(57)【要約】【課題】キメラ抗原受容体、単離された核酸、キメラ抗原受容体発現プラスミド、キメラ抗原受容体発現細胞、がん治療用の医薬組成物及びキメラ抗原受容体発現細胞の使用を提供する。【解決手段】キメラ抗原受容体は、ヒト白血球抗原Ｇに特異的に結合される。核酸は、前記キメラ抗原受容体をコードする。キメラ抗原受容体発現プラスミドは、前記キメラ抗原受容体を発現することができる。キメラ抗原受容体発現細胞は、キメラ抗原受容体を免疫細胞に形質導入することで得られる。がん治療用の医薬組成物は、キメラ抗原受容体発現細胞及び薬学的に許容される担体を含む。これによって、キメラ抗原受容体発現細胞は、哺乳類動物の腫瘍細胞の死亡を誘導することに用いることができる。【選択図】図２
2020043848.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト白血球抗原Ｇ（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｇ；ＨＬＡ−Ｇ）に特異的に結合されるキメラ抗原受容体であって、
Ｎ端からＣ端まで順次に配列する配列識別番号１に示す抗ＨＬＡ−Ｇ抗体、配列識別番号２に示すＨＬＡ−Ｇ受容体、及び配列識別番号３に示す共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体。
【請求項２】
前記共刺激ドメインのＣ端に連結される配列識別番号４に示す自殺タンパク質を更に含む請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３】
前記ＨＬＡ−Ｇ受容体及び前記共刺激ドメインを直列連結する２Ａペプチドを更に含む請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４】
請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離された核酸であって、
順次に配列する配列識別番号１１に示すコードされた抗ＨＬＡ−Ｇ抗体断片、配列識別番号１２に示すコードされたＨＬＡ−Ｇ受容体断片及び配列識別番号１３に示すコードされた共刺激ドメイン断片を含む単離された核酸。
【請求項５】
前記コードされた共刺激ドメイン断片の３’末端に連結される配列識別番号１４に示す自殺遺伝子を更に含む請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
前記コードされたＨＬＡ−Ｇ受容体断片及び前記コードされた共刺激ドメイン断片を直列連結するコードされた２Ａペプチド配列を更に含む請求項４に記載の核酸。
【請求項７】
順次に配列する配列識別番号１５に示すプロモーター及び請求項４に記載の核酸を含むキメラ抗原受容体発現プラスミド。
【請求項８】
前記核酸の３’末端に連結される配列識別番号１４に示す自殺遺伝子を更に含む請求項７に記載のキメラ抗原受容体発現プラスミド。
【請求項９】
免疫細胞と、
請求項７又は８に記載のキメラ抗原受容体発現プラスミドと、
を含むキメラ抗原受容体発現細胞。
【請求項１０】
前記免疫細胞は、Ｔ細胞である請求項９に記載のキメラ抗原受容体発現細胞。
【請求項１１】
前記免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞である請求項９に記載のキメラ抗原受容体発現細胞。
【請求項１２】
前記ナチュラルキラー細胞は、ＮＫ−９２細胞株又は第１世代ナチュラルキラー細胞である請求項１１に記載のキメラ抗原受容体発現細胞。
【請求項１３】
請求項９に記載のキメラ抗原受容体発現細胞と、
薬学的に許容される担体と、
を含むがん治療用の医薬組成物。
【請求項１４】
化学療法薬を更に含む請求項１３に記載のがん治療用の医薬組成物。
【請求項１５】
前記化学療法薬は、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、テモゾロマイド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）又はカルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）である請求項１３に記載のがん治療用の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項９に記載のキメラ抗原受容体発現細胞の使用であって、哺乳類動物の腫瘍細胞の死亡誘導用薬物を調製するためのキメラ抗原受容体発現細胞の使用。
【請求項１７】
前記腫瘍細胞は、乳癌細胞、多形性膠芽腫の腫瘍細胞、膵臓癌細胞又は卵巣癌細胞である請求項１６に記載のキメラ抗原受容体発現細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原又は抗体を含む医薬製品に関し、特に、キメラ抗原受容体、キメラ抗原受容体をコードする核酸、キメラ抗原受容体発現プラスミド、キメラ抗原受容体発現細胞、癌を治療する医薬組成物及びキメラ抗原受容体発現細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、悪性腫瘍とも呼ばれ、細胞の異常な増殖であり、且つこれらの増殖した細胞が体の他の部分に侵入する可能性があり、細胞の分裂や増殖を制御する機構の異常による病気である。世界中で癌に罹患する人々の数が増える趨勢があり、癌は、中国人の死因のトップ１０の１つとなり、且つ２７年連続で死因のトップ１０の首位にランクされる。
【０００３】
通常の腫瘍治療方法としては、手術療法、放射線療法、化学療法、標的治療等がある。腫瘍免疫療法は、上記治療方法以外の別の腫瘍治療方法であり、患者自身の免疫系を活性化して、腫瘍細胞又は腫瘍抗原性物質を利用して体内の特異的細胞免疫及び体液性免疫反応を誘導することで、体の抗癌能力を高め、腫瘍の成長、拡散及び再発を阻止して、腫瘍の掃除や制御という目的を達成させる。
【０００４】
腫瘍免疫療法は、主に、腫瘍ワクチン、細胞療法及び免疫チェックポイント阻害剤という３つの方向があり、キメラ抗原受容体免疫細胞技術が近年で非常に急速に成長する細胞療法である。従来の技術において、キメラ抗原受容体免疫細胞は、ある腫瘍抗原を認識可能な抗体の抗原結合部とＣＤ３−δ鎖又はＦｃεＲＩγの細胞内部分を体外で１つのキメラタンパク質としてカップリングし、遺伝子導入の方法によって患者の免疫細胞をトランスフェクトして、キメラ抗原受容体を発現させ、それが急性白血病及び非ホジキンリンパ腫の治療に顕著な効果を有し、最も有望な腫瘍治療法の１つであると考えられる。しかし、現在、キメラ抗原受容体免疫細胞の細胞療法は、独特の腫瘍関連抗原の欠如、腫瘍部位への免疫細胞のホーミング効率が低く及び固形腫瘍の免疫抑制微小環境を克服できないので、キメラ抗原受容体の固形腫瘍での有効性が大きく制限される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、キメラ抗原受容体、単離された核酸、キメラ抗原受容体発現プラスミド、キメラ抗原受容体発現細胞、その使用及びがん治療用の医薬組成物を提供することを目的とする。キメラ抗原受容体は、優れた腫瘍細胞に対する特異的結合の能力を有する。前記核酸は、前記キメラ抗原受容体をコードする。キメラ抗原受容体発現プラスミドは、前記核酸を含む。前記キメラ抗原受容体発現細胞は、前記キメラ抗原受容体発現プラスミドを含み、前記キメラ抗原受容体を発現して、特異的に腫瘍細胞を標的として、オフターゲット効果を避けて、更に腫瘍細胞を効果的に殺すことができるため、哺乳類動物の腫瘍細胞の死亡誘導用薬物を調製することができる。前記がん治療用の医薬組成物は、前記キメラ抗原受容体発現細胞を含み、腫瘍細胞を効果的に殺して更に癌を治療することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様による一実施形態は、ヒト白血球抗原Ｇ（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｇ；ＨＬＡ−Ｇ）に特異的に結合されるキメラ抗原受容体であって、Ｎ端からＣ端まで順次に配列する配列識別番号１に示す抗ＨＬＡ−Ｇ抗体、配列識別番号２に示すＨＬＡ−Ｇ受容体、及び配列識別番号３に示す共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供する。
【０００７】
前記キメラ抗原受容体によれば、前記共刺激ドメインのＣ端に連結される配列識別番号４に示す自殺タンパク質を更に含んでよい。
【０００８】
前記キメラ抗原受容体によれば、前記ＨＬＡ−Ｇ受容体及び前記共刺激ドメインを直列連結する２Ａペプチドを更に含んでよい。
【０００９】
本発明の一態様による他の実施形態は、前記に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離された核酸であって、順次に配列する配列識別番号１１に示すコードされた抗ＨＬＡ−Ｇ抗体断片、配列識別番号１２に示すコードされたＨＬＡ−Ｇ受容体断片及び配列識別番号１３に示すコードされた共刺激ドメイン断片を含む単離された核酸を提供する。
【００１０】
前記の単離された核酸によれば、前記コードされた共刺激ドメイン断片の３’末端に連結される配列識別番号１４に示す自殺遺伝子を更に含んでよい。
【００１１】
前記の単離された核酸によれば、前記コードされたＨＬＡ−Ｇ受容体断片及び前記コードされた共刺激ドメイン断片を直列連結するコードされた２Ａペプチド配列を更に含んでよい。
【００１２】
本発明の一態様による更なる一実施形態は、順次に排列する配列識別番号１５に示すプロモーター及び前記に記載の前記の核酸を含むキメラ抗原受容体発現プラスミドを提供する。
【００１３】
前記キメラ抗原受容体発現プラスミドによれば、前記核酸の３’末端に連結される配列識別番号１４に示す自殺遺伝子を更に含んでよい。
【００１４】
本発明の一態様の別の実施形態は、免疫細胞と、前記に記載のキメラ抗原受容体発現プラスミドと、を含むキメラ抗原受容体発現細胞を提供する。
【００１５】
前記のキメラ抗原受容体発現細胞によれば、前記免疫細胞は、Ｔ細胞又はナチュラルキラー細胞であってよい。好ましくは、前記ナチュラルキラー細胞は、ＮＫ−９２細胞株又は第１世代ナチュラルキラー細胞であってよい。
【００１６】
本発明の一態様の他の実施形態は、前記に記載のキメラ抗原受容体発現細胞と、薬学的に許容される担体と、を含むがん治療用の医薬組成物を提供する。
【００１７】
前記のがん治療用の医薬組成物によれば、化学療法薬を更に含んでよい。好ましくは、前記化学療法薬は、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、テモゾロマイド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）又はカルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）であってよい。
【００１８】
本発明の他の態様の一実施形態は、哺乳類動物の腫瘍細胞の死亡誘導用薬物を調製するための前記に記載のキメラ抗原受容体発現細胞の使用を提供する。
【００１９】
前記のキメラ抗原受容体発現細胞の使用によれば、前記腫瘍細胞は、乳癌細胞、多形性膠芽腫の腫瘍細胞、膵臓癌細胞及び卵巣癌細胞であってよい。
【００２０】
上記の発明内容は、読者に本開示内容を基本的に理解させるように、本開示内容の簡単な概要を提供することを主旨とする。この発明内容は、本開示内容の完全な概要ではなく、且つ本発明の実施例の重要／主要な素子を指摘するか又は本発明の範囲を限定することを意味しない。
下記の添付図面の説明は、本発明の上記及び他の目的、特徴、メリット及び実施例をより分かりやすくするためのものである。また、添付ファイル１〜８（図９Ａ〜Ｈに対応）は、本明細書とは別に、物件提出書にて提出される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
下記添付図面の説明は、本発明の上記及び他の目的、特徴、利点及び実施例をより分かりやすくするためのものである。
【図１】本発明の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体のタンパク質の構造を示す模式図である。
【図２】本発明のキメラ抗原受容体発現プラスミドの構築を示す模式図である。
【図３】本発明の実施例１によるキメラ抗原受容体発現細胞のキメラ抗原受容体発現量の分析図である。
【図４】図４Ａ〜Ｉは、本発明の実施例１によるキメラ抗原受容体発現細胞が腫瘍細胞の死亡を誘導する分析結果図である。
【図５】本発明の実施例２によるキメラ抗原受容体発現細胞のキメラ抗原受容体発現量の分析図である。
【図６】図６Ａ〜Ｉは、本発明の実施例２によるキメラ抗原受容体発現細胞が腫瘍細胞の死亡を誘導する分析結果図である。
【図７】本発明の実施例３によるキメラ抗原受容体発現細胞のキメラ抗原受容体発現量の分析図である。
【図８】図８Ａ〜Ｉは、本発明の実施例３によるキメラ抗原受容体発現細胞が腫瘍細胞の死亡を誘導する分析結果図である。
【図９】図９Ａ〜Ｈは、腫瘍細胞が化学療法を受けたＨＬＡ−Ｇ発現量を分析する免疫蛍光染色結果図である。
【図１０】図１０Ａ〜Ｅは、腫瘍細胞化学療法を受けたＨＬＡ−Ｇ発現量のフローサイトメトリーの分析結果図である。
【図１１】本発明のキメラ抗原受容体が本発明のキメラ抗原受容体発現細胞質膜内での理論構造及び作用機序を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書の開示内容は、キメラ抗原受容体、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸、前記核酸を含むキメラ抗原受容体発現プラスミド、前記キメラ抗原受容体発現プラスミドを含むキメラ抗原受容体発現細胞、その使用、及びキメラ抗原受容体発現細胞を含むがん治療用の医薬組成物を提案する。腫瘍細胞の細胞でテストをし、本発明のキメラ抗原受容体が優れた腫瘍細胞に対する特異的結合の能力を有し、特に腫瘍細胞の細胞膜上で発現されたヒト白血球抗原Ｇに特異的に結合される能力を有することが証明されるので、本発明のキメラ抗原受容体を発現するキメラ抗原受容体発現細胞が特異的に腫瘍細胞を標的として、オフターゲット効果を避けて、更に腫瘍細胞を効果的に殺すことで、哺乳類動物の腫瘍細胞の死亡誘導用薬物を調製することに用いることができる。前記本発明のがん治療用の医薬組成物は、本発明のキメラ抗原受容体発現細胞を含み、且つ化学療法薬を更に含んでよく、腫瘍細胞を効果的に殺して更に癌を治療することができる。
【００２３】
本明細書に記載の「ヒト白血球抗原Ｇ（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｇ；ＨＬＡ−Ｇ）」は、ＨＬＡ−Ｇ遺伝子によりコードされ、非定型ファーストクラス主要組織適合複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）であり、重鎖が約４５ｋＤａである。ＨＬＡ−Ｇは、胎児由来の胎盤細胞で発現され、免疫応答の負の調節に非常に活発であり、その作用が主に細胞毒性を抑制して細胞を免疫することにある。
【００２４】
以下、具体的な試験例によって本発明を模式的に説明し、当業者が過度に解釈せずに本発明を完全に活用して実施することに用いられる。これらの試験例は、本発明の範囲を制限するものと見なされるべきではないが、本発明の材料や方法を如何に実施するかを説明ためのものである。
【００２５】
［試験例］
一、本発明のキメラ抗原受容体、単離された核酸及びキメラ抗原受容体発現プラスミド
本発明のキメラ抗原受容体は、ヒト白血球抗原Ｇに特異的に結合され、Ｎ端からＣ端まで順次に配列する配列識別番号１に示す抗ＨＬＡ−Ｇ抗体、配列識別番号２に示すＨＬＡ−Ｇ受容体、及び配列識別番号３に示す共刺激ドメインを含む。好ましくは、共刺激ドメインのＣ端に配列識別番号４に示す自殺タンパク質が更に連結されてよく、また前記ＨＬＡ−Ｇ受容体及び前記共刺激ドメインを直列連結する配列識別番号１０に示す２Ａペプチドを更に含んでよい。詳しくは、配列識別番号１に示す抗ＨＬＡ−Ｇ抗体に、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列及び軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列が含まれる。重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、配列識別番号５に示すＣＤＲＨ１、配列識別番号６に示すＣＤＲＨ２及び配列識別番号７に示すＣＤＲＨ３である。軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、配列識別番号８に示すＣＤＲＬ２及び配列識別番号９に示すＣＤＲＬ３である。図１を参照されたい。図１は、本発明の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体のタンパク質の構造を示す模式図であり、散布点の環状領域が本発明の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体における可変ドメインを示す。配列識別番号２に示すＨＬＡ−Ｇ受容体は、キラー細胞免疫球蛋白樣受容体２ＤＳ４（ｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２ＤＳ４；ＫＩＲ２ＤＳ４）である。配列識別番号３に示す共刺激ドメインは、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＮＡＸ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １２；ＤＡＰ１２）である。配列識別番号４に示す自殺タンパク質は、ｉＣａｓ９蛋白である。
【００２６】
本発明の単離された核酸は、本発明のキメラ抗原受容体をコードする。前記核酸は、順次に配列する配列識別番号１１に示すコードされた抗ＨＬＡ−Ｇ抗体断片、配列識別番号１２に示すコードされたＨＬＡ−Ｇ受容体断片及び配列識別番号１３に示すコードされた共刺激ドメイン断片を含む。好ましくは、共刺激ドメイン断片の３’末端に、配列識別番号１４に示す自殺遺伝子が更に連結されてよい。また、前記コードされたＨＬＡ−Ｇ受容体断片及び前記コードされた共刺激ドメイン断片を直列連結する配列識別番号１５に示すコードされた２Ａペプチド配列を更に含んでよい。配列識別番号１１に示すコードされた抗ＨＬＡ−Ｇ抗体断片は、配列識別番号１に示す抗ＨＬＡ−Ｇ抗体をコードし、配列識別番号１２に示すコードされたＨＬＡ−Ｇ受容体断片は配列識別番号２に示すＨＬＡ−Ｇ受容体をコードする。配列識別番号１３に示すコードされた共刺激ドメイン断片は、配列識別番号３に示す共刺激ドメインをコードする。配列識別番号１４に示す自殺遺伝子は、配列識別番号４に示す自殺タンパク質をコードする。配列識別番号１５に示すコードされた２Ａペプチド配列は、配列識別番号１０に示す２Ａペプチドをコードする。
【００２７】
本発明のキメラ抗原受容体発現プラスミドの構築を示す模式図である図２を参照されたい。詳しくは、本試験例に示す実施例において、キメラ抗原受容体発現プラスミドは、Ｌｅｎｔｉ−ＥＦ１ａ−ＣＡＲ−１００５１７−Ｓ１Ａプラスミドであり、そのインサート（ｉｎｓｅｒｔ）断片が順次に配列するプロモーター、コードされた抗ＨＬＡ−Ｇ抗体断片、コードされたＨＬＡ−Ｇ受容体断片及びコードされた共刺激ドメイン断片を含む。プロモーターは、配列識別番号１６に示すＥＦ−１  ａｌｐｈａプロモーターである。コードされた抗ＨＬＡ−Ｇ抗体断片の配列は、配列識別番号１１に示す。コードされたＨＬＡ−Ｇ受容体断片の配列は、配列識別番号１２に示す。コードされた共刺激ドメイン断片の配列は、配列識別番号１３に示す。なお、インサートに配列識別番号１７に示すコードされたメッセージペプチド断片、配列識別番号１４に示す自殺遺伝子及び配列識別番号１５に示すコードされた２Ａペプチド配列が更に含まれる。コードされたメッセージペプチド断片がコードされた抗ＨＬＡ−Ｇ抗体断片の５’末端に連結され、自殺遺伝子が共刺激ドメイン断片の３’末端に連結され、コードされた２Ａペプチド配列が前記コードされたＨＬＡ−Ｇ受容体断片及び前記コードされた共刺激ドメイン断片を直列連結する。更に、Ｌｅｎｔｉ−ＥＦ１ａ−ＣＡＲ−１００５１７−Ｓ１Ａプラスミドを取得するために、インサート断片をＣｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓキャリア（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ；ＮＹ；ＵＳＡ）に構築する。使用されたキャリアは、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）キャリアシステムであるため、構築されたキメラ抗原受容体発現プラスミドを発現細胞にトランスフェクトして、レンチウイルスを生産することができ、後でレンチウイルスによってキメラ抗原受容体を免疫細胞に形質導入することができる。
【００２８】
二、本発明のキメラ抗原受容体発現細胞、その使用及びがん治療用の医薬組成物
本発明のキメラ抗原受容体発現細胞は、本発明のキメラ抗原受容体をレンチウイルスによって免疫細胞に形質導入することで得られる。好ましくは、前記免疫細胞は、Ｔ細胞又はナチュラルキラー細胞であってよい。より好ましくは、前記ナチュラルキラー細胞は、ＮＫ−９２細胞株又は第１世代ナチュラルキラー細胞であってよい。詳しくは、構築されたＬｅｎｔｉ−ＥＦ１ａ−ＣＡＲ−１００５１７−Ｓ１Ａプラスミドを、まずｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって２９３Ｔ細胞株にトランスフェクトして本発明のキメラ抗原受容体付きのレンチウイルスを調製し、更に、調製されたレンチウイルスを含む上清液及び８μｇ／ｍｌのポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対して第１世代Ｔ細胞を３日間培養して、本発明のキメラ抗原受容体を第１世代Ｔ細胞に形質導入する。調製されたレンチウイルスの上清液及び５０μｇ／ｍｌのプロタミン（Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対して第１世代ナチュラルキラー細胞又はＮＫ−９２細胞株を７日間培養して、本発明のキメラ抗原受容体を第１世代ナチュラルキラー細胞又はＮＫ−９２細胞株に形質導入し、本発明のキメラ抗原受容体発現細胞を取得することができる。得られたキメラ抗原受容体発現細胞は、哺乳類動物の腫瘍細胞の死亡を誘導する効果を有し、哺乳類動物の腫瘍細胞の死亡誘導用薬物を調製することに用いることができる。好ましくは、腫瘍細胞は、乳癌細胞、多形性膠芽腫の腫瘍細胞、膵臓癌細胞又は卵巣癌細胞であってよい。
【００２９】
本発明のがん治療用の医薬組成物は、本発明のキメラ抗原受容体発現細胞及び薬学的に許容される担体を含む。好ましくは、前記がん治療用の医薬組成物は、化学療法薬を更に含んでよい。より好ましくは、前記化学療法薬は、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、テモゾロマイド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）又はカルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）であってよい。
【００３０】
以下の試験例では、本発明のキメラ抗原受容体発現細胞及び本発明のキメラ抗原受容体発現細胞を含むがん治療用の医薬組成物の何れも多種の哺乳類動物の腫瘍細胞に対して良好な死亡誘導効果を有することを、データによって証明する。試験に使用された腫瘍細胞は、それぞれヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ（以下でＤＢＴＲＧと略称する）、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１及びヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３である。使用された腫瘍細胞株の何れもアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ）から購入される。ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株は、トリプルネガティブ乳癌細胞株であり、即ちホルモン受容体（ＥＲ、ＰＲ）及びＨＥＲ−２受容体は陰性であり、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有のＲＰＭＩ培養液に培養される。ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧは、１０％ウシ胎仔血清含有のＤＭＥＭ培養液に培養される。ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１は、１０％ウシ胎仔血清含有のＲＰＭＩ培養液に培養される。ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３は、１０％ウシ胎仔血清含有のＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培養液に培養される。
【００３１】
２．１．実施例１
本試験例において、本発明のキメラ抗原受容体をＮＫ−９２細胞株に形質導入することで、本発明の実施例１のキメラ抗原受容体発現細胞を取得することができ、更に得られた実施例１のキメラ抗原受容体発現細胞をフローサイトメトリーでそのキメラ抗原受容体の発現量を分析した。図３を参照されたい。図３は、本発明の実施例１におけるキメラ抗原受容体発現細胞のキメラ抗原受容体の発現量分析図である。図３では、それぞれ本発明のキメラ抗原受容体の形質導入されていない親代ＮＫ−９２細胞株のキメラ抗原受容体の発現量分析図であり、及び実施例１におけるキメラ抗原受容体発現細胞の形質導入後の３日目及び７日目のキメラ抗原受容体の発現量分析図である。図３のデータから分かるように、親代ＮＫ−９２細胞株の平均蛍光強度（ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ；ＭＦＩ）が９．９８％だけであり、実施例１におけるキメラ抗原受容体発現細胞の形質導入後の３日目及び７日目の平均蛍光強度がそれぞれ２０．１１％及び６５．０７％に達することができるので、実施例１におけるキメラ抗原受容体発現細胞は、本発明のキメラ抗原受容体を安定に発現することができることが示された。
【００３２】
本発明の実施例１におけるキメラ抗原受容体発現細胞及び本発明の実施例１におけるキメラ抗原受容体発現細胞を含むがん治療用の医薬組成物の乳癌細胞、多形性膠芽腫の腫瘍細胞、膵臓癌細胞及び卵巣癌細胞の死亡に対する誘導効果を更に試験した。
【００３３】
まず、それぞれヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧ、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１及びヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で１２ウェルプレートに植え、更に４８時間培養した後で試験した。試験上で、各種の腫瘍細胞を、それぞれ処理されていない制御群、化学療法薬で処理されたテスト群１、親代ＮＫ−９２細胞株で処理されたテスト群２、親代ＮＫ−９２細胞株及び化学療法薬で処理されたテスト群３、実施例１におけるキメラ抗原受容体発現細胞で処理されたテスト群４及び実施例１におけるキメラ抗原受容体発現細胞及び化学療法薬で処理されたテスト群５という６つの群に分けた。化学療法薬として、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の群でドキソルビシン（２００ｎＭ）を、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの群でテモゾロマイド（８０μｇ／ｍｌ）を、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の群でゲムシタビン（２０μＭ）を、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の群でカルボプラチン（２０μＭ）を使用した。テスト群４及びテスト群５で処理された実施例１におけるキメラ抗原受容体発現細胞の細胞数は１×１０５ｃｅｌｌｓであり、テスト群２及びテスト群３で処理された親代ＮＫ−９２細胞株の細胞数も１×１０５ｃｅｌｌｓであった。更に処理された各組の細胞をＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ及び核酸染料ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）で細胞染色し、且つフローサイトメーターでアポトーシス及び死亡の状況を検出し、且つＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ及び／又はＰＩに染まった細胞の百分率（つまり、二変量フローサイトメーター散布図における第１象限、第２象限及び第３象限での細胞百分率）の合計を算出することで細胞殺傷作用を取得した。各群に対して独立した試験を３回繰り返した後で、細胞殺傷作用の結果を統計した。
【００３４】
本発明の実施例１におけるキメラ抗原受容体発現細胞が腫瘍細胞死亡を誘導する分析結果図である図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、図４Ｅ及び図４Ｆを参照されたい。図４Ａは、実施例１のキメラ抗原受容体発現細胞がヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１死亡を誘導する分析結果図である。図４Ｂは、図４Ａの試験を３回繰り返した後の統計図である。図４Ｃは、実施例１のキメラ抗原受容体発現細胞がヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧ死亡を誘導する分析結果図である。図４Ｄは、図４Ｃの試験を３回繰り返した後の統計図である。図４Ｅは、実施例１のキメラ抗原受容体発現細胞がヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１死亡を誘導する分析結果図である。図４Ｆは、図４Ｅの試験を３回繰り返した後の統計図である。図４Ｇは、実施例１のキメラ抗原受容体発現細胞がヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３死亡を誘導する分析結果図である。図４Ｈは、図４Ｇの試験を３回繰り返した後の統計図である。図４Ｉは、図４Ａ、図４Ｃ、図４Ｅ及び図４Ｇの試験を３回繰り返した後の統計図である。図面において、Ｐは親代ＮＫ−９２細胞株を示し、Ｈは実施例１のキメラ抗原受容体発現細胞を示し、Ｈはドキソルビシンを示し、Ｔはテモゾロマイドを示し、Ｇはゲムシタビンを示し、Ｃはカルボプラチンを示す。
【００３５】
図４Ａ及び図４Ｂの結果から分かるように、処理されていない制御群で、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の約１０％のみが死亡したことが見られ、ドキソルビシンで処理されたテスト群１及び親代ＮＫ−９２細胞株で処理されたテスト群２で、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の死亡率が増加したが、統計的な差はなかった。親代ＮＫ−９２細胞株及びドキソルビシンで処理されたテスト群３は、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の死亡率が４０％まで向上することができ、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．０５）があった。実施例１のキメラ抗原受容体発現細胞で処理されたテスト群４により誘導されたヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の死亡率が約６０％に達することができ、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．００１）があった。なお、実施例１のキメラ抗原受容体発現細胞及びドキソルビシンで処理されたテスト群５により誘導されたヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の死亡率が更に約８０％に高く達することができ、テスト群４と比べて統計的な差（ｐ＜０．０５）があり、テスト群３と比べて統計的な差（ｐ＜０．０１）もあった。
【００３６】
図４Ｃ及び図４Ｄの結果から分かるように、処理されていない制御群で、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの１０％未満のみが死亡したことが見られ、テモゾロマイドで処理されたテスト群１及び親代ＮＫ−９２細胞株で処理されたテスト群２で、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの死亡率が増加したが、統計的な差はなかった。親代ＮＫ−９２細胞株及びテモゾロマイドで処理されたテスト群３は、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの死亡率が４０％まで向上することができ、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．０５）があった。実施例１のキメラ抗原受容体発現細胞で処理されたテスト群４により誘導されたヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの死亡率は６０％を超えることができ、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．００１）があった。なお、実施例１のキメラ抗原受容体発現細胞及びテモゾロマイドで処理されたテスト群５により誘導されたヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの死亡率が更に８０％を超えることができ、テスト群４と比べて統計的な差（ｐ＜０．０５）があり、テスト群３と比べて統計的な差（ｐ＜０．００１）もあった。
【００３７】
図４Ｅ及び図４Ｆの結果から分かるように、処理されていない制御群で、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の１０％未満のみが死亡したことが見られ、ゲムシタビンで処理されたテスト群１及び親代ＮＫ−９２細胞株で処理されたテスト群２で、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の死亡率が増加したが、統計的な差はなかった。親代ＮＫ−９２細胞株及びゲムシタビンを処理するテスト群３は、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の死亡率が約３０％まで向上することができるが、依然として統計的な差はなかった。実施例１のキメラ抗原受容体発現細胞で処理されたテスト群４により誘導されたヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の死亡率が４０％に近くすることができ、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．０１）があった。なお、実施例１のキメラ抗原受容体発現細胞及びゲムシタビンで処理されたテスト群５により誘導されたヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の死亡率が約６０％に更に達し、テスト群４と比べて統計的な差（ｐ＜０．００１）があり、テスト群３と比べて統計的な差（ｐ＜０．００１）もあった。
【００３８】
図４Ｇ及び図４Ｈの結果から分かるように、処理されていない制御群で、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の１０％未満のみが死亡したことが見られ、カルボプラチンで処理されたテスト群１及び親代ＮＫ−９２細胞株で処理されたテスト群２で、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の死亡率が増加したが、統計的な差はなかった。親代ＮＫ−９２細胞株及びカルボプラチンで処理されたテスト群３は、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の死亡率が約３０％まで向上することができ、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．０５）があった。実施例１のキメラ抗原受容体発現細胞で処理されたテスト群４により誘導されたヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の死亡率が４０％に近くすることができ、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．０１）があった。なお、実施例１のキメラ抗原受容体発現細胞及びカルボプラチンで処理されたテスト群５により誘導されたヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の死亡率が約６０％に更に達し、テスト群４と比べて統計的な差（ｐ＜０．０５）があり、テスト群３と比べて統計的な差（ｐ＜０．０１）もあった。
【００３９】
図４Ｉの結果から分かるように、実施例１で処理されたキメラ抗原受容体発現細胞は、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧ、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１及びヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の何れに対しても優れた殺傷作用を果たすため、本発明のキメラ抗原受容体発現細胞は、哺乳類動物の腫瘍細胞の死亡誘導用薬物を調製することに用いることができる。好ましくは、前記腫瘍細胞は、乳癌細胞、多形性膠芽腫の腫瘍細胞、膵臓癌細胞又は卵巣癌細胞であってよい。なお、実施例１のキメラ抗原受容体発現細胞及び化学療法薬を同時に処理すれば、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧ、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１及びヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３に対する殺傷作用がより顕著であり、本発明におけるがん治療用の医薬組成物は、腫瘍細胞を効果的に殺して更に癌を治療することができることが示された。好ましくは、本発明におけるがん治療用の医薬組成物は、化学療法薬を更に含んでよい。前記化学療法薬は、ドキソルビシン、テモゾロマイド、ゲムシタビン及びカルボプラチンを含んでよいが、それらに制限されない。
【００４０】
２．２．実施例２
本試験例では、本発明のキメラ抗原受容体を第１世代ナチュラルキラー細胞に形質導入することで、本発明の実施例２におけるキメラ抗原受容体発現細胞を取得することができ、更に得られた実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞をフローサイトメトリーでそのキメラ抗原受容体の発現量を分析した。本発明の実施例２におけるキメラ抗原受容体発現細胞のキメラ抗原受容体の発現量分析図である図５を参照されたい。図５では、それぞれ本発明のキメラ抗原受容体の形質導入されていない親代第１世代ナチュラルキラー細胞のキメラ抗原受容体の発現量分析図であり、及び実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞の形質導入後の３日目及び７日目のキメラ抗原受容体の発現量分析図である。図５のデータから分かるように、親代第１世代ナチュラルキラー細胞の平均蛍光強度は２２．０９％であり、実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞の形質導入後の３日目及び７日目の平均蛍光強度がそれぞれ２９．０２％及び５０．２１％に達することができるので、実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞は、確実に本発明のキメラ抗原受容体を安定に発現することができることが示された。
【００４１】
本発明の実施例２におけるキメラ抗原受容体発現細胞及び本発明の実施例２におけるキメラ抗原受容体発現細胞を含むがん治療用の医薬組成物の乳癌細胞、多形性膠芽腫の腫瘍細胞、膵臓癌細胞及び卵巣癌細胞の死亡に対する誘導効果を更にテストした。
【００４２】
まず、それぞれヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧ、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１及びヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で１２ウェルプレートに植え、更に４８時間培養した後で試験した。試験上で、各種の腫瘍細胞を、それぞれ処理されていない制御群、化学療法薬で処理されたテスト群１、親代第１世代ナチュラルキラー細胞で処理されたテスト群２、親代第１世代ナチュラルキラー細胞及び化学療法薬で処理されたテスト群３、実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞で処理されたテスト群４及び実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞及び化学療法薬で処理されたテスト群５という６つの群に分けた。化学療法薬として、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の群でドキソルビシン（２００ｎＭ）を、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの群でテモゾロマイド（８０μｇ／ｍｌ）を、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の群でゲムシタビン（２０μＭ）を、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の群でカルボプラチン（２０μＭ）を使用した。テスト群４及びテスト群５で、処理された実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞の細胞数は１×１０５ｃｅｌｌｓであり、テスト群２及びテスト群３で処理された親代第１世代ナチュラルキラー細胞の細胞数も１×１０５ｃｅｌｌｓであった。更に処理された各組の細胞をＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ及びＰＩで細胞染色し、且つＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ及び／又はＰＩに染まった細胞の百分率の合計を算出することで細胞殺傷作用を取得した。各群に対して独立した試験を３回繰り返した後で、細胞殺傷作用の結果を統計した。
【００４３】
本発明の実施例２におけるキメラ抗原受容体発現細胞が腫瘍細胞死亡を誘導する分析結果図である図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、図６Ｆ、図６Ｇ、図６Ｈ及び図６Ｉを参照されたい。図６Ａは、実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞がヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１死亡を誘導する分析結果図である。図６Ｂは、図６Ａの試験を３回繰り返した後の統計図である。図６Ｃは、実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞がヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧ死亡を誘導する分析結果図である。図６Ｄは、図６Ｃの試験を３回繰り返した後の統計図である。図６Ｅは、実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞がヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１死亡を誘導する分析結果図である。図６Ｆは、図６Ｅの試験を３回繰り返した後の統計図である。図６Ｇは、実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞がヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３死亡を誘導する分析結果図である。図６Ｈは、図６Ｇの試験を３回繰り返した後の統計図である。図６Ｈは、図６Ｇの統計図である。図６Ｉは、図６Ａ、図６Ｃ、図６Ｅ及び図６Ｇの試験を３回繰り返した後の統計図である。図面において、Ｐは親代第１世代ナチュラルキラー細胞を示し、Ｈは実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞を示し、Ｈはドキソルビシンを示し、Ｔはテモゾロマイドを示し、Ｇはゲムシタビンを示し、Ｃはカルボプラチンを示す。
【００４４】
図６Ａ及び図６Ｂの結果から分かるように、処理されていない制御群で、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の約１０％のみが死亡したことが見られ、ドキソルビシンで処理されたテスト群１及び親代第１世代ナチュラルキラー細胞で処理されたテスト群２で、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の死亡率が増加したが、統計的な差はなかった。親代第１世代ナチュラルキラー細胞及びドキソルビシンで処理されたテスト群３で、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の死亡率が約３０％まで向上することができ、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．０５）があった。実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞で処理されたテスト群４により誘導されたヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の死亡率が５０％を超え、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．０１）があった。なお、実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞及びドキソルビシンで処理されたテスト群５により誘導されたヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の死亡率は更に約８０％に達することができ、テスト群４と比べて統計的な差（ｐ＜０．０５）があり、テスト群３と比べて統計的な差（ｐ＜０．０１）もあった。
【００４５】
図６Ｃ及び図６Ｄの結果から分かるように、処理されていない制御群で、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの１０％未満のみが死亡したことが見られ、テモゾロマイドで処理されたテスト群１及び親代第１世代ナチュラルキラー細胞で処理されたテスト群２で、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの死亡率が増加したが、統計的な差はなかった。親代第１世代ナチュラルキラー細胞及びテモゾロマイドで処理されたテスト群３で、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの死亡率がほぼ３０％に向上されることができる。実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞で処理されたテスト群４により誘導されたヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの死亡率が２０％を超えることができ、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．０５）があった。なお、実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞及びテモゾロマイドで処理されたテスト群５により誘導されたヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの死亡率が６０％に近くすることができ、テスト群４と比べて統計的な差（ｐ＜０．０１）があり、テスト群３と比べて統計的な差（ｐ＜０．０５）もあった。
【００４６】
図６Ｅ及び図６Ｆの結果から分かるように、処理されていない制御群で、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の１０％未満のみが死亡したことが見られ、ゲムシタビンで処理されたテスト群１及び親代第１世代ナチュラルキラー細胞で処理されたテスト群２で、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の死亡率が増加したが、統計的な差はなかった。親代第１世代ナチュラルキラー細胞及びゲムシタビンで処理されたテスト群３で、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の死亡率が約３０％まで向上することができ、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．０５）があった。実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞で処理されたテスト群４により誘導されたヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の死亡率が約２０％であり、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．０１）があった。なお、実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞及びゲムシタビンで処理されたテスト群５により誘導されたヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１は、死亡率が更に約５０％に達し、テスト群４と比べて統計的な差（ｐ＜０．０１）があり、テスト群３と比べて統計的な差（ｐ＜０．０５）もあった。
【００４７】
図６Ｇ及び図６Ｈの結果から分かるように、処理されていない制御群で、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の１０％未満のみが死亡したことが見られ、カルボプラチンで処理されたテスト群１で、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の死亡率が増加したが、統計的な差はなかった。親代第１世代ナチュラルキラー細胞で処理されたテスト群２の細胞殺傷作用は、制御群と相当であった。親代第１世代ナチュラルキラー細胞及びカルボプラチンで処理されたテスト群３で、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の死亡率が２０％を超えることができ、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．０５）があった。実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞で処理されたテスト群４により誘導されたヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の死亡率が約２０％であり、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．０５）があった。なお、実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞及びカルボプラチンで処理されたテスト群５により誘導されたヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の死亡率が更にほぼ５０％に達することができ、テスト群４と比べて統計的な差（ｐ＜０．０１）があり、テスト群３と比べて統計的な差（ｐ＜０．０５）もあった。
【００４８】
図６Ｉの結果から分かるように、実施例２で処理されたキメラ抗原受容体発現細胞が乳癌細胞、多形性膠芽腫の腫瘍細胞、膵臓癌細胞又は卵巣癌細胞に対して優れた殺傷作用を果たすため、本発明のキメラ抗原受容体発現細胞は、哺乳類動物の腫瘍細胞の死亡誘導用薬物を調製することに用いることができる。なお、実施例２のキメラ抗原受容体発現細胞及び化学療法薬を同時に処理すれば、乳癌細胞、多形性膠芽腫の腫瘍細胞、膵臓癌細胞又は卵巣癌細胞に対する殺傷作用がより顕著であり、本発明におけるがん治療用の医薬組成物は、好ましくは化学療法薬を含んでよく、腫瘍細胞を効果的に殺して更に癌を治療することができることが示された。
【００４９】
２．３．実施例３
本試験例では、本発明のキメラ抗原受容体を第１世代Ｔ細胞に形質導入することで、本発明の実施例３におけるキメラ抗原受容体発現細胞を取得することができ、更に得られた実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞のキメラ抗原受容体の発現量をフローサイトメトリーで分析した。本発明の実施例３におけるキメラ抗原受容体発現細胞のキメラ抗原受容体の発現量分析図である図７を参照されたい。図７ではそれぞれ本発明のキメラ抗原受容体を形質導入しない第１世代Ｔ細胞のキメラ抗原受容体の発現量分析図であり、及び実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞の形質導入後の３日目及び７日目のキメラ抗原受容体の発現量分析図である。図７のデータから分かるように、第１世代Ｔ細胞の平均蛍光強度は９．３６％だけであり、実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞が形質導入後の３日目及び７日目の平均蛍光強度がそれぞれ３４．１％及び８８．６４％に達することができるので、実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞は、確実に本発明のキメラ抗原受容体を安定に発現することができることが示された。
【００５０】
本発明の実施例３におけるキメラ抗原受容体発現細胞及び本発明の実施例３におけるキメラ抗原受容体発現細胞を含むがん治療用の医薬組成物の乳癌細胞、多形性膠芽腫の腫瘍細胞、膵臓癌細胞及び卵巣癌細胞の死亡に対する誘導効果を更にテストした。
【００５１】
まず、それぞれヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧ、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１及びヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で１２ウェルプレートに植え、更に４８時間培養した後でテストした。試験上で、各種の腫瘍細胞を、それぞれ処理されていない制御群、化学療法薬で処理されたテスト群１、第１世代Ｔ細胞で処理されたテスト群２、第１世代Ｔ細胞及び化学療法薬で処理されたテスト群３、実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞で処理されたテスト群４及び実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞及び化学療法薬で処理されたテスト群５という６つの群に分けた。化学療法薬として、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の群でドキソルビシン（２００ｎＭ）を、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの群でテモゾロマイド（８０μｇ／ｍｌ）を、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の群でゲムシタビン（２０μＭ）を、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の群でカルボプラチン（２０μＭ）を使用した。テスト群４及びテスト群５で、処理された実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞の細胞数は１×１０５ｃｅｌｌｓであり、テスト群２及びテスト群３で処理された第１世代Ｔ細胞の細胞数も１×１０５ｃｅｌｌｓであった。更に処理された各組の細胞をＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ及びＰＩで細胞染色し、且つフローサイトメーターでアポトーシス及び死亡の状況を検出し、且つＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ及び／又はＰＩに染まった細胞の百分率の合計を算出することで細胞殺傷作用を取得した。各群に対して独立した試験を３回繰り返した後で、細胞殺傷作用の結果を統計した。
【００５２】
本発明の実施例３におけるキメラ抗原受容体発現細胞が腫瘍細胞の死亡を誘導する分析結果図である図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｄ、図８Ｅ、図８Ｆ、図８Ｇ、図８Ｈ及び図８Ｉを参照されたい。図８Ａは、実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞がヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１死亡を誘導する分析結果図である。図８Ｂは、図８Ａの試験を３回繰り返した後の統計図である。図８Ｃは、実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞がヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧ死亡を誘導する分析結果図である。図８Ｄは、図８Ｃの試験を３回繰り返した後の統計図である。図８Ｅは、実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞がヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１死亡を誘導する分析結果図である。図８Ｆは、図８Ｅの試験を３回繰り返した後の統計図である。図８Ｇは、実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞がヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３死亡を誘導する分析結果図である。図８Ｈは、図８Ｇの統計図である。図８Ｈは、図８Ｇの統計図である。図８Ｉは、図８Ａ、図８Ｃ、図８Ｅ及び図８Ｇの試験を３回繰り返した後の統計図である。図面において、Ｐは親代第１世代Ｔ細胞を示し、Ｈは実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞を示し、Ｈはドキソルビシンを示し、Ｔはテモゾロマイドを示し、Ｇはゲムシタビンを示し、Ｃはカルボプラチンを示す。
【００５３】
図８Ａ及び図８Ｂの結果から分かるように、処理されていない制御群で、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の約１０％のみが死亡したことが見られ、ドキソルビシンで処理されたテスト群１及び親代第１世代Ｔ細胞で処理されたテスト群２で、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の死亡率が増加したが、統計的な差はなかった。親代第１世代Ｔ細胞及びドキソルビシンで処理されたテスト群３で、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の死亡率が約２０％まで向上することができ、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．０１）があった。実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞で処理されたテスト群４により誘導されたヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の死亡率が３０％を超え、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．００１）があった。なお、実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞及びドキソルビシンで処理されたテスト群５により誘導されたヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の死亡率が更にほぼ５０％に達することができ、テスト群４と比べて統計的な差（ｐ＜０．０５）があり、テスト群３と比べて統計的な差（ｐ＜０．００１）もあった。
【００５４】
図８Ｃ及び図８Ｄの結果から分かるように、処理されていない制御群で、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの２０％未満のみが死亡したことが見られ、テモゾロマイドで処理されたテスト群１及び親代第１世代Ｔ細胞で処理されたテスト群２で、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの死亡率が増加したが、統計的な差はなかった。親代第１世代Ｔ細胞及びテモゾロマイドで処理されたテスト群３で、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの死亡率が３０％まで向上することができるが、依然として統計的な差はなかった。実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞で処理されたテスト群４により誘導されたヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの死亡率が５０％を超えることができ、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．００１）があった。なお、実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞及びテモゾロマイドで処理されたテスト群５により誘導されたヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの死亡率が更にほぼ８０％に近くすることができ、テスト群４と比べて統計的な差（ｐ＜０．０５）があり、テスト群３と比べて統計的な差（ｐ＜０．００１）もあった。
【００５５】
図８Ｅ及び図８Ｆの結果から分かるように、処理されていない制御群で、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の２０％未満のみが死亡したことが見られ、ゲムシタビンで処理されたテスト群１でヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の死亡率が増加したが、統計的な差はなかった。親代第１世代Ｔ細胞で処理されたテスト群２で、その細胞殺傷作用は制御群に相当する。親代第１世代Ｔ細胞及びゲムシタビンで処理されたテスト群３で、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の死亡率が３０％以上まで向上することができ、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．０５）があった。実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞で処理されたテスト群４により誘導されたヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の死亡率が５０％以上まで向上することができ、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．００１）があった。なお、実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞及びゲムシタビンで処理されたテスト群５により誘導されたヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の死亡率が約６０％に更に達し、テスト群４と比べて統計的な差（ｐ＜０．０１）があり、テスト群３と比べて統計的な差（ｐ＜０．０１）もあった。
【００５６】
図８Ｇ及び図８Ｈの結果から分かるように、処理されていない制御群で、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の１０％未満のみが死亡したことが見られ、カルボプラチンで処理されたテスト群１及び親代第１世代Ｔ細胞で処理されたテスト群２で、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の死亡率が増加したが、統計的な差はなかった。親代第１世代ナチュラルキラー細胞及びカルボプラチンで処理されたテスト群３で、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の死亡率が約３０％に達することができ、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．０５）があった。実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞で処理されたテスト群４により誘導されたヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の死亡率がほぼ６０％に達することができ、テスト群２と比べて統計的な差（ｐ＜０．００１）があった。なお、実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞及びカルボプラチンで処理されたテスト群５により誘導されたヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の死亡率が６０％以上に達することができ、テスト群４と比べて統計的な差（ｐ＜０．０５）があり、テスト群３と比べて統計的な差（ｐ＜０．００１）もあった。
【００５７】
図８Ｉの結果から分かるように、実施例３で処理されたキメラ抗原受容体発現細胞が乳癌細胞、多形性膠芽腫の腫瘍細胞、膵臓癌細胞又は卵巣癌細胞に対して優れた殺傷作用を果たすため、本発明のキメラ抗原受容体発現細胞哺は、乳類動物の腫瘍細胞の死亡誘導用薬物を調製することに用いることができる。なお、実施例３のキメラ抗原受容体発現細胞及び化学療法薬を同時に処理すれば、乳癌細胞、多形性膠芽腫の腫瘍細胞、膵臓癌細胞又は卵巣癌細胞に対する殺傷作用がより顕著であり、本発明におけるがん治療用の医薬組成物は、好ましくは化学療法薬を含んでよく、腫瘍細胞を効果的に殺して更に癌を治療することができることが示された。
【００５８】
２．４．化学療法薬の処理による、腫瘍細胞の細胞膜でのヒト白血球抗原Ｇの発現の増加
本試験例では、本発明におけるキメラ抗原受容体発現細胞及び化学療法薬を同時に処理する群がより優れた腫瘍細胞の殺傷効果を有する原因を更に検討した。
【００５９】
まず、それぞれヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧ、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１及びヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で６ウェルプレートに植え、更に次の日まで培養して細胞付着の後でテストした。試験上で、各種の腫瘍細胞は、それぞれ処理されていない制御群及び化学療法薬で４８時間処理したテスト群である２つの群に分かれた。化学療法薬として、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の群でドキソルビシン（２００ｎＭ）を、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの群でテモゾロマイド（８０μｇ／ｍｌ）を、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の群でゲムシタビン（２０μＭ）を、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の群でカルボプラチン（２０μＭ）を使用した。更に処理された各組の腫瘍細胞を免疫蛍光染色法及びフローサイトメーターで腫瘍細胞の細胞表面でのヒト白血球抗原Ｇの発現を検出した。
【００６０】
腫瘍細胞化学療法を受けたＨＬＡ−Ｇ発現量を分析する免疫蛍光染色結果図である図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、図９Ｄ、図９Ｅ、図９Ｆ、図９Ｇ、図９Ｈ及び添付ファイル１〜８を参照されたい。添付ファイル１は、図９Ａのカラー図面である。添付ファイル２は、図９Ｂのカラー図面である。添付ファイル３は、図９Ｃのカラー図面である。添付ファイル４は、図９Ｄのカラー図面である。添付ファイル５は、図９Ｅのカラー図面である。添付ファイル６は、図９Ｆのカラー図面である。添付ファイル７は、図９Ｇのカラー図面である。添付ファイル８は、図９Ｈのカラー図面である。図９Ａは、制御群のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の免疫蛍光染色結果図である。図９Ｂは、ドキソルビシンで処理されたヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の免疫蛍光染色結果図である。図９Ｃは、制御群のヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの免疫蛍光染色結果図である。図９Ｄは、テモゾロマイドで処理されたヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの免疫蛍光染色結果図である。図９Ｅは、制御群のヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の免疫蛍光染色結果図である。図９Ｆは、ゲムシタビンで処理されたヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の免疫蛍光染色結果図である。図９Ｇは、制御群のヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の免疫蛍光染色結果図である。図９Ｈは、カルボプラチンで処理されたヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の免疫蛍光染色結果図である。Ｐａｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎは上皮間葉系細胞形質転換関連タンパク質であり、細胞膜の位置を示すことができ、細胞核の位置をＤＡＰＩの染色結果で示す（青色の蛍光箇所）。
【００６１】
図９Ａ、図９Ｂの結果から分かるように、ドキソルビシンの処理は、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞膜上でヒト白血球抗原Ｇの発現を増加することができる。図９Ｃ及び図９Ｄの結果から分かるように、テモゾロマイドの処理は、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの細胞膜上でヒト白血球抗原Ｇの発現を増加することができる。図９Ｅ及び図９Ｆの結果から分かるように、ゲムシタビンの処理は、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の細胞膜上でヒト白血球抗原Ｇの発現を増加することができる。図９Ｇ及び図９Ｈの結果から分かるように、カルボプラチンの処理は、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の細胞膜上でヒト白血球抗原Ｇの発現を増加することができる。
【００６２】
腫瘍細胞化学療法を受けたＨＬＡ−Ｇ発現量のフローサイトメトリーの分析結果図である図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ及び図１０Ｅを更に参照されたい。図１０Ａは、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のフローサイトメトリー分析結果図である。図１０Ｂは、ヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧのフローサイトメトリー分析結果図である。図１０Ｃは、ヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１のフローサイトメトリー分析結果図である。図１０Ｄは、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３のフローサイトメトリー分析結果図である。図１０Ｅは、図１０Ａ〜図１０Ｄの統計図である。
【００６３】
図１０Ａ〜図１０Ｅの結果から分かるように、制御群のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の平均蛍光強度が１２．２７％だけであり、テスト群のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の平均蛍光強度が６４．４５％まで増加し、統計的な差（ｐ＜０．００１）があった。制御群のヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの平均蛍光強度が１４．０１％だけであり、テスト群のヒト悪性脳腫瘍細胞株ＤＢＴＲＧの平均蛍光強度が２２．３３％であり、統計的な差（ｐ＜０．００１）があった。制御群のヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の平均蛍光強度が１３．１８％だけであり、テスト群のヒト膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ１の平均蛍光強度が４１．４４％まで増加することができ、統計的な差（ｐ＜０．０１）があった。制御群のヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の平均蛍光強度が１４．６９％だけであり、テスト群のヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の平均蛍光強度が３８．５８％であり、統計的な差（ｐ＜０．０１）があった。
【００６４】
図９Ａ〜図１０Ｅの結果から分かるように、化学療法薬の処理が腫瘍細胞の細胞膜上でのヒト白血球抗原Ｇの発現を増加することができ、本発明のキメラ抗原受容体発現細胞の発現されたキメラ抗原受容体がヒト白血球抗原Ｇに特異的に結合されることができるため、化学療法薬を処理した後で更に本発明のキメラ抗原受容体発現細胞を処理し、又は本発明のキメラ抗原受容体発現細胞及び化学療法薬を同時に処理すれば、より優れた腫瘍細胞の殺傷効果を有する。
【００６５】
本発明のキメラ抗原受容体が本発明のキメラ抗原受容体発現細胞質膜内での理論構造及び作用機序模式図である図１１を参照されたい。本発明のキメラ抗原受容体発現細胞は、遺伝子プロセスで修飾されたナチュラルキラー細胞又はＴ細胞であり、本発明のキメラ抗原受容体を発現するが、本発明のキメラ抗原受容体は、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体（ｓｃＦｖ）、ＨＬＡ−Ｇ受容体（ＫＩＲ）及び共刺激ドメイン（ＤＡＰ１２）からなる腫瘍標的受容体複合体であり、好ましくは、自殺タンパク質−ｉＣａｓ９を更に含んでよい。本発明のキメラ抗原受容体発現細胞は、腫瘍細胞膜上でのヒト白血球抗原Ｇを特異的に認識して、更に腫瘍細胞を殺傷する作用を奏することができる。好ましくは、腫瘍細胞に化学療法薬を処理する時に、腫瘍細胞質膜上でのヒト白血球抗原Ｇの発現を正に調節することができ、本発明のキメラ抗原受容体発現細胞と腫瘍細胞表面に特異的に識別したヒト白血球抗原Ｇを結合した後でシグナル伝達をトリガーし、シグナルカスケードを生成して本発明のキメラ抗原受容体発現細胞の活性化及び増殖を引き起こし、更に溶解した粒子のエキソサイトーシスを誘発して且つ標的とする腫瘍細胞を殺す。
【００６６】
以上のように、本発明のキメラ抗原受容体は、優れた腫瘍細胞に対する特異的結合の能力を有し、特に、腫瘍細胞の細胞膜上で発現されたヒト白血球抗原Ｇに対する特異的結合の能力を有するので、本発明のキメラ抗原受容体を発現するキメラ抗原受容体発現細胞が特異的に腫瘍細胞を標的として、オフターゲット効果を避けて、更に腫瘍細胞を効果的に殺すため、哺乳類動物の腫瘍細胞の死亡誘導用薬物を調製することに用いることができる。本発明におけるがん治療用の医薬組成物は、本発明のキメラ抗原受容体発現細胞を含み、腫瘍細胞を効果的に殺して更に癌を治療することができる。化学療法薬を更に含むがん治療用の医薬組成物は、更に腫瘍細胞の細胞膜がヒト白血球抗原Ｇを大量に発現することを誘導することができるため、キメラ抗原受容体発現細胞の腫瘍細胞に対する殺傷作用を強化することができるため、より優れた腫瘍細胞に対する殺傷作用を有する。
【００６７】
本発明の実施形態を前述の通りに開示したが、これは、本発明を限定するものではなく、当業者なら誰でも、本発明の精神と範囲から逸脱しない限り、多様の変更や修正を加えることができるので、本発明の保護範囲は、下記添付の特許請求の範囲で指定した内容を基準とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−Ａ】
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【図４−Ｂ】
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【図４−Ｃ】
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【図４−Ｄ】
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【図４−Ｅ】
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【図４−Ｆ】
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【図４−Ｇ】
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【図４−Ｈ】
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【図４−Ｉ】
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【図５】
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【図６−Ａ】
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【図６−Ｂ】
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【図６−Ｃ】
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【図６−Ｄ】
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【図６−Ｅ】
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【図６−Ｆ】
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【図６−Ｇ】
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【図６−Ｈ】
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【図６−Ｉ】
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【図７】
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【図８−Ａ】
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【図８−Ｂ】
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【図８−Ｃ】
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【図８−Ｄ】
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【図８−Ｅ】
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【図８−Ｆ】
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【図８−Ｇ】
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【図８−Ｈ】
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【図８−Ｉ】
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【図９−Ａ】
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【図９−Ｂ】
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【図９−Ｃ】
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【図９−Ｄ】
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【図９−Ｅ】
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【図９−Ｆ】
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【図９−Ｇ】
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【図９−Ｈ】
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【図１０−Ａ】
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【図１０−Ｂ】
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【図１０−Ｃ】
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【図１０−Ｄ】
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【図１０−Ｅ】
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【図１１】
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【配列表】
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