(57)【要約】      （修正有）【課題】フコシル化オリゴ糖を生産するよう大腸菌（E.coli）またはその他の宿主生産細菌株を改変するための組成物および方法、ならびに感染の予防または処置におけるその使用を提供する。【解決手段】外因性ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素を含む細菌を提供する工程を含み、該酵素のアミノ酸配列がFutCに対して少なくとも22％の同一性を有する、細菌内でフコシル化オリゴ糖を生産する方法。【選択図】図２
2020188761.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素を含む細菌を提供する工程を含み、該酵素のアミノ酸配列がFutC（SEQ ID NO:1）に対して少なくとも22％の同一性を有する、細菌内でフコシル化オリゴ糖を生産する方法。
【請求項２】
外因性ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素を含む細菌を提供する工程を含み、該酵素のアミノ酸配列がFutN（SEQ ID NO:3）に対して少なくとも25％の同一性を有する、細菌内でフコシル化オリゴ糖を生産する方法。
【請求項３】
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、パラバクテロイデス・ジョンソニイ（Parabacteroides johnsonii）FutX、ラクノスピラセアエ（Lachnospiraceae）種FutQ、プレボテラ・メラニノゲニカ（Prevotella melaninogenica）FutO、プレボテラ種FutW、バクテロイデス（Bacteroides）種FutZA、タネレラ（Tannerella）種FutS、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）+13 FutP、バクテロイデス・カカエ（Bacteroides caccae）FutU、サルモネラ菌（Salmonella enterica）FutZ、メタノスファエルラ・パルストリス（Methanosphaerula palustries）FutR、ブチリビブリオ（Butyrivibrio）FutV、アケルマンシア・ムシニフィリア（Akkermansia muciniphilia）FutY、クロストリジウム・ボルテアエFutP、またはそれらの機能的変種もしくはフラグメントから選択されるいずれか一つを含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、アミノ酸配列SEQ ID NO:10〜21および292のいずれか一つまたはそれらの機能的変種もしくはフラグメントを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記細菌からまたは前記細菌の培養上清からフコシル化オリゴ糖を回収する工程をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
フコシル化オリゴ糖が、2'-フコシルラクトース（2'-FL）、ラクトジフコテトラオース（LDFT）、ラクト-N-フコペンタオースI（LNF I）、またはラクト-N-ジフコヘキサオースI（LDFH I）を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記細菌がさらに、外因性ラクトース利用性α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ酵素および／または外因性ラクトース利用性α(1,4)フコシルトランスフェラーゼ酵素を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
外因性ラクトース利用性α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、ピロリ菌（Helicobacter pylori）26695 futA遺伝子を含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
外因性ラクトース利用性α(1,4)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、ピロリ菌UA948 FucTa遺伝子またはピロリ菌株DMS6709 FucT III遺伝子を含む、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌がさらに、減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性、不完全なコラン酸合成経路、不活性化されたATP依存性細胞内プロテアーゼ、不活性化されたlacAまたはそれらの組み合わせを伴う、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
トリプトファンの存在下およびチミジンの非存在下で前記細菌を培養する工程をさらに含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、前記細菌の欠失もしくは不活性化された内因性lacZ遺伝子および／または欠失もしくは不活性化された内因性lacI遺伝子を伴う、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性がさらに、野生型細菌より低いβ-ガラクトシダーゼ活性レベルを含む外因性lacZ遺伝子またはその変種を伴う、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、野生型細菌より低い活性レベルを含む、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、6,000単位未満のβ-ガラクトシダーゼ活性を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、1,000単位未満のβ-ガラクトシダーゼ活性を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌が、lacY遺伝子の直接上流にlacIq遺伝子プロモーターを含む、請求項10記載の方法。
【請求項１８】
不完全なコラン酸合成経路が、前記細菌のwcaJ遺伝子の不活性化を伴う、請求項10記載の方法。
【請求項１９】
不活性化されたATP依存性細胞内プロテアーゼが、内因性lon遺伝子のヌル変異、不活性化変異、または欠失である、請求項10記載の方法。
【請求項２０】
内因性lon遺伝子の不活性化変異が、機能性大腸菌（E.coli）lacZ+遺伝子の挿入を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
前記細菌がさらに、機能性ラクトースパーミアーゼ遺伝子を含む、請求項10記載の方法。
【請求項２２】
前記細菌が、大腸菌lacYを含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
前記細菌がさらに、外因性大腸菌rcsAまたは大腸菌rcsB遺伝子を含む、請求項10記載の方法。
【請求項２４】
前記細菌がさらに、thyA遺伝子内に変異を含む、請求項10記載の方法。
【請求項２５】
前記細菌が、外因性ラクトースの存在下で細胞内ラクトースを蓄積する、請求項10記載の方法。
【請求項２６】
前記細菌が、細胞内GDP-フコースを蓄積する、請求項10記載の方法。
【請求項２７】
前記細菌が大腸菌である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
生産株が、バチルス（Bacillus）、パントエア（Pantoea）、ラクトバチルス（Lactobacillus)、ラクトコッカス（Lactococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、プロプリオニバクテリウム（Proprionibacterium）、エンテロコッカス（Enterococcus）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、スポロラクトバチルス（Sporolactobacillus）、ミクロモモスポラ（Micromomospora）、ミクロコッカス（Micrococcus）、ロドコッカス（Rhodococcus）、またはシュードモナス（Pseudomonas）属のメンバーである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
生産株が、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーモフィルス（Bacillus thermophilus）、バチルス・ラテロスポールス（Bacillus laterosporus）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、およびバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、エルウイニア・ヘルビコラ（Erwinia herbicola）（パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans））、シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundii）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）、ペクトバクテリウム・カロトボルム（Pectobacterium carotovorum）、ザントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・クリスパータス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・イエンセニイ（Lactobacillus jensenii）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophiles）、プロプリオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Proprionibacterium freudenreichii）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・サーモフィルス（Enterococcus thermophiles）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、およびシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
前記細菌が、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む核酸コンストラクトを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸が、細菌内での前記酵素の産生を誘導する1つまたは複数の異種制御配列に機能的に連結されている、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
異種制御配列が、細菌プロモーターおよびオペレーター、細菌リボソーム結合部位、細菌転写ターミネーター、またはプラスミド選択マーカーを含む、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
前記請求項のいずれか一項によって生産された、精製されたフコシル化オリゴ糖。
【請求項３４】
宿主細菌生産株内での該酵素の産生のための、ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む核酸コンストラクトであって、該酵素のアミノ酸配列がFutC（SEQ ID NO:1）に対して少なくとも22％の同一性を有する、核酸コンストラクト。
【請求項３５】
宿主細菌生産株内での該酵素の産生のための、ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む核酸コンストラクトであって、該酵素のアミノ酸配列がFutN（SEQ ID NO:3）に対して少なくとも25％の同一性を有する、核酸コンストラクト。
【請求項３６】
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX、ラクノスピラセアエ種FutQ、プレボテラ・メラニノゲニカFutO、プレボテラ種FutW、バクテロイデス種FutZA、タネレラ種FutS、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP、バクテロイデス・カカエFutU、サルモネラ菌FutZ、メタノスファエルラ・パルストリスFutR、ブチリビブリオFutV、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY、クロストリジウム・ボルテアエFutP、またはそれらの機能的変種もしくはフラグメントから選択されるいずれか一つを含む、請求項34または35記載のコンストラクト。
【請求項３７】
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、アミノ酸配列SEQ ID NO:10〜21および292のいずれか一つまたはそれらの機能的変種もしくはフラグメントを含む、請求項34〜36のいずれか一項記載のコンストラクト。
【請求項３８】
前記核酸が、細菌内での前記酵素の産生を誘導する1つまたは複数の異種制御配列に機能的に連結されている、請求項34〜37のいずれか一項記載のコンストラクト。
【請求項３９】
異種制御配列が、細菌プロモーターおよびオペレーター、細菌リボソーム結合部位、細菌転写ターミネーター、プラスミド選択マーカー、および／または複製起点を含む、請求項38記載のコンストラクト。
【請求項４０】
ラクトース受容性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む単離された細菌であって、該核酸によってコードされる酵素のアミノ酸配列がFutC（SEQ ID NO:1）に対して少なくとも22％の同一性を有する、単離された細菌。
【請求項４１】
ラクトース受容性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む単離された細菌であって、該核酸によってコードされる酵素のアミノ酸配列がFutN（SEQ ID NO:3）に対して少なくとも25％の同一性を有する、単離された細菌。
【請求項４２】
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX、ラクノスピラセアエ種FutQ、プレボテラ・メラニノゲニカFutO、プレボテラ種FutW、バクテロイデス種FutZA、タネレラ種FutS、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP、バクテロイデス・カカエFutU、サルモネラ菌FutZ、メタノスファエルラ・パルストリスFutR、ブチリビブリオFutV、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY、クロストリジウム・ボルテアエFutP、またはそれらの機能的変種もしくはフラグメントから選択されるいずれか一つを含む、請求項40または41記載の単離された細菌。
【請求項４３】
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、アミノ酸配列SEQ ID NO:10〜21および292のいずれか一つまたはそれらの機能的変種もしくはフラグメントを含む、請求項40〜42のいずれか一項記載の単離された細菌。
【請求項４４】
α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ酵素および／またはα(1,4)フコシルトランスフェラーゼ酵素をさらに含む、請求項40〜43のいずれか一項記載の単離された細菌。
【請求項４５】
大腸菌である、請求項40〜44のいずれか一項記載の単離された細菌。
【請求項４６】
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性、不完全なコラン酸合成経路、不活性化されたアデノシン-5'-三リン酸（ATP）依存性細胞内プロテアーゼ、不活性化された内因性lacA遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせをさらに伴う、請求項40〜45のいずれか一項記載の単離された細菌。
【請求項４７】
遺伝子型ΔampC::PtrpBcI, Δ(lacI-lacZ)::FRT, PlacIqlacY+, ΔwcaJ::FRT, thyA::Tn10, Δlon:(npt3, lacZ+)を含む、請求項46記載の単離された細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、精製されたオリゴ糖、特に、典型的にはヒト乳中で見出される特定のフコシル化オリゴ糖を生産するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒト乳は、多種で豊富な中性および酸性オリゴ糖群を含んでいる。130を超える異なる複合オリゴ糖がヒト乳において同定されており、それらの構造の多様さおよび豊富さは、ヒトに特有である。これらの分子は、栄養分としては乳児によって直接利用されないかもしれないが、そうであったとしてもそれらは健康な腸内微生物環境の確立、疾患の予防および免疫機能において重要な役割を果たしている。本明細書に記載される本発明より以前は、ヒト乳オリゴ糖（HMOS）を安価で生産する能力に問題があった。例えば、化学合成を通じたそれらの生産は立体特異性の問題、前駆体の入手性、生産物の不純度およびかさむ総費用によって制限されていた。そのため、多量のHMOSを安価で生産する新しい戦略が切に求められている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、効率的かつ経済的なフコシル化オリゴ糖生産方法を特徴とする。そのようなフコシル化オリゴ糖生産は、細菌、例えば大腸菌（Escherichia coli (E.coli)）において組み換えフコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物の生産を誘導する1つまたは複数の異種制御配列に機能的に連結された、ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）をコードする配列を含む単離された核酸を用いて達成される。
【０００４】
本開示は、ラクトースを利用し、アルファ-1,2-結合におけるGDP-フコースドナー基質からアクセプター基質へのL-フコース糖の転移を触媒する新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ（本明細書でα(1,2)FTとも呼ばれる）を提供する。好ましい態様において、アクセプター基質は、オリゴ糖である。本明細書で特定され本明細書に記載されているα(1,2)フコシルトランスフェラーゼは、ヒトミルクオリゴ糖（HMOS）、例えばフコシル化オリゴ糖の生産のために宿主細菌において発現させるのに有用である。本明細書に記載される方法によって生産される例示的なフコシル化オリゴ糖は、2'-フコシルラクトース（2'FL）またはラクトジフコテトラオース（LDFT）、ラクト-N-フコペンタオースI（LNF I）またはラクト-N-ジフコヘキサオースI（LDFH I）を含む。本明細書に開示される「α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ」は、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列およびα(1,2)フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列、ならびにα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ活性を示すその変種およびフラグメントを包含する。ラクトース受容性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含み、該核酸が任意で宿主細菌生産株内での該酵素の産生を誘導する1つまたは複数の異種制御配列に機能的に連結されている核酸コンストラクトも、本発明の範囲内である。
【０００５】
本明細書に記載されるラクトース受容性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）26695アルファ-(1,2)フコシルトランスフェラーゼ（futCまたはSEQ ID NO:1）に対して少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％同一である。好ましくは、本明細書に記載されるラクトース受容性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼは、H.ピロリ FutCまたはSEQ ID NO:1に対して少なくとも22％同一である。
【０００６】
別の局面において、本明細書に記載されるラクトース受容性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、バクテロイデス・ブルガタス（Bacteroides vulgatus）アルファ-(1,2)フコシルトランスフェラーゼ（FutNまたはSEQ ID NO:3）に対して少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％同一である。好ましくは、本明細書に記載されるラクトース受容性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼは、B.ブルガタス FutNまたはSEQ ID NO:3に対して少なくとも25％同一である。
【０００７】
あるいは、外因性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼは、好ましくは、本明細書に開示される新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼのいずれか一つに対して、例えば表1のアミノ酸配列に対して少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％の同一性を有する。
【０００８】
例示的なα(1,2)フコシルトランスフェラーゼは、プレボテラ・メラニノゲニカ（Prevotella melaninogenica）FutO、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）FutP、クロストリジウム・ボルテアエ +13 FutP、ラクノスピラセアエ（Lachnospiraceae）種FutQ、メタノスファエルラ・パルストリス（Methanosphaerula palustris）FutR、タネレラ（Tannerella）種FutS、バクテロイデス・カカエ（Bacteroides caccae）FutU、ブチリビブリオ（Butyrivibrio）FutV、プレボテラ（Prevotella）種FutW、パラバクテロイデス・ジョンソニイ（Parabacteroides johnsonii）FutX、アケルマンシア・ムシニフィリア（Akkermansia muciniphilia）FutY、サルモネラ菌（Salmonella enterica）FutZ、バクテロイデス（Bacteroides）種FutZAを含むがこれらに限定されない。例えば、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼは、以下のいずれか一つを含むアミノ酸配列を含む：プレボテラ・メラニノゲニカFutO（SEQ ID NO:10）、クロストリジウム・ボルテアエFutP（SEQ ID NO:11）、クロストリジウム・ボルテアエ +13 FutP（SEQ ID NO:292）、ラクノスピラセアエ種FutQ（SEQ ID NO:12）、メタノスファエルラ・パルストリスFutR（SEQ ID NO:13）、タネレラ種FutS（SEQ ID NO:14）、バクテロイデス・カカエFutU（SEQ ID NO:15）、ブチリビブリオFutV（SEQ ID NO:16）、プレボテラ種FutW（SEQ ID NO:17）、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX（SEQ ID NO:18）、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY（SEQ ID NO:19）、サルモネラ菌FutZ（SEQ ID NO:20）およびバクテロイデス種FutZA（SEQ ID NO:21）またはそれらの機能的変種もしくはフラグメント。他の例示的なα(1,2)フコシルトランスフェラーゼは、表1に列挙される酵素のいずれかまたはそれらの機能的変種もしくはフラグメントを含む。
【０００９】
本発明は、少なくとも1つの外因性ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼを発現する細菌を提供することによる、細菌においてフコシル化オリゴ糖を生産する方法を特徴とする。外因性ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、好ましくは、H.ピロリFutCに対して少なくとも22％同一またはB.ブルガタスFutNに対して少なくとも25％同一である。1つの局面において、細菌はまた、1つもしくは複数の外因性ラクトース利用性α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ酵素および／または1つもしくは複数の外因性ラクトース利用性α(1,4)フコシルトランスフェラーゼ酵素も発現する。生産細菌において発現されるフコシルトランスフェラーゼの組み合わせは、望まれるフコシル化オリゴ糖産物に依存する。本明細書に開示される方法はさらに、細菌または細菌の培養上清からフコシル化オリゴ糖を回収する工程を含む。
【００１０】
適当なα(1,3)フコシルトランスフェラーゼ酵素の例は、ヘリコバクター・ピロリ26695 futA遺伝子（参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号HV532291（GI:365791177））、H.ヘパティカス（H. hepaticus）Hh0072、H.ピロリ11639 FucTおよびH.ピロリUA948 FucTa（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号AF194963（GI:28436396））（Rasko, D.A., Wang, G., Palcic, M.M. & Taylor, D.E. J Biol Chem 275, 4988-4994 (2000)）を含むがこれらに限定されない。適当なα(1,4)フコシルトランスフェラーゼ酵素の例は、H.ピロリUA948 FucTa（緩いアクセプター特異性を有し、α(1,3)-およびα(1,4)-フコシル結合の両方を生成することができる）を含むがこれに限定されない。α(1,4)フコシルトランスフェラーゼ活性のみを有する酵素の例は、ヘリコバクター・ピロリDMS6709株由来のFucT III酵素（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号AY450598.1（GI:40646733））（S. Rabbani, V. Miksa, B. Wipf, B. Ernst, Glycobiology 15, 1076-83 (2005)）によって示される。
【００１１】
本発明はまた、本明細書に記載される少なくとも1つのα(1,2)フコシルトランスフェラーゼもしくは変種、またはそれらのフラグメントをコードする核酸を含む核酸コンストラクトまたはベクターを特徴とする。ベクターはさらに、1つまたは複数の調節エレメント、例えば異種プロモーターを含み得る。「異種」は、制御配列とタンパク質コード配列が異なる細菌株由来であることを意味する。調節エレメントは、融合タンパク質を発現するよう、タンパク質をコードする遺伝子、融合タンパク質遺伝子をコードする遺伝子コンストラクトまたはオペロン内で連結された遺伝子群に機能的に連結され得る。さらに別の局面において、本発明は、単離された組み換え細胞、例えば上記の核酸分子またはベクターを含む細菌細胞を含む。核酸は、任意で、宿主細菌のゲノムに組み込まれる。いくつかの態様において、核酸コンストラクトはまた、1つもしくは複数のα(1,3)フコシルトランスフェラーゼおよび／またはα(1,4)フコシルトランスフェラーゼをさらに含む。あるいは、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼが、α(1,3)フコシルトランスフェラーゼおよび／またはα(1,4)フコシルトランスフェラーゼ活性も示す。
【００１２】
本明細書に記載される生産方法において利用される細菌は、フコシル化オリゴ糖産物の効率および収量を高めるよう遺伝子操作される。例えば、宿主生産細菌は、減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性、不完全なコラン酸合成経路、不活性化されたATP依存性細胞内プロテアーゼ、不活性化されたlacAまたはそれらの組み合わせを有することで特徴付けられる。1つの態様において、細菌は、減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性、不完全なコラン酸合成経路、不活性化されたATP依存性細胞内プロテアーゼおよび不活性化されたlacAを有することで特徴付けられる。
【００１３】
本明細書で使用される場合、「不活性化された」遺伝子、コードされる遺伝子産物（すなわち、ポリペプチド）もしくは経路またはそれらの「不活性化」は、その遺伝子、遺伝子産物または経路の発現（すなわち、転写もしくは翻訳）、タンパク質レベル（すなわち、翻訳、分解率）または酵素活性の減少または消滅を表す。経路が不活性化される例において、好ましくはその経路の1つの酵素またはポリペプチドが、減少したまたは無視できる程度の活性を示す。例えば、野生型細菌またはインタクトな経路と比較してその経路の生産物が低レベルで生産されるようその経路の酵素が変更、欠失または変異される。あるいは、その経路の生産物は生産されない。遺伝子の不活性化は、その遺伝子が転写または翻訳されないようにするその遺伝子またはその遺伝子の調節エレメントの欠失または変異によって達成される。ポリペプチドの不活性化は、その遺伝子産物をコードする遺伝子の欠失もしくは変異またはその活性を破壊するポリペプチドの変異によって達成され得る。不活性化変異は、その遺伝子またはポリペプチドの発現または活性を減少または消滅させる核酸またはアミノ酸配列の1つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の付加、欠失または置換を含む。他の態様において、ポリペプチドの不活性化は、そのポリペプチドの活性が減少または消滅するよう（すなわち、立体障害によって）そのポリペプチドのNまたはC末端に外因性配列（すなわち、タグ）を付加することを通じて達成される。
【００１４】
本明細書に記載される生産システムに適した宿主細菌は、ラクトースおよび／またはGDP-フコースの増強されたまたは増大した細胞質または細胞内プールを示す。例えば、細菌は大腸菌（E.coli）であり、内因性の大腸菌代謝経路および遺伝子が、野生型大腸菌において見出されるレベルと比較して増大したラクトースおよび／またはGDP-フコースの細胞質濃度を生じるように操作される。好ましくは、細菌は、増大した細胞内ラクトースプールおよび増大した細胞内GDP-フコースプールを蓄積する。例えば、細菌は、本明細書に記載される遺伝子修飾を欠く対応する野生型細菌と比較して少なくとも10％、20％、50％もしくは2倍、5倍、10倍またはそれ以上のレベルの細胞内ラクトースおよび／または細胞内GDP-フコースを含む。
【００１５】
野生型細菌との比較で増大した宿主細菌内のラクトースの細胞内濃度は、ラクトース輸入、輸出および異化に関与する遺伝子および経路の操作によって達成される。特に、内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）およびラクトースオペロンレプレッサー遺伝子（lacI）の同時欠失によりヒトミルクオリゴ糖を生産するよう遺伝子操作された大腸菌において細胞内ラクトースレベルを増大させる方法が本明細書に記載される。この欠失を構築する間に、lacIqプロモーターはラクトースパーミアーゼ遺伝子lacYの直接上流に（それと隣接するように）配置される、すなわち、lacY遺伝子がlacIqプロモーターによる転写調節下にあるよう、lacIqプロモーターの配列がlacY遺伝子をコードする配列の開始点の直接上流に位置しかつ隣接する。この改変された株は、（lacYを通じて）培養培地からラクトースを輸送するその能力を維持しているが、ラクトース異化を担う（β-ガラクトシダーゼをコードする）lacZ遺伝子の野生型染色体コピーを欠失している。したがって、この改変された株が外因性ラクトースの存在下で培養されたとき、細胞内ラクトースプールが形成される。
【００１６】
大腸菌においてラクトースの細胞内濃度を増大させる別の方法は、lacA遺伝子の不活性化を利用する。lacAの不活性化変異、ヌル変位または欠失は、細胞内アセチル-ラクトースの形成を妨げ、これにより混入物質としてのこの分子がその後の精製物から除去されるだけでなく、過剰なラクトースをその細胞質から輸出する大腸菌の能力が消失し（Danchin A. Cells need safety valves. Bioessays 2009, Jul;31(7):769-73.）、それによって大腸菌の細胞内ラクトースプールの意図的な操作が大いに促進される。
【００１７】
本発明はまた、その生物の内因性コラン酸生合成経路を操作することによって細菌においてGDP-フコースの細胞内レベルを増大させる方法を提供する。この増大は、コラン酸前駆体生合成に直接関与するかまたはコラン酸合成レギュロンの全体制御に関与するかのいずれかの内因性大腸菌遺伝子の多くの遺伝的修飾を通じて達成される。GDP-フコース（ドナー基質）の産生後およびコラン酸の生成前にコラン酸合成経路に作用する遺伝子またはコードされるポリペプチドの不活性化が特に好ましい。例示的なコラン酸合成遺伝子は、wcaJ遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号（アミノ酸）BAA15900（GI:1736749））、wcaA遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号（アミノ酸）BAA15912.1（GI:1736762））、wcaC遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号（アミノ酸）BAE76574.1（GI:85675203））、wcaE遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号（アミノ酸）BAE76572.1（GI:85675201））、wcaI遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号（アミノ酸）BAA15906.1（GI:1736756））、wcaL遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号（アミノ酸）BAA15898.1（GI:1736747））、wcaB遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号（アミノ酸）BAA15911.1（GI:1736761））、wcaF遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号（アミノ酸）BAA15910.1（GI:1736760））、wzxE遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号（アミノ酸）BAE77506.1（GI:85676256））、wzxC遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号（アミノ酸）BAA15899（GI:1736748））、wcaD遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号（アミノ酸）BAE76573（GI:85675202））、wza遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号（アミノ酸）BAE76576（GI:85675205））、wzb遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号（アミノ酸）BAE76575（GI:85675204））およびwzc遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号（アミノ酸）BAA15913（GI:1736763））を含むがこれらに限定されない。
【００１８】
好ましくは、宿主細菌、例えば大腸菌は、UDP-グルコース脂質キャリアトランスフェラーゼをコードするwcaJ遺伝子の不活性化によってヒトミルクオリゴ糖を生産するよう遺伝子操作される。wcaJ遺伝子の不活性化は、コードされるwcaJの活性が野生型大腸菌と比較して減少または消滅するwcaJ遺伝子の遺伝子欠失、ヌル変異または不活性化変異によるものであり得る。wcaJヌルの背景の下で、GDP-フコースは、大腸菌の細胞質に蓄積される。
【００１９】
コラン酸合成経路における正の調節タンパク質RcsA（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号M58003（GI:1103316））の過剰発現は、細胞内GDP-フコースレベルを増大させる。コラン酸生合成のさらなる正の調節因子、すなわちRcsB（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号E04821（GI:2173017））の過剰発現もまた、細胞内GDP-フコースレベルを増大させるために、RcsAの過剰発現に代えてまたはそれに加えてのいずれかで利用される。
【００２０】
あるいは、コラン酸生合成は、大腸菌lon遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号L20572（GI:304907））への変異の導入後に増大する。lonは、大腸菌におけるコラン酸生合成の正の転写調節因子として前出のRcsAの分解を担うアデノシン-5'-三リン酸（ATP）依存性細胞内プロテアーゼである。lonヌルの背景の下で、RcsAは安定化され、RcsAレベルが増大し、大腸菌においてGDP-フコース合成を担う遺伝子が上方調節され、細胞内GDP-フコース濃度が増強される。本明細書に示される方法と共に使用するのに適したlonの変異は、lonの発現または機能を妨害するヌル変異または挿入を含む。
【００２１】
機能的なラクトースパーミアーゼ遺伝子も細菌内に存在する。ラクトースパーミアーゼ遺伝子は、内因性ラクトースパーミアーゼ遺伝子または外因性ラクトースパーミアーゼ遺伝子である。例えば、ラクトースパーミアーゼ遺伝子は、大腸菌lacY遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号V00295（GI:41897））を含む。多くの細菌は、（例えば、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）において見出されるような）大腸菌ラクトースパーミアーゼのホモログであるかまたは（例えば、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）およびラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）において見出されるような）偏在性PTS糖輸送ファミリーのメンバーであるトランスポーターのいずれかである輸送タンパク質を利用することによって、成長培地から細胞内へとラクトースを輸送する生来的な能力を有している。細胞外ラクトースを細胞質に輸送する生来的な能力を欠く細菌の場合、この能力は、組み換えDNAコンストラクトにより提供され、プラスミド発現ベクター上でまたは宿主染色体に組み込まれた外因性遺伝子としてのいずれかで供給される外因性ラクトーストランスポーター遺伝子（例えば、大腸菌lacY）によって付与される。
【００２２】
本明細書に記載される場合、いくつかの態様において、宿主細菌は、好ましくは、減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性を有する。細菌が内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子の欠失によって特徴付けられる態様において、外因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子が細菌に導入される。例えば、外因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するプラスミドが細菌に導入されるか、または宿主ゲノムに組み換えもしくは組み込みされる。例えば、外因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子は、宿主細菌において不活性化される遺伝子、例えばlon遺伝子に挿入される。
【００２３】
外因性b-ガラクトシダーゼ遺伝子は、いかなる遺伝子操作も欠く野生型細菌におけるβ-ガラクトシダーゼ活性との比較で減少したまたは低いレベルのb-ガラクトシダーゼ活性によって特徴付けられる機能的なb-ガラクトシダーゼ遺伝子である。例示的なβ-ガラクトシダーゼ遺伝子は、大腸菌lacZおよび多くの他の生物のいずれか由来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子（例えば、b-ガラクトシドから単糖への加水分解を触媒するクルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）のlac4遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号M84410（GI:173304）））を含む。野生型大腸菌におけるβ-ガラクトシダーゼ活性のレベルは、例えば、6,000単位である。したがって、本発明の改変宿主細菌に含まれる減少したβ-ガラクトシダーゼ活性レベルは、6,000単位未満、5,000単位未満、4,000単位未満、3,000単位未満、2,000単位未満、1,000単位未満、900単位未満、800単位未満、700単位未満、600単位未満、500単位未満、400単位未満、300単位未満、200単位未満、100単位未満または50単位未満を含む。β-ガラクトシダーゼの低い機能的なレベルは、0.05〜1,000単位の間のβ-ガラクトシダーゼ活性レベル、例えば0.05〜750単位の間、0.05〜500単位の間、0.05〜400単位の間、0.05〜300単位の間、0.05〜200単位の間、0.05〜100単位の間、0.05〜50単位の間、0.05〜10単位の間、0.05〜5単位の間、0.05〜4単位の間、0.05〜3単位の間または0.05〜2単位の間のβ-ガラクトシダーゼ活性を含む。単位の定義およびβ-ガラクトシダーゼ活性を決定するアッセイに関しては、Miller JH, Laboratory CSH. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, NY; 1972;（参照により本明細書に組み入れられる）を参照のこと。この低レベルの細胞質β-ガラクトシダーゼ活性は、細胞内ラクトースプールを有意に縮小するほど十分高くない。低レベルのβ-ガラクトシダーゼ活性は、発酵の終了時における望ましくない残留ラクトースの除去を促進するのに非常に有用である。
【００２４】
任意で、細菌は、不活性化されたthyA遺伝子を有する。好ましくは、宿主細菌におけるthyA遺伝子内の変異は、選択マーカー遺伝子としてthyAを有するプラスミドの維持を可能にする。例示的な代替の選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子、例えばBLA（β-ラクタマーゼ）またはproBA遺伝子（proAB宿主株のプロリン栄養要求性を補完するため）もしくはpurA（purA宿主株のアデニン栄養要求性を補完するため）を含む。
【００２５】
1つの局面において、大腸菌は、遺伝子型ΔampC::PtrpBcI, Δ(lacI-lacZ)::FRT, PlacIqlacY+, ΔwcaJ::FRT, thyA::Tn10, Δlon:(npt3, lacZ+), ΔlacAを含み、かつ本明細書に記載される外因性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼのいずれか一つも含む。
【００２６】
これらの特徴を有する細菌は、ラクトースの存在下で培養される。いくつかの例において、この方法はさらに、トリプトファンの存在下およびチミジンの非存在下で細菌を培養する工程を含む。フコシル化オリゴ糖は、細菌（すなわち、細胞溶解産物）からまたは細菌の培養上清から回収される。
【００２７】
本発明は、本明細書に記載される方法によって生産された、精製されたフコシル化オリゴ糖を提供する。治療用もしくは栄養補給用製品において使用するためにフコシル化オリゴ糖を精製するか、またはそのような製品において細菌を直接使用する。改変された細菌によって生産されるフコシル化オリゴ糖は、2'-フコシルラクトース（2'-FL）またはラクトジフコテトラオース（LDFT）である。新規のアルファ1,2-フコシルトランスフェラーゼはまた、アルファ1,2フコース部分を保有するより高分子量のHMOS、例えばラクト-N-フコペンタオース（LNF I）およびラクト-N-ジフコヘキサオース（LDFH I）を合成するのにも有用である。例えば、LDFTを生産するために、宿主細菌は、α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ活性も有する外因性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ、または外因性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼおよび外因性α(1,3)フコシルトランスフェラーゼを発現するよう改変される。LNF IおよびLDFH Iの生産のために、宿主細菌は、α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ活性および／もしくはα(1,4)フコシルトランスフェラーゼ活性も有する外因性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ、または外因性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ、外因性α(1,3)フコシルトランスフェラーゼおよび外因性α(1,4)フコシルトランスフェラーゼを発現するよう改変される。
【００２８】
上記の方法によって生産された精製されたフコシル化オリゴ糖もまた本発明の範囲内である。このプロセスの終了時に得られた精製されたオリゴ糖（2'-FL）は、白色／ややオフホワイト色、結晶性の甘い粉末である。例えば、本発明にしたがう改変された細菌、細菌培養上清または細菌細胞溶解産物は、本明細書に記載される方法によって生産された2'-FL、LDFT、LNF IまたはLDFH Iを含み、細胞、培養上清または溶解産物からのフコシル化オリゴ糖産物の精製の前に他のフコシル化オリゴ糖を実質的に含まない。一般的事項として、この方法によって生産されるフコシル化オリゴ糖は、2'-FL含有細胞、細胞溶解産物もしくは培養物、または上清中に無視できる量の、例えば2'-FLのレベルの1％未満または2'-FLのレベルの0.5%未満の3-FLを含む。さらに、本明細書に記載される方法によって生産されるフコシル化オリゴ糖はまた、しばしばフコシル化オリゴ糖産物、例えば2'FLと共に精製され得る最小限の量の混入ラクトースを含む。この混入ラクトースの減少は、改変された宿主細菌中に存在する減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性によるものである。
【００２９】
精製されたオリゴ糖、例えば2'-FL、LDFT、LNF I、またはLDFH Iは、重量で少なくとも90％、95％、98％、99％または100％（w/w）が所望のオリゴ糖であるものである。純度は、任意の公知の方法、例えば薄層クロマトグラフィーまたは当技術分野で公知のその他のクロマトグラフィー技術によって評価される。本発明は、上記の遺伝子改変された細菌により生産されたフコシル化オリゴ糖を精製する方法であって、所望のフコシル化オリゴ糖（例えば、2'-FL）を、細菌の細菌細胞溶解産物または細菌細胞培養上清中の混在物質から分離する工程を含む方法、を含む。
【００３０】
オリゴ糖は、精製され、そしてヒトおよび動物、例えばコンパニオンアニマル（イヌ、ネコ）ならびに家畜（ウシ類、ウマ類、ヒツジ類、ヤギ類またはブタ類動物および家禽）によって消費される多くの製品において使用される。例えば、薬学的組成物は、精製された2'-FLおよび経口投与に適した薬学的に許容される賦形剤を含む。多量の2'-FLが細菌宿主、例えば外因性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む大腸菌において生産される。
【００３１】
精製されたヒト乳オリゴ糖（HMOS）を含む薬学的組成物を生産する方法は、上記の細菌を培養し、細菌によって生産されるHMOSを精製し、そしてHMOSを賦形剤または担体と組み合わせて経口投与用栄養補助製品を生成することによって実施される。これらの組成物は、乳児および成人における腸および／または呼吸器疾患を予防または処置する方法において有用である。したがって、組成物は、そのような疾患を患っているまたはそのような疾患を発症する危険がある対象に投与される。
【００３２】
本発明はまた、宿主細菌においてフコシル化オリゴ糖を、すなわち、大腸菌において2'-フコシルラクトース（2'-FL）を合成することができるα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を同定する方法を提供する。この新規のラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素を同定する方法は、以下の工程：
1）配列データベースのコンピュータ検索を行い、任意の既知のラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼの単純配列ホモログ（simple sequence homolog）の大グループを定義する工程；
2）工程（1）のリストを使用して、リストのメンバーによって共有されている共通配列および／または構造モチーフを含む検索プロフィールを抽出する工程；
3）工程（2）で抽出された共通配列または構造モチーフに基づく検索プロフィールをクエリーとして使用して配列データベースを検索し、参照ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼに対する配列相同性が既定のパーセントしきい値である候補配列を同定する工程；
4）自然状態でα(1,2)フコシル-グリカンを発現することで特徴づけられる候補生物のリストをコンパイルする工程；
5）候補生物由来である候補配列を選択し、候補ラクトース利用性酵素のリストを生成する工程；
6）宿主生物において候補ラクトース利用性酵素を発現させる工程；ならびに
7）ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ活性について試験する工程であって、その生物における所望のフコシル化オリゴ糖産物の検出が、候補配列が新規のラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼを含むことを示す、工程、
を含む。別の態様において、検索プロフィールは、既知のα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する2つ以上の酵素のアミノ酸配列の多配列アラインメントから生成される。データベース検索は、その後、多配列アラインメントクエリーに対して有意な配列類似性を有する新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼを純化し繰り返し検索するよう設計され得る。
【００３３】
本発明は、対象において感染を処置する、予防するまたはその危険を低下させる方法であって、精製された組み換えヒト乳オリゴ糖を含む組成物を対象に投与する工程を含み、ここでHMOSは病原体に結合し、対象は病原体に感染しているまたは感染する危険がある、方法を提供する。1つの局面において、感染は、ノーウォーク様（Norwalk-like）ウイルスまたはカンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）によって引き起こされる。対象は、好ましくはそのような処置を必要とする哺乳動物である。哺乳動物は、例えば、任意の哺乳動物、例えばヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマまたはブタである。好ましい態様において、哺乳動物はヒトである。例えば、組成物は、動物用飼料（例えば、ペレット、キブル、マッシュ）またはコンパニオンアニマル、例えばイヌもしくはネコならびに食用で飼育される家畜または動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリおよびヤギのための動物用栄養補助製品に配合される。好ましくは、精製されたHMOSは、粉末（例えば、各々消費前に液体、例えば水もしくはジュースと混合される、乳児用の配合粉末もしくは成人用の栄養補助粉末）にもしくは錠剤、カプセルもしくはペーストの形態で配合されるか、または乳製品、例えば乳、クリーム、チーズ、ヨーグルトもしくはケフィアの一成分としてもしくは任意の飲料の一成分として組み込まれるか、またはプロバイオティクスの役割を果たすことが意図されている生菌培養物を含む調製物もしくはインビトロもしくはインビボのいずれかで有益な微生物の成長を高めるプレバイオティクス調製物に組み入れられる。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびオリゴ糖は、精製および／または単離される。精製は、ヒト対象への投与に関して安全である低不純物性（sterility）の程度、例えば感染性または毒性の作用物質の欠如、を定義する。詳細には、本明細書で使用される場合、「単離」または「精製」された核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質またはオリゴ糖は、他の細胞物質または、組み換え技術によって生産される場合は培養培地、または化学合成される場合は化学前駆体もしくは他の化合物を、実質的に含まない。例えば、精製されたHMOS組成物は、重量（乾燥重量）で少なくとも60％が関心対象の化合物である。好ましくは、調製物は、重量で、少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも99％が関心対象の化合物である。純度は、任意の適切な標準的方法によって、例えばカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーまたは高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）分析によって測定される。例えば、「精製されたタンパク質」は、自然界では付随する他のタンパク質、脂質および核酸から分離されたタンパク質を表す。好ましくは、タンパク質は、精製された調製物の乾燥重量で、少なくとも10、20、50、70、80、90、95、99〜100％を構成する。
【００３５】
同様に、「実質的に純粋」は、オリゴ糖が自然界では付随する成分から分離されていることを意味する。典型的に、オリゴ糖は、自然界では付随するタンパク質および天然有機分子を重量で少なくとも60％、70％、80％、90％、95％さらには99％含まない場合に、実質的に純粋である。
【００３６】
「単離された核酸」は、本発明のDNAの由来となった生物の天然に存在するゲノムにおいてその遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸を意味する。この用語は、例えば：（a）天然に存在するゲノムDNA分子の一部分であるが、自然界でそれを生成する生物のゲノムにおいてその分子の一部分に隣接している両方の核酸配列によって隣接されていないDNA；（b）生成される分子が任意の天然に存在するベクターまたはゲノムDNAと同一とならない様式でベクターまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれた核酸；（c）分離された分子、例えばcDNA、ゲノムフラグメント、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生成されたフラグメントまたは制限フラグメント；および（d）ハイブリッド遺伝子、すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子の一部分である組み換えヌクレオチド配列、を包含する。本発明にしたがう単離された核酸分子はさらに、合成により生産された分子ならびに化学的に変更されたおよび／または修飾された骨格を有する任意の核酸を含む。
【００３７】
「異種プロモーター」は、遺伝子または核酸配列が本来機能的に連結されているプロモーターとは異なるプロモーターである。
【００３８】
「過剰発現（overexpressまたはoverexpression）」という用語は、同一条件下で野生型細胞によるよりも多量の因子が遺伝子改変された細胞によって発現される状態を表す。同様に、未改変の細胞が、遺伝子改変され生産されるようになる因子を発現しない場合は、「発現」という用語（「過剰発現」と区別される」が使用され、野生型細胞が遺伝子操作以前にその因子を全く発現しなかったことが示される。
【００３９】
本明細書で使用される「処置（treatingおよびtreatment）」という用語は、有害な状態、障害または疾患を患っている臨床症候を示す個体に薬剤または配合物を投与し、症状の重症度および／もしくは頻度を軽減する、症状および／もしくはその根底にある原因を取り除く、ならびに／または損傷の改善もしくは治療を促進することを表す。「予防（preventingおよびprevention）」という用語は、特定の有害な状態、障害または疾患にかかりやすい臨床症候を示していない個体への薬剤または組成物の投与を表し、したがって症状および／またはそれらの根底にある原因の発生の予防に関する。
【００４０】
「有効量」および「治療有効量」の配合物または配合成分という用語は、非毒性であるが、所望の効果を提供するのに十分な量の配合物または成分を意味する。
【００４１】
「含む（including、containing）」または「により特徴づけられる」と同義の「含む」という用語は、包含的またはオープンエンド型であり、追加の、言及されていない要素または方法の工程を排除しない。対照的に、「からなる」というフレーズは、請求項の中で指定されていないあらゆる要素、工程または成分を排除する。「から本質的になる」というフレーズは、請求項の範囲を、指定されている物質または工程および請求項記載の発明の基本的かつ新規の特徴に実質的な悪影響を及ぼさないそれらに制限する。
【００４２】
ラクトース受容性フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現させるために使用される宿主生物は、典型的に、腸内細菌である大腸菌K12である。大腸菌K-12は、ヒトまたは動物の病原体であるまたは毒発生性であるとみなされていない。大腸菌K-12は、標準的な細菌生産株であり、結腸でコロニー形成し感染する能力の乏しさに由来するその安全性が報告されている（例えば、epa.gov/oppt/biotech/pubs/fra/fra004.htmを参照のこと）。しかし、様々な細菌種が、オリゴ糖生合成法において使用され得る、例えば、エルウィニア・ヘルビコラ（Erwinia herbicola）（パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans））、シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundii）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）、ペクトバクテリウム・カロトボルム（Pectobacterium carotovorum）またはザントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）。バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーモフィルス（Bacillus thermophilus）、バチルス・ラテロスポールス（Bacillus laterosporus）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）およびバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）を含むバチルス属の細菌もまた使用され得る。同様に、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・クリスパータス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・イエンセニイ（Lactobacillus jensenii）およびラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）を含むがこれらに限定されないラクトバチルス（Lactobacillus）およびラクトコッカス（Lactococcus）属の細菌が、本発明の方法を用いて修飾され得る。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophiles）およびプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Proprionibacterium freudenreichii）もまた、本明細書に記載される発明に適した細菌種である。本明細書に記載されるように修飾された、エンテロコッカス（Enterococcus）（例えば、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）およびエンテロコッカス・サーモフィルス（Enterococcus thermophiles））、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）（例えば、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）およびビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum））属、スポロラクトバチルス（Sporolactobacillus）種、ミクロモノスポラ（Micromomospora）種、ミクロコッカス（Micrococcus）種、ロドコッカス（Rhodococcus）種およびシュードモナス（Pseudomonas）（例えば、シ��ードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）およびシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa））由来の菌株もまた本発明の一部として含まれる。本明細書に記載される特徴を含む細菌は、ラクトースの存在下で培養され、そしてフコシル化オリゴ糖が、細菌自体または細菌の培養上清のいずれかから回収される。フコシル化オリゴ糖は、治療用もしくは栄養補給用製品において使用するために精製され、または細菌がそのような製品において直接使用される。適当な生産宿主細菌株は、そのフコシルトランスフェラーゼコード核酸配列が同定された元の細菌株と同一細菌株ではないものである。
【００４３】
本発明の他の特徴および利点は、以下のその好ましい態様の説明からおよび特許請求の範囲から明らかとなるであろう。それ以外のことが定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験には本明細書に記載されているのと類似または等価な方法および材料が使用され得るが、以下では適当な方法および材料が説明されている。本明細書で言及されているすべての公開された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書で引用されているアクセッション番号によって示されるGenbankおよびNCBI提出物は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書で引用されているすべての他の公開された参考文献、文書、原稿および科学文献は、参照により本明細書に組み入れられる。齟齬が生じる場合は、定義を含めて本明細書が優先される。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定を意図したものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図1は、ヒト乳に見られる主要中性フコシルオリゴ糖合成経路を示す概略図である。
【図２】図2は、代謝経路および大腸菌において2'-フコシルラクトース（2'-FL）合成を行うためにそれらに導入された変更点を示す概略図である。詳細には、ラクトース合成経路およびGDP-フコース合成経路が示されている。GDP-フコース合成経路において：manA = ホスホマンノースイソメラーゼ（PMI）、manB = ホスホマンノムターゼ（PMM）、manC = マンノース-1-リン酸グアニリルトランスフェラーゼ（GMP）、gmd = GDP-マンノース-4,6-デヒドラターゼ、fcl = GDP-フコースシンターゼ（GFS）およびΔwcaJ = 変異UDP-グルコース脂質キャリアトランスフェラーゼである。
【図３Ａ】図3は、4つの以前から公知のラクトース利用性α(1,2)-フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列の配列同一性および多配列アラインメントを示す。図3Aは、4つの公知のラクトース利用性α(1,2)-フコシルトランスフェラーゼ：H.ピロリfutC（SEQ ID NO:1）、H.ムステラエFutL（SEQ ID NO:2）、バクテロイデス・ブルガタスfutN（SEQ ID NO:3）および大腸菌O126 wbgL（SEQ ID NO:4）の間の配列同一性を示す表である。
【図３Ｂ】図3は、4つの以前から公知のラクトース利用性α(1,2)-フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列の配列同一性および多配列アラインメントを示す。図3Bは、4つの公知のα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼの多配列アラインメントを示す。楕円は、アラインメントにおける4つの酵素間の特に高い配列保存の領域を強調表示している。
【図４Ａ】図4は、4つの以前から公知のラクトース利用性α（1,2）-フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列に沿う、12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼシンジーンの配列アラインメントを示している。4つの公知のラクトース利用性α(1,2)-フコシルトランスフェラーゼがボックスで囲まれており、H.ピロリfutC（SEQ ID NO:1）、H.ムステラエFutL（SEQ ID NO:2）、バクテロイデス・ブルガタスfutN（SEQ ID NO:3）および大腸菌O126 wbgL（SEQ ID NO:4）を含む。12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼは以下の通りである：プレボテラ・メラニノゲニカFutO（SEQ ID NO:10）、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP（SEQ ID NO:292）、ラクノスピラセアエ種FutQ（SEQ ID NO:12）、メタノスファエルラ・パルストリスFutR（SEQ ID NO:13）、タネレラ種FutS（SEQ ID NO:14）、バクテロイデス・カカエFutU（SEQ ID NO:15）、ブチリビブリオFutV（SEQ ID NO:16）、プレボテラ種FutW（SEQ ID NO:17）、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX（SEQ ID NO:18）、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY（SEQ ID NO:19）、サルモネラ菌FutZ（SEQ ID NO:20）、バクテロイデス種FutZA（SEQ ID NO:21）。クロストリジウム・ボルテアエFutPの配列（N末端に13個の追加アミノ酸を有さない）（SEQ ID NO:11）も、このアラインメントに示されている。
【図４Ｂ】図4は、4つの以前から公知のラクトース利用性α（1,2）-フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列に沿う、12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼシンジーンの配列アラインメントを示している。4つの公知のラクトース利用性α(1,2)-フコシルトランスフェラーゼがボックスで囲まれており、H.ピロリfutC（SEQ ID NO:1）、H.ムステラエFutL（SEQ ID NO:2）、バクテロイデス・ブルガタスfutN（SEQ ID NO:3）および大腸菌O126 wbgL（SEQ ID NO:4）を含む。12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼは以下の通りである：プレボテラ・メラニノゲニカFutO（SEQ ID NO:10）、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP（SEQ ID NO:292）、ラクノスピラセアエ種FutQ（SEQ ID NO:12）、メタノスファエルラ・パルストリスFutR（SEQ ID NO:13）、タネレラ種FutS（SEQ ID NO:14）、バクテロイデス・カカエFutU（SEQ ID NO:15）、ブチリビブリオFutV（SEQ ID NO:16）、プレボテラ種FutW（SEQ ID NO:17）、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX（SEQ ID NO:18）、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY（SEQ ID NO:19）、サルモネラ菌FutZ（SEQ ID NO:20）、バクテロイデス種FutZA（SEQ ID NO:21）。クロストリジウム・ボルテアエFutPの配列（N末端に13個の追加アミノ酸を有さない）（SEQ ID NO:11）も、このアラインメントに示されている。
【図４Ｃ】図4は、4つの以前から公知のラクトース利用性α（1,2）-フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列に沿う、12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼシンジーンの配列アラインメントを示している。4つの公知のラクトース利用性α(1,2)-フコシルトランスフェラーゼがボックスで囲まれており、H.ピロリfutC（SEQ ID NO:1）、H.ムステラエFutL（SEQ ID NO:2）、バクテロイデス・ブルガタスfutN（SEQ ID NO:3）および大腸菌O126 wbgL（SEQ ID NO:4）を含む。12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼは以下の通りである：プレボテラ・メラニノゲニカFutO（SEQ ID NO:10）、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP（SEQ ID NO:292）、ラクノスピラセアエ種FutQ（SEQ ID NO:12）、メタノスファエルラ・パルストリスFutR（SEQ ID NO:13）、タネレラ種FutS（SEQ ID NO:14）、バクテロイデス・カカエFutU（SEQ ID NO:15）、ブチリビブリオFutV（SEQ ID NO:16）、プレボテラ種FutW（SEQ ID NO:17）、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX（SEQ ID NO:18）、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY（SEQ ID NO:19）、サルモネラ菌FutZ（SEQ ID NO:20）、バクテロイデス種FutZA（SEQ ID NO:21）。クロストリジウム・ボルテアエFutPの配列（N末端に13個の追加アミノ酸を有さない）（SEQ ID NO:11）も、このアラインメントに示されている。
【図４Ｄ】図4は、4つの以前から公知のラクトース利用性α（1,2）-フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列に沿う、12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼシンジーンの配列アラインメントを示している。4つの公知のラクトース利用性α(1,2)-フコシルトランスフェラーゼがボックスで囲まれており、H.ピロリfutC（SEQ ID NO:1）、H.ムステラエFutL（SEQ ID NO:2）、バクテロイデス・ブルガタスfutN（SEQ ID NO:3）および大腸菌O126 wbgL（SEQ ID NO:4）を含む。12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼは以下の通りである：プレボテラ・メラニノゲニカFutO（SEQ ID NO:10）、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP（SEQ ID NO:292）、ラクノスピラセアエ種FutQ（SEQ ID NO:12）、メタノスファエルラ・パルストリスFutR（SEQ ID NO:13）、タネレラ種FutS（SEQ ID NO:14）、バクテロイデス・カカエFutU（SEQ ID NO:15）、ブチリビブリオFutV（SEQ ID NO:16）、プレボテラ種FutW（SEQ ID NO:17）、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX（SEQ ID NO:18）、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY（SEQ ID NO:19）、サルモネラ菌FutZ（SEQ ID NO:20）、バクテロイデス種FutZA（SEQ ID NO:21）。クロストリジウム・ボルテアエFutPの配列（N末端に13個の追加アミノ酸を有さない）（SEQ ID NO:11）も、このアラインメントに示されている。
【図４Ｅ】図4は、4つの以前から公知のラクトース利用性α（1,2）-フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列に沿う、12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼシンジーンの配列アラインメントを示している。4つの公知のラクトース利用性α(1,2)-フコシルトランスフェラーゼがボックスで囲まれており、H.ピロリfutC（SEQ ID NO:1）、H.ムステラエFutL（SEQ ID NO:2）、バクテロイデス・ブルガタスfutN（SEQ ID NO:3）および大腸菌O126 wbgL（SEQ ID NO:4）を含む。12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼは以下の通りである：プレボテラ・メラニノゲニカFutO（SEQ ID NO:10）、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP（SEQ ID NO:292）、ラクノスピラセアエ種FutQ（SEQ ID NO:12）、メタノスファエルラ・パルストリスFutR（SEQ ID NO:13）、タネレラ種FutS（SEQ ID NO:14）、バクテロイデス・カカエFutU（SEQ ID NO:15）、ブチリビブリオFutV（SEQ ID NO:16）、プレボテラ種FutW（SEQ ID NO:17）、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX（SEQ ID NO:18）、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY（SEQ ID NO:19）、サルモネラ菌FutZ（SEQ ID NO:20）、バクテロイデス種FutZA（SEQ ID NO:21）。クロストリジウム・ボルテアエFutPの配列（N末端に13個の追加アミノ酸を有さない）（SEQ ID NO:11）も、このアラインメントに示されている。
【図４Ｆ】図4は、4つの以前から公知のラクトース利用性α（1,2）-フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列に沿う、12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼシンジーンの配列アラインメントを示している。4つの公知のラクトース利用性α(1,2)-フコシルトランスフェラーゼがボックスで囲まれており、H.ピロリfutC（SEQ ID NO:1）、H.ムステラエFutL（SEQ ID NO:2）、バクテロイデス・ブルガタスfutN（SEQ ID NO:3）および大腸菌O126 wbgL（SEQ ID NO:4）を含む。12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼは以下の通りである：プレボテラ・メラニノゲニカFutO（SEQ ID NO:10）、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP（SEQ ID NO:292）、ラクノスピラセアエ種FutQ（SEQ ID NO:12）、メタノスファエルラ・パルストリスFutR（SEQ ID NO:13）、タネレラ種FutS（SEQ ID NO:14）、バクテロイデス・カカエFutU（SEQ ID NO:15）、ブチリビブリオFutV（SEQ ID NO:16）、プレボテラ種FutW（SEQ ID NO:17）、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX（SEQ ID NO:18）、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY（SEQ ID NO:19）、サルモネラ菌FutZ（SEQ ID NO:20）、バクテロイデス種FutZA（SEQ ID NO:21）。クロストリジウム・ボルテアエFutPの配列（N末端に13個の追加アミノ酸を有さない）（SEQ ID NO:11）も、このアラインメントに示されている。
【図５】図5Aおよび図5Bは、12個の新規のα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼの各々のシンジーンの構築を示す2つのゲルの写真である。図5Aは、ギブソンアッセンブリー後PCRを示している。図5Bは、ゲル精製されたRI/XhoIシンジーンフラグメントを示している。
【図６】図6Aおよび図6Bは、12個の新規のα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼシンジーンを用いて大腸菌培養物中で生産されたフコシル化オリゴ糖産物の薄層クロマトグラムを示す2つの写真である。図6Aは、2μlの培養上清由来のフコシル化オリゴ糖産物を示している。図6Bは、総細胞熱抽出物の0.2 OD600細胞等価物由来のフコシル化オリゴ糖産物を示している。
【図７】図7は、培養培地中ラクトース存在下でのトリプトファン誘導（すなわち、lac + trp）後のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子WbgL、FutN、FutO、FutQおよびFutXを含むプラスミドを発現する宿主細菌の成長曲線を示すグラフである。
【図８】図8は、誘導後のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子WbgL、FutN、FutO、FutQおよびFutXを発現する宿主細菌から生産されたタンパク質を示すSDS-PAGEゲルの写真である。
【図９Ａ】図9は、誘導から7時間または24時間後の選択されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼシンジーンWbgL、FutN、FutO、FutQおよびFutXを発現する大腸菌培養物由来のフコシル化オリゴ糖産物の生産を示す薄層クロマトグラムの2つの写真である。図9Aは、2μlの培養上清由来のフコシル化オリゴ糖産物を示している。
【図９Ｂ】図9は、誘導から7時間または24時間後の選択されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼシンジーンWbgL、FutN、FutO、FutQおよびFutXを発現する大腸菌培養物由来のフコシル化オリゴ糖産物の生産を示す薄層クロマトグラムの2つの写真である。図9Bは、総細胞熱抽出物の0.2 OD600細胞等価物由来のフコシル化オリゴ糖産物を示している。
【図１０】図10Aおよび図10Bは、FutNを発現する大腸菌からの2つの異なる1.5L発酵実施:図10A）36Bおよび図10B）37A後のフコシル化オリゴ糖産物を示す薄層クロマトグラムの2つの写真である。実施36Bの培養収量は33g/Lであり、実施37Aの収量は36.3g/Lであった。
【図１１】図11は、B.ブルガタスFutN遺伝子を有するpG217のプラスミドマップである。
【図１２】図12は、LacIqプロモーター、機能的lacY遺伝子の挿入およびlacAの欠失を示す概要図である。
【図１３】図13は、FRT組み換えを用いた内因性wcaJ遺伝子の欠失を示す概要図である。
【図１４】図14は、カナマイシン耐性遺伝子（トランスポゾンTn5由来）および野生型lacZを有するDNAフラグメントのlon遺伝子への挿入を示す、大腸菌W3110染色体の概要図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
発明の詳細な説明
いくつかの研究はヒト乳グリカンが抗菌性抗接着剤として使用され得ることを示唆しているが、ヒトが消費するのに適した品質のこれらの剤を十分量生産する困難さおよび費用の高さがそれらのフルスケールの試験および想定されている用途を制限している。必要とされていることは、妥当な費用で十分量の適当なグリカンを生産する適切な方法である。本明細書に記載される本発明より以前に、グリカン合成に関して様々な異なる合成アプローチを使用する試みがなされていた。いくつかの化学的アプローチは、オリゴ糖を合成することができる（Flowers,H.M. Methods Enzymol 50, 93-121 (1978); Seeberger,P.H. Chem Commun (Camb) 1115-1121 (2003)）が、これらの方法のための試薬は高価でありかつ潜在的に毒性である（Koeller,K.M. & Wong,C.H. Chem Rev 100, 4465-4494 (2000)）。改変された生物から発現される酵素（Albermann,C., Piepersberg,W. & Wehmeier,U.F. Carbohydr Res 334, 97-103 (2001); Bettler,E., Samain,E., Chazalet,V., Bosso,C., et al. Glycoconj J 16, 205-212 (1999); Johnson,K.F. Glycoconj J 16, 141-146 (1999); Palcic,M.M. Curr Opin Biotechnol 10, 616-624 (1999); Wymer,N. & Toone,E.J. Curr Opin Chem Biol 4, 110-119 (2000)）は正確かつ効率的な合成を提供する（Palcic,M.M. Curr Opin Biotechnol 10, 616-624 (1999); Crout,D.H. & Vic,G. Curr Opin Chem Biol 2, 98-111 (1998)）が、試薬、特に糖ヌクレオチドの費用の高さが、低費用大規模生産におけるそれらの利用を制限している。微生物は、その細菌の生まれつきのヌクレオチド糖プールからオリゴ糖を合成するのに必要とされるグリコシルトランスフェラーゼを発現するよう遺伝子改変される（Endo,T., Koizumi,S., Tabata,K., Kakita,S. & Ozaki,A. Carbohydr Res 330, 439-443 (2001); Endo,T., Koizumi,S., Tabata,K. & Ozaki,A. Appl Microbiol Biotechnol 53, 257-261 (2000); Endo,T. & Koizumi,S. Curr Opin Struct Biol 10, 536-541 (2000); Endo,T., Koizumi,S., Tabata,K., Kakita,S. & Ozaki,A. Carbohydr Res 316, 179-183 (1999); Koizumi,S., Endo,T., Tabata, K. & Ozaki,A. Nat Biotechnol 16, 847-850 (1998)）。しかし、本明細書に記載される本発明より以前には、代謝的に改変された細菌宿主におけるHMOS合成に有用なさらなるグリコシルトランスフェラーゼを同定および特徴づける要望が高まっていた。
【００４６】
ヒト乳グリカン
ヒト乳は、多種で豊富な中性および酸性オリゴ糖群を含んでいる（Kunz,C., Rudloff,S., Baier,W., Klein,N., and Strobel,S. (2000). Annu Rev Nutr 20, 699-722; Bode,L. (2006). J Nutr 136, 2127-130）。130を超える異なる複合オリゴ糖がヒト乳において同定されており、それらの構造の多様さおよび豊富さは、ヒトに特有である。これらの分子は、栄養分としては乳児によって直接利用されないかもしれないが、そうであったとしてもそれらは健康な腸内微生物環境の確立（Marcobal,A., Barboza,M., Froehlich,J.W., Block,D.E., et al. J Agric Food Chem 58, 5334-5340 (2010)）、疾患の予防（Newburg,D.S., Ruiz-Palacios,G.M. & Morrow,A.L. Annu Rev Nutr 25, 37-58 (2005)）および免疫機能（Newburg,D.S. & Walker,W.A. Pediatr Res 61, 2-8 (2007)）において重要な役割を果たしている。ヒト乳オリゴ糖（HMOS）との接触が数百年に及んでいるにもかかわらず、病原体は今もなお、標的細胞への接着を妨げ感染を阻害するHMOSの能力を回避する方法を開発しなければならない。病原体接着阻害物質としてHMOSを利用する能力は、現在の急増する抗生物質耐性の危機に取り組む上で有用である。生合成により生産されたヒト乳オリゴ糖は、社会の最も対処困難な問題のいくつかに対する新規クラスの治療剤のリード化合物となる。
【００４７】
効率的、工業規模のHMOS合成の1つの代替戦略は、細菌の代謝改変である。このアプローチでは、細菌サイトゾルへの前駆体糖の取り込みのための膜輸送体である異種グリコシルトランスフェラーゼを過剰発現し、生合成前駆体として使用される再生ヌクレオチド糖の増強されたプールを有する微生物株が構築される（Dumon,C., Samain,E., and Priem,B. (2004). Biotechnol Prog 20, 412-19; Ruffing,A., and Chen, R.R. (2006). Microb Cell Fact 5, 25）。このアプローチの重要な局面は、微生物宿主において過剰発現ために選択される異種グリコシルトランスフェラーゼである。グリコシルトランスフェラーゼの選択は、酵素がキネティクス、基質特異性、ドナーおよびアクセプター分子に対する親和性、安定性ならびに可溶性に関して大きく異なり得るため、所望の合成されるオリゴ糖の最終的な収量に大きく影響し得る。異なる細菌種由来のいくつかのグリコシルトランスフェラーゼが同定され、そして大腸菌宿主株においてHMOSの生合成を触媒するそれらの能力に関して特徴づけられている（Dumon,C., Bosso,C., Utille,J.P., Heyraud,A., and Samain,E. (2006). Chembiochem 7, 359-365; Dumon,C., Samain,E., and Priem,B. (2004). Biotechnol Prog 20, 412-19; Li,M., Liu,X.W., Shao,J., Shen,J., Jia,Q., Yi,W., Song,J.K., Woodward,R.,  Chow,C.S., and Wang,P.G. (2008). Biochemistry 47, 378-387）。より速いキネティクス、ヌクレオチド糖ドナーおよび／もしくはアクセプター分子に対するより高い親和性または細菌宿主内でのより高い安定性を示すさらなるグリコシルトランスフェラーゼの同定は、治療的に有用なHMOSの収量を大きく改善する。本明細書に記載される本発明以前から、HMOSの化学合成が可能であったが、立体特異性の問題、前駆体の入手性、生産物の不純度およびかさむ総費用によって制限されていた（Flowers,H.M. Methods Enzymol 50, 93-121 (1978); Seeberger,P.H. Chem Commun (Camb) 1115-1121 (2003); Koeller,K.M. & Wong,C.H. Chem Rev 100, 4465-4494 (2000)）。本発明は、栄養補助製品として使用するために多量のヒト乳オリゴ糖（HMOS）を安価に生産する新しい戦略を提供することによって、これらの以前の取り組みの欠点を克服する。利点は、酵素の効率的発現、フコシル化オリゴ糖産物（2'-FL、LDFT、LNF I、およびLDFH I）の改善された安定性および／または可溶性ならびに宿主生物に対する低い毒性を含む。本発明は、当技術分野で現在利用されているα(1,2)FTと比べてフコシル化HMOSの効力および収量を増加させるための生産株における発現に適した新しいα(1,2)FTを特徴とする。
【００４８】
以下に詳細に記載されるように、大腸菌（またはその他の細菌）は、商業的に有益なレベルで選択されたフコシル化オリゴ糖（即ち、2'-FL、LDFT、LDFH I、およびLNF I）を生産するよう改変される。例えば、収量は、細菌発酵プロセスにおいて＞5グラム／リットルである。その他の態様において、2'-FL、LDFT、LDFH I、およびLNF Iなどのフコシル化オリゴ糖産物の収量は、10グラム／リットルよりも多い、15グラム／リットルよりも多い、20グラム／リットルよりも多い、25グラム／リットルよりも多い、30グラム／リットルよりも多い、35グラム／リットルよりも多い、40グラム／リットルよりも多い、45グラム／リットルよりも多い、50グラム／リットルよりも多い、55グラム／リットルよりも多い、60グラム／リットルよりも多い、65グラム／リットルよりも多い、70グラム／リットルよりも多い、または75グラム／リットルよりも多い。
【００４９】
感染病におけるヒト乳グリカンの役割
非結合オリゴ糖およびそれらの複合多糖の両方を含むヒト乳グリカンは、乳児の胃腸（GI）管の保護および発達において重要な役割を果たしている。2'-フコシルラクトース（2'-FL）を含む中性フコシル化オリゴ糖は、様々な重要な病原体から乳児を保護する。様々な哺乳動物において見出される乳オリゴ糖は大きく異なっており、ヒトの組成は特有である（Hamosh M., 2001 Pediatr Clin North Am, 48:69-86; Newburg D.S., 2001 Adv Exp Med Biol, 501:3-10）。さらに、ヒト乳におけるグリカンレベルは、授乳期を通じて変化し、個体間でも大きく異なる（Morrow A.L. et al., 2004 J Pediatr, 145:297-303; Chaturvedi P et al., 2001 Glycobiology, 11:365-372）。およそ200個の異なるヒト乳オリゴ糖が同定されており、単エピトープの組み合わせがこの多様性を担っている（Newburg D.S., 1999 Curr_Med Chem, 6:117-127; Ninouevo M. et al., 2006 J Agric Food Chem, 54:7471-74801）。
【００５０】
ヒト乳オリゴ糖は、5個の単糖：D-グルコース（Glc）、D-ガラクトース（Gal）、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、L-フコース（Fuc）およびシアル酸（N-アセチルノイラミン酸、Neu5Ac、NANA）、から構成される。ヒト乳オリゴ糖は、通常、それらの化学構造にしたがい2つのグループ：ラクトース（Galβ1-4Glc）コアに連結されたGlc、Gal、GlcNAcおよびFucを含む中性化合物、ならびに同じ糖およびしばしば同じコア構造プラスNANAを含む酸性化合物に分類される（Charlwood J. et al., 1999 Anal Biochem, 273:261-277; Martin-Sosa et al., 2003 J Dairy Sci, 86:52-59; Parkkinen J. and Finne J., 1987 Methods Enzymol, 138:289-300; Shen Z. et al., 2001 J Chromatogr A, 921:315-321）。
【００５１】
ヒト乳中のオリゴ糖のおよそ70〜80％はフコシル化されており、それらの合成経路は図1に示されるように進行すると考えられている。少数のオリゴ糖はシアル化されるかまたはフコシル化されかつシアル化されるが、それらの合成経路は完全に定義されていない。酸性（シアル化）オリゴ糖の理解は、一部、これらの化合物を測定する能力によって制限されている。中性および酸性の両方のオリゴ糖を分析する高感度かつ再現性のある方法が設計されている。クラスとしてのヒト乳オリゴ糖は、乳児の腸を通じた移動を非常に効果的に生き延び、本質的に非消化性である（Chaturvedi,P., Warren,C.D., Buescher, C.R., Pickering, L.K. & Newburg, D.S. Adv Exp Med Biol 501, 315-323 (2001)）。
【００５２】
ヒト乳グリカンは腸管病原体がそれらの受容体に対して結合するのを阻害する
ヒトミルクグリカンは、腸管病原体の細胞受容体に対する構造的相同性を有し、受容体のデコイとして機能する。例えば、カンピロバクター（Campylobacter）の病原性株は、H-2を含むグリカン、すなわち2'-フコシル-N-アセチルラクトサミンまたは2'-フコシルラクトース（2'FL）に特異的に結合し；カンピロバクターの結合および感染性は2'-FLおよびこのH-2エピトープを含む他のグリカンによって阻害される。同様に、いくつかの下痢誘発性大腸菌病原体は、インビボで、2結合型フコース部分を含むヒトミルクオリゴ糖によって強く阻害される。ヒトカリシウイルスのいくつかの主要株、特にノロウイルスもまた2結合型フコシル化グリカンに結合し、この結合はヒトミルク2結合型フコシル化グリカンによって阻害される。これらの2結合型フコシルオリゴ糖を高レベルで有するヒトミルクの摂取は、ノロウイルス、カンピロバクター、大腸菌関連下痢のSTおよびメキシコ人乳児集団におけるすべての原因の中等度〜重度の下痢の危険の低下に関連した（Newburg D.S. et al., 2004 Glycobiology, 14:253-263; Newburg D.S. et al., 1998 Lancet, 351:1160-1164）。いくつかの病原体、例えばインフルエンザ（Couceiro,J.N., Paulson,J.C. & Baum,L.G. Virus Res 29, 155-165 (1993)）、パラインフルエンザ（Amonsen,M., Smith,D.F., Cummings,R.D. & Air,G.M. J Virol 81, 8341-8345 (2007)）およびロタウイルス（rotovirus）（Kuhlenschmidt,T.B., Hanafin,W.P., Gelberg,H.B. & Kuhlenschmidt,M.S. Adv Exp Med Biol 473, 309-317 (1999)）は、それらの宿主受容体としてシアル化グリカンを利用する。シアリル-ルイスXエピトープは、ヘリコバクター・ピロリ（Mahdavi,J., Sonden,B., Hurtig,M., Olfat,F.O., et al. Science 297, 573-578 (2002)）、シュードモナス・エルギノーサ（Scharfman,A., Delmotte,P., Beau,J., Lamblin,G., et al. Glycoconj J 17, 735-740 (2000)）およびノロウイルスのいくつかの株（Rydell,G.E., Nilsson,J., Rodriguez-Diaz, J., Ruvoen-Clouet,N., et al. Glycobiology 19, 309-320 (2009)）によって使用される。
【００５３】
新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼの同定
本発明は、新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素を提供する。本発明はまた、宿主細菌における新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼの発現のための新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼの核酸配列を有する核酸コンストラクト（すなわち、プラスミドまたはベクター）を提供する。本発明はまた、本明細書でさらに記載されるように、適当な宿主生産細菌において新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼを発現させることによってフコシル化オリゴ糖を生産する方法を提供する。
【００５４】
すべてのα(1,2)フコシルトランスフェラーゼが、アクセプター基質としてラクトースを利用できるわけではない。アクセプター基質は、例えば、炭水化物、オリゴ糖、タンパク質または糖タンパク質、脂質または糖脂質、例えばN-アセチルグルコサミン、N-アセチルラクトサミン、ガラクトース、フコース、シアル酸、グルコース、ラクトースまたはそれらの任意の組み合わせを含む。本発明の好ましいアルファ(1,2)フコシルトランスフェラーゼは、ドナーとしてGDP-フコースを利用し、ラクトースはそのドナーに対するアクセプターである。
【００５５】
アクセプターとしてラクトースを利用することができる新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素を同定する方法は、以前に、（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、PCT/US2013/051777に記載されるように）以下の工程を用いて実施された：1）配列データベースのコンピュータ検索を行い、任意の既知のラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼの単純配列ホモログの大グループを定義する工程；2）工程1のホモログのリストを使用して、例えばMEME（http://meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgiで利用可能なMultiple Em for Motif Elicitation）またはPSI-BLAST（ncbi.nlm.nih.gov/blastで利用可能であり、cnx.org/content/m11040/latest/に追加情報が掲載されているPosition-Specific Iterated BLAST）等のコンピュータプログラムを用いることによって、この大グループのメンバーによって共有されている共通配列および／または構造モチーフを含む検索プロフィールを抽出する工程；3）これによって抽出された検索プロフィールをクエリーとして使用して配列データベースを（例えばPSI-BLASTまたはMAST（http://meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/mast.cgiで利用可能なMotif Alignment Search Tool）等のコンピュータプログラムを用いて）検索し、元のラクトース受容性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼに対する単純配列相同性が40％またはそれ未満である「候補配列」を同定する工程；4）化学文献を調査し、α(1,2)フコシル-グリカンを発現することが公知の「候補生物」のリストを作製する工程；5）「候補生物」由来である「候補配列」のみを選択し、「候補ラクトース利用性酵素」のリストを生成する工程；ならびに6）各「候補ラクトース利用性酵素」を発現させ、ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ活性について試験する工程。
【００５６】
配列分析ツールのMEMEスイート（meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgi）もまた、PSI-BLASTの代用物として使用され得る。配列モチーフは、プログラム「MEME」を用いて発見される。これらのモチーフは、その後、プログラム「MAST」を用いて配列データベースを検索するために使用され得る。BLASTおよびPSI-BLAST検索アルゴリズムは、他の周知の代用物である。
【００５７】
さらなる新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼを同定するために、以前に同定されたラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列：H.ピロリfutC（SEQ ID NO:1）、H.ムステラエFutL（SEQ ID NO:2）、バクテロイデス・ブルガタスfutN（SEQ ID NO:3）および大腸菌O126 wbgL（SEQ ID NO:4）を用いて多配列アラインメントクエリーを生成した。これらの配列アラインメントおよび配列同一性の百分率が図3に示されている。クエリーとしてFASTA形式の多配列アラインメントを用いて反復PSI-BLASTを行い、NCBI PSI-BLASTプログラムをNCBI BLAST+バージョン2.2.29のローカルコピー上で実施した。初期位置特異的スコア行列ファイル（.pssm）をPSI-BLASTによって生成し、プログラムがこれを反復相同性検索のスコアを調整するために使用した。このプロセスをさらに大きな候補グループを生成するために繰り返し、各回の結果を、行列をさらに洗練させるために使用した。
【００５８】
このPSI-BLAST検索により、初期の2515個のヒットを得た。787個のヒットが、FutCに対して22％を超える配列同一性を有していた。396個のヒットは、275を超えるアミノ酸長のものであった。FutCに対するパーセント同一性による選別、（公知のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼの）既存のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼインベントリとこれらの配列のBLASTによる比較、および通常胃腸管に存在する細菌由来のそれらを同定するためのヒット配列の手作業によるアノテーションを含む、これらのヒットのさらなる分析を行った。このスクリーンによって同定された新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼのアノテーション付きリストが表1に示されている。表1は、候補酵素が見いだされる細菌種、GenBankアクセッション番号、GI識別番号、アミノ酸配列およびFutCに対する％配列同一性を提供する。
【００５９】
同定されたヒットのうち、12個の新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼを、それらの機能的能力についてさらに分析した：プレボテラ・メラニノゲニカFutO、クロストリジウム・ボルテアエ FutP、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP、ラクノスピラセアエ種FutQ、メタノスファエルラ・パルストリスFutR、タネレラ種FutS、バクテロイデス・カカエFutU、ブチリビブリオFutV、プレボテラ種FutW、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY、サルモネラ菌FutZおよびバクテロイデス種FutZA。クロストリジウム・ボルテアエFutPについては、アノテーションが、誤った初期メチオニンコドンを指定していた。したがって、本発明は、（天然の上流DNA配列からインフレームで得られる）アノテーション付きFutPのN末端に追加の13個のアミノ酸を有するFutPを含み、これは本明細書でクロストリジウム・ボルテアエ+13 FutPと称される。同定された12個の新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼおよび4個の以前に同定されたα(1,2)フコシルトランスフェラーゼの間の配列同一性が、以下の表2に示されている。
【００６０】
（表２）配列同一性
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【００６１】
同定された（すなわち、表1の）α(1,2)フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列に基づけば、シンジーン（syngene）は、当技術分野で公知の標準的方法を用いて当業者によって容易に設計および構築され得る。例えば、シンジーンは、リボソーム結合部位を含み、宿主細菌生産株（すなわち、大腸菌）における発現に関してコドン最適化され、そして共通6カッター制限部位または大腸菌宿主株におけるクローニングおよび発現を容易にするために除去される宿主株に存在する内因性制限酵素により認識される部位（すなわち、EcoK制限部位）を有する。好ましい態様において、シンジーンは、以下の構成で構築される：EcoRI部位 - T7g10RBS - α(1,2)FTシンジーン - XhoI部位。12個の同定されたα(1,2)フコシルトランスフェラーゼのサンプルシンジーンの核酸配列が表3に示されている（開始メチオニンATGコドンが太字表示されている）。
【００６２】
（表３）12個の新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼシンジーンの核酸配列
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【００６３】
本明細書に記載される任意の方法において、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子または遺伝子産物は、変種またはその機能的フラグメントであり得る。本明細書に開示される任意の遺伝子または遺伝子産物の変種は、本明細書に記載される核酸またはアミノ酸配列に対して50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％の配列同一性を有し得る。
【００６４】
本明細書に開示される変種はまた、本明細書で詳述されている遺伝子または遺伝子産物と同じ生物学的機能を保持する本明細書に記載される遺伝子または遺伝子産物のホモログ、オルトログまたはパラログを含む。これらの変種は、これらの方法において言及されている遺伝子と交換可能に使用され得る。そのような変種は、生物学的機能にとって重要な保存されたドメイン、好ましくは機能的ドメイン、例えば触媒ドメインにおいて、一定比率の相同性または同一性、例えば50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％の同一性を示し得る。
【００６５】
2つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列との関係で言う「％同一性」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いてまたは目視検査によって測定した場合に、最大一致条件で比較および整列させたときに2つまたはそれ以上の配列または部分配列が同一であることまたは同一である特定比率のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有することを表す。例えば、％同一性は、比較される配列のコード領域の全長またはその特定のフラグメントもしくは機能的ドメインの全長に対するものである。
【００６６】
配列比較を行う場合、典型的には1つの配列が、試験配列と比較する参照配列として使用される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピュータに入力され、必要な場合、部分配列の座標が指定され、そして配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。配列比較アルゴリズムは、その後、指定されたプログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００６７】
パーセント同一性は、検索アルゴリズム、例えばBLASTおよびPSI-BLAST（Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215:3, 403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res 25:17, 3389-402）を用いて決定される。PSI-BLAST検索の場合、以下の例示的なパラメータが用いられる：（1）期待値（Expect threshold）は10とした：（2）ギャップコスト（Gap cost）は、存在（Existence）：11および拡張（Extension）：1とした；（3）用いる行列はBLOSUM62とした；（4）低複雑度領域のフィルターを「オン」にした。
【００６８】
変化は、そのタンパク質または酵素の機能的能力を変更せずにコードされるタンパク質または酵素のアミノ酸配列を変化させる本明細書に記載される遺伝子または遺伝子産物のいずれかの核酸配列またはアミノ酸配列への変異によって導入され得る。例えば、「非必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換が、本明細書に明示的に開示される配列のいずれかの配列において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は、その生物学的活性を変更せずにそのポリペプチドの野生型配列から変更することができる配列内の位置にある残基であり、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要とされる位置にある残基である。例えば、タンパク質ファミリーのメンバー間で保存されているアミノ酸残基は、変異に適さない可能性がある。しかし、他のアミノ酸残基（例えば、タンパク質ファミリーのメンバー間でほとんど保存されていないもの）は、活性に必須でないと考えられ、したがって変更に適する可能性が高い。したがって、本発明の別の局面は、活性（すなわち、フコシルトランスフェラーゼ活性）に必須でない本明細書に開示されるアミノ酸配列との比較でのアミノ酸残基の変化を含む本明細書に開示されるタンパク質または酵素をコードする核酸分子に関連する。
【００６９】
本明細書に記載される任意の遺伝子との比較で機能的能力を本質的に保持するタンパク質をコードする単離された核酸分子は、1つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされるタンパク質に導入されるよう、対応するヌクレオチド配列に1つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することによって作製され得る。
【００７０】
変異は、コードされるアミノ酸配列を変更する標準的技術、例えば部位特異的変異誘発およびPCR媒介変異誘発によって核酸配列に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、1つまたは複数の推定非必須アミノ酸残基において行われる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。特定のアミノ酸は、2つ以上に分類可能な特徴を有する側鎖を有する。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、チロシン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、特定のポリペプチド内の推定非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置き換えられる。あるいは、別の態様において、変異は、あるコード配列の全体または一部にわたって無作為的に、例えば飽和変異誘発によって導入され得、得られた変異が、活性を保持する変異を同定するために、そのポリペプチドの生物学的活性に関してスクリーンされ得る。逆に、本発明はまた、内因性の生物学的活性を増強するまたは増大させる変異を有する変種を提供する。核酸配列の変異誘発の後、コードされるタンパク質は、当技術分野で公知の任意の組み換え技術によって発現され得、そのタンパク質の活性が決定され得る。本明細書に開示される変種の特定の生物学的活性の増加、減少または消滅は、当業者によって容易に、すなわち、オリゴ糖の修飾、合成または分解を媒介する能力を（生産物の検出を通じて）測定することによって測定され得る。
【００７１】
本発明はまた、本明細書に記載される遺伝子または遺伝子産物の機能的フラグメントを提供する。フラグメントは、本明細書に提供されるこれらの配列およびすべての他のものの例においては、全体より小さい全体の一部と定義される。さらに、フラグメントは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列内の単一ヌクレオチドまたはアミノ酸からその全ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列よりも1つ少ないヌクレオチドまたはアミノ酸のサイズ範囲である。最後に、フラグメントは、上で定義された限度値の間の中間値である完全なポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の任意の一部として定義される。
【００７２】
例えば、本明細書に開示されるまたは本明細書に開示される任意の遺伝子によってコードされる任意のタンパク質または酵素のフラグメントは、10〜20アミノ酸、10〜30アミノ酸、10〜40アミノ酸、10〜50アミノ酸、10〜60アミノ酸、10〜70アミノ酸、10〜80アミノ酸、10〜90アミノ酸、10〜100アミノ酸、50〜100アミノ酸、75〜125アミノ酸、100〜150アミノ酸、150〜200アミノ酸、200〜250アミノ酸、250〜300アミノ酸、300〜350アミノ酸、350〜400アミノ酸、400〜450アミノ酸または450〜500アミノ酸であり得る。本発明に包含されるフラグメントは、機能的フラグメントを保持するフラグメントを含む。したがって、フラグメントは、好ましくは、機能的活性に必要とされるまたは重要である触媒ドメインを保持する。フラグメントは、本明細書の配列情報を使用することによって決定または生成され得、かつフラグメントは、当技術分野で公知の標準的な方法を使用して機能的活性について試験され得る。例えば、コードされるタンパク質は、当技術分野で公知の任意の組み換え技術によって発現され得、そしてそのタンパク質の活性が決定され得る。そのフラグメントの生物学的機能は、基質オリゴ糖を合成もしくは修飾する、または逆にオリゴ糖基質を異化する能力を測定することによって測定され得る。
【００７３】
本発明との関係で、「機能的等価物」は、本明細書で使用される場合、野生型フコシルトランスフェラーゼと実質的に類似の活性を示すことができる遺伝子もしくは生じるコードされているタンパク質の変種またはそれらのフラグメントを表す。詳細には、フコシルトランスフェラーゼ活性は、アルファ-(1,2)-結合を通じてフコース糖をアクセプター基質に転移させる能力を表す。本明細書で使用される場合、「実質的に類似の活性」は、野生型フコシルトランスフェラーゼの5％、10％、20％、30％、40％または50％内の活性レベルを表す。
【００７４】
ラクトース利用性フコシルトランスフェラーゼ活性を試験するため、候補酵素（またはシンジーン）を発現しかつ細胞質GDP-フコースおよびラクトースプールの両方を含む宿主生物においてフコシル化オリゴ糖（すなわち、2'-FL）の産生が評価される。フコシル化オリゴ糖の産生は、候補酵素をコードする配列がラクトース利用性α（1,2）フコシルトランスフェラーゼとして機能することを示す。
【００７５】
ヒト乳オリゴ糖2'-FLの生産のための大腸菌の改変
本明細書には、代謝的に改変された大腸菌におけるフコシル結合オリゴ糖の合成に関して新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ（α(1,2)FT）を有効化するために使用した遺伝子スクリーニングアプローチが記載されている。HMOS 2'-フコシルラクトース（2'-FL）を合成することができるα(1,2)FTが、特に関心対象である。2'-FLは、ヒト乳中に存在する最も豊富なフコシル化オリゴ糖であり、このオリゴ糖は、細菌病原体、例えばカンピロバクター・ジェジュニにより引き起こされる感染性下痢に対する保護を新生児に提供する（Ruiz-Palacious,G.M., et al. (2003). J Biol Chem 278, 14112-120; Morrow,A.L. et al. (2004). J Pediatr 145, 297-303; Newburg,D.S. et al. (2004). Glycobiology 14, 253-263）。他の関心対象のα(1,2)FTは、HMOSラクトジフコテトラオース（LDFT）、ラクト-N-フコペンタオースI（LNF I）またはラクト-N-ジフコヘキサオースI（LDFH I）の合成が可能なものである。
【００７６】
ヒト乳のフコシルオリゴ糖の合成経路は、図1に示されている。構造的に、2'-FLは、ラクトースのガラクトース部分にα1,2結合したフコース分子からなる（Fucα1-2Galβ1-4Glc）。FutCと呼ばれるH.ピロリ株26695由来のα(1,2)FTは、代謝的に改変された大腸菌において2'-FLの合成を触媒するために利用されている（Drouillard,S. et al. (2006). Angew Chem Int Ed Engl 45, 1778-780）。
【００７７】
標準的な分子生物学技術によって、α(1,2)FT（即ち、シンジーン）を発現プラスミドにクローニングした。このプラスミドは、候補遺伝子の発現を誘導するためにバクテリオファージλの強力な左方向プロモーター（PLと呼ばれる）を利用する（Sanger,F. et al. (1982). J Mol Biol 162, 729-773）。このプロモーターは制御可能であり、例えば、trp-cIコンストラクトは大腸菌宿主のゲノム（のampC座）に安定的に組み込まれ、そして制御は成長培地にトリプトファンを添加することによって行われる。タンパク質発現の段階的誘導は、温度感受性cIリプレッサーを用いて達成される。別の同様の制御戦略（温度依存的発現系）も記載されている（Mieschendahl et al., 1986, Bio/Technology 4: 802-808）。このプラスミドもまた、フコシル結合型オリゴ糖合成における重要な前駆体であるGDP-フコースの合成を上方調節する大腸菌rcsA遺伝子を有している。加えて、このプラスミドは、（研究室での利便性のために）このプラスミドをアンピシリン選択により宿主株中で維持するためのβ-ラクタマーゼ（bla）遺伝子およびthyA-宿主における代替選択手段としてのネイティブthyA（チミジル酸シンターゼ）遺伝子を有している。代替選択マーカーは、プロリン栄養性を補完するproBA遺伝子（Stein et al., (1984), J Bacteriol 158:2, 696-700 (1984)）またはアデニン栄養性を補完するpurA（S. A. Wolfe, J. M. Smith, J Biol Chem 263, 19147-53 (1988)）を含む。プラスミド選択マーカーとして機能させるために、これらの遺伝子は各々、最初に宿主細胞の染色体において不活性化され、次いでこの遺伝子の野生型コピーがプラスミド上に提供される。あるいは、薬物耐性遺伝子、例えばベータ-ラクタマーゼ（この遺伝子は上記の発現プラスミド上にすでに存在しており、それによってアンピシリン選択を可能にしている）がプラスミド上で使用され得る。アンピシリン選択は当技術分野で周知であり、標準的な参考書、例えばManiatis et al., (1982) Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, N.Y.に記載されている。
【００７８】
そのような発現プラスミドであるpEC2-(T7)FutX-rcsA-thyA (pG401)の核酸配列を以下に示す。下線を付した配列はFutXシンジーンを表しており、この配列は、標準的な組換えDNA技術を用いて、本明細書に記載した任意の新規α(1,2)FTと簡単に置き換えることが可能である。
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2020188761.tif 000009
【００７９】
この発現コンストラクトで、2'-FLの生産に有用な宿主株を形質転換した。2'-FLの生合成のために、ラクトースおよびGDP-フコースの両方の増強された細胞プールを生成する必要がある（図2）。2'-FL生産を触媒する候補の能力を試験する背景となる親として、野生型大腸菌K12原栄養株W3110を選択した（Bachmann,B.J. (1972). Bacteriol Rev 36, 525-557）。使用したこのW3110派生株は、GI724として公知の大腸菌株を生成するトリプトファン誘導性PtrpBcI+リプレッサーカセットの（ampC座への）導入によって事前に修飾されたものであった（LaVallie,E.R. et al. (2000). Methods Enzymol 326, 322-340）。GI724の他の特徴は、lacIqおよびlacPL8プロモーターの変異を含む。大腸菌株GI724は、低レベルの外因性トリプトファンによる誘導後のファージλPLプロモーターからの組み換えタンパク質の経済的生産に適している（LaVallie,E.R. et al. (1993). Biotechnology (NY)11, 187-193; Mieschendahl,et al. (1986). Bio/Technology 4, 802-08）。この株に対して、2'-FLの生合成を促進するさらなる遺伝的変更を行った。これは、GI724株において、λRed再結合（recombineering）を用いる染色体の数回の操作（Court,D.L. et al. (2002). Annu Rev Genet 36, 361-388）および汎用P1ファージ形質導入を通じて行った。
【００８０】
第1に、細胞内ラクトースを蓄積する大腸菌宿主株の能力を、内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）およびラクトースオペロンリプレッサー遺伝子（lacI）の同時欠失によって改変した。この欠失を構築する際に、lacIqプロモーターをラクトースパーミアーゼ遺伝子lacYのすぐ上流に配置させた。修飾株は、培養培地から（lacYを通じて）ラクトースを輸送する能力を維持しているが、ラクトース異化を担うlacZ（β-ガラクトシダーゼ）遺伝子の野生型コピーを欠いている。したがって、この修飾株を外因性ラクトースの存在下で培養したとき、細胞内ラクトースプールが形成される。PlacIqlacY+染色体コンストラクトの概略は、図12に示されている。
【００８１】
PlacIqlacY+染色体コンストラクトのゲノムDNA配列を以下に示す（SEQ ID NO:288）。
2020188761.tif 000010
【００８２】
第2に、細胞外莢膜多糖であるコラン酸を合成する宿主大腸菌株の能力を、UDP-グルコース脂質担体トランスフェラーゼをコードするwcaJ遺伝子の欠失により除去した（Stevenson,G. et al. (1996). J Bacteriol 178, 4885-893）。wcaJヌルの背景の下で、GDP-フコースは大腸菌の細胞質に蓄積される（Dumon,C. et al. (2001). Glycoconj J 18, 465-474）。wcaJの染色体欠失の概略が図13に示されている。
【００８３】
ΔwcaJ::FRT変異を有する大腸菌の染色体領域の配列を以下に示す（SEQ ID NO:289）。
2020188761.tif 000011
【００８４】
第3に、細胞質GDP-フコースプールの大きさを、lon遺伝子へのヌル変異の導入によって拡張した。lonは、大腸菌におけるコラン酸生合成の正の転写レギュレーターであるRcsAの分解を担うATP依存性細胞内プロテアーゼである（Gottesman,S. & Stout,V. Mol Microbiol 5, 1599-1606 (1991)）。lonヌル背景の下で、RcsAは安定化され、RcsAレベルが上昇し、大腸菌においてGDP-フコース合成を担う遺伝子が上方調節され、そして細胞内GDP-フコース濃度が向上する。lon遺伝子をほぼ完全に欠失させ、挿入された機能的な野生型であるがプロモーターを有さない大腸菌lacZ+遺伝子によって置き換えた（Δlon::(kan,lacZ+)）。λRed再結合を使用してその構築を行った。lon座へのkan,lacZ+挿入の概略が図14に示されている。
【００８５】
大腸菌株におけるlon領域へのlacZ+挿入部周囲のゲノムDNA配列を以下に示す（SEQ ID NO:290）。
2020188761.tif 000012
2020188761.tif 000013
【００８６】
第4に、thyA（チミジル酸シンターゼ）変異をP1形質導入によりこの菌株に導入した。外因性チミジンの非存在下で、thyA株はDNAを生成することができず死亡する。この欠陥は、野生型thyA遺伝子をマルチコピープラスミド上に供給することによってイントランスで補完することができる（Belfort,M., Maley,G.F., and Maley,F. (1983). Proc Natl Acad Sci USA 80, 1858-861）。この補完を、ここでは、プラスミド維持の手段として使用した。
【００８７】
遊離ラクトースの細胞質プール（したがって2'-FLの最終的な収量）を増大させるのに有用なさらなる修飾は、lacA変異の組み込みである。lacAは、高レベルのラクトースが大腸菌の細胞質に蓄積しているときにのみ活性を示すラクトースアセチルトランスフェラーゼである。（例えば、高い細胞内ラクトースプールによって引き起こされる）高い細胞内モル浸透圧濃度は、細菌の成長を阻害し得、大腸菌は、過剰な細胞内ラクトースをLacAを用いてアセチル基で「タグ付け」し次いでこのアセチル-ラクトースを細胞から能動的に排出することによってラクトースにより引き起こされる高い細胞内モル浸透圧濃度から自身を保護する機構を進化させた（Danchin,A. Bioessays 31, 769-773 (2009)）。2'-FLまたは他のヒト乳オリゴ糖を生産するよう改変された大腸菌におけるアセチル-ラクトースの生産は、したがって、望ましくなく、それは総収量を減少させる。さらに、アセチル-ラクトースは、オリゴ糖精製スキームを複雑化する副産物である。lacA変異の組み込みは、これらの問題を解消する。フコシル化オリゴ糖の準最適な生産は、コラン酸経路およびlonプロテアーゼのいずれかまたは両方における変異を欠く菌株において見られる。ラクトースから副産物（アセチル-ラクトース）への転換は、lacA変異を含まない菌株において見られる。lacA欠失の概略および対応するゲノム配列は、上に提供されている（SEQ ID NO:288）。
【００８８】
異なるα(1,2)FT候補を試験するために使用する菌株は、上記の遺伝子修飾の全てを含み、以下の遺伝子型を有する：
2020188761.tif 000014
【００８９】
異なるα(1,2)FT候補発現プラスミドを有する大腸菌株を分析した。菌株を初期指数関数期まで（チミジンを欠く）選択培地中で成長させた。次いでラクトースを終濃度0.5％となるよう添加し、そしてトリプトファン（200μM）を添加してPLプロモーターからの各候補α(1,2)FTの発現を誘導した。誘導期間（約24時間）の終了後に、各菌株および培養上清のOD600単位等価物を収集した。溶解産物を調製し、薄層クロマトグラフィー（TLC）により2'-FLの存在について分析した。
【００９０】
B.ブルガタスFutNを有するプラスミドpG217のマップを図11に示す。プラスミドpG217の配列を以下に示す（SEQ ID NO:291）。
2020188761.tif 000015
2020188761.tif 000016
【００９１】
代謝的に改変された大腸菌細胞によって生産されるフコシル化オリゴ糖は、発酵後に培養ブロスから精製される。例示的な手順は、5つの工程を含む。（1）浄化：発酵ブロスを収集し、6000 x gで30分間の予備的遠心分離による沈降によって細胞を除去する。各バイオリアクタで実施することにより約5〜7Lの部分浄化上清が得られる。（2）粗カーボンによる生産物の捕捉：およそ1000ml容積の粗カーボン（Calgon 12x40 TR）を充填したカラム（直径5cm x 長さ60cmの寸法）を1カラム容積（CV）の水で平衡化し、そして浄化した培養上清を40ml/分の流速で投入する。このカラムは、糖約120g分の総積載能力を有する。投入および糖の捕捉の後、カラムを1.5CVの水で洗浄し、次いで2.5CVの50％エタノールまたは25％イソプロパノールで溶出させる（この工程では、生産物の溶出に低濃度のエタノール（25〜30％）で十分であり得る）。この溶媒溶出工程により、カラムに結合した糖全体の約95％および少量の有色物質（color body）が放出される。この第1工程においては、最大量の糖の捕捉が主目的である。混在物質の解明は目的ではない。（3）蒸発：捕捉カラムからの2.5L容積のエタノールまたはイソプロパノール溶出液を56℃で回転蒸発させ、水中で糖シロップを生成する。この工程で使用することができる代替法は、凍結乾燥または噴霧乾燥を含む。（4）微細カーボンおよびイオン交換媒体上でのフラッシュクロマトグラフィー：Biotage Isolera One FLASH Chromatography Systemに接続されたカラム（GE Healthcare HiScale50/40、5x40cm、最大圧20バール）に750mlのDarco Activated Carbon G60（100メッシュ）：Celite 535（粗）1：1混合物を充填する（両カラム充填物をSigmaから入手した）。このカラムを5CVの水で平衡化し、そして、セライトローディングカートリッジまたは直接注射のいずれかを用いて工程3からの糖（2'-FL 対 混在ラクトースの比に依存して10〜50g）を投入する。このカラムを蒸発光散乱（ELSD）検出器に接続し、クロマトグラフィー中に溶出する糖のピークを検出する。2'-FLを単糖（存在する場合）、ラクトースおよび有色物質から分離するため、イソプロパノール、エタノールまたはメタノールの4段階勾配を行う。糖のピークに対応する画分を120mlボトルに自動回収し、プールし、そして工程5に送る。通常より長い発酵からの特定の精製作業では、2'-FL含有画分をアニオン交換およびカチオン交換カラムに通すことで、余分なタンパク質／DNA／カラメル物質の混在物を除去することができる。この目的で試験に合格した樹脂は、Dowex 22である。
【００９２】
本明細書に記載の遺伝子スクリーニングアプローチを用いることで、代謝的に改変された大腸菌宿主株における2'-FLの効率的な生合成のための新規のα(1,2)FTの同定に成功した。このスクリーンの結果が表1にまとめられている。
【００９３】
生産宿主株
大腸菌K-12は、微生物生理学および遺伝学における幅広い研究の対象であり、様々な工業利用において商業的に利用されている、よく研究された細菌である。その親種である大腸菌の自然生息場所は、哺乳動物の大腸である。大腸菌K-12は、安全使用の歴史があり、その派生株は、ヒトに投与およびヒトが消費するための化合物および薬物の生産を含む多くの工業用途で使用されている。大腸菌K-12は、1922年に、回復期のジフテリア患者から最初に単離された。それは毒性を有さず、一般的な研究用培地で容易に成長し、そして微生物生理学および遺伝学の研究において広く使用されているので、微生物学の研究、教育ならびに工業用および医薬用製品の生産において使用される標準的な細菌株となっている。大腸菌K-12は、現在、実験環境で70年を超えて維持された結果として弱体化された生物であるとみなされている。その結果、K-12株は、通常の条件下でヒトおよび他の動物の腸にコロニーを形成することができない。この周知の菌株に関するさらなる情報は、http://epa.gov/oppt/biotech/pubs/fra/fra004.htmで入手可能である。大腸菌K12に加えて、他の細菌株も生産宿主株として使用され、例えば、様々な細菌種、例えばエルウィニア・ヘルビコラ（パントエア・アグロメランス）、シトロバクター・フロインディ、パントエア・シトレア、ペクトバクテリウム・カロトボルムまたはザントモナス・カンペストリス、がオリゴ糖生合成法において使用され得る。バチルス・サブチリス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーモフィルス、バチルス・ラテロスポールス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ミコイデス、バチルス・プミルス、バチルス・レンタス、バチルス・セレウスおよびバチルス・サーキュランスを含むバチルス属の細菌もまた使用され得る。同様に、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ヘルベティクス、ラクトバチルス・デルブリュッキイ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ブルガリクス、ラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・イエンセニイおよびラクトコッカス・ラクティスを含むがこれらに限定されないラクトバチルスおよびラクトコッカス属の細菌が、本発明の方法を用いて修飾され得る。ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイもまた、本明細書に記載される発明に適した細菌種である。本明細書に記載されるように修飾された、エンテロコッカス（例えば、エンテロコッカス・フェシウムおよびエンテロコッカス・サーモフィルス）、ビフィドバクテリウム（例えば、ビフィドバクテリウム・ロングム、ビフィドバクテリウム・インファンティスおよびビフィドバクテリウム・ビフィダム）属、スポロラクトバチルス種、ミクロモノスポラ種、ミクロコッカス種、ロドコッカス種およびシュードモナス（例えば、シュードモナス・フルオレッセンスおよびシュードモナス・エルギノーサ）由来の株もまた本発明の一部として含まれる。
【００９４】
適当な宿主株は、遺伝子操作が可能なものである、例えば、それらは発現コンストラクトを維持し、所望の最終産物の前駆体を蓄積し、例えばそれらはラクトースおよびGDP-フコースのプールを維持し、そして最終産物、例えば2'-FLを蓄積する。そのような菌株は、単塩および一般的に単一の炭素源を含む定義された最小培地において十分に成長する。上記のように所望のフコシル化オリゴ糖を生産するよう改変された菌株は、最少培地において生育される。バイオリアクタにおいて使用される例示的な最少培地である、最小「FERM」培地について、以下で詳述する。
【００９５】
Ferm（10リットル）：以下を含む最少培地：
40g  (NH4)2HPO4
100g  KH2PO4
10g  MgSO4.7H2O
40g  NaOH
1X 微量元素：
1.3g  NTA（ニトリロ三酢酸）
0.5g  FeSO4.7H2O
0.09g  MnCl2.4H2O
0.09g  ZnSO4.7H2O
0.01g  CoCl2.6H2O
0.01g  CuCl2.2H2O
0.02g  H3BO3
0.01g  Na2MoO4.2H2O（pH 6.8）
水で10リットルに
DF204消泡剤（0.1ml/L）
150g グリセロール（初期バッチ生育）、その後に様々な時間、様々な速度で90％グリセロール-1％ MgSO4-1X 微量元素を供給する流加モード。
【００９６】
適当な生産宿主細菌株は、そのフコシルトランスフェラーゼコード核酸配列が同定された元の細菌株と同一細菌株ではないものである。
【００９７】
本明細書に記載される特徴を有する細菌はラクトースの存在下で培養され、そしてフコシル化オリゴ糖は細菌自体または細菌の培養上清のいずれかから回収される。フコシル化オリゴ糖は、治療用もしくは栄養補給用製品において使用するために精製され、または細菌がそのような製品において直接使用される。
【実施例】
【００９８】
実施例1：新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼの同定
さらなる新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼを同定するために、4つの以前に同定されたラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列：H.ピロリfutC（SEQ ID NO:1）、H.ムステラエFutL（SEQ ID NO:2）、バクテロイデス・ブルガタスfutN（SEQ ID NO:3）および大腸菌O126 wbgL（SEQ ID NO:4）を用い、CLCbio Main Workbenchパッケージ、バージョン6.9（CLCbio、10 Rogers Street #101, Cambridge, Massachusetts 02142, USA）のアラインメントアルゴリズムを用いて多配列アラインメントクエリーを生成した。この4つの以前に同定されたラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列間の配列アラインメントおよび配列同一性の比率が図3に示されている。クエリーとしてFASTA形式の多配列アラインメントを用いて反復PSI-BLASTを行い、NCBI PSI-BLASTプログラムをNCBI BLAST+バージョン2.2.29のローカルコピー上で実施した。初期位置特異的スコア行列ファイル（.pssm）をPSI-BLASTによって生成し、次いでこれを反復的相同性検索のスコアを調整するために使用した。このプロセスをさらに大きな候補グループを生成するために繰り返し、各回の結果を、行列をさらに洗練させるために使用した。
【００９９】
使用した初期位置特異的スコア行列ファイルの一部を以下に示す：
2020188761.tif 000017
【０１００】
使用したPSI-BLASTのコマンドラインは、以下の通りである：
psiblast-db<LOCAL NR database name> -max_target_seqs 2500-in_msa<MSA file in FAST format> -out <results output file> -outfmt"7sskingdoms sscinames scomnames sseqid stitle evalue length pident" -out_pssm<PSSM file output> -out_ascii_pssm<PSSM(ascii) output> -num_iterations 6 -num_threads 8
【０１０１】
このPSI-BLAST検索により、初期の2515個のヒットを得た。787個のヒットが、FutCに対して22％を超える配列同一性を有していた。396個のヒットは、275を超えるアミノ酸長のものであった。FutCに対するパーセント同一性による選別、（公知のラクトース利用性酵素および重複するヒットを排除するための公知のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼの）既存のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼインベントリとこれらの配列のBLASTによる比較、および通常胃腸管に存在する細菌由来のそれらを同定するためのヒットの手作業によるアノテーションを含む、これらのヒットのさらなる分析を行った。このスクリーンによって同定された新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼのアノテーション付きリストが表1に示されている。表1は、酵素が見いだされる細菌種、GenBankアクセッション番号、GI識別番号、アミノ酸配列およびFutCに対する％配列同一性を提供する。
【０１０２】
PSI-BLASTクエリーに使用した4つの公知のα(1,2)FTおよび12個の新たに同定されたα(1,2)FTの多配列アラインメントが、図4に示されている。
【０１０３】
実施例2：新規のα(1,2)FTの検証
ラクトース利用性フコシルトランスフェラーゼ活性を試験するため、候補酵素（すなわち、シンジーン）を発現し、細胞質GDP-フコースおよびラクトースプールの両方を含む宿主生物においてフコシル化オリゴ糖（すなわち、2'-FL）の産生を評価する。フコシル化オリゴ糖の産生は、候補酵素をコードする配列がラクトース利用性α（1,2）フコシルトランスフェラーゼとして機能することを示す。同定されたヒットのうち、12個の新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼを、2'-フコシルラクトースを産生するそれらの機能的能力についてさらに分析した：プレボテラ・メラニノゲニカFutO、クロストリジウム・ボルテアエFutP、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP、ラクノスピラセアエ種FutQ、メタノスファエルラ・パルストリスFutR、タネレラ種FutS、バクテロイデス・カカエFutU、ブチリビブリオFutV、プレボテラ種FutW、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY、サルモネラ菌FutZ、バクテロイデス種FutZA。
【０１０４】
これらの12個の新規のα(1,2)FTを以下の構成で含むシンジーンを構築した：EcoRI - T7g10 RBS - シンジーン - XhoI。図5Aおよび5Bは、PCR構築およびゲル精製後のシンジーンフラグメントを示している。
【０１０５】
候補α(1,2)FT（すなわち、シンジーン）を、標準的な分子生物学技術によって、例示的な発現プラスミドpEC2-(T7)-Fut syngene-rcsA-thyAにクローニングした。このプラスミドは、候補遺伝子の発現を誘導するために、バクテリオファージλの強力な左方向プロモーター（PLと呼ばれる）を利用する（Sanger, F. et al. (1982). J Mol Biol 162, 729-773）。このプロモーターは制御可能である、例えば、trp-cIコンストラクトは大腸菌宿主のゲノム（のampC座）に安定的に組み込まれ、そして制御は成長培地にトリプトファンを添加することによって行われる。タンパク質発現の段階的誘導は、温度感受性cIレプレッサーを用いて達成される。別の同様の制御戦略（温度非依存的発現システム）も報告されている（Mieschendahl et al., 1986, Bio/Technology 4:802-808）。このプラスミドはまた、フコシル結合オリゴ糖の合成における重要な前駆体であるGDP-フコース合成を上方調節する大腸菌rcsA遺伝子を有している。加えて、このプラスミドは、アンピシリン選択によってこのプラスミドを宿主株内で維持するため（研究施設における利便性のため）のβ-ラクタマーゼ（bla）遺伝子およびthyA-宿主における選択の代替手段としてのネイティブthyA（チミジル酸シンターゼ）遺伝子を有する。
【０１０６】
この発現コンストラクトを、2'-FLの生産に有用な宿主株に形質転換した。異なるα(1,2)FT候補を試験するために使用した宿主株は、上記のすべての上記遺伝子修飾を有し、以下の遺伝子型を有する：ΔampC::PtrpBcI, Δ(lacI-lacZ)::FRT, PlacIqlacY+, ΔwcaJ::FRT, thyA::Tn10, Δlon:(npt3, lacZ+), ΔlacA。
【０１０７】
異なるα(1,2)FT候補発現プラスミドを有する大腸菌株を分析した。菌株を初期指数関数期まで（チミジンを欠く）選択培地中で成長させた。次いでラクトースを終濃度0.5％となるよう添加し、トリプトファン（200μM）を添加してPLプロモーターからの各候補α(1,2)FTの発現を誘導した。誘導期間（約24時間）の終了後に、培養上清および細胞を収集した。薄層クロマトグラフィー（TLC）によって2'-FLの存在について分析された各菌株の総細胞および0.2OD600単位等価物から熱抽出物を調製し、同時に各菌株につき2μlの対応する清澄化された培養上清も調製した。
【０１０８】
図6は、培養上清および細菌細胞由来の抽出物のTLC分析によって決定された、α(1,2)FT発現細菌によって生産されたオリゴ糖を示している。2'FLは、WbgL（対照として使用）、FutO、FutP、FutQ、FutR、FutS、FutU、FutW、FutX、FutZおよびFutZAの外因性発現によって生産された。
【０１０９】
表4は、上記の2'FL合成スクリーンによって決定された、各候補シンジーンのフコシルトランスフェラーゼ活性を要約したものである。12個の候補α(1,2)FTのうちの11個がラクトース利用性フコシルトランスフェラーゼ活性を有することが見出された。
【０１１０】
（表４）2'FL合成スクリーンの結果
2020188761.tif 000018
【０１１１】
実施例3：新規のα(1,2)FTを発現する培養物の特徴付け
新規のα(1,2)FTであるFutO、FutQおよびFutXを発現する細菌のさらなる特徴付けを行った。詳細には、増殖速度および外因性α(1,2)FT発現を試験した。
【０１１２】
フコシルトランスフェラーゼWbgL（プラスミドpG204）、FutN（プラスミドpG217）および新規のα(1,2)FTであるFutO（プラスミドpG393）、FutQ（プラスミドpG395）およびFutX（pG401）を含む発現プラスミドを宿主細菌株に導入した。例えば、利用した宿主株は、以下の遺伝子型を有している：ΔampC::PtrpBcI, Δ(lacI-lacZ)::FRT, PlacIqlacY+, ΔwcaJ::FRT, thyA::Tn10, Δlon:(npt3, lacZ+), ΔlacA。
【０１１３】
各々の外因性フコシルトランスフェラーゼを発現する細菌培養物を、ラクトースの存在下で（外因性フコシルトランスフェラーゼの発現を誘導するために）トリプトファンを添加することによって誘導した。培養物の成長を、以下の時点でA600における分光光度読み取りによってモニタリングした：誘導の4時間および1時間前、誘導時（0時）、ならびに誘導から3時間、7時間および24時間後。その結果が図7に示されており、外因性フコシルトランスフェラーゼの発現が細胞増殖を妨げなかったことを示している。さらに、新規のα（1,2）フコシルトランスフェラーゼFutO、FutQおよびFutXを発現する細菌培養物の成長曲線は、公知のα(1,2)FT酵素であるWbgLおよびFutNを発現するそれらと同様である。
【０１１４】
誘導後に各フコシルトランスフェラーゼを発現する細菌培養物に関して、タンパク質発現も評価した。培養物を以前に記載されたように誘導し、誘導時（0時間）、誘導から3時間、7時間および24時間後に細菌培養物からタンパク質溶解産物を調製した。SDS-PAGEゲル上でタンパク質溶解産物を泳動させ、各時点でのタンパク質の分布を試験するために染色した。図8に示されるように、外因性FutN、FutOおよびFutXを発現する細菌培養物において、7時間および24時間の誘導は約20〜28kDaのタンパク質バンドの増加を示した。これらの結果は、誘導が外因性フコシルトランスフェラーゼの有意な発現をもたらすことを示している。
【０１１５】
最後に、公知のフコシルトランスフェラーゼであるWbgLおよびFutNとの比較で新規のα(1,2)FTであるFutO、FutQおよびFutXを発現する細菌培養物中での2'FL産生の効率および収量を評価するためのさらなるTLC分析。培養物を、7時間および24時間誘導し、TLC上を泳動させた。図9Aは、細胞上清における2'FLのレベルを示している。細菌細胞において見出される2'FLのレベルも試験した。図9Bに示されるように、2'FLは、誘導から7時間および24時間後に、新規のα(1,2)FTであるFutO、FutQおよびFutXを発現する細菌由来の細胞溶解産物中で生産されていた。
【０１１６】
実施例4：FutNは2'FLの生産に関して高い効率を示す
B.ブルガタスFutNを発現するよう代謝的に改変された大腸菌細胞によって生産されたフコシル化オリゴ糖を、発酵後の培養ブロスから精製した。
【０１１７】
発酵ブロスを収集し、6000 x gで30分間の分取目的遠心分離による沈降によって細胞を除去した。各バイオリアクタ実施で、約5〜7Lの部分清澄化上清が得られる。約1000 ml容積（5cm径 x 60cm長の寸法）の粗炭素（Calgon 12X40 TR）を装填したカラムを1カラム容積（CV）の水で平衡化し、そして40ml/分の流速で清澄化培養上清を充填した。このカラムは、約120gの糖の総収容能を有していた。充填および糖の捕捉の後、カラムを1.5CVの水で洗浄し、次いで2.5CVの50％エタノールまたは25％イソプロパノールで溶出した（この工程における低濃度のエタノール（25〜30％）は生産物の溶出に十分であると考えられる）。この溶媒溶出工程によりカラム上の結合した糖全体の約95％および有色体（カラメル化糖）のごく一部が放出された。捕捉カラムからの2.5Lの容積のエタノールまたはイソプロパノール溶出液を56℃でロータリーエバポレートし、糖シロップを含む水を得た。Biotage Isolera One FLASH Chromatography Systemに接続されたカラム（GE Healthcare HiScale50/40、5x40cm、最大圧20バール）に750mlのDarco Activated Carbon G60（100メッシュ）：Celite 535（粗）1:1混合物を装填した（どちらのカラム装填物もSigmaから入手した）。このカラムを5CVの水で平衡化し、セライト充填カートリッジまたは直接注射のいずれかを用いて、工程3からの糖（混入ラクトースに対する2'-FLの比に依存して10〜50g）を充填した。クロマトグラフィーの間の溶出糖のピークを検出するため、このカラムを蒸発光散乱（ELSD）検出器に接続した。2'-FLを単糖（存在する場合）、ラクトースおよび有色体から分離するために、イソプロパノール、エタノールまたはメタノールの4段階勾配を用いた。糖ピークに対応する画分を120-mlボトルに自動収集し、プールした。
【０１１８】
2回の発酵実施からの結果が図10Aおよび図10Bに示されている。培養物を136（実施36B）または112時間（実施37A）成長させ、生産された2'-FLのレベルをTLC分析によって分析した。図10Aおよび図10Bの両方に示されるように、2'-フコシルラクトースは培養40時間で生産され、生産量は発酵プロセスの最終時点まで増加し続けた。実施36Bから生産された2'-FLの収量は、リットルあたり33グラムであった。実施37Aから生産された2'-FLの収量は、リットルあたり36.3グラムであった。これらの結果は、外因性FutNの発現が高収量の2'-フコシルラクトース産物に適していることを示している。
【０１１９】
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【０１２０】
他の態様
本発明はその詳細な説明に関連して説明されているが、これまでの説明は例示を意図したものであり、発明の範囲を限定するものではなく、発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義されるものである。他の局面、利点および変更も添付の特許請求の範囲に包含される。
【０１２１】
本明細書で言及されている特許および科学文献は、当業者が入手可能な知見を示すものである。本明細書で引用されているすべての米国特許および公開または未公開の米国特許出願は、参照により組み入れられる。本明細書で引用されているすべての公開された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書で引用されているアクセッション番号によって示されるGenBankおよびNCBI提出物は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書で引用されているすべての他の公開された参考文献、書類、原稿および科学文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２２】
本発明は、その好ましい態様を参照して具体的に示され説明されているが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなくその中で形式および詳細に関する様々な変更がなされ得ることが当業者に理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月10日(2020.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素を含む細菌を提供する工程を含み、該α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、FutP (SEQ ID NO: 11)、FutQ (SEQ ID NO: 12)、FutR (SEQ ID NO: 13)、FutS (SEQ ID NO: 14)、FutY (SEQ ID NO: 19)、FutP (SEQ ID NO: 292)、FutX (SEQ ID NO: 18)、FutO (SEQ ID NO: 10)、FutW (SEQ ID NO: 17)、FutZA (SEQ ID NO: 21)、FutU (SEQ ID NO: 15)、FutZ (SEQ ID NO: 20)、またはFutV (SEQ ID NO: 16)のアミノ酸配列に対して少なくとも75％の配列同一性を有する、細菌内でフコシル化オリゴ糖を生産する方法。
【請求項２】
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、パラバクテロイデス・ジョンソニイ（Parabacteroides johnsonii）FutX、ラクノスピラセアエ（Lachnospiraceae）種FutQ、プレボテラ・メラニノゲニカ（Prevotella melaninogenica）FutO、プレボテラ種FutW、バクテロイデス（Bacteroides）種FutZA、タネレラ（Tannerella）種FutS、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）+13 FutP、バクテロイデス・カカエ（Bacteroides caccae）FutU、サルモネラ菌（Salmonella enterica）FutZ、メタノスファエルラ・パルストリス（Methanosphaerula palustries）FutR、ブチリビブリオ（Butyrivibrio）FutV、アケルマンシア・ムシニフィリア（Akkermansia muciniphilia）FutY、クロストリジウム・ボルテアエFutP、またはそれらの機能的変種もしくはフラグメントから選択されるいずれか一つを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、アミノ酸配列SEQ ID NO:10〜21および292のいずれか一つまたはそれらの機能的変種もしくはフラグメントを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
前記細菌からまたは前記細菌の培養上清からフコシル化オリゴ糖を回収する工程をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
フコシル化オリゴ糖が、2'-フコシルラクトース（2'-FL）、ラクトジフコテトラオース（LDFT）、ラクト-N-フコペンタオースI（LNF I）、またはラクト-N-ジフコヘキサオースI（LDFH I）を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記細菌がさらに、外因性ラクトース利用性α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ酵素および／または外因性ラクトース利用性α(1,4)フコシルトランスフェラーゼ酵素を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
外因性ラクトース利用性α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、ピロリ菌（Helicobacter pylori）26695 futA遺伝子を含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
外因性ラクトース利用性α(1,4)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、ピロリ菌UA948 FucTa遺伝子またはピロリ菌株DMS6709 FucT III遺伝子を含む、請求項6記載の方法。
【請求項９】
前記細菌がさらに、減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性、不完全なコラン酸合成経路、不活性化されたATP依存性細胞内プロテアーゼ、不活性化されたlacAまたはそれらの組み合わせを伴う、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
トリプトファンの存在下およびチミジンの非存在下で前記細菌を培養する工程をさらに含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、前記細菌の欠失もしくは不活性化された内因性lacZ遺伝子および／または欠失もしくは不活性化された内因性lacI遺伝子を伴う、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性がさらに、野生型細菌より低いβ-ガラクトシダーゼ活性レベルを含む外因性lacZ遺伝子またはその変種を伴う、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、野生型細菌より低い活性レベルを含む、請求項9記載の方法。
【請求項１４】
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、6,000単位未満のβ-ガラクトシダーゼ活性を含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、1,000単位未満のβ-ガラクトシダーゼ活性を含む、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
前記細菌が、lacY遺伝子の直接上流にlacIq遺伝子プロモーターを含む、請求項9記載の方法。
【請求項１７】
不完全なコラン酸合成経路が、前記細菌のwcaJ遺伝子の不活性化を伴う、請求項9記載の方法。
【請求項１８】
不活性化されたATP依存性細胞内プロテアーゼが、内因性lon遺伝子のヌル変異、不活性化変異、または欠失である、請求項9記載の方法。
【請求項１９】
内因性lon遺伝子の不活性化変異が、機能性大腸菌（E.coli）lacZ+遺伝子の挿入を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記細菌がさらに、機能性ラクトースパーミアーゼ遺伝子を含む、請求項9記載の方法。
【請求項２１】
前記細菌が、大腸菌lacYを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
前記細菌がさらに、外因性大腸菌rcsAまたは大腸菌rcsB遺伝子を含む、請求項9記載の方法。
【請求項２３】
前記細菌がさらに、thyA遺伝子内に変異を含む、請求項9記載の方法。
【請求項２４】
前記細菌が、外因性ラクトースの存在下で細胞内ラクトースを蓄積する、請求項9記載の方法。
【請求項２５】
前記細菌が、細胞内GDP-フコースを蓄積する、請求項9記載の方法。
【請求項２６】
前記細菌が大腸菌である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前記細菌が、バチルス（Bacillus）、パントエア（Pantoea）、ラクトバチルス（Lactobacillus)、ラクトコッカス（Lactococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、プロプリオニバクテリウム（Proprionibacterium）、エンテロコッカス（Enterococcus）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、スポロラクトバチルス（Sporolactobacillus）、ミクロモモスポラ（Micromomospora）、ミクロコッカス（Micrococcus）、ロドコッカス（Rhodococcus）、またはシュードモナス（Pseudomonas）属のメンバーである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
前記細菌が、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーモフィルス（Bacillus thermophilus）、バチルス・ラテロスポールス（Bacillus laterosporus）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、およびバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、エルウイニア・ヘルビコラ（Erwinia herbicola）（パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans））、シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundii）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）、ペクトバクテリウム・カロトボルム（Pectobacterium carotovorum）、ザントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・クリスパータス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・イエンセニイ（Lactobacillus jensenii）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophiles）、プロプリオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Proprionibacterium freudenreichii）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・サーモフィルス（Enterococcus thermophiles）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、およびシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
前記細菌が、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む核酸コンストラクトを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸が、細菌内での前記酵素の産生を誘導する1つまたは複数の異種制御配列に機能的に連結されている、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
異種制御配列が、細菌プロモーターおよびオペレーター、細菌リボソーム結合部位、細菌転写ターミネーター、またはプラスミド選択マーカーを含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
前記請求項のいずれか一項によって生産された、精製されたフコシル化オリゴ糖。
【請求項３３】
宿主細菌生産株内での該酵素の産生のための、ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む核酸コンストラクトであって、該α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、FutP (SEQ ID NO: 11)、FutQ (SEQ ID NO: 12)、FutR (SEQ ID NO: 13)、FutS (SEQ ID NO: 14)、FutY (SEQ ID NO: 19)、FutP (SEQ ID NO: 292)、FutX (SEQ ID NO: 18)、FutO (SEQ ID NO: 10)、FutW (SEQ ID NO: 17)、FutZA (SEQ ID NO: 21)、FutU (SEQ ID NO: 15)、FutZ (SEQ ID NO: 20)、またはFutV (SEQ ID NO: 16)のアミノ酸配列に対して少なくとも75％の配列同一性を有する、核酸コンストラクト。
【請求項３４】
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX、ラクノスピラセアエ種FutQ、プレボテラ・メラニノゲニカFutO、プレボテラ種FutW、バクテロイデス種FutZA、タネレラ種FutS、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP、バクテロイデス・カカエFutU、サルモネラ菌FutZ、メタノスファエルラ・パルストリスFutR、ブチリビブリオFutV、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY、クロストリジウム・ボルテアエFutP、またはそれらの機能的変種もしくはフラグメントから選択されるいずれか一つを含む、請求項33記載のコンストラクト。
【請求項３５】
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、アミノ酸配列SEQ ID NO:10〜21および292のいずれか一つまたはそれらの機能的変種もしくはフラグメントを含む、請求項33または34記載のコンストラクト。
【請求項３６】
前記核酸が、細菌内での前記酵素の産生を誘導する1つまたは複数の異種制御配列に機能的に連結されている、請求項33〜35のいずれか一項記載のコンストラクト。
【請求項３７】
異種制御配列が、細菌プロモーターおよびオペレーター、細菌リボソーム結合部位、細菌転写ターミネーター、プラスミド選択マーカー、および／または複製起点を含む、請求項36記載のコンストラクト。
【請求項３８】
ラクトース受容性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む単離された細菌であって、該α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、FutP (SEQ ID NO: 11)、FutQ (SEQ ID NO: 12)、FutR (SEQ ID NO: 13)、FutS (SEQ ID NO: 14)、FutY (SEQ ID NO: 19)、FutP (SEQ ID NO: 292)、FutX (SEQ ID NO: 18)、FutO (SEQ ID NO: 10)、FutW (SEQ ID NO: 17)、FutZA (SEQ ID NO: 21)、FutU (SEQ ID NO: 15)、FutZ (SEQ ID NO: 20)、またはFutV (SEQ ID NO: 16)のアミノ酸配列に対して少なくとも75％の配列同一性を有する、単離された細菌。
【請求項３９】
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX、ラクノスピラセアエ種FutQ、プレボテラ・メラニノゲニカFutO、プレボテラ種FutW、バクテロイデス種FutZA、タネレラ種FutS、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP、バクテロイデス・カカエFutU、サルモネラ菌FutZ、メタノスファエルラ・パルストリスFutR、ブチリビブリオFutV、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY、クロストリジウム・ボルテアエFutP、またはそれらの機能的変種もしくはフラグメントから選択されるいずれか一つを含む、請求項38記載の単離された細菌。
【請求項４０】
α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ酵素および／またはα(1,4)フコシルトランスフェラーゼ酵素をさらに含む、請求項38または39記載の単離された細菌。
【請求項４１】
大腸菌である、請求項38〜40のいずれか一項記載の単離された細菌。
【請求項４２】
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性、不完全なコラン酸合成経路、不活性化されたアデノシン-5'-三リン酸（ATP）依存性細胞内プロテアーゼ、不活性化された内因性lacA遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせをさらに伴う、請求項38〜41のいずれか一項記載の単離された細菌。
【請求項４３】
遺伝子型ΔampC::PtrpBcI, Δ(lacI-lacZ)::FRT, PlacIqlacY+, ΔwcaJ::FRT, thyA::Tn10, Δlon:(npt3, lacZ+)を含む、請求項42記載の単離された細菌。
【請求項４４】
（ａ）重量で、前記精製されたフコシル化オリゴ糖の少なくとも99%が2'-フコシルラクトース（2'-FL）およびラクト-N-フコペンタオース（LNF I）を含む、
（ｂ）前記精製されたフコシル化オリゴ糖が2'-FLのレベルの0.5%未満の3-フコシルラクトース（3-FL）の量を含む、または
（ｃ）前記精製されたフコシル化オリゴ糖がアセチル-ラクトースを含まない、
請求項32記載の精製されたフコシル化オリゴ糖。
【請求項４５】
外因性ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素を含む細菌を提供する工程を含み、該α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、FutP (SEQ ID NO: 11)、FutQ (SEQ ID NO: 12)、FutR (SEQ ID NO: 13)、FutS (SEQ ID NO: 14)、FutY (SEQ ID NO: 19)、FutP (SEQ ID NO: 292)、FutX (SEQ ID NO: 18)、FutO (SEQ ID NO: 10)、FutW (SEQ ID NO: 17)、FutZA (SEQ ID NO: 21)、FutU (SEQ ID NO: 15)、FutZ (SEQ ID NO: 20)、またはFutV (SEQ ID NO: 16)のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、細菌内でフコシル化オリゴ糖を生産する方法。
【請求項４６】
ラクトース受容性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む単離された細菌であって、該α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、FutP (SEQ ID NO: 11)、FutQ (SEQ ID NO: 12)、FutR (SEQ ID NO: 13)、FutS (SEQ ID NO: 14)、FutY (SEQ ID NO: 19)、FutP (SEQ ID NO: 292)、FutX (SEQ ID NO: 18)、FutO (SEQ ID NO: 10)、FutW (SEQ ID NO: 17)、FutZA (SEQ ID NO: 21)、FutU (SEQ ID NO: 15)、FutZ (SEQ ID NO: 20)、またはFutV (SEQ ID NO: 16)のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、単離された細菌。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
[本発明1001]
外因性ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素を含む細菌を提供する工程を含み、該酵素のアミノ酸配列がFutC（SEQ ID NO:1）に対して少なくとも22％の同一性を有する、細菌内でフコシル化オリゴ糖を生産する方法。
[本発明1002]
外因性ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素を含む細菌を提供する工程を含み、該酵素のアミノ酸配列がFutN（SEQ ID NO:3）に対して少なくとも25％の同一性を有する、細菌内でフコシル化オリゴ糖を生産する方法。
[本発明1003]
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、パラバクテロイデス・ジョンソニイ（Parabacteroides johnsonii）FutX、ラクノスピラセアエ（Lachnospiraceae）種FutQ、プレボテラ・メラニノゲニカ（Prevotella melaninogenica）FutO、プレボテラ種FutW、バクテロイデス（Bacteroides）種FutZA、タネレラ（Tannerella）種FutS、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）+13 FutP、バクテロイデス・カカエ（Bacteroides caccae）FutU、サルモネラ菌（Salmonella enterica）FutZ、メタノスファエルラ・パルストリス（Methanosphaerula palustries）FutR、ブチリビブリオ（Butyrivibrio）FutV、アケルマンシア・ムシニフィリア（Akkermansia muciniphilia）FutY、クロストリジウム・ボルテアエFutP、またはそれらの機能的変種もしくはフラグメントから選択されるいずれか一つを含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、アミノ酸配列SEQ ID NO:10〜21および292のいずれか一つまたはそれらの機能的変種もしくはフラグメントを含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記細菌からまたは前記細菌の培養上清からフコシル化オリゴ糖を回収する工程をさらに含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1006]
フコシル化オリゴ糖が、2'-フコシルラクトース（2'-FL）、ラクトジフコテトラオース（LDFT）、ラクト-N-フコペンタオースI（LNF I）、またはラクト-N-ジフコヘキサオースI（LDFH I）を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記細菌がさらに、外因性ラクトース利用性α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ酵素および／または外因性ラクトース利用性α(1,4)フコシルトランスフェラーゼ酵素を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1008]
外因性ラクトース利用性α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、ピロリ菌（Helicobacter pylori）26695 futA遺伝子を含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
外因性ラクトース利用性α(1,4)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、ピロリ菌UA948 FucTa遺伝子またはピロリ菌株DMS6709 FucT III遺伝子を含む、本発明1007の方法。
[本発明1010]
前記細菌がさらに、減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性、不完全なコラン酸合成経路、不活性化されたATP依存性細胞内プロテアーゼ、不活性化されたlacAまたはそれらの組み合わせを伴う、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1011]
トリプトファンの存在下およびチミジンの非存在下で前記細菌を培養する工程をさらに含む、本発明1010の方法。
[本発明1012]
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、前記細菌の欠失もしくは不活性化された内因性lacZ遺伝子および／または欠失もしくは不活性化された内因性lacI遺伝子を伴う、本発明1010の方法。
[本発明1013]
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性がさらに、野生型細菌より低いβ-ガラクトシダーゼ活性レベルを含む外因性lacZ遺伝子またはその変種を伴う、本発明1012の方法。
[本発明1014]
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、野生型細菌より低い活性レベルを含む、本発明1010の方法。
[本発明1015]
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、6,000単位未満のβ-ガラクトシダーゼ活性を含む、本発明1014の方法。
[本発明1016]
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、1,000単位未満のβ-ガラクトシダーゼ活性を含む、本発明1014の方法。
[本発明1017]
前記細菌が、lacY遺伝子の直接上流にlacIq遺伝子プロモーターを含む、本発明1010の方法。
[本発明1018]
不完全なコラン酸合成経路が、前記細菌のwcaJ遺伝子の不活性化を伴う、本発明1010の方法。
[本発明1019]
不活性化されたATP依存性細胞内プロテアーゼが、内因性lon遺伝子のヌル変異、不活性化変異、または欠失である、本発明1010の方法。
[本発明1020]
内因性lon遺伝子の不活性化変異が、機能性大腸菌（E.coli）lacZ+遺伝子の挿入を含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記細菌がさらに、機能性ラクトースパーミアーゼ遺伝子を含む、本発明1010の方法。
[本発明1022]
前記細菌が、大腸菌lacYを含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記細菌がさらに、外因性大腸菌rcsAまたは大腸菌rcsB遺伝子を含む、本発明1010の方法。
[本発明1024]
前記細菌がさらに、thyA遺伝子内に変異を含む、本発明1010の方法。
[本発明1025]
前記細菌が、外因性ラクトースの存在下で細胞内ラクトースを蓄積する、本発明1010の方法。
[本発明1026]
前記細菌が、細胞内GDP-フコースを蓄積する、本発明1010の方法。
[本発明1027]
前記細菌が大腸菌である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1028]
生産株が、バチルス（Bacillus）、パントエア（Pantoea）、ラクトバチルス（Lactobacillus)、ラクトコッカス（Lactococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、プロプリオニバクテリウム（Proprionibacterium）、エンテロコッカス（Enterococcus）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、スポロラクトバチルス（Sporolactobacillus）、ミクロモモスポラ（Micromomospora）、ミクロコッカス（Micrococcus）、ロドコッカス（Rhodococcus）、またはシュードモナス（Pseudomonas）属のメンバーである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1029]
生産株が、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーモフィルス（Bacillus thermophilus）、バチルス・ラテロスポールス（Bacillus laterosporus）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、およびバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、エルウイニア・ヘルビコラ（Erwinia herbicola）（パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans））、シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundii）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）、ペクトバクテリウム・カロトボルム（Pectobacterium carotovorum）、ザントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・クリスパータス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・イエンセニイ（Lactobacillus jensenii）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophiles）、プロプリオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Proprionibacterium freudenreichii）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・サーモフィルス（Enterococcus thermophiles）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、およびシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）からなる群より選択される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記細菌が、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む核酸コンストラクトを含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記核酸が、細菌内での前記酵素の産生を誘導する1つまたは複数の異種制御配列に機能的に連結されている、本発明1030の方法。
[本発明1032]
異種制御配列が、細菌プロモーターおよびオペレーター、細菌リボソーム結合部位、細菌転写ターミネーター、またはプラスミド選択マーカーを含む、本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記本発明のいずれかによって生産された、精製されたフコシル化オリゴ糖。
[本発明1034]
宿主細菌生産株内での該酵素の産生のための、ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む核酸コンストラクトであって、該酵素のアミノ酸配列がFutC（SEQ ID NO:1）に対して少なくとも22％の同一性を有する、核酸コンストラクト。
[本発明1035]
宿主細菌生産株内での該酵素の産生のための、ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む核酸コンストラクトであって、該酵素のアミノ酸配列がFutN（SEQ ID NO:3）に対して少なくとも25％の同一性を有する、核酸コンストラクト。
[本発明1036]
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX、ラクノスピラセアエ種FutQ、プレボテラ・メラニノゲニカFutO、プレボテラ種FutW、バクテロイデス種FutZA、タネレラ種FutS、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP、バクテロイデス・カカエFutU、サルモネラ菌FutZ、メタノスファエルラ・パルストリスFutR、ブチリビブリオFutV、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY、クロストリジウム・ボルテアエFutP、またはそれらの機能的変種もしくはフラグメントから選択されるいずれか一つを含む、本発明1034または1035のコンストラクト。
[本発明1037]
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、アミノ酸配列SEQ ID NO:10〜21および292のいずれか一つまたはそれらの機能的変種もしくはフラグメントを含む、本発明1034〜1036のいずれかのコンストラクト。
[本発明1038]
前記核酸が、細菌内での前記酵素の産生を誘導する1つまたは複数の異種制御配列に機能的に連結されている、本発明1034〜1037のいずれかのコンストラクト。
[本発明1039]
異種制御配列が、細菌プロモーターおよびオペレーター、細菌リボソーム結合部位、細菌転写ターミネーター、プラスミド選択マーカー、および／または複製起点を含む、本発明1038のコンストラクト。
[本発明1040]
ラクトース受容性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む単離された細菌であって、該核酸によってコードされる酵素のアミノ酸配列がFutC（SEQ ID NO:1）に対して少なくとも22％の同一性を有する、単離された細菌。
[本発明1041]
ラクトース受容性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む単離された細菌であって、該核酸によってコードされる酵素のアミノ酸配列がFutN（SEQ ID NO:3）に対して少なくとも25％の同一性を有する、単離された細菌。
[本発明1042]
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX、ラクノスピラセアエ種FutQ、プレボテラ・メラニノゲニカFutO、プレボテラ種FutW、バクテロイデス種FutZA、タネレラ種FutS、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP、バクテロイデス・カカエFutU、サルモネラ菌FutZ、メタノスファエルラ・パルストリスFutR、ブチリビブリオFutV、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY、クロストリジウム・ボルテアエFutP、またはそれらの機能的変種もしくはフラグメントから選択されるいずれか一つを含む、本発明1040または1041の単離された細菌。
[本発明1043]
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、アミノ酸配列SEQ ID NO:10〜21および292のいずれか一つまたはそれらの機能的変種もしくはフラグメントを含む、本発明1040〜1042のいずれかの単離された細菌。
[本発明1044]
α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ酵素および／またはα(1,4)フコシルトランスフェラーゼ酵素をさらに含む、本発明1040〜1043のいずれかの単離された細菌。
[本発明1045]
大腸菌である、本発明1040〜1044のいずれかの単離された細菌。
[本発明1046]
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性、不完全なコラン酸合成経路、不活性化されたアデノシン-5'-三リン酸（ATP）依存性細胞内プロテアーゼ、不活性化された内因性lacA遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせをさらに伴う、本発明1040〜1045のいずれかの単離された細菌。
[本発明1047]
遺伝子型ΔampC::PtrpBcI, Δ(lacI-lacZ)::FRT, PlacIqlacY+, ΔwcaJ::FRT, thyA::Tn10, Δlon:(npt3, lacZ+)を含む、本発明1046の単離された細菌。
本発明の他の特徴および利点は、以下のその好ましい態様の説明からおよび特許請求の範囲から明らかとなるであろう。それ以外のことが定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験には本明細書に記載されているのと類似または等価な方法および材料が使用され得るが、以下では適当な方法および材料が説明されている。本明細書で言及されているすべての公開された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書で引用されているアクセッション番号によって示されるGenbankおよびNCBI提出物は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書で引用されているすべての他の公開された参考文献、文書、原稿および科学文献は、参照により本明細書に組み入れられる。齟齬が生じる場合は、定義を含めて本明細書が優先される。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定を意図したものではない。