(57)【要約】【課題】  大腸菌を用いて生産される、野生型（天然型）もしくはそのアミノ酸配列の一部が置換された組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼを効率的に高純度で製造する製造方法を提供すること。【解決手段】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現可能な組換え大腸菌を培養する工程、及び培養した大腸菌からＴ７ＲＮＡポリメラーゼを精製する工程を含む、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの製造方法であって、精製工程で使用するカラムクロマトグラフィーゲルとして、少なくとも疎水性クロマトゲル、陰イオン交換クロマトグラフィーゲル及びアフィニティークロマトグラフィーゲルを用いる、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの製造方法により、解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現可能な組換え大腸菌を培養する工程、及び
培養した大腸菌からＴ７ＲＮＡポリメラーゼを精製する工程
を含む、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの製造方法であって、  
精製工程で使用するカラムクロマトグラフィーゲルとして、少なくとも疎水性クロマトゲル、陰イオン交換クロマトグラフィーゲル及びアフィニティークロマトグラフィーゲルを用いる、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの製造方法。
【請求項２】
カラムクロマトグラフィーの順番が、疎水性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーの順である、請求項１に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼの製造方法。
【請求項３】
疎水性クロマトゲルのリガンドがフェニルを含み、陰イオン交換クロマトゲルのリガンドがＤＥＡＥを含み、アフィニティークロマトゲルのリガンドがヘパリンを含む、請求項１または２に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼの製造方法。
【請求項４】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現可能な組換え大腸菌を培養する工程、及び
培養した大腸菌からＴ７ＲＮＡポリメラーゼを精製する工程
を含む、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの製造方法であって、
培養工程が、培養液中の大腸菌の菌体濃度がＯＤ６００で２から４である対数増殖期初期にイソプロピル‐β‐チオガラクトピラノシドを培地に２〜４ｍＭになるように加えた後、２２℃〜２８℃で１６〜２４時間培養する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は大腸菌を用いて生産される、野生型（天然型）もしくはそのアミノ酸配列の一部が置換された組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼを大量に高純度で製造する製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはＴ７プロモーター配列を含む二本鎖ＤＮＡを鋳型、ＮＴＰを基質として、プロモーター下流の鋳型ＤＮＡに相補的な一本鎖ＲＮＡを合成する酵素であり、生化学分野において広く用いられており、例えば、インヴィトロ転写や大腸菌における高発現系（特許文献１）、無細胞タンパク合成系、塩基配列決定法（特許文献２）、等温核酸増幅法等で利用されている。等温核酸増幅法の１つであるＴＲＣ法では、熱安定性及び／または比活性の高いＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体を用いて４６℃にて核酸増幅反応を行っている（特許文献３及び非特許文献１）。
【０００３】
アミノ酸置換により機能改変されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体も多数報告されており、例えば、アミノ酸置換により認識するプロモーター配列を改変した酵素（特許文献４）、高温での比活性及び熱安定性を高めた酵素（特許文献５、特許文献６）、宿主での生産性を高めた酵素（特許文献７）、アミノ酸の欠失と置換により３’−デオキシリボヌクレオチドの取り込み能を増強した酵素（特許文献８）などがある。
【０００４】
これら組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼの主な製造方法は、大腸菌を用いてＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体を菌体内発現させ、菌体破砕後、破砕液を陰イオン交換クロマトゲルやアフィニティークロマトゲル等に供し精製されている（特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２）。
【０００５】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、精製過程において、プロテアーゼによる分解を受けることが報告されており（非特許文献２）、プロテアーゼインヒビターの添加、速やかなプロテアーゼとの分離、プロテアーゼ欠損株の使用などが、高純度なＴ７ＲＮＡポリメラーゼを高収率に製造する上で有効である。また、核酸増幅反応に使用するうえでは、プロテアーゼのほか、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅとの分離は必須である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４９５２４９６号
【特許文献２】特開平１１−１８７９９号公報
【特許文献３】特開２０００−１４４００号公報
【特許文献４】米国特許第５３８５８３４号
【特許文献５】ＷＯ２０１０／０１６６２１
【特許文献６】特表２００３−５２５６２７号公報
【特許文献７】特許第５７８９９４９号
【特許文献８】特開２００３−６１６８３号公報
【特許文献９】米国特許第５３８５８３４号
【特許文献１０】ＷＯ２００１／０６６７０５号
【特許文献１１】特許第３４８０７９５号
【特許文献１２】特許第４３９９６８４号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３）
【非特許文献２】ＧＲＯＤＢＥＲＧ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０，１２４５−１２５３（１９８８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決する課題は、大腸菌を用いて生産される、野生型（天然型）もしくはそのアミノ酸配列の一部が置換された組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼを効率的にかつ高純度に製造する製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために鋭意検討した結果、大腸菌によるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの発現は、ＩＰＴＧによる発現誘導後、２５℃にて培養することで、生産効率（培養液あたりのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現量）を落とすことなく終夜実施可能になること、プロテアーゼは、疎水クロマトグラフィーにより、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅは、陰イオンクロマトグラフィーにより、プロテアーゼによって分解されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ分解物は、アフィニティークロマトグラフィーにより、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと分離可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち本発明は、以下の通り例示できる。
［１］
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現可能な組換え大腸菌を培養する工程、及び
培養した大腸菌からＴ７ＲＮＡポリメラーゼを精製する工程
を含む、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの製造方法であって、  
精製工程で使用するカラムクロマトグラフィーゲルとして、少なくとも疎水性クロマトゲル、陰イオン交換クロマトグラフィーゲル及びアフィニティークロマトグラフィーゲルを用いる、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの製造方法。
［２］
カラムクロマトグラフィーの順番が、疎水性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーの順である、［１］に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼの製造方法。
［３］
疎水性クロマトゲルのリガンドがフェニルを含み、陰イオン交換クロマトゲルのリガンドがＤＥＡＥを含み、アフィニティークロマトゲルのリガンドがヘパリンを含む、［１］または［２］に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼの製造方法。
［４］
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現可能な組換え大腸菌を培養する工程、及び
培養した大腸菌からＴ７ＲＮＡポリメラーゼを精製する工程
を含む、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの製造方法であって、
培養工程が、培養液中の大腸菌の菌体濃度がＯＤ６００で２から４である対数増殖期初期にイソプロピル‐β‐チオガラクトピラノシドを培地に２〜４ｍＭになるように加えた後、２２℃〜２８℃で１６〜２４時間培養する工程を含む、方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明におけるＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現可能な組換え大腸菌の種類に制限はないが、Ｋ−１２株やＢ株を由来とする取り扱いの簡便な大腸菌が望ましい。Ｗ３１１０株、ＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株、Ｂ８３４株、ＢＬ２１株、Ｃ１７５７株などが例示でき、より好ましくは、プロテアーゼを欠損させたＢ８３４株、ＢＬ２１株、Ｃ１７５７株が例示できるが、それらに限定されない。
【００１２】
上記宿主に形質転換されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現ベクターは、特に限定されないが、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃプロモーターなどを有する大腸菌で使用可能な発現プラスミドが好ましい。ｐＴｒｃ９９Ａ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、ｐＣＤＦ−１ｂ（タカラバイオ製）といった発現用プラスミドが例示できるが、それらに限定されず、一般的な大腸菌用ベクターであればよい。
【００１３】
適切な栄養培地を用いて、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現を可能にする条件下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現可能な組換え大腸菌を培養することで、菌体内にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現させることができる。培養温度は、大腸菌が生育できる温度であればよく、好ましくは２０℃から４０℃、より好ましくは２５℃から３７℃である。製造される菌体量および菌体内のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現量は、培養時間と培養温度によって調節することが可能である。例えば、培養を１０時間程度行う場合、植菌から培養終了まで、培養温度は３０℃から３７℃が好ましく、培養を２０時間程度行う場合、植菌から発現誘導開始まで培養温度を３０℃から３７℃で行い、発現誘導から培養終了まで、培養温度を２２℃から２８℃で行うことが好ましい。培養時間に合わせて培養温度を調節することで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの生産効率（培養液あたりのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現量）を落とすことなく製造することができる。Ｔ７の発現誘導のためにＩＰＴＧを添加する時期は、対数増殖期であればよいが、好ましくは培養液中の菌体濃度がＯＤ６００で１から８、より好ましくは２から４の対数増殖期初期である。添加されるＩＰＴＧの培養液中の濃度は、Ｔ７が発現誘導される濃度であればよく、好ましくは１〜５ｍＭ、より好ましくは２〜４ｍＭである。
【００１４】
菌体内に発現したＴ７ＲＮＡポリメラーゼをカラムクロマトに供するまでの前処理は、タンパク質精製で一般に行われている、プロテアーゼ阻害剤の添加、除核酸、硫安沈殿、清澄化フィルター濾過等が有効である。遠心分離により回収された培養菌体をプロテアーゼ阻害剤を添加した適当な水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、圧力式破砕機等により細胞膜を破砕し細胞抽出液を得る。プロテアーゼ阻害剤として、ＰＭＳＦ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ等を用いることができ、濃度は、一般に使用されている濃度でよい。細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清に除核酸剤を添加、混合後、遠心分離することにより、核酸との分離を行うことができる。除核酸剤として、ポリアミン、ストレプトマイシンを用いることができ、濃度は、一般に使用されている濃度でよい。この遠心上清に残存する核酸や除核酸剤とＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、硫安沈殿によって、分離することができる。硫安沈殿に用いる上清中の硫安濃度は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを沈殿させる濃度であればよいが、好ましくは４０％飽和硫安濃度以上、より好ましくは５０％飽和硫安濃度である。硫安沈殿物を、プロテアーゼ阻害剤を添加した疎水クロマト溶離液（１Ｍ硫安含有）に溶解後、遠心分離により不溶物を沈殿除去、上清を清澄化フィルターで濾過することで、カラムクロマトに供する溶液が調製できる。
【００１５】
本製造方法に用いるカラムクロマトグラフィーは、疎水性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーであり、前記３種類のクロマトグラフィーのうち、疎水性クロマトグラフィーを最初に実施することが好ましい。陰イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーはどちらを先に実施してもよいが、疎水性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーの順番でクロマトグラフィーを実施することが、精製効率、純度を高めるうえで特に好ましい。
【００１６】
疎水性クロマトグラフィーのリガンドは、カラムクロマト供与液に混入するプロテアーゼとＴ７ＲＮＡポリメラーゼを分離可能なものであればよいが、好ましくは、ブチル、フェニルであり、より好ましくはフェニルである。陰イオン交換ククロマトグラフィーのリガンドは、カラムクロマト供与液に混入するＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅとＴ７ＲＮＡポリメラーゼを分離可能なものであれば構わないが、好ましくは、Ｑ、ＤＥＡＥ、より好ましくはＤＥＡＥである。アフィニティークロマトグラフィーのリガンドは、カラムクロマト供与液に混入するＴ７ＲＮＡポリメラーゼ分解物とＴ７ＲＮＡポリメラーゼを分離可能なものであれば構わないが、好ましくは、Ｐｈｏｓｐｈｏ、ヘパリン、より好ましくはヘパリンである。
【００１７】
精製工程において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを分解するプロテアーゼのサンプル中の混入具合は、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥし、１００ｋＤａの位置に泳動されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼのバンドの減少具合と８０ｋＤａの位置に泳動されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ分解物のバンドの増加具合から判断することができる。また、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅの混入具合は、ＤＮＡ、ＲＮＡのアガロース電気泳動で用いられているＤＮＡ  Ｍａｒｋｅｒ、ＲＮＡ  Ｍａｒｋｅｒとサンプルを混合し一定時間加温後、アガロース電気泳動し、各バンドの減少具合から判断することができる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの精製純度は、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥし、１００ｋＤａの位置に泳動されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼのバンドとそれ以外の位置に泳動されるバンドの割合により判断することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の製造方法は、スケールアップに容易に対応可能なコンベンショナルなカラムクロマトグラフィーの組み合わせであり、高純度な組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼを大量、高効率に製造することが可能となる。
【００１９】
本発明で製造したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡを合成するために使用することができる。具体的には、基質としてリボヌクレオチド（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）を使用し、特定の配列を有する二本鎖ＤＮＡを鋳型に、一本鎖ＲＮＡ合成を行なうことができる。さらに本発明で製造したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素との協奏的作用によって特定のＲＮＡ配列を含む標的ＲＮＡを増幅する等温核酸増幅反応にも使用することができる。等温核酸増幅反応としてはＴＲＣ法（特許文献３及び非特許文献１）、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法などが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、実施例３に記載の疎水クロマト回収後の濾液と透析後の回収液のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図２】図２は、実施例５に記載のアフィニティークロマト溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図３】図３は、実施例５に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ精製液のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図４】図４は、参考例１に記載の精製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた核酸増幅反応での蛍光強度の経時変化を示す。
【図５】図５は、参考例２に記載のアフィニティークロマト回収液透析後のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図６】図６は、参考例３に記載のアフィニティークロマト回収液透析後のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【実施例】
【００２１】
＜実施例１＞組換え大腸菌の培養
（Ｍ４９０Ｖ＋Ｑ７８６Ｍ）二重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌ＨＢ１０１株を用い、以下の手順で培養し、菌体を製造した。
（１）ＬＢＧ／Ｃｒｂ液体培地（１％  バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．８％  グリセロール、１００μｇ／ｍＬ  カルベニシリン）１００ｍＬに（Ｍ４９０Ｖ＋Ｑ７８６Ｍ）二重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌ＨＢ１０１株のグリセロールストックを植菌し、５００ｍＬ容量のひだ付き三角フラスコにて３７℃で一晩振とう培養した。
（２）８Ｌのペプトン培地（５％  トリプチケースペプトン、０．７％  リン酸水素二ナトリウム、０．３％  リン酸二水素カリウム、０．０５％  ＮａＣｌ、０．１％  塩化アンモニウム、４．４％  グリセロール、４．４％  グリセロール、０．０７４％  硫酸マグネシウム７水和物、０．００３３％  塩化カルシウム、０．００４％  硫酸第一鉄７水和物、１００μｇ／ｍＬ  カルベニシリン）に前培養液８０ｍＬを植菌し、１０Ｌ容量の発酵槽にて、３７℃、１ＶＶＭ、４００ｒｐｍで培養した。
（３）（２）の培養約５時間後（Ｏ．Ｄ．６００ｎｍの値としておよそ２．０）に４００ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）４０ｍＬを添加し、温度を２５℃に下げてさらに１８時間培養した。培養中酸素濃度は１．６ｐｐｍ以上、ｐＨは６．７から７．２の範囲に維持されていた。
（４）培養終了後、４℃にて２０，０００ｘｇで連続遠心分離し、湿菌体１００ｇを得た。菌体は０．８％  塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、直ちに次の処理をしない場合は−８０℃で保存した。
【００２２】
＜実施例２＞クロマトグラフ供与液の調製
実施例１にて調製した組換え大腸菌を用い、以下の手順でクロマトグラフ供与液を調製した。
（１）３種類のプロテアーゼインヒビター（ＰＭＳＦ（１０μｇ／ｍＬ）、ベンズアミジン（１００μＭ）、バシトラシン（１０μＭ））を含むＢａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  リン酸カリウム、５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ  ｐＨ７．５）を菌体１ｇあたり５ｍｌの割合で菌体に添加、氷冷下にて菌体を懸濁した。菌体懸濁液を圧力式細胞破砕機にて、７００ｂａｒで処理後、４℃、１５，０００ｘｇ、６０分の遠心分離にて可溶性画分を回収した。
（２）回収した画分にＰｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）を０．１％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウムを０．２Ｍとなるように添加し、氷冷下で２０分攪拌後、４℃、１５，０００ｘｇ、２０分の遠心分離にて上清を回収した。
（３）回収した上清に硫酸アンモニウムを２．４Ｍとなるように添加し、水酸化カリウムにてｐＨを７．５に調整、氷冷下で１０分攪拌後、４℃、１５，０００ｘｇ、６０分の遠心分離にて沈殿を回収した。沈殿は、直ちに次の処理をしない場合は−８０℃で保存した。
（４）回収した沈殿を疎水クロマト溶離液Ｂ（３種類のプロテアーゼインヒビター、１Ｍ  硫酸アンモニウムを含むＢａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．５）の実施例１（１）の１／２量に溶解し、氷冷下で１０分攪拌後、４℃、３０，０００ｘｇ、６０分の遠心分離にて上清を回収した。回収した上清をポアサイズ２μｍ程度の清澄化フィルターで濾過し、クロマトグラフ供与液とした。
【００２３】
＜実施例３＞疎水性クロマトグラフ    
実施例２にて調製したクロマトグラフ供与液を用い、以下の手順で疎水性クロマトグラフを実施した。
（１）ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｐｈｅｎｙｌ−６００Ｍゲルを充填したカラムを疎水クロマト溶離液Ａ（３種類のプロテアーゼインヒビターを含むＢａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ）で３ＣｏｌｕｍｎＶｏｌｕｍｅ（ＣＶ）洗浄後、疎水クロマト溶離液Ｂ３ＣＶで平衡化した。実施例２にて調製したクロマトグラフ供与液を通液後、疎水クロマト溶離液Ｂ／Ａが７／３の比で３ＣＶ洗浄した。疎水クロマト溶離液Ａを２ＣＶ通液し、２８０ｎｍの吸光度ピークの立ち上がりから通液終了までの１．５ＣＶを回収した。回収液を滅菌フィルターで濾過後、濾液を２０倍量のＢａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒで３回透析した。
（２）疎水クロマト回収後の濾液と透析後の回収液をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、１００ｋＤａの位置に泳動されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼのバンドおよび８０ｋＤａの位置に泳動されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ分解物のバンドの濃さの増減を比較したところ、透析前後で両バンドの濃さに変化は見られず、疎水性クロマトグラフにより、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ回収画分からプロテアーゼが除去されていることを確認した。（図１）
＜実施例４＞陰イオン交換クロマトグラフ    
実施例３にて調製した透析後液を用い、以下の手順で陰イオン交換クロマトグラフを実施した。
（１）ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＧｉｇａＣａｐＤＥＡＥ−６５０Ｍゲルを充填したカラムを陰イオン交換クロマト溶離液Ｂ（１Ｍ塩化ナトリウムを含むＢａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．５）３ＣｏｌｕｍｎＶｏｌｕｍｅ（ＣＶ）で洗浄後、陰イオン交換クロマト溶離液Ａ（Ｂａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ）３ＣＶで平衡化した。実施例３にて調製した透析後液を通液後、陰イオン交換クロマト溶離液Ａ３ＣＶで洗浄した。陰イオン交換クロマト溶離液Ａ１００％から陰イオン交換クロマト溶離液Ｂ１００％へのリニアグラジエント条件で６ＣＶ通液し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ画分を溶出した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、２８０ｎｍの吸光度ピークの立ち上がり（溶離液中の塩化ナトリウム濃度は０．０６Ｍ）から溶離液中の塩化ナトリウム濃度が０．４Ｍになるまで間で溶出された。
回収液をＢａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒで３倍希釈後、１５倍量のＢａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒで２回透析した。
（２）透析後の回収液をアガロース電気泳動用のＤＮＡ  Ｍａｒｋｅｒ、およびＲＮＡ  Ｍａｒｋｅｒと混合し、３７℃にて６時間加温後、混合液をアガロース電気泳動し、各バンドの濃さを調べたところ、両Ｍａｒｋｅｒとも回収液の添加の有無でバンドの濃さに変化は見られず、陰イオン交換クロマトグラフにより、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ回収画分からＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅが除去されていることを確認した。
【００２４】
＜実施例５＞アフィニティークロマトグラフ      
実施例４にて調製した透析後液を用い、以下の手順でアフィニティークロマトグラフを実施した。
（１）ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｈｅｐａｒｉｎ−ＨＣ６５０Ｍゲルを充填したカラムをアフィニティークロマト溶離液Ｂ（１Ｍ塩化ナトリウムを含むＢａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．５）３ＣｏｌｕｍｎＶｏｌｕｍｅ（ＣＶ）で洗浄後、アフィニティークロマト溶離液Ａ（Ｂａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ）３ＣＶで平衡化した。実施例４にて調製した透析後液を通液後、アフィニティークロマト溶離液Ａ３ＣＶで洗浄した。アフィニティークロマト溶離液Ａ１００％から陰イオン交換クロマト溶離液Ｂ１００％へのリニアグラジエント条件で６ＣＶ通液し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ画分を溶出した。溶出画分には、まずＴ７ＲＮＡポリメラーゼ分解物が溶出され、その後Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが溶出される（図２）ため、溶出液の後半を回収することで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを高純度に回収することができる。フラクション分取された溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの溶出されたフラクションを回収した。回収液を透析ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ  リン酸カリウム、２００ｍＭ  塩化ナトリウム、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ  ｐＨ７．５）で２倍希釈後、２０倍量の透析ｂｕｆｆｅｒで２回透析した。回収した透析後液を滅菌フィルターで濾過し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ精製液とした。精製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼの２８０ｎｍの吸光度は、１４であった。またＳＤＳ−ＰＡＧＥにより酵素タンパク純度を分析し、ほぼ単一のタンパクであることを確認した。（図３）
＜参考例１＞精製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応
実施例５にて調製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ精製液を用い、ＴＲＣ法による核酸増幅反応を、結核菌のリボゾーマルＲＮＡ遺伝子（ｒＲＮＡ）を標的ＲＮＡとして、以下の方法で実施した。
（１）結核菌群ｒＲＮＡ検出試薬（ＴＲＣＲｅａｄｙ  ＭＴＢ（商品名）、東ソー製）に添付のＭＴＢ  ＲＮＡ陽性標準（濃度：１０４コピー／５μＬ）をＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、５ｍＭ  ジチオスレイトール）にて、１０３コピー／５μＬとなるよう希釈した。
（２）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容のＰＣＲ用チューブに分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００２５】
（反応液の組成）（最終反応液量３０μＬにおける濃度または量）
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ  ＭｇＣｌ２ 
１００ｍＭ  ＫＣｌ
６Ｕ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
１ｍＭ  ジチオスレイトール
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、  ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
各３．０ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
０．１２μＭ  切断用オリゴヌクレオチド（ＭＴＢ−Ｓ−１）
１．０μＭ  第一のプライマー（ＭＴＢ−Ｆ−１）
１．０μＭ  第二のプライマー（ＭＴＢ−Ｒ−１）
７．５ｎＭ  蛍光色素標識された検出用プローブ（ＭＴＢ−Ｐ−１）
１％  ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（３）（２）の反応液を４６℃で５分間保温後、あらかじめ同温度で２分間保温した以下に示す組成の酵素液５μＬを添加した。
【００２６】
（酵素液の組成）（最終反応液量３０μＬにおける濃度または量）
２％  ソルビトール
３．６μｇ  牛血清アルブミン
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４０Ｕ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
容量調整用蒸留水
（４）直接測定可能な温度調節機能付き蛍光光度計（ＴＲＣＲｅａｄｙ−８０（商品名）、東ソー製）を用い、励起波長５００ｎｍ、蛍光波長５４５ｎｍで、反応溶液中の蛍光強度を経時的に測定した。
【００２７】
酵素添加時の時間を０分として、反応液の蛍光強度の経時変化（ｎ＝４で測定）を図４に示した。本発明にて製造したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、ＭＴＢ  ｒＲＮＡを増幅した。このことから、本発明により製造されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼが、核酸増幅反応であるＴＲＣ法に使用可能であることが確認された。
【００２８】
＜参考例２＞アフィニティークロマトグラフ（ヘパリン）  
実施例２（３）にて調製した沈殿を用い、以下の手順でアフィニティークロマトグラフを実施した。
（１）実施例２（３）にて調製した沈殿をアフィニティークロマト溶離液Ａ（Ｂａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ）に溶解し、氷冷下で１０分攪拌後、４℃、３０，０００ｘｇ、６０分の遠心分離にて上清を回収した。回収した上清をポアサイズ２μｍ程度の清澄化フィルターで濾過し、クロマトグラフ供与液とした。
（２）ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｈｅｐａｒｉｎ−ＨＣ６５０Ｍゲルを充填したカラムをアフィニティークロマト溶離液Ｂ（１Ｍ塩化ナトリウムを含むＢａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．５）３ＣｏｌｕｍｎＶｏｌｕｍｅ（ＣＶ）で洗浄後、アフィニティークロマト溶離液Ａ（Ｂａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ）３ＣＶで平衡化した。クロマトグラフ供与液を通液後、アフィニティークロマト溶離液Ａ３ＣＶで洗浄した。アフィニティークロマト溶離液Ａ１００％から陰イオン交換クロマト溶離液Ｂ１００％へのリニアグラジエント条件で６ＣＶ通液し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ画分を溶出した。溶出画分には、まずＴ７ＲＮＡポリメラーゼ分解物が溶出され、その後Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが溶出されるため、溶出液の後半を回収することで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを高純度に回収することができる。フラクション分取された溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの溶出されたフラクションを回収した。回収液を透析ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ  リン酸カリウム、２００ｍＭ  塩化ナトリウム、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ  ｐＨ７．５）で２倍希釈後、２０倍量の透析ｂｕｆｆｅｒで２回透析した。
（３）アフィニティークロマト回収液と透析後の回収液をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、１００ｋＤａの位置に泳動されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼのバンドおよび８０ｋＤａの位置に泳動されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ分解物のバンドの濃さの増減を比較したところ、透析後の回収液で１００ｋＤａの位置に泳動されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼのバンドの著しい減少と８０ｋＤａの位置に泳動されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ分解物のバンドの著しい増加が見られた。ヘパリンクロマトグラフでは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ回収画分からプロテアーゼは除去できないことを確認した。（図５）
＜参考例３＞アフィニティークロマトグラフ（Ｐｈｏｓｐｈｏ）
実施例２（３）にて調製した沈殿を用い、以下の手順でアフィニティークロマトグラフを実施した。
（１）実施例２（３）にて調製した沈殿をアフィニティークロマト溶離液Ａ（Ｂａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ）に溶解し、氷冷下で１０分攪拌後、４℃、３０，０００ｘｇ、６０分の遠心分離にて上清を回収した。回収した上清をポアサイズ２μｍ程度の清澄化フィルターで濾過し、クロマトグラフ供与液とした。
（２）Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅゲル（ＪＮＣ株式会社製）を充填したカラムをアフィニティークロマト溶離液Ｂ（１Ｍ塩化ナトリウムを含むＢａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．５）３ＣｏｌｕｍｎＶｏｌｕｍｅ（ＣＶ）で洗浄後、アフィニティークロマト溶離液Ａ（Ｂａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ）３ＣＶで平衡化した。クロマトグラフ供与液を通液後、アフィニティークロマト溶離液Ａ３ＣＶで洗浄した。アフィニティークロマト溶離液Ａ１００％から陰イオン交換クロマト溶離液Ｂ１００％へのリニアグラジエント条件で６ＣＶ通液し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ画分を溶出した。溶出液を透析ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ  リン酸カリウム、２００ｍＭ  塩化ナトリウム、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ  ｐＨ７．５）で２倍希釈後、２０倍量の透析ｂｕｆｆｅｒで２回透析した。
（３）アフィニティークロマト回収液と透析後の回収液をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、１００ｋＤａの位置に泳動されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼのバンドおよび８０ｋＤａの位置に泳動されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ分解物のバンドの濃さの増減を比較したところ、透析後の回収液で１００ｋＤａの位置に泳動されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼのバンドの著しい減少と８０ｋＤａの位置に泳動されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ分解物のバンドの著しい増加が見られた。Ｐｈｏｓｐｈｏクロマトグラフでは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ回収画分からプロテアーゼは除去できないことを確認した。（図６）
＜参考例４＞アフィニティークロマトグラフ（ヘパリン）
実施例３にて調製した透析後液を用い、以下の手順でアフィニティークロマトグラフを実施した。
（１）ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｈｅｐａｒｉｎ−ＨＣ６５０Ｍゲルを充填したカラムをアフィニティークロマト溶離液Ｂ（１Ｍ塩化ナトリウムを含むＢａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．５）３ＣｏｌｕｍｎＶｏｌｕｍｅ（ＣＶ）で洗浄後、アフィニティークロマト溶離液Ａ（Ｂａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ）３ＣＶで平衡化した。実施例３にて調製した透析後液を通液後、アフィニティークロマト溶離液Ａ３ＣＶで洗浄した。アフィニティークロマト溶離液Ａ１００％から陰イオン交換クロマト溶離液Ｂ１００％へのリニアグラジエント条件で６ＣＶ通液し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ画分を溶出した。溶出画分には、まずＴ７ＲＮＡポリメラーゼ分解物が溶出され、その後Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが溶出されるため、溶出液の後半を回収することで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを高純度に回収することができる。フラクション分取された溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの溶出されたフラクションを回収した。回収液を透析ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ  リン酸カリウム、２００ｍＭ  塩化ナトリウム、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ  ｐＨ７．５）で２倍希釈後、２０倍量の透析ｂｕｆｆｅｒで２回透析した。
（２）透析後の回収液をアガロース電気泳動用のＤＮＡ  Ｍａｒｋｅｒと混合し、３７℃にて６時間加温後、混合液をアガロース電気泳動し、各バンドの濃さを調べたところ、各バンドは薄く、かつ／もしくは、スメアになっていた。ヘパリンクロマトグラフでは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ回収画分からＤＮａｓｅは除去できないことを確認した。
【００２９】
＜参考例５＞アフィニティークロマトグラフ（Ｐｈｏｓｐｈｏ）
実施例３にて調製した透析後液を用い、以下の手順でアフィニティークロマトグラフを実施した。
（１）Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅゲル（ＪＮＣ株式会社製）を充填したカラムをアフィニティークロマト溶離液Ｂ（１Ｍ塩化ナトリウムを含むＢａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．５）３ＣｏｌｕｍｎＶｏｌｕｍｅ（ＣＶ）で洗浄後、アフィニティークロマト溶離液Ａ（Ｂａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ）３ＣＶで平衡化した。実施例３にて調製した透析後液を通液後、アフィニティークロマト溶離液Ａ３ＣＶで洗浄した。アフィニティークロマト溶離液Ａ１００％から陰イオン交換クロマト溶離液Ｂ１００％へのリニアグラジエント条件で６ＣＶ通液し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ画分を溶出した。溶出液を透析ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ  リン酸カリウム、２００ｍＭ  塩化ナトリウム、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ  ｐＨ７．５）で２倍希釈後、２０倍量の透析ｂｕｆｆｅｒで２回透析した。
（２）透析後の回収液をアガロース電気泳動用のＤＮＡ  Ｍａｒｋｅｒと混合し、３７℃にて６時間加温後、混合液をアガロース電気泳動し、各バンドの濃さを調べたところ、各バンドは薄く、かつ／もしくは、スメアになっていた。Ｐｈｏｓｐｈｏクロマトグラフでは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ回収画分からＤＮａｓｅは除去できないことを確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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