(57)【要約】【課題】骨折治癒の遅延を予測及び予防するための方法、システム及びキットの提供。【解決手段】骨折治癒の遅延を処置又は治療する方法において使用するためのＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの阻害剤であって、該阻害剤は、選択的にＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αに結合可能であるリガンドであり、ＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの生物学的作用を抑止又は抑制可能である、阻害剤。また、骨折治癒の遅延を処置又は治療する方法において使用するための活性化ＣＤ８＋細胞の阻害剤であって、該阻害剤は、選択的に活性化ＣＤ８Ｔ細胞の細胞表面に結合可能であり、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の生物学的作用を抑止又は抑制可能である、阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨折治癒の遅延を処置又は治療する方法において使用するためのＩＦＮ−ガンマ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１５７９）又はＴＮＦ−α（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１３７５）の阻害剤であって、該阻害剤は、
ａ．１０−８ｍｏｌ／ｌ以下の解離定数で選択的にＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αに結合可能であるＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αに対するリガンドであり、及び阻害剤は、
ｂ．ＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの生物学的作用を抑止又は抑制可能であり、該阻害剤は、抗体又は抗体様分子であることを特徴とする、阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載のＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの阻害剤であって、前記阻害剤はＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αに対して産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする、阻害剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの阻害剤であって、前記阻害剤は部分的にヒト型のキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする、阻害剤。
【請求項４】
請求項１−３のいずれか１つに記載のＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの阻害剤であって、前記阻害剤はＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αに選択的に結合する抗原結合領域をヒト免疫グロブリンのＦｃドメインに連結したキメラ構築物であることを特徴とする、阻害剤。
【請求項５】
請求項４に記載のＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの阻害剤であって、該阻害剤はエタネルセプト（ＣＡＳ  Ｎｏ．１８５２４３−６９−０）であることを特徴とする、阻害剤。
【請求項６】
骨折治癒の遅延を処置する方法において使用するためのＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの阻害剤であって、該阻害剤は、ＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αをコードするｍＲＮＡを標的とした阻害ＲＮＡ又はＤＮＡ分子としてのｓｉ−ＲＮＡ、ｍｉ−ＲＮＡ、ｓｈ−ＲＮＡ、又はアンチセンスＤＮＡであることを特徴とする、阻害剤。
【請求項７】
骨折治癒の遅延を処置又は治療する方法において使用するための活性化ＣＤ８＋細胞の阻害剤であって、前記阻害剤は、ＣＤ８マーカー群のメンバーに対するリガンドであって、１０−８ｍｏｌ／ｌ以下の解離定数で選択的に活性化ＣＤ８Ｔ細胞の細胞表面の前記メンバーに結合可能であり、前記阻害剤は、さらに活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の生物学的作用の抑止又は抑制として、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの分泌を阻害可能であり、前記阻害剤は、抗体又は抗体様分子であることを特徴とする、阻害剤。
【請求項８】
請求項７に記載の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の阻害剤であって、前記ＣＤ８マーカー群はＣＤ８、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）、ＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ−４）、及びＣＤ１３７（４−１ＢＢ）からなることを特徴とする、阻害剤。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の阻害剤であって、前記阻害剤はＣＤ８、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）、ＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ−４）、又はＣＤ１３７（４−１ＢＢ）に対して産生されたモノクローナル抗体であることを特徴とする、阻害剤。
【請求項１０】
請求項７又は８に記載の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の阻害剤であって、前記阻害剤は部分的にヒト型のキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする、阻害剤。
【請求項１１】
請求項１０に記載の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の阻害剤であって、前記阻害剤はアレファセプト（ＣＡＳ  Ｎｏ．２２２５３５−２２−０）であることを特徴とする、阻害剤。
【請求項１２】
骨折治癒の遅延を処置する方法において使用するための活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の阻害剤であって、該阻害剤は、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）、ＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ−４）、又はＣＤ１３７（４−１ＢＢ）をコードするｍＲＮＡを標的とした阻害ＲＮＡ又はＤＮＡ分子としてのｓｉ−ＲＮＡ、ｍｉ−ＲＮＡ、ｓｈ−ＲＮＡ、又はアンチセンスＤＮＡであって、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの分泌を阻害可能とすることを特徴とする、阻害剤。
【請求項１３】
骨折治癒の遅延を処置するための医薬組成物であって、請求項１−１２のいずれか１つに記載のＩＦＮ−ガンマ若しくはＴＮＦ−αの阻害剤、又は活性化ＣＤ８Ｔ細胞の阻害剤を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の医薬組成物であって、前記組成物はＩＦＮ−ガンマの阻害剤及びＴＮＦ−αの阻害剤を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１３に記載の医薬組成物であって、前記組成物は請求項７−１２のいずれか１つに記載の活性化ＣＤ８Ｔ細胞の阻害剤を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１６】
骨折治癒の遅延を処置するための薬剤の製造方法であって、請求項１−１５のいずれか１つに記載のＩＦＮ−ガンマ若しくはＴＮＦ−αの阻害剤、又は活性化Ｔ細胞の阻害剤の使用を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨折治癒の遅延を予測及び予防するための方法、システム及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨折治癒は、連続、重複段階を含む生理学的プロセスであり、骨組織の修復をもたらす。しかしながら、重度の骨折、老齢、ステロイド療法又は糖尿病などの特定のリスク要因下で、このプロセスは遅延し、又はさらには不完全（偽関節治癒）となり、不良な長期転帰及び高い社会経済的影響を与え得る。遅延又は不完全な治癒は、長骨骨折後の患者の約５−１０％において観察され得る。
【０００３】
不良治癒の背後にあるメカニズムについて限られた知識のみが利用可能である。損傷後の骨修復プロセス内での炎症及びＴ細胞応答の重要な役割を示唆する証拠が増えており、Ｔ細胞応答は、走化性、血管形成の刺激をもたらすさらなる免疫細胞及び間葉細胞の動員、及び最後に細胞外マトリックス合成の強化などのプロセスに影響を与える（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｂｌｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ．；２７（９）：１１４７−５１；Ｋｏｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｂ  Ｒｅｖ．；１６（４）：４２７−３４；Ｔｏｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｊａｎ；２６（１）：１１３−２４）。
【０００４】
最近のデータは、適応免疫を欠損したマウスは、石灰化では対照と比べて効果が低かったが、驚くほどに促進された骨の治癒を表したことを示している（Ｃｏｌｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．；６０（６）：１６９４−７０３；Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｂｌｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ；ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ００４４１−０１１−１２０５−７）。さらに、高い回転不安定性を有する機械的に重要な創外固定器での処置に起因する治癒の遅延／障害を有するヒツジにおいて、強固に固定された動物と比較して、有意に高い割合の細胞傷害性Ｔ細胞が血腫内で見出された。
【０００５】
オステオカルシン及び骨型アルカリホスファターゼは、骨折治癒の遅延に対する予測マーカーとして調査されてきた。しかしながら、オステオカルシンは正常骨折治癒及び遅延骨折治癒の患者の間でわずかな差異のみを示し、それは骨折発生から４２日前では示されなかった。さらに、形質転換成長因子ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）は、別の潜在的バイオマーカーとして検討されている。試験により、骨折から４週間後に、骨折治癒の遅延を有する患者のＴＧＦ−ベータ１レベルは、正常な治癒を示す患者のレベルよりも低いことが示された。しかしながら、これらのパラメータは高い患者内間の変動性、サイトカインの短い半減期、及び骨折治癒の間の遅い予測時点により、骨治癒の予測について限られた有効性のみを有している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｂｌｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ．；２７（９）：１１４７−５１
【非特許文献２】Ｋｏｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｂ  Ｒｅｖ．；１６（４）：４２７−３４
【非特許文献３】Ｔｏｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｊａｎ；２６（１）：１１３−２４
【非特許文献４】Ｃｏｌｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．；６０（６）：１６９４−７０３
【非特許文献５】Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｂｌｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ；ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ００４４１−０１１−１２０５−７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
例えば、高価で副作用がないわけではないＢＭＰ（骨形成タンパク質）のような成長因子など、可能な限り早期に支持療法を施すために骨折後の転帰を予測するバイオマーカーについて、満たされていない必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は、骨折治癒の遅延を予測するための手段及び方法を提供することである。
【０００９】
本発明は、臨床関連の一般的な時点で、治癒プロセスの間の脛骨近位部骨折患者の末梢血における炎症反応及び免疫細胞組成を評価する調査の過程の間に行われた。遅延治癒に関連する骨折治癒プロセスの間の末梢血中の免疫細胞組成において妥当な差異が同定された。
【００１０】
全Ｔ細胞数（ＣＤ３＋）又は主要なサブセット分布（ＣＤ３＋４＋及びＣＤ３＋８＋）は、群間（正常治癒ｖｓ遅延治癒）で差異を示さなかった。しかしながら、驚くべきことに、遅延治癒は、損傷／手術後の異なる時点（＜１週〜＞１８週）で、ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞に対応する表現型ＣＤ８＋１１ａ＋＋２８−及び／又はＣＤ８＋１１ａ＋＋５７＋及び／又はＣＤ８＋１１ａ＋＋ＣＤ２８−５７＋を発現する最終分化したＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の有意に増強された頻度（ＣＤ５７＋８＋  遅延治癒ｖｓ正常：１．６−１．８倍、ＣＤ２８−８＋  遅延治癒ｖｓ正常：１．５−１．６倍；ＣＤ１１＋＋８＋  遅延治癒ｖｓ正常：１．２−１．３倍）と強く関連することが見出された。ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞はまた、マーカー表現型ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−も発現する。この差異は１８週間の追跡期間にわたって安定しており、これは骨折に対する外傷後反応よりもむしろ個人の免疫経験を反映していた。
【００１１】
ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞は、その（炎症）組織ホーミング特性及び強力なバイスタンダー応答性を特徴とする。ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞はまた、独立して、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、又はＴＮＦαなどのサイトカインによって、抗原非依存性物質においてそのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を誘因し得る。これらのサイトカインは、トール様受容体分子（ＴＬＲ）と損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）との間の相互作用の結果として骨折血腫において誘因される自然免疫系の細胞によって送達される。さらに、マクロファージ及び樹状細胞は、これらのＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞による炎症性サイトカイン（例えばＩＦＮ−ガンマ）の放出を誘因し得、それにより圧倒的な炎症及び線維化だけでなく、骨形成の阻害を支持する。さらに、これらの細胞は、ＨＩＶ、結核又はサイトメガロウイルスのような感染症などの慢性免疫活性化状態において上方制御されている。
【００１２】
驚くべき別の発見は、末梢血中のＣＤ３＋Ｔ細胞の他の小さなサブセット、いわゆる二重陽性ＣＤ４＋８＋Ｔ細胞の頻度もまた、遅延治癒患者において増強されていることであった。
【００１３】
本発明の第１の態様によれば、骨折治癒の遅延を予想するための生体外方法が提供され、それは被験者から得られた試料中のＣＤ８＋ＣＤ５７＋細胞、ＣＤ８＋ＣＤ２８−細胞及び／又はＣＤ８＋ＣＤ２８−ＣＤ５７＋細胞から成る第１群より選択されるＣＤ８＋Ｔ細胞亜集団の頻度を決定する工程を含む。
【００１４】
本発明の第１の態様の代替案によれば、骨折治癒の遅延を予想するための生体外方法が提供され、それは被験者から得られた試料中のＣＤ８＋ＣＤ１１ａ＋ＣＤ５７＋細胞、ＣＤ８＋ＣＤ１１ａ＋ＣＤ２８−細胞及び／又はＣＤ８＋ＣＤ１１ａ＋ＣＤ２８−ＣＤ５７＋細胞から成る第１群より選択されるＣＤ８＋Ｔ細胞亜集団の頻度を決定する工程を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、試料は、特に末梢血から得られた血液試料、又は骨折近傍の領域から、特に炎症性の骨折周囲の血腫から得られた生検試料である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、骨折後の転帰を予測するため、又は被験者からの試料を分類するために使用され、試料は骨折後の転帰における確率に割り当てられる。
【００１７】
本発明の意味における頻度は、定義可能な集団全体の細胞数に対する、これらの細胞の表面に提示される特定のマーカー分子により定義される細胞数を指す。例えば、ＣＤ３＋細胞のＣＤ８＋ＣＤ４＋亜集団における５％の頻度とは、全ＣＤ３＋細胞の５％がＣＤ８＋ＣＤ４＋亜集団に属することを意味する。
【００１８】
いくつかの例では、細胞は短縮形で表面抗原分類、陽性／陰性を示すことで本明細書において特徴付けることができ、ＣＤ４＋８＋はＣＤ４＋ＣＤ８＋と同義である。
【００１９】
一般に、本明細書に開示の方法において、所与の亜集団の頻度は、試料中の母集団の総数との関係で（各表のＣＤ３＋又はＣＤ８＋細胞それぞれにおいて示されるように）決定される。
【００２０】
任意の細胞集団が、本明細書において特定のマーカー分子に対して「陽性」と指定される場合、この指定は、前記細胞集団が、マーカー分子に対する共通の蛍光色素標識抗体で染色され得、かつ非標識細胞又は同じ抗体で標識されるが前記マーカー分子を発現しないとして一般的に知られている細胞又はアイソタイプ対照抗体で標識された細胞と比較して、少なくとも１、２又は３対数高い強度の蛍光シグナルを与えることを意味するものとする。逆に、特定のマーカー分子に対して「陰性」と指定された任意の細胞集団は、上述のようにマーカー分子に対する蛍光色素標識抗体で染色され得ない。特定のマーカー分子に対して「二重陽性」又は「＋＋」と指定された細胞は、この特定のマーカー分子の高い発現を示す細胞を意味し、それは電子ゲートにより異なった亜集団として分離可能である。「＋＋」細胞は、単一陽性「＋」ゲートの下端で細胞によって与えられる蛍光シグナルよりも有意に強い蛍光シグナルを与える。「＋＋」イベントは、一般的には別個のクラスタとして区別され得る。所与のマーカーに対する細胞の二重陽性「＋＋」は、そのマーカーの陽性「＋」集団の一部である。図１２はＣＤ８／ＣＤ１１の陽性及び二重陽性の細胞のヒストグラムを示している。２つの例示的ヒストグラムにおいて囲まれている全てのＣＤ１１ａ陽性細胞の中で、縦棒の右側にあるものは「＋＋」集団を構成している。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＣＤ８＋ＣＤ１１ａ＋＋、ＣＤ８＋ＣＤ１１ａ＋＋ＣＤ２８−、ＣＤ８＋ＣＤ１１ａ＋＋ＣＤ５７＋、及びＣＤ８＋ＣＤ１１ａ＋＋ＣＤ２８−ＣＤ５７＋Ｔ細胞から成る第２群より選択される亜集団の頻度を決定する工程を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本発明の上記態様及び実施形態による方法は、さらにＣＤ３＋細胞のＣＤ８＋／ＣＤ４＋亜集団の頻度を決定する工程を含む。
【００２３】
本発明の方法の予測的又は診断的な価値は、上記に記載の通りに追加の亜集団の頻度を決定することによって増大され得る。追加の亜集団の頻度は、連続的又は同時に決定可能である。同時決定が好ましい。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本方法はさらに、末梢血中のＩＬ−６のレベルを決定する工程を含む。したがって、上記の態様及び実施形態による方法の予測価値は、さらに全身性炎症の免疫学的マーカーとしてＩＬ−６を決定することにより増強され得る。上記の実施形態によれば、レベルは濃度として表され、例えばｐｇ／ｍｌ又はｍｏｌ／ｌなどの単位で測定され得る。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本発明による方法は、ＣＤ４（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ０１７３０）、ＣＤ１１ａ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ２０７０１）、ＣＤ２８（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ１０７４７）、ＣＤ５７及びＩＬ−６（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ０５２３１）から成るマーカー群より選択されるマーカー分子に特異的に反応する第１リガンドを試料と接触させ、かつ第１リガンドの付されたマーカー分子を提示する細胞の頻度を決定するか、又はマーカー分子に結合した第１リガンドの頻度を決定することによって行われる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、第１リガンドは抗体、抗体断片、抗体様分子、６〜３０個のアミノ酸のオリゴペプチド、及び１０〜７５個のヌクレオチド長の核酸アプタマー分子から成る群より選択され、リガンドは１０−８ｍｏｌ／ｌ以下の解離定数で前段落に記載のマーカー群メンバーに結合可能である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、抗体断片は、抗体のＦａｂドメイン（抗体の抗原結合領域）又はペプチドリンカーによって連結された抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域から成る融合タンパク質である一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。抗体断片又は抗体様分子は、組換えタンパク質発現などの適した方法によって製造され得る。
【００２８】
第１リガンドはまた、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ又はＳＥＬＥＸなどの発展的方法によって開発され得、ポリペプチド又はオリゴヌクレオチドは、関心標的に対するそれらの結合親和性に応じて選択される。さらに、より高い親和性の阻害剤は、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の進化及び選択の反復ラウンドによって同定され得る。
【００２９】
いくつかの実施形態では、上記で言及した６〜３０個のアミノ酸のオリゴペプチドはリガンドの一部に由来するペプチドであり、それは上記のマーカー群のメンバーによって認識される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、上記のマーカー群のメンバーによって認識されるリガンドは、ＣＤ２８のリガンドであるＣＤ８０（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ３３６８１）又はＣＤ８６（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ４２０８１）、又はＣＤ１１ａのリガンドであるＣＤ５４（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ０５３６２）から選択される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、第１リガンドは、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２８、ＣＤ５７と反応する抗体であり、さらに光検出のための蛍光部分を含む。前段落に記載のマーカー分子はこのような抗体と結合し、そのマーカー分子を提示する細胞は、蛍光活性化細胞選別などの蛍光に基づくフローサイトメトリ法により計数可能である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、第１リガンドはＩＬ−６と反応する抗体であり、かつ酵素活性を含んでもよく、この酵素活性は分光学的に観察できる触媒作用反応である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、第１リガンドは第２リガンドによって特異的に結合され、第２リガンドは酵素活性又は蛍光部分を含む。
【００３４】
複数の異なるマーカー分子は、複数の異なる第１リガンドを用いることによって決定され得、各リガンドは特定のマーカー分子に特異的に結合する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、複数の第１リガンドの各々は、上記の通りに特定の酵素活性又は蛍光部分を含み、複数の第１リガンドは互いに酵素活性又は蛍光部分について分光学的に区別され得る。
【００３６】
いくつかの実施形態では、第１リガンドの各々は、特定の酵素活性又は蛍光部分を有する特定の第２リガンドと結合し、第２リガンドは互いに酵素活性又は蛍光部分について分光学的に区別され得る。
【００３７】
いくつかの実施形態では、第１及び第２のリガンド又は複数のこれらは抗体であり、かつ酵素結合免疫吸着測定法に用いられる。
【００３８】
一実施形態では、本発明の前述の態様による亜集団の頻度は、フローサイトメトリーアッセイにおいて、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２８及びＣＤ５７から成る群より選択されるマーカー分子を対象とする蛍光抗体が付された細胞を計数することによって決定される。
【００３９】
一実施形態では、本方法は、さらに本発明の上記態様による被験者のカロリースコア（Ｃａｌｏｒｉ−Ｓｃｏｒｅ）を決定する工程を含む。
【００４０】
本発明での意味におけるカロリースコアは、骨折後の永続的な治癒障害である偽関節についての尺度であり、かつ骨質、骨配列、一次介入の侵襲性又は臨床的な感染状態などの関連する骨折治癒因子を評価する方法によって決定され得る。標準よりも５％以上高いカロリースコアを示す被験者は、骨折治癒の遅延について上昇した確率を有する群に割り当てられる。この方法の詳細な説明は、Ｃａｌｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｊｕｒｙ，３９，Ｓｕｐｐ  ２，Ｓ５９−６３，２００８で閲覧可能である。
【００４１】
一実施形態では、本方法はさらに決定された頻度、レベル又はカロリースコアを標準と比較する工程を含む。
【００４２】
本発明での意味において、標準は正常又は遅延していない骨折治癒を示す被験体の試料を意味する。あるいは、標準は正常骨折治癒を示す被験者であってもよい。特に、以下の基準のいずれにも該当しない場合は、被験者の骨折治癒は正常であると考えられる。
ｉ）カルス形成に基づく術後１２週目での不完全な骨折治癒、
ｉｉ）１ｍｍより大きな骨折間隙による術後１２週目での不完全な骨折治癒、
ｉｉｉ）吸収ゾーン又は不完全なカルス形成の存在、
ｉｖ）不完全な架橋、これは１〜３枚の皮質が架橋されていることを意味する、
ｖ）非架橋、これは皮質が架橋されていないことを意味する。
【００４３】
好ましい実施形態によれば、正常骨折治癒を示す患者の数において（遡及的に）決定された標準と比較して、２倍高いＣＤ８＋／ＣＤ４＋細胞の頻度を示す試料は、骨折治癒の遅延について上昇した確率を有する群に割り当てられる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、正常骨折治癒を示す患者の数において（遡及的に）決定された標準と比較して、１０％以上高いＣＤ１１ａ＋＋、ＣＤ２８−又はＣＤ５７＋Ｔ細胞の頻度を示す試料は、骨折治癒の遅延について上昇した確率を有する群に割り当てられる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ２８−又はＣＤ５７＋細胞について３０％以上の頻度を示す試料は、骨折治癒の遅延について上昇した確率を有する群に割り当てられ、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ１１ａ＋＋細胞について６５％以上の頻度を示す試料は、骨折治癒の遅延について上昇した確率を有する群に割り当てられ、かつＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ４＋細胞について５％以上の頻度を示す試料は、骨折治癒の遅延について上昇した確率を有する群に割り当てられる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、さらにＣＤ４＋Ｔ細胞の亜集団の頻度を決定する工程を含み、その亜集団は、ＣＤ４＋ＣＤ５７＋細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２８−細胞から選択される。
【００４７】
本発明の別の態様によれば、骨折治癒の遅延を診断するためのシステムが提供され、それは、
‐被験者からの試料中の細胞集団の頻度又はＩＬ−６を決定するためのデバイス、及び
‐プログラムされたマイクロプロセッサ、を備え、
プログラムされたマイクロプロセッサは、本発明の上記の態様及び実施形態による方法を実施するために搭載かつ指定される。
【００４８】
いくつかの実施形態では、デバイスは、細胞を運搬かつ整列させるためのフローセル、光又は他の生物物理学的パラメータ、例えばインピーダンスを測定するのに適したレーザ及び検出器などの光源を備えるフローサイトメータである。このようなデバイスは、本発明の上記の態様及び実施形態によるＣＤ８＋細胞の亜集団の頻度を決定するために使用され得る。
【００４９】
いくつかの実施形態では、デバイスは、キュベット又はマイクロタイタープレートなどの試料を保持する区画、吸光度又は蛍光を測定するのに適した光源及びＵＶ／Ｖｉｓ、例えばダイオードアレイを備える、分光光度計又はプレートリーダであり得る。
【００５０】
いくつかの実施形態では、デバイスは、本発明の上記の態様又は実施形態によるＩＬ−６のレベルを決定するために使用される。
【００５１】
いくつかの実施形態では、プログラムされたマイクロプロセッサは、前段落に記載のデバイスに統合されるか、又はデバイスを操作するための制御ユニット又はコンピュータの一部である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、上記のデバイスは、本発明の上記の態様及び実施形態によるＣＤ８＋Ｔ細胞の亜集団の頻度を決定するために搭載かつ指定される。
【００５３】
本発明の別の態様によれば、骨折治癒の遅延を診断するための部品のキットが提供され、それは抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体及び抗ＣＤ２８抗体を含み、上記に記載の抗体は、蛍光に基づくフローサイトメトリに適している。
【００５４】
一実施形態では、キットはさらに抗ＣＤ５７抗体を含む。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本発明の上記態様による抗体は、マウス由来のモノクローナル抗体であり、かつＡＰＣ（アロフィコシアニン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）又はＰＥ（フィコエリトリン）などのフローサイトメトリでの光検出のための蛍光部分を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＰＥ−Ｃｙ７標識マウス抗ヒトＣＤ４ＩｇＧ１、ＰＥ−Ｃｙ７（シアニン色素）タンデム蛍光体標識マウスモノクローナル抗体、ＡＰＣ−Ｃｙ７標識マウス抗ヒトＣＤ８ＩｇＧ１、タンデム蛍光体ＡＰＣ−Ｃｙ７標識マウスモノクローナル抗体、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ５７ＩｇＭ、マウスモノクローナル抗体、ＡＰＣ−Ｈ７マウス抗ヒトＣＤ２８ＩｇＧ１、ＡＰＣ−Ｃｙ７の類似体であり、かつ同じ分光特性を有するタンデム蛍光体ＡＰＣ−Ｈ７標識マウスモノクローナル抗体、及びＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ１１ａ（抗ＬＦＡ−１α、白血球機能関連抗原−１、アルファポリペプチド）ＩｇＧ２ａ、マウスモノクローナル抗体から成る群より選択される。
【００５７】
本発明の別の態様によれば、ＩＦＮ−ガンマ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１５７９）又はＴＮＦ−α（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１３７５）の阻害剤は、骨折治癒の遅延を処置する方法において使用するために提供され、阻害剤は、抗体、抗体断片、抗体様分子、可溶性受容体構築物、６〜３０個のアミノ酸のオリゴペプチド、及び１０〜７５個のヌクレオチド長の核酸アプタマー分子から成る群より選択されるＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αに対するリガンド、ＩＦＮ−γ又はＴＮＦ−α分泌の阻害剤（例えばｓｉ−ＲＮＡ又は小分子、例えばカルシニューリン阻害剤など）であり、リガンド（阻害剤）は１０−８ｍｏｌ／ｌ以下の解離定数で選択的にＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αに結合可能であり、かつＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αに対するリガンド（阻害剤）は、さらにＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの生物学的作用を抑止又は抑制可能である。
【００５８】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、阻害剤はＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体である。一実施形態では、阻害剤はＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αに対するキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒトモノクローナル抗体である。
【００５９】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、阻害剤が抗体断片である場合、阻害剤は、ＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αに対して産生された抗体のＦａｂドメイン（抗体の抗原結合領域）、又は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、すなわち、ペプチドリンカーによって連結された抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域から成る融合タンパク質である。抗体断片又は抗体様分子は、組換えタンパク質発現などの適した方法によって製造され得る。
【００６０】
一実施形態では、阻害剤はＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αに選択的に結合する抗原結合領域をヒト免疫グロブリンのＦｃドメインに連結したキメラ構築物である。このような構築物の一例は、薬物のエタネルセプト（ＣＡＳ  Ｎｏ．１８５２４３−６９−０）である。
【００６１】
本発明のこの態様による阻害剤はまた、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ又はＳＥＬＥＸなどの発展的方法によって開発され得、ポリペプチド又はオリゴヌクレオチドは、ＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αに対するそれらの結合親和性に応じて選択される。いくつかの実施形態では、上記で言及した６〜３０個のアミノ酸のオリゴペプチドは、ＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの生理学的結合パートナーの一部に由来するペプチドであり、それは選択的にＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αによって認識される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの合成は、ｓｉ−ＲＮＡ又は小分子の薬物、例えばカルシニューリン阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤などによって遮断され得る。
【００６２】
本発明の別の態様によれば、ＣＤ８＋細胞の阻害剤は、骨折治癒の遅延を処置又は治療する方法において使用するために提供される。一代替案では、このようなＣＤ８＋細胞の阻害剤は、抗体、抗体断片、抗体様分子、６〜３０個のアミノ酸のオリゴペプチド、及び１０〜７５個のヌクレオチド長の核酸アプタマー分子から成る群より選択されるＣＤ８に対するリガンドであり、リガンド（阻害剤）は１０−８ｍｏｌ／ｌ以下の解離定数で選択的にＣＤ８に結合可能であり、かつＣＤ８に対するリガンド（阻害剤）は、さらにＣＤ８＋Ｔ細胞の生物学的作用を抑止又は抑制可能であり、特に、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの分泌を阻害可能である。
【００６３】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、阻害剤はＣＤ８に対して産生されたモノクローナル抗体である。一実施形態では、阻害剤は抗胸腺細胞グロブリン（ｇｌｏｂｕｌｉｎｅ）含む、ＣＤ８に対するキメラ抗体、ヒト化抗体又はヒトモノクローナル抗体である。
【００６４】
本発明のこの態様の一実施形態では、阻害剤はＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）に対して産生された抗体である。本発明のこの態様の一実施形態では、阻害剤はＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ−４）に対して産生された抗体である。本発明のこの態様の一実施形態では、阻害剤はＣＤ１３７（４−１ＢＢ）に対して産生された抗体である。
【００６５】
本発明のこの態様の一実施形態では、阻害剤は、非限定的な例として、例えば、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）、ＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ−４）又はＣＤ１３７（４−１ＢＢ）などの活性化ＣＤ８上の分子に対して産生されたモノクローナル抗体である。一実施形態では、阻害剤はキメラ抗体、ヒト化抗体又はヒトモノクローナル抗体である。本発明のこの態様の一実施形態では、阻害剤は、ＣＤ８又はＣＤ８特異的活性化抗原、例えばＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）、ＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ−４）又はＣＤ１３７（４−１ＢＢ）などに選択的に結合する抗原結合領域を、ヒト免疫グロブリンのＦｃドメインに連結したキメラ構築物である。このような構築物の一例は、薬物のアレファセプト（ＣＡＳ  Ｎｏ．２２２５３５−２２−０）である。
【００６６】
本発明のさらに別の態様によれば、骨折治癒の遅延を処置するための医薬組成物が提供され、それは本発明の上記態様のいずれか１つに記載のＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−α又はＣＤ８の阻害剤（又はそれ対するリガンド）を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は非経口投与、例えば、皮下、静脈内、肝臓内、筋肉内、又は局所内骨折の投与用に処方される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は約０．１％〜約１０％の活性成分を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約１０％〜約１００％の活性成分を含む（凍結乾燥物）。
【００６９】
いくつかの実施形態では、医薬組成物はＩＦＮ−ガンマの阻害剤及びＴＮＦ−αの阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物はＣＤ８の阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物はＩＦＮ−ガンマに対するモノクローナル抗体又は他の中和剤、及びＴＮＦ−α対するモノクローナル抗体又は中和剤（例えば、ＴＮＦ−αを対象としたＦｃ−Ｉｇ構築物、例えばエタネルセプト）を含む。
【００７０】
本発明の別の態様によれば、骨折治癒の遅延を処置するための剤形が提供され、それは本発明の上記態様のいずれか１つに記載のＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの阻害剤（又はそれに対するリガンド）を含む。
【００７１】
剤形は、経腸投与、例えば、鼻腔、口腔、直腸、経皮若しくは経口投与、又は吸入形態若しくは坐薬用であってもよい。あるいは、皮下、静脈内、肝臓内又は筋肉内の注射形態など、非経口投与が使用されてもよい。必要に応じて、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤が存在してもよい。
【００７２】
また、本発明の範囲内には、骨折治癒の遅延に苦しむ患者を処置するための方法があり、それは本発明の上記態様のいずれか１つに記載のＩＦＮ−ガンマ若しくはＴＮＦ−αの阻害剤（若しくはそれに対するリガンド）、又は医薬組成物若しくは剤形を前記患者へ投与する工程を含む。同様に、ＣＤ８に対する抗体など、前記患者においてＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇をもたらし得る薬剤を投与する工程を含む、骨折治癒の遅延に苦しむ患者を処置するための方法が想到される。
【００７３】
本発明の別の態様によれば、骨折治癒の遅延を処置するための薬剤の製造方法が提供され、それは本発明の上記態様のいずれか１つに記載のＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの阻害剤（又はそれに対するリガンド）の使用を含む。
【００７４】
したがって、本明細書に開示の本発明における治療用途に関連する対象は以下の通りである。
【００７５】
１．骨折治癒の遅延を処置又は治療する方法において使用するためのＩＦＮ−ガンマ又（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１５７９）又はＴＮＦ−α（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１３７５）の阻害剤であって、該阻害剤は、
ａ．１０−８ｍｏｌ／ｌ以下の解離定数で選択的にＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αに結合可能であるＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αに対するリガンドであり、及び阻害剤は、
ｂ．ＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの生物学的作用を抑止又は抑制可能であることを特徴とする、阻害剤。
【００７６】
２．対象１に記載のＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの阻害剤であって、前記阻害剤は抗体、抗体断片、抗体様分子、可溶性受容体構築物、ＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αに対する受容体に由来する６〜３０個のアミノ酸のオリゴペプチド、及び１０〜７５個のヌクレオチド長の核酸アプタマー分子から成る群より選択されることを特徴とする、阻害剤。
【００７７】
３．対象１又は２に記載のＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの阻害剤であって、前記阻害剤はＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αに対して産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする、阻害剤。
【００７８】
４．対象１〜３のいずれか１つに記載のＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの阻害剤であって、前記阻害剤はキメラ（部分的にヒト）抗体、ヒト化抗体、又はヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする、阻害剤。
【００７９】
５．対象１〜４のいずれか１つに記載のＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの阻害剤であって、前記阻害剤はＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αに選択的に結合する抗原結合領域をヒト免疫グロブリンのＦｃドメインに連結したキメラ構築物であることを特徴とする、阻害剤。
【００８０】
６．対象５に記載のＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの阻害剤であって、該阻害剤はエタネルセプト（ＣＡＳ  Ｎｏ．１８５２４３−６９−０）であることを特徴とする、阻害剤。
【００８１】
７．骨折治癒の遅延を処置する方法において使用するためのＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの阻害剤であって、該阻害剤は、ＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αをコードするｍＲＮＡを標的とした阻害ＲＮＡ又はＤＮＡ分子（ｓｉ−ＲＮＡ、ｍｉ−ＲＮＡ、ｓｈ−ＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ）であることを特徴とする、阻害剤。
【００８２】
８．骨折治癒の遅延を処置又は治療する方法において使用するための活性化ＣＤ８＋細胞の阻害剤であって、前記阻害剤は、選択的に活性化ＣＤ８Ｔ細胞の細胞表面に結合可能であり、前記阻害剤は、さらに活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の生物学的作用を抑止又は抑制可能であり、特に、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの分泌を阻害可能であることを特徴とする、阻害剤。
【００８３】
９．対象８に記載の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の阻害剤であって、前記阻害剤はＣＤ８マーカー群に含まれるメンバーに対するリガンドであり、ＣＤ８マーカー群はＣＤ８、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）、ＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ−４）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）を含み、前記阻害剤は１０−８ｍｏｌ／ｌ以下の解離定数で選択的に前記マーカー群の前記メンバーに結合可能であることを特徴とする、阻害剤。
【００８４】
１０．対象８又は９に記載の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の阻害剤であって、前記阻害剤は抗体、抗体断片、抗体様分子、可溶性受容体構築物、ＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αに対する受容体に由来する６〜３０個のアミノ酸のオリゴペプチド、及び１０〜７５個のヌクレオチド長の核酸アプタマー分子から成る群より選択されることを特徴とする、阻害剤。
【００８５】
１１．対象８〜１０のいずれか１つに記載の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の阻害剤であって、前記阻害剤はＣＤ８、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）、ＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ−４）又はＣＤ１３７（４−１ＢＢ）に対して産生されたモノクローナル抗体であることを特徴とする、阻害剤。
【００８６】
１２．対象８〜１０のいずれか１つに記載の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の阻害剤であって、前記阻害剤はキメラ（部分的にヒト）抗体、ヒト化抗体、又はヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする、阻害剤。
【００８７】
１３．対象１２に記載の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の阻害剤であって、前記阻害剤はアレファセプト（ＣＡＳ  Ｎｏ．２２２５３５−２２−０）であることを特徴とする、阻害剤。
【００８８】
１４．骨折治癒の遅延を処置する方法において使用するための活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の阻害剤であって、該阻害剤は、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）、ＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ−４）又はＣＤ１３７（４−１ＢＢ）をコードするｍＲＮＡを標的とした阻害ＲＮＡ又はＤＮＡ分子（ｓｉ−ＲＮＡ、ｍｉ−ＲＮＡ、ｓｈ−ＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ）であることを特徴とする、阻害剤。
【００８９】
１５．骨折治癒の遅延を処置するための医薬組成物であって、上記対象のいずれか１つに記載のＩＦＮ−ガンマ若しくはＴＮＦ−αの阻害剤、又は活性化ＣＤ８Ｔ細胞の阻害剤を含む、医薬組成物。
【００９０】
１６．対象１５に記載の医薬組成物であって、前記組成物はＩＦＮ−ガンマの阻害剤及びＴＮＦ−αの阻害剤を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【００９１】
１７．対象１５に記載の医薬組成物であって、前記組成物は対象８〜１４のいずれか１つに記載の活性化ＣＤ８Ｔ細胞の阻害剤を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【００９２】
１８．骨折治癒の遅延に苦しむ患者を処置するための方法であって、
ａ．上記対象１〜７のいずれか１つに記載のＩＦＮ−ガンマ又はＴＮＦ−αの阻害剤、
ｂ．対象８〜１４のいずれか１つに記載の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の阻害剤、又は
ｃ．上記対象１５〜１７のいずれか１つに記載の医薬組成物又は剤形、
を前記患者に投与する工程を含む、方法。
【００９３】
１９．骨折治癒の遅延を処置するための薬剤の製造方法であって、上記対象のいずれか１つに記載のＩＦＮ−ガンマ若しくはＴＮＦ−αの阻害剤、又は活性化Ｔ細胞の阻害剤の使用を含む、方法。
【００９４】
例えば、マーカー分子又は阻害剤などの単一の分離可能な特徴における選択肢が「実施形態」として本明細書において説明されている限り、このような選択肢は自由に組み合わされて本明細書に開示の本発明における個別の実施形態を形成し得ることが理解されるべきである。
【００９５】
本発明はさらに、以下の実施例及び図面により説明され、そこからさらなる実施形態及び利点が引き出され得る。これらの実施例は本発明を説明するが、その範囲を限定するものではないことが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】正常治癒患者及び遅延治癒患者のカロリースコア（中央値、下位及び上位の四分位数）を示す図である。
【図２】術後６、１２及び１８週目の正常治癒患者及び遅延治癒患者の最大床反力（Ａ）及び平均歩行速度（Ｂ）（中央値、下位及び上位の四分位数）を示す図である。
【図３】正常治癒患者及び遅延治癒患者のＣＤ３＋Ｔ細胞集団中のＣＤ８＋ＣＤ４＋細胞の頻度（上位プロット中央値、下位及び上位の四分位数、下位プロット平均値）を示す図である。
【図４】正常治癒患者及び遅延治癒患者並びに骨折していない健常対照群のＣＤ８＋Ｔ細胞集団中のＣＤ１１ａ＋＋の頻度（中央値、下位及び上位の四分位数）を示す図である。
【図５】正常治癒患者及び遅延治癒患者並びに骨折していない健常対照群のＣＤ８＋Ｔ細胞集団中のＣＤ５７＋の頻度（中央値、下位及び上位の四分位数）を示す図である。
【図６】正常治癒患者及び遅延治癒患者並びに骨折していない健常対照群のＣＤ８＋Ｔ細胞集団中のＣＤ２８−の頻度（中央値、下位及び上位の四分位数）を示す図である。
【図７】正常治癒患者及び遅延治癒患者の血液試料中でのサイトカイン発現（Ａ  ＩＬ６；Ｂ  ＩＬ−８）（中央値、下位及び上位の四分位数）を示す図である。
【図８】ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡの骨折血腫への移行（比率）を示す図である。
【図９】末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びヒト骨髄間葉系間質細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）中のＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞及びＣＤ８＋ＣＤ５７＋ＣＤ２８−細胞のＩＦＮ−γ産生細胞の割合（平均値）を示す図である。
【図１０】ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γによる骨髄間葉系間質細胞の骨形成の阻害を示す図である。
【図１１】マウスモデルにおけるＣＤ８＋の枯渇及び骨折治癒の改善を示す図である。
【図１２】ＣＤ１１ａ＋＋細胞の決定についての一例を示す図である。
【図１３】骨折患者の手術前後の血液及び骨折血腫（ＦＨ）におけるＣＤ８＋Ｔ細胞集団中のＣＤ５７＋細胞の頻度を示す図である。
【図１４】骨折患者の手術前後の血液及び骨折血腫（ＦＨ）におけるＣＤ８＋Ｔ細胞集団中のＣＤ２８−細胞の頻度を示す図である。
【図１５】骨折患者の手術前後の血液及び骨折血腫（ＦＨ）におけるＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＤ５７＋細胞（上側パネル）及びＣＤ２８−細胞（下側パネル）の頻度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００９７】
材料及び方法
被験者及び研究プロトコル
２００８年７月〜２０１０年８月の間、１５人の患者を本研究において孤立性かつ閉鎖性の脛骨近位部骨折で登録した（年齢２３歳〜６４歳、男性９人及び女性８人）。
【００９８】
生体力学的機能及び免疫学的パラメータを評価するために、あらゆる慢性疾患（例えば骨粗鬆症、糖尿病、関節リウマチ、慢性心不全、腎不全）、特にヒト免疫不全ウイルス感染又は肝炎感染を有する患者を研究から除外した。さらに、いくつかの骨折を有する患者、又は股関節、肩関節若しくは足関節を治療中の患者も研究から除外した。
【００９９】
研究は、医薬品の臨床試験の実施の基準及びヘルシンキ宣言についての医薬品規制調和国際会議の指針を遵守して実施した。全ての患者は書面によるインフォームドコンセントを提出し、研究はベルリンのシャリテ−大学病院（Ｃｈａｒｉｔｅ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｓｍｅｄｉｚｉｎ）の倫理委員会によって承認された（Ｎｒ．ＥＡ１／００６／０８）。
【０１００】
プロトコル及び評価計画
骨折治癒の間の確立された臨床試験点と調和して骨折治癒における初期段階を評価するために、患者を術後３−５日目（以下「１週目」と称する）、２週目、４週目、６週目、１２週目及び１８週目に調査した。全ての試験点で全患者は以下の方法を受けた。
【０１０１】
血液試料
各試験日に、仰臥位で１５分間安静にした後、午前９：００〜１２：００の間の午前中に血液試料を採取した。全ての血液試料をすぐに暗い空調室に移動させ、２時間以内に実験室に送った。さらに、血漿及び血清の試料を一定分量で収集し、−８０℃で凍結させた。
【０１０２】
全血球数及び標準的な臨床変数（赤血球、ヘモグロビン、ヘマトクリット、血小板、クレアチニン、ナトリウム、カリウム、尿酸、オスターゼ（ｏｓｔａｓｅ）、ＣＲＰ）を、実験室の標準作業手順書（ＳＯＰ）に従って、血漿及び血清の試料において測定した。オステオカルシン評価のための血清試料を直ちに遠心し（３５００ｒｐｍ／１５分）、事前に凍結させた一定分量中で保存し、３時間以内に実験室に送った。
【０１０３】
半自動システムを使用して、サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−６、全ＩＬ−８、ＩＬ−１０）を血漿試料において測定した。細胞内サイトカイン染色のための抗体及び各試薬をＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社から購入した。
【０１０４】
宿主防御の適応免疫を評価するために、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ＋、ＣＤ５７＋及びＣＤ２８＋を含む、Ｔ細胞関連の表面抗原分類を調べた。細胞選別はＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩフローサイトメータを用いて行い、得られた画分の純度はＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメータで決定した。
【０１０５】
ＭＳＣ分化のためのＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞馴化培地
インフォームドコンセント及び地域の人間学倫理委員会による承認後に、Ｔ細胞受容体活性化ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞（ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ＋）の馴化培地を２人の異なるドナーから得た。ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５ＲＯ＋細胞の枯渇後、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＯ−画分からＣＤ８＋細胞の正の選択を行った。ＣＤ８＋Ｔ細胞（１×１０６細胞／ｍｌ  ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）をＣＤ３ＣＤ２８ＣＤ２でコーティングしたビーズで２４時間刺激した。
【０１０６】
骨髄間葉系間質細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）の単離及び培養
前述の通り腰の手術を受けた５人の患者（ドナーの年齢：３９−９０歳、平均＝７３歳；性別：女性２人、男性３人）の大腿骨髄のウォッシュアウトからＢＭ−ＭＳＣを単離した。フローサイトメトリ分析を用いて、ＢＭ−ＭＳＣの均質集団を、細胞表面マーカー発現を分析することにより検証した［Ｇｌａｅｓｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｓ．Ｇｅｉｓｓｌｅｒ，Ａ．Ｏｄｅ，Ｃ．Ｊ．Ｓｃｈｉｐｐ，Ｇ．Ｍａｔｚｉｏｌｉｓ，Ｗ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｐ．Ｋｎａｕｓ，Ｃ．Ｐｅｒｋａ，Ｇ．Ｎ．Ｄｕｄａ，ａｎｄ  Ｇ．Ｋａｓｐｅｒ，Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ−２  ｌｅｖｅｌｓ  ｂｙ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ：ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ．１６（１０）：ｐ．３１３９−４８（２０１０）］。以下に説明する全ての細胞アッセイは、４人以上の異なるドナーからの３−４継代でのＢＭ−ＭＳＣを用いて技術的に３回反復して行った。
【０１０７】
骨分化アッセイ
異なる濃度のＩＦＮ−γ又はＴＮＦ−αそれぞれを補充した骨形成培地（ＯＭ）を用いて、集密的なＢＭ−ＭＳＣの骨分化を誘導した。生体外で刺激かつ選別されたＣＤ８＋ＴＥＭＲＡのＣＭを用いた実験について、ＣＭを２倍濃縮ＯＭで１：２に希釈した。マトリックスの石灰化をアリザリンレッド染色で可視化した。定量は、１０％の塩化セチルピリジニウムで抽出した後に、アリザリンレッドの吸光度（ＯＤＡＲ）を測定することにより達成した。得られた値はアラマーブルーによって決定された生存細胞の数に対して正規化した。
【０１０８】
ＢＭ−ＭＳＣの生存及び生存率アッセイ
細胞生存率アッセイについて、実験前日に２４００ＢＭ−ＭＳＣ／ｃｍ２で９６ウェルプレートに播種した。翌日、培地を交換し、細胞を異なる濃度のＩＦＮ−γ又はＴＮＦ−α（０、１、１０及び１００ｎｇ／ｍｌ）を含有するＥＭ中で３日間培養した。アラマーブルー細胞生存率アッセイを用いて細胞生存率を測定した。製造元の使用説明書に従ってＣｙＱｕａｎｔアッセイを用いて、均等な細胞播種を播種の翌日に確認した。
【０１０９】
ＢＭ−ＭＳＣアポトーシスアッセイ
細胞アポトーシスアッセイについて、２４００ＢＭ−ＭＳＣ／ｃｍ２で２４ウェルプレートに播種した。ＩＦＮ−γ又はＴＮＦ−αそれぞれの指示された濃度を含有する培地で、ＢＭ−ＭＳＣを２日間培養した。続いて、培地を除去し、製造元の使用説明書に従ってＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）３／７  Ａｓｓａｙを用いて、細胞溶解物中のカスパーゼ−３及び−７の活性を測定し、値をＣｙＱｕａｎｔアッセイによって決定される細胞数に対して正規化した。
【０１１０】
マウス実験
動物保護法、実験動物の管理と使用に関するＮＩＨ指針及び国家動物保護指針によって確立された方針及び原則に従って、１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１９）を用いてマウス実験を行った。ＣＤ８−Ｔ細胞群におけるＣＤ８＋免疫細胞の枯渇を、抗体（ｍＣＤ８（ＹＴＳ  １６９．４）、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社）注射（４日間連続して注射あたり２００μｇのｍＣＤ８、最終日は手術の日）により達成した。
【０１１１】
ＣＤ８＋細胞枯渇は、ＣＤ３、ＣＤ８ａ及びＣＤ４に対して特異的な抗体を用いてＦＡＣＳ分析（ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメータ）により観測した。ＣＤ８＋Ｔ細胞群では、手術前日に２００μｌの２．５×１０６ＣＤ８＋細胞が尾静脈（ｔａｉｌ  ｖａｉｎ）に静脈注射された。骨切り術は、ＭｏｕｓｅＥｘＦｉｘシステムを用いて左大腿骨において実施した。大腿骨は、１０．５μｍ、５５ｋｅＶｐ、１４５μＡのボクセルサイズでμＣＴ分析（Ｖｉｖａ  μＣＴ４０）を受け、関心体積（ＶＯＩ）は中央に２ｍｍの骨切断間隙を含んだ。３人の独立した整形外科医の盲検評価により、骨切り術から２１日後の治癒結果を架橋又は非架橋のいずれかとして評価した。
【０１１２】
治癒分類及びデータ収集
全患者は、試験期間中に何回かのＸ線分析を受けることで、移植及び骨折間隙の安定性が評価された。Ｘ線の検査は、患者の正確な治癒の結果及び分類を確実にするために、異なる方面（整形外科、放射線科医）からの３人の独立した盲検医師によって行われた。さらに、機能データ（歩行分析）を術後１２週目で実施して、無痛全体重負荷を評価した。遅延治癒プロセスの定義を満たすためには、患者は以下の基準の１つ以上を満たさなければならない。文献において確立され、かつ診療所で使用されているように、遅延治癒プロセスについて時間依存的及び放射線学的な基準がある。
【０１１３】
骨折治癒の遅延についての時間依存的基準：
カルス形成に基づく術後１２週目での不完全な骨折治癒。
【０１１４】
骨折治癒の遅延についての放射線学的基準：
１）１ｍｍより大きな骨折間隙による術後１２週目での不完全な骨折治癒。
２）吸収ゾーン又は不完全なカルス形成の存在。
３）不完全な架橋、これは１〜３枚の皮質が架橋されていることを意味する。
４）非架橋、これは皮質が架橋されていないことを意味する。
【０１１５】
患者の個々の術後状態を数値化するために、Ｃａｌｏｒｉによる偽関節スコアリングシステムを使用した。
【０１１６】
さらに、患者の統計データ、ＡＳＡ分類、主診断、手術及び移植の種類、合併症及び微生物学的データを図表から導出し、データベースに集めた。全患者の特徴を表１に示す。
【０１１７】
【表１】
2020073485.tif 000002
【０１１８】
歩行分析
３Ｄ運動解析は、１２０Ｈｚのサンプリングレートの１２台の赤外線カメラ、かつ第１及び第５中足骨頭部並びに踵の皮膚に装着する再帰性反射マーカーを用いて行った。床反力は９６０Ｈｚで２つの力台を用いて収集した。
【０１１９】
各試験日に、患者は自己選択した速度で１０ｍの通路に沿って歩行を実施した。運動学的データから、歩行速度、歩き方及び歩幅、歩調、歩幅の高さ、並びに遊脚期及び立脚期の持続時間などの歩行パラメータの計算が可能であった。さらに、床反力を取得して、患肢及び対側肢についてのピーク水平力及び立脚持続時間を計算した。
【０１２０】
患者はまた、各足を別々の力台の上に置いて椅子からの立ち上がり試験を行い、脚間のピーク力における差異並びに立ち上がり試験の継続時間を決定し、それらは床反力に反映された。
【０１２１】
統計分析
全てのデータは平均±標準偏差として得る。群間の年齢及び性別の依存性を評価するためにカイ二乗検定を適用し、かつ正規分布しなかったそれらの値を決定するためにコルモゴロフ−スミルノフ検定を適用した。マン−ホイットニーのＵ検定は群間を比較するために使用した。ボンフェローニ補正によるＡＮＯＶＡ−反復測定を適用して、異なる調査時点間の各群の変数を調べた。
【０１２２】
２つの患者群間で異なって発現された全ての遺伝子について、受信者動作特性（ＲＯＣ曲線）分析を行った。正及び負の予測値を推定するために、ＲＯＣ曲線分析から得られた各遺伝子の感受性及び特異性を適用した。
【０１２３】
全統計分析はＳｔａｔＶｉｅｗ  ４．５（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ社、米国、バークレー）を用いて行った。統計的有意性はＰ＜０．０５で示される。
【０１２４】
各箱ひげ図は、中央値、下位及び上位の四分位数を示す。
【０１２５】
有意水準：Ｐ＜０．０５＝＊／ｐ＜０．０１＝＊＊／ｐ＜０．０００１＝＊＊＊
実施例
【実施例１】
【０１２６】
カロリースコア
正常治癒患者及び遅延治癒患者は、年齢、性別、身長及び体重において類似していた。群間で、ＡＳＡ分類、骨質、骨欠損間隙、手術技術、介入数及び喫煙状態に差異はなかった。
【０１２７】
カロリースコアを以下の因子によって計算し、因子は合計して２を乗じる。
【０１２８】
ａ）骨因子：
骨質                  良好（０Ｐｔ）、中程度（例えば、軽度の骨粗鬆症、１Ｐｔ）、不良（例えば、骨量減少、２Ｐｔ）、非常に不良（例えば、壊死、無血管、３Ｐｔ）
一次骨折              閉鎖（０Ｐｔ）、開放１段階（１Ｐｔ）、開放２−３段階  Ａグレード（３Ｐｔ）、開放３段階  Ｂ−Ｃグレード（５Ｐｔ）
追加介入              無し（１Ｐｔ）、＜２（２Ｐｔ）、＜４（３Ｐｔ）、＞４（４Ｐｔ）
ＯＰ−侵襲性          最小限の侵襲（例えば、スクリュー、０Ｐｔ）、内部の髄内（ｉｎｔｒａｍｅｄｕｌａｒ）（例えば、ネイル、１Ｐｔ）、内部の髄外（ｅｘｔｒａｍｅｄｕｌａｒ）（２Ｐｔ）、骨接合（例えば、骨移植、３Ｐｔ）
ＯＰ−適合性          十分な安定性（０Ｐｔ）、不十分な安定性（１Ｐｔ）
Ｗｅｂｅｒ＆Ｃｅｃｈ  肥大（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈ）（１Ｐｔ）、貧栄養（ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈ）（３Ｐｔ）、萎縮（ａｔｒｏｐｈ）（５Ｐｔ）
骨配向性              解剖学的（０Ｐｔ）、非解剖学的（１Ｐｔ）
骨折間隙              ０．５−１ｃｍ（２Ｐｔ）、１−３ｃｍ（３Ｐｔ）、＞３ｃｍ（５Ｐｔ）
【０１２９】
ｂ）軟組織
状態                無傷（０Ｐｔ）、発症を伴わない最近の処置（２Ｐｔ）、組織欠損の最近の処置（例えば、複数の切開、コンパートメント症候群（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｓｙｎｄｒｏｍ）、３Ｐｔ）、最近の複雑な処置（４Ｐｔ）、不良な血管新生（静脈不全、不良な毛細血管充填、５Ｐｔ）、複数の皮膚の病変又は欠損（例えば潰瘍、インプラントプレートの存在、６Ｐｔ）
【０１３０】
ｃ）患者
ＡＳＡグレード  １段階又は２段階（０Ｐｔ）、３段階又は４段階（１Ｐｔ）
糖尿病          いいえ（０Ｐｔ）、はい−良好に適応＝ＨｂＡ１ｃ＜１０（１Ｐｔ）、はい−不良な適応＝ＨｂＡ１ｃ＞１０（２Ｐｔ）
血液検査        炎症ＷＣＣ＞１２又はＥＳＲ＞２０又はＣＲＰ＞２０（１Ｐｔ）
感染            なし（０Ｐｔ）、最近の感染又は感染の疑い（１Ｐｔ）、感染（４Ｐｔ）
薬物            ステロイド（１Ｐｔ）、非ステロイド（ｓｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄｓ）（１Ｐｔ）
喫煙者          いいえ（０Ｐｔ）、はい（５Ｐｔ）。
【０１３１】
遅延治癒患者は、より複雑な処置を伴うより多くの軟組織の欠損、より高い臨床感染状態を有し、かつより多くのステロイド性又は非ステロイド性の抗炎症薬を受けていた（表２）。
【０１３２】
【表２】
2020073485.tif 000003
【０１３３】
図１は、術後の治癒合併症のリスクを反映する「カロリースコア」は、正常治癒患者と比較して遅延治癒患者において有意に高かったことを示している（スコア  ３２．６±６．３ｖｓ．２５．８±５．１；ｐ＝０．０５）。
【実施例２】
【０１３４】
歩行分析
歩行分析を術後６、１２及び１８週目実施し、患者の機能状態を評価した（図２）。その結果、遅延治癒患者は著しく遅い歩行速度及び低い最大床反力を示し、２つの異なる群の放射線学的分類を確認した。さらに、これは遅延治癒群における長期の治癒期間を明確に示している。注目すべきことに、遅延治癒患者は術後１８週目でやっと正常治癒群の術後６週目の歩行速度レベルを満たしている。
【実施例３】
【０１３５】
ＣＤ３＋Ｔ細胞集団中のＣＤ８＋／ＣＤ４＋細胞の頻度
ＣＤ３＋Ｔ細胞中のＣＤ８＋／ＣＤ４＋の割合における有意な差異が、２群間で見出された（図３）。遅延治癒患者は正常治癒患者と比較して、全時点にわたって持続的でより高いＣＤ３＋Ｔ細胞中のＣＤ８＋／ＣＤ４＋の割合を示した。加えて、ＣＤ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋／ＣＤ４＋の割合における経時的な変化は両群において観察されなかった。各群及び時点における単一細胞値を表３に示す。
【実施例４】
【０１３６】
ＣＤ８＋Ｔ細胞集団中のＣＤ１１ａ＋＋細胞の頻度
治癒遅延群におけるＣＤ１１ａ＋＋Ｔ細胞の発現は、１８週間の全調査期間にわたって正常治癒患者と比較して有意に高かった（図４）。さらに、遅延治癒患者は基準範囲（破線）と比較して病理学的に上昇したＣＤ１１ａ＋＋Ｔ細胞のレベルを示した。さらに、遅延治癒患者は骨折していない健常対照群と比較して有意に高い値を示した。３人の遅延治癒患者及び３人の正常治癒患者の術後６０週目を評価した。両群は、同一のＣＤ１１ａ＋＋Ｔ細胞濃度を示した。経時的な差異は各群において見つからなかった。各群及び時点における単一細胞値を表４に示す。ヒト患者におけるＣＤ１１ａ＋＋（高陽性）及びＣＤ１１ａ＋（陽性）画分の２つの異なる測定及び分析の例を図１２に示す。
【実施例５】
【０１３７】
ＣＤ８＋Ｔ細胞集団中のＣＤ５７＋細胞の頻度
遅延治癒患者と正常治癒患者との間で、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＣＤ５７＋の発現について、有意な差異が観察された（図５）。注目すべきことに、遅延治癒患者は、正常治癒患者又は健常人の正常値と比較して、５５％−７３％高いＣＤ５７＋の割合を示した。加えて、正常治癒患者は十分に基準範囲内であったのに対し、遅延治癒患者はＣＤ８＋ＣＤ２８−レベルを示し、結果としてこの基準範囲（点線）を超えた。さらに、これらの差異は、１８週間の全調査期間にわたって安定していた。術後１週目でのわずかな差異から始まり、これらの差異は入院２週目の間に著しくなった。調査期間の間、各群内でＣＤ８＋ＣＤ５７＋の変化は見出されず、これは骨折に対する反応よりもむしろ個人の免疫経験を反映するものであった。各群及び時点における単一細胞値を表５に示す。
【実施例６】
【０１３８】
ＣＤ８＋Ｔ細胞集団中のＣＤ２８−細胞の頻度
同様の配列がＣＤ８＋ＣＤ２８−Ｔ細胞によって示される（図６）。ここでは、遅延治癒患者は、正常治癒患者又は健常人の値それぞれと比較して、２９％−３４％持続的に高いＣＤ８＋ＣＤ２８−Ｔ細胞のレベルを示した。ＣＤ８＋ＣＤ５７＋Ｔ細胞の結果と同様に、ＣＤ８＋ＣＤ２８−Ｔ細胞の割合における差異は入院２週目の間に著しくなり、これらの差異はまた、全調査期間及び術後６０週目にわたって安定していた。さらに、調査中に各群内で有意な差異は観察されなかった。各群及び時点における単一細胞値を表６に示す。
【実施例７】
【０１３９】
サイトカイン発現ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα
ＩＬ−６レベルは、両群において術後１週目と２週目との間で有意に減少した（遅延患者はｐ＝０．０３；正常患者はｐ＝０．００３）（図７）。しかしながら、術後２週目の遅延治癒患者のＩＬ−６レベルは、術後１週目の正常治癒患者のＩＬ−６レベルと比較して、依然として高かった。各群及び時点における単一細胞値を表７に示す。
【０１４０】
群間でＩＬ−８レベルにおける有意な差異はなかったが、ＩＬ−８レベルは、両群において術後１週目から２週目で有意に減少した（遅延患者は２８１．４±１６２．７ｖｓ．１９５．４±７７．３ｐｇ／ｍＬ；ｐ＝０．０４、及び正常治癒患者は２１９．３±６６．８ｖｓ．１８２．９±５５．９ｐｇ／ｍＬ；ｐ＝０．０１）。
【０１４１】
ＴＮＦαレベルについて、調査期間にわたって差異は両群間及び両群内で観察されなかった。
【実施例８】
【０１４２】
ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡの末梢血から血腫への移行
骨折血腫は骨折治癒の初期段階を表すため、治癒結果を導くための重要物質である可能性がある。従って、ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡのサブセットが、その高い接着分子（例えばＣＤ１１ａ）発現のために骨折部位で濃縮され得るかどうかを調査した。脛骨近位部閉鎖骨折の別の４人の患者の末梢血及び骨折血腫の試料対を分析した（図８）。サブセット分析により、全患者からの骨折血腫において、末梢血と比較して１．８−２．５倍（ｐ＜０．０５）のＣＤ２８−ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡの濃縮が明らかとなった。ＣＤ５７＋ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡのサブセットについて、１．４〜３．７倍の範囲の濃縮（ｐ＝０．０７）の同様の結果が見出された。
【実施例９】
【０１４３】
ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞による強力なＩＦＮ−γの産生
ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞は強力なサイトカインプロデューサであると考えられている。実際に、プレートコーティングされた抗ＣＤ３／２８ｍＡｂによるＴ細胞の生体外刺激の後に、他のＴ細胞サブセット（ＣＤ４＋、全ＣＤ８＋、ＣＤ８＋５７−２８＋Ｔ細胞；１８−３５％のＩＦＮ−γ産生細胞）と比較して、ＣＤ３＋８＋５７＋２８−サブセット内で最も強いサイトカイン応答（＞５０％のＩＦＮ−γ産生細胞）を観察した（図９）。興味深いことに、骨再生において重要な役割を果たすことが知られており、かつＴ細胞の増殖を阻害可能であるヒト骨髄由来ＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ）は、メモリーＴ細胞によるＩＦＮ−γの分泌を抑制できず、これは組織因子からの負の信号に対するこれらの免疫細胞の抵抗を示している（図９）。
【実施例１０】
【０１４４】
ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γによる骨髄間葉系間質細胞の骨形成の阻害
次に、骨細胞に対するＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの影響を、インビトロでの骨分化及び生存率のアッセイを用いて試験した。
【０１４５】
図１０は、（ＣＤ３＋８＋）ＣＤ１１ａ＋＋、ＣＤ５７＋及びＣＤ２８−Ｔ細胞が、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを介してＢＭ−ＭＳＣの骨形成を阻害することを示している。図１０Ｂ及び１０Ｃ）は、指示されたＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの濃度をそれぞれ補充した骨形成培地で処理した後の、ＢＭ−ＭＳＣの代表的な図（上のパネル）を示している。図表は、細胞数に対して正規化したアリザリンレッドの光学濃度値（ＯＤＡＲ）を示している。図１０Ｄ及びＥ）は、指示されたサイトカイン濃度で補充した培地で培養した後に、アラマーブルー（登録商標）を用いて決定したＢＭ−ＭＳＣの活力を示している。図１０Ｆ）はＣｙＱｕａｎｔ（登録商標）により決定された全ＤＮＡ含量に対して正規化したＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）３／７Ａｓｓａｙの相対的な蛍光値を示している。図１０Ｇ）は、ＣＭを含まない対応する対照と比較した、生体外で刺激かつ選別されたＣＤ８＋ＴＥＭＲＡの馴化培地（ＣＭ）で培養した後のＢＭ−ＭＳＣのマトリックス石灰化を示している。ａ−ｆについて、ｎ＝４であり、ｇについて、ｎ＝３である。ＣＭでの処理細胞ｖｓ．未処理対照のボンフェローニ補正による分散分析、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５。破線は、未処理対照の値を示している。
【０１４６】
両方のサイトカインの添加により、濃度依存的にヒトＢＭ−ＭＳＣの骨分化が阻害された（図１０Ａ及び１０Ｂ）。興味深いことに、ＴＮＦ−αは１０−１００ｎｇ／ｍｌの濃度でヒトＢＭ−ＭＳＣの生存率を有意に減少させたが、ＩＦＮ−γは減少させなかった（図１０Ｃ及び１０Ｄ）。この観察を確認するために、アポトーシス率（図１０Ｅ）を決定した。予想されたように、ＴＮＦ−αは用量依存的にヒトＢＭ−ＭＳＣにおいてカスパーゼ３／７の活性を増加させたが、ＩＦＮ−γは影響を与えなかった。
【０１４７】
さらにＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞、その特異的なサイトカイン分泌及びそのマトリックス石灰化に対する悪影響の間の可能性のある関連性を調査するために、生体外で刺激かつ選別したＣＤ８＋ＴＥＭＲＡの馴化培地（ＣＭ）を使用した。骨分化の間、２倍濃縮骨形成培地で１：２に希釈したＣＭ中でＢＭ−ＭＳＣを培養した。あらかじめ、ＣＭ中のＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの濃度を決定し（ドナー１：ｃＩＦＮ−γ＝１．６ｎｇ／ｍｌ、ｃＴＮＦ−α＝１．８ｎｇ／ｍｌ；ドナー２：ｃＩＦＮ−γ＝２．１ｎｇ／ｍｌ、ｃＴＮＦ−α＝５．１ｎｇ／ｍｌ）、それらは非刺激細胞のＣＭ（ドナー２：ｃＩＦＮ−γ＝０．４ｎｇ／ｍｌ、ｃＴＮＦ−α＝０．２ｎｇ／ｍｌ）と比較して明らかに増加することが見出された。
【０１４８】
両方のドナーの生体外刺激ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞からのＣＭは完全にＢＭ−ＭＳＣ分化を阻害し、一方で、非刺激ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞からのＣＭは、標準骨形成培地と比較して有意な効果を示さなかった（図１０Ｆ−Ｈ）。さらに、ＩＦＮ−γ又はＴＮＦ−αのいずれかに対する中和抗体を刺激ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞のＣＭへ添加することにより、わずかにマトリックス石灰化を増加させた。しかしながら、両方の抗体の組み合わせは、ほとんど完全にＢＭ−ＭＳＣのマトリックス石灰化を逆転させた。
【０１４９】
要約すると、これらの結果から、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの両方は骨形成を阻害し、それ故、潜在的に骨治癒の遅延に寄与し得ることが示された。ＴＮＦ−αの阻害効果は、少なくとも部分的にアポトーシスの誘導に起因するようであり、一方で、ＩＦＮ−γは直接骨分化を妨害し得る。
【実施例１１】
【０１５０】
ＣＤ８＋枯渇はマウスモデルにおいて骨折治癒を改善する
メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮と不良な骨折治癒の病因との間の潜在的な因果関係を、さらにマウスモデルにおいて調査した。
【０１５１】
図１１は、ＣＤ８＋枯渇はマウスにおいて骨折治癒を改善することを示しており、Ａ）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇動物（ＣＤ８−、ｎ＝６）、未改変免疫細胞範囲を有する動物（ＷＴ、ｎ＝６）、半滅菌条件下で飼育した動物（ＷＴｅｘｐ、ｎ＝４）及びＣＤ８＋Ｔ細胞を養子免疫伝達した動物（ＣＤ８＋、ｎ＝３）の骨髄（ＢＭ）におけるＣＤ３＋ＴＣＲα／βＴ細胞のＣＤ８＋レベルを示しており、Ｂ）は示す群のＢＭにおけるＣＤ３＋Ｔ細胞のＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８＋の量を示している。Ｃ及びＤ）はＡに記載の群についての定量的なμＣＴ評価の結果を示しており、Ｅ−Ｈ）は、示す群についての代表的なμＣＴ画像を示している。ボンフェローニ補正による分散分析＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【０１５２】
第１動物群では、ＣＤ８＋細胞は抗体療法によって枯渇しており（ＣＤ８−群）、それは改善された骨治癒をもたらすことが期待された。枯渇の成功は、フローサイトメトリ（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｒｏｍｅｔｒｙ）により血液中で確認した。ほぼ完全なＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇は手術日に達成され、２１日の治癒期間にわたって部分的に回復した（枯渇前  ＣＤ３＋ＣＤ８＋  ２０．８％、手術日  ＣＤ３＋ＣＤ８＋  ０．０７％、２１日目  ＣＤ３＋ＣＤ８＋  ６．１％）。第２群は未改変免疫細胞範囲を有し（ＷＴ群、ｎ＝６）、かつ特定の病原体を含まないバリア状のハウジング条件（ＳＰＦ）下で飼育かつ維持した。この群では、動物の免疫系は、病原体に対して非常に限られた接触を有していたため、低い割合のＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８＋メモリーＴ細胞のみを有していた。第３群（ＷＴ）では、マウスを４週間以上バリアなしの半無菌条件下で飼育した。これらの動物は大いに病原体に曝露されていたため、強化されたＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８＋メモリーＴ細胞のレベルがもたらされた。最後の群（ＣＤ８＋）はさらにＣＤ８＋Ｔ細胞数を増加させるために、ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子免疫伝達を受けた。
【０１５３】
術後２１日目に、骨髄中のＣＤ８＋Ｔ細胞の量を決定した。予想されるように、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、他の全ての群と比較して、ＣＤ８−群で明らかに低かった（図１１ａ）。さらに、ＢＭ中のＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ８−群（１３±６．６）、ＷＴ群（３０±５．８）、ＷＴｅｘｐ群（３７±２．８）から、最も高い割合が検出されたＣＤ８＋群（４０±３．６）にかけて次第に増加した。同様の結果がメモリーＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８＋Ｔ細胞亜集団において見出され、それはまた他の全ての群と比較してＣＤ８−群において有意に低かった（図１１ｂ）。
【０１５４】
それ故、骨折仮骨の質のμＣＴ評価により、ＣＤ８−群からＣＤ８＋群にかけて、全体積に対する骨体積の比（ＢＶ／ＴＶ）及び骨量密度において段階的な減少が示された（図１１ｃ−ｈ）。これらの結果は、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮と低い骨質との間の因果関係に対する証拠をもたらす。
【実施例１２】
【０１５５】
骨折患者の手術前後の血液及び骨折血腫（ＦＨ）におけるＣＤ８＋Ｔ細胞集団中のＣＤ５７＋細胞
図１３は、この細胞表現型は、類似する術前及び術後の値によって示されるように手術介入による影響を受けず、それ故、術前の予後マーカーとして適していることを示している。さらに、骨折治癒の遅延を予想するための計算された遡及的なカットオフ値を用いて、遅延治癒プロセスが３人の患者において予期できる（矢印で表示）。
【０１５６】
このため、血液及び骨折血腫中のＣＤ８＋ＣＤ５７＋細胞の頻度は、長骨骨折患者の遅延治癒プロセスに対する適した尺度である。
【実施例１３】
【０１５７】
骨折患者の手術前後の血液及び骨折血腫（ＦＨ）におけるＣＤ８＋Ｔ細胞集団中のＣＤ２８−細胞
同様の結果がＣＤ４５＋３＋８＋２８−Ｔ細胞において見出だされた（図１４）。再度、この表現型は、上述したように、手術介入による影響を受けず、遅延治癒プロセスが同じ３人の患者において予期できる。
【実施例１４】
【０１５８】
骨折患者の手術前後の血液及び骨折血腫（ＦＨ）におけるＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＤ５７＋細胞及びＣＤ２８−細胞の頻度
ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞は骨折治癒プロセスにおいて重要な負の役割を果たしている。したがって、エフェクター／メモリー及び制御性のＴ細胞（Ｔｒｅｇ）ｔは治癒プロセスを改善し、早期かつ成功した治癒結果をもたらす。図１５は、これらの細胞は、手術介入による影響を受けず、かつ骨折血腫への著しい移行が見られたことを示している。
【０１５９】
概念及び証拠
長骨の遅延した、さらには不完全な（偽関節治癒）治癒は、約５−１０％の患者に影響を与え、かつ高い社会経済的影響と合わせて不良な長期転帰と関連する。本発明では、登録した患者の４１％は、一次手術介入後から１８週にわたって骨折間隙又はカルス形成及び身体機能の低下に反映されるように遅延した治癒を示した。注目すべきことに、遅延治癒患者の術後１８週目における歩行速度は、正常治癒群における術後６週目のレベルに匹敵するものであった。
【０１６０】
最も重要なことは、治癒の遅延は、表現型ＣＤ３＋８＋１１ａ＋＋２８−５７＋（ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ）を発現する最終分化したＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の有意に増大した頻度（＞２倍）を伴う、増幅した、かつ長期の炎症反応と強く関連していた。この差異は長期にわたって安定しており、それは骨折に対する反応よりもむしろ個人の免疫経験を反映するものであった。
【０１６１】
ＣＤ８＋ＣＤ５７＋を発現するリンパ球は、正常なアポトーシス経路の調節異常による後期慢性（ウイルス）感染症において増大する。臨床介入は患者の治癒プロセスにおいて大きな役割を果たしていると考えられる。ここに提示される本研究では、２群間で介入数、手術方法又は骨質において差異は見出されなかった。
【０１６２】
さらに、損傷によって引き起こされる重篤な軟組織欠損は、一般に脛骨骨折において知られており、かつ患者が高リスク患者であり、このリスクを本発明の方法により評価することで利益を有し得るという追加の指示をもたらす可能性がある。
【０１６３】
わずかな患者数と関係なく、データは、個々の免疫プロファイル（ＣＤ８＋ＴＥＭＲＡの頻度）が早期介入を可能とする骨折治癒の転帰を予測するための信頼できるバイオマーカーであることを実証する。
【０１６４】
【表３】
2020073485.tif 000004
【０１６５】
【表４】
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【０１６６】
【表５】
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【０１６７】
【表６】
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【０１６８】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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