(57)【要約】【課題】植物品種がストレス負荷の環境下に晒され、該植物品種間で特定の遺伝子あるいはＤＮＡ多型を共通に保有している場合であっても、該ストレス耐性に関連する遺伝子を特定する方法の提供。【解決手段】下記の工程を含む、植物品種のストレス耐性マーカー遺伝子の特定方法。（ａ）第一の植物品種及び第二の植物品種を準備する工程；（ｂ）該第一の植物品種及び該第二の植物品種に該ストレスを負荷する工程；（ｃ）該ストレス負荷の開始時刻、及び該ストレス負荷開始後の所定の時刻において、該第一の植物品種及び該第二の植物品種のそれぞれが含む遺伝子のｍＲＮＡの発現量情報を取得する工程；及び（ｄ）第一相対発現量が第二相対発現量と相違する遺伝子を特定する工程。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含む、植物品種のストレス耐性マーカー遺伝子の特定方法。
（ａ）ストレス耐性を有する第一の植物品種、及び該第一の植物品種よりストレス耐性の強弱を示す指標が小さい第二の植物品種を準備する工程；
（ｂ）該第一の植物品種及び該第二の植物品種に該ストレスを負荷する工程；
（ｃ）該ストレス負荷の開始時刻、及び該ストレス負荷開始後の所定の時刻において、該第一の植物品種及び該第二の植物品種のそれぞれが含む遺伝子のｍＲＮＡの発現量情報を取得する工程；及び
（ｄ）該ストレス負荷の開始時刻における該第一の植物品種が含む遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する、該ストレス負荷開始後の所定の時刻における該ｍＲＮＡの相対発現量である第一相対発現量が、該ストレス負荷の開始時刻における該第二の植物品種が含む該遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する、該ストレス負荷開始後の所定の時刻における該第二の植物品種の該ｍＲＮＡの相対発現量である第二相対発現量と相違する遺伝子を特定する工程。
【請求項２】
前記工程（ｄ）において、前記第一相対発現量が前記第二相対発現量よりも大きい、請求項１に記載の特定方法。
【請求項３】
前記工程（ｄ）において、前記第一相対発現量の前記第二相対発現量に対する比率が１．０５以上である、請求項１又は２に記載の特定方法。
【請求項４】
前記工程（ｄ）において、前記第一相対発現量が前記第二相対発現量よりも小さい、請求項１に記載の特定方法。
【請求項５】
前記工程（ｄ）において、前記第一相対発現量の前記第二相対発現量に対する比率が０．９５以下である、請求項１又は４に記載の特定方法。
【請求項６】
前記ストレスが高温ストレスである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の特定方法。
【請求項７】
前記高温ストレス耐性の強弱を示す指標が、地上部重量変化量、根部重量変化量、光化学系ＩＩの量子収率の変化量及びしおれ量の平均値である、請求項６に記載の特定方法。
【請求項８】
前記高温ストレスが、所定の温度より５〜４５℃高い温度の環境下で受けるストレスである、請求項６又は７に記載の特定方法。
【請求項９】
前記工程（ｃ）及び工程（ｄ）における高温ストレス負荷開始後の所定の時刻が、前記高温ストレス負荷開始後５分から５時間の間の時刻である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の特定方法。
【請求項１０】
前記高温ストレスが、所定の温度より２０〜３０℃高い温度の環境下で受けるストレスである、請求項６又は７に記載の特定方法。
【請求項１１】
前記工程（ｃ）及び工程（ｄ）における高温ストレス負荷開始後の所定の時刻が、前記高温ストレス負荷開始後１時間から２時間の間の時刻である、請求項６、７、及び１０のいずれか１項に記載の特定方法。
【請求項１２】
前記植物がナス科の植物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の特定方法。
【請求項１３】
前記植物がトマトである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の特定方法。
【請求項１４】
下記工程を含む、複数の植物品種から成る群からストレス耐性を有する植物品種を識別する方法。
（ｅ）複数の植物品種から成る群にストレスを負荷する工程；
（ｆ）該ストレス負荷の開始時刻、及び該ストレス負荷開始後の所定の時刻において、該複数の植物品種のそれぞれが含む、請求項２又は３に記載の特定方法で特定されたストレス耐性マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量情報を取得する工程；及び
（ｇ）該ストレス負荷の開始時刻における該遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する、該ストレス負荷開始後の所定の時刻における該ｍＲＮＡの相対発現量が、他の植物品種のそれよりも大きい植物品種を、該複数の植物品種から成る群から識別する工程。
【請求項１５】
前記工程（ｇ）が、前記ストレス負荷の開始時刻における前記遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する、該ストレス負荷開始後の所定の時刻における該ｍＲＮＡの相対発現量が、他の植物品種のそれの１．０５倍以上である植物品種を、該複数の植物品種から成る群から識別する工程である、請求項１４に記載の識別方法。
【請求項１６】
前記遺伝子が、Hsp22.0、DREB2A、HsfA2、GSTU25、FBS2、Hsp17.4-CIII、Hsp25.3-P、MADS-box、FtsH6、及びBAG5からなる群から選択される遺伝子である、請求項１４又は１５に記載の識別方法。
【請求項１７】
下記工程を含む、複数の植物品種から成る群からストレス耐性を有する植物品種を識別する方法。
（ｅ）複数の植物品種からなる群にストレスを負荷する工程；
（ｆ´）該ストレス負荷の開始時刻、及び該ストレス負荷開始後の所定の時刻において、該複数の植物品種のそれぞれが含む、請求項４又は５に記載の特定方法で特定されたストレス耐性マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量情報を取得する工程；及び
（ｇ´）該ストレス負荷の開始時刻における該遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する、該ストレス負荷開始後の所定の時刻における該ｍＲＮＡの相対発現量が、他の植物品種のそれよりも小さい植物品種を、該複数の植物品種から成る群から識別する工程。
【請求項１８】
前記工程（ｇ´）が、前記ストレス負荷の開始時刻における前記遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する、該ストレス負荷開始後の所定の時刻における該ｍＲＮＡの相対発現量が、他の植物品種のそれの０．９５倍以下である植物品種を、該複数の植物品種から成る群から識別する工程である、請求項１７に記載の識別方法。
【請求項１９】
前記ストレスが高温ストレスである、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の識別方法。
【請求項２０】
前記高温ストレス耐性の強弱を示す指標が、地上部重量変化量、根部重量変化量、光化学系ＩＩの量子収率の変化量及びしおれ量の平均値である、請求項１９に記載の識別方法。
【請求項２１】
前記高温ストレスが、所定の温度より５〜４５℃高い温度の環境下で受けるストレスである、請求項１９又は２０に記載の識別方法。
【請求項２２】
前記工程（ｆ）又は（ｆ´）及び工程（ｇ）又は（ｇ´）における高温ストレス負荷開始後の所定の時刻が、前記高温ストレス負荷開始後５分から５時間の間の時刻である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の識別方法。
【請求項２３】
前記高温ストレスが、所定の温度より２０〜３０℃高い温度の環境下で受けるストレス
である、請求項１９又は２０に記載の識別方法。
【請求項２４】
前記工程（ｆ）又は（ｆ´）及び工程（ｇ）又は（ｇ´）における高温ストレス負荷開始後の所定の時刻が、前記高温ストレス負荷開始後１時間から２時間の間の時刻である、請求項１９、２０、及び２３のいずれか１項に記載の識別方法。
【請求項２５】
前記植物がナス科の植物である、請求項１４〜２４のいずれか１項に記載の識別方法。
【請求項２６】
前記植物がトマトである、請求項１４〜２５のいずれか１項に記載の識別方法。
【請求項２７】
下記工程を含む、ストレス耐性を有する植物品種の個体の育種方法。
（ｈ）請求項１４〜２６のいずれか１項に記載の識別方法で識別された植物品種の個体を根部として接ぎ木する工程。
【請求項２８】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の特定方法で特定されたストレス耐性マーカー遺伝子を有しない植物品種に該ストレス耐性マーカー遺伝子が導入された、植物品種。
【請求項２９】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の特定方法で特定されたストレス耐性マーカー遺伝子を有する植物品種において、該ストレス耐性マーカー遺伝子が欠失した、植物品種。
【請求項３０】
前記ストレス耐性マーカー遺伝子の導入又は欠失がゲノム編集によるものである、請求項２８又は２９に記載の植物品種。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物品種のストレス耐性マーカー遺伝子の特定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ストレス（例：高温ストレス等）に対して耐性の強い植物品種を見つけるために、ストレス負荷の環境下で育種し、得られた成果物（例：果物等）の量、大きさ、色、形、味、耐病性等の形質（表現型）を基準として該ストレスに対して耐性の強い個体を選抜し、育種していた。具体的な方法の一つにＤＮＡマーカー選抜法がある。これは、例えば、水稲の品種間で遺伝子に若干の相違があることを利用し、その相違を目印として目的とする優良個体を間接的に選抜する方法である（非特許文献１、２）。すなわち、従来法とは、特定の遺伝子あるいはＤＮＡ多型の有無という静的な情報に基づく優良個体の選抜方法であるといえる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】石井卓朗、“新しい技術「ＤＮＡマーカー選抜」から生まれた品種”、［online］、2008年３月16日（2014年６月 一部改訂）、［平成29年９月12日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.jeinou.com/benri/rice/variety/2008/03/160926.html＞
【非特許文献２】農林水産研究開発レポートNo.21「ゲノム情報の品種改良への利用―ＤＮＡマーカー育種―、農林水産省農林水産技術会議監修、農林水産省農林水産技術会議事務局編集・発行、2007年７月31日発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
植物がストレス負荷の環境下に晒された場合、該植物が含む各遺伝子の発現量（発現のオン／オフを含む。）は鋭敏に変動する。ＤＮＡマーカー選抜法は、飽くまで、静的な情報に基づいて優良個体を選抜する方法であって、対象となる植物品種が対象となる遺伝子あるいはＤＮＡ多型を保有していても、ストレス負荷の環境下に晒された場合の該遺伝子の発現の有無や、その発現量の変動に基づいて優良個体を選抜するものではない。従って、植物品種間で対象となる遺伝子あるいはＤＮＡ多型が共通に保有されている場合には、そのうち、該ストレス耐性に関連する遺伝子を特定することが困難であり、その特定に基づいて優良個体を選抜することができない。
本発明は、植物品種がストレス負荷の環境下に晒され、該植物品種間で特定の遺伝子あるいはＤＮＡ多型を共通に保有している場合であっても、該ストレス耐性に関連する遺伝子を特定する方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、植物品種がストレス負荷の環境下に晒された際の、該植物品種が含む遺伝子のｍＲＮＡの発現量の変動を解析することで、該ストレス耐性に関連する遺伝子を特定できることを見出した。本発明は下記の通りである。
【０００６】
〔１〕下記の工程を含む、植物品種のストレス耐性マーカー遺伝子の特定方法。
（ａ）ストレス耐性を有する第一の植物品種、及び該第一の植物品種よりストレス耐性の強弱を示す指標が小さい第二の植物品種を準備する工程；
（ｂ）該第一の植物品種及び該第二の植物品種に該ストレスを負荷する工程；
（ｃ）該ストレス負荷の開始時刻、及び該ストレス負荷開始後の所定の時刻において、該第一の植物品種及び該第二の植物品種のそれぞれが含む遺伝子のｍＲＮＡの発現量情報を取得する工程；及び
（ｄ）該ストレス負荷の開始時刻における該第一の植物品種が含む遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する、該ストレス負荷開始後の所定の時刻における該ｍＲＮＡの相対発現量である第一相対発現量が、該ストレス負荷の開始時刻における該第二の植物品種が含む該遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する、該ストレス負荷開始後の所定の時刻における該第二の植物品種の該ｍＲＮＡの相対発現量である第二相対発現量と相違する遺伝子を特定する工程。
〔２〕前記工程（ｄ）において、前記第一相対発現量が前記第二相対発現量よりも大きい、〔１〕に記載の特定方法。
〔３〕前記工程（ｄ）において、前記第一相対発現量の前記第二相対発現量に対する比率が１．０５以上である、〔１〕又は〔２〕に記載の特定方法。
〔４〕前記工程（ｄ）において、前記第一相対発現量が前記第二相対発現量よりも小さい、〔１〕に記載の特定方法。
〔５〕前記工程（ｄ）において、前記第一相対発現量の前記第二相対発現量に対する比率が０．９５以下である、〔１〕又は〔４〕に記載の特定方法。
〔６〕前記ストレスが高温ストレスである、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の特定方法。
〔７〕前記高温ストレス耐性の強弱を示す指標が、地上部重量変化量、根部重量変化量、光化学系ＩＩの量子収率の変化量及びしおれ量の平均値である、〔６〕に記載の特定方法。
〔８〕前記高温ストレスが、所定の温度より５〜４５℃高い温度の環境下で受けるストレスである、〔６〕又は〔７〕に記載の特定方法。
〔９〕前記工程（ｃ）及び工程（ｄ）における高温ストレス負荷開始後の所定の時刻が、前記高温ストレス負荷開始後５分から５時間の間の時刻である、〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の特定方法。
〔１０〕前記高温ストレスが、所定の温度より２０〜３０℃高い温度の環境下で受けるストレスである、〔６〕又は〔７〕に記載の特定方法。
〔１１〕前記工程（ｃ）及び工程（ｄ）における高温ストレス負荷開始後の所定の時刻が、前記高温ストレス負荷開始後１時間から２時間の間の時刻である、〔６〕、〔７〕、及び〔１０〕のいずれかに記載の特定方法。
〔１２〕前記植物がナス科の植物である、〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の特定方法。
〔１３〕前記植物がトマトである、〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の特定方法。
〔１４〕下記工程を含む、複数の植物品種から成る群からストレス耐性を有する植物品種を識別する方法。
（ｅ）複数の植物品種から成る群にストレスを負荷する工程；
（ｆ）該ストレス負荷の開始時刻、及び該ストレス負荷開始後の所定の時刻において、該複数の植物品種のそれぞれが含む、請求項２又は３に記載の特定方法で特定されたストレス耐性マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量情報を取得する工程；及び
（ｇ）該ストレス負荷の開始時刻における該遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する、該ストレス負荷開始後の所定の時刻における該ｍＲＮＡの相対発現量が、他の植物品種のそれよりも大きい植物品種を、該複数の植物品種から成る群から識別する工程。
〔１５〕前記工程（ｇ）が、前記ストレス負荷の開始時刻における前記遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する、該ストレス負荷開始後の所定の時刻における該ｍＲＮＡの相対発現量が、他の植物品種のそれの１．０５倍以上である植物品種を、該複数の植物品種から成る群から識別する工程である、〔１４〕に記載の識別方法。
〔１６〕前記遺伝子が、Hsp22.0、DREB2A、HsfA2、GSTU25、FBS2、Hsp17.4-CIII、Hsp25.3-P、MADS-box、FtsH6、及びBAG5からなる群から選択される遺伝子である、〔１４〕又は
〔１５〕に記載の識別方法。
〔１７〕下記工程を含む、複数の植物品種から成る群からストレス耐性を有する植物品種を識別する方法。
（ｅ）複数の植物品種からなる群にストレスを負荷する工程；
（ｆ´）該ストレス負荷の開始時刻、及び該ストレス負荷開始後の所定の時刻において、該複数の植物品種のそれぞれが含む、請求項４又は５に記載の特定方法で特定されたストレス耐性マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量情報を取得する工程；及び
（ｇ´）該ストレス負荷の開始時刻における該遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する、該ストレス負荷開始後の所定の時刻における該ｍＲＮＡの相対発現量が、他の植物品種のそれよりも小さい植物品種を、該複数の植物品種から成る群から識別する工程。
〔１８〕前記工程（ｇ´）が、前記ストレス負荷の開始時刻における前記遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する、該ストレス負荷開始後の所定の時刻における該ｍＲＮＡの相対発現量が、他の植物品種のそれの０．９５倍以下である植物品種を、該複数の植物品種から成る群から識別する工程である、〔１７〕に記載の識別方法。
〔１９〕前記ストレスが高温ストレスである、〔１４〕〜〔１８〕のいずれかに記載の識別方法。
〔２０〕前記高温ストレス耐性の強弱を示す指標が、地上部重量変化量、根部重量変化量、光化学系ＩＩの量子収率の変化量及びしおれ量の平均値である、〔１９〕に記載の識別方法。
〔２１〕前記高温ストレスが、所定の温度より５〜４５℃高い温度の環境下で受けるストレスである、〔１９〕又は〔２０〕に記載の識別方法。
〔２２〕前記工程（ｆ）又は（ｆ´）及び工程（ｇ）又は（ｇ´）における高温ストレス負荷開始後の所定の時刻が、前記高温ストレス負荷開始後５分から５時間の間の時刻である、〔１９〕〜〔２１〕のいずれかに記載の識別方法。
〔２３〕前記高温ストレスが、所定の温度より２０〜３０℃高い温度の環境下で受けるストレスである、〔１９〕又は〔２０〕に記載の識別方法。
〔２４〕前記工程（ｆ）又は（ｆ´）及び工程（ｇ）又は（ｇ´）における高温ストレス負荷開始後の所定の時刻が、前記高温ストレス負荷開始後１時間から２時間の間の時刻である、〔１９〕、〔２０〕、及び〔２３〕のいずれかに記載の識別方法。
〔２５〕前記植物がナス科の植物である、〔１４〕〜〔２４〕のいずれかに記載の識別方法。
〔２６〕前記植物がトマトである、〔１４〕〜〔２５〕のいずれかに記載の識別方法。
〔２７〕下記工程を含む、ストレス耐性を有する植物品種の個体の育種方法。
（ｈ）〔１４〕〜〔２６〕のいずれかに記載の識別方法で識別された植物品種の個体を根部として接ぎ木する工程。
〔２８〕〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の特定方法で特定されたストレス耐性マーカー遺伝子を有しない植物品種に該ストレス耐性マーカー遺伝子が導入された、植物品種。〔２９〕〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の特定方法で特定されたストレス耐性マーカー遺伝子を有する植物品種において、該ストレス耐性マーカー遺伝子が欠失した、植物品種。
〔３０〕前記ストレス耐性マーカー遺伝子の導入又は欠失がゲノム編集によるものである、〔２８〕又は〔２９〕に記載の植物品種。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、植物品種がストレス負荷の環境下に晒され、該植物品種間で特定の遺伝子あるいはＤＮＡ多型を共通に保有している場合であっても、発現量が該ストレス耐性と関連する遺伝子を特定する方法が提供できる。
また、本方法で特定された遺伝子は、その植物品種のストレス負荷時の発現量とストレス耐性との相関性が認められたものである。そのため、同一植物における複数の植物個体から成る群において、該遺伝子のｍＲＮＡの発現量情報が得られれば、該植物個体が該ス
トレスに対してどの程度の耐性を有しているかが識別できる。
さらに、このようにして識別された植物個体を用い、育種することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の一実施例に係る、各植物品種におけるストレス耐性の強弱を示す各指標に関する結果を表す図である。
【図２】本発明の一実施例に係る、各植物品種におけるストレス耐性の強弱を示す指標Ｚ値の結果を表す図である。
【図３】本発明の一実施例に係る、ＡｒｋとＳＦにおける高温ストレス負荷開始前と高温ストレス負荷開始後の所定の時刻とにおける所定の遺伝子のｍＲＮＡの発現量を表す図である。
【図４】本発明の一実施例に係る、マイクロアレイによる、ＡｒｋとＳＦにおける高温ストレス負荷開始後の遺伝子発現解析結果を表す図である。Ａは、発現が上昇した遺伝子と発現が低下した遺伝子の数を示す図である。Ｂは、マイクロアレイ解析した全遺伝子の発現変動を表す図である。
【図５】本発明の一実施例に係る、マイクロアレイによる、ＡｒｋとＳＦにおける高温ストレス負荷開始後の遺伝子発現解析結果の一部を表す図である。
【図６】本発明の一実施例に係る、Ａｒｋ、ＳＦ、Ｍｍ８、Ｙｕｂｉ、及びＲＧＬにおける高温ストレス負荷開始前と高温ストレス負荷開始後の所定の時刻とにおける所定の遺伝子のｍＲＮＡの発現量を表す図である。
【図７】本発明の一実施例に係る、Ａｒｋ、ＳＦ、Ｍｍ８、Ｙｕｂｉ、及びＲＧＬにおける高温ストレス負荷開始前と高温ストレス負荷開始後の所定の時刻とにおける所定の遺伝子のｍＲＮＡの発現量を表す図である。
【図８】本発明の一実施例に係る、植物品種間における所定の遺伝子のｍＲＮＡの発現量差を標準化した指標Ｚ２値の結果を表す図である。
【図９】本発明の一実施例に係る、Ａｒｋ、ＳＦ、Ｍｍ８、Ｙｕｂｉ、及びＲＧＬにおける高温ストレス負荷開始前と高温ストレス負荷開始後の所定の時刻とにおける所定の遺伝子のｍＲＮＡの発現量を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の一実施態様は、下記（ａ）乃至（ｄ）の工程を含む、植物品種のストレス耐性マーカー遺伝子の特定方法である。該方法は、植物品種のストレス耐性マーカー遺伝子となり得る候補遺伝子の特定方法であってもよい。
【００１０】
＜工程（ａ）＞
工程（ａ）は、ストレス耐性を有する植物品種（第一の植物品種）、及び該第一の植物品種よりストレス耐性の強弱を示す指標が小さい植物品種（第二の植物品種）を準備する工程である。
【００１１】
第一の植物品種の植物としては、例えば、ナス科の植物、イネ科の植物、マメ科の植物等が挙げられる。ナス科の植物としては、例えば、トマト、ナス、ジャガイモ、トウガラシ、ピーマン等が挙げられる。イネ科の植物としては、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ等が挙げられる。マメ科の植物としては、例えば、サヤインゲン、サヤエンドウ、エダマメ、ソラマメ、小豆、落花生等が挙げられる。
【００１２】
第一の植物品種の品種とは、品種登録された品種をいい、登録品種の特性を有する植物個体を含む。トマトにはその品種として、例えば、アーカンソートラベラー（Ａｒｋ）、桃太郎８（Ｍｍ８）、スーパーファースト（ＳＦ）、サターン（Ｓａｔ）、優美（Ｙｕｂｉ）、ルージュグロッセリッセ（ＲＧＬ）等が挙げられる。
第一の植物品種は、通常の栽培条件で栽培されているものを用いればよく、栽培条件と
しては、例えば、実施例に記載される栽培条件が挙げられる。
【００１３】
第二の植物品種については上記第一の植物品種の説明を援用する。尚、第一の植物と第二の植物とは、通常には同一の植物である。
【００１４】
ストレスとしては、高温ストレス、低温ストレス、乾燥ストレス、日照不足ストレス、強光ストレス、浸水ストレス、塩ストレス、重金属ストレス、栄養欠乏ストレス等が挙げられる。好ましくは、より短時間で耐性試験ができる高温ストレス、低温ストレスである。高温ストレスとは、高温環境下において植物個体が受けるストレスをいう。他のストレスについても同様である。
また、ストレス耐性とは、植物品種が前記ストレスに耐える性質をいう。
【００１５】
ストレス耐性の強弱を示す指標は、ストレス負荷前後の地上部重量変化量、根部重量変化量、光化学系ＩＩの量子収率の変化量、しおれ量、相対水分量の変化量、出液速度の変化量、葉からの蒸散量の変化量、気孔密度の変化量、気孔開度の変化量、生重量の変化量、乾燥重量の変化量、葉緑素量の変化量、葉面積の変化量、作物としての収率（果実が生る植物であれば着果率）の変化量等からなる群から選択される一以上の指標の総合評価（各変化量の平均値）であり、該総合評価が大きい場合にストレス耐性が強く、該平均値が小さい場合にストレス耐性が弱いとする。
指標の数としては３以上が好ましく、４以上がより好ましく、地上部重量変化量（ＺＳ値）、根部重量変化量（ＺＲ値）、光化学系ＩＩの量子収率の変化量（ＺＰ値）、及びしおれ量（ＺＷ値）の総合評価（ＺＳ値、ＺＲ値、ＺＰ値、及びＺＷ値から成る４つの値の平均値とし、これを「Ｚ値」と定義する。）がさらに好ましい。
【００１６】
各指標は、対象とする植物品種をストレス区（ストレスを負荷する群）と対照区（ストレスを負荷しない群）とに分け、ストレス区の植物品種にストレスを負荷し、対照区にはストレスを負荷しないこと以外はストレス区と同様に試験をし、例えば、次のように測定することができる。
【００１７】
地上部重量変化量（ＺＳ値）は、試験前の植物個体の地上部重量と、試験後１週間生育させた植物個体の地上部重量との差とすることができる。対象とする植物個体数は複数であることが好ましく、その場合は、各差を平均した値を採用する。好ましくは８個体以上である。
根部重量変化量（ＺＲ値）については、地上部重量変化量（ＺＳ値）と同様である。
光化学系ＩＩの量子収率（Ｆｖ／Ｆｍ）の変化量（ＺＰ値）は、例えば、Open-FluorCam FC 800（Photon Systems Instruments社）を用いてクロロフィル蛍光を暗室で測定すること等で測定できる。具体的には、植物個体全体を３０分間暗処理した後、第１本葉全体で２次元的に測定すること等が挙げられる。対象とする植物個体数は複数であることが好ましく、その場合は、各差を平均した値を採用する。好ましくは８個体以上である。
しおれ量の変化量（ＺＷ値）は、試験前の植物個体の第１本葉と第２本葉の先端を結んだ直線距離と、試験後１週間生育させた植物個体の第１本葉と第２本葉の先端を結んだ直線距離との差とすることができる。対象とする植物個体数は複数であることが好ましく、その場合は、各差を平均した値を採用する。好ましくは４個体以上である。
後述する実施例の手法に従えば、トマト６品種について算出した前記４指標を用いたＺ値に従い、高温ストレス耐性が強いものから弱いものを順に並べると、Ａｒｋ、Ｓａｔ、Ｍｍ８、Ｙｕｂｉ、ＲＧＬ、ＳＦである。
【００１８】
＜工程（ｂ）＞
工程（ｂ）は、該第一の植物品種及び該第二の植物品種に該ストレスを負荷する工程である。
【００１９】
ストレスを負荷した後の生育期間としては、植物及び植物品種によって異なるが、好ましくは３日以上、より好ましくは５日以上であり、一方で、好ましくは１４日以下、より好ましくは１０日以下である。当該期間であることによって、後述する第一相対発現量と第二相対発現量との相違が検出し易く、長期間を要しないし、長期間のストレスによるダメージの修復中または前に検出して該相違が再び小さくなる前に検出できる。
【００２０】
前記ストレスが高温ストレスである場合の高温とは、第一の植物品種及び第二の植物品種を栽培する際の標準的な温度を所定の温度とした場合に、該所定の温度より高いことをいい、高温ストレス耐性に伴う十分な表現型の差異を識別する観点から、好ましくは５℃以上高い温度、より好ましくは２０℃以上高い温度であり、一方で、不可逆的な植物個体の過度な損傷を防ぐ観点から、好ましくは４５℃以下高い温度、より好ましくは３０℃以下高い温度である。
該所定の温度とは、通常１５℃以上、好ましくは１７℃以上、より好ましくは２２℃以上であり、通常５０℃以下、好ましくは３０℃以下、より好ましくは２５℃以下である。
【００２１】
前記ストレスが高温ストレスである場合のストレス負荷方法としては、栽培温度を前記高温にする以外は通常の栽培条件の下で栽培することが挙げられる。
高温ストレスを負荷する時間は、後述する工程（ｄ）における第一相対発現量と第二相対発現量との相違が大きくなることが好ましく、好ましくは５分以上、より好ましくは１時間以上であり、一方で、高温ストレスによる一次的な影響を適切に評価するために、好ましくは１２時間以下、より好ましくは５時間以下、さらに好ましくは２時間以下である。
【００２２】
＜工程（ｃ）＞
工程（ｃ）は、前記ストレス負荷の開始時刻、及び該ストレス負荷開始後の所定の時刻において、前記第一の植物品種及び前記第二の植物品種のそれぞれが含む遺伝子のｍＲＮＡの発現量情報を取得する工程である。
【００２３】
所定の時刻とは、該ストレス負荷の開始時刻からストレスを負荷している時間内の時刻であればよく、例えば、該ストレス負荷開始から３０分後、１時間後、２時間後等が挙げられる。該所定の時刻は、一の時刻でもよいし、複数の時刻でもよい。
【００２４】
本工程は、前記第一の植物品種及び前記第二の植物品種から、それぞれが含む遺伝子のｍＲＮＡを抽出する工程を含む。その抽出方法は特に制限されないが、例えば、実施例に記載されるように、幼苗地上部を採取し、常法に従って抽出する方法が挙げられる。
【００２５】
ｍＲＮＡの発現量情報を取得する方法は、常法に従うことができる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（例：リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、定量ＲＴ−ＰＣＲ、半定量ＲＴ−ＰＣＲ等）、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ、ＲＮＡｓｅｑ等が挙げられる。半定量ＲＴ−ＰＣＲによる方法としては、例えば、実施例１０に記載する方法が挙げられる。
【００２６】
尚、該ストレスを負荷しない場合を対照として用いる態様も好ましい。該対照が含む遺伝子の発現量が変動した場合には、発現量から対照における変動分を差し引けば、正味の発現量が計算できるからである。尚、通常には、当該対照における遺伝子の発現量と、ストレス負荷の開始時刻における遺伝子の発現量とは同等に扱うことができる。
【００２７】
＜工程（ｄ）＞
工程（ｄ）は、前記ストレス負荷の開始時刻における前記第一の植物品種が含む遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する、該ストレス負荷開始後の所定の時刻における該ｍＲＮＡの
相対発現量（第一相対発現量）が、該ストレス負荷の開始時刻における前記第二の植物品種が含む該遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する、該ストレス負荷開始後の所定の時刻における該第二の植物品種の該ｍＲＮＡの相対発現量（第二相対発現量）と相違する遺伝子を特定する工程である。
【００２８】
前記第一相対発現量が前記第二相対発現量と相違する態様は、前記第一相対発現量が前記第二相対発現量よりも大きい態様、及び前記第一相対発現量が前記第二相対発現量よりも小さい態様を含む。
【００２９】
前記第一の植物品種は、前記第二の植物品種よりもストレス耐性の強弱を示す指標が大きく、よりストレス耐性が強いことから、前記第一相対発現量が前記第二相対発現量よりも大きい態様においては、該第一相対発現量が該第二相対発現量よりもより大きい遺伝子が、ストレス耐性をより反映している遺伝子であるといえる。該態様における第一相対発現量の第二相対発現量に対する比率は、次第に好ましくなる順に、１．０５以上、１．１０以上、１．１５以上、１．２０以上、１．２５以上、１．３０以上、１．３５以上、１．４０以上、１．５以上、２．０以上、３．０以上、４．０以上、５．０以上、６．０以上、７．０以上、１０以上、１００以上である。該比率はより大きい方が好ましいため上限は特に制限されないが、例えば１００００以下である。この比率は、例えば、表３−１乃至表３−５における「誘導性の比（Ａｒｋ／ＳＦ）」欄の値や、表５における「誘導性」欄の「Ａｒｋ」の値を「ＳＦ」の値で除した値で表される。
【００３０】
一方、前記第一相対発現量が前記第二相対発現量よりも小さい態様についても同様である。該態様における第一相対発現量の第二相対発現量に対する比率は、次第に好ましくなる順に、０．９５以下、０．９０以下、０．８５以下、０．８０以下、０．７５以下、０．７０以下、０．６５以下、０．６０以下、０．５０以下、１０−１以下、１０−２以下である。該比率はより小さい方が好ましいため下限は特に制限されないが、例えば１０−４以上である。
【００３１】
本発明の他の実施態様は、下記工程（ｅ）；（ｆ）又は（ｆ´）；及び（ｇ）又は（ｇ´）を含む、複数の植物品種から成る群からストレス耐性を有する植物品種の識別方法である。
【００３２】
＜工程（ｅ）＞
工程（ｅ）は、複数の植物品種から成る群にストレスを負荷する工程である。
複数の植物品種の植物としては、前記第一の植物品種における植物の説明を援用する。
【００３３】
ストレスの説明には、前記工程（ａ）におけるストレスの説明を援用する。通常には、前記工程（ａ）乃至（ｄ）のストレスと同一のストレスである。
該ストレスを負荷する工程の説明には、前記工程（ｂ）における説明を援用する。
【００３４】
＜工程（ｆ）＞
工程（ｆ）は、前記ストレス負荷の開始時刻、及び前記ストレス負荷開始後の所定の時刻において、前記複数の植物品種のそれぞれが含む、前記特定方法（ただし、前記第一相対発現量が前記第二相対発現量よりも大きい態様）で特定されたストレス耐性マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量情報を取得する工程である。
本工程の説明には、前記工程（ｃ）における説明を援用する。
【００３５】
＜工程（ｆ´）＞
工程（ｆ´）は、前記ストレス負荷の開始時刻、及び前記ストレス負荷開始後の所定の時刻において、前記複数の植物品種のそれぞれが含む、前記特定方法（ただし、前記第一
相対発現量が前記第二相対発現量よりも小さい態様）で特定されたストレス耐性マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量情報を取得する工程である。
本工程の説明には、前記工程（ｃ）における説明を援用する。
【００３６】
＜工程（ｇ）＞
工程（ｇ）は、前記ストレス負荷の開始時刻における、前記特定方法（ただし、前記第一相対発現量が前記第二相対発現量よりも大きい態様）で特定されたストレス耐性マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する、該ストレス負荷開始後の所定の時刻における該ｍＲＮＡの相対発現量が、他の植物品種のそれよりも大きい植物品種を、該複数の植物品種から成る群から識別する工程である。
【００３７】
所定の時刻とは、通常には、前記工程（ｃ）の所定の時刻と同一の所定の時刻である。
【００３８】
前記ストレス負荷の開始時刻における、前記特定方法（ただし、前記第一相対発現量が前記第二相対発現量よりも大きい態様）で特定されたストレス耐性マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する、該ストレス負荷開始後の所定の時刻における該ｍＲＮＡの相対発現量が他の植物品種のそれよりも大きい植物品種は、該複数の植物品種の中でも該ストレスに対する耐性がより強い植物品種であるといえる。
該態様における、前記ストレス負荷の開始時刻における前記遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する、該ストレス負荷開始後の所定の時刻における該ｍＲＮＡの相対発現量は、他の植物品種のそれの、次第に好ましくなる順に、１．０５倍以上、１．１０倍以上、１．１５倍以上、１．２０倍以上、１．２５倍以上、１．３０倍以上、１．３５倍以上、１．４０倍以上、１．５０倍以上、２．０倍以上、３．０倍以上、４．０倍以上、５．０倍以上、６．０倍以上、７．０倍以上、１０倍以上、１００倍以上である。該比率はより大きい方が好ましいため上限は特に制限されないが、例えば１００００倍以下である。
【００３９】
＜工程（ｇ´）＞
工程（ｇ´）は、前記ストレス負荷の開始時刻における、前記特定方法（ただし、前記第一相対発現量が前記第二相対発現量よりも小さい態様）で特定されたストレス耐性マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する、該ストレス負荷開始後の所定の時刻における該ｍＲＮＡの相対発現量が、他の植物品種のそれよりも小さい植物品種を、該複数の植物品種から成る群から識別する工程である。
【００４０】
前記ストレス負荷の開始時刻における、前記特定方法（ただし、前記第一相対発現量が前記第二相対発現量よりも小さい態様）で特定されたストレス耐性マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する、該ストレス負荷開始後の所定の時刻における該ｍＲＮＡの相対発現量が他の植物品種のそれよりも小さい植物品種は、該複数の植物品種の中でも該ストレスに対する耐性がより強い植物品種であるといえる。
該態様における、前記ストレス負荷の開始時刻における前記遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する、該ストレス負荷開始後の所定の時刻における該ｍＲＮＡの相対発現量は、他の植物品種のそれの、次第に好ましくなる順に、０．９５倍以下、０．９０倍以下、０．８５倍以下、０．８０倍以下、０．７５倍以下、０．７０倍以下、０．６５倍以下、０．６０倍以下、０．５０倍以下、１０−１倍以下、１０−２倍以下である。該比率はより小さい方が好ましいため下限は特に制限されないが、例えば１０−４倍以上である。
【００４１】
所定の時刻とは、通常には、前記工程（ｃ）の所定の時刻と同一の所定の時刻である。
【００４２】
本発明の他の実施態様は、下記工程（ｈ）を含む、ストレス耐性を有する植物個体の育種方法である。
【００４３】
＜工程（ｈ）＞
工程（ｈ）は、前記識別方法で識別された植物品種の個体を根部として接ぎ木する工程である。
植物品種の個体を根部として接ぎ木する方法は公知であり、例えば、文献（トマトの接ぎ木苗及びその生産方法、タキイ種苗株式会社、特許第４８７３７７４号）に記載の方法が挙げられる。
【００４４】
＜遺伝子＞
本発明における遺伝子としては、本明細書及び図面に記載されている遺伝子が挙げられる。このうち、好ましくは表１に記載のＩＤが１〜１０の遺伝子である。
【００４５】
また、発現解析はｍＲＮＡの発現量に基づくところ、該ｍＲＮＡの配列は、該ｍＲＮＡの遺伝子におけるエクソンに対応する配列であって、イントロンに対応する配列を含んでいないが、該ｍＲＮＡ配列の発現量が該遺伝子の発現量を反映していることは、当業者であれば容易に理解できる。したがって、該遺伝子は、該遺伝子のエクソンであってもよい。
【００４６】
本発明の他の実施態様は、前記特定方法で特定されたストレス耐性マーカー遺伝子を有しない植物品種に該ストレス耐性マーカー遺伝子が導入された、植物品種である。
本実施態様に係る植物品種は、前記特定方法によって特定されたストレス耐性マーカー遺伝子を、該遺伝子を有しない植物品種に導入することにより得られる、ストレス耐性の強い新たな植物品種である。すなわち、該植物品種は、前記特定方法で特定されたストレス耐性マーカー遺伝子を、該遺伝子を有しない植物品種に導入する工程を含む、植物品種の製造方法により製造される植物品種ということもできる。該遺伝子は、該遺伝子を有しない植物品種において、該遺伝子の導入により該植物品種にストレス耐性を付与する遺伝子であることが好ましい。遺伝子導入の方法としては、該ストレス耐性マーカー遺伝子が導入されれば特に制限はないが、例えば、ウイルスベクターを用いる方法等の常法が挙げられる。また、該ストレス耐性は、人為的でなく自然に得られたストレス耐性よりも強いことが好ましい。
【００４７】
本発明の他の実施態様は、前記特定方法で特定されたストレス耐性マーカー遺伝子を有する植物品種において、該ストレス耐性マーカー遺伝子が欠失した、植物品種である。
本実施態様に係る植物品種は、前記特定方法によって特定されたストレス耐性マーカー遺伝子を、該遺伝子を有する植物品種において欠失させることにより得られる、ストレス耐性の強い新たな植物品種である。すなわち、該植物品種は、前記特定方法で特定されたストレス耐性マーカー遺伝子を、該遺伝子を有する植物品種において欠失させる工程を含む、植物品種の製造方法により製造される植物品種ということもできる。該遺伝子は、該遺伝子を有する植物品種において、該遺伝子の欠失により該植物品種にストレス耐性を付与する遺伝子であることが好ましい。遺伝子導入の方法としては、該ストレス耐性マーカー遺伝子が導入されれば特に制限はないが、例えば、ウイルスベクターを用いる方法等の常法が挙げられる。また、該ストレス耐性は、人為的でなく自然に得られたストレス耐性よりも強いことが好ましい。
【００４８】
前記特定方法で特定されたストレス耐性マーカー遺伝子は、複数であってもよい。植物品種によっては、該複数のストレス耐性マーカー遺伝子をすべて有している植物品種もあれば、すべて有しない植物品種もあり、さらに、該複数のストレス耐性マーカー遺伝子のうち特定のストレス耐性マーカー遺伝子を有しているが、他の特定のストレス耐性マーカー遺伝子を有しない植物品種もある。いずれにおいても、複数のストレス耐性マーカー遺伝子を適当に導入又は欠失させることにより、ストレス耐性の強い新たな植物品種を得ることができる。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を逸脱しない限り、下記の実施例に限定されるものではない。また、図中のエラーバーは、３回の独立した実験で得られた値の標準偏差を示す。
【００５０】
（植物品種）
本実施例では、植物品種としてトマトの品種である、アーカンソートラベラー（Ａｒｋ）、桃太郎８（Ｍｍ８）、スーパーファースト（ＳＦ）、サターン（Ｓａｔ）、優美（Ｙｕｂｉ）、ルージュグロッセリッセ（ＲＧＬ）を用いた。
【００５１】
（植物品種の生育）
各トマト品種の種子を水道水により２５℃で１日間、暗条件で吸水させ、さし芽タネまきの土ジフィーミックス（サカタのタネ）と、バーミキュライト覆土・目土（福島バーミ）とを１：１で混合した栽培土壌を詰めたプラントポット２号（φ70mm×H60mm、大和プ
ラスチック）に、１ポットあたり２粒又は３粒播種した。播種後、湿度60±15%、５時か
ら２１時までの１６時間を２５℃、２１時から５時までの８時間を２０℃に設定したガラス温室にて自然光下で栽培した。１６時３０分から１８時３０分の間は、照明で補光した。子葉が展開後、ポット間で個体の成長が揃うように、１ポットあたり１個体に間引きした。栽培中のポットは、場所によって日照量が異なることに起因する成長の不揃いを解消するために、２、３日毎に設置場所を変えた。播種後１０日目にホーグランド液肥（Hoagland and Arnon, 1950）を１００倍希釈し、与えた。
【００５２】
（高温ストレス耐性の強弱の決定）
［実施例１］
前記６品種を高温区、対照区に配置し、高温区には、４０℃で２時間負荷し、続けて５０℃で９時間負荷した。具体的には、上記「植物品種の生育」欄の生育条件のもと、播種からおよそ３週間経過した、第二本葉が完全に展開し、第三本葉が展開し始めた葉齢２．５期のものを用いた。高温ストレスの負荷には、植物インキュベーター LPH 240/410S（
日本医科機械製作所）を用いた。２台を同時に用いて、一方を高温区用、他方を対照区用とした。いずれも、湿度60±10%、250±25 μmol photons m-2s-1の光量子束密度の環境
とした。
地上部重量変化量（ＺＳ値）については、試験前の各個体の地上部重量と、試験後１週間生育させた各個体の地上部重量との差を測定した。対象とする個体数はいずれも８個体とし、各差を平均した値を算出した。
根部重量変化量（ＺＲ値）についても、地上部重量変化（ＺＳ値）と同様にして、各差を平均した値を算出した。
光化学系ＩＩの量子収率（Ｆｖ／Ｆｍ）の変化量（ＺＰ値）については、Open-FluorCam FC 800（Photon Systems Instruments社）を用いてクロロフィル蛍光を暗室で測定した。測定は、植物個体全体を３０分間暗処理した後、第１本葉全体で２次元的に測定した。対象とする個体数はいずれも８個体とし、各差を平均した値を算出した。
しおれ量（ＺＷ値）については、第１本葉と第２本葉の先端を結んだ直線距離と、４０℃で２時間負荷し、続けて５０℃で４時間負荷した後の各個体の第１本葉と第２本葉の先端を結んだ直線距離との差を測定した。対象とする個体数はいずれも４個体とし、各差を平均した値を算出した。
各品種で算出された各指標を図１に示す。またこれらの平均値（Ｚ値）を図２に示す。
この結果、Ｚ値が最も大きい品種はＡｒｋであり、高温ストレス耐性が最も強いと判断した。一方、Ｚ値が最も小さい品種はＳＦであり、高温ストレス耐性が最も弱いと判断した。尚、高温ストレス負荷後の見かけの強さの値になるしおれ量（ＺＷ値）についてはＲＧＬが最も大きいが、その他の指標まで勘案すると、ＲＧＬは決して高温ストレス耐性が
強い品種というわけではないと判断した。
【００５３】
（定量ＰＣＲ解析）
後述する定量ＰＣＲで用いたプライマーの配列は下表１である。
【００５４】
【表１】
2020043783.tif 000003
【００５５】
ただし、表１のＩＤ１の順方向プライマーを配列番号１とし、逆方向プライマーを配列番号２とした。また、表１のＩＤ２の順方向プライマーを配列番号３とし、逆方向プライマーを配列番号４とした。同様に、表１のＩＤ３の順方向プライマーを配列番号５とし、逆方向プライマーを配列番号６とした。同様に、表１のＩＤ４の順方向プライマーを配列番号７とし、逆方向プライマーを配列番号８とした。同様に、表１のＩＤ５の順方向プライマーを配列番号９とし、逆方向プライマーを配列番号１０とした。同様に、表１のＩＤ６の順方向プライマーを配列番号１１とし、逆方向プライマーを配列番号１２とした。同様に、表１のＩＤ７の順方向プライマーを配列番号１３とし、逆方向プライマーを配列番号１４とした。同様に、表１のＩＤ８の順方向プライマーを配列番号１５とし、逆方向プライマーを配列番号１６とした。同様に、表１のＩＤ９の順方向プライマーを配列番号１７とし、逆方向プライマーを配列番号１８とした。同様に、表１のＩＤ１０の順方向プライマーを配列番号１９とし、逆方向プライマーを配列番号２０とした。同様に、表１のＩＤ「Control」の順方向プライマーを配列番号２１とし、逆方向プライマーを配列番号２
２とした。
【００５６】
［実施例２］
代表的な高温誘導性遺伝子として、表１のＩＤ１である低分子量熱ショックタンパク遺伝子Hsp22.0と、表１のＩＤ２である高温誘導性転写因子DREB2Aを対象とした。遺伝子名
は便宜上、シロイヌナズナにおいて最も配列の類似性が高い相同遺伝子の名称を用いる。
次の手順で、定量ＰＣＲにより遺伝子のｍＲＮＡの発現量を解析した。
１．対象とする品種としてＡｒｋとＳＦを準備した。
２．４０℃、４７℃、又は５０℃で２時間の高温ストレスを負荷した。
３．負荷開始時刻から１、２時間後に、両品種の各３個体の幼苗地上部を採取し、ＲＮＡを抽出した。該ＲＮＡをサンプルとして定量ＰＣＲを行い、ＡｒｋとＳＦにおける該ストレス負荷開始後の前記時刻における該ｍＲＮＡの発現量を解析した。
［比較例２］
各品種についてストレス負荷の開始と同時にサンプリングしたものを対照とした。
［結果］
結果を図３に示す。尚、図３は、ＡｒｋとＳＦについて、ストレス負荷の開始時刻にお
ける発現量に対する該ストレス負荷開始後の前記時刻における該ｍＲＮＡの発現量（相対発現量）を示したものであるが、ＳＦの相対発現量は、Ａｒｋについてのストレス負荷の開始時刻における発現量を用いて標準化したものである。いずれの遺伝子についても、５０℃においてＡｒｋの方がＳＦより発現が強い傾向が認められた。
【００５７】
（マイクロアレイ解析）
［実施例３］
次の手順で、マイクロアレイにより遺伝子のｍＲＮＡの発現量を解析した。
１．対象とする品種としてＡｒｋとＳＦを準備した。
２．５０℃で１時間の高温ストレスを負荷した。これは、実施例２において、両品種間において前記２種類の高温誘導性遺伝子の発現の差が確認された条件のうちの１条件である。
３．負荷開始時刻から１時間後に両品種の幼苗地上部を採取し、ＲＮＡを抽出した。該ＲＮＡをサンプルとして４×４４ｋオリゴＤＮＡカスタムマイクロアレイを用いた二色法で解析した。
［比較例３］
高温ストレス負荷の開始と同時にサンプリングしたものを対照とした。
［結果］
Benjamini-hochberg法により算出されたｑ値が０．０５未満、かつＡｒｋとＳＦそれぞれで対照に比べて２倍以上発現量が増加した／減少した遺伝子を抽出したところ、図４Ａに示すように、発現量が増加した遺伝子は、Ａｒｋで３２５個、ＳＦで１６５個であり、それらのうち、両品種で共通に発現量が増加した遺伝子は１４８個であった。すなわち、ＳＦにおいて発現量が増加した遺伝子のうち約９０％が、Ａｒｋにおいても増加したことがわかった。一方で、発現量が減少した遺伝子は、Ａｒｋで７７５個、ＳＦで５８６個であり、それらのうち、両品種で共通に発現量が減少した遺伝子は４８６個であった。両品種それぞれにおいて、発現量が増加した／減少した上位１００位の遺伝子を表２−１〜表２−８に示した。
尚、表２−１中の順位１位、４位、５位、８位、１８位、及び３８位の遺伝子、表２−２中の順位５７位の遺伝子、表２−５中の順位５位、１０位、１１位、４３位、及び４５位の遺伝子、表２−６中の順位８８位、及び９３位の遺伝子は、定量RT-PCRによる解析に用いた遺伝子である。
【００５８】
【表２−１】
2020043783.tif 000004
【００５９】
【表２−２】
2020043783.tif 000005
【００６０】
【表２−３】
2020043783.tif 000006
【００６１】
【表２−４】
2020043783.tif 000007
【００６２】
【表２−５】
2020043783.tif 000008
【００６３】
【表２−６】
2020043783.tif 000009
【００６４】
【表２−７】
2020043783.tif 000010
【００６５】
【表２−８】
2020043783.tif 000011
【００６６】
次に、全遺伝子の発現変動を両品種間で比較した。図４Ｂに示されるように、高温ストレス負荷による両品種の遺伝子の発現変動は、相関係数として０．７８３を示した。Welchのｔ検定により、有意水準が０．０５未満を満たし、Ａｒｋの方がＳＦよりも２倍以上
誘導性が高い遺伝子は９０個存在し（図４Ｂにおける緑色の点）、ＳＦの方がＡｒｋよりも２倍以上誘導性が高い遺伝子は２５個存在した（図４Ｂにおける紫色の点）。すなわち、５０℃で１時間という高温ストレスの負荷を受けたＡｒｋは、ＳＦに比べてより多くの遺伝子を高い誘導性で発現させることが示された。
【００６７】
（ジーンオントロジー（ＧＯ）解析）
［実施例４］
実施例３のマイクロアレイ解析により明らかになった、両品種間において高温ストレスに対する誘導性が異なる遺伝子群に着目し、それらの分子機能を推定するためにジーンオントロジー（ＧＯ）解析を行った。トマトでは適切なＧＯデータベースが存在しないため、シロイヌナズナの相同遺伝子のデータを利用した独自のデータベースを作成し、Rパッ
ケージtopGOを用いて解析した。対象遺伝子は、ＡｒｋでＳＦよりも誘導性が１．５倍以
上高かった遺伝子２５１個（表３−１〜表３−５）とした。
尚、表３−１中の順位１位、及び４位の遺伝子は、定量RT-PCRによる解析に用いた遺伝子である。
【００６８】
【表３−１】
2020043783.tif 000012
【００６９】
【表３−２】
2020043783.tif 000013
【００７０】
【表３−３】
2020043783.tif 000014
【００７１】
【表３−４】
2020043783.tif 000015
【００７２】
【表３−５】
2020043783.tif 000016
【００７３】
［結果］
結果を表４に示す。response to heatやprotein folding等の高温応答に関連するＧＯ
タームの遺伝子が特に多く含まれていた。
【００７４】
【表４】
2020043783.tif 000017
【００７５】
［実施例５］
実施例４において、対象遺伝子を、ＳＦでＡｒｋよりも誘導性が１．５倍以上高かった遺伝子２０９個に変更した。
［結果］
結果を表５に示す。Phenylpropanoid、catabolic process、lignin catabolic process等の細胞壁成分の代謝に関連するＧＯタームの遺伝子が特に多く含まれていた。
【００７６】
【表５】
2020043783.tif 000018
【００７７】
以上より、５０℃で１時間という高温ストレスの負荷を受けたＡｒｋでは、ＳＦに比べて高温応答に関連する遺伝子がより高いレベルで発現している一方、細胞壁成分に関連する遺伝子の発現は抑えられていることがわかった。
【００７８】
［実施例６］
図５は、実施例３のマイクロアレイ結果において、高温区の品種間の発現量の比（Ａｒｋ／ＳＦ）（縦軸）がｌｏｇ２＞０、かつ、Ａｒｋにおける誘導性（高温区の発現量／対照区の発現量）（横軸）がｌｏｇ２＞０の範囲にある遺伝子を示したものである。Ａｒｋにおける誘導性が６倍以上で、かつ、Ａｒｋにおける高温区の発現量がＳＦの誘導性の１．４倍以上高く、かつマイクロアレイにおけるシグナル値（ｌｏｇ２値）が１０以上である遺伝子を中心に、解析対象遺伝子として表６に示した遺伝子、Hsp22.0, DREB2A, HsfA2, GSTU25, FBS2, Hsp17.4-CIII, Hsp25.3-P, MADS-box, FtsH6, BAG5を選抜した。また、ストレスによる影響を受けない遺伝子として、ACT11を選抜した。
【００７９】
【表６】
2020043783.tif 000019
【００８０】
［実施例７］
次の手順で、定量ＰＣＲにより遺伝子のｍＲＮＡの発現量を解析した。対象遺伝子は、表６のＩＤ２であるDREB2Aと、表６のＩＤ３であるHsfA2とした。
１．対象とする品種として、Ａｒｋ、ＳＦに加え、中間的な耐性レベルを示す、Ｍｍ８、Ｙｕｂｉ、ＲＧＬを準備した。
２．５０℃で２時間の高温ストレスを負荷した。
３．負荷開始時刻から１、２時間後に、各品種の各３個体の幼苗地上部を採取し、ＲＮＡを抽出した。該ＲＮＡをサンプルとして定量ＰＣＲを行い、ストレス負荷の開始時刻における発現量に対する、該ストレス負荷開始後の前記時刻における該ｍＲＮＡの発現量（相対発現量）を算出した。
［比較例７］
高温ストレス負荷の開始と同時にサンプリングしたものを対照とした。
［結果］
結果を図６に示す。グラフは２つの遺伝子の発現量について、２回の繰り返し実験の結果を示しており（グラフには、１回目と２回目と記載している。）、それぞれ縦軸の値は、負荷開始時刻のＡｒｋにおける発現量に対する相対発現量を示している。また、エラーバーは３回の繰り返し測定における標準偏差を示している。いずれの遺伝子についても、２時間の点で再現性良く大きな品種間差が見られた。
【００８１】
［実施例８］
対象遺伝子を、それぞれが表６のＩＤ１〜１０及びControlであるHsp22.0、GSTU25、FBS2、Hsp17.4-CIII、Hsp25.3-P、MADS-box、FtsH6、BAG5、ACT11とし、下記以外は実施
例７と同様にした。
１．幼苗地上部を採取する時刻を、負荷開始時刻から２時間後とした。
［比較例８］
高温ストレス負荷の開始と同時にサンプリングしたものを対照とした。
［結果］
結果を図７に示す。グラフはそれぞれの遺伝子の発現量について示しており、それぞれ縦軸の値は、負荷開始時刻のＡｒｋにおける発現量に対する相対発現量を示している。また、エラーバーは３回の繰り返し測定における標準偏差を示している。いずれの遺伝子の発現量も、品種の高温ストレス耐性度と相関していた。また、表６のControlであるACT11遺伝子は、高温誘導性や高温ストレス耐性と相関した発現量の違いを示さなかった。
【００８２】
［実施例９］
各遺伝子の結果を総合して評価するための指標化を行った。それぞれが表６のＩＤ１〜１０である、Hsp22.0、DREB2A、HsfA2、GSTU25、FBS2、Hsp17.4-CIII、Hsp25.3-P、MADS-box、FtsH6、BAG5について、Ａｒｋ、ＳＦ、Ｍｍ８、Ｙｕｂｉ、ＲＧＬの５品種について、５０℃で２時間の高温ストレス負荷後の発現量を測定した。Ｚ２値（Z2 score）を用いて得られた発現量データの品種間差を標準化し、さらに２回の試験によるＺ２値の平均値を算出した。Ｚ２値は次の式によって算出した。
Ｚ２値＝ （各品種の発現量−全品種の発現量の平均）／全品種の発現量の標準偏差
［結果］
図８は指標化の結果を示している。２回の試験により各遺伝子について得られた発現量のＺ２値の平均値、および破線を挟んで、遺伝子１〜４（それぞれが表６のＩＤ１〜４の遺伝子）、遺伝子１〜８（それぞれが表６のＩＤ１〜８の遺伝子）、全１０遺伝子（それぞれが表６のＩＤ１〜１０の遺伝子）のＺ２値の平均値をそれぞれさらに平均したデータを示している。得られたＺ２値の平均値は、各品種の耐性レベルと良い相関を示していた。
【００８３】
［実施例１０］
定量ＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子発現とは別途、特別な装置を必要としない半定量ＲＴ−ＰＣＲ法による発現量の比較および数値化を行った。実施例８と同様に処理したサンプルからＲＮＡを抽出して、それぞれが表６のＩＤ１〜１０である、Hsp22.0、DREB2A、HsfA2、GSTU25、FBS2、Hsp17.4-CIII、Hsp25.3-P、MADS-box、FtsH6、BAG5についてＲＴ−ＰＣＲを行い、エチジウムブロマイドを含むアガロースゲルで電気泳動して、電気泳動像をデジタルカメラで取得した。
各遺伝子について、各バンドおよびバックグラウンドについて各範囲のピクセル値を合算し、得られたデータについて、Ａｒｋ（５０℃で２時間の高温ストレス負荷）の発光強度（a.u.）が１００、バックグラウンドが０になるように一次変換して発現量とした。
まずＡｒｋ、ＳＦの２品種を用いたＲＴ−ＰＣＲにより、増幅量の差が最も大きくなるようなサイクル数を検討し、次に全５品種を用いて、設定したサイクル数でＲＴ−ＰＣＲを行った。
［比較例１０］
コントロール遺伝子として、表６のControlであるACT11を用いたこと以外は、実施例１０と同様にした。
［結果］
図９は、各遺伝子について、電気泳動像と定量値を示している。コントロール遺伝子ACT11は誘導性も品種間差も顕著でないのに対し、選抜した遺伝子は顕著な高温誘導性があ
り、５０℃で２時間の高温ストレス負荷での品種間差も検出可能であることが確かめられた。
【００８４】
上記実施例１〜１０においては、ストレス条件によらず発現するエクソンの発現量に基づき特定方法を検討した。一方で該ストレスに応答して該ストレス条件において、該植物個体の一部のエクソンが発現しなくなる、一部のイントロンが発現しなくなることを用いてマーカー遺伝子として用いることが産業上望まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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