(57)【要約】【課題】  本発明の目的は、より優れたグルコースセンサを構築することであり、また、そのようなグルコースセンサにより適したＧＤＨを提供することである。【解決手段】  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察される分子量分布の幅が、バンドの濃さの相対値が最大値の６０％を超える分子量分布で見た場合に５０ｋＤａ以内である、ＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察される分子量分布の幅が、バンドの濃さの相対値が最大値の６０％を超える分子量分布で見た場合に５０ｋＤａ以内であり、分子量が８５〜１００ｋＤａであり、以下より選ばれる微生物に由来し、och1遺伝子が破壊された又はoch1遺伝子の機能が低下したアスペルギルス属に属する微生物を宿主として得られる、ＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、シゾフィリウム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、コレトトリチウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｉｕｍ）属、シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属、アースリニウム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｎｍ）属
【請求項２】
ムコール属、アブシジア属、アクチノムコール属、コレトトリチウム属、シルシネラ属、アースリニウム属またはペニシリウム属に属する微生物に由来する、請求項１に記載のＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項３】
ムコール属またはシルシネラ属に属する微生物に由来する、請求項１または２に記載のＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項４】
ムコール・プライニ、ムコール・ヒエマリス、ムコール・スブチリシムスまたはシルシネラ・シンプレックスに由来する、請求項１〜３のいずれかに記載のＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項５】
前記アスペルギルス属に属する微生物がアスペルギルス・オリゼである、請求項１〜４のいずれかに記載のＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項６】
前記分子量分布の幅が、バンドの濃さの相対値が最大値の６０％を超える分子量分布で見た場合に４０ｋＤａ以内である、請求項１〜５のいずれかに記載のＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項７】
前記分子量分布の幅が、バンドの濃さの相対値が最大値の６０％を超える分子量分布で見た場合に３０ｋＤａ以内である、請求項１〜５のいずれかに記載のＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコースセンサ。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載のＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼまたは請求項８に記載のグルコースセンサを用いてグルコース濃度を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ、前記ＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサ、およびそれらを用いてグルコース濃度を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中グルコース濃度の測定は、糖尿病患者が適当な血糖コントロールを行うにあたって必要不可欠である。日常的に血糖値をチェックするために、例えば、グルコースオキシダーゼ（本明細書ではＧＯＤとも記載する。）もしくはグルコースデヒドロゲナーゼ（本明細書ではＧＤＨとも記載する。）を利用したグルコースセンサや簡易型自己血糖測定キットが使われる。ＧＯＤは血糖測定用酵素として古くから用いられているが、溶存酸素が測定値に影響を与えることから、近年ではＧＤＨを用いたものが主流となってきている。ＧＤＨを原料としたグルコースセンサは、ＧＤＨの以下の反応を利用して血液中のグルコース濃度を測定するものである。
Ｄ−グルコース  ＋  電子受容体（酸化型）  →
Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン  ＋  電子受容体（還元型）
すなわち、グルコースを酸化することによって生じる電子の流れを測定することにより、グルコースの定量を可能にしている。これまでに血糖測定に用いられているＧＤＨとしては、反応に要する補酵素の違いから、ニコチンアミド依存型、ピロロキノリンキノン（本明細書ではＰＱＱとも記載する。）依存型、フラビンアデニンジヌクレオチド（本明細書ではＦＡＤとも記載する。）依存型の３種類が知られている。ニコチンアミド依存型としてはバチルス属由来のものが市販されているが、補酵素を含んだホロ酵素の状態で精製することができないため、センサを作製するにあたって補酵素となるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（本明細書ではＮＡＤとも記載する。）などを加えなければならない。この煩雑さ及び補酵素となるＮＡＤ等が高価であることが問題点として挙げられる。一方、ＰＱＱ依存型ＧＤＨはホロ酵素での提供が可能であり、また比活性が高くグルコースに対する十分な応答シグナルを得られるという利点がある一方で、基質特異性の厳密さに欠け、マルトース等のグルコース以外の糖類にも反応してしまう点が問題視されている。これらの問題点をクリアしうるものとして、ＦＡＤ依存型ＧＤＨが浸透しつつある。
【０００３】
ＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本明細書ではＦＡＤＧＤＨとも記載する。）は、アスペルギルス属由来のもの（特許文献１、２および７）、ペニシリウム（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属由来のもの（特許文献３）、ケカビ科糸状菌由来のもの（特許文献４〜６）などが知られている。また、こうしたＧＤＨを使用したグルコースセンサ（血糖センサ）も知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４４９４９７８号
【特許文献２】特許第４２９２４８６号
【特許文献３】米国特許７４９４４９４号
【特許文献４】特許第４６４８９９３号
【特許文献５】特開２０１３−９０６２１
【特許文献６】特開２０１３−１１６１０２
【特許文献７】ＷＯ２００６／１０１２３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、より優れたＦＡＤＧＤＨを提供することであり、前記ＦＡＤＧＤＨを用いてより優れたグルコースセンサを構築することであり、また、それらを用いてグルコース濃度を測定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、種々のＦＡＤＧＤＨを用いてグルコースセンサの特性を種々検討した。その結果、重要な問題点として、糖鎖を有するＦＡＤＧＤＨを用いて作製されたグルコースセンサにおいて、電極における応答値に差が生じることを見出した。
【０００７】
本発明者らは、さらに検討を行い、電極における応答値の差の原因がグルコースセンサに用いるＦＡＤＧＤＨの分子量の均一性にあることを見出した。本発明者らは、さらに、グルコースセンサに用いるＦＡＤＧＤＨの分子量の均一性を高めることによって、グルコース濃度とグルコースセンサの応答値との比例関係が、より高濃度まで維持されることを明らかにした。
【０００８】
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものであり、以下の項１〜項４から構成されるものである。
項１．
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察される分子量分布の幅が、バンドの濃さの相対値が最大値の６０％を超える分子量分布で見た場合に５０ｋＤａ以内である、ＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項２．
以下のいずれか１種より選ばれる微生物に由来する、項１に記載のＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、シゾフィリウム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、コレトトリチウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｉｕｍ）属、シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属、アースリニウム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｎｍ）属
項３．
項１または２に記載のＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコースセンサ。
項４．
項１または２に記載のＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼまたは項３に記載のグルコースセンサを用いてグルコース濃度を測定する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、性能の優れたグルコースセンサを供給することが可能であり、そのようなグルコースセンサに好適なＧＤＨを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、各アスペルギルス属のｏｃｈ１オルソログのアミノ酸配列の同一性を比較した図である。
【図２】図２は、アスペルギルス・オリゼのｏｃｈ１遺伝子の破壊方法を示した図である。
【図３】図３は、アスペルギルス・オリゼ発現プラスミドｐＴＮＥ−ＡｏｍＦＡＤＧＤＨのベクターマップを示した図である。
【図４】図４は、精製酵素ＡｏｍＦＡＤＧＤＨとΔｏｃｈ１−ＡｏｍＦＡＤＧＤＨをＳＤＳ−ＰＡＧＥした図である。
【図５】図５は、精製酵素ＡｏｍＦＡＤＧＤＨ（図ではＡＯと記載、●でプロット）とΔｏｃｈ１−ＡｏｍＦＡＤＧＤＨ（図ではＡＯ−ｏｃｈと記載、▲でプロット）を用いて電極における応答値を測定した図である。図において、多項式（ＡＯ）、多項式（ＡＯ−ｏｃｈ）とは、それぞれプロットされた測定値を基に項数を２次として多項式近似を行って作成した近似曲線を示す。
【図６】図６は、精製酵素ＡｔＦＡＤＧＤＨとΔｏｃｈ１−ＡｔＦＡＤＧＤＨをＳＤＳ−ＰＡＧＥした図である。
【図７】図７は、図４で示されたＡｏｍＦＡＤＧＤＨのバンドの濃淡をスキャンして横軸に分子量、縦軸にバンドの相対的な濃さをプロットした図である。
【図８】図８は、図４で示されたΔｏｃｈ１−ＡＯｍＦＡＤＧＤＨのバンドの濃淡をスキャンして横軸に分子量、縦軸にバンドの相対的な濃さをプロットした図である。
【図９】図９は、図６で示されたＡｔＦＡＤＧＤＨのバンドの濃淡をスキャンして横軸に分子量、縦軸にバンドの相対的な濃さをプロットした図である。
【図１０】図１０は、図６で示されたΔｏｃｈ１−ＡｔＦＡＤＧＤＨのバンドの濃淡をスキャンして横軸に分子量、縦軸にバンドの相対的な濃さをプロットした図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（ＦＡＤＧＤＨ）
本発明の実施形態の一つは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察される分子量分布の幅が、バンドの濃さの相対値が最大値の６０％を超える分子量分布で見た場合に５０ｋＤａ以内であ
る、ＦＡＤＧＤＨである。
【００１２】
本発明において、分子量分布はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定する。具体的には、以下の（１）〜（４）に記載の方法に従う。
（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Ｎｕ−ＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、分子量がそれぞれ５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１６０および２２０ｋＤａのラダーを持つ分子量マーカー（ＢｅｎｃｈＭａｒｋＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ）を適用して、実行する。
（２）前記（１）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果で示されたバンドの濃淡をスキャンして、横軸に分子量、縦軸にバンドの相対的な濃さをプロットする。スキャンおよびプロットにはＧｅｌ  Ｐｒｏ  ａｎａｌｙｚｅｒ（日本ローパー製）を用いる。
（３）前記（２）でプロットした結果から、バンドの濃さの相対値が最大値の６０％を超える分子量範囲を読み取る。
（４）本発明における分子量分布は、前記（３）で読み取った分子量範囲を含む最少の分子量の幅を、前記（１）で使用した分子量マーカーのラダーで設定されている各分子量で区切って表す。例えば、前記（３）で読み取った分子量範囲が７５−８５ｋＤａであれば分子量分布は７０−９０ｋＤａとなり、８５−１０５ｋＤａであれば分子量分布は８０−１２０ｋＤａとなる。
【００１３】
本発明のＦＡＤＧＤＨの分子量分布の幅は、前記の方法で測定した場合５０ｋＤａ以内である。分子量分布の幅は、さらに好ましくは４０ｋＤａ以内、さらに好ましくは３０ｋＤａ以内、さらに好ましくは２０ｋＤａ以内である。
【００１４】
本発明のＦＡＤＧＤＨの由来は特に限定されないが、以下の（Ａ）群で示される中のいずれか１種より選ばれる微生物に由来することが好ましい。
（Ａ）アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、モナスカス属、フサリウム属、サッカロマイセス属、ピキア属、キャンディダ属、シゾサッカロマイセス属、クリプトコッカス属、シゾフィリウム属、ムコール属、アブシジア属、アクチノムコール属、コレトトリチウム属、シルシネラ属およびアースリニウム属。
【００１５】
本発明のＦＡＤＧＤＨは、以下の（Ｂ）群で示される中のいずれか１種より選ばれる微生物に由来することがより好ましい。
（Ｂ）アスペルギルス属、ムコール属、アブシジア属、アクチノムコール属、コレトトリチウム属、シルシネラ属、アースリニウム属およびペニシリウム属
【００１６】
本発明のＦＡＤＧＤＨは、さらに好ましくは、アスペルギルス属、ムコール属およびシルシネラ属からなる群のうちいずれかに由来する。このようなものとしては、たとえば、アスペルギルス・オリゼ（配列番号３）、アスペルギルス・テレウス（配列番号４）、ムコール・プライニ（ｐｒａｉｎｉｉ）（配列番号５）、ムコール・ヒエマリス（ｈｉｅｍａｌｉｓ）（配列番号６）、ムコール・スブチリシムス（ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ）（配列番号７）、シルシネラ・シンプレックス（ｓｉｍｐｌｅｘ）（配列番号８）などが挙げられる。
【００１７】
本発明のＦＡＤＧＤＨは、さらに好ましくはアスペルギルス属の微生物に由来する。本発明のＦＡＤＧＤＨは、さらに好ましくは、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｉｚａｅ）、または、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）中のいずれか１種の微生物に由来する。
【００１８】
本発明のＦＡＤＧＤＨは、前記それぞれの微生物のアミノ酸配列等に、ＦＡＤＧＤＨとしての機能を失わない程度に改変を加えたものであっても良い。アミノ酸配列を改変する場合、その改変の程度は特に限定されないが、たとえば、１または数個の置換、欠失、挿入、および／または付加がされていてもよいし、野生型のアミノ酸配列と７０％（好ましくは７５％、さらに好ましくは８０％、さらに好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％、さらに好ましくは９９％）以上の同一性を有するものであってもよい。
【００１９】
本発明のＦＡＤＧＤＨの糖鎖含量は、野生型の微生物により生産されるものと比較して均一化されていることが好ましい。その均一化の度合いは分子量分布の幅で表され、前記の方法で測定した場合５０ｋＤａ以内である。分子量分布の幅は、さらに好ましくは４０ｋＤａ以内、さらに好ましくは３０ｋＤａ以内、さらに好ましくは２０ｋＤａ以内である。
【００２０】
本発明のＦＡＤＧＤＨの糖鎖含量は、野生型の微生物により生産されるものと比較して減少していることが好ましい。その減少の度合いは特に限定されないが、好ましくは、野生型のものに比べて６０％以下、さらに好ましくは実質的に５６．３％と同じかそれ未満（本明細書では、「実質的に同じ」とは、測定のばらつき等を考慮して区別がつかない状態を言う。）、さらに好ましくは実質的に５５％と同じかそれ未満、さらに好ましくは実質的に５１．５％と同じかそれ未満、さらに好ましくは実質的に４４．０％と同じかそれ未満である。
【００２１】
本明細書において、ＦＡＤＧＤＨの糖鎖含量は、ＦＡＤＧＤＨ全体（ポリペプチド鎖部分と糖鎖部分の両方を含む）の分子量とＦＡＤＧＤＨのポリペプチド鎖部分のみの分子量（アミノ酸配列から計算できる。）とを求めたのち、ＦＡＤＧＤＨ全体の分子量からＦＡＤＧＤＨのポリペプチド鎖部分のみの分子量を差し引いた値を糖鎖部分の分子量とし、この値をＦＡＤＧＤＨ全体の分子量で割ることにより求める。
【００２２】
本明細書において、分子量は、以下の（１）（２）（５）〜（７）に記載の方法に従って求める。
（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Ｎｕ−ＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、分子量がそれぞれ５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１６０および２２０ｋＤａのラダーを持つ分子量マーカー（ＢｅｎｃｈＭａｒｋＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ）を適用して、実行する。
（２）前記（１）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果で示されたバンドの濃淡をスキャンして、横軸に分子量、縦軸にバンドの相対的な濃さをプロットする。スキャンおよびプロットにはＧｅｌ  Ｐｒｏ  ａｎａｌｙｚｅｒ（日本ローパー製）を用いる。
（５）前記（２）でプロットした結果から、バンドの相対的な濃さが最も高い分子量を読み取る。
（６）前記（５）で読み取った分子量範囲を含む最少の分子量の幅を、前記（１）で使用した分子量マーカーのラダーで設定されている各分子量で区切って表す。例えば、前記（５）で読み取ったバンドの相対的な濃さが最も高い分子量が７６ｋＤａであれば、その分子量の幅は７０−８０ｋＤａとなる。
（７）前記（６）で表した分子量の幅の中心値（その幅の上限値と下限値とを足して２で割った値）を分子量とする。
【００２３】
また、本発明のＦＡＤＧＤＨは、前記のとおり糖鎖含量が減少する結果、分子量が野生型の微生物により生産されるものと比較して減少していることが好ましい。その減少の度合いは特に限定されないが、好ましくは、野生型のものに比べて８８％以下、さらに好ましくは８３％以下、さらに好ましくは７５％以下、さらに好ましくは７０％以下、さらに好ましくは実質的に６９．７％と同じかそれ未満、さらに好ましくは実質的に６８．２％と同じかそれ未満、さらに好ましくは実質的に６５％と同じかそれ未満、さらに好ましくは実質的に６０．７％と同じかそれ未満である。
【００２４】
また、本発明のＦＡＤＧＤＨの分子量は、好ましくは１００ｋＤａ以下（さらに好ましくは９０ｋＤａ以下、さらに好ましくは実質的に８８ｋＤａと同じかそれ未満、さらに好ましくは８５ｋＤａと同じかそれ未満である。
【００２５】
前記の本発明のＦＡＤＧＤＨは、後述のグルコースセンサやグルコース測定方法への適用等を考慮して、適当な組成物の形態をとることが可能である。前記組成物の形態は特に限定されず、凍結乾燥や粉末などの乾燥状態および液体状態のどちらでもよい。そのような組成物の製造方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、当業者はその知見を適用して本発明の組成物を製造することができ、その態様は特に制限されない。前記組成物に添加できる物質としては、例えば、後述のグルコースセンサに含まれても良いものとして本明細書に例示されている種々の物質が挙げられる。
【００２６】
本発明のＦＡＤＧＤＨは、後述の実施例で示されるように、グルコースセンサに用いた場合において、真のグルコース濃度に対する応答値の良好な比例関係が、野生型のＦＡＤＧＤＨを用いたときと比較して、より高いグルコース濃度範囲まで確保される。その理由の一つとしては、糖鎖含量が低下したことで糖タンパク質重量当たりの活性が向上するため、センサに搭載する糖タンパク質重量が同じでも、酵素活性が相対的に高くなり、高い濃度のグルコースに対しても十分な応答を示すものと考えられる。
【００２７】
また、本発明の生産方法により得られるＦＡＤＧＤＨは、糖鎖含量が均一化することにより、酵素の精製段階において、クロマトグラフィーなどの工程で効率が向上し、その結果、精製収率が向上することが期待できる。
【００２８】
（グルコースセンサ）
本発明の実施形態の一つは、前記のＦＡＤＧＤＨを含むグルコースセンサである。
【００２９】
前記グルコースセンサは、本発明のＦＡＤＧＤＨを含むものであれば特に限定されない。例えば、電極としてカーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、ＮＡＤもしくはＮＡＤＰといった補酵素、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＦＡＤＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングすることができる。使用する電子メディエーターとしては、ＧＤＨの補酵素であるＦＡＤから電子を受け取り、発色物質や電極に電子を供与しうるものが挙げられ、たとえばフェリシアン化物塩、フェナジンエトサルフェート、フェナジンメトサルフェート、フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン、１−メトキシ−フェナジンメトサルフェート、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、２，５−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，５−ジクロロ−１，４−ベンゾキノン、ニトロソアニリン、フェロセン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体等が例示されるが、これらに限定されない。また、電極上のＧＤＨ組成物中には、安定化剤及び／又は活性化剤としてウシ血清アルブミン、セリシン等のタンパク質、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、コール酸塩、デオキシコール酸塩などの界面活性剤、グリシン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシルグリシン等のアミノ酸、トレハロース、イノシトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース等の糖及び／又は糖アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類、さらにはプルラン、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ポリグルタミン酸などの親水性ポリマーを含んでもよい。
【００３０】
（グルコース測定方法）
本発明の実施形態の一つは、前記のＦＡＤＧＤＨまたは前記のグルコースセンサを用いてグルコース濃度を測定する方法である。グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のＦＡＤＧＤＨを用いて、各種試料中のグルコースの量又は濃度を測定することができる。本発明のＦＡＤＧＤＨを用いてグルコースの濃度又は量が測定可能である限り、その態様は特に制限されないが、例えば、本発明のＦＡＤＧＤＨを試料中のグルコースに作用させ、グルコースの脱水素反応に伴う電子受容体（例えば、ＤＣＰＩＰ）の構造変化を吸光度で測定することにより実施することができる。グルコースを含有する試料は、特に制限されないが、例えば、血液、飲料、食品等を挙げることができる。グルコース濃度又は量の測定が可能である限り、試料に添加する酵素の量は特に制限されない。
【００３１】
前記のグルコースセンサを用いたグルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のＦＡＤＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００３２】
本発明のグルコース測定方法は、前記のグルコースセンサ以外に、グルコース測定用組成物やグルコースアッセイキットなど血中のグルコース濃度を測定する試薬、キット等を用いることによっても実行することができる。
【００３３】
前記グルコース測定用組成物、前記グルコースアッセイキットは、本発明のＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含むものであれば特に限定されない。典型的には、本発明のＦＡＤＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００３４】
前記のグルコースセンサ、グルコース測定用組成物およびグルコースアッセイキット等の利用方法や製造方法などは既に当該技術分野において確立されている。よって、当業者はその知見を適用してそれらのグルコースセンサ、グルコース測定試薬、グルコース測用キット等を製造し使用することができ、その態様は特に制限されない。たとえば、ＦＡＤＧＤＨを用いてグルコース濃度を測定する目的で用いる１セットのうち一部または全部を構成する製品であって、本発明のＦＡＤＧＤＨを含むものであれば良い。
【００３５】
（本発明のＦＡＤＧＤＨの製造方法）
前記の本発明のＦＡＤＧＤＨ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察される分子量分布の幅が、バンドの濃さの相対値が最大値の６０％を超える分子量分布で見た場合に５０ｋＤａ以内である、ＦＡＤＧＤＨ）を製造する方法は特に限定されない。
例えば、公知の、タンパク質に付加する糖鎖の構造を改変制御できる技術を用いることにより、分子量の均一性を高めることができる。そのような技術を以下に例示する。
【００３６】
タンパク質に結合する糖鎖にはタンパク質のアスパラギン残基に結合するＮ型とセリンまたはスレオニンに結合するＯ型の２種類があることが知られている。このうち、Ｎ型糖鎖の生合成経路については多くの知見があり、詳しく解析されている。
糖鎖の生合成は、まず小胞体（ＥＲ）で始まり、その後ゴルジ体でさらに糖鎖の修飾が起こる。このうちＥＲで生成する糖鎖は真菌も哺乳類細胞も基本的には同じであることが判明している。その糖鎖は８分子のマンノース（Ｍａｎ）と２分子のＮアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からなるコア構造（Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２）が構成されている。このコア構造糖鎖を持つタンパク質はゴルジ体に輸送されて、種々の修飾を受ける。
【００３７】
酵母に於いてＥＲでの糖鎖の生成過程は、ａｌｇファミリー遺伝子が合成を行う。まず、ａｌｇ７，ａｌｇ１３，ａｌｇ１４遺伝子によってＧｌｃＮＡｃが付加され、次いで、ａｌｇ１，ａｌｇ２，ａｌｇ１１，ａｌｇ３，ａｌｇ９によってマンノースが付加されてコア構造を生成する。次に、ゴルジ体に運ばれた糖タンパク質はｏｃｈ１によってさらにマンノースが付加された後、Ｍｎｎ１，Ｍｎｎ４，Ｍｎｎ６によって多量のマンノースが付加されて、ハイパーマンノース型糖鎖へと生成される。
【００３８】
酵母や糸状菌において、遺伝子工学的手法を用いることによって、上述する遺伝子の破壊により、分泌されるタンパク質に結合する糖鎖の構造を改変することが試みられている。例えば、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００８  ７４（４）：１０７６−８６には、糸状菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｒａｎｓにおいてａｌｇ３（ａｌｇＣ）遺伝子を破壊することによって、Ｎ型糖鎖に含まれるヘキソース量が低減することが示されており、ａｌｇ３遺伝子がα１，３マンノシルトランスフェラーゼをコードすることが調べられている。さらに、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１０  ５（１２）においては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓにおいて、ｏｃｈ１遺伝子を破壊することによって、糖鎖組成が変化することが調べられている。
【００３９】
他方、糸状菌においては、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００９  ２８４（１８）：１１９００−１２によると、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ａｌｇ２のＧ３７７Ｒ変異体は温度感受性になり、且つ糖鎖の鎖長も大幅に低減することが調べられている。また、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．  １９９９  ９（１２）：１２８７−９３には、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓにおいてａｌｇ２の変異体を取得したことが報告されており、５ｂｐの挿入変異によってａｌｇ２の機能が低下した変異体においてＮ型糖鎖の殆どが、Ｍａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２若しくは、Ｍａｎ２ＧｌｃＮＡｃ２の構造を有することが調べられている。
【００４０】
また、以下に例示するように、ｏｃｈ１遺伝子の機能を低下させた改変微生物を用いてＦＡＤＧＤＨを生産する方法によっても、前記の本発明のＦＡＤＧＤＨを製造することができる。
【００４１】
ｏｃｈ１遺伝子とは、タンパク質のアスパラギン残基に結合するＮ型糖鎖の生合成の関わる酵素の１つであるｏｃｈ１の発現を制御する遺伝子である。
【００４２】
ｏｃｈ１遺伝子は糖タンパク質を合成する機能を有する微生物のほぼすべてに存在する。例えば、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、モナスカス属、フサリウム属、サッカロマイセス属、ピキア属、キャンディダ属、シゾサッカロマイセス属、クリプトコッカス属、シゾフィリウム属、ムコール属、アブシジア属、アクチノムコール属、コレトトリチウム属、シルシネラ属、アースリニウム属、コッシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属、ボトリティアナ（Ｂｏｔｒｙｔｉａｎｉａ）属、レプトスファリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）属、チラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、バーティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ヤロイワ（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、シバリンデネラ（Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ）属、シェファロマイセス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ）属、エレモセシウム（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセタセア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）属、アシビア（Ａｓｈｂｙａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ラカンセア（Ｌａｃｈａｎｃｅａ）属、ザイゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、カザキスタニア（Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、ナウモボザイマ（Ｎａｕｍｏｖｏｚｙｍａ）属、テトラピシスポラ（Ｔｅｔｒａｐｉｓｉｓｐｏｒａ）属、マイセリオフォソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属などが挙げられるが特に限定されない。
【００４３】
本発明者らは、ＦＡＤＧＤＨの糖鎖含量がグルコースセンサにおける電極応答値に与える影響について、種々の、ＦＡＤＧＤＨを生産できる能力を有する微生物を用いて、より詳細に解析を行った。その結果、ＦＡＤＧＤＨを、アスペルギルス・オリゼを宿主として発現させ、液体培養によって前記宿主を増殖させた培養液から精製された精製酵素は、結合する糖鎖の組成が不均一であり、さまざまな鎖長の糖鎖が結合していると推察された。また、酵母サッカロマイセス・セレビシエを宿主として発現されたＦＡＤＧＤＨの糖鎖は、アスペルギルス・オリゼを宿主として発現されたものと同じく様々な鎖長の糖鎖が結合しており、さらにその糖鎖の鎖長はアルペルギルス・オリゼを宿主として発現されたＦＡＤＧＤＨよりも長いことが確認された。
【００４４】
そこで、本発明者らは、ＦＡＤＧＤＨに結合する糖鎖含量を調節するために、さらに鋭意検討を重ねた。その結果、ＦＡＤＧＤＨを生産できる能力を有する微生物の糖鎖合成関連遺伝子の一つであるｏｃｈ１遺伝子を破壊、若しくはその機能を低下させることによって、ＦＡＤＧＤＨに結合する糖鎖を大幅に短く（その結果、糖鎖含量を低減）することが出来、且つ、その糖鎖組成はほぼ均一となることを見出した。
微生物のｏｃｈ１遺伝子の機能を低下させるための、より好ましい手段は、ｏｃｈ１遺伝子に相当するＤＮＡを破壊することである。
【００４５】
上記で例示された、本発明のＦＡＤＧＤＨを製造する方法において、ｏｃｈ１遺伝子の配列は特に限定されないが、例えば、アスペルギルス・オリゼ（ｏｒｙｚａｅ）に由来するものであれば、配列番号２のＤＮＡ配列が挙げられる。配列番号２は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。
【００４６】
ｏｃｈ１遺伝子の配列は、微生物の種類によって異なるが、例えば、アスペルギルス属の微生物の間では高度に保存されている。また、アスペルギルス属以外の微生物においても、相同性検索から、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ属、Ｂｏｔｒｙｔｉａｎｉａ属、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ属、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ属、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ属、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ属、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ属、Ａｓｈｂｙａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｌａｃｈａｎｃｅａ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ属、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属、Ｎａｕｍｏｖｏｚｙｍａ属、Ｔｅｔｒａｐｉｓｉｓｐｏｒａ属、Ｎａｕｍｏｖｏｚｙｍａ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ属、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ属、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ属において、相同性の高い（Ｅ−ｖａｌｕｅ＜２ｅ−３４（２のマイナス３４乗（本書では「２ｅ−ｎ」で２のマイナスｎ乗を表す。）））配列を有していることが確認されており（結果を表１および表２に示す。）、このことはｏｃｈ１遺伝子の配列が真菌類において高度に保存されていることを示す。
【００４７】
【表１】
2020188798.tif 000002
【００４８】
【表２】
2020188798.tif 000003
【００４９】
塩基配列の同一性は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴにおいてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出する。Ｅ−ｖａｌｕｅとは、２つの配列の類似性を比較するための尺度で、その値が小さいほど類似度が高いことを示す。
【００５０】
上記で例示された、本発明のＦＡＤＧＤＨを製造する方法において、ｏｃｈ１遺伝子は、以下の（ａ）（ｂ）のいずれかであっても良い。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列と６８％以上（好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２のＤＮＡ配列と６８％以上（好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性を有するＤＮＡ
【００５１】
上記で例示された、本発明のＦＡＤＧＤＨを製造する方法において、ｏｃｈ１遺伝子は、アスペルギルス属に属する微生物においては、以下の（ｃ）（ｄ）のいずれかであっても良い。
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは７３％以上、さらに好ましくは７４％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは７６％以上）の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号２のＤＮＡ配列と７０％以上（好ましくは７３％以上、さらに好ましくは７４％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは７６％以上）の同一性を有するＤＮＡ
【００５２】
ＢＬＡＳＴによる相同性検索によれば、配列番号１のアミノ酸配列との同一性は、アスペルギルス・ニードランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のものと７０％、アスペルギルス・ニガー（ｎｉｇｅｒ）由来のものと７３％、アスペルギルス・カワチ（ｋａｗａｃｈｉｉ）由来のものと７４％、アスペルギルス・テレウス（ｔｅｒｒｅｕｓ）由来のものと７７％、アスペルギルス・クラバタス（ｃｌａｖａｔｕｓ）由来のものと７８％、アスペルギルス・フラバス（ｆｌａｖｕｓ）由来のものと１００％である。
【００５３】
上記で例示された、本発明のＦＡＤＧＤＨを製造する方法において、ｏｃｈ１遺伝子の配列は、アスペルギルス属に属する微生物においては、以下の（ｅ）の通りであっても良い。
（ｅ）ＢＬＡＳＴによる相同性検索において、配列番号２に対する同一性が７３％以上（好ましくは７４％以上、さらに好ましくは７６％以上、さらに好ましくは９９％以上、）の値を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
【００５４】
ＢＬＡＳＴによる相同性検索によれば、配列番号２に対する同一性は、アスペルギルス・ニードランス由来のものに対して７４％、アスペルギルス・ニガー由来のものに対して７６％、アスペルギルス・クラバタス由来のものに対して７４％、アスペルギルス・テレウス由来のものに対して７６％である。
【００５５】
上記で例示された、本発明のＦＡＤＧＤＨを製造する方法に用いる改変微生物の、改変前の微生物は、ｏｃｈ１遺伝子を有する微生物であれば特に限定されない。例えば上記で列挙した微生物を用いることができる。
【００５６】
本発明のＦＡＤＧＤＨを製造する方法に用いる改変微生物は、前記改変前の微生物のｏｃｈ１遺伝子の機能を低下させた改変微生物である。例えば、以下のいずれか１種より選ばれる微生物である。
アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、モナスカス属、フサリウム属、サッカロマイセス属、ピキア属、キャンディダ属、シゾサッカロマイセス属、クリプトコッカス属、シゾフィリウム属、ムコール属、アブシジア属、アクチノムコール属、コレトトリチウム属、シルシネラ属、アースリニウム属。
【００５７】
中でも、糸状菌に分類される微生物、特に、麹菌（アスペルギルス属に属する微生物）は糖質分解酵素であるアミラーゼやグルコアミラーゼ、タンパク質分解酵素などを大量に分泌生産するため、清酒や味噌などの発酵醸造産業に広く利用されているだけでなく、そのタンパク質分泌能力の高さから、本発明のＦＡＤＧＤＨを製造するための発現宿主として好ましい。中でも、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・二がー、アスペルギルス・テレウスなどがより好ましい。
【００５８】
上記で例示された、本発明のＦＡＤＧＤＨ生産方法に用いる改変微生物は、形質転換体であっても良い。この場合は、宿主微生物としてｏｃｈ１遺伝子の機能を低下させた改変微生物を用い、これにＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡを適切なベクターを介して導入して得られた形質転換体を用いて、ＦＡＤＧＤＨを生産する。
【００５９】
ｏｃｈ１遺伝子の機能を低下させる手段は、特に限定されない。
その手段の一つは、前記ｏｃｈ１遺伝子に相当するＤＮＡを破壊することである。この方法は、用いようとする微生物のｏｃｈ１遺伝子配列が特定されている場合に適している。ここで破壊とは、ｏｃｈ１遺伝子に相当するＤＮＡ配列の全部または一部を除去するか、前記ＤＮＡ配列の少なくとも１箇所に変異を加えるか、または、前記ＤＮＡ配列の両端以外の少なくとも１箇所に任意のＤＮＡ配列を挿入すること等によって、その機能を低減若しくは完全に停止させることを言う。
【００６０】
ｏｃｈ１遺伝子の機能を低下させた改変微生物の作製方法は、種々の公知の方法を用いて行えばよく、特に限定されない。
例えば、形質転換体を用いる場合、ｏｃｈ１遺伝子を破壊する方法としては、ＤＮＡの相同組換えを用いる方法が一般的であり、形質転換に用いるマーカー遺伝子に、目的とする遺伝子の上流非翻訳領域と下流翻訳領域を連結させた遺伝子破壊カセットを構築し、宿主微生物を形質転換することによって、ｏｃｈ１遺伝子の上流と下流で相同組換えを起こさせ、ｏｃｈ１のＯＲＦ部分を除去することにより遺伝子の機能を低下させることが可能である。
また、遺伝子破壊カセットをｏｃｈ１のＯＲＦ内部で転写が終結するように構築し、目的遺伝子の位置に遺伝子破壊カセットを挿入することにより、遺伝子の機能を停止させることも可能である。
【００６１】
ｏｃｈ１遺伝子の機能を低下させる別の手段としては、突然変異によりｏｃｈ１遺伝子の機能を低下した改変微生物を得ることも可能である。
この方法では、用いようとする微生物に対して、変異剤処理や、紫外線、エックス線またはガンマ線の照射などの物理的処理によって、突然変異を起こす頻度を高めてもよいが、天然に生じるバリアントであっても構わない。
この方法は、用いようとする微生物にｏｃｈ１遺伝子の働きに該当する機能が認められるものの、ｏｃｈ１遺伝子配列が特定されていない場合に適している。
【００６２】
ｏｃｈ１遺伝子の発現を低下させる別の手段としては、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：  ＲＮＡｉ）による転写抑制も可能である。
この方法では、目的の遺伝子によって転写されるｍＲＮＡの相補鎖となるＤＮＡ若しくはＲＮＡを微生物に導入、若しくは微生物内で転写させることによって、ｍＲＮＡと二重鎖を形成することによってｍＲＮＡを不安定化させ、また、ｍＲＮＡからペプチドへの翻訳を抑制することによって、ｏｃｈ１の発現を低下させることが可能である。
この方法は、遺伝子の相同組換え効率が低い微生物において、ターゲティングによる目的遺伝子の破壊が困難な場合に有効である。
【００６３】
本発明のＦＡＤＧＤＨを形質転換体を用いて製造する場合、前記ＦＡＤＧＤＨの由来は、その生物学的分類における属（ｇｅｎｕｓ）および／または種（ｓｐｅｃｉｅｓ）が、宿主微生物の属および／または種に対して、同じであってもかまわないし異なっていてもかまわない。
【００６４】
本発明のＦＡＤＧＤＨを形質転換体を用いて製造する場合、前記ＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡを宿主微生物に導入し発現させる方法は、特に限定されない。例えば、前記ＤＮＡを宿主に対応した適当なベクターへ挿入し、さらにそのベクターを宿主に導入して形質転換すればよい。このような方法は、標準的な組換えＤＮＡ技術であって、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １．８４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照して行うことができる。
【００６５】
本発明のＦＡＤＧＤＨを製造する方法においては、上述のいずれかの方法で作製された改変微生物を用いてＦＡＤＧＤＨを生産することができる。例えば、前記改変微生物を培養してＦＡＤＧＤＨを発現させ、得られた培養液を精製することによって製造することができる。一般に、目的の蛋白質を該蛋白質を発現する微生物を培養して得られた培養液を精製することによって製造する方法は、既に当該技術分野において確立されている。よって、当業者はその知見を適用してＦＡＤＧＤＨを製造することができ、その態様は特に制限されない。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００６７】
１．アスペルギルス・オリゼ由来ｏｃｈ１遺伝子の選抜
アスペルギルス・オリゼ由来ｏｃｈ１糖鎖合成関連遺伝子の選抜は、糖鎖合成関連遺伝子がよく研究されている、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝子情報から相同性が高い配列を選抜することにより行った。選抜した遺伝子がコードすると推定されるアミノ酸を配列番号１に、ｏｃｈ１をコードすると想定されるＤＮＡ配列を配列番号２に示す。選抜した遺伝子がコードすると推定されるアミノ酸配列情報を元に、同じアスペルギルス属においてホモロジー検索を行った結果、アスペルギルス・ニガーとは７３％、アスペルギルス・フミガタスとは７７％、アスペルギルス・ニードランスとは７０％の同一性を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子が存在しており、これら遺伝子群はアスペルギルス属において高度に保存されていると考えられる。図１に、各アスペルギルス属のｏｃｈ１オルソログのアミノ酸配列の同一性の比較を示す。
【００６８】
２．アスペルギルス・オリゼ由来ｏｃｈ１遺伝子破壊カセットの作製
アスペルギルス・オリゼのｏｃｈ１遺伝子破壊カセットは以下のようにして構築した。アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列番号９と配列番号１０に示すプライマーでＰＣＲを行い、アスペルギルス・オリゼのｏｃｈ１遺伝子を含み、遺伝子の上流２ｋｂｐから遺伝子の下流２ｋｂｐまでの領域を増幅した。増幅したＰＣＲ産物は、Ｔａｒｇｅｔ−ｃｌｏｎｅ  Ｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用いてＴＡクローニングし、ｐＴＡ２ベクターに挿入した。作製されたベクターはｐＴＡｏｏｃｈ１±２Ｋとした。
つづいて、ｏｃｈ１遺伝子のＯＲＦ部分を取り除くため、ｐＴＡｏｏｃｈ１±２Ｋをテンプレートに配列番号１１と配列番号１２に示すプライマーでｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲを行った。得られたベクターはｐＴＡｏｏｃｈ１±２Ｋ−ＯＲＦとした。続いて、マーカー遺伝子を挿入するため、ｐＵＳＡベクターから制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＳｂｆＩによってｓＣマーカー部分を切り出し、制限酵素ＮｈｅＩとＳｂｆＩで消化したｐＴＡｏｏｃｈ１±２Ｋ−ＯＲＦに挿入した。得られたベクターをｐＴΔＡｏｏｃｈ１−ｓＣを作製した。
【００６９】
３．糖鎖合成関連遺伝子破壊株の作製
２．で得られたベクターｐＴΔＡｏｏｃｈ１−ｓＣをＱｉａｆｉｌｔｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて大量に調製し、麹菌への形質転換に用いた。組換え宿主には麹菌アスペルギルス・オリゼ  ＮＳ４株を使用し、形質転換の手法は、プロトプラスト−ＰＥＧ法によって行った。遺伝子破壊の原理については図２に示す。得られた形質転換体の中からｏｃｈ１遺伝子破壊株を、ＰＣＲによって確認して選抜した。
【００７０】
４．ＡｏＦＡＤＧＤＨ遺伝子の発現
アスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨ遺伝子の発現は以下のようにして行った。麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのゲノムＤＮＡからｎｉａＤを含む領域を配列番号１３のプライマーと配列番号１４のプライマーによって増幅し、東洋紡社製のＴａｒｇｅｔ  ｃｌｏｎｅ  ｐｌｕｓによってＴＡクローニングしｐＴＮとした。次に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのゲノムＤＮＡから配列番号１５のプライマーと配列番号１６のプライマーによって、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ１αと予測される遺伝子の翻訳開始点から上流１ｋｂｐをＰＣＲによって増幅し、さらに、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのゲノムＤＮＡから配列番号１７のプライマーと配列番号１８のプライマーによって、ＡｍｙＢターミネーターの領域をＰＣＲによって増幅した。ｐＴＮについては配列番号１９のプライマーと配列番号２０のプライマーでＰＣＲを行うことにより、プラスミドを増幅した。上述の通り作製した３つのＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて融合させ、ｎｉａＤマーカーとＥＦ１プロモーター、ＡｍｙＢターミネーターを含む発現ベクターｐＴＮＥを作製した。
つづいて、アスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨについては国際公開公報ＷＯ２００９／１１９７２８に記載の配列、すなわち、アスペルギルス・オリゼＴＩ株のｃＤＮＡからクローニングされた配列にＧ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃの変異を導入した配列を使用した。ＦＡＤＧＤＨをコードするアミノ酸配列を配列番号２１にＤＮＡ配列を配列番号２２にそれぞれ示す。アスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨを配列番号２３のプライマーと配列番号２４のプライマーによって増幅し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＳｐｅＩによって消化し、同じくＳｐｅＩによって消化されたｐＴＮＥのＥＦ１プロモーターの下流に順方向に遺伝子を挿入した。得られたベクターをｐＴＮＥ−ＡｏｍＦＡＤＧＤＨとした。ｐＴＮＥ−ＡｏｍＦＡＤＧＤＨのベクターマップを図３に示す。ｐＴＮＥ−ＡｏｍＦＡＤＧＤＨをΔｏｃｈ１株及びＮＳ４株に形質転換を行った。得られた形質転換体をＤＰ培地で培養し、最も高い生産性を示す形質転換体を選抜した。
【００７１】
５．ＡｏｍＦＡＤＧＤＨの精製
４．で得られた形質転換体を滅菌した６０ｍＬのＤＰ液体培地／５００ｍｌ坂口フラスコに植菌し、３０℃下で２日間振とう培養して前培養液とした。次に、７．０ＬのＹＰＭ培地（５％酵母エキス、２％大豆ペプトン、５％マルトース）／１０Ｌ容ジャーファーメンターに前培養液を植菌し、培養温度３５℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量６．０Ｌ／分、管内圧０．２ＭＰａの条件で３日間培養した。その後、培養液を濾布で濾過し、濾過液を回収した。
濾過液を分画分子量３０，０００のＵＦ膜（ミリポア（株）製）を用いて濃縮し、濃縮液に連続してリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）を添加することによってバッファーを置換した。続いて、濃縮液に硫酸アンモニウムを４０％（ｗ／ｖ）徐々に添加して、室温で３０分間攪拌した後、ろ過助剤を用いて余分な沈殿を除去した。次に、予め４０％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した２００ｍＬのＰＳセファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラムに濾過液をチャージし、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に段階的に置換してタンパク質を溶出させた。そして、溶出された画分を分画分子量１０，０００の中空糸膜（スペクトラムラボラトリーズ製）で濃縮し、濃縮液に連続してリン酸緩衝液（５０Ｍ，ｐＨ６．０）を添加することによってバッファーを置換した。続いて、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥセファロースＦａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラム酵素液を通液し、精製酵素を得た。宿主をΔｏｃｈ１として発現されたＦＡＤＧＤＨをΔｏｃｈ１−ＡｏｍＦＡＤＧＤＨ、宿主をＮＳ４株として発現されたＦＡＤＧＤＨをＡｏｍＦＡＤＧＤＨとした。得られたＡｏｍＦＡＤＧＤＨとΔｏｃｈ１−ＡｏｍＦＡＤＧＤＨとをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、分子量を観察した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＮｕ−ＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用した。分子量がそれぞれ５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１６０および２２０ｋＤａのラダーを持つ分子量マーカー（ＢｅｎｃｈＭａｒｋＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を図４に示す。さらに、図４で示されたバンドの濃淡をスキャンして横軸に分子量、縦軸にバンドの相対的な濃さをプロットしたのが図７（ＡｏｍＦＡＤＧＤＨ）および図８（Δｏｃｈ１−ＡｏｍＦＡＤＧＤＨ）である。
【００７２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、ＡｏｍＦＡＤＧＤＨの分子量分布は８０−１６０ｋＤａ、一方で、Δｏｃｈ−ＡｏｍＦＡＤＧＤＨの分子量分布は約７０−９０ｋＤａであり、分子量分布の幅が減少していた。
【００７３】
図７によれば、ＡｏｍＦＡＤＧＤＨの場合、バンドの相対的な濃さが最も高い分子量は１２０ｋＤａと１００ｋＤａとの間にあり、分子量は１１０ｋＤａと判断される。一方、図８によれば、Δｏｃｈ−ＡｏｍＦＡＤＧＤＨの場合は、バンドの相対的な濃さが最も高い分子量は８０ｋＤａと７０ｋＤａとの間にあり、分子量は７５ｋＤａと判断される。
このように、本発明の生産方法により得られたＦＡＤＧＤＨは、その分子量が野生型のものに比べて、７５÷１１０×１００＝６８．２（％）にまで減少していた。また、ＦＡＤＧＤＨのポリペプチド鎖部分のみの分子量は６０ｋＤａであるから、糖鎖含量は、野生型の｛（１１０−６０）÷１１０｝×１００＝４５．５（％）から｛（７５−６０）÷７５｝×１００＝２０．０（％）に減少していた（野生型の４４．０％）。
【００７４】
以上の試験結果より、本発明の生産方法で作製されたアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨの分子量分布の幅は、バンドの濃さの相対値が最大値の６０％を超える分子量分布で見た場合、２０ｋＤａ以内となっていた。
【００７５】
以上の試験結果より、本発明の生産方法で作製されたアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨの分子量は、野生型のものに比べて８０％以下（好ましくは７５％以下、さらに好ましくは７０％以下、さらに好ましくは実質的に６８．２％と同じかそれ未満）となっていた。
【００７６】
以上の試験結果より、本発明の生産方法で作製されたアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨの糖鎖含量は、野生型のものに比べて６０％以下（好ましくは５５％以下、さらに好ましくは実質的に４４．０％と同じかそれ未満）となっていた。
【００７７】
以上の試験結果より、本発明の生産方法で作製されたアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨの分子量は、９０ｋＤａ以下（好ましくは８０％以下、さらに好ましくは実質的に７５ｋＤａと同じかそれ未満）であった。
【００７８】
６．電気化学式センサにおける応答値への糖鎖含量の影響比較
まず、グルコース測定用試薬として、以下の組成からなる溶液（ｐＨ＝７．０）を作製した。
１ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
５０ｍＭ  フェリシアン化カリウム
０．４ｍｇ／ｍｌ  ＦＡＤＧＤＨ
まず、０．５％のＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）５μＬを３電極を上記溶液５μＬを、３電極を有するディスポーサブルチップ（ＤＥＰ−ＣＨＩＰ、バイオデバイステクノロジーズ社製）の作用極・対極・参照極上に滴下し、５０℃１０分の加温処理を行って乾燥させた。続いて、上記組成液５μＬをＣＭＣを固定化した箇所に滴下し、５０℃１０分の加温処理を行って、センサチップとした。このセンサチップを専用ソケットを介してポテンショ／ガルバノスタットに接続し、電極上の組成物に０〜３００ｍｇ／ｄｌの標準グルコース溶液５μＬを添加して＋０．３Ｖの電圧を印加して電流値をモニタリングし、印加後３秒時点の電流値を応答値とした。グルコース標準液の濃度と応答値の関係を図５に示す。
測定の結果、ＡｏｍＦＡＤＧＤＨは１００ｍｇ／ｄｌから２００ｍｇ／ｄｌでの応答値がΔｏｃｈ１−ＡｏｍＦＡＤＧＤＨと比較して高いが、３００ｍｇ／ｄｌでは応答値がΔｏｃｈ１−ＡｏｍＦＡＤＧＤＨより低く、高濃度での応答において課題があることが判明した。一方で、Δｏｃｈ１−ＡｏｍＦＡＤＧＤＨは３００ｍｇ／ｄｌまでグルコースの濃度に応じて応答値が直線的に上昇しており、高濃度での測定に有利であることが判明した。
【００７９】
７．ＡｔＦＡＤＧＤＨの調製
続いて、他の微生物由来のＦＡＤＧＤＨについても糖鎖含量低減の効果を確認するため、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨについても同様に効果を検証した。アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨは国際公開公報ＷＯ２００４／０５８９５８及びＷＯ２００６／１０１２３９にその配列情報及び特性が開示されている。特許記載のアスペルギルス・テレウス由来ＦＡＤＧＤＨのｃＤＮＡ配列全長を人工的に合成し、さらにｐＴＮＥベクターに遺伝子を挿入することでｐＴＮＥ−ＡｔＦＡＤＧＤＨを得た。得られたプラスミドをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＮＳ４株及びΔｏｃｈ１に形質転換し、得られた形質転換体の中から最も高いＦＡＤＧＤＨ活性をしめす形質転換体を選抜し、ＦＡＤＧＤＨの精製に用いた。形質転換体の培養及び精製は２．で示すとおりに行った。宿主をΔｏｃｈ１として発現されたＦＡＤＧＤＨをΔｏｃｈ１−ＡｔＦＡＤＧＤＨ、宿主をＮＳ４株として発現されたＦＡＤＧＤＨをＡｔＦＡＤＧＤＨとした。得られたＡｔＦＡＤＧＤＨとΔｏｃｈ１−ＡｔＦＡＤＧＤＨとをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、分子量を観察した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＮｕ−ＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用した。分子量マーカー（ＢｅｎｃｈＭａｒｋＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ））を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を図６に示す。さらに、図６で示されたバンドの濃淡をスキャンして横軸に分子量、縦軸にバンドの相対的な濃さをプロットしたのが図９（ＡｔＦＡＤＧＤＨ）および図１０（Δｏｃｈ１−ＡｔＦＡＤＧＤＨ）である。
【００８０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、ＡｔＦＡＤＧＤＨの分子量分布は１００−２２０ｋＤａ、一方で、Δｏｃｈ−ＡｔＦＡＤＧＤＨの分子量分布は約８０−１００ｋＤａであり、分子量分布の幅が減少していた。
【００８１】
図９によれば、ＡｔＦＡＤＧＤＨの場合、バンドの相対的な濃さが最も高い分子量は、１６０ｋＤａと１２０ｋＤａとの間にあり、分子量は１４０ｋＤａと判断される。一方、図１０によれば、Δｏｃｈ−ＡｔＦＡＤＧＤＨの場合は、バンドの相対的な濃さが最も高い分子量は９０ｋＤａと８０ｋＤａとの間にあり、分子量は８５ｋＤａと判断される。
このように、本発明の生産方法により得られたＦＡＤＧＤＨは、その分子量が野生型のものに比べて、８５÷１４０×１００＝６０．７（％）にまで減少していた。また、ＦＡＤＧＤＨのポリペプチド鎖部分のみの分子量は６０ｋＤａであるから、糖鎖含量は、野生型の｛（１４０−６０）÷１４０｝×１００＝５７．１（％）から｛（８５−６０）÷８５｝×１００＝２９．４（％）に減少していた（野生型の５１．５％）。
【００８２】
以上の試験結果より、本発明の生産方法で作製されたアスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨの分子量分布の幅は、バンドの濃さの相対値が最大値の６０％を超える分子量分布で見た場合、２０ｋＤａ以内となっていた。
【００８３】
以上の試験結果より、本発明の生産方法で作製されたアスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨの分子量は、野生型のものに比べて８０％以下（好ましくは７５％以下、さらに好ましくは７０％以下、さらに好ましくは実質的に６０．７％と同じかそれ未満）となっていた。
【００８４】
以上の試験結果より、本発明の生産方法で作製されたアスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨの糖鎖含量は、野生型のものに比べて６０％以下（好ましくは５５％以下、さらに好ましくは実質的に５１．５％と同じかそれ未満）となっていた。
【００８５】
以上の試験結果より、本発明の生産方法で作製されたアスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨの分子量は、９０ｋＤａ以下（好ましくは実質的に８５ｋＤａと同じかそれ未満）であった。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明のＦＡＤＧＤＨは自己血糖測定において、高濃度グルコースを測定するのに適しており、自己血糖測定において極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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