(57)【要約】【課題】安全性が高く持続的に摂取可能なＧＬＵＴ１発現亢進剤を提供する。【解決手段】クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を有効成分とするＧＬＵＴ１発現亢進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を有効成分とするＧＬＵＴ１発現亢進剤。
【請求項２】
クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を有効成分とする脳内グルコース取り込み促進剤。
【請求項３】
クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を有効成分とするＧＬＵＴ１欠損症症候群の予防、治療又は改善剤。
【請求項４】
クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を有効成分とするＧＬＵＴ１発現亢進用食品。
【請求項５】
クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を有効成分とする脳内グルコース取り込み促進用食品。
【請求項６】
クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を有効成分とするＧＬＵＴ１欠損症症候群の予防又は改善用食品。
【請求項７】
クロロゲン酸類が、３-ＣＱＡ、４-ＣＱＡ、５-ＣＱＡ、３，４-ｄｉＣＱＡ、４，５-ｄｉＣＱＡ及び３，５-ｄｉＣＱＡのうち少なくとも一つから選択される１種以上である請求項１〜３のいずれか１項記載の剤、又は請求項４〜６のいずれか１項記載の食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコーストランスポーター１の発現を亢進するＧＬＵＴ１発現亢進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳はグルコースを重要なエネルギー基質とし、代謝により産生されるＡＴＰを用いて活動を維持しており、脳機能を維持するためには脳神経細胞のエネルギー代謝が重要である。１９８８年のＦｏｘらによるＰｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＰＥＴ）を用いた研究では、ヒトの視覚野の脳グルコース消費率、脳血流量および脳酸素消費量を測定し、視覚刺激による脳の機能活動亢進により脳グルコース消費が高まることが明らかにされている（非特許文献１）。つまり、脳内のエネルギー代謝基質であるグルコース量の低下は脳機能低下につながる。一方で、脳内のグルコースの取り込みはグルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １:ＧＬＵＴ１）に依存している。そのため、ＧＬＵＴ１の発現を亢進させることは脳内へのグルコース取り込み量を促進させ、脳機能向上につながる。
【０００３】
ＧＬＵＴ１欠損症症候群（ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｔｙｐｅ １ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＧＬＵＴ１ ＤＳ）は、脳のエネルギー代謝基質であるグルコースが脳内に取り込まれないことにより生じる代謝性脳症で、１９９１年にＤｅ  Ｖｉｖｏらにより初めて報告された（非特許文献２）。ＧＬＵＴ１欠損症症候群患者の大多数はＧＬＵＴ１をエンコードしているＳＬＣ２Ａ１遺伝子のヘテロ接合性ｄｅ ｎｏｖｏ変異がみられ、赤血球を用いた３-Ｏ-メチル-Ｄ-グルコース取り込み試験にて取り込み量が低下することが知られている（非特許文献３、４）。また、血糖値は正常であるが髄液中の糖が低値となることより中枢神経系内の低血糖状態を生じ、様々な中枢神経系機能不全を起こす。中でも発達遅滞、痙性麻痺、運動失調等の原因となることが知られている（非特許文献３、５）。
【０００４】
ＧＬＵＴ１欠損症症候群の具体的な治療法としては、一般的にケトン食療法が用いられているが、便秘、低血糖症、高脂血症、高コレステロール血症、軽度アシドーシスなどの副作用が報告されている。また、ウイルスベクターを用いたＧＬＵＴ１遺伝子治療法（特許文献１）や奇数鎖脂肪酸であるトリヘプタイン摂取法（特許文献２）等も開発されているが、副作用や投与方法などの問題により、一般的には使用されていない。
【０００５】
一方、クロロゲン酸類は、植物においてはコーヒー豆やじゃがいも等に見出され、これまでに末梢において抗酸化作用、抗不安作用、抗炎症作用、鎮痛作用、解熱作用、血圧降下作用等を有すること、ならびに中枢神経系においてアミロイドβ誘導毒性及び酸化ストレスから神経細胞を保護する作用を有することが報告されている（特許文献３、４）。また、２個のカフェ酸がエステル結合したジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸に神経細胞保護作用があることが報告されている（特許文献５）。また、カフェ酸には、自律神経機能向上作用（特許文献６）、血液流動性改善作用（特許文献７）があることが報告されている。
【０００６】
しかしながら、クロロゲン酸類やカフェ酸が、ＧＬＵＴ１の発現を亢進すること、ＧＬＵＴ１欠損症症候群の改善に有用であることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１７−１２３８４０号公報
【特許文献２】特表２０１６−５０４３２３号公報
【特許文献３】特開２００２−５３４６４号公報
【特許文献４】特表２０１３−５４３８５６号公報
【特許文献５】国際公開第２００７／０９１６１３号
【特許文献６】特開２００２−１４５７６５号公報
【特許文献７】特開２００４−１６８７４９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Science, 241:462-464, 1988
【非特許文献２】N Engl J Med, 325:703-9, 1991
【非特許文献３】Revue Neurologique, 170:91-99, 2014
【非特許文献４】Annals of Neurology, 70:996-1005, 2011
【非特許文献５】Nat Commun, 2017, DOI: 10.1038/ncomms14152
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、安全性が高く持続的に摂取可能なＧＬＵＴ１発現亢進剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、長期的に服用又は摂取することができる安全性の高い成分について、種々検討した結果、クロロゲン酸類が優れたＧＬＵＴ１発現亢進作用を有し、ＧＬＵＴ１欠損症症候群の予防、治療又は改善に有用であることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の１）〜６）に係るものである。
１）クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を有効成分とするＧＬＵＴ１発現亢進剤。
２）クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を有効成分とする脳内グルコース取り込み促進剤。
３）クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を有効成分とするＧＬＵＴ１欠損症症候群の予防、治療又は改善剤。
４）クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を有効成分とするＧＬＵＴ１発現亢進用食品。
５）クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を有効成分とする脳内グルコース取り込み促進用食品。
６）クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を有効成分とするＧＬＵＴ１欠損症症候群の予防又は改善用食品。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ＧＬＵＴ１の発現を亢進し、ＧＬＵＴ１欠損症症候群の予防、治療又は改善に有用な、医薬品、食品が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】クロロゲン酸摂取による脳内のＧＬＵＴ１発現亢進作用。
【図２】脳血管内皮細胞におけるクロロゲン酸類及び５−ＣＱＡのＧＬＵＴ１発現亢進作用（５時間処理）。
【図３】脳血管内皮細胞におけるクロロゲン酸類及び５−ＣＱＡのＧＬＵＴ１発現亢進作用（２４時間処理）。
【図４】脳血管内皮細胞におけるクロロゲン酸類及び５−ＣＱＡのＧＬＵＴ１発現亢進作用（４８時間処理）。
【図５】脳血管内皮細胞におけるクロロゲン酸類及びその構成成分単体のＧＬＵＴ１遺伝子発現亢進作用。
【図６】脳血管内皮細胞におけるクロロゲン酸類及びその構成成分単体のＧＬＵＴ１タンパク質発現亢進作用。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明における「クロロゲン酸類」とは、３−カフェオイルキナ酸（３-ＣＱＡ）、４−カフェオイルキナ酸（４-ＣＱＡ）及び５−カフェオイルキナ酸（５-ＣＱＡ）のモノカフェオイルキナ酸と、３−フェルロイルキナ酸（３-ＦＱＡ）、４−フェルロイルキナ酸（４-ＦＱＡ）及び５−フェルロイルキナ酸（５-ＦＱＡ）のモノフェルロイルキナ酸と、３，４−ジカフェオイルキナ酸（３，４-ｄｉＣＱＡ）、３，５−ジカフェオイルキナ酸（３，５-ｄｉＣＱＡ）及び４，５−ジカフェオイルキナ酸（４，５-ｄｉＣＱＡ）のジカフェオイルキナ酸を併せての総称である。クロロゲン酸類の含有量は上記９種の合計量に基づいて定義される。
本発明の「クロロゲン酸類」は、上記９種のクロロゲン酸類のうち少なくとも１種を含有すればよいが、ＧＬＵＴ１発現亢進作用の点から、モノ又はジカフェオイルキナ酸を含むのが好ましく、モノカフェオイルキナ酸を含むのがより好ましく、５−カフェオイルキナ酸を含むのが更に好ましい。５−カフェオイルキナ酸の含量は、１５質量％以上が好ましく、２５質量％以上がより好ましく、３５質量％以上が更に好ましい。
【００１５】
本発明の「カフェ酸」は、３，４−ジヒドロキシケイ皮酸の別称である。
【００１６】
本発明において、クロロゲン酸類及びカフェ酸は、塩の形態でもよく、塩としては薬学的に許容される塩、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属塩、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等の有機アミン塩、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。
【００１７】
本発明のクロロゲン酸類、カフェ酸又はそれらの塩は、これを含む植物の抽出物、その濃縮物又はそれらの精製物等を使用することができる。このような植物抽出物としては、例えば、ヒマワリ種子、リンゴ未熟果、コーヒー豆、シモン葉、マツ科植物の球果、マツ科植物の種子殻、ジャガイモ、カンショ、サトウキビ、小麦、南天の葉、ゴボウ、ニンジン、キャベツ、レタス、アーチチョーク、トマト、モロヘイヤ、ナスの皮、ナシ、プラム、モモ、アプリコット、チェリー、ウメの果実、フキタンポポ、ブドウ科植物等から抽出されたものが挙げられる。なかでも、クロロゲン酸類含量等の点から、コーヒー豆抽出物が好ましく、焙煎コーヒー豆でもよいが、浅焙煎コーヒー豆、微焙煎コーヒー豆、生コーヒー豆が好ましい。コーヒーの木の種類としては、アラビカ種、ロブスタ種、リベリカ種及びアラブスタ種のいずれでもよい。
【００１８】
コーヒー豆抽出物は、カフェインを除去したものが好ましく、カフェインとクロロゲン酸類との質量比（カフェイン／クロロゲン酸類）が、風味の観点から０．０５以下が好ましく、０．０３以下がより好ましく、０．０２以下が更に好ましい。なお、カフェイン／クロロゲン酸類の比の下限は特に限定されず、０であってもよい。コーヒー豆抽出物は、カリウム（Ｋ）とナトリウム（Ｎａ）の和とクロロゲン酸類との質量比〔(Ｋ+Ｎａ)／クロロゲン酸類〕が風味の観点から、０．１８以下、更に０．１４以下、更に０．１以下、殊更に０．０６以下が好ましい。なお、質量比〔(Ｋ+Ｎａ)／クロロゲン酸類〕の下限は特に限定されず、０であってもよいが、生産効率の観点から、０．０００１、更に０．００１が好ましい。
【００１９】
本発明のクロロゲン酸類、カフェ酸又はそれらの塩の抽出、濃縮、精製の方法・条件は特に限定されず、公知の方法及び条件を採用することができる。なかでも、アスコルビン酸水溶液、クエン酸水溶液又は熱水による抽出が好ましい。
また、クロロゲン酸類又はその塩の原料として市販のクロロゲン酸類含有製剤を使用してもよく、例えば、フレーバーホルダーＲＣ（長谷川香料（株））、生コーヒー豆エキスP（オリザ油化社製）、スベトール（Ｎｕｒｅｘ Ｉｎｃ.製）、ＯＸＣＨ１００（東洋発酵社製）等が挙げられる。また、カフェ酸又はその塩は、ｃａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＳＩＧＭＡ社製）等の市販品を使用することもできる。
【００２０】
後記実施例に示すように、クロロゲン酸類又はカフェ酸は、脳におけるＧＬＵＴ１遺伝子の発現亢進作用を有する。すなわち、クロロゲン酸類又はカフェ酸は、脳内のＧＬＵＴ１発現を亢進させ、グルコースの取り込みを促進する作用を有する。
ＧＬＵＴ１欠損症症候群は、ＧＬＵＴ１の遺伝子異常により、脳のエネルギー代謝基質であるグルコースが中枢神経系に取り込まれないことにより生じる代謝性脳症である。
従って、クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上は、ＧＬＵＴ１発現亢進剤、脳内グルコース取り込み促進剤、ＧＬＵＴ１欠損症症候群の予防、治療又は改善剤（以下、「本発明のＧＬＵＴ１発現亢進剤等」とも称する）となり得、ＧＬＵＴ１の発現を亢進するため、脳内グルコース取り込みを促進するため、ＧＬＵＴ１欠損症症候群を予防、治療又は改善するために使用することができ、またＧＬＵＴ１発現亢進剤、脳内グルコース取り込み促進剤、ＧＬＵＴ１欠損症症候群の予防、治療又は改善剤を製造するために使用することができる。
ここで、「使用」は、ヒト若しくは非ヒト動物への投与又は摂取であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。尚、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
【００２１】
本発明において、ＧＬＵＴ１の発現亢進には、遺伝子レベルでの発現亢進及びタンパク質レベルでの発現亢進が包含される。遺伝子レベルでの発現亢進にはｍＲＮＡの発現亢進、好ましくはｍＲＮＡへの転写亢進が挙げられ、タンパク質レベルでの発現亢進には翻訳における亢進が含まれるが、好ましくはｍＲＮＡの発現亢進である。ここで、「ＧＬＵＴ１」とは、ＮＣＢＩのデータベース（Ｇｅｎｅ）[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/]において、「ＧＬＵＴ１」として登録されているＧｌｕｃｏｓｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １を意味する。
【００２２】
本発明において、「ＧＬＵＴ１欠損症症候群」の症状としては、脳が慢性的なエネルギー不足となることで出現する様々な神経症状が挙げられ、具体的には、脳脊髄液低糖症、脳の低血糖、発達の遅延、精神遅滞、微小頭症（頭部の成長の減速）、異常眼球運動発作、無呼吸発作、Ｄｏｏｓｅ症候群、認知障害、学習障害、嗜眠・傾眠、不全片麻痺、全身麻痺睡眠障害、頭痛、嘔吐、痙攣（てんかん発作）、運動失調およびジストニアの特徴を組み合わせた複雑な運動障害等が挙げられる。
【００２３】
本発明において、「脳内グルコース取り込み促進」とは、血液中のグルコースを脳組織内に取り込む機能を促進することを意味する。
【００２４】
本明細書において、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。
また、「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転、疾患、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
また、「治療」には、疾患の完全治癒に加えて、症状を改善させることが包含される。
【００２５】
本発明の本発明のＧＬＵＴ１発現亢進剤等は、それ自体、ＧＬＵＴ１の発現を亢進するため、ＧＬＵＴ１欠損症症候群を予防、治療又は改善するための医薬品、医薬部外品、サプリメント又は食品であってもよく、或いは当該医薬品、医薬部外品、又は食品に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。
当該食品には、ＧＬＵＴ１発現亢進、ＧＬＵＴ１欠損症症候群の予防又は改善をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品、機能性表示食品、サプリメントが包含される。これらの食品は機能表示が許可された食品であるため、一般の食品と区別することができる。  
【００２６】
上記医薬品（医薬部外品も含む）の投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、又は注射剤、坐剤、吸入薬等による非経口投与が挙げられる。また、このような種々の剤型の製剤は、本発明のクロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を単独で、又はこれと他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤、本発明のクロロゲン酸類、カフェ酸又はそれらの塩以外の薬効成分等を適宜組み合わせて調製することができる。これらの投与形態のうち、好ましい形態は経口投与である。
【００２７】
上記食品の形態としては、清涼飲料水、茶系飲料、コーヒー飲料、果汁飲料、炭酸飲料、ゼリー、ウエハース、ビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品や栄養食等の各種食品の他、さらには、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）の栄養補給用組成物が挙げられる。
【００２８】
種々の形態の食品は、本発明のクロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、酸味料、甘味料、苦味料、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤、クロロゲン酸類又はその塩以外の有効成分等を適宜組み合わせて調製することができる。
【００２９】
上記の医薬品（医薬部外品を含む）や食品中のクロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上の含有量は、その使用形態により異なるが、通常、クロロゲン酸類又はカフェ酸として総量中好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、更に好ましくは０．１質量％以上であり、また、好ましくは９０質量％以下、より好ましくは６０質量％以下、更に好ましくは３０質量％以下である。また、好ましくは０．００１〜９０質量％、より好ましくは０．０１〜６０質量％、更に好ましくは０．１〜３０質量％である。
【００３０】
上記医薬品（医薬部外品も含む）及び食品の投与量又は摂取量は、適宜決定され得るが、通常、成人（６０ｋｇ）に対して１日あたり、クロロゲン酸類又はカフェ酸として、好ましくは１００ｍｇ以上、より好ましくは３００ｍｇ以上であり、また、好ましくは３０００ｍｇ以下、より好ましくは１０００ｍｇ以下である。本発明では斯かる量を１回で投与又は摂取するのが好ましい。
【００３１】
上記製剤は、任意の計画に従って投与又は摂取され、投与又は摂取期間は特に限定されないが、反復・連続して投与又は摂取することが好ましく、７日間以上連続して投与又は摂取することがより好ましく、２８日間以上連続して投与又は摂取することが更に好ましい。
【００３２】
投与又は摂取対象としては、例えばＧＬＵＴ１欠損症症候群に基づく各種神経症状があるヒト、その発症の恐れがあるヒト等が挙げられる。
【００３３】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を有効成分とするＧＬＵＴ１発現亢進剤。
＜２＞クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を有効成分とする脳内グルコース取り込み促進剤。
＜３＞クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を有効成分とするＧＬＵＴ１欠損症症候群の予防、治療又は改善剤。
＜４＞クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を有効成分とするＧＬＵＴ１発現亢進用食品。
＜５＞クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を有効成分とする脳内グルコース取り込み促進用食品。
＜６＞クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を有効成分とするＧＬＵＴ１欠損症症候群の予防又は改善用食品。
【００３４】
＜７＞ＧＬＵＴ１発現亢進剤を製造するための、クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上の使用。
＜８＞脳内グルコース取り込み促進剤を製造するための、クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上の使用。
＜９＞ＧＬＵＴ１欠損症症候群の予防、治療又は改善剤を製造するための、クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上の使用。
＜１０＞ＧＬＵＴ１発現亢進用食品を製造するための、クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上の使用。
＜１１＞脳内グルコース取り込み促進用食品を製造するための、クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上の使用。
＜１２＞ＧＬＵＴ１欠損症症候群の予防又は改善用食品を製造するための、クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上の使用。
【００３５】
＜１３＞ＧＬＵＴ１発現亢進に使用するための、クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上。
＜１４＞脳内グルコース取り込み促進に使用するための、クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上。
＜１５＞ＧＬＵＴ１欠損症症候群の予防、治療又は改善に使用するための、クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上。
【００３６】
＜１６＞ＧＬＵＴ１の発現を亢進するための、クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上の非治療的使用。
＜１７＞脳内グルコース取り込みを促進するための、クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上の非治療的使用。
＜１８＞ＧＬＵＴ１欠損症症候群を予防又は改善するための、クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上の非治療的使用。
【００３７】
＜１９＞クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取するＧＬＵＴ１発現亢進方法。
＜２０＞クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取する脳内グルコース取り込み促進方法。
＜２１＞クロロゲン酸類、カフェ酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取するＧＬＵＴ１欠損症症候群の予防、治療又は改善方法。
【００３８】
＜２２＞＜１＞〜＜２１＞において、クロロゲン酸類は、３-ＣＱＡ、４-ＣＱＡ、５-ＣＱＡ、３，４-ｄｉＣＱＡ、４，５-ｄｉＣＱＡ及び３，５-ｄｉＣＱＡのうち少なくとも一つから選択される１種以上である。
【００３９】
＜２３＞＜１＞〜＜３＞、＜７＞〜＜９＞の剤、＜４＞〜＜６＞、＜１０＞〜＜１２＞の食品における、前記有効成分の含有量は、クロロゲン酸類又はカフェ酸として総量中好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、更に好ましくは０．１質量％以上であり、また、好ましくは９０質量％以下、より好ましくは６０質量％以下、更に好ましくは３０質量％以下である。また、好ましくは０．００１〜９０質量％、より好ましくは０．０１〜６０質量％、更に好ましくは０．１〜３０質量％である。
【００４０】
＜２４＞＜１＞〜＜２１＞において、成人１人当たりの１日の投与量は、クロロゲン酸類又はカフェ酸として、好ましくは１００ｍｇ以上、より好ましくは３００ｍｇ以上であり、また、好ましくは３０００ｍｇ以下、より好ましくは１０００ｍｇ以下である。
【実施例】
【００４１】
製造例１  クロロゲン酸類含有組成物の調製
１）ロブスタ種のコーヒー生豆を熱水にて抽出し、得られた抽出液をスプレードライにて乾燥し、粗クロロゲン酸類含有組成物を得た。該粗クロロゲン酸類含有組成物の組成は、クロロゲン酸類３２．３質量％、カフェイン９．８質量％、質量比（カフェイン／クロロゲン類）が０．３０３、質量比（（Ｋ＋Ｎａ）／クロロゲン酸類）が０．２４であった。
２）該粗クロロゲン酸類含有組成物１８９ｇを、エタノール濃度５２．４質量％のエタノール水溶液７５６ｇ、酸性白土（ミズカエース＃６００、水澤化学社製）９４．５ｇ、ろ過助剤（ソルカフロック、新日鉱プロキュアメント社製）１０．７ｇと混合することにより、クロロゲン酸類含有スラリー１０５１ｇを得た。該クロロゲン酸類含有スラリーのｐＨは５．７であった。
３）該クロロゲン酸類含有スラリー１０５１ｇと、続いてエタノール濃度５２．４質量％のエタノール水溶液１８９ｇを、プレコート剤として珪藻土を堆積させた２号濾紙にてろ過し、ろ過液１０５４ｇを回収した。
４）次いで、活性炭（白鷺ＷＨ２Ｃ、日本エンバイロケミカルズ社製）を１３２ｍＬ充填したカラムと、Ｈ形カチオン交換樹脂（ＳＫ１ＢＨ、三菱化学社製）を１０５ｍＬ充填したカラムとを連結し、これに、該ろ過液１０１９ｇを通液し、続いてエタノール濃度５２．４質量％のエタノール水溶液２３１ｇを通液して、溶出したカラム処理液１０７２ｇを回収した。ろ過液中のクロロゲン酸類含量に対する活性炭の使用量は、０．８１質量倍（ｇ／ｇ）であった。イオン交換樹脂の使用量は、粗クロロゲン酸類含有組成物中の固形分含量に対して０．７４（ｍＬ／ｇ）であった。
５）該カラム処理液１０３８ｇを、０．２μｍメンブランフィルターにてろ過した後、ロータリーエバポレーターにてエタノールを留去して、クロロゲン酸類含有液２２５ｇを得た。該クロロゲン酸類含有液の組成は、クロロゲン酸類２２．６質量％、カフェイン０．２９質量％、質量比（カフェイン／クロロゲン酸類）が０．０１３、エタノール０質量％で、かつそのｐＨは３．１であった。
６）該クロロゲン酸類含有液を蒸留水にて希釈し、クロロゲン酸類濃度を３質量％に調整した。得られた希釈液１０ｇを遠心管に取り、３０００ｒｐｍ、１５℃、６０分間遠心分離し、上清を凍結乾燥処理して、クロロゲン酸類含有精製コーヒーポリフェノール（ＣＰＰ）を得た。該ＣＰＰ中におけるクロロゲン酸類とカリウムおよびナトリウムの質量比（（Ｋ＋Ｎａ）／クロロゲン酸類）は０．０３６、クロロゲン酸類とカフェインとの質量比は上記５）と同様であった。該ＣＰＰ中のクロロゲン酸類の組成比を表１に示す。
【００４２】
【表１】
2020026396.tif 000002
【００４３】
製造例２
生コーヒー豆抽出物（ＦＨ１０４１、長谷川香料製、１００％）を、中圧ＯＤＳカラムクロマト（山善、ＹＭＣ−ＰＡＣＫ  ＯＤＳ−Ａ）に展開し、水を１０  Ｂ．Ｖ．通液させ水溶出画分（Ｆｒ．１、５４．５％）を得た。その後、メタノール濃度を上げ低極性成分を溶出させ、各種クロロゲン酸類を含む画分（Ｆｒ．２：３．９％、Ｆｒ．３：７．６％、Ｆｒ．４：１８．７％、Ｆｒ．５：６．０％、Ｆｒ．６：１０．０％、Ｆｒ．７：１．４％）を得た。Ｆｒ．４を分取ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ：Ｃａｐｃｅｌｌ  ＰＡＫ  Ｃ１８（１０Ｘ２５０ｍｍ），ＵＶ：３２５ｎｍ，Ｓｏｌｖｅｎｔ：７％ＭｅＣＮ，０．１％ＴＦＡａｑ）により分画し、４−ＣＱＡ（６．２７％）を得た。Ｆｒ．５を分取ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ：Ｃａｐｃｅｌｌ  ＰＡＫ  Ｃ１８（１０Ｘ２５０ｍｍ），ＵＶ：３２５ｎｍ，  Ｓｏｌｖｅｎｔ：１２％ＭｅＣＮ，０．１％ＴＦＡａｑ）により分画し、３，４−ｄｉＣＱＡ（０．６３  ％）を得た。Ｆｒ．６を分取ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ：Ｃａｐｃｅｌｌ  ＰＡＫ  Ｃ１８（１０Ｘ２５０ｍｍ），ＵＶ：３２５ｎｍ，Ｓｏｌｖｅｎｔ：２０％ＭｅＣＮ，０．１％ＴＦＡａｑ）により分画し、３，４−ｄｉＣＱＡ（０．３％）、４．５−ｄｉＣＱＡ（０．４％）を得た。
【００４４】
試験例１  健常マウスでのクロロゲン酸類によるＧＬＵＴ1発現亢進
（動物）
試験にはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、８週齢）（日本クレア）を用いた。マウスは室温２２±２℃、湿度５５±１０％、照明１２時間サイクル（７：００ａ．ｍ．〜７：００ｐ．ｍ．）で飼育し、餌及び水は自由摂取とした。
【００４５】
（方法）
試験期間中、動物を（I）対照食群、（II）ＣＰＰ０．５％食群、及び（III）ＣＰＰ１％食群の３群に分け、それぞれに一ヶ月間継続的に以下の餌を与えた。
（I）対照食群：ＣＰＰ非添加の餌（コーン油１０％、カゼイン２０％、セルロース４％、ミネラル３．５％、ビタミン１％、ポテトスターチ６１．５％）
（II）ＣＰＰ０．５％食群：ＣＰＰを０．５質量％含む餌（コーン油１０％、カゼイン２０％、セルロース４％、ミネラル３．５％、ビタミン１％、ポテトスターチ６０．５％、製造例１で得たＣＰＰ１％）
（III）ＣＰＰ１％食群：ＣＰＰを１質量％含む餌（コーン油１０％、カゼイン２０％、セルロース４％、ミネラル３．５％、ビタミン１％、ポテトスターチ５９．５％、製造例１で得たＣＰＰ２％）
【００４６】
試験期間終了後、動物をイソフルランによる深麻酔下にてヘパリン（５Ｕ／ｍＬ）含有ＰＢＳで灌流し、脳を摘出した。摘出した脳から大脳皮質を分離し、ＲＮＡ分解阻害液（ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ａｍｂｉｏｎ）に浸漬した後、ビーズホモジナイザーを用いて破砕し、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて総ＲＮＡを調製した。抽出した総ＲＮＡをＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、添付のプロトコールに従って逆転写反応を行い、ｃＤＮＡ合成を行った。
得られたｃＤＮＡを鋳型に、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、定量的ＰＣＲを行った。定量的ＰＣＲに使用したＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅは、ＧＬＵＴ１：Ｍｍ００４４１４８０＿ｍ１、ＧＡＰＤＨ：Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１であった。ＧＬＵＴ１遺伝子の発現量は、ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子発現量で補正した。測定した発現量から、対照食群の平均値を１とする相対発現量を各群について求めた。有意差検定はＤｕｎｎｅｔｔ ｔｅｓｔを用いて対照食群と比較を行い、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１とした。
【００４７】
（結果）
結果を図１に示す。ＣＰＰを含む餌を摂取したＣＰＰ食群では、ＧＬＵＴ１遺伝子の発現が上昇した。このＧＬＵＴ１の発現上昇度合いは、摂取した餌のＣＰＰ含量に依存していた。このことから、ＣＰＰが、脳内のＧＬＵＴ１発現を亢進させ、グルコースの取り込みを促進する作用を有することが示された。
【００４８】
試験例２  脳血管内皮細胞におけるクロロゲン酸類及び５−ＣＱＡのＧＬＵＴ１発現亢進
初代培養ラット脳血管内皮細胞（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）を２４ｗｅｌｌコラーゲンＩコートプレートに２．０×１０５個／ｗｅｌｌ播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えた脳血管内皮細胞増殖培地（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）にて、３日間培養した。その後、０．１％ＦＢＳを加えた脳血管内皮増殖培地に置換し、２４時間培養した後に、０．１％ＦＢＳに溶解させた５−カフェオイルキナ酸（５−ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ：５−ＣＱＡ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ＣＰＰを５、２４、４８時間添加した。そして、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ (Ｑｉａｇｅｎ)を用いて全ＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡから、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡ合成を行った。得られたｃＤＮＡを鋳型に、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、定量的ＰＣＲを行った。定量的ＰＣＲに使用したＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅは、ＧＬＵＴ１：Ｒｎ０１４１７０９９＿ｍ１、β-ａｃｔｉｎ：Ｒｎ００６６７８６９＿ｍ１であった。ＧＬＵＴ１遺伝子の発現量は、β-ａｃｔｉｎ遺伝子発現量で補正した。測定した発現量から、ｃｏｎｔｒｏｌ群の平均値を１とする相対発現量を各群について求めた。すべての値は平均値±標準偏差（ｍｅａｎ ± ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ (ＳＤ)）で表した。有意差検定はＤｕｎｎｅｔｔ ｔｅｓｔを用いてｃｏｎｔｒｏｌ群と比較を行い、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１とした。
【００４９】
（結果）
結果を図２、３、４に示す。図２には５−ＣＱＡとＣＰＰを初代培養ラット脳血管内皮細胞に５時間処置した際、図３には２４時間処置した際、図４には４８時間処置した際のＧＬＵＴ１遺伝子発現量の変化を示している。
５−ＣＱＡを脳血管内皮細胞に処置すると、５時間後ではＧＬＵＴ１遺伝子の発現上昇は見られなかったが、２４時間では１０、１００μＭ、４８時間では１、１０、１００μＭで発現が有意に上昇した。ＣＰＰを脳血管内皮細胞に処置すると、５時間後では２１３．４μｇ／ｍＬ、２４および４８時間では２．１３、２１．３、２１３．４μｇ／ｍＬでＧＬＵＴ１遺伝子発現量が有意に上昇した。このことから、５−ＣＱＡおよびＣＰＰが、脳血管内皮細胞のＧＬＵＴ１発現を亢進させ、グルコースの取り込みを促進する作用を有することが示された。
【００５０】
試験例３  脳血管内皮細胞におけるクロロゲン酸類及びその構成成分単体のＧＬＵＴ１遺伝子発現亢進
初代培養ラット脳血管内皮細胞（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）を２４ｗｅｌｌコラーゲンＩコートプレートに２．０×１０５個／ｗｅｌｌ播種し、１０％ＦＢＳを加えた脳血管内皮細胞増殖培地（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）にて、３日間培養した。その後、０．１％ＦＢＳを加えた脳血管内皮増殖培地に置換し、２４時間培養した後に、０．１％ＦＢＳに溶解させたＣＰＰ及び３−,４−,５−ＣＱＡ、３，４−、３,５−、４,５−ｄｉＣＱＡ、カフェ酸（表２に記載）を４８時間添加した。そして、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ (Ｑｉａｇｅｎ)を用いて全ＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡから、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡ合成を行った。得られたｃＤＮＡを鋳型に、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、定量的ＰＣＲを行った。定量的ＰＣＲに使用したＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅは、ＧＬＵＴ１：Ｒｎ０１４１７０９９＿ｍ１、β-ａｃｔｉｎ：Ｒｎ００６６７８６９＿ｍ１であった。ＧＬＵＴ１遺伝子の発現量は、β-ａｃｔｉｎ遺伝子発現量で補正した。測定した発現量から、ｃｏｎｔｒｏｌ群の平均値を１とする相対発現量を各群について求めた。すべての値は平均値±標準偏差（ｍｅａｎ ± ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ (ＳＤ)）で表した。有意差検定はＤｕｎｎｅｔｔ ｔｅｓｔを用いてｃｏｎｔｒｏｌ群と比較を行い、＊＊Ｐ＜０．０１とした。
【００５１】
【表２】
2020026396.tif 000003
【００５２】
（結果）
結果を図５に示す。ラット初代培養脳血管内皮細胞においてＣＰＰ  ８．４μｇ／ｍＬ、３−ＣＱＡ  ３．９７μＭ、４−ＣＱＡ  ４．１９μＭ、５−ＣＱＡ  １０μＭ、３，４−ｄｉＣＱＡ  １．３２μＭ、３，５−ｄｉＣＱＡ  ０．９１μＭ、４，５−ＣＱＡ  １．３５μＭ、カフェ酸  １０μＭで、ＧＬＵＴ１遺伝子発現が亢進した。したがって、ＣＰＰ、モノ又はジカフェオイルキナ酸、カフェ酸は、脳血管内皮細胞のＧＬＵＴ１発現を亢進させ、グルコースの取り込みを促進する作用を有することが示された。
【００５３】
試験例４  脳血管内皮細胞でのクロロゲン酸類及びその構成成分単体によるＧＬＵＴ１タンパク質発現亢進
（方法）
初代培養ラット脳血管内皮細胞（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）を６０ｍｍコラーゲンＩコートディッシュに２．１×１０５個／ディッシュで播種し、１０％ＦＢＳを加えた脳血管内皮細胞増殖培地（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）にて、３日間培養した。その後、０．１％ＦＢＳを加えた脳血管内皮増殖培地に置換し、２４時間培養した後に、０．１％ＦＢＳに溶解させたＣＰＰ及び５−ＣＱＡ、３,５−ｄｉＣＱＡ（表３に記載）を４８時間添加した。そして、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、フォスファターゼインヒビター（SIGMA）、プロテアーゼインヒビター２（SIGMA）、プロテアーゼインヒビター３（SIGMA）を加えたＣｅｌＬｙｔｉｃＴＭ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｉｓ／Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（SIGMA）を添加し、セルスクレーパーにより細胞を回収した。回収した液をホモジェナイザーによって破砕し、遠心（１２０００ ｒｐｍ、１５分間、４℃）した。遠心後の上清を回収し、ＢＣＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてタンパク濃度を定量し、液量を補正することで各サンプルの濃度を統一した。調整したタンパク質溶液にＬａｎｅ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、熱処理を行った。得られたタンパク質溶液を用いてウェスタンブロットを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはミニプロティアンＴＧＸゲル（ＢｉｏＲａｄ）を使用し、泳動後ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ）に転写した。ＰＶＤＦ膜はＰＶＤＦ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＯＹＯＢＯ）に浸漬した後、抗ＧＬＵＴ1抗体（１：１０００、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、ＣＢＬ２４２）をＣａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ（ＴＯＹＯＢＯ）のＳｏｌｕｔｉｏｎ１で希釈し、４℃で一晩一次抗体反応を行った。Ｔ−ＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＢｉｏＲａｄ）／ＴＢＳ（ＢｉｏＲａｄ））で十分に洗浄し、ＨＲＰ標識抗ラビット抗体（１：５０００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＨＡＦ００８）をＣａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ（ＴＯＹＯＢＯ）のＳｏｌｕｔｉｏｎ２で希釈し、室温で２時間二次抗体反応を行い、Ｔ−ＴＢＳで十分に洗浄した。洗浄後、ＥＣＬ  ＳｅｌｅｃｔＴＭ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて化学発光を行い、ＣｈｅｍＤｏｃ  ＸＲＳ（ＢｉｏＲａｄ）で発光強度を測定した。
【００５４】
【表３】
2020026396.tif 000004
【００５５】
（結果）
結果を図６に示す。ＣＰＰ、５−ＣＱＡ、３，５−ｄｉＣＱＡを脳血管内皮細胞に処置すると、濃度依存的にＧＬＵＴ１タンパク質の発現上昇が確認できた。このことから、ＣＰＰ、５−ＣＱＡ、３，５−ｄｉＣＱＡが、脳血管内皮細胞のＧＬＵＴ１発現を亢進させ、グルコースの取り込みを促進する作用を有することが示された。
【図１】
2020026396.tif 000005
【図２】
2020026396.tif 000006
【図３】
2020026396.tif 000007
【図４】
2020026396.tif 000008
【図５】
2020026396.tif 000009
【図６】
2020026396.tif 000010