(57)【要約】【課題】形質転換効率が向上した偏性嫌気性酢酸生成微生物を提供する。【解決手段】ホスホロチオエート化ＤＮＡ特異的な制限修飾系で作用する第一の制限酵素の活性が欠失又は抑制されている、改変された偏性嫌気性酢酸生成微生物が提供される。好ましくは、ｄｐｔＦ遺伝子の発現が欠失又は抑制されることにより前記第一の制限酵素の活性が欠失又は抑制されている。前記偏性嫌気性酢酸生成微生物はClostridium属細菌又はMoorella属細菌であることが好ましく、Clostridium ljungdahliiであることが特に好ましい。【選択図】図１
2020043824.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホロチオエート化ＤＮＡ特異的な制限修飾系で作用する第一の制限酵素の活性が欠失又は抑制されている、改変された偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項２】
ｄｐｔＦ遺伝子の発現が欠失又は抑制されることにより前記第一の制限酵素の活性が欠失又は抑制されている、請求項１に記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項３】
ｄｐｔＦ遺伝子が改変されることにより前記ｄｐｔＦ遺伝子の発現が欠失又は抑制されている、請求項２に記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項４】
ｄｐｔＦ遺伝子の一部又は全部が欠失している、請求項３に記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項５】
前記第一の制限酵素の活性が欠失している、請求項１〜４のいずれかに記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項６】
さらに、Ｉ型制限修飾系酵素を構成する第二の制限酵素の活性が欠失又は抑制されている、請求項１〜５のいずれかに記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項７】
一酸化炭素又は二酸化炭素を唯一の炭素源として増殖可能である、請求項１〜６のいずれかに記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項８】
一酸化炭素脱水素酵素を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項９】
メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する、請求項１〜８のいずれかに記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項１０】
細菌である、請求項１〜９のいずれかに記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項１１】
Clostridium属細菌又はMoorella属細菌である、請求項１０に記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項１２】
Clostridium ljungdahliiである、請求項１１に記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物に、目的タンパク質をコードする外来遺伝子が導入され、当該目的タンパク質を発現可能である、組換え微生物。
【請求項１４】
前記外来遺伝子がゲノムに組み込まれている、請求項１３に記載の組換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は偏性嫌気性酢酸生成微生物、並びに、組換え微生物に関する。本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物は、外来遺伝子による形質転換効率が高いものである。
【背景技術】
【０００２】
偏性嫌気性酢酸生成微生物は、古くからブタノール、アセトンなどの発酵生産に用いられている。特に、Clostridium属細菌は、リグノセルロース系バイオマスや合成ガスを利用した、バイオエタノール生産や酢酸、乳酸などの有機酸の生産などに利用されている。Clostridium属細菌は医療分野への用途も期待されている。
【０００３】
Clostridium属細菌等の偏性嫌気性酢酸生成微生物を宿主とした組換え微生物は、有用物質の生産能力の向上等を図るうえで有用である。しかし、一般にClostridium属細菌の形質転換効率は極めて低いため、所望の組換え微生物を得るのが難しく、当該技術分野における開発を妨げる主要因となっている。
【０００４】
一般に、微生物は、ウイルスやファージなどの外来ＤＮＡから自己を守るために制限修飾系を発達させている。ＤＮＡのメチル化は、最もよく知られたＤＮＡ修飾システムである。メチル化による制限修飾系は、分子構造、配列、コファクターの要求性などから４種類（ＴｙｐｅＩ〜ＴｙｐｅＩＶ）に分類され、それぞれ、ＤＮＡを切断する制限酵素とＤＮＡをメチル化する修飾酵素から構成される。修飾酵素の活性により、メチル化修飾を受けたＤＮＡは制限酵素による切断から守られ、微生物自身のゲノムＤＮＡが切断されることはない。微生物は、このメチル化修飾により自身のＤＮＡとウイルスなどの外来ＤＮＡとを見分け、制限酵素で外来ＤＮＡを切断することにより、自己を守っている。
【０００５】
細菌において、ＴｙｐｅＩＩ制限修飾酵素（メチルトランスフェラーゼ）を利用した形質転換効率の向上について検討された例がある（特許文献１）。また、ＴｙｐｅＩ制限酵素系を利用した形質転換効率の向上について検討された例がある（特許文献２）。
【０００６】
一方、メチル化とは異なるＤＮＡ修飾様式として、ＤＮＡのリン酸骨格へのホスホロチオエート化修飾が存在する（非特許文献１）。ホスホロチオエート化特異的な制限修飾系では、ホスホロチオエート化されたＤＮＡは制限酵素による切断から守られ、ホスホロチオエート化されていないＤＮＡ（非修飾ＤＮＡ）は制限酵素による切断を受ける。ホスホロチオエート化修飾に関連する因子として、ｄｎｄＡ、ｄｎｄＢ，ｄｎｄＣ、ｄｎｄＤ、及びｄｎｄＥの５種から成る遺伝子クラスターが知られている。この遺伝子クラスターは、分類学的には離れた位置に存在する細菌とアーキアに共通して発見されている。さらに、いくつかの種のゲノム上では、ｄｎｄＢ、ｄｎｄＣ、ｄｎｄＤ、ｄｎｄＥの近傍にｄｐｔＦ、ｄｐｔＧ、ｄｐｔＨ（ｄｎｄＦ、ｄｎｄＧ、ｄｎｄＨと同義）の各遺伝子から成る遺伝子クラスターが確認されている。ホスホロチオエート化特異的な制限修飾系における制限酵素活性（非修飾ＤＮＡを切断する活性）の発現には、ｄｐｔＦ遺伝子、ｄｐｔＧ遺伝子、及びｄｐｔＨ遺伝子が必須とされている（非特許文献１）。
【０００７】
上記のように、近年、ホスホロチオエート化は既知のＴｙｐｅＩ〜ＴｙｐｅＩＶの制限修飾系とは全く異なる新規のＤＮＡ修飾、制限酵素反応機構として、注目が集まっている。非特許文献１には、サルモネラ菌において、宿主特異的なホスホロチオエート化修飾がなされたＤＮＡと修飾されていないＤＮＡの導入効率を比較すると、１００倍近く変動したことが記載されている。ホスホロチオエート化は宿主の遺伝子導入効率に大きく影響を与えていると考えられるが、詳細な機構は明らかになっておらず、特に、Clostridium属細菌等の合成ガス資化菌において、ホスホロチオエート化特異的な制限修飾系の改変、特に制限酵素の欠失により形質転換効率が向上したという報告は見当たらない。
【０００８】
ところで、Clostridium属細菌の中でも、特にClostridium ljungdahliiに対する期待が大きい。Clostridium ljungdahliiは、ゲノム情報が公開されている点、培養が容易である点、さらに合成ガス（Synthesis gas, Syngas）を資化できる点などの利点を有する。
【０００９】
合成ガスは、廃棄物、天然ガス、及び石炭から高温・高圧下で金属触媒の作用によって効率よく得られる、一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素を主成分とする混合ガスである。一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素を含む合成ガスは、廃棄物由来の合成ガスや工場排ガス、天然ガス、または石炭由来の合成ガスとして、ほぼ永久的に生産されており、かつ利用可能である。このことから、合成ガス資化能を有する微生物を利用した、恒久的な物質生産法の確立が期待されている。組換え微生物を用いることで、目的物質の生産性向上が期待されるが、組換え体である合成ガス資化性微生物の利用に関する報告は極めて少ない。これは、上述の通り、Clostridium属細菌における形質転換効率が低く、所望の組換え体を取得しにくいことが主要因と考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２０１５−５１５２６８号公報
【特許文献２】国際公開第２０１８／０７０１４１号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Tiegang Xu et al.，Nucleic Acids Research，2010，vol.38，No.20 7133-7141
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記現状に鑑み、本発明は、形質転換効率が向上したClostridium属細菌等の偏性嫌気性酢酸生成微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記した課題を解決するための本発明の１つの様相は、ホスホロチオエート化ＤＮＡ特異的な制限修飾系で作用する第一の制限酵素の活性が欠失又は抑制されている、改変された偏性嫌気性酢酸生成微生物である。
【００１４】
本様相は改変された偏性嫌気性酢酸生成微生物に係るものである。本様相の偏性嫌気性酢酸生成微生物では、ホスホロチオエート化ＤＮＡ特異的な制限修飾系で作用する制限酵素の活性が欠失又は抑制されている。そのため、ホスホロチオエート化特異的な制限修飾系の機能が失われているか、低下している。本様相の偏性嫌気性酢酸生成微生物は外来ＤＮＡに対する分解性（切断性）が寛容であるので、宿主として用いた場合の形質転換効率が高い。本様相の偏性嫌気性酢酸生成微生物を用いることにより、偏性嫌気性酢酸生成微生物の組換え体を高効率で得ることができる。
【００１５】
好ましくは、ｄｐｔＦ遺伝子の発現が欠失又は抑制されることにより前記第一の制限酵素の活性が欠失又は抑制されている。
【００１６】
前述のとおり、ホスホロチオエート化特異的な制限修飾系における制限酵素活性の発現には、ｄｐｔＦ遺伝子、ｄｐｔＧ遺伝子、及びｄｐｔＨ遺伝子が必須とされている。本様相は、ｄｐｔＦ遺伝子の発現が欠失又は抑制されることにより前記制限酵素の活性が欠失又は抑制されるものである。
【００１７】
好ましくは、ｄｐｔＦ遺伝子が改変されることにより前記ｄｐｔＦ遺伝子の発現が欠失又は抑制されている。
【００１８】
好ましくは、ｄｐｔＦ遺伝子の一部又は全部が欠失している。
【００１９】
好ましくは、前記第一の制限酵素の活性が欠失している。
【００２０】
好ましくは、さらに、Ｉ型制限修飾系酵素を構成する第二の制限酵素の活性が欠失又は抑制されている。
【００２１】
本様相では、ホスホロチオエート化ＤＮＡ特異的な制限修飾系に加えて、Ｉ型制限修飾系を構成する制限酵素の活性が欠失又は抑制されている。かかる構成により、偏性嫌気性酢酸生成微生物の組換え体をより高効率で得ることができる。
【００２２】
好ましくは、前記偏性嫌気性酢酸生成微生物が一酸化炭素又は二酸化炭素を唯一の炭素源として増殖可能である。
【００２３】
好ましくは、前記偏性嫌気性酢酸生成微生物が一酸化炭素脱水素酵素を有する。
【００２４】
好ましくは、前記偏性嫌気性酢酸生成微生物がメチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する。
【００２５】
好ましくは、前記偏性嫌気性酢酸生成微生物が細菌である。
【００２６】
好ましくは、前記偏性嫌気性酢酸生成微生物がClostridium属細菌又はMoorella属細菌である。
【００２７】
好ましくは、前記偏性嫌気性酢酸生成微生物がClostridium ljungdahliiである。
【００２８】
本発明の他の様相は、上記の偏性嫌気性酢酸生成微生物に目的タンパク質をコードする外来遺伝子が導入され、当該目的タンパク質を発現可能である、組換え微生物である。
【００２９】
本様相は組換え微生物に係るものである。本様相の組換え微生物は、宿主である上記偏性嫌気性酢酸生成微生物に目的タンパク質をコードする外来遺伝子が導入され、当該目的タンパク質を発現可能である。本様相の組換え微生物は、その作製が容易である。
【００３０】
好ましくは、前記外来遺伝子がゲノムに組み込まれている。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物によれば、偏性嫌気性酢酸生成微生物の組換え体を高効率で得ることができる。
【００３２】
本発明の組換え微生物は、その作製が容易である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】pMTL-dptFKOベクターの構成を表す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明において「遺伝子」という用語は、全て「核酸」あるいは「ＤＮＡ」という用語に置き換えることができる。
【００３５】
本発明の改変された偏性嫌気性酢酸生成微生物は、ホスホロチオエート化ＤＮＡ特異的な制限修飾系で作用する制限酵素の活性が欠失又は抑制されているものである。換言すれば、本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物では、ホスホロチオエート化ＤＮＡ特異的な制限修飾系における非修飾ＤＮＡに対する制限活性（切断活性）が、失われているか、低下している。
【００３６】
偏性嫌気性とは、酸素存在下では実質的に生育できない性質を指し、絶対嫌気性と同義である。酢酸生成微生物（acetogen）とは、嫌気呼吸によって酢酸（acetate）を生成する微生物を指す。
【００３７】
酵素活性の欠失とは、当該酵素の活性が無いことを意味する。酵素活性の抑制とは、改変される前の微生物（野生型）における酵素活性と比較して低下していることを指す。例えば、酵素活性が野生型の５０％以下であり、好ましくは２５％以下、より好ましくは１０％以下である。制限酵素の活性測定は、例えば、Piero R. Bianco et al., Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37, No. 10, 3377-3390 に記載の方法（DNA cleavage assay）を参考にして行うことができる。
【００３８】
前述のとおり、ホスホロチオエート化特異的な制限修飾系における制限酵素活性の発現には、ｄｐｔＦ遺伝子、ｄｐｔＧ遺伝子、及びｄｐｔＨ遺伝子の３つの遺伝子が必須とされている。これらの遺伝子のうちの１つでも欠けると、制限酵素活性を発揮できない。そのため、例えば、ｄｐｔＦ遺伝子、ｄｐｔＧ遺伝子、及びｄｐｔＨ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの発現を欠失又は抑制することにより、前記制限酵素の活性を欠失又は抑制することができる。
【００３９】
１つの実施形態では、ｄｐｔＦ遺伝子の発現が欠失又は抑制されることにより前記制限酵素の活性が欠失又は抑制されている。
【００４０】
制限酵素の活性を欠失又は抑制させる手法としては、例えば、発現する酵素の分子数を減少（ゼロを含む）させる手法と、発現する酵素自体の活性を減少（ゼロを含む）させる手法の２つが大きく挙げられる。
【００４１】
発現する酵素の分子数を減少させる手法としては、酵素の発現量を転写レベル又は翻訳レベルで減少させることが挙げられる。例えば、酵素遺伝子、酵素サブユニットの遺伝子、酵素遺伝子の発現制御因子の遺伝子、等に対するプロモーター配列やシャインダルガルノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を改変し、酵素遺伝子の発現量を減少させることが挙げられる。例えば、ｄｐｔＦ遺伝子のプロモーター配列やＳＤ配列を改変することにより、発現する制限酵素の分子数を減少させることができる。ｄｐｔＧ遺伝子、ｄｐｔＨ遺伝子についても同様である。
【００４２】
発現する酵素自体の活性を減少させる手法としては、ゲノム上の酵素遺伝子の一部又は全部を欠失させることが挙げられる。
【００４３】
発現する酵素自体の活性を減少させる他の手法としては、酵素遺伝子を改変することが挙げられる。例えば、目的微生物に変異誘発剤等による処理を行い、標的の酵素遺伝子に変異を導入することが挙げられる。例えば、放射線照射や、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の変異剤によって目的微生物を処理し、制限酵素活性が欠失又は抑制された変異微生物（改変微生物）を選抜することができる。上記標的遺伝子は、ｄｐｔＦ遺伝子であり得る。ｄｐｔＧ遺伝子、ｄｐｔＨ遺伝子でもよい。
【００４４】
標的遺伝子にフレームシフトを生じさせた変異遺伝子、標的遺伝子に点変異を生じさせた変異遺伝子、標的の遺伝子の部分断片遺伝子、等に標的遺伝子を置換（改変）することにより、制限酵素自体の活性を欠失又は抑制することもできる。上記標的遺伝子は、ｄｐｔＦ遺伝子であり得る。ｄｐｔＧ遺伝子、ｄｐｔＨ遺伝子でもよい。
【００４５】
遺伝子の置換は、ゲノム編集（CRISPR-Cas9システム）により行うこともできる。ゲノム編集は、エンドヌクレアーゼであるCas9もしくは触媒活性をもたない変異型Cas9がsgRNA（single guide RNA）と複合体を形成し、sgRNAと標的ＤＮＡが相補的に結合する領域の近傍にPAM（proto-spacer adjacent motif）と呼ばれる特定の短い塩基配列があるという条件下であれば、いかなるＤＮＡ配列も部位特異的に標的とすることが可能である。合成ガス資化性微生物におけるゲノム編集の利用については、例えば「Huang H et al.，ACS Synth Biol. 2016 Jun 15.」に記載されている。
【００４６】
遺伝子の置換は、相同組換えによっても行うことができる。相同組換えに求められる塩基配列の配列同一性は、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。なお、相同組換え法による遺伝子操作法は既に多くの細菌等で確立されており、直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、プラスミドを用いる方法等がある（米国特許第６３０３３８３号明細書、特開平０５−００７４９１号公報等）。Clostridium属細菌におけるプラスミドによる相同組換えの手法は、例えば「Heap JT et al.，J. Microbiol. Methods，2007，vol.70(3)，p.452-64」に記載されている。
【００４７】
Cas9をコードする遺伝子やsgRNAをコードする遺伝子と共に、制限酵素遺伝子等の標的遺伝子の一部又は全部を欠失させるための相同ＤＮＡ配列を導入してもよい。
【００４８】
改変前の微生物に外来遺伝子等のＤＮＡ配列（ＤＮＡ断片）を導入することにより、制限酵素遺伝子等の標的遺伝子の一部又は全部を欠失させることができる。例えば、標的遺伝子の構造遺伝子内部にＤＮＡ配列を挿入することにより、標的遺伝子の一部又は全部を欠失させることができる。この際に導入されるＤＮＡ配列としては特に限定はなく、その微生物が元々有しているＤＮＡ配列でもよいし、その微生物が元々有していない異種ＤＮＡ配列であってもよい。導入するＤＮＡ配列としては、抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【００４９】
この際に微生物にＤＮＡ断片を導入する方法としては特に限定はなく、微生物の種類等によって適宜選択すればよい。例えば、微生物に導入可能であり、かつ組換え後に自己複製できないベクターを用いることができる。例えば、微生物が細菌等の原核生物の場合には、当該ベクターとして、微生物において染色体（ゲノム）中への組み込みが可能であるものを用いることができる。例えば、ベクターを用いて上記ＤＮＡ断片を導入した後、ベクターが消失する構成が好ましい。
【００５０】
偏性嫌気性酢酸生成微生物における、ｄｐｔＦ、ｄｐｔＧ、ｄｐｔＨの各遺伝子又はそれがコードするタンパク質（ＤｐｔＦ、ＤｐｔＧ、ＤｐｔＨ）の例としては、以下のものが挙げられる。
【００５１】
ＤｐｔＦ（例えば、ドメイン名：dnd_assoc_3、Accession No.：TIGR03238）の例：
D8GSU7（Clostridium ljungdahlii-DptF）；E2D683（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Cerro-DptF）；B6I2H8（Escherichia coli (strain SE11)）；A4W622（Enterobacter sp. (strain 638)）；B5ESQ2（Vibrio fischeri (strain MJ11)-Dnd system-associated protein 3）；Q3ICW6（Pseudoalteromonas haloplanktis (strain TAC 125)）；A0A2A8ZK06（Bacillus cereus-DptF）；A0A127EIJ6（Clostridium perfringens）；A1ZY61（Microscilla marina ATCC 23134）等（いずれもUniProtKBのIDで表示）。
なお、ＤｐｔＦは、ＤｎｄＦ（ＤＮＡ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）、とも呼ばれる。
【００５２】
Clostridium ljungdahlii由来の上記D8GSU7（ＤｐｔＦ）のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００５３】
ＤｐｔＧ（例えば、ドメイン名：dnd_assoc_1、Accession No.：TIGR03236）の例：
D8GSU8（Clostridium ljungdahlii-DptG）；E2D682（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Cerro-DptG）；B6I2H9（Escherichia coli (strain SE11)）；A4W623（Enterobacter sp. (strain 638)）；B5ESQ3（Vibrio fischeri (strain MJ11)-Dnd system-associated protein 1）；Q3ICW5（Pseudoalteromonas haloplanktis (strain TAC 125)）；A0A2A8ZJX6（Bacillus cereus-DptG）；A0A127EIJ3（Clostridium perfringens）；A1ZIK4（Microscilla marina ATCC 23134）等（いずれもUniProtKBのIDで表示）。
なお、ＤｐｔＧは、ＤｎｄＧ（ＤＮＡ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）、とも呼ばれる。
【００５４】
Clostridium ljungdahlii由来の上記D8GSU8（ＤｐｔＧ）のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００５５】
ＤｐｔＨ（例えば、ドメイン名：dnd_assoc_2、Accession No.：TIGR03237）の例：
D8GSU9（Clostridium ljungdahlii-DptH）；E2D681（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Cerro-DptH）；B6I2I0（Escherichia coli (strain SE11)）；A4W624（Enterobacter sp. (strain 638)）；B5ESQ4（Vibrio fischeri (strain MJ11)-Dnd system-associated protein 2）；Q3ICW4（Pseudoalteromonas haloplanktis (strain TAC 125)）；A0A2A8ZKE7（Bacillus cereus-DptH）；A0A127EIK7（Clostridium perfringens）；A1ZY59（Microscilla marina ATCC 23134）等（いずれもUniProtKBのIDで表示）。
なお、ＤｐｔＨは、ＤｎｄＨ（ＤＮＡ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）、とも呼ばれる。
【００５６】
Clostridium ljungdahlii由来の上記D8GSU9（ＤｐｔＨ）のアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００５７】
本発明においては、さらに、ホスホロチオエート化ＤＮＡ特異的な制限修飾系以外で作用する制限酵素の活性が欠失又は抑制されていてもよい。１つの実施形態では、さらに、Ｉ型制限修飾系酵素を構成する制限酵素（第二の制限酵素）の活性が欠失又は抑制されている。Ｉ型制限修飾系酵素を構成する制限酵素の詳細については、特許文献２に記載されている。
【００５８】
本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物は、一酸化炭素又は二酸化炭素を唯一の炭素源として増殖可能であることが好ましい。
また本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物は、一酸化炭素脱水素酵素を有するものであることが好ましい。詳細には、主に一酸化炭素代謝、すなわち一酸化炭素脱水素酵素の働きにより、一酸化炭素と水から二酸化炭素とプロトンを発生する機能によって生育する微生物が好ましい。
また本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物は、メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有することが好ましい。メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する経路は、例えば、還元型アセチルＣｏＡ経路（Wood-Ljungdahl pathway）とメタノール経路（Methanol pathway）に含まれている。
本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物は、アセチルＣｏＡ経路を保有し、かつ一酸化炭素耐性と合成ガス資化性を保有する微生物が好ましい。
【００５９】
本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物は、細菌、例えばClostridium属細菌又はMoorella属細菌であることが好ましく、Clostridium ljungdahliiであることが特に好ましい。
本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物として採用可能な微生物の具体例としては、Clostridium ljungdahlii、Clostridium carboxidivorans、Clostridium ragsdalei（Kopke M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(15), 5467-5475）、Moorella thermoacetica（Clostridium thermoaceticumと同じ）（Pierce EG. Et al.，Environ. Microbiol.，2008，vol.10，p.2550-2573)、Acetobacterium woodii（Dilling S. et al.，Appl. Environ. Microbiol.，2007，vol.73(11)，p.3630-3636）等のClostridium属細菌、Moorella属細菌、又はAcetobacterium属細菌が挙げられる。これらの５種の嫌気性微生物は、合成ガス資化性微生物の代表例として知られている。特に、Clostridium属細菌は、宿主−ベクター系や培養方法が確立しており、本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物として好適である。
その他の例としては、Carboxydocella sporoducens sp. Nov.（Slepova TV. et al.，Inter. J. Sys. Evol. Microbiol.，2006，vol.56，p.797-800）、Rhodopseudomonas gelatinosa（Uffen RL, J. Bacteriol.，1983，vol.155(3)，p.956-965）、Eubacterium limosum（Roh H. et al.，J. Bacteriol.，2011，vol.193(1)，p.307-308）、Butyribacterium methylotrophicum（Lynd, LH. Et al.，J. Bacteriol.，1983，vol.153(3)，p.1415-1423）等が挙げられる。
【００６０】
なお、上記で具体的に列挙した細菌の増殖及びＣＯＤＨ活性は全て酸素感受性であるが、酸素非感受性のＣＯＤＨも知られている。例えば、Bradyrhizobium japonicum（Lorite MJ. Et al.，Appl. Environ. Microbiol.，2000，vol.66(5)，p.1871-1876）を始めその他のバクテリア種には、酸素非感受性のＣＯＤＨが存在する（King GM et al.，Appl. Environ. Microbiol.，2003，vol.69(12)，p.7257-7265）。好気性水素酸化細菌であるラルソトニア（Ralsotonia）属菌にも、酸素非感受性のＣＯＤＨが存在する（NCBI Gene ID：4249199，8019399)。
このように、ＣＯＤＨを有する細菌は広く存在しており、その中から本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物を適宜選択することができる。例えば、ＣＯ、ＣＯ／Ｈ2（ＣＯとＨ2を主成分とするガス）、若しくはＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2（ＣＯとＣＯ2とＨ2を主成分とするガス）を唯一の炭素源かつエネルギー源とした選択培地を用い、嫌気的条件で、本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物として利用できるＣＯＤＨを有する細菌を分離することができる。
【００６１】
本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物は、偏性嫌気性微生物の培養方法として公知の方法で培養することができる。例えば糖類、酢酸、エタノール、メタノール、グリセリン等の炭素源を用いて、嫌気条件下で培養することができる。
【００６２】
本発明は、上記の偏性嫌気性酢酸生成微生物に目的タンパク質をコードする外来遺伝子が導入され、当該目的タンパク質を発現可能である組換え微生物を包含する。換言すれば、目的タンパク質をコードする外来遺伝子を有し、当該目的タンパク質を発現可能である上記偏性嫌気性酢酸生成微生物を包含する。前記外来遺伝子は、ゲノム上に組み込まれていることが好ましい。
【００６３】
本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物に遺伝子（ＤＮＡ）を導入する方法としては、偏性嫌気性酢酸生成微生物の種類等によって適宜選択すればよい。例えば、当該微生物に導入可能でかつ組み込まれた遺伝子を発現可能なベクターを用いることができる。
例えば、当該微生物が細菌等の原核生物の場合には、当該ベクターとして、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、挿入された上記外来遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。例えば、当該ベクターを用いて、プロモーター、リボソーム結合配列、上記外来遺伝子、および転写終結配列からなる一連の構成を当該微生物内で構築することが好ましい。
【００６４】
偏性嫌気性酢酸生成微生物がClostridium属細菌（Moorella属細菌のような近縁種を含む）の場合について説明すると、Clostridium属細菌と大腸菌とのシャトルベクターpIMP1（Mermelstein LD et al., Bio/technology 1992, 10, 190-195）を用いることができる。本シャトルベクターは、pUC9 (ATCC 37252)とBacillus subtilisから分離されたpIM13 (Projan SJ et al., J. Bacteriol. 1987, 169 (11), 5131-5139)との融合ベクターであり、Clostridium属細菌内でも安定的に保持される。
【００６５】
また、ベクターを用いて複数種の目的遺伝子（ＤＮＡ）を本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物に導入する場合、各遺伝子を１つのベクターに組み込んでもよいし、別々のベクターに組み込んでもよい。さらに１つのベクターに複数の遺伝子を組み込む場合には、各遺伝子を共通のプロモーターの下で発現させてもよいし、別々のプロモーターの下で発現させてもよい。複数種の酵素を融合タンパク質の形で発現させるべく、複数種の遺伝子を連結させた融合遺伝子を導入してもよい。
【００６６】
本発明の組換え微生物は、偏性嫌気性微生物の培養方法として公知の方法で培養することができる。例えば糖類、酢酸、エタノール、メタノール、グリセリン等の炭素源を用いて、嫌気条件下で培養することができる。
【００６７】
合成ガスを用いて培養することもできる。例えば、ガス成分を炭素源、エネルギー源とする場合は、生育に必要な無機塩類及び、合成ガスからなる栄養条件で培養する。好ましくは０．２〜０．３ＭＰａ（絶対圧）程度の加圧状態で培養することによりガス成分の資化性は高まる。さらには、初期増殖及び到達細胞密度を良好にするためには、ビタミン、酵母エキス、コーンスティープリカー、バクトトリプトン等の有機物を少量加えてよい。
【００６８】
本発明の組換え微生物を培養することにより、導入した外来遺伝子がコードする目的タンパク質を発現させることができる。必要に応じて、培養物から目的タンパク質を単離することができる。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７０】
（１）ホスホロチオエート化ＤＮＡ特異的な制限修飾系で作用する制限酵素欠失用CRISPR-Cas9およびsgRNA発現ベクターの構築
ホスホロチオエート化ＤＮＡ特異的な制限修飾系で作用する制限酵素欠失用CRISPR-Cas9およびsgRNA発現遺伝子クラスターを含むベクターpMTL-dptFKO（図１；11112bp、配列番号４）を構築した。該遺伝子クラスターは、Clostridium/E. coliシャトルベクターpMTL 上に存在し、Streptococcus pyogenes由来Csn1（エンドヌクレアーゼ、GenBank: AAZ51387.1）、sgRNA発現カセットの各遺伝子とClostridium ljungdahliiのｄｐｔＦ（UniProtKB: D8GSU7 (D8GSU7_CLOLD)）の上流配列（LHA、1008bp）、下流配列（RHA、1023bp）、thlプロモーター（Pthl）、araEプロモーター（ParaE）を含み、さらに、fdxターミネーター（fdx terminator）を含む。pMTL-dptFKOもpMTLと同様にシャトルベクターとして機能する。
【００７１】
（２）ホスホロチオエート化ＤＮＡ特異的な制限修飾系で作用する制限酵素活性が欠失した改変型Clostridium ljungdahliiの作製
上記（１）で作製したpMTL-dptFKOを、エレクトロポレーションにてClostridium ljungdahlii（DSM13528/ATCC55383）、および、Ｉ型制限酵素欠失組換え体（国際公開第２０１８／０７０１４１号に記載）に導入し、ｄｐｔＦ欠失組換え体（改変型Clostridium ljungdahlii）２種を取得した。エレクトロポレーションは、Appl. Environ. Microbiol. 2013, 79(4):1102-9で推奨されている方法によって行った。取得した組換え体２種のゲノムＤＮＡを鋳型にし、配列番号５と配列番号６に記載のプライマーを用いてＰＣＲを行い、それぞれのゲノム上からｄｐｔＦ遺伝子が欠失していることを確認した。これにより、ｄｐｔＦ欠失組換え体、および、ｄｐｔＦ・Ｉ型制限酵素二重欠失組換え体を取得した。
【００７２】
（３）改変型Clostridium ljungdahliiによる形質転換効率向上の確認 
Clostridium/E. coliシャトルベクターpCL2（Appl. Environ. Microbiol. 2013, 79(4):1102-9）を、エレクトロポレーションにて、上記（２）で取得したｄｐｔＦ欠失組換え体、ｄｐｔＦ・Ｉ型制限酵素二重欠失組換え体、および野生型Clostridium ljungdahlii（DSM13528/ATCC55383）に導入し、形質転換効率の比較を行った。その結果、宿主として野生型Clostridium ljungdahlii（DSM13528/ATCC55383）を用いた場合においては、形質転換効率が４．８×１０2ｃｆｕ／μｇであった。これに対し、ｄｐｔＦ欠失組換え体（ｄｐｔＦ ＫＯ）を用いた場合では、２．１×１０4ｃｆｕ／μｇの値が得られ、有意に形質転換効率が向上した。さらに、ｄｐｔＦ・Ｉ型制限酵素二重欠失組換え体（ｄｐｔＦ・Ｉ型ＫＯ）を用いた場合では、５．０×１０4ｃｆｕ／μｇの値が得られ、ｄｐｔＦ単独の欠失組換え体よりも形質転換効率が向上することが確認された。（表１）
以上のことから、ホスホロチオエート化ＤＮＡ特異的な制限修飾系で作用する制限酵素活性が欠失した改変型Clostridium ljungdahliiを用いることで、形質転換効率が向上し、Clostridium ljungdahliiへの形質転換を容易に実施できることが示された。
【００７３】
【表１】
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【図１】
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【配列表】
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