(57)【要約】      （修正有）【課題】対象中のＴＮＦ−α活性を抑制する能力を有し、自己免疫および炎症疾患、例えば関節リウマチ、乾癬、クローン病、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎等の治療に有用な、抗ＴＮＦ−α抗体の提供。【解決手段】高ガラクトシル化されていることを特徴とする、抗ＴＮＦ−α抗体であって、例えばオリゴマンノース等を含有し、高ガラクトシル化されている抗ＴＮＦ−α抗体、該抗体の集団、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高ガラクトシル化されていることを特徴とする、抗ＴＮＦ−α抗体。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、全開示が本明細書に参照により全体として組み込まれる２０１３年２月１３日に出願された表題「Ｈｉｇｈｌｙ  Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ  Ａｎｔｉ−ＴＮＦ−α  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」の米国仮特許出願第６１／７６４，４７５号明細書の米国特許法第１１９条第（ｅ）項のもとの利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、一部には、抗ＴＮＦ−α抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＴＮＦ−αは、炎症促進性サイトカインであり、正常の免疫応答における感染および損傷に対する保護的役割を担う。しかしながら、ＴＮＦ−αのレベルの慢性的な上昇は、多くの自己免疫および炎症疾患の発病と関連している。多数のＴＮＦ−α結合治療剤が、自己免疫および炎症疾患、例として、関節リウマチ、乾癬、クローン病、強直性脊椎炎および潰瘍性大腸炎の治療のために承認されている。利用可能な治療ＴＮＦ−α結合剤としては、抗体、例えば、マウス−ヒトキメラモノクローナル抗ＴＮＦ抗体のインフリキシマブ／Ｒｅｍｉｃａｄｅ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、完全ヒト抗ＴＮＦ抗体のアダリムマブ／Ｈｕｍｉｒａ（Ａｂｂｏｔｔ）、および完全ヒト抗ＴＮＦ抗体のゴリムマブ／Ｓｉｍｐｏｎｉ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）が挙げられる。抗体ベースの治療ＴＮＦ−α結合剤としては、Ｉｇ１のＦｃ領域に融合しているＴＮＦ受容体の細胞外ドメインの融合タンパク質のエタネルセプト／Ｅｎｂｒｅｌ（Ａｍｇｅｎ）、およびヒト化モノクローナル抗ＴＮＦ抗体のペグ化Ｆａｂ’断片のセルトリズマブペゴル／Ｃｉｍｚｉａ（ＵＣＢ）が挙げられる。これらの抗体および抗体ベースＴＮＦ−α結合剤の治療効力は、標的化される病変に基づき変動する。さらに、抗ＴＮＦ−α治療剤の多くは、不所望な副作用を示す。従って、改善された治療特性を有する抗ＴＮＦα抗体が望まれている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様において、本開示は、高ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体およびその組成物に関する。一態様において、本開示は、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団、およびその組成物に関する。一態様において、本開示は、高ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体および高レベルのガラクトシル化を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団を作製および使用する方法に関する。
【０００５】
一態様において、本開示は、高ガラクトシル化されている抗ＴＮＦ−α抗体を提供する。一部の実施形態において、抗体は高フコシル化されている。一部の実施形態において、抗体は、モノガラクトシル化(mono-galactosylated)Ｎ−グリカンを含む。一部の実施形態において、抗体は、二ガラクトシル化(bi-galactosylated)Ｎ−グリカンを含む。一部の実施形態において、抗体の重鎖は配列番号１を含み、抗体の軽鎖は配列番号２を含む。一部の実施形態において、抗体はアダリムマブである。一部の実施形態において、抗体は、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される。一部の実施形態において、抗体は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生される。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物は、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマである。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物はヤギである。
【０００６】
一態様において、本開示は、乳汁をさらに含む、本明細書に開示の抗体のいずれかの組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
【０００７】
一態様において、本開示は、抗体の集団を含む組成物において、抗体が、抗ＴＮＦ−α抗体であり、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルが、少なくとも６０％である組成物を提供する。一部の実施形態において、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルは、少なくとも７０％である。一部の実施形態において、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルは、少なくとも８０％である。一部の実施形態において、集団中の抗体のフコシル化のレベルは、少なくとも５０％である。
【０００８】
一部の実施形態において、集団中の抗体のフコシル化のレベルは、少なくとも６０％である。本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、集団は、モノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む抗体を含む。本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、集団は、二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む抗体を含む。本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルと、集団中の抗体のフコシル化のレベルとの比は、１．０から１．４の間である。本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、集団中の抗体の少なくとも３５％が、二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含み、集団中の抗体の少なくとも２５％が、モノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む。本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、抗体の重鎖は配列番号１を含み、抗体の軽鎖は配列番号２を含む。本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、抗体は、アダリムマブである。本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、抗体は、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される。本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、抗体は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生される。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物は、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマである。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物はヤギである。一部の実施形態において、組成物は、乳汁をさらに含む。一部の実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
【０００９】
本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して、増加したレベルの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する。
【００１０】
本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して、増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。
【００１１】
本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加した、対象中のＴＮＦ−α活性を抑制する能力を有する。
【００１２】
本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して、増加した可溶性ＴＮＦ−αに結合する能力を有する。
【００１３】
本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して、増加した膜貫通ＴＮＦ−αに結合する能力を有する。
【００１４】
本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団は、細胞培養物中で産生される。
【００１５】
本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のガラクトシル化のレベルは、乳腺上皮細胞において産生される抗体のガラクトシル化のレベルと比較して５０％以下である。本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のガラクトシル化のレベルは、乳腺上皮細胞において産生される抗体のガラクトシル化のレベルと比較して３０％以下である。本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のガラクトシル化のレベルは、乳腺上皮細胞において産生される抗体のガラクトシル化のレベルと比較して１０％以下である。
【００１６】
一態様において、本開示は、抗体の集団を作製する方法において、抗体が、抗ＴＮＦ−α抗体であり、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルが、少なくとも６０％である抗体の集団が産生されるように非ヒト哺乳動物の乳腺上皮細胞において抗体の集団を発現させる工程を含む方法を提供する。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞は、培養細胞であり(in culture)、抗体をコードする配列を含む核酸でトランスフェクトされる。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞は、抗体をコードする配列を含む核酸を乳腺中で発現するように操作された非ヒト哺乳動物中に存在する。一部の実施形態において、核酸は、配列番号３および配列番号４を含む。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞は、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマの乳腺上皮細胞である。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞はヤギ乳腺上皮細胞である。
【００１７】
一態様において、本開示は、本明細書に開示の抗体、抗体の集団、または組成物のいずれかを産生する乳腺上皮細胞を提供する。
【００１８】
一態様において、本開示は、本明細書に開示の乳腺上皮細胞のいずれかを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
【００１９】
一態様において、本開示は、本明細書に開示の抗体、抗体の集団、または組成物のいずれかを、それが必要とされる対象に投与する工程を含む方法を提供する。一部の実施形態において、対象は、炎症性疾患または自己免疫疾患を有する。一部の実施形態において、炎症性疾患または自己免疫疾患は、関節リウマチ、乾癬、クローン病、若年性特発性関節炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、慢性炎症、肝炎、ベーチェット病、ウェゲナー肉芽腫症、またはサルコイドーシスである。
【００２０】
一態様において、本開示は、Ｆｃグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７、ＥＵナンバリング）上にグリカン構造を有するモノクローナル抗ＴＮＦ抗体を含むモノクローナル抗ＴＮＦ抗体組成物において、前記グリカン構造が、６０％を超えるガラクトース含有率を有する組成物を提供する。
【００２１】
一態様において、本開示は、オリゴマンノースを含有する、抗ＴＮＦ−α抗体に関する。一部の実施形態において、抗体の重鎖は配列番号１を含み、抗体の軽鎖は配列番号２を含む。一部の実施形態において、抗体はアダリムマブである。
【００２２】
一部の実施形態において、抗体は、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される。一部の実施形態において、抗体は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生される。ある実施形態において、非ヒト哺乳動物は、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマである。ある実施形態において、非ヒト哺乳動物はヤギである。
【００２３】
一部の実施形態において、乳汁をさらに含む、オリゴマンノースを含有する抗ＴＮＦ−α抗体。
【００２４】
一態様において、本開示は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むオリゴマンノースを含有する抗ＴＮＦ−α抗体を含む組成物に関する。
【００２５】
一態様において、本開示は、抗体が抗ＴＮＦ−α抗体であり、抗体の少なくとも３０％が少なくとも１つのオリゴマンノースを含有する、抗体の集団を含む組成物に関する。一部の実施形態において、抗体は、高マンノースグリコシル化パターンを示す。一部の実施形態において、乳汁由来抗体の少なくとも１つの鎖は、オリゴマンノースを含有し、フコシル化されていない。一部の実施形態において、乳汁由来抗体の主要な糖鎖(major carbohydrate)はフコシル化されていない。
【００２６】
一部の実施形態において、組成物内の抗体の重鎖は配列番号１を含み、抗体の軽鎖は配列番号２を含む。一部の実施形態において、抗体は、アダリムマブである。一部の実施形態において、抗体は、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される。一部の実施形態において、抗体は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生される。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物は、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマである。ある実施形態において、非ヒト哺乳動物はヤギである。
【００２７】
一部の実施形態において、組成物は、乳汁をさらに含む。一部の実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
【００２８】
一部の実施形態において、組成物内の抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して、増加したレベルの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する。
【００２９】
一部の実施形態において、組成物内の抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団は、細胞培養物中で産生される。
【００３０】
抗体がオリゴマンノースを含有する一部の実施形態において、オリゴマンノースはＭａｎ５である。抗体がオリゴマンノースを含有する一部の実施形態において、オリゴマンノースはＭａｎ６である。抗体がオリゴマンノースを含有する一部の実施形態において、オリゴマンノースはＭａｎ７である。組成物がオリゴマンノースを含有する抗体を含む一部の実施形態において、オリゴマンノースはＭａｎ５である。組成物がオリゴマンノースを含有する抗体を含む一部の実施形態において、オリゴマンノースはＭａｎ６である。組成物がオリゴマンノースを含有する抗体を含む一部の実施形態において、オリゴマンノースはＭａｎ７である。
【００３１】
図面を最初に説明する。図面は例示であり、本発明の実施可能性に要求されないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ヤギ＃１からの高ガラクトシル化アダリムマブ抗体の集団のＮ−グリカンの代表的なオリゴ糖シグネチャー（oligosaccharide signature）を示す。
【図２】泌乳７日目におけるヤギ＃１からの高ガラクトシル化アダリムマブ抗体の集団のＮ−グリカンのオリゴ糖シグネチャーを示す。
【図３】泌乳１７日目におけるヤギ＃１からの高ガラクトシル化アダリムマブ抗体の集団のＮ−グリカンのオリゴ糖シグネチャーを示す。
【図４】泌乳３２日目におけるヤギ＃１からの高ガラクトシル化アダリムマブ抗体の集団のＮ−グリカンのオリゴ糖シグネチャーを示す。
【図５−１】種々の泌乳日におけるヤギ＃１からの高ガラクトシル化アダリムマブ抗体の集団のＮ−グリカンオリゴ糖の割合のまとめを示す。
【図５−２】図５−１の続き。
【図６】ホルモン誘導泌乳３日目におけるヤギ＃２からの高ガラクトシル化アダリムマブ抗体の集団のＮ−グリカンのオリゴ糖シグネチャーを示す。
【図７】ホルモン誘導泌乳１１日目におけるヤギ＃２からの高ガラクトシル化アダリムマブ抗体の集団のＮ−グリカンのオリゴ糖シグネチャーを示す。
【図８】ホルモン誘導泌乳２１日目におけるヤギ＃２からの高ガラクトシル化アダリムマブ抗体の集団のＮ−グリカンのオリゴ糖シグネチャーを示す。
【図９−１】種々のホルモン誘導泌乳日におけるヤギ＃２からの高ガラクトシル化アダリムマブ抗体の集団のＮ−グリカンオリゴ糖の割合のまとめを示す。
【図９−２】図９−１の続き。
【図１０】トランスジェニック産生された(transgenically produced)アダリムマブ抗体は、可溶性ＴＮＦ−αに結合することを示す。
【図１１】抗ＣＤ１６抗体３Ｇ８を用いる競合アッセイにより示されるとおり、トランスジェニック産生されたアダリムマブ抗体は、ＮＫ細胞上で発現されたＣＤ１６に結合することを示す。
【図１２】トランスジェニック産生されたアダリムマブ抗体は、可溶性ＴＮＦ−αおよびＪｕｒｋａｔ発現ＣＤ１６細胞の両方に結合する一方、トランスジェニック産生されたアダリムマブ抗体の非グリコシル化バージョンは、結合しないことを示す。
【図１３−１】９頭の異なるヤギ＃１〜９からのトランスジェニック産生されたアダリムマブ抗体の集団中に存在する優勢グリカン型のまとめを示す。
【図１３−２】図１３−１の続き。
【図１３−３】図１３−２の続き。
【図１３−４】図１３−３の続き。
【図１４−１】ホルモン誘導泌乳の間のヤギ＃１０およびヤギ＃１からのトランスジェニック産生されたアダリムマブ抗体の集団のＮ−グリカンオリゴ糖の割合のまとめを示す。
【図１４−２】図１４−１の続き。
【図１５−１】８頭の異なるヤギ、ヤギ＃２〜９からのトランスジェニック産生されたアダリムマブ抗体の集団のＮ−グリカンオリゴ糖の割合のまとめを示す。
【図１５−２】図１５−１の続き。
【図１６】膜ＴＮＦ−αトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞クローン２Ｂ３(membrane TNF-α transfected Jurkat cells clone 2B3)上でのトランスジェニック産生されたアダリムマブ抗体（「ＴＧ−アダリムマブ」）およびＨｕｍｉｒａ抗体の抗原認識を示す。示される結果をＭＦＩとして表現し、３回の実験の平均から導く。平均＋／−ＳＥＭ。
【図１７】競合アッセイにおけるＮＫ細胞により発現されたＣＤ１６上での抗ＴＮＦ−α抗体の結合を示す。観察された平均蛍光値（ＭＦＩ）を結合パーセントとして表現し、１００％は、試験抗体なしで観察された最大３Ｇ８結合に対応する任意値であり、０％は、抗体３Ｇ８の不存在下でのＭＦＩに対応する。３回の実験の平均＋／−ＳＥＭ。
【図１８】Ａｌｅｘａ４８８結合リツキシマブ抗体を用いる競合アッセイにおけるＦｃＲｎトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞により発現されたＦｃＲｎ上での抗ＴＮＦ−α抗体の結合を示す。観察された平均蛍光値（ＭＦＩ）を、検証抗体濃度の関数として結合パーセント（１００％は、最大リツキシマブ−Ａ４８８結合単独に対応する任意値である）として表現する。３回の実験の平均＋／−ＳＥＭ。
【図１９】膜ＴＮＦ−αトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞クローン２Ｂ３に対する抗ＴＮＦ−α抗体のＣＤＣ活性を示す（４回のアッセイの平均）。結果を、抗体濃度の関数としてｍｂＴＮＦ−αＪｕｒｋａｔ細胞の溶解のパーセントとして表現する。平均＋／−ＳＥＭ。
【図２０】抗ＴＮＦ−α抗体によるＬ９２９細胞におけるＴＮＦ−α媒介細胞毒性の中和を示す。結果を、抗体濃度の関数として中和のパーセントとして表現する。４回のアッセイの平均＋／−ＳＥＭ。
【図２１】Ｈｕｍｉｒａと比較した、トランスジェニック産生されたアダリムマブにより媒介された溶解パーセント（任意単位）を示す。
【図２２】Ｈｕｍｉｒａと比較した、９頭の異なるヤギからのトランスジェニック産生されたアダリムマブのＣＤ１６結合活性を示す阻害曲線を提示する。
【図２３】ＮＫ細胞を使用する競合アッセイにより評価された、９頭の異なるヤギからのトランスジェニック産生されたアダリムマブおよびＨｕｍｉｒａのＣＤ１６結合活性に関連するＩＣ５０値を提示する。
【図２４】Ｈｕｍｉｒａと比較した、９頭の異なるヤギからのトランスジェニック産生されたアダリムマブのＣＤＣ活性を示す。
【図２５】Ｈｕｍｉｒａと比較した、９頭の異なるヤギからのトランスジェニック産生されたアダリムマブのＣＤＣ活性に関連するＥＣ５０値（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
一態様において、本開示は、高ガラクトシル化されている抗ＴＮＦ−α抗体を提供する。抗ＴＮＦ−α抗体は、ＴＮＦ−αに結合し、ＴＮＦ−αの機能不全を特徴とする種々の疾患、例として、炎症性疾患における治療剤として使用されている。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗ＴＮＦ−α抗体は、インフリキシマブ／Ｒｅｍｉｃａｄｅ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、アダリムマブ／Ｈｕｍｉｒａ（Ａｂｂｏｔｔ）、またはゴリムマブ／Ｓｉｍｐｏｎｉ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）である。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗ＴＮＦ−α抗体は、アダリムマブである。
【００３４】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗ＴＮＦ−α抗体は、配列番号１を含む重鎖を含む。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗ＴＮＦ−α抗体は、配列番号２を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗ＴＮＦ−α抗体は、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗ＴＮＦ−α抗体は、配列番号１からなる重鎖を含む。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗ＴＮＦ−α抗体は、配列番号２からなる軽鎖を含む。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗ＴＮＦ−α抗体は、配列番号１からなる重鎖および配列番号２からなる軽鎖を含む。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗ＴＮＦ−α抗体は、アダリムマブである。
【００３５】
アダリムマブの重鎖は、配列番号１に提供される：
ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＴＷＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【００３６】
アダリムマブの軽鎖は、配列番号２に提供される：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＲＹＮＲＡＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【００３７】
配列は、米国特許第６，０９０，３８２号明細書に公開されているアダリムマブの配列をベースとする。一部の実施形態において、アダリムマブの配列は、米国特許第６，０９０，３８２号明細書に公開されているものである。
【００３８】
一部の実施形態において、本開示は、アダリムマブの配列をベースとするが、バイオアベイラビリティ、安定性などに関する追加の有益な所望の特性を有する抗体を提供する突然変異を含む抗体も含むことをさらに認識すべきである。
【００３９】
一態様において、本開示は、抗炎症治療において使用することができる、高ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体を提供する。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗ＴＮＦ−α抗体は、インフリキシマブ／Ｒｅｍｉｃａｄｅ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、アダリムマブ／Ｈｕｍｉｒａ（Ａｂｂｏｔｔ）、またはゴリムマブ／Ｓｉｍｐｏｎｉ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）である。一部の実施形態において、抗ＴＮＦ−α抗体はアダリムマブである。一部の実施形態において、抗ＴＮＦ−α抗体は、炎症性疾患の治療および自己免疫疾患の治療において使用することができる。本明細書に示されるとおり、高ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体は、驚くべきことに、その向上したＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性（非高ガラクトシル化抗体と比較して）のため、その抗炎症活性において有効である。しかしながら、本明細書に開示の高ガラクトシル化抗体抗ＴＮＦ−αは、その抗炎症活性をさらに増加させるための追加の改変を含み得ることを認識すべきである。
【００４０】
静脈内投与されるＩｇの抗炎症活性は、Ｆｃ結合グリカン上に末端α２，６−シアル酸結合を有するＩｇＧ分子のサブセットから生じ得る。静脈内投与されるＩｇの集団の抗炎症活性は、全てのＦｃ結合グリカン上に末端α２，６−シアル酸結合を導入することにより増加した（例えば、Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＩＶＩＧ，ＰＮＡＳ  １０５：１９５７１−１９５７８，２００８参照）。
【００４１】
一態様において、本開示は、２，６シアリル化Ｆｃグリカンも有する高ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体を提供する。ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体のシアリル化(sialylation)は、高ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体の抗炎症作用を相乗的に増加させると考えられる。
【００４２】
一態様において、本明細書に開示の高ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体は、トランスジェニック哺乳動物または乳房上皮細胞において抗体を産生させることにより作製される。本明細書に示されるとおり、トランスジェニック哺乳動物または乳房上皮細胞により産生される高ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体は、完全にシアリル化されていない。このような抗体のシアリル化レベルは、例えば、抗体をシアリルトランスフェラーゼに供することにより増加させることができる。抗体は、インビトロまたはインビボでシアリルトランスフェラーゼに供することができる。高ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体は、精製または部分精製抗体をシアリルトランスフェラーゼおよび適切な糖ベース基質に供することによりインビトロでシアリル化することができる。高ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体は、乳腺または乳房上皮細胞においてシアリルトランスフェラーゼを産生させることによりインビボでシアリル化することができる。
【００４３】
一態様において、本開示は、トランスジェニック動物の乳腺および乳房上皮細胞において、増加したレベルのα２，６−シアリル化を有する高ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体を作製する方法を提供する。従って、本明細書に提供される方法は、トランスジェニック動物の乳腺および乳房上皮細胞において、増加した抗炎症特性を有する高ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体を産生させることを可能とする。高ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体の抗炎症特性を増加させるための本明細書に提供される方法は、任意の抗ＴＮＦ−α抗体に適用することができ、それにより、相乗的な作用様式を有する、抗炎症性の高ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体を提供することを認識すべきである。
【００４４】
一態様において、本開示は、抗ＴＮＦ−α抗体の乳腺中での産生についてトランスジェニックであり、シアリルトランスフェラーゼの産生についてトランスジェニックであるトランスジェニック動物（および乳房上皮細胞）を提供する。このような動物および細胞により産生される治療抗体は、高ガラクトシル化されており、そのＦｃ結合グリカン上に増加したレベルの末端α２，６−シアル酸結合を有することが予測される。一部の実施形態において、トランスジェニック動物（および乳房上皮細胞）は、外因性抗ＴＮＦ−α抗体の乳腺中での産生のためにトランスジェニックであり、シアリルトランスフェラーゼの産生のためにトランスジェニックである。一部の実施形態において、抗ＴＮＦ−α抗体はアダリムマブである。
【００４５】
一態様において、本開示は、Ｆｃ結合グリカン上に増加したレベルの末端α２，６−シアル酸結合を有する高ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体を対象に投与する工程を含む、対象における炎症または自己免疫疾患を治療する方法を提供する。
【００４６】
一態様において、本開示は、高ガラクトシル化されている抗ＴＮＦ−α抗体を提供する。一部の実施形態において、本開示は、高フコシル化されている抗ＴＮＦ−α抗体を提供する。一部の実施形態において、本開示は、高ガラクトシル化されており、高フコシル化されている、抗ＴＮＦ−α抗体を提供する。一部の実施形態において、本開示は、高ガラクトシル化されており、高フコシル化されており、Ｆｃグリカン上に末端シアル酸部分を有する、抗ＴＮＦ−α抗体を提供する。一部の実施形態において、高ガラクトシル化抗体は、１つ以上のモノガラクトシル化Ｎグリカンを含む。一部の実施形態において、高ガラクトシル化抗体は、二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む。
【００４７】
一態様において、本開示は、Ｆｃグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７、ＥＵナンバリング）上でグリカン構造を有し、前記グリカン構造が６０％を超えるガラクトース含有率を有する、モノクローナル抗体を含むモノクローナル抗ＴＮＦ抗体組成物を提供する。一実施形態において、抗ＴＮＦモノクローナル抗体は、精製されている。「ＥＵナンバリングシステム」または「ＥＵインデックス」は、一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域中の残基を称する場合に使用される（例えば、明示的に参照により本明細書に組み込まれるＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に報告されているＥＵインデックス）。抗体中の典型的なグリコシル化残基位置は、ＥＵナンバリングシステムによる２９７位におけるアスパラギン（「Ａｓｎ２９７」）である。
【００４８】
本明細書に開示の抗ＴＮＦモノクローナル抗体のいずれも、部分的または完全に精製されていてよいことを認識すべきである。
【００４９】
抗体は、Ｆｃ領域の重鎖中のＦｃγグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７）においてＮ−グリカンによりグリコシル化していてよい。一般に、抗体は、２つの重鎖を含み、従って、各抗体は、２つのＦｃγＮ−グリカンを有し得る。種々のグリコシル化パターンは、Ｆｃγグリコシル化部位において観察されており、この部位において見出されるオリゴ糖としては、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）、マンノース、シアル酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃまたはＮＡＮＡ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）およびフコースが挙げられる。Ｆｃγグリコシル化部位において見出されるＮ−グリカンは、一般に、抗体のアスパラギンに結合している第１のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、第１のＧｌｃＮａｃに結合している第２のＧｌｃＮＡｃおよび第２のＧｌｃＮａｃに結合している第１のマンノースの非分枝鎖からなる共通のコア構造を有する。２つの追加のマンノースは、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−マンノース鎖の第１のマンノースに結合しており、コア構造を完了させ、追加のグリコシル化のための２つの「アーム」を提供する。さらに、フコース残基が、Ｎ−結合の第１のＧｌｃＮＡｃに結合していてよい。
【００５０】
２つのアームコア構造は、「アンテナ」とも称される。血漿抗体中で見出されるＮ−グリカンモチーフの「アーム」の最も一般的なタイプのグリコシル化は、複合型(complex type)のもの、すなわち、２つ以上のタイプの単糖からなるものである。このＮ−グリカンモチーフへの生合成経路において、いくつかのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼが、ＧｌｃＮＡｃ残基をグリカンコアのマンノースに結合させ、ガラクトース、シアル酸およびフコース残基によりそれをさらに伸長させることができる。このグリコシル化モチーフは、「複合型」構造と呼ばれる。
【００５１】
Ｎ−グリカンコア構造の「アーム」上で見出される第２のグリコシル化モチーフは、追加のマンノース（分枝鎖または非分枝鎖のいずれかとして結合している）を特徴とする「高マンノース」モチーフである。
【００５２】
第３のグリコシル化モチーフは、アームの一方が置換マンノースである一方、他方のアームが複合型である、ハイブリッド構造である。
【００５３】
本明細書において使用される「ガラクトシル化」抗体は、そのＮ−グリカンの１つの中に少なくとも１つのガラクトース単糖を有する任意の抗体を称する。ガラクトシル化抗体としては、２つのＮ−グリカンがＮ−グリカンモチーフのアームのそれぞれの上に複合型モチーフをそれぞれ有する抗体、２つのＮ−グリカンがＮ−グリカンモチーフのアームの一方のみの上に複合型モチーフを有する抗体、Ｎ−グリカンのアームのそれぞれの上に複合型モチーフを有する１つのＮ−グリカンを有する抗体、およびＮ−グリカンモチーフのアームの一方のみの上に複合型モチーフを有する１つのＮ−グリカンを有する抗体が挙げられる。少なくとも１つのガラクトース単糖を含む抗体としては、Ｎ−グリカン、例えば、Ｇ１（１つのガラクトース）、Ｇ１Ｆ（１つのガラクトース、１つのフコース）、Ｇ２（２つのガラクトース）およびＧ２Ｆ（２つのガラクトース、１つのフコース）を有する抗体が挙げられる。さらに、少なくとも１つのガラクトース単糖を含むＮ−グリカンは、シアリル化されていてもシアリル化されていなくてもよい。Ｎ−グリカンは、複合型グリカンモチーフの１つ以上のアーム中に追加のガラクトース残基、例えば、αＧａｌも含有していてもよく、４つのガラクトース部分を有するＮ−グリカンを潜在的にもたらすことをさらに認識すべきである。
【００５４】
本明細書において使用される「高ガラクトシル化」抗体は、Ｎ−グリカンモチーフ中に少なくとも２つのガラクトース単糖を含む抗体を称する。高ガラクトシル化抗体としては、２つのＮ−グリカンがＮ−グリカンモチーフのアームのそれぞれの上に複合型モチーフをそれぞれ有する抗体、２つのＮ−グリカンがＮ−グリカンモチーフのアームの一方のみの上に複合型モチーフを有する抗体、およびＮ−グリカンのアームのそれぞれの上に複合型モチーフを有する１つのＮ−グリカンを有する抗体が挙げられる。従って、高ガラクトシル化抗体は、両方のＮ−グリカンがグリカンモチーフ中に１つのガラクトース（例えば、Ｇ１またはＧ１Ｆ）をそれぞれ含む抗体、グリカンモチーフ中に２つのガラクトース（例えば、Ｇ２またはＧ２Ｆ）を有する少なくとも１つのＮ−グリカンを含む抗体、およびグリカンモチーフ中に３または４つのガラクトース（例えば、（ｉ）Ｇ１グリカンモチーフを有する１つのＮ−グリカンおよびＧ２もしくはＧ２Ｆグリカンモチーフを有する１つのＮ−グリカンまたは（ｉｉ）Ｇ２もしくはＧ２Ｆを有する２つのＮ−グリカン）を有する抗体が挙げられる。一部の実施形態において、高ガラクトシル化抗体は、グリカンモチーフ中に少なくとも３つのガラクトース単糖を含む。一部の実施形態において、高ガラクトシル化抗体は、グリカンモチーフ中に少なくとも４つのガラクトース単糖を含む。
【００５５】
一部の実施形態において、グリコシル化は、高マンノースグリコシル化パターンを示す。本明細書において使用される「高マンノースグリコシル化パターン」は、少なくとも１つのオリゴマンノースを含有する抗体または抗体の少なくとも３０％が少なくとも１つのオリゴマンノースを含有する、抗体の組成物を称するものとする。一部の実施形態において、抗体の糖鎖の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多数が、オリゴマンノースである。一部の実施形態において、抗体の糖鎖の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多数が、非フコシル化オリゴマンノースである。他の実施形態において、抗体の糖鎖の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％未満またはそれより少数が、フコース含有である。さらに他の実施形態において、抗体は、低フコースであり、高オリゴマンノースである。従って、さらなる実施形態において、抗体の糖鎖の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％またはそれより多数がオリゴマンノースであり、抗体の糖鎖の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％未満が、フコース含有である。従って、いっそうさらなる実施形態において、抗体の糖鎖の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％またはそれより多数が非フコシル化オリゴマンノースであり、抗体の糖鎖の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％未満が、フコース含有である。
【００５６】
一部の態様において、マンノース含有オリゴ糖は、Ｍａｎ５からＭａｎ９の範囲であり、数字は、マンノース残基の数を示す。例えば、マンノース含有オリゴ糖としては、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８およびＭａｎ９を挙げることができる。ある実施形態において、トランスジェニック産生されるアダリムマブは、本明細書に記載のヤギ２、４および５により明らかにされたとおり、高いＭａｎ６含有率を示す。一部の実施形態において、トランスジェニック産生されるアダリムマブ中の主要な糖鎖は、Ｍａｎ５である。一部の実施形態において、トランスジェニック産生されるアダリムマブ中の糖鎖の少なくとも１０％、１５％またはそれより多数が、Ｍａｎ５である。有利には、トランスジェニック産生されるアダリムマブ中の糖鎖の少なくとも２０％が、Ｍａｎ５である。他の実施形態において、トランスジェニック産生されるアダリムマブ中の主要な糖鎖は、Ｍａｎ６である。一部の実施形態において、トランスジェニック産生されるアダリムマブ中の糖鎖の少なくとも１０％、１５％またはそれより多数が、Ｍａｎ６である。有利には、トランスジェニック産生されるアダリムマブ中の糖鎖の少なくとも２０％が、Ｍａｎ６である。他の実施形態において、トランスジェニック産生されるアダリムマブ中の主要な糖鎖は、Ｍａｎ７である。一部の実施形態において、トランスジェニック産生されるアダリムマブ中の糖鎖の少なくとも１０％、１５％またはそれより多数が、Ｍａｎ７である。有利には、トランスジェニック産生されるアダリムマブ中の糖鎖の少なくとも２０％が、Ｍａｎ７である。
【００５７】
Ｎ−グリカンのグリコシル化パターンは、当技術分野において公知の種々の方法により測定することができる。例えば、タンパク質上の糖鎖を分析する方法が、米国特許出願公開第２００６／００５７６３８号明細書および米国特許出願公開第２００６／０１２７９５０号明細書に記載されている。タンパク質上の糖鎖を分析する方法は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５８】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化抗体は、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される。一部の実施形態において、抗体は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生される。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物は、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマである。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物はヤギである。
【００５９】
一部の実施形態において、高グリコシル化抗体は、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞以外の細胞において産生される。一部の実施形態において、抗体は、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞以外の細胞において産生され、Ｎ−グリカン上のガラクトース基の数を増加させるように産生後に改変される（例えば、酵素、例えば、トランスフェラーゼの作用を介して）。
【００６０】
一態様において、本開示は、高ガラクトシル化抗体を含む組成物を提供する。一部の実施形態において、高ガラクトシル化抗体を含む組成物は、乳汁をさらに含む。一部の実施形態において、高ガラクトシル化抗体を含む組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
【００６１】
一態様において、本開示は、Ｆｃグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７、ＥＵナンバリング）上にグリカン構造を有するモノクローナル抗ＴＮＦ抗体を含む組成物において、モノクローナル抗体の前記グリカン構造が、６０％を超えるガラクトース含有率を有する組成物を提供する。一部の実施形態において、モノクローナル抗ＴＮＦ抗体組成物を含む組成物は、乳汁をさらに含む。一部の実施形態において、モノクローナル抗ＴＮＦ抗体組成物を含む組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
【００６２】
抗体の集団
一態様において、本開示は、抗体の集団を含む組成物において、抗体が、抗ＴＮＦ−α抗体であり、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルが、少なくとも６０％である組成物を提供する。一部の実施形態において、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルは、少なくとも７０％である。一部の実施形態において、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルは、少なくとも８０％である。一部の実施形態において、集団中の抗体のフコシル化のレベルは、少なくとも５０％である。一部の実施形態において、集団の抗体のフコシル化のレベルは、少なくとも６０％である。一部の実施形態において、集団は、モノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む抗体を含む。一部の実施形態において、集団は、二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む抗体を含む。一部の実施形態において、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルと、集団中の抗体のフコシル化のレベルとの比は、１．０から１．４の間である。一部の実施形態において、集団中の抗体の少なくとも３５％が、二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含み、集団中の抗体の少なくとも２５％が、モノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む。一部の実施形態において、抗体中のシアリル化のレベルは、少なくとも５０％である。一部の実施形態において、抗体中のシアリル化のレベルは、少なくとも７０％である。一部の実施形態において、抗体中のシアリル化のレベルは、少なくとも９０％である。一部の実施形態において、抗体は完全にシアリル化されている。
【００６３】
一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団の抗ＴＮＦ−α抗体は、インフリキシマブ／Ｒｅｍｉｃａｄｅ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、アダリムマブ／Ｈｕｍｉｒａ（Ａｂｂｏｔｔ）、またはゴリムマブ／Ｓｉｍｐｏｎｉ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）である。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団の抗ＴＮＦ−α抗体は、アダリムマブである。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団の抗ＴＮＦ−α抗体は、配列番号１を含む重鎖を含む。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団の抗ＴＮＦ−α抗体は、配列番号２を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団の抗ＴＮＦ−α抗体は、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団の抗ＴＮＦ−α抗体は、配列番号１からなる重鎖を含む。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団の抗ＴＮＦ−α抗体は、配列番号２からなる軽鎖を含む。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団の抗ＴＮＦ−α抗体は、配列番号１からなる重鎖および配列番号２からなる軽鎖を含む。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団の抗ＴＮＦ−α抗体は、アダリムマブである。
【００６４】
Ｎ−グリカンの生合成は、タンパク質の場合のようにテンプレートにより調節されないが、主として細胞中の特異的なグリコシルトランスフェラーゼの発現および活性に依存する。従って、糖タンパク質、例えば、抗体Ｆｃドメインは、通常、同一タンパク質骨格上で異なるグリカンを担持する糖型の異種集団として存在する。
【００６５】
高ガラクトシル化されている抗ＴＮＦ−α抗体の集団は、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルが少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％のガラクトシル化である、抗体の集団である。高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルは、少なくとも６０％である。
【００６６】
本明細書において使用されるガラクトシル化のレベルは、以下の式により決定される：
【数１】
2020073550.tif 000002
式中、
−  ｎは、クロマトグラム、例えば、順相高速液体クロマトグラフィー（ＮＰ  ＨＰＬＣ）スペクトルの分析されたＮ−グリカンピークの数を表し、
−  「Ｇａｌの数」は、ピークに対応するグリカンのアンテナ上のガラクトースモチーフの数を表し、
−  「Ａの数」は、ピークに対応するグリカン型のアンテナ上のＮ−アセチルグルコサミンモチーフの数に対応し（コア構造の２つのＮ−アセチルグルコサミンモチーフを除く）、
−  「相対面積％」は、対応するピーク下面積の％に対応する。
【００６７】
抗体の集団中の抗体のガラクトシル化のレベルは、例えば、抗体からＮ−グリカンを遊離させ、クロマトグラム上でＮ−グリカンを分解し、特異的ピークに対応するＮ−グリカンのオリゴ糖モチーフを同定し、ピーク強度を決定し、データを上記に提供される式に適用することにより決定することができる。
【００６８】
ガラクトシル化されている抗ＴＮＦ−α抗体としては、モノガラクトシル化Ｎ−グリカンおよび二ガラクトシル化Ｎ−グリカンである抗体が挙げられる。
【００６９】
高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、集団は、シアリル化されていてもいなくてもよい、モノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む抗体を含む。高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、抗体Ｎ−グリカンの少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％は、モノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む。高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、抗体の少なくとも２５％がモノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む。
【００７０】
高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、集団は、シアリル化されていてもいなくてもよい、二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む抗体を含む。高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、抗体Ｎ−グリカンの少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％が、二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む。高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、抗体の少なくとも３５％が二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む。
【００７１】
高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、集団は、シアリル化されていてもいなくてもよい、モノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む抗体、およびシアリル化されていてもいなくてもよい、二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む抗体を含む。高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、抗体Ｎ−グリカンの少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で９９％が、モノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含み、抗体Ｎ−グリカンの少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で９９％が、二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む。高ガラクトシル化されている抗体Ｎ−グリカンの集団の一部の実施形態において、抗体Ｎ−グリカンの少なくとも２５％が、モノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含み、抗体の少なくとも３５％が、二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む。
【００７２】
高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、集団は、高フコシル化されている抗体を含む。高フコシル化されている抗体の集団は、集団中の抗体Ｎ−グリカンのフコシル化のレベルが、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％のフコシル化である、抗体の集団である。高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、抗体Ｎ−グリカンのフコシル化のレベルは、少なくとも５０％である。
【００７３】
本明細書において使用されるフコシル化のレベルは、以下の式により決定される：
【数２】
2020073550.tif 000003
式中、
−  ｎは、クロマトグラム、例えば、順相高速液体クロマトグラフィー（ＮＰ  ＨＰＬＣ）スペクトルの分析されたＮ−グリカンピークの数を表し、
−  「フコースの数」は、ピークに対応するグリカン上のフコースモチーフの数を表し、
−  「相対面積％」は、フコースモチーフを含有する対応するピーク下面積の％に対応する。
【００７４】
フコシル化されている抗体としては、そのＮ−グリカンの１つの中に少なくとも１つのフコース単糖を有する抗体が挙げられる。フコシル化されている抗体としては、そのＮ−グリカンのそれぞれの中にフコース単糖を有する抗体を含む。
【００７５】
一部の実施形態において、本明細書に開示の抗ＴＮＦ−α抗体の集団は、集団中の抗体Ｎ−グリカンのガラクトシル化のレベルが少なくとも６０％であり、集団中の抗体のフコシル化のレベルが少なくとも５０％である集団に関する。一部の実施形態において、本明細書に開示の抗体の集団は、集団中の抗体Ｎ−グリカンのガラクトシル化のレベルが少なくとも５０％であり、集団中の抗体Ｎ−グリカンのフコシル化のレベルが少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％である集団に関する。一部の実施形態において、本明細書に開示の抗体の集団は、集団中の抗体Ｎ−グリカンのガラクトシル化のレベルが少なくとも６０％であり、集団中の抗体Ｎ−グリカンのフコシル化のレベルが少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％である集団に関する。一部の実施形態において、本明細書に開示の抗体の集団は、集団中の抗体Ｎ−グリカンのガラクトシル化のレベルが少なくとも７０％であり、集団中の抗体Ｎ−グリカンのフコシル化のレベルが少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％である集団に関する。一部の実施形態において、本明細書に開示の抗体の集団は、集団中の抗体Ｎ−グリカンのガラクトシル化のレベルが少なくとも８０％であり、集団中の抗体Ｎ−グリカンのフコシル化のレベルが少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％である集団に関する。一部の実施形態において、本明細書に開示の抗体の集団は、集団中の抗体Ｎ−グリカンのガラクトシル化のレベルが少なくとも９０％であり、集団中の抗体Ｎ−グリカンのフコシル化のレベルが少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％である集団に関する。一部の実施形態において、本明細書に開示の抗体の集団は、集団中の抗体Ｎ−グリカンのガラクトシル化のレベルが最大で１００％であり、集団中の抗体Ｎ−グリカンのフコシル化のレベルが少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％である集団に関する。
【００７６】
一態様において、本開示は、Ｆｃγグリコシル化部位においてガラクトシル化されている集団中の抗体Ｎ−グリカンの割合と、Ｆｃγグリコシル化部位においてフコシル化されている集団中の抗体Ｎ−グリカンの割合との規定の比を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団を含む組成物に関する。一部の実施形態において、本開示は、集団中の抗体Ｎ−グリカンのフコシル化のレベルに対する集団中の抗体Ｎ−グリカンのガラクトシル化のレベルの比が、０．５から２．５の間、０．６から２．０の間、０．７から１．８の間、０．８から１．６の間、または１．０から１．４の間である、抗体の集団を含む組成物に関する。一部の実施形態において、本開示は、集団中の抗体Ｎ−グリカンのフコシル化のレベルに対する集団中の抗体Ｎ−グリカンのガラクトシル化のレベルの比が、１．０から１．４の間、例えば、１．２である、抗体の集団を含む組成物に関する。
【００７７】
一部の実施形態において、本明細書に開示の抗体および抗体の集団は、高シアリル化されている。一部の実施形態において、シアリル化は、Ｆｃグリカンの末端ガラクトース残基上の２，６αシアリル化を称する。一部の実施形態において、高シアリル化抗体の集団において、末端ガラクトース部分の少なくとも５０％がシアリル化されている。一部の実施形態において、高シアリル化抗体の集団において、末端ガラクトース部分の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％および最大で１００％がシアリル化されている。一部の実施形態において、本開示は、少なくとも６０％がガラクトシル化されており、末端ガラクトース部分の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％および最大で１００％がシアリル化されている、抗体の集団を提供する。一部の実施形態において、本開示は、少なくとも７０％がガラクトシル化されており、末端ガラクトース部分の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％および最大で１００％がシアリル化されている、抗体の集団を提供する。一部の実施形態において、本開示は、少なくとも８０％がガラクトシル化されており、末端ガラクトース部分の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％および最大で１００％がシアリル化されている、抗体の集団を提供する。一部の実施形態において、本開示は、少なくとも９０％がガラクトシル化されており、末端ガラクトース部分の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％および最大で１００％がシアリル化されている、抗体の集団を提供する。
【００７８】
一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団は、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される。一部の実施形態において、抗ＴＮＦ−α抗体の集団は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生される。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物は、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマである。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物はヤギである。
【００７９】
一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団は、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞以外の細胞において産生される。一部の実施形態において、抗ＴＮＦ−α抗体の集団は、抗体の集団中のガラクトース基の数を増加させるように非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞以外の細胞での産生後に改変される（例えば、酵素、例えば、トランスフェラーゼの作用を介して）。
【００８０】
一態様において、本開示は、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団を含む組成物を提供する。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＴＮＦ−α抗体を含む組成物は、乳汁をさらに含む。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＴＮＦ−α抗体を含む組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
【００８１】
抗体の集団の作製
一態様において、本開示は、高レベルのガラクトシル化（例えば、少なくとも７０％）を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団を含む組成物において、抗体の集団が非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生され、抗体の集団が乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して、増加したレベルのガラクトシル化を有する組成物を提供する。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団は、細胞培養物中で産生される。本明細書において使用される、乳房上皮細胞において産生される抗体と比較して「細胞培養物中で産生される」抗体は、乳房上皮細胞を除く標準的産生細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞）中で産生される抗体を称する。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のガラクトシル化のレベルは、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される抗体のガラクトシル化のレベルと比較して、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下である。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のガラクトシル化のレベルは、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される抗体のガラクトシル化のレベルと比較して５０％以下である。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のガラクトシル化のレベルは、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される抗体のガラクトシル化のレベルと比較して３０％以下である。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のガラクトシル化のレベルは、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される抗体のガラクトシル化のレベルと比較して１０％以下である。
【００８２】
一態様において、本開示は、高レベルのフコシル化（例えば、少なくとも６０％）を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団を含む組成物において、抗体の集団が非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生され、抗体の集団が乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して、増加したレベルのフコシル化を有する組成物を提供する。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団は、細胞培養物中で産生される。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のフコシル化のレベルは、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される抗体のフコシル化のレベルと比較して、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下である。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のフコシル化のレベルは、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される抗体のフコシル化のレベルと比較して５０％以下である。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のフコシル化のレベルは、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される抗体のフコシル化のレベルと比較して３０％以下である。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のフコシル化のレベルは、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される抗体のフコシル化のレベルと比較して１０％以下である。
【００８３】
一態様において、本開示は、高レベルのガラクトシル化およびフコシル化を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団を含む組成物において、抗体の集団が非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生され、抗体の集団が乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して、増加したレベルのガラクトシル化およびフコシル化を有する組成物を提供する。
【００８４】
抗体
一部の実施形態において、用語「抗体」は、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を称する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶＨと略記）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶＬと略記）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存されている領域が散在している相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに下位分類することができる。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。一部の実施形態において、抗原は、可溶性形態、膜貫通形態またはその両方のいずれかのＴＮＦ−αである。抗体の定常領域は、宿主組織または因子、例として、種々の免疫系の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。成熟機能抗体分子の形成は、２つのタンパク質が化学量論的量で発現され、適正な構成で自己集合する場合に達成することができる。
【００８５】
用語「抗体」は、その抗原結合断片を包含することも意味する。抗体および抗原結合断片を作製する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｌｅｗｉｎ，“Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ”，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９０）、およびＲｏｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｇｏｗｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、国際公開第２００６／０４０１５３号、国際公開第２００６／１２２７８６号、および国際公開第２００３／００２６０９号参照）。本明細書において使用される抗体の「抗原結合断片」は、抗原、例えば、ＴＮＦ−αに特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の部分を称する。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片により実行され得ることが示されている。抗体の「抗原結合断片」という用語内に包含される結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により結合している２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によりコードされるが、組換え法を使用し、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一タンパク質鎖としてそれらを作製することを可能とする合成リンカーによりそれらを連結させることができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３参照）。このような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されるものとする。これらの抗体断片は、従来の手順、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ９８−１１８（Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８３）に記載のタンパク質分解断片化手順を使用し、および当業者に公知の他の技術により得られる。断片は、インタクト抗体と同一の様式で有用性についてスクリーニングされる。
【００８６】
一部の実施形態において、抗体は、アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＤのものである。さらなる実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、ＩｇＥからなる群から選択され、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤもしくはＩｇＥの免疫グロブリン定常および／もしくは可変ドメインを有する。他の実施形態において、抗体は、二重特異性または多重特異性抗体である。代替的な実施形態によれば、本開示の抗体は、二重特異性抗体、または多重特異性抗体の形態になるように改変することができる。用語「二重特異性抗体(bispecific antibody)」は、（ａ）細胞表面抗原および（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体に結合し、またはそれらと相互作用する、２つの異なる結合特異性を有する任意の作用物質、例えば、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチド複合体を含むものとする。用語「多重特異性抗体(multispecific antibody)」は、（ａ）細胞表面抗原、（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体、および（ｃ）少なくとも１つの他の構成成分に結合し、またはそれらと相互作用する、３つ以上の異なる結合特異性を有する任意の作用物質、例えば、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチド複合体を含むものとする。従って、本開示は、限定されるものではないが、細胞表面抗原に、およびエフェクター細胞上のＦｃ受容体に指向される二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、および他の多重特異性抗体を含む。用語「二重特異性抗体」は、ダイアボディをさらに含む。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現されるが、短すぎて同一鎖上でのそれら２つのドメイン間の対合を可能としないリンカーを使用し、それにより、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位を創成する二価二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｉｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。
【００８７】
用語「抗体」は、様々なタイプの抗体、例えば、組換え抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体、またはそれらの混合物も包含する。
【００８８】
一部の実施形態において、抗体は、組換え抗体である。本明細書において使用される用語「組換え抗体」は、組換え手段により調製、発現、創成または単離される抗体、例えば、別種の免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物から単離される抗体、宿主細胞中にトランスフェクトされる組換え発現ベクターを使用して発現される抗体、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離される抗体、または免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、創成もしくは単離される抗体を含むものとする。
【００８９】
さらに他の実施形態において、抗体は、キメラまたはヒト化抗体であり得る。本明細書において使用される用語「キメラ抗体」は、非ヒト（例えば、マウス、ラット、ウサギ）抗体の一部とヒト抗体の一部とを組み合わせる抗体を称する。本明細書において使用される用語「ヒト化抗体」は、ヒトフレームワーク領域を伴い、親抗体からの抗原結合ＣＤＲのみを保持する抗体を称する（Ｗａｌｄｍａｎｎ，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６５７参照）。ネズミ抗体の結合特異性を保持するこのようなキメラまたはヒト化抗体は、本開示による診断、予防または治療用途のためにインビボで投与した場合に低減した免疫原性を有することが予測される。
【００９０】
ある実施形態において、抗体は、ヒト抗体である。本明細書において使用される用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列(germline)免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含むものとする。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでランダムまたは部位特異的突然変異誘発により、またはインビボで体細胞突然変異により導入される突然変異）。ヒト抗体は、マウス免疫系ではなくヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニックマウスを使用して作製される。完全ヒトモノクローナル抗体を、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックであるマウスを免疫化することにより調製することもできる。例えば、内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５９１，６６９号明細書、米国特許第５，５９８，３６９号明細書、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、米国特許第６，１５０，５８４号明細書、およびそれらに引用されている参照文献参照。これらの動物は、内因性（例えば、ネズミ）抗体の産生が機能的に欠失するように遺伝子操作されている。動物は、それらの動物の免疫化が目的抗原に対する完全ヒト抗体の産生をもたらすようにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するようにさらに改変される。これらのマウス（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ）、ＨｕＭＡｂマウス（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＧｅｎＰｈａｒｍ））の免疫化後、モノクローナル抗体が標準的なハイブリドーマ技術に従って調製される。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、従って、ヒトに投与した場合にヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発しない。ヒト抗体は、本明細書に提供される抗体のいずれかと同様に、モノクローナル抗体であり得る。
【００９１】
一部の実施形態において、抗体は、完全長抗体である。一部の実施形態において、完全長抗体は、重鎖および軽鎖を含む。一部の実施形態において、抗体は、抗ＴＮＦ−α抗体である。一部の実施形態において、重鎖は配列番号１を含み、軽鎖は配列番号２を含む。一部の実施形態において、抗体は、アダリムマブである。
【００９２】
ＣＤＣ活性
一態様において、高レベルのガラクトシル化（例えば、少なくとも７０％）を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団を含む組成物は、高い補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する。一態様において、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団を含む組成物は、高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団を含む組成物は、高い補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有し、高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。
【００９３】
一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団は、低レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団と比較して、増加したレベルの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団および低レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団は、同一抗原エピトープに指向される。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗体の集団および低レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団は、同一の核酸によりコードされる。一部の実施形態において、核酸は、抗体アダリムマブをコードする。
【００９４】
本明細書において使用される低レベルのガラクトシル化を有する（「低ガラクトース」である）抗体の集団は、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルが、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、０％までである抗体の集団を称する。
【００９５】
一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団のＣＤＣ活性は、低レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団と比較して、少なくとも１．１倍高く、少なくとも１．２倍高く、少なくとも１．３倍高く、少なくとも１．４倍高く、少なくとも１．５倍高く、少なくとも１．６倍高く、少なくとも１．７倍高く、少なくとも１．８倍高く、少なくとも１．９倍高く、少なくとも２倍高く、少なくとも３倍高く、少なくとも５倍高く、少なくとも１０倍高く、最大で少なくとも１００倍高く、またはそれより高い。
【００９６】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗体の集団は、高フコシル化されている（高レベルのフコシル化を有する）。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、高フコシル化されている抗体の集団は、低ガラクトースであり、低フコースである（低レベルのガラクトシル化およびフコシル化を有する）抗体の集団と比較して、増加したレベルの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、高フコシル化されている抗体の集団および低ガラクトースであり、低フコースである抗体の集団は、同一の抗原エピトープに指向される。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、高フコシル化されている抗体の集団および低ガラクトースであり、低フコースである抗体の集団は、同一の核酸によりコードされる。一部の実施形態において、核酸は、抗体アダリムマブをコードする。
【００９７】
本明細書において使用される、低フコースであり、または低レベルのフコシル化を有する抗体の集団は、集団中の抗体のフコシル化のレベルが５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、０％までである抗体の集団を称する。
【００９８】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、高フコシル化されている抗体の集団のＣＤＣ活性は、低ガラクトースであり、低フコースである抗体の集団と比較して、少なくとも１．１倍高く、少なくとも１．２倍高く、少なくとも１．３倍高く、少なくとも１．４倍高く、少なくとも１．５倍高く、少なくとも１．６倍高く、少なくとも１．７倍高く、少なくとも１．８倍高く、少なくとも１．９倍高く、少なくとも２倍高く、少なくとも３倍高く、少なくとも５倍高く、少なくとも１０倍高く、最大で少なくとも１００倍高く、またはそれより高い。
【００９９】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、乳腺上皮細胞において産生される抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して、増加したレベルの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団は、細胞培養物中で産生される。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生される高ガラクトシル化されている抗体の集団および乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団は、同一の核酸によりコードされ得る。一部の実施形態において、核酸は、抗体アダリムマブをコードする。
【０１００】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、乳腺上皮細胞において産生される抗体の集団のＣＤＣ活性は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して、少なくとも１．１倍高く、少なくとも１．２倍高く、少なくとも１．３倍高く、少なくとも１．４倍高く、少なくとも１．５倍高く、少なくとも１．６倍高く、少なくとも１．７倍高く、少なくとも１．８倍高く、少なくとも１．９倍高く、少なくとも２倍高く、少なくとも３倍高く、少なくとも５倍高く、少なくとも１０倍高く、最大で少なくとも１００倍高く、またはそれより高い。
【０１０１】
一態様において、本明細書に開示の抗体の集団の組成物は、高い（補体依存性細胞傷害）ＣＤＣ活性を有する。抗体は、種々の機序を介して治療剤として作用することができ、その機序の１つはＣＤＣ活性を介する。標的細胞受容体に結合する一部の治療抗体は、補体経路のタンパク質にも結合し得る。補体タンパク質の結合は、補体カスケード（Ｃ１複合体活性化を介する）をもたらし、それが治療抗体が結合している細胞の細胞溶解および死滅を引き起こす「膜侵襲複合体」の形成を最終的にもたらす（例えば、Ｒｅｆｆ  Ｍ．Ｅ．Ｂｌｏｏｄ  １９９４，８３：４３５参照）。
【０１０２】
一部の実施形態において、増加したレベルの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する抗体の集団は、増加したレベルの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有さない抗体の集団と比較して、多量の細胞溶解を誘導する抗体の集団である。ＣＤＣのレベルを測定する方法は、当技術分野において公知であり、細胞溶解の量の測定に基づくことが多い。ＣＤＣ活性を測定するための市販のキットは、例えば、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入することができる。
【０１０３】
ＡＤＣＣ活性
一態様において、高レベルのガラクトシル化（例えば、少なくとも７０％）を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団は、低レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団と比較して、増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。一部の実施形態において、本開示は、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団を含む組成物において、抗体の集団が非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生され、抗体の集団が乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して、増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する組成物を提供する。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団は、細胞培養物中で産生される。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化（例えば、少なくとも７０％）を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団は、グリコシル化されていない抗体の集団と比較して、増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。
【０１０４】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗体の集団は、低ガラクトースである抗体の集団と比較して、増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有する。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗体の集団のＡＤＣＣ活性は、低ガラクトースである抗体の集団と比較して少なくとも１．１倍高く、１．２倍高く、１．３倍高く、１．４倍高く、１．５倍高く、１．６倍高く、１．７倍高く、１．８倍高く、１．９倍高く、２倍高く、３倍高く、５倍高く、１０倍高く、１００倍高く、またはそれより高い。
【０１０５】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、乳腺上皮細胞において産生される抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して、増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有する。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、乳腺上皮細胞において産生される抗体の集団のＡＤＣＣ活性は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して少なくとも１．１倍高く、１．２倍高く、１．３倍高く、１．４倍高く、１．５倍高く、１．６倍高く、１．７倍高く、１．８倍高く、１．９倍高く、２倍高く、３倍高く、５倍高く、１０倍高く、１００倍高く、またはそれより高い。
【０１０６】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、乳腺上皮細胞において産生される抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して、増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有する。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団は、細胞培養物中で産生される。
【０１０７】
一態様において、本明細書に開示の抗体の集団の組成物は、高いＡＤＣＣ活性を有する。抗体は、種々の機序を介して治療剤として作用することができ、その機序の１つはＡＤＣＣ活性を介する。標的細胞上の細胞受容体に結合し、Ｆｃグリコシル化部位を含む治療抗体は、Ｆｃ受容体にも結合し得、Ｆｃ受容体を発現する細胞の標的細胞への係留をもたらす。抗体のＦｃ領域の結合の親和性は、一般に、Ｆｃグリコシル化部位のグリコシル化の性質に依存する。Ｆｃ受容体は、多数の免疫細胞、例として、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、およびマスト細胞上で見出される。Ｆｃ受容体への結合は、標的細胞を殺滅するためのサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および食作用を誘導する免疫細胞をもたらす。一部の実施形態において、増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する抗体の集団は、増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有さない抗体の集団と比較して、増加したＣＤ１６発現細胞への結合を示す抗体の集団である。一部の実施形態において、増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する抗体の集団は、増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有さない抗体の集団と比較して、増加したＩＬ−２産生（例えば、ナチュラルキラー細胞中で）の誘導を示す抗体の集団である。ＡＤＣＣ活性を測定するための市販のキットは、例えば、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入することができる。一部の実施形態において、ＡＤＣＣ活性の測定は、ＣＤ１６に結合する能力を評価することにより実施される。
【０１０８】
抗ＴＮＦ−α活性
一態様において、高レベルのガラクトシル化（例えば、少なくとも７０％）を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団は、低レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団と比較して増加した、対象中のＴＮＦ−α活性を抑制する能力を有する。一部の実施形態において、本開示は、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団を含む組成物において、抗体の集団が非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生され、抗体の集団が乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加した、対象中のＴＮＦ−α活性を抑制する能力を有する組成物を提供する。
【０１０９】
一態様において、本開示は、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団を含む組成物において、抗体の集団が非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生され、抗体の集団が乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して、増加した可溶性ＴＮＦ−αに結合する能力を有する組成物を提供する。
【０１１０】
一態様において、本開示は、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団を含む組成物において、抗体の集団が非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生され、抗体の集団が乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して、増加した膜貫通ＴＮＦ−αに結合する能力を有する組成物を提供する。
【０１１１】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗体の集団は、低ガラクトースである抗体の集団と比較して増加した、ＴＮＦ−α活性を抑制し、可溶性ＴＮＦ−αに結合し、および／または膜貫通ＴＮＦ−αに結合する能力を有する。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗体の集団の増加した、ＴＮＦ−α活性を抑制し、可溶性ＴＮＦ−αに結合し、および／または膜貫通ＴＮＦ−αに結合する能力は、低ガラクトースである抗体の集団と比較して、少なくとも１．１倍高く、１．２倍高く、１．３倍高く、１．４倍高く、１．５倍高く、１．６倍高く、１．７倍高く、１．８倍高く、１．９倍高く、２倍高く、３倍高く、５倍高く、１０倍高く、１００倍高く、またはそれより高い。
【０１１２】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、乳腺上皮細胞において産生される抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加した、ＴＮＦ−α活性を抑制し、可溶性ＴＮＦ−αに結合し、および／または膜貫通ＴＮＦ−αに結合する能力を有する。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、乳腺上皮細胞において産生される抗体の集団の増加した、ＴＮＦ−α活性を抑制し、可溶性ＴＮＦ−αに結合し、および／または膜貫通ＴＮＦ−αに結合する能力は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して、少なくとも１．１倍高く、１．２倍高く、１．３倍高く、１．４倍高く、１．５倍高く、１．６倍高く、１．７倍高く、１．８倍高く、１．９倍高く、２倍高く、３倍高く、５倍高く、１０倍高く、１００倍高く、またはそれより高い。
【０１１３】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、乳腺上皮細胞において産生される抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加した、ＴＮＦ−α活性を抑制し、可溶性ＴＮＦ−αに結合し、および／または膜貫通ＴＮＦ−αに結合する能力を有する。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団は、細胞培養物中で産生される。
【０１１４】
一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生される抗ＴＮＦ−α抗体の集団は、非乳腺上皮細胞により産生される抗体よりも、対象中のＴＮＦ−α活性の抑制において優れている。対象中のＴＮＦ−α活性のレベルの測定は、例えば、抗体の集団を、ＴＮＦ−α活性の増加を特徴とする疾患（例えば、関節リウマチ）を罹患する対象またはそのような疾患について樹立されたモデルに投与することにより評価することができる（例えば、Ｈｏｒｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ｅｔ  ａｌ．４９：１２１５参照）。
【０１１５】
一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生される抗ＴＮＦ−α抗体の集団は、非乳腺上皮細胞により産生される抗体よりも、可溶性ＴＮＦ−αへの結合において優れている。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生される抗ＴＮＦ−α抗体の集団は、非乳腺上皮細胞により産生される抗体よりも、膜貫通ＴＮＦ−αへの結合において優れている。可溶性ＴＮＦ−αまたは膜貫通ＴＮＦ−αへの結合のレベルを測定するためのアッセイは、十分に確立されている（例えば、Ｈｏｒｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ｅｔ  ａｌ．４９：１２１５参照）。
【０１１６】
非ヒト乳腺上皮細胞およびトランスジェニック動物
一態様において、本開示は、高ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体または高レベルのガラクトシル化を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団を産生する乳腺上皮細胞を提供する。
【０１１７】
一態様において、本開示は、高ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体または高レベルのガラクトシル化を有する抗ＴＮＦ−α抗体の集団を産生するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
【０１１８】
一態様において、本開示は、グリコシル化抗体を産生する哺乳動物の乳房上皮細胞に関する。本明細書において、哺乳動物の乳房上皮細胞においてグリコシル化抗体を産生させる方法が提供される。このことは、細胞培養物中で乳房上皮細胞を培養することにより達成することができる（インビトロまたはエクスビボ）。このことは、トランスジェニック動物において達成することもできる（インビボ）。
【０１１９】
一部の実施形態において、哺乳動物の乳腺上皮細胞は、トランスジェニック動物中に存在する。一部の実施形態において、哺乳動物の乳腺上皮細胞は、トランスジェニック動物、例えば、マウスまたはヤギの乳汁中で組換え抗体を発現するように操作されている。このことを達成するため、組換えタンパク質をコードする遺伝子の発現は、例えば、ヤギβ−カゼイン調節エレメントの制御下であり得る。マウスおよびヤギ乳汁の両方における組換えタンパク質、例えば、抗体の発現は、既に確立されている（例えば、米国特許出願公開第２００８−０１１８５０１−Ａ１号明細書参照）。一部の実施形態において、発現は、乳汁タンパク質を産生する個々の乳管上皮細胞について最適化される。
【０１２０】
組換え抗体を産生し得るトランスジェニック動物は、当技術分野において公知の方法に従って作製することができる（例えば、米国特許第５，９４５，５７７号明細書および米国特許出願公開第２００８−０１１８５０１−Ａ１号明細書参照）。トランスジェニック発現に好適な動物としては、限定されるものではないが、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマが挙げられる。好適な動物としては、ウシ属、ヤギ属、ヒツジ属およびイノシシ属も挙げられ、それらはそれぞれウシ、ヤギ、ヒツジおよびブタ（または畜豚）の種々の種に関する。好適な動物としては、有蹄動物も挙げられる。本明細書において使用される「有蹄動物」は、有蹄の典型的には草食の四肢哺乳動物、例として、限定されるものではないが、ヒツジ、畜豚、ヤギ、畜牛およびウマのものまたはそれらに関する。好適な動物としては、乳畜、例えば、ヤギおよび畜牛、またはマウスも挙げられる。一部の実施形態において、トランスジェニック発現に好適な動物はヤギである。
【０１２１】
一実施形態において、トランスジェニック動物は、目的構築物(construct)を含む初代細胞の作製とそれに続く除核卵母細胞中への初代細胞核の核移植により作製する。目的構築物を含む初代細胞は、初代細胞に目的抗体、例えば、アダリムマブの重鎖および軽鎖のコード配列を含む単一構築物を注射もしくはトランスフェクトすることにより、または初代細胞に抗体、例えば、アダリムマブの重鎖および軽鎖のコード配列を含む別個の構築物を同時トランスフェクションもしくは同時注入することにより作製する。次いで、これらの細胞を増殖させ、特徴付けして導入遺伝子コピー数、導入遺伝子構造統合性(transgene structural integrity)および染色体組込み部位(chromosomal integration site)を評価する。次いで、所望の導入遺伝子コピー数、導入遺伝子構造統合性および染色体組込み部位を有する細胞を核移植に使用してトランスジェニック動物を作製する。本明細書において使用される「核移植」は、ドナー細胞からの核を除核卵母細胞中に移植する、クローニングの方法を称する。
【０１２２】
哺乳動物の乳房上皮細胞において発現させるべき抗体のコード配列は、配列データベース、例えば、ＮＣＢＩ、Ｇｅｎｂａｎｋからの選択動物（例えば、ヒト、畜牛またはマウス）に由来するゲノム材料もしくは逆翻訳メッセンジャーＲＮＡのライブラリーをスクリーニングすることにより、または当技術分野において公知の方法、例えば、ペプチドマッピングを使用して抗体の配列を得ることにより得ることができる。配列は、適切なプラスミドベクター中にクローニングし、好適な宿主生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で増幅させることができる。本明細書において使用される「ベクター」は、異なる遺伝子環境間の輸送のためまたは宿主細胞での発現のために制限およびライゲーションによってその中に所望の配列を挿入することができる多数の核酸のいずれであってもよい。ベクターは、典型的には、ＤＮＡから構成されるが、ＲＮＡベクターも利用可能である。ベクターとしては、限定されるものではないが、プラスミドおよびファージミドが挙げられる。クローニングベクターは、宿主細胞中で複製することができ、および１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位をさらに特徴とするものであり、そのエンドヌクレアーゼ制限部位でベクターを特定可能な様式で切断することができ、かつ新たな組換えベクターが宿主細胞中で複製する能力を保持するようにその部位に所望のＤＮＡ配列をライゲーションさせることができる。発現ベクターは、その中に所望のＤＮＡ配列をそれが調節配列に作動可能に連結するように制限およびライゲーションにより挿入し、さらにそこでＲＮＡ転写物として発現させ得るものである。ベクターは、ベクターにより形質転換またはトランスフェクトされ、またはされなかった細胞の同定における使用に好適な１つ以上のマーカー配列をさらに含有し得る。マーカーとしては、例えば、抗生物質または他の化合物に対する耐性または感受性のいずれかを増加または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、活性が当技術分野において公知の標準的アッセイにより検出可能である酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、および形質転換またはトランスフェクトされる細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に可視的に影響する遺伝子を挙げられる。
【０１２３】
抗体または目的抗体の重鎖および軽鎖のコード配列は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳汁中でのコード配列の発現を可能とする制御配列に作動可能に結合させることができる。ベクターの増幅後、ＤＮＡ構築物をベクターの残部から切断、精製し、さらにトランスジェニック動物を作製するために使用することができる発現ベクター中に導入することができる。トランスジェニック動物は、そのゲノム中に組み込まれた所望のトランスジェニックタンパク質を有する。
【０１２４】
産生をトランスジェニック動物の乳汁に方向付けるのに好適なＤＮＡ配列は、天然由来の乳汁タンパク質に由来する５’−プロモーター領域を担持し得る。このプロモーターは、結果的に、ホルモンおよび組織特異的因子の制御下であり、泌乳する乳房組織中で最も活性である。一部の実施形態において、使用されるプロモーターは、乳汁特異的プロモーターである。本明細書において使用される「乳汁特異的プロモーター」は、タンパク質を乳汁中に分泌する細胞（例えば、乳房上皮細胞）での遺伝子の発現を自然に導くプロモーターであり、例えば、カゼインプロモーター、例えば、α−カゼインプロモーター（例えば、αＳ−１カゼインプロモーターおよびαＳ２−カゼインプロモーター）、β−カゼインプロモーター（例えば、ヤギβカゼイン遺伝子プロモーター（ＤｉＴｕｌｌｉｏ，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  １０：７４−７７，１９９２）、γ−カゼインプロモーター、κ−カゼインプロモーター、乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモーター（Ｇｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ５：１１８３−１１８７，１９８７）、β−ラクトグロブリンプロモーター（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ７：４８７−４９２，１９８９）およびα−ラクトアルブミンプロモーター（Ｓｏｕｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴＳ．２９７：１３，１９９２）が挙げられる。乳房組織中で特異的に活性化されるプロモーター、例えば、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーターなどもこの定義に含まれる。一部の実施形態において、プロモーターは、ヤギ属βカゼインプロモーターである。
【０１２５】
乳房上皮全体に亘りトランスジェニックタンパク質の分泌を乳汁中に向けるタンパク質リーダー配列の産生を導くＤＮＡ配列に、プロモーターを作動可能に結合させてもよい。本明細書において使用されるコード配列および調節配列（例えば、プロモーター）は、それらがコード配列の発現または転写を調節配列の影響または制御下に置くように結合している場合、「作動可能に連結している」または「作動可能に結合している」ことになる。本明細書において使用される「リーダー配列」または「シグナル配列」は、タンパク質分泌シグナルをコードする核酸配列であり、トランスジェニックタンパク質をコードする下流の核酸分子に作動可能に結合したときに分泌を導く。リーダー配列は、天然ヒトリーダー配列であっても、人工由来リーダーであってもよく、あるいは導入遺伝子コード配列の転写を導くために使用されるプロモーターと同一の遺伝子から得たものであっても、または、例えば哺乳動物の乳房上皮細胞のような細胞から普通に分泌される別のタンパク質から得たものであってもよい。一部の実施形態において、３’−配列を付加してｍＲＮＡの安定性を改善することができ、その３’−配列は天然に分泌される乳汁タンパク質に由来するものであってよい。
【０１２６】
一部の実施形態において、核移植によるトランスジェニックヤギの作製において使用される構築物（例えば、アダリムマブ抗体をコードする）を含有する初代細胞株を作製するため、重鎖および軽鎖構築物を初代ヤギ皮膚上皮細胞中にトランスフェクトすることができ、その細胞を拡大させ、さらに完全に特徴付けして、導入遺伝子コピー数、導入遺伝子構造統合性および染色体組込み部位を評価する。本明細書において使用される「核移植」は、ドナー細胞からの核を除核卵母細胞中に移植するクローニングの方法を称する。
【０１２７】
クローニングは、目的の抗体または他の遺伝子構築物をそれぞれ産生し得るトランスジェニック動物の多重性をもたらす。産生方法は、クローン動物およびその動物の子孫の使用を含む。クローニングは、胎児の核移植、核移植、組織および臓器移植、ならびにキメラ子孫の創成も包含する。クローニングプロセスの１つの工程は、目的導入遺伝子を含有する細胞、例えば、初代細胞のゲノムを除核卵母細胞中に移行させる工程を含む。本明細書において使用される「導入遺伝子（transgene）」は、細胞、またはその祖先中に人工的に挿入され、その細胞から発生する動物のゲノムの一部になる任意の核酸分子片を称する。このような導入遺伝子は、トランスジェニック動物に対して部分的もしくは全体的に外因性（すなわち、外来）である遺伝子を含んでいてよく、またはその動物の内因性遺伝子に対して同一性を有する遺伝子であってもよい。卵母細胞の好適な哺乳動物供給源としては、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウサギ、モルモット、マウス、ハムスター、ラット、非ヒト霊長類などが挙げられる。好ましくは、卵母細胞は、有蹄動物、最も好ましくは、ヤギまたは畜牛から得る。卵母細胞を単離する方法は、当技術分野において周知である。本質的には、このプロセスは、哺乳動物、例えば、ヤギの卵巣または生殖器官から卵母細胞を単離する工程を含む。有蹄動物卵母細胞の容易に利用可能な供給源は、ホルモン誘導される雌性動物からのものである。遺伝子操作、核移植およびクローニングのような技術の良好な使用のため、卵母細胞を、好ましくは、インビボで成熟させてから、その細胞を核移植のためのレシピエント細胞として使用することができ、それを精細胞により受精させて胚に発達させた。インビボで成熟された第２減数分裂中期の卵母細胞は、核移植技術において良好に使用されている。本質的には、成熟した第２減数分裂中期の卵母細胞は、非過排卵動物または過排卵動物のいずれかから、発情期の発生からまたはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）もしくは類似のホルモンの注射から数時間後に外科的に回収する。
【０１２８】
一部の実施形態において、トランスジェニック動物（例えば、ヤギ）および乳房上皮細胞は、マイクロインジェクションを介して作製する。ヤギにおけるマイクロインジェクションは、例えば、米国特許第７，９２８，０６４号明細書に記載されている。手短に述べると、受精されたヤギ卵を、立体顕微鏡上でＰＢＳ卵管フラッシング液から回収し、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する培地中で洗浄する。前核が可視的であった場合、胚は、直ちにマイクロインジェクトすることができる。前核が可視的でない場合、前核が可視的になるまで胚を短期間培養のための培地中に配置することができる（Ｓｅｌｇｒａｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，１９９０．ｐ．１１９５−１２０５）。単細胞ヤギ胚を、ガラスくぼみスライド上で油下で培地の微液滴中に配置する。２つの可視的な前核を有する受精卵を、固定ステージを有する正立顕微鏡上でフレーム研磨保持マイクロピペット上で固定化することができる。前核に、微細ガラスマイクロニードルを使用して適切な抗体をコードする構築物を注射緩衝液中でマイクロインジェクトすることができる（Ｓｅｌｇｒａｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，１９９０．ｐ．１１９５−１２０５）。マイクロインジェクション後、生存胚を培養物中で配置し、レシピエント動物が胚移行のために調製されるまでインキュベートする（Ｓｅｌｇｒａｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，１９９０．ｐ．１１９５−１２０５）。
【０１２９】
従って、一態様において、本開示は、本明細書に開示の抗体または抗体の集団を産生する乳腺上皮細胞を提供する。一部の実施形態において、抗体は、配列番号３を含む核酸および配列番号４を含む核酸を含む。一部の実施形態において、配列番号３を含む核酸および配列番号４を含む核酸は連結している。「連結している(connected)」は、核酸が、例えば、同一のベクター内またはほぼ同一のゲノム位置内で物理的に結合していることを意味するために本明細書において使用される。一部の実施形態において、上記の乳房上皮細胞は、トランスジェニック非ヒト動物中に存在する。一部の実施形態において、トランスジェニック非ヒト哺乳動物はヤギである。
【０１３０】
アダリムマブの重鎖をコードする核酸配列は、配列番号３に提供される：
ＡＴＧＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＴＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＴＣＴＡＣＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＧＣＣＴＡＧＣＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＴＴＧＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＧＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＡＧＣＡＧＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＴＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＴＡＡＴＧＡ
【０１３１】
アダリムマブの軽鎖をコードする核酸配列は、配列番号４に提供される：
ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＡＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＴＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＴＣＴＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＴＣＡＧＧＡＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＡＧＧＴＡＣＡＡＣＡＧＧＧＣＣＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＣＡＧＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＣＧＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡＧＣＧＴＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＡＡＴＧＡ
【０１３２】
別の態様において、本開示は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳汁中で、核酸構築物によりコードされるトランスジェニック抗体を発現させる工程を含む、トランスジェニック抗体、およびその集団を作製する方法を提供する。一部の実施形態において、本開示の抗体を作製する方法は、
（ａ）非ヒト哺乳動物細胞を、抗ＴＮＦ−α抗体をコードする導入遺伝子ＤＮＡ構築物でトランスフェクトする工程；
（ｂ）前記抗ＴＮＦ−α導入遺伝子ＤＮＡ構築物がゲノム中に挿入された細胞を選択する工程；および
（ｃ）第１の核移植手順を実施して抗ＴＮＦ−α抗体についてヘテロ接合であり、それを乳汁中で発現し得る非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する工程
を含む。
【０１３３】
一部の実施形態において、抗ＴＮＦ−α抗体は、アダリムマブである。
【０１３４】
一部の実施形態において、導入遺伝子ＤＮＡ構築物は、配列番号３および／または配列番号４を含む。一部の実施形態において、非ヒトトランスジェニック哺乳動物はヤギである。
【０１３５】
別の態様において、本開示は、
（ａ）抗ＴＮＦ−α抗体を発現するように操作された非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供する工程、
（ｂ）抗ＴＮＦ−α抗体を非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁中で発現させる工程；および
（ｃ）乳汁中で発現された抗ＴＮＦ−α抗体を単離する工程
の方法を提供する。
【０１３６】
一部の実施形態において、抗ＴＮＦ−α抗体は、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、抗ＴＮＦ−α抗体は、アダリムマブである。
【０１３７】
乳腺中で発現される組換えタンパク質の量および質を予測するために使用されるツールの１つは、泌乳の誘導を介する（Ｅｂｅｒｔ  ＫＭ，１９９４）。誘導泌乳は、少なくとも１年後である妊娠から生じる最初の天然泌乳からではなく、トランスジェニック産生の初期からのタンパク質の発現および分析を可能とする。泌乳の誘導は、ホルモンにより、または手作業により行うことができる。
【０１３８】
一部の実施形態において、本明細書に提供されるグリコシル化抗体の組成物は、乳汁をさらに含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される方法は、トランスジェニック動物の乳汁から抗体の集団を単離する工程を含む。トランスジェニック動物の乳汁から抗体を単離する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｐｏｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２３１，Ｉｓｓｕｅｓ  １−２，１０  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９９，Ｐａｇｅｓ  １４７−１５７に記載されている。一部の実施形態において、本明細書に提供される方法は、所望量のガラクトシル化を有するグリコシル化抗体を精製する工程を含む。
【０１３９】
治療方法、医薬組成物、投与量、および投与
一態様において、本開示は、高ガラクトシル化抗体、高ガラクトシル化抗体の組成物、高レベルのガラクトシル化抗体を有する抗体の集団または高レベルのガラクトシル化抗体を有する抗体の集団を含む組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。一部の実施形態において、対象は、炎症性疾患または自己免疫疾患を有する。一部の実施形態において、炎症性疾患または自己免疫疾患は、関節リウマチ、乾癬、クローン病、若年性特発性関節炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、慢性炎症、肝炎、ベーチェット病、ウェゲナー肉芽腫症、またはサルコイドーシスである。
【０１４０】
一態様において、本開示は、本明細書に記載の抗体または組成物のいずれか１つを、それを必要とする対象に投与する方法を提供する。一部の実施形態において、対象は、免疫疾患または炎症を伴う疾患を有する。免疫疾患および炎症を伴う疾患としては、限定されるものではないが、成人呼吸窮迫症候群、動脈硬化症、喘息、アテローム性動脈硬化症、胆嚢炎、肝硬変、クローン病、糖尿病、肺気腫、過好酸球増加症、炎症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵炎、関節リウマチ、強皮症、大腸炎、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、糖尿病、炎症性腸疾患、セリアック病、自己免疫甲状腺疾患、アジソン病、シェーグレン症候群、シデナム舞踏病、高安動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性胃炎、自己免疫性肝炎、皮膚自己免疫疾患、自己免疫性拡張型心筋症、多発性硬化症、心筋炎、重症筋無力症、悪性貧血、多発筋痛、乾癬、急速進行性糸球体腎炎、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、血管炎、筋の自己免疫疾患、精巣の自己免疫疾患、卵巣の自己免疫疾患および眼の自己免疫疾患、尋常性座瘡、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、炎症性腸疾患、骨盤炎症疾患、再かん流傷害（ｐｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ）、関節リウマチ、サルコイドーシス、移植片拒絶反応、血管炎、ならびに間質性膀胱炎が挙げられる。
【０１４１】
一態様において、本開示は、本明細書に記載の抗体または組成物のいずれか１つを、それを必要とする対象に投与する方法を提供する。一部の実施形態において、治療を必要とする対象は、ＴＮＦレベルの機能不全を特徴とする疾患を有する対象である。ＴＮＦレベルの機能不全を特徴とする疾患としては、上記の炎症および免疫疾患に加え、アルツハイマー病、癌および鬱病が挙げられる。
【０１４２】
一態様において、本開示は、ある量の抗体または抗体の集団および薬学的に許容可能なビヒクル、希釈剤または担体を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、乳汁を含む。
【０１４３】
一態様において、本開示は、対象が有しまたは有するリスクのある疾患を治療するのに有効な量で提供される組成物を、対象に投与する工程を含む、対象を治療する方法を提供する。一実施形態において、対象は、ヒトである。別の実施形態において、対象は、非ヒト動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギまたは霊長類である。
【０１４４】
治療が必要とされる対象に治療有効量の本明細書に提供される抗体を投与する工程を含む実施形態によれば、「治療有効」または「治療するために有効な量」は、病状を阻害し、または反転させるため（例えば、炎症を治療するため）に必要とされる抗体または組成物の量を示す。治療有効量の決定は、具体的には、医薬品の毒性および効力のような因子に依存する。これらの因子は、他の因子、例えば、効能、相対的バイオアベイラビリティ、患者の体重、副作用の重症度および好ましい投与方式に応じて異なる。毒性は、当技術分野において周知の方法を使用して測定することができる。効力は、同一の指針を利用して測定することができる。効力は、例えば、炎症の減少により計測することができる。従って、薬学的有効量は、毒性学的に耐性であり、さらには有効であると臨床医により判断される量である。
【０１４５】
投与量は、投与方式に応じて局所または全身の所望の薬物（例えば、抗ＴＮＦ−α抗体）レベルを達成するように適切に調整することができる。このような用量において対象における応答が不十分な事象において、さらに高い用量（または異なるより局所的な送達経路により有効なより高い用量）を患者耐性が許容する程度で用いることができる。１日当たりの複数回投与が、抗体の適切な全身レベルを達成するために考慮される。適切な全身レベルは、例えば、薬物の患者のピークまたは持続血漿レベルの計測により特定することができる。「用量」および「投与量」は、本明細書において互換的に使用される。
【０１４６】
一部の実施形態において、対象に投与される抗体または医薬組成物の量は、１週間当たり５０から５００ｍｇ／ｋｇ、１００から４００ｍｇ／ｋｇ、または２００から３００ｍｇ／ｋｇである。一実施形態において、対象に投与される抗体または医薬組成物の量は、１週間当たり２５０ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態において、４００ｍｇ／ｋｇの初回用量を第１週に対象に投与し、次いで翌週にその対象に２５０ｍｇ／ｋｇを投与する。一部の実施形態において、投与速度は、１０ｍｇ／分未満である。一部の実施形態において、対象への抗体または医薬組成物の投与は、別の治療剤による治療の少なくとも１時間前に行う。一部の実施形態において、前治療は、抗体または医薬組成物の投与前に施す。
【０１４７】
一部の実施形態において、提供される組成物は、インビボ用途に用いられる。意図されるインビボの投与方式に応じて、使用される組成物は、固体、半固体または液体の剤形、例えば、錠剤、ピル剤、散剤、カプセル剤、ゲル剤、軟膏剤、液剤、懸濁液などであり得る。好ましくは、組成物は、正確な投与量の単回投与に好適な単位剤形で投与する。組成物は、所望される配合物に応じて、動物またはヒト投与のための医薬組成物を配合するために一般に使用される水系ビヒクルとして定義される薬学的に許容可能な担体または希釈剤も含み得る。希釈剤は、目的ヒト組換えタンパク質の生物学的活性に影響しないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンガー液、デキストローズ溶液、およびハンクス液である。同一の希釈剤を使用して凍結乾燥された目的組換えタンパク質を再構成することができる。さらに、医薬組成物は、他の薬剤、医薬剤、担体、助剤、非毒性、非治療、非免疫原性安定剤なども含み得る。このような希釈剤または担体の有効量は、構成成分の溶解度、生物学的活性などに関して薬学的に許容可能な配合物を得るために有効な量である。一部の実施形態において、本明細書に提供される組成物は、無菌である。
【０１４８】
インビボ治療の間における投与は、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、眼、膣、および直腸経路を含む、任意数の経路によるものであってよい。嚢内、静脈内、および腹腔内の投与経路を用いることもできる。当業者は、投与経路が治療すべき疾患に応じて変動することを認識する。例えば、本明細書の組成物または抗体は、経口、非経口または局所投与を介して対象に投与することができる。一実施形態において、本明細書の組成物または抗体は、静脈内注入により投与される。
【０１４９】
組成物は、それを全身送達することが望まれる場合、注射による、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合することができる。注射のための配合物は、単位剤形で、例えば、アンプル中または複数回投与容器(multi-dose containers)中で、保存剤を添加して提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、液剤またはエマルションなどのような形態であってよく、配合剤、例えば、懸濁化剤、可溶化剤および／または分散剤を含有し得る。
【０１５０】
非経口投与用の医薬組成物としては、水溶性形態の活性組成物の水溶液が挙げられる。さらに、活性組成物の懸濁液を、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有し得る。場合により、懸濁液は、高濃縮溶液の調製を可能とするために好適な安定剤または組成物の溶解度を増加させる薬剤も含有し得る。あるいは、活性組成物は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、滅菌発熱性物質除去蒸留水で構成するための、粉末の形態であり得る。
【０１５１】
経口投与のため、医薬組成物は、例えば、薬学的に許容可能な賦形剤、例えば、結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて従来の手段により調製される錠剤またはカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は、当技術分野において周知の方法によりコーティングすることができる。経口投与のための液体製剤は、例えば、液剤、シロップ剤もしくは懸濁液の形態であってよく、またはそれは水もしくは他の好適なビヒクルを使用前に用いる構成のための乾燥製品として提供することができる。このような液体製剤は、薬学的に許容可能な添加剤、例えば、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用油脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油）；および保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル−またはソルビン酸）を用いて従来の手段により調製することができる。製剤は適宜、緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含有し得る。１つまたは複数の構成成分は、抗体の経口送達が有効になるように化学修飾することができる。一般に、考えられる化学修飾は、（ａ）タンパク質分解の阻害；および（ｂ）胃または腸からの血流中への取り込みを可能とする少なくとも１つの分子の抗体への付着である。抗体の全体的な安定性の増加および体内の循環時間の増加も望まれる。このような分子の例としては、ポリエチレングリコール、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリンが挙げられる。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９８１，“Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ”：Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ，Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．３６７−３８３；Ｎｅｗｍａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５−１８９。使用することができる他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−チオキソカン（ｔｉｏｘｏｃａｎｅ）である。上記の医薬使用にはポリエチレングリコール分子が好ましい。経口用組成物に関して、放出位置は、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、または大腸であり得る。当業者は、胃中で溶解しないが、材料を十二指腸または腸中の他の場所で放出する利用可能な配合物を有する。好ましくは、放出は、抗体の保護により、または例えば腸での放出のように胃環境を越えての生物活性材料の放出により、胃環境の有害な影響を回避する。
【０１５２】
口腔内投与(buccal administration)に関して、組成物は、従来の様式で配合される錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
【０１５３】
吸入投与に関して、本開示により使用される組成物は、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスを使用する加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾル噴霧による提供の形態で都合よく送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、定量を送達するようにバルブを設置することにより決定され得る。例えば、組成物と、例えばラクトースおよびデンプンのような適切な粉末基剤との混合物を含有する、吸入器または吹付器(insufflator)で使用されるゼラチン等のカプセル剤およびカートリッジを形成することができる。
【０１５４】
本明細書において、肺送達も考慮される。組成物は、吸入している間に哺乳動物の肺に送達され、肺上皮内層を超えて血流に浸透する。限定されないが、ネブライザー、定量吸入器、および粉末吸入器等の治療薬の肺送達のために設計された広範囲の機械的装置が、本開示の実施における使用のために考えられ、当業者はその全てに精通している。
【０１５５】
本明細書に開示の医薬組成物の鼻腔送達も考慮される。鼻腔送達は、肺における治療薬の堆積を必要とせずに、治療薬を鼻腔に投与した直後、本開示の医薬組成物の血流への通過を可能とする。鼻腔送達用の配合物としては、デキストランまたはシクロデキストランを有するものが挙げられる。
【０１５６】
組成物は、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含有する、坐剤または滞留浣腸剤のような直腸または膣組成物配合することもできる。
【０１５７】
医薬組成物は、好適な固体またはゲル相担体または賦形剤も含み得る。このような担体または賦形剤の例としては、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリマー、例えば、ポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１５８】
好適な液体または固体医薬製剤形は、例えば、吸入用の水溶液もしくは生理食塩水溶液であり、マイクロカプセル化されており、渦巻型化されており(encochleated)、微細金粒子上にコーティングされており、リポソーム中に含有されており、霧状化されており、エアロゾルであり、皮膚中への移植のためのペレットであり、または皮膚を切創可能な鋭利器具上で乾燥している。医薬組成物としては、顆粒剤、散剤、錠剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル剤、坐剤、シロップ剤、エマルション、懸濁液、クリーム剤、点滴剤または活性組成物の持続性放出を備える製剤も挙げられ、この製剤中で、上記のとおり、賦形剤および添加剤および／または助剤、例えば、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、滑沢剤、香味剤、甘味剤または安定剤が習慣的に使用される。医薬組成物は、種々の薬物送達系における使用に好適である。薬物送達に関する方法の簡単な概説については、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３，１９９０参照。
【０１５９】
抗体および場合により他の治療剤は、それ自体で（無希釈で）または薬学的に許容可能な塩の形態で投与することができる。医薬として使用される場合、塩は薬学的に許容可能でなければならないが、薬学的に許容可能でない塩を都合よく使用して薬学的に許容可能なその塩を調製することができる。このような塩としては、限定されるものではないが、以下の酸から調製されるものが挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。また、このような塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類塩、例えば、カルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩として調製することができる。
【０１６０】
好適な緩衝剤としては、酢酸および塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；ならびにリン酸および塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）が挙げられる。好適な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）が挙げられる。
【０１６１】
本開示の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体中に含まれる有効量の抗体および場合により治療剤を含有する。薬学的に許容可能な担体という用語は、ヒトまたは他の脊椎動物への投与に好適である、１つ以上の適合性の固体または液体増量剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。担体という用語は、適用を容易にするために活性成分が組み合わされる天然または合成の有機または無機成分を示す。医薬組成物の構成成分はまた、所望の薬学的有効性を実質的に害する相互作用が存在しないような様式で、本開示の組成物と、および互いに混合され得る。
【０１６２】
治療剤、例として、具体的には、限定されるものではないが、抗体は、粒子で提供することができる。本明細書において使用される粒子は、全体または一部において抗体または抗体とともに投与される他の治療剤からなり得るナノまたはマイクロ粒子（または一部の例においてはこれよりも大きい）を意味する。粒子は、治療剤に加え、製薬および医学分野において定型的に使用されるそれらの材料のいずれか、例として、限定されるものではないが浸食性、非浸食性、生体分解性、もしくは非生体分解性材料またはそれらの組合せを含み得る。粒子は、抗体を溶液中でまたは半固体状態で含有するマイクロカプセルであり得る。粒子は、実質的に任意の形状であり得る。
【０１６３】
抗体の産生方法
一態様において、本開示は、高ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体および高レベルのガラクトシル化抗体を有する集団を作製する方法を提供する。
【０１６４】
一態様において、本開示は、抗体の集団を作製する方法において、抗体が、抗ＴＮＦ−α抗体であり、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルが、少なくとも７０％である抗体の集団が産生されるように非ヒト哺乳動物の乳腺上皮細胞において抗体の集団を発現させる工程を含む方法を提供する。一部の実施形態において、抗ＴＮＦ−α抗体は、アダリムマブである。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞は、培養されており、抗体をコードする配列を含む核酸でトランスフェクトされる。一部の実施形態において、核酸は、配列番号３および配列番号４を含む。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞は、抗体をコードする配列を含む核酸を乳腺中で発現するように操作された非ヒト哺乳動物中に存在する。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞は、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマの乳腺上皮細胞である。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞はヤギ乳腺上皮細胞である。
【０１６５】
一態様において、本開示は、本明細書に開示の高ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体または高レベルのガラクトシル化抗体を有する集団を発現する乳腺上皮細胞を提供する。
【０１６６】
一態様において、本開示は、本明細書に開示の高ガラクトシル化抗ＴＮＦ−α抗体または高レベルのガラクトシル化抗体を有する集団を発現する乳腺上皮細胞を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
【０１６７】
一態様において、本開示は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳汁中で核酸構築物によりコードされるグリコシル化抗体を発現させる工程を含む、グリコシル化抗体またはグリコシル化抗体の集団を作製する方法を提供する。一実施形態において、哺乳動物の乳房上皮細胞は、乳汁中で抗体を発現するように操作された非ヒト哺乳動物のものであり得る。さらに別の実施形態において、哺乳動物の乳房上皮細胞は、培養されている哺乳動物の乳房上皮細胞である。
【０１６８】
別の実施形態において、方法は、
（ａ）抗体を発現するように操作された非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供する工程、
（ｂ）抗体を非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁中で発現させる工程；
（ｃ）乳汁中で発現された抗体を単離する工程；および
（ｄ）単離された抗体上のガラクトースの存在を検出する工程
を含む。
【０１６９】
さらに別の実施形態において、方法は、産生されるグリコシル化抗体の集団が規定の割合のガラクトシル化（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれより高い）を含むように乳腺上皮細胞においてグリコシル化抗体の集団を産生させる工程を含む。一部の実施形態において、抗体は、抗ＴＮＦ−α抗体である。一部の実施形態において、グリコシル化抗体は、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、この方法は、インビトロで実施する。他の実施形態において、この方法は、インビボで、例えば、トランスジェニックヤギの乳腺中で実施する。
【０１７０】
一部の実施形態において、上記の方法は、泌乳を誘導する工程をさらに含む。さらに他の実施形態において、方法は、追加の単離および／または精製工程をさらに含む。さらに他の実施形態において、方法は、得られた抗体のグリコシル化パターンを、細胞培養物、例えば、非乳房細胞培養物中で産生された抗体と比較する工程をさらに含む。さらなる実施形態において、方法は、得られた抗体のグリコシル化パターンを、非乳房上皮細胞により産生された抗体と比較する工程をさらに含む。このような細胞は、細胞培養物の細胞であり得る。一部の実施形態において、グリコシル化パターンは、抗体または抗体の集団上に存在するガラクトースの量である。一部の実施形態において、方法は、グリコシル化抗体の集団中に存在するガラクトシル化の割合を、細胞培養物、例えば、非乳房細胞培養物中で産生されたグリコシル化抗体の集団中に存在するガラクトシル化の割合と比較する工程をさらに含む。抗体のグリコシル化パターンを評価するための実験的技術は、当業者に公知のものまたは本明細書に提供されるもの、例えば、以下の実施例に提供されるもののいずれかであり得る。このような方法としては、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析、タンデム質量分析、およびウエスタンブロット分析が挙げられる。
【０１７１】
抗体は、一部の実施形態において、本明細書に提供されるとおりに産生されるトランスジェニック動物の乳汁から、または前記トランスジェニック動物の子孫から抗体を回収することにより得ることができる。一部の実施形態において、トランスジェニック哺乳動物により産生される抗体は、産生される乳汁１リットル当たり少なくとも１グラムのレベルで産生される。有利には、本発明による方法は、産生される乳汁１リットル当たり４グラムを超える産生を、有利には、１リットル当たり５、１０、１５、２０、２５、３０、３５グラムを超える産生を、有利には、１リットル当たり最大で７０グラムの産生を可能とする。
【０１７２】
特に本明細書に定義されない限り、本開示に関して使用される科学および技術用語は、当業者により一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。本開示の方法および技術は、一般に、当技術分野において周知の従来の方法に従って実施する。一般に、本明細書に記載の生化学、酵素学、分子および細胞生物学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関して使用される命名法、およびそれらの技術は、当技術分野において周知であり、一般に使用されるものである。本開示の方法および技術は、特に明記のない限り、一般に、当技術分野において周知の従来の方法および本明細書にわたり引用および考察される種々の一般およびより具体的な参照文献に記載の方法に従って実施する。
【０１７３】
本発明を、以下の実施例によりさらに説明し、これらは決してさらに限定するものと解釈すべきでない。本出願にわたり引用される参照文献（文献の参照文献、登録特許、公開特許出願、および同時係属特許出願を含む）の全ての内容全体は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１７４】
材料および方法
アダリムマブを産生するトランスジェニックヤギの作製
アダリムマブ抗体をゲノム中でコードする核酸配列を含むトランスジェニックヤギを作製した。アダリムマブ抗体を産生するヤギは、慣習的なマイクロインジェクション技術を使用して作製した（例えば、米国特許第７，９２８，０６４号明細書参照）。重鎖および軽鎖（配列番号３および配列番号４）をコードするｃＤＮＡを、公開されているアミノ酸配列（米国特許第６，０９０，３８２号明細書）に基づき合成した。これらのＤＮＡ配列を、βカゼイン発現ベクターとライゲーションさせて構築物ＢＣ２６０１ＨＣおよびＢＣ２６０２ＬＣを得た。これらのプラスミドにおいて、アダリムマブをコードする核酸配列は、ヤギの乳腺中でのアダリムマブの発現を容易にするプロモーターの制御下である。原核生物配列を除去し、ＤＮＡをヤギの着床前胚中にマイクロインジェクトした。次いで、これらの胚を偽妊娠雌に移植した。得られた後代を導入遺伝子の存在についてスクリーニングした。両方の鎖を担持したものをトランスジェニックファウンダーとして同定した。
【０１７５】
週齢が適切になったとき、ファウンダー動物を交配させた。妊娠および分娩後、それらを搾乳した。時間経過は、分娩後の泌乳開始日である（例えば、３日目、７日目、１１日目）。アダリムマブ抗体は、それぞれの時点における乳汁から精製し、本明細書に記載のとおり特徴付けした。
【０１７６】
ＥＬＩＳＡによるトランスジェニック産生されたアダリムマブの結合の計測
５μｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを、９６ウェルプレート中で１ウェル当たり１００μｌのＰＢＳ中で４℃において一晩コーティングした。非特異的部位のブロッキング（２００μｌのＰＢＳ／１％のＢＳＡとのインキュベーション、１時間室温）後、トランスジェニック産生されたアダリムマブまたは脱グリコシル化アダリムマブを種々の濃度（０から１０μｇ／ｍｌ）においてＰＢＳ／１％のＢＳＡ中で２０分間添加した。洗浄後、コーティングされたＴＮＦ−αへのトランスジェニック産生されたアダリムマブの結合を、ペルオキシダーゼに結合しているヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）と、それに続く基質（Ｈ２Ｏ２およびテトラメチルベンジジン）の添加により評価した。２０分間のインキュベーション後、反応を５０μｌの希Ｈ２ＳＯ４により停止させ、ＯＤを４５０ｎｍにおいて読み取った。トランスジェニック産生されたアダリムマブについての結果を図１０に示す。
【０１７７】
ＣＤ１６への結合、３Ｇ８抗体の競合
ＣＤ１６へのトランスジェニック産生されたアダリムマブの結合を評価するため、抗ＣＤ１６結合抗体３Ｇ８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いる置換試験を実施した。この置換試験は、ＮＫ表面膜において発現されたＣＤ１６受容体へのトランスジェニック産生されたアダリムマブの結合の測定を可能とした。
【０１７８】
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を健常ドナーの末梢血からネガティブディプリーション（negative depletion）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）により精製した。次いで、ＮＫ細胞を変動濃度（０から８３μｇ／ｍｌ）のトランスジェニック産生されたアダリムマブおよび固定濃度の蛍光色素にコンジュゲートしている抗ＣＤ１６抗体３Ｇ８（３Ｇ８−ＰＥ）とインキュベートした。洗浄後、ＮＫ細胞上のＣＤ１６受容体への３Ｇ８−ＰＥの結合をフローサイトメトリーにより評価した。観察された平均蛍光値（ＭＦＩ）を結合パーセントとして表現し、１００％の値は試験されるトランスジェニック産生されたアダリムマブなしで観察された値に対応し、従ってこれは最大３Ｇ８結合に対応する。０％の値は、抗体３Ｇ８の不存在下のＭＦＩに対応する。Ｉｍａｘの５０％だけの３Ｇ８結合の阻害を誘導するために要求される抗体濃度ＩＣ５０を、ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して算出した。結果を図１１に示す。
【０１７９】
トランスジェニック産生されたアダリムマブのＦｃ断片を介する、Ｊｕｒｋａｔ細胞により発現されたＣＤ１６上の可溶性ＴＮＦ−αとトランスジェニック産生されたアダリムマブとの結合
Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ１６細胞を、１０μｇ／ｍｌのトランスジェニック産生されたアダリムマブまたはその脱グリコシル化バージョンと４℃において２０分間インキュベートした。洗浄後、１００μｌのＴＮＦ−αを細胞ペレットに１μｇ／ｍｌの最終濃度において４℃において２０分間添加した。後続の洗浄後、細胞を５μｇ／ｍｌのビオチン化ヤギ抗ヒトＴＮＦ−α抗体と４℃において２０分間インキュベートした。さらなる洗浄ラウンドの後、ＴＮＦ−αの結合を、ＰＥ−蛍光色素に結合しているストレプトアビジンの４℃における２０分間の添加により可視化した。試料をフラックスサイトメトリーにより分析した。結果を図１２に示す。
【０１８０】
実施例１
トランスジェニック産生されたアダリムマブ
トランスジェニックヤギの乳汁中で産生されたアダリムマブ抗体のグリコシル化パターンを、抗体からＮ−グリカンを放出させ、放出されたオリゴ糖をカラム上で流すことにより決定した（「オリゴ糖シグネチャー」）。
【０１８１】
図１〜４および６〜８は、ヤギ＃１（図１〜４）およびヤギ＃２（図６〜８）からのトランスジェニック産生されたアダリムマブ抗体から放出されたＮ−グリカンオリゴ糖を示す。単糖基を以下のとおり示す：
黒色四角：Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）
三角：フコース
灰色円：マンノース
白色円：ガラクトース
灰色菱形：Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）：シアル酸
白色菱形：Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）：シアル酸
【０１８２】
図１は、ヤギ＃１の乳汁中で産生されたトランスジェニックアダリムマブ抗体から放出されたＮ−グリカンオリゴ糖の代表的なクロマトグラムを示す。このクロマトグラムは、産生された１４個の主要なＮ−グリカンオリゴ糖のうち、１２個がＮ−グリカン鎖中に少なくとも１つのガラクトースを有し、４つのオリゴ糖が２つのガラクトースを有することを示す。オリゴ糖の２つのみが純粋にオリゴマンノースである（ピーク１およびピーク３参照）。図１は、産生された１４個の主要なオリゴ糖のうち、９つがフコシル化されていることも示す。フコシル化オリゴ糖の全てはまたガラクトシル化されている。
【０１８３】
図２〜４は、泌乳７日後（図２）、泌乳１７日後（図３）、および泌乳３２日後（図４）に回収されたヤギ＃１の乳汁中で産生されたトランスジェニックアダリムマブ抗体から放出されたＮ−グリカンオリゴ糖のクロマトグラムを示す。
【０１８４】
ヤギ＃１の乳汁中で産生されたアダリムマブ抗体から単離された全てのＮ−グリカンオリゴ糖の相対割合を、図５に示す。図５は、全体的なモノガラクトシル化の割合、二ガラクトシル化の割合、総ガラクトシル化の割合（モノガラクトシル化＋二ガラクトシル化）、上記に提供される式に従って算出されたガラクトシル化の割合、上記に提供される式に従って算出されたフコシル化の割合、ガラクトシル化とフコシル化との比、および少なくとも１つのシアル酸を有するグリカン構造の割合（シアリル化％）の一覧も示す。結果を以下の表１にもまとめる。
【０１８５】
【表１】
2020073550.tif 000004
【０１８６】
図６〜８は、泌乳３日後（図６）、泌乳１１日後（図７）、およびホルモン誘導泌乳２１日後（図８）に回収されたヤギ＃２の乳汁中のトランスジェニック産生されたアダリムマブ抗体から放出されたＮ−グリカンオリゴ糖のクロマトグラムを示す。
【０１８７】
ヤギ＃２の乳汁中で産生されたアダリムマブ抗体から単離された全てのＮ−グリカンオリゴ糖の相対割合を、図９に示す。図９は、全体的なモノガラクトシル化の割合、二ガラクトシル化の割合、総ガラクトシル化の割合（モノガラクトシル化＋二ガラクトシル化）、上記に提供される式に従って算出されたガラクトシル化の割合、上記に提供される式に従って算出されたフコシル化の割合、ガラクトシル化とフコシル化との比、および少なくとも１つのシアル酸を有するグリカン構造の割合（シアリル化％）の一覧も示す。結果を以下にもまとめる。
【０１８８】
【表２】
2020073550.tif 000005
【０１８９】
実施例２
トランスジェニック産生されたアダリムマブの結合試験
図１０は、トランスジェニック産生されたアダリムマブが９６ウェルプレート中にコーティングされた可溶性ＴＮＦ−αに結合し得ることを示す。グリコシル化されていないトランスジェニック産生されたアダリムマブも同様に、可溶性ＴＮＦ−αに結合し得た（データ示さず）。
【０１９０】
図１１は、トランスジェニック産生されたアダリムマブがナチュラルキラー（ＮＫ）細胞により発現されたＣＤ１６に結合することを示す。結合を、抗ＣＤ１６結合抗体３Ｇ８との競合実験において示す。トランスジェニック産生されたアダリムマブのＣＤ１６への結合は、低ガラクトシル化抗体のＣＤ１６への結合よりも強力である（データ示さず）。従って、トランスジェニック産生されたアダリムマブは、より高いＡＤＣＣ活性を有すると予測される。
【０１９１】
図１２は、トランスジェニック産生されたアダリムマブ抗体が、可溶性ＴＮＦ−αおよびＣＤ１６発現Ｊｕｒｋａｔ細胞の両方に結合する一方、トランスジェニック産生されたアダリムマブ抗体の非グリコシル化バージョンは結合しないことを示す。従って、トランスジェニック産生されたアダリムマブ抗体はＡＤＣＣ活性を示す一方、非グリコシル化抗体は示さないことが予測される。
【０１９２】
実施例３
追加の動物におけるトランスジェニック産生されたアダリムマブのグリコシル化分析
【０１９３】
【表３】
2020073550.tif 000006
【０１９４】
アダリムマブを、複数の異なるヤギにおいて天然泌乳の間にトランスジェニック産生した。トランスジェニック産生されたアダリムマブについてのグリカンプロファイルを試験した。図１３は、表３に列記される９頭の異なるヤギからのトランスジェニック産生されたアダリムマブ抗体の集団中に存在する異なるグリカン型の割合のまとめを提供する。
【０１９５】
図１４は、ヤギ＃１０およびヤギ＃１からのトランスジェニック産生されたアダリムマブ抗体の集団のホルモン誘導泌乳の間のＮ−グリカンオリゴ糖の割合のまとめを示す。
【０１９６】
図１５は、８頭の異なるヤギ＃２〜９からのトランスジェニック産生されたアダリムマブ抗体の集団のＮ−グリカンオリゴ糖のまとめを示す。図１５に提示されるデータを表４〜１１にまとめる。
【０１９７】
【表４】
2020073550.tif 000007
【０１９８】
【表５】
2020073550.tif 000008
【０１９９】
【表６】
2020073550.tif 000009
【０２００】
【表７】
2020073550.tif 000010
【０２０１】
【表８】
2020073550.tif 000011
【０２０２】
【表９】
2020073550.tif 000012
【０２０３】
【表１０】
2020073550.tif 000013
【０２０４】
【表１１】
2020073550.tif 000014
【０２０５】
実施例４
トランスジェニック産生されたアダリムマブの特徴付け
ヤギ乳汁からのトランスジェニック産生されたアダリムマブの生物学的特性を、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）と比較した。相対Ｋｄ、ＣＤ１６結合およびＦｃＲｎ結合を調査した。さらに、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）およびＴＮＦ−α媒介細胞毒性の中和を膜ＴＮＦ−αトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞に対して評価した。
【０２０６】
フラックスサイトメトリーにより得られた任意Ｋｄ（プラトー値の５０％を与える濃度）は、Ｈｕｍｉｒａ（０．０９μｇ／ｍｌ）と、トランスジェニック産生されたアダリムマブ（０．１１μｇ／ｍｌ）との間の差異を示さなかった（ｐ＝０．５４）。ＣＤ１６受容体に結合したトランスジェニック産生されたアダリムマブはＩＣ５０値が２５．７μｇ／ｍｌであった一方、Ｈｕｍｉｒａについては５６．６７μｇ／ｍｌであった。従って、トランスジェニック産生されたアダリムマブのＣＤ１６への結合は、Ｈｕｍｉｒａの結合よりも２．２倍高かった。
【０２０７】
ＦｃＲｎへのトランスジェニック産生されたアダリムマブ結合は、Ｈｕｍｉｒａの結合よりも、同一のＦｃ部分を有するにもかかわらず高かった。ＣＤＣ活性は、Ｈｕｍｉｒａ抗体と比較してトランスジェニック産生されたアダリムマブを用いる利点を示した（１９６と３９９ｎｇ／ｍｌ）。トランスジェニック産生されたアダリムマブおよびＨｕｍｉｒａは、両方ともＴＮＦ−α誘導Ｌ９２９アポトーシスを同様に中和した（ＥＣ５０＝１１０ｎｇ／ｍｌおよび９８ｎｇ／ｍｌ、それぞれ）。
【０２０８】
材料および方法
試薬
−  抗ＴＮＦ−α試薬：
○抗体：
・トランスジェニック産生されたアダリムマブ
・Ｈｕｍｉｒａ（アダリムマブ、Ａｂｂｏｔｔ）
−  抗ＣＤ１６０：精製番号８２９  １０  ０４９、陰性対照として使用
−  幼齢ウサギ血清（Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ）
−  アクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ）
−  ヒトＴＮＦ−α（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）
−  Ｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
【０２０９】
細胞
−  膜ＴＮＦ−αトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞クローン２Ｂ３を、クローニングにより得た（相対ＫｄアッセイおよびＣＤＣに使用）
−  ネズミ繊維芽細胞Ｌ９２９細胞
【０２１０】
膜ＴＮＦ−αへの結合および相対Ｋｄ測定
２×１０５個のＴＮＦ−αトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞を、異なる濃度（０から１００μｌ／ｍｌ、最終濃度）の１００μｌの抗ＴＮＦＡｌｅｘａ−４８８結合抗体と４℃において３０分間インキュベートした。洗浄後、フィコエリスリンに結合しているヤギ抗ヒトＦｃγ（１００μｌの１：１００の希釈物）を４℃において３０分間添加した。細胞を洗浄し、蛍光強度の平均をフローサイトメトリーにより試験した。任意Ｋｄを、ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して算出した。
【０２１１】
ＣＤ１６への結合
ＣＤ１６への結合を、マウスフィコエリスリン標識抗ＣＤ１６  ３Ｇ８（３Ｇ８−ＰＥ）およびＮＫ細胞を使用する競合アッセイにより試験した。手短に述べると、ＮＫ細胞を、ＭｙｌｔｅｎｙｉからのＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し、次いで変動濃度（０から８３μｇ／ｍｌ）の試験抗体と、固定濃度において使用されるマウス抗ＣＤ１６ｍＡｂ３Ｇ８−ＰＥと同時にインキュベートした。洗浄後、ＮＫ細胞により発現されたＣＤ１６への３Ｇ８−ＰＥの結合を、フローサイトメトリーにより評価した。観察された平均蛍光値（ＭＦＩ）をパーセントで表現し、１００％は３Ｇ８−ＰＥを単独で用いて得られた値であり、０％は３Ｇ８−ＰＥの不存在下の値である。ＩＣ５０値（３Ｇ８結合の５０％阻害を誘導するために要求される抗体濃度）を、ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して算出した。
【０２１２】
ＦｃＲｎへの結合
ＦｃＲｎへの結合を、Ａｌｅｘａ４８８により標識された抗ＣＤ２０Ｒｉｔｕｘａｎ（ＲＴＸ−Ａｌｅｘａ）およびトランスフェクトＦｃＲｎＪｕｒｋａｔ細胞を使用する競合アッセイにより試験した。手短に述べると、トランスフェクトＦｃＲｎＪｕｒｋａｔ細胞を、変動濃度（０から１０００μｇ／ｍｌ）の試験ｍＡｂと、固定濃度のＲＴＸ−Ａｌｅｘａ（５０μｇ／ｍｌ）と同時にｐＨ６においてインキュベートした。ｐＨ＝６において洗浄した後、トランスフェクトＦｃＲｎＪｕｒｋａｔ細胞により発現されたＦｃＲｎへのＲＴＸ−Ａｌｅｘａの結合をフローサイトメトリーにより評価した。観察された平均蛍光値（ＭＦＩ）をパーセントで表現し、１００％はＲＴＸ−Ａｌｅｘａを単独で用いて得られた値であり、０％はＲＴＸ−Ａｌｅｘａの不存在下の値である。ＩＣ５０値（ＲＴＸ−Ａｌｅｘａ結合の５０％阻害を誘導するために要求される抗体濃度）を、ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して算出した。
【０２１３】
ＣＤＣ
膜ＴＮＦ−αトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞（ｍｂＴＮＦ−αＪｕｒｋａｔ）を、増加濃度の抗ＴＮＦ抗体（０から５０００ｎｇ／ｍｌ）と、補体源としての幼齢ウサギ血清（１／１０に希釈）の存在下でインキュベートした。３７℃におけるインキュベーションの２時間後、溶解した標的細胞により上清中に放出されたＬＤＨの量を計測した（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）。試験抗体により媒介された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に対応する溶解パーセントを、以下の式：溶解％＝（ＥＲ−ＳＡ）（式中、ＥＲ＝有効応答（ＬＤＨ）放出、ＳＡ＝標的細胞を補体の存在下であるが抗体なしでインキュベートした場合に得られた自然活性）に従って算出した。溶解パーセントを抗体濃度の関数として表現する。Ｅｍａｘ（最大溶解の割合）およびＥＣ５０（最大溶解の５０％を誘導する抗体の量）を、ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して算出した。
【０２１４】
ｓＴＮＦ−αの中和
ヒトＴＮＦの中和を、一連の濃度の抗ＴＮＦおよび固定濃度のＴＮＦ（１００ｐｇ／ｍＬ）を使用するネズミ繊維芽細胞Ｌ９２９生物アッセイにおいて評価した。手短に述べると、試験抗体の連続希釈物（０〜１０００ｎｇ／ｍｌ）により前処理されたＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）をＬ９２９細胞と１８時間、アクチノマイシンＤ（２μｇ／ｍｌ）の存在下で３７℃において１６時間インキュベートした。次いで、２０μｌ／ウェルのＣｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＭＴＳ）を、さらに１時間添加して比色アッセイにより生存細胞の数を測定した。プレートを４９０ｎｍにおいて読み取り、結果（ＯＤ）を抗体濃度の関数として表現した。ＴＮＦ−α活性の５０％を中和する抗体濃度の逆数として表現される中和力価を、ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して算出した。
【０２１５】
略語
ＴＮＦ−α：腫瘍壊死因子α
ＣＤＣ：補体依存性細胞傷害
ＬＤＨ：乳酸デヒドロゲナーゼ
ＭＦＩ：蛍光強度の平均
ＳＡ：自然活性
ＳＲ：自然放出
【０２１６】
結果
細胞上の抗原結合および相対Ｋｄ測定
３回のアッセイの平均を図１６に提示し、対応データを表１３に提示する。膜ＴＮＦ−αトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞クローン２Ｂ３への抗ＴＮＦ抗体の結合を、それぞれの試験抗体濃度（０〜１０μｇ／ｍｌ）についての蛍光強度の平均（ＭＦＩ）として表現する。下記の任意Ｋｄは、真の親和性値（ｎＭ）を表さないが、試験抗体の親和性について同等の桁を与える。
【０２１７】
表１２ａの結果は、Ｂｍａｘ値（プラトー）および任意Ｋｄ（プラトー値の５０％を与える濃度）が、個々のＥＣ５０値（表１２ｂ）を用いて実施された統計的分析（ｐ＝０．５４）から示されるとおり、トランスジェニック産生されたアダリムマブ（Ｂｍａｘ：ＭＦＩ＝１２．４６；Ｋｄ＝０．１１μｇ／ｍｌ）およびＨｕｍｉｒａ（Ｂｍａｘ：ＭＦＩ＝１０．７２；Ｋｄ＝０．０９μｇ／ｍｌ）について類似することを示す。
【０２１８】
【表１２ａ】
2020073550.tif 000015
【０２１９】
【表１２ｂ】
2020073550.tif 000016
【０２２０】
【表１３】
2020073550.tif 000017
【０２２１】
ＣＤ１６への結合、３Ｇ８抗体の競合
表１４に示されるＩＣ５０値は、ＮＫ細胞により発現されたＣＤ１６受容体上の３Ｇ８結合の５０％の阻害を誘導するために要求される抗体濃度を表す。トランスジェニック産生されたアダリムマブ（「ＴＧ−Ｈｕｍｉｒａ」）およびＨｕｍｉｒａ抗体はＣＤ１６受容体に結合し、ＩＣ５０値はそれぞれ２５．７μｇ／ｍｌおよび５６．７μｇ／ｍｌである。従って、トランスジェニック産生されたアダリムマブのＣＤ１６への結合は、Ｈｕｍｉｒａの結合よりも約２倍高い。
【０２２２】
【表１４】
2020073550.tif 000018
【０２２３】
【表１５】
2020073550.tif 000019
【０２２４】
ＦｃＲｎへの結合
ＦｃＲｎトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞により発現されたＦｃＲｎへの抗ＴＮＦ−α抗体の結合を、Ａｌｅｘａ４８８結合リツキシマブ抗体との競合アッセイにおいて試験した。図１８に示される結果（表１７のデータに対応）は、全ての試験抗体がＦｃＲｎ受容体に結合したことを示す。トランスジェニック産生されたアダリムマブのＦｃＲｎへの結合は、Ｈｕｍｉｒａの結合よりも高いと考えられる。
【０２２５】
【表１６】
2020073550.tif 000020
【０２２６】
【表１７】
2020073550.tif 000021
【０２２７】
ＣＤＣ活性
２回のアッセイの平均を図１９に提示し、対応するデータを図１８に示す。ＣＤＣ活性を、それぞれの試験抗体濃度（０〜５０００ｎｇ／ｍｌ）についての溶解のパーセントとして表現する。図１９は、トランスジェニック産生されたアダリムマブ（ＴＧ−Ｈｕｍｉｒａ；最大溶解：３４％）およびＨｕｍｉｒａ（最大溶解：３３％）抗体がＣＤＣ活性によるｍｂＴＮＦ−αＪｕｒｋａｔの同等の溶解を誘導することを示す）。この系のＥＣ５０値（図１９）の分析は、トランスジェニック産生されたアダリムマブの、基準Ｈｕｍｉｒａ抗体と比較した小さい利点を示した（１９５．８と３９９．３ｎｇ／ｍｌ）。
【０２２８】
【表１８】
2020073550.tif 000022
【０２２９】
【表１９】
2020073550.tif 000023
【０２３０】
抗ＴＮＦ抗体の中和活性
図２０に示されるとおり、２０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦ−αにより処理されたＬ９２９細胞中のＴＮＦ−α媒介細胞活性は、トランスジェニック産生されたアダリムマブ（ＴＧ−ｈｕｍｉｒａ）およびＨｕｍｉｒａ  ｍＡｂの両方により同等の用量依存様式で有効に中和された。Ｈｕｍｉｒａプラトー値の５０％を達成するために要求される抗体濃度に対応する５０％値は、Ｈｕｍｉｒａについては９７．７ｎｇ／ｍｌ、トランスジェニック産生されたアダリムマブについては１０９．７ｎｇ／ｍｌであった。
【０２３１】
【表２０】
2020073550.tif 000024
【０２３２】
【表２１】
2020073550.tif 000025
【０２３３】
考察
ＴＮＦ誘導Ｌ９２９アポトーシスの中和は、トランスジェニック産生されたアダリムマブとＨｕｍｉｒａ（Ａｂｏｔｔ）との間で同等であった。ＣＤＣ活性、ＣＤ１６およびＦｃＲｎへの結合が改善され、増加したＣＤＣおよびＣＤ１６結合がトランスジェニック産生されたアダリムマブについて観察された。
【０２３４】
実施例５
トランスジェニック産生されたアダリムマブのＡＤＣＣ活性
トランスジェニック産生されたアダリムマブのＡＤＣＣ活性を、ＨｕｍｉｒａのＡＤＣＣと比較した。図２１は、トランスジェニック産生されたアダリムマブが３つの異なる濃度：０．５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌおよび５０００ｎｇ／ｍｌにおいてＨｕｍｉｒａよりも高いＡＤＣＣ活性を実証したことを示す。
−  抗体：−  Ｈｕｍｉｒａ（Ａｂｂｏｔｔ）
−  トランスジェニック産生されたアダリムマブ
−  細胞：−  ｍＴＮＦトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞（クローン２Ｆ８）
−  健常ドナーから単離されたＮＫエフェクター細胞
【０２３５】
ＮＫエフェクター細胞を、健常ドナーからの末梢血試料からネガティブディプリーションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離した。ｍＴＮＦでトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞を９６ウェルプレート中でプレーテングし、増加濃度の抗ＴＮＦ抗体（０．５；５０および５０００ｎｇ／ｍｌ）と４℃においてインキュベートした。２時間後、単離されたＮＫ細胞を添加し、３７℃においてさらに４時間インキュベートした。試験抗ＴＮＦ抗体により誘導された標的細胞の溶解を、溶解した標的細胞により上清中に放出された細胞内酵素の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を定量することにより発色計測した（Ｒｏｃｈｅ）。溶解パーセントは、以下の式に従って算出した：
溶解％＝［（ＥＲ−ＳＲ）／（１００−ＳＲ）］−［（ＮＣ−ＳＲ）／（１００−ＳＲ）］
式中、ＥＲおよびＳＲは、実験および自然ＬＤＨ放出をそれぞれ表し、ＮＣは、天然細胞毒性を表す。最終結果を任意単位で表現し、１００％は５０００ｎｇ／ｍｌの濃度のＨｕｍｉｒａ（Ａｂｂｏｔｔ）を用いて得られた値とする。図２１に提示されるとおり、トランスジェニック産生されたアダリムマブは、Ｈｕｍｉｒａ（Ａｂｂｏｔｔ）よりも大きいＡＤＣＣを誘導した。
【０２３６】
実施例６
トランスジェニック産生されたアダリムマブのＣＤ１６結合およびＣＤＣ活性の評価
トランスジェニック産生されたアダリムマブのＣＤ１６結合活性を、ＮＫ細胞を使用する競合アッセイにより計測し、Ｈｕｍｉｒａと比較した。図２２は、９頭の異なるヤギからのトランスジェニック産生されたアダリムマブが全て、ＮＫ細胞中でＨｕｍｉｒａよりも高程度でＣＤ１６に結合したことを示す阻害曲線を提示する。図２３は、ＣＤ１６競合結合アッセイからのＩＣ５０値を提示する。ＩＣ５０値は、トランスジェニック産生されたアダリムマブについてＨｕｍｉｒａよりも１．５〜５倍低かった。
【０２３７】
トランスジェニック産生されたアダリムマブのＣＤＣ活性をＨｕｍｉｒａの活性と比較した。図２４は、試験された９頭のヤギのうち８頭からのトランスジェニック産生されたアダリムマブが、Ｈｕｍｉｒａよりも大きいＣＤＣ活性を有したことを示す用量応答曲線を提示する。図２５は、ＥＣ５０値をＣＤＣ活性アッセイについてｎｇ／ｍｌで提示する。
【０２３８】
他の実施形態
本明細書に開示の特性の全ては、任意の組合せで組み合わせることができる。本明細書に開示のそれぞれの特性は、同一、等価、または類似の目的に役立つ代替特性により置き換えることができる。従って、特に明示的に記載のない限り、開示のそれぞれの特性は、包括的な一連の等価または類似特性の一例にすぎない。
【０２３９】
上記の詳細な説明から、当業者は本発明の不可欠な特徴を、その趣旨および範囲から逸脱せずに容易に確認することができ、本発明の種々の変更および改変を、種々の使用法および条件に適応させることができる。従って、他の実施形態も特許請求の範囲内に存在する。本発明の他のいくつかの実施形態例を以下に示す。
（１）抗体の集団を含む組成物であって、
前記抗体の集団中の抗体がトランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生された抗ＴＮＦ−α抗体であり、および
前記集団中の前記抗体のガラクトシル化のレベルが、少なくとも５％のモノガラクトシル化Ｎ−グリカンおよび／または少なくとも１０％の二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含み、かつ
前記集団中の前記抗体が、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む、組成物。
（２）前記集団中の前記抗体のフコシル化のレベルに対する前記集団中の前記抗体のガラクトシル化のレベルの比が、１．０から１．４の間である、（１）に記載の組成物。
（３）前記集団中の前記抗体の少なくとも３５％が二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含み、かつ前記集団中の前記抗体の少なくとも２５％がモノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む、（１）または（２）に記載の組成物。
（４）前記抗体の集団中の前記抗体が、前記非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生されたものであり、前記抗体の集団が、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して、増加したレベルの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する、（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）前記抗体の集団中の前記抗体が、前記非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生されたものであり、前記抗体の集団が、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して、増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する、（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）前記集団中の前記抗体のフコシル化のレベルが少なくとも３０％である、（１）〜（５）のいずれかに記載の組成物。
（７）前記集団中の前記抗体のフコシル化のレベルが少なくとも４０％である、（１）〜（５）のいずれかに記載の組成物。
（８）前記抗体がアダリムマブである、（１）〜（７）のいずれかに記載の組成物。
（９）前記抗体が非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生されたものである、（１）〜（８）のいずれかに記載の組成物。
（１０）前記非ヒト哺乳動物が、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマである、（１）〜（９）のいずれかに記載の組成物。
（１１）前記非ヒト哺乳動物がヤギである、（１）〜（１０）のいずれかに記載の組成物。
（１２）炎症性疾患または自己免疫疾患を有する対象に投与される、（１）〜（１１）のいずれかに記載の組成物。
（１３）抗体の集団を作製する方法であって、
抗体の集団が産生されるように非ヒト哺乳動物の乳腺上皮細胞において抗体の集団を発現させる工程を含み、
前記抗体が抗ＴＮＦ−α抗体であり、
前記集団中の抗体のガラクトシル化のレベルが少なくとも５％のモノガラクトシル化Ｎ−グリカンおよび／または少なくとも１０％の二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含み、かつ
前記集団中の前記抗体が、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む、方法。
（１４）（１）〜（１２）のいずれかに記載の組成物の抗体の集団を産生する、乳腺上皮細胞。
（１５）（１４）に記載の乳腺上皮細胞を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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