(57)【要約】【課題】耐熱性が高められた木材白色腐朽菌由来βグルコシダーゼの変異体の提供。【解決手段】 配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型βグルコシダーゼ１Ａの変異体であって、配列番号１のアミノ酸配列における、９７位のグリシンのプロリンへの置換、１１１位のバリンのロイシンへの置換、２３３位のロイシンのフェニルアラニンへの置換、２４０位のアスパラギン酸のプロリンへの置換、及び３２５位のアラニンのプロリンへの置換が少なくとも導入されたアミノ酸配列を有する、耐熱性βグルコシダーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型βグルコシダーゼ１Ａの変異体であって、配列番号１のアミノ酸配列における、６５位のバリン、１１１位のバリン、１４８位のトレオニン、２３３位のロイシン、４０２位のバリン、１１３位のグルタミン酸、１６２位のバリン、２２０位のグルタミン、２５０位のメチオニン、２８８位のロイシン、３６１位のバリン、４０７位のアラニン、４５９位のヒスチジン、９７位のグリシン、２４０位のアスパラギン酸、３２５位のアラニン、１４０位のリジン、２３８位のアスパラギン酸、２７６位のアスパラギン酸、３２０位のトレオニン、３３７位のグリシン、７２位のグリシン、１１４位のグリシン、２２１位のグリシン、２９１位のグリシン、及び７４位のリジンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、耐熱性βグルコシダーゼ。
【請求項２】
前記配列番号１のアミノ酸配列における、６５位のバリン、１１１位のバリン、１４８位のトレオニン、２３３位のロイシン、４０２位のバリン、１１３位のグルタミン酸、１６２位のバリン、２２０位のグルタミン、２５０位のメチオニン、２８８位のロイシン、３６１位のバリン、４０７位のアラニン、及び４５９位のヒスチジンからなる群より選択される少なくとも１つが別のアミノ酸に置換されており、その置換により、側鎖の炭素原子の数が増えている、請求項１に記載の耐熱性βグルコシダーゼ。
【請求項３】
前記配列番号１のアミノ酸配列における、９７位のグリシン、２４０位のアスパラギン酸、３２５位のアラニン、１４０位のリジン、２３８位のアスパラギン酸、２７６位のアスパラギン酸、及び３２０位のトレオニン、３３７位のグリシンからなる群より選択される少なくとも１つがプロリンに置換されている、請求項１又は２に記載の耐熱性βグルコシダーゼ。
【請求項４】
前記配列番号１のアミノ酸配列における、７２位のグリシン、１１４位のグリシン、２２１位のグリシン、及び２９１位のグリシンからなる群より選択される少なくとも１つが、アスパラギン、アスパラギン酸、又はセリンに置換されている、請求項１〜３の何れか一項に記載の耐熱性βグルコシダーゼ。
【請求項５】
前記配列番号１のアミノ酸配列における、７４位のリジンがアスパラギン酸に置換されている、請求項１〜４の何れか一項に記載の耐熱性βグルコシダーゼ。
【請求項６】
配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型βグルコシダーゼ１Ａの変異体であって、配列番号１のアミノ酸配列における、９７位のグリシンのプロリンへの置換、１１１位のバリンのロイシンへの置換、２３３位のロイシンのフェニルアラニンへの置換、２４０位のアスパラギン酸のプロリンへの置換、及び３２５位のアラニンのプロリンへの置換が少なくとも導入されたアミノ酸配列を有する、耐熱性βグルコシダーゼ。
【請求項７】
さらに、前記配列番号１のアミノ酸配列における、１１３位のグルタミン酸のロイシン、フェニルアラニン、又はチロシンへの置換、１６２位のバリンのイソロイシン、又はロイシンへの置換、２２０位のグルタミンのチロシンへの置換、２５０位のメチオニンのロイシンへの置換、２８８位のロイシンのフェニルアラニンへの置換、４０７位のアラニンのバリンへの置換、４５９位のヒスチジンのフェニルアラニン、又はチロシンへの置換、１４０位のリジンのプロリンへの置換、２３８位のアスパラギン酸のプロリンへの置換、
２７６位のアスパラギン酸のプロリンへの置換、３２０位のトレオニンのプロリンへの置換、３３７位のグリシンのプロリンへの置換、７２位のグリシンのアスパラギンへの置換、１１４位のグリシンのアスパラギンへの置換、２２１位のグリシンのアスパラギンへの置換、２９１位のグリシンのアスパラギンへの置換、及び７４位のリジンのアスパラギン酸への置換、からなる群より選択される少なくとも１つの置換が導入されている、請求項６に記載の耐熱性βグルコシダーゼ。
【請求項８】
さらに、１若しくは数個のアミノ酸が欠失又は付加された、請求項１〜７の何れか一項に記載の耐熱性βグルコシダーゼ。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか一項に記載の耐熱性βグルコシダーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の形質転換体を培養することを含む、耐熱性βグルコシダーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性βグルコシダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
βグルコシダーゼは、二糖のセロビオースを単糖のグルコースに加水分解することが可能であり、植物系バイオマスを燃料や化成品の原料に変換する際に有用な酵素である。植物や微生物等に由来する種々のβグルコシダーゼが知られており、特許文献１には、高温環境下に生息する微生物からクローニングされた、１００℃の高温においても酵素活性を示すβグルコシダーゼが開示されている。
【０００３】
一般に、至適温度の高い酵素を用いれば、高温で迅速に反応を進めること、酵素活性を長く保つこと等が期待できる。このため高温環境下に生息する微生物から有用な酵素を探索することが盛んに行われているが、至適温度が高くても、至適ｐＨ、基質特異性、溶媒耐性等が求める条件に合致しない場合が少なからずある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第６３３０２４０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】N. Koga, R. Tatsumi-Koga, G. Liu, R. Xiao, T. B. Acton, G. T. Montelione and D. Baker, “Principles for Designing Ideal Protein Structures,” Nature 491, 222-227 (2012).
【非特許文献２】Y.-R. Lin, N. Koga*, R. Tatsumi-Koga, G. Liu, A. F. Clouser, G. T. Montelione and D. Baker*, “Control over Overall Shape and Size in De Novo Designed Proteins,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E5478-E5485 (2015).
【非特許文献３】Nijikken Y, Tsukada T, Igarashi K, Samejima M, Wakagi T, Shoun H, Fushinobu S. , “Crystal structure of intracellular family 1 beta-glucosidase BGL1A from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium.” FEBS Lett. 2007 Apr 3; 581(7):1514-20.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一方、既知の酵素について、優れた特性（例えば耐熱性）を分子設計の手法により付与することができれば、微生物由来の酵素の探索を繰り返すことなく、所望の酵素を製造することができる。
本発明者らは、タンパク質の分子設計を長年に渡り研究してきた知見を活かして（非特許文献１，２）、酵母を用いたタンパク質発現系において分泌型のタンパク質として生産され得る木材白色腐朽菌由来βグルコシダーゼ（非特許文献３）の耐熱性を高めることに成功した。
【０００７】
本発明は、耐熱性が高められた木材白色腐朽菌由来βグルコシダーゼの変異体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
［I］  配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型βグルコシダーゼ１Ａの変異体であって、配列番号１のアミノ酸配列における、６５位のバリン、１１１位のバリン、１４８位のトレオニン、２３３位のロイシン、４０２位のバリン、１１３位のグルタミン酸、１６２位のバリン、２２０位のグルタミン、２５０位のメチオニン、２８８位のロイシン、３６１位のバリン、４０７位のアラニン、４５９位のヒスチジン、９７位のグリシン、２４０位のアスパラギン酸、３２５位のアラニン、１４０位のリジン、２３８位のアスパラギン酸、２７６位のアスパラギン酸、３２０位のトレオニン、３３７位のグリシン、７２位のグリシン、１１４位のグリシン、２２１位のグリシン、２９１位のグリシン、及び７４位のリジンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、耐熱性βグルコシダーゼ。
［II］ 配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型βグルコシダーゼ１Ａの変異体であって、配列番号１のアミノ酸配列における、９７位のグリシンのプロリンへの置換、１１１位のバリンのロイシンへの置換、２３３位のロイシンのフェニルアラニンへの置換、２４０位のアスパラギン酸のプロリンへの置換、及び３２５位のアラニンのプロリンへの置換が少なくとも導入されたアミノ酸配列を有する、耐熱性βグルコシダーゼ。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の耐熱性βグルコシダーゼは、野生型に比べて耐熱性が高められており、例えば、植物系バイオマスの活用に有用である。
また、本発明を完成するために用いた分子設計の手法は、βグルコシダーゼに制限されず、種々のタンパク質の耐熱化に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例で作成した５重変異体と野生型βグルコシダーゼの円二色性スペクトルを比較する図である。
【図２】実施例で作成した５重変異体と野生型βグルコシダーゼの加熱後の残存酵素活性を比較する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
≪耐熱性βグルコシダーゼ≫
配列番号１は、木材白色腐朽菌（Phanerochaete chrysosporium）に由来するβグルコシダーゼ１Ａのアミノ酸配列である。以下、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質を野生型βグルコシダーゼといい、耐熱性を付与するための変異を導入した本発明のβグルコシダーゼを耐熱性βグルコシダーゼという。
【００１２】
耐熱性βグルコシダーゼの第一実施形態は、配列番号１のアミノ酸配列における、６５位のバリン、１１１位のバリン、１４８位のトレオニン、２３３位のロイシン、４０２位のバリン、１１３位のグルタミン酸、１６２位のバリン、２２０位のグルタミン、２５０位のメチオニン、２８８位のロイシン、３６１位のバリン、４０７位のアラニン、４５９位のヒスチジン、９７位のグリシン、２４０位のアスパラギン酸、３２５位のアラニン、１４０位のリジン、２３８位のアスパラギン酸、２７６位のアスパラギン酸、３２０位のトレオニン、３３７位のグリシン、７２位のグリシン、１１４位のグリシン、２２１位のグリシン、２９１位のグリシン、及び７４位のリジンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する。
【００１３】
個々のアミノ酸置換（変異）は、それぞれ独立に、野生型βグルコシダーゼの耐熱性の向上に資する。よって、上記アミノ酸置換のうち１つ以上の変異を野生型βグルコシダーゼに導入することにより、耐熱性βグルコシダーゼが得られる。
【００１４】
上記の変異のうち、配列番号１のアミノ酸配列における、６５位のバリン、１１１位のバリン、１４８位のトレオニン、２３３位のロイシン、４０２位のバリン、１１３位のグルタミン酸、１６２位のバリン、２２０位のグルタミン、２５０位のメチオニン、２８８位のロイシン、３６１位のバリン、４０７位のアラニン、及び４５９位のヒスチジンからなる群より選択される少なくとも１つが別のアミノ酸に置換されている場合、側鎖の炭素原子の数が増えていることが好ましい。これらの変異があると、変異箇所における疎水性を強化することができると考えられ、耐熱性を向上させることが容易になる。
【００１５】
上記の変異のうち、配列番号１のアミノ酸配列における、９７位のグリシン、２４０位のアスパラギン酸、３２５位のアラニン、１４０位のリジン、２３８位のアスパラギン酸、２７６位のアスパラギン酸、及び３２０位のトレオニン、３３７位のグリシンからなる群より選択される少なくとも１つがプロリンに置換されていることが好ましい。これらの変異があると、変異箇所における変性状態の構造空間を制限することができると考えられ、耐熱性を向上させることが容易になる。
【００１６】
上記の変異のうち、前記配列番号１のアミノ酸配列における、７２位のグリシン、１１４位のグリシン、２２１位のグリシン、及び２９１位のグリシンからなる群より選択される少なくとも１つが、アスパラギン、アスパラギン酸、又はセリンに置換されていることが好ましい。これらの変異があると、変異箇所における変性状態の構造空間を制限することができると考えられ、耐熱性を向上させることが容易になる。
【００１７】
上記の変異のうち、前記配列番号１のアミノ酸配列における、７４位のリジンがアスパラギン酸に置換されていることが好ましい。この変異があると、７４位における主鎖と側鎖間の水素結合を安定化することができると考えられ、耐熱性を向上させることが容易になる。
【００１８】
本発明の第二実施形態の耐熱性βグルコシダーゼは、配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型βグルコシダーゼ１Ａの変異体であって、配列番号１のアミノ酸配列における、９７位のグリシンのプロリンへの置換、１１１位のバリンのロイシンへの置換、２３３位のロイシンのフェニルアラニンへの置換、２４０位のアスパラギン酸のプロリンへの置換、及び３２５位のアラニンのプロリンへの置換が少なくとも導入されたアミノ酸配列を有する、多重変異体である。上記の５箇所の変異を有する多重変異体は、後述するように、野生型と比べてその耐熱性が４℃程度向上し得る。
【００１９】
上記の多重変異体は、さらに、前記配列番号１のアミノ酸配列における、１１３位のグルタミン酸のロイシン、フェニルアラニン、又はチロシンへの置換、１６２位のバリンのイソロイシン、又はロイシンへの置換、２２０位のグルタミンのチロシンへの置換、２５０位のメチオニンのロイシンへの置換、２８８位のロイシンのフェニルアラニンへの置換、４０７位のアラニンのバリンへの置換、及び４５９位のヒスチジンのフェニルアラニン、又はチロシンへの置換、からなる群より選択される少なくとも１つの置換が導入されていてもよい。
これらの変異があると、変異箇所における疎水性を強化することができると考えられ、多重変異体の耐熱性をさらに向上させることができる。
【００２０】
上記の多重変異体は、さらに、前記配列番号１のアミノ酸配列における、１４０位のリジンのプロリンへの置換、２３８位のアスパラギン酸のプロリンへの置換、２７６位のアスパラギン酸のプロリンへの置換、及び３２０位のトレオニンのプロリンへの置換、３３７位のグリシンのプロリンへの置換、からなる群より選択される少なくとも１つの置換が導入されていてもよい。
これらの変異があると、変異箇所における変性状態の構造空間を制限することができると考えられ、多重変異体の耐熱性をさらに向上させることができる。
【００２１】
上記の多重変異体は、さらに、前記配列番号１のアミノ酸配列における、７２位のグリシンのアスパラギンへの置換、１１４位のグリシンのアスパラギンへの置換、２２１位のグリシンのアスパラギンへの置換、及び２９１位のグリシンのアスパラギンへの置換からなる群より選択される少なくとも１つの置換が導入されていてもよい。
これらの変異があると、変異箇所における変性状態の構造空間を制限することができると考えられ、多重変異体の耐熱性をさらに向上させることができる。
【００２２】
上記の多重変異体は、さらに、前記配列番号１のアミノ酸配列における、７４位のリジンのアスパラギン酸への置換が導入されていてもよい。
この変異があると、７４位における主鎖と側鎖間の水素結合を安定化することができると考えられ、多重変異体の耐熱性をさらに向上させることができる。
【００２３】
野生型βグルコシダーゼに導入する変異は、次に説明する分子設計の手法に基づいて選定した。まず、前記配列番号１の野生型βグルコシダーゼの各アミノ酸残基について、その位置の埋もれ度と、主鎖２面角のパターンとで表される「環境」を計算した。次いで、似た「環境」を有するアミノ酸残基を天然のタンパク質構造データベース内から探索し、抽出された複数の天然構造のうち、出現頻度の高いアミノ酸を変異の候補とした。変異の候補が、実際に耐熱性の向上に寄与する程度を、円二色性（ＣＤ）による熱安定性解析及び温度上昇後の残存活性試験のうち、少なくともＣＤを用いて評価した。
【００２４】
野生型βグルコシダーゼについて、円二色性（ＣＤ）による熱安定性解析を後述する方法で行って算出した変性中点温度Ｔｍは、６０．１９℃であった。
耐熱性βグルコシダーゼについて、同様にＣＤによる熱安定性解析を行うことにより算出される変性中点温度Ｔｍは、野生型よりも高く、６１．００℃以上が好ましく、６２．００℃以上がより好ましく、６３．００℃以上がさらに好ましく、６４．００℃以上が特に好ましい。この上限値は特に制限されず、例えば１００℃程度が目安となる。
【００２５】
野生型βグルコシダーゼについて、温度を上昇させたときの残存活性試験を後述する方法で行って算出した変性中点温度Ｔｍは、５２．６℃であった。
耐熱性βグルコシダーゼについて、同様に残存活性試験を行うことにより算出される変性中点温度Ｔｍは、野生型よりも高く、５４．０℃以上が好ましく、５５．０℃以上がより好ましく、５６．０℃以上がさらに好ましく、５６．５℃以上が特に好ましい。この上限値は特に制限されず、例えば１００℃程度が目安となる。
【００２６】
また、耐熱性βグルコシダーゼは、野生型βグルコシダーゼの３７℃におけるβグルコシダーゼ活性の活性値を１００として、温度を上昇させたときの残存活性試験を後述する方法で行い、５０℃の高温環境に置かれた後で３７℃に戻されたとき、１００以上の活性値を維持していることが好ましい。同様に、５３℃の高温環境に置かれた後で３７℃に戻されたとき、９０以上の活性値を示すことが好ましい。
【００２７】
また、耐熱性βグルコシダーゼの３７℃におけるβグルコシダーゼ活性は、野生型βグルコシダーゼの３７℃におけるβグルコシダーゼ活性の活性値を１００として、７０以上であることが好ましく、８０以上であることがより好ましく、９０以上であることがさらに好ましく、１００以上であることが特に好ましく、１１０以上であることが最も好ましい。この上限値は特に制限されず、例えば１５０程度が目安となる。
【００２８】
耐熱性βグルコシダーゼの、配列番号１のアミノ酸配列に対する配列同一性は、酵素活性を充分に維持する観点から、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
ここで、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００２９】
耐熱性βグルコシダーゼには、その耐熱性及び酵素活性に影響を与えることが少ない、１若しくは数個（例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個）の任意のアミノ酸が、欠失（除去）又は付加（挿入）されていてもよい。このような欠失又は付加としては、例えば、Ｎ末端又はＣ末端に対する各種の機能性タグ又は各種のシグナルペプチドの付加、３次構造のループ領域における１若しくは数個の欠失又は付加等が挙げられる。また、セルロース結合ドメイン等の別のドメインや、別のドメインを連結するリンカー領域が耐熱性βグルコシダーゼのＮ末端側又はＣ末端側に付加されていても構わない。
【００３０】
野生型βグルコシダーゼは、３７℃、ｐＨ５．０〜５．５付近の条件下で、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＰＮＰＧ）を基質とした加水分解活性を示す。加水分解によって生じたｐ−ニトロフェノールの量は吸光度の変化量として測定される。
耐熱性βグルコシダーゼは、野生型と同様に３７℃、ｐＨ５．０〜５．５付近の条件下で、ＰＮＰＧを基質とした加水分解活性（βグルコシダーゼ活性）を有する。
耐熱性βグルコシダーゼの至適温度は、ｐＨ５．０〜５．５付近の条件下で、２０〜７０℃の範囲内にあることが好ましく、３０〜６５℃の範囲内にあることがより好ましく、４０〜６０℃の範囲内にあることがさらに好ましい。
耐熱性βグルコシダーゼの至適ｐＨは、ｐＨ５．０〜６．５の範囲内にあることが好ましく、少なくともｐＨ５．０〜６．０の範囲内においてβグルコシダーゼ活性を示すことが好ましい。
【００３１】
耐熱性βグルコシダーゼは、βグルコシダーゼ活性以外のセルロース加水分解活性を有していてもよい。その他のセルロース加水分解活性としては、βガラクトシダーゼ活性、キシラナーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、キシロシダーゼ活性、又はセロビオハイドロラーゼ活性等が挙げられる。
【００３２】
≪耐熱性βグルコシダーゼの製造等≫
耐熱性βグルコシダーゼの製造方法としては、例えば、そのアミノ酸配列に基づいて化学的に合成する方法、後述のＤＮＡや発現ベクターを用いて、タンパク質発現系によって生産する方法が挙げられる。
タンパク質発現系を用いる方法としては、例えば、野生型βグルコシダーゼルシフェラーゼのＤＮＡ配列をベクターに組み込んだプラスミド（テンプレートＤＮＡ）を鋳型として、目的の変異を導入したプライマーを用いてＰＣＲを行い、制限酵素等を用いた常法により、目的の変異が導入された耐熱性βグルコシダーゼをコードするＤＮＡを得て、このＤＮＡを含むプラスミドを宿主に形質転換し、培地で培養することにより、耐熱性βグルコシダーゼを得ることができる。
変異の導入は、例えば、Quikchange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene社製）、KOD-plus mutagenesis kit（東洋紡社製）等を用いて常法により行うことができる。
【００３３】
本発明のＤＮＡは、本発明の耐熱性βグルコシダーゼをコードする。本発明のＤＮＡは、耐熱性βグルコシダーゼをコードする領域のみを有するものであってもよく、当該領域に加えて、セルロース結合ドメイン、リンカー配列、各種シグナルペプチド、各種タグ等をコードする領域を有していてもよい。
【００３４】
本発明の組換えベクターは、本発明の耐熱性βグルコシダーゼをコードするＤＮＡを含む。本発明の組換えベクターとしては、例えば組換えタンパク質を発現するための発現ベクターが挙げられる。
前記発現ベクターは、宿主細胞において、本発明の耐熱性βグルコシダーゼを発現し得る状態で組込まれた組換えベクターである。具体的には、例えば、上流から、プロモーター配列、耐熱性βグルコシダーゼをコードする領域、及びターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットが組込まれている。
前記発現ベクターは、大腸菌等の原核細胞へ導入されるものであってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞へ導入されるものであってもよい。
前記発現ベクターは、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が組込まれた発現ベクターであることが好ましい。
【００３５】
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを含み、発現ベクターとして導入されているものが好ましい。この形質転換体中では、耐熱性βグルコシダーゼを発現させ得る。発現ベクターを導入する宿主としては、大腸菌等の原核細胞であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞であってもよい。大腸菌の形質転換体を培養することにより、本発明に係る耐熱性βグルコシダーゼを、より簡便かつ大量に生産することができる。一方で、真核細胞内ではタンパク質に糖鎖修飾が施されるため、真核細胞の形質転換体を用いることにより、原核細胞の形質転換体を用いた場合よりも、より耐熱性に優れた耐熱性βグルコシダーゼを生産し得る。また、酵母を用いることにより、耐熱性βグルコシダーゼを培養液中に分泌させ得る。一般に、菌体内に生産される酵素を精製するよりも、菌体外に分泌される酵素を精製する方が容易である。発現ベクターを用いて形質転換体を作製する方法、及び形質転換体を培養する方法は、常法により行うことができる。
【００３６】
本発明の耐熱性βグルコシダーゼの製造方法は、前記形質転換体を培養すること（工程）を含む。前記形質転換体内において、耐熱性βグルコシダーゼを恒常的に発現していてもよく、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導してもよい。
前記形質転換体によって生産された耐熱性βグルコシダーゼは、当該形質転換体内に留めた状態で使用してもよく、当該形質転換体から抽出・精製してもよい。
【００３７】
前記形質転換体から耐熱性βグルコシダーゼを抽出又は精製する方法は、特に制限されず、常法により行うことができる。例えば、形質転換体を適当な抽出バッファーに浸し、耐熱性βグルコシダーゼを抽出した後、濾過法、遠心分離法等により抽出液と固形残渣に分離する方法が挙げられる。抽出液中の耐熱性βグルコシダーゼは、塩析法、限外濾過法、又はクロマトグラフィー法等の公知の精製方法を用いて精製することができる。
耐熱性βグルコシダーゼを、形質転換体内で分泌型シグナルペプチドを有する状態で発現させた場合には、当該形質転換体の培養液の上清を回収して容易に耐熱性βグルコシダーゼを含む溶液を得ることができる。
【実施例】
【００３８】
＜耐熱性βグルコシダーゼ遺伝子を含む組換えベクター及び組換え大腸菌の作製＞
木材白色腐朽菌（Phanerochaete chrysosporium）に由来するβグルコシダーゼ１Ａの変異体を大腸菌において発現させた。
まず、配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをベースとして、Quik Change法により、V65Iの変異（６５位のバリンをイソロイシンに置換）を導入した組換えＤＮＡを得た。この組換えＤＮＡを発現ベクター（pET28a）に組み込み、この発現ベクターを大腸菌BL21Star(DE3)株又は大腸菌Rosetta(DE3)株に導入した形質転換体を常法により得た。
次いで、形質転換した大腸菌を１ｍＬで前培養した後、カナマイシンを加えた２５０ｍＬのAuto Induction Media又はOvernight ExpressTM Autoinduction Instant TB mediaを用い、３７℃で６時間、さらに１８℃で１６時間の条件で本培養を行った。
本培養で得られた菌体から常法によりタンパク質成分を含む抽出液を得て、Ｎｉアフィニティカラムを用いた精製法により、目的のアミノ酸置換（V65I）がなされた耐熱性βグルコシダーゼを得た。発現及び精製した耐熱性βグルコシダーゼ(V65I)は、４６２位のグルタミン酸(E462)のＣ末端に、さらにLVPRGSHHHHHHのヒスチジンタグが付加されたものである。
【００３９】
＜円二色性（ＣＤ）による熱安定性解析＞
緩衝液（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に、耐熱性βグルコシダーゼ(V65I)が０．２ｍｇ／ｍＬ濃度で含まれる試料溶液４００μＬを準備した。
下記の装置及び条件により、円二色性スペクトルを測定し、装置に付属のソフトウェアを用いて、３０〜７０℃の範囲（第１転移点）を切り出し、変性領域（例えば５４．５〜６５℃）を指定して、耐熱性βグルコシダーゼの変性中点温度Ｔｍを算出した。
・測定装置：JASCO J-1500KS CD spectrometer
・測定温度範囲：20℃〜95℃ (温度上昇速度2℃/min)
・測定波長 CD 222 nm
・20℃と95℃時のCDスペクトル測定(積算4回)
・解析ソフトウェア：JASCOスペクトルマネージャ
【００４０】
野生型βグルコシダーゼについても同様のＣＤ測定を行い、変性中点温度Ｔｍを求めた。
耐熱性βグルコシダーゼの変性中点温度から野生型βグルコシダーゼの変性中点温度を引いた差△Ｔｍを算出した。△Ｔｍが大きいほど、野生型βグルコシダーゼに比べて耐熱性βグルコシダーゼの耐熱性が向上していると評価した。この結果を表１に示す。
【００４１】
＜βグルコシダーゼ活性の測定方法＞
TOYOBO ENZYMES β-glucosidase from sweet almondを参考に、下記方法で行った。
試薬Ａ：０．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）
試薬Ｂ：２０ｍＭ ＰＮＰＧ水溶液
試薬Ｃ：０．２Ｍ Na2CO3水溶液
酵素溶液：１００ｎＭ耐熱性βグルコシダーゼ（溶媒：１×ＰＢＳ，ｐＨ７．４）
１）試薬Ａ５０μＬと試薬Ｂ２５μＬの混合液を、３７℃、５分間で予備加熱する。
２）酵素溶液２５μＬを予備加熱した混合液に添加する（反応時の酵素濃度は２５ｎＭ）。
３）３７℃、１５分間で酵素反応を行った後、試薬Ｃ１００μＬを反応液に添加してよく混ぜる。
４）反応液の波長４０５ｎｍの吸光度Ａを測定する。
ブランク測定を次のように行う。
５）試薬Ａ５０μＬと試薬Ｂ２５μＬの混合液を、３７℃、５分間で予備加熱する。
６）さらに、混合液を３７℃、１５分間で保温した後、試薬Ｃ１００μＬを混合液に添加してよく混ぜる。
７）酵素溶液２５μＬを混合液に添加する（添加後の酵素濃度は２５ｎＭ）。
８）混合液の波長４０５ｎｍの吸光度Ｂを測定する。
上記で測定した吸光度Ａから吸光度Ｂを引いた差を酵素活性値とした。
【００４２】
＜野生型βグルコシダーゼに対する耐熱性βグルコシダーゼの活性比＞
上記の測定方法により３７℃で測定した野生型βグルコシダーゼの活性値を１として、耐熱性βグルコシダーゼ(V65I)の活性値を算出した。その結果を表１に示す。
【００４３】
［他の単一アミノ酸変異体］
耐熱性βグルコシダーゼ(V65I)の場合と同様にして、G97P、V111L、T148L、L233F、D240P、A325P、V361I、V402Y、の各アミノ酸置換を１つ導入した耐熱性βグルコシダーゼを作製し、その変性中点温度Ｔｍと△Ｔｍ等を算出した。その結果を表１に示す。
【００４４】
［５重変異体］
耐熱性βグルコシダーゼ(V65I)の場合と同様にして、G97P+V111L+L233F+D240P+A325Pの５つのアミノ酸置換を全て導入した耐熱性βグルコシダーゼ（５重変異体）を作製した。
５重変異体について、上記のＣＤ測定を行い、変性中点温度Ｔｍと、５重変異体の変性中点温度から野生型βグルコシダーゼの変性中点温度を引いた差△Ｔｍを算出した。その結果を表２と、図１，２に示す。
【００４５】
＜温度を上昇させた後、常温における酵素活性の残存率を調べる残存活性試験＞
緩衝液（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に、野生型βグルコシダーゼ又は耐熱性βグルコシダーゼ（５重変異体）が濃度１００ｎＭで含まれる試料溶液３０μＬをそれぞれ準備した。
まず、３７℃、ｐＨ５．０〜５．５の条件下における野生型βグルコシダーゼ活性（酵素活性値Ｘ）を後述の方法で測定した。
次いで、ブロックバスを用いて、耐熱性βグルコシダーゼ（５重変異体）の試料溶液を４５.０℃、４５.９℃、４７.３℃、４９.０℃、５１.３℃、５３.１℃、５４.５℃、５５.０℃、５６.０℃、５７.３℃、５９.０℃、６１.３℃、６３.１℃、６４.５℃、又は６５.０℃まで上昇させ１時間静置した後、常温まで自然に放冷した加熱試料溶液を得た。各加熱試料溶液のβグルコシダーゼ活性（酵素活性値Ｙ）を後述の方法で測定した。
測定後、（酵素活性値Ｙ／酵素活性値Ｘ）×１００％＝残存活性として、横軸に上昇させた温度、縦軸に残存活性率をとり、１５点をプロットして結んだグラフを作成し、変性中点温度Ｔｍを求めた。
【００４６】
野生型βグルコシダーゼについても同様の測定を行い、上記のグラフに併記して、変性中点温度Ｔｍを求めた。
耐熱性βグルコシダーゼの変性中点温度から野生型βグルコシダーゼの変性中点温度を引いた差△Ｔｍを算出した。△Ｔｍが大きいほど、野生型βグルコシダーゼに比べて耐熱性βグルコシダーゼ（５重変異体）の耐熱性が向上していると評価した。この結果を表２に示す。
【００４７】
［６重変異体］
上記の５重変異体（G97P+V111L+L233F+D240P+A325P）をベースとして、さらに下記に示す何れか１つのアミノ酸置換を導入した耐熱性βグルコシダーゼ（６重変異体）を作製し、上記のＣＤ測定を行い、変性中点温度Ｔｍと、６重変異体の変性中点温度から５重変異体の変性中点温度を引いた差△Ｔｍを算出した。その結果を表３に示す。
＜さらに導入した６番目のアミノ酸置換＞
E113L、E113F、E113Y、V162I、V162L、Q220Y、M250L、L288F、A407V、H459F、H459Y、K140P、D238P、D276PT320P、G337P、G72N、G114N、G221N、G291N、K74D
【００４８】
【表１】
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【００４９】
【表２】
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【００５０】
【表３】
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【００５１】
【表４】
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【００５２】
以上の結果から、本発明にかかる耐熱性βグルコシダーゼは、野生型βグルコシダーゼに比べて何れも△Ｔｍが上昇しており、耐熱性が向上したことが明らかである。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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