(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子組換え技術を用いて動物細胞で作製したアルカリホスファターゼの非特異的吸着を防止するために利用できる、無活性アルカリホスファターゼを提供すること。【解決手段】アルカリホスファターゼのアミノ酸配列の９２番目のアミノ酸であるセリンを欠失させるか、別のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を含み、野生型のアルカリホスファターゼと比較して活性が低下した無活性アルカリホスファターゼ。別のアミノ酸が、アスパラギン酸またはイソロイシンである、無活性アルカリホスファターゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列の９２番目のアミノ酸であるセリンを欠失させるか、別のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を含み、野生型のアルカリホスファターゼと比較して活性が低下した無活性アルカリホスファターゼ。
【請求項２】
前記別のアミノ酸が、アスパラギン酸またはイソロイシンである、請求項１に記載の無活性アルカリホスファターゼ。
【請求項３】
請求項１または２に記載の無活性アルカリホスファターゼの突然変異体を作製する方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の無活性アルカリホスファターゼを免疫測定系に添加して、アルカリホスファターゼの非特異的吸着を低減させることを特徴とする測定系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無活性アルカリホスファターゼの作製方法とそれを使用した測定系に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルカリホスファターゼは、抗原・抗体反応などの検出系にホースラディッシュパーオキシダーゼと並んでよく利用される酵素である。従来は動物の臓器から精製されたアルカリホスファターゼが利用されていたが、ロット間差などがあり均一な性能の物を入手することが難しかった。それらの課題を解決するために、遺伝子工学技術を用い、ピキア酵母で高活性遺伝子組換えＡＬＰを生産する方法（特許文献１）、ＣＨＯ細胞で発現する方法が報告されている（特許文献２）。
【０００３】
ところで、ＥＬＩＳＡを構築する際に問題となる課題の一つが、ＥＬＩＳＡを構成する各種材料の水不溶性担体への非特異的吸着である。解決方法として、ウシ血清アルブミンやスキムミルクなど反応に直接関与しない物質を共存させることで低減できる場合が多いが、非特異的吸着を十分に抑えられない場合がある。そのような場合には次のような解決方法が採用される場合がある。例えばアルカリホスファターゼ自体の非特異的吸着が起こっている場合は、活性を消失させたアルカリホスファターゼを反応系に添加しておくことで、活性を有したアルカリホスファターゼの非特異的吸着を抑えることができる。そのような目的で使用するアルカリホスファターゼは、活性を有したアルカリホスファターゼと全く同じ構造を有している事が好ましい。
【０００４】
これまでに、ピキア酵母で作製したアルカリホスファターゼの非特異的吸着を防止するために、無活性アルカリホスファターゼの作製を発現し測定系に利用する方法が報告されている。本発明では、動物細胞で作製したアルカリホスファターゼと同一の構造を有する、活性を消失させたアルカリホスファターゼ、および、非特異的吸着を低減させた測定系に関する。
【０００５】
無活性アルカリホスファターゼを作製する方法は活性に関与するアミノ酸を他のアミノ酸に変異させる方法が採用できる。例えば非特許論文１によると、金属を配位しているアミノ酸に変異を導入することで、酵素活性が低下するとの報告がされている。また、特許論文３には、活性残基である９２番目のセリンをアラニン、グリシン、バリン、ロイシンに置換することで活性が低下化する報告がされている。しかしながら、それ以外の変異体やアミノ酸を欠失させた場合にどうなるかについては開示されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３６５７８９５号公報
【特許文献２】特許第４２９５３８６号公報
【特許文献３】特許第３８５０８０６号公報
【特許文献４】特開２０１７−１９２３８１
【特許文献５】特許第５８１０５１４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７、２２９９２（２００２）
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０８、６７３；１９９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、遺伝子組換え技術を用いて動物細胞で作製したアルカリホスファターゼの非特異的吸着を防止するために利用できる、無活性アルカリホスファターゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は上記課題について鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は以下の態様を包含する。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列の９２番目のアミノ酸であるセリンを欠失させるか、別のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を含み、野生型のアルカリホスファターゼと比較して活性が低下した無活性アルカリホスファターゼ。
（２）前記別のアミノ酸が、アスパラギン酸またはイソロイシンである、（１）に記載の無活性アルカリホスファターゼ。
（３）（１）または（２）に記載の無活性アルカリホスファターゼの突然変異体を作製する方法。
（４）（１）または（２）に記載の無活性アルカリホスファターゼを免疫測定系に添加して、アルカリホスファターゼの非特異的吸着を低減させることを特徴とする測定系。
【００１０】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
【００１１】
アルカリホスファターゼの非特異的吸着に起因するバックグラウンドの向上を抑えるためには、測定系で使用しているアルカリホスファターゼと同様な構造を有しているが、活性だけが消失した無活性アルカリホスファターゼを添加することが有効である。そのためには、活性型アルカリホスファターゼと同じホスト−ベクター系で作製した、無活性アルカリホスファターゼを添加することが好ましい。
【００１２】
なお「活性が消失した」「無活性」とは、本明細書中においては、野生型のアルカリホスファターゼと比較して活性が１０００分の１以下であることを意味し、１５００分の１以下が好ましく、２０００分の１以下がより好ましい。
【００１３】
特許文献４に記載されている変異型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子を用いた製造方法と同じホスト−ベクター系を用い、９２番目のセリンを欠失させたもの、イソロイシンに置換したもの、アスパラギン酸に置換したものを、アラニンに置換したものを作製した。変異の導入方法は、特殊な作業は必要なく、一般的に知られている方法で行えばよい。
【００１４】
さらに本特許では４８０番目のアミノ酸までをコードしたアルカリホスファターゼ遺伝子を使用したが、それに限定されるものではない。
【００１５】
本特許では、発現させたアルカリホスファターゼの検出を容易にするために、上記アルカリホスファターゼのＣ末端に特許文献５に開示されているタグペプチド（ＣＫＶＬＲＲＨ）を連結させたアルカリホスファターゼを作製したが、無活性アルカリホスファターゼを生産する場合は、本タグペプチドは除去することは可能である。
【００１６】
上記各種変異体を遺伝子組み換えタンパク質として発現させるホスト・ベクター系や、その培養方法は特に限定されない。たとえば動物細胞用発現体として発現させるベクターとして、非特許文献２に示された発現ベクターを使い、ＣＨＯ細胞をホストとして用いることができる。また、ホストとして使用する動物細胞は、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などを例示することができるが、それらに限定されるものではない。もちろん、付与される糖鎖の構造が天然型と異なったり、糖鎖欠損体であってもよい場合は、大腸菌や酵母、バチルスなどの細菌でも製造することは可能であり、無細胞タンパク質合成系で生産することも可能である。ただし、活性型アルカリホスファターゼを発現させたホスト−ベクター系と同じ組み合わせを使用することが、糖鎖の付与のされ方などの、翻訳後修飾が同一となるため特に好ましい。
【００１７】
組換えアルカリホスファターゼを生産するための培養方法は、それぞれのホスト・ベクター系で最適な方法で培養すればよく、培養時間、溶存酸素濃度、ｐＨや各種培地成分をタンパク質の発現量が最適になるように調整することで生産することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明で示した無活性アルカリホスファターゼを使用することで、アルカリホスファターゼの非特異的な吸着を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】変異体の活性を比較した図。
【図２】図１の縦軸を拡大した図
【図３】アルカリホスファターゼの発現確認
【実施例】
【００２０】
［実施例１］  タグ配列付のアルカリホスファターゼ遺伝子および変異体遺伝子の作製
特許文献４に示されたアルカリホスファターゼの遺伝子の４８０番目のアミノ酸までをコードする遺伝子配列を、非特許文献２で使用されているｐＥＣＥ−ｄｈｆｒベクターに導入した。そのベクターをＡＬＰ―４８０とした。
【００２１】
その後、ＡＬＰ−４８０を鋳型として用い、ＫＯＤ−ＰＬＵＳ−ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（東洋紡績社製）により、アルカリホスファターゼの活性残基である９２番目のセリンの変異体を作製した。それぞれの変異体の名前は、９２番目のセリンを欠失させたものをＳ９２ｄ、イソロイシンに置換したものをＳ９２Ｉ、アスパラギン酸に置換したものをＳ９２Ｄ、アラニンに置換したものをＳ９２Ａで示した。
【００２２】
［実施例２］一過性発現による各種変異体の発現
実施例１で得られた発現ベクターを、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、取扱説明書に従い遺伝子を導入した。遺伝子を導入してから３日後に培養上清を回収し、以下の実験に使用した。
【００２３】
［実施例３］培養上清中に発現したアルカリホスファターゼ活性の比較
アミコンウルトラ０．５ｍｌ（３０Ｋ）（ミリポア社製）を用いることで、培養上清を１０倍に濃縮した。濃縮した溶液１０マイクロリットルを、４−ＭＵＰ溶液（１Ｍ  ジエタノールアミン、０．５ｍＭ  塩化マグネシウム、１ｍＭ  ４−ＭＵＰ）９０マイクロリットルに添加し、３０分間室温でインキュベートしたのちに、蛍光強度（励起波長３６０ｎｍ、発光波長４６５ｎｍ）をプレートリーダーで測定した。得られた結果を図１に示し、縦軸のスケールを拡大したものを図２に示した。図中Ｐｏｓｉは変異を導入していないＡＬＰ−４８０を細胞に導入した培養上清、Ｎｅｇａは、トランスフェクションを行う際に遺伝子を導入しなかった培養上清（ネガティブコントロール）の、ＰＢＳは培養上清の代わりにＰＢＳを使用した結果である。以上の結果から、今回作製したアルカリホスファターゼの活性は、ネガティブコントロールと同程度のシグナルしか得られていなかった。
【００２４】
［実施例４］変異を導入していないアルカリホスファターゼに対する変異体の活性見積もり
変異体の活性とネガティブコントロールとの差は、Ｓ９２Ａ，Ｓ９２Ｄ，Ｓ９２Ｉ、Ｓ９２ｄそれぞれ、１４、１、９、４となった。変異を導入していないアルカリホスファターゼの活性とネガティブコントロールとの差は３７，７５５であるため、変異体の活性は、変異を導入していないアルカリホスファターゼの活性と比較して、Ｓ９２Ａ，Ｓ９２Ｄ，Ｓ９２Ｉ、Ｓ９２ｄそれぞれ、２，６９７分の１、３７，７５５分の１、４，１９５分の１、９，４３９分の１であった。
【００２５】
［実施例５］ウエスタンブロッティング法による、培養上清中に発現したアルカリホスファターゼの確認
培養上清中に含まれるアルカリホスファターゼを、ウエスタンブロッティング法で確認した。まず培養上清７マイクロリットルを、定法に従い、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行いＰＶＤＦ膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜を、５％スキムミルクを含むＴＢＳ中で、４℃で一晩放置することによりブロッキングした。その後、定法でアルカリホスファターゼ標識したタグペプチドを認識する抗体（特許文献５中に記載のＢＣ２３−１１）を、０．５ｕｇ／ｍｌとなるように５％スキムミルクを含むＴＢＳで希釈した溶液と室温で２時間反応した。その後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ロシュ社製、１１６８１４５１００１）で発色させた。その結果、変異体は変異を導入していないＡＬＰ−４８０と同程度の量は培養上清中に発現していることが確認された。
【図１】
2020043814.tif 000002
【図２】
2020043814.tif 000003
【図３】
2020043814.tif 000004
【配列表】
2020043814000001.app