(57)【要約】      （修正有）【課題】幹細胞を用いた異種動物間での胚胞キメラ動物の作製方法を提供する。【解決手段】（Ａ）幹細胞を、該幹細胞に対して異種の動物の胚盤胞期の胚盤胞腔内に注入するか、または該幹細胞に対して異種の動物の分裂受精卵と混合する工程；および（Ｂ）（Ａ）工程で作製した該幹細胞を含む細胞塊を、該幹細胞の生物種と該異種の動物の生物種とのキメラ動物へと成長させる工程を包含する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を包含する、キメラ動物の作製方法：
（Ａ）幹細胞を、該幹細胞に対して異種の動物の胚盤胞期の胚盤胞腔内に注入するか、または該幹細胞に対して異種の動物の分裂受精卵と混合する工程；および
（Ｂ）（Ａ）工程で作製した該幹細胞を含む細胞塊を、該幹細胞の生物種と該異種の動物の生物種とのキメラ動物へと成長させる工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または誘導型幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞は、ｉＰＳ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｉＰＳ細胞は、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ３／４の３つの初期化因子を用いて初期化されたものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記幹細胞は、ｉＰＳ細胞であり、前記混合は、前記異種の動物の胚盤胞への注入によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記幹細胞の生物種は、マウスまたはラットである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記異種の動物の生物種は、マウスまたはラットである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記幹細胞は、標識されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞は、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が組み込まれることにより標識されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記幹細胞は、１０００Ｕ／ｍｌ以下の白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在下で維持されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記（Ａ）工程において、前記幹細胞は、胚の卵割球または卵黄周囲腔の中心に注入されること、または前記胚胞盤の内部細胞塊（ＩＣＭ）付近に注入されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記（Ａ）工程において、前記幹細胞はキメラ形成に適当な所定数注入されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記（Ｂ）工程において使用される培地は、ｍＲ１ＥＣＭ培地またはＫＳＯＭ−ＡＡ培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記（Ｂ）工程は、前記細胞の混合物を前記異種動物である非ヒト宿主哺乳動物の母胎中に戻し、該混合物を成長させて、産仔を得る工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記胚盤胞は、妊娠後４日後のラットまたはそれに該当する段階の動物から得られたものであり、前記母胎へ戻す工程は、擬似妊娠して３日目のラットまたはそれに該当する段階にて行われることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５に記載の方法によって生産されたキメラ動物。
【請求項１７】
請求項１〜１５に記載の方法によって生産されたキメラ動物の臓器またはその一部。
【請求項１８】
以下の工程を包含する、所望のゲノム型を有する臓器を製造する方法：
（Ａ）該所望のゲノム型を有する生物種の幹細胞を、該幹細胞に対して異種の動物の胚盤胞期の胚盤胞腔内に注入するか、または該幹細胞に対して異種の動物の分裂受精卵と混合する工程；
（Ｂ）（Ａ）工程で作製した該幹細胞を含む細胞塊を、該幹細胞の生物種と該異種の動物の生物種とのキメラ動物へと成長させる工程；および
（Ｃ）該キメラ動物から、所望のゲノム型を有する臓器を取り出す工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
所望のゲノム型を有するキメラ動物を生産するための、幹細胞。
【請求項２０】
ｉＰＳ細胞である、請求項１９に記載の幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞を用いた異種動物間での胚胞キメラ動物の作製に関する基本技術を提供する。
【背景技術】
【０００２】
異種動物間においてキメラ動物個体を作出する場合、通常は、胚発生初期の細胞塊を混合するいわゆるアグリゲーション法が用いられている。この方法では、その都度受精卵を用意し、それぞれが一定ステージまで分裂した胚を混合し、その後仮親に戻し、仔の発生に期待するという方法がとられている。このような手法に依存する限り、所望のキメラ動物を得ることは極めて煩雑であり、より簡便な異種間胚胞キメラの作出法が求められていた。
【０００３】
非特許文献１−３では、キメラ生成に関する研究に関するデータが報告されている。
【０００４】
非特許文献１は、ラットＥＳ細胞樹立を報告するものである。
【０００５】
非特許文献２は、非特許文献１での報告がマウスＥＳ細胞の混入であったことを認めるものであり、結果的にマウスＥＳ細胞によるラットとの胚胞キメラができたことを示すものである。すなわち、これらは異種間キメラ動物の作成を意図したものでないことは明らかである。
【０００６】
非特許文献３は、胸腺機能の研究においてキメラ作製が有用であることを記載しているが、マウス間でのキメラであり、異種間キメラの作成とは異なる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｉｎｎａｃｃｏｎｅ  ＰＭ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９４年、ｖｏｌ．１６３、２８８−２９２頁）（１９９７年にＣｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）
【非特許文献２】Ｂｒｅｎｉｎ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、１９９７年、ｖｏｌ．２９、１７６１−１７６５頁
【非特許文献３】Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｓ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ、２００５年、ｖｏｌ．１０２、ｎｏ．３０、１０５８７−１０５９２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、異種動物間において、胚胞キメラ動物を迅速かつ簡便に作出する技術を提供することを課題とする。したがって、本発明は、動物工学分野、有用な動物種の創出を非常に容易にする基本技術を提供することを課題とする。また、個人の特性に応じて皮膚などの体細胞から、「自分自身の臓器」を再生する技術にも応用できる技術を提供することを課題とする。また、ｉＰＳ細胞を用いてキメラ動物を作出することができる技術が提供されれば、胚を壊すことなく、体細胞から、極めて容易に、キメラ動物を作製することが可能となる。したがって、本発明は、キメラ動物の作出において、ｉＰＳ細胞を使用可能な技術を提供することをも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、異種間の胚胞キメラ動物を作出する際の問題点を克服するため鋭意検討を行
った結果、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の幹細胞を異種動物の胚盤胞へ注入する方法、もしくは数回分裂した異種動物受精卵と混合し、その後この混合物を発生させる方法によって、異種間胚胞キメラ動物を作出することができることを見出し、本発明を完成するに至った。ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を用いることにより、受精卵を用意することなく、異種間胚胞キメラ動物を作出することに成功した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下を提供するものである。
（１）以下の工程を包含する、キメラ動物の作製方法：
（Ａ）幹細胞を、該幹細胞に対して異種の動物の胚盤胞期の胚盤胞腔内に注入するか、または該幹細胞に対して異種の動物の分裂受精卵と混合する工程；および
（Ｂ）（Ａ）工程で作製した該幹細胞を含む細胞塊を、該幹細胞の生物種と該異種の動物の生物種とのキメラ動物へと成長させる工程
を包含する、方法。
（２）前記幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または誘導型幹（ｉＰＳ）細胞である、上記項目に記載の方法。
（３）前記幹細胞は、ｉＰＳ細胞である、上記項目に記載の方法。
（４）前記ｉＰＳ細胞は、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ３／４の３つの初期化因子を用いて初期化されたものである、上記項目に記載の方法。
（５）前記幹細胞は、ｉＰＳ細胞であり、前記混合は、前記異種の動物の胚盤胞への注入によって行われる、上記項目に記載の方法。
（６）前記幹細胞の生物種は、マウスまたはラットである、上記項目に記載の方法。
（７）前記異種の動物の生物種は、マウスまたはラットである、上記項目に記載の方法。（８）前記幹細胞は、標識されたものである、上記項目に記載の方法。
（９）前記幹細胞は、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が組み込まれることにより標識されたものである、上記項目に記載の方法。
（１０）前記幹細胞は、１０００Ｕ／ｍｌ以下の白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在下で維持されたものであることを特徴とする、上記項目に記載の方法。
（１１）前記（Ａ）工程において、前記幹細胞は、胚の卵割球または卵黄周囲腔の中心に注入されること、または前記胚胞盤の内部細胞塊（ＩＣＭ）付近に注入されることを特徴とする、上記項目に記載の方法。
（１２）前記（Ａ）工程において、前記幹細胞はキメラ形成に適当な所定数注入されることを特徴とする、上記項目に記載の方法。
（１３）前記（Ｂ）工程において使用される培地は、ｍＲ１ＥＣＭ培地またはＫＳＯＭ−ＡＡ培地である、上記項目に記載の方法。
（１４）前記（Ｂ）工程は、前記細胞の混合物を前記異種動物である非ヒト宿主哺乳動物の母胎中に戻し、該混合物を成長させて、産仔を得る工程を包含する、上記項目に記載の方法。
（１５）前記胚盤胞は、妊娠後４日後のラットまたはそれに該当する段階の動物から得られたものであり、前記母胎へ戻す工程は、擬似妊娠して３日目のラットまたはそれに該当する段階にて行われることを特徴とする、前記項目に記載の方法。
（１６）項目１〜１６に記載の方法によって生産されたキメラ動物。
（１７）項目１〜１６に記載の方法によって生産されたキメラ動物から得られた臓器またはその一部。
（１８）所望のゲノム型を有するキメラ動物を生産するための、幹細胞。
（１９）ｉＰＳ細胞である、項目１６に記載の幹細胞。
（２０）以下の工程を包含する、所望のゲノム型を有する臓器を製造する方法：
（Ａ）該所望のゲノム型を有する生物種の幹細胞を、該幹細胞に対して異種の動物の胚盤胞期の胚盤胞腔内に注入するか、または該幹細胞に対して異種の動物の分裂受精卵と混合する工程；
（Ｂ）（Ａ）工程で作製した該幹細胞を含む細胞塊を、該幹細胞の生物種と該異種の動
物の生物種とのキメラ動物へと成長させる工程；および
（Ｃ）該キメラ動物から、所望のゲノム型を有する臓器を取り出す工程、
を包含する、方法。
【００１１】
本発明において異種動物となる胚の由来としての非ヒト動物の場合、ブタ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、サル、マーモセット、ボノボ等の、ヒト以外の動物であれば、どのような動物であってもよい。混合すべき幹細胞の動物種と成体のサイズが似ている非ヒト動物から胚を採取することが好ましい。
【００１２】
他方、移入または混合される幹細胞の由来となる哺乳動物は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物、たとえばブタ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、サル、マーモセット、ボノボ等の、いずれであってもよい。ヒトについては、倫理面の問題がクリアできれば、その条件下で利用可能である。
【００１３】
本発明の１つの特徴は、レシピエントとなる胚と移植される細胞との関係が異種の関係であっても問題なく成功することができる点にある。
【００１４】
以上のようにして、移植される細胞を調製し、レシピエントとなる受精卵と混合し、または胚盤胞期の受精卵の腔内に移植し、胚盤胞期受精卵の内腔において、胚盤胞由来の内部細胞と移植される細胞とによるキメラの細胞塊を形成させ、これを成長させることにより、キメラ動物を産生することができる。
【００１５】
幹細胞を含む細胞塊を、仮親となる胚盤胞期受精卵の由来の種の偽妊娠または妊娠メス動物の子宮内に移植する。幹細胞を含む細胞塊（たとえば、胚盤胞期受精卵）を、仮親子宮内で発生させて、産仔を得る。このようにして、キメラ動物を生産することができる。また、この産仔から、哺乳動物細胞由来の目的とする臓器を取得することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によって、異種動物間において、胚胞キメラ動物を迅速かつ簡便に作出する技術がされた。本発明は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を用いることで、受精卵を用意することなしに、異種間胚胞キメラ動物を作出するということに成功した。したがって、本発明は、動物工学分野、家畜の改良等において有用な動物種の創出を非常に容易にする基本技術を提供する。本発明はまた、個人の特性に応じて皮膚などの体細胞から、「自分自身の臓器」を再生する技術にも応用できる技術を提供する。ｉＰＳ細胞を用いる場合、胚を壊すことなく、体細胞から、極めて容易に、キメラ動物を作製することができる。また、本技術を臓器再生に応用する場合、再生させたい臓器が、臓器を必要とする個体と全く同じ組織適合性抗原を有するので、臓器移植に際し拒絶反応が回避できる。このように、ｉＰＳ細胞を用いた場合、ＥＳ細胞を用いた場合に比べ、多くの利点を有する。将来倫理面での規制が変わり、ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を異種間胚胞キメラ動物の作成に応用することが可能となった場合においても、ｉＰＳ細胞を用いる方がＥＳ細胞よりも実用上の利点は大きい。たとえば、目的のゲノムを有する細胞に基づいて誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を生産して本発明を実施することにより、種々のゲノム由来の臓器を用いた研究開発を行うことも可能となる。これは、従来技術ではまったく不可能であった技術であるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、マウス／ラットキメラの作製を示す蛍光顕微鏡写真である。図中の（ａ）〜（ｂ）は、マウスＥＳ細胞のラット８細胞期胚（ａ）および胚盤胞（ｂ）へのインジェクションを示す。（ｃ）〜（ｈ）は、Ｅ１５．５胎児におけるマウス／ラットキメラ（ｃ、ｄ）、Ｅ１５．５におけるコントロール（ｅ）、新生児（ｆ、ｇ；ＧＦＰ陰性の産仔はコントロールである）および生後１週間（ｈ）（すなわち、コントロールのキメラでないラット胎児）を示す。上のパネルは明視野の像であり、下のパネルは蛍光像である。これらのキメラは、ＤｓＲｅｄで示されるＥＳ細胞（ｃ）またはＧＦＰで示されるｉＰＳ細胞（ｄ、ｆ〜ｈ）に由来するものであった。
【図２ａ】図２ａは、胎児繊維芽細胞を用いたマウス／ラットキメラの解析を示す蛍光顕微鏡写真である。胎児繊維芽細胞は、ｍＥＳ細胞インジェクションにより作製したＥ１５．５マウス／ラットキメラの仔から樹立した。上のパネルは明視野の像であり、下のパネルは赤色蛍光像である。
【図２ｂ】図２ｂは、胎児繊維芽細胞を用いたマウス／ラットキメラの解析を示す図である。キメラ胎児繊維芽細胞におけるｒＣＤ５４陽性のラット由来の細胞およびＤｓＲｅｄ陽性のマウス由来の細胞の個別の集団を示す。
【図３】図３は、ラット臓器におけるマウスｉＰＳ細胞の寄与を示す蛍光顕微鏡写真である。（ａ）は、ラット胚へのｍｉＰＳインジェクションにより作製した新生児を示す。左のパネルは明視野の像であり、右のパネルは緑色蛍光像である。（ｂ）は、腕（（ａ）における四角の枠内）の切片を示す。左側の１枚のパネルはＨＥ染色したものであり、そして、右側の３枚のパネルは、抗ＧＦＰ抗体（緑色）およびＤＡＰＩ（青色；核）で免疫染色したものである。矢印は、血管（左）および骨格筋（右）におけるＧＦＰ陽性細胞を示す。（ｃ）〜（ｆ）は、キメラの臓器（心臓（ｃ）、肝臓（ｄ）、膵臓（ｅ）および腎臓（ｆ））の像を示す。（ｃ）〜（ｆ）の各々において、左上のパネルは顕微鏡像であり、右上のパネルはその蛍光像であり、左下のパネルはＨＥ染色した切片であり、そして、右下のパネルは抗ＧＦＰ抗体（緑色）およびＤＡＰＩ（青色；核）で免疫染色した切片である。
【図４】（ａ）は、ＧＦＰマウス由来ｉＰＳ細胞樹立のストラテジーを示す図である。ＧＦＰマウス尻尾由来繊維芽細胞（Ｔａｉｌ  ｔｉｐ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＴＴＦ）の樹立を行った後、３因子（初期化因子）を導入し、２５〜３０日間ＥＳ細胞用培地にて培養し、ｉＰＳコロニーのピックアップおよびｉＰＳ細胞株を樹立した。（ｂ）は、樹立されたｉＰＳ細胞の形態をその形態をカメラ付き顕微鏡にて撮影した写真である。左は、ＧＦＰ−ｉＰＳ細胞＃２を、右には＃３を示す。（ｃ）は、アルカリフォスファターゼ活性の測定を示す蛍光顕微鏡写真である。ｉＰＳ細胞を蛍光顕微鏡下で撮影し、およびアルカリフォスファターゼ染色キット（Ｖｅｃｔｏｒ社  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＫ−５２００）により染色を施した。左から明視野像、ＧＦＰ蛍光像およびアルカリフォスファターゼ染色を示す。（ｄ）は、ゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲによる導入された３因子（初期化因子）の特定を示す電気泳動写真である。ｉＰＳ細胞よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行った結果である。上からＫｌｆ４，Ｓｏｘ２，Ｏｃｔ３／４、ｃ−ＭｙｃおよびＭｙｏｇの遺伝子の発現を示す。左から、ＧＦＰ−ｉＰＳ細胞＃２、＃３、Ｎａｎｏｇ−ｉＰＳ（４因子のもの）、コントロールとしてＥＳ細胞（ＮＣ）のものを示す。一番右には蒸留水での結果を示す。本発明において用いたｉＰＳ細胞における３因子の挿入が確認された。（ｅ）は、ＲＴ−ＰＣＲによる本発明で用いた細胞におけるＥＳ細胞に特徴的な遺伝子発現パターンの解析と導入遺伝子の発現確認を示す電気泳動写真である。上からＫｌｆ４，Ｓｏｘ２，Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃである。Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、Ｇａｐｄｈの遺伝子の発現を示す。一番下には、ネガティブコントロール（ＲＴ（−））を示す。Ｋｌｆ４，Ｓｏｘ２，Ｏｃｔ３／４については、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡとトランスジェニック（Ｔｇ）とを分けて発現を確認した。左から、ＧＦＰ−ｉＰＳ細胞＃２、＃３、コントロールとしてＥＳ細胞（ＮＣ）およびさらにコントロールとしてのＴＴＦ（ネガティブコントロール）の発現の様子を示す。一番右には蒸留水での結果を示す。（ｆ）は、ｉＰＳ細胞を用いたキメラマウス作製を示す蛍光顕微鏡写真である。樹立されたｉＰＳ細胞をＣ５７ＢＬ６とＢＤＦ１系統のマウスの交配により得られた胚盤胞に注入し、キメラマウスを作製した結果を示す。上には、胎生１３．５日目の明視野像（左）ＧＦＰ蛍光像（右）を示す。下には、新生児期のものを示す。ＮＣと記載しているのはネガティブコントロールである。
【図５】図５は、ラットｉＰＳ細胞の特徴を示す図である。（ａ）は、ラットｉＰＳ細胞樹立に用いたレンチウイルスベクターの構造の概略図である。１種類のウイルス感染によりテトラサイクリン依存的に３因子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２）を発現させるため（ｔｅｔ−ｏｎシステム）、ｒｔＴＡの発現をＵｂＣプロモーター下で、３因子の発現をＴＲＥ  プロモーター下で行った。またウイルス感染細胞および樹立できたｉＰＳ細胞株の標識を行うため、ｒｔＴＡの下流にＩＲＥＳを介してＥＧＦＰを結合させ、ＵｂＣプロモーター下で全身に発現するようにした。（ｂ）は、樹立されたラットｉＰＳ細胞（ｒＷＥｉ３．３−ｉＰＳ細胞）の形態を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図６】図６は、ｉＰＳ細胞を用いたマウス−ラット異種間キメラの作製を示す図である。（ａ）は、異種間キメラの胎児期における解析の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。マウスｉＰＳ細胞をラットの胚盤胞に注入して得られたキメラ（胎生１５日目：上）、およびラットｉＰＳ細胞をマウスの胚盤胞に注入して得られたキメラ（胎生１３日目：下）を示す。図中のスケールバーは、２ｍｍを示す。（ｂ）は、（ａ）で得られたキメラから樹立した胎児繊維芽細胞を用いたＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフである。両者ともに、ＥＧＦＰ陽性のピークが確認でき、ｉＰＳ細胞由来の寄与が確認された。
【図７】図７は、マウス−ラット異種間キメラの作製を証明する図である。（ａ）は、異種間キメラの胎児肝臓を用いたＦＡＣＳによるキメリズム解析の結果を示すグラフである。得られた胎児より肝臓を採取し、マウスおよびラットそれぞれに特異的なＣＤ４５抗体で胎児肝臓中の血液細胞を染め分けた。それぞれ単陽性の細胞が存在しているだけでなく、注入したｉＰＳ細胞由来の細胞は、ほぼ全てがＥＧＦＰを発現していた。（ｂ）は、マウスおよびラットのＯｃｔ３／４遺伝子座におけるエクソン−２およびエクソン−４間のイントロン鎖長の違いを示した模式図である。（ｃ）は、マウスおよびラットのＣＤ４５陽性細胞の由来の確認を行った結果を示す電気泳動写真である。（ａ）のキメラのＦＡＣＳパターンにおけるマウスＣＤ４５もしくはラットＣＤ４５陽性細胞を分取し、ゲノムＤＮＡ  を抽出し、鎖長の違いをマウスとラットに共通のプライマー（ｂ）の矢頭）を用いたＰＣＲにより検出した。陽性対照には、マウス、ラットそれぞれの末梢血中のＣＤ４５陽性細胞から抽出したゲノムＤＮＡを用いた。
【図８】図８は、新生児および成体におけるマウス−ラット異種間キメラを示す図である。（ａ）、（ｂ）は、新生児におけるマウス−ラット異種間キメラを示す蛍光顕微鏡写真である。（ａ）は、マウスｉＰＳ細胞をラット胚盤胞に、（ｂ）は、ラットｉＰＳ細胞をマウス胚盤胞にそれぞれ注入し得られた新生児で、ＥＧＦＰ  蛍光がそれぞれにおけるｉＰＳ細胞由来の細胞を示す。矢印で示した個体は、同腹仔の非キメラを示す。図中のスケールバーは、１０ｍｍを示す。（ｃ）、（ｄ）は、成体におけるマウス−ラット異種間キメラを示す写真である。（ｃ）は、マウスｉＰＳ細胞（毛色：黒）をラット胚盤胞（毛色：白）に、（ｄ）は、ラット  ｉＰＳ細胞（毛色：白）をマウス胚盤胞（毛色：黒）にそれぞれ注入し得られ発育した個体で、それぞれ斑な毛色を示す。（ｅ）は、新生児および成体における異種間キメラの作製効率を示すグラフである。移植胚数を１００％とした時の成体におけるキメラ率、新生児におけるキメラ率、非キメラ率、非着床もしくは流産率を示す。
【図９】図９は、新生児におけるマウス−ラット異種間キメラの全身のキメリズム解析の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ａ）、（ｃ）は、新生児におけるマウス−ラット異種間キメラの全身のキメリズムを示す。（ａ）は、マウスｉＰＳ細胞をラット胚盤胞に、（ｃ）は、ラットｉＰＳ細胞をマウス胚盤胞にそれぞれ注入して得られた新生児であり、ＥＧＦＰ蛍光がそれぞれにおけるｉＰＳ細胞由来の細胞を示す。破線は、各臓器を示し、Ｂは脳、Ｈは心臓、Ｌｕは肺、Ｌｉは肝臓、Ｐは膵臓、Ａは副腎、Ｋは腎臓をそれぞれ示す。（ｂ）、（ｄ）は、代表的な臓器の組織切片を作製し、抗−ＥＧＦＰ抗体およびＤＡＰＩにより染色を施した結果を示す。（ｂ）は、（ａ）のキメラから摘出した臓器、（ｄ）は（ｃ）のキメラから摘出した臓器を示す。図中のスケールバーは、（ａ）、（ｃ）では２ｍｍ、（ｂ）、（ｄ）では１００μｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当上記分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
（キメラ動物）
本明細書において「キメラ動物」とは、２つ以上の動物のゲノムに由来するゲノム型を含む、動物をいう。ゲノムは、同種異系であってもよく、異種であってもよい。
【００１９】
本明細書において、「幹細胞」は、多能性を有する任意の細胞をいい、代表例としては、胚性幹（ＥＳ）細胞または誘導型幹（ｉＰＳ）細胞、卵細胞、多能性生殖幹細胞（ｍＧＳ細胞）、内部細胞塊（ＩＣＭ細胞）等が挙げられる。
【００２０】
本明細書において、「胚性幹（ＥＳ）細胞」とは、当該分野における通常の意味で用いられ、胚盤胞細胞から樹立された，多分化能をもつ培養細胞株をいう。
【００２１】
本明細書において、「誘導型幹（ｉＰＳ）細胞」とは、外来の因子（本明細書では「初期化因子」という）によって、分化細胞の分化状態を初期化して未分化状態にした細胞をいう。
【００２２】
本明細書において、「初期化因子」とは、分化細胞を未分化細胞にすることができる因子または因子群あるいはその一員をいう。代表例としては、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ３／４が挙げられる。
【００２３】
本明細書において、「異種」とは、移植を意図される幹細胞に対して、動物種が異なることをいう。ラットとマウス、ブタとヒトなどは、異種の組み合わせの例である。本明細書では、動物における任意の種が対象となるべきことが理解される。本発明では、幹細胞とは異種の動物は、ホストとなるべき動物であるから、ホストの使用が企図される場合は、非ヒトである。
【００２４】
本明細書において「胚盤胞」とは、当該分野で通常使用される意味で用いられ、哺乳類の初期発生で，卵割期の終った胚をいう。代表的に、３２細胞期に、胚盤胞は、集塊の外側を包む栄養芽層と、内側の内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓｌ；ＩＣＭ）とに分かれ、集塊内に胞胚腔と呼ばれる腔所を生じる。
【００２５】
本明細書において「卵割球」とは、当該分野で通常使用される意味で用いられ、受精卵の卵割によって生じるおもに２細胞期より胞胚期にいたる間の形態的に未分化の細胞をいう。
【００２６】
本明細書において「卵黄周囲腔（ｐｅｒｉｖｉｔｅｌｌｉｎｅ  ｓｐａｃｅ）」とは、当該分野で通常使用される意味で用いられ、囲卵腔とも呼ばれ、動物卵の表面と卵を直接とりかこむ卵黄膜や受精膜との間にある隙間をいう。
【００２７】
本明細書において「分裂受精卵」とは、受精卵であって、細胞分裂を経たものをいう。代表的には、４細胞期、８細胞期、１６細胞期などを挙げることができる。
【００２８】
本明細書において「注入」は、任意の適切な手段を使用して達成することができる。そのような手段としては、例えば、Ｎａｇｙ，Ａ．，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．，Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ，Ｋ．＆  Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｓ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ
ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００３）に記載される手法が挙げられる。具体的な例としては、たとえば、以下が挙げられる。ピエゾ駆動のマイクロマニピュレーター（プライムテック製）を用いて、顕微鏡下で注意深く透明帯に穴を開けた後、８細胞期胚あるいは桑実胚であれば胚の卵割球の中心または卵黄周囲腔に、胚盤胞であれば内腔に、それぞれ約１０個のｍＥＳ／ｍｉＰＳ細胞をインジェクションすることなどが挙げられるが、それに限定されない。
【００２９】
本明細書において「混合」は、任意の適切な手段を使用して達成することができる。そのような手段としては、例えば、上記のＮａｇｙ，Ａ．らの文献に記載される手法が挙げられる。具体的な例としては、たとえば、以下が挙げられる。酸性タイロード溶液により透明帯を除去した２種の胚  （桑実胚）  同士を同じ培養液中で隣接させ物理的に接着させることができる。翌日接着が起こっていれば１つの混合胚盤胞が形成される。
【００３０】
本明細書において「幹細胞の生物種と異種の動物の生物種とのキメラ動物へと成長させる」方法は、任意の適切な方法を用いることができる。代表的には、そのような方法としては、例えば、細胞の混合物を前記異種動物である非ヒト宿主哺乳動物の母胎中に戻し、該混合物を成長させて、産仔を得る方法があげられるがそれに限定されない。この方法のバラエティーまたは他の方法としては、上記のＮａｇｙ，Ａ．らの文献に記載される手法が挙げられる。具体的な例としては、仮親の偽妊娠交配後の適切な時期に子宮内へ外科的に混合胚を移植することが挙げられる。
【００３１】
本明細書において「標識」とは、キメラ動物において、一方を他方から識別することを可能にする任意の因子をいう。異なる遺伝子であれば、その遺伝子自体が標識にあたると考えることができるが、通常は、目視等のより簡便な認識手段で峻別を可能にするものを用いる。そのような標識の例としては、たとえば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ），青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ），その他蛍光タンパク質およびＬａｃＺなどを挙げることができる。キメラ動物に用いる細胞は、一方を、混合または注入する前に、特異的に検出するための蛍光タンパク質を発現可能な状態で組み込んでもよい。たとえば、そのような検出用の蛍光タンパク質として、ＤｓＲｅｄの遺伝子変異体、ＤｓＲｅｄ．Ｔ４（Ｂｅｖｉｓ  Ｂ．Ｊ．ａｎｄ  Ｇｌｉｃｋ  Ｂ．Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２０，ｐ．８３−８７，２００２）を、ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリアクチン遺伝子プロモーター）の制御によりほぼ全身臓器に発現するように配列設計し、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）により幹細胞に組み込むことができる。移植用の細胞に対し、蛍光による標識を行うことにより、産生した動物における各組織がキメラ動物のいずれの細胞に由来するのかを容易に検出することができる。
【００３２】
本明細書において「白血病抑制因子（ＬＩＦ）」（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ）とは、白血病細胞の増殖を阻害し、マクロファージに分化誘導する因子として発見された因子をいう。ＥＳ細胞の未分化状態を維持するために細胞培養時に用いられる。
【００３３】
本明細書において「所望のゲノム型」とは、キメラ動物または臓器において作製を所望するゲノム型をいう。
【００３４】
本明細書において「臓器」とは、当該分野において通常の意味で用いられ、動物の身体を構成する器官一般または場合によってその一部を指す。
【００３５】
（キメラ動物の作製方法）
１つの局面において、本発明は、キメラ動物の作製方法を提供する。この方法は、以下の工程：（Ａ）幹細胞を、該幹細胞に対して異種の動物の胚盤胞期の胚盤胞腔内に注入するか、または該幹細胞に対して異種の動物の分裂受精卵と混合する工程；および（Ｂ）（Ａ）工程で作製した該幹細胞を含む細胞塊を、該幹細胞の生物種と該異種の動物の生物種とのキメラ動物へと成長させる工程を包含する。倫理上の問題があることから、ホストとしての人体は除外される。
【００３６】
本発明の方法において、（Ａ）工程は、幹細胞と胚盤胞期の受精卵または分裂受精卵とが混合するような様式で行われるのであれば、任意の手法を用いることができる。そのような手法としては、例えば、上記のＮａｇｙ，Ａ．らの文献に記載される手法がある。
【００３７】
本発明の方法において、（Ｂ）工程では、（Ａ）工程で生産した細胞塊を一定期間培養した後、通常の胎仔の発生過程を経由させるか、またはそれに匹敵する手法を用いてキメラ動物へと成長させることができる。
【００３８】
１つの実施形態において、本発明において用いられる幹細胞は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。
【００３９】
好ましい実施形態において、本発明において用いられる幹細胞は、ｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞は、体細胞を材料にして所望のゲノムを有するものを作成することができる。このためｉＰＳ細胞を用いれば、所望のゲノムを有する異種キメラ動物を生産することができる。ｉＰＳ細胞を用いる場合、胚を壊すことなく、体細胞から、極めて容易に、キメラ動物を作成することができる。また本技術を臓器再生に応用する場合、再生させたい臓器が、臓器を必要とする個体と全く同じ組織適合性抗原を有するので、臓器移植に際し拒絶反応が回避できる。このようにｉＰＳ細胞を用いた場合、ＥＳ細胞を用いた場合に比べ多くの利点を有する。将来倫理面での規制が変わり、ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を異種間胚胞キメラ動物の作成に応用可能となった場合においても、ｉＰＳ細胞を用いる方がＥＳ細胞よりも実用上の利点は大きい。ｉＰＳ細胞の提供は、本明細書において記載されるような種々の手法を用いて生産することによって行うことができる。あるいは、すでに生産され維持されているｉＰＳ細胞を使用してもよい。
【００４０】
好ましい実施形態において、本発明において用いられるｉＰＳ細胞は、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ３／４の３つの初期化因子を用いて初期化されたものである。理論に束縛されることを望まないが、この組み合わせが好ましい理由としては、たとえば、がん遺伝子であるｃ−Ｍｙｃを使用しないことから、がん化が見られないことなどが挙げられる。しかしながら、本発明は、これら方法に限定されるものではない。ｉＰＳ細胞の作成法は非常に多様化してきており、小分子化合物と２〜３種類の初期化遺伝子の組み合わせ、酵素阻害剤と２〜３種類の初期化遺伝子の組み合わせ等その他の因子でも樹立することが明らかになっており、これらのいずれの手法を用いても、本発明に利用することができることが理解される。
【００４１】
好ましい実施形態において、本発明において用いられる幹細胞は、ｉＰＳ細胞であり、本発明において実施される混合工程は、前記異種の動物の胚盤胞への注入によって行われる。理論に束縛されることを望まないが、この組み合わせが好ましい理由としては、たとえば、ｉＰＳ細胞は、体細胞を材料にして所望のゲノムを有するものを作成することがで
きることから、所望のゲノムを有する異種キメラ動物を生産することができることなどが挙げられる。
【００４２】
１つの実施形態において、本発明において用いられる幹細胞の生物種は、マウスまたはラットであるがこれらに限定されない。理論に束縛されることを望まないが、近年のｉＰＳ細胞樹立により特定の転写因子の組み合わせにより体細胞を初期化する技術が確立された。これにより現在までに樹立あるいは維持が困難とされてきたマウス、サル以外のブタ、ウシなどの大型動物種においても同様の方法を適用することで胚発生に寄与が可能な多能性幹細胞を樹立しうる。これらを異種間キメラ作製に用いうる。またサルやヒトといった霊長類ではすでに多能性幹細胞の存在が認められていることからこれを用いての異種間キメラを作製しうる。
【００４３】
１つの実施形態において、本発明において用いられる異種の動物の生物種は、マウスまたはラットであるがこれらに限定されない。本発明は、ブタ、ウシなどの大型動物であっても、同様の作出が可能である。その理由としては、以下が挙げられる。理論に束縛されることを望まないが、実際にヤギ、ヒツジ間では異種キメラの作製報告がすでにあり、実験動物レベルから今回示したマウス−ラットのような染色体数も異なるような異種からもキメラ作出が可能であることが示唆された。また大型動物においてもヤギ−ヒツジ間でキメラ個体が作出であることから、ブタやウシであっても本件で示したような多能性幹細胞を胚の内側に取り込まれるような方法を用いればキメラ個体の作出は可能性としてあげられる。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明において用いられる幹細胞は、標識されたものを使用することができる。このような標識としては、幹細胞自体が標識されたものであるか、標識されるように改変されたものであってもよい。例えば、実施例において使用されるＧＴ３．２細胞は、ＣＡＧ発現ユニットの制御下で、改良型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をユビキタスに発現する細胞である。また、実施例で用いられる、ＥＢ３ＤＲ細胞は、ＥＢ３  ＥＳ細胞に由来し、そして、ＣＡＧ発現ユニットの制御下でＤｓＲｅｄ−Ｔ４遺伝子を持つ。このような細胞は、すでに、標識が発現するように改変された細胞であるといえる。これ以外の標識方法については、本明細書の他の部分における説明を参酌するか、当該分野において公知の技術を応用することができる。
【００４５】
１つの具体的な実施形態では、本発明において用いられる幹細胞は、蛍光タンパク質（たとえば、緑色蛍光タンパク質）をコードする遺伝子が組み込まれることにより標識されたものである。
【００４６】
１つの実施形態において、本発明において用いられる幹細胞は、１０００Ｕ／ｍｌ以下の白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在下で維持されたものであることを特徴とする。これは、非特許文献１では、従来技術と同様、比較的高濃度のＬＩＦを用いてキメラが作製されるにいたっているが、本発明においては、低濃度のＬＩＦでキメラ化が進むことが明らかになった。
【００４７】
このましいＬＩＦ濃度としては、例えば、１０００Ｕ／ｍｌ以下、２０００Ｕ／ｍｌ、３０００Ｕ／ｍｌ以下、あるいは、５００Ｕ／ｍｌ、３００Ｕ／ｍｌ以下、２００Ｕ／ｍｌ以下、１００Ｕ／ｍｌ以下などを挙げることができる。下限としては、０Ｕ／ｍｌ以上、１０Ｕ／ｍｌ以上、２０Ｕ／ｍｌ以上、３０Ｕ／ｍｌ以上、５０Ｕ／ｍｌ以上、１００Ｕ／ｍｌ以上、２００Ｕ／ｍｌ以上、３００Ｕ／ｍｌ以上などを挙げることができる。
【００４８】
１つの実施形態において、本発明の（Ａ）工程における幹細胞は、胚の卵割球または卵黄周囲腔の中心に注入されること、または本発明において用いられる胚胞盤の内部細胞塊
（ＩＣＭ）付近に注入されることを特徴とする。理論に束縛されることを望まないが、胚盤砲に入れる場合も、アグリゲーションをさせる場合も、ドナー（つまり実施例１の場合はマウス）の方は宿主（実施例１の場合ラット）のかたまりのなるべく内側に入れることが好ましいことが明らかとなった。理論に束縛されることを望まないが、これは、ドナーが宿主の免疫系から多少なりとも逃れられるからであると考えられる。
【００４９】
１つの実施形態において、本発明の（Ａ）工程における幹細胞は、キメラ形成に適当な所定数注入されることを特徴とする。前記キメラ形成に適当な所定数は１〜２０個であり、好ましくは５〜１５個、より好ましくは８〜１２個である。
【００５０】
１つの実施形態において、本発明の（Ｂ）工程において使用される培地は、ｍＲ１ＥＣＭ培地またはＫＳＯＭ−ＡＡ培地である。マウスであれば、Ｍ１６、ＣＺＢ、ＫＳＯＭ、さらにＫＳＯＭにアミノ酸を加えたＫＳＯＭ−ＡＡを使用することができ、これらの中でも胚発生において一番よい条件であるＫＳＯＭ−ＡＡを選択することができる。
【００５１】
１つの実施形態において、（Ｂ）工程は、前記細胞の混合物を前記異種動物である非ヒト宿主哺乳動物の母胎中に戻し、該混合物を成長させて、産仔を得ることを包含する。
【００５２】
１つの実施形態において、本発明の（Ｂ）工程は、受精後４日もしくは５日目で行うことが好ましい。理論に束縛されることを望まないが、この日数が、キメラの成立および免疫抵抗性の排除のバランスから適切であると考えられるからである。したがって、これらのデータから、ブタ、ウシなどについても、本明細書における記載に基づいて実施することができる。
【００５３】
１つの実施形態では、胚盤胞は、妊娠後４日後のラットまたはそれに該当する段階の動物から得られたものであり、前記母胎へ戻す工程は、擬似妊娠して３日目のラットまたはそれに該当する段階にて行われることが有利でありうる。したがって、これらのデータから、ブタ、ウシなどの胚盤胞について、母胎へ戻す工程は、本明細書における記載に基づいて実施することができる。
【００５４】
別の局面において、本発明は、上記本発明の方法によって生産されたキメラ動物を提供する。本発明のキメラ動物の特徴は異種動物間の胚胞キメラであるということと、ＥＳ細胞もしくはｉＰＳ細胞などの幹細胞を用いているということにある。キメラ動物であることの証明は、体細胞を表面抗原による差別化、またはジェノタイピングもしくはマーカー遺伝子の検索により可能である。
【００５５】
（所望の臓器の製造）
別の局面において以下の工程を包含する、所望のゲノム型を有する臓器を製造する方法を提供する。この方法は、（Ａ）該所望のゲノム型を有する生物種の幹細胞を、該幹細胞に対して異種の動物の胚盤胞期の胚盤胞腔内に注入するか、または該幹細胞に対して異種の動物の分裂受精卵と混合する工程；（Ｂ）（Ａ）工程で作製した該幹細胞を含む細胞塊を、該幹細胞の生物種と該異種の動物の生物種とのキメラ動物へと成長させる工程；および（Ｃ）該キメラ動物から、所望のゲノム型を有する臓器を取り出す工程、を包含する。
【００５６】
本方法の効果の確認は、各臓器に特異的なマーカー、酵素、機能などを測定する公知の技術を用いて行うことができる。
【００５７】
本発明の臓器を製造する方法において、製造すべき臓器としては、腎臓、心臓、膵臓、小脳、肺臓、甲状腺、毛および胸腺などの一定の形状を有する固形臓器であればいずれのものでもよいが、好ましくは、腎臓、すい臓、毛および胸腺が挙げられる。このような固
形臓器は、全能性細胞あるいは多能性細胞を、レシピエントとなる胚の中で発生させることにより、産仔の体内において製造する。全能性細胞あるいは多能性細胞は、胚の中で発生させることにより、すべての臓器を形成することができることから、使用する全能性細胞あるいは多能性細胞の種類に依存して製造することができる固形臓器が制約を受けることはない。
【００５８】
一方、本発明は、レシピエントとなる非ヒト胚由来の産仔個体の体内において、移植される細胞にのみ由来する臓器を形成することを特徴としており、レシピエントとなる非ヒト胚由来の細胞と移植される細胞とのキメラの細胞構成を有することは望ましくない。そのため、レシピエントとなる非ヒト胚としては、発生段階において製造すべき臓器の発生が生じず、出生児において当該臓器を欠損する異常を有する動物由来の胚を使用することが望ましい。このような臓器欠損を発生させる動物であれば、特定の遺伝子が欠損することにより臓器が欠損するノックアウト動物であっても、あるいは特定の遺伝子を組み込むことにより臓器が欠損するトランスジェニック動物であってもよい。
【００５９】
たとえば、臓器として腎臓を製造する場合、レシピエントとなる非ヒト胚として、発生段階において腎臓の発生が生じない異常を有するＳａｌｌ１ノックアウト動物（Ｎｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２８，ｐ．３１０５−３１１５，２００１）の胚等を使用することができる。また、臓器として膵臓を製造する場合、レシピエントとなる非ヒト胚として、発生段階において膵臓の発生が生じない異常を有するｐｄｘ−１ノックアウト動物（Ｏｆｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２２，ｐ．９８３−９９５，１９９６）の胚、臓器として小脳を製造する場合、レシピエントとなる非ヒト胚として、発生段階において小脳の発生が生じない異常を有するＷｎｔ−１（ｉｎｔ−１）ノックアウト動物（ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ  Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．６２，ｐ．１０７３−１０８５，１９９０）の胚、臓器として肺臓、甲状腺を製造する場合、レシピエントとなる非ヒト胚として、発生段階において肺臓と甲状腺の発生が生じない異常を有するＴ／ｅｂｐノックアウト動物（Ｋｉｍｕｒａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１０，ｐ．６０−６９，１９９６）の胚等を、それぞれ使用することができる。また、腎臓，肺など複数臓器の欠損を引き起こす、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）レセプター（ＦＧＦＲ）の細胞内ドメインの欠損型を過剰発現させるドミナントネガティブ型のトランスジェニック変異体動物モデル（Ｃｅｌｌｉ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，Ｖｏｌ．１７  ｐｐ．１６４２−６５５，１９９８）の胚を使用することもできる。あるいは、ヌードマウスを用いて、毛または胸腺の生産に使用することができる。
【００６０】
（キメラ動物生産用の幹細胞）
本発明は、所望のゲノム型を有するキメラ動物を生産するための、幹細胞を提供する。特に、本発明では、異種でのキメラ動物の生産が可能になったことが特徴である。このようなキメラ動物は、従来生産することができなかったことから、動物自体にも発明としての価値があると考えられる。理論に束縛されることは望まないが、このような動物がこれまで作製することができなかったのは、異種では、キメラ動物の産生の困難性から成功率が低いと考えられていたことが原因であると考えられる。
【００６１】
好ましい実施形態では、本発明の幹細胞は、ｉＰＳ細胞である。
【００６２】
（ｉＰＳ細胞）
ｉＰＳ細胞は、初期に同定された、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの４因子を用いてもよく、他の方法によっても作製することができる。すなわち、ｉＰＳ細胞は、体細胞に初期化因子（単数または複数の因子の組み合わせでありうる）を接触
させることによって初期化を誘導させて生産することができる。そのような初期化および初期化因子の例としては以下のようなものを挙げることができる。たとえば、本発明の実施例では、ｉＰＳ細胞は３因子（Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４；これらは本発明において使用される代表的な「初期化因子」である。）を、ＧＦＰトランスジェニックマウスの尻尾より採取した繊維芽細胞に導入することにより、本発明者らが独自に作製したが、このほかの組み合わせ、たとえば、Ｙａｍａｎａｋａ因子とも呼ばれるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの４因子を利用した方法を用いることもでき、その改良法を用いることもできる。遺伝子としては、ｃ−Ｍｙｃの代わりにｎ−Ｍｙｃを用い、ベクターとしては、レトロウイルスベクターの一種であるレンチウイルスベクターを用いて、ｉＰＳ細胞を樹立することも可能である（Ｂｌｅｌｌｏｃｈ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １：２４５−２４７）。また、ＯＣＴ３／４・ＳＯＸ２・ＮＡＮＯＧ・ＬＩＮ２８の４遺伝子を胎児肺由来の線維芽細胞や新生児包皮由来の線維芽細胞へ導入することで、ヒトｉＰＳ細胞を樹立することも可能である（Ｙｕ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１９１７−１９２０）。
【００６３】
マウスｉＰＳ細胞樹立で使用されたマウス遺伝子のヒト相同遺伝子であるＯＣＴ３／４・ＳＯＸ２・ＫＬＦ４・Ｃ−ＭＹＣを用いて線維芽様滑膜細胞、および新生児包皮由来の線維芽細胞からヒトｉＰＳ細胞を生産することもできる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，ｅｔ
ａｌ．，（２００７）．Ｃｅｌｌ  １３１：  ８６１−８７２．）。ＯＣＴ３／４・ＳＯＸ２・ＫＬＦ４・Ｃ−ＭＹＣの４遺伝子にｈＴＥＲＴ・ＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔを加えた６遺伝子を用いてヒトｉＰＳ細胞を樹立することもできる（Ｐａｒｋ  ＩＨ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ  ４５１：１４１−１４６．）。また、ｃ−Ｍｙｃの遺伝子導入をせずにＯｃｔ−４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の３因子だけでも、低効率ながらマウスおよびヒトにおいてｉＰＳ細胞の樹立が可能であることが示されており、ｉＰＳ細胞が癌細胞に変化するのを抑えることに成功していることから、本発明においてこれを利用することもできる（Ｎａｋａｇａｗａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，（２００８）．Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６：１０１−１０６．；Ｗｅｒｉｎｇ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，（２００８）．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２：１０−１２）。
【００６４】
（ノックアウト動物）
本発明の技術は、ノックアウト動物と組み合わせて実施することができる。ノックアウト動物は、概ね、以下の手順で作製される。まず、ターゲッティングベクター（組換えＤＮＡ）を調製した後、エレクトロポレーション法などにより、そのターゲッティングベクターを幹細胞（たとえば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞など）に導入する。そして、相同的遺伝子組換えの生じたＥＳ細胞株を選別する。次に、８細胞期胚又は胚盤胞期胚の中に、その組換えＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などを、インジェクション法により注入し、キメラ胚を作製する。次に、そのキメラ胚を偽妊娠動物の子宮に移植し、産仔（キメラ動物）を得る。次に、作製したキメラ動物と野生型動物を交配し、生殖細胞が組換えＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などに由来する細胞により形成されているか否かを確認する。そして、生殖細胞が組換えＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などに由来する細胞により形成されていることが確認された動物同士を交配し、得られた産仔の中からノックアウト動物を選別する。
【００６５】
（遺伝子）
本明細書において、本発明において使用される遺伝子（たとえば、Ｓａｌｌ１、ｐｄｘ−１などの欠損遺伝子、またはｉＰＳ細胞を生産するのに必要な遺伝子であるＫｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４など）には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
【００６６】
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種に
おける所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子（例えば、ｓａｌｌ１）に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ヒトの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【００６７】
（種々の動物を使用する場合の留意点）
マウス以外の動物を使用する場合は、以下の点に留意することで、本明細書の実施例に記載した手法を応用して実施することができる。たとえば、他種の動物におけるキメラ作製に関して、マウス以外の種ではキメラ形成能をもつような多能性幹細胞樹立の報告よりは、胚もしくは胚の中でもＥＳ細胞の起源となる内部細胞塊を注入したキメラの報告（ラット：（Ｍａｙｅｒ，Ｊ．Ｒ．Ｊｒ．＆Ｆｒｅｔｚ，Ｈ．Ｉ．Ｔｈｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｒａｔ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｌｏｐｈｅｎｉｃ  ｒａｔｓ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．３９，１−１０（１９７４））；ウシ：（Ｂｒｅｍ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔｔｌｅ  ｃｈｉｍｅｒａｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｍｂｒｙｏ  ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ．２３，１８２（１９８５））；ブタ：（Ｋａｓｈｉｗａｚａｋｉ  Ｎ  ｅｔ．ａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｉｇｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１３０，１８６−１８７（１９９２）））が多いが、内部細胞塊を注入したキメラを用いても、本明細書に記載した方法を応用することができる。これらのように内部細胞塊を用いることで欠損動物の失われた臓器を補うことは事実上可能である。すなわち、たとえば、上記細胞をいずれも胚盤胞までｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、得られた胚盤胞から内部細胞塊を物理的に一部剥離し、それを胚盤胞へインジェクションすることができる。途中の８細胞期あるいは桑実胚同士を凝集させキメラ胚を作製することができる。そして、このような技術が異種間のキメラ動物の作出において利用される。
【００６８】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ
ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００６９】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００７０】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００７１】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００７２】
本実施例では、動物愛護の精神にのっとり、東京大学において規定される動物の取り扱いに関する規準に基づいて、以下の実験を行った。
【００７３】
（参考文献）
本実施例において、以下の文献を参考にした：
Ｈｏｏｐｅｒ  Ｍ，Ｈａｒｄｙ  Ｋ，Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．ＨＰＲＴ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ（Ｌｅｓｃｈ−Ｎｙｈａｎ）ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｕｌｔｕ
ｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  １９８７；３２６：２９２−２９５．
Ｎｉｗａ  Ｈ，Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｊ，Ｓｍｉｔｈ  ＡＧ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｃｔ−３／４  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ
ｏｆ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０００；２４：３７２−３７６．
Ｎａｇｙ，Ａ．，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．，Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ，Ｋ．＆  Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｓ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００３）
Ｑｉ−Ｌｏｎｇ  Ｙｉｎｇ，  Ｍａｒｉｏｓ  Ｓｔａｖｒｉｄｉｓ，  Ｄｅａｎ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，  Ｍｅｎｇ  Ｌｉ，  Ａｕｓｔｉｎ  Ｓｍｉｔｈ．Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｉｎ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ.Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００３;２１：１８３−１８６.
Ｓｈｙｏｓｏ  Ｏｇａｗａ，  Ｋａｈｅｉ  Ｓａｔｏｈ，Ｈａｊｉｍｅ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｏｖａ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ  Ｓｔａｇｅ．Ｎａｔｕｒｅ  １９７１；２３３：４２２−４２４.
Ｏｈ，Ｓ．Ｈ．，Ｋ．Ｍｉｙｏｓｈｉ  Ｈ．Ｆｕｎａｈａｓｈｉ．Ｒａｔ  ｏｏｃｙｔｅｓ  ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄ  ｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｒａｔ  １−ｃｅｌｌ  ｅｍｂｒｙｏ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｈｉｇｈ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｍａｉｎｔａｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ  ｓｔａｇｅ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  １９９８；５９：８８４−８８９．
（実施例１）
本実施例では、マウスのＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を幹細胞として用いてラットの受精卵または胚盤胞との混合実験または注入を行いキメラ動物が生産されることを実証した。
【００７４】
（１）マウスｉＰＳ細胞の調製
本発明者らは、誘導型多能性幹（ｉＰＳ）細胞は３因子（Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４）でＧＦＰトランスジェニックマウスの尻尾より採取した繊維芽細胞を使って生産した。そのプロトコールは以下のとおりである。そのスキームは図１および詳細には図４ａに示した。
【００７５】
ＧＦＰトランスジェニックマウスより尻尾を約１ｃｍ採取し、皮を剥ぎ２〜３片に刻んだ。それをＭＦ−ｓｔａｒｔ  ｍｅｄｉｕｍ（ＴＯＹＯＢＯ，日本）中に置き、５日間培養した。そこで出現してきた繊維芽細胞を新たな培養皿に撒きなおし数継代し、これを尻尾由来繊維芽細胞（ＴＴＦ）とした。
【００７６】
目的遺伝子およびウイルスエンベロープタンパク質を導入し作製したウイルス産生細胞株（２９３ｇｐもしくは２９３ＧＰＧ細胞株）より上清を回収し、遠心濃縮後凍結保存しておいたウイルス液を前日に１×１０５細胞／６ウェルプレートになるよう継代したＴＴＦ細胞の培養液中に加え、これを３因子（初期化因子）の導入とした。
【００７７】
３因子（初期化因子）導入後、翌日ＥＳ培養用の培養液に置換し２５〜３０日間培養した。この際、毎日培養液の置換を行った。
【００７８】
培養後出現してきたｉＰＳ細胞様コロニーをイエローチップ（たとえば、Ｗａｔｓｏｎ
から入手可能）にてピックアップし、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で単一細胞にまでバラバラにし、新たに用意したマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）上に撒いた。
【００７９】
上記方法により樹立されたｉＰＳ細胞株は、以下に示すように、ｉＰＳ細胞としての特徴すなわち未分化性と全能性とを有していることが証明された（図４ｂ−ｆ）。
【００８０】
樹立されたｉＰＳ細胞株２株について、その形態をカメラ付き顕微鏡にて撮影した。ピックアップ後のｉＰＳ細胞を継代後、ディッシュ上でセミコンフルエントになった段階で観察および撮影を行った。その結果、図４ｂに示すように、形態的にＥＳ細胞様の未分化コロニーを形成することがわかった。
【００８１】
また、ｉＰＳ細胞を蛍光顕微鏡下で撮影し、およびアルカリフォスファターゼ染色キット（Ｖｅｃｔｏｒ  社  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＫ−５２００）により染色を施した。明視野像、ＧＦＰ蛍光像をカメラを付属した顕微鏡にて観察・撮影後、培養液を除きリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄したｉＰＳ細胞の培養ディッシュに１０％ホルマリン・９０％メタノールからなる固定液を、添加し、１〜２分固定処理を施した。これを洗浄液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５））で一度洗浄した後、上記キットの染色液を添加し、暗所にて１５分間静置した。その後、再び洗浄液で洗浄後、観察・撮影した。その結果、図４ｃに示すように、本実施例で作製したｉＰＳ細胞は、ＧＦＰマウス由来であるため、ＧＦＰを恒常的に発現し、未分化細胞に特徴的である高いアルカリフォスファターゼ活性を示すことがわかった。
【００８２】
また、ｉＰＳ細胞樹立の際にゲノムＤＮＡ上に挿入された３因子の同定のため、ｉＰＳ細胞よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行った。ゲノムＤＮＡはＤＮＡｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  社）を用い製造業者のプロトコールに従い、１ｘ１０６個の細胞からＤＮＡを抽出した。そのＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用いＰＣＲを行った。
Ｏｃｔ３／４
Ｆｗ（ｍＯｃｔ３／４−Ｓ１１２０）：  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＧＧＡ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＣＣＡ  ＡＧＧ（配列番号１）
Ｒｖ（ｐＭＸ／Ｌ３２０５）：  ＣＣＣ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＴＧＧ  ＡＧＡ  ＣＴＡ  ＡＡＴ  ＡＡＡ（配列番号２）
Ｋｌｆ４
Ｆｗ（Ｋｌｆ４−Ｓ１２３６）：  ＧＣＧ  ＡＡＣ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＡＧＧ  ＣＧＡ  ＧＡＡ  ＡＣＣ（配列番号３）
Ｒｖ（ｐＭＸｓ−ＡＳ３２００）：  ＴＴＡ  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＧＴＧ
ＣＴＧ  ＣＴＧ（配列番号４）
Ｓｏｘ２
Ｆｗ（Ｓｏｘ２−Ｓ７６８）：  ＧＧＴ  ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＣＴＣ  ＣＡＧ（配列番号５）
Ｒｖ（ｐＭＸ−ＡＳ３２００）：  上記と同じ（配列番号４）
ｃ−Ｍｙｃ
ＦＷ（ｃ−Ｍｙｃ−Ｓ１０９３）：  ＣＡＧ  ＡＧＧ  ＡＧＧ  ＡＡＣ  ＧＡＧ  ＣＴＧ
ＡＡＧ  ＣＧＣ（配列番号６）
Ｒｖ（ｐＭＸ−ＡＳ３２００）：  上記と同じ（配列番号４）
その結果、図４ｄに示すように、３因子の挿入が確認された。
【００８３】
また、ＥＳ細胞に特徴的な遺伝子発現パターンおよび導入された遺伝子の発現を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法により確認した。１ｘ１０５個のＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメーターを用いＴｒｉｚｏｌ−ＬＳ  Ｒｅａｇｅｎｅｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に分取し、そこから抽出したｍＲＮＡよりＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍキット（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い付属のプロトコールに従いｃＤＮＡ合成をおこなった。合成されたｃＤＮＡを鋳型としＰＣＲ反応を行った。用いたプライマーはトランスジーンの発現（図中Ｔｇと表記）は上記ｄと同様のプライマー、それ以外の遺伝子発現についてはＴａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ  ＆  Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ
の報告（Ｃｅｌｌ  ２００６  Ａｕｇ  ２５；１２６（４）：６５２−５．）等に基づきプライマーを合成したものを用いた。その結果、図４ｅに示すように、いずれの株もＥＳ細胞とほぼ同様の発現パターンを示し、また導入された遺伝子（Ｔｇ）はｉＰＳ細胞の高い遺伝子サイレンシング活性によりその発現が抑えられていることがわかった。
【００８４】
また、樹立されたｉＰＳ細胞を胚盤胞に注入し、キメラマウスを作製した。ＰＭＳＧおよびｈＣＧホルモンの投与により過排卵誘起処理を施したＢＤＦ１系統のマウス（♀，８週齢）より採取した卵子とＣ５７ＢＬ／６由来の精子を用いインビトロ受精（ＩＶＦ；ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｉｔｏｎ）を行い、受精卵を得た。それを８細胞期／桑実胚まで培養した後、凍結保存し、胚盤胞注入を行う前日に起こした。ｉＰＳ細胞はセミコンフルエントになったものを０．２５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡにより剥がし、注入用にＥＳ細胞培養液に縣濁した。胚盤胞注入は胚盤胞補完での手法同様に顕微鏡下でマイクロマニピュレーターを用いて行い、注入後の培養を経て、ＩＣＲ系統の仮親子宮に子宮移植を施した。解析では、胎生１３日目および出生後１日目に蛍光実体顕微鏡下で観察および撮影した。その結果、図４ｆに示すように、胎児期および新生児期でｉＰＳ細胞由来の細胞（ＧＦＰ陽性）が確認でき、樹立されたｉＰＳ細胞株が高い多分化能を有していることが示唆された。
【００８５】
（２）ｍＥＳ／ｍｉＰＳ細胞の培養
未分化のマウス胚性幹（ｍＥＳ）細胞（ＥＢ３ＤＲ）（ＲＩＫＥＮ  ＣＤＢの丹羽仁史先生より供与）を、ゼラチンコートディッシュにおいて、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ；ニチレイバイオサイエンス製）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％  Ｌ−グルタミン  ペニシリン  ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）および１０００Ｕ／ｍｌの白血病抑制因子（ＬＩＦ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を補充したＧｌａｓｇｏｗ改変イーグル培地（ＧＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で、フィーダー細胞なしで維持した。このＥＢ３ＤＲ細胞は、ＥＢ３  ＥＳ細胞に由来し、そして、ＣＡＧ発現ユニットの制御下でＤｓＲｅｄ−Ｔ４遺伝子を持つ。ＥＢ３  ＥＳ細胞は、Ｅ１４ｔｇ２ａ  ＥＳ細胞（Ｈｏｏｐｅｒ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９８７）に由来する下位系統の細胞であり、Ｏｃｔ−３／４プロモーター制御下で薬剤耐性遺伝子であるブラストサイジンを発現するように構築したＯｃｔ−３／４−ＩＲＥＳ−ＢＳＤ−ｐＡベクターの組み込みを、Ｏｃｔ−３／４対立遺伝子に標的化することによって樹立されたものである（Ｎｉｗａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【００８６】
未分化のマウス人工多能性幹（ｍｉＰＳ）細胞（ＧＴ３．２）を、１５％ノックアウト血清代替添加物（ＫＳＲ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％  Ｌ−グルタミン  ペニシリン  ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）および１０００Ｕ／ｍｌの白血病抑制因子（ＬＩＦ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、マイトマイシン−Ｃ処理したマウス胎児繊維芽細胞（Ｍ
ＥＦ）上に維持した。ＧＴ３．２細胞は、オスのＥＧＦＰトランスジェニックマウス（大阪大学の岡部勝先生より寄与）の尾から採取した繊維芽細胞にＫｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４の３つの初期化因子をレトロウイルスベクターで導入することにより樹立した細胞であり、ＣＡＧ発現ユニットの制御下で改良型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をユビキタスに発現する。
【００８７】
（３）マウス８細胞／桑実胚または胚盤胞の調製
これらの胚の調製は、公表されたプロトコール（Ｎａｇｙ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００３）に従って行った。簡単に述べると、オスＣ５７ＢＬ／６マウスとの交配後２．５日（２．５ｄｐｃ）のメスＢＤＦ１マウスの卵管および子宮から、マウスの８細胞／桑実胚期の胚をＭ２培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中に採卵した。これらの胚をＫＳＯＭ−ＡＡ培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）滴中に移し、そして、胚盤胞期まで２４時間培養した。
【００８８】
（４）ラット８細胞／桑実胚または胚盤胞の調製
オスＷｉｓｔａｒ系統ラットとの交配後３．５日（本明細書において３．５ｄｐｃとも称する）のメスＷｉｓｔａｒ系統ラットの卵管および子宮からラット８細胞／桑実胚期の胚を、そして、交配後４．５日（本明細書において４．５ｄｐｃとも称する）のメスＷｉｓｔａｒ系統ラットの子宮からラット胚盤胞を、それぞれ、Ａ  液（ＨＡＭ  Ｆ−１２  （ＳＩＧＭＡ）  １．２７２ｇ，  ＮａＨＣＯ３  （ＳＩＧＭＡ）（  ０．１９２ｇ）  ＋  Ｂ液（ＲＰＭＩ１６４０  （ＳＩＧＭＡ）  ０．４１６ｇ，  ＮａＨＣＯ３  （ＳＩＧＭＡ）  ０．０５６ｇ）＋  Ｃ液（ＥＡＲＬＥ  （ＳＩＧＭＡ）  ０．３４４ｇ，  ＥＡＧＬＥ  ＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）  ０．０３５２ｇ，  ＮａＨＣＯ３  ０．０６４ｇ）  ＋  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｇ  （ＳＩＧＭＡ）  ０．０１５ｇ，  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  （ＳＩＧＭＡ）  ０．０１０ｇを含むＨＥＲｓ培地中に採卵した。これらの胚を、８０ｍＭ  ＮａＣｌ（和光純薬工業製）および０．１％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ；Ｓｉｇｍａ）を含む改変ラット１細胞胚培養培地（ｍＲ１ＥＣＭ；Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）中に移し、そして、胚盤胞期まで２４時間培養した。
【００８９】
（５）ラット８細胞／桑実胚または胚盤胞期胚へのｍＥＳ／ｍｉＰＳ細胞のインジェクション
ｍＥＳ／ｍｉＰＳ細胞をトリプシン処理し、そして、１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝溶液を加えた培養培地中に懸濁した。８細胞／桑実胚期で、胚をＨＥＰＥＳ緩衝ｍＥＳ／ｍｉＰＳ培養培地を含む微小滴内に移した。ピエゾ駆動のマイクロマニピュレーター（プライムテック製）を用いて、顕微鏡下で注意深く透明帯に穴を開けた後、胚の卵割球または卵黄周囲腔の各々の中心に、１０個のｍＥＳ／ｍｉＰＳ細胞をインジェクションした。インジェクション後、胚を胚盤胞期まで２４時間ｍＲ１ＥＣＭ培地中で培養し、その後、３．５ｄｐｃの偽妊娠交配させた仮親メスＷｉｓｔａｒ系統ラットの子宮に胚移植した。
【００９０】
胚盤胞期で、これらの胚を同じ微小滴内に移し、そして、内部細胞塊（ＩＣＭ）付近の胚盤胞腔内に１０個のｍＥＳ／ｍｉＰＳ細胞をインジェクションした。インジェクション後、胚をｍＲ１ＥＣＭ培地中で１〜２時間培養し、その後、仮親に胚移植した。コントロールとして、ｍＥＳ／ｍｉＰＳ細胞をまた、同じ方法でマウスの胚にインジェクションした。インジェクション後、これらの胚を、胚盤胞期までＫＳＯＭ−ＡＡ培地中で培養し、その後、２．５ｄｐｃの偽妊娠交配させた仮親メスＩＣＲマウスの子宮に胚移植した。移植後の産仔率およびキメラ形成率を表１に示す。
【００９１】
【表１】
2020043864.tif 000002
【００９２】
（６）キメラの解析
キメラの解析は胎児期１５．５〜１６．５日目、新生児期および成体で行った。それぞれの解析時期の割り振りは表１に示す。胎児期の解析では、仮親への移植から１２日目で開腹して胎児を摘出し、蛍光実体顕微鏡下で、ＥＳ細胞であればＤｓＲｅｄ、ｉＰＳ細胞であればＥＧＦＰの蛍光を指標に、キメラの存在とその寄与率を肉眼的に確認した（表１）。新生児期の解析では、妊娠満期である移植後１８日に自然分娩もしくは帝王切開により産仔を得て、それを胎児期同様、肉眼的に蛍光を観察した。
【００９３】
（７）胎児繊維芽細胞のフローサイトメトリーによる解析
胚移植後１１日目または１２日目の仔から、胎児繊維芽細胞を樹立した（図２ａ）。具体的には、胎児を顕微鏡下で解剖し、頭部および臓器を取り出し、そして、２０分間トリプシン処理を行った。トリプシン処理の後、この懸濁物をフィルターに通し、その後、ゼラチンコートディッシュに蒔いた。２４時間インキュベートした後、接着した細胞を回収した。図２ａは、胎児繊維芽細胞を用いたマウス／ラットキメラの解析のうち、ｍＥＳ細胞インジェクションにより作製したＥ１５．５マウス／ラットキメラの仔から樹立した胎児繊維芽細胞を示す。図２ａ上のパネルは明視野の像であり、図２ａ下のパネルは赤色蛍光像である。そして、３％ＦＢＳを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（染色用培地；ＳＭ）中に懸濁し、そして、氷上にて１時間、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を結合させた抗ラットＣＤ５４抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で免疫染色を行った。ＳＭで洗浄した後、蛍光強度を高めるために、細胞懸濁物にＡｌｅｘａ６４７を結合させた抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、氷上にて１時間免疫染色を行った。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含むＳＭ中に懸濁させた後、これらの細胞を、ＥＳ細胞由来のマウス細胞（ＤｓＲｅｄ）およびラット細胞（ｒＣＤ５４＋Ａｌｅｘａ６４７）の分布について、ＭｏＦｌｏ（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）およびＦｌｏｗ−Ｊｏソフトウェアにより解析した。結果を図２ｂに示す。
【００９４】
図２ｂは、胎児繊維芽細胞を用いたマウス／ラットキメラの解析のうち、キメラ胎児繊維芽細胞におけるｒＣＤ５４陽性のラット由来の細胞およびＤｓＲｅｄ陽性のマウス由来の細胞の個別の集団を示す。
【００９５】
（８）マウス／ラットのキメラ臓器および組織の免疫組織化学
マウス／ラットのキメラ新生児からの臓器および組織（腕、心臓、肝臓、膵臓および腎臓）を、４％パラホルムアルデヒドで６時間固定し、そして、パラフィン中に包埋した。包埋した臓器を薄切し、室温にて１時間、抗ＧＦＰ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で免疫染色を行った。ＰＢＳで洗浄した後、これらの切片を、室温にて１時間、Ａｌｅｘａ４８８を結合させた抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で免疫染色を行った。染色
した切片を、ＤＡＰＩを含む封入溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で覆い、蛍光実体顕微鏡下で解析した。この切片をまた、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色して、光学顕微鏡下で解析した。
【００９６】
結果を図３に示す。図３から明らかなように、ラット臓器におけるマウスｉＰＳ細胞の寄与が示される。ａ．ラット胚へのｍｉＰＳインジェクションにより作製した新生児。左のパネルは明視野の像であり、右のパネルは緑色蛍光像である。ｂ．腕（ａ．における四角の枠内）の切片。左側の１枚のパネルはＨＥ染色したものであり、そして、右側の３枚のパネルは、抗ＧＦＰ抗体（緑色）およびＤＡＰＩ（青色；核）で免疫染色したものである。矢印は、血管（左）および骨格筋（右）におけるＧＦＰ陽性細胞を示す。ｃ〜ｆ．キメラの臓器（心臓（ｃ）、肝臓（ｄ）、膵臓（ｅ）および腎臓（ｆ））の像。ｃ〜ｆの各々において、左上のパネルは顕微鏡像であり、右上のパネルはその蛍光像であり、左下のパネルはＨＥ染色した切片であり、そして、右下のパネルは抗ＧＦＰ抗体（緑色）およびＤＡＰＩ（青色；核）で免疫染色した切片である。
【００９７】
以上の結果から、以下のことが言える。すなわち、マウスのｉＰＳ細胞がラットの全身に寄与し、体形成を担っていることが示唆される。
【００９８】
（実施例２）
マウスーラットキメラ動物の成立を実証するため、マウスｉＰＳ細胞をラット胚に注入する方法と、ラットｉＰＳ細胞をマウス胚に注入する方法の双方を実施した。
【００９９】
（１）キメラ形成能を持ったラットｉＰＳ細胞の樹立
ｉＰＳ細胞樹立のためのソースとして  Ｗｉｓｔａｒラット胎児（雄）から繊維芽細胞を樹立した。ｉＰＳ細胞の誘導にはマウスｉＰＳ細胞の樹立時に用いたレトロウイルスではなく、テトラサイクリン依存的に３因子の発現を誘導できるシステムを組み込んだレンチウイルスベクターを用いた（図５ａ）。本ベクターではユビキチン−Ｃ（ＵｂＣ）プロモーター下でｒｔＴＡとＥＧＦＰがＩＲＥＳ配列を介して共に発現する。よって誘導時にレンチウイルスの感染が認められた細胞は恒常的にＥＧＦＰ蛍光を示すため、樹立したｉＰＳ細胞自体の標識も同時に行うことが可能となる。このレンチウイルスを介して３因子を導入しラットｉＰＳ細胞を誘導した。導入後しばらくは繊維芽細胞の増殖に必要な血清を含む培地で培養後、途中から阻害剤を含むラットＥＳ細胞用の培地に切り替え培養を継続したところ、ラットのｉＰＳ細胞様コロニーが得られた。ピックアップ後の継代培養においても自発的に分化することなく維持でき、ｉＰＳ細胞株として株化することに成功した。ここでできた細胞株のひとつをラットｉＰＳ細胞（ｒＷＥｉ３．３−ｉＰＳ細胞）とした（図５ｂ）。
【０１００】
なお、ｉＰＳ細胞の培養の条件は、以下の通りである。マウスｉＰＳ細胞の未分化維持にはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ）に１５％  ノックアウト血清リプレースメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸、１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％  Ｌ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン、１０００Ｕ／ｍｌ  マウス  ＬＩＦを加えた培地を用い、マイトマイシン−Ｃ処理を施したマウス胎児繊維芽細胞上に播種した。
【０１０１】
ラットｉＰＳ細胞の未分化維持には  Ｎ２Ｂ２７培地（Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）に１μＭ  ＭＥＫ阻害剤ＰＤ０３２５９０１（Ａｘｏｎ，  Ｇｒｏｅｎｉｎｇｅｎ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）、３μＭ  ＧＳＫ３阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１（Ａｘｏｎ）、ＦＧＦ受容体阻害剤ＳＵ５４０２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）  と１０００Ｕ／ｍｌ  ラットＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を加えた培地を用い
、マイトマイシン−Ｃ処理を施したマウス胎児繊維芽細胞上に播種した。
【０１０２】
いずれのｉＰＳ細胞の培養も、５％  ＣＯ２存在下、３７℃で行った。
【０１０３】
（２）マウス−ラット異種間キメラの胎児期における解析
異種間キメラ作製のため、マウスｉＰＳ細胞をラット胚盤胞に、もしくは逆にラットｉＰＳ細胞をマウス胚盤胞に注入した。マウスｉＰＳ細胞としては、実施例１で樹立したＥＧＦＰ−Ｔｇマウス由来のｍＧＴ３．２−ｉＰＳ細胞を用いた。胚培養および胚操作は、以下の通りである。マウス交配後の胚の採取および培養、マイクロインジェクション等は既報のプロトコールに従って行った （Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。簡単に
述べると、まずマウスの８細胞期／桑実胚期の胚は交配後２．５日後の卵管および子宮から、Ｍ２培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に回収した。回収した胚は、アミノ酸を含むＫＳＯＭ培地（ＫＳＯＭ−ＡＡ培地：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、８細胞期／桑実胚期の胚への注入に用いる場合は注入操作に用いるまでの１〜２時間、胚盤胞への注入に用いる場合は一晩、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。
【０１０４】
ラットの８細胞期／桑実胚期の胚は交配後３．５日後の卵管および子宮から、胚盤胞は交配後４．５日後の子宮からそれぞれＨＥＲ培地（Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７１）に回収した。回収した胚は、ｍＲ１ＥＣＭ培地（Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）に移し、胚への注入に用いる場合は注入操作に用いるまでの１〜２時間、５％  ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。
【０１０５】
マイクロマニピュレーションのため、ｉＰＳ細胞は、０．２５％  トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）処理によりディッシュより剥がし、それぞれの培地に懸濁した。ピエゾマイクロマニピュレーター（Ｐｒｉｍｅｔｅｃｈ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を用いて、顕微鏡下で胚の透明帯および栄養外胚葉に穴を開け、約１０個のｉＰＳ細胞を８細胞期／桑実胚期の胚の囲卵腔内、もしくは胚盤胞の内部細胞塊近傍に注入した。注入後、８細胞期／桑実胚期の胚は胚盤胞期まで一晩、胚盤胞は、１〜２時間、それぞれの培地で培養後、胚移植を行った。ラット胚盤胞は偽妊娠ラット子宮へ、マウス胚盤胞は偽妊娠マウス子宮へそれぞれ移植した。移植のレシピエントにはマウスの胚を用いた場合は精管結紮雄マウスとの交配後、２．５日目のＩＣＲ系統の雌マウス、ラットの胚を用いた場合は精管結紮ラットとの交配後、３．５日目のＷｉｓｔａｒ系統の雌ラットを用いた。解析時期は、妊娠満期に達するまでの期間がラットの方が２日間遅いため、ほぼ同じステージの胎児を解析できるように両者の間を２日分ずらし、ラットをホスト胚とした場合は胎生１５日目、マウスをホスト胚にした場合は胎生１３日目とした。解析の結果、マウスｉＰＳ細胞を注入したラット胎児、またその逆においてもＥＧＦＰの蛍光が認められた（図６ａ）。得られた胎児から繊維芽細胞を樹立し、フローサイトメーターを用いて解析したところ、両キメラともに、ＥＧＦＰ陽性のピークが確認でき、ｉＰＳ細胞の寄与によるキメラの成立を支持する結果となった（図６ｂ）。
【０１０６】
また、同胎児より肝臓を摘出しマウスおよびラットそれぞれに特異的なＣＤ４５抗体（ＡＰＣ  標識抗−マウスＣＤ４５抗体とＰＥ標識抗−ラットＣＤ４５抗体）で血球系を特異的に染色しフローサイトメーターで解析した。その結果、胎児肝臓中にマウスＣＤ４５陽性細胞およびラットＣＤ４５陽性細胞それぞれの単独分画が存在していた（図７ａ）。
【０１０７】
さらに、マウスおよびラットそれぞれのＣＤ４５陽性細胞を分取し、遺伝的に両者の由来を確認するためゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを試みた。異種間の遺伝子型の判定には、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて抽出した  ＤＮＡを用い、ＰＣＲ反応には、以下のプライマーセットを用いた。
マウスおよびラットＯｃｔ３／４
Ｆｗ  ：  ５’−  ＣＡＧＴＴＴＧＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡ−３’（配列番号：１０）                                                        
Ｒｖ  ：  ５’−  ＡＧＧＧＴＣＴＣＣＧＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴ−３’ （配列番号：１
１）
由来の判定には、両者のゲノムＤＮＡにおけるＯｃｔ３／４遺伝子座の第２  エクソンと第４エクソン間にあるイントロン鎖長の差異に着目した。この部分の鎖長はラットの方が約１００塩基ほど長くなっており、エクソンに存在する共通配列を元に設計したプライマーでＰＣＲ反応を行うことで、両者の由来を判定できる  （図７ｂ）。ＰＣＲ反応の結果、マウスＣＤ４５陽性細胞のゲノムＤＮＡはマウスＯｃｔ３／４遺伝子座の鎖長を、ラットＣＤ４５陽性細胞ではラットＯｃｔ３／４遺伝子座の鎖長を示した（図７ｃ）。よって表面抗原を用いた解析結果、あるいは遺伝的な解析結果においても、キメラ胎児肝臓中には両者の細胞が混在していることが分かった。以上のことから、マウス−ラット間における異種間キメラの成立が証明された。
【０１０８】
（３）マウス−ラット異種間キメラにおける新生児および成体までの発育
次に我々はマウス−ラット間の異種間キメラが妊娠満期、あるいは産後成体まで発育可能かを確認した。方法は前項で用いたマウスｍＧＴ３．２−ｉＰＳ細胞をラット胚盤胞へ、ラットｒＷＥｉ３．３−ｉＰＳ細胞をマウス胚盤胞へそれぞれ注入し、子宮内に移植後、妊娠満期に自然分娩もしくは帝王切開により産仔を摘出した。その結果、新生児において蛍光顕微鏡下で観察したところ、両産仔ともにモザイク状のＥＧＦＰ蛍光を示した（図８ａ、８ｂ）。また産後それらを成体まで発育させ毛色によりキメラ形成を判定した。マウスｉＰＳ細胞は黒毛のＣ５７ＢＬ／６系統を背景にもつＥＧＦＰ−Ｔｇマウス由来であるため、白毛のＷｉｓｔａｒラット胚由来と区別がつき、また逆にラットｉＰＳ細胞は白毛のＷｉｓｔａｒ由来であるため、黒毛のＣ５７ＢＬ／６×ＢＤＦ１のＦ１胚由来と区別ができる。その結果、成体においても異種間キメラ形成が確認できた（図８ｃ、８ｄ）。
【０１０９】
以上より、異種間キメラは妊娠満期まで発生が進み、産後も正常に発育することがわかった。（図８ｅ）。
【０１１０】
また、異種間キメラにおけるキメリズムの判定を行った。方法は、生体における溶血後の末梢血を、ＡＰＣ  標識  抗−マウス  ＣＤ４５  抗体、  ＰＥ  標識  抗−ラット  ＣＤ４５  抗体、ＰＥ  標識  抗−Ｇｒ−１  抗体、ＰＥ  標識  抗−Ｍａｃ−１  抗体（ラット  ＩｇＧ  ：  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＥ−Ｃｙ７  標識  抗−Ｂ２２０  抗体  （ラット  ＩｇＧ  ：  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＡＰＣ  標識  抗−ＣＤ４  抗体、ＡＰＣ−Ｃｙ７  標識  抗−ＣＤ８  抗体で染色し、Ｍｏ−ｆｌｏとＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、分取及び解析を行った。
【０１１１】
（４）異種間キメラの各組織における細胞の由来
キメラ個体内において異種のｉＰＳ細胞由来の細胞がどの程度寄与しているか、蛍光実体顕微鏡下で新生児個体を解析した。マウスｉＰＳ細胞をラット胚盤胞に注入して得られた異種間キメラ個体においてはほぼ全ての臓器でＥＧＦＰ陽性のマウスｉＰＳ細胞由来の細胞が観察された（図９ａ）。代表的な臓器について（心臓、肝臓、膵臓、腎臓）組織切片を作製し、抗ＥＧＦＰ抗体を用いてマウスｉＰＳ細胞由来の細胞の局在を確認したところ、全ての組織にモザイク状のＥＧＦＰ蛍光が見られ、キメラになっていることが分かった（図９ｂ）。また、ラットｉＰＳ細胞をマウス胚盤胞に注入して得られた異種間キメラ個体においても同様の結果が得られた（図９ｃ及び図９ｄ）。このことから両者のｉＰＳ細胞は異種の環境下においても全身のほぼ全ての組織・臓器に分化可能であることが示唆される。
【０１１２】
以上より、ｉＰＳ細胞を用いることで異種間キメラを作製することは可能であり、注入されたｉＰＳ細胞は異種の環境においても正常に胚発生を経て全身の機能的な細胞に分化できることが示された。
【０１１３】
（実施例３）
近年の報告（例えば、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４，  １６−１９，  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １８，  ２００８＝Ｒａｔ  ｉＰＳ  Ｃｅｌｌ  １３５，１２８７−１２９８，  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２６，  ２００８＝Ｒａｔ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  １３５，  １２９９−１３１０，  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２６，  ２００８＝ＲａｔＥＳなど）におけるラットの  ＥＳ  細胞、ｉＰＳ細胞樹立による臓器欠損を目的としたノックアウトラット作製に関する技術に基づき、これらのノックアウトラットホストに用いる。
【０１１４】
そして、実施例１に準じてこのホストにマウスの幹細胞を注入することにより、キメラ動物を作製する。そして、ノックアウトした臓器について、異種臓器が再生されることを確認することができる。
【０１１５】
（実施例４）
また、他方、実施例３とは逆にラットの幹細胞株を既存の臓器欠損マウスに注入し同様の成果を得ることもできる。実験としては、実施例１に準じてキメラを作製し、そして、ノックアウトした臓器について、異種臓器が再生されることを確認することができる。
【０１１６】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明は、動物工学分野、家畜の改良等において有用な動物種の創出を非常に容易にする基本技術を提供する。本発明はまた、個人の特性に応じて皮膚などの体細胞から、「自分自身の臓器」を再生する技術にも応用できる技術を提供する。
【配列表フリーテキスト】
【０１１８】
配列番号１：Ｏｃｔ３／４用フォワードプライマー、Ｆｗ（ｍＯｃｔ３／４−Ｓ１１２０）：  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＧＧＡ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＣＣＡ  ＡＧＧ
配列番号２：Ｏｃｔ３／４用リバースプライマー、Ｒｖ（ｐＭＸ／Ｌ３２０５）：  ＣＣＣ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＴＧＧ  ＡＧＡ  ＣＴＡ  ＡＡＴ  ＡＡＡ
配列番号３：Ｋｌｆ４用フォワードプライマー、Ｆｗ（Ｋｌｆ４−Ｓ１２３６）：  ＧＣＧ  ＡＡＣ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＡＧＧ  ＣＧＡ  ＧＡＡ  ＡＣＣ
配列番号４：Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ用リバースプライマー、Ｒｖ（ｐＭＸｓ−ＡＳ３２００）：  ＴＴＡ  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ配列番号５：Ｓｏｘ２用フォワードプライマー、Ｆｗ（Ｓｏｘ２−Ｓ７６８）：  ＧＧＴ
ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＣＴＣ  ＣＡＧ
配列番号６：ｃ−Ｍｙｃ用フォワードプライマー、ＦＷ（ｃ−Ｍｙｃ−Ｓ１０９３）：  ＣＡＧ  ＡＧＧ  ＡＧＧ  ＡＡＣ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＣＧＣ
配列番号７  注入された胚由来の細胞同定用のフォワード（Ｆｗ）プライマー：ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＡＡＣ
配列番号８  注入された胚由来の細胞同定用のリバース１（Ｒｖ１）プライマー：ＴＴＣ
ＡＡＣ  ＡＴＣ  ＡＣＴ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＴＣＣ
配列番号９  注入された胚由来の細胞同定用のリバース（Ｒｖ２）プライマー：ＴＧＴ  
ＧＡＧ  ＣＧＡ  ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＡＣＣ
配列番号１０  注入された胚由来の細胞同定用のＯｃｔ３／４用フォワード（Ｆｗ）プライマー：ＣＡＧ  ＴＴＴ  ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＡ
配列番号１１  注入された胚由来の細胞同定用のＯｃｔ３／４用リバースプライマー：ＡＧＧ  ＧＴＣ  ＴＣＣ  ＧＡＴ  ＴＴＧ  ＣＡＴ  ＡＴ
【図１】
2020043864.tif 000003
【図２ａ】
2020043864.tif 000004
【図２ｂ】
2020043864.tif 000005
【図３】
2020043864.tif 000006
【図４】
2020043864.tif 000007
【図５】
2020043864.tif 000008
【図６】
2020043864.tif 000009
【図７】
2020043864.tif 000010
【図８】
2020043864.tif 000011
【図９】
2020043864.tif 000012
【配列表】
2020043864000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月25日(2019.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を包含する、キメラ動物の作製方法：
（Ａ）幹細胞を、該幹細胞に対して異種の動物の胚盤胞期の胚盤胞腔内に注入するか、または該幹細胞に対して異種の動物の分裂受精卵と混合する工程；および
（Ｂ）（Ａ）工程で作製した該幹細胞を含む細胞塊を、該幹細胞の生物種と該異種の動物の生物種とのキメラ動物へと成長させる工程
を包含する、方法。