(57)【要約】      （修正有）【課題】短鎖核酸分子の検出シグナルが増強された電気化学的核酸検出方法の提供。【解決手段】被検サンプル中の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法であって、前記短鎖標的核酸の末端にアデニン連続配列を有する核酸を付加してｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸とし、ポリヌクレオ塩基プローブ及び核酸非結合物質が導体に結合してなるポリヌクレオ塩基修飾電極と、前記ｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸を含有する液体組成物と、を接触させ、前記ポリヌクレオ塩基修飾電極に酸化還元マーカーを接触させ、前記ポリヌクレオ塩基修飾電極上の前記酸化還元マーカーの酸化還元反応による前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受を検出する、短鎖標的核酸の電気化学的検出方法。【選択図】図１Ｃ
2020051890.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検サンプル中の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法であって、
前記短鎖標的核酸の末端にアデニン連続配列を有する核酸を付加してｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸とし、
ポリヌクレオ塩基プローブ及び核酸非結合物質が導体に結合してなるポリヌクレオ塩基修飾電極と、前記ｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸を含有する液体組成物と、を接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極に酸化還元マーカーを接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極上の前記酸化還元マーカーの酸化還元反応による前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受を検出する、短鎖標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項２】
前記ｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸におけるアデニン連続配列を構成する核酸の数が、２０〜１４０塩基である、請求項１に記載の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項３】
更に、前記ｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸におけるアデニン連続配列と、結合可能なチミンの連続配列を有する核酸と、を接触させ、各々をハイブリダイズさせ、ｐｏｌｙＴ結合短鎖標的核酸とする、請求項１又は請求項２に記載の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項４】
前記ｐｏｌｙＴ結合短鎖標的核酸におけるチミン連続配列を構成する核酸の数が、２０〜１４０塩基である、請求項３に記載の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項５】
前記酸化還元マーカーが、核酸結合性酸化還元マーカーである、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項６】
前記酸化還元マーカーが、メチレンブルー、ビオロゲン類縁体、ルテニウム錯体またはコバルト錯体である、請求項５に記載の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオ塩基プローブが、核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のヌクレオ塩基からなる、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオ塩基プローブがＰＮＡ又はＭＮＡからなる、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項９】
前記導体が金電極である、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極のポリヌクレオ塩基プローブ非結合領域に核酸非結合性物質が結合している、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項１１】
前記核酸非結合性物質が、ＨＨＴである、請求項１０に記載の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項１２】
前記短鎖標的核酸がＲＮＡである、請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項１３】
前記短鎖標的核酸がｍｉＲＮＡである、請求項１２に記載の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項１４】
前記酸化還元マーカーの前記酸化還元反応の測定が、前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への前記電子の前記授受により検出される、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項１５】
前記酸化還元マーカーの前記酸化還元反応の測定が、ポテンショスタット又はガルバノスタットにより行われる、請求項１〜請求項１４のいずれか１項に記載の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項１６】
前記酸化還元マーカーの前記酸化還元反応の測定が、ボルタンメトリー法（ＣＶまたはＳＷＶ）又は交流インピーダンス法（ＥＩＳ）により行われる、請求項１５に記載の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法。
【請求項１７】
被検サンプル中の短鎖標的核酸の電気化学的定量方法であって、
前記短鎖標的核酸の末端にアデニン連続配列を有する核酸を付加してｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸とし、
ポリヌクレオ塩基プローブ及び核酸非結合物質が導体に結合してなるポリヌクレオ塩基修飾電極と、前記ｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸を含有する液体組成物と、を接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極に酸化還元マーカーを接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極上の前記酸化還元マーカーの酸化還元反応による前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受レベルを測定し、
検出された前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への前記電子の前記授受レベルより、前記被検サンプル中の前記標的核酸を算出する、短鎖標的核酸の電気化学的定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、短鎖核酸分子の検出シグナルが増強された電気化学的核酸検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、２０塩基程度のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む低分子ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）が、様々な機能を有することから注目されている。特に、これらのｎｃＲＮＡレベルが疾患と相関する場合には、疾患マーカーとしての利用が可能である。核酸の検出方法として、種々の電気化学的な方法が報告されている。電気化学的方法では、電極に結合した核酸の負電荷による斥力や静電的相互作用、又は電極表面のプローブと形成した二本鎖へのインターカレートを利用して、プローブにハイブリダイズした標的核酸を検出する。このような電気化学的方法は、蛍光標識等を利用した生物学的方法と比較すると簡便で感度が高い。しかし、ｍｉＲＮＡなどの短鎖の核酸を検出する場合、プローブに結合した核酸の量が少ないことから、検出に限界がある。これまで、サンプル中の微量の短鎖核酸でも、高感度で検出可能な電気化学的核酸検出について検討されてきた。
【０００３】
例えば、特許文献１（特許公開２００６−６７９１４号）は、ループ部分と、当該ループ部分を介して存在している核酸分子内でハイブリダイズ可能な相補的な配列部分と、当該相補的な部分の片方が伸長された部分とを有することにより、ヘアピン構造をとる第一の長鎖核酸分子と、当該第一の長鎖核酸分子の伸長された部分と相補的な第二の核酸分子とがハイブリダイズした核酸複合体を利用することにより、短鎖核酸の検出感度を高めている。第一の長鎖核酸分子におけるループ部分と相補的な配列部分の一部は、短鎖の標的配列と相補的である。このような核酸複合体に、標的核酸が結合すると、分子内ハイブリダイズが解離して相補的な配列部分の片方（末端側）が一本鎖となる。この一本鎖部分が当該配列相補的な電極表面のプローブと結合することにより、標的配列よりも長鎖の核酸が電極に結合し、核酸の性質に基づく電気信号を増強している。
【０００４】
また、非特許文献１は、標的核酸の末端の一部と相補的な配列を有するＤＮＡプローブを結合させた電極と、標的核酸の反対側の末端と相補的な配列を有するレポーターＤＮＡプローブとを多数結合させた金ナノ微粒子を用いて、電極表面上に標的核酸を介して、プローブとレポータープローブを結合させるサンドイッチ法を開示している。この方法は、プローブ、標的核酸、及びレポータープローブを介して電極表面に結合した金ナノ粒子には、更に複数の第二のプローブが結合しているため、電極表面の核酸密度を高めることができる。酸化還元マーカーである［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋を、静電的相互作用により核酸に結合させて、その酸化還元電位により結合した標的核酸を検出する。
【０００５】
非特許文献２では、核酸分子の中でもアデニンが最も金に吸着されやすい性質を利用することにより、金電極表面へのプローブの化学的結合の工程を省略しながら核酸を電気化学的に測定している。プローブが結合した磁気ビーズをサンプルと接触させ、標的核酸を磁気ビーズに結合させて単離精製した後に、得られた標的核酸の３’末端にｐｏｌｙＡを伸長させる。標的核酸３’末端ｐｏｌｙＡ伸長物を金電極に接触させて、化学反応を起こすことなく吸着反応により核酸を金に付加し、［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−の酸化還元反応を検出している。
【０００６】
また、特許文献２（国際公開ＷＯ２０１７／１５８８４０）は、短鎖核酸がプライマーと同程度の長さしか持たないため、ＰＣＲ法による増幅が困難であることから、短鎖核酸を伸長して長鎖にしてから増幅させ、それをサンプルとして用いて電気化学的に検出する方法を開示している。
【０００７】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ＤＮＡやＲＮＡにおける糖鎖の代わりに、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンがアミド結合で結合した疑似ペプチド骨格を有する、ＤＮＡ又はＲＮＡアナログである。ＰＮＡはＤＮＡ又はＲＮＡと二本鎖を形成することができることから、新しいプローブとして利用されている（非特許文献３及び非特許文献４）。
【０００８】
ＰＮＡはＤＮＡと異なり電荷を持たない。この性質を利用してプローブに応用する電気化学的測定方法が知られている。例えば、ＰＮＡプローブと［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−を利用した測定方法が報告されている。本方法は、ＤＮＡ非結合では液中の負に帯電した［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−が容易に電極に到達するが、負電荷を持つＤＮＡがＰＮＡに結合すると電荷同士の斥力により［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−が電極に到達しないことを利用して標的ＤＮＡを検出する。
【０００９】
また、ＰＮＡプローブと共に金電極表面に８−アミノ−１−オクタンチオールを結合させることにより電極表面に陽電荷を与える方法が報告されている。本方法では、カチオンマーカー［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋を使用する。ＤＮＡ非結合状態では、８−アミノ−１−オクタンチオールによる陽電荷との斥力で［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋は電極に到達できないが、負電荷を持つＤＮＡが電極表面のＰＮＡと結合して、電荷が相殺されて失われると、［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋が電極表面に到達して還元反応を起こすことを利用してＤＮＡを検出する（特許文献３、非特許文献５及び６）。
【００１０】
また、金電極に標的配列と相補的なＰＮＡを結合することで、電極結合プローブへのカチオンの非特異的な結合を抑制し、検出感度を高めたとの報告もある。例えば、非特許文献７においては、金電極にＰＮＡプローブを結合し、プローブに結合したＤＮＡのリン酸基のアニオンと静電的相互作用により、金電極表面近傍に密集した［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋による電気信号を検出している。
【００１１】
核酸の電気化学的検出に利用する酸化還元種として、上述の［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−／３−、［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋の他、核酸結合性を有するメチレンブルー（非特許文献８及び９）、Ｏｒａｃｅｔ  Ｂｌｕｅ（非特許文献１０）の核酸単鎖と二本鎖への結合の違いを利用した方法になどが用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開第２００６−６７９１４号
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１７／１５８８４０号
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００２／０７３１８３
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｊｉｏｎｇ  Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ；１２８（２６）：８５７５−８５８０（２００６）
【非特許文献２】Ｋｅｖｉｎ  Ｍ．Ｋｏｏら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ；８８：２０００−２００５（２０１６）
【非特許文献３】Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ；２５４：１４９７−１５００（１９９１）
【非特許文献４】Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｅｇｈｏｌｍら、Ｎａｔｕｒｅ；３６５：５６６−５６８（１９９３）
【非特許文献５】Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ａｏｋｉら、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ；１２（１６）：１２７２−１２７６（２０００）
【非特許文献６】Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ａｏｋｉら、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ；１４（１９−２０）：１４０５−１４１０（２００２）
【非特許文献７】Ｍ．Ｓｔｅｉｃｈｅｎら、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ；２２：２２３７−２２４３（２００７）
【非特許文献８】Ｈｏｓｓａｉｎ−Ａｌｉ  Ｒａｆｉｅｅ−Ｐｏｕｒら、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ；７７：２０２−２０７（２０１６）
【非特許文献９】Ｃｈｅｎｍｅｎｇ  ＨＥら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；３３：１１５５−１１６０（２０１７）
【非特許文献１０】Ｍｏｓｔａｆａ  Ａｚｉｍｚａｄｅｈら、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ；７７：９９−１０６（２０１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
例えば、ｍｉＲＮＡは２０塩基前後の短い配列で構成されているため、負電荷量が少なく、これまでの電気化学的核酸検出方法では検出が困難であった。これまで、上述の通り、各種方法で電極表面の核酸量を増やす工夫がなされてきた。しかし、いずれの方法も特定の仲介プローブを別途作製する必要があるなど煩雑であった。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、短鎖の標的核酸の負の帯電（リン酸基）を増やすために、標的核酸を含む全ての核酸の３’末端にアデニンを付加する方法を採用した。更に、付加したアデニンの相補鎖であるポリチミン鎖を有する核酸を添加することにより、負の帯電（リン酸基）を更に増強することができることを見出した。
【００１６】
更に、本発明者らは、より検出下限濃度が低く、ダイナミックレンジも広い検出方法について種々の検討を行った。その結果、プローブとしてＰＮＡなどの非帯電性核酸物質を使用し、酸化還元マーカーとしてリン酸骨格を有する核酸への結合性のある酸化還元マーカーを使用することで、標的核酸とのハイブリダイゼーション後の１回の測定で標的核酸を検出可能であることから、より簡便な検出方法を提供することに成功した。
【００１７】
すなわち、本発明の一態様は、被検サンプル中の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法であって、
前記短鎖標的核酸の末端にアデニン連続配列を有する核酸を付加してｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸とし、
ポリヌクレオ塩基プローブ及び核酸非結合物質が導体に結合してなるポリヌクレオ塩基修飾電極と、前記ｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸を含有する液体組成物と、を接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極に酸化還元マーカーを接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極上の前記酸化還元マーカーの酸化還元反応による前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受を検出する、短鎖標的核酸の電気化学的検出方法。
に関する。
【００１８】
本発明の別に態様は、被検サンプル中の短鎖標的核酸の電気化学的定量方法であって、
前記短鎖標的核酸の末端にアデニン連続配列を有する核酸を付加してｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸とし、
ポリヌクレオ塩基プローブ及び核酸非結合物質が導体に結合してなるポリヌクレオ塩基修飾電極と、前記ｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸を含有する液体組成物と、を接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極に酸化還元マーカーを接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極上の前記酸化還元マーカーの酸化還元反応による前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受レベルを測定し、
検出された前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への前記電子の前記授受レベルより、前記被検サンプル中の前記標的核酸を算出する、短鎖標的核酸の電気化学的定量方法に関する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の一態様における方法は、短鎖標的核酸であるｍｉＲＮＡにｐｏｌｙＡポリメラーゼでＡを付加することによりｍｉＲＮＡの長さを伸長し、負の帯電を増強した。さらにｐｏｌｙＡの相補鎖となるｐｏｌｙＴをハイブリダイズさせることによりさらに負電荷を増強した。これにより、増強した負帯電に結合した酸化還元マーカーから流れる電流値を上げることができ、検出シグナルが向上した。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】左図は、標的核酸のハイブリダイゼーション前の状態の模式図を示し、右図は、標的核酸のハイブリダイゼーション後の模式図を示す。
【図１Ｂ】左図は、短鎖核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ）をサンプルとして用いてメチレンブルーで測定した時の模式図を示し、右図は、ｐｏｌｙＡを付加した短鎖核酸を、メチレンブルーで測定した時の模式図を示す。
【図１Ｃ】短鎖核酸にｐｏｌｙＡを付加し、更に短鎖核酸に付加したｐｏｌｙＡにさらにｐｏｌｙＴをハイブリダイズさせた模式図を示す。
【図２Ａ】ｐｏｌｙＡ付加時のメチレンブルーでの測定サイクリックボルタンメトリー法（ＣＶ）波形とピーク電流値を表すグラフである。上段は被検サンプルとして標的核酸を用いた結果、下段はサンプルとしてｐｏｌｙＡを付加した標的核酸を用いた結果を示す。縦軸は電流［ｎＡ］、横軸は電位［Ｖ］を表す。
【図２Ｂ】ｐｏｌｙＴ接触後にメチレンブルーを用いて測定したＣＶ波形とピーク電流値を表すグラフである。上段は被検サンプルとして標的核酸を用いた結果、下段はサンプルとしてｐｏｌｙＡを付加した標的核酸を用いた結果を示す。縦軸は電流［ｎＡ］、横軸は電位［Ｖ］を表す。
【図３】標的核酸濃度とメチレンブルーでＳＷＶ測定を行った時のピーク電流値を表すグラフである。縦軸はピーク電流値［ｎＡ］、横軸は標的核酸濃度［Ｍ］を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本出願において、「ヌクレオ塩基」とは、天然に存在するヌクレオチドの他、ヌクレオチドアナログを含む。天然に存在するヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及び／又はウラシル（Ｕ）の塩基を有するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドである。ヌクレオチドアナログとは、上述の天然に存在するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドと同じ塩基を有するが、リボースの化学構造、及び／又はホスホジエステル結合の化学構造が人為的に改変された人工ヌクレオチドを意味する。例えば、グリコール核酸（Ｇｌｙｃｏｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＧＮＡ）、架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ：ＢＮＡ）、２’，４’−架橋化核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＬＮＡ）、ペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ：ＰＮＡ）、トレオース核酸（Ｔｈｒｅｏｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＴＮＡ）、及びモルホリノ核酸（Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＭＮＡ）を挙げることができる。本出願において、ＧＮＡ，ＢＮＡ，ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡ、及びＭＮＡは、文脈によってモノマーと解釈してもよいし、ポリマーと解釈してもよい。
【００２２】
本出願において、「ポリヌクレオ塩基」とは、上述のヌクレオ塩基が直鎖状又は分岐状に重合した高分子化合物を意味する。ポリヌクレオ塩基は、１種類のヌクレオ塩基のみ（天然に存在するポリヌクレオチドのみ、又はＰＮＡの構成単位のみなど）からなるホモポリマーであってもよいし、２種類以上のヌクレオ塩基（天然に存在するポリヌクレオチドとＰＮＡ、又はＢＮＡとＬＮＡなど）のコポリマーであってもよい。よって、ＤＮＡ及びＲＮＡ等のポリヌクレオチド、並びに、ＧＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡ、及びＭＮＡのポリマーもポリヌクレオ塩基に含まれる。本出願において、「核酸」と「核酸分子」とは同義であり、ＤＮＡ及びＲＮＡの総称を表す。
【００２３】
特に、本出願において、「ｐｏｌｙＡ」とは、連続してアデニン塩基を有する核酸が重合した高分子化合物又は当該高分子化合物との結合物を意味する。ｐｏｌｙＡの長さとしては、２０〜１４０塩基、３０〜１３０塩基、４０〜１２０塩基、５０〜１１０塩基、６０〜１００塩基、又は７０〜９０塩基、あるいは８０塩基であってもよい。「ｐｏｌｙＴ」とは、連続してチミン塩基を有する核酸が重合した高分子化合物又は当該高分子化合物との結合物を意味する。ｐｏｌｙＴの長さは、ｐｏｌｙＡの長さに準じて決定することができ、例えば、２０〜１４０塩基、３０〜１３０塩基、４０〜１２０塩基、５０〜１１０塩基、６０〜１００塩基、又は７０〜９０塩基、あるいは８０塩基であってもよい。
【００２４】
本出願において「プローブ」又は「ポリヌクレオ塩基プローブ」とは、特にそのように解することが不整合である場合を除き同義であり、標的配列とのハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成するために用いられるポリヌクレオ塩基を意味する。プローブは、少なくともその一部に標的配列と相補的であり、標的配列と結合可能な配列を含む。プローブは、標識物質との結合や他の目的で標的配列と相補的でない配列を含んでいてもよい。
【００２５】
特に、ＤＮＡプローブを用いた場合には、メチレンブルー等がプローブに結合することによりバックグラウンドが上がるところ、本出願においては、核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のヌクレオ塩基をプローブとして用いることにより、標的核酸非存在時のバックグラウンドが低減されることを特徴とする。ハイブリダイズした核酸のみに核酸結合性酸化還元マーカーが結合することから、低濃度の標的核酸であっても検出が可能である。よって、核酸結合性酸化還元マーカーを用いた場合には、プローブを構成するポリヌクレオ塩基はメチレンブルー等の核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のポリヌクレオ塩基が好ましく、例えば、ＰＮＡ及びＭＮＡである。プローブのポリヌクレオ塩基部分は、核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のポリヌクレオ塩基のみからなることが好ましいが、必要に応じて、低い割合（例えば、１０％以下、５％以下、３％以下、１％以下、０．５％以下）の核酸結合性酸化還元マーカー低結合性のポリヌクレオ塩基を含んでいてもよい。
【００２６】
本出願において「酸化還元マーカー」とは、酸化還元状態の変化により電極表面への核酸の結合を検出可能な物質であれば特に制限されるものではないが、例えば、［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−、メチレンブルー、ビオロゲン類縁体、［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋などのルテニウム錯体およびコバルト錯体などを用いることができる。酸化還元マーカーとして、好ましくは、核酸結合性酸化還元マーカーである。
【００２７】
「核酸結合性酸化還元マーカー」は、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸分子には結合するが、非核酸分子には結合しない酸化還元マーカーである。本出願において、核酸結合性酸化還元マーカーは、好ましくは単鎖の核酸に結合可能な化合物であり、当該化合物は、二本鎖の核酸にも結合してもよい。また、核酸結合性酸化還元マーカーは、好ましくは、核酸二本鎖のみに結合するインターカレーターは含まない。「酸化還元マーカー」とは、酸化状態と還元状態を有し、酸化還元反応により電子の受け渡しが可能な化合物を意味する。このような核酸結合性酸化還元マーカーとしては、例えば、メチレンブルー、ビオロゲン類縁体、ルテニウム錯体およびコバルト錯体を挙げることができる。
【００２８】
メチレンブルーは正に帯電した核酸結合性酸化還元マーカーであり、−２５０ｍＶ付近に酸化還元電位をもつ。また、メチレンブルーの核酸への結合メカニズムについてはいくつか報告があり、単鎖ＤＮＡのグアニン塩基を介して結合すること（Ｙａｎｇ、Ｗら、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ；１４：１２９９−１３０２（２００２））や、負に帯電したリン酸基との静電的相互作用により結合すること（Ｚｈａｏ、Ｇら、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ；３９４：３３７−３４４（１９９９））、及びＤＮＡ二本鎖中のグアニン−シトシンペアに直接インカレートすること（Ａｒｉａｓ，ＰらＪ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ；６３４：１２３−１２６（２００９））が報告されている。さらに、メチレンブルーの酸化還元反応は２電子の移動が生じることにより電流値が大きく出るため、１電子授受型の酸化還元種に比べて微量な核酸が検出可能であるほか、電位差も大きいため核酸レベルの差を検出しやすい。特に、メチレンブルーでハイブリダイゼーションによる核酸の電気化学検出を行う際には、ＤＮＡ等の核酸プローブではなく、ＰＮＡなどの非帯電プローブを使用することにより、バックグラウンドを小さく抑えてハイブリダイズした核酸のみを検出することができ、検出感度が更に良好になる。これは、一般的に使われるＤＮＡなどの核酸プローブにはメチレンブルーが結合することにより、バックグラウンドが上がるためである。ＰＮＡはペプチド結合で塩基を連結しているため、メチレンブルーの結合が少ないと考えられる。
【００２９】
本出願において「標的核酸」とは、本発明の方法により存在を検出し、又は定量しようとする目的の核酸を意味する。標的核酸は天然物由来である必要はなく、例えば、人工核酸なども含む。例えば、本発明の方法を疾患や障害の診断目的で利用する場合、標的核酸は生体由来のＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。本明細書において、短鎖標的核酸とは、短い鎖長を有する標的核酸を意味する。短鎖標的核酸の長さは、５０ｍｅｒ以下、４５ｍｅｒ以下、４０ｍｅｒ以下、３５ｍｅｒ以下、３０ｍｅｒ以下、２９ｍｅｒ以下、２８ｍｅｒ以下、２７ｍｅｒ以下、２６ｍｅｒ以下、２５ｍｅｒ以下、２４ｍｅｒ以下、２３ｍｅｒ以下、２２ｍｅｒ以下、２１ｍｅｒ以下、例えば２０ｍｅｒ以下であってもよい。例えば、短鎖標的核酸の鎖長は、３ｍｅｒ以上、５ｍｅｒ以上、８ｍｅｒ以上、１０ｍｅｒ以上、１１ｍｅｒ以上、１２ｍｅｒ以上、１３ｍｅｒ以上、１４ｍｅｒ以上、１５ｍｅｒ以上、１６ｍｅｒ以上、１７ｍｅｒ以上、又は１８ｍｅｒ以上とすることができる。一例として、短鎖標的核酸の鎖長は、３〜５０ｍｅｒ、５〜４０ｍｅｒ、１０〜３０ｍｅｒ、１５〜２８ｍｅｒ、又は１８〜２５ｍｅｒである。また、短鎖標的核酸の代表例としては、ｍｉＲＮＡを挙げることができる。
【００３０】
本出願において「標的配列」とは、標的核酸に含まれる配列であって、検出の目的とする配列である。別の表現では、標的配列は、使用されるプローブと相補的な配列又は結合可能な配列を意味する。標的配列は、標的核酸の全長配列又は部分配列であってよい。標的配列の長さは、１０〜５０ｍｅｒである。例えば、標的配列の鎖長は、１０ｍｅｒ以上、１１ｍｅｒ以上、１２ｍｅｒ以上、１３ｍｅｒ以上、１４ｍｅｒ以上、１５ｍｅｒ以上、１６ｍｅｒ以上、１７ｍｅｒ以上、又は１８ｍｅｒ以上とすることができる。また、標的配列の鎖長は、５０ｍｅｒ以下、４５ｍｅｒ以下、４０ｍｅｒ以下、３５ｍｅｒ以下、３０ｍｅｒ以下、２９ｍｅｒ以下、２８ｍｅｒ以下、２７ｍｅｒ以下、２６ｍｅｒ以下、又は２５ｍｅｒ以下とすることができる。標的配列の鎖長は、１０〜４０ｍｅｒ、１３〜３０ｍｅｒ、１５〜２８ｍｅｒ、又は１８〜２５ｍｅｒとすることができる。
【００３１】
本出願において「非標的核酸」とは、本方法により検出することを目的としない核酸である。また、「非標的配列」とは、非標的核酸が有する配列を意味する。
【００３２】
「電極」は、ポリヌクレオ塩基プローブを結合させることができ、酸化還元マーカーによる酸化還元反応を検出可能な電極であれば、特に限定されるものではないが、例えば、好ましくは、貴金属電極であり、より好ましくは金電極である。金は、酸化還元プローブによる酸化還元反応の検出に適している。また、電極は、グラッシーカーボン、酸化グラフェンなどのカーボン電極表面に金が付着した構造をしていてもよい。また、ポリヌクレオ塩基プローブは金に直接結合している必要はなく、例えば、ポリヌクレオ塩基が結合したアクリル微粒子と金微粒子が共にカーボン電極表面に付着していてもよい。
【００３３】
「核酸非結合性物質」は、検出対象である核酸とは結合しない物質であって、プローブの構造を物理的に支える役割を果たす。核酸非結合性物質としては、例えば、短鎖アルカンチオールやジスルフィドであってもよく、より具体的には、６−メルカプト−１−ヘキサノール、６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール（ＨＨＴ）を挙げることができる。
【００３４】
本発明の一態様は、
被検サンプル中の短鎖標的核酸の電気化学的検出方法であって、
前記短鎖標的核酸の末端にアデニン連続配列を有する核酸を付加してｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸とし、
ポリヌクレオ塩基プローブ及び核酸非結合物質が導体に結合してなるポリヌクレオ塩基修飾電極と、前記ｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸を含有する液体組成物と、を接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極に酸化還元マーカーを接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極上の前記酸化還元マーカーの酸化還元反応による前記ポリヌクレオ塩基修飾電極への電子の授受を検出する、短鎖標的核酸の電気化学的検出方法に関する。
【００３５】
ｐｏｌｙＡを付加しない場合の模式図を図１Ａに示す。左図は、ハイブリダイゼーション前の状態の模式図を示し、右図は、ハイブリダイゼーション後の模式図を示す。１は金電極上に修飾した捕捉ＰＮＡプローブ、２は核酸非結合性物質のＨＨＴ、３は標的となる核酸、４は酸化還元種としてメチレンブルーを示す。メチレンブルーは正に帯電した酸化還元マーカーであり、−２５０ｍＶ付近に酸化還元電位をもつ。また、核酸のリン酸基に結合あるいは２本鎖核酸にインターカレートする。捕捉ＰＮＡプローブにハイブリダイズした核酸のリン酸基に結合しているメチレンブルーに電位をかけ、酸化還元電流を検出する。短鎖標的核酸にｐｏｌｙＡを付加した場合の模式図を図１Ｂに示す。左図は、ｐｏｌｙＡを付加していない短鎖核酸をサンプルとして用いてメチレンブルーで測定した時の模式図を示し、右図は、ｐｏｌｙＡを付加した短鎖核酸をサンプルとして用いて、メチレンブルーで測定した時の模式図を示す。また、図１Ｃは、短鎖核酸にｐｏｌｙＡを付加し、更に付加したｐｏｌｙＡにさらにｐｏｌｙＴをハイブリダイズさせた模式図を示す。左から順に、ｐｏｌｙＡを付加しなかった場合、ｐｏｌｙＡを２０塩基、４０塩基、及び８０塩基付加した場合を示す。ｐｏｌｙＡを付加することにより、負電荷が付加され、更にｐｏｌｙＴがｐｏｌｙＡにハイブリダイズすることにより、負電荷が増大する。ｐｏｌｙＡ及びｐｏｌｙＴによる負電荷の増加は、理論的にはｐｏｌｙＡの配列長に依存すると考えられる。
【００３６】
１．短鎖標的核酸へのアデニン連続配列の付加
本発明の実施形態における、短鎖標的核酸の末端にアデニン連続配列を有する核酸を付加してｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸を得るステップは、ポリメラーゼを用いて３’末端にアデニン残基を伸長させることにより付加してもよいし、制限酵素などを利用して予め調整しておいたｐｏｌｙＡを短鎖標的核酸に結合させてもよい。前者の場合、以下の手順により行うことができる。短鎖標的核酸、１０×ｐｏｌｙＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ、ＡＴＰ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｏｌｙＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、及び滅菌水を含む反応液を３７℃で５〜５０分間反応させる。アデニン付加後、６５℃で２０分間加温し、酵素を失活させる。得られた反応溶液は必要に応じて１×ＳＳＣ＋２０％ＤＭＳＯ溶液に溶解して用いることができる。また、短鎖標的核酸へのアデニン連続配列の付加は、当該短鎖標的核酸のみに付加する必要はなく、サンプル中に含まれる全ての核酸についてアデニンが付加されてもよい。
【００３７】
２．ポリヌクレオ塩基プローブの製造
本発明の実施形態において用いるポリヌクレオ塩基プローブは、標的配列と相補的に設計されたプローブ配列に基づき、本技術分野において周知の方法を利用して製造することができる。特に、ＤＮＡ又はＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ等のポリヌクレオ塩基は１塩基ずつ結合させる化学合成に方法が良く知られており、このような方法を採用することができる。また、必要に応じて、合成したポリヌクレオ塩基プローブを固相や標識などの修飾物質に結合することもできる。
【００３８】
３．修飾電極の製造
本発明の実施形態において用いる修飾電極は、金電極、又は、酸化グラフェンやスクリーンプリント電極上の金ナノ微粒子上に前記ポリヌクレオ塩基プローブを結合させることにより得ることができる。
【００３９】
４．短鎖標的核酸の電気化学的検出
本方法においては、電極表面に結合したプローブに相補的な配列を有する標的核酸が結合し、それにより酸化還元マーカーが結合するか又は接近できなくする。酸化還元マーカーの酸化還元反応による電子の放出又は獲得が電極における電流又は電圧の電気信号として現れる。すなわち、酸化還元マーカーから電極への電子の授受能増加又は減少により、結合した標的核酸を検出する。酸化還元マーカーを利用した電気化学的検出方法は広く知られている。例えば、メチレンブルーを用いた方法は本願実施例の他、上述の非特許文献に記載されている。
【００４０】
よって、本方法は、電極表面への標的核酸の結合と、酸化還元マーカーの酸化還元反応の電気化学的検出を必須の構成として含む。これらの本方法を構成する各反応は、順次行うこともできるし、同時に行うこともできる。例えば、標的核酸の存在を確認したい被検サンプルと酸化還元マーカーの両方を含む液体組成物中に修飾電極を浸し、プローブと標的核酸を反応させながら酸化還元マーカーの測定を行うこともできる。あるいは、電極表面に標的核酸の存在を確認したい被検サンプルを接触させた後、標的核酸に酸化還元マーカーを含む溶液に浸し、その後、酸化還元マーカーの酸化還元反応を電気化学的に検出してもよい。あるいは、電極表面に標的核酸の存在を確認したい被検サンプルと酸化還元マーカーを共に含む溶液に接触させて、標的核酸を結合させながら酸化還元マーカーの酸化還元反応を電気化学的に検出してもよい。ステップワイズに行う場合、各ステップの間に洗浄する工程を含んでいてもよい。例えば、電極表面への標的核酸の存在を確認したい被検サンプルを結合させた後、サンプルを含有しない液体（緩衝液など）中で電極を洗浄してから、酸化還元マーカーを接触させてもよい。あるいは、酸化還元マーカーが核酸結合性である場合、酸化還元マーカーを接触させた後、酸化還元マーカーを含まない液体（緩衝液など）で電極を洗浄してから、標的核酸に結合した酸化還元マーカーの酸化還元反応を電気化学的に検出してもよい。特に、核酸結合性の酸化還元マーカーを使用する場合、検出前に洗浄操作を行うことにより、液中の酸化還元マーカーによる非特異的なバックグラウンド電気信号を抑制することができることから、好ましくは、検出前に洗浄操作を行う。
【００４１】
被検サンプルが含有する核酸濃度としては、特に制限されるものではないが、例えば、１０−４〜１０−１６Ｍとすることができる。本方法は、被検サンプル中の標的核酸の存在を決定するために行われることから、被検サンプルは必ずしも標的核酸を含んでいる必要はない。また、被検サンプルは、標的核酸以外の核酸分子を含んでいてもよい。更に、被検サンプルは精製レベルが高いものでも低いものでもよく、被検体由来の物質として核酸のみを含んでいてもよいし、核酸以外の夾雑物（糖鎖、タンパク質など）を含んでいてもよい。例えば、被検サンプルは、検出対象となる標的核酸の存在を調べようとする目的の試料を用いて調製することができる。例えば、診断目的の場合、ＤＮＡ又はＲＮＡが検出されうる試料であれば特に制限されるものではなく、リンパ液、血液（血清、血漿）、尿、便、唾液、髄液、涙、バイオプシー、毛、皮膚、爪、浸出液、細胞（例えば、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、血管内皮細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ｍｕｓｅ細胞、又は多能性幹細胞から分化誘導された細胞）などの体液、細胞又は組織；エクソソーム；又はセルフリーＤＮＡを用いることができる。これらの試料は、適宜ＤＮＡ又はＲＮＡの検出に適したサンプルとして調製される。
【００４２】
被検サンプルと電極との反応は液中で行われ、プローブと標的核酸が結合可能な条件下であれば特に制限されるものではない。例えば、ハイブリダイズの条件として、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）又は，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗｉｌｅｙ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ等に記載の方法により行うことができる。例えば、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，０．０９Ｍ  クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ  ＮａＣｌ，０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中、３８〜４２℃で１０分〜１時間ハイブリダイズさせることができる。
【００４３】
酸化還元マーカーを含有する溶液中への電極の挿入は、例えば、上述の非特許文献の記載を参酌して行うことができる。特に、核酸結合性酸化還元マーカーを用いる場合、標的核酸への核酸結合性酸化還元マーカーの結合は、酸化還元マーカーの種類に応じて適宜決定することができる。例えば、ＮａＣｌＯ４含有リン酸バッファに酸化還元マーカーを添加して、標的核酸を結合させた電極に接触させ、１〜３０分整地することにより行うことができる。使用する酸化還元マーカーの濃度は、非特異的な結合を生じることなく核酸に効率的に結合する濃度であれば特に限定されるものではないが、例えば、メチレンブルーの場合、１〜１００μＭで行うことができる。検出測定時は酸化還元マーカーを測定溶液中に含有させないことが好ましい。すなわち、プローブにハイブリダイズした標的核酸に酸化還元マーカーを結合させた後、洗浄し、標的核酸に結合した酸化還元マーカーに電位をかけて起こる電子の授受を検出することが好ましい。測定液中に酸化還元マーカーが含まれていると液中の酸化還元マーカーから生じる電子の授受と標的核酸に結合している酸化還元マーカーからの電子の授受の区別が困難となり、検出感度が低下する可能性がある。
【００４４】
酸化還元反応の電気化学的測定は、例えば、ポテンショスタット又はガルバノスタットなどの三電極系の装置を用いて行うことができる。酸化還元反応の測定は、ＣＶなどのボルタンメトリー法；交流インピーダンス法（ＥＩＳ）；ファラデーインピーダンス分光法；及びクーロメトリー法により行うことができる。
【００４５】
５．標的核酸の電気化学的定量方法
本発明の別の態様は、被検サンプル中の短鎖標的核酸の電気化学的定量方法であって、
前記短鎖標的核酸の末端にアデニン連続配列を有する核酸を付加してｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸とし、
ポリヌクレオ塩基プローブ及び核酸非結合物質が導体に結合してなるポリヌクレオ塩基修飾電極と、前記ｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸を含有する液体組成物と、を接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極に酸化還元マーカーを接触させ、
前記ポリヌクレオ塩基修飾電極上の前記酸化還元マーカーの酸化還元反応による前記電極への電子の授受レベルを測定し、
検出された前記電極への前記電子の前記授受レベルより、前記被検サンプル中の前記標的核酸を算出する、短鎖標的核酸の電気化学的定量方法に関する。
【００４６】
この標的核酸の電気化学的定量方法の測定方法は、上述の標的核酸の電気化学的検出方法と同じ方法を用いて行うことができる。ただし、上述の方法において、結合した「標的核酸を検出」する代わりに「標的核酸のレベルを測定」することにより行う。本出願において、「レベル」とは、数値化された存在量に関する指標を意味し、例えば、標的核酸の濃度、量あるいはその代わりとして用いることができる指標を含む。よって、レベルは電気信号等の測定値そのものであってもよいし、濃度等に換算された値であってもよい。また、レベルは、絶対的な数値（存在量、単位面積・体積当たりの存在量など）であっても良いし、又は必要に応じて設定された比較対照と比較した相対的な数値であってもよい。例えば、標的核酸のレベルの測定は、測定値を予め決められた標準曲線に当てはめることにより行うことができる。あるいは、サンプルと同時に標準液を測定し、サンプルの測定値を標準液の測定値と比較して行うことができる。
【００４７】
６．ｐｏｌｙＴの結合
本発明の別の態様に係る方法は、前記ｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸におけるアデニン連続配列と結合可能なチミンの連続配列を有する核酸を接触させてｐｏｌｙＡ結合短鎖標的核酸とハイブリダイズさせることを含む。短鎖標的核酸とｐｏｌｙＴとの結合は、電極表面に結合したプローブと短鎖標的核酸とのハイブリダイズ前、ハイブリダイズと同時、又はハイブリダイズ後のいずれであってもよいが、好ましくは、ハイブリダイズ後である。短鎖標的核酸とｐｏｌｙＴとのハイブリダイズの条件は、上述のプローブと標的核酸のハイブリダイズ法に準じて行うことができ、例えば、１×ＳＳＣに溶解したｐｏｌｙＴと短鎖結合核酸とを接触させて、２０〜３０℃で４０分間静置することにより行うことができる。
【実施例】
【００４８】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【００４９】
（実施例１）
（１）電極の調製
裸金電極を酸素プラズマ装置で１０ｍＡ、２分間プラズマ照射を行い、金電極表面を洗浄した。洗浄した金電極上に０．０５％ＴＦＡに溶解した１０μＭのＰＮＡ（ＴＴＣＡＧＴＴＡＴＣＡＣＡＧＴＡＣＴＧＴＡ−ｏ−Ｃｙｓ：配列番号１）を１０μＬ塗布し、２５℃で３０分間静置した。その後、超純水で洗浄し、１ｍＭのＨＨＴを１０μＬ金電極上に塗布し、２５℃で３０分間静置した。
【００５０】
（２）ｍｉＲＮＡへのｐｏｌｙＡ付加
標的核酸として用いたｍｉＲＮＡへのｐｏｌｙＡ付加は２０μＭの人工ｍｉＲＮＡ（ＵＡＣＡＧＵＡＣＵＧＵＧＡＵＡＡＣＵＧＡＡ：配列番号２）にＥ．ｃｏｌｉ  ｐｏｌｙＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて付加した。反応条件は、１００μＭの人工ｍｉＲＮＡ  ４μＬ、１０×ｐｏｌｙＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ、１０ｍＭ  ＡＴＰ  ２μＬ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｏｌｙＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １μＬ、及び滅菌水１１μＬ添加した反応液を３７℃で５〜５０分間反応させた。経験的に本反応によるアデニン付加量は、約１０から１００塩基であると計算された。アデニン付加後、６５℃で２０分間加温し、酵素を失活させた。得られた反応溶液を１×ＳＳＣ＋２０％ＤＭＳＯ溶液で希釈し、標的濃度１００ｐＭ〜１０μＭの反応溶液として使用した。
【００５１】
（３）ハイブリダイゼーション及び電気化学測定
上記（１）で得られた捕捉プローブを修飾した金電極上に（２）で得られた反応溶液１０μＬを滴下し、４０℃で４０分ハイブリダイゼーションを行った。５０℃の超純水１００ｍＬ中で２分間、電極を洗浄後、５０μＭメチレンブルー＋０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４  １ｍＬ中に電極を浸し、５分静置した。その後、０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４で洗浄し、０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４１ｍＬ中にハイブリダイゼーションを行った後の金電極と、水系参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ  ＢＡＳ社製 ＲＥ−１Ｂ）と、Ｐｔカウンター電極（ＢＡＳ社製）とを浸し、ポテンショスタットを用いて、ＳＷＶの測定を初期電位０ｍＶから−５００ｍＶ、ステップ電位５ｍＶ、パルス振幅５０ｍＶ、周期２０Ｈｚの条件で行った。さらに、ＣＶの測定を初期電位０ｍＶ、高電位０ｍＶ、低電位−５００ｍＶ、スキャン速度５００ｍＶ／ｓｅｃで負方向の掃引により測定した。
【００５２】
（４）ｐｏｌｙＴ付加及び電気化学測定
ハイブリダイゼーション後の電極を洗浄後、１×ＳＳＣに溶解した５０μＭ  ｐｏｌｙＴ核酸（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ：配列番号３）１０μＬに電極を浸し、２５℃で４０分間ハイブリダイゼーションを行った。２×ＳＳＣ常温で洗浄後、５０μＭメチレンブルー＋０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４  １ｍＬ中に電極を浸し、５分静置した。その後、０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４で洗浄し、０．２５ｍＭリン酸バッファ（ナトリウム、ｐＨ７．０）＋０．５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４１ｍＬ中にハイブリダイゼーション後の金電極と、水系参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ  ＢＡＳ社製  ＲＥ−１Ｂ）と、Ｐｔカウンター電極（ＢＡＳ社製）とを浸し、ポテンショスタットを用いて、ＳＷＶの測定を初期電位０ｍＶから−５００ｍＶ、ステップ電位５ｍＶ、パルス振幅５０ｍＶ、周期２０Ｈｚの条件で行った。さらにＣＶの測定を初期電位０ｍＶ、高電位０ｍＶ、低電位−５００ｍＶ、スキャン速度５００ｍＶ／ｓｅｃで負方向の掃引を行った。
【００５３】
（５）結果
メチレンブルーでの測定結果のＣＶ波形とピーク電流値を図２Ａ及び図２Ｂに示す。図中の縦軸は電流［ｎＡ］、横軸は電位［Ｖ］を表す。ピーク電流値の差は、標的核酸のみの場合（図２Ａ上段）が１４．５ｎＡであるのに対し、ｐｏｌｙＡを付加した標的核酸（図２Ａ下段））では、２８．５ｎＡとシグナルが約２倍増強された。よって、ｐｏｌｙＡの付加により標的核酸への結合シグナルが増強されることが示された。また、ｐｏｌｙＴを接触させた場合、ピーク電流値の差は、標的核酸のみの場合（図２Ｂ上段）が１４．９ｎＡとＰｏｌｙＴ非接触の場合とあまり変わらなかったのに対し、ｐｏｌｙＡを付加した標的核酸（図２Ｂ下段）では、４０．８ｎＡと、ｐｏｌｙＴ非存在下と比較してシグナルが１．４倍増強されていた。よって、ｐｏｌｙＡの付加により標的核酸）への結合シグナルが増強されることが示された。すなわち、ｐｏｌｙＡ付加とｐｏｌｙＴの接触により、シグナルは２．８倍増強されていた。この結果から、ｐｏｌｙＡ付加とｐｏｌｙＴの接触が短鎖標的核酸の検出シグナルを増強することができ、検出下限濃度を下げることが示された。
【００５４】
また、標的核酸が存在すれば電流が流れるという仕組みから、ダイナミックレンジも広がり、分解能も細かく見られるようになった。図３は、ｐｏｌｙＡ付加前、ｐｏｌｙＡ付加後、ｐｏｌｙＴハイブリダイゼーション後にメチレンブルーでＳＷＶ測定した結果を示す。図３において、縦軸はピーク電流［ｎＡ］、横軸は標的核酸濃度［Ｍ］を示し、四角は伸長しない標的核酸、黒丸はｐｏｌｙＡで伸長した標的核酸、三角はｐｏｌｙＡで伸長した標的核酸にｐｏｌｙＴを結合したものを表す。ｐｏｌｙＡ付加前には検出下限濃度が約２ｎＭなのに対し、ｐｏｌｙＡやｐｏｌｙＴで増強すると検出下限濃度が約２００ｐＭであり、検出下限濃度が１桁下がった。
【図１Ａ】
2020051890.tif 000003
【図１Ｂ】
2020051890.tif 000004
【図１Ｃ】
2020051890.tif 000005
【図２Ａ】
2020051890.tif 000006
【図２Ｂ】
2020051890.tif 000007
【図３】
2020051890.tif 000008
【配列表】
2020051890000001.app