(57)【要約】【課題】より簡便に細胞培養基材上で培養された細胞を回収し得る、細胞の製造方法を提供する。【解決手段】基材本体と基材本体上に配置された撥水層とを有する細胞培養基材の撥水層上で細胞の培養を行う工程１と、撥水層と、水以外の溶媒とを接触させて、撥水層上から細胞を剥離して回収する工程２とを有し、撥水層とリン酸緩衝生理食塩水とを接触させて測定される撥水層とリン酸緩衝生理食塩水との接触部分での撥水層の弾性率Ａに対する、撥水層と工程２で使用される水以外の溶媒とを接触させて測定される撥水層の水以外の溶媒との接触部分での撥水層の弾性率Ｂの比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）が０．２以下である、細胞の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材本体と前記基材本体上に配置された撥水層とを有する細胞培養基材の前記撥水層上で細胞の培養を行う工程１と、
前記撥水層と、水以外の溶媒とを接触させて、前記撥水層上から前記細胞を剥離して回収する工程２とを有し、
前記撥水層とリン酸緩衝生理食塩水とを接触させて測定される前記撥水層と前記リン酸緩衝生理食塩水との接触部分での前記撥水層の弾性率Ａに対する、前記撥水層と前記工程２で使用される前記水以外の溶媒とを接触させて測定される前記撥水層の前記水以外の溶媒との接触部分での前記撥水層の弾性率Ｂの比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）が０．２以下である、細胞の製造方法。
【請求項２】
前記基材本体が、基板または粒状担体で構成され、
前記工程１が、液体培地が収容された容器の底面上に前記細胞培養基材を配置して、前記撥水層上で細胞の培養を行う工程である、請求項１に記載の細胞の製造方法。
【請求項３】
前記基材本体が、容器の底部の少なくとも一部を構成し、
前記工程１が、液体培地が収容された前記容器内に配置される前記撥水層上で細胞の培養を行う工程である、請求項１に記載の細胞の製造方法。
【請求項４】
前記工程２が、前記液体培地が収容された前記容器内に、比重が１．０超である前記水以外の溶媒を添加して、前記撥水層と前記水以外の溶媒とを接触させて、前記撥水層上から前記細胞を剥離して回収する工程である、請求項２または３に記載の細胞の製造方法。
【請求項５】
前記水以外の溶媒が、含フッ素溶媒、炭化水素溶媒、および、シリコーン溶媒からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。
【請求項６】
前記撥水層が、含フッ素樹脂、（メタ）アクリル樹脂、および、シリコーン樹脂からなる群から選択される樹脂を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。
【請求項７】
細胞を製造するためのキットであって、基板および前記基板上に配置された撥水層を有する細胞培養基材または粒状担体および粒状担体上に配置された撥水層を有する細胞培養基材と、水以外の溶媒とを有するキットであって、
前記撥水層とリン酸緩衝生理食塩水とを接触させて測定される前記撥水層とリン酸緩衝生理食塩水との接触部分での前記撥水層の弾性率Ａに対する、前記撥水層と前記水以外の溶媒とを接触させて測定される前記撥水層の前記水以外の溶媒との接触部分での前記撥水層の弾性率Ｂの比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）が０．２以下である、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の製造方法、および、キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞の培養は、ガラス基材などの細胞培養基材の表面上にて行われていた。細胞培養基材上で培養した細胞を回収するためには、細胞を細胞培養基材表面から剥離する必要がある。この目的のために、細胞と細胞培養基材との間の結合を破壊する作用を有する物質（例えば、トリプシンのようなタンパク質分解酵素、化学薬品）が用いられる。しかしながら、酵素処理や化学薬品処理は煩雑であるだけでなく、不純物混入の可能性が高くなること、および、細胞自体が変性し本来の機能が損なわれる場合があること等の欠点が指摘されている。
【０００３】
これらの欠点を解消するために、酵素処理や化学薬品処理を行うことなく、水に対する上限臨界溶解温度（以後、ＵＣＳＴと省略することがある）または下限臨界溶解温度（以後、ＬＣＳＴと省略することがある）が０〜８０℃である温度応答性ポリマーで基材を被覆してなる細胞培養基材を用い、温度変化によって細胞を剥離する技術が提案されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平２−２１１８６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一方、特許文献１に記載の細胞培養基材を用いる方法においては、温度変化を実現するための温調設備が必要となり、簡便性という点では必ずしも満足できるものではなかった。
【０００６】
本発明は、上記実情を鑑みて、より簡便に細胞培養基材上で培養された細胞を回収し得る、細胞の製造方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、上記製造方法にて使用されるキットを提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
（１）  基材本体と基材本体上に配置された撥水層とを有する細胞培養基材の撥水層上で細胞の培養を行う工程１と、
撥水層と、水以外の溶媒とを接触させて、撥水層上から細胞を剥離して回収する工程２とを有し、
撥水層とリン酸緩衝生理食塩水とを接触させて測定される撥水層とリン酸緩衝生理食塩水との接触部分での撥水層の弾性率Ａに対する、撥水層と工程２で使用される水以外の溶媒とを接触させて測定される撥水層の水以外の溶媒との接触部分での撥水層の弾性率Ｂの比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）が０．２以下である、細胞の製造方法。
（２）  基材本体が、基板または粒状担体で構成され、
工程１が、液体培地が収容された容器の底面上に細胞培養基材を配置して、撥水層上で細胞の培養を行う工程である、（１）に記載の細胞の製造方法。
（３）  基材本体が、容器の底部の少なくとも一部を構成し、
工程１が、液体培地が収容された容器内に配置される撥水層上で細胞の培養を行う工程である、（１）に記載の細胞の製造方法。
（４）  工程２が、液体培地が収容された容器内に、比重が１．０超である水以外の溶媒を添加して、撥水層と水以外の溶媒とを接触させて、撥水層上から細胞を剥離して回収する工程である、（２）または（３）に記載の細胞の製造方法。
（５）  水以外の溶媒が、含フッ素溶媒、炭化水素溶媒、および、シリコーン溶媒からなる群から選択される、（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞の製造方法。
（６）  撥水層が、含フッ素樹脂、（メタ）アクリル樹脂、および、シリコーン樹脂からなる群から選択される樹脂を含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞の製造方法。
（７）  細胞を製造するためのキットであって、基板および基板上に配置された撥水層を有する細胞培養基材または粒状担体および粒状担体上に配置された撥水層を有する細胞培養基材と、水以外の溶媒とを有するキットであって、
撥水層とリン酸緩衝生理食塩水とを接触させて測定される撥水層とリン酸緩衝生理食塩水との接触部分での撥水層の弾性率Ａに対する、撥水層と水以外の溶媒とを接触させて測定される撥水層の水以外の溶媒との接触部分での撥水層の弾性率Ｂの比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）が０．２以下である、キット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、より簡便に細胞培養基材上で培養された細胞を回収し得る、細胞の製造方法を提供することができる。
また、本発明によれば、上記製造方法にて使用されるキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の細胞の製造方法の第１実施形態の工程Ａ１を説明するための図である。
【図２】撥水層から細胞が剥離する機構を説明するための図であり、（Ａ）は撥水層と水以外の溶媒とを接触させる前の撥水層の一部拡大図であり、（Ｂ）は撥水層と水以外の溶媒とを接触させた後の撥水層の一部拡大図である。
【図３】撥水層と水以外の溶媒とを接触させる方法の一形態の手順を示す図である。
【図４】撥水層と水以外の溶媒とを接触させた状態の図である。
【図５】撥水層と水以外の溶媒とを接触させる方法の他形態の手順を示す図である。
【図６】撥水層と水以外の溶媒とを接触させた状態の図である。
【図７】水と、水以外の溶媒とを用いて２相状態とした図である。
【図８】本発明の細胞の製造方法の第２実施形態の工程Ｂ１を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を実施するための形態について図面を参照して説明するが、本発明は、以下の実施形態に制限されることはなく、本発明の範囲を逸脱することなく、以下の実施形態に種々の変形および置換を加えることができる。
なお、「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。
【００１１】
＜＜第１実施形態＞＞
本発明の細胞の製造方法（細胞の培養方法）の第１実施形態は、以下の工程Ａ１および工程２を有する。
工程Ａ１：液体培地が収容された容器の底面上に、基板と基板上に配置された撥水層とを有する細胞培養基材を配置して、撥水層上で細胞の培養を行う工程
工程２：撥水層と、水以外の溶媒とを接触させて、撥水層上から細胞を剥離して回収する工程
以下、本実施形態の手順について、図面を参照しながら、説明する。
【００１２】
＜工程Ａ１＞
工程Ａ１は、液体培地が収容された容器の底面上に細胞培養基材を配置して、細胞培養基材中の撥水層上で細胞の培養を行う工程である。より具体的には、図１に示すように、液体培地Ｌが収容された容器１０の底面上に、基板１２と撥水層１４とを有する細胞培養基材１６を配置して、撥水層１４上で細胞Ｃを培養する工程である。本実施形態では、基板が、基材本体に該当する。
以下では、まず、本工程で使用される部材および材料について詳述し、その後、工程の手順について詳述する。
【００１３】
（細胞培養基材）
細胞培養基材は、基板と、基板上に配置された撥水層とを有し、撥水層上にて細胞の培養が行われる。
基板の種類は特に制限されず、ガラス基板、樹脂基板、金属基板などが挙げられる。基板としては、取り扱い性の点から、ガラス基板が好ましい。
基板の厚みは特に制限されず、例えば、０．０１〜２０ｍｍである。
【００１４】
撥水層を構成する材料は特に制限されないが、例えば、公知の樹脂が挙げられる。より具体的には、（メタ）アクリル樹脂、ウレタン樹脂、エポキシ樹脂、オレフィン樹脂、スチレン樹脂、含フッ素樹脂、シリコーン樹脂などが挙げられる。なかでも、細胞の剥離性がより優れる点で、含フッ素樹脂、（メタ）アクリル樹脂、または、シリコーン樹脂が好ましく、含フッ素樹脂がより好ましい。
上記（メタ）アクリル樹脂としては、アルキル基を有する（メタ）アクリレート由来の繰り返し単位を含む樹脂が好ましく、アルキル基の炭素数は１〜１０が好ましい。
なお、（メタ）アクリルとは、アクリルおよびメタクリルを含む概念である。（メタ）アクリレートとは、アクリレートおよびメタクリレートを含む概念である。
【００１５】
また、含フッ素樹脂とは、フッ素原子が含まれる樹脂である。例えば、フッ素原子が含まれる（メタ）アクリル樹脂は、含フッ素樹脂に含まれる。
含フッ素樹脂の好適態様の一つとしては、フッ素原子を含むアルキル基を有する（メタ）アクリレート由来の繰り返し単位を含む樹脂が挙げられる。
フッ素原子を含むアルキル基中の炭素数は、３以上が好ましく、５以上がより好ましい。上限は特に制限されないが、１０以下の場合が多い。フッ素原子を含むアルキル基中においては、フッ素原子が少なくとも１個以上含まれていればよいが、いわゆるパーフルオロ（ペルフルオロ）アルキル基（アルキル基中の全ての水素原子がフッ素原子で置換された基）が好ましい。
【００１６】
撥水層は、基板上に固定されていることが好ましい。固定の形態としては、例えば、撥水層が化学的に固定されている形態が挙げられる。このような化学的に固定される形態としては、より具体的には、撥水層を構成する材料（例えば、樹脂）と基板とが共有結合を介して結合している形態が挙げられる。このような形態は、後述するグラフト重合法によって形成できる。
また、撥水層は非共有結合を介して基板と結合していてもよい。非共有結合としては、静電相互作用、π−π相互作用などが挙げられる。
【００１７】
撥水層は、３次元架橋構造を有していてもよい。撥水層がこのような構造を有する場合は、後述する工程２において添加される水以外の溶媒への撥水層を構成する成分の溶出が抑制される。
【００１８】
撥水層の形成方法は特に制限されず、公知の方法が挙げられる。例えば、撥水層を構成する材料（例えば、樹脂）を含む撥水層形成用組成物を基板上に接触させ、必要に応じて硬化処理を施して、撥水層を形成する方法が挙げられる。
また、撥水層をより強固に基板に固定できる点から、基板の表面上に重合開始剤を導入し、その重合開始剤から重合反応を開始して、基板上でポリマー鎖を合成する、いわゆるグラフト重合法が好ましい。
グラフト重合法としては、公知の手順を参照できる。例えば、まず、基板の表面上に共有結合を介して重合開始剤を固定する。重合開始剤を固定する際に用いる官能基の種類は特に制限されないが、例えば、基板表面のアミノ基を介して重合開始剤を固定化する方法などが挙げられる。次に、重合開始剤が固定された基板とモノマーとを接触させて、重合反応を開始することにより、基板上からのびるポリマー鎖が合成される。つまり、得られる撥水層には、一端が基板と化学結合を介して結合しているポリマー鎖が含まれる。
グラフト重合法以外にも、末端または側鎖の一部に基板と化学結合を形成する部位を有するポリマー鎖を基板の官能基と反応させることでポリマー鎖を直接基板に固定化するグラフト方法も挙げられる。
また、非共有結合を介した基板の結合方法としては、基板と相互作用の強いポリマーユニットを含むブロックポリマーをコーティングする方法が挙げられる。
【００１９】
撥水層の厚みは特に制限されないが、細胞の剥離性の点から、５ｎｍ以上が好ましく、２０ｎｍ以上がより好ましい。上限は特に制限されないが、１００μｍ以下の場合が多い。
【００２０】
撥水層は、基板の少なくとも一方の主面上全面の配置されるのが好ましい。
なお、必要に応じて、基板と撥水層との間には他の層が配置されていてもよい。例えば、両者の密着性を高めるためのプライマー層などが配置されていてもよい。
【００２１】
（液体培地）
液体培地は、通常用いられる細胞培養培地から、培養する細胞、目的等に応じて適宜選択できる。通常の細胞培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＭＥＭ−α、ＲＰＭＩ１６４０などが挙げられる。
また、これらの液体培地に対しては、必要に応じて、血清、各種ビタミン、各種抗生物質等、通常の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。これらの添加剤の濃度は通常用いられる濃度であればよく、例えば、血清は培地量の５〜１０容量％とすることができる。
なお、液体培地には、水が含まれる場合が多い。一般的に、液体培地は、栄養分を水に溶解させて得られる。
【００２２】
（細胞）
撥水層上で培養される細胞の種類は特に制限されず、目的等に応じて適宜選択できる。細胞としては、例えば、ヒトを含む哺乳動物の細胞が挙げられ、具体的には、体細胞、その前駆細胞、およびそれらの混合細胞が挙げられる。細胞の具体例としては、内皮細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、臍帯血由来幹細胞、歯髄幹細胞、心筋細胞、心臓壁細胞、肝細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、血管内皮細胞、肝前駆細胞、間葉系細胞、膵島細胞、軟骨細胞、上皮細胞などが挙げられ、これらからなる群から選択される少なくとも１種の細胞が好ましい。
なお、細胞は、付着性細胞であることが好ましい。ここで付着性細胞とは、非浮遊性の細胞であり、細胞増殖に際して培養器面に対する接着依存性を示す細胞である。
【００２３】
（容器）
容器は、その内部に液体培地を収容でき、かつ、その底面上に細胞培養基材が載置できるものであれば、その種類は特に制限されない。通常、容器は、少なくとも底面部と、底面部の周囲からのびる壁部とを少なくとも有する。
【００２４】
（手順）
本工程の手順は、撥水層上で細胞が培養されれば特に制限されないが、代表例としては、まず、容器内の所定の位置に細胞培養基材を配置する。次に、所定の種類の細胞を所定数となるように容器内に播種し、さらに液体培地を容器内に加え、培養を行う。なお、液体培地を先に容器内に加えて、その後、細胞を播種してもよい。
【００２５】
細胞の培養条件は、細胞の種類、目的などに応じて適宜最適な条件を選択できる。例えば、培養温度は、通常、約３０〜４０℃程度の場合が多く、約３７℃が好ましい。培養は、例えば、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で行われ、ＣＯ２濃度は、例えば２〜５％である。培養時間は、例えば、１〜１０日間である。
なお、気体を供給しながら、細胞培養を行ってもよい。供給される気体は、目的等に応じて適宜選択でき、例えば、酸素、窒素、一酸化窒素、二酸化窒素、一酸化炭素、二酸化炭素、水素、硫化水素などが挙げられる。
【００２６】
＜工程２＞
工程２は、撥水層と、水以外の溶媒（以後、「特定溶媒」とも称する）とを接触させて、撥水層上から細胞を剥離して回収する工程である。
撥水層と、特定溶媒とを接触させることにより、撥水層の運動性が向上し、結果として撥水層表面上から細胞が剥離され、細胞を容易に回収できる。
以下、基板に一端が共有結合により結合した高分子鎖（グラフト鎖）を含む撥水層の場合を一例として、撥水層上から細胞が剥離する機構について説明する。
図２（Ａ）に示すように、撥水層１４が工程２で使用される特定溶媒と接触する前は、高分子鎖Ｐは縮まった状態であり、高分子鎖Ｐの運動性は小さい。特に、通常、液体培地は水を含むため、撥水層が液体培地と接触している場合、撥水層中の高分子鎖は縮まった状態となりやすい。後段で詳述するように、撥水層と水とを接触させて測定される撥水層の弾性率Ａは、上記図２（Ａ）のように、撥水層中の高分子鎖Ｐが縮まった状態での弾性率を表す。言い換えると、弾性率Ａは、撥水層中の高分子鎖の運動性が低い状態での弾性率である。
次に、撥水層１４と特定溶媒とを接触させると、図２（Ｂ）に示すように、撥水層１４中の高分子鎖Ｐと特定溶媒との相溶性が、高分子鎖Ｐと水との相溶性よりも高いため、高分子鎖Ｐと特定溶媒とが相互作用して、撥水層が膨潤し、高分子鎖Ｐは広がった状態となる。つまり、撥水層１４が特定溶媒と接触すると、高分子鎖Ｐの運動性が高まる。このように高分子鎖Ｐの運動性が高まると、結果として、撥水層１４上にあった細胞Ｃが撥水層１４上から離れる。言い換えると、撥水層上にあった細胞を剥離させることができる。
なお、上記図２（Ｂ）に示すように、高分子鎖Ｐが特定溶媒と相互作用した場合、撥水層中に特定溶媒が取り込まれ、高分子鎖Ｐが広がった状態となり、撥水層の弾性率が特定溶媒と接触前後で変化する。後段で詳述するように、撥水層と特定溶媒とを接触させて測定される撥水層の弾性率Ｂは、上記図２（Ｂ）のように、撥水層中の高分子鎖Ｐが広がった状態での弾性率を表す。言い換えると、弾性率Ｂは、撥水層中の高分子鎖の運動性が高い状態での弾性率である。通常、弾性率Ｂは、高分子鎖が広がった状態であるため、弾性率Ａよりも低くなる。
つまり、弾性率Ａに対する弾性率Ｂの比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）は、実質的に、撥水層が特定溶媒と接触する前後の運動性の変化を表している。そのため、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）が所定値以下であるということは、撥水層と特定溶媒とが接触することにより、撥水層中の高分子鎖の運動性がある一定以上高まることを意図する。このような高分子鎖の運動性がある一定以上高まると、撥水層上にある細胞が撥水層上から離れやすい。従って、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）が所定値以下であるような撥水層と特定溶媒との組み合わせであれば、工程２において、撥水層上から細胞を剥離できる。
【００２７】
従って、本実施形態においては、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）を満たすような、撥水層と特定溶媒とを選択することにより、撥水層上から簡便に細胞を剥離・回収できる。
なお、上記のような、撥水層と特定溶媒との組み合わせとしては、例えば、撥水層に含フッ素樹脂が含まれ、特定溶媒として含フッ素溶媒を用いる態様が挙げられる。
【００２８】
上述したように、本実施形態によれば、単に特定溶媒と撥水層とを接触させることにより、細胞培養基材から細胞を容易に剥離できる。つまり、従来技術のような温調設備のような特殊な設備を用意する必要がなく、簡便に、細胞を剥離・回収できる。
なお、上記図２においては、一方の末端が基板上に固定された高分子鎖を含む撥水層について説明したが、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）を示す撥水層であればその構成は特に制限されない。例えば、上述した、３次元架橋構造を有する撥水層であってもよい。
【００２９】
以下、弾性率Ａおよび弾性率Ｂの測定方法について詳述する。
まず、弾性率Ａおよび弾性率Ｂの測定には、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いる。装置の種類は以下の通りである。
装置：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製  Ｃｙｐｈｅｒ−Ｓ
カンチレバーホルダー：液滴カンチレバーホルダー
プローブ：ｎａｎｏｔｏｏｌｓ社製Ｂ１＿ＦＭＲ（ＨＤＣ製半球状チップ  先端曲率４０ｎｍ）
【００３０】
弾性率Ａおよび弾性率Ｂを測定する際に、まず、サファイア基板測定とＳａｄｅｒ法を用いて、光てこ感度およびバネ定数を校正する。サファイア基板上に工程２で用いられる特定溶媒を滴下して、溶媒を滴下したサファイア基板表面のフォースカーブ測定より、各測定条件での光てこ感度を算出する。また、試料表面よりプローブを１ｍｍ程度離し、算出した光てこ感度を固定してサーマルノイズスペクトル（熱揺らぎによるプローブの振動スペクトル）をｓａｄｅｒ法によりフィッティングすることで、バネ定数を算出する。
次に、測定対象である細胞培養基材の撥水層上にリン酸緩衝生理食塩水を滴下して、液滴（凸状のメニスカス）が形成されるようにして、室温下にて３０分間にわたってリン酸緩衝生理食塩水と撥水層とを接触させる。なお、撥水層上のリン酸緩衝生理食塩水が揮発して目減りする場合は、適宜、リン酸緩衝生理食塩水を滴下する。
次に、上記装置を用いて、撥水層の液滴と接触している部分の試料表面形状を取得する。その後、ゴミ等を避けてインデント位置を決め、フォースカーブ測定を実施する。測定は、最大押込み力２００ｎＮ、押込み速度：１Ｈｚでインデンテーションを実施する。Ｃｙｐｈｅｒ−Ｓ付属の解析ソフト（ＡＲ  ｖｅｒ１３）により、押込み曲線をヘルツモデルでフィッティングして弾性率Ａを算出する。
なお、プローブチップ形状は半球、先端曲率は４０ｎｍを用いる。フィッティング領域は力を検出してベースラインから逸脱し始めてからほぼ直線を保つ範囲内で適宜調整する。撥水層の厚みに対して押込み深さが非常に深い場合（具体的には、弾性率がｋＰａ台の場合）は、押込み深さが深くなると急激に傾きが増大し、下地の弾性率を示すようになる。この場合は、最大押込み力を小さく設定し、下地の影響を排除して弾性率を算出する。
また、使用されるリン酸緩衝生理食塩水には、ＫＣｌ（２００ｍｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（８０００ｍｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（２００ｍｇ／Ｌ）、および、Ｎａ２ＨＰＯ４（ａｎｈｙｄ.）（１１５０ｍｇ／Ｌ）が含まれる。
上記リン酸緩衝生理食塩水としては、Ｄ−ＰＢＳ（−）（和光純薬工業社製）が市販品として挙げられる。
【００３１】
なお、上記では弾性率Ａの測定方法について述べたが、使用される溶媒をリン酸緩衝生理食塩水から所定の特定溶媒に変更することにより、弾性率Ｂを測定できる。例えば、工程２において、特定溶媒として含フッ素溶媒を用いる場合は、上記リン酸緩衝生理食塩水の代わりに含フッ素溶媒を用いて、撥水層の弾性率Ｂを測定する。
なお、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）は、０．２以下であり、細胞の剥離性がより優れる点で、０．０１以下が好ましく、０．００２以下がより好ましく、０．００１以下がさらに好ましい。
なお、下限値は特に制限されないが、撥水層を構成する材料と特定溶媒との親和性の点で、０．０００００１以上が挙げられ、０．００００１以上の場合が多い。
【００３２】
上記弾性率Ａの値としては特に制限されないが、細胞の剥離性がより優れる点で、１．０×１０６〜１．０×１０１０Ｐａが好ましく、１．０×１０７〜５．０×１０９Ｐａがより好ましい。
上記弾性率Ｂの値としては特に制限されないが、細胞の剥離性がより優れる点で、２．０×１０６Ｐａ以下が好ましく、１．０×１０５Ｐａ以下がより好ましい。下限は特に制限されないが、１．０×１０２Ｐａ以上の場合が多い。
【００３３】
特定溶媒の種類は後段で詳述するが、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）の関係を満たす撥水層と特定溶媒との好適な組み合わせとしては、含フッ素樹脂、（メタ）アクリル樹脂、および、シリコーン樹脂からなる群から選択される樹脂を含む撥水層と、含フッ素溶媒、炭化水素溶媒、および、シリコーン溶媒からなる群から選択される特定溶媒との組み合わせが挙げられ、含フッ素樹脂を含む撥水層と含フッ素溶媒との組み合わせがより好ましい。
【００３４】
以下では、本工程で使用される材料について詳述し、その後、工程の手順について詳述する。
【００３５】
（水以外の溶媒（特定溶媒））
本工程で使用される溶媒としては水以外の溶媒が挙げられ、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）を満たすように、撥水層の種類に応じて適宜最適な溶媒が選択される。
水以外の溶媒としては、疎水性溶媒および親水性溶媒のいずれでもよく、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）を満たしやすい点から、疎水性溶媒が好ましい。なお、疎水性溶媒は液体培地と相分離しやすい。
なかでも、水以外の溶媒としては、含フッ素溶媒、炭化水素溶媒、または、シリコーン溶媒がより好ましく、含フッ素溶媒がさらに好ましい。なお、上記含フッ素溶媒、炭化水素溶媒、およびシリコーン溶媒は、疎水性溶媒に該当することが好ましい。
なお、上記疎水性溶媒とは、水との親和性が小さな溶媒であり、２５℃における水に対する溶解度が５０ｇ／Ｌ以下の溶媒を意図する。また、上記親水性溶媒とは、水との親和性が大きな溶媒であり、２５℃における水に対する溶解度が５０ｇ／Ｌ超の溶媒を意図する。
水以外の溶媒は、水と相分離する溶媒であることが好ましい。
また、水以外の溶媒は、１種のみを用いてもよいし、２種以上を合わせて用いてもよい。
【００３６】
上記水以外の溶媒の比重は特に制限されないが、比重１．０超の溶媒であってもよいし、比重１．０未満の溶媒であってもよい。
後段で詳述するように、水以外の溶媒の比重によって、適宜最適な撥水層との接触方法が選択される。
【００３７】
含フッ素溶媒は、フッ素原子を含む溶媒であり、例えば、含フッ素アルカン、含フッ素オレフィン、含フッ素アルキルエーテル、含フッ素アルキルアミン、含フッ素芳香族化合物などが挙げられる。
液体培地との相分離の点から、含フッ素溶媒中のフッ素原子の総含有率であるフッ素含量は、１５質量％以上が好ましく、３０質量％以上がより好ましい。上限としては、例えば、８５質量％以下であり、８０質量％以下が好ましい。
【００３８】
含フッ素溶媒の２５℃における水に対する溶解度は、液体培地との相分離の点から、５０ｇ／Ｌ以下が好ましく、１０ｇ／Ｌ以下がより好ましく、５ｇ／Ｌ以下がさらに好ましい。水に対する溶解度の下限値は、例えば、０ｇ／Ｌである。
【００３９】
含フッ素溶媒の粘度は特に制限されず、例えば、２５℃において、０．４ｍＰａ・ｓ以上が好ましく、０．４４ｍＰａ・ｓ以上がより好ましい。上限値としては、例えば、２０００ｍＰａ・ｓ以下であり、５０ｍＰａ・ｓ以下が好ましい。
【００４０】
含フッ素溶媒の密度は特に制限されず、例えば、２５℃において、１．０ｇ／ｍＬ超が好ましく、１．１ｇ／ｍＬ以上がより好ましく、細胞より十分に重いことが好ましいことから、１．２ｇ／ｍＬがさらに好ましい。上限値としては、例えば、３．０ｇ／ｍＬ以下であり、２．１ｇ／ｍＬ以下が好ましい。
【００４１】
含フッ素溶媒の表面張力は特に制限されず、例えば、２５℃において、９ｍＮ／ｍ以上が好ましく、１２ｍＮ／ｍ以上がより好ましい。上限値としては、例えば、１００ｍＮ／ｍ以下であり、８０ｍＮ／ｍ以下が好ましい。
【００４２】
含フッ素アルカンは、直鎖状、分岐鎖状および環状のいずれであってもよい。含フッ素アルカンの炭素数は、５〜２０が好ましく、６〜１０がより好ましい。含フッ素アルカンはアルカンの水素原子のすべてがフッ素原子に置き換わったペルフルオロアルカンでもよいし、水素原子の一部がフッ素原子に置き換わったハイドロフルオロアルカンでもよい。
含フッ素アルカンとしては、例えば、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロノナン、ペルフルオロデカン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン、ペルフルオロ（１，３−ジメチルシクロヘキサン）、ペルフルオロデカリン、１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６−トリデカフルオロオクタン、１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６−トリデカフルオロヘキサン、１，１，１，２，２，３，３，４，４−ノナフルオロヘキサン、１，１，１，２，２，３，４，５，５，５−デカフルオロペンタン、１，１，２，２，３，３，４−ヘプタフルオロシクロペンタン、３Ｍ社製のＦＣ−８７、ＦＣ−８４、ＦＣ−７７、ペルフルオロケロセンなどが挙げられる。
【００４３】
含フッ素オレフィンは、直鎖状、分岐鎖状および環状のいずれであってもよいが、直鎖状または分岐鎖状が好ましい。含フッ素オレフィンの炭素数は、５〜２０が好ましく、６〜１０がより好ましい。含フッ素オレフィンに含まれる不飽和結合数は、１〜１０が好ましく、１〜５がより好ましい。含フッ素オレフィンはオレフィンの水素原子のすべてがフッ素原子に置き換わったペルフルオロオレフィンでもよいし、水素原子の一部がフッ素原子に置き換わったハイドロフルオロオレフィンでもよい。
含フッ素オレフィンとしては、例えば、ペルフルオロシクロペンテン、ペルフルオロシクロヘキセン、ペルフルオロシクロヘプテン、ペルフルオロシクロオクテン、ペルフルオロシクロノネン、ペルフルオロシクロデセン、１−クロロ−３，３，３−トリフルオロプロペン、１−クロロ−２，３，３−トリフルオロプロペン、１，１，１，２，２，３，５，５，６，６，７，７，７−トリデカフルオロ−４−メトキシ−３−ヘプテンなどが挙げられる。
【００４４】
含フッ素アルキルエーテルは、酸素原子に結合する２つのアルキル基のうち少なくとも一方にフッ素原子が１以上置換していればよい。含フッ素アルキルエーテルを構成するフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基部分は、直鎖状、分岐鎖状および環状のいずれであってもよいが、直鎖状または分岐鎖状が好ましい。含フッ素アルキルエーテルに含まれるアルキル基部分の炭素数は、５〜２０が好ましく、６〜１０がより好ましい。含フッ素アルキルエーテルに含まれるフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基部分は同一であっても、異なっていてもよい。含フッ素アルキルエーテルはアルキルエーテルの水素原子のすべてがフッ素原子に置き換わったペルフルオロアルキルエーテルでもよいし、水素原子の一部がフッ素原子に置き換わったハイドロフルオロアルキルエーテルでもよい。
含フッ素アルキルエーテルとしては、例えば、１，１，２，２−テトラフルオロエチル−２，２，２−トリフルオロエチルエーテル、１−メトキシ−１，１，２，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン、１−エトキシ−１，１，２，２，３，３，４，４，４−ノナフルオロブタン、３−メトキシ−１，１，１，２，２，３，４，４，５，５，６，６，６−トリデカフルオロヘキサン、１−メトキシ−１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６，６−トリデカフルオロヘキサン、メチルノナフルオロイソブチルエーテル、エチルノナフルオロブチルエーテル、エチルノナフルオロイソブチルエーテル、１、１、１、２、２、３、４、５、５、５−デカフルオロ−３−メトキシ−４−（トリフルオロメチル）ペンタン、ＳＯＬＶＥＹ社製のＧＡＬＤＥＮ  ＨＴ５５、ＧＡＬＤＥＮ  ＨＴ７０、ＧＡＬＤＥＮ  ＨＴ９０、ＧＡＬＤＥＮ  ＺＴ１５０、ＧＡＬＤＥＮ  ＨＴ１７０、ＧＡＬＤＥＮ  ＺＴ１８０、ＧＡＬＤＥＮ  ＨＴ２００、ＦＯＭＢＬＩＮＥ  Ｙなどが挙げられる。
【００４５】
含フッ素アルキルアミンは、一級アミン、二級アミンおよび三級アミンのいずれでもよく、なかでも三級アミンが好ましい。含フッ素アルキルアミンは、窒素原子に結合するアルキル基のうちの少なくとも１つにフッ素原子が１以上置換していればよい。含フッ素アルキルアミンを構成するフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基部分は、直鎖状、分岐鎖状および環状のいずれであってもよいが、直鎖状または分岐鎖状が好ましい。含フッ素アルキルアミンに含まれる１つのアルキル基部分の炭素数は、３〜５０が好ましく、９〜３０がより好ましい。含フッ素アルキルアミンに含まれるフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基部分が２以上ある場合、それらは同一であっても、異なっていてもよい。含フッ素アルキルアミンはアルキルアミンの水素原子のすべてがフッ素原子に置き換わったペルフルオロアルキルアミンでもよいし、水素原子の一部がフッ素原子に置き換わったハイドロフルオロアルキルアミンでもよい。
含フッ素アルキルアミンとしては、例えば、ペルフルオロトリプロピルアミン、ペルフルオロトリブチルアミン、ペルフルオロトリペンチルアミン、ペルフルオロトリヘキシルアミン、ペルフルオロトリヘプチルアミン、ペルフルオロトリオクチルアミン、ペルフルオロトリノニルアミン、ペルフルオロトリデシルアミンなどが挙げられる。
【００４６】
含フッ素芳香族化合物は、芳香族化合物に少なくとも１以上のフッ素原子が置換している化合物である。含フッ素芳香族化合物の炭素数は、５〜３０が好ましく、６〜１０がより好ましい。含フッ素芳香族化合物は芳香族化合物中の水素原子のすべてがフッ素原子に置き換わった化合物でもよいし、水素原子の一部がフッ素原子に置き換わった化合物でもよい。
含フッ素芳香族化合物としては、例えば、モノフルオロベンゼン、ジフルオロベンゼン、トリフルオロベンゼン、テトラフルオロベンゼン、ペンタフルオロベンゼン、ヘキサフルオロベンゼンなどが挙げられる。
【００４７】
炭化水素溶媒は、炭素原子と水素原子とからなる溶媒であって、例えば、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素溶媒、ペンタン、ヘキサン、オクタン、デカン、２，２，４−トリメチルペンタン、２，２，３−トリメチルヘキサンなどの脂肪族炭化水素溶媒が挙げられる。
【００４８】
シリコーン溶媒としては、例えば、ジメチルシリコーンオイル、メチルフェニルシリコーンオイル、メチルハイドロジェンシリコーンオイルなどのストレートシリコーンオイル、環状ジメチルシリコーンなどの環状ポリシロキサンなどが挙げられる。
【００４９】
なお、上述した親水性溶媒の種類は特に制限されないが、例えば、プロピレングリコール１−モノメチルエーテルなどのエーテル溶媒や乳酸エチルなどのエステル溶媒が挙げられる。
【００５０】
（手順）
撥水層と特定溶媒とを接触させる方法は特に制限されないが、例えば、図３に示すように、液体培地Ｌが収容された容器１０内に特定溶媒Ｓを添加する方法が挙げられる。この方法においては、図４に示すように、特定溶媒Ｓ中に細胞培養基材１６が浸漬するようになるまで、特定溶媒Ｓを容器１０内に添加する。上述したように、特定溶媒Ｓと接触した撥水層１４の運動性が上昇し、撥水層１４上で培養された細胞Ｃが撥水層１４上から剥離し、細胞を容易に回収できる。
なお、この方法で使用される特定溶媒Ｓとしては、液体培地Ｌよりも比重の大きい溶媒が選択される。より具体的には、特定溶媒Ｓとしては、比重が１．０超である特定溶媒が好ましい。このような特定溶媒Ｓが液体培地Ｌに加えられると、特定溶媒Ｓが液体培地Ｌよりも下層側に移動する。なお、上記比重は、１．２以上がより好ましい。比重の上限値は特に制限されないが、２．１以下の場合が多い。
この方法であれば、単に液体培地Ｌを含む容器中に特定溶媒Ｓを滴下するのみで、細胞を剥離することができ、非常に簡便な方法といえる。
【００５１】
また、上記方法以外にも、図５に示すように、容器１０内の液体培地Ｌを一旦除去した後、図６に示すように、容器１０内に特定溶媒Ｓを添加して、特定溶媒Ｓ中に細胞培養基材１６を浸漬させて、特定溶媒Ｓと撥水層１４とを接触させる方法も挙げられる。
この方法においては、特定溶媒Ｓの比重は特に制限されないが、その後の細胞の回収が容易な点で、比重が１．０未満である特定溶媒を用いることが好ましい。比重が１．０未満である特定溶媒を用いる場合、図６に示す特定溶媒Ｓ中にさらに水を添加すると、図７に示すように、特定溶媒Ｓが上相に水Ｗが下相に位置する相分離構造が得られる。このような相分離構造が形成されると、通常、細胞は水相に移動する。よって、この場合、遠心分離操作などによって細胞を含む水相を容易に回収することができ、細胞の回収効率性に優れる。なお、上記比重は、０．９５以下がより好ましい。比重の下限値は特に制限されないが、０．６以上の場合が多い。
【００５２】
なお、回収された細胞の形態は特に制限されず、細胞シート（細胞がシート状に集合したもの）であっても、個々の細胞がバラバラに分離したものであってもよい。
【００５３】
＜＜第２実施形態＞＞
本発明の細胞の製造方法の第２実施形態は、以下の工程Ｂ１および工程２を有する。
工程Ｂ１：液体培地が収容され、かつ、底面上に撥水層が配置された容器内において、撥水層上で細胞の培養を行う工程
工程２：撥水層と、水以外の溶媒とを接触させて、撥水層上から細胞を剥離して回収する工程
第１実施形態では撥水層を支持する基板が用いられていたのに対して、第２実施形態では撥水層が容器の底面上に直接配置されている点以外は、同一の手順を実施するため、同一の手順（例えば、細胞の培養手順、工程２の構成など）について説明を省略し、以下では、主に、第１実施形態との差異点について詳述する。
【００５４】
上述したように、本実施形態においては、容器と、容器の底面上に配置された撥水層とを有する撥水層付き容器が用いられる。つまり、容器の底部の少なくとも一部が、基材本体に該当する。より具体的には、図８に示すように、容器１０の底面上に撥水層１４が配置されており、容器１０内には液体培地Ｌが収容されている。
撥水層の構成は、第１実施形態と同様の構成である。
容器底面上に撥水層を形成する方法は特に制限されず、上述した第１実施形態で述べた方法が挙げられる。例えば、容器の底面上に共有結合を介して重合開始剤を固定し、重合開始剤が固定された容器とモノマーとを接触させて、重合反応を開始することにより、容器の底面上から延びるポリマー鎖が合成される。
【００５５】
なお、必要に応じて、容器と撥水層との間には他の層が配置されていてもよい。例えば、両者の密着性を高めるためのプライマー層などが配置されていてもよい。
また、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）は、撥水層付き容器を用いて、上述した方法により測定できる。
【００５６】
上記第１実施形態においては、基板と基板上に配置された撥水層とを有する細胞培養基材について述べたが、本発明において細胞培養基材はこの形態には制限されない。例えば、撥水層を担持する担体の形状は、基板のように板状であってもよいし、粒状であってもよい。つまり、細胞培養基材は、粒状担体と、粒状担体上に配置された撥水層とを有する形態であってもよい。球状担体を含む粒状の細胞培養基材は、接着培養と浮遊培養の両方の側面を持つマイクロキャリア培養に好適に適用できる。
【００５７】
粒状担体は、その表面上に撥水層が配置される、粒状の部材である。
粒状担体の形状の具体例としては、球状、楕円体状、立方体状、直方体状が挙げられる。
粒状担体の粒径は、マイクロキャリア培養への適用の点から、１００〜１０００μｍが好ましく、２００〜５００μｍがより好ましい。
粒状担体を構成する材料の具体例としては、樹脂、ガラス、金属、金属酸化物（ただし、ガラス以外）、金属窒化物が挙げられる。
粒状担体の具体例としては、ガラスビーズ、樹脂粒子、シリカビーズが挙げられる。
【００５８】
粒状担体上に配置される撥水層の形態は、第１実施形態で述べた通りであり、所定の比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）を満たす。
また、粒状担体上への撥水層の形成方法は、第１実施形態で述べた通りである。
なお、撥水層は、粒状担体上の少なくとも一部に配置されていればよく、全面に配置されているのが好ましい。
【００５９】
＜＜キット＞＞
本発明は、細胞を製造するためのキットにも関する。
キットとしては、基板および基板上に配置された撥水層を有する細胞培養基材と、水以外の溶媒（特定溶媒）とを有するキットが挙げられる。本キットは、上述した第１実施形態にて使用される。
なお、細胞培養基材中の撥水層と、上記水以外の溶媒とは、以下の要件を満たす。
要件：撥水層とリン酸緩衝生理食塩水とを接触させて測定される撥水層とリン酸緩衝生理食塩水との接触部分での撥水層の弾性率Ａに対する、撥水層と特定溶媒とを接触させて測定される撥水層の特定溶媒との接触部分での撥水層の弾性率Ｂの比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）が０．２以下である。
【００６０】
基板、撥水層および特定溶媒の定義は、上述の通りである。
また、比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）の意義、測定方法、および、好適範囲も、上述の通りである。
【００６１】
また、キットの他の形態としては、容器および容器の底面上に配置された撥水層を有する撥水層付き容器と、特定溶媒とを有するキットも挙げられる。本キットは、上述した第２実施形態にて使用される。
さらに、キットの他の形態としては、粒状担体および粒状担体上に配置された撥水層を有する細胞培養基材と、特定溶媒とを有するキットも挙げられる。
これらのキットにおいても、上記と同様の比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）の要件を満たす。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
【００６３】
＜細胞培養基材の作製＞
アミノシランコートスライドガラス（品番：Ｓ８１１１、松浪硝子工業社製）を１００ｍＬサンプル管に入れ、そこへ脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、関東化学社製）７０ｍＬ、重合開始基を有する２−ブロモイソブチリルブロミド（東京化成工業社製）１．８２ｍＬ、トリエチルアミン（関東化学社製）３．１５ｍＬを加え、重合開始基をスライドグラス表面に固定化する処理を行った。ミックスローターを用いて、サンプル管内の混合液を室温（約２５℃）で１時間撹拌した。その後、サンプル管内からスライドガラスを取り出し、メタノール、ＴＨＦを用いてスライドガラスを洗浄した後、窒素気流にて乾燥を行い、重合開始剤が固定されたスライドガラス（Ａ）を得た。
【００６４】
（細胞培養基材１の作製）
活性アルミナを用いてメタクリル酸２−（パーフルオロヘキシル）エチル（Ｃ６ＦＭＡ、旭硝子社製）の精製を行った後、乾燥窒素を用いて得られた精製物のバブリングを２０分間行った。１，３−ビス（トリフルオロメチル）ベンゼン（ｍＸＨＦ、東京化成工業社製）に対しても、乾燥窒素を用いたバブリングを２０分間行った。脱酸素ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、脱酸素トルエン、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、トリス（２−ピリジルメチル）アミン（ＴＰＭＡ）、臭化銅（ＩＩ）は購入したものをそのまま用いた。
以下の調製および反応では、上記で用意した試薬を使用した。また、以下の調製および反応はすべて窒素下で行った。
１００ｍＬサンプル管にスライドガラス（Ａ）と撹拌子とを入れ、そこへＡＩＢＮ（０．０２３ｇ）、脱酸素トルエン（１０．５ｍＬ）、ｍＸＨＦ（３８．５ｍＬ）、Ｃ６ＦＭＡ（１９．９ｍＬ）を加えた。さらに、臭化銅（ＩＩ）（０．００１６ｇ）およびＴＰＭＡ（０．００２０ｇ）をＤＭＦ（０．４ｍＬ）に溶解させて得られた溶液を、サンプル管内に滴下した。次に、オイルバス中にて、８０℃で１６時間にわたってサンプル管内の混合液を撹拌した。その後、サンプル管内からスライドガラスを取り出し、メタノール、アサヒクリンＡＫ―２２５（旭硝子社製）でスライドガラスを洗浄した後、窒素気流で乾燥を行い、細胞培養基材１を得た。
なお、細胞培養基材１中の撥水層には、ポリ（メタクリル酸２−（パーフルオロヘキシル）エチル）（ＰＣ６ＦＭＡ）が含まれていた。
【００６５】
（細胞培養基材２の作製）
メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）を活性アルミナにより、精製した。脱酸素ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、トリス（２−ピリジルメチル）アミン（ＴＰＭＡ）、臭化銅（ＩＩ）は購入したものをそのまま用いた。
以下の調製および反応では、上記で用意した試薬を使用した。また、以下の調製および反応はすべて窒素下で行った。
１００ｍＬサンプル管にスライドガラス（Ａ）と撹拌子とを入れ、そこへＡＩＢＮ（０．０３３ｇ）、ＭＭＡ（７０ｍＬ）を加えた。さらに、臭化銅（ＩＩ）（０．００１６ｇ）およびＴＰＭＡ（０．００２９ｇ）をＤＭＦ（０．４ｍＬ）に溶解させて得られた溶液を、サンプル管内に滴下した。次に、オイルバス中にて、６０℃で４時間にわたってサンプル管内の混合液を撹拌した。その後、サンプル管内からスライドガラスを取り出し、メタノール、トルエンでスライドガラスを洗浄した後、窒素気流で乾燥を行い、細胞培養基材２を得た。
なお、細胞培養基材２中の撥水層には、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）が含まれていた。
【００６６】
（細胞培養基材３の作製）
２−エチルヘキシルメタクリレート（ＥＨＭＡ）を活性アルミナにより、精製した。脱酸素ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、脱酸素トルエン、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、トリス（２−ピリジルメチル）アミン（ＴＰＭＡ）、臭化銅（ＩＩ）は購入したものをそのまま用いた。
以下の調製および反応では、上記で用意した試薬を使用した。また、以下の調製および反応はすべて窒素下で行った。
１００ｍＬサンプル管にスライドガラス（Ａ）と撹拌子とを入れ、そこへＡＩＢＮ（０．０２３ｇ）、ＥＨＭＡ（３３ｍＬ）、脱酸素トルエン（３５ｍＬ）を加えた。さらに、臭化銅（ＩＩ）（０．００２２ｇ）およびＴＰＭＡ（０．００２９ｇ）をＤＭＦ（０．４ｍＬ）に溶解させて得られた溶液を、サンプル管内に滴下した。次に、オイルバス中にて、６０℃で４時間にわたってサンプル管内の混合液を撹拌した。その後、サンプル管内からスライドガラスを取り出し、メタノール、トルエンでスライドガラスを洗浄した後、窒素気流で乾燥を行い、細胞培養基材３を得た。
なお、細胞培養基材３中の撥水層には、ポリ（２−エチルヘキシルメタクリレート）（ＰＥＨＭＡ）が含まれていた。
【００６７】
＜実施例１＞
ＩＷＡＫＩ製のディッシュ（６０ｍｍ／ｎｏｎ―ｔｒｅａｔｅｄ  ｄｉｓｈ  型番１０１０−０６０）に、２ｃｍ角にカットした細胞培養基材１を入れて、細胞培養基材１にＵＶを１５分間照射して、滅菌した。
次に、細胞（ＴＩＧ３）を２０万細胞／Ｄｉｓｈとなるよう播種し、ディッシュに液体培地（Ｇｉｂｃｏ社製  ＭＥＭ）を４ｍＬ添加した。次に、得られたディッシュをインキュベータ内にて、３７℃で２４時間置き、その後、インキュベータよりディッシュを取り出した。顕微鏡にディッシュを設置し、含フッ素溶媒（特定溶媒１）４ｍＬをディッシュ内に滴下し、細胞培養基材１上の細胞の接着挙動の経時変化を観察した。
細胞培養基材１上の接着細胞が剥離すると、接着細胞が球状に変化するか、または、流されて細胞培養基材１上から無くなる。そこで、目視により、２０分後に、接着細胞が球状に変化する、または、流されて細胞培養基材１上から無くなる場合を「○」（良好）とし、５分後に接着細胞が球状に変化する、または、流されて細胞培養基材１上から無くなる場合を「◎」（優秀）、２０分後に変化がないものを「×」（不良）とした。
【００６８】
＜実施例２〜７、比較例１〜６＞
使用される細胞培養基材の種類、特定溶媒の種類、および、細胞の種類を表１および２のように変更した以外は、実施例１と同様の手順に従って、細胞の培養を行い、上記と同様の剥離性の評価を実施した。ただし、特定溶媒４においては比重が液体培地より小さいため溶媒添加後に培地相を除去し溶媒と基板を接触させた。
結果を以下の表１および２にまとめて示す。
なお、表１および２中の特定溶媒の種類は以下の通りである。また、以下の使用した特定溶媒は、いずれも、２５℃における水に対する溶解度が５０ｇ／Ｌ以下であった。
特定溶媒１：１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６−トリデカフルオロオクタン
特定溶媒２：１，１，１，２，２，３，４，５，５，５−デカフルオロ−３−メトキシ−４−（トリフルオロメチル）ペンタン
特定溶媒３：ジクロロペンタフルオロプロパン（３，３−ジクロロ−１，１，１，２，２−ペンタフルオロプロパンおよび１，３−ジクロロ−１，１，２，２，３−ペンタフルオロプロパンの２種の溶媒の混合液に該当）
特定溶媒４：ヘキサン
特定溶媒５：パーフルオロポリエーテル（Chemours社 Krytox GPL100）
【００６９】
使用した細胞を以下に示す。
ＴＩＧ３：ヒト胎児肺由来線維芽細胞、ＪＣＲＢ細胞バンク、Cat.No. JCRB0506
ｈＭＳＣ：間葉系幹細胞、ＰＴ−２５０１、ロンザジャパン社
【００７０】
なお、比較例２および５においては、細胞培養基材４としてＩＷＡＫＩ製のディッシュを用いた。上記ＩＷＡＫＩ製のディッシュには、撥水層が含まれていなかった。
また、各実施例および比較例にて得られた細胞培養基材を用いて、上述した方法により比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）を算出した。
【００７１】
【表１】
2020043766.tif 000003
【００７２】
【表２】
2020043766.tif 000004
【００７３】
表１および２より、所定の比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）を満たす場合、細胞培養基材から細胞を容易に剥離でき、細胞を容易に製造できることが確認された。
また、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）が０．００２以下の場合、細胞の剥離性がより優れることが確認された。
【００７４】
なお、基板の代わりに、容器を用いて、実施例１と同様の操作を行ったところ、実施例１と同様の結果が得られた。つまり、撥水層付き容器を用いた場合でも、所望の効果が得られた。
【００７５】
また、基板の代わりに、ガラスビーズ（粒径５００μｍ）を用いて、細胞培養基材２と同様の操作を行った後、得られたガラスビーズを用いて実施例３および実施例６と同様の操作を行ったところ、実施例３および実施例６と同様の結果が得られた。つまり、粒状の細胞培養基材を用いた場合でも、所望の効果が得られた。
【符号の説明】
【００７６】
１０    容器
１２    基板
１４    撥水層
１６    細胞培養基材
【図１】
2020043766.tif 000005
【図２】
2020043766.tif 000006
【図３】
2020043766.tif 000007
【図４】
2020043766.tif 000008
【図５】
2020043766.tif 000009
【図６】
2020043766.tif 000010
【図７】
2020043766.tif 000011
【図８】
2020043766.tif 000012