(57)【要約】      （修正有）【課題】抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体及びその使用方法の提供。【解決手段】ヒトアルファ−シヌクレインが遊離のＮ末端メチオニン残基を有する、ヒトアルファ−シヌクレインに特異的に結合する抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトアルファ−シヌクレインが遊離のＮ末端メチオニン残基を有する、ヒトアルファ−シヌクレインに特異的に結合する抗体。
【請求項２】
抗体が、ヒト及びマウスのアルファ−シヌクレインに特異的に結合し、ヒト及びマウスのアルファ−シヌクレインが遊離のＮ末端メチオニン残基を有する、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
アルファ−シヌクレインが単量体及び／又はオリゴマーアルファ−シヌクレインである、請求項１〜２のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４】
抗体が、重鎖において配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖において配列番号１８〜２０のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合する、請求項１〜３のいずれか一項記載の抗体。
【請求項５】
抗体が、配列番号２６の重鎖可変ドメイン及び配列番号２７の軽鎖可変ドメインを含む抗体と同じエピトープに結合する、請求項１〜４のいずれか一項記載の抗体。
【請求項６】
抗体が、重鎖において配列番号２１、２２及び１７のＨＶＲ、並びに軽鎖において配列番号２３〜２５のＨＶＲを含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の抗体。
【請求項７】
抗体が、配列番号２６の重鎖可変ドメイン及び配列番号２７の軽鎖可変ドメインを含む抗体をヒト化することにより得られている、請求項１〜３及び６のいずれか一項記載の抗体。
【請求項８】
抗体が、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインにおいて配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて配列番号１８〜２０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、０〜３個のアミノ酸残基が変化されている、請求項１〜７のいずれか一項記載の抗体。
【請求項９】
抗体が、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインが、配列番号２６の重鎖可変ドメインに由来し、軽鎖可変ドメインが、配列番号２７の軽鎖可変ドメインに由来する、請求項１〜８のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１０】
重鎖において配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖において配列番号１８〜２０のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合する抗体。
【請求項１１】
重鎖において配列番号２１、２２及び１７のＨＶＲ、並びに軽鎖において配列番号２３〜２５のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合する抗体。
【請求項１２】
重鎖において配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖において配列番号１８〜２０のＨＶＲを含む抗体。
【請求項１３】
重鎖において配列番号２１、２２及び１７のＨＶＲ、並びに軽鎖において配列番号２３〜２５のＨＶＲを含む抗体。
【請求項１４】
配列番号２６の重鎖可変ドメイン及び配列番号２７の軽鎖可変ドメインを含む抗体から得られた抗体。
【請求項１５】
重鎖可変ドメインにおいて配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて配列番号１８〜２０のＨＶＲを含むヒト化抗体であって、各々のＨＶＲにおいて、０〜３個のアミノ酸残基が変化されている抗体。
【請求項１６】
重鎖可変ドメインにおいて配列番号２１、２２及び１７のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号２３〜２５のＨＶＲを含むヒト化抗体であって、各々のＨＶＲにおいて、０〜３個のアミノ酸残基が変化されている抗体。
【請求項１７】
重鎖可変ドメインが、配列番号２６の重鎖可変ドメインに由来し、軽鎖可変ドメインが、配列番号２７の軽鎖可変ドメインに由来するヒト化抗体。
【請求項１８】
抗体が、血液脳関門シャトルモジュールにコンジュゲートされる、請求項１〜１７のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１９】
血液脳関門シャトルモジュールが、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８、ヒトトランスフェリン受容体又はヒトインスリン様成長因子受容体に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントである、請求項１８記載の抗体。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項記載の抗体であって、抗体が、
ａ）ヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体、又は
ｂ）ヒトサブクラスＩｇＧ４の完全長抗体、又は
ｃ）変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを伴うヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体、
ｄ）変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを伴うヒトサブクラスＩｇＧ４の完全長抗体、
ｅ）両方の重鎖における変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ並びに１つの重鎖における変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ並びにそれぞれの他の重鎖における変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを伴うヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体、又は
ｆ）両方の重鎖における変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇ並びに１つの重鎖における変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ並びにそれぞれの他の重鎖における変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを伴うヒトサブクラスＩｇＧ４の完全長抗体、である抗体。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項記載の抗体であって、抗体が、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる、及び／又は
ｉｖ）遊離のＮ末端メチオニン残基を有するアルファ−シヌクレインに特異的に結合し、改変Ｎ末端メチオニン残基を有するアルファ−シヌクレインには特異的に結合しない、
抗体。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項記載の抗体及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬的製剤。
【請求項２３】
医薬としての使用のための、請求項１〜２１のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２４】
シヌクレイノパチーの処置における使用のための、請求項１〜２１のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２５】
パーキンソン病の処置における使用のための、請求項１〜２１のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２６】
医薬の製造における、請求項１〜２１のいずれか一項記載の抗体の使用。
【請求項２７】
医薬が、パーキンソン病の処置のためである、請求項２６記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病は、黒質線条体系のドーパミン（ＤＡ）ニューロンの進行性の喪失により、並びに、レビー小体（ＬＢ）及び神経突起（ＬＮ）（原線維状アルファ−シヌクレイン凝集体から主に構成されるタンパク質性ニューロン内封入体）の存在により特徴付けられる。アルファ−シヌクレインは、脳中で、ドーパミン作動性ニューロン機能の制御において中心的な役割を果たし、ＰＤ病態生理に決定的に関与すると考えられるタンパク質である。実際に、アルファ−シヌクレインが、ＬＢの主なタンパク質成分であるとの事実の他、遺伝学研究によって、アルファ−シヌクレイン遺伝子中の特定の点変異及びその増殖が、家族性形態のＰＤを起こすことが示された。大規模な証拠によって、ドーパミン作動性シナプスでのアルファ−シヌクレインの病理が、ＰＤ脳中での神経細胞の機能不全及び変性の発症の基礎となり得ることが示されている（Bellucci, A., et al., Brain Res. 1432 (2012) 95-113）。
【０００３】
レビー体は、アルファ−シヌクレインの沈着物であり、パーキンソン病（ＰＤ）の病理学的な徴候である（Goedert, M., Nat. Rev. Neurosci 2 (2001) 492-501）。散発的なＰＤに関連する脳の病理のステージングが、Braak et al.により報告されている（Neurobiology of aging 24 (2003）197-211）。
【０００４】
アルファ−シヌクレイン原線維状凝集体は、レビー小体及びレビー神経突起の主成分である。最近の科学的研究によって、アルファ−シヌクレインの前原線維状オリゴマーが、パーキンソン病の進行において重要な要因であり得ることが示唆されている（Luk, K.C., et al., Science 338 (2012）949-953；Auluck, P.K., et al., Science 295 (2002）865-868；Bodner, R.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006）4246-4251；Bucciantini, M., et al., J. Biol. Chem. 279 (2004）31374-31382；El-Agnaf, O.M., et al., FASEB J. 20 (2006）419-425；Kayed, R., et al., Science 300 (2003）486-489；Lashuel, H.A., et al., J. Mol. Biol. 322 (2002） 1089-1102；Masliah, E., et al., Science 287 (2000）1265-1269.）。
【０００５】
Chai, Y-J., et al.は、分泌型オリゴマー形態のシヌクレインが、膜輸送の複数の工程に影響することを報告している（FEBS Lett. 587 (2013）452-459）。アルファ−シヌクレインにより誘導されたＢＶ−２細胞のエキソソーム：ＰＤにおける神経変性の重要なメディエーターが、Chang, C. et al.により報告されている（Neurosci. Lett. 548 (2013）190-195）。Feng, R.L., et al.は、アルファ−シヌクレインが、膜コンダクタンスにおける変化を媒介すること：細胞の脆弱性におけるアルファ−シヌクレインのオリゴマーについての潜在的な役割を報告している（Eur. J. Neurosci. 32 (2010）10-17）。Lee, H-J., et al.は、オートファジー不全が、アルファ−シヌクレインのエキソサイトーシス及び細胞間移動を促進することを報告している（Exp. Mol. Med. 45 (2013） e22）。レビー小体を伴う認知症、パーキンソン病、及びパーキンソン病認知症におけるアルファ−シヌクレイン凝集のシナプス病理が、Schulz-Schaeffer, W.J.により報告されている（Acta Neuropathol. 120 (2010) 131-143）。
【０００６】
ヒト脳中のアルファ−シヌクレインの大部分が、Ｎ末端アセチル化されており（Kellie, J.F., et al., Sci. Rep. 4 (2014）5797）、このＮ末端アセチル化は、アルファ−シヌクレインを凝集から阻害する（Bartels, T., et al., PLoS One 9 (2014）e103727）。
【０００７】
組換えアルファ−シヌクレインの異なるオリゴマー形態が報告されている：Ａ型オリゴマー（Ｃａ２＋流入に対する細胞毒性効果）、Ｃ型オリゴマー（播種種を凝集する）、脂質と混合された線維（細胞内凝集体の凝集を播種する）、三重プロリン（ＴＰ）変異体Ａ３０Ｐ／Ａ５６Ｐ／Ａ７６Ｐ（主に毒性オリゴマーを形成する）（例えば、Danzer, K.M., et al., J. Neurosci. 27 (2007）9220-9232；Danzer, K.M., et al. J. Neurochem. 111 (2009) 192-203；Luk, C.K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009) 20051-20056；Desplates, P., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009）13010-13015；Karpinar, D.P., et al., EMBO J. 28 (2009) 3256-3268；Lee, H-J., et al., J. Biol. Chem. 285 (2010）9262-9272；Hansen, C., et al., J. Clin. Invest. 121 (2011) 715-725を参照のこと）。
【０００８】
病理学的なアルファ−シヌクレインの伝達は、非トランスジェニックマウスにおいてパーキンソン様神経変性を開始することが、Luk, K.C., et al.により報告されている（Science 338 (2012）949-953）。アルファ−シヌクレインオリゴマーにより誘導される播種は、アルファ−シヌクレインの病理の伝播及びアルファ−シヌクレインオリゴマーのエキソソーム性の細胞間伝達についての証拠を提供することが、Danzer, K.M., et al.により報告されている（J. Neurochem. 111 (2009）192-203；Mol. Neurodegen. 7 (2012）42）。Braidy et al.は、初代ヒト胎児腸ニューロンにおけるインビトロでのアルファ−シヌクレイン伝達及びミトコンドリア毒性を報告している（Neurotox. Res. (2013）epub on October 5, 2013）。Desplats, P., et al.は、アルファ−シヌクレインのニューロン間伝達を通じた封入体形成及び神経細胞死を報告している（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009）13010-13015）。ニューロンからアストログリアへのアルファ−シヌクレインの直接移動は、シヌクレイノパチーにおいて炎症反応を起こすことが、Lee et al.により報告されている（J. Biol. Chem. 285 (2010）9262-9272）。Lee, S-J., et al.は、アルファ−シヌクレイン凝集体の細胞間伝達を報告している（Meth. Mol. Biol. 849 (2012）347-359；Nat. Rev. Neurol. 6 (2010）702-706）。アルファ−シヌクレイン凝集シードの可能な伝達によるアルファ−シヌクレイン病理の進行の、恐らくは最も強力な証拠は、それらの脳に１１〜１６年前に移植された胎児ニューロン内のレビー病理を提示する特定のＰＤ患者の脳の死後分析から来ている（Li, J-Y., et al., Nat. Med. 14 (2008）501-503）。
【０００９】
凝集したアルファ−シヌクレインは、インビボでドーパミン作動性神経毒性を媒介する（Periquet, M., et al., J. Neurosci. 27 (2007）3338-3346）。Pieri, L., et al.は、原線維状アルファ−シヌクレイン及びハンチンチンエクソン１の会合体が細胞に毒性であることを報告している（Biophys. J. 102 (2012）2894-2905）。Van Rooijen et al.は、機構の探索において、オリゴマーアルファ−シヌクレインによる膜透過性を報告している（PLoS One 5 (2010）e14292）。
【００１０】
非常に最近、Wagner et al.は、細胞アッセイにおいて及びアルファ−シヌクレインのトランスジェニックマウスモデルにおいて、小分子Ａｎｌｅ１３８ｂが、パーキンソン病の疾患修飾治療のために有用であり得る保護的なアルファ−シヌクレインのオリゴマーモジュレーターとして作用することを実証した（Wagner, J, et al., Acta Neuropathol. 125 (2013）795-813）。Lynch, S.M. et al.は、アルファ−シヌクレインの非アミロイド成分に対するｓｃＦｖ細胞内抗体が、細胞内凝集及び毒性を低下させることを報告している（J. Mol. Biol. 377 (2008）136-147）。パーキンソン病及び関連障害の新規処置として、アルファ−シヌクレイン凝集及び毒性の阻害剤を設計するための戦略が、El-Agnaf, O.M., et al.らにより報告されている（FASEB J. (2004)）。Emadi, S., et al.は、ヒト一本鎖抗体フラグメントを用いたアルファ−シヌクレインの凝集の阻害、及び凝集を阻害し、アルファ−シヌクレイン誘導性の毒性を防止するオリゴマーアルファ−シヌクレインに対するヒト一本鎖抗体フラグメントの単離を報告している（Biochem. 43 (2004）2871-2878；J. Mol. Biol. 368 (2007）1132-1144）。Smith et al.は、アルファ−シヌクレインの凝集及び神経毒性に対する静脈内免疫グロブリンの効果を報告している（Int. Immunopharmacol. 14 (2012）550-557）。パーキンソン病及び他のシヌクレイノパチーにおける治療戦略としての細胞内及び細胞外アルファ−シヌクレインの標的化が、Vekrelis, K.及びStefanis, L.により報告されている（Expert. Opin. Ther. Targets 16 (2012）421-432）。
【００１１】
それぞれのトランスジェニックマウスにおける脳シヌクレイノパチーの抗体補助クリアランスが、能動（Masliah, E., et al., Neuron 46 (2005）857-868）及び受動（Masliah, E., et al., PLoS One 6 (2011）e19338）免疫化パラダイムにおいて実証された。特異的抗体による細胞外アルファ−シヌクレインの結合によって、細胞間凝集体伝達が防止されることが、Bae, E-J., et al.により報告された（J. Neurosci. 32 (2012）13454-13469）。
【００１２】
レビー小体病を処置するためのアルファ−シヌクレインエピトープのミモトープの使用が、ＷＯ  ２０１１／０２０１３３において報告されている。ＷＯ  ２００７／０１１９０７において、アルファ−シヌクレイン抗体及びそれに関連する方法が報告されている。高度に荷電したプロテアソームリターゲット配列との融合によって、可溶性細胞質発現及び多様な抗シヌクレインの細胞内抗体の効力が増加することが、Joshi et al.により報告されている（MABS 4 (2012）686-693）。Emadi et al.（J. Mol. Biol. 368 (2007）1132-1144）は、凝集を阻害し、アルファ−シヌクレイン誘導性の毒性を防止するオリゴマーアルファ−シヌクレインに対するヒト一本鎖抗体フラグメントの単離を報告している。アルファ−シヌクレインの形態学的に別個のオリゴマー形態の検出が、Emadi et al.により報告されている（J. Biol. Chem. 284 (2009）11048-11058）。Zhou et al.（Mol. Ther. 10 (2004）1023-1031）は、ヒト一本鎖Ｆｖ細胞内抗体が、過剰発現されたアルファ−シヌクレインの異常な細胞効果をブロックすることを報告している。アルファ−シヌクレインに対する抗体によって、生細胞内でのオリゴマー化が低下することが、Nasstrom et al.により報告されている（PLoS One 6 (2011） e27230）。前原線維結合抗体並びにパーキンソン病、レビー小体を伴う認知症及び他のアルファ−シヌクレイノパチーのための治療方法及び診断方法におけるそれらの使用が、ＷＯ  ２０１１／１０４６９６において報告されている。原子間力顕微鏡法及びファージディスプレイ技術を使用した、特異的なタンパク質形態に対する組換え抗体の単離が、Barkhordarian et al.により報告されている（Prot. Eng. Des. Select. 19 (2006）497-502）。Kvam et al.（PLoS One 4 (2009）e5727）は、生細胞における線維状ポリグルタミンタンパク質の立体構造の標的化によって、凝集及び細胞毒性が増大することを報告している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体及びその使用方法を提供する。
【００１４】
本明細書において報告する一態様は、ヒトアルファ−シヌクレインに特異的に結合する抗体であり、ヒトアルファ−シヌクレインは、遊離のＮ末端メチオニン残基を有する。
【００１５】
用語「遊離のＮ末端メチオニン残基」は、ポリペプチドのＮ末端に位置付けられ、ポリペプチドの残部にコンジュゲートされるアミド結合を除く、改変されないポリペプチド中のメチオニン残基を意味する。そのような遊離のＮ末端メチオニン残基は、一実施形態において、非改変メチオニン残基である。そのような遊離のＮ末端メチオニン残基は、一実施形態において、遊離アミノ基を有する。ヒトアルファ−シヌクレインは、配列番号４０のアミノ酸配列を有する。
【００１６】
一実施形態において、抗体は、ヒト及びマウスのアルファ−シヌクレインに特異的に結合し、ヒト及びマウスのアルファ−シヌクレインは、遊離のＮ末端メチオニン残基を有する。
【００１７】
一実施形態において、アルファ−シヌクレインは、単量体アルファ−シヌクレインである。
【００１８】
一実施形態において、アルファ−シヌクレインは、単量体及びオリゴマーアルファ−シヌクレインである。
【００１９】
一実施形態において、抗体は、重鎖において配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖において配列番号１８〜２０のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープ又は重複するエピトープに結合する。
【００２０】
一実施形態において、抗体は、重鎖において配列番号２１、２２及び１７のＨＶＲ、並びに軽鎖において配列番号２３〜２５のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープ又は重複するエピトープに結合する。
【００２１】
一実施形態において、抗体は、配列番号２６の重鎖可変ドメイン及び配列番号２７の軽鎖可変ドメインを含む抗体と同じエピトープ又は重複するエピトープに結合する。
【００２２】
一実施形態において、抗体は、重鎖において配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖において配列番号１８〜２０のＨＶＲを含む。
【００２３】
一実施形態において、抗体は、重鎖において配列番号２１、２２及び１７のＨＶＲ、並びに軽鎖において配列番号２３〜２５のＨＶＲを含む。
【００２４】
一実施形態において、抗体は、配列番号２６の重鎖可変ドメイン及び配列番号２７の軽鎖可変ドメインを含む抗体をヒト化することにより得られている。
【００２５】
一実施形態において、抗体は、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインにおいて配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて配列番号１８〜２０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、０〜３個のアミノ酸残基が変化されている。
【００２６】
一実施形態において、抗体は、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインにおいて配列番号２１、２２及び１７のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号２３〜２５のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、０〜３個のアミノ酸残基が変化されている。
【００２７】
一実施形態において、抗体はヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインは、配列番号２６の重鎖可変ドメインに由来し、軽鎖可変ドメインは、配列番号２７の軽鎖可変ドメインに由来する。
【００２８】
本明細書において報告する一態様は、重鎖において配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖において配列番号１８〜２０のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープ又は重複するエピトープに結合する抗体である。
【００２９】
本明細書において報告する一態様は、配列番号２６の重鎖可変ドメイン及び配列番号２７の軽鎖可変ドメインを含む抗体と同じ又は重複するエピトープに結合する抗体である。
【００３０】
本明細書において報告する一態様は、重鎖において配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖において配列番号１８〜２０のＨＶＲを含む抗体である。
【００３１】
本明細書において報告する一態様は、重鎖において配列番号２１、２２及び１７のＨＶＲ、並びに軽鎖において配列番号２３〜２５のＨＶＲを含む抗体である。
【００３２】
本明細書において報告する一態様は、配列番号２６の重鎖可変ドメイン及び配列番号２７の軽鎖可変ドメインを含む抗体から得られた変異型抗体である。
【００３３】
一実施形態において、変異型抗体は、配列番号２６の重鎖可変ドメイン及び配列番号２７の軽鎖可変ドメインを含む抗体をヒト化することにより得られたヒト化抗体である。
【００３４】
本明細書において報告する一態様は、重鎖可変ドメインにおいて配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて配列番号１８〜２０のＨＶＲを含むヒト化抗体であって、各々のＨＶＲにおいて、０〜３個のアミノ酸残基が変化されている。
【００３５】
本明細書において報告する一態様は、重鎖可変ドメインにおいて配列番号２１、２２及び１７のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号２３〜２５のＨＶＲを含むヒト化抗体であって、各々のＨＶＲにおいて、０〜３個のアミノ酸残基が変化されている。
【００３６】
本明細書において報告する一態様は、重鎖可変ドメインが、配列番号２６の重鎖可変ドメインに由来し、軽鎖可変ドメインが、配列番号２７の軽鎖可変ドメインに由来するヒト化抗体である。
【００３７】
全ての先の態様の一実施形態において、抗体は、血液脳関門シャトルモジュールにコンジュゲートされる。
【００３８】
一実施形態において、血液脳関門シャトルモジュールは、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８、ヒトトランスフェリン受容体又はヒトインスリン様成長因子受容体に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントである。
【００３９】
全ての先の態様の一実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。
【００４０】
全ての先の態様の一実施形態において、抗体は、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。
【００４１】
全ての先の態様の一実施形態において、抗体は、
ａ）ヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体、又は
ｂ）ヒトサブクラスＩｇＧ４の完全長抗体、又は
ｃ）変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを伴うヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体、
ｄ）変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを伴うヒトサブクラスＩｇＧ４の完全長抗体、
ｅ）両方の重鎖における変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ並びに１つの重鎖における変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ並びにそれぞれの他の重鎖における変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを伴うヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体、又は
ｆ）両方の重鎖における変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇ並びに１つの重鎖における変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ並びにそれぞれの他の重鎖における変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを伴うヒトサブクラスＩｇＧ４の完全長抗体、
である。
【００４２】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
【００４３】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて
ｉ）可変ドメインが、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
【００４４】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２６の非ヒト（ウサギ）可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２７の非ヒト（ウサギ）可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
【００４５】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
【００４６】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
【００４７】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２６のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２７のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
【００４８】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む第１抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域が、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ又はアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃのいずれかを含み、
ｂ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第２抗体重鎖を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、又は、定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含み、
ｃ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
【００４９】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む第１抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域が、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ又はアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃのいずれかを含み、
ｂ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第２抗体重鎖を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、  
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、又は、定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含み、
ｃ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
【００５０】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む第１抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２６のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域が、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ又はアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃのいずれかを含み、
ｂ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第２抗体重鎖を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２６のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、又は、定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含み、
ｃ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２７のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
【００５１】
一実施形態において、抗体フラグメントは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、配列番号５６の重鎖可変ドメインのヒト化形態である重鎖可変ドメイン及び配列番号５７の軽鎖可変ドメインのヒト化形態である軽鎖可変ドメインを含む。
【００５２】
全ての先の態様の一実施形態において、抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる、及び／又は
ｉｖ）遊離のＮ末端メチオニン残基を有するアルファ−シヌクレインに特異的に結合し、改変Ｎ末端メチオニン残基を有するアルファ−シヌクレインには特異的に結合しない。
【００５３】
本明細書において報告する一態様は、ヒトアルファ−シヌクレインに特異的に結合する抗体であり、抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【００５４】
全ての態様及び実施形態の一実施形態において、ヒト神経細胞は、テトラサイクリン制御されたｖ−ｍｙｃ過剰発現ヒト中脳由来細胞株である。全ての態様及び実施形態の一実施形態において、ヒト神経細胞は、Lundヒト中脳（ＬＵＨＭＥＳ）細胞である。
【００５５】
一実施形態において、カスパーゼ活性は、カスパーゼ３及び／又はカスパーゼ７活性である。
【００５６】
一実施形態において、抗体は、シヌクレイノパチーの処置における使用のためである。
【００５７】
一実施形態において、抗体は、パーキンソン病の処置における使用のためである。
【００５８】
一実施形態において、抗体は、エフェクター機能サイレントである。一実施形態において、抗体は、エフェクター機能を有さない。
【００５９】
一実施形態において、抗体は、アミノ酸配列ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥＧ（配列番号０１）からなるペプチドに特異的に結合する。
【００６０】
一実施形態において、抗体は、単量体ヒトアルファ−シヌクレインについて、１０−０９M未満及び１０−０７M超の結合親和性を有する。
【００６１】
一実施形態において、抗体は、単量体及びオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインに特異的に結合する。
【００６２】
一実施形態において、抗体は、重鎖可変ドメインにおいて配列番号０２〜０４のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて配列番号０５〜０７のＨＶＲを含む。
【００６３】
一実施形態において、抗体は、重鎖可変ドメインにおいて配列番号０８、０９及び０４のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号１０〜１２のＨＶＲを含む。
【００６４】
一実施形態において、抗体は、配列番号１３からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号１４からなる軽鎖可変ドメインを含む。
【００６５】
一実施形態において、抗体は、配列番号１３からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号１４からなる軽鎖可変ドメインを含む抗体をヒト化することにより得られている。
【００６６】
一実施形態において、抗体は、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインにおいて配列番号０２〜０４のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて配列番号０５〜０７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、３個までのアミノ酸残基が変化され得る。
【００６７】
一実施形態において、抗体は、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインにおいて配列番号０８、０９及び０４のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号１０〜１２のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、３個までのアミノ酸残基が変化され得る。
【００６８】
一実施形態において、抗体はヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインは、配列番号１３からなる重鎖可変ドメインに由来し、軽鎖可変ドメインは、配列番号１４からなる軽鎖可変ドメインに由来する。
【００６９】
一実施形態において、抗体は、重鎖において配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖において配列番号１８〜２０のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合する。
【００７０】
一実施形態において、抗体は、重鎖において配列番号２１、２２及び１７のＨＶＲ、並びに軽鎖において配列番号２３〜２５のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合する。
【００７１】
一実施形態において、抗体は、配列番号２６からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２７からなる軽鎖可変ドメインを含む。
【００７２】
一実施形態において、抗体は、配列番号２６からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２７からなる軽鎖可変ドメインを含む抗体をヒト化することにより得られている。
【００７３】
一実施形態において、抗体は、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインにおいて配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて配列番号１８〜２０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、３個までのアミノ酸残基が変化され得る。
【００７４】
一実施形態において、抗体は、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインにおいて配列番号２１、２２及び１７のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号２３〜２５のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、３個までのアミノ酸残基が変化され得る。
【００７５】
一実施形態において、抗体はヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインは、配列番号２６からなる重鎖可変ドメインに由来し、軽鎖可変ドメインは、配列番号２７からなる軽鎖可変ドメインに由来する。
【００７６】
一実施形態において、抗体は、重鎖において配列番号２８〜３０のＨＶＲ、及び軽鎖において配列番号３１〜３３のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合する。
【００７７】
一実施形態において、抗体は、重鎖において配列番号２８、３４及び３０のＨＶＲ、並びに軽鎖において配列番号３５〜３７のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合する。
【００７８】
一実施形態において、抗体は、配列番号３８からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号３９からなる軽鎖可変ドメインを含む。
【００７９】
一実施形態において、抗体は、配列番号３８からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号３９からなる軽鎖可変ドメインを含む抗体をヒト化することにより得られている。
【００８０】
一実施形態において、抗体は、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインにおいて配列番号２８〜３０のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて配列番号３１〜３３のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、３個までのアミノ酸残基が変化され得る。
【００８１】
一実施形態において、抗体は、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインにおいて配列番号２８、３４及び３０のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号３５〜３７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、３個までのアミノ酸残基が変化され得る。
【００８２】
一実施形態において、抗体は、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインは、配列番号３８からなる重鎖可変ドメインに由来し、軽鎖可変ドメインは、配列番号３９からなる軽鎖可変ドメインに由来する。
【００８３】
一実施形態において、抗体は、原線維状ヒトアルファ−シヌクレインに特異的に結合するが、非原線維状ヒトアルファ−シヌクレインには結合しない。
【００８４】
一実施形態において、抗体は、血液脳関門シャトルモジュールにコンジュゲートされる。
【００８５】
一実施形態において、血液脳関門シャトルモジュールは、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８、ヒトトランスフェリン受容体又はヒトインスリン様成長因子受容体に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントである。
【００８６】
一実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。
【００８７】
一実施形態において、抗体は、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。
【００８８】
一実施形態において、抗体は、ヒトアルファ−シヌクレインに結合する抗体フラグメントであり、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【００８９】
一実施形態において、抗体は、
ａ）ヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体、又は
ｂ）ヒトサブクラスＩｇＧ４の完全長抗体、又は
ｃ）変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを伴うヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体、
ｄ）変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを伴うヒトサブクラスＩｇＧ４の完全長抗体、
ｅ）両方の重鎖における変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ並びに１つの重鎖における変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ並びにそれぞれの他の重鎖における変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを伴うヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体、又は
ｆ）両方の重鎖における変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇ並びに１つの重鎖における変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ並びにそれぞれの他の重鎖における変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを伴うヒトサブクラスＩｇＧ４の完全長抗体、
である。
【００９０】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号０２、配列番号０３及び配列番号０４のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号０５、配列番号０６及び配列番号０７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【００９１】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号０８、配列番号０９及び配列番号０４のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【００９２】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１３の非ヒト（ウサギ）可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１４の非ヒト（ウサギ）可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【００９３】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【００９４】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【００９５】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２６の非ヒト（ウサギ）可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２７の非ヒト（ウサギ）可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【００９６】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【００９７】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２８、配列番号３４及び配列番号３０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【００９８】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号３８の非ヒト（ウサギ）可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号３９の非ヒト（ウサギ）可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【００９９】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号０２、配列番号０３及び配列番号０４のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号０５、配列番号０６及び配列番号０７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【０１００】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号０８、配列番号０９及び配列番号０４のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【０１０１】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１３のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１４のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【０１０２】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【０１０３】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【０１０４】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２６のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２７のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【０１０５】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【０１０６】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２８、配列番号３４及び配列番号３０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【０１０７】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号３８のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号３９のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【０１０８】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む第１抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号０２、配列番号０３及び配列番号０４のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく，  
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域が、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ又はアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃのいずれかを含み、
ｂ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第２抗体重鎖を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号０２、配列番号０３及び配列番号０４のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、又は、定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含み、
ｃ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号０５、配列番号０６及び配列番号０７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｄ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【０１０９】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む第１抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号０８、配列番号０９及び配列番号０４のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく，
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域が、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ又はアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃのいずれかを含み、
ｂ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第２抗体重鎖を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号０８、配列番号０９及び配列番号０４のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、又は、定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含み、
ｃ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｄ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【０１１０】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む第１抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１３のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域が、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ又はアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃのいずれかを含み、
ｂ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第２抗体重鎖を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１３のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、又は、定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含み、
ｃ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１４のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｄ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【０１１１】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む第１抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域が、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ又はアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃのいずれかを含み、
ｂ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第２抗体重鎖を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、又は、定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含み、
ｃ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｄ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【０１１２】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む第１抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域が、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ又はアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃのいずれかを含み、
ｂ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第２抗体重鎖を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、又は、定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含み、
ｃ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｄ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【０１１３】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む第１抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２６のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域が、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ又はアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃのいずれかを含み、
ｂ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第２抗体重鎖を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２６のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、又は、定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含み、
ｃ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２７のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｄ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【０１１４】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む第１抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域が、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ又はアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃのいずれかを含み、
ｂ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第２抗体重鎖を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、又は、定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含み、
ｃ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｄ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【０１１５】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む第１抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２８、配列番号３４及び配列番号３０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域が、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ又はアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃのいずれかを含み、
ｂ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第２抗体重鎖を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２８、配列番号３４及び配列番号３０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、又は、定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含み、
ｃ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｄ）抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【０１１６】
本明細書において報告する一態様は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする：
ａ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む第１抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号３８のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、  
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域が、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ又はアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃのいずれかを含み、
ｂ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第２抗体重鎖を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号３８のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、又は、定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含み、
ｃ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号３９のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｄ）抗体は、  
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
【０１１７】
一実施形態において、抗体フラグメントは、配列番号５６の重鎖可変ドメインのヒト化形態である重鎖可変ドメイン及び配列番号５７の軽鎖可変ドメインのヒト化形態である軽鎖可変ドメインを含む。
【０１１８】
本明細書において報告する一態様は、本明細書において報告する抗体をコードする単離核酸である。
【０１１９】
本明細書において報告する一態様は、本明細書において報告する核酸を含む宿主細胞である。
【０１２０】
本明細書において報告する一態様は、抗体が産生されるように、本明細書において報告する宿主細胞を培養する工程を含む、抗体を産生する方法である。
【０１２１】
一実施形態において、方法は、細胞又は培養培地から抗体を回収する工程を更に含む。
【０１２２】
本明細書において報告する一態様は、本明細書において報告する抗体及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬的製剤である。
【０１２３】
一実施形態において、医薬的製剤は、追加の治療的薬剤を更に含む。
【０１２４】
本明細書において報告する一態様は、医薬としての使用のための、本明細書において報告する抗体である。
【０１２５】
本明細書において報告する一態様は、シヌクレイノパチーの処置における使用のための、本明細書において報告する抗体である。
【０１２６】
本明細書において報告する一態様は、パーキンソン病の処置における使用のための、本明細書において報告する抗体である。
【０１２７】
本明細書において報告する一態様は、ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性の阻害における使用のための、本明細書において報告する抗体である。
【０１２８】
本明細書において報告する一態様は、ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達の阻害における使用のための、本明細書において報告する抗体である。
【０１２９】
本明細書において報告する一態様は、神経細胞又はグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性の低下における使用のための、本明細書において報告する抗体である。
【０１３０】
本明細書において報告する一態様は、医薬の製造における、本明細書において報告する抗体の使用である。
【０１３１】
一実施形態において、医薬は、パーキンソン病の処置のためである。
【０１３２】
一実施形態において、医薬は、ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害するためである。
【０１３３】
一実施形態において、医薬は、ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害するためである。
【０１３４】
一実施形態において、医薬は、神経細胞又はグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させるためである。
【０１３５】
本明細書において報告する一態様は、本明細書において報告する抗体の効果的な量を個体に投与することを含む、パーキンソン病を有する個体を処置する方法である。
【０１３６】
本明細書において報告する一態様は、ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害するための、本明細書において報告する抗体の効果的な量を個体に投与することを含む、個体において、ヒトニューロン及びグリア細胞におけるアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する方法である。
【０１３７】
本明細書において報告する一態様は、ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害するための、本明細書において報告する抗体の効果的な量を個体に投与することを含む、個体において、ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する方法である。
【０１３８】
本明細書において報告する一態様は、ヒトニューロン及びグリア細胞におけるアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性の阻害における、本明細書において報告する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の使用である。
【０１３９】
本明細書において報告する一態様は、ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達の阻害における、本明細書において報告する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の使用である。
【０１４０】
本明細書において報告する一態様は、神経細胞又はグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性の低下における、本明細書において報告する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の使用である。
【０１４１】
本明細書において報告する抗体は、パーキンソン病の処置において使用することができる。この理論により拘束されることなく、抗体は、毒性オリゴマーアルファ−シヌクレインの拡大を阻害する、又はニューロン及びグリア細胞による毒性オリゴマーアルファ−シヌクレインの取り込みを阻害する、又は神経炎症を低下させる。
【０１４２】
本明細書において報告する抗体を用いて、シヌクレイノパチー及び神経病理の進行の阻害／低下が影響され得る。
【０１４３】
本明細書において報告する抗体は、パーキンソン病の発生から保護するために使用することができる、又は、更に、パーキンソン病の進行を止めるために使用することができる。
【０１４４】
一実施形態において、本明細書において報告する抗体は、ｉ）アルファ−シヌクレイントランスジェニックマウス及びパーキンソン病患者の脳切片上でアルファ−シヌクレインに結合する；及び／又はＬＵＨＭＥＳ細胞においてアルファ−シヌクレインを標識する。
【０１４５】
本明細書において報告する抗体は、シヌクレイノパチーの処置のために使用することができる。シヌクレイノパチーの中には、脳鉄蓄積１型（ＮＢＩＡ１）を伴う神経変性、純粋自律神経不全症、ダウン症候群、グアム複合、及びいくつかのレビー小体障害、例えばびまん性レビー小体疾患（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病のレビー小体バリアント（ＬＢＶＡＤ）、特定の形態のゴーシェ病及びパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）がある。
【０１４６】
本明細書において報告する一態様は、ヒトアルファ−シヌクレインにおける配列番号０１のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体である。
【０１４７】
本明細書において報告する一態様は、配列番号１３の重鎖可変ドメイン及び配列番号１４の軽鎖可変ドメインを含む抗体と同じエピトープに結合する抗体である。
【０１４８】
本明細書において報告する一態様は、配列番号２６の重鎖可変ドメイン及び配列番号２７の軽鎖可変ドメインを含む抗体と同じエピトープに結合する抗体である。
【０１４９】
本明細書において報告する一態様は、配列番号３８の重鎖可変ドメイン及び配列番号３９の軽鎖可変ドメインを含む抗体と同じエピトープに結合する抗体である。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】抗アルファ−シヌクレイン抗体００１７の濃度依存的結合特異性；レーン：１）原線維状アルファ−シヌクレイン調製物、２）三重プロリン変異体アルファ−シヌクレインオリゴマー、３）Ａ型アルファ−シヌクレインオリゴマー、４）Ｃ型アルファ−シヌクレインオリゴマー。
【図２】抗アルファ−シヌクレイン抗体００１８の濃度依存的結合特異性；レーン：１）原線維状アルファ−シヌクレイン調製物、２）三重プロリン変異体アルファ−シヌクレインオリゴマー、３）Ａ型アルファ−シヌクレインオリゴマー、４）Ｃ型アルファ−シヌクレインオリゴマー。
【図３】抗アルファ−シヌクレイン抗体００８１の濃度依存的結合特異性；レーン：１）原線維状アルファ−シヌクレイン調製物、２）三重プロリン変異体アルファ−シヌクレインオリゴマー、３）Ａ型アルファ−シヌクレインオリゴマー、４）Ｃ型アルファ−シヌクレインオリゴマー。
【図４】アルファ−シヌクレイン［Ａ３０Ｐ］−トランスジェニックマウスの脳幹におけるアルファ−シヌクレイン染色；新鮮凍結１０μm矢状脳切片；４０×倍率；同一の照明条件での全ての画像；矢じりは、レビー神経突起様封入体を示す。
【図５】パーキンソン病患者（Ａ）、パーキンソン病の併存疾患を伴うアルツハイマー病患者（Ｂ）及び進行性核上性麻痺（ＰＳＰ、タウオパチー）（Ｃ）を伴うアルツハイマー病患者のヒト脳皮質における抗体００１７及び００１８の染色；矢印：レビー小体様封入体；矢じり：レビー神経突起様封入体。
【図６】１５月齢のアルファ−シヌクレイン変異体Ａ３０Ｐトランスジェニックマウス中への特異的ｍＡｂ（５日間にわたる２×６０mg/kg抗体又はＰＢＳ）の急性末梢注射時でのアルファ−シヌクレイン変異体Ａ３０Ｐトランスジェニックマウスにおける脳アルファ−シヌクレイン病理の標識；新鮮凍結２０μm矢状脳切片を、抗マウスＩｇＧ１抗体−ＡＦ５５５コンジュゲートを用いて、又はそれぞれの抗アルファ−シヌクレイン抗体及び抗マウスＩｇＧ１抗体−ＡＦ５５５コンジュゲートを用いて染色した；脳幹領域の４０×倍率；同等の照明での全ての画像；矢印：レビー小体様封入体；矢じり：レビー神経突起様封入体。
【図７Ａ】ＬＵＨＭＥＳ細胞上のＳＨＳＹ５Ｙ細胞からの組換えアルファ−シヌクレインからの条件培地の細胞毒性；（Ａ）抗体００１７。
【図７Ｂ】ＬＵＨＭＥＳ細胞上のＳＨＳＹ５Ｙ細胞からの組換えアルファ−シヌクレインからの条件培地の細胞毒性；（Ｂ）抗体００１８。
【図７Ｃ】ＬＵＨＭＥＳ細胞上のＳＨＳＹ５Ｙ細胞からの組換えアルファ−シヌクレインからの条件培地の細胞毒性；（Ｃ）抗体１２Ｆ４（参照）。
【図８】組換えアルファ−シヌクレイン発現ＳＨＳＹ５Ｙ細胞からの条件培地を用いたＬＵＨＭＥＳ細胞の処理；ａ）対照培地＝ＬＵＨＭＥＳ細胞用の分化培地及びｂ）条件培地＝組換えアルファ−シヌクレイン発現ＳＨＳＹ５Ｙ細胞から６日後に収集したＬＵＨＭＥＳ分化培地を用いた、新鮮に蒔かれたＬＵＨＭＥＳ細胞での３日間の処理。
【図９】抗体００１７及び００１８は、細胞外培地からアルファ−シヌクレインオリゴマーを免疫枯渇することができ、それにより、これらの抗体は、アルファ−シヌクレインオリゴマーの毒性を低下させる。
【図１０】融解転移の生データ（白丸、４０℃−最高値）及び、実施例１１に従って決定される対応する適合（実線）。
【図１１】抗アルファ−シヌクレイン抗体血液脳関門シャトルモジュールコンジュゲートの急性末梢注射時でのアルファ−シヌクレイン変異体Ａ３０Ｐトランスジェニックマウスにおける脳アルファ−シヌクレインの病理、血管系及び実質の標識。
【図１２】パーキンソン病患者の脳切片の免疫組織化学的に分析された凍結切片での共焦点顕微鏡分析（全ての画像について同一の設定）：（Ａ）抗体００１７、（Ｂ）抗体００１８、（Ｃ）１２Ｆ４参照抗体。
【図１３】抗体００１８のCelluSpots（商標）エピトープマッピング。
【図１４】抗体００１８への単量体（Ｎ末端遊離（１）及びＮ末端Ｈｉｓタグ（２））及び二量体（３）アルファ−シヌクレインの結合。示された結果は、５つの濃度の滴定である。１：単量体、遊離Ｎ末端、４．２mg/mL、決して解凍されない；２：単量体、ＨｉｓタグＮ末端、４．８mg/mL；３：二量体、遊離Ｎ末端、１．６mg/mL。
【発明を実施するための形態】
【０１５１】
本発明の実施形態の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークであり、下記の通りに定義される。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得る、又は、それは、アミノ酸配列変化を含み得る。一部の実施形態において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下又は２以下である。一部の実施形態において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と、配列において同一である。
【０１５２】
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）の間での非共有結合的な相互作用の合計の強度を指す。他に示さない限り、本明細書において使用する場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）の間での１：１の相互作用を反映する内在性の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹについての親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。親和性は、当技術分野において公知の一般的な方法（本明細書に記載するものを含む）により測定することができる。結合親和性を測定するための、特定の例証的及び例示的な実施形態が、以下に記載される。
【０１５３】
「親和性成熟した」抗体は、そのような変化を持たない親抗体と比較し、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）内に１つ以上の変化を伴う抗体を指し、そのような変化は、抗原についての抗体の親和性における改善をもたらす。
【０１５４】
用語「抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体」及び「ヒトアルファ−シヌクレインに結合する抗体」は、十分な親和性を伴い、ヒトアルファ−シヌクレインに結合することが可能である抗体を指し、抗体は、ヒトアルファ−シヌクレインを標的化する際に、診断的及び／又は治療的薬剤として有用であるようにする。一実施形態において、無関係な非ヒトアルファ−シヌクレインタンパク質への抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定される通り、ヒトアルファ−シヌクレインへの抗体の結合の約１０%未満である。
【０１５５】
用語「抗体」は、本明細書において、最も広い意味において使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、種々の抗体構造（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び抗体フラグメントを含むが、これらに限定されない）を包含する。
【０１５６】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。
【０１５７】
参照抗体としての「同じエピトープに結合する抗体」は、抗原上で参照抗体と同じ残基との結合相互作用を有する抗体を指す。結合相互作用は、表面プラズモン共鳴及び変異抗原又は抗体−抗原複合体のＸ線構造分析を使用して決定することができる。
【０１５８】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の部分が、特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残部が、異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
【０１５９】
抗体の「クラス」は、その重鎖により所有される定常ドメイン又は定常領域の型を指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）に更に分類し得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。
【０１６０】
「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因するそれらの生物学的活性を指し、それらは、抗体クラスに伴い変動する。抗体エフェクター機能の例は、以下を含む：Ｃ１ｑ結合及び補体依存的細胞毒性（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存的な細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節；及びＢ細胞活性化。
【０１６１】
薬剤（例えば、医薬的製剤）の「効果的な量」は、所望の治療的又は予防的結果を達成するために、その投与量で及び必要な期間にわたり効果的な量を指す。
【０１６２】
用語「Ｆｃ領域」は、本明細書において、少なくとも定常領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列のＦｃ領域及び変異型Ｆｃ領域を含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端へ伸張する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）及び、時折、Ｃ末端リジン‐グリシンジペプチド（Ｇｌｙ４４６Ｌｙｓ４４７）は存在してもよいし、存在しなくてもよい。本明細書において他に特定されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、ＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従い、それは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242において記載される通りである。
【０１６３】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、４つのＦＲドメインからなる：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）において、以下の配列中に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【０１６４】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書において互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有する、又は、本明細書において定義される通り、Ｆｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【０１６５】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、継代の数にかかわらず、一次形質転換細胞及びそれに由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸含量において完全に同一でなくてもよいが、しかし、変異を含み得る。本来の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫が、本明細書において含まれる。
【０１６６】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も共通して生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬ配列又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般的に、配列のサブグループは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3における通りのサブグループである。一実施形態において、ＶＬについて、サブグループは、Kabat et al.（上記）における通りのサブグループカッパＩである。一実施形態において、ＶＨについて、サブグループは、Kabat et al.（上記）における通りのサブグループＩＩＩである。
【０１６７】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、それらにおいて、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも部分を含み得る。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【０１６８】
用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、本明細書において使用する場合、配列中で超可変である（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触」）を含む、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般的に、抗体は６つのＨＶＲを含む；ＶＨ中の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ中の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。
【０１６９】
ＨＶＲは、本明細書において、以下を含む：
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917）；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242）；
（ｃ） アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）及び９３−１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；並びに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（Ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）及び９４−１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の組み合わせ。
【０１７０】
他に示さない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメインにおける他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Kabat et al.（上記）に従い、本明細書においてナンバリングされる。
【０１７１】
「イムノコンジュゲート」は、１つ以上の異種分子（例えば、血液脳関門シャトルモジュール）にコンジュゲートされた抗体である。
【０１７２】
「個体」又は「被験者」は哺乳動物である。哺乳動物は、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、個体又は被験者はヒトである。
【０１７３】
「単離」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。一部の実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定される通り、９５%又は９９%を上回る純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の概説については、例えば、Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87を参照のこと。
【０１７４】
「単離」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離核酸は、通常、核酸分子を含む細胞中に含まれる核酸分子を含むが、しかし、核酸分子は、染色体外に、又は、その天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【０１７５】
「抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体をコードする単離核酸」は、単一ベクター又は別々のベクター中のそのような核酸分子、及び宿主細胞において１つ以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む、抗体の重鎖及び軽鎖（又はそれらのフラグメント）をコードする１つ以上の核酸分子を指す。
【０１７６】
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、この集団を含む個々の抗体は、可能な変異型抗体（例えば、自然に生じる変異を含む、又はモノクローナル抗体調製物の産生の間に生じる）を除き、同一である及び／又は同じエピトープに結合し、そのような変異型は、一般的に少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各々のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられる。このように、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を要求すると解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、種々の技術（ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない）により作ることができ、そのような方法及びモノクローナル抗体を作るための他の例示的な方法が、本明細書において記載されている。
【０１７７】
「天然抗体」は、変動する構造を伴う自然に生じる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖で構成される。Ｎ末端からＣ末端に、各々の重鎖は、可変領域（ＶＨ）（可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各々の軽鎖は、可変領域（ＶＬ）（可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）を有し、定常軽（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、２つの型（カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる）の１つに割り当てられ得る。
【０１７８】
用語「添付文書」は、治療用産物の市販パッケージ中に慣習的に含まれる使用説明書を指すために使用され、それには、そのような治療用産物の使用に関する適応症、使用法、用量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告についての情報が含まれる。
【０１７９】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（%）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、ギャップを導入し（必要な場合）、最高パーセント配列同一性を達成した後（任意の保存的置換を配列同一性の一部として考慮しない）、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術内にある種々の方法において、例えば、公的に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign（DNASTAR）ソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、配列を整列させるための適切なパラメーター（比較されている配列の完全長にわたる最高アラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む）を決定することができる。本明細書における目的のために、しかし、%アミノ酸配列同一性の値を、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使用して生成する。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、Genentech, Inc.により作成されており、そのソースコードが、U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559においてユーザー文書と共にファイルされており、そこでは、それはU.S. Copyright Registration No.TXU510087下で登録される。ALIGN-2プログラムは、Genentech, Inc., South San Francisco, Californiaから公的に利用可能であるか、又はソースコードからコンパイルし得る。ALIGN-2プログラムを、UNIX操作システム（digital UNIX V4.0Dを含む）上での使用のためにコンパイルすべきである。全ての配列比較パラメーターは、ALIGN-2プログラムにより設定され、変動しない。
【０１８０】
ALIGN-2が、アミノ酸配列比較のために用いられる状況において、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの又はそれに対する所与のアミノ酸配列Ａの%アミノ酸配列同一性（それは、代わりに、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの又はそれに対する特定の%アミノ酸配列同一性を有する又はそれを含む、所与のアミノ酸配列Ａとして言い表すことができる）を、以下の通りに算出する：
割合Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは、Ａ及びＢのそのプログラムのアラインメントにおいて配列アラインメントプログラムALIGN-2により完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さとは等しくない場合、ＡのＢに対する%アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する%アミノ酸配列同一性とは等しくないと理解されるであろう。他に具体的に記述しない限り、本明細書において使用する全ての%アミノ酸配列同一性の値は、直前のパラグラフにおいて記載される通りに、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して得られる。
【０１８１】
用語「医薬的製剤」は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性が効果的であることを許すような形態であり、及び製剤が投与される被験者に対して許容できない毒性のある追加成分を含まない調製物を指す。
【０１８２】
「医薬的に許容可能な担体」は、被験者に非毒性である、活性成分以外の、医薬的製剤中の成分を指す。医薬的に許容可能な担体は、緩衝剤、賦形剤、安定剤又は保存剤を含むが、これらに限定されない。
【０１８３】
用語「ヒトアルファ−シヌクレイン」は、本明細書において使用する場合、天然ヒトアルファ−シヌクレイン（UniProt P37840）を指す。この用語は、「完全長」の、未処理のヒトアルファ−シヌクレイン並びに細胞における処理から生じるヒトアルファ−シヌクレインの任意の形態を包含する。この用語はまた、ヒトアルファ−シヌクレインの自然に生じる変異型（例えば、変異体、スプライス変異型又は対立遺伝子変異型）を包含する。ヒトアルファ−シヌクレインのアミノ酸配列を、配列番号４０において示す。
【０１８４】
本明細書において使用する場合、「処置」（及びその文法的なバリエーション、例えば「処置する」又は「処置している」）は、処置される個体の自然経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のため又は臨床病理の経過の間のいずれかに実施することができる。処置の望ましい効果は、疾患の発生又は再発を防止すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮減、転移を防止すること、疾患進行の速度を減少させること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は改善された予後を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態において、本発明の抗体を、疾患の発生を遅延させる、又は疾患の進行を遅らせるために使用する。
【０１８５】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原への抗体の結合に含まれる、抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは、一般的に同様の構造を有し、各々のドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む（例えば、Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91を参照のこと）。単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、それぞれ、相補的ＶＬドメイン又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングするために、抗原を結合する抗体からＶＨドメイン又はＶＬドメインを使用して単離することができる。例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887；Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照のこと。
【０１８６】
用語「ベクター」は、本明細書において使用する場合、それが連結されている別の核酸を伝播することが可能である核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びに、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組み入れられたベクターを含む。特定のベクターは、それらが作動可能に連結された核酸の発現を方向付けることが可能である。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」として言及される。
【０１８７】
ＩＩ．組成物及び方法
一態様において、本発明は、部分的に、本明細書において報告する抗体が、脳における神経細胞及びグリア細胞中でのアルファ−シヌクレイン誘導性の毒性を低下／除去するために使用することができるとの知見に基づく。特定の態様において、ヒトアルファ−シヌクレインに結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、シヌクレイノパチー及び神経障害、特にパーキンソン病及びパーキンソン病の併存疾患を伴うアルツハイマー病の診断又は処置のために有用である。
【０１８８】
Ａ．例示的な抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体
本明細書において報告する抗体は、計画的な免疫化の方法論及び特異的な結合特性を伴う抗体の目的にかなった選択を適用することにより得られている。
【０１８９】
最初に、ウサギを、組換えアルファ−シヌクレインの種々の集合体及び凝集体の混合物を用いて免疫化している。単離Ｂ細胞クローンを、ＥＬＩＳＡにより特徴付け、最善の結合剤が選択されている。次の工程において、抗体は、ペプチドアレイの方法論を使用したエピトープマッピングにより、並びに、例えば、ウエスタンブロットを使用して、単量体及びオリゴマーの組換えアルファ−シヌクレインに対するその選択性を決定することにより特徴付けられている。また、ヒト神経細胞における組換えアルファ−シヌクレイン及び生理学的なアルファ−シヌクレインへの、並びに、ヒトアルファ−シヌクレイントランスジェニックマウス及びパーキンソン病患者の脳切片における病理学的なアルファ−シヌクレインへの抗体の結合が決定されている。候補が選択される前に概説したデータに基づき、末梢注射後での病理学的なアルファ−シヌクレインへの急性のインビボ結合が決定されている。最も効率的な結合剤が、その後、選択された。選択された最も効率的な結合剤を用いて、Ｔｈｙ１−（Ａ３０Ｐ）ａＳＹＮトランスジェニックマウスにおけるアルファ−シヌクレイン病理のクリアランス及び／又はアルファ−シヌクレイン病理の進行の停止が、決定される。
【０１９０】
１つの好ましい抗体は、抗体００１７である。この抗体は、広いアルファ−シヌクレイン特異的結合プロファイルを有する、即ち、この抗体は、単量体及び凝集（オリゴマー）ヒトアルファ−シヌクレインに結合する。図１において、ヒトアルファ−シヌクレインの単量体及び複数の凝集形態に対する抗体００１７の濃度依存的結合を示す。抗体００１７は、以前に概説した手順により選択されたウサギ抗体２３３の可変ドメイン及びマウス定常領域を伴うキメラ抗体である。
【０１９１】
別の好ましい抗体は、抗体００１８である。この抗体は、アルファ−シヌクレイン凝集依存的な結合プロファイルを有する、即ち、この抗体は、単量体、二量体及びオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインに結合し、それにより、単量体ヒト及びマウスアルファ−シヌクレインへの結合は、Ｎ末端のメチオニン残基が例えばアセチル化若しくはビオチン化により改変される又は存在しない場合、縮減する。図２において、ヒトアルファ−シヌクレインの異なる凝集形態に対する抗体００１８の濃度依存的な結合を示す。オリゴマー結合の特徴は、０．５μg/ml未満の抗体濃度で明らかになる。抗体００１８は、以前に概説した手順により選択されたウサギ抗体０６４の可変ドメイン及びマウス定常領域を伴うキメラ抗体である。
【０１９２】
ヒトアルファ−シヌクレイン上での抗体００１８の結合部位の決定のためにＮ末端改変ペプチドを使用した際、全く結合を検出することはできなかった。したがって、抗体００１８のエピトープ分析は、α−シヌクレイン（１−１４０）、β−シヌクレイン（６０−１３４）、γ−シヌクレイン（６０−１２７）及びＮ−アセチル化α−シヌクレインペプチド（１−１５）の配列に対応する重複する固定化ペプチドフラグメント（長さ：１５アミノ酸、シフト：１アミノ酸）のライブラリーを用いて、並びにＥＬＩＳＡベースの検出方法（実施例１４及び図１３を参照のこと）を用いることにより行った。
【０１９３】
抗体００１８は、ペプチドアレイ上に提示される短い（１５アミノ酸長）単量体アルファ−シヌクレインペプチドに結合することが見出されている。抗体００１８は、アルファ−シヌクレインの一番端のＮ末端でエピトープを認識する。Ｎ末端アミノ酸のメチオニン（Ｍ、ＭＥＴ）は、結合のために不可欠であり、その除去（又はブロック）によって、抗体００１８結合が完全に消失する。更に、Ｎ末端メチオニンのアミノ酸残基が、Ｎアセチル化によりキャップされている場合、全く結合を観察することができない。これは、表面プラズモン共鳴分析により確認される（図１４を参照のこと）。
【０１９４】
別の好ましい抗体は、抗体００８１である。抗アルファ−シヌクレイン抗体００８１は、ブロット上のアルファ−シヌクレインの全ての形態について免疫反応性の等しい低下を伴う、抗体００１８を連想させる用量依存的な反応性パターンを示す（図３）。
【０１９５】
図４において、アルファ−シヌクレイン変異体Ａ３０Ｐトランスジェニックマウスの矢状脳切片における抗体００１７及び００１８並びに参照抗体１２Ｆ４の異なる染色挙動が示されている。
【０１９６】
図５において、パーキンソン病患者（Ａ）、パーキンソン病の併存疾患を伴うアルツハイマー病患者（Ｂ）及び進行性核上性麻痺を伴うアルツハイマー病患者（Ｃ）のヒト脳皮質中の抗体００１７及び００１８の異なる染色挙動が示されている。抗体００１７の適用によって、びまん性実質性並びにレビー小体及びレビー神経突起の染色がもたらされた。抗体００１８は、より弱い実質性染色を示し、大部分が、レビー小体及びレビー神経突起を染色する。このように、抗体００１７及び００１８は、パーキンソン病患者の脳切片中のアルファ−シヌクレイン凝集体について異なる染色パターンを示す。
【０１９７】
図６において、特異的ｍＡｂの急性末梢注射時でのアルファ−シヌクレイン変異体Ａ３０Ｐトランスジェニックマウスにおける脳アルファ−シヌクレイン病理の標識が示されている。抗アルファ−シヌクレイン抗体（５日間にわたる２×６０mg/kg）又はＰＢＳを、１５月齢のアルファ−シヌクレイン変異体Ａ３０Ｐトランスジェニックマウスに適用した。新鮮凍結２０μmの矢状脳切片を、抗マウスＩｇＧ１抗体−ＡＦ５５５コンジュゲートを用いて、又は、それぞれの抗アルファ−シヌクレイン抗体及び抗マウスＩｇＧ１抗体−ＡＦ５５５コンジュゲートを用いて染色した。
【０１９８】
図７から、抗体００１７及び００１８が、細胞外培地からアルファ−シヌクレインオリゴマーを免疫枯渇することができ、それにより、これらの抗体によって、アルファ−シヌクレインオリゴマーの毒性が低下することがわかる。
【０１９９】
一態様において、本発明は、ヒトアルファ−シヌクレインに結合する単離抗体を提供する。特定の実施形態において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体は：
・配列番号０１のアミノ酸配列を有し、単量体アルファーシヌクレインに結合するが、原線維状アルファーシヌクレインには結合しないペプチドに結合する、又は  
配列番号２６及び２７又は配列番号３８及び３９の可変ドメインの対を有し、原線維状アルファ−シヌクレインに結合するが、単量体アルファ−シヌクレインには結合しない抗体と同じエピトープに結合する、
・ニューロン及びグリア細胞におけるアルファ−シヌクレイン誘導性の毒性を阻害する、
・アルファ−シヌクレイン凝集の細胞間伝達を阻害する、
・アルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性（例えば、ＬＵＨＭＥＳ細胞において）を低下させる。
【０２００】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３より選択される少なくとも１つ又は２つ又は３つ又は４つ又は５つ又は６つのＨＶＲを含む抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体を提供する。
【０２０１】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３より選択される少なくとも１つ又は２つ又は３つ又は４つ又は５つ又は６つのＨＶＲを含む抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体を提供する。
【０２０２】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３より選択される少なくとも１つ又は２つ又は３つ又は４つ又は５つ又は６つのＨＶＲを含む抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体を提供する。
【０２０３】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３より選択される少なくとも１つ又は２つ又は３つ又は４つ又は５つ又は６つのＨＶＲを含む抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体を提供する。
【０２０４】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３より選択される少なくとも１つ又は２つ又は３つ又は４つ又は５つ又は６つのＨＶＲを含む抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体を提供する。
【０２０５】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３より選択される少なくとも１つ又は２つ又は３つ又は４つ又は５つ又は６つのＨＶＲを含む抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体を提供する。
【０２０６】
一態様において、本発明は、以下より選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は全て３つのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する：
ｉ）（ａ）配列番号０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；又は
ｉｉ）（ａ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｉｉｉ）（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｉｖ）（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｖ）（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｖｉ）（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３。
【０２０７】
一実施形態において、抗体は以下を含む：
ｉ）（ａ）配列番号０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；又は
ｉｉ）（ａ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｉｉｉ）（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｉｖ）（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｖ）（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｖｉ）（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３。
【０２０８】
別の実施形態において、抗体は、更に、以下より選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は全て３つのＶＬ  ＨＶＲ配列を含む：
ｉ）（ａ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
ｉｉ）（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｉｉｉ）（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｉｖ）（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｖ）（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｖｉ）（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【０２０９】
更なる実施形態において、抗体は以下を含む：
ｉ）（ａ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
ｉｉ）（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｉｉｉ）（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｉｖ）（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｖ）（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｖｉ）（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【０２１０】
一態様において、本発明は、以下を含む抗体を提供する：
ｉ）（ａ）配列番号０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｉｉ）（ａ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｉｉｉ）（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｉｖ）（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｖ）（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｖｉ）（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【０２１１】
上記の実施形態のいずれかにおいて、抗アルファ−シヌクレイン抗体は、ヒト化されている。一実施形態において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体は、上記の実施形態のいずれかにおける通りのＨＶＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク（例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク）を含む。
【０２１２】
別の実施形態において、ＶＨ又はＶＬは、参照配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体は、ヒトアルファ−シヌクレインに結合する能力を保持している。
【０２１３】
特定の実施形態において、合計１〜３個のアミノ酸が、本明細書において以前に記載した通り、ＨＶＲ配列の各々において、置換、挿入及び／又は欠失されている。
【０２１４】
更なる態様において、本発明は、本明細書において提供する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。
【０２１５】
例えば、特定の実施形態において、以下を含む、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される：
ａ）配列番号１３のＶＨ配列及び配列番号１４のＶＬ配列、又は
ｂ）配列番号２６のＶＨ配列及び配列番号２７のＶＬ配列、又は
ｃ）配列番号３８のＶＨ配列及び配列番号３９のＶＬ配列。
【０２１６】
特定の実施形態において、配列番号４０のアミノ酸１０１〜１１１からなるヒトアルファ−シヌクレインのフラグメント内のエピトープに結合する抗体が提供される。
【０２１７】
特定の実施形態において、配列番号４０のアミノ酸１〜１５からなるヒトアルファ−シヌクレインのフラグメント内の遊離Ｎ末端エピトープ（遊離のＮ末端メチオニン残基）に結合する抗体が提供される。
【０２１８】
一実施形態において、遊離のＮ末端メチオニン残基を有するヒトアルファ−シヌクレインに結合し、かつ、ヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜１５及び１８８〜１９５内の立体構造エピトープに結合する抗体が提供される。
【０２１９】
本発明の更なる態様において、上記の実施形態のいずれかに従った抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。一実施形態においては、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体は、抗体フラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ又はＦ（ａｂ’）２フラグメント）である。別の実施形態において、抗体は、完全長抗体（例えば、インタクトなＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体又は本明細書において定義する他の抗体クラス若しくはアイソタイプ）である。
【０２２０】
更なる態様において、上記の実施形態のいずれかに従った抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体は、下記セクション１〜７において記載する特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせで組み入れ得る。
【０２２１】
１．抗体親和性
特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体は、≦１００nM、≦１０nM、≦１nM又は１nM〜１００nMの間（例えば１０−７M以下、例えば１０−７M〜１０−９M）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【０２２２】
一実施形態において、Ｋｄは、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。一実施形態において、ＲＩＡは、目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原を用いて実施される。例えば、抗原についてのＦＡＢの溶液結合親和性は、非標識抗原の滴定系列の存在において、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原を用いてＦａｂを平衡化し、次に、抗Ｆａｂ抗体コートプレートを用いて結合抗原を捕捉することにより測定する（例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照のこと）。アッセイのための条件を確立するために、MICROTITER（登録商標）マルチウェルプレート（Thermo Scientific）に、５０mM炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μg/mlの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Cappel Labs）を用いて一晩コートし、続いて、ＰＢＳ中の２%（w/v）ウシ血清アルブミンを用いて２〜５時間にわたり室温（約２３℃）でブロックする。非吸着プレート（Nunc #269620）において、１００pM又は２６pM［１２５Ｉ］抗原を、目的のＦａｂの連続希釈物と混合する（例えば、Presta, L.G. et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599において、抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。目的のＦａｂを、次に、一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションをより長期間（例えば、約６５時間）にわたり継続し、平衡に達することを確実にしてもよい。その後、混合物を室温での（例えば、１時間にわたる）インキュベーションのために、捕捉プレートに移す。溶液を次に除去し、プレートをＰＢＳ中の０．１%  ポリソルベート２０（TWEEN-20（登録商標））を用いて８回洗浄する。プレートを乾燥させた際、１５０μl/ウェルのシンチラント（MICROSCINT-20（商標）；Packard）を加え、プレートを、TOPCOUNT（商標）ガンマカウンター（Packard）で１０分間にわたりカウントする。２０%以下の最高結合を与える各々のＦａｂの濃度を、競合結合アッセイにおける使用のために選ぶ。
【０２２３】
別の実施形態に従い、Ｋｄを、BIACORE（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定する。例えば、BIACORE（登録商標）-2000又はBIACORE（登録商標）-3000（BIACORE, Inc., Piscataway, NJ）を使用したアッセイを、〜１０応答単位（ＲＵ）で、固定化抗原ＣＭ５チップを用いて、２５℃で実施する。一実施形態において、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、BIACORE, Inc.）を、供給業者の使用説明書に従い、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化する。抗原を、流速５μl／分での注射前に１０mM酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を用いて５μg/ml（〜０．２μM）まで希釈し、約１０応答単位（ＲＵ）の共役タンパク質を達成する。抗原の注射に続き、１Mエタノールアミンを注射し、未反応基をブロックする。動態測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８nM〜５００nM）を、ＰＢＳ中で、０．０５%  ポリソルベート２０（TWEEN-20（商標））界面活性剤（PBST）を用いて、２５℃で流速約２５μl／分で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１のLangmuir結合モデル（BIACORE（登録商標）Evaluation Softwareバージョン3.2）を使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングさせることにより算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）を、比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出する（例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照のこと）。オン速度が、上記の表面プラズモン共鳴アッセイにより１０６M-1s-1を超える場合、次に、オン速度を、２５℃で、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の２０nMの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の蛍光発光強度（励起＝２９５nm；発光＝３４０nm、１６nmバンドパス）における増加又は減少を測定する蛍光クエンチング技術を、分光計（例えばストップフロー装備分光光度計（Aviv Instruments）又は8000シリーズSLM-AMINCO（商標）分光光度計（ThermoSpectronic））において、撹拌キュベットを用いて測定される増加濃度の抗原の存在において使用することにより決定することができる。
【０２２４】
２．抗体フラグメント
特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖフラグメント並びに下記に記載する他のフラグメントを含むが、これらに限定されない。特定の抗体フラグメントの概説については、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照のこと。ｓｃＦｖフラグメントの概説については、例えば、Plueckthun, A., In；The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315を参照のこと；またＷＯ  ９３／１６１８５；ＵＳ  ５，５７１，８９４及びＵＳ  ５，５８７，４５８を参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントの考察については、ＵＳ  ５，８６９，０４６を参照のこと。
【０２２５】
ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る、２つの抗原結合部位を伴う抗体フラグメントである。例えば、ＥＰ  ０  ４０４  ０９７；ＷＯ  １９９３／０１１６１；Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134；及びHolliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディはまた、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134)に記載されている。
【０２２６】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全て若しくは一部を含む抗体フラグメントである。特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、ＵＳ  ６，２４８，５１６を参照のこと）。
【０２２７】
抗体フラグメントは、本明細書において記載する通り、種々の技術（インタクトな抗体のタンパク質分解性消化並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含むが、これらに限定されない）により作ることができる。
【０２２８】
３．キメラ抗体及びヒト化抗体
特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、ＵＳ  ４，８１６，５６７；及びMorrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855において記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ又はサル等の非ヒト霊長類に由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが、親抗体のものから変化されている「クラススイッチされた」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合フラグメントを含む。
【０２２９】
特定の実施形態において、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトへの免疫原性を低下させるためにヒト化されている。一般的に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（又はその一部）が、非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）が、ヒト抗体配列に由来する、１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合により、ヒト定常領域の少なくとも一部も含み得る。一部の実施形態において、ヒト化抗体中の一部のＦＲ残基が、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換されており、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善させる。
【０２３０】
ヒト化抗体及びそれらを作る方法が、例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633において概説されており、例えば、Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329；Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；ＵＳ  ５，８２１，３３７、ＵＳ  ７，５２７，７９１、ＵＳ  ６，９８２，３２１及びＵＳ  ７，０８７，４０９；Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34（特異性決定領域（ＳＤＲ）移植を記載する）；Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498  （「リサーフェシング」を記載する）；Dall’Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60（「ＦＲシャフリング」を記載する）；並びにOsbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68及びKlimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260（ＦＲシャフリングへの「ガイド付き選択」アプローチを記載する）において更に記載されている。
【０２３１】
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域は、「最適合」方法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308を参照のこと）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；及びPresta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632を参照のこと）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照のこと）；及びＦＲライブラリーをスクリーニングすることに由来するフレームワーク領域（例えば、Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684及びRosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618)を参照のこと）を含むが、これらに限定されない。
【０２３２】
４．ヒト抗体
特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体を、当技術分野において公知の種々の技術を使用して産生することができる。ヒト抗体は、一般的に、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374及びLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459において記載されている。
【０２３３】
ヒト抗体は、抗原負荷に応答して、ヒト可変領域を伴うインタクトなヒト抗体又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することにより調製され得る。そのような動物は、典型的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含み、それによって、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換する、又は、それは、染色体外に存在する若しくは動物の染色体中に無作為に組み込まれる。そのようなトランスジェニックマウスにおいて、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の概説については、Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125を参照のこと。また、例えば、ＵＳ  ６，０７５，１８１及びＵＳ  ６，１５０，５８４（XENOMOUSE（商標）技術を記載する）；ＵＳ  ５，７７０，４２９（HUMAB（登録商標）技術を記載する）；ＵＳ  ７，０４１，８７０（K-M MOUSE（登録商標）技術を記載する）及びＵＳ  ２００７／００６１９００（VELOCIMOUSE（登録商標）技術を記載する）を参照のこと。そのような動物により生成されたインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変してもよい。
【０２３４】
ヒト抗体は、又はハイブリドーマベースの方法により作ることができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株が記載されている（例えば、Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005；Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63；及びBoerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95を参照のこと）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術から生成されたヒト抗体は、また、Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562に記載されている。追加の方法は、例えば、ＵＳ  ７，１８９，８２６（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載する）及びNi, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載する）において記載される方法を含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937及びVollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191において記載されている。
【０２３５】
ヒト抗体は、また、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することにより生成され得る。そのような可変ドメイン配列を、次に、所望のヒト定常領域と組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を、以下に記載する。
【０２３６】
５．ライブラリー由来抗体
本発明の抗体は、所望の活性（単数）又は活性（複数）を伴う抗体について、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離され得る。例えば、種々の方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を持つ抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするために、当技術分野において公知である。そのような方法は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37において概説されており、例えば、McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554；Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628；Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597；Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175；Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310；Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093；Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472；及びLee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132において更に記載されている。
【０２３７】
特定のファージディスプレイ方法において、ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングされ、ファージライブラリーにおいて無作為に組換えられ、それは、次に、Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455において記載する通り、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントとして又はＦａｂフラグメントとして、抗体フラグメントを呈する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴わず、免疫原への高親和性抗体を提供する。あるいは、Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734により記載される通り、ナイーブなレパートリーを（例えばヒトから）クローニングし、任意の免疫化を伴わず、広範囲の非自己抗原及びまた自己抗原への抗体の単一の供給源を提供することができる。最後に、ナイーブライブラリーはまた、Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388により記載される通り、幹細胞から非再配列Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし及びランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成的に作ることで、高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再配列を達成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許公開は、例えば：ＵＳ  ５，７５０，３７３並びにＵＳ  ２００５／００７９５７４、ＵＳ  ２００５／０１１９４５５、ＵＳ  ２００５／０２６６０００、ＵＳ  ２００７／０１１７１２６、ＵＳ  ２００７／０１６０５９８、ＵＳ  ２００７／０２３７７６４、ＵＳ  ２００７／０２９２９３６及びＵＳ  ２００９／０００２３６０を含む。
【０２３８】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体フラグメントは、本明細書において、ヒト抗体又はヒト抗体フラグメントと考えられる。
【０２３９】
６．多重特異性抗体
特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位について結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態において、結合特異性の１つは、ヒトアルファ−シヌクレインについてであり、他方は、任意の他の抗原についてである。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、ヒトアルファ−シヌクレインの２つの異なるエピトープに結合し得る。また、二重特異性抗体を使用し、ヒトアルファ−シヌクレインを発現する細胞に細胞毒性薬剤を局在化させてもよい。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体フラグメントとして調製することができる。
【０２４０】
多重特異性抗体を作るための技術は、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え同時発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540、ＷＯ  ９３／０８８２９及びTraunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659）及び「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、ＵＳ  ５，７３１，１６８を参照のこと）を含むが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作るために静電ステアリング効果を操作すること（ＷＯ  ２００９／０８９００４）；２つ以上の抗体又はフラグメントを架橋すること（例えば、ＵＳ  ４，６７６，９８０及びBrennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83を参照のこと）；二重特異性抗体を産生するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553を参照のこと）；二重特異性抗体フラグメントを作るために「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照のこと）；及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374を参照のこと）；及び、例えばTutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69において記載される通り、三重特異性抗体を調製することにより作られ得る。
【０２４１】
３つ以上の機能的な抗原結合部位を伴う操作抗体（「オクトパス抗体」を含む）もまた、本明細書において含まれる（例えば、ＵＳ  ２００６／００２５５７６を参照のこと）。
【０２４２】
本明細書における抗体又はフラグメントはまた、ヒトアルファ−シヌクレイン並びに別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用Ｆａｂ」又は「ＤＡＦ」を含む（例えば、ＵＳ  ２００８／００６９８２０を参照のこと）。
【０２４３】
本明細書における抗体又はフラグメントはまた、ＷＯ  ２００９／０８０２５１、ＷＯ  ２００９／０８０２５２、ＷＯ  ２００９／０８０２５３、ＷＯ  ２００９／０８０２５４、ＷＯ  ２０１０／１１２１９３、ＷＯ  ２０１０／１１５５８９、ＷＯ  ２０１０／１３６１７２、ＷＯ  ２０１０／１４５７９２及びＷＯ  ２０１０／１４５７９３において記載される多重特異性抗体を含む。
【０２４４】
７．抗体変異型
特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体のアミノ酸配列変異型が熟慮される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異型は、抗体をコードするヌクレオチド配列中へ適切な改変を導入することにより又はペプチド合成により調製され得る。そのような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列からの欠失、及び／又はその中への挿入、及び／又はその内の残基の置換を含む。最終的な構築物が所望の特徴（例えば抗原結合）を持つという条件で、欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせがなされることにより、最終的な構築物に達し得る。
【０２４５】
ａ）置換、挿入及び欠失変異型
特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異型が提供される。置換突然変異誘発のための目的の部位は、ＨＶＲ及びＦＲを含む。保存的置換を、「好ましい置換」の見出しの下に表１において示す。より実質的な変化が、「例示的置換」の見出しの下に表１において提供され、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下で更に記載される。アミノ酸置換は、目的の抗体中に導入してもよく、産物は、所望の活性（例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣ）についてスクリーニングされる。
【０２４６】
【表１】
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【０２４７】
アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ化され得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の方向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２４８】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスに交換することを伴う。
【０２４９】
置換変異型の１つの型は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。一般的には、更なる研究のために選択された、結果として得られた変異型は、親抗体と比べて特定の生物学的特性（例えば、増加した親和性、低下した免疫原性）における改変（例えば、改善）を有し、及び／又は、親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持し得る。例示的な置換変異型は、例えば、ファージディスプレイベースの親和性成熟技術（例えば、本明細書において記載するもの）を使用し、簡便に生成され得る親和性成熟抗体である。簡単には、１つ以上のＨＶＲ残基を変異させ、変異型抗体は、ファージ上に呈示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０２５０】
変化（例えば、置換）は、例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいてなされ得る。そのような変化は、ＨＶＲ「ホットスポット」、即ち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによりコードされる残基（例えば、Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196を参照のこと）、及び／又は、抗原と接触する残基でなされてもよく、結果として得られる変異型ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーから構築し、再選択することによる親和性成熟は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37において記載されている。親和性成熟の一部の実施形態において、多様性が、種々の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）のいずれかによる成熟のために選ばれた可変遺伝子中に導入される。二次ライブラリーが、次に、作製される。ライブラリーは、次に、所望の親和性を伴う任意の抗体変異型を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するための他の方法は、ＨＶＲ指向アプローチを含み、それにおいて、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６残基）がランダム化される。抗原結合に含まれるＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発又はモデリングを使用して、特異的に同定され得る。特にＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が、しばしば標的化される。
【０２５１】
特定の実施形態において、置換、挿入又は欠失は、そのような変化が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１つ以上のＨＶＲ内で生じてもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変化（例えば、本明細書において提供する保存的置換）は、ＨＶＲにおいてなされてもよい。そのような変化は、例えば、ＨＶＲ中の抗原の接触残基の外側であり得る。上記に提供する変異型ＶＨ配列及びＶＬ配列の特定の実施形態において、各々のＨＶＲが不変であるか、又は、わずか１つ、２つ若しくは３つのアミノ酸置換を含む。
【０２５２】
突然変異誘発のために標的化され得る、抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれ、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085により記載されている。この方法において、標的残基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕ等の荷電残基）の残基又は基を同定し、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）に置換することにより、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるか否かを決定する。更なる置換を、初期置換に機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入してもよい。あるいは、又は、加えて、抗体と抗原の間での接触点を同定するための抗原−抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換のための候補として標的化又は排除され得る。変異型は、それらが所望の特性を含むか否かを決定するために、スクリーニングされ得る。
【０２５３】
アミノ酸配列の挿入は、１つの残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ及び／又はカルボキシ末端融合体、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を伴う抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異型は、抗体の血清中半減期を増加させる、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ用）又はポリペプチドに対する抗体のＮ又はＣ末端への融合体を含む。
【０２５４】
ｂ）グリコシル化変異型
特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように変化される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ以上のグリコシル化部位を作製又は除去するように、アミノ酸配列を変化させることにより簡便に達成され得る。
【０２５５】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに付着した炭水化物を変化させてもよい。哺乳動物細胞により産生される天然抗体は、典型的には、一般的にＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により付着されている分岐した二分岐オリゴ糖を含む（例えば、Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32を参照のこと）。オリゴ糖は、種々の炭水化物（例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸）、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」においてＧｌｃＮＡｃに付着したフコースを含み得る。一部の実施形態において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は、特定の改善された特性を伴う抗体変異型を作製するためになされてもよい。
【０２５６】
一実施形態において、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）付着されたフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異型が提供される。例えば、そのような抗体中のフコースの量は、１%から８０%まで、１%から６５%まで、５%から６５%まで、又は２０%から４０%までであり得る。フコースの量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により測定されたＡｓｎ２９７に付着された全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）の合計と比べた、Ａｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を算出することにより決定される（例えば、ＷＯ  ２００８／０７７５４６に記載される通り）。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）におけるおよその位置２９７に位置付けられるアスパラギン残基を指す；しかし、Ａｓｎ２９７はまた、抗体における小さな配列変動に起因して、位置２９７の上流又は下流の約±３アミノ酸、即ち、位置２９４と３００との間に位置していてもよい。そのようなフコシル化変異型は、改善したＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、ＵＳ  ２００３／０１５７１０８；ＵＳ  ２００４／００９３６２１を参照のこと。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異型に関連する刊行物の例は、以下の通りである：ＵＳ  ２００３／０１５７１０８；ＷＯ  ２０００／６１７３９；ＷＯ  ２００１／２９２４６；ＵＳ  ２００３／０１１５６１４；ＵＳ  ２００２／０１６４３２８；ＵＳ  ２００４／００９３６２１；ＵＳ  ２００４／０１３２１４０；ＵＳ  ２００４／０１１０７０４；ＵＳ  ２００４／０１１０２８２；ＵＳ  ２００４／０１０９８６５；ＷＯ  ２００３／０８５１１９；ＷＯ  ２００３／０８４５７０；ＷＯ  ２００５／０３５５８６；ＷＯ  ２００５／０３５７７８；ＷＯ  ２００５／０５３７４２；ＷＯ  ２００２／０３１１４０；Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249；Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622。脱フコシル化抗体を産生することが可能な細胞株の例は、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545；ＵＳ  ２００３／０１５７１０８；及びＷＯ  ２００４／０５６３１２、特に実施例１１）及びノックアウト細胞株、例えばアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622；Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688；及びＷＯ  ２００３／０８５１０７を参照のこと）を含む。
【０２５７】
抗体変異型は、更に二分オリゴ糖を伴い提供され、例えば、それにおいて、抗体のＦｃ領域に付着した二分岐オリゴ糖が、ＧｌｃＮＡｃにより二分されている。そのような抗体変異型は、低下されたフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。そのような抗体変異型の例は、例えば、ＷＯ  ２００３／０１１８７８；ＵＳ  ６，６０２，６８４；及びＵＳ  ２００５／０１２３５４６において記載されている。Ｆｃ領域に付着されたオリゴ糖中の少なくとも１つのガラクトース残基を伴う抗体変異型も提供される。そのような抗体変異型は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。そのような抗体変異型は、例えば、ＷＯ  １９９７／３００８７；ＷＯ  １９９８／５８９６４；及びＷＯ  １９９９／２２７６４において記載されている。
【０２５８】
ｃ）Ｆｃ領域変異型
特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸改変を、本明細書において提供する抗体のＦｃ領域中に導入してもよく、それにより、Ｆｃ領域変異型を生成する。Ｆｃ領域変異型は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含み得る。
【０２５９】
特定の実施形態において、本発明では、一部の、しかし、全てではないエフェクター機能を持つ抗体変異型が熟慮され、それによって、インビボでの抗体の半減期が重要であり、更に特定のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣ）が不要又は有害である適用のための望ましい候補になる。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを実施し、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低下／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施し、抗体がＦｃγＲ結合を欠き（故に、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）、しかし、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確実にすることができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する主要な細胞が、ＦｃＲＩＩＩだけを発現するのに対し、単球は、ＦｃＲＩ、ＦｃＲＩＩ及びＦｃＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現が、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492のページ464の表３中に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例が、ＵＳ  ５，５００，３６２（例えば、Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063；及びHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502を参照のこと）；ＵＳ  ５，８２１，３３７（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361を参照のこと）において記載されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA）；及びCytoTox 96（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Promega, Madison, WI）を参照のこと）。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、又は、加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、インビボで（例えば、動物モデル、例えばClynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656において開示されるものにおいて）評価してもよい。Ｃ１ｑ結合アッセイを行い、抗体がＣ１ｑに結合することができず、故にＣＤＣ活性を欠いていることを確認してもよい。例えば、ＷＯ  ２００６／０２９８７９及びＷＯ  ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい（例えば、Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171；Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743を参照のこと）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期の測定をまた、当技術分野において公知の方法（例えば、Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006:1759-1769)を参照のこと）を使用して実施することができる。
【０２６０】
低下したエフェクター機能を伴う抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ以上の置換を伴うものを含む（ＵＳ  ６，７３７，０５６）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を伴う、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２つ以上での置換を伴うＦｃ変異体を含む（ＵＳ  ７，３３２，５８１）。
【０２６１】
ＦｃＲへの改善又は減少した結合を伴う、特定の抗体変異型が記載されている（例えば、ＵＳ  ６，７３７，０５６；ＷＯ  ２００４／０５６３１２及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照のこと）。
【０２６２】
特定の実施形態において、抗体変異型は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３及び／又は３３４（残基のＥＵナンバリング）での置換を伴うＦｃ領域を含む。
【０２６３】
一部の実施形態において、変化はＦｃ領域においてなされ、それらは、変化した（即ち、改善又は減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）をもたらす（例えば、ＵＳ  ６，１９４，５５１、ＷＯ  ９９／５１６４２及びIdusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184において記載される通り）。
【０２６４】
胎児への母体ＩｇＧの移行について責任のある新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への、増加した半減期及び改善された結合を伴う抗体（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593及びKim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）が、ＵＳ  ２００５／００１４９３４において記載されている。それらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善させる、そこでの１つ以上の置換を伴うＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ変異型は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の１つ以上での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換（ＵＳ  ７，３７１，８２６）を伴うものを含む。
【０２６５】
また、Ｆｃ領域変異型の他の例に関する、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；ＵＳ  ５，６４８，２６０；ＵＳ  ５，６２４，８２１；及びＷＯ  ９４／２９３５１を参照のこと。
【０２６６】
ｄ）システイン操作抗体変異型
特定の実施形態において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体（例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ」）を作製することが望ましいであろう。特定の実施形態において、置換された残基は、抗体の接近可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基をそれにより抗体の接近可能な部位に配置し、他の部分（例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分）に抗体をコンジュゲートするために使用し、イムノコンジュゲートを作製してもよい（本明細書において更に記載する通り）。特定の実施形態において、以下の残基のいずれか１つ以上をシステインで置換してもよい：軽鎖のＶ２０５（カバットナンバリング）；重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン操作抗体を、例えば、ＵＳ  ７，５２１，５４１において記載される通りに生成してもよい。
【０２６７】
ｅ）抗体誘導体
特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体は、更に、当技術分野において公知であり、容易に利用可能である、追加の非タンパク質性部分を含むように改変してもよい。抗体の誘導体化のために適切な部分は、水溶性ポリマーを含むが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにその混合物を含むが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性に起因して、製造に利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、分岐又は非分岐であり得る。抗体に付着するポリマーの数は変動し得るが、１つを上回るポリマーが付着する場合、それらは同じ又は異なる分子であり得る。一般的に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又は型は、抗体誘導体が定義された条件等の下での治療において使用されるか否かにかかわらず、考察（改善される抗体の特定の特性又は機能を含むが、これらに限定されない）に基づいて決定することができる。
【０２６８】
別の実施形態において、放射線への曝露により選択的に加熱され得る抗体及び非タンパク質性部分のコンジュゲートが提供される。一実施形態において、非タンパク質性部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は、任意の波長でよく、普通の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質性部分に近接する細胞が死滅する温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長を含むが、これに限定されない。
【０２６９】
ｆ）血液脳関門シャトルモジュールを伴う融合体
モノクローナル抗体は、神経学的又は中枢神経系（ＣＮＳ）疾患の処置のための膨大な治療的可能性を有するが、しかし、脳中へのそれらの通路は、血液脳関門（ＢＢＢ）により制限される。過去の研究によって、血流中に循環するＩｇＧの非常に小さなパーセンテージ（約０．１%）が、ＢＢＢを通じてＣＮＳ中へ横断することが示されおり（Felgenhauer, K., Klin. Wschr. 52 (1974) 1158-1164）、ここでは、抗体のＣＮＳ濃度は、頑強な効果を可能にするために不十分であり得る。
【０２７０】
特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体は、更に、当技術分野において公知であり、容易に利用可能である１つ以上の血液脳関門シャトルモジュールを含むように改変してもよい。
【０２７１】
１つ以上の血液脳関門シャトルモジュールは、軽鎖又は重鎖の任意の末端に融合させることができる。好ましい一実施形態において、血液脳関門シャトルモジュールは、重鎖のＣ末端に融合される。
【０２７２】
重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であり得る。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基の１つ又は２つが除去された短縮Ｃ末端であり得る。好ましい一実施形態において、重鎖のＣ末端は、ＰＧで終わる短縮Ｃ末端である。
【０２７３】
１つ以上の血液脳関門シャトルモジュールは、それぞれの抗体鎖に、直接的に又はリンカーペプチドを介して融合することができる。好ましい一実施形態において、リンカーペプチドは、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）を有する。
【０２７４】
血液脳関門シャトルモジュールは、抗体ｓｃＦｖフラグメントであり得る。一実施形態において、血液脳関門シャトルモジュールは、ＮからＣ末端の順序において、軽鎖可変ドメイン−軽鎖定常ドメイン−リンカーペプチド−重鎖可変ドメイン−重鎖定常ドメイン１を含むｓｃＦｖである。
【０２７５】
好ましい一実施形態において、血液脳関門シャトルモジュールは、（Ｇ４Ｓ）６リンカーペプチド又はそのヒト化変異型を伴う抗トランスフェリン受容体−抗体８Ｄ３のｓｃＦｖフラグメントである。
【０２７６】
用語「そのヒト化変異型」は、フレームワーク領域（ＦＲ）及び／又は超可変領域（ＨＶＲ）の各々において互いに独立に、場合により１〜３個の変異の導入を伴うヒトフレームワーク上に、マウス８Ｄ３抗体のＣＤＲを移植することにより得られた分子を意味する。
【０２７７】
一態様において、本発明は、１つの抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体、２つのペプチドリンカー、及び血液脳関門受容体に結合する２つの一価の結合実体を含む抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体融合ポリペプチドを提供し、それにおいて、リンカーによって、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体が、血液脳関門受容体に結合する一価の結合実体に共役される。
【０２７８】
一態様において、本発明は、１つの抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体、１つのペプチドリンカー、及び血液脳関門受容体に結合する１つの一価の結合実体を含む抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体融合ポリペプチドを提供し、それにおいて、リンカーによって、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体が、血液脳関門受容体に結合する一価の結合実体に共役される。
【０２７９】
一実施形態において、血液脳関門受容体に結合する一価の結合実体は、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドからなる群より選択される。
【０２８０】
一実施形態において、血液脳関門受容体に結合する一価の結合実体は、血液脳関門受容体リガンド、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨＨからなる群より選択される分子、好ましい一実施形態において、ｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂを含む。
【０２８１】
一実施形態において、血液脳関門受容体は、トランスフェリン受容体、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１及びヘパリン結合上皮成長因子様成長因子からなる群より選択される。好ましい一実施形態において、血液脳関門受容体は、トランスフェリン受容体である。
【０２８２】
一実施形態において、血液脳関門受容体に結合する一価の結合実体は、トランスフェリン受容体に向けられた１つのｓｃＦａｂ又は１つのｓｃＦｖ、特に、配列番号５２、５３及び５４のアミノ酸配列内に含まれるトランスフェリン受容体中のエピトープを認識するｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖを含む。
【０２８３】
一実施形態において、血液脳関門受容体に結合する一価の結合実体は、リンカーにより抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の重鎖のＣ末端に共役されている。
【０２８４】
一実施形態において、ペプチドリンカーは、少なくとも１５個のアミノ酸の長さ、より好ましくは１８〜２５個のアミノ酸の長さを伴うアミノ酸配列である。
【０２８５】
一実施形態において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体は、完全長抗体であり、好ましい一実施形態において、完全長ＩｇＧである。用語「完全長抗体」は、２つの抗体軽鎖ポリペプチド及び２つの抗体重鎖ポリペプチドからなる抗体を意味し、ここで、２つの抗体重鎖ポリペプチドにおいて、Ｃ末端リジン残基（Ｋ）が存在し得る又は存在し得ない。
【０２８６】
好ましい一実施形態において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体融合ポリペプチドは、脳エフェクター実体としての完全長ＩｇＧ抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体、配列ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）のリンカー、及び、血液脳受容体としてのヒトトランスフェリン受容体に結合する、一価の結合実体としての１つのｓｃＦａｂを含み、それにおいて、ｓｃＦａｂは、リンカーにより完全長抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の重鎖の１つのＣ末端（Ｆｃ部分の）に共役されており、並びに、それにおいて、ｓｃＦａｂは、配列番号５２、５３及び５４のアミノ酸配列内に含まれるヒトトランスフェリン受容体中のエピトープを認識する。
【０２８７】
好ましい一実施形態において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体融合ポリペプチドは、脳エフェクター実体としての完全長ＩｇＧ抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体、配列ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）のリンカー、及び、血液脳受容体としてのヒトトランスフェリン受容体に結合する、一価の結合実体としての１つのｓｃＦｖを含み、それにおいて、ｓｃＦａｂは、リンカーにより、完全長抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の重鎖の１つのＣ末端（Ｆｃ部分の）に共役されており、並びに、それにおいて、ｓｃＦａｂは、配列番号５２、５３及び５４のアミノ酸配列内に含まれるヒトトランスフェリン受容体中のエピトープを認識する。
【０２８８】
一実施形態においては、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の第１の重鎖は、第１の二量体化モジュールを含み、抗体の第２の重鎖は、２つの重鎖のヘテロ二量体化を可能にする、第２の二量体化モジュールを含む。
【０２８９】
一実施形態においては、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の第１の重鎖の第１の二量体化モジュールは、ノブ重鎖であり、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の第２の重鎖の二量体化モジュールは、ホール重鎖である（ノブ−イントゥ−ホール戦略に従って）。
【０２９０】
本明細書において報告する通りの抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体融合ポリペプチドは、医薬として使用することができ、特に、それは、神経学的障害（例えば、パーキンソン病等）の処置のために使用することができる。
【０２９１】
本明細書において報告する通りの抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体融合ポリペプチドは、血液脳関門を通過して、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体（脳エフェクター実体）を輸送するために使用することができる。
【０２９２】
一実施形態において、Ｆｃ領域のそのＣ末端で、ヒトトランスフェリン受容体に結合する一価の結合実体としてのｓｃＦａｂに共役されている抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の重鎖は、ＮからＣ末端の方向において、以下の構造を有する：
・ＩｇＧ重鎖、
・ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域のＣ末端をｓｃＦａｂのＶＬドメインのＮ末端に共役させるペプチドリンカー（好ましい一実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）を有する）、
・ｓｃＦａｂの可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及びＣカッパ軽鎖ドメイン、
・ｓｃＦａｂのＣカッパ軽鎖ドメインのＣ末端をｓｃＦａｂのＶＨドメインのＮ末端に共役させるペプチドリンカー（好ましい一実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）６ＧＧ（配列番号５５）を有する）、
・ｓｃＦａｂ抗体の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及びＩｇＧ  ＣＨ１重鎖ドメイン。
【０２９３】
一実施形態において、Ｆｃ領域のそのＣ末端で、ヒトトランスフェリン受容体に結合する一価の結合実体としてのｓｃＦｖに共役されている抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の重鎖は、ＮからＣ末端の方向において、以下の構造を有する：
・ＩｇＧ重鎖、
・ＩｇＧ重鎖のＦｃ部分のＣ末端をｓｃＦｖ抗体フラグメントのＶＬドメインのＮ末端に共役させるペプチドリンカー（好ましい一実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）を有するペプチドである）、
・可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）、
・可変軽鎖ドメインのＣ末端をｓｃＦｖのＶＨドメインのＮ末端に共役させるペプチドリンカー（好ましい一実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）６ＧＧ（配列番号５５）を有するペプチドである）、
・ｓｃＦｖ抗体フラグメントの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）。
【０２９４】
第２の態様において、本発明は、ＣＨ２−ＣＨ３  Ｉｇ実体、ペプチドリンカー、及び血液脳関門受容体に向けられたｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖを含む、血液脳関門を横切って脳エフェクター実体を輸送するための融合ポリペプチドを提供し、それにおいて、ｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖは、ペプチドリンカーにより、ＣＨ２−ＣＨ３  Ｉｇ実体のＣ末端に共役される。
【０２９５】
一実施形態において、血液脳関門シャトルモジュール／血液脳関門受容体に向けられたｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖは、ヒト化抗トランスフェリン受容体抗体８Ｄ３に由来する（例えば、Boado, R.J., et al., Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1251-1258を参照のこと）。マウス重鎖可変ドメインは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ  ＬＶＱＰＧＮＳＬＴＬ  ＳＣＶＡＳＧＦＴＦＳ  ＮＹＧＭＨＷＩＲＱＡ  ＰＫＫＧＬＥＷＩＡＭ  ＩＹＹＤＳＳＫＭＮＹ  ＡＤＴＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＥＭＮＳＬＲＳＥＤ  ＴＡＭＹＹＣＡＶＰＴ  ＳＨＹＶＶＤＶＷＧＱ  ＧＶＳＶＴＶＳＳ
（配列番号５６）。
【０２９６】
マウス軽鎖可変ドメイン（変異型１）は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳ  ＬＳＡＳＬＥＥＩＶＴ  ＩＴＣＱＡＳＱＤＩＧ  ＮＷＬＡＷＹＱＱＫＰ  ＧＫＳＰＱＬＬＩＹＧ  ＡＴＳＬＡＤＧＶＰＳ  ＲＦＳＧＳＲＳＧＴＱ  ＦＳＬＫＩＳＲＶＱＶ  ＥＤＩＧＩＹＹＣＬＱ  ＡＹＮＴＰＷＴＦＧＧ  ＧＴＫＬＥＬＫ
（配列番号５７）、及び
マウス軽鎖可変ドメイン（変異型２）は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳ  ＬＳＡＳＬＥＥＩＶＴ  ＩＴＣＱＡＳＱＤＩＧ  ＮＷＬＡＷＹＱＱＫＰ  ＧＫＳＰＱＬＬＩＹＧ  ＡＴＳＬＡＤＧＶＰＳ  ＲＦＳＧＳＲＳＧＴＱ  ＦＳＬＫＩＳＲＶＱＶ  ＥＤＩＧＩＹＹＣＬＱ  ＡＹＮＴＰＷＴＦＧＧ  ＧＴＫＶＥＩＫ
（配列番号５８）。
【０２９７】
１つの血液脳関門シャトルモジュール
一態様において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体融合ポリペプチドは、正確に１つの血液脳関門シャトルモジュールを含み、それにおいて、血液脳関門シャトルモジュールは、マウス抗ヒトトランスフェリン受容体抗体８Ｄ３のヒト化可変ドメインを含み、それにより、マウス抗ヒトトランスフェリン受容体抗体８Ｄ３のヒト化可変ドメインを含む血液脳関門シャトルモジュールは、血液脳関門を横切り、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体を輸送する。抗ヒトトランスフェリン受容体抗体８Ｄ３の可変ドメインは、配列番号５６及び５７のアミノ酸配列を有する。
【０２９８】
１つ又は２つの血液脳関門シャトルモジュール
一態様において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体融合ポリペプチドは、１つ又は２つの血液脳関門シャトルモジュールを含み、それにおいて、血液脳関門シャトルモジュールは、血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に低い親和性で結合する抗体に由来し、それにより、血液脳関門受容体に低い親和性で結合する抗体に由来する血液脳関門シャトルモジュールは、血液脳関門を横切り、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体を輸送する。
【０２９９】
別の態様において、ＢＢＢ−Ｒは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）及びヘパリン結合上皮成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群より選択される。そのような別の態様において、ＢＢＢ−ＲはヒトＢＢＢ−Ｒである。そのような一態様において、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲである。そのような別の態様において、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体はＴｆＲ活性を阻害しない。そのような別の態様において、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体はトランスフェリンへのＴｆＲの結合を阻害しない。
【０３００】
別の態様において、抗体は、その天然リガンドの１つ以上へのＢＢＢ−Ｒの結合を損なわない。そのような別の態様において、抗体は、それがヒトトランスフェリンへのｈＴｆＲの結合を阻害しないような様式で、ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）に特異的に結合する。
【０３０１】
別の態様において、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体は、約１nMから約１００μMまでのＢＢＢ−ＲについてのＩＣ５０を有する。そのような別の態様において、ＩＣ５０は、約５nMから約１００μMまでである。そのような別の態様において、ＩＣ５０は、約５０nMから約１００μMまでである。そのような別の態様において、ＩＣ５０は、約１００nMから約１００μMまでである。別の態様において、抗体は、約５nMから約１０μMまでのＢＢＢ−Ｒについての親和性を有する。そのような別の態様において、抗体は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体に共役される場合、約３０nMから約１μMまでのＢＢＢ−Ｒについての親和性を有する。そのような別の態様において、抗体は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体に共役される場合、約５０nMから約１μMまでのＢＢＢ−Ｒについての親和性を有する。一態様において、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体又はＢＢＢ−Ｒ用の抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体融合ポリペプチドの親和性は、スキャッチャード分析を使用して測定される。別の態様において、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体又はＢＢＢ−Ｒ用の抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体融合ポリペプチドの親和性は、BIACORE分析を使用して測定される。別の態様において、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体又はＢＢＢ−Ｒ用の抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体融合ポリペプチドの親和性は、競合ＥＬＩＳＡを使用して測定される。
【０３０２】
抗体融合ポリペプチドを含む血液脳関門シャトルの使用
別の実施形態において、本明細書において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体へのＣＮＳの曝露を増加させる方法が提供され、それにおいて、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体が、ＢＢＢ−Ｒに低い親和性で結合する抗体又は抗体フラグメントに共役されており、それにより、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体へのＣＮＳの曝露を増加させる。別の態様において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体へのＣＮＳ曝露における増加は、ＢＢＢ−Ｒについての低下した親和性を有さない、典型的な抗体と共役された抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体のＣＮＳ曝露と比べて測定される。別の態様において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体へのＣＮＳ曝露における増加は、投与後の血清中に見出される量と比べた、ＣＮＳにおいて見出される抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の量の比率として測定される。そのような別の態様において、ＣＮＳ曝露における増加は、０．１%を上回る比率をもたらす。別の態様において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体へのＣＮＳ曝露における増加は、共役した抗ＢＢＢ−Ｒ抗体の非存在下における抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体のＣＮＳ曝露と比べて測定される。別の態様において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体へのＣＮＳ曝露における増加は、イメージングにより測定される。別の態様において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体へのＣＮＳ曝露における増加は、間接的な読み出し（１つ以上の生理学的症状の改変等）により測定される。
【０３０３】
被験者に投与される抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体のＣＮＳにおける保持を増加させる方法であって、それにおいて、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体のＣＮＳにおける保持が増加するように、ＢＢＢ−Ｒに低い親和性で結合する抗体又は抗体フラグメントに共役されている。
【０３０４】
別の実施形態において、本発明は、被験者のＣＮＳにおいて有効であるように、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の薬物動態及び／又は薬力学を最適化する方法を提供し、それにおいて、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体は、ＢＢＢ−Ｒに低い親和性で結合する抗体又は抗体フラグメントに共役されており、それにより、抗体又は抗体フラグメントは、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体への共役後のＢＢＢ−Ｒについてのその親和性が、ＣＮＳにおいて抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の薬物動態及び／又は薬力学を最適化する、ＢＢＢを横切って抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体にコンジュゲートされた抗体又は抗体フラグメントの輸送の量をもたらすように選択される。
【０３０５】
別の実施形態において、本発明は、ＢＢＢ−Ｒに結合し、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体に共役された抗体又は抗体フラグメントを用いて哺乳動物を処置することを含む、哺乳動物における神経学的障害を処置する方法を提供し、それにおいて、抗体は、ＢＢＢ−Ｒについて低い親和性を有するように選択されており、それにより、抗体及び共役した抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体のＣＮＳ取り込みが改善される。一実施形態において、処置は、障害の症状の軽減又は除去をもたらす。別の態様において、処置は、神経学的障害の改善をもたらす。
【０３０６】
全ての前の態様の一実施形態において、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体は、約１nMから約１００μMまでのＢＢＢ−ＲについてのＩＣ５０を有する。そのような別の実施形態において、ＩＣ５０は約５nMから約１００μMである。そのような別の実施形態において、ＩＣ５０は、約５０nMから約１００μMである。そのような別の実施形態において、ＩＣ５０は、約１００nMから約１００μMである。別の実施形態において、抗体は、約５nMから約１０μMのＢＢＢ−Ｒについての親和性を有する。別の実施形態において、抗体は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体に共役される場合、約３０nMから約１μMまでのＢＢＢ−Ｒについての親和性を有する。別の実施形態において、抗体は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体に共役される場合、約５０nMから約１μMまでのＢＢＢ−Ｒについての親和性を有する。一実施形態において、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体又はＢＢＢ−Ｒ用の抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体融合ポリペプチドの親和性は、スキャッチャード分析を使用して測定される。別の実施形態において、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体又はＢＢＢ−Ｒ用の抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体融合ポリペプチドの親和性は、BIACORE分析を使用して測定される。別の実施形態において、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体又はＢＢＢ−Ｒ用の抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体融合ポリペプチドの親和性は、競合ＥＬＩＳＡを使用して測定される。
【０３０７】
別の実施形態において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体融合ポリペプチドは標識される。別の実施形態において、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体又はフラグメントは、その天然リガンドの１つ以上へのＢＢＢ−Ｒの結合を損なわない。別の実施形態において、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体は、それがヒトトランスフェリンへのｈＴｆＲの結合を阻害しないような様式で、ｈＴｆＲに特異的に結合する。別の実施形態において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体融合ポリペプチドは哺乳動物に投与される。別の実施形態において、哺乳動物はヒトである。別の実施形態において、哺乳動物は神経学的障害を有する。別の実施形態において、神経学的障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、癌及び外傷性脳損傷からなる群より選択される。
【０３０８】
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば、ＵＳ  ４，８１６，５６７において記載されている通りの組換え方法及び組成物を使用して産生し得る。一実施形態において、本明細書において記載する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体をコードする単離核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施形態において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施形態において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態において、宿主細胞は、以下を含む（例えば、以下で形質転換されている）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクター。一実施形態において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体を作る方法が提供され、それにおいて、その方法は、上記に提供される通りの抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現のために適切な条件下で培養すること、及び、場合により宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
【０３０９】
抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の組換え産生のために、例えば、上に記載する通りの抗体をコードする核酸を単離し、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のために、１つ以上のベクター中に挿入する。そのような核酸は、従来の手順を使用して容易に単離及び配列決定され得る（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）。
【０３１０】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現のために適切な宿主細胞は、本明細書において記載する原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、抗体は、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、細菌中で産生され得る。細菌における抗体フラグメント及びポリペプチドの発現については、例えば、ＵＳ  ５，６４８，２３７、ＵＳ  ５，７８９，１９９及びＵＳ  ５，８４０，５２３を参照のこと（また、Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254（大腸菌における抗体フラグメントの発現を記載する）を参照のこと）。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離してもよく、更に精製することができる。
【０３１１】
原核生物に加えて、真核微生物（例えば糸状菌又は酵母菌）は、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌及び酵母菌株を含む、抗体コードベクターのために適切なクローニング又は発現宿主であり、部分的な又は完全なヒトグリコシル化パターンを伴う抗体の産生をもたらす。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414；及びLi, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照のこと。
【０３１２】
グリコシル化抗体の発現のために適切な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例は、植物細胞及び昆虫細胞を含む。多数のバキュロウイルス株が同定されており、それらは、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞との組み合わせにおいて使用することができる。
【０３１３】
植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、ＵＳ  ５，９５９，１７７、ＵＳ  ６，０４０，４９８、ＵＳ  ６，４２０，５４８、ＵＳ  ７，１２５，９７８及びＵＳ  ６，４１７，４２９（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載する）を参照のこと。
【０３１４】
脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で成長するように適応された哺乳動物細胞株は、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚腎臓株（例えば、Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74において記載されている２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252において記載されているＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞（例えば、Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載されている通り）；ＭＲＣ ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）を含む）；及び骨髄腫細胞株（例えばＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０）を含む。抗体産生のための適切な特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照のこと。
【０３１５】
Ｃ．アッセイ
本明細書において提供する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体は、当技術分野において公知の種々のアッセイにより、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性について同定、スクリーニング又は特徴付けされ得る。
【０３１６】
１．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えば、公知の方法、例えばＥＬＩＳＡ、ａｌｐｈａＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、抗体又は逆相アレイ等により、その抗原結合活性について試験される。
【０３１７】
例示的なＥＬＩＳＡ又はａｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにおいて、溶液（細胞上清、細胞溶解物又は組織溶解物、体液等）中のアルファ−シヌクレインは、捕捉抗体により結合され、それは、アルファ−シヌクレイン上の第１エピトープ又は特定の立体構造のアルファ−シヌクレインに特異的に結合し、そして、検出抗体は検出実体に共役され、それは、アルファ−シヌクレインの第２エピトープ又は立体構造に特異的に結合する。読み出しは、検出実体（化学発光、蛍光、エネルギー移動誘起発光等）に基づく。一部の例において、凝集形態のアルファ−シヌクレインを検出するために、同じ抗体を捕捉抗体及び検出抗体と同じアッセイにおいて使用することができる（例えば、Tokuda, T. et al., Neurology 75 (2010) 1766-1772を参照のこと）。
【０３１８】
抗体アレイの場合において、抗体は、ガラス又はニトロセルロースチップ上にスポットされる。スライドをブロックし、アルファ−シヌクレインを含む溶液とインキュベートし、洗浄して未結合抗体を除去し、結合抗体を蛍光標識された対応する二次抗体を用いて検出する。蛍光シグナルは、蛍光スライドスキャナーにより測定される。同様に、逆相アレイのために、組換えアルファ−シヌクレイン、細胞上清、細胞溶解物又は組織溶解物、体液等を、ガラス又はニトロセルロースチップ上にスポットする。スライドをブロックし、個々のアレイをアルファ−シヌクレイン上の特異的なエピトープに対する抗体とインキュベートする。未結合抗体を洗い流し、結合抗体を、蛍光標識された対応する二次抗体を用いて検出する。蛍光シグナルは、蛍光スライドスキャナーにより測定される（Dernick, G., et al., J. Lipid Res. 52 (2011) 2323-2331）。
【０３１９】
ウエスタンブロットの例において、凝集した組換えアルファ−シヌクレイン又は細胞上清、細胞溶解物又は組織溶解物、体液等に由来するアルファ−シヌクレインを、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ又は天然ゲル条件において、分子量により分離し、ニトロセルロース膜又はＰＶＤＦ膜上にブロットする。ブロッキングした後、膜をアルファ−シヌクレインのアミノ酸配列又は立体構造に特異的な抗体とインキュベートする。その後、膜を洗浄し、非結合抗体を除去する。結合抗体を、化学発光若しくは蛍光又は他の検出手段のための検出実体に共役された、対応する二次抗体により検出する。アルファ−シヌクレインのアミノ酸配列に特異的な抗体は、エピトープが凝集によりマスクされない限り、種々の凝集形態、故に分子量におけるアルファ−シヌクレインに結合するであろう。他方で、立体構造に特異的な抗体は、特定の分子量でのバンドだけを明らかにするアルファ−シヌクレインの特定の凝集形態だけを検出するであろう（例えば、Towbin, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350-4353；Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203）。
【０３２０】
別の態様において、競合アッセイを使用し、ヒトアルファ−シヌクレインへの結合について、抗体００１７、抗体００１８又は抗体００８１と競合する抗体を同定してもよい。特定の実施形態において、そのような競合抗体は、本明細書において報告する抗体、例えば抗体００１７、抗体００１８及び抗体００８１により結合されるのと同じエピトープ（例えば、線形又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法が、Morris, G.E. (ed.), Epitope Mapping Protocols, In: Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996)において提供される。
【０３２１】
例示的な競合アッセイにおいて、固定化ヒトアルファ−シヌクレインが、ヒトアルファ−シヌクレインに結合する第１標識抗体（例えば、抗体００１７、抗体００１８又は抗体００８１）、及び、ヒトアルファ−シヌクレインへの結合について第１抗体と競合するその能力について試験されている第２非標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。対照として、固定化ヒトアルファ−シヌクレインは、第１標識抗体を含むが第２非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。ヒトアルファ−シヌクレインへの一次抗体の結合を許容する条件下でのインキュベート後、過剰な未結合抗体を除去し、固定化ヒトアルファ−シヌクレインに関連付けられる標識の量を測定する。固定化ヒトアルファ−シヌクレインに関連付けられる標識の量が、対照サンプルと比べて、試験サンプル中で実質的に低下する場合、それは、第２抗体が、ヒトアルファ−シヌクレインへの結合について第１抗体と競合していることを示す（例えば、Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)を参照のこと）。
【０３２２】
２．活性アッセイ
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するその抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体を同定するために提供される。生物学的活性は、例えば、ヒト神経細胞における、アルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性からの保護／その低下／その阻害、及び／又はオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達からの保護／その低下／その阻害、及び／又はアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性の低下を含み得る。インビボ及び／又はインビトロでそのような生物学的活性を有する抗体も提供される。
【０３２３】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。
【０３２４】
防御生物学的活性は、レシピエント神経細胞で細胞死を起こす、分泌型アルファ−シヌクレインを含む条件培地を加えることにより評価することができる。この毒性は、本明細書において記載する通りの防御抗体を加えることにより逆転させることができる。分泌型アルファ−シヌクレインの毒性性質が、以前に確立されている（Emmanouilidou, E., et al., J. Neurosci., 30 (2010) 6838-6851）。
【０３２５】
Ｄ．診断及び検出のための方法及び組成物
特定の実施形態において、本明細書において提供する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体のいずれかは、生物学的サンプル中のヒトアルファ−シヌクレインの存在を検出するために有用である。本明細書において使用する用語「検出する」は、定量的又は定性的な検出を包含する。特定の実施形態において、生物学的サンプルは、細胞又は組織（例えば脳組織）を含む。
【０３２６】
一実施形態において、診断又は検出の方法における使用のための抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体が提供される。更なる態様において、生物学的サンプル中のヒトアルファ−シヌクレインの存在を検出する方法が提供される。特定の実施形態において、方法は、ヒトアルファ−シヌクレインに対する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の結合を許容する条件下で、生物学的サンプルを本明細書において記載する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体と接触させること、及び、複合体が抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体とヒトアルファ−シヌクレインの間で形成されるか否かを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボの方法であり得る。一実施形態において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体を用いた治療について適格である被験者を選択するために使用され、例えば、ここで、ヒトアルファ−シヌクレインは、患者の選択のためのバイオマーカーである。
【０３２７】
本発明の抗体を使用して診断され得る例示的な障害は、脳鉄蓄積１型（ＮＢＩＡ１）を伴う神経変性、純粋自律神経不全症、ダウン症候群、グアム複合、及びいくつかのレビー小体障害、例えばびまん性レビー小体疾患（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病のレビー小体変異型（ＬＢＶＡＤ）、特定の形態のゴーシェ病及びパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）を含む。
【０３２８】
特定の実施形態において、標識された抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体が提供される。標識は、直接的に検出される標識又は部分（例えば蛍光標識、発色標識、高電子密度標識、化学発光標識及び放射性標識）、並びに、例えば酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される部分（例えば酵素又はリガンド）を含むが、これらに限定されない。例示的な標識は、放射性同位元素３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（ＵＳ  ４，７３７，４５６）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン（dihydrophthalazinediones）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、色素前駆体（例えばＨＲＰ）を酸化するために過酸化水素を用いる酵素と共役された複素環オキシダーゼ（例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカル等を含むが、これらに限定されない。
【０３２９】
Ｅ．医薬的製剤
本明細書において記載する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の医薬的製剤は、所望の純度を有するそのような抗体を１つ以上の任意の医薬的に許容可能な担体と混合することにより（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)）、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で調製される。医薬的に許容可能な担体は、一般的に、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、緩衝剤（例えばリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸）；抗酸化剤（アスコルビン酸及びメチオニンを含む）；保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリ（ビニルピロリドン）；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンを含む）；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎタンパク質複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むが、これらに限定されない。例示的な医薬的に許容可能な担体は、本明細書において更に、間質性薬物分散剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒｈｕＰＨ２０（HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.）を含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用の方法（ｒｈｕＰＨ２０を含む）は、ＵＳ  ２００５／０２６０１８６及びＵＳ  ２００６／０１０４９６８において記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ（例えばコンドロイチナーゼ）と組み合わせる。
【０３３０】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、ＵＳ  ６，２６７，９５８に記載されている。水性抗体製剤は、ＵＳ  ６，１７１，５８６及びＷＯ  ２００６／０４４９０８において記載されているものを含み、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝剤を含む。
【０３３１】
本明細書における製剤はまた、処置される特定の適応症について必要な１つを上回る活性成分、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的な活性を伴うものを含み得る。例えば、［抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体と組み合わせてもよいリスト薬物］を更に提供することが望ましいであろう。そのような活性成分は、意図される目的のために効果的である量で、組み合わせにおいて適切に存在する。
【０３３２】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル中に封入してもよい（例えば、それぞれコロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中又はマクロエマルション中のヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（methyl methacylate））マイクロカプセル）。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)に開示されている。
【０３３３】
徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の適切な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは、成形品の形態（例えば、フィルム又はマイクロカプセル）である。
【０３３４】
インビボ投与のために使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば無菌ろ過膜を通じたろ過により容易に達成され得る。
【０３３５】
Ｆ．治療方法及び組成物
本明細書において提供する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体のいずれかを、治療方法において使用してもよい。
【０３３６】
一態様において、医薬としての使用のための抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体が提供される。更なる態様において、パーキンソン病を処置する際の使用のための抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体が提供される。特定の実施形態において、処置の方法における使用のための抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体が提供される。特定の実施形態において、本発明は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の効果的な量を個体に投与することを含む、パーキンソン病を有する個体を処置する方法における使用のための抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体を提供する。１つのそのような実施形態において、方法は、例えば下に記載する通りの少なくとも１つの追加の治療的薬剤の効果的な量を個体に投与することを更に含む。更なる実施形態において、本発明は、ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、又はニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、又はアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる際の使用のための抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体を提供する。特定の実施形態において、本発明は、ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、又はニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、又はアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させるための、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の効果的な量を個体に投与することを含む、ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、又はニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、又は個体においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる方法における使用のための抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体を提供する。上の実施形態のいずれかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。
【０３３７】
更なる態様において、本発明は、医薬の製造又は調製における抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の使用を提供する。一実施形態において、医薬は、パーキンソン病の処置のためである。更なる実施形態において、医薬は、医薬の効果的な量を、パーキンソン病を有する個体に投与することを含む、パーキンソン病を処置する方法における使用のためである。１つのそのような実施形態において、方法は、例えば下に記載する通りの少なくとも１つの追加の治療的薬剤の効果的な量を個体に投与することを更に含む。更なる実施形態において、医薬は、ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害するため、又はニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害するため、又はアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させるためである。更なる実施形態において、医薬は、ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、又はニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、又はアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させるための、医薬の効果的な量を個体に投与することを含む、ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、又はニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、又は個体においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる方法における使用のためである。上の実施形態のいずれかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
【０３３８】
更なる態様において、本発明は、パーキンソン病を処置するための方法を提供する。一実施形態において、方法は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の効果的な量を、そのようなパーキンソン病を有する個体に投与することを含む。１つのそのような実施形態において、方法は、下に記載する通りの少なくとも１つの追加の治療的薬剤の効果的な量を個体に投与することを更に含む。上の実施形態のいずれかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
【０３３９】
更なる態様において、本発明は、ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、又はニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、又は個体においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼを低下させるための方法を提供する。一実施形態において、方法は、ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、又はニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、又はアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させるために、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の効果的な量を個体に投与することを含む。一実施形態において、「個体」はヒトである。
【０３４０】
更なる態様において、本発明は、例えば、上の治療方法のいずれかにおける使用のために、本明細書において提供する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体のいずれかを含む医薬的製剤を提供する。一実施形態において、医薬的製剤は、本明細書において提供する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体のいずれか及び医薬的に許容可能な担体を含む。別の実施形態において、医薬的製剤は、例えば下に記載する通り、本明細書において提供する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体のいずれか及び少なくとも１つの追加の治療的薬剤を含む。
【０３４１】
本発明の抗体は、治療において、単独で又は他の薬剤との組み合わせで使用することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの追加の治療的薬剤と同時投与してもよい。
【０３４２】
上に記述するそのような組み合わせ治療は、組み合わせ投与（そこでは、２つ以上の治療的薬剤が、同じ又は別々の製剤中に含まれる）及び別々の投与（その場合において、本発明の抗体の投与は、追加の治療的薬剤（単数）又は薬剤（複数）の投与に先立ち、それと同時に、及び／又は、それに続いて生じ得る）を包含する。一実施形態において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の投与及び追加の治療的薬剤の投与は、互いに約１ヶ月以内、又は約１、２若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５若しくは６日間以内に生じる。
【０３４３】
本発明の抗体（及び任意の追加の治療的薬剤）は、非経口、肺内及び鼻腔内、並びに、局所処置が望まれる場合病巣内投与を含む、任意の適切な手段により投与することができる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与を含む。投薬は、投与が短時間である又は習慣的であるかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば静脈内注射又は皮下注射等の注射によることができる。種々の投薬スケジュール（種々の時間点にわたる単一又は複数の投与、ボーラス投与及びパルス注入を含むが、これらに限定されない）は、本明細書において熟慮される。
【０３４４】
本発明の抗体は、適正な医療行為と一致する様式で製剤化、服用及び投与されるであろう。この文脈における考慮のための因子は、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジュール及び医療従事者に公知の他の因子を含む。抗体は、問題の障害を予防又は処置するために現在使用される１つ以上の薬剤を用いて製剤化する必要はないが、場合により製剤化される。そのような他の薬剤の効果的な量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は処置の型、及び上で考察する他の因子に依存する。これらは、一般的に、本明細書において記載するのと同じ投与量、投与経路を用いて、又は、本明細書において記載する投与量の約１〜９９%で、又は、経験的／臨床的に適切であると判断される任意の投与量及び任意の経路により使用される。
【０３４５】
疾患の予防又は処置のために、本発明の抗体の適切な投与量（単独で又は１つ以上の他の追加の治療的薬剤と組み合わせて使用する場合）は、処置される疾患の型、抗体の型、疾患の重症度及び経過、抗体が予防的又は治療的な目的のいずれのために投与されるか、過去の治療、患者の臨床歴及び抗体への応答、並びに主治医の判断に依存するであろう。抗体は、１回又は一連の処置にわたり患者に適切に投与される。疾患の型及び重症度に依存して、抗体の約１μg/kg〜１５mg/kg（例えば０．５mg/kg〜１０mg/kg）は、例えば、１つ又は複数の別々の投与による、又は連続注入によるかを問わず、患者への投与のための初回候補投与量であり得る。１つの典型的な１日投与量は、上に言及する因子に依存して、約１μg/kg〜１００mg/kg又はそれ以上の範囲であり得る。数日間又はそれより長い反復投与のために、状態に依存して、処置は、一般的に疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続され得る。１つの例示的な抗体の投与量は、約０．０５mg/kg〜約１０mg/kgの範囲にあり得る。このように、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg又は１０mg/kg（又はそれらの任意の組み合わせ）の１つ以上の用量を患者に投与し得る。そのような用量は、間欠的に、例えば毎週又は３週間毎に投与してもよい（例えば、患者が約２〜約２０回分、又は、例えば約６回分の抗体を受けるようにする）。初回のより高い負荷用量、続いて１つ以上の低用量が投与され得る。しかし、他の投薬計画が有用であり得る。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイにより簡単にモニターされる。
【０３４６】
上の製剤又は治療方法のいずれかを、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の代わりに又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを使用して行い得ることが理解される。
【０３４７】
ＩＩＩ．製造品
本発明の別の態様において、上に記載する障害の処置、予防及び／又は診断のために有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器及び、容器上の又はそれに関連付けられるラベル又は添付文書を含む。適切な容器は、例えばボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等を含む。容器は、種々の材料（例えばガラス又はプラスチック）から形成され得る。容器は、それ自体で又は状態を処置、予防及び／若しくは診断するために効果的な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針により貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選んだ状態を処置するために使用されることを示す。更に、製造品は、（ａ）その中に含まれる組成物を伴う第１容器（それにおいて、組成物は本発明の抗体を含む）；及び（ｂ）その中に含まれる組成物を伴う第２容器（それにおいて、組成物は更に細胞毒性薬剤又は他の治療的薬剤を含む）を含み得る。本発明のこの実施形態における製造品は、組成物を使用し、特定の状態を処置することができることを示す添付文書を更に含み得る。あるいは、又は、加えて、製造品は、医薬的に許容可能な緩衝液（例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液及びブドウ糖液）を含む第２の（又は第３の）容器を更に含み得る。それは、商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料（他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む）を更に含み得る。
【０３４８】
上の製造品のいずれかは、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の代わりに又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含み得ることが理解される。
【０３４９】
ＩＶ．具体的な実施形態
１．ヒトアルファ−シヌクレインに特異的に結合する抗体であって、抗体は、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ＬＵＨＭＥＳ細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる、抗体。
【０３５０】
２．カスパーゼ活性が、カスパーゼ３及び／又はカスパーゼ７活性であることを特徴とする、項目１記載の抗体。
【０３５１】
３．抗体が、シヌクレイノパチーの処置における使用のためであることを特徴とする、項目１〜２のいずれか一項目記載の抗体。
【０３５２】
４．抗体が、パーキンソン病の処置における使用のためであることを特徴とする、項目３記載の抗体。
【０３５３】
５．抗体が、アミノ酸配列ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥＧ（配列番号０１）からなるペプチドに特異的に結合することを特徴とする、項目１〜４のいずれか一項目記載の抗体。
【０３５４】
６．抗体が、単量体ヒトアルファ−シヌクレインについて、１０Ｅ−０９Ｍ未満及び１０Ｅ−０７Ｍ超の結合親和性を有することを特徴とする、項目１〜５のいずれか一項目記載の抗体。
【０３５５】
７．抗体が、単量体及びオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインに特異的に結合し、原線維状ヒトアルファ−シヌクレインには結合しないことを特徴とする、項目１〜６のいずれか一項目記載の抗体。
【０３５６】
８．抗体が、重鎖可変ドメインにおいて配列番号０２〜０４のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて配列番号０５〜０７のＨＶＲを含むことを特徴とする、項目１〜７のいずれか一項目記載の抗体。
【０３５７】
９．抗体が、重鎖可変ドメインにおいて配列番号０８、０９及び０４のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号１０〜１２のＨＶＲを含むことを特徴とする、項目１〜７のいずれか一項目記載の抗体。
【０３５８】
１０．抗体が、配列番号１３からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号１４からなる軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、項目８〜９のいずれか一項目記載の抗体。
【０３５９】
１１．抗体が、配列番号１３からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号１４からなる軽鎖可変ドメインを含む抗体をヒト化することにより得られていることを特徴とする、項目１〜１０のいずれか一項目記載の抗体。
【０３６０】
１２．抗体が、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインにおいて配列番号０２〜０４のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて配列番号０５〜０７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、３個までのアミノ酸残基が変化され得ることを特徴とする、項目１〜７のいずれか一項目記載の抗体。
【０３６１】
１３．抗体が、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインにおいて配列番号０８、０９及び０４のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号１０〜１２のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、３個までのアミノ酸残基が変化され得ることを特徴とする、項目１〜７のいずれか一項目記載の抗体。
【０３６２】
１４．抗体が、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインが、配列番号１３からなる重鎖可変ドメインの（に由来する）ヒト化形態であり、軽鎖可変ドメインが、配列番号１４からなる軽鎖可変ドメインの（に由来する）ヒト化形態であることを特徴とする、項目１〜７及び１２〜１３のいずれか一項目記載の抗体。
【０３６３】
１５．抗体が、重鎖において配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖において配列番号１８〜２０のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合することを特徴とする、項目１〜４のいずれか一項目記載の抗体。
【０３６４】
１６．抗体が、重鎖において配列番号２１、２２及び１７のＨＶＲ、並びに軽鎖において配列番号２３〜２５のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合することを特徴とする、項目１〜４のいずれか一項目記載の抗体。
【０３６５】
１７．抗体が、配列番号２６からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２７からなる軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、項目１５及び１６のいずれか一項目記載の抗体。
【０３６６】
１８．抗体が、配列番号２６からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２７からなる軽鎖可変ドメインを含む抗体をヒト化することにより得られていることを特徴とする、項目１〜４のいずれか一項目記載の抗体。
【０３６７】
１９．抗体が、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインにおいて配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて配列番号１８〜２０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、３個までのアミノ酸残基が変化され得ることを特徴とする、項目１〜４のいずれか一項目記載の抗体。
【０３６８】
２０．抗体が、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインにおいて配列番号２１、２２及び１７のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号２３〜２５のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、３個までのアミノ酸残基が変化され得ることを特徴とする、項目１〜４のいずれか一項目記載の抗体。
【０３６９】
２１．抗体が、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインが、配列番号２６からなる重鎖可変ドメインの（に由来する）ヒト化形態であり、軽鎖可変ドメインが、配列番号２７からなる軽鎖可変ドメインの（に由来する）ヒト化形態であることを特徴とする、項目１〜４及び１９〜２０のいずれか一項目記載の抗体。
【０３７０】
２２．抗体が、重鎖において配列番号２８〜３０のＨＶＲ、及び軽鎖において配列番号３１〜３３のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合することを特徴とする、項目１〜４のいずれか一項目記載の抗体。
【０３７１】
２３．抗体が、重鎖において配列番号２８、３４及び３０のＨＶＲ、並びに軽鎖において配列番号３５〜３７のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合することを特徴とする、項目１〜４のいずれか一項目記載の抗体。
【０３７２】
２４．抗体が、配列番号３８からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号３９からなる軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、項目２２〜２３のいずれか一項目記載の抗体。
【０３７３】
２５．抗体が、配列番号３８からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号３９からなる軽鎖可変ドメインを含む抗体をヒト化することにより得られていることを特徴とする、項目１〜４のいずれか一項目記載の抗体。
【０３７４】
２６．抗体が、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインにおいて配列番号２８〜３０のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて配列番号３１〜３３のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、３個までのアミノ酸残基が変化され得ることを特徴とする、項目１〜４のいずれか一項目記載の抗体。
【０３７５】
２７．抗体が、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインにおいて配列番号２８、３４及び３０のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号３５〜３７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、３個までのアミノ酸残基が変化され得ることを特徴とする、項目１〜４のいずれか一項目記載の抗体。
【０３７６】
２８．抗体が、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインが、配列番号３８からなる重鎖可変ドメインの（に由来する）ヒト化形態であり、軽鎖可変ドメインが、配列番号３９からなる軽鎖可変ドメインの（に由来する）ヒト化形態であることを特徴とする、項目１〜４及び２６〜２７のいずれか一項目記載の抗体。
【０３７７】
２９．抗体が、原線維状ヒトアルファ−シヌクレインに特異的に結合するが、非原線維状ヒトアルファ−シヌクレインには結合しないことを特徴とする、項目１〜４及び１５〜２８のいずれか一項目記載の抗体。
【０３７８】
３０．抗体が、血液脳関門シャトルモジュールにコンジュゲートされることを特徴とする、項目１〜２９のいずれか一項目記載の抗体。
【０３７９】
３１．血液脳関門シャトルモジュールが、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８、ヒトトランスフェリン受容体又はヒトインスリン様成長因子受容体に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントであることを特徴とする、項目３０記載の抗体。
【０３８０】
３２．抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする、項目１〜３１のいずれか一項目記載の抗体。
【０３８１】
３３．抗体が、ヒト化抗体又はキメラ抗体であることを特徴とする、項目１〜３２のいずれか一項目記載の抗体。
【０３８２】
３４．項目１〜３３のいずれか一項目記載の抗体であって、抗体が、ヒトアルファ−シヌクレインに結合する抗体フラグメントであり、並びに、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ＬＵＨＭＥＳ細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる
ことを特徴とする抗体。
【０３８３】
３５．項目１〜３４のいずれか一項目記載の抗体であって、抗体が、
ａ）ヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体、又は
ｂ）ヒトサブクラスＩｇＧ４の完全長抗体、又は
ｃ）変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを伴うヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体、
ｄ）変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを伴うヒトサブクラスＩｇＧ４の完全長抗体、
ｅ）両方の重鎖における変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ並びに１つの重鎖における変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ並びにそれぞれの他の重鎖における変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを伴うヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体、又は
ｆ）両方の重鎖における変異Ｓ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ並びに１つの重鎖における変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ並びにそれぞれの他の重鎖における変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを伴うヒトサブクラスＩｇＧ４の完全長抗体、
であることを特徴とする抗体。
【０３８４】
３６．項目１〜３５のいずれか一項目記載の抗体をコードする単離核酸。
【０３８５】
３７．項目３６の核酸を含む宿主細胞。
【０３８６】
３８．抗体が産生されるように、項目３７の宿主細胞を培養する工程を含む、抗体を産生する方法。
【０３８７】
３９．方法が、細胞又は培養培地から抗体を回収する工程を更に含むことを特徴とする、項目３８記載の方法。
【０３８８】
４０．項目１〜３５のいずれか一項目記載の抗体及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬的製剤。
【０３８９】
４１．追加の治療的薬剤を更に含むことを特徴とする、項目４０記載の医薬的製剤。
【０３９０】
４２．医薬としての使用のための、項目１〜３５のいずれか一項目記載の抗体。
【０３９１】
４３．シヌクレイノパチーの処置における使用のための、項目１〜３５のいずれか一項目記載の抗体。
【０３９２】
４４．パーキンソン病の処置における使用のための、項目１〜３５のいずれか一項目記載の抗体。
【０３９３】
４５．ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性の阻害における使用のための、項目１〜３５のいずれか一項目記載の抗体。
【０３９４】
４６．ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達の阻害における使用のための、項目１〜３５のいずれか一項目記載の抗体。
【０３９５】
４７．神経細胞又はグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性の低下における使用のための、項目１〜３５のいずれか一項目記載の抗体。
【０３９６】
４８．医薬の製造における、項目１〜３５のいずれか一項目記載の抗体の使用。
【０３９７】
４９．医薬が、パーキンソン病の処置のためである、項目４８記載の使用。
【０３９８】
５０．医薬が、ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害するためである、項目４８記載の使用。
【０３９９】
５１．医薬が、ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害するためである、項目４８記載の使用。
【０４００】
５２．医薬が、神経細胞又はグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させるためである、項目４８記載の使用。
【０４０１】
５３．項目１〜３５のいずれか一項目記載の抗体の効果的な量を個体に投与することを含む、パーキンソン病を有する個体を処置する方法。
【０４０２】
５４．ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害するための、項目１〜３５のいずれか一項目記載の抗体の効果的な量を個体に投与することを含む、個体において、ヒトニューロン及びグリア細胞におけるアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する方法。
【０４０３】
５５．ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害するための、項目１〜３５のいずれか一項目記載の抗体の効果的な量を個体に投与することを含む、個体において、ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する方法。
【０４０４】
５６．ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性の阻害における、項目１〜３５のいずれか一項目記載の抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の使用。
【０４０５】
５７．ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達の阻害における、項目１〜３５のいずれか一項目記載の抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の使用。
【０４０６】
５８．神経細胞又はグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性の低下における、項目１〜３５のいずれか一項目記載の抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の使用。
【０４０７】
５９．ヒトアルファ−シヌクレインに特異的に結合し、以下より選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は全て３つのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む抗体：
ｉ）（ａ）配列番号０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；又は
ｉｉ）（ａ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｉｉｉ）（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｉｖ）（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｖ）（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｖｉ）（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３。
【０４０８】
６０．ヒトアルファ−シヌクレインに特異的に結合し、ＶＨ  ＨＶＲ配列として以下を含む抗体：
ｉ）（ａ）配列番号０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；又は
ｉｉ）（ａ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｉｉｉ）（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｉｖ）（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｖ）（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、又は
ｖｉ）（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３。
【０４０９】
６１．項目５９〜６０のいずれか一項目記載の抗体であって、以下より選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は全て３つのＶＬ  ＨＶＲ配列を更に含むことを特徴とする抗体：
ｉ）（ａ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
ｉｉ）（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｉｉｉ）（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｉｖ）（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｖ）（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｖｉ）（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【０４１０】
６２．項目６０記載の抗体であって、ＶＬ  ＨＶＲ配列として以下を更に含むことを特徴とする抗体：
ｉ）（ａ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
ｉｉ）（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｉｉｉ）（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｉｖ）（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｖ）（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｖｉ）（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【０４１１】
６３．ヒトアルファ−シヌクレインに特異的に結合し、ＨＶＲ配列として以下を含む抗体：
ｉ）（ａ）配列番号０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｉｉ）（ａ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｉｉｉ）（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｉｖ）（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｖ）（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｖｉ）（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【０４１２】
６４．ヒトアルファ−シヌクレインが遊離のＮ末端メチオニン残基を有する、ヒトアルファ−シヌクレインに特異的に結合する抗体。
【０４１３】
６５．抗体が、ヒト及びマウスのアルファ−シヌクレインに特異的に結合しており、ヒト及びマウスのアルファ−シヌクレインが遊離のＮ末端メチオニン残基を有する、項目６４記載の抗体。
【０４１４】
６６．アルファ−シヌクレインが、単量体アルファ−シヌクレインである、項目６４〜６５のいずれか一項目記載の抗体。
【０４１５】
６７．アルファ−シヌクレインが、オリゴマーアルファ−シヌクレインである、項目６４〜６５のいずれか一項目記載の抗体。
【０４１６】
６８．アルファ−シヌクレインが、単量体及びオリゴマーアルファ−シヌクレインである、項目６４〜６７のいずれか一項目記載の抗体。
【０４１７】
６９．抗体が、重鎖において配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖において配列番号１８〜２０のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合する、項目６４〜６８のいずれか一項目記載の抗体。
【０４１８】
７０．抗体が、重鎖において配列番号２１、２２及び１７のＨＶＲ、並びに軽鎖において配列番号２３〜２５のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合する、項目６４〜６９のいずれか一項目記載の抗体。
【０４１９】
７１．抗体が、配列番号２６の重鎖可変ドメイン及び配列番号２７の軽鎖可変ドメインを含む抗体と同じエピトープに結合する、項目６４〜７０のいずれか一項目記載の抗体。
【０４２０】
７２．抗体が、重鎖において配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖において配列番号１８〜２０のＨＶＲを含む、項目６４〜６８のいずれか一項目記載の抗体。
【０４２１】
７３．抗体が、重鎖において配列番号２１、２２及び１７のＨＶＲ、並びに軽鎖において配列番号２３〜２５のＨＶＲを含む、項目６４〜６８のいずれか一項目記載の抗体。
【０４２２】
７４．抗体が、配列番号２６の重鎖可変ドメイン及び配列番号２７の軽鎖可変ドメインを含む抗体をヒト化することにより得られている、項目６４〜６８のいずれか一項目記載の抗体。
【０４２３】
７５．抗体が、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインにおいて配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて配列番号１８〜２０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、０〜３個のアミノ酸残基が変化されている、項目６４〜６８のいずれか一項目記載の抗体。
【０４２４】
７６．抗体が、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインにおいて配列番号２１、２２及び１７のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号２３〜２５のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、０〜３個のアミノ酸残基が変化されている、項目６４〜６８のいずれか一項目記載の抗体。
【０４２５】
７７．抗体が、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインが、配列番号２６の重鎖可変ドメインに由来し、軽鎖可変ドメインが、配列番号２７の軽鎖可変ドメインに由来する、項目６４〜６８のいずれか一項目記載の抗体。
【０４２６】
７８．重鎖において配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖において配列番号１８〜２０のＨＶＲを含む抗体と同じエピトープに結合する抗体。
【０４２７】
７９．重鎖において配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖において配列番号１８〜２０のＨＶＲを含む抗体。
【０４２８】
８０．重鎖において配列番号２１、２２及び１７のＨＶＲ、並びに軽鎖において配列番号２３〜２５のＨＶＲを含む抗体。
【０４２９】
８１．配列番号２６の重鎖可変ドメイン及び配列番号２７の軽鎖可変ドメインを含む抗体から得られている（変異型）抗体。
【０４３０】
８２．抗体が、配列番号２６の重鎖可変ドメイン及び配列番号２７の軽鎖可変ドメインを含む抗体をヒト化することにより得られたヒト化抗体である、項目６４〜６８のいずれか一項目記載の抗体。
【０４３１】
８３．重鎖可変ドメインにおいて配列番号１５〜１７のＨＶＲ、及び軽鎖可変ドメインにおいて配列番号１８〜２０のＨＶＲを含む（ヒト化）抗体であって、各々のＨＶＲにおいて、０〜３個のアミノ酸残基が変化されている抗体。
【０４３２】
８４．重鎖可変ドメインにおいて配列番号２１、２２及び１７のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号２３〜２５のＨＶＲを含む（ヒト化）抗体であって、各々のＨＶＲにおいて、０〜３個のアミノ酸残基が変化されている抗体。
【０４３３】
８５．重鎖可変ドメインが、配列番号２６の重鎖可変ドメインに由来し、軽鎖可変ドメインが、配列番号２７の軽鎖可変ドメインに由来する（ヒト化）抗体。
【０４３４】
８６．抗体が、血液脳関門シャトルモジュールにコンジュゲートされる、項目６４〜８５のいずれか一項目記載の抗体。
【０４３５】
８７．血液脳関門シャトルモジュールが、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８、ヒトトランスフェリン受容体又はヒトインスリン様成長因子受容体に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントである、項目８６記載の抗体。
【０４３６】
８８．抗体が、モノクローナル抗体である、項目６４〜８７のいずれか一項目記載の抗体。
【０４３７】
８９．抗体が、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、項目６４〜８８のいずれか一項目記載の抗体。
【０４３８】
９０．項目６４〜８９のいずれか一項目記載の抗体であって、抗体が、
ａ）ヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体、又は
ｂ）ヒトサブクラスＩｇＧ４の完全長抗体、又は
ｃ）変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを伴うヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体、
ｄ）変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを伴うヒトサブクラスＩｇＧ４の完全長抗体、
ｅ）両方の重鎖における変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ並びに１つの重鎖における変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ並びにそれぞれの他の重鎖における変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを伴うヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体、又は
ｆ）両方の重鎖における変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇ並びに１つの重鎖における変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ並びにそれぞれの他の重鎖における変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを伴うヒトサブクラスＩｇＧ４の完全長抗体、
である抗体。
【０４３９】
９１．抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする抗体：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
【０４４０】
９２．抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする抗体：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
【０４４１】
９３．抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする抗体：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２６の非ヒト（ウサギ）可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２７の非ヒト（ウサギ）可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
【０４４２】
９４．抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする抗体：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
【０４４３】
９５．抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする抗体：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
【０４４４】
９６．抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする抗体：
ａ）抗体が、２つの抗体重鎖を含み、各々が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２６のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、
ｂ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２７のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
【０４４５】
９７．抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする抗体：
ａ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む第１抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域が、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ又はアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃのいずれかを含み、
ｂ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第２抗体重鎖を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、又は、定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含み、
ｃ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
【０４４６】
９８．抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする抗体：
ａ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む第１抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域が、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ又はアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃのいずれかを含み、
ｂ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第２抗体重鎖を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号１７のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、又は、定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含み、
ｃ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５のＨＶＲを含み、各々のＨＶＲにおいて、互いに独立に、０、１、２又は３個のアミノ酸残基が変化されており、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
【０４４７】
９９．抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体であって、以下を特徴とする抗体：
ａ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びｓｃＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む第１抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２６のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域が、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ又はアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃのいずれかを含み、
ｂ）抗体が、ＮからＣ末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第２抗体重鎖を含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２６のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、ここで、Ｃ末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
ｉｉｉ）定常領域が、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み、並びに
ｉｖ）定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、又は、定常領域は、第１抗体重鎖がアミノ酸変化Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含む場合、アミノ酸変化Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを含み、
ｃ）抗体が、２つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
ｉ）可変ドメインが、配列番号２７のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ｉｉ）定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
【０４４８】
１００．ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合する抗体フラグメントが、配列番号５６の重鎖可変ドメインのヒト化形態である重鎖可変ドメイン及び配列番号５７の軽鎖可変ドメインのヒト化形態である軽鎖可変ドメインを含む、項目９４〜９９のいずれか一項目記載の抗体。
【０４４９】
１０１．項目６４〜１００のいずれか一項目記載の抗体であって、抗体が、
ｉ）ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び／又は
ｉｉ）ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び／又は
ｉｉｉ）ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる、及び／又は
ｉｖ）遊離のＮ末端メチオニン残基を有するアルファ−シヌクレインに特異的に結合し、改変Ｎ末端メチオニン残基を有するアルファ−シヌクレインには特異的に結合しない、
抗体。
【実施例】
【０４５０】
Ｖ．実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上記に提供する一般的な記載を前提として、種々の他の実施形態を実行し得ることが理解される。
【０４５１】
材料及び方法
組換えＤＮＡ技術
標準的方法を使用し、Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載される通りにＤＮＡを操作した。分子生物学用試薬を、製造業者の使用説明書に従って使用した。
【０４５２】
遺伝子及びオリゴヌクレオチド合成
所望の遺伝子セグメントを、Geneart GmbH（Regensburg, Germany）での化学合成により調製した。合成された遺伝子フラグメントを、伝播／増幅用の大腸菌プラスミド中にクローン化した。サブクローン化された遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列を、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。あるいは、短い合成ＤＮＡフラグメントを、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニールすることにより又はＰＣＲを介して組み立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドを、metabion GmbH（Planegg-Martinsried, Germany）により調製した。
【０４５３】
試薬
全ての商業的な化学物質、抗体及びキットを、他に記述されない場合、製造業者のプロトコールに従って提供される通りに使用した。
【０４５４】
細胞クローン
抗体００１７＝ＡＳＹＮ−２３３ＨＣ＿１１０−ＩＶ＝ａＳｙｎ．Ｓ０１９．００６Ａ０８
抗体００１８＝ＡＳＹＮ−０６４ＨＣ＿１１０−ＩＩ＝ａＳｙｎ．Ｓ００３．００６Ａ１１
抗体００８１＝ＡＳＹＮ−２３５ＨＣ＿１１０−ＩＶ＝ａＳｙｎ．Ｓ０１９．００５Ａ０８
抗体００７０＝抗体００１７＋血液脳関門シャトルモジュール
抗体００７６＝抗体００１８＋血液脳関門シャトルモジュール
【０４５５】
実施例１
抗原の調製
材料
タンパク質：
−凍結乾燥されたヒト野生型アルファ−シヌクレイン（１００μg、２００μg又は５００μg一定分量）；  
−ヒト変異体ＴＰアルファ−シヌクレイン（８．２mg/mL、５０mM  ＨＥＰＥＳ／１００mM  ＮａＣｌ中で透析）
緩衝液及び溶液（室温で保存し、直射的な日光曝露から保護する）：
−ＰＢストック（５×）：２５０mMリン酸緩衝液、ｐＨ７．０（０．２２μmろ過）
−ＥｔＯＨストック：エタノール絶対プロ分析グレード（EMSURE）（Merck；カタログ番号１．００９８９．１０００）
−ＨＰＬＣグレード水（LiChrosolv、Merck）
−５０mM  ＨＥＰＥＳ／１００mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（０．２２μmろ過）
−ＴＢＳ（５０mM  Ｔｒｉｓ／１００mM  ＮａＣｌ）ｐＨ７．０（０．２２μmろ過）
−BioPORTERタンパク質送達試薬（Genlantis、カタログ番号ＢＰ５０２４２４）
【０４５６】
Ａ１−オリゴマーの調製
参考文献については、Danzer, K.M., et al., J. Neurosci. 27 (2007) 9220-9232、及びDanzer, K.M., et al., J. Neurochem. 111 (2009) 192-203を参照のこと。
【０４５７】
凍結乾燥されたアルファ−シヌクレインをＨＰＬＣ水中に可溶化し、約７０μMのアルファ−シヌクレイン溶液を得た（１００μgタンパク質当たり１００μl）。溶液を、水浴超音波処理器中で、チューブフローティングデバイスを使用して、３０秒間にわたり超音波処理した。その後、５００μlのＨＰＬＣグレード水、２００μlの２５０mM  ＰＢ（ｐＨ７．０）、２００μlのエタノール絶対プロ分析を加えた。混合物を、フルスピードで１０秒間にわたりボルテックスした。その後、５０mM  ＰＢ（ｐＨ７．０）／２０%エタノール中の１００μg/mlアルファ−シヌクレイン溶液を生成した。参照サンプルについては、アルファ−シヌクレインの非存在下における同じ緩衝液を混合した。溶液を、振盪装置上で、室温で４時間にわたり振盪した。振盪後、溶液を、即時凍結乾燥のためにドライアイスで凍結した。凍結乾燥は、一定の回転下で（例えば、Speedvac中で）、室温で一晩実施した。凍結乾燥物を、１０%エタノールを伴う、０．５mlの５０mM  ＰＢ（ｐＨ７．０）中に再懸濁した。エタノールは、オープンキャップを伴うドラフト中で２４時間にわたり２０〜２１℃で蒸発させた（Eppendorf Thermomixer 5436、スピード５）。その後、キャップを閉じ、振盪を室温で６日間にわたり継続した。Ａ１−オリゴマーを、Vivaspin 500（３０kDカットオフ）を用いて１mg/mLまで濃縮し、免疫化のためにプールした。長期保存のために、オリゴマーを−８０℃に保持した。適切なオリゴマー形成のための品質管理を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＭにより行った。
【０４５８】
Ｃ１−オリゴマーの調製
参考文献については、Danzer, K.M., et al., J. Neurosci. 27 (2007) 9220-9232、及びDanzer, K.M., et al., J. Neurochem. 111 (2009) 192-203を参照のこと。
【０４５９】
凍結乾燥されたアルファ−シヌクレインをＨＰＬＣグレード水中に可溶化し、約７０μmの濃度の溶液を得た（１００μgタンパク質当たり１００μl）。溶液を、水浴超音波処理器中で、チューブフローティングデバイスを使用して、３０秒間にわたり超音波処理した。その後、５００μlのＨＰＬＣグレード水、２００μlの２５０mM  ＰＢ（ｐＨ７．０）、２００μlのエタノール絶対プロ分析を加えた。混合物を、フルスピードで１０秒間にわたりボルテックスした。５０mM  ＰＢ（ｐＨ７．０）／２０%エタノール中の１００μg/mlアルファ−シヌクレイン溶液を生成した。対照サンプルについては、アルファ−シヌクレインの非存在下における同じ緩衝液を混合した。溶液を、振盪装置上で、室温で１６時間にわたり（例えば、一晩）振盪した。Ｃ１−オリゴマーを、Vivaspin 500（３０kDカットオフ）を用いて１mg/mLまで濃縮し、免疫化のためにプールした。長期保存のために、オリゴマーを−８０℃に保持した。適切なオリゴマー形成のための品質管理を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＭにより行った。
【０４６０】
ＴＰ変異体アルファ−シヌクレインオリゴマーの調製
Karpinar, D.P., et al., EMBO J. 28 (2009) 3256-3268から適応。
【０４６１】
５０mM  ＨＥＰＥＳ／１００mM  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中での８．２mg/mL（約５９０mM）のＴＰアルファ−シヌクレイン１００μlの一定分量を、３７℃（２００rpm）で６日間にわたり、２×５ｍｍマイクロ磁気撹拌棒を用いて撹拌した。適切なオリゴマー形成のための品質管理を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＭにより行った。
【０４６２】
アルファ−シヌクレイン原線維形成及びBioPORTERとの混合
Luk, K.C., et al., Biochem. 46 (2007) 12522-12526、及びLuk, K.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009) 20051-20056から適応。
【０４６３】
凍結乾燥し、真空化したアルファ−シヌクレインの一定分量（−８０℃から）を、真空化したバッグを開封することなく、１０〜１５分間にわたり室温（ＲＴ）にした。その間に、軌道チューブミキサーを３７℃まで予備加熱した。その後、チューブを含むバッグを開封し、必要な場合、チューブの外側の水滴をふき取った。凍結乾燥されたアルファ−シヌクレイン１００μgを、１００μlのＴＢＳ（ｐＨ７）中に溶解した。チューブを軌道チューブミキサー中に入れ、３７℃／１０００rpmで９６時間にわたりインキュベートした。その後、チューブをフルスピード（２０，０００ｇ）で、室温で１０分間にわたり遠沈させた。９０μlの上清を除去した。ペレットを、９０μlの新鮮なＴＢＳを用いて再懸濁した（約１mg/mL濃度を想定する）。適切な原線維形成のための品質管理を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＭにより行った。長期保存のために、サンプルを−８０℃に保持した。
【０４６４】
免疫化する少し前に、１００μlの１mg/mlウェルの懸濁原線維を２０μlのBioPORTER試薬ドライフィルムに加え、ボルテックス及び水浴超音波処理により激しく混合した。溶液を、免疫化のために使用する前に、１０分間にわたり室温でインキュベートした。
【０４６５】
実施例２
ウサギの免疫化
３羽のニュージーランド白ウサギを、アルファ−シヌクレインＣ１オリゴマー、アルファ−シヌクレイン原線維及びアルファ−シヌクレインＴＰ変異体オリゴマーの混合物（最初の免疫化用の４００μgの各々の成分；継続的な免疫化用の２００μgの各々の成分；調製については、実施例１を参照のこと）を用いて免疫化した。動物は、０日目での皮内適用により、並びに７、１４、３５、６３及び９１日目での交互の筋肉内適用及び皮下適用により、完全フロイントアジュバントを用いて乳化した免疫原を受けた。血液（推定される全血液量の１０%）を、２１、４１、６９及び９７日目に採取した。血清を調製し、それをＥＬＩＳＡによる力価決定のために使用した（以下を参照のこと）。末梢単核細胞を単離し、それをＢ細胞クローニングプロセスにおける抗原特異的Ｂ細胞の供給源として使用した（実施例３及び４）。
【０４６６】
血清力価の決定
力価は、免疫原混合物の各々の成分について別々に決定した。アルファ−シヌクレインＣ１オリゴマー、アルファ−シヌクレイン原線維又はアルファ−シヌクレインＴＰ変異体オリゴマーを、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水溶液）中に０．６μg/ml、１００μl/ウェルで９６ウェルNUNC Maxisorbプレート上に固定化し、続いて、ＰＢＳ中の２%CroteinCを用いたプレートのブロッキング、２００μl/ウェル；ＰＢＳ中の０．５%CroteinC中で、二重反復での抗血清の連続希釈の適用、１００μl/ウェル；ＰＢＳ中の０．５%CroteinC中で１：１６，０００希釈したＨＲＰコンジュゲート（西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート）ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（Jackson Immunoresearch）を用いた検出、１００μl/ウェル；を行った。全ての工程において、プレートを３７℃で１時間にわたりインキュベートした。全ての工程の間で、プレートをＰＢＳ中の０．０５%Tween 20を用いて３回洗浄した。シグナルをBM Blue POD Substrate可溶性（Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany）（１００μl/ウェル）の添加により発生させ、１M  ＨＣｌ（１００μl/ウェル）の添加により低止させた。吸光度を、参照としての６９０nmに対して４５０nmで読み取った。力価を、最大半量のシグナルをもたらす抗血清の希釈として定義した。
【０４６７】
実施例３
Ｂ細胞を産生する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の単離
ウサギ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離
３羽のウサギ（実施例２に記載）を血液の供給源として使用した。製造業者の仕様に従って、lympholyte哺乳動物（Cedarlane Laboratories、Burlington、Ontario、Canada）を使用した密度遠心分離の前に、全血を含むＥＤＴＡを１×ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水；ＰＡＡ、Pasching、Austria）を用いて２倍希釈した。ＰＢＭＣを、１×ＰＢＳを用いて２回洗浄した。
【０４６８】
ＥＬ−４  Ｂ５培地
１０%ＦＣＳ（Hyclone、Logan、UT、USA）、２mMグルタミン、１%ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（PAA、Pasching、Austria）、２mMピルビン酸ナトリウム、１０mM  ＨＥＰＥＳ（PAN Biotech、Aidenbach、Germany）及び０．０５mM  β−メルカプトエタノール（Gibco、Paisley、Scotland）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Pan Biotech、Aidenbach、Germany）。
【０４６９】
マクロファージ／単球の枯渇
無菌６ウェルプレート（細胞培養グレード）を使用し、非特異的接着を通じてマクロファージ及び単球を枯渇させた。各々のウェルを、４mLの培地及び免疫化ウサギからの最大６×１０６個のＰＢＭＣを用いて最大限で充填し、３７℃で１時間にわたりインキュベーター中で結合させた。上清（末梢血リンパ球（ＰＢＬ））中の細胞を、抗原パニング工程のために使用した。
【０４７０】
プレートのコーティング
無菌細胞培養６ウェルプレートを、炭酸緩衝液（０．１M重炭酸ナトリウム、３４mM炭酸水素二ナトリウム、ｐＨ９．５５）中の２つの異なるヒトアルファ−シヌクレインオリゴマー（１μg/ml  Ｃ１オリゴマー及び１μg/ml  ＴＰ変異体オリゴマー）の混合物を用いて一晩４℃でコーティングした。プレートを、使用前に３回、無菌ＰＢＳ中で洗浄した。
【０４７１】
ヒトアルファ−シヌクレインオリゴマー上でのＢ細胞の濃縮
ヒトアルファ−シヌクレインオリゴマーを用いてコーティングした６ウェル組織培養プレートを、４ml培地当たり最大６×１０６個のＰＢＬを用いて播種し、インキュベーター中で、３７℃で１時間にわたり結合させた。アルファ−シヌクレインオリゴマー上での濃縮工程後、非接着細胞を、１×ＰＢＳを用いてウェルを１〜２回慎重に洗浄することにより除去した。残りの粘着性細胞を、インキュベーターにおいて３７℃で１０分間にわたりトリプシンにより剥離した。トリプシン処理は、ＥＬ−４  Ｂ５培地を用いて停止させた。細胞を、免疫蛍光染色まで氷上に保持した。
【０４７２】
免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー
抗ＩｇＧ抗体ＦＩＴＣコンジュゲート（AbD Serotec、Dusseldorf、Germany）を、単一細胞選別のために使用した。表面染色のために、枯渇及び濃縮工程からの細胞を、ＰＢＳ中で抗ＩｇＧ抗体ＦＩＴＣコンジュゲートとインキュベートし、４５分間にわたり４℃で暗所においてインキュベートした。染色後、ＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳを用いて２倍洗浄した。最後に、ＰＢＭＣを、氷冷ＰＢＳ中に再懸濁し、直ぐにＦＡＣＳ分析に供した。濃度５μg/ml中のヨウ化プロピジウム（BD Pharmingen、San Diego、CA、USA）を、ＦＡＣＳ分析に先立ち加え、死細胞と生細胞を識別した。
【０４７３】
コンピュータを備えたBecton Dickinson FACSAria及びFACSDivaソフトウェア（BD Biosciences、USA）を、単一細胞選別のために使用した。
【０４７４】
Ｂ細胞培養
ウサギＢ細胞の培養は、Zubler et al.により記載されたものと同様の方法により調製した（J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183）。簡単には、単一の選別されたウサギＢ細胞を、Pansorbin Cells（１：１０００００）（Calbiochem（Merck）、Darmstadt、Deutschland）、５%ウサギ胸腺細胞上清（チャージ２０１００９０８、社内産生）及びガンマ線照射マウスＥＬ−４−Ｂ５胸腺腫細胞（２．５×１０４個／ウェル）を含む２００μl/ウェルのＥＬ−４  Ｂ５培地を伴う９６ウェルプレート中で、７日間にわたり３７℃で５%ＣＯ２下でインキュベートした。Ｂ細胞培養の上清をスクリーニングのために除去した。並行して、残りの細胞のｍＲＮＡを直ぐに１００μlのＲＬＴ緩衝液（Qiagen、Hilden、Germany）中に保存し、溶解物を−８０℃で凍結した。
【０４７５】
実施例４
抗体可変ドメインコード核酸の決定
ＶドメインのＰＣＲ増幅及び配列決定
全ＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従って、NucleoSpin 8/96 RNAキット（Macherey&Nagel；カタログ番号７４０７０９．４、７４０６９８）を使用して調製した。全ての工程はepMotion 5075液体ハンドリングシステム（Eppendorf）上で行った。ＲＮＡを６０μlのＲＮＡｓｅフリー水を用いて溶出した。６μlのＲＮＡを使用し、製造業者の使用説明書に従って、Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix（Invitrogen；カタログ番号１８０８０−４００）及びオリゴｄＴプライマーを使用した逆転写酵素反応によりｃＤＮＡを生成した。４μlのｃＤＮＡを使用し、重鎖用のプライマーrbHCfinal.up（ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＴＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＧＧＣＴＴＣ；配列番号４２）及びrbHCfinal.do（ＣＣＡＴＴＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＣＣＣＧＡＧ；配列番号４３）並びに軽鎖用のプライマーrbLCfinal.up（ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＹＧＡＧＧＧＣＣＣＣＣＡＣＴＣ；配列番号４４）及びrbLCfinal.do（ＣＡＧＡＧＴＲＣＴＧＣＴＧＡＧＧＴＴＧＴＡＧＧＴＡＣ；配列番号４５）を使用して、最終容積５０μl中でAccuPrime SuperMix（Invitrogen；カタログ番号１２３４４−０４０）を用いて、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を増幅させた。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９４℃で５分間にわたるホットスタート；９４℃で２０秒間、７０℃で２０秒間、６８℃で４５秒間の３５サイクル、及び６８℃で７分間にわたる最終伸長。
【０４７６】
５０μlのＰＣＲ溶液の８マイクロリットルを、48 E-Gel 2%（Invitrogen；カタログ番号Ｇ８００８−０２）に添加した。陽性ＰＣＲ反応物を、製造業者のプロトコールに従って、NucleoSpin Extract IIキット（Macherey&Nagel；カタログ番号７４０６０９２５０）を使用して浄化し、５０μlの溶出緩衝液中に溶出した。１２μlの精製されたＰＣＲ産物を、重鎖用のrbHCfinal.up及びrbHCfinal.do並びに軽鎖用のrbLCfinal.up及びrbLCfinal.doを使用して両方向において直接的に配列決定した。
【０４７７】
実施例５
ウサギ抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体のヒト化
ウサギ抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体は、標準的な技術（例えばＣＤＲ移植）に従ってヒト化することができる。
【０４７８】
実施例６
組換え発現ベクターの生成
ａ）マウスＩｇＧ１定常領域を使用した、免疫グロブリン重鎖の発現用のベクターの生成
マウスＩｇＧ１定常領域（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３）及びウサギに由来する抗アルファ−シヌクレイン抗体ＶＨドメインを含むマウスＩｇＧ１コード融合遺伝子を、それぞれの抗アルファ−シヌクレイン特異的抗体ＶＨドメインについてコードするＤＮＡフラグメントを、マウスＩｇＧ１定常領域をコードする配列エレメントに融合することにより組み立てた。
【０４７９】
マウスＩｇＧ１定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰ  ＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮ  ＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫ  ＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴ  ＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤ  ＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶ  ＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶ  ＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳ  ＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲ  ＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴ  ＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦ  ＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩ  ＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶ  ＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶ  ＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥ  ＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥ  ＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶ  ＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷ  ＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶ  ＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥ  ＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰ  ＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰ  ＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶ  ＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦ  ＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷ  ＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮ  ＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳ  ＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱ  ＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦ  ＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨ  ＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨ  ＳＰＧＫ
（配列番号４６）。
【０４８０】
発現ベクターはまた、ベクターｐＵＣ１８からの複製起点（それによって、大腸菌におけるこのプラスミドの複製が可能になる）及び大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含んだ。
【０４８１】
抗体重鎖の転写単位は、５’から３’方向において、以下の機能的エレメントを含む：
−イントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルス（Ｐ−ＣＭＶ）からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−重鎖可変（ＶＨ）ドメインコード核酸、
−マウスＩｇＧ１定常領域コード核酸、及び
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ  ｐＡ）。
【０４８２】
ｂ）マウスＩｇ−カッパ定常領域を使用した、免疫グロブリン軽鎖の発現用のベクターの生成
マウスＩｇ−カッパ定常領域（ＣＬ−カッパ）及びウサギに由来する抗アルファ−シヌクレイン抗体ＶＬ（カッパ）ドメインを含むマウスカッパ軽鎖コード融合遺伝子を、それぞれの抗アルファ−シヌクレイン抗体ＶＬ（カッパ）ドメインについてコードするＤＮＡフラグメントをマウスＩｇ−カッパ定常領域についてコードする配列エレメントに融合することにより組み立てた。
【０４８３】
マウスＩｇ−カッパ定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩ  ＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳ  ＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮ  ＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫ  ＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮ  ＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤ  ＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳ  ＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥ  ＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴ  ＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫ  ＳＦＮＲＮＥＣ
（配列番号４７）。
【０４８４】
発現ベクターはまた、ベクターｐＵＣ１８からの複製起点（それによって、大腸菌におけるこのプラスミドの複製が可能になる）及び大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含んだ。
【０４８５】
抗体カッパ軽鎖の転写単位は、５’から３’方向において、以下の機能的エレメントを含む：
−イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス（Ｐ−ＣＭＶ）からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−軽鎖可変（ＶＬ）ドメインコード核酸、
−マウスＩｇ−カッパ定常領域コード核酸、及び
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ  ｐＡ）。
【０４８６】
ｃ）マウスＩｇ−ラムダ定常領域を使用した、免疫グロブリン軽鎖の発現用のベクターの生成
マウスＩｇ−ラムダ定常領域（ＣＬ−ラムダ）及びウサギに由来する抗アルファ−シヌクレイン抗体ＶＬ（ラムダ）ドメインを含むマウスラムダ軽鎖コード融合遺伝子を、それぞれの抗アルファ−シヌクレイン抗体ＶＬ（ラムダ）ドメインについてコードするＤＮＡフラグメントをマウスＩｇ−ラムダ定常領域についてコードする配列エレメントに融合することにより組み立てた。
【０４８７】
マウスＩｇ−ラムダ定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＧＱＰＫＳＳＰＳＶＴ  ＬＦＰＰＳＳＥＥＬＥ  ＴＮＫＡＴＬＶＣＴＩ  ＴＤＦＹＰＧＶＶＴＶ  ＤＷＫＶＤＧＴＰＶＴ  ＱＧＭＥＴＴＱＰＳＫ  ＱＳＮＮＫＹＭＡＳＳ  ＹＬＴＬＴＡＲＡＷＥ  ＲＨＳＳＹＳＣＱＶＴ  ＨＥＧＨＴＶＥＫＳＬ  ＳＲＡＤＣＳ
（配列番号４８）。
【０４８８】
発現ベクターはまた、ベクターｐＵＣ１８からの複製起点（それによって、大腸菌におけるこのプラスミドの複製が可能になる）及び大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含んだ。
【０４８９】
抗体ラムダ軽鎖の転写単位は、５’から３’方向において、以下の機能的エレメントを含む：
−イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス（Ｐ−ＣＭＶ）からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−可変軽鎖（ＶＬ）ドメインコード核酸、
−マウスＩｇ−ラムダ定常領域コード核酸、及び
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ  ｐＡ）。
【０４９０】
ｄ）血液脳関門シャトルモジュールにコンジュゲートされた免疫グロブリン鎖の発現用のベクターの生成
ＩｇＧ重鎖構築物についてコードする発現ベクターの場合において、分子のＩｇＧ部分は、ゲノム構成中にあり、即ち、イントロンが、シグナルペプチド中に、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインの間に、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の間に、ヒンジ領域とＣＨ２ドメインの間に、及びＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの間に存在した。そこに（Ｃ末端／３’末端に）、脳シャトルモジュールについてコードするｃＤＮＡエレメントを融合させた。完全抗体分子当たり１つだけの脳シャトルモジュールを持つ抗体分子を産生するために、「ノブ−イントゥ−ホール」技術を用いた。
【０４９１】
ホール重鎖は、以下の変異を含む：Ｔ３６６Ｗ。
【０４９２】
ノブ重鎖は、以下の変異を含む：Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ。
【０４９３】
場合により、人工ジスルフィド結合を、ホール重鎖の残基３５４とノブ重鎖の残基３４９の間に導入することができる。追加で要求される変異は、ホール重鎖中のＳ３５４Ｃ及びノブ重鎖中のＹ３４９Ｃである。
【０４９４】
Ｉｇ軽鎖構築物についてコードする発現ベクターの場合において、分子のＩｇ−カッパ又はＩｇ−ラムダ部分が、ゲノム構成中にあり、即ち、イントロンが、シグナルペプチド中に、及びＶＬドメインとＣＬドメインの間に存在した。
【０４９５】
発現される所望の遺伝子を含む発現単位／カセットに加えて、基礎／標準哺乳動物発現プラスミドは、以下を含む：
【０４９６】
ｉ）「ホール」変異を伴うヒトＩｇＧ１定常領域を使用した、シャトルモジュールを含む免疫グロブリン重鎖の発現用のベクターの生成
ヒトＩｇＧ１定常領域（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３）及びウサギに由来する抗アルファ−シヌクレイン抗体ＶＨドメインを含むヒトＩｇＧ１コード融合遺伝子を、それぞれの抗アルファ−シヌクレイン抗体ＶＨドメインについてコードするＤＮＡフラグメントを、「ホール」変異を含むヒトＩｇＧ１定常領域についてコードする配列エレメントに融合することにより組み立てた。構築物は、ゲノム構成中にあり、即ち、イントロンが、シグナルペプチド中に、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインの間に、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の間に、ヒンジ領域とＣＨ２ドメインの間に、及びＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの間に存在した。
【０４９７】
ヒトＩｇ１定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ  ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ  ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰ  ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ  ＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ  ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰ  ＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰ  ＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳ  ＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ  ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡ  ＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ  ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴ  ＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ  ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡ  ＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳ  ＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱ  ＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ  ＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣ  ＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩ  ＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰ  ＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ  ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹ  ＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ  ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶ  ＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴ  ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ  
（配列番号４９）。
【０４９８】
ヒトＩｇ１ホール定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ  ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ  ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰ  ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ  ＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ  ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰ  ＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰ  ＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳ  ＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ  ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡ  ＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ  ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴ  ＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ  ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡ  ＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳ  ＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱ  ＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ  ＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣ  ＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩ  ＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰ  ＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ  ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹ  ＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ  ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶ  ＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴ  ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ  
（配列番号５０）。
【０４９９】
発現ベクターはまた、ベクターｐＵＣ１８からの複製起点（それによって、大腸菌におけるこのプラスミドの複製が可能になる）及び大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含んだ。
【０５００】
ホール抗体重鎖の転写単位は、５’から３’方向において、以下の機能的エレメントを含む：
−ヒトサイトメガロウイルス（Ｐ−ＣＭＶ）からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−重鎖可変（ＶＨ）ドメインコード核酸、
−「ホール」変異コード核酸を伴うヒトＩｇＧ１定常領域、
−場合により、血液脳関門シャトルモジュールコード核酸に融合されたＧＳリンカーコード核酸、及び
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ  ｐＡ）。
【０５０１】
ｉｉ） 「ノブ」変異を伴うヒトＩｇＧ１定常領域を使用した、シャトルモジュールを含む免疫グロブリン重鎖の発現用のベクターの生成
ヒトＩｇＧ１定常領域（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３）及びウサギに由来する抗アルファ−シヌクレイン抗体ＶＨドメインを含むヒトＩｇＧ１コード融合遺伝子を、それぞれの抗アルファ−シヌクレイン抗体ＶＨドメインについてコードするＤＮＡフラグメントを、「ノブ」変異を含むヒトＩｇＧ１定常領域についてコードする配列エレメントに融合することにより組み立てた。構築物は、ゲノム構成中にあり、即ち、イントロンが、シグナルペプチド中に、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインの間に、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の間に、ヒンジ領域とＣＨ２ドメインの間に、及びＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの間に存在した。
【０５０２】
ヒトＩｇ１ノブ定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ  ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ  ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰ  ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ  ＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ  ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰ  ＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰ  ＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳ  ＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ  ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡ  ＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ  ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴ  ＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ  ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡ  ＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳ  ＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱ  ＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ  ＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣ  ＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩ  ＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰ  ＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ  ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶ  ＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ  ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶ  ＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴ  ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
（配列番号５１）。
【０５０３】
発現ベクターはまた、ベクターｐＵＣ１８からの複製起点（それによって、大腸菌におけるこのプラスミドの複製が可能になる）及び大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含んだ。
【０５０４】
ノブ抗体重鎖の転写単位は、５’から３’方向において、以下の機能的エレメントを含む：
−ヒトサイトメガロウイルス（Ｐ−ＣＭＶ）からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−重鎖可変（ＶＨ）ドメインコード核酸、
−「ノブ」変異コード核酸を伴うヒトＩｇＧ１定常領域、
−場合により、血液脳関門シャトルモジュールコード核酸に融合されたＧＳリンカーコード核酸、及び
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ  ｐＡ）。
【０５０５】
ｉｉｉ）ヒトＩｇ−カッパ定常領域を使用した、免疫グロブリンカッパ軽鎖の発現用のベクターの生成
ヒトＩｇ−カッパ定常領域（ＣＬ−カッパ）及びウサギに由来する抗アルファ−シヌクレイン抗体ＶＬ（カッパ）ドメインを含むヒトＩｇ−カッパ軽鎖コード融合遺伝子を、それぞれの抗アルファ−シヌクレイン抗体ＶＬ（カッパ）ドメインについてコードするＤＮＡフラグメントをヒトＩｇ−カッパ定常領域についてコードする配列エレメントに融合することにより組み立てた。構築物は、ゲノム構成中にあり、即ち、イントロンが、シグナルペプチド中に、及びＶＬ（カッパ）ドメインとＣＬ−カッパドメインの間に存在した。
【０５０６】
発現ベクターはまた、ベクターｐＵＣ１８からの複製起点（それによって、大腸菌におけるこのプラスミドの複製が可能になる）及び大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含んだ。
【０５０７】
抗体カッパ軽鎖の転写単位は、５’から３’方向において、以下の機能的エレメントを含む：
−ヒトサイトメガロウイルス（Ｐ−ＣＭＶ）からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−軽鎖可変（ＶＬ）ドメインコード核酸、
−ヒトＩｇＧカッパ定常領域、
−場合により、血液脳関門シャトルモジュールコード核酸に融合されたＧＳリンカーコード核酸、及び
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ  ｐＡ）。
【０５０８】
ｉｖ）ヒトＩｇ−ラムダ定常領域を使用した、免疫グロブリンラムダ軽鎖の発現用のベクターの生成
ヒトＩｇ−ラムダ定常領域（ＣＬ−ラムダ）及びウサギに由来する抗アルファ−シヌクレイン抗体ＶＬ（ラムダ）ドメインを含むヒトＩｇ−ラムダ軽鎖コード融合遺伝子を、それぞれの抗アルファ−シヌクレイン抗体ＶＬ（ラムダ）ドメインについてコードするＤＮＡフラグメントをヒトＩｇ−ラムダ定常領域についてコードする配列エレメントに融合することにより組み立てた。構築物は、ゲノム構成中にあり、即ち、イントロンが、シグナルペプチド中に、及びＶＬ（ラムダ）ドメインとＣＬ−ラムダドメインの間に存在した。
【０５０９】
発現ベクターはまた、ベクターｐＵＣ１８からの複製起点（それによって、大腸菌におけるこのプラスミドの複製が可能になる）及び大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含んだ。
【０５１０】
抗体ラムダ軽鎖の転写単位は、５’から３’方向において、以下の機能的エレメントを含む：
−ヒトサイトメガロウイルス（Ｐ−ＣＭＶ）からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−軽鎖可変（ＶＬ）ドメインコード核酸、
−ヒトＩｇＧラムダ定常領域、
−場合により、血液脳関門シャトルモジュールコード核酸に融合されたＧＳリンカーコード核酸、及び
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ  ｐＡ）。
【０５１１】
実施例７
抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の組換え産生
抗体を、F17 Medium（Invitrogen Corp.）中で培養した一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓細胞株２９３由来）中で産生させた。実施例６において記載する通りのそれぞれのベクターのトランスフェクションのために、「293-Free」Transfection Reagent（Novagen）を使用した。抗体及び抗体血液脳関門シャトル融合体を、個々の発現プラスミドから発現させた。トランスフェクションを、製造業者の使用説明書において指定される通りに実施した。組換え抗体を含む細胞培養上清を、トランスフェクションの３〜７日後に収集した。上清を、精製まで、低温（例えば、−８０℃）で保存した。
【０５１２】
例えば、ＨＥＫ２９３細胞中でのヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般的な情報が、Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203に与えられている。
【０５１３】
実施例８
組換え抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の精製
抗体を含む培養上清をろ過し、２つのクロマトグラフィー工程により精製した。
【０５１４】
抗体を、ＰＢＳ（１mM  ＫＨ２ＰＯ４、１０mM  Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７mM  ＮａＣｌ、２．７mM  ＫＣｌ）（ｐＨ７．４）を用いて平衡化したHiTrap MabSelectSuRe（GE Healthcare）を使用した親和性クロマトグラフィーにより捕捉した。非結合タンパク質を、平衡化緩衝液を用いた洗浄により除去し、抗体を２５mMクエン酸緩衝液（ｐＨ３．１）を用いて回収し、それを、溶出直後に、１M  Ｔｒｉｓベース（ｐＨ９．０）を用いてｐＨ６．０に調整した。
【０５１５】
Superdex 200（商標）（GE Healthcare）上でのサイズ排除クロマトグラフィーを、第２精製工程として使用した。サイズ排除クロマトグラフィーを、２０mMヒスチジン緩衝液、０．１４M  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中で実施した。抗体を含む溶液を、Biomax-SK膜（Millipore、Billerica、MA、USA）を備えたUltrafree-CL遠心フィルターユニットを用いて濃縮し、−８０℃で保存した。
【０５１６】
【表２】
2020073565.tif 000003
【０５１７】
実施例９
表面プラズモン共鳴を使用した結合特異性の特徴付け
BIAcore 2000、3000又はT200機器（GE Healthcare、BIAcore、Uppsala、Sweden）を、全ての記載された方法において適用した。全ての固定化工程及び結合アッセイを２５℃で実施した。固定化及び結合アッセイを、それぞれ５又は３０μl/分で実施した（特に言及しない場合）。
【０５１８】
ａ）固定化モノクローナル抗体へ結合する単量体アルファ−シヌクレインの特徴付け
緩衝液：
固定化緩衝液：１０mM  Ｈｅｐｅｓ、１５０mM  ＮａＣｌ、０．０５%  ポリソルベート２０（Ｐ２０）（ｐＨ７．５）
捕捉及び結合緩衝液：１０mM  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０mM  ＮａＣｌ、３mM  ＥＤＴＡ、０．０５%  Ｐ２０
【０５１９】
捕捉抗体上の固定化モノクローナル抗体への精製単量体α−シヌクレイン−ヘキサＨｉｓの結合アッセイ
ｉ）ヤギ抗マウス免疫グロブリンＩｇＧ（捕捉抗体）の固定化
ヤギ抗マウスＩｇＧ（マウス抗体捕捉キット；カタログ番号ＢＲ−１００８−３８；GE Healthcare、Uppsala、Sweden）の固定化を、１０mM  Ｈｅｐｅｓ、１５０mM  ＮａＣｌ、０．０５%  Ｐ２０を含む緩衝液（ｐＨ７．５）中で実施した。最初の工程において、ＣＭ５センサーチップ表面のカルボキシル基が、センサー表面を０．２M  Ｎ−エチル−Ｎ−ジメチルアミノポリカルボジイミド（ＥＤＣ）及び０．０５M  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の溶液と７分間接触させることにより、反応性スクシンイミドエステルに変換された。活性化後、センサー表面を、１０mM酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中の３０μg/mlのヤギ抗マウスＩｇＧと３分間接触させた。ＩｇＧを、約３０００ＲＵ（応答単位）のレベルに固定化した。最後に、表面上の過剰の活性化カルボキシル基をエタノールアミン（１Ｍ、ｐＨ８．５、７分間）でクエンチした。
【０５２０】
ｉｉ）抗アルファ−シヌクレイン抗体の捕捉
モノクローナル抗アルファ−シヌクレイン抗体（泳動緩衝液中の１００nM溶液）を、２００〜２５０ＲＵの捕捉抗体の量に達するまで、固定化ＩｇＧ抗体上に捕捉した。センサーチップの１つのチャネルを、参照チャネルとして、固定化ヤギ抗マウス抗体を用いて使用した。
【０５２１】
ｉｉｉ）Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグを伴う単量体アルファ−シヌクレインの結合実験
結合実験を、１０mM  Ｈｅｐｅｓ、１５０mM  ＮａＣｌ、３mM  ＥＤＴＡ、０．０５%  Ｐ２０を含む緩衝液（ｐＨ７．５）中で実施した。精製単量体アルファ−シヌクレイン−ヘキサＨｉｓを、捕捉モノクローナル抗アルファ−シヌクレイン抗体の表面上で、３３４nM（５ポイント、希釈係数２）まで滴定した。精製単量体アルファ−シヌクレイン−ヘキサＨｉｓの各々の滴定後、アルファ−シヌクレイン及びモノクローナル抗アルファ−シヌクレイン抗体の複合体を、１０mM  グリシン−ＨＣｌ溶液（ｐＨ１．７）の短いパルスを用いて、チップから除去した。新たなモノクローナル抗アルファ−シヌクレイン抗体を、その後、チップ表面上で捕捉した。
【０５２２】
ｂ）ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）チップ上にＨｉｓタグを介して固定化された単量体アルファ−シヌクレインに結合するモノクローナル抗アルファ−シヌクレイン抗体の特徴付け
緩衝液：
固定化緩衝液：１０mM  Ｈｅｐｅｓ、１５０mM  ＮａＣｌ、０．０５%  Ｐ２０（ｐＨ７．５）
結合緩衝液：１０mM  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０mM  ＮａＣｌ、３mM  ＥＤＴＡ、０．０５%  Ｐ２０
【０５２３】
ｉ）ＮＴＡセンサー表面上での精製単量体アルファ−シヌクレインの固定化
ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）センサー表面上での単量体α−シヌクレイン−ヘキサＨｉｓ（Ｎ末端）の固定化を、１０mM  Ｈｅｐｅｓ、１５０mM  ＮａＣｌ、０．０５%Ｐ２０を含む泳動緩衝液（ｐＨ７．５）中で実施した。ＮＴＡセンサー表面を、最初に、５μl／分の流量で０．３５M  ＥＤＴＡを用いて、各々１分間にわたり３回洗浄した。その後、センサー表面に、チップ表面と泳動緩衝液中の５００μM  ＮｉＣｌ２との１分間の接触により、Ｎｉ２＋イオンを添加し、更に０．２M  ＥＤＣ及び０．０５M  ＮＨＳ溶液を用いて７分間にわたり活性化した。更に、泳動緩衝液中のヘキサＨｉｓ標識アルファ−シヌクレイン（＜０．１μg/ml）をセンサー表面と接触させ、低密度面（５ＲＵまで）を達成し、アルファ−シヌクレインへのモノクローナル抗アルファ−シヌクレイン抗体の一価の結合の更なる検出を可能にした。最後に、活性エステルの残りの基を、１M  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を用いて５分間にわたり不活性化させた。固定化アルファ−シヌクレインを伴わないフローチャネルを、参照チャネルとして使用した。
【０５２４】
ｉｉ）固定化α−シヌクレインを伴うモノクローナル抗体を用いた結合アッセイ
結合アッセイを、１０mM  Ｈｅｐｅｓ、１５０mM  ＮａＣｌ、３mM  ＥＤＴＡ、０．０５%  Ｐ２０を含む緩衝液（ｐＨ７．５）中で実施した。モノクローナル抗アルファ−シヌクレイン抗体をイエス／ノー結合応答について１００nMの単一濃度で分析し、又は１００nMまでの濃度（希釈係数２を伴う５つの濃度の単回注射）の泳動緩衝液中で滴定し、単量体アルファ−シヌクレインに対する結合動態及び親和性を推定した。各々の抗アルファ−シヌクレイン抗体の各々の濃度についての結合曲線のモニタリング後、アルファ−シヌクレイン表面を、１００mM  リン酸の２つの短いパルス（２×１分間）を用いて再生し、結合抗体を洗い流し、別の抗体結合のモニタリングを可能にした。
【０５２５】
ｃ）Ｌ１センサー上のＤＯＰＣ：ＤＯＰＳリポソーム上に固定化された単量体アルファ−シヌクレインに結合するモノクローナル抗アルファ−シヌクレイン抗体の特徴付け
緩衝液：
固定化及び結合緩衝液：５０mM  Ｈｅｐｅｓ、１５０mM  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）
【０５２６】
ｉ）ＤＯＰＣ：ＤＯＰＳリポソームの調製
クロロホルム中の脂質ＤＯＰＣ：ＤＯＰＳ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン）の２５mg/mL（７：３（ｗ／ｗ））混合物を、真空フード下でアルゴン流を用いて、ガラスフラスコ中で蒸発させ、フラスコ壁上で脂質フィルムを得た。脂質フィルムを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０mM  ＨＥＰＥＳ、１５０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で水和させ、５mM緩衝脂質溶液を得た。脂質溶液をMini-Extruder（Avanti Polar Lipids、Alabaster、USA）を用いて、１００nM押出機フィルターを介した脂質溶液の１５回の通過により押出し、リポソーム溶液を得た。リポソームの質及びサイズを、動的光散乱法により証明した。
【０５２７】
ｉｉ）ＤＯＰＣ：ＤＯＰＳリポソーム上での精製単量体α−シヌクレインの固定化
ＤＯＰＣ：ＤＯＰＳリポソーム上でのアルファ−シヌクレイン−ヘキサＨｉｓ（Ｎ末端タグ）の固定化を、５０mM  Ｈｅｐｅｓ、１５０mM  ＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．５）中で実施した。Ｌ１センサー表面の全てのフローチャネルを、最初に、２０mM  Ｃｈａｐｓ溶液を用いて１分間にわたり洗浄し、安定したベースラインを得た。押出により得られたＤＯＰＣ：ＤＯＰＳリポソーム溶液を、泳動緩衝液中で５倍希釈し、全てのフローチャネルのセンサー表面上に添加し、約３０００ＲＵの固定化レベルを得た。全てのフローチャネルを、次の工程において、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）溶液（０．１mg/mL）を用いてブロックし、センサー表面上での／へのアルファ−シヌクレインの非特異的結合を低下させた。アルファ−シヌクレインを、泳動緩衝液中で濃度５．０μg/mlに希釈し、選択されたフローチャネル上で低密度（＜３０ＲＵ）にリポソーム上に固定化し、アルファ−シヌクレインに結合する一価抗体の検出を可能にした。固定化されたリポソームを伴うが、アルファ−シヌクレインを伴わないフローチャネルを、参照チャネルとして使用した。
【０５２８】
ｉｉｉ）ＤＯＰＣ：ＤＯＰＳリポソーム上での固定化アルファ−シヌクレインへのモノクローナル抗体を用いた結合アッセイ
結合アッセイにおいて、各々の抗体を、イエス／ノー結合応答について、１００nMの単一濃度で分析した、又は、１００nMの濃度まで（希釈係数２を伴う５ポイント）、アクティブチャネル及び参照チャネル上で、泳動緩衝液中で滴定し、アルファ−シヌクレインへの結合動態及び親和性を推定した。抗体結合のモニタリング後、センサー表面を、２０mM  Ｃｈａｐｓを用いて１分間にわたり再生させ、リポソームの次の固定化のために、泳動緩衝液を用いて平衡化した。
【０５２９】
ｄ）アルファ−シヌクレイン前形成原線維（ＰＦＦ）に結合するモノクローナル抗アルファ−シヌクレイン抗体の特徴付け
緩衝液：
固定化緩衝液：１０mM  Ｈｅｐｅｓ、１５０mM  ＮａＣｌ、０．０５%  Ｐ２０（ｐＨ７．５）
結合緩衝液：１０mM  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０mM  ＮａＣｌ、３mM  ＥＤＴＡ、０．０５%  Ｐ２０
【０５３０】
ｉ）ＮＴＡセンサー表面上でのα−シヌクレイン前形成原線維の固定化
アルファ−シヌクレインＰＦＦ（Ｎ末端ヘキサＨｉｓタグ標識アルファ−シヌクレイン及び非標識アルファ−シヌクレインを比率１：１０で含む）のＨｉｓタグ固定化を、１０mM  Ｈｅｐｅｓ、１５０mM  ＮａＣｌ、０．０５%  Ｐ２０を含む泳動緩衝液（ｐＨ７．５）中で、ＮＴＡセンサー上で実施した。ＮＴＡセンサー表面を、最初に、５μl/分の流量で０．３５M  ＥＤＴＡ溶液を用いて、１分間にわたり洗浄した。その後、センサー表面に、表面と泳動緩衝液中の５００μM  ＮｉＣｌ２溶液との１分間の接触により、Ｎｉ２＋イオンを添加し、更に０．２M  ＥＤＣ及び０．０５M  ＮＨＳ溶液を用いて７分間にわたり活性化した。泳動緩衝液中のアルファ−シヌクレインＰＦＦの希釈溶液を、センサー表面と接触させ、センサー表面上で種々の原線維密度（約２０ＲＵ、約２００ＲＵ及び約２０００ＲＵ）を達成した。活性エステルの残りの遊離基の不活性化を、１M  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を用いて５分間にわたり実施した。アルファ−シヌクレイン原線維が固定化されなかったフローチャネルの１つを、参照チャネルとして使用した。
【０５３１】
ｉｉ）固定化ＰＦＦへのモノクローナル抗体を用いた結合アッセイ
各々の抗アルファ−シヌクレイン抗体の結合を、並列における全ての４つのチャネルで、１００nMの濃度まで（５ポイント、希釈係数２）滴定実験においてモニターした。各々の抗体についての結合曲線のモニタリング後、アルファ−シヌクレインＰＦＦ表面を、１００mM  リン酸の短いパルス（２×１分間）を用いて再生し、結合抗体を洗い流した。
【０５３２】
結果：
また、血液脳関門シャトルモジュールを伴う融合体として、本明細書において報告する通りの異なるアルファ−シヌクレイン抗体の、及び、上に記載する通りのＳＰＲを用いて決定された特定の参照抗体の結合を、下の表中に示す。
【０５３３】
【表３】
2020073565.tif 000004
【０５３４】
−抗体００７０は、抗体００１７と抗トランスフェリン受容体抗体８Ｄ３のｓｃＦｖとの血液脳関門シャトル融合体である；
−抗体００７６は、抗体００１８と抗トランスフェリン受容体抗体８Ｄ３のｓｃＦｖとの血液脳関門シャトル融合体である。
【０５３５】
実施例１０
免疫組織化学分析及び細胞毒性アッセイ
ＰＤ脳切片の免疫組織化学分析
ヒトパーキンソン病患者の脳の凍結切片（１０μm）を、抗体００１７、抗体００１８又は抗体００５７（マウスＦｃ）の５．０μg/ml  一次ＩｇＧを用いて染色し、５．０μg/ml  ウサギ抗アルファ−シヌクレイン抗体（Cell Signaling；カタログ番号２６２８Ｓ）を用いて対比染色した。
【０５３６】
二次抗体として、Alexa Fluor 488コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｈ＋Ｌ）（Invitrogen、カタログ番号Ａ１１００１）及びAlexa Fluor 594コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｈ＋Ｌ）（高い交差吸着、Invitrogen、カタログ番号Ａ１１０３７）を使用した。
【０５３７】
標本は、６３×レンズ１．２ＮＡ、１．６×Zoom、Pinhole ＠1.0AUを使用して、ＬＥＩＣＡ共焦点顕微鏡（ＳＰ５ｘ）で画像化した。
【０５３８】
Alexa 488を＠４９７nm（１０%  ＷＬＬ）で励起した；発光＠５０５−５７１nm（９８%ＨｙＤ）。
【０５３９】
Alexa 594を＠５９０nm（８%  ＷＬＬ）で励起した；発光＠５９６−６８０nm（９２%ＨｙＤ）。画像を５×ライン平均化により平均化した。
【０５４０】
結果は、図１２を参照のこと。
【０５４１】
治療用抗体によるアルファ−シヌクレイン媒介性毒性の保護のためのヒト神経細胞（ＬＵＨＭＥＳ）機能的細胞モデル
ＬＵＨＭＥＳ細胞を、下に詳細に記載する通り、３８４ウェルプレート中で５日間にわたり分化させた。播種から２４時間後、ＬＵＨＭＥＳ分化培地中で成長するＳＨＳＹ５Ｙ細胞からの条件細胞培養上清を、１：１希釈でプレートに加え、エキソソーム媒介性アルファ−シヌクレイン毒性を誘導した。対照培養物は、ＬＵＨＭＥＳ分化培地を受けた。試験する抗体を、最終濃度１０μg/mlで、条件ＳＨＳＹ５Ｙ培地と一緒に加えた。細胞生存率を、CellTiterGloアッセイ（Promega、カタログ番号ＲＥＦ  Ｇ７５７１）により、追加の４日後に決定した。生存率の値は、ＣＰＳカウントとして表示される。
【０５４２】
細胞培養方法
コーティング、培地及び添加物：
−ポリ−Ｌ−オルニチン：Sigma-Aldrich、カタログ番号Ｐ−３６５５−１００mg
−フィブロネクチン（溶液）：Sigma-Aldrich、カタログ番号Ｆ−１１４１−５mg  
−アドバンストＤＭＥＭ／Ｆ−１２：Gibco／Invitrogen、カタログ番号１２６３４−０１０
−Ｎ−２：Gibco／Invitrogen、カタログ番号１７５０２０４８又はＰＡＡ  Ｆ００５−００４
−Ｌ−グルタミン：Sigma-Aldrich、カタログ番号Ｇ７５１３
−ＦＧＦ：R&D Systems、カタログ番号４１１４−ＴＣ（１mg）
−ＧＤＮＦ：R&D Systems、カタログ番号２１２−ＧＤ（５０μg）
−テトラサイクリン：Sigma-Aldrich、カタログ番号Ｔ−７６６０
−ｃＡＭＰ：Sigma-Aldrich、カタログ番号Ｄ０６２７
【０５４３】
ＬＵＨＭＥＳ培養及び分化：
コーティング（全てのプレート及びフラスコは、Nunclonでなければならない）：
【０５４４】
【表４】
2020073565.tif 000005
【０５４５】
コーティング溶液を、プレート及びフラスコ中に充填した（Ｔ７５フラスコ：７ml；Ｔ１７５フラスコ：１４ml；９６ウェルプレート：５０μl/ウェル、２４ウェルプレート：２５０μl/ウェル、１２ウェルプレート：５００μl/ウェル、６ウェルプレート：１ml/ウェル）。プレート及びフラスコを３７℃で少なくとも３時間にわたり（又は一晩）インキュベートした。インキュベーション後、コーティング溶液を吸引した。フラスコを、Milli Q水で２回洗浄した。使用前に、プレート及びフラスコを、層流ベンチ下で乾燥させた。
【０５４６】
増殖培地：
【０５４７】
【表５】
2020073565.tif 000006
【０５４８】
分化培地：
【０５４９】
【表６】
2020073565.tif 000007
【０５５０】
継代培養：
７５cm2フラスコにおいて増殖培地中で培養した細胞を、８０%のコンフルエンスに達した際に分割した。最初に、細胞を１０mlのＰＢＳで２回洗浄した。次に、４mlのＡＴＶ−トリプシンを加えた（２mlの２×ＡＴＶ−トリプシンストック溶液を、２mlのＰＢＳと先に混合する）。細胞を、３分間にわたり３７℃でインキュベートした。細胞が剥離した際、添加剤を伴わない２１mlのアドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を加えた。細胞懸濁液を、３００×ｇで５分間にわたり５０ml  Falconチューブ中で遠心分離した。上清を除去し、細胞を、添加剤を伴わない５mlのアドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に再懸濁した。細胞をNeubauerチャンバー中でカウントした。
【０５５１】
継代培養のために、細胞を２、３又は４日後に分割した。目的が２日間である場合、２×１０６個の細胞（分割１：５）を、７５cm2フラスコ中に播種した。３日間培養については１＊１０６個の細胞（分割１：１０）、４日間培養については５００，０００個の細胞（分割１：２０）で十分である。細胞を、１０mlの増殖培地を含む７５cm2フラスコ中に播種した。
【０５５２】
前分化：
ＬＵＨＭＥＳ細胞の前分化は、１７５cm2フラスコ中で行われた。したがって、６＊１０６個の細胞を、２０mlの増殖培地中に播種した。付着及び増殖の２４時間後、培地を交換した。増殖培地を分化培地に交換した。追加の４８時間後、前分化を終了した。
【０５５３】
細胞を、マルチウェルプレート中に播種した。したがって、培地を吸引した。細胞を１０mlのＰＢＳで２回洗浄した。その後、８mlのＡＴＶ−トリプシン（４mlの２×ＡＴＶ−トリプシンストック溶液を、４mlのＰＢＳと先に混合した）を加えた。細胞を、３〜５分間にわたり３７℃でインキュベートした。添加物を伴わない４２mlのアドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２を加えた。細胞懸濁液を、３００×ｇで５分間にわたり５０ml  Falconチューブ中で遠心分離した。上清を除去し、細胞を、１０mlの分化培地に再懸濁した。細胞をNeubauerチャンバー中でカウントした。
【０５５４】
分化：
更なる分化を、コーティングされた細胞培養プレート中で行った。
【０５５５】
【表７】
2020073565.tif 000008
【０５５６】
細胞を、分化培地で希釈し、細胞培養プレート中への適切な容積の分化培地を用いて播種した。追加の７２時間後、分化が完了する。結果については、図７及び９を参照のこと。
【０５５７】
実施例１１
熱安定性
モノクローナル抗アルファ−シヌクレイン抗体（２μM）の変性点（融点、Ｔｍ）を、レポーターフルオロフォアとしてSypro Orangeを使用した熱シフトアッセイにより決定した。
【０５５８】
融解転移は、ボルツマンシグモイド式を用いてフィッティングさせ、半値信号振幅での変曲点を、抗体の半分が変性される融解温度Ｔｍとして定義した（図１０）。６０℃と７５℃の間のＴｍ値を測定した。
【０５５９】
【表８】
2020073565.tif 000009
【０５６０】
実施例１２
エピトープマッピング
エピトープマッピングは、JPT Peptide Technologiesにより提供される特別注文のPepStar（商標）ペプチドマイクロアレイ上で実施した。ペプチド配列は、１５アミノ酸残基長を有し、ヒトアルファ−シヌクレイン（UniProtアクセッション番号：Ｐ３７８４０）の全配列をカバーするように設計した。隣接ペプチドは、１１アミノ酸の重複配列を有した。追加のペプチドは、疾患関連アルファ−シヌクレイン変異の公知の部位（Ａ３０Ｐ、Ａ５３Ｔ、Ｅ５７Ｋ）を伴う配列及びげっ歯類アルファ−シヌクレインへの交差反応性を評価するための配列を含む。更に、１２ペプチド／タンパク質をスポットし、それらは、一次及び二次抗体の反応性及び特異性の対照としての役割を果たした。タンパク質は、以下の通りであった：ウシ血清アルブミン、ヒトＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、マウスＩｇＧ、ヒトタウタンパク質、ヒトアルファ−シヌクレイン、ヒトベータ−シヌクレイン、ヒトガンマ−シヌクレイン、ヒトＩｇＭ、マウスＩｇＭ、ホスホ−チロシンペプチド、ヒトアルファ−三重プロリン変異シヌクレイン（Ａ３０Ｐ、Ａ５６Ｐ、Ａ７６Ｐ）。
【０５６１】
エピトープマッピングは、製造業者の使用説明書に従って実施した。
【０５６２】
【表９】
2020073565.tif 000010
【０５６３】
実施例１３
抗アルファ−シヌクレイン抗体−血液脳関門シャトルモジュールコンジュゲートによるアルファ−シヌクレイン病理の急性インビボ標識
研究デザイン
１５カ月齢Ｔｈｙ１−（Ａ３０Ｐ）アルファ−シヌクレイントランスジェニックマウスの３群（Ｋａｈｌｅマウス；ｎ＝３／群）及び野生型対照（ｎ＝１／群）に、３つの異なる抗アルファ−シヌクレイン抗体−血液脳関門シャトルモジュールコンジュゲートを注射した：
−抗体００７０  −＞  抗体００１７−ｓｃＦａｂ８Ｄ３コンジュゲート
−抗体００７６  −＞  抗体００１８−ｓｃＦａｂ８Ｄ３コンジュゲート
−参照  −＞  １２Ｆ４−ｓｃＦａｂ８Ｄ３コンジュゲート。
【０５６４】
１匹のトランスジェニックマウス及び１匹の野生型マウスが、非注射対照として含められた。研究では、合計１４匹のマウスが包含された。
【０５６５】
脳組織中での結合ｍＡｂ−脳シャトルの染色／検出
脳における標的占有率を、２０μmクライオスタット脳切片（４／マウス；アセトン固定し、ＮＧＳでブロック）上でＡＦ５５５タグ抗ｈｕＩｇＧ抗体を用いて検出した。同時染色を実施した：血管（抗ポドカリキシン、ＡＦ６４７）；ＤＡＰＩ。
【０５６６】
結果
脳幹の実質は：大きな神経炎／アルファ−シヌクレイン蓄積構造からシナプス染色と類似したびまん性点状染色まで変動する。
【０５６７】
神経炎病理（＝このマウスモデルにおける主要な病理学的特徴）は、脳幹に制限されており、マウスごとに高度に変動している。
【０５６８】
脳全体及び、また、非トランスジェニックマウスにおいて：大半が点状染色であり；シナプス染色に類似している。
【０５６９】
図１１を参照のこと。
【０５７０】
実施例１４
CelluSpots（商標）合成及びエピトープマッピング
抗体００１８のエピトープ分析用のペプチドアレイを、Intavis CelluSpots（商標）技術を使用することにより調製した。このアプローチにおいて、ペプチドを、合成後に溶解される改変セルロースディスク上で、自動合成器（Intavis MultiPep RS）を用いて合成した。高分子セルロースに共有結合的に連結されたままである個々のペプチドの溶液を、次に、コーティングされた顕微鏡スライド上にスポットした。CelluSpots（商標）合成は、３８４ウェル合成プレートにおいて、アミノ改変セルロースディスク上での９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を利用して、段階的に行った。各々のカップリングサイクルにおいて、対応するアミノ酸は、ＤＭＦ中のＤＩＣ／ＨＯＢｔ溶液を用いて活性化された。カップリング工程の間、未反応（即ち、遊離）アミノ基を、無水酢酸、ジイソプロピルエチルアミン及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの混合物を用いてキャップした。合成の完了時、セルロースディスクを９６ウェルプレートに移し、側鎖の脱保護のために、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジクロロメタン、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）及び水の混合物で処理した。切断溶液の除去後、セルロース結合ペプチドを、ＴＦＡ、ＴＦＭＳＡ（トリフルオロエタンスルホン酸）、ＴＩＳ及び水の混合物を用いて溶解し、ジイソプロピルエーテルを用いて沈殿させ、ＤＭＳＯ中に再懸濁した。これらのペプチド溶液を、その後、Intavisスライドスポッティングロボットを使用し、Intavis CelluSpots（商標）スライド上にスポットした。
【０５７１】
エピトープ分析のために、ブロッキング工程を５mLの１０×Western Blocking Reagent（Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany）、ＴＢＳ中の２．５gスクロース、０．１%  Tween-20を用いて１６時間にわたり４℃で実施する前に、調製されたスライドをエタノールで、その後ＴＢＳ（ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水溶液；５０mM  Ｔｒｉｓ、１３７mM  ＮａＣｌ、２．７mM  ＫＣｌ、ｐＨ８）で洗浄した。ＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ＋０．１%  Tween-20）を用いた洗浄後、スライドを、室温で２時間にわたり、０．１%  Tween-20を含む、ＴＢＳ中の抗体００１８の溶液（１μg/mL）を用いてインキュベートした。洗浄後、スライドを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ＴＢＳ−Ｔ中で１：２００００）にコンジュゲートした抗マウス又は抗ウサギ二次抗体を用いた検出のためにインキュベートし、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）基質／過酸化物緩衝液（Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany）を用いたインキュベーションが続いた。ＥＬＩＳＡ陽性スポットを定量化し、対応するペプチド配列の帰属を通じて、抗体結合エピトープを同定した。
【０５７２】
前述の発明は、理解を明確にする目的のために、例示及び実施例により、いくらか詳細に記載されているが、記載及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。本明細書において引用する、全ての特許及び科学文献の開示が、参照により、その全体において明確に組み入れられる。
【図１】
2020073565.tif 000011
【図２】
2020073565.tif 000012
【図３】
2020073565.tif 000013
【図４】
2020073565.tif 000014
【図５】
2020073565.tif 000015
【図６】
2020073565.tif 000016
【図７Ａ】
2020073565.tif 000017
【図７Ｂ】
2020073565.tif 000018
【図７Ｃ】
2020073565.tif 000019
【図８】
2020073565.tif 000020
【図９】
2020073565.tif 000021
【図１０】
2020073565.tif 000022
【図１１】
2020073565.tif 000023
【図１２】
2020073565.tif 000024
【図１３】
2020073565.tif 000025
【図１４】
2020073565.tif 000026
【配列表】
2020073565000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月7日(2020.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤＲＨ１配列、ＣＤＲＨ２配列及びＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変ドメイン、及びＣＤＲＬ１配列、ＣＤＲＬ２配列及びＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、
ＣＤＲＨ１配列は、配列番号０２又は０８であり、
ＣＤＲＨ２配列は、配列番号０３又は０９であり、
ＣＤＲＨ３配列は、配列番号０４であり、
ＣＤＲＬ１配列は、配列番号０５又は１０であり、
ＣＤＲＬ２配列は、配列番号０６又は１１であり、そして
ＣＤＲＬ３配列は、配列番号０７又は１２である、
モノクローナル抗体；
ＣＤＲＨ１配列は、配列番号１５又は２１であり、
ＣＤＲＨ２配列は、配列番号１６又は２２であり、
ＣＤＲＨ３配列は、配列番号１７であり、
ＣＤＲＬ１配列は、配列番号１８又は２３であり、
ＣＤＲＬ２配列は、配列番号１９又は２４であり、そして
ＣＤＲＬ３配列は、配列番号２０又は２５である、
モノクローナル抗体；又は
ＣＤＲＨ１配列は、配列番号２８であり、
ＣＤＲＨ２配列は、配列番号２９又は３４であり、
ＣＤＲＨ３配列は、配列番号３０であり、
ＣＤＲＬ１配列は、配列番号３１又は３５であり、
ＣＤＲＬ２配列は、配列番号３２又は３６であり、そして
ＣＤＲＬ３配列は、配列番号３３又は３７である、
モノクローナル抗体。
【請求項２】
抗体が、単量体又はオリゴマーアルファ−シヌクレインであるアルファ−シヌクレインに結合する、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
抗体が、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項１記載の抗体。
【請求項４】
抗体が、血液脳関門シャトルモジュールにコンジュゲートされ、血液脳関門シャトルモジュールが、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８、ヒトトランスフェリン受容体又はヒトインスリン様成長因子受容体に結合する抗体又は抗体フラグメントである、請求項１記載の抗体。
【請求項５】
請求項１記載の抗体であって、抗体が、さらに
ａ）ヒトサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域、
ｂ）ヒトサブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域、
ｃ）変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを伴うヒトサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域、
ｄ）変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを伴うヒトサブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域、
ｅ）変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを伴うヒトサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリン重鎖の第１のＦｃ領域、並びに変異Ｔ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを伴うヒトサブクラスＩｇＧ１の免疫グロブリン重鎖の第２のＦｃ領域、又は
ｆ）変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを伴うヒトサブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリン重鎖の第１のＦｃ領域、並びに変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを伴うヒトサブクラスＩｇＧ４の免疫グロブリン重鎖の第２のＦｃ領域を含む、抗体。
【請求項６】
請求項１記載の抗体及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項７】
シヌクレイノパチーの処置における使用のための、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
パーキンソン病の処置における使用のための、請求項６記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
2020073565000001.pdf