(57)【要約】【課題】イムノクロマト試験片におけるいわゆる白抜け現象の発生を回避し、より視認性に優れた検出ができる試験片を提供することを課題とする。また、テストラインの検出値のばらつきを防止できるイムノクロマト試験片の提供も課題とする。【解決手段】少なくとも多孔性メンブレンを含み、サンプル供給部、展開部、特異的結合性物質が固定化された検出部を有するイムノクロマト試験片であって、検出部は多孔性メンブレンの表面に固定化されており、前記多孔性メンブレンの裏面に不透明基材が配置されていることを特徴とする前記試験片により前記課題を解決する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも多孔性メンブレンを含み、サンプル供給部、展開部、検出部とを有するイムノクロマト試験片であって、前記検出部は多孔性メンブレンの表面に固定化されており、
前記多孔性メンブレンの裏面に不透明基材が配置されていることを特徴とする前記試験片。
【請求項２】
前記不透明基材が多孔性メンブレンの裏打ちのための部材である請求項１に記載の試験片。
【請求項３】
前記不透明基材が白色基材である請求項１又は２に記載のイムノクロマト試験片。
【請求項４】
前記サンプル供給部を担うサンプルパッド、及び金コロイド又は着色ラテックスで標識された異的結合性物質を含むコンジュゲートパッドを含む請求項１〜３のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
【請求項５】
特異的結合性物質が抗体である請求項１〜４のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
【請求項６】
前記多孔性メンブレンの下にバッキングシートが配置されている請求項１〜５のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
【請求項７】
光学的手段で検出するための試験片である、請求項１〜６のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のイムノクロマト試験片を含むイムノクロマト検出キット。
【請求項９】
イムノクロマト検出方法であって、以下の試験片を用いることを特徴とする前記方法；
少なくとも検出部を有する多孔性メンブレンを含み、前記多孔性メンブレンの裏側に不透明基材が配置されているイムノクロマト試験片。
【請求項１０】
前記不透明基材が多孔性メンブレンの裏打ちのための部材である請求項９に記載のイムノクロマト検出方法。
【請求項１１】
不透明基材が白色基材である請求項９または１０に記載のイムノクロマト検出方法。
【請求項１２】
前記試験片は、前記サンプル供給部を担うサンプルパッド、及び金コロイド又は着色ラテックスで標識された特異的結合性物質を含むコンジュゲートパッドを含む請求項９〜１１のいずれかに記載のイムノクロマト検出方法。
【請求項１３】
特異的結合性物質が抗体である請求項９〜１２のいずれかに記載のイムノクロマト検出方法。
【請求項１４】
前記試験片は、前記多孔性メンブレンの下にバッキングシートが配置されている請求項９〜１３のいずれかに記載のイムノクロマト検出方法。
【請求項１５】
光学的手段により標識物質に由来する光学的パラメータを検出する工程を含む、請求項９〜１４のいずれかに記載のイムノクロマト検出方法。
【請求項１６】
目視観察により標識物質に由来する呈色を判定する工程を含む、請求項９〜１５のいずれかに記載のイムノクロマト検出方法。
【請求項１７】
イムノクロマト検出方法における測定値のばらつきを低減する方法であって、
以下の試験片を用いることを特徴とする前記方法；
少なくとも多孔性メンブレンを含み、サンプル供給部、展開部、検出部を有するイムノクロマト試験片であって、
前記検出部は多孔性メンブレン表面に固定化されており、
前記多孔性メンブレンの裏側に不透明基材が配置されている試験片。
【請求項１８】
試験片を用いたイムノクロマト検出方法における、試験片の白抜けを低減する方法であって、以下の試験片を用いることを特徴とする前記方法；
少なくとも多孔性メンブレンを含み、サンプル供給部、展開部、検出部を有するイムノクロマト試験片であって、前記検出部は多孔性メンブレン表面に固定化されており、
前記多孔性メンブレンの裏側に不透明基材が配置されている試験片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はイムノクロマト用試験片および当該試験片を利用したイムノクロマト検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
患者のそばで処置するというＰＯＣＴ（ポイントオブケア）の普及に伴い、抗原抗体反応を利用した簡易な免疫測定として、ニトロセルロースメンブレン等の試験片を用いたラテラルフロー式のイムノクロマト検出法が広く普及している。
【０００３】
イムノクロマトグラフィー用の試験片（以下単にイムノクロマト試験片ということがある）は、一般に、サンプル供給部、展開部、検出部とを備えた多孔性体からなるメンブレンであって、検出対象物に対する標識抗体が、検体（サンプル）との接触後に展開部を通過して検出部に到達できるよう、展開部の展開開始部位に溶出可能に保持され、さらに検出用の抗体が展開部の一部に固定化され検出部を構成する構造となっている。
【０００４】
ここで、検体がサンプル供給部に滴下されると、検体中に検出対象物が含まれていた場合、検出対象物が標識抗体と特異的に結合して複合体を形成し、該複合体は、展開部を下流方向に向かって展開して行き、検出部で検出用の固定化抗体に結合する。したがって、検出部において、標識抗体、検出対象物及び固定化抗体によるサンドイッチ型複合体を検出することで、検出対象物を定性または定量分析することが可能である。
【０００５】
上記構成のイムノクロマト試験片の検出部において、被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出する方法として、標識体に由来する反射光の強度を測定して吸光度（反射吸光度）を算出する方法がある。反射吸光度は、例えば、検出部における被検出物質の検出ラインとその近傍の２部位の反射光強度を測定し、その比を用いて算出するが、該方法を使用する際、上記複合体が検出される検出部の上流側又は下流側付近の反射光強度が非特異的に上昇して測定波形に乱れがみられることがある。この場合、被検出物質が低濃度の場合は、測定波形の乱れを無視してベースラインを引くことができないため、特異的シグナル（ピーク）を正確に検出することができず、測定自体が不可能となることがある。
【０００６】
このような測定波形の乱れの発生頻度と測定波形の乱れの程度は一定ではないため、測定の再現性が低下したり、測定の都度適切な測定値への補正を行うこと（いいかえれば測定波形の確認）が必要であった。
【０００７】
白色のメンブレンを用いる通常のイムノクロマト検出法において、前記測定波形の乱れは、メンブレンにおける該当部位の色がその周辺の色よりも相対的に白く、色が抜けているように見える現象（いわゆる、白抜け現象、以下単に白抜けということがある）として目視でも観察されるため、標識体に由来する呈色を目視判定する際にも妨げとなり、判定結果の正確さを欠く原因となっていた。
【０００８】
このような白抜けが発生する原因は定かではないが、試験片の製造ロット間の違い、試験片の保管状態の違い、試験片の前処理条件などの製造条件の違いなどが予想される。
このような白抜け現象を解消するための方法として以下の文献が知られている。
特許文献１は、イムノクロマト試験片を長期間保管した場合に観察されることの多い白抜けを防止するためにメタノールを添加したサンプル希釈液を用いたアッセイが開示されている。
【０００９】
特許文献２には、イムノクロマト試験片の抗体固定化メンブレンをｎーオクチルーβーＤーグルコシドなどの特定の界面活性剤で処理することで白抜けや測定波形の乱れを防止する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開WO2015/080286パンフレット
【特許文献２】国際公開WO2010/001598パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、上記先行技術とは全く別のアプローチによりイムノクロマト試験片におけるいわゆる白抜け現象の発生を回避し、より視認性に優れた検出ができる試験片を提供することを課題とする。本発明は、また、テストラインの検出値のばらつきを防止できるイムノクロマト試験片の提供も課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するためにイムノクロマト試験片の様々な要素の変更を試みたところ、驚くべきことに、多孔性メンブレンを含むイムノクロマト試験片において、抗体などの特異的結合性物質を表面に固定化した多孔性メンブレンの裏面に不透明基材を設けることによって、テストライン付近の白抜けが回避でき、また、検出値のばらつきを防止できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の構成を有する。
（１）少なくとも多孔性メンブレンを含み、サンプル供給部、展開部、検出部とを有するイムノクロマト試験片であって、前記検出部は多孔性メンブレンの表面に固定化されており、前記多孔性メンブレンの裏面に不透明基材が配置されていることを特徴とする前記試験片。
（２）前記不透明基材が多孔性メンブレンの裏打ちのための部材である（１）に記載の試験片。
（３）前記不透明基材が白色基材である（１）又は（２）に記載のイムノクロマト試験片。
（４）前記サンプル供給部を担うサンプルパッド、及び金コロイド又は着色ラテックスで標識された異的結合性物質を含むコンジュゲートパッドを含む（１）〜（３）のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
（５）特異的結合性物質が抗体である（１）〜（４）のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
（６）前記多孔性メンブレンの下にバッキングシートが配置されている（１）〜（５）のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
（７）光学的手段で検出するための試験片である、（１）〜（６）のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載のイムノクロマト試験片を含むイムノクロマト検出キット。
（９）イムノクロマト検出方法であって、以下の試験片を用いることを特徴とする前記方法；
少なくとも検出部を有する多孔性メンブレンを含み、前記多孔性メンブレンの裏側に不透明基材が配置されているイムノクロマト試験片。
（１０）前記不透明基材が多孔性メンブレンの裏打ちのための部材である（９）に記載のイムノクロマト検出方法。
（１１）不透明基材が白色基材である（９）または（１０）に記載のイムノクロマト検出方法。
（１２）前記試験片は、前記サンプル供給部を担うサンプルパッド、及び金コロイド又は着色ラテックスで標識された特異的結合性物質を含むコンジュゲートパッドを含む（９）〜（１１）のいずれかに記載のイムノクロマト検出方法。
（１３）特異的結合性物質が抗体である（９）〜（１２）のいずれかに記載のイムノクロマト検出方法。
（１４）前記試験片は、前記多孔性メンブレンの下にバッキングシートが配置されている（９）〜（１３）のいずれかに記載のイムノクロマト検出方法。
（１５）光学的手段により標識物質に由来する光学的パラメータを検出する工程を含む、（９）〜（１４）のいずれかに記載のイムノクロマト検出方法。
（１６）目視観察により標識物質に由来する呈色を判定する工程を含む、（９）〜（１５）のいずれかに記載のイムノクロマト検出方法。
（１７）イムノクロマト検出方法における測定値のばらつきを低減する方法であって、
以下の試験片を用いることを特徴とする前記方法；
少なくとも多孔性メンブレンを含み、サンプル供給部、展開部、検出部を有するイムノクロマト試験片であって、前記検出部は多孔性メンブレン表面に固定化されており、
前記多孔性メンブレンの裏側に不透明基材が配置されている試験片。
（１８）試験片を用いたイムノクロマト検出方法における、試験片の白抜けを低減する方法であって、以下の試験片を用いることを特徴とする前記方法；
少なくとも多孔性メンブレンを含み、サンプル供給部、展開部、検出部を有するイムノクロマト試験片であって、前記検出部は多孔性メンブレン表面に固定化されており、
前記多孔性メンブレンの裏側に不透明基材が配置されている試験片。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、テストライン付近の白抜けが回避できることから目視による検出時の視認性に優れ、また、光学的手段による測定値のばらつきの少ないイムノクロマト試験片を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】裏打ち部材を透明基材(比較例）と白色基材（本発明）にした多孔性メンブレンを用いたイムノクロマト試験片によりイムノクロマト測定を行った場合の測定値のバラツキを示すグラフである。(試験例２、被検出物質が中濃度側）
【図２】裏打ち部材を透明基材(比較例）と白色基材（本発明）にした多孔性メンブレンを用いたイムノクロマト試験片によりイムノクロマト測定を行った場合の測定値のバラツキを示すグラフである。(試験例３、被検出物質が低濃度側）
【図３】裏打ち部材を透明基材(比較例）と白色基材（本発明）にした多孔性メンブレンを用いたイムノクロマト試験片によりイムノクロマト測定を行った場合の測定値のバラツキを示すグラフである。(試験例４、被検出物質が高濃度側）
【図４】本発明のイムノクロマト試験片を示す斜視図である。Ａはイムノクロマト試験片全体であり、Ｂは多孔性メンブレンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（イムノクロマト試験片）
本発明のイムノクロマト試験片は、少なくとも「サンプル供給部」、「展開部」、「検出部」とを備えた多孔性のメンブレンを含み、検出対象物に結合する標識された特異的結合性物質が、検体との接触後に展開部を通過して検出部に到達できるよう、展開部の展開開始部位に溶出可能に保持され、さらに検出用の特異的結合性物質が展開部の一部に固定化され検出部を構成している。
【００１６】
これらを具現化する一例として、サンプル供給部を担うサンプルパッド、検出対象物に結合する標識された特異的結合性物質が溶出可能に保持され、展開部の一部を担うコンジュゲートパッド、検出用の特異的結合性物質が一部に固定化され、展開部および検出部を担う多孔性のメンブレンを含む試験片が挙げられる。すなわち、本発明の典型的なイムノクロマトグラフィー用試験片は以下の構成を有する。
【００１７】
（１）検体が供給されるサンプルパッド
（２）サンプルパッドの下流に配置され、金コロイド表面に第一の特異的結合性物質が感作されたコンジュゲートが溶出可能に保持されたコンジュゲートパッド
（３）コンジュゲートパッドの下流に配置され、コンジュゲートと検出対象物との複合体と結合する第二の特異的結合性物質が固定化された検出部を表面に有する多孔性のメンブレンであって、裏側には、不透明基材が配置されている前記多孔性メンブレン
【００１８】
ここで、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、多孔性のメンブレンはそれぞれが別々の担体を構成する場合、あるいは２つが１つの担体を構成する場合もあり、上流から下流に向かって、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、多孔性のメンブレンの順序で構成されるものであればいずれの態様も含まれる。
イムノクロマト試験片は、上記構成のほかに、吸収パッド、３ｒｄパッドのいずれか一以上をさらに配置装着されたものも含む。
該試験片は、通常、プラスチック製粘着シートのような固相支持体上（以下、バッキングシートということがある）に配列させる。
【００１９】
また、特異的結合性物質が固定化された多孔性のメンブレンの機械的強度を上げ、かつアッセイ中の水分の蒸発（乾燥）を防ぐ目的でポリエステルフィルムなどを試験片にラミネート加工することもある。
【００２０】
本発明のイムノクロマト試験片を用いた検出方法は、以下のように行われる。
検体がサンプル供給部に滴下されると、検体中に検出対象物が含まれていた場合、検出対象物は、標識された特異的結合性物質と特異的に結合して複合体を形成する。該複合体は、展開部を下流方向に向かって展開し、検出部に固定化された特異的結合性物質と結合する。検出部では、標識された特異的結合性物質、検出対象物及び固定化された特異的結合性物質によるサンドイッチ型複合体が形成されるため、これを検出することで、検出対象物を定性または定量分析することが可能である。検出は、目視観察による呈色の判定のほか、標識体に由来する光学的パラメーターを光学的手段により検出する方法が挙げられる。光学的手段を使う場合は、手動のほか、自動化もでき、また連続測定もできる。
【００２１】
（サンプルパッド）
本発明において、「サンプルパッド」とは、サンプルを受け入れるサンプル供給部を担う部位であり、パッドに成型された状態で液体のサンプルを吸収し、液体と検出対象物の成分とが通り抜けることができる物質及び形態であればいずれのものをも含む。
本発明のサンプルパッドには、透水性の改善のために前処理をすることができる。
また、全血を測定する場合には、赤血球凝集剤を含ませておくこともできる。この場合、サンプルパッドの少なくとも一部に含まれていればよく、全体に含ませておくこともできる。
【００２２】
サンプルパッドに適した材料の具体例として、ガラス繊維（グラスファイバー）、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が含まれるが、これらに限定されない。好適には、グラスファイバー製パッドが用いられる。該サンプルパッドには、後述するコンジュゲートパッドの機能を併せ持たせることも出来る。また、サンプルパッドには、本発明の目的を逸脱せず、反応系に影響のない範囲において、必要に応じ通常使用されるブロッキング試薬を含ませることもできる。
【００２３】
（コンジュゲート）
本発明においてコンジュゲートとは、標識体に、検出対象物に結合する特異的結合性物質又はコントロール用物質が固定化されたものをいう。
本発明に用いる標識体は、抗体などの特異的結合性物質を感作（固定化）させてコンジュゲートを構成することができ、サンプルと接触させてサンプル中の対象物（抗原など）を検出する方法において標識体としての役割を担うことができるようなものであればいずれでもよく、金コロイド粒子、白金コロイド粒子、カラーラテックス粒子、磁性粒子などが挙げられ、このうちでも金コロイドや着色ラテックスが望ましく、金コロイドがよりいっそう望ましい。これらの粒子径は、それぞれの種類に応じて、測定対象物の所望の検出感度が得られるように調整すればよく、例えば、金コロイド粒子の粒径は、２０〜１００ｎｍが好ましく、より好ましくは３０〜１００ｎｍであり、特に６０ｎｍが好ましい。
本発明のコンジュゲートは、金コロイド等の表面において特異的結合性物質が結合していない領域をブロッキング剤によりブロッキングすることもできる。
【００２４】
コンジュゲートの存在様式としては、コンジュゲートパッドとして存在する様式、すなわち、サンプルパッド、サードパッド、多孔性メンブレン以外の専用のパッド（コンジュゲートパッド）に含浸された状態で存在してもよいし（タイプＡ）、サンプルパッドの一部にコンジュゲート部として存在してもよい（タイプＢ）。さらには、試験片とは別に、検体と混合されるように個別のコンジュゲート試薬として存在してもよい（タイプＣ）。
【００２５】
以下、コンジュゲートの存在様式が上記タイプＡの試験片の典型例について説明する。
サンプルの流れ方向の上流より下流に向かって、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、サードパッド、多孔性メンブレンの順で配置され、それぞれ上下の層と少なくとも一部が重複するように配置される。このような配置例の試験片を図４に示す。
【００２６】
このような試験片のサンプルパッドに、検出対象物を含有するサンプルが供給されると、検出対象物はサンプルパッドを通過して下流側のコンジュゲートパッドへと流れる。コンジュゲートパッドでは、検出対象物とコンジュゲートが接触して複合体を形成しながら当該パッドを通過する。その後、複合体はコンジュゲートパッドの下面に接触して配置されたサードパッドを通過し、多孔性メンブレンへと展開される。
【００２７】
多孔性メンブレンには、その一部に検出対象物に結合する特異的結合性物質が固定化されているため、該複合体がここで結合して固定化されることになる。固定化された複合体は、標識物質に由来する吸光度、反射光、蛍光、磁気等を検出する手段により検出される。
【００２８】
次に、コンジュゲートの存在様式がタイプＢの試験片について説明する。
上記タイプＡの試験片との違いは、サンプルパッドとコンジュゲートパッドが一体になった点であり、つまり、サンプルパッドの一部にサンプル供給部およびコンジュゲート部が構成されている点である。
上記サンプル供給部は、検出対象物を含有するサンプルを供給する部位であり、上記コンジュゲート部は、コンジュゲートを含有する部位であり、サンプル供給部がコンジュゲート部の上流側となる。
【００２９】
次に、コンジュゲートの存在様式がタイプＣの試験片について説明する。
上記タイプＡの試験片との違いは、コンジュゲートパッドが試験片として存在せず、コンジュゲートは個別のコンジュゲート試薬として存在する点である。例えば、フィルター中にコンジュゲートが内蔵されたフィルターチップが挙げられる。このようなフィルターチップを使って、検体をフィルターろ過させることでフィルター内に保持されたコンジュゲートと検出対象物が結合し、複合体（凝集体）を形成する。これをコンジュゲートパッドを有さないこと以外はタイプＡと同一の前記試験片に供給することで、検出対象物を検出することができる。
【００３０】
（検出試薬）
本発明において、「検出試薬」とは具体的には少なくともコンジュゲートを含有する溶液である。
検出試薬は、コンジュゲートを安定な状態に保ち、サンプルと混合されたときにコンジュゲートに固定化された抗体などの特異的結合性物質が検出対象物と特異的に反応するのを促進する、あるいはコンジュゲートを迅速かつ効果的に溶解、流動化する目的で、例えば１種類以上の安定化剤、溶解補助剤等を含み得る。該安定化剤、溶解補助剤等としては、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スクロース、カゼイン、アミノ酸類などをあげることができる。
【００３１】
また、検出試薬は、検出感度の向上を目的とし必要に応じて公知の増感剤やキレート剤であるＥＤＴＡやＥＧＴＡなども含み得る。
なお、本明細書において、「検出」又は「測定」という用語は、検出対象の存在の証明及び／又は定量などを含めて最も広義に解釈する必要があり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
【００３２】
（サンプル希釈液）
本発明において、検体中の検出対象物の濃度に応じて、検体の希釈が必要な場合は、希釈液を用いることがある。希釈液は、検出対象物と特異的結合性物質との反応を著しく阻害したり、または反対に著しく反応を促進して標識体が過凝集するために毛細管現象における展開不良を起こしたり、検出対象物の濃度に応じた検出対象物と特異的結合性物質との反応のシグナル検出が可能な範囲で、いずれの組成の希釈液を用いても良い。
【００３３】
（コンジュゲートパッド）
本発明において、「コンジュゲートパッド」とは、検出対象物と特異的に反応する検出試薬を後述のコンジュゲートパッドに適した材料に含浸させて乾燥させたものである。コンジュゲートパッドは、サンプルが該コンジュゲートパッドを通過する際、検出試薬と検出対象物とが複合体を形成する機能を有する。該コンジュゲートパッドは、それ単独で特異的結合性物質が固定化された多孔性メンブレンに接するように配置されていてもよい。あるいは、前記サンプルパッドと接触して配置され、毛細管流によってサンプルパッドを通過した検体を受入れ、引き続き該検体を毛細管流によって前記サンプルパッドとの接触面とは異なる面で接触する３ｒｄ Ｐａｄに移送するように配置してもよい。
【００３４】
該コンジュゲートパッドに適した材料として、紙、セルロース混合物、ニトロセルロース、ポリエステル、アクリロニトリルコポリマー、ガラス繊維またはレーヨンのような不織繊維が挙げられるが、これらに限定されない。好適には、グラスファイバー製パッドが用いられる。
【００３５】
該コンジュゲートパッドには、必要に応じて、イムノクロマト検出法の信頼性を担保するための「コントロール試薬」、例えば、標識体で標識された検体成分とは反応しない抗体や標識体で標識されたＫＬＨ（スカシ貝ヘモシアニン）などの高抗原性タンパク質などを含み得る。これらのコントロール試薬は、サンプル中に存在する可能性が考えられない成分（物質）であり、適宜に選択可能である。
【００３６】
（３ｒｄ Ｐａｄ）
本発明において、３ｒｄ Ｐａｄとは、検体と検出試薬との反応成分のうち、検出対象物の検出に不要な成分を除去し、反応に必要な成分が、特異的結合性物質が固定化された多孔性メンブレンをスムーズに展開できるようにすることを目的としてサンプルパッドと多孔性メンブレンの間に配置させることができる。例えば、血球や不溶性の血球破砕物などは、検出に不要な成分として除去されることが望ましい。また、この３ｒｄ  Ｐａｄには、測定対象物と特異的結合性物質との反応により生成する凝集体のうち、特異的結合性物質が固定化されたメンブレンに移動し、スムーズに展開できない位に大きくなった凝集体をあらかじめ除去するという付加的な効果を併せ持たせることも可能である。
【００３７】
３ｒｄ Ｐａｄとしては、液体と検出対象の成分、および検出試薬とが通り抜けることができるどんな物質及び形態をも含む。具体例として、ガラス繊維（グラスファイバー）、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が含まれるが、これらに限定されない。３ｒｄ Ｐａｄは、血球を分離する目的で使用される場合は、血球分離膜と呼ばれることもある。本発明において、全血を検体とする場合は、サンプルパッドのみでは除去しきれなかった血球をより確実に分離除去するため、血球分離膜を用いることが望ましい。
【００３８】
（赤血球凝集剤）
本発明において、全血を検体とする場合は、上記３ｒｄ Ｐａｄの使用以外に、赤血球凝集剤や赤血球結合成分を併用することが望ましい。併用する赤血球凝集剤や赤血球結合成分は特に限定されないが、公知の例示としてレクチン、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の他に、ポリカチオン性の赤血球凝集剤が使用できる。公知のポリカチオン性の赤血球凝集剤としてはポリブレンやポリリジン、ポリアクリルアミン、ポリアラニンなどが例示できるが、なかでもポリブレンが好ましい。ポリブレンは、その化学名を臭化ヘキサジメトリンといい、ＣＡＳ番号２８７２８−５５−４が付与されたカチオン性ポリマーの１種である。
【００３９】
赤血球凝集剤や赤血球結合成分の使用態様としては、検体を希釈する希釈液に添加したり、検体に直接添加する態様のほか、イムノクロマト試験片のサンプル供給部（サンプルパッド）に含ませておくことができる。このような使用態様により、全血中の赤血球が凝集される。
【００４０】
（多孔性メンブレン）
本発明のイムノクロマト試験片に用いられる多孔性メンブレンは、その表面に検出用の特異的結合性物質が固定化されており、裏面には、不透明な基材が配置されていることを特徴とする。
【００４１】
多孔性メンブレンの裏面に配置される本発明の不透明な基材は、メンブレンが多孔性であるため、メンブレンの裏打ちのために配置される部材であり、不透水性のフィルムなどが用いられる。このような本発明の不透明な基材は、いわゆる「裏打ち部材」と呼ばれることもある。当該基材は多孔性メンブレンの裏面に貼り合わせることによって裏打ちするか、あるいは、あらかじめ不透水性のフィルム上面に多孔性メンブレンを積層させることにより形成することができる。  
本発明の不透明基材は、多孔性メンブレンの裏側に配置されていればよく、接着剤層を介して接してもよいし、接着性が担保されれば接着剤層を介さずに接していてもよい。なお、後述するバッキングシートを設ける場合は、本発明の不透明基材（裏打ち部材）の下側に配置する。
本発明は、この多孔性メンブレンの裏面の基材を、従来透明であったところ、不透明な基材にすることによって、メンブレンの該当部位の色がその周辺の色よりも白く、色が抜けているように見えるいわゆる「白抜け現象」（以下、単に白抜けということがある）を回避することができた。
【００４２】
不透明とは、透明ではないこと、向こう側が透けて見えないことを言い、完全な不透明までは要求しないが、より好ましくは完全な不透明である。
不透明な基材としては、多孔性メンブレンと同系色の基材がよく、多孔性メンブレンが白色の場合は、本発明の基材も白色に近いクリーム色やグレーなどが望ましく、そのうちでも白色が最も好ましい。
不透明な基材としては、不透水性で不透明な基材であればいずれでもよく、任意の材質のものが使用できる。例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステル、ナイロン類等が挙げられる。
【００４３】
また、多孔性メンブレンの裏面に本発明の不透明基材を設けることでテストラインにおける測定値のばらつきも抑えることができた。この理由は定かではないが、メンブレン表面と裏面の色合いが一致することで、表面成分(ニトロセルロース)の外観的な不均一性の減少及びメンブレンの下層に配置されるバッキングシートの光学的手段による反射光の影響が回避されることなどにより同時再現性が向上すると推測される。
【００４４】
多孔性メンブレン（以下、単にメンブレンと記載することがある）としては、任意の材質のものが使用できる。例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体などの多糖類あるいはセラミックス等などの多孔性のメンブレンが挙げられるがこれらに限定されない。具体的には、メルクミリポア社、東洋濾紙社、GEヘルスケア社などより販売されているガラス繊維ろ紙やニトロセルロースメンブレンなどをあげることができる。また、この多孔性メンブレンの孔径と構造を適宜選択することにより、標識された特異的結合性物質と検出対象物との免疫複合体がメンブレン中を流れる速度を制御することが可能である。メンブレン中を流れる速度の制御により、メンブレンに固定化された上記特異的結合性物質に結合する標識された特異的結合性物質量を調節することができるため、メンブレンの孔径と構造は、本発明のイムノクロマト試験片のほかの構成材料との組み合わせを考慮して最適化することが望ましい。
【００４５】
（特異的結合性物質の多孔性メンブレンへの固定化）
本発明の検出対象物に対する抗体などの特異的結合性物質の多孔性メンブレンへの固定化は、一般に周知の方法で実施することができる。例えば、フロースルー式の場合、上記の特異的結合性物質を所定の濃度に調整し、その液を一定量、点あるいは＋など特定のシンボル状に、多孔性メンブレンに塗布する。またこの際、イムノクロマト検出法の信頼性を担保するため、コンジュゲートと結合できるタンパク質あるいは化合物を、検出対象物に結合する特異的結合性物質とは異なる位置に固定化して「コントロールライン」とすることが一般的である。また、前記のコントロール試薬に結合する特異的結合性物質を検出対象物に結合する特異的結合性物質とは異なる位置に固定化して「コントロールライン」とすることもできる。
【００４６】
ラテラルフロー式の場合には、上記の特異的結合性物質を所定の濃度に調整しその液をノズルから一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置などを用いて、ライン状に多孔性メンブレンに塗布することにより行われる。この際、特異的結合性物質の濃度は０．１〜５ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．５〜３ｍｇ／ｍＬがさらに好適である。また、特異的結合性物質の多孔性メンブレンへの固定化量は、フロースルー式の場合には多孔性メンブレンに滴下する塗付量を調節することによって最適化でき、ラテラルフロー式の場合には上記の装置のノズルからの吐出速度を調節することによって最適化できる。特に、ラテラルフロー式の場合、０．５〜２μＬ／ｃｍが好適である。
なお、本発明において、「フロースルー式メンブレンアッセイ」という場合は、検体液等が多孔性メンブレンに対して垂直に通過するように展開する方式を指し、「ラテラルフロー式メンブレンアッセイ」という場合は、検体液等が多孔性メンブレンに対して並行方向に移動するように展開する方式を指す。
【００４７】
また、本発明において、対象物に結合特異的結合性物質の多孔性メンブレンへの塗付位置については、ラテラルフロー式の場合、コンジュゲートパッドから、上記検出試薬が毛細管現象によって展開し、それぞれの特異的結合性物質が塗付されたラインを順に通過するように配置されれば良い。好ましくは検出対象物に結合する特異的結合性物質の塗付されたラインが上流にあり、コントロール特異的結合性物質の塗付されたラインはその下流に位置するように配置するのが好ましい。この際、それぞれのライン間の距離は標識体のシグナル検出が可能であるように十分の距離をとることが望ましい。フロースルー式の場合にも、対象物に結合する特異的結合性物質の塗付位置は標識体のシグナル検出が可能であるように配置されていれば良い。
【００４８】
上記の多孔性メンブレンへ塗付する特異的結合性物質液は、通常所定の緩衝液を用いて調製することができる。その緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液を挙げることができる。緩衝液のｐＨは、６．０〜９．５の範囲が好ましく、使用する特異的結合性物質の性質に応じ適宜設定すれば良い。例えば、後述の抗ｃＴｎＩ抗体ではｐＨ８．０の緩衝液が使用できる。緩衝液には、さらにＮａＣｌなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリンなどの防腐剤等を含んでもよい。塩類はＮａＣｌなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する工程で添加するようになるものも含まれる。多孔性メンブレンに特異的結合性物質を固定化した後、さらに、通常使用されるブロッキング剤を溶液あるいは蒸気状にして特異的結合性物質固定化部位以外を被覆し、ブロッキングを行うこともできる。本明細書では、上記のように特異的結合性物質が固定化された多孔性メンブレンを「特異的結合性物質固定化メンブレン」ということがある。
【００４９】
（吸収パッド）
本発明において、吸収パッドとは、多孔性メンブレンを移動・通過した検体を吸収することにより、検体の展開を制御する液体吸収性を有する部位である。ラテラルフロー式においては、試験片の最下流に設ければよく、フロースルー式においては、例えば特異的結合性物質固定化メンブレンの下部に設ければよい。該吸収パッドとしては、例えば、ろ紙を用いることができるが、これに限定されない。
【００５０】
（バッキングシート）
本発明において、バッキングシートとは、試験片を支持するための固相であり、プラスチック製のシートに粘着材が付着したものが通常用いられる。バッキングシートの材質としては、ポリスチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、塩化ビニルなどが挙げられるがこれに限定されない。バッキングシートの色は特に問わないが、メンブレンと同色であることが好ましく、メンブレンが白色である場合は、バッキングシートも白色であることが望ましい。
【００５１】
(トップフィルム）
本発明において、トップフィルムとは、試験片の最上面を被覆するシート状部材のことをいい、特異的結合性物質が固定化された多孔性のメンブレンの機械的強度を上げたり、アッセイ中の水分の蒸発（乾燥）を防ぐ目的で用いられる。トップフィルムの材質としては、前記目的が達成できる材質であればいずれでもよく、ポリエステルなどが挙げられ、粘着材により試験片上に被覆することもできるし、ラミネート加工することもできる。本発明において、トップフィルムを試験片に被覆することで強まる白抜け現象が、メンブレンの裏打ち部材を不透明にすることで当該現象を弱めることができることが判明した。したがって、トップフィルムを設けた試験片では本発明の効果がより顕著なものとなる。
【００５２】
（検出デバイス）
本発明のイムノクロマト用試験片は、試験片の大きさや、検体の添加方法・位置、特異的結合性物質固定化メンブレンにおける特異的結合性物質の固定化位置、シグナルの検出方法などを考慮した適当な容器（ハウジング）に格納・搭載して使用することができ、このように格納・搭載された状態を「デバイス」という。
【００５３】
（その他）
本明細書において、「多孔性メンブレン」を「固相」、抗原や抗体などの特異的結合性物質を多孔性メンブレンに物理的あるいは化学的に担持させることあるいは担持させた状態を「固定」、「固定化」、「固相化」、「感作」、「吸着」と表現することがある。
【００５４】
（検体）
本発明の検出方法において検出対象物を含む「検体」とは、血液、尿、痰、唾液、鼻汁、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、その他の体液、糞便等の生体試料等をいう。生体試料は、そのまま検体として用いてもよく、適宜希釈液によって希釈したり、抽出および／または濾過したものも本発明の検体に含まれる。血液検体は、全血のほか、赤血球、血漿、血清等が挙げられる。
また、血液検体には、採血時にＥＤＴＡやヘパリンなどの抗凝固剤を添加した採血管により採血した検体も含まれる。
【００５５】
（検出対象物）
本発明の検出対象物としては、血液（全血）、赤血球、血清、血漿、尿、唾液又は喀痰などの生物検体中に存在する物質で、例えば、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク）、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの炎症関係マーカー、フィブリン分解産物（例えばＤダイマー）、可溶性フィブリン、ＴＡＴ（トロンビン−アンチトロンビン複合体）、ＰＩＣ（プラスミン−プラスミンインヒビター複合体）などの凝固・線溶マーカー、酸化ＬＤＬ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、Ｈ−ＦＡＢＰ（心臓型脂肪酸結合タンパク）、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）などの循環関連マーカー、アディポネクチンなどの代謝関連マーカー、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）などの腫瘍マーカー、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、クラミジアトラコマティス、淋菌などの感染症関連マーカー、アレルゲン特異ＩｇＥ（免疫グロブリンＥ）、ホルモン、薬物などが例示される。これらの中でも、検体として全血を使用したいとする要望が高い、Ｄダイマー、ＣＲＰ、ＢＮＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、ｃＴnＩなどがより好ましい。
【００５６】
（特異的結性合物質）
本発明において、金コロイドなどの不溶性担体粒子や多孔性メンブレンに担持される測定対象物質に対する特異的結合性物質としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、受容体、ハプテンなどが挙げられ、分子量の高低および天然、合成といった由来に特に制限はないが、例えば、免疫反応を利用する免疫学的測定法に使用され得る抗体または抗原が挙げられる。
【００５７】
（本発明で用いられる抗体）
本発明に用いられる検出対象物に対する抗体は、検出対象物に対して特異的に反応する抗体であれば、作製する方法によって何ら限定されるものではなく、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。より好ましくは、モノクローナル抗体である。一般的に当該抗体を産生するハイブリドーマは、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻４９５頁（１９７５年）参照）に準じ、検出対象物を免疫原として免疫した動物の脾臓細胞と同種のミエローマ細胞（骨髄腫細胞）とを細胞融合して作製することができる。
【００５８】
本発明の抗体としては、抗体分子全体のほかに抗原抗体反応活性を有する抗体の機能性断片を使用することも可能である。一般的な動物（マウス、ヤギ、ヒツジなど）への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組み換え技術等により免疫原（測定対象物質）を免疫する動物とは異なる動物種のアミノ酸配列に変化させた抗体（キメラ特異的結合性物質、ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体等）であってもよい。抗体の機能性断片としては抗原抗体反応活性を有する断片であるＦ（ａｂ'）2、Ｆａｂ'や一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などが挙げられる。これらの抗体の機能性断片は前記のようにして得られた抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理することにより製造できる。 
【００５９】
ここで、いわゆるサンドイッチの形成により検出対象物を検出する測定法において用いられる抗体がモノクローナル抗体の場合、標識体固定化用抗体（第一の抗体）と多孔性メンブレン固定化用抗体（第二の抗体）の関係は、第一の抗体のエピトープが一価の場合は第二の抗体のエピトープは第一の抗体と異なるものが用いられ、第一の抗体のエピトープが多価の場合は第二の抗体のエピトープは第一の抗体と同じであってもよいし、異なるものであってもよい。
【００６０】
（キット）
本発明のイムノクロマト試験片を利用した検出キットは、少なくとも多孔性メンブレンを含み、サンプル供給部、展開部、抗体が固定化された検出部を有するイムノクロマト試験片であって、検出部は多孔性メンブレンの表面に固定化されており、前記多孔性メンブレンの裏面に不透明基材が配置されていることを特徴とする前記試験片を含むものであればよい。
本検出キットは、他に検出に必要な試薬（例えばコンジュゲートを含む検出試薬）、検体の希釈液、試験用チューブ、便採取用の綿棒、取扱い説明書、試験片格納用のハウジングなどを含んでもよい。
以下、本発明の具体的な実施例を記載するが例示にすぎず本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００６１】
〔試験例１〕白抜け現象回避効果の確認試験
本発明の白色基材で裏打ちされた抗体固定化メンブレンを用いた場合の白抜け現象回避効果を従来の透明基材で裏打ちされた場合と比較した。
【００６２】
１．本発明のイムノクロマト検出デバイスの作製
１）金コロイド標識抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体（抗ｃＴｎＩ抗体コンジュゲート）の調製
（ｉ）金コロイド溶液の調製（６０ｎｍ）
９３℃に加温した５０００ｍＬの精製水に対し、７％（ｗ／ｖ）クエン酸三アンモニウム水溶液を１０ｍＬ添加して攪拌混合した。続いて、５％（ｗ／ｖ）テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸水溶液を１０ｍＬ添加し、攪拌しながら１０分間反応させた後、反応液を沸騰させた。この後、氷水中で冷却し、平均粒子径が６０ｎｍの金コロイドの溶液を調製した。この平均粒子径が６０ｎｍの金コロイドの溶液を、精製水にて、金コロイドの極大吸収波長での吸光度で１  ＯＤ／ｍＬに調整した。
【００６３】
（ｉｉ）３ｃＴｎＩ抗体コンジュゲートの調製
上記１  ＯＤ／ｍＬの６０ｎｍ金コロイド溶液（ｐＨ８．０）２００ｍLに対し、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で６９．３μｇ／ｍL希釈した抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体を１０ｍL添加し、室温で１０分間撹拌した。当該金コロイドと抗体との混合液に対し、０．５％（ｗ／ｖ）のＮｅｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓａｖｅｒ（東洋紡社、Ｎｏ．ＮＰＳ−３０１）を含む精製水を１０ｍL添加し、室温で５分間攪拌した。その後、１０℃にて、１１９００×ｇで４５分間遠心した。上清を除去した後、得られた沈渣に、０．２％（ｗ／ｖ）のＮｅｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓａｖｅｒ水溶液を１０ｍＬ添加してコンジュゲートを懸濁し、抗ｃＴｎＩ抗体コンジュゲートを得た。
【００６４】
（ｉｉｉ）金コロイド溶液の調製（４０ｎｍ）
７３℃に加温した５０００ｍＬの精製水に対し、５％（ｗ／ｖ）クエン酸三アンモニウム水溶液を１０ｍＬ添加して攪拌混合した。続いて、５％（ｗ／ｖ）テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸水溶液を１０ｍＬ添加し、攪拌しながら１０分間反応させた後、反応液を沸騰させた。この後、氷水中で冷却し、平均粒子径が４０ｎｍの金コロイドの溶液を調製した。この平均粒子径が４０ｎｍの金コロイドの溶液を、精製水にて、金コロイドの極大吸収波長での吸光度で１  ＯＤ／ｍＬに調整した。
【００６５】
（ｉｖ）コントロールライン用金コロイド標識ＫＬＨ（ＫＬＨコンジュゲート）の調製
上記１  ＯＤ／ｍＬの４０ｎｍ金コロイド溶液（ｐＨ６．１）２００ｍＬに対し、２ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．１）で３７５μg／ｍＬとなるよう溶解したＫＬＨ（シグマ社製）を２．６７ｍＬ添加し、室温で１０分間撹拌した。当該金コロイドとＫＬＨとの混合液に対し、１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を２０ｍＬ添加し、室温で５分間攪拌した。その後、１０℃にて、４５分間遠心し、上清を除去した後、得られた沈渣に、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｃｒｉｐｐｓ社）を１０．７ｍＬ添加してコンジュゲートを懸濁し、ＫＬＨコンジュゲートを得た。
【００６６】
２）コンジュゲートパッドの作製
抗ｃＴｎＩ抗体コンジュゲート３  ＯＤ、ＫＬＨコンジュゲートを０．７５  ＯＤ、０．５％  ＬｉｐｉｄｕｒｅＢＬ−１３０１、０．２５ｍｇ／ｍｌ  Ｈｅｔｅｒｏｂｌｏｃｋ、２．４％  ラクトース、２．０％  ＮＰＳ、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、全量に対し６分の１量のＣｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを混合してコンジュゲート溶液を作製し、一定体積のグラスファイバー製パッド（メルクミリポア社）に該パッド体積の１．２倍容量滲みこませた。ドライオーブン内で７０℃、４５分間加温することにより乾燥させ、コンジュゲートパッドとした。
【００６７】
３）抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体固定化メンブレン（抗体固定化メンブレン）の作製
テストライン用に抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体を２．５％スクロースを含む１０ｍＭ  ＰＢ（０．０９％ＮａＮ３入り）（ｐＨ８．０）で３ｍｇ／ｍＬに希釈調製した。  
また、コントロールライン用に、ウサギ抗ＫＬＨポリクローナル抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製）を２．５％スクロースを含む１０ｍＭ  ＰＢ（０．０９％ＮａＮ３入り）（ｐＨ７．２）で１ｍｇ／ｍＬに希釈調製した。
表１に示す透明あるいは白色の基材で裏打ちされたニトロセルロースメンブレンの短辺の一端の内側の位置に上記抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体をイムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯ  ＤＯＴ社）を用いて１μＬ／ｃｍとなるよう設定し、ライン状に塗布し、テストラインを形成した。テストラインの位置から約４ｍｍの間隔をあけて抗ＫＬＨポリクローナル抗体を同様に塗布し、コントロールラインを形成した。ドライオーブン内で７０℃、４５分乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。
【００６８】
４）サンプルパッドの作製
０．５％ラクトース、２％ポリブレン、を含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）を調整し、サンプルパッド前処理溶液とした。
グラスファイバー製パッド（Ｌｙｄａｌｌ社）を適宜必要な大きさにカットして、サンプルパッド前処理溶液を該パッド体積の１．５倍容量浸み込ませ、ドライオーブン内で７０℃、４５分乾燥したものをサンプルパッドとして用いた。
【００６９】
５）イムノクロマト試験片の作製
バッキングシート（ａ）に上記各基材（ｂ−２）で裏打ちされた抗体固定化多孔性メンブレン（ｂ−１）を貼り、展開上流部側に抗ｃＴｎＩ抗体（ｃ）、次いで抗ＫＬＨ抗体（ｄ）の順になるように塗布部が配置されており、さらにメンブレンの上に血球分離膜（３ｒｄ Ｐａｄ）（ｅ）を装着した。次いで、上記２）で作製したコンジュゲートパッド（ｆ）を配置装着し、さらにこのコンジュゲートパッドに重なるように上記４）で作製したサンプルパッド（ｇ）を配置装着し、反対側の端には吸収パッド（ｈ）を配置装着した。最後に、吸収パッドと抗体固定化メンブレンの表面を、抗体固定化メンブレンの一部が露出するようにトップフィルム（i）で被覆した。このように各構成要素を重ね合わせた構造物に切断してイムノクロマト試験片を作製した。該試験片は、アッセイの際、プラスチック性の専用のハウジング（サンプル添加窓部及び検出窓部を有する、図４中図示せず）に格納・搭載し、イムノクロマトテスト検出デバイスの形態にしてもよい。図４にイムノクロマト試験片の模式構成図を示した。
【００７０】
２．イムノクロマト法による検出又は測定
０〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲内で何れかの濃度の心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）を含む血漿検体液１２０μＬを上記で作成したイムノクロマトテスト検出デバイスのサンプルパッド窓部に添加し、１５分後にテストライン付近を目視観察し、白抜けの有無を評価した。結果を表１に示す。
＜白抜け評価基準＞
目視でサンプルを１２もしくは２０個評価し、１個でも白抜けを認めた場合に白抜け「有り」とし、０個の場合を白抜け「無し」とした。
【００７１】
【表１】
2020051910.tif 000003
【００７２】
３．結果
透明基材で裏打ちされたニトロセルロースメンブレンを抗体固定化メンブレンとして用いた場合は、いずれもテストラインの少し前で白抜けの現象が観察されたが、本発明の白色基材で裏打ちされたニトロセルロースメンブレンを抗体固定化メンブレンとして用いた場合は、白抜けの現象が見られなかった。したがって、イムノクロマト試験の目視評価において視認性が向上することにより、より正しい評価が可能となる。
また、今回は、目視観察により白抜けを判定・評価したが、仮に装置による光学的な測定の場合には、波形の乱れが回避されベースラインを正しく設定することが可能となる。
【００７３】
〔試験例２〕ＣＶ低減効果の確認試験
本発明の白色基材で裏打ちされた抗体固定化メンブレンを用いて光学測定した場合の測定値のばらつきを従来の透明基材で裏打ちされた場合と比較した。
【００７４】
１．イムノクロマトデバイスの製造
透明基材で裏打ちされたメンブレン２種類（ＨＦ１８０、ＣＮ１４０）と本発明の白色基材で裏打ちされた多孔性メンブレン（ＣＮ１５０）を使用した以外は試験例１と同様にしてイムノクロマト試験片を製造した。
【００７５】
２．イムノクロマト法による検出又は測定
４０又は６０ｐｇ／ｍＬの心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）を含む血漿検体液１２０μＬを上記で作成したイムノクロマトテストデバイスのサンプルパッド窓部に添加し、１５分後にイムノクロマトリーダーラピッドピア（積水メディカル社）を用いてテストラインの呈色量（吸光度）を測定し、それらのＣＶ値（バラツキ）をそれぞれ算出した。ＣＶは変動係数（Coefficient of Variation) のことであり、標準偏差を平均値で割ることにより求めることができる。結果を図１に示す。
【００７６】
３．結果
本発明の白色基材で裏打ちされた多孔性メンブレンを抗体固定化メンブレンとして用いた場合は、透明基材で裏打ちされたメンブレンを抗体固定化メンブレンとした場合に比べてＣＶ値が減少し、測定の再現性が向上した。
【００７７】
〔試験例３〕ＣＶ低減効果の確認試験（低濃度側）
被検出物質が低濃度の場合であっても試験例２のバラツキ低減効果が現われるかどうか試験を行った。
【００７８】
１．イムノクロマトデバイスの製造
透明基材で裏打ちされたメンブレン（ＣＮ１４０）と本発明の白色基材で裏打ちされた多孔性メンブレン（ＣＮ１５０）の２ロットを用いたこと以外は試験例１と同様にしてイムノクロマト試験片を製造した。
【００７９】
２．イムノクロマト法による検出又は測定
１５ｐｇ／ｍＬの心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）を含む血漿検体液を用いた以外は試験例２同様に測定し、ＣＶ値（バラツキ）をそれぞれ算出した。結果を図２に示す。
【００８０】
３．結果
本発明の白色基材で裏打ちされた多孔性メンブレンを抗体固定化メンブレンとして用いた場合は、被検出対象の濃度が低濃度であっても、透明基材で裏打ちされたメンブレンを抗体固定化メンブレンとした場合に比べてＣＶ値が減少し、測定の再現性が向上した。また、異なるロット２種類で行っても同様の結果が得られた。
【００８１】
〔試験例４〕ＣＶ低減効果の確認試験（高濃度側）
被検出物質が高濃度の場合であっても試験例２のバラツキ低減効果が現われるかどうか試験を行った。
【００８２】
１．イムノクロマトデバイスの製造
透明基材で裏打ちされたメンブレン（ＣＮ１４０）と本発明の白色基材で裏打ちされた多孔性メンブレン（ＣＮ１５０）を用いたこと以外は試験例１と同様にしてイムノクロマト試験片を製造した。
【００８３】
２．イムノクロマト法による検出又は測定
４００ｐｇ／ｍＬの心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）を含む血漿検体液を用いた以外は試験例２と同様に測定し、ＣＶ値（バラツキ）をそれぞれ算出した。結果を図３に示す。
【００８４】
３．結果
本発明の白色基材で裏打ちされた多孔性メンブレンを抗体固定化メンブレンとして用いた場合は、被検出対象の濃度が高濃度であっても、透明基材で裏打ちされた多孔性メンブレンを抗体固定化メンブレンとした場合に比べてＣＶ値が大幅に減少し、測定の再現性が大幅に向上した。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明の少なくとも多孔性メンブレンを含み、サンプル供給部、展開部、特異的結合性物質が固定化された検出部を有するイムノクロマト試験片であって、検出部は多孔性メンブレンの表面に固定化されており、前記多孔性メンブレンの裏面に不透明基材が配置されている試験片によれば、テストライン付近の白抜けが回避できる。
【００８６】
また、測定値のばらつきの少ないイムノクロマト試験片を提供することができる。
本発明によれば、試験片の白抜け回避により目視判定における視認性が向上することはもちろんのこと、光学測定における測定値のばらつきも低減されるため、いずれの検出方法においてもより正確な測定が実現できる。
【符号の説明】
【００８７】
（ａ）バッキングシート
（ｂ）抗体固定化メンブレン
（ｂ−１）多孔性メンブレン
（ｂ−２）裏打ち基材
（ｃ）抗ｃＴｎＩ抗体（テストライン）
（ｄ）抗ＫＬＨ抗体（コントロールライン）
（ｅ）血球分離膜（３ｒｄ Ｐａｄ）
（ｆ）コンジュゲートパッド
（ｇ）サンプルパッド
（ｈ）吸収パッド
（ｉ）トップフィルム
【図１】
2020051910.tif 000004
【図２】
2020051910.tif 000005
【図３】
2020051910.tif 000006
【図４】
2020051910.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月13日(2018.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも多孔性メンブレンを含み、サンプル供給部、展開部、検出部とを有するイムノクロマト試験片であって、前記検出部は多孔性メンブレンの表面に固定化されており、前記多孔性メンブレンの裏面に当該多孔性メンブレンの裏打ちのための不透明基材が配置され、さらに、前記不透明基材の下にバッキングシートが配置されていることを特徴とする前記試験片。
【請求項２】
前記不透明基材が白色基材である請求項１に記載のイムノクロマト試験片。
【請求項３】
前記サンプル供給部を担うサンプルパッド、及び金コロイド又は着色ラテックスで標識された特異的結合性物質を含むコンジュゲートパッドを含む請求項１又は２に記載のイムノクロマト試験片。
【請求項４】
特異的結合性物質が抗体である請求項１〜３のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
【請求項５】
光学的手段で検出するための試験片である、請求項１〜４のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のイムノクロマト試験片を含むイムノクロマト検出キット。
【請求項７】
イムノクロマト検出方法であって、以下の試験片を用いることを特徴とする前記方法；
少なくとも検出部を有する多孔性メンブレンを含み、前記多孔性メンブレンの裏側に当該多孔性メンブレンの裏打ちのための不透明基材が配置され、さらに、前記不透明基材の下にバッキングシートが配置されているイムノクロマト試験片。
【請求項８】
不透明基材が白色基材である請求項７に記載のイムノクロマト検出方法。
【請求項９】
前記試験片は、前記サンプル供給部を担うサンプルパッド、及び金コロイド又は着色ラテックスで標識された特異的結合性物質を含むコンジュゲートパッドを含む請求項７又は８に記載のイムノクロマト検出方法。
【請求項１０】
特異的結合性物質が抗体である請求項７〜９のいずれかに記載のイムノクロマト検出方法。
【請求項１１】
光学的手段により標識物質に由来する光学的パラメータを検出する工程を含む、請求項７〜１０のいずれかに記載のイムノクロマト検出方法。
【請求項１２】
目視観察により標識物質に由来する呈色を判定する工程を含む、請求項７〜１０のいずれかに記載のイムノクロマト検出方法。
【請求項１３】
イムノクロマト検出方法における測定値のばらつきを低減する方法であって、
以下の試験片を用いることを特徴とする前記方法；
少なくとも多孔性メンブレンを含み、サンプル供給部、展開部、検出部を有するイムノクロマト試験片であって、前記検出部は多孔性メンブレン表面に固定化されており、
前記多孔性メンブレンの裏側に当該多孔性メンブレンの裏打ちのための不透明基材が配置され、さらに、前記不透明基材の下にバッキングシートが配置されている試験片。
【請求項１４】
試験片を用いたイムノクロマト検出方法における、試験片の白抜けを低減する方法であって、以下の試験片を用いることを特徴とする前記方法；
少なくとも多孔性メンブレンを含み、サンプル供給部、展開部、検出部を有するイムノクロマト試験片であって、前記検出部は多孔性メンブレン表面に固定化されており、
前記多孔性メンブレンの裏側に不透明基材が配置されている試験片。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
（ｉｉ）抗ｃＴｎＩ抗体コンジュゲートの調製
上記１  ＯＤ／ｍＬの６０ｎｍ金コロイド溶液（ｐＨ８．０）２００ｍＬに対し、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で６９．３μｇ／ｍL希釈した抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体を１０ｍＬ添加し、室温で１０分間撹拌した。当該金コロイドと抗体との混合液に対し、０．５％（ｗ／ｖ）のＮｅｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓａｖｅｒ（東洋紡社、Ｎｏ．ＮＰＳ−３０１）を含む精製水を１０ｍL添加し、室温で５分間攪拌した。その後、１０℃にて、１１９００×ｇで４５分間遠心した。上清を除去した後、得られた沈渣に、０．２％（ｗ／ｖ）のＮｅｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓａｖｅｒ水溶液を１０ｍＬ添加してコンジュゲートを懸濁し、抗ｃＴｎＩ抗体コンジュゲートを得た。