(57)【要約】【課題】抗がん剤の抗腫瘍効果を増強し、かつ抗がん剤投与に伴う副作用の低減効果を発揮するクルクミン類を用いる癌治療剤を提供する。【解決手段】クルクミン類の水溶性物質抱合体と、抗がん剤とを組み合わせたことを特徴とする非経口投与用癌治療剤等。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クルクミン類の水溶性物質抱合体を有効成分とすることを特徴とする非経口投与用癌治療剤。
【請求項２】
抗がん剤耐性がん用である請求項１記載の非経口投与用癌治療剤。
【請求項３】
クルクミン類の水溶性物質抱合体と抗がん剤とを組み合わせたことを特徴とする請求項１または２記載の癌治療剤。
【請求項４】
クルクミン類が、クルクミン及びその誘導体から選ばれる１種以上である請求項１〜３のいずれか１項に記載の癌治療剤。
【請求項５】
クルクミンの誘導体が、ビスデメトキシクルクミン、デメトキシクルクミン及びテトラヒドロクルクミンから選ばれる１種以上である請求項４記載の癌治療剤。
【請求項６】
抗がん剤が、白金製剤及び分子標的治療薬から選ばれる１種以上である請求項２〜５のいずれか１項記載の癌治療剤。
【請求項７】
前記白金製剤が、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン及びネダプラチンから選ばれる１種以上である請求項６記載の癌治療剤。
【請求項８】
前記白金製剤が、オキサリプラチンである請求項６記載の癌治療剤。
【請求項９】
前記水溶性物質が、グルクロン酸、硫酸、グルタチオン及びアミノ酸から選ばれる１種以上である請求項１〜８のいずれか１項記載の癌治療剤。
【請求項１０】
前記水溶性物質が、グルクロン酸及び硫酸から選ばれる１種以上である請求項１〜８のいずれか１項記載の癌治療剤。
【請求項１１】
前記クルクミン類の水溶性物質抱合体が、クルクミンモノグルクロニドである請求項１〜８のいずれか１項記載の癌治療剤。
【請求項１２】
前記クルクミン類の水溶性物質抱合体を、１日量として１０mg〜１０ｇ組み合わせるものである請求項１〜１１のいずれか１項記載の癌治療剤。
【請求項１３】
前記非経口投与が、静脈内投与又は皮下投与である請求項１〜１２のいずれか１項記載の癌治療剤。
【請求項１４】
さらに、免疫賦活剤及び／又は癌化学療法剤を組み合わせてなる請求項１〜１３のいずれか１項記載の癌治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非経口投与用癌治療剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療の一つとして抗がん剤やホルモン剤等の投与する化学療法等がある。この抗がん剤として、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗がん性抗生物質、微小管作用薬、低分子薬や抗体薬などの分子標的治療薬及び白金製剤等の約１００種類もの抗がん剤が開発されている。
白金製剤（プラチナ製剤）は、がん細胞のＤＮＡと結合することでＤＮＡの複製を阻害し、がん細胞の自滅（アポトーシス）を誘導することで抗腫瘍効果をあらわす薬剤で、小細胞肺がん、胃がん、非肺小細胞がん、尿路上皮がんなど数多くのがんに使用されている。
分子標的治療薬は標的タンパク質に結合してその働きを止めることで抗がん効果が発揮される。分子標的治療薬のなかでも低分子薬としては、チロシンキナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、未分化リンパ腫キナーゼ阻害薬、ヤヌスキナーゼ阻害薬、ＣＤＫ阻害薬、ＭＥＫ阻害薬、Ｒａｆキナーゼ阻害薬、ＰＡＲＰ阻害剤などがあり、白金製剤と同様に数多くのがんに使用されている。
多くの抗がん剤と同様、白金製剤や分子標的治療薬も、例えば、吐き気、嘔吐(おうと）、食欲不振、全身倦怠（けんたい）感、脱毛、発疹、ほてり、貧血などの副作用を有しており、腎障害、肝障害等のある患者への使用には注意が必要である。
第２、第３世代の白金製剤は副作用に関し一定の成果を提供するものの、副作用軽減はいまだ克服すべき重要な課題である。さらに、シスプラチン耐性がんの発現も、がん化学療法における大きな問題であり、既存の白金製剤が互いに交叉耐性を示すこともわかっている。
【０００３】
クルクミンは、近年、腫瘍形成阻害作用、抗酸化作用、抗炎症作用、コレステロール低下作用、抗アレルギー作用、脳疾患予防作用、心疾患予防治療作用等の薬理作用を有することが明らかとなり、食品（例えば、機能性食品など）、医薬品や化粧品等への利用が検討されている。
しかし、クルクミンは水難溶性であり、そのまま経口摂取しても体内にほとんど吸収されないことが知られている。また、経口摂取によってわずかに吸収されたクルクミンの大部分は、グルクロン酸及び／又は硫酸によって抱合化されたクルクミン抱合体として血中に存在し、遊離型のクルクミンは血中にわずかにしか存在していないことが示されている（非特許文献１）。
Ａ．Ｐａｌらは、インビトロで、クルクミン抱合体のＫＢＭ−５、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｕ２６６及びＡ５４９細胞株に対する細胞増殖抑制効果について調べ、遊離型クルクミンではこれら細胞の増殖を抑制する効果（抗癌作用）を認め、一方でクルクミン抱合体（クルクミンモノグルクロニド及びクルクミンジグルクロニド）では、このような効果がないことを示している（非特許文献２）。また、Ｓｈｏｊｉらは、経口投与で、クルクミン抱合体のヒト肝細胞癌細胞株（ＨｅｐＧ２細胞）に対する増殖抑制効果や遺伝子発現に及ぼす影響を調べたところ、遊離型クルクミンでは細胞増殖抑制効果を認めたが、クルクミン抱合体（クルクミンモノグルクロニド）では、その効果が認められず、また、遺伝子発現に及ぼす影響についても遊離型クルクミンと比べ、クルクミン抱合体（クルクミンモノグルクロニド）ではその作用が非常に低いことを示した（非特許文献３）。このように、抱合化されることでクルクミンが有する薬理作用が不活性化されると考えられている。
その一方、クルクミンを水溶性物質抱合体することにより、水難溶性なクルクミンの吸収性を改善した結果、クルクミンが有する薬理作用が十分に得られることが報告されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２０１６／１０４６５７号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１８／００３８５７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】恵ら，臨床化学，２００９，３８：５９−６８
【非特許文献２】Ａ．Ｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．，２０１４，２２（１），４３５−４３９
【非特許文献３】Ｍ．Ｓｈｏｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，１５１，１２６−１３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来、抗がん剤による抗腫瘍効果を増強し、抗がん剤による肝毒性の緩和効果を発揮し、またシスプラチン等の白金製剤耐性がんに対しても治療効果を発揮するクルクミン類を用いる癌治療剤については知られていない。
従って、本発明の課題は、抗腫瘍効果が増強され、かつ肝毒性が緩和された癌治療剤、また白金製剤耐性がん治療効果を有する癌治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者らは、抗がん剤の抗腫瘍効果を増強し、かつ抗がん剤投与に伴う副作用の低減効果を発揮する、また白金製剤耐性がん治療効果を発揮するクルクミン類を用いる癌治療剤を提供する手段について種々検討したところ、全く以外にも、抗がん剤とクルクミン類の水溶性物質抱合体との非経口投与用医薬とすれば、抗がん剤による抗腫瘍効果を増強し、同時に、抗がん剤による肝毒性の緩和効果を発揮すること、またクルクミン類の水溶性物質抱合体の非経口投与用医薬が単独で白金製剤耐性がんに対しても抗腫瘍効果を発揮しつつ肝毒性低減効果を示し、またクルクミン類の水溶性物質抱合体との併用効果を示すことを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、以下の[１]〜[１４]に関する。       
［１］  クルクミン類の水溶性物質抱合体を有効成分とすることを特徴とする非経口投与用癌治療剤。
［２］  抗がん剤耐性がん用である［１］記載の癌治療剤。
［３］  クルクミン類の水溶性物質抱合体と抗がん剤とを組み合わせたことを特徴とする［１］または［２］記載の癌治療剤。
［４］  クルクミン類が、クルクミン及びその誘導体から選ばれる１種以上である上記［１］〜［３］のいずれかに記載の癌治療剤。
［５］  クルクミンの誘導体が、ビスデメトキシクルクミン、デメトキシクルクミン及びテトラヒドロクルクミンから選ばれる１種以上である上記［４］記載の癌治療剤。
［６］  抗がん剤が、白金製剤及び分子標的治療薬から選ばれる１種以上である上記［２］  〜［５］のいずれかに記載の癌治療剤。
［７］  前記白金製剤が、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン及びネダプラチンから選ばれる１種以上である上記［６］記載の癌治療剤。
［８］  前記白金製剤が、オキサリプラチンである上記［６］記載の癌治療剤。
［９］  前記水溶性物質が、グルクロン酸、硫酸、グルタチオン及びアミノ酸から選ばれる１種以上である上記［１］〜［８］のいずれかに記載の癌治療剤。
［１０］  前記水溶性物質が、グルクロン酸及び硫酸から選ばれる１種以上である上記［１］〜［８］のいずれかに記載の癌治療剤。
［１１］  前記クルクミン類の水溶性物質抱合体が、クルクミンモノグルクロニドである上記［１］〜［８］のいずれかに記載の癌治療剤。
［１２］  前記クルクミン類の水溶性物質抱合体を、１日量として１０mg〜１０ｇ組み合わせるものである上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の癌治療剤。
［１３］  前記非経口投与が、静脈内投与又は皮下投与である上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の癌治療剤。
［１４］  さらに、免疫賦活剤及び／又は癌化学療法剤を組み合わせてなる上記［１］〜［１３］のいずれかに記載の癌治療剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のクルクミン類の水溶性物質抱合体を有効成分とすることを特徴とする非経口投与用癌治療剤は、後記実施例に示すように、例えば静脈内投与により、肝毒性を示すことなく抗がん剤並みの優れた抗腫瘍効果を、得ることができる。
さらに、本発明の抗がん剤耐性がん用の非経口投与用癌治療剤は単独で、肝毒性を示すことなく、抗がん剤耐性がんに対し、抗がん剤以上の抗腫瘍効果を得ることができる。
さらにまた、本発明のクルクミン類の水溶性物質抱合体と、抗がん剤とを組み合わせたことを特徴とする非経口投与用癌治療剤は、後記実施例に示すように、例えば静脈内投与により、抗がん剤の抗腫瘍効果の増強効果と、抗がん剤の肝毒性の緩和効果を得ることができる。
さらに、上記本発明のクルクミン類の水溶性物質抱合体により、この抱合体を有効成分とする肝機能改善剤を提供できる。またさらに、抗がん剤に起因する肝毒性の予防及び／又は治療のため、抗がん剤投与前、又は抗がん剤投与時に投与するための上記本発明のクルクミン類の水溶性物質抱合体を有効成分とする医薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】クルクミン抱合体、及びクルクミン抱合体とオキサリプラチンとの静脈投与による抗腫瘍効果（腫瘍サイズの評価結果）を示す。
【図２】クルクミン抱合体、及びクルクミン抱合体とオキサリプラチンとの静脈投与による肝毒性の緩和効果（肝機能の改善効果）（図２（ａ）ＡＬＴ、図２（ｂ）ＡＳＴの測定結果）を示す。
【図３】ダブル変異株担癌マウスにおけるクルクミン抱合体の腹腔内投与による抗腫瘍効果（腫瘍サイズの評価結果）、及びクルクミン抱合体とオキサリプラチンとの腹腔内投与による抗腫瘍効果（腫瘍サイズの評価結果）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
クルクミンは、ウコン色素に含まれるクルクミノイドの主成分であり、下記構造式（１）で表される化合物である。 
【００１２】
【化１】
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【００１３】
本発明のクルクミン類は、クルクミン及びその誘導体から選ばれる１種以上である。クルクミンの誘導体としては、ビスデメトキシクルクミン、デメトキシクルクミン及びテトラヒドロクルクミンが挙げられる。
本発明においてクルクミンは、化学合成されたクルクミンを用いてもよいし、ウコン色素として流通しているものを用いてもよい。ウコン色素としては、ショウガ科ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ  ＬＩＮＮＥ）の根茎の乾燥物を粉末にしたウコン末、該ウコン末を適当な溶媒（例えば、エタノール、油脂、プロピレングリコール、ヘキサン、アセトンなど）を用いて抽出して得られる粗製クルクミン或いはオレオレジン（ターメリックオレオレジン）、及び精製したクルクミンを挙げることができる。
なお、クルクミンには、互変異性体であるケト型及びエノール型のいずれも含まれる。
【００１４】
本発明のクルクミン類の水溶性物質抱合体の水溶性物質としては、グルクロン酸、硫酸、グルタチオン及びアミノ酸から選ばれる１種以上が挙げられる。アミノ酸としては、生体内に存在するアミノ酸、例えば必須アミノ酸が挙げられる。クルクミン類の水溶性物質抱合体は、遊離型クルクミンの血中濃度を高い値で維持することができる。これにより、クルクミンが有する薬理作用が十分に得られ、またクルクミン抱合体はクルクミンの生体内代謝産物であることから、安全性が非常に高いので好ましい。
【００１５】
クルクミン抱合体におけるクルクミンと前記水溶性物質との結合モル比は、抗腫瘍効果の増強効果及び肝毒性の緩和効果の点から、クルクミン：水溶性物質＝１：１〜１：３であるのが好ましく、１：１〜１：２がより好ましく、１：１がさらに好ましい。 
【００１６】
クルクミンと前記水溶性物質の抱合形態（結合形態）は、例えば次の式（２）の形態である。 
【００１７】
【化２】
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（式中、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方は前記水溶性物質の残基であり、残余は水素原子である。） 
【００１８】
前記式（２）中、Ｒ１及びＲ２の一方又は両方はグルクロン酸残基又は硫酸残基が好ましく、残余は水素原子が好ましい。 
クルクミンの水溶性物質抱合体は、前記特許文献２記載の方法によって製造することができる。
【００１９】
本発明において、クルクミン類の水溶性物質抱合体と組み合わせて用いられる抗がん剤としては、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗がん性抗生物質、微小管作用薬、低分子薬や抗体薬などの分子標的治療薬及び白金製剤等が挙げられる。これらのなかでも白金製剤、分子標的治療薬が好ましい。
白金製剤としては、例えばオキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン及びネダプラチンから選ばれる１種以上を挙げることができる。これらのなかでも、オキサリプラチンが好ましい。
分子標的治療薬としては、ゲフィチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤、ボルテゾミブやカルフィルゾミブなどのプロテアソーム阻害剤、クリゾチニブなどの未分化リンパ腫キナーゼ阻害薬、トファシチニブなどのヤヌスキナーゼ阻害薬、パルボシクリブなどのＣＤＫ阻害薬、トラメチニブなどのＭＥＫ阻害薬、ソラフェニブなどのＲａｆキナーゼ阻害薬、オラパリブなどのＰＡＲＰ阻害剤などが挙げられ、なかでも、例えばボルテゾミブやカルフィルゾミブなどのプロテアソーム阻害剤が好ましい。
【００２０】
本発明のクルクミン類の水溶性物質抱合体と抗がん剤との好適な組合せとしては、「クルクミン類の水溶性物質抱合体」がクルクミン類と水溶性物質としてのグルクロン酸及び硫酸から選ばれる１種以上であり、なかでも特にクルクミン類の水溶性物質抱合体がクルクミンモノグルクロニドであり、これらそれぞれの好適な場合において、「抗がん剤」が白金製剤である場合が好ましく、なかでも白金製剤がオキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン及びネダプラチンから選ばれる１種以上である場合が好ましく、なかでも特に白金製剤がオキサリプラチンである組合せが、抗腫瘍の増強効果と共に、ＡＬＴ及びＡＳＴ値の回復に見られるような抗がん剤による肝毒性の緩和効果に優れている、すなわち肝機能の改善効果に優れるので好ましい。
本発明の癌治療剤は、クルクミン類の水溶性物質抱合体を有効成分とし、かつ抗がん剤耐性がん用の非経口投与用癌治療剤とすることができるが、その場合の抗がん剤としては、上記に例示した抗がん剤、これらのなかでも白金製剤、中でも特にオキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン及びネダプラチンから選ばれる１種以上である場合が好ましく、さらには特に白金製剤がオキサリプラチンである場合が好ましい。
【００２１】
本発明のクルクミン類の水溶性物質抱合体、及びクルクミン類の水溶性物質抱合体と抗がん剤を組み合わせた非経口投与用癌治療剤の形態としては、非経口的に投与されるものであれば限定されないが、特に注射剤（注射用組成物）が好ましい。注射用組成物としては、静脈内投与用組成物、皮下投与用組成物が好ましいものとして挙げられるが、なかでも静脈内投与用組成物がより好ましい。 
【００２２】
本発明の癌治療剤中のクルクミンの水溶性物質抱合体の含有量は、腫瘍効果の増強対象・肝毒性の緩和ないし肝機能の改善対象となる抗がん剤の種類、患者の性別、年齢、症状などに応じて適宜決定されるため、一概に決定することはできないが、例えば、１〜１００質量％が好ましく、５〜１００質量％がより好ましく、１０〜１００質量％がさらに好ましい。 
【００２３】
本発明の癌治療剤には、前記有効成分の他、水、生理食塩水、ｐＨ調整剤、糖類、酸、アルカリ、緩衝剤、等張化剤、安定剤、無痛化剤、防腐剤等を配合することができる。 
ここで糖類としては、単糖類、二糖類、三糖類、多糖類、糖アルコール等が挙げられる。酸、アルカリとしては、水溶性無機酸、水溶性無機酸塩、水溶性有機酸、水溶性有機酸塩、アミノ酸、アミノ酸塩等が挙げられる。 
また、本発明の癌治療剤の形態は、用時溶解型の粉末充填剤（結晶又は凍結乾燥品）でもよいし、水溶液の形態でもよい。 
【００２４】
本発明の癌治療剤におけるクルクミン類の水溶性物質抱合体、及びクルクミン類の水溶性物質抱合体と抗がん剤の投与タイミングについては特に制限されない。クルクミン類の水溶性物質抱合体と抗がん剤を組み合わせる場合の投与タイミングとしては、クルクミン類の水溶性物質抱合体の投与は、腫瘍効果の増強対象となる抗がん剤の投与と同時又はその前後２４時間以内であればよく、抗がん剤の投与と同時又はその前後１２時間以内が好ましく、抗がん剤の投与と同時又はその前後８時間以内が更に好ましい。抗がん剤の投与前にクルクミン類の水溶性物質抱合体を投与する場合には予防的投与となり、抗がん剤を投与した後に投与する場合には治療的投与となる。なかでも抗がん剤を投与した後に投与することが好ましい。また、別の態様として、抗がん剤を投与する前に投与することが好ましい場合もある。さらに、同時に投与することもできる。抗がん剤の投与と同時にクルクミン類の水溶性物質抱合体を投与することは好ましい予防的投与の態様の一つであり、同時投与の間に水溶性物質抱合体を投与することは好ましい治療的投与の態様の一つである。
あるいは、本発明の癌治療剤は、クルクミン類の水溶性物質抱合体と抗がん剤とを別製剤として同一の又は別個の投与方法で投与して癌を治療する場合に使用することもでき、クルクミン類の水溶性物質抱合体と抗がん剤を同一製剤中に含むこともできる。
【００２５】
本発明の癌治療剤が適用対象となる癌は、特に限定されないが、例えば頭頚部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、胆道癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮体癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣腫瘍、骨・軟部肉腫、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、皮膚癌、中皮腫等が挙げられる。また、本発明の癌治療剤は、種々の抗がん剤耐性を有する癌に対して有効である。それらの抗がん剤耐性の癌としては、白金製剤耐性の癌、分子標的治療薬耐性の癌が挙げられる。
【００２６】
本発明の癌治療剤には、さらに免疫賦活剤及び／又は癌化学療法剤を組み合わせることができる。
そのような免疫賦活剤としては、例えば、各種サイトカインや腫瘍抗原などが挙げられる。免疫反応を刺激するサイトカインとしては、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、インターフェロン−α、β、γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−１２などが挙げられる。また、Ｂ７リガンド誘導体、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体も免疫反応を高めることができる。
癌化学療法剤としては、例えば、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物由来アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤、その他免疫療法剤またはその他の抗癌剤が挙げられる。
【００２７】
本発明の癌治療剤が、クルクミン類の水溶性物質抱合体を有効成分として、抗がん剤耐性がん用の非経口投与用癌治療剤である場合、これにさらに抗がん剤を組み合わせた癌治療剤とすることができるが、クルクミン類の水溶性物質抱合体単独の抗腫瘍効果の増強効果のみならず、抗がん剤の肝毒性の緩和効果を得ることができるので好ましい。このような抗がん剤としては、上記と同様に各種の抗がん剤を挙げることができるが、なかでも白金製剤が好ましく、より好ましくは、例えばオキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン及びネダプラチンから選ばれる１種以上の白金製剤、特に好ましくは、オキサリプラチンを挙げることができる。
【実施例】
【００２８】
次に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は下記に説明する特定の態様に限定されることはない。 
【００２９】
製造例１
（クルクミン抱合体（クルクミンモノグルクロニド）の調製方法）
ＷＯ２０１８／０３８５７号公報記載の方法に従って、クルクミンモノグルクロニドを合成した。すなわち、アセトブロモ−α−Ｄ−グルクロン酸メチルエステルとバニリンを原料として得られた化合物と、２，４−ペンタジオンとバニリンを原料として得られた化合物とを反応させて得られた化合物の脱アセチル化・精製によりクルクミンモノグルクロニドを得た。
【００３０】
評価方法１
（抗腫瘍効果の試験方法）
（１）供試動物
５週齢のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮｃｒ  ｊ−ｎｕ／ｎｕ（ホモ）マウス（雌性、体重約１５〜１９ｇ、日本チャールス・リバー社）を約１０日環境馴化させたものを用いる。 
（２）移植方法
成人男性ヒト結腸由来結腸直腸癌細胞ＨＣＴ１１６（ＫＲＡＳ／変異及びｐ５３／野生型）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２４７）４×１０６個を供試動物の側腹部の皮下に２７Ｇ注射針を用いて移植する。 
なお、抗がん剤耐性細胞による評価においては、親株の成人男性ヒト結腸由来結腸直腸癌細胞ＨＣＴ１１６（ＫＲＡＳ／変異及びｐ５３／野生型）のＫＲＡＳ／変異は変わらずｐ５３をノックアウトしたダブル変異株細胞を用いる。
（３）投与方法
前記（２）の癌細胞が接種されたマウスに、接種開始０、３、５、７、１０、１２、１４、１７、１９及び２１日後、適宜調製した被験物質を投与するとともに、経日的にマウスの腫瘍サイズを調べる。
（４）腫瘍サイズの評価法
腫瘍サイズは、接種開始０、４、７、１１、１４、１８及び２１日後にノギスを用いて腫瘍の長さ及び幅を測定し、次式によって算出する。
腫瘍サイズ（ｍｍ３）＝長さ×幅２×０．５ 
【００３１】
評価方法２
（肝機能（ＡＬＴ・ＡＳＴ）の試験方法）
マウス観察期間終了後（投与開始１４日後）にマウスを４時間以上絶食させ、このマウスをペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与による麻酔下で開腹し、腹大動脈から採血（採血量は０．６ｍＬ以上）した。次いで、この採血した血液をヘパリンナトリウムによって抗凝固処理した後、遠心分離（４℃、３０００ｒｐｍ、１０分間）することで得た血漿について、該血漿中に含まれるトランスアミナーゼ（ＡＳＴ及びＡＬＴ）を測定する。
【００３２】
実施例１〜２及び比較例１〜２
（クルクミン抱合体とオキサリプラチン及びその併用による抗腫瘍効果）
（１）被験物質の投与
前記抗腫瘍効果の試験方法に従い、癌細胞を移植したマウスに、（ｉ）抗がん剤としてのオキサリプラチン（シグマ  アルドリッチ社製）及び製造例１で得られたクルクミン水溶性物質抱合体であるクルクミンモノグルクロナイド（ＣＭＧ）の組み合わせ（実施例１）、（ｉｉ）抗がん剤オキサリプラチン単独（比較例１）、（ｉｉｉ）クルクミン（和光純薬社製）単独（比較例２）、（ｉｖ）ＣＭＧ単独（実施例２）の各被験物質の生理食塩水溶液を調製し、表１記載の投与量と投与頻度でマウスに投与した。なお、対照例（コントロール）には生理食塩水を表１記載のとおり用いた。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
（２）腫瘍サイズの評価
接種開始０〜２１日後の間の腫瘍サイズの測定結果を図１に示す。
クルクミンモノグルクロニド単独（実施例２）及びオキサリプラチン単独（比較例１）は同程度の抗腫瘍効果を示した。また、クルクミン単独（比較例２）の抗腫瘍効果は小さかった。
これらに対し、それらの併用（実施例１）では抗腫瘍の増幅効果が見られた。
抗腫瘍効果は、対照群に対して比較例１、及び実施例１、実施例２は有意に腫瘍の抑制が見られた（ｐ＜０．０５）。また、比較例１に対して実施例１は有意に腫瘍の抑制が見られた（ｐ＜０．０５）。
【００３５】
（３）肝毒性の緩和効果（肝機能の改善効果）の評価
前記肝機能の試験方法に従って、接種開始２１日後のＡＬＴ、ＡＳＴを測定した（図２(ａ)及び（ｂ））。
クルクミンモノグルクロニド単独（実施例２）及びオキサリプラチン単独（比較例１）は同程度の抗腫瘍効果であったが、一方でオキサリプラチンは肝毒性を示し、クルクミンモノグルクロニドは肝毒性が認められなかった。併用（実施例１）ではＡＬＴ値が回復しており、クルクミンモノグルクロニドはオキサリプラチンによる肝毒性を緩和することが示された（図２（ａ））。
ＡＳＴに関してもＡＬＴと同様に、クルクミンモノグルクロニド単独（実施例２）及びオキサリプラチン単独（比較例１）は同程度の抗腫瘍効果であったが、一方でオキサリプラチンは肝毒性を示し、クルクミンモノグルクロニドは肝毒性が認められなかった。併用（実施例１）ではＡＳＴ値が回復しており、クルクミンモノグルクロニドはオキサリプラチンによる肝毒性を緩和することが示された（図２（ｂ））。
【００３６】
実施例３〜４及び比較例３
（ダブル変異株担癌マウスにおけるクルクミン抱合体とオキサリプラチンの単独投与とその併用による抗腫瘍効果）
前記ダブル変異株を用いる以外は実施例１〜２、比較例１〜２と同様にして、表２記載の投与量と投与頻度でマウスに投与した。なお、対照例（コントロール）には生理食塩水を表２記載のとおり用いた。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
腫瘍サイズの評価結果を、図３に示した。オキサリプラチン単独（比較例３）ではほとんど抗腫瘍効果を示さないのに対し、クルクミンモノグルクロニド単独（実施例４）で有意な抗腫瘍効果が認められた（ｐ＜０．０５）。また、併用（実施例３）により、有意な抗腫瘍増強効果が見られた（ｐ＜０．０５）。クルクミンモノグルクロニド単独（実施例４）の肝毒性は見られず、オキサリプラチン単独（比較例３）では肝毒性が顕著に見られた。併用（実施例３）ではＡＳＴ値が回復しており、クルクミンモノグルクロニドはオキサリプラチンによる肝毒性を緩和することが示された（ｐ＜０．０５）。ＡＬＴに関してもＡＳＴと同様に、クルクミンモノグルクロニドはオキサリプラチンによる肝毒性を緩和することが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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