(57)【要約】【課題】糖鎖を分析するために、安全かつ安価な薬品をもちいて、また特別なシステムを用いることなく短時間の処理時間でＮ結合型糖鎖とＯ結合型糖鎖をタンパク質から遊離する方法を提供する。【解決手段】糖タンパク質から糖鎖を遊離させる方法であって、前記糖タンパク質に、（ａ）ヒドロキシルアミン類と、（ｂ）塩基性試薬とを含む反応液を接触させて、前記糖タンパク質から遊離した糖鎖と前記反応液との混合液を得る工程を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖タンパク質から糖鎖を遊離させる方法であって、前記糖タンパク質に、（ａ）ヒドロキシルアミン類と、（ｂ）塩基性試薬とを含む反応液を接触させて、前記糖タンパク質から遊離した糖鎖と前記反応液との混合液を得る工程を含む方法。
【請求項２】
前記反応液が前記（ａ）ヒドロキシルアミン類を２〜７０％（ｗ／ｗ）含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応液が（ｃ）アミン類を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記（ｃ）アミン類が、アンモニア水、メチルアミン水溶液、ジメチルアミン水溶液、エチルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、ブチルアミン、モルホリン、ＤＡＢＣＯ、アントラニル酸からなる群より選択される少なくとも一つの化合物である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記糖タンパク質から遊離した糖鎖が糖鎖オキシムを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記糖タンパク質に前記反応液を接触させる工程において、前記反応液のｐＨが、８〜１４の範囲内である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記（ａ）ヒドロキシルアミン類が、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシルアミンの塩、Ｏ置換ヒドロキシルアミン及びＯ置換ヒドロキシルアミンの塩からなる群より選択される少なくとも一つの化合物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記（ｂ）塩基性試薬が、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ金属の弱酸塩、アルカリ土類金属の水酸化物、アンモニア水溶液に溶解したアルカリ土類金属の塩及び有機塩基からなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記アルカリ金属の水酸化物が、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムであり、
前記アルカリ金属の弱酸塩が、重炭酸ナトリウム又は炭酸ナトリウムであり、
前記アルカリ土類金属の水酸化物が、水酸化カルシウム、水酸化バリウム又は水酸化ストロンチウムであり、
前記アルカリ土類金属の塩が、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、酢酸バリウム又は酢酸マグネシウムであり、
前記有機塩基が、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン、１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカ−５−エン、７−メチル−１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカ−５−エン、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン、２−ｔｅｒｔ−ブチル−１，１，３，３−テトラメチルグアニジン又はセチルトリメチルアンモニウムヒドロキシドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記混合液にケトン、アルデヒド又は酸無水物を添加し、前記混合液中に残存する（ａ）ヒドロキシルアミン類をケトキシム、アルドキシム又はアミドに変換する工程と、
前記混合液を、糖鎖に親和性を有する固相と接触させて、前記固相に前記糖タンパク質から遊離した糖鎖を吸着させる工程と、
前記固相から前記糖鎖を溶出させる工程と、
を更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
糖タンパク質が有する糖鎖の分析方法であって、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により糖タンパク質から糖鎖を遊離する工程と、
遊離した糖鎖を標識する工程であって、糖鎖オキシムの標識を含む工程と、
を含む、糖鎖の分析方法。
【請求項１２】
糖タンパク質から糖鎖を遊離するためのキットであって、（ａ）ヒドロキシルアミン類と（ｂ）塩基性試薬とを含むキット。
【請求項１３】
（ｃ）アミン類を更に含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
ケトン、アルデヒド又は酸無水物と、糖鎖に親和性を有する固相とを更に含む、請求項１２又は１３に記載のキット。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を行うための説明書を更に含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１６】
糖タンパク質から糖鎖を遊離するためのキットであって、（ａ）ヒドロキシルアミン類と併用して使用するための（ｂ）塩基性試薬と（ｃ）アミン類とを含むキット。
【請求項１７】
ケトン、アルデヒド又は酸無水物と、糖鎖に親和性を有する固相とを更に含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を行うための説明書を更に含む、請求項１６又は１７に記載のキット。
【請求項１９】
糖タンパク質を含む試料が収容される容器を保持する容器保持部と、前記容器に試薬を導入する試薬導入部と、を備え、
前記試薬導入部が、前記容器に（ａ）ヒドロキシルアミン類と、（ｂ）塩基性試薬とを含む反応液を導入する反応液導入部を含む、糖タンパク質から糖鎖を遊離させる装置。
【請求項２０】
前記試薬導入部が、前記容器にケトンを導入するケトン導入部、アルデヒドを導入するアルデヒド導入部又は酸無水物を導入する酸無水物導入部を更に含む、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
糖鎖に親和性を有する固相を含む容器を保持する固相保持部を更に備える、請求項１９又は２０に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖タンパク質の糖鎖遊離法に関する。本願は、２０１６年９月２７日に、日本に出願された特願２０１６−１８７９６１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬などのバイオ医薬品をはじめ、タンパク質の多くには糖鎖が結合している。バイオ医薬品において糖鎖はその医薬品の活性に影響するのみならず抗原性や動態にも影響することが示唆されており、糖鎖の分析はバイオ医薬品開発において重要な課題となっている。また、糖タンパク質の糖鎖は疾患関連バイオマーカーとして利用できるが、マーカーとなり得る糖鎖を見出すためには多検体の生体試料に含まれる糖タンパク質の糖鎖を分析する必要がある。
【０００３】
また、厚生労働省の「抗体医薬品の品質評価のためのガイダンス」では、抗体医薬品は投与量が多いことや、生産に用いた細胞によっては非ヒト型糖鎖含量が従来の例より多くなる可能性も考えられることから、非ヒト型糖鎖が結合している場合は、その割合を明らかにするとともに、安全性への影響を考慮すべきとされている。そのため、糖鎖分析においては、ヒトに存在しない糖鎖構造、具体的にはＮグリコリルノイラミン酸やＧａｌα１−３Ｇａｌ構造などは見落とさないように注意が必要である。
【０００４】
糖鎖を分析するためには、まず糖タンパク質から糖鎖を遊離させ、脱塩や除タンパク質などの後処理を行った後、その糖鎖を質量分析計で分析する、または遊離された糖鎖に蛍光標識を付与し蛍光検出器を装備した高速液体クロマトグラフィーやキャピラリー電気泳動、もしくはこれらの組み合わせで分析することが一般的である。いずれの場合にも糖タンパク質から糖鎖を遊離することが最初の段階となる。糖鎖とタンパク質の結合は、タンパク質のアスパラギン残基のアミノ基にＮアセチルグルコサミンがＮグリコシド結合で連結するＮ結合型糖鎖と、セリンおよびスレオニン残基の水酸基にＮアセチルガラクトサミンがＯグリコシド結合で連結するＯ結合型糖鎖に分けられる。タンパク質から糖鎖を遊離させるためには、それぞれに適した方法が用いられる。
【０００５】
Ｎ結合型糖鎖を遊離させるためには、ＰＮＧａｓｅＦやグリコペプチダーゼＡなどの酵素を用いて糖鎖を遊離させることができるが、それぞれに基質特異性が異なるため分析対象の生物種に応じて酵素を使い分ける必要がある。また、酵素反応の感受性を高めるため一般的には予めタンパク質を変性させたり、プロテアーゼで分解するなどの前処理が施される。
【０００６】
また、酵素を用いることなく化学反応により糖鎖を遊離する方法もある。例えば、特許文献１には、十分に乾燥させた糖タンパク質を無水ヒドラジンに溶解させ、１００℃で１０時間以上加熱処理するヒドラジン分解法を開示しており、当該方法は主にＮ型糖鎖を遊離する方法として利用されている。反応後は無水ヒドラジンを減圧留去し、さらに炭酸水素ナトリウムと無水酢酸を用いてアセチル化を行う。これはヒドラジンが、糖鎖に結合しているＮアセチル基やＮグリコリル基も分解してアミノ基へと変換してしまうため、アセチル化することにより元に戻す操作である。したがって、もともとＮグリコリル基など他のアシル基が結合していた場合も、全てＮアセチル体として分析される。
【０００７】
また、例えば、特許文献２において、ヒドラジン−水和物を用いた糖鎖遊離も報告されている。この方法は、ヒドラジン−水和物はヒドラジンに比べ取り扱いが比較的容易で安価でもあるため、大量に糖タンパク質を処理する場合などに利用される。しかしながら、この方法も反応後のヒドラジン留去、再アセチル化などの後処理はヒドラジン分解法と同様の工程を必要とするものである。
【０００８】
Ｏ結合型糖鎖の遊離については、実用性のある酵素が見出されていない。そのためもっぱら化学反応による遊離が利用されている。遊離するための化学反応としては強アルカリ水溶液中で糖鎖をβ脱離させる方法が広く使われている。しかし、遊離された糖鎖はアルカリ存在下では直ぐに分解されてしまうため、通常は水素化ホウ素ナトリウム共存下で反応を行うことにより、遊離された糖鎖を直ちにアルジトールへと還元する方法が用いられる。
【０００９】
遊離されたアルジトールは蛍光標識を付与するための糖鎖側の官能基であるアルデヒド基が還元されてアルコールに変化しているため、蛍光標識を付与することができない。そのため、アルジトールの全ての水酸基をメチル化（完全メチル化）した上で質量分析計で分析することが一般的である。
【００１０】
特許文献３は、強アルカリによるβ脱離において、アルデヒド基を温存した状態でＯ結合型糖鎖を得るために、流路内を流動させながらアルカリ溶液と試料溶液とを短時間だけ反応させ、直ちに中和処理するシステムを開示している。
【００１１】
アルデヒド基を温存したままＯ結合型糖鎖を化学的に遊離する他の方法としては、前述のヒドラジン分解法が知られている。反応後は、ヒドラジン留去、再アセチル化を行い、蛍光標識を付与した後、ＨＰＬＣなどを用いて分析されている。
【００１２】
ヒドラジン分解法によるＯ結合型糖鎖遊離は必ず糖鎖の分解を伴うため、分解を少しでも抑制することを目的として、反応系内に添加物を加えたりするなどの工夫も報告されている。また、強アルカリによるβ脱離も同様に必ず分解を伴うため、強アルカリの代わりに弱塩基を用いたβ脱離法も検討され、濃アンモニア水を用いる方法、カルバミン酸アンモニウムを用いる方法（特許文献４）などが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開平３−２２８０００号公報
【特許文献２】特開２００７−４５８８９号公報
【特許文献３】特許第４２８３２７２号公報
【特許文献４】特開２０１５−１０７９６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
バイオ医薬品の糖鎖不均一性を創薬段階から開発段階そして製造に至るまでモニターし制御することは、高品質のバイオ医薬品薬製造において重要な課題となってきている。これまで行われてきたように製品の品質管理としてのみ糖鎖を分析するのではなく、開発の各段階で随時、迅速に糖鎖を分析することが求められる。また、種々の疾患に関連した病態マーカーを探索する上でも糖鎖の分析は多検体の試料を迅速に分析することが必要となる。そして、多検体の分析にはコストも極めて大きな負担となる。
【００１５】
前述のように糖鎖を分析するためにはタンパク質から糖鎖を遊離することが最初の段階となるが、従来、糖鎖を遊離するためには前処理を含め、長時間を要していた。例えば、酵素を用いて糖鎖を遊離する場合、予めタンパク質をジチオスレイトールなどの還元剤で処理した後、ヨードアセトアミドなどのアルキル化剤を用いて処理することにより変性させ、さらにトリプシン等のプロテアーゼでペプチドに分解した後に、糖鎖遊離酵素を反応させて糖鎖を遊離するため、医薬品の製造現場で試料を採取したその日に糖鎖を分析することはできなかった。
【００１６】
さらに、糖鎖を遊離させる酵素であるＰＮＧａｓｅＦやグリコペプチダーゼＡは非常に高価であり多検体の分析を行うためには相当のコスト負担を生じていた。
【００１７】
また、ヒドラジン分解法は完全な無水条件が必要であり、反応系内に少量でも水が混入すると著しい収率の低下を招く。そのため、予め試料を十分に減圧乾燥した上で反応させる必要があった。さらに、反応時間は１０時間以上であり、反応後にヒドラジンの留去、再アセチル化まで含めると、全工程が終了するまでに少なくとも２日以上を要する。さらにヒドラジンは発がん性を有する毒物でもあり、また易爆発性の化合物でもあるため、その取り扱いには細心の注意を払う必要があった。
【００１８】
さらにヒドラジン分解法では、Ｎグリコリル基が分解されてしまうため、Ｎグリコリルノイラミン酸の分析ができないという問題もあった。バイオ医薬や糖鎖疾患マーカーではシアル酸の一種であるＮグリコリルノイラミン酸の有無が問題となることがあるため、このような目的ではヒドラジン分解法は利用できなかった。
【００１９】
一方で、Ｏ結合型糖鎖を遊離する場合には、ヒドラジン分解法でもアルカリβ脱離法でも糖鎖の還元末端のＮアセチルガラクトサミンの３位に結合している糖が脱離してしまうという副反応（ピーリング反応）を必ず伴う。それを抑制するために弱塩基を利用したβ脱離法を行ってもピーリングは避けられないだけでなく、遊離効率も著しく低下してしまうという問題があった。また、反応時間も１６時間以上かかっていた。
【００２０】
また、ピーリングを抑制するために水素化ホウ素ナトリウムを共存させる方法では、標識剤を還元末端に付与することができなくなるため、ＨＰＬＣなどで高感度に分析することができなかった。
【００２１】
以上の諸問題から、糖鎖を分析するために、安全かつ安価な薬品をもちいて、また特別なシステムを用いることなく短時間の処理時間でＮ結合型糖鎖とＯ結合型糖鎖をタンパク質から遊離する方法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者は鋭意に検討した結果、ヒドロキシルアミン存在下、水溶液中で塩基性触媒を用いてタンパク質から糖鎖が遊離できることを見出し、本発明を完成させた。
【００２３】
すなわち、本発明は以下の態様を含む。
［１］糖タンパク質から糖鎖を遊離させる方法であって、前記糖タンパク質に、（ａ）ヒドロキシルアミン類と、（ｂ）塩基性試薬とを含む反応液を接触させて、前記糖タンパク質から遊離した糖鎖と前記反応液との混合液を得る工程を含む方法。
［２］前記反応液が前記（ａ）ヒドロキシルアミン類を２〜７０％（ｗ／ｗ）含む、［１］に記載の方法。
［３］前記反応液が（ｃ）アミン類を更に含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記（ｃ）アミン類が、アンモニア水、メチルアミン水溶液、ジメチルアミン水溶液、エチルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、ブチルアミン、モルホリン、ＤＡＢＣＯ、アントラニル酸からなる群より選択される少なくとも一つの化合物である、［３］に記載の方法。
［５］前記糖タンパク質から遊離した糖鎖が糖鎖オキシムを含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記糖タンパク質に前記反応液を接触させる工程において、前記反応液のｐＨが、８〜１４の範囲内である、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記（ａ）ヒドロキシルアミン類が、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシルアミンの塩、Ｏ置換ヒドロキシルアミン及びＯ置換ヒドロキシルアミンの塩からなる群より選択される少なくとも一つの化合物である、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記（ｂ）塩基性試薬が、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ金属の弱酸塩、アルカリ土類金属の水酸化物、アンモニア水溶液に溶解したアルカリ土類金属の塩及び有機塩基からなる群より選択される少なくとも一つである、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記アルカリ金属の水酸化物が、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムであり、前記アルカリ金属の弱酸塩が、重炭酸ナトリウム又は炭酸ナトリウムであり、前記アルカリ土類金属の水酸化物が、水酸化カルシウム、水酸化バリウム又は水酸化ストロンチウムであり、前記アルカリ土類金属の塩が、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、酢酸バリウム又は酢酸マグネシウムであり、前記有機塩基が、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン、１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカ−５−エン、７−メチル−１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカ−５−エン、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン、２−ｔｅｒｔ−ブチル−１，１，３，３−テトラメチルグアニジン又はセチルトリメチルアンモニウムヒドロキシドである、請求項８に記載の方法。
［１０］前記混合液にケトン、アルデヒド又は酸無水物を添加し、前記混合液中に残存する（ａ）ヒドロキシルアミン類をケトキシム、アルドキシム又はアミドに変換する工程と、前記混合液を、糖鎖に親和性を有する固相と接触させて、前記固相に前記糖タンパク質から遊離した糖鎖を吸着させる工程と、前記固相から前記糖鎖を溶出させる工程と、を更に含む、［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］糖タンパク質が有する糖鎖の分析方法であって、［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法により糖タンパク質から糖鎖を遊離する工程と、遊離した糖鎖を標識する工程であって、糖鎖オキシムの標識を含む工程と、を含む、糖鎖の分析方法。
［１２］糖タンパク質から糖鎖を遊離するためのキットであって、（ａ）ヒドロキシルアミン類と（ｂ）塩基性試薬とを含むキット。
［１３］（ｃ）アミン類を更に含む、［１２］に記載のキット。
［１４］ケトン、アルデヒド又は酸無水物と、糖鎖に親和性を有する固相とを更に含む、［１２］又は［１３］に記載のキット。
［１５］［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法を行うための説明書を更に含む、［１２］〜［１４］のいずれかに記載のキット。
［１６］糖タンパク質から糖鎖を遊離するためのキットであって、（ａ）ヒドロキシルアミン類と併用して使用するための（ｂ）塩基性試薬と（ｃ）アミン類とを含むキット。
［１７］ケトン、アルデヒド又は酸無水物と、糖鎖に親和性を有する固相とを更に含む、［１６］に記載のキット。
［１８］［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法を行うための説明書を更に含む、［１６］又は［１７］に記載のキット。
［１９］糖タンパク質を含む試料が収容される容器を保持する容器保持部と、前記容器に試薬を導入する試薬導入部と、を備え、前記試薬導入部が、前記容器に（ａ）ヒドロキシルアミン類と、（ｂ）塩基性試薬とを含む反応液を導入する反応液導入部を含む、糖タンパク質から糖鎖を遊離させる装置。
［２０］前記試薬導入部が、前記容器にケトンを導入するケトン導入部、アルデヒドを導入するアルデヒド導入部又は酸無水物を導入する酸無水物導入部を更に含む、［１９］に記載の装置。
［２１］糖鎖に親和性を有する固相を含む容器を保持する固相保持部を更に備える、［１９］又は［２０］に記載の装置。
【００２４】
本発明は、以下の態様を含むということもできる。
〔１〕糖タンパク質から糖鎖を遊離させる方法であって、
前記糖タンパク質に、（ａ）ヒドロキシルアミン類と、（ｂ）塩基性試薬とを含む反応液を接触させる工程であって、前記（ａ）ヒドロキシルアミン類が、２〜５０％（ｗ／ｗ）で反応液中に含まれる工程、を含む方法に関する。
ここで、本発明の糖タンパク質から糖鎖を遊離させる方法は、一実施の形態において、〔２〕上記〔１〕に記載の方法であって、
前記反応液がさらに（ｃ）アミン類を含むことを特徴とする。
また、本発明の糖タンパク質から糖鎖を遊離させる方法は、一実施の形態において、〔３〕上記〔１〕または〔２〕に記載の方法であって、
前記糖タンパク質から遊離した糖鎖が糖鎖オキシムを含むことを特徴とする。
また、本発明の糖タンパク質から糖鎖を遊離させる方法は、一実施の形態において、〔４〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法であって、
前記糖タンパク質に前記反応液を接触させる工程において、前記反応液のｐＨが、８〜１４の範囲内であることを特徴とする。
また、本発明の糖タンパク質から糖鎖を遊離させる方法は、一実施の形態において、
〔５〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法であって、
前記（ａ）ヒドロキシルアミン類が、ヒドロキシルアミンおよびその塩類、ならびに、Ｏ置換ヒドロキシルアミンおよびその塩類からなる群より選択される少なくとも一つの化合物であることを特徴とする。
また、本発明の糖タンパク質から糖鎖を遊離させる方法は、一実施の形態において、
〔６〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法であって、
前記（ｂ）塩基性試薬が、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属弱酸塩、アルカリ土類水酸化物、アンモニア水溶液に溶解したアルカリ土類の塩、および、有機塩基からなる群より選択される少なくとも一つであることを特徴とする。
また、本発明の糖タンパク質から糖鎖を遊離させる方法は、一実施の形態において、〔７〕上記〔６〕に記載の方法であって、
前記アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属弱酸塩、または、アルカリ土類水酸化物が、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、水酸化ストロンチウム、からなる群より選択される少なくとも一つであり、
前記アンモニア水溶液に溶解したアルカリ土類の塩が、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、酢酸バリウム、酢酸マグネシウムからなる群より選択される少なくとも一つであることを特徴とする。
また、本発明の糖タンパク質から糖鎖を遊離させる方法は、一実施の形態において、〔８〕上記〔６〕に記載の方法であって、
前記有機塩基が、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン、１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカ−５−エン、７−メチル−１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカ−５−エン、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン、２−ｔｅｒｔ−ブチル−１，１，３，３−テトラメチルグアニジン、セチルトリメチルアンモニウムヒドロキシドからなる群より選択される少なくとも一つであることを特徴とする。
また、本発明の糖タンパク質から糖鎖を遊離させる方法は、一実施の形態において、
〔９〕上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法であって、
前記（ｃ）アミン類が、アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、ブチルアミン、モルホリン、ＤＡＢＣＯ、アントラニル酸からなる群より選択される少なくとも一つの化合物であることを特徴とする。
また、本発明は、別の態様において、
〔１０〕糖タンパク質が有する糖鎖の分析方法であって、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法により糖タンパク質から糖鎖を遊離する工程と、
遊離した糖鎖を標識する工程であって、糖鎖オキシムの標識を含む工程と
を含む、糖鎖の分析方法に関する。
また、本発明は、別の態様において、
〔１１〕糖タンパク質から糖鎖を遊離するためのキットであって、
（ａ）ヒドロキシルアミン類と（ｂ）塩基性試薬とを含むキット。
また、本発明の糖タンパク質から糖鎖を遊離するためのキットは、一実施の形態において、
〔１２〕上記〔１１〕に記載のキットであって、
（ａ）アミン類をさらに含むことを特徴とする。
また、本発明の糖タンパク質から糖鎖を遊離するためのキットは、一実施の形態において、
〔１３〕糖タンパク質から糖鎖を遊離するためのキットであって、
（ａ）ヒドロキシルアミン類と併用して使用するための（ｂ）塩基性試薬と（ｃ）アミン類とを含むキットであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の方法によれば、安全かつ安価な薬品の使用により、糖鎖の分解を抑制しつつ、短時間の処理時間で糖タンパク質から糖鎖を遊離させることができ、また、遊離した糖鎖は、糖鎖オキシムを含む混合物として回収することが可能である。
【００２６】
特に、Ｎ結合型糖鎖を糖タンパク質から遊離する方法においては、従来、ヒドラジン分解法では、Ｎグリコリル基が分解されてしまうため、Ｎグリコリルノイラミン酸の分析ができなかったが、本方法によれば、Ｎグリコリル基の分解を抑制しつつ、糖鎖の遊離を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例１において、モノクローナル抗体（ＩｇＧ）から遊離させたＮ結合型糖鎖のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２】実施例１において、Ｎ結合型糖鎖を遊離する酵素（ＰＮＧａｓｅＦ）を用いた方法によりモノクローナル抗体（ＩｇＧ）から遊離させたＮ結合型糖鎖のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図３】実施例２において、ヒト血清由来ＩｇＧから遊離させたＮ結合型糖鎖のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４】実施例３において、ウシフェツィンから遊離させたＯ結合型糖鎖のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図５】実施例４において、ウシアポトランスフェリンから遊離させたＮ結合型糖鎖のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図６】実施例５において、セイヨウワサビペルオキシダーゼから遊離させたＮ結合型糖鎖のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図７】実施例６において、ウシ顎下腺ムチンから遊離させたＯ結合型糖鎖のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図８】（ａ）〜（ｄ）は、実施例９〜１１において、ウシフェツインから遊離させたＯ結合型糖鎖のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。（ａ）は実施例１０の結果であり、（ｂ）は実施例１１の結果であり、（ｃ）は実施例９（アセトン処理）の結果であり、（ｄ）は実施例９（サリチルアルデヒド処理）の結果である。
【図９】実施例１２において、ウシフェツインから遊離させたＯ結合型糖鎖のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１０】糖タンパク質から糖鎖を遊離させる装置の一実施形態を説明する模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書において、「糖タンパク質」とは、タンパク質のアミノ酸配列中に、Ｏ結合型糖鎖、または、Ｎ結合型糖鎖が少なくとも一つ以上結合しているタンパク質をいう。本発明を適用可能な糖タンパク質は、特に制限されず、天然由来であっても、合成したものでも良い。
【００２９】
「糖鎖」には、Ｏ結合型糖鎖、および、Ｎ結合型糖鎖が含まれる。Ｏ結合型糖鎖は、タンパク質のセリン（Ｓｅｒ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）のアミノ酸残基において、各アミノ酸側鎖に含まれる−ＯＨ基を介して糖鎖が結合した構造である。また、Ｏ結合型糖鎖は、コアの構造により１〜８種に分類される。また、Ｎ結合型糖鎖は、タンパク質のアスパラギン残基の側鎖のアミド基の窒素原子に結合する糖鎖を指す。Ｎ結合型糖鎖はマンノースを基点として分岐を形成しているものが含まれ、例えば２本分岐鎖、３本分岐鎖、４本分岐鎖等がある。また、Ｎ結合型糖鎖は、その構造により、基本型、高マンノース型、ハイブリッド型、複合型などに分類することができる。
【００３０】
本発明においては、Ｏ結合型糖鎖およびＮ結合型糖鎖のいずれの糖鎖も糖タンパク質からの遊離の対象とすることができる。
【００３１】
［糖タンパク質から糖鎖を遊離させる方法］
一実施形態において、本発明は、糖タンパク質から糖鎖を遊離させる方法であって、前記糖タンパク質に、（ａ）ヒドロキシルアミン類と、（ｂ）塩基性試薬とを含む反応液を接触させて、前記糖タンパク質から遊離した糖鎖と前記反応液との混合液を得る工程を含む方法を提供する。糖タンパク質を、（ａ）ヒドロキシルアミン類と、（ｂ）塩基性試薬とを含む反応液と接触させることにより、当該糖タンパク質から糖鎖を遊離することができる。
【００３２】
ここで、「糖タンパク質に、（ａ）ヒドロキシルアミン類と、（ｂ）塩基性試薬とを含む反応液を接触させる」とは、最終的に、糖タンパク質、（ａ）ヒドロキシルアミン類、及び（ｂ）塩基性試薬が接触した状態になればよく、その混合の順序は問わない。例えば、まず、糖タンパク質に（ａ）ヒドロキシルアミン類を添加し、その後（ｂ）塩基性試薬を添加してもよい。あるいは、まず、糖タンパク質に（ｂ）塩基性試薬を添加し、その後（ａ）ヒドロキシルアミン類を添加してもよい。あるいは、まず、（ａ）ヒドロキシルアミン類と（ｂ）塩基性試薬とを混合し、これに糖タンパク質を添加してもよい。なお、Ｏ結合型糖鎖の場合には、糖鎖の分解を抑制するためにヒドロキシルアミン類を先に添加することが好ましい。
【００３３】
ここで、本実施形態に使用できる「（ａ）ヒドロキシルアミン類」としては、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシルアミンの塩、Ｏ置換ヒドロキシルアミン、Ｏ置換ヒドロキシルアミンの塩を挙げることができる。具体的には、以下に限定されないが、例えば、ヒドロキシルアミン塩酸塩、ヒドロキシルアミン水溶液、ヒドロキシルアミン硫酸塩、ヒドロキシルアミンリン酸塩、Ｏメチルヒドロキシルアミン塩酸塩、Ｏエチルヒドロキシルアミン塩酸塩、Ｏ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ヒドロキシルアミン、ニトロベンジルヒドロキシルアミン塩酸塩、Ｏ−ターシャルブチルジメチルシリルヒドロキシルアミン、Ｏ−トリメチルシリルヒドロキシルアミンからなる群より選択される少なくとも一つの化合物を挙げることができる。なお、前述する化合物の二つ以上を組み合わせて使用してもよい。好ましい実施の形態において、「（ａ）ヒドロキシルアミン類」は、ヒドロキシルアミン水溶液である。
【００３４】
反応液中の「（ａ）ヒドロキシルアミン類」の最終濃度は、例えば２〜７０％（ｗ／ｗ）、例えば２〜５０％（ｗ／ｗ）の濃度範囲とすることができる。しかしながら、前述の濃度範囲に限定されず、当業者であれば、対象とする糖タンパク質の種類や反応液中の他の成分（アミン類、塩基性試薬、その他の添加剤）、反応条件（時間、温度など）などにより適宜調整することができる。
【００３５】
発明者らは、特に、Ｏ結合型糖鎖を遊離させる場合には、「（ａ）ヒドロキシルアミン類」の最終濃度はできるだけ高いことが好ましいことを明らかにした。したがって、Ｏ結合型糖鎖を遊離させる場合には「（ａ）ヒドロキシルアミン類」の最終濃度は、例えば１０〜７０％（ｗ／ｗ）、例えば３０〜６０％（ｗ／ｗ）の濃度範囲であってよく、特に約５０％（ｗ／ｗ）が好適である。
【００３６】
なお、Ｎ結合型糖鎖を遊離させる場合には、「（ａ）ヒドロキシルアミン類」の最終濃度は、２〜５０％（ｗ／ｗ）とすることができ、好ましくは、１０〜２０％（ｗ／ｗ）とすることができる。より好ましい実施の形態においては、１０％（ｗ／ｗ）である。
【００３７】
「（ａ）ヒドロキシルアミン類」として、ヒドロキシルアミンを用いる場合、ヒドロキシルアミンの濃度が、２％（ｗ／ｗ）超５０％（ｗ／ｗ）以下であると、十分な糖鎖回収量が得られ、ヒドロキシルアミンも安定である傾向にある。
【００３８】
また、本実施形態に使用できる「（ｂ）塩基性試薬」としてはアルカリ金属の水酸化物、アルカリ金属の弱酸塩、アルカリ土類金属の水酸化物、アンモニア水に溶解したアルカリ土類金属の塩、および、有機塩基からなる群より選択される少なくとも一つの化合物を挙げることができる。
【００３９】
アルカリ金属の水酸化物としては、以下に限定されないが、例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムを挙げることができる。
【００４０】
また、アルカリ金属の弱酸塩としては、以下に限定されないが、例えば、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウムを挙げることができる。
【００４１】
また、アルカリ土類金属の水酸化物としては、以下に限定されないが、例えば、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、水酸化ストロンチウムを挙げることができる。
【００４２】
また、アンモニア水に溶解したアルカリ土類の塩としては、以下に限定されないが、例えば、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、酢酸バリウム、酢酸マグネシウムを挙げることができる。
【００４３】
これらの中でも、特に、水酸化リチウムが好ましい。
【００４４】
また、有機塩基としては、以下に限定されないが、例えば、ＤＢＵ：１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（１，８−ｄｉａｚａｂｉｃｙｃｌｏ［５．４．０］ｕｎｄｅｃ−７−ｅｎｅ）、ＴＢＤ：１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカン−５−エン（１，５，７−Ｔｒｉａｚａｂｉｃｙｃｌｏ［４．４．０］ｄｅｃ−５−ｅｎｅ）、ＭＴＢＤ：７−メチル−１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカ−５−エン（７−Ｍｅｔｈｙｌ−１，５，７−ｔｒｉａｚａｂｉｃｙｃｌｏ［４．４．０］ｄｅｃ−５−ｅｎｅ）、ＴＭＧ：１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（１，１，３，３−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｄｉｎｅ）、ｔ−ＢｕＴＭＧ：２−ｔｅｒｔ−ブチル−１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（２−ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｄｉｎｅ）、ＤＢＮ：１，５−ｄｉａｚａｂｉｃｙｃｌｏ［４．３．０］ｎｏｎ−５−ｅｎｅ、ＣＴＡＨ：ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅなどを挙げることができる。なお、前述する化合物の二つ以上を組み合わせて使用してもよい。好ましい実施の形態において、「有機塩基」は、有機強塩基（ｐＫａ１２以上）であり、具体的には、ＤＢＵ、ＴＭＧ、ＴＢＤ、ＭＴＢＤ、ＣＴＡＨを挙げることができる。これらＤＢＵ、ＴＭＧ、ＴＢＤ、ＭＴＢＤ、ＣＴＡＨを「有機塩基」として用いることで、有機溶媒による洗浄で反応後の塩基の除去が可能となる点において、好ましい。
【００４５】
反応液中の「（ｂ）塩基性試薬」の最終濃度は、例えば、２ｍＭ〜２Ｍの濃度範囲とすることができる。しかしながら、前述の濃度範囲に限定されず、当業者であれば、対象とする糖タンパク質の種類や反応液中の他の成分（ヒドロキシルアミン類、その他の添加剤）、反応条件（時間、温度など）などにより適宜調整することができる。なお、例えば、「（ｂ）塩基性試薬」として、水酸化リチウムを用いる際には、６ｍＭ〜１Ｍとすることができ、好ましくは、１００ｍＭ〜５００ｍＭとすることができる。より好ましい実施の形態においては、１００ｍＭ〜２００ｍＭである。塩基性試薬の濃度が、２ｍＭ未満だと反応時間が長時間となるとなる点において好ましくなく、２Ｍを超えると糖鎖の回収率が低下する点において好ましくない。
【００４６】
本実施形態に係る糖タンパク質から糖鎖を遊離させる方法は、糖タンパク質に対して、（ａ）ヒドロキシルアミン類と（ｂ）塩基性試薬とを含む反応液を接触させることにより糖タンパク質から糖鎖を遊離させる。このとき、（ａ）ヒドロキシルアミン類は、当該反応液に対して、２〜７０％（ｗ／ｗ）の範囲で含まれている。
【００４７】
このとき、反応液中の（ａ）ヒドロキシルアミン類と（ｂ）塩基性試薬とのモル比は、１：１〜３００：１とすることが好ましく、３：１〜２００：１とすることがより好ましい。（ａ）ヒドロキシルアミン類と（ｂ）塩基性試薬とのモル比を上記範囲とすることにより、遊離した糖鎖の分解反応を抑制することができる。
【００４８】
また、反応液のｐＨは、８〜１４の範囲内とすることができ、１０〜１３の範囲内とすることがより好ましい。
【００４９】
対象となる糖タンパク質と当該反応液とを接触させる工程において、温度や反応時間の条件は、対象となるタンパク質から糖鎖が遊離できる限りにおいて特に限定されず、対象となる糖タンパク質、ヒドロキシルアミン類、塩基性試薬の種類や濃度等の条件により当業者は適宜設定することができる。なお、温度は、例えば、室温〜８０℃とすることができる。なお、Ｎグリコリル基などは、高温で反応させると分解されやすいため、未知の糖鎖を有する糖タンパク質を対象とする場合は、５０℃以下とすることが好ましい。また、反応時間も条件により約５分〜１６時間とすることができる。
【００５０】
また、本実施形態に係る糖タンパク質から糖鎖を遊離させる方法は、一実施の形態において、反応液に「（ｃ）アミン類」をさらに加えることができる。本実施形態に使用できる「（ｃ）アミン類」としては、以下に限定されないが、例えば、アンモニア水、メチルアミン水溶液、ジメチルアミン水溶液、エチルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、ブチルアミン、モルホリン、ＤＡＢＣＯ、アントラニル酸からなる群より選択される少なくとも一つの化合物を挙げることができる。また、なお、前述する化合物の二つ以上を組み合わせて使用してもよい。好ましい実施の形態において、「（ｃ）アミン類」は、アンモニア水、モルホリン、ＤＡＢＣＯ、アントラニル酸である。アンモニア水、モルホリン、ＤＡＢＣＯ、アントラニル酸などを「（ｃ）アミン類」として用いることで、ピーリング、異性化やアミドの分解が抑制される点において、好ましい。特に、アンモニアよりもｐＫａの低いモルホリンやＤＡＢＣＯ、アントラニル酸などを用いた場合には、Ｎ結合型糖鎖を遊離する際の副反応である異性化が抑えることができる点において好ましい。
【００５１】
反応液中の「（ｃ）アミン類」の最終濃度は、例えば、４０ｍＭ〜１５Ｍの濃度範囲とすることができる。しかしながら、前述の濃度範囲に限定されず、当業者であれば、対象とする糖タンパク質の種類や反応液中の他の成分（ヒドロキシルアミン類、塩基性試薬、その他の添加剤）、反応条件（時間、温度など）などにより適宜調整することができる。なお、例えば、「（ｃ）アミン類」として、アンモニア水を用いる際には、反応液中のアンモニアの最終濃度を２〜２５％（ｗ／ｗ）とすることができ、好ましくは、１０〜２０％（ｗ／ｗ）とすることができる。より好ましい実施の形態においては、２０％（ｗ／ｗ）である。
【００５２】
［糖鎖の分析方法］
一実施形態において、本発明は、糖タンパク質が有する糖鎖の分析方法であって、上述した方法により糖タンパク質から糖鎖を遊離する工程と、遊離した糖鎖を標識する工程と、を含む、糖鎖の分析方法を提供する。
【００５３】
本実施形態の分析方法では、遊離した糖鎖を標識する工程において、糖鎖オキシムも標識される。詳細については後述する。
【００５４】
糖タンパク質から糖鎖を遊離させた後の反応溶液は、公知の方法（例えば、グラファイトカーボンを充填した固相抽出カートリッジ）を用いて、脱塩処理を行い、反応溶液中に含まれる糖鎖の分析に用いることができる。
【００５５】
溶液中に遊離している糖鎖の分析方法としては、適宜公知の方法を採用することができる。例えば、下記実施例で採用するように、ピコリンボランと２−アミノベンズアミドを用いた蛍光標識法を用いることができる。
【００５６】
なお、上述した方法により遊離した糖鎖は、アルデヒド型となった一部が糖鎖オキシムを形成する。すなわち、従来の方法においては、遊離後の糖鎖の官能基であるアルデヒド基が還元されてアルジトールへと変換された場合、直接、蛍光標識することができなかった。また、従来の方法において、糖鎖の官能基であるアルデヒド基がヒドラジンによりヒドラゾンへと変換された場合、蛍光標識を付与するためには再アセチル化操作により元の遊離糖鎖に戻す必要があった。
【００５７】
これに対し、上述した方法によれば、直接標識可能な糖鎖オキシムとして遊離した糖鎖を得ることができる。すなわち、本実施形態の方法により糖タンパク質から遊離した糖鎖は糖鎖オキシムを含む。糖鎖オキシムは直接標識することができる。
【００５８】
したがって、上述した方法により得られた遊離糖鎖は、グリコシルアミン、糖鎖オキシム、還元末端にヘミアセタール性水酸基を有する通常の糖鎖の混合物として溶液中に得ることができ、これらをまとめて標識することができる。
【００５９】
ところで、上述したように、発明者らは、特にＯ結合型糖鎖を遊離させる場合には、（ａ）ヒドロキシルアミン類の最終濃度はできるだけ高いことが好ましいことを明らかにした。
【００６０】
しかしながら、糖タンパク質と反応液との混合液が、高濃度の（ａ）ヒドロキシルアミン類を含む場合、糖鎖を遊離後の混合液に未反応の（ａ）ヒドロキシルアミン類が残存する場合がある。未反応の（ａ）ヒドロキシルアミン類は、糖鎖の蛍光標識反応を阻害してしまうため、除去することが好ましい。
【００６１】
そこで、上述した方法は、未反応の（ａ）ヒドロキシルアミン類を除去する追加の工程を更に含んでいてもよい。すなわち、上述した方法は、糖タンパク質と反応液との混合液に、ケトン、アルデヒド又は酸無水物を添加し、混合液中に残存する（ａ）ヒドロキシルアミン類をケトキシム、アルドキシム又はアミドに変換する工程と、前記混合液を、糖鎖に親和性を有する固相と接触させて、前記固相に前記糖タンパク質から遊離した糖鎖を吸着させる工程と、前記固相から前記糖鎖を溶出させる工程と、を更に含んでいてもよい。
【００６２】
（ａ）ヒドロキシルアミン類にケトンを反応させることによりケトキシムに変換することができる。また、（ａ）ヒドロキシルアミン類にアルデヒドを反応させることによりアルドキシムに変換することができる。また、（ａ）ヒドロキシルアミン類に酸無水物を反応させることによりアミドに変換することができる。
【００６３】
ケトンとしては、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、４−ヒドロキシブタノン等を使用することができる。また、アルデヒドとしては、サリチルアルデヒド、ベンズアルデヒド、４−ヒドロキシベンズアルデヒド等を使用することができる。また、酸無水物としては無水酢酸、無水コハク酸等を使用することができる。
【００６４】
続いて、上記の混合液から糖鎖を回収する。具体的には、上記の混合液を糖鎖に親和性を有する固相と接触させて、前記固相に前記糖タンパク質から遊離した糖鎖を吸着させ、続いて、前記固相から前記糖鎖を溶出させることにより、上記の混合液から糖鎖の回収することができる。
【００６５】
以上の操作により、糖タンパク質から遊離した糖鎖から、未反応の（ａ）ヒドロキシルアミン類を除去することができる。
【００６６】
糖鎖に親和性を有する固相は、特に制限されないが、例えば、グラファイトカーボン、結晶性セルロース、シリカ、モノリスシリカ等の親水性担体等が挙げられ、特にモノリスシリカが好適である。モノリスシリカとは、３次元網目構造を持つフィルター状の多孔質連続体シリカであり、従来の粒子状シリカと比較して通液性が良好であり、デッドボリュームが少ない等の長所がある。モノリスシリカは、カラム状の容器に固定されていてもよく、例えばマルチウェルプレートに固定されていてもよい。
【００６７】
モノリスシリカのポアサイズは、互いに連続した細孔（スルーポア）径が１〜１００μｍであることが好ましく、１〜５０μｍであることがより好ましく、１〜３０μｍであることが更に好ましく、１〜２０μｍであることが特に好ましい。
【００６８】
ケトン、アルデヒド又は酸無水物を添加した混合液を、親水性担体が固定されたカラム又はマルチウェルプレートに注入し、自然落下、吸引、加圧、遠心等の方法により通過させたのち、洗浄液で洗浄し、溶出液を添加し糖鎖を溶出させるとよい。
【００６９】
親水性担体にアプライする、ケトン、アルデヒド又は酸無水物を添加した混合液は、９０体積％以上の有機溶媒を含むことが好ましく、９５体積％以上の有機溶媒を含むことが更に好ましい。有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ヘキサン、酢酸エチル、塩化メチレン、テトラヒドロフラン等を用いることができるが、アセトニトリルが特に好ましい。
【００７０】
ケトン、アルデヒド又は酸無水物を添加した混合液を親水性担体にアプライした後、親水性担体を洗浄液で洗浄することが好ましい。洗浄液は９０体積％以上の有機溶媒と１０体積％以下の水を含むことが好ましく、９５体積％以上の有機溶媒と５体積％以下の水を含むことが更に好ましい。洗浄液に含まれる有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ヘキサン、酢酸エチル、塩化メチレン、テトラヒドロフラン等を用いることができるが、アセトニトリルが特に好ましい。組成の異なる洗浄液を用いてもよく、例えば１００％アセトニトリルで洗浄した後、アセトニトリル：水＝９５：５（ｖ／ｖ）の混合液で洗浄してもよい。
【００７１】
洗浄操作後、親水性担体に溶出液を添加し、糖鎖を溶出する。溶出液は１０体積％以上の水を含むことが好ましく、５０体積％以上の水を含むことがより好ましく、水が特に好ましい。溶出液に含まれる水以外の成分としては、アセトニトリル、及び、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールに代表されるアルコールから選ばれる有機溶媒であることが好ましい。溶出した糖鎖は、蛍光標識反応に供することができる。
【００７２】
［キット］
一実施形態において、本発明は、糖タンパク質から糖鎖を遊離するためのキットであって、（ａ）ヒドロキシルアミン類と（ｂ）塩基性試薬とを含むキットを提供する。また、本実施形態のキットは、一形態の形態において、（ａ）ヒドロキシルアミン類と（ｂ）塩基性試薬とに加えて、さらに（ｃ）アミン類を含むキットである。また、本実施形態の糖タンパク質から糖鎖を遊離するためのキットは、別の一実施形態において、（ａ）ヒドロキシルアミン類と併用して使用するための（ｂ）塩基性試薬と（ｃ）アミン類とを含むキットである。
【００７３】
本実施形態のキットは、その他、糖タンパク質から糖鎖を遊離する工程に使用される試薬（（ａ）ヒドロキシルアミン類、（ｃ）アミン類、その他の添加物など）、ケトン、アルデヒド又は酸無水物、糖鎖の精製に使用する担体（糖鎖に親和性を有する固相）、糖鎖の分析に使用する試薬（蛍光試薬など）や検出機器、糖タンパク質から糖鎖を遊離する方法の具体的な手順を記載した説明書等を更に含むことができる。
【００７４】
［装置］
一実施形態において本発明は、糖タンパク質を含む試料が収容される容器を保持する容器保持部と、前記容器に試薬を導入する試薬導入部と、を備え、前記試薬導入部が、前記容器に（ａ）ヒドロキシルアミン類と、（ｂ）塩基性試薬とを含む反応液を導入する反応液導入部を含む、糖タンパク質から糖鎖を遊離させる装置を提供する。なお、以下に説明する装置の構成はあくまで一例であり、本実施形態の装置はこの構成に拘束されるものではない。
【００７５】
図１０は、本実施形態の装置を説明する模式図である。装置１００は、糖タンパク質を含む試料１１０が収容される容器１２０を保持する容器保持部１３０と、容器１２０に試薬を導入する試薬導入部１４０と、を備え、試薬導入部１４０が、容器１２０に（ａ）ヒドロキシルアミン類と、（ｂ）塩基性試薬とを含む反応液１５１を導入する反応液導入部１４１を含む。
【００７６】
容器保持部１３０は、糖タンパク質を含む試料１１０が収容される容器１２０を保持するためのものである。容器保持部１３０が容器１２０を保持する態様は特に限定されず、例えば、容器保持部１３０の保持穴又は保持孔に容器の大部分を嵌入させて保持する態様が挙げられる。このほかにも、容器保持部の係合凸部（係合凹部）に容器の係合凹部（係合凸部）を係合させて保持する態様、容器保持部の挟持部で容器を挟持保持する態様等が挙げられる。
【００７７】
試薬導入部１４０は、容器保持部１３０に保持された容器１２０の内部、又は、後述する固相保持部１６０に保持された容器１７０の内部に試薬を導入するためのものである。試薬導入部１４０は、少なくとも、容器１２０に（ａ）ヒドロキシルアミン類と、（ｂ）塩基性試薬とを含む反応液１５１を導入する反応液導入部１４１を含む。
【００７８】
試薬導入部１４０は、容器１２０にケトンを導入するケトン導入部、アルデヒドを導入するアルデヒド導入部、又は酸無水物を導入する酸無水物導入部を更に含んでいてもよい。
【００７９】
図１０の例では、試薬導入部１４０は、反応液１５１、ケトン、アルデヒド、又は酸無水物１５２、標識試薬１５３を収容したタンク１５０と、タンク１５０が収容した各試薬を送液する送液管（１４２，１４３，１４４）と、各試薬の送液を制御する弁（１４５，１４６，１４７）と各試薬を容器１２０又は容器１７０の内部に導入する導入部１４１とを備えている。図１０の例では、導入部１４１は、反応液導入部、ケトン導入部、アルデヒド導入部又は酸無水物導入部、標識試薬導入部を兼ねている。反応液１５１は、（ａ）ヒドロキシルアミン類と、（ｂ）塩基性試薬とを含んでいる。
【００８０】
試薬導入部１４０が容器１２０又は容器１７０の内部に試薬を導入する態様は特に限定されず、例えば、送液すべき液体が貯留されている送液源（１５１，１５２，１５３）から管状部材を介して容器１２０又は容器１７０の内部に送液する態様が挙げられる。このほかにも、管状部材中に採取した液体を反応容器内へ注入する態様等が挙げられる。
【００８１】
反応液導入部、ケトン導入部又はアルデヒド導入部、標識試薬導入部は、別個独立した構成部材として構成されていてもよいし、同一の構成部材として構成されてもよい。
【００８２】
装置１００は、糖鎖に親和性を有する固相１７１を含む容器１７０を保持する固相保持部１６０を更に備えていてもよい。固相保持部１６０の構造は容器保持部１３０の構造と同様であってよい。また、装置１００は、容器１７０の収容物を固液分離する固液分離部１８０を更に備えていてもよい。装置１００が固液分離部１８０を含む場合、固液分離部１８０は、容器１７０中に含まれる収容物から固体と液体とを分離する。ここで、固体は、実質的には固相１０及びそれに吸着された糖鎖である。
【００８３】
固液分離部１８０の具体的な分離形式としては特に限定されず、遠心、減圧、加圧のいずれであってもよい。図１０の例では、固液分離部１８０の分離形式は遠心である。固液分離部１８０は、容器１７０を保持するラック１８１と、ドライブシャフト１８２と、モーター１８３とを備えている。
【００８４】
図１０の例のように、固液分離部１８０は、固相保持部１６０から独立した構成部材として構成されていてもよい。この場合、装置１００は、固相保持部１６０から固液分離部１８０へ、容器１７０を自動移送させる容器移送部１９０を含んでいてもよい。容器移送部１９０は、容器１７０を把持及び開放し、かつ移動するように作動するアームと、当該アームの作動を制御するアーム制御部とを含んで構成されていてもよい。
【００８５】
固液分離部１８０を作動させることで、液体が容器１７０の下部に回収される。したがって、例えば固相１７１に吸着した糖鎖を溶出して容器１７０の下部に回収することができる。
【００８６】
装置１００は、容器１２０又は１７０の収容物の温度を調節する温度調節部１９５を更に備えていてもよい。装置１００が温度調節部１９５を含む場合、温度調節部１９５は、少なくともヒータ機能を有していればよい。温度調節部１９５は、容器１２０又は１７０を、必要な温度に加温することができる。
【００８７】
装置１００は、作動しうる構成部分（例えば、導入部１４１、アーム１９０、固液分離部１８０、温度調節部１９５）の少なくともいずれか、好ましくは全てが自動制御されてもよい。これによって、糖タンパク質からの糖鎖の調製をより迅速に行うことができる。
【実施例】
【００８８】
以下の実施例は、例示のみを意図したものであり、本発明の技術的範囲を限定するものではない。
【００８９】
材料や試薬は特に断らない限り、市販されているか、又は当技術分野で慣用の手法、公知文献の手順に従って入手又は調製したものである。
【００９０】
［実施例１］
＜モノクローナル抗体（ＩｇＧ１）の糖鎖分析＞
（Ｎ結合型糖鎖遊離反応）
モノクローナル抗体（ＩｇＧ１、４０μｇ）を酢酸カルシウムで飽和させた２５％アンモニア水溶液３０μＬに溶解し、５０％ヒドロキシルアミン水溶液を２０μＬを添加して混合した後、ドラフト中、ヒートブロックを用いて８０℃にて１時間加熱した。その後、直ちに氷浴中で冷却し１Ｎ塩酸で反応液を中和した。
【００９１】
（遊離された糖鎖の分析）
グラファイトカーボンを充填した固相抽出カートリッジ（ＨｙｐｅｒＳｅｐ  Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ  ２５ｍｇ、サーモサイエンティフィック社製）を用いて中和した反応液を脱塩し、続いてピコリンボランと２−アミノベンズアミドを用いて糖鎖を蛍光標識した。蛍光標識糖鎖はＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５（ＧＥヘルスケア社製）で精製した後、ＨＰＬＣにて分析した。図１にそのクロマトグラムを示した。図１中、横軸は溶出時間を示し、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。
【００９２】
［比較例１］
従来の方法と比較するため酵素（ＰＮＧａｓｅＦ）を用いて糖鎖遊離反応を行った。モノクローナル抗体（ＩｇＧ１、４０μｇ）を１００ｍＭジチオスレイトールと０．５％ＳＤＳを含む５００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）４０μＬに溶解し、８０℃で１０分間加熱した。その後、室温まで冷却した後、５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（４０μＬ）と蒸留水１５μＬを加え、さらにＰＮＧａｓｅＦを５μＬ（１６ｍＵ、Ｔａｋａｒａ  ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）添加し３７℃にて１６時間インキュベートした。その後、直ちに氷浴中で冷却し１Ｎ塩酸で反応液を中和した。その後、固相抽出カートリッジＳｅｐＰａｋ  Ｃ１８（５０ｍｇ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）に供し、蒸留水で洗浄した。濾液と洗浄液を合わせて、実施例１に記載した方法により固相抽出カートリッジ（ＨｙｐｅｒＳｅｐ  Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ  ２５ｍｇ）にて脱塩処理、２−アミノベンズアミドによる蛍光標識、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５（ＧＥヘルスケア社製）による精製を経てＨＰＬＣに供した。図２にそのクロマトグラムを示した。図２中、横軸は溶出時間を示し、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。図１および図２に示すように、本実施例の方法により、従来法と同様のクロマトグラムが得られることが明らかとなった。
【００９３】
［実施例２］
＜ヒト血清由来ＩｇＧの糖鎖分析＞
（Ｎ結合型糖鎖遊離反応）
ヒト血清由来ＩｇＧ（２００μｇ）の水溶液２０μＬをサンプルチューブに入れ、そのチューブに５０％ヒドロキシルアミン水溶液を１０μＬ添加し、次いで２５％アンモニア水溶液の２５μＬと５μＬの１．２Ｍ水酸化リチウムとを加えて混合した後、ドラフト中、ヒートブロックを用いて５０℃、１時間加熱した。その後、直ちに氷浴中で冷却し１Ｎ塩酸で反応液を中和した。
【００９４】
（遊離された糖鎖の分析）
実施例１と同様の方法により、反応液を脱塩後、糖鎖を蛍光標識してＨＰＬＣにて分析した。図３にそのクロマトグラムを示した。図３中、横軸は溶出時間を示し、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。その結果、これまでに報告されている、ヒト血清由来ＩｇＧから遊離させた糖鎖の分析結果と同様の結果が得られた。
【００９５】
［実施例３］
＜ウシフェツインの糖鎖分析＞
（Ｏ結合型糖鎖遊離反応）
ウシフェツイン（２０μｇ）を蒸留水３８．５μＬに溶解し、５０％ヒドロキシルアミン１０μＬとジアザビシクロウンデセン１．５μＬを添加し混合した後、ドラフト中、ヒートブロックを用いて６０℃にて５分間加熱した。その後、直ちに氷浴中で冷却し１Ｎ塩酸で反応液を中和した。
【００９６】
（遊離された糖鎖の分析）
実施例１と同様の方法により、反応液を脱塩後、糖鎖を蛍光標識してＨＰＬＣにて分析した。図４にそのクロマトグラムを示した。図４中、横軸は溶出時間を示し、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。その結果、これまでに報告されている、ウシフェツインから遊離させた糖鎖の分析結果と同様の結果が得られた。
【００９７】
［実施例４］
＜ウシアポトランスフェリンの糖鎖分析＞
（Ｎ結合型糖鎖遊離反応）
ウシアポトランスフェリン（２００μｇ）の水溶液２０μＬをサンプルチューブに入れ、そのチューブに５０％ヒドロキシルアミン水溶液を２０μＬ添加し、次いで１．０Ｍ  水酸化リチウムを１０μＬ加えて混合した後、ドラフト中、ヒートブロックを用いて５０℃、１時間加熱した。その後、直ちに氷浴中で冷却し１Ｎ塩酸で反応液を中和した。
【００９８】
（遊離された糖鎖の分析）
実施例１と同様の方法により、反応液を脱塩後、糖鎖を蛍光標識してＨＰＬＣにて分析した。図５にそのクロマトグラムを示した。図５中、横軸は溶出時間を示し、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。その結果、Ｎグリコリルノイラミン酸を含有する糖鎖も分析できることが明らかとなった。
【００９９】
［実施例５］
＜セイヨウワサビペルオキシダーゼの糖鎖分析＞
（Ｎ結合型糖鎖遊離反応）
セイヨウワサビペルオキシダーゼ（２００μｇ）を含む水溶液２０μＬをサンプルチューブに入れ、そのチューブに５０％ヒドロキシルアミン水溶液を２０μＬ添加し、次いで１．０Ｍ  水酸化リチウムを１０μＬ加えて混合した後、ドラフト中、ヒートブロックを用いて５０℃、１時間加熱した。その後、直ちに氷浴中で冷却し１Ｎ塩酸で反応液を中和した。
【０１００】
（遊離された糖鎖の分析）
実施例１と同様の方法により、反応液を脱塩後、糖鎖を蛍光標識してＨＰＬＣにて分析した。図６にそのクロマトグラムを示した。図６中、横軸は溶出時間を示し、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。その結果、還元末端のＮアセチルグルコサミンの３位にフコースを有するＮ結合型糖鎖の分析も可能であることが明らかとなった。
【０１０１】
［実施例６］
＜ウシ顎下腺ムチンの糖鎖分析＞
（Ｏ結合型糖鎖遊離反応）
ウシ顎下腺ムチン（５０μｇ）の水溶液２０μＬと５０％ヒドロキシルアミン２０μＬとジアザビシクロウンデセン１０μＬを混合した後、ドラフト中、ヒートブロックを用いて６０℃にて５分間加熱した。その後、直ちに氷浴中で冷却し１Ｎ塩酸で反応液を中和した。
【０１０２】
（遊離された糖鎖の分析）
実施例１と同様の方法により、反応液を脱塩後、糖鎖を蛍光標識してＨＰＬＣにて分析した。図７にそのクロマトグラムを示した。図７中、横軸は溶出時間を示し、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。その結果、これまでに報告されているものと同様の結果が得られた。
【０１０３】
［実施例７］
＜各種条件下におけるＮ結合型糖鎖遊離反応＞
（ａ）ヒドロキシルアミン類、（ｂ）塩基性試薬、および／または、（ｃ）アミン類を含む反応液について、試薬の種類や濃度、温度条件、反応時間などの各種条件を変更した各種試験を行った。各試験例の条件および収量を表１Ａ及び表１Ｂに示す。なお、試験例１〜６において、糖タンパク質はｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ＩｇＧ  ２００μｇを用い、試験例７〜８０においては、モノクローナル抗体Ｍ−Ｌ００１  ４０μｇを用いた。また、各試薬の濃度は終濃度を示し、収量は、ＨＰＬＣにおける全糖鎖ピークの面積値の合計を表す。また、結果の「Ａ」はＰＮＧａｓｅＦを用いた従来法とほぼ同等の結果が得られたことを示し、「Ｂ」はＰＮＧａｓｅＦを用いた従来法に比べて収量が半分以下の結果が得られたことを示し、「Ｃ」は本来の糖鎖に加えて分解した糖鎖のピークが検出された結果を示し、「Ｄ」は糖鎖がほとんど分析できなかったことを示す。
【０１０４】
【表１Ａ】
2020073670.tif 000002
【０１０５】
【表１Ｂ】
2020073670.tif 000003
【０１０６】
（１）試験例１、２は、水酸化リチウムとアンモニアとの併用の影響を確認するために行った。その結果、アンモニアを添加していない試験例２と比較して、水酸化リチウムとアンモニアとを併用した試験例１では、収量が顕著に増加した。
（２）試験例４〜６では、塩基性試薬としてアルカリ土類金属のカルシウム塩または水酸化カルシウムの使用を比較した。その結果、いずれのカルシウム化合物も良好な結果を得ることができ、特に、水酸化カルシウムが最も収量が高かった。なお、水酸化リチウムと比較すると、収量自体は下がっていたが、分解反応の一種である異性化（エピメリゼーション）を抑制することができていた。
（３）試験例８〜１４では、ヒドロキシルアミン類の濃度条件を変更して比較を行った。その結果、ヒドロキシルアミンは、０．５％、１５０ｍＭでは効果を得ることができなかった。一方で、２％、６００ｍＭから遊離された糖鎖の安定化の効果を得ることができた。
（４）試験例１５〜２０では、反応時間の条件を変更して比較を行った。その結果、アンモニアと酢酸カルシウムを用いた８０℃の条件下においては、反応時間が２時間程度において、最も好ましい結果が得られたが、２時間を超えると遊離した糖鎖の分解が進行することがわかった。
（５）試験例２１〜２６では、塩基性試薬（アルカリ触媒）を変更して比較を行った。その結果、弱アルカリでも糖鎖の遊離を行うことができ、各塩基性試薬において好ましい収量および結果を得ることができた。
（６）試験例２７〜３２では、塩基性試薬のうち各種のアンモニア水に溶解したアルカリ土類金属の塩または水酸化物を用い、比較を行った。その結果、酢酸マグネシウム以外は良好な結果を得ることができた。
（７）試験例３３〜３８では、アミンを変更して比較を行った。その結果、メチルアミン、ジメチルアミンは、収量が増加する一方で、異性化やアミドの分解（デアミデーション）が促進した。エチレンジアミン、および、エタノールアミンの使用は、異性化を抑制しつつ、収量を増加させることができた。
（８）試験例３９〜４２では、低ｐＫａを有する各種アミンを用い、比較を行った。その結果、ＤＡＢＣＯおよびモルホリンにおいては、良好な収量および結果をえることができた。特に、ＤＡＢＣＯは、デアミデーションが全く見られなかった。
（９）試験例４３〜４８では、ＫＯＨの濃度を変更（２ｍＭ〜２Ｍ）して比較を行った。その結果、ＫＯＨの濃度が高い方が好ましい結果を得ることができた。
（１０）試験例４９、５０では、塩基性試薬としてのＤＢＵを用い、水酸化リチウムと比較した。その結果、ＤＢＵを用いた方が、水酸化リチウムよりも好ましい収量を得ることができた。
（１１）試験例５１〜５４では、ＤＢＵ存在下におけるヒドロキシルアミン類の濃度を変更して比較を行った。その結果、ヒドロキシルアミンの濃度が少なくとも１０％となるまでは濃度依存的に好ましい収量および結果を得ることができた。
（１２）試験例５５〜５７では、ＤＢＵ存在下、５０℃における反応時間（６０分〜２４０分）の変更について比較した。その結果、１時間が最も好ましく、１時間以上の反応時間では、反応時間が伸びるほど、収量および結果が悪くなった。
（１３）試験例５８〜６１では、室温における反応時間について比較した。その結果、室温では反応速度が低く、酵素を用いた反応の半量程度の収量をえるのに１６時間を要した。
（１４）試験例６２、６３では、ヒドロキシルアミン類として、ヒドロキシルアミン塩酸塩の使用についてＤＭＳＯ中で比較、検討した（表中には、ＤＭＳＯの表示なし）。その結果、ＤＭＳＯを溶媒とした場合にはほとんど反応が進行しないことが判明した。
（１５）試験例６４〜６７では、ＤＢＵ以外の各種有機塩基の使用について比較した。その結果、ＤＢＵとアンモニアとの組み合わせ以外は、いずれも非常に良好な収量および結果を得られた。
（１６）試験例６８〜７１では、ＤＢＵの濃度の変更について比較した。その結果、ＤＢＵは、濃度が高い方が好ましい収量および結果を得ることができた。具体的には、１００ｍＭ以上のＤＢＵを用いることで優れた効果を得ることができた。
（１７）試験例７２〜７５では、ＤＢＵ以外の各種有機塩基の使用について比較した。その結果、Ｐｒｏｔｏｎ  ｓｐｏｎｇｅでは、好ましい収量を得ることができなかった。Ｐｒｏｔｏｎ  ｓｐｏｎｇｅ以外の有機塩基では、好ましい収量および結果を得ることができた。
（１８）試験例７６〜７９では、アミン類非存在下におけるＤＢＵの濃度の変更について比較した。その結果、１００ｍＭ以上のＤＢＵを用いることで優れた効果を得ることができた。
（１９）試験例８０では、４％セチルトリメチルアンモニウム水酸化物を検討した。その結果、良好な収量および結果を得ることができた。
【０１０７】
［実施例８］
＜各種条件下におけるＯ結合型糖鎖遊離反応＞
（ａ）ヒドロキシルアミン類、（ｂ）塩基性試薬、および／または、（ｃ）アミン類を含む反応液について、試薬の種類や濃度、温度条件、反応時間などの各種条件を変更した各種試験を行った。各試験例の条件および収量を表２Ａ及び表２Ｂに示す。なお、試験例１〜５２においては、糖タンパク質としてウシフェツイン２０μｇを用いた。また、各試薬の濃度は終濃度を示し、収量は、ＨＰＬＣにおける全糖鎖ピークの面積値の合計を表す。また、結果の「Ａ」は糖鎖収量が２０００以上で、かつピーリング産物が２０％以下であったことを示し、「Ｂ」はピーリング産物が２０％以上または糖鎖収量が１０００以上２０００以下であったことを示し、「Ｃ」は糖鎖収量が２００以上１０００以下であったことを示し、「Ｄ」は糖鎖収量が２００以下であったことを示す。
【０１０８】
【表２Ａ】
2020073670.tif 000004
【０１０９】
【表２Ｂ】
2020073670.tif 000005
【０１１０】
（１）試験例３、４は、アンモニアを塩基性試薬として利用した場合におけるカルシウムの有無の比較を行った。その結果、カルシウムの存在により収量が増加し好ましい結果となった。
（２）試験例５、６は、塩基なしまたはアンモニアよりも弱い塩基を用いて比較を行った。その結果、アンモニアよりも強い塩基性が糖鎖の遊離には必要不可欠であることがわかった。
（３）試験例７〜１０は、アルカリの強度の違いによる比較を行った。その結果、いずれの試験例でも好ましい結果を得られた。また、強アルカリ条件下とすることで、収量が増加した。
（４）試験例１１〜１４では、強アルカリ条件下での温度の変化について比較した。その結果、６０〜７５℃までは、温度の上昇に伴い、収量が増加し、非常に好ましい結果が得られた。一方、９０℃でも好ましい結果は得られたが、収量が若干低下し、ピーリングが増加し始めた。
（５）試験例１５〜１８では、強アルカリ条件下でのアンモニア濃度の変化について比較した。その結果、強アルカリ条件下においては、Ｏ結合型糖鎖の遊離にアンモニアの存在は不要であった。
（６）試験例１９では、ヒドロキシルアミンの有無の影響について比較した。その結果、ヒドロキシルアミン不存在の条件では、糖鎖のほとんどがピーリングを引き起こしていた。
（７）試験例２０〜２６では、アントラニル酸存在下で反応時間を変更した際の影響について比較した。また、２１〜２６では反応液にＤＭＳＯを添加している。その結果、アントラニル酸を添加する場合にはＤＭＳＯが必要で、試験例の条件において反応時間３０分までは、ピーリングを抑えたＯ結合型糖鎖の遊離を行うことができた。一方、３０分以上ではピーリングが生じ、１時間以上では、ピーリングとは異なる分解物が生じていた。
（８）試験例２７、２８では、ＬｉＯＨの代わりに、高濃度ＫＯＨの使用を検討した。その結果は、高濃度のＫＯＨでは全くＯ結合型糖鎖を遊離させることができなかった。
（９）試験例２９、３０では、アルカリ（ＫＯＨ、ＮａＯＨ）の検討を行った。その結果、いずれのアルカリも、遊離したＯ結合型糖鎖としてジシアリル糖鎖が少なく、ＬｉＯＨの方が好ましい結果を示した。
（１０）試験例３１、３２では、ＤＡＢＣＯの効果の検討を行った。その結果、ＤＡＢＣＯの添加により収量は減少するものの、ピーリングを抑制することができた。
（１１）試験例３３、３４では、塩基性試薬としてのＤＢＵとＬｉＯＨとの比較を行った。その結果、ＤＢＵを使用した試験の方が、収量が良く、また、ジシアリル糖鎖の量も相対的に多い結果となった。
（１２）試験例３５〜３８は、２００ｍＭＤＢＵ、１０％ヒドロキシルアミンを用いた際の反応時間の長さについて比較した。その結果、室温でもＯ結合型糖鎖の遊離反応は時間の経過ごとに進行した。また、４時間の反応後であっても、ピーリングした糖鎖はほとんどなかった。
（１３）試験例４０〜４４では、他の有機塩基の使用を検討した。その結果、ＴＭＧ、ｔ−ブチルＴＭＧ、ＴＢＤ、ＭＴＢＤのいずれもＯ結合型糖鎖の遊離を行うことができ、特に、ＴＭＤ、ＴＢＤ、ＭＴＢＤの方がより好ましい収量および結果を得ることができた。
（１４）試験例４５〜４７では、ＤＢＵの濃度について検討した。その結果、ＤＢＵの濃度が高い方が、収量が増加した。
（１５）試験例４８〜５１では、ヒドロキシルアミンの濃度の検討を行った。その結果、ヒドロキシルアミンの量はＤＢＵよりも相対的に多くすることでピーリングを抑えることが可能であった。
（１６）試験例５２は、塩基性試薬として、４％セチルトリメチルアンモニウム水酸化物を用いた試験結果を示す。良好な収量および結果を得ることができた。
【０１１１】
［実施例９］
＜モノリスシリカによる試薬除去を組みあわせたウシフェツインのＯ結合型糖鎖分析＞
（５０％ヒドロキシルアミンを用いたＯ型糖鎖遊離反応）
ウシフェツイン（２０μｇ）を５０％ヒドロキシルアミン５０μＬに溶解し、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）１０μＬを添加して混合した後、ドラフト中、ヒートブロックを用いて６０℃で２０分間加熱した。その後、直ちに氷浴中で冷却し１Ｎ塩酸で反応液を中和した。
【０１１２】
（５０％ヒドロキシルアミンを用いた反応で遊離された糖鎖の回収）
中和した反応液にアセトン２００μＬ又はサリチルアルデヒド２００μＬをそれぞれ添加し攪拌した。さらに、上記の反応液にアセトニトリル１６ｍＬを添加し、あらかじめアセトニトリルで平衡化したモノリスシリカ（シリカモノリススピンカラム、Ｃｌｅａｎｕｐ  ｃｏｌｕｍｎ、住友ベークライト社製）に全量アプライし、続いてアセトニトリル１．２ｍＬで洗浄した。続いて、１０％酢酸１００μＬを用いてモノリスシリカから糖鎖を溶出し、９００μＬの純水と混合した後、実施例１と同様にしてグラファイトカーボンカートリッジによる脱塩処理を行い、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む５０％アセトニトリル１ｍＬで糖鎖を溶出し、減圧乾固した。
【０１１３】
（遊離糖鎖の分析）
乾固した糖鎖を１０％酢酸２５μＬに溶解し、ピコリンボランと２−アミノ安息香酸を用いて糖鎖を蛍光標識した。蛍光標識糖鎖は、モノリスシリカ（シリカモノリススピンカラム、Ｃｌｅａｎｕｐ  ｃｏｌｕｍｎ、住友ベークライト社製）で過剰の試薬を除去した後、ＨＰＬＣで分析した。
【０１１４】
［実施例１０］
＜１０％ヒドロキシルアミンを用いたＯ結合型糖鎖遊離反応＞
ウシフェツイン（２０μｇ）を１０％ヒドロキシルアミン５０μＬに溶解し、ＤＢＵ  １０μＬを添加して混合した後、ドラフト中、ヒートブロックを用いて６０℃で２０分間加熱した。その後、直ちに氷浴中で冷却し１Ｎ塩酸で反応液を中和した。
【０１１５】
（遊離糖鎖の回収）
実施例１と同様にして、グラファイトカーボンを充填した固相抽出カートリッジ（ＨｙｐｅｒＳｅｐ  Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ  ２５ｍｇ、サーモサイエンティフィック社製）を用いて中和した反応液を脱塩処理し、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル１ｍＬで糖鎖を溶出し、減圧乾固した。
【０１１６】
（遊離糖鎖の分析）
実施例９と同様にして糖鎖を蛍光標識し、ＨＰＬＣで分析した。
【０１１７】
［実施例１１］
＜５０％ヒドロキシルアミンを用いたＯ結合型糖鎖遊離反応＞
ウシフェツイン（２０μｇ）を５０％ヒドロキシルアミン５０μＬに溶解し、ＤＢＵ  １０μＬを添加して混合した後、ドラフト中、ヒートブロックを用いて６０℃で２０分間加熱した。その後、直ちに氷浴中で冷却し１Ｎ塩酸で反応液を中和した。
【０１１８】
（遊離糖鎖の回収）
実施例１と同様にして、グラファイトカーボンを充填した固相抽出カートリッジ（ＨｙｐｅｒＳｅｐ  Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ  ２５ｍｇ、サーモサイエンティフィック社製）を用いて中和した反応液を脱塩処理し、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル１ｍＬで糖鎖を溶出し、減圧乾固した。
【０１１９】
（遊離糖鎖の分析）
実施例９と同様にして糖鎖を蛍光標識し、ＨＰＬＣで分析した。
【０１２０】
図８（ａ）〜（ｄ）は、実施例９〜１１で蛍光標識した糖鎖をＨＰＬＣで分析した結果を示すクロマトグラムである。図８（ａ）〜（ｄ）中、横軸は溶出時間を示し、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。
【０１２１】
図８（ａ）は実施例１０の結果であり、図８（ｂ）は実施例１１の結果であり、図８（ｃ）は実施例９（アセトン処理）の結果であり、図８（ｄ）は実施例９（サリチルアルデヒド処理）の結果である。その結果、ヒドロキシルアミンを５０％の濃度で用い、アセトン又はサリチルアルデヒド処理を実施した上でモノリスシリカによる精製処理を経ることによりピーリングを抑制し、かつより高い収量で糖鎖を分析できることが明らかとなった。
【０１２２】
［実施例１２］
＜モノリスシリカからの糖鎖回収法の検討＞
（５０％ヒドロキシルアミンを用いたＯ結合型糖鎖遊離反応）
ウシフェツイン（２０μｇ）を５０％ヒドロキシルアミン５０  μＬに溶解し、ＤＢＵ  １０μＬを添加して混合した後、ドラフト中、ヒートブロックを用いて６０℃で２０分間加熱した。その後、直ちに氷浴中で冷却し１Ｎ塩酸で反応液を中和した。
【０１２３】
（５０％ヒドロキシルアミンを用いた反応で遊離された糖鎖の回収）
中和した反応液にアセトン２００μＬを添加し攪拌した。さらに、上記の反応液にアセトニトリル２０ｍＬを添加し、あらかじめアセトニトリルで平衡化したモノリスシリカ（シリカモノリススピンカラム、Ｃｌｅａｎｕｐ  ｃｏｌｕｍｎ、住友ベークライト社製）に全量アプライし、続いてアセトニトリル１．２ｍＬで洗浄した。
【０１２４】
（糖鎖の回収及び分析）
続いて、１０％酢酸２５μＬをモノリスシリカに添加し、溶液を回収した。さらに、ピコリンボランと２−アミノ安息香酸の混合液２５μＬをモノリスシリカに添加後、溶液を回収し、先の溶液と混合して５０℃で３時間反応させ、糖鎖を蛍光標識した。蛍光標識糖鎖は、モノリスシリカ（シリカモノリススピンカラム、Ｃｌｅａｎｕｐ  ｃｏｌｕｍｎ、住友ベークライト社製）で過剰の試薬を除去した後、ＨＰＬＣで分析した。
【０１２５】
図９は実施例１２で蛍光標識した糖鎖をＨＰＬＣで分析した結果を示すクロマトグラムである。図９中、横軸は溶出時間を示し、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。その結果、糖鎖の回収方法を変更しても、目的の糖鎖ピークが得られることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本発明の方法によれば、安全かつ安価な薬品の使用により、糖鎖の分解を抑制しつつ、短時間の処理時間で糖タンパク質から糖鎖を遊離させることができ、また、遊離した糖鎖は、糖鎖オキシムを含む混合物として回収することが可能である。
【符号の説明】
【０１２７】
１００…装置、１１０…糖タンパク質、１２０，１７０…容器、１３０…容器保持部、１４０…試薬導入部、１４１…導入部（反応液導入部，ケトン導入部，アルデヒド導入部，酸無水物導入部，標識試薬導入部）、１４２，１４３，１４４…送液管、１４５，１４６，１４７…弁、１５０…タンク、１５１…反応液、１５２…ケトン，アルデヒド，酸無水物、１５３…標識試薬、１６０…固相保持部、１７１…固相、１８０…固液分離部、１８１…ラック、１８２…ドライブシャフト、１８３…モーター、１９０…容器移送部、１９５…温度調節部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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