(57)【要約】【課題】分化能を保持しつつ効率的に組織幹細胞を培養することが可能な方法を提供する。【解決手段】組織幹細胞を培養する方法であって、  組織幹細胞をマイクロビーズに接着させる工程と、  組織幹細胞が接着しているマイクロビーズを液体培地中で浮遊させた状態で、マイクロビーズ上の組織幹細胞を増殖させる工程と、を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織幹細胞を培養する方法であって、
組織幹細胞をマイクロビーズに接着させる工程と、
組織幹細胞が接着しているマイクロビーズを液体培地中で浮遊させた状態で、マイクロビーズ上の組織幹細胞を増殖させる工程と、
を含む方法。
【請求項２】
組織幹細胞群に占める高機能組織幹細胞の割合を高める方法であって、
組織幹細胞群をマイクロビーズに接触させ、組織幹細胞群に含まれる少なくとも一部の組織幹細胞をマイクロビーズに接着させる工程と、
組織幹細胞が接着しているマイクロビーズを液体培地中で浮遊させた状態で、マイクロビーズ上の組織幹細胞を増殖させる工程と、
を含む方法。
【請求項３】
組織幹細胞群における高機能組織幹細胞の割合が３％以上の組織幹細胞群を製造する方法であって、
組織幹細胞群をマイクロビーズに接触させ、組織幹細胞群に含まれる少なくとも一部の組織幹細胞をマイクロビーズに接着させる工程と、
組織幹細胞が接着しているマイクロビーズを液体培地中で浮遊させた状態で、マイクロビーズ上の組織幹細胞を増殖させる工程と、
を含む方法。
【請求項４】
組織幹細胞をマイクロビーズに接着させる工程において、マイクロビーズの表面積１ｃｍ２あたり組織幹細胞を５００〜３０００個投与する、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
回転式振とう器の回転運動によってマイクロビーズを液体培地中で浮遊させた状態にする、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
回転運動の速度が６０ｒｐｍ以下である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
マイクロビーズ上の組織幹細胞を増殖させる工程において、タンパク質分解酵素処理、低ｐＨ処理、熱処理を行わない、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
組織幹細胞群に占める高機能組織幹細胞の割合が３％以上の組織幹細胞群。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織幹細胞中の高機能組織幹細胞の選択的培養増殖法に関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今、組織幹細胞を利用する細胞療法が注目され、研究されている。この細胞療法は、組織障害を修復するという組織幹細胞の本来の機能を利用するもので、実現性の高いものと認識されている。組織幹細胞のひとつとして間葉系幹細胞が挙げられる。
【０００３】
再生医療における、脂肪幹細胞などの間葉系幹細胞の有用性や安全性は既に認められている。しかしながら、生体組織から分離取得した組織幹細胞を接着培養法で培養する従来の方法では、培養を続けるほど組織幹細胞の多能性は失われてしまう。多能性を喪失したこのような細胞を治療に用いた場合、幹細胞が本来有する多能性に基づく組織修復作用は発揮されず、液性因子分泌に基づく組織保護作用や抗炎症作用を発揮するに留まる。
【０００４】
また、従来では均一と考えられていた幹細胞群内において、多能性などの機能の階層性、不均一性が存在することがわかってきた。そこで、より高度な再生医療を実現するため、再生医療効果の高い高機能性組織幹細胞の選択的な培養増殖法の需要が高まっている。
【０００５】
例えば温度やｐＨなどのストレス負荷では、高機能でない幹細胞を選択的に殺し、高機能幹細胞の選択性を高めることは可能である。しかし高機能幹細胞の増殖も阻害してしまうため、効率的な培養を行うことができない（例えば非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Heneidi S, Simerman AA, Keller E et al. Awakened by cellular stress: isolation and characterization of a novel population of pluripotent stem cells derived from human adipose tissue. PLoS One. 2013;8:e64752.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記背景に鑑みてなされたものであり、分化能を保持しつつ効率的に組織幹細胞を培養することが可能な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは前記課題について鋭意研究した結果、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明の第１の態様によれば、組織幹細胞を培養する方法であって、
組織幹細胞をマイクロビーズに接着させる工程と、
組織幹細胞が接着しているマイクロビーズを液体培地中で浮遊させた状態で、マイクロビーズ上の組織幹細胞を増殖させる工程と、
を含む方法が提供される。
【００１０】
本発明の第２の態様によれば、組織幹細胞群に占める高機能組織幹細胞の割合を高める方法であって、
組織幹細胞群をマイクロビーズに接触させ、組織幹細胞群に含まれる少なくとも一部の組織幹細胞をマイクロビーズに接着させる工程と、
組織幹細胞が接着しているマイクロビーズを液体培地中で浮遊させた状態で、マイクロビーズ上の組織幹細胞を増殖させる工程と、
を含む方法が提供される。
【００１１】
本発明の第３の態様によれば、組織幹細胞群における高機能組織幹細胞の割合が３％以上の組織幹細胞群を製造する方法であって、
組織幹細胞群をマイクロビーズに接触させ、組織幹細胞群に含まれる少なくとも一部の組織幹細胞をマイクロビーズに接着させる工程と、
組織幹細胞が接着しているマイクロビーズを液体培地中で浮遊させた状態で、マイクロビーズ上の組織幹細胞を増殖させる工程と、
を含む方法が提供される。
【００１２】
前記方法の組織幹細胞をマイクロビーズに接着させる工程において、マイクロビーズの表面積１ｃｍ２あたり組織幹細胞を５００〜３０００個投与してもよい。
【００１３】
前記方法のマイクロビーズを液体培地中で浮遊させる工程が、回転式振とう器の回転運動によって行われてもよい。このとき回転運動の速度を６０ｒｐｍ以下としてもよい。
【００１４】
マイクロビーズ上の組織幹細胞を増殖させる工程は、タンパク質分解酵素処理、低ｐＨ処理、熱処理を含まないことが好ましい。
【００１５】
本発明の第４の態様によれば、組織幹細胞群に占める高機能組織幹細胞の割合が所定値以上の組織幹細胞群が提供される。ここで所定値以上とは、例えば３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上である。
【００１６】
本発明の第５の態様によれば、上述の高機能組織幹細胞を利用した治療方法が提供される。典型的には、治療対象者は組織幹細胞の提供者（ドナー）である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、組織幹細胞の分化能を保持したまま効率的に培養することが可能である。また本発明によれば、幹細胞群における高機能幹細胞の割合を高めることができる。これによって、医療上価値の高い高機能幹細胞を多く含む幹細胞群を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】全細胞数の解析結果のグラフである。
【図２】ＳＳＥＡ−３陽性細胞数の解析結果のグラフである。
【図３】ＲＴ−ＰＣＲによって増幅させたｍＲＮＡ量の解析結果のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明について詳述する。
【００２０】
本発明は組織幹細胞に関する発明である。組織幹細胞は、多種類の細胞に分化する能力（multipotency）および自己複製能をもつ細胞である。体性幹細胞や成体幹細胞とも呼ばれる。
【００２１】
組織幹細胞としては間葉系幹細胞（中胚葉系列幹細胞）が挙げられる。間葉系幹細胞としては脂肪幹細胞（または脂肪組織由来幹細胞）が挙げられる。脂肪幹細胞は、脂肪組織中から簡易に採取することができ、その採取方法も既に確立されている。そのため、脂肪幹細胞について多くの研究がなされている。本発明でも脂肪組織や脂肪幹細胞を例に説明することがあるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
組織幹細胞の中には、分化能が特に高い高機能組織幹細胞が存在することが報告されている（すなわち、組織幹細胞のうち一部は高機能組織幹細胞であり、残りが通常の組織幹細胞である）。このような高機能組織幹細胞は、人為的な誘導操作をすることなく得ることができる。このような高機能組織幹細胞のマーカーの典型例としては、ＳＳＥＡ−３抗体が挙げられる。ＳＳＥＡ−３抗体は高機能組織幹細胞に特異的に結合することが知られている。すなわち高機能幹細胞はＳＳＥＡ−３陽性細胞と表現してもよい。
【００２３】
組織幹細胞がＳＳＥＡ−３陽性か否かを解析する手法として、本発明では細胞免疫染色を用いる。簡単に述べると、組織幹細胞をＳＳＥＡ−３抗体に晒した後、このＳＳＥＡ−３抗体を認識する二次抗体にさらに晒す。結果として、組織幹細胞がＳＳＥＡ−３陽性であれば、組織幹細胞と二次抗体とはＳＳＥＡ−３抗体を介して連結される。ここで二次抗体は、所定のシグナルを放射するように蛍光物質などで予めラベルされている。このため、ＳＳＥＡ−３陽性細胞は二次抗体による蛍光などの所定のシグナルを放射する。発光する細胞は、蛍光顕微鏡あるいはフローサイトメトリを用いて観測できる。この発光する組織幹細胞がＳＳＥＡ−３陽性細胞である。
【００２４】
高機能組織幹細胞の他のマーカーとしては、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＣＤ３４、ＮＡＮＯＧ、ＭＹＣ、ＫＬＦ４の６つの遺伝子のｍＲＮＡ量が従来知られている。高機能組織幹細胞では、これらマーカーの量が通常の組織幹細胞よりも多い。これらはＲＴ−ＰＣＲを利用してｍＲＮＡ量を増幅して解析してよい。
【００２５】
他方、高機能組織幹細胞は、体細胞と同程度のテロメラーゼ活性しか示さないことが知られている。
【００２６】
本発明の方法は、組織幹細胞をin vitroで培養する方法である。詳しくは、組織幹細胞を培養する方法であって、
組織幹細胞（特に高機能組織幹細胞）をマイクロビーズに接着させる工程と、
組織幹細胞が接着しているマイクロビーズを液体培地中で浮遊させた状態で、マイクロビーズ上の組織幹細胞を増殖させる工程と、
を含む方法である。
【００２７】
また当該培養方法によって培養された組織幹細胞群（複数の組織幹細胞の集合体）は、培養前の組織幹細胞群と比較して高機能組織幹細胞の割合が増加していた。そのため、当該培養方法は組織幹細胞群における高機能組織幹細胞の割合を増加（または濃縮）させる方法でもある。もしくは当該培養方法を利用して、組織幹細胞群における高機能組織幹細胞の割合を増加（または濃縮）させる方法である。
【００２８】
そしてこれら方法は、高機能組織幹細胞の割合が所定値以上の組織幹細胞群を製造する方法でもある。もしくは当該培養方法を利用して、高機能組織幹細胞の割合が所定値以上の組織幹細胞群を製造する方法である。ここで所定値以上とは、例えば３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上である。
【００２９】
本発明の方法では、脂肪幹細胞などの組織幹細胞を、マイクロビーズ（ミクロスフィアとも呼ばれる）に接着させる。マイクロビーズは、その表面の少なくとも一部において細胞が接着可能であれば、その材料は特に限定されない。例えばコラーゲン（ＣＬ）やポリスチレン（ＰＳ）のマイクロビーズが商業的に入手可能である。
【００３０】
マイクロビーズの平均粒径は、１００〜５００μｍ、１００〜４００μｍが好ましい。
【００３１】
組織幹細胞群をマイクロビーズに接触させ、その一部または全部の組織幹細胞をマイクロビーズに接着させる（特に、組織幹細胞群に含まれる高機能組織幹細胞をマイクロビーズに接着させる）。マイクロビーズに組織幹細胞を接着させる具体的な手順は特に限定されず、選択された組織幹細胞やマイクロビーズに応じて決定される。マイクロビーズと組織幹細胞との接触は、液体中に懸濁されている混合液の状態で通常行われる。
【００３２】
投与した組織幹細胞群に含まれる一部または全部の組織幹細胞をマイクロビーズに接着させる手順としては例えば以下の手順が挙げられる。
【００３３】
容器（好ましくは細胞が接着しにくい容器）内に、組織幹細胞群とマイクロビーズを添加する。これらを均一化するためこれらの混合液を撹拌する。組織幹細胞がマイクロビーズと接触し、接着できるように一定時間（例えば１０分以上、１５分以上、２０分以上、２５分以上）静置する。ビーズに接着していない細胞と、細胞が接着していないビーズの表面とが接触できるように、再度撹拌して静置してもよい。この撹拌と静置のサイクルを１回または複数回実行することで、ビーズ上に細胞を接着させることができる。
【００３４】
混合液中に占める組織幹細胞の濃度は、１０万〜１００万個／ｍＬが好ましい。この範囲であれば、マイクロビーズに組織幹細胞を効率よく接着させることできる。
【００３５】
混合液液中に占めるマイクロビーズの濃度は、１０万〜５０万個／ｍＬが好ましい。この範囲であれば、マイクロビーズに組織幹細胞を効率よく接着させることできる。
【００３６】
マイクロビーズに投与される、またはマイクロビーズに接触させる組織幹細胞の数は、マイクロビーズの表面積１ｃｍ２あたりの組織幹細胞の数が５００〜３０００個、７５０〜２５００個、１０００〜２０００個の範囲内であることが好ましい。この範囲であれば、マイクロビーズに組織幹細胞を効率よく接着させることできる。
【００３７】
本発明の方法では、組織幹細胞が接着したマイクロビーズを液体培地中で浮遊させる。つまり、マイクロビーズが浮遊した状態でマイクロビーズ上の組織幹細胞を増殖させる。本発明において「浮遊」は、「懸濁」または「分散」とも表現できる。
【００３８】
液体培地としては、例えばＤＭＥＭ／ｆ１２液体培地などが挙げられる。コンタミネーションを防ぐために抗生物質などを液体培地に添加してもよい。またｐＨを所定値に調整するため、ｐＨ調整剤やｐＨ指示薬を液体培地に添加してもよい。
【００３９】
単純な接着培養法では、培養時間に連れて高機能組織幹細胞の割合が減少してしまう。理由は不明だが、本発明の方法によって増殖した組織幹細胞群では高機能組織幹細胞の割合が向上する。
【００４０】
他方、単純な浮遊培養法では、足場がないことによって組織幹細胞が増殖できないか、または組織幹細胞同士がクラスターを形成し中心壊死を引き起こすことで増殖限界を招いてしまう。本発明の方法では、マイクロビーズを足場とすることで、組織幹細胞はクラスターを形成することなく、接着培養法と同様にマイクロビーズ表面に亘って効率的に増殖するものと考えられる。
【００４１】
組織幹細胞が接着したマイクロビーズを浮遊させる浮遊手段は、マイクロビーズ上の細胞に強い負荷をかけない限り、いずれの手段も使用可能である。マイクロビーズやマイクロビーズを含む液体培地に対して力をかけて直接的に浮遊させてもよいし、これらを含む容器に対して力をかけ間接的に浮遊させてもよい。細胞に負荷をかけるリスクが少ないため間接的な手段の方が好ましい。直接的な手段としては、撹拌機、バブリングなどが挙げられる。間接的な手段としては、振とう器が挙げられる。
【００４２】
振とう器による振とうは、往復式でもでもよいが、ビーズ同士が衝突することで細胞死を招くと予想される。このため回転式の振とうの方が好ましいと考えられる。回転式振とうの回転運動の方向は、通常は水平方向である。回転式振とうには、波動形揺動と呼ばれる方式の振とうが含まれる。波動形揺動の最大傾斜角度（振とう角度）は通常１〜１０度、２〜６度である。
【００４３】
回転式振とうの回転速度は、６０ｒｐｍ以下、５０ｒｐｍ以下、４０ｒｐｍ以下、３０ｒｐｍ以下、２０ｒｐｍ以下、１５ｒｐｍ以下であることが好ましい。過度に速い場合、ビーズが他のビーズや培養容器内壁に激しく衝突するため細胞死を招くリスクが高まる。回転速度は３ｒｐｍ以上、５ｒｐｍ以上、１０ｒｐｍ以上が好ましい。この回転速度であれば、異なるビーズに接着している複数の細胞間の細胞接着を防ぐことができる。
【００４４】
培養に際し、消費された栄養素の補充や生じた老廃物の排出のため、通常は液体培地の交換を行う。典型的には、マイクロビーズを同一培養容器に留めたまま、液体培地の一部または全部を培養容器から除去し、新たな液体培地を培養容器に添加する。典型的には、添加量は除去量と完全にまたはほぼ同量である。液体培地の除去と新たな液体培地の添加の順序は任意であり、同時に行ってもよいし、添加を先に行ってもよいし、添加を後に行ってもよい。培地交換は、浮遊手段を停止させてマイクロビーズを沈殿させて行ってもよい。振とうを中止する時間（マイクロビーズが浮遊していない時間）は１時間以下、５０分以下、４０分以下、３０分以下とすることが好ましい。
【００４５】
交換する培地の量と培地交換の頻度は適宜調整される。例えば、１〜５日に１度の頻度で、液体培地全量１００％のうち４０〜６０％を新たな液体培地と交換してもよい。
【００４６】
これに加えて／これとは別に、マイクロビーズを回収し新たな液体培地を含む別の培養容器へ移しかえることで培地交換としてもよい。
【００４７】
培養期間は任意に設定することができる。マイクロビーズ上に存在する組織幹細胞の数に応じて培養期間を決定してもよい。通常は１〜３０日間、３〜２５日間、５〜２０日間、７〜１５日間である。
【００４８】
本発明ではマイクロビーズを浮遊させた状態でマイクロビーズ上の細胞を増殖させるが、マイクロビーズは常に浮遊していなければならないわけではない。浮遊手段を停止させてマイクロビーズが沈殿しているタイミングがあってもよい。しかしながら、長時間浮遊していない状態が続くと本発明の効果を得られない恐れがある。そのため、本発明においては培養期間の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上の時間に亘ってマイクロビーズを浮遊させるものとする。なお、マイクロビーズを浮遊させている時間とは、浮遊手段が稼働している時間と見做してもよい。
【００４９】
マイクロビーズ上に接着している組織幹細胞を増殖させる工程において、これら細胞にストレスをかける処理を含まないことが好ましい。このようなストレスとしてはタンパク質分解酵素による処理、低ｐＨストレス、熱ストレス、低栄養、低血清濃度、低酸素濃度が挙げられる。
【００５０】
したがって、液体培地はタンパク質分解酵素を完全にまたは実質的に含有しないことが好ましい。
【００５１】
したがって、液体培地のｐＨは６〜８の範囲内で制御されていることが好ましい。
【００５２】
したがって、液体培地の温度は３８℃以下、３７．５℃以下、３７℃以下で制御されていることが好ましい。他方、温度は３０℃以上、３５℃以上、３６℃以上、３６．５℃以上、３７℃以上で制御されていることが好ましい。
【００５３】
したがって、液体培地は十分な栄養を含むことが好ましい。また液体培地の血清濃度は５％以上、７．５％以上、１０％以上であることが好ましい。血清としては、典型的にはウシ胎児血清、ヒト血清が挙げられる。このような十分な栄養および血清を含む培地は商業的にも入手可能である。
【００５４】
したがって、液体培地の酸素濃度は１５％以上、１７．５％以上、２０％以上であることが好ましい。液体培地の酸素濃度は、液体培地が曝露されている雰囲気の酸素濃度と言い換えてもよい。
【００５５】
マイクロビーズから細胞を回収する手法は従来周知の手法を用いることができる。所定のタンパク質分解酵素に晒すことで、細胞−細胞間や細胞−ビーズ間を接着させているタンパク質を分解させる手法が挙げられる。所定のタンパク質分解酵素に晒す時間は適宜決定されるが、通常は１〜３０分である。
【００５６】
これに加えて／これとは別に、マイクロビーズを分解させる処理を行ってマイクロビーズから細胞を回収してもよい。例えばマイクロビーズがコラーゲン製の場合、コラーゲン分解酵素によってコラーゲン製マイクロビーズを分解させて、前記コラーゲン製マイクロビーズ上の細胞を回収することができる。
【００５７】
マイクロビーズから細胞を回収する前に、マイクロビーズを生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの生理学的に許された液体（細胞への負荷が小さい液体）にて洗浄してもよい。
【００５８】
なお、本発明においてドナーから組織幹細胞を採取する方法は特に制限はなく、従来公知の方法が使用できる。例えば、ドナーの脂肪組織、骨髄、肝臓、胎盤、臍帯血から、それらに由来する組織幹細胞を採取することができる。ドナーはヒトであってもよいし、非ヒト動物であってもよい。
【００５９】
本発明の方法によって、高機能組織幹細胞の割合が培養前よりも高まった組織幹細胞群を得ることができる。高機能組織幹細胞の割合は、例えば３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上である。ここで高機能組織幹細胞の割合とは、ＳＳＥＡ−３陽性率（組織幹細胞群の全細胞数に対するＳＳＥＡ−３陽性細胞数の割合）を特に意味する。
【００６０】
本発明の方法によって高機能組織幹細胞を多く含む組織幹細胞群が得られる。この組織幹細胞群は主に自家移植に用いられる。すなわち、本願はこの組織幹細胞群や、これを使用した再生治療方法をも提供する。
【実施例】
【００６１】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。  
【００６２】
（製造例１）
ポリスチレン製のマイクロビーズ（Polysciences社から入手した「Polystyrene Beads Large」：粒度分布２００〜３００μｍ）の溶媒をＤＭＥＭ／ｆ１２液体培地に置換し、３７℃で１晩インキュベートしてマイクロビーズのコンディショニングを行った。ビーズ濃度は約１６万粒／ｍＬに調整した。
【００６３】
細胞非接着性のディッシュに、マイクロビーズ懸濁液を３００μＬずつ採取した。脂肪幹細胞懸濁液３００μＬ（細胞数は１×１０５）をこのディッシュに加え、３７℃で３０分静置した。３７℃において、「２分間の撹拌と２８分間の静置」を１サイクルとし、これを８サイクル（４時間）連続的に繰り返した。撹拌は波動形揺動振とう器（Ｗａｖｅ−ＰＲ）を使用した。振とう条件は温度３７℃、回転速度１０ｒｐｍ、振とう角度６度であった。これら操作によって加えた脂肪幹細胞の一部がマイクロビーズに接着した。
【００６４】
（製造例２）
ポリスチレン製のマイクロビーズの代わりにコラーゲン製のマイクロビーズ（株式会社高研から入手した「Cellagen」：粒度分布１００〜４００μｍ）を用い、コンディショニング後のビーズの濃度を約２０万粒／ｍＬに調整したこと以外は実施例１と同じ手順でマイクロビーズに脂肪幹細胞を接着させた。
【００６５】
なおマイクロビーズの濃度は、懸濁液３００μＬに含まれるマイクロビーズの表面積の合計値（算出値）が約７６ｃｍ２となるよう調整した。これはディッシュの表面積と同程度とするためである。すなわち細胞が接着できる表面積はいずれも同程度である。
【００６６】
（実施例１〜２）
製造例１〜２の脂肪幹細胞が接着したマイクロビーズの懸濁液３００μＬをそれぞれ１．５ｍＬのＤＭＥＭ／ｆ１２液体培地中に入れ、波動形揺動振とう器（Ｗａｖｅ−ＰＲ）を用いてマイクロビーズを浮遊させた。振とう条件は温度３７℃、回転速度１５ｒｐｍ、振とう角度６度の条件であった。振とうによってマイクロビーズが浮遊している状態にて、マイクロビーズ上に接着している脂肪幹細胞を増殖させた。培養中における液体培地の交換は、振とう器を停止させてマイクロビーズが沈殿した状態で、上清の上半分を除去した後、除去量と等量のフレッシュな培地を添加することで行った。培地交換は３日毎に１度の頻度で行った。培地交換のために振とうを中止した時間は概ね３０分以下であった。
【００６７】
（比較例１〜２）
製造例１〜２の脂肪幹細胞が接着したマイクロビーズの懸濁液３００μＬをそれぞれ１．５ｍＬのＤＭＥＭ／ｆ１２液体培地中に入れ、３７℃、静的条件下で（即ち振とうさせずビーズが沈殿している状態で）培養させた。培地交換は実施例１〜２と同様に行った。
【００６８】
マイクロビーズからの細胞回収は以下の手順で行った。マイクロビーズをＰＢＳで穏やかに洗浄した後、５ｍＬのタンパク質分解酵素溶液（TrypLE Express、Thermo Fisher Scientific）に１５分間懸濁させて、マイクロビーズから細胞を剥離させた。剥離された細胞を含む溶液を１００μｍ、７０μｍ、４０μｍのフィルタを用いたフィルタリングを行った。
【００６９】
（比較例３〜４）
従来通りの手順に従って、３７℃で脂肪幹細胞をディッシュ上に接着培養させた。比較例３ではポリスチレン製ディッシュを用い、比較例４ではコラーゲン製ディッシュを用いた。ディッシュからの細胞の回収は上述の手順に準じて行った。
【００７０】
回収された脂肪幹細胞群に関して解析した結果が図１〜図３である。図中のPS-beads(stirring)は実施例１、CL-beads(stirring)は実施例２に対応する。PS-beads(static)は比較例１、CL-beads(static)は比較例２に対応する。PS-dishは比較例３、CL-dishは比較例４に対応する。
【００７１】
図１は、実施例１〜２および比較例３〜４の全細胞の数を解析したグラフである。培養開始１、３、５、７、１５日後における全細胞数を調べた（０日目は初期投与量の１×１０５をプロットした）。実線が実施例１〜２の結果であり、破線が比較例３〜４の結果である。実施例同士、比較例同士それぞれではそれほど結果は変わらないことが確認された。また培養開始１日後の全細胞数に対する培養開始７日後の全細胞数の比は、実施例が比較例を僅かに上回る程度でそれほど変わらない。増殖速度自体はそれほど相違しないことが示唆される。実施例１〜２の全細胞数は、比較例３〜４の全細胞数と比較すると、初期段階においては僅かに少ないが１５日後の段階では相違しないことがわかった。初期段階において実施例の全細胞数が僅かに少ない理由は、投与した脂肪幹細胞の全てがビーズに接着したわけではないことに起因すると考えられる。これは実施例では培養開始１日後の全細胞数が初期投与量を下回っていることから示唆される。
【００７２】
図２は、実施例１〜２および比較例１〜４の培養開始後５日後におけるＳＳＥＡ−３陽性細胞の数を解析したグラフである。グラフから明らかな通り、実施例１〜２のＳＳＥＡ−３陽性細胞の数は比較例よりも多かった。実施例１〜２の全細胞の数は、比較例１〜４の全細胞の数と同程度か僅かに少ないため、割合としても実施例１〜２の方が多いことがわかった。
【００７３】
図３は、実施例１〜２および比較例１〜３の培養開始後５日後におけるｍＲＮＡの量を解析したグラフである。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＣＤ３４、ＮＡＮＯＧ、ＭＹＣ、ＫＬＦ４の６つの遺伝子のｍＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲにて増幅し解析した。グラフは比較例３の測定値を１とした相対値を示す。グラフから明らかな通り、実施例１〜２におけるこれらマーカーの量は、比較例のものと同程度以上だった。
【００７４】
上記マーカーについて免疫染色した解析においても、実施例は比較例と比べてマーカーのシグナルが多いことが確認できた。
【００７５】
高機能組織幹細胞のマーカーとして周知な上記マーカーについて解析した結果、実施例１〜２の高機能脂肪幹細胞は、比較例１〜４のものよりも明らかに増加していることがわかった。培養前における脂肪幹細胞群のＳＳＥＡ−３陽性率は１．２％であった。これに対して、培養開始後５日時点における実施例の脂肪幹細胞群のＳＳＥＡ−３陽性率は、実施例１（ポリスチレンビーズ）では５．３％、実施例２（コラーゲンビーズ）では４．８％と明らかに増幅されていた。ＳＳＥＡ−３陽性細胞の数も実施例１では１１．５倍、実施例２では１１．８倍に増加されており、ＳＳＥＡ−３陽性率を高めながら脂肪幹細胞全体が順調に増殖したことも確認できた。
【００７６】
他方、培養開始後５日時点における比較例３の脂肪幹細胞群のＳＳＥＡ−３陽性率は１．１％であり、培養前よりも僅かに減少していた。比較例３と比較すると、実施例１におけるＳＳＥＡ−３陽性率は４．８倍であり、ＳＳＥＡ−３陽性細胞の数は３．３倍であった。また、培養開始後５日時点における比較例４の脂肪幹細胞群のＳＳＥＡ−３陽性率は１．０％であり、培養前よりも僅かに減少していた。比較例４と比較すると、実施例２におけるＳＳＥＡ−３陽性率は４．７倍であり、ＳＳＥＡ−３陽性細胞の数は３．３倍であった。高機能組織幹細胞の増殖効率において実施例は明らかに優れていた。
【００７７】
これらのことから、本発明の方法によれば、高い分化能を有する再生治療効果の良好な高機能組織幹細胞を安定的かつ大量に供給することが可能であることが示された。
【００７８】
また当然のことながら、実施例１〜２で得られた脂肪幹細胞群を継代して培養すれば、高機能脂肪幹細胞の割合をさらに高める可能性がある。すなわち本発明の方法によれば、従来不可能であった、高機能組織幹細胞の割合が極めて高い組織幹細胞群を提供できる可能性がある。
【図１】
2020043817.tif 000002
【図２】
2020043817.tif 000003
【図３】
2020043817.tif 000004