好ましくはＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、およびＣＬＬの診断で使用され得る、本明細書で「標的」と称される、本発明によるペプチドベースのバイオマーカーにさらに関する。マーカーは、ペプチドそれ自体の過剰提示、または対応遺伝子の過剰発現のどちらかであり得る。マーカーはまた、好ましくは免疫療法、最も好ましくはバイオマーカーによって同定されるのと同じ標的を標的とする免疫療法である、治療の成功確率を予測するのに、使用されてもよい。例えば、抗体または可溶性ＴＣＲを使用して腫瘍切片が染色され、ＭＨＣと複合体形成する目的ペプチドの存在が検出され得る。
【０１０８】
任意選択的に、抗体は、免疫刺激ドメインまたは毒素などのさらなるエフェクター機能を保有する。
【０１０９】
本発明はまた、がん治療の文脈におけるこれらの新規標的の使用に関する。
【０１１０】
ＣＡＢＹＲは、線維鞘に結合する精子鞭毛の主部に局在して、受精能獲得過程におけるリン酸化に際してカルシウム結合を示す、タンパク質をコードする（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。非小細胞肺がん細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０およびＡ５４９における、ＣＡＢＹＲイソ型ＣＡＢＹＲ−ａおよびＣＡＢＹＲ−ｂのノックダウンは、増殖の阻害および構成的活性型Ａｋｔリン酸化の減衰をもたらすことが示された（Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＣＡＢＹＲ発現のサイレンシングは、ホスホ−ＧＳＫ−３βおよびｐ５３およびｐ２７タンパク質などのＡｋｔ経路の下流構成要素に影響を及ぼすことが示された（Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。さらに、ＣＡＢＹＲノックダウンは、生体外および生体内の双方で、化学療法剤および薬物誘導性アポトーシスに応答した化学的感受性を有意に増大させることが示され、したがって肺がんにおけるアポトーシス応答および化学的感受性を改善する新規方法であってもよい（Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＣＡＢＹＲは、最初に精巣特異的タンパク質として記載されており、引き続いて脳腫瘍、膵臓がん、および肺がんにも存在することが示された（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＣＡＢＹＲは、肝細胞がんで上方制御されることが示されており、肝がん発症ならびにその進行において、発がん性の役割を果たしてもよい（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１１１】
ＣＯＬ６Ａ３は、コラーゲンＶＩ型α３をコードするが、これはほとんどの結合組織に見られてマトリックス成分の組織化に重要な、数珠状フィラメントコラーゲンであるＶＩ型コラーゲンの３つのα鎖の１つである（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＣＯＬ６Ａ３は、ほとんどの結合組織に見られてマトリックス要素の組織化に重要な役割を果たす、数珠状フィラメントコラーゲンである、ＶＩ型コラーゲンのα３鎖をコードする（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＣＯＬ６Ａ３は、結腸、膀胱、および前立腺がんにおいて、選択的にスプライスされる。ＣＯＬ６Ａ３の長いイソ型は、がんサンプル中でほぼ排他的に発現され、新しいがんマーカーの役割を果たす可能性がある（Ｔｈｏｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＣＯＬ６Ａ３は、膵臓導管腺がん組織で高度に発現されて、腫瘍特異的選択的スプライシングを受ける（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＣＯＬ６Ａ３は、高悪性度卵巣がんと相関し、シスプラチン耐性に寄与することが実証されている。ＣＯＬ６Ａ３は、胃がん組織で頻繁に過剰発現されることが観察された（Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＣＯＬ６Ａ３変異は、腫瘍分化およびＴＮＭ進行度診断とは無関係に、結腸直腸がんのある患者のより良好な全生存期間を有意に予測した（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＣＯＬ６Ａ３発現は、膵臓がん、結腸がん、胃がん、粘液性類表皮腫、および卵巣がんで増大することが報告された。エクソン３、４、および６をはじめとするがん関連転写変異体が、結腸がん、膀胱がん、前立腺がん、および膵臓がんで検出された（Ａｒａｆａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｌｅｉｖｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｓｈｅｒｍａｎ−Ｂａｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｇａｒｄｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｔｈｏｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。卵巣がんでは、ＣＯＬ６Ａ３レベルは、より高い腫瘍悪性度と相関し、膵臓がんでは、ＣＯＬ６Ａ３は、適切な診断血清バイオマーカーに相当することが示された（Ｓｈｅｒｍａｎ−Ｂａｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０１１２】
ＣＴ８３としてもまた知られているＣＸｏｒｆ６１は、がん／精巣抗原８３をコードして、染色体Ｘｑ２３に位置する（ＲｅｆＳｅｑ、２００２）。ＣＸｏｒｆ６１の発現は、乳がんおよび肺がんをはじめとする種々のがん型にで記載されている（Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｈａｎａｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＣＸｏｒｆ６１は、肺がんにおいて免疫原性がん精巣抗原であることが示された。したがって、それは、抗がん免疫療法のための有望な候補に相当するかもしれない（Ｆｕｋｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０１１３】
ＣＹＰ４Ｚ１は、酵素のチトクロームＰ４５０スーパーファミリーメンバーをコードする。チトクロームＰ４５０タンパク質は、薬物代謝、そしてコレステロール、ステロイドおよびその他の脂質の合成に関与する、多数の反応を触媒するモノオキシゲナーゼである（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。乳がんにおけるＣＹＰ４Ｚ１過剰発現は、高い腫瘍悪性度および予後不良と関連している。機能的に、ＣＹＰ４Ｚ１は、ある程度ＰＩ３／ＡｋｔおよびＥＲＫ１／２シグナル伝達を通じて、乳がんにおける腫瘍の血管新生と増殖を促進する（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。さらに、ＣＹＰ４Ｚ１は、非小細胞肺がん進行において、役割を果たすと記載されている（Ｂａｎｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。前立腺がんおよび卵巣がんでは、ＣＹＰ４Ｚ１は、独立した予測マーカーとして同定されている（Ｔｒａｄｏｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｄｏｗｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＣＹＰ４Ｚ２Ｐは、染色体１ｐ３３に位置する偽遺伝子である（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。
【０１１４】
ＤＣＡＦ４Ｌ２は、ＤＤＢ１およびＣＵＬ４関連因子４様２をコードする。このタンパク質の特異的機能は未だに解明されていないが；それでもなおＤＣＡＦ４Ｌ２遺伝子は、視神経乳頭形態および裂溝口唇発生と関連することが示された（Ｓｐｒｉｎｇｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｂｅａｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０１１５】
ＥＳＲ１は、性的発達および生殖機能に必須である、ホルモン結合、ＤＮＡ結合、および転写活性化に重要なリガンド活性化転写因子であるエストロゲン受容体をコードする（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＥＳＲ１の変異体および一塩基多型は、肝臓、前立腺、胆嚢、および乳がんをはじめとする、種々のがん型リスクと関連している。ＥＳＲ１発現の上方制御は、細胞増殖および腫瘍増殖と結びついているが、ＥＳＲ１陽性腫瘍がある患者の全生存期間は、選択的エストロゲン受容体修飾因子を用いた成功裏の治療のために（ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ  ｔｈｅｒａｐｙ）、より良好である（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｈａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂｏｇｕｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｙａｋｉｍｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｆｕｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＥＳＲ１シグナル伝達は、ＥＧＦＲ／ＩＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ、ｐ５３、ＨＥＲ２、ＮＦκＢ、およびＴＧＦ−β経路のような、細胞変換、増殖、および生存に関与する種々の経路を妨害する（Ｆｒａｓｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｂａｎｄ  ａｎｄ  Ｌａｉｈｏ，２０１１；Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｓｋａｎｄａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｍｅｈｔａ  ａｎｄ  Ｔｒｉｐａｔｈｙ，２０１４；Ｃｉｒｕｅｌｏｓ  Ｇｉｌ，２０１４）。
【０１１６】
ＦＭＮ１は、直鎖アクチンケーブルの付着接合部形成と重合における役割を有するタンパク質である、ｆｏｒｍｉｎ１をコードする（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＦＭＮ１における一塩基多型は、前立腺がんのリスク増大と関連している（Ｌｉｓｉｔｓｋａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０１１７】
Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１またはＫＩＭ−１としてもまた知られているＨＡＶＣＲ１は、ヒトＡ型肝炎ウイルスおよびＴＩＭＤ４の双方のメンブレン受容体タンパク質をコードして、喘息およびアレルギー性疾患緩和に関与してもよい（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＨＡＶＣＲ１は、卵巣明細胞がんおよび腎細胞がんに関連する、新規バイオマーカー候補と記載されている（Ｂｏｎｖｅｎｔｒｅ，２０１４；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＨＡＶＣＲ１は、腎明細胞がん由来細胞株において、ＩＬ−６／ＳＴＡＴ−３／ＨＩＦ−１Ａ軸を活性化することが示されて、腫瘍進行および患者転帰を決定する（Ｃｕａｄｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。腎臓におけるＨＡＶＣＲ１の構成的発現は、腎明細胞がん発症の可能な易罹患性形質と記載されている（Ｃｕａｄｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。さらに、ＨＡＶＣＲ１エクトドメイン脱落の増大は、生体外では浸潤性表現型、生体内ではより高悪性度の腫瘍を促進することが示された（Ｃｕａｄｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＨＡＶＣＲ１は、腎細胞および卵巣明細胞がん、および結腸直腸がんにおいて、上方制御されると記載されている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３ｂ）。ＨＡＶＣＲ１上方制御は、結腸直腸がんの可能な診断バイオマーカー、そして手術後のより長い無病期間の予後マーカーと記載され、それはまた、結腸直腸がんにおける転移カスケードに関与してもよい（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３ｂ）。ＨＡＶＣＲ１は、Ｔ細胞大顆粒リンパ球白血病と関連していることが示された（Ｗｌｏｄａｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０１１８】
ＨＯＲＭＡＤ１（ＣＴ４６とも称される）は、減数分裂において役割を有してもよい、ＨＯＲＭＡドメイン含有するタンパク質をコードする。ＨＯＲＭＡドメインは、クロマチン結合および細胞周期調節に関与する（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＨＯＲＭＡＤ１は、乳房、胃および卵巣がんをはじめとする種々のがん型において過剰発現されるがん／精巣抗原であり、したがって可能なバイオマーカーおよび免疫療法標的である（Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｓｈａｈｚａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ａｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ａｄｅｌａｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＨＯＲＭＡＤ１下方制御は、浸潤、遊走、および腫瘍重量の低下、およびＶＥＧＦタンパク質レベルの低下をもたらす（Ｓｈａｈｚａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０１１９】
ＨＳＦ２ＢＰは、ＨＳＦ２と結合するＨＳＦ２結合タンパク質をコードし、ＨＳＦ２活性の化調節に関与してもよい（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。
【０１２０】
ＨＳＦ４は、加熱またはその他のストレス条件下で熱ショック応答遺伝子を活性化する、熱ショック転写因子４をコードする（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＨＳＦ４は、神経膠芽腫において下方制御されることが示された（Ｍｕｓｔａｆａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０１２１】
ＨＴＲ３Ａは、リガンド開口型のイオンチャネル受容体スーパーファミリー受容体に属する、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）をコードして、それは活性化後にニューロン内で迅速な脱分極応答を引き起こす（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＨＴＲ３Ａ（５−ＨＴ３とも称される）は、いくつかのがん型で脱調節され、例えば、マントル細胞リンパ腫で下方制御され、多様なＢ細胞腫瘍で差次的発現され、乳がん細胞株で発現低下される（Ｐａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｒｉｎａｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０１２２】
ＣＲＤ−ＢＰとしてもまた知られているＩＧＦ２ＢＰ１は、インスリン様成長因子２ｍＲＮＡ結合タンパク質ファミリーメンバーをコードし、それは特定遺伝子のｍＲＮＡに結合することで機能して、それらの翻訳を制御する（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＩＧＦ２ＢＰ１をはじめとするＩＧＦ２ｍＲＮＡ結合タンパク質ファミリーの２つの構成員は、真正のがん胎児性タンパク質と記載され、それは、様々なヒトがんで新規に合成され、腫瘍増殖、薬物耐性、および転移を促進する、強力な転写後発がん遺伝子であってもよい（Ｌｅｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＩＧＦ２ＢＰ１の発現は、様々なヒトがんにおいて、全体的予後不良および転移と相関すると報告された（Ｌｅｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。したがって、ＩＧＦ２ＢＰ１は、強力なバイオマーカーおよびがん療法標的候補であることが示唆された（Ｌｅｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＩＧＦ２ＢＰファミリーメンバーは、がん転移、およびＫＲＡＳ、ＭＹＣ、およびＭＤＲ１などの発がん因子発現と、高度に関連すると記載されている（Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＩＧＦ２ＢＰ１は、Ｃ−ＭＹＣと相互作用することが示され、結腸および乳房腫瘍および肉腫、ならびに乳腺線維腺腫および髄膜腫などの良性腫瘍の大部分で発現されることが分かった（Ｉｏａｎｎｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＩＧＦ２ＢＰ１は、肝細胞がんおよび基底細胞がんで、上方制御されることが示された（Ｎｏｕｂｉｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５ａ）。ＩＧＦ２ＢＰ１およびその他の遺伝子の上方制御は、肝細胞がんにおける芳しくない術後予後と有意に関連することが示された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５ａ）。ＩＧＦ２ＢＰ１は、それぞれ、肝細胞がんおよび腎細胞がんにおける、腫瘍抑制因子ｍｉＲ−９およびｍｉＲ−３７２の標的であることが示された。（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５ａ）。間質ＩＧＦ２ＢＰ１の損失は、結腸内で腫瘍形成性微小環境を促進することが示され、ＩＧＦ２ＢＰ１が、結腸間質細胞内で腫瘍抑制的役割を果たすことが示唆された（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＩＧＦ２ＢＰ１は、第４期腫瘍と関連し、神経芽細胞腫において、患者生存率およびＭＹＣＮ遺伝子増幅を低下させることが示され、したがって神経芽細胞腫における可能な発がん遺伝子および独立した負の予後因子であってもよい（Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＩＧＦ２ＢＰ１は、基底細胞がんの発生において、ＧＬＩ１発現および機能を制御する、ＷＮＴ／ｓ−カテニンシグナル伝達の直接標的と記載されている（Ｎｏｕｂｉｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０１２３】
ＩＧＦ２ＢＰ３は、インスリン様成長因子ＩＩの翻訳を抑制するがん胎児性タンパク質である、インスリン様成長因子ＩＩ  ｍＲＮＡ結合タンパク質３をコードする（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。いくつかの研究は、ＩＧＦ２ＢＰ３が、細胞極性化、遊走、形態、代謝、増殖、および分化などの細胞機能の様々な重要な側面で、機能することを示した。生体外実験は、ＩＧＦ２ＢＰ３が、腫瘍細胞増殖、付着、および浸潤を促進することを示した。さらに、ＩＧＦ２ＢＰ３は、高悪性度の進行したがんに関連することが示されている（Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＩＧＦ２ＢＰ３過剰発現は、多数の腫瘍型で記載され、例えば、神経芽細胞腫、結腸直腸がん、肝臓内胆管細胞がん、肝細胞がん、前立腺がん、および腎細胞がんなどにおいて、予後不良、進行した腫瘍病期および転移と相関する（Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｆｉｎｄｅｉｓ−Ｈｏｓｅｙ  ａｎｄ  Ｘｕ，２０１２；Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｓｚａｒｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｊｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０１２４】
ＭＡＧＥＡ３は、メラノーマ関連抗原ファミリーメンバーＡ３をコードする。ＭＡＧＥＡ３は、がん精巣抗原として広く知られている（ＲｅｆＳｅｑ，２００２；Ｐｉｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。ＭＡＧＥＡ３は、転移性メラノーマがんの治療的ワクチン接種治験で使用されることが、長年知られている。現在実施されている、進行した悪性メラノーマがある患者のＭＡＧＥＡ３および４およびその他の抗原を用いた経皮的ペプチド免疫化は、不完全応答者と比較して完全応答者で、より長い全生存期間に有意に寄与することが示された（Ｃｏｕｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｆｕｊｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＮＳＣＬＣでは、ＭＡＧＥＡ３が頻繁に発現されることが示された。ＭＡＧＥＡ３の発現は、ＮＳＣＬＣ組織サンプル中のより高い腫瘍壊死数と相関し、増殖および浸潤を阻害して、肺がん細胞株におけるアポトーシスを促進することが示された。腺がんがある患者では、ＭＡＧＥＡ３の発現は、より良好な生存期間と関連した。全細胞抗ＭＡＧＥＡ３ワクチンは、ＮＳＣＬＣの治療のための有望な第ＩＩＩ相臨床試験において、現在調査中である（Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｒｅｃｋ，２０１２；Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｇｒａｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＭＡＧＥＡ３は、その他の４つの遺伝子と共に、ＨＣＣで頻繁に発現されることが示された。これらの遺伝子の発現は、ＨＣＣ患者における、循環腫瘍細胞数、高い腫瘍悪性度、および進行した段階と相関した。肝転移の頻度は、ＭＡＧＥ３を発現しないものよりも、この遺伝子を発現する腫瘍サンプルの場合に、有意に高いことが示された（Ｂａｈｎａｓｓｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｈａｓｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。膀胱がん細胞株から、ならびに肺、結腸、または乳がん細胞株から単離された、がん幹細胞様サイドポピュレーションは、いくつかのがん精巣抗原中でも、特にＭＡＧＥＡ３の発現を示した。一般に、がん幹細胞は、現行のがん療法に耐性であり、治療後がん再発および進行を引き起こすことが知られている。したがって、ＭＡＧＥＡ３は、特に膀胱がんの免疫療法のための新規標的の役割を果たしてもよい（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。頭頸部扁上皮がんでは、ＭＡＧＥＡ３の発現は、より良好な無病生存と関連していることが示された（Ｚａｍｕｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。さらに、ＭＡＧＥＡ３は、卵巣がんのための予後マーカーとして使用され得る（Ｓｚａｊｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０１２５】
ＭＡＧＥ４としてもまた知られているＭＡＧＥＡ４は、ＭＡＧＥＡ遺伝子ファミリーメンバーをコードして、染色体Ｘｑ２８に位置する（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＭＡＧＥＡ４は、精巣抗原として記載され、それは古典的セミノーマがんのわずかな一部で発現されるが、非セミノーム性の精巣の胚細胞腫瘍、乳がん、ホジキンリンパ腫のエプスタイン・バーウイルス陰性症例、食道がん、肺がん、膀胱がん、頭頸部がん、および結腸直腸がん、口腔扁平上皮がん、および肝細胞がんでは、発現されないことが分かった（Ｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｂｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｏｔｔａｖｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｈｅｎｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＭＡＧＥＡ４は、頻繁に頭頸部の原発性粘膜メラノーマで発現されることが示され、したがってがん精巣抗原ベースの免疫療法の可能な標的であってもよい（Ｐｒａｓａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＭＡＧＥＡ４は、ＬＨＫ２肺腺がん細胞、ＳＷ４８０結腸腺がん細胞、およびＭＣＦ７乳腺がん細胞に由来するがん幹様細胞で、優先的に発現されることが示された（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。自然発生的に形質転換された正常な経口ケラチノサイトにおけるＭＡＧＥＡ４の過剰発現は、細胞周期停止を妨げることで、そしてｐ５３転写標的ＢＡＸおよびＣＤＫＮ１Ａによって媒介されるアポトーシスを阻害することで、増殖を促進することが示された（Ｂｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＭＡＧＥＡ４は、初期肝細胞がんがある患者と比較して、硬変および後期肝細胞がんがあるＣ型肝炎ウイルス感染患者でより頻繁に発現されることが示され、したがってＭＡＧＥＡ４転写物の検出は、予後を予測するのに潜在的に役立つ（Ｈｕｓｓｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＭＡＧＥＡ４は、肺がん患者における多価免疫療法の可能な候補として機能してもよい、肺がんで発現されるいくつかのがん／精巣抗原の１つであることが示された（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＭＡＧＥＡ４は、食道がんおよび肝細胞がんで上方制御されると記載されている（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ｐ２８６−１Ｙ２Ｌ９Ｌと称されるＭＡＧＥＡ４由来天然ペプチド類似体は、食道がんに対するペプチドワクチンを開発するのに適した新規候補エピトープとして記載されている（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＭＡＧＥＡ４をはじめとするいくつかのＭＡＧＥ遺伝子ファミリーメンバーは、メラノーマにおいて頻繁に変異することが示された（Ｃａｂａｌｌｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０１２６】
ＭＡＧＥＡ６は、メラノーマ関連抗原ファミリーメンバーＡ６をコードする。ＭＡＧＥＡ３は、がん精巣抗原として広く知られている（ＲｅｆＳｅｑ，２００２；Ｐｉｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。ＭＡＧＥＡ６は、メラノーマ、進行した骨髄腫、小児横紋筋肉腫、肉腫、肺、膀胱、前立腺、乳房、および結腸直腸がん、頭頸部扁平細胞、食道の扁平細胞、および経口扁平上皮がんで、頻繁に発現されることが示された（Ｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｈａｓｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｇｉｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｄａｌｅｒｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。ＭＡＧＥＡ６発現は、多発性骨髄腫患者における、より短い無増悪生存期間と関連付けられている。対照的に、頭頸部扁上皮がんでは、ＭＡＧＥＡ６の発現は、より良好な無病生存と関連していることが示された（ｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｚａｍｕｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＭＡＧＥＡ６は、パクリタキセル耐性卵巣がん細胞株において過剰発現される一連の遺伝子の１つであった。さらに、ＭＡＧＥＡ６の移入は、パクリタキセル感受性細胞に薬剤耐性の増大もまた、もたらした（Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＭＡＧＥＡ６は、卵巣がんの予後マーカーとして使用され得る（Ｓｚａｊｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。肺、結腸、または乳がん細胞株から単離されたがん幹細胞様サイドポピュレーションは、いくつかのがん精巣抗原中でも、特にＭＡＧＥＡ６の発現を示した（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０１２７】
ＭＡＧＥ９またはＭＡＧＥ−Ａ９としてもまた知られているＭＡＧＥＡ９は、ＭＡＧＥＡ遺伝子ファミリーメンバーをコードして、染色体Ｘｑ２８に位置する（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。非小細胞肺がんの腫瘍および間質細胞におけるＭＡＧＥＡ９の高度発現は、低生存率と相関することが示された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５ｂ）。ＭＡＧＥＡ９発現は、非小細胞肺がんにおける５年全生存率の独立した予後因子として記載されている（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５ｂ）。多発性骨髄腫の新規診断症例におけるＭＡＧＥＡ９の存在は、より短い全生存期間と関連していることが示された（ｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＭＡＧＥＡ９は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの樹状細胞ワクチン接種におけるその適用が、低用量ＲＥＮＣＡ−ＭＡＧＥＡ９腎細胞がん移植片の拒絶反応をもたらすことが示された、腎細胞がん抗原として記載されている（Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＭＡＧＥＡ９ペプチド特異的細胞毒性Ｔリンパ球系統は、ＭＡＧＥＡ９を腎細胞がん免疫療法の可能な適切な標的にする、ペプチド負荷Ｔ２細胞および天然ＭＡＧＥＡ９発現腎細胞がん細胞株に対して、高い細胞毒性活性を示すことが示された（Ｏｅｈｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＭＡＧＥＡ９は、子宮がんにおいて、最も一般的に発現されるがん精巣抗原の１つであることが示された（Ｒｉｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＭＡＧＥＡ９は、精巣がんで発現されるＭＡＧＥファミリーメンバーとして記載されている（Ｚｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。高いＭＡＧＥＡ９発現は、結腸直腸がんにおける静脈の浸潤およびリンパ節転移と関連していることが示された（Ｚｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＭＡＧＥＡ９発現は、結腸直腸がんにおけるより低い生存率と関連していることが示され、高いＭＡＧＥＡ９発現は、結腸直腸がん患者における芳しくない予後因子として記載されている（Ｚｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。したがって、ＭＡＧＥＡ９は、結腸直腸がん治療の新規標的になることが期待される（Ｚｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＭＡＧＥＡ９過剰発現は、上皮性卵巣がん、浸潤性乳管乳がん、喉頭扁平上皮がん、および肝細胞がんにおいて、予後不良を予測することが示された（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＭＡＧＥＡ９は、喉頭扁平上皮がん、侵入性乳管がん、上皮性卵巣がん、結腸直腸がん、および肝細胞がんにおいて、上方制御されることが示された（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｚｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０１２８】
ＭＡＧＥＡ９Ｂは、Ｘ染色体上のＭＡＧＥＡ９タンパク質の重複をコードする（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。腫瘍病期Ｉｂ非小細胞肺がんにおけるＭＡＧＥＡ９Ｂ発現は、患者生存期間と相関する（Ｕｒｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０１２９】
ＭＭＰ１は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ペプチダーゼＭ１０ファミリーメンバーをコードする。このファミリーのタンパク質は、胚発生、繁殖、および組織再構築などの正常な生理学的過程における、ならびに関節炎および転移などの疾患過程における、細胞外マトリックスの分解に関与する（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。多数の著者らが、ＭＭＰ発現パターンと、直腸および胃がん、肺がん、乳房、卵巣、前立腺、甲状腺がん、および脳腫瘍をはじめとする腫瘍浸潤性および転移能との間の正の相関を実証している（Ｖｅｌｉｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＭＭＰ１は、喉頭扁平上皮がんにおいて腫瘍病期依存性発現がある、バイオマーカーと同定された（Ｈｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。末梢血中の上皮間葉転換（ＣＴＣ＿ＥＭＴ）を伴う循環腫瘍細胞がある乳がん患者は、ＣＴＣ＿ＥＭＴのない患者よりも、腫瘍細胞（Ｐ＝０．０２）および腫瘍関連間質（Ｐ＝０．０５）内に、顕著に増大したＭＭＰ１の発現を有した（Ｃｉｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。マウスモデルでは、ＭＭＰ１発現および分泌は、腫瘍進行を実質的にブロックする、特異的抗ＦＧＦＲ３モノクローナル抗体によってブロックされた（Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０１３０】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーのタンパク質は、胚発生、繁殖、および組織再構築などの正常な生理学的過程における、ならびに関節炎および転移などの疾患過程における、細胞外マトリックスの分解に関与する。しかしながら、この遺伝子によってコードされる酵素は、構成的分泌経路内のフューリンによって、細胞内活性化される。また、その他のＭＭＰとは対照的に、この酵素は、α１−プロテイナーゼ阻害剤を切断するが、細胞外マトリックスの構造的タンパク質を弱く分解する（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ストロメライシン−３とも称されるＭＭＰ−１１は、がん細胞、間質細胞および隣接する微小環境で検出されている、ＭＭＰスーパーファミリーに属するストロメライシンサブグループのメンバーである。ＭＭＰ−１１は、様々に、腫瘍に対する二重効果を発揮する。ＭＭＰ−１１は、アポトーシスを阻害し、ならびにがん細胞の遊走および浸潤を亢進させることで、がん発生を促進する一方で；他方では、ＭＭＰ−１１は、動物モデルにおいて転移の抑制を通じて、がん発症に対して負の役割を果たす。ＭＭＰ−１１の過剰発現は、正常対照群と比較して、がん患者の血清中で、ならびに胃がん、乳がん、および膵臓がんなどの複数の腫瘍組織標本中で発見された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。ＭＭＰ−１１は、対になった正常粘膜よりも、ＣＲＣ組織内において、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで過剰発現されることが実証された。さらにＭＭＰ−１１発現は、ＣＲＣリンパ節転移；遠隔転移およびＴＮＭ病期と相関した（Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＭＭＰ−１１過剰発現は、上部尿路上皮がん腫（ＵＴＵＣ）および膀胱尿路上皮がん（ＵＢＵＣ）における、高悪性度の腫瘍表現型および好ましくない臨床転帰と関連しており、それが新規予測因子および治療標的の役割を果たしてもよいことが示唆される（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【０１３１】
ＭＸＲＡ５は、パールカンに関連する、７個のロイシン富化反復配列と１２個の免疫グロブリン様Ｃ２型ドメインとを含有する、マトリックス再構築関連タンパク質の１つをコードする（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。中国の試験は、ＭＸＲＡ５を非小細胞肺がんにおいて２番目に頻繁に変異する遺伝子として同定した（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。結腸がんでは、ＭＸＲＡ５は、過剰発現することが示され、早期診断および大網転移のバイオマーカーの役割を果たすかもしれない（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３ａ）。
【０１３２】
ＲＡＤ５４は、ＤＥＡＤ様ヘリカーゼスーパーファミリーに属するタンパク質をコードする。それは、そのどちらもがＤＮＡの相同組換えおよび修復に関与する、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＲＡＤ５４およびＲＤＨ５４との類似性を共有する。このタンパク質は二本鎖ＤＮＡに結合し、ＤＮＡ存在下ではＡＴＰアーゼ活性を示す。この遺伝子は、精巣および脾臓で高度に発現され、それは減数分裂および有糸分裂組換えにおける積極的役割を示唆する（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＲＡＤ５４Ｂのホモ接合型変異体は、原発性リンパ腫および結腸がんで観察された（Ｈｉｒａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＲＡＤ５４Ｂは、ヒト腫瘍細胞内で、ｄｓＤＮＡに対するＲＡＤ５１の直接結合のゲノム不安定化効果を抑制する（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０１３３】
ＺＦＰ４２（ＲＥＸ１とも称される）は、幹細胞マーカーとして使用され多分化能と再プログラミングに必須である、ジンクフィンガータンパク質をコードする（Ｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｍｏｎｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＺＦＰ４２の発現は、前立腺がん細胞および腎細胞がんにおいて下方制御されるが、対照的に、扁平上皮がんでは上方制御される（Ｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｒｅｉｎｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＺＦＰ４２は、細胞分化を調節するＳＯＣＳ３発現の調節を通じて、ＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路を阻害する（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０１３４】
免疫応答の刺激は、宿主免疫系によって外来性として認識された抗原の存在に依存する。腫瘍関連抗原の存在の発見は、宿主の免疫系を用いて、腫瘍成長に介入する可能性を高めた。免疫系の体液性および細胞性アームの双方を活用する様々な機構が、がん免疫療法のために目下探求されている。
【０１３５】
細胞性免疫応答の特定の要素は、腫瘍細胞を特異的に認識して破壊できる。腫瘍浸潤性細胞集団からの、または末梢血からのＴ細胞の単離は、がんに対する自然免疫防御において、このような細胞が重要な役割を果たすことを示唆する。特に、細胞質ゾル内に位置するタンパク質または欠陥リボソーム産物（ＤＲＩＰＳ）に由来する、通常は８〜１０アミノ酸残基の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）保有ペプチドのクラスＩ分子を認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が、この応答において重要な役割を果たす。ヒトのＭＨＣ分子はまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される。
【０１３６】
「Ｔ細胞応答」という用語は、生体外または生体内でペプチドによって誘導される、エフェクター機能の特異的増殖および活性化を意味する。ＭＨＣクラスＩ限定細胞毒性Ｔ細胞では、エフェクター機能は、ペプチドパルスされた、ペプチド前駆体パルスされたまたは天然ペプチド提示標的細胞の溶解；好ましくはペプチドによって誘導されるインターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−２であるサイトカインの分泌；好ましくはペプチドによって誘導されるグランザイムまたはパーフォリンであるエフェクター分子の分泌；または脱顆粒であってもよい。
【０１３７】
「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノおよびカルボニル基の間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書で使用される。ペプチドは、好ましくは９アミノ酸長であるが、８アミノ酸長程度に短く、１０、１１、１２、または１３アミノ酸程度またはより長くあり得て、ＭＨＣクラスＩＩペプチド（本発明のペプチドの伸長変異体）の場合、それらは１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０を超えるアミノ酸長程度に長くあり得る。
【０１３８】
さらに「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノおよびカルボニル基の間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基の塩を含むものとする。好ましくは、塩は、例えば、塩化物または酢酸塩（トリフルオロ酢酸塩）などの、ペプチドの薬学的に許容可能な塩である。ペプチドは生体内で塩ではないので、本発明によるペプチドの塩は、それらの生体内の状態がペプチドと実質的に異なることに留意すべきである。
【０１３９】
「ペプチド」という用語は、「オリゴペプチド」もまた含むものとする。「オリゴペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノおよびカルボニル基の間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書で使用される。オリゴペプチドの長さは、その中で正しいエピトープまたはエピトープが保持されれば、本発明には重要でない。オリゴペプチドは、典型的に、約３０アミノ酸残基長未満であり、約１５アミノ酸長を超える。
【０１４０】
「ポリペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノおよびカルボニル基の間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基を指す。正しいエピトープが保持されれば、ポリペプチドの長さは、本発明には重要でない。ペプチドまたはオリゴペプチドという用語とは対照的に、ポリペプチドという用語は、約３０を超えるアミノ酸残基を含有する分子を指すことが意図される。
【０１４１】
ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質またはこのような分子をコードするポリヌクレオチドは、免疫応答を誘導できれば「免疫原性」である（したがって本発明における「免疫原」である）。本発明では、免疫原性は、より具体的には、Ｔ細胞応答を誘導する能力と定義される。したがって「免疫原」は、免疫応答を誘導できる分子であり、本発明では、Ｔ細胞応答を誘導できる分子である。別の態様では、免疫原は、それに対する特異的抗体またはＴＣＲを生じさせるのに使用される、ペプチド、ペプチドとＭＨＣの複合体、オリゴペプチド、および／またはタンパク質であり得る。
【０１４２】
クラスＩ  Ｔ細胞「エピトープ」は、クラスＩ  ＭＨＣ受容体に結合する短いペプチドを要して、三成分複合体（ＭＨＣクラスＩα鎖、β−２−ミクログロブリン、およびペプチド）を形成し、それは、適切な親和性でＭＨＣ／ペプチド複合体に結合する適合Ｔ細胞受容体を保有するＴ細胞によって、認識され得る。ＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドは、典型的に８〜１４アミノ酸長であり、最も典型的には９アミノ酸長である。
【０１４３】
ヒトにおいては、ＭＨＣクラスＩ分子（ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ともまた称されるヒトのＭＨＣ分子）をコードする、３つの異なる遺伝子座、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃがある。ＨＬＡ−Ａ＊０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２、およびＨＬＡ−Ｂ＊０７は、これらの遺伝子座から発現され得る、異なるＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の例である。
【０１４４】
表1:HLA-A*02およびHLA-A*24の発現頻度F、および最も高頻度のHLA-DR血清型。頻度は、ハーディ・ワインベルグ式、F=1-(1-Gf)2を用いて、Mori et al.から適応された、米国人母集団内のハプロタイプ頻度Gfから推定される。連鎖不均衡のために、A*02またはA*24と特定のHLA-DR対立遺伝子との組み合わせは、それらの単一頻度から予測されるよりも、豊富でありまたは低頻度であるかもしれない。詳細については、Chanocket al. (Chanock etal., 2004)を参照されたい。
【表１Ａ】
2020188764.tif 000010
【表１Ｂ】
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【０１４５】
本発明のペプチドは、好ましくは、本明細書に記載される本発明のワクチンに包含される場合、Ａ＊０２に結合する。ワクチンはまた、汎結合ＭＨＣクラスＩＩペプチドを含んでもよい。したがって、本発明のワクチンを使用して、Ａ＊０２陽性の患者においてがんが治療され得る一方で、これらのペプチドの汎結合特性のために、ＭＨＣクラスＩＩアロタイプを選択する必要はない。
【０１４６】
本発明のＡ＊０２ペプチドが、例えばＡ＊２４などの別の対立遺伝子に結合するペプチドと組み合わされた場合、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子のいずれか単独による対処と比較して、任意の患者集団のより高い割合が治療され得る。大多数の母集団では、対立遺伝子のいずれか単独によって、５０％未満の患者が対処され得る一方で、ＨＬＡ−Ａ＊２４およびＨＬＡ−Ａ＊０２エピトープを含んでなるワクチンは、任意の妥当な母集団で、少なくとも６０％の患者を治療し得る。具体的には、様々な地域において、以下の百分率の患者が、これらの対立遺伝子の少なくとも１つについて陽性である：ＵＳＡ６１％、西欧６２％、中国７５％、韓国７７％、日本８６％（ｗｗｗ．ａｌｌｅｌｅｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ．ｎｅｔから計算された）。
【０１４７】
好ましい実施形態では、「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロ重合体を指す。
【０１４８】
特定のペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、天然起源であってもよく、またはそれらは合成的に構築されてもよい。一般に、本発明のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質をエンコードするＤＮＡ断片は、ｃＤＮＡフラグメントと短いオリゴヌクレオチドリンカーとから構築され、またはひと続きのオリゴヌクレオチドから構築されて、微生物またはウイルスオペロンに由来する調節因子を含んでなる、組換え転写単位で発現できる合成遺伝子が提供される。
【０１４９】
本明細書の用法では「ペプチドコーディング（またはコードする）ヌクレオチド」という用語は、配列が、例えば、ＴＣＲの製造に有用な樹状細胞または別の細胞株によって発現される生体系と適合性である、人工（人造）開始および停止コドンを含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を指す。
【０１５０】
本明細書の用法では、核酸配列への言及は、一本鎖および二本鎖の核酸の双方を含む。したがって、例えば、特異的配列は、文脈上明らかに別の意味が示唆されない限り、このような配列の一本鎖ＤＮＡ、このような配列とその補体との二本鎖（二本鎖ＤＮＡ）、およびこのような配列の補体を指す。
【０１５１】
「コード領域」という用語は、その天然ゲノム環境内で、遺伝子の発現産物を天然にまたは正常にコードする遺伝子の部分、すなわち、遺伝子の天然発現産物を生体内でコードする領域を指す。
【０１５２】
コード領域は、非変異（「正常」）、変異または改変遺伝子に由来し得て、またはＤＮＡ合成技術の当業者に周知の方法を使用して実験室で完全に合成された、ＤＮＡ配列または遺伝子にさえ由来し得る。
【０１５３】
「発現産物」という用語は、遺伝子の、そして遺伝コード縮重に起因する同等物をコードし、したがって同一アミノ酸をコードする任意の核酸配列の、天然翻訳産物である、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。
【０１５４】
コード配列に言及する場合、「フラグメント」という用語は、その発現産物が、完全コード領域の発現産物と本質的に同一の生物学的機能または活性を保つ、完全未満のコード領域を含んでなるＤＮＡの部分を意味する。
【０１５５】
「ＤＮＡ断片」という用語は、別々のフラグメントの形態の、またはより大型のＤＮＡコンストラクトの構成要素としての、ＤＮＡポリマーを指し、それは、実質的に純粋な、すなわち、混入内在性物質を含まない形態で、例えばクローニングベクターを使用する標準生化学的方法によって、断片およびその構成ヌクレオチド配列が同定、操作、および回収できる量または濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡに由来する。このような断片は、読み取り枠の形態で提供され、それは、典型的に真核生物遺伝子内に存在する内部非翻訳配列またはイントロンによって、中断されていない。非翻訳ＤＮＡ配列は、それがコード領域の操作または発現を妨げない、読み取り枠下流に存在してもよい。
【０１５６】
「プライマー」という用語は、短い核酸配列を意味し、それはＤＮＡの１本鎖と対合し得て、ＤＮＡポリメラーゼがそこでデオキシリボヌクレオチド鎖合成を開始する、遊離３’−ＯＨ末端を提供する。
【０１５７】
「プロモーター」という用語は、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼ結合に関与する、ＤＮＡの領域を意味する。
【０１５８】
「単離」という用語は、物質が、その元の環境（例えば、それが天然起源であれば天然環境）から取り出されることを意味する。例えば、生きている動物中に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然システムで共存する物質の一部または全部から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得て、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり得るが、このようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部でないと言う意味では、なおも単離されている。
【０１５９】
本発明によって開示されるポリヌクレオチド、および組換えまたは免疫原性ポリペプチドは、「精製」形態であってもよい。「精製」という用語は、完全に純粋である必要はなく；むしろ、それは相対的定義であることが意図されて、これらの用語が当業者によって理解されるように、高度に精製された調製物、または部分的にのみ精製された調製物を含み得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々のクローンは、電気泳動的に均一に、従来法で精製されている。少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、より好ましくは４または５桁までの、出発原料または天然物質の精製が明示的に検討される。さらに、重量基準で、好ましくは９９．９９９％、または少なくとも９９．９９％または９９．９％；さらに望ましくは９９％以上の純度を有する、特許請求されるポリペプチドが明示的に包含される。
【０１６０】
本発明によって開示される核酸およびポリペプチド発現産物、ならびにこのような核酸および／またはこのようなポリペプチドを含有する発現ベクターは、「富化形態」であってもよい。本明細書の用法では、「富化」という用語は、物質濃度が、（例えば）その天然濃度の少なくとも約２、５、１０、１００、または１０００倍であることを意味し、有利には重量基準で０．０１％、好ましくは重量基準で少なくとも約０．１％である。重量基準で約０．５％、１％、５％、１０％、および２０％の富化調製物もまた、検討される。本発明を構成する、配列、コンストラクト、ベクター、クローン、およびその他の物質は、有利には、富化または単離形態であり得る。「活性フラグメント」という用語は、通常は、単独で、または任意選択的に適切なアジュバントと共に、またはベクター内で、例えば、ウサギまたはマウスのようなそしてまたヒトをはじめとする哺乳類などの動物に投与すると免疫応答を生じる（すなわち、免疫原性を有する）ペプチド、ポリペプチドまたは核酸配列のフラグメントを意味し、このような免疫応答は、ヒトなどのレシピエント動物内でＴ細胞応答を刺激する形態を取る。代案としては、「活性フラグメント」はまた、生体外Ｔ細胞応答を誘導するのに使用されてもよい。
【０１６１】
本明細書の用法では、ポリペプチドとの関連で使用される場合、「部分」、「断片」、および「フラグメント」という用語は、アミノ酸残基などの連続する残基の配列を指し、その配列は、より大型の配列の部分集合を形成する。例えば、ポリペプチドが、トリプシンまたはキモトリプシンなどの一般的エンドペプチダーゼのいずれかによって処理されれば、このような処理から得られるオリゴペプチドは、出発ポリペプチドの部分、断片またはフラグメントに相当するであろう。ポリヌクレオチドに関して使用される場合、これらの用語は、いずれかのエンドヌクレアーゼによる前記ポリヌクレオチドの処理によって生じる生成物を指す。
【０１６２】
本発明によると、配列に言及する場合、「同一性百分率」または「パーセント同一」という用語は、比較される配列（「比較配列」）と、記載されまたは特許請求される配列（「参照配列」）とのアライメント後に、配列が、特許請求されまたは記載される配列と比較されることを意味する。次に同一性百分率は、次式に従って判定される：
同一性百分率＝１００［１−（Ｃ／Ｒ）］
式中、Ｃは、参照配列と比較される配列との間のアライメント長にわたる、参照配列と比較配列の間の差異の数であり、
（ｉ）比較配列中に対応する整列塩基またはアミノ酸を有しない、参照配列中の各塩基またはアミノ酸、および
（ｉｉ）参照配列中の各ギャップ、および
（ｉｉｉ）比較配列中の整列塩基またはアミノ酸と異なる、参照配列中の各整列塩基またはアミノ酸が、差異を構成して、
（ｉｉｉｉ）アライメントは、整合配列の１位から開始しなくてはならず；
Ｒは、比較配列とのアライメント長にわたる参照配列中の塩基またはアミノ酸の数であり、参照配列中に生じる任意のギャップもまた、塩基またはアミノ酸として数えられる。
【０１６３】
比較配列と、それに対して同一性百分率が上のように計算される参照配列との間に、特定の最小同一性百分率とほぼ同じまたはそれ以上のアライメントが存在すれば、その中に、上記のように計算された同一性百分率が特定の同一性百分率未満であるアライメントが存在したとしても、比較配列は、参照配列との特定の最小同一性百分率を有する。
【０１６４】
したがって上述したように、本発明は、配列番号１〜配列番号２８８、または配列番号１〜配列番号２８８と８８％相同的であるその変異体、またはＴ細胞を前記ペプチドと交差反応させるその変異体からなる群から選択される配列を含んでなる、ペプチドを提供する。本発明のペプチドは、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子または前記ペプチドの伸長バージョンを、クラスＩＩに結合する能力を有する。
【０１６５】
本発明では、「相同的」という用語は、２つのアミノ酸配列、すなわちペプチドまたはポリペプチド配列の配列間の同一性の程度を指す（上の同一性百分率を参照されたい）。前述の「相同性」は、比較される配列にわたり、最適条件下でアライメントされた２つの配列を比較することで判定される。このような配列相同性は、例えばＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用してアライメントを作成することで、計算され得る。一般に利用できる配列解析ソフトウェア、より具体的には、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸまたはその他のツールが、公共データベースによって提供される。
【０１６６】
当業者は、特定のペプチドの変異体によって誘導されるＴ細胞が、ペプチドそれ自体と交差反応できるかどうかを評価できるであろう（Ａｐｐａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｃｏｌｏｍｂｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｚａｒｅｍｂａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【０１６７】
所与のアミノ酸配列の「変異型」によって、本発明者らは、ペプチドが、配列番号１〜配列番号２８８からなる所与のアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同様に、ＨＬＡ分子となおも結合できるように、（例えば、それらを別の天然アミノ酸残基の側鎖で、またはその他の側鎖で、置換することにより）例えば、アミノ酸の１つまたは２つの残基の側鎖が変化することを意味する。例えば、ペプチドは、それがＨＬＡ−Ａ＊０２または−ＤＲなどの適切なＭＨＣ分子の結合溝と相互作用して結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持するように修飾されてもよく、このようにしてそれは、活性化ＣＴＬのＴＣＲに結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持する。
【０１６８】
これらのＴ細胞は、引き続いて細胞と交差反応して、本発明の態様で定義される同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞を殺滅し得る。学術文献およびデータベース（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｇｏｄｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）から誘導され得るように、ＨＬＡ結合ペプチドの特定の位置は、典型的に、アンカー残基であり、結合溝を構成するポリペプチド鎖の極性、電気物理的、疎水性、および空間特性によって画定されるＨＬＡ受容体の結合モチーフと適合する、コア配列を形成する。したがって、当業者は、既知のアンカー残基を保つことで、配列番号１〜配列番号２８８に記載されるアミノ酸配列を修飾でき、このような変異型がＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力を維持するかどうかを判定できるであろう。本発明の変異型は、活性化Ｔ細胞のＴＣＲに結合する能力を維持し、それは引き続いて、本発明の態様で定義されるような同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞と交差反応して、それを殺滅し得る。
【０１６９】
本明細書で開示される元の（未修飾）ペプチドは、特に明記されない場合は、ペプチド鎖内の異なる、おそらくは選択的な部位における、１つまたは複数の残基の置換によって修飾され得る。好ましくはこれらの置換は、アミノ酸鎖の末端に位置する。このような置換は、保存的性質であってもよく、例えば、疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸によって置換されるなど、構造および特徴の類似したアミノ酸によってアミノ酸が置換される。さらにより保存的な置換は、ロイシンのイソロイシンによる置換などの、同一または類似サイズおよび化学的性質のアミノ酸の置換である。天然起源相同タンパク質ファミリーの配列多様性の研究では、特定のアミノ酸置換は、他よりも耐容されることが多く、これらは、元のアミノ酸とその置換物の間のサイズ、電荷、極性、および疎水性の類似性との相関を示すことが多く、これが「保存的置換」の定義の基礎である。
【０１７０】
保存的置換は、本明細書では、以下の５つのグループの１つの中の交換として定義される：グループ１−小型脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；グループ２−極性の負に帯電した残基およびそれらのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）；グループ３−極性の正に帯電した残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；グループ４−大型脂肪族非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）；およびグループ５−大型芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。
【０１７１】
より保存的でない置換は、アラニンのイソロイシン残基による置換などの、類似した特徴を有するがサイズがいくらか異なる別のアミノ酸による置換を伴うかもしれない。高度に非保存的な置換は、極性アミノ酸の、または塩基性アミノ酸の酸性アミノ酸による置換を伴うかもしれない。しかし化学効果は完全に予測可能でなく、遊離基置換は単純な化学的原理からは予測できない偶然の効果を生じさせる可能性があるので、このような「遊離基」置換は、潜在的に無効であるとして却下され得ない。
【０１７２】
もちろんこのような置換には、通常のＬ−アミノ酸以外の構造体が関与してもよい。したがってＤ−アミノ酸が、本発明の抗原性ペプチドに通常見られるＬ−アミノ酸を置換するかもしれず、依然として本明細書の開示に包含される。さらに、非標準アミノ酸（すなわち、一般的な天然タンパク質新生アミノ酸以外）もまた置換目的で使用して、本発明による免疫原および免疫原性ポリペプチドが製造されてもよい
【０１７３】
２つ以上の位置における置換が、以下に定義されるように実質的に同等またはそれ以上の抗原活性のあるペプチドをもたらすことが発見された場合、これらの置換の組み合わせを試験して、置換の組み合わせが、ペプチドの抗原性に相加または相乗効果をもたらすかどうかが判定される。最大でも、ペプチド内の４つ以上の位置が同時に置換されることはない。
【０１７４】
本明細書で示されるようなアミノ酸配列から本質的になるペプチドは、非修飾ペプチドと比較すると、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力が、実質的に変化したり悪影響を受けたりすることなく交換される、１つまたは２つの非アンカーアミノ酸を有し得る（アンカーモチーフについては下記を参照されたい）。別の実施形態では、本明細書で示されるようなアミノ酸配列から本質的になるペプチド中では、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力が非修飾ペプチドと比較して実質的に変化したり悪影響を受けることなく、１つまたは２つのアミノ酸が、それらの保存的交換パートナー（以下を参照されたい）で交換され得る。
【０１７５】
Ｔ細胞受容体との相互作用に実質的に寄与しないアミノ酸残基は、その組み込みが、Ｔ細胞反応性に実質的に影響を及ぼさず、関連ＭＨＣとの結合を排除しない、他のアミノ酸での置換によって修飾され得る。したがって与えられた但し書きを除いて、本発明のペプチドは、与えられたようなアミノ酸配列またはそれらの部分または変異体を含む、任意のペプチド（本発明者らは、その用語にオリゴペプチドまたはポリペプチドを含める）であってもよい。
【０１７６】
表2A:配列番号4、13、および15に記載のペプチドの変異型およびモチーフ
【表２Ａ−１】
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【表２Ａ−２】
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【表２Ａ−３】
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【０１７７】
より長い（伸長された）ペプチドもまた、適切であってもよい。ＭＨＣクラスＩエピトープは、通常は８〜１１アミノ酸長であるが、実際のエピトープを含むより長いペプチドまたはタンパク質から、ペプチドプロセッシングによって生成することが可能である。実際のエピトープ側面に位置する残基は、プロセッシング中に実際のエピトープを曝露させるのに必要なタンパク質分解切断に、実質的に影響を及ぼさない残基であることが好ましい。
【０１７８】
本発明のペプチドは、最大４個のアミノ酸によって伸長させ得て、すなわち４：０〜０：４の間のあらゆる組み合わせで、どちらかの末端に１、２、３または４個のアミノ酸が付加され得る。本発明による伸長の組み合わせは、表３にある。
【０１７９】
表3:本発明のペプチドの伸長の組み合わせ
【表３】
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【０１８０】
伸長／延長のためのアミノ酸は、元のタンパク質配列のペプチドまたは任意のその他のアミノ酸であり得る。伸長を利用して、ペプチドの安定性または溶解度を高め得る。
【０１８１】
したがって本発明のエピトープは、天然起源腫瘍関連または腫瘍特異的エピトープと同一であってもよく、またはそれらが実質的に同一の抗原活性を有しさえすれば、４つ以下の残基が参照ペプチドと異なるエピトープを含んでもよい。
【０１８２】
代案の実施形態では、ペプチドは、４つを超えるアミノ酸で、好ましくは最大３０アミノ酸の全長まで、片側または両側で伸長される。これは、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドをもたらしてもよい。ＭＨＣクラスＩＩへの結合は、当該技術分野で公知の方法によって試験される得る。
【０１８３】
したがって、本発明は、ＭＨＣクラスＩエピトープのペプチドおよび変異型を提供し、ペプチドまたは変異型は、８〜１００、好ましくは８〜３０、最も好ましくは８〜１４、すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４アミノ酸の全長を有し、伸長されたクラスＩＩ結合ペプチドの場合、長さはまた、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２アミノ酸であり得る。
【０１８４】
もちろん、本発明によるペプチドまたは変異型は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩの分子に結合する能力を有する。ペプチドまたは変異体のＭＨＣ複合体への結合は、当該技術分野で既知の方法によって試験されてもよい。
【０１８５】
好ましくは、本発明によるペプチドに特異的なＴ細胞を置換ペプチドについて試験する場合、置換ペプチドが背景に対して最大溶解増大の半分を達成するペプチド濃度は、約１ｍＭ以下、好ましくは約１μＭ以下、より好ましくは約１ｎＭ以下、さらにより好ましくは約１００ｐＭ以下、最も好ましくは約１０ｐＭ以下である。置換ペプチドが、２人以上、少なくとも２人、より好ましくは３人の個人からのＴ細胞によって認識されることもまた好ましい。
【０１８６】
本発明の特に好ましい実施形態では、ペプチドは、配列番号に１〜配列番号２８８に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる。
【０１８７】
「から本質的になる」は、本発明によるペプチドが、配列番号１〜配列番号２８８のいずれかに記載の配列またはその変異体に加えて、ＭＨＣ分子エピトープのエピトープとして機能するペプチドの一部を必ずしも構成しない、追加的なＮおよび／またはＣ末端に位置するアミノ酸の一連の配列を含有することを意味するものとする。
【０１８８】
それでもなお、これらの一連の配列は、本発明によるペプチドの細胞への効率的な導入を提供する上で重要であり得る。本発明の一実施形態では、ペプチドは、例えば、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ００４９７に由来する、ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖の８０個のＮ末端アミノ酸を含んでなる、融合タンパク質の一部である（ｐ３３、以下の「Ｉｉ」）。その他の融合物中では、本発明のペプチドは、本明細書に記載されるような抗体、またはその機能的部分に、特に抗体の配列中に、前記抗体によって特異的に標的化されるように融合し得て、または例えば、本明細書に記載されるような樹状細胞に対して特異的な抗体に、またはその中に融合し得る。
【０１８９】
さらにペプチドまたは変異型は、より強力な免疫応答を引き起こすために、安定性および／またはＭＨＣ分子への結合を改善するようにさらに修飾されてもよい。ペプチド配列のこのような最適化方法は当該技術分野で周知であり、例えば、逆ペプチド結合または非ペプチド結合の導入が挙げられる。
【０１９０】
逆ペプチド結合中では、アミノ酸残基はペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合によって連結せず、ペプチド結合が逆転する。このようなレトロ−インベルソペプチド模倣剤は、例えば、参照により本明細書に援用される、Ｍｅｚｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）（Ｍｅｚｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）に記載されるものなどの当該技術分野で既知の方法を使用して製造されてもよい。このアプローチは、側鎖の方向でなく主鎖に関与する変化を含有する、擬ペプチドの生成を伴う。Ｍｅｚｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｚｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）は、ＭＨＣ結合およびＴヘルパー細胞応答のために、これらの擬ペプチドが有用であることを示す。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含有するレトロ−インバースペプチドは、タンパク質分解に対してはるかにより高い耐性がある。
【０１９１】
非ペプチド結合は、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−である。米国特許第４，８９７，４４５号明細書は、標準手順によって合成されるポリペプチド、およびＮａＣＮＢＨ３の存在下でアミノアルデヒドとアミノ酸を反応させることで合成される非ペプチド結合が関与する、ポリペプチド鎖中の非ペプチド結合（−ＣＨ２−ＮＨ）を固相合成する方法を提供する。
【０１９２】
上述の配列を含んでなるペプチドは、それらのアミノおよび／またはカルボキシ末端に存在する追加的な化学基と共に合成して、ペプチドの安定性、生物学的利用能、および／または親和性を高めてもよい。例えば、カルボベンゾキシル、ダンシル、またはｔ−ブチルオキシカルボニル基などの疎水性基が、ペプチドのアミノ末端に付加されてもよい。同様に、アセチル基または９−フルオレニルメトキシ−カルボニル基が、ペプチドのアミノ末端に配置されてもよい。さらに、疎水性基、ｔ−ブチルオキシカルボニル、またはアミド基が、ペプチドのカルボキシ末端に付加されてもよい。
【０１９３】
さらに、本発明のペプチドは、それらの立体配置を改変するように合成されてもよい。例えば、通常のＬ異性体でなく、ペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基のＤ異性体が使用されてもよい。なおもさらに、本発明のペプチドのアミノ酸残基の少なくとも１つは、周知の非天然起源アミノ酸残基の１つで置換されてもよい。これらのような変化は、本発明のペプチドの安定性、生物学的利用能および／または結合作用の増大に役立ってもよい。
【０１９４】
同様に、本発明のペプチドまたは変異体は、ペプチド合成の前または後のどちらかに、特異的アミノ酸を反応させることで、化学的に修飾されてもよい。このような修飾の例は、当該技術分野で周知であり、例えば、参照により本明細書に援用される、Ｒ．Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，３ｒｄ  ｅｄ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２００４（Ｌｕｎｄｂｌａｄ，２００４）に要約される。アミノ酸の化学修飾としては、これに限定されるものではないが（ａｌｔｈｏｕｇｈ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒｅｔｏ）、アシル化、アミジン化、リジンのピリドキシル化、還元アルキル化、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化、システインのシステイン酸への過ギ酸酸化によるカルボキシル基のアミド修飾およびスルフヒドリル修飾、水銀誘導体形成、その他のチオール化合物との混合ジスルフィド形成、マレイミドとの反応、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化、およびアルカリ性ｐＨでのシアネートによるカルバモイル化による修飾が挙げられるが、これに限定されるものではない（ｂｕｔ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄｔｏ）。この点において、当業者は、タンパク質の化学修飾に関するより詳細な手順について、Ｃｈａｐｔｅｒ  １５  ｏｆ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅｄｓ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  ＮＹ  １９９５−２０００）（Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）を参照されたい。
【０１９５】
簡単に述べると、例えばタンパク質中のアルギニル残基の修飾は、付加体を形成するためのフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、および１，２−シクロヘキサンジオンなどの、隣接するジカルボニル化合物の反応に基づくことが多い。別の実施例は、メチルグリオキサールとアルギニン残基の反応である。システインは、リジンおよびヒスチジンなどのその他の求核性部位の同時の修飾なしに修飾され得る。その結果、システイン修飾のために多数の試薬が利用可能である。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈなどの会社のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）が、特定の試薬に関する情報を提供する。
【０１９６】
タンパク質中のジスルフィド結合の選択的還元もまた、一般的である。ジスルフィド結合は、生物医薬品の加熱処理中に形成されて酸化され得る。ウッドワード試薬Ｋを使用して、特定のグルタミン酸残基が修飾されてもよい。Ｎ−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドを利用して、リジン残基とグルタミン酸残基の間に分子内架橋が形成され得る。例えばジエチルピロ炭酸は、タンパク質中のヒスチジル残基修飾のための試薬である。ヒスチジンはまた、４−ヒドロキシ−２−ノネナールを使用して修飾され得る。リジン残基およびその他のα−アミノ基の反応物は、例えば、ペプチドの表面への結合またはタンパク質／ペプチド架橋で有用である。リジンはポリ（エチレン）グリコールの付着部位であり、タンパク質のグリコシル化の主要な修飾部位である。タンパク質中のメチオニン残基は、例えば、ヨードアセトアミド、ブロモエチルアミン、およびクロラミンＴによって修飾され得る。テトラニトロメタンおよびＮ−アセチルイミダゾールを使用して、チロシル残基が修飾され得る。ジチロシンの形成を通じた架橋は、過酸化水素／銅イオンによって達成され得る。
【０１９７】
トリプトファンの修飾に関する最近の研究では、Ｎ−ブロモサクシニミド、臭化２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルまたは３−ブロモ−３−メチル−２−（２−ニトロフェニルメルカプト）−３Ｈ−インドール（ＢＰＮＳ−スカトール）が使用されている。
【０１９８】
ＰＥＧによる治療用タンパク質およびペプチドの成功裏の修飾が、循環半減期の延長と関係することが多い一方で、タンパク質と、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコールジアクリレート、およびホルムアルデヒドとの架橋は、ハイドロゲル調製のために使用される。免疫療法のためのアレルゲンの化学修飾は、カリウムシアネートでのカルバミル化によって達成されることが多い。
【０１９９】
ペプチドが修飾されまたは非ペプチド結合を含む、ペプチドまたは変異体は、本発明の好ましい実施形態である。一般に、ペプチドおよび変異体（少なくともアミノ酸残基間にペプチド結合を含有するもの）は、Ｌｕｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｕｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）によって、そしてその中で引用される参考文献によって開示される、Ｆｍｏｃ−ポリアミド様式の固相ペプチド合成によって合成されてもよい。一時的なＮ−アミノ基保護は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基によってもたらされる。この高度に塩基不安定性の保護基の反復性切断は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを使用して実施される。側鎖官能基は、それらのブチルエーテル（セリン、スレオニン、およびチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リジンおよびヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）、および４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニンの場合）として保護されてもよい。グルタミンまたはアスパラギンが、Ｃ末端残基である場合、側鎖アミド官能基を保護するために、４，４’−ジメトキシベンズヒドリル基が活用される。固相担体は、ジメチルアクリルアミド（主鎖単量体）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋剤）およびアクリロイルサルコシンメチルエステル（機能化因子）の３つの単量体から構成される、ポリジメチル−アクリルアミドポリマーをベースとする。使用されるペプチド−対−樹脂の切断可能な結合因子は、酸不安定性４−ヒドロキシメチル−フェノキシ酢酸誘導体である。逆転Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−カルボジイミド／１ヒドロキシベンゾトリアゾール媒介性共役手順を使用して付加されるアスパラギンおよびグルタミンを除いて、全てのアミノ酸誘導体は、それらのあらかじめ形成された対称的な無水物誘導体として添加される。全ての共役および脱保護反応は、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸またはイサチン（ｉｓｏｔｉｎ）試験手順を使用してモニターされる。合成完了時に、ペプチドは樹脂担体から切断され、同時に、５０％スカベンジャー混合物を含有する９５％トリフルオロ酢酸での処理によって、側鎖保護基が除去される。一般に使用されるスカベンジャーとしては、エタンジチオール、フェノール、アニソール、および水が挙げられ、正確な選択は、合成されるペプチドの構成アミノ酸に左右される。ペプチドの合成のための固相法と溶液相法の組み合わせもまた、可能である（例えば、（Ｂｒｕｃｋｄｏｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、およびその中で引用される参考文献を参照されたい）。
【０２００】
トリフルオロ酢酸は、真空蒸発によって除去され、引き続くジエチルエーテルを用いた磨砕は、粗製ペプチドをもたらす。存在する任意のスカベンジャーは、単純な抽出手順によって除去され、それは水相の凍結乾燥時に、スカベンジャーを含まない粗製ペプチドを与える。ペプチド合成のための試薬は、通常、例えば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）から入手できる。
【０２０１】
精製は、再結晶化、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および（通常は）例えばアセトニトリル／水勾配分離を使用した逆相高速液体クロマトグラフィーなどの技術の任意の１つまたは組み合わせによって実施されてもよい。
【０２０２】
ペプチドの分析は、薄層クロマトグラフィー、電気泳動法、特にキャピラリー電気泳動法、固相抽出（ＣＳＰＥ）、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析を使用して、高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分光分析によって、ならびにＭＡＬＤＩおよびＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分光分析によって、実施されてもよい。
【０２０３】
本発明のペプチドの同定のために、約３０００個の正常組織サンプルからの公的に利用可能なＲＮＡ発現データ（Ｌｏｎｓｄａｌｅ，２０１３）のデータベースが、生命臓器系ではほとんど発現されず、その他の重要な臓器系では低発現される遺伝子について、スクリーニングされた。第２段階では、がん関連ペプチドが、これらの遺伝子のタンパク質産物から誘導され、本明細書に記載されるようなＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（商標）プラットフォームを使用して、質量分析によって同定された。
【０２０４】
詳細には、前記データベースからのＲＮＡＳｅｑデータを使用して目的遺伝子を選択するために、生命臓器系は、脳、心臓、血管、肺、および肝臓であると見なされた。遺伝子の選択のためには、重要臓器について、１００万の読取りあたりキロベースあたりの読み取りの中央値（ＲＰＫＭ）が、２未満であることが要求され、７５％パーセンタイル値は、５ＲＰＫＭ未満であることが要求された。臓器系が、２つ以上のサンプルクラス、例えば、別々に分析された異なる脳領域によってカバーされる場合、複数のサンプルクラスにわたる最大中央値と最大７５％パーセンタイル値が、計算のために使用された。その他の重要な臓器系は、皮膚、神経、下垂体、結腸、腎臓、脂肪組織、副腎、膀胱、全血、食道、筋肉、膵臓、唾液腺、小腸、胃、乳房、脾臓、甲状腺であると考えられた。これらの臓器の最大中央値ＲＰＫＭは、遺伝子選択のために１０未満であることが要求された。その他の臓器は、生命維持に必要ないと見なされ、したがって遺伝子発現のカットオフ値は適用されなかった。これらの臓器は、子宮頸部および子宮、ファロピウス管、膣、前立腺、精巣、および卵巣であった。このスクリーニングを使用して、１４，０００前後の候補遺伝子が選択された。次に、対応するタンパク質に由来するペプチドの提示プロファイルが解析された。ペプチドが、分析された１７０個を超える正常な（すなわち、非がん性）サンプルセット中で、５個未満の正常サンプル上に提示されれば、そして最大正常組織提示が、中央値腫瘍シグナル（全ての腫瘍サンプルにわたる）の３０％未満であれば、それらは興味深いと見なされた。
【０２０５】
過剰提示ペプチドを選択するために、中央値サンプル提示ならびに反復試験変動を示す、提示プロファイルが計算される。プロファイルは、目的腫瘍実体のサンプルを正常なサンプルのベースラインに並置させる。次に、線形混合効果モデルのｐ値を計算し（Ｐｉｎｈｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、誤検出率によって複数試験について補正する（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  ａｎｄ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，１９９５）ことで、これらの各プロファイルが過剰提示スコアに統合され得る。
【０２０６】
質量分析によるＨＬＡリガンドの同定と相対的定量化のために、衝撃凍結サンプルからのＨＬＡ分子が精製されて、ＨＬＡ関連ペプチドが単離された。単離ペプチドを分離して、オンラインナノエレクトロスプレーイオン化（ｎａｎｏＥＳＩ）液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）実験によって、配列が同定された。得られたペプチド配列は、原発性腫瘍サンプルから記録された天然ＴＵＭＡＰの断片化パターンを、同一配列の対応する合成参照ペプチドの断片化パターンと比較することで、確認された。ペプチドは、原発性腫瘍のＨＬＡ分子のリガンドとして、直接同定されたので、これらの結果は、原発性がん組織上における、同定されたペプチドの天然プロセッシングおよび提示の直接的証拠を提供する。
【０２０７】
サンプル数（総計／ＱＣ−合格サンプル）は、次のとおりであった：ＰＣではＮ＝３９（３６）、ＲＣＣではＮ＝２２（１８）、ＣＲＣではＮ＝３１（２８）、食道がんではＮ＝１４（１１）、ＢＰＨおよび前立腺がんではＮ＝５３（４３）、ＨＣＣではＮ＝１５（１５）、ＮＳＣＬＣではＮ＝９６（８７）、ＧＣではＮ＝３５（３３）、ＧＢではＮ＝３８（２７）、乳がんではＮ＝２（２）、メラノーマではＮ＝５（２）、卵巣がんではＮ＝２１（２０）、ＣＬＬではＮ＝５（４）、ＳＣＬＣではＮ＝１８（１７）、ＮＨＬではＮ＝１８（１８）、ＡＭＬではＮ＝２３（１８）、ＧＢＣ、ＣＣＣではＮ＝１８（１７）、ＵＢＣではＮ＝１７（１５）、ＵＥＣではＮ＝１９（１６）。５回の質量分析反復試験が得られ、またはサンプルが完全に消費され、そして正規化係数を計算するために使用されたペプチド（すなわち５０％未満の分散がある同一サンプルの技術的反復試験中に現れ、少なくとも２つの独立したサンプル中に現れる）が、サンプル中で測定された全てのペプチドの少なくとも３０％であれば、サンプルはＱＣに合格する。稀なサブタイプ（Ａ＊０２：０５、Ａ＊０２：０６など）をもたらしたサブタイプ分類されたサンプルは、本発明ペプチドの選択から除外された。
【０２０８】
発見パイプラインＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）ｖ２．１（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第２０１３−００９６０１６号明細書を参照されたい）は、いくつかの異なる非がん性組織および臓器と比較した、がん組織上のＨＬＡ拘束性ペプチドレベルの直接相対定量化に基づく、妥当な過剰提示ペプチドワクチン候補の同定と選択ができるようにする。これは、独自仕様のデータ解析パイプラインによる獲得ＬＣ−ＭＳデータ処理、配列同定のためのアルゴリズム組み合わせ、スペクトルクラスタリング、イオン計数、滞留時間アライメント、電荷状態のデコンボリューションと正規化を使用した、無標識示差定量化の開発によって、達成された。
【０２０９】
各ペプチドおよびサンプルの誤差推定値を含む、提示レベルが確立された。腫瘍組織上で排他的に提示されるペプチド、および腫瘍内で過剰提示されるペプチドが、非がん性の組織および臓器との比較で同定された。
【０２１０】
原発性ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、およびＣＬＬサンプルからのＨＬＡ−ペプチド複合体は、精製されてＨＬＡ関連ペプチドが単離され、ＬＣ−ＭＳによって分析された（実施例を参照されたい）。本出願に含まれる全てのＴＵＭＡＰは、このアプローチによって、ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、および／またはＣＬＬサンプル上で同定され、これらの腫瘍型上のそれらの提示が確認された。
【０２１１】
複数の腫瘍および正常組織上で同定されたＴＵＭＡＰは、無標識ＬＣ−ＭＳデータのイオン計数を使用して定量化された。方法は、ペプチドのＬＣ−ＭＳシグナル面積が、サンプル中のその存在量に相関すると仮定する。様々なＬＣ−ＭＳ実験におけるペプチドの全ての定量的シグナルは、中心傾向に基づいて正規化され、サンプルあたりで平均化されて、提示プロファイルと称される棒グラフにマージされた。提示プロファイルは、タンパク質データベース検索、スペクトルクラスタリング、電荷状態デコンボリューション（除電）、および滞留時間アライメントおよび正規化のような、異なる解析法を統合する。
【０２１２】
さらに、発見パイプラインＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）ｖ２．ｘは、がんまたはその他の感染組織上で、ＭＨＣ拘束性、好ましくはＨＬＡ拘束性のペプチドレベルの直接絶対定量化ができるようにする。簡単に述べると、分析された組織サンプルの全ＤＮＡ含有量から、総細胞数が計算された。組織サンプル中のＴＵＭＡＰの全ペプチド量は、天然ＴＵＭＡＰと、既知量のＴＵＭＡＰの同位体標識バージョン、いわゆる内標準との比率として、ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定された。ＴＵＭＡＰ単離の効率は、ＴＵＭＡＰ単離手順の可能な限り早い時点で、全ての選択されたＴＵＭＡＰのペプチド：ＭＨＣ複合体を組織溶解産物中に添加して、ペプチド単離手順の完了に続く、ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるそれらの検出によって判定された。総細胞数および全ペプチド量は、組織サンプルあたり三連の測定から計算された。ペプチド単離効率は、それぞれ三連で測定された、１０回の添加実験からの平均として計算された（実施例６および表１１を参照されたい）。
【０２１３】
このＲＮＡ発現および質量分析データの複合解析は、本発明の２８８個のペプチドをもたらした。多くの場合、ペプチドは少数の腫瘍のみで同定された。しかしながら、通例の質量分析分析の限定的感度のために、ＲＮＡデータが、カバー度推定のためのより良好な基礎を提供する（実施例２を参照されたい）。
【０２１４】
本発明は、がん／腫瘍、好ましくは、本発明のペプチドを過剰にまたは排他的に提示する、ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、およびＣＬＬの治療において有用なペプチドを提供する。これらのペプチドは、ＨＬＡ分子によって、原発性ヒトＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、ＣＬＬサンプル上に、および／またはＰＣサンプル上に自然に提示されることが、質量分析によって示された。
【０２１５】
それにペプチドが由来する、起源遺伝子／タンパク質の多く（「完全長タンパク質」または「基本的タンパク質」とも称される）は、正常組織と比較して、がんにおいて非常に過剰発現されることが示され、本発明との関連で「正常組織」は、腫瘍に対応する健康な組織型（肝臓、結腸／直腸、脳、胃、食道、肺、膵臓、腎臓、前立腺、卵巣、皮膚、乳房、および白血球）、あるいは起源遺伝子の高度な腫瘍結合を示すその他の正常組織細胞のどちらかを意味するものとする（実施例２を参照されたい）。さらに、ペプチドそれ自体が腫瘍組織上で大きく過剰提示され、本発明との関連で「腫瘍組織」は、ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、またはＣＬＬに罹患している患者に由来するが、正常組織でないサンプルを意味するものとする（実施例１を参照されたい）。
【０２１６】
ＨＬＡ結合ペプチドは、免疫系、具体的にはＴリンパ球によって、認識され得る。Ｔ細胞は、例えば、誘導ペプチドを提示する、ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＰＣ、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、またはＣＬＬ細胞などの認識されるＨＬＡ／ペプチド複合体を提示する細胞を破壊し得る。
【０２１７】
本発明のペプチドは、Ｔ細胞応答を刺激でき、および／または過剰提示されることが示されおり、したがって本発明に従って、抗体および／または可溶性ＴＣＲなどのＴＣＲの製造のために使用され得る（実施例３、実施例４を参照されたい）。さらに、ペプチドは、それぞれのＭＨＣと複合体化した場合にも、抗体および／またはＴＣＲ、特に本発明によるＴＣＲ製造のために利用され得る。それぞれの方法は、当業者に良く知られており、それぞれの参考文献にもまた見られる。したがって本発明のペプチドは、それによって腫瘍細胞が破壊され得る、患者における免疫応答を生じさせるのに有用である。患者における免疫応答は、理想的には免疫原性を増強する薬剤（すなわちアジュバント）との組み合わせで、記載されるペプチド、または適切な前駆体（例えば伸長ペプチド、タンパク質、またはこれらのペプチドをコードする核酸）を患者に直接投与することで、誘導され得る。本発明の標的ペプチドは、正常組織上では同等のコピー数で提示されないので、このような治療的ワクチン接種から生じる免疫応答は、腫瘍細胞に対して高度に特異的であることが予測され得て、患者の正常細胞に対する望まれない自己免疫反応のリスクを防止する。
【０２１８】
本明細書は、鎖およびａβ鎖（「α／βＴＣＲ」）を含んでなるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）にさらに関する。ＭＨＣ分子によって提示された際に、ＴＣＲおよび抗体に結合できるペプチドもまた提供される。本明細書はまた、本明細書のＴＣＲおよびペプチドを発現するための核酸、ベクター、および宿主細胞；そしてそれを使用する方法にも関する。
【０２１９】
「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲと略記される）という用語は、αポリペプチド鎖（α鎖）およびａβポリペプチド鎖（β鎖）を含んでなるヘテロ二量体分子を指し、ヘテロ二量体受容体は、ＨＬＡ分子によって提示されるペプチド抗原と結合できる。本用語は、いわゆるγ／δＴＣＲもまた含む。
【０２２０】
一実施形態では、本明細書は、本明細書に記載されるようなＴＣＲを製造する方法を提供し、方法は、ＴＣＲの発現を促進するのに適した条件下でＴＣＲを発現できる、宿主細胞を培養するステップを含んでなる。
【０２２１】
本明細書の別の態様では、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞または人工抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩ  ＭＨＣ分子上に、抗原が負荷され、または抗原／クラスＩまたはＩＩ  ＭＨＣ複合体モノマーを四量体化することで、クラスＩまたはＩＩ  ＭＨＣ四量体上に抗原が負荷される、本明細書に記載の方法に関する。
【０２２２】
α／βＴＣＲのαおよびβ鎖、そしてγ／δＴＣＲのγおよびδ鎖は、一般にそれぞれ２つの「領域」、すなわち可変および定常領域を有すると見なされる。可変領域は、可変領域（Ｖ）の連結と、連結領域（Ｊ）とからなる。可変領域はまた、リーダー領域（Ｌ）を含んでもよい。βおよびδ鎖はまた、多様性領域（Ｄ）を含んでもよい。αおよびβ定常領域はまた、αおよびβ鎖を細胞膜に固着させるＣ末端膜貫通（ＴＭ）領域を含んでもよい。
【０２２３】
γ／δＴＣＲに関して、「ＴＣＲγ可変領域」という用語は、本明細書の用法では、リーダー領域（Ｌ）のないＴＣＲγＶ（ＴＲＧＶ）領域とＴＣＲγＪ（ＴＲＧＪ）領域との連結を指し、ＴＣＲγ定常領域という用語は、細胞外ＴＲＧＣ領域、またはＣ末端トランケート型ＴＲＧＣ配列を指す。同様に、「ＴＣＲδ可変領域」という用語は、リーダー領域（Ｌ）のないＴＣＲδＶ（ＴＲＤＶ）領域とＴＣＲδＤ／Ｊ（ＴＲＤＤ／ＴＲＤＪ）領域との連結を指し「ＴＣＲδ定常領域」という用語は、細胞外ＴＲＤＣ領域、またはｔＣ末端トランケート型ＴＲＤＣ配列を指す。
【０２２４】
本明細書のＴＣＲは、好ましくは、約１００μＭ以下、約５０μＭ以下、約２５μＭ以下、または約１０μＭ以下の結合親和性（ＫＤ）で、ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に結合する。より好ましいのは、約１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下の結合親和性を有する、高親和性ＴＣＲである。本発明のＴＣＲの好ましい結合親和性範囲の非限定的例としては、約１ｎＭ〜約１０ｎＭ；約１０ｎＭ〜約２０ｎＭ；約２０ｎＭ〜約３０ｎＭ；約３０ｎＭ〜約４０ｎＭ；約４０ｎＭ〜約５０ｎＭ；約５０ｎＭ〜約６０ｎＭ；約６０ｎＭ〜約７０ｎＭ；約７０ｎＭ〜約８０ｎＭ；約８０ｎＭ〜約９０ｎＭ；および約９０ｎＭ〜約１００ｎＭが挙げられる。
【０２２５】
本明細書の用法では、本明細書のＴＣＲとの関連で、「特異的結合」およびそれらの文法的変種は、ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に対して、１００μＭ以下の結合親和性（ＫＤ）を有するＴＣＲを意味するために使用される。
【０２２６】
本明細書のα／βヘテロ二量体ＴＣＲは、それらの定常領域の間に導入された、ジスルフィド結合を有してもよい。このタイプの好ましいＴＣＲとしては、ＴＲＡＣ定常領域配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常領域配列とを有するものが挙げられるが、ただし、ＴＲＡＣのＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のＳｅｒ５７は、システイン残基によって置換されている。前記システインは、ＴＣＲのＴＲＡＣ定常領域配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常領域配列との間に、ジスルフィド結合を形成する。
【０２２７】
上述の導入された鎖間結合の存在下または不在下で、本明細書のα／βヘテロ二量体ＴＣＲは、ＴＲＡＣ定常領域配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常領域配列とを有してもよく、ＴＣＲのＴＲＡＣ定常領域配列と、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常領域配列とが、ＴＲＡＣのエクソン２のＣｙｓ４と、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のエクソン２のＣｙｓ２との間の天然ジスルフィド結合によって連結されてもよい。
【０２２８】
本明細書のＴＣＲは、放射性核種、フルオロフォア、およびビオチンからなる群から選択される、検出可能な標識を含んでなってもよい。本明細書のＴＣＲは、放射性核種、化学療法剤、または毒素などの治療的活性薬剤にコンジュゲートされてもよい。
【０２２９】
一実施形態では、α鎖に少なくとも１つの変異を有し、および／またはβ鎖に少なくとも１つの変異を有する本明細書のＴＣＲは、非変異ＴＣＲと比較して修飾されたグリコシル化を有する。
【０２３０】
一実施形態では、ＴＣＲα鎖および／またはＴＣＲβ鎖に少なくとも１つの変異を含んでなるＴＣＲは、ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に対して、非変異ＴＣＲα鎖および／または非変異ＴＣＲβ鎖を含んでなるＴＣＲの少なくとも２倍の結合親和性および／または結合半減期を有する。腫瘍特異的ＴＣＲの親和性増大とその利用は、最適ＴＣＲ親和性のウィンドウの存在に依存する。このようなウィンドウの存在は、ＨＬＡ−Ａ２限定病原体に対して特異的なＴＣＲが、ＨＬＡ−Ａ２限定腫瘍関連自己抗原に対して特異的なＴＣＲと比較して、一般に約１０分の１のＫＤ値を有するという観察に基づく。腫瘍抗原は免疫原性である可能性を有するが、腫瘍は個人自身の細胞から生じるので、改変された翻訳プロセッシングのある変異型タンパク質またはタンパク質のみが、免疫系によって異質と見なされことが今や知られている。上方制御されまたは過剰発現される抗原（いわゆる自己抗原）は、腫瘍に対する機能性免疫応答を必ずしも誘導しない。これらの抗原に対して高度に反応性のＴＣＲを発現するＴ細胞は、中枢性免疫寛容として知られている過程、すなわち自己抗原に対する低親和性ＴＣＲがあるＴ細胞のみが残留する過程によって、胸腺内で負選択される。したがって、発明によるペプチドに対する本明細書のＴＣＲまたは変異体の親和性は、当該技術分野で周知の方法によって増大され得る。
【０２３１】
本明細書は、本明細書に従ってＴＣＲを同定して単離する方法にさらに関し、前記方法は、ＨＬＡ−Ａ＊０２陰性健常ドナーからのＰＢＭＣをＡ２／ペプチドモノマーと共にインキュベートするステップと、ＰＢＭＣを四量体フィコエリトリン（ＰＥ）と共にインキュベートするステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
【０２３２】
本明細書は、本明細書に従ってＴＣＲを同定して単離する方法にさらに関し、前記方法は、そのＴ細胞がマウスＴＣＲ欠損を補償する多様なヒトＴＣＲレパートリーを発現する、全ヒトＴＣＲαβ遺伝子遺伝子座（１．１および０．７Ｍｂ）がある遺伝子組換えマウスを得るステップと、マウスを目的ペプチドで免疫化するステップと、四量体フィコエリトリン（ＰＥ）がある遺伝子組換えマウスから得られるＰＢＭＣをインキュベートするステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
【０２３３】
一態様では、本明細書のＴＣＲを発現するＴ細胞を得るために、本明細書のＴＣＲ−αおよび／またはＴＣＲ−β鎖をコードする核酸が、γレトロウイルスまたはレンチウイルスなどの発現ベクターにクローン化される。組換えウイルスが生成され、次に、抗原特異性および機能性結合活性などの機能について試験される。次に、最終生成物のアリコートを使用して、標的Ｔ細胞集団（一般に患者のＰＢＭＣから精製される）が形質導入され、それは患者への輸液前に増殖される。
【０２３４】
別の態様では、本明細書のＴＣＲを発現するＴ細胞を得るために、例えば、生体外転写システムなどの当該技術分野で公知の技術によって、ＴＣＲ  ＲＮＡが合成される。次に生体外で合成されたＴＣＲ  ＲＮＡは、健常ドナーから得られた原発性ＣＤ８＋Ｔ細胞内に、電気穿孔によって導入され、腫瘍特異的ＴＣＲ−αおよび／またはＴＣＲ−β鎖が再発現される。
【０２３５】
発現を増大させるために、本明細書のＴＣＲをコードする核酸は、レトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）Ｕ３、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、β−アクチン、ユビキチン、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）／ＣＤ４３複合プロモーター、伸長因子（ＥＦ）−１ａ、および脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーターなどの強力なプロモーターと作動可能に連結されてもよい。好ましい実施形態では、プロモーターは、発現される核酸に対して異種である。
【０２３６】
強力なプロモーターに加えて、本明細書のＴＣＲ発現カセットは、レンチウイルスコンストラクトの核転座を促進する、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）（Ｆｏｌｌｅｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、およびＲＮＡ安定性を増大させることで導入遺伝子発現のレベルを高める、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ｗＰＲＥ）（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）をはじめとする、導入遺伝子発現を促進し得る追加的な要素を含有してもよい。
【０２３７】
本発明のＴＣＲのαおよびβ鎖は、別々のベクターにある核酸によってコードされてもよく、または同一ベクターにあるポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
【０２３８】
高レベルのＴＣＲ表面発現の達成には、導入されたＴＣＲのＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の双方が、高レベルで転写される必要がある。これを行うために、本明細書のＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖は、この障害を克服できることが示されている、単一ベクター内のバイシストロニックコンストラクトにクローン化されてもよい。ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖は、翻訳中に２つのタンパク質に分かれて等モル比のＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の生成を確実にする単一転写物から生成されるので、ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の間のウイルス配列内リボソーム進入部位の使用は、双方の鎖の協調発現をもたらす（Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。
【０２３９】
本明細書のＴＣＲをコードする核酸はコドン最適化されて、宿主細胞からの発現が増大されてもよい。遺伝コードの重複は、いくつかのアミノ酸が２つ以上のコドンによってコードされるようにするが、特定のコドンは、適合ｔＲＮＡの相対可用性ならびにその他の要因のために、他のものよりも「最適」でない（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。各アミノ酸が、哺乳類遺伝子発現のための最適コドンによってコードされるように、ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β遺伝子配列を修飾すること、ならびにｍＲＮＡ不安定モチーフまたは潜在的スプライス部位を除去することは、ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β遺伝子発現を有意に促進することが示されている（Ｓｃｈｏｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０２４０】
さらに、導入ＴＣＲ鎖と内在性ＴＣＲ鎖の間の誤対合は、自己免疫に重大なリスクをもたらす特異性の獲得を引き起こすこともある。例えば、混合ＴＣＲ二量体の形成は、適切に対合するＴＣＲ複合体を形成するために利用できるＣＤ３分子の数を減少させてもよく、ひいては導入ＴＣＲを発現する細胞の機能性結合活性を有意に低下させ得る（Ｋｕｂａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０２４１】
誤対合を減少させるために、本明細書の導入ＴＣＲ鎖のＣ末端領域は、鎖間親和性を高める一方で、導入鎖が内在性ＴＣＲと対形成する能力を低下させるために、修飾されてもよい。これらのストラテジーとしては、ヒトＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−βのＣ末端領域をそれらのマウス対応物（マウス化Ｃ末端領域）で置換する；導入ＴＣＲのＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の双方に第２のシステイン残基を導入することで、Ｃ末端領域に第２の鎖間ジスルフィド結合を作成する（システイン修飾）；ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖Ｃ末端領域内の相互作用残基を交換する（「ノブ・イン・ホール」）；そしてＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の可変領域をＣＤ３ζに直接融合させる（ＣＤ３ζ融合）が挙げられる（Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。
【０２４２】
一実施形態では、宿主細胞は、本細書のＴＣＲを発現するように遺伝子操作される。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ヒトＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞は、がん患者から得られる。その他の実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞は、健常ドナーから得られる。本明細書の宿主細胞は、治療される患者に関して、同種異系または自己由来であり得る。一実施形態では、宿主は、α／βＴＣＲを発現するように形質転換されたγ／δＴ細胞である。
【０２４３】
「医薬組成物」は、医学的状況においてヒトへの投与に適する組成物である。好ましくは、医薬組成物は無菌であり、ＧＭＰガイドラインに準拠して製造される。
【０２４４】
医薬組成物は、遊離形態または薬学的に許容可能な塩の形態のどちらかのペプチドを含んでなる（上記もまた参照されたい）。本明細書の用法では、「薬学的に許容可能な塩」は、開示されたペプチドの誘導体を指し、ペプチドは、薬剤の酸性または塩基性塩を生成することで修飾される。例えば、酸性塩は、適切な酸との反応を伴って、遊離塩基から調製される（典型的に、薬剤の中性形態が中性ＮＨ２基を有する）。酸性塩を調製するための適切な酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸、ならびに例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸リン酸などの無機酸の双方が挙げられる。逆に、ペプチド上に存在してもよい酸部分の塩基性塩の調製物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミンなどの薬学的に許容可能な塩基を用いて調製される。
【０２４５】
特に好ましい一実施形態では、医薬組成物は、酢酸（酢酸塩）、トリフルオロ酢酸または塩酸（塩化物）の塩としてのペプチドを含んでなる。
【０２４６】
好ましくは、本発明の薬剤は、ワクチンなどの免疫療法剤である。それは、患者に直接、罹患臓器に、または全身的に、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、およびｉ．ｖ．投与され、または生体外で患者またはヒト細胞系に由来する細胞に適用されて、それが引き続いて患者に投与され、または生体外で使用されて患者に由来する免疫細胞の亜集団が選択され、次にそれが患者に再投与されてもよい。核酸が、生体外で細胞に投与される場合、インターロイキン２などの免疫刺激サイトカインを同時発現させるように、細胞を形質移入することが有用であってもよい。ペプチドは、実質的に純粋であり、または免疫刺激アジュバント（下記参照）と組み合わされ、または免疫賦活性サイトカインと組み合わせて使用され、または例えばリポソームなどの適切な送達系によって投与されてもよい。ペプチドはまた、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）またはマンナンなどの適切な担体に共役されてもよい（国際公開第号パンフレット９５／１８１４５、および（Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）を参照されたい）。ペプチドはまた、標識されてもよく、融合タンパク質であってもよく、またはハイブリッド分子であってもよい。その配列が本発明に記載されるペプチドは、ＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞を刺激することが予測される。しかし、ＣＤ８  Ｔ細胞の刺激は、ＣＤ４  Ｔヘルパー細胞によって提供される援助の存在下で、より効率的である。したがって、ＣＤ８  Ｔ細胞を刺激するＭＨＣクラスＩエピトープでは、ハイブリッド分子の融合パートナーまたはセクションは、適切にはＣＤ４陽性Ｔ細胞を刺激するエピトープを提供する。ＣＤ４およびＣＤ８刺激エピトープは、当該技術分野で周知であり、本発明で同定されたものを含む。
【０２４７】
一態様では、ワクチンは、配列番号１〜配列番号２８８に記載されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドと、少なくとも１つの追加的なペプチド、好ましくは２〜５０、より好ましくは２〜２５、なおもより好ましくは２〜２０、最も好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８個のペプチドとを含んでなる。ペプチドは、１つまたは複数の特異的ＴＡＡから誘導されてもよく、ＭＨＣクラスＩ分子に結合してもよい。
【０２４８】
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドまたはペプチド変異体をエンコードする核酸（例えばポリヌクレオチド）を提供する。ポリヌクレオチドは、それがペプチドをコードしさえすれば、例えば、単鎖および／または二本鎖のいずれかのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよく、または例えばホスホロチオエート主鎖があるポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドの未変性または安定化形態であってもよく、それはイントロンを含有してもまたはしなくてもよい。もちろん、天然起源ペプチド結合によって連結する天然アミノ酸残基を含有するペプチドのみが、ポリヌクレオチドによってエンコードされ得る。本発明のなおもさらなる態様は、本発明によるポリペプチドを発現できる発現ベクターを提供する。
【０２４９】
例えば相補的付着端を通じて、ポリヌクレオチド、特にＤＮＡをベクターに連結する、多様な方法が開発されている。例えば、ベクターＤＮＡに挿入されるＤＮＡ断片に、相補的ホモポリマー配列が付加され得る。次に、相補的ホモポリマー尾部間の水素結合によって、ベクターおよびＤＮＡ断片が連結されて、組換えＤＮＡ分子が形成する。
【０２５０】
１つまたは複数の制限酵素認識部位を含有する合成リンカーは、ＤＮＡ断片をベクターに連結する代替え方法を提供する。多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＮ，ＵＳＡをはじめとするいくつかの供給元から、商業的に入手できる。
【０２５１】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを修飾する望ましい方法は、Ｓａｉｋｉ  ＲＫ，ｅｔ  ａｌ．（Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）で開示されるようなポリメラーゼ連鎖反応を用いる。この方法は、例えば適切な制限酵素認識部位を改変することで、ＤＮＡを適切なベクターに導入するために使用されてもよく、またはそれは、当該技術分野で既知のその他の有用な様式でＤＮＡを修飾するために使用されてもよい。ウイルスベクターを使用するのであれば、ポックスウイルスまたはアデノウイルスベクターが好ましい。
【０２５２】
次にＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）を適切な宿主内で発現させて、本発明のペプチドまたは変異体を含んでなるポリペプチドが製造されてもよい。このようにして、本明細書に含まれる教示を考慮して適切に修正された既知の技術に従って、本発明のペプチドまたは変異体をコードするＤＮＡを使用して、発現ベクターが構築されてもよく、次にそれを使用して、本発明のポリペプチドの発現および製造のために、適切な宿主細胞が形質転換される。このような技術としては、例えば、米国特許第４，４４０，８５９号明細書、米国特許第４，５３０，９０１号明細書、米国特許第４，５８２，８００号明細書、米国特許第４，６７７，０６３号明細書、米国特許第４，６７８，７５１号明細書、米国特許第４，７０４，３６２号明細書、米国特許第４，７１０，４６３号明細書、米国特許第４，７５７，００６号明細書、米国特許第４，７６６，０７５号明細書、米国特許第および４，８１０，６４８号明細書で開示されるものが挙げられる。
【０２５３】
本発明の化合物を構成するポリペプチドをエンコードするＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）は、適切な宿主への導入のために、多種多様なその他のＤＮＡ配列に連結されてもよい。コンパニオンＤＮＡは、宿主の性質、ＤＮＡの宿主への導入様式、およびエピソームの維持または組み込みが所望されるかどうかに左右される。
【０２５４】
一般に、ＤＮＡは、発現のための適切な方向および正しい読み枠で、プラスミドなどの発現ベクター中に挿入される。必要ならば、ＤＮＡは、所望の宿主によって認識される適切な転写および翻訳制御調節ヌクレオチド配列に連結されてもよいが、このような調節は、一般に発現ベクター内で利用できる。次に、標準的な技術を通じて、ベクターが宿主に導入される。一般に、全ての宿主がベクターによって形質転換されるわけではない。したがって、形質転換された宿主細胞を選択することが必要になる。一選択技術は、抗生物質耐性などの形質転換細胞内で選択可能な形質をコードする、任意の必要な制御要素があるＤＮＡ配列を発現ベクター内に組み込むことを伴う。
【０２５５】
代案としては、このような選択可能な形質の遺伝子は、所望の宿主細胞を同時形質転換するのに使用される、別のベクター上にあり得る。
【０２５６】
次に、本明細書で開示される教示を考慮して、当業者に知られている適切な条件下で十分な時間にわたり、本発明の組換えＤＮＡによって形質転換された宿主細胞が培養されてポリペプチドが発現され、次にそれが回収れさ得る。
【０２５７】
細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌（例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞、および昆虫細胞をはじめとする多数の発現系が知られている。好ましくは、細胞系は、ＡＴＣＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できるＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞であり得る。
【０２５８】
構成的発現のための典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドは、適切なポリＡ尾部と、ネオマイシンなどの耐性マーカーとがある、ＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーターを含んでなる。一例は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡから入手できるｐＳＶＬである。誘導性哺乳類発現ベクターの一例であるｐＭＳＧもまた、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手できる。有用な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、通常、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ  ９２０３７，ＵＳＡから入手できる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、およびｐＲＳ４０６は、酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母の選択可能なマーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、およびＵＲＡ３が組み込まれている。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母セントロメアプラスミド（Ｙｃｐｓ）である。ＣＭＶプロモーターベースのベクター（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）は、一過性または安定性発現、細胞質内発現または分泌、およびＦＲＡＧ、３ｘＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃまたはＭＡＴの様々な組み合わせでのＮ末端またはＣ末端標識付けを提供する。これらの融合タンパク質は、組換えタンパク質を検出、精製、および分析できるようにする。二重標識融合物は、検出に融通性を与える。
【０２５９】
強力なヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター調節領域は、ＣＯＳ細胞内において、構成タンパク質発現レベルを１ｍｇ／Ｌ程度の高さに駆動する。効力がより低い細胞系では、タンパク質レベルは、典型的に約０．１ｍｇ／Ｌである。ＳＶ４０複製起点の存在は、ＳＶ４０複製許容ＣＯＳ細胞内で、高レベルのＤＮＡ複製をもたらす。例えば、ＣＭＶベクターは、細菌細胞内のｐＭＢ１（ｐＢＲ３２２の誘導体）複製起点、細菌内のアンピシリン耐性選択のためのｂ−ラクタマーゼ遺伝、ｈＧＨポリＡ、およびｆ１起点を含有し得る。プレプロトリプシンリーダー（ＰＰＴ）配列を含有するベクターは、抗ＦＲＡＧ抗体、樹脂、およびプレートを使用する精製のために、培養液中へのＦＲＡＧ融合タンパク質分泌を誘導し得る。多様な宿主細胞で使用するためのその他のベクターおよび発現系が、当該技術分野で周知である。
【０２６０】
別の実施形態では、本発明の２つ以上のペプチドまたはペプチド変異型がコードされ、したがって順次発現される（「数珠玉構造」コンストラクトに類似する）。その際に、ペプチドまたはペプチド変異型は、例えばＬＬＬＬＬＬなどの一続きのリンカーアミノ酸によって、共に連結または融合されてもよく、またはそれらの間のいかなる追加的なペプチドもなしに連結されてもよい。これらのコンストラクトはまた、がん療法のために使用され得て、ＭＨＣ  ＩとＭＨＣ  ＩＩの双方が関与する免疫応答を誘導してもよい。
【０２６１】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドベクターコンストラクトで形質転換された宿主細胞にも関する。宿主細胞は、原核または真核生物のどちらかであり得る。細菌細胞は、いくつかの状況では、好ましい原核宿主細胞であってもよく、典型的には、例えば、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡから入手できる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５株、および米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡから入手できるＲＲ１（ＡＴＣＣ番号３１３４３）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。好ましい真核宿主細胞としては、酵母、昆虫、および哺乳類細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒト線維芽および結腸細胞株に由来するものなどの脊椎動物細胞が挙げられる。酵母宿主細胞としては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ  ９２０３７，ＵＳＡから一般に入手できる、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００、およびＹＰＨ５０１が挙げられる。好ましい哺乳類宿主細胞としては、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手できるＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５０として入手できるサル腎臓由来ＣＯＳ−１細胞、およびヒト胎児由来腎臓細胞である２９３細胞が挙げられる。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターで形質移入され得るＳｆ９細胞である。発現のための適切な宿主細胞の選択に関する概説は、例えば、Ｐａｕｌｉｎａ  Ｂａｌｂａｓ  ａｎｄ  Ａｒｇｅｌｉａ  Ｌｏｒｅｎｃｅの教科書”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｒｅｖｉｅｗｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”Ｐａｒｔ  Ｏｎｅ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ  ９７８−１−５８８２９−２６２−９、および当業者に知られているその他の文献にある。
【０２６２】
本発明のＤＮＡコンストラクトによる適切な細胞宿主の形質転換は、典型的に使用されるベクターのタイプに左右される周知の方法によって達成される。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７２）および（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２）を参照されたい。酵母細胞の形質転換は、Ｓｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）に記載される。Ｂｅｇｇｓ（Ｂｅｇｇｓ，１９７８）の方法もまた、有用である。脊椎動物細胞に関しては、このような細胞を形質移入するのに有用な、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランまたはリポソーム製剤などの試薬は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ  ２０８７７，ＵＳＡから入手できる。電気穿孔もまた、細胞を形質転換および／または形質移入するのに有用であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、および脊椎動物細胞を形質転換する技術分野で周知である。
【０２６３】
成功裏に形質転換された細胞、すなわち本発明のＤＮＡコンストラクトを含有する細胞は、ＰＣＲなどの周知の技術によって同定され得る。代案としては、上清中のタンパク質の存在が、抗体を使用して検出され得る。
【０２６４】
例えば、細菌、酵母、および昆虫細胞などの本発明の特定の宿主細胞は、本発明のペプチドの調製において有用であることが理解されるであろう。しかしその他の宿主細胞が、特定の治療法において有用であってもよい。例えば、樹状細胞などの抗原提示細胞は、それらが適切なＭＨＣ分子内に負荷されてもよいように、本発明のペプチドを発現するために有用に使用されてもよい。したがって、本発明は、本発明による核酸または発現ベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。
【０２６５】
好ましい実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞または抗原提示細胞である。前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）を含有する組換え融合タンパク質が負荷されたＡＰＣは、無症候性または微小症候性転移性ＨＲＰＣを治療するために、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって２０１０年４月２０日に認可された（シプロイセルＴ）（Ｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｓｍａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０２６６】
本発明のさらなる態様は、宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる。ペプチドまたはその変異型を製造する方法を提供する。
【０２６７】
別の実施形態では、本発明のペプチド、核酸または発現ベクターは、医療で使用される。例えば、ペプチドまたはその変異体は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射のために調合されてもよい。ペプチド注射の好ましい方法としては、ｓ．ｃ．、ｉ．ｄ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、およびｉ．ｖ．が挙げられる。ＤＮＡ注射の好ましい方法としては、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、およびｉ．ｖ．が挙げられる。例えば、５０μｇ〜１．５ｍｇ、好ましくは１２５μｇ〜５００μｇのペプチドまたはＤＮＡの用量が投与されてもよく、それぞれのペプチドまたはＤＮＡに左右される。この範囲の用量は、以前の治験で成功裏に使用された（Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０２６８】
活性ワクチン接種のために使用されるポリヌクレオチドは、実質的に純粋であってもよく、または適切なベクターまたは送達系に含有されてもよい。核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよい。このような核酸をデザインして導入する方法は、当該技術分野で周知である。概説は、例えば、Ｔｅｕｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｅｕｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）によって提供される。ポリヌクレオチドワクチンは調製が容易であるが、免疫応答誘導におけるこれらのベクターの作用機序は、完全には分かっていない。適切なベクターおよび送達系としては、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルスまたは２つ以上のウイルスの構成要素を含有するハイブリッドベースのシステムなどのウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡが挙げられる。非ウイルス送達系としては、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーが挙げられ、ＤＮＡ送達技術分野において周知である。「遺伝子銃」などを通じた物理的送達もまた、使用されてもよい。核酸によってコードされるペプチド（単数）またはペプチド（複数）は、例えば、上述のように、それぞれの逆ＣＤＲのＴ細胞を刺激する、エピトープとの融合タンパク質であってもよい。
【０２６９】
本発明の薬剤は、１つまたは複数のアジュバントもまた含んでもよい。アジュバントは、免疫応答（例えば、ＣＤ８陽性Ｔ細胞およびヘルパーＴ（ＴＨ）細胞によって媒介される抗原に対する免疫応答を非特異的に促進または増強する物質であり、したがって本発明の薬剤中で有用であると見なされる。適切なアジュバントとしては、１０１８  ＩＳＳ、アルミニウム塩、ＡＭＰＬＩＶＡＸ（登録商標）、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、フラジェリンまたはフラジェリン由来ＴＬＲ５リガンド、ＦＬＴ３リガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド（ＡＬＤＡＲＡ（登録商標））、レシキモド、ＩｍｕＦａｃｔＩＭＰ３２１、ＩＬ−２やＩＬ−１３やＩＬ−２１としてのインターロイキン、インターフェロン−αまたは−βまたはそれらのＰＥＧ化誘導体、ＩＳ  Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＩＳＣＯＭｓ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ（登録商標）、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＡＬＰ２、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、モンタニドＩＭＳ１３１２、モンタニドＩＳＡ２０６、モンタニドＩＳＡ５０Ｖ、モンタニドＩＳＡ−５１、油中水型および水中油型エマルション、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＯｓｐＡ、ＰｅｐＴｅｌ（登録商標）ベクター系、ポリ（ラクチドコ−グリコリド）［ＰＬＧ］ベースおよびデキストラン微粒子、タラクトフェリンＳＲＬ１７２、ビロソームおよびその他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦ  ｔｒａｐ、Ｒ８４８、β−グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、サポニン由来Ａｑｕｉｌａ’ｓ  ＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、マイコバクテリア抽出物、および合成細菌細胞壁模倣体、そしてＲｉｂｉ’ｓ  ＤｅｔｏｘまたはＱｕｉｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓなどのその他の独自仕様のアジュバントが挙げられるが、これに限定されるものではない。フロイントまたはＧＭ−ＣＳＦなどのアジュバントが好ましい。樹状細胞およびそれらの調製物に対して特異的な、いくつかの免疫学的アジュバント（例えばＭＦ５９）が、以前記載されている（Ａｌｌｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋｒｕｍｍｅｌ，１９９５）。サイトカインもまた使用されてもよい。数種のサイトカインは、樹状細胞のリンパ組織（例えばＴＮＦ−）への遊走に影響を与えること、Ｔリンパ球（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、およびＩＬ−４）のための効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟を加速すること（その内容全体が参照により本明細書に具体的に援用される、米国特許第５，８４９，５８９号明細書）、および免疫増強剤（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β）として作用することと、直接関連づけられている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【０２７０】
ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドもまた、ワクチン環境において、アジュバント効果を促進することが報告されている。理論により拘束されることなく、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、主にＴＬＲ９を通じた、内在的（非適応性）免疫系の活性化によって作用する。ＣｐＧ誘導性ＴＬＲ９活性化は、ペプチドまたはタンパク質抗原、生きたまたは死滅ウイルス、樹状細胞ワクチン、自己細胞ワクチン、そして予防的および治療的ワクチンの双方における多糖コンジュゲートをはじめとする、多種多様な抗原に対する、抗原特異的体液性および細胞性応答を増強する。より重要なことには、それは樹状細胞の成熟と分化を促進し、ＣＤ４  Ｔ細胞援助の不在下であってさえも、ＴＨ１細胞の活性化促進、および強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）生成をもたらす。ＴＬＲ９刺激によって誘導されるＴＨ１バイアスは、通常はＴＨ２バイアスを促進する、ミョウバンまたは不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）などのワクチンアジュバント存在下であってさえも、維持される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、その他のアジュバントと調合されまたは同時投与された際に、または微粒子、ナノ粒子、脂質エマルションなどの配合物、または類似配合物中で、なおもより高いアジュバント活性を示し、それは、抗原が比較的弱い場合、強力な応答を誘導するのに特に必要である。それらは免疫応答もまた加速し、いくつかの実験では、ＣｐＧなしのワクチン総量と同等の抗体応答で、抗原用量のほぼ２桁分の低減を可能にする（Ｋｒｉｅｇ，２００６）。米国特許第６，４０６，７０５Ｂ１号明細書は、抗原特異的免疫応答を誘導するためのＣｐＧオリゴヌクレオチド、非核酸アジュバント、および抗原の併用を記載する。ＣｐＧ  ＴＬＲ９拮抗薬は、Ｍｏｌｏｇｅｎ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のｄＳＬＩＭ（二重ステムループ免疫修飾物質）であり、それは本発明の医薬組成物の好ましい構成要素である。ＲＮＡ結合ＴＬＲ７、ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ９などのその他のＴＬＲ結合分子もまた、使用されてもよい。
【０２７１】
有用なアジュバントその他の例としては、化学修飾ＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）；ポリ（Ｉ：Ｃ）などのｄｓＲＮＡアナログおよびそれらの誘導体（例えばＡｍｐｌｉＧｅｎ（登録商標）、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）、ポリ（ＩＣＬＣ）、ポリ（ＩＣ−Ｒ）、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）、非ＣｐＧ細菌ＤＮＡまたはＲＮＡ；ならびにシクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ（登録商標）、セレブレックス、ＮＣＸ−４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフェニブ、テモゾロマイド、テムシロリムス、ＸＬ−９９９、ＣＰ−５４７６３２、パゾパニブ、ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、抗ＣＴＬＡ４などの免疫活性小型分子および抗体；免疫系の重要な構造体を標的にするその他の抗体（例えば、抗ＣＤ４０、抗ＴＧＦβ、抗ＴＮＦα受容体）；ＳＣ５８１７５が挙げられるが、これに限定されるものではなく、これらは治療的におよび／またはアジュバントとして作用してもよい。本発明の文脈で有用なアジュバントおよび添加剤の量と濃度は、過度の実験を実施することなく、当業者によって容易に判定され得る。
【０２７２】
好ましいアジュバントは、抗ＣＤ４０、イミキモド、レシキモド、ＧＭ−ＣＳＦ、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、インターフェロンα、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび誘導体、ポリ（Ｉ：Ｃ）および誘導体、ＲＮＡ、シルデナフィル、およびＰＬＧまたはビロソーム微粒子調合物である。
【０２７３】
本発明による薬剤組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチム）、シクロホスファミド、イミキモド、レシキモド、およびインターフェロンαなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。
【０２７４】
本発明による医薬組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチム）、シクロホスファミド、イミキモド、およびレシキモドなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。本発明による薬剤組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、シクロホスファミド、イミキモドまたはレシキモドである。なおもより好ましいアジュバントは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ  １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ポリＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標））、および抗ＣＤ４０ｍＡＢまたはそれらの組み合わせである。
【０２７５】
この組成物は、皮下、皮内、筋肉内などの非経口投与、または経口投与のために使用される。このためには、ペプチドおよび任意選択的にその他の分子が、薬学的に許容可能な、好ましくは水性担体に溶解され、または懸濁される。さらに組成物は、緩衝液、結合剤、ブラスチング剤、希釈剤、風味、潤滑剤などの賦形剤を含有し得る。ペプチドはまた、サイトカインなどの免疫刺激物質と共に投与され得る。このような組成物で使用され得る賦形剤の詳細な一覧は、例えば、Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（Ｋｉｂｂｅ，２０００）から採用され得る。組成物は、腺腫様またはがん性疾患の阻止、予防法および／または治療法のために使用され得る。例示的調合物は、例えば、欧州特許第２１１２２５３号明細書にある。
【０２７６】
本発明によるワクチンによって引き起こされる免疫応答は、異なる細胞分裂期および異なる発生段階のがんを攻撃することを理解することが重要である。さらに、異なるがん関連シグナル伝達経路が攻撃される。これは、１つまたは少数の標的のみに対処して、攻撃に対する腫瘍の容易な適応（腫瘍エスケープ）を引き起こすこともある、ワクチンに優る利点である。さらに個々の腫瘍の全てが、同一パターンの抗原を発現するとは限らない。したがって、いくつかの腫瘍関連ペプチドの組み合わせによって、ありとあらゆる腫瘍が標的の少なくとも一部を有することが確実になる。組成物は、それぞれの腫瘍が抗原のいくつかを発現することを予期して設計され、腫瘍の増殖と維持に必要ないくつかの独立した経路をカバーする。したがって、ワクチンは、より大きな患者集団のために、容易に「出来合」で使用され得る。これは、ワクチンで治療される患者の予備選択が、ＨＬＡタイピングに限定され得て、抗原発現に関する任意の追加的なバイオマーカーアセスメントを必要としないことを意味するが、いくつかの標的が誘導免疫応答によって同時に攻撃されることはなおも確実であり、これは有効性にとって重要である（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０２７７】
本明細書の用法では、「スキャフォールド」という用語は、（例えば、抗原性）決定因子に特異的に結合する分子を指す。一実施形態では、スキャフォールドはまた、それが付着する実体（例えば、（第２の）抗原結合部分）を例えば、抗原決定基（例えば本出願書に記載のペプチドとＭＨＣの複合体）を有する特異的腫瘍細胞または腫瘍間質などの型標的部位に誘導できる。別の実施形態では、キャフォールドは、例えば、Ｔ細胞受容体複合体抗原などのその標的抗原を介して、シグナル伝達を活性化できる。スキャフォールドとしては、抗体およびそれらのフラグメント、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含んでなる抗体の抗原結合ドメイン、少なくとも１つのアンキリンリピートモチーフと単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子とを含んでなる結合タンパク質、アプタマー、（可溶性）ＴＣＲ、および同種または自己由来Ｔ細胞などの（改変）細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。分子が標的に結合するスキャフォールドであるかどうかを評価するために、結合アッセイが実施され得る。
【０２７８】
「特異的」結合は、特異的標的を保有する細胞を殺滅できる活性分子を装備したスキャフォールドが、特異的標的がないがその他のペプチド−ＭＨＣ複合体を提示する別の細胞を殺滅できない程度に、スキャフォールドがその他の天然ペプチド−ＭＨＣ−複合体よりもさらに良好に、目的ペプチド−ＭＨＣ−複合体に結合することを意味する。交差反応性ペプチド−ＭＨＣのペプチドが天然に存在せず、すなわち、ヒトＨＬＡ−ペプチドームに由来しない場合、その他のペプチド−ＭＨＣ複合体への結合は無関係である。標的細胞死滅を評価する試験は、当該技術分野で周知である。それらは、非改変ペプチド−ＭＨＣ提示がある標的細胞（初代細胞または細胞株）、または天然に存在するペプチド−ＭＨＣレベルに達するようにペプチドを負荷された細胞を使用して、実施されるべきである。
【０２７９】
各スキャフォールドは標識を含んでなり得て、それは、標識によって提供されるシグナルの存在または不在を判定することで、結合スキャフォールドが検出され得ることを提供する。例えば、スキャフォールドは、蛍光染料または任意のその他の適用可能な細胞マーカー分子で標識され得る。このようなマーカー分子は、当該技術分野で周知である。例えば、蛍光染料によって提供される蛍光標識は、蛍光またはレーザー走査顕微鏡またはフローサイトメトリーによる、結合アプタマーの視覚化を提供し得る。
【０２８０】
各スキャフォールドは、例えば、ＩＬ−２１、抗−ＣＤ３、および抗−ＣＤ２８などの第２の活性分子にコンジュゲートされ得る。
【０２８１】
ポリペプチドスキャフォールドに関するさらなる情報については、例えば国際公開第２０１４／０７１９７８Ａ１号パンフレットの背景セクション、およびその中で引用された参考文献を参照されたい。
【０２８２】
本発明は、アプタマーにさらに関する。アプタマー（例えば、国際公開第２０１４／１９１３５９号パンフレット、およびその中で引用される文献を参照されたい）は、短い一本鎖核酸分子であり、それは、所定の三次元構造に折り畳まれて、特異的標的構造体を認識し得る。それらは、標的療法を開発するための適切な代案のようであった。アプタマーは、高い親和性および特異性で、多様な複合体標的と選択的に結合することが示されている。
【０２８３】
細胞表面に位置する分子を認識するアプタマーは、過去１０年内に同定されており、診断および治療的アプローチを開発する手段を提供する。アプタマーは、毒性および免疫原性がほぼ皆無であることが示されているので、それらは生物医学的用途のための有望な候補である。確かに、例えば、前立腺特異的膜抗原認識アプタマーなどのアプタマーは、標的療法のために成功裏に用いられており、異種移植片生体内モデルにおいて機能できることが示されている。さらに、特異的腫瘍細胞株を認識するアプタマーが同定されている。
【０２８４】
ＤＮＡアプタマーは、様々ながん細胞、特に固形腫瘍に由来するものに対して広域スペクトル認識特性を示す一方で、非腫瘍形成性および主要健常細胞を認識しないように選択され得る。同定されたアプタマーが、特異的腫瘍サブタイプを認識するだけでなく、むしろ一連の腫瘍と相互作用する場合、これは、アプタマーをいわゆる広域スペクトル診断薬および治療薬として応用可能にする。
【０２８５】
さらに、フローサイトメトリーによる細胞結合挙動の研究は、アプタマーが、ナノモル濃度範囲内の非常に良好な見かけの親和性を見せたことを示した。
【０２８６】
アプタマーは、診断および治療目的で有用である。さらに、アプタマーの一部は腫瘍細胞に取り込まれ、したがって腫瘍細胞内へのｓｉＲＮＡなどの抗がん剤の標的化送達のための分子ビヒクルとして、機能し得ることが示され得る。
【０２８７】
アプタマーは、細胞ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）技術を使用して、細胞および組織などの複合体標的に対して、および本発明による配列番号１〜配列番号２８８のいずれかに記載の配列とＭＨＣ分子とを含んでなり、好ましくはそれからなるペプチド複合体などに対して、選択され得る。
【０２８８】
本発明のペプチドを使用して、ＭＨＣ／ペプチド複合体に対する特異的抗体が生成され、開発され得る。これらは、毒素または放射性物質を患部組織に標的化する治療法のために、使用され得る。これらの抗体の別の用途は、ＰＥＴなどのイメージング目的の放射性核種の患部組織への標的化であり得る。この用途は、小規模な転移の検出、または病的組織のサイズと正確な位置確認の判定を助け得る。
【０２８９】
したがってＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する、組換え抗体を製造する方法を提供することが、本発明のさらなる態様であり、方法は、前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩを発現する細胞を含んでなる、遺伝子操作された非ヒト哺乳類を、前記ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した可溶性形態のＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子によって免疫化するステップと；前記非ヒト哺乳類の抗体産生細胞から、ｍＲＮＡ分子を単離するステップと；前記ｍＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質分子を提示する、ファージディスプレイライブラリーを作成するステップと；前記ファージディスプレイライブラリーから、少なくとも１つのファージを単離するステップとを含んでなり、前記少なくとも１つのファージは、前記ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する、前記抗体を提示する。
【０２９０】
ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する抗体を提供することも、本発明のさらなる態様であり、その中で抗体は、好ましくは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体および／またはキメラ抗体である。
【０２９１】
このような抗体および一本鎖クラスＩ主要組織適合性複合体を製造するそれぞれの方法、ならびにこれらの抗体を製造するためのその他のツールは、本発明の目的で、その内容全体が参照により全て明示的に援用される、国際公開第０３／０６８２０１号パンフレット、国際公開第２００４／０８４７９８号パンフレット、国際公開第０１／７２７６８号パンフレット、国際公開第０３／０７０７５２号パンフレット、および刊行物（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ａ；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ｂ；Ｄｅｎｋｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）で開示される。
【０２９２】
好ましくは、抗体は、２０ナノモル濃度未満、好ましくは１０ナノモル濃度未満の結合親和性で複合体に結合し、それは本発明の文脈で「特異的」とも見なされる。
【０２９３】
本発明は、配列番号１〜配列番号２８８からなる群から選択される配列、または配列番号１〜配列番号２８８と少なくとも８８％相同的な（好ましくは同一の）その変異体を含んでなるペプチド、またはＴ細胞を前記ペプチドと交差反応させるその変異体に関し、前記ペプチドは、基礎となる完全長ポリペプチドでない。
【０２９４】
本発明は、配列番号１〜配列番号２８８からなる群から選択される配列、または、配列番号１〜配列番号２８８と少なくとも８８％相同的な（好ましくは同一の）その変異体を含んでなるペプチドにさらに関し、前記ペプチドまたは変異体は、８〜１００、好ましくは８〜３０、最も好ましくは８〜１４アミノ酸の全長を有する。
【０２９５】
本発明は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩの分子に結合する能力を有する、本発明によるペプチドにさらに関する。
【０２９６】
本発明は、ペプチドが、配列番号１〜配列番号２８８に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる、本発明によるペプチドにさらに関する。
【０２９７】
本発明は、ペプチドが（化学的に）修飾された、および／または非ペプチド結合を含む、本発明によるペプチドにさらに関する。
【０２９８】
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、ペプチドは、融合タンパク質の一部であり、特にＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸を含んでなり、またはペプチドは、例えば樹状細胞特異的抗体などの抗体に（またその中に）融合する。
【０２９９】
本発明は、本発明によるペプチドをエンコードする核酸にさらに関するが、ただしペプチドは完全（完全長）ヒトタンパク質でない。
【０３００】
本発明は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせである、本発明による核酸にさらに関する。
【０３０１】
本発明は、本発明による核酸を発現できる、発現ベクターにさらに関する。
【０３０２】
本発明は、医療、特にＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、またはＣＬＬの治療で使用するための、本発明によるペプチド、本発明による核酸、または本発明による発現ベクターにさらに関する。
【０３０３】
本発明は、本発明による核酸または本発明による発現ベクターを含んでなる、宿主細胞にさらに関する。
【０３０４】
本発明は、抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。
【０３０５】
本発明は、本発明による宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、本発明によるペプチドを製造する方法にさらに関する。
【０３０６】
本発明は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩ  ＭＨＣ分子上に、抗原が負荷される、本発明による方法にさらに関する。
【０３０７】
本発明は、抗原提示細胞が、配列番号１〜配列番号２８８または前記異アミノ酸配列を含有する、前記ペプチドを発現できる、発現ベクターを含んでなる、本発明による方法にさらに関する。
【０３０８】
本発明は、本発明による方法によって製造される活性化Ｔ細胞にさらに関し、前記Ｔ細胞は、本発明によるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する。
【０３０９】
本発明は、本発明によるＴ細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる、患者において、本発明による任意のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する標的細胞を死滅させる方法にさらに関する。
【０３１０】
本発明は、記載される任意のペプチド、本発明による核酸、本発明による発現ベクター、本発明による細胞、または本発明による活性化細胞傷害性Ｔリンパ球の、薬剤としての、または薬剤の製造における、使用にさらに関する。本発明は、薬剤ががんに対して有効である、本発明による使用にさらに関する。
【０３１１】
本発明は、薬剤がワクチンである、本発明による使用にさらに関する。本発明は、薬剤ががんに対して有効である、本発明による使用にさらに関する。
【０３１２】
本発明は、本発明による使用にさらに関し、前記がん細胞は、ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、またはＣＬＬ細胞である。
【０３１３】
本発明は、ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、またはＣＬＬの診断および／または予後診断で使用され得る、本明細書で「標的」と称される、本発明によるペプチドベースの特定のマーカータンパク質およびバイオマーカーにさらに関する。本発明はまた、がん治療のためのこれらの新規標的の使用に関する。
【０３１４】
「抗体（単数）」または「抗体（複数）」という用語は、本明細書では広義に使用され、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方を含む。本発明によれば、非損傷または「完全」免疫グロブリン分子に加えて、「抗体」という用語には、それらが所望の性質のいずれかを示しさえすれば、これらの免疫グロブリン分子のフラグメント（例えば、ＣＤＲ、Ｆｖ、Ｆａｂ、およびＦｃフラグメント）またはポリマー、および免疫グロブリン分子のヒト化バージョンもまた含まれる（例えば、ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、またはＣＬＬマーカー（ポリ）ペプチドの特異的結合；ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、または増大したレベルでがんマーカー遺伝子を発現するＣＬＬ細胞への毒素の送達；および／またはＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、またはＣＬＬマーカーポリペプチドの活性を阻害する）。
【０３１５】
可能な場合は常に、本発明の抗体は、商業的供給元から購入されてもよい。また本発明の抗体は、周知の方法を使用して生成されてもよい。当業者は、完全長ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、またはＣＬＬマーカーポリペプチド、またはそのフラグメントのどちらかを使用して、本発明の抗体が生成されてもよいことを理解するであろう。本発明の抗体を製造するために使用されるポリペプチドは、天然原料から部分的にまたは完全に精製されてもよく、または組換えＤＮＡ技術を使用して製造されてもよい。
【０３１６】
例えば、配列番号１〜配列番号２８８ポリペプチドに記載のペプチドなどの本発明によるペプチドをコードするｃＤＮＡ；またはその変異体またはフラグメントが、原核細胞（例えば、細菌）または真核細胞（例えば、酵母、昆虫、または哺乳類細胞）で発現され得て、その後、その組換えタンパク質は精製されて、本発明による抗体を生成するために使用されるＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、またはＣＬＬマーカーポリペプチドに特異的に結合する、モノクローナルまたはポリクローナル抗体調製物を生成するために使用され得る。
【０３１７】
当業者は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の２つ以上の異なるセットの生成が、その目的の用途（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、生体内イメージング、免疫毒素療法）に必要な特異性および親和性がある抗体を得る可能性を最大化することを理解するであろう。抗体は、それに対して抗体が使用される目的に従って、既知の方法によりそれらの所望の活性について試験された（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、免疫療法など；抗体の生成および試験のさらなるガイダンスについては、例えば、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，２０１４（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，２０１４））を参照されたい。例えば、抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット、ホルマリン固定がんまたは冷凍組織切片の免疫組織化学染色で、試験されてもよい。それらの最初の生体外特性解析後、治療または生体内診断用途を意図した抗体が、既知の臨床試験法によって試験される。
【０３１８】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書の用法では、実質的に均質な抗体集団から入手される抗体を指し；すなわち、母集団を構成する個々の抗体は、微量で存在してもよい可能な自然発生的変異以外は同一である。本明細書では、「モノクローナル抗体」は、それらが所望の拮抗活性を示しさえすれば、その中で重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来しまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する、抗体中の対応する配列と同一または相同的である一方、鎖の残部は、別の種に由来しまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同的である、「キメラ」抗体、ならびにこのような抗体のフラグメントを特に含む（その内容全体が本明細書に援用される、米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。
【０３１９】
本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を使用して調製されてもよい。ハイブリドーマ法では、マウスまたはその他の適切な宿主動物が免疫剤によって典型的に免疫化されて、免疫剤と特異的に結合する抗体を産生しまたは産生できるリンパ球を生じさせる。代案としては、リンパ球は、生体外で免疫化されてもよい。
【０３２０】
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されるものなどの組換えＤＮＡ法によって製造されるものであってもよい。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して、容易に単離および配列決定され得る（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合できる、オリゴヌクレオチドプローブの使用によって）。
【０３２１】
インビトロ法もまた、一価の抗体を調製するのに適する。抗体フラグメント、特にＦａｂフラグメントを作成するための抗体の消化は、当該技術分野で既知の通例の技術を使用して達成され得る。例えば、消化は、パパインを使用して実施され得る。パパイン消化の例は、国際公開第９４／２９３４８号パンフレットおよび米国特許第４，３４２，５６６号明細書に記載される。抗体のパパイン消化は、それぞれ単一抗原結合部位があるＦａｂフラグメントと称される２つの同一の抗原結合フラグメントと、残りのＦｃフラグメントとを典型的に生じる。ペプシン処理は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびｐＦｃ’フラグメントをもたらす。
【０３２２】
抗体フラグメントは、その他の配列に付着するかどうかに関わりなく、フラグメントの活性が非修飾抗体または抗体フラグメントと比較して顕著に変化せずまたは損なわれないという条件で、特定領域または特定アミノ酸残基の挿入、欠失、置換、またはその他の選択された修飾もまた含み得る。これらの修飾は、ジスルフィド結合できるアミノ酸の除去／付加、そのバイオ寿命増大、その分泌特性改変などのいくつかの追加的な特性を提供し得る。いずれにしても、抗体フラグメントは、結合活性、結合領域における結合調節などの生理活性特性を有しなくてはならない。抗体の機能性または活性領域は、タンパク質の特定領域の変異誘発と、それに続く発現と、発現したポリペプチドの試験によって同定されてもよい。このような方法は、当該技術分野の熟練した実務家には容易に分かり、抗体フラグメントをエンコードする核酸の部位特異的変異誘発を含み得る。
【０３２３】
本発明の抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに含んでなってもよい。非ヒト（例えばマウス）抗体などのヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはその他の抗原結合部分配列など）である。ヒト化抗体としては、その中でレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト生物種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換される、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が挙げられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体または移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列のどちらにも見られない、残基を含んでなってもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つおよび典型的に２つの可変領域の実質的に全てを含んでなり、その中では、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体は、至適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部もまた含んでなる。
【０３２４】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野で周知である。通常、ヒト化抗体は、非ヒト起源から導入された、１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と称されることが多く、それは典型的に「移入」可変領域から得られる。ヒト化は、齧歯類ＣＤＲ（複数）またはＣＤＲ（単数）配列を対応するヒト抗体配列によって置換することで、基本的に実施され得る。したがって、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）であり、その中では、実質的に非損傷ヒト可変領域未満が、非ヒト生物種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的にヒト抗体であり、その中ではいくつかのＣＤＲ残基と、おそらくはいくつかのＦＲ残基とが、齧歯類抗体中の類似部位からの残基によって置換される。
【０３２５】
免疫化に際して、内在性免疫グロブリン生成不在下で、ヒト抗体の完全レパートリーを産生できる遺伝子組換え動物（例えばマウス）を用い得る。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異マウスにおける、抗体重鎖連結領域遺伝子のホモ接合型欠失が、内在性抗体生成の完全阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖細胞系変異マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの転写は、抗原チャレンジに際してヒト抗体の産生をもたらす。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー中でも産生され得る。
【０３２６】
本発明の抗体は、好ましくは薬学的に許容できる担体中で、対象に投与される。典型的に、製剤中で適当量の薬理的に許容可能な塩が使用されて、製剤を等張にする。薬理的に許容可能な担体の例としては、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。さらなる担体としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス徐放性製剤が挙げられ、そのマトリックスは、例えば、フィルム、リポソームまたは微粒子などの造形品の形態である。当業者には、例えば、投与される抗体の投与経路と濃度次第で、特定の担体がより好ましくあってもよいことが明らかであろう。
【０３２７】
抗体は、注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内）によって、またはその有効形態での血流への送達を確実にする輸液などのその他の方法によって、対象、患者、または細胞に投与され得る。抗体はまた、腫瘍内または腫瘍周囲経路によって投与されて、局所性ならびに全身性の治療効果を発揮してもよい。局所注射または静脈注射が好ましい。
【０３２８】
抗体を投与するための有効投与量およびスケジュールは、経験的に判定されてもよく、このような測定の実施は、当該技術分野の技術範囲内である。当業者では、投与しなくてはならない抗体用量が、例えば、抗体を投与される対象、投与経路、使用される特定の抗体型、および投与されるその他の薬剤次第で変動することを理解するであろう。単独使用される抗体の典型的な１日量は、上述の要素次第で、１日あたり約１（μｇ／ｋｇ〜最大１００ｍｇ／ｋｇ体重またはそれ以上の範囲であるかもしれない。好ましくは、ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、またはＣＬＬの治療のための、抗体の投与に続いて、治療用抗体の有効性は、熟練した実務家に良く知られている様々な様式で評価され得る。例えば、標準腫瘍イメージング技術を使用して、治療を受ける対象中のがんのサイズ、数、および／または分布がモニターされてもよい。抗体投与不在下で起こる疾患経過と比較して、腫瘍成長を停止させ、腫瘍収縮をもたらし、および／または新規腫瘍の発生を予防する、治療的に投与された抗体は、がん治療のための有効な抗体である。
【０３２９】
特異的ペプチド−ＭＨＣ複合体を認識する可溶性Ｔ細胞受容体（ｓＴＣＲ）を製造する方法を提供することもまた、本発明のさらなる態様である。このような可溶性Ｔ細胞受容体は、特異的Ｔ細胞クローンから生成され得て、それらの親和性は、相補性決定領域を標的とする変異誘発によって増大させ得る。Ｔ細胞受容体の選択目的で、ファージディスプレイが利用され得る（米国特許第２０１０／０１１３３００号明細書、（Ｌｉｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２））。ファージディスプレイ中に、そして薬剤として実用する際に、Ｔ細胞受容体を安定化させる目的で、例えば、非天然ジスルフィド結合、その他の共有結合（一本鎖Ｔ細胞受容体）、または二量体化ドメインによって、αおよびβ鎖を連結させ得る（Ｂｏｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｃａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｗｉｌｌｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。Ｔ細胞受容体は、標的細胞上で特定機能を発揮させるために、毒素、薬剤、サイトカイン（例えば、米国特許第２０１３／０１１５１９１号明細書を参照されたい）、および抗ＣＤ３ドメインのようなエフェクター細胞漸増ドメインなどに、連結させ得る。さらにそれは、養子免疫伝達のために使用されるＴ細胞内で発現させ得る。さらなる情報は、国際公開第２００４／０３３６８５Ａ１号パンフレットおよび国際公開第２００４／０７４３２２Ａ１号パンフレットにある。ＴＣＲの組み合わせは、国際公開第２０１２／０５６４０７Ａ１号パンフレットに記載される。さらなる製造法は、国際公開第２０１３／０５７５８６Ａ１号パンフレットで開示される。
【０３３０】
さらに本発明のペプチドおよび／またはＴＣＲまたは抗体またはその他の結合分子を使用して、病理学者の生検サンプルに基づくがん診断が確認され得る。
【０３３１】
抗体またはＴＣＲはまた、生体内診断アッセイのために使用されてもよい。通常、抗体は、免疫シンチグラフィー（ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｏｇｒａｐｈｙ）を使用して腫瘍が位置確認され得るように、放射性ヌクレオチド（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓなど）で標識される。一実施形態では、抗体またはそれらのフラグメントは、上述のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質の２つ以上の標的の細胞外ドメインに結合し、親和性（Ｋｄ）は１×１０μＭ未満である。
【０３３２】
診断用の抗体は、様々なイメージング法による検出に適するプローブで標識されてもよい。プローブの検出方法としては、蛍光、光学、共焦点および電子顕微鏡検査；磁気共鳴画像法および分光法；蛍光透視法、コンピュータ断層撮影および陽電子放射型断層撮影法が挙げられるが、これに限定されるものではない。適切なプローブとしては、フルオレセイン、ローダミン、エオジンおよびその他のフルオロフォア、放射性同位体、金、ガドリニウムおよびその他のランタニド、常磁性鉄、フッ素１８およびその他の陽電子放出放射性核種が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、プローブは二官能価または多官能価であってもよく、列挙される方法の１つ以上によって検出可能である。これらの抗体は、前記プローブで直接または間接的に標識されてもよい。特に十分に技術分野で承認されている、プローブの抗体への付着としては、プローブの共有結合、プローブの抗体への組み込み、およびプローブ結合のためのキレート化合物の共有結合が挙げられる。免疫組織化学的検査では、疾患組織サンプルは、新鮮または冷凍であってもよく、またはパラフィン包埋されてホルマリンなどの保存料で固定されてもよい。サンプルを含有する固定または包埋切片は、標識一次抗体および二次抗体と接触されて、抗体を使用して原位置タンパク質発現が検出される。
【０３３３】
本発明の別の態様は、活性化Ｔ細胞を製造するインビトロ法を含み、方法は、生体外Ｔ細胞を、適切な抗原提示細胞の表面に発現される抗原負荷ヒトＭＨＣ分子に、Ｔ細胞を抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり接触させるステップを含んでなり、抗原は本発明によるペプチドである。好ましくは、抗原提示細胞と共に、十分な量の抗原が使用される。
【０３３４】
好ましくは、哺乳類細胞は、ＴＡＰペプチド輸送体のレベルまたは機能が皆無でありまたは低下している。ＴＡＰペプチド輸送体が欠如している適切な細胞としては、Ｔ２、ＲＭＡ−Ｓ、およびショウジョウバエ細胞が挙げられる。ＴＡＰは、抗原処理に関連する輸送体である。
【０３３５】
ヒトペプチド負荷欠損細胞株Ｔ２は、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２，ＵＳＡの米国微生物系統保存機関からカタログ番号ＣＲＬ１９９２の下に入手でき；ショウジョウバエ細胞株Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ株２は、カタログ番号ＣＲＬ１９８６３の下にＡＴＣＣから入手でき；マウスＲＭＡ−Ｓ細胞株は、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｋａｒｒｅ，１９８５）に記載される。
【０３３６】
好ましくは、移入前に、宿主細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子を実質的に発現しない。刺激因子細胞が、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ３のいずれかなどのＴ細胞のための共刺激シグナルを提供する上で、重要な分子を発現することもまた好ましい。多数のＭＨＣクラスＩ分子および共刺激因子分子の核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬデータベースから公的に入手可能である。
【０３３７】
ＭＨＣクラスＩエピトープが抗原として使用される場合、Ｔ細胞はＣＤ８陽性Ｔ細胞である。
【０３３８】
抗原提示細胞が、このようなエピトープを発現するために形質移入される場合、好ましくは、細胞は、配列番号１〜配列番号２８８またはその変異アミノ酸配列を含有するペプチドを発現できる、発現ベクターを含んでなる。
【０３３９】
生体外でＴ細胞を製造するために、その他のいくつかの方法が使用されてもよい。例えば、自己由来腫瘍浸潤性リンパ球が、ＣＴＬを生成するために使用され得る。Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）は、Ｔ細胞の調製において、自己由来末梢血リンパ球（ＰＬＢ）を利用した。さらに、樹状細胞をペプチドまたはポリペプチドでパルス処理する、または組換えウイルスで感染させることによる、自己由来Ｔ細胞の製造も可能である。Ｂ細胞もまた、自己由来Ｔ細胞の製造において使用され得る。さらに、ペプチドまたはポリペプチドでパルス処理された、または組換えウイルスで感染されたマクロファージが、自己ＣＴＬの調製で使用されてもよい。Ｓ．Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）は、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を使用したＴ細胞の生体外プライミングを記載し、それはまた、選択されたペプチドに対するＴ細胞を製造するための適切な方法でもある。本発明では、ビオチン：ストレプトアビジン生化学によって、あらかじめ形成されたＭＨＣ：ペプチド複合体を表面ポリスチレン粒子（ミクロビーズ）に共役することで、ａＡＰＣが生成された。このシステムは、ａＡＰＣ上のＭＨＣ密度正確な調節を可能にし、それは、血液サンプルから高効率で、高または低結合活性の抗原特異的Ｔ細胞応答を選択的に引き起こすことを可能にする。ＭＨＣ：ペプチド複合体の他に、ａＡＰＣは、それらの表面に共役する、抗ＣＤ２８抗体のような共刺激活性があるその他のタンパク質を保有すべきである。さらにこのようなａＡＰＣベースのシステムは、例えばサイトカイン様インターロイキン１２などの適切な可溶性因子の付加を要することが多い。
【０３４０】
同種異系細胞はまた、Ｔ細胞の調製において使用されてもよく、方法は、参照により本明細書に援用される、国際公開第９７／２６３２８号パンフレットで詳述される。例えば、ショウジョウバエ細胞およびＴ２細胞に加えて、その他の細胞を使用して、ＣＨＯ細胞、バキュロウイルス感染昆虫細胞、細菌、酵母、およびワクシニア感染標的細胞などの抗原が提示されてもよい。さらに植物ウイルスを使用してもよい（例えば、外来性ペプチド提示のための高収率システムとしてのササゲモザイクウイルス開発を記載するＰｏｒｔａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｏｒｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）を参照されたい）。
【０３４１】
本発明のペプチドに向けられた活性化Ｔ細胞は、治療法において有用である。したがって、本発明のさらなる態様は、前述の本発明の方法によって入手可能な活性化Ｔ細胞を提供する。
【０３４２】
上記方法によって製造される活性化Ｔ細胞は、配列番号１〜配列番号２８８のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する、細胞を選択的に認識する。
【０３４３】
好ましくは、Ｔ細胞は、そのＴＣＲを通じた、ＨＬＡ／ペプチド複合体（例えば結合）との相互作用によって、細胞を認識する。Ｔ細胞は、その標的細胞が、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法で有用であり、患者には、有効数の活性化Ｔ細胞が投与される。患者に投与されるＴ細胞は、患者に由来して、上述のように活性化されてもよい（すなわち、それらは自己Ｔ細胞である）。代案としては、Ｔ細胞は、患者でなく別の個人に由来する。もちろん、個人が健常人であれば、それが好ましい。「健常人」によって、本発明者らは、個人が概して健康良好であり、好ましくは有能な免疫系を有して、より好ましくは容易に検査され検出され得る任意の疾患に罹患していないことを意味する。
【０３４４】
生体内で、本発明によるＣＤ８陽性Ｔ細胞の標的細胞は、（時にＭＨＣクラスＩＩを発現する）腫瘍細胞であり得て、および／または腫瘍（腫瘍細胞）周囲の間質細胞であり得る（時にＭＨＣクラスＩＩもまた発現する；（Ｄｅｎｇｊｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６））。
【０３４５】
本発明のＴ細胞は、治療用組成物の活性成分として使用されてもよい。したがって、本発明は、その標的細胞が、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法もまた提供し、方法は、上で定義されるようなＴ細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる。
【０３４６】
「異常に発現される」によって、本発明者らは、正常な発現レベルと比較して、ポリペプチドが過剰発現されること、または腫瘍がそれに由来する組織では遺伝子がサイレントであるが、腫瘍ではそれが発現されることもまた意味する。「過剰発現」によって、本発明者らは、ポリペプチドが、正常組織に存在するレベルの少なくとも１．２倍のレベルで；好ましくは正常組織に存在するレベルの少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍または１０倍のレベルで存在することを意味する。
【０３４７】
Ｔ細胞は、例えば上で記載されるものなどの当該技術分野で公知の方法によって得られてもよい。
【０３４８】
Ｔ細胞のこのいわゆる養子免疫伝達のためのプロトコルは、当該技術分野で周知である。概説は、Ｇａｔｔｉｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）にある。
【０３４９】
本発明の別の態様は、その核酸がクローン化されて、好ましくはＴ細胞である宿主細胞内に導入されるＴ細胞受容体を生成するための、ＭＨＣと複合体形成するペプチドの使用を含む。次に、この遺伝子操作Ｔ細胞は、がん治療のために患者に移入され得る。
【０３５０】
本発明の任意の分子、すなわちペプチド、核酸、抗体、発現ベクター、細胞、活性化Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体またはそれをエンコードする核酸は、免疫応答を逃れた細胞によって特徴付けられる障害の治療に有用である。したがって本発明の任意の分子は、薬剤として、または薬剤の製造において使用されてもよい。分子は、単独で、または本発明のその他の分子または既知の分子との組み合わで、使用されてもよい。
【０３５１】
本発明は、がん、特にＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、またはＣＬＬおよびその他の悪性腫瘍を治療するのに有用な薬剤をさらに提供する。
【０３５２】
本発明は、
（ａ）溶液中のまたは凍結乾燥形態の上述の医薬組成物を含有する容器；
（ｂ）任意選択的に、凍結乾燥製剤のための希釈剤または再構成溶液を含有する第２の容器；および
（ｃ）任意選択的に、（ｉ）溶液の使用、または（ｉｉ）凍結乾燥製剤の再構成および／または使用のための取扱説明書
を含んでなるキットをさらに目的とする。
【０３５３】
キットは、（ｉｉｉ）緩衝液、（ｉｖ）希釈剤、（Ｖ）濾過、（ｖｉ）針、または（Ｖ）シリンジの１つまたは複数をさらに含んでなってもよい。容器は、好ましくは、ボトル、バイアル、シリンジまたは試験管であり；それは、多回使用容器であってもよい。医薬組成物は、好ましくは凍結乾燥される。
【０３５４】
本発明のキットは、好ましくは、適切な容器内の本発明の凍結乾燥製剤と、その再構成および／または使用のための取扱説明書とを含んでなる。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル（例えば二重チャンバーバイアル）、シリンジ（二重チャンバーシリンジなど）、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成されてもよい。好ましくは、キットおよび／または容器は、容器上の、または容器に付随する、取扱説明を含み、それは再構成および／または使用上の指示を示す。例えば、ラベルは、凍結乾燥製剤が、上述されるようなペプチド濃度に再構成されることを表示してもよい。ラベルは、製剤が皮下投与に有用であり、または皮下投与用であることをさらに表示してもよい。
【０３５５】
製剤を収容する容器は、多回使用バイアルであってもよく、それは再構成製剤の反復投与（例えば２〜６回の投与）を可能にする。キットは、適切な希釈剤（例えば、炭酸水素ナトリウム溶液）を含んでなる、第２の容器をさらに含んでなってもよい。
【０３５６】
希釈剤と凍結乾燥製剤の混合時に、再構成製剤中の最終ペプチド濃度は、好ましくは少なくとも０．１５ｍｇ／ｍＬ／ペプチド（＝７５μｇ）であり、好ましくは３ｍｇ／ｍＬ／ペプチド（＝１５００μｇ）以下である。キットは、その他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および取扱説明が掲載されるパッケージインサートをはじめとする、商業的および使用者観点から望ましい、その他の物質をさらに含んでもよい。
【０３５７】
本発明のキットは、その他の構成要素（例えば、その他の化合物またはこれらのその他の化合物の医薬組成物）が添加されたまたは添加されない、本発明による医薬組成物製剤を含有する単回容器を有してもよく、または各構成要素のための別個の容器を有してもよい。
【０３５８】
好ましくは、本発明のキットは、第２の化合物（アジュバント（例えばＧＭ−ＣＳＦ）、化学療法剤、天然物、ホルモンまたは拮抗薬、抗血管新生因子または阻害剤、アポトーシス誘導剤またはキレート剤など）またはその医薬組成物の同時投与と合わせて使用するためにパッケージされた、本発明の製剤を含む。キットの構成要素は、あらかじめ混合されてもよく、または各構成要素は、患者への投与前に別個の異なる容器内にあってもよい。キットの構成要素は、１つまたは複数の液体溶液、好ましくは水溶液、より好ましくは無菌水溶液中で、提供されてもよい。またキットの構成要素は、固体として提供されてもよく、それは、好ましくは別の異なる容器内に提供される、適切な溶媒の添加によって液体に変換されてもよい。
【０３５９】
治療用キットの容器は、バイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または固体または液体を封入するその他のあらゆる手段であってもよい。通常、２つ以上の構成要素がある場合、キットは、第２のバイアルまたはその他の容器を含有して、別々の投薬を可能にする。キットは、薬学的に許容可能な液体のための別の容器もまた、含有してもよい。好ましくは、治療用キットは、装置（例えば、１本または複数本の針、シリンジ、点眼器、ピペットなど）を含有して、本キットの構成要素である本発明の作用物質の投与を可能にする。
【０３６０】
本製剤は、経口（腸内）、経鼻、眼、皮下、皮内、筋肉内、静脈内または経皮などの任意の許容できる手段によるペプチド投与に適するものである。好ましくは、投与はｓ．ｃ．であり、最も好ましくはｉ．ｄ．投与であり、輸液ポンプによってもよい。
【０３６１】
本発明のペプチドは、、ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、およびＣＬＬから単離されたので、本発明の薬剤は、好ましくは、ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、およびＣＬＬを治療するのに使用される。
【０３６２】
本発明は、予備スクリーニングＴＵＭＡＰの貯蔵庫から選択される少なくとも１つのペプチドを含んでなる、医薬組成物を製造するステップを含んでなる、個々の患者のための個別化医薬品を製造する方法にさらに関し、医薬組成物で使用される少なくとも１つのペプチドは、個々の患者における適切さについて選択される。一実施形態では、医薬組成物はワクチンである。方法はまた、ＴＣＲ単離などの下流用途、または可溶性抗体、およびその他の治療選択肢のためのＴ細胞クローンを製造するのにも適応され得る。
【０３６３】
「個別化医薬品」は、積極的個別化がんワクチンおよび自己由来患者組織を使用する養子細胞療法をはじめとする、このような個々の患者の治療のためにのみ使用される、１個人の患者のために特に調整された治療法を意味するものとする。
【０３６４】
本明細書の用法では、「貯蔵庫」という用語は、特定の腫瘍型における免疫原性および／または過剰提示について予備スクリーニングされている、一群のまたは一組のペプチドを指すものとする。「貯蔵庫」という用語は、ワクチンに含まれる特定のペプチドが、予備製造されて物理的設備内で貯蔵されることを暗示することは意図されないが、その可能性も検討される。ペプチドは、製造される各個別化ワクチンのために新規に製造されてもよく、または予備製造されて貯蔵されてもよいことが、明示的に検討される。貯蔵庫（例えば、データベースの形態）は、様々なＨＬＡ−ＡＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子があるＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、またはＣＬＬ患者の腫瘍組織内で高度に過剰発現された、腫瘍関連ペプチドから構成される。それは、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩペプチドまたは伸長ＭＨＣクラスＩペプチドを含有してもよい。いくつかの腫瘍組織から採取された腫瘍関連ペプチドに加えて、貯蔵庫は、ＨＬＡ−Ａ＊０２およびＨＬＡ−Ａ＊２４標識ペプチドを含有してもよい。これらのペプチドは、ＴＵＭＡＰによって誘導されるＴ細胞免疫の規模を定量的に比較できるようにし、したがって抗腫瘍応答を引き起こすワクチンの能力について、重要な結論が導かれるようにする。第２に、それらは、患者において、「自己」抗原に由来するＴＵＭＡＰに対するいかなるワクチン誘導Ｔ細胞応答も観察されない症例において、「非自己」抗原に由来する重要な陽性対照ペプチドとして機能する。第３に、それは、患者の免疫能力状態に関する結論が導かれるようにしてもよい。
【０３６５】
本発明および貯蔵庫のためのＴＵＭＡＰは、遺伝子発現解析、質量分析、およびＴ細胞免疫学（ＸＰｒｅｓｉｄｅｎｔ（登録商標））を組み合わせた、統合ゲノム機能解析アプローチを使用して同定される。アプローチは、高い割合の腫瘍上に真に存在するが、正常組織では皆無または最小限にのみ発現されるＴＵＭＡＰだけが、さらなる分析のために選択されることを保証する。最初のペプチド選択のためには、患者からのＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、またはＣＬＬサンプルと、健常ドナーからの血液とが、段階的アプローチで分析された。
１．ゲノム規模メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）発現解析を使用して、重要な正常（非がん性）組織では、非常に低いレベルで発現される遺伝子が同定された。これらの遺伝子が、一連の正常な臓器および組織と比較して悪性組織（ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ）で過剰発現されるかどうかが評価された。
２．悪性材料（ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、ＣＬＬ）からのＨＬＡリガンドが、質量分析によって同定された。
３．同定されたＨＬＡリガンドは、遺伝子発現データと比較された。好ましくは、ステップ２で検出されるような選択的に発現されまたは過剰発現される遺伝子によってコードされる、腫瘍組織上で過剰提示されまたは選択的に提示されるペプチドが、多重ペプチドワクチンのための適切なＴＵＭＡＰ候補と見なされた。
４．同定されたペプチドのＴＵＭＡＰとしての妥当性を支持する追加的な証拠を同定するために、文献調査が実施された
５．ｍＲＮＡレベルでの過剰発現の関連性は、ステップ３からの選択されたＴＵＭＡＰの腫瘍組織上における再検出と、健常組織における検出の欠如（またはまれな）検出によって確認された。
６．選択されたペプチドによる生体内Ｔ細胞応答の誘導が可能かどうかを評価するために、健常ドナー、ならびにＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、またはＣＬＬ患者からのヒトＴ細胞を使用して、生体外免疫原性アッセイが実施された。
【０３６６】
一態様では、貯蔵庫に含める前に、ペプチドが免疫原性について予備スクリーニングされる。制限を意図しない一例として、貯蔵庫に包含されるペプチドの免疫原性は、ペプチド／ＭＨＣ複合体および抗ＣＤ２８抗体が負荷された人工抗原提示細胞による、健常ドナーからのＣＤ８＋Ｔ細胞の反復刺激を通じた、生体外Ｔ細胞プライミングを含んでなる方法によって判定される。
【０３６７】
この方法は、稀ながんに、そして稀な発現プロファイルがある患者にとって、好ましい。一定組成がある多重ペプチド混合物とは対照的に、現在開発されている貯蔵庫は、腫瘍内の抗原の実際の発現とワクチンとの顕著により高いマッチングを可能にする。多標的アプローチでは、各患者のために、選択された単一のまたは組み合わされた数種の「既製」ペプチドが利用される。理論上は、例えば５０個の抗原性ペプチドのライブラリーからの５個の異なる抗原性ペプチドの選択に基づくアプローチは、それだけでおよそ１７００万個の可能な医薬品（ＤＰ）組成物をもたらす。
【０３６８】
一態様では、ペプチドは、本明細書に記載される、または以下のような本発明による方法に基づく、個々の患者のためのそれらの適切さに基づいて、ワクチンへの包含のために選択される。
【０３６９】
患者の腫瘍材料および血液サンプルから、ＨＬＡ表現型、トランスクリプトミクスおよびペプチドミクスデータが収集されて、「貯蔵庫」および患者に特有の（すなわち変異）ＴＵＭＡＰを含有する、各患者に対して最も適切なペプチドが同定される。患者腫瘍内で選択的にまたは過剰発現されて、可能であれば、患者の個々のＰＢＭＣと共に試験すると、強力な生体外免疫原性を示すペプチドが選択される。
【０３７０】
好ましくは、ワクチンに含まれるペプチドは、（ａ）個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を同定するステップと；（ｂ）（ａ）で同定されたペプチドを上述のペプチド貯蔵庫と比較するステップと；（ｃ）患者において同定された腫瘍関連ペプチドと関連がある貯蔵庫（データベース）から、少なくとも１つのペプチドを選択するステップとを含んでなる方法によって同定される。例えば、腫瘍サンプルによって提示されるＴＵＭＡＰは、（ａ１）腫瘍サンプルからの発現データを、腫瘍サンプルの組織型に相当する正常組織サンプルからの発現データと比較して、腫瘍サンプル中で過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質を同定するステップと；（ａ２）発現データを腫瘍サンプル中のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子と結合するＭＨＣリガンドの配列と相関させて、腫瘍によって過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質に由来するＭＨＣリガンドを同定するステップとによって同定される。好ましくは、ＭＨＣリガンドの配列は、腫瘍サンプルから単離されたＭＨＣ分子から結合ペプチドを溶出させて、溶出したリガンドを配列決定することで同定される。好ましくは、腫瘍サンプルおよび正常組織は、同一患者から入手される。
【０３７１】
貯蔵庫（データベース）モデルを使用してペプチドを選択するのに加えて、またはその代案として、ＴＵＭＡＰを患者において新規に同定し、次に、ワクチンに含めてもよい。一実施例として、（ａ１）腫瘍サンプルからの発現データを、腫瘍サンプルの組織型に相当する正常組織サンプルからの発現データと比較して、腫瘍サンプル中で過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質を同定するステップと；（ａ２）発現データを腫瘍サンプル中のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子と結合するＭＨＣリガンドの配列と相関させて、腫瘍によって過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質に由来するＭＨＣリガンドを同定するステップとによって、候補ＴＵＭＡＰが患者において同定されてもよい。別の実施例として、個々の患者からの正常な対応組織と比較して、腫瘍サンプルに特有の変異を含有するタンパク質が同定されてもよく、特異的に変異を標的とするＴＵＭＡＰが同定され得る。例えば、腫瘍のゲノム、および対応する正常組織のゲノムは、全ゲノム配列決定によって配列決定され得る。遺伝子のタンパク質コード領域中の非同義の変異を発見するために、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡが腫瘍組織から抽出され、正常な非変異ゲノム生殖細胞系ＤＮＡが末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から抽出される。適用されたＮＧＳアプローチは、タンパク質コード領域の再配列決定（エクソーム再配列決定）に限定される。この目的で、供給業者が提供する標的富化キットを使用して、ヒトサンプルからのエクソンＤＮＡが捕捉され、例えばＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）による配列決定がそれに続く。それに加えて、遺伝子発現の直接定量化と、変異遺伝子が患者の腫瘍で発現されることの妥当性評価とのために、腫瘍ｍＲＮＡが配列決定される。結果として得られる数百万の配列読み取りは、ソフトウェアアルゴリズムを通じて処理される。出力一覧は、変異および遺伝子発現を含有する。ＰＢＭＣ由来生殖細胞系の多様性と比較することで腫瘍特異的体細胞突然変異が判定され、優先順位がつけられる。次に、新規に同定されたペプチドは、貯蔵庫について上述した免疫原性について試験され得て、適切な免疫原性を保持する候補ＴＵＭＡＰが、ワクチンへの包含のために選択される。
【０３７２】
例示的一実施形態では、ワクチンに包含されるペプチドは、（ａ）上述の方法（方法）によって、個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を同定するステップと；（ｂ）ａ）で同定されたペプチドと、対応する正常組織との比較で腫瘍内の免疫原性および過剰提示について予備選別されたペプチドの貯蔵庫とを比較するステップと；（ｃ）患者において同定された腫瘍関連ペプチドと関連がある貯蔵庫から、少なくとも１つのペプチドを選択するステップと；（ｄ）任意選択的に、（ａ）で新規に同定された少なくとも１つのペプチドを選択して、その免疫原性を確認するステップとによって同定される。
【０３７３】
例示的一実施形態では、ワクチンに包含されるペプチドは、（ａ）個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を同定するステップと；（ｂ）（ａ）で新規に同定された少なくとも１つのペプチドを選択して、その免疫原性を確認するステップとによって同定される。
【０３７４】
ひとたび個別化ペプチドベースのワクチンのためのペプチドが選択されたら、ワクチンが製造される。ワクチンは、好ましくは、約３３％ＤＭＳＯなどの２０〜４０％ＤＭＳＯ、好ましくは約３０〜３５％ＤＭＳＯに溶解された、個々のペプチドからなる液体製剤である。
【０３７５】
製品に包含される各ペプチドは、ＤＭＳＯに溶解される。単一ペプチド溶液の濃度は、製品に包含されるペプチド数に応じて選択されなくてはならない。単一ペプチドＤＭＳＯ溶液が等量で混合され、ペプチドあたり約２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、製品に包含される全てのペプチドを含有する溶液が得られる。次に、混合溶液は注射用水で１：３に希釈されて、３３％ＤＭＳＯ中でペプチドあたり０．８２６ｍｇ／ｍｌの濃度を得る。希釈溶液は、０．２２μｍの無菌フィルターを通して濾過される。最終バルク溶液が得られる。
【０３７６】
最終バルク溶液はバイアルに充填されて、使用時まで−２０で保存される。１本のバイアルは、０．５７８ｍｇの各ペプチドを含有する７００μＬの溶液を含有する。この内、５００μＬ（ペプチドあたりおよそ４００μｇ）が、皮内注射のために適用される。
【０３７７】
がんを治療するために有用であるのに加えて、本発明のペプチドは、診断法としてもまた有用である。ペプチドは、ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、およびＣＬＬ細胞から生成されたので、そしてこれらのペプチドは、正常組織には存在せずまたはより低いレベルで存在すると判定されたので、これらのペプチドを使用してがんの存在が診断され得る。
【０３７８】
特許請求されるペプチドの血液サンプル中の組織生検上の存在は、がん診断において病理学者を補佐し得る。抗体、質量分析法またはその他の当該技術分野で公知の方法の手段による特定のペプチドの検出は、組織サンプルが悪性または炎症性または概して病的であることを病理学者に告げ得て、またはＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、食道がん、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ、ＯＣ、ＭＣＣ、メラノーマ、乳がん、ＳＣＬＣ、ＮＨＬ、ＡＭＬ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣ、またはＣＬＬのバイオマーカーとして利用され得る。ペプチド基の存在は、病的組織の分類または下位分類を可能にし得る。
【０３７９】
患部組織検体上のペプチドの検出は、特にＴリンパ球が作用機序に関与することが知られておりまたは予測される場合に、免疫系が関与する治療法の利点を判定できるようにする。ＭＨＣ発現の喪失は、それによって感染悪性細胞が免疫監視を逃れる、十分に説明された機序である。したがってペプチドの存在は、この機序が、分析した細胞によって活用されていないことを示す。
【０３８０】
本発明のペプチドは、ペプチドまたはＭＨＣ分子と複合体化したペプチドに対するＴ細胞応答または抗体応答などの、これらのペプチドに対するリンパ球応答を分析するのに使用されるかもしれない。これらのリンパ球応答は、さらなる治療段階を決定するための予後マーカーとして使用され得る。これらの応答はまた、例えば、タンパク質、核酸、自己材料のワクチン接種や、リンパ球の養子免疫伝達などの異なる手段によるリンパ球応答の誘導を目指す、免疫療法アプローチにおける代理応答マーカーとして使用され得る。遺伝子治療の設定では、副作用の評価において、ペプチドに対するリンパ球応答が考慮され得る。リンパ球応答のモニタリングはまた、例えば移植片対宿主病および宿主対移植片病の検出など、移植治療の経過観察検査のための有益な手段かもしれない。
【０３８１】
本発明をここで、その好ましい実施形態を描写する以下の実施例において、添付図面を参照して説明するが、それでもなお、それらには限定されないものとする。本発明の目的で、本明細書で引用される全ての参考文献は、その内容全体が参照により援用される。
【図面の簡単な説明】
【０３８２】
【図１Ａ】正常組織と比較した、種々のがん組織中の様々なペプチドの過剰提示を示す。分析は、１７０個を超える正常組織サンプル、および３７６個のがんサンプルからのデータを含んだ。示されているのは、ペプチドが提示されたと認められたサンプルのみである。遺伝子：ＣＥＮＰＥ、ペプチド：ＫＬＱＥＫＩＱＥＬ（配列番号１）、組織左から右に：４白血病細胞株、１膵臓がん細胞株、１メラノーマ細胞株、２正常組織サンプル（１副腎、１脾臓）、３１原発性がん組織サンプル（１脳腫瘍、４結腸がん、１食道がん、１腎がん、２肝臓がん、１６肺がん、４卵巣がん、１直腸がん、１胃がん）
【図１Ｂ】遺伝子：ＫＩＦ１５、ペプチド：ＱＬＩＥＫＮＷＬＬ（配列番号１０）、組織左から右に：５白血病細胞株、１膵臓がん細胞株、１骨髄性白血病細胞株、１正常組織サンプル（１副腎）、２９がん組織サンプル（４結腸がん、２食道がん、１白血病、１肝臓がん、１０肺がん、１１卵巣がん）
【図１Ｃ】遺伝子：ＨＡＶＣＲ１、ペプチド：ＬＬＤＰＫＴＩＦＬ（配列番号１１）、組織左から右に：１腎がん細胞株、１３がん組織サンプル（８腎がん、１肝臓がん、２肺がん、２直腸がん）
【図１Ｄ】遺伝子：ＲＰＧＲＩＰ１Ｌ、ペプチド：ＲＬＨＤＥＮＩＬＬ（配列番号１３）、組織左から右に：１腎がん細胞株、１前立腺がん細胞株、１メラノーマ細胞株、５０がん組織サンプル（４脳がん、１結腸がん、２食道がん、３腎がん、２肝臓がん、２３肺がん、７卵巣がん、２膵臓がん、２前立腺がん、３直腸がん、１胃がん）
【図１Ｅ】正常組織と比較した、種々のがん組織中の様々なペプチドの過剰提示。分析は、３２０個を超える正常組織サンプル、および４６２個のがんサンプルからのデータを含んだ。示されているのは、ペプチドが提示されたと認められたサンプルのみである。遺伝子：ＤＮＡＨ１４、ペプチド：ＳＶＬＥＫＥＩＹＳＩ（配列番号２）、組織左から右に：４細胞株（３血液細胞、１膵臓）、２正常組織（１リンパ節、１気管）、５２がん組織（２胆管がん、１骨髄性細胞がん、３白血病、５乳がん、１食道がん、１食道および胃がん、１胆嚢がん、４結腸がん、７肺がん、６リンパ節がん、７卵巣がん、４前立腺がん、４皮膚がん、２膀胱がん、４子宮がん）
【図１Ｆ】遺伝子：ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ６、ペプチド：ＫＩＷＥＥＬＳＶＬＥＶ（配列番号４０）、組織左から右に：８がん組織（１肝臓がん、３肺がん、２皮膚がん、１胃がん、１膀胱がん）
【図１Ｇ】遺伝子：ＨＭＸ１、ペプチド：ＦＬＩＥＮＬＬＡＡ（配列番号６７）、組織左から右に：７がん組織（４脳がん、２肺がん、１子宮がん）
【図１Ｈ】遺伝子：ＣＣＤＣ１３８、ペプチド：ＦＬＬＥＲＥＱＬＬ（配列番号８４）、組織左から右に：３細胞株（２血液細胞、１皮膚）、２４がん組織（１骨髄性細胞がん、３白血病、１骨髄がん、１乳がん、１腎がん、２結腸がん、３直腸がん、１肺がん、７リンパ節がん、３膀胱がん、１子宮がん）
【図１Ｉ】遺伝子：ＣＬＳＰＮ、ペプチド：ＳＬＬＮＱＰＫＡＶ（配列番号２３５）、組織左から右に：１３細胞株（３血液細胞、２腎臓、８膵臓）、３０がん組織（１骨髄性細胞がん、１白血病、２脳がん、２乳がん、２食道がん、１胆嚢がん、１直腸がん、２肝臓がん、４肺がん、５リンパ節がん、２卵巣がん、２皮膚がん、４膀胱がん、１子宮がん）
【図１Ｊ】遺伝子：ＳＰＣ２５、ペプチド：ＧＬＡＥＦＱＥＮＶ（配列番号２４３）、組織左から右に：３細胞株（１血液細胞、１腎臓、１膵臓）、６７がん組織（１胆管がん、４白血病、１骨髄性細胞がん、２脳がん、３乳がん、４食道がん、２胆嚢がん、２結腸がん、１直腸がん、２肝臓がん、１５肺がん、８リンパ節がん、９卵巣がん、３皮膚がん、４膀胱がん、６子宮がん）
【図２Ａ】正常組織のパネルと比較して、種々のがんで高度に過剰発現されまたは排他的に発現される、本発明の起源遺伝子の例示的発現プロファイル（正常な腎臓と比較した相対発現）を示す。ＰＲＩＭ２−組織左から右に：副腎、動脈、骨髄、脳（全体）、乳房、結腸、食道、心臓、腎臓（三連）、白血球、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、膀胱、子宮子宮頸部、子宮、静脈（各正常サンプルは幾人かのドナーのプールに相当する）、２２人の個人の前立腺がんサンプル
【図２Ｂ】ＣＨＥＫ１−組織左から右に：副腎、動脈、骨髄、脳（全体）、乳房、結腸、食道、心臓、腎臓（三連）、白血球、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、膀胱、子宮子宮頸部、子宮、静脈（各正常サンプルは幾人かのドナーのプールに相当する）、３人の個人の正常結腸サンプル、１０人の個人の結腸直腸がんサンプル
【図２Ｃ】ＴＴＣ３０Ａ−組織左から右に：副腎、動脈、骨髄、脳（全体）、乳房、結腸、食道、心臓、腎臓（三連）、白血球、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、膀胱、子宮子宮頸部、子宮、静脈（各正常サンプルは幾人かのドナーのプールに相当する）、３０人の個人の脳腫瘍サンプル
【図２Ｄ】ＴＲＩＰ１３−組織左から右に：副腎、動脈、骨髄、脳（全体）、乳房、結腸、食道、心臓、腎臓（三連）、白血球、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、膀胱、子宮子宮頸部、子宮、静脈（各正常サンプルは幾人かのドナーのプールに相当する）、１人の個人の正常肺サンプル、３８人の個人の肺がんサンプル
【図２Ｅ】ＭＸＲＡ５−組織左から右に：副腎、動脈、骨髄、脳（全体）、乳房、結腸、食道、心臓、腎臓（三連）、白血球、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、膀胱、子宮子宮頸部、子宮、静脈（各正常サンプルは幾人かのドナーのプールに相当する）、９人の個人の膵臓がんサンプル
【図２Ｆ】正常組織（白色バー）および種々のがんサンプル（黒色バー）のパネルにおいて、がんで高度に過剰発現されまたは排他的に発現される、本発明の起源遺伝子の例示的発現プロファイルを示す。ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１３（配列番号２４）−組織左から右に：８０正常組織サンプル（６動脈、２血液細胞、２脳、１心臓、２肝臓、３肺、２静脈、１脂肪組織、１副腎、５骨髄、１軟骨、１結腸、１食道、２眼、２胆嚢、１腎臓、６リンパ節、４膵臓、２末梢神経、２脳下垂体、１直腸、２唾液腺、２骨格筋、１皮膚、１小腸、１脾臓、１胃、１甲状腺、７気管、１膀胱、１乳房、５卵巣、５胎盤、１前立腺、１精巣、１胸腺、１子宮）、５０がんサンプル（１０乳がん、４胆管がん、６胆嚢がん、１１食道がん、１０膀胱がん、１０子宮がん）
【図２Ｇ】ＨＯＲＭＡＤ１（配列番号１６８）−組織左から右に：８０正常組織サンプル（６動脈、２血液細胞、２脳、１心臓、２肝臓、３肺、２静脈、１脂肪組織、１副腎、５骨髄、１軟骨、１結腸、１食道、２眼、２胆嚢、１腎臓、６リンパ節、４膵臓、２末梢神経、２脳下垂体、１直腸、２唾液腺、２骨格筋、１皮膚、１小腸、１脾臓、１胃、１甲状腺、７気管、１膀胱、１乳房、５卵巣、５胎盤、１前立腺、１精巣、１胸腺、１子宮）、４１がんサンプル（１０乳がん、１０皮膚がん、１１非小細胞細胞肺がん、１０小細胞肺がん）
【図２Ｈ】ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ３（配列番号２７４）−組織左から右に：８０正常組織サンプル（６動脈、２血液細胞、２脳、１心臓、２肝臓、３肺、２静脈、１脂肪組織、１副腎、５骨髄、１軟骨、１結腸、１食道、２眼、２胆嚢、１腎臓、６リンパ節、４膵臓、２末梢神経、２脳下垂体、１直腸、２唾液腺、２骨格筋、１皮膚、１小腸、１脾臓、１胃、１甲状腺、７気管、１膀胱、１乳房、５卵巣、５胎盤、１前立腺、１精巣、１胸腺、１子宮）、５３がんサンプル（４胆管がん、６胆嚢がん、１０リンパ節がん、１２卵巣がん、１１食道がん、１０肺がん）
【図３】例示的免疫原性データを示す：ペプチド特異的多量体染色後の：フローサイトメトリー結果。
【図４Ａ】上部：単一ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性正常（緑色または灰色の点）およびその上でペプチドが検出された腫瘍サンプル（赤色の点）について、技術的反復測定からの中央値ＭＳシグナル強度が、色つきの点としてプロットされる。腫瘍および正常サンプルは、起源臓器によってグループ分けされ、箱ひげ図は、複数サンプルにわたって正規化されたシグナル強度の中央値、２５および７５パーセンタイル数（箱）、および最小および極大値（ひげ）に相当する。正常臓器は、リスクカテゴリー（血液細胞、心臓血管系、脳、肝臓、肺：高リスク、暗緑色点；生殖器、乳房、前立腺：低リスク、灰色点；全ての他の臓器：中程度リスク；淡緑色点）によって順序付けられる。下部：各臓器中の相対ペプチド検出頻度が、棒グラフとして示される。パネル下の数値は、各臓器（Ｎ＝２９８個の正常サンプル、Ｎ＝４６１個の腫瘍サンプル）について分析された、サンプル総数あたりのペプチドが検出されたサンプル数を示す。ペプチドがサンプル上で検出されたが、技術的理由で定量化され得なかった場合、サンプルは、この検出頻度表示に含まれるが、図の上部に点は示されない。組織（左から右に）：正常サンプル：動脈；血液細胞；脳；心臓；肝臓；肺；静脈；ａｄｉｐｏｓｅ：脂肪組織；ａｄｒｅｎ．ｇｌ．：副腎；ＢＭ：骨髄；ｃｏｌｏｒｅｃｔ：結腸および直腸；ｄｕｏｄ：十二指腸；ｅｓｏｐｈ：食道；ｇａｌｌｂ：胆嚢；ＬＮ：リンパ節；ｐａｎｃ：膵臓；ｐａｒａｔｈｙｒ：副甲状腺；ｐｅｒｉｔ：腹膜；ｐｉｔｕｉｔ：下垂体；ｓａｌ．ｇｌａｎｄ：唾液腺；ｓｋｅｌ．ｍｕｓ：骨格筋；皮膚；ｓｍ．ｉｎｔ：小腸；脾臓；胃；甲状腺；気管；尿管；膀胱；乳房；卵巣；胎盤；前立腺；精巣；胸腺；子宮。腫瘍サンプル：ＡＭＬ：急性骨髄性白血病；ＰＣＡ：前立腺がん；ＢＲＣＡ：乳がん；ＣＬＬ：慢性リンパ球性白血病；ＣＲＣ：結腸直腸がん；ＧＡＬＢ：胆嚢がん；ＨＣＣ：肝細胞がん；ＭＥＬ：メラノーマ；ＮＨＬ：非ホジキンリンパ腫；ＯＣ：卵巣がん；ＯＳＣＡＲ：食道がん；ＯＳＣ＿ＧＣ：食道／胃がん；ＰＣ：膵臓がん；ＧＢ：神経膠芽腫；ＧＣ：胃がん；ＮＳＣＬＣ：非小細胞肺がん；ＲＣＣ：腎細胞がん；ＳＣＬＣ：小細胞肺がん；ＵＢＣ：尿膀胱がん；ＵＥＣ：子宮および子宮内膜がん。
【図４Ｂ】同上
【図４Ｃ】同上
【図４Ｄ】同上
【図４Ｅ】同上
【図４Ｆ】同上
【図４Ｇ】同上
【図４Ｈ】同上
【図４Ｉ】同上
【図４Ｊ】同上
【図４Ｋ】同上
【図４Ｌ】同上
【図４Ｍ】同上
【図４Ｎ】同上
【図４Ｏ】同上
【図４Ｐ】同上
【図４Ｑ】同上
【図４Ｒ】同上
【図５Ａ】種々のがんサンプル中で過剰発現される、本発明の起源遺伝子の例示的発現プロファイルを示す。腫瘍（赤色の点）および正常（緑色または灰色の点）サンプルは、起源臓器によってグループ分けされ、箱ひげ図は、ＲＰＫＭ値の中央値、２５および７５パーセンタイル数（箱）、および最小および極大値（ひげ）に相当する。正常臓器は、リスクカテゴリーによって順序付けられる。ＲＰＫＭ＝１００万個のマッピングされた読み取りあたりキロベースあたりの読み取り。正常サンプル：動脈；血液細胞；脳；心臓；肝臓；肺；静脈；ａｄｉｐｏｓｅ：脂肪組織；ａｄｒｅｎ．ｇｌ．：副腎；ＢＭ：骨髄；軟骨；ｃｏｌｏｒｅｃｔ：結腸および直腸；ｅｓｏｐｈ：食道；ｅｙｅ；ｇａｌｌｂ：胆嚢；腎臓；ＬＮ：リンパ節；神経；ｐａｎｃ：膵臓；ｐｉｔｕｉｔ：下垂体；ｓａｌ．ｇｌａｎｄ：唾液腺；ｓｋｅｌ．ｍｕｓ：骨格筋；皮膚；ｓｍ．ｉｎｔ：小腸；脾臓；胃；甲状腺；気管；膀胱；乳房；卵巣；胎盤；前立腺；精巣；胸腺；子宮。腫瘍サンプル：ＡＭＬ：急性骨髄性白血病；ＰＣＡ：前立腺がん；ＢＲＣＡ：乳がん；ＣＬＬ：慢性リンパ球性白血病；ＣＲＣ：結腸直腸がん；ＧＡＬＢ：胆嚢がん；ＨＣＣ：肝細胞がん；ＭＥＬ：メラノーマ；ＮＨＬ：非ホジキンリンパ腫；ＯＣ：卵巣がん；ＯＳＣＡＲ：食道がん；ＰＣ：膵臓がん；ＧＢ：神経膠芽腫；ＧＣ：胃がん；ＮＳＣＬＣ：非小細胞肺がん；ＲＣＣ：腎細胞がん；ＳＣＬＣ：小細胞肺がん；ＵＢＣ：尿膀胱がん；ＵＥＣ：子宮および子宮内膜がん。
【図５Ｂ】同上
【図５Ｃ】同上
【図５Ｄ】同上
【図５Ｅ】同上
【図５Ｆ】同上
【図５Ｇ】同上
【図５Ｈ】同上
【図５Ｉ】同上
【図５Ｊ】同上
【図５Ｋ】同上
【図５Ｌ】同上
【図５Ｍ】同上
【図５Ｎ】同上
【図５Ｏ】同上
【図５Ｐ】同上
【図５Ｑ】同上
【図５Ｒ】同上
【図６−１】健常ＨＬＡ−Ａ＊０２＋ドナーのペプチド特異的生体外ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の例示的結果を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、例えば、それぞれ配列番号１１ペプチド（Ａ、左パネル）または配列番号１４ペプチド（Ｂ、左パネル）（配列番号１５７（Ｃ）、２３３（Ｄ）、８５（Ｅ）、８９（Ｆ）、１５５（Ｇ）、１５３（Ｈ）、２６４（Ｉ）、１１７（Ｊ）、２５３（Ｋ）、３９（Ｌ）、および２０３（Ｍ））と複合体形成した、抗ＣＤ２８ｍＡｂおよびＨＬＡ−Ａ＊０２で被覆された、人工ＡＰＣを使用して初回刺激された。３サイクルの刺激後、ペプチド反応性細胞の検出は、例えば、Ａ＊０２／配列番号１１（Ａ）またはＡ＊０２／配列番号１４（Ｂ）などの妥当な多量体を用いた、２Ｄ多量体染色によって実施された。右側パネル（例えばＡおよびＢ）は、無関係のＡ＊０２／ペプチド複合体で刺激された細胞の調節染色を示す。生存一重細胞は、ＣＤ８＋リンパ球についてゲートされた。ブーリアンゲートは、異なるペプチドに対して特異的な多量体によって検出された、擬陽性事象の除外を助けた。ＣＤ８＋リンパ球の中の特異的多量体＋細胞の頻度が示される。
【図６−２】同上
【図６−３】同上
【図６−４】同上
【図６−５】同上
【図６−６】同上
【図６−７】同上
【図７Ａ】正常組織と比較して、種々のがん組織における様々なペプチドの過剰提示を示す。分析は、３２０個を超える正常組織サンプル、および４６２個のがんサンプルからのデータを含んだ。示されているのは、ペプチドが提示されたと認められたサンプルのみである。遺伝子：ＣＣＲ８、ペプチド：ＬＬＩＰＦＴＩＦＭ（配列番号４３）、組織左から右に：１６がん組織（１胆管がん、１乳がん、１結腸がん、７肺がん、２リンパ節がん、３卵巣がん、１皮膚がん）
【図７Ｂ】遺伝子：ＣＸＣＲ５、ペプチド：ＩＬＶＴＳＩＦＦＬ（配列番号１５２）、組織左から右に：６正常組織（１リンパ節、５脾臓）、１６がん組織（８白血病、８リンパ節がん）
【図７Ｃ】遺伝子：ＣＹＳＬＴＲ１、ペプチド：ＶＩＬＴＳＳＰＦＬ（配列番号１５６）、組織左から右に：３正常組織（１肺、１リンパ節、１脾臓）、１１がん組織（２乳がん、５白血病、３リンパ節がん、１骨髄性細胞がん）
【実施例】
【０３８３】
実施例１
細胞表面に提示される腫瘍関連ペプチドの同定および定量化
組織サンプル
患者の腫瘍組織は、Ａｓｔｅｒａｎｄ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＵＳＡおよびＲｏｙｓｔｏｎ，Ｈｅｒｔｓ，ＵＫ）；Ｖａｌ  ｄ’Ｈｅｂｒｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ）；ＢｉｏＳｅｒｖｅ（Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）；Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ（ＣＣＩＴ），Ｈｅｒｌｅｖ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｈｅｒｌｅｖ）；Ｇｅｎｅｔｉｃｉｓｔ  Ｉｎｃ．（Ｇｌｅｎｄａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｍｕｎｉｃｈ；京都府立医科大学（ＫＰＵＭ）；大阪市立大学（ＯＣＵ）；ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ  Ｉｎｃ．，（Ｃｕｌｖｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｔｕｂｉｎｇｅｎから得られた。正常組織は、Ｂｉｏ−Ｏｐｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ；ＢｉｏＳｅｒｖｅ，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ；Ｃａｐｉｔａｌ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ；Ｇｅｎｅｔｉｃｉｓｔ  Ｉｎｃ．，Ｇｌｅｎｄａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｍｕｎｉｃｈ；ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ  Ｉｎｃ．，Ｃｕｌｖｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｔｕｂｉｎｇｅｎから得られた。全ての患者の告知に基づく同意書が、外科手術または検死解剖前に得られた。組織は切除直後に衝撃凍結されて、ＴＵＭＡＰの単離まで−７０℃未満で保存された。
【０３８４】
組織サンプルからのＨＬＡペプチドの単離
衝撃凍結組織サンプルからのＨＬＡペプチド貯留は、わずかに修正されたプロトコル（Ｆａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｓｅｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）に従って、ＨＬＡ−Ａ＊０２−特異的抗体ＢＢ７．２、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ特異的抗体Ｗ６／３２、ＣＮＢｒ活性化セファロース、酸処理、および限外濾過を使用して、免疫沈殿によって固形組織から得られた。
【０３８５】
質量分析
得られたＨＬＡペプチド貯留は、逆相クロマトグラフィー（ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬ  Ｃ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｗａｔｅｒｓ）によって、それらの疎水性に従って分離され、ＥＳＩ源を装着したＬＴＱ−ｖｅｌｏｓおよびｆｕｓｉｏｎハイブリッド質量分光計（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）内で溶出ペプチドが分析された。ペプチド貯留は、毎分４００ｎＬの流速を適用して、１．７μｍ  Ｃ１８逆相材料（Ｗａｔｅｒｓ）で充填された、分析用融合シリカマイクロキャピラリーカラム（７５μｍ内径×２５０ｍｍ）上に直接挿入された。引き続いて、毎分３００ｎＬの流速で１０％から３３％へのＢの二段階１８０分間二成分勾配を用いて、ペプチドが分離された。勾配は、溶媒Ａ（水中の０．１％ギ酸）および溶媒Ｂ（アセトニトリル中の０．１％ギ酸）から構成された。ｎａｎｏＥＳＩ源への導入には、金被覆ガラス毛管（ＰｉｃｏＴｉｐ、Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）が使用された。ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分光計は、ＴＯＰ５ストラテジーを使用してデータ依存モードで操作された。手短に述べると、スキャンサイクルは、Ｏｒｂｉｔｒａｐ（Ｒ＝３００００）内の高質量精度の完全スキャンで開始され、これもまたＯｒｂｉｔｒａｐ（Ｒ＝７５００）内の５種の最も豊富な前駆イオンのＭＳ／ＭＳスキャンがそれに続き、以前選択されたイオンは動的に除外された。タンデム質量スペクトルは、ＳＥＱＵＥＳＴおよび追加的な手動調節によって解釈された。同定されたペプチド配列は、生成された天然ペプチド断片化パターンと、配列が同一の合成参照ペプチドの断片化パターンとの比較によって確認された。
【０３８６】
イオン計数によって、すなわちＬＣ−ＭＳ特性の抽出と解析によって、無標識相対ＬＣ−ＭＳ定量化が実施された（Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。方法は、ペプチドのＬＣ−ＭＳシグナル面積が、サンプル中のその豊富さに相関すると仮定する。抽出された特性は、電荷状態デコンボリューションと滞留時間アライメントによって、さらに処理された（Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｓｔｕｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。最終的に、全てのＬＣ−ＭＳ特性を配列同定結果と相互参照して、異なるサンプルの定量的データと組織からペプチドへの提示プロファイルとが組み合わされた。定量的データは、技術的および生物学的反復試験内の変動を考慮した中心傾向に従って、二段法で正規化された。このようにして、それぞれの同定されたペプチドが定量的データと関連付けられ、サンプルと組織の間の相対定量化が可能になる。さらに、ペプチド候補について得られた全ての定量的データを手動で検査し、データ整合性を保証して自動解析の確度が確認された。各ペプチドについて、提示プロファイルが計算され、平均サンプル提示ならびに反復試験変動が示された。プロファイルは、がんサンプルを正常組織サンプルのベースラインに並置する。例示的過剰提示ペプチドの提示プロファイルは、図１に示される。選択されたペプチドについて、実体全体にわたるペプチド提示の概要が表４に示される。
【０３８７】
表4A:実体全体にわたる選択されたペプチドの提示の概説
ペプチドが、正常組織と比較して、この実体のがんサンプル上で過剰提示されれば、それは実体中で興味深いと見なされた。MEL=メラノーマ、BRCA=乳がん、OSCAR=食道がん。BPHは、良性前立腺過形成ならびに膵臓がんを含む。
【表４Ａ−１】
2020188764.tif 000016
【表４Ａ−２】
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【表４Ａ−３】
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【表４Ａ−４】
2020188764.tif 000019
【０３８８】
表4B:実体全体にわたる選択されたペプチドの提示の概説
GB=神経膠芽腫、BRCA=乳がん、CRC=結腸直腸がん、RCC=腎細胞がん、CLL=慢性リンパ球性白血病、HCC=肝細胞がん、NSCLC=非小細胞肺がん、SCLC=小細胞肺がん、NHL=非ホジキンリンパ腫、AML=急性骨髄性白血病、OC=卵巣がん、PC=膵臓がん、BPH=前立腺がんおよび良性前立腺過形成、OSCAR=胃食道接合部のがんを含むめた食道がん、GBC_CCC=胆嚢腺がんおよび胆管細胞がん、MEL=メラノーマ、GC=胃がん、UBC=膀胱がん、UTC=子宮がん
【表４Ｂ−１】
2020188764.tif 000020
【表４Ｂ−２】
2020188764.tif 000021
【表４Ｂ−３】
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【表４Ｂ−４】
2020188764.tif 000023
【表４Ｂ−５】
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【表４Ｂ−６】
2020188764.tif 000025
【０３８９】
実施例２
本発明のペプチドをコードする遺伝子発現プロファイリング
正常細胞と比較した腫瘍細胞上のペプチドの過剰提示または特異的提示は、免疫療法におけるその有用性にとって十分であり、いくつかのペプチドは、それらの起源タンパク質が正常組織にもまた存在するにもかかわらず、腫瘍特異的である。それでもなお、ｍＲＮＡ発現プロファイリングは、免疫療法のためのペプチド標的の選択において、安全性のレベルを高めることができる。特に、アフィニティ成熟ＴＣＲなどの高い安全性リスクがある治療の選択肢では、理想的な標的ペプチドは、腫瘍に特有で正常組織上には見られないタンパク質に由来する。本発明では、全ての起源遺伝子の正常組織発現は、約３０００個の正常組織サンプルをカバーする、上記のＲＮＡ発現データのデータベースに基づいて、最小であることが示された。さらに、いくつかのがん実体（ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、ＢＰＨ／ＰＣＡ）の場合は、正常および腫瘍組織のＲＮＡ分析が付加されて、それぞれのがんを有する患者集団中の標的カバー度が推定された。
【０３９０】
ＲＮＡ起源および調製
外科的に除去された組織標本は、告知に基づく同意書が各患者から入手された後に、上述の通り提供された（実施例１を参照されたい）。腫瘍組織標本は、手術直後にスナップ凍結され、その後、液体窒素下で乳鉢と乳棒を用いて均質化された。全ＲＮＡは、ＴＲＩ試薬（Ａｍｂｉｏｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してこれらのサンプルから調製され、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）による精製がそれに続き；どちらの方法も製造業者のプロトコルに従って実施された。
【０３９１】
健常ヒト組織からの全ＲＮＡは、商業的に入手された（Ａｍｂｉｏｎ，Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；ＢｉｏＣｈａｉｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）。幾人（２〜１２３人）かの個人からのＲＮＡは、各個人からのＲＮＡが等しく重み付けされるように混合された。全てのＲＮＡサンプルの品質および量は、ＲＮＡ  ６０００  Ｐｉｃｏ  ＬａｂＣｈｉｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で評価された。
【０３９２】
ＲＮＡＳｅｑ実験のための健常ヒト組織からの全ＲＮＡは、Ａｓｔｅｒａｎｄ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ  ＆  Ｒｏｙｓｔｏｎ，Ｈｅｒｔｓ，ＵＫ）、ＢｉｏＣａｔ  ＧｍｂＨ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＢｉｏＳｅｒｖｅ（Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）、Ｃａｐｉｔａｌ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｓｔ  Ｉｎｃ．（Ｇｌｅｎｄａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｎａｚｉｏｎａｌｅ  Ｔｕｍｏｒｉ”Ｐａｓｃａｌｅ”（Ｎａｐｌｅｓ，Ｉｔａｌｙ）、ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ  Ｉｎｃ．（Ｃｕｌｖｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手された。
【０３９３】
ＲＮＡＳｅｑ実験のための腫瘍組織からの全ＲＮＡは、Ａｓｔｅｒａｎｄ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ  ＆  Ｒｏｙｓｔｏｎ，Ｈｅｒｔｓ，ＵＫ）、Ｂｉｏ−Ｏｐｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ），ＢｉｏＳｅｒｖｅ（Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｓｔ  Ｉｎｃ．（Ｇｌｅｎｄａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ  Ｉｎｃ．（Ｃｕｌｖｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｂｏｎｎ（Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｔｕｂｉｎｇｅｎ（Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手された。
【０３９４】
マイクロアレイ実験
カバー度は、３０個のＧＢ、１６個のＣＲＣ、５６個のＲＣＣ、１２個のＨＣＣ、３８個のＮＳＣＬＣ、１１個のＰＣ、３４個のＧＣ、および２０個の前立腺がんサンプルの発現プロファイル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ）の解析によって、推定された。
【０３９５】
全ての腫瘍および正常組織ＲＮＡサンプルの遺伝子発現解析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ（ＨＧ）Ｕ１３３ＡまたはＨＧ−Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって実施された。全てのステップは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマニュアルに従って実施された。簡単に述べると、二本鎖ｃＤＮＡは、マニュアルに記載されるようにして、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＲＴＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびオリゴｄＴ−Ｔ７プライマー（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、５〜８μｇの全ＲＮＡから合成された。生体外転写は、Ｕ１３３ＡアレイのためのＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＥＮＺＯ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて、またはＵ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０のためのＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＩＶＴ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて実施され、ｃＲＮＡ断片化、ハイブリダイゼーション、そしてストレプトアビジン−フィコエリトリンとビオチン化抗ストレプトアビジン抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）とを用いた染色がそれに続いた。画像は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２５００Ａ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｕ１３３Ａ）またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅ−Ｃｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００（Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０）でスキャンされ、全てのパラメータについてデフォルト設定を使用して、ＧＣＯＳソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によってデータが解析された。正規化のために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘによって提供される１００個のハウスキーピング遺伝子が使用された。相対的発現値は、ソフトウェアによって与えられるシグナルｌｏｇ比から計算され、正常な腎臓サンプルが自由裁量で１．０に設定された。ＨＣＣ、ＣＲＣ、ＧＢ、ＧＣ、ＮＳＣＬＣ、ＰＣ、ＲＣＣ、またはＢＰＨ／ＰＣＡで高度に過剰発現されまたは排他的に発現される、本発明の起源遺伝子の例示的発現プロファイルは、図２に示される。選択された遺伝子のカバー度の概要が、表に示される。
【０３９６】
表5A:選択されたペプチドの起源遺伝子の標的カバー度
過剰発現は、遺伝子の最大発現を示した関連正常組織と比較した、腫瘍上における1.5倍を超えるより高い発現と定義された。<19%過剰発現=I、20〜49%=II、50〜69%=III、>70%=IV。ペプチドが、いくつかの起源遺伝子に由来し得る場合、最小のカバー度がある遺伝子が決定要因となった。
【表５Ａ−１】
2020188764.tif 000026
【表５Ａ−２】
2020188764.tif 000027
【表５Ａ−３】
2020188764.tif 000028
【表５Ａ−４】
2020188764.tif 000029
【０３９７】
ＲＮＡｓｅｑ実験
腫瘍および正常組織ＲＮＡサンプルの遺伝子発現解析は、ＣｅＧａＴ（Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、次世代配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）によって実施された。簡単に述べると、配列決定ライブラリーは、ＲＮＡ断片化、ｃＤＮＡ転換、および配列決定アダプターの付加を含む、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ｖ４試薬キットを使用して、販売業者（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）のプロトコルに従って作成される。複数のサンプルに由来するライブラリーは等モル混合され、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００配列決定装置上で、製造会社の使用説明書に従って配列決定され、５０ｂｐのシングルエンドリードが生成された。処理された読み取りは、ＳＴＡＲソフトウェアを使用して、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８）にマッピングされる。発現データは、ｅｎｓｅｍｂｌ配列データベース（Ｅｎｓｅｍｂｌ７７）の注釈に基づいて、ＲＰＫＭ（１００万個のマッピングされた読み取りあたりキロベースあたり読み取り、ソフトウェアＣｕｆｆｌｉｎｋｓによって生成される）として転写物レベルで、そしてエクソンレベルで（全読み取り、ソフトウェアＢｅｄｔｏｏｌｓによって生成される）提供される。エクソン読み取りは、エクソン長さおよびアライメントサイズについて正規化されて、ＲＰＫＭ値が得られる。
【０３９８】
ＮＨＬ、ＢＲＣＡ、ＧＢＣ、ＣＣＣ、ＭＥＬ、ＯＣ、ＯＳＣＡＲ、ＳＣＬＣ、ＵＢＣ、ＵＥＣで高度に過剰発現されまたは排他的にで発現される本発明の起源遺伝子の例示的発現プロファイルは、図２Ｆ〜Ｈに示される。さらなる例示的遺伝子の発現スコアは、表５Ｂに示される。
【０３９９】
表5B:選択されたペプチドの起源遺伝子の標的カバー度
過剰発現は、遺伝子の最大発現を示した関連正常組織と比較した、腫瘍上における1.5倍を超えるより高い発現と定義された。<19%過剰発現=I、20〜49%=II、50〜69%=III、>70%=IV。ペプチドが、いくつかの起源遺伝子に由来し得る場合、最小のカバー度がある遺伝子が決定要因となった。ベースラインは、以下の関連正常組織を含んだ:脂肪組織、副腎、動脈、骨髄、脳、軟骨、結腸、食道、胆嚢、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、膵臓、下垂体、直腸、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、胸腺、甲状腺、気管、膀胱、および静脈。同一組織型のいくつかのサンプル発現データが利用できる場合、全ての各サンプルの算術平均が、計算のために使用された。AML=急性骨髄性白血病、NHL=非ホジキンリンパ腫、BRCA=乳がん、CLL=慢性リンパ球性白血病、GBC_CCC=胆嚢腺がんおよび胆管細胞がん、MEL=メラノーマ、OC=卵巣がん、OSCAR=食道がん、胃食道接合部がんを含む、SCLC=小細胞肺がん、UBC=膀胱がん、UTC=子宮がん
【表５Ｂ−１】
2020188764.tif 000030
【表５Ｂ−２】
2020188764.tif 000031
【表５Ｂ−３】
2020188764.tif 000032
【０４００】
実施例３
ＭＨＣクラスＩ提示ペプチドの生体外免疫原性
本発明のＴＵＭＡＰの免疫原性に関する情報を得るために、本発明者らは、ペプチド／ＭＨＣ複合体および抗ＣＤ２８抗体を負荷した人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）によるＣＤ８＋Ｔ細胞の反復刺激に基づく、生体外Ｔ細胞プライミングアッセイを用いて調査を実施した。このようにして、本発明者らは、これまでに本発明の４７個のＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ＴＵＭＡＰの免疫原性を示し得て、これらのペプチドが、それに対するＣＤ８＋前駆Ｔ細胞がヒトに存在する、Ｔ細胞エピトープであることを実証した（表６ＡおよびＢ）。
【０４０１】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の生体外プライミング
ペプチドＭＨＣ複合体（ｐＭＨＣ）および抗ＣＤ２８抗体を負荷した、人工抗原提示細胞による生体外刺激を実施するために、本発明者らは、最初に、告知に基づく同意後に、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｃｌｉｎｉｃｓ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙから得られた健常ドナーのＣＤ８ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ−Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した正の選択を通じて、新鮮ＨＬＡ−Ａ＊０２白血球除去生成物からＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。ＰＢＭＣおよび単離ＣＤ８＋リンパ球またはＰＢＭＣは、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清（ＰＡＮ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｉｄｅｎｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＣＣ  Ｐｒｏ，Ｏｂｅｒｄｏｒｌａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）を添加した、ＲＰＭＩ−Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からなるＴ細胞培地（ＴＣＭ）中で、使用時まで培養された。２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ，Ｎｕｒｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）もまた、この段階でＴＣＭに添加された。ｐＭＨＣ／抗ＣＤ２８被覆ビーズの生成、Ｔ細胞刺激、および読み取りは、高度に定義された生体外システム内で、刺激条件あたり４種の異なるｐＭＨＣ分子と、読み取り条件あたり８種の異なるｐＭＨＣ分子を使用して実施された。
【０４０２】
製造会社（Ｐｅｒｂｉｏ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が推奨する通りにスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンを使用して、精製共刺激マウスＩｇＧ２ａ抗ヒトＣＤ２８  Ａｂ９．３（Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）が化学的にビオチン化された。使用されたビーズは、直径５．６μｍのストレプトアビジン被覆ポリスチレン粒子（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）であった。
【０４０３】
陽性および陰性対照刺激のために使用されたｐＭＨＣは、それぞれ、Ａ＊０２０１／ＭＬＡ−００１（修飾Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１に由来するペプチドＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号２８９））、およびＡ＊０２０１／ＤＤＸ５−００１（ＤＤＸ５に由来するＹＬＬＰＡＩＶＨＩ、配列番号２９０）であった。
【０４０４】
４×１２．５ｎｇの異なるビオチンｐＭＨＣ存在下で、８００，０００個のビーズ／２００μｌが９６ウェルプレート内で被覆され、洗浄されて、引き続いて２００μｌの容量中で、６００ｎｇのビオチン抗ＣＤ２８が添加された。５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を添加した２００μｌのＴＣＭ中で、１×１０６のＣＤ８＋Ｔ細胞を２×８５個の洗浄被覆ビーズと、３７℃で３日間にわたり同時インキュベートすることで、９６ウェルプレート内で刺激が開始された。次に８０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した新鮮ＴＣＭで培地の半分を交換し、３７℃で４日間にわたり培養が継続された。この刺激サイクルが、合計３回実施された。条件あたり８種の異なるｐＭＨＣ分子を使用するｐＭＨＣ多量体読み取りでは、５種の異なる蛍光色素への共役を包含するわずかな修正を加えて、以前記載されたような（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）二次元コンビナトリアルコーディングアプローチが使用された。最後に、Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ近赤外染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体クローンＳＫ１（ＢＤ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および蛍光性ｐＭＨＣ多量体による細胞の染色によって多量体解析が実施された。解析では、適切なレーザーおよびフィルターを装着したＢＤ  ＬＳＲＩＩ  ＳＯＲＰ血球計数器が使用された。ペプチド特異的細胞は、全ＣＤ８＋細胞の百分率として計算された。多量体解析の評価は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を使用して実施された。特異的多量体＋ＣＤ８＋リンパ球の生体外初回刺激は、陰性対照刺激と比較することで検出された。１人の健常ドナーの少なくとも１つの評価可能生体外刺激ウェルが、生体外刺激後に、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞系を含有することが認められれば、所与の抗原の免疫原性が検出された（すなわちこのウェルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞内に少なくとも１％の特異的多量体＋を含有し、特異的多量体＋細胞の百分率は、陰性対照刺激の中央値の少なくとも１０倍であった）。
【０４０５】
ペプチドの生体外免疫原性
ＨＬＡクラスＩペプチドを試験するために、ペプチド特異的Ｔ細胞系の生成によって生体外免疫原性が実証され得る。本発明の１５種のペプチドに関する、ＴＵＭＡＰ特異的多量体染色後における例示的フローサイトメトリー結果は、対応する陰性対照と共に図３および図６に示される。本発明からの２つのペプチドの結果が、表６ＡおよびＢに要約される。
【０４０６】
表6A:本発明のHLAクラスIペプチドの生体外免疫原性
出願人によって実施された本発明のペプチドの生体外免疫原性実験の例示的結果。<20%=+;21%-49%=++;50%-69%=+++;>=70%=++++
【表６Ａ】
2020188764.tif 000033
【０４０７】
表6B:本発明のHLAクラスIペプチドの生体外免疫原性
出願人によって実施された、本発明のHLA-A*02拘束性ペプチドについての生体外免疫原性実験の代表的結果である。生体外免疫原性実験の結果が示される。陽性ウェルおよびドナーの百分率(評価可能内)は、示されるように要約される<20%=+;20%-49%=++;50%-69%=+++;>=70%=++++
【表６Ｂ−１】
2020188764.tif 000034
【表６Ｂ−２】
2020188764.tif 000035
【０４０８】
実施例４
ペプチドの合成
全てのペプチドは、Ｆｍｏｃストラテジーを使用する、標準的な十分に確立された固相ペプチド合成を使用して合成された。
【０４０９】
個々のペプチドのアイデンティティーおよび純度は、質量分析および分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによって判定された。ペプチドは、純度＞５０％の白色から灰白色の凍結乾燥物（トリフルオロ酢酸塩）として得られた。
【０４１０】
全てのＴＵＭＡＰは、好ましくはトリフルオロ酢酸塩または酢酸塩として投与され、その他の塩形態もまた可能である。
【０４１１】
実施例５
ＭＨＣ結合アッセイ
本発明によるＴ細胞ベースの治療法のための候補ペプチドは、それらのＭＨＣ結合能力（親和性）についてさらに試験された。個々のペプチド−ＭＨＣ複合体は、ＵＶリガンド交換によって生成され、ＵＶ感受性ペプチドはＵＶ照射に際して切断されて、分析される目的ペプチドで交換された。ペプチド受容性ＭＨＣ分子と効果的に結合して安定化し得るペプチド候補のみが、ＭＨＣ複合体の分離を防止する。交換反応の収率を判定するために、安定化ＭＨＣ複合体の軽鎖（β２ｍ）の検出に基づくＥＬＩＳＡが実施された。アッセイは、Ｒｏｄｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｒｏｄｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）に一般的に記載されるようにして実施された。
【０４１２】
９６ウェルＭＡＸＩＳｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ）が、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌストレプトアビジンにより室温で一晩被覆されて、４回洗浄され、ブロック緩衝液を含有する２％ＢＳＡ中で３７℃で１時間ブロックされた。再折りたたみされたＨＬＡ−Ａ＊０２０１０２：０１／ＭＬＡ−００１単量体が、１５〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲をカバーする標準物質の役割を果たした。ＵＶ交換反応のペプチド−ＭＨＣ単量体は、ブロック緩衝液中で１００倍に希釈された。サンプルは、３７℃で１時間インキュベートされて、４回洗浄され、２ｕｇ／ｍｌのＨＲＰ共役結合抗β２ｍと共に３７℃で１時間インキュベートされ、再度洗浄されて、ＮＨ２ＳＯ４で停止させたＴＭＢ溶液で検出された。吸光は、４５０ｎｍで測定された。抗体またはそれらのフラグメント、および／またはＴ細胞受容体またはそれらのフラグメントの生成および製造のためには、高い交換収率（好ましくは５０％よりも高い、最も好ましくは高い７５％よりも）を示す候補ペプチドが、ＭＨＣ分子に対する十分な結合活性を示してＭＨＣ複合体の分離を防止することから、一般に好ましい。
【０４１３】
表7:MHCクラスI結合スコア
HLAクラスI拘束性ペプチドとHLA-A*02:01との結合は、ペプチド交換収率によって評価された:>10%=+;>20%=++;>50=+++;>75%=++++
【表７−１】
2020188764.tif 000036
【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
2020188764.tif 000041
【０４１４】
実施例６
表8:本発明による好ましいペプチド
【表８】
2020188764.tif 000042
【０４１５】
細胞表面に提示される腫瘍関連ペプチドの絶対定量化
抗体および／またはＴＣＲなどのバインダーの生成は、骨の折れる方法であり、いくつかの選択された標的のみに実施されてもよい。腫瘍関連および特異的ペプチドの場合、選択基準としては、提示の排他性および細胞表面に提示されるペプチドの密度が挙げられるが、これに限定されない。本明細書に記載されるようなペプチドの単離および相対定量化に加えて、本発明者らは、記載されるように、細胞あたりの絶対ペプチドコピー数を分析した。固形腫瘍サンプル中の細胞あたりのＴＵＭＡＰコピーの定量化は、単離されたＴＵＭＡＰの絶対定量化、ＴＵＭＡＰ単離の効率、および分析される組織サンプルの細胞数を必要とする。
【０４１６】
ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるペプチド定量化
質量分析によるペプチドの正確な定量化のために、内標準法を使用して、各ペプチドの検量線が作成された。内標準は、各ペプチドの二重同位体標識変異体であり、すなわち、２つの同位体標識アミノ酸がＴＵＭＡＰ合成に含まれた。それは、腫瘍関連ペプチドとはその質量のみが異なるが、他の物理化学的性質に差異を示さない（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。内標準が各ＭＳサンプルに添加され、全てのＭＳシグナルは内標準のＭＳシグナルに対して正規化されて、ＭＳ実験間の可能な技術的変動が平準化された。
【０４１７】
検量線は、少なくとも３つの異なるマトリックス中で、すなわち、日常的ＭＳサンプルと類似した天然サンプルからのＨＬＡペプチド溶出液中で作成され、各調製物は二連のＭＳ試験で測定された。評価のためには、ＭＳシグナルが内標準のシグナルに対して正規化され、検量線がロジスティック回帰によって算出された。
【０４１８】
組織サンプルからの腫瘍関連ペプチドの定量化のためには、それぞれのサンプルにも内標準が添加され；ＭＳシグナルが、内標準に対して正規化され、ペプチド検量線を使用して定量化された。
【０４１９】
ペプチド／ＭＨＣ単離の効率
あらゆるタンパク質精製処理と同様に、組織サンプルからのタンパク質の単離には、目的タンパク質のいくらかの損失が伴う。ＴＵＭＡＰ単離の効率を判定するために、絶対定量化のために選択された全てのＴＵＭＡＰについて、ペプチド／ＭＨＣ複合体が生成された。添加されたものを天然ペプチド／ＭＨＣ複合体から識別できるように、ＴＵＭＡＰの単一同位体標識バージョンが使用され、すなわち、１つの同位体標識アミノ酸がＴＵＭＡＰ合成に含まれた。これらの複合体は、新鮮に調製された組織溶解産物に、すなわち、ＴＵＭＡＰ単離手順の可能な限り早い時点で添加され、次に、以下の親和性精製において、天然ペプチド／ＭＨＣ複合体のように捕捉された。したがって単一標識ＴＵＭＡＰの回収率を測定することで、個々の天然ＴＵＭＡＰの単離効率に関する結論が可能になる。
【０４２０】
単離効率は、少数のサンプルで分析され、これらの組織サンプル間で同等であった。対照的に、単離効率は、個々のペプチド間で異なる。これは、単離効率が、限定数の組織サンプル中でのみ判定されるが、任意のその他の組織標本に外挿されてもよいことを提案する。しかしながら、単離効率がペプチドからその他のペプチドに外挿されないこともあるので、各ＴＵＭＡＰは個別に分析する必要がある。
【０４２１】
固体冷凍組織中の細胞数測定
絶対ペプチド定量化に供した組織サンプルの細胞数を測定するために、本発明者らは、ＤＮＡ含量分析を適用した。この方法は、異なる起点の幅広いサンプルに、最も重要なことには、冷凍サンプルに適用できる（Ａｌｃｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｆｏｒｓｅｙ  ａｎｄ  Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，２００９；Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ペプチド単離プロトコル中に、組織サンプルは均質溶解産物に処理され、それから小さな溶解産物アリコートが取り出される。アリコートは３つに分割され、それからＤＮＡが単離される（ＱｉａＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。各ＤＮＡ単離からの全ＤＮＡ含有量は、蛍光ベースのＤＮＡ定量化アッセイ（Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、少なくとも２つの反復試験で定量化される。
【０４２２】
細胞数を計算するために、一連の定義された細胞数がある、単一健常血液細胞のアリコートから、ＤＮＡ標準曲線が作成された。標準曲線を利用して、各ＤＮＡ単離からの全ＤＮＡ含有量から、全細胞含有量が計算される。ペプチド単離のために使用された組織サンプルの平均総細胞数は、既知の溶解産物アリコートの容量および全溶解産物容量を考慮して外挿される。
【０４２３】
細胞あたりのペプチドコピー数
前述の実験のデータを用いて、本発明者らは、サンプルの全ペプチド量を総細胞数で除算して、それに続いて単離効率により除算することで、細胞あたりのＴＵＭＡＰコピー数を算出した。選択されたペプチドの細胞コピー数は、表９に示される。
【０４２４】
表9:絶対コピー数。表は、腫瘍サンプル中の絶対ペプチド定量化の結果を列挙する。細胞あたりコピー数の中央値が、各ペプチドについて示される：<100=+;>=100=++;>=1,000+++;>=10,000=++++。評価可能な高品質MSデータが利用できるサンプル数が示される。
【表９】
2020188764.tif 000043
【０４２５】
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【図１Ｃ】
2020188764.tif 000046
【図１Ｄ】
2020188764.tif 000047
【図１Ｅ】
2020188764.tif 000048
【図１Ｆ】
2020188764.tif 000049
【図１Ｇ】
2020188764.tif 000050
【図１Ｈ】
2020188764.tif 000051
【図１Ｉ】
2020188764.tif 000052
【図１Ｊ】
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【図２Ａ】
2020188764.tif 000054
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
2020188764.tif 000060
【図２Ｈ】
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【図３】
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【図４Ａ】
2020188764.tif 000063
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図４Ｍ】
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【図４Ｎ】
2020188764.tif 000076
【図４Ｏ】
2020188764.tif 000077
【図４Ｐ】
2020188764.tif 000078
【図４Ｑ】
2020188764.tif 000079
【図４Ｒ】
2020188764.tif 000080
【図５Ａ】
2020188764.tif 000081
【図５Ｂ】
2020188764.tif 000082
【図５Ｃ】
2020188764.tif 000083
【図５Ｄ】
2020188764.tif 000084
【図５Ｅ】
2020188764.tif 000085
【図５Ｆ】
2020188764.tif 000086
【図５Ｇ】
2020188764.tif 000087
【図５Ｈ】
2020188764.tif 000088
【図５Ｉ】
2020188764.tif 000089
【図５Ｊ】
2020188764.tif 000090
【図５Ｋ】
2020188764.tif 000091
【図５Ｌ】
2020188764.tif 000092
【図５Ｍ】
2020188764.tif 000093
【図５Ｎ】
2020188764.tif 000094
【図５Ｏ】
2020188764.tif 000095
【図５Ｐ】
2020188764.tif 000096
【図５Ｑ】
2020188764.tif 000097
【図５Ｒ】
2020188764.tif 000098
【図６−１】
2020188764.tif 000099
【図６−２】
2020188764.tif 000100
【図６−３】
2020188764.tif 000101
【図６−４】
2020188764.tif 000102
【図６−５】
2020188764.tif 000103
【図６−６】
2020188764.tif 000104
【図６−７】
2020188764.tif 000105
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2020188764.tif 000107
【図７Ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月22日(2020.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１５７または配列番号１５７と少なくとも８８％相同的なその変異配列の群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドであって、前記変異体が主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と結合し、および／またはＴ細胞を前記変異体ペプチドおよびその薬学的に許容可能な塩と交差反応させ；または
前記ペプチドまたはその変異体が、９〜３０のアミノ酸の全長を有し、または前記ペプチドが、配列番号１５７に示されるアミノ酸配列からなる、ペプチド。
【請求項２】
ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力を有し、前記ＭＨＣに結合すると、ＣＤ４および／またはＣＤ８Ｔ細胞によって認識されることができるようになる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、修飾され、および／または非ペプチド結合を含む、請求項１または２に記載のペプチドまたはその変異体。
【請求項４】
前記ペプチドが、ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸を含んでなる、融合タンパク質の一部である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体をエンコードする核酸、または請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体をエンコードする核酸であって、異種プロモーター配列と結合する、核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸を発現する、発現ベクター。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド、請求項５に記載の核酸または請求項６に記載の発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞であって、前記宿主細胞には樹状細胞または抗原提示細胞が含まれる、宿主細胞。
【請求項８】
医療で使用される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体、請求項５に記載の核酸、請求項６に記載の発現ベクター、または請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドを提示する、または請求項５に記載の核酸を発現する、または請求項６に記載の発現ベクターを含んでなる、請求項７に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記ペプチドまたはその変異体を前記宿主細胞またはその培養液から単離するステップとを含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体を製造する方法。
【請求項１０】
Ｔ細胞を、適切な抗原提示細胞の表面に、または抗原提示細胞を模倣する人工コンストラクトの表面に発現される抗原負荷ヒトクラスＩまたはＩＩ  ＭＨＣ分子に、前記Ｔ細胞を抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり、生体外で接触させるステップを含んでなり、前記抗原が、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドである、活性化Ｔリンパ球を製造するインビトロ法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドを提示する細胞を選択的に認識する、請求項１０に記載の方法によって製造される活性化Ｔリンパ球。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドもしくはその変異体、またはＭＨＣ分子と結合すると、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドもしくはその変異体を特異的に認識する、抗体、または可溶性もしくは膜結合抗体である、抗体。
【請求項１３】
がんの診断および／または治療で使用される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド、請求項５に記載の核酸、請求項６に記載の発現ベクター、請求項７に記載の細胞、請求項１１に記載の活性化Ｔリンパ球または請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
がんが、ペプチド配列番号１５７が由来するタンパク質の過剰発現を示す、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、神経膠芽腫（ＧＢ）、胃がん（ＧＣ）、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん（ＰＣ）、腎細胞がん（ＲＣＣ）、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）、前立腺がん（ＰＣＡ）、卵巣がん（ＯＣ）、メラノーマ、乳がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢がんおよび胆管細胞がん（ＧＢＣ、ＣＣＣ）、膀胱がん（ＵＢＣ）、子宮がん（ＵＥＣ）、およびその他の腫瘍の群から選択される、請求項１３に従って使用される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド、請求項５に記載の核酸、請求項６に記載の発現ベクター、請求項７に記載の細胞、請求項１１に記載の活性化Ｔリンパ球または請求項１２に記載の抗体。
【請求項１５】
ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体、請求項５に記載の核酸、請求項６に記載の発現ベクター、請求項７に記載の細胞、請求項１１に記載の活性化Ｔリンパ球、または請求項１２に記載の抗体を含有する医薬組成物を溶液または凍結乾燥形態で含んでなる容器；と以下（ｂ）〜（ｅ）から選択される１つ以上の要素を含んでなるキット、もしくは、以下（ｂ）〜（ｅ）を含まないキット、
ｂ）前記凍結乾燥製剤のための希釈剤または再構成溶液を含有する第２の容器；
ｃ）配列番号１〜配列番号１５６、配列番号１５８〜配列番号２８８からなる群から選択される少なくとももう１つのペプチド、および
ｄ）（ｉ）前記溶液の使用、または（ｉｉ）前記凍結乾燥製剤の再構成および／または使用のための取扱説明書、
ｅ）（ｉｉｉ）緩衝液、（ｉｖ）希釈剤、（Ｖ）フィルター、（ｖｉ）針、または（Ｖ）シリンジから選択される１つまたは複数をさらに含んでなる、キット。
【請求項１６】
ＨＬＡリガンドと反応性である、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、または組換え可溶性もしくは膜結合Ｔ細胞受容体であって、前記リガンドが、配列番号１５７に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有する、もしくは少なくとも８８％の同一性を有する、または前記アミノ酸配列が配列番号１５７からなる、Ｔ細胞受容体。
【請求項１７】
前記Ｔ細胞受容体が可溶性分子として提供される、または
前記Ｔ細胞受容体が可溶性分子として提供され、免疫刺激ドメインまたは毒素によって代表されるさらなるエフェクター機能を保有する、請求項１６に記載のＴ細胞受容体。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載のＴＣＲをエンコードする核酸、または請求項１６または１７に記載のＴＣＲをエンコードする核酸であって、異種プロモーター配列と結合する、核酸。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸を発現する、発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１８に記載の核酸、または請求項１２に記載の抗体をコードする核酸、または請求項１９に記載の発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞であって、前記宿主細胞にはＴ細胞またはＮＫ細胞が含まれる、宿主細胞。
【請求項２１】
請求項２０に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記Ｔ細胞受容体を前記宿主細胞および／またはその培養液から単離するステップとを含んでなる、請求項１６または１７に記載のＴ細胞受容体を製造する方法。
【請求項２２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド、請求項５に記載の核酸、請求項６に記載の発現ベクター、請求項７に記載の細胞、請求項１１に記載の活性化Ｔリンパ球または請求項１２に記載の抗体または請求項１６または１７に記載のＴ細胞受容体からなる群から選択される、少なくとも１つの活性成分と、薬学的に許容できる担体と、または担体および、追加的な薬学的に許容可能な賦形剤および／もしくは安定剤とを含んでなる医薬組成物。