(57)【要約】【課題】患者において赤血球レベルを高めるための、代替的な方法および組成物を提供する。【解決手段】本開示は、赤血球レベルおよびヘモグロビンレベルを高めるためにＧＤＦ１５ポリペプチドを使用することができることを実証する。ある特定の実施形態では、本開示は、患者において赤血球レベルおよびヘモグロビンレベルを高めるため、ならびに低い赤血球レベルまたはヘモグロビンレベルと関連する障害を処置することを必要とする患者において、低い赤血球レベルまたはヘモグロビンレベルと関連する障害を処置するために、ＧＤＦ１５ポリペプチドを使用する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、貧血を処置または予防することを必要とする患者において貧血を処置または予防するために、ＧＤＦ１５ポリペプチドを、単独で、または１種もしくは複数種のＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて使用するための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において、貧血を処置するため、赤血球レベルを高めるため、ヘマトクリットレベルを高めるため、および／もしくは網状赤血球レベルを高めるための組成物であって、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含む組成物。
【請求項２】
前記ＧＤＦ１５ポリペプチドが、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｃ）配列番号３のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｅ）配列番号５のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｆ）配列番号６のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｇ）配列番号７のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｈ）配列番号８のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｉ）配列番号９のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｊ）配列番号１０のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｋ）配列番号１１のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｌ）配列番号１２のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
ｍ）配列番号１のアミノ酸３０〜１９６の配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＧＤＦ１５ポリペプチドが、配列番号１３のヌクレオチド５８９〜９２４の配列と相補的な核酸とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＧＤＦ１５ポリペプチドが、医薬調製物で投与される、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記医薬調製物が、ＧＤＦ１５プロドメインポリペプチドを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＧＤＦ１５プロドメインポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸３０〜１９６の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記医薬調製物が、前記ＧＤＦ１５プロドメインポリペプチドと非共有結合により会合したＧＤＦ１５ポリペプチドを含む、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
前記患者が、慢性腎疾患、化学療法処置、がん、失血または炎症と関連する貧血を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
患者において、赤血球レベルを高めるため、ヘマトクリットレベルを高めるため、および／もしくは網状赤血球レベルを高めるため、および／または貧血、無効赤血球生成、もしくは骨髄異形成症候群を処置するための組成物であって、（ｉ）エリスロポエチン受容体活性化因子；および（ｉｉ）ＧＤＦ１５ポリペプチド、を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年１０月３０日に提出された米国仮出願第６２／０７２，８８９号に対する優先権の利益を主張する。その出願の明細書はその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
成熟した赤血球（ＲＢＣ）、すなわちエリスロサイト（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）は、脊椎動物の循環系において酸素の輸送を担っている。赤血球は、比較的高い酸素分圧（ｐＯ２）の肺において酸素に結合し、そして、比較的低いｐＯ２の身体の領域へと酸素を運搬するタンパク質であるヘモグロビンを高濃度で含む。
【０００３】
成熟赤血球は、赤血球生成と呼ばれるプロセスにおいて、多能性の造血幹細胞から生成される。出生後の赤血球生成は、主として、骨髄および赤脾臓において生じる。種々のシグナル伝達経路の連繋した作用により、細胞の増殖、分化、生存および死のバランスが制御される。正常な条件下では、赤血球は、身体において一定の赤血球質量を維持する速度で生成され、そして、この生成は、種々の刺激（酸素圧の増減または組織の要求を含む）に応じて増減し得る。赤血球生成のプロセスは、分化系列が決定した（ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）前駆体細胞の形成から始まり、そして、一連の別個の前駆体細胞型を通って進行する。赤血球生成の最終段階は、網状赤血球が血流へと放出されるときに生じ、成熟赤血球の形態を帯びながら、そのミトコンドリアおよびリボソームを失う。血中での網状赤血球レベルの上昇、または、網状赤血球：赤血球の比の上昇は、赤血球生成速度の増加を示す。
【０００４】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、脊椎動物における出生後の赤血球生成の最も重要な正の調節因子として広範に認識されている。ＥＰＯは、組織酸素分圧の低下（低酸素症）および低い赤血球レベルまたは低いヘモグロビンレベルに対する代償的な赤血球生成応答を調節する。ヒトでは、ＥＰＯレベルの上昇により、骨髄および脾臓における赤血球系前駆体の生成が刺激されることによって赤血球形成が促進される。マウスでは、ＥＰＯは、主に脾臓における赤血球生成を増強する。
【０００５】
貧血は、血液中のヘモグロビンまたは赤血球のレベルが正常未満であることによって特徴付けられる、大まかに定義される状態である。場合によって、貧血は、赤血球の産生または生存における一次障害によって引き起こされる。より一般には、貧血は、他の系の疾患に続発する（WeatherallおよびProvan（２０００年）Lancet、３５５巻、１１６９〜１１７５頁）。貧血は、赤血球の産生速度の低下もしくは破壊速度の上昇から、または出血に起因する赤血球の喪失によって生じ得る。貧血は、例えば、慢性腎不全、化学療法処置、骨髄異形成症候群、関節リウマチ、および骨髄移植を含む種々の障害から生じ得る。
ＥＰＯを用いた処置は、典型的には、健康なヒトにおいて、数週間にわたるヘモグロビンの約１〜３ｇ／ｄＬの上昇を引き起こす。この処置レジメンを貧血の個体に施すと、多くの場合、ヘモグロビンおよび赤血球レベルの相当な上昇が生じ、生活の質の改善および生存の延長がもたらされる。ＥＰＯは一様に有効ではなく、多くの個体が高用量でさえも不応性である（Horlら（２０００年）Nephrol  Dial  Transplant、１５巻、４３〜５０頁）。がんの患者の５０％超がＥＰＯに対する不十分な応答を有し、末期腎疾患の患者のおよそ１０％が低応答性であり（Glaspyら（１９９７年）J  Clin  Oncol、１５巻、１２１８〜１２３４頁；Demetriら（１９９８年）J  Clin  Oncol、１６巻、３４１２〜３４２５頁）、骨髄異形成症候群の患者で好都合に応答するのは１０％未満である（Estey（２００３年）Curr  Opin  Hematol、１０巻、６０〜６７頁）。炎症、鉄およびビタミン欠乏、不十分な透析、アルミニウム毒性、および副甲状腺機能亢進症を含めたいくつかの因子により、不十分な治療応答が予測され得る。ＥＰＯに対して抵抗性の分子機構は未だ不明である。最近の証拠により、高用量のＥＰＯは、一部の患者集団において心血管罹患率、腫瘍の成長、および死亡率に関する危険性の上昇に関連し得ることが示唆される（Krapfら、２００９年、Clin  J  Am  Soc  Nephrol、４巻：４７０〜４８０頁；Glaspy、２００９年、Annu  Rev  Med、６０巻：１８１〜１９２頁）。したがって、ＥＰＯベースの治療用化合物（エリスロポエチン刺激剤、ＥＳＡ）は、赤血球輸血の必要性を回避するのに十分な最低用量で投与することが推奨されている（Jelkmannら、２００８年、Crit  Rev  Oncol.  Hematol、６７巻：３９〜６１頁）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】WeatherallおよびProvan（２０００年）Lancet、３５５巻、１１６９〜１１７５頁
【非特許文献２】Horlら（２０００年）Nephrol  Dial  Transplant、１５巻、４３〜５０頁
【非特許文献３】Glaspyら（１９９７年）J  Clin  Oncol、１５巻、１２１８〜１２３４頁
【非特許文献４】Demetriら（１９９８年）J  Clin  Oncol、１６巻、３４１２〜３４２５頁
【非特許文献５】Estey（２００３年）Curr  Opin  Hematol、１０巻、６０〜６７頁
【非特許文献６】Krapfら、２００９年、Clin  J  Am  Soc  Nephrol、４巻：４７０〜４８０頁
【非特許文献７】Glaspy、２００９年、Annu  Rev  Med、６０巻：１８１〜１９２頁
【非特許文献８】Jelkmannら、２００８年、Crit  Rev  Oncol.  Hematol、６７巻：３９〜６１頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本開示の目的は、患者において赤血球レベルを高めるための、代替的な方法および組成物を提供することである。
【０００８】
部分的に、本開示は、赤血球レベルおよびヘモグロビンレベルを高めるためにＧＤＦ１５ポリペプチドを使用することができることを実証する。特に、本開示は、ＧＤＦ１５をインビボにおいて投与すると、赤血球レベル、ヘマトクリットおよびヘモグロビンのロバストかつ急速な上昇が引き起こされることを実証する。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、患者において赤血球レベルおよびヘモグロビンレベルを高めるため、ならびに低い赤血球レベルまたはヘモグロビンレベルと関連する障害を処置することを必要とする患者において、低い赤血球レベルまたはヘモグロビンレベルと関連する障害を処置するために、ＧＤＦ１５ポリペプチドを使用する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、貧血を処置または予防することを必要とする患者において貧血を処置または予防するために、ＧＤＦ１５ポリペプチドを、単独で、または１種もしくは複数種のＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて使用するための方法を提供する。例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドを、単独で、または１種もしくは複数種のＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、患者において貧血を処置または予防するために使用することができ、ここで、貧血は、がん、腎（ｋｉｄｎｅｙ、ｒｅｎａｌ）疾患（例えば、慢性腎疾患または末期腎疾患もしくは腎不全）、化学療法処置（例えば、タキサンを用いた処置）、炎症のうちの１種もしくは複数種に関連する、または失血の結果である。一部の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドを、単独で、または１種もしくは複数種のＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、無効赤血球生成を処置するために使用することができる。例えば、一部の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドを、単独で、または１種もしくは複数種のＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、サラセミア症候群の１つまたは複数の合併症（症状発現）の処置または予防を含め、サラセミア症候群（例えば、βサラセミア）を処置するために使用することができる。他の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドを、単独で、または１種もしくは複数種のＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、鎌状赤血球症の１つまたは複数の合併症処置または予防を含め、鎌状赤血球症を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドを、単独で、または１種もしくは複数種のＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、骨髄異形成症候群の１つまたは複数の合併症の処置または予防を含め、骨髄異形成症候群を処置するために使用することができる。
【０００９】
部分的に、本開示は、赤血球レベル（赤血球生成）を高めるまたは貧血を処置することを必要とする患者において赤血球レベル（赤血球生成）を高めるまたは貧血を処置するために、ＧＤＦ１５ポリペプチドを、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて使用することができること（例えば、同時に投与するか、または異なる時間に投与するが、一般に、薬理学的効果の重複が達成されるような方法で投与する）を実証する。部分的に、本開示は、患者において赤血球の形成を相乗的に増大させるために、ＧＤＦ１５ポリペプチドをＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて投与することができることを実証する。したがって、この併用処置の効果は、ＧＤＦ１５ポリペプチドとＥＰＯ受容体活性化因子をそれらのそれぞれの用量で別々に投与した場合の効果の合計を有意に超え得る。ある特定の実施形態では、この相乗作用は、ＥＰＯ受容体活性化因子のより低い用量で赤血球の目標レベルを達成することが可能になり、それにより、ＥＰＯ受容体活性化（EPO  receptor  activation）のレベルが高いことと関連する潜在的な有害作用または他の問題が回避されるので、有利であり得る。
【００１０】
ＥＰＯ受容体活性化因子は、ＥＰＯ受容体に直接接触し、これを活性化させることにより、赤血球生成を刺激し得る。ある特定の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化因子は、天然ＥＰＯの１６５アミノ酸配列に基づき、赤血球生成刺激因子（ＥＳＡ）として一般に公知の化合物のクラスの１つであり、その例が、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エポエチンデルタ、およびエポエチンオメガである。他の実施形態では、ＥＳＡは、望ましい薬物動態特性（循環半減期の延長）を付与する非ペプチド修飾を伴う合成ＥＰＯタンパク質（ＳＥＰ）およびＥＰＯ誘導体を含み、それらの例が、ダルベポエチンアルファおよびメトキシポリエチレングリコールエポエチンベータである。ある特定の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化因子は、ＥＰＯポリペプチド骨格を組み込んでいないか、または一般にＥＳＡと分類されない、ＥＰＯ受容体アゴニストであり得る。このようなＥＰＯ受容体アゴニストは、ＥＰＯのペプチド模倣物および非ペプチド模倣物、ＥＰＯ受容体を標的化するアゴニスト性抗体、ＥＰＯ模倣物ドメインを含む融合タンパク質、ならびに持続時間延長型エリスロポエチン受容体制限アゴニスト（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ａｇｏｎｉｓｔ）（ＥＲＥＤＬＡ）を含み得るがこれらに限定されない。
【００１１】
ある特定の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化因子は、ＥＰＯ受容体自体に接触させずに、内因性ＥＰＯの生成を増強することにより、間接的に赤血球生成を刺激し得る。例えば、低酸素誘導転写因子（ＨＩＦ）は、正常酸素状態下では、細胞の調節機構により抑制されている（不安定化している）、ＥＰＯ遺伝子発現の内因性刺激因子である。本開示は部分的に、ＧＤＦ１５と、プロピルヒドロキシラーゼ阻害剤など、ＨＩＦ安定化特性を有する間接的ＥＰＯ受容体活性化因子との組み合わせ処置によって、患者における赤血球生成の増大をもたらす。
【００１２】
ある特定の態様では、本開示は、ＧＤＦ１５ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列、または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列、または配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列、または配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列、または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列、または配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を有する。ＧＤＦ１５ポリペプチドは、ＧＤＦ１５の成熟部分をコードするヌクレオチド５８９〜９２４などの、配列番号１３の核酸の任意の部分を含めた、配列番号１３の核酸によりコードされるアミノ酸配列を含み得、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列番号１３のヌクレオチド５８９〜９２４の配列と相補的な核酸と、それほどストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、または高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下でハイブリダイズする核酸によりコードされ得る。
【００１３】
ある特定の態様では、本開示は、ＧＤＦ１５ポリペプチドと薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬調製物を提供する。ＧＤＦ１５ポリペプチドは、１つまたは複数のＩ型受容体（例えば、ＡＬＫ５）またはＩＩ型受容体に、１０マイクロモル濃度未満、１マイクロモル濃度未満、１００ナノモル濃度未満、１０ナノモル濃度未満、または１ナノモル濃度未満のＫＤで結合し得る。典型的には、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体の両方に結合するが、それらの受容体のうちの一方との結合の親和性は非常に弱い可能性がある。任意選択で、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、ＰＡＩ−１遺伝子に由来するＣＡＧＡ−１２応答性エレメントを含有するプロモーターなどの、細胞内のＳＭＡＤ２応答性プロモーターまたはＳＭＡＤ３応答性プロモーターからの発現を刺激する。
【００１４】
医薬調製物は、ＧＤＦ１５プロドメインポリペプチドをさらに含み得る。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１５プロドメインポリペプチドは、配列番号１の３０〜１９６のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を有する。ＧＤＦ１５プロドメインポリペプチドは、配列番号１３の任意の部分を含めた、配列番号１３のヌクレオチド８８〜５８８の配列によりコードされるアミノ酸配列を含み得、ＧＤＦ１５プロドメインポリペプチドは、配列番号１３のヌクレオチド８８〜５８８の配列と相補的な核酸と、それほどストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、または高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下でハイブリダイズする核酸によりコードされ得る。プロドメインポリペプチドは、ＧＤＦ１５ポリペプチドと共有結合により会合していてもよいし、または非共有結合により会合していてもよい。
【００１５】
医薬調製物は、実質的にパイロジェンフリーであることが好ましい。一般に、患者における好ましくない免疫応答の可能性を減らすために、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、天然グリコシル化を適切に媒介する哺乳動物細胞株において発現させることが好ましい。ヒト細胞株およびＣＨＯ細胞株が首尾よく使用されており、また、他の一般的な哺乳動物の発現ベクターが有用であることが予想される。
【００１６】
ある特定の態様では、本開示は、ＧＤＦ１５ポリペプチドを作製するための方法を提供する。そのような方法は、本明細書で開示される核酸のいずれか（例えば、配列番号１３または１４）をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの適切な細胞において発現させる工程を含み得る。そのような方法は、ａ）細胞を、ＧＤＦ１５ポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程であって、前記細胞がＧＤＦ１５発現構築物で形質転換される工程と、ｂ）そのように発現させたＧＤＦ１５ポリペプチドを回収する工程とを含み得る。ＧＤＦ１５ポリペプチドは、細胞培養物からタンパク質を得るため周知の技法のいずれかを使用して、粗製画分、部分的に精製された画分、または高度に精製された画分として回収することができる。精製は、陽イオン交換、陰イオン交換、および逆相ＨＰＬＣを含む１つまたは複数のクロマトグラフィー工程によって達成することができる。精製は、ＧＤＦ１５ポリペプチドを、ＧＤＦ１５に結合する、受容体タンパク質またはその改変バージョンのリガンド結合性ドメインと接触させることによっても達成することができる。リガンド結合性ドメインは、例えば、ＩｇＧのＦｃ部分との融合物（任意選択で、介在リンカーを伴って）として使用し、プロテインＡでコーティングした表面上に固定化することができる。
【００１７】
ある特定の態様では、ＧＤＦ１５ポリペプチド、または上記のもののうちの１つまたは複数を含む医薬調製物を、被験体において赤血球産生を促進するため、または赤血球レベルを高めるための方法において使用することができる。ある特定の実施形態では、本開示は、低い赤血球数または低いヘモグロビンレベルと関連する障害（例えば、貧血）を処置する、または赤血球産生を促進することを必要とする患者において、低い赤血球数または低いヘモグロビンレベルと関連する障害（例えば、貧血）を処置するため、または赤血球産生を促進するための方法を提供する。方法は、それを必要とする被験体に、有効量のＧＤＦ１５ポリペプチドを投与することを含み得る。ある特定の態様では、本開示は、本明細書に記載されている障害または状態を処置するための医薬を作製するための、ＧＤＦ１５ポリペプチドの使用を提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
患者において、赤血球レベルを高めるため、ヘモグロビンレベルを高めるため、および／または網状赤血球レベルを高めるための方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＧＤＦ１５ポリペプチドを投与することを含む方法。
（項目２）
患者において貧血を処置または予防する方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＧＤＦ１５ポリペプチドを投与することを含む方法。
（項目３）
患者において無効赤血球生成を処置または予防する方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＧＤＦ１５ポリペプチドを投与することを含む方法。
（項目４）
前記患者が、異常ヘモグロビン症を有する、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記患者が、鎌状赤血球症を有する、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記患者が、サラセミア症候群を有する、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記患者が、βサラセミアを有する、項目６に記載の方法。
（項目８）
患者において骨髄異形成症候群を処置する方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＧＤＦ１５ポリペプチドを投与することを含む方法。
（項目９）
前記ＧＤＦ１５ポリペプチドが、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｃ）配列番号３のアミノ酸配列と、少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と、少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｅ）配列番号５のアミノ酸配列と、少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｆ）配列番号６のアミノ酸配列と、少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｇ）配列番号７のアミノ酸配列と、少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｈ）配列番号８のアミノ酸配列と、少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｉ）配列番号９のアミノ酸配列と、少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｊ）配列番号１０のアミノ酸配列と、少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｋ）配列番号１１のアミノ酸配列と、少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｌ）配列番号１２のアミノ酸配列と、少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、および
ｍ）配列番号１のアミノ酸３０〜１９６の配列と、少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記ＧＤＦ１５ポリペプチドが、配列番号１３のヌクレオチド５８９〜９２４の配列と相補的な核酸とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記ＧＤＦ１５ポリペプチドが、医薬調製物で投与される、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記医薬調製物が、ＧＤＦ１５プロドメインポリペプチドを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＧＤＦ１５プロドメインポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸３０〜１９６の配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記医薬調製物が、前記ＧＤＦ１５プロドメインポリペプチドと非共有結合により会合したＧＤＦ１５ポリペプチドを含む、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１５）
前記患者が、慢性腎疾患と関連する貧血を有する、項目１、２、および８から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記患者が、化学療法処置と関連する貧血を有する、項目１、２、および８から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記化学療法処置が、タキサンである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記患者が、がんと関連する貧血を有する、項目１、２、および８から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記患者が、失血の結果として貧血を有する、項目１、２、および８から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記患者が、炎症による貧血を有する、項目１、２、および８から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
配列番号４、５、６、７、８、または９のいずれか１つの配列を含む、またはそれからなる、アミノ酸配列を含むポリペプチド。
（項目２２）
項目２１に記載のポリペプチドを含む医薬調製物。
（項目２３）
患者において、赤血球レベルを高めるため、ヘマトクリットレベルを高めるため、および／もしくは網状赤血球レベルを高めるため、ならびに／または、貧血、無効赤血球生成、もしくは骨髄異形成症候群を処置するための方法であって、それを必要とする患者に、
（ｉ）エリスロポエチン受容体活性化因子、および
（ｉｉ）ＧＤＦ１５ポリペプチド
を投与することを含む方法。
（項目２４）
前記ＧＤＦ１５ポリペプチドが、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｃ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｅ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｆ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｇ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｈ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｊ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｌ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｋ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、
ｌ）配列番号１のアミノ酸３０〜１９６の配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、および
ｍ）配列番号１３のヌクレオチド５８９〜９２４の配列と相補的な核酸とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択され、
前記エリスロポエチン受容体活性化因子および該ポリペプチドが、有効量で投与される、
項目２３に記載の方法。
（項目２５）
エリスロポエチン受容体活性化因子の投与される量が、それだけでは赤血球レベルを高めるのに有効でない、項目２３または２４に記載の方法。
（項目２６）
ポリペプチドの投与される量が、それだけでは前記患者において赤血球レベルを高めるのに有効ではないが、併用処置では有効である、項目２３または２４に記載の方法。
（項目２７）
前記エリスロポエチン受容体活性化因子が、赤血球生成刺激因子である、項目２３から２６に記載の方法。
（項目２８）
前記赤血球生成刺激因子が、
ａ．エポエチンアルファ
ｂ．エポエチンベータ（ＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ（商標））
ｃ．エポエチンデルタ（Ｄｙｎｅｐｏ（商標））
ｄ．エポエチンオメガ
ｅ．ダルベポエチンアルファ（Ａｒａｎｅｓｐ（商標））
ｆ．メトキシポリエチレングリコールエポエチンベータ（Ｍｉｃｅｒａ（商標））
ｇ．合成赤血球生成タンパク質（ＳＥＰ）
からなる群から選択されるＥＰＯベースの誘導体である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記エリスロポエチン受容体活性化因子が、エリスロポエチン受容体のアゴニストである、項目２３から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記エリスロポエチン受容体のアゴニストが、
ａ．エリスロポエチン模倣ペプチド
ｂ．持続時間延長型エリスロポエチン受容体制限アゴニスト
ｃ．エリスロポエチン模倣ドメインとＦｃドメインとを含む融合タンパク質
ｄ．エリスロポエチン受容体を標的とするアゴニスト抗体
ｅ．多量体エリスロポエチン模倣ペプチド
からなる群から選択される化合物である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記エリスロポエチン受容体活性化因子が、赤血球生成に対するその効果が、内因性エリスロポエチンのレベルの上昇によって媒介される間接因子である、項目２３から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記間接因子が、低酸素症誘導性転写因子アルファを安定化することによって内因性エリスロポエチン遺伝子発現を増大させる、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記間接因子が、プロリルヒドロキシラーゼ阻害剤である、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
前記患者が、腎臓障害と関連する貧血を有する、項目２３から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記患者が、慢性腎疾患と関連する貧血を有する、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記患者が、化学療法処置と関連する貧血を有する、項目２３から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記化学療法処置が、タキサンである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記患者が、がんと関連する貧血を有する、項目２３から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記患者が、失血の結果として貧血を有する、項目２３から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記ＧＤＦ１５ポリペプチドが、医薬調製物で投与される、項目２３から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記医薬調製物が、ＧＤＦ１５プロドメインポリペプチドを含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記ＧＤＦ１５プロドメインポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸３０〜１９６の配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記医薬調製物が、前記ＧＤＦ１５プロドメインポリペプチドと非共有結合により会合したＧＤＦ１５ポリペプチドを含む、項目４１または４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
赤血球レベルを高めること、ヘマトクリットレベルを高めること、および／もしくは網状赤血球レベルを高めること、ならびに／または貧血、無効赤血球生成、もしくは骨髄異形成症候群を処置することを必要とする患者において、赤血球レベルを高めること、ヘマトクリットレベルを高めること、および／もしくは網状赤血球レベルを高めること、ならびに／または貧血、無効赤血球生成、もしくは骨髄異形成症候群を処置することにおける使用のためのエリスロポエチン受容体活性化因子およびＧＤＦ１５ポリペプチドを有効量で投与することを含む、
エリスロポエチン受容体活性化因子、および
ＧＤＦ１５ポリペプチド。
（項目４５）
赤血球レベルを高めること、ヘマトクリットレベルを高めること、および／もしくは網状赤血球レベルを高めること、ならびに／または貧血、無効赤血球生成、もしくは骨髄異形成症候群を処置することを必要とする患者において、赤血球レベルを高めること、ヘマトクリットレベルを高めること、および／もしくは網状赤血球レベルを高めること、ならびに／または貧血、無効赤血球生成、もしくは骨髄異形成症候群を処置することにおける使用のためのエリスロポエチン受容体活性化因子およびＧＤＦ１５ポリペプチドを有効量で投与することを含む、
ＧＤＦ１５ポリペプチド、および
エリスロポエチン受容体活性化因子。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、マウス由来の成熟ＧＤＦ１５タンパク質のアミノ酸配列（ｍＧＤＦ１５、配列番号１１）とヒト由来の成熟ＧＤＦ１５タンパク質のアミノ酸配列（ｈＧＤＦ１５、配列番号３）をアラインメントした図である。アスタリスクは、完全に保存された残基を示す。
【００１９】
【図２】図２は、野生型マウスにおける、１日おきに３週間にわたって投与された組換えマウスＧＤＦ１５（０．３ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（トリス緩衝生理食塩水、ＴＢＳ）の、赤血球数（Ａ）、ヘモグロビン濃度（Ｂ）、およびヘマトクリット（Ｃ）に対する効果を示すグラフである。データは平均±ＳＥＭである；群当たりｎ＝３〜５のマウス；＊＊、Ｐ＜０．０１。
【００２０】
【図３】図３は、ＧＤＦ１５の、エクスビボにおいて赤血球系前駆細胞（erythroid  progenitor  cell）からの赤血球の形成を急速に促進する能力を示す図である。低倍率（Ａ）および高倍率（Ｂ）で示されている通り、マウス胎児肝臓から得、組換えマウスＧＤＦ１５（５０ｎｇ／ｍｌ）を用いてエクスビボにおいて２４時間処理した赤血球系前駆体（erythroid  progenitor）（細胞３．２×１０５個）は、明赤色の細胞ペレットを形成し（右のバイアル、矢印）、対照的に、培地のみに曝露した同数の前駆体（precursor）（対照）では、青白いペレット（左のバイアル、矢印）が形成された。赤色の強度は、赤血球成熟度の重要なマーカーである細胞のヘモグロビンレベルに対応する。
【００２１】
【図４】図４は、ストレスによる赤血球生成のマウスモデルにおけるヘモグロビン（Ｈｇｂ）濃度に対する、ＥＰＯによる前処置およびその後のＧＤＦ１５による処置の急速な相乗効果を示すグラフである。１日目に、ビヒクル（ＴＢＳ）またはＥＰＯ（１８００Ｕ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）を用いて前処置して、ストレスによる赤血球生成を誘導した野生型マウスを、次いで、組換えマウスＧＤＦ１５（１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）またはビヒクルを用いて、２日目および３日目に日ごと処置し、４日目に、分析のために血液を回収した。ＥＰＯによる前処置とＧＤＦ１５による処置の組合せにより、ヘモグロビン濃度がビヒクルと比較して１１％上昇し（Ｐ＝０．０１９）、これは、いずれも有意ではなかったＥＰＯおよびＧＤＦ１５単独での個々の効果の合計を超える相乗的な上昇であった。データは平均±ＳＥＭである；群当たりｎ＝５のマウス；ＮＳ、有意でない。
【００２２】
【図５】図５は、失血による貧血のマウスモデルにおける赤血球系前駆細胞（erythroid  precursor  cell）の成熟化の加速と同様の時間経過を伴う、赤血球系組織（erythroid  tissue）におけるＧＤＦ１５  ｍＲＮＡの一過性の上方制御を示すグラフである。野生型マウスにおける３日連続した毎日の血液除去（瀉血）により、脾臓（Ａ）および骨髄（Ｂ）におけるＧＤＦ１５  ｍＲＮＡレベルが瀉血の完了後１２時間までに有意に上昇し、２４時間にピークに達した。（Ｃ）完了後２４時間までに、失血により、脾臓におけるＴｅｒ１１９＋（後期）赤血球系前駆体の百分率が対照（出血させていないマウス）と比較して有意に上昇した。データは平均±ＳＥＭである；群当たりｎ＝３〜６のマウス；対照に対して、＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
１．概要
ＥＰＯとは、赤血球系前駆細胞のエリスロサイトへの増殖および成熟に関与する糖タンパク質ホルモンである。ＥＰＯは、胎児期には肝臓により生成され、成人期には腎臓により生成される。成人期において、腎不全の帰結として一般的に生じるＥＰＯの生成の減少は、貧血をもたらす。ＥＰＯは、遺伝子操作法により、ＥＰＯ遺伝子をトランスフェクトされた宿主細胞からの、タンパク質の発現および分泌に基づき生成されている。このような組換えＥＰＯの投与は、貧血の処置において有効となっている。例えば、Ｅｓｃｈｂａｃｈら（１９８７年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３１６巻：７３頁）は、慢性腎不全により引き起こされる貧血を是正するためのＥＰＯの使用について記載している。
【００２４】
ＥＰＯの効果は、サイトカイン受容体のスーパーファミリーに属し、ＥＰＯ受容体と呼ばれる細胞表面受容体へのその結合、およびこの受容体の活性化により媒介される。ヒトＥＰＯ受容体およびマウスＥＰＯ受容体は、クローニングされ、発現がなされている。（Ｄ’Ａｎｄｒｅａら（１９８９年）、Ｃｅｌｌ、５７巻：２７７頁；Ｊｏｎｅｓら（１９９０年）、Ｂｌｏｏｄ、７６巻：３１頁；Ｗｉｎｋｅｌｍａｎら（１９９０年）、Ｂｌｏｏｄ、７６巻：２４頁；および国際出願９０／０８８２２／米国特許第５，２７８，０６５号）ヒトＥＰＯ受容体遺伝子は、およそ２２４アミノ酸の細胞外ドメインを含む、４８３アミノ酸の膜貫通タンパク質をコードし、マウスＥＰＯ受容体とおよそ８２％のアミノ酸配列同一性を呈示する。（米国特許第６，３１９，４９９号を参照されたい。）クローニングされて哺乳動物細胞内で発現がなされた全長ＥＰＯ受容体（６６〜７２ｋＤａ）は、赤血球系前駆細胞上の天然の受容体のアフィニティーと同様のアフィニティー（ＫＤ＝１００〜３００ｎＭ）でＥＰＯに結合する。したがって、この形態は、主要なＥＰＯ結合決定基を含有すると考えられ、ＥＰＯ受容体と呼ばれる。他の近縁のサイトカイン受容体との類比によれば、ＥＰＯ受容体は、アゴニストに結合すると二量体化すると考えられる。しかしながら、多量体の複合体であり得るＥＰＯ受容体の詳細な構造、およびその活性化の具体的機構は、完全には理解されていない。（米国特許第６，３１９，４９９号）
【００２５】
ＥＰＯ受容体の活性化は、いくつかの生物学的効果を結果としてもたらす。これらの効果は、未成熟赤芽球の増殖の増大、未成熟赤芽球の分化の増大、および赤血球系前駆細胞におけるアポトーシスの低減を含む。（Ｌｉｂｏｉら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９０巻：１１３５１〜１１３５５頁；Ｋｏｕｒｙら（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８巻：３７８〜３８１頁）増殖を媒介するＥＰＯ受容体のシグナル伝達経路と、分化を媒介するＥＰＯ受容体のシグナル伝達経路とは、異なると考えられる。（Ｎｏｇｕｃｈｉら（１９８８年）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、８巻：２６０４頁；Ｐａｔｅｌら（１９９２年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、（１９９２年）２６７巻：２１３００頁；Ｌｉｂｏｉらｉｂｉｄ）一部の結果は、付属タンパク質が、分化シグナルの媒介に必要とされ得ることを示唆する。（Ｃｈｉｂａら（１９９３年）、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：６４６頁；Ｃｈｉｂａら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９０巻：１１５９３頁）しかし、恒常的な活性化形態の受容体は、増殖および分化のいずれも刺激し得るので、分化における付属タンパク質の役割については、議論が一致していない。（Ｐｈａｒｒら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９０巻：９３８頁）
【００２６】
ＥＰＯ受容体活性化因子として、低分子赤血球生成刺激作用因子（ＥＳＡ）のほか、ＥＰＯベースの化合物が挙げられる。前者の例は、ポリエチレングリコールに共有結合的に連結された二量体のペプチドベースのアゴニスト（商標名：Ｈｅｍａｔｉｄｅ（商標））であり、これは、健康なボランティアならびに慢性腎疾患および内因性の抗ＥＰＯ抗体の両方を有する患者において赤血球生成刺激特性を示している。（Ｓｔｅａｄら（２００６年）、Ｂｌｏｏｄ、１０８巻：１８３０〜１８３４頁；Ｍａｃｄｏｕｇａｌｌら（２００９年）、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３６１巻：１８４８〜１８５５頁）他の例として、非ペプチドベースのＥＳＡが挙げられる。（Ｑｕｒｅｓｈｉら（１９９９年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６巻：１２１５６〜１２１６１頁）
【００２７】
ＥＰＯ受容体活性化因子は、内在性ＥＰＯの産生を増強することにより、ＥＰＯ受容体自体と接触せずに赤血球生成を間接的に刺激する化合物も含む。例えば、低酸素症誘導性転写因子（ＨＩＦ）は、正常酸素条件下で細胞の調節機構によって抑制（不安定化）されるＥＰＯ遺伝子発現の内在性刺激物質である。したがって、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ酵素の阻害剤をインビボにおいてＥＰＯ誘導活性について調査されている。他のＥＰＯ受容体の間接的な活性化因子としては、ＥＰＯ遺伝子発現を持続的に阻害するＧＡＴＡ−２転写因子の阻害剤（Nakanoら、２００４年、Blood、１０４巻：４３００〜４３０７頁）、およびＥＰＯ受容体のシグナルトランスダクションの負の調節因子として機能する造血性細胞ホスファターゼ（ＨＣＰまたはＳＨＰ−１）の阻害剤（Klingmullerら、１９９５年、Cell、８０巻：７２９〜７３８頁）が挙げられる。
【００２８】
形質転換成長因子−β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーは、共通の配列エレメントおよび構造モチーフを共有する種々の成長因子を含有する。これらのタンパク質は、脊椎動物および無脊椎動物の両方における多種多様な細胞型に対する生物学的効果を発揮することが公知である。スーパーファミリーのメンバーは、胚発生の間に、パターン形成および組織特異化において重要な機能を果たし、また、脂肪生成、筋形成、軟骨形成、心臓発生、造血、神経発生、および上皮細胞分化を含めた種々の分化プロセスに影響を及ぼし得る。ＴＧＦβファミリーのメンバーの活性を操作することにより、多くの場合、生物体内で有意な生理的変化が引き起こされる可能性がある。例えば、ピエモンテ牛品種およびベルジャンブルー牛品種は、筋肉量の顕著な増加を引き起こす、ＧＤＦ８（ミオスタチンとも称される）遺伝子の機能喪失型変異を有する。Grobetら、Nat  Genet.  １９９７年、１７巻（１号）：７１〜４頁。さらに、ヒトでは、ＧＤＦ８の不活性対立遺伝子が筋肉量の増加、および報告によれば、例外的な強度に関連する。Schuelkeら、N  Engl  J  Med  ２００４年、３５０巻：２６８２〜８頁。
【００２９】
ＧＤＦ１５は、ジスルフィド連結したホモ二量体として産生され、その産生部位の付近で（局部的に）または血液中を循環することによって離れて作用し得る、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーである。ＧＤＦ１５シグナルは、リガンド刺激を受けると下流のＳｍａｄタンパク質をリン酸化し、活性化する、Ｉ型およびＩＩ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体のヘテロマー複合体によって媒介される（Massague、２０００年、Nat.  Rev.  Mol.  Cell  Biol.、１巻：１６９〜１７８頁）。これらのＩ型受容体およびＩＩ型受容体は、膜貫通タンパク質であり、システインリッチ領域を有するリガンド結合性細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されたセリン／トレオニン特異性を有する細胞質ドメインで構成される。Ｉ型受容体は、シグナル伝達のために不可欠であり、ＩＩ型受容体は、リガンドの結合およびＩ型受容体の発現に必要である。場合によって、ＩＩＩ型受容体（補助受容体／アクセサリータンパク質としても公知）が、ＩＩ型受容体へのリガンドの結合を容易にする、または他の点でリガンドシグナル伝達を改変する。リガンドが結合すると、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体は安定な複合体を形成し、その結果、ＩＩ型受容体によりＩ型受容体がリン酸化される。
【００３０】
本明細書において実証されている通り、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、エクスビボにおいて赤血球形成を促進すること、インビボにおいて赤血球レベルを高めること、およびインビボにおいてＥＰＯと相乗的に作用して赤血球レベルを高めることにおいて有効である。したがって、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、貧血の種々のモデルにおいて有益な効果を有することが予測される。造血は、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦおよび鉄ホメオスタシスを含めた種々の因子によって調節される複雑なプロセスであることに留意するべきである。「赤血球レベルを高める」および「赤血球形成を促進する」という用語は、ヘマトクリット、赤血球数（計数）およびヘモグロビン濃度測定値などの、臨床的に観察可能な測定基準を指し、そのような変化が起こる機構に関して中立であることが意図されている。
【００３１】
本明細書中で使用される用語は、一般に、本発明の文脈の範囲内で、かつ、各々の用語が使用される特定の文脈において、当該分野におけるその通常の意味を有する。本発明の組成物および方法、ならびに、これらの作製方法および使用方法の記載において、専門家にさらなる案内を提供するために、特定の用語が以下または本明細書中の他の場所で論じられている。用語の任意の使用の範囲および意味は、用語が使用される特定の文脈から明らかである。
【００３２】
「約」および「およそ」とは、一般に、測定の性質または精度を考慮して、測定量に関して許容される誤差の程度を意味するものとする。典型的には、例示的な誤差の程度は、所与の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内である。
【００３３】
その代わりに、そして特に生物系においては、「約」および「およそ」という用語は、値が所与の値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内であることを意味し得る。本明細書において示される数値的な量は、別段の指定のない限り近似値である、つまり、明示されていない場合には「約」または「およそ」という用語が推定され得る。
【００３４】
本発明の方法は、１種または複数種の変異体（配列バリアント）に対する野生型配列を含め、配列を互いに比較する工程を含み得る。そのような比較は、典型的には、例えば、当技術分野で周知の配列アラインメントのプログラムおよび／またはアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＭＥＧＡＬＩＧＮ、２、３挙げると）を使用した、ポリマー配列のアラインメントを含む。当業者は、そのようなアラインメントでは、変異が残基の挿入または欠失を含有する場合、配列アラインメントには、挿入された、または欠失した残基を含有しないポリマー配列に「ギャップ」（典型的には、ダッシュ、または「Ａ」で表される）が導入されることを容易に理解することができる。
【００３５】
「相同」は、そのあらゆる文法的な形態および語の綴りのバリエーションにおいて「共通する進化的起源」を有する２つのタンパク質間の関係を指し、同じ生物種のスーパーファミリーからのタンパク質ならびに異なる生物種からの相同タンパク質を含む。このようなタンパク質（およびこれをコードする核酸）は、％同一性の観点であれ、特定の残基もしくはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであれ、その配列類似性によって反映されるように、配列の相同性を有する。
【００３６】
用語「配列類似性」は、そのあらゆる文法的な形態において、共通する進化の起源を共有している場合も共有していない場合もある、核酸もしくはアミノ酸配列間の同一性もしくは対応性の程度をいう。
【００３７】
しかし、一般的な用法およびこの出願において、用語「相同」は、「高度に」のような副詞で修飾されるとき、配列の類似性を指す場合があり、そして、共通する進化の起源に関連していてもしていなくてもよい。
【００３８】
２．ＧＤＦ１５ポリペプチドおよび核酸
ある特定の態様では、本発明は、例えば、成熟ヒトＧＤＦ１５タンパク質、ならびに、共有結合により結合しているか非共有結合により結合しているかにかかわらず、プロドメインを保持するＧＤＦ１５ポリペプチド、ならびに前述のバリアントおよび短縮を含めた、ＧＤＦ１５ポリペプチドに関する。このようなバリエーションおよび短縮は、ＡＬＫ５を含めたＧＤＦ１５の公知の受容体のうちの１種または複数種によるシグナル伝達を刺激する能力を保持させるために選択することができる。任意選択で、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、ＣＡＧＡ−１２ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物をトランスフェクトした細胞株におけるルシフェラーゼの発現を高め得る。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「ＧＤＦ１５」という用語は、それぞれ、任意の種に由来するＧＤＦ１５タンパク質および変異誘発、短縮、または他の改変によってそのようなタンパク質から得られるバリアントのファミリーを指す。図１に示されている通り、ＧＤＦ１５タンパク質は、タンパク質の成熟部分を含め、脊椎動物系列にわたって中程度に異なる（divergent）。
【００４０】
「ＧＤＦ１５ポリペプチド」という用語は、それぞれ、ＧＤＦ１５ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチド、ならびに、有用な活性を保持する任意のそのバリアント（変異体、断片、融合物、およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを包含する。例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、任意の公知のＧＤＦ１５タンパク質の配列に由来するポリペプチドを含み得、また、シグナルペプチドを伴って、プロタンパク質形態（プロドメインと成熟部分の両方を含有する）として、および完全に成熟した形態として発現される形態を含み得る。図１に示されている通り、ヒトおよびマウスにおける成熟ＧＤＦ１５タンパク質は、中程度に異なり（アミノ酸レベルで６８％同一である）、したがって、機能的バリアントは、例えば、そのような変化は一般に許容されるので、異なる脊椎動物種の間でそれほど保存されていないアミノ酸を参照することによって選択することができる。ＧＤＦ１５ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２のいずれかなどの、天然に存在するＧＤＦ１５ポリペプチドの配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得るか、それから本質的になり得るか、または、それからなり得る。本明細書で記載される全てのヒトＧＤＦ１５ポリペプチドについてのアミノ酸の番号付けは、他に特に指定が無ければ、配列番号１についての番号付けに基づく。
ＧＤＦ１５ポリペプチドの例としては、以下が挙げられる：
【００４１】
ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００４８５５．２のアミノ酸１〜３０８に対応する、ネイティブなリーダーを含む全長ヒトＧＤＦ１５前駆体タンパク質（配列番号１）。リーダーは破線の下線で示され、成熟ＧＤＦ１５配列は実線の下線で示されている。
【化１】
2020073603.tif 000002
【００４２】
配列番号１のアミノ酸３０〜３０８に対応する、リーダーが除去された全長ヒトＧＤＦ１５前駆体タンパク質（配列番号２）。ＧＤＦ１５プロドメインには印が付いておらず、成熟ＧＤＦ１５配列には下線が引かれている。
【化２】
2020073603.tif 000003
【００４３】
配列番号１のアミノ酸１９７〜３０８に対応する、予測される全長成熟ヒトＧＤＦ１５（配列番号３）。
【化３】
2020073603.tif 000004
【化４】
2020073603.tif 000005
【００４４】
配列番号１のアミノ酸１９９〜３０８に対応する、成熟ヒトＧＤＦ１５の精製バージョン（配列番号４）。
【化５】
2020073603.tif 000006
ある特定の態様では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、アミノ酸の置換または欠失を含む機能的バリアントまたは改変された形態を含む。したがって、ＧＤＦ１５ポリペプチドのさらなる例としては、以下が挙げられる：
【００４５】
ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１３／１１３００８号に開示されている、Ｎ１９９Ｑ置換（配列番号５、下線が引かれている）を伴う、配列番号１のアミノ酸１９９〜３０８に対応する、精製された成熟ヒトＧＤＦ１５のバリアント。
【化６】
2020073603.tif 000007
【００４６】
ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１３／１１３００８号に開示されている、Ｈ２０２Ｄ置換（配列番号６、下線が引かれている）を伴う、配列番号１のアミノ酸１９９〜３０８に対応する、精製された成熟ヒトＧＤＦ１５の第２のバリアント。
【化７】
2020073603.tif 000008
【００４７】
Ｎ１９９Ｑ置換とＨ２０２Ｄ置換の両方（配列番号７、下線が引かれている）を伴う、配列番号１のアミノ酸１９９〜３０８に対応する、精製された成熟ヒトＧＤＦ１５の第３のバリアント。
【化８】
2020073603.tif 000009
【００４８】
配列番号１のアミノ酸２０１〜３０８に対応する、成熟ヒトＧＤＦ１５（配列番号８）のＮ’Δ４バリアント。
【化９】
2020073603.tif 000010
【００４９】
Ｈ２０２Ｄ置換を伴う、配列番号１のアミノ酸２０１〜３０８に対応する、成熟ヒトＧＤＦ１５のＮ’Δ４バリアント（配列番号９）。
【化１０】
2020073603.tif 000011
【００５０】
ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑ．Ｎｏ．ＮＰ＿０３５９４９．２のアミノ酸１〜３０３に対応する、ネイティブなリーダーを含む全長マウスＧＤＦ１５前駆体タンパク質（配列番号１０）。リーダーは破線の下線で示され、成熟ＧＤＦ１５配列は実線の下線で示されている。
【化１１】
2020073603.tif 000012
【００５１】
配列番号１０のアミノ酸１９２〜３０３に対応する、全長成熟マウスＧＤＦ１５（配列番号１１）。
【化１２】
2020073603.tif 000013
【００５２】
配列番号１０のアミノ酸１９６〜３０３に対応する、成熟マウスＧＤＦ１５のＮ’Δ４短縮バリアント（配列番号１２）。
【化１３】
2020073603.tif 000014
【００５３】
ある特定の態様では、ＧＤＦ１５ポリペプチドの機能的バリアントまたは改変された形態としては、ＧＤＦ１５ポリペプチドの少なくとも一部分と１つまたは複数の融合ドメインとを有する融合タンパク質が挙げられる。そのような融合ドメインの周知の例としては、これだけに限定されないが、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンが挙げられる。融合ドメインは、所望の性質が付与されるように選択することができる。例えば、いくつかの融合ドメインは、アフィニティークロマトグラフィーによって融合タンパク質を単離するために特に有用である。アフィニティー精製のためには、グルタチオンをコンジュゲートした樹脂、アミラーゼをコンジュゲートした樹脂、およびニッケルをコンジュゲートした樹脂またはコバルトをコンジュゲートした樹脂などの、アフィニティークロマトグラフィー用の関連するマトリックスが使用される。そのようなマトリックスの多くは、Ｈｉｓ６タグを含有する融合パートナー（配列番号１５）と共に有用な、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍおよびＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）などの「キット」の形態で入手可能である。
【００５４】
別の例としては、融合ドメインは、ＧＤＦ１５ポリペプチドの検出を容易にするように選択され得る。このような検出ドメインの例としては、種々の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、ならびに、「エピトープタグ」（これは、特定の抗体に利用可能な、通常は短いペプチド配列である）が挙げられる。特定のモノクローナル抗体に容易に利用可能な周知のエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。いくつかの場合、融合ドメインは、関連のプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによって、そこから組換えタンパク質を解放することを可能にする、第Ｘａ因子またはトロンビンのようなプロテアーゼ切断部位を有する。解放されたタンパク質は、次いで、その後のクロマトグラフィーによる分離によって、融合ドメインから単離され得る。
【００５５】
ある特定の好ましい実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、インビボにおいてＧＤＦ１５ポリペプチドを安定化するドメイン（「安定器（stabilizer）」ドメイン）と融合している。「安定化すること」とは、破壊の低減、腎臓によるクリアランスの低減、または他の薬物動態的影響のいずれに起因するかにかかわらず、血清中半減期を増大させる任意のことを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合により、広範囲のタンパク質に対して望ましい薬物動態特性が付与されることが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンとの融合により、望ましい特性を付与することができる。選択することができる他の型の融合ドメインとしては、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）安定化ドメインまたは機能的ドメインが挙げられる。例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチド融合タンパク質は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／１１３００８号およびＷＯ２０１４／１００６８９号に開示されているヘテロマー構造としてデザインすることができる。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリンＦｃドメイン」という用語または単に「Ｆｃ」とは、免疫グロブリン鎖定常領域、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域、またはその一部のカルボキシル末端部分を意味するものと理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）２つまたはそれ超のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域との組合せを含み得る。ある特定の実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ１ドメインを欠くことが好ましい。
【００５７】
一実施形態では、重鎖定常領域が由来する免疫グロブリンのクラスは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３、または４）である。ＩｇＧ  Ｆｃを含むＧＤＦ１５ポリペプチド融合タンパク質の例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／１１３００８号およびＷＯ２０１４／１００６８９号に開示されている。他のクラスの免疫グロブリン、ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）およびＩｇＭ（Ｉｇμ）も使用することができる。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号、および同第５，７２６，０４４号において詳細に考察されている。特定の結果を達成するための、ある特定の免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当業者のレベルの範囲内に入ると考えられる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の部分は、ヒンジドメインの少なくとも一部分、および好ましくはＦｃガンマのＣＨ３ドメインまたはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭのいずれかの相同なドメインの少なくとも一部分を含むことが好ましい。
【００５８】
さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失が本明細書で開示される方法および組成物の実施において有用であり得ることが意図されている。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／１１３００８号を参照されたい。任意選択で、Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較してＦｃγ受容体への結合能の低下を付与する１つまたは複数の変異を有する。他の場合では、変異体Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較してＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）への結合能の増大を付与する１つまたは複数の変異を有する。
【００５９】
融合タンパク質の種々の要素は、所望の機能性と一致する任意の様式で配置することができることが理解される。例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドを異種ドメインのＣ末端側に配置することもでき、あるいは、異種ドメインをＧＤＦ１５ポリペプチドのＣ末端側に配置することもできる。ＧＤＦ１５ポリペプチドドメインと異種ドメインは、融合タンパク質内で隣接している必要はなく、また、いずれかのドメインのＣ末端側もしくはＮ末端側に、またはドメインの間に追加的なドメインまたはアミノ酸配列を含めることができる。
【００６０】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書で開示されるＧＤＦ１５ポリペプチドのいずれかをコードする、単離された核酸、および／または組み換え核酸を提供する。そのような核酸は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。これらの核酸は、例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドを作製するための方法において、または直接治療剤として（例えば、遺伝子療法手法において）使用することができる。
【００６１】
ネイティブなヒトＧＤＦ１５前駆体タンパク質をコードする核酸配列は以下の通りである（配列番号１３）。リーダー配列は、ヌクレオチド１〜８７によりコードされ、プロドメインは、ヌクレオチド８８〜５８８によりコードされ、成熟ＧＤＦ１５は、ヌクレオチド５８９〜９２４によりコードされる。
【化１４】
2020073603.tif 000015
【化１５】
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【００６２】
ネイティブなマウスＧＤＦ１５前駆体タンパク質をコードする核酸配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０１１８１９．２の２４〜９３２位）は以下の通りである（配列番号１４）。リーダー配列は、ヌクレオチド１〜９０によりコードされ、プロドメインは、ヌクレオチド９１〜５７３によりコードされ、成熟ＧＤＦ１５は、ヌクレオチド５７４〜９０９によりコードされる。
【化１６】
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【化１７】
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【００６３】
ある特定の態様では、ＧＤＦ１５ポリペプチドをコードする主題の核酸は、配列番号１３のバリアントである核酸を含むことがさらに理解される。バリアントヌクレオチド配列は、対立遺伝子バリアントなどの、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加または欠失によって異なる配列を含み、したがって、配列番号１３に示されているコード配列のヌクレオチド配列とは異なるコード配列を含む。
【００６４】
ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号１３またはプロドメインもしくは成熟部分をコードするその一部と少なくとも６８％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、単離された、または組換え核酸配列を提供する。配列番号１３および配列番号１３のバリアントと相補的な核酸配列も本発明の範囲内に入ることが当業者には理解されよう。さらなる実施形態では、本発明の核酸配列は、単離されたもの、組み換えられたもの、および／もしくは異種ヌクレオチド配列と融合したもの、またはＤＮＡライブラリー内のものであり得る。
【００６５】
他の実施形態では、本発明の核酸は、プロドメインまたは成熟部分をコードするその一部を含めた配列番号１３に示されているヌクレオチド配列、プロドメインまたはその成熟部分をコードするその一部を含めた配列番号１３の相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。特定の実施形態では、本開示は、配列番号１３の５８９〜９２４の核酸の相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、および上記の核酸によりコードされるＧＤＦ１５ポリペプチドを提供する。上記の通り、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件は変動し得ることは当業者には容易に理解されよう。例えば、約４５℃における６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーションの後に、５０℃における２．０×ＳＳＣの洗浄を行い得る。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃における約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから、５０℃における約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択され得る。さらに、洗浄工程における温度は、室温（約２２℃）の低ストリンジェンシー条件から、約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで上昇され得る。温度と塩の両方が変更されても、温度または塩濃度が一定に保たれ、他の変数が変更されてもよい。一実施形態では、本開示は、室温における６×ＳＳＣとその後の室温で２×ＳＳＣでの洗浄の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
【００６６】
配列番号１３に記載される核酸とは遺伝暗号における縮重に起因して異なる単離された核酸も、本発明の範囲内に入る。例えば、いくつかのアミノ酸が、１つ超のトリプレットにより指定される。同じアミノ酸、またはシノニム（例えば、ＣＡＵとＣＡＣは、ヒスチジンについてのシノニムである）を特定するコドンにより、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異がもたらされ得る。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、代替ヌクレオチド配列によりコードされる。代替ヌクレオチド配列は、ネイティブなＧＤＦ１５核酸配列に関して縮重しているが、それでも同じタンパク質をコードする。
【００６７】
特定の実施形態では、本発明の組換え核酸は、発現構築物において１または複数の調節性ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節性のヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用される宿主細胞に対して適切なものである。種々の宿主細胞について、多数のタイプの適切な発現ベクターおよび適切な調節性配列が当該分野で公知である。代表的には、上記１または複数の調節性ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダー配列もしくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびに、エンハンサー配列もしくはアクチベーター配列が挙げられ得るがこれらに限定されない。当該分野で公知の構成的もしくは誘導性のプロモーターが、本発明によって企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または、１つより多くのプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドのようにエピソーム上で細胞中に存在し得るか、または、発現構築物は、染色体中に挿入され得る。好ましい実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は、当該分野で周知であり、そして、使用される宿主細胞により変化する。
【００６８】
本開示の特定の態様では、本主題の核酸は、ＧＤＦポリペプチドをコードし、そして、少なくとも１つの調節性配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターにおいて提供される。調節性配列は当該分野で認識され、そして、ＧＤＦポリペプチドの発現を誘導するように選択される。したがって、用語、調節性配列は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。例示的な調節性配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年）に記載される。例えば、作動可能に連結されたときにＤＮＡ配列の発現を制御する広範な種々の発現制御配列のいずれかが、ＧＤＦポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクターにおいて使用され得る。このような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスもしくはサイトメガロウイルスの前初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣもしくはＴＲＣシステム、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによってその発現が誘導されるＴ７プロモーター、ファージλの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼもしくは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α−接合因子（ｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、ならびに、原核生物もしくは真核生物の細胞、または、そのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知である他の配列、ならびにこれらの種々の組み合わせが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現されることが所望されるタンパク質のタイプのような要因に依存し得ることが理解されるべきである。さらに、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（例えば、抗生物質マーカー）の発現もまた考慮されるべきである。
【００６９】
ＧＤＦ１５ポリペプチドの生成のための組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部を、原核生物細胞、真核生物細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物）のいずれか、または両方において発現させるために適切なベクター中に連結することによって生成され得る。組換えＧＤＦ１５ポリペプチドの生成のための発現ビヒクルとしては、プラスミドおよび他のベクターが挙げられる。例えば、適切なベクターとしては、以下のタイプのプラスミドが挙げられる：原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のための、ｐＢＲ３２２由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来のプラスミドおよびｐＵＣ由来のプラスミド。
【００７０】
いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を促進するための原核生物の配列と、真核生物細胞において発現される１または複数の真核生物の転写単位との両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核生物細胞のトランスフェクションに適切な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核生物細胞および真核生物細胞の両方における複製および薬物耐性選択を容易にするために、細菌プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２）からの配列を用いて改変される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン−バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）のようなウイルスの誘導体が、真核生物細胞におけるタンパク質の一過的な発現のために使用され得る。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、遺伝子治療送達系の説明において以下に見出され得る。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において用いられる種々の方法は、当該分野で周知である。原核生物細胞および真核生物細胞の両方についての他の適切な発現系、ならびに、一般的な組換え手順。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  Ｅｄ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）１６章および１７章を参照のこと。いくつかの場合において、バキュロウイルス発現系を用いて組換えポリペプチドを発現させることが望ましくあり得る。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来のベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来のベクター（例えば、ｐＡｃＵＷｌ）およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（例えば、β−ｇａｌを含むｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩ）が挙げられる。
【００７１】
好ましい実施形態では、ベクターは、ＣＨＯ細胞における本主題のＧＤＦ１５ポリペプチドの生成のために設計される（例えば、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ））。明らかであるように、本主題の遺伝子構築物は、例えば、タンパク質（融合タンパク質または改変体タンパク質を含む）を生成するため、精製のために、培養物において増殖させた細胞において本主題のＧＤＦ１５ポリペプチドの発現を引き起こすために使用され得る。
【００７２】
本開示はまた、１または複数の本主題のＧＤＦ１５ポリペプチドのコード配列を含む組換え遺伝子をトランスフェクトされた宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、本発明のＧＤＦ１５ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００７３】
上記の核酸は、例えば、ＨＥＫ細胞、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞を含めた適切な細胞においてＧＤＦ１５ポリペプチドを発現させるために使用することができる。シグナル配列は、ＧＤＦ１５のネイティブなシグナル配列、または、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）シグナル配列もしくはミツバチメリチン（ＨＢＭ）シグナル配列などの別のタンパク質由来のシグナル配列であり得る。タンパク質ＰＡＣＥ（またはフューリン）は、プロタンパク質の２つのペプチド、プロタンパク質および成熟部分への切断を媒介し、したがって、このような切断が望まれる場合に、ＧＤＦ１５ポリペプチドの産生が意図された細胞においてＰＡＣＥ導入遺伝子を発現させるために有用である。ＧＤＦファミリーまたはＢＭＰファミリーのメンバーが十分に活性になるためには、それらのプロドメインから解離する必要があることが一般に理解されている。ＧＤＦ１５の場合では、プロドメインはネイティブな条件下では成熟部分から分離しているが、生物活性のある投与可能な医薬形態の適切な生成に最初に役立つ。あるいは、本発明では、プロドメインにより、例えば、より長い血清中半減期およびより大きな生物学的利用能を含めた望ましい薬学的性質を付与することができることが理解され、したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、プロドメインポリペプチドと共有結合により会合しているか、または非共有結合により会合しているＧＤＦ１５ポリペプチドの成熟部分を含む医薬調製物を提供する。「プロドメインポリペプチド」は、配列番号１のアミノ酸３０〜１９６などの、天然に存在するＧＤＦ１５プロドメインの配列と少なくとも６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチドである。プロドメインポリペプチドは、一般に、対応する成熟部分のアミノ酸を３０個超、２０個超、１０個超または５個超含むべきではないことが明らかである。ある特定の実施形態では、プロドメインポリペプチドは、ＧＤＦ１５ポリペプチドの成熟部分に、１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下または１０−９Ｍ以下、またはそれ未満のＫＤで結合する。
【００７４】
ある特定の実施形態では、本開示は、治療有効性、または安定性（例えば、エクスビボにおける貯蔵寿命およびインビボにおけるタンパク質分解による分解に対する抵抗性）を増強することなどの目的でＧＤＦ１５ポリペプチドの構造を改変することによって機能的バリアントを作製することを意図している。ＧＤＦ１５ポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、または付加によっても生成することができる。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンでの単独の置き換え、アスパラギン酸のグルタミン酸での単独の置き換え、トレオニンのセリンでの単独の置き換え、または、アミノ酸の、構造的に関連するアミノ酸での同様の置き換え（例えば、保存的変異）は、得られる分子の生物学的活性に主要な影響は及ぼさないと予想するのが妥当である。保存的置き換えとは、側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で生じる置き換えである。機能的バリアントをもたらす、ＧＤＦ１５ポリペプチドのアミノ酸配列の変化は、バリアントＧＤＦ１５ポリペプチドの、細胞において改変されていないＧＤＦ１５ポリペプチドに対する応答を生じさせる能力、または１つもしくは複数の受容体に結合する能力を評価することによって容易に決定することができる。プロドメインポリペプチドにおけるバリエーションの場合では、バリアントの機能活性は、プロドメインの成熟ＧＤＦ１５ポリペプチドに結合する能力を測定することによって評価することができる。
【００７５】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＧＤＦ１５ポリペプチドのグリコシル化が変更されるように特定の変異を有するＧＤＦ１５ポリペプチドを意図している。アミノ酸配列の変更は、一般にＮＸＳ配列またはＮＸＴ配列である１つまたは複数のＮ結合グリコシル化部位が導入されるように行うことができる。変異は、Ｏ結合グリコシル化部位またはＮ結合グリコシル化部位などの１つまたは複数のグリコシル化部位が排除されるように選択することもできる。変更は、ＧＤＦ１５ポリペプチドの配列に対する１つまたは複数のアスパラギン残基、セリン残基またはトレオニン残基の付加、またはそれによる置換によって行うこともできる。グリコシル化認識部位のアミノ酸の１位または３位の一方または両方における種々のアミノ酸の置換または欠失（および／または２位におけるアミノ酸の欠失）により、修飾されたトリペプチド配列における非グリコシル化がもたらされる。ＧＤＦ１５ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、ＧＤＦ１５ポリペプチドへの配糖体の化学的または酵素的なカップリングによるものである。使用されるカップリング様式に応じて、糖（複数可）を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離のカルボキシル基；（ｃ）システインのものなどの遊離のスルフヒドリル基；（ｄ）セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離のヒドロキシル基；（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのものなどの芳香族残基；または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。これらの方法は、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ８７／０５３３０、ならびにAplinおよびWriston（１９８１年）CRC  Crit.  Rev.  Biochem.、２５９〜３０６頁に記載されている。ＧＤＦ１５ポリペプチド上に存在する１つまたは複数の炭水化物部分の除去は、化学的に、かつ／または酵素的に遂行することができる。化学的な脱グリコシル化は、例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドの、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または相当する化合物への曝露を含み得る。この処理により、連結している糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外のほとんどまたは全ての糖が切断される一方で、アミノ酸配列がインタクトなままに残る。化学的な脱グリコシル化は、Hakimuddinら（１９８７年）Arch.  Biochem.  Biophys.  ２５９巻：５２頁およびEdgeら（１９８１年）Anal.  Biochem.  １１８巻：１３１頁にさらに記載されている。Thotakuraら（１９８７年）Meth.  Enzymol.  １３８巻：３５０頁に記載されている通り、ＧＤＦ１５ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞および植物細胞は全て、ペプチドのアミノ酸配列により影響を及ぼすことができる異なるグリコシル化パターンを導入することができるので、必要に応じて、ＧＤＦ１５ポリペプチドの配列を、使用される発現系の型に応じて調整することができる。一般に、ヒトにおける使用のためのＧＤＦ１５ポリペプチドは、ＨＥＫ２９３細胞株またはＣＨＯ細胞株などの、妥当なグリコシル化をもたらす哺乳動物細胞株において発現させるが、他の���乳動物発現細胞系も同様に有用であることが予測される。
【００７６】
本開示は、任意選択で、短縮バリアントを含めた、バリアント、特にＧＤＦ１５ポリペプチドのコンビナトリアルバリアントのセットを生成する方法をさらに意図している。コンビナトリアル変異体のプールは、ＧＤＦ１５配列を同定するために特に有用である。かかるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、薬物動態学の変更、または受容体結合性の変更などの、性質の変更を伴うＧＤＦ１５ポリペプチドバリアントを生成することであり得る。種々のスクリーニングアッセイを以下に提供し、そのようなアッセイは、バリアントを評価するために使用することができる。
【００７７】
ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはそのバリアントの活性は、細胞に基づくアッセイまたはインビボアッセイにおいて試験することもできる。例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドバリアントの、造血に関与する遺伝子発現に対する効果を評価することができる。同様に、ＧＤＦ１５ポリペプチドをマウスまたは他の動物に投与することができ、赤血球計数、ヘモグロビンレベル、ヘマトクリットレベル、鉄貯蔵、または網状赤血球計数などの１つまたは複数の血液測定値を、当技術分野で認められている方法を使用して評価することができる。ＳＭＡＤ２／３シグナル伝達を刺激するＧＤＦ１５および他のリガンドの生物活性を、ＣＡＧＡ−１２プロモーター構築物を含有するレポーター遺伝子をトランスフェクトしたＡ５４９細胞（ヒト肺上皮細胞株）において評価することができる。この構築物は、ヒトＰＡＩ−１遺伝子のプロモーター領域において最初に同定されたＳＭＡＤ２／３結合性モチーフの複数の反復を組み込んでいる（Dennlerら、１９９８年、EMBO  J、１７巻：３０９１〜３１００頁）。米国特許出願第１４／４６５，１８２号を参照されたい。ＧＤＦ１５ポリペプチドの生物活性は、ＤＵ−１４５細胞による成長の阻害によって評価することもできる。
【００７８】
ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、ＧＤＦ１５ポリペプチドに天然に存在する任意のものに加えて翻訳後修飾をさらに含み得る。そのような修飾としては、これだけに限定されないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質付加、アシル化およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）での修飾が挙げられる。結果として、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、ポリエチレングリコール、脂質、多糖または単糖、およびホスフェートなどの非アミノ酸要素を含有し得る。そのような非アミノ酸要素の、ＧＤＦ１５ポリペプチドの機能性に対する効果は、他のＧＤＦ１５ポリペプチドバリアントに関して本明細書で記載される通り試験することができる。ＧＤＦ１５ポリペプチドが細胞においてＧＤＦ１５ポリペプチドの新生形態の切断により生成される場合、翻訳後プロセシングは、タンパク質のフォールディングおよび／または機能を補正するためにも重要であり得る。異なる細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３）は、このような翻訳後活性に関して特定の細胞機構および特徴的な機構を有し、ＧＤＦ１５ポリペプチドの妥当な修飾およびプロセシングが確実になるように選択することができる。
【００７９】
ある特定の実施形態では、本発明は、他のタンパク質から単離された、またはそうでなければ他のタンパク質を実質的に含まない、単離および／または精製された形態のＧＤＦ１５ポリペプチドを利用可能にする。
【００８０】
ある特定の実施形態では、本発明のＧＤＦ１５ポリペプチド（修飾されていないかまたは修飾された）は、当技術分野で公知の種々の技法によって作製することができる。例えば、ポリペプチドは、Bodansky,  M.、Principles  of  Peptide  Synthesis,  Springer  Verlag、Berlin（１９９３年）およびGrant  G.  A.（編）、Synthetic  Peptides:  A  User's  Guide、W.  H.  Freeman  and  Company、New  York（１９９２年）に記載されているものなどの、標準タンパク質化学の技法を使用して合成することができる。さらに、自動ペプチド合成機が市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｍｏｄｅｌ  ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ９６００）。あるいは、ＧＤＦ１５ポリペプチド、それらの断片またはバリアントは、当技術分野で周知の様々な発現系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス）を使用した組換えで産生させ、その後のタンパク質の精製によって作製することができる。
【００８１】
したがって、本開示は、主題のＧＤＦ１５ポリペプチドを作製する方法を提供する。例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞を適切な条件下で培養してポリペプチドの発現が起こるのを可能にすることができる。ＧＤＦ１５ポリペプチドは、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含有する細胞と培地の混合物から分泌させ、単離することができる。あるいは、ポリペプチドを細胞質中または膜画分中に保持し、細胞を収集し、溶解させ、タンパク質を単離することができる。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞を培養するために適した培地は当技術分野で周知である。主題のＧＤＦ１５ポリペプチドは、細胞培養培地から、宿主細胞から、またはその両方から、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびＧＤＦ１５ポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体を用いた免疫アフィニティー精製を含めた、当技術分野で公知のタンパク質を精製するための技法を使用して単離することができる。
【００８２】
本開示は、さらに、ＧＤＦ１５ポリペプチドを精製するための新規の方法を提供する。一実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、溶出のために高濃度の尿素、例えば、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、または８Ｍの尿素濃度を使用する陽イオン交換カラムにより精製することができる。別の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、陰イオン交換カラムにより精製することができる。さらに別の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、逆相ＨＰＬＣカラムにより精製することができる。尿素溶出により陽イオン交換、陰イオン交換、および逆相ＨＰＬＣは、任意の順序で実施することができる。好ましい実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、第１に陽イオン交換および尿素での溶出により精製し、第２に陰イオン交換により精製し、第３に逆相ＨＰＬＣカラムにより精製することができる。
【００８３】
固体マトリックス（例えば、クロマトグラフィー樹脂）を上記のもののいずれかのリガンド結合性部分と接合して、ＧＤＦ１５ポリペプチドに選択的に結合するアフィニティーマトリックスを作製することができる。受容体の細胞外ドメインと免疫グロブリンのＦｃ部分を融合し、プロテインＡなどのＦｃ結合性タンパク質を含有するマトリックスと接合することができる。
【００８４】
別の実施形態では、精製用リーダー配列（例えば、組換えＧＤＦ１５ポリペプチドの所望の部分のＮ末端に位置するポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位の配列）をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーによる、発現された融合タンパク質の精製を可能にし得る。その後、精製用リーダー配列は、引き続いて、エンテロキナーゼでの処理によって除去され、精製ＧＤＦ１５ポリペプチドを提供し得る。（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら、（１９８７年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１巻：１７７頁；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８巻：８９７２頁を参照のこと。）
【００８５】
融合遺伝子を作製するための技術は周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡフラグメントの接合は、ライゲーションのための平滑末端もしくは突出（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じた粘着末端のフィルイン（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、所望されない接合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーション、を用いる従来の技術に従って行われる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子フラグメント間の相補的なオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を生じるアンカープライマーを用いて行われ得、これらのフラグメントは、その後、キメラ遺伝子配列を生じるようにアニーリングされ得る。（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２年を参照のこと。）
【００８６】
３．例示的な治療的使用
ある特定の実施形態では、本開示のＧＤＦ１５ポリペプチドは、齧歯類および霊長類などの哺乳動物、特にヒト患者において赤血球レベルを高めるために使用することができる。さらに、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、低用量の範囲で赤血球の増加を達成するために、または全体的により高レベルの赤血球またはより高い奏効率を達成するために、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて使用することができる。このことは、公知のオフターゲット効果および高用量のＥＰＯ受容体活性化因子に関連する危険性を低下させることにおいて有益であり得る。ある特定の実施形態では、本発明は、貧血を処置または予防することを必要とする個体において、個体に治療有効量のＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＧＤＦ１５ポリペプチドとＥＰＯ受容体活性化因子の組合せ（または併用療法）を投与することにより、貧血を処置または予防する方法を提供する。これらの方法は、哺乳動物、特にヒトの治療的処置および予防的処置のために使用することができる。
【００８７】
ＧＤＦ１５ポリペプチドは、ＥＰＯの有害作用を受けやすい患者においてＥＰＯ受容体活性化因子の必要用量を減らすために、これらの活性化因子と組み合わせて使用することができる。主要なＥＰＯの有害作用は、ヘマトクリットレベルまたはヘモグロビンレベルの過剰な上昇、および赤血球増加症である。ヘマトクリットレベルの上昇により、高血圧症（より詳細には高血圧症の増悪）および血管血栓症を引き起こす可能性がある。一部は高血圧症と関連する、報告されている他のＥＰＯの有害作用は、頭痛、インフルエンザ様症候群、シャントの閉塞、心筋梗塞、ならびに血栓症、高血圧性脳障害、および赤血球無形成（red  cell  blood  cell  applasia）に起因する脳痙攣である（Singibarti、１９９４年、J.  Clin  Invest  ７２巻（補遺６号）：Ｓ３６〜Ｓ４３頁；Horlら、２０００年、Nephrol  Dial  Transplant  １５巻（補遺４号）：５１〜５６頁；Delantyら、１９９７年、Neurology、４９巻：６８６〜６８９頁；Bunn、２００２年、N  Engl  J  Med、３４６巻：５２２〜５２３頁）。
【００８８】
本明細書で開示される、ＧＤＦ１５ポリペプチドとＥＰＯのヘモグロビン濃度に対する相乗効果は、ＧＤＦ１５ポリペプチドが、ＥＰＯの機構とは異なる機構によって作用することを示す。したがって、これらのアンタゴニストは、ＥＰＯに十分に応答しない患者において赤血球レベルおよびヘモグロビンレベルを高めるために有用であり得る。例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドは通常〜増加させた用量のＥＰＯ（＞３００ＩＵ／ｋｇ／週）の投与によってヘモグロビン濃度が目標のレベルまで上昇しない患者に有益であり得る。ＥＰＯ応答が不十分な患者は、貧血の全ての型で見られるが、がんの患者および末期腎疾患の患者において、より多くの非応答者数が特に頻繁に観察されている。ＥＰＯに対する不十分な応答は、構成的なもの（すなわち、ＥＰＯによる最初の処置時に観察される）であるか、または後天的なもの（例えば、ＥＰＯによる処置を繰り返すと観察される）であり得る。
【００８９】
本明細書で使用される場合、障害または状態を「予防する」治療薬とは、統計試料において、処置された試料において障害もしくは状態の出現を無処置の対照試料と比較して減少させるか、または、無処置の対照試料と比較して、障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状の発症を遅延させるもしくはその重症度を低下させる化合物を指す。用語「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、本明細書で使用される場合、名を挙げられた状態の予防法または一旦確立された状態の緩和もしくは排除を含む。いずれの場合も、予防または処置は、医師または他の健康管理提供者により提供される診断および治療剤の投与の意図された結果によって識別することができる。
【００９０】
本明細書で示されている通り、任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせた、ＧＤＦ１５ポリペプチドを使用して、健康な個体における赤血球、ヘモグロビン、または網状赤血球レベルを高めることができ、このようなＧＤＦ１５ポリペプチドは、選択された患者集団において使用することができる。適切な患者集団の例としては、貧血を有する患者などの、赤血球またはヘモグロビンレベルが望ましくなく低い患者、および実質的な失血をもたらす可能性がある大手術または他の手順を受けるところである患者などの、望ましくなく低い赤血球レベルまたはヘモグロビンレベルが発生する危険性がある患者が挙げられる。一実施形態では、適切な赤血球レベルを有する患者をＧＤＦ１５ポリペプチドで処置して赤血球レベルを高め、次いで、採血し、後に輸血に使用するために保管する。
【００９１】
任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせた、本明細書で開示されるＧＤＦ１５ポリペプチドを使用して、貧血を有する患者における赤血球レベルを高めることができる。ヒトにおいてヘモグロビンレベルを観察する場合、適切な年齢および性別のカテゴリーについて正常未満のレベルが貧血を示し得るが、個体による変動を考慮に入れる。例えば、一般に、１２ｇ／ｄｌのヘモグロビンレベルが、一般的な成体集団における正常の下限とみなされる。ヘモグロビン不十分の潜在的な原因としては、失血、栄養欠損、医薬に対する反応、種々の骨髄の障害、および多くの疾患が挙げられる。より詳細には、貧血は、例えば、慢性腎不全、骨髄異形成症候群、関節リウマチ、および骨髄移植を含む種々の障害に関連づけられている。貧血はまた、以下の状態にも関連づけられ得る：固形腫瘍（例えば、乳がん、肺がん、結腸がん）；リンパ系の腫瘍（例えば、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫）；造血系の腫瘍（例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫）；放射線療法；化学療法（例えば、白金含有レジメン）；これだけに限定されないが、関節リウマチ、他の炎症性関節炎、全身性エリスマトーデス（ＳＬＥ）、急性または慢性皮膚疾患（例えば、乾癬）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）を含めた、炎症性疾患および自己免疫疾患；特発性または先天性の状態を含めた急性または慢性の腎疾患または腎不全；急性または慢性肝疾患；急性または慢性出血；患者のアロ抗体もしくは自己抗体に起因して、かつ／または宗教上の理由で（例えば、いくつかのエホバの証人）赤血球の輸血が不可能である状況；感染症（例えば、マラリア、骨髄炎）；例えば、鎌状赤血球症、サラセミアを含めた異常ヘモグロビン症；薬物の使用または乱用、例えば、アルコールの誤用；輸血が回避される任意の原因の貧血の小児患者；ならびに高齢の患者、または、循環過剰負荷に関する懸念により輸血を受けることができない基礎心肺疾患を有する、貧血の患者。
【００９２】
貧血の最も一般的な型は、炎症、感染症、組織傷害、およびがんなどの状態を包含する慢性疾患に関する貧血である。慢性疾患に関する貧血は、骨髄におけるＥＰＯレベルが低いこととＥＰＯに対する応答が不十分であることの両方によって区別される（Adamson、２００８年、Harrison's  Principles  of  Internal  Medicine、第１７版；McGraw  Hill、New  York、６２８〜６３４頁）。多くの因子が、がんに関連した貧血に寄与し得る。一部は、疾患過程自体、ならびにインターロイキン−１、インターフェロン−ガンマ、および腫瘍壊死因子などの炎症性サイトカインの産生に関連する（Bronら、２００１年、Semin  Oncol  ２８巻（補遺８号）：１〜６頁）。炎症は、その作用の中でも、重要な鉄調節ペプチドであるヘプシジンを誘導し、これにより、マクロファージからの鉄の輸送を阻害し、一般に、赤血球生成のための鉄利用可能性を制限する（Ganz、２００７年、J  Am  Soc  Nephrol、１８巻：３９４〜４００頁）。種々の経路を通じた失血も、がんに関連した貧血に寄与し得る。がんの進行に起因する貧血の有病率は、がんの型によって変動し、前立腺がんにおける５％から多発性骨髄腫における９０％までにわたる。がんに関連した貧血には、患者に対して、疲労および生活の質の低下、処置有効性の低下、および死亡率の上昇を含めた深刻な帰結が伴う。
【００９３】
慢性腎疾患は、腎臓の機能障害の程度と共に重症度が変動する低増殖性貧血と関連する。このような貧血は、主にＥＰＯの不十分な産生および赤血球の生存の低減に起因する。慢性腎疾患は、通常、末期（ステージ５）疾患まで数年または数十年にわたって徐々に進行し、その時点で、患者が生存するためには透析または腎移植が必要である。貧血は、多くの場合、このプロセスの初期に発生し、疾患の進行と共に悪化する。腎疾患に関する貧血の臨床的帰結は、十分に記録されており、それらとして、左室肥大の発生、認知機能障害、生活の質の低下、および免疫機能の変更が挙げられる（Levinら、１９９９年、Am  J  Kidney  Dis、２７巻：３４７〜３５４頁；Nissenson、１９９２年、Am  J  Kidney  Dis  ２０巻（補遺１号）：２１〜２４頁；Revickiら、１９９５年、Am  J  Kidney  Dis、２５巻：５４８〜５５４頁；Gafterら、１９９４年、Kidney  Int、４５巻：２２４〜２３１頁）。任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせた、ＧＤＦ１５ポリペプチドを使用して、腎疾患に関する貧血を処置することができる。
【００９４】
低代謝速度をもたらす多くの状態は、軽度から中等度の低増殖性貧血を生じ得る。そのような状態としては、内分泌欠損の状態が挙げられる。例えば、貧血は、アジソン病、甲状腺機能低下症、副甲状腺機能亢進症、または去勢されたかもしくはエストロゲンで処置された男性において生じ得る。軽度から中等度の貧血はまた、特に高齢者において蔓延している状態である、食事によるタンパク質の摂取の減少に伴っても生じ得る。最後に、貧血は、ほぼ全ての原因から生じる慢性肝疾患の患者において発生し得る（Adamson、２００８年、Harrison's  Principles  of  Internal  Medicine、第１７版；McGraw  Hill、New  York、６２８〜６３４頁）。
【００９５】
外傷または分娩後の出血からなどの十分な体積の急性失血によって生じる貧血は、急性出血後貧血として公知である。急性失血では、最初に、他の血液構成物と共に赤血球が比例して枯渇するので、貧血を伴わない血液量減少症が引き起こされる。しかし、血液量減少症により、体液を血管外から血管区画までシフトさせる生理的機構が急速に誘発され、その結果、血液希釈および貧血が生じる。慢性の場合、失血により体の鉄貯蔵が徐々に枯渇し、最終的に鉄欠損に至る。本明細書で開示される結果は、ＧＤＦ１５を、急性の失血による貧血によって誘発される、赤血球産生を促進させる内在性赤血球生成シグナルとして意味づける。したがって、任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせた、ＧＤＦ１５ポリペプチドを使用して、急性失血に関する貧血からの回復を速やかにすることができる。
【００９６】
鉄欠損貧血は、中間の段階として負の鉄平衡および鉄欠損赤血球生成を含む鉄欠損の増大のグレード分けされた進行における、最終的な段階である。妊娠、欠乏食、腸での吸収不良、急性または慢性炎症、および急性または慢性失血などの状態において例証される通り、鉄欠損は、鉄要求量の増加、鉄摂取量の減少、または鉄喪失の増加によって生じ得る。この型の軽度から中等度の貧血を伴うと、骨髄は低増殖性のままであり、赤血球形態は大部分が正常であるが、軽度の貧血によってさえ、いくつかの小球性低色素性赤血球が生じ得、重症鉄欠損貧血に移行すると、骨髄が過剰増殖し、小球性かつ低色素性の赤血球がますます蔓延する（Adamson、２００８年、Harrison's  Principles  of  Internal  Medicine、第１７版；McGraw  Hill、New  York、６２８〜６３４頁）。鉄欠損貧血に対する適切な療法は、その原因および重症度に左右され、主要な従来の選択肢は、経口用鉄剤、非経口用鉄製剤、および赤血球の輸血である。任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせた、ＧＤＦ１５ポリペプチドを、単独で、または従来の治療的手法と組み合わせて使用して、慢性鉄欠損貧血、特に多因子起源の貧血を処置することができる。
【００９７】
任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせた、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、典型的には、赤血球形態のわずかな変化に関連する低増殖性骨髄に関する貧血を処置するために適し得る。低増殖性貧血としては、１）慢性疾患に関する貧血、２）腎疾患に関する貧血、および３）低代謝の状態に関連する貧血が挙げられる。これらの型の各々では、内在性ＥＰＯレベルは、観察される貧血の程度に対して不適切に低い。他の低増殖性貧血としては、４）初期の鉄欠損貧血、および５）骨髄の損傷によって引き起こされる貧血が挙げられる。これらの型では、内在性ＥＰＯレベルは、観察される貧血の程度に対して適切に上昇する。低増殖性貧血はまた、がんの化学療法薬またはがんの放射線療法によって引き起こされる骨髄抑制の結果として生じる。臨床試験についての広範な総説により、軽度の貧血は化学療法後の患者の１００％で起こり得、一方、より重症の貧血は、このような患者の最大で８０％に起こり得ることが見いだされた（Groopmanら、１９９９年、J  Natl  Cancer  Inst、９１巻：１６１６〜１６３４頁）。骨髄抑制薬としては、１）ナイトロジェンマスタード（例えば、メルファラン）およびニトロソ尿素（例えば、ストレプトゾシン）などのアルキル化剤；２）葉酸アンタゴニスト（例えば、メトトレキサート）、プリン類似体（例えば、チオグアニン）、およびピリミジン類似体（例えば、ゲムシタビン）などの代謝拮抗薬；３）アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン）などの細胞傷害性抗生物質；４）キナーゼ阻害剤（例えば、ゲフィチニブ）；５）タキサン（例えば、パクリタキセル）およびビンカアルカロイド（例えば、ビノレルビン）などの有糸分裂阻害剤；６）モノクローナル抗体（例えば、リツキシマブ）；および７）トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、トポテカンおよびエトポシド）が挙げられる。任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせた、ＧＤＦ１５ポリペプチドを使用して、化学療法剤および／または放射線療法によって引き起こされる貧血を処置することができる。
【００９８】
一部の実施形態では、任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせた、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、過小な（小球性）、過大な（大球性）、形の悪い、または異常な色をした（低色素性）赤血球によって一部特徴付けられる、不規則な赤血球成熟化に関する貧血を処置するためにも適し得る。
【００９９】
ある特定の実施形態では、任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせた、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、無効赤血球生成を処置するために有用であり得る。鉄動態研究に基づき、再生不良性貧血、出血、または末梢溶血とは元来識別される（Ｒｉｃｋｅｔｔｓら、１９７８年、Ｃｌｉｎ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ、３巻：１５９〜１６４頁）、無効赤血球生成は、成熟ＲＢＣの生成が、骨髄中に存在する赤血球系前駆体（赤芽球）の数が与えられたときに予測されるより少ない、多様な貧血群を説明している（Ｔａｎｎｏら、２０１０年、Ａｄｖ  Ｈｅｍａｔｏｌ、２０１０巻：３５８２８３頁）。このような貧血では、エリスロポエチンレベルの上昇にもかかわらず、成熟ＲＢＣ生成の無効に起因して、組織低酸素症が遷延する。最終的には、エリスロポエチンレベルの上昇が赤芽球の大規模な増殖を駆動する悪循環が発生し、これは、髄外赤血球生成に起因する脾腫（脾臓の腫大）（Ａｉｚａｗａら、２００３年、Ａｍ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ、７４巻：６８〜７２頁）、赤芽球誘導性骨病態（Ｄｉ  Ｍａｔｔｅｏら、２００８年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｈｏｍｅｏｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ、２２巻：２１１〜２１６頁）を潜在的にもたらし、治療的ＲＢＣ輸血の非存在下においてもなお、組織鉄過負荷（Ｐｉｐｐａｒｄら、１９７９年、Ｌａｎｃｅｔ、２巻：８１９〜８２１頁）を潜在的にもたらす。したがって、赤血球生成の有効性を促進することにより、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、前述の悪循環を打破し、根底にある貧血だけでなく、エリスロポエチンレベルの上昇、脾腫、骨病態、および組織鉄過負荷といった関連する合併症も緩和することができる。ＧＤＦ１５ポリペプチドは、貧血およびＥＰＯレベルの上昇のほか、脾腫、赤芽球誘導性骨病態、および鉄過負荷ならびにそれらの付随する病態などの合併症を含む、無効赤血球生成を処置することができる。脾腫に関して、このような病態は、胸痛または腹痛および網内系過形成を含む。髄外造血は、脾臓内だけでなく、潜在的には他の組織内でも、髄外造血性偽腫瘍の形態で生じる場合がある（Ｍｕｓａｌｌａｍら、２０１２年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｍｅｄ、２巻：ａ０１３４８２頁）。赤芽球誘導性骨病態に関して、付随する病態は、低骨塩密度、骨粗鬆症、および骨疼痛を含む（Ｈａｉｄａｒら、２０１１年、Ｂｏｎｅ、４８巻：４２５〜４３２頁）。鉄過負荷に関して、付随する病態は、ヘプシジン抑制および食餌中の鉄の過剰吸収（Ｍｕｓａｌｌａｍら、２０１２年、Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ、２６巻（補遺１号）：Ｓ１６〜Ｓ１９頁）、複数の内分泌障害および肝線維症／肝硬変（Ｇａｌａｎｅｌｌｏら、２０１０年、Ｏｒｐｈａｎｅｔ  Ｊ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓ、５巻：１１頁）、ならびに鉄過剰性心筋症（Ｌｅｋａｗａｎｖｉｊｉｔら、２００９年、Ｃａｎ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ、２５巻：２１３〜２１８頁）を含む。
【０１００】
無効赤血球生成の最も一般的な原因は、完全アルファヘモグロビン鎖の生成と完全ベータヘモグロビン鎖の生成との不均衡が赤芽球の成熟時におけるアポトーシスの増大をもたらす遺伝性異常ヘモグロビン症である、サラセミア症候群である（Ｓｃｈｒｉｅｒ、２００２年、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ、９巻：１２３〜１２６）。サラセミアは総体として、世界中で最も高頻度の遺伝子障害であり、疫学的パターンを変化させながら、米国および全世界のいずれにおいても増大しつつある公衆衛生問題に寄与することが予測されている（Ｖｉｃｈｉｎｓｋｙ、２００５年、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１０５４巻：１８〜２４頁）。サラセミア症候群は、それらの重症度に応じて命名される。したがって、αサラセミアは、軽症型αサラセミア（αサラセミア形質としてもまた公知であり、２つのα−グロビン遺伝子が影響を受ける）、ヘモグロビンＨ症（３つのα−グロビン遺伝子が影響を受ける）、および重症型αサラセミア（胎児水腫としてもまた公知であり、４つのα−グロビン遺伝子が影響を受ける）を含む。βサラセミアは、軽症型βサラセミア（βサラセミア形質としてもまた公知であり、１つのβ−グロビン遺伝子が影響を受ける）、中間型βサラセミア（２つのβ−グロビン遺伝子が影響を受ける）、ヘモグロビンＥサラセミア（２つのβ−グロビン遺伝子が影響を受ける）、および重症型βサラセミア（クーリー貧血としてもまた公知であり、２つのβ−グロビン遺伝子が影響を受ける結果として、β−グロビンタンパク質の完全な非存在がもたらされる）を含む。βサラセミアは、複数の機関に影響を及ぼし、無視できない罹患率および死亡率と関連し、現在のところ一生にわたるケアを必要とする。近年では、鉄のキレート化と組み合わせた定期的な輸血の使用に起因して、βサラセミアを有する患者の平均余命が延長されているが、輸血および消化管による鉄の吸収過剰の両方から生じる鉄過負荷は、心疾患、血栓症、性腺機能低下症、甲状腺機能低下症、糖尿病、骨粗鬆症、および骨減少症など、重篤な合併症を引き起こし得る（Ｒｕｎｄら、２００５年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５３巻：１１３５〜１１４６頁）。βサラセミアのマウスモデルに関して本明細書で実証される通り、任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせた、ＧＤＦ１５ポリペプチドを使用して、本明細書に記載されているものなどのサラセミア症候群を処置することができる。
【０１０１】
一部の実施形態において、任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせた、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、サラセミア症候群に加えて、無効赤血球生成による障害を処置するために使用することができる。このような障害として、鉄芽球性貧血（遺伝性または後天性）；赤血球生成異常性貧血（Ｉ型およびＩＩ型）；鎌状赤血球貧血；遺伝性球状赤血球症；ピルビン酸キナーゼ欠損症；葉酸欠損症（先天性疾患、摂取量の減少、または要求量の増加に起因する）、コバラミン欠損症（先天性疾患、悪性貧血、吸収障害、膵臓機能不全、または摂取量の減少に起因する）、ある特定の薬物、または説明されていない原因などの状態により潜在的に引き起こされる巨赤芽球性貧血（先天性赤血球生成異常性貧血、不応性巨赤芽球性貧血、または赤白血病）；骨髄線維症（骨髄化生）および骨髄ろうを含む骨髄ろう性貧血；先天性赤芽球性ポルフィリン症；ならびに鉛中毒が挙げられる。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、無効赤血球生成に対する支持療法と組み合わせて使用することができる（例えば、同時にまたは異なる時間に投与するが、一般に、薬理的効果の重複が達成されるような方法で投与する）。そのような療法は、貧血を処置する、赤血球または全血液のいずれかを用いた輸血を含む。慢性貧血または遺伝性貧血では、鉄ホメオスタシスの正常な機構が、繰り返される輸血により圧倒され、鉄の、心臓、肝臓、および内分泌腺などの生体組織内の、毒性であり、潜在的に致死性である蓄積を最終的にもたらす。したがって、無効赤血球生成を長期にわたって患っている患者のための支持療法はまた、１種または複数種の鉄キレート化分子による処置であって、尿および／または糞便中の鉄排出を促進し、これにより、組織鉄過剰負荷を予防または逆転する処置も含む（Hershko、２００６年、Haematologica、９１巻：１３０７〜１３１２頁；Caoら、２０１１年、Pediatr  Rep  ３巻（２号）：ｅ１７頁）。有効な鉄キレート化剤は、ヒドロキシルラジカルおよび酸化生成物の触媒による生成を通じた大部分の鉄毒性をもたらす可能性がある、非トランスフェリン結合鉄の酸化された形態である三価鉄に選択的に結合し、それを中和することができるものでなければならない（Espositoら、２００３年、Blood、１０２巻：２６７０〜２６７７頁）。これらの剤は、構造的に多様であるが、全て、個々の鉄原子の化学量が１：１（六座剤（hexadentate  agent））、２：１（三座）、または３：１（二座）である中和性八面体配位錯体を形成することができる酸素または窒素ドナー原子を保有する（Kalinowskiら、２００５年、Pharmacol  Rev、５７巻：５４７〜５８３頁）。有効な鉄キレート化剤はまた、比較的低分子量であり（７００ダルトン未満）、患部組織にアクセス可能なように水および脂質のどちらにも可溶性である。鉄キレート化分子の特定の例は、毎日の非経口投与が必要な細菌起源の六座剤であるデフェロキサミン、ならびに経口で活性な合成剤であるデフェリプロン（二座）およびデフェラシロクス（三座）である。２種の鉄キレート化剤の同日投与からなる併用療法には、キレート化単独療法に対して無反応性の患者における、およびデフェロキサミン（dereroxamine）単独での患者の服薬遵守が不十分である問題の克服において有望である（Caoら、２０１１年、Pediatr  Rep  ３巻（２号）：ｅ１７頁；Galanelloら、２０１０年、Ann  NY  Acad  Sci、１２０２巻：７９〜８６頁）。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、無効赤血球生成に対するヘプシジンアゴニストと組み合わせて使用することができる。主に肝臓で産生される循環ポリペプチドであるヘプシジンは、吸収性腸細胞、肝細胞、およびマクロファージ上に局在する鉄輸送タンパク質であるフェロポーチンの分解を誘導する能力により、鉄代謝の主要な調節因子と考えられる。概して、ヘプシジンは細胞外鉄の利用可能性を低下させ、したがって、ヘプシジンアゴニストは、無効赤血球生成の処置において有益であり得る（Nemeth、２０１０年、Adv  Hematol、２０１０巻：７５０６４３頁）。この見解は、βサラセミアのマウスモデルにおけるヘプシジン発現の増大による有益な効果によって裏付けられる（Gardenghiら、２０１０年、J  Clin  Invest、１２０巻：４４６６〜４４７７頁）。
【０１０４】
一部の実施形態では、ＧＤ１５ポリペプチドは、ＥＰＯの有害作用を受けやすい患者においてＥＰＯ受容体活性化因子の必要用量を減らすために、これらの活性化因子と組み合わせて使用することができる。ＥＰＯの主要な有害作用は、ヘマトクリットレベルまたはヘモグロビンレベルの過剰な上昇および多血症である。ヘマトクリットレベルの上昇は、高血圧症（より特定すれば、高血圧症の悪化）および血管内血栓症をもたらし得る。報告されている他のＥＰＯの有害作用であって、それらの一部が高血圧症と関連する有害作用は、頭痛、インフルエンザ様症候群、シャントの閉塞、心筋梗塞、および血栓症に起因する脳痙攣、高血圧性脳症、および赤血球無形成である。（Ｓｉｎｇｉｂａｒｔｉ（１９９４年）、Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ、７２巻（補遺６号）：Ｓ３６〜Ｓ４３頁；Ｈｏｒｌら（２０００年）、Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１５巻（補遺４号）：５１〜５６頁；Ｄｅｌａｎｔｙら（１９９７年）、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、４９巻、６８６〜６８９頁；およびＢｕｎｎ（２００２年）、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３４６巻（７号）、５２２〜５２３頁を参照されたい。）
【０１０５】
本明細書で開示されるＧＤＦ１５ポリペプチドの赤血球レベルに対する迅速な効果は、これらの因子がＥＰＯとは異なる機構で作用することを示す。したがって、これらのアンタゴニストは、ＥＰＯに十分に応答しない患者において赤血球レベルおよびヘモグロビンレベルを高めるために有用であり得る。例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、通常〜増加させた（＞３００ＩＵ／ｋｇ／週）用量のＥＰＯの投与によってヘモグロビンレベルが目標のレベルまで上昇しない患者に有益であり得る。ＥＰＯ応答が不十分な患者は、貧血の全ての型で見られるが、がんの患者および末期腎疾患の患者において、より多くの非応答者数が特に頻繁に観察されている。ＥＰＯに対する不十分な応答は、構成的なもの（すなわち、ＥＰＯによる最初の処置時に観察される）であるか、または後天的なもの（例えば、ＥＰＯによる処置を繰り返すと観察される）であり得る。
【０１０６】
古典的な鎌状赤血球症（ＳＣＤ；ｓｉｃｋｌｅ−ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ、ｄｒｅｐａｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）には多数の遺伝子が寄与する。主に、鎌状赤血球症は、β−グロビン遺伝子の変異（コドン６におけるグルタミン酸からバリンへの変異）によって引き起こされる遺伝性障害である。例えば、Kassimら（２０１３年）Annu  Rev  Med、６４巻：４５１〜４６６頁を参照されたい。鎌状赤血球貧血とは、鎌状赤血球症の最も一般的な形態を指し、βＳ対立遺伝子（ＨｂＳＳ）にホモ接合性変異を有し、鎌状赤血球症の人の６０〜７０％に影響を及ぼしている。β−グロビン遺伝子の変異が原因で、脱酸素された状態になると露出する疎水性モチーフを伴って異常なヘモグロビン分子が産生される［例えば、Eatonら（１９９０年）Adv  Protein  Chem、４０巻：６３〜２７９頁；Steinberg、MH（１９９９年）N  Engl  J  Med、３４０巻（１３号）：１０２１〜１０３０頁；およびBallasら（１９９２年）Blood、７９巻（８号）：２１５４〜６３頁を参照されたい］。露出すると、別々のヘモグロビン分子の鎖が重合し、これにより、赤血球膜の損傷および細胞の脱水が起こる。膜損傷は、一部において、エリスロサイト膜の外葉におけるホスファチジルセリンの発現をもたらす膜脂質の再分布によって顕在化する［例えば、（２００２年）Blood、９９巻（５号）：１５６４〜１５７１頁を参照されたい］。外面化したホスファチジルセリンは、マクロファージおよび活性化された内皮細胞の両方への接着を促進し、これは血管（ｖａｓｏ）閉塞に寄与する。したがって、低酸素の状態では、赤血球のヘモグロビンが長い結晶状に沈殿し、これにより、細長く伸び、形態学的に切り換わって「鎌状」赤血球になる。遺伝子型と脱酸素の大きさおよび程度がヘモグロビン重合の重症度に寄与する。胎児性ヘモグロビンが存在すると、比例して病理学的なヘモグロビンポリマーの量が減少し、血管閉塞性クリーゼから保護されることが実証されている。
【０１０７】
一部の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、それを投与することを必要とする被験体に、鎌状赤血球症を処置するため、特に、鎌状赤血球症の１つまたは複数の合併症（例えば、貧血、貧血クリーゼ、脾腫、疼痛クリーゼ、胸部症候群、急性胸部症候群、輸血要求、臓器損傷、疼痛薬（管理）必要性、脾臓血球貯留クリーゼ（splenic  sequestration  crises）、高溶血クリーゼ（hyperhemolytic  crisis）、血管閉塞、血管閉塞クリーゼ、急性心筋梗塞、鎌状赤血球慢性肺疾患、血栓塞栓、肝不全、肝腫大、肝臓血球貯留（ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）、鉄過剰負荷、脾臓梗塞、急性のおよび／または慢性腎不全、腎盂腎炎、動脈瘤、虚血性脳卒中、実質内出血、くも膜下出血、室内出血、周辺網膜の虚血、増殖性鎌状網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｓｉｃｋｌｅ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、硝子体出血、および／または持続勃起症）を処置または予防するために使用することができる。
【０１０８】
ある特定の態様では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、それを投与することを必要とする被験体に、鎌状赤血球症または鎌状赤血球症の１つもしくは複数の合併症を処置するために、１つまたは複数のさらなる薬剤（例えば、ヒドロキシウレア、ＥＰＯアンタゴニスト、ＥＰＯ、オピオイド鎮痛薬、非ステロイド性抗炎症薬、コルチコステロイド、鉄キレート化剤）または支持療法（例えば、赤血球輸血）と組み合わせて投与することができる。
【０１０９】
鎌状赤血球症の患者の大多数にとって処置の頼みの綱は支持的なものである。鎌状赤血球症の患者に対する現行の処置の選択肢としては、抗生物質、疼痛管理、静脈内輸液（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｆｌｕｉｄ）、輸血、外科手術、およびヒドロキシウレアなどの化合物が挙げられる。
【０１１０】
ヒドロキシウレア（例えば、Ｄｒｏｘｉａ（登録商標））は、鎌状赤血球症の処置に関して承認された薬物である。ヒドロキシウレアは、Ｓ期細胞傷害性薬物であり、長期間療法のために使用される。ヒドロキシウレアは、ヘモグロビンＦのレベルを上昇させ、それによりＳ−ポリマーの形成および赤血球の鎌状赤血球化が予防されると考えられる。ヒドロキシウレアはまた、ＮＯ産生を増大させると考えられる。鎌状赤血球症の成人におけるヒドロキシウレアの多施設試験から、ヒドロキシウレアが、有痛性エピソードの発生率をほぼ半分に低減することが示された。しかし、現在、ヒドロキシウレアは、鎌状赤血球症の重症合併症に罹患しており、毎日の投薬レジメンに従うことができる患者においてのみ使用される。一般的に、ヒドロキシウレア療法は、服薬遵守の潜在性が高い構造化された環境で与えられる場合にのみ有効であると考えられている。残念ながら、多くの鎌状赤血球症の患者はヒドロキシウレアに対して不応性である。一部の実施形態では、本開示の方法は、鎌状赤血球症を処置することを必要とする被験体において、本開示のＧＤＦ１５ポリペプチドとヒドロキシウレアの組合せを投与することにより、鎌状赤血球症を処置することに関する。一部の実施形態では、本開示の方法は、鎌状赤血球症の１つまたは複数の合併症を処置または予防することを必要とする被験体において、本開示のＧＤＦ１５ポリペプチドとヒドロキシウレアの組合せを投与することにより、鎌状赤血球症の１つまたは複数の合併症を処置または予防することに関する。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子および／または１つもしくは複数のさらなる療法（例えば、ヒドロキシウレアによる処置）と組み合わせた、本開示のＧＤＦ１５ポリペプチドを、赤血球または全血液のいずれかによる輸血と組み合わせて使用して、鎌状赤血球症または鎌状赤血球症の１つもしくは複数の合併症を有する患者において貧血を処置することができる。全血液または赤血球の輸血を頻繁に受ける患者では、鉄ホメオスタシスの正常な機構が圧倒され、鉄の、心臓、肝臓、および内分泌腺などの生体組織内の、毒性であり、潜在的に致死性である蓄積を最終的にもたらす可能性がある。定期的な赤血球輸血は、種々の血液ドナー単位への曝露を必要とし、よって、同種免疫の危険性が高い。血管アクセスの困難、鉄キレート化の利用可能性および服薬遵守、ならびに高額な費用は、なぜ赤血球輸血の数を限定することが有益であり得るかという理由の一部である］。一部の実施形態では、本開示の方法は、鎌状赤血球症を処置することを必要とする被験体において、ＧＤＦ１５ポリペプチドと１つまたは複数の血液細胞輸血の組合せを施すことにより、鎌状赤血球症を処置することに関する。一部の実施形態では、本開示の方法は、鎌状赤血球症の１つまたは複数の合併症を処置または予防することを必要とする被験体において、本開示のＧＤＦ１５アンタゴニストと１つまたは複数の赤血球輸血の組合せを施すことにより、鎌状赤血球症の１つまたは複数の合併症を処置または予防することに関する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドによる処置は、鎌状赤血球症の患者における輸血要求を減少させること、例えば、鎌状赤血球症または鎌状赤血球症の１つもしくは複数の合併症を有効に処置するために必要な輸血の頻度および／または量を減少させることにおいて有効である。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、任意選択で、ＥＰＯ受容体活性化因子および／または１つもしくは複数のさらなる療法（例えば、ヒドロキシウレアによる処置）と組み合わせたＧＤＦ１５ポリペプチドを、１種または複数種の鉄キレート化分子と組み合わせて使用して、ＳＣＤ患者において尿および／または糞便中の鉄排出を促進し、これにより、組織鉄過剰負荷を予防または逆転することができる。有効な鉄キレート化剤は、ヒドロキシルラジカルおよび酸化生成物の触媒による生成を通じた大部分の鉄毒性をもたらす可能性がある、非トランスフェリン結合鉄の酸化された形態である三価鉄に選択的に結合し、それを中和することができるものであるべきである［例えば、Espositoら（２００３年）Blood、１０２巻：２６７０〜２６７７頁を参照されたい］。これらの剤は、構造的に多様であるが、全て、個々の鉄原子の化学量が１：１（六座剤）、２：１（三座）、または３：１（二座）である中和性八面体配位錯体を形成することができる酸素または窒素ドナー原子を保有する［Kalinowskiら（２００５年）Pharmacol  Rev、５７巻：５４７〜５８３頁］。一般に、有効な鉄キレート化剤はまた、比較的低分子量であり（例えば、７００ダルトン未満）、患部組織にアクセス可能なように水および脂質のどちらにも可溶性である。鉄キレート化分子の特定の例としては、デフェロキサミン（デスフェリオキサミンＢ、デスフェロキサミンＢ、ＤＦＯ−Ｂ、ＤＦＯＡ、ＤＦＢ、またはデスフェラールとしても公知）、毎日の非経口投与が必要な細菌起源の六座剤、ならびに経口で活性な合成剤であるデフェリプロン（二座；Ｆｅｒｒｉｐｒｏｘ（商標）としても公知）およびデフェラシロクス（三座；ビス−ヒドロキシフェニル−トリアゾール、ＩＣＬ６７０、またはＥｘｊａｄｅ（商標）としても公知）が挙げられる。２種の鉄キレート化剤の同日投与からなる併用療法には、キレート化単独療法に対して無反応性の患者における、およびデフェロキサミン単独での患者の服薬遵守が不十分である問題の克服において有望である［Caoら（２０１１年）Pediatr  Rep  ３巻（２号）：ｅ１７頁；およびGalanelloら（２０１０年）Ann  NY  Acad  Sci、１２０２巻：７９〜８６頁］。
【０１１３】
ある特定の態様では、本開示は、環状鉄芽球および／または遺伝子ＳＦ３Ｂ１の１つもしくは複数の変異が存在することによって特徴付けられるＭＤＳを有する患者の処置を含め、ＧＤＦ１５ポリペプチドを用いて、ＭＤＳおよび鉄芽球性貧血を処置する方法、特に、ＭＤＳの１つまたは複数の亜型または合併症を処置または予防する方法を提供する。特に、本開示は、ＧＤＦ１５ポリペプチドを使用して、例えば、貧血、好中球減少、脾腫、輸血要求、急性骨髄性白血病の発生、鉄過剰負荷、および鉄過剰負荷の合併症、その中でも、うっ血性心不全、心不整脈、心筋梗塞、他の形態の心疾患、糖尿病、呼吸困難、肝疾患、および鉄キレート化療法の有害作用を含めた、ＭＤＳおよび鉄芽球性貧血の１つまたは複数の合併症を処置または予防するための方法を提供する。
【０１１４】
特に、本開示は、骨髄中の赤芽球の数が増加している（細胞過形成）ＭＤＳ患者において；骨髄中の鉄芽球が１％超、２％超、３％超、４％超、５％超、６％超、７％超、８％超、９％超、１０％超、１１％超、１２％超、１３％超、１４％超、１５％超、１６％超、１７％超、１８％超、１９％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超のＭＤＳ患者において；環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）のＭＤＳ患者において；環状鉄芽球および血小板増加症を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ−Ｔ）のＭＤＳ患者において；単一系統異形成（unilineage  dysplasia）を伴う不応性血球減少症（ＲＣＵＤ）のＭＤＳ患者において；多系統異形成および環状鉄芽球を伴う不応性血球減少症（ＲＣＭＤ−ＲＳ）のＭＤＳ患者において；ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＤＮＭＴ３Ａ、またはＴＥＴ２の体細胞変異のあるＭＤＳ患者において；ＡＳＸＬ１またはＺＲＳＲ２の体細胞変異のないＭＤＳ患者において；鉄過剰負荷を伴うＭＤＳ患者において；および好中球減少のＭＤＳ患者においてなど、ＧＤＦ１５ポリペプチドを使用して、貧血またはＭＤＳの亜型における他の合併症を処置または予防するための方法を提供する。
【０１１５】
また、特に、本開示は、ＧＤＦ１５ポリペプチドを使用して、これだけに限定されないが、環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）；環状鉄芽球および血小板増加症を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ−Ｔ）；多系統異形成および環状鉄芽球を伴う不応性血球減少症（ＲＣＭＤ−ＲＳ）；アルコール依存症と関連する鉄芽球性貧血；薬物誘発鉄芽球性貧血；銅欠乏（亜鉛毒性）に起因する鉄芽球性貧血；低体温に起因する鉄芽球性貧血；Ｘ連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ）；ＳＬＣ２５Ａ３８欠損症；グルタレドキシン５欠損症；赤芽球増殖性プロトポルフィリン症；運動失調を伴うＸ連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ／Ａ）；Ｂ細胞免疫不全、発熱、および発育遅延を伴う鉄芽球性貧血（ＳＩＦＤ）；ピアソン骨髄−膵臓症候群；ミオパチー、乳酸アシドーシス、および鉄芽球性貧血（ＭＬＡＳＡ）；チアミン応答性巨赤芽球性貧血（ＴＲＭＡ）；ならびに原因不明の症候性／非症候性鉄芽球性貧血を含めた、貧血または鉄芽球性貧血の他の合併症を処置または予防するための方法を提供する。
【０１１６】
ある特定の態様では、本開示は、骨髄異形成症候群、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ならびに、乳がん、膵がん、胃がん、前立腺がん、およびぶどう膜黒色腫などの、ＳＦ３Ｂ１の生殖細胞系列変異または体細胞変異と関連する障害または障害の合併症を処置または予防するための方法を提供する。ある特定の態様では、障害は、ＳＦ３Ｂ１変異について検査陽性である骨髄細胞を有する被験体、特に、骨髄異形成症候群、ＣＬＬおよびＡＭＬの被験体におけるものであり得る。任意選択で、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の変異は、エクソン、イントロンまたは５’または３’非翻訳領域におけるものである。任意選択で、ＳＦ３Ｂ１の変異は、アミノ酸配列の変化を引き起こすか、または当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化を引き起こさない。任意選択で、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の変異は、以下の変化から選択される、当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸の変化を引き起こす：Ｋ１８２Ｅ、Ｅ４９１Ｇ、Ｒ５９０Ｋ、Ｅ５９２Ｋ、Ｒ６２５Ｃ、Ｒ６２５Ｇ、Ｎ６２６Ｄ、Ｎ６２６Ｓ、Ｈ６６２Ｙ、Ｔ６６３Ａ、Ｋ６６６Ｍ、Ｋ６６６Ｑ、Ｋ６６６Ｒ、Ｑ６７０Ｅ、Ｇ６７６Ｄ、Ｖ７０１Ｉ、Ｉ７０４Ｎ、Ｉ７０４Ｖ、Ｇ７４０Ｒ、Ａ７４４Ｐ、Ｄ７８１Ｇ、Ａ１１８８Ｖ、Ｎ６１９Ｋ、Ｎ６２６Ｈ、Ｎ６２６Ｙ、Ｒ６３０Ｓ、Ｉ７０４Ｔ、Ｇ７４０Ｅ、Ｋ７４１Ｎ、Ｇ７４２Ｄ、Ｄ８９４Ｇ、Ｑ９０３Ｒ、Ｒ１０４１Ｈ、Ｉ１２４１Ｔ、Ｇ３４７Ｖ、Ｅ６２２Ｄ、Ｙ６２３Ｃ、Ｒ６２５Ｈ、Ｒ６２５Ｌ、Ｈ６６２Ｄ、Ｈ６６２Ｑ、Ｔ６６３Ｉ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｎ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ７００Ｅ、およびＶ７０１Ｆ。
【０１１７】
患者は、患者を、通常は約１０ｇ／ｄｌから約１２．５ｇ／ｄｌの間、典型的には約１１．０ｇ／ｄｌである目標のヘモグロビンレベル（Jacobsら、２０００年、Nephrol  Dial  Transplant、１５巻、１５〜１９頁も参照されたい）まで回復させることが意図された投薬レジメンにより処置することができるが、目標のレベルが低いほど、引き起こされる心血管の副作用が少なくなる。あるいは、ヘマトクリットレベル（細胞によって占有される血液試料の体積の百分率）を赤血球の状態の尺度として使用することができる。健康な個体のヘマトクリットレベルは、成人男性では４１〜５１％であり、成人女性では３５〜４５％である。目標ヘマトクリットレベルは、通常、およそ３０〜３３％である。さらに、ヘモグロビン／ヘマトクリットレベルは、人によって変動する。したがって、最適に、目標ヘモグロビン／ヘマトクリットレベルは、各患者について個別化することができる。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＧＤＦ１５ポリペプチドにより処置されているか、またはＧＤＦ１５ポリペプチドによる処置を受ける候補である患者を、該患者における１つまたは複数の血液パラメーターを測定することによって管理するための方法を提供する。血液パラメーターは、ＧＤＦ１５ポリペプチドによる処置を受ける候補である患者に対する適切な投薬を評価するため、ＧＤＦ１５ポリペプチドによる処置中に血液パラメーターをモニターするため、ＧＤＦ１５ポリペプチドによる処置中に投薬量を調整するかどうかを評価するため、および／または、ＧＤＦ１５ポリペプチドの適切な維持用量を評価するために使用することができる。血液パラメーターのうちの１つまたは複数が正常レベル外である場合、ＧＤＦ１５ポリペプチドの投薬を減少させるか、遅らせるか、または終了することができる。
【０１１９】
本明細書中で提供される方法に従って測定され得る血液学的パラメータとしては、例えば、赤血球レベル、血圧、貯蔵鉄、および、当該分野で認識されている方法を使用する、赤血球レベルの増加と相関する体液中に見出される他の作用因子が挙げられる。そのようなパラメータは、患者からの血液試料を使用して決定され得る。赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、および／またはヘマトクリットレベルの増加により、血圧の上昇が引き起こされ得る。
【０１２０】
一実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドによる処置を受ける候補である患者において、１つまたは複数の血液パラメーターが、正常範囲外であるか、または正常の高値側である場合には、血液パラメーターが自然にまたは治療的介入によって正常または許容されるレベルに戻るまで、ポリペプチドの投与の開始を遅らせることができる。例えば、候補患者が高血圧または前高血圧である場合には、患者の血圧を降下させるために、患者を降圧剤で処置することができる。例えば、利尿薬、アドレナリン作用阻害剤（アルファ遮断薬およびベータ遮断薬を含む）、血管拡張薬、カルシウムチャネル遮断薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、またはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬を含めた、個々の患者の状態に適する任意の降圧剤を使用することができる。あるいは、血圧は、食事および運動レジメンを使用して処置することができる。同様に、候補患者の鉄貯蔵が正常よりも低いか、または正常の低値側である場合には、患者の鉄貯蔵が正常または許容されるレベルに戻るまで、患者を、適切な食事および／または鉄補給剤のレジメンで処置することができる。赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルが正常よりも高い患者については、レベルが正常または許容されるレベルに戻るまでＧＤＦ１５ポリペプチドの投与を遅らせることができる。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドによる処置を受ける候補である患者において、１つまたは複数の血液パラメーターが、正常範囲外であるか、または正常の高値側である場合には、投与の開始を遅らせることができる。しかし、ＧＤＦ１５ポリペプチドの投薬の投薬量または頻度は、ＧＤＦ１５ポリペプチドを投与した際に血液パラメーターの許容されない上昇が生じる危険性を低下させる量に設定することができる。あるいは、ＧＤＦ１５ポリペプチドと血液パラメーターの望ましくないレベルに対処する治療剤とを組み合わせる治療レジメンを患者のために開発することができる。例えば、患者の血圧が上昇しているか、またはＧＤＦ１５ポリペプチドにより血圧の上昇が引き起こされると思われる場合には、ＧＤＦ１５ポリペプチドおよび降圧剤の投与を含む治療レジメンをデザインすることができる。鉄貯蔵が所望よりも低い患者については、ＧＤＦ１５ポリペプチドおよび鉄補給の治療レジメンを開発することができる。
【０１２２】
一実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドによる処置を受ける候補である患者について、１つまたは複数の血液パラメーターについてのベースラインパラメーター（複数可）を確立することができ、ベースライン値（複数可）に基づいて、その患者に対する適切な投薬レジメンを確立することができる。あるいは、患者の病歴に基づいて確立されたベースラインパラメーターを使用して、患者に対するＧＤＦ１５ポリペプチドの適切な投薬レジメンを通知することができる。例えば、健康な患者の確立されたベースライン血圧読み取りが定義された正常範囲を超えている場合、ＧＤＦ１５ポリペプチドによる処置の前に患者の血圧を、一般的な集団について正常と考えられる範囲内にもってくる必要はない場合がある。ＧＤＦ１５ポリペプチドによる処置前の１つまたは複数の血液パラメーターについての患者のベースライン値を、ＧＤＦ１５ポリペプチドによる処置中の血液パラメーターのあらゆる変化をモニターするための関連する比較値として使用することもできる。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドによる治療を受ける患者において１つまたは複数の血液パラメーターを測定する。血液パラメーターは、処置中に患者をモニターするために使用することができ、ＧＤＦ１５ポリペプチドの投薬の調整もしくは終了または別の治療剤のさらなる投薬を可能にする。例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドの投与により、血圧、赤血球レベル、もしくはヘモグロビンレベルの上昇、または鉄貯蔵の減少が生じた場合には、ＧＤＦ１５ポリペプチドの１つまたは複数の血液パラメーターに対する影響を低減するために、ＧＤＦ１５ポリペプチドの用量について、量または頻度を減少させることができる。ＧＤＦ１５ポリペプチドの投与により患者にとって有害な１つまたは複数の血液パラメーターの変化が生じた場合には、ＧＤＦ１５ポリペプチドの投薬を、血液パラメーター（複数可）が許容されるレベルに戻るまで、一時的にまたは恒久的に終了することができる。同様に、ＧＤＦ１５ポリペプチドの投与の用量または頻度を減らした後に１つまたは複数の血液パラメーターが許容される範囲内に入らなかった場合には、投薬を終了することができる。ＧＤＦ１５ポリペプチドの投薬の減少または終了の代わりに、またはそれに加えて、患者に、血液パラメーター（複数可）の望ましくないレベルに対処するさらなる治療剤、例えば、降圧剤または鉄補給剤などを投薬することができる。例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドによる処置を受けている患者の血圧が上昇している場合には、ＧＤＦ１５ポリペプチドの投薬を同じレベルで継続することができ、かつ、降圧剤を治療レジメンに追加することができる；ＧＤＦ１５ポリペプチドの投薬（例えば、量および／または頻度）を減らすことができ、かつ、降圧剤を治療レジメンに追加することができる；またはＧＤＦ１５ポリペプチドの投薬を終了することができ、かつ、患者を降圧剤で処置することができる。
【０１２４】
４．医薬調製物
ある特定の実施形態では、本発明のＧＤＦ１５ポリペプチドは、薬学的に許容されるキャリアと共に製剤化する。例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、単独でまたは医薬調製物の成分として投与することができる。対象の化合物は、ヒト医学または獣医学において使用するための、任意の都合のよいやり方での投与用に製剤化することができる。上記の通り、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、プロドメインポリペプチドを含む製剤として調製することが望ましい場合がある。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、本発明の治療方法は、調製物を、全身にまたは局部的に、埋没物またはデバイスとして投与することを含む。投与する場合、本発明において使用するための医薬調製物は、当然、パイロジェンフリーの、生理的に許容される形態である。上記の通り任意選択で調製物に同様に含めることができるＧＤＦ１５ポリペプチド以外の治療的に有用な薬剤は、主題のＧＤＦ１５ポリペプチドと同時にまたは逐次的に投与することができる。
【０１２６】
典型的には、化合物は、非経口的に投与される。非経口投与に適した医薬調製物は、１種または複数種のＧＤＦ１５ポリペプチドを、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、意図されたレシピエントの血液との等張性を製剤に与える溶質または懸濁剤または増粘剤を含有し得る、１種または複数種の薬学的に許容される滅菌等張性水溶液もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルション、または、使用する直前に滅菌注射用溶液もしくは分散液中に再構成することができる滅菌粉末（例えば、凍結乾燥物）と組み合わせて含み得る。本発明の医薬組成物に利用することができる適切な水性キャリアおよび非水性キャリアの例としては、水、糖、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、および適切なそれらの混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。
【０１２７】
さらに、調製物は、封入または注入して、標的組織部位に送達するための形態にすることができる。ある特定の実施形態では、本発明の調製物は、１つまたは複数の治療用化合物（例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチド）を標的組織部位送達すること、発達している組織のための構造をもたらすことが可能であり、最適には体内への再吸収が可能であるマトリックスを含み得る。例えば、マトリックスにより、ＧＤＦ１５ポリペプチドの緩慢な放出をもたらすことができる。そのようなマトリックスは、他の埋め込みでの医学的適用に現在使用されている材料で形成されたものであり得る。
【０１２８】
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容的外観および界面特性に基づく。主題の組成物の特定の適用により、適切な製剤が定義される。組成物のための潜在的なマトリックスは、生分解性であり、化学的に定義された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ酸無水物であり得る。他の潜在的な材料は、骨または皮膚のコラーゲンなど、生分解性であり、かつ生物学的に明確に定義される。別のマトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリックス成分で構成される。他の潜在的なマトリックスは、焼結したヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミネート、または他のセラミックスなど、非生分解性であり、化学的に定義される。マトリックスは、ポリ乳酸とヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンとリン酸三カルシウムなど、上記の型の材料のいずれかの組合せで構成され得る。バイオセラミックスは、カルシウム−アルミネート−ホスフェートなどの組成を変更し、また、孔径、粒子サイズ、粒子の形状、および生分解性を変更するために加工することができる。
【０１２９】
投薬レジメンは、主治医により、ＧＤＦ１５ポリペプチドの作用を改変する様々な因子を考慮して決定されることが理解される。様々な因子としては、これだけに限定されないが、患者の赤血球計数、ヘモグロビンレベル、収縮期血圧もしくは拡張期血圧または他の診断的評価、所望の目標の赤血球計数、患者の年齢、性別、および食事、赤血球レベルの低下に寄与し得るあらゆる疾患の重症度、投与時間、ならびに他の臨床的因子が挙げられる。最終組成物への他の公知の成長因子の添加も、投薬量に影響を及ぼし得る。進行は、赤血球レベルおよびヘモグロビンレベルの周期的な評価、ならびに網状赤血球レベルおよび造血プロセスの他の指標の評価によってモニターすることができる。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＧＤＦ１５ポリペプチドをインビボにおいて産生させるための遺伝子療法も提供する。そのような療法では、上で列挙した障害を有する細胞または組織内にＧＤＦ１５ポリヌクレオチド配列を導入することによってその治療効果を達成する。ＧＤＦ１５ポリヌクレオチド配列の送達は、キメラウイルスなどの組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を使用して達成することができる。治療用ＧＤＦ１５ポリヌクレオチド配列の送達に好ましいのは、標的化リポソームの使用である。
【０１３１】
本明細書中で教示されるような遺伝子治療に利用され得る種々のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または、ＲＮＡウイルス、例えば、レトロウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターは、マウスもしくはトリのレトロウイルスの誘導体であり得る。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベーマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。多数のさらなるレトロウイルスベクターが多数の遺伝子を組み込み得る。これらのベクターは全て、形質導入された細胞が同定および生成され得るように、選択マーカーについての遺伝子を移送または組み込み得る。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を付着させることによって、標的特異的とされ得る。好ましい標的化は、抗体を用いて達成される。当業者は、ＧＤＦ１５ポリペプチドを含むレトロウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にするために、特定のポリヌクレオチド配列がレトロウイルスゲノム中に挿入され得るか、または、ウイルスエンベロープに付着され得ることを認識する。
【実施例】
【０１３２】
本発明は、ここで、一般的に記載されるが、単に特定の実施形態および本発明の実施形態を例示する目的のために含められ、本発明を限定することは意図されない以下の実施例を参照するとより容易に理解される。
【０１３３】
（実施例１）
生物活性のあるＧＤＦ１５ポリペプチドの生成
本出願者らは、生物活性のあるネイティブな組換えＧＤＦ１５を生成するための方法体系を以前に開示し、このタンパク質を使用して、ＧＤＦ１５がそれを通じてシグナル伝達を行うＩ型受容体およびＩＩ型受容体を同定した（米国特許出願第１４／４６５，１８２号）。
【０１３４】
ＣＨＯ細胞におけるＧＤＦ１５の安定発現
本出願者らは、さらなる試験のために、ＣＨＯ細胞を使用して成熟ヒトＧＤＦ１５（ｈＧＤＦ１５）およびマウスＧＤＦ１５（ｍＧＤＦ１５）を発現させた。ヒトＧＤＦ１５前駆体タンパク質（配列番号１３）またはマウスＧＤＦ１５前駆体タンパク質（配列番号１４）をコードする、ＵＣＯＥ（商標）ベースの構築物をＣＨＯ−ＰＡＣＥ細胞株に安定にトランスフェクトした。１０ｎＭ、２０ｎＭ、および５０ｎＭのメトトレキサートレベルでクローンを選択し、次いで、コロニーを形成した任意のクローン（メトトレキサート濃度ごとに１つまたは２つ）をプールした。ＵＣＯＥ（商標）プールは、発現の安定性を維持しながら増幅するのは難しいので遺伝子増幅は実施しなかった。希釈クローニングの代わりに、高発現プールを同定し、ｈＧＤＦ１５およびｍＧＤＦ１５を生成するために使用した。
【０１３５】
ヒトＧＤＦ１５の精製
精製を開始するために、ｈＧＤＦ１５を安定に発現するＣＨＯ細胞からの馴化培地を酢酸によりｐＨ４．７に調整した。培地を周囲温度で１０分間インキュベートした後、遠心分離によって沈殿物を除去した。上清を０．８μｍの使い捨てフィルターにより濾過した。ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を緩衝液Ａ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．７）および緩衝液Ｂ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．７）により平衡化した。ローディングを１００ｃｍ／時間で実施した。カラムからタンパク質が溶出しなくなるまで、カラムを２０％Ｂ（２００ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄し、次いで、０％Ｂに戻して洗浄していかなる残留塩も除去した。タンパク質を、５０ｍＭのトリス、６Ｍの尿素、ｐＨ８．０を用いてカラムからタンパク質が溶出しなくなるまで溶出し（トリス−尿素プール）、その後、５０ｍＭのトリス、６Ｍの尿素、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０を用いて溶出した（トリス−尿素−塩プール）。各プールを５０ｍＭの４−モルホリノエタンスルホン酸（morpholineethanesulfonic  acid）（ＭＥＳ、ｐＨ６．５）中、４℃で一晩透析した。
【０１３６】
トリス−尿素−塩プール中に見いだされたＧＤＦ１５は、ウエスタンブロット分析に基づくと分解しており、したがって、このプールは廃棄した。トリス−尿素プールを、緩衝液Ａ（５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５）および緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＭＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で予め平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にローディングした。フロースルーを回収し、カラムを１０％Ｂ（１００ｍＭのＮａＣｌ）、その後、１０〜５０％Ｂ勾配（１００〜５００ｍＭのＮａＣｌ）を用い、５カラム体積にわたって１２０ｃｍ／時間で洗浄した。フロースルーおよび洗浄画分をウエスタンブロットによって評価した後、タンパク質は、主にフロースルー中に見いだされた。フロースルーを、ＨＰＬＣに接続した逆相分取Ｃ４カラム（Ｖｙｄａｃ）に注入し、緩衝液Ａ（水／０．１％ＴＦＡ）および緩衝液Ｂ（アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）で洗浄した。毎分４．５ｍＬで１時間にわたる２５〜４０％Ｂ勾配で最良の分解能がもたらされた。回収した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ）およびウエスタンブロットにより評価して、遠心エバポレーターで濃縮する画分を選択した。
【０１３７】
マウスＧＤＦ１５の精製
馴化培地を酢酸によりｐＨ４．７に調整した。培地を周囲温度で１０分間インキュベートした後、遠心分離によって沈殿物を除去した。上清を０．８μｍの使い捨てフィルターにより濾過した。ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を緩衝液Ａ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．７）および緩衝液Ｂ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．７）により平衡化した。ローディングを１００〜１５０ｃｍ／時間で実施し、カラムからタンパク質が溶出しなくなるまで、カラムを緩衝液Ａで洗浄した。ＵＶトレースに基づいて、カラムからタンパク質が溶出しなくなるまで、カラムを５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０で洗浄した。次いで、５０ｍＭのＭＥＳ、６００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０を用い、５〜６カラム体積にわたってタンパク質を溶出した。カラムを５０ｍＭのＭＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で洗浄し、次いで、５０ｍＭのトリス、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄した。ウエスタンブロットにより、トリス−溶出画分中に一部のタンパク質が見いだされたが、以前の実験からこれらの画分中に見出されるｍＧＤＦ１５は基本的に不活性であることが示されているので、さらなる精製には使用しなかった。その代わりに、６００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０を用いて溶出されたタンパク質を使用して精製を継続した。このプールをＨＰＬＣに接続した逆相分取Ｃ４カラム（Ｖｙｄａｃ）に注入した。緩衝液Ａは水／０．１％ＴＦＡ、緩衝液Ｂはアセトニトリル／０．１％ＴＦＡであった。タンパク質を、２５〜４０％Ｂ勾配を用い、毎分４．５ｍＬで１時間にわたって溶出した。逆相カラム画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ）およびウエスタンブロットによって評価した後、純粋なｍＧＤＦ１５を含有する画分をプールし、遠心エバポレーターで濃縮した。
【０１３８】
配列確認および生物活性
精製された組換えＧＤＦ１５ポリペプチドの同一性をＮ末端配列決定によって確認した。成熟組換えｍＧＤＦ１５は、全長形態（配列番号１１）およびＮ’Δ４短縮形態（配列番号１２）として精製され得る。成熟組換えｈＧＤＦ１５は全長形態（配列番号３）ならびにＮ’Δ２短縮形態（配列番号４）で精製されており、本出願者らは、ｍＧＤＦ１５のＮ’Δ４短縮形態と類似したｈＧＤＦ１５のＮ’Δ４短縮形態（例えば、配列番号８）を想定する。
【０１３９】
（実施例２）
野生型マウスにおける組換えＧＤＦ１５投与の赤血球指標に対する効果
ＧＤＦ１５の循環レベルは、βサラセミアにおいてなど、無効赤血球生成によって特徴付けられるヒト貧血において著しく上昇する（Tannoら、２００７年、Nat  Med、１３巻：１０９６〜１１０１頁）。しかし、研究試験のための生物活性のあるＧＤＦ１５の利用可能性が限られていること、およびＧＤＦ１５シグナル伝達経路に関する不確実性に起因して、そのような疾患における内在性ＧＤＦ１５の役割は不明なままである。実施例１に記載の通り生成および精製した生物活性のあるネイティブなＧＤＦ１５を用いて、本出願者らは、野生型マウスにおける定常状態の赤血球生成条件の間の、ＧＤＦ１５による処置の赤血球数、ヘモグロビン濃度、およびヘマトクリットに対する効果を調査した。本実験では、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、組換えマウスＧＤＦ１５（０．３ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（トリス緩衝食塩水）を腹腔内に用いて１日おきに３週間にわたって処置し、その時点で、全血球計算（ＣＢＣ）による分析のために尾静脈を介して血液試料を取得した。ビヒクルと比較して、この用量レベルおよび頻度でのＧＤＦ１５による処置により、赤血球数、ヘモグロビン濃度、およびヘマトクリットの、およそ６％から９．５％の間の統計的に有意な増大が引き起こされた（図２）。ＧＤＦ１５による処置の白血球または他の血液パラメーターに対する実質的な効果はなく、したがって、赤血球系系列（erythroid  lineage）の細胞に対する選択的効果の証拠がもたらされた。これらの結果は、組換えのネイティブなＧＤＦ１５の持続的投与により、エリスロサイト数、ヘモグロビン濃度、およびヘマトクリットによって測定される、インビボにおける赤血球の循環レベルを上昇させることができることを示すものである。
【０１４０】
（実施例３）
ＧＤＦ１５による処置は、エクスビボにおける赤血球系前駆体からの赤血球の形成を急速に促進する
実施例２に記載の持続的なＧＤＦ１５による処置の赤血球指標に対する効果は、理論的に、赤血球の形成の増大以外の因子によって、例えば、既に循環している赤血球の寿命が増すことによって、または、血漿体積の減少によって媒介される可能性がある。したがって、本出願者らは、組換えのネイティブなＧＤＦ１５により直接赤血球の形成を増大させることができるかどうかを調査した。
【０１４１】
赤血球系前駆細胞を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓから入手した野生型マウス胚（胚齢１２日）の肝臓から単離した。肝組織を機械的粉砕に供し、得られた細胞懸濁液を、３００μｍのメッシュを通過させた。次いで、肝臓細胞を、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ３ｅ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５Ｒ、Ｌｙ−６Ｃ、およびＬｙ−６Ｇに対するビオチン化抗体のパネル（Ｂｉｏｔｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｐａｎｅｌ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、＃５５９９７１）と共にインキュベートして、Ｅａｓｙ  Ｓｅｐ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた成熟赤血球系細胞（Ｔｅｒ１１９＋）ならびに赤血球系系列でない細胞（ＣＤ３ｅ＋など）の選択的な排除を可能にした。次いで、残りの初期の赤血球系前駆細胞［主にコロニー形成単位、赤血球系（ＣＦＵ−Ｅ）の段階にあるもの］を、分化を可能にするが促進はしない最適以下の増殖培地：２Ｕ／ｍｌのＥＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、４０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１、２００μｇ／ｍｌのホロトランスフェリン、および１００μＭのβ−メルカプトエタノールを補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養した。
【０１４２】
精製した赤血球系前駆体をこの増殖培地中、組換えマウスＧＤＦ１５を伴って、または伴わずに培養した。２４時間処置した前駆体を検査したところ、ＧＤＦ１５（５０ｎｇ／ｍｌ）で処置した前駆体は、増殖培地のみに曝露した同じ数の前駆体細胞から形成された細胞ペレットよりもはるかに明るい赤色の細胞ペレットを形成したことが明らかであった（図３）。赤色の強度は、エリスロサイト成熟度の機能的なマーカーである細胞のヘモグロビンレベルに対応する。その後の、２４時間または４８時間の処置後のフローサイトメトリーによるこれらの細胞の分析から、Ｔｅｒ１１９免疫染色の強度の増大によって、および細胞サイズの縮小によって決定される通り（データは示していない）、ＧＤＦ１５が成熟赤芽球の数を有意に増加させることが確認された。赤芽球分化が進行するにしたがい、Ｔｅｒ１１９レベルが進行性に上昇し、赤芽球サイズが進行性に縮小することが十分に確立された。まとめると、これらの所見は、組換えＧＤＦ１５が、エクスビボにおいて赤血球系前駆細胞からの赤血球の形成を急速にかつ直接促進できることを示す。
【０１４３】
（実施例４）
ストレスによる赤血球生成のマウスモデルにおけるＧＤＦ１５とＥＰＯの相乗効果
貧血によって生じる組織低酸素症は、組織への酸素送達を増大させる生理的ストレス応答の活性化を引き起こす。この応答はＥＰＯに依存するが、定常状態の赤血球生成とは機構が異なると考えられ、したがって、「ストレスによる赤血球生成」と称される（Paulsonら、２０１１年、Curr  Opin  Hematol、１８巻：１３９〜１４５頁）。マウスモデルにおけるＧＤＦ１５の赤血球指標に対する効果を調査するために、成体Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスを、１日目にＥＰＯ（１８００Ｕ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）またはビヒクル（ＴＢＳ）を用いて前処置してストレスによる赤血球生成を誘導した。次いで、これらのマウスを組換えマウスＧＤＦ１５（１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）またはビヒクル（ＴＢＳ）を用いて、２日目および３日目に日ごと処置し、４日目に、全血球計算による分析のために血液を回収した。この実験の３日間の時間枠の中で、ＥＰＯもＧＤＦ１５も単独ではヘモグロビン濃度をビヒクルと比較して有意に上昇させなかったが、この２つの剤を用いた併用処置ではヘモグロビン濃度の有意な上昇がもたらされ、これは予想外に相乗的であった、すなわち、それらの個々の効果の合計よりも大きかった（図４）。この型の相乗作用は、一般に、個々の剤が異なる細胞機構によって作用することの証拠とみなされる。特に、野生型マウスをＥＰＯ単独で２４時間処置すると、赤血球生成組織（骨髄）において、ビヒクルと比較して１０倍を超えるＧＤＦ１５  ｍＲＮＡレベルの一過性の上昇が引き起こされた（データは示していない）。他の所見（以下を参照されたい）と合わせて、これらの結果は、ＧＤＦ１５が、ＥＰＯによる赤血球生成刺激の内在性メディエーターであり、したがって、外因性ＧＤＦ１５ポリペプチドの赤血球形成を促進する能力の根本的な基礎を提供することを示唆する。
【０１４４】
（実施例５）
内在性ＧＤＦ１５は、マウスにおける失血による貧血からの回復に関与した
本出願者らは、ＥＰＯ受容体活性化因子の投与を必要としない、ストレスによる赤血球生成の生理的形態である急性失血による貧血の条件下で赤血球生成組織におけるＧＤＦ１５発現を調査した。失血による貧血を誘導するために、成体Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスに、３日連続して、等体積の食塩水による置き換え（ｉ．ｐ）を伴って瀉血した（毎日４００μｌ）（Ramosら、２０１１年、Blood、１１７巻：１３７９〜１３８９頁）。試験終了時に骨髄、脾臓、全血、および血清を回収した。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＲｉｂｏＰｕｒｅ  Ｋｉｔを使用して骨髄および脾臓からＲＮＡを単離した。ＲＴ−ＰＣＲ反応物は、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キットにより生成されたインプットｃＤＮＡを１００ｎｇ含有し、ＲＴ−ＰＣＲは、Ｂｉｏ−Ｒａｄから購入したｉＴａｑ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを使用して実施した。対照（出血させていないマウス）と比較して、血液除去は、瀉血の完了後１２時間および２４時間の時点で（骨髄と脾臓の両方）、および４８時間の時点で（脾臓のみ）、ＧＤＦ１５  ｍＲＮＡの有意なレベルの上昇を引き起こした（図５Ａ〜Ｂ）。これらの結果は、ストレスによる赤血球生成の生理的に関連するモデルにおいて、失血により、赤血球生成組織におけるＧＤＦ１５  ｍＲＮＡレベルが一過性に上方制御されることを示すものである。
【０１４５】
次に、インビボにおいて、瀉血したマウスにおけるＧＤＦ１５発現の前述の変化に赤血球系前駆体の数の変更が伴うかどうかを決定した。標準の方法に従って実施したフローサイトメトリーによって決定された通り、失血による貧血を有するマウスの脾臓におけるＴｅｒ１１９＋赤血球前駆体の数が、瀉血の２４時間後に、出血させていない対照と比較して有意に増加し、したがって、失血により、より成熟した細胞への集団シフトが誘発されることが確認された（図５Ｃ）。予測通り、脾臓重量もまた、瀉血の２４時間後までに２倍超になり（データは示していない）、これは、ストレスによる赤血球生成の間に赤血球系前駆体の数が増加したことを反映していた。これらの結果は、マウスにおける失血に応答した赤血球前駆体集団の増大および分化の前および／またはその間に、赤血球系組織においてＧＤＦ１５  ｍＲＮＡレベルのスパイクが起こることを示す。外因性ＧＤＦ１５の、エクスビボにおいて赤血球形成を促進する能力を考慮すると、これらの結果は、ＧＤＦ１５が、インビボにおいて低酸素条件下で赤血球の形成を促進する誘導性赤血球系シグナル（erythroid  signal）であることを強力に示唆する。
【０１４６】
要約すると、前述の結果は、ＧＤＦ１５ポリペプチドによる処置により、エクスビボにおいて赤血球形成を促進できること（実施例３）、およびインビボにおいて、定常状態の赤血球生成の条件下（実施例２）またはストレスによる赤血球生成の条件下（実施例４）で赤血球指標を増大できることを示す。さらに、本明細書で開示される結果は、ＧＤＦ１５を、急性失血による貧血によって誘発される、赤血球産生を促進する内在性赤血球生成シグナルとして関連づける（実施例５）。したがって、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、種々の型の貧血および赤血球およびヘモグロビンの増大を必要とする他の状態を有する患者における赤血球数、ヘモグロビン濃度、および／またはヘマトクリットを増大させるために有用であり得る。ＧＤＦ１５ポリペプチドとＥＰＯ受容体活性化因子を用いた併用処置の効果は、ＧＤＦ１５ポリペプチドとＥＰＯ受容体活性化因子とをそれらのそれぞれの用量で別々に投与した場合の効果の合計よりも大きくなり得る。ある特定の実施形態では、この相乗作用は、ＥＰＯ受容体活性化因子のより低い用量で目標の赤血球レベルまたはヘモグロビン濃度を達成することを可能にし、それにより、ＥＰＯ受容体活性化のレベルが高いことと関連する潜在的な有害作用または他の問題が回避されるので、有利であり得る。
【０１４７】
参照による組み込み
本明細書において言及されている全ての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許のそれぞれが、具体的にかつ個別に、参照により組み込まれることが示されたかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
主題の特定の実施形態が考察されているが、上記の明細書は例示的なものであり、限定的なものではない。本明細書および以下の特許請求の範囲を精査すれば、多くの変形が当業者には明らかになると予想される。本発明の全範囲は、特許請求の範囲を均等物の全範囲と共に、明細書をそのような変形と共に参照することによって決定されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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