(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳動物においてコラーゲン合成を誘導する方法の提供。【解決手段】治療有効量のシラジットもしくはその個々の成分またはこれらの成分の２つ以上の組み合わせを投与することを含み、前記哺乳動物の体は、新しいコラーゲンならびに／またはテネイシン、デコリン、エラスチン、ミオフェルリン、フィブリリンおよびフィブロネクチンからなる群から選択される１つもしくは複数のタンパク質を合成することを特徴とする方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物においてコラーゲン合成を誘導する方法において、そうした処置を必要とする前記哺乳動物に、治療有効量のシラジットもしくはその個々の成分またはこれらの成分の２つ以上の組み合わせを投与することを含み、前記哺乳動物の体は、新しいコラーゲンならびに／またはテネイシン、デコリン、エラスチン、ミオフェルリン、フィブリリンおよびフィブロネクチンからなる群から選択される１つもしくは複数のタンパク質を合成することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シラジット（Ｓｈｉｌａｊｉｔ）；その個々の化学成分、たとえば３−ヒドロキシ−ジベンゾ−α−ピロン、３，８−ジヒドロキシ−ジベンゾ−α−ピロン、ジベンゾ−α−ピロン色素タンパク質、フミン酸、フルボ酸および４０超のミネラル；またはこれらの組み合わせの使用により、コラーゲン合成を促進し、それによって筋肉の増強および修復と、ヒトを含む哺乳動物の体内の皮膚、軟骨、結合組織、筋肉、血管組織、骨および歯の健康とを向上させること、および／またはヒトを含む哺乳動物の体内の皮膚、軟骨、結合組織、筋肉、血管組織、骨および歯の疾患の処置することに関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、強固な三重らせん状に巻き付き合った３本のタンパク質鎖からなる、体の主要な構造タンパク質である。この独特の構造により、コラーゲンは鋼より引張強さが大きい。体内のタンパク質の約３３パーセントはコラーゲンである。このタンパク質は組織および器官を支持し、これらの構造体を骨に結合する。実際に、骨もカルシウムおよびリンなどの特定の元素と組み合わされたコラーゲンからなる。コラーゲンは、細胞の形状および分化の支持に貢献する、細胞を取り囲む構造スキャホールドを与えるうえで重要な役割を果たしている。網目のようなコラーゲンネットワークは細胞と結合し合って、細胞が発生して機能し、そして組織および骨が治癒する支持的フレームワークまたは環境を整える。
【０００３】
コラーゲンは、細長いフィブリルの形態で、大部分は腱、靭帯および皮膚などの線維組織に見られる。コラーゲンは、角膜、軟骨、骨、血管、腸、椎間板および歯の象牙質にも豊富である。筋肉組織では、コラーゲンは筋内膜の主要成分として働く。コラーゲンは筋肉組織の１〜２パーセントであり、強い腱筋の重量の６パーセントを占める。コラーゲンを作る最も一般的な細胞は、線維芽細胞である。
【０００４】
コラーゲンの型：
コラーゲンは、体中の多くの場所に生じる。体内のコラーゲンの９０パーセント超はＩ型である。これまで、２８型のコラーゲンが同定され、記載されている。最も一般的な５つの型は、以下である：
・  コラーゲンＩ：皮膚、腱、血管結紮部、器官、骨（骨の有機部分の主な成分）；
・  コラーゲンＩＩ：軟骨（軟骨の主な成分）；
・  コラーゲンＩＩＩ：細網組織（細網線維の主な成分）、コラーゲンＩと並んで多く見られる；
・  コラーゲンＩＶ：基底板、上皮から分泌される基底膜の層を形成する；および
・  コラーゲンＶ：細胞表面、毛髪および胎盤。
【０００５】
体内でのコラーゲンの役割：
コラーゲンは、下記に詳述するように皮膚、結合組織、腱、骨および軟骨の健康の維持に極めて重要な役割を果たすため、健康にとって重要である。
【０００６】
皮膚の健康：コラーゲンは、皮膚の健康に重要な役割を果たす。コラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩは、他の型のコラーゲンと比較して高い比率でヒト皮膚において形成され、正常な皮膚組織において互いに一定比率で維持される。コラーゲンＩは、皮膚におけるコラーゲンの約７０パーセントであり、コラーゲンＩＩＩは皮膚におけるコラーゲンの約１０パーセントであり、コラーゲンＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩはそれぞれ皮膚において微量のコラーゲンである。コラーゲンは皮膚の張りおよび弾性を維持する。コラーゲン加水分解物の形態のコラーゲンは、皮膚の水分を保持する。年齢と共に体内のコラーゲンの量が減少し、たるみ、縦じわ、しわ、張力および弾性の不足、ならびに創傷治癒プロセスの遅延が生じる。
【０００７】
創傷治癒：コラーゲンは、結合組織の極めて重要なタンパク質であり、瘢痕の修復および形成により創傷治癒において重要な役割を果たす。年齢に伴う創傷治癒の遅延は、コラーゲンの合成障害および分解の増加により引き起こされる。
【０００８】
骨：骨の有機部分の約９５％は、コラーゲン、主にコラーゲンＩでできている。硬いミネラルと柔軟なコラーゲンとの組み合わせにより、骨は脆くなりすぎずに軟骨より硬くなっている。コラーゲンメッシュと水との組み合わせにより、筋運動中に関節内の骨の端部の衝撃を緩和する強く滑りやすいパッドが関節に形成される。
【０００９】
軟骨、腱、靭帯：細長いフィブリルの形態のコラーゲンは主に、腱および靭帯などの線維組織に見られる。コラーゲンは、組織を支持するため体に使用される柔軟で伸縮性のあるタンパク質であり、よって軟骨、腱および靭帯の維持に不可欠な役割を果たす。正常な腱は、密集したコラーゲン線維束で構成されかつ腱鞘に囲まれた、軟質な線維性結合組織からなる。軟骨の主要成分はコラーゲンＩＩである。
【００１０】
筋肉：筋肉組織では、コラーゲンは、筋内膜の主要成分として働く。
【００１１】
歯組織：象牙質および歯髄の有機部分はコラーゲン、主にコラーゲンＩ、加えて少量のコラーゲンＩＩＩおよびＶからなる。セメント質に見られる主なコラーゲンはコラーゲンＩであり、歯根膜ではコラーゲンＩ、ＩＩＩ、およびＸＩＩである。
【００１２】
基底膜：上皮基底膜はコラーゲンＩＶおよびＶＩＩからなる。
【００１３】
コラーゲン関連障害：
コラーゲン関連障害は、生合成、構築、翻訳後修飾、分泌、または正常なコラーゲン産生に関与する他の過程に影響を与える遺伝子欠損または栄養障害から起こるのが最も一般的である。様々なコラーゲン関連障害について以下に記載する。
【００１４】
コラーゲンＩの突然変異により引き起こされる常染色体優性障害にオステオゲンセス不全症がある。オステオゲンセス不全症では骨が脆弱になり、結合組織が不規則に走行する。一部の症例は軽度であることもあるが、重症例は致死的であり得る。軽症例は、コラーゲンＩのレベルが低いことを特徴とする一方、重症例はコラーゲンの構造異常を特徴とする。
【００１５】
軟骨異形成症は、コラーゲンＩＩの突然変異により引き起こされると考えられる骨格障害であり、継続的な調査努力の対象である。
【００１６】
エーラスダンロス症候群は、結合組織に変形が起こる。この障害では異なる１０型が知られており、その一部は動脈の破裂を特徴とし、よって致死的である。エーラスダンロス症候群の各型は、異なる突然変異、たとえば、この症候群の４型はコラーゲンＩＩＩの突然変異により引き起こされる。
【００１７】
アルポート症候群は、通常Ｘ染色体連鎖優性遺伝子としてだけでなく、常染色体優性遺伝子および常染色体劣性遺伝子の両方としても遺伝的に受け継がれ得る。アルポート症候群に罹患している人は、腎臓および眼の不調、ならびに小児期または青年期に難聴を経験する。
【００１８】
骨粗鬆症は、遺伝的に伝えられるよりむしろ加齢に伴い認められ、皮膚および骨のコラーゲンのレベルの減少と関連している。コラーゲンの何らかの減少に対抗するため、骨粗鬆症の可能な処置として成長ホルモン注射が研究されている。
【００１９】
Ｋｎｏｂｌｏｃｈ症候群は、コラーゲンＸＶＩＩＩ遺伝子の突然変異により引き起こされる。Ｋｎｏｂｌｏｃｈ症候群に罹患している患者は、脳組織の突出および網膜の変性を呈する。Ｋｎｏｂｌｏｃｈ症候群に罹患している家族構成員の１人または複数人は、遺伝的素因があるため家族構成員自身Ｋｎｏｂｌｏｃｈ症候群を発症するリスクが高い。
【００２０】
コラーゲンの分解および産生の減少：
年齢と共にコラーゲンは分解し、コラーゲンの産生が減少する。その結果、皮膚に小じわおよびしわが現れる。皮膚はまた、その弾性を失い、たるむ。コラーゲンは、既存のコラーゲンの分解の減少および新しいコラーゲンの産生の増加により維持することができる。コラーゲンの分解は、（ａ）皮膚をＵＶＡ線およびＵＶＢ線から保護すること；（ｂ）太陽光に過剰にあたることを回避すること；（ｃ）フリーラジカル対策のため抗酸化剤を含む食事をとること；（ｄ）新しいコラーゲンの産生を促進するビタミンＣを摂取すること；（ｅ）コラーゲン刺激ペプチドを補充すること；および（ｆ）体が新しいコラーゲンを産生する固有能力を増大させることにより減少させることができる。
【００２１】
本発明の意義を理解するため、筋肉および結合組織におけるいくつかのタンパク質の簡単な説明が求められる。
【００２２】
テネイシンＸＢは、テネイシンファミリー、テネイシンＸ（ＴＮ−Ｘ）のメンバーであり、ヘキサブラキオン様タンパク質（ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）とも呼ばれる。テネイシンＸＢは、皮膚、関節および筋肉を含む結合組織に発現する糖タンパク質である。ヒトではテネイシンＸＢは、ＴＮＸＢ遺伝子によりコードされる。
【００２３】
デコリンは結合組織の成分であり、コラーゲンＩフィブリルに結合し、マトリックスアセンブリーにおいて役割を果たし、ＤＣＮ遺伝子によりコードされる。デコリンは、フィブリル形成に影響を与え、さらにフィブロネクチン、トロンボスポンジン、補体成分Ｃ１ｑ、上皮増殖因子受容体（「ＥＧＦＲ」）およびトランスフォーミング増殖因子β（「ＴＧＦ−β」）と相互作用するようである。デコリンは、ＴＧＦ−β１の活性を増強あるいは阻害することが示されている。デコリンの主な機能は、細胞周期における制御に関係する。デコリンは、内皮細胞のオートファジーの制御に関与し、血管新生を阻害する。この過程は、ＰＥＧ  ３と呼ばれる腫瘍抑制因子遺伝子のレベルの増加をもたらす、血管内皮細胞増殖因子受容体（「ＶＥＧＦＲ２」）との高親和性相互作用に媒介される。デコリンは近年、マイオカインとして確認された。この役割において、デコリンは、ミオスタチンとの結合により筋肉肥大を促進する。
【００２４】
ミオフェルリン（ｍｙｏｆｅｒｌｉｎ）は、ＭＹＯＦ遺伝子によりコードされたヒトのタンパク質である。骨格筋は、筋芽細胞のシンシチウムへの融合により発生しかつ維持される、多核のシンシチウムである。ミオフェルリンは、筋芽細胞に高発現しかつ筋芽細胞の筋管との効率的な融合に必要とされる、複数のＣ２ドメインを含む膜アンカー型タンパク質である。よって、ミオフェルリンは、筋肉の増強および再生において重要な役割を果たす。
【００２５】
前記のように、２８型のコラーゲンが存在する。コラーゲンＩ、ＩＩおよびＩＩＩが最も多く見られる型である。ＣＯＬ１Ａ１遺伝子は、プロα１（Ｉ）鎖と呼ばれるコラーゲンＩの成分を作る。この鎖は、別のプロα１（Ｉ）鎖、さらにプロα２（Ｉ）鎖（ＣＯＬ１Ａ２遺伝子により作られる）と組み合わさってＩ型プロコラーゲンの分子を形成する。これらロープ状の三本鎖プロコラーゲン分子は、細胞外で酵素により処理される。これらの分子は処理されたならば、自らを整えて、細胞周囲のスペースで互いに架橋する細長いフィブリルとなる。架橋により非常に強い成熟コラーゲンＩ線維が形成される。
【００２６】
ＣＯＬ１Ａ２遺伝子は、大部分の結合組織に見られる線維性コラーゲン、コラーゲンＩの鎖の１つをコードする。この遺伝子の突然変異は、骨形成不全症、エーラスダンロス症候群、特発性骨粗鬆症および非定型マルファン症候群と関連している。しかしながら、この遺伝子の突然変異と関連している症状は、α−１コラーゲンＩの遺伝子の突然変異より重症度が低い傾向がある。α−２の方が豊富でないためである。
【００２７】
ＣＯＬ２Ａ１遺伝子は、コラーゲンＩＩのプロα１（ＩＩ）鎖の産生の指令を出すヒト遺伝子である。この遺伝子は、軟骨および眼の硝子体液に見られる線維性コラーゲン、コラーゲンＩＩのα−１鎖をコードする。この遺伝子の突然変異は、軟骨無発生症、軟骨異形成症、早期発症型家族性変形性関節症、先天性ＳＥＤ、Ｌａｎｇｅｒ−Ｓａｌｄｉｎｏ型軟骨無発生症、Ｋｎｉｅｓｔ異形成、Ｓｔｉｃｋｌｅｒ症候群Ｉ型およびＳｔｒｕｄｗｉｃｋ型脊椎骨端骨幹端異形成と関連している。さらに、コラーゲンＩＩのＣ−プロペプチドであるカルシウム結合タンパク質、プロセシングコンドロカルシンの異常も軟骨異形成症と関連している。ＣＯＬ２Ａ１遺伝子では２つの転写物が同定されている。結合組織に構造および強度を加えるコラーゲンＩＩは主に、眼球（硝子体）、内耳および脊椎の椎間板の中央部（髄核）を満たすゼリー状の物質、軟骨に見られる。３本のプロα１（ＩＩ）鎖は、絡み合ってロープ状の三本鎖プロコラーゲン分子を形成する。これらのプロコラーゲン分子は、細胞内で酵素により処理されなければならない。これらの分子は処理されたならば、細胞から放出され、自らを整えて、細胞周囲のスペースで互いに架橋する細長いフィブリルとなる。架橋により非常に強い成熟コラーゲンＩＩ線維が形成される。
【００２８】
コラーゲンＩＩＩα−１は、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子によりコードされる。コラーゲンＩＩＩα−１は、頻繁にコラーゲンＩと結合して皮膚、肺および血管系などの伸張性のある結合組織に見られる線維性コラーゲンである。
【００２９】
ＣＯＬ５Ａ２遺伝子は、少量の線維性コラーゲンの１つのα鎖をコードする。線維性コラーゲン分子は、１つまたは複数の種類のα鎖からなり得る３量体である。コラーゲンＶは、コラーゲンＩを含む組織に見られ、コラーゲンＩとＶと両方からなる異型の線維の構築を制御するようである。この遺伝子産物はコラーゲンＸＩと密接に関連しており、コラーゲンＶおよびＸＩのコラーゲン鎖は、組織特異的な鎖の組み合わせにより単一のコラーゲン型を構成することが可能である。
【００３０】
ＣＯＬ６Ａ３遺伝子は、大部分の結合組織に見られるビーズ状フィラメントコラーゲン、コラーゲンＶＩの３つのα鎖の１つα３鎖をコードする。コラーゲンＶＩのα３鎖は、α１鎖および２鎖よりかなり大きい。この大きさの相違は主に、すべてのα鎖のアミノ末端球状ドメインに見られる、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子Ａ型ドメインに類似したサブドメイン数の増加による。これらのドメインは、細胞外マトリックス（「ＥＣＭ」）タンパク質に結合すること（このコラーゲンのマトリックス成分の組織化における重要性を説明する相互作用）が示されている。
【００３１】
ＣＯＬ１４Ａ１遺伝子は、断続性三重らせんを有する線維付随性コラーゲン（「ＦＡＣＩＴ：ｆｉｂｒｉｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ  ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅｌｉｃｅｓ」）コラーゲンファミリーのメンバー、コラーゲンＸＩＶのα鎖をコードする。コラーゲンＸＩＶはフィブリル表面と相互作用し、フィブリル形成の制御に関与する。
【００３２】
エラスチンは、弾性があり、かつ体内の多くの組織が伸長または収縮後にその形状を回復できるようにする結合組織のタンパク質である。エラスチンは、皮膚が突かれるまたはつままれたとき、その元の位置に戻るのを助ける。エラスチンはまた、脊椎動物の体内の重要な耐荷重性組織であり、機械的エネルギーを蓄えなければならない場所に使用される。ヒトでは、エラスチンはＥＬＮ遺伝子によりコードされる。
【００３３】
フィブリリンは、結合組織に見られる弾性線維の形成に不可欠な糖タンパク質である。フィブリリンは、線維芽細胞によりＥＣＭに分泌され、エラスチンの沈着の足場となると思われる不溶性ミクロフィブリルに組み込まれる。フィブリリンは、遺伝子ＦＢＮ１によりコードされる。
【００３４】
フィブロネクチンは、インテグリンと呼ばれる膜スピニング受容体タンパク質に結合するＥＣＭの高分子量糖タンパク質である。インテグリンと同様に、フィブロネクチンはコラーゲン、フィブリンおよびヘパリン硫酸プロテオグリカン（たとえばシンデカン）などのＥＣＭ成分に結合する。フィブロネクチンは、細胞の接着、増殖、遊走および分化において主要な役割を果たし、創傷治癒および胚発生などのプロセスに重要である。
【００３５】
上記に参照した遺伝子の突然変異は、１つまたは複数のコラーゲン関連障害の原因となると考えられる。
【００３６】
ＥＣＭは、骨格筋の発生、維持および再生に不可欠である。Ｃ．Ａ．Ｂｕｃｋ  ＆  Ａ．Ｆ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３  ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬ．１７９（１９８７）；Ｐ．Ｐ．Ｐｕｒｓｌｏｗ，Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｗｉｔｈｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ，１３３  ＣＯＭＰ．ＢＩＯＣＨＥＭ．ＰＨＹＳＩＯＬ．Ａ  ＭＯＬ．ＩＮＴＥＧＲ．ＰＨＹＳＩＯＬ．９４７（２００２）。ＥＣＭは主に、糖タンパク質、コラーゲンおよびプロテオグリカンからなる。ＥＣＭは筋肉のマクロ組織にも関与し、線維を束にして束を筋束にし、筋肉構造を腱膜および腱と融合させる。加えて、ＥＣＭは、メカノトランスダクションに不可欠な役割を果たすと考えられ、力を側方に線維から腱およびその逆に伝える。Ｇ．Ｍ．Ｆｏｍｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｒｔ，４８  Ｊ．ＭＯＬ．ＣＥＬＬ  ＣＡＲＤＩＯＬ．４９０（２０１０）；Ｐ．Ｐ．Ｐｕｒｓｌｏｗ  ＆  Ｊ．Ａ．Ｔｒｏｔｔｅｒ，Ｔｈｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｍｙｓｉｕｍ  ｉｎ  ｓｅｒｉｅｓ−ｆｉｂｒｅｄ  ｍｕｓｃｌｅｓ：ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｌｅｎｇｔｈ，１５  Ｊ．ＭＵＳＣＬＥ  ＲＥＳ．ＣＥＬＬ  ＭＯＴＩＬ．２９９（１９９４）；Ｓ．Ｆ．Ｓｔｒｅｅｔ，Ｌａｔｅｒａｌ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｆｒｏｇ  ｍｙｏｆｉｂｅｒｓ：ａ  ｍｙｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ  ａｒｅ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ，１１４  Ｊ．ＣＥＬＬ  ＰＨＹＳＩＯＬ．３４６（１９８３）。ＥＣＭの機械的強度および弾性は、その機能性にとって決定的に重要である。ＥＣＭは、収縮の負荷に耐えるのに十分強くなければならない一方、外部から印加される歪みによる断裂を防ぐのに十分な弾性がなければならない。Ｐ．Ｐ．Ｐｕｒｓｌｏｗ，ｓｕｐｒａ，１３３  ＣＯＭＰ．ＢＩＯＣＨＥＭ．ＰＨＹＳＩＯＬ．Ａ  ＭＯＬ．ＩＮＴＥＧＲ．ＰＨＹＳＩＯＬ．ａｔ  ９４７。これらの特性は、年齢および疾患と共に変化し、ＥＣＭの慢性的変化は、筋肉機能を障害するようである。Ｒ．Ｌ．Ｌｉｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｒｉｏｒ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓｐａｓｔｉｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ｂｕｎｄｌｅｓ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ  ｂｕｔ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｍａｔｅｒｉａｌ，２８  ＭＵＳＣＬＥ  ＮＥＲＶＥ  ４６４（２００３）；Ｌ．Ｚｈｏｕ  ＆  Ｈ．Ｌｕ，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，６９  Ｊ．ＮＥＵＲＯＰＡＴＨＯＬ．ＥＸＰ．ＮＥＵＲＯＬ．７７１（２０１０）。骨格筋は、様々な生理的要求に適応するため、その機能特性、構造特性および代謝特性を制御すべく大きな可塑性を示す。ＭｃＧｅｅらは、１回の運動後にヒト骨格筋におけるＨＤＡＣ特異的阻害パターンおよびヒストンアセチル化の変化を検出した。Ｓ．Ｌ．ＭｃＧｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｅｒｃｉｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ，５８７  Ｊ．ＰＨＹＳＩＯＬ．５９５１（２００９）。
【００３７】
身体運動は本質的に健常生活習慣に寄与し、リスク低下と、予後改善と、癌のほか心血管障害、代謝障害および神経変性障害を含むいくつかの一般的疾患の医学的処置に特有の副作用の減少とにつながる。Ｉ．Ｍ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｉｎａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｎ  ｍａｊｏｒ  ｎｏｎ−ｃｏｍｍｕｎｉｃａｂｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ：ａｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｌｉｆｅ  ｅｘｐｅｃｔａｎｃｙ，３８０  ＬＡＮＣＥＴ  ２１９（２０１２）；Ｄ．Ｓｃｈｍｉｄ  ＆  Ｍ．Ｆ．Ｌｅｉｔｚｍａｎｎ，Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ａｍｏｎｇ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｒｖｉｖｏｒｓ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ，２５  ＡＮＮ．ＯＮＣＯＬ．１２９３（２０１４）。たとえば、短期運動トレーニングは、代謝疾患の進行をある程度抑制し、一方、身体活動の増加を組み込んだ生活習慣介入は依然として代謝疾患の一次予防アプローチである。実際、定期的運動を食事介入と組み合わせると、ＩＩ型糖尿病（「Ｔ２ＤＭ」）およびサルコペニアの処置において薬剤介入がよりうまくいく。Ｗ．Ｃ．Ｋｎｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌｉｆｅｓｔｙｌｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｒ  ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ，３４６  Ｎ．ＥＮＧ．Ｊ．ＭＥＤ．３９３（２００２）；Ｓ．Ｅ．Ｂｏｒｓｔ，Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ  ａｎｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ｗｅａｋｎｅｓｓ  ｉｎ  ｏｌｄｅｒ  ｐｅｏｐｌｅ，３３  ＡＧＥ  ＡＧＥＩＮＧ  ５４８（２００４）。定期的運動を採用する利点は以前から知られているが、分子生物学者は近年、運動に対する適応応答を調整するシグナル伝達経路のネットワークおよび制御分子を明らかにした。Ｓｃｈｍｉｄ  ＆  Ｌｅｉｔｚｍａｎｎ，ｓｕｐｒａ  ａｔ  １２９３；Ｏ．Ｍａｔｈｉｅｕ−Ｃｏｓｔｅｌｌｏ  ＆  Ｒ．Ｔ．Ｈｅｐｐｌｅ，Ｍｕｓｃｌｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｏｘｙｇｅｎ  ｆｌｕｘ  ｆｒｏｍ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｔｏ  ｆｉｂｅｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ，３０  ＥＸＥＲＣ．ＳＰＯＲＴ  ＳＣＩ．ＲＥＶ．８０（２００２）。運動トレーニングにより誘導される適応は、骨格筋の血液分布を豊富にし、運動中の筋肉内の酸素の流れやすさを促進する重要な手段であることが認められる。Ｓｃｈｍｉｄ  ＆  Ｌｅｉｔｚｍａｎｎ，ｓｕｐｒａ  ａｔ  １２９３；Ｍａｔｈｉｅｕ−Ｃｏｓｔｅｌｌｏ  ＆  Ｈｅｐｐｌｅ，ｓｕｐｒａ  ａｔ  ８０。運動は、様々な組織のＥＣＭに直接影響を与えることが知られている。運動は、運動中のラットの心臓におけるコラーゲンパターンを変化させることが報告されている。Ｈ．Ｂ．Ｋｗａｋ，Ａｇｉｎｇ，ｅｘｅｒｃｉｓｅ，ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅａｒｔ，９  Ｊ．ＥＸＥＲＣ．ＲＥＨＡＢＩＬ．３３８（２０１３）。
【００３８】
加齢した皮膚の弾性および張りを向上させるため、および関節健康の向上のため、経口摂取用のほか局所適用用に市場で入手できる種々のコラーゲンサプリメントが存在する。しかしながら、これらのサプリメントは有効性が疑わしい場合がある。タンパク質であるコラーゲンは経口摂取時に消化されるものであり、かつコラーゲンの分子サイズは大きいので皮膚に浸透できない可能性があるためである。よって、体が新しいコラーゲンを産生する能力を高めるための方法は、非常に有用性があると考えられる。
【００３９】
「Ｍｏｏｍｉｙｏ」とも呼ばれるシラジットは、ヒマラヤ山脈の高地に見られ、紀元前３５００年まで遡る伝統的なインドの医学体系アーユルヴェーダ（Ａｙｕｒｖｅｄａ）の「奇跡の薬（ｗｏｎｄｅｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ）」の１つと考えられている。シラジットは、アーユルヴェーダの医学大系において最も重要な成分の１つと見なされており、アダプトゲンとしても使用される。Ｓ．Ｇｈｏｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｉｌａｊｉｔ  Ｉ：ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ，６５  Ｊ．ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．７７２（１９７６）；Ｃ．Ｖｅｌｍｕｒｕｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓａｆｅｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｂｌａｃｋ  ｓｈｉｌａｊｉｔ  ａｆｔｅｒ  ９１  ｄａｙｓ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ，２  ＡＳＩＡＮ  ＰＡＣ．Ｊ．ＴＲＯＰ．ＢＩＯＭＥＤ．２１０（２０１２）。シラジットは、アーユルヴェーダにおいて「ｍａｈａｒａｓａ」（超活力剤（ｓｕｐｅｒ−ｖｉｔａｌｉｚｅｒ））と見なされている。シラジットは、腐植岩と、岩石鉱物と、海洋生物および微生物代謝物と混合された岩層により圧縮された有機物とからなる。シラジットは、夏の間に岩が熱くなると１０００〜５０００メートルに及ぶ高地のヒマラヤ山脈の岩から黒い塊としてしみ出る。Ｃ．Ｖｅｌｍｕｒｕｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ  ａｔ  ２１０。シラジットは、その主な成分としてのフルボ酸（「ＦＡ」）と共にジベンゾ−α−ピロン（「ＤＢＰ」）およびＤＢＰ色素タンパク質、フミン酸ならびに４０超のミネラルを含む。
【００４０】
Ｎａｔｒｅｏｎ  Ｉｎｃ．の特許成分、ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）は、栄養補助食品用途の精製および標準化されたシラジット抽出物である。米国特許第６，８６９，６１２号明細書および同第６，４４０，４３６号明細書。調査から、ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジットは、エネルギー、再活性化およびアンチエイジングを促進するための作用を標的としていることが示される。ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジットは、高レベルのジベンゾ−α−ピロンおよびジベンゾ−α−ピロン色素タンパク質と共に６０パーセント以上のフルボ酸および等価物を有するように標準化される。シラジット由来のフルボ酸複合体はＦＡと共に、還元形および酸化形の両方の、コア核としての酸素化ＤＢＰおよびアシル化ＤＢＰを含む天然に存在する低および中分子量化合物と、部分構造単位としての脂質との集合体である。よって、シラジットの有効成分は、ＤＢＰおよび関連する代謝物と、小ペプチド（非タンパク質アミノ酸を構成する）と、一部の脂質と、キャリア分子と、ＦＡとを含む。Ｇｈｏｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ  ａｔ  ７７２；Ｈ．Ｍｅｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｉｌａｊｉｔ：Ａ  ｐａｎａｃｅａ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ａｌｔｉｔｕｄｅ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ，１  ＩＮＴ’Ｌ  Ｊ．ＡＹＵＲＶＥＤＡ  ＲＥＳ．３７（２０１０）；Ｓ．Ｇｈｏｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｉｌａｊｉｔ  Ｐａｒｔ  ７−Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｈｉｌａｊｉｔ，ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ａｙｕｒｖｅｄｉｃ  ｒａｓａｙａｎａ，６２  ＰＵＲＥ  ＡＰＰＬ．ＣＨＥＭ．（ＩＵＰＡＣ）１２８５（１９９０）；Ｓ．Ｇｈｏｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｃｏｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｓｈｉｌａｊｉｔ  ｈｕｍｕｓ，２３  ＳＯＩＬ  ＢＩＯＬ．ＢＩＯＣＨＥＭ．６７３（１９９２）。
【００４１】
シラジットは、多様な臨床状態に対してアーユルヴェーダで広く使用される。何世紀にもわたり、ヒマラヤおよび隣接する地域の孤立した村に住む人々は、糖尿病に伴う問題を予防および対処するため、シラジットを単独または他の植物薬と組み合わせて使用してきた。Ｔｉｗａｒｉ，Ｖ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｙｕｒｖｅｄｉｃａ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｏｎ  Ｓｈｉｌａｊｉｔ，８  Ｊ．ＲＥＳ．ＩＮＤＩＧＥＮＯＵＳ  ＭＥＤ．５７（１９７３）。さらに、抗酸化剤であるシラジットは、細胞毒性酸素ラジカルにより誘導される膵島細胞の損傷を予防する。Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ  Ｓ．Ｋ．，Ｓｈｉｌａｊｉｔ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ  ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ，９  ＰＨＹＴＯＴＨＥＲ．ＲＥＳ．４１（１９９５）；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ  Ｓ．Ｋ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｓｈｉｌａｊｉｔ  ｏｎ  ｂｉｏｇｅｎｉｃ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ，９  ＰＨＹＴＯＴＨＥＲ．ＲＥＳ．５６（１９９５）；およびＧｈｏｓａｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｈｉｌａｊｉｔ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｇｅｎｉｃ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ，３４Ｂ  ＩＮＤＩＡＮ  Ｊ．ＣＨＥＭ．５９６（１９９５）。糖尿病におけるグルコース、脂肪およびタンパク質の代謝障害は、高脂血症の発症に至ることが提唱されてきた。ある研究では、シラジットは、ラットの脂質プロファイルにおいて著しく有益な作用を発揮した。Ｔｒｉｖｅｄｉ  Ｎ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｓｈｉｌａｊｉｔ  ｏｎ  ｂｌｏｏｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｉｎ  ａｌｌｏｘａｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒａｔｓ，３６  ＩＮＤＩＡＮ  Ｊ．ＰＨＡＲＭＡＣＯＬ．３７３（２００４）。シラジットの経口補充は、強制水泳試験のモデルのアルビノマウスにおいて生理的エネルギー状態を著しく向上させたＳ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  Ｓｈｉｌａｊｉｔ  ｏｎ  ｓｗｉｍｍｉｎｇ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｅｎｅｒｇｙ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ，１  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ  ＯＮＬＩＮＥ  ８１７（２００９）。
【００４２】
上記で論じたように、シラジットは様々な病気の処置に使用されている。シラジットは運動能力向上薬としても推奨される。電解質および抗酸化剤としての機能に加えて、ＦＡは、植物およびヒトを含む動物の生体システムにおいて多くの重要な作用、たとえば（ａ）ミネラルおよび栄養素のバイオアベイラビリティーの向上；（ｂ）重金属を含む有毒物質の解毒；および（ｃ）免疫機能の向上を誘発することが報告されている。
【００４３】
さらに、シラジットのＤＢＰは、ミトコンドリア内の電子伝達に関与し、それによってより多くのＡＴＰの産生を促進してエネルギーの増加をもたらすとの仮説も立てられている。Ｓ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｉｌａｊｉｔ  ｄｉｂｅｎｚｏ−α−ｐｙｒｏｎｅｓ：Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ，２  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ  ＯＮＬＩＮＥ  ６９０（２００９）。よって、シラジットは、数ある有利な量の中で特にエネルギーを増加させることが分かる。
【００４４】
しかしながら、下記のように、コラーゲンを含む哺乳動物の組織および器官の健康の維持に対する、コラーゲン関連障害の処置に対する、または筋肉の増強および再生に対するシラジットまたはその成分の有用性は、完全に新規なものであり、ヒトを含む哺乳動物にとって極めて大きな価値がある。よってシラジットのそうした使用が求められている。
【発明の概要】
【００４５】
本発明は、シラジットの投与によってコラーゲンおよび関連タンパク質の合成に関与する遺伝子を上方制御し、それによって皮膚、軟骨、腱、結合組織、筋肉、血管組織、骨および歯の健康の向上に役立つことにより、体がコラーゲンを産生する能力を高めるそうした方法を提供する。こうしたシラジットの有効性は、全体としてのシラジット、もしくはその個々の成分：フルボ酸、３−ＯＨ−ジベンゾ−α−ピロン、３，８−ジヒドロキシ−ジベンゾ−α−ピロン、ジベンゾ−α−ピロン色素タンパク質、フミン酸および４０超のミネラル、またはこれらの成分の２つ以上の組み合わせに起因し得る。シラジットはまた、２，３００μｍｏｌ  ＴＥ／ｇのＯＲＡＣ値を有する抗酸化剤でもあり、この特性は、その有効性にも寄与し得る。
【００４６】
本発明の目的は、新しいコラーゲンおよび／または関連タンパク質を合成するようにヒトの体を含む哺乳動物の体を誘導し、それによって皮膚、結合組織、筋肉、軟骨、骨および歯などのコラーゲンを含む組織および器官のすべての健康を増進させるため、筋肉の増強および再生を向上させるため、および／またはコラーゲン関連障害を処置するため、シラジットもしくはその個々の成分またはこれらの成分の２つ以上の組み合わせを使用する方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、本発明の一実施形態における、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋の脂質プロファイル、具体的にはコレステロールおよびＨＤＬコレステロールに対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の作用を示す。
【図２】図２は、本発明の一実施形態における、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋の脂質プロファイル、具体的にはＬＤＬコレステロールおよび総コレステロールに対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の作用を示す。
【図３】図３は、本発明の一実施形態における、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋の脂質プロファイル、具体的にはｎｏｎ−ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリドに対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の作用を示す。
【図４】図４は、本発明の一実施形態における、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋の血漿クレアチンキナーゼ、ミオグロビンおよび血漿グルコースに対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の作用を示す。
【図５】図５は、本発明の一実施形態における、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋のコラーゲンＣＯＬ１Ａ１およびＣＯＬ１Ａ２遺伝子発現に対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の、１２週間の補充後の作用を示す。
【図６】図６は、本発明の一実施形態における、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋のコラーゲンＣＯＬ５Ａ２およびＣＯＬ６Ａ３遺伝子発現に対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の、１２週間の補充後の作用を示す。
【図７】図７は、本発明の一実施形態における、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋のコラーゲンＣＯＬ１４Ａ１遺伝子発現に対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の、１２週間の補充後の作用を示す。
【図８】図８は、本発明の一実施形態における、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋のＦＮ１およびＴＮＸＢ遺伝子発現に対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の、１２週間の補充後の作用を示す。
【図９】図９は、本発明の一実施形態における、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋のＭＹＯＦおよびＤＣＮ遺伝子発現に対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の、１２週間の補充後の作用を示す。
【図１０】図１０は、本発明の一実施形態における、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋のＥＬＮ遺伝子発現に対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の、１２週間の補充後の作用を示す。
【図１１】図１１は、本発明の一実施形態における、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋のＦＢＮ１遺伝子発現に対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の、１２週間の補充後の作用を示す。
【図１２】図１２は、本発明の一実施形態における、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋のＨＳＤ１７Ｂ１１遺伝子発現に対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の、１２週間の補充後の作用を示す。
【図１３】図１３は、本発明の一実施形態における、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋のＨＳＤ１７Ｂ６遺伝子発現に対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の、１２週間の補充後の作用を示す。
【図１４】図１４は、ＲＰ−Ｃ  １８カラムを用いたＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジットの高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明の一実施形態では、組織および器官の健康を増進させる、筋肉の増強および再生を向上させる、および／またはコラーゲン関連障害を処置する方法は、１日約２０ミリグラムから約２０００ミリグラムの用量のシラジットをヒト被験者に投与することを含む。
【００４９】
本発明の代替の実施形態では、組織および器官の健康を増進させる、筋肉の増強および再生を向上させる、および／またはコラーゲン関連障害を処置する方法は、１日約１００ミリグラムから約５００ミリグラムの用量のシラジットをヒト被験者に投与することを含む。
【００５０】
シラジットが、新しいコラーゲンを産生するようにヒトの体を誘導するかどうかを判定するため、ヒト臨床研究を行った。本研究は、１２週間の総研究期間内で過体重／クラス１肥満ヒト被験者の群を対象に、ヒト骨格筋適応に対するシラジット補充および運動トレーニングの作用を判定することを目的とした。本研究の仮説は、シラジットの経口補充が骨格筋のＥＣＭ関連遺伝子の発現に影響を与えるということ、さらに経口摂取がトレッドミル運動トレーニングと相乗的に作用して骨格筋遺伝子の発現に好ましい影響を及ぼすということであった。
【００５１】
１．材料および方法：
被験品、ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジットカプセル、２５０ｍｇは、Ｎａｔｒｅｏｎ、Ｉｎｃ．，２Ｄ  Ｊａｎｉｎｅ  Ｐｌａｃｅ，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ  ０８９０１から提供された。本カプセルは、ＮＦグレードである賦形剤としてゼラチン、微結晶性セルロース、クロスカルメロース、ヒュームド二酸化ケイ素およびステアリン酸マグネシウムを含んでいた。
【００５２】
１．１  ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジットの高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）解析
ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジットは、精製および標準化されたシラジットであり、０．３％以上のＤＢＰ、１０．０％以上のＤＢＰ色素タンパク質、およびＤＢＰコア核を有する５０％以上のＦＡを含み、重金属を１ｐｐｍ未満の鉛、１ｐｐｍ未満の砒素および０．１ｐｐｍ未満の水銀に低下させるプロセスにより製造される。品質管理は、高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）により行われる。ＨＰＬＣ解析は、Ｗａｔｅｒｓ社製５１５ポンプ、Ｗａｔｅｒｓ社製フォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）モデル２９９６、Ｗａｔｅｒｓ社製ポンプコントローラモジュールおよびＥｍｐｏｗｅｒソフトウェア（バージョン１）を備えたＷａｔｅｒｓ社製ＨＰＬＣ装置を用いて周囲条件下で行った。サンプル（２０μＬ）は、２０μＬループを装着したＲｈｅｏｄｙｎｅ社製インジェクターによって注入した。化合物は、０．８ｍＬ／ｍｉｎの流速、移動相水：アセトニトリル：ｏ−リン酸［６７：３２：０１ｖ／ｖ／ｖ］を用いてＣ１８逆相（Ｌｉｃｈｏｃａｒｔ（登録商標）カラム（２５０ｍｍ×４ｍｍ  ｉ．ｄ．、５μｍ粒子；カラム番号３３１３０３、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ））で分離した。溶離液のＵＶ吸光度は、２４０ｎｍの波長でモニターした。精製されたＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジットのＨＰＬＣプロファイルおよびクロマトグラフ条件を図１４に示す。
【００５３】
１．２  研究の被験者および実験デザイン：
Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄｓ（「ＷＩＲＢ」）は、本研究のプロトコル（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  ＮＣＴ０２０２６４１４）および材料を承認した。すべての被験者が本研究の参加前に書面で同意した。
【００５４】
過体重／クラス１肥満（ボディマスインデックス［ＢＭＩ］：２５〜３５）成人（２１〜７０歳）健常ヒト被験者は、男女共に本研究に参加できることとした。参加者に血液サンプル採取の前に一晩絶食するように依頼した。食事または運動において、自己申告による何らかの逸脱があれば記録した。ＣＶＤ関連障害の管理／処置のため以下の薬剤：ステロイド（プレドニゾン等）、β遮断薬、ヒドロクロロチアジド、スタチン類（クレストール、リピトール等）、アスピリンおよびＡＣＥ阻害剤のいずれか１つを使用した場合、被験者を本研究から除外した。妊婦のほか治療上免疫不全状態にあった人も本研究から除外した。本研究に参加した被験者の人口統計学的データを表１に提示する。試験デザインには、初回のベースライン来院後、１２週間の研究期間中に３回の追跡調査来院が設定された。第１の追跡調査来院は、患者にサプリメントを投与してから８週間後とした。第２の追跡調査来院は、第１の追跡調査来院に続く４週間の補充および運動後とし、第３の追跡調査来院は、同じ日の３０分の運動後とした。各来院時に、５０ｍＬの血液、５ｍｍの筋生検、ならびに年齢、性別、身長、体重、ＢＭＩ、血圧および脈拍を含む人口統計学的情報を得た。表１を参照されたい。
【００５５】
2020073552.tif 000003
【００５６】
１．３  補充レジメントおよびコンプライアンス：
各被験者に、本研究に組み入られた最初の８週間１日２回２５０ｍｇのＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット（Ｎａｔｒｅｏｎ，Ｉｎｃ．）を投与した。本研究の最後の４週間、被験者は２５０ｍｇのＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット（Ｎａｔｒｅｏｎ，Ｉｎｃ．）サプリメントを１日２回服用しながら、トレッドミル運動（最大心拍数の７０〜７５％の運動２０分に加え５分のウォーミングアップ運動および５分のクールダウン運動、１日合計３０分間、週３日）も終了した。すべての被験者が、３回の追跡調査来院および１回のベースライン来院を含む合計１２週間の本研究に参加した。
【００５７】
１．４  安全性モニタリング：
臨床研究スタッフから報告された、ダイエタリーサプリメントに直接関連する有害作用はなかった。
【００５８】
１．５  血液サンプリングおよび検査法：
すべてのベースライン来院および追跡調査来院において、末梢静脈血をヘパリンチューブに採取し、直ちに氷上に移して脂質プロファイル、グルコース、クレアチンキナーゼ（「ＣＫ」）および血清ミオグロビンのレベルを評価した。脂質プロファイルの中で総コレステロール（「ＨＤＬ」）、高密度リポタンパク質コレステロール（「ＨＤＬ−Ｃ」）、低密度リポタンパク質コレステロール（「ＬＤＬ−Ｃ」）およびトリグリセリドのレベル、ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ＬＤＬコレステロールおよびｎｏｎ−ＨＤＬコレステロールのレベルを、標準的な臨床脂質プロファイルを用いて測定し、クレアチンキナーゼ、グルコースおよび血清ミオグロビンの試験を、Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗｅｘｎｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで製造者の指示に従い行った。本研究においては、全血を４２２７ＲＣＦ、４℃で３分間遠心して血漿を分離した。血漿をアリコートに分け、さらなる解析のため−８０℃で保管した。
【００５９】
１．６  筋生検材料の採取
生検部位：外側広筋または腓腹筋。生検材料は、生検部位への局所麻酔薬の適用後、１２ゲージＳｅｎｏＲｘ、超音波定位Ｅｎｃｏｒ  Ｐｒｏｂｅ（ＢＡＲＤ  Ｅｎｃｏｒ  Ｕｌｔｒａ、乳房生検システム；ＡＺ，ＵＳＡ）を有する１００〜１２０Ｖ、５０〜６０Ｈｚ、６００ＶＡ生検器を用いて認定医が採取した。筋サンプルは、ｍＲＮＡの発現プロファイリングおよびＲＴ−ＰＣＲに使用した。
【００６０】
１．７  ＧｅｎｅＣｈｉｐプローブアレイ解析
異なる期間の筋サンプルで差次的に発現する遺伝子のセットを同定するため、ＲＮＡ抽出、ターゲット標識、ＧｅｎｅＣｈｉｐプローブアレイ解析を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ａｒｒａｙ２．０を用いて行った。簡単に説明すると、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＩＶＴ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）のインビトロ転写（「ＩＶＴ」）反応を使用してＲＮＡサンプルからビオチン化ｃＲＮＡを得た。サンプルをハイブリダイズし、アレイを洗浄し、ストレプトアビジンフィコエリトリンで染色して遺伝子アレイスキャナー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）でスキャンした。データ取得および画像処理にはＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（「ＧＣＯＳ」、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を利用した。生データは、Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ  ＧＸ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ  ＣＡ）を用いて解析した。データの追加処理は、ｄＣｈｉｐソフトウェア（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を用いて行った。データ正規化にはＧＣ−ＲＭＡ（Ｇｅｎｅ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＧＸ、Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用した。差次的発現遺伝子を、２標本ｔ検定を用いて同定し、有意水準をｐ＜０．０５に設定し、偽発見率にはＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正を用いた。有意に上方制御された遺伝子を、Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（「ＤＡＶＩＤ」、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨ）、および遺伝子オントロジー（「ＧＯ」）を用いて機能解析に供した。ＥＣＭ関連遺伝子を、シラジット補充後に変化した主要なクラスターとした同定した（表４）。選択した差次的発現候補遺伝子を、リアルタイム定量ＰＣＲを用いて検証した（図４〜６）。
【００６１】
１．８  リアルタイム定量ＰＣＲを用いたマイクロアレイ結果のバリデーション
リアルタイムＰＣＲを行って、マイクロアレイにより明らかになった候補ｍＲＮＡを検証した。選択した遺伝子のレベルを、二本鎖ＤＮＡ結合色素ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ−Ｉを用いてリアルタイムＰＣＲによりアッセイした。ＧＡＰＤＨを標準ハウスキーピング遺伝子として使用した。
【００６２】
１．９  データ解析
統計的手法：
全１４の遺伝子発現（ΔΔＣＴ）値が隣接する時点で共に異なるかどうかを調べるため、多変量線形回帰を使用した。異なる時点で５つの比較を行った。多変量回帰から、１つのｐ値を有する遺伝子ごとに差の推定と共にその９５％信頼区間が得られ、全１４遺伝子のΔΔＣＴ値が隣接する時点で共に異なったかどうかを調べられる。多変量回帰は、本研究に２８の個々の比較を行う検出力がなかったため使用した。多変量正規性は、標準化正規確率プロットを用いてチェックした。正規型でない値があった場合、自然対数を用いてそれらを変換した。新しい多変量線形回帰モデルを用いて、患者の脂質／グルコース／筋損傷マーカーの値が隣接する時点で共に異なっていたかどうかをチェックした。脂質／グルコース／筋損傷マーカーの値を、３時点ごとに平均および標準偏差を用いてまとめた。解析はすべて、Ｓｔａｔａ  １３．１，ＳｔａｔａＣｏｒｐ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＴＸを用いて行った。
【００６３】
２．結果
２．１  ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充後のグルコース、脂質プロファイル、クレアチンキナーゼおよび血清ミオグロビンのレベルの変化：
脂質プロファイルの測定から、ベースライン来院において観察されたレベルと比較して８週間のＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充後に、平均コレステロール値、平均ＨＤＬコレステロール値、平均ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ＬＤＬコレステロール値、平均総コレステロール／ＨＤＬ値、平均ｎｏｎ−ＨＤＬコレステロール値およびトリグリセリド値を何ら有意に変化させることなく、良好な忍容性が示された（図２、表２および３）。加えて、運動を伴う１２週間の補充期間後および同じ日の３０分の最後の運動後の脂質プロファイルレベルは、ベースライン来院および８週間の来院において観察されたレベルと比較して変わらなかった（図２、表２および３）。さらに、どの追跡調査来院時にも、他の変数、たとえば血糖と、クレアチンキナーゼおよび血清ミオグロビンのレベルを含む筋損傷マーカーとに有害な変化は観察されなかった（図３、表２および３）。
【００６４】
2020073552.tif 000004
【００６５】
2020073552.tif 000005
【００６６】
２．２  ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充後の骨格筋のマイクロアレイ解析
補充および運動に応答したｍＲＮＡ発現プロファイルの変化を判定するため、各来院において筋サンプルを採取し、ＲＮＡ抽出、ターゲット標識およびＧｅｎｅＣｈｉｐデータ解析を、前述のようにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ａｒｒａｙ２．０を用いて行った。８週間のＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充後に骨格筋サンプルにおいてベースライン来院と比較して高度に発現した遺伝子を選択してさらに研究を行った。表４は、８週間のＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充においてベースライン来院と比較して筋肉で上方制御された上位１２遺伝子を示す。それら有意に上方制御された遺伝子は、テネイシンＸＢ（ＴＮＸＢ）、デコリン（ＤＣＮ）、ミオフェルリン（ＭＹＯＦ）、コラーゲン（ＣＯＬ）（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＶＩ型、ＸＩＶ型）、エラスチン（ＥＬＮ）、フィブリリン１（ＦＢＮ１）およびフィブロネクチン１（ＦＮ１）である（表４）。
【００６７】
2020073552.tif 000006
【００６８】
２．３  リアルタイム定量ＰＣＲを用いたマイクロアレイ結果のバリデーション
マイクロアレイを用いたｍＲＮＡ定量の正確性を検証するため、上記の上方制御されたＥＣＭ関連遺伝子、加えてＨＳＤ１７Ｂ１１およびＨＳＤ１７Ｂ６遺伝子を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて再調査した。マイクロアレイ結果と一致して、ＲＴ−ＰＣＲ結果からも、ベースライン来院と比較して８週間のＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充後（図４〜６および表５）の、および８週間の来院と比較して運動を伴う１２週間の補充後（最後の運動の前および後）（図４〜６および表５）の筋サンプルにおけるそれらのＥＣＭ関連遺伝子の発現の有意な変化が明らかになった。
【００６９】
2020073552.tif 000007
【００７０】
３．考察および結論
骨格筋は、体内で最大の代謝的に活性な組織であり、体重の約４０％を占める。骨格筋は、その収縮および代謝プロファイルが異なる不均一な筋肉線維からなる適応性の組織である。本研究は、８週間の補充後、運動を伴う追加の４週間の補充後、および同じ日の３０分の運動後に、健常な過体重／クラス１肥満のヒト被験者の骨格筋における血中脂質組成の変化のほか、クレアチンキナーゼ、血清ミオグロビンなどの筋損傷マーカー、および血糖の変化を判定するために計画された。肥満症は、トリアシルグリセロールおよび脂肪酸代謝物、たとえばセラミド、ジアシルグリセロールおよび長鎖アシルＣｏＡとして筋肉に蓄積する循環脂質（ＦＦＡ、トリグリセリド）の増加により特徴づけられることは、以前から十分に確立されていた。ＨＤＬコレステロールレベルが他の代謝パラメーター、たとえばトリグリセリドおよびＬＤＬコレステロールのレベルと関連していることも観察されていた。一方、本研究では、健常な過体重／クラス１肥満のヒト被験者の血中脂質プロファイルの変化が、８週間のＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充後のほか、その後の運動を伴う４週間の補充後も、同じ日の３０分の最後の運動後も報告されないことから、ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充は骨格筋に対して有害作用がないことが示唆された。ホスホクレアチン（「ＰＣｒ」）は、エネルギー需要が急速に変動する組織における１つの主要なＡＴＰ補給源である。この供給には、クレアチン（「Ｃｒ」）およびＡＤＰがそれぞれＰＣｒおよびＡＴＰに可逆的にリン酸化されるクレアチンキナーゼ（「ＣＫ」）反応が介在する。ＡＴＰレベルの空間的および時間的緩衝装置として機能するＰＣｒ−ＣＫ系は、哺乳動物骨格筋において高レベルの細胞内総クレアチンを必要とする。よって、クレアチンキナーゼが減少すると、骨格筋内のＡＴＰ形成が妨げられる可能性がある。高い細胞内クレアチン濃度は、内因性産生と外部からの食事摂取との組み合わせ、その後の血管からのクレアチンの細胞内取り込みにより達成される。本研究では、血清クレアチンキナーゼレベルの変化が、健常な過体重／クラス１肥満のヒト被験者において最初の８週間の補充後、次の運動を伴う４週間の補充、および３０分の運動後の第３の追跡調査来院で観察されなかったことから、骨格筋の完全性を維持するうえでＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジットの重要な役割を示す証拠が示される。ミオグロビンは主に骨格筋または心筋に存在し、その濃度が高いためＯ２の貯蔵が可能であり、さらに心筋および骨格筋のＯ２の拡散を促進する。４回の来院後のヒト被験者の血清ミオグロビンレベルが変化しないことからは、重度の低酸素下の骨格筋に酸素レベルを維持するうえで考えられるＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジットの役割も示される。これらのパラメーターに加えて、我々は、健常な過体重／クラス１肥満のヒト被験者においてすべての来院時に血糖レベルが影響されないことも認めた。これらを総合すると、本データから、ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジットは健常ヒトボランティアの骨格筋において生理機能の忍容性が良好であり、正常な全身グルコース代謝、ホメオスタシスおよび筋肉完全性を維持することが示唆される。
【００７１】
これは、健常な過体重／クラス１肥満のヒトボランティアを対象にＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充後のＥＣＭ関連遺伝子の発現の変化を系統的に評価する最初の研究である。本研究では、マイクロアレイ結果およびＲＴ−ＰＣＲ結果から、８週間のＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充、運動を伴うさらなる４週間の補充、および同じ日の３０分の運動の後、骨格筋において様々な型のコラーゲン、エラスチン、テネイシンＸＢ、デコリン、ミオフェルリン、フィブリリン、フィブロネクチン１、ＨＳＤ１７Ｂ１１およびＨＳＤ１７Ｂ６を含む様々なＥＣＭ成分のｍＲＮＡ発現の上昇が明らかになった。コラーゲンは、皮膚の張りおよび弾性を維持する。コラーゲンＩおよびＩＩＩは、他の型と比較して高い比率でヒト皮膚において形成され、正常な皮膚組織において互いに一定の比率で維持される。コラーゲンＩは、皮膚におけるコラーゲンの約７０パーセントであり、コラーゲンＩＩＩは、皮膚におけるコラーゲンの約１０パーセントであり、コラーゲンＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩはそれぞれ皮膚において微量のコラーゲンである。コラーゲン加水分解物の形態のコラーゲンは、皮膚の水分を保持する。加齢に伴う体内のコラーゲンの量の減少により、たるみ、縦じわおよびしわ、張力および弾性の不足、ならびに創傷治癒プロセスの遅延が生じる。これまでの研究から、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１およびＣＯＬ５Ａ１の遺伝子発現の増加が創傷治癒における細胞増殖およびＥＣＭの活発なリモデリングに有用であることが証明された。よって、本研究におけるコラーゲン発現の増加から、アンチエイジングにおけるＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジットの潜在的な役割が示唆される。コラーゲンは主要構造を与えるが、他のＥＣＭ成分も骨格筋適応において重要な役割を果たす。小型ロイシンリッチプロテオグリカンであるデコリンも、筋形成に伴い集合した筋線維を支持する筋周膜のコラーゲン線維の形成および安定化に寄与している。ミオフェルリンは、筋発生の過程で特に融合を起こしている筋芽細胞で高発現する。さらに、フィブロネクチンは、創傷修復の初期において暫定肉芽組織の合成を補助する極めて重要なタンパク質である。ミクロフィブリルの１種、フィブリリンも、骨格筋のＥＣＭにおいて極めて重要な構造要素の１つである。フィブリリンは、結合組織に広く分布することが分かっており、組織特異的構造に組織化されると報告されている。さらに、ミクロフィブリル束は互いに平行に配向し、エラスチン線維と高度に共局在していた。もう１つのＥＣＭ成分、テネイシンＸは、コラーゲンの機械的特性を決定する。さらに、ミオフェルリンは、血管内皮細胞増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ−２）のリサイクリングを制御することが示されている。ミオフェルリンタンパク質のレベルは成人骨格筋では通常低く、健常筋線維にはほとんど存在しない。ミオフェルリンレベルが増加すると、損傷した筋線維の修復を待ち望む単核のミオフェルリン陽性筋芽細胞の集積が起こることが以前に観察されており、ミオフェルリンは筋再生において重要であることが示唆される。
【００７２】
本研究におけるマイクロアレイおよびＲＴ−ＰＣＲの結果を合わせると、骨格筋の発生／再生において積極的な役割を果たすことが以前に示されたこれらのＥＣＭ関連遺伝子の高発現が示され、かつＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充が、成人の健常な過体重／クラス１肥満のヒト被験者の骨格筋の完全性および弾性を維持することにより、ＥＣＭの強化において重要な役割を果たすことが強く提言された。
【００７３】
表１から、シラジットは、コラーゲンおよび他の関連タンパク質の合成を担う遺伝子、特にほぼ５倍上方制御されたコラーゲンＩα−１、Ｉα−２およびＩＩＩα−１を有意に上方制御したことは明らかである。コラーゲンＶα−２、ＶＩα−３およびＸＩＶα−１の遺伝子は１．６〜３倍上方制御された。本研究で組織サンプルを採取した骨格筋はコラーゲンＩＩを含まないため、本研究ではコラーゲンＩＩの上方制御は見られなかった。
【００７４】
テネイシン、ミオフェルリン、デコリン、エラスチン、フィブリリンおよびフィブロネクチンをコードする遺伝子も上方制御された。
【００７５】
すべての結果が統計学的に有意であり、ｐ値は０．００６〜０．０５の範囲であった。結果を図１〜１４に示す。
【００７６】
図１は、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋の脂質プロファイルに対する、ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の作用を示す。値は平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１６）である。＊はベースラインと比較してＰ＜０．０５を示す。ＣＨＯＬ、コレステロール；ＨＤＬ、高密度リポタンパク質；ＬＤＬ、低密度リポタンパク質。ベースライン来院において観察されたレベルと比較して、８週間のＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充後の平均コレステロール値、平均ＨＤＬコレステロール値、平均ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ＬＤＬコレステロール値、平均総コレステロール／ＨＤＬ値、平均ｎｏｎ−ＨＤＬコレステロール値およびトリグリセリド値に変化はなかった。加えて、運動を伴う１２週間の補充期間後の脂質プロファイルレベルは、平均ベースライン来院において観察されたレベルと比較して変わらなかった。
【００７７】
図２は、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋の脂質プロファイルに対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の作用を示す。値は平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１６）である。＊はベースラインと比較してＰ＜０．０５を示す。ＣＨＯＬ、コレステロール；ＨＤＬ、高密度リポタンパク質；ＬＤＬ、低密度リポタンパク質。ベースライン来院中に観察されたレベルと比較して８週間のＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充後に平均コレステロール値、平均ＨＤＬコレステロール値、平均ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ＬＤＬコレステロール値、平均総コレステロール／ＨＤＬ値、平均ｎｏｎ−ＨＤＬコレステロール値およびトリグリセリドに変化はなかった。加えて、運動を伴う１２週間の補充期間後の脂質プロファイルレベルも、平均ベースライン来院中に観察されたレベルと比較して変わらなかった。
【００７８】
図３は、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋の脂質プロファイルに対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の作用を示す。値は平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１６）である。＊はベースラインと比較してＰ＜０．０５を示す。ＣＨＯＬ、コレステロール；ＨＤＬ、高密度リポタンパク質。ベースライン来院中に観察されたレベルと比較して８週間のＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充後の平均コレステロール値、平均ＨＤＬコレステロール値、平均ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ＬＤＬコレステロール値、平均総コレステロール／ＨＤＬ値、平均ｎｏｎ−ＨＤＬコレステロール値およびトリグリセリドに変化はなかった。加えて、運動を伴う１２週間の補充期間後の脂質プロファイルレベルは、平均ベースライン来院中に観察されたレベルと比較して変わらなかった。
【００７９】
図４は、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋の血漿クレアチンキナーゼ、ミオグロビンおよび血漿グルコースに対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の作用を示す。値は平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１６）である。＊はベースラインと比較してＰ＜０．０５を示す。ベースライン来院と比較して運動を伴う最初の８週間の補充および１２週間の補充時後の血糖、クレアチンキナーゼおよび血清ミオグロビンのレベルに有害な変化は、観察されなかった。
【００８０】
図５は、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋の異なるコラーゲン遺伝子の発現に対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の作用を示す。筋生検材料のＣＯＬ１Ａ１およびＣＯＬ１Ａ２のｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）補充（２５０ｍｇの１日２回投与）の作用を、全来院：８週間の補充、運動を伴う１２週間の補充（最後の運動プログラムの直前および直後）の期間中に測定した。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１６）である；ベースライン来院と比較して＊ｐ＜０．０５。ＣＯＬ１Ａ１、コラーゲンＩα１；ＣＯＬ１Ａ２、コラーゲンＩα２。ＲＴ−ＰＣＲ結果から、ベースライン来院と比較して運動を伴う１２週間のＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）補充後の筋サンプルにおいてＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ６Ａ３およびＣＯＬ１４Ａ１の高発現が示された。総合すると、骨格筋の発生／再生において積極的な役割を果たすことが以前に示されたこれらの遺伝子の高発現、およびＲＴ−ＰＣＲを用いたバリデーションから、ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）補充は筋肉適応／再生において重要な役割を果たすことが強く提言される。
【００８１】
図６は、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋の異なるコラーゲン遺伝子の発現に対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の作用を示す。筋生検材料のＣＯＬ５Ａ２およびＣＯＬ６Ａ３のｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）補充（２５０ｍｇの１日２回投与）の作用を、全来院：８週間の補充、運動を伴う１２週間の補充（最後の運動プログラムの直前および直後）の期間中に測定した。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１６）である；ベースライン来院と比較して＊ｐ＜０．０５。ＣＯＬ５Ａ２、コラーゲンＶα２；ＣＯＬ６Ａ３、コラーゲンＶＩα３。ＲＴ−ＰＣＲ結果から、ベースライン来院と比較して運動を伴う１２週間のＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）補充後の筋サンプルにおいてＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ６Ａ３およびＣＯＬ１４Ａ１の高発現が示された。総合すると、骨格筋の発生／再生において積極的な役割を果たすことが以前に示されたこれらの遺伝子の高発現、およびＲＴ−ＰＣＲを用いたバリデーションから、ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）補充は、筋肉適応／再生において重要な役割を果たすことが強く提言される。
【００８２】
図７は、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋の異なるコラーゲン遺伝子の発現に対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の作用を示す。筋生検材料のＣＯＬ１４Ａ１のｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）補充（２５０ｍｇの１日２回投与）の作用を、全来院：８週間の補充、運動を伴う１２週間の補充（最後の運動プログラムの直前および直後）の期間中に測定した。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１６）である；ベースライン来院と比較して＊ｐ＜０．０５。ＣＯＬ１４Ａ１、コラーゲンＸＩＶα１。ＲＴ−ＰＣＲ結果から、ベースライン来院と比較して運動を伴う１２週間のＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）補充後の筋サンプルのＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ６Ａ３およびＣＯＬ１４Ａ１の高発現が示された。総合すると、骨格筋の発生／再生において積極的な役割を果たすことが以前に示されたこれらの遺伝子の高発現、およびＲＴ−ＰＣＲを用いたバリデーションから、ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）補充は、筋肉適応／再生において重要な役割を果たすことが強く提言される。
【００８３】
図８は、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋のＦＮ１およびＴＮＸＢ遺伝子発現に対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の作用を示す。筋生検材料のＦＮ１およびＴＮＸＢのｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）補充（２５０ｍｇの１日２回投与）の作用を、来院：８週間の補充、運動を伴う１２週間の補充（最後の運動プログラムの直前および直後）の期間中に測定した。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１６）である；ベースライン来院と比較して＊ｐ＜０．０５。ＦＮ、フィブロネクチン；ＴＮＸＢ、テネイシンＸＢ。
【００８４】
図９は、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋のＭＹＯＦおよびＤＣＮ遺伝子発現に対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の作用を示す。筋生検材料のＭＹＯＦおよびＤＣＮのｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）補充（２５０ｍｇの１日２回投与）の作用を、来院：８週間の補充、運動を伴う１２週間の補充（最後の運動プログラムの直前および直後）の期間中に測定した。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１６）である；ベースライン来院と比較して＊ｐ＜０．０５。ＭＹＯＦ、ミオフェルリン；ＤＣＮ、デコリン。
【００８５】
図１０は、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋のＥＬＮ遺伝子発現に対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の作用を示す。筋生検材料のＥＬＮのｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）補充（２５０ｍｇの１日２回投与）の作用を、全来院：８週間の補充、運動を伴う１２週間の補充（最後の運動プログラムの直前および直後）の期間中に測定した。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１６）である；ベースライン来院と比較して＊ｐ＜０．０５。ＥＬＮ、エラスチン。
【００８６】
図１１は、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋のＦＢＮ１遺伝子発現に対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の作用を示す。筋生検材料のＦＢＮ１のｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）補充（２５０ｍｇの１日２回投与）の作用を、全来院：８週間の補充、運動を伴う１２週間の補充（最後の運動プログラムの直前および直後）の期間中に測定した。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１６）である；ベースライン来院と比較して＊ｐ＜０．０５。ＦＢＮ１、フィブリリン。
【００８７】
図１２は、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋のＨＳＤ１７Ｂ１１遺伝子発現に対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の作用を示す。筋生検材料のＨＳＤ１７Ｂ１１のｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）補充（２５０ｍｇの１日２回投与）の作用を、全来院：８週間の補充、運動を伴う１２週間の補充（最後の運動プログラムの直前および直後）の期間中に測定した。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１６）である；ベースライン来院と比較して＊ｐ＜０．０５。ＨＳＤ１７Ｂ１１、ヒドロキシステロイド（１７β）デヒドロゲナーゼ１１。
【００８８】
図１３は、体を動かすことの少ない肥満予備群から肥満のヒトの骨格筋のＨＳＤ１７Ｂ６遺伝子発現に対するＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジット補充の作用を示す。筋生検材料のＨＳＢ１７Ｂ６のｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。ＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）補充（２５０ｍｇの１日２回投与）の作用を、全来院：８週間の補充、運動を伴う１２週間の補充（最後の運動プログラムの直前および直後）の期間中に測定した。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１６）である；ベースライン来院と比較して＊ｐ＜０．０５。ＨＳＤ１７Ｂ６、ヒドロキシステロイド（１７β）デヒドロゲナーゼ６。
【００８９】
図１４は、ＲＰ−Ｃ  １８カラムによるＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標）シラジットの高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）である。フルボ酸（ＦＡ）ｔＲ：２．０〜３．０ｍｉｎ；ジベンゾクロモタンパク質（ＤＣＰ）ｔＲ：３．０〜５．８ｍｉｎ；３，８−（ＯＨ）２−ジベンゾ−α−ピロンｔＲ：９．０７ｍｉｎ；３−ＯＨ−ジベンゾ−α−ピロンｔＲ：２６．０２ｍｉｎ。
【００９０】
よって、本発明は、シラジットもしくはその個々の成分またはそれらの成分の２つ以上の組み合わせを使用して、ヒトの体を含む哺乳動物の体を、新しいコラーゲンを合成するように誘導し、それによって皮膚、結合組織、筋肉、軟骨、眼、骨および歯などコラーゲンを含むすべての組織および器官の健康を増進させる、筋肉の増強および再生を向上させる、および／またはコラーゲン関連障害を処置する方法を提供する。
【００９１】
本発明の実施形態に使用される製品は、当該産業の標準的な賦形剤および製剤技術を用いて錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、咀嚼剤、グミ剤、経皮剤、注射剤等を含む栄養補助食品または医薬品剤形に製剤化してもよい。本発明の実施形態に使用される製品は、哺乳動物に固形剤形で経口投与しても、あるいは非経口もしくは経皮投与で投与してもよい。
【００９２】
前述の明細書では本発明についてその特定の実施形態との関連で記載し、説明を目的として多くの詳細を提示してきたが、本発明は追加の実施形態の影響を受けやすいこと、および本明細書に記載の詳細の一部は本発明の基本的な原理を逸脱することなく、かなり異なってもよいことが当業者には明らかとなるであろう。
【００９３】
本明細書に引用する参考文献はすべて、参照によりその全体を援用する。本発明は、精神またはその本質的な特性を逸脱することなく他の特定の形態で実施してもよく、したがって、本発明の範囲を示すものとして、前述の明細書でなく、添付の特許請求の範囲を参照されたい。
【図１】
2020073552.tif 000008
【図２】
2020073552.tif 000009
【図３】
2020073552.tif 000010
【図４】
2020073552.tif 000011
【図５】
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【図６】
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【図７】
2020073552.tif 000014
【図８】
2020073552.tif 000015
【図９】
2020073552.tif 000016
【図１０】
2020073552.tif 000017
【図１１】
2020073552.tif 000018
【図１２】
2020073552.tif 000019
【図１３】
2020073552.tif 000020
【図１４】
2020073552.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月4日(2020.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
運動後の哺乳動物においてコラーゲン合成を誘導する方法に用いるための医薬製剤であって、
前記医薬製剤は、治療有効量のシラジットおよび１つまたは複数の賦形剤を含み、前記哺乳動物の体の少なくとも骨格筋は、前記シラジット医薬製剤の補充および運動後に新しいコラーゲンならびに／またはテネイシン、デコリン、エラスチン、ミオフェルリン、フィブリリンおよびフィブロネクチンからなる群から選択される１つもしくは複数のタンパク質を合成する、
ことを特徴とする医薬製剤。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬製剤において、前記医薬製剤は、コラーゲンを含む組織および／または器官の健康を増進させ、前記組織および／または器官は皮膚、結合組織、筋肉、軟骨、眼、骨および歯からなる群から選択されることを特徴とする医薬製剤。
【請求項３】
請求項１に記載の医薬製剤において、前記哺乳動物はヒトであり、かつ前記医薬製剤は筋肉の増強および再生を向上させることを特徴とする医薬製剤。
【請求項４】
請求項１に記載の医薬製剤において、前記哺乳動物はヒトであり、かつ前記医薬製剤はオステオゲンセス不全症、軟骨異形成症、エーラスダンロス症候群、アルポート症候群、骨粗鬆症およびＫｎｏｂｌｏｃｈ症候群からなる群から選択されるコラーゲン関連障害を処置することを特徴とする医薬製剤。
【請求項５】
請求項１に記載の医薬製剤において、シラジットの個々の成分は３−ヒドロキシ−ジベンゾ−α−ピロン、３，８−ジヒドロキシ−ジベンゾ−α−ピロン、ジベンゾ−α−ピロン色素タンパク質、フミン酸、フルボ酸およびミネラルを含むことを特徴とする医薬製剤。
【請求項６】
請求項１に記載の医薬製剤において、シラジットは３−ヒドロキシ−ジベンゾ−α−ピロン、３，８−ジヒドロキシ−ジベンゾ−α−ピロン、ジベンゾ−α−ピロン色素タンパク質、フミン酸、フルボ酸およびミネラルを含む化学組成を有することを特徴とする医薬製剤。
【請求項７】
請求項１に記載の医薬製剤において、前記哺乳動物はヒトであり、かつシラジットの用量はヒトにおいて１日約２０ｍｇ〜約２０００ｍｇであることを特徴とする医薬製剤。
【請求項８】
請求項７に記載の医薬製剤において、シラジットの用量はヒトにおいて１日約１００ｍｇ〜約５００ｍｇであることを特徴とする医薬製剤。
【請求項９】
請求項７に記載の医薬製剤において、皮膚、結合組織、筋肉、軟骨、眼、骨および歯の健康が向上することを特徴とする医薬製剤。
【請求項１０】
請求項１に記載の医薬製剤において、コラーゲンによる瘢痕の修復および形成が向上することを特徴とする医薬製剤。
【請求項１１】
請求項１に記載の医薬製剤において、前記新しいコラーゲンおよび／または前記１つもしくは複数のタンパク質の合成は、ＴＮＸＢ、ＤＣＮ、ＭＹＯＦ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＭＩＲ３６０６、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＯＬ１４Ａ１、ＥＬＮ、ＦＢＮ１およびＦＮ１からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現増加により特徴づけられることを特徴とする医薬製剤。
【請求項１２】
請求項１１に記載の医薬製剤において、前記新しいコラーゲンおよび／または前記１つもしくは複数のタンパク質の合成は、それぞれの量として、１３００乃至１５００倍のＣＯＬ１Ａ１、７００乃至８００倍のＣＯＬ１Ａ２、１５０乃至２００倍のＣＯＬ５Ａ２、６０乃至８０倍のＣＯＬ６Ａ３、８０乃至１２０倍のＣＯＬ１４Ａ１、９０乃至１００倍のＦＮ１、１０乃至２５倍のＴＮＸＢ、３５乃至４５倍のＭＹＯＦ、１５乃至２０倍のＤＣＮ、８０乃至１００倍のＥＬＮ、および３０乃至４０倍のＦＢＮ１からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の骨格筋における発現増加により特徴づけられることを特徴とする医薬製剤。
【請求項１３】
請求項１１に記載の医薬製剤において、前記１つまたは複数の遺伝子の発現増加は、前記哺乳動物にシラジットを１日あたり５００ｍｇの用量で８週間から１２週間にわたって投与した後の骨格筋で起きることを特徴とする医薬製剤。
【請求項１４】
請求項４に記載の医薬製剤において、前記医薬製剤は、骨粗鬆症を処置することを特徴とする医薬製剤。
【請求項１５】
請求項１に記載の医薬製剤において、前記哺乳動物はヒトであり、かつ前記医薬製剤は、関節炎を処置することを特徴とする医薬製剤。