(57)【要約】      （修正有）【課題】信頼性があり、簡単に実行可能な非侵襲的全身骨格筋量の測定法を提供する。【解決手段】（ａ）１０〜２００ｍｇのＤ３−クレアチン、その塩、またはこれらの水和物を被検体に経口投与するステップと、（ｂ）Ｄ３−クレアチンの投与後、少なくとも１２時間経過させるステップと、（ｃ）被検体から生体試料を取得するステップと、（ｄ）生体試料中のクレアチニン濃度およびＤ３−クレアチニン濃度を定量するステップと、（ｅ）被検体の全身骨格筋量を計算するために、定量した上記クレアチニン濃度およびＤ３クレアチニン濃度を用いるステップとを含む。【選択図】図１
2020073890.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体の全身骨格筋量の定量方法であって、
（ａ）Ｄ３−クレアチンが被検体に経口投与され、Ｄ３−クレアチンが全身骨格筋クレアチンプールに希釈され、全身骨格筋クレアチンプールの同位体が定常状態となった被検体から取得された、クレアチニンおよびＤ３−クレアチニンを含有する生体試料である尿試料中のクレアチニンおよびＤ３−クレアチニンを、ＨＰＬＣ／ＭＳ、ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、ＬＣＭＳ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、および同位体比質量分析（ＩＲＭＳ）からなる群から選択される方法によって検出するステップと、
（ｂ）時間ｔにおけるクレアチニンおよびＤ３−クレアチニンを測定することによって上記生体試料中のＤ３−クレアチニンの濃縮率を測定するステップと、
（ｃ）Ｄ３−クレアチンの投与から時間ｔまでの尿中Ｄ３−クレアチンの総量を測定するステップと、
（ｄ）上記被検体の全身クレアチン貯蔵量を、下記の式（１）を用いて決定するステップと、
式（１）：
全身クレアチン貯蔵量
＝[Ｄ３−クレアチン投与量(g)−尿中Ｄ３−クレアチン総量(0-t)(g)]／上記（ｂ）で求めた濃縮率(t)
（ｅ）下記の式（２）に基づいて、上記被検体の全身骨格筋量を定量するステップ、
式（２）：
全身骨格筋量＝（全身クレアチン貯蔵量）／（骨格筋のクレアチン濃度）
とを含む方法。
【請求項２】
上記被検体に投与されたＤ３−クレアチンが、５〜２５０ｍｇのＤ３−クレアチン、その塩、またはこれらの水和物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記被検体に投与されたＤ３−クレアチンが、Ｄ３−クレアチン水和物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記被検体に投与されたＤ３−クレアチンが、Ｄ３−クレアチン一水和物であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記Ｄ３−クレアチンの投与から少なくとも２４時間経過後に取得された生体試料を用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記Ｄ３−クレアチンの投与から少なくとも３６時間経過後に取得された生体試料を用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記Ｄ３−クレアチンの投与から少なくとも４８時間経過後に取得された生体試料を用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
上記Ｄ３−クレアチンの投与から少なくとも６０時間経過後に取得された生体試料を用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記Ｄ３−クレアチンの投与から少なくとも７２時間経過後に取得された生体試料を用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
尿中への流出が最小限にとどまるように被検体にＤ３−クレアチンが投与され、投与されたＤ３−クレアチンの９９％以上が、全身骨格筋クレアチンプールに希釈され、全身骨格筋クレアチンプールの同位体が定常状態となった被検体から取得された生体試料を用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
骨格筋中のクレアチン濃度を、４．３ｇ／ｋｇとすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ３-クレアチンのトレーサーの経口投与を利用した、被検体のクレアチンの全身貯蔵量および全身骨格筋量を定量する方法に関するものであり、生体試料中のクレアチニン濃度のより優れた定量方法も包含する。
【背景技術】
【０００２】
骨格筋は、疾病（カヘキシー（ｃａｃｈｅｘｉａ）等）、肥満、および老化（サルコペニア（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）等）における身体活動の増減に対する代謝的適応において中心的な役割を果たす。サルコペニアは、加齢に関する骨格筋の減少として記載されており（Ｅｖａｎｓ  （１９９５）  Ｊ．  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．  ５０Ａ：５−８）、移動機能障害に関連し（ＪａｎｓｓｅｎおよびＲｏｓｓ，  （２００５）  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．  Ｈｅａｌｔｈ  Ａｇｉｎｇ  ９：４０８−１９）、高齢者の健康管理コストを大きく増加させている（Ｊａｎｓｓｅｎら（２００４）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｇｅｒｉａｔｒ．  Ｓｏｃ．  ５２：８０−５）。加齢に伴う骨格筋の減少は、エネルギー必要量の減少と、それに伴う肥満、衰弱、障害、インシュリン抵抗性、および糖尿病リスクの増加を伴う。疾病（カヘキシー）に潜在する骨格筋の減少は、死亡率の大きな増加を伴う（Ｅｖａｎｓ  （２００８）  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．  ２７：７９３−９）。
【０００３】
全身骨格筋量が老化および疾病において重要な役割を果たすことから、製薬技術においては、筋タンパク質合成を促進し、筋肉量を増加させる治療薬を特定する取組みがなされている。しかし、筋肉の合成および筋肉量の従来の定量方法は、侵襲的な処置（筋肉の生体組織検査等）を伴い、あるいは全身筋肉量の間接的なデータしか示さない高価な装置（つまりＤＥＸＡ、ＭＲＩ、またはＣＴ）に頼ることが多い。こうした制約のため、診療所で日常的に用いられる骨格筋量の概算方法や、筋肉量を概算するための診断基準が作り出されてこなかった。結果として、筋タンパク質合成量における治療薬候補の影響を定量する直接的な方法は存在しない。
【０００４】
したがって、信頼性があり、簡単に実行可能な非侵襲的全身骨格筋量の測定法が、本技術分野において依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、規定された単回投与量のＤ３−クレアチンのトレーサーを経口投与した後における尿試料中の定常状態のＤ３−クレアチニン濃縮度を用いて、被検体の全身クレアチン貯蔵量および骨格筋量を算出することができるという知見に基づいている。
【０００６】
本発明は、クレアチニンＭ＋２同位体の濃度を測定し、この濃度を希釈係数で割ることによって、生体試料中のクレアチニン濃度が定量可能であるという知見にさらに基づいている。該希釈係数は、生体試料中の、クレアチニンＭ＋０濃度に対するクチアチニンＭ＋２濃度の比である。これらのより優れた方法による生体試料中のクレアチン濃度の定量によって、広く利用可能な装置を用いて単一試料中のクレアチニン濃度およびＤ３−クレアチニン濃度を同時に測定することが可能となる。したがって、このようなより優れた検出方法によって、患者の骨格筋量の定量に用いられる本発明の方法の広範囲な適用が促進され得る。
【０００７】
したがって、本発明の一態様は、被検体内の全身骨格筋量の定量方法を提供し、上記方法は、
（ａ）１０〜２００ｍｇのＤ３−クレアチン、その塩、またはこれらの水和物を上記被検体に経口投与するステップと、
（ｂ）上記Ｄ３−クレアチンの投与後、少なくとも１２時間経過させるステップと、
（ｃ）上記被検体から生体試料を取得するステップと、
（ｄ）上記生体試料中のクレアチニン濃度およびＤ３−クレアチニン濃度を定量するステップと、
（ｅ）上記被検体の全身骨格筋量を計算するために、定量した上記クレアチニン濃度およびＤ３クレアチニン濃度を用いるステップとを含んでいる。
【０００８】
ある実施形態では、上記生体試料は尿試料である。
【０００９】
ある実施形態では、上記尿試料中のクレアチニンおよびＤ３−クレアチニン濃度がＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって定量される。
【００１０】
別の態様では、本発明は、被検体の生体試料中のクレアチニン濃度の定量方法を提供し、上記方法は、
（ａ）上記被検体から生体試料を取得するステップと、
（ｂ）上記生体試料を分析して、上記生体試料のクレアチニンＭ＋２同位体ピークのピーク面積を求めるステップと、
（ｃ）（ｂ）で求めたピーク面積と、Ｄ３−クレアチニンを用いて作成した検量線とを比較して、上記生体試料中のクレアチニンＭ＋２同位体濃度を定量するステップと、
（ｄ）（ｃ）で取得した濃度を、生体試料中のクレアチニンＭ＋０濃度に対するクレアチニンＭ＋２濃度の比である希釈係数で割るステップとを含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】成長期のラットの尿中Ｄ−３クレアチニン濃縮度および全身クレアチン貯蔵量を示す。Ａは、０．４７５ｍｇのＤ３−クレアチンの単回経口投与後、図示された時間における、９週齢のラット（平均体重３０４±１１ｇ、ｎ＝１０）、および１７週齢のラット（平均体重５５３±３９ｇ、ｎ＝１０）の尿中Ｄ−３クレアチニン濃縮度（質量分析による同位体比の定量）である。４８時間までに同位体の定常状態に達し、成長期のラットの各年齢グループ間で明確に分離されている（グループ間は常にＰ＜０．０００１；各グループ内の４８〜７２時間の間の差異は小さい；２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびスチューデントのｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ））。Ｂは、図１のラットグループの７２時間の尿中Ｄ３−クレアチニン濃縮度から算出したクレアチン貯蔵量であり、各年齢グループ間で明確に分離されている（ｐ＜０．０００１）。
【図２】図１のラットのグループにおいて、年齢効果を調整した、定量磁気共鳴（ＱＭＲ：Quantitative Magnetic Resonance）による除脂肪量（ＬＢＭ：Lean Body Mass）と全身クレアチン貯蔵量との間の相関関係（ｒａｌｌ  ｒａｔｓ＝０．６９；Ｐ＜０．００１）を示す。
【図３】図１の異なる年齢のラットの各グループ内でも、クレアチン貯蔵量と、定量磁気共鳴（左側）またはＤＥＸＡ（右側）のいずれかによる除脂肪量との間に有意な相関関係があることを示す。
【図４】２週間にわたって、溶媒またはデキサメタゾンを投与された２２週齢のラット（各グループにおいてｎ＝１０）の、定量磁気共鳴で定量した除脂肪量と、Ｄ３−クレアチン希釈物によって定量したクレアチン貯蔵量との間の有意な相関関係（それぞれ、Ｐ＜０．００１、およびＰ＝０．０１）を示す。
【図５】２つの横断的研究で用いられた全４０匹のラットの、定量磁気共鳴により定量した除脂肪量と、Ｄ３−クレアチン希釈物によって定量した全身クレアチン貯蔵量との間の相関関係（ｙ＝０．２０ｘ＋９１．６；ｒ＝０．９５１７；Ｐ＜０．０００１）を示す。
【図６】全身骨格筋量の定量方法の、ある実施形態のフローチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、規定された単回投与量のＤ３−クレアチンを経口投与した後の尿試料中のＤ３−クレアチニン濃縮度を用いて、被検体の全身クレアチン貯蔵量および骨格筋量を算出することができるという知見に基づいている。したがって、本発明は、非侵襲的で正確な全身骨格筋の定量方法を提供する。本発明の上記方法は、特に、全身骨格筋量の変化に関連した症状の診断およびモニタ、および筋肉量への治療薬候補の影響を判定し治療薬候補をスクリーニングする上で利用され得る。
【００１３】
上記方法によると、Ｄ３−クレアチンは被検体に経口投与される。本発明はメカニズムによって限定されるものではないが、Ｄ３−クレアチンはすぐに吸収、分布され、そして能動的に骨格筋に運搬され、骨格筋のクレアチンプールで希釈されると考えられている。骨格筋は全身クレアチンの大部分（＞９８％）を含有している。筋肉組織では、クレアチンは、１日あたり約１．７％の安定した割合で、非酵素的反応によって不可逆的にクレアチニンに変換される。このクレアチニンは、筋肉からすぐに拡散する安定した代謝産物であり、クレアチントランスポータの基質ではなく、筋肉へ送り返されることなく、尿中に排出される。その結果、同位体の定常状態に到達すると、規定された投与量のＤ３−クレアチンのトレーサーを経口投与した後のスポット尿試料中のＤ３−クレアチニン濃縮度は、筋肉のクレアチン濃縮度を反映しており、クレアチン貯蔵量を直接的に定量するために用いることができる。その結果、既知のクレアチン含有量に基づいて骨格筋量を計算することができる。
【００１４】
したがって、一態様において、本発明は、被検体内の全身骨格筋量の定量方法を提供し、上記方法は、
（ａ）１０〜２００ｍｇのＤ３−クレアチン、その塩、またはこれらの水和物を上記被検体に経口投与するステップと、
（ｂ）上記Ｄ３−クレアチンの投与後、少なくとも１２時間経過させるステップと、
（ｃ）上記被検体から尿試料を取得するステップと、
（ｄ）上記尿試料中のクレアチニン濃度およびＤ３−クレアチニン濃度を定量するステップと、
（ｅ）上記被検体の全身骨格筋量を算出するために、定量した上記クレアチニン濃度およびＤ３クレアチニン濃度を用いるステップとを含んでいる。
【００１５】
ある実施形態では、Ｄ３−クレアチン水和物が被検体に投与される。ある実施形態では、Ｄ３クレアチン一水和物が投与される。
【００１６】
被検体に対するＤ−３クレアチンの投与量は、標識クレアチンがすぐに血流中に吸収されて、尿中に流出する過剰の標識クレアチンが最小になるよう選択されることが好ましい。したがって、被検体がヒトの場合、Ｄ３−クレアチンは、概して５〜２５０ｍｇ（２０〜１２５ｍｇ等）である。ある実施形態では、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇのＤ３−クレアチンが投与される。ある実施形態では、被検体の性別に基づいて投与量が調整される。したがって、ある実施形態では、被検体が女性であり、１０〜５０ｍｇ（２０〜４０ｍｇ等）、または特に３０ｍｇのＤ３クレアチンが被検体に投与される。別の実施形態では、被検体が男性であり、４０〜８０ｍｇ（５０〜７０ｍｇ等）、特に６０ｍｇまたは７０ｍｇのＤ３−クレアチンが被検体に投与される。
【００１７】
経口投与に適した医薬品の剤形は、カプセル剤または錠剤；散剤または顆粒剤；それぞれ水性または非水性液体を有する液剤または懸濁剤；可食発泡剤（edible foams）または起泡剤（whips）；または水中油型液状乳剤あるいは油中水型液状乳剤等の個別の単位として提供されてもよい。例えば、錠剤またはカプセル剤で経口投与するために、薬剤の有効成分を、エタノール、グリセロール、水等の経口用の非毒性の薬学的に許容される不活性担体と混合してもよい。散剤は、通常、化合物を適当な微細な大きさに粉砕し、デンプンやマンニトール等の食用の糖質等の適当な薬学的担体と混合することで調製される。香料、保存剤、分散剤、および着色剤を加えてもよい。
【００１８】
カプセル剤は、粉末、液体、または懸濁液の混合物を調製し、ゼラチンまたは他の適当な殻用素材でカプセル化することで調製することができる。カプセル化の前に、コロイダルシリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたは固体ポリエチレングリコール等の滑剤または潤滑剤を上記混合物に添加してもよい。寒天、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム等の崩壊剤または可溶化剤を加えて、カプセル剤摂取時の薬物の有効性を向上させてもよい。さらに、望ましい場合、または必要性がある場合、適当な結合剤、潤滑剤、崩壊剤、および着色剤を上記混合物に加えても良い。適切な結合剤の例として、デンプン、ゼラチン、グルコース、β−ラクトース、またはコーン甘味料等の天然糖、アラビアゴム、トラガカント、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等の天然ゴムおよび合成ゴムが挙げられる。これらの投与形態における有用な潤滑剤の例として、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。崩壊剤としては、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
錠剤は、例えば、粉末混合物を調製し、顆粒化またはスラッギングし、潤滑剤および崩壊剤を加え、錠剤に圧縮して生成することができる。粉末混合物は、上述したように、適当に粉砕した化合物を、希釈剤または基剤と混合して調製してもよい。任意の成分として、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、またはポリビニルピロリドン等の結合剤、パラフィン等の溶解抑制剤、４級塩等の吸収促進剤、および／またはベントナイト、カオリン、またはリン酸二カルシウム等の吸着剤が挙げられる。上記粉末混合物は、シロップ剤、デンプン糊、アラビアゴム等の結合剤、セルロース溶液、または高分子材料等と湿式顆粒処理を行い、ふるいにかけるようにしてもよい。顆粒化する代わりに、上記粉末混合物を錠剤機にかけてもよく、錠剤機にかけられた該粉末混合物は、顆粒状に粉砕された不完全なスラッグとなる。顆粒が錠剤形成用の型に付着しないように、ステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク、または鉱油を加えて潤滑化してもよい。上記潤滑化した混合物は、その後錠剤に圧縮される。本発明の上記化合物を、フリーフロー不活性担体（free flowing inert carrier）と結合させ、顆粒化処理またはスラッギング処理を介さずに、直接錠剤に圧縮するようにしてもよい。シェラックの封入コーティング、糖衣または高分子材料のコーティング、およびワックスによる研磨コーティングからなる透明または不透明の保護コーティングを施しても良い。これらのコーティングに色素を加えて、他の製剤単位と区別してもよい。
【００２０】
液剤、シロップ剤、およびエリキシル剤等の経口用液体を、規定量の化合物を含有する一定量の投薬単位ごとに調製してもよい。シロップ剤は、例えば、化合物を適当な風味の水溶液に溶解して調製してもよく、エリキシル剤は、非毒性アルコール性溶媒を使用して調製してもよい。懸濁液は、概して非毒性溶媒に化合物を分散させて処方してもよい。エトキシル化イソステアリルアルコールなどの可溶化剤およびポリオキシエチレンソルビトールエーテル等の乳化剤を加えてもよい。本発明に従って使用してもよい可溶化剤として、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（ポリオキシエチレンヒマシ油）、ビタミンＥ、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール），およびＳｏｌｕｔｏｌ（ソルトール）が挙げられる。防腐剤、および／または、はっか油または天然甘味料、サッカリンまたはその他の人工甘味料等の風味添加剤を添加してもよい。
【００２１】
本発明の方法によると、尿中のＤ３−クレアチニン濃縮レベルが定常状態に達した後に、尿試料を採取することが好ましい。したがって、ある実施形態では、尿試料の採取前に、Ｄ３−クレアチンの投与後、少なくとも６時間または少なくとも１２時間経過させることができる。ある実施形態では、少なくとも２４時間経過させることができる。ある実施形態では、尿試料の採取前に、Ｄ３−クレアチンの投与後、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、または少なくとも７２時間経過させることができる。
【００２２】
本発明は、尿試料中のクレアチニンおよびＤ３−クレアチニンを検出する、特定のより優れた分析方法も包含する。具体的には、本発明は、ＨＰＬＣ／ＭＳ、特にＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる尿試料中のクレアチニンおよびＤ３−クレアチニンの検出方法を提供する。しかし、本発明の方法において公知の代替方法を使用して尿試料中のクレアチニンおよび／またはＤ３−クレアチニンを検出してもよい。そのような方法は、蛍光検出を用いたＨＰＬＣのＧＣ／ＭＳ分析に続く、クレアチニンの、直接または間接的な比色測定、ヤッフェ（Ｊａｆｆｅ）法、酵素分解分析、または誘導体化を含んでいる。
【００２３】
したがって、一態様では、本発明は、被検体の生体試料中のクレアチニン濃度の定量方法を提供し、上記方法は、
（ａ）上記被検体から生体試料を取得するステップと、
（ｂ）上記生体試料を分析して、上記生体試料のクレアチニンＭ＋２同位体ピークのピーク面積を求めるステップと、
（ｃ）（ｂ）で求めた上記ピーク面積と、Ｄ３−クレアチニンを用いて作成した検量線とを比較して、上記生体試料中のクレアチニンＭ＋２同位体濃度を定量するステップと、
（ｄ）（ｃ）で取得した濃度を、生体試料中のクレアチニンＭ＋０濃度に対するクレアチニンＭ＋２濃度の比である希釈係数で割るステップとを含んでいる。
【００２４】
上記生体試料は、任意の適切な試料であればよく、該試料としては、尿、血液、血清、血漿、または組織が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ある実施形態では、上記生体試料は尿試料である。別の実施形態では、上記生体試料は血液試料である。
【００２５】
好ましい実施形態では、クレアチニンＭ＋２同位体ピークのピーク面積が、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて求められる。
【００２６】
ある実施形態では、上記希釈係数は０．０００２１４２±０．００００２１４である。特に、上記希釈係数は０．０００２１４２±０．００００１（０．０００２１４２±０．０００００５等）である。
【００２７】
本発明の方法は、全身骨格筋量の変化に関連する症状を診断およびモニタする上で有用である。筋肉量の減少が、機能、行動状態、または生存において重要な働きをする症状の例としては、虚弱、高齢者のサルコペニアに限定されるわけではなく、カヘキシー（癌、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、心不全、ＨＩＶ感染、結核、末期腎不全（ＥＳＲＤ）等）；ＨＩＶの治療、移動機能障害（関節炎、慢性肺疾患等）を含む疾患に関連する筋肉の衰退；神経筋疾患（脳卒中、筋萎縮性側索硬化症等）；外傷、手術（股関節置換手術を含む）、医学的疾患、または療養を要する他の症状の後のリハビリ、感染または腫瘍性症状等の異化性疾患からの回復；代謝またはホルモン異常（真性糖尿病、性機能低下性状態、甲状腺疾患等）；薬物反応（グルココルチコイド、甲状腺ホルモン等）；栄養失調または自発的な体重減少等が挙げられる。特許請求の範囲に記載された方法は、スポーツに関連する全身骨格筋量の評価においても有用である。
【００２８】
本発明の方法は、全身骨格筋量を増加させる治療化合物を特定する、試験化合物のスクリーニングにも有用である。この実施形態によると、被検体への試験化合物の投与前後に、本方法にしたがって被検体の全身骨格筋量が測定される。上記試験化合物の全身骨格筋量への影響をモニタするために、全身骨格筋量の評価を適切な間隔で繰り返すことができる。
【実施例】
【００２９】
（実験）
Ｄ３−クレアチントレーサー希釈法を用いた前臨床モデルの全身骨格筋量の定量
ラット１匹あたり０．４７５ｍｇのＤ３−クレアチンを投与し、尿への流出最小限に止めて、Ｄ３−クレアチンが直ちに完全に吸収されて全身に循環するようにし、９９％以上のＤ３−クレアチントレーサーを、体内のクレアチン貯蔵量と平衡になるようにした。
【００３０】
その後、上記クレアチン希釈法を用いて、成長期のラットの尿中Ｄ３−クレアチン濃縮度を定量し、同位体が定常状態になるまでの時間を求めた。横断的研究では、ラット１匹あたり、９週齢と１７週齢の２つのラットのグループの各ラットに、０．４７５ｍｇのＤ３−クレアチンを単回経口投与し、投与から、２４時間、４８時間、７２時間後の時点で尿を採取した。予想通り、１７週齢の高齢ラットの尿中Ｄ３−クレアチニン濃縮度（過剰モルパーセント（ＭＰＥ）として表される）は、９週齢の若齢ラットよりも全ての時点で低かったが、これは全身クレアチンプール内でＤ３−クレアチントレーサーがより多く希釈されたことを反映している。両週齢のグループで、尿中の濃縮度は２４時間の時点が最も高く、４８〜７２時間の間で安定していることから、Ｄ３−クレアチントレーサー投与後の２４〜４８時間の間に同位体が定常状態に達したことを示している（図１Ａ）。
【００３１】
次に、トレーサーの濃縮度に基づいた貯蔵量を定量する式を用いて、全身クレアチン貯蔵量を算出し、単一のクレアチンプール（WｏｌｆｅおよびＣｈｉｎｋｅｓ（２００５）Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ：Ｓｉｎｇｌｅ−ｐｏｏｌ  ｍｏｄｅｌ．  ２ｎｄ  ｅｄ．  Ｉｓｏｔｏｐｅ  ｔｒａｃｅｒｓ  ｉｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．２１−９）とみなして、Ｄ３−クレアチン投与量（０．４７５ｍｇ）をＤ３−クレアチニン濃縮度（ＭＰＥ／１００）で割った。図１Ｂは、９週齢と１７週齢のラットグループのトレーサー投与から７２時間後の尿中濃縮度から算出した全身クレアチン貯蔵量を示しており、１７週齢の高齢ラットは、９週齢の若齢ラットよりもクレアチン貯蔵量が著しく多いことを示している。
【００３２】
Ｄ３−クレアチントレーサーを投与する前日に、全ラットの除脂肪量（ＬＢＭ）を、定量磁気共鳴（ＱＭＲ）またはＤＥＸＡのいずれかによって算定した。図２は、年齢効果を考慮した後、ＱＭＲによるＬＢＭと、クレアチン貯蔵量が有意に相関することを示している。ＱＭＲによるＬＢＭと、クレアチン貯蔵量は各年齢層内でも有意に相関しており、ＤＥＸＡによるＬＢＭと、クレアチン貯蔵量は１７週齢のグループ内で有意に相関している（図３）。
【００３３】
第２の横断的研究では、Ｄ３−クレアチンの投与前の２週間、より高齢のラットグループ（成長段階にある２２週齢のラット）に、生理食塩水溶媒、または骨格筋萎縮を誘発するデキサメタゾンのいずれかを、１日１回皮下投与した。９週齢と１７週齢のラットを用いた第１の横断的研究と同様に、４８〜７２時間の間に同位体が定常状態に達した。
【００３４】
上記溶媒を投与したコントロールと比較して、デキサメタゾンはＬＢＭを大きく減少させ（３５３±３２ｇ対４５９±４５ｇ、Ｐ＜０．００１）、全身クレアチン貯蔵量も大きく減少させた（１２１６±２２７ｇ対１８５３±２２８ｍｇ、Ｐ＜０．００１）。第１の研究と同様に、ＬＢＭとクレアチン貯蔵量は２つの各投与グループ間で有意な相関を示した（図４）。
【００３５】
図５は２つの横断的研究で用いられた全４０匹のラットのＬＢＭとクレアチン貯蔵量との相関を示している（ｒ＝０．９５；Ｐ＜０．００１）。
【００３６】
Ｄ３−クレアチントレーサー希釈法を用いたヒト被検者における全身骨格筋量の定量
ヒト被検者に、３０、６０または１００ｍｇのＤ３−クレアチン一水和物を単回経口投与する。その後、Ｄ３クレアチン一水和物の投与から１、２、３、４、５または６日後に尿試料を採取する。
【００３７】
各採取間隔で行われる尿の薬物動態分析には、ＩＲＭＳによるＭＰＥ率の定量、ＬＣＭＳによる総クレアチンおよび総クレアチニンに対する重水素標識クレアチンおよび重水素標識クレアチニンの比率、総クレアチニン、クレアチン貯蔵量、および尿中に排出された重水素標識クレアチン量（％）を含んでもよい。
【００３８】
定常状態の濃縮度（ＭＰＥ）は、視覚的に、および濃縮度（ＭＰＥ）の線形回帰対時間（各尿採取間隔の中間）の傾きの推定値から算定可能である。混合効果ＡＮＯＶＡモデルを、固定効果として時間（連続変数）に当てはめ、ランダム効果として被検者に当てはめることができる。時間効果の傾きの係数を用いて定常状態を求めることができる。傾きに対する９０％信頼区間を求めることができる。
【００３９】
クレアチン貯蔵量は、定常状態の間の各採取間隔において、定常状態の濃縮度に達した時に、下記の式に従って概算することができる。
【００４０】
[Ｄ３Ｃｒの投与量（ｇ）−尿中Ｄ３Ｃｒ（０−ｔ）の総量（ｇ）]／濃縮率（ｔ）
式中、ｔは、定常状態の間の尿の採取間隔である。
【００４１】
筋肉量は、クレアチン濃度が全筋湿重量（ＷＷＭ）あたり４．３ｇ／ｋｇであると想定してクレアチン貯蔵量から概算可能である（Ｋｒｅｉｓｂｅｒｇ（１９７０）Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８：２６４−７）。
【００４２】
筋肉量＝クレアチン貯蔵量／筋肉中のＣｒ濃度
クレアチン貯蔵量は、総尿クレアチニン（モル／日）をＫ（１／日）で割ることによって概算することもできる。
【００４３】
排出速度定数（Ｋ）は、各採取間隔の経過時間（採尿間隔の中間）に対する採尿間隔中のＤ３−クレアチン量の対数における下降線の傾きを概算する排出率法を用いて求めることが可能である。２４時間の尿中クレアチン排出量からクレアチン貯蔵量を算出する上で、代謝回転の概算の文献値を用いるよりも、このＫの概算の方が有用である。
【００４４】
臨床被検体の尿試料中のＤ３−クレアチンおよびＤ３−クレアチニンの定量分析方法
Ｄ３−クレアチン一水和物およびＤ３クレアチニンの参照標準物質をＣ／Ｄ／Ｎ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ,  Ｍｏｎｔｒｅａｌ  Ｃａｎａｄａから購入した。
【００４５】
（ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析）
Ｄ３−クレアチンの分離をＺｏｒｂａｘ  Ｈｉｌｉｃ  Ｐｌｕｓのシリカ分析カラム（５０×２．１ｍｍ，Ｒａｐｉｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＤ  １．８μ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｏｒｐ．，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ  ＣＡ．）を備えたＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．,  Ｍｉｌｆｏｒｄ，  Ｍａ．）を用いて実施した。注入量は概して８μＬである。
【００４６】
移動相Ａ（ＭＰ  Ａ）は、１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液から成り、移動相Ｂはアセトニトリルである。初期移動相組成が２％の１０ｍＭのギ酸アンモニウムのグラジエントクロマトグラフィーを、流速０．７ｍＬ／分で行った。このグラジエントクロマトグラフィーを０．５分間行い、その後、２．３分時点で、直線勾配が５０％ＭＰＡに達した。この直線勾配はすぐに８０％に上昇して、０．４分間持続し、その後２．９分時点で初期状態に戻った。総実施時間は３．５分であった。このグラジエントクロマトグラフィーによって、妨害化合物からのＤ３−クレアチンのベースライン分離が可能となった。
【００４７】
Ｄ３−クレアチンの検出をＳｃｉｅｘ  ＡＰＩ１５００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて行った。ＨＰＬＣシステムを、下記パラメータを用いてポジティブイオン化モードで作動するターボイオンスプレー源を介して、ＡＰＩ５０００に連結した。該パラメータは、イオン化温度：６５０℃、イオンスプレー電圧：２５００Ｖ、カーテンガス：４５（Ｎ２）、ネブライザーガス：６５（Ｎ２）、乾燥ガス：７０（Ｎ２）、衝突ガス：３（Ｎ２）である。他のすべての質量分析パラメータを個々のトランジションに合わせて最適化した。以下のイオントランジション（ＭＲＭ）が得られた。Ｄ３−クレアチン：ｍ／ｚ＝１３５〜ｍ／ｚ＝４７（保持時間は概して１．９９分）。標準クレアチンを、ｍ／ｚ＝１３９〜ｍ／ｚ＝５０のイオントランジション（保持時間は概して１．９９分）でモニタした。
【００４８】
クレアチニンおよびＤ３−クレアチニン分析物の分離を、Ｚｏｒｂａｘ  Ｈｉｌｉｃ  Ｐｌｕｓのシリカ分析カラム（寸法：５０×２．１ｍｍ，Ｒａｐｉｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＤ  １．８μ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｏｒｐ．，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ  ＣＡ．）を備えたＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．,  Ｍｉｌｆｏｒｄ，  Ｍａ．）を用いて実施した。注入量は概して５μＬであった。
【００４９】
移動相Ａは、５ｍＭギ酸アンモニウムから成り、移動相Ｂはアセトニトリルとした。初期移動相組成が２％の５ｍＭのギ酸アンモニウムのグラジエントクロマトグラフィーを流速０．７ｍＬ／分で行った。このグラジエンクロマトグラフィーを０．４分間行い、その後、２．１分時点で、直線勾配が４０％ＭＰＡに達した。この直線勾配はすぐに、２．２分時点で５０％に上昇して、０．４分間持続し、その後２．７分時点で最初の状態に戻った。総駆動時間は３．５分であった。このグラジエントクロマトグラフィーによって、妨害化合物からのｄ３−クレアチニンおよびクレアチニンのベースライン分離が可能となった。
【００５０】
クレアチニンおよびＤ３−クレアチニン分析物の検出をＳｃｉｅｘ  ＡＰＩ１５００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  Ｃａ．）を用いて行った。ＨＰＬＣシステムを、ポジティブイオン化モードで作動するターボイオンスプレー源を介して、下記パラメータを有するＡＰＩ５０００に連結した。該パラメータは、イオン化温度：３５０℃、イオンスプレー電圧：５５００Ｖ、カーテンガス：４５（Ｎ２）、ネブライザーガス：６０（Ｎ２）、乾燥ガス：６５（Ｎ２）、衝突ガス：３（Ｎ２）である。他のすべての質量分析パラメータを個々のトランジションに合わせて最適化した。以下のイオントランジション（ＭＲＭ）が得られた。Ｄ３−クレアチニン：ｍ／ｚ＝１１７〜ｍ／ｚ＝４７、およびクレアチニン（Ｍ＋２同位体）：ｍ／ｚ＝１１６〜ｍ／ｚ＝４４（保持時間は概して１．５分）。標準クレアチンを、ｍ／ｚ＝１２１〜ｍ／ｚ＝５１のイオントランジション（保持時間は概して１．５分）でモニタした。試料が緩衝液により希釈されるのを防ぐために、クレアチニンの代わりに、クレアチニンＭ＋２同位体の形態を得た。
【００５１】
Ｄ３−クレアチニン検量線を用いてヒトの尿の臨床試料中の内因性クレアチニン濃度値を定量する。Ｄ３−クレアチニン同位体は抽出、およびＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ処理の間クレアチニンと同様に挙動するので、純粋な尿マトリックスを用いて検量線用標準試料およびＱＣ試料を調製することができる。
【００５２】
ヒトの臨床試料中の内因性クレアチニン量（ｍ／ｚ＝１１４）はＤ３−クレアチニンの値よりもはるかに多い（〜１０００倍）。したがって、試料を希釈する代わりに、クレアチニンのＭ＋２同位体（ｍ／ｚ＝１１６）をモニタすることで、１つの試料分析からクレアチニンおよびＤ３−クレアチニンの同時測定が可能となる。（Ｍ＋２）内因性クレアチニンのＭＲＭ（１１６／４４）をモニタする。１１６／４４対１１４／４４のＭＲＭ比を示す補正係数を用いて、ｄ３−クレアチニン検量線から定量した算出濃度を補正する。（Ｍ＋２）ＭＲＭ／（Ｍ＋０）ＭＲＭの同位体比、または補正係数は０．００２８６である。したがって、Ｄ３クレアチンの投与量、および内因性クレアチニンに由来するＤ３−クレアチニン量は、１つのＤ３−クレアチニン検量線から定量することが可能である。
【００５３】
（実施例）
化学薬品および試薬：Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）から購入したアセトニトリルおよび水（すべてＨＰＬＣグレードまたはそれ以上）。Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）から購入したギ酸アンモニウム。ＣＤＮ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ，  Ｍｏｎｔｒｅａｌ  Ｃａｎａｄａから購入したｄ３−クレアチン（一水和物）およびｄ３−クレアチニンの参照標準。
【００５４】
ｄ３−クレアチンおよびｄ３−クレアチニンの原液を水で１．０ｍｇ／ｍＬに調製し、等価性を確認する。０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、および０．２μｇ／ｍＬ〜２００μｇ／ｍＬの範囲に水で調製した希釈液を用いて、ｄ３−クレアチンおよびｄ３−クレアチニンのヒトの尿の検量線用標準試料および品質管理（ＱＣ）試料をそれぞれ調製した。同位体標識された内部標準クレアチン（ＳＩＬ）（１３Ｃ３２Ｈ３１５Ｎ１−クレアチン）およびクレアチニン（ＳＩＬ）（１３Ｃ３２Ｈ４１５Ｎ１−クレアチニン）を水で１．０ｍｇ／ｍＬに調製した。これらの希釈液をアセトニトリルで５００ｎｇ／ｍＬに調製し、尿の検量線用標準試料、ＱＣ試料、および調査試料の抽出溶媒として用いた。
【００５５】
試料調製：（ｄ３−クレアチン、尿中クレアチニン、および尿中ｄ３−クレアチニン）
上記内部標準として機能するアセトニトリル溶液（５００ｎｇ／ｍＬ）を２００μＬの分取し、アセトニトリルを加えるダブルブランクサンプル以外の各ウェルに加えた。試料、検量線用標準試料、またはＱＣ試料を４０μＬ分取し、ＳＩＬを含有するプレート内の適切なウェルに移す。上記プレートを密封し、約３分間撹拌混合した。上記プレートを約３０００ｇで５分間遠心分離する。上清を未使用の９６ウェルプレートに移し、その後ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに注入して分析する。別々のヒトの尿試料からのＤ３−クレアチンおよびｄ３−クレアチニンを分析する。
【００５６】
（ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析）
ｄ３−クレアチン、ｄ３−クレアチニンおよびクレアチニンの分離を、Ａｇｉｌｅｎｔ
Ｚｏｒｂａｘ  Ｈｉｌｉｃ  Ｐｌｕｓのシリカ分析カラム（寸法：５０×２．１ｍｍ，Ｒａｐｉｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＤ  １．８μ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｏｒｐ．，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ  ＣＡ．）を備えたＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．,  Ｍｉｌｆｏｒｄ，  Ｍａ．）を用いて実施する。注入量は概して２μＬである。
【００５７】
Ｄ３−クレアチン：移動相Ａは、１０ｍＭのギ酸アンモニウムから成り、移動相Ｂはアセトニトリルである。初期移動相組成が２％の１０ｍＭのギ酸アンモニウムのグラジエントクロマトグラフィーを流速０．７ｍＬ／分で行う。このグラジエンクロマトグラフィーを０．５分間行い、その後、２．３分時点で、直線勾配が５０％ＭＰＡに達する。この直線勾配は０．２分かけて８０％に上昇して、０．４分間持続し、その後３．０分時点で最初の状態に戻る。総駆動時間は３．５分である。
【００５８】
ｄ３−クレアチンの検出をＳｃｉｅｘ  ＡＰＩ１５００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて行う。ＨＰＬＣシステムを、下記パラメータを用いてポジティブイオン化モードで作動するターボイオンスプレー源を介して、ＡＰＩ５０００に連結する。該パラメータは、イオン化温度：６５０℃、イオンスプレー電圧：２５００Ｖ、カーテンガス：４５（Ｎ２）、ネブライザーガス：６５（Ｎ２）、乾燥ガス：７０（Ｎ２）、衝突ガス：３（Ｎ２）である。他のすべての質量分析パラメータを個々のトランジションに合わせて最適化する。以下のイオントランジション（ＭＲＭ）が得られる。ｄ３−クレアチン：ｍ／ｚ＝１３５〜ｍ／ｚ＝４７（保持時間は概して２分）。ＳＩＬを、ｍ／ｚ＝１３９〜ｍ／ｚ＝５０のイオントランジション（保持時間は２分）でモニタする。
【００５９】
Ｄ３−クレアチニン：移動相Ａは、５ｍＭのギ酸アンモニウムから成り、移動相Ｂはアセトニトリルである。初期移動相組成が２％の５ｍＭのギ酸アンモニウムのグラジエントクロマトグラフィーを、流速０．７ｍＬ／分で行う。このグラジエンクロマトグラフィーを０．４分間行い、その後、２．１分時点で、直線勾配が６０％アセトニトリルに達する。この直線勾配はすぐに５０％アセトニトリルに上昇して、０．４分間持続し、その後２．７分時点で最初の状態に戻る。総駆動時間は３．５分である。
【００６０】
クレアチニンおよびｄ３−クレアチニン分析物の検出をＳｃｉｅｘ  ＡＰＩ１５００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて行う。ＨＰＬＣシステムを、下記パラメータを用いてポジティブイオン化モードで作動するターボイオンスプレー源を介して、ＡＰＩ５０００に連結した。該パラメータは、イオン化温度：３５０℃、イオンスプレー電圧：５５００Ｖ、カーテンガス：４５（Ｎ２）、ネブライザーガス：６０（Ｎ２）、乾燥ガス：６５（Ｎ２）、衝突ガス：３（Ｎ２）である。他のすべての質量分析パラメータを個々のトランジションに合わせて最適化する。以下のイオントランジション（ＭＲＭ）が得られる。ｄ３−クレアチニン：ｍ／ｚ＝１１７〜ｍ／ｚ＝４７、およびクレアチニン（Ｍ＋２同位体）：ｍ／ｚ＝１１６〜ｍ／ｚ＝４４（保持時間は概して１．５分）。ＳＩＬを、ｍ／ｚ＝１２１〜ｍ／ｚ＝５１のイオントランジション（保持時間は概して１．５分）でモニタした。試料が代替基質により希釈されるのを防ぐために、クレアチニンの代わりに、クレアチニンＭ＋２同位体ＭＲＭを取得する（クレアチニンを含まないコントロール尿では得られない）。これらの同位体は、抽出、およびＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ処理の間同様に挙動するので、純粋な尿マトリックスを用いて検量線用標準試料およびＱＣ試料を調製することができ、重水素化形態のクレアチニンから作成される検量線を用いて、内因性クレアチニンの定量を行うことができる。したがって、ｄ３−クレアチニン量および内因性クレアチニン量を単一のｄ３−クレアチニン検量線から定量することができる。
【００６１】
ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータを取得し、Ａｎａｌｙｔｅ（商標）ソフトフェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４．２，  ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ，  Ｃａｎａｄａ）を用いて処理した。の面積比に対するｄ３−クレアチニン濃度のキャリブレーションプロットを構築し、加重１／ｘ２線型回帰を該データに当てはめた。
【００６２】
（結果）
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いてバイオマーカーの生体分析定量を行うために、代替マトリックスまたは代替分析物を用いる必要がある。このアッセイでは、ｄ３−クレアチニンが内因的に検出されないのでヒトの尿を使用することができ、ｄ３―クレアチニン検量線からクレアチニンの定量を行うことができる。ｄ３−クレアチニンおよびクレアチニンの等価性が示された。
【００６３】
（Ｄ３−クレアチニンおよびクレアチニンの等価性の判定）
クレアチニンを定量するための代替分析物としてｄ３クレアチニンが利用可能であること、および１１６／４４（Ｍ＋２）のＭＲＭトランジションを同位体比の補正係数とともに利用可能であることを立証するために多くの実験が行われた。
【００６４】
クレアチニンの代替分析物としてｄ３クレアチニンが利用可能なことを確認するために、２つの濃度値でクレアチニンおよびｄ３クレアチニンの純粋標準液を調製し、同等のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ反応を示すようにした。２００ｎｇ／ｍＬおよび４０ｎｇ／ｍＬのクレアチニン標準液のピーク面積、およびｄ３クレアチニン標準液のピーク面積を、それぞれ１１４／４４および１１７／４７のＭＲＭトランジション用いて比較した。二つの溶液は、平均差異（％）および７．５％未満のＣＶ（％）において同等の反応を示した（表１参照）。
【００６５】
【表１】
2020073890.tif 000003
【００６６】
これらの結果は、ｄ３クレアチニンおよびクレアチニンが同等のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ反応を示し、ｄ３−クレアチニンをクレアチニンの代替分析物として利用することができることを示している。このことは、重水素化化合物が、アッセイを実証するために、安定した標識内部標準として管理環境下で通常使用されることから驚くべきことではない。これらの重水素化標準試料は、マトリックス効果、ならびにその他の抽出およびクロマトグラフィーに関する効果による分析物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ反応を補正することが示された。上記２つの化合物は、メチル基の３つの水素原子の余剰陽子にのみ違いがあるだけなので、抽出、クロマトグラフィー分離、および質量スペクトル検出において、ほぼ同一の反応を示すことが予想される。
【００６７】
（同位体比の決定）
この方法は、ｄ３クレアチンの投与によって変換されたヒトの尿中のｄ３クレアチニン量を定量するために用いられる。さらに、内因性クレアチニン量はｄ３クレアチニン検量線を用いて定量される。
【００６８】
ヒトの臨床尿試料中の内因性クレアチニン量は、ｄ３−クレアチニンの値よりもはるかに多い（〜１０００倍）。したがって、試料を希釈する代わりに、クレアチニンのＭ＋２同位体をモニタする。これにより、尿マトリックスの検量線を利用して、１つの試料からクレアチニンおよびｄ３−クレアチニンの同時測定が可能となる。（Ｍ＋２）内因性クレアチニンのＭＲＭ（１１６／４４）のピーク面積を、ｄ３クレアチニンＭＲＭ（１１７／４７の）とともにモニタする。１１６／４４対１１４／４４のＭＲＭ比を示す補正係数を用いて、ｄ３−クレアチニン検量線から定量した算出濃度を補正する。
【００６９】
同位体比（反応比）、または、本来豊富な形態のクレアチン（Ｍ＋０）つまりｍ／ｚ＝１１４から、ずっと少ない形態のクレアチニン（Ｍ＋２）、つまりｍ／ｚ＝１１６のピーク面積反応の差を、実験的に算出する。２つの異なる実験処理を用いて同位体比が決定される。この独自の実験の構成では、１つの標準濃度を用い、表２ａでは、２００ｎｇ／ｍＬのクレアチン溶液を用いた。Ｍ＋０およびＭ＋２のＭＲＭトランジション（１１４／４４および１１６／４４）でクレアチニンのピーク面積をそれぞれモニタする。分離した注入液、および、分離溶液の調製から生じることがある変数を減らすために１つの溶液を使用した。この濃度が選択されるのは、両ＭＲＭのピーク面積を検出器の範囲内とし、より小さいピークでもノイズに対する信号が十分なためである。しかし、日差測定では、表３に示すように変動性が見られる（±１０％）。したがって、この反応比を求めるためのさらなる実験を行った。２番目のアプローチでは、２つの別々の溶液を用いて上記反応比を実験的に決定する。各ＭＲＭトランジションの別々の溶液を、ピーク面積の規模が互いに近似するよう調製する。１０ｎｇ／ｍＬのクレアチニン溶液を用いて、１１４／４４のＭＲＭトランジションを取得し、５００ｎｇ／ｍＬの溶液を用いて、１１６／４４のＭＲＭトランジションを取得する。これらの溶液のＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムへの注入を１０回繰り返し、各溶液の平均ピーク面積比（ＰＡＲ）を決定する。その後、１１６／４４の平均ＰＡＲを補正した１１４／４４のＰＡＲで割り、反応比を算出する。２つのＭＲＭからのＰＡＲを比較するために、１０ｎｇ／ｍＬ溶液から得たＰＡＲに５０を掛ける（５００ｎｇ／ｍＬは１０ｎｇ／ｍＬの５０倍大きいため）。表２ｂに例を示す。これによって両溶液のピーク面積の値が近くなり、ノイズ値に対する信号に大きな違いがあるために両ピークを統合することで生じる誤差を排除することができる。
【００７０】
【表２】
2020073890.tif 000004
2020073890.tif 000005
【００７１】
補正したピーク面積比は１１４／４４のＭＲＭトランジションのピーク面積をモニタした５００ｎｇ／ｍＬのクレアチニン標準試料と同等となる。
【００７２】
同位体比（反応比）を、４カ月間にわたって複数回、２つの異なる三連四重極装置によって決定した。これら９つの平均値を求め、この反応比率の逆数を希釈係数として、ＬＩＭＳシステムにおいてクレアチニン値を補正するために用いた（表３参照）。
【００７３】
【表３】
2020073890.tif 000006
【００７４】
この実験的に決定された反応比率はクレアチニンＭ＋２（ＭＲＭ：１６／４４）のピーク面積を補正するために用いられ、これらの補正したクレアチニンのピーク面積をｄ３クレアチニンの標準試料（ＭＲＭ：１１７／４７）と同じ濃度のピーク面積と比較する。補正したクレアチニンのピーク面積とｄ３クレアチニン標準試料から得たピーク面積とを比較すると、差異（％）および１０％未満のＣＶ（％）において同等の反応を示した（表４参照）。
【００７５】
【表４】
2020073890.tif 000007
【図１】
2020073890.tif 000008
【図２】
2020073890.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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