(57)【要約】【課題】歯周病の病原性因子である歯周病原因菌産生システインプロテアーゼが有する蛋白質分解活性を抑制するために用いる組成物を提供する。【解決手段】ヒノキチオール及びシャクヤク加工物よりなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として歯周病原因菌産生システインプロテアーゼの活性抑制用組成物、特にジンジパイン活性抑制用組成物を調製する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒノキチオール及びシャクヤク加工物よりなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、歯周病原因菌産生システインプロテアーゼの活性抑制用組成物。
【請求項２】
ヒノキチオール及びシャクヤク加工物よりなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とするジンジパイン活性抑制用組成物。
【請求項３】
ヒノキチオール及びシャクヤク加工物よりなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする塩基性アミノ酸−ジンジパイン活性抑制用組成物。
【請求項４】
口腔用組成物である請求項１〜３のいずれかに記載する活性抑制用抑制剤。
【請求項５】
口腔用組成物にヒノキチオール及びシャクヤク加工物よりなる群より選択される少なくとも１種を配合する工程を有する、口腔用組成物に歯周病原因菌産生システインプロテアーゼの活性抑制作用を付与する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周病原因菌が産生するシステインプロテアーゼの活性を抑制するために用いられる組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は、歯周病原因菌の感染により生じる慢性感染性疾患である。原因菌の感染により炎症が進行すると、歯肉が腫れて血や膿が出るだけでなく、歯を支える歯槽骨が破壊されやがては歯を喪失する。更に歯周病は、糖尿病、心疾患、そして、妊婦の低体重児出産などの全身疾患のリスクファクターであることが知られている。そのため、歯周病の予防又は治療は、健康な口腔機能の維持及び回復だけではなく、全身疾患のリスク低減という面からも非常に重要である。
【０００３】
近年、歯周病原因菌のなかでもグラム陰性嫌気性桿菌のポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis、以下「Ｐ.ジンジバリス」と称する）が最も重要な病因菌であり、それが産生するプロテアーゼ群がコラーゲンを始めとする歯周組織成分や生体防御系に関与する血清蛋白質を分解することが知られ、歯周病の病原性に深く関係していることが明らかになっている。特にアルギニン−ジンジパイン（Arg-gingipain）等の塩基性アミノ酸−ジンジパインは、Ｐ.ジンジバリスが産生するトリプシン様プロテアーゼ活性を有するシステインプロテアーゼであり、最も有力な歯周病の病原性因子であるとされている。具体的には、塩基性アミノ酸−ジンジパインは、菌自身の栄養素獲得に重要な機能をもち、更に、歯周組織を構成する細胞間マトリックス、例えばコラーゲンやフィブロネクチンなどを分解し、菌を排除する生体反応の重要な要素である抗体や補体を分解し、更に、好中球の機能を阻害することで感染を持続し、炎症を慢性化させることが知られている。そこで、歯周病を治療又は予防するために、塩基性アミノ酸−ジンジパインの活性を抑制する製剤の開発が期待されている。
【０００４】
塩基性アミノ酸−ジンジパインのうち、アルギニン−ジンジパインの活性を阻害する物質としては、アンチパイン、ロイペプチン、ＴＬＣＫ（トシル−リシン−クロロメチルケトン塩酸塩）またはＥ−６４等のシステインプロテアーゼ阻害剤が知られている。また、アルギニン−ジンジパインがアルギニン末端を選択的に分解する基質特性に着目して、その拮抗的阻害剤としてのペプチド誘導体が提案されている（特許文献１または２参照）。しかし、いずれも安全性が確認されておらず、実用化には至っていない。また、膵炎や汎発性血管内血液凝固症の治療薬として用いられているメシル酸ガベキサートがアルギニン−ジンジパインに対して高い特異的活性阻害作用を発揮することから、それを用いた各種のアルギニン−ジンジパイン活性阻害剤が提案されている（特許文献３〜６参照）。
【０００５】
一方、ヒノキチオールは、従来より抗菌作用が知られており、その広範な抗菌スペクトルにより防腐用食品添加物、育毛剤、化粧品などの添加物として広く使用されている。またマトリクスメタロプロテアーゼ活性阻害作用を有することが知られているが、歯周病原因菌が産生するトリプシン様プロテアーゼ活性を有するシステインプロテアーゼ、特に塩基性アミノ酸−ジンジパインの活性を阻害する作用を有することは知られていない。また、シャクヤクには筋緊張緩和、血管拡張、抗炎症作、鎮静及び鎮痛等の作用があることが知られており、その根は生薬（日本薬局方）の原料として使用されている。またシャクヤクエキスは医薬品部外品原料規格に記載されており、従来より医薬品部外品の原料として使用されている。しかし、シャクヤクまたはそのエキスが歯周病原因菌産生システインプロテアーゼ、特に塩基性アミノ酸−ジンジパインの活性を阻害する作用を有することは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１１−２２８５２６号公報
【特許文献２】特開２００１−８９４３６号公報
【特許文献３】特開２００８−１５０３２５号公報
【特許文献４】特開２００９−１３７８９５号公報
【特許文献５】特開２０１０−１２２８号公報
【特許文献６】特開２０１２−１３１７２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、歯周病の病原性因子である歯周病原因菌産生システインプロテアーゼ、特に塩基性アミノ酸−ジンジパインが有する蛋白質分解活性を抑制するために用いる組成物を提供することを課題とする。また、本発明はヒノキチオールやシャクヤクについて見出された新たな作用に基づいて、その新たな用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねていたところ、後述する実施例に示すように、ヒノキチオールおよびシャクヤクエキスに歯周病原因菌産生システインプロテアーゼが有する蛋白質分解活性を抑制する作用があることを見出し、この知見に基づいてさらに検討を重ねて、本発明を完成するに至った。本発明は下記の実施態様を有するものである。
【０００９】
（Ｉ）歯周病原因菌産生システインプロテアーゼの活性抑制用組成物
（Ｉ−１）ヒノキチオール及びシャクヤク加工物よりなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、歯周病原因菌産生システインプロテアーゼの活性抑制用組成物。
（Ｉ−２）ヒノキチオール及びシャクヤク加工物よりなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とするジンジパイン活性抑制用組成物。
（Ｉ−３）ヒノキチオール及びシャクヤク加工物よりなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする塩基性アミノ酸−ジンジパイン活性抑制用組成物。
（Ｉ−４）前記塩基性アミノ酸がアルギニンまたはリジンである、（Ｉ−３）に記載する塩基性アミノ酸−ジンジパイン活性抑制用組成物。
（Ｉ−５）口腔用組成物である（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）のいずれかに記載する活性抑制用組成物。
（Ｉ−６）活性抑制用組成物中のヒノキチオールの割合が０．００１〜０．５質量％、好ましくは０．０５〜０．２質量％、より好ましくは０．０１〜０．２質量％である、（Ｉ−１）〜（Ｉ−５）のいずれかに記載する活性抑制用組成物。
（Ｉ−７）活性抑制用組成物中のシャクヤク加工物の割合が乾燥物換算で０．００００１〜１質量％、好ましくは０．００００５〜０．１質量％、より好ましくは０．０００１〜０．０１質量％である、（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）のいずれかに記載する活性抑制用組成物。
【００１０】
（ＩＩ）歯周病原因菌産生システインプロテアーゼの活性抑制作用を付与する方法
（ＩＩ−１）口腔用組成物にヒノキチオール及びシャクヤク加工物よりなる群より選択される少なくとも１種を配合する工程を有する、口腔用組成物に歯周病原因菌産生システインプロテアーゼの活性抑制作用を付与する方法。なお、当該方法は、「口腔用組成物にヒノキチオール及びシャクヤク加工物よりなる群より選択される少なくとも１種を配合する工程を有する、歯周病原因菌産生システインプロテアーゼの活性抑制作用を有する口腔用組成物の製造方法」と言い換えることができる。
（ＩＩ−２）前記歯周病原因菌産生システインプロテアーゼがジンジパイン、好ましくは塩基性アミノ酸−ジンジパインである（ＩＩ−１）に記載する方法。
（ＩＩ−３）前記塩基性アミノ酸がアルギニンまたはリジンである、（ＩＩ−２）に記載する方法。
（ＩＩ−４）口腔用組成物にヒノキチオールの含有量が０．００１〜０．５質量％、好ましくは０．０５〜０．２質量％、より好ましくは０．０１〜０．２質量％になるように配合する工程を有する、（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）のいずれかに記載する方法。
（ＩＩ−５）口腔用組成物にシャクヤク加工物の含有量が乾燥含量で０．００００１〜１質量％、好ましくは０．００００５〜０．１質量％、より好ましくは０．０００１〜０．０１質量％になるように配合する工程を有する、（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−４）のいずれかに記載する方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の歯周病原因菌産生システインプロテアーゼ、ジンジパインまたは塩基性アミノ酸−ジンジパインの活性抑制用組成物によれば、歯周病原因菌であるＰ．ジンジバリスが産生するこれらの蛋白質分解酵素の活性を抑制することができる。また本発明の方法によれば、歯周病原因菌であるＰ．ジンジバリスが産生するシステインプロテアーゼ、ジンジパインまたは塩基性アミノ酸−ジンジパインの活性を抑制する作用を口腔用組成物に付与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実験例１において、Ｐ．ジンジバリス産生プロテアーゼ液（粗酵素液）中でのBz-L-Arg-pNA・HCl（基質）の分解が、ヒノキチオール及びシャクヤク加工物のいずれも含有しない被験試料（比較例１）、ヒノキチオールを０．０１％、０．０２％または０．０４％含有する被験試料（実施例１、２及び３）、シャクヤクエキスを０．０００１％、０．００１％または０．０１％含有する被験試料（実施例４、５及び６）、ヒノキチオールとシャクヤクエキスを含有する被験試料（実施例７〜８）の存在で阻害されるか否かを評価した結果を示す。
【図２】実験例１において、Ｐ．ジンジバリス産生プロテアーゼ液（粗酵素液）中でのAc-Lys-pNA・HCl（基質）の分解が、ヒノキチオール及びシャクヤク加工物のいずれも含有しない被験試料（比較例２）、ヒノキチオールを０．０１％、０．０２％または０．０４％含有する被験試料（実施例９、１０及び１１）、シャクヤクエキスを０．０００１％、０．００１％または０．０１％含有する被験試料（実施例１２、１３及び１４）の存在で阻害されるか否かを評価した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（Ｉ）歯周病原因菌産生システインプロテアーゼの活性抑制用組成物
本発明が対象とする組成物は、ヒノキチオール及びシャクヤク加工物よりなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする組成物であり、歯周病原因菌産生システインプロテアーゼの活性を抑制するために使用されることを特徴とする。ここで本発明が対象とする歯周病原因菌は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）（Ｐ.ジンジバリス）である。また、当該Ｐ.ジンジバリスが産生するシステインプロテアーゼとしては、好ましくはジンジパイン、特にアルギニン残基のＣ末端を切断する作用を有するアルギニン−ジンジパインやリジン残基のＣ末端を切断する作用を有するリジン−ジンジパイン等の塩基性アミノ酸−ジンジパインを挙げることができる。このため、本発明の組成物は、好ましくはジンジパインの活性抑制用組成物であり、より好ましくは塩基性アミノ酸−ジンジパインの活性抑制用組成物であり、特に好ましくはアルギニン−ジンジパインまたはリジン−ジンジパインである。なお、塩基性アミノ酸とは、側鎖にプロトン（H+）を受け取ることができるアミノ基またはイミノ基を有するアミノ酸を指し、アルギニン、リジン、ヒスチジン、トリプトファン、及びオルニチンを挙げることができる。好ましくはアルギニン、及びリジンである。本明細書において、以下、ジンジパイン、及び塩基性アミノ酸−ジンジパインを含むシステインプロテアーゼの総称として「Ｃｙｓプロテアーゼ」という用語を使用する。
【００１４】
本発明においてＣｙｓプロテアーゼ活性抑制とは、Ｐ.ジンジバリスが産生するＣｙｓプロテアーゼが有する蛋白質分解活性（トリプシン様プロテアーゼ活性）を減弱または消失させることを意味する。当該Ｃｙｓプロテアーゼ活性の抑制作用は、後述する実験例１で示すように、被験試料の存在下または非存在下で、Ｃｙｓプロテアーゼを、その基質として使用するBz-L-Arg-pNA・HCl（Benzoyl-L-arginine p-nitroanilide monohydrochloride）（アルギニン−ジンジパイン用基質）またはAc-Lys-pNA・HCl（N-α-Acetyl-L-lysine p-nitroanilide monohydrochloride）（リジン−ジンジパイン用基質）に反応させて、生じるパラニトロアニリン（pNA）に由来する発光を吸光度で測定することで評価することができる。被験試料の存在下で反応させた場合の反応液の吸光度が非存在下で反応させた場合の反応液の吸光度よりも低い場合、または被験試料の存在下で反応させた場合の反応前後の吸光度の差が非存在下で反応させた場合の反応前後の吸光度の差よりも低い場合は、当該被験試料はＣｙｓプロテアーゼ活性抑制作用があると判断することができる。
【００１５】
本発明のＣｙｓプロテアーゼ活性抑制用組成物が有効成分として含有するヒノキチオールは、台湾ヒノキやヒバに含まれている不飽和七員環化合物であり、別名β-ツヤプリシン、及び４-イソプロピルトロポロンとも称される。従来より抗菌作用が知られており、防腐用食品添加物、育毛剤、化粧品などの添加物として広く使用されている公知の化合物である。金属イオンと接触すると塩を形成するが、本発明をそれらの塩も含めて、ヒノキチオールと総称する。ヒノキチオールは台湾ヒノキやヒバから抽出された精油から単離することもできるが、簡便には商業的に入手することができる。
【００１６】
本発明のＣｙｓプロテアーゼ活性抑制用組成物中のヒノキチオールの含有量は、Ｃｙｓプロテアーゼ活性抑制作用を発揮することを限度として特に制限されず、目的及び用途によって適宜設定することができる。例えば、本発明のＣｙｓプロテアーゼ活性抑制用組成物がそのまま口腔内に適用される口腔用組成物である場合は、例えば０．００１〜０．５質量％の範囲から適宜設定することができる。好ましくは０．００５〜０．２質量％であり、より好ましくは０．０１〜０．２質量％である。また本発明のＣｙｓプロテアーゼ活性抑制用組成物が、用時に水で希釈して口腔内に適用される口腔用組成物である場合は、希釈後の濃度が前記範囲になるようにヒノキチオールを含有するものであればよい。例えば、制限されないものの、一例を挙げると、用時に水で１０倍に希釈して使用する場合、例えばヒノキチオールを０．０１〜５質量％の濃度で含むように口腔用組成物を調製することができる。さらに本発明のＣｙｓプロテアーゼ活性抑制用組成物が、前述する口腔用組成物（そのまま使用、用時希釈使用のものを含む）にＣｙｓプロテアーゼ活性抑制用を付与するための添加剤として使用されるものである場合、前記口腔用組成物が調製できることを限度としてヒノキチオールの含有量は特に制限されることなく、例えば０．１〜１００質量％の範囲から適宜設定することができる。  
【００１７】
本発明のＣｙｓプロテアーゼ活性抑制用組成物が有効成分として含有するシャクヤク加工物は、ボタン科（Paeoniaceae）のシャクヤク（Paeonia lactiflora Pallas）又はその他近縁植物の根の加工物であり、根の粉砕物、細切物及びこれらの乾燥物、並びに溶媒抽出物（シャクヤクエキス）のいずれであってもよい。好ましくはシャクヤクエキスである。シャクヤクエキスの抽出に使用される抽出溶媒としては、例えば、水、有機溶媒（エタノール、メタノール、イソプロパノール等の低級アルコール：プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール；エーテル、ヘキサン、ベンゼン、クロロホルム、アセトン、ペンタン、酢酸エチル等）等またはこれらの混合物を挙げることができる。好ましくは水、エタノール、１，３−ブチレングリコール、又はこれらの混合溶媒（例えば含水エタノールなど）である。
【００１８】
シャクヤクエキスの製造にて採用される抽出方法については、特に制限されず、植物抽出物の製造に使用される一般的な抽出手法であればよい。例えば抽出溶媒中にシャクヤクの根（好ましくは乾燥粉砕物）を冷浸、温浸等によって浸漬し、必要に応じて撹拌する方法；パーコレーション法；水蒸気蒸留法等を挙げることができる。得られた抽出液を、必要に応じてろ過または遠心分離によって固形物を除去することにより、シャクヤクエキスが回収できる。本発明のＣｙｓプロテアーゼ活性抑制用組成物では、上記抽出処理により得られた液状のシャクヤクエキスをそのまま使用してもよいが、必要に応じて、一部又は全ての溶媒を除去して濃縮液若しくは乾燥物（エキス末、乾燥エキス）として使用してもよい。また、これらの濃縮物若しくは乾燥物を更に精製処理に供してもよく、更にこれらを適当な溶剤に溶解もしくは懸濁して用いることもできる。
【００１９】
シャクヤク加工物（シャクヤクの根の粉砕物やシャクヤクエキスなど）については、商業的に販売されているので、本発明では商業的に入手したものを使用してもよい。
【００２０】
本発明のＣｙｓプロテアーゼ活性抑制用組成物中のシャクヤク加工物の含有量は、Ｃｙｓプロテアーゼ活性抑制作用を発揮することを限度として特に制限されず、目的及び用途によって適宜設定することができる。例えば、本発明のＣｙｓプロテアーゼ活性抑制用組成物がそのまま口腔内に適用される口腔用組成物である場合は、シャクヤク加工物の乾燥物に換算して、例えば０．００００１〜１質量％の範囲から適宜設定することができる。好ましくは０．００００５〜０．１質量％であり、より好ましくは０．０００１〜０．０１質量％である。また本発明のＣｙｓプロテアーゼ活性抑制用組成物が、用時に水で希釈して口腔内に適用される口腔用組成物である場合は、希釈後の濃度が前記範囲になるようにシャクヤク加工物を含有するものであればよい。例えば、制限されないものの、一例を挙げると、用時に水で１０倍に希釈して使用する場合、例えばシャクヤク加工物を０．０００００１〜０．１質量％の濃度で含むように口腔用組成物を調製することができる。さらに本発明のＣｙｓプロテアーゼ活性抑制用組成物が、前述する口腔用組成物（そのまま使用、用時希釈使用のものを含む）にＣｙｓプロテアーゼ活性抑制作用を付与するための添加剤として使用されるものである場合、前記口腔用組成物が調製できることを限度としてシャクヤク加工物の含有量は特に制限されることなく、例えば０．１〜１００質量％の範囲から適宜設定することができる。  
【００２１】
本発明のＣｙｓプロテアーゼ活性抑制用組成物は、前述するように、そのまままたは水で希釈して口腔内に適用される口腔用組成物として使用されるものであってもよいし、またこれらの口腔用組成物に添加してＣｙｓプロテアーゼ活性抑制作用を有する口腔用組成物を調製するための添加剤として使用されるものであってもよい。
【００２２】
ヒノキチオールは水に微溶性の結晶であるため、本発明のＣｙｓプロテアーゼ活性抑制用組成物を口腔用組成物への添加剤として使用する場合（以下、この場合の本発明の組成物を「本発明の添加剤」と称する）は、ヒノキチオールをエタノールまたはプロピレングリコール等の可溶性溶媒に溶解した液剤の状態として調製されることが好ましい。
【００２３】
本発明のＣｙｓプロテアーゼ活性抑制用組成物をそのまままたは水で希釈して口腔用組成物として使用する場合（以下、この場合の本発明の組成物を「本発明の口腔用組成物」と称する）、その剤型としては、歯磨剤（練り歯磨剤、粉歯磨剤、ジェル歯磨剤、液体歯磨剤）、洗口液（マウスリンス、マウスウォッシュ、デンタルリンス）、口腔用軟膏剤、および口中清涼剤（マウススプレー等の液剤、錠剤（錠菓を含む）、口腔衛生剤、カプセル剤、顆粒剤、グミ、ガムなど）等を制限なく例示することができる。洗口液などの液状の剤型については、原液のまま使用するタイプであっても、また濃縮タイプであって使用時に希釈して使用するタイプであってもよい。これらは、Ｃｙｓプロテアーゼの活性を抑制する目的に加えて、歯磨きなど口腔内を洗浄・清掃する目的、口腔内に清涼感を付与する目的、口腔内を殺菌する目的、及び／または口臭を除去または防止する目的で使用されるものであってもよい。
【００２４】
本発明の口腔用組成物は、本発明の効果を損なわない範囲で、口腔用組成物の種類、剤型及び目的に応じて通常配合され得る研磨剤、発泡剤、増粘剤、香料、甘味剤、湿潤剤、抗酸化剤、ｐＨ調整剤、着色剤、防腐剤等の添加剤や、薬理活性成分、溶剤等を添加し、従来公知の手法に従って所望の剤型に調製することができる。
【００２５】
研磨剤としては、口腔用組成物に一般的に使用される種々の研磨剤を配合することができる。特に限定されないが、例えば、第１リン酸カルシウム、第２リン酸カルシウム・２水和物及び無水和物、第３リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム、水酸化アルミニウム、アルミナ、シリカゲル、無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウム、沈降性シリカ、不溶性メタリン酸ナトリウム、第３リン酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、硫酸カルシウム、ポリメタクリル酸メチル、ベントナイト、ケイ酸ジルコニウム、チタニウム結合ケイ酸塩等が挙げられる。
【００２６】
発泡剤としては、口腔用組成物に一般的に使用される種々の発泡剤（発泡性界面活性剤）を配合することができる。特に限定されないが、アニオン界面活性剤、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、及び／または両性界面活性剤を配合することができる。より具体的には、アニオン界面活性剤としては、例えば、ラウロイルメチルタウリン又はその塩、ラウロイルグルタミン酸又はその塩、ラウロイルサルコシン又はその塩等のアミノ酸系界面活性剤；ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、水素添加ココナッツ脂肪酸モノグリセリドモノ硫酸ナトリウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。ノニオン界面活性剤としては、例えば、ショ糖脂肪酸エステル、マルトース脂肪酸エステル、マルチトール脂肪酸エステル、ラクトール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。カチオン界面活性剤としては、例えば、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム等が挙げられる。両性界面活性剤としては、例えば、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ラウリルジメチルアミンオキシド、２-アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリウムベタイン、Ｎ−ラウリルジアミノエチルグリシン、Ｎ−ミリスチルジアミノエチルグリシン、Ｎ−アルキル−１−ヒドロキシエチルイミダゾリンベタインナトリウム等が挙げられる。
【００２７】
増粘剤としては、口腔用組成物に一般的に使用される種々の増粘剤を配合することができる。特に限定されないが、キサンタンガム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸ナトリウム、カラギナン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００２８】
香料としては、口腔用組成物に一般的に使用される種々の香料を配合することができる。特に限定されないが、ｌ−メントール、ｌ−カルボン、シンナミックアルデヒド、オレンジオイル、アネトール、１，８−シネオール、メチルサリシレート、オイゲノール、チモール、リナロール、リモネン、メントン、メンチルアセテート、シトラール、カンファー、ボルネオール、ピネン、スピラントール、エチルアセテート、エチルブチレート、イソアミルアセテート、ヘキサナール、ヘキセナール、メチルアンスラニレート、エチルメチルフェニルグリシデート、ベンズアルデヒド、バニリン、エチルバニリン、フラネオール、マルトール、エチルマルトール、ガンマ／デルタデカラクトン、ガンマ／デルタウンデカラクトン、Ｎ−エチル−ｐ−メンタン−３−カルボキサミド、メンチルラクテート、エチレングリコール−ｌ−メンチルカーボネート等の香料成分；ペパーミント油、スペアミント油、ユーカリ油、クローブ油、タイム油、セージ油、カルダモン油、ローズマリー油、マジョラム油、レモン油、ナツメグ油、ラベンダー油、パラクレス油等の天然精油；アップル、バナナ、ストロベリー、ブルーベリー、メロン、ピーチ、パイナップル、グレープ、マスカット、ワイン、チェリー、スカッシュ、コーヒー、ブランデー、ヨーグルト等の調合フレーバーが挙げられる。
【００２９】
甘味剤としては、口腔用組成物に一般的に使用される種々の甘味料を配合することができる。特に限定されないが、サッカリンナトリウム、アセスルファームＫ、ステビオサイド、ネオヘスポリジルジヒドロカルコン、グリチルリチン、ペリラルチン、タウマチン、アスパルチルフェニルアラニンメチルエステル、ｐ−メトキシシンナミックアルデヒド、アスパルテーム、キシリトール、エリスリトール等が挙げられる。
【００３０】
湿潤剤としては、口腔用組成物に一般的に使用される種々の湿潤剤を配合することができる。特に限定されないが、ソルビット、グリセリン、濃グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、１,３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。
【００３１】
抗酸化剤としては、口腔用組成物に一般的に使用される種々の抗酸化剤を配合することができる。特に限定されないが、ローズマリー抽出物、ステビア抽出物、ヒマワリ種子抽出物、没食子酸プロピル、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、Ｌ−システイン塩酸塩、フィチン酸、ハイドロキノン及びその配糖体、ノルジヒドログアヤレチン酸、グアヤク脂、ポリフェノール、トコフェロール酢酸エステル、マツエキス、アスコルビン酸等が挙げられる。
【００３２】
ｐＨ調整剤としては、口腔用組成物に一般的に使用される種々のｐＨ調整剤を配合することができる。特に限定されないが、フタル酸、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、フマル酸、リンゴ酸、炭酸やそれらのカリウム塩、ナトリウム塩又はアンモニウム塩、水酸化ナトリウムなどが挙げられる。本発明の口腔用組成物のｐＨは、口腔内及び人体に安全性上問題ない範囲であれば特に限定されるものではないが、例えば口腔用組成物３０ｇを２５℃７０ｍＬの水に溶解させた場合のｐＨの範囲としてｐＨ３〜９が挙げられる。本発明の口腔用組成物のｐＨは、必要に応じて前記ｐＨ調整剤を使用して当該範囲に調整され得る。
【００３３】
着色剤としては、口腔用組成物に一般的に使用される種々の着色剤を配合することができる。特に限定されないが、例えば、赤色２号、赤色３号、赤色２２５号、赤色２２６号、黄色４号、黄色５号、黄色２０５号、青色１号、青色２号、青色２０１号、青色２０４号、緑色３号、雲母チタン、酸化チタン等が挙げられる。
【００３４】
防腐剤としては、口腔用組成物に一般的に使用される種々の防腐剤を配合することができる。特に限定されないが、例えば安息香酸ナトリウム、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン等のパラベン類、塩化セチルピリジニウム、塩酸アルキルジアミノエチルグリシン、ソルビン酸カリウム等が挙げられる。
【００３５】
薬理活性成分としては、口腔用組成物に一般的に使用される種々の薬理活性成分を配合することができる。特に限定されないが、例えばクロロヘキシジン、トリクロサン、イソプロピルメチルフェノール、塩化セチルピリジニウム、グルコン酸亜鉛、クエン酸亜鉛等の殺菌又は抗菌剤；トラネキサム酸、グリチルリチン酸ジカリウム塩等の抗炎症剤；アラントイン、アラントインクロルヒドロキシアルミニウム、アスコルビン酸、塩化リゾチーム、グリチルリチン酸及びその塩類、塩化ナトリウム、乳酸アルミニウム等の収斂剤；デキストラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ムタナーゼ、リゾチーム等の酵素；塩化ストロンチウム、硝酸カリウム等の知覚過敏抑制剤などが挙げられ、これらを薬剤学的に許容できる範囲で使用することができる。
【００３６】
溶剤としては、エタノールやイソプロピルアルコール等を使用することができる。
【００３７】
本発明の口腔用組成物中の任意成分の含有量としては、配合される各成分の量、担体、添加剤の種類等に応じて適宜設定され得るが、総量として１〜８０重量％が挙げられる。
【００３８】
また、本発明の口腔用組成物は、薬理学的に許容される従来公知の担体を含んでいてもよい。このような担体としては、例えば水（イオン交換水、蒸留水、精製水等）、生理食塩水等の水性担体；高級脂肪酸、植物油、動物油、シリコーン油類、金属石鹸等の油性担体が挙げられる。本発明において、これらの担体の含有量は、口腔用組成物において有効成分であるヒノキチオールと、その他の任意成分以外の残部に相当するように調整される。
【００３９】
本発明の口腔用組成物の使用量／回は特に限定されず、用途に応じて適宜調整され得るが、例えば、練歯磨剤の場合には０．２〜１ｇが挙げられ、液体歯磨剤や洗口剤の場合には５〜２０ｍＬが挙げられる。また本発明の口腔用組成物の適用者は好ましくは成人であり、より好ましくは歯周病に罹患した人または歯周病に罹患しやすい人である。
【００４０】
（ＩＩ）Ｃｙｓプロテアーゼの活性抑制作用を付与する方法
後述する実験例１に示すようにヒノキチオール及びシャクヤク加工物には歯周病原因菌であるＰ.ジンジバリスが産生するＣｙｓプロテアーゼの活性を抑制する作用がある。このため、口腔用組成物にヒノキチオール及びシャクヤク加工物から選択される少なくとも１種を配合することで、当該口腔用組成物にＰ.ジンジバリスが産生するＣｙｓプロテアーゼの活性を抑制する作用を付与することができる。
【００４１】
従って、本発明は口腔用組成物にヒノキチオール及びシャクヤク加工物から選択される少なくとも１種を配合する工程を有する、口腔用組成物に歯周病原因菌産生Ｃｙｓプロテアーゼの活性抑制作用を付与する方法を提供する。口腔用組成物にはヒノキチオール単独で配合してもよいし、シャクヤク加工物を単独または形態が異なるシャクヤク加工物を２種以上組み合わせて配合してもよいし、さらにヒノキチオールとシャクヤク加工物とを組み合わせて配合してもよい。ここで配合する好適なシャクヤク加工物としては、シャクヤクエキスを例示することができる。
【００４２】
ここでヒノキチオール及び／またはシャクヤク加工物を添加配合する対象の口腔用組成物は、その剤型及び含有成分として、ヒノキチオール及びシャクヤク加工物を含有していないことを除いて、前述する口腔用組成物を挙げることができる。当該口腔用組成物に対するヒノキチオールの配合量は、調製する口腔用組成物の種類や剤型及び目的によって相違するものの、例えば、調製する口腔用組成物がそのまま口腔内に適用される口腔用組成物である場合は、例えば０．００１〜０．５質量％の範囲から適宜設定することができる。好ましくは０．００５〜０．２質量％であり、より好ましくは０．０１〜０．２質量％である。また調製する口腔用組成物が、用時に水で希釈して口腔内に適用される口腔用組成物である場合は、希釈後の口腔用組成物中のヒノキオールの濃度が前記範囲になるようにヒノキチオールを配合すればよい。例えば、制限されないものの、一例を挙げると、用時に水で１０倍に希釈して使用される口腔用組成物の場合、例えばヒノキチオールを０．０１〜５質量％の割合で配合して口腔用組成物を調製することができる。
【００４３】
口腔用組成物に対するシャクヤク加工物の配合量は、調製する口腔用組成物の種類や剤型及び目的によって相違するものの、例えば、調製する口腔用組成物がそのまま口腔内に適用される口腔用組成物である場合は、乾燥物換算で、例えば０．００００１〜１質量％の範囲から適宜設定することができる。好ましくは０．００００５〜０．１質量％であり、より好ましくは０．０００１〜０．０１質量％である。また調製する口腔用組成物が、用時に水で希釈して口腔内に適用される口腔用組成物である場合は、希釈後の口腔用組成物中のシャクヤク加工物の濃度が前記範囲になるようにシャクヤク加工物を配合すればよい。例えば、制限されないものの、一例を挙げると、用時に水で１０倍に希釈して使用される口腔用組成物の場合、例えばシャクヤク加工物を０．０００００１〜１０質量％の割合で配合して口腔用組成物を調製することができる。
【００４４】
以上、本明細書において、「含む」及び「含有する」の用語には、「からなる」及び「から実質的になる」という意味が含まれる。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明の構成及び効果について、その理解を助けるために、実験例を用いて本発明を説明する。但し、本発明はこれらの実験例によって何ら制限を受けるものではない。以下の実験は、特に言及しない限り、室温（２５±５℃）、及び大気圧条件下で実施した。また、特に言及しない限り、「％」は質量％を意味する。
【００４６】
実験例１  ジンジパイン活性抑制効果の評価
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）（Ｐ．ジンジバリス）が産生するプロテアーゼ（ジンジパイン）の蛋白質分解活性（ジンジパイン活性）に対するヒノキチオール及びシャクヤクエキスの抑制効果を、以下の試験により評価した。
【００４７】
（１）試験方法
（１−１）Ｐ．ジンジバリス産生プロテアーゼの精製
Ｐ．ジンジバリス（JCM 12257）を５０μｇ／ｍＬヘミン及び１μｇ／ｍＬメナジオン含有ＧＡＭ液体培地にて、３７℃で２日間嫌気培養した。培養後、培養液を遠心分離（10000rpm、4℃、10分間）した後、回収した上清に８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、４℃条件下で２時間スターラーで撹拌した。次いでこれを遠心分離（10000rpm、4℃、30分間）した後、得られた沈殿物にBuffer（20mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、10mM CaCl2）を加えて溶解し、これを透析膜に入れて、Buffer（20mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、10mM CaCl2、0.05％ Tween20）（４℃）にて１日間透析した。透析後、透析膜から回収した透析液を、遠心分離（10000rpm、4℃、30分間）し、得られた上清に終濃度が２５％になるようにグリセリンを添加して、これをＰ．ジンジバリス産生プロテアーゼ液（粗酵素液）とした。
【００４８】
（１−２）ジンジパイン活性の測定
０.１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の中で、終濃度０．０５ｍＭ  システイン、表１に示す組成からなる被験試料（実施例用、比較例用）、上記方法で調製したＰ．ジンジバリス産生プロテアーゼ液（粗酵素液）の１００倍希釈液、及び１ｍＭ  Bz-L-Arg-pNA・HCl［L-BAPA]（Benzoyl-L-arginine p-nitroanilide monohydrochloride）（アルギニン−ジンジパイン用基質）または１ｍＭ  Ac-Lys-pNA・HCl（N-α-Acetyl-L-lysine p-nitroanilide monohydrochloride）（リジン−ジンジパイン用基質）を混合し、３７℃で５時間インキュベートした。なお、ここに記載する各成分の濃度は、添加混合後の終濃度である。インキュベート前後で、反応液０．５ｍＬを４８ウェルマイクロプレートに移し、波長４３０ｎｍにおける吸光度を測定した。インキュベート前の吸光度（初期値）とインキュベート後の吸光度との差から反応により分解生成したパラニトロアニリン（pNA）の量、つまり基質の分解活性（ジンジパイン活性）を評価した。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
（２）試験結果
基質としてアルギニン−ジンジパイン用基質を用いた場合の結果を表２及び図１に、リジン−ジンジパイン用基質を用いた場合の結果を表３及び図２に、それぞれ示す。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
【表３】
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【００５３】
表２及び図１に示すように、ヒノキチオール及びシャクヤクエキスのいずれも含有しない比較例１では、pNA由来の発光が確認され、アルギニン−ジンジパイン活性を示したのに対し、ヒノキチオールを０．０１％含有する実施例１、０．０２％含有する実施例２、及び０．０４％含有する実施例３では、いずれもその活性が用量依存的に抑制されることが確認された。この結果より、ヒノキチオールには、アルギニン−ジンジパイン活性を抑制する作用があることが判明した。またシャクヤクエキスを０．０００１％含有する実施例４、０．００１％含有する実施例５、及び０．０１％含有する実施例６でもその活性が用量依存的に抑制されることが確認された。この結果より、シャクヤクエキスを始めとするシャクヤク加工物には、アルギニン−ジンジパイン活性を抑制する作用があることが判明した。また実施例７及び８の結果から、ヒノキチオールにシャクヤクエキスを併用すると、ヒノキチオールのアルギニン−ジンジパイン活性抑制作用は損なわれることなく、維持または増強することが確認された。
【００５４】
また表３及び図２に示すように、ヒノキチオール及びシャクヤクエキスのいずれも含有しない比較例２では、pNA由来の発光が確認され、リジン−ジンジパイン活性を示したのに対し、ヒノキチオールを０．０１％含有する実施例９、０．０２％含有する実施例１０２、及び０．０４％含有する実施例１１では、いずれもその活性が用量依存的に抑制されることが確認された。この結果より、ヒノキチオールには、アルギニン−ジンジパイン活性だけでなくリジン−ジンジパイン活性をも抑制する作用があることが判明した。またシャクヤクエキスを０．０００１％含有する実施例１２、０．００１％含有する実施例１３、及び０．０１％含有する実施例１４でもその活性が用量依存的に抑制されることが確認された。この結果より、シャクヤク加工物にも、アルギニン−ジンジパイン活性だけでなくリジン−ジンジパイン活性を抑制する作用があることが判明した。これらの実験結果から、ヒノキチオール及びシャクヤクエキスには、塩基性アミノ酸−ジンジパイン活性を抑制する作用があることが明らかになった。
【００５５】
歯磨き剤の形態を有する本発明の歯周病原因菌産生システインプロテアーゼの活性抑制用組成物を表４に例示する。
【００５６】
【表４】
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【００５７】
洗口液の形態を有する本発明の歯周病原因菌産生システインプロテアーゼの活性抑制用組成物を表５に例示する。
【００５８】
【表５】
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【００５９】
ゲル状軟膏剤（半固形剤）の形態を有する本発明の歯周病原因菌産生システインプロテアーゼの活性抑制用組成物を表６に例示する。
【００６０】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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