(57)【要約】【課題】より簡便に細胞培養基材上で培養された細胞を回収し得る、細胞の製造方法を提供する。【解決手段】基材本体と基材本体上に配置された撥水層とを有する細胞培養基材の撥水層上で細胞の培養を行う工程１と、撥水層と、水以外の溶媒とを接触させて、撥水層上から細胞を剥離して回収する工程２とを有し、以下の溶解度測定方法によって算出される撥水層の溶解度が１ｍｇ／ｇ以上である、細胞の製造方法。溶解度測定方法：撥水層を、工程２で使用される水以外の溶媒に２４時間浸漬し、水以外の溶媒中に溶解した撥水層を構成する成分の量を撥水層の溶解度とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材本体と前記基材本体上に配置された撥水層とを有する細胞培養基材の前記撥水層上で細胞の培養を行う工程１と、
前記撥水層と、水以外の溶媒とを接触させて、前記撥水層上から前記細胞を剥離して回収する工程２とを有し、
以下の溶解度測定方法によって算出される前記撥水層の溶解度が１ｍｇ／ｇ以上である、細胞の製造方法。
溶解度測定方法：前記撥水層を、前記工程２で使用される前記水以外の溶媒に２４時間浸漬し、前記水以外の溶媒中に溶解した前記撥水層を構成する成分の量を前記撥水層の溶解度とする。
【請求項２】
前記基材本体が、基板で構成され、
前記工程１が、液体培地が収容された容器の底面上に前記細胞培養基材を配置して、前記撥水層上で細胞の培養を行う工程である、請求項１に記載の細胞の製造方法。
【請求項３】
前記基材本体が、容器の底部の少なくとも一部を構成し、
前記工程１が、液体培地が収容された前記容器内に配置される前記撥水層上で細胞の培養を行う工程である、請求項１に記載の細胞の製造方法。
【請求項４】
前記工程２が、前記液体培地が収容された前記容器内に、比重が１．０超である前記水以外の溶媒を添加して、前記撥水層と前記水以外の溶媒とを接触させて、前記撥水層上から前記細胞を剥離して回収する工程である、請求項２または３に記載の細胞の製造方法。
【請求項５】
前記水以外の溶媒が、含フッ素溶媒、炭化水素溶媒、および、シリコーン溶媒からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。
【請求項６】
前記撥水層が、含フッ素樹脂、（メタ）アクリル樹脂、および、シリコーン樹脂からなる群から選択される樹脂を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。
【請求項７】
細胞を製造するためのキットであって、基板および前記基板上に配置された撥水層を有する細胞培養基材と、水以外の溶媒とを有するキットであって、
以下の溶解度測定方法によって算出される前記撥水層の溶解度が１ｍｇ／ｇ以上である、キット。
溶解度測定方法：前記撥水層を、前記水以外の溶媒に２４時間浸漬し、前記水以外の溶媒中に溶解した前記撥水層を構成する成分の量を前記撥水層の溶解度とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の製造方法、および、キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞の培養は、ガラス基材などの細胞培養基材の表面上にて行われていた。細胞培養基材上で培養した細胞を回収するためには、細胞を細胞培養基材表面から剥離する必要がある。この目的のために、細胞と細胞培養基材との間の結合を破壊する作用を有する物質（例えば、トリプシンのようなタンパク質分解酵素、化学薬品）が用いられる。しかしながら、酵素処理や化学薬品処理は煩雑であるだけでなく、不純物混入の可能性が高くなること、および、細胞自体が変性し本来の機能が損なわれる場合があること等の欠点が指摘されている。
【０００３】
これらの欠点を解消するために、酵素処理や化学薬品処理を行うことなく、水に対する上限臨界溶解温度（以後、ＵＣＳＴと省略することがある）または下限臨界溶解温度（以後、ＬＣＳＴと省略することがある）が０〜８０℃である温度応答性ポリマーで基材を被覆してなる細胞培養基材を用い、温度変化によって細胞を剥離する技術が提案されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平２−２１１８６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一方、特許文献１に記載の細胞培養基材を用いる方法においては、温度変化を実現するための温調設備が必要となり、簡便性という点では必ずしも満足できるものではなかった。
【０００６】
本発明は、上記実情を鑑みて、より簡便に細胞培養基材上で培養された細胞を回収し得る、細胞の製造方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、上記製造方法にて使用されるキットを提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
（１）  基材本体と基材本体上に配置された撥水層とを有する細胞培養基材の撥水層上で細胞の培養を行う工程１と、
撥水層と、水以外の溶媒とを接触させて、撥水層上から細胞を剥離して回収する工程２とを有し、
後述する溶解度測定方法によって算出される撥水層の溶解度が１ｍｇ／ｇ以上である、細胞の製造方法。
（２）  基材本体が、基板で構成され、
工程１が、液体培地が収容された容器の底面上に細胞培養基材を配置して、撥水層上で細胞の培養を行う工程である、（１）に記載の細胞の製造方法。
（３）  基材本体が、容器の底部の少なくとも一部を構成し、
工程１が、液体培地が収容された容器内に配置される撥水層上で細胞の培養を行う工程である、（１）に記載の細胞の製造方法。
（４）  工程２が、液体培地が収容された容器内に、比重が１．０超である水以外の溶媒を添加して、撥水層と水以外の溶媒とを接触させて、撥水層上から細胞を剥離して回収する工程である、（２）または（３）に記載の細胞の製造方法。
（５）  水以外の溶媒が、含フッ素溶媒、炭化水素溶媒、および、シリコーン溶媒からなる群から選択される、（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞の製造方法。
（６）  撥水層が、含フッ素樹脂、（メタ）アクリル樹脂、および、シリコーン樹脂からなる群から選択される樹脂を含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞の製造方法。
（７）  細胞を製造するためのキットであって、基板および基板上に配置された撥水層を有する細胞培養基材と、水以外の溶媒とを有するキットであって、
後述する溶解度測定方法によって算出される撥水層の溶解度が１ｍｇ／ｇ以上である、キット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、より簡便に細胞培養基材上で培養された細胞を回収し得る、細胞の製造方法を提供することができる。
また、本発明によれば、上記製造方法にて使用されるキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の細胞の製造方法の第１実施形態の工程Ａ１を説明するための図である。
【図２】撥水層から細胞が剥離する機構を説明するための図であり、（Ａ）は撥水層と水以外の溶媒とを接触させる前の撥水層の一部拡大図であり、（Ｂ）は撥水層と水以外の溶媒とを接触させた後の撥水層の一部拡大図である。
【図３】撥水層と水以外の溶媒とを接触させる方法の一形態の手順を示す図である。
【図４】撥水層と水以外の溶媒とを接触させた状態の図である。
【図５】撥水層と水以外の溶媒とを接触させる方法の他形態の手順を示す図である。
【図６】撥水層と水以外の溶媒とを接触させた状態の図である。
【図７】水と、水以外の溶媒とを用いて２相状態とした図である。
【図８】本発明の細胞の製造方法の第２実施形態の工程Ｂ１を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を実施するための形態について図面を参照して説明するが、本発明は、以下の実施形態に制限されることはなく、本発明の範囲を逸脱することなく、以下の実施形態に種々の変形および置換を加えることができる。
なお、「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。
【００１１】
＜＜第１実施形態＞＞
本発明の細胞の製造方法の第１実施形態は、以下の工程Ａ１および工程２を有する。
工程Ａ１：液体培地が収容された容器の底面上に、基板と基板上に配置された撥水層とを有する細胞培養基材を配置して、撥水層上で細胞の培養を行う工程
工程２：撥水層と、水以外の溶媒とを接触させて、撥水層上から細胞を剥離して回収する工程
以下、本実施形態の手順について、図面を参照しながら、説明する。
【００１２】
＜工程Ａ１＞
工程Ａ１は、液体培地が収容された容器の底面上に細胞培養基材を配置して、細胞培養基材中の撥水層上で細胞の培養を行う工程である。より具体的には、図１に示すように、液体培地Ｌが収容された容器１０の底面上に、基板１２と撥水層１４とを有する細胞培養基材１６を配置して、撥水層１４上で細胞Ｃを培養する工程である。本実施形態では、基板が、基材本体に該当する。
以下では、まず、本工程で使用される部材および材料について詳述し、その後、工程の手順について詳述する。
【００１３】
（細胞培養基材）
細胞培養基材は、基板と、基板上に配置された撥水層とを有し、撥水層上にて細胞の培養が行われる。
基板の種類は特に制限されず、ガラス基板、樹脂基板、金属基板などが挙げられる。基板としては、取り扱い性の点から、ガラス基板が好ましい。
基板の厚みは特に制限されず、例えば、０．０１〜２０ｍｍである。
【００１４】
撥水層を構成する材料は特に制限されないが、例えば、公知の樹脂が挙げられる。より具体的には、（メタ）アクリル樹脂、ウレタン樹脂、エポキシ樹脂、オレフィン樹脂、スチレン樹脂、含フッ素樹脂、シリコーン樹脂などが挙げられる。なかでも、細胞の剥離性がより優れる点で、含フッ素樹脂、（メタ）アクリル樹脂、または、シリコーン樹脂が好ましく、含フッ素樹脂がより好ましい。
上記（メタ）アクリル樹脂としては、アルキル基を有する（メタ）アクリレート由来の繰り返し単位を含む樹脂が好ましく、アルキル基の炭素数は１〜１０が好ましい。
なお、（メタ）アクリルとは、アクリルおよびメタクリルを含む概念である。（メタ）アクリレートとは、アクリレートおよびメタクリレートを含む概念である。
【００１５】
また、含フッ素樹脂とは、フッ素原子が含まれる樹脂である。例えば、フッ素原子が含まれる（メタ）アクリル樹脂は、含フッ素樹脂に含まれる。
含フッ素樹脂の好適態様の一つとしては、フッ素原子を含むアルキル基を有する（メタ）アクリレート由来の繰り返し単位を含む樹脂が挙げられる。
フッ素原子を含むアルキル基中の炭素数は、３以上が好ましく、５以上がより好ましい。上限は特に制限されないが、１０以下の場合が多い。フッ素原子を含むアルキル基中においては、フッ素原子が少なくとも１個以上含まれていればよいが、いわゆるパーフルオロ（ペルフルオロ）アルキル基（アルキル基中の全ての水素原子がフッ素原子で置換された基）が好ましい。
【００１６】
撥水層は、基板上に固定されていることが好ましい。固定の形態としては、例えば、撥水層が物理的に固定されている形態が挙げられる。このような物理的に固定される形態としては、より具体的には、撥水層を構成する材料（例えば、樹脂）と基板とが非共有結合を介して結合している形態が挙げられる。非共有結合としては、静電相互作用、π−π相互作用などが挙げられる。
【００１７】
撥水層の形成方法は特に制限されず、公知の方法が挙げられる。例えば、撥水層を構成する材料（例えば、樹脂）を含む撥水層形成用組成物を基板上に接触させ、必要に応じて硬化処理を施して、撥水層を形成する方法が挙げられる。
【００１８】
撥水層の厚みは特に制限されないが、細胞の剥離性の点から、０．１μｍ以上が好ましく、１μｍ以上がより好ましい。上限は特に制限されないが、１０００μｍ以下の場合が多い。
【００１９】
なお、必要に応じて、基板と撥水層との間には他の層が配置されていてもよい。例えば、両者の密着性を高めるためのプライマー層などが配置されていてもよい。
【００２０】
（液体培地）
液体培地は、通常用いられる細胞培養培地から、培養する細胞、目的等に応じて適宜選択できる。通常の細胞培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＭＥＭ−α、ＲＰＭＩ１６４０などが挙げられる。
また、これらの液体培地に対しては、必要に応じて、血清、各種ビタミン、各種抗生物質等、通常の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。これらの添加剤の濃度は通常用いられる濃度であればよく、例えば、血清は培地量の５〜１０容量％とすることができる。
なお、液体培地には、水が含まれる場合が多い。一般的に、液体培地は、栄養分を水に溶解させて得られる。
【００２１】
（細胞）
撥水層上で培養される細胞の種類は特に制限されず、目的等に応じて適宜選択できる。細胞としては、例えば、ヒトを含む哺乳動物の細胞が挙げられ、具体的には、体細胞、その前駆細胞、およびそれらの混合細胞が挙げられる。細胞の具体例としては、内皮細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、臍帯血由来幹細胞、歯髄幹細胞、心筋細胞、心臓壁細胞、肝細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、血管内皮細胞、肝前駆細胞、間葉系細胞、膵島細胞、軟骨細胞、上皮細胞などが挙げられ、これらからなる群から選択される少なくとも１種の細胞が好ましい。
なお、細胞は、付着性細胞であることが好ましい。ここで付着性細胞とは、非浮遊性の細胞であり、細胞増殖に際して培養器面に対する接着依存性を示す細胞である。
【００２２】
（容器）
容器は、その内部に液体培地を収容でき、かつ、その底面上に細胞培養基材が載置できるものであれば、その種類は特に制限されない。通常、容器は、少なくとも底面部と、底面部の周囲からのびる壁部とを少なくとも有する。
【００２３】
（手順）
本工程の手順は、撥水層上で細胞が培養されれば特に制限されないが、代表例としては、まず、容器内の所定の位置に細胞培養基材を配置する。次に、所定の種類の細胞を所定数となるように容器内に播種し、さらに液体培地を容器内に加え、培養を行う。なお、液体培地を先に容器内に加えて、その後、細胞を播種してもよい。
【００２４】
細胞の培養条件は、細胞の種類、目的などに応じて適宜最適な条件を選択できる。例えば、培養温度は、通常、約３０〜４０℃程度の場合が多く、約３７℃が好ましい。培養は、例えば、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で行われ、ＣＯ２濃度は、例えば２〜５％である。培養時間は、例えば、１〜１０日間である。
なお、気体を供給しながら、細胞培養を行ってもよい。供給される気体は、目的等に応じて適宜選択でき、例えば、酸素、窒素、一酸化窒素、二酸化窒素、一酸化炭素、二酸化炭素、水素、硫化水素などが挙げられる。
【００２５】
＜工程２＞
工程２は、撥水層と、水以外の溶媒（以後、「特定溶媒」とも称する）とを接触させて、撥水層上から細胞を剥離して回収する工程である。
撥水層と、特定溶媒とを接触させることにより、撥水層が溶解し、結果として撥水層表面上から細胞が剥離され、細胞を容易に回収できる。
以下、図面を参照して、細胞が剥離する機構について説明する。
図２（Ａ）に示すように、撥水層１４が工程２で使用される特定溶媒と接触する前は、細胞Ｃが撥水層１４上に接着している状態である。
次に、撥水層と特定溶媒とを接触させると、撥水層の一部が特定溶媒中に溶解する。特に、図２（Ｂ）に示すように、特定溶媒と接触する撥水層１４の表面から溶解が進行するため、撥水層１４の厚みが薄くなる。それに伴い、撥水層１４上から細胞Ｃが離れる。言い換えると、撥水層上にあった細胞を剥離させることができる。
つまり、後述する溶解度測定方法にて測定される溶解度は、特定溶媒への撥水層を構成する材料の溶解性を表し、この値が所定値以上であると、細胞が撥水層上から剥離する程度まで、撥水層が特定溶媒に溶解することを表している。
【００２６】
従って、本実施形態においては、溶解度測定方法により得られる溶解度を満たすような、撥水層と特定溶媒とを選択することにより、撥水層上から簡便に細胞を剥離・回収できる。
なお、上記のような、撥水層と特定溶媒との組み合わせとしては、例えば、撥水層に含フッ素樹脂が含まれ、特定溶媒として含フッ素溶媒を用いる態様が挙げられる。
【００２７】
上述したように、本実施形態によれば、単に特定溶媒と撥水層とを接触させることにより、細胞培養基材から細胞を容易に剥離できる。つまり、従来技術のような温調設備のような特殊な設備を用意する必要がなく、簡便に、細胞を剥離・回収できる。
【００２８】
以下、溶解度測定方法について詳述する。
まず、基板上に厚み３００μｍ程度の撥水層（２ｃｍφの円）が配置された細胞培養基材を用意する。次に、室温下（約２３℃）にて、工程２で使用される特定溶媒（１０ｇ）中に上記細胞培養基材を２４時間浸漬する。２４時間経過後、細胞培養基材を特定溶媒から取り出し、乾燥後、電子天秤による重量測定により、特定溶媒中に溶解（溶出）した撥水層を構成する成分の量（撥水層由来の成分の量）を測定し、撥水層の溶解度とする。
なお、基板が特定溶媒に溶解する場合は、上記と同様の浸漬条件にて、基板のみを特定溶媒中に浸漬させて、特定溶媒中に溶解した基板を構成する成分の量を予め測定し、上記方法で得られた値から基板から溶解した成分の量を除することにより、撥水層から溶解した成分の量を算出することもできる。
【００２９】
なお、上記溶解度は、１ｍｇ／ｇ以上であり、細胞の剥離性がより優れる点で、１０ｍｇ／ｇ以上が好ましく、２０ｍｇ／ｇ以上がより好ましい。
なお、上限値は特に制限されないが、溶媒との親和性の点で、１０００ｍｇ／ｇ以下の場合が多く、５００ｍｇ／ｇ以下が好ましい。
【００３０】
特定溶媒の種類は後段で詳述するが、上記要件を満たす撥水層と特定溶媒との好適な組み合わせとしては、含フッ素樹脂、（メタ）アクリル樹脂、および、シリコーン樹脂からなる群から選択される樹脂を含む撥水層と、含フッ素溶媒、炭化水素溶媒、および、シリコーン溶媒からなる群から選択される特定溶媒との組み合わせが挙げられ、含フッ素樹脂を含む撥水層と含フッ素溶媒との組み合わせがより好ましい。
【００３１】
以下では、本工程で使用される材料について詳述し、その後、工程の手順について詳述する。
【００３２】
（水以外の溶媒）
本工程で使用される溶媒としては水以外の溶媒が挙げられ、上記要件を満たすように、撥水層の種類に応じて適宜最適な溶媒が選択される。
水以外の溶媒としては、疎水性溶媒および親水性溶媒のいずれでもよく、上記要件を満たしやすい点から、疎水性溶媒が好ましい。なお、疎水性溶媒は液体培地と相分離しやすい。
なかでも、水以外の溶媒としては、含フッ素溶媒、炭化水素溶媒、または、シリコーン溶媒がより好ましく、含フッ素溶媒がさらに好ましい。なお、上記含フッ素溶媒、炭化水素溶媒、およびシリコーン溶媒は、疎水性溶媒に該当することが好ましい。
なお、上記疎水性溶媒とは、水との親和性が小さな溶媒であり、２５℃における水に対する溶解度が５０ｇ／Ｌ以下の溶媒を意図する。また、上記親水性溶媒とは、水との親和性が大きな溶媒であり、２５℃における水に対する溶解度が５０ｇ／Ｌ超の溶媒を意図する。
水以外の溶媒は、水と相分離する溶媒であることが好ましい。
また、水以外の溶媒は、１種のみを用いてもよいし、２種以上を合わせて用いてもよい。
【００３３】
上記水以外の溶媒の比重は特に制限されないが、比重１．０超の溶媒であってもよいし、比重１．０未満の溶媒であってもよい。
後段で詳述するように、水以外の溶媒の比重によって、適宜最適な撥水層との接触方法が選択される。
【００３４】
含フッ素溶媒は、フッ素原子を含む溶媒であり、例えば、含フッ素アルカン、含フッ素オレフィン、含フッ素アルキルエーテル、含フッ素アルキルアミン、含フッ素芳香族化合物などが挙げられる。
液体培地との相分離の点から、含フッ素溶媒中のフッ素原子の総含有率であるフッ素含量は、１５質量％以上が好ましく、３０質量％以上がより好ましい。上限としては、例えば、８５質量％以下であり、８０質量％以下が好ましい。
【００３５】
含フッ素溶媒の２５℃における水に対する溶解度は、液体培地との相分離の点から、５０ｇ／Ｌ以下が好ましく、１０ｇ／Ｌ以下がより好ましく、５ｇ／Ｌ以下がさらに好ましい。水に対する溶解度の下限値は、例えば、０ｇ／Ｌである。
【００３６】
含フッ素溶媒の粘度は特に制限されず、例えば、２５℃において、０．４ｍＰａ・ｓ以上が好ましく、０．４４ｍＰａ・ｓ以上がより好ましい。上限値としては、例えば、２０００ｍＰａ・ｓ以下であり、５０ｍＰａ・ｓ以下が好ましい。
【００３７】
含フッ素溶媒の密度は特に制限されず、例えば、２５℃において、１．０ｇ／ｍＬ超が好ましく、１．１ｇ／ｍＬ以上がより好ましく、細胞より十分に重いことが好ましいことから、１．２ｇ／ｍＬがさらに好ましい。上限値としては、例えば、３．０ｇ／ｍＬ以下であり、２．１ｇ／ｍＬ以下が好ましい。
【００３８】
含フッ素溶媒の表面張力は特に制限されず、例えば、２５℃において、９ｍＮ／ｍ以上が好ましく、１２ｍＮ／ｍ以上がより好ましい。上限値としては、例えば、８０ｍＮ／ｍ以下であり、１００ｍＮ／ｍ以下が好ましい。 
【００３９】
含フッ素アルカンは、直鎖状、分岐鎖状および環状のいずれであってもよい。含フッ素アルカンの炭素数は、５〜２０が好ましく、６〜１０がより好ましい。含フッ素アルカンはアルカンの水素原子のすべてがフッ素原子に置き換わったペルフルオロアルカンでもよいし、水素原子の一部がフッ素原子に置き換わったハイドロフルオロアルカンでもよい。
含フッ素アルカンとしては、例えば、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロノナン、ペルフルオロデカン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン、ペルフルオロ（１，３−ジメチルシクロヘキサン）、ペルフルオロデカリン、１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６−トリデカフルオロオクタン、１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６−トリデカフルオロヘキサン、１，１，１，２，２，３，３，４，４−ノナフルオロヘキサン、１，１，１，２，２，３，４，５，５，５−デカフルオロペンタン、１，１，２，２，３，３，４−ヘプタフルオロシクロペンタン、３Ｍ社製のＦＣ−８７、ＦＣ−８４、ＦＣ−７７、ペルフルオロケロセンなどが挙げられる。
【００４０】
含フッ素オレフィンは、直鎖状、分岐鎖状および環状のいずれであってもよいが、直鎖状または分岐鎖状が好ましい。含フッ素オレフィンの炭素数は、５〜２０が好ましく、６〜１０がより好ましい。含フッ素オレフィンに含まれる不飽和結合数は、１〜１０が好ましく、１〜５がより好ましい。含フッ素オレフィンはオレフィンの水素原子のすべてがフッ素原子に置き換わったペルフルオロオレフィンでもよいし、水素原子の一部がフッ素原子に置き換わったハイドロフルオロオレフィンでもよい。
含フッ素オレフィンとしては、例えば、ペルフルオロシクロペンテン、ペルフルオロシクロヘキセン、ペルフルオロシクロヘプテン、ペルフルオロシクロオクテン、ペルフルオロシクロノネン、ペルフルオロシクロデセン、１−クロロ−３，３，３−トリフルオロプロペン、１−クロロ−２，３，３−トリフルオロプロペン、１，１，１，２，２，３，５，５，６，６，７，７，７−トリデカフルオロ−４−メトキシ−３−ヘプテンなどが挙げられる。
【００４１】
含フッ素アルキルエーテルは、酸素原子に結合する２つのアルキル基のうち少なくとも一方にフッ素原子が１以上置換していればよい。含フッ素アルキルエーテルを構成するフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基部分は、直鎖状、分岐鎖状および環状のいずれであってもよいが、直鎖状または分岐鎖状が好ましい。含フッ素アルキルエーテルに含まれるアルキル基部分の炭素数は、５〜２０が好ましく、６〜１０がより好ましい。含フッ素アルキルエーテルに含まれるフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基部分は同一であっても、異なっていてもよい。含フッ素アルキルエーテルはアルキルエーテルの水素原子のすべてがフッ素原子に置き換わったペルフルオロアルキルエーテルでもよいし、水素原子の一部がフッ素原子に置き換わったハイドロフルオロアルキルエーテルでもよい。
含フッ素アルキルエーテルとしては、例えば、１，１，２，２−テトラフルオロエチル−２，２，２−トリフルオロエチルエーテル、１−メトキシ−１，１，２，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン、１−エトキシ−１，１，２，２，３，３，４，４，４−ノナフルオロブタン、３−メトキシ−１，１，１，２，２，３，４，４，５，５，６，６，６−トリデカフルオロヘキサン、１−メトキシ−１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６，６−トリデカフルオロヘキサン、メチルノナフルオロイソブチルエーテル、エチルノナフルオロブチルエーテル、エチルノナフルオロイソブチルエーテル、１、１、１、２、２、３、４、５、５、５−デカフルオロ−３−メトキシ−４−（トリフルオロメチル）ペンタン、ＳＯＬＶＥＹ社製のＧＡＬＤＥＮ  ＨＴ５５、ＧＡＬＤＥＮ  ＨＴ７０、ＧＡＬＤＥＮ  ＨＴ９０、ＧＡＬＤＥＮ  ＺＴ１５０、ＧＡＬＤＥＮ  ＨＴ１７０、ＧＡＬＤＥＮ  ＺＴ１８０、ＧＡＬＤＥＮ  ＨＴ２００、ＦＯＭＢＬＩＮＥ  Ｙなどが挙げられる。
【００４２】
含フッ素アルキルアミンは、一級アミン、二級アミンおよび三級アミンのいずれでもよく、なかでも三級アミンが好ましい。含フッ素アルキルアミンは、窒素原子に結合するアルキル基のうちの少なくとも１つにフッ素原子が１以上置換していればよい。含フッ素アルキルアミンを構成するフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基部分は、直鎖状、分岐鎖状および環状のいずれであってもよいが、直鎖状または分岐鎖状が好ましい。含フッ素アルキルアミンに含まれる１つのアルキル基部分の炭素数は、３〜５０が好ましく、９〜３０がより好ましい。含フッ素アルキルアミンに含まれるフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基部分が２以上ある場合、それらは同一であっても、異なっていてもよい。含フッ素アルキルアミンはアルキルアミンの水素原子のすべてがフッ素原子に置き換わったペルフルオロアルキルアミンでもよいし、水素原子の一部がフッ素原子に置き換わったハイドロフルオロアルキルアミンでもよい。
含フッ素アルキルアミンとしては、例えば、ペルフルオロトリプロピルアミン、ペルフルオロトリブチルアミン、ペルフルオロトリペンチルアミン、ペルフルオロトリヘキシルアミン、ペルフルオロトリヘプチルアミン、ペルフルオロトリオクチルアミン、ペルフルオロトリノニルアミン、ペルフルオロトリデシルアミンなどが挙げられる。
【００４３】
含フッ素芳香族化合物は、芳香族化合物に少なくとも１以上のフッ素原子が置換している化合物である。含フッ素芳香族化合物の炭素数は、５〜３０が好ましく、６〜１０がより好ましい。含フッ素芳香族化合物は芳香族化合物中の水素原子のすべてがフッ素原子に置き換わった化合物でもよいし、水素原子の一部がフッ素原子に置き換わった化合物でもよい。
含フッ素芳香族化合物としては、例えば、モノフルオロベンゼン、ジフルオロベンゼン、トリフルオロベンゼン、テトラフルオロベンゼン、ペンタフルオロベンゼン、ヘキサフルオロベンゼンなどが挙げられる。
【００４４】
炭化水素溶媒は、炭素原子と水素原子とからなる溶媒であって、例えば、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素溶媒、ペンタン、ヘキサン、オクタン、デカン、２，２，４−トリメチルペンタン、２，２，３−トリメチルヘキサンなどの脂肪族炭化水素溶媒が挙げられる。
【００４５】
シリコーン溶媒としては、例えば、ジメチルシリコーンオイル、メチルフェニルシリコーンオイル、メチルハイドロジェンシリコーンオイルなどのストレートシリコーンオイル、環状ジメチルシリコーンなどの環状ポリシロキサンなどが挙げられる。
【００４６】
なお、上述した親水性溶媒の種類は特に制限されないが、例えば、プロピレングリコール１−モノメチルエーテルなどのエーテル溶媒や乳酸エチルなどのエステル溶媒が挙げられる。
【００４７】
（手順）
撥水層と特定溶媒とを接触させる方法は特に制限されないが、例えば、図３に示すように、液体培地Ｌが収容された容器１０内に特定溶媒Ｓを添加する方法が挙げられる。この方法においては、図４に示すように、特定溶媒Ｓ中に細胞培養基材１６が浸漬するようなるまで、特定溶媒Ｓを容器１０内に添加する。上述したように、撥水層１４と特定溶媒Ｓとが接触すると、撥水層１４が特定溶媒Ｓ中に溶解し、撥水層１４上で培養された細胞Ｃが撥水層１４上から剥離し、細胞を容易に回収できる。
なお、この方法で使用される特定溶媒Ｓとしては、液体培地Ｌよりも比重の大きい溶媒が選択される。より具体的には、特定溶媒Ｓとしては、比重が１．０超である特定溶媒が好ましい。このような特定溶媒Ｓが液体培地Ｌに加えられると、特定溶媒Ｓが液体培地Ｌよりも下層側に移動する。なお、上記比重は、１．２以上がより好ましい。比重の上限値は特に制限されないが、２．１以下の場合が多い。
この方法であれば、単に液体培地Ｌを含む容器中に特定溶媒Ｓを滴下するのみで、細胞を剥離することができ、非常に簡便な方法といえる。
【００４８】
また、上記方法以外にも、図５に示すように、容器１０内の液体培地Ｌを一旦除去した後、図６に示すように、容器１０内に特定溶媒Ｓを添加して、特定溶媒Ｓ中に細胞培養基材１６を浸漬させて、特定溶媒Ｓと撥水層１４とを接触させる方法も挙げられる。
この方法においては、特定溶媒Ｓの比重は特に制限されないが、その後の細胞の回収が容易な点で、比重が１．０未満である特定溶媒を用いることが好ましい。比重が１．０未満である特定溶媒を用いる場合、図６に示す特定溶媒Ｓ中にさらに水を添加すると、図７に示すように、特定溶媒Ｓが上相に水Ｗが下相に位置する相分離構造が得られる。このような相分離構造が形成されると、通常、細胞は水相に移動する。よって、この場合、遠心分離操作などによって細胞を含む水相を容易に回収することができ、細胞の回収効率性に優れる。なお、上記比重は、０．９５以下がより好ましい。比重の下限値は特に制限されないが、０．６以上の場合が多い。
【００４９】
なお、回収された細胞の形態は特に制限されず、細胞シート（細胞がシート状に集合したもの）であっても、個々の細胞がバラバラに分離したものであってもよい。
【００５０】
＜＜第２実施形態＞＞
本発明の細胞の製造方法の第２実施形態は、以下の工程Ｂ１および工程２を有する。
工程Ｂ１：液体培地が収容され、かつ、底面上に撥水層が配置された容器内において、撥水層上で細胞の培養を行う工程
工程２：撥水層と、水以外の溶媒とを接触させて、撥水層上から細胞を剥離して回収する工程
第１実施形態では撥水層を支持する基板が用いられていたのに対して、第２実施形態では撥水層が容器の底面上に直接配置されている点以外は、同一の手順を実施するため、同一の手順（例えば、細胞の培養手順、工程２の構成など）について説明を省略し、以下では、主に、第１実施形態との差異点について詳述する。
【００５１】
上述したように、本実施形態においては、容器と、容器の底面上に配置された撥水層とを有する撥水層付き容器が用いられる。つまり、容器の底部の少なくとも一部が、基材本体に該当する。より具体的には、図８に示すように、容器１０の底面上に撥水層１４が配置されており、容器１０内には液体培地Ｌが収容されている。
撥水層の構成は、第１実施形態と同様の構成である。
容器底面上に撥水層を形成する方法は特に制限されず、上述した第１実施形態で述べた方法が挙げられる。
【００５２】
なお、必要に応じて、容器と撥水層との間には他の層が配置されていてもよい。例えば、両者の密着性を高めるためのプライマー層などが配置されていてもよい。
また、上記溶解度は、撥水層付き容器を用いて、上述した方法により測定できる。
【００５３】
＜＜キット＞＞
本発明は、細胞を製造するためのキットにも関する。
キットとしては、基板および基板上に配置された撥水層を有する細胞培養基材と、水以外の溶媒（特定溶媒）とを有するキットが挙げられる。本キットは、上述した第１実施形態にて使用される。
なお、細胞培養基材中の撥水層と、上記特定溶媒とは、以下の要件を満たす。
要件：以下の溶解度測定方法によって算出される撥水層の溶解度が１ｍｇ／ｇ以上である。
溶解度測定方法：撥水層を、特定溶媒に２４時間浸漬し、水以外の溶媒中に溶解した撥水層を構成する成分の量を撥水層の溶解度とする。
【００５４】
基板、撥水層および特定溶媒の定義は、上述の通りである。
また、溶解度測定方法の意義、測定方法、および、好適範囲も、上述の通りである。
【００５５】
また、キットの他の形態としては、容器および容器の底面上に配置された撥水層を有する撥水層付き容器と、特定溶媒とを有するキットも挙げられる。本キットは、上述した第２実施形態にて使用される。
本キットにおいても、上記と同様の要件を満たす。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
【００５７】
＜細胞培養基材の作製＞
（ポリマー準備）
（１）ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）
ポリメタクリル酸メチル（分子量：１２０，０００）はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社より購入してものをそのまま用いた。
【００５８】
（２）ポリ（メタクリル酸２−（パーフルオロヘキシル）エチル）（ＰＣ６ＦＭＡ）
活性アルミナを用いてメタクリル酸２−（パーフルオロヘキシル）エチル（Ｃ６ＦＭＡ、旭硝子社製）の精製を行った後、乾燥窒素を用いて得られた精製物のバブリングを２０分間行った。以下では、上記手順により精製されたＣ６ＦＭＡを用いた。また、以下の調製および反応はすべて窒素下で行った。
Ｃ６ＦＭＡ（５６．８７ｍＬ）、２−ブロモイソ酪酸エチル（０．５９６ｍＬ）、臭化銅（ＩＩ）（０．５７４ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタメチルジエチレントリアミン（０．６９３ｇ）、１，３−ビス（トリフルオロメチル）ベンゼン（７０ｍＬ）を３００ｍＬフラスコに加え、１００℃にて２０．５時間にわたって混合液を撹拌した。得られた溶液をＰＴＦＥ不織布にてろ過後、得られたろ液にアサヒクリンＡＫ−２２５（旭硝子社製）（１２５ｍＬ）を加えた。次に、得られた溶液に対して過剰量のクロロホルムおよびエタノールの混合溶媒（クロロホルム：エタノール＝１：１）を用いて再沈殿処理を行い、得られた沈殿物をろ過により回収し、回収物を真空乾燥させて、ＰＣ６ＦＭＡを得た。
【００５９】
（細胞培養基材１の作製）
上記ＰＭＭＡをＡＫ−２２５に溶解させ、ＰＭＭＡの濃度が１質量％の溶液を調製した。次に、得られた溶液（１ｍＬ）をスライドガラス（品番：Ｓ２１１１、松浪硝子工業社製）上に滴下して、スピンコーティング（条件：２００ｒｐｍ、１０秒間）を行い、細胞培養基材１を得た。
【００６０】
（細胞培養基材２の作製）
上記ＰＭＭＡをＡＫ−２２５（２ｍＬ）に溶解させ、ＰＭＭＡの濃度が１質量％の溶液を調製した。次に、得られた溶液（１ｍＬ）をＩＷＡＫＩ製のディッシュ（６０ｍｍ／ｎｏｎ―ｔｒｅａｔｅｄ ｄｉｓｈ 型番１０１０−０６０）の底面に滴下した。窒素気流下、室温で１時間乾燥させ、ディッシュの底面に撥水層（ＰＭＭＡ層）が配置されてなる細胞培養基材２を得た。なお、得られた細胞培養基材２は、撥水層付き容器に該当する。
【００６１】
（細胞培養基材３の作製）
ＰＭＭＡの代わりにＰＣ６ＦＭＡを用いた以外は（細胞培養基材２の作製）と同様の手順に従って細胞培養基材３を得た。
【００６２】
＜実施例１＞
ＩＷＡＫＩ製のディッシュ（６０ｍｍ／ｎｏｎ―ｔｒｅａｔｅｄ ｄｉｓｈ 型番１０１０−０６０）に、２ｃｍ角にカットした細胞培養基材１を入れて、細胞培養基材１にＵＶを１５分間照射して、滅菌した。
次に、細胞（ＴＩＧ３）を２０万細胞／Ｄｉｓｈとなるよう播種し、ディッシュに液体培地（Ｇｉｂｃｏ社製  ＭＥＭ）を４ｍＬ添加した。次に、得られたディッシュをインキュベータ内にて、３７℃で２４時間置き、その後、インキュベータよりディッシュを取り出した。顕微鏡にディッシュを設置し、含フッ素溶媒（特定溶媒１）４ｍＬをディッシュ内に滴下し、細胞培養基材１上の細胞の接着挙動の経時変化を観察した。
細胞培養基材１上の接着細胞が剥離すると、接着細胞が球状に変化するか、または、流されて細胞培養基材１上から無くなる。そこで、目視により、２０分後に、接着細胞が球状に変化する、または、流されて細胞培養基材１上から無くなる場合を「○」（良好）とし、変化がないものを「×」（不良）とした。
【００６３】
＜実施例２＞
細胞培養基材２の撥水層上に、細胞（ＴＩＧ３）を２０万細胞／Ｄｉｓｈとなるよう播種し、液体培地（Ｇｉｂｃｏ社製  ＭＥＭ）を４ｍＬ添加した。次に、得られた細胞培養基材２をインキュベータ内にて、３７℃で２４時間置き、その後、インキュベータより細胞培養基材２を取り出した。顕微鏡に細胞培養基材２を設置し、含フッ素溶媒（特定溶媒１）４ｍＬを細胞培養基材２内に滴下し、撥水層上の細胞の接着挙動の経時変化を観察した。
撥水層上の接着細胞が剥離すると、接着細胞が球状に変化するか、または、流されて撥水層上から無くなる。そこで、目視により、２０分後に、接着細胞が球状に変化する、または、流されて撥水層上から無くなる場合を「○」（良好）とし、変化がないものを「×」（不良）とした。
【００６４】
＜実施例３〜４、比較例２〜３＞
使用される細胞培養基材の種類、および、特定溶媒の種類を変更した以外は、実施例２と同様の手順に従って、細胞の培養を行い、上記と同様の剥離性の評価を実施した。
結果を以下の表１にまとめて示す。
【００６５】
＜比較例１＞
使用される細胞培養基材の種類、および、特定溶媒の種類を変更した以外は、実施例１と同様の手順に従って、細胞の培養を行い、上記と同様の剥離性の評価を実施した。
結果を以下の表１にまとめて示す。
【００６６】
なお、表１中の特定溶媒の種類は以下の通りである。また、以下の使用した「特定溶媒１」、「特定溶媒２」、および、「特定溶媒４」は、いずれも、２５℃における水に対する溶解度が５０ｇ／Ｌ以下であった。また、「特定溶媒３」は、２５℃における水に対する溶解度が５０ｇ／Ｌ超であった。
特定溶媒１：ジクロロペンタフルオロプロパン（３，３−ジクロロ−１，１，１，２，２−ペンタフルオロプロパンおよび１，３−ジクロロ−１，１，２，２，３−ペンタフルオロプロパンの２種の溶媒の混合液に該当）
特定溶媒２：１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６−トリデカフルオロオクタン
特定溶媒３：プロピレングリコール１−モノメチルエーテル
特定溶媒４：１，１，１，２，２，３，４，５，５，５−デカフルオロ−３−メトキシ−４−（トリフルオロメチル）ペンタン
【００６７】
なお、比較例１においては、細胞培養基材４としてスライドガラスを用いた。
また、比較例２においては、細胞培養基材５としてＩＷＡＫＩ製のディッシュ（６０ｍｍ／ｎｏｎ―ｔｒｅａｔｅｄ ｄｉｓｈ 型番１０１０−０６０）を用いた。
また、各実施例および比較例にて得られた細胞培養基材を用いて、上述した溶解度測定方法により溶解度（ｍｇ／ｇ）を算出した。
なお、以下表１中、「＞１００」とは、溶解度が１００ｍｇ／ｇ超であることを意図する。
【００６８】
【表１】
2020043765.tif 000003
【００６９】
表１より、撥水層の溶解度が所定値以上である場合、細胞培養基材から細胞を容易に剥離でき、細胞を容易に製造できることが確認された。
なお、実施例１〜３では特定溶媒として疎水性溶媒が、実施例４では特定溶媒として親水性溶媒が使用されている。実施例１〜３においては剥離した細胞が凝集することなく浮遊していたが、実施例４においては剥離した細胞が一部凝集しており、実施例１〜３の態様が細胞そのものの回収性という点でより優れていた。
【符号の説明】
【００７０】
１０    容器
１２    基板
１４    撥水層
１６    細胞培養基材
【図１】
2020043765.tif 000004
【図２】
2020043765.tif 000005
【図３】
2020043765.tif 000006
【図４】
2020043765.tif 000007
【図５】
2020043765.tif 000008
【図６】
2020043765.tif 000009
【図７】
2020043765.tif 000010
【図８】
2020043765.tif 000011