(57)【要約】      （修正有）【課題】ピタバスタチンカルシウムを、工業的な規模で、高収率及び高選択性で、且つ安全に低コストで製造する方法の提供。【解決手段】下記一般式（１）で表される化合物をアセタール化して一般式（３）で表される化合物を得る工程（ｉ）、一般式（３）で表される化合物を酸と反応させて一般式（４）で表される化合物を得る工程（ｉｉ）及び一般式（４）で表される化合物を加水分解した後、カルシウム化合物と反応させる工程（ｉｉｉ）を含むことを特徴とするピタバスタチンカルシウムの製造方法。2020109102.tif 000073【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉｖ）下記一般式（６）：
【化１】
2020109102.tif 000068
（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖アルキル基又は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表す。）
で表される化合物とメタンスルホン酸とを１０℃〜５０℃の温度で反応させた後、下記一般式（１’）：
【化２】
2020109102.tif 000069
（式中、Ｘ１はメタンスルホン酸を表し、Ｒは前記と同義である。）
で表される化合物を結晶として析出させることを特徴とする前記一般式（１’）で表される化合物の製造方法。
【請求項２】
前記一般式（６）で表される化合物とメタンスルホン酸とを１０℃〜５０℃の温度で反応させた後、冷却することにより下記一般式（１’）で表される化合物を結晶として析出させることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記一般式（６）で表される化合物が、下記一般式（１０）：
【化３】
2020109102.tif 000070
（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖アルキル基又は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表す。）
で表される化合物、又は下記一般式（１４）：
【化４】
2020109102.tif 000071
（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖アルキル基又は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表す。）
で表される化合物に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて得られたものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
下記一般式（１’）：
【化５】
2020109102.tif 000072
（式中、Ｒはエチル基を表し、Ｘ１はメタンスルホン酸を表す。）
で表される化合物の結晶であって、２θ＝２０．６°及び２１．８°に相対強度の大きいピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有する結晶。
【請求項５】
さらに、２θ＝６．９°及び１３．５°に相対強度の大きいピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有する請求項４に記載の結晶。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピタバスタチンカルシウムの改良された製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピタバスタチンカルシウムは、コレステロール合成の律速酵素であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を特異的かつ拮抗的に阻害する活性を有しており、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症等の治療に用いられている。
ピタバスタチンカルシウムは、下記式：
【０００３】
【化１】
2020109102.tif 000002
【０００４】
で表される化学名：ビス［（３Ｒ，５Ｓ，６Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−３−キノリル］−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸］−カルシウムである。
ピタバスタチンカルシウムは、その前駆体化合物である下記一般式（１６）：
【０００５】
【化２】
2020109102.tif 000003
【０００６】
（式中、Ｒ７は炭素数１〜４のアルキル基である）
で表される２−［（４Ｒ，６Ｓ）−６−［（Ｅ）−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−３−キノリル］ビニル］−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−イル］酢酸エステルを加水分解することにより製造できることが知られている。
一般式（１６）で表される化合物は、ウィッティヒ（Ｗｉｔｔｉｇ）反応により得ることができる。
特許文献１には、ｎ−ブチルリチウムの存在下、−７８℃で、縮合ピリジン誘導体とアルデヒド化合物を反応させることにより、上記一般式（１６）で表される化合物を得ることが記載されている。
特許文献１に記載の方法は、反応が−７８℃という超低温で実施されることから、工業的生産には特殊な設備が必要であり、収率も低い。また、塩基として、発火しやすいｎ−ブチルリチウムを使用するため、工業的規模での製造には安全面で懸念がある。さらに、反応に用いるｎ−ブチルリチウムや三臭化リンが高価であるため、高コストである。
特許文献２には、下記一般式（１７）：
【０００７】
【化３】
2020109102.tif 000004
【０００８】
（式中、Ｒ７は上記と同義である。）
で表される化合物と下記一般式（１８）：
【０００９】
【化４】
2020109102.tif 000005
【００１０】
（式中、Ｒ８はアリール基、アラルキル基、アルキル基である。）
で表される化合物をアルカリ金属塩の存在下で反応させることにより、上記一般式（１６）で表される化合物を得ることが記載されている。
特許文献２に記載の方法も、工業的生産を行うには、収率が不十分である。また、一般式（１７）で表される化合物や一般式（１８）で表される化合物は、多段階の工程を経て合成する必要があるため、コスト的に懸念がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開平５−３１０７００号公報
【特許文献２】特開２０１４−１１７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ピタバスタチンカルシウムを、工業的な規模で、高収率及び高選択性で、且つ安全に低コストで製造する方法の開発が望まれている。
本発明は、安全面やコスト面に優れ、且つ高収率及び高選択性で、純度の高いピタバスタチンカルシウムを工業的な規模で製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは鋭意検討した結果、特定の中間体化合物を用いることにより上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
［１］（ｉ）下記一般式（１）：
【００１４】
【化５】
2020109102.tif 000006
【００１５】
（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖アルキル基又は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表し、Ｘは酸を表す。）
で表される化合物をアセタール化して、下記一般式（３）：
【００１６】
【化６】
2020109102.tif 000007
【００１７】
（式中、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒは前記と同義である。）
で表される化合物を得る工程；
（ｉｉ）上記一般式（３）で表される化合物を、酸と反応させて下記一般式（４）：
【００１８】
【化７】
2020109102.tif 000008
【００１９】
（式中、Ｒは前記と同義である。）
で表される化合物を得る工程；
（ｉｉｉ）上記一般式（４）で表される化合物を加水分解した後、カルシウム化合物と反応させてピタバスタチンカルシウムを得る工程；
を有することを特徴とするピタバスタチンカルシウムの製造方法。
［２］さらに、（ｉｖ）下記一般式（６）：
【００２０】
【化８】
2020109102.tif 000009
【００２１】
（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖アルキル基又は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表す。）
で表される化合物を酸と反応させて下記一般式（１）：
【００２２】
【化９】
2020109102.tif 000010
【００２３】
（式中、Ｘは酸を表し、Ｒは前記と同義である。）
で表される化合物を得る工程；
を有することを特徴とする、［１］に記載のピタバスタチンカルシウムの製造方法。
［３］（ｖ）下記式（７）：
【００２４】
【化１０】
2020109102.tif 000011
【００２５】
で表される化合物と、下記一般式（８）：
【００２６】
【化１１】
2020109102.tif 000012
【００２７】
（式中、Ｒ５は炭素数１〜８の直鎖アルキル基又は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表す。ただし、Ｒ５は、上記一般式（１）のＲとは異なるものである。）
で表される化合物を、塩基の存在下に縮合させて下記一般式（９）：
【００２８】
【化１２】
2020109102.tif 000013
【００２９】
（式中、Ｒ５は前記と同義である。）
で表される化合物を得る工程；
（ｖｉ）工程（ｖ）で得られた上記一般式（９）で表される化合物と、Ｒ−ＯＨ（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖アルキル基又は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表す。）で表されるアルコールを反応させて下記一般式（１０）：
【００３０】
【化１３】
2020109102.tif 000014
【００３１】
（式中、Ｒは前記と同義である。）
で表される化合物を得る工程；及び
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）で得られた上記一般式（１０）で表される化合物に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて、下記一般式（６）：
【００３２】
【化１４】
2020109102.tif 000015
【００３３】
（式中、Ｒは前記と同義である。）
で表される化合物を得る工程；
を有することを特徴とする、［２］に記載のピタバスタチンカルシウムの製造方法。
［４］（ｖｉｉｉ）下記式（１２）：
【００３４】
【化１５】
2020109102.tif 000016
【００３５】
で表される化合物を、チタン触媒の存在下、下記一般式（１３）：
【００３６】
【化１６】
2020109102.tif 000017
【００３７】
（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖アルキル基又は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表す。）
で表される化合物と反応させて、下記一般式（１４）：
【００３８】
【化１７】
2020109102.tif 000018
【００３９】
（式中、Ｒは前記と同義である。）
で表される化合物を得る工程；及び
（ｉｘ）工程（ｖｉｉｉ）で得られた上記一般式（１４）で表される化合物に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて、下記一般式（６）：
【００４０】
【化１８】
2020109102.tif 000019
【００４１】
（式中、Ｒは前記と同義である。）
で表される化合物を得る工程；
を有することを特徴とする、［２］に記載のピタバスタチンカルシウムの製造方法。
［５］下記一般式（１’）：
【００４２】
【化１９】
2020109102.tif 000020
【００４３】
（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖アルキル基又は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表し、Ｘ１はメタンスルホン酸を表す。）で表される化合物。
［６］（ｉｖ）下記一般式（６）：
【００４４】
【化２０】
2020109102.tif 000021
【００４５】
（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖アルキル基又は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表す。）
で表される化合物を酸と反応させることを特徴とする下記一般式（１）：
【００４６】
【化２１】
2020109102.tif 000022
【００４７】
（式中、Ｘは酸を表し、Ｒは前記と同義である。）
で表される化合物の製造方法。
【００４８】
本発明の要旨はまた、以下のとおりである。
［１Ａ］（ｉ）下記一般式（１）：
【００４９】
【化２２】
2020109102.tif 000023
【００５０】
（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖アルキル基又は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表し、Ｘは酸を表す。）
で表される化合物をアセタール化して、下記一般式（３）：
【００５１】
【化２３】
2020109102.tif 000024
【００５２】
（式中、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒは前記と同義である。）
で表される化合物を製造する工程；
（ｉｉ）下記一般式（３）：
【００５３】
【化２４】
2020109102.tif 000025
【００５４】
（式中、Ｒ、Ｒ３及びＲ４は前記と同義である。）
で表される化合物を、酸触媒と反応させて下記一般式（４）：
【００５５】
【化２５】
2020109102.tif 000026
【００５６】
（式中、Ｒは前記と同義である。）
で表される化合物を製造する工程；
（ｉｉｉ）下記一般式（４）：
【００５７】
【化２６】
2020109102.tif 000027
【００５８】
（式中、Ｒは前記と同義である。）
で表される化合物を加水分解した後、カルシウム化合物と反応させる工程；
を有することを特徴とする、下記式（５）：
【００５９】
【化２７】
2020109102.tif 000028
【００６０】
で表されるピタバスタチンカルシウムの製造方法。
［２Ａ］（ｉｖ）下記一般式（６）：
【００６１】
【化２８】
2020109102.tif 000029
【００６２】
（式中、Ｒは前記と同義である。）
で表される化合物を酸と反応させる工程；
を有することを特徴とする、［１Ａ］に記載のピタバスタチンカルシウムの製造方法。
［３Ａ］（ｖ）下記式（７）：
【００６３】
【化２９】
2020109102.tif 000030
【００６４】
で表される化合物と、下記一般式（８）：
【００６５】
【化３０】
2020109102.tif 000031
【００６６】
（式中、Ｒ５は炭素数１〜８の直鎖アルキル基又は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表す。ただし、Ｒ５はＲとは異なるものである。）
で表される化合物を、塩基の存在下に縮合させて下記一般式（９）：
【００６７】
【化３１】
2020109102.tif 000032
【００６８】
（式中、Ｒ５は前記と同義である。）
で表される化合物を製造する工程；
（ｖｉ）工程（ｖ）で得られた上記一般式（９）で表される化合物と、Ｒ−ＯＨ（式中、Ｒは前記と同義である。）で表されるアルコールを反応させて下記一般式（１０）：
【００６９】
【化３２】
2020109102.tif 000033
【００７０】
（式中、Ｒは前記と同義である。）
で表される化合物を製造する工程；及び
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）で得られた上記一般式（１０）で表される化合物に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて、下記一般式（６）：
【００７１】
【化３３】
2020109102.tif 000034
【００７２】
（式中、Ｒは前記と同義である。）
で表される化合物を製造する工程；
を有することを特徴とする、［２Ａ］に記載のピタバスタチンカルシウムの製造方法。
［４Ａ］（ｖｉｉｉ）下記式（１２）：
【００７３】
【化３４】
2020109102.tif 000035
【００７４】
で表される化合物を、Ｔｉ触媒の存在下、下記一般式（１３）：
【００７５】
【化３５】
2020109102.tif 000036
【００７６】
で表される化合物と反応させて、下記一般式（１４）：
【００７７】
【化３６】
2020109102.tif 000037
【００７８】
（式中、Ｒは前記と同義である。）
で表される化合物を製造する工程；及び
（ｉｘ）工程（ｖｉｉｉ）で得られた上記一般式（１４）で表される化合物に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて、下記一般式（６）：
【００７９】
【化３７】
2020109102.tif 000038
【００８０】
（式中、Ｒは前記と同義である。）
で表される化合物を製造する工程；
を有することを特徴とする、［２Ａ］に記載のピタバスタチンカルシウムの製造方法。
［５Ａ］下記一般式（１）：
【００８１】
【化３８】
2020109102.tif 000039
【００８２】
（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖アルキル基又は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表し、Ｘ１はメタンスルホン酸を表す。）で表される化合物。
［６Ａ］（ｉｖ）下記一般式（６）：
【００８３】
【化３９】
2020109102.tif 000040
【００８４】
（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖アルキル基又は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表す。）
で表される化合物を酸と反応させることを特徴とする下記一般式（１）：
【００８５】
【化４０】
2020109102.tif 000041
【００８６】
（式中、Ｘは酸を表し、Ｒは前記と同義である。）
で表される化合物の製造方法。
【発明の効果】
【００８７】
本発明の製造方法によれば、ピタバスタチンカルシウムを、工業的な規模で、高収率及び高選択性で、且つ安全に低コストで製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】実施例５で得られたＤＯＬＥ  ＭｓＯＨのＸ線回折チャートである。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
以下、本明細書において用いられる用語について詳しく説明する。
Ｒは、炭素数１〜８の直鎖アルキル基又は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表し、好ましくは炭素数１〜８の直鎖アルキル基であり、より好ましくは炭素数１〜４の直鎖アルキル基であり、特に好ましくはメチル基、エチル基、又はｎ−プロピル基である。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、炭素数１〜４のアルキル基を表し、好ましくは炭素数１〜４の直鎖アルキル基であり、特に好ましくはメチル基、エチル基、又はｎ−プロピル基である。また、Ｒ１及びＲ２は連結して環を形成していてもよい。
Ｒ５は、炭素数１〜８の直鎖アルキル基又は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表す。ただし、Ｒ５はＲとは異なるものである。Ｒ５は、好ましくは炭素数３〜８の分岐状アルキル基であり、より好ましくはイソプロピル基、ｓ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｔｅｒｔ−アミル基であり、特に好ましくはｔｅｒｔ−ブチル基である。
Ｒａは、炭素数１〜１０のアルキル基を表す。Ｒａは、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔ−ブチル基等の炭素数１〜４の低級アルキル基であり、工業的にはイソプロピル基が特に好ましい。
Ｘは、酸を表し、好ましくは硫酸、塩酸等の鉱酸；蟻酸、酢酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸を表し、より好ましくは、硫酸、塩酸、メタンスルホン酸又はｐ−トルエンスルホン酸であり、特に好ましくはメタンスルホン酸である。
Ｘ１は、メタンスルホン酸を表す。
本明細書において、「カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素」とは、カルボニル基含有化合物中のカルボニル基を不斉還元して光学活性なアルコール類に変換する活性を有する酵素を意味する。
「カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性」を有するか否かは、カルボニル基含有化合物中のカルボニル基を不斉還元して光学活性なアルコール類に変換する活性を、通常のアッセイ法で測定することにより判定可能である。例えば、下記一般式（１９）：
【００９０】
【化４１】
2020109102.tif 000042
【００９１】
（式中、Ｒbは炭素数１〜８の直鎖アルキル基又は炭素数３〜６の分岐状アルキル基を表す。−Ｑ１及び−Ｑ２はそれぞれ独立して、−ＯＨ又は＝Ｏを表し、少なくとも−Ｑ１又は−Ｑ２のいずれか一方は＝Ｏである。）
で表される化合物に、測定の対象とする酵素を作用させ、一般式（１９）で表される化合物から変換された一般式（６）で表される化合物の量を直接的に測定することにより、その酵素活性を確認することができる。
【００９２】
また、本明細書における「酵素」には、精製酵素（部分的に精製した酵素を含む。）や、通常の固定化技術を用いて担体などに固定化したもの、例えば、ポリアクリルアミド、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等も含まれる。
本明細書において、「カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞」（以下、「本発明の微生物若しくは細胞」と称することがある。）とは、「カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性」を有していれば特に制限はなく、内在的に前記活性を有する微生物若しくは細胞であってもよいし、育種により前記活性を付与した微生物若しくは細胞であってもよい。育種により前記活性を付与する手段としては、遺伝子組換え処理（形質転換）や変異処理など、公知の方法を採用することができる。形質転換の方法としては、目的とする遺伝子を導入する、有機化合物の生合成経路における酵素遺伝子の発現を強化する、副生物生合成経路における酵素遺伝子の発現を低減するなどの方法を用いることができる。
なお、「本発明の微生物若しくは細胞」の種類としては、後述の宿主生物若しくは宿主細胞に記載のものが挙げられる。「本発明の微生物若しくは細胞」は、凍結された状態でも用いることができる。また、本明細書において、「前記活性を有する酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞」としては、生きている微生物若しくは細胞に限られず、生体としては死んでいるが酵素活性を有するものも含まれる。
また、「本発明の微生物若しくは細胞」は、例えば、国際公開第２００３／０７８６３４号に記載の方法で作製することができる。
【００９３】
本明細書において、「宿主生物」とする生物の種類は特に限定されず、大腸菌、枯草菌、コリネ型細菌、シュードモナス属細菌、バチルス属細菌、リゾビウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、サクシノバチルス属細菌、アナエロビオスピリラム属細菌、アクチノバチルス属細菌等の原核生物、酵母、糸状菌等の菌類、植物、動物等の真核生物が挙げられる。中でも、好ましくは大腸菌、酵母、コリネ型細菌であり、特に好ましくは大腸菌である。
本明細書において、「宿主細胞」とする細胞の種類は特に限定されず、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等を用いることができる。
本明細書において、「発現ベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み宿主生物へ導入することにより、所望の機能を有するタンパク質を前記宿主生物において複製及び発現させるために用いられる遺伝因子である。例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、発現ベクターはプラスミドである。
本明細書において、「形質転換体」とは、前記発現ベクターが導入され、所望の機能を有するタンパク質に関連する所望の形質を表すことができるようになった微生物又は細胞を意味する。
本明細書において、「微生物若しくは細胞の処理物」とは、微生物若しくは細胞を培養し、該微生物若しくは細胞を、１）有機溶媒等により処理したもの、２）凍結乾燥したもの、３）担体などに固定化したもの、４）物理的又は酵素的に破壊したものであり、かつ、所望の機能を有するタンパク質を含有するもの等を意味する。
本明細書において、「微生物若しくは細胞を培養して得られた酵素を含む培養液」とは、１）微生物若しくは細胞の培養液、２）微生物若しくは細胞の培養液を有機溶媒等により処理をした培養液、３）微生物若しくは細胞の細胞膜を物理的又は酵素的に破壊してある培養液を意味する。
【００９４】
次に、本発明のピタバスタチンカルシウムの製造方法について詳しく説明する。なお、以下において、ｗ／ｖは、重量／容量を意味する。
本発明のピタバスタチンカルシウムの製造方法には、以下に示すように、一般式（１）で表される化合物をアセタール化して一般式（３）で表される化合物を得る工程（ｉ）、一般式（３）で表される化合物を酸と反応させて一般式（４）で表される化合物を得る工程（ｉｉ）、及び一般式（４）で表される化合物を加水分解した後、カルシウム化合物と反応させて式（５）で表されるピタバスタチンカルシウムを得る工程（ｉｉｉ）が含まれる。
【００９５】
【化４２】
2020109102.tif 000043
【００９６】
また、一般式（１）で表される化合物は、一般式（６）で表される化合物を酸と反応させることにより得ることができる。
【００９７】
【化４３】
2020109102.tif 000044
【００９８】
以下に、本発明の製造方法の各工程について詳細に説明する。
工程（ｉ）：
【００９９】
【化４４】
2020109102.tif 000045
【０１００】
工程（ｉ）は、一般式（１）で表される化合物をアセタール化して一般式（３）で表される化合物を得る工程である。
具体的には、一般式（１）で表される化合物を、下記一般式（２−１）又は（２−２）で表されるアセタール化剤と反応させる。
【０１０１】
【化４５】
2020109102.tif 000046
【０１０２】
アセタール化剤の使用量は、特に限定されないが、通常、一般式（１）で表される化合物１ｍｏｌに対して１ｍｏｌ〜１０ｍｏｌ、好ましくは１ｍｏｌ〜６ｍｏｌである。
反応は、酸触媒の存在下に行ってもよい。
酸触媒としては、硫酸、塩酸等の鉱酸；蟻酸、酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ピリジニウムｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸；ゼオライト等の固体酸等を用いることができる。これらの一種または二種以上を混合して用いてもよい。これらの中でも、工業的には、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸又はピリジニウムｐ−トルエンスルホン酸が好ましい。
酸触媒を使用する場合には、後述する溶媒に溶解して使用してもよい。
酸触媒の使用量は、特に限定されないが、通常、一般式（１）で表される化合物１ｍｏｌに対して０．００１ｍｏｌ〜２ｍｏｌ、好ましくは０．０１ｍｏｌ〜１．５ｍｏｌである。
アセタール化剤との反応は、溶媒を用いて行うことが好ましい。溶媒は、反応が進行する限り特に限定されないが、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、トルエン等の炭化水素溶媒；ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、シクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）等のエーテル系溶媒；酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒；メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール等のアルコール系溶媒；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒；アセトニトリル等が好適に用いられる。これらの溶媒を一種または二種以上を混合して用いてもよい。
溶媒の使用量は、特に限定されないが、通常、一般式（１）で表される化合物１ｇに対して１ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは１ｍＬ〜２０ｍＬである。
反応温度は、使用する溶媒の沸点より低い温度で且つ融点より高い温度であれば、反応への影響や目的物の収率への影響はほとんどないため、この温度範囲で適宜選択することができるが、工業的には、好ましくは０℃〜８０℃、より好ましくは１０℃〜７０℃である。
反応時間は、通常０．５時間〜２４時間、好ましくは１時間〜１２時間である。
【０１０３】
また、工程（ｉ）で得られた一般式（３）で表される化合物を含む反応生成物を、さらに酸と反応させて、一般式（３）で表される化合物のアセタール部分を一部分解することにより、エピマー含有率の低い一般式（３）で表される化合物を製造することも可能である。
酸としては、硫酸、塩酸等の鉱酸；蟻酸、酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ピリジニウムｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸を用いることができる。これらの一種または二種以上を混合して用いてもよい。これらの中でも、工業的には、硫酸、塩酸、メタンスルホン酸が好ましい。
酸は、水溶液として使用してもよいし、後述する溶媒に溶解して使用してもよい。
酸の使用量は、特に限定されないが、通常、一般式（３）で表される化合物１ｍｏｌに対して０．０１ｍｏｌ〜１ｍｏｌ、好ましくは０．０５ｍｏｌ〜０．５ｍｏｌである。
酸との反応は、溶媒を用いて行うことが好ましい。溶媒は、反応が進行する限り特に限定されないが、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、トルエン等の炭化水素溶媒；ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、シクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）等のエーテル系溶媒；酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒；メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール等のアルコール系溶媒；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒；アセトニトリル等が好適に用いられる。これらの溶媒の一種または二種以上を混合して用いてもよい。
溶媒の使用量は、特に限定されないが、通常、一般式（１）で表される化合物１ｇに対して１ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは１ｍＬ〜２０ｍＬである。
反応温度は、使用する溶媒の沸点より低い温度で且つ融点より高い温度であれば、反応への影響や目的物の収率への影響はほとんどないため、この範囲で適宜選択することができるが、工業的には、好ましくは０℃〜６０℃、より好ましくは１０℃〜５０℃である。
エピマー含有率は、反応の進行度によって制御することができ、例えば、転化率が５％〜３０％になるように反応を行うことにより、エピマー含有率を０．３％以下にすることができる。
【０１０４】
工程（ｉ）で得られた一般式（３）で表される化合物は、そのまま工程（ｉｉ）に使用してもよいし、上記のようにエピマー含有率を減少させた後で工程（ｉｉ）に使用してもよいし、さらに精製した後で工程（ｉｉ）に使用してもよい。
精製方法としては、カラムクロマトグラフィーによる精製や結晶化などを適宜組み合わせることができる。カラムクロマトグラフィーの場合は、例えば、ｎ−へプタン、ｎ−ヘキサン、トルエン等の非極性溶媒と、酢酸エチル、メチルエチルケトン、ＴＨＦ、エタノール等の極性溶媒とを組み合わせることにより精製することができる。結晶化の場合は、例えば、ｎ−へプタン、ｎ−ヘキサン、トルエン等の非極性溶媒又は水と、酢酸エチル、メチルエチルケトン、ＴＨＦ、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール等の極性溶媒とを組み合わせることにより精製することができる。
また、一般式（１）中のＸがメタンスルホン酸である化合物（メタンスルホン酸塩）の場合は、工程（ｉ）終了後、又は、エピマー含有率を減少させた後に反応系に水を加えるだけで、一般式（３）で表される化合物が結晶化するため、容易に一般式（３）で表される化合物を取得することができるので好ましい。水を加える際には、結晶化を容易にするために、別途取得した一般式（３）で表される化合物を種晶として用いてもよい。また、結晶化の際には、系を中和するために塩基を添加してもよい。塩基としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等の無機塩、トリエチルアミンなどの有機塩基が挙げられ、好ましくは、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムである。
工程（ｉｉ）：
【０１０５】
【化４６】
2020109102.tif 000047
【０１０６】
工程（ｉｉ）は、一般式（３）で表される化合物を、酸と反応させて脱アセタール化し、一般式（４）で表される化合物を得る工程である。
酸としては、硫酸、塩酸等の鉱酸；蟻酸、酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ピリジニウムｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸を用いることができる。これらの一種または二種以上を混合して用いてもよい。これらの中でも、工業的には、硫酸又は塩酸が好ましい。
酸は、水溶液として使用してもよいし、後述する溶媒に溶解して使用してもよい。
酸の使用量は、特に限定されないが、通常、一般式（３）で表される化合物１ｍｏｌに対して１ｍｏｌ〜５ｍｏｌ、好ましくは１ｍｏｌ〜２ｍｏｌである。
酸との反応は、溶媒を用いて行うことが好ましい。溶媒は、反応が進行する限り特に限定されないが、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、トルエン等の炭化水素溶媒；ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、シクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）等のエーテル系溶媒；酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒が好適に用いられる。これらの溶媒を一種または二種以上を混合して用いてもよい。
溶媒の使用量は、特に限定されないが、通常、一般式（３）で表される化合物１ｇに対して１ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは１ｍＬ〜２０ｍＬである。
反応温度は、使用する溶媒の沸点より低い温度で且つ融点より高い温度であれば、反応への影響や目的物の収率への影響はほとんどないため、この範囲で適宜選択することができるが、工業的には、好ましくは０℃〜７０℃、より好ましくは１０℃〜５０℃である。
反応時間は、通常１時間〜１０時間、好ましくは１時間〜５時間である。
工程（ｉｉｉ）：
【０１０７】
【化４７】
2020109102.tif 000048
【０１０８】
工程（ｉｉｉ）は、一般式（４）で表される化合物を加水分解した後、カルシウム化合物と反応させて式（５）で表されるピタバスタチンカルシウムを得る工程である。好ましくは、一般式（４）で表される化合物をアルカリ触媒と反応させて加水分解し、得られた化合物をカルシウム化合物と反応させてピタバスタチンカルシウムを得る。通常、ピタバスタチンカルシウムは、結晶として析出するので、析出したピタバスタチンカルシウムを、濾過し、乾燥する。アルカリ触媒としては、無機塩基を用いることができ、好ましくは水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物を用いることができる。工業的には、特に水酸化ナトリウムが好ましい。
アルカリ触媒の使用量は、特に限定されないが、通常、一般式（４）で表される化合物１ｍｏｌに対して１ｍｏｌ〜２ｍｏｌ、好ましくは１ｍｏｌ〜１．５ｍｏｌである。
加水分解は、溶媒を用いて行うことが好ましい。溶媒としては、水が好ましい。また、必要に応じて、ＴＨＦ、１，４−ジオキサン等のエーテル系溶媒；メタノール、エタノールなどのアルコール系溶媒；アセトン等のケトン系溶媒をさらに加えてもよい。これらの溶媒の一種または二種以上を混合して用いてもよい。
溶媒の使用量は、特に限定されないが、通常、一般式（４）で表される化合物１ｇに対して１ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは１ｍＬ〜５０ｍＬである。
加水分解時の温度は、使用する溶媒の沸点より低い温度で且つ融点より高い温度であれば、加水分解への影響や目的物の収率への影響はほとんどないため、この範囲で適宜選択することができるが、工業的には、好ましくは０℃〜７０℃、より好ましくは１０℃〜５０℃である。
加水分解の時間は、通常１時間〜２４時間、好ましくは１時間〜１２時間である。
加水分解により得られた化合物をカルシウム化合物と反応させることによりピタバスタチンカルシウムを得る。加水分解により得られた化合物は、必ずしも単離する必要はない。工業的には、加水分解した後、連続してカルシウム化合物と反応させることが好ましい。
カルシウム化合物としては、カルシウムの無機塩や有機塩を使用することができ、好ましくは塩化カルシウム、酢酸カルシウム等を用いることができる。
カルシウム化合物との反応温度は、使用する溶媒の沸点より低い温度で且つ融点より高い温度であれば、反応への影響や目的物の収率への影響はほとんどないため、この範囲で適宜選択することができるが、工業的には、好ましくは０℃〜７０℃、より好ましくは１０℃〜６０℃である。
反応時間は、通常０．１時間〜１０時間、好ましくは０．５時間〜５時間である。
ピタバスタチンカルシウムの濾過、乾燥方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
ピタバスタチンカルシウムの水分量は、通常、５重量％〜１５重量％、好ましくは７重量％〜１３重量％、特に好ましくは、８重量％〜１２重量％である。得られたピタバスタチンカルシウムを、乾燥により所望の水分量まで調整してもよいし、乾燥後に湿潤させて所望の水分量まで調整してもよい。
工程（ｉｖ）：
【０１０９】
【化４８】
2020109102.tif 000049
【０１１０】
工程（ｉｖ）は、工程（ｉ）で使用する一般式（１）で表される化合物を得る工程である。具体的には、一般式（６）で表される化合物を酸と反応させて一般式（１）で表される化合物を得る。
一般式（１）で表される化合物は、一般式（６）で表される化合物の塩である。好ましくは硫酸塩、塩酸塩等の鉱酸の塩；蟻酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等の有機酸の塩であり、より好ましくは、硫酸塩、塩酸塩、メタンスルホン酸塩又はｐ−トルエンスルホン酸塩である。一般式（１）で表される化合物は、結晶性の点から、メタンスルホン酸塩、すなわち下記一般式（１’）で表される化合物が工業的には好ましい。
【０１１１】
【化４９】
2020109102.tif 000050
【０１１２】
（式中、Ｘ１はメタンスルホン酸を表し、Ｒは前記と同義である。）
酸としては、硫酸、塩酸等の鉱酸；蟻酸、酢酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸を用いることができる。これらの一種または二種以上を混合して用いてもよい。これらの中でも、工業的には、硫酸、塩酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸が好ましい。
酸の使用量は、特に限定されないが、通常、一般式（６）で表される化合物１ｍｏｌに対して１ｍｏｌ〜２ｍｏｌ、好ましくは１ｍｏｌ〜１．５ｍｏｌである。
反応は、溶媒を用いて行うことが好ましい。溶媒は、反応が進行する限り特に限定されないが、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、トルエン等の炭化水素溶媒；ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、シクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）等のエーテル系溶媒；酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒；メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒；アセトニトリル等が好適に用いられる。これらの溶媒の一種または二種以上を混合して用いてもよい。
溶媒の使用量は、特に限定されないが、通常、一般式（６）で表される化合物１ｇに対して１ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは１ｍＬ〜５０ｍＬである。
反応温度は、使用する溶媒の沸点より低い温度で且つ融点より高い温度であれば、反応への影響や目的物の収率への影響はほとんどないため、この範囲で適宜選択することができるが、工業的には、好ましくは０℃〜７０℃、より好ましくは１０℃〜５０℃である。
反応時間は、通常０．１時間〜１０時間、好ましくは０．５時間〜５時間である。
一般式（６）で表される化合物は、これを得る工程に由来する不純物を含有していることがある。例えば、後述する（ａ）又は（ｂ）の方法のようなバイオ反応工程を経て一般式（６）で表される化合物を得た場合、反応生成物は一般式（６）で表される化合物以外に不純物を含有しているので、精製等によって不純物を除去した後に、工程（ｉ）に用いることが好ましい。
本発明の工程（ｉｖ）で得られる一般式（１）で表される化合物、特にメタンスルホン酸塩は、結晶性に優れているため、容易に結晶として析出する。したがって、一般式（１）で表される化合物を容易に単離することができる。
本発明は、工程（ｉｖ）を有することにより、前工程から持ち込まれる不純物を効率的に除去することができるため、工業的規模の製造において、精製工程を省略したり簡略化することが可能になる。
【０１１３】
一般式（６）で表される化合物は、有機合成工程やバイオ反応工程により得ることができる。本発明においては、一般式（６）で表される化合物を以下の（ａ）又は（ｂ）の方法により製造することが好ましい。
【０１１４】
【化５０】
2020109102.tif 000051
【０１１５】
【化５１】
2020109102.tif 000052
【０１１６】
方法（ａ）：
方法（ａ）は、工程（ｖ）、工程（ｖｉ）及び工程（ｖｉｉ）を含むことを特徴とする。
工程（ｖ）：
【０１１７】
【化５２】
2020109102.tif 000053
【０１１８】
工程（ｖ）は、式（７）で表される化合物と一般式（８）で表される化合物を、塩基の存在下、縮合させて一般式（９）で表される化合物を得る工程である。
塩基としては、水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化カルシウム等の金属水素化物；ナトリウムアミド等の金属アミド；ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド等の有機リチウム；ｔｅｒｔ−ブチルマグネシウムクロライド等のグリニャール試薬；ナトリウムエトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、カリウムｔｅｒｔ-ブトキシド等のアルコキシド等を用いることができる。特に、ナトリウムアミド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、水素化ナトリウムが好ましい。
塩基の使用量は、特に限定されないが、通常、式（７）で表される化合物１ｍｏｌに対して１ｍｏｌ〜５ｍｏｌ、好ましくは１ｍｏｌ〜４ｍｏｌである。
縮合反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒は、反応が進行する限り特に限定されないが、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、トルエン等の炭化水素溶媒；クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等のハロゲン系溶媒；ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、シクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）等のエーテル系溶媒；Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒等を用いることができる。これらの一種または二種以上を混合して用いてもよい。
溶媒の使用量は、特に限定されないが、通常、式（７）で表される化合物１ｇに対して５ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは５ｍＬ〜３０ｍＬである。
反応温度は、使用する溶媒の沸点より低い温度で且つ融点より高い温度であれば、縮合反応への影響や目的物の収率への影響はほとんどないため、この範囲で適宜選択することができるが、工業的には、通常０℃〜１００℃、好ましくは０℃〜５０℃である。
反応時間は、通常０．１時間〜２００時間、好ましくは１時間〜２４時間である。
式（７）で表される化合物は、例えば、特許第２５６９７４６号公報に記載の方法により製造することができ、また、市販のものを用いることもできる。
一般式（８）で表される化合物は、公知の方法に準じて得ることができる。例えば、ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ，１８（７），７３５−７３９（１９８８）に記載の方法より得ることができる。また、市販のものを用いることもできる。
一般式（８）で表される化合物のｐＨは、好ましくはｐＨ４以下、より好ましくはｐＨ３以下である。一般式（８）で表される化合物のｐＨをこの範囲にすることにより、一般式（８）で表される化合物の保存安定性が向上し、反応時の不純物の生成を低減させることができる。なお、一般式（８）で表される化合物のｐＨは、一般式（８）で表される化合物と水とを１：１（体積比）で混合した後、水層のｐＨを測定した値である。このｐＨの値が高過ぎるとき（例えば、ｐＨが４より大きいとき）は、必要に応じて、酢酸、塩酸、硫酸等の酸でｐＨを下げることができる。
一般式（９）において、Ｒ５は、結晶性の点から、好ましくは炭素数３〜８の分岐状アルキル基であり、より好ましくはイソプロピル基、ｓ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｔｅｒｔ−アミル基であり、特に好ましくはｔｅｒｔ−ブチル基である。結晶性が高い一般式（９）で表される化合物は、クロマトグラフィー等の煩雑な精製を行うことなく高純度で得ることができるため、工業的に好ましい。
工程（ｖｉ）：
【０１１９】
【化５３】
2020109102.tif 000054
【０１２０】
工程（ｖｉ）は、一般式（９）で表される化合物とＲ−ＯＨで表されるアルコールを反応させて一般式（１０）で表される化合物を得る工程である。
Ｒ−ＯＨで表されるアルコールの使用量は、特に限定されないが、通常、式（９）で表される化合物１ｇに対して１ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは１ｍＬ〜１０ｍＬである。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒は、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル等のエステル溶媒；シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、トルエン等の非極性溶媒；塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒；ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル(ＭＴＢＥ)、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、シクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）等のエーテル溶媒；Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒等を用いることができる。これらの一種または二種以上を混合して用いてもよい。また、Ｒ−ＯＨで表されるアルコール自体を溶媒として用いてもよい。
溶媒の使用量は、特に限定されないが、通常、式（９）で表される化合物１ｇに対して１ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは１ｍＬ〜１０ｍＬである。
反応温度は、使用する溶媒の沸点より低い温度で且つ融点より高い温度であれば、反応への影響や目的物の収率への影響はほとんどないため、この範囲で適宜選択することができるが、工業的には、通常３０℃〜１５０℃、好ましくは４０℃〜１１０℃である。
反応時間は、通常１時間〜４８時間、好ましくは２時間〜２４時間である。
Ｒ−ＯＨ及び一般式（１０）において、Ｒは、バイオ反応工程（ｖｉｉ）における反応効率の点から、好ましくは炭素数１〜８の直鎖アルキル基であり、より好ましくは炭素数１〜４の直鎖アルキル基であり、特に好ましくはメチル基、エチル基又はｎ−プロピル基である。このような、一般式（１０）で表される化合物は、バイオ反応工程（ｖｉｉ）において、カルボニル基の立体選択的な還元が効率よく進むため好ましい。
工程（ｖｉｉ）：バイオ反応工程
【０１２１】
【化５４】
2020109102.tif 000055
【０１２２】
工程（ｖｉｉ）は、一般式（１０）で表される化合物に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞（本発明の微生物若しくは細胞）、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液（以下、これらをまとめて「本発明の酵素等」と称することがある。）を作用させて還元して、一般式（６）で表される化合物を得る工程である。
工程（ｖｉｉ）で用いる酵素としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するもの（以下「ＯＣＲ１」と称する場合がある）又は該アミノ酸配列のホモログを用いることができる。具体的には、下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すポリペプチドのいずれかを含む酵素、又はこれらのホモログが挙げられる。
（Ａ）特許第４２７０９１８号に記載のＯｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＮＢＲＣ１４７３由来のカルボニル還元酵素（ＯＣＲ１）（配列番号２）を有するポリペプチド
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、一般式（１０）で表される化合物を、一般式（６）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチド
（Ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ一般式（１０）で表される化合物を、一般式（６）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチド
【０１２３】
上記（Ｂ）のホモログは、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を害さない範囲において、配列番号２に示されるアミノ酸配列全長と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するタンパク質である。
また、上記（Ｃ）のホモログは、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を害さない範囲において、配列番号２に記載のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有するものである。ここで、「１又は数個のアミノ酸」とは、具体的には２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下のアミノ酸である。
【０１２４】
上記酵素をコードする遺伝子は、下記（Ｄ）、（Ｅ）又は（Ｆ）に示す塩基配列、又はこれらのホモログを含むＤＮＡである。
（Ｄ）配列番号１に記載の塩基配列
（Ｅ）配列番号１に記載の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、一般式（１０）で表される化合物に作用して、一般式（６）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（Ｆ）配列番号１に記載の塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失若しくは付加された塩基配列を含み、かつ一般式（１０）で表される化合物に作用して、一般式（６）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
【０１２５】
ここで、上記（Ｅ）の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、ストリンジェントな条件下、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、又はサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。ストリンジェントな条件としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法及びプラークハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７ｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液の存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム水溶液）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
【０１２６】
各ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．，１９８９．等に記載されている方法に準じて行うことができる。
また、上記（Ｆ）のホモログは、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を害さない範囲において、配列番号１に記載の塩基配列に１又は数個の塩基が欠失、付加又は置換された塩基配列を有するものである。「１又は数個の塩基」とは、具体的には６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１５個以下、さらに好ましくは１０個以下、特に好ましくは５個以下の塩基である。
【０１２７】
工程（ｖｉｉ）において、本発明の酵素等は、取り扱い性に優れ、また、反応系への添加が容易であることから、凍結した状態で用いることもできる。凍結した本発明の酵素等を用いるときは、その形状は、特に制限はないが、例えば、角柱状、円柱状、塊状、球状等にすることができる。
工程（ｖｉｉ）において、反応基質となる一般式（１０）で表される化合物は、通常、基質濃度が０．０１％ｗ／ｖ〜２０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖの範囲で用いられる。反応基質は、予め反応系に存在させていてもよいし、反応開始時に一括して添加してもよい。また、酵素の基質阻害があった場合にはその影響を減らし、また生成物の蓄積濃度を向上させるという観点から、反応開始時から連続的又は間欠的に添加することもできる。
工程（ｖｉｉ）においては、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）＋又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下で行なうことが好ましく、この場合、上記補酵素を、通常、０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度になるように添加するのが好ましい。
【０１２８】
上記補酵素を添加する場合には、生産効率向上のため、反応系内で、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから生成するＮＡＤ（Ｐ）＋をＮＡＤ（Ｐ）Ｈへ再生させることが好ましい。再生方法としては、１）本発明の微生物若しくは細胞自体のＮＡＤ（Ｐ）＋からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する能力、すなわち、ＮＡＤ（Ｐ）＋還元能を利用する方法、２）ＮＡＤ（Ｐ）＋からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する能力を有する微生物やその処理物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生に利用可能な酵素（以下、「再生酵素」という）を一種類以上反応系内に添加する方法、３）本発明の微生物若しくは細胞を作製するに当たり、上記再生酵素の遺伝子を一種類以上、合わせて宿主生物若しくは宿主細胞に導入する方法等が挙げられる。
【０１２９】
上記１）の方法においては、反応効率の点から、反応系にグルコース、エタノール、２−プロパノール又はギ酸などを添加することが好ましい。
また、上記２）の方法においては、上記再生酵素を生産する能力を有する微生物、該微生物をアセトン処理したもの、グルタルアルデヒド処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的又は酵素的に破砕したもの等の微生物の処理物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の酵素を用いてもよい。
上記再生酵素の使用量としては、本発明のカルボニル基を立体選択的に還元しうる能力を有する酵素のカルボニル還元活性と比較して、酵素活性で通常０．０１倍〜１００倍、好ましくは０．５倍〜２０倍程度となるように添加するのがよい。
また、上記再生酵素の基質となる化合物の添加、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノール又はイソプロパノール等の添加も必要となるが、その添加量としては、一般式（１０）で表される化合物１ｍｏｌに対して、通常０．１ｍｏｌ〜２０ｍｏｌ、好ましくは１ｍｏｌ〜１０ｍｏｌである。
また、上記３）の方法においては、工程（ｉ）に用いられる酵素をコードするＤＮＡと共に上記再生酵素のＤＮＡを染色体に組み込む方法、単一の発現ベクター中に両ＤＮＡを導入し宿主生物若しくは細胞を形質転換する方法、又は両ＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに導入した後に宿主生物若しくは宿主細胞を形質転換する方法等を用いることができる。両ＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに導入した後に宿主生物若しくは宿主細胞を形質転換する方法の場合は、両発現ベクター同士の不和合性を考慮して発現ベクターを選択する必要がある。
単一の発現ベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させる方法も可能である。
【０１３０】
工程（ｖｉｉ）は、水性媒体中又は水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。水性媒体、又は水性媒体と有機溶媒との混合物は、一般式（１０）で表される化合物、並びに上記酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を含有する。また、必要に応じて各種補酵素を含有していてもよい。補酵素を含有する場合は、その再生システム、すなわち、補酵素を再生できるようになっていることがより好ましい。
なお、一般式（１０）で表される化合物は、後述する方法により製造することも可能である。
水性媒体としては、水、又はリン酸カリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、トリス塩酸緩衝液等のｐＨ緩衝液が挙げられる。
有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール等、一般式（１０）で表される化合物の溶解度が高いものを使用することができる。これらの中でも、有機溶媒としては、一般式（１０）で表される化合物の溶解度が高いことから、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノールが好ましい。さらに転化率が高いことからジメチルスルホキシドがより好ましい。
【０１３１】
工程（ｖｉｉ）は、通常４℃〜７０℃、好ましくは３０℃〜６０℃の反応温度で、通常ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ４〜８で行われる。反応時間は、通常０．５時間〜４８時間、好ましくは０．５時間〜２４時間である。
工程（ｖｉｉ）で得られる一般式（６）で表される化合物は、遠心分離やフィルトレーションなどにより菌体やポリペプチド等を分離した後に、適当なｐＨに調整し、ヘキサン、酢酸エチル、トルエンなどの有機溶媒による抽出、カラムクロマトグラフィーによる精製、結晶化などを適宜組み合わせることにより精製することができる。
【０１３２】
方法（ｂ）：
方法（ｂ）は、工程（ｖｉｉｉ）及び工程（ｉｘ）を含むことを特徴とする。
工程（ｖｉｉｉ）：
【０１３３】
【化５５】
2020109102.tif 000056
【０１３４】
工程（ｖｉｉｉ）は、一般式（１２）で表される化合物を、下記一般式（１５）で表されるチタン触媒（Ｔｉ触媒）の存在下、一般式（１３）で表される化合物と反応させて、一般式（１４）で表される化合物を得る工程である。
【０１３５】
【化５６】
2020109102.tif 000057
【０１３６】
（式中、Ｒａは炭素数１〜１０のアルキル基を表す。）
一般式（１３）で表される化合物の使用量は、特に限定されないが、通常、一般式（１２）で表される化合物１ｍｏｌに対して１ｍｏｌ〜１０ｍｏｌ、好ましくは１ｍｏｌ〜５ｍｏｌである。
一般式（１５）で示されるＴｉ触媒のビナフチル構造は、Ｓ配座のものが好ましい。また、Ｒａとしては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔ−ブチル基等の炭素数１〜４の低級アルキル基が好ましいが、工業的にはイソプロピル基が特に好ましい。
Ｔｉ触媒の使用量は、特に限定されないが、通常、一般式（１２）で表される化合物１ｍｏｌに対して０．００１ｍｏｌ〜１ｍｏｌ、好ましくは０．０１ｍｏｌ〜０．５ｍｏｌである。
反応は、溶媒を用いて行うことが好ましい。溶媒は、反応が進行する限り特に限定されないが、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、トルエン等の炭化水素溶媒；ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、シクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）等のエーテル系溶媒；酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒；アセトニトリル等が好適に用いられる。これらの溶媒の一種または二種以上を混合して用いてもよい。
溶媒の使用量は、特に限定されないが、通常、一般式（１２）で表される化合物１ｇに対して１ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは１ｍＬ〜５０ｍＬである。
反応系に塩化リチウム及び／又は合成ゼオライトを添加することも可能である。これにより、所望とする光学純度の高いものを得ることができる。
塩化リチウムの使用量は、特に限定されないが、通常、一般式（１２）で示される化合物１ｍｏｌに対して０．００１ｍｏｌ〜２ｍｏｌ、好ましくは０．０１ｍｏｌ〜１ｍｏｌである。
合成ゼオライトとしては、例えばモレキュラーシーブス３Ａ、４Ａ、５Ａ、１３Ｘなどが挙げられる。好ましくはモレキュラーシーブス３Ａ、４Ａである。
合成ゼオライトの使用量は、特に限定されないが、通常、一般式（１２）で示される化合物１ｇに対して０．０１〜１ｇ、好ましくは０．１〜０．５ｇである。
反応温度は、使用する溶媒の沸点より低い温度で且つ融点より高い温度であれば、反応への影響や目的物の収率への影響はほとんどないため、この範囲で適宜選択することができるが、工業的には、好ましくは０℃〜１００℃、より好ましくは１０℃〜５０℃である。
反応時間は、通常１時間〜２４時間、好ましくは１時間〜１２時間である。
【０１３７】
一般式（１２）で表される化合物は、公知の方法に準じて得ることができる。例えば、ＷＯ２０００／４２０１６号に記載の方法により得ることができる。また、市販のものを用いることもできる。
一般式（１３）で表される化合物も、以下のように公知の方法に準じて得ることができる。例えば、ＷＯ２００３／４２０１８０号に記載の方法により得ることができる。
【０１３８】
【化５７】
2020109102.tif 000058
【０１３９】
工程（ｉｘ）：
【０１４０】
【化５８】
2020109102.tif 000059
【０１４１】
工程（ｉｘ）は、一般式（１４）で表される化合物に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞（本発明の微生物若しくは細胞）、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて還元して、一般式（６）で表される化合物を得る工程である。
工程（ｉｘ）は、前述の工程（ｖｉｉ）と同様にして実施することができる。
【実施例】
【０１４２】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
なお、本実施例における略号は、以下の化合物を表す。
ＰＴ-ＤＯＸＥ：（６Ｅ）−７−[２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−３−キノリニル]−３，５−ジオキソ−６−ヘプテン酸エチルエステル
ＰＴ−ＡＬＤ：［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル)−３−キノリニル］カルボアルデヒド
ＤＨＡＢ：３，５−ジオキソヘプテン酸ｔ−ブチルエステル
ＰＴ−ＤＯＸＢ：（６Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−３−キノリニル]−３，５−ジオキソ−６−ヘプテン酸ｔ−ブチルエステル）
ＰＴ−ＤＯＬＥ：（３Ｒ，５Ｓ，６Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−３−キノリニル]−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸エチルエステル
ＤＯＬＥ  ＭｓＯＨ：（３Ｒ，５Ｓ，６Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−３−キノリニル]−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸エチルエステル  メタンスルホン酸塩
５Ｓ−ＭＯＬＥ：（Ｅ）−（５Ｓ）−７−[２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル]−５−ヒドロキシ−３−オキソ−ヘプト−６−エノイック酸エチルエステル
ＡＣＰＴ：（４Ｒ，６Ｓ，１Ｅ）−２−[２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−３−キノリニル]−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−酢酸  エチルエステル
Ｍｅ：メチル基
Ｅｔ：エチル基
ｔ−Ｂｕ：ターシャリーブチル基
ＥｔＯＨ：エタノール
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
【０１４３】
また、本実施例における定量分析は、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｓ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用い、以下の条件で測定を行った。
＜ＰＴ−ＤＯＸＥの化学純度＞
カラム：資生堂製  Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８  ＭＧ（４．６ｍｍ×７５ｍｍ、３μｍ）
移動相：
Ａ：水／酢酸／酢酸アンモニウム＝１０００／１００／７．７（ｍＬ／ｍＬ／ｇ）
Ｂ：ＴＨＦ
グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：４１容量％（０分）→４１容量％（１７分）→９０容量％（２７分）
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ
【０１４４】
＜ＰＴ−ＤＯＬＥの化学純度＞
カラム：ＣＥＲＩ社製  Ｌ−Ｃｏｌｕｍｎ ＯＤＳ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ）
移動相：
Ａ：１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム
Ｂ：エタノール／ＴＨＦ＝１５／１（容量比）
グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：４８容量％（０分）→４８容量％（３５分）→６４容量％（５５分）
流速：１．０ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ２４５ｎｍ
【０１４５】
＜ＡＣＰＴの化学純度＞
カラム：Ｉｍｔａｃｔ製  Ｕｎｉｓｏｎ  ＵＫ−Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、３μｍ）
移動相：
Ａ：３０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム水溶液／アセトニトリル＝２０／８０（容量比）
Ｂ：３０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム水溶液／アセトニトリル＝５／９５（容量比）
グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：０容量％（０分）→０容量％（１０分）→９０容量％（３０分）
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ２４５ｎｍ
【０１４６】
＜ピタバスタチンカルシウムの化学純度＞
カラム：Ｉｍｔａｃｔ製  Ｕｎｉｓｏｎ  ＵＫ−Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、３μｍ）
移動相：
Ａ：０．１容量％ギ酸
Ｂ：アセトニトリル
グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：２５容量％（０分）→３５容量％（２０分）→９０容量％（３０分）→９０容量％（３５分）
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ３３１ｎｍ
【０１４７】
＜粉末Ｘ線回折の測定条件＞
測定装置：島津製  タイプＸＲＤ６０００
線源：Ｃｕ
波長：１．５４０６０Å
モノクロメータ：使用
管電圧：４０．０Ｋｖ、管電流：４０．０ｍＡ
ダイバージェンス：１．００ｄｅｇ
スキャッタリング：１．００ｄｅｇ
レシービング：０．１５ｍｍ
モード：連続スキャン
駆動軸：θ−２θ
データ範囲：２〜４０ｄｅｇ
ステップ：０．０２ｄｅｇ
スキャン速度：２．００００ｄｅｇ/分
回転速度：６０ｒｐｍ
【０１４８】
実施例１（ＰＴ-ＤＯＸＥの製造）
【０１４９】
【化５９】
2020109102.tif 000060
【０１５０】
窒素雰囲気下、フラスコに水素化ナトリウム２０．８ｇ（純度５９．５％、５１５ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ ２００ｍＬを仕込み、１７℃まで冷却した。この混合液に、ＤＨＡＢ ５３．９ｇ（純度９１．９％，２４７．１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２００ｍＬ）溶液を２時間かけて滴下し、滴下終了後の混合溶液を２５℃で１３時間撹拌した。
撹拌後の混合溶液に、ＰＴ−ＡＬＤ ４０．０ｇ（１３７．３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４００ｍＬ）溶液を４時間かけて滴下し、滴下終了後の溶液を２５℃で１時間撹拌した。撹拌後の溶液をＨＰＬＣで分析した結果、ＰＴ−ＤＯＸＢへの転化率は９９．２％であった。
撹拌後の溶液に、ｎ−ヘプタン２００ｍＬ及び水４００ｍＬを２５℃で滴下した後、分液を行った。その後、４重量％塩化ナトリウム水溶液、１０重量％クエン酸水溶液及び１０重量％塩化ナトリウム水溶液を使用して有機層を洗浄した。得られた有機層をＨＰＬＣにより分析した結果、ＰＴ−ＤＯＸＢの収率は８８．２％であった。
得られた有機層を減圧濃縮し、エタノール２００ｍＬを加えた。得られた溶液を、オートクレーブ（密閉容器）を用いて、内温１００℃〜１０５℃まで昇温し、維持した。１０時間経過後、得られた溶液をＨＰＬＣにより分析した結果、ＰＴ−ＤＯＸＥへの転化率は９９．０％であった。得られた溶液を６４℃まで冷却し、１時間撹拌した。撹拌後の溶液を０℃〜−５℃までゆっくり冷却した後、固液分離により結晶を回収した。
得られた結晶及びエタノール２００ｍＬをフラスコに仕込み、エタノールが還流する温度まで昇温した。その後、内温７０℃まで冷却し、１時間撹拌した。撹拌後の溶液を０℃〜−５℃までゆっくり冷却し、固液分離により結晶を回収した後、減圧乾燥した。得られた結晶をＨＰＬＣにより分析した結果、ＰＴ−ＤＯＸＥの純度は９９．１面積％であり、収量は３９．７ｇ（収率６４．９％）であった。
【０１５１】
実施例２（ＰＴ−ＤＯＸＢの製造）
【０１５２】
【化６０】
2020109102.tif 000061
【０１５３】
窒素雰囲気下、フラスコに水素化ナトリウム１５．６ｇ（純度５９．５％、３８６ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ １５０ｍＬ及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド７５ｍＬを仕込み、５℃まで冷却した。この混合液に、ＤＨＡＢ ４０．４ｇ（純度９１．９％、１８５．４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５０ｍＬ）溶液を２時間かけて滴下し、滴下終了後の混合溶液を８℃〜１０℃で１４時間撹拌した。
撹拌後の混合溶液にＰＴ−ＡＬＤ ３０．０ｇ（１０３．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２２５ｍＬ）溶液を３時間かけて滴下し、滴下終了後の溶液を８℃〜１０℃で６時間撹拌した。撹拌後の溶液をＨＰＬＣで分析した結果、ＰＴ−ＤＯＸＢへの転化率は９８．５％であった。
撹拌後の溶液に、ｎ−ヘプタン１５０ｍＬ及び水１５０ｍＬを１０℃で滴下した後、分液を行った。その後、４重量％塩化ナトリウム水溶液、１０重量％クエン酸水溶液及び１０重量％塩化ナトリウム水溶液を使用して有機層を洗浄した。得られた有機層をＨＰＬＣにより分析した結果、ＰＴ−ＤＯＸＢの収率は８８．９％であった。
【０１５４】
参考例１（菌体の調製）
［カルボニル還元酵素（以下、「ＯＣＲ１」という。）及びグルコース−１−デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＤＨ」という。）を共発現した組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨの調製］
（１）遺伝子のクローニング
オガタエア・ミヌタ  変種ノンファーメンタス（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ＮＢＲＣ（旧ＩＦＯ）１４７３由来のＯＣＲ１（日本特許第４２７０９１８号公報に記載されている配列番号２）をコードする遺伝子配列（ｏｃｒ１）を元に、ｏｃｒ１遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーｏｃｒ１＿Ｆ（配列番号３）とｏｃｒ１＿Ｒ（配列番号４）を設計、合成した。続いて、オガタエア・ミヌタ  変種ノンファーメンタス（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、常法に従ってＰＣＲを行い、約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
次に、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＬ００９１２６．３）がコードするグルコース−１−デヒドロゲナーゼにおいて、９６番目のアミノ酸残基のグルタミン酸をアラニンに置換したＧＤＨ（配列番号６）をコードする遺伝子配列（以下、ｇｄｈ（配列番号５））に対し、ｇｄｈの遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーｇｄｈ＿Ｆ１（配列番号７）とｇｄｈ＿Ｒ１（配列番号８）を設計、合成した。続いて、常法に従ってＰＣＲを行い、約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【０１５５】
（２）発現用プラスミドの調製
上記（１）で得られたｏｃｒ１のＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ＭｕｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化したプラスミドｐＫＶ３２（特開２００５−３４０２５号公報に記載のもの）にＬｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いてｔｒｃプロモーターの下流に導入し、ｐＫＶ３２ＯＣＲ１を得た。
次に、上記（１）で得られたｇｄｈのＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩにより消化し、ＭｕｎＩ及びＸｂａＩにより消化したプラスミドｐＫＶ３２にＬｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いてｔｒｃプロモーターの下流に導入し、ｐＫＶ３２ＧＤＨを得た。
さらに、ｐＫＶ３２ＧＤＨを鋳型として、制限酵素サイトＨｉｎｄＩＩＩを付加したプライマーｇｄｈ＿Ｆ２（配列番号９）とｇｄｈ＿Ｒ２（配列番号１０）でＰＣＲを行い、得られたフラグメントを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化して、あらかじめ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＫＶ３２ＯＣＲ１の下流に挿入し、ｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨを得た。得られたプラスミドにおけるｇｄｈ遺伝子の向きはＰＣＲにより確認した。
【０１５６】
（３）発現株の調製
上記（２）で得られたプラスミドｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨを用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（タカラバイオ社製）を常法に従い形質転換し、組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨを得た。
【０１５７】
実施例３（ＰＴ-ＤＯＬＥの製造）
【０１５８】
【化６１】
2020109102.tif 000062
【０１５９】
２５０ｍＬのジャーファーメンターに、イオン交換水５７ｍＬ、グルコース一水和物３０ｇ（１５１．５ｍｍｏｌ）、ＮＡＤＰ＋３０ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）、リン酸二水素カリウム２．７６ｇ（２０．３ｍｍｏｌ）、及びリン酸水素二カリウム０．３９ｇ（２．３ｍｍｏｌ）を仕込み溶解させた。そこに、参考例１の方法で調製した組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨの凍結菌体４５ｇ、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）３６．３ｇに実施例１と同様の方法で得られたＰＴ-ＤＯＸＥ １．２ｇ（２．６９ｍｍｏｌ）を溶解して調製した基質溶液全量を添加し、内温５０℃で４時間撹拌し、反応させた。反応中は２５重量％水酸化ナトリウム水溶液を滴下してｐＨを６に保持した。得られた反応液をアセトニトリルで３６倍に希釈した後、孔径０．２ｎｍのフィルターでろ過し、ろ液を取得した。ろ液をＨＰＬＣにより分析した結果、ＰＴ−ＤＯＸＥからＰＴ-ＤＯＬＥへの変換率は８５．７％であった。
【０１６０】
実施例４（ＰＴ−ＤＯＬＥの製造）
【０１６１】
【化６２】
2020109102.tif 000063
【０１６２】
３０Ｌのジャーファーメンターに、イオン交換水１２Ｌ、グルコース一水和物７５０ｇ、ＮＡＤＰ＋２．９ｇ、リン酸水素二カリウム２０．８５ｇ（０．１２ｍｏｌ）、及びリン酸二水素カリウム１４７．０ｇ（１．０８ｍｏｌ）を仕込み溶解させた。そこに、参考例１の方法で調製した組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨの凍結菌体２．１ｋｇ、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）３．３ｋｇに５Ｓ−ＭＯＬＥ（特表２００５−５１６０６４号公報記載の方法に準じて製造したもの）０．３ｋｇ（０．６７ｍｏｌ）を溶解して調製した基質溶液全量を添加し、内温５０℃で３時間撹拌し、反応させた。反応中は２５重量％水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、ｐＨを６．５に保持した。得られた反応液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、菌体と反応生成物からなる沈殿物を得た。この沈殿物を５重量％硫酸ナトリウム水溶液に懸濁した後、酢酸エチルで抽出を行った。酢酸エチルによる抽出を３回繰り返した後、得られた抽出液を合わせて溶液を得た。得られた溶液をＨＰＬＣにより分析した結果、ＰＴ−ＤＯＬＥの純度は９７．６面積％であり、収量は２３６ｇ（収率７８．７％）であった。
【０１６３】
実施例５（ＤＯＬＥ  ＭｓＯＨの製造）
【０１６４】
【化６３】
2020109102.tif 000064
【０１６５】
実施例４と同様の方法で得られたＰＴ−ＤＯＬＥの溶液を減圧濃縮し、濃度１１．６重量％に調製したＰＴ−ＤＯＬＥの溶液を得た。得られたＰＴ−ＤＯＬＥの溶液３７７．６ｇ（９７．４ｍｍｏｌ）に、温度３０℃でメタンスルホン酸０．５ｇ（５．２ｍｍｏｌ）を添加し、同温度で１．５時間撹拌した後、メタンスルホン酸８．９ｇ（９２．６ｍｍｏｌ）を酢酸エチル３９．３ｇに溶解した溶液を滴下した。滴下終了後、反応液を−３℃まで冷却した。
冷却後、得られたスラリーをろ過し、残渣を外温４０℃で減圧乾燥した。得られた固体をＨＰＬＣにより分析した結果、ＤＯＬＥ  ＭｓＯＨの収量は５２．４ｇ（収率９８％）であった。また、得られた固体の融点、１Ｈ−ＮＭＲ及び粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）測定結果は以下のとおりであった。
融点：１３２℃
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１．２２−１．２４（６Ｈ，ｍ），１．４６（２Ｈ，ｓ），１．４９（１Ｈ，ｍ），２．２２−２．３３（２Ｈ，ｍ），２．３７（３Ｈ，ｓ），２．６１（１Ｈ, ｍ），３．７６（１Ｈ，ｍ），４．０８（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝８Ｈｚ）４．１４（１Ｈ，ｍ），５．６７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，１６Ｈｚ），６．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ），７．３５−７．４０（５Ｈ，ｍ），７．５６（１Ｈ，ｍ），７．８２（１Ｈ，ｍ），８．０９（１Ｈ，ｍ）
ＸＲＤ測定結果：
【０１６６】
【表１】
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【０１６７】
実施例６（ＡＣＰＴの製造）
【０１６８】
【化６４】
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【０１６９】
実施例５と同様の方法で得られたＤＯＬＥ  ＭｓＯＨ １５．０ｇ（２７．５ｍｍｏｌ）とアセトニトリル５８．５ｇをフラスコに仕込んだ。その混合物に、アセトンジメチルアセタール１１．３ｇ（１０９ｍｍｏｌ）を内温２０℃で添加した。３時間撹拌した後、炭酸水素ナトリウム２．９ｇ及び水１９．５ｇを添加した。更に水１３．０ｇを添加し、１２時間撹拌した。その後、水を４２．２ｇ追加し、内温を−４℃まで冷却して、得られた結晶をろ過し、減圧乾燥して、ＡＣＰＴの粗結晶を１３．３ｇ（収率９９％）得た。
得られたＡＣＰＴの粗結晶１０ｇ、エタノール５８．８ｇ及び水１４．７ｇをフラスコに仕込み、内温を６０℃付近まで昇温して溶解させた。得られた溶液を内温３７℃付近まで冷却し、しばらく撹拌したところ結晶が析出した。その後、内温を−３℃まで６時間かけて冷却した。得られた結晶をろ過して回収し、減圧乾燥した。得られた結晶をＨＰＬＣにより分析した結果、ＡＣＰＴの純度は９９．８面積％であり、収量は８．９ｇ（収率８９％）であった。
【０１７０】
実施例７（ピタバスタチンカルシウムの製造）
【０１７１】
【化６５】
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【０１７２】
実施例６と同様の方法で得られたＡＣＰＴの結晶８ｇ（１６．３ｍｍｏｌ）とエタノール４０ｍＬをフラスコに仕込んだ。その混合物に、３５重量％塩酸２．４ｇと水２１．６ｇを混合した溶液を、内温３０℃付近で添加した。３．５時間撹拌した後、酢酸エチル９０ｍＬ及び７重量％炭酸水素ナトリウム水溶液４５ｇを添加した。得られた溶液を分液した後、水層に酢酸エチル４５ｍＬを添加し、分液した。得られた有機層を合わせたものを、２０重量％塩化ナトリウム水溶液４５ｇで洗浄した後、濃縮した。
濃縮後、得られた残渣にエタノール７４ｍＬ及び水７４ｍＬを添加した。その混合物に、８重量％水酸化ナトリウム水溶液９．９ｇを添加した。３時間撹拌した後、得られた溶液を減圧濃縮した。減圧濃縮後、得られた残渣に、ｔ−ブチルメチルエーテル３７ｍＬを添加し、分液した。この操作を２回実施した。水層を減圧濃縮した後、塩化カルシウム２水和物２．６ｇを水１０４ｇに溶解した溶液を、内温３２℃付近で滴下した。その後、得られた反応液を２℃付近まで冷却し、生成した結晶をろ別し、湿結晶を減圧乾燥した。結晶の水分が９．６重量％に達した時点で乾燥を停止した。得られた結晶をＨＰＬＣにより分析した結果、ピタバスタチンカルシウムの純度は９９．９３面積％であり、収量は９．７ｇ（収率９４％）であった。
【０１７３】
実施例８（ピタバスタチンカルシウムの製造）
実施例６と同様の方法で得られたＡＣＰＴの結晶７０ｇ（１４３ｍｍｏｌ）とエタノール３５０ｍＬをフラスコに仕込んだ。その混合物に、３．５重量％塩酸２０８ｇを、内温３０℃付近で添加した。２時間撹拌した後、エタノール２１０ｍＬを追加し、８重量％水酸化ナトリウム水溶液１００ｇを添加した。混合物を濃縮して容量を６３０ｍＬとした。その後、３．５重量％塩酸１７８ｇを追加し、室温で２時間撹拌した。その後、８重量％水酸化ナトリウム水溶液１７８ｇを追加し、室温で２時間撹拌した。混合物に２１０ｍＬの水を添加した後、容量が７００ｍＬになるまで濃縮を行った。濃縮液に水３５０ｍＬ及びｔ−ブチルメチルエーテル３５０ｍＬを添加して分液をした後、水層を容量が９８０ｍＬになるまで濃縮した。得られた濃縮液に塩化カルシウム２水和物２２．９ｇと水１７３ｇを混合した溶液を温度３０℃付近で滴下した。得られたスラリーを室温まで冷却し、生成した結晶をろ別し、湿結晶を減圧乾燥した。得られた結晶の水分は７．８重量％であった。得られた結晶に湿潤した窒素を流通し、水分を１０．９重量％に調整した。得られた結晶をＨＰＬＣにより分析した結果、ピタバスタチンカルシウムの純度は９９．９６面積％であり、収量は６６．０ｇ（収率９３％）であった。
【産業上の利用可能性】
【０１７４】
本発明の方法によれば、ピタバスタチンカルシウムを、工業的な規模で、高収率及び高選択性で、且つ安全に低コストで製造することができる。
【０１７５】
本出願は、日本で出願された特願２０１５−１５４８６４を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
【図１】
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【配列表】
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