(57)【要約】      （修正有）【課題】懸濁液中で移動性であるスフェロイドを培養する際の細胞培養培地の交換方法を提供する。【解決手段】細胞培養アセンブリ１００において、開口１１８および天底１１６を有する１つ以上のウェル１１５を含む細胞培養容器、ウェルの内部に収まる構造の挿入体１５０であって、第１の開放端部、および開口を有する第２の端部を含み、第１の開放端部および第２の端部がそれらの間に空洞を画成した挿入体を備え、第２の端部が流体透過性メッシュ１７０を備え、細胞培養容器が細胞培養表面を備え、細胞培養表面が、マイクロウェルのアレイを有する基体から作られており、ウェル中で培養される細胞は、マイクロウェル中でスフェロイドを形成するように構成されており、各マイクロウェルは、上部開口、側壁、およびガス透過性底を備え、底は細胞に非接着性である、細胞培養アセンブリ。【選択図】図３
2020043866.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養アセンブリにおいて、
開口および天底を有する少なくとも１つのウェルを含む細胞培養容器、および
前記細胞培養容器の前記少なくとも１つのウェルの内部に収まる構造の挿入体であって、第１の開放端部、および開口を有する第２の端部を含み、該第１の開放端部および該第２の端部がそれらの間に空洞を画成している、挿入体、
を備え、
前記第２の端部が流体透過性メッシュを備え、
前記細胞培養容器が細胞培養表面を備え、該細胞培養表面が、マイクロウェルのアレイを有する基体から作られており、
前記ウェル中で培養される細胞は、マイクロウェルのアレイにおけるマイクロウェル中でスフェロイドを形成するように構成されており、
各マイクロウェルは、上部開口、側壁、およびガス透過性底を備え、前記底は細胞に非接着性である、細胞培養アセンブリ。
【請求項２】
前記メッシュが、１０マイクロメートルから２００マイクロメートルの範囲の平均細孔径を有する細孔を含む、請求項１記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項３】
前記ウェルが、該ウェル内で培養された細胞が前記マイクロウェルのアレイ内にスフェロイドを形成するように構成されている、請求項１または２記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項４】
前記メッシュの細孔が、個々の細胞が該メッシュを通り抜けられるのを可能にし、前記マイクロウェルのアレイ内に形成されたスフェロイドが該メッシュを通り抜けるのを防ぐサイズのものである、請求項３記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項５】
前記挿入体が、前記第１の開放端部から前記第２の端部まで延在する、側壁、または複数の支持体をさらに備える、請求項１から４いずれか１項記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項６】
前記側壁の少なくとも一部が前記メッシュを構成する、請求項５記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項７】
前記挿入体が前記第１の開放端部から延在する１つ以上のフランジをさらに備える、請求項１から６いずれか１項記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項８】
前記ウェルが上縁をさらに画成し、前記挿入体の第１の開放端部が該ウェルの上縁に接触して、前記メッシュを前記天底からある距離に位置付ける、請求項１から７いずれか１項記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項９】
支持体をさらに備え、前記挿入体が該支持体と接触して、前記メッシュを前記天底からある距離に位置付ける、請求項８記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項１０】
前記メッシュが、４０マイクロメートル以下の平均細孔径を有する、請求項１から９いずれか１項記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項１１】
前記ウェルが、前記開口から前記天底まで円錐形状を構成する、請求項１から９いずれか１項記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項１２】
前記挿入体の内面の少なくとも一部が、該挿入体の内面に対する細胞接着を防ぐように処理または被覆されている、請求項１から１１いずれか１項記載の細胞培養アセンブリ。
【請求項１３】
請求項１から１２いずれか１つに記載の細胞培養アセンブリ内でスフェロイド細胞を培養する方法であって、
ウェル内に挿入体を位置付ける工程、
該挿入体の空洞中に細胞および培地を入れる工程、および
細胞を前記挿入体のメッシュに通過させ、前記ウェルの天底と該挿入体のメッシュとの間の空間にスフェロイドを形成させる工程、
を有してなる方法。
【請求項１４】
請求項１から１２いずれか１つに記載の細胞培養アセンブリから培地を除去する方法であって、
ウェル内に挿入体を位置付ける工程、
該挿入体の空洞中に細胞および培地を入れる工程、
細胞を前記挿入体のメッシュに通過させ、前記ウェルの天底と該挿入体のメッシュとの間の空間にスフェロイドを形成させる工程、および
前記ウェルから前記挿入体の上より前記培地を除去する工程、
を有してなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞培養アセンブリ、それを用いた培養方法、およびその培地を除去する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スフェロイドなどの三次元で培養された細胞は、単層などの二次元で培養されたそれらの対応物よりも、インビボ様機能性を示すことができる。二次元の細胞培養システムにおいて、細胞は、それらが培養される基体に接着し得る。しかしながら、スフェロイドなどの細胞が三次元で増殖する場合、それらの細胞は、基体に接着するよりもむしろ、互いに相互作用する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、細胞がその中で、懸濁液中で移動性であるスフェロイドとして培養される、培養システムに関する細胞培養培地の交換は、難題となり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示の様々な実施の形態によれば、スフェロイドを吸引せずに、またはスフェロイドに損傷を与えずに、スフェロイドを収容するウェル中の培地を交換できるように構成された細胞培養挿入体が記載される。その細胞培養挿入体は、第１の開放端部、第２の開放端部、およびその第１の開放端部と第２の開放端部の間に延在する少なくとも１つの支持体を有するフレームを備えることができる。その挿入体は、そのフレームに連結され、第２の開放端部に亘り配置された流体透過性メッシュも備えている。そのメッシュは、１０マイクロメートルから２００マイクロメートルの範囲、例えば、１０、２０、５０、１００または２００マイクロメートルと、先の値のいずれの間の範囲も含む、平均細孔径を有する細孔を画成する。実施の形態において、その細孔は、個々の細胞が、メッシュを横切ってまたは通って通り抜けるが、スフェロイド細胞クラスターが通り抜けるのを防ぐようなサイズである。
【０００５】
いくつかの実施の形態において、細胞培養ウェル挿入体において、第１の開放端部、開口を画成する第２の端部、およびその第１の開放端部と第２の端部の間に延在する少なくとも１つの支持体を有するフレームであって、その第２の端部の開口が、９ｍｍと０．２５ｍｍの間（例えば、９、・・・５、・・・３、・・・２、・・・０．７５、・・・０．２５ｍｍ）の直径を有するものであるフレーム；およびそのフレームに連結され、第２の端部の開口に亘り配置された流体透過性メッシュであって、１０マイクロメートルから２００マイクロメートル（例えば、１０、・・・３５、・・・７５、・・・２００マイクロメートル）の範囲の平均細孔径を有する細孔を画成するメッシュを備えた細胞培養ウェル挿入体がここに提供される。いくつかの実施の形態において、そのフレームは、ｉ）そのメッシュが細胞培養物品のウェルの天底からある距離をおいてそのウェル内に位置付けられ、かつｉｉ）スフェロイドが、そのウェル内に存在する場合には、ウェル内に捕捉されるように、そのウェル中に少なくとも部分的に挿入されるように構成されている。
【０００６】
いくつかの実施の形態において、第１の開放端部と、開口を持つ第２の端部を有するウェル挿入体であって、その第１の開放端部および第２の端部がそれらの間に空洞を画成し、その第２の端部の開口が９ｍｍと０．２５ｍｍの間の直径を有するウェル挿入体；および第２の端部の開口に亘り配置された流体透過性メッシュであって、１０マイクロメートルから２００マイクロメートルの範囲の平均細孔径を有する細孔を画成するメッシュを備えた装置において、そのウェル挿入体が、ｉ）そのメッシュが細胞培養物品のウェルの天底からある距離をおいてそのウェル内に位置付けられ、かつｉｉ）スフェロイドが、そのウェルに存在する場合には、ウェル内に捕捉されるように、そのウェル中に少なくとも部分的に挿入されるように構成されている、装置がここに提供される。ある実施の形態において、そのウェル挿入体は一体成形装置である。
【０００７】
特定の実施の形態において、前記フレームは、第１の開放端部から第２の端部の延在する複数の支持体を備えている。他の実施の形態において、そのメッシュは、フレームの第１の開放端部から第２の端部まで延在し、そのフレーム内に空洞を画成する。さらに別の実施の形態において、そのフレームの少なくとも１つの支持体は、第１の開放端部から第２の端部まで延在し、フレームの内部を画成する囲い側壁を有する。いくつかの実施の形態において、そのフレームの少なくとも１つの支持体は、第１の開放端部から第２の端部まで延在し、フレームの内部を画成する側壁を有する。さらに別の実施の形態において、そのフレームは、第１の開放端部から放射状に延在する１つ以上のフランジをさらに有する。追加の実施の形態において、そのフレームは、そのメッシュが細胞培養物品のウェルの天底からある距離をおいてそのウェル内に位置付けられるように、そのウェル中に少なくとも部分的に挿入されるように構成されている。
【０００８】
特定の実施の形態において、ここに記載されたような細胞培養挿入体を有するウェル中で細胞を培養する工程を有してなる方法が、ここに提供される。特定の実施の形態において、その細胞はスフェロイド内にある、および／または細胞がスフェロイドを形成する。さらに別の実施の形態において、挿入体の上に培地があり、その方法は、その挿入体の上でウェルから培地を除去する工程をさらに含む。
【０００９】
ある実施の形態において、天底を画成する内面を画成するウェル；およびここに記載されたような挿入体を備えた細胞培養アセンブリにおいて、その挿入体が、流体透過性メッシュが天底からある距離をおいてそのウェル内に位置付けられるようにウェル内に少なくとも部分的に挿入されるように構成されている、細胞培養アセンブリが、ここに提供される。いくつかの実施の形態において、そのウェルは、細胞に対して非接着性である。さらに別の実施の形態において、そのウェルは、そのウェル内で培養された細胞がスフェロイドを形成するように構成されている。追加の実施の形態において、そのメッシュの細孔は、個々の細胞がメッシュを通って通り抜けられ、それから形成されたスフェロイドがメッシュを通って通り抜けるのを防ぐサイズのものである。
【００１０】
ある実施の形態において、細胞培養アセンブリにおいて、ａ）天底を画成する内面を画成するウェルであって、その中で培養される細胞がスフェロイドを形成するように構成されたウェル、およびｂ）ｉ）１０マイクロメートルから２００マイクロメートルの範囲の平均細孔径を有する細孔を画成する流体透過性メッシュであって、前記ウェルの少なくとも一部の中に、前記天底からある距離に位置付けられるように構成されたメッシュと、ｉｉ）そのメッシュに結合され、天底から離れて延在するように構成されたフレームとを含む挿入体を備えた細胞培養アセンブリが、ここに提供される。
【００１１】
ある実施の形態において、前記メッシュの細孔は、スフェロイドがメッシュを通り抜けるのを防ぐように構成されている。他の実施の形態において、フレームは、メッシュを天底からある距離に位置付けられるように構成されている。追加の実施の形態において、ウェルは上縁をさらに備え、フレームが上縁と接触して、メッシュを天底からある距離に位置付ける。他の実施の形態において、アセンブリは支持体をさらに備え、フレームがその支持体と接触して、メッシュを天底からある距離に位置付ける。追加の実施の形態において、メッシュは細孔を画成し、その細孔は４０マイクロメートル以下（例えば、４０、・・・３５、・・・２５、・・・１５、・・・または１０マイクロメートル）の平均細孔径を有する。ある実施の形態において、ウェルは天底と反対に開口をさらに画成し、そのウェルの内面は、開口から天底まで円錐形を画成する。いくつかの実施の形態において、メッシュは円形または正方形を画成する。
【００１２】
さらなる実施の形態において、前記アセンブリは複数のウェルをさらに備え、前記挿入体は複数の流体透過性メッシュをさらに備え、前記流体透過性メッシュおよび前記複数の流体透過性メッシュの各々は、ウェルおよび複数のウェルの異なるものの少なくとも一部中に配置されるように構成されている。他の実施の形態において、ウェルの内面は超低接着材料で被覆されている。さらなる実施の形態において、メッシュはメッシュ縁を画成し、フレームは、メッシュ縁に沿ってそのメッシュを取り囲み、天底から離れて延在する。他の実施の形態において、フレームは、流体透過性メッシュに結合した少なくとも１つの支持ワイヤを備える。いくつかの実施の形態において、ウェルは、内面に沿って少なくとも１つのサブウェルを含む。
【００１３】
特定の実施の形態において、細胞培養装置のウェルであって、天底を有する内面を画成するウェルから培地を除去する方法において、ａ）挿入体の端部をウェル内に配置する工程であって、挿入体の端部が挿入体の空洞と流体連通した開口を画成し、挿入体がその開口に亘り配置された流体透過性メッシュを有し、挿入体の端部が、メッシュが天底からある距離に位置付けられるようにウェル内に配置される工程、ｂ）流体除去装置の先端を、その先端が、メッシュから天底までの距離と少なくとも同じくらい遠い、天底からの距離にあるように挿入体の空洞中に挿入する工程、およびｃ）流体除去装置により流体を吸い込むことによって、ウェルから流体を除去する工程を有してなる方法が、ここに提供される。
【００１４】
ある実施の形態において、細胞培養アセンブリにおいて、天底を画成する内面を画成する第１のウェル；１０マイクロメートルから２００マイクロメートルの範囲の平均細孔径を有する細孔を画成する流体透過性メッシュ；およびメッシュに結合し、第１のウェルの少なくとも一部の上の位置にメッシュを維持するように構成されたフレームを備えた細胞培養アセンブリが、ここに提供される。
【００１５】
いくつかの実施の形態において、前記メッシュは細孔を画成し、その細孔は２０マイクロメートルから２００マイクロメートルの範囲の平均細孔径を有する。さらなる実施の形態において、流体透過性メッシュは９ｍｍと０．２５ｍｍの間（例えば、９、・・・７、・・・４、・・・２、・・・１、・・・０．２５ｍｍ）の直径を有する。他の実施の形態において、メッシュは細孔を画成し、その細孔は４０マイクロメートル以下の平均細孔径を有する。追加の実施の形態において、そのメッシュは、ウェルの少なくとも一部の内部で天底からある距離に位置付けられるように構成されている。他の実施の形態において、フレームは天底から離れて延在するように構成されている。追加の実施の形態において、第１のウェルは上縁を画成し、メッシュはウェルの上縁上に配置されるように構成されている。さらなる実施の形態において、前記アセンブリは第２のウェルを備え、メッシュは、第２のウェル上に位置付けられるように構成されている。特定の実施の形態において、メッシュはメッシュ周囲を画成し、フレームはそのメッシュ周囲に沿ってメッシュを取り囲む。
【００１６】
いくつかの実施の形態において、ウェル（例えば、マイクロウェル）は、正弦波に似た断面形状を有する。そのような実施の形態において、ウェルの底部は丸くなっており（例えば、半球状に丸い）、側壁は、ウェルの底部から上部まで直径が増加し、ウェルの間の境界は丸くなっている。このように、ウェルの上部は、直角に終わっていない。いくつかの実施の形態において、ウェルは、底部と上部の間の中間点での直径Ｄ（Ｄ中間点とも称する）、ウェルの上部での直径Ｄ上部、およびウェルの底部から上部の高さＨを有する。これらの実施の形態において、Ｄ上部はＤより大きい。ウェルの幅が隣接するウェルの間の障壁の幅より大きい、追加の実施の形態が図７に示されている。そのような実施の形態により、培養表面の所定の面積内のウェルを多くすることができる。
【００１７】
本開示の主題の追加の特徴および利点は、以下の詳細な説明に述べられており、一部は、その説明から当業者に容易に明白となるか、または以下の詳細な説明、特許請求の範囲、並びに添付図面を含む、ここに記載された本開示の主題を実施することにより認識されるであろう。
【００１８】
先の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方とも、本開示の主題の実施の形態を提示しており、特許請求の範囲に記載されたような本開示の主題の性質および特徴を理解するための概要または骨子を提供することが意図されているのが理解されよう。添付図面は、本開示の主題のさらなる理解を与えるために含まれ、本明細書に包含され、その一部を構成する。図面は、本開示の主題の様々な実施の形態を示しており、説明と共に、本開示の主題の原理および作動を説明する働きをする。その上、その図面および説明は、単なる例示であることを意味し、請求項の範囲をいかようにも限定することは意図されていない。
【００１９】
本開示の特定の実施の形態の以下の詳細な説明は、同様の構造が同様の参照番号により示されている、以下の図面と共に読まれたときに、もっともよく理解できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】ウェルを有する細胞培養装置の実施の形態の斜視図
【図１Ｂ】図１Ａに示された装置の実施の形態の断面図
【図１Ｃ】構造化表面の実施の形態のウェル内でスフェロイドとして増殖した細胞の概略上面図
【図２Ａ】球体トラップまたはウェル挿入体の実施の形態の斜視図
【図２Ｂ】ある形状のメッシュを示す、図２Ａのウェル挿入体の実施の形態の上面図
【図２Ｃ】異なる形状のメッシュを示す、図２Ａのウェル挿入体の実施の形態の上面図
【図３】複数のウェルおよび複数のウェル挿入体の実施の形態の概略断面図
【図４】複数のサブウェルを含むウェルおよびウェル挿入体の実施の形態の概略断面図
【図５】複数のウェルおよび１つのウェル挿入体を有する細胞培養装置の実施の形態の斜視図
【図６】正弦波または放物線形状を有するウェルのアレイの図
【図７】実施の形態における、スフェロイドを収容するウェルのアレイの側面図
【図８】ここに記載された装置の実施の形態を使用するための例示の方法を示す概略図
【発明を実施するための形態】
【００２１】
ここで、そのいくつかの実施の形態が添付図面に示されている、本開示の主題の様々な実施の形態を詳しく参照する。図面に使用される同様の番号は、同様の構成要素、工程などを指す。しかしながら、所定の図面においてある構成要素を指すためのある番号の使用は、同じ番号がふられた別の図面の構成要素を制限することは意図されていないことを理解すべきである。その上、構成要素を指すための異なる番号の使用は、異なる番号がふられた構成要素が他の番号がふられた構成要素と同じまたは類似であり得ないことを示すことは意図されていない。
【００２２】
本開示は、とりわけ、１つ以上のウェルを画成する基体、およびその１つ以上のウェルの少なくとも１つの中に位置付けられるであろう細胞培養ウェル挿入体を有する細胞培養装置を記載する。
【００２３】
いくつかの実施の形態において、前記ウェルは、そのウェル内で培養される細胞がスフェロイドを形成するように構成されることがある。例えば、そのウェルは、ウェル内の細胞が互いに結合し、スフェロイドクラスターを形成するように、細胞に対して非接着性であり得る。そのスフェロイドは、ウェルの形状により課せられるサイズ限界まで拡大することがある。いくつかの実施の形態において、そのウェルは、ウェルを細胞に対して非接着性にするために超低結合材料で被覆されることがある。細胞はウェルの表面に対して非接着性であるので、スフェロイドを吸引せずにまたは乱さずに、細胞培養培地を交換することは難しくなり得る。
【００２４】
スフェロイドなどの三次元で培養された細胞は、単層などの二次元で培養されたそれらの対応物よりも、インビボ様機能性を示すことができる。二次元の細胞培養システムにおいて、細胞は、それらが培養される基体に接着し得る。しかしながら、スフェロイドなどの細胞が三次元で増殖する場合、それらの細胞は、基体に接着するよりもむしろ、互いに相互作用する。三次元で培養される細胞は、細胞間のやり取りおよび細胞外基質の開発の観点から、インビボ組織により密接に似ている。それゆえ、スフェロイドは、細胞移動、分化、生存、および増殖に関する優れたモデルを提供し、したがって、研究、診断、並びに薬効、薬理学、および毒性試験のためのより良好なシステムを提供する。
【００２５】
いくつかの実施の形態において、前記装置は、その装置内で培養される細胞がスフェロイドを形成するように構成される。例えば、中で細胞が増殖するウェルは、細胞に対して非接着性であり、ウェル内の細胞を互いに結合させ、球体を形成させることができる。そのスフェロイドは、ウェルの形状により課せられるサイズ限界まで拡大する。いくつかの実施の形態において、それらのウェルは、そのウェルを細胞に対して非接着性にするために超低結合材料で被覆される。
【００２６】
非接着性材料の例としては、過フッ素化高分子、オレフィン、または同様の高分子、もしくはそれらの混合物が挙げられる。他の例には、アガロース、ポリアクリルアミドなどの非イオン性ハイドロゲル、ポリエチレンオキシドなどのポリエーテル、およびポリビニルアルコールなどのポリオール、または同様の材料もしくはそれらの混合物がある。例えば、非接着性ウェル、ウェル形状（例えば、サイズと形）、および／または重力の組合せにより、ウェル内で培養される細胞のスフェロイドへの自己集合が誘発される。あるスフェロイドは、単層中で増殖した細胞に対して、よりインビボ様応答を示す、分化細胞機能を維持する。間葉間質細胞などの他の細胞種類は、スフェロイドとして培養された場合、それらの多能性を維持する。
【００２７】
いくつかの実施の形態において、ここに記載されたシステム、装置、および方法は、１種類以上の細胞を含む。いくつかの実施の形態において、その細胞は凍結保存されている。いくつかの実施の形態において、その細胞は三次元培養される。そのようないくつかの実施の形態において、前記システム、装置、および方法は、１種類以上のスフェロイドを含む。いくつかの実施の形態において、その細胞の１種類以上は積極的に分割している。いくつかの実施の形態において、前記システム、装置、および方法は、培地（例えば、栄養素（例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸）、エネルギー（例えば、炭水化物）、必須金属およびミネラル（例えば、カルシウム、マグネシウム、鉄、リン酸塩、硫酸塩）、緩衝剤（例えば、リン酸塩、酢酸塩）、ｐＨ変化の指示薬（例えば、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル）、選択剤（例えば、化学薬品、抗菌剤）など）を含む。いくつかの実施の形態において、１種類以上の試験化合物（例えば、薬剤）が、そのシステム、装置、および方法に含まれる。
【００２８】
多種多様な細胞種類が培養されるであろう。いくつかの実施の形態において、スフェロイドは、ただ１つの細胞種類を含有する。いくつかの実施の形態において、スフェロイドは、複数の細胞種類を含有する。いくつかの実施の形態において、複数の細胞種類を増殖させる場合、各スフェロイドは同じ種類のものであり、一方で、他の実施の形態において、２種類以上の異なる種類のスフェロイドを増殖させる。スフェロイドとして増殖する細胞は、天然細胞または変性細胞（例えば、１つ以上の非天然遺伝子変化を含む細胞）であってよい。いくつかの実施の形態において、細胞は体細胞である。いくつかの実施の形態において、細胞は、任意の所望の分化状態（例えば、多能性、多分化能、運命決定、不死化など）にある幹細胞または前駆細胞（例えば、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞）である。いくつかの実施の形態において、細胞は、疾患細胞または疾患モデル細胞である。例えば、いくつかの実施の形態において、スフェロイドは、１種類以上の癌細胞または高増殖状態に誘起できる細胞（例えば、形質転換細胞）を含む。細胞は、以下に限られないが、副腎、膀胱、血管、骨、骨髄、脳、軟骨、頚部、角膜、子宮内膜、食道、胃腸、免疫系（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、白血球、マクロファージ、および樹枝状細胞）、肝臓、肺、リンパ管、筋肉（例えば、心筋）、神経、卵巣、膵臓（例えば、島細胞）、下垂体、前立腺、腎臓、唾液、皮膚、腱、精巣、および甲状腺を含む、どのような所望の組織または器官種類からのものであっても、もしくはそれに由来してもよい。いくつかの実施の形態において、細胞は哺乳類細胞（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヤギ、ウマなど）である。
【００２９】
培養された細胞には、多種多様の研究、診断、薬剤スクリーニングおよび試験、治療、および工業的利用に用途が見出されている。
【００３０】
いくつかの実施の形態において、前記細胞は、タンパク質またはウイルスの産生のために使用される。多数のスフェロイドを並行して培養するシステム、装置、および方法は、タンパク質産生にとって特に効果的である。三次元培養により、細胞密度を増加させ、細胞増殖表面積の平方センチメートル当たりのタンパク質収量を高めることができる。ワクチン生産のためのどの所望のタンパク質またはウイルスを、細胞中で増殖させ、要求通りの使用のために単離または精製してもよい。いくつかの実施の形態において、そのタンパク質はその細胞に対して天然タンパク質である。いくつかの実施の形態において、そのタンパク質は非天然である。いくつかの実施の形態において、そのタンパク質は組換え的に発現される。そのタンパク質が非天然プロモーターを使用して過剰発現されることが好ましい。そのタンパク質は融合タンパク質として発現されることがある。いくつかの実施の形態において、精製または検出タグが、その精製および／または検出を容易にするために、関心のあるタンパク質に対する融合パートナーとして発現される。いくつかの実施の形態において、精製後に融合パートナーの分離を可能にするために、融合は、開裂可能なリンカーと共に発現される。
【００３１】
いくつかの実施の形態において、前記タンパク質は治療用タンパク質である。そのようなタンパク質としては、以下に限られないが、欠損または異常（例えば、インスリン）である、既存の経路（例えば、阻害剤または作動物質）を増強する、新規の機能または活性を提供する、分子または微生物を妨げる、もしくは他の化合物またはタンパク質（例えば、放射性核種、細胞毒性薬、エフェクター・タンパク質など）を送達するタンパク質を置き換えるタンパク質およびペプチドが挙げられる。いくつかの実施の形態において、そのタンパク質は、任意の種類（例えば、ヒト化、二重特異性、多特異的、など）の抗体（例えば、モノクローナル抗体）などのイムノグロブリンである。治療用タンパク質の部類としては、以下に限られないが、抗体に基づいた薬剤、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、抗原、血液因子、骨形態形成タンパク質、改変タンパク質の骨組み、酵素、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、および血栓溶解剤が挙げられる。治療用タンパク質を使用して、癌、免疫疾患、代謝異常、継承された遺伝性疾患、感染、および他の疾病および症状を予防するまたは治療してもよい。
【００３２】
いくつかの実施の形態において、前記タンパク質は診断用タンパク質である。診断用タンパク質としては、以下に限られないが、抗体、親和結合パートナー（例えば、受容体結合リガンド）、阻害剤、拮抗薬などが挙げられる。いくつかの実施の形態において、その診断用タンパク質は、検出可能な部分（例えば、蛍光部分、発光部分（例えば、ルシフェラーゼ）、発色部分など）と共に発現されるか、または検出可能な部分である。
【００３３】
いくつかの実施の形態において、前記タンパク質は工業用タンパク質である。工業用タンパク質としては、以下に限られないが、食品成分、工業用酵素、農業用タンパク質、分析用酵素などが挙げられる。
【００３４】
いくつかの実施の形態において、前記細胞は、創薬、特徴付け、有効性試験、および毒性試験に使用される。そのような試験としては、以下に限られないが、薬理的効果の評価、発癌性評価、医用造影剤特徴評価、半減期評価、放射線安全性評価、遺伝毒性試験、免疫毒性試験、生殖および発達試験、薬物間相互作用評価、線量評価、吸着評価、処分評価、代謝評価、排出研究などが挙げられる。特異的細胞種類を特定の試験（例えば、肝臓毒性に関する肝細胞、腎臓毒性に関する腎近位尿細管上皮細胞、血管毒性に関する血管内皮細胞、神経毒性に関する神経細胞およびグリア細胞、心臓毒性に関する心筋細胞、横紋筋融解症に関する骨格筋細胞など）に使用してよい。治療された細胞を、以下に限られないが、膜完全性、細胞内代謝物含有量、ミトコンドリア機能、リソソーム機能、アポトーシス、遺伝子変化、遺伝子発現差などを含むいくつの所望のパラメータについて評価してもよい。
【００３５】
いくつかの実施の形態において、前記細胞培養装置は、より大型のシステムの構成部材である。いくつかの実施の形態において、そのシステムは、そのような細胞培養装置を複数（例えば、２、３、４、５、・・・、１０、・・・、２０、・・・、５０、・・・、１００、・・・、１０００など）備えている。いくつかの実施の形態において、そのシステムは、最適培養条件（例えば、温度、気圧、湿度など）で培養装置を維持するためのインキュベータを備えている。いくつかの実施の形態において、そのシステムは、細胞を撮像するまたは他の様式で分析するための検出器を備えている。そのような検出器としては、以下に限られないが、蛍光光度計、照度計、カメラ、顕微鏡、プレート・リーダー（例えば、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ  ＥＮＶＩＳＩＯＮプレート・リーダー；ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ  ＶＩＥＷＬＵＸプレート・リーダー）、細胞分析装置（例えば、ＧＥ ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００および２２００；ＴＨＥＲＭＯ／ＣＥＬＬＯＭＩＣＳ  ＣＥＬＬＮＳＩＧＨＴ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ）、および共焦点撮像システム（例えば、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ  ＯＰＥＲＡＰＨＥＮＩＸハイスループットコンテントスクリーニングシステム；  ＧＥ  ＩＮＣＥＬＬ  ６０００  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）が挙げられる。いくつかの実施の形態において、そのシステムは、培地または他の成分を、培養される細胞に供給する、補給する、循環させるためのかん流システムまたは他の構成要素を備えている。いくつかの実施の形態において、そのシステムは、培養装置の取扱い、使用、および／または分析を自動化するためのロボット構成要素（例えば、ピペット、アーム、プレート・ムーバーなど）を備えている。
【００３６】
いくつかの実施の形態において、ここに記載されたような挿入体を使用できる前記細胞培養装置は、９６ウェル丸底プレートなどのマルチウェル丸底プレートである。
【００３７】
細胞培養容器１００の実施の形態が、図１Ａおよび１Ｂに示されている。図１Ａは、複数のウェル１１５を有する９６ウェルプレートである実施の形態を示している。一般に、「ウェル」は、図１Ａに示されたものなどのマクロウェルを意味する。しかしながら、どのタイプの細胞培養容器を提供してもよい。例えば、皿、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または１５３６ウェルプレートを提供してもよい。「マイクロウェル」は、一般に、ただ１つのスフェロイドを収容するように構築された小さいウェルを意味する。複数のウェル１１５は、様々な異なる配列で提供してもよい。例えば、複数のウェル１１５は、積み重ねられた、六方最密充填などであるパターンを画成することがある。実施の形態において、ウェル１１５は主面１１２に形成される。ウェル１１５は、図１Ａに示されるような規則正しく並べられたウェル構造のアレイを含むことがある。基体１１０内に形成された丸底ウェルを示す、マルチウェル細胞培養容器の実施の形態の垂直断面図が図１Ｂに示されている。この実施の形態において、複数のウェル１１５の各々は、細胞培養装置１００の主面１１２の下に落ち込み、上述したような、スフェロイドを形成するための位置を提供する丸底を有する。
【００３８】
実施の形態において、細胞培養容器１００は、ここに記載されたような、挿入体を収容するのに適した、図１Ａおよび図１Ｂに示されるようなマクロウェルを有することがある。これらのマクロウェルは、例えば、１５３６ウェルプレート内のウェル（一般に、深さが５．０１ｍｍであり、上部直径は１．６９ｍｍである）のような比較的小さいことがあるが、それでも、マイクロウェル（深さが５００μｍであり、幅が約５００μｍであり得る）よりずっと大きい。その上、実施の形態において、マクロウェルは、マイクロウェル１２５（図４の１２５も参照のこと）を含有する細胞培養表面（図４の１２６）を有することがある。これらのマイクロウェルは、各マイクロウェル内にただ１つのスフェロイドを収容するように構築されている。マイクロウェルのサイズおよび形状は、先に述べたように、スフェロイドの形成を誘発することがある。図１Ｃは、六方最密充填マイクロウェルのアレイを含む構造化表面１１３の実施の形態のマイクロウェル１２５（１２５として図４に示されている）内で増殖される細胞２００を示す概略図である。いくつかの実施の形態において、各ウェル１２５内の細胞２００は、図１Ｃに示されるように、ただ１つのスフェロイドを形成する。マイクロウェルは、図１Ｃに示されたものを含むどの形態または形状または配置をとってもよい。
【００３９】
図２Ａ〜Ｃは、実施の形態において、細胞培養容器１００のウェル１１５内に挿入できる、細胞培養挿入体の実施の形態を示している。これらは、マクロウェル挿入体である。
【００４０】
複数のウェル１１５の各々は、図２Ａに示されるように、スフェロイド捕捉用挿入体、またはウェル挿入体、または挿入体１５０を含むことがある。ウェル挿入体１５０は、ウェル１１５の少なくとも一部中に位置付けられるように構成されることがある。ウェル挿入体１５０、またはその一部は、どの適切な材料から作られてもよい。細胞または培地と接触することが意図されている材料が、その細胞および培地に適合していることが好ましい。典型的に、細胞培養構成要素は、高分子材料から形成される。適切な高分子材料の例としては、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリスチレン共重合体、フルオロポリマー、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレンブタジエン共重合体、完全に水素化されたスチレン重合体、ポリカーボネートＰＤＭＳ共重合体、並びにポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン共重合体および環状オレフィン共重合体などのポリオレフィン等が挙げられる。
【００４１】
図２Ａに示されるように、ウェル挿入体１５０は、フレーム１６０を含むことがある。フレーム１６０は、第１の端部１６１、第２の端部１６２、および第１の端部１６１と第２の端部１６２の間に延在する少なくとも１つの支持体１６３を有することがある。図示されるように、第１の端部１６１は開口または開口部１６４を画成することがある。第１の端部１６１の開口１６４は、ウェルの上部開口と整列し、ウェルの内部の少なくとも一部へのアクセスを可能にすることがある。いくつかの実施の形態において、第１の端部１６１は、ウェルの外側にあり、ウェルの上部開口から離れて置かれることがある（図４参照）。フレーム１６０の第１の端部１６１は、様々な形状、例えば、円形、正方形、矩形、菱形、六角形などにより画成されることがある。いくつかの実施の形態において、第１の端部１６１の形状は、ウェルの上部開口の形状に一致することがある。
【００４２】
図２Ａに示されるように、フレーム１６０の第１の端部１６１は、フレーム１６０がウェルの少なくとも一部の中に位置付けられるように構成されることがある。例えば、フレーム１６０は、ウェルの上部開口からウェル中に下方に延在することがある。いくつかの実施の形態において、第１の端部１６１の形状は、フレーム１６０をウェルの上部開口に近接した位置に保持するのに役立つことがある。図２Ａに示されるように、フレーム１６０は、フレーム１６０の第１の端部１６１から延在する１つ以上のフランジ１６８を備えることがある。１つ以上のフランジ１６８は、フレーム１６０をウェルの少なくとも一部の中に位置付けるのに役立つことがある。例えば、１つ以上のフランジ１６８は、フレーム１６０をウェルの少なくとも一部の中に位置付けるようにウェルに近接した部分と接触することがある。いくつかの実施の形態において、１つ以上のフランジ１６８は、フレーム１６０をウェルの少なくとも一部の中に位置付けるように細胞培養装置のある他の部分と接触することがある。
【００４３】
支持体１６３は側壁であることがある。ウェル挿入体１５０のフレーム１６０の支持体１６３は、図２Ａ〜２Ｃに示されるように、ウェル挿入体１５０の第１と第２の端部１６１、１６２の間に延在し、それらに連結されることがある。図２Ｂおよび２Ｃに示されるように、フレーム１６０は４つの支持体１６６を備える。フレーム１６０は、４つ未満の支持体（例えば、１つの支持体、２つの支持体、３つの支持体など）、４つの支持体、または５つ以上の支持体（例えば、５つの支持体、６つの支持体、８つの支持体、１０の支持体など）を備えてもよい。１つ以上の支持体１６３としては、例えば、ワイヤ、バー、ロッドが挙げられる。第１と第２の端部１６１、１６２の間に延在する１つ以上の支持体１６３は、実質的に開いたフレームを画成することがある。言い換えると、第１と第２の端部１６１、１６２の間の空間は、概して開いている。いくつかの実施の形態において、１つ以上の支持体１６３は、第１と第２の端部１６１、１６２から延在し、それらに連結した側壁を含むことがある。いくつかの実施の形態において、その側壁は、第２の端部１６２の縁または周囲を完全に取り囲むことがある。言い換えると、その側壁は、第１と第２の端部１６１、１６２の間の区域を包囲し、したがって、フレーム１６０の閉じた管状構造を画成することがある。その側壁支持体は、様々な異なる特徴、例えば、中実、多孔質、流体透過性によって規定されることがある。
【００４４】
フレーム１６０の第２の端部１６２が開口１６５を画成することがある。第２の端部１６２の開口１６５は、フレーム１６０がウェルの少なくとも一部の中に位置付けられたときに、第１の端部１６１がウェルの底部に対するよりも、ウェルの底部により近いことがある。
【００４５】
ウェル挿入体１５０は、フレーム１６０に連結され、第２の端部１６２の開口１６５に亘り配置された流体透過性メッシュ１７０も備えることがある。メッシュ１７０は細孔１７１を画成することがある。細孔１７１は、およそ、例えば、５マイクロメートル以上、１０マイクロメートル以上、２０マイクロメートル以上、３５マイクロメートル以上、５０マイクロメートル以上など、または２００マイクロメートル以下、９０マイクロメートル以下、７５マイクロメートル以下、６０マイクロメートル以下、４５マイクロメートル以下などの平均細孔径を有することがある。いくつかの実施の形態において、それらの細孔は、約４０マイクロメートルの平均細孔径を有することがある。細孔１７１は、スフェロイドがメッシュ１７０を通り抜けるのを防ぐサイズであると規定されることがある。また、細孔１７１は、個々の細胞がメッシュ１７０を通り抜けられるサイズであると規定されることがある。メッシュは、以下に限られないが、トラックエッチング膜、もしくは織物または不織布多孔質材料を含む、様々な異なる材料から作られてよい。多孔質膜の材料を処理または被覆して、その膜をより接着性、湿潤性、または細胞に対してより非接着性にしてもよい。処理に、プラズマ放電、コロナ放電、気体プラズマ放電、イオン衝撃、イオン化放射、および高強度紫外線を含む、当該技術分野で公知のいくつの方法が伴ってもよい。コーティングは、印刷、吹き付け、凝縮、放射エネルギー、イオン化技術または浸漬を含む、当該技術分野で公知のどの適切な方法により導入しても差し支えない。ある実施の形態において、次いで、コーティングは、共有結合または非共有結合部位のいずれかを与えることがある。そのような部位は、細胞培養構成要素（例えば、増殖または接着を促進するタンパク質）などの部位に付着するのに使用できる。さらに、コーティングは、細胞（例えば、ポリリジン）の結合を向上させるために使用してもよい。あるいは、上述したような細胞非接着性コーティングを使用して、細胞結合を防ぐまたは阻害しても差し支えない。いくつかの実施の形態において、そのメッシュは、ナイロンまたはポリエステルメッシュを含む。
【００４６】
いくつかの実施の形態において、前記メッシュは、第１と第２の端部の間に配置されることもある。メッシュまたは側壁が第１と第２の端部の間に延在する、そのような実施の形態において、フレームは、フレームの内部空間または空洞を画成することがある。言い換えると、フレームの内部空間または空洞は、第２の開口に亘り配置されたメッシュおよび第１と第２の端部の間に延在する側壁（例えば、メッシュ、固体など）により画成されるであろう。
【００４７】
第２の端部１６２の開口１６５、およびそれゆえメッシュ１７０は、様々な形状、例えば、正方形、矩形、円形、六角形などにより画成されることがある。図２Ｂに示されるように、第２の端部１６２の開口１６５は円形により画成されることがある。図２Ｃに示されるように、第２の端部１６２の開口１６５は正方形により画成されることがある。第２の端部１６２の形状は、ウェル挿入体１５０が中に位置付けられたときに、スフェロイドがウェルを出るのを防ぐと記載されることがある。言い換えると、フレーム１６０の第２の端部１６２の形状は、フレーム１６０の第２の端部１６２とウェルの側部の間のどの空隙も、スフェロイドを通り抜けさせるほど十分に大きくはないようにウェルの形状に対応することがある。例えば、第２の端部１６２は、ウェルの側部により画成されるのと同じサイズの形状を画成し、それにより、それら２つの間にどのような空間もなくなることがある。
【００４８】
いくつかの実施の形態において、細胞培養容器１００は、図３に示されるように、１つ以上のウェル１１５および１つ以上のウェル挿入体１５０を備えることがある。図示されるように、各ウェル１１５は対応するウェル挿入体１５０を収容している。ウェル挿入体１５０は、ウェル１１５の少なくとも一部の中に位置付けられるように構成される。言い換えると、ウェル挿入体１５０はウェル１１５の少なくとも一部の中に挿入されることがあり、ウェル挿入体１５０は、ウェル１１５の少なくとも一部から取り出されることがある。いくつかの実施の形態において、１つ以上のウェル挿入体１５０は、１つ以上のウェル挿入体１５０が１つ以上のウェル１１５に同時に出し入れできるように、互いに連結されることがある。１つ以上のウェル１１５はフレーム１６０を使用して連結されることがある。他の実施の形態において、１つ以上のウェル挿入体１５０の各々は、対応するウェル１１５から個々に出し入れできるように構成されることがある。言い換えると、実施の形態において、１つ以上のウェル挿入体１５０のいずれも互いに結合されていない。さらに他の実施の形態において、１つ以上のウェル挿入体は、用途に基づいて、様々な組合せで互いに結合されることがある。例えば、１つ以上のウェル挿入体は、約３８４、９６、４８、２４、１２、６などの群で結合されることがある。
【００４９】
図４に示されるような、追加の実施の形態において、ウェル１１５は、ウェルの底部に細胞培養表面１２６を有することがある。実施の形態において、その細胞培養表面は、少なくとも一部に、マイクロウェル１２５のアレイを有する構造化表面１１３を有する。
【００５０】
ここに記載されたような、細胞培養装置１００の構造化表面１１３は、どのような適切なサイズまたは形状を有してもよい、いくつの適切な数のマイクロウェル１２５を画成してもよい。マイクロウェル１２５はそのサイズと形状に基づく容積を規定する。多くの実施の形態において、ウェル１２５の１つ以上または全ては、縦軸の周りに対称に回転可能である。いくつかの実施の形態において、マイクロウェル１２５の１つ以上または全ての縦軸は、互いに平行である。マイクロウェル１２５は、均一にまたは不均一に間隔が開けられていてもよい。マイクロウェル１２５が均一に間隔が開けられていることが好ましい。マイクロウェル１２５の１つ以上または全てが、同じサイズと形状を有することがあり、異なるサイズと形状を有しても差し支えない。
【００５１】
ある実施の形態において、ウェル１１５は、主面１１２の下に延在する、ウェルの底部を画成する基体１１０により画成されることがある。１つ以上のウェル１１５の各ウェルは、内面１２０、外面１４０、および上部開口１１８を画成する。いくつかの実施の形態において、ウェル１１５は、基体１１０を通じてガス透過性であることがある。基体１１０を通る外面１４０へのウェル１１５のガス透過性は、一部には、基体の材料およびウェル１１５に沿った基体の厚さに依存する。例えば、ウェルのガス透過性は、同一出願人による米国仮特許出願第６２／０７２０８８号明細書に記載されたようなものであってよく、その米国仮特許出願は、本開示と矛盾しない程度までここに完全に引用される。
【００５２】
ウェルの内面は、上部開口１１８と反対の、天底１１６、または最低点を規定する。さらに図３を参照して、ウェル１１５は、天底１１６から上部開口１１８までの高さにより規定される深さｄを有する。ウェル１１５は、上部開口１１８により規定されるウェルに亘り直径、幅などの直径寸法ｗも有する。ウェルはどのような適切な深さｄおよび直径寸法ｗを有してもよい。いくつかの実施の形態において、ウェルの深さｄ、直径寸法ｗおよび形状は、ウェルを形成する材料と共に、細胞が中で増殖できる容積を画成する働きをする。
【００５３】
いくつかの実施の形態において、ここに記載されたウェル１１５は、約２００マイクロメートルから約５００マイクロメートルの範囲の直径寸法ｗを有する。そのような直径寸法は、スフェロイド１３０の内部の細胞が健康な状態に維持されるように、その中で増殖するスフェロイド１３０のサイズを制御することができる。いくつかの実施の形態において、ウェル１１５は、約１００マイクロメートルから約５００マイクロメートルの範囲の深さｄを有する。もちろん、３０００マイクロメートルまでまたはそれより大きい寸法などの他の適切な寸法も使用してもよい。
【００５４】
いくつかの実施の形態において、ウェル１１５の内面は細胞に対して非接着性である。ウェル１１５は、非接着性ウェルを形成するために、非接着性材料から形成されても、または非接着性材料で被覆されてもよい。いくつかの実施の形態において、その非接着性材料は、超低接着材料と記載されることがある。非接着性材料の例としては、過フッ素化高分子、オレフィン、または同様の高分子もしくはそれらの混合物が挙げられる。他の例には、アガロース、ポリアクリルアミドなどの非イオン性ハイドロゲル、またはポリエチレンオキシドなどのポリエーテル、またはポリビニルアルコールなどのポリオール、または同様の材料もしくはそれらの混合物があるであろう。例えば、非接着性ウェル、ウェル形状、および重力の組合せにより、ウェル内で培養される細胞のスフェロイド１３０への自己集合が誘発されることがある。あるスフェロイド１３０は、単層内で増殖した細胞に対して、よりインビボ様応答を示す分化細胞機能を維持することができる。
【００５５】
図４に示されるように、内面１２０は、上部開口１１８から天底１１６まで様々な異なる形状を画成することがある。例えば、いくつかの実施の形態において、１つ以上のウェル１１５は、半球または窪んだ表面、丸底を有する円錐表面、および同様の表面形状またはその組合せなどの弧状表面により画成されることがある。ウェル１１５の天底１１６は、窪み、へこみ、および同様の凹面円錐台状起伏表面、またはそれらの組合せなどの、スフェロイドを助長する丸まったまたは湾曲表面で、最終的に有限である、端部、または底になることがある。ガス透過性スフェロイド助長ウェルの他の形状および構造が、同一出願人による米国特許出願第１４／０８７９０６号明細書に記載されており、この出願は、本開示と矛盾しない程度まで、ここに完全に引用される。
【００５６】
いくつかの実施の形態において、内面１２０は、平らまたは先細であることがある。内面１２０は、どの他の適切な形状または寸法を有してもよい。
【００５７】
いくつかの実施の形態において、メッシュ１７０は、細胞がウェル１１５内に播種されているときに、個々の細胞がメッシュを通り抜けるように構成されることがある。例えば、細孔１７１は、個々の細胞より大きい平均細孔径を有することがある。しかしながら、細胞がスフェロイド１３０の形を成した後、スフェロイド１３０は、メッシュ１７０を通って戻れないほど大きいであろう。スフェロイド１３０がメッシュ１７０と内面１２０の天底１１６の間に一旦位置付けられたら、メッシュ１７０は、誤りの見込みを減少させることによって、ユーザの効率を増加させるのに役立つこともある。例えば、メッシュ１７０が存在すると、ピペットがスフェロイド１３０と接触するのが防がれる。その上、メッシュ１７０は、ウェル１１５に導入されたり、そこから吸い出される培地の流れを拡散させたりするのに役立つであろう。この拡散は、渦がスフェロイド１３０を乱すのを防ぐのに役立つであろう。
【００５８】
いくつかの実施の形態において、ウェルの周りの基体の厚さおよび形状は、内面に入り、外面から出る光の屈折を補正するように構成されている。例えば、その形状および厚さは、同一出願人による米国仮特許出願第６２／０７２０１９号明細書に記載されたようなものであってよく、その米国仮特許出願は、本開示と矛盾しない程度までここに完全に引用される。
【００５９】
いくつかの実施の形態において、前記ウェル挿入体１５０は、流体透過性メッシュ１７０およびフレーム１６０を備えることがある。図３に示されるように、ウェル挿入体１５０は、メッシュ１７０が天底１１６からある距離１１９でウェル１１５内に位置付けられるようにウェル１１５中に少なくとも部分的に挿入されるように構成されている。フレーム１６０は、メッシュ１７０に結合され、ウェル挿入体１５０がウェル１１５内に位置付けられているときに、天底１１６から離れて延在することがある。フレーム１６０は、ウェル挿入体１５０をウェル１１５に出し入れするのに役立てるために使用してもよい。いくつかの実施の形態において、フレーム１６０は、メッシュ１７０を天底１１６から距離１１９に位置付けるように構成されることがある。例えば、フレーム１６０は、ウェルの上縁１２１に接触して、メッシュ１７０を天底１１６から距離１１９に位置付けることがある。別の例において、細胞培養アセンブリ１００は、メッシュ１７０が天底１１６から距離１１９に位置付けられることを確実にするようにフレーム１６０と接触する支持体を備えることがある。別の実施の形態において、メッシュ１７０は、ウェル１１５の内面１２０と接触し、それによって、メッシュ１７０の底１１６からの距離１１９を制御してもよい。
【００６０】
図４に示されるように、ウェル１１５は、ウェル１１５の内面に沿った細胞培養表面１２６上に少なくとも１つのマイクロウェル１２５を含むことがある。いくつかの実施の形態において、複数のマイクロウェル１２５が、ウェル１１５の内面１２０に沿って位置付けられている。マイクロウェル１２５は、上述したウェル１１５と同様の特徴を有することがある。あるいは、細胞培養装置は貯留部を備えることがあり、その貯留部は、ここに記載されたような複数のウェルを備えることがある。図４に示されるように、ウェル１１５は、図３と同様に、ウェル１１５の内面とウェル１１５の上部開口の間に位置付けられたウェル挿入体１５０をその中に収容してもよい。
【００６１】
いくつかの実施の形態において、細胞培養アセンブリ５００は、図５に示されるように、ウェル５１５、５２５のアレイ、流体透過性メッシュ５７０、およびメッシュ５７０に結合したフレーム５６０を有する貯留部５２１を備えることがある。フレーム５６０は、メッシュ５７０を第１のウェル５１５の少なくとも一部の上の位置に維持するように構成されることがある。いくつかの実施の形態において、メッシュ５７０は、第１のウェル５１５の上縁５２０の上に配置されるように構成されている。いくつかの実施の形態において、細胞培養アセンブリ５００は第２のウェル５２５を備えることがあり、メッシュ５７０は、第２のウェル５２５の上に位置付けられるように構成されている。
【００６２】
細胞培養容器のウェル１１５内にスフェロイドを収容する、すなわち、ウェル１１５内の細胞培養培地を交換することなどの過程の最中にスフェロイドがウェル１１５から出るのを防ぐのに役立てるために、ここに記載されたようなウェル挿入体を使用してもよい。いくつかの実施の形態において、ウェル挿入体１５０（例えば、図２Ａ）がウェル１１５の少なくとも一部の中に位置付けられているときに、細胞培養装置１００を傾けて細胞培養培地を除去してもよい。他の実施の形態において、ウェル挿入体１５０がウェル１１５の少なくとも一部の中に位置付けられているときに、ピペットを使用して、細胞培養培地を除去してもよい。ピペットと組み合わせてウェル挿入体１５０を使用すると、ピペットがスフェロイドに影響を与える虞が低下するであろう、例えば、ピペットはスフェロイドを吸引できない。
【００６３】
図６は、マイクロウェルのアレイ６０１が正弦波または放物線形状を有することがあることを示している。この正弦波または放物線形状は、丸まった上部および丸まったウェル底部を有する。図６に示されるように、ウェル６１５は、上部直径Ｄ上部を有する上部開口、ウェルの底部６１６からウェルの上部までの高さＨ、およびウェルの上部とウェルの底部６１６の間の高さの中間点６１３でのウェルの直径Ｄ中間を有する。実施の形態において、細胞培養容器のアレイのウェルは、細胞が挿入体と細胞培養ウェルの底面または天底との間に一旦捕捉されたら、スフェロイドの形成を誘発するために、ウェルのアレイの内部に、図６および図７に示されたものなどの構造を有するマイクロウェルのアレイを有することがある。
【００６４】
図７は、マイクロウェルのアレイの概略図である。図７は、構造化表面１１３のアレイに配列された複数のマイクロウェル６１５を示している。その複数のマイクロウェル６１５内に存在する複数のスフェロイド５００も、図７に示されている。実施の形態において、細胞培養容器の天底または細胞培養表面、例えば、９６ウェルプレートのウェルの床は、スフェロイドの形成を誘発する、マイクロウェルのアレイを有する基体であってよい。これは、構造化底面とも呼ばれる。
【００６５】
細胞培養装置のウェルから培地を除去するための方法８００が、図８に示されている。そのウェルは、天底を含む内面を画成する。挿入体の端部がウェル内に位置され８１０、挿入体の端部が、挿入体の空洞を流体連通する開口を画成している。挿入体は開口に亘り配置された流体透過性メッシュを備え、その挿入体の端部は、そのメッシュが天底からある距離に位置付けられるようにウェル内に配置されている。流体除去装置の先端が、その先端が、メッシュから天底までの距離と少なくとも同じくらい遠い天底からの距離にあるように、挿入体の空洞中に挿入される８２０。流体除去装置により流体を吸い込むことによって、流体がウェルから除去される８３０。図８は、ここに記載されたような装置の実施の形態を使用するための例示の方法８００を示す概略図である。最初に、８１０において、この方法は、メッシュが天底からある距離に位置付けられるように挿入体の端部をウェル中に配置する。第２に、８２０において、この方法は、流体除去装置の先端を、その先端が少なくとも天底からある距離にあるように挿入体の空洞中に挿入する。第３に、８３０において、その方法は、流体除去装置により流体を吸い込むことによって、流体をウェルから除去する。
【００６６】
ここに記載されたような構造化底面は、どのような適切な方法で形成しても差し支えない。例えば、基体を成形して構造化表面を形成しても差し支えなく、基体フイルムにエンボス加工して、構造化表面を形成して差し支えないなどである。
【００６７】
ここに記載されたような構造化底面は、どのような適切な方法で細胞培養装置に組み込んでも差し支えない。例えば、構造化底面および細胞培養装置の１つ以上の他の構成部材を単一部品として成形してもよい。いくつかの実施の形態において、構造化底面またはその一部が、細胞培養装置の１つ以上の他の構成部材に溶接（例えば、熱溶接、超音波溶接など）、接着または熱成形される。
【００６８】
ここに記載された細胞培養ウェル挿入体が、例えば、スフェロイドの上部にウェル挿入体を収容する複数のウェル／チャンバ上を培地が流れる細胞培養装置に使用されることがある。いくつかの実施の形態において、細胞培養挿入体は、細胞培養装置と一体（例えば、それに結合されている、またはその成形部品）である。ある実施の形態において、ウェル挿入体は、ウェル内のスフェロイドがウェルから出て、細胞培養かん流装置を通過する培地の流れに入るのを防ぐ。図５に示されるような特定の実施の形態において、複数のウェルを覆うために、ただ１つの挿入体が使用される。そのような挿入体は、細胞培養装置中に挿入できるか、またはその一体部品であり得る。その細胞培養装置は、酸素供給器の有無にかかわらずに使用してよい。酸素供給器を必要としない例示の細胞培養装置（例えば、ウェルがガス透過性であり、装置内に通気道が設けられている）が、図８および９を参照して、下記に記載されている。
【００６９】
ここに使用した全ての科学用語および技術用語は、特に明記のない限り、当該技術分野で一般に使用される意味を持つ。ここに与えられた定義は、ここに頻繁に使用される特定の用語の理解を促進するためであり、本開示の範囲を限定する意図はない。
【００７０】
ここに用いたように、名詞は、特に明記のない限り、複数の対象を指す。それゆえ、例えば、「構造化底面」は、特に明記のない限り、そのような「構造化底面」を２つ以上有する例を含む。
【００７１】
本明細書および付随する特許請求の範囲に使用されているように、「または」という用語は、特に明記のない限り、「および／または」を含む意味で一般に使用されている。「および／または」という用語は、列挙された要素の内の１つまたは全て、もしくは列挙された要素のいずれか２つ以上の組合せを意味する。
【００７２】
ここに用いたように、「持つ」、「有する」、「含む」、「備える」などは、制約のない包括的な意味で使用され、概して、「含むが、それに限られない」ことを意味する。
【００７３】
「随意的な」または「必要に応じて」は、その後に記載された事象、状況、または構成要素が、生じ得るまたは生じ得ないことを意味し、その記載が、その事象、状況、または構成要素が生じる場合と、生じない場合を含むことを意味する。
【００７４】
「好ましい」および「好ましくは」という単語は、特定の状況下で特定の恩恵を提供するであろう、本開示の実施の形態を指す。しかしながら、同じまたは他の状況下で、他の実施の形態が好ましいこともある。さらに、１つ以上の好ましい実施の形態の列挙は、他の実施の形態が有用ではないことを意味せず、本発明の技術の範囲から他の実施の形態を排除する意図はない。
【００７５】
範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値まで、とここに表現され得る。そのような範囲が表現された場合、例は、その１つの特定の値から、および／または他方の特定の値まで、を含む。同様に、値が、先行詞「約」の使用により、近似として表現される場合、特定の値は別の態様を形成することが理解されよう。範囲の各端点は、他の端点に関してと、他の端点とは関係なくの両方で有意であることがさらに理解されよう。
【００７６】
端点による数値範囲の列挙は、その範囲内に含まれる全ての数字を含む（例えば、１から５は、１，１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５など）。値の範囲が、たとえば、特定の値「より大きい」、「未満」などである場合、その値は、その範囲に含まれる。
【００７７】
「天」、「底」、「左」、「右」、「上部」、「下部」、「上」、「下」並びに他の方向および向きなどのここに称されるどの方向も、図面に関する明瞭さのためにここに記載され、実際の装置またはシステム、若しくはその装置またはシステムの使用を制限するものではない。ここに記載された装置、物品またはシステムの多くは、多数の方向および向きで使用してよい。細胞培養装置に関してここに記載される方向の記述語は、しばしば、その装置が、装置内で細胞を培養する目的のために向けられたときの方向を指す。
【００７８】
特に明記のない限り、ここに述べられたどの方法も、その工程が特定の順序で行われることを必要とすると解釈されることは決して意図されていない。したがって、方法の請求項が、その工程が従うべき順序を実際に列挙していない、または工程が特定の順序に限定されることが請求項または記載に他に具体的に述べられていない場合、どの特定の順序も推測されることは決して意図されていない。いずれか１つの請求項においてどの列挙された１つまたは多数の特徴または態様も、どの他の請求項におけるどの他の列挙された特徴または態様と組み合わせても、並べ替えられても差し支えない。
【００７９】
ここでの列挙は、特定の様式で機能するように「構成」または「適用」されている構成要素を指すことも留意のこと。この点に関して、そのような構成要素は、そのような列挙が、目的とする使用の列挙とは異なり、構造的列挙である場合、特定の性質を具体化する、または特定の様式で機能するように「構成」または「適用」されている。より詳しくは、構成要素が「構成」または「適用」される様式のここでの列挙は、その構成要素の既存の物理的条件を示し、それゆえ、その構成要素の構造的特徴の明白な列挙として解釈すべきである。
【００８０】
特定の実施の形態の様々な特徴、要素または工程が、移行句「含む」を使用して開示されることがあるが、移行句「からなる」または「から実質的になる」を使用して記載されることのあるものを含む代わりの実施の形態が暗示されることを理解すべきである。それゆえ、例えば、フレームおよびメッシュを含む挿入体に対して暗示される代わりの実施の形態は、挿入体がフレームおよびメッシュからなる実施の形態、並びに挿入体がフレームおよびメッシュから実質的になる実施の形態を含む。
【００８１】
本開示の精神および範囲から逸脱せずに、本発明の技術に対して様々な改変および変更が行えることが、当業者に明白であろう。本発明の技術の精神および実体を含む開示の実施の形態の改変、組合せ、下位の組合せ、および変更が、当業者に想起されるであろうから、本発明の技術は、付随の特許請求の範囲およびその同等物の範囲に全てを含むと解釈されるべきである。
【００８２】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【００８３】
実施形態１
細胞培養アセンブリにおいて、
開口および天底を有する少なくとも１つのウェルを含む細胞培養容器、および
前記細胞培養容器の前記少なくとも１つのウェルの内部に収まる構造の挿入体であって、第１の開放端部、および開口を有する第２の端部を含み、該第１の開放端部および該第２の端部がそれらの間に空洞を画成している、挿入体、
を備え、
前記第２の端部が、１０マイクロメートルから２００マイクロメートルの範囲の平均細孔径を有する細孔を含む流体透過性メッシュを備える、細胞培養アセンブリ。
【００８４】
実施形態２
前記細胞培養容器が細胞培養表面を備え、該細胞培養表面が、マイクロウェルのアレイを有する基体から作られている、実施形態１に記載の細胞培養アセンブリ。
【００８５】
実施形態３
前記挿入体が、前記第１の開放端部から前記第２の端部まで延在する、側壁、または複数の支持体をさらに備える、実施形態１または２に記載の細胞培養アセンブリ。
【００８６】
実施形態４
前記側壁の少なくとも一部が前記メッシュを構成する、実施形態３に記載の細胞培養アセンブリ。
【００８７】
実施形態５
前記挿入体が前記第１の開放端部から延在する１つ以上のフランジをさらに備える、実施形態１から４いずれか１つに記載の細胞培養アセンブリ。
【００８８】
実施形態６
前記挿入体が、側壁から延在する１つ以上のフランジをさらに備える、実施形態５に記載の細胞培養アセンブリ。
【００８９】
実施形態７
前記ウェルが上縁をさらに画成し、前記挿入体の第１の開放端部が該ウェルの上縁に接触して、前記メッシュを前記天底からある距離に位置付ける、実施形態１から６いずれか１つに記載の細胞培養アセンブリ。
【００９０】
実施形態８
支持体をさらに備え、前記挿入体が該支持体と接触して、前記メッシュを前記天底からある距離に位置付ける、実施形態７に記載の細胞培養アセンブリ。
【００９１】
実施形態９
前記メッシュが、４０マイクロメートル以下の平均細孔径を有する、実施形態１から８いずれか１つに記載の細胞培養アセンブリ。
【００９２】
実施形態１０
前記ウェルが、前記開口から前記天底まで円錐形状を構成する、実施形態３から９いずれか１つに記載の細胞培養アセンブリ。
【００９３】
実施形態１１
前記挿入体の内面の少なくとも一部が、該挿入体の内面に対する細胞接着を防ぐように処理または被覆されている、実施形態１から１０いずれか１つに記載の細胞培養アセンブリ。
【００９４】
実施形態１２
前記ウェルの内面の少なくとも一部が、該ウェルの内面に対する細胞接着を防ぐように処理または被覆されている、実施形態１から１１いずれか１つに記載の細胞培養アセンブリ。
【００９５】
実施形態１３
実施形態１から１２いずれか１つに記載の細胞培養アセンブリ内でスフェロイド細胞を培養する方法であって、
ウェル内に挿入体を位置付ける工程、
該挿入体の空洞中に細胞および培地を入れる工程、および
細胞を前記挿入体のメッシュに通過させ、前記ウェルの天底と該挿入体のメッシュとの間の空間にスフェロイドを形成させる工程、
を有してなる方法。
【符号の説明】
【００９６】
１００    細胞培養容器、細胞培養装置、細胞培養アセンブリ
１１０    基体
１１２    主面
１１３    構造化表面
１１５、５１５、５２５、６１５    ウェル
１１６、６１６    天底
１１８    上部開口
１２０    内面
１２５    マイクロウェル
１３０    スフェロイド
１４０    外面
１５０    ウェル挿入体
１６０、５６０    フレーム
１６１    第１の端部
１６２    第２の端部
１６３    支持体
１６４    開口
１６８    フランジ
１７０、５７０    流体透過性メッシュ
１７１    細孔
２００    細胞
５００    細胞培養アセンブリ、スフェロイド
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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