(57)【要約】      （修正有）【課題】ブドウ種子のような植物原料を抽出して、平均重合度（ｍｄｐ）の低い単離プロシアニジン抽出物を得ることができる、生物学的適合性の高い工程の提供。【解決手段】ブドウ種子を抽出する方法であって、温水を用いてブドウ種子を抽出する段階、不溶性の植物性物質を実質的に除去するために、抽出物を酵素処理し精密ろ過する段階、第１の透過液及び第１の保持液を得るために、酵素処理した抽出物を限外ろ過によって加工処理する段階であって、分子量の比較的大きなポリマーが第１の透過液から除去され、第１の透過液が少なくとも８０％の糖を含む段階、３未満の平均重合度を有するポリフェノールを含む第２の透過液、並びに食物繊維及び５超のｍｄｐを有するポリフェノールに富む第２の保持液を得るために、第１の保持液を水で還元し、次いで、第１の保持液を限外ろ過によって加工処理する段階を含む、ブドウ種子を抽出する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、ブドウ種子を抽出する方法：
水の沸点より低い水温の温水を用いて、洗浄したブドウ種子を抽出する段階;
抽出物中の不溶性の植物性物質を実質的に除去しかつ清澄化された抽出物を産生するために、該抽出物を酵素処理し精密ろ過する段階;
第1の透過液および第1の保持液を得るために、該酵素処理した抽出物を限外ろ過によって加工処理する段階であって、分子量の比較的大きなポリマーが該第1の透過液から除去され、該第1の透過液が、少なくとも80％の糖を含む、段階;
3未満の平均重合度(mdp)を有するポリフェノールを含む第2の透過液、ならびに食物繊維および5超のmdpを有するポリフェノールに富む第2の保持液を得るために、該第1の保持液を水で還元して(reconstitute)、水で還元した第1の保持液とし、次いで、水で還元した第1の保持液を限外ろ過によって加工処理する段階。
【請求項２】
第1の透過液を濃縮しかつ/または乾燥させる段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
第2の透過液を濃縮しかつ乾燥させる段階をさらに含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
第2の保持液を濃縮しかつ乾燥させる段階をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
酵素処理した抽出物を加工処理する段階が、1〜5kDの範囲の分子量カットオフを有する膜を用いる限外ろ過を含み、かつ水で還元した第1の保持液を加工処理する段階が、100〜500kDの範囲の分子量カットオフを有する膜を用いる限外ろ過を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
抽出物を精密ろ過する段階が、清澄化された抽出物を産生するために、1〜10μの範囲の細孔を有するフィルターを用いて該抽出物を精密ろ過する段階を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
ブドウ種子がシャルドネブドウ種子である、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
第1の透過液が、80％超の糖、5％未満の脂質、および1％未満のポリフェノールを含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
第2の透過液が、1％未満の脂質および少なくとも38％であるが70％未満であるポリフェノールを含み、該ポリフェノールの10％未満が、10個超の単量体単位を含み、該第2の透過液が2.5未満のmdpを有する、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
第2の保持液が、26〜30％の食物繊維、5超のmdpを有する45〜55％のポリフェノール、2〜3％のタンパク質、および1％未満の脂質を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
限外ろ過の効率を高めるために、限外ろ過の前にヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)を抽出物に添加する段階をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
請求項2記載の方法の産物を含む組成物。
【請求項１３】
請求項3記載の方法の産物を含む組成物。
【請求項１４】
請求項4記載の方法の産物を含む組成物。
【請求項１５】
請求項11記載の方法の産物を含む組成物。
【請求項１６】
請求項2〜4または11のいずれか一項、任意の組合せ、またはすべてに記載の方法の産物を含む組成物。
【請求項１７】
食事サプリメントまたは機能性食品中の、請求項12〜16のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１８】
製品を調味する方法において使用するための、請求項12記載の組成物。
【請求項１９】
血管または認知に関する健康状態を改善する必要がある対象に前記組成物を投与する段階を含む方法において使用するための、請求項13記載の組成物。
【請求項２０】
プレバイオティック栄養サプリメントを必要とする対象に前記組成物を投与する方法において使用するための、請求項14記載の組成物。
【請求項２１】
ガラナ抽出物、ビタミンB6、ビタミンB12、葉酸塩、ブルーベリー粉末/抽出物、および生コーヒー豆抽出物の内の1つまたは複数をさらに含む食事サプリメント中の、請求項12〜16のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２２】
認知に関する健康状態のためのサプリメントとして使用するための食事サプリメント中の、請求項13記載の組成物。
【請求項２３】
請求項12、13、および14のすべてに記載の組成物を含み、かつ、ガラナ抽出物、ビタミンB6、ビタミンB12、葉酸塩、ブルーベリー粉末/抽出物、および生コーヒー豆抽出物をさらに含む、食事サプリメントとしての組成物。
【請求項２４】
ビタミンB6、ビタミンB12、または葉酸塩の内の1つまたは複数が、非天然の形態で存在する、請求項21または23記載の組成物。
【請求項２５】
シャルドネ種子抽出物を含み、該抽出物のフラバノールが3未満の平均重合度(mdp)を有し、総ポリフェノールが70％未満である、組成物。
【請求項２６】
シャルドネ種子抽出物中のフラバノールが、50％超の単量体フラバノールである、請求項25記載の組成物。
【請求項２７】
シャルドネ種子抽出物が、1％未満の脂質を含む、請求項25または26記載の組成物。
【請求項２８】
シャルドネ種子抽出物が、38〜50％のポリフェノール、9〜12％の食物繊維、1〜2％のタンパク質、1％未満の脂質、および25〜30％の糖を含む、請求項27記載の組成物。
【請求項２９】
45〜55％のポリフェノール、26〜30％の食物繊維、および1％未満の脂質を含む、シャルドネ種子抽出物を含む組成物。
【請求項３０】
シャルドネ種子抽出物が、2〜3％のタンパク質および1％未満の糖をさらに含む、請求項29記載の組成物。
【請求項３１】
1％未満のポリフェノール、1％未満のタンパク質、3％未満の脂質、および90〜95％の糖を含む、シャルドネ種子抽出物を含む組成物。
【請求項３２】
請求項25、29、および31記載の異なる組成物の内の2つまたは3つの組合せを含む組成物。
【請求項３３】
以下の画分A、B、またはCの内の1つを含む、シャルドネ種子の水抽出物：
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。
【請求項３４】
画分Bまたは画分Cのみを含む、請求項33記載の抽出物。
【請求項３５】
画分Bのみを含む、請求項33記載の抽出物。
【請求項３６】
水のみを用いて抽出され、70％未満のポリフェノールを有する、シャルドネ種子抽出物。
【請求項３７】
限外ろ過にさらに供され、1％未満の脂質含有量を有する、請求項36記載のシャルドネ種子抽出物。
【請求項３８】
1％未満の脂質含有量を有し、3未満の平均重合度(mdp)を有するフラバノールをさらに含む、請求項36記載のシャルドネ種子抽出物。
【請求項３９】
2.5未満のmdpを有する、請求項38記載のシャルドネ種子抽出物。
【請求項４０】
請求項12〜39のいずれか一項記載のシャルドネ種子抽出物を含む、栄養組成物。
【請求項４１】
請求項40記載の栄養組成物を対象に投与することによって、心血管または認知に関する健康状態を改善する方法。
【請求項４２】
洗浄したブドウ種子を、水温100〜200°Fの水を用いて抽出する、請求項1記載の方法。
【請求項４３】
洗浄したブドウ種子を、水温130〜190°Fの水を用いて抽出する、請求項42記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2014年5月30日に出願され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国仮出願第62/005,708号の恩典を主張する。
【０００２】
分野
本開示は、ブドウ種子抽出物、ブドウ種子抽出工程、および健康に有益な製品を製造するために抽出物の画分を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
果物および野菜を食べると、いくつかの慢性疾患、最も顕著には心血管疾患および癌のリスクが低下する(Fung et al., Am J Clin Nutr 92:1429-1435, 2010（非特許文献1）)。果物および野菜は、ビタミンおよびミネラルの重要な供給源であるが、これらの食物の健康増進効果は、主に、食物繊維および抗酸化物質といったそれらの内容物のおかげであると考えられている。ビタミンCおよびビタミンEなど特定のビタミンは、酸素ラジカルおよび窒素ラジカルの直接的補足に主に基づいて、抗酸化活性を発揮する。果物および野菜中の様々なフェノール物質(ポリフェノール類とも呼ばれる)もまた、かなりの抗酸化能力を有しており、多数の細胞シグナル伝達カスケードに影響を及ぼす。ポリフェノール類は、地中海地方の食事および赤ワインの健康上の便益をもたらすために極めて重要であるとみなされている(Del Rio et al., Antioxid Redox Signal 18:1818-1892, 2013（非特許文献2）)。
【０００４】
特に、ブドウは、ポリフェノール類の豊富な供給源であり、このことによって、ブドウ、ブドウジュース、およびワインを飲食することの健康上の便益の説明がつくと考えられている。ブドウ(特に白ブドウ)中に存在する顕著なポリフェノール種は、緑茶およびココア中で同定されるもの、すなわちフラバノール類またはフラバン-3-オール類と類似している(Del Rio et al., Antioxid Redox Signal 18:1818-1892, 2013（非特許文献2）)。ブドウ種子は、ブドウのジュース、ゼリー、ピューレ、およびワインの商業的製造によって生じる廃棄物の流れ(waste stream)としばしばみなされる。これらの種子が、ブドウ内部のポリフェノール類の最も濃縮された供給源であるという認識がきっかけとなって、濃縮されたポリフェノール抽出物を製造する目的でブドウ種子を加工処理するための様々な産業的工程の開発が始まった。典型的には、これらの工程は、カテキンおよびエピカテキンなどの単量体フラバノールから、これらの単量体単位2〜10個からなるオリゴマー(プロシアニジン、プロアントシアニジン、またはOPCと略されるオリゴマープロアントシアニジンとして公知)まで、これらの単量体単位からなる高分子量ポリマー(ポリマーのプロシアニジン、タンニン、または縮合型タンニンとして公知)まで多岐にわたる、種子内部に存在するフェノール類の全量(entire complement)を含む抽出物を生じる。しかしながら、最近10年間にわたる調査により、単量体のカテキン系ポリフェノールとオリゴマーのカテキン系ポリフェノールとポリマーのカテキン系ポリフェノールとでは生物学的利用能が違い、生物学的作用が異なることが明らかになっている。残念ながら、ポリフェノールを濃縮するための大半の既存の抽出工程は、複雑な分画スキームを通して除去しなければならない刺激性溶媒を使用する。他の分画方法は、溶離のためにエタノールのような溶媒を使用する吸着方法を使用し、特殊な製造施設が必要となる。
【０００５】
米国特許第3,435,407号（特許文献1）および同第4,698,360号（特許文献2）は、塩化ナトリウムによる抽出および沈降を用いて、付随するポリマーポリフェノール(縮合型タンニン)の抽出を最小限に抑えつつ、マツ樹皮からプロアントシアニジンを抽出するための方法を開示している。これらの方法は、酢酸エチルを用いて繰り返し抽出することを必要とする。次いで、酢酸エチルは蒸発によって除去され、クロロホルムの添加によってオリゴマープロシアニジンが沈殿させられる。
【０００６】
米国特許第5,484,594号（特許文献3）は、オリゴマープロアントシアニジンに富むが、この特許によれば望ましくない廃棄物である単量体はほとんど含まないブドウ種子抽出物を調製するための多段工程を開示している。80％含水アセトンを用いて種子が抽出され、ろ過によってポリマー廃棄物が除去され、次いで、溶媒が蒸発させられ、残存するポリフェノールが濃縮される。これらの段階に続いて、さらにろ過されて、望まれない単量体が排除される。この工程は、公知の発癌物質である塩素化炭化水素を使用する。アセトンおよび塩素化炭化水素の使用はまた、プロシアンジン(procyandin)との反応および抽出されたプロシアニジンの性質変化の可能性を高める。
【０００７】
米国特許第5,912,363号（特許文献4）は、加圧下および/または低酸素下にて最高350°Fまでの温度で水溶性の固体の植物性物質混合物を加熱することによる、植物性物質からのプロアントシアニジンの抽出と、それに続く、抽出されたプロアントシアニジンを含む透過液を産生するための膜ろ過を開示している。次いで、抽出されたプロアントシアニジンは、透過液を吸着性樹脂と接触させ、次いでエタノールを用いて溶出させることにより、透過液から分離させられる。これらの例はすべて、大気圧下での水の沸点より高い温度240°Fで実施される。重合度(dp)の低いオリゴマーに対する選択性は、開示されていない。
【０００８】
米国特許第6,544,581号（特許文献5）は、熱水抽出および二重pH処理を用いて、まるごとの(whole)ブドウ、種子、または搾りかすからオリゴマーポリフェノールおよびポリマーポリフェノールを非選択的に抽出するための方法(process)を開示している。最大7dpのオリゴマープロシアニジンおよび最大16dpのポリマープロシアニジンが、硫酸のような鉱酸を使用する工程で得られ、次いで、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩基を用いて中和される。抽出物は、吸着樹脂で処理され、ポリフェノールは、エタノールを用いて溶離される。得られる産物は、フェノール総量は非常に高レベルであるが、単量体プロシアニジンの比率は比較的低い。
【０００９】
米国特許第7,767,235号（特許文献6）では、抽出物を硫酸のような鉱酸を用いて酸性化し、次いで、珪藻土を用いてそれをろ過することにより、ブドウ、ブドウ種子、またはブドウ搾りかすの抽出物を製造する。この抽出物は、約5〜15％の単量体プロシアニジンを有すると述べられている。
【００１０】
米国特許第8,075,929号（特許文献7）では、高温でブドウを抽出し、抽出物をタンナーゼで処理し、かつ約1.5〜2.5のpHで抽出物を酸性化することによって、約5〜15％の単量体を有するブドウ抽出物を製造する。
【００１１】
一般に、従来のプロシアニジン抽出工程は、対象に投与する前に除去されなければならないメタノール、エタノール、またはアセトンなどの生物学的にあまり望ましくない酸性化有機溶媒を用いてブドウ種子を抽出する。他の従来の抽出工程は、高温での加工処理を必要とする。一部の方法は、高圧高温下での加圧液体抽出(PLE)、メタノール中クロロホルムによる連続的抽出、または硫酸のような鉱酸による酸性化を使用する。このような有毒な可能性がある処理を用いた場合でさえ、得られる抽出物は、単量体プロシアニジンにあまり富んでおらず、抽出物中には約15〜17％以下の単量体しか存在しない。
【００１２】
ブドウ種子のような植物原料を抽出して、平均重合度(mdp)の低い単離プロシアニジン抽出物を得ることができる、生物学的適合性の高い工程を提供することが、望ましいと思われる。ブドウ種子の他の生物学的に有用な構成成分が、単量体フラバノールおよび二量体フラバノールと共に得られ単離されるような方法を提供することもまた、有利であると思われる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第3,435,407号
【特許文献２】米国特許第4,698,360号
【特許文献３】米国特許第5,484,594号
【特許文献４】米国特許第5,912,363号
【特許文献５】米国特許第6,544,581号
【特許文献６】米国特許第7,767,235号
【特許文献７】米国特許第8,075,929号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Fung et al., Am J Clin Nutr 92:1429-1435, 2010
【非特許文献２】Del Rio et al., Antioxid Redox Signal 18:1818-1892, 2013
【発明の概要】
【００１５】
概要
ブドウ種子は、ポリフェノール抽出物およびブドウ種子油の商業的製造のために使用されるが、ブドウ種子は、血管内皮に関する健康状態に特に有益である単量体フラバノールの比較的乏しい供給源とみなされている。ブドウ種子はまた、他の有益な食事構成成分、特に顕著には食物繊維を含むことが見出されている。乾燥重量を基準として、ブドウ種子は、20〜50％の食物繊維を含み得るのに対し、ほとんどの市販用ブドウ種子抽出物は、70〜95％の間のポリフェノールを提供するように標準化されている。これらのポリフェノールに富む抽出物を製造する工程は、脂質の特性(profiles)を改良し、プレバイオティック機能を高めることができる貴重な食物繊維を除去してしまった。さらに、ブドウ種子の異なる構成成分は、異なる個々の健康上の便益を提供する。本明細書において開示する方法は、以前の工程の多くが有する生物学的危害を回避する工程を用いて、ブドウ種子抽出物の様々な画分の選択的分離および保持を可能にする。これらの分離された画分を別々に使用するか、または任意の組合せもしくは比率で組み合わせて、個体または個体群にとって望ましい生物学的効果を有する組成物を調製することができる。
【００１６】
開示する抽出工程はまた、抽出を実施するのに鉱酸を必要とせず、標準的な商業的工程および液状水溶媒(例えば、純粋溶媒)だけを用いることによって、既存の方法の制約を克服する。また、抽出は、水の沸点(212°F)より低い温度および大気圧下で実施することもできる。ブドウ種子の有益な構成成分は、連続的限外ろ過段階によって、異なる目的に特に適している次の3つの画分に分けられる：(A)甘味付け/調味目的のための単糖および芳香族フェノールを主に含む画分;(B)血液循環を促進するのに有用である低分子量フラバノールすなわち単量体種および二量体種を主に含む、画分;ならびに(C)プレバイオティック効果を与えるための、食物線維ならびにフラバノールオリゴマーおよびフラバノールポリマーに富む画分。2〜3％の脂質内容物を含む現在入手可能な市販用ブドウ種子抽出物とは対照的に、後者の2つの画分(BおよびC)は1％未満の脂質内容物を含むこともまた、注目に値する。典型的には、高い脂質含有量は、圧縮に抵抗しブドウ種子抽出物を錠剤に製剤化するのを妨げる、ロウのような粘着性の特徴を与える。脂質含有量が2〜3％であるブドウ種子抽出物は、錠剤がスティッキング(streaking)およびキャッピングを起こす原因となる傾向があり、粘着性のために、製造機械との相性もさらに悪い。したがって、ブドウ種子抽出物製剤は、最も一般的には、カプセル剤中に、またはソフトゲルカプセルのような、より高価な形態で存在する。後述のポリフェノールに富む画分は脂質含有量が極度に少ないため、錠剤に製剤化することができる。
【００１７】
開示する工程を用いて、多くの種子、および多くのブドウ種子の様々な構成成分を抽出および分離することができるが、特にシャルドネブドウ種子が、開示する抽出工程に非常に適している。シャルドネヴァラエタルは、世界的に最も人気のあるワインの1つであり、したがって、豊富な量のブドウ種子が生じる。さらに、シャルドネ種子は、比較的多い含有量のエピカテキン(Fuleki and Ricardo da Silva, J Agric Food Chem 45:1156-1160, 1997; Yilmaz and Toledo, J Agric Food Chem 52:255-260, 2004)、すなわち、ヒト内皮機能に対する有益な作用をもたらすと報告されており、少なくともある程度、循環機能に対するココアおよびブドウ種子抽出物の効果の基盤をなしている可能性があるフラバノール単量体(Jimenez et al., J Agric Food Chem 60:8823-8830, 2012)を含むと報告されている。
【００１８】
この方法の特定の例では、洗浄したブドウ種子を、約100〜200°F、例えば120〜195°F、例えば130〜190°Fの温度の熱水を用いて抽出する。最初の抽出物を酵素処理し精密ろ過して、不溶性の植物性物質を実質的に除去し、かつ清澄化された抽出物を産生する。清澄化された抽出物を第1の限外ろ過によって加工処理して、第1の透過液(permeate)および第1の保持液(retentate)を得、ここで、分子量の比較的大きなポリマーが第1の透過液から除去され、第1の透過液は、少なくとも80％の糖を含む。第1の保持液を水で還元し(reconstitute)、次いで、第2の限外ろ過によって加工処理して、3未満、例えば2.5未満のmdpを有するポリフェノールを含む第2の透過液、ならびに食物繊維および5超のmdpを有するポリフェノールに富む第2の保持液を得る。特定の例では、第1の限外ろ過は、1〜5kDの範囲の分子量カットオフを有する限外ろ過膜を用いて実施し、第2の限外ろ過は、100〜500kDの範囲の分子量カットオフを有する膜を用いて実施する。
【００１９】
単離または精製されたシャルドネ種子抽出物を含む組成物もまた、本明細書において開示され、ここで該抽出物のフラバノールが3未満、例えば2.5未満の平均重合度を有し、総ポリフェノール含有量が70％未満、いくつかの例では該ポリフェノール含有量が50％未満である。いくつかの例において、シャルドネ種子抽出物中のフラバノールは、50％超の単量体フラバノールであり、かつ/または1％未満の脂質を含む。特定の例では、シャルドネ種子抽出物は、38〜50％のポリフェノール、9〜12％の食物繊維、1〜2％のタンパク質、25〜30％の糖、および1％未満の脂質を含む。
【００２０】
開示される別の組成物は、単離または精製されたシャルドネ種子抽出物を含み、この組成物は、45〜55％のポリフェノール、26〜30％の食物繊維、および1％未満の脂質を含む。いくつかの例において、シャルドネ種子抽出物は、2〜3％のタンパク質および1％未満の糖をさらに含む。
【００２１】
開示される別の組成物は、単離または精製されたシャルドネ種子抽出物を含み、この組成物は、90〜95％の糖、1％未満のポリフェノール、1％未満のタンパク質、および3％未満の脂質を含む。
【００２２】
他の態様において、組成物は、これらの異なる組成物の内の2つまたは3つの組合せである。
【００２３】
開示される別の態様は、シャルドネ種子の単離または精製された水抽出物であり、抽出物は、以下の画分A、B、またはCの内の1つである。
2020043863.tif 000003
【００２４】
いくつかの態様において、組成物は、画分Aまたは画分Bまたは画分Cのみを含む。他の例において、組成物は、以前は別々の画分の組合せ、例えば、画分AおよびB、AおよびC、BおよびC、またはA、B、およびCの組合せを含む。
【００２５】
さらに別の例において、シャルドネ種子抽出物は、水のみを用いてシャルドネ種子を抽出することによって、例えば、アルコール溶媒(例えば、メタノール溶媒またはエタノール溶媒)も、鉱酸溶媒(例えば硫酸)も、樹脂も用いない水溶媒抽出によって得られる抽出物である。水抽出物を、脂質含有量が1％未満である抽出物を生じる限外ろ過にさらに供してもよい。いくつかの例において、脂質含有量が1％未満である水抽出物は、平均重合度が3未満、およびいくつかの例では2.5未満のフラバノールをさらに含む。いくつかの例において、これらの抽出物は38〜50％のポリフェノールを含み、いくつかの例において、これらの抽出物は45〜55％のポリフェノールを含む。
【００２６】
液状形態または乾燥形態の抽出物は、例えば、錠剤もしくはカプセル剤などの剤形または非天然の調製された食料製品(例えばエネルギーバー)に組み入れることにより、例えば、それを栄養補助用担体、例えば非天然栄養補助用担体と混合することによって、栄養組成物に配合することができる。
【００２７】
単離された抽出物およびそれらの抽出物を含む組成物は、それらを対象に投与することによって心血管または認知に関する健康状態を支援、維持、または改善するのに使用することができる。液状形態または乾燥形態の抽出物は、単独で、または他の栄養物、例えば、ガラナ抽出物、ビタミンB6、ビタミンB12、葉酸塩、ブルーベリー粉末/抽出物、および生コーヒー豆抽出物の内の1つもしくは複数と組み合わせて、対象に投与するのに適している。特定の例において、第2の透過液を用いて得られた低mdp画分は、単独で、または他の栄養物の内の1つもしくは複数と組み合わせて、投与される。いくつかの例において、これらの組成物は、循環および認知に関する健康状態を改善するのに使用される。
【００２８】
[本発明1001]
以下の段階を含む、ブドウ種子を抽出する方法：
水の沸点より低い水温の温水を用いて、洗浄したブドウ種子を抽出する段階;
抽出物中の不溶性の植物性物質を実質的に除去しかつ清澄化された抽出物を産生するために、該抽出物を酵素処理し精密ろ過する段階;
第1の透過液および第1の保持液を得るために、該酵素処理した抽出物を限外ろ過によって加工処理する段階であって、分子量の比較的大きなポリマーが該第1の透過液から除去され、該第1の透過液が、少なくとも80％の糖を含む、段階;
3未満の平均重合度(mdp)を有するポリフェノールを含む第2の透過液、ならびに食物繊維および5超のmdpを有するポリフェノールに富む第2の保持液を得るために、該第1の保持液を水で還元して(reconstitute)、水で還元した第1の保持液とし、次いで、水で還元した第1の保持液を限外ろ過によって加工処理する段階。
[本発明1002]
第1の透過液を濃縮しかつ/または乾燥させる段階をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
第2の透過液を濃縮しかつ乾燥させる段階をさらに含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
第2の保持液を濃縮しかつ乾燥させる段階をさらに含む、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
酵素処理した抽出物を加工処理する段階が、1〜5kDの範囲の分子量カットオフを有する膜を用いる限外ろ過を含み、かつ水で還元した第1の保持液を加工処理する段階が、100〜500kDの範囲の分子量カットオフを有する膜を用いる限外ろ過を含む、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
抽出物を精密ろ過する段階が、清澄化された抽出物を産生するために、1〜10μの範囲の細孔を有するフィルターを用いて該抽出物を精密ろ過する段階を含む、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
ブドウ種子がシャルドネブドウ種子である、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
第1の透過液が、80％超の糖、5％未満の脂質、および1％未満のポリフェノールを含む、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
第2の透過液が、1％未満の脂質および少なくとも38％であるが70％未満であるポリフェノールを含み、該ポリフェノールの10％未満が、10個超の単量体単位を含み、該第2の透過液が2.5未満のmdpを有する、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
第2の保持液が、26〜30％の食物繊維、5超のmdpを有する45〜55％のポリフェノール、2〜3％のタンパク質、および1％未満の脂質を含む、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
限外ろ過の効率を高めるために、限外ろ過の前にヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)を抽出物に添加する段階をさらに含む、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1012]
本発明1002の方法の産物を含む組成物。
[本発明1013]
本発明1003の方法の産物を含む組成物。
[本発明1014]
本発明1004の方法の産物を含む組成物。
[本発明1015]
本発明1011の方法の産物を含む組成物。
[本発明1016]
本発明1002〜1004または1011のいずれか、任意の組合せ、またはすべての方法の産物を含む組成物。
[本発明1017]
食事サプリメントまたは機能性食品中の、本発明1012〜1016のいずれかの組成物。
[本発明1018]
製品を調味する方法において使用するための、本発明1012の組成物。
[本発明1019]
血管または認知に関する健康状態を改善する必要がある対象に前記組成物を投与する段階を含む方法において使用するための、本発明1013の組成物。
[本発明1020]
プレバイオティック栄養サプリメントを必要とする対象に前記組成物を投与する方法において使用するための、本発明1014の組成物。
[本発明1021]
ガラナ抽出物、ビタミンB6、ビタミンB12、葉酸塩、ブルーベリー粉末/抽出物、および生コーヒー豆抽出物の内の1つまたは複数をさらに含む食事サプリメント中の、本発明1012〜1016のいずれかの組成物。
[本発明1022]
認知に関する健康状態のためのサプリメントとして使用するための食事サプリメント中の、本発明1013の組成物。
[本発明1023]
本発明1012、1013、および1014のすべての組成物を含み、かつ、ガラナ抽出物、ビタミンB6、ビタミンB12、葉酸塩、ブルーベリー粉末/抽出物、および生コーヒー豆抽出物をさらに含む、食事サプリメントとしての組成物。
[本発明1024]
ビタミンB6、ビタミンB12、または葉酸塩の内の1つまたは複数が、非天然の形態で存在する、本発明1021または1023の組成物。
[本発明1025]
シャルドネ種子抽出物を含み、該抽出物のフラバノールが3未満の平均重合度(mdp)を有し、総ポリフェノールが70％未満である、組成物。
[本発明1026]
シャルドネ種子抽出物中のフラバノールが、50％超の単量体フラバノールである、本発明1025の組成物。
[本発明1027]
シャルドネ種子抽出物が、1％未満の脂質を含む、本発明1025または1026の組成物。
[本発明1028]
シャルドネ種子抽出物が、38〜50％のポリフェノール、9〜12％の食物繊維、1〜2％のタンパク質、1％未満の脂質、および25〜30％の糖を含む、本発明1027の組成物。
[本発明1029]
45〜55％のポリフェノール、26〜30％の食物繊維、および1％未満の脂質を含む、シャルドネ種子抽出物を含む組成物。
[本発明1030]
シャルドネ種子抽出物が、2〜3％のタンパク質および1％未満の糖をさらに含む、本発明1029の組成物。
[本発明1031]
1％未満のポリフェノール、1％未満のタンパク質、3％未満の脂質、および90〜95％の糖を含む、シャルドネ種子抽出物を含む組成物。
[本発明1032]
本発明1025、1029、および1031の異なる組成物の内の2つまたは3つの組合せを含む組成物。
[本発明1033]
以下の画分A、B、またはCの内の1つを含む、シャルドネ種子の水抽出物：
2020043863.tif 000004
。
[本発明1034]
画分Bまたは画分Cのみを含む、本発明1033の抽出物。
[本発明1035]
画分Bのみを含む、本発明1033の抽出物。
[本発明1036]
水のみを用いて抽出され、70％未満のポリフェノールを有する、シャルドネ種子抽出物。
[本発明1037]
限外ろ過にさらに供され、1％未満の脂質含有量を有する、本発明1036のシャルドネ種子抽出物。
[本発明1038]
1％未満の脂質含有量を有し、3未満の平均重合度(mdp)を有するフラバノールをさらに含む、本発明1036のシャルドネ種子抽出物。
[本発明1039]
2.5未満のmdpを有する、本発明1038のシャルドネ種子抽出物。
[本発明1040]
本発明1012〜1039のいずれかのシャルドネ種子抽出物を含む、栄養組成物。
[本発明1041]
本発明1040の栄養組成物を対象に投与することによって、心血管または認知に関する健康状態を改善する方法。
[本発明1042]
洗浄したブドウ種子を、水温100〜200°Fの水を用いて抽出する、本発明1001の方法。
[本発明1043]
洗浄したブドウ種子を、水温130〜190°Fの水を用いて抽出する、本発明1042の方法。
本発明の前述および他の目的、特徴、および利点は、添付図面に関連して続く以下の詳細な説明からより明らかになると考えられる。この開示の概要の中のなにごとも、本明細書において要約する方法および組成物の任意の局面の限界(criticality)を意味すると解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】抽出方法のある態様の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
詳細な説明
I  用語
以下の用語および方法の説明は、本発明の開示をより良く説明するため、かつ本開示の実践に際して当業者を導くために、提供される。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの(a)」もしくは「1つの(an)」または「その(the)」は、文脈において特に規定がない限り、複数の指示内容を含む。本明細書において使用される場合、「含む(comprises)」は、「含む(includes)」を意味する。したがって、「AまたはBを含む(comprising A or B)」は、追加の要素を除外せずに「A、B、またはAおよびBを含む(including A, B, or A and B)」ことを意味する。
【００３１】
別段の説明がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において説明されるものと同様または等価な方法および材料を、本開示の実践または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を後述する。「約(about)」または「約(approximately)」などの単語が記載されているか否かを問わず、任意の定量的値はおおよその値であることが、さらに理解されるべきである。別段の定めがない限り、パーセンテージおよび比率はすべて、重量に基づいて計算される。
【００３２】
投与：シャルドネ種子抽出物を含む組成物のような作用物質を任意の効果的な経路で対象に提供するか、または与えること。例示的な投与経路には、経口経路、注射経路(皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内、および腫瘍内など)、舌下経路、経皮経路、鼻腔内経路、局所経路、および吸入経路が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００３３】
ブルーベリーの粉末または抽出物：ブルーベリー、例えば有機ブルーベリーを、ドラム乾燥、電子レンジ乾燥、または凍結乾燥などの典型的な商業的手段によって乾燥し、次いで粉砕して粉末にする。「ブルーベリー抽出物」とは、溶媒抽出されたブルーベリー、例えば、抽出物を得るための典型的な水または水/エタノール液体抽出によって得られる抽出物を意味する。
【００３４】
シャルドネブドウ：白ワインを製造するのに使用される皮が緑色のブドウ品種であり、ヴィティス・ヴィニフェラ(Vitis vinifera)シャルドネとしても公知である。
【００３５】
重合度：重合度(dp)とは、1つのポリマー分子またはオリゴマー分子中の単量体単位の数である。平均重合度(mdp)は、単量体、オリゴマー、およびポリマーを含むフラバノール種の複雑な混合物(例えば抽出物)中の構成要素であるフラバノールの平均(mean)または平均(average)分子長(分子を形成する単量体単位の数)と定義される。mdpが低いほど、混合物中の単量体および二量体の百分率は高い。mdpは、測定される試料の平均的ポリマー鎖中の単量体フラバノール単位の数として表すことができる。複雑な混合物の中の構成要素分子の平均長は、例えば、チオ開裂(オリゴマーの酸性触媒による切断とそれに続くベンジルチオエーテル誘導体化が実施され、その後で、質量分析によって誘導体化単量体が定量される)(Gu et al., J Agric Food Chem 50:4852-4860, 2002)およびゲル浸透クロマトグラフィー(dpが1〜10であるオリゴマーが分子サイズに基づいてクロマトグラフィーによって分離され、質量分析によって定量される)(Hammerstone et al., J Agric Food Chem 47:490-496, 1999)などの方法を用いて測定することができる。
【００３６】
有効量：単独で、または追加の作用物質(例えば、追加の抗酸化物質)と共に、所望の応答を誘発する、組成物の量。本明細書において開示する調製物は、治療的に(例えば栄養補助的に)有効な量で投与することができる。有効量は、例えば毎日、単一用量で、またはいくつかの用量で投与することができる。しかし、有効量は、治療される対象、治療される病態の重症度およびタイプ、ならびに投与様式に応じて変わり得る。
【００３７】
賦形剤：組成物の有効成分のための担体として使用される不活性物質。賦形剤には、非常に強力な有効成分を含む製剤のかさを高くするために使用され、簡便かつ正確な投与量決定(dosage)を可能にし、有効成分を安定にし、かつ送達系を視覚的および/または感覚受容的に許容されるものにする物質が含まれ得る。薬学的賦形剤の例には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールなどが含まれる。
【００３８】
抽出物：植物または1つもしくは複数のその一部分、例えば、果実もしくは種子の有効成分の少なくとも一部分の溶液または他の調製物。本明細書において開示する抽出物は、種子が(温水のような)液体抽出溶媒にさらされて、種子から有効成分(principle)が取り出される、溶媒抽出物である。溶媒抽出によって最初に得られる抽出物は、乾燥形態に変換されてもよく、それでもなお「抽出物」とみなされてよい。「水系」または「水」抽出物とは、水を用い他の溶媒(例えばエタノール)を用いない溶媒抽出によって得られた抽出物を意味する。
【００３９】
フラボノイド：植物の二次代謝産物のクラス。乾燥重量基準で、ブドウ種子は、約4〜8％のフラボノイドを含む。フラボノイドは、植物に広範囲に分布する食事性ポリフェノール化合物の重要な群を構成する。4000種類を超える化学的に独特なフラボノイドが、果実、野菜、マメ科植物、木の実、種子、ハーブ、香辛料、花などの植物供給源中、ならびに茶、ココア、ビール、ワイン、およびブドウジュースなどの飲料中で同定されている。
【００４０】
ブドウ種子中のフラボノイドとは、主にフラバン-3-オール、具体的には(+)-カテキン、(-)-エピカテキン、および(-)-エピカテキン3-ガラート、およびそれらの複合体を指す。ブドウ種子中のフラバン-3-オールは、単量体型、オリゴマー型、またはポリマー型で存在する。2つまたはそれ以上の化学結合したフラバン-3-オール単量体は、プロアントシアニジンまたはオリゴマープロアントシアニジン(「OPC」)と呼ばれ、プロシアニジンおよびプロデルフィニジンが含まれる。2つの単量体を含むOPCは二量体と呼ばれ、3つの単量体を含むOPCは三量体と呼ばれ、4つの単量体を含むOPCは四量体と呼ばれ、5つの単量体を含むOPCは五量体と呼ばれ、以降も同じである。オリゴマーの鎖長は2〜10である;ポリマーは、鎖長が10より長い構成成分に相当する。したがって、ブドウ抽出物中のオリゴマーには、例えば、二量体および三量体が含まれ、ポリマーは50〜100もの単位を有し得るという証拠がある。
【００４１】
ポリフェノール化合物がブドウ抽出物として商業的に使用されるためには、これらの化合物は、さらに濃縮した形態でブドウから分離されなければならない。科学的研究では、プロアントシアニジンの抗酸化力は、ビタミンEより20倍大きく、ビタミンCより50倍大きいことが示されている。徹底的な調査により、ブドウ種子抽出物は、抗酸化作用のおかげで、健康に関する多くの領域で有益であり、コラーゲンと結合して、若々しい皮膚、細胞の健康、弾性、および柔軟性を促進することが示唆されている。他の研究では、プロアントシアニジンが、日光による損傷から身体を保護するのを、視力を向上させるのを、関節、動脈、および心臓のような体組織の柔軟性を向上させるのを、かつ毛細血管、動脈、および静脈を強くすることによって血液循環を改善するのを、助けることが示されている。
【００４２】
葉酸塩：ビタミンB9としても公知である。葉酸塩は、B複合体の水溶性ビタミンである。葉酸塩は、食物中に天然に存在する形態であり、葉酸は、食事サプリメント(dietary supplement)およびビタミン強化食品中にしばしば存在する合成型である。「葉酸塩」および「葉酸」という用語はしばしば同義的に使用され、本明細書でもそのように使用される。その結果、「葉酸塩」への言及は、葉酸塩ならびに葉酸および他の形態の栄養的に許容される葉酸塩、例えば、食物中には存在しない非天然葉酸塩を含む。それゆえ、「葉酸塩」は、他の形態または生物学的前駆体もしくは生物学的に活性化された形態、例えば、メチル葉酸塩(methyl-folate)、5-メチルテトラヒドロ葉酸塩(5-methyltetrahydrofolate；5-MTHF)、および葉酸塩の光学的ラセミ体または純粋な形態、例えばL-5-MTHFを含む。メチル葉酸塩は、特に、低レベルのMTHFR酵素活性に関連付けられているMTHFR遺伝子多型を有する個体のためのサプリメントに含まれることがあるビタミンの一形態である。葉酸塩は、ホモシステインの血清レベルを低下させ、それによって、一部の対象における心血管疾患および認知症のリスクを低くするのに有効である。
【００４３】
生コーヒー豆抽出物：生コーヒー豆の抽出物(例えば液体抽出物)。典型的には、生コーヒー豆抽出物は、標準化された量のクロロゲン酸およびカフェインを含む、焙煎されていない乾燥生コーヒー豆(コヒア・アラビカ(Coffea Arabica))の熱水またはエタノール/水抽出物である。
【００４４】
ガラナ抽出物：典型的には、南アメリカの植物であるガラナ(パウリニア・クパナ(Paullinia Cupana))の種子の水/エタノール抽出物。通常、4〜10％のアルカロイド(カフェインに加えてテオブロミン)に標準化され、また5〜15％のポリフェノールも含む。
【００４５】
HPMCまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース：以下に示す一般構造を有する、滑沢剤または賦形剤として使用される半合成の不活性な粘弾性ポリマー。
2020043863.tif 000005
【００４６】
栄養物：栄養物は、生物が生存および/または丈夫に成長するのに使用する、食物中の栄養になる構成成分である。栄養物は食物中に存在するが、本明細書において使用される栄養物は、天然に存在しても、または合成によって製造されてもよい。「自然食品（whole food）栄養物」とは、自然食品中に存在し、合成によって作製されていない、栄養物を意味する。
【００４７】
薬学的に許容されるビヒクル：本開示において有用な薬学的に許容されるビヒクル(担体)は、慣習的である。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition (1995)では、1種または複数種の組成物、例えば、1種または複数種のブドウ種子抽出物組成物、および自然界ではブドウ種子抽出物と共に存在しないであろう追加の天然または非天然の薬学的物質を薬学的に送達するに適した組成物および製剤を説明している。薬学的に許容される担体の使用は、そのようにして作製された製品が薬学的な目的にのみ有用であることを意味しない。もっと正確に言えば、その製品が、例えば、対象による経口摂取に適している薬剤または栄養補助食品として、対象に投与するかまたは対象が飲食するのに適していることを意味する。
【００４８】
一般に、ビヒクルの性質は、使用される個々の投与様式に依存すると考えられる。例えば、非経口製剤は、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、またはグリセロールなどの薬学的かつ生理学的に許容される液体をビヒクルとして含む注射用液体を通常含む。固形組成物(例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態)の場合、従来の非毒性固形ビヒクルには、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中性なビヒクルのほかに、投与される薬学的組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびpH緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンも含んでよい。
【００４９】
ポリフェノール：ブドウおよびココアに由来するポリフェノールは、心血管機能および認知に関する健康状態の両方を向上させることが見出されている。フラバノール(フラバン-3-オールとも呼ばれる)は、ブドウ種子およびココアのポリフェノールの大部分に相当する;このクラスのフェノール化合物は、カテキンおよびエピカテキンなどの単量体種から、オリゴマー(しばしばプロアントシアニジンと呼ばれる)、ポリマー(しばしばタンニンまたは縮合型タンニンと呼ばれる)まで様々である。「フェノールの」という用語は、当技術分野および本明細書において、ポリフェノールという用語と同義的に使用される。
【００５０】
ブドウ種子は、ワイン醸造所およびブドウジュース産業の廃棄物である。これらの種子は、脂質、タンパク質、炭水化物、および品種によって4〜8％のポリフェノール(乾燥重量)を含む。したがって、ブドウ種子抽出物は、早老、疾患、および変性から身体を保護する強力な抗酸化物質である。
【００５１】
プレバイオティック：消化器系中の有益な細菌の増殖および/または活動を促進する消化不可能な食品成分。
【００５２】
精製された：「精製された」という用語は、絶対的な純度を必要としない;もっと正確に言えば、相対的な用語として意図される。したがって、例えば、精製された物質とは、その天然環境中、例えば果実(例えばブドウ)中の該物質よりも該物質が濃縮されているものである。1つの態様において、調製物は、その物質が調製物の全内容物の少なくとも約5％(例えば、限定されるわけではないが、少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、70％、80％、90％、95％、98％、または99％)に相当するように、精製される。ある例において、抗酸化活性を有する開示される組成物は、最低限の純度が少なくとも50％、70％、80％、90％、95％、98％、または99％(重量基準)であるシャルドネブドウ種子抽出物を含む。
【００５３】
範囲：範囲に関して、「x〜yの範囲の」または「xからyまで」という用語は、xとyの間の任意の値、ならびに両端の値(endpoints)xおよびyを含む。
【００５４】
選択的抽出：選択的抽出とは、標的(例えば単量体プロシアニジン)の優先的抽出を意味する。いくつかの態様において、選択的抽出とは、標的が、抽出された優勢な化学種であることを意味する。
【００５５】
限外ろ過：力(例えば圧力または濃度勾配)によって半透性膜を通過させて分離するタイプの膜ろ過。典型的には、限外ろ過膜は、膜の分子量カットオフ(MWCO)を特徴とする。高分子量の懸濁された固体および溶質は、保持液中に保持されるのに対し、水および低分子量の溶質は、膜を通過して透過液中に入る。様々なタイプのモジュールを、限外ろ過工程のために使用することができる。このようなモジュールの例は、プラスチックチューブまたは紙チューブの内側にポリマー膜の型(cast)を用いる管形エレメント;複数の中空糸を含む中空糸デザイン;平らな膜シートが、中央の穴のあいたチューブの周りに巻かれた薄い網目状のスペーサー材料によって隔てられ、管状の鋼製圧力容器の囲いにはめ込まれている、スパイラル(spiral wound)モジュール;ならびにろ液が通過するメッシュ様材料によって隔てられた平らな板の上に置かれた膜を使用する平板(plate and frame)集合体である。
【００５６】
単位用量：治療的効果のような所望の効果を個別にまたは共同でもたらすように算出された所定の量の活性物質を含む、物理的に個別の単位。単一の単位用量または複数の単位用量が、抗酸化活性のような所望の効果または活性を提供するために使用され得る。1つの例において、単位用量は、心血管または認知に関する健康状態を増進する所望の量の作用物質を含む。別の例において、単位剤形は、複数の所定の投薬量の活性物質を含む。
【００５７】
ビタミンB6：ビタミンB複合体の一部分である水溶性ビタミン。「ビタミンB6」は、このビタミンの栄養的に許容されるすべての形態、例えば、ピリドキシン、ピリドキシン5'-ホスファート、ピリドキサール、ピリドキサール5'-ホスファート、ピリドキサミン5'-ホスファート、および4-ピリドキシン酸を含む。これは、塩酸ピリドキシン型または活性なリン酸ピリドキサール型として食事サプリメント中で提供されることがある。ビタミンB6は、アミノ酸代謝の多くの反応において、活性な補助因子である。
【００５８】
ビタミンB12：ビタミンB複合体の別の水溶性ビタミン。これは、コバラミンとして公知であり、非天然型のようないくつかの異なる形態で、食事サプリメント中で提供される。「ビタミンB12」は、シアノコバラミン、ヒドロキソコバラミン、およびメチルコバラミンなどあらゆる形態のコバラミンを指す。ビタミンB12は、脳保存(neuropreservation)および認知増強に重要であることが判明している。その欠乏は、軽度の認知機能障害および認知症に関連付けられている。ビタミンB12欠乏症は、特に高齢者集団において一般的であると考えられており、可逆性の認知症および神経障害の初期の形態(primary form)の内の1つに相当する。ビタミンB12はまた、赤血球生成(赤血球の産生)およびメチオニンへのホモシステインの変換にも必要とされる。ビタミンB12の欠乏は、MTHFR酵素に特定の変異を有する個体にとって特に問題である。ビタミンB12は、シアノコバラミンの形態で提供されることが多いが、メチルコバラミンおよび5-デオキシアデノシルコバラミンが、ヒト代謝において活性であるビタミンB12の形態である。本明細書の特定の例において、ビタミンB12は、シアノコバラミンとして提供されるが、任意の栄養的に許容される形態のコバラミンが、ビタミンB12という用語に含まれる。
【００５９】
II  いくつかの態様の説明
この詳細な説明では、ブドウ種子、例えばシャルドネ種子のような植物原料を溶媒抽出するための方法のいくつかの態様を説明する。具体的な抽出の詳細の単なる開示は、任意のそのような詳細の限界(criticality)を意味するものではなく、方法の特定の態様を用いて得られるデータの提示も、その方法がそのようなデータを得るのに使用された特定の段階に限定されることを意味するものではない。
【００６０】
開示する方法によって、植物原料から、例えば、特定の例ではシャルドネ種子であるブドウ種子のような種子から、プロアントシアニジンおよび他の有益な栄養補助物質を抽出することが可能になる。ブドウ種子を、約100〜200°F、例えば120〜195°F、例えば130〜190°Fの温度の水を用いて抽出し、次いで、その抽出物を酵素処理し精密ろ過して、抽出物中の不溶性の植物性物質を実質的に除去する。水抽出物は、1〜10μ、例えば1〜5μより大きい物質、特定の例では、1μ、5μ、または10μよりサイズが大きい任意の固体の植物性物質を排除するフィルターを用いてろ過することによって、限外ろ過の前に清澄化する。次いで、精密ろ過した抽出物を、固体含有量が10％未満になるまで、例えば、固体含有量が5〜10％になるまで濃縮して体積を小さくし、同時に、その後の限外ろ過段階の間に限外ろ過フィルターが目詰まりするのを最小限にするのに十分な薄さでそれを維持する。
【００６１】
酵素処理し精密ろ過した抽出物を、次に、第1の透過液および第1の保持液を得るために限外ろ過によってさらに加工処理し、ここで、分子量の比較的大きなポリマーが第1の透過液から除去され、第1の透過液は、少なくとも80％の糖を含む。この第1の限外ろ過段階は、糖/芳香族フェノール画分(A)を生じる。第1の保持液を水で還元し、次いで、3または2.5よりも低い(例えば2〜3または2〜2.4)の平均重合度(mdp)を有するポリフェノールを含む第2の透過液(B)、ならびに食物繊維およびポリフェノールに富む第2の保持液(C)を得るために、限外ろ過によって加工処理して、ここで、第2の保持液(C)中のポリフェノールのmdpは5より大きい(例えば5〜6、例えば5.6)。第1および第2の透過液ならびに第2の保持液のいずれかまたはすべてを濃縮し乾燥して、一般に粉末形態で保存される、保持される最終製品を提供することができる。
【００６２】
特定の例において、酵素処理し精密ろ過した抽出物を、最大分子量カットオフが5kDである限外ろ過膜を用いて最初に加工処理する。例えば、第1の限外ろ過膜の最大分子量カットオフの範囲は1〜5kDである。この範囲に収まるいくつかの例において、第1の限外ろ過膜の最小分子範囲カットオフ(minimum molecular range cutoff)は、1、2、3、または4kDである。この範囲に収まる他の例において、第1の限外ろ過膜の最大分子量カットオフは、2、3、4、または5kDである。1〜5kDという範囲に関係なく、他の例において、第1の限外ろ過膜の最小分子量カットオフは、1、2、3、または4kDであることができ、最大分子量カットオフは、2、3、4、または5kDであることができる。
【００６３】
第1の保持液を水で還元し、500kDの最大分子量カットオフを有する膜を用いる限外ろ過によって、さらに加工処理する。例えば、第2の限外ろ過膜の最大分子量カットオフの範囲は100〜500kDである。この範囲に収まるいくつかの例において、第2の限外ろ過膜の最小分子量カットオフは、100、200、300、または400kDである。この範囲に収まる他の例において、最大分子量カットオフは、200、300、400、または500kDである。100〜500kDという範囲に関係なく、他の例において、最小分子量カットオフは、100、200、300、または400kDであることができ、最大分子量カットオフは、200、300、400、または500kDであることができる。
【００６４】
説明される工程は、ブドウ種子抽出物を、様々な生物学的用途を有する生物学的に適合性のある画分に効率的に分ける。例えば、第1の透過液(画分A)は、80％超の糖、5％未満の脂質、および1〜2％未満のポリフェノールを含んでよく、調味料材料として適切であり得る。例えば、第2の透過液(画分B)は、1％未満の脂質および少なくとも38％のポリフェノールを含んでよく、ここで、ポリフェノールの10％未満が、10個超の単量体単位を含む。いくつかの態様において、第2の透過液(画分B)が含有する総ポリフェノールは70％未満であり、例えば、総ポリフェノールは60％未満または50％未満である。いくつかの例において、画分Bは、38〜50％の間のフェノール類を含む。この態様および他の態様において、抽出物中のポリフェノールは、少なくとも50％、60％、またはさらに70％の単量体、例えば50〜80％の単量体である。画分Bは、血管に関する健康状態、およびしたがって認知に関する健康状態を向上させるために消化管から吸収させるのに特に適している。例えば、第2の保持液(画分C)は、25〜30％の食物繊維、5超のmdpを有する45〜55％のポリフェノール、2〜3％のタンパク質、および1％未満の脂質を含み得る。
【００６５】
いくつかの任意の態様において、限外ろ過の前にヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)を抽出物に添加して、限外ろ過の効率を高める。
【００６６】
画分A、B、およびCの内の任意の1つ、2つ、または3つを含む組成物を作製することができる。この組成物は、食事サプリメントまたは機能性食品として調製することができる。個別の画分は、様々な感覚受容目的または栄養目的に特に適している。例えば、主に糖(フルクトースおよびグルコース)を含む画分Aは、天然調味料として調製または使用することができる。別の例として、mdpが低いプロシアニジンを含む画分Bは、血管に関する健康状態または認知に関する健康状態を向上させるための栄養サプリメント(nutritional supplement)として調製または使用することができる。さらに別の例として、食物繊維およびmdpが高いポリフェノールに富む画分Cを、錠剤または粉末形態のプレバイオティック栄養補助食品として調製または使用することができる。
【００６７】
さらに別の態様において、画分A、B、およびCの任意の組合せまたはすべてを含む栄養サプリメントは、他の栄養物、例えば、ガラナ抽出物、ビタミンB6、ビタミンB12、葉酸塩、ブルーベリー粉末またはブルーベリー抽出物、および生コーヒー豆抽出物の内の1つもしくは複数またはすべてと組み合わせることができる。このような組成物は、血管に関する健康状態および/または認知に関する健康状態を支援するサプリメントとしてこのうえなく適している。特定の態様において、画分Bは、これらの他の栄養物の内の1つまたは複数と組み合わせることができる。他の特定の例において、画分Bは、ガラナ抽出物、ビタミンB6、ビタミンB12、葉酸塩、ブルーベリー粉末またはブルーベリー抽出物、および生コーヒー豆抽出物のすべてと組み合わせることができる。
【００６８】
別の例において、抽出方法は、温水、例えば、100°Fを超えるが水の沸点(212°F)よりは低い、例えば100〜200°Fの範囲、例えば120〜195°F、例えば130〜190°Fの温度まで加熱された水の中でブドウ種子を抽出することによって調製された固体の植物性物質(例えばブドウ種子)の水性混合物を提供する段階を含む。次いで、抽出物を酵素処理して、セルロース、ペクチン、およびタンパク質の含有量を減らす。例えば、精密ろ過する前の粗製抽出物(第1の水抽出物)中で酵素を使用して、食物繊維、セルロース、ペクチン、および/またはタンパク質などの植物性物質中の比較的大きな分子を分解する。これらの分子の分解によって、任意のタイプのミクロン規模のフィルタリング(精密フィルタリング)を用いるろ過および限外ろ過が容易になる。したがって、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、およびセルラーゼが、出発原料の内容物が何を含むかということおよびその工程の最終製品において何が望まれるかということに応じて、個別にまたは組み合わせて使用され得る。例えば、出発原料がタンパク質を含まない場合、プロテアーゼは使用されないはずである。ペクチンが、出発原料中の唯一の大型化合物であり、最終製品中で望ましくない場合、液状のペクチナーゼ調製物、例えば、Rapidase(登録商標)Adex-G (DSM, Centerchem, Inc.)のみが、0.01〜0.1％(体積/体積)の濃度で1〜3時間、添加され得る。
【００６９】
本明細書において開示する工程の例では、食物繊維をいくらか保持するがタンパク質は保持しないことが望ましく、それゆえ、画分C中に最終的に集められる食物繊維のすべてを破壊するとは限らない酵素および量(dose)を選択する。
【００７０】
様々な多くの酵素がこの目的のために使用され得るが、具体的に開示される非限定的な例は、クロコウジカビ(Aspergillus niger)に由来する酵素の混合物を含む、Scott Laboratories (Petaluma, CA)社製のSCOTTZYME KSである。この酵素混合物は、沈降およびろ過を促進するためにジュースと共に使用するのに適しており、0.01〜0.1％(体積/体積)の濃度で8〜16時間、抽出物に添加することができる。次いで、酵素処理した水抽出物を、1〜10μ、より好ましくは1〜5μのフィルターを用いる精密ろ過に供し、固体が10％以下になるまで濃縮する。次いで、濃縮した抽出物を、1〜5kDの範囲の分子量カットオフを有する限外ろ過膜を用いる限外ろ過に供して、糖を含む第1の透過液(画分A)および第1の保持液(限外ろ過を通過しない物質)を産生する。第1の保持液を、固体が10％以下になるまで水で還元し、100〜500kDの範囲の分子量カットオフを有する限外ろ過膜を用いる第2の限外ろ過に供する。次いで、得られた透過液(画分B)および保持液(画分C)を回収し、さらに加工処理、例えば乾燥させることによって粉末を製造してもよい。
【００７１】
別の例において、ろ過されていない最初の水性種子抽出物にHPMCを添加して、最初の液体抽出物のタンニン含有量を減らして限外ろ過の速度を上げる。HPMCを使用する場合、画分AおよびBは、上記の画分AおよびBの説明から変わらないが、画分Cは、より多くの食物繊維(50％を超える、例えば50〜60％)を含み、画分Cのポリフェノール種は、mdpが2.5〜2.9である小型プロシアニジンを主に含む。したがって、食物繊維含有量が多いこの改変された画分Cは、そのプレバイオティック活性に加えて、血液脂質プロファイルに対して、より大きな有益な効果を有すると予想される。
【実施例】
【００７２】
実施例1
抽出方法
抽出工程の具体的な非限定的態様を図1に示す。シャルドネブドウ種子1(生、冷凍、または乾燥)を、室温の飲用水を用いて段階(1)で洗浄する。様々な重量比、例えば2:1〜10:1の比の水とブドウ種子を使用することができるが、例示する例では、5:1の比[重量:重量]の水とブドウ種子を使用し、連続的に混ぜながら15分間、ブドウ種子を洗浄する。この工程を少なくとも2回またはそれ以上、好ましくは3回、最高で4回、繰り返す。いくつかの例において、水、例えば第1の洗浄の水を塩基の添加によって中和して、洗浄液(wash)中にポリフェノールが抽出されるのを減らしつつ、洗浄液中に糖が抽出されるのを促進する。特定の例において、0.1％重炭酸ナトリウムのような重炭酸ナトリウムを水に添加することによって、水を中和する。主に糖、脂質、およびいくつかの有機酸を含む各洗浄液を廃棄する。
【００７３】
次いで、洗浄した種子を段階2の抽出タンクに移し、1〜3時間、例えば2.5時間の間、温水(100〜200°Fまたは130〜190°F)(例えば約130°Fまたは175°F)の中で(5:1の比の水と種子[重量:重量])、2回抽出する。種子の搾りかすを廃棄し、抽出した液体を集め、ろ過して不溶性の植物性物質を除去し(USMESH 270)、次いで、この複合抽出物を貯蔵タンク3に入れ、そこで酵素処理してセルロース、ペクチン、およびタンパク質の含有量を減らして、その後のろ過を容易にする。このような酵素の市販物の例は、SCOTTZYME KS (Scott Laboratories)である。酵素処理は、0.01〜0.1％(体積/体積)の濃度で適用し、12〜24時間、好ましくは16時間、45〜100°F、好ましくは65°F以下で実施する。任意で、酵素処理後、工程は、1グラム/リットルの濃度でヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC;低粘度、医薬品グレード)を添加する段階、および60〜80°F、好ましくは65°Fで1時間混合する段階を含んでよい。酵素処理(および任意でHPMC添加)に続いて、ろ過/分離装置4(例えば、Nozzle Separator HFC 15-01-177、GEA Wesphalia Groupのような設備)において精密ろ過(1〜10μフィルター、好ましくは1〜5μ)を用いて液体抽出物を清澄化し、その清澄化された抽出物を、固体が5〜10％、好ましくは固体が10％未満になるように濃縮する。
【００７４】
次いで、濃縮した抽出物を限外ろ過5(ポリエーテルスルホン膜システム、例えばSUPER-COR UFシステムシリーズ(Koch Industries)のような5000ダルトン(または5kD)以下の標準的な名目上分子量カットオフの限外ろ過膜を用いる)に供する。限外ろ過段階5によって透過液6が得られ、これは画分Aである。画分Aは、分子量が5000ダルトン(5kD)未満の化合物からなり、主にフルクトースおよびグルコースからなる80％以上(典型的には80〜95％の範囲、例えば90〜95％)の糖、9〜10％の水、5％未満の脂質、5％未満のミネラル、および1％未満のフェノール化合物を含む;これらのフェノール化合物は、極微量の複数の芳香性/調味分子、例えばテルペンおよびビニルフェノール化合物を含む。画分Aは、バー、ゲル、および「グミ(gummies)」の形態の食用栄養サプリメントの天然調味料として、各組成物の5〜20％という標準量で利用されている。
【００７５】
低分子量限外ろ過から残存する保持液(限外ろ過膜を通過しない物質)を水で還元して固体濃度を5〜10％、好ましくは固体を10％以下にし、ポリエーテルスルホン膜システム、例えばSUPER-COR UFシステムシリーズ(Koch Industries)のような100〜500kDカットオフ(例えば100kDカットオフ)の限外ろ過膜を用いる第2の限外ろ過工程7に供する(ただし、他の膜システムも使用され得る)。結果として生じる透過液8、すなわち画分B、および保持液9、すなわち画分Cを、凍結乾燥または放射ゾーン(radiant zone)乾燥などの従来の方法によって段階10で乾燥し、粉砕して粉末を得る。
【００７６】
画分Bの粉末は、主にポリフェノール(少なくともまたは約38％のポリフェノール)、具体的には、フラバノール、例えば、単量体のカテキンおよびエピカテキンならびに小型オリゴマーのプロシアニジン(10個未満の単位を含む)からなる。分子量が500,000ダルトンまでの分子は限外ろ過膜を透過することができるが、画分B中のプロシアニジン種の90％超はポリマー10単位以下で、主に単量体、二量体、および三量体からなり、平均重合度(mdp)の値が2〜2.4となることが予想外に判明した。画分Bはまた、少量の食物繊維(9〜12％)、糖(25〜30％)、タンパク質(1〜2％)、脂質(<1％)、および極微量のミネラル、例えば、カルシウムおよびマグネシウムも含む。血管に関する健康状態に対する単量体および低分子量のプロシアニジンの報告されている効果ならびにフラボノールの抗酸化能力に基づいて、画分Bには多岐にわたる用途が存在する。この画分は、1回分当たり50mg〜2グラムの用量で健康な血液循環を促進するか、または抗酸化的保護を提供するように設計された、あらゆる形態の栄養サプリメントに添加されてよい。
【００７７】
画分Cの粉末(第2の限外ろ過の保持液)は、食物繊維(26〜30％)およびポリフェノール(45〜55％)の両方に極めて富む。しかし、画分Bとは対照的に、ポリフェノール画分は、mdp値が5より大きい、例えば5〜10、および具体的には5.6である高分子量のプロシアニジンおよびタンニンから主になっている。画分Cはまた、少量の糖(<1％)、タンパク質(2〜3％)、脂質(<1％)、およびミネラル(極微量)も含む。画分Cは、1回分当たり2〜20グラムの範囲の用量で、錠剤または粉末形態のプレバイオティック栄養補助食品として働くか、または機能性食品の栄養価を高めるのに、このうえなく適している。
【００７８】
HPMCを任意で使用すると、最初の液体抽出物のタンニン含有量が減り、それによって限外ろ過の速度が速まる(facilitating)。この場合、画分AおよびBの組成は、前述したものと本質的に同一のままである。しかしここで、画分Cは、主に食物繊維(50〜60％)からなり、ポリフェノール種は、mdpが2.5〜2.9である小型プロシアニジンから主になる。1回分当たり2〜20グラムの量で栄養補助食品および/または機能性食品中で使用すると、プレバイオティック活性が与えられると思われる：食物繊維含有量の増加により、血液脂質プロファイルが改善されると予想される。
【００７９】
画分A、B、およびCは、別々に使用された場合に異なる栄養補助機能を果たすのに、このうえなく適している。それでもなお、いくつかの用途では、これらの画分の内の2つまたは3つの組合せを使用する場合がある。例えば、エネルギーバーまたは食物繊維バーのような機能性食品は、食物繊維を提供するための画分Cおよび調味を実現するための画分Aの両方を含み得る。
【００８０】
実施例2
解析結果
まるごとのシャルドネ種子(典型的には、生のブドウ種子は、40〜50％の水を含む)ならびに画分A、B、およびC(最大カットオフが1回目は5kDおよび2回目の限外ろ過膜については500kDである限外ろ過膜を用いて実施例1で説明したように産生した)の栄養物含有量およびポリフェノール(没食子酸等価物[GAE])を、フォリン-チオカルト改良法によって解析した(Singleton and Rossi, Am J Enol Vitic 16:144-158, 1965)。表1に示すように、画分Aは、ほぼすべてが糖であり、その90％はフルクトースおよびグルコースである。画分Bは、少量の食物繊維に加えて、単量体および二量体のフラバノール(下記の表2および3を参照されたい)などの低分子量ポリフェノールから主になる。画分Cは、下記の表2および3に説明するフラバノールオリゴマーおよびポリマー(タンニン)からなり、食物繊維含有量が高くなっている。重要なことには、画分BおよびCは、極めて低レベルの脂質(<1％)を含むのに対し、表3に示す市販のブドウ種子抽出物の脂質平均値は2.3％であった。画分BおよびC中の脂質が低レベルであることにより、カプセル形態(かさ高く、飲み込みにくい)またはソフトゲル形態(製造費用が高い)での送達を必要とする他の市販抽出物とは違って、錠剤の剤形が可能になる。
【００８１】
（表１）シャルドネブドウ種子ならびに抽出画分A、B、およびCの栄養構成要素(％、乾量基準)
2020043863.tif 000006
【００８２】
表2は、チオ開裂およびゲル浸透クロマトグラフィーによって測定した、画分BおよびC中の低分子量(単量体、二量体など)フラバノール種および高分子量(>10単位)フラバノール種の分布を示す(Gu et al., J Agric Food Chem 50:4852-4860, 2002; Hammerstone et al., J Agric Food Chem 47:490-496, 1999)。画分Bは、50％超の単量体、例えば、60％または70％超の単量体を含む。いくつかの例において、画分Bは、70〜80％の単量体を含む。画分Bはまた、5％または6％超の二量体、例えば5〜7％の二量体、例えば6.5％の二量体も含む。高分子量のろ過膜(100〜500kD)の結果として、画分B中の単量体種が高濃度であることは予想されていない。重合度(dp)が極めて低いフラバノールのみが小腸で吸収され(Del Rio et al., Antioxid Redox Signal 18:1818-1892, 2013)、したがって、画分Bが、内皮機能または血流中へのフラボノールの吸収を必要とする他の作用を強化するような生理学的効果を有するための全身吸収に適切であると思われる。低分子量フラバノール種(低mdp)のこの濃度は、高分子量および低分子量のフラバノール種の両方を含むまるごとのブドウ種子のものとはかなり異なる(表3)。さらに、画分Bは、市販用ブドウ種子抽出物と比べて勝っている(表3)。高分子量フラバノール種を含む画分Cは、この画分中の同じく容易に発酵させられる食物繊維と共に、結腸のミクロフローラによって代謝されることができる;したがって、画分Cは、大腸にプレバイオティック効果を届けるのにこのうえなく適している。
【００８３】
（表２）画分BおよびCのフラバノール組成(フラバノール総量に対する比率(％))
2020043863.tif 000007
【００８４】
表3では、まるごとの乾燥シャルドネブドウ種子、HPMC処理ありおよびなしの画分Bおよび画分C、ならびに様々な市販のブドウ種子製品のフェノールの属性を要約している。mdpおよびフェノールの総含有量の解析は、前述したようにして実施した。画分Bの平均dp値は2.3と非常に小さく、これは、主に単量体フラバノールおよび二量体フラバノールからそれがなることと一致している。画分Bは、他の市販用ブドウ種子抽出物と比べて非常に優れており、実際に、画分Bの平均dp値は、試験したあらゆる市販試料のなかで最も小さい。したがって、ブドウ種子からのポリフェノール抽出を最大にし、さらに吸着方法を用いて高フェノール含有量(>70％)に標準化されたブドウ種子抽出物を生じさせようとする既存の産業的方法は、フラボノールのサイズ分布を10dp未満に限定する能力を犠牲にし得る可能性がある。画分Cのdp値は、まるごとのシャルドネ種子または市販用シャルドネ種子粉末のdp値よりわずかに低いにすぎず、これは、高分子量のフラボノールが、この画分中のフェノール化合物の大半を構成していることを反映している。任意のHPMC処理によって、画分Bのmdp値は変化しなかったのに対し、画分Cのmdp値はかなり低くなった。HPMC処理は、シャルドネ種子を構成する高分子量フラバノールおよびタンニンをかなりの量、除去するように見受けられる。表3に示すように、画分Bおよび画分Cは、他の市販用ブドウ種子抽出物と比べて脂質含有量がかなり少なく、そのおかげで、錠剤の剤形に適するようになっている。既存の商業的抽出工程において溶媒を使用することにより、出発原料からの脂質の抽出を増加させることが可能である;表3に示すように、ブドウ種子は、かなりの脂質部分(fraction)を含む。
【００８５】
シャルドネ種子それ自体は単量体の含有量が多いが、多くの従来の工程がサイズ選択性を欠いている原因は、それらの方法が、高熱またはエタノールのような溶媒のような苛酷な条件を用いて、種子からの全ポリフェノール/フラバノール内容物の抽出を最大にしようと試みることにある。これらの条件は抽出物のdpの選択性を低めるだけでなく、抽出物はまた、かなりの量の大型プロシアニジンおよびタンニンを有する。刺激性で時には毒性である溶媒の使用もまた、これらの従来の方法の不都合な点である。本明細書において開示する新しい抽出方法は、鉱酸および/またはアルコール(例えばエタノール)を実質的に含まない、純水のような水性溶媒中で、水の沸点より低い温度で実施され、吸着性樹脂も、抽出物の酸性化も、必要としない。また、工程は、大気圧または雰囲気圧下で、例えば、抽出のために大気圧または雰囲気圧より低いまたは高い圧力まで容器に加圧することなく実施することができる。本発明で開示するろ過工程の例は、70％未満のフェノール、例えば、60％または50％未満のフェノール(例えばポリフェノール)を有するシャルドネ種子抽出物を与えるが、これは、mdpの小さい画分を選択的に抽出する。
【００８６】
（表３）ブドウ種子製品の平均重合度(mdp)、フェノール総含有量、および脂質含有量(乾量基準)
2020043863.tif 000008
【００８７】
実施例3
洗浄段階
本実施例は、限外ろ過の前の種子洗浄がポリフェノール収量に与える有益な効果を例示する。種子洗浄は、低い抽出温度でのフェノール回収を改善することが示されているが、洗浄段階は、実施例1に開示した方法の不可欠な構成要素ではない。そうではなく、洗浄段階は、実施例1で別々に説明した分離方法に付加的な利益を与え、したがって、洗浄段階は、本方法の必要条件とみなされるべきではない。
【００８８】
開示される抽出工程の最も重要な目標は、様々な用途で使用するためにブドウ種子の様々な構成成分を分離することを目指しているが、(重量およびポリフェノールの両方の)収穫効率を高めることは、商業的実現性を良くするのに役立つ。前述したように、既存の工程は、抽出収量を最大にするために刺激性の溶媒および/または高い抽出温度をしばしば含むが、これらの条件は、様々な理由から望ましくない。特にブドウ種子のフラバノール組成に関して、高温は、それらの重合を促進する。したがって、高温で抽出すると、単量体および二量体の含有量が減り、得られる抽出物の平均重合度が大きくなる。
【００８９】
方法の初期の段階(図1の段階5より前)の相対的効率を測定するために、抽出温度および室温の水で種子を洗浄する段階の有無(図1の段階1)以外は実施例1と同一の抽出条件にシャルドネブドウ種子を供した。表4に示すように、低温(130°F)の場合と比べて、高温(180°F)で抽出した生のまるごとの未洗浄シャルドネ種子は、得られる抽出物の抽出率(11.39％に対して12.81％)、フェノール回収率(70.80％に対して91.07％)がより良好で、フェノール含有量がより多かった(39.65％に対して51％)。さらに、低温での抽出前にブドウ種子を乾燥させる段階によって、得られる抽出物の抽出率(12.49％まで)およびフェノール含有量(47.21％まで)が向上したが、フェノール回収率は、高い抽出温度を用いて得られたものと比べて比較的低い(84.30％)ままであった。
【００９０】
驚くべきことに、洗浄した生のブドウ種子を低温(130°F)で抽出すると、高温での抽出によってもたらされたのと本質的に同一の、抽出物の抽出率、フェノール回収率、およびフェノール含有量がもたらされた。したがって、抽出および限外ろ過の前に洗浄段階を追加することにより、驚くべきことに、抽出温度を上げた人為的結果としてのフラバノール重合の可能性を上昇させることなく、抽出効率が上がる。洗浄手順によって除去される種子原料はかなりの量であり(種子重量のおよそ3.5％で、驚くべきことに、最高で、糖および脂質の両方の含有量の50％)、ブドウ種子の望ましくない構成成分(主に糖、脂質、および有機酸)に相当する。理論に拘泥するものではないが、これらの種子構成成分を穏やかな洗浄によって除去することにより、低温でのフェノール回収を促進することが可能である。
【００９１】
（表４）異なる温度ならびに洗浄段階がある場合およびない場合の抽出効率
2020043863.tif 000009
【００９２】
実施例4
組合せ組成物
画分Bのmdp値が予想外に低いことから、画分Bが、内皮機能に有益な効果を与えるために、したがって、健康な血液循環を支援するために、非常に適していることが示唆される;ブドウ種子抽出物の効果に関する文献に基づくと(Vislocky and Fernandez, Nutr Rev 68:656-670, 2010)、内皮機能を向上させるのに必要な画分Bの量は、50〜2000mgの範囲である。脳に関する健康状態を維持するにあたっての心血管系の不可欠な役割は周知である;数兆個のシナプスで起こる複雑な活動パターンおよび構造変化は、並外れた代謝要求を引き起こす。実際，脳は我々の体重の2％しか占めないが、身体の血流、酸素、および循環血中栄養物の20〜25％を受け取る(Nichols et al., From Neuron to Brain, 2011; Kalaria, Nutr Rev 68:S74-S87, 2010)。ほんの数分の酸素欠乏でさえ、神経細胞の損傷および/または死をもたらす場合があり、長期の血管不全が認知低下に関連していることは周知である(Kalaria, Nutr Rev 68:S74-S87, 2010; Marshall and Lazar, Stroke 42:221-226, 2011)。したがって、健康な血液循環は、その瞬間その瞬間での最適な認知を維持するために決定的に重要であり、さらに、新しいシナプスを作るには、酸素および栄養物を十分に供給するために新しい血管を形成すること(血管新生)が必要である。それゆえ、画分Bは、認知に関する健康状態を支援または維持するように設計された栄養補助食品の成分としても使用され得る。例えば、画分Bは、後述するような、脳に関する健康状態および認知の様々な面に影響を及ぼすことが実証されている他の天然成分と組み合わせられてよい。
【００９３】
カエデ科の植物であるガラナ(パウリニア・クパナ)は、中央アマゾン原産であり、その種子から製造された茶として伝統的に使用されてきた長い歴史がある。カフェイン、テオブロミン、サポニン、タンニン、およびカテキン単量体(最も顕著には、カテキンおよびエピカテキン)を含む、多数の有効成分が、ガラナ中に存在する。健康な若年成人でのいくつかの二重盲検プラセボ対照クロスオーバー臨床試験により、ガラナ抽出物(35〜300mg)を飲食すると、少なくとも6時間にわたって、記憶力、注意力、認識速度、集中(focus)、用心深さ、精神的鋭敏さ、および気分が改善されたことが実証されている(Haskell et al., J Psychopharm 21:65-70, 2007; Kennedy et al., Pharmacol Biochem Behav 79:410-411, 2004; Kennedy et al., Appetite 50:506-513, 2008; Scholey et al., Nutrients 5:3589-3604, 2013)。これらの効果は、カフェイン含有量に起因する見込みは少なく、実際、より多くのカフェインを含む高用量のガラナ抽出物は、認知パフォーマンスを向上させる効果が低いことが判明した(Haskell et al., J Psychopharm 21:65-70, 2007)。前臨床試験もまた、ガラナの記憶パフォーマンスを向上させる特性および不安を軽減する特性の証拠を提供している(Roncon et al., Planta Med 77:236-241, 2011; Espinola et al., J Ethnopharmacol 55:223-229, 1997)。
【００９４】
認知に関する健康状態を維持するにあたってのビタミンB群の不可欠な役割は明白であり、ビタミンB欠乏症は、いくつかの神経障害に関連付けられており、おそらくはそれらの原因である(Selhub et al., Nutr Rev 68:S112-S118, 2010)。ビタミンB群のB6、B12、および葉酸塩は、神経伝達物質、リン脂質(phopholipid)、およびミエリンなどの極めて重要な脳構成要素の合成に不可欠である一炭素代謝に関与する酵素の補助因子および/または基質である。最近、これらのビタミンBが、軽度の認知機能障害を有する高齢者集団におけるプラセボ対照試験で試験され(de Jager et al., Int J Geriatr Psychiatry DOI:10.1002/gps.2758; Smith et al., PLoS ONE 5(9): e12244. doi:10.1371/journal.pone.0012244, 2010)、脳の構造と認知機能の両方の加齢に関連する減退を顕著に和らげることが示された;2年の期間にわたって、脳体積の収縮が30％減少しただけでなく、実行系認知(executive cognition)もまた、安定した。ベースラインで、試験集団全体は、循環血中ホモシステインが正常レベルである対象を含んだ。しかし、ベースラインにおいてホモシステインの血漿レベルが高い対象において、より多くの利益が観察された。ビタミンB6、B12、および葉酸は、各自のRDAから各自の上限より10％少ない量までの範囲の用量で有益と思われる(Bowman et al., Neurology 78:241-249, 2012)。いくつかの例において、ビタミンB6は、1.5〜90mg(例えば、10、20、または30mg)の用量で存在してよく、ビタミンB12は、2.4〜1000mcg(例えば、400、550、700、または800mcg)の用量で存在してよく、葉酸塩または葉酸は、400〜900mcg(例えば、550、700、または800mcg)の用量で存在してよい。
【００９５】
ブルーベリーは、エピカテキン、クロロゲン酸、およびプテロスチルベンを含む;これらのポリフェノールは、生物が利用可能であり、実験室での研究で、エピカテキンおよびプテロスチルベンが血液脳関門を通過することが実証されている(Williams and Spencer, Free Radic Biol Med 52:35-45, 2012; Joseph et al., J Agric Food Chem 56:10544-10551, 2008)。実験室での研究において、ブルーベリー抽出物は、新しい神経細胞の形成に関与している神経単位成長因子および生化学的シグナルの生成を刺激し、海馬中の神経細胞の数を増加させ(Casadesus et al., Nutr Neurosci 7:309-316, 2004)、かつ神経細胞間の情報交換のために使用される生化学的シグナルのレベルを上昇させた(Williams et al., Free Rad Biol Med 45:295-305, 2008)。これらの研究に基づくと、ブルーベリー粉末またはブルーベリー抽出物は、10mg〜1グラムの範囲の用量で有益であると思われる。
【００９６】
生コーヒー豆抽出物は、生物が利用可能なクロロゲン酸を含み(Farah et al., J Nutr. 138:2309-2315, 2008)、クロロゲン酸は、実験室での研究において、神経細胞の成長および発達を刺激し、神経伝達物質を分解する酵素の活性を阻害し、かつ神経細胞を酸化ストレスから保護することが示されている(Ito et al., Biosci Biotechnol Biochem 72:885-888, 2008; Kwon et al., Eur J Pharmacol 649:210-217, 2010)。これらの研究から、生コーヒー豆抽出物は、15mg〜500mgの用量で有益であると思われる。
【００９７】
新規に開示する抽出工程によって製造される産物は、抗酸化剤として、ならびに心血管および認知に関する健康状態を促進するために、食品、飲料、および栄養補助食品中で使用されてよい。これらの抽出物の抗酸化特性は、幅広い用途の全般で有益である。したがって、本発明が開示する工程のポリフェノール産物を含む食品、飲料、食事サプリメント、栄養補助食品、および化粧品が、製造され得る。液体または粉末形態のシャルドネブドウ種子抽出物は、食料製品、飲料、化粧品、および食事サプリメント中で着色料として使用され得る。
【００９８】
いくつかの例において、組成物中の天然物、栄養物、または添加物のいずれかの濃度は、0〜10％の範囲、例えば、0.04〜45％の範囲、例えば、5〜25％の範囲である。
【００９９】
十分な量のシャルドネ種子抽出物(画分B)、ガラナ抽出物、ビタミンB6、ビタミンB12、葉酸塩、ブルーベリー粉末/抽出物、および生コーヒー豆抽出物を含む単位剤形のような組成物の例は、認識および脳に関する健康状態を促進するのに有用であると思われる。
【０１００】
実施例5
組成物、製剤、および包装
ブドウ種子抽出物および組成物は、例えば、食事サプリメント剤形(例えば、錠剤またはカプセル剤)、液体(例えば、飲料またはゲル)、および飲食可能な製品(例えば、食品または液体と混合される粉末)の形態の栄養補助食品を製造するために、薬学的に許容される担体に配合することができる。このような組成物のための製剤は、当技術分野において周知である。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition, 1995では、開示する組成物の送達に適した例示的製剤(およびそれらの構成成分)を説明している。いくつかの例において、これらの組成物はまた、ガラナ抽出物、ビタミンB6、ビタミンB12、葉酸塩、ブルーベリー粉末/抽出物、および生コーヒー豆抽出物などの付加的な作用物質も含む。これらの化合物の内の少なくとも1つを含む組成物を、ヒトまたは動物用の医薬品中で使用するために製剤化することができる。開示する薬学的組成物の具体的な製剤は、例えば、投与様式(例えば、経口、局所、もしくは非経口)および/または治療しようとする病態に応じて変わり得る。いくつかの態様において、製剤は、少なくとも1つの有効成分に加えて、薬学的に許容される担体を含む。
【０１０１】
通常、非経口製剤は、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、またはグリセロールなどの薬学的かつ生理学的に許容される液体をビヒクルとして含む注射用液体を含む。固形組成物、例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態の場合、従来の非毒性固形担体には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中性な担体のほかに、投与される薬学的組成物は、少量の非毒性補助物質または賦形剤、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびpH緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウラートも任意で含んでよい。他の非限定的な賦形剤には、クレモフォールのような非イオン性可溶化剤またはヒト血清アルブミンのようなタンパク質が含まれる。
【０１０２】
組成物は、任意でいくつかの形態で使用される。例えば、組成物は、小さな容器から、希釈形態で大きな容器から、または茶さじの用量として、そのまま飲める溶液であることができる。しかし、いくつかの例において、組成物は、使用者が水と混ぜるか、または食品もしくは飲料中に混ぜることを可能にする濃縮物として提供され得る。あるいは、それは、舌下スプレーの形態で、または使用者が必要に応じて溶液に混合する粉末形態で提供され得るか、食品基質(food substrate)に直接添加されるか、または直接、経口摂取される。別の例において、組成物は、ティーバッグおよび/またはコーヒーポッドのもののように、お湯に浸す(brewing)のに適したガーゼの袋の中に含まれる。あるいは、製剤は、小袋、例えば、1回分または複数回分を含む簡単に破って開けられる柔軟なミニ小袋の中に乾燥粉末として含まれる。
【０１０３】
製剤の包装は、固体、液体、乳濁液、または懸濁液などを入れることができる任意の包装または容器、例えば、缶、瓶、小袋、ガーゼの袋、または小さい包みであってよい。任意で、包装は、大量の製品、複数回分、または単一用量のためのものである。別の例において、組成物は、スプレーボトル、例えば舌下スプレー送達ボトルのような瓶に入れた、または片端が次第に細くなっているスポイトが付いた瓶に入れた、液状形態で提供される。さらに別の態様は、本明細書において説明する栄養構成要素のいずれかの任意の組合せおよび/または並べ換え(permutation)を含む。
【０１０４】
開示される本発明の原理を適用することができる多くの考え得る態様に鑑みて、例示される態様は、本発明の好ましい例にすぎず、本発明の範囲を限定するものとしてみなすべきではないことが、認識されるべきである。正しくは、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および精神に収まるすべてを本発明者らの発明として主張する。
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月12日(2019.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シャルドネ種子抽出物を含み、該抽出物のフラバノールが3未満の平均重合度(mdp)を有し、総ポリフェノールが70％未満である、組成物。
【請求項２】
シャルドネ種子抽出物中のフラバノールが、50％超の単量体フラバノールである、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
シャルドネ種子抽出物が、1％未満の脂質を含む、請求項1または2記載の組成物。
【請求項４】
シャルドネ種子抽出物が、38〜50％のポリフェノール、9〜12％の食物繊維、1〜2％のタンパク質、1％未満の脂質、および25〜30％の糖を含む、請求項3記載の組成物。
【請求項５】
45〜55％のポリフェノール、26〜30％の食物繊維、および1％未満の脂質を含む、シャルドネ種子抽出物を含む組成物。
【請求項６】
シャルドネ種子抽出物が、2〜3％のタンパク質および1％未満の糖をさらに含む、請求項5記載の組成物。
【請求項７】
1％未満のポリフェノール、1％未満のタンパク質、3％未満の脂質、および90〜95％の糖を含む、シャルドネ種子抽出物を含む組成物。
【請求項８】
請求項1、5、および7記載の異なる組成物の内の2つまたは3つの組合せを含む組成物。
【請求項９】
以下の画分B、またはCの内の1つを含む、シャルドネ種子の水抽出物：
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。
【請求項１０】
画分Bのみを含む、請求項9記載の抽出物。
【請求項１１】
水のみを用いて抽出され、70％未満のポリフェノールを有する、請求項10記載の抽出物。
【請求項１２】
限外ろ過にさらに供され、1％未満の脂質含有量を有する、請求項11記載の抽出物。
【請求項１３】
1％未満の脂質含有量を有し、3未満の平均重合度(mdp)を有するフラバノールをさらに含む、請求項11記載の抽出物。
【請求項１４】
2.5未満のmdpを有する、請求項13記載の抽出物。
【請求項１５】
請求項1〜14のいずれか一項記載のシャルドネ種子抽出物を含む、栄養組成物。