(57)【要約】      （修正有）【課題】正常およびガン性細胞におけるＭＣＭサブユニットから機能的なＭＣＭ複合体の形成を阻害する方法及び、抗ガン化合物についてスクリーニングする方法の提供。【解決手段】子宮頸癌、鼻咽頭癌または肝癌の治療用の薬剤を製造するための、ガン性細胞におけるＭＣＭサブユニットから機能的なＭＣＭ複合体の形成を阻害することができる化合物の使用であって、１７ベータ−デアセチルタンギニン、１７ベータ−ネリイホリンおよび１７ベータ−デアセチルタンギニンジオールからなる群から選択される化合物の使用。および、抗ガン化合物についてスクリーニングする方法であって、（ａ）候補化合物を一定の期間にわたって細胞の集団と接触させる工程、および、（ｂ）そのサブユニットから形成される機能的なＭＣＭ複合体の量を上記細胞において決定する工程を含む方法。【選択図】図１
2020073544.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮頸癌、鼻咽頭癌または肝癌の治療用の薬剤を製造するための、ガン性細胞におけるＭＣＭサブユニットから機能的なＭＣＭ複合体の形成を阻害することができる化合物の使用であって、
前記化合物が、１７ベータ−デアセチルタンギニン、１７ベータ−ネリイホリンおよび１７ベータ−デアセチルタンギニンジオールからなる群から選択される、化合物の使用。
【請求項２】
前記化合物が、ガン性細胞を頓挫性Ｓ期に入らせるが、正常細胞をＧ１期において停止させるその能力のためにさらに選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記機能的なＭＣＭ複合体が、核の中に移動することができ、かつ、ＤＮＡ複製のために必要であるヘテロヘキサマー環状構造体である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ガン性細胞におけるＭＣＭサブユニットから機能的なＭＣＭ複合体の形成の阻害が、ｈＭｃｍ２とｈＭｃｍ６との間における相互作用を妨害することによって達成される、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
抗ガン化合物についてスクリーニングする方法であって、（ａ）候補化合物を一定の期間にわたって細胞の集団と接触させる工程、および、（ｂ）そのサブユニットから形成される機能的なＭＣＭ複合体の量を前記細胞において決定する工程を含み、工程（ｂ）が、核に位置するＭＣＭサブユニットの一部を、細胞質に位置する一部と比較して検出することによって行われる方法。
【請求項６】
間接的な蛍光プロセス（免疫染色）が、１つまたは複数の内因性ＭＣＭサブユニットに対する１つまたは複数の一次抗体と、前記一次抗体を認識する蛍光標識された二次抗体とが、前記細胞が特定の継続期間にわたって前記候補化合物で処理された後における前記ＭＣＭタンパク質の所在を可視化するために使用される工程（ｂ）において行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
直接的な蛍光プロセスが、前記細胞が、蛍光タンパク質と融合される１つまたは複数のＭＣＭサブユニットを発現することができる１つまたは複数のプラスミドでトランスフェクションされており、その後、前記蛍光標識されたＭＣＭサブユニットの所在が、前記細胞が特定の継続期間にわたって前記候補化合物で処理された後で検出される工程（ｂ）において行われる、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は米国仮特許出願第６１／６４４，４４２号（２０１２年５月９日出願；その内容がその全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）からの利益を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ＭＣＭ複合体（６個のサブユニットから形成されるヘテロヘキサマー環状体）の機能性をＤＮＡ複製の過程において阻害することができる作用因を使用することによってガンを処置するための方法に関連し、また、さらには、候補化合物で処理される細胞におけるＭＣＭサブユニット（例えば、ｈＭｃｍ２およびｈＭｃｍ６など）の所在および機能を検出することによってそのような作用因についてスクリーニングする方法に関連する。
【背景技術】
【０００３】
ガン性細胞は、制御できずに分裂および成長し、身体の近くの部分に浸潤し、また、リンパ系および／または血流を介して身体の他の部分に広がることもある細胞である。ガンの処置は通常、例えば、手術、化学療法、放射線療法または免疫療法などによるガン性細胞の除去または破壊を伴う。しかしながら、それらの形態の処置のすべてにおける課題の１つが、ガン性細胞をいかにして完全に除去または破壊するかであり、また、同時に、正常または健康な細胞および組織に対する重大な損傷をいかにして生じさせないかである。化学療法の場合、数十年間にわたって、細胞毒性化合物についてスクリーニングすることが研究開発の主要な焦点であることをもたらした。多数の化学化合物が細胞毒性活性および抗ガン活性を有することが示されている。Ｓｃｈｗａｒｔｓｍａｎｎ他によって述べられるように、１９８８年までに、６００，０００を超える化合物がスクリーニングされており、しかし、それらのうちの約４０個だけが何らかの臨床的重要性を有している。この低い成功率は主として、抗ガン薬物についての毒性の懸念のためである。これは、抗ガン薬物は一般に、狭い治療指数を有しており、すなわち、抗ガン効果のために要求される用量と、許容できない毒性を引き起こす用量との間の余裕が小さいからである。細胞増殖に対する阻害効果を細胞毒性に基づいて有する化合物を発見することの有用性は限定されており、また、そのような発見は、臨床的に関連があるとはとてもいえないものである。必要とされ、かつ、より有意義であることが、細胞増殖を強く阻害するだけでなく、正常または健康な細胞および組織に対する重大な損傷を引き起こすことなく、ガン性細胞に対する特異性を伴って細胞増殖を強く阻害する化合物を見つけることである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
したがって、本発明の１つの目的が、正常な細胞に対する著しい損傷を引き起こすことなく、大きい特異性によりガン性細胞を殺す方法を提供することである。この目的が、機能的なＭＣＭ（ミニ染色体維持）複合体がそのサブユニットから形成されることを中断させることによって実現される。ＭＣＭ複合体は、プレＲＣ（すなわち、複製前複合体）組み立て（これはまた、複製ライセンス化と呼ばれる）およびＤＮＡ複製伸長において不可欠な役割を果たすことが知られている。機能的なＭＣＭ複合体は、Ｏｒｃｌ−６、Ｎｏｃ３、Ｉｐｉｌ−３、Ｃｄｔｌ、Ｃｄｃ６およびおそらくはいくつかの他のタンパク質の助けを借りて複製起点に載るヘテロヘキサマー環状体を形成するために６個すべてのＭＣＭサブユニット（Ｍｃｍ２〜Ｍｃｍ７）を必要とする。ＡＡＡ＋（様々な活性に関連するＡＴＰａｓｅ）ファミリーのタンパク質のメンバーとして、ＭＣＭ複合体は複製フォークと一緒に移動して、おそらくは、複製ヘリカーゼとして働いてＤＮＡ二重鎖を巻き戻すと考えられる。本発明者らの以前の研究は、米国特許第７３９３９５０号および同第８３１８９２２号に開示されるが、ＭＣＭサブユニットの遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞増殖阻害効果を有することを明らかにしている。上記特許の内容が本書により参照によって組み込まれる。
【０００５】
ＭＣＭタンパク質は、機能的であるためには環状構造体との無傷の複合体を形成しなければならないので、それらの相互作用の中断（すなわち、ＭＣＭタンパク質に、機能的な複合体を形成することができなくさせること）により、ＤＮＡ複製が阻害されるであろうし、かつ、アポトーシスが誘導されるであろうし、また、より重要なことに、ＭＣＭの機能性を中断させることの影響が、正常な細胞および健康な細胞に対してではなく、ガン性細胞に対して重大かつ永続的であるにすぎない。
【０００６】
そのような大きい特異性が本発明の本質である。理論によってとらわれることを望まないが、本発明の大きい特異性は、正常な細胞は、細胞死を回避するために細胞周期をＧ１期において停止させる無傷のチェックポイントを有しており、これに対して、ガン細胞はチェックポイント制御を欠き、頓挫性Ｓ期に入るであろうという違いにあると考えられる。言い換えれば、正常な細胞は、ＭＣＭ複合体が形成されて、機能的であるかどうかを感知する能力を有しており、かつ、ＭＣＭ複合体がその規則をＤＮＡ複製において果たす準備ができていることに気づいたときにＳ期に入るだけである。そうでない場合、正常な細胞はＧ１期において一時的に停止されるであろう。比喩を使用すると、このことは、機能するブレーキを備える走行中の車に似ている。運転者は、前方の川に架かる橋が壊れていることに気づくと、車を停止させることができる。他方で、ガン性細胞は、機能不全のブレーキを有する車に似ており、車は、壊れた橋に到達する前に止まることができず、川の中に落下するまでその進路を続けるであろう（すなわち、進行し続けて頓挫性Ｓ期の中に入るであろう）。
【０００７】
本発明の別の目的が、ガン性細胞を殺し、一方で、正常な細胞に対する重大な損傷を引き起こさない大きい特異性を有する抗ガン薬物についてスクリーニングする方法を提供することである。この目的が、細胞質に留まることになり、核に輸送され得ない、サブユニットからの機能的なＭＣＭ複合体（ヘテロヘキサマー環状構造体）の形成を損なう化合物を特定するためのプロセスによって実現される。
【０００８】
好ましくは、上記方法は、（ａ）多数の候補化合物を一定の期間にわたって細胞の集団と接触させる工程、および、（ｂ）機能的なＭＣＭ複合体のレベルを前記候補化合物で処理される前記細胞において検出する工程を含む。より好ましくは、工程（ｂ）が、核に位置するＭＣＭサブユニットの一部を、細胞質に位置する一部と比較して検出することによって間接的に行われる。機能的なＭＣＭ複合体のみが核内に位置することができるので、ＭＣＭサブユニットが核に少なく位置するほど、機能的なＭＣＭ複合体の形成に対する候補化合物の破壊的影響が強くなる。一層より好ましくは、工程（ｂ）が、１つまたは複数の内因性ＭＣＭタンパク質に対する一次抗体を認識する蛍光標識された二次抗体により、候補化合物に特定の継続期間にわたってさらされた後における内因性ＭＣＭタンパク質の細胞内所在の可視化が可能になる間接的な蛍光法（免疫染色）によって行われる。代替において、工程（ｂ）はまた、細胞が、蛍光タンパク質と融合される１つまたは複数のＭＣＭサブユニット（例えば、ｈＭｃｍ２−ＧＦＰおよび／またはｈＭｃｍ６−ＧＦＰなど）を発現することができるプラスミドでトランスフェクションされており、それにより、細胞が候補化合物で処理された後における蛍光性ＭＣＭ融合タンパク質の所在を検出することができる直接的な蛍光法によって行われる場合がある。工程（ｂ）のための他の方法には、ＭＣＭサブユニットの物理的相互作用を検出すること、または、様々なＭＣＭタンパク質が正常にそれらの機能を行うクロマチンに結合するＭＣＭタンパク質の量を測定することが含まれる。
【０００９】
必要に応じて、追加の工程が、工程（ｂ）を補完するために行われる場合があり、または、別個の工程として、ＤＮＡ複製の欠陥を様々な方法によって調べるために、例えば、ＢｒｄＵ取り込みアッセイ、フローサイトメトリーなどによって調べるために行われる場合がある。さらなる工程がまた、機能的なＭＣＭ複合体の形成を中断させる能力により特定される化合物がまた、抗増殖およびアポトーシス誘導の面での強力な示差的影響をガン性細胞と正常な細胞との間において有することを確認するために取られる場合がある。
【００１０】
本発明の別の目的が、本発明による治療方法を具体化するための大きい特異性を有する抗ガン剤としての特異的な化合物を提供することである。好ましい化合物が、４環骨格構造を含む式（Ｉ）である：
式中、Ｒ１はＨであるか、あるいは、１つまたは複数の糖ユニットによって置換される；Ｒ２はベータ型立体配置での５員環基または６員環基である；Ｒ３およびＲ４はそれぞれがＨまたはＯＨであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、Ｒ３およびＲ４がそれぞれ、それぞれ結合する２個のＣ原子との３員環を形成するただ１つのＯ原子である；Ｒ５はＯＨであり、かつ、Ｒ６はＨであるか、あるいは、Ｒ５およびＲ６は、Ｒ５およびＲ６がそれぞれ、それぞれ結合する２個のＣ原子との３員環を形成するただ１つのＯ原子である。
【００１１】
本発明の方法および化合物は、ＭＣＭ複合体の中断に対して感受性であるすべての形態のガンに対して適用可能であり、例えば、子宮頸ガン、前立腺ガン、結腸ガン、乳ガン、卵巣ガン、急性骨髄球性白血病、慢性リンパ球性白血病、非ホジキン病リンパ腫、ホジキン病リンパ腫、急性リンパ球性白血病、膵臓ガン、胃ガン、皮膚ガン、膀胱ガン、食道ガン、鼻咽頭ガン、小細胞肺ガン、濾胞性リンパ腫または非小細胞肺ガンに対して適用可能である。
【００１２】
要約すれば、本発明の根底にある特別な技術的特徴は、機能的なＭＣＭ複合体がそのサブユニットから形成されることを妨げることによってガン性細胞を選択的に殺すことができる作用因を伴う。
【００１３】
発明を特徴づける新規な様々な特徴が、本開示に添付され、かつ、本開示の一部を形成する請求項において詳しく指摘される。本発明、その操作上の利点、および、その使用によって達成される特定の目的をよりよく理解するためには、本発明の好ましい実施形態が例示され、また、記載される図面および下記の説明を参照しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の抗ガン化合物（３〜８）の構造を不活性な異性体（１〜２）の構造との比較で示す。
【００１５】
【図２】直接的な顕微鏡法観察（Ａ）およびＷＳＴ−１（水溶性テトラゾリウム−１）アッセイデータ（Ｂ〜Ｈ）を示し、これらは、１７ベータ−デアセチルタンギニン（Ａ〜Ｃ）、１７ベータ−ネリイホリン（Ｄ）および１７ベータ−デアセチルタンギニンジオール（Ｅ）、すなわち、本発明の抗ガン化合物の３つの代表例が、正常な細胞に対する著しい細胞毒性を伴うことなく、強力な抗ガン活性を有することを示す。比較のために、パクリタキセル（タキソール）は、ガン細胞よりも、正常な細胞に対して細胞毒性であり（Ｆ）、ＶＰ１６（リン酸エトポシド）は選択性を正常な細胞とガン細胞との間においてほとんど有していない（ＧおよびＨ）。
【００１６】
【図３】１７ベータ−デアセチルタンギニン（ＤＡＴ）および１７ベータ−ネリイホリン（ＮＲＦ）がＭＣＭサブユニットの間における相互作用を損ない、一方、１７ベータ−デアセチルタンギニンジオール（Ｄｉｏｌ）はより弱い活性を有することを共免疫沈澱によって示す。
【００１７】
【図４】１７ベータ−デアセチルタンギニン（ＤＡＴ）、１７ベータ−ネリイホリン（ＮＲＦ）および１７ベータ−デアセチルタンギニンジオール（Ｄｉｏｌ）がｈＭｃｍ２（ｈ、ヒト）およびｈＭｃｍ６の核局在化を損なうことを示す間接的な免疫蛍光顕微鏡法のデータを示す。
【００１８】
【図５】１７ベータ−デアセチルタンギニンが複製前複合体（プレＲＣ）の組み立てを阻害し、ガン細胞のアポトーシスを誘導することを示すためのクロマチン結合アッセイデータおよびフローサイトメトリーデータを示す。
【００１９】
【図６】１７ベータ−デアセチルタンギニンがガン細胞においてＤＮＡ複製を阻害し、アポトーシスを誘導することをフローサイトメトリーによって示す。
【００２０】
【図７】１７ベータ−デアセチルタンギニンがＤＮＡ複製を阻害することを示すためのＢｒｄＵ取り込みアッセイデータを示す。
【００２１】
【図８】１７ベータ−デアセチルタンギニン（ＤＡＴ）、１７ベータ−ネリイホリン（ＮＲＦ）および１７ベータ−デアセチルタンギニンジオール（Ｄｉｏｌ）がアポトーシスをガン細胞において誘導し得ることを示すフローサイトメトリーデータおよびアネキシンＶ染色データを示す。
【００２２】
【図９】ガン細胞ではなく、正常な細胞は、ＷＳＴ−１アッセイによって測定されるように、１７ベータ−デアセチルタンギニンが除かれた後において成長を再開することができることを示す。
【００２３】
【図１０】ヌードマウス異種移植モデルにおける１７ベータ−デアセチルタンギニンのインビボ抗腫瘍活性を示す。
【００２４】
【図１１】１７ベータ−デアセチルタンギニンは、明白な毒性を、図１０に示される実験に供されたヌードマウスにおいて何ら有しないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
細胞株およびプラスミド
ヒトＭｃｍ６およびヒトＭｃｍ２のｃＤＮＡフラグメントをそれぞれ、局在化検出のためにｐＥＧＦＰ−Ｃ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。ＨｅＬａ細胞（子宮頸部腺ガン）、ＨｅｐＧ２細胞（肝細胞ガン）、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（肝細胞ガン）、ＨＫｌ（鼻咽頭ガン）およびＣ６６６−１（鼻咽頭ガン）を、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭにおいて培養した。Ｌ−０２細胞（正常なヒト肝臓細胞）を、１０％のＦＢＳを伴うＲＰＭＩ１６４０において培養した。ＮＰ４６０細胞を補充物Ｓ０１２５（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）とともに１：１のケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＭＥＰＩ５００ＣＡにおいて培養した。すべての細胞株を、５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気において３７℃で培養した。
【００２６】
抗増殖活性アッセイ
化合物の抗増殖活性をヒト細胞株において試験し、ＩＣ５０を計算するために、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａおよびＨｅｐ３Ｂを含むガン細胞（４×１０５細胞／ウエル）ならびに正常なＬ−０２細胞（５×１０５細胞／ウエル）を１００μｌの培養培地において９６ウエルプレートにそれぞれ播種し、３７℃で約１２時間インキュベーションした。細胞を４８時間にわたって薬物の２倍連続希釈物で処理した。培地を除き、１μＭのＷＳＴ−１（水溶性テトラゾリウム−１）を含有する１００μｌの培養培地をそれぞれのウエルに加えた。細胞を２時間インキュベーションし、その後、４０５ｎｍにおける吸光度（６３０ｎｍにおける参照）を測定した。細胞数とＯＤ４０５における吸光度との関係の標準曲線を構築するために、既知の細胞数を有する細胞の連続希釈物を播種し、６時間インキュベーションし、その後で、ＷＳＴ−１アッセイによる測定を行った。細胞生存性を、候補化合物で処理される生細胞の数の、ＤＭＳＯ処理細胞の数に対する比率として表した。
【００２７】
抗ガン化合物の天然物スクリーニングおよび生物活性誘導による単離
化学サンプルを抗ガン薬物選別アッセイのための天然供給源から調製するための一般的プロトコルは下記の通りであった。１０〜１００グラムの薬草材料（植物全体、根、茎、葉または実）を、室温で３回、メタノールで抽出した。それぞれの総抽出物を水に懸濁し、その後、Ｅｔ２Ｏ、ＥｔＯＡｃ、ｎ−ＢｕＯＨにより順次、分配して、４つの画分、すなわち、Ｅｔ２Ｏ画分、ＥｔＯＡｃ画分、ｎ−ＢｕＯＨ画分およびＨ２Ｏ画分を得た。それぞれの総抽出物または画分をスクリーニングアッセイのための１０ｍｇ／ｍｌのストック液としてＤＭＳＯに溶解した。精製された単一の化合物をそれぞれ１ｍｇ／ｍｌのストック液として調製した。
【００２８】
上記のスクリーニング手法を使用して、強力なＭＣＭ複合体中断活性および抗ガン活性を有する１つの画分を特定した。この画分は、セレブラ・マンハス（Ｃｅｒｅｂｒａ  ｍａｎｈａｓ）およびセレブラ・オドラム（Ｃｅｒｅｂｒａ  ｏｄｏｌｌａｍ）の乾燥葉または幼若ブラチ（ｂｒａｃｈ）の抽出物のＥｔ２Ｏ画分である。この画分を続いて、ＳｉＯ２、ＭＣＩゲル  ＣＨＰ  ２０Ｐ（７５〜１５０ｍ、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、日本）、Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ  ＯＤＳ（１００〜２００メッシュ、Ｆｕｊｉ  Ｓｉｌｙｓｉａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｔｄ．、日本）およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０Ｆ（Ｔｏｓｏｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、日本）での異なるカラムクロマトグラフィーの組合せを使用することによって活性誘導による分画化に供し、これにより、１７ベータ−デアセチルタンギニンを、セレブラ・オドラムおよびセレブラ・マンハスの乾燥葉および幼若ブラチの活性画分の活性を担うリード化合物として単離した。
【００２９】
１７ベータ−デアセチルタンギニンの構造特定
１７ベータ−デアセチルタンギニンの構造を分光学的証拠に基づいて特徴づけた。ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ−４００分光計を使用して記録した。結合定数がＨｚ単位で与えられ、化学シフトを内部標準としてのＭｅ４Ｓｉに対して（ｐｐｍ）で表した。ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳをＱ−ＴＯＦ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、ＭＡ、米国）で行った。
【００３０】
高分解能ＥＳＩ−ＭＳ（陽イオンモード）：ｍ／ｚ  ５４９．３０７７［Ｍ＋Ｈ］＋（計算値、Ｃ３０Ｈ４５Ｏ９：５４９．３０６４）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ピリジン−ｄ５）：δ６．３１（１Ｈ、ｓ、Ｈ−２２）、５．２５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝２．９Ｈｚ、Ｈ−１’）、５．２０（１Ｈ、ｍ、Ｈ−２１）、５．０２（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１８．０、１．４Ｈｚ、Ｈ−２１）、４．３３（１Ｈ、ｍ、Ｈ−５’）、４．１２（１Ｈ、ｂｒｓ、Ｈ−３）、４．０９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝９．０、４．０Ｈｚ、Ｈ−２’）、４．０３（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、Ｈ−３’）、３．８５（３Ｈ、ｓ、３’−ＯＭｅ）、３．６９（１Ｈ、ｍ、Ｈ−４’）、３．４１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．８Ｈｚ、Ｈ−７）、２．８２（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝９．０、５．０Ｈｚ、Ｈ−１７）、１．６６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．２Ｈｚ、Ｈ−６’）、１．０６（３Ｈ、ｓ、Ｈ−１９）、０．９９（３Ｈ、ｓ、Ｈ−１８）。１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ピリジン−ｄ５）：δ３２．７（Ｃ−１）、２８．０（Ｃ−２）、７３．７（Ｃ−３）、３３．５（Ｃ−４）、３４．８（Ｃ−５）、２８．９（Ｃ−６）、５１．９（Ｃ−７）、６５．１（Ｃ−８）、３２．５（Ｃ−９）、３４．４（Ｃ−１０）、２１．５（Ｃ−１１）、４１．４（Ｃ−１２）、５３．２（Ｃ−１３）、８２．４（Ｃ−１４）、３５．９（Ｃ−１５）、２９．３（Ｃ−１６）、５１．５（Ｃ−１７）、１３．０（Ｃ−１８）、２５．０（Ｃ−１９）、１７５．９（Ｃ−２０）、７４．４（Ｃ−２１）、１１３．４（Ｃ−２２）、１７５．１（Ｃ−２３）、９９．６（Ｃ−１’）、７４．０（Ｃ−２’）、８６．０（Ｃ−３’）、７７．２（Ｃ−４’）、６９．６（Ｃ−５’）、１９．２（Ｃ−６’）、６１．２（Ｃ−３’−ＯＭｅ）。
【００３１】
１７ベータ−デアセチルタンギニンを、Ｃ３０Ｈ４４Ｏ９の分子式に対応するその高分解能ＥＳＩ−ＭＳ、カルデノリドに由来する特徴的なシグナルを示す１Ｈ−ＮＭＲスペクトル［Ｃ−２１におけるメチレンプロトン（δ５．２０、ｍ；５．０２、ｄｄ、Ｊ＝１８．０、１．４Ｈｚ）およびＣ−２２におけるオレフィンプロトン（δ６．３１、ｓ）］、および、糖成分のアノマープロトンのシグナル（δ５．２５、ｄ、Ｊ＝２．９Ｈｚ）によってカルデノリドモノグリコシドであると決定した。Ｃ−７位およびＣ−８位におけるエポキシ基が、ネリホルリン（セルベラ・マングハス（Ｃｅｒｂｅｒａ  ｍａｎｇｈａｓ）の葉から得られる主要なカルデノリド）のＣ−７およびＣ−８のシグナルと比較して、Ｃ−７およびＣ−８のシグナルについての大きい低磁場シフトによって示唆され、また、７，８−エポキシ基を有するカルデノリド類の化学シフトとの化学シフト比較によってさらに裏付けられた。Ｃ−１７の立体配置が、Ｈ−１７のシグナル（δ２．８２、ｄｄ、Ｊ＝９．０、５．０Ｈｚ）によって証明されるように、また、ラクトン環の遮蔽効果を受けているＣ−１２のシグナル（δＣ４１．４）によって裏付けられるように、βであることが立証された。アグリコンが、その１３Ｃ−ＮＭＲデータを報告されるデータと比較することによって３β−ヒドロキシ−７β，８β−エポキシ−１４β−ヒドロキシ−カルド−２０（２２）−エノリドとして特定された。糖成分が、そのプロトンシグナルおよび炭素シグナルを文献に記載されるデータと比較することによってα−Ｌ−テベトース（３−Ｏ−メチル−６−デオキシ−α−Ｌ−グルコピラノシル）であることが明らかにされた。上記の証拠に基づいて、ＨＭＧ−１７ベータ−デアセチルタンギニンの構造を、３β−Ｏ−（３−Ｏ−メチル−６−デオキシ−α−Ｌ−グルコピラノシル）−７β，８β−エポキシ−１４β−ヒドロキシ−カルド−２０（２２）−エノリド（１７ベータ−デアセチルタンギニン）であると特徴づけた。
【化１】
2020073544.tif 000003
【００３２】
免疫染色アッセイ
ｈＭｃｍ２とｈＭｃｍ６との間の相互作用に対する抗ガン化合物の影響を細胞において研究するために、免疫染色を、タンパク質の細胞内局在化を検出するために行った。薬物処理を伴う、または伴わない、（ポリ−Ｄ−リシンで被覆される）カバースリップにおいて成長させられるＨｅＬａ細胞を、室温で２０分間、ＰＢＳにおける４％のＰＦＡにより固定処理した。ＰＢＳにおける０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１％のＢＳＡによる透過処理を２０分間行った後、細胞を１％のＢＳＡによりブロッキング処理し、その後、ウサギ抗ｈＭｃｍ６一次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ；１：５００）およびマウス抗ｈＭｃｍ２一次抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、１：５００）と室温で１時間インキュベーションした。その後、細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲート化ロバ抗ヤギ抗体およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４コンジュゲート化ロバ抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：５００）と室温で１時間インキュベーションした。ＰＢＳによる３回の洗浄を抗体インキュベーションのそれぞれの操作の後で行った。その後、細胞を核染色のためにＨｏｃｈｅｓｔ３３８５２（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ；１μｇ／ｍｌ）と室温で１５分間インキュベーションし、再度、ＰＢＳにより３回洗浄した。最後に、細胞をスライドガラスに載せ、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ２０００Ｅ）のもとで観察した。
【００３３】
細胞の同期化
細胞をＭ期において停止させるために、ＨｅＬａ細胞を２μＭのチミジンで１８時間にわたって事前に同期化し、新鮮な培地の中に６時間にわたって解放し、その後、０．１μｇ／ｍｌのノコドゾールで６時間にわたって初期Ｍ期において停止させた。ＨｅＬａ細胞を０．５ｍＭのミモシンによる２０時間の処理によってＧ１／Ｓ期境界で停止させた。その後、Ｇ１／Ｓ期細胞のアリコートをヒドロキシ尿素含有培地の中に４時間にわたって解放して、初期Ｓ期細胞を得た。
【００３４】
ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
ポリ−Ｄ−リシンで被覆されるカバースリップにおいて成長させられるＨｅＬａ細胞を、２４時間の１７ベータ−デアセチルタンギニン処理の後、５０μＭのＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ）と３７℃で１時間インキュベーションした。その後、細胞をＰＢＳにおける４％のＰＦＡにより室温で２０分間にわたって固定処理し、ＰＢＳにおける０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１％のＢＳＡにより２０分間にわたって透過処理し、その後、抗ＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ；１：５００）および抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ；１：５００）と順次、それぞれ３７℃で１時間インキュベーションし、ＰＢＳにおける３回の洗浄をそれぞれの抗体インキュベーションの後で行った。ＢｒｄＵシグナルを蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ２０００Ｅ）のもとで観察した。
【００３５】
クロマチン結合アッセイ
細胞をトリプシン処理によって集め、冷ＰＢＳにより２回洗浄した。抽出緩衝液（ＥＢ；約２０μｌ／１０６細胞）（１００ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．５、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＮａＦ、５ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、０．１ｍＭ  ＮａＶＯ３、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、２０μｇ／ｍｌのロイペプチン、２０μｇ／ｍｌのアプロチニン、０．２ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃ、２ｍＭのベンズアミジンＨＣｌおよび０．２ｍｇ／ｍｌのバシトラシン）を加えて再懸濁し、細胞をピペッティングによって溶解した。細胞を氷上に１０分間置き、インキュベーション期間中において２分毎〜３分毎に軽くたたいて混合した。プロテアーゼ阻害剤を含有するＥＢに等しい体積の３０％氷冷スクロースをチューブの底に加えた。チューブを微量遠心分離器において最高速度で１０分間遠心分離して、クロマチンおよび遊離タンパク質を分離した。上清を新しいチューブに移し、氷上で保った。ペレットを、チューブを軽くたたいてペレットをチューブの壁から取り除くことによって等体積のＥＢにより洗浄し、軽いボルテックス処理によって再懸濁した。懸濁物を再び、最高速度で５分間遠心分離した。２つの上清を一緒にした。ペレットを上清の体積の半量に等しいＥＢに再懸濁した。上清画分およびペレット画分を最終的には免疫ブロッティングのために処理した。
【００３６】
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ分析）
浮遊細胞および付着細胞の両方を回収し、ＰＢＳにより１回洗浄した。細胞を、−２０℃で１時間〜一晩、７０％エタノールにおいて固定処理し、ＰＢＳにより徹底的に洗浄し、その後、５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ  Ａ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）および５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムにおいて４℃で３０分間染色した。サンプルをＦＡＣＳｏｒｔ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。
【００３７】
大きい特異性を正常な細胞とガン細胞との間において有する抗増殖剤の特定
植物由来の化合物、分画物または粗抽出物、および、合成化合物である数百個のサンプルのスクリーニングの後、ヒトＭＣＭタンパク質およびＤＮＡ複製を阻害することができるいくつかの候補物を特定した。これらの候補物のうち、１７ベータ−デアセチルタンギニンと呼ばれる小さい化合物（図１）を、植物抽出物、分画物および化合物の数回の活性誘導分画化、精製および試験の後で単離し、特定した。１７ベータ−デアセチルタンギニンに構造的に関連するいくつかの他の化合物および１７ベータ−デアセチルタンギニンの化学的誘導体（７ベータ−デアセチルタンギニンジオール）もまた、１７ベータ−デアセチルタンギニンと類似する活性を有することが見出された（図１の（３）〜（８））。一方で、それらの１７アルファ異性体（図１の（１）および（２））は不活性であることが見出された。
【００３８】
１対のヒト細胞株、すなわち、Ｌ−０２（正常な肝臓細胞）およびＨｅｐＧ２（肝臓ガン細胞株）を１７ベータ−デアセチルタンギニンで４８時間処理した。顕微鏡法のもとでの細胞密度および形態学の直接的な観察では、１７ベータ−デアセチルタンギニンは培養においてガン細胞（ＨｅｐＧ２）の増殖を効率的に阻害することができ、かつ、はるかにより低い活性を正常な細胞（Ｌ−０２）に対して有することが示された（図２Ａ）。したがって、１７ベータ−デアセチルタンギニンが、細胞毒性を正常な細胞に対してほとんど有しない高活性な抗増殖剤として特定された。図２Ｂ〜図２Ｈにおいて、生細胞数の定量化が、ＷＳＴ−１（水溶性テトラゾリウム−１）アッセイを使用して行われた。
【００３９】
１７ベータ−デアセチルタンギニンをさらに試験するために、また、ＩＣ５０値を求めるために、Ｌ−Ｏ２およびＨｅｐＧ２の他に、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ｐ５３陰性である別の肝臓ガン細胞株）、ＨｅＬａ細胞（子宮頸ガン細胞株）、ＨＫ１細胞およびＣ６６６−１細胞（鼻咽頭ガン）、ならびに、ｈＴｅｒｔにより不死化された正常な鼻咽頭細胞株（ＮＰ４６０）を１７ベータ−デアセチルタンギニンで４８時間処理し、相対的な細胞生存性をＷＳＴ−１アッセイによって求めた（図２Ｂ、図２Ｃ）。これらのガン細胞株および（肺ガンなどを含む）他のガン細胞株（データは示されず）を用いて、１７ベータ−デアセチルタンギニンが広範囲のガン細胞を殺傷し得ることを明らかにした。試験されたすべてのガン細胞株の成長が１７ベータ−デアセチルタンギニンによって著しく阻害された。ＩＣ５０値が種々のガン細胞株の間でわずかに異なっていたが、ガン細胞株に対する１７ベータ−デアセチルタンギニンの平均ＩＣ５０が約０．１μｇ／ｍｌ（０．２μＭ）であり、一方、正常な細胞についてのＩＣ５０ははるかにより大きかった（４μｇ／ｍｌを超えていた）。ガン細胞と正常な細胞との間における類似する抗ガン活性および選択性が、いくつかの構造的に関連した化合物について得られた：例えば、１７ベータ−ネリイホリン（図２Ｄ）、本発明者らが合成した１７ベータ−デアセチルタンギニンの新規な化学的誘導体である１７ベータ−デアセチルタンギニンジオール（これは１７ベータ−デアセチルタンギニンよりも低い抗ガン活性を有した；図２Ｅ）、ブファリン、レシブホゲニンおよびシノブファギン（下記の表）。一方で、１７アルファ−デアセチルタンギニンおよび１７アルファ−ネリイホリンは抗増殖活性をほとんど有しておらず（下記の表）、このことは、１７ベータの立体配置がこれらの化合物の抗増殖活性のために非常に重要であることを示している。
【表１】
2020073544.tif 000004
【００４０】
比較のために、臨床での抗ガン薬物であるパクリタキセル（タキソール；図２Ｆ）およびＶＰ１６（リン酸エトポシド；図２Ｇ、図２Ｈ）は、有意な選択性をガン細胞と正常な細胞との間で示さなかった（それらは、ガン細胞と同様に、正常な細胞に対して細胞毒性である；実際、パクリタキセルは、肝臓ガン細胞よりも、正常な肝臓細胞に対して毒性である）。
【００４１】
ＭＣＭ複合体の形成の中断およびＭＣＭタンパク質の核局在化
１７ベータ−デアセチルタンギニンがヒト細胞においてｈＭｃｍ２タンパク質およびｈＭｃｍ６タンパク質を標的とするかを試験するために、これら２つのタンパク質の起こり得る共免疫沈澱（ｃｏ−ＩＰ）を、１７ベータ−デアセチルタンギニンで処理される細胞から得られるヒト細胞抽出物において試験した。図３において、非同期のＨｅＬａ細胞をＤＭＳＯまたは１７ベータ−デアセチルタンギニン（ＤＡＴ）で処理し（図３Ａ）、あるいは、ＤＭＳＯ、１７ベータ−ネリイホリン（ＮＲＦ）または１７ベータ−デアセチルタンギニンジオール（Ｄｉｏｌ）で処理した（図３Ｂ）。また、全細胞抽出物を調製し、化合物とさらにインキュベーションし、その後で、化合物の存在下でのｃｏ−ＩＰのために使用した。その後、免疫沈殿物を、抗ｈＭｃｍ６抗体、抗ｈＭｃｍ２体、抗ｈＭｃｍ４抗体および抗ｈＭｃｍ７抗体により免疫ブロットした。結果は、１７ベータ−デアセチルタンギニンがｈＭｃｍ２とｈＭｃｍ６との相互作用および他のＭＣＭサブユニットの間における相互作用を中断させたことを示した（図３Ａ）。同様に、１７ベータ−ネリイホリンもまた、ｈＭｃｍ２−ｈＭｃｍ６の相互作用を中断させることができ、一方、１７ベータ−デアセチルタンギニンジオールはより弱い活性を示した（図３Ｂ）。
【００４２】
ＭＣＭサブユニットの間における対での相互作用がＭＣＭヘテロヘキサマー環状構造体のために要求され、また、このＭＣＭヘテロヘキサマー環状構造体が核内へのそれらの輸入のために不可欠であるので、ｈＭｃｍ２とｈＭｃｍ６との間での相互作用の中断はこのヘキサマーを破壊し、かつ、ＭＣＭタンパク質の核局在化の不首尾を生じさせるであろう
。このことを試験するために、本発明者らは、内因性ＭＣＭタンパク質に対する抗体を使用する間接的な蛍光顕微鏡法（免疫染色）と、ｈＭｃｍ２−ＧＦＰおよびｈＭｃｍ６−ＧＦＰを細胞において発現するためのプラスミドによるトランスフェクションの後における直接的な蛍光顕微鏡法との両方を用いた。
【００４３】
免疫染色において、ＨｅＬａ細胞を１７ベータ−デアセチルタンギニンによって２４時間処理し、内因性のｈＭｃｍ２およびｈＭｃｍ６をこれらのタンパク質に対する特異的な抗体によって検出した。結果は、ｈＭｃｍ２およびｈＭｃｍ６の核局在化が１７ベータ−デアセチルタンギニンによって損なわれたことを示した（図４Ａ）。直接的な蛍光顕微鏡法において、ｈＭｃｍ２−ＧＦＰおよびｈＭｃｍ６−ＧＦＰを発現するＨｅＬａ細胞を、ｈＭｃｍ２−ＧＦＰおよびｈＭｃｍ６−ＧＦＰを発現するプラスミドによるトランスフェクションの後４時間から開始して３６時間、１７ベータ−デアセチルタンギニンで処理した。結果は、発現したｈＭｃｍ２−ＧＦＰおよびｈＭｃｍ６−ＧＦＰの一部が細胞質に位置し、一方、非処理のコントロール細胞では、発現したｈＭｃｍ２−ＧＦＰおよびｈＭｃｍ６−ＧＦＰのほとんどすべてが核に位置したことを示した（図４Ｂ）。いくつかのＭＣＭタンパク質の細胞質局在化が、１７ベータ−デアセチルタンギニンによって引き起こされる細胞周期停止に起因したという可能性を除外するために、本発明者らはミモシンを使用して、細胞を、ＭＣＭタンパク質が阻害されない場合にはすべてのＭＣＭタンパク質が核に存在するにちがいない後期Ｇ１期において停止させた。本発明者らは、ｈＭｃｍ２およびｈＭｃｍ６の核局在化が依然として１７ベータ−デアセチルタンギニンによって妨げられたことを見出した（データは示されず）。
【００４４】
まとめると、これらのデータは、１７ベータ−デアセチルタンギニンはＭＣＭの核局在化を特異的に阻止し得ることを示している。本発明者らはまた、１７ベータ−ネリイホリン、すなわち、セレブラ・マンハスから単離され、１７ベータ−デアセチルタンギニンに構造的に関連する別の化合物もまた、１７ベータ−デアセチルタンギニンが中断させ得るのと同じくらい効率的にＭＣＭの核局在化を中断させ得ること、一方、１７ベータ−デアセチルタンギニンの化学的誘導体である１７ベータ−デアセチルタンギニンジオールはより弱い活性を有することを見出した（図４Ｃ）。
【００４５】
プレＲＣの組み立ての阻害
プレＰＣの成分として、ＭＣＭ複合体がＤＮＡ複製のライセンス化において中心的な役割を果たしている。１７ベータ−デアセチルタンギニンはｈＭｃｍ２およびｈＭｃｍ６の相互作用を中断させることができ、かつ、それらの核局在化を妨げることができるので、１７ベータ−デアセチルタンギニンはＭＣＭタンパク質のクロマチン会合を阻害するにちがいなく、このことはプレＲＣ組み立て（複製ライセンス化）の不首尾を示している。このことを試験するために、本発明者らは、クロマチン会合タンパク質を検出するためにクロマチン結合アッセイを行った。図５Ａおよび図５Ｂにおいて、非同期のＨｅｌａ細胞を１７ベータ−デアセチルタンギニンで２４時間処理し、クロマチン結合アッセイによって分析した（図５Ａ）。非処理の細胞（Ｕｎｔｒｅａｔ）、溶媒のＤＭＳＯで処理される細胞、および、０．２、０．４または０．８ｇ／ｍｌの１７ベータ−デアセチルタンギニンで処理される細胞を、免疫ブロッティングによって、クロマチン画分および上清画分におけるプレＲＣ成分について分析した（図５Ａ）。ベータ−アクチンを負荷コントロールとして使用した。それぞれの細胞サンプルはまた、フローサイトメトリーによって細胞周期分布について分析した（図５Ｂ）。図５Ｃおよび図５Ｄに示される実験は、細胞が、ノコダゾール（Ｎｏｃ．）を使用してＭ期において同期化され、その後、示されるようにＤＭＳＯまたは１７ベータ−デアセチルタンギニン（ＤＡＴ）を含有する新鮮な培地の中に解放されたことを除いて、図５Ａおよび図５Ｂにおける実験と類似していた。
【００４６】
予測と一致して、ｈＭｃｍ２およびｈＭｃｍ６の両方が、投薬量依存的様式で１７ベータ−デアセチルタンギニンによってクロマチン画分において著しく減少した（図５Ａ）。これらの結果から、プレＲＣは１７ベータ−デアセチルタンギニンの存在下において集合することができなかったことが示唆される。そのうえ、細胞は、同じ実験から得られる細胞のアリコートを用いるフローサイトメトリーによって求められるように、アポトーシスを受けた（図５Ｂ）。
【００４７】
同期化された細胞における１７ベータ−デアセチルタンギニンの影響を明らかにするために、ＨｅＬａ細胞を最初に、チミジンにより後期Ｇ１／初期Ｓ期において事前に同期化し、その後、ノコドゾールによりＭ期において停止させた。その後、細胞を１７ベータ−デアセチルタンギニンの存在下において新鮮な培地の中に解放した。ＤＭＳＯ処理細胞および非処理細胞を含むコントロール細胞はＭ期およびＧ１期を通過して、Ｓ期に入ることができた（図５Ｄ）。しかしながら、１７ベータ−デアセチルタンギニン処理細胞はＧ１期に入っただけで、細胞のほとんどがＳ期に入らなかった（図５Ｄ）。免疫ブロティング分析は、クロマチンへのＭＣＭ負荷が１７ベータ−デアセチルタンギニンによって大きく妨げられたことを示した（図５Ｃ）。これらの結果は、１７ベータ−デアセチルタンギニンはヒト細胞におけるプレＲＣの組み立てを妨げることができることを示している。
【００４８】
ガン細胞におけるアポトーシスを伴うＤＮＡ複製の阻害
１７ベータ−デアセチルタンギニンはｈＭｃｍ２とｈＭｃｍ６との間における相互作用を中断させ、かつ、クロマチンとのＭＣＭタンパク質の会合を阻害するので、１７ベータ−デアセチルタンギニンはＤＮＡ複製を阻止するにちがいない。このことを確認するために、本発明者らはＨｅＬａ細胞を１７ベータ−デアセチルタンギニンで２４時間処理し、その後、細胞をＢｒｄＵにより１時間標識した。細胞のＤＮＡにおける取り込まれたＢｒｄＵを、抗ｂｒｄＵ抗体、続いて、蛍光顕微鏡のもとで可視化されたＦＩＴＣ−抗マウス二次抗体によって検出した（図６Ａ）。ＤＡＰＩを使用して、核を染色し（図６Ａ）、ＢｒｄＵ陽性細胞の割合を定量化した（図６Ｂ）。ＢｒｄＵシグナルが、１７ベータ−デアセチルタンギニンが０．２ｇ／ｍｌを超えたときにはほとんど全く認められず、一方、ＤＭＳＯ処理細胞および非処理細胞では、約３０％が、予想されるようにＢｒｄＵ陽性であったように（図６Ａ、図６Ｂ）、ＤＮＡ複製の有意な阻害が１７ベータ−デアセチルタンギニン処理のＨｅＬａ細胞において認められた。
【００４９】
そのうえ、１７ベータ−デアセチルタンギニンによるＤＮＡ複製の阻害およびその後でのアポトーシスの誘導をフローサイトメトリーによって示すことができた。図７において、Ｈｅｌａ細胞がノコダゾールによってＭ期で阻止され（Ｎｏｃ；図７Ａ）、ミモシンによってＧ１／Ｓ移行において阻止され（ＭＭＳ；図７Ｂ）、または、ヒドロキシ尿素によって初期Ｓ期で阻止され（ＨＵ；図７Ｃ）、その後、１７ベータ−デアセチルタンギニン（ＤＡＴ）の存在下において新鮮な培地の中に解放された。解放後の種々の時点での細胞をフォローサイトメトリーによって分析した。Ａｙｎ．は非同期の細胞を意味する。非処理細胞、および、溶媒のＤＭＳＯで処理される細胞は、解放後にＭ期、Ｇ１期およびＳ期を完了することができた（図７Ａ）。１７ベータ−デアセチルタンギニンで処理される細胞は有糸分裂を完了することができ、しかし、Ｍ期におけるノコダゾール停止から解放された後ではＳ期に入ることができず、また、アポトーシスを１７ベータ−デアセチルタンギニンによるより長時間の処理により開始した（図７Ａ）。同様に、（Ｇ１／Ｓ移行における）ミモシン（ＭＭＳ）停止から解放された細胞（図７Ｂ）、または、（初期Ｓ期おける）ヒドロキシ尿素（ＨＵ）停止から解放された細胞（図７Ｃ）は、１７ベータ−デアセチルタンギニンの存在下においてＳ期を終えることができなかった。これらの結果は、ＤＮＡ複製の開始および伸長の両方においてＭＣＭ機能の阻害と一致している。
【００５０】
１７ベータ−デアセチルタンギニンはまた、アポトーシス細胞死をガン細胞において誘導した。これは、亜Ｇ１ガン細胞の集団（これはアポトーシスを示す）が１７ベータ−デアセチルタンギニンによる処理の後においてフローサイトメトリーによって検出され（図５Ｂ、図７および図８Ａ）、これに対して、正常なＬ−０２細胞は大部分が、低下したＧ２／Ｍ集団を伴ってＧ１期において停止されたからである（図８Ａ）。図８Ａにおいて、フローサイトメトリーを、様々な濃度での１７ベータ−デアセチルタンギニンで２４時間処理されるＨｅｐＧ２細胞およびＬ−０２細胞におけるＤＮＡ含有量を分析するために行った。図８Ｂにおいて、Ｈｅｌａ細胞を１７ベータ−デアセチルタンギニンで２４時間処理し、アネキシンＶ−Ｃｙ３（Ａｒｍ．Ｃｙ３）により２０分間標識した。ミトキサントロン（ＭＴＸ）、すなわち、アポトーシスをガン細胞において誘導することができる臨床での抗ガン薬物を陽性コントロールとして使用した。結果は、１７ベータ−デアセチルタンギニン処理のガン細胞がアネキシンＶによって染色され得たことを示す（図８Ｂ）。このことは、アポトーシスが１７ベータ−デアセチルタンギニンによって誘導されたという見解を裏付けている。
【００５１】
上記のように、１７ベータ−デアセチルタンギニンはＤＮＡ複製を（ＢｒｄＵ取り込みアッセイによって）非同期のＨｅＬａ細胞において阻害し（図６）、また、フローサイトメトリーの結果によって判断されるように、Ｍ期から解放される同期化された細胞のほとんどがＧ１期に入り、しかし、明らかに、１７ベータ−デアセチルタンギニンの存在下ではＳ期に入らなかった（図７Ａ）。１７ベータ−デアセチルタンギニンとのガン細胞のより長期間のインキュベーションは、フローサイトメトリーのプロフィルにおける亜Ｇ１集団（図７Ａ）によって、また、アネキシンＶ染色（図８Ｂ）によって証明されるように、アポトーシスを誘導することができた。１７ベータ−デアセチルタンギニンで処理されるガン細胞における細胞死の原因を明らかにするために、本発明者らはＨｅＬａ細胞をミモシンによりＧ１／Ｓ移行において停止させ、その後、１７ベータ−デアセチルタンギニンを培地に加えて、細胞を１２時間にわたって前処理した。その後、細胞を、１７ベータ−デアセチルタンギニンの存在下においてミモシン阻止から解放し、解放後の種々の時点で集め、フローサイトメトリーおよびＢｒｄＵ取り込みアッセイによって分析した。ＢｒｄＵ取り込みの結果は、約１００％がＢｒｄＵ陽性である非処理細胞およびＤＭＳＯ処理細胞と比較して、１７ベータ−デアセチルタンギニンで処理される細胞の約４０％がＢｒｄＵ陽性であったことを示した；しかしながら、１７ベータ−デアセチルタンギニン処理細胞におけるＢｒｄＵシグナル強度は、非処理細胞およびＤＭＳＯ処理細胞におけるＢｒｄＵシグナル強度よりもはるかに低かった（図８Ｃ）。このことは、少なくとも一部の１７ベータ−デアセチルタンギニン処理細胞が低度のＤＮＡ複製を経たことを示しており、この場合のＤＮＡ複製は、１７ベータ−デアセチルタンギニン処理細胞におけるＭＣＭ複合体の不完全な阻害、したがって、いくつかの複製起点の低度の活性化およびＤＮＡ複製の限定された伸長のためであると考えられた。そのようなものとして、ゲノムの頓挫的な部分的重複化がＤＮＡ損傷を引き起こし、これにより、アポトーシスをもたらしたということが最も考えられる。
【００５２】
１７ベータ−デアセチルタンギニンに加えて、多数の構造的に関連する化合物、例えば、１７ベータ−ネリイホリンおよび１７ベータ−デアセチルタンギニンジオールもまた、フローサイトメトリー分析における亜Ｇ１集団の細胞によって示されるように、ガン細胞のアポトーシスを誘導することができることが見出された（図８Ｄ）。
【００５３】
ガン性細胞に対する抗増殖化合物の特異性のさらなる試験
図２および図８Ａにおけるデータは、本発明の抗増殖化合物が、正常な細胞に対する細胞毒性をほとんど伴うことなく、ガン細胞を特異的に殺傷し得ることを示している。正常な細胞および／またはガン細胞が、１７ベータ−デアセチルタンギニンを除いた後で細胞成長を再開し得るかを試験するために、Ｌ−０２（正常な肝臓）細胞およびＨｅｐＧ２（肝臓ガン）細胞を１７ベータ−デアセチルタンギニンまたはＤＭＳＯと１日間インキュベーションし、その後、１７ベータ−デアセチルタンギニンまたはＤＭＳＯを除き、細胞をさらに、新鮮な成長培地と３日間インキュベーションした。生細胞数をＷＳＴ−１アッセイによって毎日モニターした。図９において、Ｌ＋ＤＡＴは、１７ベータ−デアセチルタンギニンで処理されるＬ−０２細胞を示す；Ｌ＋Ｄは、ＤＭＳＯで処理されるＬ−０２細胞を示す；Ｈ＋ＤＡＴは、１７ベータ−デアセチルタンギニンで処理されるＨｅｐＧ２細胞を示す；Ｈ＋Ｄは、ＤＭＳＯで処理され、その後で、新鮮な培地の中に解放されるＨｅｐＧ２細胞を示す。結果は、ガン細胞ではなく、正常な細胞が、１７ベータ−デアセチルタンギニンを除いた後で成長を再開したことを示した（図９）。このことは、正常な細胞の大部分が、１７ベータ−デアセチルタンギニンで処理されたときにはＧ１期に留まり、これに対して、ガン細胞は、同じ処理のもとでは頓挫性Ｓ期に入り、死んだという本発明者らの発見と一致している（図８Ａ）。
【００５４】
ヌードマウス異種移植モデルにおけるインビボ抗ガン活性
インビボ抗ガン活性試験を、ヌードマウスにＨｅＬａ細胞を左側腹および右側腹の両方に接種することによってヌードマウス異種移植モデルにおいて行った。無作為グループ化の後、ヌードマウスを１７ベータ−デアセチルタンギニンまたは溶媒（ＰＢＳにおける３０％のプロピレングリコール）により腹腔内処理した。小さい腫瘍が形成し始めた腫瘍接種後３日での最初の試験において、２群のヌードマウスを１日目〜３日目および６日目〜１０日目に３．５ｍｇ−薬物／ｋｇ−体重および７．０ｍｇ−薬物／ｋｇ−体重の１７ベータ−デアセチルタンギニンでそれぞれ処置し、別の一群のコントロールマウスを同じ体積の溶媒で処置した（図１０Ａ）。図１０Ａにおいて、細い線でつながれる小さいサイズのデータ点記号によって表される腫瘍体積データは、腫瘍サイズの両方の測定および薬物注入が行われた日に得られ、太い線でつながれる大きいサイズのデータ点記号によって表される腫瘍体積データは、薬物注入のない日に得られた。それぞれの腫瘍サイズがそれぞれの群において５匹のマウスにおける１０個の腫瘍の平均であった。結果は、１７ベータ−デアセチルタンギニンが腫瘍成長を著しく抑制し、高用量（７．０ｍｇ／ｋｇ）では９０％抑制し、低用量（３．５ｍｇ／ｋｇ）では７０％抑制したことを示した。実際、高用量において、１７ベータ−デアセチルタンギニンの最後の５回の連続注入については、腫瘍サイズが低下さえした。このことは、１７ベータ−デアセチルタンギニンがマウスにおいて腫瘍細胞の死を誘導していたことを示唆する。
【００５５】
タキソールによる比較研究およびインビボ毒性評価
次に、さらなる一組の動物実験をより長い期間により行い、この期間において、５．０ｍｇ／ｋｇでの１５回の薬物注入を、腫瘍サイズが０．０５〜０．１ｃｍ３に達した腫瘍接種後１週において行った。図１０Ｂにおいて、薬物注入および腫瘍サイズ測定をデータ点によって表される日に行い、図１０Ｃにおける写真を２０日目に撮影した。結果は、腫瘍成長が再び、著しく抑制されたことを示した；１７ベータ−デアセチルタンギニンで処置されるマウスにおける腫瘍は、溶媒処置されたコントロールマウスにおける腫瘍よりも８０％を超えて小さかった（図１０Ｂ、図１０Ｃ）。比較のために、注入あたり１０ｍｇ／ｋｇでのパクリタキセル（タキソール）は、最初の１０日において１７ベータ−デアセチルタンギニンよりもはるかに小さい抗腫瘍活性を示し、これらのマウスはタキソールの毒性のために１０日目に死亡した（図１０Ｂ）。
【００５６】
図１０Ｂに記載されるような薬物処置が終了したとき、明白な体重減少が、５．０ｍｇ／ｋｇの１７ベータ−デアセチルタンギニンによる２０日間の腹腔内投与の後のヌードマウスにおいて何ら認められなかった（図１１Ａ）。図１１において、Ｓは、腫瘍接種が行われない溶媒処置マウスを示す；Ｓ＋Ｔは、腫瘍接種が行われる溶媒処置マウスを表す；ＤＡＴは、腫瘍接種が行われない１７ベータ−デアセチルタンギニン処置マウスを示す；ＤＡＴ＋Ｔは、腫瘍接種が行われる１７ベータ−デアセチルタンギニン処置マウスを表す；Ｐ＋Ｔは、腫瘍接種が行われるパエリタキセル処置マウスを示す。それぞれの群において中間的な腫瘍サイズを有する５匹のマウスのうちの３匹を生理学的パラメーター検査のために選択した。腫瘍（Ｔ）、ならびに、肝臓（Ｌ）、心臓（Ｈ）および腎臓（Ｋ）を含む内臓器官をそれぞれのマウスから切除した。腫瘍のサイズ（図１１Ｂ）は、図１０Ｂに示される腫瘍体積測定と一致していた。すべての臓器が正常であるように見えた。例えば、膨大または異常な色はどちらも認められず（図１１Ｂ）、また、体重に対する臓器重量は有意に変化していなかった（図１１Ｃ）。
【００５７】
さらに、それぞれのマウスから得られる血液もまた、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）活性およびＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）活性の試験のために採取した。ＡＴＬレベルは肝臓損傷を明らかにし、一方、ＬＤＨレベルは一般には、どのような組織であれ、組織に対する損傷を反映する。両試験の結果を、非処理マウスに対する種々に処置されたマウスの値として表した。図１１Ｄに示されるように、１７ベータ−デアセチルタンギニンは血中のＡＴＬレベルまたはＬＤＨレベルの著しい増大を誘導しなかった。まとめると、これらのデータは、１７ベータ−デアセチルタンギニンが、マウスにおいて、毒性をほとんど伴うことなく、著しい抗腫瘍活性を有することを強く示唆する。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態に対して適用されるような本発明の基本的な新規特徴が記載され、また指摘されているが、様々な省略および置換および変化が、例示される実施形態の形式および細部においては、本発明の精神から逸脱することなく、当業者によって行われる場合があることが理解されるであろう。本発明は、例としてのみ示される上記で記載される実施形態によって限定されるのではなく、添付されている特許請求項によって定義される保護の範囲の範囲内において様々な様式で改変することができる。
【００５９】
（付記）
（付記１）
ガンを患者において処置する方法であって、抗ガン剤をガン性細胞におけるヒトＭＣＭ複合体に対するその阻害効果のために選択する工程（ａ）、および、（ｂ）前記選択された抗ガン剤を含む医薬組成物の治療効果的な量を前記患者に投与する工程（ｂ）を含む方法。
（付記２）
前記抗ガン剤が、ガン性細胞を頓挫性Ｓ期に入らせ、かつ、正常な細胞をＧ１期において実質的に停止させるその能力のためにさらに選択される、付記１に記載の方法。
（付記３）
前記阻害効果が、ＭＣＭサブユニットからの機能的なＭＣＭ複合体の形成を中断させることによって達成される、付記２に記載の方法。
（付記４）
前記機能的なＭＣＭ複合体が、核の中に移動することができるヘテロヘキサマー環状構造体であり、かつ、ＤＮＡ複製のために必要である、付記３に記載の方法。
（付記５）
選択された抗ガン剤が、ｈＭｃｍ２とｈＭｃｍ６との間における相互作用を妨害することによって前記機能的なＭＣＭ複合体の前記形成を中断させる、付記３に記載の方法。
（付記６）
前記抗ガン剤が、式（Ｉ）
（式中、Ｒ１はＨであるか、あるいは、１つまたは複数の糖ユニットによって置換される；Ｒ２はベータ型立体配置での５員環基または６員環基である；Ｒ３およびＲ４はそれぞれがＨまたはＯＨであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、Ｒ３およびＲ４がそれぞれ、それぞれ結合する２個のＣ原子との３員環を形成するただ１つのＯ原子である；Ｒ５はＯＨであり、かつ、Ｒ６はＨであるか、あるいは、Ｒ５およびＲ６は、Ｒ５およびＲ６がそれぞれ、それぞれ結合する２個のＣ原子との３員環を形成するただ１つのＯ原子である）である、付記１に記載の方法。
（付記７）
前記抗ガン剤が、１７ベータ−デアセチルタンギニン、１７ベータ−ネリイホリン、ブファリン、１７ベータ−デアセチルタンギニンジオール、レシブホゲニンおよびシノブファギンからなる群から選択される、付記６に記載の方法。
（付記８）
前記抗ガン剤が１７ベータ−デアセチルタンギニンである、付記７に記載の方法。
（付記９）
前記抗ガン剤が１７ベータ−デアセチルタンギニンジオールである、付記７に記載の方法。
（付記１０）
前記抗ガン剤が、ブファリン、シノブファギンまたはレシブホゲニンである、付記７に記載の方法。
（付記１１）
抗ガン化合物についてスクリーニングする方法であって、（ａ）候補化合物を一定の期間にわたって細胞の集団と接触させる工程、および、（ｂ）そのサブユニットから形成される機能的なＭＣＭ複合体の量を前記細胞において決定する工程を含む方法。
（付記１２）
工程（ｂ）が、核に位置するＭＣＭサブユニットの一部を、細胞質に位置する一部と比較して検出することによって行われる、付記１１に記載の方法。
（付記１３）
間接的な蛍光プロセス（免疫染色）が、１つまたは複数の内因性ＭＣＭサブユニットに対する１つまたは複数の一次抗体と、前記一次抗体を認識する蛍光標識された二次抗体とが、前記細胞が特定の継続期間にわたって前記候補化合物で処理された後における前記ＭＣＭタンパク質の所在を可視化するために使用される工程（ｂ）において行われる、付記１２に記載の方法。
（付記１４）
直接的な蛍光プロセスが、前記細胞が、蛍光タンパク質と融合される１つまたは複数のＭＣＭサブユニットを発現することができる１つまたは複数のプラスミドでトランスフェクションされており、その後、前記蛍光標識されたＭＣＭサブユニットの所在が、前記細胞が特定の継続期間にわたって前記候補化合物で処理された後で検出される工程（ｂ）において行われる、付記１２に記載の方法。
（付記１５）
前記ＭＣＭサブユニットが、ｈＭｃｍ２、ｈＭｃｍ３、ｈＭｃｍ４、ｈＭｃｍ５、ｈＭｃｍ６およびｈＭｃｍ７からなる群から選択される１つまたは複数のものを含む、付記１２に記載の方法。
（付記１６）
工程（ｂ）が、前記ＭＣＭサブユニットの物理的相互作用を検出することによって、または、クロマチンに結合するＭＣＭタンパク質の量を測定することによって行われる、付記１１に記載の方法。
（付記１７）
工程（ｂ）が、ＭＣＭタンパク質の酵素機能（例えば、ＡＴＰａｓｅ活性および／またはヘリカーゼ活性など）を測定することによって行われる、付記１１に記載の方法。
（付記１８）
前記細胞に対する前記候補化合物の抗増殖効果およびアポトーシス誘導効果を調べる確認工程をさらに含む、付記１１に記載の方法。
（付記１９）
前記確認工程が、ＢｒｄＵ取り込みアッセイおよび／またはフローサイトメトリーを使用することによって行われる、付記１７に記載の方法。
（付記２０）
ガンを患者において処置するための方法であって、効果的な量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩またはその配合物 （式中、Ｒ１はＨであるか、あるいは、１つまたは複数の糖ユニットによって置換される；Ｒ２はベータ型立体配置での５員環基または６員環基である；Ｒ３およびＲ４はそれぞれがＨまたはＯＨであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、Ｒ３およびＲ４がそれぞれ、それぞれ結合する２個のＣ原子との３員環を形成するただ１つのＯ原子であり、但し、Ｒ１が１つまたは複数の糖ユニットによって置換されるとき、Ｒ３およびＲ４はただ１つのＯ原子でなければならず、これにより、３員環を形成する；Ｒ５はＯＨであり、かつ、Ｒ６はＨであるか、あるいは、Ｒ５およびＲ６は、Ｒ５およびＲ６がそれぞれ、それぞれ結合する２個のＣ原子との３員環を形成するただ１つのＯ原子である）を患者に投与することを含む方法。
（付記２１）
前記化合物が１７ベータ−デアセチルタンギニンである、付記１９に記載の方法。
【図１】
2020073544.tif 000005
【図２Ａ】
2020073544.tif 000006
【図２Ｂ】
2020073544.tif 000007
【図２Ｃ】
2020073544.tif 000008
【図２Ｄ】
2020073544.tif 000009
【図２Ｅ】
2020073544.tif 000010
【図２Ｆ】
2020073544.tif 000011
【図２Ｇ】
2020073544.tif 000012
【図２Ｈ】
2020073544.tif 000013
【図３Ａ】
2020073544.tif 000014
【図３Ｂ】
2020073544.tif 000015
【図４Ａ】
2020073544.tif 000016
【図４Ｂ】
2020073544.tif 000017
【図４Ｃ】
2020073544.tif 000018
【図５Ａ】
2020073544.tif 000019
【図５Ｂ】
2020073544.tif 000020
【図５Ｃ】
2020073544.tif 000021
【図５Ｄ】
2020073544.tif 000022
【図６Ａ】
2020073544.tif 000023
【図６Ｂ】
2020073544.tif 000024
【図７Ａ】
2020073544.tif 000025
【図７Ｂ】
2020073544.tif 000026
【図７Ｃ】
2020073544.tif 000027
【図８Ａ】
2020073544.tif 000028
【図８Ｂ】
2020073544.tif 000029
【図８Ｃ】
2020073544.tif 000030
【図９】
2020073544.tif 000031
【図１０Ａ】
2020073544.tif 000032
【図１０Ｂ】
2020073544.tif 000033
【図１０Ｃ】
2020073544.tif 000034
【図１１Ａ】
2020073544.tif 000035
【図１１Ｂ】
2020073544.tif 000036
【図１１Ｃ】
2020073544.tif 000037
【図１１Ｄ】
2020073544.tif 000038