(57)【要約】      （修正有）【課題】シミュレートされた生理環境における物質の挙動を分析するためのインビトロ方法および装置の提供。【解決手段】本方法は、第１の流体、ゲルマトリックスおよび第２の流体を準備するステップと、第１の流体およびゲルマトリックスを少なくとも１つの第１半透膜で分離するステップと、ゲルマトリックスおよび第２の流体を少なくとも１つの第２半透膜で分離するステップとを含む。この方法は、さらに、物質を第１の流体内に注入するステップと、第１の流体から、少なくとも１つの第１半透膜と、ゲルマトリックスと、少なくとも１つの第２半透膜とを通して、第２の流体内へ物質を移動させるステップと、第１の流体からの物質のクリアランスを測定するステップとを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シミュレートされた生理環境における物質の挙動を分析するインビトロ方法であって、
−第１の流体、ゲルマトリックス、および第２の流体を準備するステップと、
−少なくとも１つの第１半透膜によって、第１の流体とゲルマトリックスを分離するステップと、
−少なくとも１つの第２半透膜によって、ゲルマトリックスと第２の流体を分離するステップと、
−第１の流体内に物質を注入するステップと、
−第１の流体から、少なくとも１つの第１半透膜と、ゲルマトリックスと、少なくとも１つの第２半透膜とを通して、第２の流体内へ物質を移動させるステップと
−第１の流体からの物質のクリアランスを測定するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第１の流体が硝子体液であり、第２の流体が緩衝液、好ましくは生理学的に適切な緩衝液であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の流体からの物質のクリアランスを測定する前記ステップは、前記第１の流体、前記第２の流体または前記第１の流体および前記第２の流体における物質濃度を測定することによって行われることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの第１半透膜または前記少なくとも１つの第２半透膜の分画分子量（ＭＷＣＯ）を変化させるステップ、或いは前記ゲルマトリックスの組成を変化、好ましくは前記ゲルマトリックスの粘度を変化または前記ゲルマトリックスの成分の濃度を変化させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記注入された物質が、約１００〜約４００ｋＤａの範囲、好ましくは約１ｋＤａ〜約２５０ｋＤａの範囲、例えば４ｋＤａ〜１５０ｋＤａの大きさを有する分子を含むことを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも1つの第1膜が、網膜排除限界（ＲＥＬ）に実質的に対応する分画分子量（ＭＷＣＯ）を有することを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の流体内に物質を注入するステップは、物質送達系を介して前記第１の流体内に物質を注入することで、当該物質を前記第1の流体内に遅延して放出させることを含むことを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記物質が、高分子、製剤、賦形剤、タンパク質またはこれらの組み合わせのうち、少なくとも1つであることを特徴とする請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
シミュレートされた生理環境における分子の挙動を分析するための装置であって、
第１の流体を収容する第１区画室と、
ゲルマトリックスを収容する第２区画室と、
第２の流体を収容する第３区画室と、を含み、
当該装置は、さらに、
少なくとも１つの第１半透膜を支持する第１支持体と、
少なくとも１つの第２半透膜を支持する第２支持体と、を含み、
前記第２支持体は、前記第１支持体から離間して配置され、
前記第１支持体は、前記第１区画室と前記第２区画室の間に配置され、
前記第２支持体は、前記第２区画室と前記第３区画室の間に配置される
ことを特徴とする装置。
【請求項１０】
前記第１支持体は、前記第１区画室の多孔質壁および前記第２区画室の多孔質壁を形成し、
前記第２支持体は、前記第２区画室の多孔質壁および前記第３区画室の多孔質壁を形成することを特徴とする請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの第１半透膜が前記第１支持体上に配置され、前記少なくとも１つの第２半透膜が前記第２支持体上に配置され、前記少なくとも１つの第１半透膜が、前記少なくとも１つの第２半透膜の分画分子量（ＭＷＣＯ）以下の分画分子量（ＭＷＣＯ）を有することを特徴とする請求項９または請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの第１半透膜の分画分子量（ＭＷＣＯ）は、網膜排除限界（ＲＥＬ）に実質的に対応することを特徴とする請求項９から請求項１１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
前記第１支持体の形状および大きさが、網膜の形状および大きさに適合していることを特徴とする請求項１０から請求項１２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１４】
少なくとも前記第１支持体は、凹形状を有することを特徴とする請求項１０から請求項１３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１５】
シミュレートされた生理環境における分子の挙動を分析するための装置であって、
第１の流体を収容する第１区画室と、
ゲルマトリックスを収容する第２区画室と、
第２の流体を収容する第３区画室と、を含み、
当該装置は、さらに、
少なくとも１つの第１半透膜と、
少なくとも１つの第２半透膜と、を含み、
前記少なくとも１つの第２半透膜は、前記少なくとも１つの第１半透膜から離間して配置され、
前記少なくとも１つの第１半透膜は、前記第１区画室と前記第２区画室の間に配置され、
前記少なくとも１つの第２半透膜は、前記第２区画室と前記第３区画室の間に配置されることを特徴とする装置。
【請求項１６】
前記第１区画室、前記第２区画室および前記第３区画室は一列に配置され、前記少なくとも１つの第１半透膜および前記少なくとも１つの第２半透膜は、それぞれの区画室の間で実質的に垂直に配置されていることを特徴とする請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの第１半透膜および前記少なくとも１つの第２半透膜を、それぞれの区画室の間に保持するホルダをさらに備えることを特徴とする請求項１５または請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
ガラスを含む、またはガラス製であることを特徴とする請求項９から請求項１７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１９】
前記第１区画室の開口部を閉じるカバーをさらに備えることを特徴とする請求項９から請求項１８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２０】
前記物質の安定性または生体利用効率に関するデータを測定するため、インビトロで物質を試験するための、請求項９から請求項１９のいずれか一項に記載の装置の使用。
【請求項２１】
前記物質が製剤であることを特徴とする請求項２０に記載の装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シミュレートされた生理環境において物質、好ましくは、タンパク質などの高分子の挙動を分析するためのインビトロ方法および装置に関する。特に、本発明は、シミュレートされた眼疾患における物質の挙動を分析するためのインビトロ方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、糖尿病性網膜症などの黄斑変性症または網膜疾患を治療するため、薬物の硝子体内注入がこれまで有効であることがわかっている。硝子体内注入では、製剤を硝子体液（ＶＨ）、すなわち、例えば、ヒトの眼球のレンズと網膜との間の空間を満たす透明なゲルに直接注入する。これは、特に、硝子体内注入では、投与量中、変化せずに網膜に到達する薬物量の割合が高く、通常、硝子体内注入は高い生体利用効率を有するからである。
【０００３】
しかしながら、例えば、硝子体液（ＶＨ）における製剤の安定性を調査するインビトロ試験は、インビボ条件で実際にシミュレートする際には、ほとんど有用でないことが判明している。ＶＨは、自然環境にないときには速く変性し、ＶＨのｐＨ値は、ＶＨにおける変性産物の滞積に起因して急速に増加し得る。従って、試験は、生きているヒトの眼の実際の状況に相当するものとはなり得ず、例えば、数日間のように、特に、長時間にわたるものに相当するものではない。最新の試験系では、ＶＨの生理学的ｐＨ値は、緩衝系を適用することによって安定化され得る。ここで、変性産物は、半透膜を通してＶＨを緩衝液内に出すことができる。
【０００４】
しかしながら、これらの系では、製剤の異なるバリア条件をシミュレートすることができない。特に、これらは、例えば、後眼部組織によって提供されるような異なるバリア条件をシミュレートすることができない。
【０００５】
したがって、例えば、高分子のような物質の挙動を分析するために、生理環境をシミュレートする改善されたインビトロ方法および装置が必要とされている。特に、シミュレートされた生理環境が異なる物質の長期安定性を分析するインビトロ方法および装置が必要とされている。
【０００６】
本発明の一態様によれば、シミュレートされた生理学的自然環境における物質の挙動を分析するインビトロ方法が提供される。この方法は、第１の流体、ゲルマトリックス、および第２の流体を準備するステップを含む。この方法は、さらに、少なくとも１つの第１半透膜によって、第１の流体とゲルマトリックスを分離するステップと、少なくとも１つの第２半透膜によって、ゲルマトリックスと第２の流体を分離するステップと、を含む。さらなるステップは、第１の流体内に物質を注入するステップと、物質を第１の流体から、少なくとも１つの第１半透膜と、ゲルマトリックスと、少なくとも１つの第２半透膜とを通して、第２の流体内へ移動させるステップと、第１の流体からの物質のクリアランスを測定するステップである。
【０００７】
少なくとも第１半透膜と少なくとも第２半透膜との間にゲルマトリックスを配置することにより、現実的な方法で、物質の拡散バリアをシミュレートすることおよび前記バリアを介した物質の拡散をシミュレートすることができる。ゲルマトリックスは、例えば分子、例えばタンパク質または製剤のような高分子などの物質が注入される第１の流体と、緩衝液として作用する第２の流体との間に配置される。第１の流体は、物質が注入される液体または組織に対応するか当該液体または組織をシミュレートする。第１の流体は、ヒトまたは動物から抽出された流体でもよいが、このような天然の流体をシミュレートした人工の流体でもよい。第２の流体は、例えば、系のｐＨ値が所望の値（例えば、一定）に維持されるような緩衝液として作用する。第２の流体は、沈殿物または変性産物を入れるまたは吸収するリザーバとしての役割を果たしてもよい。
【０００８】
特別な配置により、同一の生理学的な系における異なるバリア条件だけでなく、異なる生理学的な系における異なるバリア条件をシミュレートすることができる。例えば、硝子体液への製剤の注入では、ヒトのみならず動物の眼についても、製剤の安定性および生体利用効率をシミュレートすることができる。例えば、（年齢または疾患により、ある程度変性した眼に対応する）様々な眼の状態における異なるタンパク質に対して、そして、前眼部組織および後眼部組織ならびにこれらの任意の組み合わせに対して、異なる拡散および沈殿の挙動を試験することができる。これらの組織は異なる分子バリア特性を有し、当該分子バリア特性は、本発明の方法および装置でゲルマトリックスの特性および任意選択的に半透膜の特性を変化させることによって、シミュレートおよび試験することができる。さらに、有効な注入位置と拡散バリアの位置との間の距離と、注入場所に存在する物理的および化学的な環境とを考慮して、例えば、タンパク質または製剤などの物質の安定性および生体利用効率について、より現実的な試験結果を得ることができる。したがって、本発明による方法および装置は、自然環境、最も好ましくは眼環境の幾何学的形状を、より現実的にシミュレートすることを可能にする。これは、流体およびゲルマトリックスの特別な配置と、更なる詳細を以下に説明するような装置の構成によって可能になる。
【０００９】
本発明による方法および装置は、安定性評価に適用することができるが、安定性評価のみに限定されない。安定性評価としては、例えば、製剤、高分子、タンパク質および／または賦形剤またはこれらの組み合わせなどの物質の濃度に依存する沈殿；例えば、硝子体液中のタンパク質などの特定の流体環境における高分子および／または賦形剤などの物質の相互作用；例えば、硝子体液などの特定の流体に希釈する際の物質の安定性と、例えば、界面活性剤、糖、緩衝種（buffering species）および等張化剤などの安定化賦形剤が消失した後の安定性；および、例えば、眼環境などのシミュレートされた生理環境における長期安定性；を挙げることができる。
【００１０】
以下の説明では、方法および装置は、一般に、物質の試験、特に、シミュレートされた眼環境における高分子の試験を対象とする。したがって、方法の好ましい一実施形態では、第１の流体が硝子体液であり、第２の流体が緩衝液、好ましくは生理学的に適切な緩衝液である。しかしながら、方法および装置はこれらの用途に限定されない。例えば、血液脳関門をシミュレートして、物質が、例えば、血管に注入されたときの脳組織中の物質の安定性および生体利用効率を試験することもできる。この場合、第１および第２の流体は、血液および脳脊髄液、或いは血液をシミュレートした流体および脳脊髄液をシミュレートした流体としてもよい。
【００１１】
本願で使用される「物質」は、流体内に注入され得るあらゆる物質を意味し、本発明の方法または装置において、その安定性または生体利用効率の観点から分析されるべきあらゆる物質を意味する。物質は、分子、例えば、タンパク質、抗体、抗体断片、融合タンパク質、二重特異性抗体、複合タンパク質、天然または合成のペプチドまたはオリゴヌクレオチドなどの高分子、天然または合成の分子（例えば、小分子薬物、糖、界面活性剤、緩衝液、ポリマー、または一般的に使用されるあらゆる賦形剤）とすることができる。好ましくは、物質は、例えば、溶液、懸濁液または乳濁液のような製剤であり、固体マトリックス中に、或いは本明細書中で以下に説明する他のいずれかの送達系内に含まれるものでもよい。
【００１２】
本願で使用される「硝子体液」は、天然のもの或いは人工的に供給されるものでもよい。天然の硝子体液は、ブタ、ウシ、イヌ、ネコなどの様々な動物種由来、ウサギおよび非ヒト霊長類由来、またはヒト由来のものでよい。天然の硝子体液は、例えば、事前に取り除かれた眼から得ることができる。人工硝子体液は、好ましくは、ヒト硝子体液に模倣させている。人工硝子体液は、例えば、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、寒天、キトサン、ゼラチン、キサンタンガム、ペクチン、コラーゲンなどを挙げることができるが、これらに限定されない天然ポリマー；例えば、プルロニックゲル（pluronic gel）、ポリビニルアルコール、ポリフォスファーゼン、或いはＰＥＧ，ＰＣＬ、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＬＧＡ、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸からなる二量体、三量体または多量体のゲル化ポリマーなどを挙げることができるが、これらに限定されない合成ポリマー；および異なる濃度でのこれらのポリマーの組み合わせなど、様々なポリマー材料から調製することができる。
【００１３】
硝子体液は、人工および天然の硝子体液の混合物またはこれらの成分を異なる組み合わせで混合したものでもよい。
【００１４】
本願で使用される「ゲルマトリックス」は、流動体または（固体と液体の中間の特性を有する）半流動体であり、所定の（しかし、可変の）粘度と、所定の（しかし、可変の）濃度のゲルマトリックス材料の化合物を有している。好ましくは、ゲルマトリックスは、粘性液体である。ゲルマトリックスは、シミュレートされたバリアのコアを表し、少なくとも１つの第１の半透膜と少なくとも１つの第２の半透膜との間に挟まれている。好ましくは、少なくとも１つの第１の半透膜および少なくとも１つの第２の半透膜は、２つの単一の半透膜、好ましくは透析膜である。しかしながら、これらは多重半透膜であってもよく、複数の、好ましくは２つの膜が相互に重ねて配置されている。バリアの仕様は、ゲルマトリックスの物理的および／または化学的特性を変化させることによって、変化する試験条件に合わせて変更および適合させることができる。ゲルマトリックスについては、天然または人工的に作られた異なるポリマー材料を、個々にまたは異なる濃度で組み合わせて用いることができる。化学修飾された天然ポリマーを利用して、ゲルマトリックスを調製することができる。天然、半合成および合成ポリマーは、ゲルマトリックスの調製のため、異なる組み合わせと濃度で用いることができる。ゲルマトリックスは、例えば、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、寒天、キトサン、ゼラチン、キサンタンガム、ペクチン、コラーゲンなどを挙げることができるが、これらに限定されない天然ポリマー；例えば、プルロニックゲル（pluronic gel）、ポリビニルアルコール、ポリフォスファーゼン、或いはＰＥＧ，ＰＣＬ、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＬＧＡ、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸からなる二量体、三量体または多量体のゲル化ポリマーなどを挙げることができるが、これらに限定されない合成ポリマー；および異なる濃度でのこれらのポリマーの組み合わせなど、様々なポリマー材料から調製することができる。
【００１５】
本発明による方法のいくつかの好ましい実施形態では、少なくとも１つの第１半透膜または少なくとも１つの第２半透膜または両方の膜の分画分子量（ＭＷＣＯ）を変化させる。本発明による方法のいくつかの好ましい実施形態では、好ましくはゲルマトリックスの粘度またはゲルマトリックスの化合物の濃度を変化させることによって、ゲルマトリックスの組成を変化させる。本発明による方法のいくつかの好ましい実施形態では、膜の少なくとも１つのＭＷＣＯおよびゲルマトリックスの組成の両方を変化させる。これらの処理によって、膜を通した拡散率および／またはゲルマトリックスを通した物質の透過率を変更することができる。第１の流体内の物質とゲルマトリックス材料との相互作用と、物質の安定性、適合性および適応性に対するこれらの影響を調査してもよい。
【００１６】
「緩衝液」は、好ましくは、例えばｐＨ５．５〜ｐＨ８．５の間、好ましくは約ｐＨ７．０〜約ｐＨ７．６の間、より好ましくはｐＨ７．４である、系のｐＨ値を有するか或いは維持することができる溶液である。「生理学的に適切な緩衝液」は、好ましくは、約ｐＨ７．０〜約ｐＨ７．６の間、より好ましくはｐＨ７．２〜７．４の系のｐＨ値を有するか或いは維持することができる溶液である。好ましくは、緩衝液は塩を含む。緩衝液は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、重炭酸塩緩衝液、リンゲル重炭酸塩緩衝液、リンゲル乳酸緩衝液、シミュレートされた体液、他の等張溶液、細胞培地、およびその他の生理学的に代表的な緩衝液とすることができる。緩衝液として使用される流体は、上述したゲルマトリックス材料と組み合わせて、ゲルマトリックスの調製に用いることもできる。
【００１７】
本願では、第１の流体などの「流体からの物質のクリアランス」は、物質が注入された流体からの物質の拡散を含むと理解される。しかしながら、クリアランスには、物質の物理的または化学的変化も含まれ、これらは、例えば、流体または系の他の部分（例えば、ゲルマトリックスまたは第２の流体）での物質の分解または沈殿を含む。したがって、第１の流体の物質のクリアランスは、例えば、各流体およびシミュレートされた生理環境全体における物質の安定性および生体利用効率に関する情報を含む。
【００１８】
本発明による方法では、注入された物質、例えば、タンパク質または賦形剤の挙動を分析することができるだけではない。本発明による方法では、例えば、物質を第１の流体に注入し、第１の流体から他の流体内へ拡散する際に生じる、第１の流体または他の流体の分解または物理的および化学的変化を監視することもできる。
【００１９】
本発明による方法の一態様によれば、第１の流体からの物質のクリアランスを測定するステップは、第１の流体、第２の流体または第１の流体および第２の流体の両方で、物質濃度を測定することによって行われる。これは、例えば、それぞれの流体の試料を採取して、物質含有量または分解生成物について分析することによって行うことができる。分析は、分光法、例えば、蛍光分光分析法、ラマン分光法または紫外可視分光法によって行うことができる。流体試料の分析は、液体またはガスクロマトグラフィー、例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）またはイオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥ−ＨＰＬＣ）によって行うこともできる。分析は、光散乱法、例えば、静的光散乱、動的光散乱または比濁分析によって行うこともできる。好ましくは、クリアランスを測定するための濃度測定または他の測定は、繰り返し、好ましくは、定期的に行われる。好ましくは、測定は、数時間にわたり、より好ましくは数日間にわたり、例えば、１週間または２週間まで、或いはそれ以上長く行われる。測定を行う継続時間および光度は、物質、例えば、系の分子サイズおよび透過性に適合させることができる。濃度測定または例えば、ｐＨ測定のような他の測定は、測定すべきそれぞれの流体にプローブを直接置くことによっても実施することができる。
【００２０】
本発明による方法の別の態様によれば、注入される物質は、約１００Ｄａ〜約４００ｋＤａの範囲、好ましくは、約１ｋＤａ〜約２５０ｋＤａの範囲、例えば、４ｋＤａ〜１５０ｋＤａの大きさを有する分子を含む。半透膜の仕様は、本発明による方法で使用される分子の大きさおよび形態（例えば、直線状、球状）に適合させることができる。例えば、膜の分画分子量（ＭＷＣＯ）は、例えば、第１の流体中、または例えば、ゲルマトリックス中の物質の所望の保存期間に応じて調整することができる。例えば、分析すべき物質がより小さい分子、例えば、約１０ｋＤａより小さい分子からなる或いはこのような分子を含む場合、好ましくは、１０ｋＤａ以下のＭＷＣＯを有する膜を用いて、保存時間を（例えば、数日まで）延長することができる。保存時間を（例えば、数時間まで）減少しなければならない場合、１０ｋＤａよりも大きいＭＷＣＯを有する膜を用いることができる。好ましくは、約１０ＫＤａ〜１００ＫＤａの範囲のＭＷＣＯを有する膜は、約５０ＫＤａ〜１５０ＫＤａの大きさを有する高分子からなる或いはこのような高分子を含む物質に対して使用される。好ましくは、約１ＫＤａ〜５０ＫＤａの範囲のＭＷＣＯを有する膜は、約１０ＫＤａの大きさの高分子からなる或いはこのような高分子を含む物質に対して使用される。
【００２１】
好ましくは、１つの第１半透膜および１つの第２半透膜が、本発明による方法および装置において使用される。しかしながら、１つの膜の代わりに、多重膜を支持体の上に配置することもできる。好ましくは、膜は、互いに直接隣接して配置され、好ましくは、互いに重なり合って配置される。幾つかの、例えば、２つの膜が使用される場合、幾つかの膜は、ＭＷＣＯが同一でもよく、異なるＭＷＣＯを有してもよい。多重膜を使用することによって、バリアの仕様をさらに変更することができる。多重膜は、複数の膜で厚さを増加させることによってのみならず、（ＭＷＣＯが同じ場合であっても）単一の膜に対する多重膜の孔径を変えることによって、バリアの仕様を変更してもよい。また、孔の位置と大きさが膜により異なるので、１つの膜から次の膜への移行は、バリアの仕様に寄与する。
【００２２】
好ましくは、膜の仕様は、実際の組織の透過性に適合される。例えば、本発明による方法の幾つかの好ましい実施形態では、少なくとも１つの第１半透膜は、網膜排除限界（Retinal Exclusion Limit；ＲＥＬ）に実質的に対応する分画分子量（ＭＷＣＯ）を有する。「実質的に対応する」とは、ＲＥＬを含むことのみならず、ＭＷＣＯ値が、例えば、約５０％までＲＥＬと異なるものも含む。ＲＥＬは、一般に、眼の網膜を横切って自由に拡散することができる分子の最大寸法として知られている。健康な人間の眼では、ＲＥＬは、約５０ｋＤａ（１０３ダルトン）〜１００ｋＤａの範囲、好ましくは、７０ｋＤａであると定義される。しかしながら、この範囲は、種が異なることや目の状態（年齢、死亡などによる変化）に応じて、著しく変わることがある。さらに、ＲＥＬは、拡散する分子の構造、例えば、分子の線状または球状構造に大きく依存する。
【００２３】
本発明による方法および装置に使用される半透膜は、膜を通る拡散速度を制御することを可能にする。半透膜は、拡散制御膜であるとともに、分子量サイズ選択膜であると考えることもできる。好ましくは、半透膜は透析膜である。透析膜は、半透過性フィルム、例えば、様々な大きさの孔を含む再生セルロースまたはセルロースエステルのシートである。一般に、細孔よりも大きい分子は膜を通過することができないが、小さい分子は自由に膜を通過することができる。透析膜の孔径の範囲によって決定される分離特性は、膜の分画分子量（ＭＷＣＯ）と呼ばれる。ＭＷＣＯ付近の分子の拡散は、ＭＷＣＯよりも著しく小さい分子と比較して遅くなる。膜のＭＷＣＯは、明確に限定された値ではない。透析膜は、製造に用いられる材料に応じて、広範囲の細孔径を含む可能性がある。拡散制御膜の他の例としては、異なる細孔径を有するフィルタ膜を挙げることができる。一般に、大きなＭＷＣＯを有する膜は、大きな分子を第１の流体内に注入する際に使用され、小さなＭＷＣＯを有する膜は、小さな分子を第１の流体内に注入する際に使用される。しかしながら、膜のＭＷＣＯは、上記で概略を述べたように、第１の流体中の物質の滞留時間に影響を及ぼすように変化させてもよい。例えば、分子の第１の流体との相互作用調査を行うために、物質を第１の流体中に長期間保持させなければならない場合には、ＭＷＣＯを減少させてもよい。
【００２４】
本発明による方法のさらなる態様によれば、第１の流体内に物質を注入するステップは、物質送達系を介して、第１の流体内に物質を注入することを含む。これにより、物質を第1の流体内に遅延して放出させる。物質は、例えば、ナノ粒子、微粒子、薬物デポ剤（固体、液体またはゲル形態のもの）、繰り返しの注入を伴い、または伴わずに物質の反復送達を可能とする薬物デポ剤または外部デバイスとして機能するインプラントなどの送達系により、第１の流体内に注入してもよい。このような送達系では、物質は、カプセル封入され、共役化（高分子に結び付けられ）され、または経時的に物理変化または化学変化またはその両方（例えば、膨張、分解）の変化を受けて、送達系が注入された流体中で物質を放出するような物質または成分に閉じ込められる。送達系を設けることにより、第１の流体中への物質の放出を時間的に遅延させることができる。第１の流体中で送達系の移動が起こると、送達系は、物質が放出されて第１の流体と接触する前に、少なくとも１つの第１半透膜に近づく。実際の系では、送達系を使用することで、物質、例えば、製剤を、注入部位を変化させることを要せずに目的位置に近づけることができることで、生体利用効率を向上させることができる。
【００２５】
本発明による方法の一態様では、本方法は、半透膜によって支持されたゲルマトリックス層中の２Ｄまたは３Ｄ細胞培地で細胞を成長させるステップをさらに含んでもよい。例えば、一般的に使用される網膜細胞株は、ＡＲＰＥ−１９、Ｄ４０７、ＲＦ−６Ａなどである。細胞は、ヒト後部組織を表すように、培養または共培養で成長させることができる。系は、注入物質または送達系または細胞分解に関する細胞単位の毒性調査およびクリアランスの調査を行うために使用することができる。
【００２６】
本発明による方法および装置は、流体、ゲルマトリックスおよび半透膜の選択によって、特定の試験シナリオに適合させることだけに限られない。当該方法および装置は、例えば、半透膜の配向に依存して、上述した化合物の幾何学的配置によって、それらの生理環境における物質の異なる挙動を分析するように調整してもよい。試験流体中のそれぞれの分子の滞留時間が十分に長い場合、例えば、タンパク質または製剤などの分子の長期安定性、または例えば、抗原結合親和性を最もよく分析することができる。安定性試験および滞留時間により、例えば、特定の薬物の投与頻度をどのように選択しなければならないかに関する情報を得ることができる。したがって、いくつかの用途では、第１の流体中の物質の滞留時間が、数日、好ましくは、数週間、より好ましくは、数ヶ月まであることが望ましいであろう。好ましくは、第１の流体中の物質の滞留時間の間、試験条件は、生理環境にできるだけ近い環境を維持する。以下、シミュレートされた生理環境における分子の挙動を分析するための装置の様々な実施形態を記載する。
【００２７】
本発明のさらなる態様によれば、シミュレートされた生理環境における分子の挙動を分析するための装置が提供される。この装置は、第１の流体を収容する第１区画室と、ゲルマトリックスを収容する第２区画室と、第２の流体を収容する第３区画室とを含む。当該装置は、さらに、少なくとも１つの第１半透膜を支持する第１支持体と、少なくとも１つの第２半透膜を支持する第２支持体とを含む。第２支持体は、第１支持体から離間して配置される。第１支持体は、第１区画室と第２区画室の間に配置され、第２支持体は、第２区画室と第３区画室の間に配置される。
【００２８】
本発明による装置では、第１区画室内の第１の流体は、第１支持体によって保持される少なくとも１つの第１半透膜によって、第２区画室内のゲルマトリックスから分離された状態で維持してもよい。好ましくは、少なくとも１つの第１半透膜は、第１支持体上に配置される。少なくとも１つの第１半透膜は、膜の縁部においてのみ、第１支持体上に配置することができる。第１支持体は、少なくとも１つの膜が、第１支持体の略全域に配置され且つ支持されるように設計することができる。同様に、ゲルマトリックスは、第２支持体によって保持される少なくとも１つの第２半透膜によって、第３区画室内の第２の流体から分離された状態で維持してもよい。好ましくは、少なくとも１つの第２半透膜は、第２支持体上に配置される。少なくとも１つの第２半透膜は、第２支持体上に、膜の縁部のみに配置してもよい。第２支持体は、少なくとも１つの膜が、第２支持体の略全域に配置され且つ支持されるように設計することができる。
【００２９】
第２区画室は、主に、少なくとも１つの第１半透膜および少なくとも１つの第２半透膜によって、場合によっては、装置の側壁によっても形成される。装置の実施形態および支持体の配置に依存して、第２区画室は、主に第１支持体および第２支持体によって、場合によっては、装置の側壁によっても形成される。好ましくは、３つの区画室は直列に配置される。好ましくは、第１区画室と第３区画質との間に生じる唯一の物質交換は、分子が少なくとも１つの第１半透膜および少なくとも１つの第２半透膜を透過し、ゲルマトリックスを通って拡散することだけである。
【００３０】
好ましくは、第１区画室、第２区画室および第３区画室には、少なくとも１つの開口部が設けられている。好ましくは、区画室の少なくとも１つの開口部は、第１支持体および第２支持体のそれぞれに設けられた少なくとも１つの開口部に対応する。好ましくは、第１支持体および第２支持体は、少なくとも１つの開口部が設けられた区画壁である。少なくとも１つの開口部は、それぞれの少なくとも１つの半透膜によって覆われている。幾つかの好ましい実施形態では、第１支持体は、第１区画室および第２区画室の多孔質壁を形成し、第２支持体は、第２区画室および第３区画室の多孔質壁を形成する。これらの実施形態では、第１支持体および第２支持体は、好ましくは、複数の開口部を備え、複数の開口部は、支持体の全領域にわたって分布していることが好ましい。
【００３１】
装置の態様および利点は、本発明による方法に関連して既に述べているので、ここでは説明を繰り返さない。
【００３２】
本発明による装置の一態様によれば、少なくとも１つの第１半透膜が、少なくとも１つの第２半透膜の分画分子量（ＭＷＣＯ）以下の分画分子量（ＭＷＣＯ）を有する。少なくとも１つの第２膜のＭＷＣＯが大きいかまたは等しいことで、理論的には、少なくとも１つの第１膜を通過したすべての分子が、少なくとも１つの第２膜を通過し、第２流体内で検出されるであろうあることを保証している。本発明による方法および装置のいくつかの好ましい実施形態では、少なくとも１つの第１半透膜の分画分子量（ＭＷＣＯ）は、実質的に網膜排除限界（ＲＥＬ）に対応する。好ましくは、少なくとも１つの第１膜のＭＷＣＯは、特に、眼環境をシミュレートする場合には、１０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以下の範囲内にある。
【００３３】
本発明による装置のさらなる態様によれば、第１支持体の形状および大きさが、網膜、好ましくは、ヒトの網膜の形状および大きさに適合している。そして、１つまたは少なくとも１つの膜が第１支持体上に配置され、第１支持体の形状をとる。これにより、眼球の硝子体内に注入された物質の分布および移動をシミュレートすることができる。特に、注入部位と網膜または眼球の前部との距離を、現実的にシミュレートすることができる。したがって、幾つかの好ましい実施形態では、少なくとも第１支持体は凹形状を有する。これにより、第１区画室の少なくとも一部は、第１支持体によって形成された第１区画室の一部に対応する眼球の一部の形状をシミュレートすることができる。この部分は、高分子の透過に関して、最も関連性が深い。凹形状（または凸形状）の支持体および対応する区画室の形状により、場合によっては、他の器官の形状も、屈曲面によって、より現実的に模倣することができる。好ましくは、第２支持体も凹形状を有し、当該凹形状の第２支持体を第１支持体と同心状に配置してもよい。第１支持体および第２支持部は、相互に平行に配置され、且つ相互に離間して配置されている。そして、第２区画室は、第１支持体および第２支持体（およびそれぞれの支持体上に載置されている対応する膜）によって、略完全に形成することができる。
【００３４】
第１区画室および少なくとも１つの第１膜のこのような配置では、眼球内部の幾何学的形状と物理的および化学的な環境がシミュレートされる。ゲルマトリックスおよび好ましくは、凹形状の少なくとも１つの第２膜との組み合わせにより、前眼部組織または後眼部組織などの眼球を覆う組織全体からのバリアをシミュレートすることができる。
【００３５】
装置、すなわち区画壁および支持体は、装置に使用される流体および物質に適した任意の材料から製造することができる。好ましくは、ガラス、ステンレス鋼、不活性金属合金、不活性合成プラスチックまたはポリマー材料などの不活性材料が使用される。好ましくは、材料の透明性のため、ガラスまたは不活性プラスチック材料が使用される。好ましくは、不活性と優れた再利用特性のため、ガラスが装置の材料として使用される。本発明による装置の幾つかの好ましい実施形態では、装置はガラスを含むか、またはガラス製である。好ましくは、第１区画室、第２区画室または第３区画室、第１支持体および第２支持体の少なくとも１つは、ガラスを含むか、またはガラス製である。好ましくは、第１支持体および第２支持体を含む装置の全ての壁は、完全にガラス製である。
【００３６】
本発明による装置の別の態様によれば、装置は、第１区画室の開口部を閉じるカバーをさらに備える。開口部を通して、第１の流体を第１区画室内に充填したり、第１区画室から除去したりすることができる。好ましくは、閉じるときには密閉するようにしてもよい。これにより、物質の注入前後の第１の流体に対する周囲の影響（例えば、湿気または汚染）を最小限に抑えることができる。好ましくは、カバーは、装置と同じ材料で作られる。好ましくは、カバーはガラス製である。
【００３７】
半透膜用の支持体を含む装置の実施形態は、水平または略水平に配置された半透膜を備えた用途に特に好適である。装置の水平配置では、少なくとも２つの区画室、好ましくは、すべての区画室が互いに上下に重なり合って配置される。その場合、半透膜の配置は、正確に水平でもよい。しかしながら、水平配置には、例えば、網膜または他の組織形態をシミュレートする膜の凹形状または凸形状が含まれる。支持体は、膜全体を支持してもよく、水平に配置された半透膜に作用する流体またはゲルマトリックスの重量を支持してもよい。注入された物質は、重力によって下方に移動する傾向がある。半透膜の略水平な配置では、半透膜は、基本的にそれぞれの区画室の底を形成する。したがって、物質は半透膜上に滞積する傾向があり、どちらかと言うと、区画室から直接浸透する可能性がある。膜の上に物質を滞積させない場合、区画室内の物質の滞留時間に影響を及ぼす可能性があることが判明している。これは、以下のように説明することができる。すなわち、区画室の底が閉じていると、物質が半透膜の位置に移動するまで、物質は、区画室内の流体中に再拡散する可能性があるからである。半透膜は、例えば、区画室の側壁を形成してもよい。装置のこのような実施形態は、半透膜の垂直または略垂直な配置に対して好適である。垂直な配置では、物質を膜上に滞積させない或いは少なくともこれを制限し、第１の流体中またはゲルマトリックス中の物質の滞留時間を延長することができる。
【００３８】
本発明の別の態様によれば、シミュレートされた生理環境における分子の挙動を分析するための別の装置が提供される。この装置は、第１の流体を収容する第１区画室と、ゲルマトリックスを収容する第２区画室と、第２の流体を収容する第３区画室とを含む。当該装置は、さらに、少なくとも１つの第１半透膜と少なくとも１つの第２半透膜を含み、当該少なくとも１つの第２半透膜は、少なくとも１つの第１半透膜から離間して配置されている。少なくとも１つの第１半透膜は、第１区画室と第２区画室の間に配置され、少なくとも１つの第２半透膜は、第２区画室と第３区画室の間に配置されている。
【００３９】
本発明による装置のこれらの実施形態では、半透膜は、第１支持体および第２支持体なしで装置内に配置される。装置は、少なくとも１つの第１半透膜および少なくとも１つの第２半透膜を、それぞれの区画室の間に保持するホルダを含んでいてもよい。このようなホルダは、例えば、膜を挟み込むまたは取り付けるクランプ手段又は装着手段とすることができる。好ましくは、ホルダは、装置の外部に配置され、装置内に延在せず、特に、いずれの区画室内にも延在しない。これにより、装置の製造、組立ておよび清掃を簡単に行うことができる。さらに、半透膜は、区画室内の流体とゲルマトリックスとの間の唯一のバリアとして機能し、第１支持体および第２支持体の場合のように、付加的な機械的要素は何も存在しない。
【００４０】
本発明によるこの装置の一態様によれば、第１区画室、第２区画室および第３区画室は一列に配置され、少なくとも１つの第１半透膜および少なくとも１つの第２半透膜は、それぞれの区画室の間で実質的に垂直に配置されている。このような半透膜の垂直配置では、重力が基本的に膜自体に沿って膜に作用することで、膜の支持体を省略することができる。ゲルマトリックスおよび（それらの密度によっては）流体であっても、膜に対して横並びで配置した場合、半透膜に対する支持効果を有する可能性がある。実質的に垂直な配置においては、半透膜の配置が正確に垂直であってもよい。しかしながら、正確な垂直位置に対して所定の角度で配置してもよい。「実質的に垂直」には、例えば、シミュレートされる眼球の一部または他の組織形態をシミュレートするために、凹形状または凸形状も含まれる。
【００４１】
半透膜の実質的に垂直な配置では、区画室が相互に上下に重なって配置される装置の実施形態の場合のように、物質は膜に滞積しないであろう。したがって、例えば、硝子体液などの第１の流体における安定性試験のような長期試験は、半透膜を通した物質の透過性に重力が影響を及ぼさないか或いは限られた影響しか及ぼさないような装置構成において行われることが好ましい。
【００４２】
支持体のない装置の実施形態は、ガラス製であることが好ましいが、半透膜と、好ましくは、ホルダは除かれる。
【００４３】
本発明によるこのさらなる装置のさらなる態様及び利点は、半透膜の支持体を含む本発明による方法及び装置に関連して既に述べているので、ここでは説明を繰り返さない。特に、さらなる装置には、前述したように成形および構成することができる支持体が設けられていてもよい。支持体を用いることで、ホルダを省略することができる。さらには、少なくとも第１支持体は、眼球または網膜の形状をシミュレートするために凹形状であってもよい。また、半透膜の仕様と実現は、上述したものと同様のものでもよく、例えば、特定のＭＷＣＯを採用したり、例えば、単一の半透膜の形態或いは２つ以上の半透膜の配置または組み合わせの形態のように、拡散制御膜を実現することができる。
【００４４】
好ましくは、ここに説明する本発明による装置は、物質、好ましくは、製剤のインビトロ試験に使用され、物質、好ましくは、製剤の安定性または生体利用効率に関するデータを測定する。好ましくは、本発明による装置は、ここに説明する本発明による方法を実施するために使用される。
【００４５】
本発明を、以下の図面を用いて例示される実施例および実施態様に関して、さらなる説明を行う。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明による試験装備の概略図を示す。
【図２】ゲルマトリックスにおけるヒアルロン酸濃度に対するデキストランの拡散速度を示す。
【図３】ゲルマトリックスにおけるヒアルロン酸濃度に対するデキストランの透過率を示す。
【図４】時間とともに変動する高分子の拡散に関して、異なる膜の効果を示す。
【図５】様々な高分子の拡散を示す。
【図６】様々な高分子の透過率を示す。
【図７】モノクローナル抗体を用いて行った試験結果を示す。
【図８ａ】本発明による装置の第１実施形態を示す。
【図８ｂ】本発明による装置の第１実施形態を示す。
【図８ｃ】本発明による装置の第１実施形態を示す。
【図８ｄ】本発明による装置の第１実施形態を示す。
【図８ｅ】本発明による装置の第１実施形態を示す。
【図９】本発明による装置の第２の実施形態の概略図を示す。
【図１０】図９の装置の実施形態の変形例を示す。
【００４７】
図１には、装置および方法の装備の一実施形態が概略的に示されている。この装備は、眼の幾何学的形状と状況をシミュレートするものであり、眼疾患をシミュレートするインビトロ試験に使用することができる。硝子体液を収容する第１区画室１は、上壁１０と、上壁１０の一部を覆う第１半透膜４によって形成されている。上壁１０には、開口部１０１を通して第１区画室１を充填するための開口部１０１が設けられている。開口部１０１は、カバー６によって、好ましくは、密閉して閉じることもできる。カバー６は、例えば、円錐形の栓、例えば、ガラス栓でもよい。半透膜４は、円の一部、例えば、円の２／３の形状を有する。第１区画室１および第１膜の形状は、眼球および網膜の幾何学的形状をシミュレートする。第１区画室１は、第３区画室３に取り付けられている。これにより、第１膜４は、好ましくは、第３区画室３の上部開口部３０３および第３区画室３内に完全に挿入される。第３区画室３は、緩衝液を収容するためのものである。凹形状の第２半透膜５が上部開口部３０３に配置され、第３区画室３の上壁３０の一部を覆っている。同様に、第２膜５も円の一部、例えば、円の１／２〜２／３の形状を有する。第１膜４および第２膜５は、図８ａ〜図８ｅに関して下記に説明するような区画壁を形成する第１支持体および第２支持体によって、それぞれ支持してもよい。第１区画室１および第３区画室３を取り付けた状態では、２つの半透膜４，５が相互に離間して、第１膜と第２膜の間の間隙に第２区画室２を形成する。間隙の大きさは、例えば、シミュレートされる生理学的系に適合させるために変更することができる。第１膜４および第２膜５は同心円状に配置され、そのため膜の間に、好ましくは、膜の全長にわたって、所定の距離を有する。第１区画室１の上壁１０に設けられた入口および出口開口部１０２を介して、ゲルマトリックスを第２区画室２内に充填したり、第２区画室２から除去したりすることができる。３つの区画室は、例えば、第３区画室の上壁３０上に配置され、第２区画室２を形成する間隙の周囲に円周状に配置されるＯリングを設けることで密封されてもよい。
【００４８】
第３区画室３には、入口開口部３２および出口開口部３３が設けられている。入口開口部を通して、第３区画室３が緩衝液で充填され、出口開口部を通して、第３区画室３を空にすることができる。入口および出口は、第３区画室３の内容物を清掃および交換するように、第３区画室を通した流体の流れを許容するように設計することが好ましい。第３区画室３を通した連続するまたは不連続な流体の流れを用いて、第２の流体をサンプリングし、後続の試料分析を行うこともできる。
【００４９】
第１区画室および第１膜４により、眼球内の物理的および化学的環境だけでなく幾何学的形状がシミュレートされる。ゲルマトリックスおよび第２膜５の組み合わせにより、前部組織または後部組織などの眼球を覆う組織からのバリアがシミュレートされる。物質、例えば、高分子は、第１区画室１の硝子体液中に注入することができる。物質は、第１膜まで移動し、第１膜４および第２区画室２のゲルマトリックスを通過し、さらに第２膜を通過して、第３区画室３の緩衝液へと移動する。第１区画室１の脱着自在のカバー６と、第３区画室の入口及び出口３２，３３により、分析のために試料を抽出することが可能となる。
【００５０】
以下では、図１で説明した系を用いて行った実施例について説明する。実施例で述べるすべての実験は、無菌状態における層流の条件下で行われた。試料は、異なる時間間隔で、第１区画室１および第３区画室３（またはＶＨ区画室１およびＦＴ区画室３のそれぞれ）から採取した。
【実施例１】
【００５１】
ヒアルロン酸ゲルマトリックスの濃度を最適化するため、実施例１を行った。このために、硝子体液（ＶＨ）区画室１から（ＦＴ）区画室３を通って流れるＦＩＴＣ−デキストラン（４０ｋＤａ）の拡散速度に対するヒアルロン酸（ＨＡ）（分子量１．４×１０６ダルトン）ゲルマトリックス（ＧＭ）の異なる濃度の影響を調べた。ＶＨ区画室およびＦＴ区画室は、拡散制御バリアとして機能するＧＭ区画室２によって分離された。２つの透析膜４，５を用いて、これら３つの区画室１，２，３を分離した。ＶＨ区画室１をＧＭ区画室２から分離する第１透析膜４をＤＭ−１（透析制御膜４）として、ＧＭ区画室をＦＴ区画室から分離する第２透析膜をＤＭ−２（透析制御膜５）と名付けた。ＤＭ−１およびＤＭ−２の分画分子量（ＭＷＣＯ）は、それぞれ５０ｋＤａおよび１００ｋＤａであった。ＦＴ区画室３を滅菌したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）で満たし、ＧＭ区画室２を、ＰＢＳ中で調製した約３ｍＬの異なる濃度の滅菌したＨＡゲル（０〜０．９％ｗ／ｖの範囲）で満たした。約３．５ｍＬの滅菌したブタＶＨをＶＨ区画室に添加した。装置を密封し、ＶＨを３７℃で一晩コンディショニングした。インキュベーションの最後に、８０ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−デキストラン（４０ｋＤａ）５０μＬをＶＨ区画室１に注入した。試験中ずっと装置を密閉し、３７℃でインキュベートした。蛍光分光光度計を用いて、励起波長４９０ｎｍおよび発光波長５２０ｎｍで、ＦＩＴＣ−デキストランの濃度について試料を評価した。図２はＨＡの濃度に対する拡散の割合を示し、図３はＨＡの濃度に対する見掛けの透過率（Ｐａｐｐ）を示す。透過率は、バリアの一方の側から他方の側へ成分を移動させる拡散制御バリア（単一バリア）の特性である。２つ以上の拡散制御バリアを用いる場合、透磁率は見掛けの透過率（Ｐａｐｐ（見掛け））またはＰｅｆｆ（有効））として計算される。本実験では、インビトロ拡散データとエクスビボ拡散データの、文献で報告されているインビボ拡散データとの相関関係を容易にするため、Ｐａｐｐ（見掛け）が実行されている。例えば、見掛けの透過率は、関係式Ｐａｐｐ＝Ｑ／［Ａ・ｔ・（Ｃｏ−Ｃｉ）］から計算することができる。ここで、Ｑは、時間ｔで面積（Ａ）の膜を通って移動する透過物の量である。ＣｏおよびＣｉは、それぞれドナー濃度（ＶＨ室中の濃度）およびレシーバ濃度（ＦＴ区画室中の濃度）である。Ｐａｐｐは、ｃｍ／ｓｅｃ、ｃｍ／ｍｉｎまたはｃｍ／ｈｒで表すことができる。
【００５２】
図２に記載した結果は、ＨＡゲルマトリックスの濃度の増加が、高分子の拡散速度と見掛けの透過率を有意に低下させることを示唆している。もっともらしい説明としては、ＨＡ濃度の増加がマトリックスの気孔率を低下させ、および／またはデキストランとマトリックス成分との相互作用を増加させて、ＦＩＴＣ−デキストランの拡散が遅くなる可能性があるというものである。これらの結果は、ＧＭ濃度を変化させることで、系を横切る高分子の拡散速度を調整することができることを示している。
【実施例２】
【００５３】
高分子の拡散に対する透析膜の効果を分析するために、実施例２を行った。
【００５４】
ＶＨ区画室からＦＴ区画室への流れ方向におけるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の拡散を、透析膜のＭＷＣＯを変化させることによって調べた。実験は、僅かな変更を加えたうえで、実施例１に記載したものと同様に行った。２つの異なるＭＷＣＯ透析膜を使用し、ＤＭ−１としては、ＭＷＣＯを５０ｋＤａおよび１００ｋＤａとする一方、ＤＭ−２のＭＷＣＯは１００ｋＤａで一定に保った。ＶＨ区画室を３．５ｍＬの滅菌したブタＶＨで満たし、ＧＭ区画室を約３ｍＬの滅菌したＨＡゲル（０．６％ｗ／ｖ）で満たした。ＦＴ区画室は、滅菌したＰＢＳで満たした。装置を密封し、ＶＨを３７℃で一晩コンディショニングした。インキュベーションの最後に、５０μＬのＦＩＴＣ−ＢＳＡ（８０ｍｇ／ｍＬ）または２００μＬのＦＩＴＣ−ＩｇＧ（２０ｍｇ／ｍＬ）をＶＨ区画室に注入した。試験中ずっと装置を密閉し、３７℃でインキュベートした。蛍光分光光度計を用いて、励起波長４９０ｎｍおよび発光波長５２０ｎｍで、ＦＩＴＣ−ＢＳＡおよびＦＩＴＣ−ＩｇＧの濃度について試料を評価した。
【００５５】
図４では、ＦＴ区画室３（図中ではＰＢＳ区画室と名付けられている）内の拡散を経時測定した結果が図示されている。ここで、ＭＷＣＯが１００ｋＤａのＤＭ−１およびＤＭ−２を用いたＢＳＡを符号８１で示し、ＭＷＣＯが１００ｋＤａのＤＭ−１およびＤＭ−２を用いたＩｇＧ（約１４４ｋＤａ）を符号８２で示し、ＭＷＣＯが５０ｋＤａのＤＭ−１およびＭＷＣＯが１００ｋＤａのＤＭ−２を用いたＢＳＡを符号８３で示し、ＭＷＣＯが５０ｋＤａのＤＭ−１およびＭＷＣＯが１００ｋＤａのＤＭ−２を用いたＩｇＧを符号８４で示す。図４に示す結果は、１００ｋＤａのＭＷＣＯを有するＤＭ−１で観察された拡散（８１，８２）と比較すると、５０ｋＤａのＭＷＣＯを有するＤＭ−１（８３，８４）が、ＩｇＧおよびＢＳＡの両方の拡散を有意に抑制したことを示唆している。したがって、透析膜のＭＷＣＯを変更することで、高分子の拡散をさらに調整することが可能となる。
【実施例３】
【００５６】
異なる高分子（直鎖状および球状）の拡散を観察するために、実施例３を行った。
【００５７】
この実験は、僅かな変更を加えたうえで、実施例１に記載したものと同様に行った。５０ｋＤａのＭＷＣＯを有する透析膜をＤＭ−１として用いて、１００ｋＤａのＭＷＣＯを有する透析膜をＤＭ−２として用いた。ＶＨ区画室を３．５ｍＬの滅菌したブタＶＨで満たし、ＧＭ区画室を約３ｍＬの滅菌したＨＡゲル（０．６％ｗ／ｖ）で満たした。ＦＴ区画室は、約３５ｍＬの滅菌したＰＢＳで満たした。装置を密封し、ＶＨを３７℃で一晩コンディショニングした。インキュベーションの最後に、８０ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−デキストラン４ｋＤａ（符号９１参照）、ＦＩＴＣ−デキストラン４０ｋＤａ（符号９２参照）、ＦＩＴＣ−デキストラン７０ｋＤａ（符号９４参照）、ＦＩＴＣ−ＢＳＡ（符号９３参照）を５０μＬ、或いは２０ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−ＩｇＧ（符号９５参照）を２００μＬ、ＶＨ区画室内に注入した。試験中ずっと装置を密閉し、３７℃でインキュベートした。蛍光分光光度計を用いて、励起波長４９０ｎｍおよび発光波長５２０ｎｍで、ＦＩＴＣ−デキストランの濃度について試料を評価した。
【００５８】
異なる拡散高分子量の経時変化を図示した図５に示すように、高分子は異なる拡散速度を示した。小さい分子は、大きな分子と比較して、予想通り早い速度で拡散した。直鎖状および球状の高分子についても、同様の現象が観察された。同様に、小さい分子は、図６に図示した大きい分子に比べて、高いＰａｐｐを示した。これは、小さな分子と比較して大きな分子は分子半径が大きいため、ＧＭによって、大きな分子がより大きな抵抗を受け、結果としてＰａｐｐが低くなることによるものと考えられる。興味深いことに、ＦＩＴＣ−デキストラン（４０ｋＤａ）およびＦＩＴＣ−ＢＳＡ（６６ｋＤａ）は、Ｐａｐｐの値が同様の値を示した。分子半径が略同じである（ＦＩＴＣ−デキストランは４０ｋＤａで４．５ｎｍ、ＦＩＴＣ−ＢＳＡは３．６２ｎｍ）ため、Ｐａｐｐが略同じになると考えられる。
【実施例４】
【００５９】
この実験では、ＶＨ区画室からＦＴ区画室への方向で、ＧＭの存在下または非存在下におけるモノクローナル抗体（ｍＡｂ１）の拡散を調べた。実験は、僅かな変更を加えたうえで、実施例１に記載したものと同様に行った。ここでも、５０ｋＤａのＭＷＣＯを有する透析膜をＤＭ−１として用いて、１００ｋＤａのＭＷＣＯを有する透析膜をＤＭ−２として用いた。ＶＨ区画室を３．５ｍＬの滅菌したブタＶＨで満たし、ＧＭ区画室を約３ｍＬの滅菌したＨＡゲル（０．６％ｗ／ｖ）または滅菌したＰＢＳ（マトリックスなし）で満たした。ＦＴ区画室は、滅菌したＰＢＳで満たした。装置を密封し、ＶＨを３７℃で一晩コンディショニングした。インキュベーションの最後に、３３μＬのｍＡｂ１（１２０ｍｇ／ｍＬ）をＶＨ区画室内に注入した。試験中ずっと装置を密閉し、３７℃でインキュベートした。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて、ｍＡｂ１の濃度について試料を評価した。
【００６０】
図７には、ＶＨ区画室内のｍＡＢ１の量の経時変化が図示されている。図示したように、曲線８６で示されるようなＧＭの非存在下で観察された拡散（約８７％のｍＡｂ１が、１２０時間でＶＨ区画室から拡散した）と比較すると、ｍＡｂ１の拡散は、曲線８５で示すように、ＧＭの存在下で著しく減少した（約５１％のｍＡｂ１が、１２０時間でＶＨ区画室から拡散した）。拡散の減少は、ゲルマトリックスによりもたらされた抵抗に起因すると考えられる。この結果は、ゲルマトリックスの濃度を変化させることによって、ＶＨ区画室１内でのタンパク質治療薬の滞留時間を調整することが可能であることを明確に示している。
【００６１】
図８ａ乃至図８ｅには、本発明による装置の実施形態とその部品が示されている。図１と同じ参照番号は、同一または類似の特徴をもつものに使用される。図８ａは、円筒形状を有し、第１区画室１の上壁１０の開口部１０１の大きさに対応する円周を有するカバー６を示す。図８ｃに示すような取付状態では、カバーは上壁１０１と気密シールを形成することが好ましい。硝子体液１１などの第１の流体中の高分子７（物質を表す）は、丸印で表す。図８ｃでは、既に高分子が、第１区画室１内で第１の流体１１（例えば、硝子体液）を通して第１膜４の方向に移動している。第１膜は、第１区画室１の上壁１０１の一部を形成する第１支持体１４上に配置されている。図８ｄにおいて、第２膜５は、第２支持体１５上に配置されている。第２支持体１５は、第３区画室３の上壁３０の一部を形成する。第３区画室は円筒形状であるが、基本的には他の任意の形状でもよい。第３区画室は、第２の流体、好ましくは、生理学的に適切な緩衝液３１で満たされている。入口および出口３３，３２は、第３区画室３の側壁３４に取り付けられた或いは好ましくは側壁３４と一体に形成されたチューブ部分によって形成される。第１支持体１４および第２支持体１５は、図８ｅに示すように、第１区画室および第３区画室を取り付けた状態で等間隔に配置されている。ここで、幾つかの高分子は、第１膜４に移動したものとして示され、幾つかの高分子は、（第１支持体１４および第２支持体１５によって支持された）第１膜４および第２膜５により形成された第２区画室２内のゲルマトリックス２１を部分的に通過したものとして示され、さらに幾つかの高分子は、第２膜５を通って拡散しようとしているものとして示されている。
【００６２】
３つの区画室１，２，３は、互いに上下に重なり合って配置される。半透膜４，５は、装置の「水平配置」を形成するそれぞれの区画室の間で、実質的に水平に配置される。
【００６３】
装置の膜に隣接する全ての部品は、ガラス製とすることができる。好ましくは、装置は、３つの別体の部品、すなわち、カバー、第１区画室および第３区画室のみからなり、当該別体の部品は、好ましくは、気密に相互に取り付けられる。同様に、図９に示す装置もガラス製であることが好ましい。
【００６４】
図９の装置は、例えば、直方体または円筒形の形状の容器１００を備えている。第１半透膜４および第２半透膜５は、容器１００の内部を第１区画室１、第２区画室２、および第３区画室３に分割するように、容器内に配置されている。第１半透膜４および第２半透膜５は、容器１００内で垂直に、そして容器１００の長手方向軸３００に直交して配置される。
【００６５】
第１区画室１は、第１の流体（例えば、硝子体液）を第１区画室１内に供給するために、容器１００の上に配置された第１の入口１７を備える。第１区画室１の１つの側壁は、第１半透膜４によって形成される。
【００６６】
２つの半透膜４，５は互いに離間して配置され、２つの膜の間に第２区画室２を形成している。膜４，５間の距離は、例えば、シミュレートされる生理学的系に適合させるように変更してもよい。好ましくは、第１膜４および第２膜５は、膜の間で、好ましくは、膜の全長にわたって、所定の距離を有する。第２区画室２は、ゲルマトリックスを第２区画室２内に供給し、第２区画室２からゲルマトリックスを除去するために、容器１００の上に配置された第２の入口１８を備える。
【００６７】
第３区画室３は、入口および出口３２，３３を含む通流室として形成され、入口および出口３２，３３は、第３の流体（例えば、緩衝液）を供給したり除去したりするために、図９において容器１００の上に配置されている。しかしながら、入口および出口は、好ましくは、第３区画室の異なる（稠密な）側壁に配置してもよい。第３区画室３の１つの側壁（容器の壁で形成されたものではない）は、第２半透膜５によって形成されている。
【００６８】
３つの区画室１，２，３は、相互に近接して並んで配置されている。半透膜４，５は、容器内で垂直に配置され、装置の「垂直配置」を形成している。
【００６９】
半透膜４，５は、ホルダ２４，２５により保持されている。ホルダ２４，２５は、容器１００の外側で、容器１００の上部と容器１００の底部の下方に配置されている。ホルダ２４，２５は、容器１００の周囲に円周方向に沿って配置してもよい。ホルダは、例えば、クランプとすることができる。
【００７０】
容器１００自体によって、膜４，５を挟み込むこともできる。例えば、容器１００を幾つかの部品、例えば、３つの部品から構成してもよい。半透膜は、部品を相互に取り付けて固定する際に、２つの部品の間で挟み込んで固定してもよい。すると、各部品が基本的に区画室を形成する。このような装置の実施形態を、図１０ａおよび図１０ｂに示す。図１０ａは、容器１００の個別の３つの部品１０１，１０２，１０３を示し、これらの部品は、第１半透膜４が第１部品１０１および第２部品１０２の間で挟み込んで固定され、第２半透膜５が第２部品１０２および第３部品１０３の間で挟み込んで固定された状態で、本発明による装置に取り付けることができる。容器の各２つの部品には、２つの部品を相互に保持し、２つの部品の間で液密な接続を達成するためのクランプ手段（図示せず）を設けることもできる。クランプを支持するため、各部品１０１，１０２，１０３には、円周方向に延びるリム１０１０，１０２０，１０２１，１０３０が設けられている。図１０ｂに示すように、容器が取り付けられた状態では、各２つのリム１０１０，１０２０および１０２１，１０３０は、相互に対向配置され、リング部に沿って半透膜を挟み込んでいる。好ましくは、クランプ手段は、各２つのリム部を挟み込んで固定するように設けられる。
【００７１】
好ましくは、半透膜４，５は平面膜である。しかしながら、膜の材料次第では、膜を事前に成形し、例えば、凹形状または凸形状として、眼球の一部の幾何学的形状をシミュレートすることもできる。好ましくは、半透膜４，５の形状は、相互に対応する。垂直に配置された膜は、クランプまたは他の保持手段によって容器内に保持されることが好ましいが、第１膜および第２膜４，５を、図８ａ乃至図８ｅに関して上述したように区画室の壁を形成する第１支持体および第２支持体によりそれぞれ支持されてもよい。ホルダ２４，２５は、省略してもよい。
【００７２】
物質、例えば、高分子を、第１の開口部１７を通して、第１区画室１内の第１の流体の中に注入してもよい。物質は四方八方に移動する。重力の影響で、第１区画室の底部へ移行する傾向がある。しかしながら、底部が閉じた容器の壁によって形成されているため、底部を通って第１の流体から物質が拡散することができない。物質が第１半透膜４に移動するときにのみ、第１区画室から、第１膜４を通過して、第２区画室２内のゲルマトリックス内へ、さらに当該ゲルマトリックスを通り、第２膜を通過して、第３区画室３内の緩衝液中へと拡散が起こる。入口１７と、第３区画室の入口および出口３２，３３は、分析目的のために試料の抽出を可能とする。
【００７３】
本発明を特定の実施形態に関連して説明した。しかしながら、本発明の範囲から逸脱することなく、さらなる実施形態を実現することができる。例えば、装置の形状及び大きさは、物質を試験する特定の用途に適合させることができる。特に、装置の幾何学的形状を変更することができる。例えば、区画室および膜は、装置が膜によって分離された区画室の積み重ねによって形成されるように、実質的に平坦に配置されてもよい。装置の幾何学的配置は、本発明による方法および装置において使用される材料に影響を及ぼす可能性もある。例えば、平坦な構成では、物質が膜の十分な支持体を提供するので、例えば、場合によっては第１支持体を省略するか或いは小さな縁部に限定することができる。さらに、ゲルマトリックスの流体または半流動物質は、バリアを形成する多孔質体材料と置換することができる。バリア材料内での細胞増殖と組み合わせる際には、例えば、開気孔セラミックまたは開放プラスチック材料が好ましい。さらに別の１つの膜を、同一または異なるＭＷＣＯを有する２つ以上の膜と置換することができる。
【図１】
2020126081.tif 000002
【図２】
2020126081.tif 000003
【図３】
2020126081.tif 000004
【図４】
2020126081.tif 000005
【図５】
2020126081.tif 000006
【図６】
2020126081.tif 000007
【図７】
2020126081.tif 000008
【図８ａ】
2020126081.tif 000009
【図８ｂ】
2020126081.tif 000010
【図８ｃ】
2020126081.tif 000011
【図８ｄ】
2020126081.tif 000012
【図８ｅ】
2020126081.tif 000013
【図９】
2020126081.tif 000014
【図１０】
2020126081.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月28日(2020.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シミュレートされた生理環境における分子の挙動を分析するための装置であって、
第１の流体を収容する第１区画室と、
ゲルマトリックスを収容する第２区画室と、
第２の流体を収容する第３区画室と、を含み、
当該装置は、さらに、
少なくとも１つの第１半透膜と、
少なくとも１つの第２半透膜と、を含み、
前記少なくとも１つの第２半透膜は、前記少なくとも１つの第１半透膜から離間して配置され、
前記少なくとも１つの第１半透膜は、前記第１区画室と前記第２区画室の間に配置され、
前記少なくとも１つの第２半透膜は、前記第２区画室と前記第３区画室の間に配置され、
前記第１区画室、前記第２区画室および前記第３区画室は一列に配置され、前記少なくとも１つの第１半透膜および前記少なくとも１つの第２半透膜は、それぞれの区画室の間で実質的に垂直に配置され、
前記装置は、前記少なくとも１つの第１半透膜および前記少なくとも１つの第２半透膜を、それぞれの区画室の間に保持するホルダをさらに備え、
前記ホルダは、前記第１区画室、前記第２区画室及び前記第３区画室のいずれの内にも延在していない
ことを特徴とする装置。
【請求項２】
前記少なくとも１つの第１半透膜の分画分子量（ＭＷＣＯ）は、網膜排除限界（ＲＥＬ）に実質的に対応することを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記少なくとも１つの第１半透膜が、前記少なくとも１つの第２半透膜の分画分子量（ＭＷＣＯ）以下の分画分子量（ＭＷＣＯ）を有することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記少なくとも１つの第１半透膜は、凹形状を有することを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
ガラスを含む、またはガラス製であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
前記少なくとも１つの第１半透膜を支持する第１支持体、又は前記少なくとも１つの第２半透膜を支持する第２支持体を含むことを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
少なくとも前記第１支持体は、凹形状を有することを特徴とする請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記第１区画室は、硝子体液である前記第１の流体を含むことを特徴とする請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
前記第３区画室は、緩衝液である前記第２の流体を含むことを特徴とする請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１０】
前記緩衝液は、生理学的に適切な緩衝液であることを特徴とする請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
物質の安定性または生体利用効率に関するデータを測定するため、インビトロで前記物質を試験するための、請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の装置の使用。
【請求項１２】
前記物質が製剤であることを特徴とする請求項１１に記載の装置の使用。
【請求項１３】
前記物質が、１００〜４００ｋＤａの範囲の大きさを有する分子を含むことを特徴とする請求項１１または請求項１２に記載の装置の使用。
【請求項１４】
前記物質が、１ｋＤａ〜２５０ｋＤａの範囲の大きさを有する分子を含むことを特徴とする請求項１１から請求項１３のいずれか一項に記載の装置の使用。
【請求項１５】
前記物質が、４ｋＤａ〜１５０ｋＤａの範囲の大きさを有する分子を含むことを特徴とする請求項１１から請求項１４のいずれか一項に記載の装置の使用。