(57)【要約】      （修正有）【課題】高いレベルの遺伝子導入を達成するＡＡＶキャプシドの提供、及び、哺乳動物に目的の核酸を導入する方法の提供。【解決手段】特定の配列を有するアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有する、又は、特定の配列を有するアミノ酸配列に対して少なくとも９４％の同一性を有する、アミノ酸配列を有するＡＡＶキャプシドタンパク質。及び、組換えＡＡＶベクターを哺乳動物に導入することを含む、目的の核酸を哺乳動物に導入する方法であって、組換えＡＡＶベクターが、キャプシドタンパク質を含むキャプシドに包含された目的の遺伝子を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３の配列に対して少なくとも９８％の同一性を有する、又は配列番号４の配列に対して少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、配列番号３の配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する、又は、配列番号４の配列に対して少なくとも９７％の同一性を有する、請求項１記載のＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が、配列番号３の配列を有する、請求項１又は２記載のＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項４】
前記アミノ酸配列が、配列番号４の配列を有する、請求項１又は２記載のＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載のキャプシドタンパク質を含む、ＡＡＶキャプシド。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載のキャプシドタンパク質を含む、ウイルス粒子。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項記載のキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、組換えＡＡＶベクター。
【請求項８】
組換えＡＡＶベクターを哺乳動物に導入することを含む、哺乳動物に目的の核酸を導入する方法であって、該組換えＡＡＶベクターが、請求項１〜４のいずれか１項記載のキャプシドタンパク質を含むキャプシドに包含される目的の遺伝子を含む、方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項記載のキャプシドタンパク質、又は請求項７記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項記載のキャプシドタンパク質、又は請求項７記載のベクターを含む細胞を含む、トランスジェニック動物。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項記載のキャプシドタンパク質、又は請求項７記載のベクター、及び１以上の医薬上許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
近年、様々なウイルスに基づく、多数の組換え遺伝子導入ベクターが開発されている。様々な組織の様々なタイプの分裂及び非分裂細胞を形質導入し得る能力や、安定で長期間の導入遺伝子の発現を確立し得る能力から、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく遺伝子導入ベクター、すなわちＡＡＶベクターが好ましい。例えばアデノウイルスやレトロウイルスなどの他のウイルスに基づくベクターは、特定の望ましい特徴を有し得るものの、それらは望ましくない副作用にも結び付いている。かかる副作用は、ＡＡＶに基づく遺伝子導入ベクターでは検出されていない（Ｍａｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ，１２（３）：３４２（２００６））。
【０００３】
多くのＡＡＶの血清型が同定され、クローニングされ、配列決定され、且つベクターに変換されている。これらの血清型としては、ＡＡＶ８、ＡＡＶ５、ＡＡＶ３Ｂ、及び比較的最近記載されたＡＡＶ−ＬＫ０３（ＷＯ２０１３／０２９０３０）が挙げられる。しかしながら、本発明者らは、現在用いられるベクターの多くはヒトにおける形質導入率が低いことを見出した。例えば、ＡＡＶ８ベクターは、ヒトにおいてはマウスよりも形質導入が２０倍低いのみならず、高用量コホートの３分の２において、一過性、プレドニゾロン反応性の、高トランスアミナーゼ血症（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ，ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ，ｔｒａｎｓａｍｉｎｉｔｉｓ）が発生している。従って、より広い臨床適用性を促進させることのみならず、有効性および安全性が改善された新規ＡＡＶベクターの必要性が依然として存在する。
【０００４】
この目的に対して、本発明者らは、（１）ＡＡＶ８、（２）ＡＡＶ５、（３）ＡＡＶ３Ｂ、および（４）ＡＡＶ−ＬＫ０３の４種類の異なるＡＡＶキャプシド由来の様々なドメインを実験的に交換することにより、新規のハイブリッドキャプシドを開発した。現在使用されるベクターよりも最大５倍高いレベルの遺伝子導入を達成するキャプシドが開発された。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らのリサーチプログラムは、比較的高い形質導入率と最小限の副作用を有するＡＡＶベクターを構築するために企図された。結果として、本発明者らは、新規のハイブリッドキャプシド及びベクターを開発した。
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明は、これより、図面を参照してのみ例として詳細に説明される：
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、ハイブリッドＡＡＶキャプシドの評価を示す。パートＡは、ハイブリッドキャプシドの概略を示し、パートＢは、ＨＵＨ７細胞における２つの異なるＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、感染多重度）での、様々なハイブリッドキャプシドのインビトロ導入効率を例証する。
【図２−Ａ】図２は、細胞形質導入実験の結果を示す。図２−Ａは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ５、ＡＡＶ−ｒｈ１０、ＡＡＶ−ＬＫ０３及びＡＡＶＭｕｔａｎｔ ＣベクターでのＨＵＨ７細胞の形質導入の結果を示す。
【図２−Ｂ】図２は、細胞形質導入実験の結果を示す。図２−Ｂは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ５、ＡＡＶ−ＬＫ０３及びＡＡＶＭｕｔａｎｔ Ｃベクターでの接着性ＨｅｐＧ２細胞の形質導入の結果を示す。
【図３−Ａ】図３−Ａは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ５、ＡＡＶ−ｒｈ１０及びＡＡＶ Ｍｕｔａｎｔ Ｃベクターでの初代肝細胞の形質導入のフローサイトメトリー解析を示す。
【図３−Ｂ】図３−Ｂは、形質導入された肝細胞の蛍光顕微鏡イメージである。
【図４−Ａ】図４−Ａは、ＧＦＰ遺伝子を含有するＡＡＶ８及びＡＡＶ Ｍｕｔａｎｔ Ｃベクターを１ｘ１０４又は１ｘ１０５のＭＯＩでＨｅｐＧ２細胞の３Ｄ培養物に形質導入したことにより生じる、４８５ｎｍ／５３５ｎｍでのＧＦＰの励起／発光を示す。
【図４−Ｂ】図４−Ｂは、形質導入された３Ｄ ＨｅｐＧ２細胞の蛍光顕微鏡イメージである（対物５×、ＧＦＰ露光時間一定（ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｉｍｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ）［３００ｍｓ］）。
【図５】図５は、重篤な血友病患者におけるＡＡＶベクターに対する抗体の保有を、ＥＬＩＳＡ免疫吸着法の結果として示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の要旨
本発明の第一の態様において、配列番号３に対して少なくとも９８％の同一性、又は配列番号４に対して少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。
【０００９】
本発明者らは、驚くべきことに、新規のキャプシドタンパク質が、現在用いられるＡＡＶベクターよりも高い形質導入率をもたらすキャプシドを生み出すことを見出した。さらに、患者における該キャプシドに対する抗体の保有が、幾つかの現在用いられるＡＡＶベクターよりも低いことを見出した。
【００１０】
いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号４の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する。特定の実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号４の配列に対して少なくとも９６％の同一性を有する。更なる実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号４の配列に対して少なくとも９７％の同一性を有する。幾つかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号４の配列に対して少なくとも９８％の同一性を有する。他の実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号４の配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する。特定の実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号４の配列を有する。
【００１１】
幾つかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号３の配列に対して少なくとも９８．５％の同一性を有し、好ましくは配列番号３の配列に対して少なくとも９９％の同一性を有し、及び、より好ましくは、配列番号３の配列に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。特定の実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号３の配列を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号３の配列と同一性を有する。他の実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号４の配列と同一性を有する。好ましい実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号４の配列を有する。より好ましくは、アミノ酸配列は、配列番号３の配列を有する。
【００１３】
上記に定義されるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質は、他の必要なキャプシドタンパク質と共に、機能的なキャプシドを形成することができる機能的キャプシドタンパク質である。機能的キャプシドは、遺伝物質を包み込むことができ、細胞内に入ることができ、且つ、該遺伝物質で該細胞を形質導入することができるものである。キャプシド
が機能的かどうかを決定することは、充分に当業者の能力の範囲内である。例えば、以下の発明の詳細な説明において記載される実験を用いることにより、キャプシドが成功裏に細胞を形質導入し得るか否かを決定することができる。
【００１４】
配列番号３はＡＡＶ３ＢキャプシドのＶＰ２及びＶＰ３ドメインの上流に、ＡＡＶ８ＶＰ１領域を含む１４６アミノ酸の領域をクローニングすることにより作製される。配列番号４は、ＡＡＶ３ＢＶＰ２及びＶＰ３領域の上流に、ＡＡＶ５ ＶＰ１領域をクローニン
グすることにより作製される。ＡＡＶ血清型及びキャプシドタンパク質の更なる詳細は、以下に提供される。
【００１５】
本発明の第二の態様は、上記のＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶキャプシドを提供する。ＡＡＶキャプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質から構成され、ウイルスの遺伝物質を包含する（又は包み込む）タンパク質シェル（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓ
ｈｅｌｌ）である。
【００１６】
更に、上記のＡＡＶキャプシドタンパク質を含むウイルス粒子が提供される。ウイルス粒子は、ウイルスのＡＡＶキャプシド及び遺伝物質を含む。
【００１７】
本発明の第３の態様において、上記のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターが提供される。これは、ベクターが機能的キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有することを意味する。
【００１８】
好ましくは、ベクターは更にヌクレオチド配列が発現可能となるようにプロモーターを含む。好ましくは、ベクターは、多くの哺乳動物細胞種において構成的に活性型のＡＡＶ２ｐ４０ウイルスプロモーターを含む。
【００１９】
従って、本発明は、通常ヒトに感染する（例、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、及び６）又は霊長目動物に感染する（例、血清型１及び４）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく遺伝子送達ベクターを提供する。このウイルスについての更なる情報は、ＫｅｎｎｅｔｈＩ． Ｂｅｒｎｓ、“Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：ＴｈｅＶｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ
Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｃｈａｐｔｅｒ ６９ ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（３ｄ Ｅｄ．１９９６）に記載されている。
【００２０】
既知のＡＡＶ血清型のゲノム構成は全て、非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは、長さが約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の、直鎖状の一本鎖ＤＮＡ分子である。逆位末端反復配列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）（ＩＴＲ）は、非構造的な複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質についての固有のコードヌクレオチド配列に隣接する。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）がキャプシドを形成する。末端の１４５ｎｔは自己相補的であり、Ｔ字型ヘアピンを形成する、エネルギー的に安定な分子内二重鎖が形成され得るように構成される。これらのヘアピン構造は、細胞のＤＮＡポリメラーゼ複合体についてのプライマーとして機能し、ウイルスＤＮＡ複製のための起点としての役割を果たす。哺乳動物細胞における野生型（ｗｔ）ＡＡＶ感染に続いて、Ｒｅｐ遺伝子（即ち、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードする）が、それぞれＰ５プロモーター及びＰ１９プロモーターから発現し、両方のＲｅｐタンパク質が、ウイルスゲノムの複製における機能を有する。ＲｅｐＯＲＦにおけるスプライシングイベントは、実際に４つのＲｅｐタンパク質（即ち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）の発現をもたらす。しかし、哺乳動物細胞中の、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードする、スプライシングされていないｍＲＮＡが、ＡＡＶベクター産生にとっては十分であることが示されている。昆虫細胞においても、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質が、ＡＡＶベクター産生にとっては十分である。
【００２１】
遺伝子治療ベクターとして用いるのに好適なＡＡＶにおいて、ベクターゲノムは、典型的には、標的細胞へ送達するためにパッケージングされる目的の核酸を含む。この特定の実施形態によれば、核酸は、ベクターゲノムの両末端のウイルスＩＴＲの間に位置する。ＡＡＶゲノムが一つのＩＴＲのみで機能することは可能である。従って、ＡＡＶに基づく本発明の遺伝子治療ベクターにおいては、ベクターゲノムには、少なくとも１つのＩＴＲが隣接するが、より典型的には、２つのＡＡＶＩＴＲが（一般に、ベクターゲノムの両側、すなわち一つが５’末端、及び一つが３’末端に）隣接する。ベクターゲノム中の核酸と、１つ以上のＩＴＲとの間に、介在配列が存在し得る。
【００２２】
本発明の関係において、「少なくとも１つのＩＴＲ」は、「Ａ」、「Ｂ」及び「Ｃ」領域とも呼ばれる、ほぼ相補的な、対称的に配置された配列を含むパリンドローム配列を意味すると理解される。ＩＴＲは、複製起点、複製において「シス」の役割を有する部位（即ち、パリンドローム、及び該パリンドロームの内部の特定の配列を認識する、Ｒｅｐ７８（又はＲｅｐ６８）（例）等の、トランスに作用する複製タンパク質の認識部位）として機能する。ＩＴＲ配列の対称性の例外の１つは、ＩＴＲの「Ｄ」領域である。それは独特である（１つのＩＴＲ内に相補（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を有さない）。一本鎖ＤＮＡのニッキングは、Ａ領域とＤ領域との間の接続部で生じる。それは新しいＤＮＡ合成が開始する領域である。Ｄ領域は、通常、パリンドロームの一方の側に位置し、核酸複製工程に方向性をもたらす。哺乳動物細胞中で複製するＡＡＶは、典型的には２つのＩＴＲ配列を有する。しかし、結合部位がＡ領域の両方の鎖上にあり、及びＤ領域が対称的に、パリンドロームの各側に１つ存在するように、ＩＴＲを改変することが可能である。二本鎖環状ＤＮＡ鋳型（例、プラスミド）上では、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８が補助する核酸複製が、その場合、両方向に進行し、単一のＩＴＲが、環状ベクターのパルボウイルス複製にとっては十分である。従って、単一のＩＴＲヌクレオチド配列が、本発明の関係において用いられ得る。しかし、好ましくは、２つ又は別の偶数の正規のＩＴＲが用いられる。最も好ましくは、２つのＩＴＲ配列が用いられる。安全性の理由から、細胞への最初の導入後、更に増殖することができないＡＡＶベクターを構築することが望ましい場合がある。レシピエントにおける望ましくないベクター増殖を制限するかかる安全機構は、米国特許出願公開第２００３１４８５０６号に記載の通りのキメラＩＴＲを有するＡＡＶを用いることによって提供され得る。
【００２３】
当業者は、本発明のＡＡＶベクターを製造するために用いられるウイルスＲｅｐタンパク質（複数可）が、ウイルスＩＴＲのソースを考慮して選択され得ることを理解する。例えば、ＡＡＶ５ＩＴＲは、典型的には、ＡＡＶ５ Ｒｅｐタンパク質とより効率的に相互
作用するが、ＩＴＲとＲｅｐタンパク質（複数可）との血清型が一致する必要はない。
【００２４】
本発明において用いられるＩＴＲ（複数可）は、典型的には、機能的であり、即ち、それらは完全に解離可能であり得、ＡＡＶの配列であり、血清型１、２、３、４、５又は６が好ましい。本発明による解離可能なＡＡＶＩＴＲは、ＩＴＲが所望の機能、例えば、ウイルスパッケージング、組み込み、及び／又はプロウイルスレスキュー（ｐｒｏｖｉｒｕｓ ｒｅｓｃｕｅ）等を媒介する限り、野生型ＩＴＲ配列を有する必要はない（例、野生
型配列は、挿入、欠失、切断又はミスセンス変異により改変され得る）。
【００２５】
更に好ましい実施形態において、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子及びＡＡＶのｒｅｐ遺伝子は鋳型ゲノムから（従って、それから生産されるウイルス粒子ＤＮＡから）欠失される。この構成は、ＡＡＶキャプシドによって運搬され得る核酸配列（複数可）のサイズを最大にする。
【００２６】
ＡＡＶ遺伝子治療ベクターの製造のために、本発明において用いられ得るＡＡＶ配列は
、任意のＡＡＶ血清型のゲノムに由来し得る。一般に、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸レベルで顕著な相同性を有するゲノム配列を有し、一連の同一遺伝機能を提供し、物理的及び機能的に実質的同等であるウイルス粒子を産生し、実質的に同一のメカニズムによって複製及び集合する。様々なＡＡＶ血清型のゲノム配列及びゲノム類似性の概要については、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ８９７９０；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ０１９０１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０４３３０３；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６（例）を参照。ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８又は９が、本発明において用いられ得る。しかし、ＡＡＶ血清型１、５又は８が、本発明の関係において使用するための、ＡＡＶ配列の好ましいソースである。ＡＡＶ血清型由来の配列は、遺伝子治療ベクターの製造において用いられる場合、突然変異させられ得るか、又は改変され得る。
【００２７】
好ましくは、本発明の関係において使用するためのＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、
ＡＡＶ２、ＡＡＶ４及び／又はＡＡＶ６に由来する。同様に、Ｒｅｐ（Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）のコード配列は、好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４及び／又はＡＡＶ６に由来する。
【００２８】
ＡＡＶのＲｅｐ配列及びＩＴＲ配列は、大部分の血清型間で特に保存される。様々なＡＡＶ血清型のＲｅｐ７８タンパク質は、８９％超同一（例）であり、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ及びＡＡＶ６間のゲノムレベルでの全ヌクレオチド配列の同一性は約８２％である。更に、多くのＡＡＶ血清型のＲｅｐ配列及びＩＴＲが、哺乳動物細胞におけるＡＡＶ粒子の産生において、他の血清型由来の対応する配列を効率的に交差補完（即ち、機能的に置換）することが知られている。米国特許出願公開第２００３１４８５０６号は、ＡＡＶのＲｅｐ配列及びＩＴＲ配列が、昆虫細胞において、他のＡＡＶのＲｅｐ配列及びＩＴＲ配列を効率的に交差補完することも報告している。
【００２９】
ＡＡＶのＶＰタンパク質は、ＡＡＶウイルス粒子の細胞指向性を決定することが知られている。ＶＰタンパク質コード配列は、異なるＡＡＶ血清型間のＲｅｐタンパク質及び遺伝子よりも、保存具合が顕著に低い。Ｒｅｐ配列及びＩＴＲ配列が、他の血清型の対応する配列を交差補完する能力は、１つの血清型（例、ＡＡＶ１、５又は８）のキャプシドタンパク質と、別のＡＡＶ血清型（例、ＡＡＶ２）のＲｅｐ配列及び／又はＩＴＲ配列とを含むシュードタイプ化ＡＡＶ粒子の産生を可能にする。任意のＡＡＶ血清型のＲｅｐ配列及び／又はＩＴＲ配列が本発明の改変されたキャプシドタンパク質と共に用い得ることから、かかるシュードタイプ化ｒＡＡＶ粒子は本発明の一部である。
【００３０】
改変された「ＡＡＶ」配列は、本発明の関係において、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターの製造（例）においても用いられ得る。かかる改変配列としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９のＩＴＲ或いはＲｅｐに対し、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上のヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列の同一性を有する配列（例、約７５〜９９％のヌクレオチド配列同一性を有する配列）（例）が挙げられ、野生型ＡＡＶのＩＴＲ配列又はＲｅｐ配列の代わりに用いられ得る。
【００３１】
ＡＡＶ５は、多くの点で他のＡＡＶ血清型と類似しているが、他の既知のヒト及びサルの血清型にも増して、他のヒト及びサルのＡＡＶ血清型とは異なる。それを考慮すると、ｒＡＡＶ５の製造は、昆虫細胞における他の血清型の製造とは異なり得る。ｒＡＡＶ５を製造するために本発明の方法が用いられる場合、１つ以上のコンストラクトが、（１超のコンストラクトの場合はトータルで）ＡＡＶ５のＩＴＲを含むヌクレオチド配列、ＡＡＶ５のＲｅｐコード配列を含むヌクレオチド配列（即ち、ＡＡＶ５のＲｅｐ７８を含むヌクレオチド配列）を含むことが好ましい。かかるＩＴＲ配列及びＲｅｐ配列を所望により改
変して、ＡＡＶ５又はシュードタイプ化ＡＡＶ５ベクターの効率的製造を達成し得る。
【００３２】
最も適切なウイルス、ウイルスサブタイプ又はウイルス血清型を選択することは、当業者の技術的スキル（ｔｅｃｈｎｉｃａｌｓｋｉｌｌ）の範囲内である。いくつかのサブタイプ又は血清型は、特定のタイプの組織に対して、他のものよりも適切であり得る。
【００３３】
例えば、目的の核酸の肝臓特異的発現は、ＡＡＶが媒介する、肝臓細胞の形質導入によって都合よく誘導され得る。肝臓は、ＡＡＶが媒介する形質導入がしやすく、種々の血清型が用いられ得る（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５又はＡＡＶ８）。筋肉の形質導入は、核酸をコードするＡＡＶの、血流を介した投与によって達成され得る。従って、静脈内又は動脈内の投与が適用可能である。
【００３４】
好適には、本発明のベクターを用いることにより、より効果的な細胞形質導入が達成され得る。これは、肝臓細胞における場合に特に当てはまる。
【００３５】
従って、本発明のベクターは、肝臓細胞等の適切な細胞種に効果的に形質導入する遺伝子治療ベクター内の核酸を改変することによる、治療的ヌクレオチド配列をインビボ送達するための戦略の開発用ツールに相当する。
【００３６】
ベクターは、機能的な治療的タンパク質が発現することを可能にするための他の要素を含み得る。かかる要素は、当業者に周知である。
【００３７】
好ましくは、上記の核酸及びアミノ酸配列は単離される。
【００３８】
上記の核酸分子及びアミノ酸配列を製造することは、充分に当業者の能力の範囲内である。これは、例えば、ある特定の配列の化学合成を用いて行われ得る。
【００３９】
本発明はまた、組換えＡＡＶベクターを哺乳動物へ導入する工程を含む、目的の核酸を哺乳動物へ導入する方法であって、該組換えＡＡＶベクターが上記のキャプシドタンパク質を含むキャプシドに包含される目的の遺伝子を含む、方法に関する。
【００４０】
本発明はまた、上記のアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質又は上記のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００４１】
本明細書で用いられる場合、用語「宿主」は、本発明のタンパク質又はベクターを有する生物及び／又は細胞、並びに組換え遺伝子又はタンパク質の発現における使用に好適な生物及び／又は細胞を指す。本発明を任意の特定の種類の細胞又は生物に制限することは意図されていない。実際に、任意の好適な生物及び／又は細胞に、本発明における、宿主としての用途を見出すと考えられる。宿主細胞は、単一細胞、類似の又は異なる細胞の集団の形態、例えば、（液体培養物又は固体基質上の培養物等の）培養物、生物又はその一部の形態であり得る。
【００４２】
本発明による宿主細胞は、治療的核酸分子の発現を可能にし得る。従って、宿主細胞は、例えば、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物の細胞であり得る。
【００４３】
更に、本発明は、上記のアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質又は上記のベクターを含む細胞を含む、トランスジェニック動物を提供する。好ましくは、動物は非ヒト哺乳動物、特に霊長類である。或いは、動物は、げっ歯類、特にマウスであり得、又はイヌ、ネコ、ヒツジ若しくはブタであり得る。
【００４４】
一態様においては、本発明は、本発明のアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質又は本発明のベクター、及び１つ以上の医薬的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。１つ以上の賦形剤としては、担体、希釈剤及び／又は他の薬剤、医薬品又はアジュバントなどが挙げられる。
【００４５】
本発明の配列により達成されるより高いレベルの遺伝子導入は、本技術分野の現状を超える進歩を表すものである。効果における改善が観察されており、より低いベクター用量を用いた遺伝子導入が可能となるため、安全性（特に用量依存的な肝臓毒性の低減）が改善され、且つ、より低いコストで遺伝子導入が可能となる。従って、本発明の配列及びベクターは、とりわけ、先天性第ＶＩＩ因子欠乏症、ゴーシェ病、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（ＯＴＣ欠損症）、ファブリー病、グリコーゲン蓄積症、α−１−アンチトリプシン欠損症、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症、ウィルソン病、クリグラー・ナジャール（Ｃｒｉｇｌｅｒ−Ｎａｊｊａｒ）症候群及び肝細胞がん等の疾患に対して臨床適用性を有し得る。
【００４６】
従って、本発明は、上記に列挙された１以上の疾患を治療する方法であって、該疾患に罹患している患者に、上記の通りのベクターの治療有効量を投与することを含む、方法を提供し得る。好ましくは、患者はヒトである。
【００４７】
前記疾患が、上記方法で「治療」される場合、これは、前記疾患の１つ以上の症状が改善されることを意味する。それは、前記疾患の症状が、患者にもはや存在しないように、完全に治癒される（いくつかの方法においては、これがあてはまり得るのだが）ことを意味しない。治療方法は、前記疾患の１つ以上の症状を、治療前よりも重篤でなくする。
【００４８】
「治療有効量」は、所要の投与量で所要の期間に、所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。
【００４９】
さらに、本発明は、治療において使用するための上記した通りのキャプシドタンパク質、又は上記した通りのベクターを提供し、好ましくは先述した疾患の一つを治療するための上記した通りのキャプシドタンパク質、又は上記した通りのベクターを提供し得る。
【００５０】
加えて、本発明は、上記で言及した通りの疾患の一つを治療するための医薬の製造における、上記の通りのキャプシドタンパク質又は上記の通りのベクターの使用を提供し得る。
【００５１】
上記説明においては、用語「同一性」は、２つの配列の類似性を指すために用いられる。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するためには、配列が、最適な比較の目的のためにアラインメントされることが、本明細書で定められる（例、第２のアミノ酸配列との最適なアラインメントのために、アミノ酸の配列にギャップが導入され得る）。次いで、アミノ酸残基が比較される。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸又はアミノ酸残基によって占有される場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一位置の数の関数である（即ち、同一性％＝同一位置の数／位置（即ち、オーバーラップする位置（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）の総数）×１００）。好ましくは、２つの配列は同じ長さである。
【００５２】
配列比較は、比較される２つの配列の全長にわたって行われても、２つの配列の断片にわたって行われてもよい。典型的には、比較は、比較される２つの配列の全長にわたって行われる。しかし、配列同一性は、例えば、約２０、約５０、約１００、約２００、約５００、約１０００又は約２０００若しくはそれ以上の連続したアミノ酸残基の領域にわた
って行われ得る。
【００５３】
当業者は、２つの配列間の相同性又は同一性を決定するために、いくつかの異なるコンピュータプログラムが利用可能であるという事実を認識する。好ましい実施形態においては、２つの配列間の同一性は、ソフトウェアパッケージＣｌｏｎｅＭａｎａｇｅｒ Ｐｒ
ｏｆｅｓｓｉｏｎａｌｖｅｒｓｉｏｎ ９（好ましくは、ｖｅｒｓｉｏｎ９．４）を用い
て解析される。この解析ツールは、Ｓｃｉ−Ｅｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ ＆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，１１０１０Ｌａｋｅ Ｇｒｏｖｅ 
Ｂｌｖｄ，Ｓｔｅ １００，ＰＭＢ １２２，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ２７５６０，ＵＳＡ−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｄ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ）によって生産される。配列を比較するために使用される設定は、好ましくは、以下の通りである：アライメント：全体的なＤＮＡアライメント；パラメータ：両鎖；スコアリングマトリックス：リニアー（ミスマッチ２、オープンギャップ（ＯｐｅｎＧａｐ）４、エクステンションギャップ（ＥｘｔＧａｐ）１）。或いは、ＦａｓｔＳｃａｎ−ＭａｘＳｃｏｒｅ及びＦａｓｔ Ｓｃａｎ ＭａｘＱｕａｌ等の方法も、同じソフトウェア及びローカル設定で用いられ得る。
【００５４】
他の方法も、配列同一性を決定するために用いられ得る。例えば、２つのアミノ酸配列又は核酸配列間の同一性パーセントは、ＡｃｃｅｌｒｙｓＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／で入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄ Ｗｕｎｓ
ｃｈ（１９７０）のアルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、並びにギャップウェイト（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）１６、１
４、１２、１０、８、６又は４、及びレングスウェイト（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）
１、２、３、４、５、又は６を用いて決定され得る。
【００５５】
本明細書において引用される全ての特許及び参考文献（ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５６】
当業者は、本発明のすべての態様が、それらが例えば、アミノ酸、ウイルス粒子、ベクター、宿主細胞、又は使用に関係するか否かに関わらず、本発明の他のすべての態様に等しく適用可能であることを理解する。特に、治療方法の態様において、例えばベクターの投与は、本発明の他の態様（例えば、治療におけるベクターの使用に関する態様）のいくつかよりも詳細に記載されている場合がある。しかし、当業者は、本発明の特定の態様に関してより詳細な情報が与えられている場合、この情報は、一般に本発明の他の態様に等しく適用可能であることを理解する。更に、当業者は、治療方法に関する記載が、治療におけるベクターの使用に等しく適用可能であることも理解する。
【実施例】
【００５７】
実施例１
新規のハイブリッドキャプシドは、４つの異なるＡＡＶキャプシド（（１）ＡＡＶ８、（２）ＡＡＶ５、（３）ＡＡＶ３Ｂ及び（４）ＡＡＶ−ＬＫ０３）由来の様々なドメインを実験的に交換することにより作製した（図１参照）。後者は、現在利用可能な天然に生じるＡＡＶキャプシドよりも効率よくヒト肝細胞を形質導入できることが報告されている。注目すべきは、ＬＫ０３がＡＡＶ３Ｂと９５％を超えるアミノ酸配列相同性を有することである。本発明のキャプシドタンパク質は、血清型１−ｒｈ１０由来の野生型ＡＡＶキャプシド由来のモチーフを選択することにより開発された合成キャプシドである。ＬＫ０３のＶＰ２及びＶＰ３領域を、ＡＡＶ８及びＡＡＶ５由来の対応する領域で置換し、変異体Ａ（配列番号１）（ＭｕｔＡ）及び変異体Ｂ（配列番号２）（Ｍｕｔ Ｂ）をそれぞれ
作製した。変異体Ｃ（配列番号３）（Ｍｕｔ Ｃ）においては、ＡＡＶ３Ｂキャプシドの
ＶＰ２及びＶＰ３ドメインの上流に、ＡＡＶ８のＶＰ１領域を含む１４６アミノ酸の領域をクローニングした。同様に、変異体Ｄ（配列番号４）（ＭｕｔＤ）においては、ＡＡＶ５−ＶＰ１領域を、ＡＡＶ３ＢのＶ２及びＶ３領域の上流にクローニングした。変異体Ｅ（配列番号５）（ＭｕｔＥ）においては、ＡＡＶ８のドメインｖ−Ｉ、ｖ−ＩＩ及びｖ−ＩＸを、ＡＡＶ３Ｂ由来の同系（ｃｏｇｎａｔｅ）により置換した。変異体Ｆ（配列番号６）（ＭｕｔＦ）においては、ＡＡＶ３Ｂの肝細胞成長因子受容体結合部位を含有する２６２のアミノ酸領域をＡＡＶ８キャプシドの対応する領域へクローニングした。
【００５８】
合成キャプシドのＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の割合は、特に変異体Ｃ及び変異体Ｄにおいては、ＡＡＶ２、３ｂ、５又は８に見られる割合と同様である。変異体Ｃ及び変異体Ｄの両方ともヒト肝臓細胞に対して強い指向性を有しており、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８を含む野生型のＡＡＶキャプシドと比較した場合、これらの細胞への比較的高いレベルの遺伝子導入を媒介することができる。
【００５９】
オーバーラップＰＣＲにより、又は遺伝子合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ；Ｍｕｔ Ｃ、Ｍ
ｕｔ Ｅ及びＦ）により、キャプシド配列を構築又は作製した。改変された開始コドン（
ＡＴＧをＡＣＧへ）を有する、ＡＡＶ２のＲｅｐ７８をコードする配列を含有するＡＡＶヘルパープラスミドへ、キャプシド配列をクローニングした。ベクターストックは、ｐＣＭＶ−ｅＧＦＰ、ｐＲｅｐ２Ｃａｐ、及びアデノウイルスヘルパープラスミドであるｐＨＧＴＩで、ＨＥＫ２９３細胞を標準的なトリプルプラスミドトランスフェクションすることにより調製した。ベクターをイオジキサノールでの密度勾配遠心により精製した。ｅＧＦＰに特異的なプライマーによるＱＰＣＲにより、ベクターゲノムの力価を測定した。ハイブリッドＡＡＶベクターの収量は、ＡＡＶ８で以前に観察されていた収量と同程度であった。感染多重度（ＭＯＩ）を１×１０４及び１×１０５としてＨＵＨ７肝細胞がん細胞株を用いて、これらのハイブリッドキャプシドの遺伝子導入効率をインビトロで評価した。遺伝子導入のレベルを、フローサイトメトリーにより、レポーター遺伝子であるｅＧＦＰを検出することによって決定した。遺伝子導入の最も高いレベルは、変異体Ｃにより達成され、それはＡＡＶ８の少なくとも５倍高いレベルであった（図１Ｂ）。この変異体は、ＡＡＶ３Ｂ及び新規血清型ＬＫ０３と同程度のレベルの遺伝子導入を媒介した。変異体Ｄの遺伝子導入の効率は、変異体Ｃのそれよりは低かったが、親の血清型であるＡＡＶ５よりも３倍高かった。変異体Ｅ及びＦは、変異体Ｃと比較した場合、遺伝子導入は非常に低いレベルであり、野生型のＡＡＶ８及びＡＡＶ５で見られたのと類似するレベルのＧＦＰ陽性細胞であった。
【００６０】
実施例２
組換えＡＡＶベクターの製造。ＥＧＦＰ受容体遺伝子がＣＭＶプロモーターの制御下にあるベクタープラスミド、アデノウイルスヘルパープラスミド、及び、それぞれのＡＡＶ 
ｃａｐ遺伝子が内在性プロモーターの制御下にあるＡＡＶ２ Ｒｅｐ遺伝子の下流に存在
するパッケージングプラスミドからなるプラスミドの組合せで、接着性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をコトランスフェクションすることにより、ＡＡＶベクターを作製した。ＡＶＢカラムクロマトグラフィーを用いて、ベクターを精製した。全てのベクターの力価測定はｑＰＣＲアッセイ及びアルカリゲル解析により行った。
【００６１】
インビトロ形質導入。単層で生育させた肝臓がん細胞株を様々なＭＯＩにてＡＡＶで形質導入し、その後、フローサイトメトリーを用いて遺伝子導入後〜７２時間の時点で導入効率を評価した。
【００６２】
初代ヒト肝細胞をライフテクノロジーズより入手し、提供者の指示に従って培養下で維持した。次いで、それらをＣＭＶプロモーター下でＧＦＰをコードするＡＡＶに曝露した。遺伝子導入効率を３〜４日後にフローサイトメトリー又はダイレクト蛍光顕微鏡法（ｄ
ｉｒｅｃｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）のいずれかを用いて評価した。
【００６３】
カプセル化されたＨｅｐＧ２細胞（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ）の３Ｄ培養物を様々なＭＯＩのＡＡＶに曝露し、その後プレートリーダーを用いて緑色蛍光を定量化するか、又はダイレクト蛍光顕微鏡法により評価した。
【００６４】
抗ＡＡＶ抗体の力価。免疫吸着法を用いて、重篤な血友病患者から得られた血漿試料中の抗ＡＡＶ抗体の力価を評価した。抗ＡＡＶ抗体の力価は、平均吸光バックグラウンド値の５倍に等しい吸光値で補間された希釈度の逆数として定義される、エンドポイント力価（相対単位／ｍｌ）として表した。
【００６５】
ヒト肝臓細胞株及び初代ヒト肝細胞において他の血清型と比較したＡＡＶ変異体Ｃベクターの形質導入効率
集中的な研究において、Ｈｕｈ７（肝臓がん細胞株）及びＨｅｐＧ２細胞株（肝臓がん細胞株）におけるＡＡＶ８、ＡＡＶ５、ＡＡＶ−ｒｈ１０、ＡＡＶ−ＬＫ０３及びＡＡＶ
Ｍｕｔ Ｃのインビトロでの形質導入効率を比較した。全てのベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にある緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子を含有した。
【００６６】
ＡＡＶ８、ＡＡＶ５及びＡＡＶ−ｒｈ１０ベクターは、平均ＧＦＰ発現が１５％〜２６％の範囲であり、Ｈｕｈ７細胞の形質導入について比較的効率は良くなかった。比較して、ＡＡＶ−ＬＫ０３及びＭｕｔ Ｃでは、これらのキャプシドタンパク質でシュードタイ
プ化したベクターに関して形質導入効率が７０％に迫り、高いレベルの遺伝子導入が観察された（図２−Ａ）。Ｍｕｔ Ｃ及びＡＡＶ８の間の遺伝子導入効率における差は、極め
て有意であった（ｐ＝０．００１２）。
【００６７】
同様の結果がＨｅｐＧ２細胞株において得られ（図２−Ｂ）、ＨｅｐＧ２細胞をＡＡＶ
Ｍｕｔ Ｃ及びＡＡＶ−ＬＫ０３で形質導入した場合、ＭＯＩに関わらず、ＡＡＶ８及びＡＡＶ５と比較して、ほぼ１０倍高い遺伝子導入効率が観察された（Ｐ＝＜０．０５）。
【００６８】
次に、３人の異なるドナー由来の初代ヒト肝細胞の遺伝子導入効率を評価した。全てのドナーは男性であり、２名がコーカサス起源であり、１名がアフリカ系カリブ起源であった。これらのドナーの年齢は２１〜５２歳の範囲であった。初代肝細胞は、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＧＦＰをコードするベクターを用いて、１０６のＭＯＩでＡＡＶベクターに曝露された。形質導入効率を、遺伝子導入後４〜５日の時点で、蛍光顕微鏡法又はフローサイトメトリーにより評価した。図３に示されるように、ＡＡＶ Ｍｕｔ Ｃで達成される遺伝子導入効率（３２．０６±４％）は、ＡＡＶ８で達成されるそれ（７．３±７％）よりも、４倍を超えて高かった。ＡＡＶ Ｍｕｔ Ｃ及びＡＡＶ８群の間の、初代ヒト肝細胞の遺伝子導入効率における差は、極めて有意であった（１標本ｔ−検定を用いてｐ＝０．００１５）。ダイレクト蛍光イメージ解析により、ＡＡＶ Ｍｕｔ Ｃで形質導入された細胞における非常に高いレベルのＧＦＰ発現を示すフローサイトメトリーのデータの正当性が確認された（図３−Ｂ）。
【００６９】
本発明者らは、次に、アルギン酸塩中でカプセル化されたＨｅｐＧ２細胞の３Ｄ培養物への、ＡＡＶが媒介する遺伝子導入について検討した。ビーズ１ｍｌ当たりおよそ１．７Ｍの濃度でＨｅｐＧ２細胞を含有する、およそ５００μｍの球状ビーズを調製するために、ジェットカッター（ＪｅｔＣｕｔｔｅｒ）を使用した。このモデルの強みは、ビーズ内で、カプセル化された細胞が増殖し、良好な細胞間接触及び細胞機能を備えたコンパクトな細胞スフェロイド（ＡＥＬＳ）を形成することにある。ＡＥＬＳは、単層培養と比較し
て、より良好な増殖及びアップレギュレートされた肝臓特異的機能を示し、デスモソーム、タイトジャンクション、及び微絨毛を示す典型的な細胞構造、小胞体及びミトコンドリアの高表出、及び正常な肝臓におけるそれを連想させる細胞外マトリックスの生成を備える。
【００７０】
３Ｄビーズ培養物を、ＣＭＶ ＧＦＰ発現カセットを含有するベクターを用いて、１×
１０４又は１×１０５のＭＯＩで、ＡＡＶ８又はＡＡＶ Ｍｕｔ Ｃのいずれかで形質導入した。前述の通り、形質導入効率は、プレートリーダーを用いて緑色蛍光を定量化することにより（図４−Ａ）、又は、ダイレクト蛍光顕微鏡法により（図４−Ｂ）、決定した。ＡＡＶ８で形質導入されたビーズにおけるＧＦＰ発現と比較した場合、ＡＡＶ Ｍｕｔ Ｃでは、３〜５倍高い３Ｄスフェロイドの遺伝子導入効率が観察された。遺伝子導入効率におけるこの差は、ダイレクト蛍光顕微鏡法を用いても認められた。
【００７１】
重度血友病患者における変異体Ｃに対する既存抗体の評価
任意抽出の重度血友病患者由来の血漿試料をスクリーニングし、ＥＬＩＳＡ免疫吸着法を用いて、ＡＡＶ Ｍｕｔ Ｃに対する既存抗体の保有を評価した。６３％の患者は、ＡＡＶ Ｍｕｔ Ｃに対する検出可能な抗体を呈さなかった。ＡＡＶ８及びＡＡＶ−ＬＫ０３に関して、対応するレベルは５１％であった。従って、これはＡＡＶ Ｍｕｔ Ｃに対する抗体を有する重度の血友病患者が比較的少ないことを示唆している。
【図１】
2020096587.tif 000002
【図２−Ａ】
2020096587.tif 000003
【図２−Ｂ】
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【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
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【図４−Ａ】
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【図４−Ｂ】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月13日(2019.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３の配列に対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、配列番号３の配列に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する、請求項１記載のＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が、配列番号３の配列を含む、請求項１又は２記載のＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項４】
患者におけるＡＡＶキャプシドタンパク質に対する抗体の保有が、ＡＡＶ血清型８のＡＡＶキャプシドタンパク質に対してよりも低い、請求項１〜３のいずれか一項記載のＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項５】
ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ヒト肝臓細胞に対して強い指向性を有する、請求項１〜４のいずれか１項記載のＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のキャプシドタンパク質を含む、ＡＡＶキャプシド。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項記載のキャプシドタンパク質を含む、ウイルス粒子。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項記載のキャプシドタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項記載のキャプシドタンパク質、又は請求項８記載の核酸分子、及び１以上の医薬上許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項記載のキャプシドタンパク質、又は請求項８記載の核酸分子を含む、医薬組成物。