(57)【要約】【課題】グリコシル化シグナルを欠く改変バクテリオファージｇ３ｐアミノ酸配列を含むポリペプチドの提供。【解決手段】本発明は、アミロイドに結合するおよび／またはアミロイドを脱凝集させるのに十分な、糸状バクテリオファージ遺伝子３タンパク質（ｇ３ｐ）の一部分、例えば、ｇ３ｐのＮ１−Ｎ２部分ならびにその変異体および断片、を含むポリペプチドに関し、ここで、そのｇ３ｐアミノ酸配列は、推定グリコシル化シグナルを除去するように、アミノ酸欠失、挿入または置換を介して改変されている。本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用される場合に、対応する野生型ｇ３ｐアミノ酸配列よりも免疫原性が実質的に少なくなるように、さらなるアミノ酸置換を介しても改変された、かかるポリペプチドにさらに関する。本発明のポリペプチドは、アミロイドに結合するおよび／または脱凝集させるそれらの能力を保持する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１４年１２月３日に出願された米国仮出願第６２／０８７，０５２号（これは、開示の継続性を提供するために、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、アミロイドに結合するおよび／またはアミロイドを脱凝集させるのに十分な、糸状バクテリオファージ遺伝子３タンパク質（ｇ３ｐ）の一部分、即ち、ｇ３ｐのＮ１−Ｎ２部分ならびにその変異体および断片、を含むポリペプチドに関し、ここで、そのｇ３ｐアミノ酸配列は、推定グリコシル化シグナルを除去するように、アミノ酸欠失、挿入または置換を介して改変されている。本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用される場合に、対応する野生型ｇ３ｐアミノ酸配列よりも免疫原性が実質的に少なくなるように、さらなるアミノ酸置換を介しても改変された、かかるポリペプチドにさらに関する。本発明のポリペプチドは、アミロイドに結合するおよび／または脱凝集させるそれらの能力を保持する。本発明は、アミロイドのミスフォールディングまたは凝集と関連する疾患の処置および／または予防における、これらのｇ３ｐ改変ポリペプチドの使用にさらに関する。
【背景技術】
【０００３】
糸状バクテリオファージｇ３ｐタンパク質、特に、ｇ３ｐのＮ１−Ｎ２領域を含むそのポリペプチド部分は、種々のアミロイド、例えば、β−アミロイド、タウタンパク質およびプリオンタンパク質に結合し、それらを脱凝集させることが実証されている。それらの各々の開示が参照によって本明細書に組み込まれる、同時係属中のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６６７９３ならびに米国仮特許出願第６１／８０１，３４９号および米国仮特許出願第６１／８０１，８４９号を参照のこと。Ｒ．Ｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（２０１４年）もまた参照のこと。その有効性にもかかわらず、組換え哺乳動物細胞系におけるかかるポリペプチドの産生は、ｇ３ｐ配列中の推定アスパラギン結合型グリコシル化シグナルにおけるグリコシル化によって有害に影響され得ることが予測される。さらに、ｇ３ｐまたはそのＮ１−Ｎ２領域を含むポリペプチドの、ヒトへの全身投与は、有害な免疫応答を引き起こし得る。これらの先行技術の教示は、推定グリコシル化に関するいずれの潜在的な問題も特定していない。
【０００４】
多くの組換えまたは他の非ネイティブの治療的タンパク質またはポリペプチドの有効性は、その治療的タンパク質またはポリペプチドに対する患者の望まれない免疫反応によって制限され得る。タンパク質による免疫応答の誘導における主要な因子は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子上での提示を介した、そのタンパク質内のＴ細胞エピトープ、即ち、Ｔ細胞の活性を刺激できるアミノ酸配列の存在である。Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有する任意のアミノ酸配列として一般に規定される。ＭＨＣ分子に結合したとき、Ｔ細胞エピトープは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識され得、Ｔ細胞受容体を係合してＴ細胞応答を促進することによって、Ｔ細胞の活性化を引き起こし得る。しかし、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する特定のＴ細胞エピトープは、Ｔ細胞応答を刺激しないと一般に理解されるが、それは、これらのペプチドが、そのタンパク質が投与される生物内で「自己」と認識されるからである。
【０００５】
一部のＴ細胞エピトープは、細胞内での治療的タンパク質またはポリペプチドの分解の間にペプチドとして放出され得、次いで、ＭＨＣの分子によって提示されて、Ｔ細胞の活性化を誘発する。次いで、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されたペプチドに対して、Ｔ細胞のかかる活性化は、例えば、そのような抗体を産生するようにＢ細胞を直接刺激することによって、抗体応答を生じさせ得る。
【０００６】
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ヘルパーＴ細胞の選択および活性化において中心的な役割を果たす高度に多型性のタンパク質の一群である。ヒト白血球抗原群ＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）は、この群のタンパク質の優勢なアイソタイプである。しかし、アイソタイプＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰは、類似の機能を果たす。ヒトでは、およそ７０の異なるアロタイプのＤＲアイソタイプが公知であり、ＤＱについては、３０の異なるアロタイプが存在し、ＤＰについては、４７の異なるアロタイプが公知である。各個体は２〜４つのＤＲ対立遺伝子、２つのＤＱおよび２つのＤＰ対立遺伝子を保有する。
【０００７】
個体におけるタンパク質またはポリペプチドに対する免疫応答は、その個体のＨＬＡ−ＤＲアロタイプのペプチド結合特異性の関数であるＴ細胞エピトープ認識によって、大きく影響される。世界的人口を背景としてタンパク質またはポリペプチド内のＴ細胞エピトープを同定するために、可能な限りの多様なセットのＨＬＡ−ＤＲアロタイプの結合特性を検討し、したがって、世界人口の可能な限り高い百分率をカバーすることが望ましい。
Ｔ細胞エピトープ同定は、エピトープ排除の第１のステップである。Ｔ細胞エピトープの検出を可能にする方法は、当該分野で公知であり、ＷＯ９８／５２９７６、ＷＯ００／３４３１７、米国特許出願公開第２００７／０２６９４３５号；米国特許第７，２０８，１４７号、Ｋｅｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４巻：９７５〜９７８頁（１９９８年）；およびＫｗｏｋら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２２巻：５８３〜５８８頁（２００１年）に開示されている。これらのアプローチでは、予測または同定されたＴ細胞エピトープは、治療的タンパク質またはポリペプチドの一次配列内での賢明なアミノ酸置換の使用によって除去される。これらの参考文献は、Ｔ細胞エピトープの推定的同定を可能にするが、生物学的活性に対する負の影響を回避するアミノ酸置換の選択は、合理的に予測することができない。それは、改変されたポリペプチドの各々をかかる活性について試験することによってのみ決定され得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第９８／５２９７６号
【特許文献２】国際公開第００／３４３１７号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７／０２６９４３５号明細書
【特許文献４】米国特許第７，２０８，１４７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、そのアミロイド結合／脱凝集特性を破壊することなしに、単独で、またはｇ３ｐのＮ１−Ｎ２部分の免疫原性を低減させることと一緒に、グリコシル化を試験および低減させることが望ましい。これは、グリコシル化と関連する製造の困難さなしに、ｇ３ｐのＮ１−Ｎ２部分を含むポリペプチドが哺乳動物細胞において作製させるのを可能にする。さらに、低減された免疫原性は、そのＮ１−Ｎ２部分を含むポリペプチドが、治療目的および／または診断目的のために慢性的に全身投与されるのを可能にする。本発明は、ｇ３ｐのＮ１−Ｎ２部分中の推定グリコシル化シグナルを同定し、それら両方が参照によって本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ１３／６２８６２（ＷＯ２０１４／０５５５１５）に記載されるｇ３ｐポリペプチドまたはＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３９７６０に記載される免疫原性を低減もしくは排除するように改変されたｇ３ｐポリペプチドの活性を保ちつつグリコシル化を防止するその改変を提供することによって、この要求を満たす。したがって、本発明の特定のｇ３ｐポリペプチドは、アミロイドに結合し、アミロイド凝集を防止し、および／またはアミロイドプラークの脱凝集をもたらすバリアントＮ１−Ｎ２の能力を破壊することなしに、そのＴ細胞エピトープの免疫原性を低減または排除するバリアントＮ１−Ｎ２配列を産生するために、グリコシル化を防止するように改変されているだけでなく、これらの潜在的Ｔ細胞エピトープ内に特定のアミノ酸置換もまた含む。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のある特定の実施形態では、これらのポリペプチドは、グリコシル化シグナルを除去するように改変されたｇ３ｐまたはそのアミロイド結合性断片を含む。一実施形態では、本発明は、同定されたＴ細胞エピトープのうちの１つまたは複数内の１つまたは複数のアミノ酸置換に起因して低減された免疫原性を有し、グリコシル化シグナルを欠く、Ｎ１−Ｎ２アミノ酸配列のバリアントまたはその変異体もしくは断片を含むポリペプチドもまた提供する。一態様では、本発明は、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域に融合したバリアントＮ１−Ｎ２配列を含む融合タンパク質を提供する。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物、ならびにミスフォールドしたおよび／または凝集したアミロイドタンパク質と関連する疾患に罹患しているかまたはそのような疾患に対して感受性の被験体にかかる医薬組成物を投与することによって、そのような疾患を処置または予防する方法を提供する。
【００１２】
さらなる一実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子、ならびにこれらの核酸分子を含むベクターおよびかかるベクターを保有する細胞を提供する。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドを産生するための方法を提供する。特に、かかる方法は、核酸分子および／またはかかる核酸分子を含むベクターを保有する細胞を使用する。
本発明の実施形態の一部の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
出発アミノ酸配列のバリアントを含むポリペプチドであって、前記出発アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１〜２１７または配列番号２のアミノ酸１〜２１７、ならびに以下の改変：
アミノ酸４３〜４５におけるＶＶＶのＡＡＡによる置換；置換Ｃ５３Ｗ；アミノ酸９６〜１０３の欠失；アミノ酸２１２〜２１４におけるＱＰＰのＡＧＡによる置換；置換Ｗ１８１Ａ、Ｆ１９０ＡおよびＦ１９４Ａ；アミノ酸１の欠失；アミノ酸１および２の欠失；ならびにＮ末端メチオニン残基の付加
のうちの１つまたは複数を有する、上記のもののいずれかの変異体から選択され、ここで、
（ａ）前記出発アミノ酸配列は、アミノ酸３９〜４１における推定グリコシル化シグナルを除去するように改変されている；および
（ｂ）前記ポリペプチドは、アミロイドに結合するおよび／またはアミロイドを脱凝集させる、
ポリペプチド。
（項目２）
アミノ酸３９〜４１における前記改変が、Ｎ３９、Ａ４０および／またはＴ４１のうちの１つまたは複数の置換；Ｎ３９、Ａ４０および／またはＴ４１のうちの１つまたは複数の欠失；Ｎ３９とＡ４０との間での１つまたは複数のアミノ酸の挿入；ならびにＡ４０とＴ４１との間での１つまたは複数のアミノ酸の挿入から選択される、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
前記出発アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸１〜２１７および配列番号２のアミノ酸１〜２１７から選択される、項目１または２に記載のポリペプチド。
（項目４）
配列番号１または配列番号２のアミノ酸３９〜４１における前記改変が、Ｎ３９および／またはＴ４１のうちの１つまたは複数のアミノ酸置換から選択される、項目１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目５）
配列番号１または配列番号２のアミノ酸３９〜４１における前記推定グリコシル化シグナルを除去する前記改変が、Ｔ４１Ｇ、Ｔ４１Ｗ、Ｔ４１Ｈ、Ｔ４１Ｖ、Ｔ４１Ｉ、Ｔ４１Ｌ、Ｔ４１Ｒ、Ｔ４１Ｋ、Ｔ４１Ｙ、Ｔ４１Ｆ、Ｔ４１Ｄ、Ｔ４１Ｅ、Ｔ４１Ｑ、Ｔ４１ＮおよびＴ４１Ａから選択されるアミノ酸置換である、項目４に記載のポリペプチド。（項目６）
配列番号１または配列番号２のアミノ酸３９〜４１における前記推定グリコシル化シグナルを除去する前記改変が、Ｔ４１Ｇ置換である、項目５に記載のポリペプチド。
（項目７）
（ｃ）前記ポリペプチドが、前記出発アミノ酸配列を含む対応するポリペプチドと比較して、低減された免疫原性を有し；かつ
（ｄ）前記バリアントが、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸３９〜４１またはそれらの変異体における任意のアミノ酸置換に加えて、１〜９個のアミノ酸置換を有し、各アミノ酸置換は、以下：
【表１７】
2020073610.tif 000002
に示されるアミノ酸置換の群から選択され、かつ
（ｅ）前記出発アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸１〜２１７である場合、前記１〜９個のアミノ酸置換のいずれかが、以下：
【表１８】
2020073610.tif 000003
に示されるアミノ酸置換の群から任意選択でさらに選択される、
項目３から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目８）
前記１〜９個のアミノ酸置換の各々が、以下：
【表１９】
2020073610.tif 000004
に示されるアミノ酸置換の群から選択される、項目７に記載のポリペプチド。
（項目９）
前記出発アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸１〜２１７および配列番号２のアミノ酸１〜２１７から選択される、項目３から８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１０）
前記バリアントのアミノ酸配列が、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸３９〜４１またはそれらの変異体における任意のアミノ酸置換に加えて、２〜９個のアミノ酸置換を有し、少なくとも１つの置換は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸４８〜５６を含むエピトープ１中に存在し；少なくとも１つの置換は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１７３〜１８１を含むエピトープ３中に存在する、項目３から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１１）
前記バリアントのアミノ酸配列が、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸３９〜４１またはそれらの変異体における任意のアミノ酸置換に加えて、２つのみのアミノ酸置換を有し、前記置換は、以下：
【表２０】
2020073610.tif 000005
に示される２つのアミノ酸置換の群から選択される、項目１０に記載のポリペプチド。
（項目１２）
前記バリアントのアミノ酸配列のＣ末端に、ペプチドリンカーを介してまたは直接的に融合した、ヒトまたはヒト化免疫グロブリンＦｃポリペプチド配列から本質的になる、項目１から１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１３）
前記免疫グロブリンＦｃポリペプチド配列が、ヒトＩｇＧのＦｃ部分である、項目１２に記載のポリペプチド。
（項目１４）
前記ペプチドリンカーおよび前記ヒトＩｇＧのＦｃ部分のアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸２１８〜４８８および配列番号２のアミノ酸２１８〜４８６から選択される、項目１３に記載のポリペプチド。
（項目１５）
出発アミノ酸配列のバリアントからなるポリペプチドであって、前記出発アミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２から選択され、前記出発アミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸３９〜４１における推定グリコシル化シグナルを除去するように改変されており、前記改変は、Ｎ３９、Ａ４０および／またはＴ４１のうちの１つまたは複数のアミノ酸置換；Ｎ３９、Ａ４０および／またはＴ４１のうちの１つまたは複数の欠失；Ｎ３９とＡ４０との間での１つまたは複数のアミノ酸の挿入；ならびにＡ４０とＴ４１との間での１つまたは複数のアミノ酸の挿入から選択される、ポリペプチド。
（項目１６）
配列番号１または配列番号２のアミノ酸３９〜４１における前記推定グリコシル化シグナルを除去する前記改変が、Ｎ３９および／またはＴ４１のうちの１つまたは複数のアミノ酸置換から選択される、項目１５に記載のポリペプチド。
（項目１７）
配列番号１または配列番号２のアミノ酸３９〜４１における前記推定グリコシル化シグナルを除去する前記改変が、Ｔ４１Ｇ、Ｔ４１Ｗ、Ｔ４１Ｈ、Ｔ４１Ｖ、Ｔ４１Ｉ、Ｔ４１Ｌ、Ｔ４１Ｒ、Ｔ４１Ｋ、Ｔ４１Ｙ、Ｔ４１Ｆ、Ｔ４１Ｄ、Ｔ４１Ｅ、Ｔ４１Ｑ、Ｔ４１ＮおよびＴ４１Ａから選択されるアミノ酸置換である、項目１６に記載のポリペプチド。
（項目１８）
配列番号１または配列番号２のアミノ酸３９〜４１における前記推定グリコシル化シグナルを除去する前記改変が、Ｔ４１Ｇ置換である、項目１７に記載のポリペプチド。
（項目１９）
前記出発アミノ酸配列が、配列番号２であり、前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸３９〜４１における任意のアミノ酸置換に加えて、以下：
【表２１】
2020073610.tif 000006
のうちのいずれかから選択される２つのアミノ酸置換を有する、項目１５から１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目２０）
配列番号５のアミノ酸配列を有する、項目１９に記載のポリペプチド。
（項目２１）
項目１から２０のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
（項目２２）
患者の血流中への注射もしくは注入のために製剤化された、項目２１に記載の医薬組成物。
（項目２３）
脳またはＣＮＳへの直接投与のために製剤化された、項目２１に記載の医薬組成物。
（項目２４）
アミロイドまたはタウタンパク質凝集体の低減を必要とする患者においてアミロイドまたはタウタンパク質凝集体を低減させる方法であって、有効量の、項目１から１８のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは項目２１から２４のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記患者に投与するステップを含む、方法。
（項目２５）
前記患者が、アミロイドまたはタウタンパク質凝集体の存在と関連する神経変性疾患の症状を示している、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
バイオマーカーであるフロルベタピルがポジトロン放出断層撮影における画像化剤として使用される場合、前記患者が、前記バイオマーカーについて陽性である、項目２４または項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記患者が、早期発症型アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病および発症前アルツハイマー病が含まれるアルツハイマー病、パーキンソン病、ＳＡＡアミロイドーシス、シスタチンＣ、遺伝性アイスランド型症候群、老化、多発性骨髄腫、クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、スクレイピーおよびウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）が含まれるがこれらに限定されないプリオン病；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ１、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６またはＳＣＡ７）、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、遺伝性脳アミロイド血管症、家族性アミロイドーシス、イギリス型／デンマーク型認知症、家族性脳症、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合、嗜銀顆粒性認知症、皮質基底核変性症、ボクシング認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、ハラーホルデン・シュパッツ病、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン・ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化型認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、ならびに以下の臨床症候群：行動異常型ＦＴＤ（ｂｖＦＴＤ）、進行性非流暢性失語（ＰＮＦＡ）、第１７染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）および意味性認知症（ＳＤ）のうちの１つまたは複数を有する患者を含めた前頭側頭葉認知症（ＦＴＤ）から選択される神経変性疾患に罹患している、項目２４から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病またはハンチントン病である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記患者が、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー、致死性家族性不眠症またはゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群から選択されるプリオン媒介性疾患に罹患している、項目２７に記載の方法。
（項目３１）
項目１から２０に記載のポリペプチドのいずれか１つをコードする、核酸配列。
（項目３２）
前記ポリペプチドをコードする配列とインフレームで融合した哺乳動物シグナル配列をさらにコードする、項目３１に記載の核酸配列。
（項目３３）
配列番号６である、項目３２に記載の核酸配列。
（項目３４）
項目３１から３３のいずれか一項に記載の核酸配列を含むベクターであって、前記核酸配列は、前記ベクター中の発現制御配列に作動可能に連結されている、ベクター。
（項目３５）
項目３４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目３６）
項目１から２０のいずれか一項に記載のポリペプチドを作製する方法であって、項目３１から３３のいずれか一項に記載の核酸配列によってコードされるタンパク質を発現させるステップ；および発現されたポリペプチドを単離するステップ、を含む、方法。
（項目３７）
項目１から２０のいずれか一項に記載のポリペプチドを作製する方法であって、項目３５に記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現を可能にするのに十分な条件下で培養するステップ；および発現された前記ポリペプチドを単離するステップ、を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、太字かつ下線によって特定された５つのＴ細胞エピトープならびにイタリック、太字かつ下線の推定グリコシル化シグナルを有する、Ｎ１−Ｎ２−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。アミノ酸１〜２１７は、野生型ｇ３ｐ配列のＮ１−Ｎ２部分を構成する。アミノ酸２１８〜２５６は、Ｍ１３バクテリオファージ中に存在する野生型ｇ３ｐグリシン−リッチＮ２−Ｃ末端リンカーからなるリンカー領域を示す。この領域は、陰によって特定される。アミノ酸２５７〜２６１は、融合タンパク質をコードする核酸分子を構築するために使用したマルチクローニング部位によってコードされるアミノ酸を示す。タンパク質のＩｇＧ−Ｆｃ部分は、アミノ酸２６２で始まる。
【００１５】
【図２】図２は、太字かつ下線によって特定された３つのＴ細胞エピトープならびにイタリック、太字かつ下線の推定グリコシル化シグナルを有する、別のｇ３ｐ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。４番目のＴ細胞エピトープは、配列番号１と比較して、Ｖ２１５ＡおよびＧ２２０Ｅの置換によって排除されており、５番目のＴ細胞エピトープは、配列番号１のアミノ酸２５８および２５９に対応するアミノ酸の欠失によって排除されている。
【００１６】
【図３】図３は、Ｎ末端哺乳動物シグナル配列を有する、配列番号１のｇ３ｐ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号３）を示す図である。
【００１７】
【図４】図４は、Ｎ末端哺乳動物シグナル配列を有する、配列番号２のｇ３ｐ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号４）を示す図である。
【００１８】
【図５】図５は、実施例１に記載される研究において発現されたドナーアロタイプの頻度の比較を示す図である。
【００１９】
【図６】図６は、配列番号２と比較して、推定グリコシル化シグナル（Ｔ４１Ｇ）、エピトープ１（Ｔ５６Ｈ）およびエピトープ３（Ｋ１７４Ｒ）中にアミノ酸変化を有するｇ３ｐ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質である本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５）を示す図である。置換されたアミノ酸は、太字、イタリック、下線かつ灰色の強調である。
【００２０】
【図７】図７は、Ｎ末端哺乳動物シグナル配列を有するポリペプチド８６をコードするプラスミドのＤＮＡ配列（配列番号６）を示す図である。シグナル配列を含むコード配列は、太字で示される。配列番号１をコードするＤＮＡと比較したコドン変化は、下線によって示される。
【００２１】
【図８】図８は、Ｎ末端哺乳動物シグナル配列を有するポリペプチド８６  Ｔ４１ＧをコードするプラスミドのＤＮＡ配列（配列番号７）を示す図である。シグナル配列を含むコード配列は、太字で示される。配列番号１をコードするＤＮＡと比較したコドン変化は、下線によって示される。
【００２２】
【図９】図９は、配列番号１のポリペプチドをポリペプチド８６およびポリペプチド８６  Ｔ４１Ｇと比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【００２３】
【図１０】図１０は、配列番号１のポリペプチドをポリペプチド８６およびポリペプチド８６  Ｔ４１Ｇと比較するフィルター遅延アッセイの結果を示す図である。
【００２４】
【図１１】図１１は、ＥＬＩＳＡによって測定した、３つの異なる型の線維についての、配列番号１のポリペプチドとポリペプチド８６  Ｔ４１Ｇとの比較結合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本出願では、参照（未改変）アミノ酸または核酸配列に関して、用語「バリアント」（およびその同語源語）とは、１つもしくは複数のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入、またはコドンの対応する置換、欠失もしくは挿入を含有する配列を指す。参照配列は、「出発アミノ酸配列」または「出発配列」とも呼ばれる。バリアントは、参照配列の物理的操作を必ずしも必要としない。配列が参照配列と比較して異なるアミノ酸を含有する限り、どのようにして合成されたかに関わらず、それは「バリアント」とみなされる。
【００２６】
本明細書で使用する場合、用語「変異体」（およびその同語源語）とは、本出願中に示される具体的配列（例えば、配列番号１、配列番号２など）と比較して改変された出発配列を指す。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「改変された」（およびその同語源語）とは、参照アミノ酸配列または核酸配列中の変化を指す。出発配列が改変される場合、得られた配列はバリアントである。改変には、１つもしくは複数のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入、またはコドンの対応する置換、欠失もしくは挿入が含まれる。
【００２８】
用語「対応する置換」とは、本明細書で使用する場合、そのような変異体または断片が配列番号１のアミノ酸１〜２１７と整列された場合に、表１、表２、表６または表７中の等価なアミノ酸置換に対応する、配列番号１のアミノ酸１〜２１７の変異体または断片中の置換を意味する。
【００２９】
アミロイドに結合するおよび／またはアミロイドを脱凝集させる配列番号１のアミノ酸１〜２１７の断片の一例には、配列番号１のアミノ酸１〜６７を含む任意の断片が含まれるがこれらに限定されない。アミロイドに結合するおよび／またはアミロイドを脱凝集させる配列番号１のアミノ酸１〜２１７の変異体の例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：（１）配列番号２のアミノ酸１〜２１７；（２）アミノ酸４３〜４５におけるＶＶＶのＡＡＡによる置換を保有する、配列番号１のアミノ酸１〜２１７、配列番号２のアミノ酸１〜２１７または配列番号５のアミノ酸１〜２１７；（３）置換Ｃ５３Ｗを有する、配列番号１のアミノ酸１〜２１７、配列番号２のアミノ酸１〜２１７または配列番号５のアミノ酸１〜２１７；（４）アミノ酸９６〜１０３の欠失を有する、配列番号１のアミノ酸１〜２１７、配列番号２のアミノ酸１〜２１７または配列番号５のアミノ酸１〜２１７；（５）アミノ酸２１２〜２１４におけるＱＰＰのＡＧＡによる置換を保有する、配列番号１のアミノ酸１〜２１７、配列番号２のアミノ酸１〜２１７または配列番号５のアミノ酸１〜２１７；（６）置換Ｗ１８１Ａ、Ｆ１９０ＡおよびＦ１９４Ａを有する、配列番号１のアミノ酸１〜２１７、配列番号２のアミノ酸１〜２１７または配列番号５のアミノ酸１〜２１７；（７）ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６６７９３に開示される他の活性変異体および断片；（８）配列番号５のアミノ酸１〜２１７；（９）配列番号１のアミノ酸２〜２１７、配列番号２のアミノ酸２〜２１７または配列番号５のアミノ酸２〜２１７；（１０）配列番号１のアミノ酸３〜２１７、配列番号２のアミノ酸３〜２１７または配列番号５のアミノ酸３〜２１７；（１１）さらなるＮ末端メチオニン残基を含有する、配列番号１のアミノ酸１〜２１７、配列番号２のアミノ酸１〜２１７または配列番号５のアミノ酸１〜２１７のいずれか１つ。
【００３０】
糸状バクテリオファージｇ３ｐタンパク質のＮ１−Ｎ２部分は、アミロイド結合特性および脱凝集特性を有することが以前に示されている（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６６７９３を参照のこと）。ネイティブＭ１３ファージのＮ１−Ｎ２部分は、配列番号１のアミノ酸１〜２１７によって示される。同じＮ１−Ｎ２アミノ酸配列は、ｆｄおよびｆ１糸状バクテリオファージ中にも存在する。配列番号１のアミノ酸２１８〜２５６は、ネイティブｇ３ｐ配列の一部でもあり、典型的には、Ｎ３ドメインとしても公知のｇ３ｐのＣ末端ドメイン（ＣＴ）にｇ３ｐのＮ２領域を接続する、グリシン−リッチリンカーとも呼ばれることを理解すべきである。配列番号１のアミノ酸２５７〜２６１は、配列番号１の融合タンパク質をコードする核酸分子を構築するために使用したマルチクローニング部位によってコードされるアミノ酸を示す。
【００３１】
ポリペプチド
したがって、一実施形態では、本発明は、出発アミノ酸配列のバリアントを含むポリペプチドを提供し、出発アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１〜２１７または配列番号２のアミノ酸１〜２１７、および以下の改変のうちの１つまたは複数を有する、上記のもののいずれかの変異体から選択される：アミノ酸４３〜４５におけるＶＶＶのＡＡＡによる置換；置換Ｃ５３Ｗ；アミノ酸９６〜１０３の欠失；アミノ酸２１２〜２１４におけるＱＰＰのＡＧＡによる置換；置換Ｗ１８１Ａ、Ｆ１９０ＡおよびＦ１９４Ａ；アミノ酸１の欠失；アミノ酸１および２の欠失；ならびにＮ末端メチオニン残基の付加、ここで、
（ａ）出発アミノ酸配列は、アミノ酸３９〜４１における推定グリコシル化シグナルを除去するように改変されている；および
（ｂ）ポリペプチドは、アミロイドに結合するおよび／またはアミロイドを脱凝集させる。
【００３２】
この実施形態の一態様では、出発アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１〜２１７および配列番号２のアミノ酸１〜２１７から選択される。
【００３３】
推定グリコシル化シグナルの排除は、そのような置換、欠失または挿入が、グリコシル化シグナルを再生させない限り、Ｎ３９、Ａ４０および／またはＴ４１のうちの１つまたは複数のアミノ酸置換；Ｎ３９、Ａ４０および／またはＴ４１のうちの１つまたは複数の欠失；Ｎ３９とＡ４０との間での１つまたは複数のアミノ酸の挿入；ならびにＡ４０とＴ４１との間での１つまたは複数のアミノ酸の挿入によって達成される。推定グリコシル化配列は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒであり、式中、Ｘは、ＰｒｏまたはＣｙｓ以外の任意のアミノ酸である。したがって、Ａ４０については特定の置換のみが、グリコシル化配列を排除する。これらの実施形態の一態様では、推定グリコシル化シグナルの排除は、Ｎ３９、Ａ４０および／またはＴ４１のうちの１つまたは複数のアミノ酸置換によって達成される。これらの実施形態のより具体的な一態様では、推定グリコシル化シグナルの排除は、Ｔ４１のアミノ酸置換によって達成される。これらの実施形態のさらにより具体的な一態様では、推定グリコシル化シグナルの排除は、以下の置換のいずれかによって達成される：Ｔ４１Ｇ、Ｔ４１Ｗ、Ｔ４１Ｈ、Ｔ４１Ｖ、Ｔ４１Ｉ、Ｔ４１Ｌ、Ｔ４１Ｒ、Ｔ４１Ｋ、Ｔ４１Ｙ、Ｔ４１Ｆ、Ｔ４１Ｄ、Ｔ４１Ｅ、Ｔ４１Ｑ、Ｔ４１ＮまたはＴ４１Ａ。これらの実施形態の最も具体的な一態様では、推定グリコシル化シグナルの排除は、Ｔ４１Ｇ置換によって達成される。
【００３４】
本発明の別の実施形態では、アミノ酸３９〜４１における推定グリコシル化シグナルを除去するように改変されたポリペプチドは、出発アミノ酸配列を含む対応するポリペプチドと比較して、低減された免疫原性をさらに有する；バリアントは、出発アミノ酸配列と比較して、（グリコシル化シグナルを排除した任意の置換に加えて）１〜９個のアミノ酸置換を有し、各アミノ酸置換は、表１および表２に示されるアミノ酸置換の群から選択される。用語「出発アミノ酸配列を含む対応するポリペプチド」とは、本明細書で使用する場合、
【００３５】
グリコシル化シグナルの改変およびさらなる置換（複数可）を除いて、出発アミノ酸配列を含むポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。
【表１】
2020073610.tif 000007
【表２】
2020073610.tif 000008
【００３６】
表１および２に示されるアミノ酸置換は、Ｎ１−Ｎ２アミノ酸配列内に完全に存在するＴ細胞エピトープを同定することによって誘導した。これは、潜在的なＴ細胞エピトープを同定するために、ＨＬＡ−ＤＲアロタイプの世界人口を最もよく示す地域社会の血液ドナーのコホート由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対して、Ｎ１−Ｎ２配列の異なる重複するペプチド部分をインキュベートすることによって実施した。次いで、この情報を、既知のＴ細胞エピトープのデータベースに対するソフトウェア分析に供して、潜在的エピトープ内の最適なアミノ酸置換を同定した。これらの手順は、実施例に詳細に記載されている。
【００３７】
これらの実施形態の一態様では、（グリコシル化シグナルを排除した任意の置換に加えて）１〜９個のさらなるアミノ酸置換が、表１に示される置換から選択される。上に示される実施形態のより具体的な一態様では、ポリペプチドは、特定の単一アミノ酸置換のみを有する、配列番号１のアミノ酸１〜２１７のバリアントまたは配列番号２のアミノ酸１〜２１７のバリアントを含み、置換は、表３に示される置換のうちの１つから選択される：
【表３】
2020073610.tif 000009
【００３８】
これらの実施形態のさらにより具体的な一態様では、特定の単一アミノ酸置換は、エピトープ２（配列番号１のアミノ酸１３５〜１４３）中にはない。
【００３９】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、（グリコシル化シグナルを排除した任意の置換に加えて）２〜９個のアミノ酸置換を有する、配列番号１のアミノ酸１〜２１７のバリアントまたは配列番号２のアミノ酸１〜２１７のバリアントを含み、これらの置換は、エピトープ１、２および３のうちの少なくとも２つ中にあり、これらの置換は、表１および２に示される置換から選択される。より具体的な一態様では、配列番号１のアミノ酸１〜２１７のバリアントまたは配列番号２のアミノ酸１〜２１７のバリアント中の少なくとも２つの置換は、表１に示される置換から選択される。さらにより具体的な一態様では、ポリペプチドは、２つのみのアミノ酸置換を有する、配列番号１または配列番号２のバリアントを含み、これらの置換は、表４に示される２つの具体的なアミノ酸置換のいずれかから選択される：
【表４】
2020073610.tif 000010
【００４０】
これらの実施形態のより具体的な一態様では、２つのアミノ酸置換のいずれも、エピトープ２（配列番号１のアミノ酸１３５〜１４３）中にはない。これらの実施形態のさらにより具体的な一態様では、これら２つのアミノ酸置換は、Ｔ５６ＨおよびＫ１７４Ｒである。
【００４１】
別の実施形態では、ポリペプチドは、（グリコシル化シグナルを排除した任意の置換に加えて）３〜９個のアミノ酸置換を有する、配列番号１のアミノ酸１〜２１７のバリアントまたは配列番号２のアミノ酸１〜２１７のバリアントを含み、少なくとも１つのアミノ酸置換が、エピトープ１、２および３の各々中にあり、これらの置換は、表１および表２に示される置換から選択される。より具体的な一態様では、配列番号１のアミノ酸１〜２１７のバリアントまたは配列番号２のアミノ酸１〜２１７のバリアント中の少なくとも３つのアミノ酸置換が、表２に示される置換から選択される。さらにより具体的な一態様では、配列番号１のアミノ酸１〜２１７のバリアントまたは配列番号２のアミノ酸１〜２１７のバリアントを含むポリペプチドは、３つのみのアミノ酸置換を有し、これらの置換は、表５に示される３つの特定のアミノ酸置換のいずれかから選択される。
【表５】
2020073610.tif 000011
【００４２】
別の実施形態では、本発明は、１〜９の置換のうちの１つが、Ｖ２１５Ａ、Ｖ２１５Ｓ、Ｖ２１５ＧもしくはＶ２１５Ｔ、Ｖ２１５Ｃ、Ｖ２１５Ｄ、Ｖ２１５Ｅ、Ｖ２１５Ｆ、Ｖ２１５Ｈ、Ｖ２１５Ｋ、Ｖ２１５Ｎ、Ｖ２１５Ｐ、Ｖ２１５ＱまたはＶ２１５Ｒから選択されるエピトープ４中の置換である、ｇ３ｐバリアントを含むポリペプチドを提供する。なお別の実施形態では、本発明は、１〜９個の置換のうちの１つが、Ｖ２１５Ａ、Ｖ２１５Ｓ、Ｖ２１５Ｇ、Ｖ２１５Ｔ、Ｖ２１５Ｃ、Ｖ２１５Ｄ、Ｖ２１５Ｅ、Ｖ２１５Ｆ、Ｖ２１５Ｈ、Ｖ２１５Ｋ、Ｖ２１５Ｎ、Ｖ２１５Ｐ、Ｖ２１５ＱまたはＶ２１５Ｒから選択されるエピトープ４中の置換である、配列番号１のアミノ酸１〜２１７のバリアントを含むポリペプチドを提供する。Ｎ１−Ｎ２配列の重複する潜在的Ｔ細胞エピトープペプチド部分の試験を通じて、本出願人らは、配列番号１中のＶ２１５が、配列番号１のアミノ酸２１５〜２２３（Ｎ２の最後からグリシン−リッチリンカーの一部分まで）にわたる潜在的Ｔ細胞エピトープ（図１のエピトープ４）の一部であることを決定した。この実施形態のより具体的な一態様では、エピトープ４は、Ｖ２１５ＡおよびＧ２２０Ｅ置換を有する（配列番号２と同様）。さらに、配列番号１と比較した、エピトープ４中の単一Ｖ２１５Ｇ置換は、アミロイドに結合するまたはアミロイドを脱凝集させるポリペプチドの能力に影響を与えなかった。上に示されるＶ２１５についての他の置換の各々は、アミロイド結合に対する影響をほとんどまたは全く有さずに、Ｔ細胞エピトープを排除するために、ソフトウェアおよびデータベース分析によって同様に予測される。
【００４３】
より具体的な一態様では、配列番号１のアミノ酸１〜２１７のバリアントを含むポリペプチドは、アミノ酸３９〜４１における推定グリコシル化部位を除去する改変；上に示されるＶ２１５置換のいずれか１つ；ならびに１〜８の、表１または表２に示されるアミノ酸置換を有する。さらにより具体的な一実施形態では、１〜８個のアミノ酸置換は、表１に示される置換から選択される。さらにより具体的な一態様では、ポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ、Ｔ４１Ｗ、Ｔ４１Ｈ、Ｔ４１Ｖ、Ｔ４１Ｉ、Ｔ４１Ｌ、Ｔ４１Ｒ、Ｔ４１Ｋ、Ｔ４１Ｙ、Ｔ４１Ｆ、Ｔ４１Ｄ、Ｔ４１Ｅ、Ｔ４１Ｑ、Ｔ４１ＮおよびＴ４１Ａから選択されるＴ４１置換；Ｖ２１５Ａ、Ｖ２１５Ｓ、Ｖ２１５ＧまたはＶ２１５Ｔ、Ｖ２１５Ｃ、Ｖ２１５Ｄ、Ｖ２１５Ｅ、Ｖ２１５Ｆ、Ｖ２１５Ｈ、Ｖ２１５Ｋ、Ｖ２１５Ｎ、Ｖ２１５Ｐ、Ｖ２１５ＱおよびＶ２１５Ｒから選択されるＶ２１５置換；ならびに表３に示される置換から選択される１つのさらなる単一アミノ酸置換を有し、単一アミノ酸置換は、エピトープ２中にはない。より具体的な一態様では、配列番号１のアミノ酸１〜２１７のバリアントを含むポリペプチドは、アミノ酸３９〜４１における推定グリコシル化部位を除去する改変；上に示されるＶ２１５置換のいずれか１つ；および２〜８個のさらなるアミノ酸置換を有し、これらのさらなる置換は、エピトープ１、２および３のうちの少なくとも２つ中にあり、これらの置換は、表１または表２に示される置換から選択される。さらにより具体的な一実施形態では、エピトープ１、２および３のうちの少なくとも２つ中の少なくとも１つの置換は、表１に示される置換から選択される。なおより具体的な一実施形態では、ポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ、Ｔ４１Ｗ、Ｔ４１Ｈ、Ｔ４１Ｖ、Ｔ４１Ｉ、Ｔ４１Ｌ、Ｔ４１Ｒ、Ｔ４１Ｋ、Ｔ４１Ｙ、Ｔ４１Ｆ、Ｔ４１Ｄ、Ｔ４１Ｅ、Ｔ４１Ｑ、Ｔ４１ＮおよびＴ４１Ａから選択されるＴ４１置換；Ｖ２１５Ａ、Ｖ２１５Ｓ、Ｖ２１５ＧまたはＶ２１５Ｔ、Ｖ２１５Ｃ、Ｖ２１５Ｄ、Ｖ２１５Ｅ、Ｖ２１５Ｆ、Ｖ２１５Ｈ、Ｖ２１５Ｋ、Ｖ２１５Ｎ、Ｖ２１５Ｐ、Ｖ２１５ＱおよびＶ２１５Ｒから選択されるＶ２１５置換；ならびに表４に示される２つの特定のアミノ酸置換のうちの１つを有し、これらのアミノ酸置換のいずれも、エピトープ２中にはない。
【００４４】
より具体的な一態様では、配列番号１のアミノ酸１〜２１７のバリアントを含むポリペプチドは、アミノ酸３９〜４１における推定グリコシル化部位を除去する改変；上に示されるＶ２１５置換のいずれか１つ；ならびに３〜８つの、表１または表２に示される置換から選択されるさらなるアミノ酸置換を有し、エピトープ１、２および３の各々が、これらのさらなる置換のうちの１つを含む。さらにより具体的な一実施形態では、エピトープ１、２および３の各々中の置換は、表１に示される置換から選択される。なおより具体的な一実施形態では、ポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ、Ｔ４１Ｗ、Ｔ４１Ｈ、Ｔ４１Ｖ、Ｔ４１Ｉ、Ｔ４１Ｌ、Ｔ４１Ｒ、Ｔ４１Ｋ、Ｔ４１Ｙ、Ｔ４１Ｆ、Ｔ４１Ｄ、Ｔ４１Ｅ、Ｔ４１Ｑ、Ｔ４１ＮおよびＴ４１Ａから選択されるＴ４１置換；Ｖ２１５Ａ、Ｖ２１５Ｓ、Ｖ２１５ＧまたはＶ２１５Ｔ、Ｖ２１５Ｃ、Ｖ２１５Ｄ、Ｖ２１５Ｅ、Ｖ２１５Ｆ、Ｖ２１５Ｈ、Ｖ２１５Ｋ、Ｖ２１５Ｎ、Ｖ２１５Ｐ、Ｖ２１５ＱおよびＶ２１５Ｒから選択されるＶ２１５置換；任意選択のＧ２２０Ｅ置換；ならびに表５に示される特定の３つのアミノ酸置換のうちの１つを有する。
【００４５】
さらにより具体的な一実施形態では、ポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ、Ｔ４１Ｗ、Ｔ４１Ｈ、Ｔ４１Ｖ、Ｔ４１Ｉ、Ｔ４１Ｌ、Ｔ４１Ｒ、Ｔ４１Ｋ、Ｔ４１Ｙ、Ｔ４１Ｆ、Ｔ４１Ｄ、Ｔ４１Ｅ、Ｔ４１Ｑ、Ｔ４１ＮおよびＴ４１Ａから選択されるＴ４１置換；ならびに表４に示される置換から選択される一対の置換を有する、配列番号２のアミノ酸１〜２１７のバリアントを含み、これらの置換のうちの一方は、エピトープ１中にあり、他方は、エピトープ３中にある。この実施形態の一態様では、Ｔ４１置換は、Ｔ４１Ｇである。この実施形態の代替的な一態様では、置換のうちの一方がエピトープ１中にあり他方がエピトープ３中にある置換の対は、Ｔ５６ＨおよびＫ１７４Ｒである。この実施形態のさらにより具体的な一態様では、ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸１〜２１５を含む。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、バリアントｇ３ｐアミノ酸配列のＣ末端に、ペプチドリンカーを介してかまたは直接的に融合した、ヒトまたはヒト化免疫グロブリンＦｃポリペプチド配列から本質的になる、融合タンパク質である。用語「ペプチドリンカー」とは、本明細書で使用する場合、ポリペプチドの機能を妨害しない一連の連続アミノ酸を指す。上に示すように、配列番号１および３において、アミノ酸２１８〜２５６は、Ｍ１３  ｇ３ｐタンパク質中に通常存在するグリシン−リッチリンカーを示す。そのリンカーが使用され得、またはしたがって、異なるリンカーが、本発明のポリペプチドにおいて置換され得る。あるいは、Ｆｃポリペプチド配列は、Ｎ２をコードする最後のアミノ酸（例えば、配列番号１および３のアミノ酸２１７）に直接連結され得る。リンカー配列および／またはその非存在の選択は、本発明のポリペプチドの組換え発現のために利用可能なベクターおよびかかるリンカーがポリペプチドに与え得る任意の二次または三次構造を考慮して、当業者によって行われ得る。この実施形態の一態様では、Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃ部分である。より具体的な一態様では、ポリペプチドは、アミノ酸３９〜４１における推定グリコシル化部位を除去する改変を有する、配列番号１または配列番号３のバリアントである。さらにより具体的な一態様では、ポリペプチドは、アミノ酸３９〜４１における推定グリコシル化部位を除去する改変；および以下の表１、表２または表６または表７に示されるアミノ酸置換の群から選択される、その中の１〜９個のさらなるアミノ酸残基置換を有する、配列番号１または配列番号２のバリアントである：
【表６】
2020073610.tif 000012
【表７】
2020073610.tif 000013
【００４６】
一実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸３９〜４１における推定グリコシル化部位を除去する改変；および２〜９個のさらなるアミノ酸置換を有する配列番号１のバリアントであり、さらなる置換のうちの１つは、表６および表７に示される置換であり；置換のうちの少なくとも１つの他のものは、表１および表２に示される置換である。この実施形態のより具体的な一態様では、さらなる置換のうちの１つは、表６に示される置換であり；置換のうちの少なくとも１つの他のものは、表１に示される置換である。この実施形態のさらにより具体的な一態様では、ポリペプチドは、エピトープ２中に置換を有さない。この実施形態の別のさらにより具体的な態様では、ポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ、Ｔ４１Ｗ、Ｔ４１Ｈ、Ｔ４１Ｖ、Ｔ４１Ｉ、Ｔ４１Ｌ、Ｔ４１Ｒ、Ｔ４１Ｋ、Ｔ４１Ｙ、Ｔ４１Ｆ、Ｔ４１Ｄ、Ｔ４１Ｅ、Ｔ４１Ｑ、Ｔ４１ＮおよびＴ４１Ａから選択されるＴ４１置換を有する。この実施形態のなおより具体的な一態様では、ポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ置換を有する。
【００４７】
別の実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸３９〜４１における推定グリコシル化部位を除去する改変を有する配列番号１のバリアントであり；３〜９個のさらなるアミノ酸置換を有し、さらなる置換のうちの少なくとも１つは、表６および表７に示される置換から選択され、エピトープ１、２および３のうちの少なくとも２つは、表１および表２に示される置換から選択される少なくとも１つの置換を含む。より具体的な一態様では、ポリペプチドは、表６に示される置換のうちの少なくとも１つ、ならびに表１に示される置換から選択される、エピトープ１、２および３のうちの少なくとも２つ中の少なくとも１つの置換を有する。この実施形態のさらにより具体的な一態様では、ポリペプチドは、エピトープ２中に置換を有さない。この実施形態の別のさらにより具体的な一態様では、ポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ、Ｔ４１Ｗ、Ｔ４１Ｈ、Ｔ４１Ｖ、Ｔ４１Ｉ、Ｔ４１Ｌ、Ｔ４１Ｒ、Ｔ４１Ｋ、Ｔ４１Ｙ、Ｔ４１Ｆ、Ｔ４１Ｄ、Ｔ４１Ｅ、Ｔ４１Ｑ、Ｔ４１ＮおよびＴ４１Ａから選択されるＴ４１置換を有する。この実施形態のなおより具体的な一態様では、ポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ置換を有する。この実施形態の代替的な一態様では、ポリペプチドは、２つのみのさらなる置換を有し、一方はエピトープ１中にあり、他方はエピトープ３中にある。この実施形態のさらにより具体的な一態様では、ポリペプチドは、２つのみのさらなる置換を有し、一方はＴ５６Ｈであり、他方はＫ１７４Ｒである。
【００４８】
別の実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸３９〜４１における推定グリコシル化部位を除去する改変を有する配列番号１のバリアントであり；４〜９個のアミノ酸置換；表６および表７に示される置換のうちの少なくとも１つ；ならびに表１および表２に示される置換から選択される、エピトープ１、２および３の各々中の少なくとも１つの置換を有する。この実施形態の具体的な一態様では、ポリペプチドは、表６に示される置換のうちの少なくとも１つ、ならびに表１に示される置換から選択される、エピトープ１、２および３の各々中の少なくとも１つの置換を有する。別のより具体的な態様では、ポリペプチドは、表６に示される置換のうちの少なくとも１つ；ならびにそれぞれ表３、表４または表５に示される特定の置換である１、２または３つのアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを有する。この実施形態のなお別のより具体的な態様では、ポリペプチドは、配列番号１のバリアントであり、表６に示されるアミノ酸置換のうちの１つのみ、ならびにそれぞれ表３、表４または表５に示される特定の１、２または３つのアミノ酸置換のうちの１つから選択される１、２または３つのみのさらなるアミノ酸置換を有する。この実施形態の別のさらにより具体的な一態様では、ポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ、Ｔ４１Ｗ、Ｔ４１Ｈ、Ｔ４１Ｖ、Ｔ４１Ｉ、Ｔ４１Ｌ、Ｔ４１Ｒ、Ｔ４１Ｋ、Ｔ４１Ｙ、Ｔ４１Ｆ、Ｔ４１Ｄ、Ｔ４１Ｅ、Ｔ４１Ｑ、Ｔ４１ＮおよびＴ４１Ａから選択されるＴ４１置換を有する。この実施形態のなおより具体的な一態様では、ポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ置換を有する。
【００４９】
代替的な一実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸３９〜４１における推定グリコシル化部位を除去する改変；ならびに表１および表２に示されるアミノ酸置換の群から選択される１〜９個のさらなるアミノ酸残基置換を有する、配列番号２のバリアントである。より具体的な一態様では、少なくとも１つのさらなる置換は、表１に示される。この実施形態のさらにより具体的な一態様では、ポリペプチドは、エピトープ２中に置換を有さない。この実施形態の別のさらにより具体的な一態様では、ポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ、Ｔ４１Ｗ、Ｔ４１Ｈ、Ｔ４１Ｖ、Ｔ４１Ｉ、Ｔ４１Ｌ、Ｔ４１Ｒ、Ｔ４１Ｋ、Ｔ４１Ｙ、Ｔ４１Ｆ、Ｔ４１Ｄ、Ｔ４１Ｅ、Ｔ４１Ｑ、Ｔ４１ＮおよびＴ４１Ａから選択されるＴ４１置換を有する。この実施形態のなおより具体的な一態様では、ポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ置換を有する。
【００５０】
別の実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸３９〜４１における推定グリコシル化部位を除去する改変；ならびに表１および表２に示される置換のいずれかから選択される、２〜９個のさらなるアミノ酸置換、ならびにエピトープ１、２および３のうちの少なくとも２つ中の少なくとも１つの置換を有する、配列番号２のバリアントである。より具体的な一態様では、エピトープ１、２および３のうちの少なくとも２つ中の少なくとも１つの置換は、表１に示される置換から選択される。この実施形態のさらにより具体的な一態様では、ポリペプチドは、エピトープ２中に置換を有さない。この実施形態の別のさらにより具体的な一態様では、ポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ、Ｔ４１Ｗ、Ｔ４１Ｈ、Ｔ４１Ｖ、Ｔ４１Ｉ、Ｔ４１Ｌ、Ｔ４１Ｒ、Ｔ４１Ｋ、Ｔ４１Ｙ、Ｔ４１Ｆ、Ｔ４１Ｄ、Ｔ４１Ｅ、Ｔ４１Ｑ、Ｔ４１ＮおよびＴ４１Ａから選択されるＴ４１置換を有する。この実施形態のなおより具体的な一態様では、ポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ置換を有する。この実施形態の代替的な一態様では、ポリペプチドは、エピトープ１中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびエピトープ３中の少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。この実施形態のさらにより具体的な一態様では、ポリペプチドは、Ｔ５６ＨおよびＫ１７４Ｒ置換を含む。
【００５１】
別のより具体的な一態様では、ポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のバリアントであり、３〜９個のアミノ酸置換を有し、少なくとも１つの置換は、エピトープ１、２および３の各々中にあり、表１および表２に示される置換のいずれかから選択される。より具体的な一態様では、エピトープ１、２および３の各々中の少なくとも１つの置換は、表１に示される置換から選択される。さらにより具体的な一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のバリアントであり、それぞれ表３、表４または表５に示される特定の１、２または３つのアミノ酸置換のうちの１つから選択される１、２または３つのみのアミノ酸置換を有する。この実施形態の別のさらにより具体的な一態様では、ポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ、Ｔ４１Ｗ、Ｔ４１Ｈ、Ｔ４１Ｖ、Ｔ４１Ｉ、Ｔ４１Ｌ、Ｔ４１Ｒ、Ｔ４１Ｋ、Ｔ４１Ｙ、Ｔ４１Ｆ、Ｔ４１Ｄ、Ｔ４１Ｅ、Ｔ４１Ｑ、Ｔ４１ＮおよびＴ４１Ａから選択されるＴ４１置換を有する。この実施形態のなおより具体的な一態様では、ポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ置換を有する。
【００５２】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ、Ｔ４１Ｗ、Ｔ４１Ｈ、Ｔ４１Ｖ、Ｔ４１Ｉ、Ｔ４１Ｌ、Ｔ４１Ｒ、Ｔ４１Ｋ、Ｔ４１Ｙ、Ｔ４１Ｆ、Ｔ４１Ｄ、Ｔ４１Ｅ、Ｔ４１Ｑ、Ｔ４１ＮおよびＴ４１Ａから選択されるＴ４１置換；ならびに表４に示される２つの特定のアミノ酸置換のいずれかから選択される２つのみのさらなるアミノ酸置換を有する、配列番号２のバリアントである。この実施形態の具体的な一態様では、ポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ置換を有する。この実施形態のより具体的な一態様では、ポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ置換を有する。この実施形態の別のより具体的な態様では、一方のさらなるアミノ酸置換は、エピトープ１中にあり、他方のさらなるアミノ酸置換は、エピトープ３中にある。この実施形態のなおより具体的な一態様では、一方のさらなるアミノ酸置換は、Ｔ５６Ｈであり、他方のさらなるアミノ酸置換は、Ｋ１７４Ｒである。この実施形態のさらにより具体的な一態様では、ポリペプチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する。
【００５３】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ、Ｔ４１Ｗ、Ｔ４１Ｈ、Ｔ４１Ｖ、Ｔ４１Ｉ、Ｔ４１Ｌ、Ｔ４１Ｒ、Ｔ４１Ｋ、Ｔ４１Ｙ、Ｔ４１Ｆ、Ｔ４１Ｄ、Ｔ４１Ｅ、Ｔ４１Ｑ、Ｔ４１ＮおよびＴ４１Ａから選択されるＴ４１置換；ならびに表５に示される３つの特定のアミノ酸置換のいずれかから選択される３つのみのさらなるアミノ酸置換を有する、配列番号２のバリアントである。この実施形態の具体的な一態様では、ポリペプチドは、Ｔ４１Ｇ置換を有する。
【００５４】
核酸分子、配列、ベクターおよび宿主細胞
他の実施形態では、本発明は、上記ｇ３ｐバリアントを含むポリペプチドまたは融合タンパク質のいずれかをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を提供する。この実施形態の一態様では、単離された核酸分子は、配列番号３または４のヌクレオチド１８１〜１８９によってコードされる推定グリコシル化部位（配列番号１または３のアミノ酸３９〜４１におけるアミノ酸ＮＡＴに対応する）を破壊するコドン置換、インフレームコドン挿入またはインフレームコドン欠失によって改変された、配列番号３のヌクレオチド６４〜７１４または配列番号５のヌクレオチド６４〜７０８のバリアントを含む。これらの実施形態のより具体的な一態様では、配列番号３または４のヌクレオチド６４〜７１４のバリアントは、配列番号３または４のヌクレオチド１８１〜１８９によってコードされる推定グリコシル化部位を破壊するコドン置換によって改変されている。これらの実施形態のさらにより具体的な一態様では、配列番号３または４のヌクレオチド６４〜７１４のバリアントは、Ｔ４１Ｇ、Ｔ４１Ｗ、Ｔ４１Ｈ、Ｔ４１Ｖ、Ｔ４１Ｉ、Ｔ４１Ｌ、Ｔ４１Ｒ、Ｔ４１Ｋ、Ｔ４１Ｙ、Ｔ４１Ｆ、Ｔ４１Ｄ、Ｔ４１Ｅ、Ｔ４１Ｑ、Ｔ４１ＮおよびＴ４１Ａから選択されるアミノ酸置換をコードする、ヌクレオチド１８７〜１８９（配列番号１および２のＴ４１をコードする）におけるコドン置換によって改変されている。これらの実施形態のさらにより具体的な一態様では、置換されたコドン置換は、ｇｇａ、ｔｇｇ、ｃａｔ、ｇｔｔ、ａｔｔ、ｃｔｔ、ａｇｇ、ａａａ、ｔａｔ、ｔｔｃ、ｇａｃ、ｇａｇ、ｃａｇ、ａａｔおよびｇｃｔから選択される。これらの実施形態のさらにより具体的な一態様では、配列番号３または４のヌクレオチド６４〜７１４のバリアントは、アミノ酸置換Ｔ４１Ｇをコードするヌクレオチド１８７〜１８９におけるコドン置換によって改変されている。これらの実施形態のさらにより具体的な一態様では、置換されたコドン置換は、ｇｇａである。
【００５５】
別の実施形態では、配列番号３または４のヌクレオチド１８１〜１８９によってコードされる推定グリコシル化部位を破壊する改変に加えて、配列番号３または４のヌクレオチド６４〜７１４のバリアントはさらに、１〜９個のコドン置換からなり、各コドン置換は、表１および表２に示される置換、ならびに以下のＶ２１５アミノ酸置換のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸置換に対応する：Ｖ２１５Ａ、Ｖ２１５Ｓ、Ｖ２１５ＧまたはＶ２１５Ｔ、Ｖ２１５Ｃ、Ｖ２１５Ｄ、Ｖ２１５Ｅ、Ｖ２１５Ｆ、Ｖ２１５Ｈ、Ｖ２１５Ｋ、Ｖ２１５Ｎ、Ｖ２１５Ｐ、Ｖ２１５ＱおよびＶ２１５Ｒ。これらの実施形態のさらにより具体的な一態様では、バリアント核酸配列は、上に示されるＶ２１５アミノ酸置換のうちのいずれか１つをコードするように選択された１つのコドン置換；および１〜８のさらなるコドン置換によって改変されており、さらなるコドン置換の各々は、表１に示されるアミノ酸置換をコードするように選択される。これらの実施形態のなおより具体的な一態様では、バリアント核酸配列は、上に示されるＶ２１５アミノ酸置換のうちのいずれか１つをコードするように選択された１つのコドン置換；および２〜８のさらなるコドン置換によって改変されており、各さらなるコドン置換は、表１に示されるアミノ酸置換をコードし、コドン置換は、エピトープ１、２および３のうちの少なくとも２つの各々中に存在する。なおより具体的な一実施形態では、バリアント核酸配列は、上に示されるＶ２１５アミノ酸置換のうちのいずれか１つをコードするように選択された１つのコドン置換；および３〜８のさらなるコドン置換によって改変されており、各さらなるコドン置換は、表１に示されるアミノ酸置換をコードし、コドン置換は、エピトープ１、２および３の各々中に存在する。なおより具体的な一実施形態では、バリアント核酸配列は、Ｖ２１５Ａアミノ酸置換をコードするように選択された１つのコドン置換；および表３に示される単一アミノ酸置換のうちの１つをコードするように選択された１つのさらなるコドン置換によって改変されている。この実施形態のより具体的な一態様では、表３に示される単一アミノ酸置換のうちの１つをコードするように選択された１つのさらなるコドン置換は、エピトープ２中のアミノ酸置換をコードしない。別の具体的な実施形態では、バリアント核酸配列は、上に示されるＶ２１５Ａアミノ酸置換をコードするように選択された１つのコドン置換；および表４に示される２つの特定のアミノ酸置換のうちの１つをコードするように選択された２つのさらなるコドン置換によって改変されている。この実施形態のより具体的な一態様では、表４に示される２つの特定のアミノ酸置換のうちの１つをコードするように選択された２つのさらなるコドン置換は、エピトープ２中のアミノ酸置換をコードしない。なおより具体的な一実施形態では、バリアント核酸配列は、上に示されるＶ２１５アミノ酸置換をコードするように選択された１つのコドン置換；および表５に示される３つの特定のアミノ酸置換のうちの１つをコードするように選択された３つのさらなるコドン置換によって改変されている。
【００５６】
なお他の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号３のヌクレオチド６４〜１５３０または配列番号６のヌクレオチド６４〜１５２４のバリアントを含み、その配列は、配列番号３または４のヌクレオチド１８１〜１８９によってコードされる推定グリコシル化部位（配列番号１または３のアミノ酸３９〜４１におけるアミノ酸ＮＡＴに対応する）を破壊するコドン置換、インフレームコドン挿入またはインフレームコドン欠失によって改変されている。これらの実施形態のより具体的な一態様では、配列番号３のヌクレオチド６４〜１５３０または配列番号４のヌクレオチド６４〜１５２４のバリアントは、配列番号３または４のヌクレオチド１８１〜１８９によってコードされる推定グリコシル化部位を破壊するコドン置換によって改変されている。これらの実施形態のさらにより具体的な一態様では、配列番号３のヌクレオチド６４〜１５３０または配列番号４のヌクレオチド６４〜１５２４のバリアントは、Ｔ４１Ｇ、Ｔ４１Ｗ、Ｔ４１Ｈ、Ｔ４１Ｖ、Ｔ４１Ｉ、Ｔ４１Ｌ、Ｔ４１Ｒ、Ｔ４１Ｋ、Ｔ４１Ｙ、Ｔ４１Ｆ、Ｔ４１Ｄ、Ｔ４１Ｅ、Ｔ４１Ｑ、Ｔ４１ＮおよびＴ４１Ａから選択されるアミノ酸置換をコードするヌクレオチド１８７〜１８９（配列番号１および２のＴ４１をコードするａｃａ）におけるコドン置換によって改変されている。これらの実施形態のさらにより具体的な一態様では、置換されたコドン置換は、ｇｇａ、ｔｇｇ、ｃａｔ、ｇｔｔ、ａｔｔ、ｃｔｔ、ａｇｇ、ａａａ、ｔａｔ、ｔｔｃ、ｇａｃ、ｇａｇ、ｃａｇ、ａａｔおよびｇｃｔから選択される。これらの実施形態のさらにより具体的な一態様では、配列番号３または４のヌクレオチド６４〜７１４のバリアントは、アミノ酸置換Ｔ４１Ｇをコードするヌクレオチド１８７〜１８９におけるコドン置換によって改変されている。これらの実施形態のさらにより具体的な一態様では、置換されたコドン置換は、ｇｇａである。
【００５７】
別の実施形態では、配列番号３または４のヌクレオチド１８１〜１８９によってコードされる推定グリコシル化部位を破壊する改変に加えて、配列番号３のヌクレオチド６４〜１５３０または配列番号４のヌクレオチド６４〜１５２４のバリアントはさらに、１〜９個のコドン置換からなり、各コドン置換は、表１、表２に示される置換、および以下のＶ２１５アミノ酸置換のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸置換に対応する：Ｖ２１５Ｓ、Ｖ２１５ＧまたはＶ２１５Ｔ、Ｖ２１５Ｃ、Ｖ２１５Ｄ、Ｖ２１５Ｅ、Ｖ２１５Ｆ、Ｖ２１５Ｈ、Ｖ２１５Ｋ、Ｖ２１５Ｎ、Ｖ２１５Ｐ、Ｖ２１５ＱおよびＶ２１５Ｒ。この実施形態のより具体的な一態様では、各コドン置換は、表１に示される置換、および上に示されるＶ２１５置換のいずれか１つから選択されるアミノ酸置換に対応する。さらにより具体的な一実施形態では、バリアント核酸配列は、上に示されるＶ２１５アミノ酸置換のうちのいずれか１つをコードするように選択された１つのコドン置換、および１〜８個のさらなるコドン置換によって改変されており、さらなるコドン置換の各々は、表１に示される置換から選択されるアミノ酸置換に対応する。より具体的な一態様では、バリアントは、表３に示される１つの特定のアミノ酸置換のうちの１つに対応する１つのさらなるコドン置換を有する。この実施形態のより具体的な一態様では、表３に示される単一アミノ酸置換のうちの１つをコードするように選択された１つのさらなるコドン置換は、エピトープ２中のアミノ酸置換をコードしない。
【００５８】
別の実施形態では、配列番号３または４のヌクレオチド１８１〜１８９によってコードされる推定グリコシル化部位を破壊する改変に加えて、配列番号３のヌクレオチド６４〜１５３０または配列番号６のヌクレオチド６４〜１５２４のバリアントは、上に示されるＶ２１５アミノ酸置換のうちのいずれか１つをコードするように選択された１つのコドン置換；および２〜８のさらなるコドン置換からなる改変を有し、各さらなるコドン置換は、表１に示されるアミノ酸置換に対応し、コドン置換は、エピトープ１、２および３のうちの少なくとも２つの各々中に存在する。より具体的な一態様では、バリアントは、表４に示される２つの特定のアミノ酸置換のうちの１つに対応する２つのさらなるコドン置換を有する。この実施形態のより具体的な一態様では、表４に示される２つの特定のアミノ酸置換のうちの１つをコードするように選択された２つのさらなるコドン置換は、エピトープ２中のアミノ酸置換をコードしない。この実施形態のさらにより具体的な一態様では、表４からの２つの特定のアミノ酸置換は、Ｔ５６ＨおよびＫ１７４Ｒである。この実施形態のさらにより具体的な一態様では、バリアントヌクレオチド配列は、配列番号８である。
【００５９】
別の実施形態では、配列番号３または４のヌクレオチド１８１〜１８９によってコードされる推定グリコシル化部位を破壊する改変に加えて、配列番号３のヌクレオチド６４〜１５３０または配列番号６のヌクレオチド６４〜１５２４のいずれか１つのバリアントは、上に示されるＶ２１５アミノ酸置換のうちのいずれか１つをコードするように選択された１つのコドン置換；および３〜８のさらなるコドン置換からなる改変を有し、各さらなるコドン置換は、表１に示されるアミノ酸置換に対応し、コドン置換は、エピトープ１、２および３の各々中に存在する。より具体的な一態様では、バリアントは、表５に示される３つの特定のアミノ酸置換のうちの１つに対応する３つのさらなるコドン置換を有する。
【００６０】
本発明の核酸分子のなお他の実施形態では、核酸分子は、バリアントｇ３ｐをコードする核酸配列の５’末端と同相で直接融合したシグナル配列をコードする核酸配列をさらに含む。これらの実施形態の一態様では、シグナル配列をコードする核酸配列は、配列番号３のヌクレオチド１〜６３である。
【００６１】
本発明の核酸分子は、上記核酸分子のいずれかと縮重的であるが、上記核酸分子のいずれかによってコードされるのと同じアミノ酸配列をコードする核酸配列を包含する。
【００６２】
組換え産生のために、本発明の核酸分子のいずれかが、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメント、またはＲＮＡウイルスベクターの場合には複製および翻訳に必要なエレメントを含有する、適切な発現ベクター中に挿入され得る。コード核酸は、適切なリーディングフレームでベクター中に挿入される。したがって、本発明は、本発明の核酸分子および配列を含むベクターを提供する。かかるベクターには、ＤＮＡベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれるがこれらに限定されない。本発明の核酸分子および配列をクローニングするための適切なベクターの選択は、発現を実施するための選択された宿主細胞とベクターとの適合性の周知の知識を使用して、当業者によって行われ得る。これは、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、細菌細胞、酵母細胞などのいずれかにおいて実施され得る。これらの細胞型の各々に適切なベクターは、当該分野で周知であり、一般に市販されている。
【００６３】
別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸分子または核酸配列を含有するベクターを保有する宿主細胞を提供する。本発明のベクターを宿主細胞中にトランスフェクトまたは形質転換または他の方法で入れ込む方法は、当該分野で公知である。適切な条件下で培養した場合、ベクターを保有する細胞は、本発明のポリペプチドを産生する。本発明のポリペプチドの組換え産生に使用されるベクターおよび細胞の具体的な例は、以下の実施例のセクションに示される。
【００６４】
医薬組成物
一部の実施形態では、本発明は、任意選択で薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と一緒に、バリアントｇ３ｐを含む任意のポリペプチドまたは融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。「医薬組成物」とは、生理学的に適切な担体および／または賦形剤を伴う、治療有効量の本明細書に記載される組成物を指す。医薬組成物は、生物への顕著な刺激を引き起こさない。相互交換可能に使用され得る語句「生理学的に適切な担体」および「薬学的に許容される担体」とは、生物への顕著な刺激を引き起こさず、投与された組成物の生物学的活性および特性を無効にしない、担体または希釈剤を指す。用語「賦形剤」とは、活性成分の投与をさらに促進するために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。例には、限定なしに、例えば、生理食塩水、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖および種々の型のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、および例えばポリソルベート２０が含まれる界面活性剤が含まれる。
【００６５】
本発明に従う使用のための医薬組成物は、薬学的に使用され得る組成物への活性成分の加工を促進する賦形剤および補助剤を含む１種または複数の生理学的に許容される担体を使用して、従来の様式で製剤化され得る。適切な製剤化は、選択された投与経路および送達される組成物の性質（例えば、ポリペプチドのサイズおよび溶解度）に依存する。これらの実施形態の一態様では、医薬組成物は、患者の血流中への注射または注入のために製剤化される。これらの実施形態の別の一態様では、医薬組成物は、例えば、直接髄内注射、くも膜下腔内注射または脳室内注射による、患者の脳または中枢神経系への直接投与のために製剤化される。
【００６６】
本明細書に記載される組成物は、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与のために製剤化され得る。非経口投与のための医薬組成物には、水溶性形態の組成物の水溶液が含まれる。さらに、活性成分の懸濁物が、油性または水ベースの注射懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチル、トリグリセリドもしくはリポソームが含まれる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増加させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有し得る。任意選択で、懸濁物は、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、適切な安定剤または活性成分の溶解度を増加させる薬剤（例えば、界面活性剤、例えば、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ  ２０））もまた含有し得る。タンパク質ベースの薬剤、例えばアルブミンなどが、送達表面（即ち、ＩＶバッグ、カテーテル、針など）への本発明のポリペプチドの吸着を防止するために使用され得る。
【００６７】
経口投与のために、組成物は、活性化合物を、当該分野で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって、容易に製剤化され得る。
【００６８】
製剤は、任意選択で、添加された防腐剤と共に、単位剤形で、例えば、バイアル、アンプル中に、または多用量容器中に、提示され得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁物、溶液またはエマルジョンであり得、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含有し得る。単一剤形は、液体形態または固体形態であり得る。単一剤形は、改変なしに患者に直接投与され得、または投与前に希釈もしくは再構成され得る。ある特定の実施形態では、単一剤形は、ボーラス形態、例えば、単一注射で、複数の錠剤、カプセル剤、丸剤などを含む経口用量を含む単一経口用量で、投与され得る。代替的実施形態では、単一剤形は、一定期間にわたって、例えば、注入によって、またはＩＣＶポンプなどの移植されたポンプを介して、投与され得る。後者の実施形態では、単一剤形は、バリアントｇ３ｐを含むポリペプチドまたは融合タンパク質の適切な量を予め充填した注入バッグまたはポンプレザバであり得る。あるいは、注入バッグまたはポンプレザバは、適切な用量のバリアントｇ３ｐを、注入バッグまたはポンプレザバ溶液と混合することによって、患者への投与の直前に調製され得る。
【００６９】
本発明の別の態様は、本発明の医薬組成物を調製するための方法を含む。薬物の製剤化のための技術は、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．の最新版中に見出され得る。
【００７０】
本発明の文脈での使用のために適切な医薬組成物には、意図した目的を達成するために有効な量で活性成分が含有される組成物が含まれる。
【００７１】
治療有効量または診断有効量の決定は、特に、本明細書に提供される詳細な開示に照らして、当業者の能力の十分に範囲内である。
【００７２】
投薬量および投薬間隔は、特定の脳の疾患、障害または状態を処置または診断するのに十分なファージディスプレイビヒクルの脳レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）を提供するために個々に調整され得る。ＭＥＣは、各調製物について変動するが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータから推定され得る。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は、個々の特徴に依存する。
【００７３】
投薬間隔は、ＭＥＣ値を使用しても決定され得る。調製物は、１０〜９０％の時間、好ましくは３０〜９０％の間、最も好ましくは５０〜９０％にわたって、ＭＥＣを上回って脳レベルを維持するレジメンを使用して投与すべきである。
【００７４】
処置される状態の重症度および応答性に依存して、投薬は、数日間から数週間持続する処置の過程での、または治癒がもたらされるまで、もしくは疾患状態の減退が達成されるまでの、単一または複数の投与のものであり得る。
【００７５】
投与される組成物の量は、当然、処置または診断されている被験体、苦痛の重症度、処方医師の判断などに依存する。ある特定の実施形態では、投与されるポリペプチドの量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ被験体体重；０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ；１〜３０ｍｇ／ｋｇ；１〜１０ｍｇ／ｋｇ；３〜３０ｍｇ／ｋｇ；１〜３ｍｋｇ／ｋｇ；３〜１０ｍｇ／ｋｇ；および１０〜３０ｍｇ／ｋｇから選択される。一部の実施形態では、ペプチドは、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、または１ヵ月に１回、被験体に投与される。
【００７６】
本発明の組成物は、所望の場合、活性成分を含有する１種または複数の単位剤形を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス、例えば、ＦＤＡ承認されたキット中で提示され得る。パックは、例えば、金属またはプラスチックホイル、例えば、ブリスターパックを含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための指示が添付され得る。パックまたはディスペンサーには、医薬品の製造、使用または販売に関する行政機関によって規定された形態の、容器と関連する通知書もまた提供され得、この通知書は、組成物の形態またはヒトもしくは獣医学投与の、機関による承認を反映する。かかる通知書は、例えば、処方薬についての米国食品医薬品局によって承認されたラベリングのもの、または承認された製品添付文書のものであり得る。適合性の医薬品担体中に製剤化された本発明の調製物を含む組成物もまた、上にさらに詳述したように、調製され得、適切な容器中に配置され得、適用される状態の処置についてラベルされ得る。
【００７７】
上述および以下の両方の説明は、例示的および説明的にすぎず、特許請求された本発明を限定しないことを理解すべきである。
【００７８】
治療的使用
本発明の別の一態様は、ｆＡβ４２、ｆαｓｙｎまたはｆｔａｕのいずれかが関与する疾患が含まれるがこれに限定されないタンパク質ミスフォールディング疾患の処置における、本発明のポリペプチド、核酸分子または組成物のいずれかの使用に関する。
【００７９】
処置に関して、用語「患者」、「被験体」および「レシピエント」は、互換的に使用され、ヒトおよび他の哺乳動物を含む。一部の実施形態では、患者は、タンパク質ミスフォールディング疾患と関連するバイオマーカーについて陽性のヒトである。一実施形態では、患者は、フロルベタピルを用いたＰＥＴ画像化によって検出されるような、β−アミロイド沈着を示す。
【００８０】
用語「処置する」およびその同語源語は、疾患の１つまたは複数の臨床症状を示す患者において、疾患の進行を低減、減速または逆転させることを意味するように意図される。「処置する」はまた、疾患の１つまたは複数の臨床症状を示す患者において、疾患の症状を低減、減速または逆転させることを意味するように意図される。一実施形態では、患者は、フロルベタピルを用いたＰＥＴ画像化によって検出されるような、β−アミロイド沈着を示し、β−アミロイド沈着の数は、処置によって低減される。一実施形態では、患者は、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド組成物によって検出されるような、β−アミロイド沈着を示し、β−アミロイド沈着の数は、処置によって低減または維持される。別の実施形態では、患者は、ＰＥＴ画像化によって検出されるような、任意の型のアミロイド沈着を示し、患者の認知機能は、処置によって改善される。認知機能における改善は、ＭｃＫｈａｎｎら、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ＆  Ｄｅｍｅｎｔｉａ  ７巻（３号）：２６３〜９頁（２０１１年）の方法および試験によってアッセイされ得る。
【００８１】
「予防」は、処置とは異なり、任意の臨床症状の発生の前の個体への組成物の投与を指す。本発明のポリペプチドまたはその組成物のいずれかを使用する予防が包含される。予防は、１つまたは複数の遺伝子マーカーのみに基づいて、ある疾患についての増加したリスクがあることが既知の個体、または疾患を確実に発症する個体に関与し得る。多くの遺伝子マーカーが、種々のタンパク質ミスフォールディング疾患について同定されている。例えば、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）中にＳｗｅｄｉｓｈ変異、Ｉｎｄｉａｎａ変異またはＬｏｎｄｏｎ変異のうちの１つまたは複数を有する個体は、早期発症型アルツハイマー病を発症する増加したリスクがあり、したがって、予防のための候補である。同様に、ハンチンチン遺伝子中にトリヌクレオチドＣＡＧリピートを有する個体、特に、３６またはそれ超のリピートを有する個体は、ハンチントン病を最終的に発症し、したがって、予防のための候補である。
【００８２】
用語「タンパク質ミスフォールディング」とは、例えば、β−アミロイド、血清アミロイドＡ、シスタチンＣ、ＩｇＧカッパ軽鎖またはプリオンタンパク質であるがこれらに限定されない凝集性タンパク質（アミロイド形成性ペプチド）によるアミロイドタンパク質の形成を特徴とする疾患を指す。ミスフォールドしたおよび／または凝集したアミロイドタンパク質と関連することが公知の疾患には、早期発症型アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病および発症前アルツハイマー病が含まれるアルツハイマー病、パーキンソン病、ＳＡＡアミロイドーシス、シスタチンＣ、遺伝性アイスランド型症候群（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  Ｉｃｅｌａｎｄｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、老化、多発性骨髄腫、クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、スクレイピーおよびウシ海綿状脳症（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）（ＢＳＥ）が含まれるがこれらに限定されないプリオン病；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ１）、（ＳＣＡ３）、（ＳＣＡ６）、（ＳＣＡ７）、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｅｎｔａｔｏｒｕｂｒａｌ−ｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ  ａｔｒｏｐｈｙ）、球脊髄性筋萎縮症、遺伝性脳アミロイド血管症、家族性アミロイドーシス、前頭側頭葉認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｌｏｂｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、イギリス型／デンマーク型認知症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）ならびに家族性脳症が含まれる。本発明のポリペプチドおよび組成物は、「タンパク質ミスフォールディング」疾患を処置するために使用され得る。
【００８３】
ミスフォールドしたおよび／または凝集したアミロイドタンパク質疾患の多くは、中枢神経系（ＣＮＳ）において生じる。ＣＮＳにおいて生じる疾患の一部の例は、パーキンソン病；アルツハイマー病；以下の臨床症候群：行動異常型（ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｖａｒｉａｎｔ）ＦＴＤ（ｂｖＦＴＤ）、進行性非流暢性失語（ＰＮＦＡ）および意味性認知症（ＳＤ）を有する患者を含めた前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）；前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）；ならびにハンチントン病である。本発明のポリペプチドおよび組成物は、中枢神経系（ＣＮＳ）において生じるミスフォールドしたおよび／または凝集したアミロイドタンパク質を特徴とする疾患を処置するために使用され得る。
【００８４】
タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集は、ＣＮＳの外側でも生じ得る。アミロイドーシスＡ（ＡＡ）（これについて、前駆体タンパク質は、血清急性期アポリポタンパク質、ＳＡＡである）および多発性骨髄腫（前駆体タンパク質免疫グロブリン軽鎖および／または重鎖）は、ＣＮＳの外側で生じる２つの広く知られたタンパク質ミスフォールディングおよび／または凝集したタンパク質疾患である。他の例には、α２−ミクログロブリン、トランスサイレチン（家族性アミロイドポリニューロパチー［ＦＡＰ］、家族性アミロイド心筋症（Ｆａｍｉｌｉａｌ  Ａｍｙｌｏｉｄｏｔｉｃ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）［ＦＡＣ］および老人性全身性アミロイドーシス［ＳＳＡ］）、（アポ）血清ＡＡ、アポリポタンパク質ＡＩ、ＡＩＩおよびＡＩＶ、ゲルゾリン（フィンランド型の家族性アミロイドポリニューロパチー）、リゾチーム、フィブリノーゲン、シスタチンＣ（脳アミロイド血管症、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、アイスランド型）、（プロ）カルシトニン、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰアミロイドーシス）、心房性ナトリウム利尿因子、プロラクチン、インスリン、ラクトアドヘリン（ｌａｃｔａｈｅｄｒｉｎ）、ケラト−エピテリン、ラクトフェリン、歯原性エナメル芽細胞（ｏｄｏｎｔｏｇｅｎｉｃ  ａｍｅｌｏｂｌａｓｔ）関連タンパク質、およびセメノゲリン（ｓｅｍｅｎｏｇｅｌｉｎ）Ｉによって形成されるアミロイドが関与する疾患が含まれる。本発明のポリペプチドおよび組成物は、ＣＮＳの外側で生じるタンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集が関与する疾患を処置するために使用され得る。
【００８５】
神経変性疾患には、タウ病変もまた関与し得る。Ｌｅｅら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２４巻：１１２１〜１５９頁（２００１年）で概説される。タウタンパク質は、中枢神経系および末梢神経系の両方のニューロンの軸索において発現される微小管関連タンパク質である。神経変性タウオパチー（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｔａｕｏｐａｔｈｙ）（タウオパチーと呼ばれる場合もある）が包含される。タウオパチーの例には、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合（ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ−ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、嗜銀顆粒性認知症、皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ボクシング認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｐｕｇｉｌｉｓｔｉｃａ）、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ダウン症候群、第１７染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症が含まれる前頭側頭型認知症、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、ハラーホルデン・シュパッツ病、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン・ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患（ｎｏｎ−Ｇｕａｍａｎｉａｎ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅｓ）、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎および神経原線維変化型認知症（ｔａｎｇｌｅ  ｏｎｌｙ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）が含まれる。これらの疾患の一部は、原線維アミロイドβペプチドの沈着もまた含み得る。例えば、アルツハイマー病は、アミロイドβ沈着およびタウ病変の両方を示す。同様に、プリオン媒介性疾患、例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症およびゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群もまた、タウ病変を有し得る。したがって、疾患が「タウオパチー」であるという表示は、簡便さのためにのみ提供される他の神経変性疾患の分類またはグループ分けから疾患を除外するものと解釈すべきではない。本発明のポリペプチドおよび組成物は、神経変性疾患およびタウ病変が関与する疾患を処置するために使用され得る。
【００８６】
一実施形態では、医薬組成物または製剤は、有効量の本明細書に記載される医薬組成物または製剤を患者に投与するステップを含む、アミロイドの存在に関連する症状を示す患者、またはタンパク質ミスフォールディング疾患と関連するバイオマーカー、例えばフロルベタピル（ＡＶ−４５、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）について陽性である患者において、アミロイドを低減させる方法における使用のためのものである。一実施形態では、投与経路は、くも膜下腔内注射もしくは注入、直接的脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入から選択される。
【００８７】
一実施形態では、医薬組成物または製剤は、有効量の本明細書に記載される医薬組成物または製剤を患者に投与するステップを含む、アミロイドの存在に関連する症状を示す患者、またはタンパク質ミスフォールディング疾患と関連するバイオマーカー、例えばフロルベタピル（ＡＶ−４５、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）について陽性である患者において、アミロイドのレベルを維持する方法における使用のためのものである。一実施形態では、投与経路は、くも膜下腔内注射もしくは注入、直接的脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入から選択される。
【００８８】
一実施形態では、医薬組成物または製剤は、有効量の本明細書に記載される医薬組成物または製剤を、アミロイドを有する患者に投与するステップを含む、患者においてアミロイドを脱凝集させる方法における使用のためのものである。一実施形態では、その投与経路は、くも膜下腔内注射もしくは注入、直接的脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入から選択される。
【００８９】
一実施形態では、本発明の医薬組成物または製剤は、有効量の本明細書に記載される医薬組成物を、それを必要とする患者の脳中に直接注射し、それによって、脳においてβ−アミロイド沈着の低減を引き起こすステップを含む、脳においてβ−アミロイド沈着の脱凝集を引き起こす方法における使用のためのものである。代替的な一実施形態では、本発明の医薬組成物または製剤は、有効量の本明細書に記載される医薬組成物を、それを必要とする患者中へ静脈内送達で注射し、それによって、脳においてβ−アミロイド沈着の低減を引き起こすステップを含む、脳においてβ−アミロイド沈着の脱凝集を引き起こす方法における使用のためのものである。
【００９０】
一実施形態では、医薬組成物または製剤は、脳においてアミロイド形成を低減させる方法における使用のためのものである。脳においてアミロイド形成を低減させることは、タンパク質−ミスフォールディング疾患または神経変性疾患を予防し、処置し、またはそれらの症状もしくは重症度を低減させ得る。一実施形態では、その投与経路は、くも膜下腔内注射もしくは注入、直接的脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入から選択される。
【００９１】
一実施形態では、本発明の医薬組成物または製剤は、脳においてアミロイドクリアランスを促進するための方法における使用のためのものである。アミロイドクリアランスを促進することは、タンパク質−ミスフォールディング疾患または神経変性疾患を予防し、処置し、またはそれらの症状もしくは重症度を低減させ得る。一実施形態では、その投与経路は、くも膜下腔内注射もしくは注入、直接的脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入から選択される。
【００９２】
一実施形態では、本発明の医薬組成物または製剤は、脳においてアミロイド凝集を阻害するための方法における使用のためのものである。脳においてアミロイド凝集を阻害することは、タンパク質−ミスフォールディング疾患または神経変性疾患を予防し、処置し、またはそれらの症状もしくは重症度を低減させ得る。一実施形態では、その投与経路は、くも膜下腔内注射もしくは注入、直接的脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入から選択される。
【００９３】
一実施形態では、本発明の医薬組成物または製剤は、脳において毒性アミロイドオリゴマーを取り除くための方法における使用のためのものである。脳において毒性アミロイドオリゴマーを取り除くことは、タンパク質−ミスフォールディング疾患または神経変性疾患を予防し、処置し、またはそれらの症状もしくは重症度を低減させ得る。一実施形態では、その投与経路は、くも膜下腔内注射もしくは注入、直接的脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入から選択される。
【００９４】
一実施形態では、本発明の医薬組成物または製剤は、脳において毒性アミロイドオリゴマーの形成を予防するための方法における使用のためのものである。脳において毒性オリゴマーの形成を予防することは、タンパク質−ミスフォールディング疾患または神経変性疾患を予防し、処置し、またはそれらの症状もしくは重症度を低減させ得る。一実施形態では、その投与経路は、くも膜下腔内注射もしくは注入、直接的脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入から選択される。
【００９５】
一実施形態では、本発明の医薬組成物または製剤は、アミロイド損傷からニューロンを保護するための方法における使用のためのものである。アミロイド損傷からニューロンを保護することは、タンパク質−ミスフォールディング疾患または神経変性疾患を予防し、処置し、またはそれらの症状もしくは重症度を低減させ得る。一実施形態では、その投与経路は、くも膜下腔内注射もしくは注入、直接的脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入から選択される。一実施形態では、アミロイド損傷からニューロンを保護することにおける使用のための本発明の医薬組成物または製剤は、予防的に与えられる。
【００９６】
一部の実施形態では、患者は、タンパク質ミスフォールディング疾患および／または凝集疾患と関連するバイオマーカーについて陽性である。一実施形態では、バイオマーカーは、フロルベタピル（ＡＶ４５、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）である。
【００９７】
一部の実施形態では、患者は、アミロイドの存在と関連する神経変性疾患の症状を示している。種々の実施形態では、アミロイドは、ｆＡβ４２、ｆαｓｙｎまたはｆｔａｕのいずれかである。
【００９８】
ある特定の実施形態では、神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病またはハンチントン病である。一実施形態では、神経変性疾患はアルツハイマー病である。一実施形態では、神経変性疾患はアルツハイマー病であり、患者は、画像化剤フロルベタピル（ＡＶ−４５、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）によって検出されるような、β−アミロイドを示す。
【００９９】
一部の実施形態では、患者は、プリオン媒介性疾患の症状を示している。
【０１００】
ある特定の実施形態では、プリオン媒介性疾患は、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー、致死性家族性不眠症またはゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群から選択される。
【０１０１】
一部の実施形態では、患者は、アルツハイマー病以外の神経変性タウオパチーの症状を示している。ある特定の実施形態では、処置される疾患は、嗜銀顆粒性認知症、皮質基底核変性症、ボクシング認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、第１７染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症を含む前頭側頭型認知症、ハラーホルデン・シュパッツ病、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン・ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎および神経原線維変化型認知症から選択される。
【０１０２】
別の実施形態では、上記疾患状態のいずれかは、例えば、吸入および静脈内注入などの任意の適切な経路による、患者への直接的な、本発明の核酸分子（即ち、低減された免疫原性を示し、アミロイドに結合する能力、アミロイドプラークを脱凝集させる能力および／またはアミロイドの凝集を防止する能力を保有するバリアントｇ３ｐをコードするもの）単独の、または例えば、脂質ナノ粒子、ポリマー性担体、もしくはベクター、例えばウイルスベクターなどの適切な担体と関連した投与によって処置され得る。この処置に適切な本発明のバリアントｇ３ｐをコードする核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
診断薬
【０１０３】
本発明の別の態様では、本明細書に記載されるポリペプチドおよび組成物は、本明細書に記載される種々の疾患と関連する診断適用において使用される。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで画像化剤として使用される場合、本発明の組成物の結合は、記載されたタンパク質ミスフォールディング疾患のうちの１つの診断の一部であり得る。診断剤として使用される場合、本発明のポリペプチドは、検出可能な標識をさらに含み得るか、またはｉｎ  ｖｉｖｏで他の方法で検出され得る。種々の標識が、タンパク質を標識するための標準的な技術を使用して、診断組成物のアミロイド結合性構成成分に結合され得る。標識の例には、蛍光標識および放射性標識が含まれる。広範な種々の使用され得る放射性標識が存在するが、一般に、標識は、１８Ｆ、１１Ｃおよび１２３Ｉが含まれるがこれらに限定されない放射性標識からしばしば選択される。これらおよび他の放射性同位体は、周知の化学を使用してタンパク質に結合され得る。一実施形態では、標識は、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）を使用して検出される。しかし、放射性同位体の検出のための任意の他の適切な技術もまた、放射性トレーサーを検出するために使用され得る。
【０１０４】
本発明のポリペプチドおよび組成物は、β−アミロイドに特異的な画像化剤、例えば、Ｆ１８−ＡＶ−４５、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙなどと組み合わせて、診断的画像化剤として使用され得る。非β−アミロイド凝集体に対する既知の画像化剤は現在存在しないので、β−アミロイド特異的画像化剤と合わせた本発明の診断組成物の使用は、示差的検出に基づいた非β−アミロイド凝集体の検出を生じる。したがって、一実施形態では、本発明の診断組成物は、非β−アミロイド凝集体を検出するために、β−アミロイド画像化剤と組み合わせて、画像化剤として使用される。
【０１０５】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドまたは組成物は、脳を含むＣＮＳにおいてβ−アミロイドを検出するための診断的画像化剤として使用される。
【０１０６】
本発明の診断組成物は、治療組成物について記載された経路と同じ経路を使用して投与され得る。一実施形態では、投与経路は、くも膜下腔内注射もしくは注入、直接的脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入から選択される。
【実施例】
【０１０７】
（実施例１：ｇ３ｐ中のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープのマッピング）
配列番号１のアミノ酸１〜２４０の配列にわたる８７個の重複するペプチド（１２アミノ酸の重複を伴う１５アミノ酸長）を合成し、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞からの応答について、Ｔ細胞エピトープマッピングアッセイで試験した。個々のペプチドを、６連ＰＢＭＣ培養物中で試験し、Ｔ細胞応答を、エピトープの位置およびそれらの相対的効力を同定するために評価した。
【０１０８】
ＰＢＭＣ（末梢血単核球）を、ＵＫ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から取得された健康な地域社会ドナーのバフィーコート（２４時間以内に採血した血液由来）から、Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｌｏｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって与えられた認可に従って、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−ｓｈｉｅｌｄ、Ｄｕｎｄｅｅ、ＵＫ）密度遠心分離によって単離した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ８＋ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）を使用して枯渇させた。ドナーを、ＨＬＡ  ＳＳＰ−ＰＣＲベース組織タイピングキット（Ｂｉｏｔｅｓｔ、Ｓｏｌｉｈｕｌｌ、ＵＫ）を使用してＨＬＡ−ＤＲハプロタイプを同定することによって特徴付けた。対照ネオ抗原タンパク質（ＫＬＨタンパク質（Ｐｉｅｒｃｅ（Ｐｅｒｂｉｏ）、Ｃｒａｍｌｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）ならびにＩＦＶおよびＥＢＶに由来するペプチド）に対するＴ細胞応答もまた決定した。次いで、ＰＢＭＣを凍結し、必要になるまで液体窒素中で貯蔵した。
【０１０９】
５５人のドナーのコホートを、世界人口において発現されるＨＬＡ−ＤＲアロタイプの数および頻度を最良に示すように、アッセイのために選択した。世界人口において発現されるアロタイプに対する、コホートにおいて発現されるアロタイプの分析により、＞８０％のカバー度（ｃｏｖｅｒａｇｅ）が達成されたこと、および全ての主要なＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子（世界人口において発現される頻度＞５％を有する個々のアロタイプ）が十分に代表されたことが明らかになった。個々のドナーハプロタイプの詳細ならびに世界人口および試料集団において発現されるＭＨＣクラスＩＩハプロタイプの頻度の比較は、それぞれ、表８および図３に示される。
【表８−１】
2020073610.tif 000014
【表８−２】
2020073610.tif 000015
【０１１０】
各ドナー由来のＰＢＭＣを解凍し、計数し、生存度を評価した。細胞を、室温ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）中で生き返らせ、その後、細胞密度を２〜３×１０６のＰＢＭＣ／ｍｌ（増殖細胞ストック）に調整した。遊離Ｎ末端アミンおよびＣ末端カルボン酸を有する１５アミノ酸長ペプチドを、１〜３ｍｇスケールで合成した。ペプチドを、１０ｍＭの濃度になるようにＤＭＳＯ中に溶解させ、ペプチド培養物ストックを、ウェル中で５μＭの最終濃度になるようにＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培養培地中に希釈することによって調製した。各ペプチドおよび各ドナーについて、６連培養物を、平底９６ウェルプレートにおいて確立した。陽性対照培養物および陰性対照培養物の両方もまた、６連で試験した。各ドナーについて、３つの対照（ＫＬＨタンパク質ならびにＩＦＶおよびＥＢＶに由来するペプチド）もまた含めた。陽性対照として、ＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）を、２．５μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。
【０１１１】
培養物を、合計６日間にわたってインキュベートし、その後、各ウェルに０．７５μＣｉ３［Ｈ］−チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標）、Ｂｅａｃｏｎｓｆｉｅｌｄ、ＵＫ）を添加した。培養物を、さらに１８時間インキュベートし、その後、ＴｏｍＴｅｃ  Ｍａｃｈ  ＩＩＩ細胞ハーベスターを使用して、フィルターマット上に回収した。各ウェルについてのｃｐｍを、ｐａｒａｌｕｘ低バックグラウンドカウントモードで、マイクロプレートベータカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標）、Ｂｅａｃｏｎｓｆｉｅｌｄ、ＵＫ）でのＭｅｌｔｉｌｅｘ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標）、Ｂｅａｃｏｎｓｆｉｅｌｄ、ＵＫ）シンチレーションカウントによって決定した。
【０１１２】
データの分析のために、ＳＩ≧２．００と等しいまたはそれよりも大きい刺激指数（ＳＩ）の閾値を使用した（境界ＳＩ≧１．９０〜１．９９の応答を考慮して）。陽性応答を、以下の統計的閾値および実験的閾値によって規定した：
１．独立２試料スチューデントｔ検定を使用して試験ウェルのｃｐｍを培地対照ウェルに対して比較することによる、応答の有意性（ｐ＜０．０５）；
２．２．００よりも大きい刺激指数（ＳＩ≧２．００）、ここで、ＳＩ＝試験ウェルの平均ｃｐｍ／平均ｃｐｍ培地対照ウェルである。この方法で提示されるデータは、ＳＩ≧２．００、ｐ＜０．０５として示される。
【０１１３】
さらに、アッセイ内変動を、複製培養物からの生データのＣＶおよびＳＤを計算することによって評価した。増殖アッセイを、６連培養物において設定した（「非調整データ」）。アッセイ内変動性が低いことを確実にするために、データを、最大ｃｐｍ値および最小ｃｐｍ値を除去した後にも分析し（「調整済データ」）、ドナー応答のＳＩを、両方のデータセットを使用して比較した。Ｔ細胞エピトープを、この研究中の全てのペプチドに対する陽性応答の平均頻度（上で規定した）プラスＳＤを計算して、バックグラウンド応答速度を得ることによって、同定した。調整済データおよび非調整データの両方においてバックグラウンド応答速度を上回る増殖応答を誘導した任意のペプチドを、Ｔ細胞エピトープを含有するとみなした。２つの重複するペプチドが増殖応答速度を誘導した場合、Ｔ細胞エピトープがその重複領域中にあるとみなした。これに基づいて、以下のＴ細胞エピトープが、試験したポリペプチドにおいて同定された：
エピトープ１：ＣＴＧＤＥＴＱＣＹＧＴＷ（配列番号１のアミノ酸４６〜５７）
エピトープ２：ＴＦＭＦＱＮＮＲＦＲＮＲ（配列番号１のアミノ酸１３３〜１４４）
エピトープ３：ＳＳＫＡＭＹＤＡＹＷＮＧ（配列番号１の１７２〜１８３のアミノ酸）
エピトープ４：ＰＶＮＡＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１のアミノ酸２１４〜２２５）
エピトープ５：ＳＧＳＧＡＭＶＲＳＤＫＴＨＴＣ（配列番号１のアミノ酸２５３〜２６７）
【０１１４】
（実施例２：ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析による、Ｔ細胞エピトープ４および５中の置換の設計）
Ｔ細胞アッセイにおいて陽性であったペプチドの配列を、ｉＴｏｐｅ（商標）およびＴＣＥＤ（商標）ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏテクノロジーを使用して、エピトープ領域由来の重複する９マーを使用して分析した［Ｐｅｒｒｙら、Ｄｒｕｇｓ  Ｒ  Ｄ  ９巻（６号）：３８５〜９６頁（２００８年）］。各９マーを、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（合計で３４）のデータベースに対して試験し、ＭＨＣクラスＩＩ分子とのフィットおよび相互作用に基づいてスコア付けした。さらに、各９マーを、この９マーの配列と、以前のＴ細胞アッセイにおいてＴ細胞応答を刺激した無関係のタンパク質由来のデータベースペプチドの配列との間のあらゆる高い配列相同性を同定するために、公知のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープのデータベースに対してＢＬＡＳＴ検索した。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析からの情報に基づいて、同定されたエピトープからのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ活性の潜在的除去のための置換を同定した。
【０１１５】
エピトープ５は、ネイティブＮ２−ＣＴ  Ｇｌｙ−リッチリンカーのＣ末端、配列番号１のＮ１−Ｎ２−ヒトＩｇ  Ｆｃ融合タンパク質を産生するために使用したｐＦＵＳＥベクターのマルチクローニング部位（「ＭＣＳ」）によってコードされるアミノ酸、およびヒトＩｇ  Ｆｃ領域のＮ末端にわたる。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析により、配列番号１のＭ２５８およびＶ２５９が、Ｐ１アンカーとしてＴ細胞活性を担うことが暗示された。Ｎ１−Ｎ２コード領域の外側のそれらの位置に基づいて、これら２つのアミノ酸の除去は、機能喪失を引き起こさないと予測された。これら２つのアミノ酸は、ＭＣＳによってコードされた。したがって、ＭＣＳを改変し、配列番号１のＭ２５８およびＶ２５９をコードするヌクレオチドを排除した二本鎖ＤＮＡ分子を、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用する部位特異的変異誘発によって産生した。この後、得られた変異誘発されたＤＮＡ配列を、ＭＣＳ中のＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩ制限部位を使用して、ｐＦＵＳＥベクター中に再クローニングして戻した。得られた成熟（シグナル配列を欠く）融合タンパク質は、Ｍ２５８およびＶ２５９を除外した。この融合タンパク質は、以下に記載したアッセイにおいて、配列番号１の融合タンパク質と同じ、Ａベータに結合する能力を保持した。
【０１１６】
エピトープ４は、Ｎ２ドメインおよびネイティブＧｌｙ−リッチリンカーと重複する。ｇ３ｐタンパク質の結晶構造（示さず）は、エピトープ４が、アミロイド結合領域から離れて位置し、したがって、活性に影響を与えることなしにアミノ酸置換に対して許容性であることを示唆した。Ｐ１アンカーとして同定されたＶ２１５（配列番号１）は、タンパク質コアに向かう側鎖のわずかな配向で表面曝露される。構造分析から、表６および７に示されるＶ２１５についての置換のいずれかは、エピトープを除去するはずである。さらに、表６および７に示される、このエピトープ内の他のアミノ酸の置換のいずれかもまた考慮に入れるべきである。Ｖ２１５Ａ置換を含み、Ｍ２５８およびＶ２５９を除外するＮ１−Ｎ２−Ｉｇ  Ｆｃをコードする核酸配列（配列番号４）を、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用する部位特異的変異誘発によって、上記ヌクレオチド配列から誘導した。得られた成熟融合タンパク質（配列番号２）は、配列番号１または上記Ｍ２５８およびＶ２３９を欠く成熟融合タンパク質のいずれかのアミノ酸配列を有する融合タンパク質と比較して、結合アッセイにおいて、Ａベータへの増加した結合を実証した。配列番号４の核酸配列を親配列として使用して、エピトープ１、２および３中の全ての改変を取り込む遺伝子を創出した。
【０１１７】
（実施例３：ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析による、Ｔ細胞エピトープ１、２および３中の置換の設計）
エピトープ１は、Ｎ１−Ｎ２の推定Ａベータ結合部分に対してすぐＣ末端側に存在する。エピトープ１のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析は、Ｔ細胞エピトープのアミノ酸置換および除去のためのエリアとして、配列番号１のアミノ酸４８〜５６を強調した。この９マー内のアミノ酸を、既存のアミノ酸の性質、表面曝露、およびｇ３ｐのＸ線結晶構造から解釈されるようなｇ３ｐのアミロイド結合領域との相互作用に基づいて、置換のために標的化した。特に、Ｇ４８、Ｔ５１、Ｙ５４およびＴ５６を、表１に示される変化による置換のために標的化した。この領域中の他の潜在的アミノ酸置換は、表２に示される。
【０１１８】
エピトープ２のｉＴｏｐｅ（商標）分析は、そのエピトープを低減するまたは排除するための標的として、配列番号１のアミノ酸１３５〜１４３を指し示した。Ｘ線結晶構造に基づくと、配列番号１のアミノ酸１３６〜１３９は、Ｎ１−Ｎ２のヒンジ領域との結合を形成するループ領域を形成し、したがって、アミロイド結合活性にとって重要であり得る。これらのアミノ酸への変化は、あまり好ましくなく、表２に示されるのみである。より好ましい変化は、Ｍ１３５、Ｒ１４０、Ｆ１４１およびＮ１４３への変化であり、表１に示される。この９個のアミノ酸領域への他の潜在的な変化は、表２に示される。
【０１１９】
配列番号１のアミノ酸１７３〜１８２が、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析によって、置換のための標的としてエピトープ３内で同定された。エピトープ３は、Ｎ２ドメインのアルファらせん部分中に位置し、したがって、この戦略は、疎水性残基および小さい極性非荷電残基の導入を回避するためであった。さらに、本発明者らは、このエピトープのＣ末端に対して極性残基酸性残基を導入することの回避を望んだ。Ｘ線結晶学的データに基づいて、本発明者らは、表１に示される変化による置換のために、Ｓ１７３、Ｄ１７４、Ｍ１７６、Ｄ１７８およびＷ１８２を標的化した。この領域中の他の潜在的アミノ酸置換は、表２に示される。
【０１２０】
（実施例４：低減されたＴ細胞エピトープを有するＮ１−Ｎ２−ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドの生成）
表３に示される異なる単一アミノ酸置換を含有するＮ１−Ｎ２−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質を各々がコードする５８の異なる核酸分子を調製した。これを、所望の置換を導入するための適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用した配列番号４の部位特異的変異誘発と、その後の、ｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ２ベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（登録商標）、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ、カタログ番号ｐｆｕｓｅ−ｈｇ１ｆｃ２）中へのＰＣＲ増幅した変異誘発配列の再クローニングとによって達成した。
【０１２１】
これらの「脱免疫化」Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする遺伝子を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ、カタログ番号Ｒ７９０−０７）において個々のｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ２ベクター中で一過的に発現させた。トランスフェクションの当日に、細胞を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２３３８）中で１×１０６／ｍＬになるように希釈して、＞９０％の生存度を確実にした。プラスミドＤＮＡおよびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、Ｏｐｔｉｍｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３１９８５）中に別々に希釈し、５分間インキュベートし、その後、ＰＥＩをＤＮＡに緩徐に添加し、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を室温で５分間インキュベートした。インキュベーション後、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を、フラスコを旋回させながら、２９３−Ｆ細胞に滴下して添加した。トランスフェクトされた培養物を、１３５ｒｐｍで回転するオービタルシェーカープラットフォーム上で３７℃、８％ＣＯ２で６〜７日間インキュベートし、その後、それらを回収した。
【０１２２】
ポリペプチドを含有する培養培地を、遠心分離によって回収し、１０×ＰＢＳを使用してｐＨを調整した。タンパク質を、４℃で一晩回転させることによって、プロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）に結合させた。ビーズを１×ＰＢＳで２回洗浄し、ＳｉｇｍａＰｒｅｐスピンカラム（Ｓｉｇｍａ）に移した。試料を、０．１ＭグリシンｐＨ３．０を使用して遠心分離によって溶出させ、１／１０容積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０を使用して収集チューブ中で中和した。溶出物を、２ｍｌ  ＺｅｂａＳｐｉｎカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃｒａｍｌｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ、カタログ番号８９８９０）を使用して、１×ＰＢＳへと緩衝液交換した。試料をフィルター滅菌し、２８０ｎｍでの吸光度を各試料について測定した。
【０１２３】
（実施例５：脱免疫化ポリペプチドのＡベータ結合分析）
Ａ．Ａベータ（Ａβ）線維調製。Ａβ４２（１ｍｇ、ｒＰｅｐｔｉｄｅ  Ａ−１００２−２）を、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ、１ｍＬ）中に溶解させ、徹底的にボルテックスし、透明な溶液が現れるまで２〜１８時間室温でインキュベートした。アリコート（１００μｌ、１００μｇ）を、１．５ｍＬ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中に配置し、減圧下で２〜３時間乾燥させた（ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  ５３０１）。得られたモノマーを、２０μＬのＤＭＳＯ中に再懸濁し、ピペッティングし、完全に溶解するまで徹底的にボルテックスした。この溶液を、２６０μＬの１０ｍＭ  ＨＣｌ溶液で希釈し（最終Ａβ４２濃度は８０μＭである）、２０秒間ボルテックスした。透明な溶液を３７℃で３日間インキュベートして（振盪なし）凝集させる。
【０１２４】
このアッセイでの使用のために、得られたストック溶液からのＡβ４２線維を、ＰＢＳ中１．６μＭの最終濃度になるように５０倍希釈した。
【０１２５】
Ｂ．ＥＬＩＳＡプレート調製。９６ウェルプレート（Ｆ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ；カタログ番号：４４２４０４、ロット１２５４３６および１２８１５８；Ｄｅｎｍａｒｋ）の各ウェルに、２００μＬの１％ＢＳＡ溶液を添加した。これらのプレートを密封し、７℃で３時間インキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳ（２５０μＬ／ウェル）で３回洗浄した。本発明者らは、希釈されたＡβ４２線維溶液（１．６μＭ）５０μＬを各ウェルに添加し、完全に乾燥するまで３７℃で一晩カバーなしでインキュベートした。ＰＢＳ（５０μｌ／ウェル）を対照ウェル（Ａβ４２線維なし）に添加する。次いで、プレートを、水で２回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄した（各洗浄について２５０μＬ／ウェル）。
【０１２６】
Ｃ．ＥＬＩＳＡアッセイ。５０μＬ中の変動する濃度の各ポリペプチド（および配列番号２のポリペプチド）を各ウェルおよび非Ａβ４２線維コートウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄した（各洗浄について２５０μＬ／ウェル）。次いで、本発明者らは、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ミルク（Ｄｉｆｃｏ（商標）スキムミルク、Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ．ＵＳＡ、カタログ番号：２３２１００、ロット番号：７３２０４４８）中に１：２５００（０．３２μｇ／ｍＬ最終）希釈したＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒト抗Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、カタログ番号１０９−０３５−００８、ロット番号：１０６６１７）５０μｌを各ウェルに添加し、３７℃で４０分間インキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳ−Ｔで６回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄した（各洗浄について２５０μＬ／ウェル）。次いで、本発明者らは、５０μｌ／ウェルのＯＰＤ溶液（１５ｍｇ／７．５ｍｌの０．０５Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ５．５／３μｌのＨ２Ｏ２）を添加し、３〜６分間発色させた。次に、本発明者らは、２５μｌ／ウェルの４Ｎ  ＨＣｌ溶液を添加して、反応を停止させた。プレートを、４９２ｎｍおよび４０５ｎｍでの吸光度について読み取った。４０５ｎｍでの吸光度を、４９２ｎｍでの吸光度から減算し、結果を、ポリペプチド濃度の関数としてプロットした。次いで、各脱免疫化ポリペプチドへの結合についてのＩＣ５０を計算し、配列番号２のポリペプチドについて計算したＩＣ５０と比較した。結果は以下の表９に示される。
【表９】
2020073610.tif 000016
【０１２７】
（実施例６：全タンパク質ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の分析）
配列番号１と比較して、本発明のポリペプチドのいずれかからのＣＤ４＋Ｔ細胞応答を分析するために、全タンパク質Ｔ細胞アッセイを実施した。ＰＢＭＣを、実施例１と同様に調製した２０個の健康なヒトドナーバフィーコートから単離した。ＰＢＭＣを、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培養培地中で凍結から生き返らせ、ＣＤ１４＋細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣＤ１４マイクロビーズおよびＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）を使用して単離した。単球を、１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４および１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを補充したＡＩＭ−Ｖ（登録商標）（「ＤＣ培養培地」）中に４〜６×１０６のＰＢＭＣ／ｍｌになるように再懸濁し、次いで、２４ウェルプレート中に分配した（２ｍｌの最終培養容積）。２日目に、半容積のＤＣ培養培地の置き換えによって細胞に培地供給した。３日目までに、４０ｕｇ／ｍｌの試験ポリペプチドまたは４０ｕｇ／ｍｌの配列番号１のポリペプチドのいずれかを含む抗原および１００μｇ／ｍｌのＫＬＨまたは培地のみと共に事前インキュベートした単球は、半成熟樹状細胞（ＤＣ）へと分化した。半成熟ＤＣを、抗原と共に２４時間インキュベートし、その後、細胞を２回洗浄し、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）を補充したＤＣ培養培地中に再懸濁することによって、過剰な抗原を除去した。ＤＣに、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを補充した半容積のＤＣ培養培地の置き換えによって７日目に培地供給し、成熟ＤＣを８日目に回収した。回収された成熟ＤＣを計数し、生存度を、トリパンブルー色素排除を使用して評価した。次いで、ＤＣにγ照射（４０００ラド）し、ＡＩＭ−Ｖ培地中に２×１０５細胞／ｍｌに再懸濁し、使用前に、Ｔ細胞増殖アッセイおよびＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて以下のように分析した。さらに、８日目に、新鮮なＣＤ４＋Ｔ細胞もまた調製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を精製するために、ＰＢＭＣを、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培養培地中で生き返らせ、ＣＤ４＋細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣＤ４マイクロビーズおよびＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）を使用して単離し、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地中に２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。
【０１２８】
８日目に、Ｔ細胞増殖アッセイを確立し、それによって、１×１０５の自家ＣＤ４＋Ｔ細胞を、９６ウェルＵ底プレート中の１×１０４の抗原負荷したＤＣに添加し（１０：１の比率）、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地を、最終容積２００ｕｌ／ウェルになるように添加した。１４日目に、アッセイプレートに、２５ｕｌのＡＩＭ−Ｖ（登録商標）中で１ｕＣｉ［３Ｈ］（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｂｅａｃｏｎｓｆｉｅｌｄ、ＵＫ）／ウェルを６時間パルスし、その後、ＴｏｍＴｅｃ  Ｍａｃｈ  ＩＩＩ（Ｈａｍｄｅｎ  ＣＴ、ＵＳＡ）細胞ハーベスターを使用して、フィルターマット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上に回収した。全てのポリペプチドを、６連培養物において試験した。各ウェルについてのカウント毎分（ｃｐｍ）を、ｐａｒａｌｕｘ低バックグラウンドカウントで、１４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｗａｌｌａｃ  Ｔｒｉｌｕｘ液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）でのＭｅｌｔｉｌｅｘ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）シンチレーションカウントによって決定した。各抗原についてのカウント毎分を、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地のみの対照に対して正規化した。
【０１２９】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイのために、ＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｗａｔｆｏｒｄ、ＵＫ）を、ＰＢＳ中１００ｕｌ／ウェルのＩＬ−２捕捉抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ）でコーティングした。次いで、プレートを、ＰＢＳ中で２回洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ））中で一晩インキュベートし、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地中で洗浄した。８日目に、１×１０５の自家ＣＤ４＋Ｔ細胞を、９６ウェルのＥＬＩＳｐｏｔプレート中の１×１０４の抗原負荷したＤＣに添加した（１０：１の比率）。全てのポリペプチド調製物を、６連培養物において試験した。各ドナーＰＢＭＣについて、陰性対照（ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地単独）、細胞なし対照およびＰＨＡ（１０ｕｇ／ｍｌ）陽性対照もまた含めた。
【０１３０】
さらに７日間のインキュベーション期間後に、ＥＬＩＳｐｏｔプレートを、ｄＨ２ＯおよびＰＢＳ中での３回の逐次的洗浄と、その後のＰＢＳ／１％ＢＳＡ中の濾過されたビオチン化検出抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ）１００ｕｌの添加とによって、発色させた。３７℃で１．５時間のインキュベーション後、プレートを、ＰＢＳ中でさらに３回洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中の濾過されたストレプトアビジン−ＡＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）１００ｕｌを、１時間にわたって添加した（室温におけるインキュベーション）。ストレプトアビジン−ＡＰを廃棄し、プレートをＰＢＳ中で４回洗浄した。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。スポット発色を、ウェルおよびウェルの裏面をｄＨ２Ｏで３回洗浄することによって停止させた。乾燥させたプレートを、Ｉｍｍｕｎｏｓｃａｎ（商標）アナライザーでスキャンし、スポット／ウェル（ｓｐｗ）を、Ｉｍｍｕｎｏｓｃａｎ（商標）バージョン４ソフトウェアを使用して決定した。
【０１３１】
増殖アッセイおよびＩＬ−２  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの両方について、結果を、陽性Ｔ細胞応答について２と等しいまたはそれよりも大きいＳＩの閾値（ＳＩ≧２．０）を使用して、培地のみの対照に対する試験ポリペプチドについてのｃｐｍの比率（増殖アッセイ）またはスポット（ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ）として規定した刺激指数（ＳＩ）として表した。
【０１３２】
（実施例７：Ｔ細胞エピトープ１、２および３のうち２またはそれ超中の二重および三重置換の設計）
結合アッセイの結果に基づいて、配列番号２と比較して２つのアミノ酸置換を含有するポリペプチド中に存在するように、以下の置換をエピトープ１、２および３において選択した。各置換は、異なるエピトープ中にある。
【表１０】
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【０１３３】
各々異なるエピトープ中にある、表１０に示されるアミノ酸置換のうち２つを有するＮ１−Ｎ２−ヒトＩＧ  Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡを、適切な出発ＤＮＡ（典型的には、実施例３に示されるように調製した２つの置換のうち１つをコードするＤＮＡ）の部位特異的変異誘発を使用することによって調製した。これらの融合タンパク質をコードする得られたＤＮＡを使用して、細胞を形質転換し、実施例４に示されるように発現させ精製し、実施例５に示されるように結合について試験した。次いで、エピトープ１、２および３の各々中に１つの置換を有するポリペプチドを、２つのアミノ酸置換されたポリペプチドに対する結合アッセイの結果に基づいて設計した。エピトープ１、２および３の各々中に１つの置換を有するポリペプチドを、Ａベータ結合およびＴ細胞応答の両方について、実施例６に示されるようにアッセイした。特に、以下の二重および三重エピトープバリアントを、以下の表１１に示されるように、配列番号２中の特定のアミノ酸を置換することによって作製した。
【表１１】
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【０１３４】
上に示したポリペプチドを、実施例５に示されるＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ベータ−アミロイドへの結合についてアッセイした。結果は、表１２および１３に示される。相対的結合値は、ＩＣ５０（試験したポリペプチド）／ＩＣ５０（配列番号２のポリペプチド）を反映する（例えば、この値が小さくなるほど、配列番号２のポリペプチドと比較して、そのポリペプチドの結合は大きくなる）。複数の値は、結合アッセイにおける２連の試験を反映する。
【表１２】
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【０１３５】
（実施例８：酢酸セルロースフィルター遅延アッセイ）
このアッセイを使用して、非アミロイド形成的凝集体または可溶性凝集体へのアミロイド線維の不安定化（脱凝集）またはリモデリングをモニタリングした。このアッセイは、Ｃｈａｎｇ，  Ｅ．およびＫｕｒｅｔ，  Ｊ．、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３７３巻、３３０〜６頁（２００８年）ならびにＷａｎｋｅｒ，  Ｅ．  Ｅ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３０９巻、３７５〜８６頁（１９９９年）から主に適応させた。具体的には、ｆＡβアミロイド線維の２．５μＭ調製物を、異なる濃度の本発明のバリアント融合ポリペプチド（１ｎＭ〜２μＭ）と共に、３７℃で３日間事前インキュベートした。インキュベーション後、融合ポリペプチドありおよびなしの線維を希釈し、減圧ブロットで酢酸セルロースメンブレン上にスポットした。これらのメンブレンを、ＰＢＳで広範に洗浄し、ＡβのＮ末端に特異的な抗体を用いて１時間プローブした。ＨＲＰコンジュゲート化二次Ａｂを使用して、メンブレン上に保持された原線維凝集体を定量した。スポットの色を分析し、濃度測定スキャナーを使用してデジタル化した。ＥＣ５０（最大半量有効濃度）を、各スポットのシグナルの強度対各スポットに添加した融合ペプチドの濃度に基づいて計算した。
【０１３６】
上記実施例から理解できるように、本発明のバリアントポリペプチドは全て、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定されるように、Ａβへの結合を示した。試験したバリアントポリペプチドのほとんどは、ドットブロットアッセイによって決定されるように、Ａβの脱凝集もまた示した。
【０１３７】
（実施例９：改変されたグリコシル化シグナルを有するポリペプチドの構築および分析）
本発明者らは、部位特異的変異誘発のための出発材料として、配列番号３、またはポリペプチド番号８６をコードする改変バージョンのヌクレオチド配列配列番号４のいずれかのヌクレオチド配列を使用して、配列番号１または配列番号２のアミノ酸３９〜４１におけるグリコシル化シグナルを欠くポリペプチドを構築した。
【０１３８】
ｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ２ベクター（ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ）に由来し、哺乳動物シグナル配列に融合したポリペプチド８６をコードするプラスミドベクターを、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）および以下のプライマー：
フォワードプライマー：ＧＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＡＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＧＴＴＧＴＡＧＴＴＴＧ（配列番号８）
リバースプライマー：ＣＡＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＣＣＴＣＣＡＧＣＡＴＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣ（配列番号９）
を使用して、製造業者の指示に従って変異誘発させて、Ｔ４１Ｇ置換を創出した。得られたベクター（配列番号７）を使用して、標準的な技術を使用して所望のプラスミドを単離および配列決定するために、ＮＥＢ  ５−アルファコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換した。
【０１３９】
次いで、精製されたベクターを使用して、市販のＥｘｐｉ２９３（商標）発現系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｈｃｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＥｘｐｉ２９３細胞を形質転換した。トランスフェクションの前日に、Ｅｘｐｉ２９３細胞を、２×１０６の生存細胞／ｍｌの密度で播種した。トランスフェクションの当日に、５００μｇのフィルター滅菌したプラスミドを、２５ｍｌの総容積になるように、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ中に希釈した。別々のチューブ中で、１．３３３ｍｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬を、２５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ中に希釈し、反転させることによって混合した。室温で５分間のインキュベーション後、希釈したＤＮＡを、希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬に添加し、さらに２０〜３０分間インキュベートした。ＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬複合体を、フラスコを穏やかに旋回させながら５００ｍｌ細胞（＞３×１０６細胞／ｍｌ）に緩徐に添加した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションエンハンサーＩおよびＩＩ、それぞれ２．５ｍｌおよび２５ｍｌを、トランスフェクトされた細胞におよそ１８時間後に添加し、細胞を、オービタルシェーカーで３７℃、８％ＣＯ２、１３５ｒｐｍでもう５日間インキュベートする。発現された融合タンパク質（「ポリペプチド８６−Ｔ４１Ｇ」と呼ぶ）を含有する培地を、１０，０００ｒｐｍで４℃で２０分間の遠心分離によって回収した。上清を、５ｍｌのＨｉＴｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、全てのステップは４℃で実施した。カラムを、５容積の溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン、ｐＨ３）で再生させ、５〜１０容積の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中で洗浄し、その後、５ｍｌ／分の流速を使用して細胞培地を適用した。このカラムを、５〜１０容積の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、その後、結合したポリペプチド８６−Ｔ４１Ｇを、０．１ＭグリシンｐＨ３を用いて溶出させた。１〜３ｍｌの画分を、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９を含むチューブ中に収集して、ｐＨを調整した。収量を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００Ｃで２８０ｎｍでの吸光度によって決定した。５μｌの各タンパク質含有画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ＴＧＸゲル（ＢｉｏＲａｄ）上で分離し、２時間クマシー染色した。ポリペプチド８６−Ｔ４１Ｇを含有する画分をプールし、Ｄ−ＰＢＳ中で４℃で一晩透析した。最終ポリペプチド８６−Ｔ４１Ｇ試料を、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅスピンフィルターで滅菌し、濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ  ２０００Ｃで測定した。
【０１４０】
精製されたポリペプチド８６−Ｔ４１Ｇ（配列番号５）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したところ、これは、ポリペプチド８６よりもわずかに低い分子量（見かけで約５００ダルトン小さい）を有する単一のバンドとして移動した（図９）。本発明者らは、このより低い分子量は、アミノ酸４１におけるＴからＧへの変化およびＮ３９上のグリコシル化の喪失の両方に起因すると考えている。
【０１４１】
精製されたポリペプチド８６−Ｔ４１Ｇを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーによっても分析した。このカラムを洗浄し、１００ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）で平衡化した。１００マイクログラム（１００μｇ）のポリペプチド８６−Ｔ４１Ｇを、２００μＬの最終容積になるようにＰＢＳ中に希釈し、カラム上にロードした。次いで、このカラムを、０．７５ｍＬ／分の速度で、１．５カラム容積のＰＢＳで溶出させた。画分中のタンパク質を、２１４ｎｍおよび２８０ｎｍにおいて分光光度的にモニタリングしたところ、均一性を示す鋭いピークが実証された（データ示さず）。
【０１４２】
精製されたポリペプチド８６−Ｔ４１Ｇを、実施例５に記載されたＥＬＩＳＡを使用して、Ａベータ結合について分析した。このアッセイにおけるＡベータ結合についてのＥＣ５０は、配列番号１のポリペプチドについての２０．６〜２７．０１ｎＭおよびポリペプチド８６についての３４．５ｎＭと比較して、１３．１５ｎＭであることが計算された。
【０１４３】
精製されたポリペプチド８６−Ｔ４１Ｇをまた、実施例８に記載された酢酸セルロースフィルター遅延アッセイを使用して、Ａベータ結合について、配列番号１のポリペプチドおよびポリペプチド８６と比較した。このアッセイの結果は、図１０に示される。
【０１４４】
次いで、精製されたポリペプチド８６−Ｔ４１Ｇを、ヒトＨＬＡハプロタイプの９５％に相当する５０人の異なるＰＢＭＣドナーを使用する全タンパク質ＣＤ４＋Ｔ細胞応答アッセイにおいて；および実施例６に記載されるＥＬＩＳｐｏｔサイトカイン（ＩＬ−２）アッセイにおいて、ポリペプチド８６および配列番号１のポリペプチド（ならびに陽性対照としてのヒト化Ａ３３抗体およびキーホールリンペットヘモシアニン）と比較した。結果は、以下の表１３および１４に示される。
【表１３】
2020073610.tif 000020
【表１４】
2020073610.tif 000021
【０１４５】
上の表から理解できるように、配列番号１のポリペプチド（アミノ酸３９〜４１における推定グリコシル化部位または任意の推定Ｔ細胞エピトープのいずれにもアミノ酸変化なし）は、ドナーの１２％（６／５０）について、バックグラウンドの＞２倍の増殖応答（「ＳＩ」）を惹起した。ポリペプチド８６およびポリペプチド８６  Ｔ４１Ｇは、有意により少ないドナーＰＢＭＣ（４％；２／５０）から増殖応答を惹起し、応答したものはまた、バックグラウンドの２倍よりもわずかに高い増殖応答を有した。これは、ヒト被験体に対するポリペプチド８６  Ｔ４１Ｇのより低い予測された免疫原性を示す。このＩＬ−２アッセイは、Ｔ細胞応答アッセイの結果を確認する。
【０１４６】
ポリペプチド８６  Ｔ４１Ｇをまた、Ａベータ４２線維、ＮＡＣ線維およびｔａｕ−ｍｔｂｒ線維への結合について、配列番号１のポリペプチドと比較した。
【０１４７】
線維およびＥＬＩＳＡプレート調製。Ａβ４２ペプチド（ｒＰｅｐｔｉｄｅ  Ａ−１００２−２）を、ボルテックスおよび室温で１８時間のインキュベーションによって、ヘキサフルオロイソプロパノール中に溶解させた。アリコートを減圧下で乾燥させ、−２０℃で貯蔵した。１００ｕｇのＡβ４２モノマーを、２０μｌのＤＭＳＯ中に溶解させ、ボルテックスによって溶解させ、１０ｍＭ  ＨＣｌ溶液中に８０μＭになるように希釈した。このＡβ４２ペプチド溶液を、３７℃で３日間インキュベートし、線維形成を、ＴｈＴ蛍光アッセイを用いて検証した。
【０１４８】
老人斑の非アミロイドベータ構成成分（ＮＡＣ）は、パーキンソン病の顕著な特徴である凝集体、アルファ−シヌクレインの凝集した断片である。ＮＡＣペプチド（Ｂａｃｈｅｍ  Ｈ２５９８）を、２０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３中に６００ｕＭで溶解させ、１００，０００×ｇで４℃で１時間遠心分離した。上清を、２Ｎ  ＨＣｌで中和し、１０ｍＭ  ＨＣｌと１：１混合した。このペプチドを、３７℃で４日間インキュベートし、線維形成を、ＴｈＴ蛍光アッセイによって確認した。
【０１４９】
Ｔａｕの微小管結合部分を含む線維（Ｔａｕ−ｍｔｂｒ線維）を、Ｆｒｏｓｔら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００９年５月８日；２８４巻（１９号）：１２８４５〜５２頁に従って作製した。簡潔に述べると、４０ｕＭのｔａｕ−ｍｔｂｒタンパク質を、４０ｕＭの低分子量ヘパリン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＢＰ２５２４）および２ｍＭ  ＤＴＴと共に、３７℃で３日間インキュベートした。原線維形成を、ＴｈＴ蛍光アッセイによって確認した。
【０１５０】
線維を、ＰＢＳＡ−０．０２％中で１μＭになるように希釈し、３７℃で一晩のインキュベーションによって、Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ  ＥＬＩＳＡプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  カタログ番号４４２４０４）上でドライコーティング（ｄｒｙ−ｃｏａｔ）した。ウェルを、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  カタログ番号３７５１５）中で２００μｌ／ウェルで室温で１時間ブロッキングし、ＰＢＳＴ−０．０５％中で洗浄した。
【０１５１】
結合アッセイおよび結果。配列番号１のポリペプチドおよびポリペプチド８６  Ｔ４１Ｇを、５０ｎＭおよび２００ｎＭで線維ＥＬＩＳＡに別々に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを、ＰＢＳＴ−０．０５％２００μｌで６回洗浄し、その後、ＴＢＳＴ−０．０５％；１％ミルクブロック（ＬａｂＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  カタログ番号７３２−２９１−１９４０）中１：２５００のヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片特異的ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓ  カタログ番号１０９−０３５−００８）と共に室温で４５分間インキュベートした。プレートを、２００ｕｌのＴＢＳＴ−０．０５％中で４回、２００ｕｌのＰＢＳ中で２回洗浄し、その後、５０ｕｌ／ウェルのＴＭＢ溶液（Ｓｉｇｍａ
Ｔ０４４０）を添加した。反応を、８分間発色させ、５０μｌ／ウェルの２Ｎ  ＨＣｌを添加することによって停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｔｅｃａｎプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００Ｐｒｏ）で記録した。
【０１５２】
データポイントを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで計算した標準偏差を伴う３連のウェルの平均から取った。これらの値を、各基質についていずれのポリペプチドもなしでインキュベートしたウェルにおける平均吸光度を減算することによって、バックグラウンドに対して補正した。
【０１５３】
図１１に示されるように、ポリペプチド８６  Ｔ４１Ｇは、配列番号１のポリペプチドと比較して同じまたはより高い親和性で、Ａβ４２ｍ  ＮＡＣ線維およびｔａｕ−ｍｔｂｒ線維を結合する。
【０１５４】
本発明者らは、推定グリコシル化部位を排除するためだけに改変された配列番号１の以下のバリアント（置換は括弧内に示される）もまた、同様のプロトコールによって構築した：
ポリペプチド２００（Ｎ３９Ａ）    ポリペプチド２０２（Ｔ４１Ｍ）    ポリペプチド２０４（Ｔ４１Ｈ）
ポリペプチド２０１（Ｎ３９Ｑ）    ポリペプチド２０３（Ｔ４１Ｗ）    ポリペプチド２０５（Ｔ４１Ｖ）
ポリペプチド２０６（Ｔ４１Ｉ）    ポリペプチド２１１（Ｔ４１Ｆ）    ポリペプチド２１６（Ｔ４１Ａ）
ポリペプチド２０７（Ｔ４１Ｌ）    ポリペプチド２１２（Ｔ４１Ｄ）    ポリペプチド２１７（Ｔ４１Ｇ）
ポリペプチド２０８（Ｔ４１Ｒ）    ポリペプチド２１３（Ｔ４１Ｅ）
ポリペプチド２０９（Ｔ４１Ｋ）    ポリペプチド２１４（Ｔ４１Ｑ）
ポリペプチド２１０（Ｔ４１Ｙ）    ポリペプチド２１５（Ｔ４１Ｎ）
【０１５５】
（実施例１０：ポリペプチド２１７および配列番号１の薬物動態（ＰＫ）研究）
動物処置および試料収集。Ｃ５７Ｂｌ６マウス（８〜１２週齢；Ｈｉｌｌｔｏｐ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌｓ）に、使用した配列番号１のポリペプチド（ｎ＝２２）またはポリペプチド２１７（ｎ＝２２）の単一２０ｍｇ／ｋｇ腹腔内用量を投与した。配列番号１のポリペプチドは、２２匹のマウスに１回投与した（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）。ポリペプチド２１７は、別個のセットの２２匹のマウスに１回投与した（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）。血液を、異なる時点（投薬後０時間、６時間、９時間、１２時間、１日、３日、７日および１４日）において、各動物から１回収集した。血漿を、血液試料から単離し、１００μＬアリコートで貯蔵し、全ての引き続く分析に使用した。血液の収集後、マウスを安楽死させ、ＰＢＳで経心的に灌流し、それらの脳を回収した。脳を半切除し、各半球を、吻側、尾側、海馬および小脳部分へとさらに切片にした。血漿を、薬物動態分析のためにＩｎｔｅｒｔｅｋ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に発送し、左前頭皮質を、ＰＫ分析のためにＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）に発送した。
【０１５６】
血漿ＥＬＩＳＡ分析。分析した全ての標準および試料を、２１７ｍＭ酢酸に室温（「ＲＴ」）で３０分間曝露させ、次いで、（１：１．５ｖ／ｖ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９．５：試料）中で中和した。この酸解離ステップは、不溶性画分中に存在するポリペプチドを可溶化した。
【０１５７】
サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して、血漿中のポリペプチドレベルを測定した。ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートを、ストック由来の１：１，０００希釈のウサギ抗Ｍ１３（Ａｂｃａｍ：ａｂ６１８８）（３．７μｇ／ｍＬ、０．３７μｇ／ウェル）を用いて、炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で４℃で一晩コーティングした。プレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（「ＰＢＳＴ」）で３回洗浄し、ＰＢＳ中１％のミルクで３７℃で２時間、その後ＲＴで１時間ブロッキングした。プレートを、ＰＢＳＴで再度３回洗浄し、次いで、試料または標準をウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ウェルを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰ標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（重鎖および軽鎖、Ｂｅｔｈｅｌ：Ａ８０−２１９Ｐ；１：１０，０００）と共にＲＴで３０分間インキュベートした。ウェルを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで、プレートを、ＴＭＢ基質を用いてＲＴで発色させた。最も高い標準のＡ４５０が０．６〜０．８の間になった後に、反応を停止させた。ポリペプチドのレベルを、４５０ｎｍでの吸光度読み取りマイナス６５０ｎｍでの参照吸光度から定量した。血漿を、１：２０、１：３００および１：３，０００の希釈において分析した；これらの希釈では、マトリックス干渉は観察されなかった。結果は、以下の表１５に示される。
【表１５】
2020073610.tif 000022
【０１５８】
脳ＥＬＩＳＡ分析。脳組織（左前頭皮質）を、ｔｒｉｐ  Ｐｕｒｅ  Ｍ−Ｂｉｏ  Ｇｒａｄｅビーズ入りチューブおよびＰｒｅｃｅｌｌｙｓ０２４溶解ホモジナイザー（５，０００ＲＰＭで２０秒間を２回、ホモジナイズ化サイクル間に５秒間の間隔）を使用して、冷ＰＢＳ中でホモジナイズした。ホモジネートを、１４，０００ｒｐｍで４℃で５分間遠心分離した。上清を新たなチューブに取り出し、全ての引き続く分析に使用した。脳溶解物のタンパク質含量を、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して決定した。溶解物は１：２希釈で使用した。
【０１５９】
サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して、脳中のポリペプチドレベルを測定した。ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートを、１：１，０００のウサギ抗Ｍ１３（Ａｂｃａｍ：ａｂ６１８８）（３．７μｇ／ｍＬ、０．３７μｇ／ウェル）を用いて、炭酸塩緩衝液中で４℃で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳ中１％のミルクで３７℃で２時間、その後ＲＴで１時間ブロッキングした。次いで、プレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、試料または標準をウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴで再度３回洗浄し、次いで、ウェルを、ＨＲＰ標識化ロバ抗ヒトＩｇＧ（重鎖および軽鎖、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ：７０９−０３５−１４９；１：１０，０００）と共にＲＴで３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回の洗浄後、プレートを、ＴＭＢ基質を用いてＲＴで１５分間発色させた。反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。脳中のポリペプチドのレベルを、溶解物のタンパク質含量と比較して表した。結果は以下の表１６に示される。
【表１６】
2020073610.tif 000023
【図１】
2020073610.tif 000024
【図２】
2020073610.tif 000025
【図３】
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【図４】
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【図５】
2020073610.tif 000028
【図６】
2020073610.tif 000029
【図７】
2020073610.tif 000030
【図８】
2020073610.tif 000031
【図９】
2020073610.tif 000032
【図１０】
2020073610.tif 000033
【図１１】
2020073610.tif 000034
【配列表】
2020073610000001.app
【外国語明細書】
2020073610000001.pdf