(57)【要約】【課題】本発明は、新規デンドリマー複合体、それらの調製方法、及び疾患の治療のためへのそれらの使用に関する。本発明は、本発明のデンドリマー複合体の取り込みを可能にする膜貫通溶質担体タンパク質を用いることにより、治療活性分子を有するデンドリマー複合体の細胞中への送達のための新規方法を開示する。【解決手段】本発明の特定の主題は、式：Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］m[式中、Ｅは、治療又は診断エフェクター分子であり、Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）nは、ｎ個の硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+を担持するデンドリマーＤであり、ここで前記硫酸基の数であるｎは６〜９６から選択され、Ｍは、アニオン性硫酸基に対するカチオン性無機又は有機対イオンであり、Ｌは、Ｄ及びＥ間のリンカー又はスペーサーであり、Ｇは、ＬとＥとの間に結合を形成する結合官能基であり、そしてｍは、１〜２０の整数である］で表される複合体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される、複合体
[式中、
Ｅは、治療又は診断エフェクター分子であり、
Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）nは、ｎ個の硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+を担持するデンドリマーＤであり、ここで前記硫酸基の数であるｎは６〜９６から選択され、
Ｍは、アニオン性硫酸基に対するカチオン性無機又は有機対イオンであり、
Ｌは、Ｄ及びＥ間のリンカー又はスペーサーであり、
Ｇは、ＬとＥとの間に結合を形成する結合官能基であり、そして
ｍは、１〜２０の整数であり、そして
前記複合体の各デンドリマーＤは、同じ分子量を有し、そして
前記硫酸基の数ｎが各デンドリマーＤについて同じであり、
ここでリンカー単位Ｌは、ある位置でデンドリマーＤの焦点に共有結合され、それにより、この焦点から、デンドリマーは成長し、そのデンドリマー構造に達し、そして
デンドリマーＤ（ＯＳＯ3-Ｍ+）nは、Ｍ+がナトリウムイオンであるとする計算により、ｎと分子量との間で次の関係を有する：
【表１】
2020073643.tif 000036
］。
【請求項２】
前記デンドリマーＤを構築するモノマーの反復単位が、１，２−置換グリセロール、１，３−置換グリセロール、ペンタエリトリトール、グルコース、マンノース、ガラクトース、リシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（プロピオン酸）アミノメタン、１，１’−ビス（ヒドロキシメチル）−プロピオン酸、コハク酸、グルタル酸、マレイン酸、グリコール酸、ジグリコール酸、アジピン酸、乳酸、クエン酸、プロピオン酸（２−アミノエチル）アミド、プロピレンイミン、エチレンイミン、プロピレンオキシド、及びエチレンオキシドから成る群から選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記デンドリマーＤ中の前記モノマーの結合が、エーテル、チオエーテル、カルボン酸エステル、スルホニルエステル、スルホンアミド、カルボキシルアミド、アミン、カルバメート、チオカルバメート、尿素、チオウレア、ヒドラゾン、イミン、ジスルフィド、ホスフェート、ホスホネート、トリアゾール、アセタール、及びケタールから選択される官能基に基づかれる、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
Ｄが、１，２−ジスルファトアルキル、１，３−ジスルファトアルキル、１，２，４−トリスルファト−３−アルキル、Ｎ、Ｎ’−ジ（１−スルファトアルキル）アミン、トリス（スルファトメチル）メチル、及び１，２，３，４，５−ペンタスルファトアルキルから選択される末端基を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５】
Ｌが、１又は２以上のメチレン基がＯ、Ｓ、ＮＨ、ＮＨ−Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ、Ｃ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ）2、Ｓ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ2）Ｏ、Ｓ−Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ、Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）Ｏ、Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）Ｏ、アリーレン、エテニレン又はエチニレン、及びトリアゾリレン（ここで任意の水素原子がメチル、エチル又はヒドロキシメチルにより独立して選択されていてもよい）からなる群から選択される単位により独立して置換されていてもよい、脂肪族環状、分岐鎖状又は直鎖状単位からなる群から選択されるＣ4-100−アルキル基である、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
Ｅが、治療又は診断エフェクター分子である、請求項１に記載の複合体。
【請求項７】
前記エフェクター分子が、小分子、ペプチド、タンパク質、グリカン及び核酸から成る群より選択される、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
前記エフェクター分子が、増殖、アポトーシス、結合組織材料（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン）の合成、免疫機能、セネッセンス又は免疫防御の細胞内機構を妨げることができる物質を含む治療エフェクター分子である、請求項６又は７に記載の複合体。
【請求項９】
前記小分子が、細胞増殖抑制剤、及びペプチド又はペプチド模倣構造体（天然又は非天然構造の修飾を有する環状又は開鎖ペプチドを含む）からなる群から選択される、請求項７に記載の複合体。
【請求項１０】
前記タンパク質が、球状タンパク質、糖タンパク質、毒素、酵素、抗体、抗体フラグメント、操作された抗体及びタンパク質構造体（単一ドメイン抗体（sdAb）、単鎖Ｆｖ抗体（scFv）、単鎖Ｆｖ−Ｆｃ抗体（scFv-Fc）を含む）からなる群より選択される、請求項７に記載の複合体。
【請求項１１】
Ｅが、腫瘍細胞の増殖及びアポトーシスに関与する分子に対して向けられる、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１２】
Ｇが、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＨ−Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ、Ｃ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ）2、Ｓ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ2）Ｏ、Ｓ−Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ、Ｃ ＝ Ｎ−ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）Ｏ、Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）Ｏ、アリーレン、エテニレン、エチニレン、及びトリアゾリレンからなる群より選択される、ＥとＬとの間に共有結合を形成する結合官能基である、請求項１に記載の複合体。
【請求項１３】
（ｉ）癌、炎症、自己免疫疾患、代謝性疾患及び線維症を包含する群より選択される疾患の治療における、又は（ｉｉ）抗増殖性、増殖促進性、抗アポトーシス性、アポトーシス促進性、抗線維性、線維化促進性、抗脂質生成性、抗糖尿病性、免疫刺激性及び抗加齢性の治療を包含する群より選択される治療における使用のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の複合体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規デンドリマー複合体、それらの調製方法、及び疾患の治療のためへのそれらの使用に関する。本発明は、本発明のデンドリマー複合体の取り込みを可能にするトランスポータータンパク質、及びそれらの治療的活性分子と、細胞内の疾患に直接関連する分子との相互作用を用いることにより、治療活性分子を有するデンドリマー複合体の細胞中への送達のための新規方法を開示する。
【背景技術】
【０００２】
過去数十年間、診断及び治療薬の有効性を改善するために多大な進歩があった。過去数十年間に、健康な組織及び器官に対する重度の望ましくない薬物の影響を回避するためのいくつかの戦略が続いている。主に薬物の研究は、標的構造の疾患−特異的発現を約束する新薬標的に焦点を当ててきた。増殖及び活性化細胞におけるシグナルトランスダクション機構の発見に関して、多くの新規標的が同定されて来た。しかしながら、治療分子は、特に、標的が細胞内部で発現される場合、組織、膜障壁及び細胞を浸透し、標的に達する物理化学的特性を有すべきであるので、ほとんど例外なく、新しく発見された薬物標的の大部分の治療的な攻撃はあまり有効ではなかった。従って、臨床学的に確立された治療薬の生物学的利用能を改善するために、多くの努力が払われて来た。生物学的利用能を改善するために、薬物研究は、治療分子の化学的修飾又は医薬製剤に焦点を当てた。治療薬物分子の大部分は疾患の部位に到達せず、必要な血中薬物濃度に達するために人体に適用されるのみであり、従って、疾患組織に対するレベルの選択性がない。従って、適用された薬物の最大部分は、疾患の部位に達することなく、血液循環から排除される。
【０００３】
タンパク質及びペプチドベースの多くの治療分子が、非常に特異的且つ有効な治療剤として使用されている。しかしながら、それらの使用は、それらの物理化学的性質のため複雑であり、そしてかかる物理化学的性質は、極性アミド結合のアミノ酸組成及びポリペプチド骨格が本質的に極性であるという性質によるものである。特に、それらの分子サイズ及びタンパク質の電荷が、所望の標的で生物学的利用能を妨げる。治療タンパク質の適用はさらに、多くのタンパク質及びペプチド薬物が細胞内でそれらの治療標的を有する状況により複雑になる。従って、新薬又は薬物送達技法を見出すために取り組まなければならない主要な課題は、かかる種類の薬物を、標的細胞の細胞質又は核中に運ぶために細胞膜を透過させることである。１ｋＤａ以上の分子量を有する単一分子は、細胞質内に直接侵入しないことは公知である。
【０００４】
多くの診断分子、例えば蛍光色素、磁気共鳴イメージング用の造影剤、ＣＴ及び核イメージング用の放射性キレート化剤は、親水性の性質のものであり、そしてポリペプチドの上記特性と同様に、細胞に侵入することはできない（van der Molen AJ, Eur. J. Radiol. 2008, 66, 168）。従って、疾患の細胞経路を特徴づけ、そして治療分子と細胞内分子との相互作用を検出する目的で診断薬の選択を可能にする一般的な経路は存在しない。
【０００５】
細胞内送達の従来の方法は、タンパク質のエレクトロポレーション又はマイクロインジェクションである。ここで、細胞膜の無傷性が、短時間、妨害され、１ｋＤａ以上のサイズを有する高分子の細胞内送達を可能にする。しかしながら、この方法は侵襲的であり、そしてインビトロ実験のみに適用可能であるが、臨床条件には適用できない。別の欠点は、標的タンパク質を有する腫瘍細胞の数により測定することが可能な手順の効能が低いことである。エレクトロポレーション又はマイクロインジェクションは、通常、処理された細胞の約２０〜４０％で細胞内送達をもたらすが、再現性は非常に低い。
【０００６】
最近では、治療ポリペプチド、タンパク質及び抗体を、腫瘍細胞内に送達するための新規医薬的アプローチが確立されて来た。医薬ナノキャリア、例えばリポソーム、自己アセンブリーミセルシステム、又はポリマー性ナノ粒子が、治療タンパク質の細胞内送達のために使用され得る（Du et al., Curr Drug Metab, 2012, 13, 82-92）。それらはエンドソーム代謝を免れ得るが、しかし腫瘍細胞に対する特異性を欠いている。これに関して、ターゲッティングリガンドを用いて、そのようなナノキャリアを腫瘍細胞に向けることができる。しかしながら、治療ペプチド、抗体、及びタンパク質を、ターゲッティングリガンドと組合せて担持するリポソーム及び他のナノ粒子製剤（van der Meel et al., Adv Drug Deliv Rev. 2013, 65, 1284-98）は、高価で複雑な化学物質と考えられている。それらの最適化は、キャリア材料と治療負荷との間の相互的な作用を慎重に合わせなければならないという事実のために、複雑であることが多い。診断負荷に関し、診断剤の物理化学的特性は、機能的な化学物質を搭載するのと同じように慎重にキャリアに合わせなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ナノ粒子キャリヤシステムと医薬的に組み合わせる機会があるものの、原則として受容生物に対して外来性である、複雑な高分子としてのそれらの性質に関連する全ての固有の特性により、治療剤としてのタンパク質及びペプチドの使用自体が妨げられる。これは、生理学的ｐＨ値及び温度、特にそれらのタンパク質が通常の環境と異なる環境において活性でなければならない場合、大部分のペプチド及びタンパク質薬物の安定性は低くなる。種々の生物学的活性タンパク質及びペプチドのインビボでの不活性化をもたらす様々なプロセスとして、温度、ｐＨ、高塩濃度又は界面活性剤の影響による不活性形への立体配座タンパク質の変換が挙げられる。タンパク質の凝集は、機能及び代謝の損失につながり、これにより医薬ナノキャリアシステムにおいて正確に決定することが困難であることが非常に多い。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本出願の発明者らは、驚くべきことには、治療分子、特にポリペプチドを、特に疾患の細胞内に送達する方法を見出した。この問題に対する解決策は、そのようなポリペプチド及びタンパク質が、ナノ粒子、ポリマー、ミセル又はリポソームベースの医薬製剤なしで、腫瘍細胞内に送達され得るという驚くべき発見に基づかれている。その代わりに、治療エフェクターに共有結合される規定されたデンドリマーベースの化合物群がデンドリマー複合体として標的細胞内に輸送され得ることが見いだされた。特に、規定された複数の硫酸基（−ＯＳＯ2-Ｍ+）を担持するタイプのデンドリマーがそれぞれの治療ポリペプチド又は他のタイプのエフェクター、例えば治療及び診断分子に共有結合される場合、このデンドリマーが活性トランスポーター部分として作用し得ることが見出された。
【０００９】
本発明の主題は、デンドリマー複合体、それらの調製方法、及び疾患の治療及び診断のためのそれらの使用である。
【００１０】
細胞に不浸透性である治療及び診断分子は、正常細胞に取り込まれることを妨げられ、膜貫通溶質担体に基づく取り込み機構を有する細胞のみに向けられるので、選択性が改善され生物に対する毒性が低減する。驚くべき且つ予期しないことには、本発明により、トランスポータータンパク質を介しての治療的活性分子の膜貫通送達を可能にするデンドリマー複合体が提供される。上記性質のために、単一化合物として細胞中に取り込まれることができない治療的活性分子及び診断分子を細胞内に輸送しそして細胞内で治療又は診断効果を直接的に示すために適用可能であることが驚くべきことには見出された。さらに、本発明のデンドリマー複合体により生物中の細胞に対する特異的標的化が可能になる。この場合、規定されるデンドリマー複合体は、広範囲の治療及び診断エフェクター分子、例えばポリペプチド及び小分子治療薬の生物学的利用能及び選択性の改善を可能にする。細胞に侵入できない治療及び診断分子が、トランスポータータンパク質を利用して細胞内に輸送される。驚くべき且つ予期しないことには、これは、エフェクター分子と硫酸化デンドリマーとの間の共有結合と組合わせ、本発明の複合体内の各デンドリマーの分子量の均質性により達成され得る。担体粒子又はポリマー（担体に対して共有結合しない）に物理的に埋め込まれるか、又はカプセル化される治療分子内の医薬製剤は、治療エフェクター分子が担体の分解及び／又は担体からの漏出により生物中に再分布され、それにより生物に対するその親毒性を示す欠点を示した。従って、診断分子は再分布できるので、取り込み機構に連結されない誤った分子状態を試験者に検出させるシグナルを生成する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の硫酸化デンドリマーの典型的な化学構造を示す；（Ａ）：例えばペンタエリトリトール又はＴＲＩＳから誘導可能なコア、デンドリマー単位：グリセロール、１，２−置換、エーテル（−Ｏ−）として結合される、２４個の硫酸基；（Ｂ）：例えばグリセロール又は２−アミノ−プロパン−１，３−ジオールから誘導可能なコア、デンドリマー単位：グリセロール、１，３−置換、エーテル（−Ｏ−）として結合される、３２個の硫酸基（硫酸基は球状でＳとして示される、星印は、リンカーＬへの結合を示す）。
【００１２】
【図２】図２は、本発明の硫酸化デンドリマーの典型的な化学構造を示す；（Ａ）：例えばペンタエリトリトール又はＴＲＩＳから誘導可能なコア、デンドリマー単位：ペンタエリトリトール及びグリセロール、１，２−置換、エーテル（−Ｏ−）として結合される、３６個の硫酸基；（Ｂ）：コア２、２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸、デンドリマー単位：２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸、エステルとして連結される、及びグリセロール、１，２−置換、エーテル（−Ｏ−）として結合される、３２個の硫酸基。
【００１３】
【図３】図３は、本発明の硫酸化デンドリマーの典型的な化学構造を示す；（Ａ）：例えば、アミノメチル−トリス（プロピオン酸）、又はアミドとして結合されるヒドロキシメチル−トリス（プロピオン酸）から誘導可能なコア、デンドリマー単位：グリセロール、１，２−置換及び１，３−置換、エーテル（−Ｏ−）として結合される、２４個の硫酸基；（Ｂ）：例えばペンタエリトリトール又はＴＲＩＳから誘導可能なコア、デンドリマー単位：アミドとして結合されるプロピオン酸、１，２−置換グリセロール及び１，３−置換グリセロール、エーテル（−Ｏ−）として結合される、２４個の硫酸基。
【００１４】
【図４】図４は、本発明の硫酸化デンドリマーの典型的な化学構造を示す；（Ａ）：例えばトリス（プロピオン酸）メチルアミンから誘導可能なコア、デンドリマー単位：ペンタエリトリトール、エステルとして結合される、グリセロール、エーテルとして結合され、１，２−置換、３６個の硫酸基；（Ｂ）：例えばトリス（プロピオン酸）メチルアミンから誘導可能なコア、デンドリマー単位：ビス（プロピオン酸）エチレンジアミン、アミドとしての結合、アミドとして結合されるトリグリセロールアミン、３２個の硫酸基。
【００１５】
【図５】図５は、本発明の硫酸化デンドリマーの典型的な化学構造を示す；（Ａ）：例えば、グリセロール又は２−アミノ−プロパン−１，３−ジオールから誘導可能なコア、デンドリマー単位：グリセロール、１，３−置換、エーテル（−Ｏ−）として結合される、琥珀酸、エステルとして結合される、３２個の硫酸基；（Ｒ）：例えばトリス（プロピオン酸）メチルアミンから誘導可能なコア、デンドリマー単位：グリセロール、１，３−置換、琥珀酸、２４個の硫酸基。
【００１６】
【図６】図６は、本発明の糖部分に基づいての硫酸化デンドリマーの典型的な化学構造を示す；（Ａ）：一官能化シクロデキストリン（図ではβ−シクロデキストリン）ベースのコア；デンドリマー単位：グリセロール、１，２−置換、エーテル（−Ｏ−）として結合される、４個の硫酸基；（Ｂ）：例えばペンタエリトリトール又はＴＲＩＳから誘導可能なコア、デンドリマー単位：アミドとして結合されるプロピオン酸、アミドとして結合されるビス（グルカミン）、３０個の硫酸基。
【００１７】
【図７】図７は、本発明の硫酸化デンドリマーの典型的な化学構造を示す：例えばペンタエリトリトール又はＴＲＩＳから誘導可能なコア；エーテル結合を介してペンタエリトリトールに結合される酸化エチレン単位：グリセロール、１、２−置換、エーテルを介して結合される；３６個の硫酸基。
【００１８】
【図８】図８は、本発明のデンドリマー複合体（実施例１５）の細胞取り込みを示す；（Ａ）：細胞体の可視化を可能にする均一な分布としてのＩＣＣ−ｄ０２の蛍光を示すＳＫＢＲ３の細胞の顕微鏡画像を示し；（Ｂ）ＩＣＣ−ｄ０２とのインキュベーションの後におけるＳＫＢＲ３の細胞溶解物の吸収スペクトルを示し、細胞コンパートメントから回収された分子が細胞当たり５Ｍｉｏである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の記載される特徴は、本発明を支持するために提示される例示的な実施形態の以下の記載により実証されるが、それらは本発明を限定するものではない。
【００２０】
本発明の主題は、以下の通りである：
式：Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］m
[式中、
Ｅは、治療又は診断エフェクター分子であり、
Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）nは、ｎ個の硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+を担持するデンドリマーＤであり、ここで前記硫酸基の数であるｎは６〜９６から選択され、
Ｍは、アニオン性硫酸基に対するカチオン性無機又は有機対イオンであり、
Ｌは、Ｄ及びＥ間のリンカー又はスペーサーであり、
Ｇは、ＬとＥとの間に結合を形成する結合官能基であり、そして
ｍは、１〜２０の整数である］で表される、複合体。
【００２１】
好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、ポリ硫酸化デンドリマーＤ、及び前記ポリ硫酸化デンドリマーに共有結合される治療又は診断エフェクター分子Ｅを含む複合体である。
【００２２】
より好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、式：Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mの複合体であり、式中前記複合体の各デンドリマーＤは、同じ分子量を有する。前記実施形態内で、デンドリマー構造は、規定されたユニークな分子量を有する。つまり、得られる複合体は、ポリマーの性質を左右する、別の構造、分岐、サイズ、電荷、容積又は極性がそれぞれ様々である多くの異なったデンドリマー分子から構成されないことを意味する。国際公開第２０１１／０９５３１１号においては、硫酸化ポリオールと治療タンパク質との複合体の使用が記載されており、ここでそれらの硫酸化ポリオールは分子量が規定されていないポリマー性質のものである。それらは、治療分子の統計学的な結合を用いた多分散性に基づく平均分子量により特徴づけられる。毒素タンパク質に結合される規定されたリンカーを有する規定されたデンドリマー系（２４、３２又は４８の硫酸基）は、これに相当する平均分子量を有する多分散ポリグリセロール硫酸塩と比較して、細胞培養物における腫瘍細胞の治療においてより高い効率をもたらすことが驚くべきことに見出された（実施例１９を参照のこと）。
【００２３】
驚くべきことには及び予期しないことに、ポリマー硫酸化ポリグリセロールに比較して、単一分子量の規定されたデンドリマー系を用いる別の利点が、本発明により同定することができた。蛍光色素（ＩＣＣ）により標識し、例えば実施例８の化合物（ＩＣＣ−ｄ０ｌ、 ＩＣＣ−ｄｌ２、 ＩＣＣ−ｄｌ８）を生成した後、細胞内取り込み研究が、ポリマーＩＣＣ−ポリグリセロール硫酸塩（平均分子量１２０００Ｄａ）と比較して、実施された。ＩＣＣ−ｄ０ｌ、 ＩＣＣ−ｄｌ２、 ＩＣＣ−ｄｌ８は、サイトゾル内での細胞内分布をもたらし、そしてポリマーＩＣＣ−ポリグリセロール硫酸塩は、おそらくポリマー混合物の部分的なエンドサイトーシス取り込みのために、エンドソームコンパートメント内での実質的な局在化を示した。ポリマーについてのエンドサイトーシス取り込みは、また、硫酸化ポリマーについて、国際公開第２０１１／０９５３１１号に記載されるように、２０ｋＤａ以上で優勢になる。一般的に、エンドソームコンパートメントによる治療タンパク質の取り込みは、以下の主要な理由のために回避されなくてならない。第１に、エンドソーム膜は、サイトゾルへの治療エフェクター分子のトランスロケーションに対する障壁となる。通常、治療エフェクター分子は、サイトゾルにおける治療標的分子で利用できない。第２に、多くの代謝及び触媒酵素が、それらがサイトゾルにトランスロケートされる前、治療エフェクター分子を破壊する。この点は、タンパク質治療エフェクター分子に特に重要である。ポリグリセロール骨格を合成するためにアニオン性開環重合を含むポリグリセロール硫酸塩の合成は、通常、１．５〜１．８の多分散指数を有する平均分子量Ｍｎ付近で一定の分子量分布を導く公開された最先端技術である（Groger et al, Bioconjug. Chem. 2013, 24, 1507-14）。従って、１．５〜１．８の多分散指数を有する、５〜１０ｋＤａ以内の平均分子量Ｍｎについて、定量化するのに困難である、相当量の高分子量構造（２０ｋＤａ以上）を混合物に常に有する。従って、実施例１８においては、エンドサイトーシスからの明確な独立性が、硫酸化デンドリマーを有するタンパク質複合体（Ａｓｐ-ｄ０２）についてのみ明白であり、そしてポリグリセロール硫酸塩との複合体については明白ではない。
【００２４】
さらに、当業者は、各デンドリマーが同じ分子量を有することを証明する方法、例えば有機化学の従来の技法である1Ｈ−ＮＭＲ分光法、13Ｃ−ＮＭＲ分光法、元素分析、質量分析法を知っている。
【００２５】
特定の実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mの複合体であり、式中硫酸基の数ｎは、各デンドリマーＤについて同じである。従って、前記複合体中の各デンドリマーは、１つの選択されたｎ個の硫酸基のみ、例えばわずか６、又はわずか８、又はわずか１２、又はわずか１６個の硫酸基を含むことができ、これにより、硫酸基の数ｎは、６〜９６から選択される。
【００２６】
本発明のさらなる主題は、硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+が、好ましくは、硫酸化工程により硫酸基（硫酸のモノエステル）に転換されるヒドロキシル基に由来する、複合体である。
【００２７】
ヒドロキシル基の硫酸化を実施する好ましい剤は、三酸化硫黄の複合体（例えば、ＳＯ3−ピリジン複合体、ＳＯ3−トリエチルアミン複合体、ＳＯ3−トリメチルアミン複合体、ＳＯ3−ＤＭＦ複合体）、又はスルファミン酸の複合体である（Mol J A et al., Carbohydr Res. 2003 338:1397-401）。
【００２８】
別の実施形態によれば、本発明の主題は、複合体であり、ここでデンドリマー構造を構築するモノマーの反復単位が、１，２−置換グリセロール、１，３−置換グリセロール、ペンタエリトリトール、グルコース、マンノース、ガラクトース、リシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（プロピオン酸）アミノメタン、１，１’−ビス（ヒドロキシメチル）−プロピオン酸、コハク酸、グルタル酸、マレイン酸、グリコール酸、ジグリコール酸、アジピン酸、乳酸、クエン酸、プロピオン酸（２−アミノエチル）アミド、プロピレンイミン、エチレンイミン、プロピレンオキシド、及びエチレンオキシドから成る群から選択される。
【００２９】
別の特定の実施形態によれば、本発明の主題は、複合体であり、ここでデンドリマーにおけるモノマーの結合が、エーテル、チオエーテル、カルボン酸エステル、スルホニルエステル、スルホンアミド、カルボキシルアミド、アミン、カルバメート、チオカルバメート、尿素、チオウレア、ヒドラゾン、イミン、ジスルフィド、ホスフェート、ホスホネート、トリアゾール、アセタール、及びケタールから選択される官能基に基づかれる。
【００３０】
別の実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mの複合体であり、式中前記デンドリマーＤは、リンカー単位の共有結合を有する中心デンドリマーコア単位（ＣＤＣＵ）を含む。前記ＣＤＣＵは、ペンタエリトリトール、グリセロール、トリグリセロール、グリセロールアミン、トリス（プロピオン酸）メチル、トリス（ヒドロキシメチル）メチル、テトラオキサスピロ（５．５）ウンデカン、アダマンチルから選択された構造を含む。
【００３１】
好ましいのは以下の構造である：リンカー単位の共存結合を有する中心デンドリマーコア単位（ＣＤＣＵ）が、ペンタエリトリトール、グリセロール、トリグリセロール、グリセロールアミン、トリス（プロピオン酸）メチルといった構造、下記に示される構造といった構造を含む：
【００３２】
【化１】
2020073643.tif 000002
【００３３】
別の特定の実施形態によれば、本発明の主題は、複合体であり、ここでＤは、１，２−ジスルファトアルキル、１，３−ジスルファトアルキル、Ｎ、Ｎ’−ジ（１−スルファトアルキル）アミン、トリス（スルファトメチル）メチル、１，２，４−トリスルファト−３−アルキル、及びグルコサミン由来の１，２，３，４，５−ペンタスルファトアルキルから選択される末端基を含む。
【００３４】
高密度の硫酸基を達成するために、アルキル部分でのそれらの位置は、それらがお互い非常に接近して存在するようでなければならない。これは、１，２−ジスルファトアルキル、１，３−ジスルファトアルキル、Ｎ，Ｎ’−ジ（１−スルファトエチル）アミンの構造モチーフにより達成され得る。１，２−ジスルファト−又は１，３−ジスルファト構造モチーフを含む異なる構造が可能である。そのような構造下では、硫酸化の後、その構造内に１，２−ジスルファト−又は１，３−ジスルファト単位も含む糖又はグリカン部分が存在する。モノ−、ジ−又はオリゴクリカン部分が可能であり、そしてそれらの構造内に、環状又は開鎖（還元）構造が可能である。本発明の範囲は、ヘキソース（グルコース、ガラクトース、マンノース）糖、例えばグルコサミン又はグルカミン由来の１，２，３，４，５−ペンタヒドロキシヘキシル構造を含む。Ｄ−グルカミンは、グルカミン残基当たり５個の硫酸基を導くデンドリマー系に使用され得る。別の範囲は、リンカーＬを連結するために一官能化され（当業者に知られている６−デオキシ−６−アジド−シクロデキストリン；Roux M et al., Eur Biophys J. 2007, 36, 861 -7）、そして各ヒドロキシル基で、グリセロールにより、続いて硫酸化により変性され得るシクロデキストリン（α、β又はγ−シクロデキストリン）を包含する。
【００３５】
従って、好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、糖、好ましくはグルコサミン由来の末端１，２，３，４，５−ペンタスルファト単位を有するデンドリマーＤ、グリセロール構造を含む小さなヒドロキシル化単位に由来する末端１，２−ジスルファト単位を有するデンドリマーＤ、及びビス−（ヒドロキシメチル）アルキル部分に由来の末端１，３−ジスルファト単位を有するデンドリマーＤである。Ｄにおける構造実体として、より好ましいものは、グリセロール単位由来の末端１−置換１，２−ジスルファトプロピルに基づく１，２−ジスルファトアルキル構造である。
【００３６】
この実施形態内では、１，２−置換グリセロールとは、２つの隣接するヒドロキシル基がデンドリマー構造における次世代シェル（next generation shell）の次の（subsequent）モノマー単位への結合を形成することを意味する。１，３−置換グリセロールとは、２つの外側のヒドロキシル基がこの結合を形成することを意味する。
【００３７】
好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、複合体であり、ここでＤは、硫酸基を含み、その硫酸基は、デンドリマー性ポリマー及びデンドリマーに使用されることが知られているスルホネート及びカルボキシレート基よりも、特に好ましい（Weinhart et al., Biomacromolecules. 201 1 , 12, 2502）。公開されているように、スルホネート及びカルボキシレート基は、ヒドロキシル又はアミン基を、例えば無水コハル酸、ブロモ酢酸、１，３−プロパンサルトン、１，４−ブタンサルトンにより変性することにより、デンドリマー分子中に導入され得る。驚くべきことに、硫酸デンドリマーは、カルボキシレート及びスルホネート基に比較して、より小さな分子量（２４未満のアニオン性基の数）について、より効果的な細胞取り込み（蛍光標識された複合体により検出される）も示す。
【００３８】
より特定の実施形態によれば、本発明の主題は、リンカー単位ＬがデンドリマーＤに共有結合されている、複合体である。
【００３９】
別の非常に特定の実施形態によれば、本発明の主題は、複合体であり、ここでリンカー単位Ｌは、ある位置でデンドリマーＤの焦点に共有結合され、それにより、この焦点から、デンドリマーは成長し、そのデンドリマー構造に達する。
【００４０】
本発明のさらなる主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］m[式中、ＬはＣ4-100−アルキル基である]で表される複合体である。
【００４１】
１つの実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mの複合体であり、式中Ｌは、１又は２以上のメチレン基がＯ、Ｓ、ＮＨ、ＮＨ−Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ、Ｃ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ）2、Ｓ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ2）Ｏ、Ｓ−Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ、Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）Ｏ、Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）Ｏ、アリーレン、エテニレン又はエチニレン、及びトリアゾリレン（ここで任意の水素原子がメチル、エチル又はヒドロキシメチルにより独立して選択されていてもよい）からなる群から選択される単位により独立して置換されていてもよい、脂肪族環状、分岐鎖状又は直鎖状単位からなる群から選択されるＣ4-100−アルキル基である。
【００４２】
本発明のさらなる主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mの複合体であり、式中Ｌの構造は、下記式：
【００４３】
【化２】
2020073643.tif 000003
【００４４】
[式中、ａｌｋｙｌは、Ｃ4-100−アルキル基であり、ここで１又は２以上のメチレン基が、１又は２以上のメチレン基がＯ、Ｓ、ＮＨ、ＮＨ−Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ、Ｃ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ）2、Ｓ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ2）Ｏ、Ｓ−Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ、Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）Ｏ、Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）Ｏ、アリーレン、エテニレン又はエチニレン、及びトリアゾリレン（ここで任意の水素原子がメチル、エチル又はヒドロキシメチルにより独立して選択されていてもよい）からなる群から選択される単位により独立して置換されていてもよい、脂肪族環状、分岐鎖状又は直鎖状単位からなる群から選択される基により置換され得、ＸはＮＨ、Ｓ又はＯであり、そしてａ、ｂ及びｃは独立して０又は１であり得る（ａ＋ｂ＋ｃ＝０は排除される）]で表される複合体である。
【００４５】
好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中Ｌは、Ｃ4-50−アルキル基であり、ここで１〜１０個のメチレン基が、Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ、ドリアゾールを含む群から選択された基により置換され、ＸはＮＨ又はＯであり、そしてａ、ｂ及びｃは独立して０又は１であり得る（ａ＋ｂ＋ｃ＝０は排除される）。
【００４６】
より好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、Ｌは、Ｃ4〜Ｃ18の炭素鎖を含むアルキル、単位Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ、及び１０個までのＣＨ2ＣＨ2Ｏの反復単位の短いＰＥＧ鎖であり、これに、連結基Ｇが、Ｅへの共有結合のために反応性基としてこの鎖の末端で置換されている。
【００４７】
特定の実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中Ｌは、細胞内条件下で切断可能な構造を含み、ここで前記切断可能な構造は、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）、酸分解性構造、ＣＨ＝Ｎ、ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ、ＣＨ＝Ｎ−ＮＨＣ（＝Ｏ）、Ｃ＝Ｎ−Ｏの群から選択され、ここで任意の窒素又は炭素原子がエチル又はメチルにより置換され得る。細胞内条件下で切断可能な別の構造は、２〜１０個のアミノ酸のアミノ酸配列を含む。
【００４８】
より特定の実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表されている複合体であり、式中Ｌは、２８０〜６５０ｎｍ、好ましくは３００〜５５０ｎｍ内のＵＶ〜ＶＩＳスペクトル範囲に光吸収ピークを示す構造を含む。
【００４９】
さらにより特定の実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中Ｌは、少なくとも２種の芳香族又はビス芳香族部分、例えばビフェニル、ナフチル、ジベンゾケトン、ダンシル、ピレン、ペリレン、クマリン、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ、３a−ジアザ−ｓ−インダセン、又はシアニン色素、好ましくはインドカルボシアニン又はモノメチン発色団部分を用いる構造を含む。分光学的定量化により、デンドリマー：タンパク質／ポリペプチド比の決定が可能になる。Ｄに連結されるＬのＵＶ〜ＶＩＳで検出可能な構造の例は、実施例９及び１０に記載されている。
【００５０】
本発明のさらなる主題は、Ｅが治療又は診断エフェクター分子である、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mの複合体である。
【００５１】
蛍光色素により共有結合される硫酸化デンドリマーの使用は、Paulus et al. (Macromol. Biosci. 2014, 14, 643-654)により記載されている。[Ｇ４．０]−デンドリマーは、６４個のヒドロキシ基のポリオールに由来し、これと、統計学的に、リンカーが結合され、続いて硫酸化及び色素による標識を伴う。この設計は、リンカー部分を、所望の位置で、１：１の比で正確に配置できないので、不完全な構造となる。上記文献は、それら及びより低い分枝度のポリマー性ポリ硫酸塩の腫瘍細胞中への取り込み、そして６０％という中程度の分枝度（完全でないデンドリマー構造）での最適な取り込みを教示している。疾病の分子機構に対する細胞内相互作用に治療的活性分子を利用できるようにするための、取り込みの機構についての情報やトランスポーター介在性経路がそれらの分子を輸送するために使用され得るか否かについての情報は存在しない。
【００５２】
特定の実施形態によれば、本発明の主題は、Ｅが治療エフェクター分子である、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mの複合体である。
【００５３】
別の実施形態によれば、本発明の主題は、複合体であり、ここでエフェクター分子は、増殖、アポトーシス、結合組織材料（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン）の合成、免疫機能、セネッセンス又は免疫防御の細胞内機構を妨げることができる物質を含む。
【００５４】
より具体的には、疾患の細胞内機構を妨げるとは、細胞内に硫酸化デンドリマーと治療分子の複合体を輸送し、それにより、細胞内に治療エフェクター分子Ｅ（この分子Ｅは疾患の分子機構と直接的に相互作用する）を局在化することによる細胞の治療においてこの複合体を使用することを含む。この相互作用は、細胞内で分子に直接的に結合することにより、生物学的シグナル伝達経路の妨害又は変更を誘発することに基づく。前記結合は、治療エフェクター分子の分子的な性質及び構造に依存する、結合強度又は結合親和性を規定する（下記セクションにおいて、さらに実証されるように）。
【００５５】
より好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、膜貫通溶質担体を介しての治療活性分子の細胞中への膜貫通送達を可能にする、膜貫通溶出担体群からのトランスポータータンパク質に基づく取り込み機構を有する細胞の処理への使用のための、硫酸化デンドリマー及び治療分子の複合体である。それらの膜貫通溶質担体は、好ましくは有機アニオン性トランスポータータンパク質（OATPs; Liu T et al., J. Drug Target. 2014,22, 14-22）を含む。好ましい実施形態は、腫瘍特異的発現を有するＯＡＴＰ、例えばＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ｂ３又は ＮＴＣＰである（Buxhofer-Ausch et al., J Drug Deliv. 2013, 863539）。
【００５６】
より好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、癌の治療及び診断における使用のための、硫酸化デンドリマー及び治療分子の複合体であり、ここで前記硫酸化デンドリマー及び治療分子は、癌細胞における分子標的に対して向けられる（directed against）。癌細胞の種類としては、好ましくは、癌、例えば膵臓癌、肺癌、CNS癌、メラノーマ、結腸癌、皮膚癌、乳癌、腎臓癌、肝癌の治療のための、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ｂ３ 又は ＮＴＣＰの高い発現が含まれる。別の好ましい実施形態は、しばしば、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ｂ３ 又は ＮＴＣＰを高レベルで発現する癌幹細胞の治療である。
【００５７】
従って、本発明の主題は、疾患の治療及び診断における使用のための、硫酸化デンドリマー及び治療分子の複合体であり、ここで前記硫酸化デンドリマー及び治療分子の複合体は、トランスポータータンパク質により細胞内に取り込まれ、そして細胞の内部で疾患の分子機構と相互作用する。
【００５８】
さらにより好ましいものは、膜貫通溶質担体群からのトランスポータータンパク質に基づく取り込み機構（これを有さない場合、前記トランスポーター分子を取り込むことができない）を有する細胞の治療における使用のための、硫酸化デンドリマー及び治療分子の複合体である（また、実施例１８を参照のこと）。驚くべきことには、治療エフェクター分子が結合親和性を示す標的分子に到達不可王であったため、従前では不可能であったトランスポータータンパク質による複合体の取り込みの機構に基づいて、標的細胞内に蓄積されるか、又は富化され得る。
【００５９】
従って、本発明の主題は、疾患の治療及び診断における使用のための、硫酸化デンドリマー及び治療分子の複合体であり、ここで前記硫酸化デンドリマー及び治療分子の複合体は、トランスポータータンパク質により細胞中に取り込まれ、細胞の内部で疾患の分子機構と相互作用し、そして細胞内標的分子に対する治療エフェクター分子の結合親和性のために、細胞に蓄積する。さらに、細胞内標的は、以下に実証されている。
【００６０】
別の特定の実施形態によれば、本発明の主題は、複合体であり、ここで前記エフェクター分子は、小分子、ペプチド、タンパク質、グリカン及び核酸から成る群より選択される。単独では細胞中内に取り込まれない種類のエフェクター分子が好ましい。
【００６１】
別の非常に特定の実施形態によれば、本発明の主題は、複合体であり、ここで小分子は、ペプチド又はペプチド模倣構造体（天然又は非天然の構造の修飾を有する環状又は開鎖ペプチドを包含する）群から選択される。細胞内への取り込まれない親和性ペプチドは、本発明のデンドリマーへの結合した後、腫瘍細胞内に局在化することができる、驚くべきことには示された。
【００６２】
別の非常に特定の実施形態によれば、本発明の主題は、複合体であり、ここでタンパク質は、球状タンパク質、糖タンパク質、毒素、酵素、抗体、抗体フラグメント、操作された抗体及びタンパク質構造体（単一ドメイン抗体（sdAb）、単鎖Ｆｖ抗体（scFv）、単鎖Ｆｖ−Ｆｃ抗体（scFv-Fc）を含む）からなる群より選択される。
【００６３】
別の非常に特定の実施形態によれば、本発明の主題は、複合体であり、ここでタンパク質は、抗体のように、抗原を特異的に結合できるが、しかし抗体と構造的に関連しない抗体模倣体を包含する群から選択される。特に好ましいものは、アフィボディ（affibodies）、アフィリン(affilins)、アビマー（avimers）、アンチカリン（antikallins）、ダルピン（darpins）、クニッツ（Kunitz）ドメイン、フィノボディ（fynobodis）、フィブロネクチンのIII型ドメインから生成されたポリペプチドの群から選択された抗体模倣体である。
【００６４】
別の非常に特定の実施形態によれば、本発明の主題は、複合体であり、ここで核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンス−ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ又は操作された形式、例えばアプタマーを包含する。
【００６５】
別の特定の実施形態によれば、本発明の主題は、複合体であり、ここでＥは、腫瘍細胞の増殖及びアポトーシスに関与する分子に対して向けられる。より特異的には、それらの分子は、腫瘍細胞、好ましくは腫瘍細胞の細胞質ゾル内に局在化される。
【００６６】
別の非常に特定の実施形態によれば、本発明の主題は、複合体であり、ここでＥは、例えば下記の標的に結合するポリペプチド又は小分子エフェクター分子を包含する群から選択される：Ｆｏｘ０ｌ、ＨＤＡＣ、 ＤＰ−１、 Ｅ２Ｆ、 ＡＢＬ、 ＡＭＰＫ、 ＢＲＫ、 ＢＲＳＫ１、 ＢＲＳＫ２、 ＢＴＫ、 ＣＡＭＫＫ１、 ＣＡＭＫＫα、 ＣＡＭＫＫ β、 Ｒｂ、 Ｓｕｖ３９Ｈ１、 ＳＣＦ、 ｐ１９ＩＮＫ４Ｄ、 ＧＳＫ−３、 ｐ１８ ＩＮＫ４、ｍｙｃ、サイクリンＥ、 ＣＤＫ２、 ＣＤＫ９、 ＣＤＧ４/６、サイクリン Ｄ、 ｐｌ６ ＩＮＫ４Ａ、 ｃｄｃ２５Ａ、 ＢＭＩ１、 ＳＣＦ、 Ａｋｔ、 ＣＨＫｌ/２、 ＣＫ１δ、 ＣＫ１γ、 ＣＫ２、 ＣＬＫ２、 ＣＳＫ、 ＤＤＲ２、 ＤＹＲＫ１Ａ/２/３、 ＥＦ２Ｋ、 ＥＰＨ−Ａ２/Ａ４/Ｂ１/Ｂ２/Ｂ３/Ｂ４、 ＥＩＦ２ＡＫ３、 Ｓｍａｄ２、 Ｓｍａｄ３、 Ｓｍａｄ４、 Ｓｍａｄ７、 ｐ５３、 ｐ２１ Ｃｉｐｌ、 ＰＡＸ、 Ｆｙｎ、 ＣＡＳ、 Ｃ３Ｇ、 ＳＯＳ、 Ｔａｌ、 Ｒａｐｔｏｒ、 ＲＡＣＫ−１、 ＣＲＫ、 Ｒａｐｌ、 Ｒａｃ、 ＫＲａｓ、 ＮＲａｓ、 ＨＲａｓ、 ＧＲＢ２、 ＦＡＫ、 ＰＩ３Ｋ、 ｓｐｒｅｄ、 Ｓｐｒｙ、 ｍＴＯＲ、 ＭＰＫ、 ＬＫＢｌ、 ＰＡＫ １/２/４/５/６、 ＰＤＧＦＲＡ、 ＰＹＫ２、 Ｓｒｃ、 ＳＲＰＫ１、 ＰＬＣ、 ＰＫＣ、 ｃ−Ｒａｆ、 ＰＫＡ、 ＰＫＢα/β、 ＰＫＣ α/γ/ζ、 ＰＫＤ、 ＰＬＫｌ、 ＰＲＡＫ、 ＰＲＫ２、 ＲＩＰＫ２、 Ｂ−Ｒａｆ、ＷＡＶＥ−２、 ＴＳＣ２、 ＤＡＰＫｌ、 ＢＡＤ、 ＩＭＰ、 ｃ−ＴＡＫ１、 ＴＡＫｌ、 ＴＡＯｌ、 ＴＢＫ１、 ＴＥＳＫ１、 ＴＧＦＢＲ１、 ＴＩＥ２、 ＴＬＫ１、 ＴｒｋＡ、 ＴＳＳＫ１、 ＴＴＢＫ１/２、 ＴＴＫ、 Ｔｐｌ２/ｃｏｔｌ、 ＭＥＫ１、 ＭＥＫ２、 ＰＬＤ１、Ｅｒｋｌ、 Ｅｒｋ２、 Ｅｒｋ５、 Ｅｒｋ８、 ｐ９０ＲＳＫ、 ＰＥＡ−１５、 ＳＲＦ、 ｐ２７ ＫＩＰ１、 ＴＩＦｌａ、 ＨＭＧＮ１、 ＥＲ８１、 ＭＫＰ−３、 Ｃ−Ｆｏｓ、ＦＧＦ−Ｒ１、 ＧＣＫ、 ＧＳＫ３ β、 ＨＥＲ４、 ＨＩＰＫ１/２/３/、 ＩＧＦ−１Ｒ、 ｃｄｃ２５、 ＵＢＦ、 ＬＡＭＴＯＲ２、 Ｓｔａｔｌ、 Ｓｔａｔ３、 ＣＲＥＢ、 ＪＡＫ、 Ｓｒｃ、 ＰＴＥＮ、 ＮＦ−κＢ、 ＨＥＣＴＨ９、 Ｂａｘ、 ＨＳＰ７０、 ＨＳＰ９０、 Ａｐａｆ−１、 Ｃｙｔｏ ｃ、 ＢＣＬ−２、 Ｂｃｌ−ｘＬ、 Ｓｍａｃ、 ＸＩＡＰ、 カスパーゼ‐９、カスパーゼ−３、カスパーゼ−６、カスパーゼ‐７、 ＣＤＣ３７、 ＴＡＢ、 ＩＫＫ、 ＴＲＡＤＤ、 ＴＲＡＦ２、 Ｒ１Ｐ１、 ＦＬＩＰ、 ＴＡＫｌ、 ＪＮＫｌ/２/３、 Ｌｃｋ、 Ａ−Ｒａｆ、 Ｂ−Ｒａｆ、 Ｃ−Ｒａｆ、 ＭＯＳ、 ＭＬＫｌ/３、 ＭＮＫｌ/２、 ＭＳＫｌ、 ＭＳＴ２/３/４、 ＭＰＳＫ１、 ＭＥＫＫｌ、 ＭＥＫＫ４、 ＭＥＬＫ、 ＡＳＫ１、 ＭＩＮＫ１、 ＭＫＫ１/２/３/４/６/７、 ＮＥＫ２ａ/６/７、 ＮＵＡＫ１、 ＯＳＲ１、 ＳＡＰＫ、 ＳＴＫ３３、Ｓｙｋ、 Ｌｙｎ、 ＰＤＫ１、 ＰＨＫ、 ＰＩＭ １/２/３、 Ａｔａｘｉｎ− １、ｍＴＯＲＣｌ、 ＭＤＭ２、 ｐ２１ Ｗａｆｌ 、サイクリンＤｌ、 Ｌａｍｉｎ Ａ、 Ｔｐｌ２、 Ｍｙｃ、 カテニン、 Ｗｎｔ、 ＩＫＫ−β、 ＩＫＫ−γ、 ＩＫＫ−α、 ＩＫＫ−ε、 ＥＬＫ、 ｐ６５ＲｅｌＡ、 ＩＲＡＫ１、 ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４、 ＩＲＲ、 ＦＡＤＤ、 ＴＲＡＦ６、 ＴＲＡＦ３、 ＭＫＫ３、 ＭＫＫ６、 ＲＯＣＫ２、 ＲＳ���１/２、 ＳＧＫ１、ＳｍＭＬＣＫ、 ＳＩＫ２/３、 ＵＬＫ１/２、 ＶＥＧＦＲ１、 ＷＮＫｌ、 ＹＥＳ１、 ＺＡＰ７０、 ＭＡＰ４Ｋ３、 ＭＡＰ４Ｋ５、 ＭＡＰＫｌｂ、 ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２/Ｋ３、 ｐ３８ α/β/δ/γ ＭＡＰＫ、 Ａｕｒｏｒａ Ａ、 Ａｕｒｏｒａ Ｂ、 Ａｕｒｏｒａ Ｃ、 ＭＣＡＫ、 Ｃｌｉｐ、 ＭＡＰＫＡＰＫ、 ＦＡＫ、 ＭＡＲＫ １/２/３/４、 Ｍｕｃｌ、 ＳＨＣ、 ＣＸＣＲ４、 Ｇａｐ−１。
【００６７】
より特異的には、標的カテニンは、転写因子複合体を形成するための、いくつかの補因子とアダプタータンパク質との相互作用に基づく転写活性を示す。カテニン転写複合体は、治療標的として使用され得るいくつかのタンパク質−タンパク質相互作用を表す。相互作用するタンパク質構造体のアミノ酸配列に由来するペプチドモチーフ、例えばα−ヘリックス又はβ−シートが治療リード構造体として使用され得る。Ｂｃｌ９、ｂｃｌ９／２又はPygopusに由来するα−ヘリックスペプチドは好ましくは、カテニン転写複合体のインヒビターとして使用される。
【００６８】
より特異的には、腫瘍細胞のアポトーシス（プログラムされた細胞死）は、ｂｃｌ−２ファミリー、例えばｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ｘ１及びｍｃｌ−１のメンバーにより抑制される。アポトーシスの誘発は、腫瘍治療のために非常に魅力的なアプローチと考えられている。アポトーシス増感タンパク質、例えばＢＩＭ、ＢＩＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡと、アポトーシスの負の調節因子、例えばｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ｘ１及びｍｃｌ−１との相互作用がアポトーシス及び腫瘍細胞死を誘発しうることが、文献において知られている。相互作用タンパク質構造体のアミノ酸配列に由来するペプチドモチーフ、例えばα−ヘリックス又はβ−シートは、治療リード構造体として使用され得る。アポトーシス増感タンパク質、例えばＢＩＭ、ＢＩＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ由来のα−ヘリックスペプチドは好ましくはアポトーシスを抑制するタンパク質、例えばｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ｘ１及びｍｃｌ−１のインヒビターとして使用される。
【００６９】
別の特定の実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中Ｅは酵素であり、式中、前記酵素は、治療的酵素であり、治療的酵素としては、腫瘍増殖に必要な特定のアミノ酸を破壊することにより作用する抗腫瘍酵素；オリゴヌクレオチド鎖を破壊することにより作用する酵素；消化官の種々の不全の矯正のための置換療法のための酵素（通常、消化酵素）；リソソーム蓄積症の治療のための酵素；血栓溶解療法のための酵素；抗菌及び抗ウィルス酵素；及び加水分解及び抗炎症性酵素が挙げられる。
【００７０】
別の実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中Ｅは、改変された植物及び細菌毒素の種類からの毒素ポリペプチドである。
【００７１】
別の特定の実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中Ｅは、改変された植物及び細菌毒素の種類からの毒素ポリペプチドであり、ここで前記毒素ポリペプチドは、リボソーム阻害タンパク質のクラス、及び腫瘍増殖の阻害のための構造的に誘導された配列に属する。
【００７２】
別の非常に特定の実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中Ｅは、改変された植物及び細菌毒素の種類からの毒素ポリペプチドであり、ここで前記毒素ポリペプチドは、ジフテリア毒素、受容体結合活性を欠いているジフテリア毒素、シュードモナス外毒素Ａ、受容体結合ドメインＩａを欠いている切断形のシュードモナス外毒素、リシン毒素、サポリン、ジアンチン、ゲロニン、トリコサンチン、ヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質（ＰＡＰ）、ブーゲニン、炭疽防御抗原、αトキシン、アブリン、アポトーシス誘導ポリペプチドを包含する。
【００７３】
非常に特定の実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中、Ｅは、野生型ｐ５３、野生型ｐ２１、アポトーシス誘導因子１（ＡＩＦ１）、ＡＳＫ１、アポトーシス誘導タンパク質（ＡＩＰ）、カスパーゼ‐２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ‐９、カスパーゼ−１０、Ｂａｘ、セリンプロテアーゼ、Ｓｎａｃ、シトクロムｃ、Ａｐａｆ−１、アポプチンから選択されたタンパク質を包含する。
【００７４】
別の実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中、Ｅは、腫瘍増殖の阻害のために有糸分裂の機構を標的とするポリペプチドである。
【００７５】
別の特定の実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中、Ｅは、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮアーゼＩ）、デオキシリボヌクレアーゼＩＩ（ＤＮアーゼＩＩ）、α−チューブリンを標的とするポリペプチド、β−チューブリンを標的とするポリペプチド、ダイニンを標的とするポリペプチド、キネシンを標的とする結合ポリペプチド、ＮＥＤＤ１を標的とするポリペプチド、トランスフォーミング酸性コイルド−コイルタンパク質ＴＡＣＣを標的とするポリペプチド、結腸肝腫瘍過剰発現遺伝子ｃｈＴＯＧを標的とするポリペプチドを包含する群から選択された毒素ポリペプチドである。
【００７６】
毒素の構造及び作用機構に関する知識が向上することにより、今日前臨床及び臨床研究下にあるような新規な化学物質がもたらされている。ほとんどの天然タンパク質毒素は、次の３つの主要グループに分けられ得る：（１）膜の完全性を破壊することにより細胞を損傷する毒素、（２）毒性化された生物の神経系の正常な電気的活性を破壊する毒素、（３）細胞プロセスを破壊するか又は妨害し、そして酵素又は非酵素活性により標的細胞に影響を及ぼすことがある毒素。第３グループのいくつかのメンバーは、細胞質への自己トランスロケーションの能力を有し、細胞質内で作用し、これにより毒性化された細胞の死へとつながることが多い、極めて毒性の高いポリペプチドである。しかしながら、操作された毒素の臨床学的適用はまだ、多くの課題に直面している。免疫毒素の全身性投与に関する２つの主要な問題は、次の通りである：（１）健康な組織上にも存在する標的抗原／受容体の存在に起因する特異性の欠如、及び（２）特にその標的抗原／受容体に対してよりもむしろ細胞表面成分に対して結合する免疫毒素による健康組織の望ましくない毒性化（「標的非依存性毒性」）。従って、１つの実施形態によれば、本発明の主題は、かかる種類の治療エフェクターの細胞内送達による増殖性疾患の治療のための毒性ポリペプチド又は毒素を有する、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体である。
【００７７】
別の特定の実施形態によれば、本発明の主題は、複合体であり、ここで硫酸化デンドリマーは抗体、抗体フラグメント又は操作されたタンパク質に化学的結合され、そして増殖細胞、例えば腫瘍細胞及び炎症性活性化細胞内への細胞内送達を可能にする。
【００７８】
好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、複合体であり、ここで治療エフェクター分子Ｅは、１００ｋＤａに等しいか又はそれ以下、より好ましくは８０ｋＤａ未満、さらにより好ましくは６０ｋＤａ未満の分子量（これは、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ2、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体、ミニボディ、バイト抗体(bite antibody)又は二重特異的抗体（diabody）から選択される抗体フラグメントを有する硫酸化デンドリマーの結合により達成され得る）、及び最も好ましくは、４０ｋＤａ未満の分子量（これは、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、又は合成小分子量ペプチドから選択される抗体フラグメントを有する硫酸化デンドリマーの結合により達成され得る）を有する。
【００７９】
合成ペプチドのグループ内に、開鎖ペプチド、Ｎ／Ｃ−末端環化による環状ペプチド、システイン−システイン（ジスルフィド）環化による環状ペプチド、及び２５個までのアミノ酸、好ましくは２０個までのアミノ酸、より好ましくは１５個までのアミノ酸、最も好ましくは１０個までのアミノ酸の非天然のアミノ酸（例えば、ステープルされるペプチド）により結合される脂肪族環を有するペプチドが存在する。
【００８０】
また、３０〜４０個のアミノ酸のより長いペプチドも、特に、追加のアミノ酸がスペーシング、溶解性の導入、及び改善された安定性の付与のために使用され得るので、本発明の主題である。
【００８１】
上記合成ペプチド内の別の実施形態は好ましくは、タンパク質相互作用に関与し特定のα−ヘリックスを形成する配列を用いる天然の結合ペプチドに由来する構造モチーフである。特に、α−ヘリックスペプチド配列は、溶液中の特定のヘリシティ（helicity）により特徴づけられ、そのヘリシティにより、他のタンパク質への結合親和性が生ずる。必要なヘリシティ度は、使用するペプチド構造に依存し（Bernal F et al. Methods Mol. Biol. 2014, 1 1 76, 107-14）、そして当業者に知られている手段により、例えばＣＤ−分光法又はＨ−ＮＭＲにより測定され得る（Bonache MA et al, ACS Comb Sci. 2014, 16, 250-258）。ヘリシティは、[％]で与えられる。
【００８２】
従って、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中、Ｅは、タンパク質−タンパク質相互作用、又は腫瘍細胞の増殖及びアポトーシスに関与する分子に対して向けられたα−ヘリックスペプチドであり、ここで前記複合体は、腫瘍細胞内、好ましくは腫瘍細胞の細胞質ゾル内に局在化される。ｍが１である複合体が好ましい。水溶液において、α−ヘリックスを形成する、４０個までのアミノ酸、好ましくは３０個までのアミノ酸、より好ましくは２０個までのアミノ酸の合成ペプチドが好ましい。α−ヘリックスは、その配列内に非天然のアミノ酸を用いること、及び／又は環状ペプチド（例えば、頭一尾の環化、ジスルフィドの環化、炭化水素のステープリングであるが、但しそれらだけには限定されない）を形成することにより、安定化され得る。それらのペプチドの好ましいヘリシティ値は、４０％超、より好ましくは６０％超、さらにより好ましくは８０％超である。
【００８３】
また、本発明は、好ましくは、ポリペプチド又はペプチド群の治療エフェクター分子の分子量に関する驚くべき知見も包含する。抗体、抗体フラグメント又は操作されたタンパク質に化学的に結合される硫酸化デンドリマーが、増殖細胞、例えば腫瘍細胞内への細胞内送達を可能にすることが、驚くべきことには見出された。ＩｇＧ型の抗体は、１５０ｋＤａの平均分子量を有するタンパク質であり、そして通常、細胞質内に侵入することはできない。デンドリマー抗体複合体の細胞内取り込みの程度を、一連の異なった腫瘍細胞系において調べ、ＦＡＣＳ測定及び蛍光顕微鏡検査により決定した。デンドリマーＩｇＧ複合体との腫瘍細胞のインキュベーションを開始してからわずか３時間後には、細胞内取り込みが存在したことが見出された。陽性細胞の数、及び電態的な取り込み度が、デンドリマーＩｇＧ複合体との腫瘍細胞の２４時間までのインキュベーションにより高まった。さらに、タンパク質治療薬の分子量が取り込み速度に関して重要であることが、驚くべきことには観察された。詳細には、１５０ｋＤａ未満の全分子量を有するデンドリマータンパク質は、１５０ｋＤａの分子量を有する完全ＩｇＧよりも、細胞内取り込みが速く、及び陽性細胞の割合が高かったことが示された。抗体フラグメント、例えば（Ｆａｂ）2、ｓｃＦｖ−Ｆｃ又は二重特異的抗体は、１００〜１２０ｋＤａの平均分子量を有するタンパク質を表す。最強の細胞内取り込みが、単一ドメイン抗体（１５ｋＤａ）などの４０ｋＤａよりも低い分子量を有するデンドリマータンパク質複合体で存在する。当業者は、インキュベーションの開始後、様々な時点でのＦＡＣＳ測定により、腫瘍細胞による細胞内取り込みの程度を測定することができる（また、実施例１５も参照のこと）。
【００８４】
１つの実施形態によれば、本発明の主題は、デンドリマー複合体であり、ここでそれらのデンドリマー複合体は、二重、三重又は多重特異的抗体、抗体フラグメント又は操作されたタンパク質との複合体であり、ここでそれらのタンパク質は、複数の分子標的に向けられ、そして同時に異なった疾患機構に対する治療効果を誘発することができる。
【００８５】
別の特定の実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中、Ｅは、それらのアミノ酸配列に１又は２以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含むポリペプチドであり、それらのＮＬＳはポリペプチドをタグ付することにより、例えばインポーチン受容体に関する、核輸送により細胞核内への輸送を可能にすることが知られている。ＮＬＳは、当業者に公知であり（Lange et al ., J Biol Chem. 2007, 282, 5101-5を参照のこと）、そして通常、カチオン性アミノ酸（リシン、アルギニン）の１又は２以上の配列を含む。
【００８６】
本発明のさらなる主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中、Ｅは、抗腫瘍薬（antineoplastic agents）のクラス、例えばアルキル化及びアルキル化様抗腫瘍薬、の治療エフェクター分子であり、例えば以下が挙げられる：シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、トロフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、アルキルスルホナート、ブスルファン、トレオスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ニムスチン、エストラムスチン、ストレプトゾトシン、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、デュオカルマイシン及び類似体、センダナマイシン、アドゼレシン、ビゼレシン、カルゼレシノール、抗代謝物のクラスの治療エフェクター分子、例えばプリン類似体（６−チオグアニン、ペントスタチン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、フルダラビン、クラドリビン）又はピリミジン類似体（ゲムシタビン、５−フルオロウラシル）又は抗葉酸剤（メトトレキセート）、抗有糸分裂活性を有する植物アルカロイド及びテルペノイド、例えばビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン）、ジソラゾール及び誘導体（ジソラゾールＡ１、Ａ２、Ｅ１、Ｚ）、ポドフィロトキシン、例えばエトポシド及びテニポシド、タキサン（ドセタキセル、パクリタキセル）、コルチシン及び誘導体、メイタンシン及び誘導体、例えばンカーを有する類似体、ゲルダナマイシン及び類似体、例えばアミノヘキシルダナマイシン又は１７−アミノゲルダナマイシン; トポイソメラーゼインヒビター、例えばカンプトテシン誘導体、イリノテカン及びトポテカン、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、及びテニポシド、抗腫瘍抗生物質、例えばダクチノマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、２−ピロリノドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、例えばアントラマイシン、マゼトラマイシン、トマイマイシン（tomaymycin）、及び類似体、例えばＰＢＤダイマー、チロシンキナーゼインヒビター及びマルチキナーゼインヒビター、例えばスタウロスポリン、アファチニブ、 アキシチニブ、カボザンチニブ、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、フォアチニブ（foretinib）、フルマチニブ（flumatinib）、イマチニブ、ポナチニブ、レゴラフェニブ（regorafenib）、リゴセルチブ（rigosertib）、ソラフェニブ、スニチミブ、タソシチニブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ、ルキソリチニブ、タソジチニブ、トラメチニブ、及び共有結合のための官能基を有するこれらの薬剤の類似体; 他の合成又は半合成抗有糸分裂剤、例えばアウリスタチン誘導体（モノメチルアウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＦ及び類似体を含む)、ドラスタチン誘導体（モノメチルドラスチンＮ及び類似体を含む）、チューブリジン及び類似体、カリケアマイシン及びその誘導体（カリケアマイシン１及びＮ−アセチルγカリケアマイシンＤＭＨを含む）; ＲＮＡポリメラーゼＩＩインヒビター、例えば環状ペプチドα−アマニチン及び類似体。
【００８７】
別の特定の実施形態によれば、本発明のさらなる主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中、Ｅは治療エフェクター分子であり、ここでポリペプチドエフェクター分子は、抗腫瘍薬のクラスの小治療エフェクター分子に結合される抗体又は抗体フラグメントである。
【００８８】
１つの特定の実施形態によれば、本発明の主題は複合体であり、ここで抗腫瘍薬のクラスの種類の小治療エフェクター分子に結合されるポリペプチドエフェクター分子は、トラスツズマブ−ＤＭ１（メイタンシンに結合される抗体）、モノメチルアウリスタチンＥ又はＦに結合される抗体又は二重特異性抗体、カリケアマイシンに結合される抗体から選択される。
【００８９】
別の実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中、Ｅは、光増感剤のクラス小治療エフェクター分子であり、例えば以下が挙げられる：テトラピロール、ポルフィリン、サフィリン、クロリン、テトラフェニルポルフィリン、テトラフェニルクロリン、バクテリオクロリン、テトラフェニル − バクテリオクロリン、フェオフォルビド、バクトクリオフェオフォルビド、ピロフェオフォルビド、バクテリオピロフェオフォルビド、プルプリンイミド、バクテリオプルプリンイミド、ベンゾポルフィリン、フタロシアニン、ナフタロシアニン及びその誘導体。好ましくは、光増感剤は、フェオフォルビドa（pheophorbide a）、ピロフェオフォルビドa、３−アセチルフェオフォルビドa、３−アセチルピロフェオフォルビドa、プルプリン−１８−Ｎ−アルキルイミド、プルプリン−１８−Ｎ−ヒドロキシルイミド、３−アセチルプルプリン−１８−Ｎ−アルキルイミド、３−アセチルプルプリン−１８−Ｎ−ヒドロキシルイミド、塩素e６、Ｓｎ−塩素e６、m−テトラヒドロキシフェニルクロリン（m−ＴＨＬＣ）及びベンゾポルフィリン誘導体、ベンゾポルフィリン誘導体一酸（ＢＰＤ−ＭＡ、ベルテポルフィン）を含む群から選択される。
【００９０】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中、Ｇは、ＥとＬとの間に共有結合を形成する結合官能基である。
【００９１】
別の特定の実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中、Ｇは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＨ−Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ、Ｃ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ）2、Ｓ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ2）Ｏ、Ｓ−Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ、Ｃ ＝ Ｎ−ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）Ｏ、Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）Ｏ、アリーレン、エテニレン、エチニレン、及びトリアゾリレンからなる群から選択される。
【００９２】
別の非常に特定の実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中、ＧはリンカーＬにおける反応性基と、治療エフェクター分子Ｅとの間の結合反応により形成される。反応性基としては、ＣＯＯＨ、ＯＯＨの活性化エステル、例えばN-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、N-ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル又はスルホジクロロフェニルエステル; アミノ、ヒドラジン、カルボキシヒドラジノ、イソチオシアネート、イソシアナート、マレイミド、テトラジン、ビニルスルホン酸エステル、ビニルスルホンアミド、ブロモアセチル、ヨードアセチル、ブロモアセチルアミド、ヨードアセチルアミド、カルバルデヒド、チオール、ピリジルジスルフィド、チオアセチル、アジド、プロパルギル、エチニル、アリル、ビニル、（ジフルオロ）シクロオクチニル、トリアリールホスフィン、ビス（アルキルオキシ）アリールホスフィン、（グリシル）グリシルグリシン、グアニジンが挙げられる。次の構造の結合が好ましい： Ｌにおける活性化エステルに由来するＣ（Ｏ）ＮＨ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステルを含む）、Ｌにおけるイソチオシアネート基に由来するＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ、Ｌにおけるマレイミド基に由来する−Ｓ−スクシニルアミド、Ｌにおけるピリジルジスルフィド又はアセチルスルフィドに由来するジスルフィドＳ−Ｓ−、Ｌにおける末端プロパルギル基又はシクロオクチル基に由来するトリアゾール、Ｌにおけるアルデヒド基に由来するＣ ＝ Ｎ−（イミン）、Ｌのアルデヒド基に由来する−ＣＨ2−ＮＨ−（還元的アミノ化によるイミン経由のアミン）。
【００９３】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、複合体であり、ここで前記結合のためのＧは、アミド結合Ｃ（Ｏ）ＮＨを含み、これは、酵素連結反応に由来するペプチド鎖の一部である。
【００９４】
本発明のさらなる主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中、対イオンＭ+は、リシン、メグルミン、ＴＲＩＳ、グリシン又はアミノ酸由来の他のアミン、又はカリウム、ナトリウム、リチウム、又はそれらの混合物から選択された有機及び無機カチオンを含む。
【００９５】
別の実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中、ｍは１〜２０の数であり、前記は、前記実施形態が、治療エフェクター分子Ｅに結合される、１又は２以上の硫酸化デンドリマー−リンカー系Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）を含むことを表す。
【００９６】
本発明のさらなる主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中、ｎは、６〜９６から選択された硫酸基の数である。
【００９７】
好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、複合体であり、ここでｎは６、８、１２、１６、１８、２４、３０、３２、３６、４０、４８、７２又は９６から選択された偶数である。
【００９８】
デンドリマーＤ（ＯＳＯ3-Ｍ+）nに関して、硫酸塩の数は、デンドリマー構造及び硫酸基（対イオンを含む）により構成され得られる分子量にも関連する。硫酸塩の密度は、特定の実施形態では、一定レベルで存在するであろうことが見出された。従って、Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）nの分子量は、本発明の特定の実施形態によれば、各数ｎについて制限される。
【００９９】
Ｍ+がアルカリイオン、好ましくはナトリウムである場合、ｎと分子量との間の次の関係を有するデンドリマーＤ（ＯＳＯ3-Ｍ+）nが好ましい。
【０１００】
【表１】
2020073643.tif 000004
【０１０１】
ヒドロキシル化デンドリマー構造（ポリオール構造）を生成するための合成経路によれば、６又はそれ以上の数ｎから選択された一定数の硫酸基が好ましい。抗体フラグメント（５０ｋＤａ、色素ＩＣＣによりＣｙ３範囲で蛍光標識された、実施例８を参照のこと）に結合した高度に硫酸化されたデンドリマーは、数が２４又は３２個の硫酸基を有する場合、数が１２又は１６個の硫酸基を有する同様の複合体に比較して、腫瘍細胞において３倍の高い検出を可能にしたことが、驚くべきことには見出された。しかし、小分子エファクターＥ（１２００Ｄａ）を用いることにより、同様の効果が、１２及び１８個の硫酸基のデンドリマーで観察された。
【０１０２】
従って、合成工程における利便性のため、１つの好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、ｎは、１２、１６、１８、２４、３０、３２、３６、４０、４８、７２又は９６の偶数である。好ましくは、ｎは１２、１８、２４、３２、３６、４０又は４８である。Ｅが４０ｋＤａ超の分子量のタンパク質を表す場合、ｎは好ましくは、２４、３２、３６、４０、４８又はそれ以上である。Ｅが約６００〜２０００Ｄａの小分子化合物又はペプチド、又は１２００〜４００００Ｄａのタンパク質を表す場合、ｎは好ましくは、１２、１６、２４又は３２である。ｍが２又はそれ以上である場合、ｎは好ましくは、６、１２、１６又は２４である。
【０１０３】
本発明のさらなる主題は、活性化細胞又は増殖細胞内への細胞内取り込みによる疾患の治療における使用のための、一般式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体である。
【０１０４】
好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、癌、炎症、自己免疫疾患、代謝性疾患及び線維症を包含する群より選択される疾患の治療における、並びに抗増殖性（anti-proliferative）、増殖促進性（pro-proliferative）、抗アポトーシス性（ant-apoptotic）、アポトーシス促進性（pro-apoptotic）、抗線維性（anti-fibrotic）、線維化促進性（pro-fibrotic）、抗脂質生成性（anti-lipogenic）、抗糖尿病性（anti-diabetic）、免疫刺激性（immune-stimulatory）及び抗加齢性（anti-aging）の治療における使用のための、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体である。
【０１０５】
より好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、代謝疾患の治療及び診断における使用のための硫酸化デンドリマー及び治療分子の複合体であり、ここで前記硫酸化デンドリマー及び治療分子の複合体は肝臓の細胞（liver cells）、例えば肝細胞（hepatocytes）又は肝星細胞（hepatic stellar cells）における分子標的に対して向けられる。
【０１０６】
より特定の実施形態によれば、本発明の主題は、次の代謝疾患の診断及び治療における使用のための硫酸化デンドリマー及び治療分子の複合体である：糖尿病、アルコール性肝疾患、薬物誘発性又は「毒性」肝疾患、脂肪肝疾患（肝脂肪症）、非アルコール性脂肪肝疾患、脂肪性肝炎、二次性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、バッドキアリ症候群、ヘモクロマトーシス、遺伝性アミロイドーシス、ギルバート症候群。
【０１０７】
さらにより特定の実施形態によれば、本発明の主題は、肝臓のウィルス性疾患の治療及び診断における使用のための硫酸化デンドリマー及び治療分子の複合体であり、ここで前記複合体は、肝臓の細胞、例えば肝細胞又は肝星細胞におけるウィルス性及び非ウィルス性分子標的に対して向けられる。
【０１０８】
別のより特定の実施形態によれば、本発明の主題は、次の代謝疾患の診断及び治療における使用のための硫酸化デンドリマー及び治療分子の複合体である：A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎、エプスタイン − バー−ウィルス誘導性肝炎、サイトメガウィルス誘発性肝炎、単純ヘルペスウィルス誘発性肝炎、風疹ウィルス、ムンプスウィルス誘発性肝炎、風疹ウィルス誘発性肝炎、アデノウィルス誘発性肝炎、黄熱病性肝炎。
【０１０９】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、診断及び治療における使用のための硫酸化デンドリマー及び治療分子の複合体であり、ここで硫酸化デンドリマーにより結合される前記治療分子は、下記群から選択され得る：デルベブリール（deleburir）、レディパスビル（ledipasvir）、ラミブジン（lamivudine）、アデフォビル（adefovir）、ジピボキシル（dipivoxil）、テルブジン（televudine）、テノホビル（tenafarvir）、リバビリン（ribavarin）、テラプレビル（telaprevir）、ボセプレビル（boceprevir）、セメプレビル（simeprevir）、アスナプレビル（asunaprevir）、ファルダプレビル（faldaprevir）、ソフォスブビル（sofosbuvir）、ダクロラトスビル（daclatasvir）、バニプレビル（vaniprevil）、エンテカビル（entecavir）、ＡＢＴ−３３３、ＡＢＴ−０７２、 ＢＭＳ−７９１３２５、インターフェロン-α、ペグ化インターフェロン-α、 ＶＸ−９５０、ＶＸ−２２２、 ＶＸ−９８５、 ＡＬＳ−２２００、 ＡＬＳ−２１５８、 ＳＩＲＮＡ−０３４、ＭＫ−０６０８、 Ｒ７２２７、 Ｒ７１２８ (ＲＯ５０２４０４８)、ＲＧ７３４８、 ＴＭＣ４３５、 ＴＭＣ６４９１２８、 ＰＦ−８６８５５４、 ＰＦ−４８７８６９１ 、 ＢＩ ２０１３３５、 ＢＩ ２０７１２７、 ＩＣ４１、 ＢＭＳ−７９００５２、 ＢＭＳ−７９１３２５、 ＢＭＳ−６５００３２、 ＢＭＳ−８２４３９３、 ＡＮＡ５９８、 ＶＣＨ−７５９、 ＧＩ ５００５、 １ＴＸ５０６１、ＩＴＸ４５２０、 ＩＤＸ１８４、 ＩＤＸ３２０、 ＩＤＸ３７５、 Ａ−８３７０９３、 ＧＳ ９１９０、 ＧＳ ９２５６、 ＡＣＨ−１０９５、 ＡＣＨ− １６２５、 ＡＣＨ−２６８４、 ＡＣＨ−２９２８、 ＰＰＩ−４６１、ＰＰＩ−１３０１、 ＴＧ４０４０、 ＡＺＤ７２９５、 ＭＢＬ−ＨＣＶ １ 、クロミゾル（Clemizole）、 ＳＰＣ３６４９、ロックされた核酸ｍＲＮＡ１２２インヒビター、 ＧＮＩ−１０３、 ＧＮ１−１０４、 ＧＳＫ６２５４３３、 ＡＢＴ−４５０、 ＡＢＴ−０７２、 ＩＮＸ−１８９、ＰＳＩ−９３８、 ＥＤＰ−２３９、 ＳＰ−３０、 ＡＶＬ− １８１ 、 ＡＶＬ−１９２、 ＡＴＩ−０８１０、 ＰＲＯ ２０６、 ＩＴＸ２１５５、 ＶＸ−５００、ＶＸ−８１３、 アルブフェロンアルブインターフェロンα‐２ｂ、 ＳＣＶ−０７、 ＭＸ３２３５、セルゴシビル（Celgosivir）、 ＫＰＥ０２００１００３、 ＫＰＥ００００１１１３、ＣＴＳ−１０２７、 ＣＢ５３００、 Ｄｅｂｉｏ ０２５、 ＭＤＸ−１１０６ （ＯＮＯ−４５３８）、 ＣＹＴ１０７、 ＣＢ−１８３８７２、ＲＥＰ ９Ｃ広域スペクトル侵入インヒビター、 ＡＮ ０２５−１、 ＧＥＡ００７．１、 ＩＭＭＵ １０５。
【０１１０】
本発明のさらなる主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体を含む医薬組成物である。
【０１１１】
１つの特定の実施形態によれば、本発明の主題は、医薬組成物であり、ここで前記組成物は、単位投与剤（unit dosage form）、例えば錠剤、丸薬、カプセル、粉末、顆粒、滅菌非経口溶液又は懸濁液を有する。
【０１１２】
別の特定の実施形態によれば、本発明の主題は、医薬組成物であり、ここで前記組成物は、既知の医薬的に許容できる担体及び／又は賦形剤と共に、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体を含む固体製剤である。
【０１１３】
好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、医薬組成物であり、ここで前記医薬の剤形は凍結乾燥体である。
【０１１４】
より好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、医薬組成物であり、ここで投与経路は、非経口（皮下、静脈内、腹腔内、眼内、筋肉内、腫瘍内を含む)投与である。
【０１１５】
さらにより好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、医薬組成物であり、ここで投与経路は、毎日の治療、２〜７日ごとの治療、１日１回を超える治療、又は時間間隔、例えば５日間の間隔での治療を包含する、静脈内、皮下又は腹腔内経路の投与（化合物の複数回投与を包含する）から選択される。
【０１１６】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、複数回治療における使用のための医薬組成物であり、ここで患者に対する複数回治療は、体重あたり、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの皮下用量を含む。
【０１１７】
別の特定の実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、ここで数ｍは、前記式に従って使用される分子Ｅの性質の依存して異なり得る。典型的な実施形態は、それらの合成に関して以下に詳細に記載される。本発明のさらなる主題は、一般式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表されるタンパク質の使用であり、式中、リンカーＬを介する結合基ＧとＤとの結合がリシンのアミノ基で起こり、これは当業者に公知の統計的結合の手順である。実施例１１〜１３は、いくつかの可能性を示している。結合は、アクセスできるアミノ官能基の数に依存して、統計学的に生じる。従って、ポリペプチドに対するデンドリマー系Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）nのモル比は、数ｍにより記載され、平均１又はそれ以上である。統計学的結合に関しては、１〜５、より好ましくは１〜３の平均比が好ましく、ここでデンドリマーＤのそれぞれは、同じ分子量を有する。これは、Ｅに結合される各硫酸化デンドリマーは、同じ分子量を有するが、しかし前記複合体は、ｍの１つの特定値、好ましくは１〜１０の１つの特定値により記載されるモル比を、それぞれ有する複合体の混合物から構成され得ることを意味する。これは、ｍについての平均数に基づく不均一な混合物となる。この平均数は、例えばＨＰＬ又は測光分析により、当業者により分析的に決定され得る。
【０１１８】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中、Ｅはチオールであり、これにより、それらはジスルフィド結合の還元により通常アクセスできる内部システインのチオール基である。チオールは好ましくは、チオエーテルを形成するマレイミド（例えば、デンドリマー ｄ０２、ｄ０３、ｄ１３、ｄｌ４、ｄｌ９、ｄ２０）、又はＧのためのジスルフィドを形成するピリジルジスルフィド（例えば、デンドリマーｄ０４、ｄ０５、ｄｌ５、ｄ２１）により標識される。
【０１１９】
好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中、ポリペプチド又は小さなエフェクター分子に基づくエフェクター分子Ｅは、それぞれの官能基が、硫酸化デンドリマー、例えばジスルフィド結合の還元により生成された内部システインのチオール基に共有結合される場合、親ポリペプチドに存在しないか、アクセスできないか、又はＥの官能性の損失を引き起こす反応性官能基を導入するために合成的に修飾され得る。チオール又はアジドのような官能基を導入するためのポリペプチドの反応の例は、当業者に知られているように、２−イミノチオラン、アセチルチオプロピオン酸、アジドアルキルカルボン酸、アジド−ＰＥＧ−アルキルカルボン酸及び他のものとの反応である（Bioconjugate Techniques; Greg T. Hermanson; Academic Press, 2008）。
【０１２０】
好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、ペイロードとの共有部位特異的結合の機能を有する、ポリペプチド配列における規定される位置で構造体を担持するよう、バイオテクノロジー的に操作されるポリペプチドの使用である（Wang et al,, Front Biosci. 2008, 13, 1716）。我々は、システインモチーフ（ｃｙｓ−ｔａｇ、例えばアミノ酸配列ＧＧＧＣＡ 又は ＧＧＧＣＧＧＧ）、アジドホモアラニンによるメチオニン置換を介してコードされるクリック標識のためのアジド機能（Kiick et al., PNAS 2002, 99, 19-24）、又は酵素連結、例えばＮ末端グリシンモチーフを有するＣ末端配列ＬＰＸＴＧのソルターゼ媒介連結のためのモチーフ（Popp et al.. Nature Chem Biol., 2007, 1 1 , 707）を知っている。このポリペプチドは、既知組換え生成技法又は固相ペプチド合成により入手可能である。従って、前記実施形態はまた、上記のように、平均数を与える統計学的連結とは対照的に、部位特異的結合（site directed conjugation）のために正確に１である、ポリペプチドに対するデンドリマー系Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）nのモル比ｍも包含する。チオエーテルを形成するマレイミド、又はＧのためのジスルフィドを形成するピリジルジスルフィドを有するｃｙｓ−ｔａｇのチオール基への連結、及び配列ＬＰＸＴＧＧ（例えば、デンドリマーｄ２５を有する）のためのソルターゼ−媒介酵素連結、並びにアジドホモアラニン由来のアジドのクリック標識が好ましい。
【０１２１】
特定の実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中、エフェクター分子Ｅは、結合された硫酸化デンドリマーよりも高い分子量を有する。好ましい実施形態は、Ｅが、ポリペプチドに結合される同一のデンドリマー単位［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mの数ｎにより与えられる分子量の合計に対し２０倍までの高い分子量（ダルトンでの）、より好ましくは、１０倍までの分子量、さらにより好ましくは、５倍までの分子量を有するポリペプチドに基づかれている、複合体を包含する。
【０１２２】
別の実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される複合体であり、式中、Ｅは、腫瘍細胞の細胞質ゾルから必須の栄養素又は因子を破壊する酵素クラスからの治療ポリペプチドである。例えば、デンドリマーＬ−アスパラギナーゼ複合体は驚くべきことには、多くの腫瘍細胞系において強い抗増殖剤として作用することが見出された。これまでのところ、当業者は、腫瘍細胞の細胞質ゾル内に治療高分子Ｌ−アスパラギナーゼを送達することはできなかった。しかしながら、この特性は、腫瘍細胞の大部分が細胞内デノボ合成によるアスパラギンの取り込みの欠如を補完でき、非常に重要である。これはまた、腫瘍細胞代謝を標的化するデンドリマータンパク質複合体も包含する。治療エフェクター分子としての酵素タンパク質、例えばグリコシラーゼ、加水分解酵素、ピルビン酸キナーゼ、フマル酸ヒドラターゼ、ヘキソキナーゼ、アルドラーゼ、エノラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼが好ましい。
【０１２３】
特に好ましい実施形態によれば、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される本発明の主題は、ホモテトラマーであるＬ−アスパラギナーゼとデンドリマー系との複合体であり、ここでホモテトラマー中の各４個の単位は、酵素機能の損失なしに、還元及び結合のために１つのジスルフィド架橋を提供する（Balan et al., Bioconjugatc Chcm. 2007, 18, 61）；合成については実施例１２ａ、及び生物学的データについては実施例１５及び１６を参照のこと。
【０１２４】
別の実施形態によれば、本発明の主題は、ｃｙｓｔａｇを用いるそれらのフォーマットを含む異なったフォーマットで利用できる、プロテインＡ又はプロテインＧの使用である。例えば、デンドリマーは、ネズミ又はヒトＩｇＧにおけるＦｃ構造へのプロテインＧの結合親和性を維持しながら、ｒＣｙｓ−プロテインＧに結合される（実施例１２ｃ）。従って、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表されるデンドリマー複合体であり、ここで治療エフェクターは、上記のような結合技法を用いたプロテインＡ又はＧへの硫酸化デンドリマーの共有結合を伴って、ＩｇＧ抗体−プロテインＡ又はプロテインＧ複合体である。数ｍは、プロテインＡ又はＧにおいて１つの硫酸化デンドリマーを使用する場合に、溶液中での非共有アセンブリーによるＩｇＧとデンドリマープロテインＡ／Ｇとの間の比率を調節し、好ましくは、１，２又は３である。
【０１２５】
好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される、硫酸化デンドリマーと、治療エフェクター分子との複合体の使用を包含する、上記のような疾患の治療方法であり、ここで治療エフェクターＥが細胞質ゾルに送達される。より好ましくは、細胞質ゾルへの送達が安定性のあるリンカーＬにより起こり、それにより、硫酸化デンドリマーからの治療エフェクターＥの放出／分解を可能にしない。担体分子からの薬物放出の測定は、例えばWakankar et al., MAbs 201 1 , 3, 161 -172により記載される、当業者に公知の方法、例えばヒト血清下でインキュベートされた薬物複合体を分析するために使用されるＨＰＬＣ又は質量分析方法により行われ得る。前記実施形態において、好ましい方法は、ヒト血清において３７℃での２４時間のインキュベーションの後、ＨＰＬＣによる測定で、遊離薬物が結合された量（１００％）の好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下であるような安定性を有する開示デンドリマー複合体であるよう本明細書に記載される適用法である。
【０１２６】
好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される、硫酸化デンドリマーと治療エフェクター分子との複合体の使用を包含する、上記のような疾患の治療方法であり、ここで前記治療エフェクターＥは、生物に対する毒性レベルが高い血清や組織濃度のため、結合なしに薬物単独として適用できない。それらは好ましくは、メイタンシン及び類似体、アウリスタチン及び類似体、及びスタウロスポリン及び類似体である。それらの治療分子との硫酸化デンドリマーの複合体は、非増殖性細胞に対し、薬物分子単独に比較してより低い毒性を示す。生物における生理学的条件下で安定な非分解性リンカー構造をＬとして用いると、その生物において検出される遊離薬物の血清レベルが低い。
【０１２７】
実施形態の別の側面は、硫酸化デンドリマーへの結合が無いと細胞内への浸透が限定されてしまうという性質に関連する治療化合物Ｅに関する。それらは通常上記に記載されるようなタンパク質及びポリペプチドであるが、親水性合成細胞毒性化合物であることもある。実施例１５は、タンパク質Ｌ−アスパラギナーゼは腫瘍細胞内への取り込みを示さないが、硫酸化デンドリマーに結合されたＬ−アスパラギナーゼは腫瘍細胞内での実質的に増強された濃度を示す（表７）ことを示す。従って、デンドリマーが結合されると、細胞内取り込みが増強される。本発明のさらなる主題は、細胞内に局在化された（例えば、色素標識された複合体を用いてＦＡＣＳにより測定される；実施例１５を参照のこと）式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される治療エフェクター分子と硫酸化デンドリマーとの複合体分子の数について、結合されていない治療分子Ｅよりも、３倍、好ましくは５倍、最も好ましくは１０倍超、取り込みが増強される、方法である。
【０１２８】
本発明の範囲内で、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される化合物は、サポートする実施例にも記載されているように、腫瘍細胞に対して細胞毒性効果を示す。この効果は、いくつかの実施例で記載されるように、Ｍ［ｍｏｌ／Ｌ］表記のＩＣ50値により定量化することができる。従って、腫瘍細胞の培養物において１０-7Ｍ未満、好ましくは１０-8未満、より好ましくは１０-9Ｍ未満のＩＣ50を示す、前記式で表される治療エフェクター分子と硫酸化デンドリマーとの複合体の使用を包含する、上記のような疾患を治療するための方法を提供することもまた、本発明の主題である。この値は、使用される細胞系及び分析方法（ＭＭＴ試験により、又は生存対死亡細胞の細胞計数により分析される細胞増殖であり得る）に依存して、異なることが理解される。
【０１２９】
結合剤として作用し、通常、タンパク質−タンパク質相互作用をブロックするために適用されるタンパク質群の中で、操作されたポリペプチド足場は非常に重要なものである。ポリペプチド足場は、分子標的のための既存の結合部位を修飾するか、又は新しい結合部位を導入するために使用され得る剛直な天然のポリペプチド構造を担持するポリペプチドを表す。通常、そのような足場は、強固で小さな可溶性モノマーポリペプチド（例えば、ｋｕｎｉｔｚインヒビター又はリポカリン）から、又は細胞表面受容体の安定して折り畳まれた膜外ドメイン（例えば、プロテインＡ、フィブロネクチン又はアンキリン反復体）から誘導される。抗体又はそれらの組換えフラグメントに比較して、それらのポリペプチド足場はしばしば、独立した知的財産の状況と共に、微生物発現系における高められた安定性及び高い生成収率を含め、実用的な利点を提供する。それらの結合ポリペプチドは、強い標的−結合活性を達成するために、生物分子操作方法により得られるので、他の所望する性質（例えば、溶解性、熱安定性、プロテアーゼ耐性、等）に焦点を当てた、さらなる選択スキームに供されることがある。５０を超える様々なポリペプチド足場が、過去１０〜１５年間に提案されて来た。この分野における最も進歩したアプローチは、次のポリペプチドクラスを包含する：（１）ブドウ球菌プロテインＡのＺ−ドメイン、すなわちそのα−ヘリックスの２つ上に界面を提供する５８残基の３−ヘリックスの束に基づくアフィボディ、（２）様々なプロテアーゼ特異性のために操作され得る、典型的にはヒト起源（例えば、ＬＡＣＩ−Ｄ１）の、小さく（約５８残基）強力なジスルフィド架橋されたセリンプロテアーゼインヒビターに基づく、操作されたＫｕｎｉｔｚドメイン、（３）２〜３の露出されたループを有するＩｇ−様ｂ−サンドイッチ折り畳み（９４残基）を採用するが、しかし中心のジスルフィド架橋を欠いている、ヒトフィブロネクチンIII （１０Ｆｎ３）の１０番目の細胞外ドメインに基づくモノボディー又はアドネクチン、（４）リポカリン、すなわちヒト、昆虫及び多くの他の生物において豊富である、開放端で４つの構造的に可変のループにより、小リガンドのための結合部位を天然において形成する、多様なファミリーの８本鎖ｂ−バレルタンパク質（約１８０の残基）由来のアンチカリン、（５）典型的には、３個の反復ｂ−ターン、及び最終的には、より特有の折り畳み、例えばマルチマーＬＤＬＲ−Ａモジュールに基づく数個の他の結合タンパク質（Ａｖｉｍｅｒｓ又はシステインに富んでいるノッテインペプチド）から生じる硬い界面を提供する、ＤＡＲＰｉｎｓ、すなわち設計されたアンキリン反復ドメイン（１６６の残基）。
【０１３０】
操作された足場の多くの魅力的な性質の他に、それらは低分子量であるため、静脈内注射の後、速やかな排除が起こるのでその作用が妨げられる。本発明のさらなる主題は、腫瘍増殖の機構を妨害するために、操作されたポリペプチドの細胞内送達のためのデンドリマー及び操作されたポリペプチドの複合体である。好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、硫酸化デンドリマー及び操作されたポリペプチドの複合体であり、ここで前記ポリペプチドは、デンドリマーアフィボディ複合体、デンドリマークニッツ複合体、デンドリマーアンチカリン複合体、デンドリマーアフィリン複合体、デンドリマーモノボディー（アドネクチン）複合体、デンドリマーＤＡＲＰＩＮ複合体及びデンドリマーペプチド複合体である。特に好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、ピコモル範囲、及びＤＡＲＰｉｎｓのように高い安定性で治療標的に対して高い親和性を発揮する、デンドリマー及び操作されたタンパク質の複合体である。
【０１３１】
操作された足場ポリペプチドが合成され、そして同一の抗原、並びに類似するか又は異なった抗原に対する標的結合性を有する、二量体又は３以上のポリペプチド鎖の多量体として発現され得ることは当業者に知られている。これにより、血液中の循環半減期の上昇及び標的結合の強度の上昇が達成され得る。デンドリマー、及び二量体又は多量体の操作されたポリペプチドの複合体は、発明的であり、そして文献では知られていない。デンドリマー、及び２〜１００の反復ポリペプチド鎖から成る操作された足場の複合体が、デンドリマー及び単一の操作されたポリペプチドの複合体よりも強い増殖阻害活性を有することが、驚くべきことには観察された。従って、好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、デンドリマー、及び２〜２０の反復ポリペプチド鎖の複合体である。特に好ましい実施形態によれば、本発明の主題は、デンドリマー、及び２〜１０の反復ポリペプチドの複合体である。別の実施形態によれば、本発明の主題は、デンドリマー及び多重反復ポリペプチドの複合体であり、ここで前記ポリペプチドは、切断可能なリンカー分子、例えば酵素的に切断可能なアミノ酸配列により結合される。
【０１３２】
本発明の別の側面は、Dernedde et al. in PNAS, 2010, 107, 19679-84により記載のようにして決定され得る、Ｌ−セレクチンの分子結合阻害に関する。ここで、ポリマー性の規定されないポリグリセロール硫酸塩（Ｍｎ〜１０ｋＤａ）は、例えば平均６１個の硫酸基を有するポリマーを用いると、Ｌ−セレクチン結合阻害が８ｎＭのＩＣ50となり高いことが示される。これに比較して、４８個の硫酸基を有する、本発明の規定された硫酸化デンドリマーでは、値が驚くべきことに高く（〜３００ｎＭ）、このことは、Ｌ−セレクチン結合阻害が非常に弱いことを示す。従って、本発明の主題は、PNAS, 2010, 107, 19679-84に従って測定される場合、ＩＣ50が＞３０ｎＭ、好ましくは＞１００ｎＭ、より好ましくは＞３００ｎＭ、最も好ましくは＞５００ｎＭのＬ−セレクチン結合阻害の値を示す、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される化合物の提供である。
【０１３３】
本発明のさらに好ましい実施形態は、以下の連続番号の文により反映される：
１．式：Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］m
[式中、
Ｅは、治療又は診断エフェクター分子であり、
Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）nは、ｎ個の硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+を担持するデンドリマーＤであり、ここで前記硫酸基の数であるｎは６〜９６から選択され、
Ｍは、アニオン性硫酸基に対するカチオン性無機又は有機対イオンであり、
Ｌは、Ｄ及びＥ間のリンカー又はスペーサーであり、
Ｇは、ＬとＥとの間に結合を形成する結合官能基であり、そして
ｍは、１〜２０の整数である］で表される、複合体。
【０１３４】
２．前記複合体中の各デンドリマーＤが、同じ分子量を有する、実施形態１の複合体。
【０１３５】
３．前記硫酸基の数ｎが、各デンドリマーＤについて同じである、実施形態１又は２の複合体。
【０１３６】
４．前記デンドリマーＤを構築するモノマーの反復単位が、１，２−置換グリセロール、１，３−置換グリセロール、ペンタエリトリトール、グルコース、マンノース、ガラクトース、リシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（プロピオン酸）アミノメタン、１，１’−ビス（ヒドロキシメチル）−プロピオン酸、コハク酸、グルタル酸、マレイン酸、グリコール酸、ジグリコール酸、アジピン酸、乳酸、クエン酸、プロピオン酸（２−アミノエチル）アミド、プロピレンイミン、エチレンイミン、プロピレンオキシド、及びエチレンオキシドから成る群から選択される、実施形態１〜３のいずれか１つの複合体。
【０１３７】
５．前記デンドリマーＤ中の前記モノマーの結合が、エーテル、チオエーテル、カルボン酸エステル、スルホニルエステル、スルホンアミド、カルボキシルアミド、アミン、カルバメート、チオカルバメート、尿素、チオウレア、ヒドラゾン、イミン、ジスルフィド、ホスフェート、ホスホネート、トリアゾール、アセタール、及びケタールから選択される官能基に基づかれる、実施形態１〜４のいずれか１つの複合体。
【０１３８】
６．Ｄが、１，２−ジスルファトアルキル、１，３−ジスルファトアルキル、１，２，４−トリスルファト−３−アルキル、Ｎ、Ｎ’−ジ（１−スルファトアルキル）アミン、トリス（スルファトメチル）メチル、及び１，２，３，４，５−ペンタスルファトアルキルから選択される末端基を含む、実施形態１〜５のいずれか１つの複合体。
【０１３９】
７．Ｌが、１又は２以上のメチレン基がＯ、Ｓ、ＮＨ、ＮＨ−Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ、Ｃ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ）2、Ｓ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ2）Ｏ、Ｓ−Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ、Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）Ｏ、Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）Ｏ、アリーレン、エテニレン又はエチニレン、及びトリアゾリレン（ここで任意の水素原子がメチル、エチル又はヒドロキシメチルにより独立して選択されていてもよい）からなる群から選択される単位により独立して置換されていてもよい、脂肪族環状、分岐鎖状又は直鎖状単位からなる群から選択されるＣ4-100−アルキル基である、実施形態１の複合体。
【０１４０】
８．Ｅが、治療又は診断エフェクター分子である、実施形態１の複合体。
【０１４１】
９．前記エフェクター分子が、小分子、ペプチド、タンパク質、グリカン及び核酸から成る群より選択される、実施形態８の複合体。
【０１４２】
１０．前記エフェクター分子が、増殖、アポトーシス、結合組織材料（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン）の合成、免疫機能、セネッセンス又は免疫防御の細胞内機構を妨げることができる物質を含む治療エフェクター分子である、実施形態８又は９の複合体。
【０１４３】
１１．前記小分子が、細胞増殖抑制剤、及びペプチド又はペプチド模倣構造体（天然又は非天然構造の修飾を有する環状又は開鎖ペプチドを含む）からなる群から選択される、実施形態９の複合体。
【０１４４】
１２．前記タンパク質が、球状タンパク質、糖タンパク質、毒素、酵素、抗体、抗体フラグメント、操作された抗体及びタンパク質構造体（単一ドメイン抗体（sdAb）、単鎖Ｆｖ抗体（scFv）、単鎖Ｆｖ−Ｆｃ抗体（scFv-Fc）を含む）からなる群より選択される、実施形態９の複合体。
【０１４５】
１３．Ｅが、腫瘍細胞の増殖及びアポトーシスに関与する分子に対して向けられる、実施形態８〜１２のいずれかの複合体。
【０１４６】
１４．Ｇが、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＨ−Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ、Ｃ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ）2、Ｓ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ2）Ｏ、Ｓ−Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ、Ｃ ＝ Ｎ−ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）Ｏ、Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）Ｏ、アリーレン、エテニレン、エチニレン、及びトリアゾリレンからなる群より選択される、ＥとＬとの間に共有結合を形成する結合官能基である、実施形態１の複合体。
【０１４７】
１５．（ｉ）癌、炎症、自己免疫疾患、代謝性疾患及び線維症を包含する群より選択される疾患の治療における、又は（ｉｉ）抗増殖性、増殖促進性、抗アポトーシス性、アポトーシス促進性、抗線維性、線維化促進性、抗脂質生成性、抗糖尿病性、免疫刺激性及び抗加齢性の治療における使用のための、実施形態８〜１４のいずれかの複合体。
【０１４８】
１６．実施形態１〜１５のいずれかの複合体を含む医薬組成物．
【０１４９】
１７．ｍが１である、実施形態１の複合体。
【０１５０】
１８．前記デンドリマーＤが、下記群：
【０１５１】
【化３】
2020073643.tif 000005
【０１５２】
から選択された中心デンドリマーコア単位（ＣＤＣＵ）を含む、実施形態１〜１５のいずれかの複合体。
【０１５３】
１９．前記デンドリマーが、前記中心デンドリマーコア単位（ＣＤＣＵ）及びモノマーＲＵｘ（ｘは１〜pにわたる）の反復単位のｍ個のシェルからなる構造を有し、ここで各シェルにおいて、反復単位は同一であり、そしてシェルＲＵ１〜ＲＵｐの反復単位は、１，２−置換グリセロール、１，３−置換グリセロール、ペンタエリトリトール、グルコース、マンノース、ガラクトース、リシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリ（プロピオン酸）アミノメタン、１，１’-ビス（ヒドロキシメチル）−プロピオン酸、コハク酸、グルタル酸、マレイン酸、グリコール酸、ジグリコール酸、アジピン酸、乳酸、クエン酸、プロピオン酸（２−アミノエチル）アミド、プロピレンイミン、エチレンイミン、プロピレンオキサイド、エチレンオキサイド、特に１，２−置換グリセロール、１，３−置換グリセロールプロピレンオキサイド及びエチレンオキシドから独立して選択され、そしてシェルｘ当たりの反復単位の数は、シェル（ｘ−１）における遊離官能基の数と同一であり、そしてシェルＲＵｐのすべての遊離官能基は硫酸化される、実施形態４の複合体。
【０１５４】
２０．前記反復単位ＲＵｐは、すべてのシェルにおいて同一である、実施形態１９の複合体。
【０１５５】
２１．Ｅが、標的細胞内、好ましくは標的細胞の細胞ゾル内に局在化される標的分子に対して向けられ、特に前記標的細胞は腫瘍細胞である、実施形態１〜１５のいずれかの複合体。
【０１５６】
２２．前記標的分子が、Ｆｏｘ０１、ＨＤＡＣ、 ＤＰ−１、 Ｅ２Ｆ、 ＡＢＬ、 ＡＭＰＫ、 ＢＲＫ、 ＢＲＳＫ１、 ＢＲＳＫ２、 ＢＴＫ、 ＣＡＭＫＫ１、 ＣＡＭＫＫα、 ＣＡＭＫＫ β、 Ｒｂ、 Ｓｕｖ３９Ｈ１、 ＳＣＦ、 ｐ１９ＩＮＫ４Ｄ、 ＧＳＫ−３、 ｐ１８ ＩＮＫ４、 ｍｙｃ、 サイクリンＥ、 ＣＤＫ２、 ＣＤＫ９、 ＣＤＧ４/６、サイクリン Ｄ、 ｐｌ６ ＩＮＫ４Ａ、 ｃｄｃ２５Ａ、 ＢＭＩ１、 ＳＣＦ、 Ａｋｔ、 ＣＨＫｌ/２、 ＣＫ１δ、 ＣＫ１γ、 ＣＫ２、 ＣＬＫ２、 ＣＳＫ、 ＤＤＲ２、 ＤＹＲＫ１Ａ/２/３、 ＥＦ２Ｋ、 ＥＰＨ−Ａ２/Ａ４/Ｂ１/Ｂ２/Ｂ３/Ｂ４、 ＥＩＦ２ＡＫ３、 Ｓｍａｄ２、 Ｓｍａｄ３、 Ｓｍａｄ４、 Ｓｍａｄ７、 ｐ５３、 ｐ２１ Ｃｉｐｌ、 ＰＡＸ、 Ｆｙｎ、 ＣＡＳ、 Ｃ３Ｇ、 ＳＯＳ、 Ｔａｌ、 Ｒａｐｔｏｒ、 ＲＡＣＫ−１、 ＣＲＫ、 Ｒａｐｌ、 Ｒａｃ、 ＫＲａｓ、 ＮＲａｓ、 ＨＲａｓ、 ＧＲＢ２、ＦＡＫ、 ＰＩ３Ｋ、 ｓｐｒｅｄ、 Ｓｐｒｙ、 ｍＴＯＲ、 ＭＰＫ、 ＬＫＢｌ、 ＰＡＫ １/２/４/５/６、 ＰＤＧＦＲＡ、 ＰＹＫ２、 Ｓｒｃ、 ＳＲＰＫ１、 ＰＬＣ、 ＰＫＣ、 ｃ−Ｒａｆ、 ＰＫＡ、 ＰＫＢα/β、 ＰＫＣ α/γ/ζ、 ＰＫＤ、 ＰＬＫｌ、 ＰＲＡＫ、 ＰＲＫ２、 ＲＩＰＫ２、 Ｂ−Ｒａｆ、 ＷＡＶＥ−２、 ＴＳＣ２、 ＤＡＰＫｌ、 ＢＡＤ、 ＩＭＰ、 Ｃ−ＴＡＫ１、 ＴＡＫｌ、 ＴＡＯｌ、 ＴＢＫ１、 ＴＥＳＫ１、 ＴＧＦＢＲ１、 ＴＩＥ２、 ＴＬＫ１、 ＴｒｋＡ、 ＴＳＳＫ１、 ＴＴＢＫ１/２、 ＴＴＫ、 Ｔｐｌ２/ｃｏｔｌ、 ＭＥＫ１、 ＭＥＫ２、 ＰＬＤ１、 Ｅｒｋｌ、 Ｅｒｋ２、 Ｅｒｋ５、 Ｅｒｋ８、 ｐ９０ＲＳＫ、 ＰＥＡ−１５、 ＳＲＦ、 ｐ２７ ＫＩＰ１、 ＴＩＦ ｌａ、 ＨＭＧＮ１、 ＥＲ８１、 ＭＫＰ−３、 ｃ−Ｆｏｓ、ＦＧＦ−Ｒ１、 ＧＣＫ、 ＧＳＫ３ β、 ＨＥＲ４、 ＨＩＰＫ１/２/３/、 ＩＧＦ−１Ｒ、 ｃｄｃ２５、 ＵＢＦ、 ＬＡＭＴＯＲ２、 Ｓｔａｔｌ、 Ｓｔａｔ３、ＣＲＥＢ、 ＪＡＫ、 Ｓｒｃ、 ＰＴＥＮ、 ＮＦ−κＢ、 ＨＥＣＴＨ９、 Ｂａｘ、 ＨＳＰ７０、 ＨＳＰ９０、 Ａｐａｆ−１、 Ｃｙｔｏ ｃ、 ＢＣＬ−２、 Ｂｃｌ−ｘＬ、 Ｓｍａｃ、 ＸＩＡＰ、カスパーゼ‐９、カスパーゼ−３、カスパーゼ−６、カスパーゼ‐７、 ＣＤＣ３７、 ＴＡＢ、 ＩＫＫ、 ＴＲＡＤＤ、 ＴＲＡＦ２、 ＲＩＰ１、 ＦＬＩＰ、 ＴＡＫｌ、 ＪＮＫｌ/２/３、 Ｌｃｋ、 Ａ−Ｒａｆ、 Ｂ−Ｒａｆ、 Ｃ−Ｒａｆ、 ＭＯＳ、 ＭＬＫｌ/３、 ＭＮＫｌ/２、 ＭＳＫｌ、 ＭＳＴ２/３/４、 ＭＰＳＫ１、 ＭＥＫＫｌ、 ＭＥＫＫ４、 ＭＥＬ、 ＡＳＫ１、 ＭＩＮＫ１ 、 ＭＫＫ１/２/３/４/６/７、 ＮＥＫ２ａ/６/７、 ＮＵＡＫ１、 ＯＳＲ１、 ＳＡＰＫ、 ＳＴＫ３３、 Ｓｙｋ、 Ｌｙｎ、 ＰＤＫ１、 ＰＨＫ、 ＰＩＭ１/２/３、 Ａｔａｘｉｎ−１、 ｍＴＯＲＣｌ、 ＭＤＭ２、 ｐ２１ Ｗａｆｌ 、サイクリンＤｌ、 Ｌａｍｉｎ Ａ、 Ｔｐｌ２、 Ｍｙｃ、 カテニン、 Ｗｎｔ、 ＩＫＫ−β、 ＩＫＫ−γ、 ＩＫＫ−α、 ＩＫＫ−ε、 ＥＬＫ、 ｐ６５ＲｅｌＡ、 ＩＲＡＫ１、 ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４、 ＩＲＲ、 ＦＡＤＤ、 ＴＲＡＦ６、 ＴＲＡＦ３、 ＭＫＫ３、 ＭＫＫ６、 ＲＯＣＫ２、 ＲＳＫ１/２、 ＳＧＫ １、ＳｍＭＬＣＫ、 ＳＩＫ２/３、 ＵＬＫ１/２、 ＶＥＧＦＲ１、 ＷＮＫｌ 、 ＹＥＳ１、 ＺＡＰ７０、 ＭＡＰ４Ｋ３、 ＭＡＰ４Ｋ５、 ＭＡＰ���ｌｂ、 ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２/Ｋ３、 ｐ３８ α/β/δ/γ ＭＡＰＫ、 Ａｕｒｏｒａ Ａ、 Ａｕｒｏｒａ Ｂ、 Ａｕｒｏｒａ Ｃ、 ＭＣＡＫ、 Ｃｌｉｐ、 ＭＡＰＫＡＰＫ、 ＦＡＫ、 ＭＡＲＫ １/２/３/４、 Ｍｕｃｌ、 ＳＨＣ、 ＣＸＣＲ４、 Ｇａｐから選択される、実施形態２１の複合体。
【０１５７】
定義：
科学的には、複合体は、複数の化合物の連結により形成される化合物を言及する。本発明の記載及び請求項において使用される場合、用語「複合体（conjugate）」とは、式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］m、特にエフェクター分子Ｅ、結合官能基Ｇ、リンカーＬ、デンドリマーＤ、及びｎ個の硫酸基（ＯＳＯ3-Ｍ+）（ここで、Ｍは、カチオン性無機又は有機対イオンである）の要素を有する化合物が連結した群を意味し、ここでｍは１〜２０の整数である。
【０１５８】
用語「デンドリマー（dendrimer）」Ｄは、本明細書において使用される場合、一般的に、反復して分枝状の分子を示し、ここでデンドリマーは典型的には、コアの周りで対称であり、そしてしばしば、球状の三次元形態をとる。デンドリマー分子は、構造的な完全性により特徴づけられる。デンドリマーは、単分散性であり、そして通常、高い対称性の球状化合物である。デンドリマー分子の分野は、低分子量種及び高分子量種に大別され得る。最初のカテゴリーは、デンドリマー及びデンドロンを包含し、そして後者は、樹枝状ポリマー（dendronized polymers）、超分枝ポリマー（hyperbranched polymers）、及びポリマーブラシ（polymer brush）を包含する。
【０１５９】
デンドリマーの性質は、分子表面上の官能基により支配されるが、しかしながら、内部に機能性を有するデンドリマーの例が存在する。機能性分子のデンドリマー封入は、活性部位の単離を可能にし、これは、生体分子における活性部位の構造を模倣する構造を有する。また、ほとんどのポリマーとは異なって、荷電された種又は他の基を有するそれらの外側シェルを官能化することにより、デンドリマーを水溶性にすることが可能である。デンドリマーの他の制御可能な特性は、毒性、結晶性、テクトデンドリマー形成及びキラリティーを包含する。
【０１６０】
Ｄは、その分子量に関して構造的に規定される、デンドリマー状構造又は樹枝状構造であり、単一の分子量を有する化学構造でもある。
【０１６１】
Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）nとは、デンドリマーＤが、ｎ個の硫酸基（ＯＳＯ3-Ｍ+）を担持して、高度に硫酸化されていることを意味する。硫酸基は好ましくは、硫酸化工程により、硫酸基（硫酸のモノエステル）に転換されるヒドロキシル基から誘導される（また、実施例も参照のこと）。従って、デンドリマーは、ＯＨ基由来の一定数の硫酸基を含む。それらのＯＨ基は好ましくは、デンドリマーの表面又は外側シェル上に位置し、そしてデンドリマーポリオール構造を構成するために使用される構築ブロックの一部である。
【０１６２】
デンドリマーは、１，２−置換グリセロール、１，３−置換グリセロール、ペンタエリトリトール、リシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンのような構造を含むデンドリマー構造を構築するためのモノマーの反復単位からなる。また、アルキル−カルボン酸−含有又はアルキル−ビスカルボン酸構造、例えばトリス（プロピオン酸）アミノメタン、1，1’−ビス（ヒドロキシメチル）−プロピオン酸、コハク酸、グルタル酸、マレイン酸、グリコール酸、ジグリコール酸、アジピン酸、乳酸、クエン酸、プロピオン酸（２−アミノエチル）アミド、並びにアルキルアミノ構造、例えばプロピレンイミン、エチレンイミン、及びアミノ酸構築ブロックは、本実施形態の一部である。さらに、単糖構造、例えばグルコース、マンノース、ガラクトースは、デンドリマーにおける可能な反復単位である。代表的だが非限定的な例を、図１〜７に示す。好ましいデンドリマーは、１，２−置換グリセロール及び／又は１，３−置換グリセロールを含む。より好ましいデンドリマーは、任意には、アルキルカルボン酸単位を組合して、１，２−置換グリセロール及び／又は、１，３−置換グリセロールを含み、それらは、好ましくは、官能基エステル、エーテル及びアミドから選択された結合を可能にする。
【０１６３】
デンドリマーの合成は、当業者に公知である。デンドリマーの一般構造は、収束性合成経路又は発散性合成経路により構築され得る（Tomalia、 交際公開第２００６/１ １５５４７号; Medina et al., Chem. Rev. 2009, 109, 3141 ; Crespo et al., Chem. Rev. 2005, 105, 1663）。合成の好ましい実施形態は、合成経路であり、ここでコア単位（上記のような）は、さらなるリンカー単位による延長のためのリンカー単位又は官能基が確立されるように修飾される。次に、デンドリマーは、コア単位から出発して、さらなるシェルを付加することにより発散性に構築される。従って、コア単位に結合されたリンカーは、焦点として中心位置にある。収束性合成経路との組み合わせに続いて、コア単位又はシェルに、発散性又は収束性経路の何れかにより、前もって構築されている、さらなるデンドリマー単位の付加を伴い、それにより、さらなるシェルを創造する。また、次に、焦点リンカー結合を伴っての収束合成されたデンドリマーが、さらなるシェルの発散性付加によりさらに修飾され得る。この実施形態は、合成の実施例（１〜１１）により支持される。
【０１６４】
デンドリマー中の結合は、エーテル、チオエーテル、カルボン酸エステル、スルホニルエステル、スルホンアミド、アミン、カルバメート、チオカルバメート、尿素、チオ尿素、ヒドラゾン、イミン、ジスルフィド、ホスフェート、ホスホネート、トリアゾールから選択された官能基に基づかれる。従って、デンドリマーは、本明細書に記載される例（図１〜７）に制限されるものではないが、様々なモノマー単位に基づく反復サブユニット又はシェルから成る。好ましいデンドリマーは、任意には、アルキルカルボン酸単位と組合して、１，２−置換グリセロール及び／又は１，３−置換グリセロールを含み、それらは好ましくは、官能基エステル、エーテル及びアミドから選択された結合を可能にする。
【０１６５】
樹状の分枝構造として一般的に理解されている、用語デンドリマーが、実施形態を通して使用される。用語デンドロンは通常、焦点と呼ばれる単一のアドレス可能な基を有するデンドリマーを記載するが、しかしその用語は典型的には、交換可能的に使用される。
【０１６６】
デンドリマーＤは、リンカー単位Ｌがそれに共有結合される様式で構成される。リンカー単位Ｌは、焦点とも呼ばれる、デンドリマーの中心位置に共有結合されている構造が好ましい。代表的だが非限定的な例を図１〜７に示し、ここで「星印」はデンドリマーの焦点へのリンカーＬの結合を示している。
【０１６７】
本発明の「リンカー（linker）」又は「スペーサー（spacer）」は、第１分子に対して１つの共有結合を、及び第２分子に対して別の共有結合を形成することにより、２つの化学分子を架橋する化学構造を示す。リンカーは通常、同一であっても（ホモ二官能性リンカー）、又は異なっていても良い（ヘテロ二官能性リンカー）、２つの反応性基を含む。本発明においては、硫酸化デンドリマーＤは、第１分子であり、そしてリンカーがデンドリマーにおける焦点と共有結合を形成する。治療エフェクター分子Ｅは、構造Ｇにより形成される共有結合を有する第２分子である。用語「スペーサー」はしばしば、同様に使用され、この構造では、２つの結合された分子間の一定距離（「空間」）が生成されることを記載する意図がある。
【０１６８】
本発明によれば、「複合体（conjugate）」とは、リンカー又はスペーサーによりお互い共有結合され、それにより複合体を形成する、複数の異なった型の分子から成る分子である。
【０１６９】
デンドリマーＤの化学構造における用語「末端基（terminal group）」とは、さらなるモノマー単位が結合されないモノマーである、外側シェルのモノマー単位を記載する。分子の化学的性質のほとんどは、末端基のタイプに依存する。分子の物理的性質、例えば溶解性及び粘性はまた、末端基によっても影響される。従って、本発明の範囲内の末端基は、ヒドロキシル基由来の硫酸基を提供する。それらの硫酸基は、上記に概略されたように、エフェクター分子を有する本発明のデンドリマー複合体の生物学的性質を決定する。
【０１７０】
対イオンＭ+は、有機及び無機カチオンを含む。有機カチオンは、リシン、メグルミン、ＴＲＩＳ、グリシン、又はアミノ酸由来の他のアミンを含む。無機カチオンは、カリウム、ナトリウム、リチウム、又はそれらの混合物を含む。ＳＯ3-Ｎａ+基をもたらすナトリウムが好ましい。
【０１７１】
用語「抗体（antibody）」とは、当業界において良く知られている。本明細書において使用される場合、それは、免疫グロブリン又はその任意の機能的フラグメントを示す。それは、抗原結合部位を有する任意のポリペプチドを包含する。それは、モノクローナル、ポリクローナル、単一特異性、多特異性、非特異的、ヒト化、ヒト、単鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、突然変異、移植、及びインビトロで生成された抗体を含むが、但しそれらだけには限定されない。用語「抗体」は、抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、及び抗原結合機能を保持する任意の他の抗体フラグメントを包含する。典型的には、そのようなフラグメントは、抗原結合ドメインを含む。上記に定義されるような用語「抗体」は好ましくは、本発明に従って、少なくとも１０-7〜１０-10Ｍの結合定数により特徴づけられる。さらに、「抗体」とは、抗原刺激に対する反応として生成され、そしてその刺激を生成する抗原を特異的に認識し、そして結合するタンパク質である。
【０１７２】
本明細書において使用される場合、用語「抗体模倣体（antibody mimetic）」とは、抗体のように、抗原を特異的に結合するが、しかし抗体には構造的に関連しない有機化合物である。それらは、通常、約３〜２０ｋＤａのｍｏｌ質量を有する人工ペプチド又はタンパク質である。核酸及び小分子は時々、抗体模倣体と同様に見なされるが、しかし人工抗体、抗体フラグメント及びそれらから構成される融合タンパク質としては見なされない。いくつかのタイプは、抗体様β−シート構造を有する。抗体に対する一般的な利点は、良好な溶解性、組織浸透、熱及び酵素に対する安定性、及び比較的低い製造費用である。抗体模倣体は、治療及び診断剤として開発されている。上記で使用されるような用語「足場（scaffold）」とは、用語「抗体模倣体」に属する。本明細書において使用される場合、用語「エフェクター（effector）」とは、治療又は診断エフェクター分子として作用することができるエフェクター分子を言及する。治療エフェクター分子は通常、タンパク質に対して選択的に結合し、そしてその生物学的活性を制御する分子である。このように、治療エフェクター分子は、酵素活性、遺伝子発現又は細胞シグナル伝達を高めるか、又は低めることができるリガンドとして作用する。エフェクター分子はまた、いくつかのｍＲＮＡ分子の活性を直接的に調節することができる（リボスイッチ）。本発明においては、上記のようなタンパク質及び抗体を包含するペプチドは、特に細胞シグナルトランスダクションカスケードにおいて、治療エフェクター分子として機能すると思われる。
【０１７３】
用語、診断エフェクター分子とは、上記生物学的相互作用に基づいて、標的細胞におけるこの分子の存在の定量化又はモニターリングを可能にする検出可能な又は記録可能なシグナルを提供する分子を言及する。このシグナルは、分析的、化学的又は物理的技法、例えば蛍光、放射能放射、又は磁気緩和の検出を含む、ＥＬＩＳＡ、イムノアッセイ、診断イメージングにより測定され得る。特に、エフェクター分子は、蛍光色素、放射性同位体、常磁性金属から選択された検出可能分子により標識され得る。
【０１７４】
用語「トランスポータータンパク質（transport protein）」とは、膜貫通ポンプ、トランスポータータンパク質、エスコートタンパク質、酸トランスポータータンパク質、カチオントランスポータータンパク質又はアニオントランスポータータンパク質を包含する様々な用語を包含する。従って、それは生物内の他の物質を移動するタンパク質である。異なった種類のトランスポータータンパ質が、それらの機能に従って知られている。それらは、生物学的膜を通しての、イオン、小分子、又は高分子、例えば別のタンパク質又はウィルスの移動に関与するキャリアタンパク質を包含する。キャリアタンパク質は、膜タンパク質であり、物質輸送される膜内にそれらが存在することを意味する。それらは受動的又は能動的輸送を助け、キャリア媒介輸送とも呼ばれ、膜貫通溶質担体タンパク質とも呼ばれる。
【実施例】
【０１７５】
次の実施例は、本発明の遺伝的に又は特異的に記載された反応体及び／又は操作条件を置換することにより、類似する成功を伴って、反復され得る。当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認し、そして例示として本発明の実施例を理解すると考えられる。従って、下記の実施例は、本発明の主題を制限するものではない。
【０１７６】
実施例１：２４個の硫酸基及びアミノデシルリンカーを有するポリグリセロールデンドリマー系（化合物ｄ０１）の合成。
【０１７７】
実施例１ａ：１０−アジドデシル−トリアリルペンタエリトリトールの合成
【０１７８】
【化４】
2020073643.tif 000006
【０１７９】
５０ｍｌの無水ＴＨＦ中、トリアリルペンタエリトリトール（５ｇ、１９．５mmol）の溶液に、固形ＮａＨ（３．９ｇ、９８mmol、鉱油中、６０％の分散液）を少しずつ添加する。その混合物を、４０℃で３時間、攪拌し、続いて、０．３ｇのヨウ化カリウム及び２０ｍｌのＴＨＦ中、１、１０−ジブロモデカン（２９．３ｇ、９８mmol）の溶液を添加した。還流下での２４時間後、その混合物を水により処理し、蒸発乾燥し、そして残渣を水／ジクロロメタンに溶解する。生成物を、ジクロロメタン中に抽出し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、そしてシリカクロマトグラフィー（シクロヘキサン／酢酸エチル）により精製し、８．１ｇの中間体１０−プロモデシル−トリアリルペンタエリトリトールを得た。８ｇ（１６．８mmol）の前記中間体を、ＤＭＦ（５０ｍｌ）の溶解し、そしてアジ化ナトリウム（５．６ｇ、８４mmol）を添加する。その混合物を、８０℃で２４時間、攪拌し、続いて濾過し、そして溶媒を蒸発する。クロマトグラフィー精製（シクロヘキサン、次にジクロロメタン：メタノール  ９５：５〜１：１）により、４．０ｇ（５５％）の生成物を、わずかに黄色の油状物として得た。
【０１８０】
実施例１ｂ：１０−アジドデシル−トリス（２，３−ジヒドロキシプロピル）ペンタエリトリトールの合成
【０１８１】
【化５】
2020073643.tif 000007
【０１８２】
反応を、Zieringer et al., ChemPhysChem, 2010, 1, 2617に従って実施する。１０−アジドデシル−トリアリルペンタエリトリトール（４．０ｇ、９．１mmol）を、６−ブタノール／水（１：１）の混合物３００ｍｌに溶解する。この混合物に、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド二水和物（９．１ｇ、８２．４mmol）、クエン酸（１０．０ｇ、４７．７mmol）及びオスミウム酸カリウム二水和物（０．４ｇ、１．１mmol）を添加し、続いて室温で２４時間、攪拌する。イオン交換樹脂Lewatit K6267 (70g)を添加し、そしてその混合物を、さらに１時間、攪拌する。濾過及びｔ−ブタノール／水（１：１）による洗浄の後、その溶液を蒸発乾燥し、そして残渣を、ＭＰＬＣ系中、水／メタノールを用いて、クロマトグラフィー（ＲＰ  Ｃ−１８  Licroprep）により精製する。無色の粘性油状物としての収量３．５ｇ（７１％）。
【０１８３】
実施例１ｃ：１０−アジドデシル−トリス（２，３−ジヒドロキシプロピル）ペンタエリトリトールからのデンドリマー生成
デンドリマーを、ＮａＨ／アリルブロミドによる交互アリル化及びジヒドロキシル化の４反応工程下で、公開された方法（Zieringer et al., Chem. Phys. Chem. 2010, 1 1, 2617 及びWyszogrodska et al, Eur. J. Org. Chem. 2008, 53）により、２４個のヒドロキシ基を用いて、グリセロールモノマー（１,２−置換パターン）から成るデンドロンから構築する。生成物は、１０−アジドデシル−グリセロール（ＯＨ24）（分子量１８７３ｇ／ｍｏｌ）であり、これを次の工程で硫酸化する。
【０１８４】
実施例１ｄ：１０−アジドデシルデンドロン（ＯＨ）24の硫酸化
１００ｍｇ（０．０５３mmol）の１０−アジドデシルデンドロン（ＯＨ24）を、０．５ｍｌの無水ＤＭＦに溶解し、そして６０℃に加熱する。攪拌下で、ＳＯ3−ピリジン複合体（２４５ｍｇ、１．５４mmol）を添加し、続いて６０℃で５時間、及び室温で１８時間、攪拌する。その反応混合物を、水により急冷し、１ｍＭのＮａＯＨを用いてｐＨ９−１０に調節し、濾過し、そして水による限外濾過（ＭＷＣＯ  １０００）に供する。生成物１０−アジドデシルデンドロン（ＯＳＯ3-Ｎａ+）24（１５０ｍｇ、６５％）を、凍結乾燥の後、得る。元素分析は、完全な硫酸化を示した。Ｎ ０．８６３、Ｃ ２１．７０、Ｓ １７．８３、 Ｈ ３．０４２、分子量 ４３２２ｇ/ｍｏｌ。
【０１８５】
実施例１ｅ：１０−アミノデシルデンドロン（ＯＳＯ3-Ｎａ+）24（化合物ｄ０１）の合成
【０１８６】
【化６】
2020073643.tif 000008
【０１８７】
水／メタノール（１：１）（２ｍｌ）中、１０−アジドデシルデンドロン（ＯＳＯ3-Ｎａ+）24（１５０ｍｇ、０．０３５mmol）の溶液に、ＴＣＥＰ（６０ｍｇ、０．２mmol）を添加し、そしてその混合物を、室温で１８時間、攪拌する。蒸発の後、残渣を、２０％ＮａＣｌ及び蒸留水に対して透析し（標準的セルロース、ＭＷＣＯ  １０００）、凍結乾燥の後、１０７ｍｇ（７２％）の化合物ｄ０１（分子量４２９６ｇ／ｍｏｌ）を得る。
【０１８８】
この実施例はまた、デカンを超えてアルカン置換基、例えば１，６−ジブロモヘキサン、１，８−ジブロモオクタン、１，１１−ジブロモウンデカン、又は一般式Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mにおけるリンカーＬの記載に従っての不飽和、環状又は置換部分を用いる、さらなるジブロモアルカンの使用にも拡張され得る。さらに、リンカーは、ＰＥＧ−アルカン部分、例えばアジド−ＰＥＧ−臭化／ヨウ化アルキル（又はメシレート、トシレート）、例えばアジド−ＰＥＧ3-10−（ＣＨ2）2-18−Ｂｒにより導入され得る。
【０１８９】
実施例２：二官能性ＰＥＧ−ＣＯＯＨ  ＮＨＳエステルとの反応による、ｄ０１からの生物結合のための反応性基、及び２４個の硫酸基を有するポリグリセロールデンドリマー系の合成。
【０１９０】
実施例２ａ：マレイミド−ＰＥＧ（４）−ＣＯＯＨ  ＮＨＳエステルとの反応によるｄ０１からのマレイミド反応性基及び２４個の硫酸基を有するポリグリセロールデンドリマー系（化合物ｄ０２）の合成。
【０１９１】
【化７】
2020073643.tif 000009
【０１９２】
１０ｍｇ（２．３３μｍｏｌ）の化合物ｄ０１を、１ｍｌのＤＭＦ／水（９：１）に溶解し、そしてマレイミド−ＰＥＧ（４）−ＣＯＯＨ  ＮＨＳエステル（３．０ｍｇ、５．８３μｍｏｌ）を添加し、続いて４０℃で４８時間、振盪する。生成物（化合物ｄ０２）を、ジクロロメタンの添加、遠心分離、及びジクロロメタンによる反復洗浄により沈殿し、続いて、蒸留水から凍結乾燥した。カップリングの程度を、マレイミドシグナル（２Ｈ、ｓ）及び脂肪族スペーサー（多重＜１．５、１６Ｈ）の比率に基づいて、Ｈ−ＮＭＲ（７００ＭＨｚ）により決定し、ｄ０２（ＭＷ４６９４ｇ／ｍｏｌ）についての８８％のカップリング度を得る。
【０１９３】
実施例２ｂ−ｈ：
２４個の硫酸基及びさらなる反応性リンカーを有するポリグリセロールデンドリマーシステムの合成を、アジド、プロパルギル、シクロオクチニル、ピリジニルジスルフィド、チオアセチル又はマレイミド基を含む、異なった二官能性ＰＥＧ−ＣＯＯＨ  ＮＨＳエステルを用いることにより達成する。化合物ｄ０１との反応を、実施例２ａに従って実施する（収率７０−８５％）。表２は、生成物ｄ０３〜ｄ０９を要約する。
【０１９４】
実施例２ｉ：生物結合のための、２４個の硫酸基及びイソチオシアネート基を有するポリグリセロールデンドリマー系（化合物ｄ１０）の合成。
他方では、アミノ基を、イソチオシアネート基に直接、転換することができる。１０ｍｇ（２．３３μｍｏｌ）の化合物ｄ０１を、０．５ｍｌのＤＭＦに溶解し、そしてジ（２−ピリジル）−チオノカーボネート（１．１ｍｇ、４．６６μｍｏｌ）を添加し、続いて、４０℃で６時間、振盪する。生成物ｄ１０を、実施例２ａに記載のようにして、単離する。転換を、ＦＴＩＲ（２１００Ｃｍ-1）（ＭＷ４３３８ｇ／ｍｏｌ）によりモニターする。
【０１９５】
【表２】
2020073643.tif 000010
【０１９６】
上記のタイプｄ０１のデンドリマー系は、例示として理解されるべきであり、本明細書示す特定のｎ個の数として他のｎ個の数の適用に拡張可能であり、例えば、アリル化／ジヒドロキシル化を介してヒドロキシル基を倍増することにより、硫酸化の後、４８個の硫酸を与え、ｄ０３−ｄ１０に類似する化合物を得ることができる。
【０１９７】
実施例３：二官能性プロパルギル−ＰＥＧ−ＣＯＯＨリンカーとの反応により、実施例１ｄ（アジドリンカー）からの生物結合のための２４個の硫酸基及びＮＨＳエステル基を有するポリグリセロールデンドリマー系の合成。
【０１９８】
実施例３ａ：プロパルギル−ＰＥＧ（４）−カルボン酸−ｔ−ブチルエステルとのアジドデンドリマー（実施例１ｄ）のクリックカップリング。
水／ＤＭＦ（１：１）の混合物１ｍｌ中、１００ｍｇ（０．０２３mmol）のアジドデンドリマー（実施例１ｄ）の溶液に、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（５．７ｍｇ、０．０２３mmol）、アスコルビン酸（０．０３５mmol）及び（０．０５８mmol）プロパルギル−ＰＥＧ４−ＣＯＯtブチルエステル（Broadpharm Ltd., US）を添加し、そしてその混合物を８０℃で１８時間、攪拌する。凍結乾燥後に得られる残渣を、ジクロロメタン（５ｍｌ）、トリフルオロ酢酸（３ｍｌ）及び水（０．１ｍｌ）の混合物に懸濁し、４０℃で５時間、攪拌し、遊離カルボン酸基を得る。蒸発の後、残渣を、メタノールに懸濁し、そしてジエチルエーテル下で沈殿し、ジクロロメタンにより洗浄し、そして遠心分離により単離する。残渣を、ＮａＣｌ及び蒸留水に対して透析し（標準的セルロース、ＭＷＣＣ  １ｋＤａ）、凍結乾燥の後、８０ｍｇのカルボキシデンドリマー（ＭＷ４５８２ｇ／ｍｏｌ）を得る。
【０１９９】
実施例３ｂ：生物結合のための２４個の硫酸基及びＮＨＳ基を有するポリグリセロールデンドリマー系（化合物ｄ１１）の合成：
【０２００】
【化８】
2020073643.tif 000011
【０２０１】
２ｍｌのＤＭＦ中、８０ｍｇ（１７．５μｍｏｌ）のカルボキシデンドリマー（実施例３ａ）の溶液に、６μｌ（３５μｍｏｌ）のＤＩＰＥＡを添加し、続いて、１３ｍｇのＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′, Ｎ′−テトラメチル−ウランヘキサフルオロホスフェート（ＨＳＴＵ；３５μｍｏｌ）を添加する。室温での１８時間の攪拌の後、生成物を、ジクロロメタンによる沈殿により単離し（ＤＭＦ／ＣＨ2Ｃｌ2の反復サイクル）、そして真空下で乾燥し、８２ｍｇのＮＨＳエステル（化合物ｄ１１：ＭＷ４６７９ｇ／ｍol）を、非晶性固形物として得、これをさらに精製しないで使用する。
【０２０２】
タイプｄ１１のポリグリセロールデンドリマー系に関する本発明の範囲は、ＮＨＳエステル官能基がポリ硫酸化デンドリマーで合成できることを示すが、この実施例に制限されず、例えば、アリル化／ジヒドロキシル化を介してヒドロキシル基を倍増することにより、硫酸化の後、４８個の硫酸基を与え、他の数ｎ個の硫酸基、又は硫酸化デンドリマー系のＮＨＳエステルを合成するための他のアジド−アルキルカルボン酸誘導体を包含してもよい。
【０２０３】
実施例４：生物結合のための３２個の硫酸基及び反応性基を有するポリグリセロールデンドリマー系（化合物ｄ１２−ｄ１７）の合成。
実施例４ａ：アジドウンデシルリンカーによる、ポリグリセロールデンドロン[Ｇ３．０]−ＯＨ（Wyszogrodzka M. et al., Chemistry 2008, 14, 9202）に基づくポリグリセロールデンドリマーの修飾。
【０２０４】
２ｍｌの無水ＴＨＦ中、０．３ｇ（０．２１mmol）の[Ｇ３．０]−ＯＨ（１６個のＯＨ基、アセタール保護された）の溶液と、１,１０−ジプロモデカン及び続いて、実施例１ａに記載のように、ＮａＨ3とを反応せしめ、続いて、ＭｅＯＨ／ＨＣｌ中でアセタール基を切断し、そして水／メタノールを用いて、ＲＰ  Ｃ−１８クロマトグラフィー（Licroprep）により精製し、０．１５ｇ（５２％）の[Ｇ３．０]−Ｏ−（ＣＨ2）11−Ｎ3（ＭＷ１３５５ｇ／ｍｏｌ）を得る。
【０２０５】
実施例４ｂ：３２個の硫酸基を有するアミノウンデシル−デンドリマー系（化合物ｄ１２）を得るための、アリル化／ジヒドロキシル化、硫酸化及び還元を通してアジドデシルリンカーによるポリグリセロールデンドリマー（実施例４ａ）の形成。
【０２０６】
【化９】
2020073643.tif 000012
【０２０７】
合成を、実施例１ｄ−ｅに記載のようにして達成し、１５５ｍｇの生成物ｄ１２を、無色の非晶性固形物（ＭＷ５７２１ｇ／ｍｏｌ）として得る。
【０２０８】
実施例４ｃ−ｈ：
２４個の硫酸基及びさらに、反応性リンカーを有するポリグリセロールデンドリマーの合成を、アジド、プロパルギル、シクロオクチニル、ピリジニルジスルフィド、チオアセチル又はマレイミド基を含む異なった二官能性ＰＥＧ−ＣＯＯＨ  ＮＨＳエステルを用いることにより達成する。化合物ｄ０１との反応を、実施例２ａ／４ｃに従って行う（収率６５−８６％）。表３は、達成可能な生成物ｄ１３〜ｄ１７を要約する。
【０２０９】
【表３】
2020073643.tif 000013
【０２１０】
タイプｄ１２のポリグリセロールデンドリマー系に関する本発明の範囲は、実施例に限定されず、他のｎ個の数の硫酸基を包含してもよく、例えば、アリル化／ジヒドロキシル化を介してヒドロキシル基を倍増することにより、硫酸化の後、６４個の硫酸基を与え、ｄ１３−ｄ１７に類似する化合物を与えることができる。
【０２１１】
実施例５：アミノメチル−トリス（プロピオン酸）及びトリグリセロールに基づく、生物結合（bioconjugation）のための２４個の硫酸基及び反応性基を有するポリグリセロール／アミドデンドリマー系（化合物ｄ１８−ｄ２２）の合成。
【０２１２】
実施例５a：アミノメチル−トリス（プロピオン酸）−トリス（トリグリセロールアミド）の合成。
【０２１３】
【化１０】
2020073643.tif 000014
【０２１４】
１５ｍｌのＤＭＦ中、ニトロメタン−トリプロピオン酸（１．５ｇ、５．４ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（３．９ｇ、３０ｍｍｏｌ）溶液に、２ｍｌのＤＭＦ中、ＨＢＴＵ（９．３ｇ、２４ｍｍｏｌ）の溶液を添加する。室温での３０分の攪拌の後、２ｍｌのＤＭＦ中、（７．３ｇ、２３ｍｍｏｌ）トリグリセロールアミン、すなわちアセタール保護された（１，３−ビス[２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メトキシ]−２−プロピルアミン）（Wyszogrodzka M. et al, Chemistry 2008, 14. 9202）の溶液を添加し、続いて、室温で２４時間、攪拌する。その反応混合物を蒸発乾燥し、そしてシクロヘキサン／酢酸エチルを用いて短いシリカカラムを通して濾過する。生成物含有画分を集め、蒸発し、そして残渣を２０ｍｌのメタノールに溶解し、これに、１．７ｍｌの濃ＨＣｌを添加し、さらなる２４時間の攪拌により、アセタール保護基を切断する。蒸発乾燥の後、残渣を、水／メタノールを用いて、ＲＰＣ−１８クロマトグラフィー（Licroprep）により精製し；２．７ｇ（５３％）の中間体生成物（Ｈ−ＮＭＲ、ＥＳＩ  ＭＳ）を得る。アミノ基へのニトロ基の還元を、１２０ｍｌのメタノールに２．７ｇの中間体を溶解することにより達成し、これにＰｄ／Ｃ（０．３ｇ）及び蟻酸アンモニウム（１．２７ｇ、２０ｍｍｏｌ）を添加する。その混合物を、５バール／室温で４８時間、水素化し、続けて、セライト上で濾過し、蒸発し、そして上記のようにして、ＲＰ  Ｃ−１８クロマトグラフィー処理し、粘性油状物として、１．９ｇ（７４％）のアミノメチル−トリス（プロピオン酸）−トリス（トリグリセロールアミド）を得る。
【０２１５】
実施例例５ｂ：１１−アジドウンデカンカルボン酸によるリンカー修飾。
２ｍｌのＤＭＦ中、１１−アジドウンデカンカルボン酸（０．１１ｇ、０．５ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．１６ｇ、１．２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＢＴＵ（０．２ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を添加し、そしてその混合物を１時間、攪拌し、続いてアミノメチル−トリス（プロピオン酸）−トリス（トリグリセロールアミド）（０．３ｇ、０．３３ｍｍｏｌ；実施例５ａ）を添加する。その混合物を、室温で４８時間、攪拌し、蒸発乾燥し、そして水／メタノールを用いて、ＲＰ  Ｃ−１８クロマトグラフィー（Licroprep）により精製し；粘性油状物として、０．２６ｇ（７１％）を得る。
【０２１６】
実施例５ｃ：２４個の硫酸基を有するアミノデシルカルボニルデンドリマー系（化合物ｄ１８）を得るために、アリル化／ジヒドロキシル化、硫酸化及びアジド還元を通しての、アジドデシルカルボニルリンカー（実施例５ｂ）によるポリグリセロール／アミドデンドリマーの形成。
【０２１７】
【化１１】
2020073643.tif 000015
【０２１８】
この合成を、実施例１ｄ−ｅに記載のようにして達成し、１２０ｍｇの生成物ｄ１８を、無色の非晶性固形物（ＭＷ４４３２ｇ／ｍｌ）として得る。
【０２１９】
実施例５ｃ−ｈ：
２４個の硫酸基及びさらなる反応性リンカーを有するポリグリセロール／アミドデンドリマー系の合成を、アジド、フロパルギル、シクロオクチニル、ピリジニルジスルフィド、チオセチル又はマレイミド基を含む異なった二官能性ＰＥＧ−ＣＯＯＨ  ＮＨＳエステルを用いることにより達成する。化合物ｄ０１との反応を、実施例２ａ／４ｃに従って実施する（収率６５−８６％）。表４は、達成可能な生成物ｄ１９〜ｄ２２を要約する。別の選択肢は、遊離カルボン酸（生成物ｄ２２）を導入するために、既知方法により、無水物、例えばジグリコール酸無水物によるアミノ基の誘導体化、又はイソチオシアネート基（生成物ｄ２３；また実施例２ｉも参照のこと）へのアミノ基の転換である。
【０２２０】
【表４】
2020073643.tif 000016
【０２２１】
タイプｄ１８のポリグリセロールデンドリマー系に関する本発明の範囲は、実施例に限定されず、他のｎ個の数の硫酸基を包含してもよく、アリル化／ジヒドロキシル化を介してヒドロキシル基を倍増することにより、硫酸化の後、４８個の硫酸基を与え、ｄ１９−ｄ２２に類似する化合物を与えることができる。
【０２２２】
実施例６：リンカーに２４個の硫酸基、ＮＨＳエステル反応性基、及び還元的に切断できるジスルフィド単位を有するポリグリセロールデンドリマー系（化合物ｄ２４）の合成。
【０２２３】
【化１２】
2020073643.tif 000017
【０２２４】
０．５ｍｌのメタノール／ＤＭＦ（１：１）中、化合物ｄ０９（実施例２ｈ）（２５ｍｇ、５．３μｍｏｌ）及び２０ｍｇのイオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ（登録商標）５０Ｗの溶液を、３時間、振盪し、濾過し、そして蒸発乾燥する。残渣を、ＰＢＳ緩衝液（５０ｍＭ；ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡを含む）／メタノール（１：１）に溶解し、これに、４−（２−ピリジルジチオ）ブタン酸（２．４ｍｇ、１０．６μｍｏｌ；Widdison et al., J. Med. Chem. 2006, 49. 4392）添加する。１８時間の攪拌の後、残渣を蒸発し、そして２０％ＮａＣｌ及び蒸留水に対して透析し（標準的セルロース、ＭＷＣＯ  １０００）、凍結乾燥物（ＭＷ４７６４ｇ／ｍｏｌ）として２１ｍｇの化合物ｄ２４を得る。
【０２２５】
実施例７：ソルターゼ介在性酵素的連結のための２４個の硫酸基及びトリグリシンモチーフを有するポリグリセロール／アミドデンドリマー系（ｄ２５）の合成。
【０２２６】
【化１３】
2020073643.tif 000018
【０２２７】
Ｂｏｃ−ＧｌｙＧｌｙＧｌｙ−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ；２５ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１１ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を、３ｍｌのＤＭＦに溶解し、そしてＨＡＴＵ（３８ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を添加する。１時間後、化合物ｄ１８（９５ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）を添加する。その混合物を、５０℃で４８時間、攪拌する。生成物を、ジエチルエーテルの添加により沈殿せしめ、そして濾過により集める。残渣を、反復してジクロロメタンにより洗浄し、そして次に、ジクロロメタン／トリフルオロ酢酸（１：１）の混合物５ｍｌに懸濁し、続いて室温で５時間、攪拌する。
【０２２８】
実施例８：蛍光色素ＩＣＣによるデンドリマー系の複合体の合成。
実勢例８ａ−ｃ：シアニン色素によるアミノデンドリマー化合物ｄ０１、ｄ１２及びｄ１８の複合体化。
【０２２９】
異なった官能基及び置換パターンを用い、標識用のシアニン色素、例えばＣｙ３又はＩＣＣが、既知文献に従って合成的にアクセスできる。ＩＣＣ色素（ＮＨＳエステル）は、公開されているＶＩＳ色素（吸光度／蛍光、〜５５０ｎｍ／５７５ｎｍ）（Groger et al, Bioconjugate Chem 2013, 24, 1507）である。
【０２３０】
【化１４】
2020073643.tif 000019
【０２３１】
１０ｍｇ（２．３３μｍｏｌ）の化合物ｄ０１を、１ｍｌのＤＭＦ／水（９：１）に溶解し、そしてＩＣＣ  ＮＨＳエステル（MiDye550 NHSエステル, Iris Biotech., Germany）（８．９ｍｇ、１２μｍｏｌ）を添加し、続いて４０℃で７２時間、振盪する。生成物（ＩＣＣ−ｄ０１）を、ジクロロメタンの添加により沈殿し、そして水/メタノールを用いて、ＲＰ  Ｃ−１８クロマトグラフィー（Licroprep）により精製する。カップリング度を、分光光度法（550 nm でのICC 色素 λmax、 ε 120.000 L-1 M-1）により決定し、５４％のカップリング度を得る。デンドリマーｄ１２及びｄ１８を、類似する態様で、ＩＣＣ色素ＮＨＳエステルにより共有結合する。
【０２３２】
他の蛍光色素ＮＨＳエステル、例えばシアニン色素ＩＴＣＣ  ＮＨＳエステル、Ｃｙ３〜Ｃｙ７  ＮＨＳエステル、ローダミン又はフルオレセインＮＨＳエステルが、本明細書に記載のようにして複合体化され得る。また、一般的に知られているそのような色素のイソチオシアネート（ＩＴＣ）誘導体、例えばＦＩＴＣが使用され得る。
【０２３３】
色素複合体化のための別の方法は、２−イミニチオラン及びマレイミド色素（例えば、ＩＣＣマレイミド）と組合して、アミノデンドリマー（例えば、ｄ０１、ｄ１２、ｄ１８）を用いることであり、例えばＩＣＣ−ＩＴ−ｄ０１又はＩＣＣ−ＩＴ−ｄ１８が得られる。
【０２３４】
実施例９：ＵＶ−検出可能リンカーを有するデンドリマー（ｄ２６）の合成。
【０２３５】
【化１５】
2020073643.tif 000020
【０２３６】
ｄ２６の合成を、リンカーとして、１，１０−ジブロモデカンの代わりに、４、４′−ジ−（３−ブロモプロピルオキシ）ベンゾフェノン（Yan et al., Bioorg. Med. Chem. 2013, 21 , 508）を用いて、実施例４と同様に達成する。次に、デンドリマーｄ２６を実施例４ｃ−ｈに記載のようにして、さらに修飾し、タンパク質複合体化のために用いることができる。４、４′−ジ−（３−ブロモプロピルオキシ）ベンゾフェノンリンカーを用いて、実施例１−３のタイプのデンドリマーを構築することができる。
【０２３７】
実施例１０：ＶＩＳ−検出可能シアニン色素リンカーを有するデンドリマー（ｄ２８）の合成。
実施例１０a：２４個の硫酸基及びアミノへキシルリンカーを有するポリグリセロールデンドリマー系（化合物ｄ２７）の合成。
化合物ｄ２７は、アミノへキシル基を有するｄ０１と類似し、そして出発材料として１，６−ジブロモヘキサンを用いて、実施例１ａ−ｃに従って合成され；ｄ２７の分子量は、４２４０ｇ／ｍｏｌである。
【０２３８】
実施例１０ｂ：ＶＩＳ−検出可能リンカーとしてインドシアニン部分、及びＮＨＳエステル反応性基を有する複合体（ｄ２８）。
【０２３９】
【化１６】
2020073643.tif 000021
【０２４０】
５、５′−ジカルボキシ−１、１′−ジメチルインドカルボシアニンモノアセテートを、既知方法に従って合成する。３ｍｌのＤＭＦ中、０．１ｇ（０．２ｍｍｏｌ）のこの色素及びＤＩＰＥＡ（０．１１ｇ、０．８ｍｍｏｌ）の溶液に、０．５ｍｌのＤＭＦ中、ＨＢＴＵ（０．３１ｇ、０．８ｍｍｏｌ）の溶液を添加する。室温での９０分の攪拌の後、ｄ２７（０．１７ｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を固形物として、少しづつ添加し、そして得られる混合物を６０℃で７２時間、攪拌する。生成物を３ｍｌのジエチルエーテルの添加により沈殿し、そして遠心分離により集める。水／エタノールを用いてＲＰ  Ｃ−１８クロマトグラフィー（licroprep）による精製により、０．１２ｇの中間体を、凍結乾燥の後、得る。ＮＨＳエステルへの転換を、１ｍｌのＤＭＦ中、中間体及び３５μｌのＤＩＰＥＡの溶液にＨＳＴＵ（７５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を添加し、そして室温で１８時間、攪拌し、続いてジエチルエーテルによる沈殿する（ＤＭＦ／ジエチルエーテルの反復サイクル）ことにより、実施し、０．１０ｇの生成物ｄ２８（分子量４７４３ｇ／ｍｏｌ）を得る。
【０２４１】
実施例１１：タンパク質及び抗体とデンドリマー系との複合体の合成。
実施例１１ａ:マレイミド基を有するデンドリマー系（ｄ０２、ｄ０３、ｄｌ３、ｄｌ４、ｄｌ９、ｄ２０）を用いての一般的複合体化方法。
１ｍｌの５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．４／１０ｍＭのＥＤＴＡ中、２ｍｇのタンパク質の溶液と、１０モル当量の２−イミノチオランとを、６０分間、反応せしめる。この混合物に、１４モル当量のマレイミド−官能化デンドリマー（例えば、ｄ０２、ｄ０３、ｄｌ３、ｄｌ４、ｄｌ９、ｄ２０）を添加し、続いて１８時間インキュベートする。この混合物を、ＮＡＰ １０カラム又はＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ 透析カセット (標準的セルロース、ＭＷＣＯ １０ ｋＤａ)を用いて、ＴＲＩＳ−緩衝生理食塩水（ＴＢＳ：ｐＨ７．４）への精製に供する。
【０２４２】
実施例１１ｂ：ピリジルジスルフィド基を有するデンドリマー系（ｄ０４、ｄ０５、ｄ１５、ｄ２１）を用いての一般的複合体化方法。
１ｍｌの５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．４／１０ｍＭのＥＤＴＡ中、２ｍｇのタンパク質の溶液と、１０モル当量の２−イミノチオランとを、６０分間、反応せしめる。この混合物に、１０ｍｏｌ当量のマレイミド−官能化デンドリマー（例えば、ｄ０４、ｄ０５、ｄ１５、ｄ２１）を添加し、続いて３時間インキュベートする。この混合物を、ＮＡＰ １０カラム又はＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ 透析カセット (標準的セルロース、ＭＷＣＯ １０ ｋＤａ)を用いて、ＴＲＩＳ−緩衝生理食塩水（ＴＢＳ：ｐＨ７．４）への精製に供する。
【０２４３】
実施例１１ｃ：イソチオシアネート又はＮＨＳエステル基を有するデンドリマー系（ｄ１０、ｄ１１、ｄ２３）を用いての一般的複合体化方法。
１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、２ｍｇのタンパク質の溶液と、１０ｍｏｌ当量のイソチオシアネート又はＮＨＳエステルデンドリマー（例えば、ｄ１０、ｄ１１、ｄ２３）とを、２４時間、反応せしめる。この混合物を、ＮＡＰ １０カラム又はＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ 透析カセット（標準的セルロース、ＭＷＣＯ １０ ｋＤａ)を用いて、ＴＲＩＳ−緩衝生理食塩水（ＴＢＳ：ｐＨ７．４）への精製に供する。
【０２４４】
実施例１２：酵素とデンドリマー系との複合体の合成。
実施例１２ａ：マレイミド基を有するデンドリマー系（ｄ０２、ｄ１３、ｄ１９）と酵素Ｌ−アスパラギナーゼとの複合体化。
Ｌ−アスパラギナーゼは、各モノマー単位におけるジスルフィド架橋で修飾され得る、３４ｋＤａの分子量の４単位のホモテトラマーである（Balan et al., Bioconjugate Chem 2007, 18, 61）。Ｌ−アスパラギナーゼ（１０ｍｇ、０．２９μｍｏｌのモノマー；Ｌ−アスパラギナーゼ５０００Ｅ、Ｍｅｄａｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、２ｍｌの５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ８／１０ｍＭのＥＤＴＡに溶解する。ジチオトレイトール（ＤＴＴ：８０ｍｇ）を添加し、そしてその溶液を１時間、振盪する。過剰のＤＴＴを、ＳＥＣ（Sephadex G50; リン酸緩衝液ｐＨ８ / １０ ｍＭ のＥＤＴＡ）を通して除去する。得られる溶液（ＵＶにより測定される場合、４ｍｌ中、約８ｍｇ）に、約０．２ｍｌの水中、２．３μｍｏｌ（８モル当量）のマレイミドデンドリマー（例えば、ｄ０２、ｄ１３、ｄ１９）の溶液を添加し、続いて、軽く振盪しながら、２４時間インキュベートする。精製を、限外濾過（Centriprep（登録商標）フラスコ、標準的セルロース、ＭＷＣＯ  ２０，０００）により達成する。
【０２４５】
実施例１２ｂ：マレイミド基を有するデンドリマー系（ｄ０２）と酵素ＤＮアーゼとの複合体化。
合成を、実施例１１ａに記載のようにして達成し、ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中、溶液としてＤＮアーゼ−ｄ０２を得る。
【０２４６】
実施例１２ｃ：イソチオシアネート基を有するデンドリマー系（ｄ１０）と酵素ＤＮアーゼとの複合体化。
１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、２ｍｇ（６５ｎｍｏｌ）のＤＮアーゼ（牛膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼＩ、３１Ｄａ）の溶液に、０．２ｍｌのＰＢＳ中、５ｍｏｌ当量のイソチオシアネートデンドリマーｄ１０（１．４ｍｇ）を添加し、続いて室温で１８時間、反応せしめる。精製を、Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（セルロースエステル、ＭＷＣＯ  １０ｋＤａ）でＴＢＳ（ｐＨ７．４）中で行う。
【０２４７】
【表５】
2020073643.tif 000022
【０２４８】
表５によるデンドリマー系とのタンパク質複合体をさらに、蛍光色素により複合体化し、生物学的システムにおける複合体を検出することができる。蛍光標識は既知の方法であり、そして種々の反応性フルオロフォアにより達成され得る。ここで、色素ＩＣＣ  ＮＨＳエステル（Groger et al., Bioconjugatc Chem 2013, 24, 1507）が実施例において使用され、ＦＡＣＳ及び顕微鏡により細胞取り込みの結果が示される。
【０２４９】
実施例１３：小分子ペプチド及びペプチド模倣体とデンドリマー系との複合体の合成
実施例１３ａ:モノメチルアウリスタチンＥを有するデンドリマー複合体の合成。
【０２５０】
【化１７】
2020073643.tif 000023
【０２５１】
マレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチンＥ（ｍｃ−ＭＭＡＥ）を、文献（Doronina et al., 2006, 17, 114）に従って合成することができる。複合体化を、０．５ｍｌの５０ｍＭのヒドロキシルアミン水溶液にデンドリマーｄ０９（２ｍｇ、０．４３μｍｏｌ）を溶解し、続いて、マレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチンＥ（０．５ｍｌのＤＭＦ／ＰＢＳ（１：１）中、０．３７ｍｇ）を添加することにより達成する。２５℃での１８時間のインキュベーションの後、生成物を、ジクロロメタンにより沈殿し、続いて、ＨＰＬＣ精製し（水／メタノール）、ＭＭＡＥ−ｄ０９（１．１ｍｇ）を得る。
【０２５２】
本明細書に記載される方法に従って合成されるアウリスタチンエフェクター分子を有するデンドリマーｄ０１の構造の他の非制限的例は、次のものを包含することができる：
【０２５３】
【化１８】
2020073643.tif 000024
【０２５４】
実施例１３ｂ：ステープルペプチドを有するデンドリマー複合体の合成。
【０２５５】
【化１９】
2020073643.tif 000025
【０２５６】
ｐ５３経路の活性化のためのステープルペプチド（Ｎ末端β−アラニンを有するＡＴＳＰ−３９００）を、文献（Chang et al., PNAS 2013, 1 10, E3445）に従って合成することができる。複合体化を、０．５ｍｌの５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８）に、デンドリマーｄ１０（２ｍｇ、０．４６μｍｏｌ）を溶解することにより達成する。この溶液に、０．２ｍｌのＤＭＦ中、β−アラニル−ＡＴＳＰ−３９００（０．６５ｍｇ、０．４０μｍｏｌ）の溶液を添加し、続いて、４０℃で２４時間、反応せしめる。精製をＨＰＬＣ（水／メタノール）により行い、ＡＴＳＰ３９００−ｄ１０複合体（０．８ｍｇ）を得る。
【０２５７】
実施例１３ｃ：天然の結合モチーフ由来のα−ヘリカルペプチドを有するデンドリマー複合体の合成。
ペプチド配列Ｐ１−Ｐ１７（Ｃ末端アミドとして）を、一般的な固相ペプチド合成により合成した。それらのペプチドは、チオール基へのマレイミドデンドリマーの結合のためのＮ−末端システインを担持する。デンドリマー（ｄ０２、ｄ０３、ｄｌ３、ｄ１４、ｄ１９）への複合体化を実施した。例として、デンドリマーｄ０２を用いる手順を記載する：１ｍｇのペプチドを、２００μｌのＤＭＦに溶解し、そしてさらに、５０ｍＭのリン酸緩衝液（５００μｌまでの）により希釈する。この溶液に、５ｍoｌ当量のＴＣＥＰ（水中、原液）を添加し、続いて、２００−３００μｌの水に溶解された０．９モル当量のデンドリマーを添加する。その混合物を、２５℃で１８時間、軽く振盪する。精製を、ＨＰＬＣ（水／アセトニトリル）又はＳＥＣ（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０、水／ＤＭＦ）、又は両者の組み合わせにより実施し、表６に列挙される複合体を得る。
【０２５８】
【表６】
2020073643.tif 000026
【０２５９】
実施例１４：小分子インヒビターを有するデンドリマー系の複合体の合成。
実施例１４ａ:スタウロスポリンを有するデンドリマー複合体の合成。
【０２６０】
【化２０】
2020073643.tif 000027
【０２６１】
スタウロスポリンは、その阻害活性を保持しながら、担体分子に結合され得るキナーゼインヒビターである。スクシノイル−スタウロスポリンを、記載のようにして合成し（Caravatti et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994, 4, 399）、そしてＨＡＴＵ／ＤＩＰＥＡカップリング条件を用いて、ＤＭＦ中、ｄ０１に結合する。
【０２６２】
実施例１４ｂ：メイタンシン誘導体を有するデンドリマー複合体の合成。
【０２６３】
【化２１】
2020073643.tif 000028
【０２６４】
Ｎ2′−デアセチル−Ｎ2′−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシンは、ジスルフィド結合又はマレイミド結合を通して生物分子への共有結合のために適切にされた、公開されている誘導体である（Erickson et al. Bioconjugatc Chem. 2010, 21, 84）。タイプｄ０２、ｄ０３、ｄ１３、ｄ１９、ｄ２０（マレイミド）のデンドリマー系への共有結合は可能である。０．５ｍｌのＤＭＦ／５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０＋５ｍＭのＥＤＴＡ（９：１）中、Ｎ2′−デアセチル−Ｎ2′−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（５ｍｇ、６．８μｍｏｌ）及びデンドリマーｄ０２（２４ｍｇ、５．２μｍｏｌ）の溶液を、室温で３時間、反応せしめ、１ｍｌのジクロロメタンの添加により、生成物を沈殿する。過剰のメイタンシンを、ＤＭＦ／ジクロロメタンからの反復された沈殿サイクルにより除去し、２１ｍｇのｍａｙ−ｄ０２（分子量５４３２ｇ／ｍｏｌ）を得る。
【０２６５】
実施例１５：デンドリマー−ＩＣＣ色素複合体（実施例８）及びデンドリマータンパク質複合体（実施例１１）の細胞取り込み。
ヒト癌細胞系Ａ２７８０及びＱＧＰ−１を、ＲＰＭＩ培地において培養し、そして１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２％グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加する。すべての細胞を、１×１０5個の細胞／ｍｌで、培地に播種し、５％ＣＯ2下で３７℃で培養し、そして週、２度、１：５に分割する。上皮ヒト癌細胞系Ａ５４９、ＭＣＦ７、ＨａＣａＴ及びＨｅｐＧ２を、１０％胎児ＦＣＳ、２％グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを含む、ＤＭＥＭ培地（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）において培養した。細胞を、１×１０5個の細胞／ｍｌで、培地中に播種する（５％ＣＯ2下で３７℃、週２度、１：１０に分割する）。細胞顕微鏡のために、細胞を、ガラスカバースリップ（Ｓｉｇｍａ）上の２４−ウェル培養プレートに、２×１０5個の細胞／ｍｌで播種し、３７℃で２４時間、培養し、次に、４８個の硫酸基を有する、１０-6ＭのＩＣＣ−ｄ０１、ＩＣＣ−ｄ１２、ＩＣＣ−ｄ１８又はそれぞれの誘導体、又はタンパク質（実施例１２及び１３）又は１０-6Ｍのグリセロール−ＩＣＣ（対照）を有するデンドリマー複合体を含む培地において、３７℃で２４時間まで、培養する。その後、細胞を冷アセトンにより固定し、すすぎ、そして核対比染色のために、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ａｂｃａｍ）により被覆する。画像取得を、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＲＢ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて実施する。画像を、すべての画像に対して同じ露光時間で、デジタルカメラ（スポット３２、Diagnostic Instruments）により撮影する。図８Ａは、細胞質ゾル領域における細胞内分布の例を示す（ＩＣＣ−ｄ０１、実施例８）。硫酸化デンドリマーにより介在される細胞取り込みを定量化するために、ＩＣＣ−ｄ０１（実施例８）を用いて、１０-6ＭのＩＣＣ−ｄ０１と共に、１０7個のＳＫＢＲ３腫瘍細胞を２４時間インキュベートする。この量及び時間は、プールし、そしてＤＭＳＯによる細胞溶解の後、上清液を測定するのに十分である。図８Ｂは、得られる吸収スペクトル（ＩＣＣ  消衰係数（５５９ｎｍ）１５０，０００Ｍ-1ｃｍ-1）を示し、１０-17ｍｏｌ／細胞が得られ、これは、細胞当たり約５Ｍｉｏ分子に相当する。
【０２６６】
ＦＡＣＳ研究のために、２×１０5個の細胞／ｍｌの細胞を、正常培養、又は異なった濃度の試験物質を含む培地を有する２４−ウェルプレートにおいて３又は２４時間、培養する。その後、細胞を、ＰＢＳにより洗浄し、そして２００μｌ／ウェルのアキュテーゼ（ＰＡＡ）により分離し、そしてＰＢＳにより２度、洗浄する。細胞を、５００μｌの３％パラホルムアルデヒドにより、４℃で１０分間、固定し、２ｍｌのＰＢＳにより停止し、２５０ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離する。上清液を除き、そして細胞を、０．５％ウシ血清アルブミン（Ｒｏｔｈ）と共に２００μｌのＰＢＳに懸濁する。固定された細胞を、ＦＡＣＳ  Calibur装置（Becton-Dickinson）での分析まで、４℃で保持する。表７は、ＦＡＣＳ分析の例を示す。
【０２６７】
【表７】
2020073643.tif 000029
【０２６８】
実施例１６：腫瘍細胞におけるタンパク質−デンドリマー複合体の活性。
細胞毒性測定のために、２×１０5個の細胞を、上昇する濃度の試験物質を含む培地１ｍｌと共にインキュベートした。７２時間の処理の後、アポトーシス工程のパラメーターとしての細胞数、生存率及び細胞直径を、細胞カウンター及び分析装置システム（CASY（登録商標）, Scharfe Systems）により分析した。さらに、薬物細胞毒性を、細胞の代謝活性についての試験としてＭＴＴアッセイ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を用いて、インビトロで評価した。ウェル当たり１×１０4個の細胞を、上昇する濃度の試験物質を含む培地１００μｌを含む９６−ウェルプレート上に播種した。１０μｌのＭＴＴ（ＰＢＳ中、５ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａから入手された）を、各ウェルに添加し、そしてプレートを、４時間、２４時間、４８時間又は７２時間までインキュベートした。得られるホルマザン生成物を、酸イソプロパノールと共に溶解し、そして５７０ｎｍの波長での吸光度（Ｅｘ５７０）を、マイクロプレート分光光度計 (Anthos htll, Microsystems)上で読み取った。いくつかの実験において、試験物質を有する培地を、４８時間後、除き、細胞を計数し、そして試験物質を含まない新培地を用いて、同一の細胞数を、新しいプレートに播種した。ＭＴＴアッセイを、７２時間のさらなるインキュベーションの後、実施した。
【０２６９】
例として、表８は、リボソーム阻害毒素の複合体が、細胞取り込み及び細胞内活性のために、高められた細胞毒性を示すことを示している。効果は、例えば化合物Ｓａｐ−ｄ０２、Ｓａｐ−ｄｌ３又はＳａｐ−ｄｌ９を用いることにより得られる。類似する効果が、異なった腫瘍細胞系、例えばＨＴ２９結腸腫瘍細胞、ＨｅｐＧ２肝臓腫瘍細胞、ＱＧＰ−１膵腫瘍細胞、Ａ４３１類表皮腫瘍細胞において得られる。
【０２７０】
【表８】
2020073643.tif 000030
【０２７１】
実施例１７：腫瘍細胞におけるペプチド−デンドリマー複合体の活性。
細胞培養測定を、実施例１６に記載のようにして行った。表９は、異なったペプチド−デンドリマー複合体についての結果を示す。
【０２７２】
【表９】
2020073643.tif 000031
【０２７３】
実施例１８：タンパク質とのデンドリマー複合体の細胞内取り組みの選択性：Ｌ−アスパラギナーゼ複合体Ａｓｐ−ｄ０２（実施例１２ａ）の取り込みに対するインヒビターの効果。
ＦＡＣＳにより測定された細胞取り込みに対する研究を、実施例１３に記載のようにして実施した。化合物Ａｓｐ−ｄ１３を、ＱＧＰ−１腫瘍細胞において、１０-7Ｍの濃度で、３及び６時間インキュベートする。インキュベーションを、次の２種の基質の１つの存在下で実施する：（１）０．１ｍＭのゲニステイン、すなわちエンドサイトーシス取り込みのためのインヒビター（Rejman et al.. Mol. Ther. 2005, 1 2, 468-474）、又は（２）５０ｍＭのリファマイシン、すなわち有機アニオントランスポータータンパク質を介しての取り込みのインヒビター（OATP; Bi et al, Drug Metab Dispos. 2012. 40, 1085-92）。その結果は、インヒビターを含まないＡｓｐ−ｄ１３に関するＦＡＣＳシグナル（１００％として定義される）は、リファマイシンの存在下で３７−４０％まで低下し、ところが有意な低下はゲニステインの存在下で測定され得られない（８０−８５％）ことを示し、データについては表１０を参照のこと。ポリグリセロールスルフェート（１２０００Ｄａの平均分子量；国際公開第２００１／０９５３１１号に従って使用される）に結合されるＬ−アスパラギナーゼについては、エンドサイトーシスがゲニステインによる阻害のために同定され得る。
【０２７４】
【表１０】
2020073643.tif 000032
【０２７５】
実施例１９：硫酸化ポリマーに比較して腫瘍細胞におけるタンパク質−デンドリマー複合体の活性。
この実施例においては、サポリン複合体Ｓａｐ−ｄ０２（実施例１１）を、匹敵する分子量（６０００ ｇ/ｍｏｌでの平均値; Groger et al, Bioconjugatc Chem 2013, 24, 1507に従って合成される）を有するポリマー性の非特定の性質のポリグリセロールスルフェートを用いて類似複合体と比較する。このポリマーを、実施例２ａに記載のようにしてリンカーマレイミド−ＰＥＧ（４）−ＣＯＯＨ  ＮＨＳエステルにより官能化し、そしてさらに、ＲＰクロマトグラフィーにより補正する。サポリンへの結合を、実施例１１に記載のようにして達成する。比較細胞毒性測定を、実施例１６に従って実施し、４つの異なる細胞系におけるＭＴＴ試験からのＩＣ50値を得る（表１１を参照のこと）。
【０２７６】
【表１１】
2020073643.tif 000033
【０２７７】
実施例２０：Ｎ末端システイン（Ｃｙｓｔａｇ）を用いてのタンパク質を有するデンドリマーの化学選択的及び部位特異的複合体化方法。
実施例２０ａ：
デンドリマーは、タンパク質及び抗体治療薬、並びに合成ペプチドにより、それらのポリアミノ酸がシステイン標識を提供される場合、複合体化され得、それにより、マレイミド、ピリジニルジスルフィド又は当業者に知られている他のチオール−選択性基（例えば、ブロモアセチル、ビニルスルホン）を担持するデンドリマーとのシステインへの化学選択的複合体化を可能にする。
【０２７８】
Ｃｙｓｔａｇとのタンパク質（２５−３０ｋＤａ）の複合体化のための一般的プロトコル：１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ中、タンパク質（濃度２ｍｇ／ｍｌ）の溶液１ｍｌを、ＰＢＳ中、ＴＣＥＰの溶液（混合物において１ｍＭのＴＣＥＰを生成する）と共に、室温で３時間インキュベートし、続いて、２モル当量のマレイミド含有、又はピリジニルジスルフィド含有、硫酸化デンドリマー（例えば、ｄ０２−ｄ０５、ｄ１３−ｄ１５）を添加し、そして室温で、さらに２時間、反応せしめる。精製を、ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中でのFloat-A-Lyzer透析カセット（セルロースエステル、ＭＷＣＯ １０ｋＤａ）において達成する。
【０２７９】
実施例２０ｂ：
Ｎ末端システイン又はシステインサロゲートを有するタンパク質を、ネイティブ化学連結（ＮＣＬ）方法によりチオエステル部分を使用する他の高分子と融合することができる（Wong CT et al, Mol Biosyst. 2013, 9, 826-33）。驚くべきことには、硫酸化デンドリマーを、チオエステルとして合成することができ、そしてＮ末端システインを有するタンパク質へのＮＣＬ型複合体化を可能にする。
【０２８０】
チオエステル基を有する、硫酸化デンドリマーの合成：ＤＭＦ（１ｍｌ）中、ＮＨＳエステルを有する、硫酸化デンドリマー（ｄ１１；１０ｍｇ）の溶液を、１０モル当量の３−チオプロピオン酸メチルエステル（Xiao et al, Bioorg Med Chem Lett 2013, 23, 6046-6051）と、４０℃で２４時間、反応せしめる。ＤＭＦ／酢酸エチルにおける反復沈殿化及び蒸留水からの凍結乾燥の後、１１ｍｇの生成物ｄ２９を、黄色の固形物として得た。
【０２８１】
Ｃｙｓｔａｇとのタンパク質（２５−３０ｋＤａ）の複合体化のための一般的プロトコル：５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、ＭＰＡＡ及びＴＣＥＰを含むＮＣＬ−緩衝液中、タンパク質（濃度２ｍｇ／ｍｌ）の溶液１ｍｌを、２．５モル当量のデンドリマーｄ２９と共に室温で２４時間インキュベートする。精製を、ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中でのSlide-A-Lyzer透析カセット（セルロースエステル、ＭＷＣＯ ２０ｋＤａ）において達成する。生成物は、ＮＣＬの機構に従って、遊離システインを含み、そしてさらに、蛍光色素（例えば、ＩＣＣマレイミド）に複合体化され得る。
【０２８２】
実施例２１：カルバルデヒド基を有する硫酸化デンドリマーを用いた還元性アミノ化を通しての化学選択的複合体化。
実施例２１ａ：カルバルデヒド基を有する硫酸化デンドリマーｄ３１の合成。
【０２８３】
【化２２】
2020073643.tif 000034
【０２８４】
デンドリマーｄ０６におけるアジド基（実施例２ｅ）を、ＴＣＥＰによりアミンに還元する。水／メタノール（１：１）の混合物１ｍｌ中、ｄ０６（５０ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＣＥＰ（２０ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）を添加し、そしてその混合物を室温で１８時間、攪拌する。蒸発の後、残渣を、２０％ＮａＣｌ及び蒸留水に対し透析し（標準的セルロース、ＭＷＣＯ  １０００）、凍結乾燥の後、４５ｍｇ（９０％）の化合物ｄ３０（分子量４６３１ｇ／ｍｏｌ）を得る。カルバルデヒドによる修飾を、ＤＭＦ／水下で、４−ホルミル安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（Hooker, JM et al., Nano Letters 2007. 7, 2207-2210）との反応により達成し、硫酸化デンドリマーｄ３１を、固形沈殿物（分子量４７６３ｇ／ｍｏｌ）として得る。
【０２８５】
実施例２１ｂ：還元性アミノ化を通してのタンパク質への硫酸化デンドリマーｄ３１の化学選択的複合体化。
この工程は、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、２．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液により実施される。一般的手順：１ｍｇのタンパク質（０．４ｍｌ）及び３モル当量のデンドリマーｄ３１の溶液を、水中、シアノ水素ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ3ＣＮ）の原液により処理し、混合物中、１ｍＭの最終濃度のＮａＢＨ3ＣＮを得、これを２０℃で４８時間、軽く振盪する。精製を、ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中でのSlide-A-Lyzer透析カセット（セルロースエステル、ＭＷＣＯ ２０ｋＤａ）において達成する。デンドリマー複合体化を、ゲル電気泳動により決定し、複合体へのタンパク質の５０−７０％の転換率を得る（デンドリマー：タンパク質の比は未知である）。使用されるタンパク質は、オボアルブミン、サポリン、ジフテリア毒素及び非特異的ＩｇＧであった。精製を、ＳＥＣ  ＨＰＬＣにより行う。デンドリマー：タンパク質の比の分析を、ゲル電気泳動により実施する。
【０２８６】
実施例２２：酸分解性結合を介してのタンパク質への硫酸化デンドリマーの複合体化：ヒドラゾンリンカー及びマレイミド基を有する、硫酸化デンドリマーの合成。
【０２８７】
【化２３】
2020073643.tif 000035
【０２８８】
デンドリマーｄ３１を、公開されている方法（Walker GF et al.. Molecular Therapy 2005, 11 , 418-425）に従って、ＥＭＣＨ（ε−マレイミドカプロン酸ヒドラジド）に融合する。
【０２８９】
それらのタイプの修飾は、結果的に、ヒドラゾン、カルボキシヒドラゾン及びイミンが得られるような他の芳香族、脂肪族アルデヒド部分、及びケトン部分（例えば、４−アセチル安息香酸）に拡張され得る。
【図１】
2020073643.tif 000037
【図２】
2020073643.tif 000038
【図３】
2020073643.tif 000039
【図４】
2020073643.tif 000040
【図５】
2020073643.tif 000041
【図６】
2020073643.tif 000042
【図７】
2020073643.tif 000043
【図８】
2020073643.tif 000044
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月5日(2019.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：Ｅ−［Ｇ−Ｌ−Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）n］mで表される、複合体
[式中、
Ｅは、治療又は診断エフェクター分子であり、
Ｄ（ＯＳＯ3-Ｍ+）nは、ｎ個の硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+を担持するデンドリマーＤであり、ここで前記硫酸基の数であるｎは６〜９６から選択され、
Ｍは、アニオン性硫酸基に対するカチオン性無機又は有機対イオンであり、
Ｌは、Ｄ及びＥ間のリンカー又はスペーサーであり、
Ｇは、ＬとＥとの間に結合を形成する結合官能基であり、そして
ｍは、１〜２０の整数である］。
【請求項２】
前記複合体の各デンドリマーＤは、同じ分子量を有する、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記硫酸基の数ｎが各デンドリマーＤについて同じである、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
前記デンドリマーＤを構築するモノマーの反復単位が、１，２−置換グリセロール、１，３−置換グリセロール、ペンタエリトリトール、グルコース、マンノース、ガラクトース、リシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（プロピオン酸）アミノメタン、１，１’−ビス（ヒドロキシメチル）−プロピオン酸、コハク酸、グルタル酸、マレイン酸、グリコール酸、ジグリコール酸、アジピン酸、乳酸、クエン酸、プロピオン酸（２−アミノエチル）アミド、プロピレンイミン、エチレンイミン、プロピレンオキシド、及びエチレンオキシドから成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５】
前記デンドリマーＤ中の前記モノマーの結合が、エーテル、チオエーテル、カルボン酸エステル、スルホニルエステル、スルホンアミド、カルボキシルアミド、アミン、カルバメート、チオカルバメート、尿素、チオウレア、ヒドラゾン、イミン、ジスルフィド、ホスフェート、ホスホネート、トリアゾール、アセタール、及びケタールから選択される官能基に基づかれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
Ｄが、１，２−ジスルファトアルキル、１，３−ジスルファトアルキル、１，２，４−トリスルファト−３−アルキル、Ｎ、Ｎ’−ジ（１−スルファトアルキル）アミン、トリス（スルファトメチル）メチル、及び１，２，３，４，５−ペンタスルファトアルキルから選択される末端基を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項７】
Ｌが、１又は２以上のメチレン基がＯ、Ｓ、ＮＨ、ＮＨ−Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ、Ｃ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ）2、Ｓ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ2）Ｏ、Ｓ−Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ、Ｃ＝Ｎ−ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）Ｏ、Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）Ｏ、アリーレン、エテニレン又はエチニレン、及びトリアゾリレン（ここで任意の水素原子がメチル、エチル又はヒドロキシメチルにより独立して選択されていてもよい）からなる群から選択される単位により独立して置換されていてもよい、脂肪族環状、分岐鎖状又は直鎖状単位からなる群から選択されるＣ4-100−アルキル基である、請求項１に記載の複合体。
【請求項８】
Ｅが、治療又は診断エフェクター分子である、請求項１に記載の複合体。
【請求項９】
前記エフェクター分子が、小分子、ペプチド、タンパク質、グリカン及び核酸から成る群より選択される、請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
前記エフェクター分子が、増殖、アポトーシス、結合組織材料（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン）の合成、免疫機能、セネッセンス又は免疫防御の細胞内機構を妨げることができる物質を含む治療エフェクター分子である、請求項８又は９に記載の複合体。
【請求項１１】
前記小分子が、細胞増殖抑制剤、及びペプチド又はペプチド模倣構造体（天然又は非天然構造の修飾を有する環状又は開鎖ペプチドを含む）からなる群から選択される、請求項９に記載の複合体。
【請求項１２】
前記タンパク質が、球状タンパク質、糖タンパク質、毒素、酵素、抗体、抗体フラグメント、操作された抗体及びタンパク質構造体（単一ドメイン抗体（sdAb）、単鎖Ｆｖ抗体（scFv）、単鎖Ｆｖ−Ｆｃ抗体（scFv-Fc）を含む）からなる群より選択される、請求項９に記載の複合体。
【請求項１３】
Ｅが、腫瘍細胞の増殖及びアポトーシスに関与する分子に対して向けられる、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１４】
Ｇが、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＨ−Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ、Ｃ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ）2、Ｓ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ2）Ｏ、Ｓ−Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ、Ｃ ＝ Ｎ−ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）Ｏ、Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）Ｏ、アリーレン、エテニレン、エチニレン、及びトリアゾリレンからなる群より選択される、ＥとＬとの間に共有結合を形成する結合官能基である、請求項１に記載の複合体。
【請求項１５】
（ｉ）癌、炎症、自己免疫疾患、代謝性疾患及び線維症を包含する群より選択される疾患の治療における、又は（ｉｉ）抗増殖性、増殖促進性、抗アポトーシス性、アポトーシス促進性、抗線維性、線維化促進性、抗脂質生成性、抗糖尿病性、免疫刺激性及び抗加齢性の治療を包含する群より選択される治療における使用のための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の複合体を含む医薬組成物。