(57)【要約】【課題】液体サンプル中の微生物などの粒子を収集し破砕する作業を、コンタミネーションのリスクを抑えつつ、簡便に行えるようにする。【解決手段】微生物ＤＮＡ抽出装置１０は、内部空間１７を有し、前記内部空間１７に連通するインレット１５及びアウトレット１６を備える容器１１と、前記内部空間内に設けられ、前記インレット１５から流入し前記アウトレット１６から流出する液体サンプル中の微生物を捕捉する第１フィルター２０と、前記内部空間１７内に配置され、前記第１フィルター２０に捕捉された前記微生物のＤＮＡを抽出するために前記微生物を破砕するビーズ３０と、を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部空間を有し、前記内部空間に連通するインレット及びアウトレットを備える容器と、
前記内部空間内に設けられ、前記インレットから流入し前記アウトレットから流出する液体サンプル中の微生物を捕捉する第１フィルターと、
前記内部空間内に配置され、前記第１フィルターに捕捉された前記微生物のＤＮＡを抽出するために前記微生物を破砕するビーズと、
を備える微生物ＤＮＡ抽出装置。
【請求項２】
前記第１フィルターは、前記内部空間を、前記インレット側の第１空間と前記アウトレット側の第２空間と区分けするように設けられ、
前記ビーズは、前記第１空間に配置されている
請求項１に記載の微生物ＤＮＡ抽出装置。
【請求項３】
前記ビーズが前記インレットから前記容器外へ脱落するのを防止する脱落防止部材を更に備える
請求項２に記載の微生物ＤＮＡ抽出装置。
【請求項４】
前記脱落防止部材は、前記第１フィルターよりも前記インレット側に設けられ、前記微生物を透過させるが前記ビーズを透過させない第２フィルターを含む
請求項３に記載の微生物ＤＮＡ抽出装置。
【請求項５】
前記内部空間から前記インレットを通って流出する内容物を収容できるように前記容器に着脱自在に装着される遠沈管を更に備える
請求項１から４のいずれか１項に記載の微生物ＤＮＡ抽出装置。
【請求項６】
前記インレットを塞ぐように着脱自在に装着された第１部材と、
前記アウトレットを塞ぐように着脱自在に装着された第２部材と、
を更に備える
請求項１から５のいずれか１項に記載の微生物ＤＮＡ抽出装置。
【請求項７】
前記第１フィルターは、ろ過孔径が０．１μｍから１μｍの範囲内である
請求項１から６のいずれか１項に記載の微生物ＤＮＡ抽出装置。
【請求項８】
前記ビーズは、直径が０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下である
請求項１から７のいずれか１項に記載の微生物ＤＮＡ抽出装置。
【請求項９】
内部空間を有し、前記内部空間に連通するインレット及びアウトレットを備える容器と、
前記内部空間内に設けられ、前記インレットから流入し前記アウトレットから流出する液体サンプル中の粒子を捕捉する第１フィルターと、
前記内部空間内に配置され、前記第１フィルターに捕捉された粒子を破砕するビーズと、
を備える粒子破砕装置。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれか１に記載の微生物ＤＮＡ抽出装置の使用方法であって、
前記インレットから注入された液体サンプル中の微生物を前記第１フィルターによって捕捉する工程と、
前記内部空間に溶液を保持させる工程と、
前記容器を振とうさせることで、前記第１フィルターによって捕捉された前記微生物を前記内部空間内において前記ビーズによって破砕する工程と、
を含む使用方法。
【請求項１１】
前記インレットを通って流出する内容物を収容できるように前記容器に遠沈管を装着する工程と、
前記容器に装着された前記遠沈管を遠心分離機にかけることで、前記インレットから前記内部空間内の内容物を遠心力により前記遠沈管に移行させ、前記遠沈管内の内容物の遠心分離を行う遠心分離工程と、
を更に含む請求項１０に記載の使用方法。
【請求項１２】
前記遠心分離工程では、前記内部空間内のビーズを含む前記内容物が遠心力により前記遠沈管に移行する
請求項１１に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、微生物ＤＮＡ抽出装置、フィルター装置、及び微生物ＤＮＡ抽出装置の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
水中に存在する微生物は目には見えないが、水域生態系の動態・維持に大きな貢献をしている。例えば、有害物質の分解・光合成を介した無機物質の有機化・大型生物への病原性などの機能はよく知られている。これらの役割をよく理解するために、水中にいる微生物の検出方法は非常に重要である。
【０００３】
現在、水(やその他の環境中)からの微生物検出はＤＮＡを利用した方法が主流である。この方法では、まず水サンプルを収集し、ろ過・濃縮などの前処理を経てＤＮＡ抽出を行う。
【０００４】
ここで、非特許文献１は、ろ過用のカートリッジ型フィルターを、水中に浮遊する魚類ＤＮＡの捕捉に利用することを開示している。カートリッジ型フィルター（例えば、Sterivex（登録商標）,メルクミリポア）は、カートリッジ内にフィルターが収納されている。フィルターがカートリッジ内に収納されていることで、外部からのコンタミネーションを抑制することが可能である。非特許文献１では、カートリッジ内部に細胞融解溶液(Lysis buffer)を入れることで、ＤＮＡを抽出する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Miya et al. (2016) “Use of a filter cartridge for filtration of water samples and extraction of environmental DNA” Journal of Visualized Experiments 117 DOI:10.3791/54741
【発明の概要】
【０００６】
非特許文献１の方法では、硬い細胞壁を持つ微生物を検出できない可能性がある。すなわち、水中に浮遊する魚類ＤＮＡとは異なり、細胞壁を持つ微生物の場合、細胞融解溶液だけではＤＮＡを抽出するのが困難なことがある。
【０００７】
また、カートリッジからフィルターを取り出し、フィルターに捕捉された微生物をビーズ破砕することで、ＤＮＡを効率的に抽出する方法も考えられるが、この場合、フィルター取り出しのため、カートリッジの破壊が必要となる。カートリッジの破壊は、手間がかかり煩雑である。しかも、カートリッジの破壊によりフィルターが外気に直接晒され、他の微生物等が混入するコンタミネーションのリスクが増大する。
【０００８】
そこで、液体サンプル中の微生物などの粒子を収集し破砕する作業を、コンタミネーションのリスクを抑えつつ、簡便に行えることが望まれる。
【０００９】
本開示の一側面は、微生物ＤＮＡ抽出装置である。微生物ＤＮＡ抽出装置は、内部空間を有し、前記内部空間に連通するインレット及びアウトレットを備える容器と、前記内部空間内に設けられ、前記インレットから流入し前記アウトレットから流出する液体サンプル中の微生物を捕捉する第１フィルターと、前記内部空間内に配置され、前記第１フィルターに捕捉された前記微生物のＤＮＡを抽出するために前記微生物を破砕するビーズと、を備える。
【００１０】
本開示の他の側面は、粒子破砕装置である。上記の微生物ＤＮＡ抽出装置は、微生物ＤＮＡの抽出に限らず、液体サンプル中の粒子を捕捉し、捕捉された粒子を破砕するためにも用いることができる。すなわち、粒子破砕装置は、内部空間を有し、前記内部空間に連通するインレット及びアウトレットを備える容器と、前記内部空間内に設けられ、前記インレットから流入し前記アウトレットから流出する液体サンプル中の粒子を捕捉する第１フィルターと、前記内部空間内に配置され、前記第１フィルターに捕捉された粒子を破砕するビーズと、を備える。
【００１１】
本開示の他の側面は、微生物ＤＮＡ抽出装置の使用方法である。使用方法は、前記インレットから注入された液体サンプル中の微生物を前記第１フィルターによって捕捉する工程と、前記内部空間に溶液を保持させる工程と、前記容器を振とうさせることで、前記第１フィルターによって捕捉された前記微生物を前記内部空間内において前記ビーズによって破砕する工程と、を含む。
【００１２】
更なる詳細は、後述の実施形態として説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、微生物ＤＮＡ抽出装置の断面図である。
【図２】図２は、微生物ＤＮＡ抽出装置の外観側面図である。
【図３】図３は、微生物ＤＮＡ抽出装置を用いた微生物ＤＮＡ抽出及び分析の手順を示すフローチャートである。
【図４】図４は、遠沈管が装着された微生物ＤＮＡ抽出装置の遠心分離作業を示す説明図である。
【図５】図５は、微生物ＤＮＡ抽出装置の第１変形例を示す部分断面図である。
【図６】図６は、微生物ＤＮＡ抽出装置の第２変形例を示す断面図である。
【図７】図７は、実験に用いた装置の写真である。
【図８】図８は、実験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜１．微生物ＤＮＡ抽出装置、粒子破砕装置、及び微生物ＤＮＡ抽出装置の使用方法の概要＞
【００１５】
（１）実施形態に係る微生物ＤＮＡ抽出装置は、内部空間を有し、前記内部空間に連通するインレット及びアウトレットを備える容器を備える。実施形態に係る装置はさらに、前記内部空間内に設けられ、前記インレットから流入し前記アウトレットから流出する液体サンプル中の微生物を捕捉する第１フィルターを備える。第１フィルターが容器内に設けられていることで、第１フィルターが直接外部に晒されず、コンタミネーションのリスクを抑制できる。ここで、液体サンプルとは、例えば、水サンプルであり、水サンプルは、例えば、河川・湖・海など微生物が生息する水域から採取される。液体サンプルは、第１フィルターによってろ過され、ろ過の際に、微生物は第１フィルターに捕捉される。実施形態に係る装置はさらに、前記内部空間内に配置され、前記第１フィルターに捕捉された前記微生物のＤＮＡを抽出するために前記微生物を破砕するビーズ、を備える。破砕ビーズを備えることで、微生物が硬い細胞壁を有していても、微生物を破砕でき、効率的にＤＮＡを抽出できる。
【００１６】
（２）前記第１フィルターは、前記内部空間を、前記インレット側の第１空間と前記アウトレット側の第２空間と区分けするように設けられ、前記ビーズは、前記第１空間に配置されているのが好ましい。微生物は、主に、第１フィルターの第１空間側で捕捉されるため、ビーズが第１空間に配置されていることで、効率的に微生物を破砕できる。
【００１７】
（３）実施形態に係る装置は、前記ビーズが前記インレットから前記容器外へ脱落するのを防止する脱落防止部材を更に備えることができる。
【００１８】
（４）前記脱落防止部材は、前記第１フィルターよりも前記インレット側に設けられ、前記微生物を透過させるが前記ビーズを透過させない前記第２フィルターを含むことができる。
【００１９】
（５）実施形態に係る装置は、前記内部空間から前記インレットを通って流出する内容物を収容できるように前記容器に着脱自在に装着される遠沈管を更に備えることができる。
【００２０】
（６）実施形態に係る装置は、前記インレットを塞ぐように着脱自在に装着された第１部材と、前記アウトレットを塞ぐように着脱自在に装着された第２部材と、を更に備えることができる。第１部材及び第２部材により、装置の取り扱いの簡便性が向上するとともに、コンタミネーションのリスクをより抑制できる。
【００２１】
（７）前記第１フィルターは、ろ過孔径が０．１μｍから１μｍの範囲内であるのが好ましい。
【００２２】
（８）前記ビーズは、直径が０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下であるのが好ましい。
【００２３】
（９）実施形態に係る装置は、粒子破砕装置としてとらえることもできる。粒子は、例えば、微生物であってもよいが、微生物以外の他の粒子、例えば土壌粒子そのもの、硬い外骨格を持つミジンコなど微小な無脊椎動物、細胞壁を持つ植物プランクトンなど、であってもよい。粒子破砕装置は、内部空間を有し、前記内部空間に連通するインレット及びアウトレットを備える容器と、前記内部空間内に設けられ、前記インレットから流入し前記アウトレットから流出する液体サンプル中の粒子を捕捉する第１フィルターと、前記内部空間内に配置され、前記第１フィルターに捕捉された粒子を破砕するビーズと、を備えることができる。
【００２４】
（１０）実施形態に係る方法は、前記微生物ＤＮＡ抽出装置の使用方法である。使用方法は、前記インレットから注入された液体サンプル中の微生物を前記第１フィルターによって捕捉する工程と、前記内部空間に溶液を保持させる工程と、前記容器を振とうさせることで、前記第１フィルターによって捕捉された前記微生物を前記内部空間内において前記ビーズによって破砕する工程と、を含む。溶液は、例えば、細胞融解溶液を含むのが好ましい。容器の振とうにより、微生物をビーズにより破砕することができる。
【００２５】
（１１）使用方法は、前記インレットを通って流出する内容物を収容できるように前記容器に遠沈管を装着する工程と、前記容器に装着された遠沈管を遠心分離機にかけることで、前記インレットから前記内部空間内の内容物を遠心力により前記遠沈管に移行させ、前記遠沈管内の内容物の遠心分離を行う遠心分離工程と、を更に含むことができる。
【００２６】
（１２）前記遠心分離工程では、前記内部空間内のビーズを含む前記内容物が遠心力により前記遠沈管に移行するのが好ましい。
【００２７】
＜２．微生物ＤＮＡ抽出装置、粒子破砕装置、及び微生物ＤＮＡ抽出装置の使用方法の例＞
【００２８】
＜２．１  微生物ＤＮＡ抽出装置（粒子破砕装置）の構造＞
【００２９】
図１及び図２は、微生物ＤＮＡ抽出装置１０を示している。微生物ＤＮＡ抽出装置１０は、液体サンプル中の微生物を捕捉し、捕捉された微生物を破砕するために用いられる。なお、図１及び図２に示す装置１０は、微生物以外の粒子を捕捉し、捕捉された粒子を破砕するために用いてもよい。
【００３０】
装置１０は、容器（カートリッジ）１１を備える。容器１１は、中空円筒状の容器本体１３と、容器本体１３の長手方向の一端側に設けられたインレット１５と、長手方向の他端側に設けられたアウトレット１６と、を備える。容器本体１３は、円筒部１３１と、円筒部１３１の長手方向両端に設けられた端面部１３２，１３３と、を備える。インレット１５は、容器本体１３よりの細径の円筒状であり、端面部１３２から突出状に形成されている。インレット１５は、液体サンプルを容器１１の内部空間１７に流入させる流入口となる開口１５１を備える。アウトレット１６は、容器本体１３よりも細径の円筒状であり、端面部１３３から突出状に形成されている。アウトレット１６は、内部空間１７から液体サンプルを流出させる流出口となる開口１６１を備える。
【００３１】
容器１１は、例えば、合成樹脂製であり、より具体的には、強化プラスチック製である。容器１１は、透明であってもよいし、不透明であってもよい。容器１１は、内部空間１７への紫外線の透過を減少又は遮るための処理（例えば、コーティング処理など）が施されていてもよい。
【００３２】
容器本体１３の内部には、容器本体１３の内部空間１７を外径側空間１７１と内径側空間１７２とに仕切るように形成されたコア部１９を備える。コア部１９は、内部空間１７内において、端面部１３３からインレット１５側へ立設された中空の円筒部１９１を備える。円筒部１９１は、例えば、合成樹脂製であり、容器１１と同様に、強化プラスチック製であるのが好ましい。
【００３３】
外径側空間１７１は、インレット１５と連通している。したがって、インレット１５から流入した液体は、まず、外径側空間１７１に入る。
【００３４】
円筒部１９１には、円筒部１９１の外から内への液体の通過を許容するための複数の貫通孔１９３が形成されている。したがって、外径側空間１７１の液体は、貫通孔１９３を通って、内径側空間１７２へ移動することができる。内径側空間１７２は、アウトレット１６と連通している。したがって、インレット１５から流入した液体は、外径側空間１７１、貫通孔１９３、内径側空間１７２を順に通って、アウトレット１６から流出する。
【００３５】
なお、円筒部１９１の上部には通気口フィルター１９２が設けられている。通気口フィルター１９２は、例えば、疎水性のベントフィルター膜によって構成される。通気口フィルター１９２のフィルター孔径は、例えば、０．１μｍである。
【００３６】
装置１０は、容器１１の内部空間１７内に設けられたフィルター（第１フィルター）２０を備える。フィルター２０は、液体サンプル中の微生物を捕捉する。実施形態において、フィルター２０は、コア部１９の円筒部１９１表面に張り付けられた膜状のろ過フィルターによって構成されている。フィルター２０は多孔質膜又は繊維膜であるのが好ましい。フィルター２０は、例えば、フッ素樹脂製であり、より好ましくは、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）製である。
【００３７】
フィルター２０のろ過孔径は、微生物を捕捉する観点から適切な大きさに設定される。ろ過孔径の好ましい範囲は、例えば、０．１μｍから１μｍである。微生物の大きさは、１μｍ前後又は数μｍ程度であることが多いため、捕捉される微生物の大きさよりも小さいろ過孔径のフィルターを採用することで、微生物を効率的に捕捉できる。例えば、ろ過孔径が、１μｍ以下であれば、１μｍより大きい微生物を捕捉できるため、好ましく、０．５μｍ以下であれば、０．５μｍより大きい微生物を捕捉できるため、より好ましく、０．３μｍ以下であれば、ほとんどの微生物を捕捉でき、さらに好ましい。なお、ろ過孔径の好適な一例は、０．２２μｍである。０．２２μｍのフィルター２０としては、例えば、メルク社のデュラポア（Durapore：登録商標）メンブレンフィルタ（ポアサイズ０．２２μｍ，ＰＶＤＦ）を用いることができる。
【００３８】
フィルター２０は、複数の貫通孔１９３全てを覆うように、円筒部１９１の表面に張り付けられている。フィルター２０によって、容器１１の内部空間１７は、外径側空間（第１空間）１７１と内径側空間（第２空間）１７２とに区分けされる。したがって、インレット１５から流入した液体サンプルに含まれる微生物は、フィルター２０の外径側空間１７１側表面付近において捕捉され、フィルター２０を透過できない。フィルター２０によってろ過された液体サンプルは、貫通孔１９３を通って、内径側空間１７２に流入し、アウトレット１６から容器１１外へ流出する。
【００３９】
なお、前述の通気口フィルター１９２が設けられていることで、液体サンプルが、外径側空間１７１側から内径側空間１７２側へ流入した際に、内径側空間１７２内の空気を、通気口フィルター１９２から外径側空間１７１へ逃がすことができる。これにより、液体サンプルの流れが円滑になる。また、通気口フィルター１９２にも微生物が捕捉されることがある。
【００４０】
装置１０は、容器１１の内部空間１７内に配置されたビーズ３０を備える。ビーズ３０は、フィルター２０，１９２に捕捉された微生物などの粒子を破砕すべく容器１１内に収納されている。実施形態において、ビーズ３０は、内部空間１７のうち、外径側空間（第１空間）１７１に配置され、内径側空間（第２空間）１７２には配置されていない。実施形態においては、微生物は、フィルター２０の外径側空間１７１側の表面付近において捕捉されるため、破砕用ビーズ３０は、外径側空間（第１空間）１７１に配置されていれば足りる。
【００４１】
なお、内部空間１７は、フィルター２０によって外径側空間１７１と内径側空間１７２とに区切られており、ビーズ３０は、外径側空間１７１内を自由に移動できるが、外径側空間１７１にあるビーズ３０は、内径側空間１７２へは移動できない。
【００４２】
ビーズ３０は、微生物などの粒子を効率的に破砕すべく、セラミックス又はガラスなどの硬質材料によって構成されている。ビーズ３０径は、破砕対象粒子（ここで、微生物）を効率的に破砕する観点から、適切な大きさに設定される。ビーズ３０の直径の好ましい範囲は、例えば、０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下である。ビーズ３０は、一般に、ビーズ直径の１／１０００程度から１／１０程度の大きさの粒子を破砕することができる。したがって、ビーズ直径が、０．１ｍｍであれば、０．１μｍ程度から１０μｍ程度の粒子を破砕できる。また、ビーズ直径が、１ｍｍであれば、１μｍ程度から１００μｍ程度の粒子を破砕できる。微生物の大きさは、１μｍ前後又は数μｍ程度であることが多いため、ビーズ直径が、０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下であれば、ほとんどの微生物を効率的に破砕できる。
【００４３】
ビーズ直径のより好ましい範囲の下限は、０．３ｍｍであり、さらに好ましい下限は０．４ｍｍである。ビーズ直径のより好ましい範囲の上源は、０．７ｍｍであり、さらに好ましい上限は０．６ｍｍである。ビーズ直径の好適な一例は、０．５ｍｍである。直径０．５ｍｍのビーズ３０としては、例えば、ニッカトー、ジルコニアボール（型番：ＹＴＺ−０．５）を用いることができる。
【００４４】
ビーズ３０は、容器１１内においてビーズ３０が配置される空間（ここでは、外径側空間１７１）の体積Ａの５０％以下の体積を占める量が、容器１１内に収納されているのが好ましい。ビーズ３０は、より好ましくは、体積Ａの３０％以下の体積、さらに好ましくは、体積Ａの２０％以下の体積を占める量が収納されているのが好ましい。ビーズ３０は、効率的な破砕のため、体積Ａの１％以上の体積、より好ましくは、体積Ａの５％以上の体積、さらに好ましくは、体積の１０％以上の体積を占める量が収納されているのが好ましい。
【００４５】
図２に示すように、インレット１５には、インレットキャップ（脱落防止部材；第１部材）５０が着脱自在に装着されている。インレットキャップ５０は、インレット１５に嵌合されて、インレット１５を塞ぐ。インレットキャップ５０が装着されていることで、ビーズ３０が、インレット１５から容器１１外へ脱落するのが防止される。また、インレットキャップ５０は、容器１１内に注入された溶液がインレット１５から流出するのを防止できる。さらに、インレットキャップ５０は、インレット１５からの異物の進入を防止でき、コンタミネーションの抑制に寄与する。
【００４６】
アウトレット１６には、アウトレットキャップ（第２部材）６０が着脱自在に装着されている。アウトレットキャップ６０は、アウトレット１６に嵌合されて、アウトレット１６を塞ぐ。アウトレットキャップ６０は、容器１１内に注入された溶液がアウトレット１６から流出するのを防止できる。さらに、アウトレットキャップ６０は、アウトレット１６からの異物の進入を防止でき、コンタミネーションの抑制に寄与する。
【００４７】
なお、キャップ５０，６０を容器１１へ着脱自在に装着するための構造としては、上述の嵌合構造に限られず、ねじ構造など、着脱自在に装着するための公知の様々な構造を採用することができる。
【００４８】
実施形態においては、装置１０は、容器１１に着脱自在に装着される遠沈管（遠心菅）４０を備える。後述するように、遠沈管４０は、液体サンプルを容器１１に注入する際には取り外される。遠沈管４０は、後述する遠心分離工程において容器１１に装着される。遠沈管４０は、例えば、マイクロチューブである。容器１１のインレット１５側の端面１３２は、遠沈管４０の開口に嵌入される嵌合部１３２Ａを備えている。嵌合部１３２Ａは、インレット１５の基端付近において端面１３２から突出状に形成されている。嵌合部１３２Ａは、遠沈管４０の内面とほぼ同径同大に形成されており、嵌合部１３２Ａが、遠沈管４０の開口から挿入されることで、遠沈管４０が容器１１に装着される。遠沈管４０が容器１１に装着された状態においては、遠沈管４０内部にインレット１５が位置する。したがって、遠沈管４０は、容器１１の内部空間１７からインレット１５を通って流出する溶液を、その内部に収容することができる。
【００４９】
なお、遠沈管４０を容器１１へ着脱自在に装着するための構造としては、上述の嵌合構造に限られず、ねじ構造など、着脱自在に装着するための公知の様々な構造を採用することができる。
【００５０】
＜２．２  ＤＮＡ抽出＞
【００５１】
図３は、装置１０を利用したＤＮＡ抽出の工程を示している。まず、湖、河川、海などの水サンプルの採取地において、水サンプルを採取する。水サンプルには、微生物が含まれる。採取された水サンプルを、ビーズ３０入りの容器１１へ注入する（ステップＳ１１）。水サンプルの容器１１への注入には、図示しない注入器（シリンジ）を用いる。注入に先立って、容器１１からキャップ５０，６０が取り外される。なお、遠沈管４０が容器１１に装着されている場合には、遠沈管４０も容器１１から取り外される。続いて、容器１１のインレット１５と水サンプルを保持した注入器の先端とを接続する。そして、注入器のプランジャの押操作により、注入器からインレット１５を通って容器１１内へ水サンプルが注入される。
【００５２】
図１に示すように、インレット１５から注入された水サンプルは、まず、外径側空間１７１に流入し、フィルター２０及び貫通孔１９３を通って、内径側空間１７２へ移動する。この際、水サンプルは、フィルター２０によってろ過される。すなわち、水サンプル中の微生物が、フィルター２０によって捕捉される。ろ過後の水サンプルは、内径側空間１７２からアウトレット１６を通って、容器１１外へ排出される。
【００５３】
フィルター２０による微生物の捕捉を、水サンプルの採取地で行った場合、その後のＤＮＡ抽出処理を直ちに行えないことが多い。そのような場合、容器１１内に、組織保存試薬を入れ、微生物の組織内に組織保存試薬を浸透させる。また、インレット１５にインレットキャップ５０を装着するとともに、アウトレット１６にアウトレットキャップ６０を装着する。これにより、容器１１内部が密閉状態となり、内部からの溶液・ビーズ等の流出が防止されるとともに、外部からの異物混入が防止される。この状態で、容器１１を、ＤＮＡ抽出を行う施設（例えば、実験室）に持ち帰る。
【００５４】
ＤＮＡ抽出を行う際には、組織保存試薬が使用されている場合は組織保存試薬をアウトレット１６から排出した後、容器１１からキャップ５０，６０を取り外し、容器１１内へ細胞溶解溶液を注入する（ステップＳ１２）。細胞溶解溶液は、例えば、インレット１５から注入される。そして、必要に応じて、キャップ５０，６０を再び容器１１へ装着する。
【００５５】
その後、容器１１を振とうする（ステップＳ１３）。容器１１を振とうすることで、容器１１内で、フィルター２０によって捕捉された微生物が、容器１１内のビーズ３０によりビーズ破砕される。振とうは、ボルテックスミキサーなどの機器を用いてもよいし、手動で行ってもよい。
【００５６】
振とう後の容器１１内の内容物（ビーズ、細胞溶解溶液、破砕された微生物など）は、マイクロチューブなどの遠沈管４０に移され、遠心分離機により遠心分離される。ただし、本実施形態では、効率化のため、内容物のマイクロチューブ４０への移行と遠心分離とを並行して行う。すなわち、まず、インレット１５からインレットキャップ５０を取り外し、振とう後の容器１１の嵌合部１３２Ａにマイクロチューブ４０を装着する（ステップＳ１４；図４参照）。そして、容器１１ごとマイクロチューブ４０を遠心分離機にセットする（ステップＳ１５）。このとき、インレット１５からマイクロチューブ４０の底部４０Ａに向かう方向が、遠心力が働く方向と一致するように、遠心分離機にセットされる。そして、遠心分離を実行する（ステップＳ１６）。
【００５７】
図４に示すように、遠心力により、容器１１内のビーズを含む内容物は、容器１１からマイクロチューブ４０へ移行する。さらに、遠心力により、ビーズ３０などの異物・不要物がマイクロチューブ４０の底部４０Ａに沈降する。遠心後に容器１１からマイクロチューブ４０を取り外し、上清をマイクロチューブ４０から回収することで、ＤＮＡとビーズ分離が達成される。
【００５８】
上清として回収されたＤＮＡは、さらに精製され、精製後に、溶出バッファを用いて溶出され、公知の方法によりＤＮＡ分析される（ステップＳ１７）。
【００５９】
＜２．３  変形例＞
【００６０】
＜２．３．１  第１変形例＞
【００６１】
図５は、第１の変形例に係る装置１０を示している。第１の変形例に係る装置１０は、ビーズ３０の脱落防止部材として、フィルター（第２フィルター）８０を備える。フィルター８０は、例えば、微生物などの捕捉対象粒子を透過させるが、ビーズ３０を透過させない程度の大きさの通過孔を有する網目構造体により構成される。フィルター８０は、フィルター２０よりもインレット１５側の範囲に設けられている。フィルター８０は、インレットキャップ５０がインレット１５に装着されていなくても、ビーズ３０が容器１１外へ脱落するのを防止することができる。また、フィルター８０は、微生物の大きさに比べて十分に大きな通過孔を有しているため、インレット１５からの微生物の流入出を疎外しない。
【００６２】
フィルター８０が設けられていると、微生物のビーズ破砕後に、容器１１から破壊された微生物を含む溶液をインレット１５から排出させる際に、ビーズ３０は容器１１内に残る。したがって、前述のような遠心分離によるビーズ分離の必要がなくなる。
【００６３】
図５に示す装置１０は、更に、液体サンプルを容器１１へ注入する際に（ステップＳ１１）、液体サンプル中の比較的大きな異物が容器１１内へ入るのを防止する第３フィルター構造体９０を備える。第３フィルター構造体９０は、インレット１５に着脱自在に装着される筒状体９１と筒状態の内部に設けられた第３フィルター９２とを備える。第３フィルター構造体９０をインレット１５に装着した状態で、液体サンプルを容器１１へ注入すると（ステップＳ１１）、比較的大きな異物が容器１１内へ入るのを防止できる。液体サンプル注入後は、第３フィルター構造体９０を取り外せばよい。第１変形例において、説明を省略した点は、図１及び図２に示す装置１０と同様である。
【００６４】
＜２．３．２  第２変形例＞
【００６５】
図６は第２の変形例に係る装置１０を示している。図１に示す装置１０では、容器１１の内部空間１７が、フィルター２０によって径方向に２つの空間１７１，１７２に区分けされていたのに対して、第２の変形例に係る装置１０では、容器１１の内部空間１７が、インレット１５からアウトレットへ向かう方向（円筒状容器１１の軸方向）に２つの空間１７１，１７２に区分けされている。
【００６６】
すなわち、第２変形例に係る装置１０において、円筒状の容器１１が、インレット１５を備える第１容器部材１１Ａとアウトレット１６を備える第２容器部材１１Ｂとを接続して構成されている。微生物などの粒子を捕捉するフィルター２０は、第１容器部材１１Ａと第２容器部材１１Ｂによって挟み込んで保持されている。フィルター２０は、容器１１の内部空間１７を、インレット１５側の第１空間１７１と、アウトレット１６側の第２空間１７２とに区分けしている。第２変形例に係る装置１０においても、ビーズ３０は、インレット１５側の第１空間１７１に配置されている。
【００６７】
インレット１５から注入された液体サンプルは、第１空間１７１、フィルター２０、第２空間１７２を通って、アウトレット１６から排出される。液体サンプルは、フィルター２０によってろ過され、液体サンプル中の微生物は、フィルター２０によって捕捉される。捕捉された微生物は、振とうによりビーズ破砕される。
【００６８】
＜２．４  実験＞
【００６９】
図１に示す装置１０と類似の構造の装置１０を実験に用いた。図７は、実験に用いた装置１０を示している。実験に用いた装置１０は、液体のろ過に用いられる市販のカートリッジ型ろ過フィルターに、破砕用のジルコニアビーズを投入し、カートリッジのインレット及びアウトレットにキャップを装着することで製作した。
市販のカートリッジ型ろ過フィルターとして、図７（ａ）に示すφ０．２２μｍ  Ｓｔｅｒｉｖｅｘ（登録商標）  フィルターカートリッジ(SVGV010RS, Merck Millipore, Darmstadt, Germany)を用いた。このカートリッジ型ろ過フィルターは、インレット１５及びアウトレット１６を備える容器１１内にフィルター２０が設けられた構造を持つ。このカートリッジ型ろ過フィルターは、ポアサイズ０．２２μｍろ過フィルター（ＰＶＤＦ製）２０を備える。
【００７０】
このカートリッジ型ろ過フィルターのインレット１５から直径０．５ｍｍのジルコニアビーズ３０を投入した。ジルコニアビーズ３０として、ニッカトー、ジルコニアボール（型番：ＹＴＺ−０．５）を用いた。
【００７１】
カートリッジ型ろ過フィルターのインレット１５には、インレット１５への装着に適したサイズの閉鎖用プラグをインレットキャップ５０として装着した。同様に、アウトレット１６には、アウトレット１６への装着に適したサイズの閉鎖用プラグをアウトレットキャップ６０として装着した（inlet cap = Luer Fitting VRMP6; outlet cap = Luer Fitting VRSP6, AsOne, Osaka, Japan）。
【００７２】
図１０（ｂ）は、カートリッジ型ろ過フィルター内に、ビーズ３０が投入され、インレット１５及びアウトレット１６にキャップ５０，６０が装着されて構成された装置１０を示している。図１０（ｃ）は、図１０（ｂ）の拡大写真であり、投入されたビーズ３０を示している。
【００７３】
なお、実験に用いた装置１０における容器１１は、マイクロチューブ４０を嵌合させるための構造は有していない。
【００７４】
水サンプルを、川サイト及び湖サイトにて採取した。川サイトは、日本国滋賀県の天神川（35° 4’ 19’’ N, 135° 55’ 59’’ E）であり、湖サイトは同じく滋賀県の琵琶湖（34° 55’ 45’’ N, 135° 56’ 41’’ E）である。
【００７５】
実験では、ＤＮＡ抽出を３つの試験方法にて行った。第１の試験方法（実施例）では、図７（ｂ）に示すビーズ入りのカートリッジ型ろ過フィルターを用いて微生物を捕捉する。第２の試験方法（比較例）では、図７（ａ）に示すビーズなしのカートリッジ型ろ過フィルターを用いて微生物を捕捉する。第３の試験方法（比較例）では、図７（ａ）に示すビーズなしのカートリッジ型ろ過フィルターを用いて微生物を捕捉した後、容器１１であるカートリッジを破壊し、内部のろ過フィルター２０を取り出し、Power Soil（登録商標） DNA isolation kit(QIAGEN)を用いてＤＮＡを抽出する。
【００７６】
第１の試験方法では、採取した水サンプルを、採取地にて、ビーズ入りのカートリッジ型ろ過フィルターに注入し、ろ過によって微生物をフィルター２０に捕捉させた。ろ過後、２ｍｌの組織保存試薬（RNAlater solution, ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA）を容器へ入れ、４°Ｃに維持しつつ、実験室へ持ち帰った。
【００７７】
第２の試験方法及び第３の試験方法でも、ろ過に用いるのがビーズなしのカートリッジ型ろ過フィルターである以外は、採取地での作業は、第１の試験方法と同様に行った。
【００７８】
第１の試験方法及び第２の試験方法では、ＤＮＡ抽出に、DNeasy（登録商標） Blood and Tissue Kit(QIAGEN)を用いた。第３の試験方法では、ＤＮＡ抽出に、Power Soil（登録商標） DNA isolation kit(QIAGEN)を用いた。いずれの試験方法でも、まず、実験室に持ち帰ったカートリッジ型ろ過フィルターから、組織保存試薬を吸引により除去し、洗浄水により洗浄した。
【００７９】
第２の試験方法では、非特許文献１に記載されているのと同様の方法で、ＤＮＡを抽出する。すなわち、細胞融解溶液などの溶液をカートリッジ内部に入れ、ＤＮＡを抽出する。一方、第１の試験方法では、細胞溶解液などの溶液をカートリッジ内部に入れた後、ビーズ入りのカートリッジ型ろ過フィルターをボルテックスミキサーにて激しく振とうする（180sec 3200rpm）。この振とうにより、フィルター２０にて捕捉された微生物が破砕され、ＤＮＡが効率的に抽出される。
【００８０】
第１の試験方法及び第２の試験方法では、ＤＮＡ抽出の後、カートリッジ型ろ過フィルターの内容物がインレット１５からマイクロチューブに移される。第１の試験方法では、マイクロチューブに移される内容物はビーズを含む。マイクロチューブは、遠心分離機にセットされ、遠心分離される。遠心分離後、上清をマイクロチューブ４０から回収する。その際に、第１の試験方法では、ビーズが分離される。回収されたＤＮＡは、DNeasy（登録商標） Blood and Tissue Kit(QIAGEN)の添付文書に記載されたプロトコールに従って、精製・溶出される。
【００８１】
第３の試験方法では、組織保存試薬の除去・洗浄後、容器１１であるカートリッジを破壊し、微生物が捕捉されている内部のフィルター２０を取り出した。膜状のフィルター２０を、切断により細片化した。細片化したフィルター２０からPowerSoil（登録商標） DNA Isolation Kitを用いてＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ抽出は、PowerSoil（登録商標） DNA Isolation Kitの添付文書に記載されたプロトコールに従って行った。PowerSoil（登録商標） DNA Isolation KitによるＤＮＡ抽出工程には、微小ビーズによって、フィルター２０上の微生物を破砕する工程を含んでいる。この第３の試験方法では、カートリッジの破壊が必要となり煩雑である。しかも、カートリッジの破壊によりフィルターが外気に直接晒され、他の微生物等が混入するコンタミネーションのリスクが増大する。
【００８２】
各試験方法で抽出されたＤＮＡを、ＰＣＲを用いてＤＮＡ分析した。図８は、その結果を示す。図８において、「Beads」は第１の試験方法を示し、「No Beads」は第２の試験方法を示し、「PowerSoil」は、第３の試験方法を示す。また、図８において、「lake」は、湖サイトで採取した水サンプルの分析結果を示し、「river」は川サイトで採取した水サンプルの分析結果を示す。図８の分析結果は、試験方法特異的に検出された微生物の門（phylum）ごとのＤＮＡ量を示す。すなわち、それぞれのパネルは各試験方法を用いたときにしか検出されなかった(他の方法では検出できなかった)微生物の門を示している。
【００８３】
図８に示すように、第１の試験方法（「Beads」:実施例）では、第２の試験方法（「No Beads」:比較例）及び第３の試験方法（「PowerSoil」：比較例）に比べて、検出可能な微生物の種類が増加した。また、いくつかの微生物種は、第１の試験方法でのみ検出され、他の試験方法では検出されなかった。例えば、Bacteroidetes門及びCyanobacteria門に属するいくつかの微生物は、第１の試験方法でのみ検出された。また、DNAの抽出量や微生物の総検出種数も第１の試験方法で増大した。これらは、ビーズ破砕による効果であると考えることができる。したがって、第１試験方法は、微生物ＤＮＡの効率的抽出に非常に有用である。
【００８４】
＜３．付記＞
本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、様々な変形が可能である。
【符号の説明】
【００８５】
１０      ：微生物ＤＮＡ抽出装置
１１      ：容器
１１Ａ    ：第１容器部材
１１Ｂ    ：第２容器部材
１３      ：容器本体
１５      ：インレット
１６      ：アウトレット
１７      ：内部空間
１９      ：コア部
２０      ：フィルター
３０      ：ビーズ
４０      ：遠沈管
４０Ａ    ：底部
５０      ：インレットキャップ（第１部材）
６０      ：アウトレットキャップ（第２部材）
８０      ：フィルター
９０      ：第３フィルター構造体
９１      ：筒状体
９２      ：第３フィルター
１３１    ：円筒部
１３２    ：端面部
１３２    ：端面
１３２Ａ  ：嵌合部
１３３    ：端面部
１５１    ：開口
１６１    ：開口
１７１    ：第１空間
１７２    ：第２空間
１９１    ：円筒部
１９２    ：通気口フィルター
１９３    ：貫通孔
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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