(57)【要約】      （修正有）【課題】界面活性剤存在下での残存活性が向上したアマドリアーゼの提供、又、界面活性剤存在下でのアマドリアーゼの残存活性を維持する、又は残存活性の低下を軽減する安定化剤及び／又は緩衝剤並びにこれらを含む組成物の提供。【解決手段】界面活性剤を添加してから５分後の残存活性（％）が、特定のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して向上しているアマドリアーゼであって、（ｉ）該アミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換がなされたアミノ酸配列を有し、かつ／又は（ｉｉ）該アミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、前記アマドリアーゼ。【選択図】図５
2020096596.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面活性剤を添加してから５分後の残存活性（％）が、配列番号１、３、または３７に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して向上しているアマドリアーゼであって、
（ｉ）配列番号１、３、または３７に示すアミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換がなされたアミノ酸配列を有し、かつ／又は
（ｉｉ）配列番号１、３、または３７に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、
前記アマドリアーゼ。
【請求項２】
界面活性剤がイオン性界面活性剤である、請求項１記載のアマドリアーゼ。
【請求項３】
配列番号１または３に示すアミノ酸配列における以下の（i）から（xiv）：
（i）２６２位のアスパラギン、
（ii）２５７位のバリン、
（iii）２４９位のグルタミン酸
（iv）２５３位のグルタミン酸、
（v）３３７位のグルタミン、
（vi）３４０位のグルタミン酸、
（vii）２３２位のアスパラギン酸、
（viii）１２９位のアスパラギン酸、
（ix）１３２位のアスパラギン酸、
（x）１３３位のグルタミン酸、
（xi）４４位のグルタミン酸、
（xii）２５６位のグリシン、
（xiii）２３１位のグルタミン酸、及び
（xiv）８１位のグルタミン酸、
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有する、請求項１又は２記載のアマドリアーゼ。
【請求項４】
配列番号１または３に示すアミノ酸配列のアミノ酸が、
以下の（i）から（xiv）の置換：
（i）２６２位のアスパラギンがヒスチジンに置換されている；
（ii）２５７位のバリンがシステイン、セリン、トレオニンに置換されている；
（iii）２４９位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
（iv）２５３位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
（v）３３７位のグルタミンがリジン、アルギニンに置換されている；
（vi）３４０位のグルタミン酸がプロリンに置換されている；
（vii）２３２位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
（viii）１２９位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
（ix）１３２位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
（x）１３３位のグルタミン酸がアラニン、メチオニン、リジン、アルギニンに置換されている；
（xi）４４位のグルタミン酸がプロリンに置換されている；
（xii）２５６位のグリシンがリジン、アルギニンに置換されている；
（xiii）２３１位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている；及び
（xiv）８１位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
のいずれか１以上を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
【請求項５】
配列番号１または３に示すアミノ酸配列において、以下の（i）から（ix）：
（i）４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換および３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換；
（ii）４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換；
（iii）４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換；
（iv）４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換および２３２位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換；
（v）４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換および２４９位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換；
（vi）４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、２５３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換；
（vii）４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、２５３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換および１２９位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換；
（viii）４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、１３３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、２５３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換；並びに
（ix）４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、１３３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、２５３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、３３７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換
よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
【請求項６】
配列番号３７に示すアミノ酸配列のアミノ酸が、
以下の（i）から（ix）の置換：
（i）２４７位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
（ii）２５１位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
（iii）３３５位のトレオニンがリジン、アルギニンに置換されている；
（iv）２３０位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
（v）１２９位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
（vi）１３２位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
（vii）１３３位のグルタミン酸がアラニン、メチオニン、リジン、アルギニンに置換されている；
（viii）２５４位のアスパラギンがリジン、アルギニンに置換されている；及び
（ix）２２９位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
のいずれか１以上を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
【請求項７】
配列番号３７に示すアミノ酸配列において、以下の（i）から（iv）：
（i）２５１位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および３３５位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンの置換；
（ii）１３２位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および３３５位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換；
（iii）１３３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換および３３５位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換；並びに
（iv）２２９位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および３３５位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換；
よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を有する、請求項１〜３および６のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のアミノ酸配列をコードするアマドリアーゼ遺伝子。
【請求項９】
請求項８記載のアマドリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
以下の工程：
（ｉ）請求項１０記載の宿主細胞を培養する工程；
（ｉｉ）宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程；及び
（ｉｉｉ）培養物からアマドリアーゼを単離する工程を含む、アマドリアーゼを製造する方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定に用いるための組成物。
【請求項１３】
１以上の界面活性剤及びアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビン測定用組成物。
【請求項１４】
アマドリアーゼが、
（ｉ）界面活性剤を添加してから５分後の残存活性（％）が、添加しない場合と比較して、１５％以上残存し、かつ／又は
（ｉｉ）終濃度０．０４％の界面活性剤の存在下において、発色基質Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４′−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ−６４）を添加し５分間反応させた後の７５１ｎｍにおける吸光度と、糖化アミノ酸溶液または糖化ペプチド溶液の代わりにイオン交換水を用いた対照液添加から５分後の７５１ｎｍにおける吸光度との差が０．００６以上となるアマドリアーゼである、
請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
アマドリアーゼが配列番号１、３、３７または４０に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するアマドリアーゼである、請求項１３又は１４に記載の組成物。
【請求項１６】
界面活性剤が、７０ｍＭ以下の臨界ミセル濃度を有するものである、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
界面活性剤が、以下の一般式（I)で表される第四級アンモニウム塩、
【化１】
2020096596.tif 000029
［式中、Ｒ１〜Ｒ４は、同一又は異なっていてもよく、置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル、アルケニル、アリール又はベンジルを表し、Ｚ−は、１価の陰イオンを表す。］
以下の一般式（II)で表されるピリジニウム塩、
【化２】
2020096596.tif 000030
［式中、Ｒ５は、置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキルを表し、各Ｒａは、同一又は異なっていてもよく、水素原子又は置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル、アルケニル、アリール又はベンジルを表し、ｎは１〜５の整数を表し、Ｚ−は、１価の陰イオンを表す。］
以下の一般式（III)で表されるホスホニウム塩、
【化３】
2020096596.tif 000031
［式中、Ｒ６〜Ｒ９は、同一又は異なっていてもよく、置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル、アルケニル、アリール又はベンジルを表し、Ｚ−は、１価の陰イオンを表す。］
並びにドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選択される１以上のイオン性界面活性剤である、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
界面活性剤が、オクチルトリメチルアンモニウムクロリド、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド、ジオクチルジメチルアンモニウムクロリド、ジオクチルジメチルアンモニウムブロミド、デシルトリメチルアンモニウムクロリド、デシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロリド、オクタデシルトリメチルアンモニウムブロミド、エイコシルトリメチルアンモニウムクロリド及びエイコシルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンジルドデシルジメチルアンモニウムクロリド、ベンジルドデシルジメチルアンモニウムブロミド、ベンジルテトラデシルジメチルアンモニウムクロリド、ベンジルテトラデシルジメチルアンモニウムブロミド、ベンジルセチルジメチルアンモニウムクロリド、およびベンジルセチルジメチルアンモニウムブロミド、
１−デシルピリジニウムクロリド、１−デシルピリジニウムブロミド、１−ドデシルピリジニウムクロリド、１−ドデシルピリジニウムブロミド、１−テトラデシルピリジニウムクロリド、１−テトラデシルピリジニウムブロミド、１−ヘキサデシルピリジニウムクロリド、１−ヘキサデシルピリジニウムブロミド、Ｎ−セチル−２−メチルピリジニウムクロリド、Ｎ−セチル−２−メチルピリジニウムブロミド、Ｎ−セチル−３−メチルピリジニウムクロリド、Ｎ−セチル−３−メチルピリジニウムブロミド、Ｎ−セチル−４−メチルピリジニウムクロリド、Ｎ−セチル−４−メチルピリジニウムブロミド、１−オクタデシルピリジニウムクロリド、１−オクタデシルピリジニウムブロミド、１−エイコシルピリジニウムクロリド及び１−エイコシルピリジニウムブロミド、
テトラエチルホスホニウムクロリド、テトラエチルホスホニウムブロミド、トリブチルメチルホスホニウムクロリド、トリブチルメチルホスホニウムブロミド、トリブチルメチルホスホニウムヨージド、テトラブチルホスホニウムクロリド、テトラブチルホスホニウムブロミド、テトラ−ｎ−オクチルホスホニウムクロリド、テトラ−ｎ−オクチルホスホニウムブロミド、トリブチルドデシルホスホニウムクロリド、トリブチルドデシルホスホニウムブロミド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムクロリド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムブロミド、メチルトリフェニルホスホニウムクロリド、メチルトリフェニルホスホニウムブロミド、メチルトリフェニルホスホニウムヨージド、テトラフェニルホスホニウムクロリド、並びにテトラフェニルホスホニウムブロミド、
からなる群より選択される１以上のイオン性界面活性剤である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
含まれる界面活性剤が、測定時における終濃度として、０．０１％（ｗ／ｖ）以上である、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
ホウ酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、フマル酸緩衝剤、グルタル酸緩衝剤、シトラコン酸緩衝剤、メサコン酸緩衝剤、マロン酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、アジピン酸緩衝剤、ＡＣＥＳ（N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸）緩衝剤、ＢＥＳ（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸）緩衝剤、Ｂｉｃｉｎ（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン）緩衝剤、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン）緩衝剤、ＥＰＰＳ（4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＨＥＰＰＳＯ（N-(ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＭＥＳ（2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸）緩衝剤、ＭＯＰＳ（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸）緩衝剤、ＭＯＰＳＯ（2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)）緩衝剤、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)）緩衝剤、ＴＡＰＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＴＡＰＳＯ（3-[N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＴＥＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸）緩衝剤、トリシン（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン）緩衝剤及びこれらの組合せからなる群より選択される１以上の緩衝剤をさらに含む、請求項１３に記載の糖化ヘモグロビン測定用組成物。
【請求項２１】
測定溶液における終濃度が100mM以上となるリン酸緩衝剤、測定溶液における終濃度が10mM以上となるクエン酸緩衝剤、測定溶液における終濃度が150mM以上となるＭＥＳ（2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸）緩衝剤、測定溶液における終濃度が100mM以上となるＭＯＰＳ（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸）緩衝剤、測定溶液における終濃度が100mM以上となるＭＯＰＳＯ（2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤、及び測定溶液における終濃度が200mM以上となるＡＣＥＳ（N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸）緩衝剤からなる群より選択される１以上の緩衝剤を含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
リン酸、トリカルボン酸、ジカルボン酸、モノカルボン酸、式（IV）の化合物、
【化４】
2020096596.tif 000032
[式中、nは0、1、2または3であってもよく、R10は、それぞれ独立にH、OH、-CH2OHまたは-COOHであってもよい]
硫酸アンモニウム及びこれらの組合せからなる群より選択される１以上の安定化剤をさらに含む、請求項１３に記載の糖化ヘモグロビン測定用組成物。
【請求項２３】
トリカルボン酸がクエン酸であるか、または、ジカルボン酸がフマル酸、グルタル酸、シトラコン酸、メサコン酸、マロン酸、酒石酸、コハク酸、アジピン酸、マレイン酸、リンゴ酸及びこれらの組合せからなる群より選択されるものであるか、モノカルボン酸が酢酸であるか、または、式（IV）の化合物がＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ及びこれらの組合せからなる群より選択されるものである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記安定化剤が、測定溶液における終濃度が2mM以上となるリン酸、測定溶液における終濃度が0.2mM以上となるクエン酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となるリンゴ酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となるマレイン酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となるシトラコン酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となるマロン酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となるグルタル酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となる酒石酸、測定溶液における終濃度が10mM以上となる酢酸、測定溶液における終濃度が10mM以上となるＭＥＳ（2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸）、測定溶液における終濃度が10mM以上となるＭＯＰＳ（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸）、測定溶液における終濃度が10mM以上となるＭＯＰＳＯ（2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸）、測定溶液における終濃度が2mM以上となる硫酸アンモニウム、及びこれらの組合せからなる群より選択される１以上の安定化剤である、請求項２２または２３に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項２０又は２１に記載の緩衝剤、及び、請求項２２、２３又は２４に記載の安定化剤を含む糖化ヘモグロビン測定用組成物。
【請求項２６】
アマドリアーゼが、配列番号１、配列番号３７もしくは配列番号４０のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、または請求項１〜７のいずれか１項に記載のアマドリアーゼである、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病の診断用酵素として、また、糖尿病マーカーの測定キットに有利に利用され得る界面活性剤耐性に優れたアマドリアーゼ、その遺伝子および組換え体ＤＮＡならびに界面活性剤耐性に優れたアマドリアーゼの製造法に関する。また、本発明はアマドリアーゼの安定化剤及び／又は緩衝剤、並びにこれを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化タンパク質は、グルコースなどのアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体）のアルデヒド基と、タンパク質のアミノ基が非酵素的に共有結合を形成し、アマドリ転移することにより生成したものである。タンパク質のアミノ基としてはアミノ末端のαアミノ基、タンパク質中のリジン残基側鎖のεアミノ基が挙げられる。生体内で生じる糖化タンパク質としては血液中のヘモグロビンが糖化された糖化ヘモグロビン、アルブミンが糖化された糖化アルブミンなどが知られている。
【０００３】
これら生体内で生じる糖化タンパク質の中でも、糖尿病の臨床診断分野において、糖尿病患者の診断や症状管理のための重要な血糖コントロールマーカーとして、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）が注目されている。血液中のＨｂＡ１ｃ濃度は過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は糖尿病の症状の診断や管理において重要な指標となっている。
【０００４】
このＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法として、アマドリアーゼを用いる酵素的方法、すなわち、ＨｂＡ１ｃをプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端より遊離させたα−フルクトシルバリルヒスチジン（以降「αＦＶＨ」と表す。）もしくはα−フルクトシルバリン（以降「αＦＶ」と表す。）を定量する方法が提案されている（例えば、特許文献１〜７参照。）。実際には、ＨｂＡ１ｃからαＦＶを切り出す方法では、夾雑物等による影響が大きく、正確な測定値が得られないという課題があり、より正確な測定値を得る目的から、特に現在ではαＦＶＨを測る方法が主流となっている。
【０００５】
アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸もしくはその誘導体（「アマドリ化合物」ともいう）を酸化して、グリオキシル酸またはα−ケトアルデヒド、アミノ酸またはペプチドおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する。
【０００６】
アマドリアーゼは、細菌、酵母、真菌から見出されているが、特にＨｂＡ１ｃの測定に有用である、αＦＶＨおよび／またはαＦＶに対する酵素活性を有するアマドリアーゼとしては、例えば、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）属、ユーペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ピレノケータ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ）属、アルスリニウム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ）属、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、フェオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属、ウロクラディウム（Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アカエトミエラ（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ）属、アカエトミウム（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、シエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、カエトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、ゲラシノスポラ（Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ）属、ミクロアスカス（Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ）属、レプトスフェリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、オフィオボラス（Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ）属、プレオスポラ（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ）属、コニオケチジウム（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属由来のアマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１、６〜１５、非特許文献１〜１１参照。）。なお、上記報告例の中で、アマドリアーゼは、文献によってはケトアミンオキシダーゼやフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等の表現で記載されている場合もある。
【０００７】
ＨｂＡ１ｃを測定する際に、測定用の試薬組成物中にはアマドリアーゼが過剰に含有されていることが知られている。例えば、終濃度０．３６μＭのＨｂＡ１ｃを測定する際に、アマドリアーゼは１．４ｋＵ／Ｌ、すなわち１分間当たり１．４ｍＭの基質を反応させることができる濃度を用いている（特許文献１６参照。）。アマドリアーゼを用いたＨｂＡ１ｃの測定は、自動分析装置を用いた手法が主流となっており、そのアマドリアーゼの基質との反応時間は５分〜２５分程度で測定を行うことが多い。アマドリアーゼを過剰量で含有させる理由は、上記のような短時間の測定時間の中で基質に対し十分に反応させるためであり、また、アマドリアーゼの反応性や安定性に大きな負の影響を与え得る物質が測定用組成物中に共存する場合には、この影響への対策として、アマドリアーゼを過剰に配合せざるを得ないためである。
【０００８】
アマドリアーゼを用いて全血または赤血球からＨｂＡ１ｃを測定するための前処理方法として、界面活性剤を用いて溶血する事例が挙げられている（例えば、特許文献２、１６〜１８参照。）。ＨｂＡ１ｃをプロテアーゼで分解する際に、反応促進剤として界面活性剤が用いられることもある（例えば、特許文献１９参照。）。したがって、アマドリアーゼを用いてＨｂＡ１ｃを測定するに当たり、界面活性剤は必要不可欠であるが、界面活性剤およびプロテアーゼで処理したＨｂＡ１ｃ溶液とアマドリアーゼ溶液を混合してからＨｂＡ１ｃ定量反応を開始する際に、また、界面活性剤とアマドリアーゼを混合して保存した際に、界面活性剤がアマドリアーゼを変性させる可能性が極めて高い。現在のＨｂＡ１ｃ測定用キットは、アマドリアーゼを必要量より多分に処方し、かつ、安定化剤を処方しているために正確な測定を成し得ているが、多量の試薬を用いているために高コストになることは避けられない。また、現行より効果の強い界面活性剤を使用できるならば、ＨｂＡ１ｃのプロテアーゼ分解効率がより改善され、ＨｂＡ１ｃの測定感度が向上する可能性が高い。さらに、界面活性剤にはヘモグロビンやＨｂＡ１ｃ由来の不溶性ペプチド断片の可溶化効果もあるため、濁りの発生を防止し、測定精度の向上に寄与する。したがって、アマドリアーゼを糖尿病の臨床診断用酵素としてキット試薬に処方する上で要望される性質のひとつに、界面活性剤を含んだ液状の良好な安定性があるといえる。
【０００９】
実際の測定条件は個々に異なるが、公知の文献中に各種アマドリアーゼの液状における安定性に関する開示がみられる：Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．  ＮＩＳＬ  ９３３０株由来アマドリアーゼを含んだ溶液に、５ｍＭのエチレンジアミン４酢酸および３％のグリシンを添加した際は、３０℃、７日間後において７９％の残存活性を維持していることが示されている（例えば、特許文献２０参照。）。また、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ＩＦＯ−９９７２株由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含んだ溶液に、３％のＬ−アラニン、３％のグリシンまたは３％のザルコシンを添加した際は、３７℃、２日間後において１００％の残存活性を維持していることが示されている（例えば、特許文献２１参照。）。
【００１０】
しかしながら、上述のようなアマドリアーゼタンパク質を含んだ溶液には界面活性剤は添加されておらず、界面活性剤の影響を低減する記述は一切ない。また、界面活性剤耐性が高いアマドリアーゼは報告されていない。また界面活性剤存在下でのアマドリアーゼの残存活性を維持する又は残存活性の低下を軽減する安定化剤や緩衝剤は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００４／１０４２０３号
【特許文献２】国際公開第２００５／４９８５７号
【特許文献３】特開２００１−９５５９８号公報
【特許文献４】特公平０５−３３９９７号公報
【特許文献５】特開平１１−１２７８９５号公報
【特許文献６】国際公開第９７／１３８７２号
【特許文献７】特開２０１１−２２９５２６号公報
【特許文献８】特開２００３−２３５５８５号公報
【特許文献９】特開２００４−２７５０１３号公報
【特許文献１０】特開２００４−２７５０６３号公報
【特許文献１１】特開２０１０−３５４６９号公報
【特許文献１２】特開２０１０−５７４７４号公報
【特許文献１３】国際公開第２０１０／４１７１５号
【特許文献１４】国際公開第２０１０／４１４１９号
【特許文献１５】国際公開第２０１１／１５３２５号
【特許文献１６】国際公開第２０１２／０２０７４４号
【特許文献１７】国際公開第２００５／８７９４６号
【特許文献１８】国際公開第２００２／０６５１９号
【特許文献１９】国際公開第２００６／１２０９７６号
【特許文献２０】特開２００６−３２５５４７号公報
【特許文献２１】特開２００９−０００１２８号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３１１，  １０４−１１，  ２００３
【非特許文献２】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  １０６，  ３５８−６６，  ２０１０
【非特許文献３】Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  １０２，  ２４１−３，  ２００６
【非特許文献４】Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４２，  ４９９−５０５，  １９９６
【非特許文献５】Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７８，３４４−５０，２００２
【非特許文献６】Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６，６２５−３２，２００４
【非特許文献７】Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，  ４８７−９１，１９９５
【非特許文献８】Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７４，  ８１３−８１９，  ２００７
【非特許文献９】Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６６，  １２５６−６１，  ２００２
【非特許文献１０】Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６６，  ２３２３−２９，  ２００２
【非特許文献１１】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２７，  ２７−３２，２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述のように従来、アマドリアーゼは、測定時間中に基質に対し十分に反応するよう過剰量で使用されてきた。本発明者らは、界面活性剤がアマドリアーゼの安定性に顕著に負の影響を与え得る成分であることを今回新たに見出した。よって、従来のアマドリアーゼよりも、さらに優れた界面活性剤耐性を有する酵素を作製すれば、酵素およびキットの流通における利便性や、キットに処方するアマドリアーゼや安定化剤の量を低減することで低コスト化、強力な界面活性剤が処方可能になることによるＨｂＡ１ｃの測定感度向上において多大に貢献することが期待される。したがって本発明が解決しようとする課題は、従来のアマドリアーゼと比較して界面活性剤耐性が優れたアマドリアーゼを提供すること、並びに界面活性剤存在下でも、ＨｂＡ１ｃまたはそれに由来する糖化ペプチドの定量が可能な試薬組成物を提供することにある。
【００１４】
また、本発明が解決しようとする課題は、界面活性剤存在下でのアマドリアーゼの残存活性を維持する、又は残存活性の低下を軽減する安定化剤及び／又は緩衝剤並びにこれらを含む組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
酵素に界面活性剤耐性を付与するための情報はほとんど開示されていない現状の中で、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼに対して、特定のアミノ酸残基の置換を導入することにより、また、界面活性存在下でも活性が残存するアマドリアーゼを試薬組成物に含有することにより、上記課題を解決し得ることを見出し、さらに、特定の安定化剤及び／又は緩衝剤を用いると、界面活性剤存在下でのアマドリアーゼの残存活性が維持されるか、又は残存活性の低下が有意に軽減できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１６】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
【００１７】
[１]  界面活性剤を添加してから５分後の残存活性（％）が、配列番号１、３、または３７に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して向上しているアマドリアーゼであって、
（ｉ）配列番号１、３、または３７に示すアミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換がなされたアミノ酸配列を有し、かつ／又は
（ｉｉ）配列番号１、３、または３７に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、
前記アマドリアーゼ。   
【００１８】
[２]  界面活性剤がイオン性界面活性剤である、[１]記載のアマドリアーゼ。   
【００１９】
[３]  配列番号１または３に示すアミノ酸配列における以下の（i）から（xiv）：
（i）２６２位のアスパラギン、
（ii）２５７位のバリン、
（iii）２４９位のグルタミン酸
（iv）２５３位のグルタミン酸、
（v）３３７位のグルタミン、
（vi）３４０位のグルタミン酸、
（vii）２３２位のアスパラギン酸、
（viii）１２９位のアスパラギン酸、
（ix）１３２位のアスパラギン酸、
（x）１３３位のグルタミン酸、
（xi）４４位のグルタミン酸、
（xii）２５６位のグリシン、
（xiii）２３１位のグルタミン酸、及び
（xiv）８１位のグルタミン酸、
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有する、[１]又は[２]記載のアマドリアーゼ。   
【００２０】
[４]  配列番号１または３に示すアミノ酸配列のアミノ酸が、
以下の（i）から（xiv）の置換：
（i）２６２位のアスパラギンがヒスチジンに置換されている；
（ii）２５７位のバリンがシステイン、セリン、トレオニンに置換されている；
（iii）２４９位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
（iv）２５３位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
（v）３３７位のグルタミンがリジン、アルギニンに置換されている；
（vi）３４０位のグルタミン酸がプロリンに置換されている；
（vii）２３２位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
（viii）１２９位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
（ix）１３２位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
（x）１３３位のグルタミン酸がアラニン、メチオニン、リジン、アルギニンに置換されている；
（xi）４４位のグルタミン酸がプロリンに置換されている；
（xii）２５６位のグリシンがリジン、アルギニンに置換されている；
（xiii）２３１位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている；及び
（xiv）８１位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
のいずれか１以上を有する、[１]〜[３]のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
【００２１】
[５]  配列番号１または３に示すアミノ酸配列において、以下の（i）から（ix）：
（i）４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換および３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換；
（ii）４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換；
（iii）４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換；
（iv）４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換および２３２位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換；
（v）４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換および２４９位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換；
（vi）４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、２５３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換；
（vii）４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、２５３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換および１２９位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換；
（viii）４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、１３３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、２５３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換；並びに
（ix）４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、１３３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、２５３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、３３７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換
よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を有する、[１]〜[４]のいずれかに記載のアマドリアーゼ。   
【００２２】
[６]  配列番号３７に示すアミノ酸配列のアミノ酸が、
以下の（i）から（ix）の置換：
（i）２４７位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
（ii）２５１位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
（iii）３３５位のトレオニンがリジン、アルギニンに置換されている；
（iv）２３０位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
（v）１２９位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
（vi）１３２位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
（vii）１３３位のグルタミン酸がアラニン、メチオニン、リジン、アルギニンに置換されている；
（viii）２５４位のアスパラギンがリジン、アルギニンに置換されている；及び
（ix）２２９位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている；
のいずれか１以上を有する、[１]〜[３]のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
【００２３】
[７]  配列番号３７に示すアミノ酸配列において、以下の（i）から（iv）：
（i）２５１位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および３３５位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンの置換；
（ii）１３２位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および３３５位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換；
（iii）１３３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換および３３５位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換；並びに
（iv）２２９位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および３３５位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換；
よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を有する、[１]〜[３]および[６]のいずれかに記載のアマドリアーゼ。   
【００２４】
[８]  [１]〜[７]のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするアマドリアーゼ遺伝子。
【００２５】
[９]  [８]記載のアマドリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。   
【００２６】
[１０]  [９]記載の組換えベクターを含む宿主細胞。   
【００２７】
[１１]  以下の工程：
（ｉ）[１０]記載の宿主細胞を培養する工程；
（ｉｉ）宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程；及び
（ｉｉｉ）培養物からアマドリアーゼを単離する工程を含む、アマドリアーゼを製造する方法。   
【００２８】
[１２]  [１]〜[７]のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定に用いるための組成物。   
【００２９】
[１３]  １以上の界面活性剤及びアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビン測定用組成物。   
【００３０】
[１４]  アマドリアーゼが、
（ｉ）界面活性剤を添加してから５分後の残存活性（％）が、添加しない場合と比較して、１５％以上残存し、かつ／又は
（ｉｉ）終濃度０．０４％の界面活性剤の存在下において、発色基質Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４′−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ−６４）を添加し５分間反応させた後の７５１ｎｍにおける吸光度と、糖化アミノ酸溶液または糖化ペプチド溶液の代わりにイオン交換水を用いた対照液添加から５分後の７５１ｎｍにおける吸光度との差が０．００６以上となるアマドリアーゼである、
[１３]に記載の組成物。   
【００３１】
[１５]  アマドリアーゼが配列番号１、３、３７または４０に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するアマドリアーゼである、[１３]又は[１４]に記載の組成物。   
【００３２】
[１６]  界面活性剤が、７０ｍＭ以下の臨界ミセル濃度を有するものである、[１３]〜[１５]のいずれか１項に記載の組成物。   
【００３３】
[１７]  界面活性剤が、以下の一般式（I)で表される第四級アンモニウム塩、
【化１】
2020096596.tif 000003
［式中、Ｒ１〜Ｒ４は、同一又は異なっていてもよく、置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル、アルケニル、アリール又はベンジルを表し、Ｚ−は、１価の陰イオンを表す。］
以下の一般式（II)で表されるピリジニウム塩、
【化２】
2020096596.tif 000004
［式中、Ｒ５は、置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキルを表し、各Ｒａは、同一又は異なっていてもよく、水素原子又は置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル、アルケニル、アリール又はベンジルを表し、ｎは１〜５の整数を表し、Ｚ−は、１価の陰イオンを表す。］
以下の一般式（III)で表されるホスホニウム塩、
【化３】
2020096596.tif 000005
［式中、Ｒ６〜Ｒ９は、同一又は異なっていてもよく、置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル、アルケニル、アリール又はベンジルを表し、Ｚ−は、１価の陰イオンを表す。］
並びにドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選択される１以上のイオン性界面活性剤である、[１３]〜[１６]のいずれかに記載の組成物。   
【００３４】
[１８]  界面活性剤が、オクチルトリメチルアンモニウムクロリド、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド、ジオクチルジメチルアンモニウムクロリド、ジオクチルジメチルアンモニウムブロミド、デシルトリメチルアンモニウムクロリド、デシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロリド、オクタデシルトリメチルアンモニウムブロミド、エイコシルトリメチルアンモニウムクロリド及びエイコシルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンジルドデシルジメチルアンモニウムクロリド、ベンジルドデシルジメチルアンモニウムブロミド、ベンジルテトラデシルジメチルアンモニウムクロリド、ベンジルテトラデシルジメチルアンモニウムブロミド、ベンジルセチルジメチルアンモニウムクロリド、およびベンジルセチルジメチルアンモニウムブロミド、
１−デシルピリジニウムクロリド、１−デシルピリジニウムブロミド、１−ドデシルピリジニウムクロリド、１−ドデシルピリジニウムブロミド、１−テトラデシルピリジニウムクロリド、１−テトラデシルピリジニウムブロミド、１−ヘキサデシルピリジニウムクロリド、１−ヘキサデシルピリジニウムブロミド、Ｎ−セチル−２−メチルピリジニウムクロリド、Ｎ−セチル−２−メチルピリジニウムブロミド、Ｎ−セチル−３−メチルピリジニウムクロリド、Ｎ−セチル−３−メチルピリジニウムブロミド、Ｎ−セチル−４−メチルピリジニウムクロリド、Ｎ−セチル−４−メチルピリジニウムブロミド、１−オクタデシルピリジニウムクロリド、１−オクタデシルピリジニウムブロミド、１−エイコシルピリジニウムクロリド及び１−エイコシルピリジニウムブロミド、
テトラエチルホスホニウムクロリド、テトラエチルホスホニウムブロミド、トリブチルメチルホスホニウムクロリド、トリブチルメチルホスホニウムブロミド、トリブチルメチルホスホニウムヨージド、テトラブチルホスホニウムクロリド、テトラブチルホスホニウムブロミド、テトラ−ｎ−オクチルホスホニウムクロリド、テトラ−ｎ−オクチルホスホニウムブロミド、トリブチルドデシルホスホニウムクロリド、トリブチルドデシルホスホニウムブロミド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムクロリド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムブロミド、メチルトリフェニルホスホニウムクロリド、メチルトリフェニルホスホニウムブロミド、メチルトリフェニルホスホニウムヨージド、テトラフェニルホスホニウムクロリド、並びにテトラフェニルホスホニウムブロミド、
からなる群より選択される１以上のイオン性界面活性剤である、[１７]に記載の組成物。
【００３５】
[１９]  含まれる界面活性剤が、測定時における終濃度として、０．０１％（ｗ／ｖ）以上である、[１３]〜[１８]のいずれかに記載の組成物。   
【００３６】
[２０]  ホウ酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、フマル酸緩衝剤、グルタル酸緩衝剤、シトラコン酸緩衝剤、メサコン酸緩衝剤、マロン酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、アジピン酸緩衝剤、ＡＣＥＳ（N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸）緩衝剤、ＢＥＳ（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸）緩衝剤、Ｂｉｃｉｎ（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン）緩衝剤、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン）緩衝剤、ＥＰＰＳ（4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＨＥＰＰＳＯ（N-(ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＭＥＳ（2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸）緩衝剤、ＭＯＰＳ（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸）緩衝剤、ＭＯＰＳＯ（2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)）緩衝剤、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)）緩衝剤、ＴＡＰＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＴＡＰＳＯ（3-[N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＴＥＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸）緩衝剤、トリシン（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン）緩衝剤及びこれらの組合せからなる群より選択される１以上の緩衝剤をさらに含む、[１３]に記載の糖化ヘモグロビン測定用組成物。   
【００３７】
[２１]  測定溶液における終濃度が100mM以上となるリン酸緩衝剤、測定溶液における終濃度が10mM以上となるクエン酸緩衝剤、測定溶液における終濃度が150mM以上となるＭＥＳ（2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸）緩衝剤、測定溶液における終濃度が100mM以上となるＭＯＰＳ（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸）緩衝剤、測定溶液における終濃度が100mM以上となるＭＯＰＳＯ（2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤、及び測定溶液における終濃度が200mM以上となるＡＣＥＳ（N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸）緩衝剤からなる群より選択される１以上の緩衝剤を含む、[２０]に記載の組成物。   
【００３８】
[２２]  リン酸、トリカルボン酸、ジカルボン酸、モノカルボン酸、式（IV）の化合物、
【化４】
2020096596.tif 000006
[式中、nは0、1、2または3であってもよく、R10は、それぞれ独立にH、OH、-CH2OHまたは-COOHであってもよい]
硫酸アンモニウム及びこれらの組合せからなる群より選択される１以上の安定化剤をさらに含む、[１３]に記載の糖化ヘモグロビン測定用組成物。   
【００３９】
[２３]  トリカルボン酸がクエン酸であるか、または、ジカルボン酸がフマル酸、グルタル酸、シトラコン酸、メサコン酸、マロン酸、酒石酸、コハク酸、アジピン酸、マレイン酸、リンゴ酸及びこれらの組合せからなる群より選択されるものであるか、モノカルボン酸が酢酸であるか、または、式（IV）の化合物がＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ及びこれらの組合せからなる群より選択されるものである、[２２]に記載の組成物。   
【００４０】
[２４]  前記安定化剤が、測定溶液における終濃度が2mM以上となるリン酸、測定溶液における終濃度が0.2mM以上となるクエン酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となるリンゴ酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となるマレイン酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となるシトラコン酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となるマロン酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となるグルタル酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となる酒石酸、測定溶液における終濃度が10mM以上となる酢酸、測定溶液における終濃度が10mM以上となるＭＥＳ（2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸）、測定溶液における終濃度が10mM以上となるＭＯＰＳ（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸）、測定溶液における終濃度が10mM以上となるＭＯＰＳＯ（2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸）、測定溶液における終濃度が2mM以上となる硫酸アンモニウム、及びこれらの組合せからなる群より選択される１以上の安定化剤である、[２２]または[２３]に記載の組成物。   
【００４１】
[２５]  [２０]又は[２１]に記載の緩衝剤、及び、[２２]、[２３]又は[２４]に記載の安定化剤を含む糖化ヘモグロビン測定用組成物。   
【００４２】
[２６]  アマドリアーゼが、配列番号１、配列番号３７もしくは配列番号４０のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、または[１]〜[７]のいずれかに記載のアマドリアーゼである、[２０]〜[２５]のいずれかに記載の組成物。
【００４３】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-167005号、2013-221515号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００４４】
本発明によれば、糖尿病の診断用酵素として、また、糖尿病マーカーの測定キットに有利に利用され得る界面活性剤耐性の優れたアマドリアーゼおよびそれをコードする遺伝子等を提供することができる。このアマドリアーゼを用いると、高濃度の界面活性剤の存在下でも糖化ヘモグロビンの測定を行うことができる。また本発明の安定化剤及び／又は緩衝剤を用いることにより界面活性剤存在下でのアマドリアーゼの残存活性を維持でき又は残存活性の低下を軽減でき、高濃度の界面活性剤の存在下でも糖化ヘモグロビンの測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１−１】図１−１は、各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列のアライメントである。
【図１−２】図１−２は、各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列のアライメントである。
【図１−３】図１−３は、各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列のアライメントである。
【図２】図２は、０．０１％のＣＴＡＣの混合下でＣＦＰ−Ｔ７を用いて、αＦＶＨを測定した結果を示す。
【図３】図３は、０．０２％のＣＴＡＣの混合下でＣＦＰ−Ｔ７を用いて、αＦＶＨを測定した結果を示す。
【図４】図４は、０．０２％のＣＴＡＣの混合下でＣＦＰ−Ｄ７を用いて、αＦＶＨを測定した結果を示す。
【図５】図５は、０．２％のＣＴＡＣの混合下でＣＦＰ−Ｄ７を用いて、αＦＶＨを測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００４７】
（アマドリアーゼ）
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等とも称され、酸素の存在下で、イミノ２酢酸またはその誘導体（アマドリ化合物）を酸化して、グリオキシル酸またはα−ケトアルデヒド、アミノ酸またはペプチドおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物または植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母または細菌等から得ることができる。
【００４８】
本発明のアマドリアーゼの一態様は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼまたは配列番号３７に示されるアミノ酸配列を有するＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のアマドリアーゼに基づき作製された、界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼの変異体である。このような変異体の例としては、配列番号１または配列番号３７と高い配列同一性（例えば、７０％以上、好ましくは、７５％以上、好ましくは、８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上）を有するアミノ酸配列を有するアマドリアーゼおよび配列番号１または配列番号３７のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼを挙げることができる。
【００４９】
なお、本発明のアマドリアーゼは例えば、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ属、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ属、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ属、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ属、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ属、Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ属、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ属、Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ属、Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ属、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ属、Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ属、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ属、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属などのの生物種に由来するアマドリアーゼに基づき作製されたものでもよい。これらの中でも界面活性剤耐性を有し、かつ／又はアミノ酸配列が上記のように配列番号１又は配列番号３７と高い配列同一性を有するものが好ましい。
【００５０】
界面活性剤耐性が改変されたアマドリアーゼの変異体（改変体）は、アマドリアーゼのアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基を置換する、または付加する、または欠失させることによって得ることができる。
【００５１】
界面活性剤耐性の向上をもたらすアミノ酸の置換として、配列番号１または３に示すアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。
【００５２】
（１）２６２位のアスパラギンの置換、例えば、ヒスチジンへの置換。 
（２）２５７位のバリンの置換、例えば、システイン、セリン、トレオニンへの置換。 
（３）２４９位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（４）２５３位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（５）３３７位のグルタミンの置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（６）３４０位のグルタミン酸の置換、例えば、プロリンへの置換。 
（７）２３２位のアスパラギン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（８）１２９位のアスパラギン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（９）１３２位のアスパラギン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（１０）１３３位のグルタミン酸の置換、例えば、アラニン、メチオニン、リジン、アルギニンへの置換。 
（１１）４４位のグルタミン酸の置換、例えば、プロリンへの置換。 
（１２）２５６位のグリシンの置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（１３）２３１位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（１４）８１位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
【００５３】
界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼの変異体は、上記アミノ酸置換を少なくとも１つ有していればよく、複数のアミノ酸置換を有していてもよい。例えば、上記アミノ酸置換の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４を有している。
【００５４】
その中でも、以下のアミノ酸の位置に対応するアミノ酸の置換を有している変異体が好ましい。 
(11)-(6) ４４位のグルタミン酸の置換および３４０位のグルタミン酸の置換、例えば、４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換および３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換を有する変異体。 
(11)-(1)-(6) ４４位のグルタミン酸の置換、２６２位のアスパラギンの置換および３４０位のグルタミン酸の置換、例えば、４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換を有する変異体。 
(11)-(2)-(1)-(6) ４４位のグルタミン酸の置換、２５７位のバリンの置換、２６２位のアスパラギンの置換および３４０位のグルタミン酸の置換、例えば、４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換を有する変異体。 
(11)-(7)-(2)-(1)-(6) ４４位のグルタミン酸の置換、２５７位のバリンの置換、２６２位のアスパラギンの置換、３４０位のグルタミン酸の置換、および２３２位のアスパラギン酸の置換、例えば、４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、および２３２位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンまたはアルギニンへの置換を有する変異体。 
(11)-(3)-(2)-(1)-(6) ４４位のグルタミン酸の置換、２５７位のバリンの置換、２６２位のアスパラギンの置換、３４０位のグルタミン酸の置換、および２４９位のグルタミン酸の置換、例えば、４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、および２４９位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンまたはアルギニンへの置換を有する変異体。
【００５５】
(11)-(4)-(2)-(1)-(6) ４４位のグルタミン酸の置換、２５３位のグルタミン酸の置換、２５７位のバリンの置換、２６２位のアスパラギンの置換および３４０位のグルタミン酸の置換、例えば、４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、２５３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンまたはアルギニンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換を有する変異体。 
(11)-(8)-(4)-(2)-(1)-(6) ４４位のグルタミン酸の置換、２５３位のグルタミン酸の置換、２５７位のバリンの置換、２６２位のアスパラギンの置換、３４０位のグルタミン酸の置換、および１２９位のアスパラギン酸の置換、例えば、４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、２５３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンまたはアルギニンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、および１２９位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンまたはアルギニンへの置換を有する変異体。 
(11)-(10)-(4)-(2)-(1)-(6) ４４位のグルタミン酸の置換、１３３位のグルタミン酸の置換、２５３位のグルタミン酸の置換、２５７位のバリンの置換、２６２位のアスパラギンの置換および３４０位のグルタミン酸の置換、例えば、４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、１３３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、２５３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンまたはアルギニンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換を有する変異体。 
(11)-(10)-(4)-(2)-(1)-(5)-(6) ４４位のグルタミン酸の置換、１３３位のグルタミン酸の置換、２５３位のグルタミン酸の置換、２５７位のバリンの置換、２６２位のアスパラギンの置換、３３７位のグルタミンのリジンへの置換および３４０位のグルタミン酸の置換、例えば、４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、１３３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、２５３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンまたはアルギニンへの置換、２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、３３７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のリジンまたはアルギニンへの置換および３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換を有する変異体。 
【００５６】
本発明の界面活性剤耐性の優れたアマドリアーゼ変異体は、配列番号１に示すアミノ酸配列において、上記の界面活性剤耐性の向上をもたらすアミノ酸の置換を有し得る。さらに、本発明の界面活性剤耐性アマドリアーゼ変異体は、それらの置換アミノ酸以外の位置で、さらに１または数個（例えば１〜１５個、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、挿入、付加および／または置換されていてもよい。さらに本発明は、上記の界面活性剤耐性の向上をもたらすアミノ酸の置換変異、基質特異性等、界面活性剤耐性以外の性質を向上させるアミノ酸の置換変異を有し、配列番号１または３に示すアミノ酸配列における前記置換したアミノ酸以外のアミノ酸を除いた部分のアミノ酸配列に対して、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上のアミノ酸配列同一性を有し、アマドリアーゼ活性を有し、界面活性剤耐性が改変されたアマドリアーゼ変異体を包含する。
【００５７】
なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼは、国際公開２００７／１２５７７９号においてｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７と称する組換え体プラスミド（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５９３）を保持する大腸菌が生産するＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７）であり、先に出願人が見出した熱安定性の優れた改変型アマドリアーゼである。このＣＦＰ−Ｔ７は、天然型のＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼに対し、２７２位、３０２位および３８８位に人為的な変異を順次導入することにより獲得した３重変異体である。
【００５８】
また、配列番号３は国際公開第２０１２／１８０９４号で示される基質特異性改善型変異（Ｅ９８Ａ）と国際公開第２００７／１２５７７９号および国際公開第２０１３／１００００６号で示される熱安定性向上型変異（Ｆ４３Ｙ、Ｇ１８４Ｄ、カルボキシル末端の３アミノ酸残基が欠失）を導入したＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼのアミノ酸配列である。
【００５９】
上記のアミノ酸置換において、アミノ酸の位置は配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置を表しているが、他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列においては、配列番号１に示されるアミノ酸配列における位置に対応する位置のアミノ酸が置換されている。「対応する位置」の意味については後述する。
【００６０】
また界面活性剤耐性の向上をもたらすアミノ酸の置換として、配列番号３７に示すアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。
（i）２４７位のグルタミン酸の置換、例えばリジン、アルギニンへの置換；
（ii）２５１位のグルタミン酸の置換、例えばリジン、アルギニンへの置換；
（iii）３３５位のトレオニンの置換、例えばリジン、アルギニンへの置換；
（iv）２３０位のアスパラギン酸の置換、例えばリジン、アルギニンへの置換；
（v）１２９位のアスパラギン酸の置換、例えばリジン、アルギニンへの置換；
（vi）１３２位のアスパラギン酸の置換、例えばリジン、アルギニンへの置換；
（vii）１３３位のグルタミン酸の置換、例えばアラニン、メチオニン、リジン、アルギニンへの置換；
（viii）２５４位のアスパラギンの置換、例えばリジン、アルギニンへの置換；及び
（ix）２２９位のグルタミン酸の置換、例えばリジン、アルギニンへの置換。
【００６１】
界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼの変異体は、上記アミノ酸置換を少なくとも１つ有していればよく、複数のアミノ酸置換を有していてもよい。例えば、上記アミノ酸置換の１、２、３、４、５、６、７、８、または９を有している。
【００６２】
その中でも、以下のアミノ酸の位置に対応するアミノ酸の置換を有している変異体が好ましい。 
配列番号３７に示すアミノ酸配列において、以下の（i）から（iv）：
（i）２５１位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および３３５位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンの置換を有する変異体；
（ii）１３２位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および３３５位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換を有する変異体；
（iii）１３３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換および３３５位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換を有する変異体；並びに
（iv）２２９位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および３３５位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換を有する変異体。
【００６３】
（アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得）
これらのアマドリアーゼをコードする本発明の遺伝子（以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう。）を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷＩＬＥＹ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【００６４】
次いで、上記アマドリアーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからアマドリアーゼ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、アマドリアーゼをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のアマドリアーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
【００６５】
このようにして得られたアマドリアーゼをコードする遺伝子の好ましい一例として、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ遺伝子（特開２００３−２３５５８５号公報）の例などが挙げられる。
【００６６】
これらのアマドリアーゼ遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましい。例えば、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．  ＮＩＳＬ  ９３３０株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡがｐＫＫ２２３−３  Ｖｅｃｔｏｒ（ＧＥヘルスケア社製）に挿入された組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ（特開２００３−２３５５８５号公報）が挙げられる。
【００６７】
（ベクター）
本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなくそれ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等が好ましい。
【００６８】
（アマドリアーゼ遺伝子の変異処理）
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；またはタンパク質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
【００６９】
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸または５−ブロモウラシル等を挙げることができる。
【００７０】
上記接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件をとることが可能であり、現実に所望の変異をアマドリアーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、ｐ２４〜３０、１９８９年６月号）。
【００７１】
タンパク質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３５０（１９８７）：Ｇｅｎｅ，３７，７３（１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，８７４９（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，８７６５（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１４，９６７９（１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，４８８（１９８５）：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７））等が挙げられる。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社，  ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の利用が挙げられる。
【００７２】
また、一般的なＰＣＲ法（ポリメラーゼチェインリアクション、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，１１（１９８９））。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変アマドリアーゼ遺伝子を合成することもできる。
【００７３】
上記方法により得られるアマドリアーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定もしくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いることにより行うことができる。
【００７４】
（形質転換・形質導入）
上述の如くして得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞もしくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、得られた組換え体ＤＮＡを用いて、任意の宿主、例えば、エッシェリシア属に属する微生物、具体例としては大腸菌Ｋ−１２株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株（ともにタカラバイオ社製）や大腸菌Ｂ株、好ましくは大腸菌ＢＬ２１株（ニッポンジーン社製）等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得ることができる。
【００７５】
（アミノ酸配列の同一性）
アミノ酸配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．１１（ゼネティックス社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフト社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。
【００７６】
（アミノ酸に対応する位置の特定）
「アミノ酸に対応する位置」とは、配列番号１に示すＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。
【００７７】
「アミノ酸に対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００７８】
図１−１、１−２、１−３に種々の公知の生物種由来のアマドリアーゼの配列を例示する。配列番号１で示されるアミノ酸配列を最上段に示す。図１に示される各種配列は、いずれも配列番号１の配列と７０％以上の同一性を有し、公知のアルゴリズムを用いて整列させた。図中に、本発明の変異体における変異点を示す。図１−１、１−２、１−３からＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置を知ることができる。図１−１、１−２、１−３には、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ（配列番号１）、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ（配列番号３４）、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号３５）、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号３６）、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号３７）、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号３８）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号３９）、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号４０）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号４１）、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号４２）およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号４３）のアミノ酸配列を示してある。
【００７９】
（置換箇所に対応する位置）
なお、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の４４位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの４４位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図１−１により特定することができる。
【００８０】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは４４位のリジン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４４位のロイシン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４４位のプロリン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４３位のプロリン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４４位のプロリン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４４位のプロリンである。
【００８１】
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の８１位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの８１位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１−１より特定することができる。
【００８２】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは８１位のアスパラギン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のヒスチジン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のアスパラギン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８１位のアスパラギン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８０位のアスパラギン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８１位のアスパラギンである。
【００８３】
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１３３位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の１３３位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１−１より特定することができる。
【００８４】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは１３３位のグルタミン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のグルタミン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のアラニン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のグルタミン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のアラニン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３３位のグルタミン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３１位のグルタミン酸、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のグルタミン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３３位のリジン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３３位のアスパラギン酸である。
【００８５】
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２５３位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５３位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１−２より特定することができる。
【００８６】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２５３位のアラニン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２５１位のアラニン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２５３位のグルタミン酸、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２５１位のグルタミン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２５３位のバリン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５３位のグルタミン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２４９位のアルギニン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５３位のアラニン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５１位のグルタミン酸、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５３位のグルタミンである。
【００８７】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２５６位のグリシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２５６位のグリシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１−２より特定することができる。
【００８８】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２５６位のアスパラギン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２５４位のアスパラギン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２５６位のグリシン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２５４位のアスパラギン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２５６位のグリシン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５６位のグルタミン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５２位のアスパラギン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５６位のアスパラギン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５４位のアスパラギン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５６位のアスパラギン酸である。
【００８９】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２５７位のバリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２５７位のバリンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１−２より特定することができる。
【００９０】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２５７位のバリン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２５５位のトレオニン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２５７位のシステイン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２５５位のバリン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２５７位のシステイン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５７位のシステイン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５３位のセリン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５７位のトレオニン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５５位のバリン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５７位のバリンである。
【００９１】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２６２位のアスパラギンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２６２位のアスパラギンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１−２より特定することができる。
【００９２】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２６２位のアスパラギン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２６０位のアスパラギン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２６２位のヒスチジン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２６０位のアスパラギン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２６２位のヒスチジン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６２位のアスパラギン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５８位のアスパラギン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６２位のアスパラギン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６０位のアスパラギン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６２位のアスパラギン酸である。
【００９３】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３３７位のグルタミンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３３７位のグルタミンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１−２より特定することができる。
【００９４】
すなわちＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは３３７位のリジン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３３５位のリジン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３３８位のグルタミン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３３５位のトレオニン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３３７位のリジン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３７位のリジン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３３３位のリジン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３７位のアスパラギン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３５位のトレオニン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３７位のリジンである。
【００９５】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３４０位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３４０位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１−２より特定することができる。
【００９６】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは３４０位のグルタミン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３３８位のグルタミン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３４１位のグルタミン酸、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３３８位のグルタミン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３４０位のプロリン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３３６位のリジン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３８位のグルタミン酸、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸である。
【００９７】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１２９位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１２９位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１−１より特定することができる。
【００９８】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは１２９位のグルタミン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２９位のセリン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１２７位のアスパラギン酸、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２８位のグルタミン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２９位のグルタミン酸である。
【００９９】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１３２位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１３２位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１−１より特定することができる。
【０１００】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のグルタミン酸、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３０位のアスパラギン酸、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３１位のアスパラギン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸である。
【０１０１】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２３１位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２３１位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１−２より特定することができる。
【０１０２】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２３１位のグルタミン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２２９位のグルタミン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２２９位のグルタミン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２２７位のヒスチジン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２２９位のグルタミン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸である。
【０１０３】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２３２位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２３２位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１−２より特定することができる。
【０１０４】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２３２位のアスパラギン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２３０位のアスパラギン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２３０位のアスパラギン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３２位のグリシン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２２８位のグルタミン酸、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３０位のアスパラギン酸、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３２位のアスパラギン酸である。
【０１０５】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２４９位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２４９位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１−２より特定することができる。
【０１０６】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２４９位のリジン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２４７位のリジン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２４９位のヒスチジン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２４７位のグルタミン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２４９位のグルタミン酸、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４９位のグルタミン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２４５位のグルタミン酸、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４９位のアラニン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４７位のセリン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４９位のグルタミンである。
【０１０７】
（本発明のアマドリアーゼの生産）
上記のようにして得られた界面活性剤耐性の優れたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
【０１０８】
また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーまたは大豆もしくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄または硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
【０１０９】
なお、培地の初発ｐＨは、ｐＨ７〜９に調整するのが適当である。
【０１１０】
また、培養は任意の条件を用いることができるが、例えば、２０〜４２℃の培養温度、好ましくは３０℃前後の培養温度で４〜２４時間、さらに好ましくは３０℃前後の培養温度で８〜１６時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施することができる。
【０１１１】
培養終了後、該培養物よりアマドリアーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、またはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪もしくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩または硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、アマドリアーゼの粗酵素を得る。
【０１１２】
上記アマドリアーゼの粗酵素よりさらにアマドリアーゼ精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、スーパーデックス若しくはウルトロゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またはこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたアマドリアーゼ酵素標品を得ることができる。このようにして、所望の基質特異性が改善されたアマドリアーゼを得ることができる。
【０１１３】
（本発明における界面活性剤）
本発明における界面活性剤としては、本発明のＨｂＡ１ｃの測定方法を可能とする界面活性剤であれば特に制限は無く、非イオン性界面活性剤やイオン性の界面活性剤、例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられるが、特にカチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤が好ましい。本明細書において界面活性剤というとき、特に断らない限り、この表現は１以上の界面活性剤を包含するものとする。
【０１１４】
本発明における界面活性剤は、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）が７０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、７ｍＭ以下、６ｍＭ以下、５ｍＭ以下、４．５ｍＭ以下、４ｍＭ以下、３．５ｍＭ以下、３ｍＭ以下、２．５ｍＭ以下、２ｍＭ以下、１．５ｍＭ以下、１．３ｍＭ以下、又は１ｍＭ以下のものであり得る。ある実施形態において本発明の界面活性剤の臨界ミセル濃度は０．１ｍＭ又は０．０１ｍＭ以上であり得る。好ましくは、臨界ミセル濃度は５０ｍＭ以下であり、より好ましくは２０ｍＭ以下であり、より好ましくは１０ｍＭ以下であり、より好ましくは７ｍＭ以下であり、より好ましくは６ｍＭ以下であり、最も好ましくは５ｍＭ以下である。臨界ミセル濃度とは界面活性剤が溶液中でミセルを形成する臨界濃度であり、これよりも低濃度ではミセルは形成されない。一般に臨界ミセル濃度が低い方が、低濃度の界面活性剤でもミセル形成し、界面活性剤としての作用は強くなる傾向がある。当業者であれば、慣用の手法により所望の界面活性剤の臨界ミセル濃度を決定することができる。例えば界面活性剤と相互作用する蛍光試薬の蛍光変化を利用して、界面活性剤の臨界ミセル濃度を測定する市販のキット等を用いることができる（例えばＰＦＰ社のＤｅｔｅｒｇｅｎｔ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｍｉｃｅｌｌｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＣＭＣ）  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ等）。
【０１１５】
例えば、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ８、ＯＴＡＢ）のＣＭＣは約１４０ｍＭであり、デシルトリメチルアンモニウムクロリド（Ｃ１０）のＣＭＣは約６５ｍＭであり、デシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ１０）のＣＭＣは約７０ｍＭであり、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド（Ｃ１２）のＣＭＣは約２０ｍＭであり、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ１２、ＤＴＡＢ）のＣＭＣは約１６ｍＭであり、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド（Ｃ１４，ＴＴＡＣ）  のＣＭＣは約４．５ｍＭであり、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ１４、ＴＴＡＢ）のＣＭＣは約５ｍＭであり、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド（Ｃ１６，ＣＴＡＣ）  のＣＭＣは約１．３ｍＭであり、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ１６）のＣＭＣは約１ｍＭであり、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロリド（Ｃ１８、ＳＴＡＣ）のＣＭＣは約０．３ｍＭであり、オクタデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ１８、ＳＴＡＢ）のＣＭＣは約０．３ｍＭである（例えば、Ｊ．  ＰＨＹＳ．  ＣＯＬＬＩＤＥ．  ＣＨＥＭ．，  ５２，  １３０（１９４８）、Ｊ．  ＰＨＹＳ．  ＣＨＥＭ．，  ６６，  １８３９（１９６２）、Ｊ．  ＡＭ．  ＯＩＬ．  ＣＨＥＭＩＳＴＳ．  ＳＯＣ．，  ３０，  ７４（１９５３）、Ｊ．  ＰＨＡＲＭ．  ＳＣＩ．，  ５４，  ４３６（１９６５）、ＫＯＮＩＮＫＩ．  ＮＥＤ．  ＡＫＡＤ．  ＷＥＴＥＮ．  ＰＲＯＣ．  ＳＥＲ  Ｂ，  ５８，  ９７（１９５５）、Ｊ．  ＰＨＹＳ．  ＣＨＥＭ．，  ６５，  １８０７（１９６１）、Ｊ．  ＡＭ．  ＣＨＥＭ．  ＳＯＣ．，  ６５，  ６９２（１９４３）、Ｊ．  ＡＭ．  ＣＨＥＭ．  ＳＯＣ．，  ６９，  ２０９５（１９４７）、Ｊ．  ＣＯＬＬＩＤＥ．  ＩＮＴＥＲＦＡＣＥ．  ＳＣＩ．，  ２２，  ４３０（１９６６）、Ｊ．  ＡＭ．  ＣＨＥＭ．  ＳＯＣ．，  ７０，  ３８０３（１９４８）参照。）。なお、かっこ内に最も長い置換基の炭素鎖数を示した。
【０１１６】
また、例えば、１−ドデシルピリジニウムブロミド（Ｃ１２）のＣＭＣは約１２ｍＭであり、１−ドデシルピリジニウムクロリド（Ｃ１２、１−ＤＰＣ）のＣＭＣは約１４ｍＭであり、１−テトラデシルピリジニウムブロミド（Ｃ１４）のＣＭＣは約２．９ｍＭであり、１−ヘキサデシルピリジニウムクロリド（Ｃ１６、１−ＣＰＣ）のＣＭＣは約０．６ｍＭであり、１−ヘキサデシルピリジニウムブロミド（Ｃ１６、１−ＣＰＢ）のＣＭＣは約０．９ｍＭであり、Ｎ−セチル−４−メチルピリジニウムクロリド（Ｃ１６、４Ｍｅ−１−ＣＰＣ）のＣＭＣは約１．９ｍＭであり、１−オクタデシルピリジニウムブロミドのＣＭＣは約０．６ｍＭであり、１−オクタデシルピリジニウムクロリドのＣＭＣは約０．２４ｍＭである（例えば、Ｊ．  ＣＯＬＬＩＤＥ．  ＩＮＴＥＲＦＡＣＥ．  ＳＣＩ．，  ２１，  ５２２（１９６６）、Ｊ．  ＰＨＡＲＭ．  ＳＣＩ．，  ５４，  ４３６（１９６５）、ＴＲＡＮＳ．  ＦＡＲＡＤＡＹ．  ＳＯＣ．，  ６２，  ３２４４（１９６６）、Ｊ．  ＡＭ．  ＣＨＥＭ．  ＳＯＣ．，  ７０，  ３８０３（１９４８）、ＲＥＶ．  ＣＨＩＭ．  ＡＣ．  ＲＥＰ．  ＰＯＰ．  ＲＯＵＭ．，  ６，  ３０９（１９６１）、Ｊ．  ＡＭ．  ＣＨＥＭ．  ＳＯＣ．，  ７０，  ３０４９（１９４８）参照。）。
【０１１７】
またベンジルドデシルジメチルアンモニウムクロリドのＣＭＣは約２．８ｍＭであり、ベンジルテトラデシルジメチルアンモニウムクロリド（Ｃ１４、ＢＤＴＡＣ）のＣＭＣは約０．３７ｍＭであり、ベンジルセチルジメチルアンモニウムクロリド（Ｃ１６、ＢＣＤＡＣ）のＣＭＣは約０．０４２ｍＭである（例えば、界面活性剤便覧，  １３１（１９６０）、Ｊ．  ＣＯＬＬＩＤＥ．  ＩＮＴＥＲＦＡＣＥ．  ＳＣＩ．，  ２２，  ４３０（１９６６）、Ｊ．  ＣＯＬＬＩＤＥ．ＳＣＩ．，  ８，  ３８５（１９５３）参照）。
【０１１８】
非イオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどが挙げられる。
【０１１９】
カチオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩、ピリジニウム塩、例えばアルキルピリジニウム塩、ホスホニウム塩、例えばアルキルホスホニウム塩、イミダゾリウム塩、例えばアルキルイミダゾリウム塩、イソキノニウム塩、例えばアルキルイソキノニウム塩などが挙げられる。
【０１２０】
また本発明のカチオン性界面活性剤としては、以下の一般式で表される第四級アンモニウム塩（I)、ピリジニウム塩(II)やホスホニウム塩(III)が挙げられる。
【化５】
2020096596.tif 000007
［式中、Ｒ１〜Ｒ４は、同一又は異なっていてもよく、置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル、アルケニル、アリール又はベンジルを表し、Ｚ−は、１価の陰イオンを表す。］
【化６】
2020096596.tif 000008
［式中、Ｒ５は、置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキルを表し、各Ｒａは、同一又は異なっていてもよく、水素原子又は置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル、アルケニル、アリール又はベンジルを表し、ｎは１〜５の整数を表し、Ｚ−は、１価の陰イオンを表す。］
【化７】
2020096596.tif 000009
［式中、Ｒ６〜Ｒ９は、同一又は異なっていてもよく、置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル、アルケニル、アリール又はベンジルを表し、Ｚ−は、１価の陰イオンを表す。］
【０１２１】
第四級アンモニウム塩としては、例えば、オクチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＯＴＡＣ）、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＯＴＡＢ）、デシルトリメチルアンモニウムクロリド、デシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＴＴＡＣ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロリド、オクタデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＳＴＡＢ）、エイコシルトリメチルアンモニウムクロリド、エイコシルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンジルドデシルジメチルアンモニウムクロリド、ベンジルドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＢＤＤＡＢ）、ベンジルテトラデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＢＤＴＡＣ）、ベンジルテトラデシルジメチルアンモニウムブロミド、ベンジルセチルジメチルアンモニウムクロリド（ＢＣＤＡＣ）、ベンジルセチルジメチルアンモニウムブロミド、ジオクチルジメチルアンモニウムクロリド、およびジオクチルジメチルアンモニウムブロミド、が挙げられる。
【０１２２】
ピリジニウム塩としては、例えば、１−デシルピリジニウムクロリド、１−デシルピリジニウムブロミド、１−ドデシルピリジニウムクロリド（１−ＤＰＣ）、１−ドデシルピリジニウムブロミド、１−テトラデシルピリジニウムクロリド、１−テトラデシルピリジニウムブロミド、１−ヘキサデシルピリジニウムクロリド（１−ＣＰＣ）、１−ヘキサデシルピリジニウムブロミド（１−ＣＰＢ）、Ｎ−セチル−２−メチルピリジニウムクロリド、Ｎ−セチル−３−メチルピリジニウムクロリド、Ｎ−セチル−４−メチルピリジニウムクロリド（４Ｍｅ−１−ＣＰＣ）、１−オクタデシルピリジニウムクロリド、１−オクタデシルピリジニウムブロミド、１−エイコシルピリジニウムクロリド及び１−エイコシルピリジニウムブロミドが挙げられる。
【０１２３】
ホスホニウム塩としては、例えば、テトラエチルホスホニウムクロリド、テトラエチルホスホニウムブロミド、トリブチルメチルホスホニウムクロリド、トリブチルメチルホスホニウムブロミド、トリブチルメチルホスホニウムヨージド、テトラブチルホスホニウムクロリド、テトラブチルホスホニウムブロミド、テトラ−ｎ−オクチルホスホニウムクロリド、テトラ−ｎ−オクチルホスホニウムブロミド、トリブチルドデシルホスホニウムクロリド、トリブチルドデシルホスホニウムブロミド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムクロリド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムブロミド（ＴＢＣＰＢ）、メチルトリフェニルホスホニウムクロリド、メチルトリフェニルホスホニウムブロミド、メチルトリフェニルホスホニウムヨージド、テトラフェニルホスホニウムクロリド、テトラフェニルホスホニウムブロミドが挙げられる。
【０１２４】
カチオン性界面活性剤の対となる陰イオンZ-は例えばCl-、Br-、I-等でありうる。
【０１２５】
アニオン性界面活性剤としては、例えば、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルファーオレフィンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、α−スルホ脂肪酸エステル塩及び天然脂肪酸のアルカリ金属塩などが挙げられる。このような界面活性剤としては例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。
【０１２６】
両性界面活性剤としては、例えば、アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタインなどが挙げられる。
【０１２７】
（本発明のアマドリアーゼ及び界面活性剤を含むキット）
本発明はアマドリアーゼ及び界面活性剤を含む糖化ヘモグロビン測定用キットを提供する。界面活性剤は非イオン性又はイオン性界面活性剤とすることができる。また、アマドリアーゼと界面活性剤とは、キット中に同一又は別個の成分として含まれ得る。一般に、同一の成分としてアマドリアーゼと界面活性剤とがキット中に含まれる場合、界面活性剤はアマドリアーゼを失活させない濃度で含まれるのが好ましい。別個の成分としてアマドリアーゼと界面活性剤とがキット中に含まれる場合、界面活性剤は測定時における終濃度よりも高濃度のストック溶液を用いてもよい。このストック溶液を適宜希釈して、測定に用いる溶液を調製する。
【０１２８】
本発明のアマドリアーゼ及び界面活性剤を含むキットは、さらにαＦＶＨ測定用試薬、αＦＶＨを切り出すためのプロテアーゼまたはペプチダーゼ、その他公知の安定化剤や緩衝溶液を含み得る。αＦＶＨを測定するための各種キットに用いられている技術を、本発明のアマドリアーゼ及び界面活性剤を含むキットの製造に適宜用いることができる。すなわち本発明は、適当なアマドリアーゼ及び界面活性剤を用意するステップを含む、アマドリアーゼ及び界面活性剤を含むキットの製造方法を提供する。このとき、アマドリアーゼ及び界面活性剤は同一又は別個の成分として用意することができる。キット中に別個の成分としてアマドリアーゼと界面活性剤とが提供される場合、これらはαＦＶＨ測定の直前に混合され得る。
【０１２９】
本発明のキットに含まれるアマドリアーゼは、好ましくはキットに含まれる界面活性剤を終濃度に調製したものを添加してから５分後の残存活性（％）が、添加しない場合と比較して、好ましくは１３％以上、より好ましくは１５％以上、最も好ましくは１９％以上、例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上又は９９％以上である。残存活性については下記に説明する。
【０１３０】
本発明のキットに含まれるアマドリアーゼは、好ましくは測定時における終濃度として、界面活性剤０．０１％（ｗ／ｖ）当たり１１０μｇ／ｍｌ以下、例えば１００μｇ／ｍｌ以下、７０μｇ／ｍｌ以下、又は５０μｇ／ｍｌ以下である。また、キットに含まれる界面活性剤は、測定時における終濃度として、０．０１％（ｗ／ｖ）以上、例えば０．０２％（ｗ／ｖ）以上、０．０４％（ｗ／ｖ）以上、０．０５％（ｗ／ｖ）以上、０．０６％（ｗ／ｖ）以上、０．０７％（ｗ／ｖ）以上、０．０８％（ｗ／ｖ）以上、０．０９％（ｗ／ｖ）以上、０．１％（ｗ／ｖ）以上、０．１５％（ｗ／ｖ）以上、０．２％（ｗ／ｖ）以上、０．２５％（ｗ／ｖ）以上、又は０．３％（ｗ／ｖ）以上である。ここで、測定時における終濃度、とは最終的に成分を希釈して糖化ヘモグロビン測定を行うときの濃度をいう。したがってキット中では、測定時における終濃度よりも高濃度のストック溶液を用いてもよい。
【０１３１】
本発明のキットに含まれるアマドリアーゼは、配列番号１又は配列番号３７に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ又はこれに基づき作製された、界面活性剤耐性が向上した変異体であり得る。該変異体は、配列番号１又は配列番号３７と例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するか、或いは配列番号１又は配列番号３７のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有し得る。
【０１３２】
また本発明のキットに含まれるアマドリアーゼは、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ属、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ属、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ属、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ属、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ属、Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ属、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ属、Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ属、Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ属、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ属、Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ属、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ属、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属などに由来する天然のアマドリアーゼ又はそれらの変異体であり得る。こうした変異体は、場合により配列番号１または３に示すアミノ酸配列の２６２位のアスパラギン、２５７位のバリン、２５３位のグルタミン酸、３３７位のグルタミン、３４０位のグルタミン酸、１３３位のグルタミン酸、４４位のグルタミン酸、２５６位のグリシン、８１位のグルタミン酸、１２９位のアスパラギン酸、１３２位のアスパラギン酸、２３１位のグルタミン酸、２３２位のアスパラギン酸、２４９位のグルタミン酸よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１またはそれ以上のアミノ酸置換を有しうる。当業者であれば、例えば後述する試験法や実施例７の評価法等により、あるアマドリアーゼ又はその変異体が本発明のキットに使用可能か、すなわち所望の界面活性剤耐性を有するか容易に調べることができる。
【０１３３】
（緩衝剤）
本発明のキット又は組成物には、アマドリアーゼの活性が失活しない範囲であるｐＨ５．０〜ｐＨ１０．０、好ましくはｐＨ６．０〜ｐＨ８．０の範囲で緩衝能を有する緩衝剤または緩衝液を適宜加えて良い。本明細書において緩衝剤というとき、特に断らない限り、この用語は１以上の緩衝剤を包含するものとする。緩衝液とは溶液のpHを一定範囲に保つ緩衝作用（緩衝能）のある溶液のことをいい、緩衝剤とは溶液に緩衝作用を付与する物質をいう。緩衝剤は、弱酸を例にとると、弱酸とその塩から構成され、この場合、当該塩を共役塩と呼ぶ。例えば緩衝剤がリン酸とそのカリウム塩から構成される場合、本明細書ではベースとなる化合物がリン酸であることからこれを便宜上、リン酸緩衝剤と呼ぶことがある。またある緩衝剤についての濃度は、当該緩衝剤のベースとなる化合物の単独形態とその共役塩の形態とを合計したベース化合物についての濃度をいう。例えば100mMのリン酸緩衝剤というとき、これは終濃度として溶液に含まれるリン酸及びその共役塩(例えばリン酸カリウム塩)を合計したリン酸濃度が100mMであることをいう。
【０１３４】
種々の緩衝剤（緩衝液）の中でも、特に、界面活性剤存在下でアマドリアーゼの残存活性を維持する、又は残存活性の低下を軽減するものが好ましい。本明細書においてこのような好ましい緩衝剤を特に、アマドリアーゼ安定化作用を有する緩衝剤、又は本発明の緩衝剤と呼ぶことがある。例えばHEPESは500mM（pH 7.0）で用いても、Coniochaeta属由来アマドリアーゼ（CFP-T7、配列番号１）に対してアマドリアーゼ安定化作用を示さない。したがってHEPESは本発明のアマドリアーゼ安定化作用を有する緩衝剤に該当しない。このように、あらゆる緩衝剤がアマドリアーゼ安定化作用を有するわけではない。よって本発明のアマドリアーゼ安定化作用を有する緩衝剤は、単に溶液のpHを一定に保つに留まらず、pHを緩衝する際にアマドリアーゼを安定化させる作用を有する。ここで本発明の緩衝剤についていうアマドリアーゼ安定化作用とは、界面活性剤存在下でのアマドリアーゼの残存活性を維持する、又は残存活性の低下を軽減する作用をいう。このようなアマドリアーゼ安定化作用は、界面活性剤存在下において、緩衝剤を追加しない溶液或いは本発明のアマドリアーゼ安定化作用を有しない緩衝剤を用いた溶液の残存アマドリアーゼ活性と、本発明の緩衝剤を用いた溶液の残存アマドリアーゼ活性とを比較することにより評価できる。
【０１３５】
本発明のキット（組成物）に用いることのできる緩衝剤（緩衝液）としては、例えば、ホウ酸及び／又はその塩を含むホウ酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、リン酸及び／又はその塩を含むリン酸緩衝剤、例えばリン酸カリウム緩衝剤又はリン酸ナトリウム緩衝剤、有機酸緩衝剤及び／又はその塩を含む有機酸緩衝剤、例えばトリカルボン酸緩衝剤及び／又はその塩を含むトリカルボン酸緩衝剤、例えばクエン酸及び／又はその塩を含むクエン酸緩衝剤、モノカルボン酸緩衝剤及び／又はその塩を含むモノカルボン酸緩衝剤、例えば酢酸緩衝剤及び／又はその塩を含む酢酸緩衝剤等の緩衝剤が挙げられる。また、本発明のキット等に用いることのできる緩衝剤としては、ＡＣＥＳ（N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸）、ＢＥＳ（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸）、Ｂｉｃｉｎ（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン）、ＣＨＥＳ（N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸）、ＥＰＰＳ（4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンプロパンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（N-(ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)）、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)）、ＴＡＰＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（3-[N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸）、トリシン（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン）及び／又はそれらの塩等を含むグッド緩衝剤が挙げられる。また、以下の式（IV）
【化８】
2020096596.tif 000010
[式中、nは0、1、2または3であってもよく、R10は、それぞれ独立にH、OH、-CH2OHまたは-COOHであってもよい]の化合物及び／又はその塩を含む緩衝剤も挙げられる。また、フタル酸及び／又はその塩を含むフタル酸緩衝剤、マレイン酸及び／又はその塩を含むマレイン酸緩衝剤、フマル酸及び／又はその塩を含むフマル酸緩衝剤、グルタル酸及び／又はその塩を含むグルタル酸緩衝剤、シトラコン酸及び／又はその塩を含むシトラコン酸緩衝剤、メサコン酸及び／又はその塩を含むメサコン酸緩衝剤、マロン酸及び／又はその塩を含むマロン酸緩衝剤、酒石酸及び／又はその塩を含む酒石酸緩衝剤、コハク酸及び／又はその塩を含むコハク酸緩衝剤、アジピン酸及び／又はその塩を含むアジピン酸緩衝剤、リンゴ酸及び／又はその塩を含むリンゴ酸緩衝剤等のジカルボン酸をベースとした緩衝剤も挙げることができる。ＨＥＰＥＳおよびＣＨＥＳを除き、これらは本発明のアマドリアーゼ安定化作用を有する緩衝剤でありうる。好ましい本発明のアマドリアーゼ安定化作用を有する緩衝剤としてはリン酸緩衝剤、ＡＣＥＳ緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、マレイン酸緩衝剤、シトラコン酸緩衝剤、マロン酸緩衝剤、グルタル酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、及び式（IV）で表される緩衝剤、例えばＭＥＳ緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤、及びＭＯＰＳＯ緩衝剤が挙げられるがこれに限られない。これらのうち１種のみを適用しても良いし、２種以上を用いても良い。また、本発明のアマドリアーゼ安定化作用を有する緩衝剤を上記緩衝剤以外の物質（例えばアマドリアーゼ安定化作用を有しない緩衝剤）と組み合わせて用いてもよい。塩としてはベース化合物のナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩及びアンモニウム塩が挙げられるがこれに限らない。
【０１３６】
本発明の緩衝剤は、適当な濃度で本発明のキットまたは組成物に用いることができる。通常、本発明のキットまたは組成物に添加する本発明の緩衝剤の量は、測定溶液での終濃度に基づいて算出することができる。ある実施形態において測定溶液における本発明の緩衝剤の終濃度は、好ましくは当該測定溶液に生じうるpH変化を緩衝するのに十分な濃度である。別の実施形態において、測定溶液における本発明の緩衝剤の終濃度は、界面活性剤を含む溶液におけるアマドリアーゼの残存活性が20%以上、好ましくは40％以上、好ましくは60%以上、好ましくは80%以上となる濃度である。本発明の緩衝剤の終濃度は、例えば1mM以上、5mM以上、10mM以上、20mM以上、例えば50mM以上、1M以下、500mM以下、400mM以下、300mM以下、200mM以下、100mM以下、例えば1mM〜1M、5mM〜500mM、10mM〜300mM、例えば50mM〜100mMであり得る。本発明のアマドリアーゼ安定化作用を有する緩衝剤として、リン酸緩衝剤を用いる場合、その濃度は50mM〜500mM、例えば50mM〜300mM好ましくは100mM〜300mMであり得る。本発明の緩衝剤としてクエン酸緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、マレイン酸、シトラコン酸緩衝剤、マロン酸緩衝剤、グルタル酸緩衝剤、または酒石酸緩衝剤を用いる場合、その濃度は5mM〜500mM、好ましくは10mM〜200mM、例えば10mM〜100mMであり得る。本発明の緩衝剤として式（IV）で表される緩衝剤、例えばMES緩衝剤、MOPS緩衝剤、またはMOPSO緩衝剤を用いる場合、その濃度は10mM〜500mM、例えば100mM〜500mM、例えば150mM〜300mMであり得る。本発明の緩衝剤としてACES緩衝剤を用いる場合、その濃度は200mM〜1M、例えば200mM〜500mMであり得る。本発明の緩衝剤として、複数の緩衝剤を組み合わせてもよい。なお、組成物に用いる本発明の緩衝剤の量は、組成物に安定化剤も添加する場合、当該安定化剤の量に応じて変化しうる。
【０１３７】
（安定化剤）
本発明のキット又は組成物には、界面活性剤存在下でのアマドリアーゼの残存活性を維持する又は残存活性の低下を軽減する安定化剤を適宜加えてもよい。本明細書において安定化剤とは、界面活性剤存在下でのアマドリアーゼの残存活性を維持する又は残存活性の低下を軽減する物質を言う。本明細書において安定化剤というとき、特に断らない限り、この表現は１以上の安定化剤を包含するものとする。本発明のキット又は組成物に含まれる安定化剤（安定剤）としては、例えば、リン酸、トリカルボン酸（例えば、クエン酸）、ジカルボン酸（例えば、リンゴ酸、マレイン酸、シトラコン酸、マロン酸、グルタル酸、酒石酸）、モノカルボン酸（例えば、酢酸）、式（IV）で表される化合物（例えばＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ）、硫酸アンモニウム、これらの塩及びこれらの任意の組合せが挙げられる。
【０１３８】
本発明の安定化剤は、適当な濃度で本発明のキット又は組成物に用いることができる。通常、本発明のキットまたは組成物に添加する安定化剤の量は、測定溶液における終濃度に基づいて算出する。ある実施形態において添加する安定化剤の量は、界面活性剤を含む溶液中のアマドリアーゼの残存活性が35%以上、37.5%以上、好ましくは40％以上、45％以上、50%以上、55%以上、好ましくは60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、好ましくは80%以上、85%以上、90%以上又は95%以上となる量である。本発明の安定化剤は例えば、測定溶液における終濃度が0.1mM〜100mM、0.2mM〜100mM、0.5mM〜50mM、1mM〜30mM、2mM〜30mM、5mM〜20mM又は10mM〜20mMとなる様にキット又は組成物に添加しうる。本発明の組成物に緩衝剤も添加する場合、安定化剤の量は当該緩衝剤の量に応じて変化しうる。例えば安定化剤を添加した際に、ｐＨの変化を防ぐために、添加する緩衝剤の種類及び量を適宜選択し調整してもよいし、安定化剤の溶液のｐＨを適宜調整してもよい。
【０１３９】
本発明の緩衝剤のうち、特にリン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、およびMES緩衝剤については、溶液のpHを一定に保つ緩衝能を発揮する濃度、すなわちリン酸緩衝剤については例えば100mM、クエン酸緩衝剤については例えば50mM、MES緩衝剤については例えば150mMにて用いた場合、アマドリアーゼ安定化作用が観察された。しかしながら、pH緩衝剤として、アマドリアーゼ安定化作用を示さないHEPESを用いて溶液のpHを一定範囲に保ちつつ、組成物に加えるリン酸及び／又はそのカリウム塩、クエン酸及び／又はそのナトリウム塩、あるいはMES及び／又はそのナトリウム塩の濃度をさらに低減させても、界面活性剤存在下でのアマドリアーゼの残存活性の安定化が観察された。この安定化作用は、リン酸及び／又はそのカリウム塩、クエン酸及び／又はそのナトリウム塩、およびMES及び／又はそのナトリウム塩が緩衝作用を有効に発揮する濃度よりも低い濃度、具体的にはリン酸については5mM、クエン酸については0.5mM、MESについては20mM、でも観察された。このことから、リン酸及び／又はそのカリウム塩、クエン酸及び／又はそのナトリウム塩、並びにMES及び／又はそのナトリウム塩については、本発明の緩衝剤としてのアマドリアーゼ安定化作用以外にも、別にアマドリアーゼ活性を残存させる安定化作用があることが確認された。本発明の緩衝剤のアマドリアーゼ安定化作用と区別するため、便宜上、このような作用を、本発明の安定化剤のアマドリアーゼ安定化作用と呼ぶことがある。したがってリン酸及び／又はそのカリウム塩、クエン酸及び／又はそのナトリウム塩、並びにMES及び／又はそのナトリウム塩は本発明の緩衝剤のアマドリアーゼ安定化作用を有し、かつ本発明の安定化剤のアマドリアーゼ安定化作用を有する。別の言い方をすると、リン酸及び／又はそのカリウム塩、クエン酸及び／又はそのナトリウム塩、並びにMES及び／又はそのナトリウム塩は本発明の緩衝剤に該当する一方で、本発明の安定化剤にも該当する。
【０１４０】
また、アマドリアーゼ安定化作用を有するマレイン酸、シトラコン酸、マロン酸、グルタル酸、酒石酸、MOPS、およびMOPSOは緩衝作用を有効に発揮する濃度よりも低い濃度である10mMまたは20mMでアマドリアーゼ安定化作用が観察されたが、これらはより高濃度（50mM、100mM、150mM等）では緩衝作用を発揮しうる化合物である。したがってマレイン酸、シトラコン酸、マロン酸、グルタル酸、酒石酸、MOPS、MOPSO、式（IV）で表される化合物もまた本発明の緩衝剤に該当し、かつ、本発明の安定化剤にも該当する。
【０１４１】
本発明のキットまたは組成物が、アマドリアーゼ、界面活性剤、安定化剤及び／又は緩衝剤を含む場合、これらは任意の順でキット又は組成物に添加することができる。好ましくは本発明のキット又は組成物には、安定化剤及び／又は緩衝剤を（それらを含める場合には）先に添加し、界面活性剤はその後添加することで、アマドリアーゼの残存活性低下を軽減できる。
【０１４２】
（本発明のアマドリアーゼにおける界面活性剤耐性の向上）
上記のような手段で得られる本発明のアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、改変前のものと比較して界面活性剤耐性が向上していることを特徴とする。具体的には、改変前のアマドリアーゼの活性と比較して、改変アマドリアーゼは、本明細書中に記載の活性測定方法および界面活性剤耐性評価方法に記載した反応条件下で、所定の界面活性剤処理、例えば、０．０１％（ｗ／ｖ）のヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド（以下、「ＣＴＡＣ」と表す）を添加してから、３０℃、５分後の残存活性（％）が、向上していることを特徴とする。ここで、残存活性（％）とは、界面活性剤処理前の活性を１００とした場合の界面活性剤処理後の活性の割合をパーセンテージ（％）で表したものである。なお、本明細書において界面活性剤の濃度をパーセンテージで記載する場合、特に断らない限りこれは％（ｗ／ｖ）を意味するものとする。
【０１４３】
本発明の改変アマドリアーゼの残存活性（％）の向上度合は限定されないが、例えば、本発明の変異を導入する前及び後のアマドリアーゼについて界面活性剤処理を行った後の残存活性（％）が好ましくは１３％以上、より好ましくは１５％以上、最も好ましくは１９％以上、例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上又は９９％以上である改変アマドリアーゼが本発明に包含される。また、本発明の変異を導入する前及び後のアマドリアーゼについて界面活性剤処理を行った後の残存活性（％）同士の数値比較において２％以上、好ましくは９％以上、最も好ましくは１９％以上、例えば２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上又は９９％以上、残存活性が向上している改変アマドリアーゼが本発明に包含される。
【０１４４】
ある実施形態では、本発明の変異を導入する前のアマドリアーゼについて界面活性剤処理を行うと活性が全て消失することがある。このような場合、本発明の変異を導入した後のアマドリアーゼの残存活性（％）の向上を見るには、界面活性剤処理によっても活性が全て消失しない基準となるアマドリアーゼを用い、基準となるアマドリアーゼの界面活性剤処理後の残存活性と、変異導入後のアマドリアーゼの界面活性剤処理後の残存活性とを比較してもよい。
【０１４５】
実際には、測定時の温度条件に加えて、変異導入前のアマドリアーゼの界面活性剤耐性の程度によっても相対的な評価結果は異なってくるため、残存活性（％）や残存活性比率数値の大小のみを比較して、各変異体の絶対的な界面活性剤耐性を評価することは難しい。ただし、本発明における実施例の条件を踏襲することで、各変異体の界面活性剤耐性を絶対的に評価することが可能である。また、本発明のアマドリアーゼの選抜を容易にする意図から変異導入前のアマドリアーゼの残存活性（％）が十分に低く算出される界面活性剤処理条件を選択することにより、一般的には、残存活性（％）の向上度合および残存活性比率が高く算出される傾向を有する。
【０１４６】
例えば、本発明に包含される、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７／２５３Ｋ）株が生産する本発明のアマドリアーゼを、０．０１％のＣＴＡＣと混合して、３０℃、５分間に供したときには、本発明の変異を導入する前のアマドリアーゼであるＣＦＰ−Ｔ７の残存活性が６９．９％であるのに対し、本発明の変異導入後のアマドリアーゼは残存活性が７２％を上回る。また、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ７）株が生産する本発明のアマドリアーゼを、０．０４％のＣＴＡＣと混合して、３０℃、５分間に供したときには、本発明の変異を導入する前のアマドリアーゼであるＣＦＰ−Ｄの残存活性が１２．７％であるのに対し、本発明の変異導入後のアマドリアーゼは残存活性が１５％を上回る。このように界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼは、該酵素含有製品等における保存性が著しく向上し、また、ＨｂＡ１ｃのプロテアーゼ分解効率を向上させ、測定感度を高めるために強い界面活性剤を使用する場合にも安定であるため、産業上非常に有利である。
【０１４７】
（アマドリアーゼ活性の測定方法）
アマドリアーゼの活性の測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。
【０１４８】
（アマドリアーゼ活性の測定方法）
本発明におけるアマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。
【０１４９】
以下、本発明におけるアマドリアーゼの活性測定には、断りのない限り、フルクトシルバリンを基質として用いる。なお、酵素力価は、フルクトシルバリンを基質として測定したとき、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。フルクトシルバリン等の糖化アミノ酸、およびフルクトシルバリルヒスチジン等の糖化ペプチドは、阪上らの方法に基づき合成、精製することができる（特開２００１−９５５９８号参照）。
【０１５０】
Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：ＰＯＤ−４−ＡＡ溶液
４．０ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマン社製）、１００ｍｇの４−アミノアンチピリン（東京化成工業社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１Ｌに定容する。
【０１５１】
（２）試薬２：ＴＯＯＳ溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳ（N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム、同仁化学社製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
【０１５２】
（３）試薬３：基質溶液（１５０ｍＭ；終濃度  ５ｍＭ）
フルクトシルバリン４１７ｍｇをイオン交換水に溶解して１０ｍｌに定容する。
【０１５３】
Ｂ．測定法
２．７ｍｌの試薬１，１００μｌの試薬２、および１００μｌの試薬３を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、酵素液を１００μｌ加えてよく混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３０１０、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度を測定する。測定値は、５５５ｎｍにおける１分後から３分後の１分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様に調製する。３７℃、１分当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位（Ｕ）とし、下記の式に従って算出する。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝  ｛（ΔＡｓ−ΔＡ０）×３．０×ｄｆ｝÷（３９．２×０．５×０．１）
ΔＡｓ  ：  反応液の１分間あたりの吸光度変化
ΔＡ０    ：  対照液の１分間あたりの吸光度変化
３９．２：  反応により生成されるキノンイミン色素の
ミリモル吸光係数（ｍＭ−１・ｃｍ−１）
０．５  ：  １ｍｏｌの過酸化水素による生成されるキノンイミン色素のｍｏｌ数
ｄｆ    ：  希釈係数
【０１５４】
（界面活性剤耐性測定方法）
アマドリアーゼ粗酵素液、またはアマドリアーゼ精製標品を約１．０Ｕ／ｍｌとなるように、３０ｍＭ  ＭＥＳ／２１ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈し、ＣＴＡＣ（例えば、東京化成工業社製）を終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）または０．０４％となるように添加後、３０℃にて５分間加温する。加温後、０．１５％のＢＳＡを含む１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２倍希釈し、上述のＢ．の方法を用いて界面活性剤処理前と界面活性剤処理後のサンプルの酵素活性を測定し、界面活性剤処理前の活性を１００とした場合の界面活性剤処理後の活性の割合、すなわち、残存活性（％）を求めることにより、界面活性剤耐性を評価する。
【０１５５】
（緩衝剤評価方法）
上記の界面活性剤耐性測定方法において、３０ｍＭ  ＭＥＳ／２１ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液の代わりに種々の緩衝剤を用いてアマドリアーゼの残存活性の測定を行うことで、緩衝剤によるアマドリアーゼ活性残存への寄与を評価することができる。例えば３０ｍＭ  ＭＥＳ／２１ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（pH 6.5）の代わりに、リン酸緩衝液（pH 7.0）、クエン酸緩衝液(pH 6.0)、ＨＥＰＥＳ緩衝液(pH 7.0)、ＡＣＥＳ緩衝液(pH 7.0)等を用いることができる。他の条件及び手順は上記の界面活性剤耐性測定方法と同様としうる。
【０１５６】
（安定化剤評価方法）
上記の界面活性剤耐性測定方法において、種々の安定化剤をさらに添加してアマドリアーゼの残存活性の測定を行うことで、当該安定化剤の作用を評価することができる。評価対象である安定化剤が緩衝作用をも有する化合物である場合、当該化合物の緩衝作用によるアマドリアーゼ活性残存への寄与によらないアマドリアーゼ安定化作用を評価するためには、アマドリアーゼ安定化作用を有しない緩衝剤を溶液に緩衝能を付与するのに十分な濃度で使用しつつ（例えばHEPES(pH 7.0)を500mMにて使用）、安定化剤を低濃度で、すなわち溶液に緩衝能を付与するには十分でない低濃度で用いることができる。溶液に緩衝能を付与するのに十分な濃度とは、当該溶液に添加する他の試薬に起因するpH変動が生じずpHが一定の範囲(例えばpH5〜10、pH6〜8)に保たれる濃度をいう。溶液に緩衝能を付与するには十分でない濃度とは、当該溶液に他の試薬を添加するとpH変動が生じpHが一定範囲から逸脱する濃度をいう。これらの濃度は溶液に添加される他の試薬の種類及び量に応じて変化するが、当業者であれば慣用法により該濃度を適宜決定することができる。他の条件及び手順は上記の界面活性剤耐性測定方法と同様としうる。
【０１５７】
（併用作用）
本発明の緩衝剤と、本発明の安定化剤とを併用した場合のアマドリアーゼ安定作用を評価するために、本発明のアマドリアーゼ及び界面活性剤を含む溶液に、安定化剤及び緩衝剤を適宜濃度調整しつつ添加し、アマドリアーゼの残存活性を測定することもできる。他の条件及び手順は上記の界面活性剤耐性測定方法と同様としうる。
【０１５８】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【０１５９】
［実施例１］
（界面活性剤耐性向上型変異について）
（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡの調製
ＣＦＰ−Ｔ７遺伝子（配列番号２）を含む組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株（国際公開２００７／１２５７７９号参照）を、ＬＢ−ａｍｐ培地［１％（Ｗ／Ｖ）  バクトトリプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ）  ペプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ）  ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ  Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ］２．５ｍｌに接種して、３７℃で２０時間振とう培養し、培養物を得た。
【０１６０】
この培養物を７，０００ｒｐｍで、５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。次いで、この菌体よりＱＩＡＧＥＮ  ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７を抽出して精製し、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７のＤＮＡ２．５μｇを得た。
【０１６１】
（２）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡの部位特異的改変操作
得られた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号５、６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
【０１６２】
すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５０℃、３０秒」−「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。
【０１６３】
反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約６，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて決定し、その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６２位のアスパラギンがヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２６２Ｈ）を得た。
【０１６４】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５７位のバリンをシステインに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号７、８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５７位のバリンがシステインに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２５７Ｃ）を得た。
【０１６５】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５７位のバリンをセリンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号８、９の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５７位のバリンがセリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２５７Ｓ）を得た。
【０１６６】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５７位のバリンをトレオニンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号８、１０の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５７位のバリンがトレオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２５７Ｔ）を得た。
【０１６７】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５３位のグルタミン酸をリジンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号１１、１２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５３位のグルタミン酸がリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２５３Ｋ）を得た。
【０１６８】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５３位のグルタミン酸をアルギニンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号１２、１３の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５３位のグルタミン酸がアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２５３Ｒ）を得た。
【０１６９】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の３３７位のグルタミンをリジンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号１４、１５の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の３３７位のグルタミンがリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−３３７Ｋ）を得た。
【０１７０】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の３４０位のグルタミン酸をプロリンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号１６、１７の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の３４０位のグルタミン酸がプロリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−３４０Ｐ）を得た。
【０１７１】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の１３３位のグルタミン酸をアラニンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号１８、１９の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１３３位のグルタミン酸がアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−１３３Ａ）を得た。
【０１７２】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の１３３位のグルタミン酸をメチオニンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号１９、２０の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１３３位のグルタミン酸がメチオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−１３３Ｍ）を得た。
【０１７３】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の１３３位のグルタミン酸をリジンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号１９、２１の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１３３位のグルタミン酸がリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−１３３Ｋ）を得た。
【０１７４】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の４４位のグルタミン酸をプロリンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号２２、２３の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の４４位のグルタミン酸がプロリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−４４Ｐ）を得た。
【０１７５】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５６位のグリシンをリジンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号８、２４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５６位のグリシンがリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２５６Ｋ）を得た。
【０１７６】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５６位のグリシンをアルギニンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号８、２５の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５６位のグリシンがアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２５６Ｒ）を得た。
【０１７７】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の８１位のグルタミン酸をリジンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号２６、２７の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の８１位のグルタミン酸がリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−８１Ｋ）を得た。
【０１７８】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の１２９位のアスパラギン酸をリジンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号４６、４７の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１２９位のアスパラギン酸がリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−１２９Ｋ）を得た。
【０１７９】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の１３２位のアスパラギン酸をリジンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号１９、４８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１３２位のアスパラギン酸がリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−１３２Ｋ）を得た。
【０１８０】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２３１位のグルタミン酸をリジンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号４９、５０の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２３１位のグルタミン酸がリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２３１Ｋ）を得た。
【０１８１】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２３２位のアスパラギン酸をリジンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号５０、５１の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２３２位のアスパラギン酸がリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２３２Ｋ）を得た。
【０１８２】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２４９位のグルタミン酸をリジンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号５２、５３の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２４９位のグルタミン酸がリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２４９Ｋ）を得た。
【０１８３】
（３）各種改変型アマドリアーゼの生産
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを保持するそれぞれの大腸菌ＪＭ１０９株を、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、３０℃で１６時間培養した。その後、各菌体をｐＨ７．０の０．０１Ｍリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、各粗酵素液１．５ｍｌを調製した。
【０１８４】
（４）各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価
このようにして調製した各粗酵素液をサンプルとし、ＣＴＡＣの終濃度を０．０１％として、上記の界面活性剤耐性測定法に従って、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表１−１に示す。なお加温後のサンプルをＢＳＡ溶液で２倍希釈してから３０分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。表１−１において、ＣＦＰ−Ｔ７は、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株由来のアマドリアーゼを示す。なお、本実施例では大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株由来のアマドリアーゼであるＣＦＰ−Ｔ７を変異元酵素としたため、表中に記載の「アミノ酸変異」の記載には、ＣＦＰ−Ｔ７に既に導入済みの各種変異点は含めていない。
【表１−１】
2020096596.tif 000011
【０１８５】
表１−１に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ７の残存活性は６９．９％となった。これに対し、部位特異的変異導入により得られた１５の変異体、すなわち、ＣＦＰ−Ｔ７の２６２位のアスパラギンがヒスチジンに、２５７位のバリンがシステイン、セリン、トレオニンに、２５３位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに、３３７位のグルタミンがリジンに、３４０位のグルタミン酸がプロリンに、４４位のグルタミン酸がプロリンに、１３３位のグルタミン酸がアラニン、メチオニン、リジンに、２５６位のグリシンがリジン、アルギニンに、８１位のグルタミン酸がリジンに、１２９位のアスパラギン酸がリジンに、１３２位のアスパラギン酸がリジンに、２３１位のグルタミン酸がリジンに、２３２のアスパラギン酸がリジンに、または２４９位のグルタミン酸がリジンにそれぞれ変異したアマドリアーゼにおいては、残存活性がいずれも７２％以上に向上し、顕著なものでは７９％以上に向上し、より顕著なものでは８９％以上に向上した。したがって、これらの各変異点が、アマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させる変異点であることが確認された。
【０１８６】
なおＣＦＰ−Ｔ７の２５３位および２５６位については、塩基性アミノ酸残基であるリジンへの置換およびアルギニンへの置換のいずれについても界面活性剤耐性の向上が見られた。したがって８１位、１２９位、１３２位、１３３位、２３１位、２３２位、２４９位、および３３７位についてもリジンと同様に塩基性アミノ酸残基であるアルギニンへの置換により界面活性剤耐性が向上すると考えられる。
【０１８７】
（５）Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来ＣｃＦＸについて
配列番号３７はＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来ケトアミンオキシダーゼ（以降ＣｃＦＸと称する）のアミノ酸配列である（国際公開第２００４／１０４２０３号）。配列番号３７のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号５５）を定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成によりｃＤＮＡを全合成することで取得した（終止コドンＴＡＡを含む）。このとき、配列番号５５の５´末端、３´末端にはそれぞれＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄIIIサイトを付加した。また、クローニングした遺伝子配列から予想されるアミノ酸配列全長は図１のＣｃＦＸの配列と一致していることを確認した。続いて、取得した配列番号５５の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄIIIサイト（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理し、ｐＫＫ−２２３−３  Ｖｅｃｔｏｒ（ＧＥヘルスケア社製）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIサイトに挿入することで、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸを取得し、上記と同様の条件で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ）株を得た。
【０１８８】
次に、ＣｃＦＸに界面活性剤耐性向上変異を導入した。具体的にはＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７）における１２９位、１３２位、１３３位、２３１位、２３２位、２４９位、２５３位、２５６位、および３３７位に対応する位置であるＣｃＦＸの１２９位、１３２位、１３３位、２２９位、２３０位、２４７位、２５１位、２５４位、および３３５位に変異を導入した。
【０１８９】
出発プラスミドとしてＣｃＦＸ遺伝子（配列番号５５）を含む組換え体プラスミドを使用し、これを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ）株について、上記（１）および（２）に記載の手順と同様にして各種変異体を作製した。変異導入に用いたプライマーの配列は、配列番号５６〜７４に示すとおりである。次に上記（３）に記載の手順で改変型アマドリアーゼを生産した。続いて、（４）に記載の界面活性剤耐性測定方法に従って、ただし、界面活性剤処理条件に関しては、アマドリアーゼを２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、０．０１％のＣＴＡＣの混合を行うことで、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表１−２に示す。なお加温後のサンプルをＢＳＡ溶液で２倍希釈してから３０分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
【表１−２】
2020096596.tif 000012
【０１９０】
表１−２に示す通り、本実施例の条件下では、ＣｃＦＸの残存活性は２７．４％となった。これに対し、部位特異的変異導入により得られた１２の変異体アマドリアーゼにおいては、残存活性がいずれも３４％以上に向上し、顕著なものでは５６％以上に向上し、より顕著なものでは６４％以上に向上した。
【０１９１】
このように、ＣＦＰ−Ｔ７について界面活性剤耐性向上が確認された変異を、ＣｃＦＸの対応する位置に導入したところ、上記のとおり同様の界面活性剤耐性向上が確認された。したがって、これらの各変異導入の効果は特定の種に由来するアマドリアーゼに限定されるものではなく、対応する位置に変異を導入することで各種のアマドリアーゼについても界面活性剤耐性を向上させる効果がある。
【０１９２】
なおＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼとＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来ケトアミンオキシダーゼは約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。よってＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼまたはＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来ケトアミンオキシダーゼと８０％以上のアミノ酸配列同一性を有する他の種由来のアマドリアーゼについても、上記位置に対応する位置に変異を導入することで界面活性剤耐性を向上させることができると考えられる。
【０１９３】
またＣｃＦＸの２５１位および３３５位ではリジンまたはアルギニンへの置換により界面活性剤耐性の向上が見られた。このことから、ＣｃＦＸの８１位、１２９位、１３２位、１３３位、２２９位、２３０位、２４７位、２５１、２５４、および３３５位は塩基性アミノ酸残基であるリジンまたはアルギニンへの置換により界面活性剤耐性が向上すると考えられる。また他の各種のアマドリアーゼについても同様である。
【０１９４】
また、ＣＦＰ−Ｔ７の１３３位ではアラニンまたはメチオニンへの置換、ＣｃＦＸの１３３位ではアラニンへの置換により界面活性剤耐性の向上が見られた。このことから、ＣＦＰ−Ｔ７の１３３位およびＣｃＦＸの１３３位は疎水性アミノ酸残基であるアラニン、メチオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリンへの置換により界面活性剤耐性が向上すると考えられる。また他の各種のアマドリアーゼについても同様である。
【０１９５】
なお、特定の論理に拘束されるものではないが、本発明の変異体アマドリアーゼが界面活性剤耐性となる機構は、例えば次のようなものと考えられる。すなわち、アマドリアーゼの酸性アミノ酸を疎水性アミノ酸や塩基性アミノ酸へ置換することで、アマドリアーゼとカチオン性界面活性剤との親和性が低下し、アマドリアーゼが界面活性剤の変性作用から保護されるものと考えられる。特に、塩基性アミノ酸残基であるリジンまたはアルギニンを導入すると、塩基性アミノ酸残基がカチオン性界面活性剤と反発することで、さらにアマドリアーゼが界面活性剤の変性作用から保護されるものと考えられる。
【０１９６】
本発明のこれらの変異点は、単独変異として有効であるのみならず、既に知られている各種公知の変異と組み合わせ、また、本発明の変異同士を組み合わせることによって、実用上の利点を有する変異体を創出することに貢献することが期待される。
【０１９７】
［実施例２］
（界面活性剤耐性向上型変異の蓄積）
実施例１で見出された界面活性剤耐性向上変異の知見に基づき、これらを組み合わせて変異を蓄積させることにより、さらに界面活性剤耐性を高めたアマドリアーゼを取得することを目的として、多重変異体（２重変異体、３重変異体、４重変異体、５重変異体、６重変異体、７重変異体）の作製による界面活性剤耐性向上型変異の蓄積を試みた。
【０１９８】
配列番号３は基質特異性改善型変異（Ｅ９８Ａ）と熱安定性向上型変異（Ｆ４３Ｙ、Ｇ１８４Ｄ、カルボキシル末端の３アミノ酸残基が欠失）を導入したＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼのアミノ酸配列（以下、「ＣＦＰ−Ｄ」と表記。）であり、配列番号４の遺伝子にコードされている。ｐＫＫ２２３−３ベクターにＣＦＰ−Ｄ遺伝子が挿入されたプラスミドＤＮＡを鋳型として、界面活性剤耐性向上型変異の蓄積を行った。合成オリゴヌクレオチド（配列番号５、６、７、１６、１７、１８、１９、２３、２８、２９、３０、３１、３２、３３、４６、４７、５０、５１、５２、５４）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。
【０１９９】
これにより、４４位のグルタミン酸がプロリンに置換された変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ１；４４位のグルタミン酸がプロリンに置換され、かつ３４０位のグルタミン酸がプロリンに置換された二重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ２；４４位のグルタミン酸がプロリンに置換され、２６２位のアスパラギンがヒスチジンに置換され、かつ３４０位のグルタミン酸がプロリンに置換された三重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ３；４４位のグルタミン酸がプロリンに置換され、２５７位のバリンがシステインに置換され、２６２位のアスパラギンがヒスチジンに置換され、かつ３４０位のグルタミン酸がプロリンに置換された四重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ４；４４位のグルタミン酸がプロリンに置換され、２５７位のバリンがシステインに置換され、２６２位のアスパラギンがヒスチジンに置換され、３４０位のグルタミン酸がプロリンに置換され、かつ２３２位のアスパラギン酸がリジンに置換された五重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ４／２３２Ｋ；４４位のグルタミン酸がプロリンに置換され、２５７位のバリンがシステインに置換され、２６２位のアスパラギンがヒスチジンに置換され、３４０位のグルタミン酸がプロリンに置換され、かつ２４９位のグルタミン酸がリジンに置換された五重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ４／２４９Ｋ；４４位のグルタミン酸がプロリンに置換され、２５３位のグルタミン酸がリジンに置換され、２５７位のバリンがシステインに置換され、２６２位のアスパラギンがヒスチジンに置換され、かつ３４０位のグルタミン酸がプロリンに置換された五重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ５；４４位のグルタミン酸がプロリンに置換され、２５３位のグルタミン酸がリジンに置換され、２５７位のバリンがシステインに置換され、２６２位のアスパラギンがヒスチジンに置換され、３４０位のグルタミン酸がプロリンに置換され、かつ１２９位のアスパラギン酸がリジンに置換された六重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ５／１２９Ｋ；４４位のグルタミン酸がプロリンに置換され、１３３位のグルタミン酸がアラニンに置換され、２５３位のグルタミン酸がリジンに置換され、２５７位のバリンがシステインに置換され、２６２位のアスパラギンがヒスチジンに置換され、かつ３４０位のグルタミン酸がプロリンに置換された六重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ６；４４位のグルタミン酸がプロリンに置換され、１３３位のグルタミン酸がアラニンに置換され、２５３位のグルタミン酸がリジンに置換され、２５７位のバリンがシステインに置換され、２６２位のアスパラギンがヒスチジンに置換され、３３７位のグルタミンがリジンに置換され、かつ３４０位のグルタミン酸がプロリンに置換された七重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ７を得た。
【０２００】
そして、上記と同様の条件で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ１）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ２）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ３）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ４）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ４／２３２Ｋ）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ４／２４９Ｋ）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ５）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ５／１２９Ｋ）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ６）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ７）株を得た。
【０２０１】
上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ１）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ２）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ３）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ４）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ４／２３２Ｋ）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ４／２４９Ｋ）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ５）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ５／１２９Ｋ）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ６）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｄ７）株を、上記の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液１．５ｍｌを調製した。得られた各粗酵素液をサンプルとし、上記（４）に記載の界面活性剤耐性測定方法に従って、ただし、界面活性剤処理条件に関しては、より厳しい条件である０．０４％のＣＴＡＣの混合に変更し、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表２−１に示す。なお加温後のサンプルをＢＳＡ溶液で２倍希釈してから３０分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
【表２−１】
2020096596.tif 000013
【０２０２】
表２−１に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ７の残存活性はわずか２．２７％であった。このように過酷な界面活性剤条件下においては、従来のアマドリアーゼは、ほとんど活性を失ってしまうことが確認された。
【０２０３】
これに対し、実施例１で確認された各種の単独変異を組み合わせて作製した各種多重変異体においては、残存活性がいずれも顕著に向上していた。具体的には、４４位のグルタミン酸がプロリンに置換され、かつ３４０位のグルタミン酸がプロリンに置換された二重変異体における残存活性は３７．１％であり、ＣＦＰ−Ｔ７と比較して向上した。さらに、この変異に２６２位のアスパラギンがヒスチジンに置換された三重変異体における残存活性は５１．４％であり、ＣＦＰ−Ｔ７と比較してさらに向上した。さらに、この変異に２５７位のバリンがシステインに置換された四重変異体における残存活性は６０．７％であり、ＣＦＰ−Ｔ７と比較して顕著に向上した。さらに、この変異に２５３位のグルタミン酸がリジンに置換された五重変異体における残存活性は９５．６％であり、さらに、この変異に１３３位のグルタミン酸がアラニンに置換された六重変異体における残存活性は９９．２％であり、さらに、この変異に３３７位のグルタミンがリジンに置換された七重変異体における残存活性は１００％であり、ＣＦＰ−Ｔ７と比較して顕著に向上し、ＣＴＡＣによるアマドリアーゼの失活はほとんど無かった。また前記四重変異体ＣＦＰ−Ｄ４の２３２位のアスパラギン酸がリジンにさらに置換された五重変異体における残存活性は６６．２％であり、前記四重変異体ＣＦＰ−Ｄ４の２４９位のグルタミン酸がリジンにさらに置換された五重変異体における残存活性は９１．０％であり、前記五重変異体ＣＦＰ−Ｄ５の１２９位のアスパラギン酸がリジンにさらに置換された六重変異体における残存活性は９８．１％でありＣＦＰ−Ｔ７と比較して顕著に向上し、ＣＴＡＣによるアマドリアーゼの失活はほとんど無かった。
【０２０４】
しかも、ＣＦＰ−Ｄに変異を蓄積する都度、得られたさらなる多重変異体の界面活性剤耐性は段階的に向上しており、実施例１で確認された本発明の変異点を適宜組み合わせることによって、一層優れた界面活性剤耐性を有するアマドリアーゼが作出され得ることが明らかとなった。
【０２０５】
次にｐＫＫ２２３−３ベクターにＣｃＦＸ遺伝子が挿入されたプラスミドＤＮＡを鋳型として、界面活性剤耐性向上型変異の蓄積を行った。ＣＦＰ−Ｄ遺伝子の代わりにＣｃＦＸ遺伝子を用いた以外は、手順は上記と同様に行った。合成オリゴヌクレオチド（配列番号７２、７３）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。
【０２０６】
これにより、１３２位のアスパラギン酸がリジンに置換され、３３５位のトレオニンがリジンに置換された変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ／１３２Ｋ／３３５Ｋ；１３３位のグルタミン酸がアラニンに置換され、３３５位のトレオニンがリジンに置換された変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ／１３３Ａ／３３５Ｋ；２２９位のグルタミン酸がリジンに置換され、３３５位のトレオニンがリジンに置換された変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ／２２９Ｋ／３３５Ｋ；および２５１位のグルタミン酸がリジンに置換され、３３５位のトレオニンがリジンに置換された変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ／２５１Ｋ／３３５Ｋを得た。そして、上記と同様の条件で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、形質転換株を、上記の方法で培養し、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液１．５ｍｌを調製した。得られた各粗酵素液をサンプルとし、上記（４）に記載の界面活性剤耐性測定方法に従って、ただし、界面活性剤処理条件に関しては、アマドリアーゼを２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、０．０１％のＣＴＡＣの混合を行うことで、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表２−２に示す。なお加温後のサンプルをＢＳＡ溶液で２倍希釈してから３０分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
【表２−２】
2020096596.tif 000014
【０２０７】
表１−２、表２−２に示す通り、本実施例の条件下では、ＣｃＦＸの残存活性は２７．４％であったのに対し、実施例１で確認された各種の単独変異を組み合わせて作製した各種二重変異体においては、残存活性がいずれも顕著に向上していた。また表１−２のＣｃＦＸの単変異体と比較してもＣｃＦＸの二重変異体の界面活性剤耐性は向上しており、やはりアマドリアーゼ酵素の種類を問わず変異の効果は蓄積するものであることが確認された。
【０２０８】
［実施例３−１］
（界面活性剤ＴＴＡＣに対する評価）
実施例２で用いた界面活性剤ＣＴＡＣに変わり、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド（以下、「ＴＴＡＣ」と表記。）を用いて、ＣＦＰ−Ｄの安定性を評価した。実施例１に準じた界面活性剤耐性測定方法に従って、ただし、界面活性剤処理条件に関しては、アマドリアーゼを２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、０．０４％のＴＴＡＣの混合を行うことで、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表３−１に示す。なお加温後のサンプルをＢＳＡ溶液で２倍希釈してから３０分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
【表３−１】
2020096596.tif 000015
【０２０９】
表３−１に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｄの残存活性は２９．２％であった。
【０２１０】
これに対し、実施例２で作製した各種多重変異体においては、残存活性がいずれも顕著に向上していた。具体的には、４４位のグルタミン酸がプロリンに置換され、かつ３４０位のグルタミン酸がプロリンに置換された二重変異体における残存活性は６９．９％であり、ＣＦＰ−Ｄと比較して向上した。さらに、この変異に２６２位のアスパラギンがヒスチジンに置換された三重変異体における残存活性は８５．３％であり、ＣＦＰ−Ｄと比較してさらに向上した。さらに、この変異に２５７位のバリンがシステインに置換された四重変異体における残存活性は９１．１％であり、ＣＦＰ−Ｄと比較して顕著に向上した。さらに、この変異に２５３位のグルタミン酸がリジンに置換された五重変異体における残存活性は９４．９％であり、さらに、この変異に１３３位のグルタミン酸がアラニンに置換された六重変異体における残存活性は９６．４％であり、さらに、この変異に３３７位のグルタミンがリジンに置換された七重変異体における残存活性は１００％であり、ＣＦＰ−Ｄと比較して顕著に向上し、ＴＴＡＣによるアマドリアーゼの失活はほとんど無かった。
【０２１１】
したがって、これらのアミノ酸置換はアマドリアーゼのＴＴＡＣに対する耐性を向上させることが分かった。
【０２１２】
［実施例３−２］
（ＣＦＰ−Ｔ７、ＣＦＰ−Ｄ２、ＣＦＰ−Ｄ７の精製）
実施例１，２で得たＣＦＰ―Ｔ７、ＣＦＰ−Ｄ２およびＣＦＰ−Ｄ７の粗酵素を用いて、調製した粗酵素液を２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した４ｍｌのＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に８０ｍｌの同緩衝液で樹脂を洗浄し、続いて１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂に吸着していた蛋白質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。
【０２１３】
得られたアマドリアーゼ活性を示す画分を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５，  ３０Ｋ  ＮＭＷＬ（ミリポア社製）で濃縮した。その後、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、同緩衝液で溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収し、野生型および改変型アマドリアーゼの精製標品を得た。得られた精製標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析により、単一なバンドまで精製されていることを確認した。
【０２１４】
（種々の界面活性剤に対する評価）
種々の界面活性剤を用い、上記のようにして得た精製酵素ＣＦＰ−Ｔ７、ＣＦＰ−Ｄ２およびＣＦＰ−Ｄ７の安定性を評価した。実施例１に準じた界面活性剤耐性測定方法に従って、ただし、界面活性剤処理条件に関しては、アマドリアーゼを２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、各種濃度の界面活性剤の混合を行うことで、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表３−２に示す。なお加温後のサンプルをＢＳＡ溶液で２倍希釈してから３０分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
【表３−２】
2020096596.tif 000016
【０２１５】
表３−２より、変異導入前のＣＦＰ−Ｔ７は、界面活性剤としてＯＴＡＢおよびＯＴＡＣを用いた場合を除き、ほとんどの界面活性剤により大幅に活性が低下した。これに対して二重変異体ＣＦＰ−Ｄ２は試験した全ての種類の界面活性剤に関し、ＣＦＰ−Ｔ７よりも優れた界面活性剤耐性を示した。また、七重変異体ＣＦＰ−Ｄ７も試験した全ての種類の界面活性剤に関し、ＣＦＰ−Ｔ７よりも優れた界面活性剤耐性を示し、ほとんどの場合、二重変異体ＣＦＰ−Ｄ２よりも界面活性剤耐性が向上していた。
【０２１６】
表３−２より、界面活性剤として炭素鎖の長さの異なるOTAB（C8）、DTAB（C12）、TTAB（C14）、STAB（C18）を用いた場合に、D2もD7も界面活性剤耐性が向上していた。したがって炭素鎖C10のデシルトリメチルアンモニウムブロミドや炭素鎖C16のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド等の界面活性剤についても同様と考えられる。これらの臭化物塩に対応する塩化物塩であるOTAC（C8）、TTAC（C14）、CTAC（C16）、およびSTAC（C18）についても同様であり、本発明のアマドリアーゼは炭素鎖C10のデシルトリメチルアンモニウムクロリドや炭素鎖C12のドデシルトリメチルアンモニウムクロリドに対して耐性を有すると考えられる。
【０２１７】
また、表３−２よりD2およびD7は共に、対イオン(Z)が塩化物イオンであっても臭化物イオンであっても界面活性剤耐性を示した。
【０２１８】
また、表３−２よりD2およびD7は共に、アンモニウムイオン系の界面活性剤のみならず、ピリジニウムイオン系界面活性剤およびホスホニウムイオン系界面活性剤についても耐性を示したことから、界面活性剤耐性は、各種のカチオン性界面活性剤に対するものであることが示された。
【０２１９】
以上をまとめると、本発明の界面活性剤耐性アマドリアーゼは、界面活性剤の対イオンの種類にかかわらず、鎖長にかかわらず、そしてカチオン性界面活性剤の基本構造にかかわらず、幅広い界面活性剤耐性スペクトルを有することが実証された。
【０２２０】
なお、用いた各種界面活性剤の名称及び構造をまとめると以下のとおりである。
【表３−３】
2020096596.tif 000017
【０２２１】
［実施例４］
（界面活性剤ＳＤＳに対する評価）
実施例２で用いた界面活性剤ＣＴＡＣに変わり、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、「ＳＤＳ」と表記。）を用いて、ＣＦＰ−Ｄの安定性を評価した。実施例１に準じた界面活性剤耐性測定方法に従って、ただし、界面活性剤処理条件に関しては、アマドリアーゼを３０ｍＭ  ＭＥＳ／２１ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈し、０．０４％のＳＤＳの混合を行うことで、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表４に示す。なお加温後のサンプルをＢＳＡ溶液で２倍希釈してから３０分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
【表４】
2020096596.tif 000018
【０２２２】
表４に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ７の残存活性は２．７６％であった。
【０２２３】
これに対し、実施例２で作製した各種多重変異体においては、残存活性がいずれも顕著に向上していた。具体的には、４４位のグルタミン酸がプロリンに置換され、かつ３４０位のグルタミン酸がプロリンに置換された二重変異体における残存活性は１９．２％であり、ＣＦＰ−Ｔ７と比較して向上した。さらに、この変異に２６２位のアスパラギンがヒスチジンに置換された三重変異体における残存活性は１１．３％であり、ＣＦＰ−Ｔ７と比較して向上した。さらに、この変異に２５７位のバリンがシステインに置換された四重変異体における残存活性は１７．１％であり、ＣＦＰ−Ｔ７と比較して向上した。さらに、この変異に２５３位のグルタミン酸がリジンに置換された五重変異体における残存活性は５．０７％であり、さらに、この変異に１３３位のグルタミン酸がアラニンに置換された六重変異体における残存活性は３．６２％であり、さらに、この変異に３３７位のグルタミンがリジンに置換された七重変異体における残存活性は３．９２％であり、ＣＦＰ−Ｔ７と比較して向上した。
【０２２４】
したがって、これらのアミノ酸置換はアマドリアーゼのＳＤＳに対する耐性を向上させることが分かった。
【０２２５】
［実施例５］（界面活性剤混合下におけるフルクトシルペプチド試料の測定）
実施例３−２で得たＣＦＰ−Ｔ７、およびＣＦＰ−Ｄ７の精製酵素を用いて、下記に示した試料の測定を実施した。なお、ＣＦＰ−Ｔ７、およびＣＦＰ−Ｄ７の活性値はアマドリアーゼ活性の測定方法に記載の方法に従い、終濃度５ｍＭのαＦＶＨを基質として、ｐＨ７．０に調整した（試薬１）を用いて決定した。
【０２２６】
（１１）フルクトシルペプチド試料の調製
（試薬４）αＦＶＨ  １２５ｍｇをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容することにより、基質溶液３０ｍＭを得た。さらに、ＣＴＡＣ溶液で７１４倍希釈することにより、４２μＭのαＦＶＨ／０％〜０．２％のＣＴＡＣ溶液を得た。
【０２２７】
（１２）フルクトシルペプチド試料の測定
（試薬５）
０．２１ｍＭ  ＤＡ−６４（Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４′−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、和光純薬工業社製）
２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
（試薬６）
６．７Ｕ／ｍｌ  ＣＦＰ−Ｔ７、あるいはＣＦＰ−Ｄ７
１９Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ（キッコーマン社製）
２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
予め３７℃で５分間加温しておいた１３５μｌの（試薬５）と上記（１１）で調製した２５μｌの試料の混合溶液に対し、５０μｌの（試薬６）を添加して反応を開始し、３７℃で５分間反応後の波長７５１ｎｍにおける吸光度を自動分析装置Ｂｉｏ  Ｍａｊｅｓｔｙ  ＪＣＡ‐ＢＭ１６５０（日本電子）で測定した。基質溶液の代わりにイオン交換水を用いて作製した（試薬４）に対しても、同様に操作して測定した波長７５１ｎｍにおける吸光度（試薬ブランク）を対照として、下記の式により、それぞれの試料を測定した場合の吸光度変化量（差）を算出した。発色基質ＤＡ−６４の終濃度は０．１５ｍＭであり、基質ありの場合はαＦＶＨの終濃度は５μＭであり、吸光度測定に用いたセルの長さ(光路)は１ｃｍであった。
吸光度変化量＝ΔＡｅｓ−Ａｅ０
ΔＡｅｓ：反応開始から５分経過後の吸光度
ΔＡｅ０：対照液を添加した場合の反応開始から５分経過後の吸光度
【０２２８】
αＦＶＨ／０％〜０．２％ＣＴＡＣを試料とした際の吸光度変化量を算出した。結果を表５に示す。
【表５】
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【０２２９】
表５に示す通り、本実施例の条件下では、０％のＣＴＡＣ混合下においては、ＣＦＰ−Ｔ７の吸光度変化量は０．１５０であり、０．００５％のＣＴＡＣ混合下においては、ＣＦＰ−Ｔ７の吸光度変化量は０．１１１であった。さらに、０．０１％のＣＴＡＣ混合下においては、ＣＦＰ−Ｔ７の吸光度変化量は０．０７７であり、０．０２％のＣＴＡＣ混合下においては、ＣＦＰ−Ｔ７の吸光度変化量は０．０３１であり、０．０４％のＣＴＡＣ混合下においては、ＣＦＰ−Ｔ７の吸光度変化量は０．００５まで減少し、ＣＴＡＣ濃度が高くなるほど吸光度変化量が減少することが分かった。
【０２３０】
これに対し、ＣＦＰ−Ｄ７においては、０．０２％のＣＴＡＣ混合下においては、ＣＦＰ−Ｄ７の吸光度変化量は０．１４０であり、０．２％のＣＴＡＣ混合下においては、ＣＦＰ−Ｄ７の吸光度変化量は０．０６９であった。すなわち、ＣＦＰ−Ｔ７がＣＴＡＣを混合するほど、吸光度変化量が減少したのに対し、ＣＦＰ−Ｄ７は、吸光後変化量の減少が抑制され、さらに、０．１％以上のＣＴＡＣ存在下において吸光度変化量が一定になった。また、ＣＴＡＣの臨界ミセル濃度である１．３ｍＭ（０．０４％）まで吸光度変化量の減少幅が大きいが、臨界ミセル濃度以上の濃度においては、アマドリアーゼに与える影響の変化が小さくなった。したがって、ＣＦＰ−Ｄ７は高いＣＴＡＣ濃度混合下においても、安定に存在し、αＦＶＨを測定可能であることが分かった。
【０２３１】
［実施例６］
（界面活性剤混合下におけるフルクトシルペプチド試料の定量）
ＣＦＰ−Ｔ７、およびＣＦＰ−Ｄ７の精製酵素を用いて、ＣＴＡＣ混合下において、０．５〜３μＭの範囲でαＦＶＨ測定値の直線性を比較した。ＣＦＰ−Ｔ７は、０．０１％または０．０２％のＣＴＡＣ混合をし、さらに４．２μＭ、８．４μＭ、１３μＭ、１７μＭ、２１μＭまたは２５μＭのαＦＶＨ、つまり終濃度では、０．５μＭ、１．０μＭ、１．５μＭ、２．０μＭ、２．５μＭまたは３．０μＭのαＦＶＨを用いる条件で、実施例５と同様に吸光度変化量を測定し、相関係数を算出した。同様に、ＣＦＰ−Ｄ７は、０．０２％または０．２％のＣＴＡＣ混合をし、上記と同様のαＦＶＨを用いる条件で、実施例５と同様に吸光度変化量を測定し、相関係数を算出した。その結果を表６に示し、各相関データを図２、３、４、５に示す。図２は、０．０１％のＣＴＡＣの混合下でＣＦＰ−Ｔ７を用いて、αＦＶＨを測定した結果であり、図３は、０．０２％のＣＴＡＣの混合下でＣＦＰ−Ｔ７を用いて、αＦＶＨを測定した結果であり、図４は、０．０２％のＣＴＡＣの混合下でＣＦＰ−Ｄ７を用いて、αＦＶＨを測定した結果であり、図５は、０．２％のＣＴＡＣの混合下でＣＦＰ−Ｄ７を用いて、αＦＶＨを測定した結果である。
【表６】
2020096596.tif 000020
【０２３２】
表６に示す通り、本実施例の条件下では、０．０１％のＣＴＡＣ混合下においては、ＣＦＰ−Ｔ７による０．５μＭ〜３．０μＭのαＦＶＨの相関係数は、０．９２４と高かったが、０．０２％のＣＴＡＣ混合下においては、０．６２５と低い相関係数であった。これに対し、ＣＦＰ−Ｄ７を用いると、０．２％のＣＴＡＣ混合下においても、０．５μＭ〜３．０μＭのαＦＶＨの相関係数は、０．９６５と高い直線性を示した。
【０２３３】
また、酵素法のＨｂＡ１ｃ測定キットであるサンク  ＨｂＡ１ｃ（アークレイ社製）の添付文書によると、全血検体を４１６倍希釈した状態でアマドリアーゼと反応させている。例えば、ＮＧＳＰ値におけるＨｂＡ１ｃ値が６．５％であり、また、全Ｈｂ濃度が１４１〜１５０ｇ／ｌであり、血液試料を４１６倍希釈して測定した場合に、プロテアーゼで切り出されるαＦＶＨの濃度は、０．５０〜０．５３μＭである。実際の糖尿病診断のＨｂＡ１ｃ値の境界値は、ＮＧＳＰ値で６．５％である。したがって、ＣＦＰ−Ｄ７は実際のＨｂＡ１ｃ測定において十分に利用することができ、また、強い界面活性剤、例えばＣＴＡＣを併用することで、測定感度を高めることができるといえる。
【０２３４】
［実施例７］
（各種アマドリアーゼの界面活性剤耐性の評価）
界面活性剤、好ましくはイオン性界面活性剤の存在下においても活性が残存するアマドリアーゼを含む糖化ヘモグロビン測定用組成物を提供するために、上述のようにＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼを改変して界面活性剤耐性を向上させた。また、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼ以外のアマドリアーゼにおいては、イオン性界面活性剤存在下においてのＨｂＡ１ｃ測定が可能か知られていない。そこで、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼおよびＮｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼとイオン性界面活性剤を組み合わせて、αＦＶＨの測定を試みた。
【０２３５】
１．Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼの生産・精製
配列番号４０はＰｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ（以降ＰｎＦＸと称する）のアミノ酸配列である（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  １０６，  ３５８−３６６，  ２０１０参照）。配列番号４０のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号４４）を定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成によりｃＤＮＡを全合成することで取得した。このとき、配列番号４０の５´末端、３´末端にはそれぞれＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトを付加した。また、クローニングした遺伝子配列から予想されるアミノ酸配列全長は図１のＰｎＦＸの配列と一致していることを確認した。続いて、取得した配列番号４４の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理し、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）  Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入することで、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸを取得し、上記と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ）株を得た。
【０２３６】
上記のようにして得られたＰｎＦＸ生産能を有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ）株を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
【０２３７】
調製したＰｎＦＸの粗酵素液を前述の非特許文献（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  １０６，  ３５８−３６６，  ２０１０）記載の方法に従い、精製した。すなわち、粗酵素液を硫酸アンモニウムにより分画し、１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で透析し、陰イオン交換クロマトグラフィー（本実施例ではＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いた）により精製し、ゲルろ過クロマトグラフィー（本実施例ではＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｅｐｒｄｅｘ  ２００を用いた）により精製した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、ＰｎＦＸの精製標品とした。
【０２３８】
２．Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼの生産・精製
配列番号３８はＮｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来ケトアミンオキシダーゼ（ＮｖＦＸ）のアミノ酸配列であり、配列番号３８のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号４５）を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸを大腸菌で発現させることにより、ＮｖＦＸの活性が確認されている（国際公開第２０１２／１８０９４号参照）。実施例１と同様に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、得られた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ）株を用いて上記の方法で培養して、ＮｖＦＸの粗酵素液を調製した。
【０２３９】
調製した粗酵素液を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂を洗浄し、続いて３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂に吸着していたＮｖＦＸを溶出させ回収した。
【０２４０】
得られたＮｖＦＸを含む粗酵素液を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムにアプライして同緩衝液でＮｖＦＸを溶出させ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性（アマドリアーゼ活性）を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、ＮｖＦＸの精製標品とした。
【０２４１】
上記のようにして得られた各種アマドリアーゼ精製標品をサンプルとし、実施例５と同様に、ＰｎＦＸとＮｖＦＸを用いてＣＴＡＣ混合下におけるαＦＶＨの測定を行った。結果を表７に示す。
【表７】
2020096596.tif 000021
【０２４２】
表７に示す通り、本実施例の条件下では、０％のＣＴＡＣ混合下においては、ＰｎＦＸの吸光度変化量は０．１７３であり、０．０１％のＣＴＡＣ混合下においては、吸光度変化量は０．１１５であった。また、０．０２％のＣＴＡＣ混合下においては、ＰｎＦＸの吸光度変化量は０．０８４であるのに対し、ＣＦＰ−Ｔ７の吸光度変化量は０．０３１であり、０．０４％のＣＴＡＣ混合下においては、ＰｎＦＸの吸光度変化量は０．０２６であるのに対し、ＣＦＰ−Ｔ７の吸光度変化量は０．００５であった。すなわち、ＰｎＦＸは、０．０２％以上という高い濃度のＣＴＡＣの混合下で、基質であるαＦＶＨを測定することができるといえる。
【０２４３】
ＮｖＦＸについては、０．０２％までのＣＴＡＣ混合下において、吸光度が増加したが、濁りが発生した影響で基質の代わりにイオン交換水を用いたブランクにおいても吸光度が増加し、正確にαＦＶＨを測定することができなかった。
【０２４４】
［実施例８］
（各種緩衝剤存在下におけるアマドリアーゼの界面活性剤耐性評価）
３０ｍＭ  ＭＥＳ／２１ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝剤（ｐＨ６．５）以外の緩衝剤を用いた場合に、アマドリアーゼの界面活性剤耐性が向上するか検討した。上記のように精製したＣＦＰ−Ｔ７をサンプルとし、ＣＴＡＣの終濃度を０．０１％として、３０ｍＭ  ＭＥＳ／２１ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝剤（ｐＨ６．５）の代わりに各種緩衝剤、具体的にはリン酸とリン酸カリウムとを含むリン酸緩衝剤（ｐＨ７．０）、クエン酸とクエン酸ナトリウムとを含むクエン酸緩衝剤（ｐＨ６．０）、ＭＥＳとそのナトリウム塩とを含むＭＥＳ緩衝剤（ｐＨ７．０）、ＨＥＰＥＳとそのナトリウム塩とを含むＨＥＰＥＳ緩衝剤（ｐＨ７．０）、ＡＣＥＳとそのナトリウム塩とを含むＡＣＥＳ緩衝剤（ｐＨ７．０）の存在下において、実施例１の界面活性剤耐性測定法に従って、ＣＦＰ−Ｔ７の界面活性剤耐性評価を行った。結果を表８に示す。なお加温後のサンプルをＢＳＡ溶液で２倍希釈してから３０分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
【表８】
2020096596.tif 000022
【０２４５】
表８に示す通り、本実施例の条件下では、リン酸緩衝剤、ＭＥＳ緩衝剤、ＡＣＥＳ緩衝剤の存在下においては、緩衝剤の濃度依存的に、ＣＦＰ−Ｔ７の界面活性剤耐性が向上することが明らかとなった。クエン酸緩衝剤においては、１０ｍＭであっても界面活性剤による失活がみられず、特に有用であった。ＨＥＰＥＳ緩衝剤は、アマドリアーゼ活性を残存させる効果は見られなかった。以上のことから、驚くべきことに、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、ＭＥＳ緩衝剤、ＡＣＥＳ緩衝剤には、アマドリアーゼに界面活性剤に対する耐性を向上させる効果があることを示している。
【０２４６】
［実施例９］
（各安定化剤添加時におけるアマドリアーゼの界面活性剤耐性評価）
種々の安定化剤を添加した際に、アマドリアーゼの界面活性剤耐性が向上するか検討した。安定化剤として、リン酸、トリカルボン酸（例えば、クエン酸）、ジカルボン酸（例えば、リンゴ酸、マレイン酸、シトラコン酸、マロン酸、グルタル酸、酒石酸）、モノカルボン酸（例えば、酢酸）、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、硫酸アンモニウムを用いた。また比較例としてＣＨＥＳを用いた。安定化剤を添加した際に、ｐＨの変化を防ぐようにするために、緩衝液は５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用い、上記のように精製したＣＦＰ−Ｔ７をサンプルとし、ＣＴＡＣの終濃度を０．０１％として、さらに、種々の安定化剤を添加し、実施例１の界面活性剤耐性測定法に従って、ＣＦＰ−Ｔ７の界面活性剤耐性評価を行った。結果を表９−１、９−２に示す。また、５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）緩衝剤を用い、上記のように精製したＣＦＰ−Ｄ２をサンプルとし、さらに、種々の安定化剤を添加し、実施例１の界面活性剤耐性測定法に従って、ただし、界面活性剤処理条件に関しては、ＣＴＡＣの終濃度を０．０８％、処理温度を３７℃とより過酷な条件を設定し、ＣＦＰ−Ｄ２の界面活性剤耐性評価を行った。結果を表９−３に示す。実際に、安定化剤を添加した際に、ｐＨは実際に７．０を示すことを確認した。なお加温後のサンプルをＢＳＡ溶液で２倍希釈してから３０分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
【表９−１】
2020096596.tif 000023
【表９−２】
2020096596.tif 000024
【表９−３】
2020096596.tif 000025
【０２４７】
表９−１、９−２に示す通り、本実施例の条件下では、安定化剤として、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、シトラコン酸、マロン酸、グルタル酸、酒石酸、酢酸、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、硫酸アンモニウムを添加した際に、安定化剤の濃度依存的に、ＣＦＰ−Ｔ７の界面活性剤耐性が向上することが明らかとなった。特に、クエン酸は０．２ｍＭと極微量に添加した際にもＣＦＰ−Ｔ７の界面活性剤耐性を向上させることができることが分かった。また表９−３に示す通り、安定化剤としてリン酸、リンゴ酸、ＭＯＰＳを添加すると、安定化剤が存在しない場合と比較して顕著にＣＦＰ−Ｄ２精製酵素の界面活性剤耐性が向上した。アマドリアーゼの界面活性剤に対する安定性が種々の化合物によって向上できることは公知ではなく、驚くべきことであった。特に以下の構造を有するＣＨＥＳ
【化９】
2020096596.tif 000026
は安定化作用を有しなかったのに対し、驚くべきことに、これと非常に構造の類似する式（IV）
【化１０】
2020096596.tif 000027
[式中、nは0、1、2または3であってもよく、R10は、それぞれ独立にH、OH、-CH2OHまたは-COOHであってもよい]
に包含されるＭＥＳ（n=1, R10はH）、ＭＯＰＳ（n=2, R10はいずれもH）、ＭＯＰＳＯ（n=2, R10はOHおよびH）はいずれもアマドリアーゼ安定化作用を示した。以上のことから、リン酸、トリカルボン酸、ジカルボン酸、モノカルボン酸、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ等の式（IV）で表される化合物、硫酸アンモニウムには、アマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させる効果があることを示している。また、本発明の変異を導入していないアマドリアーゼＣＦＰ−Ｔ７についても、本発明の変異を導入したアマドリアーゼＣＦＰ−Ｄ２についても界面活性剤耐性の向上が観察された。
【０２４８】
なお、表８及び９−１の結果を合わせると、本発明の安定化剤のアマドリアーゼ安定化作用が、本発明の緩衝剤のアマドリアーゼ安定化作用と異なる作用であることが分かる。具体的には表８からはＭＥＳを本発明の緩衝剤として用いた場合、濃度50mMにてCFP-T7アマドリアーゼの残存活性が14.3%であり、濃度100mMにて同残存活性が17.6%であり、濃度150mMにて同残存活性が62.9%であることが確認された。これに対して表９からは、アマドリアーゼ安定化作用を有しない単なるpH緩衝剤としてHEPES(pH 7.0)を使用しつつＭＥＳを本発明の安定化剤として用いると、MESの濃度10mMにてCFP-T7アマドリアーゼの残存活性が19.5%であり、MES濃度20mMにて同残存活性が54.1%であることが確認された。すなわち緩衝能を十分に発揮できない20mMといった低濃度でもMESはアマドリアーゼ安定化作用を示し、確認されたアマドリアーゼの残存活性は、驚くべきことに本発明の緩衝剤としてMESを濃度100mMにて用いた場合の残存活性（表８、17.6%）を上回った。したがって本発明の安定化剤のアマドリアーゼ安定化作用は、本発明の緩衝剤のアマドリアーゼ安定化作用とは異なる安定化作用であることが分かる。リン酸及びクエン酸についても同様である。また、安定化作用を示したジカルボン酸、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯについても、これらは緩衝剤としても使用可能であることから、同様と考えられる。
【０２４９】
（各安定化剤添加時におけるＰｎＦＸの界面活性剤耐性評価）
Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼ以外のアマドリアーゼとして、例えば、ＰｎＦＸに対し、上記の安定化剤は界面活性剤耐性向上効果があるか検討した。安定化剤は上記と同様のものを用い、安定化剤を添加した際に、ｐＨの変化を防ぐようにするために、緩衝液は３００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用い、上記のように精製したＰｎＦＸをサンプルとし、ＣＴＡＣの終濃度を０．０４％として、上記と同様に、ＰｎＦＸの界面活性剤耐性評価を行った。実際に、安定化剤を添加した際に、ｐＨは実際に７．０を示すことを確認した。結果を表１０に示す。なお加温後のサンプルをＢＳＡ溶液で２倍希釈してから３０分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
【表１０】
2020096596.tif 000028
【０２５０】
表１０に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ７と同様にＰｎＦＸに対しても、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、酢酸、ＭＥＳ、硫酸アンモニウムを添加した際に、界面活性剤耐性向上効果が示された。したがって、リン酸、トリカルボン酸、ジカルボン酸、モノカルボン酸、ＭＥＳ、硫酸アンモニウムには、多種多様なアマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させる安定化剤として有用であるといえる。ＣＦＰ−Ｔ７とＰｎＦＸのアミノ酸配列同一性は７５％であることから、ＣＦＰ−Ｔ７と７５％のアミノ酸配列同一性を有するアマドリアーゼは、上記の効果を有するといえる。
【配列表フリーテキスト】
【０２５１】
配列番号１．  ＣＦＰ−Ｔ７のアミノ酸配列
配列番号２．  ＣＦＰ−Ｔ７の遺伝子配列
配列番号３．  ＣＦＰ−Ｄのアミノ酸配列
配列番号４．  ＣＦＰ−Ｄの遺伝子配列
配列番号５．  Ｎ２６２Ｈ導入プライマーＦｗ
配列番号６．  Ｎ２６２Ｘ導入プライマーＲｖ
配列番号７．  Ｖ２５７Ｃ導入プライマーＦｗ
配列番号８．  Ｖ２５７Ｘ導入プライマーＲｖ
配列番号９．  Ｖ２５７Ｓ導入プライマーＦｗ
配列番号１０．  Ｖ２５７Ｔ導入プライマーＦｗ
配列番号１１．  Ｅ２５３Ｋ導入プライマーＦｗ
配列番号１２．  Ｅ２５３Ｘ導入プライマーＲｖ
配列番号１３．  Ｅ２５３Ｒ導入プライマーＦｗ
配列番号１４．  Ｑ３３７Ｋ導入プライマーＦｗ
配列番号１５．  Ｑ３３７Ｘ導入プライマーＲｖ
配列番号１６．  Ｅ３４０Ｐ導入プライマーＦｗ
配列番号１７．  Ｅ３４０Ｘ導入プライマーＲｖ
配列番号１８．  Ｅ１３３Ａ導入プライマーＦｗ
配列番号１９．  Ｅ１３３Ｘ導入プライマーＲｖ
配列番号２０．  Ｅ１３３Ｍ導入プライマーＦｗ
配列番号２１．  Ｅ１３３Ｋ導入プライマーＦｗ
配列番号２２．  Ｅ４４Ｐ導入プライマーＦｗ
配列番号２３．  Ｅ４４Ｘ導入プライマーＲｖ
配列番号２４．  Ｇ２５６Ｋ導入プライマーＦｗ
配列番号２５．  Ｇ２５６Ｒ導入プライマーＦｗ
配列番号２６．  Ｅ８１Ｋ導入プライマーＦｗ
配列番号２７．  Ｅ８１Ｘ導入プライマーＲｖ
配列番号２８．  Ｆ４３Ｙ／Ｅ４４Ｐ導入プライマーＦｗ
配列番号２９．  Ｖ２５７Ｘ／Ｎ２６２Ｈ導入プライマーＲｖ
配列番号３０．  Ｅ２５３Ｋ／Ｖ２５７Ｃ導入プライマーＦｗ
配列番号３１．  Ｅ２５３Ｘ／Ｖ２５７Ｃ／Ｎ２６２Ｈ導入プライマーＲｖ
配列番号３２．  Ｑ３３７Ｋ／Ｅ３４０Ｐ導入プライマーＦｗ
配列番号３３．  Ｑ３３７Ｘ／Ｅ３４０Ｐ導入プライマーＲｖ
配列番号３４．  Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ
配列番号３５．  Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号３６．  Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号３７．  Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号３８．  Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号３９．  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号４０．  Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号４１．  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号４２．  Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号４３．  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号４４．  Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼの遺伝子
配列番号４５．  Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼの遺伝子
配列番号４６．  Ｄ１２９Ｋ導入プライマーＦｗ
配列番号４７．  Ｄ１２９Ｋ導入プライマーＲｖ
配列番号４８．  Ｄ１３２Ｋ導入プライマーＦｗ
配列番号４９．  Ｅ２３１Ｋ導入プライマーＦｗ
配列番号５０．  Ｅ２３１Ｘ導入プライマーＲｖ
配列番号５１．  Ｄ２３２Ｋ導入プライマーＦｗ
配列番号５２．  Ｅ２４９Ｋ導入プライマーＦｗ
配列番号５３．  Ｅ２４９Ｋ導入プライマーＲｖ
配列番号５４．  Ｅ２４９Ｋ/Ｖ２５７Ｃ導入プライマーＲｖ
配列番号５５．  Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼの遺伝子
配列番号５６．  ＣｃＦＸのＤ１２９Ｋ導入プライマーＦｗ
配列番号５７．  ＣｃＦＸのＤ１２９Ｋ導入プライマーＲｖ
配列番号５８．  ＣｃＦＸのＤ１３２Ｋ導入プライマーＦｗ
配列番号５９．  ＣｃＦＸのＥ１３３Ｋ導入プライマーＦｗ
配列番号６０．  ＣｃＦＸのＥ１３３Ａ導入プライマーＦｗ
配列番号６１．  ＣｃＦＸのＥ１３３Ｘ導入プライマーＲｖ
配列番号６２．  ＣｃＦＸのＥ２２９Ｋ導入プライマーＦｗ
配列番号６３．  ＣｃＦＸのＤ２３０Ｋ導入プライマーＦｗ
配列番号６４．  ＣｃＦＸのＤ２３０Ｘ導入プライマーＲｖ
配列番号６５．  ＣｃＦＸのＥ２４７Ｋ導入プライマーＦｗ
配列番号６６．  ＣｃＦＸのＥ２４７Ｋ導入プライマーＲｖ
配列番号６７．  ＣｃＦＸのＥ２５１Ｋ導入プライマーＦｗ
配列番号６８．  ＣｃＦＸのＥ２５１Ｘ導入プライマーＲｖ
配列番号６９．  ＣｃＦＸのＥ２５１Ｒ導入プライマーＦｗ
配列番号７０．  ＣｃＦＸのＮ２５４Ｋ導入プライマーＦｗ
配列番号７１．  ＣｃＦＸのＮ２５４Ｋ導入プライマーＲｖ
配列番号７２．  ＣｃＦＸのＴ３３５Ｋ導入プライマーＦｗ
配列番号７３．  ＣｃＦＸのＴ３３５Ｘ導入プライマーＲｖ
配列番号７４．  ＣｃＦＸのＴ３３５Ｒ導入プライマーＦｗ
【０２５２】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１−１】
2020096596.tif 000033
【図１−２】
2020096596.tif 000034
【図１−３】
2020096596.tif 000035
【図２】
2020096596.tif 000036
【図３】
2020096596.tif 000037
【図４】
2020096596.tif 000038
【図５】
2020096596.tif 000039
【配列表】
2020096596000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月10日(2020.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上のイオン性界面活性剤、アマドリアーゼ、及び、イオン性界面活性剤存在下でのアマドリアーゼの残存活性を維持する又は残存活性の低下を軽減する安定化剤を含む、糖化ヘモグロビン測定用組成物であって、
前記安定化剤がリン酸、トリカルボン酸、ジカルボン酸、モノカルボン酸、式（IV）の化合物、
【化１】
2020096596.tif 000040
[式中、nは0、1、2または3であってもよく、R10は、それぞれ独立にH、OH、-CH2OHまたは-COOHであってもよい]
硫酸アンモニウム及びこれらの組合せからなる群より選択されるものである、前記組成物。
【請求項２】
トリカルボン酸がクエン酸であるか、または、ジカルボン酸がフマル酸、グルタル酸、シトラコン酸、メサコン酸、マロン酸、酒石酸、コハク酸、アジピン酸、マレイン酸、リンゴ酸及びこれらの組合せからなる群より選択されるものであるか、モノカルボン酸が酢酸であるか、または、式（IV）の化合物がＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ及びこれらの組合せからなる群より選択されるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記安定化剤が、測定溶液における終濃度が2mM以上となるリン酸、測定溶液における終濃度が0.2mM以上となるクエン酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となるリンゴ酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となるマレイン酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となるシトラコン酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となるマロン酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となるグルタル酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となる酒石酸、測定溶液における終濃度が10mM以上となる酢酸、測定溶液における終濃度が10mM以上となるＭＥＳ（2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸）、測定溶液における終濃度が10mM以上となるＭＯＰＳ（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸）、測定溶液における終濃度が10mM以上となるＭＯＰＳＯ（2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸）、測定溶液における終濃度が2mM以上となる硫酸アンモニウム、及びこれらの組合せからなる群より選択される１以上の安定化剤である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
１以上のイオン性界面活性剤、アマドリアーゼ、及び、イオン性界面活性剤存在下でのアマドリアーゼの残存活性を維持する又は残存活性の低下を軽減する緩衝剤を含む、糖化ヘモグロビン測定用組成物であって、
前記緩衝剤がホウ酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、フマル酸緩衝剤、グルタル酸緩衝剤、シトラコン酸緩衝剤、メサコン酸緩衝剤、マロン酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、アジピン酸緩衝剤、ＡＣＥＳ（N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸）緩衝剤、ＢＥＳ（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸）緩衝剤、Ｂｉｃｉｎ（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン）緩衝剤、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン）緩衝剤、ＥＰＰＳ（4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＨＥＰＰＳＯ（N-(ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＭＥＳ（2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸）緩衝剤、ＭＯＰＳ（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸）緩衝剤、ＭＯＰＳＯ（2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)）緩衝剤、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)）緩衝剤、ＴＡＰＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＴＡＰＳＯ（3-[N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＴＥＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸）緩衝剤、トリシン（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン）緩衝剤及びこれらの組合せからなる群より選択される１以上の緩衝剤を含む、前記組成物。
【請求項５】
測定溶液における終濃度が100mM以上となるリン酸緩衝剤、測定溶液における終濃度が10mM以上となるクエン酸緩衝剤、測定溶液における終濃度が150mM以上となるＭＥＳ（2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸）緩衝剤、測定溶液における終濃度が100mM以上となるＭＯＰＳ（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸）緩衝剤、測定溶液における終濃度が100mM以上となるＭＯＰＳＯ（2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤、及び測定溶液における終濃度が200mM以上となるＡＣＥＳ（N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸）緩衝剤からなる群より選択される１以上の緩衝剤を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の緩衝剤、及び、請求項１、２又は３に記載の安定化剤を含む糖化ヘモグロビン測定用組成物。