(57)【要約】【課題】皮革に含まれるコラーゲンのトリプシン分解物を用いる爬虫類皮革の判定方法を提供する。【解決手段】皮革に含まれるコラーゲンのトリプシン分解物を用いた爬虫類皮革の判定方法であって、特定の６種のペプチドを指標とし、前記トリプシン分解物に含まれる前記ペプチドの有無から、クロコダイル、アリゲーター、カイマン、またはトカゲのいずれであるかを判定する方法である。アミノ酸配列で特定するため形態に基づく判定より精度が高く、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで測定できるため迅速な判断が可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮革に含まれるコラーゲンのトリプシン分解物を用いた爬虫類皮革の判定方法であって、
下記表１に示される配列番号１〜６のペプチドを指標とし、
下記表２に従い、前記トリプシン分解物に含まれる前記ペプチドの有無から、前記皮革が、クロコダイル、アリゲーター、カイマンまたはトカゲのいずれであるかを判定することを特徴とする、爬虫類皮革の判定方法。
【表１】
2020051976.tif 000008
【表２】
2020051976.tif 000009
【請求項２】
前記ペプチドの有無は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定することを特徴とする、請求項１記載の爬虫類皮革の判定方法。
【請求項３】
前記皮革は、原皮、鞣し皮または皮革製品の一部であることを特徴とする、請求項１または２記載の爬虫類皮革の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮革に含まれるコラーゲンのトリプシン分解物を用いた爬虫類皮革の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一部に皮革を使用する製品は多く、様々な動物種由来の皮革がバッグ、財布、ベルト、靴などに多用されている。皮革の種類によって価値が異なるため、製品には原皮の正しい表示が求められる。例えば爬虫類の皮革として、クロコダイル、アリゲーター、カイマン等などがあり、皮革製品にはいずれの爬虫類であるかを表示する必要がある。しかしながら、ワニをアリゲーターと称呼する国や地域がある一方、ワニをクロコダイルと称呼する国や地域があり、慣習の相違その他により誤表記される場合がある。更に、皮革の種類によって価値や価格が異なるため、不正に誤表記を行う場合もある。
【０００３】
爬虫類の皮革は、動物の形態から識別することができる。例えば、クロコダイルは、腹に穿孔と呼ばれる感覚器官が存在するが、アリゲーターやカイマンには存在しない。これに基づき、穿孔を有する皮革をクロコダイルと判定することができる。しかしながら、加工工程で穿孔が消失し、視認が困難となる場合がある。また、アリゲーターはへそ近傍に特有の模様があるが、使用面積が小さい時計バンドなどの製品にはへそ近傍の特有の模様が含まれない場合があり、実質的にアリゲーターと判定することは難しい。
【０００４】
一方、天然皮革製品の判定法として、皮革製品の表面被膜から物理的に採取した試験片にコラゲナーゼを作用させ、ＤＮＡを抽出し、予測される動物種特有のプライマーを用いて種特有のＤＮＡ断片を増幅し、動物種を判断する、天然皮革製品の判別法がある（特許文献１）。また、皮革に含まれるコラーゲンのトリプシン分解物に含まれる特定のペプチドを指標とし、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタおよびシカのいずれに由来するかを判定する方法（特許文献２）もある。特許文献２記載の方法は、分解しやすいＤＮＡ配列に代えてアミノ酸配列で特定するため精度が高く、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで測定できるため迅速な判断が可能であるという。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−１２５７８１号公報
【特許文献２】特開２０１６−２２４００７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ワニ革の種判定のためのＤＮＡアプローチは報告がなく、そもそも皮革製品に加工する工程でＤＮＡが損傷を受ける可能性が高いという問題もある。また、特許文献２記載の動物種の判定方法は、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタおよびシカのいずれかを判別するものであり、爬虫類皮革を対象とするものではない。
【０００７】
更に、形態観察による場合は熟練した能力が要求され、多数の試料を処理することは困難である。
【０００８】
上記現状に鑑み、皮革の構造に習熟した専門家でなくても簡便かつ迅速に、皮革製品が、クロコダイル、アリゲーター、カイマンおよびトカゲのいずれであるかを、判定する方法の開発が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、爬虫類の皮革に含まれるコラーゲンのトリプシン分解物を詳細に検討し、トリプシン分解物に含まれる特定のペプチドを組み合わせることで、当該皮革の動物種を判定できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち本発明は、皮革に含まれるコラーゲンのトリプシン分解物を用いた爬虫類皮革の判定方法であって、
下記表１に示される配列番号１〜６のペプチドを指標とし、
下記表２に従い、前記トリプシン分解物に含まれる前記ペプチドの有無から、前記皮革が、クロコダイル、アリゲーター、カイマンまたはトカゲのいずれであるかを判定することを特徴とする、爬虫類皮革の判定方法を提供するものである。
【００１１】
【表１】
2020051976.tif 000002
【００１２】
【表２】
2020051976.tif 000003
【００１３】
また本発明は、前記ペプチドの有無は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定することを特徴とする、前記爬虫類皮革の判定方法を提供するものである。
【００１４】
また、前記皮革は、原皮、鞣し皮または皮革製品の一部であることを特徴とする、前記爬虫類皮革の判定方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の判定方法によれば、皮革由来のコラーゲンのトリプシン分解物に含まれるペプチドの有無を測定することで、当該皮革がクロコダイル、アリゲーター、カイマン、トカゲのいずれであるかを判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１の皮革（クロコダイル）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図２】実施例１の皮革（アリゲーター）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図３】実施例１の皮革（カイマン）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図４】実施例１の皮革（トカゲ）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図５】実施例２の皮革（クロコダイル製品）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図６】実施例２の皮革（アリゲーター製品）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図７】実施例２の皮革（カイマン製品）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図８】実施例２の皮革（ワニ型押し牛革製品）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図９】実施例２で分析に使用したベルト製品の部分正面図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、皮革に含まれるコラーゲンのトリプシン分解物を用いた爬虫類皮革の判定方法である。上記表１に示される配列番号１〜６のペプチドを指標とし、上記表２に従い、前記トリプシン分解物に含まれる前記ペプチドの有無から、前記皮革が、クロコダイル、アリゲーター、カイマンまたはトカゲのいずれであるかを判定することができる。なお、上記表１に示すアミノ酸配列において、Ｏはヒドロキシプロリンを示す。爬虫類の皮革の判定においてペプチドを指標とすれば、ＤＮＡを使用する場合と比較して短時間で処理でき、かつＤＮＡよりも安定性が高いため判定精度を高く維持することができる。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明において「皮革」とは、動物の皮膚の生のままの原皮、前記原皮を鞣した鞣し皮、前記鞣し皮を使用した皮革製品を含む。
【００１９】
本発明では爬虫類皮革を判定するペプチドとして、皮革に含まれるコラーゲンのトリプシン分解物に含まれるペプチドを用いる。本来、コラーゲンのアミノ酸配列は動物間によって近似し、ゆえに抗原性の少ない生体材料として使用される場合も多い。しかしながら、種々の爬虫類皮革から得たコラーゲンのトリプシン分解物を詳細に検討したところ、前記トリプシン分解物に含まれる上記表１に示す６種のペプチドを組み合わせることで、クロコダイル、アリゲーター、カイマンまたはトカゲのいずれであるかを判定できることが判明した。
【００２０】
コラーゲンは、３本のポリペプチド鎖の三重螺旋構造を基本単位とし、−（Ｇｌｙ−アミノ酸Ｘ−アミノ酸Ｙ）ｎ−で示される、いわゆる「コラーゲン様配列」と呼ばれる一次構造を有する。生体内で前記一次構造を有するペプチド鎖が翻訳された後に、プロリンやリジンがそれぞれヒドロキシプロリンやヒドロキシリジンに変換され、前記三重螺旋構造を形成する。コラーゲンには、Ｉ型からＸＸＶＩＩＩ型までが知られ、生体を構成する部位によって異なるコラーゲン型が主成分となるが、いずれも上記一次構造と三重螺旋構造とを有する点で共通する。皮革に含まれるコラーゲンは、Ｉ型を主成分とすることが知られ、これを抽出してトリプシン分解することで、本発明の爬虫類皮革の判定方法の測定用試料として利用することができる。なお、コラーゲンの分解にコラゲナーゼを使用すると、Ｇｌｙ−アミノ酸Ｘ−アミノ酸Ｙまで分解し、ペプチドの特異性を失う場合がある。よって本発明では、トリプシン分解物に限定している。
【００２１】
例えば、皮革から得たコラーゲンのトリプシン分解物が、配列番号３および５のペプチドを含み、配列番号１、２、４および６のペプチドを含まない場合には、当該皮革の動物種を「クロコダイル」と判定する。同様に、配列番号３，４，５および６のペプチドを含み、配列番号１および２のペプチドを含まない場合は、「アリゲーター」と判定する。一方、例えば、配列番号３、４および６のペプチドを含み、配列番号１、２および５のペプチドを含まない場合は、表２のいずれの動物種にも該当しない。この場合には、クロコダイル、アリゲーター、カイマン、トカゲのいずれにも該当せず、「不明」と判定する。本発明の特徴は、上記表１に示す６種のペプチドを使用し表２に従って判定すれば、何れの動物種間においても２以上のペプチドの有無の相違をもって動物種を判定することができるため、誤判定を効果的に防止することができる。
【００２２】
なお、市販品には、ワニ型押し牛革を使用した製品などもある。爬虫類皮革は表面に特有の斑やウロコ模様を有することを特徴とするため、例えば牛革に爬虫類皮革の斑やウロコ模様をプレス加工した製品は、安価に爬虫類皮革のテイストを味わうことができる利点がある。したがって、爬虫類皮革にワニ型押し牛革が混入する場合にも、上記４種の爬虫類皮革を正確に判定する必要がある。更に、型押しに使用された皮革の動物種が判定出来ればより便宜である。
【００２３】
前記特許文献２には、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シカの６種の動物種を判別するために、皮革に含まれるコラーゲンのトリプシン分解物に含まれる下記表３に示される６種のペプチドを指標とし、下記表４に従って動物種を判定する方法が記載されている。したがって、表１に示すペプチドと表３に示すペプチドが異なるものであれば、１２種のペプチドを使用することで、表２および表４に従い、クロコダイル、アリゲーター、カイマン、トカゲ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シカの何れであるかを判別することができる。
【００２４】
【表３】
2020051976.tif 000004
【００２５】
【表４】
2020051976.tif 000005
【００２６】
上記ペプチドの有無を評価する方法は、特に限定されない。例えば、液体クロマトグラフィーなどによりコラーゲンのトリプシン分解物から上記ペプチドを分離し、ペプチドシークエンスなどにより確認しつつ、その有無を評価することができる。また、ＬＣ／ＭＳやＬＣ／ＭＳ／ＭＳなどであってもよい。本発明は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析することが好適である。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによれば、ＬＣ部でトリプシン分解物をカラムとの親和性によって分離でき、イオン化してから、ＭＳ部で更に質量ごとに分離して検出することができるため、一連の操作を迅速に行うことができる。特に、３連４重極型質量分析装置を用いれば、１段目の４重極部でプレカーサーイオンを選択し、２段目の衝突室でそのイオンを壊して、３段目の４重極部で前記壊して得たプロダクトイオンの中から特定のイオンを検出する多重反応モニタリング方法（ＭＲＭモード）を設定することができるため、特異性の高い判定が可能となる。さらに、一度の測定で複数のチャンネルを設定することができるため、多成分の分析が可能となる。
【００２７】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行う場合には、前記配列番号１〜６のペプチドのプレカーサーイオンを特定し、発生するプロダクトイオン（測定イオン）を検出することで、当該ペプチドが含まれていると分析することができる。更に、別のプロダクトイオン（確認イオン）を特定し、その有無から確実性をさらに高くできる。測定イオンと確認イオンとを検出することで、確実にその有無を評価することができる。
【００２８】
本発明では、爬虫類皮革の判定に使用するペプチドはわずか６種であり、他の動物種を含める場合でも１２種である。各ペプチドに対応するプレカーサーイオンや測定イオン、更には確認イオンの検出条件を予め設定し、一度の分析で上記１２種を同時に分析することで、簡便に爬虫類を含む動物種の判定を行うことができる。
【００２９】
判定対象の皮革から抽出したコラーゲンのトリプシン分解物をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにて分析して動物種を判定する場合、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析装置に更に判定用の電子機器を配設し、前記電子機器の記憶部に予め表２の内容を記憶させ、演算部にＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析装置の配列番号１〜６の結果を入力させ、前記表２の動物種と入力結果とを関連づけて動物種を判定させることができる。判定結果は、印字またはディスプレイ等に表示させてもよい。
【００３０】
動物種を判定するためのコラーゲンのトリプシン分解物は、定法により調製することができる。たとえば、皮革からコラーゲンまたはゼラチンを抽出し、これをトリプシンで分解したり、原皮やタンニン鞣し皮などの皮革の一部を水中で加熱した後にトリプシンを添加して分解すればよい。皮革片は、抽出効率を高めるため、細切断することが好ましい。例えば、１ｍｍ角に切断した皮革を使用する。これを１〜２０倍の水に投入し、加熱する。加熱処理は、温度５０〜１００℃、好ましくは６０〜９０℃、特に好ましくは７０〜９０℃である。加熱時間は、試験片のサイズにもよるが、５分から２時間、好ましくは１０分から１時間、特に好ましくは２０分から５０分である。これにより皮革に含まれるコラーゲンがゼラチン様に変化する。
【００３１】
次いで、コラーゲンがゼラチン様に変化した皮革に、温度１５〜６０℃でトリプシンを作用させる。反応時間は、１〜２４時間、好ましくは２〜１６時間、特に好ましくは４〜１６時間である。この際、反応液に緩衝液その他を添加してもよい。緩衝液としては、トリス塩酸緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液などがある。更に添加しうる試薬としては、塩化カルシウムなどの安定化剤、ドデシル硫酸ナトリウムや尿素などの変性剤などがある。遠心分離し、不要の固形分などを除去し動物種判定用の試験液とすることができる。
【００３２】
上記したように、皮革の加熱処理とトリプシン処理との双方の処理時間を含めて、最短で約５時間で測定用の試料を調製することができる。
【００３３】
なお、クロム鞣し皮の動物種を判定する場合には、クロム鞣しによる影響を除去する必要がある。試験片を細切断した後に、皮革に対して１〜２０倍の０．２５％水酸化カルシウム溶液を加えて１０分〜２４時間、好ましくは３０分から１０時間、特に好ましくは１〜５時間振盪し、水洗すれば脱クロム処理を行うことができる。その後、この水洗試験片を上記と同様に加熱処理し、およびトリプシン処理すればよい。なお、後記する実施例２に示すように、革を粉末化する場合には脱クロム処理を省略できることが判明した。したがって、皮革を粉末化した場合には、粉末皮革を加熱処理すれば、トリプシン消化のみでペプチドの生成を確認することができる。
【００３４】
本発明の皮革の動物種を判定する方法において、トリプシン分解物に含まれるペプチドをＬＣ／ＭＳ／ＭＳで測定する場合には、測定時間が１０分で済む。上記したように、たとえクロム鞣し皮や皮革製品の動物種を判定する場合に水酸化カルシウム水溶液による処理を加えても、１日で判別を行うことができる。
【実施例】
【００３５】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
【００３６】
各実施例で調製したサンプルのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件は以下に従った。
（１）装置
高速液体クロマトグラフ（アジレント・テクノロジー社製：１２００シリーズ）と質量分析装置（株式会社エービーサイエックス製、３２００ＱＴＲＡＰ）を含むＬＣ／ＭＳを使用した。
（２）ＨＰＬＣ条件
分析カラム：Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃ１８ １５ｃｍ×２．１ｍｍ×５μｍ
移動相：Ａ液；０．１％ギ酸、Ｂ液；１００％アセトニトリル、
グラジエント条件：０−２分：Ａ液９８％、２．１−６分：Ａ液９８−４０％、６．１−８分：Ａ液４０−１０％、８．１−１０分：Ａ液９８％
流速：５００μｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
注入量：２μｌ
（３）質量分析条件
イオン化：ＥＳＩ、ポジティブ
分析モード：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＭＲＭ）モード
イオンスプレー電圧：４．０ｋＶ
イオンソース温度：５００℃
【００３７】
【表５】
2020051976.tif 000006
【００３８】
（実施例１）
（１）標品サンプルの調製
クロコダイル、アリゲーター、カイマンおよびトカゲの革を１ｍｍ角に細切し、その約１０片を０．２５％水酸化カルシウム１０ｍｌに２時間浸漬し脱クロム処理を行った。その後、溶液を７回水洗した。この試験片に水２００μＬを加え、温度８０℃で３０分間加熱処理した。次いで水を除去し、１００ｍＭトリス塩酸バッファー／１ｍＭ塩化カルシウム（ｐＨ７．６）に０．２５μｇ／μＬトリプシンを含むトリプシン消化液を２００μＬ添加し、３７℃で４時間静置した。その後、１％となるようにギ酸を添加し、遠心分離した後、不要の固形分などを除去し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析用サンプルとした。
【００３９】
（２）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析
この分析用サンプルを使用し、上記表５に示す配列番号１〜配列番号６に示すペプチドの検出チャンネルを指標に、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＭＲＭのチャートを図１〜図４に示す。クロコダイルからは、配列番号３と５の２種のペプチドのみが検出され（図１）、アリゲーターからは、配列番号３、４、５および６の４種のペプチドのみが検出され（図２）、カイマンからは、配列番号２、３、５および６の４種のペプチドのみが検出され（図３）、トカゲからは、配列番号１および２の２種のペプチドのみが検出された（図４）。なお、図１〜４において、Ｐ１、Ｐ２・・・Ｐ６は、配列番号１、配列番号２・・・配列番号６を意味する。
【００４０】
（実施例２）
（１）製品サンプルの調製
図９に示す市販のクロコダイル、アリゲーター、カイマンおよびワニ型押し牛革による時計バンドの裏面を鉄ヤスリで削り試料を採取した。試料約１００μｇを使用し、脱クロム処理は行わず、水２００μＬを加え、温度８０℃で３０分間加熱処理した。次いで水を除去し、１００ｍＭトリス塩酸バッファー／１ｍＭ塩化カルシウム（ｐＨ７．６）に０．０１μｇ／μＬトリプシンを含むトリプシン消化液を５０μＬ添加し、３７℃で４時間振とうした。その後、１％となるようにギ酸を添加し、遠心分離した後、不要の固形分などを除去し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析用サンプルとした。
【００４１】
（２）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析
この分析用サンプルを使用し、配列番号１〜配列番号６に示すペプチドの検出チャンネルに加えて、下記表６に示す配列番号７〜配列番号１２に示すペプチドの検出チャンネルを指標に、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。なお、配列番号７〜配列番号１２に示すペプチドの有無から、上記表４に従ってウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シカの６種の動物種を判別することができる。ＭＲＭのチャートを図５〜図８に示す。クロコダイル製品からは、配列番号３と５の２種のペプチドのみが検出され（図５）、アリゲーター製品からは、配列番号３、４、５および６の４種のペプチドのみが検出され（図６）、カイマン製品からは、配列番号２、３、５および６の４種のペプチドのみが検出され（図７）、ワニ型押し牛革からは、配列番号７，８および１０の３種のペプチドのみが検出された（図８）。なお、図５〜８において、Ｐ１、Ｐ２・・・Ｐ１２は、配列番号１、配列番号２・・・配列番号１２を意味する。
【００４２】
このデータから、クロコダイルと表示された製品の皮革はクロコダイルと、アリゲーターと表示された製品の皮革はアリゲーターと、カイマンと表示された製品の皮革はカイマンと、ワニ型押し牛革と表示された製品の皮革はウシと判定された。
【００４３】
【表６】
2020051976.tif 000007
【００４４】
本発明によれば、配列番号１〜６を指標として、クロコダイル、アリゲーター、カイマンまたはトカゲの何れに該当するかを判定することができた。また、ワニ型押し牛革が混在する場合でも、配列番号７〜１２を指標とすれば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シカの６種の何れに該当するかを判定することができた。
【図１】
2020051976.tif 000010
【図２】
2020051976.tif 000011
【図３】
2020051976.tif 000012
【図４】
2020051976.tif 000013
【図５】
2020051976.tif 000014
【図６】
2020051976.tif 000015
【図７】
2020051976.tif 000016
【図８】
2020051976.tif 000017
【図９】
2020051976.tif 000018
【配列表】
2020051976000001.app