(57)【要約】      （修正有）【課題】ＲＳＶに特異的に結合することができる抗体およびその機能的等価物、ならびにこれらを製造するための手段および方法を提供する。【解決手段】呼吸器合胞体ウイルスに特異的に結合することができ、ａ．配列ＮＹＩＩＮまたは配列ＤＹＩＩＮを含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、ｂ．配列ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧまたは配列ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧを含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、ｃ．配列ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮまたは配列ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮを含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列と、ｄ．配列ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮと少なくとも８５％同一である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、ｅ．配列ＶＡＳＮＬＥＴを含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、ｆ．配列ＱＱＹＤＮＬＰを含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列とを含んでよい合成抗体もしくは組み換え抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器合胞体ウイルスに特異的に結合することができ、
ａ．配列ＮＹＩＩＮ（配列番号１）または配列ＤＹＩＩＮ（配列番号９）と少なくとも７０％同一である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、
ｂ．配列ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）または配列ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）と少なくとも７５％同一である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、
ｃ．配列ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）または配列ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）と少なくとも７０％同一である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列と、
ｄ．配列ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）と少なくとも８５％同一である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、
ｅ．配列ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）と少なくとも７０％同一である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、
ｆ．配列ＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）と少なくとも７０％同一である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列と
を含む合成抗体もしくは組み換え抗体またはこれらの機能的部分であって、
前記重鎖中の少なくとも１個のアミノ酸が配列番号７と異なり、前記少なくとも１個のアミノ酸が
2020103293.tif 000028
から選択される、合成抗体もしくは組み換え抗体またはその機能的部分。
【請求項２】
ａ．重鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、ＮＹＩＩＮ（配列番号１）もしくはＤＹＩＩＮ（配列番号９）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む、
ｂ．重鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）もしくはＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）と１個もしくは２個のアミノ酸が異なる配列を含む、
ｃ．重鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）もしくはＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）と１個もしくは２個のアミノ酸が異なる配列を含む、
ｄ．軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む、
ｅ．軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む、および／または
ｆ．軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、ＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む、
請求項１に記載の抗体または機能的部分。
【請求項３】
ａ．重鎖可変領域ＣＤＲ１配列がＮＹＩＩＮ（配列番号１）またはＤＹＩＩＮ（配列番号９）を含む、
ｂ．重鎖可変領域ＣＤＲ２配列がＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）またはＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）を含む、
ｃ．重鎖可変領域ＣＤＲ３配列がＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）またはＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）を含む、
ｄ．軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列がＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）を含む、
ｅ．軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列がＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）を含む、および
ｆ．軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列がＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）を含む、
請求項１に記載の抗体または機能的部分。
【請求項４】
前記重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる、
2020103293.tif 000029
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項５】
前記重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる、
2020103293.tif 000030
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項６】
前記重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる、
2020103293.tif 000031
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項７】
前記重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる、
2020103293.tif 000032
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項８】
前記重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる、
2020103293.tif 000033
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項９】
前記重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる、
2020103293.tif 000034
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項１０】
前記重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる、
2020103293.tif 000035
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項１１】
前記重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる、
2020103293.tif 000036
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項１２】
前記重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる、
2020103293.tif 000037
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項１３】
前記重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる、
2020103293.tif 000038
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項１４】
前記重鎖可変領域が配列番号７または配列番号１３と少なくとも９０％同一であり、前記軽鎖可変領域が配列番号８と少なくとも９０％同一である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項１５】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、ＮＹＩＩＮ（配列番号１）またはＤＹＩＩＮ（配列番号９）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む、請求項１、請求項２または請求項４〜１４のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項１６】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）またはＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）と１個または２個のアミノ酸が異なる配列を含む、請求項１、請求項２または請求項４〜１５のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項１７】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）またはＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）と１個または２個のアミノ酸が異なる配列を含む、請求項１、請求項２または請求項４〜１６のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項１８】
前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む、請求項１、請求項２または請求項４〜１７のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項１９】
前記軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む、請求項１、請求項２または請求項４〜１８のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項２０】
前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３が、ＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む、請求項１、請求項２または請求項４〜１９のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項２１】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ１配列がＮＹＩＩＮ（配列番号１）またはＤＹＩＩＮ（配列番号９）を含む、請求項１、請求項２または請求項４〜１４または請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項２２】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２配列がＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）またはＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）を含む、請求項１、請求項２、請求項４〜１５または請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項２３】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ３配列がＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）またはＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）を含む、請求項１、請求項２、請求項４〜１６または請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項２４】
前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列がＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）を含む、請求項１、請求項２、請求項４〜１７または請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項２５】
前記軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列がＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）を含む、請求項１、請求項２、請求項４〜１８または請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項２６】
前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３がＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）を含む、請求項１、請求項２、請求項４〜１９または請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項２７】
前記重鎖可変領域が、配列番号７および配列番号１２〜２１から選択される配列とフレームワーク領域において９５％同一である配列を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項２８】
前記重鎖可変領域が、配列番号１２〜２１から選択される配列とフレームワーク領域において同一である配列を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項２９】
前記重鎖可変領域が、配列番号１２〜２１から選択される配列と少なくとも７０％同一である配列を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項３０】
配列番号８と少なくとも７０％同一である配列を含む軽鎖可変領域配列を有する請求項１〜２９のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項３１】
配列番号８と同一である配列を含む軽鎖配列可変領域を有する請求項１〜２９のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項３２】
ＲＳＶ  Ｆ抗原に特異的に結合することができ、
ａ．アミノ酸配列ＤＹＩＩＮ（配列番号９）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、
ｂ．アミノ酸配列ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、
ｃ．アミノ酸配列ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列と、
ｄ．アミノ酸配列ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、
ｅ．アミノ酸配列ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、  ｆ．アミノ酸配列ＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３と
を含む合成抗体もしくは組み換え抗体またはこれらの機能的部分。
【請求項３３】
ＲＳＶ  Ｆ抗原に特異的に結合することができ、
ａ．アミノ酸配列ＤＹＩＩＮ（配列番号９）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、
ｂ．アミノ酸配列ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、
ｃ．アミノ酸配列ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列と、
ｄ．アミノ酸配列ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、
ｅ．アミノ酸配列ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、  ｆ．アミノ酸配列ＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３と
を含む合成抗体もしくは組み換え抗体またはこれらの機能的部分。
【請求項３４】
前記抗体または機能的部分が完全ヒト、ヒト化抗体またはキメラである、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項３５】
前記機能的部分が、一本鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ'）2断片である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の機能的部分。
【請求項３６】
前記抗体または機能的部分は、ＲＳＶ  Ａ２の中和アッセイにおいてＩＣ５０が５．０ｎｇ／ｍｌ以下である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項３７】
前記抗体または機能的部分は、ＲＳＶ  Ｂ９３２０の中和アッセイにおいてＩＣ５０が３．０ｎｇ／ｍｌ以下である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項３８】
前記抗体または機能的部分が、２５２Ｙ位でＹを有し、２５４Ｔ位でＴを有し、２５６位でＥを有するＦｃ領域を有し、この番号付けはＫａｂａｔでのＥＵインデックスに対応する、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。
【請求項３９】
対象のＲＳＶ感染を抑制する方法であって、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項４０】
前記対象がヒト患者である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記対象が、早産であったヒト患者である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分をコードする合成核酸配列、組み換え核酸配列または単離核酸配列。
【請求項４３】
対象のＲＳＶ感染を抑制する方法であって、請求項４２に記載の核酸を対象に投与することを含む方法。
【請求項４４】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分を産生することができる、単離されている抗体産生細胞。
【請求項４５】
少なくとも９週にわたり安定である請求項４４に記載の抗体産生細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
継続出願データ
本出願は、２０１４年１月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／９２７，８１９号明細書の利益を主張し、その明細書は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本出願は生物工学および医学の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
呼吸器合胞体ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）は、パラミクソウイルス科に属する一般的な風邪ウイルスである。ＲＳＶは伝染性が強く、容易に感染し、２歳未満の子供における下気道疾患の最も一般的な原因である。デイケアに通院している子供の最大９８％が１度のＲＳＶシーズン中に感染するだろう。ＲＳＶに感染している子供の０．５％と３．２％との間が入院を必要とする。米国では、年間約９０，０００例の入院および４，５００例の死亡が報告された。ＲＳＶを原因とする入院の主な危険因子は、早産、慢性肺疾患、先天性心疾患、免疫力の低下（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）およびその他の点では健康な子供での６週未満の年齢である。ＲＳＶ陽性細気管支炎には、十分な栄養および酸素療法という形での支持療法に加えて更なる処置が必要とされている。ＲＳＶ感染ではリバビリン等の抗ウイルス療法が有効であることは証明されていない。ＲＳＶ感染の予防用に、一モノクローナル抗体であるパリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）とも呼ばれる）が登録されている。パリビズマブは、ＲＳＶの融合タンパク質に対する遺伝子操作（ヒト化）モノクローナル抗体である。パリビズマブは非常に有効な予防薬ではあるが、代替の抗体および療法がＲＳＶに対する更なる適用範囲を提供することが有利であるだろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＲＳＶ感染を和らげるためのおよび／または予防するための手段および方法を提供することが目的である。ＲＳＶに対する代替のおよび／もしくは改良型の抗体またはそのような抗体の機能的等価物を提供すること、ならびにＲＳＶに対する抗体またはその機能的等価物を産生することができる安定した細胞を提供することが更なる目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書に従って、呼吸器合胞体ウイルスに特異的に結合することができる合成抗体、組み換え抗体もしくは単離抗体またはこれらの機能的部分は、
ａ．配列ＮＹＩＩＮ（配列番号１）または配列ＤＹＩＩＮ（配列番号９）と少なくとも７０％同一である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、
ｂ．配列ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）または配列ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）と少なくとも７５％同一である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、
ｃ．配列ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）または配列ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）と少なくとも７０％同一である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列と、
ｄ．配列ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）と少なくとも８５％同一である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、
ｅ．配列ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）と少なくとも７０％同一である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、
ｆ．配列ＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）と少なくとも７０％同一である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列と
を含み、
重鎖中の少なくとも１個のアミノ酸が配列番号７と異なり、前記少なくとも１個のアミノ酸が下記から選択される。
【０００６】
2020103293.tif 000002
【０００７】
別の実施形態では、本抗体または本機能的部分は、
ａ．重鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、ＮＹＩＩＮ（配列番号１）もしくはＤＹＩＩＮ（配列番号９）と１個のアミノ酸が異なる配列を含むこと、
ｂ．重鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）もしくはＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）と１個もしくは２個のアミノ酸が異なる配列を含むこと、
ｃ．重鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）もしくはＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）と１個もしくは２個のアミノ酸が異なる配列を含むこと、
ｄ．軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）と１個のアミノ酸が異なる配列を含むこと、
ｅ．軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）と１個のアミノ酸が異なる配列を含むこと、および／または
ｆ．軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、ＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）と１個のアミノ酸が異なる配列を含むこと
を含む。
【０００８】
別の実施形態では、本抗体または本機能的部分は、
ａ．重鎖可変領域ＣＤＲ１配列がＮＹＩＩＮ（配列番号１）またはＤＹＩＩＮ（配列番号９）を含むこと、
ｂ．重鎖可変領域ＣＤＲ２配列がＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）またはＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）を含むこと、
ｃ．重鎖可変領域ＣＤＲ３配列がＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）またはＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）を含むこと、
ｄ．軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列がＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）を含むこと、  ｅ．軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列がＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）を含むこと、および
ｆ．軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列がＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）を含むこと
を含む。
【０００９】
更なる実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号７と異なる重鎖可変領域中の下記のアミノ酸を少なくとも含む。
【００１０】
2020103293.tif 000003
【００１１】
追加の実施形態では、重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる。
【００１２】
2020103293.tif 000004
【００１３】
更なる実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号７と異なる重鎖可変領域中の下記のアミノ酸を少なくとも含む。
【００１４】
2020103293.tif 000005
【００１５】
追加の実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号７と異なる重鎖可変領域中の下記のアミノ酸を少なくとも含む。
【００１６】
2020103293.tif 000006
【００１７】
更なる実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号７と異なる重鎖可変領域中の下記のアミノ酸を少なくとも含む。
【００１８】
2020103293.tif 000007
【００１９】
追加の実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号７と異なる重鎖可変領域中の下記のアミノ酸を含む。
【００２０】
2020103293.tif 000008
【００２１】
追加の実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号７と異なる重鎖可変領域中の下記のアミノ酸を少なくとも含む。
【００２２】
2020103293.tif 000009
【００２３】
追加の実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号７と異なる重鎖可変領域中の下記のアミノ酸を少なくとも含む。
【００２４】
2020103293.tif 000010
【００２５】
更なる実施施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号７と異なる重鎖可変領域中の下記のアミノ酸を少なくとも含む。
【００２６】
2020103293.tif 000011
【００２７】
追加の実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号７と異なる重鎖可変領域中の下記のアミノ酸を少なくとも含む。
【００２８】
2020103293.tif 000012
【００２９】
更なる実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、ＮＹＩＩＮ（配列番号１）もしくはＤＹＩＩＮ（配列番号９）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）もしくはＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）と１個もしくは２個のアミノ酸が異なる配列を含む、および／または重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）もしくはＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）と１個もしくは２個のアミノ酸が異なる配列を含む。
【００３０】
更なる実施形態では、軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む、および／または軽鎖可変領域ＣＤＲ３は、ＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む。
【００３１】
更なる実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ１配列はＮＹＩＩＮ（配列番号１）もしくはＤＹＩＩＮ（配列番号９）を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列はＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）もしくはＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）を含む、および／または重鎖可変領域ＣＤＲ３配列はＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）もしくはＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）を含む。
【００３２】
追加の実施形態では、軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列はＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列はＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）を含む、および／または軽鎖可変領域ＣＤＲ３はＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）を含む。
【００３３】
一実施形態では、ＲＳＶ  Ｆ抗原に特異的に結合することができる合成抗体、組み換え抗体もしくは単離抗体またはこれらの機能的部分は、
ａ．アミノ酸配列ＤＹＩＩＮ（配列番号９）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、
ｂ．アミノ酸配列ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、
ｃ．アミノ酸配列ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列と、
ｄ．アミノ酸配列ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、
ｅ．アミノ酸配列ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、  ｆ．アミノ酸配列ＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３と
を含む。
【００３４】
別の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆ抗原に特異的に結合することができる合成抗体、組み換え抗体もしくは単離抗体またはこれらの機能的部分は、
ａ．アミノ酸配列ＤＹＩＩＮ（配列番号９）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、
ｂ．アミノ酸配列ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、
ｃ．アミノ酸配列ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列と、
ｄ．アミノ酸配列ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、
ｅ．アミノ酸配列ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、  ｆ．アミノ酸配列ＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３と
を含む。
【００３５】
更なる実施形態では、本抗体または本機能的部分は、２５２Ｙ位でＹを有し、２５４Ｔ位でＴを有し、２５６位でＥを有するＦｃ領域を有し、この番号付けはＫａｂａｔでのＥＵインデックスに対応する。
【００３６】
更なる実施形態では、対象のＲＳＶ感染を抑制する方法であって、本明細書に記載した抗体または機能的部分を対象に投与することを含む方法。
【００３７】
更なる実施形態では、合成核酸配列、組み換え核酸配列または単離核酸配列は、本明細書に記載した抗体または機能的部分をコードする。
【００３８】
追加の目的および利点が、下記に続く説明にある程度は記載されるだろう、この説明からある程度は自明であるだろう、または実践により習得される場合がある。この目的および利点は、添付した特許請求の範囲で具体的に指摘した構成要素および組み合わせにより実現され得る、および達成され得る。
【００３９】
上述の概要および下記の詳細な説明は両方とも単に例示および説明のためであり特許請求の範囲を限定するものではないことを理解しなければならない。
【００４０】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付図面は、一実施形態またはいくつかの実施形態を説明し、本明細書と共に、本明細書に記載した原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】Ｄ２５重鎖ならびにいくつかの重鎖バリアント（変異体）（Ｊ、ＬおよびＬＡ）の配列を表す図である。
【図１Ｂ】Ｄ２５重鎖ならびにいくつかの重鎖バリアント（変異体）（Ｊ、ＬおよびＬＡ）の配列を表す図である。
【図２】いくつかの最適化されたバリアント（多様体）（１Ｇ７、１Ｆ５、２Ｄ１０）の重鎖の配列を表す図である。
【図３Ａ】最適化されたバリアント１Ｇ７の４種の更なるバリアントの重鎖の配列を表す図である。これらのバリアント（１Ｇ７−ＧＬＭ、Ｂ１２−１、Ｅ３−５およびＥ９−２）を、生殖細胞系残基を組み込むことによりｐＩを変更するように作成した。
【図３Ｂ】最適化されたバリアント１Ｇ７の４種の更なるバリアントの重鎖の配列を表す図である。これらのバリアント（１Ｇ７−ＧＬＭ、Ｂ１２−１、Ｅ３−５およびＥ９−２）を、生殖細胞系残基を組み込むことによりｐＩを変更するように作成した。
【図４】マイクロ中和アッセイにおけるＤ２５およびいくつかのバリアントのインビトロでの活性を示すグラフである。
【図５】Ｄ２５およびいくつかのバリアントがＲＳＶ  Ａ２サブタイプおよびＲＳＶ  Ｂサブタイプのチャレンジに対する防御を付与することを示すグラフである。
【図６】１Ｇ７で処理した動物、１Ｆ５で処理した動物、Ｄ２５で処理した動物（図中においてＤ２５ｗｔと命名する）または抗体で処理しなかった動物における、コットンラットＲＳＶ  Ａ２チャレンジの結果を示すグラフである。
【図７】１Ｇ７がＲＳＶ  Ａ２およびＲＳＶ  Ｂ９３２０の両方に対して防御することを示すグラフである。ＲＳＶの肺力価を摘出時でのヒトＩｇＧの血清濃度の関数としてプロットする。
【図８】様々な抗体によるＲＳＶ  Ａ２およびＲＳＶ  Ｂ９３２０の両方の中和を示すグラフである。
【図９】モノクローナル抗体耐性変異体により定義される、１Ｇ７の結合用エピトープを示す図である。
【図１０】ＲＳＶの臨床単離株に対する中和アッセイの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
配列の説明
下記の表１には、本実施形態で参照するいくつかの配列のリストが記載されている。
【００４３】
【表１】
2020103293.tif 000013
【００４４】
2020103293.tif 000014
【００４５】
実施形態の説明
Ｉ．抗体またはその機能的部分
その他の抗体と比較して特性が改良されている改良型ＲＳＶ特異的抗体またはその機能的部分が提供される。抗体または機能的部分、例えば抗体もしくは抗原結合断片、バリアントまたはこれらの誘導体として、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬドメインもしくはＶＨドメインを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリにより生成された断片が挙げられるがこれらに限定されない。ＳｃＦｖ分子は当分野で既知であり、例えば米国特許第５，８９２，０１９号明細書に記載されている。本開示に包含される免疫グロブリン分子または抗体分子は、あらゆるタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）の、あらゆるクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のまたはあらゆるサブクラスの免疫グロブリン分子であることができる。
【００４６】
例えば、本発明者らは、ＲＳＶ  ＡサブタイプおよびＲＳＶ  Ｂサブタイプに対する改良された防御、改良された中和およびより低いＩＣ５０値等の、これまでのＲＳＶ特異的抗体と比較して改良された特性を有するＲＳＶ特異的抗体の生成に成功している。そのような抗体はＲＳＶに対する特に高いまたは強い親和性を有しており、従って、ＲＳＶ感染および／またはＲＳＶ感染の悪影響を和らげるおよび／または少なくともある程度は予防するのに特に好適である。抗体およびその機能的部分はＲＳＶ特異的結合分子と同義であり、該抗体およびその機能的部分として、ＲＳＶに特異的に結合することができるあらゆる完全長抗体または抗体部分が挙げられる。
【００４７】
Ａ．非生殖細胞系残基が生殖細胞系残基に変更されている抗体または機能的部分
一実施形態では、Ｄ２５（配列番号７）の重鎖可変領域の少なくとも１個の非生殖細胞系残基が生殖細胞系残基に変更されている。別の実施形態では、Ｄ２５残基の重鎖可変領域の少なくとも２個の、３個の、４個の、５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個のまたは１２個の非生殖細胞系残基が生殖細胞系残基に再び交換されている。更なる実施形態では、少なくとも１個の非生殖細胞系残基を生殖細胞系残基に変更することができ、配列番号７と比べてＣＤＲの少なくとも１箇所を改変することができる。
【００４８】
一実施形態は、呼吸器合胞体ウイルスに特異的に結合することができ、
ａ）配列ＮＹＩＩＮ（配列番号１）または配列ＤＹＩＩＮ（配列番号９）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９４％同一である配列を含む重鎖ＣＤＲ１配列と、
ｂ）配列ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）または配列ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９４％同一である配列を含む重鎖ＣＤＲ２配列と、
ｃ）配列ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）または配列ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９４％同一である配列を含む重鎖ＣＤＲ３配列と、
ｄ）配列ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９４％同一である配列を含む軽鎖ＣＤＲ１配列と、
ｅ）配列ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９４％同一である配列を含む軽鎖ＣＤＲ２配列と、
ｆ）配列ＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９４％同一である配列を含む軽鎖ＣＤＲ３配列と
を含む単離抗体、合成抗体もしくは組み換え抗体またはこれらの機能的部分であって、
重鎖中の少なくとも１個のアミノ酸が配列番号７と異なり、前記少なくとも１個のアミノ酸が下記から選択される、単離抗体、合成抗体もしくは組み換え抗体またはこれらの機能的部分を含む。
【００４９】
【表２】
2020103293.tif 000015
【００５０】
「重鎖可変領域中の少なくとも１個のアミノ酸が配列番号７と異なる」とは、本抗体または本機能的部分は配列番号７との少なくとも１個のアミノ酸の相違を含まなければならないが、いくつかの実施形態では、本抗体または本機能的部分は配列番号７との複数個の相違を含むことができることを意味する。いくつかの実施形態では、本抗体または本機能的部分は、表２で概説した置換、表２に列挙した位置での欠失もしくは代替アミノ酸、または表２に列挙していない位置での相違（欠失、置換もしくは付加等）を含む。表２における位置番号は配列番号７に対して相対的に記載されており、この位置番号は、目的の抗体または機能的部分におけるアミノ酸の連続的な番号付けに基づく位置番号とは最終的には同じではない場合がある。その代わりに、位置番号は、配列番号７との配列比較に基づいて割り当てられている。
【００５１】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は重鎖および／または軽鎖を含み、重鎖可変領域は配列番号７または配列番号１５と少なくとも９０％同一であり、軽鎖可変領域は配列番号８と少なくとも９０％同一である。別の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号７または配列番号１５と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。別の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号８と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【００５２】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、重鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、ＮＹＩＩＮ（配列番号１）またはＤＹＩＩＮ（配列番号９）と１個のアミノ酸が異なる配列を含むことを含む。
【００５３】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）またはＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）と１個または２個のアミノ酸が異なる配列を含むことを含む。
【００５４】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）またはＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）と１個または２個のアミノ酸が異なる配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列を含む。
【００５５】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列を含む。
【００５６】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列を含む。
【００５７】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、軽鎖可変領域ＣＤＲ３がＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）と１個のアミノ酸が異なる配列を含むことを含む。
【００５８】
更なる実施形態では、本抗体または本機能的部分は、ＮＹＩＩＮ（配列番号１）もしくはＤＹＩＩＮ（配列番号９）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列、ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）もしくはＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）と１個もしくは２個のアミノ酸が異なる配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列、ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）もしくはＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）と１個もしくは２個のアミノ酸が異なる配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列、ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列、ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列、および／またはＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本抗体または本機能的部分は、少なくとも１個のまたは最大で全てのＣＤＲが配列番号７（重鎖）および／または配列番号８（軽鎖）と同一である。
【００６０】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、ＮＹＩＩＮ（配列番号１）またはＤＹＩＩＮ（配列番号９）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列を含む。
【００６１】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）またはＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列を含む。
【００６２】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）またはＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列を含む。
【００６３】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、ＮＹＩＩＮ（配列番号１）もしくはＤＹＩＩＮ（配列番号９）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列、ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）もしくはＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列、および／またはＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）もしくはＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列を含む。
【００６４】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列がＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）を含むことを含む。
【００６５】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列がＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）を含むことを含む。
【００６６】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、軽鎖可変領域ＣＤＲ３がＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）を含むことを含む。
【００６７】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列がＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）を含むこと、軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列がＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）を含むこと、および／または軽鎖可変領域ＣＤＲ３がＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）を含むことを含む。
【００６８】
更なる実施形態では、本抗体または本機能的部分は、ＮＹＩＩＮ（配列番号１）もしくはＤＹＩＩＮ（配列番号９）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列、ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）もしくはＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列、ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）もしくはＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列、ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列、ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列、および／またはＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列を含む。
【００６９】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号１２〜２１から選択される配列とフレームワーク領域において９５％同一である配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００７０】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号１２〜２１から選択される配列とフレームワーク領域において同一である配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００７１】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号７と異なる重鎖可変領域中の下記のアミノ酸を少なくとも含む。
【００７２】
【表３】
2020103293.tif 000016
【００７３】
別の実施形態では、表３に記載した相違は配列番号７との唯一の相違である。一実施形態では、表３に記載した相違は配列番号７との唯一の相違ではない。別の実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号８を含む。
【００７４】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号７と異なる重鎖可変領域中の下記のアミノ酸を少なくとも含む。
【００７５】
【表４】
2020103293.tif 000017
【００７６】
別の実施形態では、表４に記載した相違は配列番号７との唯一の相違である。一実施形態では、表４に記載した相違は配列番号７との唯一の相違ではない。別の実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号８を含む。
【００７７】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号７と異なる重鎖可変領域中の下記のアミノ酸を少なくとも含む。
【００７８】
【表５】
2020103293.tif 000018
【００７９】
別の実施形態では、表５に記載した相違は配列番号７との唯一の相違である。一実施形態では、表５に記載した相違は配列番号７との唯一の相違ではない。別の実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号８を含む。
【００８０】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号７と異なる重鎖可変領域中の下記のアミノ酸を少なくとも含む。
【００８１】
【表６】
2020103293.tif 000019
【００８２】
別の実施形態では、表６に記載した相違は配列番号７との唯一の相違である。一実施形態では、表６に記載した相違は配列番号７との唯一の相違ではない。別の実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号８を含む。
【００８３】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号７と異なる重鎖可変領域中の下記のアミノ酸を少なくとも含む。
【００８４】
【表７】
2020103293.tif 000020
【００８５】
別の実施形態では、表７に記載した相違は配列番号７との唯一の相違である。一実施形態では、表７に記載した相違は配列番号７との唯一の相違ではない。別の実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号８を含む。
【００８６】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号７と異なる重鎖可変領域中の下記のアミノ酸を少なくとも含む。
【００８７】
【表８】
2020103293.tif 000021
【００８８】
別の実施形態では、表８に記載した相違は配列番号７との唯一の相違である。一実施形態では、表８に記載した相違は配列番号７との唯一の相違ではない。別の実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号８を含む。
【００８９】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号７と異なる重鎖可変領域中の下記のアミノ酸を少なくとも含む。
【００９０】
【表９】
2020103293.tif 000022
【００９１】
別の実施形態では、表９に記載した相違は配列番号７との唯一の相違である。一実施形態では、表９に記載した相違は配列番号７との唯一の相違ではない。別の実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号８を含む。
【００９２】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号７と異なる重鎖可変領域中の下記のアミノ酸を少なくとも含む。
【００９３】
【表１０】
2020103293.tif 000023
【００９４】
別の実施形態では、表１０に記載した相違は配列番号７との唯一の相違である。一実施形態では、表１０に記載した相違は配列番号７との唯一の相違ではない。別の実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号８を含む。
【００９５】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号７と異なる重鎖可変領域中の下記のアミノ酸を少なくとも含む。
【００９６】
【表１１】
2020103293.tif 000024
【００９７】
別の実施形態では、表１１に記載した相違は配列番号７との唯一の相違である。一実施形態では、表１１に記載した相違は配列番号７との唯一の相違ではない。別の実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号８を含む。
【００９８】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号７と異なる重鎖可変領域中の下記のアミノ酸を少なくとも含む。
【００９９】
【表１２】
2020103293.tif 000025
【０１００】
別の実施形態では、表１２に記載した相違は配列番号７との唯一の相違である。一実施形態では、表１２に記載した相違は配列番号７との唯一の相違ではない。別の実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号８を含む。
【０１０１】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む重鎖可変領域配列を含む。別の実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１のフレームワーク（即ち非ＣＤＲ）配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む重鎖配列可変領域を含む。
【０１０２】
別の実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＡＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＶＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ（配列番号８）と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む軽鎖可変領域配列を含む。
【０１０３】
別の実施形態では保存的アミノ酸置換が適用される。保存的アミノ酸置換として、全体の機能が深刻な影響を受けそうにないような１個のアミノ酸の、概して特性（大きさ、疎水性等）が類似している別のものへの置換が挙げられる。
【０１０４】
Ｂ．ＣＤＲが改良されている抗体または機能的部分
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、配列番号７中に存在するＣＤＲと比べて少なくとも１個のＣＤＲ変異を含むことができる。一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、表１３中の変更の内の少なくとも１個を含むことができる。別の実施形態では、本抗体または本機能的部分は、表１３中の変更の内の１個、２個または３個全てを含むことができる。
【０１０５】
【表１３】
2020103293.tif 000026
【０１０６】
別の実施形態は、ＲＳＶ  Ｆ抗原に特異的に結合することができ、アミノ酸配列ＤＹＩＩＮ（配列番号９）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、アミノ酸配列ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、アミノ酸配列ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列と、アミノ酸配列ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、アミノ酸配列ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、アミノ酸配列ＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む単離抗体、合成抗体もしくは組み換え抗体またはこれらの機能的部分を含む。
【０１０７】
別の実施形態は、ＲＳＶ  Ｆ抗原に特異的に結合することができ、アミノ酸配列ＮＹＩＩＮ（配列番号１）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、アミノ酸配列ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、アミノ酸配列ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列と、アミノ酸配列ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、アミノ酸配列ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、アミノ酸配列ＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む単離抗体、合成抗体もしくは組み換え抗体またはこれらの機能的部分を含む。
【０１０８】
別の実施形態は、ＲＳＶ  Ｆ抗原に特異的に結合することができ、アミノ酸配列ＮＹＩＩＮ（配列番号１）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、アミノ酸配列ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、アミノ酸配列ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列と、アミノ酸配列ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、アミノ酸配列ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、アミノ酸配列ＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３とを含む単離抗体、合成抗体もしくは組み換え抗体またはこれらの機能的部分を含む。
【０１０９】
別の実施形態では、単離抗体、合成抗体もしくは組み換え抗体またはこれらの機能的部分は、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖とを含み、少なくとも１個の、２個のまたは３個全ての重鎖ＣＤＲは表１４中の列Ａから選択され、残りの重鎖ＣＤＲ（存在する場合）は列Ｂから選択され、軽鎖ＣＤＲは列Ｃを含む。そのため、一実施形態では、軽鎖ＣＤＲは表１４の列Ｃに記載されており、重鎖がＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を１個ずつ有する限りにおいて列Ａおよび列Ｂから重鎖ＣＤＲを混ぜて組み合わせることができる。
【０１１０】
【表１４】
2020103293.tif 000027
【０１１１】
様々な代替ＣＤＲの実施形態が、第Ｉ．Ａ節において上記で論じた非生殖細胞系から生殖細胞系への変異をいずれも必ずしも含まないが、これらの変異のいずれかまたは全てが任意選択的に存在することができる。
【０１１２】
一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、表１４からの代替重鎖ＣＤＲの内の少なくとも１個を含むことができ、少なくとも１個のその他のＣＤＲ改変を有することができる。具体的には、更に別の実施形態において、本抗体または本機能的部分は、ＮＹＩＩＮ（配列番号１）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列が、ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）と１個もしくは２個のアミノ酸が異なる配列を含むこと、重鎖ＣＤＲ３配列が、ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）と１個もしくは２個のアミノ酸が異なる配列を含むこと、軽鎖ＣＤＲ１配列が、ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）と１個のアミノ酸が異なる配列を含むこと、軽鎖ＣＤＲ２配列が、ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）と１個のアミノ酸が異なる配列を含むこと、および／または軽鎖ＣＤＲ３配列が、ＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）と１個のアミノ酸が異なる配列を含むことを含み、少なくとも１個の重鎖ＣＤＲ１がＤＹＩＩＮ配列番号９）である、重鎖ＣＤＲ２がＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）である、または重鎖ＣＤＲ３がＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）である。
【０１１３】
Ｃ．半減期が改良されている抗体または機能的部分
一実施形態では、本明細書に記載した抗体または機能的部分に更なる改変を行って、該抗体または機能的部分の半減期を改良することができる。一実施形態では、該抗体または本機能的部分に、欠失変異、付加変異または置換変異等の変異を行って、該抗体または本機能的部分の半減期を改良することができる。一実施形態では、Ｆｃ領域を変異させて下記の置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅの内の１個、２個または３個全てを含ませることができ、この番号付けはＫａｂａｔでのＥＵインデックスに対応する。一実施形態では、Ｆｃ領域を変異させて下記の置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅの全てを含ませることができ、この番号付けはＫａｂａｔでのＥＵインデックスに対応する。Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１ｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦｃＲｎ），Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１（３３）：２３５１４−２３５２４（２００６）。３個全ての置換を有する実施形態をＹＴＥバリアントと表す。別に表すと、一実施形態では、本抗体または本機能的部分は、２５２Ｙ位でＹを有し、２５４Ｔ位でＴを有し、２５６位でＥを有するＦｃ領域を有し、この番号付けはＫａｂａｔでのＥＵインデックスに対応する。
【０１１４】
Ｄ．抗体およびその機能的部分のその他の特性
ある実施形態では、本抗体または本機能的部分は、Ｈｅｐ−２細胞がＲＳＶと本抗体または本機能的部分とに感染するインビトロでの中和アッセイにおいてＩＣ５０値が１０ｎｇ／ｍｌ未満である。別の実施形態では、このＩＣ５０は、ＲＳＶサブタイプＡおよび／またはＲＳＶサブタイプＢの場合に９ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌもしくは２ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満である。一実施形態では、このＩＣ５０を、実施例で記載したインビトロでの中和アッセイで測定し、任意選択的にＲＳＶ  Ａ２および／またはＲＳＶ  Ｂ９３２０の場合の実施例で記載したインビトロでの中和アッセイで測定する。
【０１１５】
一実施形態では、本抗体およびその機能的部分は、ＲＳＶサブタイプＡ株を中和するのに効果的である。一実施形態では、本抗体およびその機能的部分は、ＲＳＶサブタイプＢ株を中和するのに効果的である。別の実施形態では、本抗体およびその機能的部分は、ＲＳＶサブタイプＡ株およびＲＳＶサブタイプＢ株の両方を中和するのに効果的である。
【０１１６】
本明細書で使用する場合、用語抗体またはその機能的部分は最も広い意義で使用される。用語抗体またはその機能的部分は、従来のハイブリドーマ技術、組み換え技術により生成されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）等の人工物および／またはその機能的断片であることができる。用語抗体またはその機能的部分には、インタクトな免疫グロブリン分子、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、単一特異性抗体（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、動物抗体（例えばラクダ抗体）、キメラ抗体と、これらの一部、断片、領域、ペプチドおよび誘導体（酵素的切断、ペプチド合成または組み換え技術（これらに限定されない）等のあらゆる既知の技法により生成される）、例えば軽鎖を欠いている免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、抗体断片、ダイアボディ、Ｆｄ、ＣＤＲ領域、または抗原もしくはエピトープに結合することができる抗体の任意の部分もしくはペプチド配列等との両方が含まれ得る。一実施形態では、本機能的部分は、単鎖抗体、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）2断片である。
【０１１７】
抗体または機能的部分は、該抗体または機能的部分が分子と特異的に反応し、それにより該分子を該抗体に結合させることができる場合に、該分子に「結合することができる」と言われる。抗体の断片または一部はインタクトな抗体のＦｃ断片を欠くことができ、循環からより急速に除去さえ得、インタクトな抗体と比べて非特異的組織結合を少なくすることができる。当分野で公知の方法を使用して、例えばパパイン（Ｆａｂ断片の生成用）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）2断片の生成用）等の酵素によるタンパク質分解的切断により、インタクトな抗体から抗体の例を生成することができる。抗体の一部を、上記方法のいずれかにより製造することができる、または組み換え分子の一部を発現させることにより製造することができる。例えば、組み換え抗体のＣＤＲ領域を単離して適切な発現ベクターにサブクローニングすることができる。
【０１１８】
一実施形態では、抗体または機能的部分はヒト抗体である。ヒトの治療を目的とするヒト抗体の使用により、非ヒト配列に対するヒト個体中の免疫学的反応に起因する副作用の可能性を低減させることができる。別の実施形態では、本抗体または本機能的部分はヒト化されている。別の実施形態では、抗体または機能的部分はキメラ抗体である。このようにして、目的の配列、例えば目的の結合部位等を抗体または機能的部分に含ませることができる。
【０１１９】
一実施形態では、本抗体は、ＩｇＧアイソタイプ、ＩｇＡアイソタイプ、ＩｇＭアイソタイプまたはＩｇＥアイソタイプを有することができる。一実施形態では、本抗体はＩｇＧである。
【０１２０】
ＩＩ．抗体およびその機能的部分をコードする核酸
本実施形態は、上記の第Ｉ．Ａ節または第Ｉ．Ｂ節に記載した抗体または機能的部分のいずれかをコードする単離核酸配列、合成核酸配列または組み換え核酸配列を更に提供する。そのような核酸は例えば、抗体または機能的部分を産生することができるＢ細胞から単離される。そのような核酸は、本明細書に記載した重鎖配列および軽鎖配列をコードする。あるいは、そのような核酸は、本明細書に記載した重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲをそれぞれ含む重鎖配列および軽鎖配列をコードする。いくつかの実施形態では、該核酸は、本明細書に記載した抗体の機能的部分をコードすることができる。核酸コードの縮重に起因して複数の核酸が同じアミノ酸をコードすることができ、全てが本出願に包含される。
【０１２１】
ＩＩＩ．使用方法
Ａ．抗体または機能的部分の使用方法
一実施形態では、抗体または機能的部分を処置方法でまたは医薬として使用することができる。該方法を、ＲＳＶ感染を和らげるためにもしくは少なくともある程度は予防するために、またはＲＳＶ感染の悪影響を和らげるためにもしくは少なくともある程度は予防するために使用することができる。該方法はまた、本明細書に記載した治療上有効な量の抗体または機能的部分を、必要とする個体に投与することも含む。一実施形態では、必要とする個体はヒト患者である。
【０１２２】
一実施形態では、ＲＳＶを和らげるために、抗体または機能的部分を、ＲＳＶ感染が起こる前に個体に投与することができ、換言すると予防薬として個体に投与することができる。あるいは、個体が既にＲＳＶに感染している場合に抗体または機能的部分を投与することができる。前記抗体または機能的部分を、ＲＳＶ感染のリスクが増大している個体、例えば早産の子供、慢性肺疾患を有する、先天性心疾患を有するおよび／または免疫力が低下している個体、６週未満の年齢の子供に投与することができる。早産の子供には、１歳の乳児と、ＲＳＶ感染のリスクが残っている２歳の子供およびより年上の子供との両方が含まれる。また、高齢者もＲＳＶ感染のリスクが高く、そのためリスクに応じて投与の対象となり得る。本抗体または本機能的部分を、過去にＲＳＶ感染している個体に投与することもできる。
【０１２３】
治療用途の場合、抗体または機能的部分は概して、薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤および／または賦形剤と組み合わされる。一実施形態では、本抗体または本機能的部分は注射用水と組み合わされる。別の実施形態では、本抗体または本機能的部分は、無菌で防腐剤が入っていない、ヒスチジン、グリシンおよび塩化物との液体溶液で調製される。別の実施形態では、好適な担体は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン（例えばＢＳＡまたはＲＳＡ）およびオボアルブミンを例えば含む。別の実施形態では、前記好適な担体は例えば生理食塩水のような溶液を含む。その他の実施形態では、本抗体または機能的部分は凍結乾燥形態で提供され、投与前に注射用水と混合される。
【０１２４】
Ｂ．抗体または機能的部分をコードする核酸の使用方法
更に別の実施形態では、抗体または機能的部分をコードする核酸を投与することができる。そのような核酸を投与すると、宿主の機構により抗体または機能的部分が産生される。産生された抗体または機能的部分は、ＲＳＶ感染および／またはＲＳＶ感染の悪影響を予防することができる、および／または和らげることができる。
【０１２５】
抗体の機能的部分をコードする核酸とは、抗体をコードする核酸としての少なくとも１つの発現特性（種類であり必ずしも量ではない）を含む、少なくとも３０塩基対長の、少なくとも５０塩基対長のまたは少なくとも１００塩基対長の核酸を意味する。一実施形態では、抗体の機能的部分をコードする核酸は、本明細書に記載した抗体の２個のまたは任意選択的に３個のＣＤＲを含むアミノ酸配列を少なくともコードする。
【０１２６】
ＩＶ．抗体および機能的部分を製造する方法
抗体または機能的部分を産生することができる、単離されている抗体産生細胞も提供される。本明細書に記載した抗体または機能的部分を、抗体を分泌するハイブリドーマから製造することができる、または本抗体もしくは本機能的部分をコードする遺伝子により形質転換されているもしくは形質移入されている組み換え生成細胞から製造することができる。
【０１２７】
一実施形態は、核酸が発現されて本抗体が産生される条件下で宿主細胞を培養し、続いて本抗体を回収することにより本抗体または本機能的部分を製造する方法を含む。様々な細胞系を使用して本抗体または本機能的部分を発現させることができ、該細胞系として哺乳動物細胞株が挙げられるがこれに限定されない。一実施形態では、該細胞系はヒトであることができる。別の実施形態では、細菌または昆虫の細胞系を使用することができる。一実施形態では、該細胞系として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ細胞のバリアント（例えばＤＧ４４）、２９３細胞およびＮＳＯ細胞が挙げられる。別の実施形態では、細胞系として、ＶＥＲＹ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３Ｆ細胞、２９３Ｔ細胞、３Ｔ３細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＴ４８３細胞、Ｈｓ５７８Ｔ細胞、ＨＴＢ２細胞、ＢＴ２Ｏ細胞およびＴ４７Ｄ細胞、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ細胞およびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられる。
【０１２８】
組み換え発現では、本抗体または本機能的部分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築物を利用する。ポリヌクレオチドを得ると、当分野で公知の組み換えＤＮＡ技術により本抗体の産生用ベクターを生成することができる。発現ベクターは、適切な転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルを含むことができる。このことを、インビトロでの組み換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボでの遺伝子組み換えを使用して達成することができる。一実施形態では、複製可能なベクターは、異種プロモータに作動可能に連結されている抗体または機能的部分をコードする核酸配列を含む。
【０１２９】
米国特許第５，８０７，７１５号明細書に記載されているように、様々な宿主発現ベクター系を利用して抗体または機能的部分を発現させることができる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）等の哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な中間初期（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子プロモータ要素等のベクターと共に、抗体の効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４５：１０１（１９８６）およびＣｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：２（１９９０））。加えて、目的の配列の発現を調節するまたは所望される特定の様式で遺伝子産物を改変するおよびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。そのようなタンパク質産物の改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば切断）がタンパク質の機能にとって重要な場合がある。様々な宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび改変のための特徴的で特有の機構を有している。本発明のタンパク質の正確な改変およびプロセシングを確かなものとするために、適切な細胞系または宿主系を選択することができる。この目的のために、一次転写産物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を保有する真核宿主細胞を使用することができる。
【０１３０】
細菌系では、発現される抗体または機能的部分に関して意図される用途に応じて、多数の発現ベクターを選択することができる。例えば、抗体または機能的部分を含む医薬組成物を生成するために、そのような抗体または機能的部分を大量に製造しようとする場合、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を導くベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターとして、融合タンパク質が産生されるようにｌａｃＺコード領域によりインフレームでコード配列をベクター中に個々にライゲートすることができる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ，１２：１７９１（１９８３））、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）、Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４：５５０３−５５０９（１９８９））等が挙げられるがこれらに限定されない。ｐＧＥＸベクターを使用して、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させることもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースアフィニティマトリクスへの吸着および結合とその後の遊離グルタチオンの存在下での溶出とにより、溶解細胞から容易に精製され得る。ｐＧＥＸベクターは、クローン化標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るように、トロンビンプロテアーゼ切断部位および／または第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を発現ポリペプチドに導入するように設計されている。
【０１３１】
昆虫系では、オートグラファ・カリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用する。このウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で増殖する。タンパク質コード配列をウイルスの非必須領域（例えばポリへドリン遺伝子）に個々にクローン化してＡｃＮＰＶプロモータ（例えばポリへドリンプロモータ）の制御下に置くことができる。
【０１３２】
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスに基づく発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、目的のコード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体にライゲートすることができ、例えば後期プロモータおよび３連リーダー配列（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）にライゲートさせることができる。次いで、このキメラ遺伝子を、インビトロでのまたはインビボでの組み換えによりアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ１または領域Ｅ３）への挿入により、感染した宿主中において、生存可能であり本抗体または本機能的部分を発現することができる組み換えウイルスが生じ得る（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３５５−３５９（１９８４）を参照されたい）。挿入された抗体または機能的部分をコードする配列の効率的な翻訳のためには、特異的開始シグナルも必要である。該シグナルはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、開始コドンは通常、挿入物全体の翻訳を確かなものとするために、所望のコード配列のリーディングフレームを有するフレーム内でなければならない。外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは様々な起源（天然および合成の両方）であることができる。適切な転写エンハンサ要素、転写ターミネータ等の包含により発現の効率を高めることができる（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１−５４４（１９８７）を参照されたい）。
【０１３３】
安定発現を使用して、組み換えタンパク質を長期にわたり高収率で産生することができる。例えば、該タンパク質分子を安定的に発現する細胞系を生成することができる。宿主細胞を、発現制御要素（例えば、プロモータ、エンハンサ、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位等）と選択可能なマーカー遺伝子とを含む、適切に操作されたベクターで形質転換させることができる。外来性ＤＮＡの導入後、細胞を栄養強化培地中で１〜２日にわたり増殖させることができ、次いで選択培地に切り換える。組み換えプラスミド中の選択可能なマーカーは選択に対する耐性を付与し、プラスミドが染色体に安定的に組み込まれた細胞を増殖させてフォーカスを形成させることができ、次いでクローン化して細胞系に拡張することができる。抗体または機能的部分をコードするプラスミドを使用して、遺伝子／ｃＤＮＡを、培養下での産生に好適なあらゆる細胞系に導入することができる。
【０１３４】
多数の選択系を使用することができ、選択系として、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１：２２３（１９７７））遺伝子、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：２０２（１９９２））遺伝子およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２２：８−１７（１９８０））遺伝子が挙げられるがこれらに限定されず、これらをｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞またはａｐｒＴ細胞でそれぞれ利用することができる。また、代謝拮抗物質耐性を下記の遺伝子の選択の基礎として使用することもできる：ｄｈｆｒ（メトトレキサートに対する耐性を付与する）（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：３５７（１９８０）、Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１５２７（１９８１））、ｇｐｔ（ミコフェノール酸に対する耐性を付与する）（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２（１９８１））、ｎｅｏ（アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）、Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３））、ならびにｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシンに対する耐性を付与する）（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３０：１４７（１９８４））。組み換えＤＮＡ技術の分野で一般に知られている方法を所望の組み換えクローンの選択に機械的に適用させることができ、そのような方法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）ならびに第１２章および第１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）、Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１に記載されている。
【０１３５】
抗体または機能的部分が組み換え発現により産生されると、該抗体または機能的部分を、免疫グロブリン分子の精製に関する分野で既知の任意の方法により精製することができ、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特に特異的抗原であるプロテインＡもしくはプロテインＧに対する親和性により、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差次的溶解度（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）により精製することができる、またはタンパク質の精製用のあらゆるその他の標準的技法により精製することができる。さらに、本発明のタンパク質または断片を、本明細書に記載したまたは当分野で既知の異種ポリペプチド配列に融合させて精製を容易にすることができる。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、少なくとも６ヶ月にわたり安定であるＲＳＶ特異的抗体産生細胞が生成される。別の実施形態では、ＲＳＶ特異的抗体産生細胞は、少なくとも９週間にわたり、少なくとも３ヶ月にわたり、または少なくとも６ヶ月にわたり安定である。別の実施形態では、抗体および機能的部分を製造する代替法が当分野で公知であり、少なくとも米国特許第８，５６２，９９６号明細書に記載されている。
【０１３７】
これより、本例示的実施形態をより詳細に参照し、実施形態の例を添付図面に示す。可能な限り、同じまたは類似の部分に言及するために、図面全体にわたって同じ参照番号が使用されるだろう。その他の実施形態は、本明細書と本明細書に開示した実行との検討により当業者に明らかであるだろう。実施形態を下記の実施例で更に説明する。実施例は特許請求の範囲を限定せず、いくつかの実施形態を明確にするのに役立つにすぎない。本明細書および実施例は単なる例とみなされ、真の範囲および趣旨は下記の特許請求の範囲で示されることが意図されている。
【実施例】
【０１３８】
実施例１．モノクローナル抗体の調製および発現
１Ｇ７免疫グロブリンの可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）のＤＮＡ断片（抗体の効力を高める所望の変異をそれぞれ含む）を、カッパ軽定常領域およびＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  ＩｇＧ１重定常領域を含むヒトＩｇＧ１発現ベクターに挿入した。１Ｇ７抗体を発現させるために、２９３Ｆｅｃｔｉｎ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、ヒト胚腎臓２９３−Ｆ細胞を１Ｇ７含有ベクターで過度的に形質転換した。細胞を、３７℃、１２０ｒｐｍ、５％ＣＯ2および８０％湿度で増殖させた。等体積の培地を添加することにより２日目に培養培地を供給し、形質移入後１０日目に回収した。上清を滅菌ろ過して細胞および残屑を除去した。プロテインＡカラム（ハイトラッププロテインＡカラム、Ｓｉｇｍａ）を使用してＩｇＧを精製し、溶出したタンパク質を４℃で一晩ＰＢＳに対して透析した。ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中でのタンパク質定量化によりＩｇＧ濃度を測定した。
【０１３９】
同じアプローチを講じてその他の抗体を産生した。
【０１４０】
実施例２．インビトロでのマイクロ中和アッセイ
マイクロ中和アッセイを下記のように実施した：簡潔に言うと、ＭＡｂの２倍段階希釈液を、１５μＬ／ウェルの体積でＨＥｐ−２細胞培養培地により３８４ウェルマイクロタイタープレート中に導入した。その後、１５μＬのＲＳＶ  Ａ２ウイルスまたはＲＳＶ  Ｂ９３２０ウイルスをＨｅｐ−２細胞培養培地で８０から１５０ｐｆｕ／ウェルの範囲の濃度に希釈し、ＨＥｐ−２細胞培養培地のみを含むコントロールウェルを含む各ウェルに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１．５時間にわたりインキュベートした。ＨＥｐ−２細胞を３０μＬ中に２．５×１０5個の細胞／ｍｌで各ウェルに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。ＲＳＶ  Ａ２の場合は３日後に、またはＲＳＶ  Ｂ９３２０の場合には４日後に培地を除去し、３０μＬの氷冷８０％アセトン／２０％ＰＢＳを添加して細胞を固定した。
【０１４１】
ウイルス複製を、ＲＳＶ  ＦのＣ部位（１３３１Ｈ）を標的とするセイヨウワサビペルオキシダーゼ共役抗ＲＳＶ  Ｆ  ＭＡｂを使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した（Ｂｅｅｌｅｒ  ａｎｄ  ｖａｎ  Ｗｙｋｅ  Ｃｏｅｌｉｎｇｈ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６３（７）：２９４１−２９５０（１９８９）。１３３１Ｈ  ＭＡｂをＰＢＳで１：６，０００に希釈し、３０μＬを各ウェルに添加した。３７℃での２時間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ＴＭＢペルオキシダーゼ３０μＬを各ウェルに添加し、プレートを１５分にわたり暗所で室温にてインキュベートした。１５μＬの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに添加して反応を停止させた。マイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍでの吸光度をモニタリングすることにより、基質ターンオーバーを測定した。可変傾斜カーブフィット（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｌｏｐｅ  ｃｕｒｖｅ  ｆｉｔ）によるｌｏｇ（抑制剤）対反応を使用するＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍでの非線形フィットアルゴリズム（ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ  ｆｉｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用してＩＣ５０値を算出し、このＩＣ５０値は、４５０ｎｍで測定した吸光度の５０％減少に必要なＭＡｂの濃度を表す。
【０１４２】
結果を図４に示し、図４は、マイクロ中和において１Ｇ７、１Ｆ５、２Ｄ１０およびＤ２５それぞれがＲＳＶ  Ａ２およびＲＳＶ  Ｂ９３２０の複製を抑制したことを示す。１Ｇ７が最も効果的であり、続いて１Ｆ５、２Ｄ１０であり、次いでＤ２５であった。
【０１４３】
実施例３．コットンラットＲＳＶモデル
Ａ）Ｄ２５バリアント、Ｊバリアント、ＬバリアントおよびＬＡバリアントのＲＳＶチャレンジに対する防御能力の比較
図に示した様々な投与量レベルでの筋肉内注射により、０．１ｍｌの抗体を動物に投与した。２４時間後、イソフルラン（ｉｓｏｆｌｏｕｒａｎｅ）チャンバを使用して動物を麻酔し、１×１０6ｐｆｕ／動物のＲＳＶ株Ａ２を鼻腔内点滴により感染させた。４日後、二酸化炭素窒息により動物を屠殺し、この動物の肺を外科的に取り出して二等分し、液体窒素で凍結させた、または直ちにプロセシングした。屠殺時に心臓穿刺により血液サンプルを得た。
【０１４４】
コットンラットの肺中でのＲＳＶ複製へのＭＡｂ投与の影響を評価するために、各投与群に関してコットンラットの肺ホモジネート中のＲＳＶウイルス力価を測定した。この目的のために、室温でＴｅｅｎＡＬｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘチューブにより２０秒にわたりＦａｓｔ  Ｐｒｅｐ  ２４組織ホモジナイザーを使用して、摘出した肺を１０（重量／体積）部のハンクス平衡塩類溶液およびリン酸スクロース中で個々にホモジナイズした。結果として生じた懸濁液を４℃で１０分にわたり９３０×ｇで遠心分離し、上清を回収して分析するまで−８０℃で保存した。肺ホモジネートサンプルを培養培地で１：１０および１：１００に希釈し、接種の２４時間前に、５０μＬの未希釈肺ホモジネートサンプルまたは希釈済肺ホモジネートサンプルを、２４ウェルプレート中に２．５×１０5個の細胞／ウェルの細胞密度で播種されているＨＥｐ−２細胞の２連ウェルに添加した。３７℃および５％ＣＯ2での１時間のインキュベーション後、接種源を、０．８％メチルセルロースを含む培養培地に置き換え、細胞を３７℃および５％ＣＯ2でインキュベートした。５日後に上敷きを取り去り、細胞を固定してヤギ抗ＲＳＶポリクローナル抗体で免疫染色し、続いて二次抗ヤギＨＲＰ抗体で免疫染色した。ＡＥＣ試薬との反応により溶菌斑を視覚化した。１０倍の対物レンズを使用する顕微鏡下で溶菌斑を定量化した。このアッセイの検出限界は組織１ｇ当たり２００ｐｆｕである。統計的分析のために、ウイルス力価が検出限界未満である（＜２００ｐｆｕ／ｇ）サンプルを１００ｐｆｕ／ｇ（検出の下限の半分）とした。結果を図５に示し、この結果から、Ｊバリアント、ＬバリアントおよびＬＡバリアントは全てＲＳＶ  Ａチャレンジに対する防御においてＤ２５よりも効果的であったが、ＬバリアントおよびＬＡバリアントはＲＳＶ  Ｂサブタイプに対する防御において効果が低かった（Ｌは１種のＢ株に対して別のものよりも良好に作用した）ことが明らかである。このデータに基づいて、更なる最適化の出発点としてＪを選択した。
【０１４５】
Ｂ）１Ｇ７バリアント、１Ｆ５バリアントおよびＤ２５バリアントのＲＳＶチャレンジに対する防御能力の比較
本実施例のパート（Ａ）において上記で論じたモデルを使用して、１Ｇ７、１Ｆ５およびＤ２５のＲＳＶチャレンジに対する防御能力を比較した。動物に２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇおよび０．２５ｍｇ／ｋｇで投与した。結果を図６に示す。データは、１Ｇ７はＲＳＶチャレンジに対する防御において１Ｆ５よりも良好に作用したが、両方ともウイルス力価を検出限界まで低下させることができたことを示す。１Ｇ７および１Ｆ５の両方がＤ２５よりも良好に作用した。
【０１４６】
Ｃ）１Ｇ７バリアントの詳細な評価
上記第（Ａ）節に記載したのと同じコットンラットモデルを使用した。図７で報告したように抗体が様々な濃度で存在する０．１ｍｌの抗体を各動物に投与した。１Ｇ７は、ＲＳＶ  Ａ２およびＲＳＶ  Ｂ９３２０の両方に関してＲＳＶ肺力価との用量反応関係を明確に示す。
【０１４７】
Ｄ）バリアントのＲＳＶ  Ａ２およびＲＳＶ  Ｂ９３２０を中和する能力の比較
上記第（Ａ）節に記載したのと同じコットンラッドモデルを使用した。
【０１４８】
肺摘出日のコットラット血清サンプル中におけるヒトＩｇＧの濃度を、ＥＬＩＳＡ法を使用して測定した。このアッセイでは、ヒト抗体を、マイクロタイタープレートに結合したヤギ抗ヒト抗体で捕捉した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（１×ＰＢＳ中に０．５μｇ／ｍｌ）を、３０μＬ体積で４℃にて一晩、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ３８４ウェルマイクロタイタープレート上に塗布した。プレートを洗浄し、次いで室温で１時間にわたり６０μＬのＰＢＳ＋３％加熱不活性化ヤギ血清の溶液でブロックした。ブロッキング緩衝液を除去し、サンプルを下記のように適合させた：５００ｎｇ／ｍｌから０．４８８ｎｇ／ｍｌの濃度範囲の標準曲線用に、アッセイ緩衝液で希釈した標準ヒト抗体の２倍段階希釈液を使用した。４パラメータカーブフィット（４  ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｃｕｒｖｅ  ｆｉｔ）を使用して標準曲線をフィットさせた。
【０１４９】
結果を図８に示し、この結果は、本明細書に記載したバリアントがＲＳＶ  Ａ２およびＲＳＶ  Ｂ９３２０の両方の中和においてＤ２５よりも低いＩＣ５０を有することを示す。このことから、Ａ２ウイルスまたはＢ９３２０ウイルスに対する活性が喪失せず、Ｅ９−２およびＢ１２−１では活性の増加が見られ、１Ｇ７  ＧＬＭおよびＥ３−５でのみＢ９３２０ウイルスに対する活性がわずかに喪失したことも明らかである。
【０１５０】
実施例４．モノクローナル抗体耐性変異体により定義されるエピトープ
２５０ｎｇ／ｍｌの１Ｇ７−ＹＴＥの存在下で３回継代させることにより、ＲＳＶ  Ａウイルス変異体およびＲＳＶ  Ｂウイルス変異体を単離した。１Ｇ７−ＹＴＥは、上記第Ｉ．Ｃ節において上記に記載したＹＴＥ変異を有する１Ｇ７抗体である。最後の継代後、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の配列を確認した。変異は、ＲＳＶ  Ｆと親Ｄ２５抗体との共結晶構造で既に定義された領域に対応する。全ての耐性変異体は、アミノ酸２００〜２１３の間のＦ１領域においてＲＳＶ  Ｆタンパク質の領域の変化を含んだ。２９４位での二次変異は耐性の向上を示さず、領域２００〜２１３での単一の変異によるものと同程度の耐性であった。Ｎ２０８Ｓ変異バックグラウンドのＦ２領域での二次変異により耐性が向上した。結果を図９に示す。
【０１５１】
実施例５．ＲＳＶの臨床単離株に対する中和
増殖させた臨床単離ウイルスを抗体の希釈系列と共にプレインキュベートした後にＨＥｐ２細胞に感染させることにより、中和アッセイを実施した。細胞の感染を、細胞の表面上でのＦタンパク質発現の関数として測定した。中和曲線の非線形フィッティングによりＩＣ５０値を算出した。ウイルス複製を実施例２（インビトロでのマイクロ中和アッセイ）と同様に測定した。
【０１５２】
結果を図１０に示す。１Ｇ７および１Ｆ５のＩＣ５０は両方とも、ＨＥｐ２細胞中でのＲＳＶのＡ単離株またはＢ単離株の中和に関してＤ２５よりも低い。
【０１５３】
参照による援用
本明細書で引用した全ての参考文献、例えば特許、特許出願、論文、テキスト等およびこれらで引用されている参考文献は、参照により既に本明細書に援用されていない限り、この記載により、それらの全体があらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。
【０１５４】
等価物
上述した明細書は、当業者が本実施形態を実施することができるのに十分であると考えられる。上記の説明および実施例はいくつかの実施形態を詳述し、発明者らが予期するベストモードを説明する。しかしながら、上記の説明および実施例が本文中でどれだけ詳述されていても実施形態を多くの方法で実施することができ、特許請求の範囲はこれらのあらゆる等価物を含むことが認識されるだろう。
【図１Ａ】
2020103293.tif 000039
【図１Ｂ】
2020103293.tif 000040
【図２】
2020103293.tif 000041
【図３Ａ】
2020103293.tif 000042
【図３Ｂ】
2020103293.tif 000043
【図４】
2020103293.tif 000044
【図５】
2020103293.tif 000045
【図６】
2020103293.tif 000046
【図７】
2020103293.tif 000047
【図８】
2020103293.tif 000048
【図９】
2020103293.tif 000049
【図１０】
2020103293.tif 000050
【配列表】
2020103293000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月11日(2020.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
等価物
上述した明細書は、当業者が本実施形態を実施することができるのに十分であると考えられる。上記の説明および実施例はいくつかの実施形態を詳述し、発明者らが予期するベストモードを説明する。しかしながら、上記の説明および実施例が本文中でどれだけ詳述されていても実施形態を多くの方法で実施することができ、特許請求の範囲はこれらのあらゆる等価物を含むことが認識されるだろう。   
本発明は以下の実施形態を包含する。 
[１]  呼吸器合胞体ウイルスに特異的に結合することができ、
ａ．配列ＮＹＩＩＮ（配列番号１）または配列ＤＹＩＩＮ（配列番号９）と少なくとも７０％同一である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、
ｂ．配列ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）または配列ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）と少なくとも７５％同一である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、
ｃ．配列ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）または配列ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）と少なくとも７０％同一である配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列と、
ｄ．配列ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）と少なくとも８５％同一である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、
ｅ．配列ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）と少なくとも７０％同一である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、
ｆ．配列ＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）と少なくとも７０％同一である配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列と
を含む合成抗体もしくは組み換え抗体またはこれらの機能的部分であって、
前記重鎖中の少なくとも１個のアミノ酸が配列番号７と異なり、前記少なくとも１個のアミノ酸が
2020103293.tif 000051
から選択される、合成抗体もしくは組み換え抗体またはその機能的部分。   
[２]  ａ．重鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、ＮＹＩＩＮ（配列番号１）もしくはＤＹＩＩＮ（配列番号９）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む、
ｂ．重鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）もしくはＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）と１個もしくは２個のアミノ酸が異なる配列を含む、
ｃ．重鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）もしくはＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）と１個もしくは２個のアミノ酸が異なる配列を含む、
ｄ．軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む、
ｅ．軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む、および／または
ｆ．軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、ＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む、
１に記載の抗体または機能的部分。   
[３]  ａ．重鎖可変領域ＣＤＲ１配列がＮＹＩＩＮ（配列番号１）またはＤＹＩＩＮ（配列番号９）を含む、
ｂ．重鎖可変領域ＣＤＲ２配列がＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）またはＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）を含む、
ｃ．重鎖可変領域ＣＤＲ３配列がＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）またはＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）を含む、
ｄ．軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列がＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）を含む、
ｅ．軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列がＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）を含む、および
ｆ．軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列がＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）を含む、
１に記載の抗体または機能的部分。   
[４]  前記重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる、
2020103293.tif 000052
１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[５]  前記重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる、
2020103293.tif 000053
１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[６]  前記重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる、
2020103293.tif 000054
１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[７]  前記重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる、
2020103293.tif 000055
１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[８]  前記重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる、
2020103293.tif 000056
１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[９]  前記重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる、
2020103293.tif 000057
１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[１０]  前記重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる、
2020103293.tif 000058
１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[１１]  前記重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる、
2020103293.tif 000059
１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[１２]  前記重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる、
2020103293.tif 000060
１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[１３]  前記重鎖可変領域中の少なくとも下記のアミノ酸が配列番号７と異なる、
2020103293.tif 000061
１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[１４]  前記重鎖可変領域が配列番号７または配列番号１３と少なくとも９０％同一であり、前記軽鎖可変領域が配列番号８と少なくとも９０％同一である、１〜１３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[１５]  前記重鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、ＮＹＩＩＮ（配列番号１）またはＤＹＩＩＮ（配列番号９）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む、１、２または４〜１４のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[１６]  前記重鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）またはＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）と１個または２個のアミノ酸が異なる配列を含む、１、２または４〜１５のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[１７]  前記重鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）またはＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）と１個または２個のアミノ酸が異なる配列を含む、１、２または４〜１６のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[１８]  前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む、１、２または４〜１７のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[１９]  前記軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む、１、２または４〜１８のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[２０]  前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３が、ＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）と１個のアミノ酸が異なる配列を含む、１、２または４〜１９のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[２１]  前記重鎖可変領域ＣＤＲ１配列がＮＹＩＩＮ（配列番号１）またはＤＹＩＩＮ（配列番号９）を含む、１、２または４〜１４または１６〜２０のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[２２]  前記重鎖可変領域ＣＤＲ２配列がＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号２）またはＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）を含む、１、２、４〜１５または１７〜２１のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[２３]  前記重鎖可変領域ＣＤＲ３配列がＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）またはＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）を含む、１、２、４〜１６または１８〜２２のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[２４]  前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列がＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）を含む、１、２、４〜１７または１９〜２３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[２５]  前記軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列がＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）を含む、１、２、４〜１８または２０〜２４のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[２６]  前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３がＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）を含む、１、２、４〜１９または２１〜２５のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[２７]  前記重鎖可変領域が、配列番号７および配列番号１２〜２１から選択される配列とフレームワーク領域において９５％同一である配列を含む、１〜２６のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[２８]  前記重鎖可変領域が、配列番号１２〜２１から選択される配列とフレームワーク領域において同一である配列を含む、１〜２６のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[２９]  前記重鎖可変領域が、配列番号１２〜２１から選択される配列と少なくとも７０％同一である配列を含む、１〜２６のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。 
[３０]  配列番号８と少なくとも７０％同一である配列を含む軽鎖可変領域配列を有する１〜２９のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[３１]  配列番号８と同一である配列を含む軽鎖配列可変領域を有する１〜２９のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[３２]  ＲＳＶ  Ｆ抗原に特異的に結合することができ、
ａ．アミノ酸配列ＤＹＩＩＮ（配列番号９）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、
ｂ．アミノ酸配列ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、
ｃ．アミノ酸配列ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＲＰＨＹＦＤＮ（配列番号１１）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列と、
ｄ．アミノ酸配列ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、
ｅ．アミノ酸配列ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、  ｆ．アミノ酸配列ＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３と
を含む合成抗体もしくは組み換え抗体またはこれらの機能的部分。   
[３３]  ＲＳＶ  Ｆ抗原に特異的に結合することができ、
ａ．アミノ酸配列ＤＹＩＩＮ（配列番号９）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、
ｂ．アミノ酸配列ＧＩＩＰＶＬＧＴＶＨＹＧＰＫＦＱＧ（配列番号１０）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、
ｃ．アミノ酸配列ＥＴＡＬＶＶＳＴＴＹＬＰＨＹＦＤＮ（配列番号３）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列と、
ｄ．アミノ酸配列ＱＡＳＱＤＩＶＮＹＬＮ（配列番号４）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、
ｅ．アミノ酸配列ＶＡＳＮＬＥＴ（配列番号５）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、  ｆ．アミノ酸配列ＱＱＹＤＮＬＰ（配列番号６）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３と
を含む合成抗体もしくは組み換え抗体またはこれらの機能的部分。   
[３４]  前記抗体または機能的部分が完全ヒト、ヒト化抗体またはキメラである、１〜３３のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[３５]  前記機能的部分が、一本鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ'）2断片である、１〜３４のいずれか一項に記載の機能的部分。   
[３６]  前記抗体または機能的部分は、ＲＳＶ  Ａ２の中和アッセイにおいてＩＣ５０が５．０ｎｇ／ｍｌ以下である、１〜３５のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[３７]  前記抗体または機能的部分は、ＲＳＶ  Ｂ９３２０の中和アッセイにおいてＩＣ５０が３．０ｎｇ／ｍｌ以下である、１〜３６のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[３８]  前記抗体または機能的部分が、２５２Ｙ位でＹを有し、２５４Ｔ位でＴを有し、２５６位でＥを有するＦｃ領域を有し、この番号付けはＫａｂａｔでのＥＵインデックスに対応する、１〜３７のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分。   
[３９]  対象のＲＳＶ感染を抑制する方法であって、１〜３８のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分を前記対象に投与することを含む方法。   
[４０]  前記対象がヒト患者である、３９に記載の方法。   
[４１]  前記対象が、早産であったヒト患者である、４０に記載の方法。   
[４２]  １〜３８のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分をコードする合成核酸配列、組み換え核酸配列または単離核酸配列。   
[４３]  対象のＲＳＶ感染を抑制する方法であって、４２に記載の核酸を対象に投与することを含む方法。   
[４４]  １〜３８のいずれか一項に記載の抗体または機能的部分を産生することができる、単離されている抗体産生細胞。   
[４５]  少なくとも９週にわたり安定である４４に記載の抗体産生細胞。
【外国語明細書】
2020103293000001.pdf