(57)【要約】      （修正有）【課題】検出下限濃度が低く、ダイナミックレンジも広い電気化学的核酸検出方法を提供する。【解決手段】被検サンプル中の標的核酸の電気化学的検出方法であって、核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のヌクレオ塩基からなるポリヌクレオ塩基プローブが導体に結合してなるポリヌクレオ塩基修飾電極と、被験サンプルを含有する液体組成物と、を接触させ、核酸結合性酸化還元マーカーをポリヌクレオ塩基修飾電極に接触させ、ポリヌクレオ塩基修飾電極上の前記核酸結合性酸化還元マーカーの酸化還元反応によるポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受を検出する、標的核酸の電気化学的検出方法。【選択図】図２
2020051889.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検サンプル中の標的核酸の電気化学的検出方法であって、
核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のヌクレオ塩基からなるポリヌクレオ塩基プローブが導体に結合してなるポリヌクレオ塩基修飾電極と、被験サンプルを含有する液体組成物と、を接触させ、
前記核酸結合性酸化還元マーカーを前記ポリヌクレオ塩基修飾電極に接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極上の前記核酸結合性酸化還元マーカーの酸化還元反応による前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受を検出する、標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項２】
前記ポリヌクレオ塩基プローブが、ＰＮＡ又はＭＮＡからなる、請求項１に記載の標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項３】
前記核酸結合性酸化還元マーカーが、メチレンブルー、ビオロゲン類縁体、ルテニウム錯体またはコバルト錯体である、請求項１又は請求項２に記載の標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項４】
前記導体が金電極である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項５】
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極のポリヌクレオ塩基プローブ非結合領域に核酸非結合性物質が結合している、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項６】
前記核酸非結合性物質が、ＨＨＴである、請求項５に記載の標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項７】
前記標的核酸が、ＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項８】
前記標的核酸がｍｉＲＮＡである、請求項７に記載の標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項９】
前記核酸結合性酸化還元マーカーの前記酸化還元反応の測定が、ポテンショスタット又はガルバノスタットにより行われる、請求項８に記載の標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項１０】
前記核酸結合性酸化還元マーカーの前記酸化還元反応の測定が、ボルタンメトリー法（ＣＶまたはＳＷＶ）又は交流インピーダンス法（ＥＩＳ）により行われる、請求項９に記載の標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項１１】
被検サンプル中の標的核酸の電気化学的定量方法であって、
核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のヌクレオ塩基からなるポリヌクレオ塩基プローブが導体に結合してなるポリヌクレオ塩基修飾電極と、被験サンプルを含有する液体組成物と、を接触させ、
前記核酸結合性酸化還元マーカーを前記ポリヌクレオ塩基修飾電極に接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極上の前記核酸結合性酸化還元マーカーの酸化還元反応による前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受のレベルを測定し、
検出された前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受のレベルより、前記被検サンプル中の前記標的核酸のレベルを算出する、標的核酸の電気化学的定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分子の電気化学的検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、２０塩基程度のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む低分子ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）が様々な機能を有することから注目されている。特に、これらのｎｃＲＮＡレベルが疾患と相関する場合には、疾患マーカーとしての利用が可能である。ｎｃＲＮＡの検出には、蛍光検出や電気化学測定などの手法が用いられている。
【０００３】
ｎｃＲＮＡの検出に際しては、核酸を用いたプローブによってハイブリダイゼーションさせて捕捉することが一般的である。捕捉プローブにはＤＮＡやＲＮＡのような天然核酸だけでなく、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのヌクレオチドアナログが用いられることもある。ＰＮＡは、ＤＮＡやＲＮＡにおける糖鎖の代わりに、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンがアミド結合で結合した疑似ペプチド骨格を有する。ＰＮＡはＤＮＡ又はＲＮＡと二本鎖を形成することができることから、新しいプローブとして利用されている（非特許文献１及び非特許文献２）。
【０００４】
ＰＮＡはＤＮＡ又はＲＮＡと異なり電荷を持たない。この性質を利用してプローブに応用する電気化学的測定方法が知られている。例えば、ＰＮＡプローブと［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−を利用した測定方法が報告されている。本方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡ非結合では液中の負に帯電した［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−が容易に電極に到達するが、負電荷をもつＤＮＡ又はＲＮＡがＰＮＡに結合すると電荷同士の斥力により［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−が電極に到達しないことを利用して、標的ＤＮＡ又はＲＮＡを検出する。
【０００５】
また、ＰＮＡプローブと共に金電極表面に８−アミノ−１−オクタンチオールを結合させることにより電極表面に陽電荷を与える方法が報告されている。本方法では、カチオンマーカー［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋を使用する。ＤＮＡ又はＲＮＡ非結合状態では、８−アミノ−１−オクタンチオールによる陽電荷との斥力で［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋は電極に到達できないが、負電荷を持つＤＮＡ又はＲＮＡが電極表面のＰＮＡと結合して、電荷が相殺されて失われると、［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋が電極表面に到達して還元反応を起こすことを利用してＤＮＡ又はＲＮＡを検出する（特許文献１、非特許文献３及び４）。
【０００６】
また、金電極に標的配列と相補的なＰＮＡを結合することで、電極結合プローブへのカチオンの非特異的な結合を抑制し、検出感度を高めたとの報告もある。例えば、非特許文献５においては、金電極にＰＮＡプローブを結合し、プローブに結合したＤＮＡのリン酸基のアニオンと静電的相互作用により、金電極表面近傍に密集した［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋による電気信号を検出している。
【０００７】
核酸の電気化学的検出に利用する酸化還元種として、上述の［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−、［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋の他、核酸結合性を有するメチレンブルー（非特許文献６及び７）、Ｏｒａｃｅｔ  Ｂｌｕｅ（非特許文献８）の核酸単鎖と二本鎖への結合の違いを利用した方法になどが用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００２／０７３１８３
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ；２５４：１４９７−１５００（１９９１）
【非特許文献２】Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｅｇｈｏｌｍら、Ｎａｔｕｒｅ；３６５：５６６−５６８（１９９３）
【非特許文献３】Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ａｏｋｉら、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ；１２（１６）：１２７２−１２７６（２０００）
【非特許文献４】Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ａｏｋｉら、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ；１４（１９−２０）：１４０５−１４１０（２００２）
【非特許文献５】Ｍ．Ｓｔｅｉｃｈｅｎら、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ；２２：２２３７−２２４３（２００７）
【非特許文献６】Ｈｏｓｓａｉｎ−Ａｌｉ  Ｒａｆｉｅｅ−Ｐｏｕｒら、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ；７７：２０２−２０７（２０１６）
【非特許文献７】Ｃｈｅｎｍｅｎｇ  ＨＥら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；３３：１１５５−１１６０（２０１７）
【非特許文献８】Ｍｏｓｔａｆａ  Ａｚｉｍｚａｄｅｈら、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ；７７：９９−１０６（２０１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来の電気化学的核酸検出方法は、酵素などを利用した生化学的方法と比較して検出下限濃度が低いなどの特徴を有していたが、０．１〜５００ｐＭのレンジで検出下限濃度は８４．３ｆＭであった（上記非特許文献６）。また、従来の方法は、ハイブリダイゼーション前のバックグラウンドが高いため、標的核酸とのハイブリダイゼーションの前後を比較することにより結合を測定する方法や、ハイブリダイゼーション前に示した高い電流値が、ハイブリダイゼーションにより低くなることを利用して測定する方法である。このような従来の方法では、ハイブリダイゼーション前及びハイブリダイゼーション後の２回の測定を行わなければならなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、より検出下限濃度が低く、ダイナミックレンジも広い検出方法について種々の検討を行った。その結果、プローブとしてＰＮＡなどの非帯電性核酸物質を使用し、酸化還元マーカーとしてリン酸骨格を有する核酸への結合性のある化合物を使用することで、検出下限濃度が低く、ダイナミックレンジも広い検出を可能とすることを見出した。特に、本発明の一態様における方法は、プローブに非帯電性核酸物質を用いることで酸化還元マーカーがプローブにわずかしか結合しないことから、ハイブリダイゼーション前の酸化還元電流を大きく低減し、ハイブリダイゼーション前の測定を不要なものとした。その結果、標的核酸とのハイブリダイゼーション後の１回の測定で標的核酸を検出可能であることから、より簡便な検出方法を提供することに成功した。
【００１２】
すなわち、本発明の一態様は、被検サンプル中の標的核酸の電気化学的検出方法であって、
核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のヌクレオ塩基からなるポリヌクレオ塩基プローブが導体に結合してなるポリヌクレオ塩基修飾電極と、被験サンプルを含有する液体組成物と、を接触させ、
前記核酸結合性酸化還元マーカーを前記ポリヌクレオ塩基修飾電極に接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極上の前記核酸結合性酸化還元マーカーの酸化還元反応による前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受を検出する、標的核酸の電気化学的検出方法に関する。
【００１３】
また、本発明の別の態様は、被検サンプル中の標的核酸の電気化学的定量方法であって、
核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のヌクレオ塩基からなるポリヌクレオ塩基プローブが導体に結合してなるポリヌクレオ塩基修飾電極と、被験サンプルを含有する液体組成物と、を接触させ、
前記核酸結合性酸化還元マーカーを前記ポリヌクレオ塩基修飾電極に接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極上の前記核酸結合性酸化還元マーカーの酸化還元反応による前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受のレベルを測定し、
検出された前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受のレベルより、前記被検サンプル中の前記標的核酸のレベルを算出する、標的核酸の電気化学的定量方法。に関する。
【発明の効果】
【００１４】
メチレンブルーを酸化還元マーカーとしてＰＮＡプローブと共に用いることにより、ハイブリダイゼーションによる核酸の電気化学検出におけるバックグラウンドを小さく抑える事ができる。これにより、検出下限濃度が低く、かつダイナミックレンジが広い電気化学的な核酸検出方法を提供することが可能となった。例えば、負に帯電した酸化還元マーカーであるフェロシアン化カリウムに比べて検出下限濃度がおよそ１桁低く、ダイナミックレンジも２桁以上の幅がある。また、バックグラウンドが低いことにより、プローブと標的核酸のハイブリダイゼーションの前後を比較する必要がなくなり、ハイブリダイゼーション前の測定を行うことなく、ハイブリダイゼーション後の１回の検出のみで核酸を検出することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】メチレンブルーの酸化還元ピークを示すグラフであり、上図がサイクリックボルタンメトリー法（ＣＶ）測定した時の電位−電流のグラフを示し、下図が矩形波ボルタンメトリー（ＳＷＶ）測定した時の電位−電流のグラフを示す。
【図２】（Ａ）本発明の実施例のハイブリダイゼーション前の状態の模式図を示す。（Ｂ）本発明の実施例のハイブリダイゼーション後の状態の模式図を示す。（Ｃ）フェロシアン化カリウムを用いた測定のハイブリダイゼーション前の状態の模式図を示す。（Ｄ）フェロシアン化カリウムを用いた測定のハイブリダイゼーション後の状態の模式図を示す。
【図３】フェロシアン化カリウムでハイブリダイゼーション前後をＣＶ測定した時の電位−電流のグラフであり、上図は標的核酸が存在しない時、下図は標的核酸が存在する時を示す。
【図４】ＰＮＡプローブ及びＤＮＡプローブのＳＷＶ測定でのバックグラウンド電流値を示すグラフであり、上図がＰＮＡプローブのバックグラウンド電流を測定した時の電位−電流のグラフを示し、下図がＤＮＡプローブのバックグラウンド電流を測定した時の電位−電流のグラフを示す。
【図５】フェロシアン化カリウムを酸化還元マーカーとした時の標的核酸濃度とピーク電流値比の関係を示すグラフである。
【図６】メチレンブルーを酸化還元マーカーとした時の標的核酸濃度とＳＷＶ測定のピーク電流値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本出願において、「ヌクレオ塩基」とは、天然に存在するヌクレオチドの他、ヌクレオチドアナログを含む。天然に存在するヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及び／又はウラシル（Ｕ）の塩基を有するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドである。ヌクレオチドアナログとは、上述の天然に存在するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドと同じ塩基を有するが、リボースの化学構造、及び／又はホスホジエステル結合の化学構造が人為的に改変された人工ヌクレオチドを意味する。例えば、グリコール核酸（Ｇｌｙｃｏｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＧＮＡ）、架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ：ＢＮＡ）、２’，４’−架橋化核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＬＮＡ）、ペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ：ＰＮＡ）、トレオース核酸（Ｔｈｒｅｏｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＴＮＡ）、及びモルホリノ核酸（Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＭＮＡ）を挙げることができる。本出願において、ＧＮＡ，ＢＮＡ，ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡ、及びＭＮＡは、文脈によってモノマーと解釈してもよいし、ポリマーと解釈してもよい。
【００１７】
本出願において、「ポリヌクレオ塩基」とは、上述のヌクレオ塩基が直鎖状又は分岐状に重合した高分子化合物を意味する。ポリヌクレオ塩基は、１種類のヌクレオ塩基のみ（天然に存在するポリヌクレオチドのみ、又はＰＮＡの構成単位のみなど）からなるホモポリマーであってもよいし、２種類以上のヌクレオ塩基（天然に存在するポリヌクレオチドとＰＮＡ、又はＢＮＡとＬＮＡなど）のコポリマーであってもよい。よって、ＤＮＡ及びＲＮＡ等のポリヌクレオチド、並びに、ＧＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡ、及びＭＮＡのポリマーもポリヌクレオ塩基に含まれる。本出願において、「核酸」と「核酸分子」とは同義であり、ＤＮＡ及びＲＮＡの総称を表す。
【００１８】
本出願において「プローブ」又は「ポリヌクレオ塩基プローブ」とは、特にそのように解することが不整合である場合を除き同義であり、標的配列とのハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成するために用いられるポリヌクレオ塩基を意味する。プローブは、少なくともその一部に標的配列と相補的であり、標的配列と結合可能な配列を含む。プローブは、標識物質との結合や他の目的で標的配列と相補的でない配列を含んでいてもよい。
【００１９】
特に、ＤＮＡプローブを用いた場合にはメチレンブルー等がプローブに結合することによりバックグラウンドが上がるところ、本出願においては、核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のヌクレオ塩基をプローブとして用いる（核酸結合性酸化還元マーカー低結合性プローブ）ことにより、標的核酸非存在時のバックグラウンドが低減されることを特徴とする。ハイブリダイズした核酸のみに核酸結合性酸化還元マーカーが結合することから、低濃度のターゲット核酸であっても検出が可能である。よって、プローブを構成するポリヌクレオ塩基は、メチレンブルー等の核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のポリヌクレオ塩基であり、例えば、ＰＮＡ及びＭＮＡである。プローブのポリヌクレオ塩基部分は核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のポリヌクレオ塩基のみからなることが好ましいが、必要に応じて、低い割合（例えば、１０％以下、５％以下、３％以下、１％以下、０．５％以下）の核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のポリヌクレオ塩基を含んでいてもよい。あるプローブ又はヌクレオ塩基が核酸結合性酸化還元マーカー低結合性であるか否かは、当該プローブ又はヌクレオ塩基を結合した金電極と核酸結合性酸化還元マーカーを接触させ、特定の電位をかけた時の電極への電子の授受による電流の変化が生じるか否かを測定することにより決定することができる。電流の変化が無いか、無視できる程度に低い場合（例えば、ＰＮＡと同程度）の場合には、当該ローブ又はヌクレオ塩基は核酸結合性酸化還元マーカー低結合性であると判定される。
【００２０】
「核酸結合性酸化還元マーカー」は、ＤＮＡ及びＲＮＡなどのリン酸骨格を有する核酸分子には結合するが、非帯電の核酸分子には結合しないあるいは低結合性の酸化還元マーカーである。本出願において、核酸結合性酸化還元マーカーは、好ましくは単鎖の核酸に結合可能な化合物であり、当該化合物は、二本鎖の核酸にも結合してもよい。また、核酸結合性酸化還元マーカーは、好ましくは、核酸二本鎖のみに結合するインターカレーターは含まない。「酸化還元マーカー」とは、酸化状態と還元状態を有し、酸化還元反応により電子の受け渡しが可能な化合物を意味する。このような核酸結合性酸化還元マーカーとしては、例えば、メチレンブルー、ビオロゲン類縁体、ルテニウム錯体およびコバルト錯体を挙げることができる。
【００２１】
メチレンブルーは正に帯電した核酸結合性酸化還元マーカーであり、−２５０ｍＶ付近に酸化還元電位をもつ（図１）。また、メチレンブルーの核酸への結合メカニズムについてはいくつか報告があり、単鎖ＤＮＡのグアニン塩基を介して結合すること（Ｙａｎｇ、Ｗら、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ；１４：１２９９−１３０２（２００２））や、負に帯電したリン酸基との静電的相互作用により結合すること（Ｚｈａｏ、Ｇら、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ；３９４：３３７−３４４（１９９９））、及びＤＮＡ二本鎖中のグアニン−シトシンペアに直接インカレートすること（Ａｒｉａｓ，ＰらＪ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ；６３４：１２３−１２６（２００９））が報告されている。さらに、メチレンブルーの酸化還元反応は、２電子の移動が生じるため電流値が大きく出るため、１電子授受型の酸化還元種に比べて微量な核酸が検出可能であるほか、電位差も大きいため核酸レベルの差を検出しやすい。特に、メチレンブルーでハイブリダイゼーションによる核酸の電気化学検出を行う際には、ＤＮＡ等の負帯電核酸プローブではなく、ＰＮＡなどの非帯電核酸プローブを使用することにより、バックグラウンドを小さく抑えてハイブリダイズした核酸のみを検出することができ、検出感度が更に良好になる。これは、一般的に使われるＤＮＡなどの核酸プローブにはメチレンブルーが結合することにより、バックグラウンドが上がるためである。ＰＮＡはペプチド結合で塩基を連結しているため、メチレンブルーの結合が少ないと考えられる。
【００２２】
本出願において「標的核酸」とは、本発明の方法により存在を検出し、又は定量しようとする目的の核酸を意味する。標的核酸は天然物由来である必要はなく、例えば、人工核酸なども含む。例えば、本発明の方法を疾患や障害の診断目的で利用する場合、標的核酸は生体由来のＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。標的核酸の長さは特に限定されるものではないが、５０ｍｅｒ以下、４５ｍｅｒ以下、４０ｍｅｒ以下、３５ｍｅｒ以下、３０ｍｅｒ以下、２９ｍｅｒ以下、２８ｍｅｒ以下、２７ｍｅｒ以下、２６ｍｅｒ以下、又は２５ｍｅｒ以下の標的核酸が好ましい。例えば、標的核酸の鎖長は、１０ｍｅｒ以上、１１ｍｅｒ以上、１２ｍｅｒ以上、１３ｍｅｒ以上、１４ｍｅｒ以上、１５ｍｅｒ以上、１６ｍｅｒ以上、１７ｍｅｒ以上、又は１８ｍｅｒ以上とすることができる。一例として、標的核酸の鎖長は、１０〜５０ｍｅｒ、１０〜４０ｍｅｒ、１３〜３０ｍｅｒ、１５〜２８ｍｅｒ、又は１８〜２５ｍｅｒである。また、標的核酸の代表例としては、ｍｉＲＮＡを挙げることができる。
【００２３】
本出願において「標的配列」とは、標的核酸に含まれる配列であって、検出の目的とする配列である。別の表現では、標的配列は、使用されるプローブと相補的な配列又は結合可能な配列を意味する。標的配列は、標的核酸の全長配列又は部分配列であってよい。標的配列の長さは、１０〜５０ｍｅｒである。例えば、標的配列の鎖長は、１０ｍｅｒ以上、１１ｍｅｒ以上、１２ｍｅｒ以上、１３ｍｅｒ以上、１４ｍｅｒ以上、１５ｍｅｒ以上、１６ｍｅｒ以上、１７ｍｅｒ以上、又は１８ｍｅｒ以上とすることができる。また、標的配列の鎖長は、５０ｍｅｒ以下、４５ｍｅｒ以下、４０ｍｅｒ以下、３５ｍｅｒ以下、３０ｍｅｒ以下、２９ｍｅｒ以下、２８ｍｅｒ以下、２７ｍｅｒ以下、２６ｍｅｒ以下、又は２５ｍｅｒ以下とすることができる。標的配列の鎖長は、１０〜４０ｍｅｒ、１３〜３０ｍｅｒ、１５〜２８ｍｅｒ、又は１８〜２５ｍｅｒとすることができる。
【００２４】
本出願において「非標的核酸」とは、本方法により検出することを目的としない核酸である。また、「非標的配列」とは、非標的核酸が有する配列を意味する。
【００２５】
「電極」は、ポリヌクレオ塩基プローブを結合させることができ、酸化還元マーカーによる酸化還元反応を検出可能な電極であれば、特に限定されるものではないが、例えば、好ましくは、貴金属電極であり、より好ましくは金電極である。金は、酸化還元プローブによる酸化還元反応の検出に適している。また、電極は、グラッシーカーボン、酸化グラフェンなどのカーボン電極表面に金が付着した構造をしていてもよい。また、ポリヌクレオ塩基プローブは金に直接結合している必要はなく、例えば、ポリヌクレオ塩基が結合したアクリル微粒子と金微粒子が共にカーボン電極表面に付着していてもよい。
【００２６】
「核酸非結合性物質」は、検出対象である核酸とは結合しない物質であって、プローブの構造を物理的に支える役割を果たす。核酸非結合性物質としては、例えば、短鎖アルカンチオールやジスルフィドであってもよく、より具体的には、６−メルカプト−１−ヘキサノール、６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール（ＨＨＴ）を挙げることができる。
【００２７】
図２（Ａ）は、核酸がハイブリダイゼーションしていない状態の本発明の方法で用いる電極の模式図を示す。１は金電極上に修飾した捕捉ＰＮＡプローブ、２は核酸非結合性物質の６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオールを示す。ＤＮＡ又はＲＮＡがハイブリダイゼーションしていない状態では金電極表面には電荷は生じないため、メチレンブルーなどの核酸結合性酸化還元マーカーは電極表面に結合しない。図２（Ｂ）は、本発明の標的核酸がハイブリダイゼーションした状態の本発明の方法で用いる電極の模式図を示す。１は金電極上に修飾した捕捉ＰＮＡプローブ、２は核酸非結合性物質の６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール、３は標的核酸、４はメチレンブルーを示す。ＤＮＡ又はＲＮＡが結合することにより、電荷が生じ、メチレンブルーなどの核酸結合性酸化還元マーカーが電極表面に結合し、電極と電子の授受を行う。図２（Ｃ）は、フェロシアン化カリウムを用いた測定において、ＤＮＡ又はＲＮＡがハイブリダイゼーションしていない状態の模式図を示す。１は金電極上に修飾した捕捉ＰＮＡプローブ、２は核酸非結合性物質の６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール、３はフェロシアン化カリウムを示す。ＤＮＡ又はＲＮＡがハイブリダイゼーションしていない状態では電気的斥力が働かないため、フェロシアン化カリウムが電極表面に接近しうるため、電極と電子の授受を行うことができる。図２（Ｄ）はフェロシアン化カリウムを用いた測定において、ＤＮＡ又はＲＮＡがハイブリダイゼーションした状態の模式図を示す。１は金電極上に修飾した捕捉ＰＮＡプローブ、２は核酸非結合性物質の６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール、３はフェロシアン化カリウム、４は標的核酸を示す。ＤＮＡ又はＲＮＡが結合することにより電気的斥力が働き、フェロシアン化カリウムが電極と電子の授受を行うことができなくなる。
【００２８】
１．ポリヌクレオ塩基プローブの製造
本発明の実施形態において用いるポリヌクレオ塩基プローブは、標的配列と相補的に設計されたプローブ配列に基づき、本技術分野において周知の方法を利用して製造することができる。特に、ＤＮＡ及びＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ等のポリヌクレオ塩基は１塩基ずつ結合させる化学合成に方法が良く知られており、このような方法を採用することができる。また、必要に応じて、合成したポリヌクレオ塩基プローブを固相や標識などの修飾物質に結合することもできる。
【００２９】
２．修飾電極の製造
本発明の実施形態において用いる修飾電極は、金電極、又は、酸化グラフェンやスクリーンプリント電極上の金ナノ微粒子などの導体上に前記ポリヌクレオ塩基プローブを結合させることにより得ることができる。本発明の方法は、任意で導体に核酸結合性酸化還元マーカー低結合性ヌクレオ塩基からなるポリヌクレオ塩基プローブを結合して、ポリヌクレオ塩基修飾電極を作製する工程を含んでいてもよい。
【００３０】
３．標的核酸の電気化学的検出方法
本発明の一態様は、被検サンプル中の標的核酸の電気化学的検出方法であって、
核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のヌクレオ塩基からなるポリヌクレオ塩基プローブが導体に結合してなるポリヌクレオ塩基修飾電極と、被験サンプルを含有する液体組成物と、を接触させ、
前記核酸結合性酸化還元マーカーを前記ポリヌクレオ塩基修飾電極に接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極上の前記核酸結合性酸化還元マーカーの酸化還元反応による前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受を検出する、標的核酸の電気化学的検出方法に関する。
【００３１】
本方法においては、電極表面に結合したプローブに相補的な配列を有する標的核酸が結合し、当該核酸に核酸結合性酸化還元マーカーが結合する。結合した核酸結合性酸化還元マーカーの酸化還元反応による電子の放出又は獲得が電極における電流又は電圧の電気信号として現れる。すなわち、酸化還元マーカーから電極への電子の授受により、結合した標的核酸を検出する。酸化還元マーカーを利用した電気化学的検出方法は広く知られており、例えば、メチレンブルーを用いた方法は本願実施例の他、上述の非特許文献６及び７（ただし、これらの非特許文献においてはプローブとしてＤＮＡを使用）に記載されている。すなわち、メチレンブルーを用いた場合には、メチレンブルーと電極との電子の授受が標的核酸の結合を示す。
【００３２】
よって、本方法は、電極表面への標的核酸の結合と、標的核酸への酸化還元マーカーの結合、標的核酸に結合した酸化還元マーカーの酸化還元反応の電気化学的検出を必須の構成として含む。これらの本方法を構成する各反応は、順次行うこともできるし、同時に行うこともできる。例えば、標的核酸の存在を確認したい被検サンプルと酸化還元マーカーの両方を含む液体組成物中に修飾電極を浸し、反応させながら結合測定を行うこともできる。あるいは、電極表面への標的核酸の存在を確認したい被検サンプルを結合させた後、標的核酸に酸化還元マーカーを接触させて結合させ、その後、標的核酸に結合した酸化還元マーカーの酸化還元反応を電気化学的に検出してもよい。あるいは、電極表面に標的核酸の存在を確認したい被検サンプルと酸化還元マーカーとを同時に接触させて結合させ、その後、標的核酸に結合した酸化還元マーカーの酸化還元反応を電気化学的に検出してもよい。ステップワイズに行う場合、各ステップの間に洗浄する工程を含んでいてもよい。例えば、電極表面への標的核酸の存在を確認したい被検サンプルを結合させた後、サンプルを含有しない液体（緩衝液など）中で電極を洗浄してから、酸化還元マーカーを接触させてもよい。あるいは、酸化還元マーカーを接触させた後、酸化還元マーカーを含まない液体（緩衝液など）で電極を洗浄してから、標的核酸に結合した酸化還元マーカーの酸化還元反応を電気化学的に検出してもよい。特に、検出前に洗浄操作を行うことにより、液中の酸化還元マーカーによる非特異的なバックグラウンド電気信号を抑制することができることから、好ましくは、検出前に洗浄操作を行う。
【００３３】
被検サンプルが含有する核酸濃度としては、特に制限されるものではないが、例えば、１０−４〜１０−１6Ｍとすることができる。本方法は、被検サンプル中の標的核酸の存在を決定するために行われることから、被検サンプルは必ずしも標的核酸を含んでいる必要はない。また、被検サンプルは、標的核酸以外の核酸分子を含んでいてもよい。更に、被検サンプルは精製レベルが高いものでも低いものでもよく、被検体由来の物質として核酸のみを含んでいてもよいし、核酸以外の夾雑物（糖鎖、タンパク質など）を含んでいてもよい。例えば、被検サンプルは、検出対象となる標的核酸の存在を調べようとする目的の試料を用いて調製することができる。例えば、診断目的の場合、ＤＮＡ又はＲＮＡが検出されうる試料であれば特に制限されるものではなく、リンパ液、血液（血清、血漿）、尿、便、唾液、髄液、涙、バイオプシー、毛、皮膚、爪、浸出液、細胞（例えば、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、血管内皮細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ｍｕｓｅ細胞、又は多能性幹細胞から分化誘導された細胞）などの体液、細胞又は組織；エクソソーム；又はセルフリーＤＮＡを用いることができる。これらの試料は、適宜ＤＮＡ又はＲＮＡの検出に適したサンプルとして調製される。
【００３４】
被検サンプルと電極との反応は液中で行われ、核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のポリヌクレオ塩基と標的核酸が結合可能な条件下であれば特に制限されるものではない。例えば、ハイブリダイズの条件として、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）又は，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗｉｌｅｙ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ等に記載の方法により行うことができる。例えば、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，０．０９Ｍ  クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ  ＮａＣｌ，０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中、３８〜４２℃で１０分〜１時間ハイブリダイズさせることができる。
【００３５】
標的核酸への酸化還元マーカーの結合は、酸化還元マーカーの種類に応じて適宜決定することができる。例えば、ＮａＣｌＯ４含有リン酸バッファに酸化還元マーカーを添加して、標的核酸を結合させた電極に接触させ、１〜３０分静置することにより行うことができる。使用する酸化還元マーカーの濃度は、非特異的な結合を生じることなく核酸に効率的に結合する濃度であれば、特に限定されるものではないが、例えば、メチレンブルーの場合、１〜１００μＭで行うことができる。検出測定時は酸化還元マーカーを測定溶液中に含有させないことが好ましい。すなわち、プローブにハイブリダイズした標的核酸に酸化還元マーカーを結合させた後、洗浄し、標的核酸に結合した酸化還元マーカーに電位をかけて起こる電子の授受を検出することが好ましい。測定液中に酸化還元マーカーが含まれていると液中の酸化還元マーカーから生じる電子の授受と標的核酸に結合している酸化還元マーカーからの電子の授受の区別が困難となり、検出感度が低下する可能性がある。
【００３６】
酸化還元反応の電気化学的測定は、例えば、ポテンショスタット又はガルバノスタットなどの三電極系の装置を用いて行うことができる。酸化還元反応の測定は、ＣＶなどのボルタンメトリー法；交流インピーダンス法（ＥＩＳ）；ファラデーインピーダンス分光法；及びクーロメトリー法により行うことができる。
【００３７】
４．標的核酸の電気化学的定量方法
本発明の別の態様は、被検サンプル中の標的核酸の電気化学的定量方法であって、
核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のヌクレオ塩基からなるポリヌクレオ塩基プローブが導体に結合してなるポリヌクレオ塩基修飾電極と、被験サンプルを含有する液体組成物と、を接触させ、
前記核酸結合性酸化還元マーカーを前記ポリヌクレオ塩基修飾電極に接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極上の前記核酸結合性酸化還元マーカーの酸化還元反応による前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受のレベルを測定し、
検出された前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受のレベルより、前記被検サンプル中の前記標的核酸のレベルを算出する、標的核酸の電気化学的定量方法に関する。
【００３８】
この標的核酸の電気化学的測定方法による定量方法は、上述の標的核酸の電気化学的検出方法と同じ方法を用いて行うことができる。ただし、上述の方法において、結合した標的核酸や電子の授受を「検出」する代わりに標的核酸や電子の授受の「レベルを測定」することにより行う。本出願において、「レベル」とは、数値化された存在量に関する指標を意味し、例えば、標的核酸の濃度、量あるいはその代わりとして用いることができる指標を含む。よって、レベルは電気信号等の測定値そのものであってもよいし、濃度等に換算された値であってもよい。また、レベルは、絶対的な数値（存在量、単位面積・体積当たりの存在量など）であっても良いし、又は必要に応じて設定された比較対照と比較した相対的な数値であってもよい。
【００３９】
検出された前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受のレベルからの前記被検サンプル中の前記標的核酸のレベルの算出は、採用した測定方法等に応じて適宜行うことができる。例えば、標的核酸のレベルの算出は、測定値を予め決められた標準曲線に当てはめることにより行うことができる。あるいは、サンプルと同時に予め濃度が判明している標準液を測定し、サンプルの測定値を標準液の測定値と比較して行うことができる。
【実施例】
【００４０】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【００４１】
（実施例１）メチレンブルーの酸化還元電位
裸金電極を酸素プラズマ装置で１０ｍＡ、２分間プラズマ照射を行い、金電極表面を洗浄した。その後、０．１ｍＭメチレンブルー＋０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、１ｍＬ中に金電極と水系参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ  ＢＡＳ社製ＲＥ−１Ｂ）とＰｔカウンター電極（ＢＡＳ社製）を浸し、ポテンショスタットを用いて、ＳＷＶの測定を初期電位０ｍＶから終電位−５００ｍＶまで、ステップ電位５ｍＶ、パルス振幅５０ｍＶ、周期２０Ｈｚの条件で行った。また、ＣＶを初期電位０ｍＶ、高電位０ｍＶ、低電位−５００ｍＶ、スキャン速度５００ｍＶ／ｓｅｃで負方向の掃引により測定した。メチレンブルーは正に帯電した酸化還元マーカーであり、−２５０ｍＶ付近に酸化還元電位をもつことが示された。図１は、メチレンブルーの酸化還元ピークを示すグラフであり、上図がＣＶ測定した時の電位-電流のグラフを示し、下図がＳＷＶ測定した時の電位−電流のグラフを示す。縦軸は電流（ｎＡ）、横軸は電位（Ｖ）を示す。
【００４２】
（実施例２）フェロシアン化カリウムを用いたＣＶ測定
裸金電極を酸素プラズマ装置で１０ｍＡ、２分間プラズマ照射を行い、金電極表面を洗浄した。洗浄した金電極上に０．０５％ＴＦＡに溶解した１０μＭのＰＮＡ（ＴＴＣＡＧＴＴＡＴＣＡＣＡＧＴＡＣＴＧＴＡ−ｏ−Ｃｙｓ）（配列番号１）を１０μＬ塗布し、２５℃で３０分間静置した。その後、超純水で洗浄し、１ｍＭのＨＨＴを金電極上に塗布し、２５℃で３０分間静置した。ハイブリダイゼーション前に１ｍＭ  フェロシアン化カリウム＋０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４１ｍＬ中にＰＮＡプローブおよびＨＨＴ修飾をした金電極、水系参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ  ＢＡＳ社製 ＲＥ−１Ｂ）とＰｔカウンター電極（ＢＡＳ社製）を浸し、ポテンショスタットを用いて、ＣＶを初期電位−１５０ｍＶ、高電位５００ｍＶ、低電位−１５０ｍＶ、スキャン速度５００ｍＶ／ｓｅｃで正方向の掃引により測定した。超純水で洗浄後、ＰＮＡプローブ、ＨＨＴを修飾した金電極上に、１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍ  クエン酸３ナトリウム）＋２０％ＤＭＳＯに溶解した１０−７Ｍの標的核酸（ＵＡＣＡＧＵＡＣＵＧＵＧＡＵＡＡＣＵＧＡＡ）（配列番号３）溶液を１０μＬ滴下し、４０℃で４０分ハイブリダイゼーションを行った。５０℃の超純水１００ｍＬ中で２分間、ハイブリダイゼーション後の金電極を洗浄した後、１ｍＭ  フェロシアン化カリウム＋０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４  １ｍＬ中にハイブリダイゼーションを行った後の金電極、水系参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ  ＢＡＳ社製  ＲＥ−１Ｂ）とＰｔカウンター電極（ＢＡＳ社製）を浸し、ポテンショスタットを用いて、ＣＶを初期電位−１５０ｍＶ、高電位５００ｍＶ、低電位−１５０ｍＶ、スキャン速度５００ｍＶ／ｓｅｃで正方向の掃引により測定した。フェロシアン化カリウムの検出は、ハイブリダイゼーションの前後にフェロシアン化カリウム含有測定液中でＣＶ測定を行い、そのピーク電流値の比として算出した。ハイブリダイゼーション前のＣＶ波形のピーク電流値を１とした時のハイブリダイゼーション後の同一電位での電流値を比として算出した。結果を図３に示す。フェロシアン化カリウムでハイブリダイゼーション前後をＣＶ測定した時の電位−電流のグラフであり、上図は標的核酸が存在しない時、下図は１０−７Ｍ標的核酸が存在する時を示す。フェロシアン化カリウムを酸化還元マーカーとして使用した時は電流値の差、特に電流値の低下が標的核酸の存在量を示すため、ハイブリダイゼーション前とハイブリダイゼーション後の測定が必要となる。
【００４３】
（実施例３）ＰＮＡプローブおよびＤＮＡプローブのバックグラウンド電流
裸金電極を酸素プラズマ装置で１０ｍＡ、２分間プラズマ照射を行い、金電極表面を洗浄した。洗浄した金電極上に０．０５％ＴＦＡに溶解した１０μＭのＰＮＡ（ＴＴＣＡＧＴＴＡＴＣＡＣＡＧＴＡＣＴＧＴＡ−ｏ−Ｃｙｓ）（配列番号１）を１０μＬ塗布し、２５℃で３０分間静置した。その後、超純水でＰＮＡプローブ修飾金電極を洗浄した。また、プラズマ洗浄後の金電極上に０．０５％ＴＦＡに溶解した１０μＭのＤＮＡ（ＴＴＣＡＧＴＴＡＴＣＡＣＡＧＴＡＣＴＧＴＡ−ＳＨ）（配列番号２）を１０μＬ塗布し、２５℃で３０分間静置した。その後、超純水でＤＮＡプローブ修飾金電極を洗浄した。両プローブ修飾金電極を５０μＭメチレンブルー＋０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４１ｍＬ中に浸し、５分静置した。その後０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４で洗浄し、０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４  １ｍＬ中に水系参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ  ＢＡＳ社製  ＲＥ−１Ｂ）とＰｔカウンター電極（ＢＡＳ社製）とともに浸し、ポテンショスタットを用いて、ＳＷＶの測定を初期電位０ｍＶから終電位−５００ｍＶまで、ステップ電位５ｍＶ、パルス振幅５０ｍＶ、周期２０Ｈｚの条件で行った。図４にＰＮＡプローブおよびＤＮＡプローブ修飾金電極をＳＷＶで測定したバックグラウンド電流値を示した。図４において、上図がＰＮＡプローブのバックグラウンド電流を測定した時の電位−電流のグラフを示し、下図がＤＮＡプローブのバックグラウンド電流を測定した時の電位−電流のグラフを示す。縦軸は電流（ｎＡ）、横軸は電位（Ｖ）を示す。ＰＮＡプローブ修飾金電極のバックグラウンド電流値は４．５５ｎＡを示したが、ＤＮＡプローブ修飾金電極のバックグラウンド電流値は５８．４９ｎＡを示し、約１３倍のバックグラウンド値を示した。バックグラウンド値が小さければ数ｎＡ以下の電流値の違いを検出しやすいが、ＤＮＡプローブのようにバックグラウンド値が高すぎると、そこから数ｎＡ増加しても検出値がバックグラウンド値のばらつきに埋もれてしまい、検出感度の低下につながる。そこでＤＮＡプローブよりもＰＮＡプローブのほうが微量核酸の検出には適切であることが示された。
【００４４】
（実施例４）ＰＮＡプローブへの核酸結合測定
裸金電極を酸素プラズマ装置で１０ｍＡ、２分間プラズマ照射を行い、金電極表面を洗浄した。洗浄した金電極上に０．０５％ＴＦＡに溶解した１０μＭのＰＮＡ（ＴＴＣＡＧＴＴＡＴＣＡＣＡＧＴＡＣＴＧＴＡ−ｏ−Ｃｙｓ）（配列番号１）を１０μＬ塗布し、２５℃で３０分間静置した。その後、超純水で洗浄し、１ｍＭのＨＨＴを金電極上に塗布し、２５℃で３０分間静置した。ハイブリダイゼーション前に１ｍＭ  フェロシアン化カリウム＋０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４１ｍＬ中にＰＮＡプローブおよびＨＨＴ修飾をした金電極、水系参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ  ＢＡＳ社製 ＲＥ−１Ｂ）とＰｔカウンター電極（ＢＡＳ社製）を浸し、ポテンショスタットを用いて、ＣＶを初期電位−１５０ｍＶ、高電位５００ｍＶ、低電位−１５０ｍＶ、スキャン速度５００ｍＶ／ｓｅｃで正方向の掃引により測定した。超純水で洗浄後、ＰＮＡプローブ、ＨＨＴを修飾した金電極上に、１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍ  クエン酸３ナトリウム）＋２０％ＤＭＳＯに溶解した１０−７〜１０−１０Ｍの標的核酸（ＵＡＣＡＧＵＡＣＵＧＵＧＡＵＡＡＣＵＧＡＡ）（配列番号３）溶液を１０μＬ滴下し、４０℃で４０分ハイブリダイゼーションを行った。５０℃の超純水１００ｍＬ中で２分間、ハイブリダイゼーション後の金電極を洗浄した後、１ｍＭ  フェロシアン化カリウム＋０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４  １ｍＬ中にハイブリダイゼーションを行った後の金電極、水系参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ  ＢＡＳ社製  ＲＥ−１Ｂ）とＰｔカウンター電極（ＢＡＳ社製）を浸し、ポテンショスタットを用いて、ＣＶを初期電位−１５０ｍＶ、高電位５００ｍＶ、低電位−１５０ｍＶ、スキャン速度５００ｍＶ／ｓｅｃで正方向の掃引により測定した。フェロシアン化カリウムの検出は、ハイブリダイゼーションの前後にフェロシアン化カリウム含有測定液中でＣＶ測定を行い、そのピーク電流値の比として算出した。ハイブリダイゼーション前のＣＶ波形のピーク電流値を１とした時のハイブリダイゼーション後の同一電位での電流値を比として算出した。
【００４５】
その後、０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４で洗浄後、５０μＭメチレンブルー＋０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４  １ｍＬ中にハイブリダイゼーション後の電極を浸し、５分静置した。その後０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４で洗浄し、０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４１ｍＬ中にハイブリダイゼーション後の金電極と水系参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ  ＢＡＳ社製 ＲＥ−１Ｂ）とＰｔカウンター電極（ＢＡＳ社製）を浸し、ポテンショスタットを用いて、ＳＷＶの測定を初期電位０ｍＶから終電位−５００ｍＶまで、ステップ電位５ｍＶ、パルス振幅５０ｍＶ、周期２０Ｈｚの条件で行った。さらにＣＶ測定を初期電位０ｍＶ、高電位０ｍＶ、低電位−５００ｍＶ、スキャン速度５００ｍＶ／ｓｅｃで負方向の掃引により測定した。本実験では、測定液中にメチレンブルーを入れてしまうと測定液中のメチレンブルーから生じる電子の授受と核酸に結合しているメチレンブルーからの電子の授受の区別がつかず、検出感度が低くなる可能性を考慮し、測定溶液中にメチレンブルーが存在しない条件下で測定を行った。
【００４６】
結果を図５および図６に示す。図５は、フェロシアン化カリウムを酸化還元マーカーとした時の標的核酸濃度とピーク電流値比の関係を示すグラフであり、図６は、メチレンブルーを酸化還元マーカーとした時の標的核酸濃度とＳＷＶ測定のピーク電流値を示すグラフである。図５にピーク電流値の比（縦軸）と標的核酸濃度［Ｍ］（横軸）の関係を示し、図６において、横軸は標的核酸濃度［Ｍ］、縦軸は電流値［ｎＡ］を示す。メチレンブルーは、負に帯電した酸化還元マーカーであるフェロシアン化カリウムに比べて検出下限濃度がおよそ１桁低く、１０−９Ｍが検出可能であった。ダイナミックレンジも１０−９〜１０−７Ｍ以上と２桁以上の幅があった。本方法は、核酸がハイブリダイズすれば電流が流れるという仕組みから、ダイナミックレンジも広がり、分解能も細かく見られるようになった。また、バックグラウンドがほとんどないことから、ハイブリダイゼーションの前の測定を行わずに核酸の測定が行えることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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