(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫不全ウイルス感染の処置のための方法および組成物。【解決手段】哺乳類の細胞中のレトロウイルスを不活性化する方法であって、１つのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと１つ以上のガイドＲＮＡからなる１つの遺伝子編集複合体をコードする１つの単離核酸を含む１つの組成物に、前記細胞を暴露するステップを有し、ここにおいて前記ガイドＲＮＡは前記レトロウイルス内の標的核酸配列に相補的である、ことを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の細胞中のレトロウイルスを不活性化する方法であって、
１つのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと１つ以上のガイドＲＮＡからなる１つの遺伝子編集複合体をコードする１つの単離核酸を含む１つの組成物に、前記細胞を暴露するステップを有し、ここにおいて前記ガイドＲＮＡは前記レトロウイルス内の標的核酸配列に相補的である、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記レトロウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス；サル免疫不全ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス；およびウシ免疫不全ウイルスからなるグループから選択されるレンチウイルスである、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒト免疫不全ウイルスはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２である、ことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト免疫不全ウイルスは組み込まれたプロウイルスＤＮＡを有する、ことを特徴とする請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は潜伏感染した細胞である、ことを特徴とする請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記潜伏感染した細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ、単球、腸管関連リンパ細胞、ミクログリア細胞またはアストロサイトである、ことを特徴とする請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記不活性化は生体内で行われる、ことを特徴とする請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記不活性化は生体外で行われる、ことを特徴とする請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記細胞はヒト免疫不全ウイルス感染を有する被験者からの１つの培養細胞、１つの体外移植組織または１つの細胞株を含む、ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験者からの前記培養細胞は、前記暴露ステップの後に前記被験者に再導入される、ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子編集複合体は前記プロウイルスＤＮＡ中に１つ以上の変異を導入し、ここにおいて前記変異はウイルスの複製またはウイルスの遺伝子発現を不活性化する、ことを特徴とする請求項１−１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルスＤＮＡ内の前記変異は前記ガイドＲＮＡ配列に相補的な１つの配列の中にある、ことを特徴とする請求項１−１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記変異は、欠失、挿入、または点変異からなるグループから選択される、ことを特徴とする請求項１−１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記変異は、欠失である、ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記欠失はプロウイルスＤＮＡの約１−約１０，０００個のヌクレオチドを含む、ことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記欠失は前記プロウイルスＤＮＡの全てまたは実質的に全てを含む、ことを特徴とする請求項１−１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９である、ことを特徴とする請求項１−１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはヒト細胞における発現に対し最適化される、ことを特徴とする請求項１−１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記標的配列は前記ヒト免疫不全ウイルスのコーディング領域内の１つの配列を含む、ことを特徴とする請求項１−１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記標的配列は前記ヒト免疫不全ウイルスの非コーディング領域内の１つの配列を含む、ことを特徴とする請求項１−１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記非コーディング領域は前記ヒト免疫不全ウイルスの１つの長い末端反復を含む、ことを特徴とする請求項１−１８または２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記標的配列は前記ヒト免疫不全ウイルスの前記長い末端反復内の１つの配列を含む、ことを特徴とする請求項１−１８または２０−２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記ヒト免疫不全ウイルスの前記長い末端反復内の前記配列は、Ｕ３，Ｒ、またはＵ５領域内の１つの配列を含む、ことを特徴とする請求項１−１８または２０−２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記長い末端反復内の前記配列は、ＬＴＲ  Ａ（配列ＩＤ番号：９６）、ＬＴＲ  Ｂ（配列ＩＤ番号：１２１）、ＬＴＲ  Ｃ（配列ＩＤ番号：８７）、ＬＴＲ  Ｄ（配列ＩＤ番号：１１０）、またはそれらの組み合わせからなるグループから選択される１つの配列に９５％一致する１つの配列を含む、ことを特徴とする請求項１−１８または２０−２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記長い末端反復内の前記配列は、ＬＴＲ  Ａ（配列ＩＤ番号：９６）、ＬＴＲ  Ｂ（配列ＩＤ番号：１２１）、ＬＴＲ  Ｃ（配列ＩＤ番号：８７）、ＬＴＲ  Ｄ（配列ＩＤ番号：１１０）、またはそれらの組み合わせからなるグループから選択される１つの配列を含む、ことを特徴とする請求項１−１８または２０−２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記遺伝子編集複合体はさらに、トランス活性化スモールＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする１つの配列を含む、ことを特徴とする請求項１−２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記トランス活性化スモールＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列は前記ガイドＲＮＡをコードする配列に融合される、ことを特徴とする請求項１−２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記遺伝子編集複合体をコードする前記核酸はさらに核酸配置信号を含む、ことを特徴とする請求項１−２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記遺伝子編集複合体をコードする前記核酸は１つの発現ベクターに動作可能に結合している、ことを特徴とする請求項１−２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記発現ベクターは１つのレンチウイルスベクター、１つのアデノウイルスベクター、または１つのアデノ−関連ウイルスベクターである、ことを特徴とする請求項１−２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
哺乳類の細胞中のレトロウイルスを不活性化する方法であって、
１つのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペプチドと１つ以上のガイドＲＮＡからなる１つの組成物に、前記細胞を接触させるステップを有し、ここにおいて前記ガイドＲＮＡは前記レトロウイルス内の標的核酸配列に相補的である、ことを特徴とする方法。
【請求項３２】
前記組成物は医薬的に受容可能な担体を含む、ことを特徴とする請求項１−３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記医薬的に受容可能な担体は、脂質ベースまたはポリマーベースのコロイドを含む、ことを特徴とする請求項１−３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記コロイドは、リポソーム、ヒドロゲル、マイクロ粒子、ナノ粒子、またはブロック共重合体ミセルである、ことを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物は局所適用のために処方される、ことを特徴とする請求項１−３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
哺乳類の細胞中のレトロウイルスを不活性化する方法であって、
ａ）少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと１つのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする１つの単離核酸と；そして
ｂ）少なくとも１つ以上のガイドＲＮＡと１つのガイドＲＮＡをコードする単離核酸と；
からなる１つの組成物に、前記細胞を暴露するステップを有し、
ここにおいて前記ガイドＲＮＡは前記レトロウイルス内の１つの標的核酸配列に相補的である、ことを特徴とする方法。
【請求項３７】
単離核酸配列であって、１つのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つの配列を含み、ここにおいて前記ガイドＲＮＡはヒト免疫不全ウイルス内の１つの標的核酸配列に相補的である、ことを特徴とする単離核酸配列。
【請求項３８】
前記レトロウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス；サル免疫不全ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス；およびウシ免疫不全ウイルスからなるグループから選択されるレンチウイルスである、ことを特徴とする請求項３７に記載の単離核酸配列。
【請求項３９】
前記ヒト免疫不全ウイルスはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２である、ことを特徴とする請求項３７または３８に記載の単離核酸配列。
【請求項４０】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９である、ことを特徴とする請求項３７−３９のいずれかに記載の単離核酸配列。
【請求項４１】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはヒト細胞における発現に対し最適化される、ことを特徴とする請求項３７−４０のいずれかに記載の単離核酸配列。
【請求項４２】
前記標的配列は前記ヒト免疫不全ウイルスのコーディング領域内の１つの配列を含む、ことを特徴とする請求項３７−４１のいずれかに記載の単離核酸配列。
【請求項４３】
前記標的配列は前記ヒト免疫不全ウイルスの非コーディング領域内の１つの配列を含む、ことを特徴とする請求項３７−４１のいずれかに記載の単離核酸配列。
【請求項４４】
前記非コーディング領域は前記ヒト免疫不全ウイルスの１つの長い末端反復を含む、ことを特徴とする請求項３７−４１または４３のいずれかに記載の単離核酸配列。
【請求項４５】
前記標的配列は前記ヒト免疫不全ウイルスの前記長い末端反復内の１つの配列を含む、ことを特徴とする請求項３７−４１または４３−４４のいずれかに記載の単離核酸配列。
【請求項４６】
前記ヒト免疫不全ウイルスの前記長い末端反復内の前記配列は、Ｕ３，Ｒ、またはＵ５領域内の１つの配列を含む、ことを特徴とする請求項３７−４１または４３−４５のいずれかに記載の単離核酸配列。
【請求項４７】
前記長い末端反復内の前記配列は、ＬＴＲ  Ａ（配列ＩＤ番号：９６）、ＬＴＲ  Ｂ（配列ＩＤ番号：１２１）、ＬＴＲ  Ｃ（配列ＩＤ番号：８７）、ＬＴＲ  Ｄ（配列ＩＤ番号：１１０）、またはそれらの組み合わせからなるグループから選択される１つの配列に９５％一致する１つの配列を含む、ことを特徴とする請求項３７−４１または４３−４６のいずれかに記載の単離核酸配列。
【請求項４８】
前記長い末端反復内の前記配列は、ＬＴＲ  Ａ（配列ＩＤ番号：９６）、ＬＴＲ  Ｂ（配列ＩＤ番号：１２１）、ＬＴＲ  Ｃ（配列ＩＤ番号：８７）、ＬＴＲ  Ｄ（配列ＩＤ番号：１１０）、またはそれらの組み合わせからなるグループから選択される１つの配列を含む、ことを特徴とする請求項３６−４１または４３−４６のいずれかに記載の単離核酸配列。
【請求項４９】
前記遺伝子編集複合体はさらに、トランス活性化スモールＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする１つの配列を含む、ことを特徴とする請求項３７−４１または４３−４６のいずれかに記載の単離核酸配列。
【請求項５０】
前記トランス活性化スモールＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列は前記ガイドＲＮＡをコードする配列に融合される、ことを特徴とする請求項４９に記載の単離核酸配列。
【請求項５１】
前記遺伝子編集複合体をコードする前記核酸はさらに核酸配置信号を含む、ことを特徴とする請求項３７−５０のいずれかに記載の単離核酸配列。
【請求項５２】
請求項３７−５１のいずれかに記載の前記核酸配列を含む、ことを特徴とする発現ベクター。
【請求項５３】
前記発現ベクターはレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ−関連ウイルスベクターである、ことを特徴とする請求項５２に記載の発現ベクター。
【請求項５４】
請求項５２―５３のいずれかに記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５５】
請求項３６−５１のいずれかに記載の核酸配列、請求項５２−５３のいずれかに記載の発現ベクター、または請求項５４に記載の宿主細胞を含む、ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項５６】
前記組成物は医薬的に受容可能な担体を含む、ことを特徴とする請求項３７−５５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記医薬的に受容可能な担体は、脂質ベースまたはポリマーベースのコロイドを含む、ことを特徴とする請求項３７−５６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５８】
前記コロイドは、リポソーム、ヒドロゲル、マイクロ粒子、ナノ粒子、またはブロック共重合体ミセルである、ことを特徴とする請求項５７に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
前記組成物は局所に適用するために処方される、ことを特徴とする請求項３７−５８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６０】
前記組成物はコンドーム内に含まれる、ことを特徴とする請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
ヒト免疫不全ウイルス感染を有する被験者を処置する方法であって、前記被験者に処置的に有効な量の請求項３７−５９のいずれかに記載の組成物を投与するステップを有する、ことを特徴とする方法。
【請求項６２】
ヒト免疫不全ウイルス感染を有する被験者を識別するステップをさらに有する、ことを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ガイドＲＮＡは前記被験者に感染するヒト免疫不全ウイルス内の１つの標的配列に対して相補的である、ことを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記ヒト免疫不全ウイルス感染は潜伏感染である、ことを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記組成物は局所または非経口で投与される、ことを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
抗レトロウイルス薬を投与するステップをさらに有する、ことを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６７】
前記抗レトロウイルス薬は非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、および侵入阻害剤からなるグループから選択される、ことを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記抗レトロウイルス薬は高度に活性な抗レトロウイルス療法を含む、ことを特徴とする請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
ヒト免疫不全ウイルスを感染するリスクのある被験者において、ヒト免疫不全ウイルス感染のリスクを減少させる方法であって、前記被験者に治療的に有効な量の請求項３６−５９のいずれかに記載の組成物を投与するステップを有する、ことを特徴とする方法。
【請求項７０】
前記被験者は性的に活発である、ことを特徴とする請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記被験者は医療従事者または救命救急従事者である、ことを特徴とする請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
ヒト免疫不全ウイルスに感染している妊娠中または授乳中の母親から彼女の出生児にヒト免疫不全ウイルスを伝染させる可能性を低減する方法であって、前記母親に治療的に有効な量の請求項３７−５９のいずれかに記載の組成物を投与するステップを有する、ことを特徴とする方法。
【請求項７３】
前記組成物は出産前、出産時、出産後またはそれらの組み合わせにおいて投与される、ことを特徴とする請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
抗レトロウイルス薬を投与するステップをさらに有する、ことを特徴とする請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記抗レトロウイルス薬は非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、および侵入阻害剤からなるグループから選択される、ことを特徴とする請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記抗レトロウイルス薬は高度に活性な抗レトロウイルス療法を含む、ことを特徴とする請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記出生児に治療的に有効な量の請求項３７−５９のいずれかに記載の組成物を投与するステップを有する、ことを特徴とする請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
ヒト免疫不全ウイルス感染を有する被験者を処置する方法であって、
ａ）前記ヒト免疫不全ウイルスの核酸配列を決定するステップと；および
ｂ）前記被験者に、１つのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つの核酸を含む医薬組成物を投与するステップと；
を有し、ここにおいて前記ガイドＲＮＡは前記ヒト免疫不全ウイルス内の標的配列に相補的である、ことを特徴とする方法。
【請求項７９】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９である、ことを特徴とする請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはヒト細胞における発現に対し最適化される、ことを特徴とする請求項７８または７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記標的配列は前記ヒト免疫不全ウイルスの長い末端反復内の１つの配列を含む、ことを特徴とする請求項７８−８０のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
前記ヒト免疫不全ウイルスの前記長い末端反復内の前記配列は、Ｕ３，Ｒ、またはＵ５領域内の１つの配列を含む、ことを特徴とする請求項７８−８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
前記長い末端反復内の前記配列は、ＬＴＲ  Ａ（配列ＩＤ番号：９６）、ＬＴＲ  Ｂ（配列ＩＤ番号：１２１）、ＬＴＲ  Ｃ（配列ＩＤ番号：８７）、ＬＴＲ  Ｄ（配列ＩＤ番号：１１０）、またはそれらの組み合わせからなるグループから選択される１つの配列に９５％一致する１つの配列を含む、ことを特徴とする請求項７８−８２のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
前記長い末端反復内の前記配列は、ＬＴＲ  Ａ（配列ＩＤ番号：９６）、ＬＴＲ  Ｂ（配列ＩＤ番号：１２１）、ＬＴＲ  Ｃ（配列ＩＤ番号：８７）、ＬＴＲ  Ｄ（配列ＩＤ番号：１１０）、またはそれらの組み合わせからなるグループから選択される１つの配列を含む、ことを特徴とする請求項７８−８３のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
前記遺伝子編集複合体はさらに、トランス活性化スモールＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする１つの配列を含む、ことを特徴とする請求項７８−８４のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】
前記トランス活性化スモールＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列は前記ガイドＲＮＡをコードする配列に融合される、ことを特徴とする請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
ヒト免疫不全ウイルス感染を処置するための薬剤を生産するために、単離核酸配列を使用する方法であって、
前記単離核酸配列は、
１つのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つの配列を含み、ここにおいて前記ガイドＲＮＡはヒト免疫不全ウイルス内の１つの標的核酸配列に相補的である；または、
１つのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと１つのガイドＲＮＡをコードする１つの配列を含み、ここにおいて前記ガイドＲＮＡはヒト免疫不全ウイルス内の１つの標的核酸配列に相補的である；
ことを特徴とする方法。
【請求項８８】
ヒト免疫不全ウイルス感染のリスクを減少させるための薬剤を生産するために、単離核酸配列を使用する方法であって、
前記単離核酸配列は、
１つのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つの配列を含み、ここにおいて前記ガイドＲＮＡはヒト免疫不全ウイルス内の１つの標的核酸配列に相補的である；または、
１つのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと１つのガイドＲＮＡをコードする１つの配列を含み、ここにおいて前記ガイドＲＮＡはヒト免疫不全ウイルス内の１つの標的核酸配列に相補的である；
ことを特徴とする方法。
【請求項８９】
キットであって、測定された量の１つの組成物を有し、
前記組成物は、単離核酸配列であって、１つのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つの配列を含み、ここにおいて前記ガイドＲＮＡはヒト免疫不全ウイルス内の１つの標的核酸配列に相補的である、１つの単離核酸配列、または、前記核酸をコードする１つのベクターを有し、
前記キットはまた、包装材料、使用説明書を含む装入物、無菌液、シリンジ、および無菌容器からなるグループから選択される１つ以上のアイテムを有する、
ことを特徴とするキット。
【請求項９０】
前記組成物はさらに医薬的に許容可能な担体を含む、ことを特徴とする請求項８９に記載のキット。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レトロウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）内の標的配列を特異的に切断する組成物に関するものである。クリスパー（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸、およびＨＩＶ内の標的配列に相補的なガイドＲＮＡ配列を含みうるこのような組成物は、ＨＩＶ感染症を罹患するまたは罹患のリスクのある被験者に投与されうる。
【０００２】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は２０１３年８月２９日出願の米国暫定出願６１／８７１，６２６（特許文献１）、２０１４年６月２７日出願の米国暫定出願６２／０１８，４４１（特許文献２）および２０１４年７月１８日出願の米国暫定出願６２／０２６，１０３（特許文献３）の出願日の恩恵を主張する。米国暫定出願６１／８７１，６２６、米国暫定出願６２／０１８，４４１および米国暫定出願６２／０２６，１０３の恩恵を主張するため、これら出願の内容はその全てがここに参照として採り入れられる。
【０００３】
（配列リスト）
本願はＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列リストを含み、それはその全てにおいてここに参照として採り入れられる。そのＡＳＣＩＩコピーは２０１４年８月２６日に作成され、その名称はＦ５１２９−０００３１  ＳＬ．ｔｘｔであり、そのサイズは７４，５４７バイトである。
【０００４】
（連邦政府補助研究に関する宣言）
本発明は、国立保健局により授与された補助番号Ｒ０１ＭＨ０９３２７１，Ｒ０１ＮＳ０８７９７１およびＰ３０ＭＨ０９２１７７の下での米国政府の補助により行われた。米国政府が本発明に対し一定の権利を有する可能性がある。
【背景技術】
【０００５】
ＨＩＶ−１の発見以来３０年以上にわたって、ＡＩＤＳは公衆衛生上の重要課題として存在しつづけ、世界中で３５．５百万人以上の人に影響を及ぼしている。ＡＩＤＳはＨＩＶ−１の宿主ゲノムへの永久的組み込みに起因して、不治の病でありつづけている。ＨＩＶ−１感染を制御しその進行を遅らせる近年の処置法（高活性抗レトロウイルス療法、またはＨＡＡＲＴ）はＨＩＶ−１感染をサポートする細胞内のウイルス複製を減少させ、そしてプラズマ・ウイルス血症を最低レベルに減少させる。しかしＨＡＡＲＴは組織内の低レベルのウイルスゲノム発現および複製を抑制することに失敗し、そして、ＨＩＶ−１の保管場所として機能する、潜伏感染した細胞、例えば休止中のメモリＴ細胞、脳内マクロファージ、ミクログリア、およびアストロサイト、腸管関連リンパ細胞、を標的とすることに失敗している。持続性ＨＩＶ−１感染は心臓および腎臓疾患、骨減少症および神経疾患、を含む合併症にも関連している。持続性ウイルス保管庫を標的とする根処置法的戦略に対する永続的な必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国暫定出願６１／８７１，６２６
【特許文献２】米国暫定出願６２／０１８，４４１
【特許文献３】米国暫定出願６２／０２６，１０３
【発明の概要】
【０００７】
本明細書ではレトロウイルス感染の処置および防止に関する組成物および方法が提供される。レトロウイルスはレンチウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、またはウシ免疫不全ウイルスでありうる。ヒト免疫不全ウイルスはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２でありうる。１つの実施形態では、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つの配列を含む核酸配列を有し、そのガイドＲＮＡはヒト免疫不全ウイルス内の標的配列に対し相補的である。いくつかの実施形態では、その核酸は発現ベクターの中に含まれる。１つの実施形態では、組成物はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペプチド、および１つ以上のガイドＲＮＡを含み、ここでそのガイドＲＮＡはヒト免疫不全ウイルス内の標的配列に対し相補的である。また、本明細書に開示される核酸、発現ベクターまたはポリペプチドを含む医薬組成物が提供される。また、本明細書ではＨＩＶ感染症を罹患するまたは罹患のリスクのある被験者の処置の方法が提供され、ここで処置の方法は被験者に処置的に有効な量のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび１つ以上のガイドＲＮＡをコードするベクターを含む組成物を投与するステップを含み、ここでガイドＲＮＡはヒト免疫不全ウイルス内の標的配列に対し相補的である。また細胞を、１つのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび１つ以上のガイドＲＮＡからなる遺伝子編集複合体をコードする単離核酸からなる組成物に露出させることによるヒト細胞内のレトロウイルスを不活性化する方法が提供され、ここでガイドＲＮＡはヒト免疫不全ウイルス内の標的配列に対し相補的である。その遺伝子編集複合体は１つ以上の変異をプロウイルスＤＮＡに導入する。いくつかの実施形態では、その変異は欠失を含み、それは全てのまたは実質的に全てのプロウイルスＤＮＡ配列を含んでもよい。もう１つ別の側面では、測定された量の本明細書に記載される組成物を含むキットがまた提供される。
【０００８】
１つまたはそれ以上の本発明の実施形態の詳細がそれに付随する図面および以下の記述により示される。本発明の他の特徴、目的および利点はそれら図面、記述および請求項により明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ−Ｄ】Ｃａｓ９／ＬＴＲ−ｇＲＮＡがＨＩＶ−１に潜伏感染したＣＨＭＥ５ミクログリア細胞におけるＨＩＶ−１レポーターウイルス産生を抑制することを示す図である。（Ａ）ＥＧＦＰフローサイトメトリーの代表的なゲーティング図は、安定的に発現されるＣａｓ９プラスＬＴＲ−Ａまたは−Ｂによる、潜伏ｐＮＬ４−３−ΔＧａｇ−ｄ２ＥＧＦＰのレポーターウイルスのトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）誘発性再活性化の劇的な減少を、空Ｕ６−駆動ｇＲＮＡ発現ベクター（Ｕ６−ＣＡＧ）に対して示す図である。（Ｂ）選択されたＬＴＲ−Ａ−または−Ｂを発現する安定的クローンからのＰＣＲ産物（ＬＴＲ内−４５３から＋４３まで）のＳＵＲＶＥＹＯＲ  Ｃｅｌ−Ｉヌクレアーゼ検定は、劇的なインデル変異パターン（矢印）を示す。（Ｃ、Ｄ）ＰＣＲ断片分析は、ＬＴＲ  ＡとＢの切断部位の間の１９０ｂｐ領域の正確な欠失を示し（図Ｄの矢頭および矢印）、３０６ｂｐの断片（図Ｃの矢印）を残し、それらはＴＡクローニングおよび配列決定の結果によって検証された。図１Ｄは、出現順に、それぞれ、配列番号１−３を開示する。
【図１Ｅ−Ｈ】（Ｅ−Ｇ）ＬＴＲ−Ａ／Ｂ安定クローンのサブクローニングは、ＥＧＦＰのフローサイトメトリーによって決定されるレポーター活性化の完全な喪失（Ｅ）とＥＧＦＰおよびＨＩＶ−１のＲｅｖ応答配列（ＲＲＥ）のためのゲノムＤＮＡの標準（Ｆ）およびリアルタイム（Ｇ）ＰＣＲ増幅によって検出されたｐＮＬ４−３−ΔＧａｇ−ｄ２ＥＧＦＰプロウイルスゲノムの除去、を明らかにする；βアクチンは、ＤＮＡ精製および負荷に対する対照である。（Ｈ）ＨＩＶ−１  ＬＴＲ  Ｕ３／Ｒ／Ｕ５領域（−４１１から＋１２９まで）をカバーするＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーを用いた、ＬＴＲ−Ａ／Ｂのサブクローン（＃８、１３）のＰＣＲ遺伝子型判定は、インデル（ａ、欠失；ｃ、挿入）および「無処置」または組み合わせＬＴＲ（ｂ）を示す。
【図２Ａ】Ｃａｓ９／ＬＴＲ−ｇＲＮＡが効率的にＵ１単球細胞から潜伏ＨＩＶ−１ウイルスを根絶することを示す。（Ａ）右、染色体のＸｐ１１．４におけるＨＩＶ−１ゲノム全体の切除を示す図である。ＨＩＶ−１の組込み部位は、ゲノムウォーカーリンクＰＣＲキットを用いて同定された。左、Ｘ染色体組込み部位隣接配列を標的とするプライマー対（Ｐ１／Ｐ２）を使用したＰＣＲ増幅産物の長さ分析は、２つの断片（８３３および６７０ｂｐ）を残した、ＨＩＶ−１ゲノム全体（９７０９ｂｐ）の消失を明らかにした。
【図２Ｂ−Ｃ】（Ｂ）ＬＴＲ断片（８３３ｂｐ）のＴＡクローニングおよび配列決定であり、宿主ゲノム配列（小文字、２２６ｂｐ）および、ＬＴＲ−Ａ標的部位周辺の２７−ｂｐの欠失（２番目の実線下線を引いた部分）を有する５´−ＬＴＲ（破線下線部分）及び、３´−ＬＴＲ（最初の実線下線部分）の部分配列（６３４−２７＝６０７ｂｐ）を示す。下部、１５個の配列決定されたクローンの増幅産物から識別される２つのインデル対立遺伝子。６７０ｂｐ断片は、宿主配列（２２６ｂｐ）及びＬＴＲ−ＡとＢの標的部位での同時切断による１９０ｂｐの切除後の残りのＬＴＲ配列（６３４−１９０＝４４４ｂｐ）からなる。下線付きの強調表示された配列はｇＲＮＡ  ＬＴＲ−Ａ標的部位とプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を示す。図２Ｂは、出現順に、それぞれ、配列番号４−１３を開示する。（Ｃ）は、ＬＴＲ−Ａ／Ｂ誘導ＨＩＶ−１ゲノム根絶の機能解析であり、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）／ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）再活性化誘導ｐ２４ウイルス粒子放出の実質的な阻害を示す。Ｕ１細胞はｐＸ２６０−ＬＴＲ−Ａ、−Ｂ、または−Ａ／Ｂを遺伝子導入された。２週間のピューロマイシン選択後、細胞はＴＳＡ（２５０ｎＭの）／ＰＭＡで２日間処理され、その後Ｐ２４のＧａｇ  ＥＬＩＳＡが実施された。
【図３】Ｃａｓ９プラスＬＴＲ−Ａ／Ｂの安定な発現が、ＴＺＭ−ｂｌ細胞を新たなＨＩＶ−１ウイルス感染に対してワクチン接種することを示している。（Ａ）抗Ｆｌａｇ抗体を用いた免疫細胞化学（ＩＣＣ）およびウエスタンブロット（ＷＢ）分析は、２週間ピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）選択された、ＴＺＭ−ｂｌ安定クローンにおけるＦｌａｇ−Ｃａｓ９の発現を確認した。（Ｂ）Ｃａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ安定クローン（ｃ１−ｃ７）のＰＣＲ遺伝子型決定は、ＬＴＲ切除とＬＴＲルシフェラーゼレポーター活性化の抑制との間の密接な相関関係を明らかにした。倍数変化は、対応する非誘発レベルに対するＴＳＡ／ＰＭＡ誘発レベルを表す。（Ｃ）安定的にＣａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂを発現する細胞（ｃ４）は、示される感染多重度（ＭＯＩ）で偽−ｐＮＬ４−３−Ｎｅｆ−ＥＧＦＰレンチウイルスを感染させられ、感染多重度はＥＧＦＰフローサイトメトリーにより感染２日後に測定された。（Ｄ）代表的位相コントラスト／蛍光顕微鏡写真は、ＬＴＲ−Ａ／Ｂ安定細胞が、ｐＮＬ４−３−ＡＥ−ＥＧＦＰ  ＨＩＶ−１レポーターウイルス（グレー）による新たな感染に抵抗性を示す（右パネル）が、対照細胞（Ｕ６−ＣＡＧ；黒）ではそうではない、ことを示す。
【図４】ヒトゲノム上のＣａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂのオフターゲット効果を示す図である。（Ａ）ＳＵＲＶＥＹＯＲ検定は、ヒトのＴＺＭ−ｂｌとＵ１細胞における予測される／潜在的なオフターゲット領域にはインデル変異がないことを示す。ＬＴＲ−Ａ標的領域（Ａ）はポジティブ対照として使用され、空Ｕ６−ＣＡＧベクター（Ｕ６）はネガティブ対照として使用された。（Ｂ−Ｄ）：ＬＴＲ−Ａ／Ｂ安定的ＴＺＭ−ｂｌサブクローンの全ゲノム配列決定であり、Ｕ６−ＣＡＧ対照およびＬＴＲ−Ａ／Ｂサンプルにおける、コールされたインデルの数（Ｂ）、両方のサンプルにおけるｇＲＮＡ標的部位の近くの１０個のコールされたインデルの詳細情報（Ｃ）、およびオフターゲットのコールされたインデルの分布（Ｄ）を示す。図４Ｃは、出現順に、それぞれ、配列ＩＤ番号１４−１５が開示されている。
【図５】ＴＡクローニング及びヒトＴＺＭ−ｂｌ細胞のゲノムＤＮＡからのＰＣＲ産物（−４１１から−１０）の配列決定により同定された、組み込みレンチウイルスＬＴＲ−ホタルルシフェラーゼレポーターのＬＴＲ  Ｕ３配列を示す図である。４つのｇＲＮＡ（ＬＴＲ−ＡからＤ）のプロトスペーサーとプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ（ＮＧＧ））配列、および示されている転写因子の予測結合部位が強調されている。正確な切断部位は、はさみで標識付けされている。＋１は、転写開始部位を示す。図５は、配列ＩＤ番号１６が開示されている。
【図６】ＬＴＲ−Ｃ及びＬＴＲ−Ｄが、ＣＨＭＥ５ミクログリア細胞において潜伏ｐＮＬ４−３−ΔＧａｇ−ｄ２ＥＧＦＰウイルスのＴＳＡ誘発性再活性化を著しく抑制することを示す図である。（Ａ）図は模式的にレポーター遺伝子ｄ２ＥＧＦＰと共に、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｅｎｖ、Ｖｐｕ、およびＮｅｆを含むｐＮＬ４−３−ΔＧａｇ−ｄ２ＥＧＦＰベクターを示す。（Ｂ）Ｃａｓ９／ＬＴＲ−Ｄの標的ＬＴＲゲノム内のインデル変異を示すが、Ｃａｓ９／ＬＴＲ−Ｃではインデル変異を示さない、ことを示すＳＵＲＶＥＹＯＲ検定である。（Ｃ）ＥＧＦＰのフローサイトメトリーの代表的なゲーティング図であって、空のＵ６駆動ｇＲＮＡ発現ベクター（Ｕ６−ＣＡＧ）と比較して、Ｃａｓ９／ＬＴＲ−ＣまたはＬＴＲ−Ｄの安定発現により、潜伏ｐＮＬ４−３−ΔＧａｇ−ｄ２ＥＧＦＰレポーターウイルスのＴＳＡ誘発性再活性化が劇的に減少することを示す。
【図７】ＨＩＶ−１  ＬＴＲ−ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定的に組み込んだＴＺＭ−ｂｌ細胞において、ＬＴＲ−Ｃ及びＬＴＲ−Ｄの両方がインデル変異を誘発し、そして構成的およびＴＳＡ／ＰＭＡ誘導ルシフェラーゼ活性を有意に減少させたことを示す図である。（Ａ）機能的ルシフェラーゼレポーター検定がＬＴＲ−Ｃ、ＬＴＲ−Ｄまたはその両方によってＬＴＲの再活性化が有意に減少することを明らかにした。（Ｂ）ＳＵＲＶＥＹＯＲ検定であり、ＬＴＲ−Ｃ及びＬＴＲ−Ｄによって誘発されるＬＴＲ  ＤＮＡ（−４５３から＋４３）中のインデル変異を示す（上矢印）。ＬＴＲ−ＣおよびＬＴＲ−Ｄの組み合わせは、ＬＴＲ−ＣおよびＬＴＲ−Ｄとの間の３０２ｂｐの領域の欠失に起因する１９４ｂｐ断片（下部矢印）を生成する。（Ｃ、Ｄ）３０個のクローンのサンガー配列決定は、ＬＴＲ−Ｃに対するインデル効率を２３％、そしてＬＴＲ−Ｄに対するインデル効率を１３％と評価し、そして例示的クロマトグラムは挿入／削除を示す。図７Ｃは、出現順に、それぞれ、配列ＩＤ番号１７−２５を開示する。図７Ｄは、出現順に、それぞれ、配列ＩＤ番号２６−３０を開示する。（Ｅ）ＬＴＲの−４５３から＋４３までをカバーするＰＣＲ産物の５部位（９６、１０２、３７２、３８６、４８２）を切断するためにＢｓａＪを用いた、ＰＣＲ−制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析は、Ｕ６−ＣＡＧ対照試料中に２つの主要なバンドを示し（９６ｂｐ、２７０ｂｐ）、しかし９６／１０２部位におけるＬＴＲ−Ｃ誘発インデル変異後の３７２ｂｐバンド（上の矢印）、３７２部位におけるＬＴＲ−Ｄ誘発インデル変異後の２９０ｂｐバンド（中央の矢印）、およびＬＴＲ−Ｃ／Ｄ誘導切除後の１８０ｂｐ断片（下の矢印）を追加で示した。（Ｆ）事例的クロマトグラムであり、ＬＴＲ−Ｃ及びＬＴＲ−Ｄの間の３０２ｂｐ断片の欠失（上）と、追加の１７ｂｐの欠失（底部）を示す。赤い矢印は、接合部位を示す。＊  Ｐ  ＜０．０５はＵ６−ＣＡＧ対照と比較してＬＴＲ−ＣまたはＬＴＲ−Ｄ媒介ルシフェラーゼ活性の有意な減少を示す。図７Ｆは、出現順に、それぞれ、配列ＩＤ番号３１−３２を開示する。
【図８】ＨＩＶ−１  ＬＴＲ  Ｕ３／Ｒ／Ｕ５領域（−４１１から＋１２９まで）をカバーするプライマーを用いてＬＴＲ−Ａ／Ｂと空Ｕ６−ＣＡＧ対照のＣＨＭＥ５サブクローンからのＰＣＲ産物のＴＡクローニングとサンガー配列決定を示す図である。（Ａ）５´および３´両方のＬＴＲ上のＬＴＲ−Ａ及びＬＴＲ−Ｂカットの可能な組み合わせが、示されるようにａ−ｃの潜在的断片を生成する。（Ｂ）断片ａ（３５１ｂｐ）のブラスト図であり、ＬＴＲ−ＡとＬＴＲ−Ｂ切断部位の間の１９０ｂｐの欠失を示す。（Ｃ）断片ｃ（６８２ｂｐ）のブラスト図であり、ＬＴＲ−Ａ切断部位での１７５ｂｐの挿入及びＬＴＲ−Ｂ切断部位での２７ｂｐの欠失を示す。図８Ｃは、出現順にそれぞれ、配列ＩＤ番号３３−３４を開示する。
【図９】Ｃａｓ９／ＬＴＲ−ｇＲＮＡが効率的にＵ１単球細胞から潜伏ＨＩＶ−１ウイルスを根絶することを示す図である。（Ａ）２番染色体の組み込み部位−隣接配列（小文字、４６７ｂｐ）を標的とするプライマーペア（Ｔ４９２／Ｔ４９３）を使用した、ロングレンジＰＣＲからの１．１ｋｂ断片のサンガー配列決定は、ＨＩＶ−１ゲノム（９７０９ｂｐ）全体を除去し、ＰＡＭ（ＴＧＧ）ＬＴＲ−Ａ標的サイト（下線部分）から正確に３番目のヌクレオチドにおける６ｂｐの挿入（箱入り）、および４ｂｐの欠失（ｎｎｎｎ）を有する５´ＬＴＲ（破線の下線部分）と３´ＬＴＲの組み合わせを残す、ことを明らかにした。図９Ａは、配列ＩＤ番号３５を開示する。（Ｂ）代表的なＤＮＡゲル画像であり、ＨＩＶ−１ゲノムの特異的根絶を示す。ＮＳは非特異的バンドを意味する。（Ｃ，Ｄ）Ｇａｇ遺伝子を標的とするプライマー対（Ｔ４５７／Ｔ４５８）を用いた定量的ＰＣＲ分析であり、Ｃａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ発現Ｕ１細胞における全ＨＩＶ−１ゲノム根絶の８５％の効率を示す。Ｕ１細胞はｐＸ２６０空ベクター（Ｕ６−ＣＡＧ）またはＬＴＲ−Ａ／Ｂコード化ベクターで遺伝子導入された。２週間のピューロマイシン選択後に、細胞のゲノムＤＮＡは、標準としてスパイクｐＮＬ４−３−ΔＥ−ＥＧＦＰヒトゲノムＤＮＡを用いた、絶対定量ＰＣＲ分析のために使用された。  ＊＊Ｐ＜０．０１は、Ｕ６−ＣＡＧ対照と比較して有意の減少を示した。
【図１０】Ｃａｓ９／ＬＴＲ  ｇＲＮＡが効果的にＪ−Ｌａｔ潜伏感染Ｔ細胞におけるＨＩＶ−１プロウイルスを根絶することを示す図である。（Ａ）ＥＧＦＰフローサイトメトリーによる機能解析は、ＥＧＦＰレポーターウイルスのＰＭＡおよびＴＮＦα誘発性再活性化の約５０％の減少を明らかにする。（Ｂ）ＳＵＲＶＥＹＯＲ検定はＣａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ遺伝子導入細胞の標的ＬＴＲゲノム中のインデル変異（矢印）を示す。Ｊ−Ｌａｔ細胞はｐＸ２６０空ベクターまたはＬＴＲ−Ａおよび−Ｂで遺伝子導入された。２週間のピューロマイシン選択後、細胞はＰＭＡまたはＴＮＦαで２４時間処理された。ゲノムＤＮＡは、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ  Ｕ３／Ｒ／Ｕ５領域（−４１１から＋１２９）をカバーするプライマーを用いたＰＣＲに供され、そしてＳＵＲＶＥＹＯＲ検定が行われた。  ＊＊Ｐ＜０．０１はＵ６−ＣＡＧ対照と比較して有意な減少を示す。（Ｃ）ＨＩＶ−１  ＬＴＲ（−３７４から＋４３）をカバーするプライマーを使用したＰＣＲフラグメント分析であって、２２７ｂｐの断片（矢印）を残した、ＬＴＲ  ＡとＢの切断部位の間の１９０ｂｐの領域の正確な欠失を示す。ハウスキーピング遺伝子βアクチンは、ＤＮＡ精製および負荷対照として機能する。
【図１１】ゲノム編集効率がＣａｓ９とｇＲＮＡｓの存在に依存することを示す図である。（Ａ、Ｂ）ＰＣＲ遺伝子型決定は、ゲノム編集の徴候のないピューロマイシン選択ＴＺＭ−ＢＬサブクローンにおいて、Ｕ６駆動ＬＴＲ−ＡまたはＬＴＲ−Ｂ発現カセットの不存在（Ａ）、およびＣＭＶ駆動Ｃａｓ９  ＤＮＡの不存在／減少（Ｂ）を明らかにした。示されたサブクローンからのゲノムＤＮＡは、Ｕ６プロモーター（Ｔ３５１）およびＬＴＲ−Ａ（Ｔ３５４）または−Ｂ（Ｔ３５６）をカバーし、そしてＣａｓ９を標的とするプライマー対（Ｔ４７７／Ｔ４９１）を使用する、従来型（Ａ）またはリアルタイム（Ｂ）のＰＣＲ分析に供された。（Ｃ、Ｄ）Ｃａｓ９タンパク質発現は無効性ＴＺＭ−ｂｌサブクローンには存在しない。Ｆｌａｇ標識付きＣａｓ９融合タンパク質が、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット（ＷＢ）および免疫細胞化学（ＩＣＣ）によって検出された。フラグ−Ｃａｓ９を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株が、ＷＢ（Ｃ）のためのポジティブ対照として使用された。ＧＡＰＤＨは、タンパク質負荷対照として機能する。クローンｃ６はＣａｓ９のＤＮＡを含むが、Ｃａｓ９タンパク質発現を有しない、そのことは、ピューロマイシン選択後のエピジェネティックな抑圧の潜在的なメカニズムを示唆した。クローンｃ５、ｃ３は切り詰め型フラッグＣａｓ９（ｔＣａｓ９）を表してもよい。核はヘキスト３３２５８で染色された（Ｄ）。
【図１２】ＴＺＭ−ｂｌ細胞におけるＣａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡの安定的発現が、偽型または天然のＨＩＶ−１ウイルスに対してワクチン接種することを示す図である。（Ａ）フローサイトメトリーであって、Ｃａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ発現ＴＺＭ−ｂｌサブクローンにおいて、天然ｐＮＬ４−３−ΔＥ−ＥＧＦＰレポーターウイルス感染効率の有意な減少を示す。（Ｂ、Ｃ）リアルタイムＰＣＲ分析であって、Ｃａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡｓによるウイルスＲＮＡ（Ｂ）及びＤＮＡ（Ｃ）の抑制または除去を明らかにする。（Ｄ）ホタルルシフェラーゼ発光検定であって、Ｃａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡｓによるウイルス感染−刺激ＬＴＲプロモーター活性の劇的な阻害を示す。安定的にＣａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡを発現するＴＺＭ−ｂｌ細胞は、示された天然ＨＩＶ−１ウイルスで２時間感染させられ、そしてＰＢＳで２回洗浄された。感染後２日目に、細胞は回収され、固定され、そしてＥＧＦＰ発現のためのフローサイトメトリーによって分析され（Ａ）、または総ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ｑＰＣＲのために溶解され（Ｂ）、定量ＰＣＲのためにゲノムＤＮＡ精製され（Ｃ）、そして、発光測定された（Ｄ）。＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１は、Ｕ６−ＣＡＧ対照と比較して有意な減少を示す。
【図１３】予測されるＬＴＲ  ｇＲＮＡとそのオフターゲット数（１００％一致）を示す。ｐＨＲ´−ＣＭＶ−ＬａｃＺのレンチウイルスベクター（ＡＦ１０５２２９）の５´−ＬＴＲセンス配列およびアンチセンス配列（それぞれ配列ＩＤ番号７９−１１１および１１２から１４１）（６３４ｂｐ）が、Ｊａｃｋ  ＬｉｎのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｇＲＮＡファインダーツール（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｏｔ．ｃｏｌｏｒａｄｏ．ｅｄｕ／〜ｓｌｉｎ／ｃａｓ９．ｈｔｍｌ）を使用して、２０ｂｐのガイド配列（プロトスペーサー）プラスプロトスペーサー隣接モチーフ配列（ＮＧＧ）を含むＣａｓ９／ｇＲＮＡ標的部位を検索するために使用された。それぞれのｇＲＮＡプラスＮＧＧ（ＡＧＧ、ＴＧＧ、ＧＧＧ、ＣＧＧ）が表示されている１０００個の整列された配列を有する利用可能なヒトゲノムと転写産物配列に対してブラストされた。コントロール＋Ｆを押した後、標的配列（１−２３から９−２３まで）をコピー／ペーストし、そして１００％一致するゲノム標的の数を見つける。それぞれの検索に対するオフターゲットの数は、繰り返されたゲノムライブラリーに起因して３で除した。示した数は４回の検索（ＮＧＧ）の合計を示す。トップの数値（例えば、ｇＲＮＡ配列（センス）に対して：２０、１９、１９、１７、１６、１５、１４、１３、１２）はＮＧＧから最も遠いｇＲＮＡ標的配列を示す。選択されたＬＴＲ−Ａ／Ｂ及びＬＴＲ−Ｃ／Ｄのための配列およびオフターゲット数はそれぞれ赤と緑で強調表示されている。
【図１４】ＰＣＲと配列決定のために使用されるｇＲＮＡ標的部位用のオリゴヌクレオチドおよびプライマー（出現順に、それぞれ、配列ＩＤ番号３６−７８）を示す図である。
【図１５−１】ＬＴＲ−Ａ及びＬＴＲ−Ｂの予測されるｇＲＮＡ標的部位の位置を示し、そして「ｑｕｅｒｙ  Ｓｅｑ」配列を配列ＩＤ番号１４２−２５２として、「ｒｅｆ  Ｓｅｑ」を配列ＩＤ番号２５３−３６３として、出現順にそれぞれ開示する図である。
【図１５−２】図１５−１の続きである。
【図１６】ＨＩＶ−１  ＬＴＲホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定的に組み込まれたＴＺＭＢＩ細胞において、ＬＴＲ−Ｃ及びＬＴＲ−Ｄの両方が、構成的およびＴＳＡ／ＰＭＡ誘導ルシフェラーゼ活性を減少させ、そしてＬＴＲ−Ｃ及びＬＴＲ−Ｄの組み合わせが正確なゲノムの切除を誘発したことを示す図である。６つのｇＲＮＡ標的が、ＨＩＶ−ＬＴＲのプロモーター領域に対して設計された（図１６Ａ）。図１６Ａは、配列ＩＤ番号１６を開示する。ＴＺＭ細胞はリポフェクタミン２０００によりＣａｓ９−ＥＧＦＰおよびキメラｇＲＮＡ発現カセット（ＰＣＲ産物）を共導入された。３日後、ＥＧＦＰポジティブ細胞がＦＡＣＳを通して選別され、グループあたり２０００個の細胞がルシフェラーゼ検定用に収集された（図１６Ｂ）。図１６Ｂは、配列ＩＤ番号３１を開示する。選別された細胞集団は２日間培養され、そしてＴＳＡ／ＰＭＡで１日間処理され、その後ルシフェラーゼ検定に供された（図１６Ｃ）。単一細胞は９６ウェルプレートにソートされ、ＴＳＡ／ＰＭＡの不存在下（図１６Ｄ）または存在下（図ＩＥ）で、ルシフェラーゼ検定のために集密まで１日間培養された。集団ソートされた細胞からのＰＣＲ産物はサーベイヤＣｅｌ−Ｉヌクレアーゼ検定で分析され（図１６Ｆ）、制限断片長多型がＢｓａｊＩで分析され（図１６Ｇ）、変異（図１６Ｆ）、または未切断（図１６Ｇ）バンド（赤矢印）を示す。予想されたＬＴＲ−ＣとＬＴＲ−Ｄとの間の３２１ｂｐ領域の欠失（図１６Ａ、赤い矢頭）の結果から生じる２００ｂｐ断片（図１６Ｆ、１６Ｇ、黒い矢印）が、正確なゲノム切除を示すＴＡクローニングおよび配列決定により検証された（図１６Ｈ）。個々のＬＴＲ−Ｃおよび−ＤからのＰＣＲ産物のサンガー配列決定は、それぞれ％および％インデル変異効率を同定した（図１６）。＊ｐ＜０．０５は、対応するＵ６−ＣＡＧ対照と比較して、スチューデントのｔ検定を用いて統計学的に有意な減少を示す。プロトスペース（Ｅ）、プロトスペース（Ｃ）、プロトスペース（Ａ）、プロトスペース（Ｂ）、プロトスペース（Ｄ）、及びプロトスペース（Ｆ）は、それぞれ、出現順に配列ＩＤ番号３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、及び３７５に対応する。
【図１７Ａ−Ｅ】Ｃａｓ９／ＬＴＲ−ｇＲＮＡが、ＨＩＶ−１潜伏感染ＣＨＭＥ５ミクログリア細胞株において、ＥＧＦＰのフローサイトメトリーによって測定されるＨＩＶ−１ウイルスの構成的および誘導的産生を抑制することを示す図である。レポーター遺伝子ｄ２ＥＧＦＰを有する、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｅｎｖ、Ｖｐｕ、およびＮｅｆを含むｐＨＲ´レンチウイルスベクターは、ヒト胎児ミクログリア細胞株ＣＨＭＥ５の中へ形質導入され、そして３´−ＬＴＲのＵ３領域内の４００ｂｐの欠失が示される（図１７Ａ）。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡの一過性遺伝子導入の後、ヒトＨＩＶ−１  ＬＴＲ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは、単独で、または組み合わせで強度を減少させたが、しかしＥＧＦＰ細胞の割合はＬＴＲプロモーター活性の抑制に起因して減少しなかった（図１７Ｂ、１７Ｃ）。１−２週間の構成物質選択の後、ＥＧＦＰ細胞の割合も減少した（図１７Ｄ、１７Ｅ）。
【図１７Ｆ−Ｈ】安定した選択されたクローンからのＰＣＲ産物は、サーベイヤＣｅｌ−Ｉヌクレアーゼ検定を用いて分析され（図１７Ｆ）、その結果はＬＴＲ−Ａ及びＬＴＲ−Ｂにおける劇的なインデル変異を示したが、しかし、ＬＴＲ−Ａ／Ｂの組み合わせでは弱かった（赤矢印）。予測されたＬＴＲ−Ａ及びＬＴＲ−Ｂ間の１９０ｂｐ領域の欠失（図１７Ｈ、赤い矢印）に起因する３３１ｂｐ断片（図１７Ｆ、１７Ｇ、黒い矢印）は、正確なゲノム切除を示すＴＡクローニングおよび配列決定により検証された（図１７Ｈ）。図１７Ｈは、出現順に、それぞれ、配列ＩＤ番号１−３を開示する。
【図１８】代表的ＨＩＶ−１配列（配列ＩＤ番号：３７６）のＬＴＲを示す図である。Ｕ３領域はヌクレオチド１からヌクレオチド４３２まで延び（配列ＩＤ番号：３７７）、Ｒ領域はヌクレオチド４３２からヌクレオチド５５９まで延び（配列ＩＤ番号：３７８）、そしてＵ５領域はヌクレオチド５６０からヌクレオチド６４４まで延びる（配列ＩＤ番号：３７９）。
【図１９】代表的ＳＩＶ配列（配列ＩＤ番号：３８０）のＬＴＲを示す図である。Ｕ３領域はヌクレオチド１からヌクレオチド５１７まで延び（配列ＩＤ番号：３８１）、Ｒ領域はヌクレオチド５１８からヌクレオチド６９３まで延び（配列ＩＤ番号：３８２）、そしてＵ５領域はヌクレオチド６９４からヌクレオチド８１８まで延びる（配列ＩＤ番号：３８３）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は部分的に、我々がＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼシステム（Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ）を単一または多重の構成において使用して、ＨＩＶ−１感染細胞からの組み込みＨＩＶ−１ゲノムを除去することができたという我々の発見に基づいている。我々はＨＩＶ−１のＬＴＲ  Ｕ３領域において高度に特異的な標的を識別し、その標的はＣａｓ９／ｇＲＮＡにより効率的に編集され、潜伏感染したミクログリア、前単球およびＴ細胞においてウイルスの遺伝子発現および複製を不活性化した。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡは宿主細胞に対して遺伝子毒性も標的外編集も引き起こさず、そして５´から３´ＬＴＲにおよぶ組み込みプロウイルスＤＮＡの９７０９ｂｐフラグメントを完全に切除した。さらにＣａｓ９発現細胞内の多重ｇＲＮＡの存在はＨＩＶ−１感染を防止した。われわれの結果はＣａｓ９／ｇＲＮＡが、ＡＩＤＳに対する特異的、効果的、予防的そして処置的なアプローチを提供するように設計できることを示唆した。
【００１１】
従って、本発明はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび、レトロウイルス例えばＨＩＶ内の標的配列に対し相補的である１つのガイドＲＮＡをコードする１つの核酸配列を有する組成物、およびＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびＨＩＶ内の標的配列に対し相補的である１つのガイドＲＮＡをコードする１つの核酸配列を有する医薬製剤を特徴とする。またＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペプチドおよびＨＩＶ内の標的配列に対し相補的である１つのガイドＲＮＡを有する組成物、およびＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペプチドおよびＨＩＶ内の標的配列に対し相補的である１つのガイドＲＮＡを有する医薬製剤も特徴とする。
【００１２】
またレトロウイルス感染、例えばＨＩＶ感染を処置するためにその組成物を投与する方法、ウイルス複製を根絶する方法、およびＨＩＶ感染を防止する方法も特徴とする。本明細書に記載される処置的方法は他の抗レトロウイルス処置法（例えば、高活性抗レトロウイルス療法ＨＡＡＲＴ）に関連して実施可能である。
【００１３】
ＨＩＶ感染の臨床経過は被験者の遺伝的背景、年齢、全般的健康状態、栄養状態、処置履歴、およびＨＩＶサブタイプを含む多くの要因によって変化しうる。一般的にほとんどの個人は感染から２−３週間または数カ月のうちに風邪に似た徴候を発症する。徴候は、熱、頭痛、筋肉痛、発疹、寒気、のどの痛み、口内炎または陰部潰瘍、リンパ腺腫大、関節痛、寝汗、および下痢を含むことができる。徴候の強さは個人によってマイルドからシビアまで変化し得る。急性期の間ＨＩＶウイルス粒子は適切なＣＤ４受容体分子を発現する細胞に引き寄せられそして侵入する。一度ウイルスが宿主細胞に入ってしまうと、ＨＩＶコード化逆転写酵素がＨＩＶ  ＲＮＡのプロウイルスＤＮＡのコピーを生成し、そしてそのプロウイルスＤＮＡはその宿主細胞の遺伝子ＤＮＡに組み込まれる。宿主細胞により複製されるのはこのＨＩＶプロウイルスであり、その結果新しいＨＩＶウイルス粒子の放出となり、その新しいウイルス粒子はその後他の細胞に感染できる。本発明の方法および組成物は組み込まれたＨＩＶプロウイルスＤＮＡの切除に全般的にそして種々に有用であるが、しかし本発明はそれだけに限定されず、そして組成物は任意の感染期の被験者に、またはＨＩＶ感染のリスクを有する未感染被験者に投与されてもよい。
【００１４】
最初のＨＩＶ感染は２−３週間から２−３カ月の間に沈静し、そしてその後一般的に長い臨床的「潜伏」期に繋がり、それは長ければ１０年におよぶ。潜伏期はまた無症候性ＨＩＶ感染または慢性ＨＩＶ感染とも呼ばれる。被験者のＣＤ４リンパ数はリバウンドするが、しかし感染前のレベルには至らず、そして殆どの被験者は感染から２−４週間以内に抗体陽転となる、即ち血液内に検知可能レベルの抗ＨＩＶ抗体を持つ。この潜伏期の間、末梢血単核細胞内では検知可能なウイルスの複製はありえず、そして末梢血内には殆どまたは全く培養可能なウイルスが存在しえない。臨床潜伏ステージとも呼ばれる潜伏期の間、ＨＩＶに感染した人々はＨＩＶ関連の徴候を経験しないか、してもマイルドな徴候のみ経験する。しかし、ＨＩＶウイルスは非常に低レベルで再生産し続ける。抗レトロウイルス処置を受けた被験者では。この潜伏期は数十年間またはそれ以上に延長する。しかしこの潜伏期の被験者は、たとえ抗レトロウイルス処置を受けていても、抗レトロウイルス処置が伝染のリスクを減少させるものの、他人にＨＩＶを伝染させる能力がある。上記のように抗レトロウイルス処置は低レベルのウイルスゲノム発現を抑制せず、また休止中のメモリＴ細胞、脳内マクロファージ、ミクログリア、アストロサイト、および腸管関連リンパ細胞などの潜伏感染した細胞を効率的に標的としない。
【００１５】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の臨床的徴候および症状は、ＣＤ４リンパ数の減少として現れ、それは結果的に免疫システムに不可逆的損傷を与える。多くの患者がエイズ関連合併症を示し、それらは例えば、結核、サルモネラ症、サイトメガロウイルス、カンジダ症、クリプトコッカス髄膜炎、トキソプラズマ症およびクリプトスポリジウム症などの日和見感染；および例えばカポジ肉腫およびリンパ腫を含むある種の癌；および消耗症候群、神経性合併症およびＨＩＶ関連腎障害を含む。
【００１６】
（組成物）
本発明の組成物はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ例えばＣａｓ９およびレトロウイルス、例えばＨＩＶ内の標的配列に対し相補的である１つのガイドＲＮＡをコードする１つの核酸配列を有する。バクテリアでは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座は、可動遺伝要素（ウイルス、転位因子および接合性プラスミド）に対するＲＮＡガイド適応性免疫システムをコードする。ＣＲＩＳＰＲシステムの３つのタイプ（Ｉ−ＩＩＩ）はすでに識別されている。ＣＲＩＳＰＲクラスターはスペーサーを有し、その配列は前駆可動要素に相補的である。ＣＲＩＳＰＲクラスターは転写されそして成熟ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセスされる。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼのＣａｓ９はタイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに属し、そして標的ＤＮＡを切断する強いエンドヌクレアーゼ活性を有する。Ｃａｓ９は、約２０塩基対（ｂｐ）のユニークな標的配列（スペーサーと呼ばれる）および、ｃｒＲＮＡ前駆体のリボヌクレアーゼＩＩＩ補助プロセシングに対するガイドとして機能する、トランス活性化低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む、成熟ｃｒＲＮＡによりガイドされる。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的ＤＮＡ上の相補的配列（プロトスペーサーと呼ばれる）の間の相補的対形成を介して、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに向ける。Ｃａｓ９は切断部位（ＰＡＭから３番目のヌクレオチド）を特定するためにトリヌクレオチド（ＮＧＧ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは別々に発現され、または天然ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣するため合成ステムループを介して人工的融合小分子量ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に操作されてもよい。ｓｇＲＮＡは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のように、直接ＲＮＡ遺伝子導入のために合成され、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写され、またはＵ６またはＨ１プロモートＲＮＡ発現ベクターから発現される。しかし人工的ｓｇＲＮＡの切断効率はｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡが別々に発現されるシステムの効率に比べて低い。
【００１７】
本発明の組成物はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼでありうる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは野生型化膿連鎖球菌配列と同一のヌクレオチド配列を持ち得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは他の種類からの配列、例えば、緑膿菌、大腸菌、または他の配列決定された細菌のゲノムと古細菌、または他の原核微生物などの他の連鎖球菌種からの配列でありうる。あるいは、野生型膿連鎖球菌Ｃａｓ９配列は修飾されることができる。核酸配列は、哺乳動物細胞における効率的な発現のためにコドン最適化、すなわち「ヒト化」することができる。ヒトＣａｓ９ヌクレアーゼ配列は、例えばＧｅｎｂａｎｋアクセス番号ＫＭ０９９２３１．１  ＧＬ６６９１９３７５７；またはＫＭ０９９２３２．１  ＧＬ６６９１９３７６１；またはＫＭ０９９２３３．１  ＧＬ６６９１９３７６５に記載される発現ベクターのいずれかによりコードされるＣａｓ９ヌクレアーゼ配列であり得る。あるいは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、例えばＡｄｄｇｅｎｅ（ケンブリッジ、ＭＡ）からのＰＸ３３０またはＰＸ２６０など商業的に入手可能なベクター内に含まれる配列でありうる。
【００１８】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＫＭ０９９２３１．１  ＧＬ６６９１９３７５７；またはＫＭ０９９２３２．１  ＧＬ６６９１９３７６１；またはＫＭ０９９２３３．１  ＧＬ６６９１９３７６５の任意のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ配列の変異体またはフラグメント、またはＰＸ３３０またはＰＸ２６０（Ａｄｄｇｅｎｅ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）のＣａｓ９アミノ酸配列でありうる。Ｃａｓ９ヌクレオチド配列はＣａｓ９の生物学的に活性な変異体をコードするように修飾されることができ、これらの変異体は一つまたはそれ以上の変異（例えば、付加、欠失、置換変異またはそれら変異の組合せ）を含むことに起因して、例えば野生型Ｃａｓ９と異なるアミノ酸配列を持つことができ、または含むことができる。１つまたはそれ以上の置換変異は、１つの置換（例えば、保存的アミノ酸置換）でありうる。例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドの生物学的に活性な変異体は、野生型Ｃａｓ９ポリペプチドに対して少なくともまたは約５０％の配列相同性（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性）を有するアミノ酸配列を有することができる。
【００１９】
保存的アミノ酸置換は、典型的には、以下のグループ内の置換を含む：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリンとスレオニン；リジン、ヒスチジンおよびアルギニン；およびフェニルアラニンおよびチロシン。Ｃａｓ９アミノ酸配列中のアミノ酸残基は、非天然起源アミノ酸残基であることができる。天然起源アミノ酸残基は、遺伝子コードにより自然にコードされるもの、ならびに非標準アミノ酸を含む（例えば、Ｌ−配置の代わりにＤ−配置を有するアミノ酸）。本発明のペプチドはまた、標準的な残基の修飾バージョンのアミノ酸残基（例えば、ピロロリジンは、リジンの代わりに使用することができ、そしてセレノシステインはシステインの代わりに使用することができる）を含みうる。非天然起源アミノ酸残基は、天然に見出されていないものであるが、それは、アミノ酸の基本式に適合し、そしてペプチドに組み込まれうる。これらは、Ｄ−アロイソロイシン（２Ｒ、３Ｓ）−２−アミノ−３−メチルペンタン酸およびＬ−シクロペンチルグリシン（Ｓ）−２−アミノ−２−シクロペンチル酢酸を含む。他の例については、教科書またはワールドワイドウェブ（１つのサイトが現在、カリフォルニア工科大学によって維持され、成功裏に機能性タンパク質に組み込まれている非天然起源アミノ酸の構造を表示している）を参照することができる。
【００２０】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は変異配列でありうる。例えばＣａｓ９ヌクレアーゼは、ストランド特異的切断に関与している保存されたＨＮＨとＲｕｖＣドメインにおいて変異可能である。例えば、ＲｕｖＣ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニン（Ｄ１０Ａ）への変異は、Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体（Ｃａｓ９ｎ）が、一本鎖切断を得るためにＤＮＡを切断するよりも切れ目を入れることを許容し、そしてその後のＨＤＲを通じた優先的修理は、標的外の二本鎖の切断からの不要なインデル変異の頻度を潜在的に減らすことができる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、上記の任意の核酸配列によってコードされるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペプチドを含むことができる。典型的には様々な大きさのペプチド配列を指すが、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用される。我々は、本発明のアミノ酸ベースの組成物を、アミノ酸残基の線状ポリマーであることを伝えるために、そして完全長タンパク質と区別するために、「ポリペプチド」と呼ぶことがある。本発明のポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの断片を「構成し」または「含む」ことができ、そして本発明はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの生物学的に活性な変異体を構成し、または含むポリペプチドに及ぶ。したがってポリペプチドがＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（またはその生物学的に活性な変異体）の１つの断片のみを含むことができ、しかし追加の残基を含むかもしれないことは理解されるであろう。生物学的に活性な変異体は、標的ＤＮＡを切断するために十分な活性を保持する。
【００２２】
アミノ酸残基間の結合は、従来のペプチド結合、または別の共有結合（例えば、エステル又はエーテル結合など）でありえ、そしてポリペプチドはアミド化、リン酸化またはグリコシル化によって修飾されうる。修飾は、ポリペプチド骨格および／または１つ以上の側鎖に影響を与えうる。化学修飾は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳後にインビボで行われる天然起源の修飾（例えば細菌宿主における、グリコシル化）、またはインビボで行われる合成修飾でありうる。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの生物学的に活性な変異体は、天然起源（すなわち、インビボで自然に行われる）および合成修飾（すなわち、インビトロで行われた天然または非天然の修飾）の任意の組み合わせからから生じる１つまたはそれ以上の構造的修飾を含むことができる。修飾の例としては、これらに限定されないが、アミド化（例えば、アミノ基によるＣ末端の遊離カルボキシル基の置換）；ビオチン化（例えば、ビオチン分子によるリジンまたは他の反応性アミノ酸残基のアシル化）；グリコシル化（例えば、糖タンパク質または糖ペプチドを生成するための、アスパラギン、ヒドロキシリジン、セリンまたはトレオニン残基のいずれかに対するグリコシル基の付加）；アセチル化（例えば、アセチル基の付加、通常はポリペプチドのＮ末端に）；アルキル化（例えば、アルキル基の付加）；イソプレニル化（例えば、イソプレノイド基の付加）；リポイル化（例えば、リポ酸塩部分の付加）；およびリン酸化（例えば、セリン、チロシン、トレオニン又はヒスチジンへのリン酸基の付加）を含む。
【００２３】
生物学的に活性な変異体中の１つ以上のアミノ酸残基は、非天然起源のアミノ酸残基でありうる。天然起源のアミノ酸残基には、遺伝子コードにより自然にコードされたもの、ならびに非標準アミノ酸（例えばＬ−配置の、代わりにＤ配置を有するアミノ酸）を含む。本発明のペプチドはまた、標準的な残基の修飾バージョンのアミノ酸残基（例えば、ピロロリジンは、リジンの代わりに使用することができ、そしてセレノシステインはシステインの代わりに使用することができる）を含むことができる。非天然起源アミノ酸残基は、天然に見出されていないものであるが、それは、アミノ酸の基本式に適合し、そしてペプチドに組み込まれうる。これらは、Ｄ−アロイソロイシン（２Ｒ、３Ｓ）−２−アミノ−３−メチルペンタン酸およびＬ−シクロペンチルグリシン（Ｓ）−２−アミノ−２−シクロペンチル酢酸を含む。他の例については、教科書またはワールドワイドウェブ（１つのサイトが現在、カリフォルニア工科大学によって維持され、正常に機能性タンパク質に組み込まれている非天然起源アミノ酸の構造を表示している）を参照することができる。
【００２４】
あるいはまたはそれに加えて、生物学的に活性な変異体における一つ以上のアミノ酸残基は、野生型配列中の対応する位置に見出される天然起源残基とは異なる、天然起源残基でありうる。換言すれば、生物学的に活性な変異体は、一つ以上のアミノ酸置換を含みうる。我々は、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失を野生型配列の変異と呼ぶことがある。上述のように、置換は、天然起源アミノ酸残基を非天然起源残基または単に異なる天然起源アミノ酸残基と置換することができる。さらに置換は、保存的または非保存的置換から構成されうる。保存的アミノ酸置換は、典型的には、以下のグループ内の置換を含む：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリンとスレオニン；リジン、ヒスチジンおよびアルギニン；およびフェニルアラニンおよびチロシン。
【００２５】
ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの生物学的に活性な変異体であるポリペプチドは、その配列が、対応する野生型ポリペプチドと類似または同一である程度の観点から特徴付けることができる。例えば、生物学的に活性な変異体の配列は、野生型ポリペプチド中の対応する残基の少なくとも又は約８０％同一でありうる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの生物学的に活性な変異体は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼまたはそのホモログまたはオルソログに対して、少なくとも約８０％の配列相同性（例えば、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性）を有することができる。
【００２６】
ＣＲＩＳＰＲ関連酵素ポリペプチドの生物学的に活性な変異体は、本発明の方法において有用であるために十分な生物学的活性を保持する。生物学的に活性な変異体は、標的ＤＮＡの切断において機能するために十分な活性を保持する。生物学的活性は、当業者に公知の方法で評価され、そしてそれは、限定されないがインビトロ切断検定または機能検定を含むことができる。
【００２７】
ポリペプチドは、例えば、組換え技術または化学合成を含む種々の方法によって生成されうる。一旦生成されると、ポリペプチドは当技術分野で周知の手段によって任意の所望の程度まで単離しそして精製することができる。例えば、逆相（好ましくは）または順相ＨＰＬＣなどの後に凍結乾燥を使用することができ、または、セファデックスＧ−２５のような多糖類ゲル培地上でのサイズ排除または分配クロマトグラフィーを使用することが出来る。最終的なポリペプチドの組成は、標準的な手段によるペプチドの分解後のアミノ酸分析によって、アミノ酸配列決定により、またはＦＡＢ−ＭＳ技術によって確認してもよい。ポリペプチドのアミノ基の酸の塩、エステル、アミド、およびＮ−アシル誘導体を含む塩は、当技術分野で公知の方法を用いて調製することができ、そしてそのようなペプチドは、本発明の文脈において有用である。
【００２８】
本発明の組成物は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列を含み、それはレトロウイルス中の標的配列に相補的な配列を含む。レトロウイルスは、レンチウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、またはウシ免疫不全ウイルスでありえる。ヒト免疫不全ウイルスは、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２でありうる。標的配列は、任意のＨＩＶ、例えばＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２からの配列、およびそれらの任意の循環組換え型を含むことができる。ＨＩＶの遺伝的多様性は上述の多重のグループおよびサブタイプに反映されている。ＨＩＶ配列のコレクションはロスアラモスＨＩＶデータベースと一覧（すなわち、配列データベースのＷｅｂサイトはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／）に編集されている。本発明の方法および組成物は、任意のこれらの様々なグループ、サブタイプのからのＨＩＶ、および循環組換え型に適用することができる。これらは、例えば、ＨＩＶ−１の主要なグループ（多くの場合、グループＭと呼ばれる）と、マイナーグループ、グループＮ、Ｏ、およびＰ、ならびに、限定されないが、任意の次のサブタイプ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びＫ、またはＨＩＶのグループ（例えば、しかし限定されないが、任意の以下の群；Ｎ、Ｏ及びＰ）を含む。本発明の方法および組成物はまた、ＨＩＶ−２及び任意のＡ、Ｂ、Ｃ、ＦまたはＧクレード（また、「サブタイプ」または「グループ」と呼ばれる）およびＨＩＶ−２の任意の循環組換え型にも適用することができる。
【００２９】
ガイドＲＮＡは、コーディング配列または非コーディング配列に相補的な配列でありうる。例えば、ガイドＲＮＡは、長い末端反復（ＬＴＲ）配列、タンパク質コーディング配列、または制御配列などのＨＩＶ配列とすることができる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＨＩＶの長い末端反復（ＬＴＲ）領域に相補的な配列を有する。ＨＩＶ−１  ＬＴＲは、長さ約６４０ｂｐである。代表的なＨＩＶ−１  ＬＴＲは、配列番号：３７６の配列である。代表的なＳＩＶ  ＬＴＲは、配列番号：３８０の配列である。ＨＩＶ−１の長い末端反復（ＬＴＲ）は、Ｕ３、ＲおよびＵ５領域に分割されている。代表的なＨＩＶ−１  ＬＴＲのＵ３、ＲおよびＵ５領域は、それぞれ配列番号：３７７、３７８および３７９である。代表的なＳＩＶ  ＬＴＲのＵ３、ＲおよびＵ５領域は、それぞれ配列番号：３８１、３８２、および３８３である。代表的なＨＩＶ−１およびＳＩＶ配列のＵ１、Ｒ、Ｕ５領域の構成はそれぞれ図１８及び１９に示される。ＬＴＲは、遺伝子発現のために必要な信号のすべてを含み、そしてプロウイルスの宿主細胞のゲノムへの組み込みに関与している。例えば、基本またはコアプロモーター、コアエンハンサーおよび修飾領域はＵ３内に見出され、一方トランス活性化応答要素はＲ内に見出される。ＨＩＶ−１では、Ｕ５領域は複数のサブ領域、例えば、転写活性化に関与しているＴＡＲまたはトランス作用応答因子；二量体化およびゲノムパッケージングに関与しているＰｏｌｙ  Ａ；ＰＢＳまたはプライマー結合部位；Ｐｓｉまたはパッケージング信号；ＤＩＳまたは二量体開始部位、を含む。
【００３０】
有用なガイド配列は、ＬＴＲのＵ３、Ｒ、またはＵ５領域に相補的である。ＨＩＶ−１のＵ３領域を標的とする代表的なガイドＲＮＡ配列は、図１３に示される。ガイドＲＮＡ配列は例えば、以下の配列を含むことができる：
ＬＴＲ  Ａ：ＡＴＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧ（配列番号：９６）、
ＬＴＲ  Ｂ：ＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣＧＧ（配列番号：１２１）、
ＬＴＲ  Ｃ：ＧＡＴＴＧＧＣＡＧＡＡＣＴＡＣＡＣＡＣＣＡＧＧ（配列番号：８７）、または
ＬＴＲ  Ｄ：ＧＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＧＧＡＣＴＧＧＧＧ（配列番号：１１０）。
【００３１】
Ｕ３（配列番号：１６）内のＬＴＲ  Ａ（配列番号：：９６）、ＬＴＲ  Ｂ（配列番号：１２１）、ＬＴＲ  Ｃ（配列番号：８７）およびＬＴＲ  Ｄ（配列番号：１１０）の位置は図５に示される。Ｕ３領域を標的とする追加の代表的なガイドＲＮＡ配列は図１３の表に示され、そして配列番号：７９−１１１及び配列番号：１１１から１４１の任意の配列を有しうる。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、配列番号：７９−１１１及び配列番号：１１１−１４１の任意の配列と９５％の相同性を有する配列を含むことができる。従って、ガイドＲＮＡ配列は、例えば、以下の配列と９５％の相同性を有する配列を含むことができる：
ＬＴＲ  Ａ：ＡＴＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧ（配列番号：９６）、
ＬＴＲ  Ｂ：ＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣＧＧ（配列番号：１２１）、
ＬＴＲ  Ｃ  ＧＡＴＴＧＧＣＡＧＡＡＣＴＡＣＡＣＡＣＣＡＧＧ（配列番号：８７）、または
ＬＴＲ  Ｄ：ＧＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＧＧＡＣＴＧＧＧＧ（配列番号：１１０）。
ガイドＲＮＡ配列はプロトスペーサーと呼ばれることがある、例えば、プロトスペース（Ａ）、プロトスペース（Ｂ）、プロトスペース（Ｃ）、及びプロトスペース（Ｄ）。
【００３２】
ガイドＲＮＡ配列はＨＩＶ−１  Ｕ３、Ｒ、またはＵ５領域の基準配列またはコンセンサス配列内に見出される配列でありうる。しかし本発明はそのように限定されず、そしてガイドＲＮＡ配列は、任意の変異体または突然変異体ＨＩＶ配列を標的とするように選択されうる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、変異配列または疑似種配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、処置中の被験者により保有されるウイルスのゲノム中の配列に対応する配列でありうる。従って、例えば、被験者に保有されるＨＩＶウイルスの特定のＵ３、Ｒ、またはＵ５領域の配列を得ることができ、そして患者の特定の配列に相補的なガイドＲＮＡを使用することができる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡはタンパク質コーディング配列、例えば、一つ以上のウイルス構造タンパク質をコードする配列（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよびｔａｔ）に相補的な配列でありうる。したがって、その配列は、ｇａｇポリタンパク質、例えば、ＭＡ（マトリックスタンパク質、ｐ１７）；ＣＡ（カプシド蛋白質、ｐ２４）；ＳＰ１（スペーサーペプチド１、ｐ２）；ＮＣ（ヌクレオカプシド蛋白質、ｐ７）；ＳＰ２（スペーサーペプチド２、ｐ１）およびＰ６タンパク質：ｐｏｌ、例えば、逆転写酵素（ＲＴ）およびＲＮａｓｅ  Ｈ、インテグラーゼ（ＩＮ）、およびＨＩＶプロテアーゼ（ＰＲ）：ｅｎｖ、例えば、ｇｐ１６０、またはｇｐ１６０の切断産物、例えば、ｇｐ１２０やＳＵ、およびｇｐ４１またはＴＭ：またはｔａｔ、例えば、７２個のアミノ酸と１−エクソンのＴａｔまたは８６−１０１アミノ酸と２−エクソンのＴａｔ、内の配列に相補的でありうる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、例えばｖｉｆ、ｎ  ｗｉｌｌｅｆ（マイナス因子）、ｖｐｕ（ウイルスタンパク質Ｕ）およびｔｅｖなどのアクセサリータンパク質をコードする配列に相補的な配列でありうる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、配列は、構造的または制御的要素に相補的な配列、例えば、上記の長い末端反復（ＬＴＲ）；ＴＡＲ（ウイルスのトランス活性化のための標的配列）、Ｔａｔタンパク質および細胞タンパク質の結合部位、ＨＩＶ−１ではウイルスｍＲＮＡの最初の約４５ヌクレオチドからなり（ＨＩＶ−２では最初の１００ヌクレオチド）、ヘアピンステムループ構造を形成する；ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）、ＨＩＶ−１のｅｎｖ領域内でコードされるＲＮＡエレメント、約２００ヌクレオチドからなり（ＨＩＶ−１において転写の開始点から７７１０−８０６１に位置し、ｇｐ１２０およびｇｐ４１の境界に及ぶ）；ＰＥ（Ｐｓｉエレメント）、Ｇａｇ開始コドンに先行しそして重なる１組の４つのステム−ループ構造；ＳＬＩＰ、ＴＴＴＴＴＴ「滑りやすいサイト」、そのあとにループ構造が続く；ＣＲＳ（Ｃｉｓ−作用抑制配列）；ＩＮＳ（阻害性／不安定性ＲＮＡ配列）、例えばＨＩＶ−１のｇａｇ領域の４１４−６３１ヌクレオチドに見出される；でありうる。
【００３５】
ガイドＲＮＡ配列は、センスまたはアンチセンス配列でよい。ガイドＲＮＡ配列は、一般的にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。ＰＡＭの配列は使用されるＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの特異性要求に依存して変化しうる。化膿連鎖球菌由来ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムでは、標的ＤＮＡは、典型的には、５´−ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の直前に位置する。したがって、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９に対し、ＰＡＭシーケンスはＡＧＧ、ＴＧＧ、ＣＧＧまたはＧＧＧでありうる。他のＣａｓ９オルソログは、異なるＰＡＭの特異性を有してもよい。例えば、高温性連鎖球菌からのＣａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ１に対して５´−ＮＮＡＧＡＡが必要であり、そしてＣＲＩＳＰＲ３に対して５´−ＮＧＧＮＧが必要であり、そして髄膜炎菌は５´−ＮＮＮＮＧＡＴＴが必要である。ガイドＲＮＡの特定配列は変化しうるが、しかし配列に関係なく、有用なガイドＲＮＡ配列は、高効率およびゲノム組み込みＨＩＶ−１プロウイルスの完全な除去を達成しながらオフターゲット効果を最小化する配列であろう。ガイドＲＮＡ配列の長さは、約２０から約６０以上のヌクレオチドまで変化することができ、例えば、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９  、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０またはそれ以上のヌクレオチドである。有用な選択方法は、外来性のウイルスゲノムと内在性レトロウイルスＤＮＡを含む宿主細胞ゲノムの間の極めて低い相同性を有する領域を同定し、オフターゲットヒトトランスクリプトームまたは（まれに）非翻訳ゲノムサイトを除外するために、１２ｂｐの＋ＮＧＧ標的選択基準を使用する、バイオインフォマティクススクリーニング；ＨＩＶ−１  ＬＴＲプロモーター（潜在的に宿主ゲノム中に保存される）内の転写因子結合部位を回避；２０ｂｐのｇＲＮＡ−、キメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃＲＮＡベースのシステムに対して特異性／効率性を高めるため、ＬＴＲ−Ａと−Ｂに向かう、３０ｂｐのｇＲＮＡおよび元の細菌性免疫機構を反映するプレｃｒＲＮＡシステムの選択；そして潜在的なオフターゲット効果を識別し排除するため、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）、サンガー配列決定とＳＵＲＶＥＹＯＲ検定；を含む。
【００３６】
ガイドＲＮＡ配列は、単一の配列として、または一つ以上の異なる配列の組み合わせ、例えば、多重化構成として構成されうる。多重構成は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上の異なるガイドＲＮＡの組み合わせ、例えばＵ３、ＲまたはＵ５内の配列の任意の組み合わせを含みうる。いくつかの実施形態においては、ＬＴＲ  Ａ、ＬＴＲ  Ｂ、ＬＴＲ  Ｃ及びＬＴＲ  Ｄの組み合わせを使用しうる。いくつかの実施形態においては、任意の配列ＬＴＲ  Ａ（：９６）、ＬＴＲ  Ｂ（配列番号：１２１）、ＬＴＲ  Ｃ（配列番号：８７）、およびＬＴＲ  Ｄ（配列番号：１１０）の組み合わせが使用しうる。いくつかの実施形態においては、配列番号７９−１１１及び配列番号：１１１−１４１の配列を有する配列の任意の組み合わせが使用しうる。組成物が１つの発現ベクターにおいて投与される場合、ガイドＲＮＡは、単一のベクターによってコードされうる。あるいは、複数のベクターが、それぞれに２つ以上の異なるガイドＲＮＡを含むように設計することができる。有用な構成は切断部位間のウイルス配列の切除をもたらし、その結果ＨＩＶゲノム又はＨＩＶタンパク質発現の切除となる。したがって、２つ以上の異なるガイドＲＮＡの使用は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼによって認識される切断部位の間のウイルス配列の切除を促進する。切除された領域の寸法は、単一ヌクレオチドから数千ヌクレオチドまで変化しうる。代表的な切除領域は、実施例に記載されている。
【００３７】
組成物が核酸として投与されるか、または発現ベクター内に含まれている場合、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ配列に対するものと同じ核酸またはベクターによってコードされうる。あるいは、またはさらに、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ配列から物理的に離れた１つの核酸内で、または別個のベクター内でコードされ得る。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子、例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡは１つ以上の修飾核酸塩基を含むように設計される。
例えば、ＲＮＡ分子の既知の修飾は、例えば、遺伝子ＶＩ、第９章（「遺伝コードの解釈」）、ルイス、エド（１９９７年、オックスフォード大学出版、ニューヨーク）およびＧｒｏｓｊｅａｎおよびＢｅｎｎｅ著ＲＮＡの修飾と編集（１９９８、ＡＳＭプレス、ワシントンＤＣ）に記載されている。
修飾されたＲＮＡの構成要素は、次のものがある：２´−Ｏ−メチルシチジン；Ｎ４−メチルシチジン；Ｎ４−２´−Ｏ−ジメチルシチジン；Ｎ４−アセチルシチジン；５−メチルシチジン；５，２´−Ｏ−ジメチルシチジン；５−ヒドロキシジメチルシチジン；  ５−フォルミルシチジン；２´−Ｏ−メチル−５−フォルミルシチジン；３−メチルシチジン；２−チオシチジン；ライシジン；２´−Ｏ−メチルウリジン；２−チオウリジン；２−チオ−２´−Ｏ−メチルウリジン；３，２´−Ｏ−ジメチルウリジン；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン；４−チオウリジン；リボシルチミン；  ５，２´−Ｏ−ジメチルウリジン；５−メチル−２−チオウリジン；５−ヒドロキシウリジン；５−メトキシウリジン；ウリジン５−オキシ酢酸；ウリジン−５−オキシ酢酸メチルエステル；５−カルボキシメチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチル−２´−Ｏ−メチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチル−２´−チオウリジン；５−カルバモイルメチルウリジン；５−カルバモイルメチル−２´−Ｏ−メチルウリジン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル；５−アミノメチル−２−チオウリジン；５−メチルアミノメチルウリジン；５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン；５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２´−Ｏ−メチル−ウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン；ジヒドロウリジン；ジヒドロリボシルチミン；２´−メチルアデノシン；２−メチルアデノシン；Ｎ．ｓｕｐ．６Ｎ−メチルアデノシン；Ｎ６、Ｎ６−ジメチルアデノシン；Ｎ６，２´−Ｏ−トリメチルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６Ｎ−イソペンテニルアデノシン；Ｎ６−（シスヒドロキシイソペンテニル）−アデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−（シスヒドロキシイソペンテニル）−アデノシン；Ｎ６−グリシニルカルバモイル）アデノシン；Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；２´−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸塩）；イノシン；２´−Ｏ−メチルイノシン；１−メチルイノシン；１，２´−Ｏ−ジメチルイノシン；２´−Ｏ−メチルグアノシン；１−メチルグアノシン；Ｎ２−メチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン；Ｎ２，２´−Ｏ−ジメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，２´−Ｏ−トリメチルグアノシン；２´−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸塩）；７−メチルグアノシン；Ｎ２，７−ジメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン；ワイオシン；メチルワイオシン；未修飾ヒドロキシワイブトシン；ワイブトシン；ヒドロキシワイブトシン；ペルオキシワイブトシン；キューオシン；エポキシキューオシン；ガラクトシル−キューオシン；マンノシル−キューオシン；７−��アノ−７−デアザグアノシン；アルカエオシン（ａｒａｃｈａｅｏｓｉｎｅ）［７−ホルムアミド−７−デアザグアノシンとも呼ばれる］；そして７‐アミノメチル−７−デアザグアノシン。
【００３９】
我々は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびＤＮＡ（またはＲＮＡ）含有核酸アナログを含むＲＮＡとＤＮＡの両方を指して用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」を互換的に使用することがあり、それらのいずれも本発明のポリペプチドをコードすることができ、そしてそれら全ては本発明に包含される。ポリヌクレオチドは、本質的に任意の三次元構造を有しうる。核酸は、二本鎖または一本鎖であり得る（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖）。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびその一部、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー、ならびに核酸類似体を含む。本発明の文脈において、核酸は、天然起源Ｃａｓ９の断片またはその生物学的に活性な変異体およびガイドＲＮＡをコードすることができ、ここでガイドＲＮＡはＨＩＶ中の配列に相補的である。
【００４０】
「単離された」核酸は、天然起源ゲノムにおいてそのＤＮＡ分子のすぐ隣に通常見出される核酸配列の少なくとも一つが、除去されまたは非存在であるかぎり、例えば、天然起源ＤＮＡ分子またはその断片でありうる。したがって、単離された核酸は、限定されないが、他の配列とは独立の別個の分子（例えば、化学的に合成された核酸、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または制限エンドヌクレアーゼ処理によって産生されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）として存在するＤＮＡ分子を含む。単離された核酸はまた、ベクター、自律複製プラスミド、ウイルスの中に、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡの中に組み込まれるＤＮＡ分子を指す。さらに、単離された核酸は、ハイブリッドまたは融合核酸の一部であるＤＮＡ分子のような遺伝子操作された核酸を含みうる。例えば、ｃＤＮＡライブラリまたはゲノムライブラリー、またはゲノムＤＮＡ制限消化物を含むゲルスライス、内の他の多く（百万例えば、数十、あるいは数百）の核酸の間に存在する１つの核酸は、単離された核酸ではない。
【００４１】
単離された核酸分子は、標準的な技術によって製造することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、本明細書に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載のヌクレオチド配列を含む単離された核酸を得るために使用することができる。ＰＣＲは、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡからの配列を含む、ＤＮＡならびにＲＮＡからの特定の配列を増幅するために使用することができる。種々のＰＣＲ法は、例えば、ＰＣＲプライマー：実験室マニュアル、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈとＤｖｅｋｓｌｅｒ著、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９９５年に記載されている。一般的に、対象領域の末端またはその向こうからの配列情報は、増幅されるべきテンプレートの反対側の鎖に配列が同一または類似である、オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために使用される。様々なＰＣＲ戦略が利用可能であｒｉ，それにより部位特異的ヌクレオチド配列の修飾が、テンプレート核酸に導入されうる。
【００４２】
単離された核酸はまた、単一の核酸分子として（例えば、ホラミダイト技術を使用して３´から５´方向での自動ＤＮＡ合成を用いて）または一連のオリゴヌクレオチドとして、化学的に合成することができる。例えば、所望の配列を含有する長いオリゴヌクレオチド（例えば、＞５０‐１００ヌクレオチド）の一つ以上の対が合成可能であり、それぞれの対は相補性の短いセグメント（例えば、約１５ヌクレオチド）を含み、それによりオリゴヌクレオチド対がアニールされたときに二本鎖が形成される。ＤＮＡポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドを伸長するために使用され、それは結果的にオリゴヌクレオチド対ごとに単一の二本鎖核酸分子となり、それはその後ベクター内に結合されうる。本発明の単離された核酸はまた、例えばＣａｓ９コーディングＤＮＡ（例えば上記の処方による）の天然起源部分の変異誘発によって得ることができる。
【００４３】
２つの核酸またはそれらがコードするポリペプチドは、互いに一定の相同性を有するものとして説明することができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質およびその生物学的に活性な変異体は、一定の程度の相同性を示すものとして説明することができる。配列比較は、短いＣａｓ９配列をタンパク質情報研究（ＰＩＲ）サイト（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｒ．ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ．ｅｄｕ）に置くことにより構築され、その後ＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）上の「短いほぼ同一の配列」基本的ローカル配列検索ツール（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムでの分析が行われてもよい。
【００４４】
本明細書で使用する場合、用語「パーセント配列相同性」は、任意の所与の問い合わせ配列と対象配列間の相同性の程度を指す。例えば、天然起源Ｃａｓ９が問い合わせ配列となり、Ｃａｓ９タンパク質の断片が対象配列となりうる。同様に、Ｃａｓ９タンパク質の断片が問い合わせ配列となり、その生物学的に活性な変異体が対象配列となりうる。
【００４５】
配列相同性を決定するために、核酸配列またはタンパク質配列のアライメントをそれらの全長（グローバルアライメント）に亘って実行可能にする、コンピュータプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（バージョン１．８３、デフォルトパラメータ）を用いて、１つの問い合わせ核酸配列またはアミノ酸配列が、それぞれ一つ以上の対象核酸配列またはアミノ酸配列にアライメントされうる。Ｃｈｅｎｎａら著、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３４９７‐３５００、２００３参照。
【００４６】
ＣｌｕｓｔａｌＷは、１つの問い合わせ配列と１つまたは複数の対象配列との間の最良の一致を計算し、相同性、類似性と相違性を決定することができるようにそれらをアライメントします。１つ以上の残基のギャップが、配列アラインメントを最大にするために、問い合わせ配列、対象配列、又はその両方に挿入することができる。核酸配列の高速ペアワイズアライメントに対しては、以下のデフォルトパラメータが使用されている：ワードサイズ：２；ウィンドウサイズ：４；採点方法：パーセント；トップ対角線の数：４；およびギャップペナルティ：５。核酸配列の多重アラインメントに対しては、次のパラメータが使用されている：ギャップオープニングペナルティ：１０．０；ギャップ伸長ペナルティ：５．０；そして重み遷移：はい。タンパク質配列の高速ペアワイズアライメントに対しては、次のパラメータが使用されている：ワードサイズ：１；ウィンドウサイズ：５；採点方法：パーセント；トップ対角線の数：５；ギャップペナルティ：３。タンパク質配列のマルチプルアライメントに対しては、次のパラメータが使用されている：重み行列：ｂｌｏｓｕｍ；ギャップオープニングペナルティ：１０．０；ギャップ伸長ペナルティ：０．０５；親水性ギャップ：オン；親水性残基：グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）及びリシン（Ｌｙｓ）；残基特異的ギャップペナルティ：オン。出力は、配列間の関係を反映する配列比較である。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、ベイラー大学医学部の検索ランチャーサイト（ｓｅａｒｃｈｌａｕｎｃｈｅｒ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｍｕｌｔｉ−ａｌｉｇｎ／ｍｕｌｔｉ−ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌ）およびＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上の欧州バイオインフォマティクス研究所のサイト（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）で実行することができる。
【００４７】
問い合わせ配列と対象配列間のパーセント相同性を決定するために、ＣｌｕｓｔａｌＷは最良のアラインメント内の相同数を比較される残基の数で除し（ギャップ位置は除外されている）、そしてその数値に１００を乗ずる。出力は、問い合わせ配列に対する対象配列のパーセント相同である。パーセント相同性値は、小数点以下第１位に四捨五入することができることに留意されたい。たとえば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、および７８．１４は、切り捨てられて７８．１となり、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、および７８．１９は切り上げて７８．２となる。
【００４８】
本明細書に記載の核酸およびポリペプチドは、「外因性」と呼ばれてもよい。用語「外因性」は、核酸またはポリペプチドが組換え核酸構築物の一部である、またはそれによってコードされる、またはその天然の環境にはないことを示している。例えば、外因性核酸は、別の種に導入された１つの種からの配列、すなわち、異種核酸でありうる。典型的には、例えば、外因性核酸は、組換え核酸構築物を介して、他の種に導入される。外因性核酸は、ある生物にネイティブであり、それが、その生物の細胞に再度導入された配列でありうる。ネイティブ配列を含む外因性核酸は、多くの場合、外因性核酸に関係する非天然配列、例えば、組換え核酸構築物中のネイティブ配列に隣接する非ネイティブ制御配列、の存在により、区別することができる。加えて、安定的に形質転換された外因性核酸は、一般的には、ネイティブ配列が検出された位置以外の位置に組み込まれる。
【００４９】
組換え構築物はまた、本明細書に提供され、そしてＣａｓ９および／またはＨＩＶ中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡを発現させるために細胞を形質転換するために使用できる。組換え核酸構築物は、Ｃａｓ９および／または本明細書に記載のようなＨＩＶ中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡをコードする１つの核酸を有し、その核酸はＣａｓ９および／またはＨＩＶ中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡを発現するのに適したその細胞内の制御領域に作動可能に連結する。多くの核酸が、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードできることが理解されるであろう。遺伝コードの縮重は、当技術分野でよく知られている。多くのアミノ酸に対し、そのアミノ酸のためのコドンとして機能する１つ以上のヌクレオチドトリプレットが存在する。例えば、Ｃａｓ９のコーディング配列中のコドンは、その生物のための適切なコドンバイアス表を使用して、特定の生物における最適な発現が得られるように修飾することができる。
【００５０】
本明細書にも記載されているような核酸を含むベクターが提供される。「ベクター」は、挿入されるセグメントの複製をもたらすためにそのＤＮＡセグメントを挿入することができる、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンである。一般的にベクターは適切な制御エレメントを伴うとき複製することができる。適切なベクターの骨格は、例えば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、ＢＡＣ、ＹＡＣまたはＰＡＣのような当該技術分野で日常的に使用されるものを含む。「ベクター」という用語は、クローニングベクターおよび発現ベクター、ならびにウイルスベクターおよび組み込みベクターを含む。「発現ベクター」は、制御領域を含むベクターである。広範囲の宿主／発現ベクターの組み合わせが本明細書に記載の核酸配列を発現するために使用することができる。適切な発現ベクターは、限定されないが、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、およびレトロウイルス由来のプラスミドおよびウイルスベクターを含む。多数のベクターおよび発現系がＮｏｖａｇｅｎ社（マジソン、ＷＩ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（カリフォルニア州パロアルト）、ストラタジーン（ラホヤ、カリフォルニア州）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社／ライフテクノロジーズ（カールスバッド、カリフォルニア州）などの企業から市販されている。
【００５１】
本明細書で提供されるベクターは、例えば、複製起点、足場付着領域（ＳＡＲ）、および／またはマーカーを含みうる。マーカー遺伝子は、宿主細胞に選択可能な表現型を付与することができる。例えば、マーカーは、抗生物質（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、またはハイグロマイシン）に対する耐性などの殺生物剤耐性を付与することができる。上述したように、発現ベクターは、発現されたポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または局在化）を促進するように設計されたタグ配列を含むことができる。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素、またはフラッグ（登録商標）タグ（コダック社、ニューヘブン、ＣＴ）などのタグ配列は、一般的に、コードされたポリペプチドとの融合体として発現される。そのようなタグは、カルボキシルまたはアミノ末端のいずれかを含む、ポリペプチド内の任意の場所に挿入することができる。
【００５２】
追加の発現ベクターには、例えば、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントも含むことができる。適切なベクターには、ＳＶ４０の誘導体および既知の細菌性プラスミド、例えば、大腸菌プラスミドのｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＭＢ９およびその誘導体、ＲＰ４のようなプラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、ファージ１の多数の誘導体、例えば、ＮＭ９８９、および他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３および糸状一本鎖ファージＤＮＡ；２μプラスミド又はそれらの誘導体のような酵母プラスミド、昆虫または哺乳動物細胞において有用なベクターのような真核生物細胞において有用なベクター；ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を使用するように修飾されたプラスミドのような、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、を含む。
【００５３】
酵母発現系も使用することができる。例えば、２つだけを挙げると、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）または融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、Ｓｈｏｌ、ＮｏｔＩ、のＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂で精製され、エンテロキナーゼで切断されたＮ末端ペプチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）は、本発明にしたがって使用することができる。酵母２−ハイブリッド発現系も、本発明に従って調製することができる。
【００５４】
ベクターは、制御領域を含むことができる。用語「制御領域」とは、転写または翻訳の開始および速度、そして転写または翻訳産物の安定性および／または移動度に影響を与えるヌクレオチド配列を意味する。制御領域としては、限定されないが、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、５´および３´非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、核局在化信号、およびイントロン、を含む。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、転写される配列の転写または翻訳に影響を与えるような、核酸内における制御領域と転写される配列の配置を言う。例えば、コーディング配列をプロモーターの制御下にもたらすために、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、典型的には、プロモーターの下流の１ヌクレオチドと約５０ヌクレオチドとの間に配置される。しかし、プロモーターは、翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチド上流まで、または転写開始部位の約２，０００ヌクレオチド上流までに配置することができる。プロモーターは、典型的には、少なくともコア（基礎）プロモーターを含む。プロモーターはまた、少なくとも１つの制御エレメント、例えばエンハンサー配列、上流エレメントまたは上流活性化領域（ＵＡＲ）を含むことができる。含めるべきプロモーターの選択は、限定されないが、効率、選択性、誘導性、所望の発現レベル、および細胞または組織優先的発現、を含むいくつかの要因に依存する。コーディング配列に対してプロモーターおよび他の制御領域を適切に選択し、配置することによって、コーディング配列の発現を修飾することは、当業者にとって日常的事項である。
【００５６】
ベクターは、例えば、（例えば、アデノウイルス（Ａｄ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、およびレトロウイルスのような）ウイルスベクター、リポソームおよび他の脂質含有複合体、および宿主細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介することが可能な他の高分子複合体を含む。ベクターはまた、遺伝子送達および／または遺伝子発現をさらに修飾するか、そうでなければ標的細胞に有益な特性を提供する、他の構成要素または機能を含むことができる。以下でより詳細に説明され、図示されるように、そのような他の構成要素は、例えば、細胞への結合または標的化に影響を与える構成要素（細胞タイプまたは組織特異的結合を媒介する構成要素を含む）；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を及ぼす構成要素；取り込み後の細胞内でポリヌクレオチドの局在化に影響を及ぼす構成要素（例えば、核局在化を媒介する薬剤）；およびポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす構成要素、を含む。このような構成要素はまた、ベクターによって送達される核酸が取り込まれ、そしてそれを発現している細胞を検出または選択するために使用されうる、検出可能および／または選択可能マーカーなどのマーカーを含みうる。このような構成要素は、ベクターの天然由来の特徴として提供することができ（例えば、結合および取り込みを仲介する構成要素または機能を有する特定のウイルスベクターの使用など）、またはベクターは、このような機能を提供するように修飾されうる。他のベクターは、Ｃｈｅｎら著；バイオ技術、３４：１６７−１７１（２００３）に記載されたものを含む。このような多種多様ベクターは当技術分野で公知であり、そして一般に入手可能である。
【００５７】
「組換えウイルスベクター」は、１つ以上の異種遺伝子産物または配列を有するウイルスベクター意味する。多くのウイルスベクターは、パッケージングに関係するサイズの制約を示すので、異種遺伝子産物または配列は、典型的には、ウイルスゲノムの１つ以上の部分を置換することによって導入される。このようなウイルスは、複製欠損になることがあり、それは削除された機能がウイルス複製およびキャプシド形成の間にトランスで提供される（例えば、ヘルパーウイルス、または複製および／またはキャプシド形成に必要な遺伝子産物を担持するパッケージング細胞株を使用することによって）必要がある。その中で送達されるべきポリヌクレオチドがウイルス粒子の外側に担持される、修飾ウイルスベクターもまた開示されてきた（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ、ＤＴら著、ＰＮＡＳ８８：．８８５０‐８８５４、１９９１参照）。
【００５８】
適切な核酸送達系は、組換えウイルスベクター、典型的には少なくとも一つの、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルパー依存型アデノウイルス、レトロウイルス、またはセンダイウイルス（ＨＶＪ）‐リポソーム複合体からの配列を含む。このようなケースでは、ウイルスベクターはポリヌクレオチドに作動可能に連結した、強力な真核生物プロモーター例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。組換えウイルスベクターは、その中に一つ以上、好ましくは約１つのポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用されるウイルスベクターは、約１０８から約５×１０１０  のｐｆｕ（プラーク形成単位）を有する。ポリヌクレオチドが非ウイルスベクターを用いて投与される実施形態では、約０．１ナノグラム−約４０００マイクログラムの間、例えば約１ナノグラム−約１００マイクログラムの使用が多くの場合有用である。
【００５９】
付加的なベクターには、ウイルスベクター、融合タンパク質および化学的複合体を含む。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスおよびＨＩＶベースのウイルスを含む。１つのＨＩＶベースのウイルスベクターは、少なくとも２つのベクターを有し、ここでｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子が１つのＨＩＶゲノムからのものであり、ｅｎｖ遺伝子は、別のウイルスからのものである。ＤＮＡウイルスベクターは、オルトポックスまたはアビポックスベクターのようなポックスベクター、単純ヘルペスＩウイルス（ＨＳＶ）ベクターのようなヘルペスウイルスベクター（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉら著、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、６４：４８７（１９９５）；Ｌｉｍ，Ｆら著、ＤＮＡクローニング：哺乳動物系、Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編（オックスフォード大学出版、オックスフォード、イングランド）（１９９５）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉら著、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：Ｕ．Ｓ．Ａ．：９０  ７６０３（１９９３）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉら著、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：Ｕ．Ｓ．Ａ．：８７：１１４９（１９９０））、アデノウイルスベクター（ＬｅＧａｌ  ＬａＳａｌｌｅら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９：９８８（１９９３）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら著、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９（１９９３）；Ｙａｎｇら著、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４（１９９５）），およびアデノ随伴ウイルスベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ、Ｍ．Ｇ．ら著、Ｎａｔ．Ｇｎｅｔ．８：１４８（１９９４））を含む。
【００６０】
ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞の細胞質に導入する。アビポックスウイルスベクターは短期間だけの核酸の発現をもたらす。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、本発明のいくつかの実施形態を示している可能性がある。アデノウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスより短期（例えば、約１カ月短い）の発現結果となり、いくつかの実施形態では、はるかに長い発現を示すかもしれない。選択される特定のベクターは標的細胞および処置される条件に依存する。適切なプロモーターの選択は容易に達成しうる。適切なプロモーターの例は、７６３塩基対サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。遺伝子発現のために使用され得る他の適切なプロモーターとしては、限定されないが、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）（Ｄａｖｉｓら著、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ４：１５１（１９９３））、ＳＶ４０初期プロモーター領域、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン（ＭＭＴ）の制御配列遺伝子、βラクタマーゼプロモーター、ｔａｃプロモーターのような原核生物の発現ベクター、Ｇａｌ４プロモーターのような酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；および動物転写制御領域、それは組織特異性を示し、遺伝子組み換え動物において利用されてきた：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域、膵臓β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域、リンパ系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳房、リンパ系およびマスト細胞において活性なマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域、α−フェトプロテイン遺伝子制御領域、肝臓で活性なアルファ１アンチトリプシン遺伝子制御領域、骨髄細胞で活性なβ−グロビン遺伝子制御領域、脳内のオリゴデンドロサイト細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域、および視床下部で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域、を含む。
【００６１】
一定のタンパク質は、それらのネイティブプロモーターを使用して発現されうる。発現を増強することができる他の要素は、高レベルの発現をもたらすエンハンサーまたはシステム、例えばｔａｔ遺伝子およびｔａｒ要素を含めることができる。このカセットは、次いで、ベクター、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２のようなプラスミドベクター、または大腸菌複製起点を含む他の公知のプラスミドベクターに挿入することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ他著、分子クローニング：実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、（１９８９）参照。プラスミドベクターはまた、マーカーポリペプチドが処置されている生物の代謝に悪影響を与えない限り、アンピシリン耐性に対するβラクタマーゼ遺伝子のような選択可能マーカーを含んでよい。カセットはまた、ＷＯ９５／２２６１８で開示されるような、非天然送達システムにおける核酸結合部分に結合されうる。
【００６２】
所望であれば、本発明のポリヌクレオチドはカチオン性リポソームおよびアデノウイルスベクターなどのマイクロ送達媒体と共に使用されうる。リポソーム製剤、標的化および内容物の送達に関しては、ＭａｎｎｉｎｏとグＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ、バイオ技術６：６８２（１９８８）を参照。また、ＦｅｌｇｎｅｒおよびＨｏｌｍ著、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓ．Ｌａｂ．Ｆｏｃｕｓ，１１（２）：２１（１９８９）およびＭａｕｒｅｒ，Ｒ．Ａ．著，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓ．Ｌａｂ．Ｆｏｃｕｓ，１１（２）：２５（１９８９）参照。
【００６３】
複製欠損組換えアデノウイルスベクターは、公知の技術に従って製造することができる。Ｑｕａｎｔｉｎら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：２５８１−２５８４（１９９２年）；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｄｅｔら著、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９０：６２６−６３０（１９９２）；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら著、Ｃｅｌｌ，６８：１４３−１５５（１９９２）参照。
【００６４】
別の送達方法は、細胞内で発現生成物を生成できる、一本鎖ＤＮＡ生成ベクターを使用することである。例えば、Ｃｈｅｎら著、バイオ技術、３４：１６７−１７１（２００３）参照。その全体は、参照により、本明細書に組み込まれる。
【００６５】
（医薬組成物）
上述したように、本発明の組成物は、当業者に公知の種々の方法で調製することができる。それらの元のソースまたはそれらが得られた態様に関係なく、本発明の組成物は、それらの使用方法に従って処方できる。例えば、上述の核酸およびベクターは、組織培養中細胞への適用、または患者または被験者への投与のために組成物内に処方されうる。任意の本発明の医薬組成物は医薬品の調製における使用のために処方することができ、そして特定の使用は、処置、例えば、ＨＩＶ感染を有するまたはＨＩＶ感染のリスクのある被験者の処置、の文脈で以下に示される。医薬品として使用する場合、任意の核酸およびベクターは、医薬組成物の形態で投与されうる。
【００６６】
これらの組成物は、医薬分野において周知の態様で調製することができ、そして局所または全身処置が望ましいかによって、そして処置の領域に応じて、様々な経路によって投与することができる。投与は、局所（点眼用及び、鼻腔内、膣および直腸送達を含む粘膜送達を含む）、肺性（例えば粉末またはエアロゾルの吸入またはガス注入による、ネブライザーによるものを含み：気管内、鼻腔内、上皮および経皮）、点眼、経口または非経口である。眼送達の方法は、局所（点眼剤）、結膜下、眼球周囲または硝子体内への注射またはバルーンカテーテルや結膜嚢に外科的に置かれた眼科用インサートによる導入を含むことができる。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または注入；または頭蓋内、例えば、くも膜下腔内または脳室内投与を含む。非経口投与は、単回ボーラス投与の形態であることができ、または、例えば、連続灌流ポンプによるものであってもよい。局所投与用の医薬組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体、粉末、等を含むことができる。従来の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤およびそれらに類似するものが必要または望ましいかもしれない。
【００６７】
本発明はまた、１つ以上の薬学的に許容される担体と組み合わされた、活性成分として本明細書で記載の核酸およびベクターを含有する、医薬組成物を含む。「医薬的に許容される」（または「薬理学的に許容される」）という用語は、動物またはヒトに適切に投与したとき、副作用、アレルギーまたは他の有害反応を生じない分子性実体および組成物を指すため使用する。本明細書で使用される用語「医薬的に許容される担体」は、医薬的に許容される物質のための媒体として使用され得る、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、等張および吸収遅延剤、緩衝剤、賦形剤、結合剤、潤滑剤、ゲル剤、界面活性剤などを含む。本発明の組成物の製造において、活性成分は、典型的には、賦形剤と混合され、賦形剤で希釈され、または、例えば、カプセル、錠剤、小袋、紙、または他の容器の形態でのこのような担体内に封入される。
【００６８】
賦形剤が希釈剤として働く場合、それは活性成分のためのビヒクル、担体または媒体として作用する、固体、半固体、または液体材料（例えば、通常生理食塩水）でありうる。したがって、組成物は、錠剤、丸剤、散剤、トローチ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、乳液、溶液、シロップ、エアロゾル（固体としてまたは液体媒体中）、ローション、クリーム、軟膏、ゲル剤、軟質および硬質ゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射溶液、および滅菌包装粉末の形態でありうる。当技術分野で知られているように、希釈剤のタイプは、意図した投与経路に依存して変化しうる。結果としての組成物は、防腐剤のような追加の薬剤を含めることができる。いくつかの実施形態では、担体は、脂質ベースのまたはポリマーベースのコロイドである、または、それを含むことができる。いくつかの実施形態において、担体材料は、リポソーム、ヒドロゲル、マイクロ粒子、ナノ粒子、またはブロック共重合体ミセルとして処方されたコロイドでありうる。上述のように、キャリア材料は、カプセルを形成することができ、そして材料はポリマーベースのコロイドでもよい。
【００６９】
本発明の核酸配列は、被験者の適切な細胞に送達されうる。これは、例えば、マクロファージのような食細胞による食作用を最適化するように寸法採りされた、ポリマーの、生分解性マイクロ粒子またはマイクロカプセル送達媒体の使用により達成することができる。例えば、直径約１−１０μｍのＰＬＧＡ（ポリ乳酸コグリコリド）マイクロ粒子を使用することができる。ポリヌクレオチドは、それらマイクロ粒子内にカプセル封入され、それはマクロファージによって取り込まれ、そして徐々に細胞内で分解され、それによりポリヌクレオチドを放出する。一度放出されると、ＤＮＡは細胞内で発現される。マイクロ粒子の第二のタイプは、細胞によって直接取り込まれず、むしろ主として核酸の徐放性リザーバとして機能することを意図され、核酸は生分解を介してマイクロ粒子からの放出の際に細胞によって取り込まれる。したがってこれらのポリマー粒子は、食作用を排除するのに十分なほど大きい必要がある（すなわち、５μｍより大きく、好適には２０μｍよりも大きい）。
【００７０】
核酸の取り込みを達成する別の方法は、標準的な方法によって調製されたリポソームを使用することである。核酸は、送達ビヒクルに単独で組み込まれ、または、組織特異的抗体、例えばＨＩＶ感染症の共通潜伏感染リザーバである細胞型を標的とする抗体、例えば脳マクロファージ、ミクログリア、星状細胞、および腸関連リンパ細胞、と共に組み込まれうる。代替的に、静電気または共有結合力によってポリ−Ｌ−リジンに結合したプラスミドまたは他のベクターからなる分子複合体を調製することができる。ポリ−Ｌ−リジンは、標的細胞上の受容体に結合し得るリガンドに結合する。筋肉内、皮内、または皮下部位への「裸のＤＮＡ」（すなわち、送達ビヒクルなし）の送達は、インビボ発現を達成するための別の手段である。関連するポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡをコードする１つの配列を有する１つの単離核酸配列をコードする核酸配列は、プロモーターまたはエンハンサー−プロモーターの組み合わせに作動可能に連結されている。プロモーターおよびエンハンサーは、上記に記載されている。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、ナノ粒子、例えば、ＤＮＡと複合され、ポリエチレングリコール修飾（ＰＥＧ化）低分子量線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）のシェルに取り囲まれた高分子量ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）のコアからなるナノ粒子、として処方されうる。
【００７２】
核酸およびベクターはデバイス（例えば、カテーテル）の表面に適用され、またはポンプ、パッチまたは他の薬物送達装置内に含まれてもよい。本発明の核酸およびベクターは、薬学的に許容される賦形剤または担体（例えば、生理食塩水）の存在下で、単独または混合物中で投与されうる。賦形剤または担体は、投与の様式および経路に基づいて選択される。適切な医薬担体、ならびに、医薬処方での使用のための医薬的必要性は、この分野でよく知られている参照テキストであるレミントンの薬学（ＥＷマーティン）、およびＵＳＰ／ＮＦ（米国薬局方および国民医薬品）に記載されている。
【００７３】
いくつかの実施形態において、組成物は、ＨＩＶの性行為による感染を阻止するための局所ゲルとして処方されうる。局所ゲルは、性行為の前に皮膚や男性または女性の生殖器部分の粘膜に直接適用することができる。あるいは、またはさらに、局所ゲルは男性用コンドームまたは女性用ペッサリーの表面に適用され、またはその中に収容されうる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓ９または変異体Ｃａｓ９および標的ＨＩＶに相補的なガイドＲＮＡ配列をコードする核酸、またはＣａｓ９および標的ＨＩＶに相補的なガイドＲＮＡ配列をコードする核酸を有するベクター、をカプセル封入するナノ粒子として処方されうる。あるいは、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペプチド、例えば、Ｃａｓ９または変異体Ｃａｓ９および標的に相補的なガイドＲＮＡ配列、を封入したナノ粒子として処方されうる。
【００７５】
本発明の処方は、Ｃａｓ９およびターゲットＨＩＶに相補的なガイドＲＮＡ配列をコードするベクターにおよぶことが出来る。ガイドＲＮＡ配列は、単一の領域に相補的な配列、例えば長い末端反復（ＬＴＲ）Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤを含むことができ、またはそれはＬＴＲ  Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤに対して相補的な配列の任意の組み合わせを含むことができる。あるいはＣａｓ９をコードする配列とガイドＲＮＡ配列をコードする配列は別々のベクター上にあってもよい。
【００７６】
（処置の方法）
ここで開示された組成物は、レトロウイルス感染、例えば、ＨＩＶ感染を有する被験者の処置にとって全般的にそして様々に有用である。我々は、被験者、患者、または個人を交換可能に言う。本発明の方法は、任意のＨＩＶ、例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびそれらの任意の循環組換え形態を標的とするために有用である。被験者は、臨床的に有益な結果が起こる場合は常に有効に処置されている。これは、例えば、疾患の症状の完全な回復、疾患の症状の重症度の減少、または疾患の進行の遅延を意味してもよい。これらの方法はさらに、ａ）ＨＩＶ感染を有する被験者（例えば、患者、より具体的には、ヒト患者）の識別；およびｂ）ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９およびＨＩＶの標的配列に相補的なガイドＲＮＡ、例えばＨＩＶ  ＬＴＲをコードする１つの核酸を含む組成物を被験者に提供するステップ、を含みうる。被験者は、標準的な臨床試験、例えば、被験者の血清中のＨＩＶ抗体、またはＨＩＶのｐ２４のポリペプチドを検出するための免疫検定法を使用して、またはＨＩＶ核酸増幅検定法を介して識別しうる。疾患の症状の完全な回復、疾患の症状の重症度の減少、または疾患の進行の遅延をもたらす、被験者に提供されるこれら組成物の量が処置上有効な量とみなされる。
【００７７】
本発明の方法は、投薬およびスケジューリングの最適化だけでなく、予後の予測を補助するための監視ステップを含むことができる。本発明のいくつかの方法においては、まず、患者が潜伏ＨＩＶ−１感染を有するかどうかを決定し、その後、一つ以上の本明細書に記載の組成物で患者を処置するか否かの決定をする。モニタリングはまた、薬剤耐性の発現を検出し、そして迅速に応答性患者を非応答性患者から区別するために使用できる。いくつかの実施形態では、本発明の方法はさらに、患者が有する特定のＨＩＶの核酸配列を決定し、その後それらの特定の配列に相補的であるように、ガイドＲＮＡを設計するステップを含むことができる。例えば、被験者のＬＴＲのＵ３、ＲまたはＵ５領域の核酸配列を決定し、その後、患者の配列に正確に相補的であるように１つ以上のガイドＲＮＡを設計することができる。
【００７８】
組成物は、例えば、レトロウイルス感染症例えばＨＩＶ感染症に罹患しているリスクのある被験者の予防的処置として、処置に有用である。これらの方法はさらに、ａ）ＨＩＶ感染症に罹患しているリスクを有する被験者を識別し、ｂ）ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ例えば、Ｃａｓ９およびＨＩＶの標的配列、例えばＨＩＶ  ＬＴＲに相補的なガイドＲＮＡをコードする１つの核酸を含む組成物を被験者に提供する、ステップを有する。ＨＩＶ感染症に罹患しているリスクのある被験者は、例えば、任意の性的に活発な個人で無防備な性行為を行う人、即ち、コンドームを使用せずに性行為を行う人；性的に活発な個人で、他の伝染された性感染症に罹患している人；静脈内薬物使用者；または包皮未切除の男性、でありうる。ＨＩＶ感染症に罹患しているリスクのある被験者は、例えば、職業がＨＩＶ感染集団との接触をもたらす個人、例えば、医療従事者や救命救急従事者でありうる。ＨＩＶ感染症に罹患しているリスクのある被験者は、例えば、矯正施設の収容者やセックスワーカー、即ち、所得、雇用や食品、医薬品、または避難所などの非貨幣項目のために性行為を行う個人、でありうる。
【００７９】
組成物は、母親から彼女の出生児にＨＩＶを伝染させる可能性を低減するために、ＨＩＶ感染症に罹患している妊娠中または授乳中の女性に投与されうる。ＨＩＶに感染した妊婦は、子宮内で胎盤を経由して、出産時に産道を介して、または出産後母乳を介して、出生児にウイルスを伝染させる可能性がある。本明細書に開示された組成物は、ＨＩＶに感染した母親に出産前、出産時や出産後の授乳期間中に、または出産前、出産時や出産後の投与の任意の組み合わせで投与されうる。組成物は、以下に記載されるように、標準的な抗レトロウイルス療法と共に母親に投与されうる。いくつかの実施形態において、本発明の組成物はまた、出産後すぐに乳児に投与されてもよく、そしていくつかの実施形態では、その後間を置いて投与されてもよい。幼児も標準的な抗レトロウイルス療法を受けることができる。
【００８０】
本明細書に開示される方法および組成物は、レトロウイルス感染症の処置に有用である。代表的なレトロウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＶ）；および、ヤギ関節炎／脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）を含む。本明細書に開示される方法は、広範囲の種、例えば、ヒト、非ヒト霊長類｛例えば、サル）、ウマ、または他の家畜、イヌ、ネコ、フェレット、またはペットとして飼われる他の哺乳動物、ラット、マウス、または他の実験動物に適用されうる。
【００８１】
本発明の方法は、医薬品の調製という言葉で表現されうる。従って、本発明は、薬物の調製における、本明細書に記載の薬剤及び組成物の使用を包含する。本明細書に記載の化合物は、治療用組成物及び治療計画において有用であり、または本明細書に記載の疾患または病状の処置に使用される医薬の製造のために有用である。
【００８２】
本明細書に記載の任意の組成物は、その後の標的細胞への送達のために宿主の身体の任意の部分に投与することができる。組成物は、限定されないが、哺乳動物の脳、脳脊髄液、関節、鼻粘膜、血液、肺、腸、筋肉組織、皮膚、または腹腔に送達されうる。送達経路の観点では、本組成物は、静脈内、頭蓋内、腹腔内、筋肉内、皮下、筋肉内、直腸内、膣内、髄腔内、気管内、皮内、または経皮の注射によって、経口または経鼻投与によって、または時間をかけたゆっくりとした灌流によって投与されうる。さらなる例では、組成物のエアロゾル調製物が吸入によって宿主に与えられてもよい。
【００８３】
必要な投与量は、投与経路、製剤の性質、患者の病気の性質、患者の身長、体重、表面積、年齢、性別、投与される他の薬物、および担当臨床医の判断に依存するであろう。必要な投与量の広い変動が、細胞性標的の多様性および種々の投与経路の異なる効率の観点から予想される。これら投与量レベルの変動は、当技術分野でよく理解されているように、最適化のための標準的な経験的ルーチンを用いて調整することができる。投与は、単一または多重（例えば、２−または３−、４−、６−、８−、１０−、２０−、５０−、１００−、１５０−倍、またはそれ以上の倍数）でありうる。適切な送達ベヒクル中への組成物のカプセル封入（例えば、ポリマーマイクロ粒子または埋め込み型装置）は送達の効率を増加させうる。
【００８４】
本明細書で提供される任意の組成物による処置期間は、一日という短い期間から宿主の寿命までという長い期間（例えば、多くの年数）までの任意の長さでありうる。例えば、ある化合物は、週１回（例えば、４週間から多くの月数または年数の期間に対し）；月１回（例えば、３ヶ月から１２ヶ月、または多くの年数に対して）；または５年、１０年またはそれ以上の期間に対し、５年に１回投与されうる。処置の頻度を可変であることにも留意されたい。例えば、本発明の化合物は、毎日、毎週、毎月、または毎年一回（または２回、３回、他）投与されうる。
【００８５】
本明細書で提供される任意の組成物の有効量を、処置を必要とする個人に投与することができる。本明細書で使用される用語「有効」とは、患者に対し有意の毒性を誘導しないで所望の応答を誘導する任意の量を意味する。このような量は、特定の組成物の既知の量を投与した後の患者の応答を評価することにより決定することができる。また、毒性のレベルは、もしあれば、特定の組成物の既知の量を投与した前と後の患者の臨床症状を評価することによって決定することができる。一人の患者に投与される特定の組成物の有効量は、所望の結果並びに患者の応答および毒性のレベルに従って調整することができることに留意されたい。有意な毒性は、それぞれの特定の患者に対して変化しえて、そして限定されないが、患者の病状、年齢、および副作用に対する耐性を含む、多重の要素に依存する。
【００８６】
当業者に公知の任意の方法が、特定の応答が誘導されるか否かを決定するために使用することができる。特定の病状の程度を評価することができる臨床的方法を応答が誘導されるかどうかを決定するために用いることがでる。応答を評価するために使用される特定の方法は、患者の疾患の性格、患者の年齢、性別、投与されている他の薬物、ならびに担当臨床医の判断に依存する。
【００８７】
組成物は、他の治療薬、例えば、ＨＡＡＲＴで使用される抗レトロウイルス薬、と共に投与することができる。代表的な抗レトロウイルス剤は、逆転写酵素阻害剤（例えば、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤、ジドブジン、エムトリシタビン、ラミブジン及びテノホビル；及び非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えばエファビレンツ、ネビラピン、リルピビリン）；プロテアーゼ阻害剤、例えば、ｔｉｐｉｒａｖｉｒ、ダルナビル、インジナビル；侵入阻害剤、例えば、マラビロック；融合阻害剤、例えば、エンフビルチド；またはインテグラーゼ阻害剤、例えば、ラルテグラビル、ドルテグラビル、を含む。代表的な抗レトロウイルス薬はまた、マルチクラスの組合せ剤、例えば、エムトリシタビン、エファビレンツ、及びテノホビルの組み合わせ；エムトリシタビン、リルピビリン、およびテノホビルの組み合わせ；またはエルビテグラビル、コビシスタット、エムトリシタビンとテノホビルの組み合わせ；を含みうる。
【００８８】
二つ以上の治療薬の同時投与は、薬剤がその治療効果を発揮している時間期間に重複があれば、同じ時間にまたは同じ経路で投与されることを必要としない。同時または、異なる日または週における投与のような連続投与が企図される。治療薬はメトロノームレジメンの下で投与、例えば、連続的な低用量の下で投与されてもよい。
【００８９】
このような組成物の投与量、毒性、および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（人口の５０％で治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性と治療効果の間の用量比が治療指数であり、それは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現できる。
【００９０】
細胞培養検定および動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲を処方するために使用することができる。そのような組成物の投与量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む１つの循環濃度の範囲内にある。用量は、用いられる剤形および使用される投与経路に応じてこの範囲内で変動しうる。本発明の方法において使用される任意の組成物について、治療有効用量は、細胞培養検定から最初に推定されうる。用量は、細胞培養において決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量阻害を達成する、試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて処方されうる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより、測定することができる。
【００９１】
上述のように、治療的有効量の組成物（すなわち、有効用量）は、治療的（例えば、臨床的に）望ましい結果を生成するのに十分な量を意味する。組成物は、一日一回またはそれ以上から１週間に１回またはそれ以上まで；一日おきに一度を含み、投与することができる。当業者は、限定されないが、疾患または障害の重症度、以前の処置、被験体の全体的健康状態および／または年齢、および他の現在罹患している疾病、を含む特定の要因が効果的に被験者を処置するために必要な投薬量およびタイミングに影響を与えうることを理解しよう。さらに、本発明の組成物の治療的有効量による対象の処置は、一回の処置または一連の処置を含みうる。
【００９２】
本明細書に記載の組成物は、上記の種々の薬物送達システムにおける使用に適している。さらに、投与される化合物のインビボ血清半減期を高めるために、組成物は、カプセル化され、リポソームの内腔に導入され、コロイドとして調製されてもよく、または化合物の延長された血清半減期を提供する他の従来技術が用いられてもよい。例えば、Ｓｚｏｋａら著、米国特許番号４２３５８７１、４５０１７２８および４８３７０２８で記載されているように、様々な方法がリポソームを調製するために使用可能であり、それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。更に、標的化薬物送達システム例えば、組織特異的抗体で被覆されたリポソームで薬物を投与してもよい。リポソームは、その器官に対し標的化され、そしてその期間により選択的に取り込まれる。
【００９３】
また哺乳動物細胞におけるヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、またはウシ免疫不全ウイルスなどの、レトロウイルスを不活性化する方法も提供される。ヒト免疫不全ウイルスは、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２でありうる。
ヒト免疫不全ウイルスは、染色体に組み込まれたプロウイルスでありうる。哺乳動物細胞は、限定されないが、ＣＤ４＋リンパ球、マクロファージ、線維芽細胞、単球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、ランゲルハンス細胞および濾胞樹状細胞のような樹状細胞、造血幹細胞、内皮細胞、脳の小膠細胞および胃腸上皮細胞を含む、ＨＩＶに感染された任意の細胞型でありうる。このような細胞型は一般的に、一次感染時に感染した細胞型、例えば、ＣＤ４＋リンパ球、マクロファージ、またはランゲルハンス細胞、ならびに潜伏ＨＩＶ貯蔵庫を構成するこれら細胞型、即ち、潜伏感染細胞を含む。
【００９４】
方法は、１つのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、およびレトロウイルス中の標的核酸配列に対して相補的である１つまたは複数のガイドＲＮＡ、を含む１つの遺伝子編集複合体、をコードする１つの単離核酸を有する１つの組成物に細胞を暴露させるステップを含みうる。接触ステップはｉｎ  ｖｉｖｏで起こることができ、即ち、その組成物はＨＩＶ感染を有する被験者に直接投与されうる。しかし方法はそのように限定されず、接触ステップは、ｅｘ  ｖｉｖｏで行いうる。例えば、１つの細胞または複数の細胞、または組織外植片は、ＨＩＶ感染を有する被験者から除去され、培養物中に入れられ、そしてその後、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ，およびヒトＨＩＶ中の標的核酸配列に対して相補的であるガイドＲＮＡ，を含む組成物に接触されうる。上述したように、組成物は、１つのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、およびヒトＨＩＶ中の標的核酸配列に対して相補的である１つのガイドＲＮＡ、をコードする１つの核酸；その核酸配列を有する１つの発現ベクター；または１つのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、およびＨＩＶ中の核酸配列に対して相補的な１つのガイドＲＮＡをコードする１つの核酸を有する１つの医薬組成物；またはその核酸配列を含む１つの発現ベクター；でありうる。
【００９５】
組成物が核酸またはポリペプチドとして投与されるかどうかにかかわらず、それらは哺乳動物細胞による取り込みを促進するように処方される。有用なベクター系および処方は、上記に記載されている。いくつかの実施形態では、ベクターは、特定の細胞型に組成物を送達することができる。しかし本発明はそのように限定されるものではなく、例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、リポソーム、リポプレックス、界面活性剤、及びペルフルオロ薬液を用いた化学的トランスフェクションのような他のＤＮＡ送達方法もまた、電気穿孔、マイクロインジェクション、弾道粒子、および「遺伝子銃」システムのような物理的な送達方法と同様に、考慮される。
【００９６】
標準的な方法、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを検出するための免疫検定法、ｇＲＮＡを検出するためのＰＣＲのような核酸ベース検定法は、複合体が導入された細胞によって複合体が取り上げられ、そして発現されたことを確認するために使用することができる。その後遺伝子操作された細胞は、以下に説明するように、それらの細胞が由来する被検者に再導入されうる。
【００９７】
遺伝子編集複合体は、１つのＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、および、標的レトロウイルス配列、例えばＨＩＶ標的配列に相補的な１つのガイドＲＮＡ、を含む。遺伝子編集複合体は、プロウイルスＤＮＡに様々な変異を導入することができる。このような変異がウイルスを不活性化するメカニズムは様々であり、例えば、変異は、プロウイルス複製、ウイルス遺伝子発現またはプロウイルス切除に影響を与えうる。変異は、制御配列または構造遺伝子配列に位置し、ＨＩＶの不良生成の結果となる。変異は遺伝子欠失を含みうる。欠失のサイズは単一ヌクレオチド塩基対から約１０，０００塩基対まで変化しうる。いくつかの実施形態では、欠失は、全てまたは実質的に全てのプロウイルス配列を含みうる。いくつかの実施形態では、欠失は、プロウイルス配列の全体を含みうる。変異は挿入を含みうる。それはプロウイルス配列への１つ以上のヌクレオチド塩基対の付加である。挿入された配列のサイズも、例えば、約１塩基対から約３００ヌクレオチド塩基対まで変化しうる。変異は点変異を含み、それは単一のヌクレオチドの別のヌクレオチドとの置換である。有用な点変異は、機能的結果を有する点変異であり、例えば、アミノ酸コドンの終止コドンへの変換をもたらす変異、または非機能性タンパク質の産生をもたらす変異である。
【００９８】
他の実施形態では、組成物は１つ以上のＣａｓ／ｇＲＮＡベクターで形質転換または形質導入された１つの細胞からなる。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏで適用することができる。すなわち、被験者の細胞を身体から除去し、そしてＨＩＶ配列を切除するために培養中の組成物で処置され、そして処置された細胞は被験者の体内に戻されうる。細胞は、被験者の細胞またはハプロタイプ適合または１つの細胞株であってよい。細胞は複製を防止するため照射されてもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合、自己由来、細胞株、またはそれらの組み合わせであってよい。他の実施形態においては、細胞は幹細胞でありうる。例えば、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞（誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞））。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（誘導多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞）は、ヒトを含む多くの動物種から確立されている。細胞が分化することができるので多能性幹細胞のこれらのタイプは、再生医学のための最も有用な細胞源であろう、なぜならば、これらの細胞は適切な分化の誘導によって殆ど全ての臓器に分化することができ、一方で多能性を維持しながら活発に分裂する能力を保持する。ｉＰＳ細胞は、特に、自己由来の体細胞から確立されることができ、そしてしたがって、胚を破壊することによって生成されるＥＳ細胞と比較して、倫理的及び社会問題を引き起こす可能性が少ない。さらに、自己由来細胞であるｉＰＳ細胞は、再生医療や移植処置にとって最大の障害である拒絶反応を回避することを可能にする。
【００９９】
ｇＲＮＡ発現カセットは容易に、例えば、当技術分野において公知の方法、例えばｓｉＲＮＡを送達する方法、によって被験者に送達することができる。いくつかの態様では、Ｃａｓは１つの断片であってもよく、ここでＣａｓ分子の活性ドメインは含まれ、これにより、分子の大きさを減らしている。したがって、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ分子は、現在の遺伝子処置に採用される手法に類似して臨床的に使用することができる。具体的には、細胞移植療法並びにＨＩＶ−１ワクチン接種のためのＣａｓ９／多重ｇＲＮＡ安定発現幹細胞またはｉＰＳ細胞が、被験者における使用のために開発されるであろう。
【０１００】
形質導入された細胞が再注入のために確立された方法で調製される。培養物中で約２〜４週間の期間の後、細胞の数は１×１０６と１０１０の間である。これに関して、細胞の増殖特性は、患者と患者の間および細胞型と細胞型の間で異なる。形質導入された細胞の再注入の約７２時間前に、１つのアリコートが表現型および処置薬を発現する細胞の割合を分析するために採取される。投与のため、本発明の細胞は、種々の濃度における、細胞型のＬＤ５０および細胞型の副作用により決定される、体重および患者の全体的な健康に適用される、速度で投与されうる。投与は、単回または分割用量を介して達成されうる。成体幹細胞も、かれらの生産を刺激し、限定されないが骨髄や脂肪組織を含む組織またはスペースから放出される、外来投与される要素を使用して動員することができる。
【０１０１】
（製造品）
本明細書に記載の組成物は、例えば、レトロウイルス感染、例えばＨＩＶ感染を有する被験者、またはレトロウイルス感染、例えばＨＩＶ感染を罹患するリスクのある被験者を処置するための治療薬として使用するために標識化された適切な容器に収容されうる。容器は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−関連エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、およびヒト免疫不全ウイルスに相補的なガイドＲＮＡ、またはその核酸、をコードする１つの核酸、またはその核酸をコードする１つのベクター、および１つ以上の適切な安定剤、担体分子、香味料、および／または意図される用途のために適切な類似のものを有する、１つの組成物を含みうる。したがって、パッケージ製品（例えば、１つ以上の本明細書に記載の組成物を含み、濃縮またはすぐに使用できる濃度で貯蔵、出荷、または販売用に包装された滅菌容器）および、少なくとも一つの本発明の組成物、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよびヒト免疫不全ウイルス内の標的配列に対して相補的なガイドＲＮＡをコードする１つの核酸配列、またはその核酸をコードする１つのベクター、および使用説明書、を含むキットは、本発明の範囲に含まれる。製品は、一つまたはそれ以上の本発明の組成物を含む容器（例えば、バイアル、ジャー、ボトル、バッグ、等）を含みうる。さらに製造品は、例えば、包装材料、使用説明書、シリンジ、送達装置、予防または処置が必要とされる病状を処置またはモニターするためのバッファまたは他の対照試薬を含んでよい。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の抗レトロウイルス薬、例えば、逆転写阻害薬、プロテアーゼ阻害薬、または導入阻害薬、を含みうる。追加の薬剤は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、およびヒト免疫不全ウイルス内の標的配列に対して相補的なガイドＲＮＡ、をコードする核酸配列、またはその核酸をコードするベクター、と同じ容器内に一緒にパッケージされても、あるいは別々にパッケージされてもよい。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよびヒト免疫不全ウイルス内の標的配列に対して相補的なガイドＲＮＡ、をコードする核酸配列、またはその核酸をコードするベクター、とその追加の薬剤は使用の直前に組み合わされても、あるいは別々に投与されてもよい。
【０１０３】
製品はまた、レジェンド（例えば、製品の使用方法を記載した印刷ラベルまたはインサートまたは他の媒体（例えば、オーディオまたはビデオテープ））を含んでよい。レジェンドは容器に付随（例えば容器の付属品）していてもよく、そしてその中に含まれる組成物の投与の態様（例えば、投与の頻度および経路）、そのための指示、および他の用途を記載してもよい。組成物はすぐに投与可能であってもよく（例えば容量が適切なユニットになっている）、そして１つ以上の医薬的に許容可能な免疫賦活剤、担体、または他の希釈剤、および／または追加の処置剤を含んでもよい。あるいは、組成物は濃縮された形態で希釈剤および希釈の指示書と共に提供されてもよい。
【０１０４】
（例）
（事例１：材料と方法）
プラスミドの調製：ヒトＣａｓ９とｇＲＮＡ発現カセットを含むベクター、ｐＸ２６０およびｐＸ３３０（Ａｄｄｇｅｎｅ）が、種々の構築物ＬＴＲ−Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤを作成するために利用された。
細胞培養および安定な細胞株：ＴＺＭ−ｂｌレポーターおよびＵ１細胞株は、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ試薬プログラムから得られ、ＣＨＭＥ５ミクログリア細胞は、当技術分野で知られている。
免疫組織化学およびウエスタンブロット：細胞の免疫細胞化学観察のための標準的な方法、およびウエスタンブロットによるタンパク質発現の評価が使用された。
ホタルルシフェラーゼ検定：細胞は、処置後２４時間後に受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して溶解され、そしてルシフェラーゼレポーター遺伝子検定キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造業者のプロトコルに従って検定された。ルシフェラーゼ活性は、平行ＭＴＴ検定（Ｖｙｂｒａｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって測定された細胞数に対して正規化された。
ｐ２４  ＥＬＩＳＡ：感染または再活性化後、上清中のＨＩＶ−１ウイルス負荷のレベルが、ｐ２４Ｇａｇ  ＥＬＩＳＡ（アドバンスド・バイオサイエンス・ラボラトリーズ社）により、製造業者のプロトコルに従って定量化された。処置時の細胞生存率を評価するため、ＭＴＴ検定が平行で、製造業者の取扱説明書（Ｖｙｂｒａｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に従って、実施された。
ＥＧＦＰフローサイトメトリー：細胞はトリプシン処理され、ＰＢＳで洗浄され、そして室温で１０分間、２％パラホルムアルデヒド中で固定され、次いで、ＰＢＳで２回洗浄され、そしてＧｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅミニフローサイトメータ（グアバテクノロジーズ）を用いて解析された。
【０１０５】
ＨＩＶ−１レポーターウイルス調製及び感染：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ｐＮＬ４−３−ＡＥ−ＥＧＦＰ（ＮＩＨエイズ研究および対照試薬プログラム）で、リポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて遺伝子導入された。４８時間後、上清が収集され、０．４５μｍで濾過され、感染マーカーとしてＥＧＦＰを用いてヒーラー細胞内でタイターされた。ウイルス感染のために、安定したＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＴＺＭ−ｂｌ細胞が、希釈ウイルスストックで２時間インキュベートされ、その後ＰＢＳで２回洗浄された。感染後２日および４日に、細胞が回収され、固定され、ＥＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーによって分析され、またはＰＣＲおよび全ゲノム配列決定のためゲノムＤＮＡの精製が実施された。
ゲノムＤＮＡの増幅、ＰＣＲ、ＴＡクローニング、およびサンガー配列決定、ゲノムウォーカーリンクＰＣＲ：クローニングおよび配列決定のためのＤＮＡ操作に対する標準的な方法が使用された。ＨＩＶ−１の組み込み部位の同定のため、我々は、レンチＸ（登録商標）組込み部位分析キットを使用した。
【０１０６】
サーベイヤ検定：ＰＣＲ産物における変異の存在は、サーベイヤ変異検出キット（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）を用いて製造業者のプロトコルに従って検査された。簡潔には異種起源のＰＣＲ産物は、９５℃で１０分間で変性し、サーモサイクラーを用いて徐冷することによりハイブリダイズされた。次に、３００ｎｇのハイブリダイズされたＤＮＡ（９μｌ）が、０．２５μｌのＳＵＲＶＥＹＯＲエンハンサーＳと１５ｍＭのＭｇＣｌの存在下で、０．２５μｌのＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼで４２℃で４時間消化を受けた。その後停止溶液が添加され、そして等量の未消化ＰＣＲ産物の対照と共に２％アガロースゲル内で分離された。いくつかのＰＣＲ産物は、制限断片長多型解析に使用された。等量のＰＣＲ産物がＢｓａＪＩで消化された。消化されたＤＮＡは、臭化エチジウム含有アガロースゲル（２％）上で分離された。配列決定のために、ＰＣＲ産物を、ＴＡ  クローニング（登録商標）キット二重プロモーターを用いてｐＣＲ（登録商標）ＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でクローニングした。インサートをＥｃｏＲＩで消化することにより確認し、ポジティブクローンをサンガー配列決定のためジーンウィズ社に送った。
【０１０７】
ＬＴＲ標的部位の選択、全ゲノム配列決定とバイオインフォマティクスと統計分析：
ＬＴＲ内の潜在的な標的部位の最初の同定のため、ジャック・リンのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｇＲＮＡファインダーツールを使用した。
プラスミド調製：ＬＴＲ−ＡまたはＬＴＲ−Ｂを発現するｃｒＲＮＡ前駆体のためのＤＮＡセグメントが、ピューロマイシン選択遺伝子を含むｐＸ２６０ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ社、プラスミド＃４２２２９）の中にクローニングされた。ＬＴＲ−ＣまたはＬＴＲ−Ｄを発現するキメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡのためのＤＮＡセグメントが、ｐＸ３３０ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ社、プラスミド＃４２２３０）の中にクローニングされた。両ベクター共に、ＣＡＧプロモーターによって駆動されるヒト化Ｃａｓ９コーディング配列、およびヒトＵ６プロモーターによって駆動されるｇＲＮＡ発現カセットを含む。ベクターは、ＢｂｓＩで消化され、そしてアンタークティックホスファターゼで処理され、そして直線化ベクターは、クイックヌクレオチド除去キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製された。各標的部位（図１４、アルファＤＮＡ）に対する一対のオリゴヌクレオチドが、徐冷され、リン酸化され、そして直線化ベクターに連結された。ｇＲＮＡ発現カセットは、Ｕ６配列決定プライマー（図１４）でジーンウィズ社において配列決定された。ｐＸ３３０ベクターに対し、我々は直接遺伝子導入または他のベクターへのサブクローニングのため、ｇＲＮＡ発現カセット（Ｕ６−ｇＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ−ステム−ｔｒａｃｒＲＮＡ）を開裂することができる、オーバーハング消化部位を持つ１対のユニバーサルＰＣＲプライマー（図１４）を設計した。
【０１０８】
細胞培養  Ｊｏｈｎ  Ｃ．Ｋａｐｐｅｓ博士、Ｘｉａｏｙｕｎ  Ｗｕ博士およびＴｒａｎｚｙｍｅ社からのＴＺＭ−ｂｌレポーター細胞株，およびＴｈｏｍａｓ  Ｆｏｌｋｓ博士からのＵ１／ＨＩＶ−１細胞株、およびＥｒｉｃ  Ｖｅｒｄｉｎ博士からのＪ−Ｌａｔ全長クローンが、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ試薬プログラム、エイズ部門、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨを通じて得られた。ＣＨＭＥ５／ＨＩＶ胎児ミクログリア細胞株は、以前に記載のように作製された。ＴＺＭ−ｂｌおよびＣＨＭＥ５細胞は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充されたダルベッコ基礎培地高グルコ−ス中で培養された。Ｕ１およびＪ−Ｌａｔ細胞は、２．０ｍＭのＬ−グルタミン、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養された。
安定な細胞株およびサブクローニング  ＴＺＭ−ｂｌまたはＣＨＭＥ５／ＨＩＶ細胞は  １．５×１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種され、そしてリポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１μｇのｐＸ２６０（ＬＴＲ−Ａ及びＢの場合）または１μｇ／０．１μｇのｐＸ３３０／ｐＸ２６０プラスミド（ＬＴＲ−ＣおよびＤの場合）で遺伝子導入された。翌日、細胞は１００ｍｍディッシュに移され、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む増殖培地（Ｓｉｇｍａ）でインキュベートされた。二週間後、生存細胞コロニーがクローニングシリンダー（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を用いて単離された。Ｕ１細胞（１．５ｘ１０５）は１μｇのＤＮＡで、１０μｌチップ、３×１０ｍｓ１４００Ｖのインパルスを使用してネオン（登録商標）トランスフェクションシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）においてエレクトロポレーションされた。細胞は、０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンで２週間に亘って選択された。安定したクローンが限界希釈法を使用して９６ウェルプレート内で継代培養され、そして単一細胞由来のサブクローンがさらなる研究のために維持された。
【０１０９】
免疫細胞化学およびウエスタンブロット  Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ安定発現ＴＺＭ−ｂｌ細胞は、８ウェルチャンバースライド内で２日間培養され、そして４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で１０分間固定された。３回洗浄後、細胞は０．５％トリトンＸ−１００／ＰＢＳで２０分間処理され、そして、１０％ロバ血清中で１時間ブロックされた。  細胞は、マウス抗フラッグＭ２一次抗体（１：５００、シグマ社）と共に４℃で一晩インキュベートされた。３回洗浄後、細胞はロバ抗マウスアレクサ・フルーア−５９４二次抗体で１時間インキュベートされ、そしてヘキスト３３２５８とともに５分間インキュベートされた。ＰＢＳで３回洗浄後、細胞は抗退色水性マウント培地（Ｂｉｏｍｅｄａ社）でカバースリップされ、そしてライカＤＭＩ６０００Ｂ蛍光顕微鏡下で分析された。
【０１１０】
６ウェルプレート中で培養されたＴＺＭ−ｂｌ細胞は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％トリトンＸ−１００、５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸，５ｍＭのジチオトレイトール，１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｘ核抽出プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ），１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、および３０ｍＭのＮａＦを含有する、２００μｌのトリトンＸ−１００ベース溶解緩衝液中で可溶化された。細胞溶解物は４℃で３０分間回転された。細胞核および細胞の破片が４℃で２０分間２０，０００ｇで遠心分離することによって除去された。等量の溶解物タンパク質（２０μｇ）がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプル緩衝液中で５分間煮沸することにより変性され、トリス−グリシン緩衝液中のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画され、そしてニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ社製）に移された。ＳｅｅＢｌｕｅ予備染色標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を分子量の基準として使用した。ブロットは１時間５％ＢＳＡ／トリス緩衝生理食塩液（ｐＨ７．６）および０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）でブロッキングされ、そしてその後、マウス抗フラッグＭ２モノクローナル抗体（１：１０００、Ｓｉｇｍａ社）またはマウス抗ＧＡＰＤＨモノクローナル抗体（１：３０００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて４℃で一晩インキュベートされた。ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、ブロットは室温で１時間ＩＲＤｙｅ６８０ＬＴ結合抗マウス抗体とインキュベートされた。膜は、スキャンされ、そしてオデッセイ赤外線イメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析された。
【０１１１】
ホタルルシフェラーゼ検定  細胞は、受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して処理後２４時間後に溶解され、製造業者のプロトコルに従って、ルシフェラーゼレポーター遺伝子検定キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて検定された。ルシフェラーゼ活性は、平行ＭＴＴ検定（Ｖｙｂｒａｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で測定された細胞数に対して正規化された。
ｐ２４ＥＬＩＳＡ  感染または再活性化した後、上清中のＨＩＶ−１ウイルス負荷レベルは、製造業者のプロトコルに従ってｐ２４  Ｇａｇ  ＥＬＩＳＡ（アドバンスト・バイオサイエンスラボラトリーズ社）によって定量された。処置の際の細胞の生存率を評価するために、製造業者のプロトコルに従ってＭＴＴ検定（Ｖｙｂｒａｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が平行で行われた。
ＥＧＦＰフローサイトメトリー  細胞はトリプシン処理され、ＰＢＳで洗浄され、そして２％パラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定され、その後、ＰＢＳで２回洗浄され、そしてグアバＥａｓｙＣｙｔｅミニフローサイトメータ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて分析された。
【０１１２】
ＨＩＶ−１レポーターウイルス調製及び感染  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、リポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＮＬ４−３−ΔＥ−ＥＧＦＰ、ＳＦ１６２とＪＲＦＬ（ＮＩＨエイズ研究および標準試薬プログラム）で遺伝子導入された。偽型ｐＮＬ４−３−ΔＥ−ＥＧＦＰのために、ＶＳＶＧベクターが共導入された。  
４８時間後、上清が回収され、０．４５μｍで濾過され、そして感染マーカーとして発現ＥＧＦＰを用いてヒーラー細胞内で滴定された。ウイルス感染のために、安定したＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＴＺＭ−Ｂｌ細胞は、希釈されたウイルスストックで２時間インキュベートされ、そしてＰＢＳで２回洗浄された。感染後２日目および４日目に、細胞は回収され、固定され、そしてＥＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーによって分析され、またはＰＣＲおよび全ゲノム配列決定のためにゲノムＤＮＡの精製が実施された。
ゲノムＤＮＡ精製、ＰＣＲ、ＴＡクローニングおよびサンガー配列決定  ゲノムＤＮＡは、製造業者が推奨するプロトコルに従ってＡｒｃｈｉｖｅＰｕｒｅ  ＤＮＡ細胞／組織精製キット（５ＰＲＩＭＥ社）を用いて細胞から単離された。抽出されたＤＮＡの１００ｎｇが、図１４に記載のプライマーを用いた高忠実度のＦａｉｌＳａｆｅ  ＰＣＲキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を用いてＰＣＲを受けた。標準的ＰＣＲの３つのステップが５５℃のアニーリングと７２℃の伸長の３０サイクルに亘って実行された。産物は２％アガロースゲル内に溶解された。対象バンドはゲル精製され、そしてｐＣＲＩＩＴ−Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングされ、そして個々のクローンのヌクレオチド配列は、ユニバーサルＴ７および／またはＳＰ６プライマーを用いてジーンウィズで配列決定により決定された。
【０１１３】
従来型およびリアルタイム逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ  全ＲＮＡ抽出のために、細胞が、製造者の指示に従ってＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて処理された。潜在的残留ゲノムＤＮＡは、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅセット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてカラム上でのＤＮａｓｅ消化を介して取り除かれた。各サンプルの１μｇのＲＮＡは、ランダムヘキサヌクレオチドプライマーを用いて高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）でｃＤＮＡに逆転写された。従来型ＰＣＲは、標準的プロトコルを用いて実施された。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析は、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＰＣＲマスターミックスキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、ライトサイクラー４８０（Ｒｏｃｈｅ社）で行われた。逆転写反応は反応物１マイクロリットル当たり５ｎｇの全ＲＮＡに希釈され、そして２μｌが２０−μｌＰＣＲ反応に使用された。ＨＩＶ−１プロウイルスのｑＰＣＲ分析のために、５０ｎｇのゲノムＤＮＡが使用された。プライマーはＡｌｐｈａＤＮＡにおいて合成され、図１４に示される。ヒトハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨとＲＰＬ１３Ａためのプライマーは、リアルタイムプライマー社（Ｅｌｋｉｎｓ  Ｐａｒｋ、ＰＡ）から入手した。各サンプルは３回試験された。サイクル閾値（Ｃｔ）が、標的遺伝子及びハウスキーピング遺伝子についてグラフから得られた。ハウスキーピング遺伝子と標的遺伝子との間のＣｔ値の差は、ΔＣｔ値として示された。ΔΔＣＴ値は、対照試料のΔＣｔ値を実験試料のΔＣｔ値から差し引くことにより得られた。相対的な倍数またはパーセント変化は、２−ΔΔＣｔとして計算された。いくつかの場合には、絶対的定量化が、ヒトゲノムＤＮＡに標準としてスパイクされたｐＮＬ４−３−ΔＥ−ＥＧＦＰプラスミドを用いて実施された。ＨＩＶ−１ウイルスのコピー数は、ハウスキーピング遺伝子での正規化後の標準曲線に基づいて計算された。
【０１１４】
ゲノムウォーカーリンクＰＣＲとロングレンジＰＣＲ  宿主細胞におけるＨＩＶ−１の組込み部位は、製造業者の指示に従ってレンチＸ（登録商標）組込部位分析キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて同定した。簡潔には、高品質ゲノムＤＮＡがＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ組織キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、Ｕ１細胞から抽出された。ウイルス組み込みライブラリを構築するために、各ゲノムＤＮＡサンプルは、平滑末端生成消化酵素ＤｒａＩ、ＳｓｐＩまたはＨｐａＩで別々に３７℃で一晩消化された。消化効率は、０．６％アガロース上での電気泳動によって確認された。消化したＤＮＡはＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎゲルおよびＰＣＲクリーンアップキットを用いて精製され、その後消化されたゲノムＤＮＡ断片はゲノムウォーカー（登録商標）アダプターに１６℃で一晩かけて結合された。結合反応は、５分間７０℃でインキュベートすることによって停止され、そしてＴＥ緩衝液で５倍に希釈された。一次ＰＣＲは、アダプタープライマー１（ＡＰＩ）およびＬＴＲ特異的プライマー１（ＬＳＰ１）でアドバンテージ２ポリメラーゼミックスを使用して実施され、その後ＡＰ２とＬＳＰ２プライマー（図１４）を用いた二次（ネスト）ＰＣＲが実施された。二次ＰＣＲ産物は１．５％臭化エチジウムを含有するアガロースゲル上で分離された。主要なバンドはゲル精製され、そしてｐＣＲＩＩ−Ｔ−Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングされ、そして個々のクローンのヌクレオチド配列は、ユニバーサルＴ７およびＳＰ６プライマーを用いてジーンウィズにおいて配列決定により決定された。配列読み出しは、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ検索により分析された。Ｕ１細胞内のＨＩＶ−１の２つの組込み部位が、染色体Ｘおよび染色体２において同定された。各組込み部位（図１４）をカバーする１対のプライマーがＡｌｐｈａＤＮＡ内で合成された。Ｕ１ゲノムＤＮＡを用いたロングレンジＰＣＲが、製造業者のプロトコルに従ってＰｈｕｓｉｏｎ高忠実度ＰＣＲキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて実施された。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲル上で可視化され、サンガー配列決定により検証された。
【０１１５】
サーベイヤー検定  ＰＣＲ産物中の変異の存在が、製造業者のプロトコルに従ってＳＵＲＶＥＹＯＲ変異検出キット（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ社）を用いて試験された。簡潔には異種起源のＰＣＲ産物は、９５℃で１０分間変性され、そしてサーモサイクラーを用いて徐々に冷却することによりハイブリダイズされた。次に３００ｎｇのハイブリダイズしたＤＮＡ（９ＵＬ）は、４２℃で４時間、０．２５μｌのＳＵＲＶＥＹＯＲエンハンサーＳと１５ｍＭのＭｇＣｌの存在下で０．２５μｌのＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼで消化を受けた。その後停止溶液が添加され、そしてサンプルは等量の未消化ＰＣＲ産物と共に２％アガロースゲルの中に溶解された。いくつかのＰＣＲ産物が、制限断片長多型解析に使用された。等量のＰＣＲ産物がＢｓａＪｌで消化された。消化されたＤＮＡは、臭化エチジウム含有アガロースゲル（２％）上で分離された。配列決定のために、ＰＣＲ産物は、ｐＣＲ（登録商標）ＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でＴＡクローニング（登録商標）キット二重プロモーターを用いてクローニングされた。挿入物は、ＥｃｏＲＩでの消化により確認され、そしてポジティブクローンはサンガー配列決定のためジーンウィズに送られた。
【０１１６】
ＬＴＲ標的部位の選択と潜在的オフターゲット部位の予測  最初の研究のために、我々は継代中のＬＴＲの潜在的な変異に起因して、ヒトＴＺＭ−ｂｌ細胞のゲノムから、ＰＣＲ産物のＴＡクローニング配列決定により、組み込みレンチウイルスＬＴＲルシフェラーゼレポーターのＬＴＲプロモーター配列（−４１１から−１０まで）を得た。このプロモーター配列は、ｐＨＲ´−ＣＭＶ−ＬａｃＺレンチウイルスベクター（ＡＦ１０５２２９）の５´−ＬＴＲに対して１００％の一致を有する。このように、完全長のｐＨＲ´５´−ＬＴＲ（６３４ｂｐ）のセンス配列およびアンチセンス配列が、ジャック・リンのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｇＲＮＡファイダーツール（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｏｔ．ｃｏｌｏｒａｄｏ．ｅｄｕ／〜ｓｌｉｎ／ｃａｓ９．ｈｔｍｌ）を使用して、２０ｂｐの標的配列とＰＡＭシーケンス（ＮＲＧ）を含むＣａｓ９／ｇＲＮＡ標的部位を探索するために使用された。完全一致の潜在的なオフターゲットの数は、各ｇＲＮＡ標的配列とＮＲＧ（ＡＧＧ、ＴＧＧ、ＧＧＧとＣＧＧ；ＡＡＧ、ＴＡＧ、ＧＡＧ、ＣＡＧ）を、利用可能なすべてのヒトゲノム配列と転写配列に対し、ＮＣＢＩ／ｂｌａｓｔｎスイートをＥ値カットオフ１，０００そしてワードサイズ７で用いて、ブラストすることにより予測された。コントロール＋Ｆを押した後、標的配列（１−２３から９−２３ヌクレオチドまで）をコピー／ペーストし、それにより標的配列に１００％一致するゲノム標的の数がわかる。各検索に対するオフターゲットの数は、繰り返しゲノムライブラリーのため３で除された。
【０１１７】
全ゲノム配列決定とバイオインフォマティクス解析  ＴＺＭ−ＢＬ細胞の対照サブクローンＣ１と実験サブクローンＡＢ７が、目標カット効率及びＬＴＲ−ルシフェラーゼレポーターの機能抑制に関し検証された。ゲノムＤＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ組織キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて単離された。ＤＮＡサンプルはテンプル大学フォックスチェイスがんセンターのネクストジェンシークエンシング施設に提出された。２重のゲノムＤＮＡライブラリが、製造業者の指示に従って、イルミナのためのＮＥＢＮｅｘｔウルトラＤＮＡライブラリプレップキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社）を用いて、各サブクローンから調製された。すべてのライブラリは、ＨｉＳｅｑ２５００装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）上の２つのイルミナラピッドランフローセルにおける対形成末端１４１ｂｐ読み出しで配列決定された。配列決定されたライブラリからのデマルチプレクスされた読み取りデータは、専門的バイオインフォマティクス解析のためＡｃｃｕｒａＳｃｉｅｎｃｅ、ＬＬＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｕｒａｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）に送られた。簡単に言えば、生の読み取りデータはＢｏｗｔｉｅ２を使用して、ヒトゲノム（ｈｇｌ９）とＨＩＶ−１ゲノムに対してマッピングされた。ゲノム解析ツールキット（ＧＡＴＫ、バージョン２．８．１）が重複読み出しの除去、ローカルアライメント、塩基品質の再較正と挿入欠失呼び出しのために使用された。信頼度スコア１０と３０は、それぞれ低品質（ＬｏｗＱｕａｌ）と高信頼性呼出し（ＰＡＳＳ）のしきい値であった。様々な不一致を有するＬＴＲ−Ａ及びＬＴＲ−Ｂの潜在的なオフターゲット部位が、上記のＮＣＢＩ／ｂｌａｓｔｎスイートおよびＣＲＩＳＰＲ設計ツール（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）によって予測された。すべての潜在的なｇＲＮＡ標的部位（図１５）はＧＡＴＫによって識別される各挿入欠失の周りの±３００ｂｐの領域をマッピングするために使用された。ヒトゲノムおよびＨＩＶ−１ゲノム中の重複領域の位置が対照Ｃ１と実験的ＡＢ７の間で比較された。
【０１１８】
統計分析  定量的データは、３〜５回の独立した実験からの平均±標準偏差を表し、そしてスチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡ及びニューマン−クールズ多重比較検定により評価された。ｐ値＜０．０５または０．０１は、統計的に有意な差異とみなされた。
【０１１９】
（事例２：Ｃａｓ９／ＬＴＲ−ｇＲＮＡはＨＩＶ−１に潜伏感染したＣＨＭＥ５ミクログリア細胞におけるＨＩＶ−１レポーターウイルス産生を抑制する）
我々は、ＨＩＶ−１指向ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡｓ）の、ＬＴＲの転写活性を阻害し、脳内のＨＩＶ−１貯蔵場所として機能し、特に難治性の集団である、潜伏感染骨髄細胞のゲノムからプロウイルスＤＮＡを根絶する能力について評価した。我々の戦略は、ＨＩＶ−１  ＬＴＲプロモーターのＵ３領域を標的とすることに焦点を当てた。バイオインフォマティクススクリーニングおよび効率／オフターゲット予測により、我々は保存された転写因子結合部位を避け、宿主の遺伝子発現を変化させる可能性を最小限に抑える、４つのｇＲＮＡ標的（プロトスペーサ；ＬＴＲ  Ａ−Ｄ）を同定した（図５および１３）。我々は、ｇＲＮＡ  Ａ−Ｄに相補的なＤＮＡ断片をヒト化Ｃａｓ９発現ベクター（ｐＸ２６０でＡ／Ｂ；ｐＸ３３０でＣ／Ｄ）に挿入し、そして、組み込みＨＩＶ−１ゲノム活性を変化させるそれらの個々のそして組み合わせた能力を試験した。
【０１２０】
我々は最初、５´および３´ＬＴＲを含む単一ラウンドＨＩＶ−１ベクターの組込まれたコピーを保有するミクログリア細胞株ＣＨＭＥ５および、Ｇａｇ（ｐＮＬ４−３−ΔＧａｇ−ｄ２ＥＧＦＰ）を置換する強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）レポーターをコードする１つの遺伝子を使用した。ＣＨＭＥ５細胞をトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤で処理することは、組み込まれたプロウイルスの大部分からの転写を再活性化し、そしてＥＧＦＰおよび残りのＨＩＶ−１プロテオームの発現をもたらす。ｇＲＮＡプラスＣａｓ９の発現はＴＳＡ誘導ＥＧＦＰポジティブなＣＨＭＥ５細胞の割合を著しく減少させた（図１Ａおよび６）。我々は、ＣｅｌＩヌクレアーゼ系ヘテロ二本鎖特異ＳＵＲＶＥＹＯＲ検定を用いて、ＬＴＲ  Ａ−Ｄ（図１Ｂおよび図６Ｂ）に対する挿入／欠失遺伝子変異（インデル）を検出した。同様に、ホタル−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を駆動する安定的に組み込まれたＨＩＶ−１  ＬＴＲコピーを含む、ヒーラー細胞由来のＴＺＭ−ｂｌ細胞中のＬＴＲ  ＣとＤを標的とするｇＲＮＡｓの発現は、ウイルスプロモーター活性を抑制し（図７Ａ）、そしてＬＴＲ  Ｕ３領域（図７Ｂ−Ｄ）内のインデルを誘発し、それはＳＵＲＶＥＹＯＲとサンガー配列決定によって実証された。また、これらの細胞におけるＬＴＲ  Ｃ／Ｄを標的とするｇＲＮＡｓの組み合わせ発現は、予測された３０２ｂｐのウイルスＤＮＡ配列の切除、および残留１９４ｂｐの断片（図７Ｅ−Ｆ）の出現を引き起こした。
【０１２１】
混合クローンＣＨＭＥ５細胞中のＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡｓの多重発現は、ＡとＢの標的部位の間の１９０−ｂｐの断片の欠失を引き起こし、そして様々な程度でインデルにつながった（図１Ｃ−Ｄ）。＞２０のピューロマイシン選択、安定サブクローンの中で、我々は、ＥＧＦＰ（図ＩＥ）用のフローサイトメトリーによって決定された、ＴＳＡ誘発性ＨＩＶ−１プロウイルスの再活性化を完全に阻害する細胞集団を発見した。プロウイルスゲノムにおけるＥＧＦＰおよびＨＩＶ−１のＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）に対するＰＣＲベースの分析は、ＨＩＶ−１ゲノムの根絶を検証した（図１Ｆ、Ｇ）。さらに、ＰＣＲ産物の配列決定は、５´−３´ＬＴＲにまたがるウイルスゲノム全体が削除され、切断部位ＡとＢとの間の１９０ｂｐの切除を介した３５１ｂｐの断片（図１Ｇおよび８）、および、１７５ｂｐの挿入と２７ｂｐの欠失をそれぞれＬＴＲ−Ａおよび−Ｂサイトで持つ（図８Ｃ）６８２ｂｐの断片を得た、ことを明らかにした。残留ＨＩＶ−１ゲノム（図１Ｆ−Ｈ）は、トレースＣａｓ９／ｇＲＮＡネガティブ細胞の存在を反映する可能性がある。これらの結果は、ＬＴＲを標的とするＣａｓ９／ｇＲＮＡ  Ａ／Ｂは、潜伏感染ミクログリア細胞においてＨＩＶ−１ゲノムを根絶し、そしてその再活性化を阻害する、ことを示している。
【０１２２】
（事例３：Ｃａｓ９／ＬＴＲ−ｇＲＮＡが効率的にＵ１単球細胞から潜伏ＨＩＶ−１ウイルスを根絶する）
前単球Ｕ９３７細胞のサブクローンＵ１、感染した血管周囲性マクロファージおよび単球のためのＨＩＶ−１の潜伏モデルは、慢性的にＨＩＶ−１に感染され、そして低レベルの構成的ウイルス遺伝子の発現および複製を示す。ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒマッピングは、Ｕ１細胞内の染色体Ｘｐ１１−４（図２Ａ）および２ｐ２１（図９Ａ）で２つの組み込みプロウイルスＤＮＡのコピーを検出した。９７０９ｂｐのプロウイルスＨＩＶ−１ＤＮＡ全体プラス隣接する２２６ｂｐのＸ染色体由来の配列（図２Ａ）を示す９９３５ｂｐのＤＮＡ断片、および９７０９ｂｐのＨＩＶ−１ゲノムプラスその隣接する２染色体由来の４６７ｂｐを含む１０１７６ｂｐの断片（図９Ａ、Ｂ）が、親対照または空ベクター（Ｕ６−ＣＡＧ）Ｕ１細胞のロングレンジＰＣＲ分析により同定された。２２６ｂｐおよび４６７ｂｐの断片はそれぞれ、Ｘ染色体と２番染色体の他のコピーからの予測セグメントを表し、それらは組み込まれたプロウイルスＤＮＡを欠いた。ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡｓとＣａｓ９を発現するＵ１細胞内で、我々はＸ染色体内に８３３及び６７０ｂｐの二つの追加のＤＮＡ断片を、そして２番染色体内に１１０２ｂｐの１つの追加のＤＮＡ断片を発見した。したがってｇＲＮＡ  Ａ／Ｂは、Ｃａｓ９が両方の染色体においてＨＩＶ−１の５´−３´ＬＴＲにまたがるウイルスゲノムセグメントを切除することを可能にした。８３３ｂｐの断片は、宿主ゲノムからの予想される２２６ｂｐおよびＬＴＲ−Ａ部位の周りの約２７ｂｐの欠失を有する６０７ｂｐのウイルスＬＴＲ配列を含む（図２Ａ−Ｂ）。６７０ｂｐ断片は、両方のＬＴＲにおけるｇＲＮＡ  Ａ／Ｂ誘導切断に起因する（図２Ａ）１９０ｂｐの断片切除後に２２６ｂｐの宿主配列と残留４４４ｂｐのウイルスのＬＴＲ配列を包含した（図１Ｄ）。
【０１２３】
追加の断片は、循環型ＬＴＲ組み込みを介しては出現しなかった、なぜなれば、それは親のＵ１細胞には存在せず、そしてそのような循環型ＬＴＲウイルスゲノム構成は、ＨＩＶ−１感染の直後に発生するが、短命であり、そして繰り返される継代に不耐性である。これらの細胞は、機能的ｐ２４ＥＬＩＳＡ複製検定（図２Ｃ）およびリアルタイムＰＣＲ分析（図９Ｃ、Ｄ）で示されるように、実質的に減少したＨＩＶ−１ウイルス負荷を発現した。検出可能であるが低い、残留ウイルス負荷と再活性化は、細胞集団の異種起源性および／または不完全なゲノム編集に起因する可能性がある。我々はまた、組み込みＨＩＶ−Ｒ７／Ｅ−／ＥＧＦＰを保有する潜伏感染Ｊ−Ｌａｔ  Ｔ細胞において、Ｃａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡによるＨＩＶ−１ゲノムの切除を、フローサイトメトリー分析、ＳＵＲＶＥＹＯＲ検定およびＰＣＲ遺伝子型決定（図１０）を使用して検証し、その結果はＣａｓ９／ｇＲＮＡとＺＦＮによるジャーカットＴ細胞におけるＨＩＶ−１プロウイルスの削除に関する以前の報告の結果を支持した。まとめると、我々の結果は、多重ＬＴＲ−ｇＲＮＡｓ／Ｃａｓ９システムは、ヒトＨＩＶ−１潜伏感染に典型的な、ＨＩＶ−１潜伏感染「貯蔵場所」（ミクログリア、単球およびＴ）細胞において、そしてＨＩＶ−１転写および再活性化の検出に高感度のＴＺＭ−ｂｌ細胞において、ＨＩＶ−１複製および再活性化を効率的に抑制することを示唆している。５´−および３´−ＬＴＲを標的とする単一または多重ｇＲＮＡは、ＨＩＶ−１ゲノム全体を効率的に根絶した。
【０１２４】
（事例４：Ｃａｓ９プラスＬＴＲ−Ａ／Ｂの安定な発現は、ＴＺＭ−ｂｌ細胞を新規ＨＩＶ−１ウイルス感染に対しワクチン接種する）
次に我々は、安定的にＣａｓ９／ｇＲＮＡ−Ａおよび−Ｂを発現するＴＺＭ−ｂｌベースのクローンを用いて、Ｃａｓ９／ＬＴＲ  ｇＲＮＡの組み合わせがＨＩＶ−１感染に対して細胞を免疫化することができるかどうかを試験した（図３Ａ）。７つのピューロマイシン選択サブクローンの内の２つが１９０ｂｐのＬＴＲ−Ａ／Ｂ部位にまたがるＤＮＡ断片（図３Ｂ）の効率的な切除を示した。しかし、残りの５サブクローンには、サンガー配列決定によって確認されるように切除もインデル変異も示さなかった（図３Ｂ）。Ｃａｓ９およびＵ６−ＬＴＲを標的とするプライマーを用いたＰＣＲ遺伝子型決定は、これらの非有効なサブクローンのいずれもが、Ｃａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡ発現カセットの組み込まれたコピーを保持しないことを示した。（図１１Ａ、Ｂ）。その結果、完全長Ｃａｓ９の発現は検出されなかった（図１１Ｃ、Ｄ）。Ｃａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡの長期発現は、細胞の増殖や生存率に悪影響を及ぼさなかった。そのことはこのモデルにおいて、宿主ゲノムに対するオフターゲット干渉、またはＣａｓ９誘発毒性の低い発生率を示唆した。我々は、ＨＩＶ−１複製を示すフローサイトメトリーにより、ＥＧＦＰ−ポジティブな、ＶＳＶＧ偽型ｐＮＬ４−３−ΔＥ−ＥＧＦＰレポーターウイルスを細胞に感染させることによって、新規ＨＩＶ−１複製を評価した。対照Ｕ６−ＣＡＧ細胞とは異なり、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＬＴＲ−Ａ／Ｂを安定的に発現する細胞は、感染後２日目においてＨＩＶ−１複製をサポートすることに失敗した、それは、それらが効果的に新たなＨＩＶ−１感染に対して免疫化したことを示す（図３Ｃ−Ｄ）。ＨＩＶ−ｌに対する同様の免疫性が、ネイティブＴ−向性Ｘ４株ｐＮＬ４−３−ΔＥ−ＥＧＦＰレポーターウイルス（図１２Ａ）または、ＳＦ１６２およびＪＲＦＬ（図１２Ｂ−Ｄ）などのネイティブＭ向性Ｒ５株に感染したＣａｓ／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡ発現細胞で観察された。
【０１２５】
（事例５：ヒトゲノム上のＣａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂのオフターゲット効果）
Ｃａｓ９／ｇＲＮＡの介入アプローチとしての魅力は、その高度に特異的なオンターゲットのインデル生成切断にかかっているが、多重ｇＲＮＡは、潜在的に宿主ゲノム変異誘発および染色体異常、細胞毒性、遺伝子毒性、または腫瘍形成を引き起こす可能性がある。ウイルス−ヒトのかなり低いゲノム相同性は、このリスクを減少させるが、ヒトゲノムは、ＨＩＶ−１を指向したｇＲＮＡｓに潜在的に感受性の多数の内在性レトロウイルスゲノムを含む。したがって、我々は、選択されたＨＩＶ−１  ＬＴＲ  ｇＲＮＡｓのヒトゲノムに対するオフターゲット効果を評価した。プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）領域（ＮＧＧ）に最近接の１２−１４ｂｐのシード配列が切断特異性のために重要であるため、我々は、＞１４ｂｐのシード＋ＮＧＧをサーチし、そしてＬＴＲ  ｇＲＮＡｓのＡ−Ｄによってオフターゲット候補部位を全く発見しなかった（図１３）。連続的により短いｇＲＮＡセグメントが、対応するオンターゲット対応配列に１００％一致したオフターゲット切断部位をより多くもたらしたこと（即ち、ＮＧＧ＋１３ｂｐは、それぞれ６、０、２、９個のオフターゲット部位をもたらし、一方ＮＧＧ＋１２ｂｐは１６、５、１６、２９個をもたらした；図１３）ことは驚くべきことではない。ヒトゲノムＤＮＡから、我々は、高忠実度ＰＣＲを用いて、予測されたオフターゲット部位の１つをカバーする５００−８００ｂｐの配列を取得し、潜在的変異をＳＵＲＶＥＹＯＲとサンガー配列決定により解析した。我々は変異を全く発見しなかった。（ＴＺＭ−ｂｌとＵ１細胞中の代表的オフターゲット部位＃１、５および６を参照；図４Ａ）
【０１２６】
総合的にオフターゲット効果のリスクを評価するために、我々は、安定的にＣａｓ９  ／ｇＲＮＡ  Ａ／Ｂを発現する細胞と対照Ｕ６−ＣＡＧ  ＴＺＭ−ｂｌ細胞を使用して全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）を実施した（図４Ｂ−Ｄ）。我々は、参照配列としてヒト（ｈｇｌ９）とＨＩＶ−１ゲノムを有するゲノム解析ツールキット（ＧＡＴＫ、ｖ．２．８．１）を使用して、６７６，１０５個のインデルを同定した。インデルのうち、２４％は、Ｕ６−ＣＡＧ対照で、２６％はＬＴＲ−Ａ／Ｂのサブクローンで、そして５０％はその両方で発生した（図４Ｂ）。このような大きなサンプル間インデル−呼び出しの不一致は、オフターゲット効果を可能性として示唆するが、しかし、その限られた信頼度、限られたＷＧＳカバレッジ（１５−３ＯＸ）、および細胞の異種起源性に起因する可能性が最も高い。ＧＡＴＫは確信を持って識別されたインデルのみを報告した：いくつかはＵ６−ＣＡＧ対照で発見されたがＬＴＲ−Ａ／Ｂでは発見されず、そしてそれ以外はＬＴＲ−Ａ／Ｂで発見されたがＵ６−ＣＡＧ対照では発見されなかった。私たちは、限られたＷＧＳカバー率に起因して、両方のサンプルに対し多くの欠落したインデル呼び出しを予測した。このような限られたインデル−呼び出し信頼度もまた偽陰性：ＬＴＲ−Ａ／Ｂでは発生するが、Ｕ６−ＣＡＧ対照では発生しない、見落とされたインデル：の可能性を示唆した。
【０１２７】
細胞の異種起源性はＣａｓ９／ｇＲＮＡ編集効率及び継代の効果の変動性に反映しうる。したがって、我々はＨＩＶ−１ゲノムのＬＴＲ−Ａ／Ｂ標的部位、および宿主ゲノムの予測される／潜在的ｇＲＮＡオフターゲット部位に対して、それぞれのインデルに隣接する±３００ｂｐを解析することにより、各インデルがＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡに誘導されたものか否かを試験した（図１５）。シード（１２ｂｐ）プラスＮＲＧを含む配列に１００％一致した配列について、我々は６７６，１０５インデルに対して９２の潜在的オフターゲット部位の８つの重複領域だけを同定した：６つのインデルは両方のサンプルで発生し、２つのインデルはＵ６−ＣＡＧ対照でのみ発生した（図４Ｃ、Ｄ）。  我々はまた、ＬＴＲ−Ａ／Ｂサブクローンでのみ発生したが、Ｕ６−ＣＡＧ対照では予想した通り発生しなかった、２つのインデルを同定した（図４Ｃ）。この結果は、ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡが、示された標的上のインデルを誘発するが、オフターゲットインデルを誘発しないことを示し、それは予想される／潜在的なオフターゲットサイトをカバーするＰＣＲ産物の深い配列決定を使用した従来技術における発見と一致した。
【０１２８】
我々の組み合わせアプローチは、高効率とゲノム的に組み込まれたＨＩＶ−１プロウイルスの完全な除去を達成しながら、オフターゲット効果を最小限に抑えた。外来のウイルスゲノムと内在性レトロウイルスＤＮＡを含む宿主細胞ゲノムの間の極めて低い相同性に加えて、我々の研究における重要な設計属性は：オフターゲットヒトトランスクリプトームまたは（まれに）非翻訳ゲノム部位を除外するための、最も厳しい１２ｂｐ＋ＮＧＧ標的選択基準を使用した、生物情報スクリーニング；ＨＩＶ−１  ＬＴＲプロモーター内の転写因子結合部位（潜在的に宿主ゲノム中に保存）を回避する；２０ｂｐのｇＲＮＡ、キメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃＲＮＡベースのシステムに対して特異性／効率性を強化するための、ＬＴＲ−Ａ−及び−Ｂ指向、３０ｂｐのｇＲＮＡ、および元の細菌の免疫機構を反映するプレｃｒＲＮＡシステムの選択；そして、潜在的なオフターゲット効果を識別して除外するためのＷＧＳ、サンガー配列決定およびＳＵＲＶＥＹＯＲ検定；を含む。確かに、新たに開発されたＣａｓ９ダブルニッキングおよびＲＮＡ誘導型のＦｏｋＩヌクレアーゼの使用は、オフターゲット効果を減少させながら、ＨＩＶ−１の様々な保存領域内の新しい標的の同定を補助することができる。
【０１２９】
我々の結果は、ＨＩＶ−１  Ｃａｓ９／ｇＲＮＡシステムが、異なる染色体上に位置している１つ以上のＬＴＲのコピーを標的にする能力を有することを示し、そのことは、このゲノム編集システムが、多重のプロウイルスＤＮＡを保有する潜伏感染患者の細胞内のＨＩＶ−１のＤＮＡ配列を変化させることができることを示唆した。さらに高い編集有効性と我々の技術の整合性を確保するために、患者サンプル中のＨＩＶ−１を根絶するためのターゲットとして、ＨＩＶ−１ゲノムの最も安定領域を考慮してもよいが、それはＨＩＶ−１の唯一の株を保有しないことがある。あるいは、処置用Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ分子を操作する前に、患者由来のウイルスゲノムの深い配列決定からのデータに基づいてパーソナライズされた処置法を開発してもよい。
【０１３０】
本発明者らの結果はまた、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡゲノム編集が、細胞をＨＩＶ−１感染に対して免疫化するために使用されうることを示している。ワクチンの予防接種は、システムがウイルスが感染した細胞に入る方法に関係なくゲノム配列を標的とするため、ＨＩＶ−１株の多様性とは無関係である。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡシステムの細胞内先在は、新たなＨＩＶ−１が宿主ゲノムに組み込まれる前にＨＩＶ−１の迅速な排除につながった。ＨＩＶ−１感染を根絶するため、リスクの高い被験者の免疫化のためのＣａｓ９／ＬＴＲ−ｇＲＮＡの送達、例えば、遺伝子処置（ウイルスベクターおよびナノ粒子）、および自家Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ修飾骨髄幹／前駆細胞または誘導多能性幹細胞の移植、のための様々なシステムを模索してもよい。
【０１３１】
本明細書では、ＨＩＶ−１標的ゲノムを編集する際のＣａｓ９／ｇＲＮＡの高い特異性を実証した。サブクローンデータからの結果は、ゲノム編集のＣａｓ９とｇＲＮＡ両方の存在に対する厳格な依存性を明らかにした。また、設計されたｇＲＮＡターゲットにおけるただ１つのヌクレオチド不一致が編集効力を無効にする。また、我々の設計した４つのＬＴＲ  ｇＲＮＡ全てが、異なる細胞株でよく機能し、そのことは、編集が宿主細胞ゲノムよりＨＩＶ−１ゲノム中においてより効率的であることを示した。ここで全ての設計されたｇＲＮＡは機能性を有さず、このことは、おそらく異なるエピジェネティック調節、可変ゲノムアクセシビリティ、または他の理由に起因する。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡの開発の容易さおよび迅速さを前提とすれば、上記のようにＨＩＶ−１変異が１つのＣａｓ９／ｇＲＮＡ処置法に対する抵抗性を付与しても、ＨＩＶ−１変異体は遺伝子型解析されて、個々の患者のためのもう１つの個別化処置を可能にする。
【０１３２】
本発明の多数の実施形態が記載されてきた。それにもかかわらず、種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解されよう。したがって、他の実施形態は以下の特許請求の範囲の内にある。
【図１Ａ−Ｄ】
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【図１Ｅ−Ｈ】
2020188757.tif 000003
【図２Ａ】
2020188757.tif 000004
【図２Ｂ−Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７Ａ−Ｅ】
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【図１７Ｆ−Ｈ】
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【図１８】
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【図１９】
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