(57)【要約】      （修正有）【課題】生体試料中に存在する亜鉛濃度を、キレート剤を用いることなく測定する方法、及び、該方法のための試薬を含むキットの提供。【解決手段】（１）生体採取試料に該生体採取試料内に存在しない亜鉛要求性酵素を加えるステップ、（２）さらに該亜鉛要求性酵素の基質を加え、該亜鉛要求性酵素を反応させるステップ、（３）該酵素反応物を検出定量するステップ、及び、（４）得られた結果から、該生体試料中の亜鉛濃度を決定するステップを含み、前記亜鉛要求性酵素が、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸デアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．８１）である、生体試料中の亜鉛濃度測定方法［（１）及び（２）は同時または連続してでもよい］。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）生体採取試料に該生体採取試料内に存在しない亜鉛要求性酵素を加えるステップ、
（２）さらに該亜鉛要求性酵素の基質を加え、該亜鉛要求性酵素を反応させるステップ、
（３）該酵素反応物を検出定量するステップ及び
（４）得られた結果から、該生体試料中の亜鉛濃度を決定するステップ
を含む、生体試料中の亜鉛濃度測定方法
［ここでステップ（１）及び（２）は同時または連続してでもよい］。
【請求項２】
生体採取試料が血清又は血漿である、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記亜鉛要求性酵素がアミノアシラーゼである請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記アミノアシラーゼがＤ−アミノアシラーゼ（ＤＡＡ）である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記基質がＮ−アシルＤ−アミノ酸である、請求項４に記載の測定方法。
【請求項６】
前記Ｎ−アシルＤ−アミノ酸がアセチルＤ−アミノ酸である、請求項５に記載の測定方法。
【請求項７】
前記アセチルＤ−アミノ酸が、アセチルＤ−フェニルアラニン（Ａｃ―Ｄ−Ｐｈｅ）、アセチルＤ−メチオニン（Ａｃ―Ｄ−Ｍｅｔ）、アセチルＤ−ロイシン（Ａｃ―Ｄ−Ｌｅｕ）、及びアセチルＤ−バリン（Ａｃ―Ｄ−Ｖａｌ）からなる群から選択されるアセチルＤ−アミノ酸である、請求項６に記載の測定方法。
【請求項８】
前記酵素反応物がＤ−アミノ酸である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素反応物がＤ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｄ−Ｌｅｕ及びＤ−Ｖａｌからなる群から選択されるＤ−アミノ酸である、請求項７に記載の測定方法。
【請求項１０】
前記ステップ（３）が、さらに
（３−１）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）を加え、Ｄ−アミノ酸を脱アミノ化し、α―ケト酸とアンモニア、及び過酸化水素を得るステップ；ならびに
（３−２）得られた過酸化水素の量から前記酵素反応物を検出定量するステップを含む、請求項８又は９に記載の測定方法。
【請求項１１】
前記ステップ（３−２）がペルオキシダーゼとペルオキシダーゼ発色基質（色原体）を用いて、生成する色素の発色の検出を含む、請求項１０に記載の測定方法。
【請求項１２】
前記ペルオキシダーゼ発色基質（色原体）が、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）と３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）とからなる発色基質（色原体）である請求項１１に記載の測定方法。
【請求項１３】
色素の発色の検出を測定波長５４６ｎｍ〜７００ｎｍの吸光度にて行う請求項１２に記載の測定方法。
【請求項１４】
前記ステップ（３）が、さらに
（３−１）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）を加え、Ｄ−アミノ酸を脱アミノ化し、α―ケト酸とアンモニア、及び過酸化水素を得るステップ；ならびに
（３−２）得られたα―ケト酸の量から前記酵素反応物を検出定量するステップを含む、請求項８または９に記載の測定方法。
【請求項１５】
前記ステップ（３）が、さらに
（３−１）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）を加え、Ｄ−アミノ酸を脱アミノ化し、α―ケト酸とアンモニア、及び過酸化水素を得るステップ；ならびに
（３−２）得られたアンモニアの量から前記酵素反応物を検出定量するステップを含む、請求項８または９に記載の測定方法。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の測定方法に使用するためのキットであって、亜鉛要求性酵素とその基質を含むキット。
【請求項１７】
請求項１０から１５のいずれか一項に記載の測定方法に使用するためのキットであって、亜鉛要求性酵素であるＤ−アミノアシラーゼ、その基質であるＮ−アシルＤ−アミノ酸、ならびにＤ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）を含むキット。
【請求項１８】
請求項１１に記載の測定方法に使用するためのキットであって、亜鉛要求性酵素であるＤ−アミノアシラーゼ、その基質であるＮ−アシルＤ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）ならびにペルオキシダーゼとペルオキシダーゼ発色基質を含むキット。
【請求項１９】
請求項１２又は１３に記載の測定方法に使用するためのキットであって、亜鉛要求性酵素であるＤ−アミノアシラーゼ、その基質であるＮ−アシルＤ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）ならびにペルオキシダーゼと、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）と３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸  （ＨＴＩＢ）とからなる発色基質（色原体）であるペルオキシダーゼ発色基質を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中の亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）の酵素的定量方法及びそのための試薬に関する。更に、本発明には、該測定方法より得られた値を用いた、対象の診断方法も含まれる。
【背景技術】
【０００２】
地球上の生物はその重量の９５％以上を主要元素である酸素（Ｏ）、炭素（Ｃ）、水素（Ｈ）、窒素（Ｎ）の４元素で構成しており、残りの５％未満が準主要元素であるナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、塩素（Ｃｌ）、リン（Ｐ）及び硫黄（Ｓ）で構成されている。それ以外の元素は全部合わせても生体重量の０．０２％を占めるにすぎず、微量元素（ＴｒａｃｅＥｌｅｍｅｍｅｎｔｓ）と呼ばれている。これらの微量元素のうち生体に必須の元素として鉄（Ｆｅ）、亜鉛（Ｚｎ）、銅（Ｃｕ）、セレン（Ｓｅ）、ヨウ素（Ｉ）、コバルト（Ｃｏ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、モリブデン（Ｍｏ）が確認されている。これらは生体内で生命維持に必要な酵素あるいはタンパク質の構成成分であることが確認されている（非特許文献１〜３）。
【０００３】
従って、微量であるとはいえ、これらの生体内の存在量の過不足は生体に様々な症状疾患を引き起こす。鉄（Ｆｅ）であれば、不足していれば貧血を引き起こし、過剰であればフェントン反応を通じて、ヒドロキシラジカルのような活性酸素を発生させ、発生した活性酸素を通じて間接的に細胞のタンパク質やＤＮＡを損傷させる。活性酸素が各臓器を攻撃し、肝臓には肝炎、肝硬変、肝臓がんを、膵臓には糖尿病、膵臓癌を、心臓には心不全等を引き起こす。
【０００４】
亜鉛も２００種以上の金属酵素（亜鉛要求性酵素）が活性を有するために必須の微量元素であり、不足した場合は食欲不振、発育障害、皮膚異常、性成熟障害、免疫不全、味覚異常、脱毛などを引き起こし、逆に亜鉛は消化管からの吸収において銅と競合するため、亜鉛を長期に渡って摂りすぎると銅欠乏を生じさせる。
【０００５】
従ってこれらの微量元素の生体試料内の濃度を測定することは、医療の現場において不可欠な診断方法の一助である。
【０００６】
これらの微量元素は生体内で大半がカチオンイオンの形で存在するため、各々の微量元素特異的なキレート剤を用いた比色定量法が用いられている。鉄の場合は、２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フェノール（Ｎｉｔｒｏｓｏ−ＰＳＡＰ）、亜鉛の場合は２−（５−ブロモ−２−ピリジラゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フェノール（５−Ｂｒ−ＰＡＰＳ）などが多用されているが、これらの比色定量法が正確に微量元素を測定するためには、除タンパク処理や、他のイオンの反応系からマスキングを前処理として必要とする。
【０００７】
鉄はその貯蔵タンパク質として生体内でアポフェリチンと結合して、フェリチン（ｆｅｒｒｉｔｉｎ）を形成している。また血清中を輸送される際は、トランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）と特異的に結合している。これらのタンパク質との複合体の量は生体内の鉄存在量と極めて高い相関関係を有しているので、これらの複合体を測定することにより、間接的に生体内の鉄を計測することが可能である。
【０００８】
それに対して、亜鉛は鉄のように貯蔵や輸送を特異的に行うために機能する生体内のタンパク質は存在しておらず、アルブミンやα２−マクログロブリンと非特異的に結合して存在している。一方、生体中には活性を保つのに亜鉛イオンを必要とする、亜鉛要求性酵素が存在している。カルボキシペプチターゼ、アミノペプチターゼ、アルコール脱水素酵素、アルコールホスファターゼ、スーパーオキシドジムスターゼ、アンジオテンシン変換酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、コラゲナーゼ、デルタアミノレブリン酸脱水酵素、プロテインキナーゼＣ、ホスホリパーゼＣ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、ヌクレオチドホスホリラーゼなどが亜鉛要求性酵素として知られている。
それら内在性の酵素の活性は、亜鉛欠乏時には低下することが知られており、内在性のアルカリフォスファターゼやアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の活性を計測することにより間接的に亜鉛濃度を計測する方法も模索されている（非特許文献４及び５）。しかしながら、この方法は試料中の対象（患者）依存的な元々の酵素の発現存在量、及び採取後の試料内での酵素の自然分解の影響を受け、客観的な基準を決めるのは難しい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｚｉｎｃ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．  ＫｉｎｇＪＣ．Ｊ  Ｎｕｔｒ．２０００
【非特許文献２】Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌｓ  ａｎｄ  ｂｒａｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｔａｋｅｄａ  Ａ．  Ｙａｋｕｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ．２００４
【非特許文献３】Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｔａｌ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｋａｍｂｅ  Ｔ．  Ｇｅｎｅｓｉｓ．２００８
【非特許文献４】Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ４１：１２１４−９，１９８５
【非特許文献５】Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．Ａｐｒ；３１（４）：５８１−４，１９８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本願発明は採取試料の亜鉛濃度を、キレート剤を用いることなく、決定することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意研究した結果、外部より特定の亜鉛要求性酵素を加え、その酵素活性を計測することにより定量的に試料内の亜鉛濃度を決定できることを新たに見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
即ち、本発明の構成は以下の［１］から［１９］の通りである。
［１］（１）生体採取試料に該生体採取試料内に存在しない亜鉛要求性酵素を加えるステップ、
（２）さらに該亜鉛要求性酵素の基質を加え、該亜鉛要求性酵素を反応させるステップ、
（３）該酵素反応物を検出定量するステップ及び
（４）得られた結果から、該生体試料中の亜鉛濃度を決定するステップ
を含む、生体試料中の亜鉛濃度測定方法
＜ここでステップ（１）及び（２）は同時または連続してでもよい＞；
［２］生体採取試料が血清又は血漿である、上記［１］に記載の測定方法。
【００１３】
［３］前記亜鉛要求性酵素がアミノアシラーゼである上記［１］又は［２］に記載の測定方法；
［４］前記アミノアシラーゼがＤ−アミノアシラーゼ（ＤＡＡ）である上記［３］に記載の方法。
【００１４】
［５］前記基質がＮ−アシルＤ−アミノ酸である、上記［４］に記載の測定方法；
［６］前記Ｎ−アシルＤ−アミノ酸がアセチルＤ−アミノ酸である、上記［５］に記載の測定方法；
［７］前記アセチルＤ−アミノ酸が、アセチルＤ−フェニルアラニン（Ａｃ―Ｄ−Ｐｈｅ）、アセチルＤ−メチオニン（Ａｃ―Ｄ−Ｍｅｔ）、アセチルＤ−ロイシン（Ａｃ―Ｄ−Ｌｅｕ）、及びアセチルＤ−バリン（Ａｃ―Ｄ−Ｖａｌ）からなる群から選択されるアセチルＤ−アミノ酸である、上記［６］に記載の測定方法。
【００１５】
［８］前記酵素反応物がＤ−アミノ酸である、上記［５］又は［６］に記載の方法；
［９］前記酵素反応物がＤ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｄ−Ｌｅｕ及びＤ−Ｖａｌからなる群から選択されるＤ−アミノ酸である、上記［７］に記載の測定方法。
【００１６】
［１０］前記ステップ（３）が、さらに
（３−１）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）を加え、Ｄ−アミノ酸を脱アミノ化し、α―ケト酸とアンモニア、及び過酸化水素を得るステップ；ならびに
（３−２）得られた過酸化水素の量から前記酵素反応物を検出定量するステップを含む、上記［８］または［９］に記載の測定方法；
［１１］前記ステップ（３−２）がペルオキシダーゼとペルオキシダーゼ発色基質（色原体）を用いて、生成する色素の発色の検出を含む、上記［１０］に記載の測定方法；
［１２］前記ペルオキシダーゼ発色基質（色原体）が、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）と３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸  （ＨＴＩＢ）とからなる発色基質（色原体）である上記［１１］に記載の測定方法；
［１３］色素の発色の検出を測定波長５４５ｎｍ〜７００ｎｍの吸光度にて行う上記［１２］に記載の測定方法。
【００１７】
［１４］前記ステップ（３）が、さらに
（３−１）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）を加え、Ｄ−アミノ酸を脱アミノ化し、α―ケト酸とアンモニア、及び過酸化水素を得るステップ；ならびに
（３−２）得られたα―ケト酸の量から前記酵素反応物を検出定量するステップを含む、上記［８］または［９］に記載の測定方法；
［１５］前記ステップ（３）が、さらに
（３−１）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）を加え、Ｄ−アミノ酸を脱アミノ化し、α―ケト酸とアンモニア、及び過酸化水素を得るステップ；ならびに
（３−２）得られたアンモニアの量から前記酵素反応物を検出定量するステップを含む、上記［８］または［９］に記載の測定方法。
【００１８】
［１６］上記［１］から［１５］のいずれか一項に記載の測定方法に使用するためのキットであって、亜鉛要求性酵素とその基質を含むキット；
［１７］上記［１０］から［１５］のいずれか一項に記載の測定方法に使用するためのキットであって、亜鉛要求性酵素であるＤ−アミノアシラーゼ、その基質であるＮ−アシルＤ−アミノ酸、ならびにＤ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）を含むキット；
［１８］上記［１２］に記載の測定方法に使用するためのキットであって、亜鉛要求性酵素であるＤ−アミノアシラーゼ、その基質であるＮ−アシルＤ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）ならびにペルオキシダーゼとペルオキシダーゼ発色基質を含むキット；
［１９］上記［１３］又は［１４］に記載の測定方法に使用するためのキットであって、亜鉛要求性酵素であるＤ−アミノアシラーゼ、その基質であるＮ−アシルＤ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）ならびにペルオキシダーゼと、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）と３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸  （ＨＴＩＢ）とからなる発色基質（色原体）であるペルオキシダーゼ発色基質を含むキット。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の測定方法によれば、生体試料中の他の微量元素をマスクすることなく、亜鉛濃度を定量的に検出することが可能になる。
かかる方法で得られた亜鉛濃度を用いて、患者の症状の重篤度の診断及び治療効果の診断を手助けすることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】亜鉛水溶液中の希釈直線性の確認
【図２】ヒト血清中の亜鉛測定
【図３】ヒト血清中の亜鉛測定における界面活性剤の影響（界面活性剤なし）
【図４】ヒト血清中の亜鉛測定における界面活性剤の影響（界面活性剤あり）
【図５】炭酸脱水素酵素を用いた場合の亜鉛水溶液中の希釈直線性の確認（参考例）
【図６】炭酸脱水素酵素を用いたヒト血清中の亜鉛測定（参考例）
【図７】ヒト血清中の亜鉛測定におけるＢＳＡの影響
【図８】ＤＡＡ２を用いた亜鉛水溶液中の希釈直線性の確認
【図９】ＤＡＡ２を用いたヒト血清中の亜鉛測定（基質：馬尿酸）
【図１０】ＤＡＡ２を用いたヒト血清中の亜鉛測定（基質：ＮアセチルＤ−Ｔｒｐ）
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、生体採取試料中の亜鉛濃度を外部から亜鉛要求性酵素を添加して、内在性の亜鉛イオンと外部から添加した亜鉛要求性酵素の複合体を形成させ、該酵素の活性を測定することにより、生体採取試料中の亜鉛濃度を間接的に測定する方法である。
【００２２】
本発明の方法が適用される生体採取試料とは末梢血、その血漿(blood plasma)ないし血清（blood serum）、髄液、尿、精液、または月経血などがある。
末梢血とは採血した状態の血球を分離していない血液であり、採血用の採血管等に含まれるヘパリン、フッ化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、モノヨード酢酸等の抗凝固剤や解糖阻止剤等を含んでいてもよい。保存した血液の場合には、エチレンジアミン四酢酸・２カリウム塩（ＥＤＴＡ・２Ｋ）、エチレンジアミン四酢酸・２ナトリウム塩（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）などのキレート剤は含まない方がよい。
又、採血管等を使用せずに、自己血糖測定等に用いられる穿刺器具等により採血した血液でもよい。穿刺による採血部位は、指先の他、前腕外側や腹壁又は上腕外側等特に制限はない。その採血量は、例えば、２００μＬ以下、好ましくは０．１μＬから５０μＬ程度、より好ましくは２μＬから２０μＬ程度である。
採血した血液を遠心分離して細胞成分（赤血球、白血球、血小板）を除いたものが血漿 (plasma)であり、血液（全血）を凝固させ血小板や凝固因子を除いたものが血清 (serum)である。
【００２３】
亜鉛要求性酵素とはその活性を維持するために補酵素として亜鉛イオンを必要とする酵素のことを示す。たとえば、Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）  （http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/）においてＺｉｎｃ  ｐｒｏｔｅｉｎと明記されているものが挙げられる。具体的な例としては、カルボキシペプチターゼ、アミノペプチターゼ、アルコール脱水素酵素、アルコールホスファターゼ、スーパーオキシドジムスターゼ、アンジオテンシン変換酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、コラゲナーゼ、デルタアミノレブリン酸脱水酵素、プロテインキナーゼＣ、ホスホリパーゼＣ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、ヌクレオチドホスホリラーゼなどが挙げられるがこれに限定されない。
【００２４】
亜鉛要求性酵素の基質とは、上記で定義される亜鉛要求性酵素により分解修飾等される分子のことを示す。たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１）であれば、上記ＮＣ−ＩＵＢＭＢウェブサイトにおいて、アルコールがそれにあたることが明示されている。
【００２５】
亜鉛要求性酵素とその基質を反応させるステップにおいて、界面活性剤の濃度としては、０．０１重量％から１０重量％程度、好ましくは０．１重量％から３重量％程度加えてもよい。
界面活性剤としては、亜鉛濃度の測定に影響しなければ特に限定されず、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等の界面活性剤が挙げられるが、中でも、両性イオン性界面活性剤が好ましい。両面界面活性剤としては、ベタイン型（ラウリルジメチルアミノ酢酸、ベタインジメチルアルキルラウリル、ベタインアルキルカルボキシベタインなど）、スルホベタイン型（ラウロアンホ酢酸ナトリウムなど）、アミンオキシド型（ジメチルラウリルアミンオキシド、ラウリルジメチルアミンオキサイドなど）が挙げられる。
【００２６】
アミノアシラーゼとは、Ｎ−アシルアミノ酸を有機酸とアミノ酸に加水分解する酵素を指し、光学異性体を認識するＬ−アシル体選択的アミノアシラーゼやＤ−アシル体選択的アミノアシラーゼなどが含まれる。
Ｌ−アミノアシラーゼ（ＬＡＡ）(N-acyl-L-amino-acid deacylase)とは、以下の化学式の反応によりＮアシルＬアミノ酸を加水分解する活性を有する酵素をいう：
Ｒ’ＣＯＮＨ・ＣＨ（Ｒ）・ＣＯＯＨ＋Ｈ２Ｏ  
→  ＮＨ２・ＣＨ（Ｒ）・ＣＯＯＨ＋Ｒ’ＣＯＯＨ
［ここでＮＨ２・ＣＨ（Ｒ）・ＣＯＯＨはＬ−アミノ酸であり、Ｒ’ＣＯ-はアシル基である］。
Ｄ−アミノアシラーゼ（ＤＡＡ）(N-acyl-D-amino-acid deacylase)とは、以下の化学式の反応によりＮアシルＤアミノ酸を加水分解する活性を有する酵素をいう：
Ｒ’ＣＯＮＨ・ＣＨ（Ｒ）・ＣＯＯＨ＋Ｈ２Ｏ  
→  ＮＨ２・ＣＨ（Ｒ）・ＣＯＯＨ＋Ｒ’ＣＯＯＨ
［ここでＮＨ２・ＣＨ（Ｒ）・ＣＯＯＨはＤ−アミノ酸であり、Ｒ’ＣＯ-はアシル基である］。
ＥＣ番号（酵素番号：Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓ）は酵素を整理すべく反応形式に従ってＥＣに続く４組の数字で表したものであり、国際生化学連合（現在のＮＣ−ＩＵＢＭＢ）の酵素委員会によって規定されたものである。Ｄ−アミノアシラーゼ１（ＤＡＡ１）（ＥＣ３．５．１．８１）は下記のウェブページの記載で規定される：
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/5/1/81.html
特に好ましくは、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｏｓｏｘｙｄａｎｓ及びＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｘｙｌｏｓｏｘｙｄａｎｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｘｙｌｏｓｏｘｙｄａｎｓ由来のＤ−アミノアシラーゼである。
本願におけるＤ−アミノアシラーゼ（ＤＡＡ）には、上記N-acyl-D-amino-acid deacylase（ＥＣ３．５．１．８１）、N-acyl-D-glutamate deacylase（ＥＣ３．５．１．８２）やN-acyl-D-aspartate deacylase（ＥＣ３．５．１．８３）が含まれるが、これに限定されない。亜鉛要求性であり、ＮアシルＤアミノ酸を加水分解する活性を有する酵素であれば、他にいかなる活性（たとえばＮアシルＬアミノ酸を加水分解する活性）を有していてもよい。
【００２７】
添加する酵素量としては生体採取試料１μＬあたり０．０１Ｕから１０Ｕ程度、好ましくは０．２Ｕから２Ｕ程度である。なお、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅを基質にして３７℃で１分間に１μｍｏｌのＤ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅを産生する酵素量を１Ｕとする。
【００２８】
Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸とはＤ−アミノ酸がアシル化された分子である（Ｒ’ＣＯＮＨ・ＣＨ（Ｒ）・ＣＯＯＨ）。Ｎアシル基はオキソ酸からヒドロキシル基を取り除いた形の官能基を意味し、より好ましくは、アルカノイル基（Ｒ−ＣＯ−）を指す。
Ｄアミノ酸とはＬアミノ酸の光学異性体であり、Ｄ−Ａｌａ（アラニン）、Ｄ−Ａｒｇ（アルギニン）、Ｄ−Ａｓｎ（アスパラギン）、Ｄ−Ａｓｐ（アスパラギン酸）、Ｄ−Ｃｙｓ（システイン）、Ｄ−Ｇｌｎ（グルタミン）、Ｄ−Ｇｌｕ（グルタミン酸）、Ｄ−Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ｄ−Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｄ−Ｌｅｕ（ロイシン）、Ｄ−Ｌｙｓ（リジン）、Ｄ−Ｍｅｔ（メチオニン）、Ｄ−Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、Ｄ−Ｐｒｏ（プロリン）、Ｄ−Ｓｅｒ（セリン）、Ｄ−Ｔｈｒ（トレオニン）、Ｄ−Ｔｒｐ（トリプトファン），Ｄ−Ｔｙｒ（チロシン），Ｄ−Ｖａｌ（バリン）などが挙げられる。
従ってアセチルＤ−アミノ酸とはアセチルＤ−Ａｌａ、アセチルＤ−Ａｒｇ、アセチルＤ−Ａｓｎ、アセチルＤ−Ａｓｐ、アセチルＤ−Ｃｙｓ、アセチルＤ−Ｇｌｎ、アセチルＤ−Ｇｌｕ、アセチルＤ−Ｈｉｓ、アセチルＤ−Ｉｌｅ、アセチルＤ−Ｌｅｕ、アセチルＤ−Ｌｙｓ、アセチルＤ−Ｍｅｔ、アセチルＤ−Ｐｈｅ、アセチルＤ−Ｐｒｏ、アセチルＤ−Ｓｅｒ、アセチルＤ−Ｔｈｒ、アセチルＤ−Ｔｒｐ，アセチルＤ−Ｔｙｒ，アセチルＤ−Ｖａｌなどが挙げられる。
【００２９】
添加するＮ−アシルＤ−アミノ酸の量は、最終濃度で１ｍＭ〜５００ｍＭ、より好ましくは２０ｍＭ〜１００ｍＭであり、添加する酵素１Ｕあたり０．０５μｍｏｌ〜５０００μｍｏｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ〜２５００μｍｏｌである。反応時間は３７度で５分以上が好ましい。
【００３０】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）とその補酵素であるフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）はペルオキシソーム酵素  （ＥＣ  １．４．３．３）である（http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC1/4/3/3.html）。Ｄ−アミノ酸を相当するイミノ酸（α―ケト酸）に変換し、同時にアンモニアと過酸化水素を合成する。
添加するＤ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）の量は、最終濃度で約０.１ＫＵ／Ｌ〜約１００ＫＵ／Ｌ、より好ましくは約１ＫＵ／Ｌ〜約１０ＫＵ／Ｌである。場合により、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を反応系に加えてもよい。
反応時間は３７度で５分以上が好ましい。
【００３１】
本発明の測定方法において、得られたα−ケト酸の量から前記酵素反応物を検出定量する工程としては、α−ケト酸脱水素酵素とＮＡＤＨを用いて、以下の反応：
α−ケト酸  +  ＮＡＤＨ  →  α−ヒドロキシ酸  ＋  ＮＡＤ
を行い、ＮＡＤの吸光度変化量からα−ケト酸の量を換算し、その量から前記酵素反応物を検出定量する方法があげられる。
あるいは、α−ケト酸還元酵素とβ-ＮＡＤＰＨを用いて、以下の反応：
α−ケト酸  +  β-ＮＡＤＰＨ  →  α−ヒドロキシ酸  ＋  β-ＮＡＤＰ
を行い、β-ＮＡＤＰの吸光度変化量からα−ケト酸の量を換算し、その量から前記酵素反応物を定量する方法があげられる。
【００３２】
本発明の測定方法において、得られたアンモニアの量から前記酵素反応物を検出定量する工程としては、α-ケトグルタル酸とβ-ＮＡＤＰＨを用いて、以下の反応：
ＮＨ３  ＋  α-ケトグルタル酸  +  β-ＮＡＤＰＨ  →  グルタミン酸  +  β-ＮＡＤＰ
を行い、β-ＮＡＤＰの吸光度変化量からアンモニア量を換算し、その量から前記酵素反応物を定量する方法があげられる。
【００３３】
本発明の測定方法において、得られた過酸化水素の量から前記酵素反応物を検出定量する工程としては、ペルオキシダーゼと色原体を用い、色原体から生成する色素の発色の検出を含む工程が好ましい。色原体から生成する色素の吸収波長が５００ｎｍから９００ｎｍである色原体が好ましく、５００ｎｍから９００ｎｍ（より好ましくは５４６ｎｍ〜７００ｎｍ）におけるどこかの波長において分子吸光度変化数が１００００以上である色素を生成する色原体が更に好ましい。
該色原体としては酸化発色型色原体又は酸化カップリング発色型色原体が挙げられるが、酸化カップリング発色型色原体が好ましい。
【００３４】
該酸化発色型色原体としては、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン・ナトリウム塩（ＤＡ６４）、１０−カルボキシメチルアミノカルボニル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム塩（ＤＡ６７）、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−カルボキシエチルアミノフェニル］アミン、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢＺ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４’’−トリアミノトリフェニルメタン・ヘキサナトリウム塩（ＴＰＭ−ＰＳ）等が挙げられる。
【００３５】
該酸化カップリング発色型色原体とは、過酸化水素及びペルオキシダーゼの存在下で酸化的にカップリングし色素を生成する２種の化合物であり、２種の化合物の組み合わせとしてはカプラーとアニリン類（トリンダー試薬）との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。
該カプラーとしては、例えば、４−アミノアンチピリン（４ＡＡＰ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、２−ヒドラゾノ−２，３−ジヒドロ−３−メチル−６−ベンゾチアゾールスルホン酸（ＳＭＢＴＨ）、Ｎ−メチル−３−メトキシ―４’−アミノ−ジフェニルアミン（ＮＣＰ−０６）、Ｎ−メチル−４−アミノ―ジフェニルアミン（ＮＣＰ−０４）等がある。
カプラーと酸化縮合する該アニリン類（トリンダー試薬）又は該フェノール類としては、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。
【００３６】
中でも好ましい色原体としての酸化カップリング発色型色原体としては、カプラーとしての４ＡＡＰ、カプラーと縮合する該フェノール類としてのＨＴＩＢが挙げられる。
【００３７】
本発明の測定方法において色原体の測定時の使用濃度は０．１ｍＭから１００ｍＭ、好ましくは１ｍＭから５０ｍＭである。測定時のｐＨは５．５から９．５、好ましくは６．０から８．０である。
【００３８】
本発明の測定方法において、前記色原体から生成する色素の発色を吸光度を用いて検出する場合、分光光度計で測定してもよい。その測定波長としては、５００ｎｍから９００ｎｍである色原体が好ましく、５００ｎｍから９００ｎｍにおけるどこかの波長において分子吸光度変化数が１００００以上である色素を生成する色原体が更に好ましい。
該色原体としては酸化発色型色原体又は酸化カップリング発色型色原体などが挙げられるが、酸化カップリング発色型色原体が好ましい。
【００３９】
本発明の測定方法の一例として、実際の生化学検査に使用される汎用の自動分析装置を用いる測定について説明する。
汎用の自動分析装置としては、例えば、（株）日立製の７０２０形、７０７０形、７１７０形、７１８０形、７７００形、９０００形、ＬＡＢＯＳＰＥＣＴ  ００３形、ＬＡＢＯＳＰＥＣＴ  ００６形、ＬＡＢＯＳＰＥＣＴ  ００８形；（株）日本電子製のＪＣＡ−ＢＭ６０１０形、ＪＣＡ−ＢＭ６０５０形、ＪＣＡ−ＢＭ６０７０形、ＪＣＡ−ＢＭ９１３０形、ＪＣＡ−ＢＭ８０００Ｇ形；（株）東芝製のＴＢＡ−１２０ＦＲ、ＴＢＡ−ｃ８０００、ＴＢＡ−２０００ＦＲ、ＴＢＡ−ｃ１６０００；（株）ベックマン・コールター製のＡＵ４８０、ＡＵ６４０、ＡＵ６８０、ＡＵ５８００；（株）古野電気製のＣＡ−２７０、ＣＡ−４００などの自動分析装置がある。
汎用の自動分析装置のサンプルポートに測定する生体採取試料をセットし、第一試薬として亜鉛要求性酵素を含む溶液をセットし、第二試薬として該酵素反応物を検出定量するために使用する試薬を含む溶液をセットし、生体採取試料、第一試薬及び第二試薬の分注量、反応時間、反応温度、測定波長を入力し測定を行う。
【００４０】
亜鉛要求性酵素としてＤＡＡを用い、Ｄアミノ酸を検出するためにＤ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）とその補酵素であるフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を用いる場合には、第一試薬、第二試薬のどちらにＤＡＡＯ、ＦＡＤならびにＮ−アシルＤ−アミノ酸を添加してもよい。
又、第一試薬、第二試薬はｐＨ６．５からｐＨ９．５が好ましく、緩衝剤としてＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ等を用いるのが好ましい。
更に、再現性向上のための試薬（たとえば非イオン性界面活性剤のＢｒｉｊｉ−３５、両性イオン性界面活性剤のアンヒトール２０ＢＳ）や防腐剤（アジ化ナトリウム）、あるいは酵素安定性のための試薬（たとえば（血清）アルブミンなど）を加えてもよい。
【００４１】
上記ＤＡＡ及びＤＡＡＯを用いた態様において、生成される過酸化水素を検出するために、ペルオキシダーゼと酸化カップリング発色型色原体を用いる場合、第一試薬と第二試薬にカプラー試薬とカプラーと酸化縮合するアニリン類（トリンダー試薬）又はフェノール類を含む試薬が別々に含まれていることが好ましい。
【００４２】
検体量は１μＬから４０μＬ程度、好ましくは２μＬから２０μＬ程度でよい。この程度の検体量の場合、第一試薬は１０μＬから５００μＬ程度、好ましくは３０μＬから３００μＬ程度、第二試薬は１０μＬから５００μＬ程度、好ましくは３０μＬから３００μＬ程度使用する。検体量と第一試薬の混合容量比は、１：１０〜１：５００、好ましくは、１：２０〜１：２００、更に好ましくは、１：２０〜１：１５０である。反応時間は、検体と第一試薬の反応が５分間、その反応終了後に第二試薬を加えて更に５分間が好ましい。
反応温度としては２０℃から４５℃、好ましくは３７℃である。
【００４３】
本発明の測定方法の他の実施態様としては、生体採取試料と亜鉛要求性酵素及びその基質を含む溶液、該酵素反応物を検出定量するための試薬溶液を順次、分光光度計のキュベット内で混合しその吸光度を測定する方法がある。
更に、他の実施態様としては、ＬａｂｏｎＣｈｉｐの形態で、生体採取試料を、亜鉛要求性酵素及びその基質を含む乾燥試薬の上通過反応させた後、該酵素反応物を検出定量するための乾燥試薬の上を通過させ、最終的な試料体積を増加させることなく、亜鉛濃度を計測する方法がある。
【００４４】
本発明には前記の測定方法に使用し、亜鉛要求性酵素及びその基質を含む試薬と該酵素反応物を検出定量するための試薬を含有する亜鉛濃度の測定用キットも含まれる。測定用キットでは、亜鉛要求性酵素を含む第一試薬及び該酵素反応物を検出定量するための第二試薬の両方が乾燥試薬と復元液の組み合わせでもよい。又、どちらかが乾燥試薬と復元液で、他方が液状試薬でもよい。
本発明の測定用キットの各試薬の構成は２以上に分かれていてもよい。
【００４５】
更に、本発明の亜鉛の測定用キットには濃度の決まった亜鉛の標準液を含有していてもよく、該標準液は測定すべき生体採取試料の種類によって異なってよい。
【００４６】
本発明には前記標準液を用いて検量線を作成し、生体採取試料から得られる測定値から、生体採取試料中の亜鉛濃度を算出する方法も含まれる。
【実施例】
【００４７】
以下の実施例および参考例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。以下の第一試薬，第二試薬に示す各構成成分については、各試薬中における各構成成分の濃度にて記載する。又、酵素量１Ｕは文献公知の方法により求められ、例えばＤ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅの場合、Ｄ−ａｌａｎｉｎｅを基質にして１分間に１μｍｏｌの過酸化水素とピルビン酸を産生する酵素量を１Ｕとし；Ｄ−ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ１の場合、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅを基質にして１分間に１μｍｏｌのＤ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅを産生する酵素量を１Ｕとし；Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅの場合、ピロガロールを基質にして２０秒間に１．０ｍｇのＰｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎを産生する酵素量を１Ｕとする。
【００４８】
＜実施例１＞
亜鉛存在下での種々のアセチル−Ｄ−アミノ酸に対する反応性確認
１．方法
水溶液中に含まれる亜鉛をアセチル−Ｄ−アミノ酸を基質として用いた場合に測定できるか検討した。試料および試薬は以下の通りである。
試料
生理食塩水および亜鉛を１０００μｇ／ｄＬ含む生理食塩水
第一試薬
Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＴＡＰＳ］  ｐＨ９．０（同仁化学）
１００ｍＭ
ＨＴＩＢ（同仁化学）                                          １ｍＭ
Ｂｒｉｊｉ−３５（ナカライテスク）                            ０．１％
Ｆｌａｖｉｎ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ロシュ・ダイアグノスティクス）                                                          ０．５ｍＭ
Ｃａｔａｌａｓｅ（キッコーマン）                              ２００ＫＵ／Ｌ
Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ                      １ＫＵ／Ｌ
（シグマアルドリッチ）
Ｄ−ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ１（耐熱性酵素研究所）            ５ＫＵ／Ｌ
Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  （渡辺化学）           １００ｍＭ
第二試薬
Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＴＡＰＳ］  ｐＨ９．０（同仁化学）
１００ｍＭ
４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ（埼京化成）                ４ｍＭ
Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ（和光純薬）      １ｍＭ
ＢＰＳＨ−２５（日光ケミカルス）                              ２％
Ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ（ナカライテスク）                    ０．０９％
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（東洋紡）                                １０ＫＵ／Ｌ
【００４９】
また、第一試薬に使用したＡｃｅｔｙｌ−Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄはＡｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（以下Ｐｈｅ）、Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ（以下Ｍｅｔ）、Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ａｌａｎｉｎｅ（以下Ａｌａ）、Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒａｇｉｎｅ（以下Ａｓｎ）、Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｌｅｕｃｉｎｅ（以下Ｌｅｕ）、Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｖａｌｉｎｅ（以下Ｖａｌ）を使用した。
【００５０】
測定法は、以下のようにして行った。日立７１８０形自動分析装置を用い、試料４μＬと第一試薬１６０μＬとを３７℃、５分間混合した後、得られる液に、第二試薬４０μＬを加え同温度で５分間、発色反応させる。発色反応開始後の１分間当りの吸光度変化を主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。
【００５１】
２．結果
各基質に対する吸光度変化量（ｘ１００００）を表１に示す。
【表１】
2020043857.tif 000002
【００５２】
表１の結果からＡｌａ、Ａｓｎを除く全ての基質で良好な結果を示した。
【００５３】
＜実施例２＞
亜鉛水溶液中の希釈直線性の確認
１．方法
亜鉛水溶液における希釈直線性の検討を行った。
試料
酢酸亜鉛を３６５μｇ／ｄＬになるように生理食塩水に溶解し、その溶液を生理食塩水にて７段階に希釈した。
第一試薬
Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＴＡＰＳ］  ｐＨ９．０（同仁化学）
１００ｍＭ
ＨＴＩＢ（同仁化学）                                          １ｍＭ
Ｂｒｉｊｉ−３５（ナカライテスク）                            ０．１％
Ｆｌａｖｉｎ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ        ０．５ｍＭ
（ロシュ・ダイアグノスティクス）
Ｃａｔａｌａｓｅ（キッコーマン）                              ２００ＫＵ／Ｌ
Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ                      １ＫＵ／Ｌ
（シグマアルドリッチ）
Ｄ−ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ１（耐熱性酵素研究所）            ５ＫＵ／Ｌ
Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（渡辺化学）      １００ｍＭ
第二試薬
Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＴＡＰＳ］  ｐＨ９．０（同仁化学）
１００ｍＭ
４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ（埼京化成）                ４ｍＭ
Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ（和光純薬）      １ｍＭ
ＢＰＳＨ−２５（日光ケミカルス）                              ２％
Ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ（ナカライテスク）                    ０．０９％
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（東洋紡）                                １０ＫＵ／Ｌ
【００５４】
測定法は実施例１と同様の方法にて測定した。
【００５５】
２．結果
本法での希釈直線性を図１に示す。
希釈倍率をＸ、本法をＹとして希釈直線性を確認した。図１に示したように、Ｙ  ＝  ５２．３８Ｘ  −  ５．９９、相関係数０．９９９６と良好な結果が得られた。このことから本法は希釈直線性が正確であるといえる。
【００５６】
＜実施例３＞
生体試料での添加回収試験の確認
１．方法
生体試料中の亜鉛を正確に測定できるか確認するため添加回収試験を実施した。試料および試薬は以下の通りである。なお、比較例として亜鉛を測定する場合の一般的な方法である、キレート剤用いた直接法も検討した。
試料
下記に示す３種類の試料を作製し、添加回収試験を実施した。
生体試料（亜鉛濃度９５μｇ／ｄＬ）と生理食塩水を９対１で混合したもの［Ｉ］
生体試料（亜鉛濃度９５μｇ／ｄＬ）と亜鉛水溶液（亜鉛濃度１０００μｇ／ｄＬ）を９対１で混合したもの [ＩＩ]
生理食塩水と亜鉛水溶液（亜鉛濃度１０００μｇ／ｄＬ）を９対１で混合したもの［ＩＩＩ］
第一試薬
Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＴＡＰＳ］ｐＨ８．５（同仁化学）
１００ｍＭ
ＨＴＩＢ（同仁化学）                                          １ｍＭ
ユニセーフＡ−ＬＭ（日油）                                    １％
Ｄ−ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ１（耐熱性酵素研究所）            ５ＫＵ／Ｌ
第二試薬
２−[４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＨＥＰＥＳ］  ｐＨ７．０（同仁化学）
２５０ｍＭ
４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ（埼京化成）                ４ｍＭ
Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ（和光純薬）      １ｍＭ
ＢＰＳＨ−２５（日光ケミカルス）                              ２％
Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（渡辺化学）      ４００ｍＭ
Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ（池田糖化工業）      ５０ＫＵ／Ｌ
Ｆｌａｖｉｎ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ        １．５ｍＭ
（ロシュ・ダイアグノスティクス）
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（東洋紡）                                １０ＫＵ／Ｌ
【００５７】
測定法は実施例１と同様の方法にて測定した。
【００５８】
添加回収率の演算式は以下の通り。
添加回収率（％）  ＝  （試料[ＩＩ]−  試料［ＩＩＩ］）  ／  試料［Ｉ］×  １００
【００５９】
２．結果
各試料に対する本測定系の測定値と添加回収率を表２に示す。
【表２】
2020043857.tif 000003
【００６０】
表２に示したように、添加回収試験において生体試料中の亜鉛を直接法よりも正確に測定できることが判明した。
【００６１】
＜実施例４＞
共存物質を含む生体試料中の亜鉛測定
１．方法
共存物質を添加した場合に試料中の亜鉛を正確に測定できるか検討した。試料および試薬は以下の通りである。
試料
生体試料（亜鉛濃度１１０μｇ／ｄＬ）と共存物質を９対１で混合し、共存物質を目的の濃度にした。
添加した共存物質と終濃度は以下の通りである。
抱合型ビリルビン      ２０ｍｇ／ｄＬ
非抱合型ビリルビン    ２０ｍｇ／ｄＬ
ヘモグロビン          ２００ｍｇ／ｄＬ
乳糜                  ３０００ＦＴＵ
イントラリピッド      ５％
第一試薬
Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＴＡＰＳ］ｐＨ８．５（同仁化学）
１００ｍＭ
ＨＴＩＢ（同仁化学）                                          １ｍＭ
アンヒトール  ２０ＢＳ（花王）                                １％
Ｄ−ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ１（耐熱性酵素研究所）            ５ＫＵ／Ｌ
第二試薬
２−[４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＨＥＰＥＳ］  ｐＨ７．０（同仁化学）
２５０ｍＭ
４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ（埼京化成）                ４ｍＭ
Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ（和光純薬）      １ｍＭ
ＢＰＳＨ−２５（日光ケミカルス）                              ２％
Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（渡辺化学）      ４００ｍＭ
Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ（池田糖化工業）      ５０ＫＵ／Ｌ
Ｆｌａｖｉｎ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ        １．５ｍＭ
（ロシュ・ダイアグノスティクス）
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（東洋紡）                                １０ＫＵ／Ｌ
【００６２】
測定法は実施例１と同様の方法にて測定した。
【００６３】
２．結果
各共存物質に対する本測定系の影響率を表４に示す。
【表３】
2020043857.tif 000004
【００６４】
表３に示したように、ビリルビン、ヘモグロビン、乳糜、イントラリピッドを含む生体試料において、ヒト生体採取試料中の亜鉛を正確に測定できることが判明した。
【００６５】
＜実施例５＞
ヒト血清中の亜鉛測定
１．方法
既存法（直接法）との相関性を確認した。なお、既存法としてキレート剤を用いた、アキュラスオートＺｎを使用した。
試料
インフォームドコンセントの得られたヒト血清（ｎ＝１０）を用いた。
第一試薬
Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＴＡＰＳ］  ｐＨ８．５（同仁化学）
１００ｍＭ
ＨＴＩＢ（同仁化学）                                          １ｍＭ
ユニセーフＡ−ＬＭ（日油）                                    １％
Ｄ−ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ１（耐熱性酵素研究所）            ５ＫＵ／Ｌ
第二試薬
２−[４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＨＥＰＥＳ］  ｐＨ７．０
２５０ｍＭ
４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ（埼京化成）                ４ｍＭ
Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ（和光純薬）      １ｍＭ
ＢＰＳＨ−２５（日光ケミカルス）                              ２％
Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（渡辺化学）      ４００ｍＭ
Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ（池田糖化工業）      ５０ＫＵ／Ｌ
Ｆｌａｖｉｎ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
（ロシュ・ダイアグノスティクス）                                １．５ｍＭ
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（東洋紡）                                １０ＫＵ／Ｌ
【００６６】
測定法は実施例１と同様の方法にて測定した。
【００６７】
２．結果
既存法との相関性を図２に示す。
既存法をＸ、本法をＹとして相関性を確認した。図２に示したように、Ｙ  ＝  １．０４５５Ｘ  −  ３．７３６７、相関係数０．９８２６と良好な結果が得られた。このことから本法はヒト生体採取試料中の亜鉛を正確に測定できているといえる。
【００６８】
＜実施例６＞
金属特異性の確認
１．方法
ヒト血液中に含まれる金属を測定した場合の反応性を確認した。試料および試薬は以下の通りである。
試料
生体濃度に調製した金属を含む生理食塩水。金属種と添加量を表４に示す。
【表４】
2020043857.tif 000005
【００６９】
第一試薬
Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＴＡＰＳ］ｐＨ８．５（同仁化学）
５０ｍＭ
ＨＴＩＢ（同仁化学）                                          １ｍＭ
アンヒトール２０ＢＳ（花王）                                  １％
Ｄ−ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ１（耐熱性酵素研究所）            ５ＫＵ／Ｌ
第二試薬
２−[４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＨＥＰＥＳ］  ｐＨ７．０（同仁化学）
２５０ｍＭ
４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ（埼京化成）                ４ｍＭ
Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ（和光純薬）      １ｍＭ
ＢＰＳＨ−２５（日光ケミカルス）                              ２％
Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（渡辺化学）      ４００ｍＭ
Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ（池田糖化工業）      ５０ＫＵ／Ｌ
Ｆｌａｖｉｎ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ        １．５ｍＭ
（ロシュ・ダイアグノスティクス）
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（東洋紡）                                １０ＫＵ／Ｌ
【００７０】
測定法は実施例１と同様の方法にて測定した。
【００７１】
２．結果
各金属に対する吸光度変化量（ｘ１００００）を表５に示す。
【表５】
2020043857.tif 000006
【００７２】
表５の結果から亜鉛を添加した場合に吸光度変化が大きいことが示された。このことから本法は特異的に亜鉛を測定できているといえる。
【００７３】
＜実施例７＞
ヒト血清中の亜鉛測定における界面活性剤の影響
１．方法
既存法（直接法）との相関性を確認した。なお、既存法としてキレート剤を用いた、アキュラスオートＺｎを使用した。
試料
インフォームドコンセントの得られたヒト血清（ｎ＝１０）を用いた。
第一試薬
Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＴＡＰＳ］ｐＨ８．５（同仁化学）
１００ｍＭ
ＨＴＩＢ（同仁化学）                                          １ｍＭ
Ｄ−ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ１（耐熱性酵素研究所）            ５ＫＵ／Ｌ
ユニセーフＡ−ＬＭ（日油）                                    ０％  又は  １％
第二試薬
２−[４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＨＥＰＥＳ］  ｐＨ７．０
２５０ｍＭ
４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ（埼京化成）                ４ｍＭ
Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ（和光純薬）      １ｍＭ
Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（渡辺化学）      ４００ｍＭ
Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ（池田糖化工業）      ５０ＫＵ／Ｌ
Ｆｌａｖｉｎ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ        １．５ｍＭ
（ロシュ・ダイアグノスティクス）
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（東洋紡）                                １０ＫＵ／Ｌ
【００７４】
測定法は実施例１と同様の方法にて測定した。
【００７５】
２．結果
キレート法との相関性を図３（界面活性剤０％）及び、図４（界面活性剤１％）に示す。
既存法をＸ、本法をＹとして相関性を確認した。図３ではＹ  ＝  １．００９Ｘ  ＋  ２．８３１、相関係数０．９３３４、図４ではＹ  ＝  ０．８８４Ｘ  ＋  ６．６８４、相関係数０．９７７２と良好な結果が得られた。このことから本法はヒト生体採取試料中の亜鉛を正確に測定できているといえる。また、界面活性剤の添加による測定性能の違いは認められなかった。
【００７６】
＜参考例１＞
アルコール脱水素酵素を用いた反応系の確認
１．方法
水溶液中に含まれる亜鉛をモノエタノールアミンを基質として用いた場合に測定できるか検討した。試料および試薬は以下の通りである。
試料
生理食塩水および亜鉛を５００μｇ／ｄＬ含む生理食塩水
第一試薬
Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＴＡＰＳ］  ｐＨ８．５（同仁化学）
１００ｍＭ
Ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌ  ａｍｉｎｅ（和光純薬）                １００ｍＭ
第二試薬
２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ  ［ＭＥＳ］ｐＨ６．０（同仁化学）                      ５０ｍＭ
β−Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（オリエンタル酵母）                                                    １０ｍＭ
Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ                  １ｍＭ
Ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（オリエンタル酵母）２５ＫＵ／Ｌ
【００７７】
測定法は、以下のようにして行った。日立７１８０形自動分析装置を用い、試料１０μＬと第一試薬１５０μＬとを３７℃、５分間混合した後、得られる液に、第二試薬５０μＬを加え同温度で５分間、発色反応させる。発色反応開始後の１分間当りの吸光度変化を主波長４０５ｎｍ、副波長３４０ｎｍで測定した。
【００７８】
２．結果
各亜鉛添加量に対する吸光度変化量を表６に示す。試料中に亜鉛が含まれている場合においても、吸光度変化は生じなかった。
【表６】
2020043857.tif 000007
【００７９】
＜参考例２＞
炭酸脱水素酵素を用いた反応系の確認
１．方法
水溶液中に含まれる亜鉛をパラニトロフェニル酢酸を基質として用いた場合に測定できるか検討した。試料および試薬は以下の通りである。
試料
酢酸亜鉛を６５０μｇ／ｄＬになるように生理食塩水に溶解し、その溶液を生理食塩水にて１０段階に希釈した。
第一試薬
２−[４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＨＥＰＥＳ］  ｐＨ７．５（同仁化学）
５００ｍＭ
Ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ（ＳＥＲＶＡ）             ０．２５ｍｇ／ｍＬ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）
第二試薬
塩化ナトリウム（和光純薬）                                    １５０ｍＭ
ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ                    ４．５ｍＭ
【００８０】
本測定法に使用するＣａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅは前処理によりＣａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ中の残存亜鉛を取り除く必要がある。亜鉛除去の方法は以下のようにして行った。
Ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅを７５ｍＭのＰｙｒｉｄｉｎｅ  ２，６−ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（東京化成）溶液に溶解させ、Ｐｙｒｉｄｉｎｅ  ２，６−ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄに亜鉛を１２時間結合させる。次いで、２００ｍＭのリン酸二水素ナトリウム溶液  ｐＨ７．４（和光純薬）にて１２時間透析を行う。透析を計３回行うことでＣａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ中の亜鉛を完全に除去させる。
【００８１】
測定法は、以下のようにして行った。日立７１８０形自動分析装置を用い、試料３μＬと第一試薬１５０μＬとを３７℃、５分間混合した後、得られる液に、第二試薬５０μＬを加え同温度で５分間、発色反応させる。発色反応開始後の１分間当りの吸光度変化を主波長４５０ｎｍ、副波長４０５ｎｍで測定した。
【００８２】
２．結果
本法での希釈直線性を図５に示す。
希釈倍率をＸ、本法をＹとして希釈直線性を確認した。図５に示したように、Ｙ  ＝  ６３．３２Ｘ  ＋  １．１７、相関係数０．９９９３と良好な結果が得られた。このことから本法は希釈直線性が正確であるといえる。
【００８３】
＜参考例３＞
炭酸脱水素酵素を用いたヒト血清中の亜鉛測定
１．方法
既存法（直接法）との相関性を確認した。なお、既存法としてキレート剤を用いた、アキュラスオートＺｎを使用した。
試料
インフォームドコンセントの得られたヒト血清（ｎ＝２５）を用いた。
第一試薬
２−[４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＨＥＰＥＳ］  ｐＨ７．５（同仁化学）
５００ｍＭ
Ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ（ＳＥＲＶＡ）            ０．２ｍｇ／ｍＬ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）
第二試薬
コハク酸  ｐＨ５．０（和光純薬）                              ５０ｍＭ
塩化ナトリウム（和光純薬）                                    １５０ｍＭ
ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ                    ４．５ｍＭ
【００８４】
Ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅは参考例２と同様のものを使用した。
測定法は参考例２と同様の方法にて測定した。
【００８５】
２．結果
キレート法との相関性を図６に示す。
既存法をＸ、本法をＹとして相関性を確認した。図６に示したように、Ｙ  ＝  １．２２２８Ｘ  ＋  １３０．４７、相関係数０．４０３７と良好な結果が得られなかった。このことから本法はヒト生体採取試料中の亜鉛を正確に測定できていないことが示された。
【００８６】
以上により、亜鉛要求性酵素として公知の酵素の中にも、本発明に適用できないものがあることが示唆された。
【００８７】
＜実施例８＞
ウシ血清アルブミン添加による亜鉛測定試薬の安定化
１．方法
亜鉛測定試薬にウシ血清アルブミンを添加することによる試薬の安定性向上について検討した。試料および試薬は以下の通りである。
試料
酢酸亜鉛を３００μｇ／ｄＬになるように生理食塩水に溶解し、その溶液を生理食塩水にて４段階に希釈した。
第一試薬
Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＴＡＰＳ］ｐＨ９．０（同仁化学）
５０ｍＭ
ＴＯＯＳ（同仁化学）                                           １ｍＭ
Ｄ−ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ１（耐熱性酵素研究所）           ５ＫＵ／Ｌ
ユニセーフＡ−ＬＭ（花王ケミカルス）                           １％
Ｂａｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ   （ナカライテスク）            ２５ｍＭ
Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
０％又は３％
第二試薬
２−[４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＨＥＰＥＳ］  ｐＨ７．０（同仁化学）
２５０ｍＭ
４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ（埼京化成）                 ４ｍＭ
Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ（和光純薬）       １ｍＭ
Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（渡辺化学）       ４００ｍＭ
Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ（池田糖化工業）       ５ＫＵ／Ｌ
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（東洋紡）                                 １０ＫＵ／Ｌ
ＢＰＳＨ−２５（日光ケミカルス）                               ２％
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）         ０．５％
Ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（和光純薬）                     １５０ｍＭ
【００８８】
熱安定性試験は調液後０日目、及び３７℃にて７日間保存した試薬を用いて実施した。
測定法は実施例１と同様の方法にて測定し、主波長を６００ｎｍに変更して測定を行った。
上記０日目、７日目の試薬を用いて測定した各亜鉛濃度の吸光度に対し、同日に測定した対応する亜鉛０μｇ／ｄＬの吸光度の差を各亜鉛濃度における反応感度とし、式[（７日目感度／０日目感度）ｘ１００]によって感度維持率を算出した。
【００８９】
２．結果
熱安定性試験におけるＢＳＡ添加の有無による感度結果を表７に示す。熱安定性試験０日目を感度１００％とすると、ＢＳＡ未添加では試験７日目に感度が０％となるのに対し、ＢＳＡを添加すると９９％−１０３％に感度が維持されることが示された。このことからＢＳＡの添加により試薬の安定性が向上したといえる。
【表７】
2020043857.tif 000008
【００９０】
＜実施例９＞
ヒト血漿中の亜鉛測定
１．方法
既存法（直接法）との相関性を確認した。なお、既存法としてキレート発色剤を用いた、アキュラスオートＺｎを使用した。
試料
インフォームドコンセントの得られたヒト血漿（ｎ＝５０）を用いた。
第一試薬
Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＴＡＰＳ］ｐＨ８．５（同仁化学）
５０ｍＭ
ＨＴＩＢ（同仁化学）                                            １ｍＭ
Ｄ−ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ１（耐熱性酵素研究所）              ５ＫＵ／Ｌ
ユニセーフＡ−ＬＭ（花王ケミカルス）                          １％
Ｂａｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ   （ナカライテスク）            ２５ｍＭ
Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
３％
第二試薬
２−[４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＨＥＰＥＳ］  ｐＨ７．０（同仁化学）
２５０ｍＭ
４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ（埼京化成）                  ４ｍＭ
Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ（和光純薬）        １ｍＭ
Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（渡辺化学）        ４００ｍＭ
Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ（池田糖化工業）        ５ＫＵ／Ｌ
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（東洋紡）                                  １０ＫＵ／Ｌ
ＢＰＳＨ−２５（日光ケミカルス）                                ２％
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）         ０．５％
Ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（和光純薬）                     １５０ｍＭ
【００９１】
測定法は実施例１と同様の方法にて測定した。
【００９２】
２．結果
キレート法との相関性を図７に示す。
既存法をＸ、本法をＹとして相関性を確認した。図７に示したように、Ｙ  ＝  ０．９１３６Ｘ  −  ７．７７１３、相関係数０．９９１２と良好な結果が得られた。このことから本法はヒト生体採取試料中の亜鉛を正確に測定できているといえる。
【００９３】
＜実施例１０＞
Ｄ−ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ２を用いた亜鉛水溶液中の希釈直線性の確認
１．方法
亜鉛要求性酵素としてＤ−ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ２、および対応する基質として馬尿酸を用いた亜鉛測定試薬により、亜鉛水溶液における希釈直線性の検討を行った。
試料
酢酸亜鉛を５００μｇ／ｄＬになるように生理食塩水に溶解し、その溶液を生理食塩水にて５段階に希釈した。
第一試薬
２−[４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＨＥＰＥＳ］  ｐＨ８．０（同仁化学）
１００ｍＭ
ＴＯＯＳ（同仁化学）                                            ２ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）         ０．０５％
Ｈｉｐｐｕｒｉｃ  ａｃｉｄ（和光純薬）                          １００ｍＭ
Ｓａｒｃｏｓｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ（東洋紡）                    １０ＫＵ／Ｌ
Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）                        １０ｍＭ
Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（耐熱性酵素研究所）
１ＫＵ／Ｌ
Ｄ−ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ２（耐熱性酵素研究所）              １ＫＵ／Ｌ
第二試薬
２−[４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＨＥＰＥＳ］  ｐＨ８．０（同仁化学）
１００ｍＭ
４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ（埼京化成）                  ６ｍＭ
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（東洋紡）                                  １０ＫＵ／Ｌ
測定法は、以下のようにして行った。日立７１８０型自動分析装置を用い、試料５μＬと第一試薬１５０μＬとを３７℃、５分間混合した後、得られる液に、第二試薬５０μＬを加え同温度で５分間、発色反応させる。発色反応開始後の１分間当りの吸光度変化を主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。
【００９４】
２．結果
本法での希釈直線性を図８に示す。
希釈倍率をＸ、本法をＹとして希釈直線性を確認した。図８に示したように、Ｙ  ＝  ９８．７６Ｘ  ＋  １０．１８、相関係数０．９９８６と良好な結果が得られた。このことから本法は希釈直線性が正確であるといえる。
【００９５】
＜実施例１１＞
Ｄ−ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ２を用いたヒト血清中の亜鉛測定
１．方法
亜鉛要求性酵素としてＤ−ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ２、および対応する基質として馬尿酸を用いた亜鉛測定試薬によるヒト血清中の亜鉛測定において、既存法（直接法）との相関性を確認した。なお、既存法としてキレート発色剤を用いた、アキュラスオートＺｎを使用した。試料および試薬は以下の通りである。
【００９６】
試料
ヒトプール血清に酢酸亜鉛をそれぞれ２５０μｇ／ｄＬ、５００μｇ／ｄＬ、７００μｇ／ｄＬ添加した。また、インフォームドコンセントの得られたヒト血清（ｎ＝６）を用いた。
第一試薬
２−[４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＨＥＰＥＳ］  ｐＨ８．０（同仁化学）
１００ｍＭ
ＴＯＯＳ（同仁化学）                                          １ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）         ０．１％
Ｈｉｐｐｕｒｉｃ  ａｃｉｄ（和光純薬）                          １００ｍＭ
Ｓａｒｃｏｓｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ（東洋紡）                    １０ＫＵ／Ｌ
Ｃａｔａｌａｓｅ（キッコーマンバイオケミファ）                １００ＫＵ／Ｌ
Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）            １０ｍＭ
Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（耐熱性酵素研究所）                                                             ５ＫＵ／Ｌ
第二試薬
２−[４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＨＥＰＥＳ］  ｐＨ８．０（同仁化学）
１００ｍＭ
４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ（埼京化成）                  ３ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）         ０．１％
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（東洋紡）                                  １０ＫＵ／Ｌ
Ｄ−ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ２（耐熱性酵素研究所）              ５ＫＵ／Ｌ
Ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ（ナカライテスク）                     ０．０９％
【００９７】
測定法は実施例１０と同様の方法にて測定した。
【００９８】
２．結果
キレート法との相関性を図９に示す。
既存法をＸ、本法をＹとして相関性を確認した。図９に示したように、Ｙ  ＝  １．０１７８Ｘ  −  ０．９２、相関係数０．９９８５と良好な結果が得られた。このことから本法はヒト生体採取試料中の亜鉛を正確に測定できているといえる。
【００９９】
＜実施例１２＞
Ｄ−ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ２を用いたヒト血清中の亜鉛測定
１．方法
亜鉛要求性酵素としてＤ−ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ２を用いた亜鉛測定試薬において、対応する基質としてＮ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎを用いた場合の、ヒト血清中に含まれる亜鉛測定の既存法（直接法）との相関性を確認した。なお、既存法としてキレート発色剤を用いた、アキュラスオートＺｎを使用した。試料および試薬は以下の通りである。
試料
インフォームドコンセントの得られたヒト血清（ｎ＝２０）を用いた。
第一試薬
２−[４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＨＥＰＥＳ］  ｐＨ８．０（同仁化学）
１００ｍＭ
ＴＯＯＳ（同仁化学）                                            １ｍＭ
Ｄ−ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ２（耐熱性酵素研究所）            ０．７５ＫＵ／Ｌ
第二試薬
２−[４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ［ＨＥＰＥＳ］  ｐＨ７．０（同仁化学）
１００ｍＭ
４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ（埼京化成）                  ３ｍＭ
Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（渡辺化学）         １００ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）          ０．１％
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（東洋紡）                                  １０ＫＵ／Ｌ
Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ（池田糖化工業）        ５ＫＵ／Ｌ
【０１００】
測定法は、以下のようにして行った。日立７１８０型自動分析装置を用い、試料５μＬと第一試薬１６０μＬとを３７℃、５分間混合した後、得られる液に、第二試薬４０μＬを加え同温度で５分間、発色反応させる。発色反応開始後の１分間当りの吸光度変化を主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。
【０１０１】
２．結果
キレート法との相関性を図１０に示す。
既存法をＸ、本法をＹとして相関性を確認した。図１０に示したように、Ｙ  ＝  ０．９９６９Ｘ  −  ９．８０２、相関係数０．８３４９と良好な結果が得られた。このことから本法はヒト生体採取試料中の亜鉛を正確に測定できているといえる。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明の測定方法によれば、生体試料中の他の微量元素の影響を受けることなく、選択的に亜鉛濃度を定量化することが可能である。かかる方法で得られた亜鉛濃度を用いて、患者の症状の重篤度及び治療効果の診断を手助けすることが可能である。
【図１】
2020043857.tif 000009
【図２】
2020043857.tif 000010
【図３】
2020043857.tif 000011
【図４】
2020043857.tif 000012
【図５】
2020043857.tif 000013
【図６】
2020043857.tif 000014
【図７】
2020043857.tif 000015
【図８】
2020043857.tif 000016
【図９】
2020043857.tif 000017
【図１０】
2020043857.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月30日(2019.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）生体採取試料に該生体採取試料内に存在しない亜鉛要求性酵素を加えるステップ、
（２）さらに該亜鉛要求性酵素の基質を加え、該亜鉛要求性酵素を反応させるステップ、
（３）該酵素反応物を検出定量するステップ及び
（４）得られた結果から、該生体試料中の亜鉛濃度を決定するステップ
を含み、前記亜鉛要求性酵素が、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸デアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．８１）である、生体試料中の亜鉛濃度測定方法
［ここでステップ（１）及び（２）は同時または連続してでもよい］。
【請求項２】
生体採取試料が血清又は血漿である、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記基質がＮ−アシルＤ−アミノ酸である、請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記Ｎ−アシルＤ−アミノ酸がアセチルＤ−アミノ酸である、請求項３に記載の測定方法。
【請求項５】
前記アセチルＤ−アミノ酸が、アセチルＤ−フェニルアラニン（Ａｃ―Ｄ−Ｐｈｅ）、アセチルＤ−メチオニン（Ａｃ―Ｄ−Ｍｅｔ）、アセチルＤ−ロイシン（Ａｃ―Ｄ−Ｌｅｕ）、及びアセチルＤ−バリン（Ａｃ―Ｄ−Ｖａｌ）からなる群から選択されるアセチルＤ−アミノ酸である、請求項４に記載の測定方法。
【請求項６】
前記酵素反応物がＤ−アミノ酸である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項７】
前記酵素反応物がＤ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｄ−Ｌｅｕ及びＤ−Ｖａｌからなる群から選択されるＤ−アミノ酸である、請求項６に記載の測定方法。
【請求項８】
前記ステップ（３）が、さらに
（３−１）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）を加え、Ｄ−アミノ酸を脱アミノ化し、α―ケト酸とアンモニア、及び過酸化水素を得るステップ；ならびに
（３−２）得られた過酸化水素の量から前記酵素反応物を検出定量するステップを含む、請求項６又は７に記載の測定方法。
【請求項９】
前記ステップ（３−２）がペルオキシダーゼとペルオキシダーゼ発色基質（色原体）を用いて、生成する色素の発色の検出を含む、請求項８に記載の測定方法。
【請求項１０】
前記ペルオキシダーゼ発色基質（色原体）が、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）と３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）とからなる発色基質（色原体）である請求項９に記載の測定方法。
【請求項１１】
色素の発色の検出を測定波長５４６ｎｍ〜７００ｎｍの吸光度にて行う請求項１０に記載の測定方法。
【請求項１２】
前記ステップ（３）が、さらに
（３−１）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）を加え、Ｄ−アミノ酸を脱アミノ化し、α―ケト酸とアンモニア、及び過酸化水素を得るステップ；ならびに
（３−２）得られたα―ケト酸の量から前記酵素反応物を検出定量するステップを含む、請求項６または７に記載の測定方法。
【請求項１３】
前記ステップ（３）が、さらに
（３−１）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）を加え、Ｄ−アミノ酸を脱アミノ化し、α―ケト酸とアンモニア、及び過酸化水素を得るステップ；ならびに
（３−２）得られたアンモニアの量から前記酵素反応物を検出定量するステップを含む、請求項６または７に記載の測定方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の測定方法に使用するためのキットであって、前記亜鉛要求性酵素とその基質を含むキット。
【請求項１５】
請求項８から１３のいずれか一項に記載の測定方法に使用するためのキットであって、前記亜鉛要求性酵素、その基質であるＮ−アシルＤ−アミノ酸、ならびにＤ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）を含むキット。
【請求項１６】
請求項９に記載の測定方法に使用するためのキットであって、前記亜鉛要求性酵素、その基質であるＮ−アシルＤ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）ならびにペルオキシダーゼとペルオキシダーゼ発色基質を含むキット。
【請求項１７】
請求項１０又は１１に記載の測定方法に使用するためのキットであって、前記亜鉛要求性酵素、その基質であるＮ−アシルＤ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）ならびにペルオキシダーゼと、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）と３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）とからなる発色基質（色原体）であるペルオキシダーゼ発色基質を含むキット。