(57)【要約】      （修正有）【課題】ＤＮＡ結合可能で、かつ転写因子（ＴＦ）対の協同作用の模倣が可能な合成分子の提供。【解決手段】協同的ＴＦ対−ＤＮＡ相互作用を模倣するための一般的なフレームワークで用いられる、ホスト−ゲスト部分にコンジュゲートしたプログラム可能なＤＮＡバインダーピロール−イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）である分子を、協同モジュール部分を左巻き（ＬＨ）γＰＮＡモジュール、すなわち、核酸ベースの協同システムとコンジュゲートしたＰＩＰに置き換えた分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一対のＤＮＡバインダーと、核酸ベースの協同ドメインとのコンジュゲート。
【請求項２】
ＤＮＡバインダーがピロール−イミダゾールポリアミドである、請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項３】
核酸ベースの協同ドメインが左巻（ＬＨ）γ−ＰＮＡを含む、請求項１または２記載のコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、核酸ベースの協同（cooperation）システムとコンジュゲートしたピロール−イミダゾールポリアミドに関する。具体的には、本開示は、強力な協同的ＤＮＡ結合システムＰｉｐ−ＮａＣｏ（pyrrole-imidazole polyamides conjugated with nucleic acid-based cooperation system）に関する。該システムの協同性は、天然のシステムに大いに匹敵することが示された。
【背景技術】
【０００２】
時空間的遺伝子発現は、哺乳類において２００個の短いＤＮＡモチーフを認識する１０００を超える転写因子（ＴＦ）によって正確に制御される［１］。通常、ＴＦは、非共有結合したホモ／ヘテロダイマーの形成を通じて、互いに異なる向きおよび／または互いに関連したギャップ間隔で生じる、協同的な（cooperative）ＴＦ−ＴＦ対として機能する［２］。ＴＦ−ＴＦ対間の多様なギャップ間隔の、遺伝子活性化に対する効果は、よく特徴付けられており［３］、ＴＦ対は、多様な結合配向性での相互結合を柔軟に促進する［４］。例えば、Ｗｎｔ経路を介した特定の遺伝子活性化に不可欠なＴ細胞因子（ＴＣＦ）のＣクランプの結合部位は、古典的高移動度群（ＨＭＧ）結合部位の上流または下流に位置するように回転することによって、ヘルパーとして作用することができる［５］。プログラム可能な分子、例えば、核酸アナログ、ピロール−イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）、短ペプチド、およびペプチド−小分子共有結合体は、個々のＴＦ−ＤＮＡ相互作用を破壊するために広く適用されてきた［６］。しかしながら、それらは、協調的ＴＦ対とＤＮＡとの間の相互作用を遮断することができない。したがって、遺伝子発現パターンの意図的かつ正確な操作においてこれらの課題に対処するには、新規な戦略、特に、ＤＮＡバインダー間の協同的相互作用を可能にするモジュールの組み込みが必要とされる［７］。
【０００３】
ＰＩＰは現在、最も良好な特徴づけられたプログラム可能なＤＮＡ副溝バインダーであり、Ｐｙ／ＩｍとＣ／Ｇ、Ｉｍ／ＰｙとＧ／Ｃ、およびＰｙ／ＰｙとＡ／ＴおよびＴ／Ａの規則に従って結合する［８］。近年、発明者らは、協同的ＴＦ対を標的とするための、Ｐｉｐ−ＨｏＧｕと名付けられた、ＰＩＰをコンジュゲートしているホスト−ゲスト協同ベースのシステムを報告した（図１）［９］。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび細胞ベースのアッセイから、Ｐｉｐ−ＨｏＧｕは、２つのＤＮＡバインダー間の＜５ｎｔの間隔で強力な協同関係を示す。ＤＮＡ結合における協同性（cooperativity）の本質は、パートナー鎖の付加が複合体全体の結合を高度に安定化できることであり、パートナー鎖の不在下または存在下での複合体形成能の違いは、協同性の大きさを反映する［１０］。さらに、２つのバインダーは、むしろ、２つの標的部位を含むＤＮＡ部位に適切な結合向きで同時に結合し、一方、モノマー結合の割合を減少させる。さらに、協同性は、ミスマッチ結合をある程度回避できるものであり、また、いくつかの条件下で合理的な親和性で縮重ＤＮＡ部位に結合するものである［４］。以前に報告されたＰｉｐ−ＨｏＧｕシステムには、いくつかの潜在的な制限がある。例えば、間隔が＞５ｎｔの場合、さらに有意には、別の配向性の場合、それは実用的ではない。ホスト−ゲストシステムの協同結合エネルギーは、個別に微調整することができなかった［４］。さらに、ホスト−ゲスト部分の相互作用は、残基特異的相互作用ではなく、静電的および疎水性相互作用である。
【発明の概要】
【０００４】
［発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段］
ここに、発明者らは、ホスト−ゲストシステム由来の協同モジュールを、オリゴヌクレオチド指向性の配列特異的認識部分へ拡張した［７ｂ］。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、酵素的に安定で、強固に結合性であり、合成的に多様であり、かつ、情報インターフェースな核酸プラットフォームである［１１］。いくつかのグループは、ランダムに折り畳まれたＰＮＡを事前に組織化された（preorganized）右巻き（ＲＨ）または左巻き（ＬＨ）螺旋に変形させるガンマ骨格ＰＮＡ修飾を用いて、重要な前進を遂げた［１２］。より興味深いことに、ＬＨ  γＰＮＡは、相補的配列を含有し、かつ、螺旋の向きに合致するパートナー鎖にハイブリダイズすることができるが、ＲＨ  γＰＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡとクロスハイブリダイズしない［１３］。このようなオルソゴナルな（orthogonal）特性およびプログラム可能であることにより、ＬＨ  γＰＮＡに、ホストの内因性遺伝物質とのクロスハイブリダイゼーションを回避しながら、分子集合およびコンピューター計算のためのＴＦ対協同作用を模倣するための所望の協同モジュールが付与される。
【０００５】
この文脈において、発明者らは、ＴＦ対の天然の多様性結合システムを模倣するための、Ｐｉｐ−ＮａＣｏと名付けられた、プログラム可能なＰＩＰとオルソゴナルなＬＨ  γＰＮＡ協同システムの統合を構想した（図１）。Ｐｉｐ−ＨｏＧｕとは別個のＰｉｐ−ＮａＣｏ協同作用は、塩基対形成と水素結合の特異的相互作用であり、理論上、そのリンカーの長さと同じくらいの間隔をカバーできる。結果は、−３．２７ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１の最少協同作用を示し、ＰＩＰ結合配向性およびコンジュゲーション部位を柔軟に変化させることができる。さらに、ＰＮＡ長を調整可能なこと（tunability)、オルソゴナリティー（orthogonality）、および足がかりとなる（toehold）鎖の置換性能により、Ｐｉｐ−ＮａＣｏは、転写因子対の協同作用を模倣する魅力的なツールとなる。
【０００６】
ＤＮＡ結合可能で、かつ転写因子（ＴＦ）対の協同作用の模倣が可能な合成分子は、遺伝子発現を操作するための有望なツールであると長い間考えられてきた。発明者らが以前に報告した、ホスト−ゲスト部分にコンジュゲートしたプログラム可能なＤＮＡバインダー ピロール−イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）である、Ｐｉｐ−ＨｏＧｕシステムは、協同的ＴＦ対−ＤＮＡ相互作用を模倣するための一般的なフレームワークを定義した。今回、発明者らは、該協同モジュールを、左巻き（ＬＨ）γＰＮＡモジュール、すなわち、核酸ベースの協同システムとコンジュゲートしたＰＩＰ（Ｐｉｐ−ＮａＣｏ）に置き換えた。ＬＨ  γＰＮＡは、そのバイオオルソゴナリティー（bioorthogonality）、配列特異的相互作用、およびパートナー鎖に対する高い結合親和性のために選択された。Ｐｉｐ−ＮａＣｏシステムの結果から、協同性は、天然ＴＦ対−ＤＮＡシステムに大いに匹敵し、最小協同エネルギーは−３．２７ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１である。さらに、リンカーコンジュゲーション部位、結合様式、およびγＰＮＡ配列長の変化によって、Ｐｉｐ−ＮａＣｏの協同エネルギーは、独立して、かつ、合理的に調整することができる。また、該Ｐｉｐ−ＮａＣｏプラットフォームは、三重ないし多重のヘテロ結合システムの構築によって、生物学的プロセスの正確な操作の可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
（原文に記載なし）
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本明細書に開示される、一対のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）バインダーと、核酸ベースの協同（ＮａＣｏ）ドメインとのコンジュゲートは、一対のＤＮＡバインダーおよび核酸ベースの協同ドメインを含む複合体であってもよい。本明細書に開示されるコンジュゲートは、ＤＮＡに結合することができ、かつ、転写因子（ＴＦ）対の協同作用を模倣することができる。
【０００９】
本明細書で使用される場合、ＤＮＡバインダーは、プログラム可能なＤＮＡバインダーである。ＤＮＡバインダーの例には、限定するものではないが、核酸アナログ、ピロール−イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）、短ペプチド、およびペプチド−小分子共有結合コンジュゲートが包含される。好ましくは、一実施形態において、そのＤＮＡバインダーはＰＩＰである。コンジュゲートに含まれるＤＮＡバインダーは、互いに同じであっても異なっていてもよい。各ＤＮＡバインダーは、ＤＮＡ上の標的部位に結合するように設計される。一般的に、ＰＩＰ中に含まれるピロールおよびイミダゾール部分の数および配置は任意であり、該ＰＩＰがＤＮＡ上の標的部位に結合できるように適宜当業者によって適宜決定することができる。
【００１０】
本明細書で使用される場合、「核酸ベースの協同システム」なる用語は、分子集合体の構成成分が配列特異的にその協同相互作用を確立できるようにする、核酸ベースの配列特異的相互作用ドメインを含む分子集合体を示す。核酸ベースの配列特異的相互作用ドメインの例には、限定されないが、「ＮａＣｏドメイン」が包含される。一の実施形態において、ＮａＣｏドメインは、互いに相補的な２つの左巻き（ＬＨ）ガンマ−ＰＮＡ（γＰＮＡ）配列を有していてもよい。ＮａＣｏドメイン中のγＰＮＡ配列は、それらが意図される協同相互作用を確立できるかぎり、いずれの長さであってもよい。すなわち、該配列の長さは、調整可能であり、例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｔ長、またはそれ以上の長さであってもよい。γＰＮＡの配列の種類および／または長さは、本明細書の開示に照らして、該集合体の意図される相互作用に基づき、当業者によって適宜決定することができる。
【００１１】
一の実施形態において、γＰＮＡは、そのγ−部位において、アミノ酸、例えば、リジン、アラニン、グルタミン酸、ジエチレングリコール等で修飾されていてもよい。
【００１２】
一の実施形態において、核酸ベースの協同システムに含まれるＤＮＡバインダーは、リンカーを介してＮａＣｏドメインとコンジュゲートされる。本明細書で使用される場合、「リンカー」なる用語は、化学合成、例えば、固相合成によって調製される化学化合物または部分（すなわち、所望の生成物）のための結合点として機能することができる部分を指す。リンカーの例には、限定するものではないが、例えば、ＰＥＧリンカーが包含される。
【００１３】
一の実施形態において、２つのＰＩＰは、ＤＮＡバインダーとして作用してもよく、ＰＩＰのリンカーコンジュゲーション部位は、例えば、それらの末端またはγ−ターンに位置していてもよい。２つのＰＩＰの一方のリンカーコンジュゲーション部位がその端末にあってもよく、他方のリンカーコンジュゲーション部位がそのγ−ターンにあってもよく、または、２つのＰＩＰの両方のリンカーコンジュゲーション部位がそれらの末端またはγ−ターンにあってもよい。一の実施形態において、２つのＰＩＰの一方はその末端でリンカーに連結され、他方はそのγ−ターンで該リンカーに連結される。
【００１４】
一の実施形態において、ＤＮＡ上の標的部位に結合した２つのＰＩＰは、互いに種々の配向であってもよい。例えば、該２つのＰＩＰは、同じ向きまたは反対の向きでＤＮＡに結合していてもよい。すなわち、２つのＰＩＰは互いに平行に並んでいるが、同じ方向性または逆の方向性を有する。
【００１５】
一の実施形態において、標的ＤＮＡ上の２つのγＰＮＡコンジュゲーション部位間の間隔は調整可能であってもよい。
【００１６】
本開示によれば、一の施形態において、オルソゴナルなガンマ−ＰＮＡ二量体化ドメインが、転写因子対の協同性および多様性を模倣する協同性および多様性をＤＮＡバインダーに付与する。
【実施例】
【００１７】
結果および考察
Ｐｉｐ−ＮａＣｏシステムの原理
２つのＰＩＰは、それらの合致配列を標的とするように設計され［９］、ＰＥＧリンカーを介してγＰＮＡドメイン（γ−部位でＬ−ジエチレングリコール（Ｌ−ＭＰ）で修飾されている）と個々にコンジュゲートされた（図２）［１４］。ジエチレングリコール単位の組み込みにより、水溶性が向上し、凝集が著しく減少することが確認された［１５］。一本鎖γＰＮＡの事前に組織化されたコンフォメーションおよびその各合致鎖との結合は、エントロピーペナルティの減少および骨格剛性の増加のため、より高い親和性および配列選択性をもたらした［１２ｂ］。完全な合成手法およびＰｉｐ−ＮａＣｏの全コンジュゲートの特徴づけは、サポート情報に提供される。注目すべきは、Ｆｍｏｃ固相合成から得られたＰＩＰを、Ｂｏｃ固相樹脂上のγＰＮＡの尾部に組み込んだことである［１２ｄ、１６］。
【００１８】
Ｐｉｐ−ＮａＣｏシステムは、平行結合配向性で設計された。すなわち、γＰＮＡ二重鎖はｄｓＤＮＡに平行であり、γＰＮＡ鎖は、頭尾（head-to-tail）が互いに向かい合っている（図２）。発明者らの知る限りでは、Ｐｉｐ−ＮａＣｏは、プログラム可能なＤＮＡバインダーとコンジュゲートしている、オルソゴナルな、天然ＤＮＡを除くＬＨ  γＰＮＡの応用の初めての例である。
【００１９】
立体配座研究
ＬＨ  γＰＮＡのコンフォメーションに対するＰＩＰコンジュゲーションの影響を測定するために、円二色性（ＣＤ）実験を行った［１３］。ガンマ−Ｌ−ＭＰで修飾したＰＰ１およびＰＰ２は、ＰＩＰコンジュゲーションしないでガンマ−Ｒ−Ｍｅで修飾された以前に報告されたＬＨ  γＰＮＡのように［１３］、同じヌクレオチド配列を有する。ＣＤスペクトルを測定し、それらをガンマ−Ｒ−Ｍｅで修飾されたＬＨ  γＰＮＡのＣＤスペクトルと比較することによって、ＰＩＰの導入が事前に組織化されたγＰＮＡのＬＨコンフォメーションを妨げないことを予測した。予想通り、ＰＰ１、ＰＰ２、およびＰＰ１−ＰＰ２は同様のＣＤパターンを示した。すなわち、２４０ｎｍ付近の正のピークと２６５〜２７５ｎｍの負のピークがあり、ＬＨ螺旋コンフォメーションを示唆した（図３、Ｓ１）。ＰＩＰコンジュゲーションを伴わない各γＰＮＡ配列（ガンマ−Ｒ−Ｍｅ）と比較すると、ＰＰ１およびＰＰ１−ＰＰ２は、それぞれ非修飾一本鎖γＰＮＡ配列およびそれらの非修飾γＰＮＡ二重鎖配列と高度に同一のＣＤプロファイルを示した（図Ｓ１Ａ、Ｃ）［１７］。発明者らは、ＰＩＰコンジュゲーションが事前に組織化されたγＰＮＡのＬＨコンフォメーションを破壊しないと結論付ける。さらに、ＰＰ２は、ＬＨコンフォメーションの標準的なＣＤプロファイルを示したが、ＰＩＰコンジュゲーションを伴わないその各々のγＰＮＡとは相違した（図Ｓ１  Ｂ）。γ−Ｌ−ＭＰで置換することによるγＰＮＡの事前の組織化（preorganization）の増強および安定化がメカニズムの一つである可能性がある［１５］。
【００２０】
ＰＰ１およびＰＰ２は、ＰＰ１−ＰＰ２二重鎖と比較して、ＣＤシグナルの中程度の赤方偏移を示した。ＰＰ１−ＰＰ２二重鎖のＣＤ振幅は、２本の個々の鎖のＣＤ振幅の合計よりも高く、３番目の、わずかに正のピークが２８５ｎｍに出現する。これらの結果はさらに、ハイブリダイゼーションがフィッシャーの「鍵と鍵穴（lock and key）」仮説［１８］に従う可能性が高く、また、γＰＮＡ二重鎖の形成がＬＨ二次コンホメーションを促進および増強する［１９］という概念を支持する。
【００２１】
間隔依存方式の協同的結合
Ｐｉｐ−ＮａＣｏ配列を、Ｍｏｄｅ ＡおよびＢのＤＮＡ配列を使用した結合親和性アッセイに適用した（図４Ａ）［９］。Ｍｏｄｅ ＡおよびＢの違いは、ＰＰ１およびＰＰ２結合部位の相対的位置に由来する。より具体的には、Ｍｏｄｅ Ａにおいて、γＰＮＡコンジュゲーション部位は、互いに近接にあり、短い間隔をカバーした後に二重鎖を形成することができる（間隔＝ギャップ距離、図４Ｂ）。しかしながら、負の結合Ｍｏｄｅ Ｂにおいて、２つのγＰＮＡドメインは、ギャップ距離と２つのＰＩＰ結合部位の和に等しいより長い間隔を有する（間隔＝ギャップ距離＋２つのＰＩＰ結合部位；図４Ｃ、表Ｓ１）。
【００２２】
協同的結合の強度、およびそれが２つのＰＩＰ結合部位間の間隔によってどのように影響されるかを決定するために、安定な複合体の形成におけるバンド−シフト挙動の直接可視化によって、電気泳動移動シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を行った［２０］。ＰＰ１−ＰＰ２は、さまざまな間隔のＤＮＡオリゴマー（ＯＤＮ）（Ｍｏｄｅ ＡおよびＢ）で平衡化した。ＰＩＰ結合の立体的競合のため、１塩基対が欠失されたＯＤＮ（ＯＤＮ１’ＰおよびＯＤＮ１’Ｎ）では、シフトしたバンドは観察されなかった（図４Ｂ、Ｃ）。しかしながら、シフトバンドの出現は、Ｍｏｄｅ ＡのＯＤＮ（０〜８塩基対のギャップ距離）が強力な協同的結合を示すことを示した。Ｐｉｐ−ＨｏＧｕシステム（０−５ｎｔの間隔に限定される協同作用）とは著しく対照的に、１２および１３塩基対の間隔を有するＭｏｄｅ ＢのＯＤＮでも有意なバンドシフトが観察された。
【００２３】
さらに、ＥＭＳＡデータは、Ｍｏｄｅ Ａにおいて、中間のＯＤＮ（ＯＤＮ３Ｐ、ＯＤＮ４Ｐ、およびＯＤＮ５Ｐ）のシフトバンドが、両端のＯＤＮのバンドよりも弱いことを示した。これらの結果は、コンピューターによる研究からのデータと一緒にすると説明できる。２つのＰＩＰ結合部位の間にスペーサーを挿入すると、直線距離がシフトするだけでなく、元の位置から回転もする。正規ＢＤＮＡでは、１ｎｔを付加すると、ＤＮＡ螺旋に沿って３６度回転し、１０ｎｔを挿入すると、再び同じ方向になる。コンピューターによる研究に基づくと、ＰＰ１およびＰＰ２は、ＯＤＮ４Ｐにおいて最大角の距離であり、間隔のさらなる増加は、２つのＰＩＰの再整列をもたらし、これは観察された結果と一致する。
【００２４】
結合部位の配向バリエーション
ＤＮＡ結合タンパク質は、パートナーＴＦと結合した場合に、その結合配向を柔軟に並べ替えることができる［２ａ］。発明者らは、ＰＰ１−ＰＰ２が、ＴＦ−ＤＮＡ複合体の多様な結合様式に対応するのに十分な長さである０−１３ｎｔ間隔のＯＤＮで、強力なバンド−シフト能力を有することを確認した。ここに、発明者らは、協同的結合に対するＰＩＰ結合部位の配向性の影響を分析するために、２つの付加的な結合様式、Ｍｏｄｅ ＣおよびＤにおいてＯＤＮと複合体化したＰＰ１−ＰＰ２を研究した（図５Ａ）。
【００２５】
図５Ｂに示される結果は、複合体の結合親和性の順序が、Ｍｏｄｅ Ａ−２Ｐ＜Ｍｏｄｅ Ａ−６Ｐ＜Ｍｏｄｅ Ｄ＜Ｍｏｄｅ Ｃであることを示唆した。γＰＮＡモジュールは頭尾結合するので、大型の二量体化ドメインは、Ｍｏｄｅ Ａ−２Ｐ（２ｎｔの間隔を有する）に好ましくない立体障害を課す。かかる立体障害は、距離が６または７塩基対に増加すると緩和される。さらに、Ｍｏｄｅ ＣおよびＤはどちらも、Ｍｏｄｅ Ａ−６Ｐよりも高い結合親和性を示し、コンパクトな結合様式が複合体の安定化に役立つことを示唆した。Ｍｏｄｅ Ｅ（５．０μＭ、１５．６％）と比べてＭｏｄｅ Ｄのわずかに高い結合親和性（５．０μＭ、２９．１％）は、ＤＮＡ配列の配向性の違いによって説明できる可能性がある［４］。
【００２６】
協同的結合のエネルギー論
協同性の大きさを分析するために、定量的ＥＭＳＡを行った［７ｂ、２０］。実験設計では、ＰＰ２の存在下および非存在下でのＰＰ１のＭｏｄｅ Ｃへの結合の平衡定数を測定した。ＥＭＳＡの結果により、γＰＮＡ配列のコンジュゲーションがＰＩＰ結合親和性を適度に減ずることを確認した（図Ｓ２）。Ｍｏｄｅ ＣとＰＰ１のみのインキュベーションでは、非常に弱いバンド−シフトをもたらした（図６Ａ、Ｓ２）。
【００２７】
低濃度の単独ＰＰ１での、および５．０μＭ  ＰＰ２の存在下でのバンド−シフトの増加は、協同的効果を説明する。弱いモノマー結合と比較して、γＰＮＡ二量化ドメインは、そのそれぞれの結合部位への二量体結合を促進する。Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合等温線に適合させることにより、結合等温線が得られ、また、単独のＰＰ１に関して１．８７×１０４Ｍ−１（Ｋ１）の平衡結合定数および５．０μＭ  ＰＰ２の存在下でのＰＰ１に関して４．６７×１０６Ｍ−１（Ｋ１，２）の平衡結合定数が得られた（図６Ｂ）。結合自由エネルギー等式（free-energy-of binding equation）に基づいて、ＰＰ２の存在下および非存在下におけるＰＰ１に関するΔＧがそれぞれ、−９．０９および−５．８２ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１であると算出することができる。このことから、相互作用の最小自由エネルギー（ΔＧ１，２−ΔＧ１）が−３．２７ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１であることを概算することができる（図６Ｃ）。したがって、このシステムでは、パートナーＰＰ２の存在がＰＰ１の結合親和性を２００倍以上増強する。Ｐｉｐ−ＮａＣｏは、また、１−ｂｐミスマッチＤＮＡ配列を用いたアッセイにおいて、高い配列選択性を示した（図Ｓ３）。
【００２８】
Ｐｉｐ−ＮａＣｏは、モノ−またはコンビナトリアル処理により、Ｐｉｐ−ＨｏＧｕと比べて結合親和性の合理的な減少を示すが、Ｐｉｐ−ＮａＣｏは、協同結合エネルギー（cooperation binding energy）において有意な改善（−２．３２から−３．２７ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１）を示し、さらなる実験により、協同強度（cooperation strength）は合理的に調節でき、γＰＮＡモジュール上で柔軟性のあるものであることが実証された（下記参照）。
【００２９】
協同的結合に対するＰＮＡ長の効果
γＰＮＡに基づく協同システムの重要な特徴は、ＰＮＡ配列の長さおよびマッチ／ミスマッチの改変によって平行なγＰＮＡ二量体化ドメインを調整して、安定化を調節できることである。ここでは、γＰＮＡ二重鎖がｄｓＤＮＡに対して平行であるＰｉｐ−ＮａＣｏアセンブリーの協同作用に対するＰＮＡ長の影響を調べた。ＰＰ１およびＰＰ２中の５ｎｔ  γＰＮＡ配列を７ｎｔまで伸長させて、それぞれＰＰ４およびＰＰ５を生成した（図７Ａ）。固相合成後、５ｎｔおよび７ｎｔコンジュゲートを、同じγＰＮＡ長（５ｎｔ：５ｎｔまたは７ｎｔ：７ｎｔ）または混合した長さ（５ｎｔ：７ｎｔ）のいずれかの二量体を用いて評価した。
【００３０】
データは、以下の順序のＭｏｄｅ Ｃに対する結合親和性を示した：ＰＰ１−ＰＰ２＞ＰＰ２−ＰＰ４＞ＰＰ１−ＰＰ５＞ＰＰ４−ＰＰ５。これにより、７ｎｔ  γＰＮＡコンジュゲートが、５ｎｔ  γＰＮＡと比べて結合を不安定化することが示唆された（図７Ｂ）。これらのデータは、γＰＮＡの長さが複合体の結合の調節において重要な因子であることを示唆し、また、Ｍｏｄｅ Ｃの結合に関しては、５ｎｔ  γＰＮＡが強力な二重鎖結合能を十分に示した一方で、γＰＮＡ長のさらなる増加は協同作用におけるわずかな改善を導いたが、ＰＩＰ−ＤＮＡ結合親和性を有意に減少させるかもしれないことを考慮すると、短いγＰＮＡが好ましいかもしれないことを示唆した［１３］。ここで強調すべき一つのポイントは、より大きなサイズのγＰＮＡ二量体化ドメインの平行形態がＤＮＡ副溝からＰＩＰを容易に外してしまうかもしれないことが推測されたことである。将来、より安定なγＰＮＡ補助複合体を形成する可能性を有する、γＰＮＡ二重鎖がｄｓＤＮＡに対して垂直である垂直のγＰＮＡ結合様式を探求することは興味深いかもしれない（未発表）［７ｂ］。
【００３１】
また、ＰＩＰと繋がれたリンカーコンジュゲーション部位の影響を研究した。ＰＰ２と比較して、リンカーが、ガンマターンよりもむしろＰＩＰ２の尾部にコンジュゲートされたＰＰ３を設計した（図Ｓ４）。結果は、コンジュゲーション部位におけるこの小さな変化が相互作用を劇的に不安定化したことを実証し、γターン上でのコンジュゲーション部位が保存されるべきであることを示唆した。
【００３２】
競合アッセイ
足がかり配列介在鎖置換アッセイ（toehold-mediated strand displacement assay）の特徴は、核酸ベースの人工システムの応用を拡大した［２１］。本願の人工システムの一つの利点は、外部環境の組成（例えば、競合γＰＮＡ鎖の存在）に依存するγＰＮＡ二本鎖形成の可逆性に由来する。ここでは、競合アッセイにおいてＰｉｐ−ＮａＣｏシステムの能力を調べた。足がかり配列介在鎖置換アッセイの理論に基づいて、７ｎｔ  ＰＮＡ５鎖を導入して、ＰＰ４結合を置換した（図８Ａ、Ｓ５）。５ｎｔ：７ｎｔのγＰＮＡ二量体化ドメインを有するＰＰ２−ＰＰ４複合体は、Ｍｏｄｅ Ｃで安定化された（レーン１、図８Ｂ）。γＰＮＡ５による濃度依存的な置換が、短いインキュベーションの間に観察され、γＰＮＡ５が３倍過剰になると、８０％を超えるＰＰ４がＰＰ２結合複合体から放出された（レーン５）。これにより、γＰＮＡに基づく足がかり配列介在鎖置換が、多様な可逆的人工制御システムにおける将来の応用にとって価値があることが示唆された。
【００３３】
結論
本願で特徴づけられた人工システムＰｉｐ−ＮａＣｏの重要な特徴は、認識ドメインＰＩＰと協同的二量化ドメインＰＮＡの両方がモジュール式であることであり、それらは制御可能な協同エネルギーを有することが示唆される。リンカーコンジュゲーション部位、結合様式、およびＰＩＰおよびγＰＮＡの配列を変化させることにより、結合部位の配向性および協同相互作用エネルギーを独立して、かつ合理的に調整することができる。さらに、ＬＨγＰＮＡのオルソゴナルな特性は、配列特異的パートナーとのより高い二量化能を維持しながら、過剰な内因性核酸によって生じる混乱を排除するという圧倒的な利点を有する。最も重要なことに、Ｐｉｐ−ＮａＣｏには、天然の転写因子対と比較して卓越した協同的相互作用能があり、種々の配向の結合部位をカバーすることができる。また、本願のＰｉｐ−ＮａＣｏプラットフォームは、生物学的プロセスを正確に操作する可能性も有する。
【００３４】
実験セクション
完全な実験の詳細は、サポート情報に記載される。
【００３５】
2020096579.tif 000002
2020096579.tif 000003
2020096579.tif 000004
2020096579.tif 000005
【００３６】
サポート情報を以下に記載する。
【００３７】
材料および方法
全般
ポリアミド合成のための試薬、例えば、Ｆｍｏｃ−Ｐｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｍ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｙ−Ｉｍ−ＯＨ、およびＩｍ−ＣＣｌ３、固体支持体（Ｆｍｏｃ−Ｐｙ−オキシム樹脂およびＦｍｏｃ−β  Ａｌａ−Ｗａｎｇ樹脂）、Ｏ−（１Ｈ−６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）およびベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）は、ＨｉＰｅｐ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（京都、日本）から入手した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、３，３’−ジアミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミン、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、メタノール、酢酸（ＡｃＯＨ）、１−メチル−２−プロロリドン（ＮＭＰ）、およびＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は、Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ（京都、日本）から入手した。Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｄａｂ（Ｂｏｃ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−ＮＨ−ｄＰＥＧ３−ＣＯＯＨは、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ（マルクトレドヴィッツ、ドイツ）から入手した。ポリアミド鎖のアセンブリーは、自動合成装置ＰＳＳＭ−８（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、京都、日本）で行った。ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）を分析および分取ＨＰＬＣの両方に使用した。水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、東京、日本）で調製した。すべての化学物質は受け取ったままで使用した。逆相ＲＰ−ＨＰＬＣによる分析は、オンラインＬＣＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００イオントラップ質量分析計、ＨＣＴ  ｕｌｔｒａ、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、横浜、日本）で、分析ＲＰ−ＨＰＬＣカラムで行い、ＵＶスペクトルをＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。ここに示されている構造決定のためのＥＳＩ−ＭＳおよびＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳデータは、京都大学またはカーネギーメロン大学で実施された。
【００３８】
ポリアミドＦｍｏｃカップリング手法
ポリアミドは、ＰＳＳＭ−８ペプチド合成装置（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、京都）を使用して、４３ｍｇのＦｍｏｃ−ピロール−オキシム樹脂およびβ  Ａｌａ−Ｗａｎｇ樹脂（約０．４２ｍｍｏｌ／ｇ、１００〜２００メッシュ）でコンピューター補助操作システムを用いて、Ｆｍｏｃ固相化学によって調製した［１］。反応サイクルは次のとおりである：ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで４分間のブロック解除ステップを２回；対応するカルボン酸、ＨＣＴＵ（８８ｍｇ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（３６μＬ）、１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）で、６０分間のカップリングステップ；ＤＭＦで１分間の洗浄ステップを５回。ステップにおける各カップリング試薬は、Ｆｍｏｃ−Ｐｙ−ＣＯＯＨ（７７ｍｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｍ−ＣＯＯＨ（７７ｍｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｙ−Ｉｍ−ＣＯＯＨ（７０ｍｇ）、Ｆｍｏｃ−β−ＣＯＯＨ（６６ｍｇ）、Ｆｍｏｃ−γ−ＣＯＯＨ（６９ｍｇ）およびＦｍｏｃ−ｍｉｎｉ  ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（６９ｍｇ）のＮＭＰ溶液中で調製した。他のすべてのカップリングは、Ｎ２ガスのバブリングによって攪拌しながら、シングルカップルサイクルで行った。典型的には、樹脂（４０ｍｇ）を２．５ｍＬプラスチック反応容器中の１ｍＬ  ＮＭＰ中で３０分間膨潤させた。ＮＭＰ  １ｍＬ中のＨＣＴＵと共にＦｍｏｃモノマーをロードした２ｍＬプラスチック製遠心チューブを、プログラムされた位置に配置した。溶液を移した後、すべてのラインをＮＭＰで洗浄した。ペプチド合成装置による合成の完了後、樹脂をＤＭＦ（１ｍＬ×２）、メタノール（１ｍＬ×２）で洗浄し、デシケーター内で室温で真空乾燥した。
【００３９】
樹脂の切断および精製手法
得られたポリアミドオキシム樹脂を、４５℃で３時間、Ｎ、Ｎ−ジメチル−１，３−プロピルジアミンで固体支持体から切断した。ポリアミド−β  Ａｌａ−Ｗａｎｇ樹脂を、室温で３０分間、９５％ＴＦＡ、２．５％トリイソプロピルシラン、および２．５％水で固体支持体から切断した。樹脂を濾別し、得られた液体をジエチルエーテルで処理した。沈殿した粗ポリアミドをジエチルエーテルで３回洗浄し、ＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。粗ポリアミドを分取カラム上で４０℃で精製した。精製されたペプチドは、ＬＣ−ＭＳシステムによって評価した。
【００４０】
ＰＮＡモノマー：
各ＰＮＡモノマーおよびＰＮＡポリマーの詳細な合成経路は、以前の研究に記載されている［２］。
【００４１】
【化１】
2020096579.tif 000006
【００４２】
モノマーｐＡ：ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ３６Ｈ４５Ｎ７ＮａＯ１０＋［Ｍ＋Ｎａ］＋のｍ／ｚ計算値：７５８．３１２６；実測値：７５８．３１１４
モノマーｐＴ：ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ２８Ｈ４０Ｎ４ＮａＯ１０＋の［Ｍ＋Ｎａ］＋のｍ／ｚ計算値：６１５．２６４２；実測値：６１５．２６２８
モノマーｐＧ：ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ３６Ｈ４５Ｎ７ＮａＯ１１＋［Ｍ＋Ｎａ］＋のｍ／ｚ計算値：７７４．３０７５；実測値：７７４．３０６０
モノマーｐＣ：ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ３５Ｈ４５Ｎ５ＮａＯ１１＋［Ｍ＋Ｎａ］＋のｍ／ｚ計算値：７３４．３０１３；実測値：７３４．３００６
【００４３】
ＰＩＰ１の合成
ポリアミド合成手法は上記のとおりである。樹脂の切断および化合物の精製手法は、上記のとおりである。ＰＩＰ１は、白色粉末として得られた。全体の収量は４．５％である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ５４Ｈ６１Ｎ２１ＮａＯ１２＋［Ｍ＋Ｎａ］＋のｍ／ｚ計算値：１２１９．２０６８；実測値：１２１８．６０８。ＨＰＬＣ：ｔＲ＝１６．６７５分（０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、直線勾配０−１００％、０−４０分）。（質量データは下部に添付）。
【００４４】
【化２】
2020096579.tif 000007
【００４５】
ＰＩＰ２の合成
ポリアミド合成手法は上記のとおりである。樹脂の切断および化合物の精製手法は、上記のとおりである。ＰＩＰ２は、白色粉末として得られた。全体の収量は１３．５％である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ６２Ｈ７８Ｎ２３Ｏ１３＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：１３５３．４５４０；実測値：１３５１．９６８。ＨＰＬＣ：ｔＲ＝９．８７５分（０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、直線勾配０−１００％、０−２０分）。（質量データは下部に添付）
【００４６】
ＰＩＰ３の合成
ポリアミド合成手法は上記のとおりである。樹脂の切断および化合物の精製手法は、上記のとおりである。ＰＩＰ３は、白色粉末として得られた。全体の収量は５．５％である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ５４Ｈ６２Ｎ２１Ｏ１２＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：１１９７．２２５０；実測値：１１９６．８９８。ＨＰＬＣ：ｔＲ＝１７．１４２分（０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、直線勾配０−１００％、０−４０分）。（質量データは下部に添付）
【００４７】
Ｐｉｐ−ＰＮＡ合成［２］：
ＰＰ１の合成ルート（ＰＰ１−ＰＰ５に適用）：
【００４８】
【化３】
2020096579.tif 000008
【００４９】
ＰＰ１の合成
【化４】
2020096579.tif 000009
【００５０】
合成経路は上に示す。樹脂の切断および化合物の精製手法は、上記のとおりである。ＰＰ１は、白色粉末として得られた。収率は３５．１％である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ１４５Ｈ２０５Ｎ５４Ｏ４４＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：３４０８．５６９０；実測値：３４０５．７０３。ＨＰＬＣ：ｔＲ＝２６．２８３分（０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、直線勾配０−５０％、０−４０分）。（質量データは下部に添付）
【００５１】
ＰＰ２の合成
【化５】
2020096579.tif 000010
【００５２】
合成経路はＰＰ１に類似する。樹脂の切断および化合物の精製手法は、上記のとおりである。ＰＰ２は、白色粉末として得られた。収率は２７．１％である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ１５６Ｈ２２３Ｎ５６Ｏ４９＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：３６６６．８４３０；実測値：３６６４．７００。ＨＰＬＣ：ｔＲ＝２６．９９０分（０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、直線勾配０−５０％、０−４０分）。（質量データは下部に添付）
【００５３】
ＰＰ３の合成
【化６】
2020096579.tif 000011
【００５４】
合成経路はＰＰ１に類似する。樹脂の切断および化合物の精製手法は、上記のとおりである。ＰＰ３は、白色粉末として得られた。収率は２５．９％である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ１４８Ｈ２０７Ｎ５４Ｏ４８＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：３５１０．６１４０；実測値：３５０９．８９１。ＨＰＬＣ：ｔＲ＝２７．２００分（０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、直線勾配０−５０％、０−４０分）。（質量データは下部に添付）
【００５５】
ＰＰ４の合成
【化７】
2020096579.tif 000012
【００５６】
合成経路はＰＰ１に類似する。樹脂の切断および化合物の精製手法は、上記のとおりである。ＰＰ４は、白色粉末として得られた。収率は３６．５％である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ１７７Ｈ２６０Ｎ６８Ｏ６８＋［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ計算値：４２２７．３７５０；実測値：４２２６．８９０。ＨＰＬＣ：ｔＲ＝２６．０８３分（０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、直線勾配０−５０％、０−４０分）。（質量データは下部に添付）
【００５７】
ＰＰ５の合成
【化８】
2020096579.tif 000013
【００５８】
合成経路はＰＰ１に類似する。樹脂の切断および化合物の精製手法は、上記のとおりである。ＰＰ５は、白色粉末として得られた。収率は２８．１％である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ１８６Ｈ２６８Ｎ６６Ｏ６１＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：４４０５．５９９００；実測値：４４０５．１４９。ＨＰＬＣ：ｔＲ＝２６．２４２分（０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、直線勾配０−５０％、０−４０分）。（質量データは下部に添付）
【００５９】
化合物溶液の調製
化合物は、最初にストック溶液としてＤＭＳＯに溶解した。ＰＩＰおよびＰＩＰ−ＰＮＡコンジュゲートの濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を使用して、最大約３１０ｎｍで、１ピロールまたはイミダゾール部分あたり９９００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を用いて算出した［１ａ］。ＰＮＡオリゴマーの濃度は、９０℃で記録された２６０ｎｍのＯＤから、以下の吸光係数：Ｔ＝８６００Ｍ−１ｃｍ−１、Ａ＝１３，７００Ｍ−１ｃｍ−１、Ｃ＝６６００Ｍ−１ｃｍ−１、Ｇ＝１１，７００Ｍ−１ｃｍ−１を用いて決定した［２］。
【００６０】
円偏光二色性（ＣＤ）実験
すべてのＰＩＰおよびＰｉｐ−ＰＮＡコンジュゲートは、以前に確立されたＰＩＰの方法のとおりに定量した［３］。ＣＤ滴定用のＰｉｐ−ＰＮＡサンプル（５μＭ、５００μＬ）は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２中で調製された。化合物のマスター溶液のアリコート（ＤＭＳＯ中１ｍＭ）を連続的に添加し、平衡に達するように少なくとも３分間インキュベートした。ＣＤスペクトルは、２２℃にて、パス長１ｃｍの石英キュベット中、ＪＡＳＣＯ  Ｊ−８０５ＬＳＴ分光計を使用して、２３０〜３５０ｎｍの範囲で記録した。
【００６１】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
ローディング混合物の調製［４］
使用したＤＮＡの配列は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。分析バッファーは次のとおりである：０．２５％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯを含有する、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２の水溶液。ポリアミドおよびｄｓＤＮＡの最終濃度は、明細書中に明記した。混合物を室温で２時間置いた後、ゲルにロードした。ゲルローディング色素は、ＳＤＳを含まないＰｕｒｐｌｅ  ６Ｘであった（Ｂ７０２５Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ  ｌａｂ）。
【００６２】
ゲルの調製
清潔なガラス製ビーカー中、下記の試薬：５．２５ｍＬ  ＭｉｌｉＱ、１ｍＬ  １０×ＴＢＥ、および３．７５ｍＬの４０％アクリルアミド／Ｂｉｓ溶液（２９：１）を所定の順序で混合した（１０ｍｌシステム、２０ｍｌシステムの場合は試薬量が２倍になる）。次いで、すべての気泡を確実に除去するためにガス除去した。次いで、９０μＬ  ＡＰＳ（ＭｉｌｉＱ中１０％ｗ／ｗ）および１００μＬ  ＴＥＭＥＤ（ＭｉｌｉＱ中１０％ｖ／ｖ）を混合物に添加し、適切に混合した後、平行ガラス板に沿って穏やかに注いだ。重合に十分な時間が与えられた（２０分）。
【００６３】
電気泳動
ローディングの前に、ゲルのプレランを行った。ゲルが、１×Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡバッファー（ＴＢＥバッファー）中に適切に浸漬されていること、ローディングウェルには気泡がないことを注意して確認した。プレラン後にウェルを洗浄した。機器設定：４℃で３０分間１２０Ｖ。次いで、４μＬのローディング混合物をウェルにロードした。４℃で３０分間、１２０Ｖで再度プレランした。次に、機器の設定：４℃で１６０分間、１８０Ｖでゲルに流した。
【００６４】
ゲルの分析
バンドをＳＹＢＲゴールド（ＤＭＳＯ中１００００×濃度、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ製）で染色し、ＦｕｊｉＦｉｌｍ  ＦＬＡ−３０００Ｇ蛍光イメージングアナライザーで定量した。ＦＡＭ標識フォワード鎖（５’−ＦＡＭ−ＡＡＣＴＡＧＣＣＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＡＴ−３’）を、ＳＹＢＲゴールド染色無しのＦｕｊｉＦｉｌｍ  ＦＬＡ−３０００Ｇ蛍光イメージングアナライザーによる定量アッセイに直接使用した。
【００６５】
最小協同結合エネルギーの定量的測定
【化９】
2020096579.tif 000014
【００６６】
協同性の大きさを分析するために、定量的ＥＭＳＡ（ＦＡＭ標識ＯＤＮ）を行った［５］。実験計画には、ＰＰ２の存在下および非存在下でのＭｏｄｅ ＣへのＰＰ１の結合の平衡定数の測定が含まれた。Ｌａｎｍｕｉｒ結合等温線をフィッティングすることで、ＰＰ１単独およびＰＰ２存在下でのＰＰ１について、結合等温線およびそれぞれＫ１およびＫ１，２の平衡会合定数が得られた。結合自由エネルギー等式に基づいて、ＰＰ２の存在下および非存在下で、ＰＰ１について、それぞれΔＧ２およびΔＧ２−１を算出することができる。このことから、相互作用の最小自由エネルギー（ΔＧ１，２−ΔＧ１）を概算することができる。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を使用して曲線フィッティングを行い、平衡会合定数を計算した。ガス定数（Ｒ）は０．００１９８７ｋｃａｌ・Ｋ−１・ｍｏｌ−１、Ｔ＝２９８Ｋである。
【００６７】
統計分析
連続変数の結果は、平均±標準誤差として表した。連続変数における２群差を、対応のないＴ検定（unpaired T-test）によって評価した。統計分析は、処理されたサンプルと未処理のコントロールを比較することによって行った。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を使用して行った。
【００６８】
サポートする表および図
【００６９】
表Ｓ１．ギャップ距離、部分（moiety）距離、およびプロペラ角度の関係の詳細な情報
【表１】
2020096579.tif 000015
【００７０】
図Ｓ１．γ−Ｒ−Ｍｅで修飾されたＬＨ  γＰＮＡおよびγ−Ｌ−ＭＰで修飾されたＰＩＰ−ＰＮＡ間のＣＤスペクトルの比較
【化１０】
2020096579.tif 000016
上図：γＰＮＡ（赤い矢印の破線）、ＰＩＰを伴わない、ＰＩＰ−ＰＮＡコンジュゲートと同じＰＮＡ配列を有する［６］。
下図：ＰＩＰ−ＰＮＡコンジュゲート
Ａ．ＰＮＡ５およびＰＰ１；Ｂ．ＰＮＡ６およびＰＰ２；Ｃ．ＰＮＡ５−ＰＮＡ６およびＰＰ１−ＰＰ２
【００７１】
ＰＰ２（ＰＩＰ２−Ｒ−ＭｅγＰＮＡ２、２つのチミンを含む）は、チミンが４つの核酸塩基の中で最も低い塩基スタッキングエネルギーを有するため、Ｒ−ＭｅγＰＮＡ１よりも不安定である（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１５、１３７、８６０３−８６１０）。別の報告（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１１、７６、５６１４−５６２７）では、γ部位のジエチレングリコール（ＭＰ）置換基がＰＮＡの事前の組織化を増加させる。これらの結果に基づいて、ＰＰ２（ＰＩＰ２−Ｓ−ＭＰγＰＮＡ）のより高い安定化ＬＨコンフォメーションは、Ｒ−ＭｅγＰＮＡ２（Ｒ−Ｍｅ置換基）と比較して、γ部位のＳ−ＭＰ置換基に起因するとは考えられない。さらに、ＰＩＰコンジュゲーションは、ＣＤパターンの変化を促進すると認められる。しかし、そのような変化は、ＬＨコンフォメーションを安定化するのではなく、不安定化するかもしれない。
【００７２】
図Ｓ２．ＰＩＰ１およびＰＰ１のゲルシフトアッセイとそれぞれの化学構造
【化１１】
2020096579.tif 000017
【００７３】
図Ｓ３．ＰＰ１−ＰＰ２とのミスマッチ配列のゲルシフトアッセイ
【化１２】
2020096579.tif 000018
【００７４】
図Ｓ４．種々の結合様式を有するＰＰ３−ＰＰ２およびＰＰ１−ＰＰ１間の結合親和性の比較
【化１３】
2020096579.tif 000019
【００７５】
図Ｓ５．Ｌ−ＭＰγＰＮＡ５の化学構造
【化１４】
2020096579.tif 000020
【００７６】
ＭＡＳＳデータおよびＨＰＬＣデータ
モノマーＡ
【化１５】
2020096579.tif 000021
【００７７】
モノマーＴ
【化１６】
2020096579.tif 000022
【００７８】
モノマーＧ
【化１７】
2020096579.tif 000023
【００７９】
モノマーＣ
【化１８】
2020096579.tif 000024
【００８０】
ＰＩＰ１は白色粉末として得られた。全体の収量は４．５％である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ５４Ｈ６１Ｎ２１ＮａＯ１２＋［Ｍ＋Ｎａ］＋のｍ／ｚ計算値：１２１９．２０６８；実測値：１２１８．６０８。ＨＰＬＣ：ｔＲ＝１６．６７５分（０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、直線勾配０−１００％、０−４０分）。
【００８１】
【化１９】
2020096579.tif 000025
【００８２】
ＰＩＰ２は白色粉末として得られた。全体の収量は１３．５％である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ６２Ｈ７８Ｎ２３Ｏ１３＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：１３５３．４５４０；実測値：１３５１．９６８。ＨＰＬＣ：ｔＲ＝９．８７５分（０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、直線勾配０−１００％、０−２０分）。
【００８３】
【化２０】
2020096579.tif 000026
【００８４】
ＰＩＰ３は白色粉末として得られた。全体の収量は５．５％である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ５４Ｈ６２Ｎ２１Ｏ１２＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：１１９７．２２５０；実測値：１１９６．８９８。ＨＰＬＣ：ｔＲ＝１７．１４２分（０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、直線勾配０−１００％、０−４０分）。
【００８５】
【化２１】
2020096579.tif 000027
【００８６】
ＰＰ１は白色粉末として得られた。収率は３５．１％である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ１４５Ｈ２０５Ｎ５４Ｏ４４＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：３４０８．５６９０；実測値：３４０５．７０３。ＨＰＬＣ：ｔＲ＝２６．２８３分（０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、直線勾配０−５０％、０−４０分）。
【００８７】
【化２２】
2020096579.tif 000028
【００８８】
ＰＰ２は白色粉末として得られた。収率は２７．１％である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ１５６Ｈ２２３Ｎ５６Ｏ４９＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：３６６６．８４３０；実測値：３６６４．７００。ＨＰＬＣ：ｔＲ＝２６．９９０分（０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、直線勾配０−５０％、０−４０分）。
【００８９】
【化２３】
2020096579.tif 000029
【００９０】
ＰＰ３は白色粉末として得られた。収率は２５．９％である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ１４８Ｈ２０７Ｎ５４Ｏ４８＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：３５１０．６１４０；実測値：３５０９．８９１。ＨＰＬＣ：ｔＲ＝２７．２００分（０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、直線勾配０−５０％、０−４０分）。
【００９１】
【化２４】
2020096579.tif 000030
【００９２】
ＰＰ４は白色粉末として得られた。収率は３６．５％である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ１７７Ｈ２６０Ｎ６８Ｏ６８＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：４２２７．３７５０；実測値：４２２６．８９０。ＨＰＬＣ：ｔＲ＝２６．０８３分（０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、直線勾配０−５０％、０−４０分）。
【００９３】
【化２５】
2020096579.tif 000031
【００９４】
ＰＰ５は白色粉末として得られた。収率は２８．１％である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ１８６Ｈ２６８Ｎ６６Ｏ６１＋［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：４４０５．５９９００；実測値：４４０５．１４９。ＨＰＬＣ：ｔＲ＝２６．２４２分（０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、直線勾配０−５０％、０−４０分）。
【００９５】
【化２６】
2020096579.tif 000032
【００９６】
参考文献：
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[4] B. Heddi, V. V. Cheong, H. Martadinata, A. T. Phan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2015, 112, 9608-9613. 
[5] a) R. Moretti, L. J. Donato, M. L. Brezinski, R. L. Stafford, H. Hoff, J. S. Thorson, P. B. Dervan, A. Z. Ansari, ACS. Chem. Biol. 2008, 3, 220-229;b) M. D. Distefano, P. B. Dervan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993, 90, 1179-1183. 
[6] I. Sacui, W.-C. Hsieh, A. Manna, B. Sahu, D. H. Ly, J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 8603-8610. 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月19日(2020.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
【図１】研究設計の概略図。発明者らが以前に報告したＰｉｐ−ＨｏＧｕシステムに基づいて、ホスト−ゲスト相互作用ドメインを、Ｐｉｐ−ＮａＣｏと呼ばれる、核酸ベースの配列特異的相互作用ドメインに置き換えた。
【図２】Ｐｉｐ−ＮａＣｏアセンブリーの２つの成分（ＰＰ１およびＰＰ２）の、ｄｓＤＮＡ骨格との協同的相互作用の概略図。太い実線は、標的部位のｄｓＤＮＡ骨格および関連するオリゴヌクレオチドを表す。薄いモジュールアレイは、オリゴヌクレオチド配列特異的水素結合を示す。ｎ＝ギャップ距離。５ｎｔ配列からなるＬＨＬ−ＭＰγＰＮＡの二量体化ドメインは、色付きの太字の斜体文字で示される。（下図）ＰＰ１およびＰＰ２の化学構造。
【図３】２２℃で記録された、それぞれ１０．０μＭ濃度のハイブリダイズしていないＰＰ１およびＰＰ２、ならびに各鎖が５．０μＭ濃度の対応するＰＰ１−ＰＰ２のＣＤスペクトル。ＣＤスペクトルは、２３０〜３００ｎｍで記録された。ＣＤ測定は、リン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中で調製された。
【図４】間隔依存的な、Ｐｉｐ−ＮａＣｏの協同的結合。Ａ）正の（Ｍｏｄｅ Ａ、ＯＤＮ１’Ｐ−ＯＤＮ８Ｐ）および負の（Ｍｏｄｅ Ｂ、ＯＤＮ１’Ｎ−ＯＤＮ８Ｎ）結合配列を包含する、Ｔｍアッセイで使用されるＤＮＡオリゴマー（ＯＤＮ）。ギャップ距離（緑）は、ＰＰ１（青）とＰＰ２（赤）の結合部位間の塩基対の数である。間隔は、２つのＰＮＡコンジュゲーション部位間の距離である。すなわち、間隔は、Ｍｏｄｅ Ａのギャップ距離に等しく、Ｍｏｄｅ Ｂでは、ギャップ距離と２つのＰＩＰ結合部位の和に等しい。上段のチャートは、フォワードＤＮＡ鎖だけを示し、相補的なＤＮＡ鎖を省略する。Ｂ、Ｃ）ＰＰ１−ＰＰ２を用いる、Ｍｏｄｅ Ａ（Ｂ）における正の結合配列、およびＭｏｄｅ Ｂ（Ｃ）における負の結合配列の全てのゲルシフト挙動。ＯＤＮ濃度：１．０μＭ。化合物濃度：１０．０μＭ。黒い矢印：ＯＤＮ２Ｐ；赤：ＯＤＮ２Ｐ／ＰＰ１−ＰＰ２。特記しない限り、ゲルのバンドはＳＹＢＲゴールドで染色し、ＦｕｊｉＦｉｌｍ  ＦＬＡ−３０００Ｇ蛍光イメージングアナライザーで定量した。別記しない限り、電気泳動移動シフトアッセイ測定に使用された全てのサンプルは、リン酸ナトリウム緩衝液中（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中で調製した。
【図５】種々の結合様式におけるＰｉｐ−ＮａＣｏの協同作用を説明するＥＭＳＡの結果。Ａ）Ｍｏｄｅ ＣおよびＤにおいてＯＤＮと結合しているＰＰ１−ＰＰ２の概略図。Ｂ）Ｍｏｄｅ Ａ−２Ｐ（レーン１−４）、Ｍｏｄｅ Ａ−６Ｐ（レーン５−７）、Ｍｏｄｅ Ｃ（レーン８−１０）、およびＭｏｄｅ Ｄ（レーン１１−１３）のＯＤＮとの、ＰＰ１−ＰＰ２のゲルシフト挙動。ギャップ距離（緑）は、ＰＰ１（青）とＰＰ２（赤）の結合部位間の塩基対の数である。間隔は、２つのＰＮＡコンジュゲーション部位間の距離である。すなわち、Ｍｏｄｅ Ｃにおいて、間隔は、ギャップ距離とＰＰ２結合部位との和に等しい。ＯＤＮ濃度：１．０μＭ。化合物濃度：１０．０μＭ。
【図６】Ｐｉｐ−ＮａＣｏの協同作用を評価する定量的ＥＭＳＡ。Ａ）種々の濃度（上）のＰＰ１および５．０μＭ  ＰＰ２を補充したＰＰ１（下）を用いる、Ｍｏｄｅ Ｃの定量ＥＭＳＡ。ＯＤＮ濃度：１００ｎＭ。化合物濃度の範囲：０．１〜１０．０μＭ（１００ｎＭからの１０倍濃度を図に示す）。ＳＹＢＲゴールド染色をしない定量アッセイに使用されたＦＡＭ標識フォワード鎖（５’−ＦＡＭ−ＡＡＣＴＡＧＣＣＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＡＴ−３’）。Ｂ）定量的なＥＭＳＡを使用して、ＰＰ１単独（■）およびＰＰ２の存在下のＰＰ１（●）にて得られた結合等温線。データポイントは、３連の実験の平均シフトバンド強度から算出した。Ｃ）ＰＰ１−ＰＰ２を用いるＭｏｄｅ Ｃの平衡結合定数および自由エネルギー。
【図７】Ｐｉｐ−ＮａＣｏの協同作用に対するＰＮＡ長の影響。Ａ）Ｍｏｄｅ Ｃにおける、７ｎｔ  γＰＮＡ配列を含有するＰｉｐ−ＮａＣｏアセンブリーの概略図。破線の四角枠は、挿入されたｎｔを強調する。Ｂ）Ｍｏｄｅ Ｃを用いる、ＰＰ１−ＰＰ２（レーン１、２）、ＰＰ１−ＰＰ５（レーン３、４）、ＰＰ２−ＰＰ４（レーン５、６）、およびＰＰ４−ＰＰ５（レーン７、８）のゲルシフト挙動。ＯＤＮ濃度：１．０μＭ。化合物濃度：３．０μＭおよび１０．０μＭ。
【図８】Ｐｉｐ−ＮａＣｏの足がかり配列介在鎖置換アッセイ（Toehold-mediated strand displacement assay）。Ａ）Ｐｉｐ−ＮａＣｏアセンブリーを用いる、足がかり配列介在鎖置換アッセイの概略図。γＰＮＡ５は、ＰＰ２結合を置き換えるための競合鎖である。Ｂ）Ｍｏｄｅ Ｃを用いるＥＭＳＡにおける、足がかり配列介在鎖置換アッセイ。ＯＤＮ濃度：１．０μＭ。化合物濃度を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【外国語明細書】
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