(57)【要約】【課題】少ない光量で脱窒菌の増殖を制御することを目的とする。【解決手段】合成培地にて嫌気的脱窒条件下で培養される脱窒菌の増殖を制御する方法であって、脱窒菌に光を照射して脱窒菌の増殖を阻害する工程であって、照射する光は３４０ｎｍ〜４８０ｎｍのいずれかの波長の光を含み、培地表面での放射照度は３０ｍＷ／ｃｍ２以下である工程、を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成培地にて嫌気的脱窒条件下で培養される脱窒菌の増殖を制御する方法であって、
脱窒菌に光を照射して脱窒菌の増殖を阻害する工程であって、照射する光は３４０ｎｍ〜４８０ｎｍのいずれかの波長の光を含み、培地表面での放射照度は３０ｍＷ／ｃｍ２以下である工程、を含む、方法。
【請求項２】
照射する光が４００ｎｍ〜４２０ｎｍのいずれかの波長の光を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
照射する光が４００ｎｍ〜４１０ｎｍのいずれかの波長の光を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
培地表面での放射照度が２．５ｍＷ／ｃｍ２以下である、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱窒菌の増殖を制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脱窒菌は、好気呼吸と、環境中の硝酸、亜酸化窒素等を利用した嫌気的呼吸との両方を行うことが可能な細菌である。脱窒菌の中には、病原性を有するもの、又は日和見感染の原因となるものがあり、これら脱窒菌の増殖を制御する技術が求められている。また、ある種の脱窒菌を水処理に利用することも期待されており、この点からも、脱窒菌の増殖を人為的に制御する技術には価値がある。
【０００３】
脱窒菌の増殖は光照射により影響を受けることが知られている。例えば、非特許文献１には、緑色光を主成分とする光を脱窒菌に照射することにより、脱窒菌の増殖が阻害されることが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ｓｔｒａｉｎ  ＪＲ  １２，  Ｌｉｇｈｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｄｕｒｌｉｎｇ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ．（Ｂａｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献１に記載される技術では、脱窒菌の増殖を制御するために１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ〜５００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ程度の光量を要しており、効率が悪い。また、光量が多いと、すなわち、照射光の光強度が高いと、細胞が有する種々の色素が光を吸収することによりラジカル又は過酸化物が生成し、脱窒菌の生育環境に悪影響を及ぼす。本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、少ない光量で脱窒菌の増殖を制御することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
合成培地にて嫌気的脱窒条件下で培養される脱窒菌の増殖を制御する本発明の方法は、脱窒菌に光を照射して脱窒菌の増殖を阻害する工程を含む。照射する光は、３４０ｎｍ〜４８０ｎｍのいずれかの波長の光を含み、培地表面での放射照度は３０ｍＷ／ｃｍ２以下である。
【０００７】
照射する光は、４００ｎｍ〜４２０ｎｍのいずれかの波長の光を含んでよく、４００ｎｍ〜４１０ｎｍのいずれかの波長の光を含んでもよい。培地表面での放射照度は、２．５ｍＷ／ｃｍ２以下であってよい。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法によれば、少ない光量で脱窒菌の増殖を制御することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】脱窒菌の培養装置の一例を示す模式図である。
【図２】脱窒菌を（Ａ）硝酸呼吸、及び（Ｂ）亜酸化窒素呼吸により培養した際に、青色光及び赤色光が脱窒菌の増殖に及ぼす影響を示すグラフである。
【図３】酸素が光照射による脱窒菌の増殖阻害に及ぼす影響を示すグラフである。
【図４】照射光の強度が脱窒菌の増殖阻害に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】光照射による脱窒菌の増殖阻害の作用スペクトルを示すグラフである。
【図６】培地中のポリペプトンの濃度が、光照射による脱窒菌の増殖阻害に及ぼす影響を示すグラフである。
【図７】ポリペプトン及び酸素が、光照射による脱窒菌の増殖阻害に及ぼす影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
合成培地にて嫌気的脱窒条件下で培養される脱窒菌の増殖を制御する本発明の方法は、脱窒菌に光を照射する工程を含む。
【００１１】
脱窒菌は、脱窒を行うことができる菌であれば限定されず、グラム陰性及びグラム陽性の細菌のいずれであってもよい。培養のしやすさの観点から、脱窒菌はグラム陰性細菌であることが好ましい。グラム陰性脱窒細菌としては、例えば、アクロモバクター・キシロソキシダンス、シュードモナス種、シュードモナス・エルギノーサ、パラコックス・デニトリフィカンス等が挙げられる。
【００１２】
合成培地は、脱窒菌の増殖に必要な炭素源及び窒素源を有する合成培地であれば限定されず、市販の合成培地を利用することもできる。脱窒菌に硝酸呼吸又は亜硝酸呼吸を行わせる場合、合成培地には、硝酸イオン又は亜硝酸イオンが含まれていてよい。合成培地には、ペプトン、酵母エキス、血清等の天然物が添加されていてもよいが、合成培地中の天然物の量は極微量である必要がある。合成培地中の天然物の量は、例えば、０．２質量％未満、０．１５質量％以下、０．１質量％以下、又は０．０５質量％以下である。合成培地は、天然物を含まない完全合成培地であることが好ましい。
【００１３】
嫌気的脱窒条件とは、脱窒菌が酸素呼吸を行わず、硝酸呼吸、亜硝酸呼吸、一酸化窒素呼吸又は亜酸化窒素呼吸を行うことを可能とする条件であれば限定されない。このような条件は、酸素を実質的に含まず、脱窒の原料となる硝酸イオン、亜硝酸イオン、一酸化窒素、又は亜酸化窒素を含む環境を指す。
【００１４】
脱窒菌に照射する光（照射光）は、３４０ｎｍ〜４８０ｎｍのいずれかの波長の光を含む。３４０ｎｍ以上の波長を含む光によれば、脱窒菌の増殖を、脱窒菌を死滅させることなく制御することができる。より効率的に脱窒菌の増殖を制御する観点から、照射光は、好ましくは、３５０ｎｍ以上、３６０ｎｍ以上、３７０ｎｍ以上、３８０ｎｍ以上、３９０ｎｍ以上、又は４００ｎｍ以上、かつ、４７０ｎｍ以下、４６０ｎｍ以下、４５０ｎｍ以下、４４０ｎｍ以下、４３０ｎｍ以下、４２０ｎｍ以下、４１０ｎｍ以下、又は４００ｎｍ以下の領域にあるいずれかの波長の光を含む。人が視覚的に認識できるという安全上の観点から、照射光は、より好ましくは４００ｎｍ〜４２０ｎｍのいずれかの波長の光を含み、さらに好ましくは４００ｎｍ〜４１０ｎｍのいずれかの波長の光を含む。すなわち、本発明においては、ＵＶ−Ａ（３１５ｎｍ〜４００ｎｍ）よりも、紫色光（４００ｎｍ〜４３５ｎｍ）又は青色光（４３５ｎｍ〜４８０ｎｍ）が好ましく用いられる。
【００１５】
照射光には、３４０ｎｍ〜４８０ｎｍの領域外の波長の光、すなわち３４０ｎｍ未満又は４８０ｎｍより大きい波長の光が含まれてもよいが、より効率的に脱窒菌の増殖を制御する観点から、照射光のピーク波長は、上記好ましい波長領域中のいずれか波長であることが好ましい。
【００１６】
光源は特に限定されず、例えば、青色発光ダイオード等の発光ダイオード（ＬＥＤ）及び波長可変光源など、所望の波長領域の光を選択的に照射可能な光源を使用することができる。また、タングステンランプ等、幅広い波長領域の光を照射可能な光源を、必要に応じてバンドパスフィルター又は分光器と組み合わせて、使用することもできる。
【００１７】
培地表面での放射照度は３０ｍＷ／ｃｍ２以下である。本発明によれば、培地表面での放射照度が、２５ｍＷ／ｃｍ２以下、２０ｍＷ／ｃｍ２以下、１５ｍＷ／ｃｍ２以下、１０ｍＷ／ｃｍ２以下、５ｍＷ／ｃｍ２以下、２．５ｍＷ／ｃｍ２以下、又は１ｍＷ／ｃｍ２以下であっても、脱窒菌の増殖を制御することができる。培地表面での放射照度は、０．５ｍＷ／ｃｍ２以上、１ｍＷ／ｃｍ２以上又は２ｍＷ／ｃｍ２以上であってよい。
【００１８】
脱窒菌に光を照射する方法は、培地表面での放射照度が上記範囲内になる方法であれば特に限定されず、例えば、図１に示すように、脱窒菌を含む培養管に光を直接照射することができる。図１は、脱窒菌を嫌気的に培養するための装置１０を示す模式図である。窒素ボンベ１、質量流量計２、水フィルター３、及び培養管６は、ガラス管９を介してこの順に接続されている。培養管６に直接接続されたガラス管９には綿栓４が詰められている。窒素ボンベ１から供給される窒素ガスは、ガラス管９の中を矢印Ａの方向に流れ、ガラスボールフィルター５を通って培養管６の中の培養液８に導入される。培養管６の周りには少なくとも一つの青色ＬＥＤランプ７が配置されており、培養液８に向けて光を照射することができる。なお、光源は青色ＬＥＤランプ７に限定されず、任意の光源を用いることができる。光源は１つ又はそれ以上であってよい。光源が複数ある場合、光源は培養管６を取り囲むように配置されてもよい。窒素ボンベ１は、かわりに亜酸化窒素、一酸化窒素等、酸素以外の他のガスを供給するボンベであってもよい。培養管６は、かわりに培養槽であってもよい。
【００１９】
本発明の方法によれば、脱窒菌に上記特定の波長で光を照射することで、少ない光量で、脱窒菌の増殖を阻害することができる。また、かかる方法によれば、脱窒菌は死滅せず、光照射をやめることで脱窒菌の増殖を再び開始させることができる。したがって、本発明によれば、脱窒菌の増殖を人為的に、簡便に制御することができる。
【実施例】
【００２０】
＜実施例１＞
光が脱窒菌の増殖に及ぼす影響を調べた。図１に示す装置を用いて、嫌気的条件下、合成培地（ｐＨ約７）でアクロモバクター・キシロソキシダンス（ＮＣＩＢ１１０１５）を培養した。ただし、窒素ボンベ１は、必要に応じて亜酸化窒素ボンベに置き換えた。合成培地は、９８０ｍＬのＡ溶液と、１０ｍＬのＢ溶液と、１０ｍＬのＣ溶液と、を混合することにより調製した。Ａ溶液、Ｂ溶液、及びＣ溶液の組成は表１に示すとおりである。培養開始から１時間毎に６６０ｎｍにおける培養液の光学密度（ＯＤ６６０）を測定することにより、アクロモバクターの増殖度の変化を調べた。培養の途中で、アクロモバクター・キシロソキシダンスに、赤色光及び青色光を、別々に照射した。光照射時の培養容器表面の放射照度は、いずれも０．５ｍＷ／ｃｍ２〜１．０ｍＷ／ｃｍ２であった。
【００２１】
【表１】
2020043776.tif 000002
【００２２】
アクロモバクターの増殖曲線を図２の（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図２の（Ａ）は、窒素ガスを吹き込みながらアクロモバクターを培養した場合の結果である。図２の（Ｂ）は、硝酸イオンを除いた上記合成培地を用いて、亜酸化窒素ガスを吹き込みながらアクロモバクターを培養した場合の結果である。図２に示すように、赤色光はアクロモバクターの増殖に影響を与えなかった。これに対し、青色光はアクロモバクターの増殖を即座に阻害し、青色光を照射し続けることで、アクロモバクターのＯＤ６６０が減少した。青色光を照射した後、アクロモバクターを暗黒下で培養し続けたところ、アクロモバクターは再び対数的に増殖するようになった。
【００２３】
＜実施例２＞
酸素が光照射による脱窒菌の増殖阻害に及ぼす影響を調べた。実施例１と同様に、窒素ガスを吹き込んだ嫌気的条件下、アクロモバクター・キシロソキシダンス（ＮＣＩＢ１１０１５）を培養した。培養開始から３時間後に空気を注入し、好気的条件に切り替えた。その１時間後に４６７ｎｍ（半値幅４５５ｎｍ〜４８０ｎｍ）の波長を有する青色光を照射した。青色光を１時間照射した後、照射をやめ、窒素ガスを吹き込むことにより嫌気的条件に戻した。嫌気的条件下で１時間培養した後、再び青色光を１時間照射した。光照射時の培養容器表面の放射照度は、いずれも０．５ｍＷ／ｃｍ２〜１．０ｍＷ／ｃｍ２であった。
【００２４】
図３に、アクロモバクターの増殖曲線を示す。好気的条件下では、青色光を照射しても、アクロモバクターの増殖は阻害されなかった。好気的条件から再び嫌気的条件に切り替えたところ、青色光の照射により、アクロモバクターの増殖が阻害された。培地から硝酸イオンを除去し、窒素ガスのかわりに亜酸化窒素ガスを用いて同様の実験を行った場合も、同様の阻害パターンが観察された。
【００２５】
＜実施例３＞
異なるグラム陰性脱窒菌を用いて、光照射が脱窒菌の増殖に及ぼす影響を調べた。実施例１の培地を用いて、表２に示すグラム陰性脱窒菌を３０℃で培養した。培養は、空気、亜酸化窒素ガス、又は窒素ガスを吹き込みながら行った。また、窒素ガスを吹き込む場合、硝酸呼吸に必要な硝酸イオンを培地に添加した。実施例２と同じ照射条件を用いて青色光を照射し、脱窒菌のＯＤ６６０を観察した。結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
2020043776.tif 000003
【００２７】
表２中、＋は増殖が阻害されたことを示し、−は増殖が阻害されなかったことを示す。いずれの脱窒菌においても、硝酸呼吸又は亜酸化窒素呼吸時には光照射により増殖が阻害されたのに対し、酸素呼吸時には増殖が阻害されなかった。
【００２８】
＜実施例４＞
照射光の強度が光照射による脱窒菌の増殖阻害に及ぼす影響を調べた。アクロモバクター・キシロソキシダンス（ＮＣＩＢ１１０１５）を、実施例１と同様の培地を含むキュベット中で、嫌気脱窒条件下、培養した。キュベットは分光光度計（日立５５７）内に配置した。波長可変光源Ｌ１２１９４（浜松ホトニクス株式会社製）を用いて、４２０ｎｍの波長を有する光を、光ファイバーを介して分光光度計内のキュベットの側面に照射した。照射は、それぞれ異なる光強度で、２回行った。光照射時のキュベット表面の放射照度は、２．５ｍＷ／ｃｍ２及び５ｍＷ／ｃｍ２であった。図４に、アクロモバクターの増殖曲線を示す。キュベット表面の放射照度が５ｍＷ／ｃｍ２のときはアクロモバクターの増殖が阻害されたのに対し、放射照度が２．５ｍＷ／ｃｍ２のときは増殖が阻害されなかった。
【００２９】
＜実施例５＞
実施例４と同様の実験を、照射光の波長及び強度を変化させて行った。異なる波長の光をアクロモバクターに照射し、各波長の光について、増殖の阻害が観察される放射照度の閾値を求めた。各波長における放射照度の閾値を図５に示す。ＵＶ−Ａ（３４０ｎｍ〜４００ｎｍ）、紫色光（４００ｎｍ〜４３５ｎｍ）、又は青色光（４３５ｎｍ〜４８０ｎｍ）の照射によりアクロモバクターの増殖が阻害された。
【００３０】
＜実施例６＞
培地成分が光照射による脱窒菌の増殖阻害に及ぼす影響を調べた。異なる濃度でポリペプトンを添加した実施例１の培地を用いて、アクロモバクター・キシロソキシダンス（ＮＣＩＢ１１０１５）を７時間培養した。４６８ｎｍの波長を有する青色光を照射しながらさらに１８時間培養した後、増殖量（ＯＤ６６０）を比較した。結果を図６に示す。青色光を照射しなかったサンプル（コントロール）は、ＯＤ６６０がポリペプトンの濃度によらず一定であった。青色光を照射したサンプルのＯＤ６６０は、ポリペプトン濃度が高いほど高く、すなわち、ポリペプトンの濃度が高いほど光照射による増殖阻害作用が弱められた。
【００３１】
＜実施例７＞
ポリペプトン及び酸素が、光照射による脱窒菌の増殖阻害に及ぼす影響についてさらに調べた。実施例１の培地を用いて、アクロモバクター・キシロソキシダンス（ＮＣＩＢ１１０１５）を３０℃で培養した。４０５ｎｍの波長を有する紫色光をアクロモバクターに照射した。照射開始から５分後に、０．０２質量％のポリペプトンを添加するか、酸素を吹き込み、ＯＤ６６０の変化を観察した。結果を図７に示す。図中、ポリペプトンの添加及び酸素の導入は、矢印で示した。図７の（Ａ）に示すように、ポリペプトンを培地に添加した場合、光照射によるＯＤ６６０の低下が見られず、アクロモバクターは対数的に増殖を続けた。一方、図７の（Ｂ）に示すように、酸素を吹き込んだ場合、光照射による一時的なＯＤ６６０の低下が見られ、その後、時間の経過とともに対数増殖が回復した。これらの結果から、光照射による脱窒菌の増殖阻害を弱める作用は、ポリペプトンの場合は即効的であり、酸素の場合は遅効的であるといえる。
【符号の説明】
【００３２】
１…窒素ボンベ、２…質量流量計、３…水フィルター、４…綿栓、５…ガラスボールフィルター、６…培養管、７…青色ＬＥＤランプ、８…培養液、９…ガラス管、１０…培養装置、Ａ…流れの方向。
【図１】
2020043776.tif 000004
【図２】
2020043776.tif 000005
【図３】
2020043776.tif 000006
【図４】
2020043776.tif 000007
【図５】
2020043776.tif 000008
【図６】
2020043776.tif 000009
【図７】
2020043776.tif 000010