(57)【要約】【課題】本発明は、角膜内皮細胞の培養方法を提供する。【解決手段】より詳細には、本発明は、角膜内皮細胞において発現するラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子を含む、角膜内皮細胞の培養または増殖のための組成物を提供する。詳細には、本発明はラミニン５１１（α５β１γ１）、ラミニン５２１（α５β２γ１）あるいはこれらのフラグメントを含みうる。本発明はまた、本発明の組成物をコーティングした角膜内皮細胞の培養容器を提供する。本発明はさらに、本発明の組成物または本発明の容器を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する、角膜内皮細胞の培養方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラミニンの角膜内皮の細胞培養（維持）または増殖のための成分としての用途に関する。詳細には、ラミニンを含む角膜内皮細胞培養・増殖用組成物、容器、培養法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの角膜内皮細胞は、出生時には１平方ミリメートル当たり約３０００個の密度で存在しているが、一度障害を受けると再生する能力を持たない。このように、角膜内皮細胞は、培養が困難であるとされており、移植技術において培養、増殖が困難な現在の状況のため、角膜内皮の処置、手術が事実上不可能となっている。日本での角膜提供は不足しており、角膜移植の待機患者約２６００人に対し、年間に国内で行われている角膜移植件数は１７００件程度である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開2011-78370
【特許文献２】WO2013/047763
【特許文献３】WO2011/024070
【特許文献４】WO2010/140464
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】東邦医学会雑誌  Vol.56,  No.1,Page.39  (2009.01.01)
【非特許文献２】日本眼科学会雑誌  Vol.105,  臨時増刊号,  Page.196  (2001.03.15)
【非特許文献３】J  Biol  Chem.2013  Sep  13.  [Epub  ahead  of  print]
【非特許文献４】PLoS  One.2013;8(1):e53648.  doi:  10.1371/journal.pone.0053648.  Epub  2013  Jan  7.
【非特許文献５】Cell  Adh  Migr.2013  Jan-Feb;7(1):142-9.  doi:  10.4161/cam.22125.  Epub  2012  Oct  17.
【非特許文献６】J  Cell  Biochem.2007  Feb  15;100(3):545-56.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、特定のラミニンが、角膜内皮の培養および増殖に有用であることを見出したことによって、本発明を完成した。したがって、本発明は、代表的に、以下を提供する。
（１）角膜内皮細胞において発現するラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子を含む、角膜内皮細胞の培養または増殖のための組成物。（２）前記ラミニンは、ラミニン５１１（α５β１γ１）およびラミニン５２１（α５β２γ１）を含む、項目１に記載の組成物。
（３）前記フラグメントは、角膜内皮細胞の細胞接着能を有する、項目１または２に記載の組成物。
（４）前記因子は、ラミニン５１１、ラミニン５２１またはラミニン５１１−Ｅ８フラグメントである、項目１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
（５）前記角膜内皮細胞はヒトのものである、項目１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
（６）項目１〜５のいずれか１項に記載の組成物を含む、角膜内皮細胞の培養用培地。
（７）項目１〜５のいずれか１項に記載の組成物をコーティングした角膜内皮細胞の培養容器。
（８）項目１〜５のいずれか１項に記載の組成物を用いる工程を包含する、角膜内皮細胞の培養方法。
（９）項目６に記載の培地を用いる工程を包含する、角膜内皮細胞の培養方法。
（１０）項目７に記載の培養容器を用いる工程を包含する、角膜内皮細胞の培養方法。
【０００６】
上記特徴はそれぞれ組み合わせて用いることができることが理解される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、角膜内皮細胞（特に、ヒト角膜内皮細胞）の培養および維持、増殖を可能にする成分を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ヒト角膜内皮細胞のラミニン鎖のｍＲＮＡ発現を示す図である。左から、分子量マーカー、ラミニンα１鎖、α２鎖、α３鎖、α４鎖、α５鎖、β１鎖、β２鎖、β３鎖、β４鎖、γ１鎖、γ２鎖、γ３鎖を示す。
【図２】図２は、ヒト角膜内皮細胞のインテグリン鎖のｍＲＮＡ発現を示す。上段は、左から、インテグリンα１鎖、α２鎖、α３鎖、α４鎖、α５鎖、α６鎖、α７鎖、α８鎖、α９鎖、α１０鎖、α１１鎖、αＥ鎖、αＶ鎖、αＬ鎖、αＭ鎖、αＸ鎖、αＤ鎖、αＩＩｂ鎖を示す。下段は、左から、インテグリンβ１鎖、β２鎖、β３鎖、β４鎖、β５鎖、β６鎖、β７鎖、β８鎖、を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｃは、まとめて、フローサイトメトリーによるヒト角膜内皮細胞の種々のインテグリン鎖の発現解析を示す。図３Ａは、フローサイトメトリーによるヒト角膜内皮細胞の種々のインテグリン鎖の発現解析を示す。上段は、左から、インテグリンα１、α２およびα３を示す。下段は、左から、α４、α５およびα６を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｃは、フローサイトメトリーによるヒト角膜内皮細胞のインテグリン鎖の発現解析を示す。上段は、左から、αＥ、αＶおよびα１を示す。下段は、左から、αＭ、αＸ、およびαＩＩｂ（ＣＤ４１ａ）を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜図３Ｃは、フローサイトメトリーによるヒト角膜内皮細胞のインテグリン鎖の発現解析を示す。上段は、左から、αＩｂ（ＣＤ４１ｂ）、β１、およびβ２を示す。下段は、左から、β３、β４およびβ７を示す。
【図４】図４は、ラミニン５１１および５２１はヒト角膜内皮細胞の細胞接着を促進することを示す写真である。上段は左からラミニン５１１、ラミニン５２１、ラミニン２１１を示し。下段は左からコーティングなし、ＦＮＣコーティング、ゼラチンコーティングを示す。縮尺は50μmである。
【図５】図５は、ラミニン５１１および５２１はヒト角膜内皮細胞の細胞接着を促進することを示すグラフである。ｙ軸は細胞数（％コントロール）を示す。ｘ軸は左から、コーティングなし（コントロール）、ラミニン５１１、ラミニン５２１、ラミニン２１１、ＦＮＣ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｍｉｘ、ゼラチン、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメントを示す。
【図６】図６は、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメントはヒト角膜内皮細胞の細胞接着を促進することを示すグラフである。ｙ軸は細胞数（％コントロール）を示す。ｘ軸は左から、コーティングなし（コントロール）、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメントの各濃度（順に０．００１μｇ／ｃｍ２、０．０１μｇ／ｃｍ２、０．１μｇ／ｃｍ２、０．５μｇ／ｃｍ２、１．０μｇ／ｃｍ２、１．５μｇ／ｃｍ２）、ならびにＦＮＣ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｍｉｘを示す。
【図７】図７は、ラミニン５１１、ラミニン５２１およびラミニン５１１−Ｅ８フラグメントはヒト角膜内皮細胞の細胞増殖を促進することを示すグラフである。ｙ軸はＢｒｄＵの取り込み量のコントロールに対する相対値（％）を示す。ｘ軸は、左から、コーティングなし（コントロール）、ラミニン５１１、ラミニン５２１、ラミニン２１１、ＦＮＣ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｍｉｘ、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメント（左から、０．５μ／ｃｍ２、１．０μｇ／ｃｍ２、１．５μｇ／ｃｍ２）を示す。
【図８】図８は、ラミニン５１１および５２１はヒト角膜内皮細胞の細胞培養を効率化することを示す培養２日目の位相差顕微鏡写真である。左上はラミニン５１１を示し、右上はラミニン５２１を示し、左下はラミニン２１１を示し。右下はコーティングなしを示す。バーは１００μｍを示す。
【図９】図９は、ラミニン５１１および５２１は細胞密度の高いヒト角膜内皮細胞の細胞培養を可能にすることを示す２０日目の位相差顕微鏡写真である。左上はラミニン５１１を示し、右上はラミニン５２１を示し、左下はラミニン２１１を示し。右下はコーティングなしを示す。バーは１００μｍを示す。
【図１０】図１０は、ラミニン５１１および５２１は細胞密度の高いヒト角膜内皮細胞の細胞培養を可能にすることを示す写真である。赤染色はＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅに対する染色を示し、青染色はＤＡＰＩに対する染色を示す。左上はラミニン５１１を示し、右上はラミニン５２１を示し、左下はラミニン２１１を示し。右下はコーティングなしを示す。バーは１００μｍを示す。
【図１１】図１１は、ラミニン５１１および５２１は細胞密度の高いヒト角膜内皮細胞の細胞培養を可能にすることを示す写真である。緑染色はＺＯ−１に対する染色を示し、青染色はＤＡＰＩに対する染色を示す。左上はラミニン５１１を示し、右上はラミニン５２１を示し、左下はラミニン２１１を示し。右下はコーティングなしを示す。バーは１００μｍを示す。
【図１２】図１２は、ラミニン５２１およびラミニン５１１−Ｅ８フラグメントを培地に添加して培養することでも、ヒト角膜内皮細胞の細胞接着を促進することを示すグラフである。ｙ軸は細胞数（％コントロール）を示す。ｘ軸は左から、コーティングなし（コントロール）、ラミニン５２１の各濃度（順に１．０μｇ／ｃｍ２、２．０μｇ／ｃｍ２、４．０μｇ／ｃｍ２）およびラミニン５１１−Ｅ８フラグメントの各濃度（順に１．０μｇ／ｃｍ２、２．０μｇ／ｃｍ２、４．０μｇ／ｃｍ２）を培地に添加したものならびにＦＮＣ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｍｉｘにて培養皿をコーティングしたものを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。従って、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１０】
（定義）
本明細書において「角膜内皮細胞」とは当該分野で用いられる通常の意味で用いられる。角膜とは、眼を構成する層状の組織の一つであり透明であり、最も外界に近い部分に位置する。角膜は、ヒトでは外側（体表面）から順に５層でできているとされ、外側から角膜上皮、ボーマン膜、固有層、デスメ膜（角膜内皮基底膜）、および角膜内皮で構成される。特に、特定しない限り、上皮および内皮以外の部分は「角膜実質」とまとめて称することがあり、本明細書でもそのように称する。本明細書において「ＨＣＥＣ」（human  corneal  endothelial  cells）とは、ヒト角膜内皮細胞の略称である。本発明で使用される角膜内皮細胞は、天然に存在する細胞のほか、幹細胞から分化した細胞、例えばｉＰＳ等からの誘導分化細胞を用いることができることが理解される。
【００１１】
本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないことをいう。従って、単離された細胞、組織などとは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。
【００１２】
本明細書において「角膜内皮製剤」とは、角膜内皮または角膜内皮細胞を含む任意の薬剤をいう。本発明の方法で培養して生産される角膜内皮細胞は、製剤化されうることから、角膜内皮製剤は、本発明の方法で培養して生産される角膜内皮細胞を用いて製造されうる。
【００１３】
本明細書において「細胞外マトリクス」とは、（ＥＣＭ）とは「細胞外基質」とも呼ばれ、上皮細胞、非上皮細胞を問わず体細胞（ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の間に存在する物質をいう。細胞外マトリクスは、通常細胞が産生し、従って生体物質の一つである。細胞外マトリクスは、組織の支持だけでなく、すべての体細胞の生存に必要な内部環境の構成に関与する。細胞外マトリクスは一般に、結合組織細胞から産生されるが、一部は上皮細胞や内皮細胞のような基底膜を保有する細胞自身からも分泌される。線維成分とその間を満たす基質とに大別され、線維成分としては膠原線維および弾性線維がある。基質の基本構成成分はグリコサミノグリカン（酸性ムコ多糖）であり、その大部分は非コラーゲン性タンパクと結合してプロテオグリカン（酸性ムコ多糖−タンパク複合体）の高分子を形成する。このほかに、基底膜のラミニン、弾性線維周囲のミクロフィブリル（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌ）、線維、細胞表面のフィブロネクチンなどの糖タンパクも基質に含まれる。特殊に分化した組織でも基本構造は同一で、例えば硝子軟骨では軟骨芽細胞によって特徴的に大量のプロテオグリカンを含む軟骨基質が産生され、骨では骨芽細胞によって石灰沈着が起こる骨基質が産生される。ここで、代表的な細胞外マトリクスを構成する物質としては、例えば、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、エラスチン、コラーゲンＶＩＩＩ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、トロンボスポンディン、プロテオグリカン類（例えば、デコリン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、ヒアルロン酸、アグリカンなど）などを挙げることができるがそれらに限定されず、細胞接着を担う細胞外マトリクスであれば、種々のものが本発明において利用され得る。
【００１４】
本明細書において「ラミニン」とは細胞外マトリックスの基底膜を構成するタンパク質であり、多細胞体制・組織構築とその維持、細胞接着、細胞移動、細胞増殖を促進し、がん細胞と関係が深い。胚発生の初期（2細胞期）に発現するとされる。α鎖、β鎖および
γ鎖のそれぞれ１本ずつからなるヘテロ三量体である。ラミニンの命名は、発見順の名称（ラミニン−１、ラミニン−２等）が知られていたが、サブユニットとの対応は考慮されていないため本明細書では、より新たな命名法である、α、β、γのサブクラスの名称（３桁の番号、百の位はα、十の位はβ、一の位はγを示す。）を併記する方法を採用し、α１、β１およびγ１の場合、ラミニン１１１などと称する。ラミニンはα鎖が５種、β鎖が３種，γ鎖が３種、見出だされている。従って、理論的な組み合わせの最大数は、５×３×３＝４５で、４５種類のラミニン分子が可能であるが、天然にすべての組み合わせが存在しているわけではないとされている。各サブユニットは、例えばα鎖についてはＬＡＭＡ１、ＬＡＭＡ２、ＬＡＭＡ３、ＬＡＭＡ４、ＬＡＭＡ５等と称し、β鎖についてはＬＡＭＢ１、ＬＡＭＢ２、ＬＡＭＢ３と称し、γ鎖についてはＬＡＭＣ１、ＬＡＭＣ２、ＬＡＭＣ３と称される。本発明で使用されるラミニンタンパク質は天然型であっても、あるいはその生物学的活性、特に細胞接着促進活性を保持したまま１またはそれ以上のアミノ酸残基が修飾された修飾型であってもよい。また、本発明におけるラミニンタンパク質は本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。したがって、本発明で使用されるラミニンタンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現させたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。本発明で使用されるラミニンタンパク質の由来は特に、限定されないが、好ましくは、ヒト由来のものである。医療材料を得る目的などでヒト細胞を培養する場合には、他の動物に由来する材料の使用を避けるために、ヒト由来のラミニンを用いることが好ましいがこれに限定されない。
【００１５】
ラミニンの結合分子も知られており、α１β１、α２β１、α２β２、α３β１、α６β１、α６β４、α７β１、α９β１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ８がラミニンレセプターとして知られるインテグリンである。
【００１６】
以下の表に代表的なラミニンおよびその説明を記載する。
【００１７】
【表１Ａ】
2020188778.tif 000002
【００１８】
本明細書において「α１鎖」（ＬＡＭＡ１）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＡ１；ＬＡＭＡ；Ｓ−ＬＡＭ−ａｌｐｈａなどと称する。ヒトＬＡＭＡ１は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_005559およびNP_005550に登録されている。OMIMは150320とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「α１鎖」、「ＬＡＭＡ１」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００１９】
本明細書において「α２鎖」（ＬＡＭＡ２）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＡ２；ＬＡＭＭなどと称する。ヒトＬＡＭＡ２は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がＮＣＢＩ登録番号のNM_000426およびNP_000417に登録されている。ＯＭＩＭは156225とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「α２鎖」、「ＬＡＭＡ２」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００２０】
本明細書において「α３鎖」（ＬＡＭＡ３）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＡ３；ＢＭ６００；Ｅ１７０；ＬＡＭＮＡ；ＬＯＣＳ；ｌａｍａ３ａなどと称する。ヒトＬＡＭＡ３は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_000227およびNP_000218に登録されている。OMIMは600805とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「α３鎖」、「ＬＡＭＡ３」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００２１】
本明細書において「α４鎖」（ＬＡＭＡ４）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＡ４；ＬＡＭＡ３；ＬＡＭＡ４＊−１；ＣＭＤ１ＪＪなどと称する。ヒトＬＡＭＡ４は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_001105206およびNP_001098676に登録されている。OMIMは600133とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「α４鎖」、「ＬＡＭＡ４」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００２２】
本明細書において「α５鎖」（ＬＡＭＡ５）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＡ５；ＫＩＡＡ１９０７などと称する。ヒトＬＡＭＡ５は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_005560およびNP_005551に登録されている。OMIMは601033とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「α５鎖」、「ＬＡＭＡ５」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００２３】
本明細書において「β１鎖」（ＬＡＭＢ１）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＢ１；ＣＬＭ；ＬＩＳ５などと称する。ヒトＬＡＭＢ１は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_002291およびNP_002282に登録されている。ＯＭＩＭは150240とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「β１鎖」、「ＬＡＭＢ１」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００２４】
本明細書において「β２鎖」（ＬＡＭＢ２）(laminin  S)とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＢ２；ＬＡＭＳ；ＮＰＨＳ５などと称する。ヒトＬＡＭＢ２は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_002292およびNP_002283に登録されている。ＯＭＩＭは150325とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「β２鎖」、「ＬＡＭＢ２」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００２５】
本明細書において「β３鎖」（ＬＡＭＢ３）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＢ３；ＢＭ６００−１２５ＫＤＡ；ＬＡＭ５；ＬＡＭＮＢ１などと称する。ヒトＬＡＭＢ３は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_000228およびNP_000219に登録されている。ＯＭＩＭは150310とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「β３鎖」、「ＬＡＭＢ３」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００２６】
本明細書において「γ１鎖」（ＬＡＭＣ１）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＣ１；ＬＡＭＢ２などと称する。ヒトＬＡＭＣ１は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_002293およびNP_002284に登録されている。OMIMは150290とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「γ１鎖」、「ＬＡＭＣ１」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００２７】
本明細書において「γ２鎖」（ＬＡＭＣ２）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＣ２；Ｂ２Ｔ；ＢＭ６００；ＣＳＦ；ＥＢＲ２；ＥＢＲ２Ａ；ＬＡＭＢ２Ｔ；ＬＡＭＮＢ２などと称する。ヒトＬＡＭＣ２は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_005562およびNP_005553に登録されている。OMIMは150292とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「γ２鎖」、「ＬＡＭＣ２」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００２８】
本明細書において「γ３鎖」（ＬＡＭＣ３）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＣ３；ＯＣＣＭなどと称する。ヒトＬＡＭＣ３は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_006059およびNP_006050に登録されている。OMIMは604349とのアクセッション番号で同定される。本明細書の目的で使用される場合は、「γ３鎖」、「ＬＡＭＣ３」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００２９】
本明細書において「角膜内皮細胞において発現するラミニン」とは、角膜内皮細胞において通常状態において遺伝子が発現、好ましくはタンパク質レベルで、有意に発現しているラミニンの種類をいう。本明細書における解析により、α５、β１、β２およびγ１が発現していることが確認されている（図２）。したがって、ラミニン５１１、ラミニン５２１が角膜内皮細胞において発現していることが少なくとも確認されている。ラミニン５１１については、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２１８，２１３−２３４，２０００、およびＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７７（１５），１２７４１−１２７４８，２００２に詳細な記載があるので、これらの文献に記載された内容は、本明細書中に援用する。ラミニン５１１等は、市販されているものを利用することも可能である。例えば、ＢｉｏＬａｍｉｎａ社からラミニン５１１、ラミニン５２１の組換えタンパク質が市販されており入手可能である。
【００３０】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてmRNAが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたもの（本明細書にいう誘導体）であり得る。例えば、ラミニン各鎖の発現レベルは、任意の方法によって決定することができる。具体的には、ラミニン各鎖のmRNAの量、ラミニン各鎖タンパク質の量、そしてラミニン各鎖タンパク質の生物学的な活性を評価することによって、ラミニン各鎖の発現レベルを知ることができる。ラミニン各鎖のmRNAやタンパク質の量は、本明細書に記載したような方法によって決定することができる。
【００３１】
本明細書において「機能的等価物」とは、対象となるもとの実体に対して、目的となる機能が同じであるが構造が異なる任意のものをいう。従って、「ラミニンもしくはラミニン各鎖またはその機能的等価物」または「ラミニン、ラミニン各鎖およびその機能的等価物からなる群」という場合は、ラミニンもしくはラミニン各鎖自体のほか、ラミニンもしくはラミニン各鎖のフラグメント、変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、眼細胞等の細胞接着能、分化制御および／または増殖促進作用を１つ以上有するもの、ならびに、作用する時点においてラミニンもしくはラミニン各鎖自体またはこのラミニンもしくはラミニン各鎖のフラグメント、変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、ラミニンもしくはラミニン各鎖自体またはラミニンもしくはラミニン各鎖のフラグメント、変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含されることが理解される。「ラミニンもしくはラミニン各鎖またはその機能的等価物」または「ラミニン、ラミニン各鎖およびその機能的等価物からなる群」としては、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子が代表例として挙げられる。本発明において、ラミニンもしくはラミニン各鎖の機能的等価物は、格別に言及していなくても、ラミニンもしくはラミニン各鎖と同様に用いられうることが理解される。
【００３２】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなラミニンの鎖は、その活性、例えば、増殖促進または維持の因子として機能する場合、そのフラグメント自体も本発明の範囲内に入ることが理解される。本発明に従って、用語「活性」は、本明細書において、最も広い意味での分子の機能を指す。活性は、限定を意図するものではないが、概して、分子の生物学的機能、生化学的機能、物理的機能または化学的機能を含む。活性は、例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力、および他の分子の機能を活性化するか、促進するか、安定化するか、阻害するか、抑制するか、または不安定化する能力、安定性、特定の細胞内位置に局在する能力を含む。適用可能な場合、この用語はまた、最も広い意味でのタンパク質複合体の機能にも関する。本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。2つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、2分子は結合していると考えられる。従って、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。従って、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測���可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が挙げられる。
【００３３】
本明細書で使用される「機能的に活性な」は、本発明のポリペプチド、フラグメントまたは誘導体が関連する態様に従って、生物学的活性などの、タンパク質の構造的機能、制御機能、または生化学的機能を有する、ポリペプチド、フラグメントまたは誘導体を指す。
【００３４】
本明細書において、ラミニンの「フラグメント」とは、ラミニンの任意のフラグメントを指し、本発明において使用される因子としては、ラミニン全長のみならず、ラミニンのフラグメントも、その機能、特に内皮細胞の細胞接着能を有する限り使用されうることが理解される。したがって本発明において使用されるラミニンのフラグメントは、通常、ラミニンの機能を少なくとも１つ有する。そのような機能としては、特に内皮細胞の細胞接着能が含まれうる。
【００３５】
以下に、本発明で角膜内皮細胞に発現していることが見出されたラミニンについて、その配列について説明する。これらのラミニンは、本発明の好ましい代表例を示すものであり、本発明は、これらの特定のラミニンサブタイプに限定されるものではないことが理解される。
【００３６】
ラミニンα５鎖の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンα５鎖の有する活性をいう。α５鎖については、Ｄｏｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７７（１５），１２７４１−１２７４８，２００２；米国特許第６，９３３，２７３号を参照することができる。
【００３７】
ラミニンα５鎖のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンα５鎖の有する活性をいう。α５鎖については、Ｄｏｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７７（１５），１２７４１−１２７４８，２００２；米国特許第６，９３３，２７３号を参照することができる。
【００３８】
ラミニンβ１鎖の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンβ１鎖の有する活性をいう。β１鎖については、Ｐｉｌｌａｒａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（２２），１０４５４−１０４６２，１９８７；米国特許第６，９３３，２７３号を参照することができる。
【００３９】
ラミニンβ１鎖のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンβ１鎖の有する活性をいう。β１鎖については、Ｐｉｌｌａｒａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（２２），１０４５４−１０４６２，１９８７；米国特許第６，９３３，２７３号を参照することができる。
【００４０】
ラミニンβ２鎖の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号５に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンβ２鎖の有する活性をいう。β２鎖については、Ｗｅｗｅｒ  ＵＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  １９９４  Ｎｏｖ  １５；２４（２）：２４３−５２．，１９８７；米国特許第６，９３３，２７３号を参照することができる。
【００４１】
ラミニンβ２鎖のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号５に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号６に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンβ２鎖の有する活性をいう。β２鎖については、Ｗｅｗｅｒ  ＵＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  １９９４  Ｎｏｖ  １５；２４（２）：２４３−５２．，１９８７；米国特許第６，９３３，２７３号を参照することができる。
【００４２】
ラミニンγ１鎖の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号７に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号７に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンγ１鎖の有する活性をいう。γ１鎖については、Ｐｉｌｌａｒａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１４），６７５１−６７５８，１９８８；米国特許第６，９３３，２７３号を参照することができる。
【００４３】
ラミニンγ１鎖のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号８に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号７に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号８に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンγ１鎖の有する活性をいう。γ１鎖については、Ｐｉｌｌａｒａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１４），６７５１−６７５８，１９８８；米国特許第６，９３３，２７３号を参照することができる。
【００４４】
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、交換可能で本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が包含される。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の1または2以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本発明のタンパク質（例えばラミニン各鎖）は、目的とする各鎖遺伝子をコードするＤＮＡを、適当なベクター中に組み込み、これを真核生物または原核生物細胞のいずれかに、各々の宿主で発現可能な発現ベクターを用いて導入し、それぞれの鎖を発現させることにより所望のタンパク質を得ることができる。ラミニンを発現させるために用いることができる宿主細胞は特に限定されるものではなく、大腸菌、枯草菌等の原核宿主細胞、および酵母、真菌、昆虫細胞、植物および植物細胞、哺乳動物細胞等の真核生物宿主が挙げられる。目的とするラミニン鎖等を発現するように構築したベクターを、トランスフォーメーション、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、アグロバクテリウム法、直接マイクロインジェクション等により、上記の宿主細胞中に導入することができる。ベクターを含む細胞を適当な培地中で成長させて、本発明で使用するラミニン鎖等を産生させ、細胞または培地から精製することにより、ラミニン鎖等を得ることができる。精製はサイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫アフィニティークロマトグラフィー等を用いて行うことができる。
【００４５】
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
【００４６】
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、交換可能で本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がN3’−P5’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがC−5プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine−modified  cytosine）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、DNA中のリボースが2’−O−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが2’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、1またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの3番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzer  et  al.,  Nucleic  Acid  Res.19:5081(1991);Ohtsuka  et  al.,  J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Rossolini  et  al.,  Mol.Cell.Probes  8:91-98(1994)）。本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。
【００４７】
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する遺伝子を調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。
【００４８】
アミノ酸は、その一般に公知の3文字記号か、またはIUPAC−IUB  Biochemical  Nomenclature  Commissionにより推奨される1文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された1文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるBLASTを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、NCBIのBLAST  2.2.26（2011.10.30発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記BLASTを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。類似性は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。
【００４９】
本明細書において「ストリンジェント（な）条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明で使用されるラミニンは、具体的に開示された各ラミニンの核酸配列に対して「ストリンジェント（な）条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」によってコードされるものも使用されうることが理解される。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のDNAを固定化したフィルターを用いて、0．7〜1．0MのNaCl存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0．1〜2倍濃度のSSC（saline−sodium  citrate）溶液（1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM  塩化ナトリウム、15mM  クエン酸ナトリウムである）を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Molecular  Cloning  2nd  ed.,Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Supplement  1-38,  DNA  Cloning  1:Core  Techniques,A  Prac1tical  Approach,  Second  Edition,  Oxford  University  Press(1995)などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、A配列のみまたはT配列のみを含む配列が除外される。従って、本発明において使用されるポリペプチド（例えば、トランスサイレチンなど）には、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。これらの低ストリンジェンシー条件は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、および１０％（重量／体積）デキストラン硫酸を含む緩衝液中、４０℃で１８〜２０時間ハイブリダイゼーションし、２ｘＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中、５５℃で１〜５時間洗浄し、そして２ｘＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中、６０℃で１．５時間洗浄することを含む。
【００５０】
本発明の機能的等価物としては、アミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加されたものを用いることができる。本明細書において、「アミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、あるいは天然の変異により、天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされていることを意味する。
【００５１】
本発明で用いられるラミニン各鎖等の改変アミノ酸配列は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、ラミニン各鎖等のアミノ酸配列において１または複数個（好ましくは１もしくは数個または１、２、３、もしくは４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。ここで「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００５２】
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではａｇｅｎｔに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５３】
本明細書において「培養」とは、対象となる細胞を育成することをいい、狭義にはその状態が悪化しないで維持される（たとえば、細胞数が実質的に減少しない）ことをいう。狭義には培養維持または維持と同じ意味で使用される。
【００５４】
本明細書において「増殖」とは、細胞の数が増加することをいう。
【００５５】
本明細書において「増殖能」とは、細胞の増殖する能力をいう。本明細書では格別に言及しない場合、増殖の状態は、定常状態での増殖の可能性を指す。ここで、「定常状態」とは、生体での通常の条件であって、生体の恒常性が維持されている状態をいう。そのような状態は、当業者であれば、容易に決定することができる。たとえば、細胞密度解析により、細胞密度がほぼ一定で変化しないこと、または細胞増殖マーカーの発現が認められないことなどによって確認することができる。本明細書において「増殖促進」とは、ある細胞の増殖状態が促進されることをいう。対象となる細胞が増殖していなかった場合は、少しでも増殖を始めれば増殖促進に該当し、すでに増殖をしている細胞の場合は、その増殖レベルが維持またはより高まれば、好ましくは高まれば増殖促進に該当する。
【００５６】
本明細書において「幹細胞」とは、複数系統の細胞に分化できる能力（多分化能）と、細胞分裂を経ても多分化能を維持できる能力（自己複製能）を併せ持つ細胞をいう。幹細胞には、胚性幹細胞、生殖細胞、iPS細胞、組織幹細胞などが包含される。本発明が対象とする角膜内皮細胞は、幹細胞から分化させたものであってもよい。幹細胞から角膜内皮細胞への分化は当該分野で公知の手法を用いて達成することができる。
【００５７】
本明細書において細胞の「正常細胞機能」とは、角膜内皮細胞等の具体的細胞について言う場合、その細胞が本来有している機能をいう。角膜内皮細胞についていえば、そのような機能としては、ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、角膜移植への適応能（Matsubara  M,  Tanishima  T:  Wound-healing  of  the  corneal  endothelium  in  the  monkey:  a  morphometric  study,  Jpn  J  Ophthalmol  1982,  26:264-273；Matsubara  M,  Tanishima  T:  Wound-healing  of  corneal  endothelium  in  monkey:  an  autoradiographic  study,  Jpn  J  Ophthalmol  1983,  27:444-450；Van  Horn  DL,  Hyndiuk  RA:  Endothelial  wound  repair  in  primate  cornea,  Exp  Eye  Res  1975,  21:113-124およびVanHorn  DL,  Sendele  DD,  Seideman  S,  Buco  PJ:  Regenerative  capacity  of  the  corneal  endothelium  in  rabbit  and  cat,  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci  1977,  16:597-613）等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００５８】
ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅは、遺伝子の発現を免疫的な手段またはＲＴ−ＰＣＲ等の核酸レベルでの発現をみることによって評価することができる。Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１が正常細胞と同程度に発現および／または機能していることを確認することによって、対象の細胞が正常の機能を有しているかどうかを確認することができる。
【００５９】
角膜移植への適応能は、通常ウサギ等の実験動物においても水疱性角膜症モデルとして角膜内皮を機械的に掻爬して、培養細胞の移植試験を行うことができる。しかしながら、ウサギの角膜内皮細胞は生体内で増殖するため、ホストの角膜内皮細胞の増殖による自然治癒の可能性を否定できない（Matsubara  M,  et  al.,  Jpn  J  Ophthalmol  1982,  26:264-273；Matsubara  M,et  al.,  Jpn  J  Ophthalmol  1983,  27:444-450；Van  Horn  DL,  et  al.,  Exp  Eye  Res  1975,  21:113-124およびVan  Horn  DL,  et  al.,  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci  1977,16:597-613）。したがって、より正確な移植適応能を評価するためには、霊長類への生着を評価することが好ましい。ヒトへの移植適応能を評価する場合は、霊長類であるカニクイザルなどにおいて、例えば、少なくとも１ヶ月、好ましくは少なくとも２ヶ月、より好ましくは少なくとも３ヶ月、さらに好ましくは少なくとも６ヶ月、さらにより好ましくは少なくとも１２ヶ月経過させた後の適応性を評価する。サル等の霊長類での移植適応能を確認することは特にヒトへの適用において重要である。
【００６０】
本明細書において「ＢｒｄＵ」とは、臭素化デオキシウリジンの省略形であり、ＤＮＡ合成のときｄＴＴＰのアナログとして取り込まれることから、ＢｒｄＵを取り込んだＤＮＡ（細胞核）は、ＤＮＡに取り込まれたＢｒｄＵに特異的な抗体で検出することができるため、増殖能／分化能が高いことの指標として使用される。
【００６１】
本明細書において「ＢｒｄＵ陽性」とは、細胞マーカーであるＢｒｄＵが標的細胞において発現していることをいう。
【００６２】
本明細書において「培養物」は、角膜内皮等の細胞等を培養して生成されるものをいう。したがって、「角膜内皮培養物」は、角膜内皮の培養物をいい、通常、生体内に存在するものとは異なる状態で存在するものをさす。従来の培養法で得られる角膜内皮培養物は、増殖能が低く、容易に形質転換して機能を喪失することが問題であった（Peh  GS,  BeuermanRW,  Colman  A,  Tan  DT,  Mehta  JS  (2011)  Human  corneal  endothelial  cell  expansionfor  corneal  endothelium  transplantation:  an  overview.  Transplantation  91:811-819.、Okumura  N,  Kay  E,  NakaharaM,  Hamuro  J,  Kinoshita  S,  et  al.  (2013)  Inhibition  of  TGF-βsignaling  enables  human  corneal  endothelial  cell  expansion  in  vitro  for  use  inregenerative  medicine.  PLoS  One  8:e58000.）。したがって、培養物という観点からは、特に長期に培養したり、継代したものについていえば、このような細胞密度は達成することができなかったものといえる。すなわち、角膜内皮細胞は培養することで容易に密度が低下する。角膜内皮密度は臨床的には最も重要な健常度の指標の一つである。そのため、高い密度に培養することは再生医療の観点から重要である。また、内皮密度を事前に上昇させた後に、生体への投与することができ、極めて重要な治療薬となり得る。その意味で、通常の培養法で低下した密度を、再度上昇させることができたことが重要である。ヒト角膜内皮の生体における正常値は2500−3000個／mm2程度であり、これに培養物の細胞密度を近づけるかあるいはこれを超える技術を提供することができた点でも本発明は有意義である。
【００６３】
本明細書において「培地」とは、角膜内皮細胞を培養または増殖することができる任意の培地を指し、必要に応じ適切な場合、液体培地（培養液）、懸濁培地、固体培地等の任意の形態をとることができる。このような角膜内皮細胞に使用される培地の成分としては、例えば、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ヒト血清）、増殖因子／成長因子（例えば、ｂ−ＦＧＦ）、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン）等を挙げることができる。
【００６４】
本明細書において「（培養）容器」とは、角膜内皮細胞を培養するための容器をいう。培養容器としては、特に限定されるものではなく、細菌の混入を防ぐために滅菌処理され、かつ細胞を培養するのに適した任意の材料、任意の形状の容器を用いることができる。そのような培養容器の例として、当該分野で一般的に用いられている培養用ディッシュ、培養用フラスコ、培養用シャーレ、９６ウェル、４８ウェル、１２ウェル、６ウェル、４ウェル等の培養用プレート、培養用ボトルなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
【００６５】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook  J.  et  al.(1989).Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harborおよびその3rd  Ed.(2001);  Ausubel,  F.  M.(1987).Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience;  Ausubel,F.M.(1989).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience;  Innis,  M.  A.  (1990).  PCR  Protocols:  A  Guide  to  Methods  and  Applications,  Academic  Press;  Ausubel,  F.  M.  (1992).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates;  Ausubel,  F.  M.(1995).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates;  Innis,  M.  A.  et  al.(1995).  PCR  Strategies,  Academic  Press;  Ausubel,  F.  M.  (1999).  Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Wiley,  and  annual  updates;  Sninsky,  J.  J.  et  al.(1999).PCR  Applications:  Protocols  for  Functional  Genomics,  Academic  Press,  Gait,  M.  J.  (1985).  Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Gait,  M.  J.  (1990).  Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Eckstein,  F.(1991).  Oligonucleotides  and  Analogues:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Adams,  R.  L.  et  al.(1992).The  Biochemistry  of  the  Nucleic  Acids,  Chapman  &  Hall;  Shabarova,  Z.  et  al.(1994).  Advanced  Organic  Chemistry  of  Nucleic  Acids,  Weinheim;  Blackburn,  G.  M.  et  al.(1996).  Nucleic  Acids  in  Chemistry  and  Biology,  Oxford  University  Press;  Hermanson,  G.  T.  (I996).  Bioconjugate  Techniques,  Academic  Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されている。角膜内皮細胞については、Ｎａｎｃｙ  Ｊｏｙｃｅらの報告｛Joyce,  2004  #161}  {Joyce,  2003  #7｝がよく知られているが、前述のごとく長期培養、継代培養により線維芽細胞様の形質転換を生じるため、効率的な培養法の研究が現在も行われている。これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００６６】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。また、任意の実施形態が組み合わせ得ることも理解されるべきである。
【００６７】
（角膜内皮細胞の培養または増殖のための組成物および培養容器）
１つの局面において、本発明は、角膜内皮細胞において発現するラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子を含む、角膜内皮細胞の培養または増殖のための組成物を提供する。
【００６８】
本発明の因子（ラミニン等）は、培養培地に含めて使用されてもよいが、これを培養皿にコーティング（被覆）して使用してもよい。目的とする細胞の初代培養および／または継代培養を行うには、採取分離した細胞を適切な培地（例えば、ＤＭＥＭ（Dulbecco'smodifiedEagle'smedium）培地、ＯｐｔｉＭＥＭ培地）を用い、培養用培養皿に細胞を播種して初代培養および継代培養する。本発明においては、培地への１０％以下の血清の添加量においても良好な増殖結果を得ることができる。更に、本発明においては、添加物質として、ラミニンに加えて、またはラミニンのコーティングに加えて、サイトカイン（例えば、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ））を培地に添加することができる。本発明の因子は、実施例に記載のような単離した細胞においても有用であり、またiPSやES細胞から誘導した内皮細胞にも有用であるし、また、誘導自体にも有効であると理解される。
【００６９】
使用されるラミニンの濃度としては、例えば、培養培地液（例えば、ＰＢＳ）中約０．１μｇ〜約５００μｇ／ｍｌ等を挙げることができる。コーティングされる場合は、単位面積あたり（例えば１ｃｍ２）約0.75μg/cm2の量がコーティングに使用されてもよい。培養容器の処理に使用される場合、本発明のラミニンまたはそのフラグメントの量は特に限定されない。好ましくは、約０．０１μｇ／ｍｌ以上、好ましくは約０．０１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．０１〜約２μｇ／ｍｌのラミニンまたはそのフラグメントの溶液で処理した場合、良好な結果が得られ得る。約０．０１〜約１０μｇ／ｍｌ、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌのラミニンまたはそのフラグメントは、培養容器の面積あたりの固相化するラミニンまたはそのフラグメントの量としては、約０．００１５〜約１．５μｇ／ｃｍ２、約０．００１５〜約０．３μｇ／ｃｍ２に相当する。
【００７０】
１つの好ましい実施形態では、前記ラミニンは、ラミニン５１１およびラミニン５２１を含む。したがって、この実施形態では、本発明の因子は、ラミニン５１１、ラミニン５２１またはそれらのフラグメントでありうる。本発明のラミニン５１１のフラグメントまたはラミニン５２１のフラグメントは、角膜内皮細胞の培養（本明細書では、「維持」、「培養維持」ということもあるが培養と同じ意味で使用される）または増殖に使用されうる限り、どのようなフラグメントを用いてもよい。このようなフラグメントとしては、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメントおよびラミニン５２１ーフラグメント（それぞれ、配列番号９、１０（核酸配列、アミノ酸配列）および配列番号１１、１２（核酸配列、アミノ酸配列））（Taniguchi  Y,  Ido  H,  Sanzen  N,  Hayashi  M,  Sato-Nishiuchi  R,  Futaki  S,  Sekiguchi  K.  The  C-terminal  region  of  laminin  beta  chains  modulates  the  integrin  binding  affinities  of  laminins.  J  Biol  Chem.  284:7820-7831,  2009、参照。ニッピ株式会社から入手可能）が挙げられるがそれに限定されない。ラミニン５１１−Ｅ８フラグメントおよびラミニン５２１−フラグメントは、エラスターゼ処理により得られるフラグメントの一つで、ヘテロ３量体の  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ドメインの一部とα鎖Ｃ末端領域にある３個の  ＬＧ  ドメイン（ＬＧ１〜ＬＧ３）からなる。Ｅ８フラグメントは、ラミニンのα鎖、β鎖、γ鎖が互いに  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ドメインを介して会合したヘテロ３量体分子のインテグリン結合部位に該当するとされている。したがって、好ましいフラグメントとしては、ラミニン全長において、インテグリン結合部位が実質的に保持されたものを使用することができる。このようなフラグメントは、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメント、ラミニン５２１ーフラグメントの情報を元に、適宜改変して作製することができることが理解される。
【００７１】
ここで、ヒトラミニンα５β１γ１のＥ８フラグメント（本明細書において「ヒトラミニン５１１−Ｅ８」ともいう。）は、マウスラミニンα１β１γ１のＥ８フラグメント（本明細書において「マウスラミニン１１１−Ｅ８」ともいう。）に相当するヒトラミニンα５β１γ１（本明細書において「ヒトラミニン５１１」ともいう）のフラグメントを意味する。ラミニンのＥ８フラグメントは、マウスラミニンα１β１γ１（以下、「マウスラミニン１１１」と記す。）をエラスターゼで消化して得られたフラグメントの中で、強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである（Edgar  D.,  Timpl  R.,  Thoenen  H.  The  heparin-binding  domain  of  lamininis  responsible  for  its  effects  on  neurite  outgrowth  and  neuronal  survival.  EMBOJ.,  3:1463-1468,  1984.、Goodman  SL.,  Deutzmann  R.,  von  der  Mark  K.Two  distinctcell-binding  domains  in  laminin  can  independently  promote  nonneuronal  celladhesion  and  spreading.  J.  Cell  Biol.,  105:589-598,  1987.）。ヒトラミニン５１１およびヒトラミニン３３２についてもエラスターゼで消化した際にマウスラミニン１１１−Ｅ８に相当するフラグメントの存在が推定されている。本発明に用いられるヒトラミニン５１１−Ｅ８は、ヒトラミニン５１１のエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく、マウスラミニン１１１−Ｅ８と同様の細胞接着活性を有し、同様の構造を有し、同程度の分子量を有するヒトラミニン５１１のフラグメントであればよい。ヒトラミニン５１１−Ｅ８の製造方法は特に限定されず、例えば、全長のヒトラミニン５１１をエラスターゼ等のタンパク質分解酵素で消化し、目的のフラグメントを分取、精製する方法や、組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。製造量、品質の均一性、製造コスト等の観点から、組換えタンパク質として製造することが好ましい。組換えヒトラミニン５１１−Ｅ８は、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。組換えヒトラミニン５１１−Ｅ８の製造方法としては、例えば、ヒトラミニン５１１−Ｅ８のα鎖、β鎖およびγ鎖の各タンパク質をコードするＤＮＡをそれぞれ取得し、これをそれぞれ発現ベクターに挿入し、得られた３種類の発現ベクターを適切な宿主細胞に共導入して発現させ、３量体を形成しているタンパク質を公知の方法で精製することにより製造できる（例えば、HiroyukiIdo,  et  al,  “The  requirement  of  the  glutamic  acid  residue  at  the  third  positionfrom  the  carboxyl  termini  of  the  laminin  γ  chains  in  integrin  binding  bylaminins”  The  Journal  of  Biological  Chemistry,  282,  11144-11154,  2007.参照）。具体的な作製方法としては、JP2011-78370を参照することができる。同様のフラグメントは、ヒトラミニン５２１を用いても作製することができる。これは、ラミニン５２１−Ｅ８フラグメントと称され、ラミニン５１１−Ｅ８と同様に作製することができ、ラミニン５１１−Ｅ８と同様の活性を保持することが理解される。
【００７２】
１つの好ましい実施形態では、前記因子は、ラミニン５１１、ラミニン５２１、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメントまたはラミニン５２１−Ｅ８フラグメントである。
【００７３】
１つの好ましい実施形態では、前記角膜内皮細胞はヒトのものである。
【００７４】
本発明が対象とする内皮細胞は、ドナー角膜からのネイティブな角膜内皮を、デスメ膜の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）および実質層の構造と機能に害を与えることなく除くことにより剥離角膜として調製することができる（例えば、ＷＯ２００５／０３８０１５）。剥離角膜はヒト角膜内皮培養細胞として用いることができる。
【００７５】
別の局面において、本発明は、本発明の因子または組成物をコーティングした角膜内皮細胞の培養容器を提供する。
【００７６】
角膜内皮細胞の培養のためのラミニン等の被覆容器または培養用プレートの調製は、当該分野で公知の手法を参酌して実施することができる。培養容器の調製（コーティング）は以下のようにして行うことができる。例えば、リン酸緩衝液で20μg/mLに希釈したラミニン溶液を培養皿に添加し、37℃(5%  CO2)  で2時間インキュベートし、その後、溶液を取り除き、リン酸緩衝液と培地で各2回ずつ洗浄し使用することができる。
【００７７】
したがって別の局面では、本発明はまた、角膜内皮細胞において発現するラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子（例えば、ラミニン５１１、ラミニン５２１またはそれらのフラグメント）を含む系で細胞を培養するための細胞培養容器を固相化（コーティング）するための組成物、あるいは、細胞培養容器を固相化（コーティング）するための薬剤に関する。１つの実施形態では、本発明の組成物または薬剤は、コーティング用組成物又はコーティング剤である。培養容器の表面にラミニンを固相化する処理技術は当該分野で公知であり、当業者は本発明の目的に応じて任意の培養容器を採用して該容器を処理し、該容器を本発明の方法に用いることができる。
【００７８】
別の局面では、本発明はさらに、上記組成物または薬剤を含む、キットに関する。本発明のキットは、さらに、細胞培養用培地、細胞培養容器等を含んでもよい。細胞培養容器は、例えば、プレコート培養ディッシュ、プレコート培養プレート等でもよい。あるいは、キットの細胞培養容器は、角膜内皮細胞において発現するラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子（例えば、ラミニン５１１、ラミニン５２１またはそれらのフラグメント）を固相化した状態あってもよい。本発明の細胞培養容器、組成物、剤、キットは、本発明の角膜内皮細胞において発現するラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子（例えば、ラミニン５１１、ラミニン５２１またはそれらのフラグメント）を含んだ系で哺乳類細胞を培養する方法に使用することができる。
【００７９】
（角膜内皮細胞を培養する方法）
別の局面において、本発明は、本発明の組成物を用いた、角膜内皮細胞の培養方法を提供する。すなわち、本発明は、本発明の因子（ラミニン、そのフラグメント等）を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する、角膜内皮細胞を培養する、培養または増殖する方法を提供する。本発明の方法において用いられる因子（ラミニン、そのフラグメント等）は、本明細書において説明される任意の形態を用いることができることが理解される。また、本発明の方法において使用されうる培養成分は、角膜内皮の培養に用いられうる成分であればどのようなものでも用いることができ、本明細書において説明される任意の形態のものを例示することができる。
【００８０】
１つの実施形態では、本発明において培養される角膜内皮細胞は霊長類由来である。好ましい実施形態では、本発明において培養される角膜内皮細胞はヒト由来である。
【００８１】
好ましい実施形態では、本発明の方法が目的とする培養は、角膜内皮障害の予防または治療のための細胞培養であり、特に移植用の細胞または組織等を生産するために用いることができる。
【００８２】
角膜内皮細胞を培養する際の温度条件は、角膜内皮細胞が生育する限りにおいて特に限定されないが、例えば約２５℃〜約４５℃、増殖効率を考慮すれば好ましくは約３０℃〜約４０℃、さらに好ましくは約３７℃である。培養方法は、通常の細胞培養用インキュベーター内で、加湿下、約５〜１０％のＣＯ２濃度の環境下で行われる。
【００８３】
本発明において使用されうる培養成分は、角膜内皮の培養に用いられうる成分であればどのようなものでも用いることができ、従来販売され使用されている培地成分であってもよく、あるいは、別途角膜内皮用に開発された成分であってもよい。そのような培地成分の例としては、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ，Ｍ１９９、ＭＥＭ等（これらは、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ等から入手可能）を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００８４】
本発明は、細胞培養において、本発明の因子（例えば、特定のラミニンまたはそのフラグメント）を含む細胞培養系において、特定のポリペプチドおよび／またはペプチドを併せて使用することにより、種々の特定のラミニンまたはそのフラグメントの活性を上昇させることを特徴とする。ポリペプチドは、血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α−グロブリン、β−グロブリン、α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）またはアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、ならびに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択される。限定されるわけではないが、本発明の１つの実施形態では、追加の成分として使用されうるポリペプチドおよび／またはペプチドは、血清アルブミン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質またはペプトンであり、あるいは、ポリペプチドおよび／またはペプチドは、免疫グロブリンまたはゼラチンである。
【００８５】
本発明においては、好ましくは、血中タンパク質、より好ましくは、細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質を本発明の因子（特定のラミニンまたはそのフラグメント）とともに使用することができる。血中タンパク質は、好ましくは血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α−グロブリン、β−グロブリン、α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）またはアディポネクチンから選択される。これらはいずれも細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質である。「細胞外マトリックス」とは、細胞外の空間を充填する物質であると同時に骨格的役割（例：動物の軟骨や骨）、細胞接着における足場の役割（例：基底膜やフィブロネクチン）、細胞増殖因子などを保持・提供する役割（例：ヘパラン硫酸に結合する細胞増殖因子ＦＧＦ）などを担う。多細胞生物を構成する個々の細胞の多くは細胞外マトリックスのベッドあるいは巣に埋もれて生活しているとも言える。ヒトを含めた脊椎動物の細胞外マトリックスに顕著な成分は、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチンやラミニンといった糖タンパク質（一部は細胞接着分子）である。「細胞外マトリックスタンパク質」とは、このような細胞外マトリックスを構成するタンパク質を意味する。
【００８６】
本発明における、「細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質」とは、血中タンパク質のうちでも、細胞接着等に関与する細胞外マトリックスタンパク質以外のものを意味する。これらは、いずれも公知のタンパク質であり当業者は適宜入手することが可能である。細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質好ましくは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ／例えば、ナカライテスクより入手可能）、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ／例えば、ＳＩＧＭＡ−ALDRICHより入手可能）、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ／例えば、ＳＩＧＭＡ−ALDRICHより入手可能）であるがこれらに限定されない。また、「細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、免疫グロブリンであってもよい。免疫グロブリンは当業者に周知であり、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどが含まれる。例えば、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ／例えば、オリエンタル酵母工業株式会社より入手可能）を使用することができるが、これらに限定されない。
【００８７】
本明細書において言及される「ゼラチン」とは、動物の皮膚や骨、腱などの結合組織の主成分であるコラーゲンに熱を加えて抽出したもので、タンパク質を主成分とする。
【００８８】
本明細書では、追加の成分として、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質を使用することができる。「腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ、ＴＮＦ）」は、サイトカインの一種であり、狭義にはＴＮＦはＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンホトキシン（ＬＴ）−α）およびＬＴ−βの３種類である。「ＴＮＦファミリーに属するタンパク質」には、受容体活性化因子ＮＦκＢリガンド（ＲＡＮＫＬ）、Ｆａｓリガンド、ＣＤ４０リガンド等の少なくとも１９種類以上の分子が含まれる。本発明において使用される追加の成分として使用される、ＴＮＦファミリーに属するタンパク質の例として、好ましくは、受容体活性化因子ＮＦκＢリガンド（ＲＡＮＫＬ、ｓＲＡＮＫＬ）が使用されうる。
【００８９】
本発明では、追加の成分としてペプトンを利用しうる。「ペプトン」とは、タンパク質をタンパク質分解酵素で分解したものである。生体内ではタンパク質が胃でペプシンにより消化されてペプトンとなり、膵臓で分泌される膵液や空腸で分泌される腸液によりさらにアミノ酸まで消化される。微生物の栄養源として適しているため、培地においてしばしば添加される。この培地栄養源としてのペプトンは、蛋白質をアミノ酸および低分子量のペプチドまで加水分解したもので、一般には牛乳の蛋白質（ミルクカゼイン）を酵素分解（豚の膵臓から抽出したパンクレアチンなどのプロテアーゼを使用）したものが一般的に使用されている。限定されるわけではないが、ペプトンは好ましくは植物由来のものが使用される。例えば、綿実由来ペプトン、大豆由来ペプトン、小麦由来ペプトンおよびエンドウ豆由来ペプトンからなる群から選択される。
【００９０】
（角膜内皮細胞および角膜内皮製剤）
本発明は、本発明の方法で培養して生産される角膜内皮細胞を提供する。本発明は、通常の培養を行い継代しても、正常に培養または増殖した細胞である点で従来の細胞に無い性質を有するということができる。そして、最も重要な性質は、機能としては正常な角膜内皮の性質を有しているという点である。したがって、本発明が提供する角膜内皮細胞は、製剤として提供されうることから、本発明は、角膜内皮製剤を提供するということになる。したがって、本発明は、本発明の因子もしくは組成物を含む培養液または本発明の因子もしくは組成物がコーティングされた容器を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を含む、角膜内皮製剤の製造方法を提供する。
【００９１】
１つの局面において、本発明の角膜内皮製剤は、基材と、その基材上で培養した角膜内皮細胞層とを含有する。
【００９２】
本発明において使用される基材とは、培養角膜内皮細胞層を担持し、移植後一定期間好ましくは少なくとも３日間は生体内でもその形状を維持しうるものであれば特に限定されるものではない。また、本発明において使用される基材は、角膜内皮細胞を試験管内で培養する場合のスキャフォールドとしての役割を有するものであってもよく、培養後の角膜内皮細胞層を担持させる役割のみを有するものであってもよい。好ましくは、本発明において使用される基材は、角膜内皮細胞の培養に用いられ、培養完了後にそのまま移植に供することが可能なスキャフォールドとしての役割を有するものである。
【００９３】
本発明において使用される基材としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、セルロース等の天然物由来の高分子材料、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）等の合成高分子材料、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の生分解性高分子材料、ハイドロキシアパタイト、羊膜などがあげられる。
【００９４】
本発明において使用される基材の形状は、角膜内皮細胞層を担持し、移植に適する形状であれば特に限定されるものではないが、シート状であることが好ましい。本発明の製剤がシート状の場合、移植時に適用部位に合わせた大きさに切断して用いることができる。また、シートを小さく丸めた後、創口から挿入することも可能である。好ましい具体例として、障害した角膜内皮の面積の約８割を覆う円形の形状が例示される。また、適用部位に密着可能なように、この円形の周辺部に切り込みを入れることも好ましい。
【００９５】
好ましい実施形態において、本発明において使用される基材の例はコラーゲンである。コラーゲンとしては、特開２００４−２４８５２号公報に記載のコラーゲンシートが好適に使用できる。かかるコラーゲンシートは、特開２００４−２４８５２号公報に記載の方法に従って、例えば、羊膜から調製することができる。
【００９６】
以下に角膜内皮製剤の一例として角膜内皮細胞層の調製を記載する。
【００９７】
本発明で使用される角膜内皮細胞層は、以下の特徴を少なくとも１つ備えるものであることが好ましい。より好ましくは、以下の特徴を２つ以上、さらにより好ましくは全て備えるものである。
（１）細胞層が単層構造である。これは生体の角膜内皮細胞層が備える特徴の一つである。
（２）細胞層における細胞密度は約１，０００〜約４，０００細胞／ｍｍ２である。特に、成人をレシピエント（移植者）とする場合には約２，０００〜約３，０００細胞／ｍｍ２であることが好ましい。
（３）細胞層を構成する細胞の平面視形状が略六角形である。これは生体における角膜内皮細胞層を構成する細胞が備える特徴の一つである。本発明の製剤は生体の角膜内皮細胞層に類似し、生来の角膜内皮細胞層と同様の機能を発揮するとともに、生体内で増殖能も発揮することができる。
（４）細胞層において細胞が規則正しく整列している。生体の角膜内皮細胞層においてはそれを構成する細胞は規則正しく整列しており、これによって角膜内皮細胞の正常な機能と高い透明性が維持され、また角膜の水分調整機能が適切に発揮されると考えられている。したがって、このような形態的な特徴を備えることにより、本発明の製剤は、生体における角膜内皮細胞層と同様の機能を発揮することが期待される。
【００９８】
本発明の製造方法は、本発明の因子、組成物、または容器を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を含み、例えば以下の方法により実施され得る。
【００９９】
＜１＞角膜内皮細胞の採取および試験管内での培養
角膜内皮細胞はレシピエント自身または適切なドナーの角膜から常法で採取される。本発明における移植条件を考慮すれば、同種由来の角膜内皮細胞を準備すればよい。例えば、角膜組織のデスメ膜と内皮細胞層を角膜実質から剥離した後、培養皿に移し、ディスパーゼなどで処理する。これによって角膜内皮細胞はデスメ膜より脱落する。デスメ膜に残存している角膜内皮細胞はピペッティングなどによって脱落させることができる。デスメ膜を除去した後、本発明の培養液中で角膜内皮細胞を培養する。培地または培養液としては例えば市販のＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）（例えば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１２３２０等を）にＦＢＳ（ウシ胎仔血清）（例えば、ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）、ｂ−ＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）（例えば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１３２５６−０２９）、およびペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質を適宜添加し、さらに本発明の培養正常化剤の成分を添加したものを使用することができる。本発明の因子をコーティングして培養を行うことで角膜内皮細胞の培養容器表面への接着が促され、良好な増殖が行われる。また、培養液にラミニンを添加して培養する場合は、培養皿の表面にＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンまたはウシ等の角膜内皮細胞の細胞外マトリックスなどをコーティングしてあるものを使用することが好ましい。あるいは、通常の培養容器をＦＮＣ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｍｉｘ（登録商標）（５０ｍｌ（ＡＥＳ−０４０７）、ＡＴＨＥＮＡ、カタログ番号：０４０７）等の市販のコーティング剤で処理したものを用いてもよい。角膜内皮細胞を培養する際の温度条件は、角膜内皮細胞が生育する限りにおいて特に限定されないが、例えば約２５℃〜約４５℃、増殖効率を考慮すれば好ましくは約３０℃〜約４０℃、さらに好ましくは約３７℃である。培養方法は、通常の細胞培養用インキュベーター内で、加湿下、約５〜１０％のＣＯ２濃度の環境下で行われる。
【０１００】
＜２＞継代培養
培養に供された角膜内皮細胞が増殖した後に継代培養を行うことができる。好ましくはサブコンフルエントないしコンフルエントになった時点で継代培養を行う。継代培養は次のように行うことができる。まずトリプシン−ＥＤＴＡ等で処理することによって細胞を培養容器表面から剥がし、次いで細胞を回収する。回収した細胞に本発明の培養正常化剤または培地を加えて細胞浮遊液とする。細胞を回収する際、あるいは回収後に遠心処理を行うことが好ましい。かかる遠心分離処理によって細胞密度の高い細胞浮遊液を調製することができる。好ましい細胞密度は、約１〜２×１０６個／ｍＬである。尚、ここでの遠心分離処理の条件としては、例えば、５００ｒｐｍ（３０ｇ）〜１０００ｒｐｍ（７０ｇ）、１〜１０分を挙げることができるがこれらに限定されない。
【０１０１】
細胞浮遊液は上記の初期培養と同様に培養容器に播種され、培養に供される。継代時の希釈倍率は細胞の状態によっても異なるが、約１：２〜１：４、好ましくは約１：３である。継代培養は上記の初期培養と同様の培養条件で行うことができる。培養時間は使用する細胞の状態などによっても異なるが、例えば７〜３０日間である。以上の継代培養は必要に応じて複数回行うことができる。本発明の因子、組成物、培地または容器において、細胞接着促進剤（例えば、ＲＯＣＫ阻害剤等）を用いれば、培養初期の細胞接着を亢進させることにより、培養期間の短縮が可能となる。
【０１０２】
＜３＞角膜内皮細胞層の調製
細胞浮遊液は、コラーゲンシート等の基材上に播種され、培養に供される。この際、最終的に製造される角膜内皮製剤において所望の細胞密度の細胞層が形成されるように播種する細胞数が調整される。具体的には細胞密度が約１，０００〜約４，０００細胞／ｍｍ２の細胞層が形成されるように細胞を播種する。培養は上記の初期培養などと同様の条件で行うことができる。培養時間は使用する細胞の状態などによっても異なるが、例えば３〜３０日間である。
【０１０３】
以上のようにして培養を行うことにより、基材上に試験管内で培養した角膜内皮細胞層が形成された角膜内皮製剤が得られる。
【０１０４】
本発明において、角膜内皮製剤は、角膜内皮細胞を培養または増殖するために、本発明の因子、組成物、もしくはそれを含む培地を含んでいてもよく、またはそれを含む容器において維持されていてもよい。また、角膜内皮製剤は、移植に供されるまでに本発明の因子、組成物、もしくはそれを含む培地を含んでいてもよく、またはそれを含む容器において維持されていてもよい。本発明は、角膜内皮製剤と本発明の因子、組成物、もしくはそれを含む培地を含んでいてもよく、またはそれを含む容器との組合せも提供する。
【０１０５】
本発明の製造方法により得られた角膜内皮製剤は、角膜内皮の移植が必要な疾患、例えば水疱性角膜症、角膜浮腫、角膜白斑、特に、角膜ジストロフィ、外傷または内眼手術に起因する角膜内皮障害によって生じる水疱性角膜症の治療における移植片として用いることができる。このような水疱性角膜症、角膜内皮障害などの原因としては、手術のほかフックス角膜内皮ジストロフィ、偽落屑症候群、角膜内皮炎等を挙げることができる。
【０１０６】
本発明の角膜内皮製剤の投与対象は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）があげられ、好ましくは霊長類（例えば、ヒト）である。
【０１０７】
（角膜内皮疾患、障害または状態の処置または予防）
本発明は、角膜内皮細胞の培養または増殖のための方法（この方法は、本発明の因子、組成物、もしくは培地または容器を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する）によって生産された角膜内皮細胞を含む、角膜内皮疾患、障害または状態の処置または予防のための医薬を提供する。本発明の因子、組成物、もしくは培地または容器は本明細書において説明される任意の形態を用いることができることが理解され、例えば、（角膜内皮細胞の培養または増殖のための組成物）、（角膜内皮細胞を培養する方法）、（角膜内皮細胞および角膜内皮製剤）等の本明細書に記載された事項を参酌することができる。また、医薬として使用される角膜内皮細胞は、本明細書において使用される任意の形態をとり得ることが理解され、例えば、（角膜内皮細胞および角膜内皮製剤）に記載された事項を参酌することができる。
【０１０８】
１つの実施形態では、本発明の医薬は、霊長類の角膜内皮疾患、障害または状態の処置または予防を目的とする。好ましくは、この処置または予防の対象は、ヒトの角膜内皮である。
【０１０９】
１つの実施形態では、本発明の医薬において使用される角膜内皮細胞は霊長類由来である。好ましくは、本発明の医薬において使用される角膜内皮細胞はヒト由来である。
【０１１０】
１つの実施形態では、本発明の医薬が対象とする角膜内皮疾患、障害または状態が水疱性角膜症、角膜内皮炎、角膜浮腫、角膜白斑等である。
【０１１１】
１つの実施形態では、本発明の医薬は、シート状または懸濁物で提供される。
【０１１２】
１つの実施形態では、本発明の医薬は、細胞接着促進剤をさらに含む。細胞接着促進剤は、角膜組織から分離された角膜内皮細胞または分離され継代した角膜内皮細胞に対して接着促進作用を奏する。この細胞接着促進剤は、医薬として提供される角膜内皮細胞と一緒にまたは別々に提供されることができる。具体的な実施形態では、本発明の医薬において使用される細胞接着促進剤としては、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を挙げることができる。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤としては、下記文献：米国特許４６７８７８３号、特許第３４２１２１７号、国際公開第９５／２８３８７、国際公開９９／２０６２０、国際公開９９／６１４０３、国際公開０２／０７６９７６、国際公開０２／０７６９７７、国際公開第２００２／０８３１７５、国際公開０２／１００８３３、国際公開０３／０５９９１３、国際公開０３／０６２２２７、国際公開２００４／００９５５５、国際公開２００４／０２２５４１、国際公開２００４／１０８７２４、国際公開２００５／００３１０１、国際公開２００５／０３９５６４、国際公開２００５／０３４８６６、国際公開２００５／０３７１９７、国際公開２００５／０３７１９８、国際公開２００５／０３５５０１、国際公開２００５／０３５５０３、国際公開２００５／０３５５０６、国際公開２００５／０８０３９４、国際公開２００５／１０３０５０、国際公開２００６／０５７２７０、国際公開２００７／０２６６６４などに開示された化合物があげられる。かかる化合物は、それぞれ開示された文献に記載の方法により製造することができ、例えば、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジンまたはその塩（たとえば、ファスジル（１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン））、（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（４−ピリジルカルバモイル）シクロヘキサンカルボキサミドまたはその塩（たとえば、Ｙ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）など）などを挙げることができる。
【０１１３】
本発明の医薬または方法の投与(移植)対象は、晴乳動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等)があげられるが、霊長類が好ましく、特にヒトが好ましい。霊長類での角膜内皮治療はこれまで十分な成績が達成されておらず、その意味で本発明は画期的な治療法および医薬を提供する。
【０１１４】
別の局面において、本発明は、角膜内皮細胞を正常に培養する方法（この方法は、本発明の因子、組成物、培地または容器を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する、）によって生産された角膜内皮細胞を用いる工程を包含する、角膜内皮疾患、障害または状態の処置または予防のための方法を提供する。
【０１１５】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１１６】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１１７】
以下に、本発明の角膜内皮細胞の細胞を正常に培養する例を記載する。該当する場合生物試料等の取り扱いは、厚生労働省、文部科学省等において規定される基準を遵守し、該当する場合はヘルシンキ宣言またはその宣言に基づき作成された倫理規定に基づいて行った。研究のための眼の寄贈については、全ての故人ドナーの近親者から同意書を得た。本研究は、ＳｉｇｈｔＬｉｆｅＴＭ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）アイバンクの倫理審査により承認された。
【０１１８】
（実験手法：研究グレードのヒト角膜組織）
それぞれ、１２個のヒトドナー角膜は、ＳｉｇｈｔＬｉｆｅＴＭアイバンクから入手し、全ての角膜を、初代培養前に１４日未満の期間にわたり、保存培地（Ｏｐｔｉｓｏｌ；Ｃｈｉｒｏｎ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）中、４℃で保存した。
【０１１９】
（統計解析）
２サンプルの比較の平均値における統計的有意差（Ｐ値）は、スチューデントのｔ検定を用いて決定した。複数のサンプルセットの比較における統計的有意差は、ダネットの多重比較検定を用いて解析した。グラフに示す値は平均±ＳＥを表す。
【０１２０】
（実施例１：角膜内皮細胞およびデスメ膜におけるラミニン鎖およびインテグリン鎖の発現）
本実施例では、角膜内皮細胞の基底膜であるデスメ膜におけるラミニン鎖の発現を観察した。
【０１２１】
（材料および方法）
ラミニン鎖ｍＲＮＡの発現はＰＣＲ法にて行った。なお、データは示さないがタンパク質の発現についても免疫染色にて確認している。
【０１２２】
二次抗体はＰＢＳにて希釈し、室温３０分間インキュベートした。使用する二次抗体には、ＡｌｅｘａＴＭ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ヤギ抗ウサギＩｇＧ（カタログ番号：Ａ１１０３４；１：１５００；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。０．１５  ％  Ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳ−にて２回、ＰＢＳ−にて１回振盪洗浄後、ヨウ化プロピジウム（カタログ番号：ＳＰ２９００４−４１；ＰＩ；  Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，  Ｉｎｃ．  Ｋｙｏｔｏ，  Ｊａｐａｎ）にて核染色を行い、カバーガラスをかけて包埋した。共焦点レーザー顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）にて観察し、写真撮影した。ＰＣＲ法にて使用したラミニン鎖のプライマーの配列は以下の表１に示す。ＰＣＲ法にて使用したインテグリン鎖のプライマーの配列は以下の表2に示す。これらのプライマーはライフテクノロジーズジャパン株式会社(カタログ番号：10336022)  から入手した。
【０１２３】
【表１】
2020188778.tif 000003
【０１２４】
【表２】
2020188778.tif 000004
【０１２５】
・ＰＣＲ法：RT-PCR（半定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）により、各ラミニン鎖およびインテグリン鎖に対するＰＣＲ法を行った。プライマーは、オリゴヌクレオチド合成会社であるINVITROGENから購入し、脱塩処理したものを用いた。細胞からの総ＲＮＡの抽出にはRNEasy  Mini  Kit（QIAGEN社、カタログ番号：74106）を用いた。シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より、角膜内皮細胞を含むデスメ膜を剥離し、角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離して、角膜内皮細胞からのRNA抽出に用いた。ＲＮＡはReverTra  Ace（TOYOBO社（カタログ番号：TRT−101））により逆転写反応（４２℃、６０分間）を行い、TAKARA  Taq  HotStart  Version（タカラバイオ社、カタログ番号：RR001A）によりＧＡＰＤＨを内部標準としてCD166、CD73を増幅した。同量のｃＤＮＡを、ＰＣＲ機（GeneAmp  9700；Applied  Biosystems）と、下記のプライマーペアによって増幅した。ＰＣＲ反応にはTable1および2および下記に示すプライマーを用いた。
・ＧＡＰＤＨ-Ｆ：GAGTCAACGGATTTGGTCGT  （配列番号８５）
・ＧＡＰＤＨ-Ｒ：TTGATTTTGGAGGGATCTCG  （配列番号８６）
【０１２６】
増幅されたＤＮＡ断片は１．５％アガロースゲル（ナカライテスク、カタログ番号：01149−76）で電気泳動し、エチジウムブロマイド（ナカライテスク、カタログ番号：14603−51）での染色により検出した。
【０１２７】
・フローサイトメトリー：培養ヒト角膜内皮をFNC  Coating  Mixをコートした培養皿へ播種し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下にてコンフルエントに到達するまで約１４日間培養した。TrypLETM  Selectにて細胞を剥離して回収した。Human  Cell  Surface  Marker  Screening  Panel(BD  LyoplateTM、BD  Bio-sciences，  Franklin  Lakes，  NJ)を用いて、説明書に準じてフローサイトメーター（BD  FACSCantoTMII  (BD  Biosciences、Franklin  Lakes、NJ)）を使用してインテグリン鎖の表面抗原解析を行った。
【０１２８】
ヒトの角膜内皮細胞の培養は以下の通り行った。シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より、角膜内皮細胞を含むデスメ膜を剥離し、角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離して、コラゲナーゼ（ＲＯＣＨＥ  カタログ番号：１０  １０３  ５８６  ００１）を用いて基底膜よりはがして（代表的には、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて３７℃にて２時間処理した。）回収後、初代培養を行った。培地はＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ，  Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：３１９８５−０７０）＋８％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）＋２００ｍｇ／ｍｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）＋０．０８％  コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）＋２０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）＋５０μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：１５７１０−０６４）＋５ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）を３Ｔ３フィーダー細胞用に馴化させたものを用いた。具体的には、３７℃での消化後、個々の角膜から得られたＨＣＥＣを培養培地中に再懸濁させ、ＦＮＣ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｍｉｘ（登録商標）でコーティングした１２ウェルプレートの１ウェルにプレーティングした。培養培地は、一部の改変を加えた公開されたプロトコールに従って調製した。簡単に述べると、ＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、８％  ＦＢＳ、５ｎｇ／ｍＬ  上皮増殖因子（ＥＧＦ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１μM  ＳＢ４３１５４２（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、２０μｇ／ｍＬ  アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２００ｍｇ／Ｌ  塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０８％  コンドロイチン硫酸（和光純薬工業株式会社、大阪市）および５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有する基本培養培地を準備し、次いで、不活性化３Ｔ３線維芽細胞の培養後に馴化培地を回収した。３Ｔ３線維芽細胞の不活性化は、以前に記載されたとおりに実施した。簡単に述べると、コンフルエントな３Ｔ３線維芽細胞を４μｇ／ｍＬ  マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）（協和発酵キリン株式会社、東京都）とともに、５％ＣＯ２下で３７℃にて２時間インキュベートし、次いでトリプシン処理し、そして、２×１０４細胞／ｃｍ２の密度でプラスチック皿にプレーティングした。ＨＣＥＣは、５％ＣＯ２中３７℃にて加湿雰囲気下で培養し、２日おきに培養培地を交換した。ＨＣＥＣが１４〜２８日でコンフルエントに達すると、これらを、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋非含有ＰＢＳ中でリンスし、３７℃にて５分間０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理し、そして、１：２の比で継代した。
【０１２９】
（結果）
デスメ膜（角膜内皮細胞基底膜）におけるラミニン鎖の発現をみたところ、ラミニンα５鎖、ラミニンβ１鎖、ラミニンγ１鎖、の発現が著明であり、他方、ラミニンα１鎖、ラミニンα２鎖、ラミニンα３鎖における発現は明らかでなかった（データ示さず）。
【０１３０】
図１に示すように、ヒト角膜内皮細胞のラミニン鎖のｍＲＮＡ発現をみたところ、ラミニンα５鎖、ラミニンβ１鎖、ラミニンβ２鎖、およびラミニンγ１鎖の発現が著明であり、他方、ラミニンα１鎖、ラミニンα２鎖、ラミニンα３鎖、ラミニンα４鎖、ラミニンβ３鎖、ラミニンγ２鎖、およびラミニンγ３鎖の発現は明らかでなかった。
【０１３１】
図２に示すように、インテグリンα１鎖、インテグリンα2鎖、インテグリンα3鎖、インテグリンα6鎖、インテグリンα10鎖、インテグリンα１1鎖、インテグリンβ１鎖、インテグリンβ5鎖、インテグリンβ8鎖、インテグリンαV鎖の発現が認められた。インテ
グリンβ３鎖、インテグリンβ４鎖、インテグリンβ６鎖においてもわずかに発現が認められた。このことより角膜内皮細胞はラミニン結合インテグリンと知られるインテグリンであるα1β1、α2β1、α3β1、α6β1、α7β1、α6β4の少なくとも1つ以上を発現す
ることが示唆された。
【０１３２】
図３（図３Ａ〜図３Ｃ）に示すように、表面抗原としての発現としてもインテグリンα１鎖、インテグリンα2鎖、インテグリンα3鎖、インテグリンα５鎖、インテグリンβ１鎖の発現が認められた。
【０１３３】
（実施例２：ヒト角膜内皮細胞の細胞接着の促進）
本実施例では、ラミニン等を培養容器にコーティングしたものを用いて、ヒト角膜内皮細胞の細胞接着がなされるかどうかを確認した。
【０１３４】
（材料および方法）
・ラミニン５１１（株式会社ベリタス、LN511）
・ラミニン５２１（株式会社ベリタス、LN521）
・ラミニン５１１−Ｅ８フラグメント（株式会社ニッピ、382-02413）
・ＦＮＣ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｍｉｘ（登録商標）（５０ｍｌ（ＡＥＳ−０４０７）、ＡＴＨＥＮＡ、カタログ番号：０４０７）
・ゼラチン（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社、G1890-500G）
・容器（CORNING、3526）
【０１３５】
（手法）
・ヒト角膜内皮細胞（ＨＣＥＣ、入手先および培養方法）：ＨＣＥＣの培養は、上述の実施例１の通りに行った。培養した細胞は、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋非含有ＰＢＳ中でリンスし、３７℃にて５分間０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理し、ＦＮＣ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｍｉｘ（登録商標）でコーティングした１２ウェルプレートに播種した。培養培地は、一部の改変を加えた公開されたプロトコールに従って調製した。簡単に述べると、ＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、８％  ＦＢＳ、５ｎｇ／ｍＬ  上皮増殖因子（ＥＧＦ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１０μM  ＳＢ４３１５４２（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、２０μｇ／ｍＬ  アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２００ｍｇ／Ｌ  塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０８％  コンドロイチン硫酸（和光純薬工業株式会社、大阪市）および５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有する基本培養培地を準備し、次いで、不活性化３Ｔ３線維芽細胞の培養後に馴化培地を回収した。３Ｔ３線維芽細胞の不活性化は、以前に記載されたとおりに実施した。簡単に述べると、コンフルエントな３Ｔ３線維芽細胞を４μｇ／ｍＬ  マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）（協和発酵キリン株式会社、東京都）とともに、５％ＣＯ２下で３７℃にて２時間インキュベートし、次いでトリプシン処理し、そして、２×１０４細胞／ｃｍ２の密度でプラスチック皿にプレーティングした。ＨＣＥＣは、５％ＣＯ２中３７℃にて加湿雰囲気下で培養し、２日おきに培養培地を交換した。
【０１３６】
（手法）ＨＣＥＣをラミニン５１１、ラミニン５２１、ラミニン２１１、ゼラチン、ＦＮＣ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｍｉｘ（登録商標）でコーティングした96ウェルプレートの各ウェルに播種して24時間後の細胞形態を位相差顕微鏡にて観察した。96ウェル培養プレートに、5,000個/ウェルの播種密度で播種し、細胞播種後24時間の時点での接着細胞数をCellTiter-Glo（登録商標）  Luminescent  Cell  Viability  Assay  (PromegaCorporation,  Madison,  WI,  USA)を用いて検討した。また、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメント（0.001〜1.5μg/cm2）でコーティングした培養皿においても細胞の接着を評価した。また、ラミニン521およびラミニン５１１−Ｅ８フラグメントを各種濃度で培地に添加して播種
し24時間後の細胞数を同様に評価した。
【０１３７】
（ＢｒｄＵ取り込みによる細胞増殖測定）
同様に各種基質でコーティングしたHCECのBrdUとり込みをELISA法により評価した。96ウェル培養プレートに、5,000個/ウェルの播種密度で播種し一晩培養した。その後、培地に5-ブロモ-2’-デオキシウリジン（BrdU）を添加し、一晩培養した。培地を除去し、固定溶液（Amersham  cell  proliferation  biotrak  ELISA  system,  version2）を加えて30分間室温でインキュベートした。次いで、固定溶液を除去し、ブロッキング溶液（Amersham  cell  proliferation  biotrak  ELISA  system,  version2）を加えて30分間、室温で静置した。次いで、ブロッキング溶液を除去し、ペルオキシダーゼ結合抗BrdU抗体を添加し、室温で90分静置した。洗浄バッファーで3回プレートを洗浄し、TMB（3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン）基質（Amersham  cell  proliferationbiotrak  ELISA  system,  version2）を加えて5〜30分間静置した。1M  硫酸で反応を停止し、プレートリーダーで450nmにおける吸光度を測定した。結果は5回の測定の平均値±標準誤差として示した。
【０１３８】
（結果）
図４に示すように、ラミニン５１１および５２１の存在下では、角膜内皮細胞の接着、伸展が良好であるのに対して、それ以外の条件では、増殖が良好ではないことが示される。
【０１３９】
図５に示すように、ラミニン５１１および５２１の存在下では、角膜内皮細胞の細胞接着はそれ以外の条件と比較して良好であることが示される。
【０１４０】
図６に示すように、ラミニン５１１−Ｅ８フラグメントの存在下では、角膜内皮細胞の細胞増殖はそれ以外の条件と比較して良好であることが示される。特に0.1〜1.5μg/cm2
の濃度において有意に細胞接着は促進された。
【０１４１】
図７に示すように、ラミニン５１１および５２１およびラミニン５１１−Ｅ８フラグメントの存在下では、角膜内皮細胞の細胞増殖はそれ以外の条件と比較して良好であることが示される。
【０１４２】
（実施例３：ラミニン５１１および５２１はヒト角膜内皮細胞の細胞培養における機能付与分析）
本実施例では、ラミニン５１１および５２１はヒト角膜内皮細胞の細胞培養における機能付与分析を行った。
【０１４３】
（材料および方法）
・ヒト角膜内皮細胞（ＨＣＥＣ、入手先および培養方法）：ＨＣＥＣの培養は、以下のように行った。簡単に述べると、シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より、角膜内皮細胞を含むデスメ膜を剥離し、角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離して、コラゲナーゼ（ＲＯＣＨＥ  カタログ番号：１０  １０３  ５８６  ００１）を用いて基底膜よりはがして（代表的には、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて３７℃にて２時間処理した。）回収後、初代培養を行った。初代培養時に、ラミニン５１１、ラミニン５２１、ラミニン２１１、ＦＮＣ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｍｉｘ（登録商標）でコーティングした１２ウェルプレートの１ウェルにプレーティングした。培地は実施例１と同様のものを用いた。細胞観察は経時的に位相差顕微鏡にて行った。
【０１４４】
・染色等の細胞観察方法（組織学的試験）：培養したHCECを固定した後に機能関連マーカーとしてＺＯ−１、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅを用いて免疫染色を行い蛍光顕微鏡にて観察を行った。４％ホルムアルデヒドで１０分間室温（ＲＴ）で固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに３０分間インキュベートした。密着結合関連タンパク質であるＺＯ−１、ポンプ機能に関連するタンパク質であるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅの免疫組織化学分析を行った。それぞれ、一次抗体を１：２００希釈を用いて実施した。二次抗体には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識、または、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：２０００希釈を使用した。次いで、細胞の核をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。次いで、スライドを蛍光顕微鏡(BZ-9000;  Keyence,  Osaka,  Japan)で観察した。
【０１４５】
・Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅに対する抗体：ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  カタログ番号：０５−３６９）のものを用いた。
【０１４６】
・ＺＯ−１に対する抗体：ウサギＺＹＭＥＤ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製（ＺＹＭＥＤ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ  カタログ番号：６１−７３００）のものを用いた。
【０１４７】
（結果）
図８に示されるように、ラミニン５１１および５２１はヒト角膜内皮細胞の細胞培養を効率化することを示す。写真は初代培養2日後の位相差顕微鏡写真である。
【０１４８】
図９に示されるように、ラミニン５１１および５２１は細胞密度の高いヒト角膜内皮細胞の細胞培養を可能にすることを示す。写真は初代培養20日後の位相差顕微鏡写真である。
【０１４９】
図１０および１１に示されるようにラミニン５１１および５２１は、ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅの活性を保持することが示され、本発明の方法で培養すると正常な機能を維持しつつ増殖させることができることが証明された）。細胞密度はラミニン511およびラミニン521においてラミニン211および非コーティングのコントロールと比べ
て高かった。
【０１５０】
図１２に示すように、ラミニン521およびラミニン５１１−Ｅ８フラグメントを各種濃
度で培地に添加して播種することで角膜内皮細胞の細胞接着は促進された。
【０１５１】
（実施例４：製剤例：角膜内皮シート調製用培養液）
本実施例では、製剤例として、本発明の因子を含有する角膜内皮シート調製用培養液を以下のようにして製造する。
【０１５２】
常法により下に示す培養液を調製する。
ラミニン５１１、ラミニン５２１および／またはそれらのフラグメント（0.75μg/cm2）
ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）                  １０ｍＬ
ペニシリン−ストレプトマイシン溶液      １ｍＬ
ＦＧＦ  ｂａｓｉｃ                      ２００ｎｇ
ＤＭＥＭ                                適量
全量                                    １００ｍＬ
【０１５３】
ＦＢＳは例えば、ＢＩＯＷＥＳＴ（カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）またはインビトロジェン製、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液はナカライテスク製（ペニシリン  ５０００ｕ／ｍＬ，ストレプトマイシン  ５０００μｇ／ｍＬ含有）、ＦＧＦ  ｂａｓｉｃは例えば、インビトロジェン製（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１３２５６−０２９）、ＳＢ４３１５４２はＴＯＣＲＩＳ社製、ＳＢ２０３５８０はＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、ＤＭＥＭはインビトロジェン製を用いることができる。
【０１５４】
（実施例５：製剤例：角膜保存または増幅用容器用組成物）
本実施例では、製剤例として、本発明の因子を含む、容器コーティング用溶液を以下のように製造する。
【０１５５】
常法により下に示す保存液を調製する。
ラミニン５１１、ラミニン５２１および／またはそれらのフラグメント（0.75μg/cm2）
適宜の緩衝液            適量
全量                    １００ｍＬ
各成分は、実施例４と同様に入手することができる。
【０１５６】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本出願は、２０１３年１１月２７日に出願した特願２０１３−２４４９７２に対して優先権を主張するものであり、その内容はその全体が参考として本明細書において援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１５７】
角膜内皮細胞の増殖を促す培養用成分、培養方法が提供され、角膜移植に関連する技術に関与する産業（細胞培養産業、製薬等）において利用可能な技術が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【０１５８】
配列番号:1  ラミニンα5鎖核酸配列（NM_005560）
配列番号:2  ラミニンα5鎖アミノ酸配列（NP_005551）
配列番号:3  ラミニンβ1鎖核酸配列（NM_002291）
配列番号:4  ラミニンβ1鎖アミノ酸配列（NP_002282）
配列番号:5  ラミニンβ2鎖核酸配列（NM_002292）
配列番号:6  ラミニンβ2鎖アミノ酸配列（NP_002283）
配列番号:7  ラミニンγ1鎖核酸配列（NM_002293）
配列番号:8  ラミニンγ1鎖アミノ酸配列（NP_002284）
配列番号:9  ラミニンα1鎖sense  プライマー配列：5'-GAGTCCGTCTCTCTGGACATAG-3'
配列番号:10  ラミニンα1鎖アンチセンスプライマー配列：5'-CGTGGCATTCACAGGGTTGAC-3'
配列番号:11  ラミニンα2鎖sense  プライマー配列：5'-TGCTAGAATTTACCTCCGCTCG-3'
配列番号:12  ラミニンα2鎖アンチセンスプライマー配列：5'-GATCAAGTGGACAAGCCCTG-3'配列番号:13  ラミニンα3鎖sense  プライマー配列：5'-CTCCAAAGGCCCAACTCAAG-3'
配列番号:14  ラミニンα3鎖アンチセンスプライマー配列：5'-CCATAACTGCCTCCTTAGTCTC-3'
配列番号:15  ラミニンα4鎖sense  プライマー配列：5'-CTTACGCAACACCACCGGATTC-3'
配列番号:16  ラミニンα4鎖アンチセンスプライマー配列：5'-CCTTCTTCCAAGCATTCTCCG-3'
配列番号:17  ラミニンα5鎖sense  プライマー配列：5'-GAGGACTGAAGTGAAAACTCAA-3'
配列番号:18  ラミニンα5鎖アンチセンスプライマー配列：5'-CCACTGAAGTTGTAAATGGTG-3'
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配列番号:21  ラミニンβ2鎖sense  プライマー配列：5'-GATGATCGCATCCAAGGGAC-3'
配列番号:22  ラミニンβ2鎖アンチセンスプライマー配列：5'-GTCCAGAGTAGGGAGTCTCAG-3'
配列番号:23  ラミニンβ3鎖sense  プライマー配列：5'-CCCAGATGGAGGAAGATGTC-3'
配列番号:24  ラミニンβ3鎖アンチセンスプライマー配列：5'-GTAGCTGAGTCTGTGGGCAG-3'配列番号:25  ラミニンβ4鎖sense  プライマー配列：5'-GGCAGGCTACTTTGGATTTC-3'
配列番号:26  ラミニンβ4鎖アンチセンスプライマー配列：5'-GCTTGAGGGATCATCTGGAC-3'配列番号:27  ラミニンγ1鎖sense  プライマー配列：5'-GATGAGATGGTGACAGATCAAG-3'
配列番号:28  ラミニンγ1鎖アンチセンスプライマー配列：5'-TTTCCAGTCTCTTCAATGGTAT-3'
配列番号:29  ラミニンγ2鎖sense  プライマー配列：5'-ATCGAAGGTTACTGCGGAATC-3'
配列番号:30  ラミニンγ2鎖アンチセンスプライマー配列：5'-GTAGCCAGAAGCACAATCCTG-3'
配列番号:31  ラミニンγ3鎖sense  プライマー配列：5'-GGGATACAAGAGGGAGATGC-3'
配列番号:32  ラミニンγ3鎖アンチセンスプライマー配列：5'-CATAGAAACCTGGCAAACAGC-3'
配列番号:33  インテグリン  α1鎖sense  プライマー配列：5'-gaagaacctcctgaaacccttt-3'
配列番号:34  インテグリン  α1鎖アンチセンスプライマー配列：5'-tgatgtcatattggggaatgaa-3'
配列番号:35  インテグリン  α2鎖sense  プライマー配列：5'-tgatgggacagaagtaacatgc-3'
配列番号:36  インテグリン  α2鎖アンチセンスプライマー配列：5'-tggaccaacatcttcaaaactg-3'
配列番号:37  インテグリン  α3鎖sense  プライマー配列：5'-gctctgcctttggtttatctgt-3'
配列番号:38  インテグリン  α3鎖アンチセンスプライマー配列：5'-ttcccactagaaggtctgggta-3'
配列番号:39  インテグリン  α4鎖sense  プライマー配列：5'-atattcagtcggagctggtcat-3'
配列番号:40  インテグリン  α4鎖アンチセンスプライマー配列：5'-gcatatttgtcacttccaacga-3'
配列番号:41  インテグリン  α5鎖sense  プライマー配列：5'-tcctcagcaagaatctcaacaa-3'
配列番号:42  インテグリン  α5鎖アンチセンスプライマー配列：5'-gttgagtcccgtaactctggtc-3'
配列番号:43  インテグリン  α6鎖sense  プライマー配列：5'-agcaaggcagatggaataatgt-3'
配列番号:44  インテグリン  α6鎖アンチセンスプライマー配列：5'-cagggtaggaatttcgatcaag-3'
配列番号:45  インテグリン  α7鎖sense  プライマー配列：5'-caggtcaccttctacctcatcc-3'
配列番号:46  インテグリン  α7鎖アンチセンスプライマー配列：5'-accgtgacctcatacttgacct-3'
配列番号:47  インテグリン  α8鎖sense  プライマー配列：5'-atggaaaatgtaaccaggatgg-3'
配列番号:48  インテグリン  α8鎖アンチセンスプライマー配列：5'-cagttatgaatgggcagaacaa-3'
配列番号:49  インテグリン  α9鎖sense  プライマー配列：5'-cactttcagcccatcaatatca-3'
配列番号:50  インテグリン  α9鎖アンチセンスプライマー配列：5'-acagtgtgctgttaggcaagaa-3'
配列番号:51  インテグリン  α10鎖sense  プライマー配列：5'-atcagtgtggttcagagggact-3'
配列番号:52  インテグリン  α10鎖アンチセンスプライマー配列：5'-gccctggctttgtagtattgtc-3'
配列番号:53  インテグリン  α11鎖sense  プライマー配列：5'-ggacactgctgactacgtgaag-3'
配列番号:54  インテグリン  α11鎖アンチセンスプライマー配列：5'-gcgtgtgctctctatgatgaag-3'
配列番号:55  インテグリン  αE鎖sense  プライマー配列：5'-tagcagtgaagaagctgacgag-3'
配列番号:56  インテグリン  αE鎖アンチセンスプライマー配列：5'-tctttcaggaagacgacagtga-3'
配列番号:57  インテグリン  αV鎖sense  プライマー配列：5'-atctgtgaggtcgaaacaggat-3'
配列番号:58  インテグリン  αV鎖アンチセンスプライマー配列：5'-accttgccaataaaagctacca-3'
配列番号:59  インテグリン  αL鎖sense  プライマー配列：5'-gaaccattgacaccagaagtga-3'
配列番号:60  インテグリン  αL鎖アンチセンスプライマー配列：5'-ttcttcaaaccccaactgtctt-3'
配列番号:61  インテグリン  αM鎖sense  プライマー配列：5'-gatcggctaagagaaggacaga-3'
配列番号:62  インテグリン  αM鎖アンチセンスプライマー配列：5'-cattgccacaattcttctcaaa-3'
配列番号:63  インテグリン  αX鎖sense  プライマー配列：5'-ccaacatctgcctttacattga-3'
配列番号:64  インテグリン  αX鎖アンチセンスプライマー配列：5'-cgtgaagtatctctgagcatcg-3'
配列番号:65  インテグリン  αD鎖sense  プライマー配列：5'-ttaaccagatgaagggctttgt-3'
配列番号:66  インテグリン  αD鎖アンチセンスプライマー配列：5'-ggtctttgtacttctgcccatc-3'
配列番号:67  インテグリン  αIIb鎖sense  プライマー配列：5'-gaaaagactgaggaggctgaga-3'
配列番号:68  インテグリン  αIIb鎖アンチセンスプライマー配列：5'-gagaaaatatccgcaactggag-3'
配列番号:69  インテグリン  β1鎖sense  プライマー配列：5'-gctgaagactatcccattgacc-3'
配列番号:70  インテグリン  β1鎖アンチセンスプライマー配列：5'-atttccagatatgcgctgtttt-3'
配列番号:71  インテグリン  β2鎖sense  プライマー配列：5'-tgatggacctctcctactccat-3'
配列番号:72  インテグリン  β2鎖アンチセンスプライマー配列：5'-gaaactggttggagttgttggt-3'
配列番号:73  インテグリン  β3鎖sense  プライマー配列：5'-tgtttaccactgatgccaagac-3'
配列番号:74  インテグリン  β3鎖アンチセンスプライマー配列：5'-tcccataagcatcaacaatgag-3'
配列番号:75  インテグリン  β4鎖sense  プライマー配列：5'-gcttcacacctatttccctgtc-3'
配列番号:76  インテグリン  β4鎖アンチセンスプライマー配列：5'-gaaggaaggtttcagatggatg-3'
配列番号:77  インテグリン  β5鎖sense  プライマー配列：5'-gctggtgttcacaacagatgat-3'
配列番号:78  インテグリン  β5鎖アンチセンスプライマー配列：5'-atcccagactgacaactccact-3'
配列番号:79  インテグリン  β6鎖sense  プライマー配列：5'-tgtgactgtggtgaatgtgtgt-3'
配列番号:80  インテグリン  β6鎖アンチセンスプライマー配列：5'-caccagctagtttgcacttgtc-3'
配列番号:81  インテグリン  β7鎖sense  プライマー配列：5'-cacttcagacgacacattccat-3'
配列番号:82  インテグリン  β7鎖アンチセンスプライマー配列：5'-cccaactgcagacttaggaatc-3'
配列番号:83  インテグリン  β8鎖sense  プライマー配列：5'-gcattatgtcgaccaaacttca-3'
配列番号:84  インテグリン  β8鎖アンチセンスプライマー配列：5'-atttcttcaggcttctcacgtc-3'
配列番号:85  GAPDH-F:  GAGTCAACGGATTTGGTCGT
配列番号:86  GAPDH-R:  TTGATTTTGGAGGGATCTCG
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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