(57)【要約】      （修正有）【課題】莢膜以外のその他の抗原を標的とする次世代の肺炎球菌ワクチンの提供。【解決手段】（１）自立性の無脂質のペプチド（ｓｅｌｆ−ｓｔａｎｄｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ−ｆｒｅｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）として、パラレル二量体、三量体、又はそれより高次のオリゴマーヘリカルバンドルを形成するパラレルコイルドコイルドメインを含むペプチド鎖と、（２）少なくとも１つの負電荷、及び少なくとも１つの正電荷を帯びたアミノ酸を含み、少なくとも１５％のアミノ酸がプロリンであり、任意選択的に更なる抗原と結合したプロリンリッチペプチド抗原と、（３）２つ又は３つ分の長さのヒドロカルビル鎖を含む脂質部分からなるリポペプチドビルディングブロックであって、前記ペプチド鎖、前記プロリンリッチペプチド抗原、及び前記脂質部分が、直接的に又はリンカーを介して共有結合しているリポペプチドビルディングブロック。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）自立性の無脂質のペプチド（self-standing lipid-free peptide）として、パラレル二量体、三量体、又はそれより高次のオリゴマーヘリカルバンドルを形成するパラレルコイルドコイルドメインを含むペプチド鎖と、
（２）少なくとも１つの負電荷、及び少なくとも１つの正電荷を帯びたアミノ酸を含み、少なくとも１５％のアミノ酸がプロリンであり、任意選択的に更なる抗原と結合したプロリンリッチペプチド抗原と、
（３）２つ又は３つ分の長さのヒドロカルビル鎖を含む脂質部分
からなるリポペプチドビルディングブロックであって、
前記ペプチド鎖、前記プロリンリッチペプチド抗原、及び前記脂質部分が、直接的に又はリンカーを介して共有結合しているリポペプチドビルディングブロック。
【請求項２】
前記ペプチド鎖が２１から２００個のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項３】
前記ペプチド鎖が３から８個のヘプタドモチーフからなるコイルドコイルドメインを含む、請求項１又は２に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項４】
コイルドコイルドメイン内で、各ヘプタドモチーフ（ａｂｃｄｅｆｇ）内の位置ａ及びｄが、小〜中程度の大きさの疎水性側鎖及び／又は芳香族若しくはヘテロ芳香族側鎖を有するアルファアミノ酸を含み、
ａ及びｄのすべての位置のうちの０、１つ又は２つの位置のアミノ酸が極性の非荷電残基であり、かつ
ａ及びｄのすべての位置のうちの０又は１つの位置のアミノ酸が極性のカチオン性残基若しくはそのアシル化誘導体、又は極性のアニオン性残基、又はグリシンである、
請求項３に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項５】
小〜中程度の大きさの疎水性側鎖を有するアルファアミノ酸が、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びバリンであり、
芳香族又はヘテロ芳香族側鎖を有するアルファアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、及びヒスチジンであり、
極性の非荷電残基を有するアルファアミノ酸が、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、及びトレオニンであり、
極性のカチオン性残基を有するアルファアミノ酸が、アルギニン、リジン、及びヒスチジンであり、
極性のアニオン性残基を有するアルファアミノ酸が、アスパラギン酸及びグルタミン酸である、
請求項４に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項６】
前記プロリンリッチペプチド抗原が、少なくとも１つのグルタミン酸残基と少なくとも１つのリジン又はアルギニン残基とを含む、請求項１から５の何れか一項に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項７】
前記プロリンリッチペプチド抗原が、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）及び／又はブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）のタンパク質に由来する、請求項１から６の何れか一項に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項８】
前記プロリンリッチペプチド抗原が、タンパク質ＰｓｐＡ及び／又はＰｓｐＣに由来する、請求項１から６の何れか一項に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項９】
前記プロリンリッチペプチド抗原が、配列番号２７から１１２のペプチドを含み、かつ該ペプチドにおいて、１、２、又は３個のアミノ酸がその他のアミノ酸により置換されている、請求項１から８の何れか一項に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１０】
前記脂質部分が、以下のタイプＺ１からＺ８
2020073487.tif 000046
（式中、Ｒ１及びＲ２は、長鎖ヒドロカルビル又は長鎖ヒドロカルビル−Ｃ＝Ｏであり、Ｙは、Ｈ又はＣＯＯＨである）、
2020073487.tif 000047
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、長鎖ヒドロカルビル若しくは長鎖ヒドロカルビル−Ｃ＝Ｏであり、又は
Ｒ１及びＲ２は、長鎖ヒドロカルビル若しくは長鎖ヒドロカルビル−Ｃ＝Ｏであり、Ｒ３は、Ｈ若しくはアセチル若しくは低級アルキル−Ｃ＝Ｏである）、
2020073487.tif 000048
（式中、Ｒ１及びＲ２は、長鎖ヒドロカルビル又は長鎖ヒドロカルビル−Ｃ＝Ｏであり、ｎは、１、２、３又は４である）、
2020073487.tif 000049
（式中、Ｒ１及びＲ２は、長鎖ヒドロカルビルであり、Ｘは、Ｏ又はＮＨであり、ｎは、１、２、３又は４である）、又は
2020073487.tif 000050
（式中、Ｒ１及びＲ２は、長鎖ヒドロカルビルである）、
のうちの１つであって、長鎖ヒドロカルビルが８から２５個の炭素原子と、任意選択的に鎖内の１、２又は３個の二重結合からなる、直鎖状又は分岐状のアルキル又はアルケニルである、請求項１から９の何れか一項に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１１】
前記脂質部分が、式Ｚ３のジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルであり、式中、Ｒ１及びＲ２がパルミトイルであり、Ｒ３がＨ又はアセチルである、請求項１０に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１２】
パラレルコイルドコイルを含むペプチド鎖が、一方の端においてＰＲペプチド抗原と、もう一方の端において前記脂質部分と結合している、請求項１から１１の何れか一項に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１３】
ペプチド鎖ＰＣが、ペプチド鎖の１つの末端において又はその近傍において
ＬＭ−ＰＣ      （１）
として直接的に、又は
ＬＭ−Ｌ−ＰＣ      （２）
としてリンカー（Ｌ）を介して
脂質部分ＬＭと共有結合しており、
リンカーＬが、
2020073487.tif 000051
（式中、ＸがＯ又はＮＨであり、ｍが１から４５であり、ｎが１から４５である）
から選択される、請求項１２に記載のリポペプチドビルディングブロック。
【請求項１４】
請求項１から１３の何れか一項に記載のリポペプチドビルディングブロックを、２、３、４、５、６又は７個含むヘリカルリポペプチドバンドルからなる合成ウイルス様粒子。
【請求項１５】
請求項１４に記載の合成ウイルス様粒子を含むワクチン。
【請求項１６】
免疫学的に有効な量の請求項１４に記載の合成ウイルス様粒子が、それを必要としている患者に投与される、グラム陰性菌により引き起こされた疾患に対するワクチン接種法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、すべて共有結合しているパラレルコイルドコイルドメイン、プロリンリッチペプチド抗原、及び脂質部分を含むペプチド鎖からなる多量体リポペプチドであって、合成ウイルス様粒子に凝集するリポペプチドに関する。これらのプロリンリッチ抗原を担持する合成ウイルス様粒子は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等のグラム陽性菌により引き起こされる感染性疾患に対するワクチンとして有用である。
【背景技術】
【０００２】
連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）又はブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）を含むグラム陽性菌は、重要な病原菌であり、また肺炎、敗血症、髄膜炎、創傷感染、心内膜炎、急性リウマチ熱、新生児敗血症、又は毒素ショック症候群を含むいくつかの重篤な疾患の病原体である。従って、これらの病原菌に対するワクチンを開発するニーズが存在する。ワクチンは、いくつかの肺炎連鎖球菌血清型についてすでに入手可能である；これらは、製造プロセスが極めて複雑である等の短所を有する。
【０００３】
肺炎連鎖球菌は、極めて多様な多糖カプセル化α−溶血性連鎖球菌であり、ヒト鼻咽頭においてコロニー形成する頻度が高く、また非侵襲的肺炎球菌疾患、例えば中耳炎、副鼻腔炎、及び非菌血性肺炎等、並びにより重度の侵襲的な疾患、例えば菌血症／敗血症、髄膜炎、及び菌血症性肺炎等を、主に幼児及び高齢者において引き起こすおそれがある。
【０００４】
多糖類莢膜は、浸潤期間における病毒性の主要な決定要素であり、またＣ３ｂのオプソニン化及び好中球による非オプソニン性の死滅を阻止する。現在認可されているワクチンは、莢膜多糖抗原を含み、同抗原は、肺炎球菌多糖類ワクチン（ＰＰＳＶ）では単独で処方化される、又は肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ）では、修飾されたジフテリア毒素ＣＲＭ１９７等のキャリアタンパク質にコンジュゲートしている。４０の血清群において、９０を超える異なる莢膜血清型が存在する。
【０００５】
多糖類肺炎球菌ワクチンは、血清型特異的防御を提供し得るが、同一血清群内であっても、交差防御性は低い。２０００年に米国において、コンジュゲートワクチンＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）７の導入後、血清型置換が認められた。とりわけ、新規の血清型は、多剤耐性莢膜スイッチ変異体でもある。従って、莢膜以外のその他の抗原を標的とする次世代の肺炎球菌ワクチンに対するニーズが存在する。
【０００６】
次世代の肺炎球菌ワクチンに組み込まれる可能性のある１つの抗原として、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）が挙げられる。ＰｓｐＡは、単量体の多型性コリン結合性タンパク質であり、それ自身でアンチパラレルのコイルドコイルを形成し、時に比較的保存性の非プロリンブロックにより分散したプロリンリッチな領域であるＮ末端αヘリカル部分及びコリン結合性ドメインの多重リピートを含有するＣ末端領域を含有する。
【０００７】
ＰｓｐＡのＮ末端領域は、免疫優性エピトープを含有する。この領域を含む組換えタンパク質及びこの領域を発現する細菌ベクターは、様々なモデルにおいて防御能力を示した。例えば、Ｌａｎｇｅｒｍａｎｎらは、ＰｓｐＡを発現する組換えＢａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ｒＢＣＧ）ベクターを調製した。細菌膜内のＰｓｐＡを係留可能にするために、ＰｓｐＡ由来の遺伝子セグメントを、Ｍｔｂ１９リポタンパク質と融合させた（Langermann S.ら、J. Exp. Med.、1994年、第180巻、p2277-2286を参照）。ワクチン抗原としてＰｓｐＡを使用することに関連した安全上の懸念が存在しており、その理由は、そのＮ末端領域が、ヒトミオシンと類似する可能性があり、従ってこの領域を含む免疫原を用いて免疫化を行うと、組織交差反応性抗体をもたらす可能性があるからである。従って、近年、抗原としてＰｓｐＡのその他の領域を使用する努力が払われている。次世代の肺炎球菌ワクチンに組み込むのに適し得る別のＰｓｐＡ領域として、プロリンリッチ領域が挙げられる。ＰｓｐＡのプロリンリッチ領域（ＰＲＲ）は、多型性であるが、ＰＫＰ、ＰＡＰＡＰ、ＰＥＫＰのような短いアミノ酸モチーフを含むいくつかの保存されたモチーフ及びいくつかのＰｓｐＡ分子中に存在する極めて保存性の非プロリンブロック（ＮＰＢ）を含有する（Brooks-Walter, A.ら、Infect Immun、1999年、第67巻、p6533-6542; Hollingshead, S. K.ら、Infect Immun、2000年、第68巻、p5889-5900; Daniels, C. C.ら、Infect Immun、2010年、第78巻、p2163-2172）。ＰＲＲは、免疫優性エピトープを含まないが、ＰｓｐＡのこの部分に対する抗体が、抗原としてチオレドキシン（Ｔｒｘ）融合タンパク質を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を利用して、小児で検出されている（Melin, M.ら、Vaccine 2012年、第30巻、p7157-7160）。ＮＰＢは極めて保存性であるので、その著者らはＰＲＲに対する抗体がＮＰＢエピトープの認識を通じて大部分の系統と交差反応する可能性があるものとの仮説を立てている。
【０００８】
ＰｓｐＡのＰＲＲのサイズは小さく（最大約１００個のアミノ酸）、従って抗原単独で用いた場合、十分に免疫応答誘発性でない可能性がある。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｔｒｘ融合タンパク質が産生され、その防御の可能性が静脈内感染のマウスモデルにおいて示唆された（国際公開第２００７／０８９８６６号、及び  Daniels, C. C.ら、Infect Immun、2010年、第78巻、p2163-2172）。しかし、非防御的Ｔｒｘエピトープに対して免疫応答を誘発する可能性があり、またネイティブなＰＲエピトープの構造的提示が不十分なので、Ｔｒｘ融合タンパク質は、ワクチンとしてはヒト用途に適さない可能性がある。更に、ＮＰＢ又はプロリンリッチ（ＰＲ）配列は、非防御的エピトープも含む可能性があり、従って、有効性が得られるように、免疫応答を防御的エピトープに集中させることが重要であり得る。
【０００９】
類似したＰＲ配列が、表面タンパク質ＰｓｐＣ（ＣｂｐＡ又はＨｉｃとしても知られている）並びにＰｈｔＸタンパク質ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、及びＰｈｔＥを含むその他の肺炎球菌タンパク質に見出され得、そのようなその他の肺炎球菌タンパク質に由来するプロリンリッチ領域は、ＰｓｐＡに由来するプロリンリッチ配列のように、次世代の肺炎球菌ワクチンに組み込むのに適する可能性がある。
【００１０】
その他のグラム陽性菌由来のいくつかの免疫応答誘発性細菌表面タンパク質は、これら病原菌に対するワクチンの標的対象と同様になり得るプロリンリッチ配列を含む。これらのタンパク質として、Ｍ６等のその他の連鎖球菌由来の表面タンパク質、Ｓ．ピオゲネス（ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＳｃｌＡ、及びＳｃｌＢタンパク質、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）のＣＢｅｔａ（ｂａｃ）及びＢｉｂＡ、又はＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のＰ１アドヘシン、又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のタンパク質が挙げられる。
【００１１】
合成細菌性リポペプチド類似体は、そのアジュバント効果について、またペプチド抗原用の担体として、両方の観点からワクチン研究において幅広い注目を浴びている（Ghielmetti M.ら、Immunobiology、2005年、第210巻、p211-215）。多くのリポペプチド構築物が報告されており、そこではアジュバント効果を有することが知られている脂質がペプチドと結合して自己−免疫賦活化ワクチン候補を生成するとされている。特に、十分に試験されたものとして、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン（Ｎ−パルミトイル−Ｓ−（２，３−ビス−（Ｏ−パルミトイルオキシ）−プロピル）−システイニル−、又はＰａｍ３Ｃｙｓ）、及びジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン（２，３−ビス−（Ｏ−パルミトイルオキシ）−プロピル）−システイニル−、又はＰａｍ２Ｃｙｓ）が挙げられる。これらの脂質部分は、グラム陰性菌の内膜及び外膜のリポタンパク質成分に見出される。特許出願国際公開第９８／０７７５２号は、ペプチド部分が三重らせん構造を誘発する能力を有するコラーゲン様の配列であり得る、薬物ターゲティングを目的としたリポペプチドの使用について記載している。特許出願国際公開第２００８／０６８０１７号は、ヘリカルリポペプチドバンドルを含み、脂質コアとペプチド性外部表面を備えた球体構造又は楕円体構造を有する合成ウイルス様粒子について記載する。リポペプチドのペプチド鎖は、コイルドコイルドメインを含む。リポペプチドビルディングブロックのペプチド鎖内に存在するコイルドコイルドメインの特性は、ビルディングブロックを組み合わせて合成ウイルス様粒子を形成する際の、該ビルディングブロックの数を決定する。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、（１）自立性の無脂質のペプチド（self-standing lipid-free peptide）として、パラレル二量体、三量体、又はそれより高次のオリゴマーヘリカルバンドルを形成するパラレルコイルドコイルドメインを含むペプチド鎖、（２）少なくとも１つの負電荷、及び少なくとも１つの正電荷を帯びたアミノ酸を含み、少なくとも１５％のアミノ酸がプロリンであり、任意選択的に更なる抗原と結合したプロリンリッチ（ＰＲ）ペプチド抗原、及び（３）２つ又は３つ分の長さのヒドロカルビル鎖を含む脂質部分からなるリポペプチドビルディングブロックであって、前記ペプチド鎖、前記ＰＲペプチド抗原、及び前記脂質部分が、直接、又はリンカーを介して共有結合しているリポペプチドビルディングブロックに関する。好ましくは、パラレルコイルドコイルを含むペプチド鎖は、一方の端部においてＰＲペプチド抗原と、他方の端部において脂質部分と結合している。
【００１３】
これらのリポペプチドビルディングブロックは、ヘリカルリポペプチドバンドル及び合成ウイルス様粒子（ＳＶＬＰ）に凝集する。ＳＶＬＰ表面上にＰＲ抗原が提示されると、ＰＲエピトープに対する免疫応答が増強される。
【００１４】
連鎖球菌及び／又はブドウ球菌に由来する、より好ましくは肺炎連鎖球菌由来のＰＲペプチド抗原を含むリポペプチドビルディングブロックが好ましい。
【００１５】
本発明は、リポペプチドビルディングブロック、ヘリカルリポペプチドバンドル、及び合成ウイルス様粒子の製造方法；ワクチン調製におけるリポペプチドビルディングブロック、ヘリカルリポペプチドバンドル、及びＰＲペプチド抗原を担持する合成ウイルス様粒子の使用；並びにこのようなワクチンを用いてワクチン接種する方法に更に関する。同様に、本発明は、ＰＲ抗原を担持する合成ウイルス様粒子を含有する薬学的製剤に関する。
【００１６】
連鎖球菌及び／又はブドウ球菌に由来する、特に肺炎連鎖球菌由来のＰＲペプチド抗原を含む本発明の組成物は、肺炎連鎖球菌又はその他のグラム陽性菌に対する免疫応答を誘発する、及び感染性疾患、例えば肺炎連鎖球菌により引き起こされた肺炎球菌疾患等を予防又は治療するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】リポペプチド１５（黒丸及び四角）又はアラムで免疫賦活化された組換えＰｓｐＡ（ｒＰｓｐＡ、黒三角）で２回免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスから得た血清、及び非免疫化コントロールから得た血清（白抜きの記号）のＩｇＧ  ＥＬＩＳＡエンドポイント力価を示す図である。記号は、個々のマウスから得た血清のエンドポイント力価を示し、線はメジアン値を示す。力価は、プロリンリッチ領域（ＰＲペプチド）を提示するペプチド、並びにＮ末端αヘリカル部分全体、プロリンリッチ領域、及び非プロリンブロック（ｒＰｓｐＡ）を含む組換えＰｓｐＡタンパク質に対して測定した。
【図２】肺炎連鎖球菌血清型１の用量を増加させたときの、免疫化及び非免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウスのチャレンジ後の生存時間を日数（Ｄ）で表わした図である。生存の割合（％Ｓ）をｙ軸に示し、免疫原及びチャレンジ用量（ＣＦＵ表示）を右側に示す。マウスをリポペプチド１５又はｒＰｓｐＡ＋アラムで２回免疫化し、次に経静脈的にチャレンジを行った。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、
（１）自立性の無脂質のペプチドとして、パラレル二量体、三量体、又はそれより高次のオリゴマーヘリカルバンドルを形成するパラレルコイルドコイルドメインを含むペプチド鎖（ＰＣ）、
（２）少なくとも１つの負電荷、及び少なくとも１つの正電荷を帯びたアミノ酸を含み、少なくとも１５％のアミノ酸がプロリンであり、任意選択的に更なる抗原と結合したプロリンリッチ（ＰＲ）ペプチド抗原、及び
（３）３つ分又は好ましくは２つ分の長さのヒドロカルビル鎖を含む脂質部分（ＬＭ）からなるリポペプチドビルディングブロックであって、
前記ペプチド鎖、前記ＰＲペプチド抗原、及び前記脂質部分が、直接、又はリンカーを介して、特に２つの異なるリンカーを介して共有結合しているリポペプチドビルディングブロックに関する。
【００１９】
好ましくは、パラレルコイルドコイルを含むペプチド鎖は、一方の端部においてＰＲペプチド抗原と、及び他方の端部において脂質部分と結合している。
【００２０】
ペプチド鎖（ＰＣ）は、パラレルコイルドコイルドメインを含む。このようなコイルドコイルドメインは、定義されたヘリカルバンドルに、例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、又は七量体のバンドルに会合する。パラレルコイルドコイルドメインは、単量体のペプチド鎖がループバックして、アンチパラレルの配置で単量体ペプチドの２つ（以上）の部分的なドメインを配置することにより、らせん状の下部構造を形成するアンチパラレルコイルドコイルとは異なる。パラレルコイルドコイルドメインは、１２−１２０個のアミノ酸残基、好ましくは２１−８０個のアミノ酸残基を含み得る。コイルドコイルドメインは、２つ以上の逐次的なリピートパターン（通常、ヘプタド（ｈｅｐｔａｄ）リピートで、その７つの構造的な位置はａ−ｇとラベリングされ、ａとｄは、疎水性残基を表す）を含み、自立性の無脂質のペプチドとして、パラレルコイルドコイルヘリカルバンドルに自己会合する特性を有する（Lupas A.N.、Gruber M.; The structure of alpha-helical coiled coils, Adv. Protein Chem.、2005年、第70巻、p37-78）。ペプチド鎖は、多量体化して定義されたオリゴマー化状態（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、又は七量体、特に二量体、三量体、四量体、又は五量体）のパラレルコイルドコイルヘリカルバンドルを形成しなければならない。好ましいペプチド配列は、ヒトのワクチン接種で適用された際に、自己免疫障害リスクを避けるためにヒト以外の配列である。
【００２１】
リポペプチドビルディングブロックは、少なくとも１つの負電荷及び少なくとも１つの正電荷を帯びたアミノ酸を含むプロリンリッチ（ＰＲ）ペプチド抗原を更に含む。本明細書で検討される荷電したアミノ酸とは、生理学的ｐＨにおいて正に荷電した又は負に荷電した側鎖を備えたアミノ酸である。天然のアミノ酸のうち、本明細書で検討される最高頻度の正荷電アミノ酸は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンである；最高頻度の負荷電アミノ酸は、グルタミン酸及びアスパラギン酸である。ペプチドは、少なくとも１５％のアミノ酸がプロリンである場合には「プロリンリッチ」と考えられる。少なくとも１つのグルタミン酸残基、及び少なくとも１つのリジン又はアルギニン残基を含むプロリンリッチペプチドが好ましい。
【００２２】
好ましいＰＲペプチド抗原は、連鎖球菌及び／又はブドウ球菌、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ）、及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）からなる群より選択されるグラム陽性菌に由来する。
【００２３】
好ましくは、このＰＲペプチド抗原は、タンパク質ＰｓｐＡ及び／若しくはＰｓｐＣ、又はＰｈｔＸタンパク質を含む肺炎球菌感染に対して防御的なその他のタンパク質に由来する。
【００２４】
「由来する」とは、ペプチド抗原のアミノ酸配列又はアミノ酸配列の相当な部分（すなわち、５０％以上）が、１つ又は複数の天然のタンパク質に由来することを意味し、０％−最大５０％のアミノ酸配列が新規に設計される。異なるＰｓｐＡ／ＰｓｐＣ分子及び／又はプロリンリッチセグメントを含有するその他のタンパク質に由来するプロリンリッチ配列の組み合わせを含むＰＲペプチド抗原も含まれる。「プロリンリッチセグメント」とは、セグメントに含まれる少なくとも１５％のアミノ酸がプロリンであることを意味する。
【００２５】
特別に興味深いプロリンリッチな（ＰＲ）ペプチド抗原は、肺炎連鎖球菌に由来し、ＰｓｐＡ又はＰｓｐＣのらせん領域のＣ末端の直後、及び非プロリンブロック（ＰｓｐＡ又はＰｓｐＣ配列が、非プロリンブロックを含む場合）、又はリピート領域の前に位置する。あるいは、ＰＲペプチド抗原は、肺炎球菌ポリヒスチジントライアドタンパク質（ＰｈｔＸ）の中央領域に位置する。あるいは、ＰＲペプチド抗原は、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・アガラクティエ、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・スイス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ、ペプトストレプトコッカス・マグヌス、及び黄色ブドウ球菌からなる群より選択されるグラム陽性菌のＰＲタンパク質の領域、例えばストレプトコッカス・ミュータンスのＰ１アドヘシンの中央領域等に位置する。
【００２６】
防御的なＰＲペプチド抗原は、ＰｓｐＡ及び／又はＰｓｐＣ、及び／又は臨床分離株に由来するその他の遺伝子を配列決定し、ＰＲ領域の部分を選択し、ＰＲペプチドを合成し、並びにリポペプチドに組み込まれるように又はリポペプチドの一部分となるように、これをペプチド鎖（ＰＣ）にコンジュゲートさせることにより識別される。
【００２７】
ＰＲペプチド抗原の有効性は、リポペプチドコンジュゲート及びそれから得られた合成ウイルス様粒子を投与し、肺炎球菌性敗血症又は連鎖球菌感染により引き起こされたその他の疾患を有する動物モデルを対象に、活性及び有効性を観察することにより試験される。
【００２８】
ＰＲペプチド抗原は、任意選択的に更なる抗原と結合する。考えられる更なる抗原として、その他の肺炎球菌ペプチド又は多糖類、特にアミノ酸配列が配列番号：１１３−１１９のペプチド、及び以下に記載するその他の抗原が挙げられる。
【００２９】
ＰＲペプチド抗原は、ＰＲペプチド抗原のＮ末端若しくはＣ末端において直接、又はリンカーを介してコンジュゲートしており、コイルドコイルドメインを含むペプチド鎖（ＰＣ）のＮ末端若しくはＣ末端、又は任意選択的にアミノ酸側鎖に連結している。あるいは、ＰＲペプチド抗原は、コイルドコイルドメインを含むペプチド鎖（ＰＣ）に、ＰＲペプチド抗原の側鎖残基、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、オルニチン、又はシステイン側鎖の末端部又は内部等を介してコンジュゲートしている。考えられるリンカーとして、２−２０個のアミノ酸からなる短いペプチド、ヒドロキシアルキル−又はアミノアルキル−カルボン酸、置換型又は非置換型のポリアルキルエノキシグリコールが挙げられ、好ましくは１−１２個のＣ２及び／又はＣ３アルキレンオキシ単位、ポリアルキルエノキシグリコールブロックコポリマー（例えば、プルロニック）、単糖、二糖、三糖、及びオリゴ糖を含有し、これらは、アセチル、グリセロールリン酸、又は１つ又は複数の位置におけるその他の置換基、多糖類、例えばポリ（シアリル酸（ｓｉａｌｙｌｉｃ  ａｃｉｄ））及びその誘導体（例えば、ペプチドコンジュゲート）等、タンパク質原性又は非タンパク質原性アミノ酸、及びＣ１−Ｃ８飽和又は不飽和炭化水素を含み得る、及び１つ又は複数の下記の官能基：ジスルフィド結合、アミン、アミド、アセタール、エステル、エーテル、チオエーテル、ヒドラゾン、ヒドラジド、イミン、オキシム、ウレア、チオウレア、カルボネート、イミノカルボネート、アミジン、アミド、イミド、アルキルスクシンイミドを含み得るが、アミド、スルホンアミド、スルホン、又は窒素及び酸素より選択される１つ又は複数の原子を含む複素環式リング、好ましくはトリアゾールに加水分解される場合もある。同じ様に考えられることとして、実施例で用いられるものを含む上記リンカーの組み合わせが挙げられる。
【００３０】
ペプチド又はその他の抗原を抗原送達システム、例えばキャリアタンパク質、ポリマー、デンドリマー、ナノ粒子、又はウイルス様粒子等にコンジュゲートさせるのに用いられるあらゆる方法が、ＰＲペプチド抗原を、パラレルコイルドコイルドメインを含むペプチド鎖（ＰＣ）にコンジュゲートさせるのに利用可能である。このような方法は、当業者にとって周知であり、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００８年を参照。
【００３１】
ＰＲペプチド抗原は、５−２００個のアミノ酸、好ましくは８−８０個のアミノ酸からビルディングされる。多重ＰＲペプチドコンジュゲートは、ワクチン処方物で併用して利用可能である。ＰＲペプチド抗原は、より長い人工的なＰＲペプチドを産生するために、共に融合させることも可能である。また、ＰＲコンジュゲートは、その他の肺炎球菌ペプチド又は多糖類を含むコンジュゲートとも併用可能である。官能基（例えばアミノ−、ハロー−、ヒドラジノ−、ヒドロキシルアミノ−、又はスルフヒドリル基）を含むアミノ酸及びその誘導体は、ＰＲペプチドのコンジュゲーションをし易くし、また安定性を増強するために、ＰＲペプチドに組み込み可能である。
【００３２】
ペプチド鎖（ＰＣ）は、１つ又は複数のＴヘルパー細胞エピトープ、及び／又は水中でのリポペプチドビルディングブロックの溶解度を高める極性残基のストリングを含むアミノ酸配列を更に含み得る。
【００３３】
ペプチド鎖（ＰＣ）に組み込み可能なＴヘルパーエピトープとして、下記の表１に記載するもの、及び１、２、又は３個のアミノ酸がその他のアミノ酸に置き換わっている又は除去されているその変異体が挙げられる。
2020073487.tif 000002
【００３４】
ペプチド鎖（ＰＣ）の全長は、好ましくは２１−２００個のアミノ酸残基、より好ましくは２１−１２０個のアミノ酸残基である。
【００３５】
脂質部分（ＬＭ）は、２つ又は３つ分、好ましくは２つ分の長さのヒドロカルビル鎖を有する脂質アンカー及びこれらのヒドロカルビル鎖が組み合わさった構造を含有し、ペプチド鎖（ＰＣ）と直接、又はリンカーを介して連結する。脂質部分は、ＰＲペプチドと再度連結することもやはり可能であり、次にパラレルコイルドコイルを含むペプチド鎖にはコンジュゲートされる、しかし、脂質部分がペプチド鎖と連結するのが好ましい。好ましい脂質部分は、２つ又は３つ分、好ましくは２つ分延長したヒドロカルビル鎖を含有する脂質である。
【００３６】
「長鎖ヒドロカルビル」とは、少なくとも７個の炭素原子からなる直鎖アルキル又はアルケニル基、例えば、８−５０個のＣ原子、好ましくは８−２５個のＣ原子からなる直鎖アルキル又はアルケニルを意味する。アルケニルは、鎖内に好ましくは１、２、又は３つの二重結合を有し、そのそれぞれは、天然の脂肪酸及び脂肪族アルコールに通常見出されるように、Ｅ又はＺの幾何学的配置を取る。同じ様に、「長鎖ヒドロカルビル」の定義に含まれるものとして、分岐型アルキル又はアルケニル、例えば鎖の端部から数えて第２又は第３番目の炭素原子にメチル又はエチル置換基を担持する、例えば２−エチル−ヘキシルのようなアルキルが挙げられる。
【００３７】
「低級アルキル」とは、１−７個の炭素原子（Ｃ１−Ｃ７）、好ましくは１−４個の炭素原子（Ｃ１−Ｃ４）を有するアルキル、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、又はｔｅｒｔ−ブチル等を意味する。
【００３８】
本発明による、特別に好ましい脂質部分として、Ｚ１−Ｚ８の式が挙げられる。
2020073487.tif 000003
（式中、Ｒ１及びＲ２は、長鎖ヒドロカルビル又は長鎖ヒドロカルビル−Ｃ＝Ｏであり、Ｙは、Ｈ又はＣＯＯＨである）、
2020073487.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、長鎖ヒドロカルビル若しくは長鎖ヒドロカルビル−Ｃ＝Ｏであり、又はＲ１及びＲ２は、長鎖ヒドロカルビル若しくは長鎖ヒドロカルビル−Ｃ＝Ｏであり、Ｒ３はＨ若しくはアセチル若しくは低級アルキル−Ｃ＝Ｏである）、
2020073487.tif 000005
（式中、Ｒ１及びＲ２は、長鎖ヒドロカルビル又は長鎖ヒドロカルビル−Ｃ＝Ｏであり、ｎは１、２、３、又は４である）、
2020073487.tif 000006
（式中、Ｒ１及びＲ２は、長鎖ヒドロカルビルであり、Ｘは、Ｏ又はＮＨであり、ｎは、１、２、３、又は４である）、あるいは
2020073487.tif 000007
（式中、Ｒ１及びＲ２は、長鎖ヒドロカルビルである）
【００３９】
脂質部分は、例えばＺ１−Ｚ８に示す脂肪酸等に見出されるような長鎖ヒドロカルビル鎖を少なくとも２つ含有する。１つの好ましい脂質部分は、例えば式Ｚ１又はＺ２のような様々なタイプのリン脂質であり、例えば１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンのエナンチオマー、又は１，３−ジパルミトイル−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン等のアキラルアナログ等のエステル又はエーテル結合した延長型アルキル又はアルケニル鎖を有する。好ましい脂質部分は、トリ−又はジ−パルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニル残基（タイプＺ３）又はタイプＺ４−Ｚ８の脂質部分である。最も好ましいものとして、実施例に記載する脂質部分が挙げられる。
【００４０】
ペプチド鎖（ＰＣ）は、一方の末端、すなわちＮ末端又はＣ末端、好ましくはＮ末端において、又はその近傍で脂質部分（ＬＭ）と共有結合している。脂質部分は、
ＬＭ−ＰＣ    （１）
のように直接、
又は
ＬＭ−Ｌ−ＰＣ    （２）
のようにリンカー（Ｌ）を介して結合し得る。
【００４１】
ペプチド鎖（ＰＣ）及び脂質部分（ＬＭ）が、直接結合する場合には、この結合は、好ましくは、脂質部分のカルボニル官能基とペプチド鎖（ＰＣ）のアミノ官能基、例えばＮ末端アミノ官能基との間のアミド結合を通じて実現する。特定の脂質部分Ｚ１、Ｚ２、及びＺ８は、好ましくはそのアミン官能基と、ペプチド鎖（ＰＣ）のカルボキシ官能基、例えばＣ末端カルボキシ官能基との間のアミド結合を通じて連結する。
【００４２】
幅広く多様で好適なリンカー及びカップリング戦略が存在し、これには、ジカルボン酸誘導体に基づくリンカー、１つ若しくは複数のエチレングリコール単位、アミノ酸残基（α−、β−、γ−、δ−アミノ酸を含む）、又は糖（炭水化物）単位を含有するリンカー、又は複素環式リングを含有するリンカーが非限定的に含まれることは、当業者にとって明白である。考えられる特別なリンカーとして、Ｌ１−Ｌ１６のリンカーが挙げられ、ここで、ｎは１−４５、及びｍは１−４５、例えばｎは１−２０、及びｍは１−２０であり、連結官能基Ｃ＝Ｏ及び／又はＸと共に示される（式中のＸはＯ又はＮＨである）：
2020073487.tif 000008
【００４３】
実施例に記載するリンカーが最も好ましい。
【００４４】
特定のリンカーＬ１−Ｌ１６は、以下のようにＬＭとＰＣとを連結し得る：
【００４５】
Ｌ１−Ｌ１６において示すようなカルボニル官能基は、アミド結合を介して、適する脂質部分（ＬＭ）のアミノ官能基及び／又はペプチド鎖（ＰＣ）のアミノ官能基、例えばＮ末端アミノ官能基と連結し得る。あるいは、Ｌ１−Ｌ１６において示すようなカルボニル官能基は、特定の脂質部分Ｚ３−Ｚ７内の対応するカルボニル官能基と置換することにより、脂質部分（ＬＭ）と連結し得る。
【００４６】
Ｌ１−Ｌ１６において示すような官能基Ｘ（ＮＨ又はＯを意味する）は、適する脂質部分（ＬＭ）のカルボニル官能基、及び／又はペプチド鎖（ＰＣ）のカルボキシ官能基、例えばＣ末端カルボキシ官能基と、アミド結合（Ｘ＝ＮＨの場合）を介して、又はエステル結合（Ｘ＝Ｏの場合）を介して連結し得る。
【００４７】
Ｌ８の末端ＣＨ２基は、適する脂質部分（ＬＭ）のアミノ官能基、ペプチド鎖（ＰＣ）のアミノ官能基、例えばＮ末端アミノ官能基、又は適する脂質部分（ＬＭ）のカルボニル官能基と連結し得る。
【００４８】
この連結で理解されるような「一方の端部近傍」とは、脂質部分又はリンカーが、ペプチドのＮ末端又はＣ末端それぞれから数えて第１、第２、第３、第４番、又は第５番目のアミノ酸に結合していることを意味する。脂質部分は、ペプチド構造の骨格又は末端近傍のこれらのアミノ酸のうち、１つの側鎖と、直接又はリンカーを介して結合し得る。
【００４９】
「コイルドコイルドメイン」は、自発的自己会合により、へリックスの熱力学的に安定なα−へリックス状パラレルバンドルを形成するような、適するアミノ酸配列を慎重に選択することにより設計される。
【００５０】
コイルドコイルドメインは、右旋性の両親媒性α−へリックスを形成する標準的タンデムヘプタド配列リピートに基づくペプチドを含み、次に会合して左旋性のスーパーコイルとヘリカルバンドルを形成する。同じ様に含まれるものとして、必ずしも左旋性ではない又は規則的なスーパーコイルでもないコイルドコイルを形成する非標準的、非ヘプタドベースのリピートから構成されたペプチドが挙げられる。
【００５１】
標準的なコイルドコイルは、天然の生物学的に活性なペプチド及びタンパク質において幅広く生じており、新規に設計されてもいる。定義されたオリゴマー化状態、トポロジー、及び安定性を有するヘリカルバンドルを採用するコイルドコイルペプチドを設計するために、一連の規則が明らかにされている（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、又は七量体）。これらの規則は、設計者が、所与の標的構造に適合するペプチド配列を構築できるようにする。最も重要なこととして、標準的なコイルドコイルペプチドの配列は、一般的に３−１０回反復した特徴的な７残基モチーフを含む。１つのヘプタドモチーフ内の位置は、ａｂｃｄｅｆｇとして伝統的に表され、主に（但し、非排他的に）疎水性残基が、部位ａ及びｄに生じ、また一般的に極性のヘリックス指向性残基は別の場所に生ずる。ペプチド鎖に沿ったタンデムなヘプタドモチーフは、ａとｄの残基の間で、α−ヘリックスの１つの面と向き合えるような平均的な間隙を有する。２つ以上のへリックスが、共にパッキングされてコイルドコイルバンドルになると、へリックスの疎水性の面は相互に会合し、疎水表面間の接触が最大化するように相互に巻き付く。ヘプタドリピート内の各位置において生ずる可能性がある残基の種類は、ヘリカルバンドルの安定性及びオリゴマー化状態に影響を及ぼす。一般的に、主に疎水性残基（Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ）、又は芳香族疎水性側鎖（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）は、ａ及びｄの部位において用いられる。残りのｂ、ｃ、ｅ、ｆ、及びｇの部位は、極性のヘリックス指向性残基（Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、及びＧｌｎ）を好むものの、ａ及びｄの部位より許容的な傾向を有する。ａ及びｄの部位における残基を選択する場合、その選択は、コイルドコイルのオリゴマー化状態（すなわち、二量体と三量体）に影響を及ぼす可能性がある。従って、ｄの位置に非β−分岐状残基（例えば、Ｌｅｕ）が来る場合、二量体が好まれる；これらの部位では、β−分岐状残基（Ｖａｌ及びＩｌｅ）は、二量体を好まない。一方、二量体の場合、ａ部位では、β−分岐状残基（Ｉｌｅ、Ｖａｌ）が好ましい。別のルールとして、ａ＝ｄ＝Ｉｌｅ又はＬｅｕの場合、三量体が好まれることが挙げられ、特にパラレル三量体を形成するコイルドコイルを設計する際に有用である。これらの及びその他の設計規則が、Ｗｏｏｌｆｓｏｎ，Ｄ．Ｎ．、Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．、２００５年、第７０巻、ｐ７９−１１２でより詳細に議論されている。
【００５２】
ヘプタドモチーフは、その疎水性の面を介してオリゴマー化する両親媒性α−へリックスをコードする。コイルドコイルドメインは、少なくとも３つのタンデムヘプタドリピートモチーフを含む。各鎖内のヘプタドリピートの数が大きいほど、ヘリカルバンドルの安定性に影響を及ぼす。その数は、長鎖ペプチドの化学合成のフィージビリティーにより、主に制約を受けるが、３つを超えるヘプタドリピート（例えば、４、５、６、７、及び８つのヘプタドリピート）を含有する配列が好ましい。以下で議論される実施例は、三量体のα−ヘリックスコイルドコイルを形成するが、本発明は二量体、四量体、五量体、六量体、及び七量体のコイルドコイルドメインとも同様に関連する。
【００５３】
本発明によるコイルドコイルドメインは、天然のコイルドコイル内に存在するようなより長いリピート単位、例えば１１残基リピート及び１５残基リピートを有し得る。従って、凝集構造の形成に必要とされるヘリカルバンドルは、７つ以外の周期性を有するコイルドコイルモチーフを用いるときにも生じる可能性がある。まれな周期性を有するコイルドコイルも可能である。多くの天然のコイルドコイルでは、未破壊のヘプタドリピートパターンは、様々な不連続性を含み得る。２つの一般的な不連続性は、ヘプタドパターンへの１残基の挿入、並びに３又は４残基挿入である。例えば、１残基挿入が、インフルエンザ赤血球凝集素の三量体コイルドコイル内に認められる。その他の天然のコイルドコイルは、７以外の周期性、例えば１１残基の規則的周期性（ヘンデカドと呼ばれる）を示し、タフィロテルムス・マリナス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）の表層タンパク質テトラブラチオンに見出される。
【００５４】
ウイルスの外被タンパク質内に天然に生ずるコイルドコイルペプチド配列のその他の例として、ＨＩＶ−１のｇｐ４１外被タンパク質及びＲＳＶのＦ−糖タンパク質内で、三量体ヘリカルバンドルを形成するコイルドコイルモチーフが挙げられる。これらのコイルドコイルドメインは、本発明によるコイルドコイルドメインの定義に含まれる。
【００５５】
好ましいコイルドコイルペプチドは、３−８個のタンデムに結合したヘプタドモチーフを含むべきである。コイルドコイル内のヘプタドモチーフは、同一の配列を有し得る、又はそれぞれ異なる配列を有する可能性がある。すべてのケースにおいて、１つのヘプタドモチーフ内の７つのアミノ酸残基の７つの位置は、ａ  ｂ  ｃ  ｄ  ｅ  ｆ  ｇの文字を用いて命名されている。従って、コイルドコイルペプチドは、位置（ａｂｃｄｅｆｇ）３−８を有するアミノ酸配列を含む。
【００５６】
３−８個のタンデムに結合したヘプタドモチーフを含有するコイルドコイルペプチド配列が好ましく、各ヘプタドモチーフ（ａｂｃｄｅｆｇ）内の位置ａ及びｄは、本明細書において以下で定義するようなグループ１及び／又はグループ２に属するα−アミノ酸を含む。更に、すべてのａ及びｄの位置のうちの２つを超えない位置は、グループ３に属する任意のアミノ酸残基により占有され得るが、またすべてのａ及びｄの位置のうちの１つを超えない位置は、グループ４若しくはグループ５に属する任意のアミノ酸残基又はグリシンにより占有され得る。更に、位置ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、及びｇでは、グループ３、４、及び５に属するα−アミノ酸が好ましいものの、但し任意の１つのヘプタドモチーフ内のこれらの位置のうちの１つを超えない位置は、グリシンであってもよいが、プロリンであってはならないことが加われば、グループ１及び２に属するアミノ酸も許される。
【００５７】
グループ１は、小〜中程度の大きさの疎水性側鎖を有するα−アミノ酸残基を含む。疎水性残基は、生理学的ｐＨにおいて電荷を有さず、水溶液により排斥されるアミノ酸側鎖を意味する。これらの側鎖は、一級及び二級アミド、一級及び二級アミン、並びにその対応するプロトン化した塩、チオール、アルコール、ウレア、又はチオウレア等のように水素結合供与基を一般的に含まない。しかし、このような側鎖は、エーテル、チオエーテル、エステル、三級アミド、又は三級アミン等の水素結合受容基を含み得る。このグループに含まれる遺伝学的にエンコードされるアミノ酸として、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びバリンが挙げられる。
【００５８】
グループ２は、芳香族又はヘテロ芳香族側鎖を有するアミノ酸残基を含む。芳香族アミノ酸残基とは、共役芳香族π（パイ）−電子系を有する少なくとも１つのリングを含有する側鎖を有する疎水性アミノ酸を意味する。更に、同グループは、低級アルキル、アリール、又はハロゲン等の追加の疎水基、一級及び二級アミン、及びその対応するプロトン化した塩、一級及び二級アミド、アルコール等の水素結合供与基、並びにエーテル、チオエーテル、エステル、三級アミド、又は三級アミン等の水素結合受容基等を含み得る。遺伝学的にエンコードされる芳香族アミノ酸として、フェニルアラニン及びチロシンが挙げられる。ヘテロ芳香族アミノ酸残基とは、少なくとも１つのヘテロ原子、例えばＯ、Ｓ、及びＮ等が組み込まれた共役芳香族π−系を有する少なくとも１つのリングを含有する側鎖を有する疎水性アミノ酸を意味する。更に、このような残基は、水素結合供与基、例えば一級及び二級アミド、一級及び二級アミン、並びにその対応するプロトン化した塩、アルコール等、並びに水素結合受容基、例えばエーテル、チオエーテル、エステル、三級アミド、又は三級アミン等を含み得る。遺伝学的にエンコードされるヘテロ芳香族アミノ酸として、トリプトファン及びヒスチジンが挙げられる。
【００５９】
グループ３は、極性の非荷電残基を有する側鎖を含有するアミノ酸を含む。極性の非荷電残基とは、生理学的なｐＨにおいて電荷を有さないが、水溶液により排斥されない親水性側鎖を意味する。このような側鎖は、水素結合供与基、例えば一級及び二級アミド、一級及び二級アミン、チオール、及びアルコール等を一般的に含む。これらの基は、水分子と共に水素結合ネットワークを形成し得る。更に、このような側鎖は、水素結合受容基、例えばエーテル、チオエーテル、エステル、三級アミド、又は三級アミン等も含み得る。遺伝学的にエンコードされる極性の非荷電アミノ酸として、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、及びトレオニンが挙げられる。
【００６０】
グループ４は、極性のカチオン性残基及びアシル化されたその誘導体、例えばアシルアミノ誘導型残基及びウレア誘導型残基等を有する側鎖を含有するアミノ酸を含む。極性のカチオン性側鎖とは、塩基性の側鎖を意味し、生理学的なｐＨにおいてプロトン化している。遺伝学的にエンコードされる極性のカチオン性アミノ酸として、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが挙げられる。シトルリンは、ウレア誘導型アミノ酸残基の例である。
【００６１】
グループ５は、極性のアニオン性残基を有する側鎖を含有するアミノ酸を含む。極性アニオン性とは、酸性の側鎖を意味し、生理学的なｐＨにおいて脱プロトン化している。遺伝学的にエンコードされる極性のアニオン性アミノ酸として、アスパラギン酸、及びグルタミン酸が挙げられる。特別な極性のカチオン性残基として、−（ＣＨ２）ａＣＯＯＨが挙げられ、ａは１−４である。
【００６２】
３−８個のタンデムに結合したヘプタドモチーフを含有するコイルドコイルペプチド配列がより好ましく、ここで、各ヘプタドモチーフ（ａｂｃｄｅｆｇ）は、下記の配列のうちの任意の１つを有し得る：
１ｘｘ１ｘｘｘ（それぞれ位置ａｂｃｄｅｆｇを意味する）；
１ｘｘ２ｘｘｘ（それぞれ位置ａｂｃｄｅｆｇを意味する）；
２ｘｘ１ｘｘｘ（それぞれ位置ａｂｃｄｅｆｇを意味する）；又は
２ｘｘ２ｘｘｘ（それぞれ位置ａｂｃｄｅｆｇを意味する）；
式中、１は、グループ１に属する遺伝学的にエンコードされるアミノ酸、２は、グループ２に属する遺伝学的にエンコードされるアミノ酸、及びｘは、グループ１、２、３、４、若しくは５に属する遺伝学的にエンコードされるアミノ酸、又はグリシンである。
【００６３】
天然のペプチド及びタンパク質において識別されるコイルドコイルペプチド配列も、同じように好ましいが、但しヒト起源の配列を除く。これらは、例えばウイルス及び細菌タンパク質において識別されるコイルドコイルである。
【００６４】
本発明は、ＰＲペプチド抗原を担持する合成ウイルス様粒子、及びリポペプチドビルディングブロックを適する担体、好ましくは水性バッファー系（例えば、緩衝化生理食塩水又は非緩衝化生理食塩水）中に溶解するステップを伴うこのような合成ウイルス様粒子を調製する方法とも関連する。溶媒は、合成ウイルス様粒子の調製後に、例えば凍結乾燥又はスプレー乾燥により除去され得る。
【００６５】
本発明は、免疫学的に有効な量の本明細書に記載するようなＰＲペプチド抗原を担持する合成ウイルス様粒子が動物に投与される、免疫応答を誘発する方法に更に関する。任意の動物が利用可能であるが、本発明では、温血動物、特にヒトが最適と考えられる。
【００６６】
本発明は、ＰＲペプチド抗原を担持する１つ又は複数の合成ウイルス様粒子を、主要成分又は更なる有効成分として単独で、又は薬学的に許容される担体と併用して含むワクチン（又は同様に、任意のその他の薬学的製剤又は医薬）とも関連する。
【００６７】
ワクチンは、１つ又は複数のアジュバント、例えば無機塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、リン酸カルシウム）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、サポニンを含有する植物抽出物（例えば、ＱＳ−２１）、イミダゾキノリン（例えば、イミキモド）、ムラミルジペプチド、及びトリペプチド、リポペプチド、水中油型エマルジョン（例えば、モンタニドＩＳＡ７２０）、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２又はＧＭ−ＣＳＦ）、マイコバクテリア、及び細菌誘導体（例えば、フロイント完全アジュバント）、ＢＣＧ、核酸誘導体（例えば、ポリＩＣ）等、並びに当業者にとって公知のその他のアジュバントも含み得る。
【００６８】
また、ワクチンのいくつかの成分は、例えば制御放出に有用であり得る生分解性ポリマー、例えばポリ乳酸、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、及びヒドロゲルの架橋型若しくは両親媒性ブロックコポリマー内にカプセル化される若しくはこれと結合してもよい又はリポソーム内で処方化されてもよい。
【００６９】
ワクチンは、それ自体公知である方法、例えば従来方式の溶解及び凍結乾燥プロセスによって調製される、並びに／又は賦形剤、例えば防腐剤、安定剤、湿潤剤、等張化剤、及び／若しくは乳化剤、可溶化剤、浸透圧を制御する塩、及び／若しくはｐＨを安定化する緩衝物質を含んでもよい。
【００７０】
ワクチンは、液体形態又は固体（例えば、凍結乾燥された）形態であり得、また従来方式の周知の滅菌処理技法により滅菌処理され得る、又は滅菌濾過され得る。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装され得る、若しくは凍結乾燥、スプレードライ化され得る、又は溶媒は別の方法で除去され得る。固体形態は、投与前に滅菌状態の希釈剤（例えば、水）と混合され得る、又はそのまま投与され得る。同様に、ワクチンは、エマルジョン、分散物若しくは懸濁物、又は意図するような投与経路に適する任意のその他の形態を採り得る。
【００７１】
ワクチンは、任意の適する経腸経路又は非経口経路、例えば鼻腔内、経口、舌下、筋肉内、皮内、経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、及び皮下又は経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）経路等により投与され得る。採用され得るその他の経路は、当技術分野において公知である。
【００７２】
従来型の針及びシリンジ、マイクロニードル、固体投与用バリスティックデバイス（例えば、国際公開第９９／２７９６１号に記載の）、パッチ（例えば、国際公開第９８／２０７３４号に記載の）、無針注射システム（例えば、国際公開第０１／０５４５３９号に記載の）、スプレーデバイス等のデバイスが、投与形態及び投与経路に応じて投与するのに利用可能である。デバイスは、事前充填型又はワクチンコーティング型であり得る。
【００７３】
ワクチンは、適する投与形態で、約０．０５％−約５０％の有効成分を含む。非経口投与用の単位剤形は、例えばアンプル、事前充填型シリンジ、又はバイアル、例えば約０．２５ｍｌ−１．５ｍｌの投与容積で、約０．０００１ｍｇ−約０．７５ｇの有効成分を含有するバイアルである。
【００７４】
有効成分の用量は、意図するような摂取対象（例えば、種）、その年齢、体重、及び個々の条件、及び投与経路に依存する。特定の有効成分及び特定の対象母集団について、最適な用量を、対象のしかるべき免疫応答の観察所見を伴う標準的な試験により求めることができる。
【００７５】
病原性肺炎球菌又はその他のグラム陽性菌に対して免疫性を十分付与するワクチンの量は、当業者にとって周知の方法により決定される。この量は、ワクチンの摂取対象の特徴、及び肺炎球菌又はその他のグラム陽性菌が関わる感染により引き起こされた疾患に対する所望のレベルの免疫性に基づき決定される。
【００７６】
ワクチンは、単回投与又は適切に時間間隔を置いた２回以上の投与として投与され得る。ワクチンは、その他のワクチンと共に投与される場合もある。例えば、ワクチンは、その他のワクチンと併用して、プライム−ブースト療法で利用可能である。
【００７７】
ワクチンは、菌血症、及び肺炎連鎖球菌感染により引き起こされるその他の疾患、例えば肺炎、急性副鼻腔炎、中耳炎、髄膜炎、菌血症、敗血症、骨髄炎、敗血症性関節炎、心内膜炎、腹膜炎、心膜炎、蜂窩織炎、又は脳腫瘍、又は保因等を予防及び／又は治療するために、予防目的又は治療目的、又は両方で用いられる。同様に、ワクチンは、グループＡの連鎖球菌又はＳ．ミュータンスにより引き起こされた疾患、例えば咽頭炎、膿皮症、リウマチ熱、糸球体腎炎、又はカリエス等を予防及び／又は治療するために、予防目的又は治療目的、又は両方に役立つ。
【００７８】
例えば、ワクチンは、菌血症、肺炎、及び髄膜炎に対して、又は侵襲的肺炎球菌疾患（ＩＰＤ）、肺炎連鎖球菌が血液若しくは別の通常滅菌性の部位から単離され得る感染に対して、又は菌血症、肺炎、及び中耳炎に対して防御する。あるいは、ワクチンは咽頭炎、膿皮症、リウマチ熱、及び糸球体腎炎、又はカリエスに対して防御する。
【００７９】
ワクチンは、未感染である、又は感染若しくはワクチン接種に対してこれまでに応答しなかった母集団、適切に高齢化した高齢者（例えば、６５、７５、又は８５歳を超える）、高リスクの成人、例えば保健機関労働者、リスク因子を有する若年成人、免疫不全者、又は小児母集団等を含む異なる対象母集団に投与され得る。
【００８０】
本発明は、ＰＲペプチド抗原を担持する合成ウイルス様粒子を、その他の抗原を担持する合成ウイルス様粒子又は合成ウイルス様粒子により搬送されない抗原と混合する工程を含むワクチン作製方法に更に関する。
【００８１】
本発明は、防御的なＰＲペプチド抗原を担持する合成ウイルス様粒子に対する抗体、特にＰＲペプチド抗原に対する抗体とも関連する。ＰＲペプチド抗原に対する抗体は、幅広く変化に富んだ遺伝学的に多様な系統及び異なる莢膜血清型と交差反応し、また受身移入モデルのメジアン生存時間を延長し得る。
【００８２】
ＰＲペプチド抗原に対する防御抗体は、オプソニン食作用活性（ＯＰＡ）を有し得る。ＯＰＡを有する抗体は、適するアッセイ法、例えばオプソニン食作用性死滅アッセイ法（ＯＰＫＡ）により、細胞系又はドナー由来の全血を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出可能である。防御抗体は、ＯＰＡと関係しないその他の機構による防御にも関与している可能性がある。
【００８３】
本発明は、治療及び／又は予防を目的とする薬学的製剤又は医薬品を製造する、また診断キットを製造するために、本明細書に記載するようなＰＲペプチドに対する防御抗体を使用することとも関連する。
【００８４】
すべてのＰＲペプチドが、ワクチン抗原と同じように防御的であり得るわけではないが、防御的なＰＲペプチドが好ましい。このようなペプチドは、周知の方法、例えば連鎖球菌疾患に関して好適な動物モデルを対象とするチャレンジ試験法等を用いて識別され得る。例えば、肺炎球菌性敗血症モデルでは、マウスは、本明細書に記載するように、ＰＲペプチド抗原を担持する合成ウイルス様粒子で免疫化し、その後、致死量の肺炎連鎖球菌で経静脈的にチャレンジを受けることができる。このモデルでは、防御的なＰＲペプチド抗原を担持する合成ウイルス様粒子で免疫化したマウスは、免疫化コントロールマウスと比較してこれよりも有意に長い生存時間を有する。
【００８５】
ＰＲペプチド抗原は、例えばＳ．ピオゲネス、Ｓ．アガラクティエ、Ｓ．ミュータンス、Ｓ．エクイ、Ｓ．スイス、Ｓ．ディスガラクティエ、ペプトストレプトコッカス・マグヌス等、又はその他の病原性グラム陽性菌、例えば黄色ブドウ球菌等のその他の病原性連鎖球菌に由来する場合もあり、またこれらのＰＲペプチド抗原を担持する合成ウイルス様粒子は、同様にこれらの細菌に対するワクチンとして役立つ。
【００８６】
肺炎連鎖球菌のＰｓｐＡ及びＰｓｐＣ由来の好ましいＰＲペプチド抗原配列を、下記の表２にまとめる。ペプチド抗原Ｐ３は、２つの配列を組み合わせた合成構築物である。
2020073487.tif 000009
2020073487.tif 000010
【００８７】
好ましい配列番号：２７−８３のＰＲペプチドのうち、１、２、又は３つのアミノ酸は、その他のアミノ酸に置換可能である。
【００８８】
肺炎連鎖球菌由来、及びＳ．ピオゲネス、Ｓ．アガラクティエ、Ｓ．ミュータンス、Ｓ．スイス、Ｓ．エクイ、Ｓ．ディスガラクティエ、ペプトストレプトコッカス・マグヌス、及び黄色ブドウ球菌タンパク質に由来する代替的なＰＲペプチド抗原配列を、下記の表３にまとめる。
2020073487.tif 000011
【００８９】
好ましい配列番号：８４−１１２のＰＲペプチドのうち、１、２、又は３つのアミノ酸は、その他のアミノ酸に置換可能である。
【００９０】
単独で投与したときに、限定された防御能力しかもたらさない追加の配列は、ＰＲペプチド抗原にコンジュゲートし得るが、そのような配列として、特に、３番目又は４番目の各位置にプロリンを含まず、及び／又はプロリンを１５％以上含まないＰｓｐＡ又はＰｓｐＣの領域、又はその他のタンパク質に由来する配列、特に下記の配列が挙げられる：
ＱＱＡＥＥＤＹＡＲＲＳＥＥＥＹＮＲＬＰＱＱＱＰＰＫＡＥＫＰ（非プロリンブロック）（配列番号：１１３）、
及び
ＡＥＤＱＫＥＥＤＲＲＮＹＰＴＮＴＹＫＴＬＥＬＥＩＡＥＳＤＶＥＶ（ＰｓｐＣ由来のヘリカルペプチド）
（配列番号：１１４）。
【００９１】
ＰＲペプチド抗原と併用され得るその他の配列として、プロリンリッチ領域を含まない細菌表面タンパク質に由来する配列が挙げられ、下記の配列を含む：
ＳｔｋＰ由来の配列、好ましくはＣ末端７９−８２アミノ酸、
ＳＶＡＭＰＳＹＩＧＳＳＬＥＦＴＫＮＮＬＩＱＩＶＧＩＫＥＡＮＩＥＶＶＥＶＴＴＡＰＡＧＳＡＥＧＭＶＶＥＱＳＰＲＡＧＥＫＶＤＬＮＫＴＲＶＫＩＳＩＹＫＰＫＴＴＳＡＴＰ（配列番号：１１５）、
及びそのフラグメント；
ＰｓａＡ由来の配列、好ましくはアミノ酸２５０−３０９：
ＳＬＦＶＥＳＳＶＤＤＲＰＭＫＴＶＳＱＤＴＮＩＰＩＹＡＱＩＦＴＤＳＩＡＥＱＧＫＥＧＤＳＹＹＳＭＭＫＹＮＬＤＫＩＡＥＧＬＡＫ（配列番号：１１６）；
コレステロール依存性細胞溶解素由来の配列、例えばＰｌｙの４番ドメイン、アミノ酸３６０−４７１等：
ＮＧＤＬＬＬＤＨＳＧＡＹＶＡＱＹＹＩＴＷＮＥＬＳＹＤＨＱＧＫＥＶＬＴＰＫＡＷＤＲＮＧＱＤＬＴＡＨＦＴＴＳＩＰＬＫＧＮＶＲＮＬＳＶＫＩＲＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＹＥＫＴＤＬＰＬＶＲＫＲＴＩＳＩＷＧＴＴＬＹＰＱＶＥＤＫＶＥＮＤ（配列番号：１１７）、
及びそのフラグメント；
連鎖球菌ポリヒスチジントライアドタンパク質、例えば肺炎連鎖球菌ＰｈｔＤのＣ末端側半分に由来するフラグメント、例えばアミノ酸６８０−７７０：
ＶＥＨＰＮＥＲＰＨＳＤＮＧＦＧＮＡＳＤＨＶＲＫＮＫＶＤＱＤＳＫＰＤＥＤＫＥＨＤＥＶＳＥＰＴＨＰＥＳＤＥＫＥＮＨＡＧＬＮＰＳＡＤＮＬＹＫＰＳＴＤＴＥＥＴＥＥＥＡＥＤＴＴＤＥＡＥＩＰＱＶ（配列番号：１１８）、
又はアミノ酸７７１−８３９：
ＥＮＳＶＩＮＡＫＩＡＤＡＥＡＬＬＥＫＶＴＤＰＳＩＲＱＮＡＭＥＴＬＴＧＬＫＳＳＬＬＬＧＴＫＤＮＮＴＩＳＡＥＶＤＳＬＬＡＬＬＫＥＳＱＰＡＰＩＱ（配列番号：１１９）、
又はそのフラグメント。
【００９２】
好ましい配列、配列番号：１１３−１１９のうち、１、２、又は３つのアミノ酸は、その他のアミノ酸に置換可能である。
【００９３】
更なる配列として、ＰＣＴ／米国特許第２０１２／０２２１２７号又は米国特許第２００５／００２０８１３Ａ１号に記載されている配列が挙げられる。代替的配列として、欧州特許第０２８０５７６Ａ２号に記載されている配列が挙げられる。
【００９４】
追加の抗原が、ＰＲペプチド抗原を担持する合成ウイルス様粒子と併用され得る。例えば、国際公開第９８／１８９３１号、同第９８／１８９３０号、米国特許第６６９９７０３号、同第６８００７４４号、国際公開第９７／４３３０３号、及び同第９７／３７０２６号において識別された肺炎連鎖球菌タンパク質；Ｌｙｔファミリー（ＬｙｔＸ）、Ｐｈｔファミリー（ＰｈｔＸ）、Ｓｐ１２８、１型又は２型繊毛タンパク質、その他の連鎖球菌抗原、例えば国際公開第１９９３／００５１５５号、同第２００２／０３４７７１号、同第２００２／０８３８５９号、同第２００２／３４７７１号、同第２００３／０９３３０６号、同第２００４／０４１１５７号、又は同第２００５／００２６１９号において識別された抗原等；又はその他の抗原、例えばＳｐ１０１、Ｓｐ１３０、Ｓｐ１２５、又はＳｐ１３３等は、肺炎球菌ＰＲペプチド抗原を担持する合成ウイルス様粒子と併用され得る。
【００９５】
糖類抗原、例えば肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、又は３３Ｆの莢膜糖類等も、ＰＲペプチド抗原を担持する合成ウイルス様粒子と併用され得る。あるいは、その他の糖類が、ＰＲペプチド抗原、例えばその他の肺炎連鎖球菌血清型に由来する糖類、及び／又はその他のグラム陽性菌に由来する糖類（例えば、Ｓ．アガラクティエ、Ｓ．ピオゲネス、及び／又は黄色ブドウ球菌に由来する糖類）等と併用され得る。
【００９６】
同様に、その他のグラム陽性菌由来のタンパク質、例えばＭタンパク質、フィブロネクチン結合タンパク質（Ｓｆｂｌ）、連鎖球菌ヘム関連タンパク質（Ｓｈｐ）、又はストレプトリジンＳ（ＳａｇＡ）において識別されたタンパク質を含むＳ．ピオゲネス由来の１つ又は複数のタンパク質、及び／又はα−毒素、クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）、コラーゲン結合タンパク質（ＣＮＡ）、フィブロネクチン−結合タンパク質Ａ（ＦｂＡ）、細胞外フィブリノゲン−結合タンパク質（Ｅｆｂ）、鉄制御型表面決定因子（Ｉｓｄ）タンパク質、ペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）、セリン−アスパラギン酸リピートタンパク質（Ｓｄｒ）、及び／又はＩｇＧのバインダー（Ｓｂｉ）等の黄色ブドウ球菌由来の１つ又は複数のタンパク質も、ＰＲペプチド抗原を担持する合成ウイルス様粒子と併用され得る。同様に、このようなタンパク質に由来するペプチド抗原も、ＰＲペプチド抗原を担持する合成ウイルス様粒子と併用され得る。
【実施例】
【００９７】
略号：
Ｂｏｃ、ｔ−ブトキシカルボニル；
ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン；
ＤＩＥＡ、ジイソプロピルエチルアミン；
ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；
ＥＤＴ、エタンジチオール；
Ｆｍｏｃ、９−フルオレニルメトキシカルボニル；
ＨＡＴＵ、２−（１Ｈ−９−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；
ＨＢＴＵ、２−［１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル］−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；
ＨＯＢｔ、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール；
Ｐｂｆ、２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル；
ＮＭＰ、Ｎ−メチルピロリドン；
ＭＢＨＡ、メチルベンズヒドリルアミン；
ＯＤ、光学濃度；
ｉＰｒ２Ｏ、ジイソプロピルエーテル；
ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応
ＰｙＢＯＰ、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）−トリピロリジノホスホニウム−ヘキサフルオロホスフェート；
ＰＥＯ６、Ｎ−Ｆｍｏｃ−２１−アミノ−４，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサオキサヘンエイコサン酸（ｈｅｘａｏｘａｈｅｎｅｉｃｏｓａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）
ｒ．ｔ．、室温；
ＲＰ−ＨＰＬＣ、逆相高速液体クロマトグラフィー；
ＴＡ、チオアニソール；
ＴＩＳ、トリイソプロピルシラン；
Ｔｒｔ、トリチル；
ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸；
ＴＦＥ、２，２，２−トリフルオロエタノール；
ｔＲ、保持時間；
ＳＤ、標準偏差。
【００９８】
実施例１：  ＰＲペプチドの設計及び合成
極めて高毒性血清型１臨床分離株ＳＰ１５７７から得たＰｓｐＡのプロリンリッチ領域（Leimkugelら、JID、2005年、第192巻、p192-199）を増幅し、Ｈｏｌｌｉｎｇｓｈｅａｄ、Ｂｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、２０００年、第６８巻、ｐ５８８９−５９００に従い、２つのプライマー（ＬＳＭ１３及びＳＫＨ２）を用いて配列決定した。
ＬＳＭ１３：５’−ＧＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＴＡＴＡＧＡＡＡＴＴＴＧＴＡＡＣ−３’（配列番号：１２０）
ＳＫＨ２：５’−ＣＣＡＣＡＴＡＣＣＧＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣＣ−３’（配列番号：１２１）
【００９９】
プロリンリッチ領域の増幅を、プライマーＬＳＭ１３とＳＫＨ２、及びＧｏＴａｑポリメラーゼを用いて、ＰＣＲにより実施した（ＰＣＲ条件：４８℃で１分間アニーリングし、７２℃で３分間、３０サイクルにて伸長）。得られたサイズ約１．２ｋｂのフラグメントを、ＰＣＲ反応物から単離し、プライマーＬＳＭ１３とＳＫＨ２を用いて配列決定した。ｐｓｐＡ遺伝子のうち約１’１００塩基が読み取り可能であった。翻訳後のヌクレオチド配列を以下に示す。非プロリンブロックを含めると共に、プロリンリッチ領域をイタリック体で示す。
ＸＸＬＧＡＧＦＶＸＸ  ＸＰＴＸＸＸＸＸＥＡ  ＰＶＡＳＱＸＫＡＥＫ  ＤＸＤＡＸＫＲＤＡＥ  ＮＸＫＫＡＬＥＥＡＫ  ＸＸＱＫＫＹＥＤＤＱ  ＫＫＴＥＥＫＸＫＫＥ  ＫＥＡＳＫＥＥＱＡＡ  ＮＬＫＹＱＱＥＬＶＫ  ＹＡＳＥＫＤＳＶＫＫ  ＡＫＩＬＫＥＶＥＥＡ  ＥＫＥＨＫＫＫＲＡＥ  ＦＥＫＶＲＳＥＶＩＰ  ＳＡＥＥＬＫＫＴＲＱ  ＫＡＥＥＡＫＡＫＥＡ  ＥＬＩＫＫＶＥＥＡＥ  ＫＫＶＴＥＡＫＱＫＬ  ＤＡＥＲＡＫＥＶＡＬ  ＱＡＫＩＡＥＬＥＮＥ  ＶＹＲＬＥＴＥＬＫＧ  ＩＤＥＳＤＳＥＤＹＶ  ＫＥＧＬＲＡＰＬＱＳ  ＥＬＤＡＫＲＴＫＬＳ  ＴＬＥＥＬＳＤＫＩＤ  ＥＬＤＡＥＩＡＫＬＥ  ＫＮＶＥＹＦＫＫＴＤ  ＡＥＱＴＥＱＹＬＡＡ  ＡＥＫＤＬＡＤＫＫＡ  ＥＬＥＫＴＥＡＤＬＫ  ＫＡＶＮＥＰＥＫＰＡ  ＥＥＴＰＡＰＡＰＫＰ  ＥＱＰＡＥＱＰＫＰＡ  ＰＡＰＱＰＡＰＡＰＫ  ＰＥＫＴＤＤＱＱＡＥ  ＥＤＹＡＲＲＳＥＥＥ  ＹＮＲＬＰＱＱＱＰＰ  ＫＡＥＫＰＡＰＡＰＫ  ＰＥＱＰＶＰＡＰＫＴ  ＧＷＫＱＥＮＧＭＷＣ  Ｒ（配列番号１２２）
【０１００】
この配列から、Ｐ１  ＰＲ配列（ＰＡＰＫＰＥＱＰＡＥＱＰＫＰＡＰＡＰＱＰＡＰＡＰＫＰＥＫＴ、配列番号：２７）を選択した。Ｐ１は、ＳＰ１５７７  ＰｓｐＡのヘリカル／コイルドコイル領域と非プロリンブロックとの間に位置する。
【０１０１】
ＳＶＬＰリポペプチドとのコンジュゲーションが可能となるようにするために、下記のマレイミドペプチドを設計及び合成した：
【０１０２】
マレイミドペプチド１：
2020073487.tif 000012
【０１０３】
マレイミドペプチド１では、３−マレイミドプロピオン酸が、２１−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサヘンエイコサン（ｈｅｘａｏｘａｈｅｎｅｉｃｏｓａｎ）−２１−オイック酸リンカーを介して、Ｐ１（配列番号：２７）のＮ末端に連結しており、またグリシンがＰ１のＣ末端に付加され、その後にエキソプロテアーゼに対して安定性を付与するために、アミド（「ＮＨ２」）としてＤ−アラニン残基（「ａ」）が続く。
【０１０４】
マレイミドペプチド１の合成は、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法を用いて以下のように実施した：
【０１０５】
ペプチドＰＡＰＫＰＥＱＰＡＥＱＰＫＰＡＰＡＰＱＰＡＰＡＰＫＰＥＫＴＧａ（配列番号：２７、グリシン−Ｄ−アラニンだけ延長されている）を、Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ樹脂（ローディング：０．６９ｍｍｌ／ｇ）（３６２ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、及び標準Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳプロトコールを用いて、ＡＢＩ  ４３３Ａペプチドシンセサイザー上で組み立てた。下記のアミノ酸を用いた（しかるべき順序で）：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ。組み立て及びＮ末端Ｆｍｏｃ保護基の除去後、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）及びＣＨ２Ｃｌ２で、樹脂を洗浄した。マレイミドのカップリングの場合、樹脂の一部分（約０．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦで洗浄し、４．５ｍｌのＤＭＦに溶解したＦｍｏｃ−ＰＥＯ６−ＯＨ（１１５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（１０４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２７ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（６６μｌ、０．４ｍｍｏｌ）の溶液を調製し、３０秒間混合し、アルゴン下で樹脂に添加した。混合物を１６時間振盪させた。樹脂を濾過し、４×のＤＭＦで洗浄した。次に、ＤＭＦに溶解した２０％ピペリジンで処理してＦｍｏｃ基を除去した（６×２分）。次に、樹脂をＤＭＦで再度洗浄し、ＤＭＦに溶解した３−マレイミドプロピオン酸（３４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（１０４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２７ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（６６μｌ、０．４ｍｍｏｌ）の溶液を調製し、アルゴン下で樹脂に添加した。樹脂を３時間振盪させ、濾過し、連続して４回、ＤＭＦ、ＣＨ２Ｃｌ２、及びＭｅＯＨで洗浄し、減圧下、ＫＯＨペレット上、一晩乾燥した。樹脂からペプチドを切り離し、側鎖保護基を除去する場合、８５：５：５：５のＴＦＡ／ＴＩＳ／ＴＡ／フェノール（１０ｍｌ）を調製し、アルゴン雰囲気下で乾燥樹脂に添加した。樹脂を３時間振盪させ、濾過し、マレイミドペプチド１をｉＰｒ２Ｏで沈殿させ、−２０℃に事前冷却した（５０ｍｌ）。次に、ペプチドを４回、ｉＰｒ２Ｏで洗浄し、一晩風乾し、調製用のＣ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ３００  ＰｒｅｐＨＴ、２５０×２１．５ｍｍ）、及びＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中、１６分間で１０−４０％ＭｅＣＮのリニアグラジエントを用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥して、白色粉末として１を得た。ペプチドを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（２５０×４．６ｍｍ）、及びＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中、２５分間で１０−１００％ＭｅＣＮのリニアグラジエントを用いて、分析用のＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した：純度＞９７％；ｔＲ＝８．５３分。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１６３Ｈ２５９Ｎ４１Ｏ５１のＭＷ計算値：３６０９．１Ｄａ；ＭＷ実測値：３６０９．７（±０．０２％）。
【０１０６】
マレイミドペプチド２：
2020073487.tif 000013
【０１０７】
このマレイミドペプチドでは、グリシンがＰ１（配列番号：２７）のＣ末端に付加され、マレイミドがアミノエチルスペーサーを介してグリシンＰ１に連結している。Ｎ末端はアセチル化されている。
【０１０８】
マレイミドペプチド２内のペプチド鎖を、１について記載した場合と同様に、ＡＢＩ  ４３３Ａ上で、Ｆｍｏｃ  ＳＰＰＳを用いて組み立てたが、但し、Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ樹脂の代わりに、固相支持体として０．６ｍｍｏｌ／ｇ（４１６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の樹脂置換レベルまで、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨで事前ロードした２−クロルトリチル樹脂を用いた点を除く。組み立て及びＮ末端Ｆｍｏｃ保護基の除去後、ＮＭＰ（１０ｍｌ）に溶解した０．５ＭのＡｃ２Ｏ、０．０５ＭのＨＯＢｔ、及び０．１３６ＭのＤＩＥＡの溶液で、３０分間振盪させながら処理することにより、樹脂をアセチル化した。次に、樹脂をＤＭＦで４回、ＣＨ２Ｃｌ２で４回洗浄し、２：８のＴＦＥ／ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）で、アルゴン下、振盪させながら、４時間処理して、側鎖が完全に保護されたペプチドを樹脂から遊離させた。樹脂を濾過し、２：８のＴＦＥ／ＣＨ２Ｃｌ２、１０ｍｌで２回洗浄し、濾過液を濃縮し、４℃の冷却Ｅｔ２Ｏで保護されたペプチドを沈殿させ、Ｅｔ２Ｏで４回洗浄した。次に、保護されたペプチドを減圧下、一晩乾燥し、−２０℃で保管した。
【０１０９】
マレイミドのカップリングの場合、未精製の側鎖保護ペプチドの一部分（１００ｍｇ）、ＨＡＴＵ（１５ｍｇ、３９μｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（５ｍｇ、３９μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．８ｍｌ）に溶解し、ＤＩＥＡ（２３μｌ、１４２μｍｏｌ）を添加して、混合物を１分間撹拌した。ＤＭＦ（０．２ｍｌ）に溶解したＮ−（２−アミノエチル）マレイミドＴＦＡ塩（１５０ｍｇ、６０μｍｏｌ）の溶液を添加して、混合物を３時間アルゴン雰囲気下で撹拌した。次に、ＤＭＦを減圧下で除去した。側鎖保護ペプチドを０．３ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に懸濁し、４℃の冷却Ｅｔ２Ｏで沈殿させ、Ｅｔ２Ｏで４回洗浄し、減圧下、一晩乾燥した。
【０１１０】
次に、側鎖保護基を除去し、ペプチドを上記１のように沈殿、精製を行い、最終生成物２を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（２５０×４．６ｍｍ）、及びＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中、２５分間で１０−１００％ＭｅＣＮのリニアグラジエントを用いて、分析用のＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した：純度＞９７％；ｔＲ＝７．０６分。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ１４６Ｈ２２７Ｎ３９Ｏ４３のＭＷ計算値：３２１６．６Ｄａ；ＭＷ実測値：３２１５．７Ｄａ（±０．０５％）。
【０１１１】
マレイミドペプチド３：
2020073487.tif 000014
【０１１２】
マレイミドペプチド３では、３−マレイミドプロピオン酸は、２１−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサヘンエイコサン−２１−オイック酸リンカーを介して配列番号：１１３のＮ末端に連結しており、またＣ末端は、Ｄ−アラニン（「ａ」）によりキャップ化され、またアミド化されている。配列番号：１１３は、Ｐ１５７７  ＰｓｐＡの非プロリンブロックに対応する。
【０１１３】
マレイミドペプチド３を、上記マレイミドペプチド１のように合成及び精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（２５０×４．６ｍｍ）、及びＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中、２５分間で１０−１００％ＭｅＣＮのリニアグラジエントを用いて、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した：純度＞９７％；ｔＲ＝５．３１分。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ１７４Ｈ２７２Ｎ５０Ｏ６３のＭＷ計算値：４０７２．３Ｄａ；ＭＷ実測値：４０７１．０Ｄａ（±０．０５％）。
【０１１４】
その他のＰＲ配列は、ｐｓｐＡ又はｐｓｐＣ遺伝子の配列決定により取得可能である、又は、代わりにＵｎｉＰｒｏｔＫＢ等の公開データベースにおいてアクセス可能である。例えば、血清型１９Ａ分離株ＴＣＨ８４３１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｄ６ＺＰＷ２）のＰｓｐＡ配列は：
ＭＮＫＫＫＭＩＬＴＳ  ＬＡＳＶＡＩＬＧＡＧ  ＦＶＴＳＱＰＴＶＶＲ  ＡＥＥＳＰＶＡＳＱＳ  ＫＡＥＫＤＹＤＡＡＶ  ＫＫＳＥＡＡＫＫＨＹ  ＥＥＡＫＫＫＡＥＤＡ  ＱＫＫＹＤＥＤＱＫＫ  ＴＥＡＫＡＥＫＥＲＫ  ＡＳＥＫＩＡＥＡＴＫ  ＥＶＱＱＡＹＬＡＹＬ  ＱＡＳＮＥＳＱＲＫＥ  ＡＤＫＫＩＫＥＡＴＱ  ＲＫＤＥＡＥＡＡＦＡ  ＴＩＲＴＴＩＶＶＰＥ  ＰＳＥＬＡＥＴＫＫＫ  ＡＥＥＡＫＡＥＥＫＶ  ＡＫＲＫＹＤＹＡＴＬ  ＫＬＡＬＡＫＫＥＶＥ  ＡＫＥＬＥＩＥＫＬＱ  ＹＥＩＳＴＬＥＱＥＶ  ＡＴＡＱＨＱＶＤＮＬ  ＫＫＬＬＡＧＡＤＰＤ  ＤＧＴＥＶＩＥＡＫＬ  ＫＫＧＥＡＥＬＮＡＫ  ＱＡＥＬＡＫＫＱＴＥ  ＬＥＫＬＬＤＳＬＤＰ  ＥＧＫＴＱＤＥＬＤＫ  ＥＡＥＥＡＥＬＤＫＫ  ＡＤＥＬＱＮＫＶＡＤ  ＬＥＫＥＩＳＮＬＥＩ  ＬＬＧＧＡＤＰＥＤＤ  ＴＡＡＬＱＮＫＬＡＡ  ＫＫＡＥＬＡＫＫＱＴ  ＥＬＥＫＬＬＤＳＬＤ  ＰＥＧＫＴＱＤＥＬＤ  ＫＥＡＥＥＡＥＬＤＫ  ＫＡＤＥＬＱＮＫＶＡ  ＤＬＥＫＥＩＳＮＬＥ  ＩＬＬＧＧＡＤＳＥＤ  ＤＴＡＡＬＱＮＫＬＡ  ＴＫＫＡＥＬＥＫＴＱ  ＫＥＬＤＡＡＬＮＥＬ  ＧＰＤＧＤＥＥＥＴＰ  ＡＰＡＰＱＰＥＱＰＡ  ＰＡＰＫＰＥＱＰＡＰ  ＡＰＫＰＥＱＰＡＰＡ  ＰＫＰＥＱＰＡＰＡＰ  ＫＰＥＱＰＡＫＰＥＫ  ＰＡＥＥＰＴＱＰＥＫ  ＰＡＴＰＫＴＧＷＫＱ  ＥＮＧＭＷＹＦＹＮＴ  ＤＧＳＭＡＴＧＷＬＱ  ＮＮＧＳＷＹＹＬＮＡ  ＮＧＳＭＡＴＧＷＶＫ  ＤＧＤＴＷＹＹＬＥＡ  ＳＧＡＭＫＡＳＱＷＦ  ＫＶＳＤＫＷＹＹＶＮ  ＳＮＧＡＭＡＴＧＷＬ  ＱＹＮＧＳＷＹＹＬＮ  ＡＮＧＤＭＡＴＧＷＬ  ＱＹＮＧＳＷＹＹＬＮ  ＡＮＧＤＭＡＴＧＷＡ  ＫＶＮＧＳＷＹＹＬＮ  ＡＮＧＡＭＡＴＧＷＡ  ＫＶＮＧＳＷＹＹＬＮ  ＡＮＧＳＭＡＴＧＷＶ  ＫＤＧＤＴＷＹＹＬＥ  ＡＳＧＡＭＫＡＳＱＷ  ＦＫＶＳＤＫＷＹＹＶ  ＮＧＬＧＡＬＡＶＮＴ  ＴＶＤＧＹＫＶＮＡＮ  ＧＥＷ（配列番号１２３）
である。
【０１１５】
この配列から、Ｐ２配列（ＰＫＰＥＱＰＡＰＡＰＫＰＥＱＰＡＫＰＥＫＰＡ、配列番号：２８）を選択した。Ｐ２は、ＴＣＨ８４３１  ＰｓｐＡのヘリカル／コイルドコイル領域直後に位置する。ＳＶＬＰリポペプチドとのコンジュゲーションをし易くするために、下記のマレイミドペプチドを設計及び合成した：
【０１１６】
マレイミドペプチド４
2020073487.tif 000015
【０１１７】
このマレイミドペプチドは、２１−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサヘンエイコサン−２１−オイック酸リンカーを介して、Ｐ２（配列番号：２８）のＮ末端と連結した３−マレイミドプロピオン酸を含む。「ａ」は、Ｄ−アラニンを表す。Ｃ末端はアミド化されている。
【０１１８】
マレイミドペプチド４を、上記マレイミドペプチド１のように合成及び精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（２５０×４．６ｍｍ）、及びＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中、２５分間で１０−１００％ＭｅＣＮのリニアグラジエントを用いて、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した：純度＞９７％；ｔＲ＝５．２１分。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ１３１Ｈ２１０Ｎ３２Ｏ４のＭＷ計算値：２８８９．３Ｄａ、ＭＷ実測値：２８８８．８Ｄａ（±０．０５％）。
【０１１９】
マレイミドペプチド５
2020073487.tif 000016
【０１２０】
このマレイミドペプチドでは、グリシンがＰ２（配列番号：２８）のＣ末端に付加されており、またマレイミドは、アミノエチルスペーサーを介してグリシンに連結している。Ｎ末端は、アセチル化されている。
【０１２１】
マレイミドペプチド５を、上記マレイミドペプチド２のように合成及び精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（２５０×４．６ｍｍ）、及びＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中、２５分間で１０−１００％ＭｅＣＮのリニアグラジエントを用いて、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した：純度＞９７％；ｔＲ＝６．３１分。ＥＳＩ  ＭＳ：Ｃ１１３Ｈ１７８Ｎ３０Ｏ３３のＭＷ計算値：２４８４．８Ｄａ；ＭＷ実測値：２４８３．２Ｄａ（±０．０２％）。
【０１２２】
マレイミドペプチド６
人工的なＰＲ配列は、２つ以上の異なるＰｓｐＡタンパク質に由来する短尺ＰＲ配列と融合させることにより生成可能である。例えば、配列Ｐ３（配列番号：２９）は、Ｐ１のＮ末端残基ＰＡＰＫＰＥＱＰＡＥＱ（配列番号：１２４）をＰ２（配列番号：２８）と融合させ、Ｐ２のＣ末端ＡｌａをＧｌｙ残基に置換することにより設計した。コンジュゲーションが可能となるようにするために、下記のマレイミドペプチドを設計及び合成した：
2020073487.tif 000017
【０１２３】
マレイミドペプチド６を、上記マレイミドペプチド２のように合成及び精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（２５０×４．６ｍｍ）、及びＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中、２５分間で１０−１００％ＭｅＣＮのリニアグラジエントを用いて、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した：純度＞９７％；ｔＲ＝１０．１１分。ＭＡＬＤＩ  ＭＳ：Ｃ１６４Ｈ２５５Ｎ４５Ｏ５０のＭＷ計算値：３６５７．１Ｄａ；ＭＷ実測値：３６５４．９Ｄａ（±０．０５％）。
【０１２４】
ＰＲペプチド抗原の更なる実施例について以下に記載する：
【０１２５】
マレイミドペプチド７
2020073487.tif 000018
【０１２６】
マレイミドペプチド７を、上記マレイミドペプチド２のように合成及び精製した。ＥＳＩ  ＭＳ：Ｃ９１Ｈ１３７Ｎ２５Ｏ２７のＭＷ計算値：２０１２．０Ｄａ；ＭＷ実測値：２０１２．４Ｄａ（±０．０５％）。
【０１２７】
マレイミドペプチド８
2020073487.tif 000019
マレイミドペプチド８を、上記マレイミドペプチド２のように合成及び精製した。ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ８１Ｈ１２４Ｎ２２Ｏ２５のＭＷ計算値：１８０４．９Ｄａ；ＭＷ実測値：１８０５．４Ｄａ（±０．０５％）
【０１２８】
マレイミドペプチド９
2020073487.tif 000020
【０１２９】
このマレイミドペプチドは、ＰｈｔＤ（Ｐ６０、配列番号：８６）のＰＲペプチドに由来する。Ｎ末端はアセチル化されている。マレイミドペプチドを、上記マレイミドペプチド２のように合成及び精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（２５０×４．６ｍｍ）、及びＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中、２５分間で２０−１００％ＭｅＣＮのリニアグラジエントを用いて、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した：純度＞９７％；ｔＲ＝３．４１分。ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１３６Ｈ２０１Ｎ３７Ｏ４８のＭＷ計算値：３１２０．４Ｄａ；ＭＷ実測値：３１２０．６Ｄａ（±０．０５％）。
【０１３０】
実施例２：  ＰＲペプチド抗原のリポペプチドへのコンジュゲーション
免疫化用のリポペプチドコンジュゲートを調製するために、下記の４つのリポペプチドビルディングブロックを合成した。
【０１３１】
リポペプチドビルディングブロック１０
2020073487.tif 000021
【０１３２】
このリポペプチドは、国際公開第２００８／０６８０１７号の実施例１３に対応する。国際公開第２００８／０６８０１７号及びＧｈａｓｐａｒｉａｎ、Ｒｉｅｄｅｌら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ、２０１１年、第１２巻、ｐ１００−１０９の記載に従い、合成を実施し、生成物の特徴づけを行った。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ  ＵＰ５ＷＣ４−２５ＱＳ、Ｈ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中、２５分間で２５−１００％ＭｅＣＮ）：純度＞９６％、ｔＲ＝２２．７１分。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：Ｃ３１２Ｈ５５２Ｎ７４Ｏ８５Ｓ３のＭＷ計算値：６７９６．４Ｄａ；ＭＷ実測値：６７９８．２Ｄａ（±０．０５％）。
【０１３３】
リポペプチドビルディングブロック１１
2020073487.tif 000022
【０１３４】
このリポペプチドビルディングブロックは、修飾されたコイルドコイルドメインを含有し、ヘプタドリピート「ｄｅｆｇａｂｃ」ＩＥＫＫＩＥＧ（配列番号：１２５）の「ｃ」の位置にＧｌｙを有する。
【０１３５】
修飾されたリポペプチドビルディングブロックを、国際公開第２００８／０６８０１７号の記載に従い、合成及び精製した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ  ＵＰ５ＷＣ４−２５ＱＳ、Ｈ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中、２５分間で２５−１００％ＭｅＣＮ）：純度＞９８％、ｔＲ＝２１．４１分。ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ３０８Ｈ５４４Ｎ７４Ｏ８５Ｓ３のＭＷ計算値；６７４０．３Ｄａ；実測値６７４１．７Ｄａ。
【０１３６】
リポペプチドビルディングブロック１２
2020073487.tif 000023
【０１３７】
このリポペプチドビルディングブロックは、修飾された脂質であるＮ，Ｎ’−ジパルミトイル−２，３−ジアミノプロピオンアミド（「Ｐａｍ２Ｄａｐ」）を含有する。「ａ」は、Ｄ−アラニンを意味する。
【０１３８】
リポペプチドビルディングブロックを、国際公開第２００８／０６８０１７号の記載に従い合成及び精製したが、但し合成終了時にＰａｍ２Ｃｙｓの代わりにＰａｍ２Ｄａｐを組み込んだ点を除く。リポペプチドを、分析用ＨＰＬＣ及びＭＳにより分析した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム、Ａ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、２５分間で２０−１００％Ｂ）：純度：＞９５％。ｔＲ＝２２．１分。ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ計算値９５９４．５Ｄａ、実測値９５９６．１７Ｄａ。
【０１３９】
リポペプチドビルディングブロック１３
2020073487.tif 000024
【０１４０】
このリポペプチドビルディングブロックは、インフルエンザ赤血球凝集素残基３０７−３０９（配列番号：１９）から得られたＨＬＡ−ＤＲＢ１０１拘束性エピトープに由来する乱雑なＴヘルパーエピトープ（ＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＲＫ、配列番号：１２６）を含有する（Ｓｔｅｒｎ、ＬＪ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９４年、第３６８巻、ｐ２１５）。「ａ」は、Ｄ−アラニンを意味する。
【０１４１】
リポペプチドビルディングブロックを、実質的に国際公開第２００８／０６８０１７号の記載に従い合成及び精製し、分析用ＨＰＬＣ及びＭＳにより分析した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム、Ａ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、２５分間で２０−１００％Ｂ）：純度：＞９５％。ｔＲ＝２２．３５分。ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ３０２Ｈ５３８Ｎ７４Ｏ７９Ｓ２のＭＷ計算値：６５３０．０Ｄａ；実測値６５３０．４Ｄａ（±０．０５％）。
【０１４２】
下記のコンジュゲートを合成した：
【０１４３】
コンジュゲート１４（マレイミドペプチド１＋リポペプチド１０）
2020073487.tif 000025
【０１４４】
実質的に国際公開第２００８／０６８０１７号の記載に従い、１−１０のコンジュゲーションを実施した。１：１のＨ２Ｏ／ＭｅＣＮに１０（６．０ｍｇ、０．９μｍｏｌ）を溶解した溶液（３ｍｌ）に、１：１のＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ（２．４ｍｌ）に１（４．８ｍｇ、１．３μｍｏｌ）を溶解した溶液を添加した。０．１  ＮａＯＨで、ｐＨをｐＨ６．５−７．０に慎重に調整及び維持し、混合物を２時間、室温で撹拌した。次に、Ｃ４調製用のカラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ  ＵＰ５ＷＣ４−２５Ｍ、２５０×１０ｍｍ）、及びＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中、１７分間で５０−１００％ＭｅＣＮのグラジエントを用いて、コンジュゲートをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。コンジュゲート１４を、Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ  ＵＰ５ＷＣ４−２５ＱＳカラム（２５０×４．６ｍｍ）、及びＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中、２５分間で２０−１００％ＭｅＣＮのグラジエントを用いて、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した：純度＞９７％；ｔＲ＝２２．３４分。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ４７５Ｈ８１１Ｎ１１５Ｏ１３６Ｓ３のＭＷ計算値：１０４０６．６Ｄａ；実測値１０４０７．８Ｄａ（±０．１％）。
【０１４５】
コンジュゲートをＰＢＳに懸濁し、３０分間平衡化し、０．５ｍｇ／ｍｌに稀釈し、Ｗｙａｔｔ  ＤｙｎａＰｒｏ  Ｔｉｔａｎ装置上、レーザー強度４００’０００カウント／秒及び取得時間１０秒を用いて、４℃、２５℃、及び３７℃において、動的光散乱（ＤＬＳ）により分析した。正則化解析によるサイズ分布はモノモーダルであり、サイズ分散度は小さかった。２５℃における平均流体力学的半径（Ｒｈ）は１２．０ｎｍであり、また％Ｐｄ値は１２．３％であった。Ｒｈ及び％Ｐｄについて類似した数値がその他の温度においても得られた。
【０１４６】
コンジュゲート１５（マレイミドペプチド２＋リポペプチド１０）
2020073487.tif 000026
【０１４７】
２−１０のコンジュゲーション及びコンジュゲートの精製を、実質的に上記コンジュゲート１４のように実施した。生成物１５を、Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ  ＵＰ５ＷＣ４−２５ＱＳカラム（２５０×４．６ｍｍ）、及びＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中、２５分間で２０−１００％ＭｅＣＮのグラジエントを用いて、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した：純度＞９７％；ｔＲ＝２２．４１分。ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ４５８Ｈ７７９Ｎ１１３Ｏ１２８Ｓ３のＭＷ計算値：１００１２．９Ｄａ；実測値１００１１．１Ｄａ（±０．１％）。
【０１４８】
コンジュゲート１２のＰＢＳ中懸濁物を調製し、上記１４のようにＤＬＳを用いて分析した。２５℃において、Ｒｈ数値は１３．２−１４．２ｎｍの範囲であり、また％Ｐｄ値は１２．６−１８．０％の範囲であった。
【０１４９】
コンジュゲート１６（マレイミドペプチド３＋リポペプチド１０）
2020073487.tif 000027
【０１５０】
３−１０のコンジュゲーション及びコンジュゲートの精製を、実質的に上記コンジュゲート１４のように実施した。生成物１６を、Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ  ＵＰ５ＷＣ４−２５ＱＳカラム（２５０×４．６ｍｍ）、及びＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中、２５分間で２０−１００％ＭｅＣＮのグラジエントを用いて、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した：純度＞９７％；ｔＲ＝２２．０分。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ４７５Ｈ８１１Ｎ１１５Ｏ１３６Ｓ３のＭＷ計算値：１０８６９．８Ｄａ；実測値１０’８７２．３Ｄａ（±０．１％）。
【０１５１】
コンジュゲート１３のＰＢＳ中懸濁物を調製し、上記１４のように、ＤＬＳを用いて分析した。Ｒｈ値は１４．０−１５．０ｎｍの範囲、及び％Ｐｄ値は１３．０−１３．７％の範囲であった。コンジュゲート１４及びコンジュゲート１６粒子からなる混合物のＤＬＳ解析より、Ｒｈとして１２．３−１３．３ｎｍ及び％Ｐｄ値として約２５−２６％が得られ、粒子を混合しても全体的なサイズ分布に変化がなかったことが示唆された。
【０１５２】
コンジュゲート１７（マレイミドペプチド４＋リポペプチド１４）
2020073487.tif 000028
【０１５３】
４−１０のコンジュゲーション及びコンジュゲートの精製を、実質的に上記コンジュゲート１７のように実施した。生成物１７を、Ｃ４分析用カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ、ＵＰ５ＷＣ４−２５ＱＳ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、３００Å）上で逆相ＨＰＬＣにより、及びＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム、Ａ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、２５分間で２０−１００％Ｂ）：純度：＞９５％。ｔＲ＝１８．８分。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ４４３Ｈ７６２Ｎ１０６Ｏ１２６Ｓ３のＭＷ計算値：９６８５．６Ｄａ；実測値９６８６．２Ｄａ（±０．１％）。
【０１５４】
上記１４のように、コンジュゲート１７のＰＢＳ中懸濁物を調製し、ＤＬＳを用いて分析した。Ｒｈ値は１１．１−１１．８ｎｍの範囲、及び％Ｐｄ値は約１３％であった。
【０１５５】
コンジュゲート１８（マレイミドペプチド５＋リポペプチド１０）
2020073487.tif 000029
【０１５６】
実質的に上記コンジュゲート１８のように、５−１０のコンジュゲーション及びコンジュゲートの精製を実施した。生成物１８を、Ｃ４分析用カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ、ＵＰ５ＷＣ４−２５ＱＳ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、３００Å）上で逆相ＨＰＬＣにより、及びＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム、Ａ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、２５分間で２０−１００％Ｂ）：純度：＞９６％。ｔＲ＝２２．５５分。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ４２５Ｈ７２８Ｎ１０４Ｏ１１８Ｓ３のＭＷ計算値：９２７９．２Ｄａ；実測値９２８０．２Ｄａ（±０．１％）。
【０１５７】
上記１４のように、コンジュゲート１８のＰＢＳ中懸濁物を調製し、ＤＬＳを用いて分析した。Ｒｈ値は１０．０−１０．５ｎｍの範囲であり、また％Ｐｄ値は約１６％であった。
【０１５８】
コンジュゲート１９（マレイミドペプチド６＋リポペプチド１０）
2020073487.tif 000030
【０１５９】
実質的に上記コンジュゲート１４のように、６−１０のコンジュゲーション及びコンジュゲートの精製を実施した。生成物１９を、Ｃ４分析用カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ、ＵＰ５ＷＣ４−２５ＱＳ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、３００Å）上で逆相ＨＰＬＣにより、及びＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム、Ａ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、２５分間で２０−１００％Ｂ）：純度：＞９６％。ｔＲ＝２２．３４分。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ４７６Ｈ８０７Ｎ１１９Ｏ１３５Ｓ３のＭＷ計算値：１０４５３．４Ｄａ；実測値１０４５２．７Ｄａ（±０．１％）。
【０１６０】
上記１９のように、コンジュゲート１７のＰＢＳ中懸濁物を調製し、ＤＬＳを用いて分析した。Ｒｈ値は１２．１−１４．５ｎｍの範囲であり、また％Ｐｄ値は１２−２０％であった。
【０１６１】
コンジュゲート２０（マレイミドペプチド６＋リポペプチド１１）
2020073487.tif 000031
【０１６２】
実質的に上記コンジュゲート１４のように、６−１１のコンジュゲーション及びコンジュゲートの精製を実施した。生成物２０を、Ｃ４分析用カラム（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ、ＵＰ５ＷＣ４−２５ＱＳ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、３００Å）上で逆相ＨＰＬＣにより、及びＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム、Ａ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、２５分間で２０−１００％Ｂ）：純度：＞９８％。ｔＲ＝２２．３４分。ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ４５４Ｈ７７３Ｎ１１３Ｏ１２９Ｓ３のＭＷ計算値（スクシンイミドリング加水分解）：９９７５．０２Ｄａ；実測値９９７４．７Ｄａ（±０．０１％）。
【０１６３】
上記１４のように、コンジュゲート２０のＰＢＳ中懸濁物を調製し、ＤＬＳを用いて分析した。Ｒｈ値は１１．７−１２．３ｎｍの範囲であり、また％Ｐｄ値は約２０％であった。
【０１６４】
コンジュゲート２１（マレイミドペプチド４＋リポペプチド１１）
2020073487.tif 000032
【０１６５】
上記コンジュゲート１４のように、マレイミドペプチド４を１１にコンジュゲーションし、コンジュゲートを精製した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム、Ａ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、２５分間で２０−１００％Ｂ）：純度：＞９５％。ｔＲ＝１７．７８分。Ｃ４３９Ｈ７５３Ｎ１０５Ｏ１２７Ｓ３ＭＷ計算値：９６３０．５Ｄａ；実測値９６３１．２Ｄａ。
ＤＬＳ（ＰＢＳ中、０．５ｍｇ／ｍｌ、２５℃）：Ｒｈ＝１０．７ｎｍ；％Ｐｄ＝１２−１３％。
【０１６６】
コンジュゲート２２（マレイミドペプチド６＋リポペプチド１２）
2020073487.tif 000033
【０１６７】
上記コンジュゲート１４のように、マレイミドペプチド４を１２にコンジュゲーションし、コンジュゲートを精製した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム、Ａ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、２５分間で２０−１００％Ｂ）：純度：＞９５％。ｔＲ＝１８．３７分。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：Ｃ４４０Ｈ７５７Ｎ１０７Ｏ１２４Ｓ２のＭＷ計算値：９５９４．５Ｄａ、実測値９５９５．１（±０．１％）Ｄａ。
ＤＬＳ測定（ＰＢＳ中、０．５ｍｇ、２５℃）より、Ｒｈとして１０．４−１１．１ｎｍ、及び％Ｐｄ値として１０−１２％を得た。
【０１６８】
コンジュゲート２３（マレイミドペプチド６＋リポペプチド１３）
2020073487.tif 000034
【０１６９】
上記コンジュゲート１４のように、マレイミドペプチド６を１３にコンジュゲーションし、コンジュゲートを精製した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム、Ａ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、２５分間で２０−１００％Ｂ）：純度：＞９５％。ｔＲ＝１８．２５分。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：Ｃ４４８Ｈ７６５Ｎ１１３Ｏ１２３Ｓ２のＭＷ計算値（スクシンイミドリング加水分解）：９７６８．７Ｄａ、実測値９７６７．０Ｄａ（±０．１％）。
ＤＬＳ測定（ＰＢＳ中、０．５ｍｇ、２５℃）より、Ｒｈとして９．９−１０．２ｎｍ、及び％Ｐｄ値として１５−１８％を得た。
【０１７０】
追加のリポペプチドを、ＰＲペプチド抗原のＮ末端をリポペプチドビルディングブロックのＣ末端に融合させて調製した。下記の融合リポペプチドを調製した。
【０１７１】
リポペプチド（２４）
2020073487.tif 000035
【０１７２】
この例では、ＰＲ配列Ｐ７、ＰＡＰＡＰＫＰＥＱＰＡＥＱＰＫＰ（配列番号：３３）を、ＧＧ（ＩＥＫＫＩＥＧ）４ＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳＫ（配列番号：１２７）のＣ末端に直接融合させて、配列ＧＧ（ＩＥＫＫＩＥＧ）４ＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳＫＰＡＰＡＰＫＰＥＱＰＡＥＱＰＫＰ（配列番号：１２８）を得た。Ｐａｍ２Ｃｙｓを付加してＮ末端を脂質化し、またＤ−アラニン（「ａ」）を、リポペプチド２４のＣ末端に付加した。
【０１７３】
従来型の固相ペプチド合成法（W.C. Chan、P.D. White、Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach、Oxford University Press, Oxford、英国、2000年）を用いて、融合リポペプチド２４を合成し、また上記リポペプチド１０のように精製した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ３６９Ｈ６３３Ｎ８９Ｏ１０４Ｓ２のＭＷ計算値：８０４４．６Ｄａ；実測値：８０４４．６Ｄａ（±０．１％）。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ  ＵＰ５ＷＣ４−２５ＱＳ、Ｈ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中、２５分間で２５−１００％ＭｅＣＮ）：純度＞９８％、ｔＲ＝２０．４８分。
ＤＬＳ（ＰＢＳ中、０．５ｍｇ／ｍｌ、２５℃）：Ｒｈ＝１０．７ｎｍ；％Ｐｄ＝１２−１３％。
【０１７４】
リポペプチド（２５）
2020073487.tif 000036
【０１７５】
この例では、ＰＲ配列Ｐ７、ＰＡＰＡＰＫＰＥＱＰＡＥＱＰＫＰ（配列番号：３３）を、ＧＧ（ＩＥＫＫＩＥＧ）４ＩＥＫＫＩＡＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＲ（配列番号：１２９）のＣ末端に直接融合させて、配列ＧＧ（ＩＥＫＫＩＥＧ）４ＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳＫＰＡＰＡＰＫＰＥＱＰＡＥＱＰＫＰ（配列番号：１３０）を得た。Ｐａｍ２Ｃｙｓを付加してＮ末端を脂質化し、またＤ−アラニン（「ａ」）を、リポペプチド２５のＣ末端に付加した。
【０１７６】
上記２４のように、融合リポペプチド２５を合成及び精製した。ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ３６０Ｈ６３９Ｎ９１Ｏ９９ＳのＭＷ計算値：７９６６．６Ｄａ；実測値：７９６７．０Ｄａ（±０．１％）。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ  ＵＰ５ＷＣ４−２５ＱＳ、Ｈ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中、２５分間で２５−１００％ＭｅＣＮ）：純度＞９８％、ｔＲ＝２１．４１分。
ＤＬＳ（ＰＢＳ中、０．５ｍｇ／ｍｌ、２５℃）：Ｒｈ＝１２．２−１３．７ｎｍ；％Ｐｄ＝１０−１５％。
【０１７７】
実施例３：  コントロールの調製
下記のコントロール化合物を、免疫化及びチャレンジ実験用に調製した。
【０１７８】
コンジュゲート２６（非ＰＲコンジュゲート）
2020073487.tif 000037
【０１７９】
このコンジュゲートは、表面露出性の疎水性残基を除去するために、２つの突然変異（Ｆ５９４Ｑ及びＩ６０２Ｔ）がＳｔｋＰ配列に組み込まれている点を除き、ＳｔｋＰ（配列番号：１１５）のＣ末端部分（ＳｔｋＰ−Ｃ；ＰＡＳＴＡ＋Ｃ末端）を含有し、その結果、配列ＳＶＡＭＰＳＹＩＧＳＳＬＥＱＴＫＮＮＬＩＱＴＶＧＩＫＥＡＮＩＥＶＶＥＶＴＴＡＰＡＧＳＡＥＧＭＶＶＥＱＳＰＲＡＧＥＫＶＤＬＮＫＴＲＶＫＩＳＩＹＫＰＫＴＴＳＡＴＰ（配列番号：１３１）が得られた。Ｃ末端はａ−ＮＨ２でブロックされたが、「ａ」はＤ−アラニンを表す。このコンジュゲート内のＳｔｋＰペプチドは、ＮＭＲによれば、規則的なペニシリン結合タンパク質、及びＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ関連（ＰＡＳＴＡ）ドメイン構造を取っている。
【０１８０】
対応するマレイミドペプチド２７（３−マレイミドプロピオニル）−２１−アミノ−４，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサオキサヘンエイコサノイル−（配列番号：１３１）−ａ−ＮＨ２）を合成し、上記１４のように１０にコンジュゲーションした。コンジュゲート２６を、ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、及びＤＬＳにより分析した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ  ＵＰ５ＷＣ４−２５ＱＳ、２５０×４．６ｍｍ、Ａ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、２５分間で２０−１００％Ｂ）：純度：＞９５％。ｔＲ＝１８．４１分。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：Ｃ７００Ｈ１２０１Ｎ１７７Ｏ２１６Ｓ５のＭＷ計算値：１５７１３．４１Ｄａ；実測値１５７１５．４Ｄａ（±０．１％）。ＤＬＳ（ＰＢＳ中、０．５ｍｇ／ｍｌ、２５℃）：Ｒｈ＝１６．３ｎｍ、％Ｐｄ＝１６．９％。
【０１８１】
リポペプチド２８
2020073487.tif 000038
【０１８２】
このリポペプチドでは、溶解度を改善するために、２つの突然変異が抗原に組み込まれた点（Ｌ３６６Ａ、Ｉ３７０Ｋ；ＴＩＧＲ４  ＰｓｐＣナンバリング）を除き、Ｃ末端の３１個のアミノ酸がＴＩＧＲ４（配列番号：１１６）のＰｓｐＣに由来するアミノ酸３４４−３７７に対応し、その結果、ペプチドＡＥＤＱＫＥＥＤＲＲＮＹＰＴＮＴＹＫＴＡＥＬＥＫＡＥＳＤＶＥＶ（配列番号：１３２）が得られた。Ｃ末端はｒ−ＮＨ２でブロックされた（式中の「ｒ」は、Ｄ−アルギニンを表す）。このペプチドは、短いリンカー（ＫＫＫ）を介して、ユニバーサルＴヘルパー細胞エピトープＣＳＴ．３＊（配列番号：２３）と更に連結している。
【０１８３】
国際公開第２００８／０６８０１７号の記載に従い、リポペプチド２８を合成及び精製し、ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、及びＤＬＳにより分析した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍ  ＵＰ５ＷＣ４−２５ＱＳ、２５０×４．６ｍｍ、Ａ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、２５分間で２０−１００％Ｂ）：純度：＞９５％。ｔＲ＝１８．４１分。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：Ｃ３８６Ｈ６５４Ｎ１００Ｏ１２１Ｓ２のＭＷ計算値：８６９６．１Ｄａ；実測値８６９６．０Ｄａ。ＤＬＳ（ＰＢＳ中、０．５ｍｇ／ｍｌ、２５℃）：Ｒｈ＝７．９ｎｍ；％Ｐｄ＝２９％。
【０１８４】
組換えＰｓｐＡタンパク質（ｒＰｓｐＡ）
肺炎連鎖球菌ＳＰ１５７７系統由来のＰｓｐＡのプロリンリッチ領域をクローン化し、組換えＴｒｘ融合タンパク質（ｒＰｓｐＡ）として発現させた。ＳＰ１５７７系統由来の組換えＰＲのクローニング及び発現を、国際公開第２００７／０８９８６６号の記載に従い実施した。純度及び同一性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、抗ＰｓｐＡ抗体を用いたドット−ブロット、及び質量分析により確認した。タンパク質の配列は、
ＭＳＤＫＩＩＨＬＴＤ  ＤＳＦＤＴＤＶＬＫＡ  ＤＧＡＩＬＶＤＦＷＡ  ＥＷＣＧＰＣＫＭＩＡ  ＰＩＬＤＥＩＡＤＥＹ  ＱＧＫＬＴＶＡＫＬＮ  ＩＤＱＮＰＧＴＡＰＫ  ＹＧＩＲＧＩＰＴＬＬ  ＬＦＫＮＧＥＶＡＡＴ  ＫＶＧＡＬＳＫＧＱＬ  ＫＥＦＬＤＡＮＬＡＧ  ＳＧＳＧＨＭＨＨＨＨ  ＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧ  ＳＧＭＫＥＴＡＡＡＫ  ＦＥＲＱＨＭＤＳＰＤ  ＬＧＴＤＤＤＤＫＡＭ  ＡＤＬＫＫＡＶＮＥＰ  ＥＫＰＡＥＥＴＰＡＰ  ＡＰＫＰＥＱＰＡＥＱ  ＰＫＰＡＰＡＰＱＰＡ  ＰＡＰＫＰＥＫＴＤＤ  ＱＱＡＥＥＤＹＡＲＲ  ＳＥＥＥＹＮＲＬＰＱ  ＱＱＰＰＫＡＥＫＰＡ  ＰＡＰＫＰＥＱＰＶＰ  ＡＰＫＰＥＱＰＶＰＡ  ＰＫＴＧＷＫＱＥ（配列番号１３３）
であった。
【０１８５】
非プロリンブロックを含めると共に、ＰｓｐＡプロリンリッチ領域をイタリック体で示す。
【０１８６】
実施例４：  マウス免疫化試験
コンジュゲートを、マウスを対象として、肺炎連鎖球菌に対する免疫応答誘発性について試験した。すべての実験を、動物の愛護に関するスイス国諸規則に則り実施し、また所轄当局より承認を受けた。
【０１８７】
抗体応答の解析の場合、非近交系の６−８週齢のメスＮＭＲＩ非近交系マウス（１群当たり１０匹）を、３週間の間隔で２回、０日目及び２１日目に、表４に示す処方物０．１ｍｌで、皮下に免疫化した。コントロール動物を、ＰＢＳ又は生理食塩水に溶解したｒＰｓｐＡ＋アラムで免疫化した。第１回目の免疫化の前、及び第２回目の免疫化後１０日目に血液を収集し、プロリンリッチペプチドに対するＩｇＧ抗体の力価を測定するためにＥＬＩＳＡを、内因性タンパク質に対するＩｇＧを測定するためにウェスタンブロットを、及びインタクトな肺炎球菌に対するＩｇＧの表面結合性を測定するためにフローサイトメトリーを用いて、血清を分析した。
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【０１８８】
ＥＬＩＳＡの場合、ＭａｘｉＳｏｒｐ９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を、ＰＢＳに溶解した５μｌ／ｍｌのＰＲペプチド溶液又はｒＰｓｐＡ溶液、ｐＨ７．２（５０μｌ／ウェル）で、４℃、一晩コーティングした。実質的に国際公開第２００８／０６８０１７号の記載に従い、ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）抗体（Ｓｉｇｍａ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、及びＩｇＧ検出用に１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、ＥＬＩＳＡを実施した。エンドポイント力価を、試験血清のＯＤが、ＰＢＳの平均ＯＤ＋２ＳＤより大きい最高血清稀釈として規定した。
【０１８９】
免疫血清のウェスタンブロット解析の場合、血液カンテンプレート内、３７℃、５％ＣＯ２にてＳＰ１５７７を培養し、総細菌ライセートを調製した。ライセートを還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースメンブレン上でブロッティングした。ブロットを、免疫又はプレ免疫血清（ＰＢＳに１：５００で溶解）と共にインキュベーションし、ＥＣＬシステムを用いて現像した。ＰｓｐＡ特異的モノクロナール抗体を、陽性コントロールとして用いた。
【０１９０】
フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）の場合、ＳＰ１５７７を上記のように培養し、ホルマリンで、３０分間、不活性化し、ＰＢＳに溶解した５ｍｇ／ｍｌの脂肪酸を含まないＢＳＡでブロックし、約７×１０５個のＣＦＵを、免疫又はプレ免疫血清（ＰＢＳに１：１００で溶解）と共に、１時間、室温でインキュベーションした。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲート二次抗体を用いて、表面に結合したＩｇＧを検出した。
【０１９１】
ＥＬＩＳＡの幾何平均エンドポイント力価（ＧＭＴ）±平均の１×標準偏差（ＳＥＭ）、及びウェスタンブロット及びＦＡＣＳ解析の結果（陽性と陰性の反応性）を表５にまとめる。
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【０１９２】
抗体応答は、非近交マウスでは変動しやすかったが、ＥＬＩＳＡで測定したとき、すべてのマウスが高力価の抗原特異的ＩｇＧを発現し、またほとんどの免疫血清中のＩｇＧは、内因性ＰｓｐＡ及びインタクトなＳＰ１５７７細胞に結合した。プレ免疫血清及びＰＢＳ免疫化マウス由来の血清では、有意なレベルの抗原特異的ＩｇＧを検出することはできなかった。
【０１９３】
ウェスタンブロット、及びＦＡＣＳ、及びＰｓｐＡファミリー１−３に由来する異なるクレードに属する異なるＰｓｐＡを代表する遺伝学的に多様な肺炎球菌株のパネル、及び現在認可されている肺炎球菌コンジュゲートワクチンによりカバーされない血清型を含む異なる肺炎球菌莢膜血清型を用いて、誘発されたＩｇＧの交差反応性を評価したが、上記ファミリーは、Ｈｏｌｌｉｎｇｓｈｅａｄ、Ｂｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、２０００年、第６８巻、ｐ５８８９−５９００に規定されている。
【０１９４】
ＳＰ１５７７について上記のように細菌を培養し、免疫化したマウスに由来する血清を用いてウェスタンブロット及びＦＡＣＳ解析を実施した。結果を下記の表６にまとめる。
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【０１９５】
ＰＲペプチド抗原構築物によっては、他のものより広範囲の交差反応性を有するＩｇＧを誘発したが、遺伝学的に多様なパネルを用いて得られた結果から、ＰＲペプチド抗原で免疫化すれば、広範囲の交差反応性を有するＩｇＧが誘発されたことが示唆される。
【０１９６】
チャレンジ試験では、ＮＭＲＩ非近交系マウスを上記のような異なる処方物で免疫化した。免疫応答誘発性の比較では、追加の動物をｒＰｓｐＡ＋アラム、コンジュゲート４４、又はリポペプチド４６で免疫化した。マウスを、最終免疫化後１０日間飼育し、セロコンバージョンを決定するために、上記のように血清をＥＬＩＳＡで分析した。次に、チャレンジ前に投与したときにマウスにおいて高い毒性をもたらした、事前に決定された致死用量の１００倍（１００×ＬＤ１００）の肺炎球菌を用いて、マウスを尾静脈経由で経静脈的（ｉｖ）にチャレンジした。細菌を、腹腔内（ｉｐ）又は静脈内（ｉｖ）注射により投与した。チャレンジ後、マウスの健康状態を１４日間にわたりモニタリングした。瀕死状態の動物を安楽死させ、瀕死状態に至るまでの時間を記録した。リポペプチド又はタンパク質で免疫化した動物の生存率及び瀕死状態に至るまでの時間を、ＰＢＳ単独で免疫化した動物の場合と比較した。
【０１９７】
ＳＰ１５７７系統を用いて得られた結果を、下記の表７にまとめる。ＳＰ１５７７系統は、マウスにとって高い毒性を有する。未防御のマウスは、チャレンジ後、最初の１２−２４時間内で死亡した、又は瀕死の状態に陥った。従って、防御は高い有効性を示す。
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【０１９８】
ＳＶＬＰにコンジュゲートしたＰＲペプチド抗原で免疫化したマウスは、部分的に防御され、メジアン生存時間は、ＰＢＳ免疫化マウス及びｒＰｓｐＡで免疫化したマウスの場合と比較して延長した。ＳＶＬＰ又はｒＰｓｐＡで免疫化したマウスについて得られた生存率の分布を、ＰＢＳ単独で免疫化したマウス（陰性コントロール）と、対数順位検定により比較した。ＰＲコンジュゲート単独で、又はこれをその他の抗原と併用して免疫化したマウスの結果は、ＰＢＳ免疫化マウスの結果と有意に異なった。Ｐ値は、０．００２７−０．０１４３の範囲であった。ｒＰｓｐＡで免疫化したマウスの結果は、マウスによっては防御されたが、ＰＢＳ免疫化マウスの結果と比較して有意に異ならなかった（Ｐ＝０．１３３６）。群が大きくなるほど差異は有意となり得る。ＳｔｋＰ及びＰｓｐＣ由来のコンジュゲートの結果は、ＰＢＳと比較して有意でなく、これらの抗原は、このモデルにおいて防御的ではないことを示唆する。
【０１９９】
受動免疫化／チャレンジ実験の場合、抗体が防御に関与しているか決定するために、モノクロナール抗体をマウス内で生成した。１つの実験では、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、コンジュゲート１７で３回免疫化した。抗原特異的モノクロナールＩｇＧ抗体（ｍＡｂｓ）を生成する７つのＢ細胞ハイブリドーマ系統を、１つのマウスの脾臓細胞から生成し、異なる肺炎球菌系統との交差反応性について、ＦＡＣＳ解析により試験した。１つのｍＡｂ（５Ｈ８）が、異なるＰｓｐＡクレード及び莢膜血清型を示す、広範囲の系統（臨床分離株）に結合した。その他のｍＡｂｓは、ＥＬＩＳＡにおいて、ＰＲ抗原に結合したが、インタクトな細菌には結合しなかった。エピトープマッピングより、ｍＡｂ  ５Ｈ８は、幅広く異なる多様なＰｓｐＡ配列に生ずるＰＲペプチドのＣ末端部分内のエピトープを認識するが、他方の６つのｍＡｂｓは、異なるＰｓｐＡ配列においてそれほど頻繁には見出されないその他のエピトープを認識したことが示唆された。チャレンジの場合、０．１−０．５ｍｇの精製された５Ｈ８又はその他のｍＡｂｓを、ＮＭＲＩマウス５匹の群に、ｉｖ注射により投与した。ＳｔｋＰ由来のｍＡｂ（１Ａ７）で受動的に免疫化した動物、及びナイーブ動物をコントロールとして用いた。平衡化するのに十分な時間を置いた後、マウスをｉｖにより、継代した肺炎球菌でチャレンジし、健康状態及び瀕死状態に至るまでの時間を、上記のようにモニタリングした。ＳＰ１５７７系統を用いて得られた結果を下記の表８に示す。
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【０２００】
ｍＡｂ  ５Ｈ８のみ、受動免疫化後にナイーブマウスと比較して有意に異なる結果をもたらした。防御は用量依存性であった。ＭＡｂｓ  ３Ｈ５及び１Ｈ９は、この受動的防御のモデルでは、有意な効果を示さなかった。配列決定より、ＳＰ１５７７系統のＰｓｐＡは、５Ｈ８エピトープのみを含有し、その他２つのＰＲ由来抗体のエピトープは含有しないことが判明した。このモデルにおいても、ＳｔｋＰ由来のｍＡｂ  １Ａ７について防御性は認められなかった。
【０２０１】
結果より、プロリンリッチペプチド抗原を担持するＳＶＬＰ形成性リポペプチドで免疫化すると、単独で、又はその他の抗原と併用して投与したとき、アジュバントを同時投与しなくても、マウスにおいて高度に肺炎連鎖球菌と交差反応する抗体が誘発されることが示唆される。
【０２０２】
実施例５：  ウサギ免疫化試験
非齧歯動物において抗体応答を特徴づけるために、コンジュゲート１７、１８、又は１９をＰＢＳ、０．４ｍｌに異なる濃度で溶解し、これをアジュバント（Ｒ８４８）が有る場合又は無い場合で、０、２８、及び５６日目の３回、ｓｃにて、ニュージーランドホワイトラビットを免疫化した（表９）。セロコンバージョンを決定するために、血液サンプルを０、１４、３８、及び６６日目に採取した。
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【０２０３】
プレ免疫血清及び第３回免疫化後の血清を、ウサギＩｇＧ特異的二次抗体、及びマウスについて上記したような様々な肺炎球菌分離株を用いて、ウェスタンブロット及びＦＡＣＳにより分析した。ＩｇＧ応答の発現も、実質的に上記のように、ＩｇＧを検出するために、４−ニトロフェニルリン酸と共にモノクロナール抗ウサギＩｇＧ（γ鎖特異的）アルカリホスファターゼ抗体を用いて、ＥＬＩＳＡにより分析した。結果を表１０に示す。免疫化したすべてのウサギでは、免疫化に応答して、内因的に発現したＰｓｐＡ及びインタクトな肺炎球菌上で発現するＰｓｐＡに結合するＩｇＧが生じた。プレ免疫血清は、これらのアッセイにおいて、有意な反応性を示さなかった。アジュバント無しで、低用量のコンジュゲートを投与した後の場合であっても、高力価のＰＲペプチド特異的ＩｇＧ抗体が、免疫化したウサギに由来する免疫血清内で検出された。
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【０２０４】
結果より、プロリンリッチペプチド抗原を担持するＳＶＬＰ形成性リポペプチドで免疫化すると、アジュバントを伴わないで投与した場合でも、非齧歯動物において広範囲に交差反応性を有する抗体が誘発されることが示唆される。
【０２０５】
実施例６：  ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗原特異的抗体応答の比較
コンジュゲート１５ＳＶＬＰにより誘発された抗原特異的抗体応答を、組換えＰｓｐＡタンパク質で誘発された応答と比較した。６−８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり１８匹）を、３週間の間隔で２回、０日目及び２１日目に、上記実施例５のように調製したコンジュゲート１５のＰＢＳ溶液、又はｒＰｓｐＡ＋アラムの生理食塩水溶液、０．１ｍｌで皮下に免疫化した。第２回目の免疫化後１０日目に血液を収集した。
【０２０６】
抗体応答の抗原特異性を決定するために、ＰＲ特異的抗体を測定するためのコーティング抗原としてＰＲペプチド配列番号：２７、及び総抗ＰｓｐＡ抗体（すなわち、Ｎ末端エピトープ、ＮＰＢ、及びＰＲに対する抗体）を測定するためのコーティング抗原としてｒＰｓｐＡを用いて、実施例５に記載するように、ＥＬＩＳＡを実施した。結果を図１に示す。免疫化されないマウス由来の血清は、ＥＬＩＳＡにおいて、いずれの抗原とも交差反応性を示さなかった。
【０２０７】
期待通りに、ｒＰｓｐＡは、極めて免疫応答誘発性が高かったが（抗ＰｓｐＡ  ＩｇＧ  ＧＭＴ±ＳＥＭ＝８１’９６９±２８’０６８）、有意レベルの抗ＰＲ抗体（抗ＰｓｐＡ  ＩｇＧ  ＧＭＴ±ＳＥＭ＝２１３±２１８）を誘発することができなかった。コンジュゲート１５ＳＶＬＰに対して生じた抗体は、ＥＬＩＳＡにおいて、ＰＲペプチド（抗ＰｓｐＡ  ＩｇＧ  ＧＭＴ±ＳＥＭ＝２７’５８３±６’２０４）及びｒＰｓｐＡ抗原（２０’９１９±３’４４４）の両方を認識したので、これは、ｒＰｓｐＡに対して生じた抗体が、ＰＲペプチドに結合できないことに起因するわけではなかった。従って、ｒＰｓｐＡに誘発された抗体の大部分は、Ｎ末端αヘリカル部分内のエピトープに結合すると考えられる。
【０２０８】
Ｎ末端αヘリカル部分を欠いているＰｓｐＡは、ＰＲ特異的抗体をより誘発するか決定するために、マウスを切除型組換えＰｓｐＡ−Ｔｒｘ融合タンパク質（ｒＰｓｐＡ−δ−Ｎ末端；ＰＲ及びＮＰＢを含有する）で免疫化した。驚くべきことに、切除型タンパク質も、有意レベルの抗ＰＲ抗体を誘発することができなかった：タンパク質につきＧＭＴ±ＳＥＭは１２８’４９６±２８’４８１、及びＰＲ抗原につき２１３±１’０９４であった。これは、コンジュゲート１５ＳＶＬＰ−免疫化コントロール動物（タンパク質につき３２’７７６±６９７４、及びＰＲペプチドにつき４７’６７９±２３’３８３のＧＭＴ±ＳＥＭ）の場合よりも有意に小さかった。総じて、これらの結果より、ＳＶＬＰは、組換えＰｓｐＡよりも有意に高いレベルのＰＲ特異的抗体を誘発することが示唆される。
【０２０９】
実施例７：  チャレンジ用量増加に対する防御
チャレンジ用量の増加に対する免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウスの防御を決定するために、上記実施例６のように、マウスをコンジュゲート１５又はｒＰｓｐＡで免疫化し、１０２−１０６ＣＦＵの血清型１細菌の用量を増加させて経静脈的にチャレンジを行い、生存率についてモニタリングした。標準化された肺炎球菌血清型１の細菌接種源を、Ａａｂｅｒｇｅ  Ｉ．Ｓ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、１９９５年、巻１８号、ｐ１４１−１５２の記載に従い調製した。非免疫化マウスのＬＤ５０を、細菌の用量を増加させながらＢＡＬＢ／ｃマウスに経静脈注射し、生存率についてモニタリングすることにより検証した。
【０２１０】
免疫化したマウスの防御は、細菌チャレンジ用量及び免疫原の種類に依存する。チャレンジ用量が低い場合、防御は、ｒＰｓｐＡ又はリポペプチドビルディングブロック１５ＳＶＬＰで免疫化した動物について同等であった（図２を参照）。チャレンジ用量がより高い場合（１００−１０’０００×ＬＤ５０）、コンジュゲート１５ＳＶＬＰで免疫化したマウスは、ｒＰｓｐＡで免疫化したマウスより良好に防御された。総じて、これらの結果から、ＳＶＬＰにより誘発された抗ＰＲ抗体は、ｒＰｓｐＡに対して生じた抗体よりも広範囲の細菌チャレンジ用量において防御性を有することが示唆される。
【図１】
2020073487.tif 000052
【図２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月24日(2019.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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