(57)【要約】      （修正有）【課題】例えば炎症性腸疾患、そして特にクローン病、自己免疫性疾患、アレルギーの治療のための方法、及び治療的ワクチン接種、並びに診断における使用のための組成物を提供する。【解決手段】胃腸管に生物学的に活性なカーゴ物質を供給することによってクローン病を治療又は予防するために使用するための組成物であって、ここにおいて、前記組成物は、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）含んでなり、これは、ＰＤ−Ｌ１発現を促進することができる、生物学的に活性なカーゴ物質を捕捉し、これによって、カーゴ物質が胃腸管内の興味ある部位に供給されることを可能にする、ここにおいて、前記カーゴ物質は、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）である、前記組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃腸管に生物学的に活性なカーゴ物質を供給する方法において使用するための組成物であって、ここにおいて、前記組成物は、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）含んでなり、これは、生物学的に活性なカーゴ物質を捕捉し、これによって、カーゴ物質が胃腸管内の興味ある部位に供給されることを可能にする、前記組成物。
【請求項２】
胃腸管に生物学的に活性なカーゴ物質を供給することによって症状を治療又は予防する方法において使用するための組成物であって、ここにおいて、前記組成物は、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）含んでなり、これは、生物学的に活性なカーゴ物質を捕捉し、これによって、カーゴ物質が胃腸管内の興味ある部位に供給されることを可能にする、前記組成物。
【請求項３】
胃腸管に生物学的に活性なカーゴ物質を供給する方法であって、前記方法は、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）を含んでなる組成物を患者に投与することを含んでなり、これは、生物学的に活性なカーゴ物質を捕捉し、これによって、カーゴ物質が胃腸管内の興味ある部位に供給されることを可能にする、前記方法。
【請求項４】
胃腸管に生物学的に活性なカーゴ物質を供給することによって症状を治療又は予防する方法であって、前記方法は、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）を含んでなる組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含んでなり、これは、生物学的に活性なカーゴ物質を捕捉し、これによって、カーゴ物質が胃腸管内の興味ある部位に供給されることを可能にする、前記方法。
【請求項５】
治療の方法、あるいは、先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記マグネシウム置換リン酸カルシウムが、Ｘ線回折によって決定されるように非晶質である、前記組成物。
【請求項６】
治療の方法、あるいは、先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムＸ線回折パターンが、２５度の２シータにおける最大を持ち、広域で、そして拡散している、前記組成物。
【請求項７】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムＸ線回折パターンが、結晶質ヒドロキシアパタイトのＸ線回折パターンに伴う一つ又はそれより多いピークを欠く、前記組成物。
【請求項８】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、胃腸管内の細胞による取込みが可能であるナノ粒子を形成するために分散することが可能である、前記組成物。
【請求項９】
治療の方法、あるいは請求項８に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記ナノ粒子が、腸の粘膜の免疫細胞による取込みが可能である、前記組成物。
【請求項１０】
治療の方法、あるいは請求項８及び９のいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記胃腸管内の細胞が、腸内に存在する抗原提示免疫細胞である、前記組成物。
【請求項１１】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するため
の組成物であって、生物学的に活性なカーゴ物質を、パイエル板又は腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）に供給する、前記組成物。
【請求項１２】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、経口投与、鼻腔胃投与又は直腸投与のためである、前記組成物。
【請求項１３】
治療の方法、あるいは請求項１２に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、経口投与のためにカプセル化されている、前記組成物。
【請求項１４】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、ＣＤ１１ｂ陽性細胞及び／又はＣＤ１１ｃ陽性細胞による取込みが可能であるナノ粒子を形成するために分散することが可能である、前記組成物。
【請求項１５】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、樹状細胞及び／又はマクロファージによる取込みが可能であるナノ粒子を形成するために分散することが可能である、前記組成物。
【請求項１６】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、自己免疫性疾患、癌、食物アレルギー及び／又は不耐性を治療する方法において使用するための、前記組成物。
【請求項１７】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、炎症性腸疾患の治療又は予防の方法において使用するための、前記組成物。
【請求項１８】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、クローン病又はセリアック病の治療或いは予防の方法において使用するための、前記組成物。
【請求項１９】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、患者のワクチン接種の方法において使用するためのものであり、そして前記生物学的に活性なカーゴ分子が治療的ワクチン組成物である、前記組成物。
【請求項２０】
治療の方法、あるいは請求項１９に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記治療的ワクチン組成物が、癌の治療又は予防のためのものである、前記組成物。
【請求項２１】
治療の方法、あるいは請求項２０に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記癌が、骨髄性白血病である、前記組成物。
【請求項２２】
治療の方法、あるいは請求項１９に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記治療的ワクチン組成物が、自己免疫性疾患の治療又は予防のためのものであり、ここにおいて、前記ワクチン組成物が、自己免疫Ｔ細胞及び自己抗体反応に対する耐性を誘発することが可能である、前記組成物。
【請求項２３】
治療の方法、あるいは請求項２２に記載の、治療の方法において使用するための組成物で
あって、前記自己免疫性症状が、多発性硬化症である、前記組成物。
【請求項２４】
治療の方法、あるいは請求項１９に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記治療的ワクチン組成物が、炎症性腸疾患の治療又は予防のためのものである、前記組成物。
【請求項２５】
治療の方法、あるいは請求項２４に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記炎症性腸疾患が、クローン病又はセリアック病である、前記組成物。
【請求項２６】
治療の方法、あるいは請求項１９に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記治療的ワクチン組成物が、Ｉ型糖尿病の治療又は予防のためのものである、前記組成物。
【請求項２７】
治療の方法、あるいは請求項１９に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記治療的ワクチン組成物が、全身性エリテマトーシス（ＳＬＥ）の治療又は予防のためのものである、前記組成物。
【請求項２８】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記カーゴ物質が、カーゴ分子又はカーゴナノ粒子である、前記組成物。
【請求項２９】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、興味ある部位に生物学的に活性なカーゴ分子を供給するために分散されることが可能な凝集したナノ粒子を含んでなる、前記組成物。
【請求項３０】
治療の方法、あるいは請求項２９に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記ナノ粒子が、金属基剤ナノ粒子又は金属オキソ−水酸化物基剤ナノ粒子である、前記組成物。
【請求項３１】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、興味ある部位において非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムに対して、単独の生物学的に活性なカーゴ物質に対する反応と実質的に異なる補助的反応を起こさないサイレントな供給プラットフォームである、前記組成物。
【請求項３２】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、興味ある部位において非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムに対して、直接的な転写反応を起こさないサイレントな供給プラットフォームである、前記組成物。
【請求項３３】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、マグネシウムイオン及び／又は生物学的に活性なカーゴ分子によって安定化される、前記組成物。
【請求項３４】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム中のＭｇ：Ｃａの比が、少なくとも１：２５、更に好ましくは少なくとも１：２０、更に好ましくは少なくとも１：１０、更に好ましくは少なくとも１：５、更に好ましくは少なくとも１：４、そして最も好ましくは１：３である、前記組成物。
【請求項３５】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が、複数のカーゴ分子を含んでなる、前記組成物。
【請求項３６】
治療の方法、あるいは請求項３５に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が、二つ又はそれより多い異なったカーゴ分子を含んでなる、前記組成物。
【請求項３７】
治療の方法、あるいは請求項１５又は請求項３６に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が、三つ又はそれより多いカーゴ分子を含んでなる、前記組成物。
【請求項３８】
治療の方法、あるいは請求項３５−３７のいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が、治療的ワクチン成分及び免疫賦活剤又は耐性誘導剤を含んでなる、前記組成物。
【請求項３９】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記生物学的に活性なカーゴ物質が、治療的カーゴ分子である、前記組成物。
【請求項４０】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記生物学的に活性なカーゴ物質が、栄養補助食品カーゴ分子である、前記組成物。
【請求項４１】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記カーゴ物質が、タンパク質抗原、生理活性なサイトカイン、ペプチドグリカン、低分子量有機分子及びナノ粒子からなる群から選択される、前記組成物。
【請求項４２】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記カーゴ物質が、ペプチドグリカン、ムラミルジペプチドを含むペプチドグリカンサブユニット、自己抗原、ワクチン組成物、核酸配列、標的細胞に対するＰＤ−Ｌ１発現を修復する分子、組織又は細胞ホモジネート／懸濁液／上清、栄養素、栄養補助食品、タンパク質、ペプチド配列を含むタンパク質抗原及びアレルゲンからなる群から選択される、前記組成物。
【請求項４３】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記カーゴ物質が、栄養素、ナノ粒子、治療的分子、ワクチン、核酸分子、例えばＤＮＡ又はＲＮＡである、前記組成物。
【請求項４４】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記組成物が、ｅｘ  ｖｉｖｏで細胞にカーゴ分子を供給するために使用され、ここにおいて、供給されたカーゴ分子を含んでなる前記ｅｘ  ｖｉｖｏの細胞が、受容者への再導入のためのものであるか、及び／又はここにおいて、カーゴにより形質移入されたｅｘ  ｖｉｖｏの細胞に影響された細胞が、受容者への再導入のためのものである、前記組成物。
【請求項４５】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が、カーゴ分子を捕捉するために多孔質である、前記組成物。
【請求項４６】
治療の方法、あるいは先行するいずれか１項に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムのナノ粒子が、２０ｎｍ及び３５０ｎｍ間の範囲の平均直径を有する、前記組成物。
【請求項４７】
治療の方法、あるいは請求項４６に記載の、治療の方法において使用するための組成物であって、少なくとも７５％の前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムのナノ粒子が、前記範囲の平均直径を有する、前記組成物。
【請求項４７】
クローン病を治療する方法において使用するための腸内リンパ濾胞の抗原提示免疫細胞内のＰＤ−Ｌ１発現を促進することが可能な薬剤。
【請求項４８】
診断又は画像化の方法において使用するための組成物であって、ここにおいて、前記組成物は、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）を含んでなり、ここにおいて、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムは、検出可能な分子を捕捉する、前記組成物。
【請求項４９】
請求項４８に記載の、診断又は画像化の方法において使用するための組成物であって、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が、胃腸管内の興味ある部分にカーゴ物質を供給することが可能である、前記組成物。
【請求項４９】
請求項４８に記載の、診断の方法において使用するための組成物であって、前記検出可能な分子が、ナノ粒子、例えば金属基剤ナノ粒子又は金属オキソ−水酸化物ナノ粒子を含んでなる、前記組成物。
【請求項５０】
捕捉した生物学的に活性なカーゴ物質を含有する非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物を製造するための方法であって：
（ａ）カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を含んでなる溶液及びリン酸イオン（ＰＯ４２−）を含んでなる溶液を用意し、ここにおいて、溶液の一つ又は両方は、一つ又はそれより多い生物学的に活性なカーゴ物質を含んでなり；
（ｂ）カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を含んでなる溶液を、リン酸イオン（ＰＯ４２−）を含んでなる溶液と混合して、その中に生物学的に活性なカーゴ物質が捕捉された非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムを沈殿させ；
（ｃ）非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムを回収し；そして
（ｄ）所望により前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムを洗浄及び乾燥すること；
を含んでなる、前記方法。
【請求項５１】
カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）及び生物学的に活性なカーゴ分子を含んでなる溶液が、少なくとも８．０のｐＨに緩衝される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記生物学的に活性なカーゴ分子が、リン酸カルシウムの結晶質相への転換に対する非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムの安定性を、捕捉されたカーゴ物質含まない対応する組成物と比較して増加する、請求項５０又は５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記洗浄及び乾燥工程が、前記組成物をアセトン中に再スラリー化し、そして前記洗浄された組成物を遠心を使用して乾燥する、ことを含んでなる、請求項５０−５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記洗浄及び乾燥工程が、２回繰り返される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記工程（ａ）及び／又は（ｂ）中のｐＨが、８．０より大きい、請求項５０−５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
記緩衝液が、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ、ＴＲＩＣＩＮＥ又はクエン酸緩衝液、或いはアミノ酸、例えばリシン又はグリシンである、請求項５０−５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
更に非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムを、医薬組成物として処方することを含んでなる、請求項５０−５６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物及びその医学的使用に、そして更に特にカーゴ物質、例えば非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムの細孔中に含有されたカーゴ分子又はカーゴナノ粒子の、免疫系の細胞への供給において使用するための非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物に関する。更なる側面において、本発明は、炎症性腸疾患、そして特にクローン病、自己免疫性疾患、アレルギーの治療のための新規な治療法、及び治療的ワクチン接種、並びに診断における使用のための非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン酸カルシウムは、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）を、オルトリン酸（ＰＯ４３−）、メタリン酸又はピロリン酸（Ｐ２Ｏ７４−）及び水素又は水酸イオンと一緒に含有するミネラルのファミリーに与えられた名称である。骨及び歯のエナメル質中に存在するリン酸カルシウムの天然に存在する形態の一つは、生物学的なヒドロキシアパタイト（ＨＡ）であり、これは、通常Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２と書かれる近似式Ｃａ５（ＰＯ４）３（ＯＨ）を有する。生物学的分野において、合成結晶質ヒドロキシアパタイトは、生体組織工学において、主として骨及び歯の修復のための充填物質として使用される。ヒドロキシアパタイトのナノ粒子は、更に薬物の担体として提案され、そして画像処理技術において使用されている。
【０００３】
ヒドロキシアパタイトは、中性又は塩基性溶液中のカルシウム及び二塩基性リン酸塩の沈殿反応中で調製することができ、そしてその最終産物として結晶質ヒドロキシアパタイトを有する。然しながら、沈殿中に、構造的及び化学的に別個な前駆体相が形成され、これは、Ｘ線回折に対して非晶質であり、非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）として知られている。
【０００４】
前駆体相の化学分析は、この非結晶質相が、水和されたリン酸カルシウムであることを示す。他の非晶質物質のように、ＡＣＰに対する幾つかの式、例えばＣａ９（ＰＯ４）６が提案されている。
【０００５】
ヒドロキシアパタイトは、生体分子のための担体として、特にＤＮＡトランスフェクション、薬物供給、並びに整形外科及び歯科において使用されている。例として、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ等は、結晶質のヒドロキシアパタイトの形態のリン酸カルシウムと共にＤＮＡを沈殿させることによる、培養物中の哺乳動物細胞へのＤＮＡの供給を調査している（Ｇｅｎｅ，３４１：７７−８２，２００４；Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１１６（２）：ｅ６８−ｅ６９，２００６；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２８：９６−９７，２００４；ＵＳ２００７／００７７３０６を参照されたい）。これらの実験は、粒子サイズの増加に伴うトランスフェクション効率の損失を回避するために、沈殿したヒドロキシアパタイト及びＤＮＡの粒子の成長を阻害するための薬剤としてＭｇ２＋を使用することを含んでいた。然しながら、Ｍｇ２＋は、ＤＮＡと共に沈殿したアパタイト粒子に組込まれるが、粒子は、結晶質のままであった。Ｄａｓｇｕｐｔａ等は、ウシ血清アルブミンのための制御放出担体としてのＺｎ−及びＭｇ−でドープされたヒドロキシアパタイトナノ粒子の使用を報告した（Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２６（７）：４９５８−４９６４，２０１０）。然しながら、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ等によって報告された研究と同様に、製造されたドープされたヒドロキシアパタイト物質は、改変されていないヒドロキシアパタイトと共通の明確な程度の結晶性を保持していた。
【０００６】
合成中に、ＡＣＰは、微結晶ヒドロキシアパタイトに急速に転換し（水の存在中で）、そして水溶液中の準安定なＡＣＰの寿命は、ある種の巨大分子の存在並びに妨害イオン、ｐＨ、粘度、イオン強度及び温度の関数であることが報告されている。Ｂｏｓｋｅｙ及びＰｏｓｎｅｒ（１９７３，１９７４）は、転換の動力学を研究し、そしてＡＣＰ中のＣａイオンのＭｇイオンによる置換が、非晶質状態のより大きい安定性に導き、更に結晶質な相、例えばヒドロキシアパタイトに転換するその傾向を減少するを見出した。彼らは、少なくとも１：２５（Ｍｇ：Ｃａ）の比において、非晶質リン酸マグネシウムカルシウム相が産生され、乾燥粉末としてのこれは、長時間安定なままであることを示した。
【０００７】
ＡＣＰの合成が報告されてきたが、歯科及び生体組織工学の分野における骨及び歯の修復において使用するための構造物質として、そして生体組織工学のための骨格として非常に限られたこの物質の適用のみが報告されている。例として、Ｚｈａｏ等（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，５：４０−４７，２０１１）は、歯の再石灰化及び補修のための複合体としての歯科における非晶質リン酸カルシウムの使用を記載している。彼らは、他のイオンの存在中、及びｉｎ  ｖｉｖｏの条件下で、ＡＣＰは、合成ＡＣＰのヒドロキシアパタイトへの転換を防止するＭｇ２＋、Ｆ−、炭酸、ピロリン酸、ジホスホン酸、或いはポリリン酸化代謝産物又はヌクレオチドの存在中の動力学的安定化のために、相当期間存続することができることを報告している。Ｌｉ及びＷｅｎｇ（Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．：Ｍａｔｅｒ．Ｍｅｄ．，１８：２３０３−２３０８，２００７）は、非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）の合成を報告し、そして低温における安定化添加剤としてポリ（エチレングリコール）を使用していた。彼らは、ＡＣＰを、母液中のポリ（エチレングリコール）によって、１８時間より多い時間５℃で、ＡＣＰ粉末中の４重量％のポリ（エチレングリコール）により安定化することができることを見出し、そしてＡＣＰを生体組織工学のための生分解性骨格として使用することができることを示唆した。
【０００８】
パイエル板（Ｐｅｙｅｒ’ｓ  Ｐａｔｃｈｅｓ）は、胃腸管内で重要な免疫感知及び監視機能を行うリンパ濾胞である。パイエル板上皮の下の領域は、上皮下ドーム（ＳＥＤ）と呼ばれ、そして抗原提示細胞に富んでいる。全体の細菌及び類似のサイズの腸管腔のマイクロ粒子は、上方に遊走し、そして濾胞関連上皮を通して樹状突起を伸長する特殊化ＳＥＤ樹状細胞によって、直接貪食されることができる。可溶性分子及び小さい粒子の調査のために、上皮は、特有の小襞（Ｍ）細胞を含有し、これは、管腔を直接試料採取し、そして試料採取した物質を下層の免疫細胞に運搬するように見受けられる。正確には、これがどのように起こり、そして例えば、抗原がこの過程でなぜ分解されないかは、理解されていない。
【０００９】
なぜパイエル板のＭ細胞が、腸管腔からの直径約２０−２５０ｎｍの非生物学的ナノ粒子を貪欲に試料採取するかということも更に不明である。然しながら、これが起こることは、細胞及び動物モデルにおいて、そして更に、加工された食品、医薬及び歯磨きからのナノ粒子に、通常毎日曝露されているヒトに対して十分示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＵＳ２００７／００７７３０６。
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｇｅｎｅ，３４１：７７−８２，２００４；
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１１６（２）：ｅ６８−ｅ６９，２００６；
【非特許文献３】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２８：９６−９７，２００４；
【非特許文献４】Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２６（７）：４９５８−４９６４，２０１０；
【非特許文献５】Ｂｏｓｋｅｙ  ａｎｄ  Ｐｏｓｎｅｒ（１９７３，１９７４）；
【非特許文献６】Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，５：４０−４７，２０１１；
【非特許文献７】Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．：Ｍａｔｅｒ．Ｍｅｄ．，１８：２３０３−２３０８，２００７。
【発明の概要】
【００１２】
概して、本発明は、哺乳動物の胃腸管管腔の最も豊富な非生物学的粒子は、非晶質リン酸カルシウムナノ粒子の形態のリン酸カルシウムであるという、本明細書中に開示される実験からの本発明人等の洞察に基づく。Ｃａ２＋及びＰＯ４３−イオンの両方は、遠位の腸管腔に活発に分泌され、ここでリン酸カルシウムは過飽和となり、そして従って沈殿する。腸によるカルシウムの分泌は、しばしば内因性損失と呼ばれるが、しかしこれがカルシウムの恒常性に僅かしか寄与しないため、なぜこれが起こるか知られていなく、その排出は尿により仲介される。本発明は、更に、胃腸管において、カルシウムイオン及びリン酸イオンは沈殿し、そしてナノ粒子及び小さいマイクロ粒子を形成し、これが、パイエル板中の腸粘膜免疫細胞及び腸間膜リンパ節に供給するために、管腔中に存在する有機分子を捕捉することの本発明人等の発見に基づく。いずれもの特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、本発明人等は、これが、局所環境にある抗原及び他の分子の腸の免疫監視に寄与し、これにより抗原及び他の分子が免疫系に提示されるか、又はそれによって監視される機構を提供すると信じる。本明細書中に開示される研究は、これが、マウス及びヒトの腸組織の分泌を、特に（ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ）腸免疫細胞中のリン酸カルシウムナノ粒子の存在及びペプチドグリカンの存在と一緒に検出するために使用した実験において、細菌のペプチドグリカンに対して天然に存在することを示す。これは、更にマウスにおいて、経口的に給餌されたタンパク質抗原、即ち卵白アルブミンがこの経路に従うこと示すことによって確認された。
【００１３】
マイクロ粒子、即ちマイクロメートルの直径のサイズ又は少なくとも典型的な微生物のサイズのリン酸カルシウムを形成し、そして腸管内で機能を有することできることが広く提案されているが、本発明は、より小さい非晶質粒子に関する。本発明人等は、更に内因的に産生されたリン酸カルシウムナノ粒子が、５ｎｍのように小さい、そして２５０ｎｍのように大きいことはあるが、典型的には７５ｎｍ−１５０ｎｍの直径の非晶質リン酸カルシウム相を含んでなり、そしてこれらが電子顕微鏡によって大規模な多孔性を有することを示している。多孔性は、典型的には１−２ｎｍの直径であり、そして部分的に又は全てが、電子顕微鏡によって画像化できない有機分子の組込みのためであることが提案されている。
【００１４】
本発明人等は、胃腸管内の免疫細胞による内因性の小さいナノ粒子の取込みは、カーゴ物質、例えばカーゴ分子又はナノ粒子を、細胞による取込みのために内因的に産生されたナノ粒子と類似の様式で運搬することが可能である、内因性ナノ粒子の合成模倣体が発生したことを意味することに気がついた。従って、一つの側面において、本発明は、小さい内因性非晶質リン酸カルシウムナノ粒子の合成模倣体及び、特に治療及び診断適用の両方のために、生物学的に活性なカーゴ物質、例えばカーゴ分子及び／又はナノ粒子を捕捉及び供給するためのその使用に関する。従って、この側面において、本発明は、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）を含んでなる組成物に関し、ここにおいて、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムは、興味のある部位への供給のための生物学的に活性なカーゴ物質を捕捉する。関連する側面において、本発明は、カーゴ物質の供給において使用するための非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物を提供し、ここにおいて、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムは、治療において使用するためのカーゴ物質を捕捉する。関連する側面において、本発明は、カーゴ物質の供給において使用す
るための非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物を提供し、ここにおいて、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムは、カーゴ物質及び関連する方法を使用する診断の方法における使用のためのカーゴ物質を捕捉する。
【００１５】
関連する側面において、本発明は、生物学的に活性なカーゴ物質を胃腸管に供給することによって症状を治療又は予防する方法において使用するための組成物を提供し、ここにおいて、組成物は、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）を含んでなり、これは、生物学的に活性なカーゴ物質を捕捉し、これによってカーゴ物質が胃腸管の興味ある部位に供給されることを可能にする。
【００１６】
更なる側面において、本発明は、生物学的に活性なカーゴ物質を胃腸管に供給することによって症状を治療又は予防する方法を提供し、この方法は、治療を必要とする患者に非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）を含んでなる組成物を投与することを含んでなり、これは、生物学的に活性なカーゴ物質を捕捉し、これによってカーゴ物質が胃腸管の興味ある部位に供給されることを可能にする。
【００１７】
更なる側面において、本発明は、生物学的に活性なカーゴ物質を胃腸管に供給することによって炎症性腸炎、例えばクローン病又はセリアック病を治療又は予防する方法において使用するための組成物を提供し、ここにおいて、この組成物は非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）を含んでなり、これは、生物学的に活性なカーゴ物質を捕捉し、これによってカーゴ物質が胃腸管の興味ある部位に供給されることを可能にする。
【００１８】
更なる側面において、本発明は、生物学的に活性なカーゴ物質を胃腸管に供給することによって自己免疫性疾患を治療又は予防する方法において使用するための組成物を提供し、ここにおいて、この組成物は非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）を含んでなり、これは、生物学的に活性なカーゴ物質を捕捉し、これによってカーゴ物質が胃腸管の興味ある部位に供給されることを可能にする。自己免疫性疾患の例は、多発性硬化症、セリアック病、１型糖尿病及び全身性エリテマトーシス（ＳＬＥ）を含む。
【００１９】
更なる側面において、本発明は、生物学的に活性なカーゴ物質を胃腸管に供給することによってアレルギーを治療又は予防する方法において使用するための組成物を提供し、ここにおいて、この組成物は非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）を含んでなり、これは、生物学的に活性なカーゴ物質を捕捉し、これによってカーゴ物質が胃腸管の興味ある部位に供給されることを可能にする。
【００２０】
更なる側面において、本発明は、生物学的に活性なカーゴ物質を胃腸管に供給することによって癌を治療又は予防する方法において使用するための組成物を提供し、ここにおいて、この組成物は非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）を含んでなり、これは、生物学的に活性なカーゴ物質を捕捉し、これによってカーゴ物質が胃腸管の興味ある部位に供給されることを可能にする。癌の治療又は予防に関連する本発明の医学的使用の例は、例えば骨髄球性白血病、例えば慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【００２１】
更なる側面において、本発明は、生物学的に活性なカーゴ物質を細胞に供給する方法を提供し、この方法は、細胞を、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）中に捕捉された生物学的に活性なカーゴ物質を含んでなる組成物と、組成物が分散されて、細胞によって取り込まれることが可能であるナノ粒子を形成し、これによって生物学的に活性なカーゴ物質が細胞に供給されるように接触させることを含んでなる。
【００２２】
更なる側面において、本発明は、捕捉された生物学的に活性なカーゴ物質を含有する非
晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物を製造するための方法を提供し、この方法は：
（ａ）カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を含んでなる溶液及びリン酸イオン（ＰＯ４２−）を含んでなる溶液を用意し、ここにおいて、溶液の一つ又は両方は一つ又はそれより多い生物学的に活性なカーゴ物質を含んでなり；
（ｂ）カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を含んでなる溶液を、リン酸イオン（ＰＯ４２−）を含んでなる溶液と混合して、その中に生物学的に活性なカーゴ物質が捕捉された非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムを沈殿させ；
（ｃ）非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムを回収し；そして
（ｄ）所望により非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムを洗浄及び乾燥すること；を含んでなる。
【００２３】
本発明人等は、合成後、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムは、生物学的に活性なカーゴ分子を興味ある部位に供給するために分散することが可能である凝集したナノ粒子を含んでなることを見出している。これは、この物質が、生物学的環境におけるカーゴの供給のためにナノ粒子を形成し、一方、合成後に容易に精製及び加工されるという利点を有する。好都合には、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物は、タンパク質の存在中の水性環境中で効率よく分散し、これらをｉｎ  ｖｉｖｏの設定におけるカーゴ物質の供給に適合させる。
【００２４】
幾つかの適用において、本発明人等は、本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が、これらが興味ある部位においてナノ粒子に対して補助的な（ａｄｊｕｖａｎｔ）及び／又は直接の転写反応を起こさないサイレントな供給プラットフォームであるという、有意な利点を有することを見出した。例えば、ナノ粒子を取込み、そして加工した細胞は、単独の生物学的に活性なカーゴ物質に対する及び／又は未処置の対照細胞に対する反応と実質的に異なった反応を持たない。
【００２５】
従って、幾つかの場合、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムナノ粒子は、直接的転写反応を改変しないという意味でサイレントであり、これは、好ましくは非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムナノ粒子に対する３時間の曝露で評価されるように、ナノ粒子で刺激された細胞及び未処置の対照細胞間で異なる。これは、図１０に基づく実験で決定することができ、これは、正常な細胞と比較した、合成ＡＭＣＰに対する遺伝子の直接的転写反応におけるこの相関が、好ましくは２倍の上方及び２倍の下方制御の範囲に入ることを示す。
【００２６】
この特徴は、本発明の組成物を、それから供給剤が形成される物質が、供給された抗原によって起こされる反応に加えて補助的反応（ａｄｊｕｖａｎｔ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を産生する従来の技術の供給系と区別する。幾つかの態様において、本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物は、ナノ粒子を優先的に取込む細胞種へのカーゴ分子の供給を標的とするために、使用することができる。例として、これは、胃腸管中の細胞、例えば腸リンパ濾胞の抗原提示免疫細胞を含む。ナノ粒子を優先的に取込む細胞種は、抗原提示Ｂ細胞を含むが、しかし特に樹状細胞及びマクロファージ、例えばＣＤ１１ｂ及びＣＤ１１ｃ陽性細胞である。
【００２７】
別に又は更に、本発明人等は、本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が、組成物がマグネシウムイオン及び／又は生物学的に活性なカーゴ物質によって非晶質相中で安定化されるという有意な利点を有するということを更に見出した。これに関連して、無機化学の分野において、ＡＣＰ中のＣａ２＋イオンのＭｇ２＋イオンによる置換が、更に結晶質な相を経由して転換するその傾向を減少し、非晶質状態のより大きい安定性に導くことが認識されている。Ｂｏｓｋｅｙ及びＰｏｓｎｅｒ（１９７３，１９７４）
は、少なくとも１：２５（Ｍｇ：Ｃａ）の比において、非晶質のＭｇＣａＰＯ４相を産生することができ、これは、乾燥粉末として長時間安定なままであることを示した。然しながら、本発明人等は、その合成中に、マグネシウムイオンによって安定化された非晶質リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）が、カーゴ分子、例えばタンパク質抗原、生理活性なサイトカイン、ペプチドグリカン、低分子量有機分子、及びカーゴナノ粒子、例えば無機ナノ粒子を含む広い範囲のカーゴ物質を捕捉するために特に有用であることを初めて認識した。これは、次に本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物のための異なった適用の範囲を開く。カーゴ分子の具体的な例は、制約されるものではないが、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む。
【００２８】
更に、本発明人等は、本発明の合成方法を、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物（Ｍｇ、Ｃａ、ＰＯ４）を形成するために使用することができることを見出し、ここにおいて、組成物に伴うカーゴ分子は、単純に粒子の表面に結合されるにではなく、少なくとも部分的に物質内に組込まれる。これは、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が、カーゴ物質の周囲をある程度鋳型にして、全体の多孔質物質の形成の外観を与えることを意味する。言い換えれば、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物を、他のカーゴ物質の存在中で同時沈殿させることによって、少なくともある程度のこれらの他のカーゴ物質が合成中に物質中に捕捉されるようになることに導く。好都合には、これは、カーゴが表面に単に吸着される場合と比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏの標的細胞への過程においてカーゴをよりよく保護することができる。
【００２９】
更に、本発明は、本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が、細胞によって取込まれることを受け入れられるカーゴ物質を含有するナノ粒子を形成するために分散し、細胞の消化におけるカーゴ物質の放出に導き、そしてその後、カーゴ物質に対する典型的な細胞反応を提供することが可能であることを示す。例えば、細菌のペプチドグリカンは、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物によって捕捉されることができ、そして細胞に供給された場合、細菌のペプチドグリカンに特有のサイトカイン（ＩＬ−１０；ＩＬ−Ｉ；ＴＮＦα等）の産生を得るものである。上述したように、本発明人等は、粒子に包埋されたカーゴが、カーゴ単独から供給された細胞のシグナルを忠実に再現する、即ち、両方向のシグナル伝達の減衰がないことを驚くべきことに見出した。
【００３０】
好都合には、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムナノ粒子は非毒性であり、そして細胞による取込みに対して安全である。非晶質粒子が、結晶質粒子より細胞に対して安全であることは一般的に当技術において認識されている。本発明のナノ粒子に曝され、そして例えばリン酸カルシウムのヒドロキシアパタイトへの遅延性の曝露とは異なって、これを取込んだ細胞は死なない。
【００３１】
更に、本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物は、二つ又はそれより多い異なったカーゴ物質を、同時供給するために使用することができる。例えば、本明細書中に記載される実験は、ペプチドグリカン及び抗原が両方とも存在する場合、抗原に対するＴ細胞の反応を確保することは、ペプチドグリカンの存在のために分泌されるＩＬ−１０のために有意に減少されることを示している。
【００３２】
更なる側面において、本発明は、内因性非晶質リン酸カルシウムナノ粒子が腸内で伴った細胞が、クローン病におけるタンパク質のプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の減少した発現又は非存在を示し、これは、さもなければ、対応する健康な細胞中には存在することの観察に基づく。ＰＤ−Ｌ１は耐性誘導分子であり、これは、疾病の原因が、これらの細胞のＰＤ−Ｌ１の発現の失敗に関係し得ることを意味する。従って、この側面において、本発明は、炎症性腸疾患、例えばクローン病を治療する方法において使用するため
の薬剤を提供し、ここにおいて、薬剤は、（ａ）ＰＤ−Ｌ１の発現を上方制御する；又は（ｂ）ＰＤ−Ｌ１タンパク質を活性化する；（ｃ）ＰＤ−Ｌ１発現の抑圧を阻害する；又は（ｄ）さもなければ、腸リンパ濾胞の幾つかの抗原提示細胞上のＰＤ−Ｌ１を活性化する特性を有する。関連する側面において、本発明は、薬剤がカーゴ物質として本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム物質内に捕捉されるような薬剤を含んでなる医薬組成物を提供する。
【００３３】
更なる側面において、本発明は、クローン病を治療する方法において使用するための腸リンパ濾胞の抗原提示免疫細胞中のＰＤ−Ｌ１発現を促進することが可能な薬剤を提供する。
【００３４】
本発明の態様は、ここに、例の方法として記載されるものであり、そして付属する図面に対する言及は制約ではない。然しながら、本発明の各種の更なる側面及び態様は、本開示の観点から、当業者にとって明白となるものである。
【００３５】
“及び／又は”は、本明細書中で使用する場合、二つの規定された特徴又は成分の、他方を含む又は含まない、それぞれの特定の開示と解釈されるべきである。例えば、“Ａ及び／又はＢ”は、それぞれが個々に本明細書中に記載されたかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ及び（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの特定の開示として解釈されるべきである。
【００３６】
文脈が他に記述されない限り、先に記載された特徴の記載及び定義は、本発明のいずれもの特定の側面又は態様に制約されず、そして記載される全ての側面及び態様に等しく適用されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、合成ＡＭＣＰナノ粒子のＳＴＥＭ特徴付けであり：ａ−は、合成ＡＭＣＰ粒子クラスターの高角度円環状検出暗視野ＳＴＥＭ画像（スケールバーは２０ｎｍ）であり、そしてｂ−は、エネルギー分散型Ｘ線微量分析による模範的元素組成物である。ｃ−ｅ−は、再構成された体積（ｆ）からのＸＹ平面を通る幾つかのオルトスライス（ｏｒｔｈｏｓｌｉｃｅ）による詳細な内部構造（ｆ−ｉ）を明らかにする合成ＡＭＣＰ粒子の一連のオルトスライス（スケールバーは２０ｎｍ）、及び（ｇ−ｉ）それぞれＹＺ、ＸＺ及びＸＹ方向を通る透視図である。
【図２】図２は、酸化鉄ナノ粒子の存在中で形成されたＡＭＣＰ粒子（実施例８参照）のＡ．透過電子顕微鏡及びＢ．３Ｄ断層撮影の再構築であり、そして如何に幾つかがＣ−Ｄに示すようにＡＭＣＰ内に捕捉されているかを示す。Ｅは、実施例２及び３において調製されたようなＡＭＣＰ粒子中のＢＳＡ及びＰｇの組込みの％である。
【図３】図３のＡは、合成後及び組織培養培地中の希釈後のＡＭＣＰ粒子中に存在するＣａ及びＰ元素のＩＣＰ−ＯＥＳ分析である。Ｂは、実施例２及び４のように調製され、そしてｎａｎｏｓｉｇｈｔを使用するナノトラッキング（ｎａｎｏｔａｃｋｉｎｇ）分析（ＮＴＡ）によって分析されたＡＭＣＰ粒子のサイズ分布（組織培養倍中に再懸濁及び希釈した後）である。
【図４】図４のＡは、フローサイトメトリー画像化によって測定されるような、ＡＭＣＰ／ＢＳＡ及びＡＭＣＰ／ＢＳＡ／Ｐｇとの３時間のインキュベーション後のＰＢＭＣ中の二重カルセインの高ＣＤ１０７ａ高ＣＤ１４＋ＡＰＣの平均パーセントである（ｎ＝４）。Ｂは、内部移行した粒子（カルセイン＋）及びリソソームマーカーＣＤ１０７ａとの、フローサイトメトリー画像化によって測定された粒子の同時局在化を示すＣＤ１４＋細胞の代表的画像である（１個の健康な対照のＰＢＭＣからのデータを示す）。Ｂは、ＡＭＣＰ／ＢＳＡ／ｓＰｇ対対照に対するシグナル対数比（ＳＬＲ）を、ｙ軸上にプロットし、ｓＰｇ対対照に対するＳＬＲを、ｘ軸上にプロットした。それぞれの点は、一つの遺伝子である。完全相関の曲線をデータ上に重ね、そして線形の２倍の上方／下方制御に対応する境界を、完全相関の線のそれぞれの点に対して＋１又は−１を加えることによって計算した（伝統的に、最小の倍数変化は潜在的‘差’を示すために必要である）。
【図５】図５は、リポ多糖（ＬＰＳ）及びＴ細胞抗原ＰＰＤの二重輸送が、ＰＰＤ抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを示す。左上：ＣＦＳＥ増殖アッセイにおけるＣＤ４＋ＣＤ３＋分裂細胞（低ＣＦＳＥ）を示すフロープロットの例である；生存リンパ球ゲート内の細胞は、ＣＤ４に対してゲート開閉され、そしてＣＤ３対ＣＦＳＥをプロットした。右上：５日目のＰＢＭＣ中の可溶性及び粒子状ＰＰＤ抗原／抗原−ＬＰＳの組合せに反応するＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の増殖であり、５個のＰＰＤ反応物からの平均データを示す。刺激指数として示される刺激に反応するＰＢＭＣ集団内のＣＤ４＋ＣＤ３＋低ＣＦＳＥ細胞である。下：ＰＤ−Ｌ１及びＩＬ−１０Ｒ遮断を伴う更なるＣＦＳＥのＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞増殖Ｔ細胞アッセイである。６個のＰＰＤ反応物からの平均データを示す。全ての増殖アッセイのＰＰＤ反応は、増殖性画分が２％又はそれより多く、そして４又はそれより大きい刺激指数を有する場合、有意であると考えられた。
【図６】図６は、ＰＢＭＣからのＩＬ−１β分泌であり、これは、最初にＬＰＳで３時間予備刺激され（１０ｎｇ／ｍｌ、縞付きカラム）て、又は予備刺激されず（無地カラム）に、プロ−ＩＬ１βを誘導し、そして次いで更に負の対照（即ち、組織培養培地）、ＡＭＣＰ／ＢＳＡ（Ａ−Ｂ）、ｓＰｇ及びＡＭＣＰ／ＢＳＡ／ｓＰｇ（Ｃ−Ｄ）と共にインキュベート（３時間）した。
【図７】図７は、ＩＬ−１β（Ａ）及びＩＬ−１０（Ｂ）が、ＰＢＭＣ中で反応し、これらが、ＬＰＳを伴って又は伴わずに刺激され（３時間；１０ｎｇ／ｍｌ）、そして次いでｓＰｇ及びＡＭＣＰ／ＢＳＡ／ｓＰｇで更に３時間刺激されている（ｎ＝２）ことを示す。３時間の刺激後及び２１時間目の更なる追跡を伴って上清を分析した。
【図８】図８は、それぞれ健康な及び病気の内部移行ＡＭＣＰ（緑色）及びＰＤ−Ｌ１の誘発又は欠損（赤色）を示す、健康（Ａ；灰色）な及びクローン病（Ｂ；青色）のパイエル板腸細胞の共焦点顕微鏡写真である。
【図９】図９は、（ａ）マグネシウム（Ｍｇ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の非存在中、（ｂ）０．９ｍＭ（Ｍｇ；最終濃度）、（ｃ）１．８ｍｍのＭｇ、（ｄ）１．８ｍＭのＭｇ及びＢＳＡ、（ｅ）３．６ｍＭのＭｇ並びに（ｆ）３．６ｍＭのＭｇ及びＢＳＡの存在中で調製されたリン酸カルシウムナノ粒子のＸ線回折パターンである。
【図１０】図１０は、ベヒクル対照処理（ｎ＝７）のそれに対して相関された、合成ＡＭＣＰへの３時間の曝露後の遺伝子の平均ｌｏｇ２表示値であり、そしてタンパク質付加合成ＡＭＣＰナノ粒子により挑戦された細胞が、非挑戦（対照）細胞のそれに対して類似のトランスクリプトームの‘特徴’を示すことを示している。完全相関の理論的線は、中心線に示され、一方境界を示す線は２倍の上方及び下方制御に対応する。
【図１１】図１１のＡは、パイエル板に加えて、虫垂の免疫活性リンパ様板（ｐａｔｃｅｓ）が、更に内因性ナノミネラルを取込むことを示す、上皮下部位の明白なカルセイン染色（緑色）を示す盲腸板である。核を灰色で示す；スケールバーは５０μｍである。Ｂは、有意な数のＡＭＣＰ（緑色）ナノミネラル＋細胞を示すマウスの腸間膜リンパ節である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
非晶質リン酸カルシウム
非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）は、これが、結晶質リン酸カルシウムの長い範囲の周期的原子スケールの秩序を欠くことにおいてリン酸カルシウムの全ての形態中で独特である。これは、ＡＰＣを、２５度の２シータにおける最大値を伴ない、そして十分に結晶化されたヒドロキシアパタイトと比較して他の異なった特徴を持たない、その広域で、そして拡散したＸ線解析パターンから認識することができることを意味する。更に又は別に、非晶質リン酸カルシウムは、ＸＲＤによる分析が、概略３１の２−シータにおける、そして２２から３６の２−シータまで広がる典型的な幅広いバンドのピークを示すことにおいてリン酸カルシウム物質として特徴づけることができる（例えば、図９のｄ−ｆの回折図）。この幅広いバンドが、ヒドロキシアパタイト物質中に存在する３２の２−シータにおける非常に鋭いピークと区別されることに注意されたい（例えば、図９中の回折図ａ−ｃ）。幅広いＸＲＤバンドは、図９に示すように、更に本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物の特徴である。対照的に、Ｄａｓｇｕｐｔａ等及びＣｈｏｗｄｈｕｒ等（上記）の少なくとも部分的に結晶質の物質に対するＸＲＤ回折パターンは、ヒドロキシアパタイトのそれに更によく似ている。非晶質リン酸カルシウム及び結晶質ヒドロキシアパタイトに対するＸ線回折パターンの比較は、図９に示され、そして当業者は、リン酸カルシウムの形態が非晶質であるか否かを、Ｘ線回折によって、パターンを図９に示したそれと比較することによって、容易に決定することができる。電子顕微鏡下で、ＡＣＰの形態学的形態が、ナノメートルの十分の一のスケールの小さい球体の粒子として示される。従って、本明細書中で使用する場合、ＡＣＰ及びＡＭＣＰ（“非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム”）は、リン酸カルシウムのこのような非晶質の形態を指し、そしてリン酸カルシウムの結晶質の形態、例えばヒドロキシアパタイトを含まない。
【００３９】
一般的に、本発明人等は、本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が合成された場合、これらが、例えば濾過及び／又は遠心による精製、並びに他の技術、例えば乾燥を使用する加工を受けやすい凝集した粒子の形態で製造され、そして物質を貯蔵及び使用のための組成物中に処方することをことを見出している。乾燥又は他の製造過程中の凝集を最小にし、又は防止するために、適当な賦形剤を処方に加えることができることは当業者にとって明白であるものである。然しながら、本発明人等は、好都合に、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が、臨床的に又は生物学的環境において存在するアクア化環境に供給された場合、この物質は、本明細書中に記載される特徴を有するナノ粒子の形態で再分散されることを見出している。これは、例えば、ナノ粒子が細胞の取込みに適合性のサイズを有することを意味する。従って、本明細書中で使用する場合、“凝集体”は、比較的緩やかに結合された粒子の収集物を指し、これらは、環境の変化に反応して、個々の粒子、例えばナノ粒子に再分散されることが可能である。
【００４０】
好ましくは、本発明において使用される非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物は、以下の特徴を有する。好ましくは、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物中のＣａに対するＭｇの比は、少なくとも１：２５、所望により少なくとも１：２０、所望により少なくとも１：１０、所望により少なくとも１：５、所望により少なくとも１：４、そして最も所望により少なくとも１：３である。
【００４１】
一般的に、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が、例えば供給時にアクア化形態である場合、これらは分散されて、ナノ粒子の組成物を形成する。一般的に、ナノ粒子は、５ｎｍ−５００ｎｍの直径のサイズの範囲の平均直径、２０ｎｍ及び３５０ｎｍ間の範囲の平均直径、更に好ましくは２０ｎｍ及び２００ｎｍ間の範囲の平均直径、更に好ましくは２０ｎｍ及び１５０ｎｍ間の範囲の平均直径、更に好ましくは７５ｎｍ及び１５０ｎｍ間の範囲の平均直径を有する。与えられたサイズの範囲で、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムのナノ粒子の少なくとも７５％が、その範囲の平均直径を有することが好ましく、そして更に好ましくは、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムのナノ粒子の少なくとも９０％が、その範囲の平均直径を有することが好ましい。粒子のサイズは、Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｔｒａｃｋｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓによって、例えばＮＴＡ２．２  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用するＮａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ５００（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ，Ａｍｅｓｂｕｒｙ，ＵＫ）を使用して評価することができる。
【００４２】
以下で説明するように、本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物は、これらが、カーゴ物質、例えばカーゴ分子又はカーゴナノ粒子を捕捉し、又はその周囲を鋳型とするために、多孔質であるように見受けられる。非晶質マグネシウム置換リン酸カ
ルシウム組成物の小孔は、真の細孔、及びそれがミネラルの領域を示し、そしてこれらの穴が非ミネラルの領域（細孔）であるために電子顕微鏡が “盲目”である、有機カーゴ
を部分的に又は全体的に含有する細孔の組合せである。これは、ＴＥＭによって、ＳＴＥＭによって更に良好に、そしてＳＴＥＭ断層撮影によって最もよく観察することができる。ＢＥＴ又は水銀侵入は、カーゴによって占有されていない真の細孔の測定値を提供することができる。典型的には、ナノ粒子中の細孔のサイズは、１０ｎｍ又はそれより小さく、更に好ましくは５ｎｍ又はそれより小さく、そして最も好ましくは約１−３ｎｍである。一般的に、これらがナノ粒子の形態である場合、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム粒子は、概略球体又は細長い球体の形である。
【００４３】
本発明の非晶質マグネシウム置換カルシウム組成物の安定性は、本発明の物質の重要な利点であり、そしてこれは、部分的に物質中のマグネシウムイオンの存在から生じる。非晶質のＡＭＣＰ（Ｍｇ  Ｃａ  ＰＯ４）相が産生されることができ、これは、乾燥粉末として長時間安定なままである。好ましくは、これは、２５個のＣａ原子毎に少なくとも一つのＭｇ原子を、そして一つのＣａイオン毎に一つより多くないＭｇイオンを含有する。更に好ましいＭｇ：Ｃａ比は、少なくとも１：２０、更に好ましくは少なくとも１：１０、そして更に好ましくは少なくとも１：５のＭｇ：Ｃａイオン、更に好ましくは少なくとも１：４のＭｇ：Ｃａイオン又は少なくとも１：３のＭｇ：Ｃａイオンである。
【００４４】
マグネシウム置換リン酸カルシウムナノ粒子のコンピューターによるモデル化
最初の主要なＤＦＴモデル化は、ＣＡＳＴＥＰ（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ：Ｆｉｒｓｔ
ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ＣＡＳＴＥＰ．Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ  ｆｕｒ  Ｋｒｉｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｅ：２２０（５−６）：５６７−５７０，２００５）の平面波シミュレーションコードを使用して行った。粒子の核形成の初期段階の代表の小さい前駆体のリン酸カルシウムクラスターを構築し、そしてシミュレートした。
【００４５】
Ｐｏｓｎｅｒのクラスター（Ｐｏｓｎｅｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，８：２７３−２８１，１９７５）、（Ｃａ９（ＰＯ４）６）を、結晶質アパタイトの形成に対する前駆体であると考える。この構造を出発モデルとして使用したが、しかしこの式は、実験的に測定した組成を反映するために、ＭｇＣａ７（ＰＯ４）６に変更された。クラスターの幾何学的構造及び安定性の分析を行った。安定性は、形成エネルギー分析を使用して、熱力学的項目で評価した。この分析は、以下の結果に導いた。上記の実験的に測定した組成において、クラスターは、マグネシウムの場合、カルシウムの場合より更に安定である。これは、マグネシウム置換が遊離ではないＰｏｓｎｅｒのクラスターの場合、当てはまらない。
【００４６】
結晶質のヒドロキシアパタイト（ＨＡ）においてマグネシウム置換を行うために、エネルギーが必要であり、そして従って、置換の形成エネルギーは正である。実験的に測定された組成のクラスターにおける同じ置換の形成エネルギーは負であり、そして従ってより好都合である。これは、実験的クラスター中のマグネシウムが、非晶質構造を結晶化に対して安定化することを示す。マグネシウム置換のための最も好都合な位置は、クラスターのまさに中心である。これが、マグネシウムイオンが最も安定である位置である。
【００４７】
クラスターの配置は、置換されたＰｏｓｎｅｒのクラスター及びマグネシウムを伴わないクラスターの両方と比較した場合、非常に“緩やか”である。置換されたＰｏｓｎｅｒのクラスターと比較した場合、Ｍｇ−Ｐの距離は２．５％大きく、そしてＰ−Ｐの距離は５％大きい。クラスターは、その球形の配置を喪失し、弱い結合を伴うより非晶質様のクラスターを示す。
【００４８】
捕捉されたカーゴ物質
本明細書中に記載される実験は、本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物中に一つ又はそれより多いカーゴ物質を捕捉することが可能であることを示す。
【００４９】
【表１】
2020073467.tif 000002
【００５０】
カーゴ物質としてのナノ粒子
ナノ粒子構造は、直接的にこれら自体の、又はその中の治療剤の輸送のためのいずれかの治療的利益を有することができる。一般的に＜２０ｎｍ、好ましくは＜１５ｎｍ、そして最も好ましくは＜１０ｎｍの直径の小さいナノ粒子は、本発明の非晶質マグネシウム置換カルシウム組成物中に容易に組込まれることができる。これは、さもなければ、これらに向けられるものではない小さいナノ粒子を標的とする利益を有することができる。例えば、新型インフルエンザに対する妨害ＲＮＡを、小さい核標的ナノ粒子に組込むことができ、これはそれ自体が非晶質マグネシウム置換カルシウム組成物中に組込まれて、吸入器又は類似の装置による初期の上部気道供給を可能にし、そして非晶質マグネシウム置換カルシウム組成物が肺の内張り流体中に溶解されてから、深部の上皮細胞への更なる移動及び供給のために小さい粒子を放出することを可能にする。
【００５１】
第２の例は、治療的鉄である。例えば、胃における分解をバイパス又は減少することが望ましいものであることができる。この例は、フェリチン核のような水酸化鉄のナノ粒子であり、これは、これらがエンドサイトーシスによって全体として小腸で取込まれ、そして次いでＦｅ利用のためにリソソーム内的に溶解されるように小腸に供給することを望むことができる。
【００５２】
他の側面において、本発明は、金属ナノ粒子又は金属オキソ−水酸化物ナノ粒子、例えば鉄又は銅ナノ粒子、或いは量子ドットの、非晶質マグネシウム置換カルシウム組成物を使用する供給を可能にし、これは、例えば粒子のカーゴを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの系の両方において追跡することを可能にする実験に対して望ましいことであり得る。従って、更なる側面において、本発明は、検出可能な分子、例えばラベルを含んでなるカーゴ物質を捕捉する非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）を含んでなる、診断の方法において使用するための組成物を提供する。一つの態様において、これは、カーゴ物質を胃腸管に供給し、これによって、カーゴ物質が胃腸管中の興味ある部位に供給され、そして検出可能な分子を検出することが可能な技術を使用して検出することを可能にすることを含むことができる。
【００５３】
関連する側面において、本発明は、患者に、検出可能な分子を含んでなるカーゴ物質を捕捉する非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）を含んでなる組成物を投与し、胃腸管へのカーゴ物質を含んでなる非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムを供給し、そして検出可能な分子を検出することを含んでなる診断の方法を提供する。
【００５４】
カーゴ物質としてのワクチン
治療剤は、ａ）特異的な細胞種を標的とし、及び／又はｂ）胃腸を通過中に消化から保護されることを必要とすることができる。本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物は、両方の場合の利益を提供することができる。第１に、経口的、直腸的又は非経口的に与えられるか否かに関わらず、ＡＰＣ及び／又は網内皮系細胞を標的とすることによる。本明細書中に記載した理由のために、本発明の非晶質マグネシウム置換カルシウム組成物は、カーゴ物質のパイエル板及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）への供給に十分に適している。第２に、酵素による消化に対するある程度の保護を提供することによる。例は、ワクチン接種であるものである。一つ又はそれより多い一つのカーゴ分子を含んでなるワクチンは、上記の目的の両方又は一つを達成するために非晶質マグネシウム置換カルシウム組成物に組込まれることができる。第２の例は、炎症性腸疾患、リウマチ様関節炎、又は他の炎症性又は自己免疫性疾患における治療的供給である。これは、実際に本発明の非晶質マグネシウム置換カルシウム組成物中に包装され、そしてＡＰＣ及び関連する細胞に標的とされる非標的治療剤として使用される特異的治療剤、例えばステロイド、メトトレキセート、アザチオプリン、又は更に‘生物学的製剤’のために有益であることができる。
【００５５】
いずれもの特定の理論に束縛されることを望むものではないが、本発明人等は、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物は、症状、例えば自己免疫性症状、炎症性腸疾患、リウマチ様関節炎、又は他の炎症性疾患を、これらの症状の根底にある全身性及び／又は局所的反応を弱めるために経口耐性を導入することによって治療するために使用することができると信じる。消化されていない経口的に消費された物質は、内因的に産生されたリン酸カルシウムナノ粒子によって捕捉され、そして関連する細胞に運搬されるが、この過程は、本発明の合成非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物中に既に存在するカーゴ物質への細胞の曝露と比較して、相対的に非効率的である。
【００５６】
核酸カーゴ分子
非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物は、核酸配列であるカーゴ物質を供給
するために、例えば、細胞中の核酸配列の発現を得るために、遺伝子ノックダウンのための短い核酸配列の供給、等のために使用することができる。一般的に、核酸は、裸の配列であるか、又は他に発現ベクターに組込まれることができる。核酸は、全体的に又は部分的合成であることができ、そしてゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡを含むことができる。本発明による核酸がＲＮＡを含む場合、示された配列に対する言及は、ＵでＴを置換したＲＮＡ均等物に対する言及と解釈されるべきである。
【００５７】
例えば遺伝子及び／又はその調節エレメントの全て又は一部をコードする核酸配列は、本明細書中に含まれる情報及び参考文献、並びに当技術において既知の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ
ｅｔ  ａｌ，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９２を参照されたい）を使用して当業者によって容易に調製することができる。これらの技術は、（ｉ）例えばゲノム供給源からのこのような核酸の試料を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、（ｉｉ）化学的合成、又は（ｉｉｉ）Ｅ．ｃｏｌｉ中の増幅を含む。核酸配列に対する修飾を、例えば核酸を発現するために使用する宿主細胞のコドン優先度を考慮する部位特異的変異誘発を使用して行うことができる。核酸の増幅のためのＰＣＲ技術は、米国特許第４，６８３，１９５号中に記載されている。ＰＣＲ技術の一般的使用のための参考文献は、Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３，（１９８７）、Ｅｈｒｌｉｃｈ（ｅｄ．），ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９、Ｅｈｒｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１６４３−１６５０，（１９９１）、“ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｅｄｓ．Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９０）を含む。
【００５８】
核酸配列の発現を得るために、これは、核酸に、その発現を制御するために操作可能に連結された制御配列を有するベクターに組込むことができる。ベクターは、他の配列、例えば挿入された核酸、遺伝子によってコードされるポリペプチドが、融合物として産生されるような核酸配列の発現を推進するためのプロモーター又はエンハンサー、及び／又は宿主細胞中で産生されるポリペプチドが細胞から排出されるように分泌シグナルをコードする核酸を含むことができる。プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他の配列を適宜に含む適当な調節配列を含有する適したベクターは、選択又は構築することができる。ベクターは、適宜に、プラスミド又はウイルス、例えばファージ、又はファージミドであることができる。更なる詳細は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。核酸の操作、例えば核酸構築物の調製、変異誘発、配列化、細胞へのＤＮＡの導入、及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析のための多くの既知の技術及びプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２中に詳細に記載されている。核酸又は発現ベクターは、興味のある遺伝子をコードする核酸が、標的細胞中で発現されるように、本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が使用中にその中に分散されるナノ粒子を使用して、標的細胞に形質移入することができる。
【００５９】
ポリペプチドカーゴ分子
非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムナノ粒子は、ペプチド又はポリペプチド、例えばタンパク質抗原又はサイトカインであるカーゴ分子を供給するために使用することができる。ポリペプチドは、本明細書中で使用する場合、モノマーがアミノ酸であり、そしてアミド結合により一緒に接続したポリマーを含む。ポリペプチドを形成するアミノ酸は、非天然のアミノ酸、例えばβ−アラニン、フェニルグリシン及びホモアルギニン、又は核酸でコードされないアミノ酸、及び／又は反応性基、グリコシル化部位、ポリマー、治療分子を含むように改変されたアミノ酸を含むことができ、生体分子等も、更に本発明において使用することができる。本発明において使用される全てのアミノ酸は、Ｄ−又はＬ−形態のいずれかであることができる。天然に存在するＬ−異性体の使用が、一般的に好ましい。
【００６０】
記載される方法は、単一のアミノ酸及びペプチドから、１００ｋＤａまで又はそれを超える、そしてフェリチンのような例外的な場合、百万ｋＤａまで又はそれを超える分子量を有するポリペプチド及びタンパク質までの、いずれものサイズ又は種類のポリペプチドに適用可能である。従って、便宜上、本明細書中の方法は、一般的に“ポリペプチド”への言及によって記載されるが、これは、時に当技術においてペプチドと呼ばれるアミノ酸の短い配列（例えば、２、３、４、、５又は１０個のアミノ酸の長さから３０、４０又は５０個のアミノ酸の長さまで）、並びに一般的にタンパク質と呼ばれる大きいポリペプチドを含むと解釈されるべきである。この用語は、更に一般的にタンパク質と呼ばれる第二、第三又は第四構造を有するポリペプチド、並びに疾病過程における多ドメインタンパク質又は他の重要なタンパク質及びポリペプチドを含むと解釈されるべきである。
【００６１】
適したポリペプチドのクラスの例は、例えば前処理及び細胞の再教育のためのインターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、リンホカイン及びサイトカイン、アレルゲン（即ち経口又は全身性）、細菌のタンパク質及び自己免疫タンパク質を含む。
【００６２】
カーゴ分子としての微生物関連分子パターン
非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物は、微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）、例えばペプチドグリカンを包含するカーゴ分子を供給するために使用することができる。ＭＡＭＰの例は、リポ多糖、ムラミルジペプチド、リポテイコ（ｌｉｐｏｔｏｃｈｅｉｃ）酸又は細胞のｔｏｌｌ様受容体及び／又は細胞内ＮＯＤ様受容体及び関連するファミリーメンバーを結合することができるいずれもの分子を含む。ＭＡＭＰは、細胞に環境によって、その炎症性（免疫賦活剤）又は抗炎症性特性（免疫寛容原性）のいずれかのために使用することができる。例えば、胃腸管において、初期状態は耐性の一つである。末梢において、これは免疫反応性の一つである。培養中に、細胞を、その腸の免疫耐性状態を試み、そしてそれを模倣するように条件付けすることが当技術において知られている。ペプチドグリカンは、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで適当な条件付けを伴って、本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物を使用して、免疫耐性シグナルが興味のある細胞中で誘発されるように標的細胞に供給することができる。例えば、ＩＬ−１０を分泌し、そしてＰＤ−Ｌ１を上方制御することができる。更に粒子が抗原を保有する場合、提示された抗原に反応するＴ細胞は、有用に免疫耐性であることができる。この経路が操作できないクローン病のような条件において、本明細書の他の場所で更に考察されたような他の物質を考慮することができる。
【００６３】
カーゴ分子としての小分子
非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物は、小分子、例えば栄養素を捕捉し、そして供給するために意図的に使用することができる。これは、多くの方法において利益を有することができる。第１に、栄養素、特にマグネシウム、ケイ素及びビタミンＤに対して、これらは、カルシウムの栄養学的利益と相乗的である。第２に、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物は、本発明の組成物が分散されているナノ粒子によって、
胃中で溶解し、そして従って胃酸が栄養素組成物の内部に作用する時間を遅らせることによって、栄養素を、消化から部分的に又は完全に保護するために作用することができる。更なる例は、小分子、例えば栄養素、アミノ酸、その配列を含む核酸の、経口的に又は非経口的に投与されたか否かを問わないＡＭＣＰ粒子を特異的に除去する細胞への標的化供給を含む。ＡＰＣ及び網内皮系細胞は、この様式において特に標識とされるものである。
【００６４】
非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム物質の合成
捕捉された生物学的に活性なカーゴ物質を含有する本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム物質の合成は、Ｂｏｓｋｅｙ及びＰｏｓｎｅｒ（１９７３、１９７４）によって開示された方法を、彼らの物質が生物学的に活性なカーゴ物質を捕獲しないという区別を伴って、そして彼らの方法に対する幾つかの更なる改良を伴って適合させた。概して、本発明の方法は、非晶質相中のリン酸カルシウムを安定化させるために、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を使用する。然しながら、本発明人等は、生物学的に活性なカーゴ物質が、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）によって提供されるそれを超える、更なる安定化を提供することができ、そして沈殿した物質の乾燥の工程の効率が、非晶質相を保存することにおいて重要な役割を演じていることを見出している。
【００６５】
従って、一つの側面において、本発明は、捕捉された生物学的に活性なカーゴ物質を含有する非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物を製造するための方法を提供し、この方法は：
（ａ）カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を含んでなる溶液及びリン酸イオン（ＰＯ４２−）を含んでなる溶液を用意し、ここにおいて、溶液の一つ又は両方は、一つ又はそれより多い生物学的に活性なカーゴ物質を含んでなり；
（ｂ）カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を含んでなる溶液を、リン酸イオン（ＰＯ４２−）を含んでなる溶液と混合して、生物学的に活性なカーゴ物質がその中に捕捉された非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムを沈殿させ；
（ｃ）非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムを回収し；そして
（ｄ）所望により、捕捉されたカーゴ物質を伴う非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムを洗浄及び乾燥すること；
を含んでなる。
【００６６】
好都合には、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）及び生物学的に活性なカーゴ物質を含んでなる溶液は、例えば、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ、ＴＲＩＣＩＮＥ又はクエン酸緩衝液、或いはアミノ酸、例えばリシン又はグリシンを、約ｐＨ７．５及びｐＨ１０間のｐＨで、そして更に好ましくは約８．０のｐＨで使用して緩衝される。これは、Ｔｒｉｓ緩衝液を５０ｍＭ及び３００ｍＭ間の濃度範囲で、例えば約１５０ｍＭのＴｒｉｓを使用して達成することができる。一般的に、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）の濃度は、５ｍＭ及び２００ｍＭ間、例えば約１７．７ｍＭである。一般的に、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）に対するマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）の比は、少なくとも１：２５、所望により少なくとも１：２０、所望により少なくとも１：１０、所望により少なくとも１：５、所望により少なくとも１：４、そして所望により少なくとも１：３である。生物学的に活性なカーゴ分子の濃度は、沈殿されたナノ粒子中に捕捉されることが望まれる分子の量に依存する。例示として、生物学的の活性なカーゴ分子が治療的に活性な分子である適用において、濃度は、一般的に、生物学的に活性なカーゴ分子が栄養補助食品分子である適用に対するより低いことができる。
【００６７】
リン酸イオン（ＰＯ４２−）の溶液の濃度は、５ｍＭ及び２００ｍＭ間、例えば約２０ｍＭであり、そして一般的にカルシウムイオン（Ｃａ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）及び生物学的に活性なカーゴ分子を含んでなる溶液と同じ緩衝溶液で緩衝される。リン酸イオン（ＰＯ４２−）の溶液の、カルシウム溶液への急速な添加は、非晶質リン酸
カルシウム（ＡＣＰ）相が形成される間の、Ｃａ２＋及びＰＯ４２−の比が一定であることを確実にする。安定剤の非存在において、これは、通常より結晶質の相、例えばヒドロキシアパタイトに急速に転換されるものである。この転換は、リン酸カルシウムのミネラル中に組込まれることによって格子を破壊し、そして表面の再構築を減少するマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）の合成中の添加によって、防止又は少なくとも制約することができる（図７Ａ，Ｂ）。
【００６８】
マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）による非晶質リン酸カルシウムによる安定化は、最初にＢｏｓｋｅｙ及びＰｏｓｎｅｒ（１９７４）によって調査されたが、本発明人等は、ナノ粒子の多孔質構造が、ある範囲の異なった種類の生物学的に活性なカーゴ分子を組込むことが可能であることを驚くべきことに見出している。更に、本発明人等は、ナノ粒子の構造内に捕捉されたカーゴ分子が、更に、合成中の、そしてその後の乾燥及び貯蔵中の非晶質相の安定化を増加することを見出している。これは、Ｂｏｓｋｅｙ及びＰｏｓｎｅｒが非晶質リン酸カルシウム相を安定化するために必要であることを見出したもの、例えば１７．７ｍＭのＣａ当り１．８ｍＭのＭｇより低い濃度のマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を、本発明の方法が使用することを可能にする。然しながら、一般的に、高い濃度のマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）が、このように製造されたナノ粒子の安定性を向上するために好ましい。
【００６９】
好都合には、本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物の回収は、遠心又は濾過によって行うことができ、そして次いで組成物は洗浄され、そして部分的に又は完全に乾燥される。この操作の容易さは、合成中のナノ粒子のミクロンサイズの凝集体への一次的な凝集のために達成され、これは次いで適当に再アクア化された場合、ナノ形態に再分散されるものである。都合よくは、洗浄及び乾燥工程は、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物からの水の除去を援助するために、１回又はそれより多いアセトン線条を使用して行うことができる。本発明人等は、これを達成する方法が、組成物をアセトン中で再スラリー化（好ましくは約１０のｐＨで）し、そして次いで遠心を使用して乾燥することであることを見出している。組成物の最適な安定化のために、アセトン洗浄工程は、２回繰り返され、以下の表１を参照されたい。
【００７０】
【表２】
2020073467.tif 000003
【００７１】
表２は、Ｍｇ：Ｃａ比を、合成において、そして最終物質中で測定した実験の結果を示す。
【００７２】
【表３】
2020073467.tif 000004
【００７３】
本発明人等は、更に、カーゴ分子の組込みが、水性環境中の物質の相安定性を増加することを見出し、これは、生物医学的適用のために有益である。これは、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムナノ粒子が、タンパク質カーゴ分子で付加された組織培養培地中で例示され、ここで、タンパク質カーゴ分子、この場合、タンパク質ウシ血清アルブミンが付加された非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムは、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）に転換するために、対応する付加されない非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムより有意に長く必要とする（表３）。
【００７４】
【表４】
2020073467.tif 000005
【００７５】
試料を遠心し、そしてｐＨ１０．０の水で２回洗浄した
試料をＤ１０中に再懸濁した（合成混合物と同体積）
試料を遠心し、そしてｐＨ１０．０の水で洗浄した
試料を遠心し、そしてアセトンで２回洗浄した
オーブン中で一晩乾燥した。
【００７６】
更に、本発明人等は、合成のｐＨをｐＨ８．０より上に増加することが、Ｂｏｓｋｅｙ及びＰｏｓｎｅｒ（１９７４）によって使用されたようにｐＨ８．０で合成された対応する物質と比較して改良された相安定性を持つ非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物を製造することができることを見出している。従って、工程（ａ）及び／又は（ｂ）中のｐＨが、７．５、好ましくは少なくともｐＨ８．０、更に好ましくは少なくともｐＨ８．５、そして最も好ましくは少なくともｐＨ９．０より大きいことがことが好ましい。
【００７７】
製剤及び使用
本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物は、捕捉されたカーゴ物質、例えばカーゴ分子又はカーゴナノ粒子を供給するための薬剤として使用するために処方することができ、そしてカーゴ分子に反応する症状を治療及び／又は予防するために、ｉｎｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができる。他の場所で記載されるように、診断の適用に使用するための組成物も更に開示される。従って、本発明の組成物は、一つ又はそれより多い本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物に加えて、医薬的に受容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤又は当業者にとって公知の他の物質を含んでなることができる。このような物質は、非毒性でなければならず、そして当該適用のための固相物質の効力に有意に干渉するべきではない。
【００７８】
担体又は他の成分の正確な特質は、組成物の投与の方法又は経路に関連することができる。これらの組成物は、制約されるものではないが：胃腸管供給、特に経口及び鼻腔胃供給；注射を含む非経口供給；或いはこの目的又は主として他の目的のためであるがこの利益を有するために使用することができる装具を含む、特定の部位におけるインプラントを含むある範囲の供給経路によって供給することができる。特に、組成物は、遺伝子の形質移入又は核酸配列の導入、ワクチン接種、治療剤の供給、同じ又は異なった受容者に対する再注入のための細胞のｅｘ−ｖｉｖｏ操作、及び栄養素の供給において使用することができる。特に、組成物は、ワクチン接種において、そして癌治療の一部としての自己免疫性疾患の治療又は予防、脱感作を含む食物アレルギー及び／又は不耐性の治療、並びに炎症性腸疾患、最も特にクローン病の治療及び予防において使用することができる。
【００７９】
本明細書中に記載されるように、本発明は、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が、広い範囲の治療物質を、主として胃腸管中に存在する細胞、例えばパイエル板及び腸間膜リンパ節中、回腸及び盲腸の盲腸板、特に虫垂のような位置に存在する細胞に供給するために使用される医学的使用を提供する。
【００８０】
一つの態様において、本発明は、癌の治療又は予防のために、特にワクチン組成物として使用することができる。例えば、本発明の組成物は、骨髄性白血病の治療のためのワクチンとして使用することができる。これは、骨髄球性白血病、例えば慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のフィラデルフィア染色体の形成から得られるＢＣＲ−ＡＢＬ（切断点クラスター領域−エーベルソン）の融合タンパク質であるカーゴ分子を使用することを含むことができる。その部分又は合成類似体を含むＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質は、ＡＭＣＰに組込み、そして所望により免疫賦活性（耐性破壊）剤、例えばＭＡＭＰと組合せて、異常な癌融合タンパク質に対する強固な適合性免疫Ｔ細胞反応を誘発することができる。治療的ワクチン接種のためのカーゴ分子として使用することができるもう一つの癌融合タンパク質標的は、ＧＡＧ−ＯＮＣ（ラウス肉腫ウイルス）である。これらのタンパク質の詳細は、以下のように入手可能である：
ＧＡＧ−ＯＮＣ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ／ｍｅｓｈ／２０１１／ＭＢ＿ｃｇｉ？ｍｏｄｅ＝＆ｔｅｒｍ＝ｇａｇ−ｏｎｃ＋Ｆｕｓｉｏｎ＋Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ＢＣＲ−ＡＢＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ／ｍｅｓｈ／２０１１／ＭＢ＿ｃｇｉ？ｍｏｄｅ＝＆ｔｅｒｍ＝Ｆｕｓｉｏｎ＋Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，＋ｂｃｒ−ａｂｌ＆ｆｉｅｌｄ＝ｅｎｔｒｙ＃ＴｒｅｅＤ１２．７７６．６０２．５００．５００．１００。
【００８１】
更なる態様において、本発明は、自己免疫性Ｔ細胞及び自己抗体反応に対する耐性を導入するための治療的ワクチン接種を使用することによって自己免疫性疾患を治療又は予防するために使用することができる。自己免疫性神経抗原に対する治療的ワクチン接種が標的とする、多発性硬化症に対する実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のマウスモデルを使用する従来の研究は、経口の経路によって達成することができる（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｅｙｅｒ’ｓ  ｐａｔｃｈ  ｉｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｌｅｌｉｔｉｓ（ＥＡＥ）．Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２００８  Ｊｕｎｅ；３０（４）：２３０−７）。
【００８２】
一つの態様において、本発明の組成物は、治療的ワクチン接種による、例えば一つ又はそれより多い自己免疫性中枢神経系の神経抗原性タンパク質を、所望により一つ又はそれより多い耐性誘発剤、例えば自己免疫標的に対して反応する免疫耐性Ｔ細胞を誘導するためのペプチドグリカンと共にＡＭＣＰに組込むことによる多発性硬化症の治療又は予防のために使用することができる。例示として、多発性硬化症の治療に特異的に関係する神経抗原性タンパク質は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、Ｓ１００β糖タンパク質（ＳＢ）、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭＧＰ）、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、αβ−クリスタリン（ＣＲＡＢ）、及び２’−３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ（ｐＰｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ）（ＣＮＰ）を含む（Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ，ｎｅｕｒｏａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ
ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｎｏｖｅｌ
ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ．Ｂｌｏｏｄ  ２００４  Ｊｕｎ  １；１０３（１１）：４２２２−３１を参照されたい）。従って、一つ又はそれより多いこれらのタンパク質、又は生物学的に活性なこれらの断片は、カーゴ分子として使用することができる。
【００８３】
更なる態様において、本発明は、炎症性腸疾患、例えばクローン病又はセリアック病の治療又は予防のために使用することができる。炎症性腸疾患、例えばセリアック病の治療又は予防のための治療的ワクチン接種は、コムギ中に見出されるプロラミン（グルテンタンパク質）であるグリアジン、又はコムギ連（例えばオオムギ及びライムギ）の収穫物中に見出される類似のタンパク質を、ＡＭＣＰ中に、耐性誘発剤（例えばペプチドグリカン）を伴って又は伴わずに組込むことによって、自己免疫標的に対して反応する免疫耐性誘発Ｔ細胞を誘導するために行うことができる。Ｄｉ  Ｓａｂａｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ−２５  Ａｐｒｉｌ  ２００９（Ｖｏｌ．３７３，Ｉｓｓｕｅ  ９６７３，Ｐａｇｅｓ  １４８０−１４９３）及びを参照されたい。
【００８４】
更なる態様において、本発明は、１型糖尿病の治療又は予防のために使用することができる。１型糖尿病の治療又は予防のための治療的ワクチン接種は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）アイソフォームＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５を、ＡＭＣＰに耐性誘発剤（例えばペプチドグリカン）を伴って又は伴わずに組込むことによって、自己免疫標的に対して反応する免疫耐性誘発性Ｂ細胞を誘導するために行うことができる。Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｔｗｏ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｉｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９２；８９（１）：２８３−２９２）を参照されたい。
【００８５】
更なる態様において、本発明は、自己免疫性症状、例えば全身性エリテマトーシス（ＳＬＥ）の治療又は予防のために使用することができる。ＳＬＥの治療又は予防のための治療的ワクチン接種は、高移動度タンパク質ボックス１（ＨＭＧＢ１）及び他の小分子核リボ核タンパク質（ループス及び他の自己免疫性疾患における自己抗体の共通の標的であるｎＲＮＰ）を、ＡＭＣＰに、耐性誘発剤（例えばペプチドグリカン）を伴って又は伴わずに組込むことによって、自己免疫標的に対して反応する免疫耐性誘発性Ｂ細胞を誘導するために行うことができる。Ｐｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅａｒｌｙ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ｎＲＮＰ  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２００９  Ｍａｒｃｈ；６０（３）：８４８−８５９を参照されたい。
【００８６】
幾つかの態様において、本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物は、これらを優先的に取込む細胞種又は生物学的位置にカーゴ物質を供給するために使用することができる。これらは、胃腸管の位置、例えば回腸、及び盲腸の盲腸板、特に虫垂に存在するパイエル板、及び腸間膜リンパ節を含む。
【００８７】
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末、ゲル、液体の形態、スプリンクル又は食品であることができる。錠剤は、固体担体、例えばゼラチン、又はアジュバントを含むことができる。カプセルは、特殊化された特性、例えば腸溶性被覆を有することができる。液体の医薬組成物は、一般的に、液体担体、例えば水、石油、動物又は植物油、鉱油或いは合成油を含む。生理学的食塩溶液、デキストロース又は他の糖類溶液又はグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールを含むことができる。本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムナノ粒子が、例えば物質の成分の供給を制御するために固体の形態中に維持される必要がある場合、製剤の成分を、例えば物質の液体製剤が製造される場合、それに合うように選択する必要があり得る。物質が食品と共に投与される場合、製剤の成分は、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物と適合性であるように選択され、そして適した物理化学的及び感覚受容特性を提供するものである。
【００８８】
静脈内、皮膚又は皮下注射、或いは苦痛の部位における注射のために、活性成分は、非経口的に受容可能な水溶液又は懸濁液の形態であるものであり、これは、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物内のものを除き、パイロジェンフリーであり、そして適したｐＨ、等張性及び安定性を有する。当業者は、例えば、等張性ベヒクル、例えば塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、乳酸リンゲル注射剤を使用して適した溶液を調製することが十分可能である。保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／又は他の添加剤を、必要に応じて含むことができる。
【００８９】
個人に与えられる本発明によって使用される物質及び組成物は、これが好ましくは個々の臨床状態に対する利益を示すために十分である“予防的に有効な量”又は“治療的に有効な量”（予防は治療と考えることができるが、場合によって）で投与される。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間経過は、治療されるものの特質及び重篤度に依存するものである。投与量等の決定は、一般医及び他の医師の責任の範囲内であり、そして典型的には治療される疾患、個々の患者の症状、供給の部位、投与の方法及び医師にとって既知の他の因子が考慮される。先に記述した技術の例及びプロトコルは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ中に見出すことができる。組成物は、単独で、又は他の治療剤と組合せて、治療される症状によって、同時に又は連続的にのいずれかで投与することができる。
【００９０】
本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物の使用の例は、制約されるものではないが、食事性ミネラル栄養補助剤及び強化剤（ｆｏｒｔｉｆｉｃａｎｔ）；治療的ミネラル栄養補助剤（例えばｉ．ｖ．及び経口投与によって投与されるような）；薬物、栄養素又は美容担体／共複合体（ｃｏ−ｃｏｍｐｌｅｘ）；リン酸結合剤；他の結合性又は封鎖性適用剤；食品添加剤；制汗剤；日焼け止め剤；ワクチン組成物アジュバント；免疫調節剤；剥離剤を含む直接的な美容への適用；骨及び歯充填物／セメント；密封小線源治療を含むインプラント物質、並びに画像化及び造影剤の供給のための使用を含む。一つの態様において、本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物は、栄養学的又は医学的利益のための栄養補助剤のための供給プラットフォームとして使用することができる。一つの態様において、本発明は、ナノ粒子、例えば金属基剤又は金属オキソ−水酸化物基剤ナノ粒子を、カーゴ物質として使用する。これらは、画像化のために、例えば本発明の組成物が投与された患者中に存在する非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムを追跡するために使用することができる。全ての形式において、しかし特に強化剤のために、その後の処方、例えば保護被覆（例えば脂質）の付加は、その物質を、その意図する用途に適合性にするために必要とすることができる。例えば、組成物は、経口投与のためにカプセル化することができる。
【００９１】
腸の健康及び疾病における、特にクローン病におけるＰＤ−Ｌ１の役割
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、これらが、ＭＨＣの溝中のその表面のポリペプチドを加工し、そして提示する可溶性及び／又は粒子状のタンパク質抗原を獲得することができる。次いでＴ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を経由してＭＨＣを結合し、ＭＨＣ−抗原−ＴＣＲ複合体を形成する。正確には、如何にＴ細胞が反応するかは、多くの因子に依存し、重要な一つは、他の表面分子からの刺激シグナルである。
【００９２】
胃腸管において、Ｔ細胞に対するＡＰＣによるタンパク質抗原の遭遇及び提示の一つの重要な領域が、回腸のパイエル板及び盲腸の盲腸板、特に虫垂によって例示されるリンパ
濾胞であることが知られている。胃腸管における一般的反応が、腸が曝露される全ての有益な抗原に対する活性な免疫反応を予防するための免疫耐性の一つであることも更に知られている（例えば、環境及び食品タンパク質中に生存する善玉菌）。抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現されるプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）は、一般的にＴ細胞に対する強力な免疫耐性シグナルを提供する共刺激分子であり、そして胃腸管における耐性を維持することを援助する一つの候補分子である。本発明の一つの側面において、本発明人等は、内因性リン酸カルシウムナノミネラルの存在のためにカルセインで染色されるパイエル板の細胞が、腸のリンパ濾胞の抗原受領細胞の代表であり、そして通常、別個に、そして殆ど高いレベルのＰＤ−Ｌ１を発現することを見出している。これらの細胞は、殆ど、腸のこの領域における樹状細胞の集団の典型である、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１１ｃ陽性であり、そして少数派は、成熟したマクロファージの典型であるＣＤ６８陽性である。まとめれば、これらの観察は、（ａ）リン酸カルシウムナノ粒子によるリンパ濾胞免疫細胞への抗原の取込み及び提示、並びに（ｂ）抗原が免疫耐性誘発の状況において提示されることを確実にするために、これらの特異的細胞中で重要な役割を演じるＰＤ−Ｌ１と一致する。
【００９３】
驚くべきことに、本発明人等は、ここに、クローン病において、これらの細胞がＰＤ−Ｌ１に対してほとんど常に負であるか、又は非常に低いレベルで発現することを見出している。これは、これらの領域、即ち腸リンパ濾胞におけるＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の欠如が、クローン病の疾病原因（ａｅｔｉｏｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）の基本的欠陥であることを示唆し、これを修正して、治療的利益を患者に提供することができる。従って、一つの側面において、本発明は、クローン病を治療する方法において使用するために腸に存在する抗限提示免疫細胞中のＰＤ−Ｌ１の発現を増加することが可能な薬剤を提供する。幾つかの態様において、この薬剤は、本明細書中に記載される非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムナノ粒子を使用して細胞に供給し、これによって、これらの細胞によるその選択的取込みの利益を受け取ることができる。
【００９４】
説明として、プログラム細胞死リガンド１（‘ＰＤ−Ｌ１’）は、２９０個のアミノ酸タンパク質をコードする遺伝子を有する。更にＣＤ２７４としても知られる、主ＰＤ−Ｌ１において、共受容体分子のＢ７：ＣＤ２８スーパーファミリーに属し、そしてこれは、その受容体のＰＤ−１に結合した場合、サイトカイン産生及びＴＣＲシグナル伝達を減衰することによってＴ細胞機能の阻害剤として機能する。
【００９５】
ＰＤ−Ｌ１に対するＨＵＧＯ遺伝子記号の報告（遺伝子名ＣＤ２７４；同義語Ｂ７Ｈ１、ＰＤＣＤ１Ｌ１、ＰＤＣＤ１ＬＧ１、ＰＤＬ１、そして時にＰＤ−１リガンド１と呼ばれる）は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｎａｍｅｓ．ｏｒｇ／ｄａｔａ／ｈｇｎｃ＿ｄａｔａ．ｐｈｐ？ｈｇｎｃ＿ｉｄ＝１７６３５において見出すことができ、これは、ＰＤ−Ｌ１核酸及びアミノ酸配列、並びにマウス及びラットホモログに対する参考文献へのリンクを提供する。全長のヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列は、配列番号：１（識別子：Ｑ９ＮＺＱ７−１）のＵｎｉＰｒｏｔ知識ベース中に記載されているが、別のスプライシングによって産生された二つの他のアイソフォームが記載され、これは、基準配列と次のように異なっている：アイソフォーム２において、アミノ酸１９−１３２が欠損し（識別子：Ｑ９ＮＺＱ７−２）、一方、アイソフォーム３において、１７８位においてアミノ酸交換（１７８−１７８：Ｋ→Ｄ）があり、そしてアミノ酸１７９−２９０が欠損している（識別子：Ｑ９ＮＺＱ７−３）。
ＭＲＩＦＡＶＦＩＦＭ  ＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴ  ＶＴＶＰＫＤＬＹＶＶ  ＥＹＧＳＮＭＴＩＥＣ  ＫＦＰＶＥＫＱＬＤＬ  ＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥ  ＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧ  ＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳ  ＹＲＱＲＡＲＬＬＫＤ  ＱＬＳＬＧＮＡＡＬＱ  ＩＴＤＶＫＬＱＤＡＧ
ＶＹＲＣＭＩＳＹＧＧ  ＡＤＹＫＲＩＴＶＫＶ  ＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲ  ＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥ  ＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹ  ＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳ  ＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴ  ＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬ  ＦＮＶＴＳＴＬＲＩＮ  ＴＴＴＮＥＩＦＹＣＴ  ＦＲＲＬＤＰＥＥＮ
Ｈ  ＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰ  ＬＡＨＰＰＮＥＲＴＨ  ＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣ  ＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲ  ＬＲＫＧＲＭＭＤＶＫ  ＫＣＧＩＱＤＴＮＳＫ  ＫＱＳＤＴＨＬＥＥＴ。
【００９６】
従って、一つの側面において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１の発現を上方制御するように、腸リンパ濾胞のこれらの抗原提示細胞を処理することによって、クローン病の治療又は予防において有意な治療的利益であるものであることによる新規な発見に基づく。Ｉｎ  ｖｉｖｏのナノミネラルを模倣する本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム物質は、従って、治療を必要とする腸リンパ濾胞細胞をまさに標的とする利益を有する、捕捉されたカーゴ物質としてのＰＤ−Ｌ１発現を上方制御することが可能な薬剤を供給するために使用することができる。このような治療は、これが、クローン病、又は実際に一般的に炎症性腸疾患におけるＰＤ−Ｌ１発現の欠損に対する根底にある機構的な理由であることを証明する場合、提案される‘ペプチドグリカン遮断’をバイパスすることが必要であるものである。
【００９７】
幾つかの例として、ＰＤ−Ｌ１を誘発することが可能な薬剤は、当技術において既知である。ＰＤ−Ｌ１は、１型インターフェロン、例えばＩＦＮガンマによってヒトの細胞中で誘発される（Ｓｅｕｎｇ−Ｊｉｎ  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００６，Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２００２）。この経路は、マイクロＲＮＡ−５１３の使用によりヒト胆管上皮細胞中のＰＤ−Ｌ１発現を誘発又は抑制するために好結果に操作されている：アンチセンスオリゴヌクレオチドによる胆管上皮細胞のｍｉＲＮＡ−５１３への形質移入は、ＰＤ−Ｌ１発現を誘発した（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）。
【００９８】
ウイルスのｄｓＲＮＡの類似体である、ポリイノシン酸−ポリシチジン酸（ポリＩＣ）は、上皮細胞中の核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化によりＢ７−Ｈ１の発現を上方制御する（Ｋｅｉｋｏ  Ｋａｎ−ｏ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３）。同様に、ＨＩＶのようなウイルス感染は、ＡＰＣのＰＤ−Ｌ１のウイルス的に誘発された上方制御を伴う（Ｔｒａｂａｔｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００３，Ｓｅｙｅｒｌ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０）。
【００９９】
更に、マイコバクテリア感染は、ＡＰＣのＰＤ−Ｌ１発現を誘発する（Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０）。これは、マイコバクテリアタンパク質産物、例えばツベルクリンのタンパク質の精製誘導体（ＰＰＤ）による刺激でさえ行うことができ、最も注目すべきは、ＰＰＤが非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムの形態中に存在する場合、ＡＰＣのＰＤ−Ｌ１の上方制御をもたらす。
【０１００】
幾つかの側面において、本発明は、
（ａ）ＰＤ−Ｌ１の発現を上方制御する；又は
（ｂ）ＰＤ−Ｌ１タンパク質を活性化する；又は
（ｃ）ＰＤ−Ｌ１の抑圧を阻害する；又は
（ｄ）さもなければ、腸リンパ濾胞の抗原提示細胞のＰＤ−Ｌ１を、一般的にクローン病、又は炎症性腸疾患を治療する方法において使用するために活性化すること；
の一つ又はそれより多くが可能である薬剤に関する。
【０１０１】
関連する側面において、本発明は、このような薬剤を含んでなる医薬組成物を提供し、ここにおいて、この薬剤は、カーゴ物質として本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム物質内に捕捉される。
【０１０２】
一つの方法において、本明細書中に記載される治療は、標的細胞中にＰＤ−Ｌ１発現を誘発するために、遺伝子療法を使用することができる：遺伝子療法は、本明細書中の他の場所に詳細に記載されている。幾つかの態様において、これは、本発明の合成マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物中に組込まれるＰＤ−Ｌ１をコードする核酸を含んでなる
カーゴ物質を、低いレベルのＰＤ−Ｌ１発現を伴う又はそれを発現しない標的細胞に供給するために含むことができる。
【０１０３】
一般的に、本発明のこの側面による遺伝子療法の方法は、活性なポリペプチドを合成することが不可能な、又はそれを正常なレベルで合成することが不可能な患者を治療するために生物学的に活性なＰＤ−Ｌ１ポリペプチドをコードする核酸を使用するものであり、これによって、野生型ＰＤ−Ｌ１によって提供される効果を提供し、そしてクローン病を治療し、又はこの症状の新しい勃発を抑制する。
【０１０４】
ベクター、例えばウイルスベクターは、幅広い各種の異なった標的細胞に遺伝子を導入するために従来の技術で使用されている。典型的には、ベクターは、所望のポリペプチドの発現からの有用な治療又は予防効果を得るために細胞の十分な部分において形質移入が起こるように標的細胞に曝露される。形質移入された核酸は、それぞれの標的細胞のゲノムに永久的に組込まれ、長く継続する効果を提供することができるか、又は別の方法として、治療は周期的に繰り返されなければならないかもしれない。
【０１０５】
ウイルスベクター及びプラスミドベクターの両方の各種のベクターは、当技術において既知であり、米国特許第５，２５２，４７９号、及びＷＯ９３／０７２８２を参照されたい。特に、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、ＨＳＶ及びＥＢＶを含むヘルペスウイルス、及びレトロウイルスを含む多くのウイルスが、遺伝子導入ベクターとして使用されている。従来の技術の多くの遺伝子療法プロトコルは、無効化マウスレトロウイルスを使用している。
【０１０６】
ウイルスベクターの使用に対する別の方法として、細胞に核酸を導入する他の既知の方法は、電気穿孔、リン酸カルシウム共沈殿、機械的技術、例えば微量注入、リポソームによって仲介される導入及び直接的ＤＮＡ取込み並びに受容体仲介ＤＮＡ導入を含む。更に、本発明は、本明細書中に記載する非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物を使用する、ＰＤ−Ｌ１核酸配列を標的細胞に供給する更なる手段を提供する。
【０１０７】
先に記述したように、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド、又はその活性な部分をコードする核酸を使用する遺伝子療法の目的は、野生型ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドのレベルが、非存在か、又は減少したレベルのみで存在する細胞中の核酸の発現産物の量を増加することである。
【０１０８】
第２の方法において、この療法は、これがタンパク質として発現するように、ＰＤ−Ｌ１遺伝子のプロモーター領域を活性化する薬剤であることができる。幾つかの態様において、これは、本発明の合成マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物中に組込まれるカーゴ物質として使用される薬剤を含むことができる。ＰＤ−Ｌ１発現の活性化物質は、本明細書中に記載されるスクリーニングの方法を使用して見出すことができる。
【０１０９】
第３の方法において、この治療は、ＭＡＭＰを、これらがＰＤ−Ｌ１を誘発することが知られているために含むことができる。ＭＡＭＰの例は、本明細書の他の場所に与えられている。ペプチドグリカン、及びペプチドグリカンの断片は、先に記載した理由のために、有用なＭＡＭＰであることができるか、又はできない。幾つかの態様において、これは、本発明の合成マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物中に組込まれるカーゴ物質として使用されるＭＡＭＰを含むことができる。
【０１１０】
第４の方法において、この治療は、可溶性、コロイド状、ナノ粒子又はマイクロ粒子の形態の化合物又は化合物の混合物を含むことができ、これは、ポリＩＣ及びインターフェロン又は他のサイトカイン、特にＩ型インターフェロンのようなＰＤ−Ｌ１発現を誘発する。幾つかの態様において、これは、本発明の合成マグネシウム置換リン酸カルシウム組
成物中に組込まれるカーゴ物質として使用される化合物を含むことができる。
【０１１１】
第５の方法において、この治療は、ＰＤ−Ｌ１を誘発する生物学的薬剤、例えばウイルス又は細菌、或いはこれらの弱毒化された形態、このような生物学的薬剤の混合物及び／又はホモジネート、例えばＰＰＤ又は核酸配列を含むことができる。幾つかの態様において、これは、本発明の合成マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物中に組込まれるカーゴ物質として使用される生物学的薬剤を含むことができる。
【０１１２】
第６の方法において、この治療は、クローン病におけるＰＤ−Ｌ１発現の抑圧を阻害するための治療を含むことができ、この治療剤は、所望により合成マグネシウム置換リン酸カルシウムのカーゴである。幾つかの態様において、これは、本発明の合成マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物中に組込まれるカーゴ物質として使用されるＰＤ−Ｌ１発現の抑圧を阻害することが可能な薬剤を含むことができる。
【０１１３】
これらの方法は、単独で、又はいずれもの組合せで使用することができることは当業者にとって明白であるものである。ＰＤ−Ｌ１を活性化するための更なる方法は、一つ又はそれより多いケモカイン又はサイトカイン（例えば、インターフェロン）、マイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−５１３）、ペプチド、タンパク質又は糖タンパク質、抗体、酵素、オリゴヌクレオチド及び／又はｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉの使用を含むことができる。
【０１１４】
ＰＤ−Ｌ１活性化物質のためのスクリーニングの方法
本発明は、クローン病の治療又は予防において使用するためのＰＤ−Ｌ１の発現を増加することが可能な薬剤に対するスクリーニングの方法を含む。本明細書中で説明されるように、ＰＤ−Ｌ１が抗原提示細胞、例えば樹状細胞上に存在する場合、これは、その細胞によって提示される抗原に対して耐性であるＴ細胞を指示するマーカーとして作用することが知られている。いずれもの特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、この適用の結果は、ＰＤ−Ｌ１の発現の減少した又は無のレベルが、この耐性を誘発することの欠如に導き、そして従って、クローン病の中心である炎症を起こすことを示す。本発明人等は、ＰＤ−Ｌ１の減少した発現が、管腔の抗原を受け取る抗原提示細胞中のＰＤ−Ｌ１の発現を誘発することによるクローン病の治療又は予防のいずれかのための治療的標的であると信じる。一つの態様において、この方法は、ＰＤ−Ｌ１機能又は発現を補修することが可能な薬剤を供給するために腸中のこのような細胞を標的とすることにおいて、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムナノ粒子の特性を使用することができる。
【０１１５】
治療剤が、同時刺激性分子の発現、例えば腸リンパ濾胞中のＰＤ−Ｌ１の発現を実際に増加するか否かを評価することに、多くの方法を採用することができることは当業者にとってよく知られることである。一つの方法は、処理後のリンパ球凝集物を切断又は生検し、そしてＰＤ−Ｌ１又は他の発現を、例えば採取された組織の領域又は抽出細胞の切片の免疫染色、又はＥＬＩＳＡ又は遺伝子発現分析によって比較することを含むものである。結果は、偽処置又はプラセボ処置の場合と、又は基線で採取された試料と比較されるものである。ヒトの場合、腸リンパ球凝集物が内視鏡による生検の目的のためにより良好に特定されるように、専門的（ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ）染料を使用することができる。明らかに、このような技術は、クローン病を持つ患者に適用することができる。
【０１１６】
従って、本発明は、更にＰＤ−Ｌ１活性化物質を見出すための候補化合物のスクリーニングのための、例えばＰＤ−Ｌ１発現、又は炎症性腸疾患の、そして特にクローン病の治療にための薬剤としてのその後の使用又は開発のためにタンパク質活性を活性化することが可能である候補薬剤を特定するための方法を含む。好都合には、これは、アッセイの成分が相互作用を援助するアッセイ緩衝液中で、そして複数の候補薬剤を試験するために多重ウェル形式で行うことができる。次いで、ＰＤ−Ｌ１の活性を、一つ又はそれより多い
候補化合物の存在及び非存在中で決定して、与えられた候補がＰＤ−Ｌ１発現又はＰＤ−Ｌ１タンパク質レベル又は活性を増加したか否かを決定することができる。
【０１１７】
ＰＤ−Ｌ１を上方制御する供給されたカーゴによって、標的細胞において結合することができるどの受容体が発現されたかを理解するために、遺伝子発現の免疫染色及び測定を含む受容体発現を探求する技術を使用することができる。従って、受容体を結合し、そしてＰＤ−Ｌ１発現に導くものである適したカーゴは、更なるスクリーニング研究によって得ることができる。
【０１１８】
例として、本発明のこの側面において使用するための適したカーゴ分子は、ＰＤ−Ｌ１の既知の活性化物質又は新しく特定されたものであることができる。コンビナトリアルライブラリー技術は、標的タンパク質、例えばＰＤ−Ｌ１の活性を調節する能力に対して、潜在的に莫大な数の異なった物質を試験する一つの効率のよい方法を提供する。このようなライブラリー及びその使用は、当技術において既知である。更なる調査のための候補薬剤の特定後、問題の薬剤は、これが正常な細胞に対して致死的でなく、又はさもなければ治療的使用に適しているか否かを決定するために試験することができる。これらの、及びｉｎ  ｖｉｖｏの治療に対するその選択を確認する他の研究の後、この薬剤は、製造及び／又は医薬、医薬組成物又は剤形の調製に使用することができる。
【０１１９】
幾つかの態様において、ＰＤ−Ｌ１活性化物質のためのスクリーニングの方法は、ＰＤ−Ｌ１を発現することが可能である細胞を、一つ又はそれより多い候補薬剤と接触させ、そしてタンパク質のＰＤ−Ｌ１発現活性が候補薬剤に対する反応において増加するか否かを決定する工程を含んでなる細胞ベースのアッセイを使用することができる。この方法は、ＰＤ−Ｌ１発現又はタンパク質活性を増加する候補薬剤を特定することを更に含んでなることができる。本発明の適用は、スクリーニングのこのような方法において使用するために適した細胞種及び表現型を特定する。これらがそれ等自体がシグナルを送る場合、上皮層及び腸の他の場所から、耐性導入の表現型を、局所的抗原提示細胞（ＡＰＣ）に付与するシグナルが誘導されることは当技術において公知である（Ｉｌｉｅｖ，２００９，２００９；，Ｒｉｍｏｌｄｉ，２００５；Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉ，２０１１）。この過程を模倣することができるｉｎ  ｖｉｔｒｏの条件は、既知である。従って、血液細胞を採取し、そして化学薬品のカクテル、又は実際に上皮細胞培養物からの培地（いわゆる上皮細胞馴化培地）を使用し、そしてこのＡＰＣの耐性促進表現型を誘発することは可能である（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；ｄｅｎ  Ｈａｒｔｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｚｅｕｔｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｓｔｅｉｎｂｒｉｎｋ，１９９７）。このＡＰＣの耐性促進過程を破壊することは、同等に可能である。例えば、ＴＮＦアルファの添加を伴い。そしてこれは、クローン病の過程を模倣することができる（Ｂａｍｉａｓ，２０１３）。
【０１２０】
一つの方法において、ＰＤ−Ｌ１を上方制御することが可能な候補薬剤は、従来の技術から確認することができる。これらの薬剤は、馴化されたＡＰＣと、単独で、そして本発明のマグネシウム置換リン酸カルシウム組成物内のカーゴ物質としての両方で接触させることができる。馴化された細胞は、ＴＮＦアルファ及び／又は他の耐性破壊剤の存在又は非存在中であることができる。ＰＤ−Ｌ１制御は、例えば、遺伝子の上方制御に対する定量的ＲＴ−ＰＣＲ、及びタンパク質に対するフローサイトメトリーによる抗体染色によって評価されるものである。好ましくは、ＰＤ−Ｌ１発現を向上することが可能であると確認された候補薬剤は、ＡＰＣの耐性促進過程を破壊するＴＮＦαのような薬剤の使用にも関わらずそのようにすることが可能であるものである。
【０１２１】
第２の方法において、正常な、又はクローン病の上皮細胞培養からの培地で馴化されたＡＰＣによったことを除き、類似の方法を行うことができ、これらの上皮細胞は、内視鏡
生検又は外科手術に由来する。好ましくは、向上したＰＤ−Ｌ１発現が可能であると確認された候補薬剤は、クローン病の上皮細胞によって馴化された培地の使用にも関わらず、そのようにすることが可能であるものである。
【０１２２】
第３の方法において、多くの動物モデルがクローン病のために存在する。例えば、一つは、Ａｄｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３によって記載されている。異なったモデルが、カルセインのためのパイエル板切片及びＰＤ−Ｌ１の染色によってスクリーニングされるものである。クローン病において観察される、カルセイン陽性のパイエル板ＡＰＣ中の類似の低いＰＤ−Ｌ１発現を伴うモデルは、候補薬剤を治療剤としての適合性に対して試験するために使用されるものである。これらは、本発明の合成マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物中で又はその外部で適用することができ、そして腸溶性被覆を伴って又は伴わずに、経口的に、或いは潜在的治療剤がパイエル板と１時間又はそれより多く接触させられる注入又はタイドループ（ｔｉｅｄ  ｌｏｏｐ）実験、或いは類似の外科的実験で適用される。次いでパイエル板は、潜在的治療剤の適用後のある時点で切除し、そしてタンパク質に対する染色及び／又は遺伝子の上方制御に対するｉｎ  ｓｉｔｕのハイブリダイゼーションによって、ＰＤ−Ｌ１発現の変化を評価することができる。所望により、板の領域又は切断された単一の細胞でさえ、先に記載したようなフローサイトメトリー及び／又は遺伝子分析技術によって評価することができる。
【０１２３】
第４の方法において、クローン病を持つ患者において、所望により合成マグネシウム置換ナノミネラルに組込まれた又は組込まれていない潜在的治療剤は、経口的に又は直腸的に、回腸及び／又は大腸における放出を可能にする適当な腸溶性被覆を必要に応じて伴って適用することができる。治療は、１日、好ましくは３日間、そして最も好ましくは３週間又はそれより多く適用することができ、そして腸リンパ球凝集物は、治療の前後に生検し、そしてＰＤ−Ｌ１発現の変化は、上記のように評価することができる。
【０１２４】
上記の全て又は幾つかは、クローン病を持つ患者の腸リンパ濾胞のＡＰＣにおいて適当にＰＤ−Ｌ１を誘発するものである最適の治療剤を特定するために使用することができることは当業者にとって明白であるものである。
【実施例】
【０１２５】
実験
第Ｉ部：ＡＭＣＰナノ粒子の内因性集合体の発見及び腸管腔のパイエル板内因性ナノミネラル中の役割
回腸瘻造設患者から回収された遠位小腸の内容物を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）のためにプラスチック被覆した台紙上で空気乾燥した。膨大な数のミクロン以下のサイズの粒子を特定し、そしてそのリン酸カルシウムに富んだ元素組成を、Ｘ線微量分析（ＸＲＭＡ）によって確認した。高倍率ＳＥＭは、粒子が一般的に小さいナノ粒子構造の凝集体であることを示した。
【０１２６】
Ｉｎ  ｓｉｔｕの分散をよりよく模倣するために、次いでマウスの遠位小腸を包埋した非水性樹脂の全体の断面を研究し、そしてより大きい解像度を得るために透過型ＥＳを使用した。高い密度の比較的電子が密なナノ粒子が可視であり、そしてこれらは、分析によって再び、カルシウム及びリンに富んでいた。高倍率ＴＥＭ画像は、これらの粒子が多孔質であり、そして制限視野電子回折は、更に典型的に生物学的系に伴う生物学的なアパタイト又は五リン酸八カルシウムとは対照的に、これらが結晶質ではないことを確認した。
【０１２７】
パイエル板のＭ細胞は内因性ナノミネラルを運搬する
腸管腔のこれらの内因的に形成されたナノミネラルが、パイエル板上皮のＭ細胞によって運搬されるか否かを決定するために、マウス由来の薄い切片のＴＥＭ分析を行った。Ｉ
ｎ  ｓｉｔｕの粒子構造を保存するために非水性樹脂を使用し、一方、Ｍ細胞は、隣接する腸細胞とは対照的な、そのよく記載される発育を阻害された表面の微絨毛、又はその欠如によって特定された。この戦略により、Ｍ細胞内の多くの分散ナノミネラル構造が、腸管腔において特徴付けされたものと一致するサイズ、形状、非晶質構造及びＸ線元素組成を伴って確認された。稀に、Ｍ細胞−腸細胞界面において、一つ又は二つのこのような粒子が観察されたが、しかし通常の腸細胞内のこれらの粒子の証拠は見いだせなかった：代わりに、これらは、典型的なＭ細胞の特徴を持つ細胞内に制限され、そして豊富であるように見受けられた。
【０１２８】
パイエル板の抗原提示細胞中の内因性ミネラル
Ｍ細胞は、抗原加工に対して小さい能力を有するが、しかしむしろ管腔の分子を下部の免疫細胞に伝えるように見受けられる。内因性ナノミネラルは、分散様式でＭ細胞内にあることがＴＥＭによって確認されているが、ナノ粒子のクラスターは、ＡＰＣの小胞（即ちリソソーム）区画に生じた場合、光学顕微鏡によって観察することができる。従って、ヒト及びマウスのパイエル板の両方の冷凍された切片を研究し、そしてミネラル化されたリン酸塩に対する改良フォンコッサ染色は、深部上皮下ドームの多くの陽性細胞を明らかにした。ミネラル化されたカルシウムに対する蛍光カルセイン染色は、これらの観察を確認した。ＳＥＭに設置した後方拡散電子に対する検出器は、同じ上皮下ドーム領域の電子が密な領域の特定を可能にし、これは、Ｘ線微量分析により、再び、カルシウム及びリンに富んでいた。ヒト及びマウスの組織試料の両方は、これらの特徴に対して同様に陽性であった。
【０１２９】
マウス及びヒトのパイエル板中のこれらのミネラル陽性細胞のＡＰＣ表現型を確認するために、共通の抗体ベース蛍光マーカーを使用した。恐らく染色の細胞内ミネラルへの吸着により、これらの細胞に人為的細胞抗原の染色が起こることができるために、表現型の決定に対して、全ての染色が、予測される抗原の位置に典型的な、そしてミネラルに富んだ細胞領域と単純に同時発生的ではない細胞分布を示すことを確実にするために、注意が払われた。核の染色に加えて、二重染色、即ちミネラルのためのカルセイン及び一つの表現型マーカーが同時に使用された。ヒト及びマウスのカルセイン＋細胞の大部分は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ及びＨＬＡ−ＤＲに対し強く陽性であり、別個の亜集団を伴い、これはＣＤ６８ｈｉであった）。単球のマーカー（末梢）ＣＤ１４は、非存在であり、一方、これ及び先に記述した陽性抗原は、これらのマーカーを発現する細胞を含有する特異的陽性−対照組織中で全て確認された（方法を参照されたい）。従って、全体的に、パイエル板上皮下ドームのミネラル陽性細胞の表現型は、このゾーンに存在する単核ＡＰＣと一致した。
【０１３０】
カルセイン＋ミネラルを含有する個々の細胞内小胞は、上皮下ドームのＡＰＣ内で区別することができる。この領域において、薄い切片を包埋した非水性樹脂のＴＥＭ画像化は、管腔及び上皮Ｍ細胞粒子と同一の個々のナノミネラルの形態を示した。画像化による類似性は、Ｐｅｒの板及び管腔の内容物の類似の薄い切片からのＸ線微量分析スペクトルの標準的な微量元素定量化を使用して、Ｃａ、Ｍｇ及びＰ含有率に対して分析的に確認された。
【０１３１】
Ｉｎ  ｓｉｔｕの走査型ＴＥＭ（ＳＴＥＭ）特徴付け及び３Ｄナノ断層撮影
ナノ粒子のミネラル化カルシウムのクラスターは、恐らく細胞のリソソーム中のナノミネラルに対して公知である内部小胞膜への付着によって説明される、上皮下ドームのＡＰＣにおいてしばしば観察された。このようなクラスターからの領域を、高角度環状暗視野（ＨＡＡＤＦ）ＳＴＥＭを使用して画像化して、非染色の非水性樹脂包埋検体との十分な対比を可能にした。ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭの傾斜系列を記録し、そして３Ｄモデルを再構築するために使用した。
【０１３２】
内因性ナノミネラルトは、管腔の細菌断片及び食事性抗原を捕捉及び運搬する
豊富な多孔性管腔のリン酸カルシウムナノミネラル均一な形成、及びＭ細胞を通るパイエル板のＡＰＣへのその顕著な運搬は、本出願人等を機能に対する疑問に導く。リン酸カルシウムは、有機分子を捕捉することに優れ、そしてある環境下で、その結合した物質を伴って細胞に侵入する。ここで、従って内因性ナノミネラルの恒常的な“カーゴシップ”機能は、それによって可溶性となり、管腔の有機巨大分子は捕捉され、そして次いで腸のＡＰＣに運搬されると考えられた。経口的に供給された食事性タンパク質の抗原が、内因的に形成されたナノミネラルを伴われて、パイエル板を通過することができるか否かを試験するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）ラベルの卵白アルブミンを給餌した。パイエル板中で検出されたタンパク質は、上皮下ドームのナノミネラル陽性の細胞により、殆ど単独で区画化されていた。卵白アルブミン及び蛍光色素は、消化中に開裂されることが可能なままであるために、後者のみがナノミネラルに伴われ、卵白アルブミンに対するパイエル板切片は、更に直接染色された。共焦点顕微鏡による解像度を最大にするために、Ｈｕｙｇｅｎｓの最大最小予測逆畳み込み（ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｅａｓｔ  ｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）アルゴリズムを使用し、明確な共存が再び観察された。更に、ナノミネラルが、そのカーゴをリソソーム内的に溶解し、最初にそれを暴露し、そして次いでそれを放出する場合に予測されるものであるような、近接した、しかし別個の細胞内カルセイン及びタンパク質のシグナルが存在した。
【０１３３】
ＭＡＭＰＳ、例えばペプチドグリカンは、共生細菌叢の代謝回転のために、回腸を含む遠位の胃腸管の管腔に偏在的に存在する。ペプチドグリカンは、抗体２Ｅ９によって、ヒト及びマウス腸粘膜の尖端側面において確認され、これは、分解された／遊離のペプチドグリカンのみを認識し、そして全細菌中に存在するものを認識しない。２Ｅ９抗体を使用する実験の実験は、食事由来の卵白アルブミンと同様に、ペプチドグリカンは、分離不可能な蛍光シグナル関して、そして更に分離した、しかし密接に隣接したシグナルとして、ＡＰＣのナノミネラルにより区画化されることを再び示した。本出願人等は、パイエル板に対するように、ＡＭＣＰナノ粒子を更に盲腸板の上皮下免疫細胞において観察して確認した。まとめると、これらのデータは、内因性腸ＡＭＣＰナノ粒子は、回腸中で形成し、そして腸の免疫誘発部位、即ち、盲腸及びパイエル板のＡＰＣに、主として上皮のＭ細胞を経由して侵入することを示す、図１１Ａを参照されたい。経口的に供給されたタンパク質に対する腸の免疫反応は、パイエル板及び腸間膜リンパ節間の協力を含む。特に、腸間膜リンパ節へのＡＰＣの遊走は、機能的活性（即ち、抗原提示）を意味し、そして本出願人等は、マウスの腸間膜リンパ節が有意な数のＡＭＣＰナノミネラル＋細胞を有することを確認した。
【０１３４】
考察
ヒトの胃腸管管腔中の内因性ナノミネラル粒子の列挙は、現時点の分析能力を超えているが、ヒト及びマウスの小腸内容物のこれらの観察は、これらが莫大な数で起こることを示唆する。例えば、ヒト回腸のｓｕｃｃｕｓ  ｅｎｔｅｒｉｃｕｓ（腸液）中の［Ｃａ］及び［Ｐ］の１Ｌ／２４時間の中央値が、それぞれ４．２ｍＭ及び１０ｍＭであり、そして平均６：１０のモル比（ＭｇがＣａを置換するため、Ｐ：（Ｃａ＋Ｍｇ））で第３の沈殿物が、平均で５０％の空隙体積（空隙率）を伴う１００ｎｍの直径の球形の非晶質粒子（リン酸八カルシウムにおけるものと類似のＰ充填密度を持つ）を形成する場合、約２・１０１４個の粒子が存在するものであることが推定される。このナノミネラルが、粒子が小さく、そして分析に対する加工技術は、水性の分解を回避するために注意深く制御しなければならないために、以前には観察／特徴付けされていない可能性がある。
【０１３５】
このナノミネラルに、幾つかの注意すべき、そして独特な特徴が存在する。第１に、これは、別々の（分散した）自己組織化ナノ粒子のままである。一方、内因性ナノミネラル
の形成は公知であり（例えば、フェリチン分子核中のフェリハイドライト、又は骨の主要な結晶質構造としての生物学的アパタイト）、これらは有機物質によって鋳型化される。対照的に、異所性の自己組織化ミネラル化は、通常、粒子の制御されない沈殿及び凝集を含む。第２に、更に結晶質のリン酸カルシウムに優先して、非晶質リン酸カルシウムを形成するために必要である最小のイオン活性の産物は、一般的にｉｎ  ｖｉｖｏで高すぎ、そして従って、生物学的な非晶質リン酸カルシウムは希である。ヒトにおいて、例えば、これは、基質の小胞の生体ミネラル化の開始において過渡的な役割を演じることができるが、骨における非晶質リン酸カルシウムの出現に対する証拠は乏しい。その場合にも、リン酸カルシウム相の最も少ない安定性である非晶質リン酸カルシウムは、リン酸八カルシウムに、そしてそれ以降、アパタイト型構造に急速に転換される。然しながら、腸中で、リン酸カルシウムナノミネラルは、管腔から粘膜の免疫細胞に供給するまで完全に非晶質の形態で安定で、そして恐らく比較的高いＭｇ含有率及び相当な有機カーゴによって安定化されるように見受けられる。重要なことには、リン酸カルシウムの最も容易な可溶性の形態であるため、リソソームの条件は、内因性のナノミネラルの急速な溶解及び腸管腔から誘導される有機カーゴの放出を可能にするものである。実際に、これらの内因的に形成されたナノミネラルの第３の独特な特性は、その広範な多孔性及び管腔分子を捕捉するその注目すべき機能の能力であり、そしてこれらをＭ細胞門脈を経由してパイエル板のＡＰＣに供給する。
【０１３６】
これらの実験は、ペプチドグリカン及び食事性タンパク質抗原を、捕捉、及び非晶質リン酸カルシウムナノミネラルによる免疫細胞の供給のための二つの標的として特定し、そして他の分子はカーゴ分子として同様に使用され、そして、例えば、パイエル板のＡＰＣに付き添われることができる。胃腸管の免疫系は、管腔物質を試料採取し、そして適当な（初期条件として免疫寛容原生）免疫反応を発生する機構の明確なアレイを有する。この作業は、カーゴ分子、例えば管腔抗原及び微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）をＭ細胞を通る上皮下ＡＰＣへの供給を伴い捕捉する非晶質リン酸カルシウムナノ粒子が、腸の免疫監視及び耐性ネットワークの重要な部分を形成することを示す。実際に、刷子縁酵素のネットワークは、ナノミネラルに組込まれた有機分子のみが、パイエル板の尖端粘膜を安全に下部の免疫細胞に横切ることができるように、遊離の又は粒子に吸着されたＭＡＭＰ及び抗原を破壊することができる。
【０１３７】
全体として、本発明にこれらの側面は、栄養、腸の生理学及び自己組織化内因性ナノ粒子によって仲介される粘膜の免疫系間の相互作用の新しい洞察を提供する。特に、これらは、（ａ）何故、パイエル板が、約２０−２５０ｎｍの範囲の非生物学的ナノ粒子の取込みに対してこのような顕著な能力を有するか、（ｂ）如何に、恒常的条件下で、管腔の抗原及びＭＡＭＰが、深部の上皮下ドームのＡＰＣに事前の酵素的分解又は結合性の上皮反応を受けずに、到達することができるか、（ｃ）何故、腸の管腔への‘義務的な’内因性カルシウムの損失が存在するか、に対する解答を示唆する。
【０１３８】
第ＩＩ部：ＡＣＰナノ粒子の合成模倣体の開発、その特徴付け及びカーゴの担体としての使用
胃腸管において、カルシウムイオン及びリン酸イオンが沈殿し、そしてナノ粒子を形成し、これは、腸の免疫細胞に供給するために管腔に存在する有機分子を捕捉するという上記の第Ｉ部の発見に基づき、本発明人等は、内因性腸内リン酸カルシウムナノ粒子の合成模倣体を製造し、そしてこれらが安定で、そしてカーゴ分子の担体として作用することが可能であるか否かを決定するために実験を行った。
【０１３９】
実施例１：非晶質リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）粒子の合成
合成の非晶質リン酸カルシウム（“ＡＣＰ”）粒子を、Ｂｏｓｋｅｙ及びＰｏｓｎｅｒ（Ｂｏｓｋｅｙ  ａｎｄ  Ｐｏｓｎｅｒ，１９７４）の改変したプロトコルを使用して調
製した。改変は、マグネシウム（Ｍｇ２＋）の添加、及び／又は相の安定性を向上するために、ＡＭＰＣ粒子の内部に捕捉されることになることが可能なある範囲の分子の存在中の合成を行うことによることからなっていた。付加された及び付加されないＡＭＣＰ粒子のための合成方法は、両方ともアルカリ性のｐＨ（典型的にはｐＨ８又は９及びＴｒｉｓで緩衝）に緩衝された、カルシウム溶液へのリン酸（ＰＯ４）溶液の急速な添加に基づいていた。最初に、非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）相が形成され、これは、より結晶質の相に転換される傾向がある。転換過程は、Ｍｇ２＋イオンの添加、及び／又は合成を、ＡＭＣＰ粒子の内部に捕捉されるようになることが可能な広い範囲の分子の存在中で行うことによって防止、又は少なくとも阻害することができた。
【０１４０】
例示として、１８．１ｇのＴｒｉｚｍａ塩基Ｃ４Ｈ１１ＮＯ３を、１Ｌの超純水中に溶解して、ＴＲＩＳ緩衝の０．１５Ｍ溶液を製造した。ｐＨを塩酸（ＴＲＩＳ−ＨＣｌ）の滴下による添加によってｐＨ８に調節した。溶液Ａを、２．６ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを、０．７３ｇのＭｇＣｌ２・２Ｈ２Ｏを含有する５００ｍｌｓのＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液に加え、そしてｐＨをｐＨ８に調節することによって調製した。溶液Ｂを、２．６ｇの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４を、５００ｍｌｓのＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液に加え、そしてｐＨをｐＨ８に調節することによって調製した。次いで等量の溶液Ａ及びＢを一緒に混合し（容積／容積）、そして室温で１時間回転した。１時間後、得られた粒子を、ｐＨ１０の水で２回、アセトンで１回洗浄した。次いで粒子を一晩５０℃で乾燥し、そして秤量した。平均で２．１９ｍｇ±０．１４（ｎ＝４）の乾燥ＡＭＣＰ粉末を、１ｍｌの粒子標品当り回収した。
【０１４１】
実施例２：タンパク質を含有する非晶質リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）粒子の合成
ＡＣＰ粒子を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はアビジンによって例示されるようなタンパク質を、１ｍｇ／ｍｌを得るために溶液Ａに加える改変を伴って、実施例１に記載したように調製した。次いで、等量の溶液Ａ及びＢを一緒に混合し（容積／容積）、そして室温で１時間回転した。１時間後、得られた粒子をｐＨ１０の水で２回洗浄し、そして得られた粒子のペレットをクエン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ３）に溶解した。粒子に組込まれたタンパク質の量をブラッドフォードタンパク質アッセイによって測定した。時々、粒子を更に一晩５０℃で乾燥し、そして粉末を秤量した（ｎ＝４、アセトン中で２回洗浄後）。平均で２４２．９μｇ±４７．７７（ｎ＝８）のＢＳＡ又は１５７．７６μｇのアビジン（ｎ＝１）が、２．３９ｍｇ±０．１４のＡＣＰ粉末（ｎ＝４）中に存在した。
【０１４２】
実施例３：タンパク質及び細菌モチーフを含有する非晶質リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）粒子の合成
ＡＭＣＰ粒子を、ＢＳＡ及びＳ．ａｙｒｅｕｓからの染色された（Ｒｅｍａｚｏｌ  Ｂｌｕｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ，１９８８）粗製のペプチドグリカンを、それぞれ１ｍｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌを得るように溶液Ａに加える改変を伴って、実施例１に記載したように調製した。次いで、等量の溶液Ａ及びＢを一緒に混合し（容積／容積）、そして室温で１時間回転した。１時間後、得られた粒子をｐＨ１０の水で２回洗浄した。得られた粒子のペレットをクエン酸緩衝液に、定量化の目的のために溶解し、そして粒子に組込まれたタンパク質のレベルを、ブラッドフォードタンパク質アッセイによって測定し、一方、染色したペプチドグリカンの量は、５９５ｎｍで読取った。平均で、２７０．５μｇ±１３．９５（ｎ＝３）のＢＳＡ及び４５．２０μｇ±０．９９（ｎ＝４）の粗製のＰｇが、１．９８ｍｇ（ｎ＝１）のＡＣＰ粉末中に存在した。
【０１４３】
実施例４：タンパク質及び可溶性細菌モチーフを含有する非晶質リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）粒子の合成
ＡＭＣＰ粒子を、ＢＳＡ及びＥ．ｃｏｌｉからの可溶性ペプチドグリカンを、それぞれ１ｍｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌを得るように溶液Ａに加える改変を伴って、実施例１
に記載したように調製した。次いで、等量の溶液Ａ及びＢを一緒に混合し（容積／容積）、そして室温で１時間回転した。１時間後、得られた粒子をｐＨ１０で２回洗浄した。得られた粒子のペレットをクエン酸緩衝液に、定量化の目的のために溶解し、そして粒子に組込まれたタンパク質のレベルを、ブラッドフォードタンパク質アッセイによって測定し、一方、可溶性ペプチドグリカンの量は、適合された過ヨウ素酸シッフアッセイ（Ｊｕｇｄａｏｈｓｉｎｇｈ  Ｒ，１９９９）によって評価した。平均で、２３２．９μｇ±１４．６２（ｎ＝５）のＢＳＡ及び２９．４７±１２．８３μｇ（ｎ＝９）の可溶性Ｐｇが、ＡＣＰ粒子中に存在した。
【０１４４】
実施例５：タンパク質及び可溶性複合多糖類を含有する非晶質リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）粒子の合成
ＡＭＣＰ粒子を、ＢＳＡ及び可溶性デンプンを、それぞれ１ｍｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌを得るように溶液Ａに加える改変を伴って、実施例１に記載したように調製した。次いで、等量の溶液Ａ及びＢを一緒に混合し（容積／容積）、そして室温で１時間回転した。１時間後、得られた粒子をｐＨ１０で２回洗浄した。得られた粒子のペレットをクエン酸緩衝液に、定量化の目的のために溶解し、そして粒子に組込まれた可溶性デンプンの量は、適合された過ヨウ素酸シッフアッセイ（Ｊｕｇｄａｏｈｓｉｎｇｈ  Ｒ，１９９９）によって評価し、そして４５．９９μｇ（ｎ＝１）であることが見いだされた。
【０１４５】
実施例６：タンパク質及び免疫原を含有する非晶質リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）粒子の合成
ＡＣＰ粒子を、ＢＳＡを、１ｍｇ／ｍｌを得るように溶液Ａに加え、一方タンパク質の精製された誘導体（Ｍ．ＴｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからのＰＰＤ）を、２００μｇ／ｍｌを得るように溶液Ｂに加える改変を伴って、実施例１に記載したように調製した。次いで、等量の溶液Ａ及びＢを一緒に混合し（容積／容積）、そして室温で１時間回転した。１時間後、得られた粒子をｐＨ１０で２回洗浄した。得られた粒子のペレットをクエン酸緩衝液に、定量化の目的のために溶解した。粒子に組込まれたタンパク質のレベルを、ブラッドフォードタンパク質アッセイ及びＰＡＳアッセイによって測定した。平均で、１８８．９μｇ±２４．５４（ｎ＝４）のＢＳＡ及び５１．６１±２０．０７μｇ（ｎ＝３）のＰＰＤが、ＡＣＰ粒子中に存在した。
【０１４６】
実施例７：タンパク質及びサイトカインを含有する非晶質リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）粒子の合成
ＡＣＰ粒子を、ＢＳＡを、１ｍｇ／ｍｌを得るように溶液Ａに加え、一方、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）を、１００又は１ｎｇ／ｍｌを得るように溶液Ｂに加える改変を伴って、実施例１に記載したように調製した。次いで、等量の溶液Ａ及びＢを一緒に混合し（容積／容積）、そして室温で１時間回転した。１時間後、得られた粒子をｐＨ１０の水で２回洗浄した。得られた粒子のペレットをクエン酸緩衝液に、定量化の目的のために溶解し、そして粒子に組込まれたＴＳＬＰのレベルを、ＴＳＬＰに対して特異的なＥＬＩＳＡによって測定し、そしてそれぞれ、１．３８ｎｇ（ｎ＝１）及び２５．７４ｐｇ（ｎ＝１）であることを見出した。
【０１４７】
実施例８：酸化鉄含有粒子及びタンパク質を含有する非晶質リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）粒子、或いは“ＡＭＰＣ／ＢＳＡ／Ｆｅ”の合成
ＡＭＣＰ粒子を、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋／ＢＳＡの溶液を、更に１００μｇの酸化鉄溶液と混合した改変を伴って、実施例２に記載したように調製した。次いで、得られた溶液を等体積のＰＯ４溶液と混合して、粒子の沈殿を可能にした。
【０１４８】
合成リン酸カルシウム粒子の構造的特徴付け
小さい酸化鉄ナノ粒子の非存在（即ちＡＭＣＰ／ＢＳＡ）又は存在（即ちＡＭＣＰ／Ｂ
ＳＡ／Ｆｅ）中で調製された合成リン酸カルシウム粒子を、非水性樹脂‘Ｑｕｅｔｏｌ  ６５１’中に固定し、そして切片を７０ｎｍの厚さに切断した。走査透過型電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）モードにおける高角度環状暗視野（ＨＡＡＤＦ）画像化に基づく断層撮影を、ＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｆ２０電子顕微鏡により２００ｋＶで、試料を−４２°から＋７０°まで、２°の間隔で、概略単一軸で、Ｆｉｓｃｈｉｏｎｅ  ２０２０超高角度傾斜断層撮影保持器を使用して傾斜させて行った。傾斜の系列を整列し、そしてＩｎｓｐｅｃｔ３Ｄソフトウェアを使用して再構築し、そしてＡＭＩＲＡソフトウェアを、可視化のために使用した。
【０１４９】
合成リン酸カルシウム粒子内に含有された有機画分の定量化
合成後、カーゴ分子、例えばＢＳＡ又はｓＰｇ（単独で又は組合せで）を含有する粒子を、１，５００ｒｐｍで遠心（５分）し、そして上清を収集した。次に、粒子をｐＨ１０の水で２回洗浄した。次いで、定量化の目的のために、粒子を１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３）に溶解して、有機物質を放出させた。全タンパク質含有量を、ブラッドフォードタンパク質アッセイ（製造業者のプロトコルのとおり、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＫ）を使用して測定し、一方、Ｐｇ物質は、改変した過ヨウ素酸シッフアッセイ（ＰＡＳ；Ｊｕｇｄａｏｈｓｉｎｇｈ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）を使用して定量した。このアッセイは、その吸光度が溶液中の多糖の量に比例する紫色の複合体の形成に依存する。試料及び標準（１００μｍ）を、まず０．５Ｍの硫酸中の９２ｎＭの過ヨウ素酸ナトリウムと共に（１０μｌ／ウェル、３７℃で３０分間、時々振盪）、そして次いで０．６８ＭのＨＣｌ中の２．７％の亜ヒ酸ナトリウムと共に（２０μｌ／ウェル）室温でプレート振盪機上で（４０分）インキュベートした。シッフ試薬（５０μｌ／ウェル；Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の添加、そして更なる３７℃のインキュベーション後、プレートを５４０ｎｍで読取った。多糖の濃度を、可溶性Ｐｇの標準曲線に対して決定し、そして試料の基質を構成するために、ＡＭＣＰ／ＢＳＡ粒子の溶解物中で調製した。
【０１５０】
サイズの測定
ナノ粒子トラッキング解析を、ＮＡＴ２．２解析ソフトウェアを使用するＮａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ５００（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ，Ａｍｅｓｂｕｒｙ，ＵＫ）で行った。それぞれの実験のために、試料を、技術的に三重で測定し（それぞれ９０秒）、そして結果を平均した。データを、三つの独立な実験の平均として示す。
【０１５１】
元素組成の決定
合成リン酸カルシウム粒子を、ＩＣＰ−ＯＥＳ分析に先立って、５％のＨＮＯ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ．，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）中に溶解した。試料を、ＪＹ２０００  ＩＣＰ−ＯＥＳ（Ｈｏｒｉｂａ  Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ  Ｌｔｄ．，Ｓｔａｎｍｏｒｅ，ＵＫ）を使用して分析し、そしてＣａ及びＰを、それぞれ３９６．８４７ｎｍ及び１７７．４４０ｎｍで検出した。定量化を、外部標準（補正標準溶液１０００ｐｐｍ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＵＫ  Ｌｔｄ，Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ；０．５−５０ｐｐｍ）を使用して行った。全Ｃａ及びＰを、合成後、又はＴＣＭ中の希釈後に収集された粒子懸濁液から得て、一方、粒子懸濁液のアリコートを、限外濾過（ＭＷＣＯ  ３ｋＤａ、１０分、１２．０００ｒｐｍ）にかけて、可溶性Ｃａ及びＰ画分を決定した。背景補正を、Ｄ１０（即ちＴＣＭ）から得たＣａ及びＰ値を使用して行い、これは、粒子懸濁液と同じ処置にかけられた。次いで元素粒子画分を、全体及び可溶性元素組成間の差として計算した。
【０１５２】
細胞の分離
白血球コーン（ｃｏｎｅ）（ｎ＝７）を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫから購入し、そして末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、分離
媒体としてＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ  Ｓｈｉｅｌｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ，Ｄｕｎｄｅｅ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を伴う密度勾配遠心によって分離した。簡単には、血液を、ＨＢＳＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で希釈し、そして２５ｍｌの希釈した血液を、１０ｍｌのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ上に注意深く層にした。２０分の遠心（８００×ｇ、中断）後、得られた単核細胞の層を収集し、ＨＢＳＳで３回洗浄し、そして次いで、Ｒ１０（１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び２ｍＭのＬ−グルタミン（全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））中に、５・１０６細胞／ｍｌの濃度で、単核細胞の更なる濃縮のために再懸濁した。
【０１５３】
この目的のために、第２の密度勾配遠心を、Ｍａｒｔｉｎｅｚによって記載されたように行った。簡単には、密度勾配媒体パーコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、９．２５部のパーコールを０．７５部の１０×のＤＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムを伴う；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合することによって２８５ｍＯｓｍに浸透圧を調節し（ｏｓｍｏｌａｒｉｓｅｄ）、そして次いで、Ｒ１０中で４６（容積／容積）％に希釈した。ＰＢＭＣ懸濁液を、等体積の２８５ｍＯｓｍのパーコールの４６％溶液上に注意深く層にした。３０分の遠心（４００×ｇ、中断）後、得られた単核球に富んだＰＢＭＣの層を収集し、ＨＢＳＳで３回洗浄し、そして最終的にＲ１０中に１・１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。単核細胞富化ＰＢＭＣは、トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）色素排除アッセイによって決定されるように、≧９５％の生存率を常に示した（そしてフローサイトメトリーによって測定されたような５７．２９％のＣＤ１４＋単核細胞と一致した）。
【０１５４】
細胞の刺激
単核球富化ＰＢＭＣの培養及び刺激を、滅菌の１５ｍｌのＦａｌｃｏｎ試験管（Ｓｔａｒｌａｂ  ＵＫ  Ｌｔｄ，Ｍｉｌｔｏｎ  Ｋｅｙｎｅｓ，ＵＫ）中で、１・１０６細胞／ｍｌ及び３７℃／５％ＣＯ２で行った。新しく分離された単核球富化ＰＢＭＣを、一晩静置し、その後、新しい組織培養培地（即ち、Ｄ１０：１０％の熱不活化血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び２ｍＭのＬ−グルタミンで補充されたＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））で補充した。次いで、５・１０６細胞を、負の対照としてのベヒクルのＲ１０或いは可溶性（ｓＰｇ）又は粒子（ＡＭＣＰ／ＢＳＡ／ｓＰｇ）の形態のいずれかの４．４μｇ／ｍｌの可溶性ペプチドグリカン（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉから；供給源ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  ｐｌｃ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）で３時間刺激した。これは、Ｄ１０中の４０μｇ／ｍｌのｓＰｇを調製し、又は５０μｇ／ｍｌのｓＰｇ（粒子の洗浄中のｓＰｇ損失を考慮して）を伴うＡＭＣＰ／ＢＳＡ／ｓＰｇ粒子を合成し、そして細胞懸濁液のｍｌ当たり１２５μｌの刺激物質を加えることによって達成された。３時間後、刺激物質を除去し、そして細胞をＨＢＳＳで２回洗浄してから、これらを核酸精製溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）で溶解し、そして細胞溶解物をＲＮＡ分離に先立ち−８０℃で保存した。
【０１５５】
ＲＮＡの抽出
全ＲＮＡを、Ａｂｉ  Ｐｒｉｓｍ  ６１００  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）を製造業者の説明書に従い、そしてＡｂｓｏｌｕｔｅＲＮＡ洗浄溶液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）による洗浄工程を、再び製造業者の説明書通りに含んで精製した。溶出したＲＮＡの濃縮及び精製は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（Ｌａｂｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ，ＵＫ）で決定した。時に、そしてヌクレオチド濃度を増加するために、第２の精製方法を、ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅＴＭ精製キット（Ｑｉ
ａｇｅｎ  Ｌｔｄ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）を、製造業者の説明書に従って使用して行った。試料を、更なるマイクロアレイ加工まで、−８０℃で保存した。
【０１５６】
マイクロアレイ加工
全ＲＮＡ（１００ｎｇ）を、Ａｍｂｉｏｎ  ＷＴ発現キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｌｅｉｓｗｉｊｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して標識し、そして１９．７３２の遺伝子をコードするヒト全ゲノムのＧｅｎｅｃｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．１  ＳＴアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）にハイブリダイズした。試料の標識、チップへのハイブリダイゼーション及び画像走査は、製造業者の説明書によって行った。
【０１５７】
マイクロアレイデータ解析
マイクロアレイ解析を、マイクロアレイデータの統計的解析のためのＭＡＤＭＡＸパイプラインを使用して行った。更なる解析のために、カスタムアノーテーションを、再編成されたオリゴヌクレオチドプローブに基づき使用し、これを遺伝子のための全ての個々のプローブと組合せた。アレイ上に存在する少なくとも五つのプローブを有する遺伝子のみを考慮した。発現値を、ロバストマルチチップ（ｒｏｂｕｓｔ  ｍｕｌｔｉｃｈｉｐ）平均（ＲＭＡ）法を使用して計算し、これは、クオンタイル（Ｑｕａｎｔｉｌｅ）正規化を含む。アレイのデータを選別し、そして四つより多いアレイにおいて２０より高い発現値を持つプローブの組を発現したと考え、そして更なる統計的解析のために選択した。更に、０．２５の四分位範囲（ＩＱＲ）カットオフを、条件間で僅かな変化を示す遺伝子を選別して除外するために使用した。発現の有意な差を、対応のあるインテンシティーベースドモデレーテド（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｏｄｅｒａｔｅｄ）Ｔ−検定（ＩＢＭＴ［５］）を使用して評価した。遺伝子を、ｐ値が＜０．０１である場合、有意に変化したと定義した。
【０１５８】
可溶性及び粒子の形態のペプチドグリカンによる遺伝子調節の類似性を評価するために、二つの処置の少なくとも一つによって有意に変化した遺伝子のみを考慮した。これらに対して、対照処置と比較したそれぞれの刺激物質の平均シグナル対数比（ＳＬＲ；対数的倍数変化）を計算し、そして相関プロット中に可視化した［ここで、それぞれの点は単一の遺伝子である］。［完全相関の曲線をデータ上に重ね、そして線形の２倍の上方／下方制御に対応する境界を、完全相関の線のそれぞれの点に対して＋１又は−１を加えることによって計算した］。
【０１５９】
結果
合成模倣体は多孔質の非晶質リン酸カルシウムナノ粒子を産生する
Ｂｏｓｋｅｙからの改変プロトコルを使用して合成されたリン酸カルシウムは、そのｉｎ  ｖｉｖｏの腸内の対応物のそれと同じサイズの範囲の均一なナノ粒子を製造し（図１Ａ）、そして主としてカルシウム、リン及びマグネシウムを含んでなっていた（図１Ｂ）。本出願人等の従来のｉｎ  ｖｉｖｏの発見と一致して、高角度環状暗視野走査透過型電子顕微鏡（ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭ；図１Ｃ−Ｅ）による分析、そして次いで、タンパク質付加合成ＡＭＣＰクラスターの３Ｄ再構築（図１Ｆ−Ｉ）は、粒子の多孔性の性質を確認した（１−３ｎｍの細孔平均サイズ）。
【０１６０】
合成模倣体は無機及び有機成分の周囲を鋳型とする
結果は、多孔性が、部分的に母液中に存在する無機及び有機成分（例えば、酸化鉄ナノ粒子、タンパク質及び／又は細菌性成分）の周囲を鋳型とすることのためであることを示した。実際に、合成模倣体が、酸化鉄ナノ粒子の存在中で調製された場合、ＴＥＭは、全体的に組込まれた小さいナノ−鉄粒子を伴う合成非晶質リン酸カルシウムナノ粒子を示した（図２Ａ）。合成非晶質リン酸カルシウムナノ−鉄粒子の走査透過型電子顕微鏡（ＳＴ
ＥＭ）断層撮影の再構築は、更に、小さいナノ−鉄粒子の均一な内部及び外部分布を確認した（図２Ｂ−Ｄ）。全体として、合成模倣体が、加えられた有機物質の５０−７０％を組込むことが見出された（図２Ｅ）。
【０１６１】
更なる実験において、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ポリＩ：Ｃ及びレチノイン酸（ＲＡ）を含むカーゴ分子は、本発明による合成ＡＭＣＰナノ粒子中に組込まれることを示している。
【０１６２】
合成模倣体は細胞培養条件下で安定なままである
腸内の内因性ナノミネラルのための模倣体を好結果で産生し、そしてそのｉｎ  ｖｉｖｏの関連性／機能を更に理解するために、本出願人等は、先ず、非晶質リン酸カルシウムナノ粒子が、細胞培養条件で試験された場合、その構造的及び化学的特性を保つか否かを確認した。図３に示すように、そのカーゴの存在中のリン酸カルシウム模倣体は、そのＰに対するＣａの比及び７０ｎｍのその平均サイズを保っている。
【０１６３】
合成模倣体はサイレントな抗原の供給プラットフォームである
次いで、これらの粒子が一次免疫細胞によって良好に取込まれるか否か、そしてその取込みが、その中に保持されたカーゴに対する免疫反応を調節するものであるか否かを調査するための調査を行った。合成模倣体とのインキュベーションは、細胞死がないことを確実にして安全を証明した。第２に、そして図４に示すように、これらのナノ粒子（図４Ｂ、カルセイン）は、単核細胞によって効率よく取り込まれ（図４Ｂ、ＣＤ１４）、そしてリソソームの区画に運搬された（図４Ｂ、ＣＤ１０７及びオーバーレイ）。更に、細菌性成分（即ちＰｇ）を含有する粒子の取込みがより大きく見える（図４Ａ）が、粒子自体は、同じ投与量のペプチドグリカンがそれ自体に供給された場合に得られる遺伝子発現プロフィルを変化しない（図４Ｃ）ことに言及することは興味あることである。図１０は、ベヒクル対照処置のそれに対して相関された、合成ＡＭＣＰに対する３時間の曝露後の遺伝子の平均ｌｏｇ２発現値を示す（ｎ＝７）。これは、タンパク質を付加した合成ＡＭＣＰナノ粒子で挑戦された細胞が、挑戦されない（対照）細胞のそれと類似のトランスクリプトームの‘特徴’を示す。完全相関の理論的線は、黒色で示し、一方、２倍の上方及び下方制御に対応する境界は、赤色で示す。要約すると、内因性腸内リン酸カルシウムナノミネラルの合成模倣体は、抗原供給のための安全で、そして適したプラットフォームであり、そして他のリン酸カルシウムと異なって、そのカーゴを、サイレント／不活性な様式で供給することが証明された。
【０１６４】
第ＩＩＩ部：非晶質リン酸カルシウムナノ粒子の細胞性特性
腸内非晶質リン酸カルシウムナノ粒子模倣体によって同時供給された抗原−多糖に対する減少した抗原特異的ＣＤ４Ｔ細胞反応
このデータは、抗原特異的Ｔ反応のＭＡＭＰの粒子性輸送による阻害が、ペプチドグリカンのそれに制限されず、そして更に、本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム物質によるＴ細胞抗原と同時供給されたリポ多糖を含むことを示す（図５）。
【０１６５】
ＡＭＣＰ及びインフラマソーム
２−４人の患者からのＰＢＭＣを、まずＬＰＳで３時間で予備刺激（１０ｎｇ／ｍｌ、縞付きカラム）して、又はせず（無地カラム）に、プロ−ＩＬ１βを誘発し、そして次いで、負の対照（即ち、組織培養培地）又はＡＣＰ／ＢＳＡと共に更にインキュベートした（３時間）。図６Ａ及びＢに示すように、ＡＣＰ／ＢＳＡは、負の対照に対して研究のいずれもの時点において観察されたそれと異なり、いずれものＩＬ−１β反応を誘発しなかった。これは、そのカーゴに更なるペプチドグリカン（ｓＰｇ）成分を保持する粒子に対しても真実であった（図６Ｃ−Ｄ）。
【０１６６】
ＡＣＰ／ＢＳＡ粒子は、Ｐｇに対する反応をＩＬ−１βレベルで有意に調節しないように見えるが（図７Ａ）、然しながら、これらは、抗炎症性のＩＬ−１０の分泌を増加するように見える（図７Ｂ）。
【０１６７】
全体として、データは、内因性リン酸カルシウムナノミネラルの合成模倣体が、インフラマソームプラットフォームを活性化せず、そのカーゴを細胞に供給することが可能であり、Ｐｇに対するＩＬ−１β反応を調節しないが、しかしむしろ抗炎症性シグナルを増加することができることを示す。これは、本発明の非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）ナノ粒子が、ナノ粒子に取り込まれたカーゴ分子の、細胞に対する抗原提示を遮断する又は変更する特性を持たないことを意味する。これは、ＡＭＣＰナノ粒子を、ＡＭＣＰナノ粒子自体によって起こされる補助的な効果（ａｄｊｕｖａｎｔ  ｅｆｆｅｃｔ）を実質的にもたらさない、カーゴ分子のための供給剤として使用することができることを意味する。
【０１６８】
第ＩＶ部：クローン病法におけるＰＤ−Ｌ１発現の役割
パイエル板を含む急速冷凍されたヒト回腸組織切片を、組織バンク（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ＵＫ）から適所に適当な倫理を伴って購入した。対照試料を、腫瘍又は潰瘍性大腸炎を持つ患者の切除断端（回腸カルチノイド腫瘍を持つ３人、大腸の腺癌を持つ２人、小腸の悪性黒色腫を持つ１人及び潰瘍性大腸炎を持つ２人）からのものであった。クローン病の試料は、異なったクローン病の解剖学的位置（回腸３人、回盲部１人、回腸及び大腸の両方の関与を伴う２人並びに大腸のみの１人）を持つ患者からのものであった。切片の染色及び共焦点画像化は、一つのクローン切片が一つの非クローン切片によって、両方が同一の処置を伴って常に伴われるように、対で（又はこれらの多重で）行った。従って、全ての試料を等しく切片にし、そして同時に染色した。
【０１６９】
パイエル板を、１４μｍで冷凍切片にし（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０５）、そしてＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ（登録商標）スライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）上に収集し、そして３０分間室温で空気乾燥させた。
【０１７０】
４％ホルムアルデヒドで固定後（４℃、１５分）、ヒトの切片を、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ８．０）で洗浄し、そしてマウス抗−ヒトＰＤ−Ｌ１［（Ｍ１Ｈ１）ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（１４−１５９８３）］一次抗体と共に、４時間４℃でインキュベートした。Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ８．０）中の更なる洗浄後、次いでスライドを、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８ヤギ抗−マウス［ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ａ１１００４）］二次抗体と共に、２時間４℃でインキュベートした。次いでナノミネラル化リン酸カルシウムの検出を可能にするために、切片をＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ８．０）の３回の交換によりそれぞれ５分間洗浄し、そしてカルセインＴｒｉｓ−ＨＣＬ溶液と共に１．５時間４℃の暗所でインキュベートした。インキュベーション後、切片をＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ８．０）の３回の交換によりそれぞれ５分間注意深く洗浄し、そして最後に核染料Ｔｏ−Ｐｒｏ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１μｍ）で対比染色した。Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ８．０）の１分間で３回の交換後、切片をＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）金退色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ）で永久的に標本化した。
【０１７１】
切片を、ダイオードＡｒ／ＡｒＫｒ及びＨｅＮｅレーザーを備えたＬｅｉｃａ  ＤＭＩＲＥ２顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、４８８、５６８又は６３３ｎｍで、×６３の１．２ＮＡ水浸対対物レンズを使用して画像化した。データを、Ｌｅｉｃａ  Ｃｏｎｆｏｃａｌソフトウェア（ｖ２．６１）を使用して記録し、そして画像を、オープンソースのＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して加工した。同一
の画像化及びデータ収集のルーチンを、クローン病及び非クローン病の切片に適用した。
【０１７２】
結果及び結論
一貫して、画像は、クローン及び非クローンの組織試料の両方からのパイエル板リンパ濾胞の上皮下ドーム中の、同様な数のカルセイン陽性細胞を示した。然しながら、カルセイン陽性細胞は、更に非クローン病の患者からの組織試料中のＰＤ−Ｌ１の高い発現を示し、そして再び一貫してそのようであるが、これらは、クローン病の試料において、殆どＰＤ−Ｌ１陰性であるか又は、よくともＰＤ−Ｌ１は低い。画像化された試料中の腫瘍又は炎症の存在或いは非存在は、これらの観察から説明することはできなかった。同様に、疾病の部位（即ち、回腸、大腸又は両方であるかを問わず）は、これらの発見を説明することができなかった。年齢に対する関係もなかった。この作業の結論は、腸内のリンパ濾胞中の管腔の抗原を受領及び提示する細胞上にＰＤ−Ｌ１を適当に発現することができないことは、免疫寛容原性の状況において提示されないものであるために、この抗原が、クローン病の原因の根底にあることである。いずれもの特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、本発明人等は、それが管腔のナノミネラルによって同様に誘発される、ペプチドグリカンに反応してＰＤ−Ｌ１を上方制御することの、これらの細胞における固有の欠如が、なぜ、これらの細胞が、クローン病のＰＤ−Ｌ１中でそのように普遍的に低いかを説明していると信じる。
【０１７３】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年10月15日(2019.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃腸管に生物学的に活性なカーゴ物質を供給することによってクローン病を治療又は予防するために使用するための組成物であって、
ここにおいて、前記組成物は、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）含んでなり、これは、ＰＤ−Ｌ１発現を促進することができる、生物学的に活性なカーゴ物質を捕捉し、これによって、カーゴ物質が胃腸管内の興味ある部位に供給されることを可能にする、
ここにおいて、前記カーゴ物質は、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）である、
前記組成物。
【請求項２】
前記マグネシウム置換リン酸カルシウムが、Ｘ線回折によって決定されるように非晶質である、請求項１の組成物。
【請求項３】
前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムＸ線回折パターンが、２５度の２シータにおける最大を持ち、広域で、そして拡散している、請求項２の組成物。
【請求項４】
前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムＸ線回折パターンが、結晶質ヒドロキシアパタイトのＸ線回折パターンに伴う一つ又はそれより多いピークを欠く、請求項２の組成物。
【請求項５】
前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、胃腸管内の細胞による取込みが可能であるナノ粒子を形成するために分散することが可能である、請求項１の組成物。
【請求項６】
前記ナノ粒子が、腸の粘膜の免疫細胞による取込みが可能である、請求項５の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、生物学的に活性なカーゴ物質を、パイエル板又は腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）に供給する、請求項１の組成物。
【請求項８】
前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、興味ある部位に生物学的に活性なカーゴ分子を供給するために分散されることが可能な凝集したナノ粒子を含んでなる、請求項１の組成物。
【請求項９】
前記ナノ粒子が、金属基剤ナノ粒子又は金属オキソ−水酸化物基剤ナノ粒子である、請求項８の組成物。
【請求項１０】
前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、興味ある部位において非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムに対して、単独の生物学的に活性なカーゴ物質に対する反応と実質的に異なる補助的な反応を起こさないサイレントな供給プラットフォームである、請求項１の組成物。
【請求項１１】
前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム中のＭｇ：Ｃａの比が、少なくとも１：２５、少なくとも１：２０、少なくとも１：１０、少なくとも１：５、１：４、及び１：３、から選択される、請求項１の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
上記の全て又は幾つかは、クローン病を持つ患者の腸リンパ濾胞のＡＰＣにおいて適当にＰＤ−Ｌ１を誘発するものである最適の治療剤を特定するために使用することができることは当業者にとって明白であるものである。
非限定的に、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］  胃腸管に生物学的に活性なカーゴ物質を供給する方法において使用するための組成物であって、ここにおいて、前記組成物は、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）含んでなり、これは、生物学的に活性なカーゴ物質を捕捉し、これによって、カーゴ物質が胃腸管内の興味ある部位に供給されることを可能にする、前記組成物。
［態様２］  胃腸管に生物学的に活性なカーゴ物質を供給することによって症状を治療又は予防する方法において使用するための組成物であって、ここにおいて、前記組成物は、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）含んでなり、これは、生物学的に活性なカーゴ物質を捕捉し、これによって、カーゴ物質が胃腸管内の興味ある部位に供給されることを可能にする、前記組成物。
［態様３］  胃腸管に生物学的に活性なカーゴ物質を供給する方法であって、前記方法は、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）を含んでなる組成物を患者に投与することを含んでなり、これは、生物学的に活性なカーゴ物質を捕捉し、これによって、カーゴ物質が胃腸管内の興味ある部位に供給されることを可能にする、前記方法。
［態様４］  胃腸管に生物学的に活性なカーゴ物質を供給することによって症状を治療又は予防する方法であって、前記方法は、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）を含んでなる組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含んでなり、これは、生物学的に活性なカーゴ物質を捕捉し、これによって、カーゴ物質が胃腸管内の興味ある部位に供給されることを可能にする、前記方法。
［態様５］  前記マグネシウム置換リン酸カルシウムが、Ｘ線回折によって決定されるように非晶質である、前記治療の方法、即ち態様１ないし４のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様６］  前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムＸ線回折パターンが、２５度の２シータにおける最大を持ち、広域で、そして拡散している、前記治療の方法、即ち態様１ないし５のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様７］  前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムＸ線回折パターンが、結晶質ヒドロキシアパタイトのＸ線回折パターンに伴う一つ又はそれより多いピークを欠く、前記治療の方法、即ち態様１ないし６のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様８］  前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、胃腸管内の細胞による取込みが可能であるナノ粒子を形成するために分散することが可能である、前記治療の方法、即ち態様１ないし７のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様９］  前記ナノ粒子が、腸の粘膜の免疫細胞による取込みが可能である、前記治療の方法、即ち態様８に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様１０］  前記胃腸管内の細胞が、腸内に存在する抗原提示免疫細胞である、前記治療の方法、即ち態様８及び９のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様１１］  前記組成物が、生物学的に活性なカーゴ物質を、パイエル板又は腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）に供給する、前記治療の方法、即ち態様１ないし１０のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様１２］  前記組成物が、経口投与、鼻腔胃投与又は直腸投与のためである、前記治療の方法、即ち態様１ないし１１のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様１３］  前記組成物が、経口投与のためにカプセル化されている、前記治療の方法、即ち態様１２に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様１４］  前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、ＣＤ１１ｂ陽性細胞及び／又はＣＤ１１ｃ陽性細胞による取込みが可能であるナノ粒子を形成するために分散することが可能である、前記治療の方法、即ち態様１ないし１３のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様１５］  前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、樹状細胞及び／又はマクロファージによる取込みが可能であるナノ粒子を形成するために分散することが可能である、前記治療の方法、即ち態様１ないし１４のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様１６］  前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、自己免疫性疾患、癌、食物アレルギー及び／又は不耐性を治療する方法において使用するための、前記治療の方法、即ち態様１ないし１５のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様１７］  前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、炎症性腸疾患の治療又は予防の方法において使用するための、前記治療の方法、即ち態様１ないし１６のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様１８］  前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、クローン病又はセリアック病の治療或いは予防の方法において使用するための、前記治療の方法、即ち態様１ないし１７のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様１９］  前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、患者のワクチン接種の方法において使用するためのものであり、そして前記生物学的に活性なカーゴ分子が治療的ワクチン組成物である、前記治療の方法、即ち態様１ないし１８のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様２０］  前記治療的ワクチン組成物が、癌の治療又は予防のためのものである、前記治療の方法、即ち態様１９に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様２１］  前記癌が、骨髄性白血病である、前記治療の方法、即ち態様２０に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様２２］  前記治療的ワクチン組成物が、自己免疫性疾患の治療又は予防のためのものであり、ここにおいて、前記ワクチン組成物が、自己免疫Ｔ細胞及び自己抗体反応に対する耐性を誘発することが可能である、前記治療の方法、即ち態様１９に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様２３］  前記自己免疫性症状が、多発性硬化症である、前記治療の方法、即ち態様２２に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様２４］  前記治療的ワクチン組成物が、炎症性腸疾患の治療又は予防のためのものである、前記治療の方法、即ち態様１９に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様２５］  前記炎症性腸疾患が、クローン病又はセリアック病である、前記治療の方法、即ち態様２４に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様２６］  前記治療的ワクチン組成物が、Ｉ型糖尿病の治療又は予防のためのものである、前記治療の方法、即ち態様１９に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様２７］  前記治療的ワクチン組成物が、全身性エリテマトーシス（ＳＬＥ）の治療又は予防のためのものである、前記治療の方法、即ち態様１９に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様２８］  前記カーゴ物質が、カーゴ分子又はカーゴナノ粒子である、前記治療の方法、即ち態様１ないし２７のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様２９］  前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、興味ある部位に生物学的に活性なカーゴ分子を供給するために分散されることが可能な凝集したナノ粒子を含んでなる、前記治療の方法、即ち態様１ないし２８のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様３０］  前記ナノ粒子が、金属基剤ナノ粒子又は金属オキソ−水酸化物基剤ナノ粒子である、前記治療の方法、即ち態様２９に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様３１］  前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、興味ある部位において非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムに対して、単独の生物学的に活性なカーゴ物質に対する反応と実質的に異なる補助的な反応を起こさないサイレントな供給プラットフォームである、前記治療の方法、即ち態様１ないし３０のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様３２］  前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、興味ある部位において非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムに対して、直接的な転写反応を起こさないサイレントな供給プラットフォームである、前記治療の方法、即ち態様１ないし３１のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様３３］  前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムが、マグネシウムイオン及び／又は生物学的に活性なカーゴ分子によって安定化される、前記治療の方法、即ち態様１ないし３２のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様３４］  前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム中のＭｇ：Ｃａの比が、少なくとも１：２５、更に好ましくは少なくとも１：２０、更に好ましくは少なくとも１：１０、更に好ましくは少なくとも１：５、更に好ましくは少なくとも１：４、そして最も好ましくは１：３である、前記治療の方法、即ち態様１ないし３３のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様３５］  前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が、複数のカーゴ分子を含んでなる、前記治療の方法、即ち態様１ないし３４のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様３６］  前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が、二つ又はそれより多い異なったカーゴ分子を含んでなる、前記治療の方法、即ち態様３５に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様３７］  前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が、三つ又はそれより多いカーゴ分子を含んでなる、前記治療の方法、即ち態様３５又は３６のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様３８］  前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が、治療的ワクチン成分及び免疫賦活剤又は耐性誘導剤を含んでなる、前記治療の方法、即ち態様３５ないし３７のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様３９］  前記生物学的に活性なカーゴ物質が、治療的カーゴ分子である、前記治療の方法、即ち態様１ないし３８のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様４０］  前記生物学的に活性なカーゴ物質が、栄養補助食品カーゴ分子である、前記治療の方法、即ち態様１ないし３９のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様４１］  前記カーゴ物質が、タンパク質抗原、生理活性なサイトカイン、ペプチドグリカン、低分子量有機分子及びナノ粒子からなる群から選択される、前記治療の方法、即ち態様１ないし４０のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様４２］  前記カーゴ物質が、ペプチドグリカン、ムラミルジペプチドを含むペプチドグリカンサブユニット、自己抗原、ワクチン組成物、核酸配列、標的細胞に対するＰＤ−Ｌ１発現を修復する分子、組織又は細胞ホモジネート／懸濁液／上清、栄養素、栄養補助食品、タンパク質、ペプチド配列を含むタンパク質抗原及びアレルゲンからなる群から選択される、前記治療の方法、即ち態様１ないし４１のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様４３］  前記カーゴ物質が、栄養素、ナノ粒子、治療的分子、ワクチン、核酸分子、例えばＤＮＡ又はＲＮＡである、前記治療の方法、即ち態様１ないし４２のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様４４］  前記組成物が、ｅｘ  ｖｉｖｏで細胞にカーゴ分子を供給するために使用され、ここにおいて、供給されたカーゴ分子を含んでなる前記ｅｘ  ｖｉｖｏの細胞が、受容者への再導入のためのものであるか、及び／又はここにおいて、カーゴにより形質移入されたｅｘ  ｖｉｖｏの細胞に影響された細胞が、受容者への再導入のためのものである、前記治療の方法、即ち態様１ないし４３のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様４５］  非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が、カーゴ分子を捕捉するために多孔質である、前記治療の方法、即ち態様１ないし４４のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様４６］  前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムのナノ粒子が、２０ｎｍ及び３５０ｎｍ間の範囲の平均直径を有する、前記治療の方法、即ち態様１ないし４５のいずれか１項に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様４７］  少なくとも７５％の前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムのナノ粒子が、前記範囲の平均直径を有する、前記治療の方法、即ち態様４６に記載の治療の方法において使用するための組成物。
［態様４８］  クローン病を治療する方法において使用するための腸内リンパ濾胞の抗原提示免疫細胞内のＰＤ−Ｌ１発現を促進することが可能な薬剤。
［態様４９］  診断又は画像化の方法において使用するための組成物であって、ここにおいて、前記組成物は、非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム（ＡＭＣＰ）を含んでなり、ここにおいて、前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムは、検出可能な分子を捕捉する、前記組成物。
［態様５０］  前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物が、胃腸管内の興味ある部分にカーゴ物質を供給することが可能である、態様４９に記載の診断又は画像化の方法において使用するための組成物。
［態様５１］  前記検出可能な分子が、ナノ粒子、例えば金属基剤ナノ粒子又は金属オキソ−水酸化物ナノ粒子を含んでなる、態様４９に記載の診断又は画像化の方法において使用するための組成物。
［態様５２］  捕捉した生物学的に活性なカーゴ物質を含有する非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウム組成物を製造するための方法であって：
（ａ）カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を含んでなる溶液及びリン酸イオン（ＰＯ４２−）を含んでなる溶液を用意し、ここにおいて、溶液の一つ又は両方は、一つ又はそれより多い生物学的に活性なカーゴ物質を含んでなり；
（ｂ）カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を含んでなる溶液を、リン酸イオン（ＰＯ４２−）を含んでなる溶液と混合して、その中に生物学的に活性なカーゴ物質が捕捉された非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムを沈殿させ；
（ｃ）非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムを回収し；そして
（ｄ）所望により前記非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムを洗浄及び乾燥すること；
を含んでなる、前記方法。
［態様５３］  カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）及び生物学的に活性なカーゴ分子を含んでなる溶液が、少なくとも８．０のｐＨに緩衝される、態様５２に記載の方法。
［態様５４］  前記生物学的に活性なカーゴ分子が、リン酸カルシウムの結晶質相への転換に対する非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムの安定性を、捕捉されたカーゴ物質含まない対応する組成物と比較して増加する、態様５２又は５３のいずれか１項に記載の方法。
［態様５５］  前記洗浄及び乾燥工程が、前記組成物をアセトン中に再スラリー化し、そして前記洗浄された組成物を遠心を使用して乾燥することを含んでなる、態様５２ないし５４のいずれか１項に記載の方法。
［態様５６］  前記洗浄及び乾燥工程が、２回繰り返される、態様５５に記載の方法。
［態様５７］  前記工程（ａ）及び／又は（ｂ）中のｐＨが、８．０より大きい、態様５２ないし５６のいずれか１項に記載の方法。
［態様５８］  記緩衝液が、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ、ＴＲＩＣＩＮＥ又はクエン酸緩衝液、或いはアミノ酸、例えばリシン又はグリシンである、態様５２ないし５７のいずれか１項に記載の方法。
［態様５９］  更に非晶質マグネシウム置換リン酸カルシウムを、医薬組成物として処方することを含んでなる、態様５２ないし５８のいずれか１項に記載の方法。
【外国語明細書】
2020073467000001.pdf