(57)【要約】      （修正有）【課題】ＪＮＫシグナリングと強く関連する様々な疾患又は障害の処置のための、タンパク質キナーゼ阻害剤の使用の提供。【解決手段】膀胱炎の処置における使用のためのキメラペプチドであって、共有結合により連結される少なくとも１つの第１のドメイン及び少なくとも１つの第２のドメインを含み、前記第１のドメインが輸送配列を含み、前記第２のドメインがＪＮＫ阻害剤配列を含み、前記キメラペプチドは特定の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、前記キメラペプチドは膀胱内に投与されることを特徴とするキメラペプチドを提供する。タンパク質キナーゼであるｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼの阻害剤、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、又はそれをコードする核酸並びにそれを含有する医薬組成物の使用に言及するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膀胱炎の処置における使用のためのキメラペプチドであって、前記キメラペプチドは、共有結合により連結される少なくとも１つの第１のドメイン及び少なくとも１つの第２のドメインを含み、前記第１のドメインが輸送配列を含み、前記第２のドメインがＪＮＫ阻害剤配列を含み、前記キメラペプチドは配列番号１１と少なくとも８０％の配列同一性を有し、前記キメラペプチドは膀胱内に投与されることを特徴とするキメラペプチド。
【請求項２】
前記キメラペプチドが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるか、又はそれを含む、請求項１に記載の使用のためのキメラペプチド。
【請求項３】
前記キメラペプチドが、急性膀胱炎の処置に使用される、請求項１から２のいずれかに記載の使用のためのキメラペプチド。
【請求項４】
前記キメラペプチドが、間質性膀胱炎の処置に使用される、請求項１から２のいずれかに記載の使用のためのキメラペプチド。
【請求項５】
前記キメラペプチドが、出血性膀胱炎の処置に使用される、請求項１から２のいずれかに記載の使用のためのキメラペプチド。
【請求項６】
間質性膀胱炎／膀胱痛症候群（ＩＣ／ＰＢＳ）の処置における使用のためのキメラペプチドであって、前記キメラペプチドは、共有結合により連結される少なくとも１つの第１のドメイン及び少なくとも１つの第２のドメインを含み、前記第１のドメインが輸送配列を含み、前記第２のドメインがＪＮＫ阻害剤配列を含み、前記キメラペプチドは配列番号１１と少なくとも８０％の配列同一性を有し、前記キメラペプチドは膀胱内に投与されることを特徴とするキメラペプチド。
【請求項７】
前記キメラペプチドが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるか、又はそれを含む、請求項６に記載の使用のためのキメラペプチド。
【請求項８】
前記キメラペプチドが、間質性膀胱炎の処置に使用される、請求項６から７のいずれかに記載の使用のためのキメラペプチド。
【請求項９】
前記キメラペプチドが、膀胱痛症候群の処置に使用される、請求項６から７のいずれかに記載の使用のためのキメラペプチド。
【請求項１０】
膀胱感染の処置における使用のためのキメラペプチドであって、前記キメラペプチドは、共有結合により連結される少なくとも１つの第１のドメイン及び少なくとも１つの第２のドメインを含み、前記第１のドメインが輸送配列を含み、前記第２のドメインがＪＮＫ阻害剤配列を含み、前記キメラペプチドは配列番号１１と少なくとも８０％の配列同一性を有し、前記キメラペプチドは膀胱内に投与されることを特徴とするキメラペプチド。
【請求項１１】
前記キメラペプチドが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるか、又はそれを含む、請求項１０に記載の使用のためのキメラペプチド。
【請求項１２】
前記キメラペプチドが反復投与される請求項１から１１のいずれかに記載の使用のためのキメラペプチド。
【請求項１３】
前記キメラペプチドが、毎日、２又は３日ごと、若しくは毎週、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０週間にわたって投与される請求項１２に記載の使用のためのキメラペプチド。
【請求項１４】
前記キメラペプチドが単回投与される請求項１から１１のいずれかに記載の使用のためのキメラペプチド。
【請求項１５】
前記キメラペプチドが、膀胱内輸注により投与される請求項１から１４のいずれかに記載の使用のためのキメラペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＪＮＫシグナリングと強く関連する様々な新規疾患又は障害の処置のための、タンパク質キナーゼ阻害剤の使用、より具体的には、タンパク質キナーゼｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼの阻害剤、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、又はそれをコードする核酸の使用並びにそれを含有する医薬組成物の使用に言及するものである。
【背景技術】
【０００２】
ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、分裂促進因子活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼのストレス活性化群のメンバーである。これらのキナーゼは、細胞増殖及び分化の制御、より一般的には、環境刺激に対する細胞の応答に関与してきた。ＪＮＫシグナル伝達経路は、環境ストレスに応答して、また、いくつかのクラスの細胞表面受容体の関与によって活性化される。これらの受容体は、サイトカイン受容体、セルペンチン受容体及び受容体チロシンキナーゼを含んでもよい。哺乳動物細胞において、ＪＮＫは発がん性形質転換などの生物学的プロセス及び環境ストレスに対する適応反応の媒介に関与してきた。ＪＮＫはまた、免疫細胞の成熟及び分化などを含む免疫応答の調節、並びに免疫系による破壊について同定された細胞におけるプログラム細胞死の実行と関連してきた。このユニークな特性は、ＪＮＫシグナリングを、薬学的介入を開発するための有望な標的にする。いくつかの神経障害のうち、ＪＮＫシグナリングは虚血性脳卒中及びパーキンソン病に特に関与するが、以下に更に記載される他の疾患にも関与する。更に、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ｐ３８アルファは、ＪＮＫ−ｃＪｕｎ経路と拮抗することによって細胞増殖を負に調節することが示された。したがって、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ｐ３８アルファは、正常な細胞増殖及びがん細胞増殖の抑制において活性であると考えられ、更に、がん疾患におけるＪＮＫの関与を証明する（例えば、非特許文献１を参照されたい）。また、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、脊髄神経結紮（ＳＮＬ）によりもたらされる神経障害性疼痛に関与し、ＳＮＬはＪＮＫ、特に、ＪＮＫ１の遅く持続的な活性化を誘導するが、ｐ３８分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ活性化はＳＮＬ後に脊髄ミクログリア中に見出され、２１日までに基底レベル近くまで低下したことも示された（非特許文献２）。
【０００３】
したがって、ＪＮＫシグナリング経路の阻害又は中断、特に、ＪＮＫシグナリング経路の阻害剤の提供は、ＪＮＫシグナリングと強く関連する障害に対抗するための有望な手法であると考えられる。しかしながら、今までのところ知られるＪＮＫシグナリング経路の阻害剤はほんのわずかしか存在しない。
【０００４】
先行技術において既に公知であるＪＮＫシグナリング経路の阻害剤としては、特に、例えば、上流キナーゼ阻害剤（例えば、ＣＥＰ−１３４７）、例えば、タンパク質キナーゼのＡＴＰ結合部位と競合することによってキナーゼ活性に直接影響するＪＮＫの低分子化学的阻害剤（ＳＰ６００１２５及びＡＳ６０１２４５）、並びにＪＮＫとその基質（Ｄ−ＪＮＫＩ及びＩ−ＪＩＰ）との相互作用のペプチド阻害剤（例えば、非特許文献３）が挙げられる。
【０００５】
上流キナーゼ阻害剤ＣＥＰ−１３４７（ＫＴ７５１５）は、混合系統キナーゼファミリーの半合成阻害剤である。ＣＥＰ−１３４７（ＫＴ７５１５）は、栄養除去後の初代胚性培養物及び分化したＰＣ１２細胞において、並びに１−メチル−４−フェニルテトラヒドロピリジンで処置されたマウスにおいてｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化を阻害する用量でニューロン生存を促進する。更に、ＣＥＰ−１３４７（ＫＴ７５１５）は、培養ニワトリ胚の後根神経節、交感神経、毛様体及び運動ニューロンの長期生存を促進することができる（例えば、非特許文献４を参照されたい）。
【０００６】
低分子化学的ＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５は、Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスにおけるＭＰＴＰ誘発性ＰＤにおいて、ｃ−Ｊｕｎリン酸化のレベルを低下させ、ドーパミン作動性ニューロンをアポトーシスから保護し、ドーパミンのレベルを部分的に回復させることが見出された（非特許文献５）。これらの結果は、ＪＮＫ経路がｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＰＴＰの神経毒性効果の主要なメディエータであり、ＪＮＫ活性の阻害がＰＤを処置するための新しく有効なストラテジーであり得ることを更に示している。
【０００７】
低分子化学的阻害剤の更なる例は、上記のＪＮＫ阻害剤ＡＳ６０１２４５である。ＡＳ６０１２４５は、ＪＮＫシグナリング経路を阻害し、脳虚血後の細胞生存を促進する。ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＡＳ６０１２４５は、一過性全脳虚血のスナネズミモデルにおいて海馬ＣＡ１ニューロンの遅延喪失に対する有意な保護を提供した。この効果はＪＮＫ阻害によって、したがって、ｃ−Ｊｕｎの発現及びリン酸化によって媒介される（例えば、非特許文献６を参照されたい）。
【０００８】
第３のクラスのＪＮＫシグナリング経路の阻害剤は、上記のような、ＪＮＫとその基質との相互作用のペプチド阻害剤である。そのようなＪＮＫ阻害剤ペプチドの構築のための出発点として、天然に存在するＪＮＫタンパク質の配列アラインメントを使用することができる。典型的には、これらのタンパク質は、ＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）を含み、ＩＢ１又はＩＢ２などの様々なインスリン結合（ＩＢ）タンパク質中に存在する。そのような例示的な配列アラインメントの結果は、例えば、ＩＢ１（配列番号１３）、ＩＢ２（配列番号１４）、ｃ−Ｊｕｎ（配列番号１５）及びＡＴＦ２（配列番号１６）のＪＮＫ結合ドメインの間の配列アラインメントである（例えば、図１Ａ〜図１Ｃを参照されたい）。そのようなアラインメントは、部分的に保存された８アミノ酸の配列を示す（例えば、図１Ａを参照されたい）。ＩＢ１とＩＢ２のＪＢＤの比較は、２つの配列間で高度に保存された７個及び３個のアミノ酸の２つのブロックを更に示す。
【０００９】
そのようなアラインメントに基づいて構築された配列は、例えば、特許文献１又は特許文献２に開示されている。特許文献２及び特許文献１は、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質の基本輸送配列に由来するいわゆるＴＡＴ細胞透過配列と、ＩＢ１の最小２０アミノ酸の阻害的配列とを含む、低分子細胞透過性融合ペプチドを開示する。両成分は、互いに共有結合される。特許文献２と特許文献１の両方に開示されたＭＡＰＫ−ＪＮＫシグナリング経路の例示的な（及び現在唯一の）阻害剤は、例えば、Ｌ−ＪＮＫＩ１（Ｌアミノ酸から構成されるＪＮＫ阻害剤ペプチド）又はプロテアーゼ耐性Ｄ−ＪＮＫＩ１ペプチド（非天然Ｄアミノ酸から構成されるＪＮＫ阻害剤ペプチド）である。これらのＪＮＫ阻害剤（ＪＮＫＩ）ペプチドは、ＪＮＫ（ＪＮＫ１、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３）に対して特異的である。上記で考察されたこれらの低分子化合物阻害剤とは対照的に、特許文献２又は特許文献１中の阻害剤配列、例えば、ＪＮＫＩ１はむしろ、ＪＮＫとその基質との相互作用を阻害する。ＴＡＴに由来するその輸送配列により、融合ペプチドは細胞中に効率的に輸送される。輸送成分により得られる新規特性のため、融合ペプチドは細胞中に能動的に輸送され、そこでそれらはタンパク質分解的分解まで有効なままである。
【００１０】
しかしながら、特許文献２又は特許文献１に記載のペプチドは、特に限られた数の疾患、特に、非悪性疾患又は免疫関連細胞増殖性疾患において活性であると示されているに過ぎない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ０１／２７２６８
【特許文献２】ＷＯ２００７／０３１２８０
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｈｕｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ  ３９、ｎｏ．６、Ｊｕｎｅ  ２００７
【非特許文献２】Ｚｈｕａｎｇら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｒｃｈ  ２９、２００６、２６（１３）：３５５１〜３５６０頁
【非特許文献３】Ｋｕａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ−ＣＮＳ  ＆  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００５、ｖｏｌ．４、ｎｏ．１、６３〜６７頁（５）
【非特許文献４】Ｂｏｒａｓｉｏら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．９（７）：１４３５〜１４３９頁、１９９８年５月１１日
【非特許文献５】Ｗａｎｇら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．２００４  Ｆｅｂ；４８（２）；１９５〜２０２頁
【非特許文献６】Ｃａｒｂｏｎｉら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２００４  Ｊｕｌ；３１０（１）：２５〜３２頁、ＥＰＵＢ  ２００４年２月２６日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の１つの目的は、したがって、ＪＮＫ阻害剤ペプチドを用いて対抗することができる、更なる疾患を同定することである。本発明の別の目的は、これらの疾患及びＪＮＫシグナリングと強く関連することが未だ知られていない、又は既に知られている疾患の処置及び／又は防止のための新しいＪＮＫ阻害剤ペプチド及びその誘導体（の使用）を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この目的は、対象におけるＪＮＫシグナリングと強く関連する様々な炎症性又は非炎症性疾患を処置及び／又は防止するための医薬組成物の調製のための、好ましくは、本明細書に定義される、典型的には、１５０未満の長さのアミノ酸を含むＪＮＫ阻害剤配列の使用によって解決され、ここで、前記疾患又は障害は、以下の群：
（ａ）脳脊髄炎、特に、急性播種性脳脊髄炎、脊椎炎、特に、強直性脊椎炎、抗合成酵素症候群、皮膚炎、特に、アトピー性皮膚炎又は接触皮膚炎、肝炎、特に、自己免疫性肝炎、自己免疫性末梢神経障害、膵炎、特に、自己免疫性膵炎、ベーチェット病、ビッカースタッフ型脳炎、ブラウ症候群、セリアック病、シャーガス病、多発性神経障害、特に、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、骨髄炎、特に、慢性再発性多発性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、コーガン症候群、巨細胞性動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、血管炎、特に、皮膚小血管性血管炎及び蕁麻疹様血管炎、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、全身性強皮症、ドレスラー症候群、薬物誘発性全身性エリテマトーデス、円板状紅斑性狼瘡、腱付着部炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、結節性紅斑、特発性肺線維症、胃炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、汗腺膿瘍、特発性炎症性脱髄疾患、筋炎、特に、封入体筋炎、膀胱炎、特に、間質性膀胱炎、川崎病、扁平苔癬、ルポイド肝炎、マジード症候群、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、混合性結合組織疾患、脊髄炎、特に、視神経脊髄炎、甲状腺炎、特に、オード甲状腺炎、リウマチ、特に、回帰性リウマチ、パーソナージュ・ターナー症候群、尋常性天疱瘡、静脈周囲性脳脊髄炎、結節性多発動脈炎、多発性筋痛、特に、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎、肝硬変、特に、原発性胆汁性肝硬変、胆管炎、特に、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、ラスムッセン脳炎、再発性多発性軟骨炎、特に、反応性関節炎（ライター病）及び関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、シュニッツラー症候群、血清病、脊椎関節症、高安動脈炎、トローザ・ハント症候群、横断性脊髄炎、及びウェゲナー肉芽腫症、
（ｂ）特に、ブドウ膜炎、特に、前眼部、中間部及び／又は後眼部ブドウ膜炎、交感性ブドウ膜炎及び／又は全ブドウ膜炎；一般的な強膜炎、特に、前眼部強膜炎、角膜辺縁性強膜炎、後部強膜炎、及び角膜障害を伴う強膜炎；一般的な上強膜炎、特に、一過性周期性上強膜炎及び結節性上強膜炎；網膜炎；角膜手術；一般的な結膜炎、特に、急性結膜炎、粘液膿性結膜炎、アトピー性結膜炎、中毒性結膜炎、偽膜性結膜炎、漿液性結膜炎、慢性結膜炎、巨大乳頭結膜炎、濾胞性結膜炎、春季結膜炎、眼瞼結膜炎、及び／又は瞼裂斑炎；一般的な非感染性角膜炎、特に、角膜潰瘍、表層角膜炎、黄斑角膜炎、糸状角膜炎、雪眼炎、点状角膜炎、角結膜炎、例えば、曝露性角結膜炎、ドライアイ症候群（乾性角結膜炎）、神経栄養性角結膜炎、結節性眼炎、フリクテン性角結膜炎、春季角結膜炎及び他の角結膜炎、間質性結膜炎及び深層角膜炎、硬化性角膜炎、角膜血管新生及び他の角膜炎；一般的な虹彩毛様体炎、特に、急性虹彩毛様体炎、亜急性虹彩毛様体炎及び慢性虹彩毛様体炎、原発性虹彩毛様体炎、再発性虹彩毛様体炎及び続発性虹彩毛様体炎、水晶体起因性虹彩毛様体炎、フックス虹彩異色性毛様体炎、フォークト・小柳症候群；虹彩炎；一般的な脈絡網膜炎症、特に、限局性脈絡網膜炎症及び播種性脈絡網膜炎症、脈絡網膜炎、脈絡膜炎、網膜炎、網膜脈絡膜炎、後部毛様体炎、原田病、感染症及び寄生虫疾患における脈絡網膜炎症；前眼部及び／又は後部手術の後、例えば、白内障手術、レーザー眼科手術（例えば、レーザー原位置角膜切開反転術（ＬＡＳＩＫ））、緑内障手術、屈折矯正手術、角膜手術、硝子体−網膜手術、眼筋手術、眼形成手術、眼腫瘍手術、翼状片を含む結膜手術、及び涙器を含む手術の後の眼の術後炎症、好ましくは、眼内炎症、特に、術後眼内炎症、好ましくは、複雑な眼の手術及び／又は複雑ではない眼の手術の後の術後眼内炎症、例えば、処置後のブレブの炎症；眼の網膜を損傷する炎症性疾患；網膜血管炎、特に、イールズ病及び網膜血管周囲炎；一般的な網膜症、特に、糖尿病性網膜症、（動脈高血圧誘発性）高血圧性網膜症、滲出性網膜症、放射線誘発性網膜症、日光誘発性日光網膜症、外傷誘発性網膜症、例えば、プルチェル網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）及び／又は過粘稠度関連網膜症、非糖尿病性増殖性網膜症、及び／又は増殖性硝子体網膜症；濾過胞炎；眼内炎；交感性眼炎；麦粒腫；霰粒腫；眼瞼炎；まぶたの皮膚炎及び他の炎症；涙腺炎；涙管炎、特に、急性及び慢性涙小管炎；涙嚢炎；眼窩の炎症、特に、眼窩の蜂巣炎、眼窩の骨膜炎、眼窩のテノン嚢炎、眼窩の肉芽腫及び眼窩筋炎；化膿性内眼球炎及び寄生虫性眼内炎から選択される眼の炎症性及び非炎症性疾患；
（ｃ）アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、抗リン脂質症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ球増殖性症候群、自己免疫性多内分泌症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、バロー同心円性硬化症、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、補体第２成分欠損症関連疾患、クッシング症候群、ドゴー病、有痛脂肪症、好酸球性肺炎、後天性表皮水疱症、新生児溶血性疾患、クリオグロブリン血症、エバンス症候群、進行性骨化性線維形成異常症、消化管類天疱瘡、グッドパスチャー症候群、橋本脳症、妊娠性類天疱瘡、Ｈｕｇｈｅｓ−Ｓｔｏｖｉｎ症候群、低ガンマグロブリン血症、ランバート・イートン筋無力症候群、硬化性苔癬、限局性強皮症、急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋緊張病、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、Ｐａｒｒｙ−Ｒｏｍｂｅｒｇ症候群、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、むずむず脚症候群、後腹膜線維化症、自己免疫性多内分泌症候群２型、全身硬直症候群、Ｓｕｓａｃ症候群、熱性好中球性皮膚症、シデナム舞踏病、血小板減少症、及び白斑、
（ｄ）関節炎、特に、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎及び関節リウマチ、並びに関節症、及び変形性関節症、
（ｅ）特に、一般的な丘疹落屑性障害、特に、一般的な乾癬、例えば、尋常性乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、貨幣状乾癬、尋常性乾癬（ｐｌａｑｕｅ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、汎発性膿疱性乾癬、疱疹状膿痂疹、Ｖｏｎ  Ｚｕｍｂｕｓｃｈ病、連続性肢端皮膚炎、滴状乾癬、乾癬性関節症、遠位指節間乾癬性関節症、乾癬性破壊性関節炎、乾癬性脊椎炎、乾癬性若年性関節症、一般的な乾癬性関節症、及び／又は曲げ乾癬、一般的な類乾癬、例えば、大斑型類乾癬、小斑型類乾癬、網状類乾癬、苔癬状粃糠疹及びリンパ腫様丘疹症；バラ色粃糠疹；扁平苔癬及び他の丘疹落屑性障害、例えば、毛孔性紅色粃糠疹、光沢苔癬、線状苔癬、念珠状紅色苔癬、及び小児丘疹性先端皮膚炎；湿疹；一般的な皮膚炎、特に、アトピー性皮膚炎、例えば、ベニエー痒疹、アトピー性又は広範性神経皮膚炎、曲げ湿疹、乳児湿疹、内因性湿疹、アレルギー性湿疹、他のアトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、例えば、頭部脂漏、乳児脂漏性皮膚炎、他の脂漏性皮膚炎、おむつ皮膚炎、例えば、おむつ紅斑、おむつ発疹及び乾癬様おむつ発疹、特に、金属に起因する、接着剤に起因する、化粧品に起因する、皮膚と接触した薬物に起因する、染料に起因する、他の化学製品に起因する、皮膚と接触した食品に起因する、食品以外の植物に起因する、動物のフケに起因する、及び／又は他の薬剤に起因する、アレルギー性接触皮膚炎、特に、洗剤に起因する、油及びグリースに起因する、溶媒に起因する、化粧品に起因する、皮膚と接触した薬物に起因する、他の化学製品に起因する、皮膚と接触した食品に起因する、食品以外の植物に起因する、金属に起因する、及び／又は他の薬剤に起因する、刺激性接触皮膚炎、非特定接触皮膚炎、剥脱性皮膚炎、皮膚炎、例えば、内部的に摂取された物質に起因する、特に、薬物及び医薬品に起因する、摂取された食品に起因する、他の物質に起因する、全身及び局部皮膚発疹、貨幣状皮膚炎、壊疽性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、乾燥肌皮膚炎、人工皮膚炎、口囲皮膚炎、皮膚及び皮下組織の放射線関連障害、鬱滞性皮膚炎、慢性単純性苔癬及び痒疹、掻痒、発汗異常症、皮膚自己感作、感染性皮膚炎、間擦性紅斑及び／又は白色粃糠疹；蜂巣炎（皮膚を含む細菌感染）；リンパ管炎、特に、急性又は慢性リンパ管炎；一般的な脂肪織炎、特に、血管炎を伴わない小葉性脂肪織炎、例えば、以前はウェーバー・クリスチャン病と呼ばれた急性脂肪織炎、及び全身性結節性脂肪織炎、血管炎を伴う小葉性脂肪織炎、血管炎を伴わない中隔性脂肪織炎及び／又は血管炎を伴う中隔性脂肪織炎；リンパ節炎、特に、急性リンパ節炎；毛巣嚢胞及び毛巣瘻；一般的な膿皮症、特に、壊疽性膿皮症、増殖性膿皮症、壊疽性皮膚炎、膿性皮膚炎、敗血性皮膚炎及び化膿性皮膚炎；紅色陰癬；臍炎；天疱瘡、特に、尋常性天疱瘡、増殖性天疱瘡、落葉状天疱瘡、ブラジル天疱瘡、紅斑性天疱瘡、薬物誘発性天疱瘡、ＩｇＡ天疱瘡、例えば、角層下膿疱症及び表皮内好中球ＩｇＡ天疱瘡、及び／又は腫瘍随伴性天疱瘡；一般的な座瘡、特に、尋常性座瘡、集簇性座瘡、痘瘡状座瘡、粟粒性壊死性座瘡、熱帯性座瘡、小児座瘡、若年性女子表皮剥離性座瘡、ピッカー座瘡、及び／又はケロイド座瘡；口腔及び他の皮膚潰瘍；一般的な蕁麻疹、特に、アレルギー性蕁麻疹、特発性蕁麻疹、寒冷及び高温に起因する蕁麻疹、皮膚描記性蕁麻疹、振動性蕁麻疹、コリン性蕁麻疹、及び／又は接触性蕁麻疹；一般的な紅斑、特に、多形性紅斑、例えば、非水疱性多形性紅斑、スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮壊死症（ライエル）、及びスティーブンス・ジョンソン症候群−中毒性表皮壊死症重複症候群、結節性紅斑、中毒性紅斑、遠心性環状紅斑、有縁性紅斑及び／又は他の慢性模様状紅斑；紫外線照射に起因する日焼け及び他の急性皮膚変化；非イオン化放射線への慢性曝露に起因する皮膚変化；放射線皮膚炎；毛嚢炎；毛包周囲炎；偽性毛嚢炎；化膿性汗腺炎；サルコイドーシス；血管炎；成人線状ＩｇＡ疾患；酒さ、特に、口囲皮膚炎、鼻瘤、及び他の酒さ；及び／又は皮膚及び皮下組織の卵胞嚢胞、特に、粉瘤腫、毛嚢胞、トリコデルマ嚢胞、多発性脂腺嚢腫、皮脂嚢胞及び／又は他の卵胞嚢胞から選択される皮膚疾患及び皮下組織の疾患；
（ｆ）タウオパシー、アミロイドーシス及びプリオン病、
（ｇ）ポリープ、
（ｈ）特に、一般的な歯髄炎、特に、急性歯髄炎、慢性歯髄炎、増殖性歯髄炎、潰瘍性歯髄炎、不可逆性歯髄炎及び／又は可逆性歯髄炎；インプラント周囲炎；一般的な歯周症、特に、慢性歯周炎、複合歯周炎、単純歯周炎、侵襲性歯周炎、及び／又は例えば、歯髄起源の根尖性歯周炎；歯周症、特に、若年性歯周炎；一般的な歯肉炎、特に、急性歯肉炎、慢性歯肉炎、プラーク性歯肉炎、及び／又は非プラーク性歯肉炎；歯冠周囲炎、特に、急性及び慢性歯冠周囲炎；唾液腺炎；耳下腺炎、特に、感染性耳下腺炎及び自己免疫性耳下腺炎；一般的な口内炎、特に、アフタ性口内炎（例えば、マイナー若しくはメジャー）、ベドナーアフタ、再発性壊死性粘膜腺周囲炎、再発性アフタ性潰瘍、疱疹状口内炎、壊疽性口内炎、義歯性口内炎、潰瘍性口内炎、水疱性口内炎及び／又は歯肉口内炎；粘膜炎、特に、抗新生物療法に起因する、（他の）薬物に起因する、若しくは放射線に起因する粘膜炎、潰瘍性粘膜炎及び／又は口腔粘膜炎；一般的な口唇炎、特に、唇のひび割れ、光線口唇炎、口角炎、湿疹性口唇炎、感染性口唇炎、肉芽腫性口唇炎、薬物関連口唇炎、剥脱性口唇炎、腺性口唇炎、及び／又は形質細胞性口唇炎；特に、口腔及び／又は口唇の蜂巣炎（細菌感染）；剥離性障害、特に、剥離性歯肉炎；及び／又は顎関節障害から選択される口腔又は顎骨の炎症性疾患；
（ｉ）骨壊死、
（ｊ）一般的な黄斑及び／又は後極の変性と関連する疾患及び／又は障害、特に、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、特に、滲出型又は非滲出型の加齢黄斑変性、滲出性及び／又は非滲出性加齢黄斑変性、及び白内障、
（ｋ）特に、肺、心臓、肝臓、骨髄、縦隔、後腹膜、皮膚、腸、関節、及び肩線維症から選択される線維性疾患及び／又は障害、
（ｌ）特に、一般的な糸球体腎炎、例えば、非増殖性糸球体腎炎、特に、微小変化型疾患、巣状分節状糸球体硬化症、巣状分節状糸球体ヒアリン変性及び／又は硬化症、巣状糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、及び／又は菲薄基底膜病、及び増殖性糸球体腎炎、特に、膜性増殖性糸球体腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、管内増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、デンスデポジット病（膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型）、管外糸球体腎炎（半月体形成性糸球体腎炎）、急速進行性糸球体腎炎（ＲＰＧＮ）、特に、Ｉ型ＲＰＧＮ、ＩＩ型ＲＰＧＮ、ＩＩＩ型ＲＰＧＮ、及びＩＶ型ＲＰＧＮ、急性増殖性糸球体腎炎、感染後糸球体腎炎、及び／又はＩｇＡ腎症（ベルガー病）；急性腎炎症候群；急速進行性腎炎症候群；反復性及び持続性血尿；慢性腎炎症候群；ネフローゼ症候群；特定の形態学的病変を有するタンパク尿；糸球体炎；糸球体症；糸球体硬化症；一般的な急性腎臓傷害（「ＡＫＩ」、「急性腎不全」若しくは「急性腎臓不全」とも呼ばれる）、特に、腎前性ＡＫＩ、内因性ＡＫＩ、腎後性ＡＫＩ、腎尿細管壊死、例えば、急性腎尿細管壊死、腎尿細管壊死を伴うＡＫＩ、皮質壊死、例えば、急性皮質壊死及び腎皮質壊死を伴うＡＫＩ、髄質壊死、例えば、髄質（乳頭）壊死、急性髄質（乳頭）壊死及び慢性髄質（乳頭）壊死を伴うＡＫＩ、若しくは他のＡＫＩ；慢性腎臓病；一般的な腎症、特に、膜性腎症、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、遺伝性腎症、鎮痛薬性腎症、ＣＦＨＲ５腎症、造影剤誘導腎症、アミロイド腎症、逆流性腎症及び／又はメソアメリカ腎症；一般的な腎炎、特に、ループス腎炎、腎盂腎炎、間質性腎炎、尿細管間質性腎炎、慢性腎炎若しくは急性腎炎、びまん性増殖性腎炎、及び／又は巣状増殖性腎炎、尿細管間質性腎炎、感染性間質性腎炎、腎盂炎、腎盂腎炎、間質性腎炎；尿細管症、尿細管炎、特に、ＲＴＡ（ＲＴＡ１及びＲＴＡ２）、ファンコニ症候群、バーター症候群、ギッテルマン症候群、リドル症候群、腎性尿崩症、腎乳頭壊死、水腎症、膿腎症及び／又は急性尿細管壊死慢性腎疾患（ＣＫＤ）；グッドパスチャー症候群（抗糸球体基底膜抗体病）；多発性血管炎を伴う肉芽腫症；顕微鏡的多発性血管炎；及び／又はチャーグ・ストラウス症候群から選択される腎臓疾患及び／又は障害；
（ｍ）特に、尿管炎；尿路感染（膀胱感染、急性膀胱炎）；一般的な膀胱炎、特に、間質性膀胱炎、ハナー潰瘍、三角炎及び／又は出血性膀胱炎；尿道炎、特に、非淋菌性尿道炎若しくは淋菌性尿道炎；膀胱痛症候群；及び／又は後腹膜線維化症から選択される泌尿器系の疾患及び／又は障害；
（ｎ）特に、腎臓、心臓、肺、膵臓、肝臓、血液細胞、骨髄、角膜、事故で切断された四肢、特に、指、手、足、顔、鼻、骨、心臓弁、血管又は腸移植拒絶反応から選択される移植拒絶反応、
（ｏ）大脳皮質基底核変性症、進行性核上麻痺、統合失調症、遺伝性クロイツフェルト・ヤコブ病、運動ニューロン疾患、脊髄小脳失調／脊髄小脳萎縮症、認知症、特に、前頭側頭型認知症及びレビー小体型認知症、多系統萎縮症、遺伝性痙性対麻痺、フリードライヒ失調症、シャルコー・マリー・ツース病、
（ｐ）特に、炭水化物代謝の代謝障害、例えば、グリコーゲン蓄積症、アミノ酸代謝の障害、例えば、フェニルケトン尿症、メープルシロップ尿症、グルタル酸血症１型、尿素サイクル異常症若しくは尿素サイクル障害、例えば、カルバモイルリン酸シンテターゼＩ欠損症、有機酸代謝の障害（有機酸尿症）、例えば、アルカプトン尿症、脂肪酸酸化及びミトコンドリア代謝の障害、例えば、中鎖アシルコエンザイムＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＭＣＡＤＤと短縮されることが多い）、ポルフィリン代謝の障害、例えば、急性間欠性ポルフィリン症、プリン若しくはピリミジン代謝の障害、例えば、レッシュ・ナイハン症候群、ステロイド代謝の障害、例えば、リポイド先天性副腎過形成、若しくは先天性副腎過形成、ミトコンドリア機能の障害、例えば、キーンズ・セイアー症候群、ペルオキシソーム機能の障害、例えば、ツェルヴェーガー症候群、又はリソソーム蓄積障害、例えば、ゴーシェ病若しくはニーマン・ピック病の群から選択される、遺伝性又は非遺伝性の代謝疾患、
（ｑ）特に、一般的な固形腫瘍；一般的な血液腫瘍、特に、白血病、例えば、急性リンパ球性白血病（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、前骨髄球性白血病（Ｍ３）、単球性白血病（ＭＳ）、骨髄芽球性白血病（Ｍ１）、骨髄芽球性白血病（Ｍ２）、巨核芽球性白血病（Ｍ７）及び骨髄単球性白血病（Ｍ４）；骨髄腫、例えば、多発性骨髄腫；リンパ腫、例えば、非ホジキンリンパ腫、菌状息肉腫、バーキットリンパ腫、及びホジキン症候群；膵臓がん、特に、膵臓癌；卵巣がん、特に、卵巣癌；一般的な肝臓がん及び肝臓癌、特に、肝臓転移、肝臓細胞癌、肝細胞癌、ヘパトーマ、肝内胆管癌、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫（肝臓の）、及び他の特定又は不特定の肝臓の肉腫及び癌腫；皮膚がん；メラノーマ、特に、悪性メラノーマ；扁平上皮癌；グリア芽腫；一般的な結腸がん及び結腸癌、特に、盲腸癌、虫垂癌、上行結腸癌、肝湾曲部癌、横行結腸癌、脾湾曲部癌、下行結腸癌、Ｓ状結腸癌、結腸の重複部位の癌腫及び／又は結腸の悪性カルチノイド腫瘍；前立腺がん及び前立腺腫瘍、特に、前立腺癌から選択されるがん及び／又は腫瘍疾患；
（ｒ）特に、聴神経鞘腫、肺癌；腺癌；肛門癌；気管支癌；頸部癌；子宮頸がん；星状細胞腫；基底細胞腫；Ｂｃｒ−Ａｂｌ形質転換を伴うがん；膀胱がん；芽細胞腫；骨肉腫；脳転移；脳腫瘍；乳がん；カルチノイド；子宮頸がん；子宮体がん；頭蓋咽頭腫；ＣＵＰ症候群；ウイルス誘発性腫瘍；ＥＢＶ誘発性Ｂ細胞リンパ腫；子宮内膜癌；赤白血病（Ｍ６）；食道がん；胆嚢がん；消化管がん；消化管間質腫瘍；消化管腫瘍；泌尿生殖器がん；緑内障；グリオーマ；頭頸部腫瘍；Ｂ型肝炎誘発性腫瘍；肝細胞又は肝細胞性癌；肝癌；ヘパトーマ；ヘルペスウイルス誘発性腫瘍；ＨＴＬＶ−１誘発性リンパ腫；ＨＴＬＶ−２誘発性リンパ腫；インスリノーマ；腸がん；カポジ肉腫；腎臓がん；腎臓癌；喉頭がん；白血病；眼瞼腫瘍；肺がん；リンパがん；乳腺癌；マントル細胞リンパ腫；神経線維腫症；髄芽細胞腫；髄膜腫；中皮腫；非小細胞癌；非小細胞肺癌；食道がん；食道癌；乏突起膠腫；パピローマウイルス誘発性癌；陰茎がん；下垂体部腫瘍；形質細胞腫；直腸腫瘍；直腸癌；腎細胞癌；網膜芽腫；肉腫；シュネーベルガー病；小細胞肺癌；小腸がん；小腸腫瘍；軟部組織腫瘍；棘細胞癌；扁平上皮癌；胃がん；精巣がん；咽喉がん；胸腺腫；甲状腺がん；甲状腺癌；舌がん；未分化ＡＭＬ（ＭＯ）；尿道がん；子宮がん；膣がん；フォン・ヒッペル・リンドウ病；外陰部がん；ウィルムス腫瘍；色素性乾皮症から選択される更なるがん及び／又は腫瘍疾患；
（ｓ）それぞれ、特に、アレキサンダー病；タウオパシー、特に、一般的なアルツハイマー病、例えば、早発型アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病、老年型及び初老期型アルツハイマー認知症；軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳溢血、毛細血管拡張性運動失調症、切断又はその他破壊された軸索、軸索切断、脳病変、ＣＭＴ（シャルコー・マリー・ツース病）、大脳皮質基底核変性症、認知症、神経系の疾患又は障害、ジストニア、てんかん、ファーバー病、フリードライヒ失調症（ＳＣＡ）、ガングリオシドーシス、ギラン・バレー症候群、遺伝性痙性対麻痺、ヒルシュスプルング病、ヒト免疫不全ウイルス性認知症、ハンチントン病、脳梗塞、虚血性脳卒中、クラッベ病、レノックス・ガストー症候群、脳回欠損、多発性硬化症、骨髄異形成症候群、ミエロパシー、ＡＩＤＳ関連神経変性疾患、神経線維腫症２型（ＮＦ−２）、神経性ラチリスム、神経細胞アポトーシス、神経細胞死、神経障害性疼痛、神経障害、化学療法誘発性神経障害、糖尿病誘発性神経障害、ＮＭＤＡ誘発性神経毒性、疼痛、パーキンソン病、パーキンソニズム、ピック病、多発性神経障害、進行性核上麻痺、サンドホッフ病、二分脊椎、脳卒中、テイ・サックス病、ＴＢＩ（びまん性軸索損傷）、例えば、炎症性疼痛により誘発されるダークニューロンの処置、ウエスト症候群、脊髄性筋萎縮症から選択される神経疾患、神経系疾患及び／又は神経変性疾患、
（ｔ）特に、前記感染により引き起こされる炎症反応、例えば、ウイルス性脳炎、ウイルス誘発性がん（例えば、上記のもの）、ヒト免疫不全ウイルス性認知症、髄膜炎、髄膜脳炎、脳脊髄炎、へんとう炎、水痘帯状疱疹ウイルス感染から選択される、細菌又はウイルス感染の結果生じる疾患、
（ｕ）特に、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）；喘息；呼吸器系を含む慢性疾患；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；嚢胞性線維症；炎症性肺疾患；肺炎；肺線維症から選択される、呼吸系の疾患、特に、肺疾患、並びに
（ｖ）特に、一般的な糖尿病、特に、１型糖尿病、２型糖尿病、原因となる状態に起因する、例えば、先天性風疹、クッシング症候群、嚢胞性線維症、悪性新生物、栄養不良、又は膵炎及び膵臓の他の疾患に起因する糖尿病、薬物又は化学物質誘発性糖尿病、及び／又は他の糖尿病、ファブリ病、ゴーシェ病、低体温症、高体温性低酸素症、脂質性組織球増殖症、リピドーシス、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症、ニーマン・ピック病、肥満、及びウォルマン病から選択される代謝障害
から選択される。
【００１５】
１つの好ましい実施形態によれば、防止及び／又は処置される障害／疾患は、特に、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、特に、滲出型又は非滲出型の加齢黄斑変性、滲出性及び／又は非滲出性加齢黄斑変性、及び白内障から選択される黄斑の変性と関連する疾患及び／又は障害である。
【００１６】
「非滲出型」の進行性ＡＭＤは、網膜の下の網膜色素上皮層の萎縮の結果生じ、眼の中心部分の光受容体（桿体及び錐体）の喪失により失明を引き起こす。新血管の「滲出型」の進行性ＡＭＤは、ブルッフ膜を介して、脈絡膜毛細血管における異常な血管増殖（脈絡膜血管新生）に起因する失明を引き起こし、最終的には、黄斑下の血液及びタンパク質の漏出をもたらす。これらの血管からの出血、漏出、及び瘢痕化は、未処置のまま放置した場合、最終的には光受容体に対する不可逆的損傷及び急速な失明を引き起こす。本発明の分子は、両方の型のＡＭＤを処置するのに好適である。
【００１７】
別の好ましい実施形態によれば、防止及び／又は処置される障害／疾患は、特に、糖尿病性網膜症、（動脈高血圧誘発性）高血圧性網膜症、滲出性網膜症、放射線誘発性網膜症、日光誘発性日光網膜症、外傷誘発性網膜症、例えば、プルチェル網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）及び／又は過粘稠度関連網膜症、非糖尿病性増殖性網膜症、及び／又は増殖性硝子体網膜症から選択される網膜症であり、糖尿病性網膜症及び未熟児網膜症（ＲＯＰ）が好ましく、糖尿病性網膜症が特に好ましい。
【００１８】
以前は水晶体後部線維増殖症（ＲＬＦ）として知られていた未熟児網膜症（ＲＯＰ）は、一般に、新生児集中治療を受けている、未熟児で生まれた新生児が罹患する眼の疾患である。それは、瘢痕化及び網膜剥離をもたらし得る網膜血管の無秩序な増殖によって引き起こされると考えられている。ＲＯＰは、軽度であってもよく、寛解することがあるが、重症例では失明をもたらし得る。そのようなものとして、全ての早産児は、ＲＯＰのリスクがあり、非常に低い出生時体重は更なる危険因子である。酸素毒性と相対的低酸素状態の両方が、ＲＯＰの発症に寄与し得る。本発明の分子は、ＲＯＰを処置するのに好適である。
【００１９】
更に、本発明の分子は、あらゆる型の網膜症、特に、糖尿病誘発性網膜症、動脈高血圧誘発性高血圧性網膜症、放射線誘発性網膜症（イオン化放射線への曝露に起因する）、日光誘発性日光網膜症（日光への曝露）、外傷誘発性網膜症（例えば、プルチェル網膜症）及び異常タンパク血症を引き起こす障害において見られるような過粘稠度関連網膜症を処置するのに特に好適である。
【００２０】
別の好ましい実施形態によれば、防止及び／又は処置される障害／疾患は、眼の術後又は外傷後炎症、特に、術後眼内炎症、好ましくは、前眼部及び／又は後部手術後の眼内炎症である。眼の内部は通常、その自己含有された構造及び隔絶された構造のため、感染及び（例えば、その後の）炎症に非常に罹りにくいが、眼組織の外科的処置後及び／又は他の（例えば、機械的）傷害（外傷）後には炎症は次第に起こるようになる。眼科手術における技術的進歩にも拘わらず、この手順の物理的外傷は、手術後（すなわち、術後）の眼炎症を誘発し続けており、処置を正当化する。眼組織においては、アラキドン酸は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）によって、炎症の最も重要な脂質由来メディエータであるプロスタグランジン（ＰＧ）に代謝される。外科的外傷は、アラキドン酸カスケードを誘発し、次いで、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の活性化によってＰＧを生成する。細胞膜中のリン脂質は、ホスホリパーゼＡの基質であり、アラキドン酸を生成し、それから化学的に異なるＰＧ及びロイコトリエンのファミリーが産生される。眼炎症の処置のための従来の「至適基準」は、局所コルチコステロイド及び／又は非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である。（短期的な）コルチコステロイド使用に関して報告された副作用としては、白内障形成、眼圧（ＩＯＰ）の増大、ウイルス感染に対する感受性の増加並びに角膜上皮及び間質の創傷治癒の遅延が挙げられる。更に、コルチコステロイドによる長期的処置は、グルコース障害、高血圧、緑内障の発症、視力異常、視野の喪失、及び後嚢下白内障形成などの全身性副作用を誘導することが知られている。したがって、本発明における使用のための化合物を、特に、眼の手術又は外傷後の眼内炎症、特に、炎症した創傷及び創縁部の処置のために使用することができる。
【００２１】
それにより、眼の手術は、好ましくは、（眼球の）前眼部及び／又は後部に関するものであってもよい。一般には、「前眼部」とは、前眼部１／３を指す。それは、硝子体液の前にある構造、例えば、角膜、虹彩、毛様体、及び水晶体を含み、前眼部内には、２つの流体で満たされた空間：（ｉ）角膜の後部表面（すなわち、角膜内皮）と虹彩との間の前房、及び（ｉｉ）虹彩と硝子体の前面との間の後房が存在する。「後眼部」とは一般に、眼の後ろ２／３を指す。それは、前眼部ヒアリン膜及びその後ろに、全ての構造物、特に、光学構造：硝子体液、網膜、脈絡膜、及び視神経を含む。
【００２２】
術後眼内炎症に関する眼科手術の例としては、（ｉ）白内障と網膜剥離、白内障と黄斑上膜及び／又は白内障と黄斑円孔のための手術を含んでもよい、前眼部と後眼部の混合手術；（ｉｉ）緑内障手術；（ｉｉｉ）後眼部手術、特に、複合後眼部手術；（ｉｖ）糖尿病性網膜症と関連する白内障手術を含んでもよい複雑な眼内手術及び／又は複雑な網膜剥離眼科手術が挙げられる。更に、本発明のＪＮＫ阻害剤を使用して、術後眼内炎症を処置及び／又は防止することができ、眼科手術は、例えば、白内障、黄斑上膜、網膜上膜、網膜分離症、硝子体内出血、黄斑円孔、血管新生緑内障、眼内の軽減、水晶体、特に、人工水晶体の亜脱臼、及び硝子体黄斑牽引を含む群から選択される適応症のため実施される。眼科手術の更なる例としては、白内障手術、レーザー眼科手術（例えば、レーザー原位置角膜切開反転術（ＬＡＳＩＫ））、緑内障手術、屈折矯正手術、角膜手術、硝子体−網膜手術、眼筋手術、眼形成手術、眼腫瘍手術、翼状片を含む結膜手術、及び／又は涙器を含む手術が挙げられる。好ましくは、本発明によるＪＮＫ阻害剤によって防止及び／又は処置される障害／疾患は、前眼部及び／又は後眼部手術後の眼内炎症、好ましくは、複雑な眼の手術の後及び／又は複雑ではない眼の手術の後の術後眼内炎症、例えば、処置後のブレブの炎症、又は外傷後眼内炎症（好ましくは、結膜下注射による）である。
【００２３】
別の好ましい実施形態によれば、防止及び／又は処置される障害／疾患は、ブドウ膜炎、特に、前眼部、中間部及び／又は後眼部ブドウ膜炎、交感性ブドウ膜炎及び／又は全ブドウ膜炎、好ましくは、前眼部及び／又は後眼部ブドウ膜炎である。
【００２４】
別の好ましい実施形態によれば、防止及び／又は処置される障害／疾患は、ドライアイ症候群である。乾燥角膜炎、眼球乾燥症、乾性角結膜炎（ＫＣＳ）又は乾性角膜とも呼ばれるドライアイ症候群（ＤＥＳ）は、眼の乾燥により引き起こされ、次いで、涙液産生の減少又は涙液層蒸発の増加により引き起こされる眼疾患である。ドライアイ症候群の典型的な症状は、乾燥、焼けるような眼の疼痛及び砂が入ったような眼の刺激である。ドライアイ症候群は、眼の表面の炎症と関連することが多い。ドライアイ症候群が未処置のままであるか、又は重症になった場合、それは視力低下又は更には失明をもたらす眼の損傷を引き起こし得る合併症をもたらし得る。未処置のドライアイ症候群は、特に、眼の上皮における病理学的事例、扁平上皮化生、杯細胞の喪失、角膜表面の肥厚化、角膜びらん、点状角膜症、角膜上皮欠損、角膜潰瘍、角膜血管新生、角膜瘢痕化、角膜菲薄化、及び更には角膜穿孔をもたらし得る。本発明によるＪＮＫ阻害剤を、例えば、加齢、糖尿病、コンタクトレンズ若しくは他の原因に起因する、及び／又は眼の手術若しくは外傷の後、特に、単にレーザー眼科手術と一般的に呼ばれるレーシック（レーザー支援ｉｎ  ｓｉｔｕ角膜曲率形成術）の後のドライアイ症候群、特に、シェーグレン症候群又は非シェーグレン症候群ドライアイの処置及び／又は防止において用いることができる。
【００２５】
ドライアイの標準的な処置は、人工涙液、シクロスポリン（特に、シクロスポリンＡ；例えば、Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標））；自己血清点眼薬；潤滑眼軟膏剤及び／又は例えば、点眼薬若しくは眼軟膏剤の形態での（コルチコ）ステロイドの投与を含んでもよい。したがって、本発明はまた、本明細書で定義されたＪＮＫ阻害剤と、ドライアイの標準処置、特に、上記の処置のいずれか１つとの組合せ投与を含む、ドライアイ症候群の処置方法における本明細書に記載のＪＮＫ阻害剤の使用にも関する。特に好ましいのは、シクロスポリンＡ、最も好ましくは人工涙液との組合せである。組合せ投与は、平行投与及び／又は事後投与（最初に本明細書に記載のＪＮＫ阻害剤、次いで、（コルチコ）ステロイドの投与、又はその逆）を含む。確かに、事後投与と平行投与を組み合わせてもよく、例えば、処置を本明細書に記載のＪＮＫ阻害剤から開始し、処置の経過の後の時点で、（コルチコ）ステロイドを平行して投与する、又はその逆である。
【００２６】
別の好ましい実施形態によれば、防止及び／又は処置される障害／疾患は、特に、一般的な乾癬、例えば、尋常性乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、貨幣状乾癬、尋常性乾癬（ｐｌａｑｕｅ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、汎発性膿疱性乾癬、疱疹状膿痂疹、Ｖｏｎ  Ｚｕｍｂｕｓｃｈ病、連続性肢端皮膚炎、滴状乾癬、乾癬性関節症、遠位指節間乾癬性関節症、乾癬性破壊性関節炎、乾癬性脊椎炎、乾癬性若年性関節症、一般的な乾癬性関節症、及び／又は曲げ乾癬；一般的な類乾癬、例えば、大斑型類乾癬、小斑型類乾癬、網状類乾癬、苔癬状粃糠疹及びリンパ腫様丘疹症；バラ色粃糠疹；扁平苔癬及び他の丘疹落屑性障害、例えば、毛孔性紅色粃糠疹、光沢苔癬、線状苔癬、念珠状紅色苔癬、及び小児丘疹性先端皮膚炎から選択される皮膚疾患、特に、丘疹落屑性障害である。好ましくは、防止及び／又は処置される障害／疾患は、乾癬、例えば、尋常性乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、貨幣状乾癬、尋常性乾癬（ｐｌａｑｕｅ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、汎発性膿疱性乾癬、疱疹状膿痂疹、Ｖｏｎ  Ｚｕｍｂｕｓｃｈ病、連続性肢端皮膚炎、滴状乾癬、乾癬性関節症、遠位指節間乾癬性関節症、乾癬性破壊性関節炎、乾癬性脊椎炎、乾癬性若年性関節症、一般的な乾癬性関節症、及び／又は曲げ乾癬である。
【００２７】
別の好ましい実施形態によれば、防止及び／又は処置される障害／疾患は、神経変性疾患、特に、タウオパシー、好ましくは、アルツハイマー病、例えば、早発型アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病、老年型及び初老期型アルツハイマー認知症である。
【００２８】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶障害及び認知症と共に進行性の認知低下をもたらす破壊的な神経変性障害である。神経病理学的病変は、β−アミロイド（Ａβ）ペプチドにより形成される老人斑の細胞外沈着、及び高リン酸化タウタンパク質から構成される細胞内神経原線維変化（ＮＦＴ）を特徴とする（Ｄｕｙｃｋａｅｒｔｓら、２００９、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  １１８：５〜３６頁）。アミロイドカスケード仮説によれば、ＡＤにおける神経変性は、ベータ部位ＡＰＰ切断酵素１（ＢＡＣＥ１）及びプレセニリン１の活性を介してプロセシングする異常なアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と関連し、Ａβ斑を形成する前に線維状Ａβペプチドに蓄積する毒性Ａβオリゴマーの産生をもたらし得る。Ａβの蓄積は、シナプス機能障害、ＮＦＴ形成をもたらすキナーゼ活性の変化、ニューロン脱落及び認知症をもたらし得る（Ｈａｒｄｙ及びＨｉｇｇｉｎｓ、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１８４〜５頁）。したがって、ＡＤの発病は、Ａβの蓄積によって誘発されると考えられ、Ａβは様々なサイズのものであってよいオリゴマーに自己凝集し、実質及び血管中で拡散斑及び老人斑を形成する。Ａβオリゴマー及び斑は強力なシナプス毒性を有し、プロテアソーム機能を遮断し、ミトコンドリア活性を阻害し、細胞内Ｃａ２＋レベルを変化させ、炎症プロセスを刺激する。Ａβの正常な生理機能の喪失はまた、ニューロン機能障害に寄与すると考えられる。Ａβは、微小管関連タンパク質タウのリン酸化を調節するシグナリング経路と相互作用する。タウの高リン酸化は、軸索内輸送の調節におけるその正常な機能を破壊し、神経原線維変化（ＮＦＴ）及び毒性種の可溶性タウの蓄積をもたらす。更に、プロテアソームによる高リン酸化タウの分解は、Ａβの作用によって阻害される。したがって、これらの２つのタンパク質及びその関連するシグナリング経路は、ＡＤのための重要な治療標的である。
【００２９】
Ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、３つの遺伝子ＪＮＫ１、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３によりコードされ、ｍＲＮＡ選択的スプライシングによって１０の異なるアイソフォームとして発現されるセリン−トレオニンタンパク質キナーゼであり、それぞれのアイソフォームは短い形態（４６ｋＤａ）及び長い形態（５４ｋＤａ）として発現される（Ｄａｖｉｓ、２０００、Ｃｅｌｌ  １０３：２３９〜５２頁）。ＪＮＫ１及びＪＮＫ２は遍在性であるが、ＪＮＫ３は主に脳において発現される（Ｋｙｒｉａｋｉｓ及びＡｖｒｕｃｈ、２００１、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ８１：８０７〜６９頁）。ＪＮＫは、紫外線ストレス、サイトカイン及びＡβペプチドなどの細胞外刺激によるＭＡＰキナーゼ活性化を介するリン酸化により活性化され（ｐＪＮＫ）、それらは遺伝子発現調節、細胞増殖及びアポトーシスなどの複数の機能を有する（Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎ及びＲｅｄｄｙ、２００８、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２７：６２４５〜５１頁）。
【００３０】
本発明によれば、本発明によるＪＮＫ阻害剤は、タウの高リン酸化を減少させ、したがって、ニューロン脱落を減少させると推測される。したがって、本発明によるＪＮＫ阻害剤は、タウオパシーを処置及び／又は防止するのに有用であり得る。タウオパシーは、ヒトの脳におけるタウタンパク質の病理学的凝集と関連する神経変性疾患の１つの分類である。最も知られるタウオパシーは、タウタンパク質がタウタンパク質の高リン酸化により形成される神経原線維変化（ＮＦＴ）の形態でニューロン内に沈着するアルツハイマー病（ＡＤ）である。ＡＤにおけるＮＦＴの関与の程度は、ブラークステージによって定義される。ブラークステージＩ及びＩＩは、ＮＦＴの関与が主に脳の内側嗅領域（ｔｒａｎｓｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ）に限定される場合に使用され、海馬などの辺縁領域の関与がある場合にはステージＩＩＩ及びＩＶが使用され、広範囲に及ぶ新皮質の関与がある場合にはステージＶ及びＶＩが使用される。これは、別に進行する老人斑関与の程度と混同されるべきではない。したがって、ＪＮＫ阻害剤を、タウオパシー、特に、ＮＦＴが関与するアルツハイマー病、例えば、ブラークステージＩを有するＡＤ、ブラークステージＩＩを有するＡＤ、ブラークステージＩＩＩを有するＡＤ、ブラークステージＩＶを有するＡＤ及び／又はブラークステージＶを有するＡＤを処置及び／又は防止するために本発明に従って使用することができる。
【００３１】
更なるタウオパシー、すなわち、神経原線維変化（ＮＦＴ）が一般的に観察され、したがって、本発明によるＪＮＫ阻害剤によって処置及び／又は防止することができる状態としては、ＰＨＦ（対になったらせん状フィラメント）タウよりもむしろ真っ直ぐなフィラメントを有する進行性核上麻痺；ボクサー認知症（慢性外傷性脳症）；検出可能なβ−アミロイド斑を含まないが第１７染色体と関連する前頭側頭型認知症及びパーキンソン病；Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病（グアムパーキンソン−認知症複合）；ＡＤと類似するＮＦＴを含むが、斑は有さない神経原線維変化型老年期認知症；神経節膠腫及び神経節細胞腫；髄膜血管腫症；亜急性硬化性全脳炎；及び／又は鉛脳症、結節硬化症、ハラーフォルデン・シュパッツ病、及びリポフスチン症が挙げられる。本発明によるＪＮＫ阻害剤によって処置及び／又は防止することができる更なるタウオパシーとしては、ピック病；大脳皮質基底核変性症；嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）；前頭側頭型認知症及び前頭側頭葉変性症が挙げられる。ピック病及び大脳皮質基底核変性症においては、タウタンパク質は、膨張した、又は「風船化した」ニューロン内に封入体の形態で沈着する。アルツハイマー病の型として考えられることもあり、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、及びまたピック病などの他のタウオパシーと同時に存在し得る別の型の認知症である嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）は、脳組織の顕微鏡検査上での豊富な嗜銀顆粒及びコイル体の存在を特徴とする。非アルツハイマー型タウオパシーは、「ピック複合」として一緒に分類されることもある。
【００３２】
また、本発明によれば、本発明によるＪＮＫ阻害剤によって防止及び／又は処置される障害／疾患が、軽度認知障害（ＭＣＩ）、特に、アルツハイマー病に起因するＭＣＩであることも好ましい。典型的には、軽度認知障害（ＭＣＩ）は、アルツハイマー病とは異なる、すなわち、軽度認知障害（ＭＣＩ）は、典型的には、アルツハイマー病ではないが、それ自体、Ｆ０６．７においてＩＣＤ−１０によって分類される疾患である。ＩＣＤ−１０（Ｆ０６．７）においては、ＭＣＩは、記憶障害、学習困難、及び短期間を超えて仕事に集中する能力の低下を特徴とする障害と記載される。精神的作業が試みられる場合に精神的疲労の顕著な感覚があることが多く、新しい学習が、客観的に成功している場合であっても、主観的には難しいとわかっている。これらの症状はいずれもそれほど重篤ではなく、認知症（Ｆ００−Ｆ０３）又はせん妄（Ｆ０５．−）のいずれかの診断を行うことができる。この障害は、脳と全身の両方である様々な感染及び身体障害に先行する、付随する、又はその後に続くものであってもよいが、脳の関与の直接的証拠は必ずしも存在しない。それを、その異なる病因、より厳密な範囲の一般的により軽度の症状、及び通常はより短い持続期間により、脳炎後症候群（Ｆ０７．１）及び脳震とう後症候群（Ｆ０７．２）と区別することができる。軽度認知障害（ＭＣＩ）、特に、アルツハイマー病に起因するＭＣＩは、記憶及び思考技術を含む認知能力のわずかであるが、顕著で測定可能な低下を引き起こす。ＭＣＩは、個体の年齢及び教育に基づいて予測されるが、その日常活動を妨害するには有意に十分ではないものを超えるあらゆる型の認知障害の開始及び進化を含む。ＭＣＩの診断は、例えば、Ａｌｂｅｒｔ  ＭＳ、ＤｅＫｏｓｋｙ  ＳＴ、Ｄｉｃｋｓｏｎ  Ｄ、Ｄｕｂｏｉｓ  Ｂ、Ｆｅｌｄｍａｎ  ＨＨ、Ｆｏｘ  ＮＣ、Ｇａｍｓｔ  Ａ、Ｈｏｌｔｚｍａｎ  ＤＭ、Ｊａｇｕｓｔ  ＷＪ、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ＲＣ、Ｓｎｙｄｅｒ  ＰＪ、Ｃａｒｒｉｌｌｏ  ＭＣ、Ｔｈｉｅｓ  Ｂ、Ｐｈｅｌｐｓ  ＣＨ（２０１１）Ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｌｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｄｕｅ  ｔｏ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇ−Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｏｒｋｇｒｏｕｐｓ  ｏｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｅｍｅｎｔ．；７（３）：２７０〜９頁により記載されている。ＭＣＩは、あらゆる型の認知症の開始時にあってもよく、又は認知症の臨床症状をもたらすことなく時間と共に消失し得る一時的な（ｅｐｈｅｍｅｒｉｃ）形態の認知障害を表す。ＭＣＩを有する人は、アルツハイマー病又は別の認知症を発症するリスクが高く、特に、アルツハイマー病を発症するリスクが高いが、認知症、特に、アルツハイマー病を必ず発症するとは限らない。軽度認知障害を処置するための薬剤は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって現在認可されていない。アルツハイマー病の症状を処置するために認可された薬物は、ＭＣＩの認知症への進行を遅延させるか、又は防止する際にいかなる持続的な利益も示していない。
【００３３】
別の好ましい実施形態によれば、防止及び／又は処置される障害／疾患は、口腔又は顎骨の炎症性疾患、特に、歯髄炎、インプラント周囲炎、歯周炎、歯肉炎、口内炎、粘膜炎、剥離性障害、及び／又は顎関節障害、好ましくは、歯周炎である。
【００３４】
別の好ましい実施形態によれば、防止及び／又は処置される障害／疾患は、移植片拒絶又は移植拒絶反応、特に、肝臓、肺、腎臓、膵臓、皮膚又は心臓移植の移植片拒絶、例えば、移植片対宿主又は宿主対移植片である。
【００３５】
更に別の好ましい実施形態によれば、防止及び／又は処置される障害／疾患は、特に、糸球体腎炎、例えば、非増殖性糸球体腎炎、特に、微小変化型疾患、巣状分節状糸球体硬化症、巣状分節状糸球体ヒアリン変性及び／又は硬化症、巣状糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、及び／又は菲薄基底膜病、及び増殖性糸球体腎炎、特に、膜性増殖性糸球体腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、管内増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、デンスデポジット病（膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型）、管外糸球体腎炎（半月体形成性糸球体腎炎）、急速進行性糸球体腎炎（ＲＰＧＮ）、特に、Ｉ型ＲＰＧＮ、ＩＩ型ＲＰＧＮ、ＩＩＩ型ＲＰＧＮ、及びＩＶ型ＲＰＧＮ、急性増殖性糸球体腎炎、感染後糸球体腎炎、及び／又はＩｇＡ腎症（ベルガー病）；急性腎炎症候群；急速進行性腎炎症候群；反復性及び持続性血尿；慢性腎炎症候群；ネフローゼ症候群；特定の形態学的病変を有するタンパク尿；糸球体炎；糸球体症；糸球体硬化症；一般的な急性腎臓傷害（「ＡＫＩ」、「急性腎不全」若しくは「急性腎臓不全」とも呼ばれる）、特に、腎前性ＡＫＩ、内因性ＡＫＩ、腎後性ＡＫＩ、腎尿細管壊死、例えば、急性腎尿細管壊死、腎尿細管壊死を伴うＡＫＩ、皮質壊死、例えば、急性皮質壊死及び腎皮質壊死を伴うＡＫＩ、髄質壊死、例えば、髄質（乳頭）壊死、急性髄質（乳頭）壊死及び慢性髄質（乳頭）壊死を伴うＡＫＩ、又は他のＡＫＩ；慢性腎臓病から選択される腎疾患（腎臓疾患）である；好ましくは、防止及び／又は処置される障害／疾患は、糸球体腎炎である。また、防止及び／又は処置される腎臓障害／疾患は、特に、膜性腎症、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、遺伝性腎症、鎮痛薬性腎症、ＣＦＨＲ５腎症、造影剤誘導腎症、アミロイド腎症、逆流性腎症及び／又はメソアメリカ腎症腎症から選択される腎症であることも好ましく、好ましくは、防止及び／又は処置される障害／疾患は、糖尿病性腎症である。
【００３６】
更に別の好ましい実施形態によれば、防止及び／又は処置される障害／疾患は、特に、尿管炎；尿路感染（膀胱感染、急性膀胱炎）；一般的な膀胱炎、特に、間質性膀胱炎、ハナー潰瘍、三角炎及び／又は出血性膀胱炎；尿道炎、特に、非淋菌性尿道炎若しくは淋菌性尿道炎；膀胱痛症候群；ＩＣ／ＰＢＳ；尿道症候群；及び／又は後腹膜線維化症、好ましくは、一般的な膀胱炎、特に、間質性膀胱炎から選択される泌尿器系の疾患及び／又は障害である。これに関連して、間質性膀胱炎（ＩＣ）が症状及び重症度において非常に異なることがわかっており、したがって、多くの研究者が、それが１つではなく、いくつかの疾患であると考えている。近年では、科学者は、ＩＣの最も厳密な定義を満たさなくてもよい、痛みのある泌尿器症状を伴う事例を記載するために用語「膀胱痛症候群」（ＢＰＳ）又は「疼痛膀胱症候群」（ＰＢＳ）を使用し始めている。用語「ＩＣ／ＰＢＳ」は、感染又は尿路結石などの他の原因に帰することができない尿路疼痛の全ての事例を含む。間質性膀胱炎、又はＩＣという用語は、典型的には、例えば、米国立糖尿病・消化器・腎疾病研究所（ＮＩＤＤＫ）により確立された、全てのＩＣ基準を満たす事例を記述する場合にのみ使用される。
【００３７】
更に別の好ましい実施形態によれば、防止及び／又は処置される障害／疾患は、特に、一般的な固形腫瘍；一般的な血液腫瘍、特に、白血病、例えば、急性リンパ球性白血病（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、前骨髄球性白血病（Ｍ３）、単球性白血病（ＭＳ）、骨髄芽球性白血病（Ｍ１）、骨髄芽球性白血病（Ｍ２）、巨核芽球性白血病（Ｍ７）及び骨髄単球性白血病（Ｍ４）；骨髄腫、例えば、多発性骨髄腫；リンパ腫、例えば、非ホジキンリンパ腫、菌状息肉腫、バーキットリンパ腫、及びホジキン症候群；膵臓がん、特に、膵臓癌；卵巣がん、特に、卵巣癌；一般的な肝臓がん及び肝臓癌、特に、肝臓転移、肝臓細胞癌、肝細胞癌、ヘパトーマ、肝内胆管癌、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫（肝臓の）、及び他の特定又は不特定の肝臓の上皮性悪性腫瘍及び非上皮性悪性腫瘍；皮膚がん；メラノーマ、特に、悪性メラノーマ；扁平上皮癌；グリア芽腫；一般的な結腸がん及び結腸癌、特に、盲腸癌、虫垂癌、上行結腸癌、肝湾曲部癌、横行結腸癌、脾湾曲部癌、下行結腸癌、Ｓ状結腸癌、結腸の重複部位の癌腫及び／又は結腸の悪性カルチノイド腫瘍；前立腺がん及び前立腺腫瘍、特に、前立腺癌から選択される、がん及び／又は腫瘍疾患である。
【００３８】
更に、処置される以下の更なる疾患が開示される。
【００３９】
本発明のＪＮＫ阻害剤を、例えば、急性炎症並びに慢性炎症を含む、例えば、炎症性疾患の処置のために使用することができる。本発明のＪＮＫ阻害剤を使用して、任意の型の組織炎症、例えば、眼における炎症、口腔内の炎症、特に、肺を含む呼吸器系の炎症、皮膚の炎症、心血管系内の炎症、脳の炎症、耳における炎症などを処置することができる。そのような炎症性疾患状態のいくつかの非限定例は、粘膜炎、口内炎、インプラント周囲炎、網膜炎、脈絡膜炎、乾性角結膜炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ブドウ膜炎（例えば、前眼部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、後眼部ブドウ膜炎）、歯周炎、ＣＯＰＤ、喘息、歯髄炎、関節リウマチ、変形性関節症、クローン病、乾癬性関節炎、血管炎、間質性膀胱炎；感染又は創傷部位での急性炎症、髄膜炎、脳炎、肺炎、咽頭炎、へんとう炎、耳炎（中耳炎を含む）、血管炎、滑膜炎、腸炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、移植片拒絶；術後又は外傷後炎症、特に、前眼部及び／又は後眼部手術後の眼内炎症などである。
【００４０】
本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤を、例えば、耳疾患（特に、内耳の疾患）、聴力低下（特に、急性聴力低下）、損傷した有毛細胞の不動毛、有毛細胞アポトーシス、騒音外傷、耳炎、中耳炎などの処置の方法において使用することができる。聴力低下及び関連する有毛細胞アポトーシスは、ＪＮＫ阻害がストレス応答をモジュレートし、例えば、アポトーシスを遮断することができる細胞に関するストレス状況の結果生じる障害の非限定例である。
【００４１】
また、本発明のＪＮＫ阻害剤を、代謝障害の処置のため、例えば、一般的な糖尿病、特に、１型糖尿病、２型糖尿病、原因となる状態に起因する、例えば、先天性風疹、クッシング症候群、嚢胞性線維症、悪性新生物、栄養不良、又は膵炎及び膵臓の他の疾患に起因する糖尿病、薬物又は化学物質誘発性糖尿病、及び／又は他の糖尿病、ファブリ病、ゴーシェ病、低体温症、高体温性低酸素症、脂質性組織球増殖症、リピドーシス、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症、ニーマン・ピック病、肥満、及びウォルマン病の処置のために使用することもできる。低体温症、高体温症及び低酸素症は、ＪＮＫ阻害がストレス応答をモジュレートし、例えば、アポトーシスを遮断することができる細胞に関するストレス状況のさらなる非限定例である。
【００４２】
同様に、本発明のＪＮＫ阻害剤を、それぞれ、神経疾患、神経系疾患及び／又は神経変性疾患の処置のために使用することができる。そのような疾患の例は、例えば、アレキサンダー病；タウオパシー、特に、一般的なアルツハイマー病、例えば、早発型アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病、老年型及び初老期型アルツハイマー認知症；軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳溢血、毛細血管拡張性運動失調症、切断又はその他破壊された軸索、軸索切断、脳病変、ＣＭＴ（シャルコー・マリー・ツース病）、大脳皮質基底核変性症、認知症、神経系の疾患又は障害、ジストニア、てんかん、ファーバー病、フリードライヒ失調症（ＳＣＡ）、ガングリオシドーシス、ギラン・バレー症候群、遺伝性痙性対麻痺、ヒルシュスプルング病、ヒト免疫不全ウイルス性認知症、ハンチントン病、脳梗塞、虚血性脳卒中、クラッベ病、レノックス・ガストー症候群、脳回欠損、多発性硬化症、骨髄異形成症候群、ミエロパシー、ＡＩＤＳ関連神経変性疾患、神経線維腫症２型（ＮＦ−２）、神経性ラチリスム、神経細胞アポトーシス、神経細胞死、神経障害性疼痛、神経障害、化学療法誘発性神経障害、糖尿病誘発性神経障害、ＮＭＤＡ誘発性神経毒性、疼痛、パーキンソン病、パーキンソニズム、ピック病、多発性神経障害、進行性核上麻痺、サンドホッフ病、二分脊椎、脳卒中、テイ・サックス病、ＴＢＩ（びまん性軸索損傷）、例えば、炎症性疼痛により誘発されるダークニューロンの処置、ウエスト症候群、脊髄性筋萎縮症などである。
【００４３】
自己免疫障害に関して、本発明のＪＮＫ阻害剤ペプチドを、例えば、ＣＮＳの自己免疫疾患、自己炎症性疾患、セリアック病；シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデスなどの処置の方法において使用することができる。
【００４４】
本発明のＪＮＫ阻害剤を用いて処置することができる骨疾患の例は、例えば、関節炎、椎間板ヘルニア、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）、変形性関節症、大理石骨病、骨粗鬆症、特に、糖尿病誘発性骨粗鬆症、パジェット病、関節リウマチなどである。
【００４５】
本発明のＪＮＫ阻害剤を用いて処置することができる好ましい皮膚疾患の例は、乾癬及び紅斑性狼瘡である。より一般的な用語では、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤を用いて好ましく処置及び／又は防止することができる皮膚疾患及び皮下組織の疾患は、丘疹落屑性障害である。これらのものとしては、乾癬、類乾癬、バラ色粃糠疹、扁平苔癬及び他の丘疹落屑性障害、例えば、毛孔性紅色粃糠疹、光沢苔癬、線状苔癬、念珠状紅色苔癬、及び小児丘疹性先端皮膚炎が挙げられる。好ましくは、本発明によるＪＮＫ阻害剤により処置及び／又は防止される疾患は、乾癬及び類乾癬の群から選択され、乾癬が特に好ましい。乾癬の例としては、尋常性乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、貨幣状乾癬、尋常性乾癬（ｐｌａｑｕｅ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、汎発性膿疱性乾癬、疱疹状膿痂疹、Ｖｏｎ  Ｚｕｍｂｕｓｃｈ病、連続性肢端皮膚炎、滴状乾癬、乾癬性関節症、遠位指節間乾癬性関節症、乾癬性破壊性関節炎、乾癬性脊椎炎、乾癬性若年性関節症、一般的な乾癬性関節症、及び／又は曲げ乾癬が挙げられる。類乾癬の例としては、大斑型類乾癬、小斑型類乾癬、網状類乾癬、苔癬状粃糠疹及びリンパ腫様丘疹症が挙げられる。
【００４６】
本発明のＪＮＫ阻害剤を用いて処置することができる好ましい皮膚疾患の更なる例は、湿疹；一般的な皮膚炎、特に、アトピー性皮膚炎、例えば、ベニエー痒疹、アトピー性又は広範性神経皮膚炎、曲げ湿疹、乳児湿疹、内因性湿疹、アレルギー性湿疹、他のアトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、例えば、頭部脂漏、乳児脂漏性皮膚炎、他の脂漏性皮膚炎、おむつ皮膚炎、例えば、おむつ紅斑、おむつ発疹及び乾癬様おむつ発疹、特に、金属に起因する、接着剤に起因する、化粧品に起因する、皮膚と接触した薬物に起因する、染料に起因する、他の化学製品に起因する、皮膚と接触した食品に起因する、食品以外の植物に起因する、動物のフケに起因する、及び／又は他の薬剤に起因する、アレルギー性接触皮膚炎、特に、洗剤に起因する、油及びグリースに起因する、溶媒に起因する、化粧品に起因する、皮膚と接触した薬物に起因する、他の化学製品に起因する、皮膚と接触した食品に起因する、食品以外の植物に起因する、金属に起因する、及び／又は他の薬剤に起因する、刺激性接触皮膚炎、非特定接触皮膚炎、剥脱性皮膚炎、皮膚炎、例えば、内部的に摂取された物質に起因する、特に、薬物及び医薬品に起因する、摂取された食品に起因する、他の物質に起因する、全身及び局部皮膚発疹、貨幣状皮膚炎、壊疽性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、乾燥肌皮膚炎、人工皮膚炎、口囲皮膚炎、皮膚及び皮下組織の放射線関連障害、鬱滞性皮膚炎、慢性単純性苔癬及び痒疹、掻痒、発汗異常症、皮膚自己感作、感染性皮膚炎、間擦性紅斑及び／又は白色粃糠疹；蜂巣炎（皮膚を含む細菌感染）；リンパ管炎、特に、急性又は慢性リンパ管炎；一般的な脂肪織炎、特に、血管炎を伴わない小葉性脂肪織炎、例えば、以前はウェーバー・クリスチャン病と呼ばれた急性脂肪織炎及び全身性結節性脂肪織炎、血管炎を伴う小葉性脂肪織炎、血管炎を伴わない中隔性脂肪織炎及び／又は血管炎を伴う中隔性脂肪織炎；リンパ節炎、特に、急性リンパ節炎；毛巣嚢胞及び毛巣瘻；一般的な膿皮症、特に、壊疽性膿皮症、増殖性膿皮症、壊疽性皮膚炎、膿性皮膚炎、敗血性皮膚炎及び化膿性皮膚炎；紅色陰癬；臍炎；天疱瘡、特に、尋常性天疱瘡、増殖性天疱瘡、落葉状天疱瘡、ブラジル天疱瘡、紅斑性天疱瘡、薬物誘発性天疱瘡、ＩｇＡ天疱瘡、例えば、角層下膿疱症及び表皮内好中球ＩｇＡ天疱瘡、及び／又は腫瘍随伴性天疱瘡；一般的な座瘡、特に、尋常性座瘡、集簇性座瘡、痘瘡状座瘡、粟粒性壊死性座瘡、熱帯性座瘡、小児座瘡、若年性女子表皮剥離性座瘡、ピッカー座瘡、及び／又はケロイド座瘡；口腔及び他の皮膚潰瘍；一般的な蕁麻疹、特に、アレルギー性蕁麻疹、特発性蕁麻疹、寒冷及び高温に起因する蕁麻疹、皮膚描記性蕁麻疹、振動性蕁麻疹、コリン性蕁麻疹、及び／又は接触性蕁麻疹；一般的な紅斑、特に、多形性紅斑、例えば、非水疱性多形性紅斑、スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮壊死症（ライエル）、及びスティーブンス・ジョンソン症候群−中毒性表皮壊死症重複症候群、結節性紅斑、中毒性紅斑、遠心性環状紅斑、有縁性紅斑及び／又は他の慢性模様状紅斑；紫外線照射に起因する日焼け及び他の急性皮膚変化；非イオン化放射線への慢性曝露に起因する皮膚変化；放射線皮膚炎；毛嚢炎；毛包周囲炎；偽性毛嚢炎；化膿性汗腺炎；サルコイドーシス；血管炎；成人線状ＩｇＡ疾患；酒さ、特に、口囲皮膚炎、鼻瘤、及び他の酒さ；及び／又は皮膚及び皮下組織の卵胞嚢胞、特に、粉瘤腫、毛嚢胞、トリコデルマ嚢胞、多発性脂腺嚢腫、皮脂嚢胞及び／又は他の卵胞嚢胞である。
【００４７】
本発明のＪＮＫ阻害剤を用いて処置することができる眼の疾患は、例えば、特に、滲出型又は非滲出型の加齢黄斑変性（ＡＭＤ）；網膜色素線条；前眼部虚血性視神経症；前眼部ブドウ膜炎；白内障、特に、加齢型白内障；中心性滲出性脈絡網膜症；中心性漿液性網脈絡膜症；霰粒腫；先天性脈絡膜欠如；脈絡膜炎；脈絡膜硬化症；結膜炎；毛様体炎；糖尿病性網膜症；ドライアイ症候群；眼内炎；上強膜炎；眼感染症；白点状眼底；脳回転状網膜脈絡膜萎縮；麦粒腫；眼瞼の炎症性疾患；脈絡膜の炎症性疾患；毛様体の炎症性疾患；結膜の炎症性疾患；角膜の炎症性疾患；虹彩の炎症性疾患；涙腺の炎症性疾患；眼窩骨の炎症性疾患；強膜の炎症性疾患；硝子体の炎症性疾患；ブドウ膜の炎症性疾患；網膜の炎症性疾患；中間部ブドウ膜炎；虹彩炎；角膜炎；レーバー病；多巣性脈絡膜炎；眼筋の筋炎；新生血管黄斑症（例えば、高度近視、傾斜乳頭症候群、脈絡膜骨腫などにより引き起こされる）；ＮＭＤＡ誘導性網膜毒性；非慢性又は慢性炎症性眼疾患；小口病；視神経疾患；眼窩蜂巣炎；全眼球炎；全ブドウ膜炎；後発白内障；後嚢混濁（ＰＣＯ）（白内障術後合併症）；後眼部ブドウ膜炎；増殖性硝子体網膜症；網膜動脈閉塞；網膜剥離；網膜疾患；網膜傷害；網膜細動脈瘤；網膜色素上皮剥離；網膜静脈閉塞；網膜炎；網膜色素変性；白点状網膜炎；網膜症、特に、未熟児網膜症及び糖尿病性網膜症；強膜炎；スタルガルト病；炎症した眼外傷及び／又は眼外傷端部の処置；眼の手術又は外傷後の眼内炎症の処置、好ましくは前眼部及び／又は後眼部手術後の眼内炎症；ブドウ膜炎；卵黄様黄斑ジストロフィーなどを含む。
【００４８】
特に、本発明のＪＮＫ阻害剤を使用して、眼の炎症性疾患を処置及び／又は防止することができ、そのような疾患は、全体としての眼又は眼の異なる部分に関するものであってもよい。例えば、本発明のＪＮＫ阻害剤を使用して、眼内構造を含む眼の全表面の炎症である、全眼球炎を処置及び／又は防止することができる。本発明のＪＮＫ阻害剤を用いて処置及び／又は防止することができる、更なる眼の炎症性疾患としては、例えば、眼内炎、例えば、化膿性内眼球炎及び寄生虫性眼内炎；濾過胞炎；麦粒腫；霰粒腫；眼瞼炎；まぶたの皮膚炎及び他の炎症；涙腺炎；涙管炎、特に、急性及び慢性涙小管炎；涙嚢炎；眼窩の炎症、特に、眼窩の蜂巣炎、眼窩の骨膜炎、眼窩のテノン嚢炎、眼窩の肉芽腫（肉芽腫性炎症）及び眼窩筋炎が挙げられる。
【００４９】
更に、本発明のＪＮＫ阻害剤を使用して、結膜の炎症性疾患、特に、結膜炎、例えば、急性結膜炎、粘液膿性結膜炎、アトピー性結膜炎、中毒性結膜炎、偽膜性結膜炎、漿液性結膜炎、慢性結膜炎、巨大乳頭結膜炎、濾胞性結膜炎、春季結膜炎、眼瞼結膜炎、及び／又は瞼裂斑炎を処置及び／又は防止することができる。結膜炎は、一般的には感染又はアレルギー反応に起因する、結膜の炎症である。
【００５０】
特に、本発明のＪＮＫ阻害剤を使用して、眼の強膜、角膜、虹彩、毛様体、網膜及び／又は脈絡膜の炎症性疾患を処置及び／又は防止することができる。好ましくは、本発明のＪＮＫ阻害剤を使用して、ブドウ膜炎、すなわち、ブドウ膜の炎症を処置及び／又は防止することができる。ブドウ膜は、眼の中央の有色素血管構造からなり、虹彩、毛様体、及び脈絡膜を含む。典型的には、ブドウ膜炎は、前眼部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、後眼部ブドウ膜炎、及び／又は全ブドウ膜炎として分類され、後者は、ブドウ膜の全ての層の炎症である。更に、ブドウ膜炎は、一方の眼への外傷後の両眼の両側性びまん性肉芽腫性ブドウ膜炎である、交感性眼炎（交感性ブドウ膜炎）を含む。本発明のＪＮＫ阻害剤を用いて処置される特に好ましい前眼部ブドウ膜炎としては、虹彩毛様体炎及び虹彩炎が挙げられる。虹彩炎は、前房及び虹彩の炎症である。虹彩毛様体炎は、虹彩炎と同じ症状を呈するが、硝子体腔における炎症も含む。本発明のＪＮＫ阻害剤を用いて防止及び／又は処置される虹彩毛様体炎の例としては、限定されるものではないが、急性虹彩毛様体炎、亜急性虹彩毛様体炎、及び慢性虹彩毛様体炎、原発性虹彩毛様体炎、再発性虹彩毛様体炎、及び続発性虹彩毛様体炎、水晶体起因性虹彩毛様体炎、フックス虹彩異色性毛様体炎、フォークト・小柳症候群が挙げられる。扁平部炎としても知られる、中間部ブドウ膜炎は、特に、扁平部への炎症物質の「雪だまり（ｓｎｏｗｂａｎｋｉｎｇ）」又は沈着を伴うこともある、硝子体腔における細胞の炎症である硝子体炎を含む。後眼部ブドウ膜炎としては、特に、網膜及び脈絡膜の炎症である脈絡網膜炎、並びに脈絡膜炎（脈絡膜のみ）が挙げられる。より一般的な用語では、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤を使用して、一般的な脈絡網膜炎、例えば、限局性及び／又は播種性脈絡網膜炎症、脈絡網膜炎、脈絡膜炎、網膜脈絡膜炎、後眼部毛様体炎、原田病、感染症及び寄生虫疾患における脈絡網膜炎症及び／又は網膜炎、すなわち、網膜の炎症を処置及び／又は防止することができる。網膜炎、特に、網膜血管炎、例えば、イールズ病及び網膜血管周囲炎に加えて、一般に眼の網膜を損傷する炎症疾患が含まれる。本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤を用いて処置及び／又は防止される眼の強膜、角膜、虹彩、毛様体、網膜及び／又は脈絡膜の更なる炎症性疾患としては、強膜炎、すなわち、強膜の炎症、例えば、前眼部強膜炎、角膜辺縁性強膜炎、後眼部強膜炎、角膜障害を伴う強膜炎及び穿孔性強膜軟化症；上強膜炎、特に、一過性周期性上強膜炎及び結節性上強膜炎；並びに角膜の炎症である角膜炎、特に、角膜潰瘍、表層角膜炎、黄斑角膜炎、糸状角膜炎、雪眼炎、点状角膜炎、角結膜炎、例えば、曝露性角結膜炎、乾性角結膜炎（ドライアイ）、好中球性角結膜炎、結節性眼炎、フリクテン性角結膜炎、春季結膜炎及び他の角結膜炎、間質性角膜炎及び深層角膜炎、硬化性角膜炎、角膜血管新生及び他の角膜炎が挙げられる。
【００５１】
更に、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤は、眼の、術後（若しくは「処置後」）又は外傷後（眼内）炎症を処置及び／又は防止するのに特に有用である。「術後」とは、特に、眼に対して、及び／又は眼の中で行われた手術、好ましくは、前眼部及び／又は後眼部手術、例えば、白内障手術、レーザー眼科手術、緑内障手術、屈折矯正手術、角膜手術、硝子体−網膜手術、眼筋手術、眼形成手術、眼腫瘍手術、翼状片を含む結膜手術、及び／又は涙器を含む手術を指す。好ましくは、「術後」において言及される手術は、複雑な眼の手術及び／又は複雑ではない眼の手術である。特に好ましくは、術後又は外傷後眼内炎症、特に、前眼部及び／又は後眼部手術後の眼内炎症を処置及び／又は防止するための本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤の使用である。
【００５２】
本発明によるＪＮＫ阻害剤を用いて処置及び／又は防止される別の特に好ましい眼疾患は、網膜症である。網膜症の非限定例としては、糖尿病性網膜症、高血圧性網膜症（例えば、動脈高血圧誘発性）、滲出性網膜症、放射線誘発性網膜症、日光誘発性日光網膜症、外傷誘発性網膜症、例えば、プルチェル網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）及び／又は過粘稠度関連網膜症、非糖尿病性増殖性網膜症、及び／又は増殖性硝子体網膜症が挙げられる。本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤は、それぞれ、糖尿病性網膜症及び未熟児網膜症の処置及び／又は防止にとって特に好ましい。
【００５３】
更に、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、一般的な黄斑及び／又は後極部の変性と関連する疾患及び／又は障害の処置において用いられる。特に、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、特に、滲出型及び／又は非滲出型加齢黄斑変性、滲出性及び／又は非滲出性加齢黄斑変性の処置及び／又は防止が好ましい。
【００５４】
本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤を用いて処置することができる例示的な口腔の疾患は、歯周症、特に、慢性歯周炎；粘膜炎、口腔剥離性障害、口腔扁平苔癬、尋常性天疱瘡、歯髄炎；口内炎；顎関節障害、インプラント周囲炎などである。本発明によるＪＮＫ阻害剤を用いて防止及び／又は処置される好ましい口腔又は顎骨の疾患を、一般的な歯髄炎、特に、急性歯髄炎、慢性歯髄炎、増殖性歯髄炎、潰瘍性歯髄炎、不可逆性歯髄炎及び／又は可逆性歯髄炎；インプラント周囲炎；一般的な歯周症、特に、慢性歯周炎、複合歯周炎、単純歯周炎、侵襲性歯周炎、及び／又は例えば、歯髄起源の根尖性歯周炎；歯周症、特に、若年性歯周炎；一般的な歯肉炎、特に、急性歯肉炎、慢性歯肉炎、プラーク性歯肉炎、及び／又は非プラーク性歯肉炎；歯冠周囲炎、特に、急性及び慢性歯冠周囲炎；唾液腺炎；耳下腺炎、特に、感染性耳下腺炎及び自己免疫性耳下腺炎；一般的な口内炎、特に、アフタ性口内炎（例えば、マイナー若しくはメジャー）、ベドナーアフタ、再発性壊死性粘膜腺周囲炎、再発性アフタ性潰瘍、疱疹状口内炎、壊疽性口内炎、義歯性口内炎、潰瘍性口内炎、水疱性口内炎及び／又は歯肉口内炎；粘膜炎、特に、抗新生物療法に起因する、（他の）薬物に起因する、若しくは放射線に起因する粘膜炎、潰瘍性粘膜炎及び／又は口腔粘膜炎；一般的な口唇炎、特に、唇のひび割れ、光線口唇炎、口角炎、湿疹性口唇炎、感染性口唇炎、肉芽腫性口唇炎、薬物関連口唇炎、剥脱性口唇炎、腺性口唇炎、及び／又は形質細胞性口唇炎；特に、口腔及び／又は口唇の蜂巣炎（細菌感染）；剥離性障害、特に、剥離性歯肉炎；及び／又は顎関節障害からなる群から選択することができる。
【００５５】
本発明はまた、膀胱機能の喪失をもたらす疾患（例えば、尿失禁、過活動膀胱、間質性膀胱炎、又は膀胱がん）の処置における使用にとって好適である。特に、泌尿器系の疾患及び／又は障害を、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤を用いて処置及び／又は防止することができる。そのような疾患は、特に、尿管炎；尿路感染（膀胱感染、急性膀胱炎）；一般的な膀胱炎、特に、間質性膀胱炎、ハナー潰瘍、三角炎及び／又は出血性膀胱炎；尿道炎、特に、非淋菌性尿道炎若しくは淋菌性尿道炎；膀胱痛症候群；及び／又は後腹膜線維化症から選択される。
【００５６】
更に、腎臓疾患及び／又は障害を、本発明によるＪＮＫ阻害剤を用いて処置及び／又は防止することができる。本発明によるＪＮＫ阻害剤を用いて処置及び／又は防止される特に好ましい腎臓疾患としては、糸球体症、特に、糸球体腎炎、急性腎臓傷害及び腎症が挙げられる。糸球体腎炎とは、いくつかの腎疾患を指し、多くの疾患が、腎臓中の糸球体又は小血管の炎症を特徴とするが、全ての疾患が必ずしも炎症性成分を有するとは限らない。本発明によるＪＮＫ阻害剤を用いて処置及び／又は防止される糸球体腎炎疾患の非限定例としては、非増殖性糸球体腎炎、特に、微小変化型疾患、巣状分節状糸球体硬化症、巣状分節状糸球体ヒアリン変性及び／又は硬化症、巣状糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、及び／又は菲薄基底膜病、及び増殖性糸球体腎炎、特に、膜性増殖性糸球体腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、管内増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、デンスデポジット病（膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型）、管外糸球体腎炎（半月体形成性糸球体腎炎）、急速進行性糸球体腎炎（ＲＰＧＮ）、特に、Ｉ型ＲＰＧＮ、ＩＩ型ＲＰＧＮ、ＩＩＩ型ＲＰＧＮ、及びＩＶ型ＲＰＧＮ、急性増殖性糸球体腎炎、感染後糸球体腎炎、及び／又はＩｇＡ腎症（ベルガー病）が挙げられる。更に、本発明によるＪＮＫ阻害剤を用いて処置及び／又は防止される疾患としては、急性腎炎症候群；急速進行性腎炎症候群；反復性及び持続性血尿；慢性腎炎症候群；ネフローゼ症候群；特定の形態学的病変を有するタンパク尿；糸球体炎；糸球体症；糸球体硬化症が挙げられる。急性腎臓傷害（「ＡＫＩ」、「急性腎不全」又は「急性腎臓不全」とも呼ばれる）は、腎臓機能の突然の消失であり、腎虚血／再かん流傷害モデルにおいて調査されることが多く、例えば、腎前性ＡＫＩ、内因性ＡＫＩ、腎後性ＡＫＩ、腎尿細管壊死、例えば、急性腎尿細管壊死、腎尿細管壊死を伴うＡＫＩ、皮質壊死、例えば、急性皮質壊死及び腎皮質壊死を伴うＡＫＩ、髄質壊死、例えば、髄質（乳頭）壊死、急性髄質（乳頭）壊死及び慢性髄質（乳頭）壊死を伴うＡＫＩ、又は他のＡＫＩを含む。腎症、すなわち、腎臓に対する損傷又は腎臓の疾患は、非炎症性腎症であるネフローゼ、及び炎症性腎臓疾患である腎炎も含む。本発明によるＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、腎症、特に、膜性腎症、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、遺伝性腎症、鎮痛薬性腎症、ＣＦＨＲ５腎症、造影剤誘導腎症、アミロイド腎症、逆流性腎症及び／又はメソアメリカ腎症；一般的な腎炎、特に、ループス腎炎、腎盂腎炎、間質性腎炎、尿細管間質性腎炎、慢性腎炎若しくは急性腎炎、びまん性増殖性腎炎、及び／又は巣状増殖性腎炎、尿細管間質性腎炎、感染性間質性腎炎、腎盂炎、腎盂腎炎、間質性腎炎；尿細管症、尿細管炎、特に、ＲＴＡ（ＲＴＡ１及びＲＴＡ２）、ファンコニ症候群、バーター症候群、ギッテルマン症候群、リドル症候群、腎性尿崩症、腎乳頭壊死、水腎症、膿腎症及び／又は急性尿細管壊死慢性腎疾患（ＣＫＤ）；グッドパスチャー症候群（抗糸球体基底膜抗体病）；多発性血管炎を伴う肉芽腫症；顕微鏡的多発性血管炎；及び／又はチャーグ・ストラウス症候群を処置及び／又は防止するために使用される。処置及び／又は防止される特に好ましい腎症は、糖尿病性腎症である。
【００５７】
別の使用分野は、疼痛、特に、神経障害性疼痛、偶発的疼痛、突出痛、心因性疼痛、又は幻想痛の処置であり、これらの型の疼痛は全て、急性型又は慢性型にある。
【００５８】
同様に、他のＪＮＫ阻害剤について既に以前に提唱されたように、本発明のＪＮＫ阻害剤を、聴神経鞘腫、肺癌；急性リンパ球性白血病（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；腺癌；肛門癌；気管支癌；頸部癌；子宮頸がん；星状細胞腫；基底細胞腫；Ｂｃｒ−Ａｂｌ形質転換を伴うがん；膀胱がん；芽細胞腫；骨肉腫；脳転移；脳腫瘍；乳がん；バーキットリンパ腫；カルチノイド；子宮頸がん；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；一般的な結腸がん及び結腸癌、特に、盲腸癌、虫垂癌、上行結腸癌、肝湾曲部癌、横行結腸癌、脾湾曲部癌、下行結腸癌、Ｓ状結腸癌、結腸の重複部位の癌腫及び／又は結腸の悪性カルチノイド腫瘍；子宮体癌；頭蓋咽頭腫；ＣＵＰ症候群；ウイルス誘発性腫瘍；ＥＢＶ誘発性Ｂ細胞リンパ腫；子宮内膜癌；赤白血病（Ｍ６）；食道がん；胆嚢がん；消化管がん；消化管間質腫瘍；消化管腫瘍；泌尿生殖器がん；緑内障；グリア芽腫、グリオーマ；頭頸部腫瘍；Ｂ型肝炎誘発性腫瘍；肝細胞又は肝細胞性癌；ヘパトーマ；ヘルペスウイルス誘発性腫瘍；ホジキン症候群；ＨＴＬＶ−１誘発性リンパ腫；ＨＴＬＶ−２誘発性リンパ腫；インスリノーマ；腸がん；カポジ肉腫；腎臓がん；腎臓癌；喉頭がん；白血病；眼瞼腫瘍；一般的な肝臓がん及び肝臓癌、特に、肝臓転移、肝臓細胞癌、肝細胞癌、ヘパトーマ；肺がん；リンパがん；リンパ腫；悪性メラノーマ；乳腺癌；マントル細胞リンパ腫；髄芽細胞腫；巨核芽球性白血病（Ｍ７）；メラノーマ、特に、悪性メラノーマ；髄膜腫；中皮腫；単球性白血病（ＭＳ）；多発性骨髄腫；菌状息肉腫；骨髄芽球性白血病（Ｍ１）；骨髄芽球性白血病（Ｍ２）；骨髄単球性白血病（Ｍ４）；神経線維腫症；非ホジキンリンパ腫；非小細胞癌；非小細胞肺癌；食道がん；食道癌；乏突起膠腫；卵巣がん；卵巣癌；膵臓がん；膵臓癌；パピローマウイルス誘発性癌；陰茎がん；下垂体部腫瘍；形質細胞腫；前骨髄球性白血病（Ｍ３）；前立腺がん；前立腺腫瘍；直腸腫瘍；直腸癌；腎細胞癌；網膜芽腫；肉腫；シュネーベルガー病；小細胞肺癌；小腸がん；小腸腫瘍；軟部組織腫瘍；棘細胞癌；扁平上皮癌；胃がん；精巣がん；咽喉がん；胸腺腫；甲状腺がん；甲状腺癌；舌がん；未分化ＡＭＬ（ＭＯ）；尿道がん；子宮がん；膣がん；フォン・ヒッペル・リンドウ病；外陰部がん；ウィルムス腫瘍；色素性乾皮症などの、がん及び腫瘍疾患のような増殖性疾患の処置のために使用することができる。
【００５９】
ＪＮＫシグナリングは多くの心血管疾患及び障害にも関与するため、そのような疾患の処置におけるＪＮＫ阻害剤の使用は、既に過去に提言されている。したがって、例えば、動脈高血圧；アテローム性動脈硬化症；アテローム性動脈硬化症病変；ベーチェット症候群；血管の分岐；心臓肥大；心血管肥大；心筋症、特に、化学療法誘発性心筋症；脳虚血；冠動脈性心疾患；腹部大動脈の拡張；局所的脳虚血；全脳虚血；心肥大；腎臓下動脈瘤高血圧；虚血；心筋梗塞、特に、急性心筋梗塞；心筋炎；再かん流；再狭窄；血管炎；ウェゲナー肉芽腫症などの心血管疾患の処置のために、本発明の阻害剤を使用することができる。
【００６０】
心血管疾患においては、本発明のＪＮＫ阻害剤を、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ手術）；経皮経管冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）；及び／又は例えば、前記（外科的）処置の結果生じる内膜過形成を防止若しくは処置するためのステント処置に対する補完として使用することもできる。
【００６１】
本発明のＪＮＫ阻害剤を用いて効率的に処置することができる呼吸器系の疾患、特に、肺疾患は、例えば、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）；喘息；呼吸系を含む慢性疾患；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；嚢胞性線維症；炎症性肺疾患；肺炎；肺線維症などである。
【００６２】
先行技術における阻害剤と同様に、本発明の阻害剤を使用して、腸管の疾患、例えば、大腸炎（例えば、非定型大腸炎、化学性大腸炎；コラーゲン蓄積大腸炎、遠位大腸炎、空置性大腸炎；劇症大腸炎、不確定大腸炎、感染性大腸炎、虚血性大腸炎、リンパ球性大腸炎、又は顕微鏡的大腸炎）、クローン病、胃腸炎、ヒルシュスプリング病、炎症性消化器系疾患；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、Ｍｏｒｂｕｓ  Ｃｒｏｈｎ、非慢性又は慢性消化器系疾患、非慢性又は慢性炎症性消化器系疾患；限局性腸炎；潰瘍性大腸炎などを処置することもできる。
【００６３】
本発明のＪＮＫ阻害剤は、例えば、細菌又はウイルス感染の結果生じる感染症の処置のための治療剤としても機能できる。本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤は、例えば、前記感染により引き起こされる炎症反応を防止するか、又は改善することができる。非限定的であると考えられるそのような疾患状態の例は、ウイルス性脳炎；ウイルス誘発性がん（例えば、上記のような）、ヒト免疫不全ウイルス性認知症、髄膜炎、髄膜脳炎、脳脊髄炎、へんとう炎、水痘帯状疱疹ウイルス感染などである。
【００６４】
本発明のＪＮＫ阻害剤を処置として使用することができる多くの他の疾患、疾患状態及び障害、例えば、アースコグ症候群、アセトアミノフェン肝毒性；アルダー・レイリー異常症；円形脱毛症；アルファ−１−抗トリプシン欠乏症；アナフィラキシー；アポトーシス；アポトーシス細胞死；非定型溶血性尿毒症症候群；好塩基球減少症；好塩基球増加症；双極性障害；熱傷；細胞剪断ストレス；チェディアック・東症候群；化学療法薬に起因するＤＮＡ損傷；胆汁鬱滞；第１１染色体、部分モノソミー１１ｑ；第２２染色体、モザイクトリソミー；慢性肉芽腫症；慢性又は劇症肝炎などの肝炎；臨床的鬱病；分類不能型低ガンマグロブリン血症；先天性Ｃ３欠乏症；活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）からのＣＴＬ保護；難聴；鬱病及び抑鬱障害（特に、抑鬱障害の防止はサイトカイン誘導性疾患挙動の背景で発症する）、ディジョージ症候群；アポトーシス欠損により引き起こされる疾患；肝臓の疾患；脊椎の疾患；子宮の疾患；ＤＮＡ損傷剤及び／又はイオン化放射線への曝露及びその結果の細胞ストレスに起因する疾患状態及び症状；ダウン症候群；デュシェンヌ型筋ジストロフィー；外胚葉異形成症；子宮内膜症；好酸球減少症；好酸球増加症；興奮毒性（ｅｘｏｃｉｔｏｘｉｃ）細胞死；胎児性アルコール症候群；線維症；線維性疾患；線維組織の形成；フリーラジカル（細胞ストレスをもたらす）；移植片拒絶；移植片対宿主疾患、特に、皮膚移植片対宿主；脱毛；溶血性尿毒症症候群；肝毒性；糖尿病誘発性痛覚過敏症などの痛覚過敏症；異常高熱；低血糖症；甲状腺機能低下症；特発性好酸球増加症候群；ＩｇＡ腎症；幼児伴性無ガンマグロブリン血症；炎症性疼痛；腎臓下動脈瘤；膵島再生；膵島移植；ヨブ症候群（高ＩｇＥ）；走化性欠損白血球症候群；白血球グルコース−６−リン酸脱水素酵素欠損症；大脳白質萎縮症；白血球減少症；リンパ球性白血球増加症；リンパ球減少症；リンパ球増加症；大鬱病；躁病；躁鬱病；マルファン症候群；肥満細胞症；メイ・ヘグリン異常症；膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型；単球減少症；単球増加症；ミエロペルオキシダーゼ欠損症−良性；ミオパシー；好中球減少症；好中球増加症；ネゼロフ症候群；臓器移植；酸化ストレス傷害；ペルゲル・フェット核異常；多発性嚢胞腎；透析後症候群；放射線症候群；放射線療法；腎疾患；腎不全；活性化誘導細胞死からのＣＴＬのレスキュー；重症複合免疫不全疾患；移植拒絶；移植；トリソミー；単極性鬱病；ＵＶ誘導傷害；ウィスコット・アルドリッチ症候群；創傷治癒などが存在する。
【００６５】
本発明の発明者らは、顎関節障害、粘膜炎、口内炎、口腔扁平苔癬（剥離性障害）、尋常性天疱瘡（剥離性障害）、歯周炎、慢性歯周炎、歯髄炎、インプラント周囲炎、ブドウ膜炎（前眼部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、後眼部ブドウ膜炎）、乾性角結膜炎（ドライアイ症候群）、特に、滲出型及び非滲出型の加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜症、特に、糖尿病性網膜症、術後又は外傷後眼内炎症、好ましくは、前眼部及び／又は後眼部手術後の眼内炎症、糸球体腎炎、腎症、特に、糖尿病性腎症、間質性膀胱炎、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ手術）、急性心筋梗塞、経皮経管冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の内膜過形成の防止、ステント留置後の内膜過形成の防止、アテローム性動脈硬化症、ＣＯＰＤ、喘息、関節リウマチ、変形性関節症、クローン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、乾癬、糖尿病、脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病、全身性エリテマトーデス、及び血管炎、特に、ウェゲナー肉芽腫症が、本発明のＪＮＫ阻害剤を用いる処置にとって特に有用であると考えている。
【００６６】
別の態様によれば、本発明は、移植前又は移植後の組織又は臓器移植片の（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの）処置のための１５０未満の長さのアミノ酸を含むＪＮＫ阻害剤配列を提供する。用語「移植前」は、単離の時間及びかん流／輸送の時間を含む。したがって、「移植前の」組織又は臓器移植片の処置とは、例えば、単離中及び／又はかん流中及び／又は輸送中の処置を指す。特に、組織又は臓器移植片の単離のために使用される溶液並びに組織又は臓器移植片のかん流、輸送及び／又はその他処置のために使用される溶液は、好ましくは、本発明によるＪＮＫ阻害剤を含有することができる。
【００６７】
移植において、許容される冷虚血時間（ＣＩＴ）及び許容される温虚血時間（ＷＩＴ）は、重要な役割を果たす。ＣＩＴは、ドナーから臓器が取り出される間、特に、冷溶液による臓器のかん流／処置の時間から、レシピエントへのその移植までに経過する時間の長さである。ＷＩＴは、一般に、常温条件下での細胞及び組織の虚血を記述するために使用される用語である。特に、ＷＩＴは、ドナーの死亡の間、特に、交差クランピング又は心臓が鼓動していないドナーにおける心停止の時間から、冷かん流が開始されるまでに経過する時間の長さを指す。更に、ＷＩＴはまた、氷からの臓器の取り出しから、再かん流までの、埋め込みの間の虚血を指してもよい。同種移植においては、通常、脳死ドナーを起源とする移植片は、典型的には、ＷＩＴにはかけられないが、８〜１２ｈのＣＩＴ（調達病院から単離実験室までの輸送に必要な時間）を有する一方、心臓が鼓動していないドナーからの移植片は、典型的には、より長いＷＩＴ及びまた８〜１２ｈのＣＩＴにさらされる。しかしながら、そのような移植は、ＷＩＴに起因する損傷に関する関心のため、現在は日常的に使用されていない。自己移植においては、ＷＩＴを行ってもよいが、ＣＩＴは通常限定される（例えば、慢性膵炎を有する患者における膵島自己移植においては、典型的には１〜２ｈ）。
【００６８】
ドナーによって、臓器及び／又は組織は、移植前に可変量の時間にわたって血液をかん流されず、虚血をもたらす。虚血は、移植、例えば、腎臓移植に付随する不可避の事象である。虚血変化は、重症血行動態障害と関連する脳死から始まる：頭蓋内圧の増大は徐脈及び心拍出量の減少をもたらす；クッシング反射は、頻脈及び血圧の上昇を引き起こす；短期間の安定化後、全身血管抵抗は低血圧と共に低下し、心停止をもたらす。フリーラジカル媒介性傷害は、炎症性サイトカインを放出させ、先天性免疫を活性化する。これらの変化−初期先天性応答及び虚血組織損傷は全て、適応反応の発達において役割を果たし、次いで、移植片拒絶をもたらし得ると提言されている。移植前の様々な期間の臓器及び／又は組織の低温保存は、虚血組織損傷を増大させる。虚血傷害の最終段階は、再かん流の間に起こる。虚血傷害のエフェクター相である再かん流傷害は、初期の損傷の数時間又は数日後に生じる。修復及び再生プロセスは、細胞アポトーシス、自食作用、及び壊死と共に起こる；臓器の運命は、細胞死又は再生が優勢になるかどうかに依存する。全プロセスは、虚血−再かん流（Ｉ−Ｒ）傷害と記載されている。それは、移植される臓器又は組織の初期機能だけでなく、後期機能にも大きく影響する。したがって、Ｉ−Ｒ傷害の防止は、ドナーの事前処置による臓器回収の前に既に開始することができる。
【００６９】
そのような移植片は、宿主に移植されるまで、その生存性及び機能性を改善するために、本発明によるＪＮＫ阻害剤により（予備）処置することができることがわかった。本発明のその態様について、移植片は、特に、腎臓、心臓、肺、膵臓、特に、膵島（ランゲルハンス島とも呼ばれる）、肝臓、血液細胞、骨髄、角膜、事故で切断された四肢、特に、指、手、足、顔、鼻、骨、心臓弁、血管又は腸移植片、好ましくは、腎臓、心臓、膵臓、特に、膵島（ランゲルハンス島とも呼ばれる）、又は皮膚移植片である。
【００７０】
更に、更なる態様において、本発明は、移植中又は移植後の、組織若しくは臓器移植片、又は組織若しくは臓器移植を受けた動物若しくはヒトの処置のための本明細書に定義されるＪＮＫ阻害剤を提供する。用語「移植後」とは、特に、臓器又は組織、例えば、腎臓の再かん流を指し、再かん流は、例えば、それぞれの血流のクランプを外すことにより始まる。移植後の本発明によるＪＮＫ阻害剤を用いる処置は、特に、再かん流後の最大４時間、好ましくは再かん流後の最大２時間、より好ましくは再かん流後の最大１時間及び／又は移植の次の日での時間間隔を指す。移植後、例えば、腎臓移植後の処置のために、本発明によるＪＮＫ阻害剤を、例えば、全身的に、特に、静脈内に、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲、より好ましくは、０．５〜２ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、単回用量又は反復用量として、本明細書に記載の医薬組成物として組織又は臓器移植を受けた、例えば動物又はヒトに投与することができる。
【００７１】
本発明のその態様について、移植片は、特に、腎臓、心臓、肺、膵臓、特に、膵島（ランゲルハンス島とも呼ばれる）、肝臓、血液細胞、骨髄、角膜、事故で切断された四肢、特に、指、手、足、顔、鼻、骨、心臓弁、血管又は腸移植片、好ましくは、腎臓、心臓、膵臓、特に、膵島（ランゲルハンス島とも呼ばれる）、又は皮膚移植片である。
【００７２】
当技術分野で公知のＪＮＫ阻害剤配列は限られた数の疾患にとって有用であることがわかっているに過ぎないため、本明細書に定義されるＪＮＫ阻害剤配列を、上記のＪＮＫシグナリングと強く関連する疾患又は障害の処置のために使用することができ、それにとって好適であるということは驚くべき知見であった。これは、一般的なＪＮＫ阻害剤配列が当技術分野から公知であったとしても、先行技術によって自明でもなく、又は示唆もされていない。
【００７３】
典型的には、上記に定義されたＪＮＫ阻害剤配列を、ヒト又はラットのＩＢ１配列から、好ましくは、配列番号１０２（ラット由来ＩＢ１  ｃＤＮＡ配列及びその予測アミノ酸配列を記載する）、配列番号１０３（ｒＩＢ１遺伝子−スプライスドナーのエクソン−イントロン境界によりコードされるラット由来ＩＢ１タンパク質配列を記載する）、配列番号１０４（ヒト（Homo  sapiens）由来ＩＢ１タンパク質配列を記載する）、又は配列番号１０５（ヒト由来ＩＢ１  ｃＤＮＡ配列を記載する）の配列のいずれかにより定義又はコードされるアミノ酸配列から、より好ましくは、配列番号１０４（ヒト由来ＩＢ１タンパク質配列を記載する）、又は配列番号１０５（ヒト由来ＩＢ１  ｃＤＮＡ配列を記載する）の配列のいずれかにより定義又はコードされるアミノ酸配列から、又はその任意の断片若しくはバリアントから誘導することができる。換言すれば、ＪＮＫ阻害剤配列は、ヒト又はラットＩＢ１配列の断片、バリアント、又はそのような断片のバリアントを含む。ヒト又はラットＩＢ配列は、それぞれ、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４又は配列番号１０５の配列によって定義又はコードされる。
【００７４】
好ましくは、本明細書で使用されるそのようなＪＮＫ阻害剤配列は、全長１５０個未満のアミノ酸残基、好ましくは、５〜１５０個の範囲のアミノ酸残基、より好ましくは、１０〜１００個のアミノ酸残基、更により好ましくは、１０〜７５個のアミノ酸残基、最も好ましくは、１０〜５０個の範囲のアミノ酸残基、例えば、１０〜３０、１０〜２０、又は１０〜１５個のアミノ酸残基を含む。
【００７５】
より好ましくは、そのようなＪＮＫ阻害剤配列及び上記範囲を、上記配列のいずれかから、更により好ましくは、配列番号１０４に従って定義された、又は配列番号１０５によりコードされたアミノ酸配列から、更により好ましくは、配列番号１０５のヌクレオチド４２０〜９８０の領域又は配列番号１０４のアミノ酸１０５〜２９１、最も好ましくは、配列番号１０５のヌクレオチド５６１〜６４７の領域又は配列番号１０４のアミノ酸１５２〜１８０から選択することができる。
【００７６】
特定の実施形態によれば、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、典型的には、ＪＮＫに結合する、及び／又は少なくとも１つのＪＮＫ活性化転写因子、例えば、ｃ−Ｊｕｎ若しくはＡＴＦ２（例えば、それぞれ、配列番号１５及び配列番号１６を参照されたい）又はＥｌｋ１の活性化を阻害する。
【００７７】
同様に、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、好ましくは、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００のいずれか１つに記載の少なくとも１つのアミノ酸配列、又はその断片、誘導体若しくはバリアントを含む、又はそれからなる。より好ましくは、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００のアミノ酸配列、又はそのバリアント、断片若しくは誘導体の１、２、３、４又は更に多くのコピーを含有してもよい。１より多いコピーで存在する場合、本明細書で使用される、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００のこれらのアミノ酸配列、又はそのバリアント、断片、若しくは誘導体を、リンカー配列を用いずに互いに直接連結するか、又は１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸を含むリンカー配列を介して連結することができる。リンカー配列を形成するアミノ酸は、好ましくは、アミノ酸残基としてグリシン又はプロリンから選択される。より好ましくは、本明細書で使用される、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００のこれらのアミノ酸配列、又はその断片、バリアント若しくは誘導体を、２個、３個又はそれ以上のプロリン残基のヒンジによって互いに分離することができる。
【００７８】
本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、又は両方の組合せから構成されていてもよい。好ましくは、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、少なくとも１個又は更には２個、好ましくは少なくとも３、４又は５個、より好ましくは少なくとも６、７、８又は９個、更により好ましくは少なくとも１０個以上のＤ−及び／又はＬ−アミノ酸を含み、ここで、Ｄ−及び／又はＬ−アミノ酸を、ブロックワイズに、非ブロックワイズに、又は交互の様式で、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列中に配置してもよい。
【００７９】
１つの好ましい実施形態によれば、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、Ｌ−アミノ酸のみから構成されていてもよい。次いで、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、配列番号１又は配列番号３の少なくとも１つの「天然ＪＮＫ阻害剤配列」を含む、又はそれからなってもよい。これに関連して、用語「天然」又は「天然ＪＮＫ阻害剤配列」は、全てＬ−アミノ酸から構成される、本明細書で使用される配列番号１又は配列番号３のいずれかの変化していないＪＮＫ阻害剤配列を指す。
【００８０】
したがって、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤は、少なくとも１つの（天然）アミノ酸配列ＮＨ２−Ｘｎｂ−Ｘｎａ−ＲＰＴＴＬＸＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＩＢ一般（ｓ））（配列番号３）及び／又はＩＢ１のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）ＸＲＰＴＴＬＸＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤＳ／ＴＸ（Ｌ−ＩＢ（一般）（配列番号１９）を含むか、又はそれからなってもよい。これに関連して、それぞれのＸは、典型的には、好ましくは任意の（天然）アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基を表す。Ｘｎａは、典型的には、好ましくはセリン又はトレオニン以外の任意のアミノ酸残基から選択される１つのアミノ酸残基を表し、ここで、ｎ（Ｘの反復数）は０又は１である。更に、それぞれのＸｎｂを、任意のアミノ酸残基から選択することができ、ここで、ｎ（Ｘの反復数）は０〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０以上であるが、但し、Ｘｎａのｎ（Ｘの反復数）が０である場合、Ｘｎｂは好ましくはこの位置でのセリン又はトレオニンを回避するために、そのＣ末端にセリン又はトレオニンを含まない。好ましくは、Ｘｎｂは、配列番号１又は配列番号３に由来するペプチド残基の連続ストレッチを表す。Ｘｎａ及びＸｎｂは、Ｄ又はＬアミノ酸を表してもよい。更に、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１のＪＮＫ結合ドメインＤＴＹＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤＴ（Ｌ−ＩＢ１）（配列番号１７）を含む群から選択される少なくとも１つの（天然）アミノ酸配列を含むか、又はそれからなってもよい。より好ましくは、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、少なくとも１つの（天然）アミノ酸配列ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＩＢ１（ｓ））（配列番号１）を更に含むか、又はそれからなってもよい。更に、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１  Ｌ−ＩＢ１（ｓ１）（ＮＨ２−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ、配列番号３３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２）（ＮＨ２−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ、配列番号３４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３）（ＮＨ２−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ、配列番号３５）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ４）（ＮＨ２−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号３６）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ５）（ＮＨ２−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ、配列番号３７）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ６）（ＮＨ２−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ、配列番号３８）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ７）（ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ、配列番号３９）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ８）（ＮＨ２−ＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ、配列番号４０）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ９）（ＮＨ２−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ、配列番号４１）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１０）（ＮＨ２−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ、配列番号４２）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１１）（ＮＨ２−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号４３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１２）（ＮＨ２−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ、配列番号４４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１３）（ＮＨ２−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ、配列番号４５）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１４）（ＮＨ２−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ���配列番号４６）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１５）（ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰ−ＣＯＯＨ、配列番号４７）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１６）（ＮＨ２−ＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ、配列番号４８）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１７）（ＮＨ２−ＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ、配列番号４９）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１８）（ＮＨ２−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ、配列番号５０）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１９）（ＮＨ２−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号５１）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２０）（ＮＨ２−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ、配列番号５２）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２１）（ＮＨ２−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ、配列番号５３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２２）（ＮＨ２−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ、配列番号５４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２３）（ＮＨ２−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰ−ＣＯＯＨ、配列番号５５）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２４）（ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ−ＣＯＯＨ、配列番号５６）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２５）（ＮＨ２−ＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ、配列番号５７）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２６）（ＮＨ２−ＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ、配列番号５８）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２７）（ＮＨ２−ＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ、配列番号５９）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２８）（ＮＨ２−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号６０）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２９）（ＮＨ２−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ、配列番号６１）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３０）（ＮＨ２−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ、配列番号６２）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３１）（ＮＨ２−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ、配列番号６３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３２）（ＮＨ２−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰ−ＣＯＯＨ、配列番号６４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３３）（ＮＨ２−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ−ＣＯＯＨ、配列番号６５）；及びＬ−ＩＢ１（ｓ３４）（ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬ−ＣＯＯＨ、配列番号６６）のＪＮＫ結合ドメインを含む群から選択される少なくとも１つの（天然）アミノ酸配列を含むか、又はそれからなってもよい。
【００８１】
更に、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１の（長い）ＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）ＰＧＴＧＣＧＤＴＹＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤＴ（ＩＢ１−ｌｏｎｇ）（配列番号１３）、ＩＢ２の（長い）ＪＮＫ結合ドメインＩＰＳＰＳＶＥＥＰＨＫＨＲＰＴＴＬＲＬＴＴＬＧＡＱＤＳ（ＩＢ２−ｌｏｎｇ）（配列番号１４）、ｃ−ＪｕｎのＪＮＫ結合ドメインＧＡＹＧＹＳＮＰＫＩＬＫＱＳＭＴＬＮＬＡＤＰＶＧＮＬＫＰＨ（ｃ−Ｊｕｎ）（配列番号１５）、ＡＴＦ２のＪＮＫ結合ドメインＴＮＥＤＨＬＡＶＨＫＨＫＨＥＭＴＬＫＦＧＰＡＲＮＤＳＶＩＶ（ＡＴＦ２）（配列番号１６）を含む群から選択される少なくとも１つの（天然）アミノ酸配列を含むか、又はそれからなってもよい（例えば、図１Ａ〜図１Ｃを参照されたい）。これに関連して、アラインメントは、部分的に保存された８アミノ酸の配列（例えば、図１Ａを参照されたい）を示し、ＩＢ１とＩＢ２のＪＢＤの更なる比較は、２つの配列間で高度に保存された７個及び３個のアミノ酸の２つのブロックを示した。
【００８２】
別の好ましい実施形態によれば、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、部分的に、又は専ら、上記で定義されたＤ−アミノ酸から構成されていてもよい。より好ましくは、Ｄ−アミノ酸から構成されるこれらのＪＮＫ阻害剤配列は、上記の（天然）ＪＮＫ阻害剤配列の非天然Ｄレトロ−インベルソ配列である。用語「レトロ−インベルソ配列」とは、配列の向きが逆転し、各アミノ酸残基のキラリティが反転した線状ペプチド配列の異性体を指す（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、７４４〜７４６頁（１９９４）；Ｂｒａｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、６９２〜６９３頁（１９９４）を参照されたい）。Ｄ−エナンチオマーとリバース合成との組合せの利点は、各アミド結合中のカルボニル基とアミノ基の位置が交換されるが、各アルファ炭素での側鎖基の位置が保持されるということである。別途、特に記述しない限り、本発明に従って使用される任意の所与のＬ−アミノ酸配列又はペプチドを、対応する天然のＬ−アミノ酸配列又はペプチドの配列又はペプチドのリバースを合成することによって、Ｄレトロ−インベルソ配列又はペプチドに変換することができると推定される。
【００８３】
本明細書で使用され、上記で定義されたＤレトロ−インベルソ配列は、様々な有用な特性を有する。例えば、本明細書で使用されるＤレトロ−インベルソ配列は、本明細書で使用されるＬ−アミノ酸配列と同程度に効率的に細胞に進入するが、本明細書で使用されるＤレトロ−インベルソ配列は対応するＬ−アミノ酸配列よりも安定である。
【００８４】
したがって、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、アミノ酸配列ＮＨ２−Ｘｎｂ−ＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲ−Ｘｎａ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＩＢ１一般（ｓ））（配列番号４）及び／又はＸＳ／ＴＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲＸ（Ｄ−ＩＢ（一般））（配列番号２０）の少なくとも１つのＤレトロ−インベルソ配列を含むか、又はそれからなってもよい。この状況で使用される場合、Ｘ、Ｘｎａ及びＸｎｂは上記で定義された通りであり（好ましくは、Ｄアミノ酸を表す）、ここで、Ｘｎｂは好ましくは、配列番号２又は配列番号４に由来する残基の連続ストレッチを表す。更に、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）ＴＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＹＴＤ（Ｄ−ＩＢ１）（配列番号１８）を含むアミノ酸配列の少なくとも１つのＤレトロ−インベルソ配列を含むか、又はそれからなってもよい。より好ましくは、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、アミノ酸配列ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＩＢ１（ｓ））（配列番号２）の少なくとも１つのＤレトロ−インベルソ配列を含むか、又はそれからなってもよい。更に、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１  Ｄ−ＩＢ１（ｓ１）（ＮＨ２−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号６７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２）（ＮＨ２−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ、配列番号６８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３）（ＮＨ２−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ、配列番号６９）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ４）（ＮＨ２−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号７０）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ５）（ＮＨ２−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ、配列番号７１）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ６）（ＮＨ２−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ、配列番号７２）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ７）（ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ、配列番号７３）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ８）（ＮＨ２−ＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号７４）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ９）（ＮＨ２−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ、配列番号７５）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１０）（ＮＨ２−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ、配列番号７６）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１１）（ＮＨ２−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号７７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１２）（ＮＨ２−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ、配列番号７８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１３）（ＮＨ２−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ、配列番号７９）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１４）（ＮＨ２−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ、配列番号８０）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１５）（ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬ−ＣＯＯＨ、配列番号８１）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１６）（ＮＨ２−ＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号８２）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１７）（ＮＨ２−ＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ、配列番号８３）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１８）（ＮＨ２−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ、配列番号８４）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１９）（ＮＨ２−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号８５）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２０）（ＮＨ２−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ、配列番号８６）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２１）���ＮＨ２−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ、配列番号８７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２２）（ＮＨ２−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ、配列番号８８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２３）（ＮＨ２−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬ−ＣＯＯＨ、配列番号８９）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２４）（ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮ−ＣＯＯＨ、配列番号９０）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２５）（ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬ−ＣＯＯＨ、配列番号９１）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２６）（ＮＨ２−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮ−ＣＯＯＨ、配列番号９２）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２７）（ＮＨ２−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬ−ＣＯＯＨ、配列番号９３）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２８）（ＮＨ２−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ、配列番号９４）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２９）（ＮＨ２−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ、配列番号９５）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３０）（ＮＨ２−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ、配列番号９６）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３１）（ＮＨ２−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号９７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３２）（ＮＨ２−ＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ、配列番号９８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３３）（ＮＨ２−ＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ、配列番号９９）；及びＤ−ＩＢ１（ｓ３４）（ＮＨ２−ＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号１００）のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）を含むアミノ酸配列の少なくとも１つのＤレトロ−インベルソ配列を含むか、又はそれからなってもよい。
【００８５】
本明細書で使用され、上記に開示されたＪＮＫ阻害剤配列を、表１に提示する（配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００）。この表は、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列の名称、並びにその配列識別番号、その長さ、及びアミノ酸配列を提示する。更に、表１は、例えば、それぞれ、配列番号１、２、５、６、９及び１１並びに配列番号３、４、７、８、１０及び１２に関する配列並びにその一般式を示す。表１は、キメラ配列である配列番号９〜１２及び配列番号２３〜３２（以下を参照されたい）、Ｌ−ＩＢ１配列である配列番号３３〜６６及びＤ−ＩＢ１配列である配列番号６７〜１００を更に開示する。
【００８６】
【表１−１】
2020073573.tif 000002
【表１−２】
2020073573.tif 000003
【表１−３】
2020073573.tif 000004
【表１−４】
2020073573.tif 000005
【００８７】
別の好ましい実施形態によれば、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の上記で定義された天然又は非天然アミノ酸配列の少なくとも１つのバリアント、断片及び／又は誘導体を含むか、又はそれからなる。好ましくは、これらのバリアント、断片及び／又は誘導体は、本明細書で使用される上記に開示された天然又は非天然ＪＮＫ阻害剤配列、特に、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の天然又は非天然アミノ酸配列の生物活性、すなわち、ＪＮＫへの結合、及び／又は少なくとも１つのＪＮＫ活性化転写因子、例えば、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２若しくはＥｌｋ１の活性化の阻害を保持する。様々な試験、例えば、ペプチドのその標的分子への結合試験により、又は生物物理学的方法、例えば、分光法、コンピュータモデリング、構造分析などにより、機能を試験することができる。特に、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列又はそのバリアント、断片及び／又は誘導体を、ペプチドの疎水性及び親水性領域を同定するために使用することができ、したがって、結合実験などにおける実験操作のため、又は抗体合成のための基質の設計に役立つ親水性分析（例えば、Ｈｏｐｐ及びＷｏｏｄｓ、１９８１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：３８２４〜３８２８頁を参照されたい）によって分析することができる。また、二次構造分析を実施して、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列又はそのバリアント、断片及び／又は誘導体の領域を同定し、特定の構造モチーフを推定することもできる（例えば、Ｃｈｏｕ及びＦａｓｍａｎ、１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３：２２２〜２２３頁を参照されたい）。操作、翻訳、二次構造予測、親水性及び疎水性プロファイル、オープンリーディングフレーム予測及びプロッティング、並びに配列相同性の決定を、当技術分野で利用可能なコンピュータソフトウェアプログラムを使用して達成することができる。構造分析の他の方法としては、例えば、Ｘ線結晶構造解析（例えば、Ｅｎｇｓｔｒｏｍ、１９７４．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  １１：７〜１３頁を参照されたい）、質量分析及びガスクロマトグラフィー（例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ、１９９７、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照されたい）が挙げられ、コンピュータモデリング（例えば、Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ及びＺｏｌｌｅｒ（編）、１９８６、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照されたい）を用いることもできる。
【００８８】
したがって、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の（天然又は非天然）アミノ酸配列の少なくとも１つのバリアントを含むか、又はそれからなってもよい。本発明においては、「配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の（天然又は非天然）アミノ酸配列のバリアント」は、好ましくは、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかに由来する配列であり、ここで、バリアントは、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００のアミノ酸配列のアミノ酸変化を含む。そのような変化は、典型的には、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００のアミノ酸の１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個の置換、付加及び／又は欠失を含み、ここで、バリアントは、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は更には９９％の配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかとの配列同一性を示す。
【００８９】
上記で定義され、本明細書で使用される配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の（天然又は非天然）アミノ酸配列のバリアントが特定のアミノ酸の置換によって得られる場合、そのような置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換を含む。保存的アミノ酸置換は、群のメンバー間での置換が分子の生物活性を保持するような、十分に類似する物理化学的特性を有する群内の同義アミノ酸残基を含んでもよい（例えば、Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．（１９７４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８５、８６２〜８６４頁を参照されたい）。特に、挿入及び／又は欠失がわずかなアミノ酸、例えば、２０個未満、好ましくは、１０個未満しか含まず、機能活性にとって重要であるアミノ酸を除去しない、又は置き換えない場合、アミノ酸を、その機能を変化させることなく上記で定義された配列中で挿入及び／又は欠失させることもできることが当業者には明らかである。更に、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列又は本明細書で使用されるキメラペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの不活化を回避するために、ホスホリラーゼ、好ましくは、キナーゼに接近可能であるアミノ酸位置に追加のトレオニンをもたらす置換を、本明細書で使用されるバリアントにおいては回避すべきである。
【００９０】
好ましくは、同じ群に分類され、典型的には、保存的アミノ酸置換によって交換可能である同義アミノ酸残基を、表２に定義する。
【００９１】
【表２】
2020073573.tif 000006
【００９２】
本明細書で使用される配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００のバリアントの特定の形態は、典型的には、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００と比較して少なくとも１個の欠失によって変化した、本明細書で使用される配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の（天然又は非天然）アミノ酸配列の断片である。好ましくは、断片は、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００のいずれかの少なくとも４個の連続するアミノ酸を含み、その長さは、典型的には、これらの配列のいずれかに由来するエピトープの特異的認識を可能にするために十分なものである。更により好ましくは、断片は、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００のいずれかの４〜１８、４〜１５、又は最も好ましくは４〜１０個の連続するアミノ酸を含み、その範囲の下限は、４、又は５、６、７、８、９、又は１０であってもよい。欠失されるアミノ酸は、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の任意の位置にあってもよいが、好ましくは、Ｎ又はＣ末端にある。
【００９３】
更に、上記のような、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の（天然又は非天然）アミノ酸配列の断片は、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は更には９９％の本明細書で使用される配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかとの配列同一性を有する配列と定義することができる。
【００９４】
本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、上記で定義された配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の（天然又は非天然）アミノ酸配列の少なくとも１つの誘導体を更に含むか、又はそれからなってもよい。これに関連して、「配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の（天然又は非天然）アミノ酸配列の誘導体」は、好ましくは、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかに由来するアミノ酸配列であり、ここで、誘導体は、少なくとも１個の改変されたＬ−又はＤ−アミノ酸（非天然アミノ酸を形成する）、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、更により好ましくは、１〜５個の改変されたＬ−又はＤ−アミノ酸を含む。バリアント又は断片の誘導体もまた、本発明の範囲内にある。
【００９５】
これに関する「改変されたアミノ酸」は、例えば、様々な生物における異なるグリコシル化、リン酸化又は特定のアミノ酸の標識によって変化した任意のアミノ酸であってもよい。次いで、そのような標識は、典型的には、
（ｉ）放射性標識、すなわち、放射性リン酸化又は硫黄、水素、炭素、窒素などを用いる放射性標識；
（ｉｉ）有色色素（例えば、ジゴキシゲニンなど）；
（ｉｉｉ）蛍光基（例えば、フルオレセインなど）；
（ｉｖ）化学発光基；
（ｖ）固相上への固定のための基（例えば、Ｈｉｓ−タグ、ビオチン、ストレプタグ、フラッグタグ、抗体、抗原など）；及び
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）の下で記載された２つ以上の標識の組合せ
を含む標識群から選択される。
【００９６】
上記に関連して、本発明のクエリアミノ酸配列に対して少なくとも、例えば、９５％の「配列同一性を有する」配列を有するアミノ酸配列は、対象アミノ酸配列が、クエリアミノ酸配列のそれぞれの１００個のアミノ酸あたり、５個までのアミノ酸変化を含んでもよいことを除いて、対象アミノ酸配列の配列がクエリ配列と同一であることを意味することが意図される。換言すれば、クエリアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸配列を得るために、対象配列中のアミノ酸残基の最大５％（１００個のうちの５個）を、挿入するか、又は別のアミノ酸で置換するか、又は欠失させることができる。
【００９７】
正確に一致しない配列については、第１の配列の「同一性％」を、第２の配列に対して決定することができる。一般に、比較されるこれらの２つの配列を整列させて、配列間の最大相関を得る。これは、アラインメントの程度を増強するために、一方又は両方の配列に「ギャップ」を挿入することを含んでもよい。次いで、同じか、若しくは類似する長さの配列にとって特に好適である、比較される配列のそれぞれの全長にわたって（いわゆるグローバルアラインメント）、又は等しくない長さの配列にとってより好適である、より短い、規定の長さにわたって（いわゆるグローバルアラインメント）、同一性％を決定することができる。
【００９８】
特に、本明細書で使用されるような、２つ以上の配列の同一性及び相同性を比較するための方法は、当技術分野で周知である。したがって、例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２、３８７〜３９５頁）中で利用可能なプログラム、例えば、プログラムＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰを使用して、２つのポリヌクレオチド間の同一性％並びに２つのポリペプチド配列間の同一性％及び相同性％を決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、（Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７、１９５〜１９７頁）の「部分相同性」アルゴリズムを使用し、２つの配列間の類似性の最良の単一領域を見出すものである。配列間の同一性及び／又は類似性を決定するための他のプログラムも、当技術分野で公知であり、例えば、ワールドワイドウェブサイトｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのＮＣＢＩのホームページを介してアクセス可能なＢＬＡＳＴファミリーのプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３〜４１０頁）及びＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３、６３〜９８頁；Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８５、２４４４〜２４４８頁）がある。
【００９９】
本発明に従って使用され、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列を、当技術分野で周知の方法、例えば、化学的合成又は以下に考察される遺伝子工学的方法によって取得又は産生することができる。例えば、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列の所望の領域を含む前記ＪＮＫ阻害剤配列の一部に対応する、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏで所望の活性を媒介するペプチドを、ペプチド合成装置の使用によって合成することができる。
【０１００】
本明細書で使用され、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列を、輸送配列によって更に改変し、本明細書で使用され、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列を細胞中に効率的に輸送することができる。そのような改変されたＪＮＫ阻害剤配列は、好ましくは、キメラ配列として提供及び使用される。
【０１０１】
したがって、第２の態様によれば、本発明は、対象における上記で定義されたＪＮＫシグナリングと強く関連する疾患又は障害を処置するための医薬組成物の調製のための、少なくとも１つの第１のドメインと少なくとも１つの第２のドメインとを含むキメラペプチドの使用を提供し、ここで、キメラペプチドの第１のドメインは輸送配列を含むが、キメラペプチドの第２のドメインは上記で定義された、好ましくは配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列又はその誘導体若しくは断片を含む。
【０１０２】
典型的には、本発明に従って使用されるキメラペプチドは、少なくとも２５個のアミノ酸残基、例えば、２５〜２５０アミノ酸残基、より好ましくは２５〜２００個のアミノ酸残基、更により好ましくは２５〜１５０個のアミノ酸残基、２５〜１００個のアミノ酸残基、最も好ましくは２５〜５０個のアミノ酸残基の長さを有する。
【０１０３】
第１のドメインとして、本明細書で使用されるキメラペプチドは、好ましくは、（それが存在する）ペプチドを所望の細胞運命に指向させるアミノ酸の任意の配列から典型的に選択される輸送配列を含む。したがって、本明細書で使用される輸送配列は、典型的には、細胞膜を横断して、例えば、細胞の外部から、細胞膜を通って、細胞質にペプチドを指向させる。あるいは、又は更に、輸送配列は、例えば、２つの成分（例えば、細胞透過のための成分と核局在化のための成分）を組み合わせることにより、又は例えば、細胞膜輸送及び標的化された、例えば、核内での輸送の特性を有する１つの単一成分によって、ペプチドを、細胞内の所望の位置、例えば、核、リボソーム、小胞体（ＥＲ）、リソソーム、又はペルオキシソームに指向させることができる。輸送配列は、細胞質成分又は任意の他の成分又は細胞のコンパートメント（例えば、小胞体、ミトコンドリア、グルーム（ｇｌｏｏｍ）装置、リソソーム小胞）に結合することができる別の成分を更に含んでもよい。したがって、例えば、第１のドメインの輸送配列及び第２のドメインのＪＮＫ阻害剤配列を、細胞質又は細胞の任意の他のコンパートメント中に局在化させることができる。これにより、取込み時の細胞におけるキメラペプチドの局在化を決定することができる。
【０１０４】
好ましくは、輸送配列（本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中に含まれる）は、５〜１５０個の長さのアミノ酸配列、より好ましくは５〜１００個の長さ、最も好ましくは５〜５０個、５〜３０個又は更には５〜１５個の長さのアミノ酸を有する。
【０１０５】
より好ましくは、輸送配列（本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中に含まれる）は、第１のドメイン中に連続するアミノ酸配列ストレッチとして存在してもよい。あるいは、第１のドメイン中の輸送配列を、２つ以上の断片に分割してもよく、ここで、これらの断片の全ては、輸送配列全体と類似し、輸送配列が上記に開示されたようなその運搬特性をそのまま保持するという条件で、１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸によって互いに分離されていてもよい。輸送配列の断片を分離するこれらのアミノ酸を、例えば、輸送配列とは異なるアミノ酸配列から選択することができる。あるいは、第１のドメインは、それぞれの成分が、第２のドメインのカーゴＪＮＫ阻害剤配列の、例えば、特定の細胞コンパートメントへの輸送のためのそれ自身の機能を有する、１つを超える成分から構成される輸送配列を含有してもよい。
【０１０６】
上記で定義された輸送配列は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、又は両方の組合せから構成されていてもよい。好ましくは、輸送配列（本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中に含まれる）は、少なくとも１個又は更には２個、好ましくは少なくとも３、４又は５個、より好ましくは少なくとも６、７、８又は９個、更により好ましくは少なくとも１０個以上のＤ−及び／又はＬ−アミノ酸を含んでもよく、ここで、Ｄ−及び／又はＬ−アミノ酸を、ブロックワイズに、非ブロックワイズに、又は交互の様式で、ＪＮＫ輸送配列中に配置してもよい。
【０１０７】
１つの代替的な実施形態によれば、本明細書で使用されるキメラペプチドの輸送配列は、Ｌ−アミノ酸のみから構成されていてもよい。より好ましくは、本明細書で使用されるキメラペプチドの輸送配列は、上記で定義された少なくとも１つの「天然」輸送配列を含むか、又はそれからなる。これに関連して、用語「天然」は、全てＬ−アミノ酸から構成される変化していない輸送配列を指す。
【０１０８】
別の代替的な実施形態によれば、本明細書で使用されるキメラペプチドの輸送配列は、Ｄ−アミノ酸のみから構成されていてもよい。より好ましくは、本明細書で使用されるキメラペプチドの輸送配列は、上記に提示された配列のＤレトロ−インベルソペプチドを含んでもよい。
【０１０９】
本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメインの輸送配列は、天然の供給源から取得するか、又は遺伝子工学技術若しくは化学的合成（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照されたい）を使用することにより産生することができる。
【０１１０】
例えば、ＴＡＴタンパク質（例えば、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる参考文献である米国特許第５，８０４，６０４号及び第５，６７４，９８０号に記載されている）、ＶＰ２２（例えば、ＷＯ９７／０５２６５号；Ｅｌｌｉｏｔｔ及びＯ’Ｈａｒｅ、Ｃｅｌｌ  ８８：２２３〜２３３頁（１９９７）に記載されている）、非ウイルスタンパク質（Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０６９１〜１０６９５頁（１９９２））、アンテナペディア（例えば、アンテナペディア担体配列）に由来する、又は塩基性ペプチド、例えば、５〜１５アミノ酸、好ましくは１０〜１２アミノ酸の長さを有し、例えば、アルギニン、リシン及び／又はヒスチジンなどの、少なくとも８０％、より好ましくは８５％若しくは更には９０％の塩基性アミノ酸を含むペプチドに由来する輸送配列などの、例えば、天然タンパク質を含む第１のドメインの輸送配列のための供給源を用いることができる。更に、輸送配列として使用される天然タンパク質の１つのバリアント、断片及び誘導体が、本明細書に開示される。バリアント、断片及び誘導体に関して、それは本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列について上記に与えられた定義を言う。バリアント、断片並びに誘導体は、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列について上記したように一致して定義される。特に、輸送配列に関連して、バリアント又は断片又は誘導体は、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は更には９９％の上記で定義された輸送配列として使用される天然タンパク質の１つとの配列同一性を有する配列と定義することができる。
【０１１１】
本明細書で使用されるキメラペプチドの好ましい実施形態においては、第１のドメインの輸送配列は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１  ＴＡＴタンパク質に由来する配列、特に、ＴＡＴタンパク質を構成する８６個のアミノ酸のいくらか、又は全部を含むか、又はそれからなる。
【０１１２】
輸送配列（本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中に含まれる）については、ＴＡＴタンパク質の機能的に有効な断片、すなわち、細胞への進入及び取込みを媒介する領域を含むＴＡＴペプチドを形成する、完全長ＴＡＴタンパク質の部分配列を使用することができる。そのような配列がＴＡＴタンパク質の機能的に有効な断片であるかどうかに関して、公知の技術を使用して決定することができる（例えば、Ｆｒａｎｋｅｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ  ８６：７３９７〜７４０１頁（１９８９）を参照されたい）。したがって、本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中の輸送配列を、８６個未満のアミノ酸を含み、細胞への取込み、場合により、細胞核への取込みを示すＴＡＴタンパク質配列の機能的に有効な断片又は部分から誘導することができる。より好ましくは、細胞膜を横断するキメラペプチドの透過を媒介する担体として使用されるＴＡＴの部分配列（断片）は、完全長ＴＡＴの塩基性領域（アミノ酸４８〜５７又は４９〜５７）を含むことが意図される。
【０１１３】
より好ましい実施形態によれば、輸送配列（本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中に含まれる）は、ＴＡＴ残基４８〜５７又は４９〜５７を含有するアミノ酸配列、最も好ましくは、一般ＴＡＴ配列ＮＨ２−Ｘｎｂ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｌ−一般−ＴＡＴ（ｓ））（配列番号７）及び／又はＸＸＸＸＲＫＫＲＲＱ  ＲＲＲＸＸＸＸ（Ｌ−一般−ＴＡＴ）（配列番号２１）（ここで、Ｘ又はＸｎｂは上記で定義された通りである）を含むか、又はそれからなってもよい。更に、配列番号８中の「Ｘｎｂ」残基の数は、記載されたものに限定されず、上記のように変化してもよい。あるいは、本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中に含まれる輸送配列は、例えば、アミノ酸配列ＮＨ２−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＴＡＴ）（配列番号５）を含有するペプチドを含むか、又はそれからなっていてもよい。
【０１１４】
別のより好ましい実施形態によれば、輸送配列（本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中に含まれる）は、上記に提示された配列のＤレトロ−インベルソペプチド、すなわち、配列ＮＨ２−Ｘｎｂ−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｄ−一般−ＴＡＴ（ｓ））（配列番号８）及び／又はＸＸＸＸＲＲＲＱＲＲＫＫＲＸＸＸＸ（Ｄ−一般−ＴＡＴ）（配列番号２２）を有する一般ＴＡＴ配列のＤレトロ−インベルソ配列を含んでもよい。また、ここで、Ｘｎｂは上記で定義された通りである（好ましくは、Ｄアミノ酸を表す）。更に、配列番号８中の「Ｘｎｂ」残基の数は、記載されたものに限定されず、上記のように変化してもよい。最も好ましくは、本明細書で使用される輸送配列は、Ｄレトロ−インベルソ配列ＮＨ２−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＴＡＴ）（配列番号６）を含んでもよい。
【０１１５】
別の実施形態によれば、本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中に含まれる輸送配列は、上記で定義された輸送配列のバリアントを含むか、又はそれからなっていてもよい。「輸送配列のバリアント」は、好ましくは、上記で定義された輸送配列に由来する配列であり、ここで、バリアントは、上記で定義された輸送配列中に存在する少なくとも１つのアミノ酸の改変、例えば、付加、（断片をもたらす）（内部）欠失及び／又は置換を含む。そのような改変は、典型的には、１〜２０個、好ましくは、１〜１０個、より好ましくは、１〜５個のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失を含む。更に、バリアントは、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は更には９９％の、好ましくは、上記で定義された輸送配列、より好ましくは、配列番号５〜８又は配列番号２１〜２２のいずれかとの配列同一性を示す。
【０１１６】
好ましくは、本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中に含まれる輸送配列のそのような改変は、安定性が増大又は減少した輸送配列をもたらす。あるいは、輸送配列のバリアントを、本明細書で使用されるキメラペプチドの細胞内局在化をモジュレートするように設計することができる。外因的に付加した場合、上記で定義されたそのようなバリアントは、典型的には、細胞に進入する輸送配列の能力が保持される（すなわち、細胞中への輸送配列のバリアントの取込みが、輸送配列として使用される天然タンパク質のものと実質的に類似する）ように設計される。例えば、核局在化にとって重要であると考えられる塩基性領域の変化（例えば、Ｄａｎｇ及びＬｅｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１８０１９〜１８０２３頁（１９８９）；Ｈａｕｂｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１１８１〜１１８７頁（１９８９）；ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１〜８頁（１９８９）を参照されたい）は、輸送配列、したがって、本明細書で使用されるキメラペプチドの成分としてのＪＮＫ阻害剤配列の細胞質の位置又は部分的に細胞質の位置をもたらすことができる。上記に加えて、例えば、コレステロール又は他の脂質部分を輸送配列に連結して、膜溶解性が増大した輸送配列を産生することにより、更なる改変をバリアント中に導入することができる。本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中に含まれる輸送配列の上記の開示されたバリアントのいずれかを、典型的には、当業者には公知の技術を使用して産生することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。
【０１１７】
第２のドメインとして、本明細書で使用されるキメラペプチドは、典型的には、これらのＪＮＫ阻害剤配列のバリアント、断片及び／又は誘導体を含む、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列のいずれかから選択されるＪＮＫ阻害剤配列を含む。
【０１１８】
本明細書で使用されるキメラペプチドの両ドメイン、すなわち、第１及び第２のドメインは、機能的ユニットを形成させるように連結されていてもよい。当技術分野で一般的に公知の第１及び第２のドメインを連結するための任意の方法を適用することができる。
【０１１９】
一実施形態によれば、本明細書で使用されるキメラペプチドの第１及び第２のドメインは、好ましくは、共有結合によって連結される。本明細書で定義される共有結合は、例えば、ペプチド結合であってもよく、融合タンパク質として上記で定義されたキメラペプチドを発現させることによって取得することができる。本明細書に記載される融合タンパク質を、以下に記載されるような標準的な組換えＤＮＡ技術と類似するか、又はそれから容易に適合可能である方法で形成させ、使用することができる。しかしながら、両ドメインを、側鎖を介して連結するか、又は化学的リンカー部分により連結することもできる。
【０１２０】
本明細書で使用されるキメラペプチドの第１及び／又は第２のドメインは、前記キメラペプチド中に１又はそれ以上のコピーで存在してもよい。両ドメインが単一のコピーで存在する場合、第１のドメインを、第２のドメインのＮ末端又はＣ末端に連結することができる。複数のコピーで存在する場合、第１及び第２のドメインを、任意の可能な順序で配置させることができる。例えば、第１のドメインは、好ましくは、連続する順序で配置される、複数のコピー数で、例えば、２、３又はそれ以上のコピーで、本明細書で使用されるキメラペプチド中に存在してもよい。次いで、第２のドメインは、第１のドメインを含む配列のＮ又はＣ末端に存在する単一コピーで存在してもよい。あるいは、第２のドメインは、複数のコピー数で、例えば、２、３又はそれ以上のコピーで存在してもよく、第１のドメインは単一のコピーで存在してもよい。両方の選択肢によれば、第１及び第２のドメインは、連続する配置においていずれの場所を取ってもよい。例示的な配置を以下に示す：例えば、第１のドメイン−第１のドメイン−第１のドメイン−第２のドメイン；第１のドメイン−第１のドメイン−第２のドメイン−第１のドメイン；第１のドメイン−第２のドメイン−第１のドメイン−第１のドメイン；又は例えば、第２のドメイン−第１のドメイン−第１のドメイン−第１のドメイン。当業者は、これらの例が、例示目的に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではないことをよく理解できる。したがって、コピー数及び配置を、最初に定義されたように変化させることができる。
【０１２１】
好ましくは、第１及び第２のドメインを、いかなるリンカーも用いずに互いに直接連結することができる。あるいは、それらを、１〜１０個、好ましくは、１〜５個のアミノ酸を含むリンカー配列を介して互いに連結することができる。リンカー配列を形成するアミノ酸は、好ましくは、アミノ酸残基としてのグリシン又はプロリンから選択される。より好ましくは、第１及び第２のドメインを、第１のドメインと第２のドメインとの間の２、３個以上のプロリン残基のヒンジによって互いに分離することができる。
【０１２２】
少なくとも１つの第１のドメインと少なくとも１つの第２のドメインとを含む、上記で定義され、本明細書で使用されるキメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、又は両方の組合せから構成されていてもよい。その中で、それぞれのドメイン（並びに使用されるリンカー）は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、又は両方の組合せ（例えば、Ｄ−ＴＡＴとＬ−ＩＢ１（ｓ）又はＬ−ＴＡＴとＤ−ＩＢ１（ｓ）など）から構成されていてもよい。好ましくは、本明細書で使用されるキメラペプチドは、少なくとも１個又は更には２個、好ましくは少なくとも３、４又は５個、より好ましくは少なくとも６、７、８又は９個、更により好ましくは少なくとも１０個以上のＤ−及び／又はＬ−アミノ酸を含んでもよく、ここで、Ｄ−及び／又はＬ−アミノ酸を、ブロックワイズに、非ブロックワイズに、又は交互の様式で、本明細書で使用されるキメラペプチド中に配置してもよい。
【０１２３】
特定の実施形態によれば、本明細書で使用されるキメラペプチドは、一般Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドＮＨ２−Ｘｎｂ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｘｎｂ−Ｘｎａ−ＲＰＴＴＬＸＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ（一般）（ｓ））（配列番号１０）（式中、Ｘ、Ｘｎａ及びＸｎｂは好ましくは上記で定義された通りである）に記載のＬ−アミノ酸キメラペプチドを含むか、又はそれからなる。より好ましくは、本明細書で使用されるキメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸キメラペプチドＮＨ２−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ））（配列番号９）を含むか、又はそれからなる。あるいは、又は更に、本明細書で使用されるキメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸キメラペプチド配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ  ＰＰＤＴＹＲＰＫＲＰ  ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ  ＲＳＱＤＴ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１）（配列番号２３）、若しくはＸＸＸＸＸＸＸＲＫＫ  ＲＲＱＲＲＲＸＸＸＸ  ＸＸＸＸＲＰＴＴＬＸ  ＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤ  Ｓ／ＴＸ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ一般）（配列番号２４）（式中、Ｘは好ましくは上記で定義された通りである）を含むか、若しくはそれからなる、又は本明細書で使用されるキメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸キメラペプチド配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ１））（配列番号２７）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＸｎｃＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ２））（配列番号２８）、若しくはＲＫＫＲＲＱＲＲＲＸｎｃＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ３））（配列番号２９）を含むか、若しくはそれからなる。これに関連して、それぞれのＸは、典型的には、上記で定義されたアミノ酸残基を表し、より好ましくは、Ｘｎｃは、それぞれのＸがグリシン又はプロリンから互いに独立に選択されるペプチド残基の連続するストレッチ、例えば、単調なグリシンストレッチ又は単調なプロリンストレッチを表し、ここで、ｎ（Ｘｎｃの反復数）は、典型的には、０〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０又は更により好ましくは０〜５又は５〜１０である。Ｘｎｃは、Ｄ又はＬアミノ酸を表してもよい。
【０１２４】
代替的な特定の実施形態によれば、本明細書で使用されるキメラペプチドは、上記で開示されたＬ−アミノ酸キメラペプチドのＤ−アミノ酸キメラペプチドを含むか、又はそれからなる。本発明による例示的なＤレトロ−インベルソキメラペプチドは、例えば、一般Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドＮＨ２−Ｘｎｂ−ＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲ−Ｘｎａ−Ｘｎｂ−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ（一般）（ｓ））（配列番号１２）である。ここで、Ｘ、Ｘｎａ及びＸｎｂは、好ましくは上記で定義された通りである（好ましくは、Ｄアミノ酸を表す）。より好ましくは、本明細書で使用されるキメラペプチドは、ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ））（配列番号１１）に記載のＤ−アミノ酸キメラペプチドを含むか、又はそれからなる。あるいは、又は更に、本明細書で使用されるキメラペプチドは、Ｄ−アミノ酸キメラペプチド配列ＴＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＹＴＤＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１）（配列番号２５）若しくはＸＴ／ＳＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲＸＸＸＸＸＸＸＸＲＲＲＱＲＲＫＫＲＸＸＸＸＸＸＸ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ一般）（配列番号２６）（式中、Ｘは好ましくは、上記で定義された通りである）を含むか、若しくはそれからなる、又は本明細書で使用されるキメラペプチドは、Ｄ−アミノ酸キメラペプチド配列ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ１））（配列番号３０）、ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＸｎｃＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ２））（配列番号３１）、若しくはＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＸｎｃＲＲＲＱＲＲＫＫＲ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ３））（配列番号３２）を含むか、若しくはそれからなる。Ｘｎｃは、上記で定義された通りであってもよい。
【０１２５】
上記で定義されたキメラペプチドの第１及び第２のドメインを、当技術分野で公知の任意の好適な様式で実行される化学的又は生物化学的カップリングによって、例えば、第１のドメインと第２のドメインとの間のペプチド結合を確立することによって、例えば、融合タンパク質として第１のドメインと第２のドメインを発現させることによって、又は例えば、上記で定義されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを架橋することによって、互いに連結することができる。
【０１２６】
上記で定義されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとの化学的架橋にとって好適な多くの公知の方法は非特異的である、すなわち、それらはカップリング点を、輸送ポリペプチド又はカーゴ大分子上の任意の特定の部位に指向させない。結果として、非特異的架橋剤の使用は、機能部位を攻撃するか、又は活性部位を立体的に遮断し、コンジュゲートされたタンパク質を生物学的に不活性にすることができる。したがって、好ましくは、第１のドメインと第２のドメインとのより特異的なカップリングを可能にする、そのような架橋方法が使用される。
【０１２７】
これに関連して、カップリング特異性を増大させる１つの方法は、架橋しようとする第１のドメインと第２のドメインの一方又は両方に１回のみ、又は数回存在する官能基への直接的な化学的カップリングである。例えば、チオール基を含有する唯一のタンパク質アミノ酸であるシステインは、多くのタンパク質ではほんの数回出現する。また、例えば、ポリペプチドがリシン残基を含有しない場合、第１級アミンに特異的な架橋試薬は、そのポリペプチドのアミノ末端に対して選択的である。カップリング特異性を増大させるためのこの手法の使用の成功には、ポリペプチドが分子の生物活性を失うことなく変化させることができる分子の領域中に好適には稀で反応性の残基を有することが必要である。システイン残基がポリペプチド配列の一部に存在する場合、それらを置き換えてもよく、そうでなければ橋反応へのそれらの関与が生物活性を阻害する可能性がある。システイン残基が置き換えられる場合、典型的には、ポリペプチドの折りたたみの結果生じる変化を最小化することが望ましい。ポリペプチドの折りたたみの変化は、置き換えがシステインと化学的に、また立体的に類似する場合に最小化される。これらの理由から、セリンが、システインへの置き換えとして好ましい。以下の実施例に示されるように、システイン残基を、架橋目的でポリペプチドのアミノ酸配列中に導入することができる。システイン残基が導入される場合、アミノ末端又はカルボキシ末端での、又はその近くでの導入が好ましい。従来の方法は、そのようなアミノ酸配列改変のために利用可能であり、ここで、目的のポリペプチドは、化学的合成により、又は組換えＤＮＡの発現を介して産生される。
【０１２８】
上記で定義され、本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとのカップリングを、カップリング剤又はコンジュゲート剤により達成することもできる。使用することができるいくつかの分子間架橋試薬が存在する（例えば、Ｍｅａｎｓ及びＦｅｅｎｅｙ、ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ、１９７４、３９〜４３頁を参照されたい）。これらの試薬の中には、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）又はＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド（両方ともスルフヒドリル基に対して高度に特異的であり、不可逆的結合を形成する）；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセタミド）又は６〜１１個の炭素のメチレン架橋を有する他のそのような試薬（スルフヒドリル基に対して比較的特異的である）；並びに１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（アミノ及びチロシン基との不可逆的結合を形成する）がある。この目的にとって有用な他の架橋試薬としては；ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン（アミノ及びフェノール基との不可逆的架橋を形成する）；ジメチルアジピミデート（アミノ基に特異的である）；フェノール−１，４ジスルホニルクロリド（主にアミノ基と反応する）；ヘキサメチレンジイソシアネート若しくはジイソチオシアネート、又はアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート（主にアミノ基と反応する）；グルタルアルデヒド（いくつかの異なる側鎖と反応する）及びジスジアゾベンジジン（主にチロシン及びヒスチジンと反応する）が挙げられる。
【０１２９】
上記で定義されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを架橋するために使用される架橋試薬は、ホモ二官能性であってもよい、すなわち、同じ反応を受ける２つの官能基を有する。好ましいホモ二官能性架橋試薬は、ビスマレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）である。ＢＭＨは、温和な条件（ｐＨ６．５〜７．７）下でスルフヒドリル含有化合物と特異的に反応する２つのマレイミド官能基を含有する。２つのマレイミド基は、炭化水素鎖によって接続される。したがって、ＢＭＨは、システイン残基を含有するポリペプチドの不可逆的架橋にとって有用である。
【０１３０】
上記で定義されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを架橋するために使用される架橋試薬はまた、ヘテロ二官能性であってもよい。ヘテロ二官能性架橋剤は、それぞれ、遊離アミン及びチオールを有する２つのタンパク質を架橋する、２つの異なる官能基、例えば、アミン反応基及びチオール反応基を有する。ヘテロ二官能性架橋剤の例は、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（「ＭＢＳ」）、及びスクシンイミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（「ＳＭＰＢ」）、ＭＢＳの拡張鎖類似体である。これらの架橋剤のスクシンイミジル基は第１級アミンと反応し、チオール反応性マレイミドはシステイン残基のチオールと共有結合を形成する。
【０１３１】
上記で定義されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを架橋するのに好適な架橋試薬は、水中で低い溶解度を有することが多い。したがって、スルホネート基などの親水性部分を架橋試薬に付加して、その水溶性を改善することができる。これに関して、スルホ−ＭＢＳ及びスルホ−ＳＭＣＣは、本発明に従って使用することができる、水溶性について改変された架橋試薬の例である。
【０１３２】
同様に、多くの架橋試薬は、細胞条件下で本質的に非切断性であるコンジュゲートをもたらす。しかしながら、上記で定義されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを架橋するのに特に好適ないくつかの架橋試薬は、細胞条件下で切断性である、ジスルフィドなどの共有結合を含有する。例えば、トラウト試薬、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオン酸）（「ＤＳＰ」）、及びＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（「ＳＰＤＰ」）は、周知の切断性架橋剤である。切断性架橋試薬の使用により、カーゴ部分は標的細胞中への送達後に輸送ポリペプチドから分離することが可能となる。直接ジスルフィド結合も有用であり得る。
【０１３３】
上記で考察されたものを含むいくつかの架橋試薬が商業的に入手可能である。その使用のための詳細な説明書は、業者から容易に入手可能である。タンパク質架橋及びコンジュゲート調製に関する一般的な参考文献は、Ｗｏｎｇ，  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳＬＩＮＫＩＮＧ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９１）である。
【０１３４】
上記で定義されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとの化学的架橋は、スペーサーアームを含んでもよい。スペーサーアームは、分子内可撓性を提供するか、又はコンジュゲートされた部分の間の分子間距離を調整し、それによって、生物活性を保持するのに役立ち得る。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸、例えば、プロリンを含むポリペプチド部分の形態にあってもよい。あるいは、スペーサーアームは、「長鎖ＳＰＤＰ」（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．ＣＯ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．、カタログ番号２１６５１Ｈ）などにおける架橋試薬の一部であってもよい。
【０１３５】
好ましくは、本明細書に開示される任意のペプチド、特に、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤、輸送配列及びキメラペプチド、好ましくは、配列番号１１のＪＮＫ阻害剤は、その末端の一方又は両方に、すなわち、Ｃ若しくはＮ末端又は両方に改変を有してもよい。Ｃ末端は、好ましくは、アミド改変により改変することができるが、Ｎ末端は例えば、アシル化などの任意の好適なＮＨ２保護基により改変することができる。より好ましくは、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤及びキメラペプチド、好ましくは、配列番号１１のＪＮＫ阻害剤は、Ｃ末端でのアミド改変によって改変される。
【０１３６】
また、本明細書に開示される任意のペプチド、特に、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤、輸送配列（例えば、キメラペプチドの）及びキメラペプチド、好ましくは、配列番号１１のＪＮＫ阻害剤を、１、２又は３個のアミノ酸によって、そのＮ及び／又はＣ末端で欠失させることも好ましい。例えば、本発明によるキメラペプチドにおいて、それぞれのドメイン、すなわち、ＪＮＫ阻害剤及び輸送配列ドメインを、１、２若しくは３個のアミノ酸によってそのＮ及び／又はＣ末端で欠失させる、及び／又は本発明によるキメラペプチドを、１、２若しくは３個のアミノ酸によってそのＮ及び／又はＣ末端で欠失させることができる。より好ましくは、本発明のキメラペプチドは、ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチド［ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ−ＣＯＯＨ、配列番号１１］に記載のＤ−アミノ酸キメラペプチドを含むか、又はそれからなり、第１のドメインと第２のドメインの連結部分（ＰＰの代わり）は、上記で定義された−Ｘｎａ−Ｘｎｂ−から構成されていてもよい。特に、最終的には（ＰＰ）の代わりに−Ｘｎａ−Ｘｎｂ−を含む配列番号１１の第２のドメインを、１、２又は３個のアミノ酸によってそのＮ及び／又はＣ末端で欠失させることができる。別の好ましい実施形態においては、配列番号１１の第１のドメインを、１、２又は３個のアミノ酸によってそのＮ及び／又はＣ末端で欠失させることができる。この／これらの欠失を、第２のドメインの末端のアミノ酸残基について開示される欠失と組み合わせることができる。繰り返しになるが、ペプチドが短くなるほど、その（非特異的）細胞毒性が低くなる。しかしながら、そのペプチドは、その生物学的機能、すなわち、その細胞膜透過性（第１のドメイン）及びそのＪＮＫ阻害機能（第２のドメイン）を保持しなければならない。
【０１３７】
更に、上記で開示されたキメラペプチドの１つのバリアント、断片又は誘導体を、本明細書で使用することができる。断片及びバリアントに関して、それは一般的には、ＪＮＫ阻害剤配列について上記に与えられた定義を言う。
【０１３８】
特に、本発明ににおいて、「キメラペプチドのバリアント」は、好ましくは、配列番号９〜１２及び２３〜３２の配列のいずれかに由来する配列であり、ここで、キメラバリアントは、本明細書で使用されるような配列番号９〜１２及び２３〜３２のキメラペプチドのアミノ酸変化を含む。そのような変化は、典型的には、配列番号９〜１２及び２３〜３２のアミノ酸の１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個の置換、付加及び／又は欠失（断片をもたらす）を含み、本明細書で使用される変化したキメラペプチドは、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、又は９５％、９８％又は更には９９％の、配列番号９〜１２及び２３〜３２の配列のいずれかとの配列同一性を示す。好ましくは、これらのバリアントは、本明細書で使用されるキメラペプチド中に含まれるような第１及び第２のドメインの生物活性、すなわち、上記で開示された第１のドメインの輸送活性と、ＪＮＫに結合する、及び／又は少なくとも１つのＪＮＫ活性化転写因子の活性化を阻害する第２のドメインの活性とを保持する。
【０１３９】
したがって、本明細書で使用されるキメラペプチドはまた、上記に開示されたキメラペプチド、特に、配列番号９〜１２及び２３〜３２のいずれかのキメラペプチド配列の断片も含む。したがって、本発明においては、「キメラペプチドの断片」は、好ましくは、配列番号９〜１２及び２３〜３２の配列のいずれかに由来する配列であり、断片は配列番号９〜１２及び２３〜３２のいずれかの少なくとも４つの連続するアミノ酸を含む。この断片は、好ましくは、これらの配列のいずれかに由来するエピトープの特異的認識を可能にし、前記配列を細胞、核又は更に好ましい位置に輸送するのに十分である長さを含む。更により好ましくは、断片は、配列番号９〜１２及び２３〜３２のいずれかの４〜１８、４〜１５、又は最も好ましくは４〜１０個の連続するアミノ酸を含む。本明細書で使用されるキメラペプチドの断片を、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、又は９５％、９８％又は更には９９％の、配列番号９〜１２及び２３〜３２のいずれかの配列のいずれかとの配列同一性を有する配列と更に定義することができる。
【０１４０】
最後に、本明細書で使用されるキメラペプチドはまた、上記で開示されたキメラペプチド、特に、配列番号９〜１２及び２３〜３２のいずれかのキメラペプチド配列の誘導体も含む。
【０１４１】
本発明は更に、対象における上記で定義されたＪＮＫシグナリングと強く関連する疾患又は障害を処置するための医薬組成物の調製のための、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列をコードする核酸配列、全て上記で定義された、キメラペプチド又はその断片、バリアント若しくは誘導体の使用に関する。本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列をコードする好ましい好適な核酸は、典型的には、ヒトＩＢ１核酸（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０７４０９１）、ラットＩＢ１核酸（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１０８９５９）、若しくはヒトＩＢ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２１８７７８）から、又は上記で定義された配列のいずれかをコードする任意の核酸配列、すなわち、配列番号１〜２６の任意の配列から選択される。
【０１４２】
本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列又は本明細書で使用されるキメラペプチドをコードする核酸を、当技術分野で公知の任意の方法によって取得することができる（例えば、配列の３’及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅による、及び／又は所与の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチド配列を使用するｃＤＮＡ若しくはゲノムライブラリーからのクローニングによる）。
【０１４３】
更に、ストリンジェントな条件下で、上記で定義された（天然）ＪＮＫ阻害剤配列又はキメラペプチドをコードする適切な鎖とハイブリダイズする核酸配列も同様に本明細書に開示される。好ましくは、そのような核酸配列は、特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さを有する、少なくとも６個の（連続する）核酸を含む。より好ましくは、そのような核酸配列は、６〜３８個、更により好ましくは６〜３０個、最も好ましくは６〜２０個又は６〜１０個の（連続する）核酸を含む。
【０１４４】
「ストリンジェントな条件」は、配列依存的であり、異なる環境下では異なるものである。一般に、ストリンジェントな条件を、規定のイオン強度及びｐＨで特定の配列に関する融点（ＴＭ）より約５℃低くなるように選択することができる。ＴＭは、標的配列の５０％が、完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度（規定のイオン強度及びｐＨの下で）である。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７で少なくとも約０．０２モルであり、温度が少なくとも約６０℃であるものである。他の因子がハイブリダイゼーションのストリンジェンシー（特に、とりわけ塩基組成及び相補鎖のサイズを含む）、有機溶媒の存在及び塩基不一致の程度に影響し得るため、パラメータの組合せが、いずれか１つの絶対的な尺度よりも重要である。
【０１４５】
「高ストリンジェンシー条件」は、例えば、以下のものを含んでもよい。ステップ１：６＊ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡから構成されるバッファー中、６５℃で８時間から一晩、ＤＮＡを含有するフィルターを予備処理する。ステップ２：１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ及び５〜２０＊１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを添加した上記のプレハイブリダイゼーション混合物中、６５℃で４８時間、フィルターをハイブリダイズさせる。ステップ３：２＊ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％Ｆｉｃｏｌｌ、及び０．０１％ＢＳＡを含有する溶液中、３７℃で１時間、フィルターを洗浄する。この後、０．１＊ＳＳＣ中、５０℃で４５分間洗浄する。ステップ４：フィルターをオートラジオグラフィーにかける。使用することができる高ストリンジェンシーの他の条件は、当技術分野で周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ＮＹ及びＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照されたい）。
【０１４６】
「中ストリンジェンシー条件」は、以下のものを含んでもよい。ステップ１：６＊ＳＳＣ、５＊Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ＳＤＳ及び１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、５５℃で６時間、ＤＮＡを含有するフィルターを予備処理する。ステップ２：５〜２０＊１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを添加した同じ溶液中、５５℃で１８〜２０時間、フィルターをハイブリダイズさせる。ステップ３：２＊ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する溶液中、３７℃で１時間、フィルターを洗浄した後、１＊ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含有する溶液中、６０℃で３０分間、２回洗浄する。ステップ４：フィルターをドライブロットし、オートラジオグラフィーに曝露する。使用することができる中ストリンジェンシーの他の条件は、当技術分野で周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ＮＹ及びＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照されたい）。
【０１４７】
最後に、「低ストリンジェンシー条件」は、以下を含んでもよい。ステップ１：３５％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＰＶＰ、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、１％ＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４０℃で６時間、ＤＮＡを含有するフィルターを予備処理する。ステップ２：０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）硫酸デキストラン、及び５〜２０ｘ１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを添加した同じ溶液中、４０℃で１８〜２０時間、フィルターをハイブリダイズさせる。ステップ３：２ＸＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．１％ＳＤＳを含有する溶液中、５５℃で１．５時間、フィルターを洗浄する。洗浄溶液を新鮮な溶液と交換し、６０℃で更に１．５時間インキュベートする。ステップ４：フィルターをドライブロットし、オートラジオグラフィーに曝露する。必要に応じて、フィルターを６５〜６８℃で３回目の洗浄を行い、フィルムに再曝露する。使用することができる低ストリンジェンシーの他の条件は、当技術分野で周知である（例えば、交差種ハイブリダイゼーションのために用いられる）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ＮＹ；及びＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照されたい。
【０１４８】
本発明による上記で定義された核酸配列を使用して、ペプチド、すなわち、分析、特徴付け又は治療的使用のために；対応するペプチド（本明細書で使用される）が優先的に発現される（構成的に、又は組織分化若しくは発達の特定の段階で、又は疾患状態において）組織のマーカーとして、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列又は本明細書で使用されるキメラペプチドを発現させることができる。これらの核酸のための他の使用としては、例えば、核酸のゲル電気泳動に基づく分析における分子量マーカーが挙げられる。
【０１４９】
本発明の更なる実施形態によれば、発現ベクターを、上記で定義された１つ若しくはそれ以上のＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドの組換え発現のために上記目的で使用することができる。用語「発現ベクター」は、二本鎖又は一本鎖である、環状又は線状ＤＮＡ又はＲＮＡを指すように本明細書で使用される。それは、宿主細胞又は単細胞若しくは多細胞宿主生物中に導入される上記で定義された少なくとも１つの核酸を更に含む。本明細書で使用される発現ベクターは、好ましくは、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列又はその断片若しくはバリアント、又は本明細書で使用されるキメラペプチド又はその断片若しくはバリアントをコードする上記で定義された核酸を含む。更に、本発明による発現ベクターは、好ましくは、インスレーター、境界エレメント、ＬＣＲ（例えば、Ｂｌａｃｋｗｏｏｄ及びＫａｄｏｎａｇａ（１９９８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１、６１〜６３頁によって記載されている）又はマトリックス／足場結合領域（例えば、Ｌｉ，Ｈａｒｊｕ及びＰｅｔｅｒｓｏｎ（１９９９）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１５、４０３〜４０８頁によって記載されている）などの、宿主細胞中における挿入されたポリヌクレオチドの発現を駆動する、ウイルス、細菌、植物、哺乳動物、及び他の真核供給源に由来するエンハンサー／プロモーターなどの様々な調節エレメントを含む、発現を支援するための適切なエレメントを含む。いくつかの実施形態においては、調節エレメントは異種性である（すなわち、天然の遺伝子プロモーターではない）。あるいは、必要な転写及び翻訳シグナルを、遺伝子のための天然プロモーター及び／又はその隣接領域によって供給することもできる。
【０１５０】
本明細書で使用される用語「プロモーター」とは、上記で定義された１つ又は複数の核酸配列の転写を制御するように機能し、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼの結合部位及びプロモーター機能を調節するように相互作用する他のＤＮＡ配列の存在によって構造的に同定されるＤＮＡの領域を指す。プロモーターの断片を促進する機能的発現は、プロモーターとしての活性を保持する短縮型又はトランケート型プロモーター配列である。プロモーター活性は、当技術分野で公知の任意のアッセイによって測定することができる（例えば、Ｗｏｏｄ、ｄｅ  Ｗｅｔ、Ｄｅｗｊｉ、及びＤｅＬｕｃａ（１９８４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２４、５９２〜５９６頁；Ｓｅｌｉｇｅｒ及びＭｃＥｌｒｏｙ（１９６０）、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８８、１３６〜１４１頁を参照されたい）、又はＰｒｏｍｅｇａ（登録商標）から商業的に入手可能である。
【０１５１】
本明細書で定義される発現ベクターに対して使用される「エンハンサー領域」は、典型的には、１つ又は複数の遺伝子の転写を増加させるように機能するＤＮＡの領域を指す。より具体的には、本明細書で使用される用語「エンハンサー」は、発現させる遺伝子に関してその位置及び向きと関係なく遺伝子の発現を増強する、増大させる、改善する、又は改良するＤＮＡ調節エレメントであり、１を超えるプロモーターの発現を増強する、増大させる、改善する、又は改良してもよい。
【０１５２】
本明細書で定義される発現ベクター中で使用されるプロモーター／エンハンサー配列は、植物、動物、昆虫、又は真菌調節配列を使用してもよい。例えば、酵母及び他の真菌に由来するプロモーター／エンハンサーエレメント（例えば、ＧＡＬ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター）を使用することができる。あるいは、又は更に、それらは、動物の転写制御領域、例えば、（ｉ）膵臓ベータ細胞内で活性なインスリン遺伝子制御領域（例えば、Ｈａｎａｈａｎら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５〜１２２頁を参照されたい）；（ｉｉ）リンパ系細胞内で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（例えば、Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３８：６４７〜６５８頁を参照されたい）；（ｉｉｉ）肝臓内で活性なアルブミン遺伝子制御領域（例えば、Ｐｉｎｃｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ  １：２６８〜２７６頁を参照されたい）；（ｉｖ）脳のオリゴデンドロサイト細胞内で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（例えば、Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７、Ｃｅｌｌ  ４８：７０３〜７１２頁を参照されたい）；及び（ｖ）海馬内で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（例えば、Ｍａｓｏｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２〜１３７８頁を参照されたい）などを含んでもよい。
【０１５３】
更に、本明細書で定義される発現ベクターは、増幅マーカーを含んでもよい。この増幅マーカーを、例えば、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）及びＮ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸耐性（ＣＡＤ）からなる群から選択することができる。
【０１５４】
本発明にとって好適な例示的な発現ベクター又はその誘導体としては、特に、例えば、ヒト又は動物のウイルス（例えば、ワクシニアウイルス又はアデノウイルス）；昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルス）；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダファージ）；プラスミドベクター及びコスミドベクターが挙げられる。
【０１５５】
本発明は、更に、上記で定義された核酸のペプチドコード配列を発現することができる、様々な宿主−ベクター系を使用することができる。これらのものとしては、限定されるものではないが、（ｉ）ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどに感染した哺乳動物細胞系；（ｉｉ）バキュロウイルスなどに感染した昆虫細胞系；（ｉｉｉ）酵母ベクターを含有する酵母又は（ｉｖ）バクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、若しくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が挙げられる。使用される宿主−ベクター系に応じて、いくつかの好適な転写及び翻訳エレメントのいずれか１つを使用することができる。
【０１５６】
好ましくは、目的の挿入配列の発現をモジュレートする、又は所望の特定の様式で前記配列によってコードされる発現されるペプチドを改変する、若しくはプロセシングする、そのような宿主−ベクター系にとって好適な宿主細胞株を選択することができる。更に、ある特定のプロモーターからの発現を、選択された宿主株中、ある特定の誘導因子の存在下で増強させ、したがって、遺伝子操作されたペプチドの発現の制御を容易にすることができる。更に、様々な宿主細胞が、発現されるペプチドの翻訳及び翻訳後プロセシング及び改変（例えば、グリコシル化、リン酸化など）のための特徴的で特異的な機構を有する。したがって、適切な細胞株又は宿主系を選択して、所望の改変を確保することができ、外来ペプチドのプロセシングが達成される。例えば、細菌系内でのペプチド発現を使用して、非グリコシル化されたコアペプチドを産生させることができるが、哺乳動物細胞内での発現は、異種ペプチドの「天然」グリコシル化を確保する。
【０１５７】
本発明は、本明細書で定義されるＪＮＫシグナリングと強く関連する疾患又は障害の処置のための医薬組成物を調製するための、上記のＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドに対する抗体の使用を更に提供する。更に、本発明によるＪＮＫ阻害剤配列、又はそのような阻害剤配列を含有するキメラペプチドに特異的な抗体の産生のための効率的な手段が記載され、この目的のために使用することができる。
【０１５８】
本発明によれば、本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチド、並びに、その断片、バリアント又は誘導体を、これらのペプチド成分に免疫特異的に結合する抗体を生成するための免疫原として使用することができる。そのような抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片及びＦａｂ発現ライブラリーが挙げられる。特定の実施形態においては、本発明は、上記で定義されたキメラペプチド又はＪＮＫ阻害剤配列に対する抗体を提供する。当技術分野で公知の様々な手順を、これらの抗体の産生のために使用することができる。
【０１５９】
例えば、様々な宿主動物を、上記で定義された任意のキメラペプチド又はＪＮＫ阻害剤配列を用いる注射によってポリクローナル抗体の産生のために免疫することができる。それにより、様々なアジュバントを使用して、免疫応答を増加させることができ、それには、限定されるものではないが、Ｆｒｅｕｎｄの（完全及び不完全）アジュバント、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ＣｐＧ、ポリマー、プルロニック、並びにカルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）などのヒトアジュバントが挙げられる。
【０１６０】
上記で定義されたキメラペプチド又はＪＮＫ阻害剤配列に対するモノクローナル抗体の調製のために、連続細胞株培養によって抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用することができる。そのような技術としては、限定されるものではないが、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７頁を参照されたい）；トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２頁を参照されたい）及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７〜９６頁を参照されたい）が挙げられる。ヒトモノクローナル抗体を、本発明の実施において使用し、ヒトハイブリドーマの使用（Ｃｏｔｅら、１９８３、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２０２６〜２０３０頁を参照されたい）により、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＢ細胞をエプスタイン・バーウイルスで形質転換すること（Ｃｏｌｅら、１９８５、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７〜９６頁を参照されたい）により産生することができる。
【０１６１】
本発明によれば、技術を、本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドに特異的な一本鎖抗体（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい）の産生のために適合させることができる。更に、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために方法を適合させて（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５〜１２８１頁を参照されたい）、これらのＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ効率的な同定を可能にすることができる。当技術分野で周知の技術（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい）により、非ヒト抗体を「ヒト化」することができる。例えば、（ｉ）抗体分子のペプシン消化により産生されるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成されるＦａｂ断片；（ｉｉｉ）抗体分子のパパイン及び還元剤による処理により生成されるＦａｂ断片並びに（ｉｖ）Ｆｖ断片などの、本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドに対するイディオタイプを含有する抗体断片を、当技術分野で公知の技術により産生することができる。
【０１６２】
本発明の一実施形態においては、抗体のスクリーニングのために使用することができ、所望の特異性を有する方法としては、限定されるものではないが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び当技術分野で公知の他の免疫学的に媒介される技術が挙げられる。特定の実施形態においては、本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドの特定のエピトープ（例えば、典型的には、５〜２０個、好ましくは８〜１８個、最も好ましくは８〜１１個のアミノ酸の長さを含むその断片）に特異的である抗体の選択は、そのようなエピトープを有する、本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドの断片に結合するハイブリドーマの生成によって容易になる。上記で定義されたエピトープに特異的であるこれらの抗体も、本明細書で提供される。
【０１６３】
本明細書で定義される抗体を、例えば、適切な生理学的試料内のペプチドのレベルを測定する際に使用するため、診断方法において使用するため、又はペプチドを画像化する際に使用するためなどに、ＪＮＫ阻害剤配列（及び／又は対応する上記で定義されたキメラペプチド）の局在化及び／又は定量化に関する当技術分野で公知の方法において使用することができる。
【０１６４】
本発明に従って定義されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞及び／又は抗体を、本明細書で定義される疾患のいずれかの防止又は処置、特に、本明細書で定義されるＪＮＫシグナリングと強く関連する疾患又は障害の防止又は処置に適用することができる、医薬組成物中で製剤化することができる。典型的には、本発明に従って使用されるそのような医薬組成物は、活性成分として、例えば、（ｉ）上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチド、及び／又はそのバリアント、断片若しくは誘導体、特に、配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列及び／又は配列番号９〜１２及び２３〜３２の配列のいずれかのキメラペプチド、及び／又は配列番号５〜８及び２１〜２２のいずれかの輸送配列を含む、配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列、又は上記定義内にあるそのバリアント若しくは断片のいずれか１つ若しくは複数；及び／又は（ｉｉ）上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチド及び／又はそのバリアント若しくは断片をコードする核酸、及び／又は（ｉｉｉ）上記で定義された、ＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチド、及び／又はそのバリアント、断片若しくは誘導体のいずれか１つ若しくは複数を含む細胞、及び／又は（ｉｖ）上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチド及び／又はそのバリアント若しくは断片をコードするベクター及び／又は核酸をトランスフェクトされた細胞を含む。
【０１６５】
好ましい実施形態によれば、本発明に従って使用されるそのような医薬組成物は、典型的には、安全かつ有効な量の上記で定義された成分、好ましくは、配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかの少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列及び／又は配列番号９〜１２及び２３〜３２の配列のいずれかの少なくとも１つのキメラペプチド、及び／又は配列番号５〜８及び２１〜２２のいずれかの輸送配列を含む、配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかの少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列、又は上記定義内にあるそのバリアント若しくは断片、又はそれをコードする少なくとも１つの核酸、又は上記で定義された少なくとも１つのベクター、宿主細胞若しくは抗体を含む。本発明に従って使用される医薬組成物は、活性成分として、配列番号１１の配列を含むか、又はそれからなるキメラペプチドを含むことが特に好ましい。
【０１６６】
更に、本発明に従って使用される医薬組成物は、更に、すなわち、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドのいずれか１つ若しくは複数、及び／又はそのバリアント、断片若しくは誘導体に加えて、場合により、それぞれの疾患においても有用である更なる「活性成分」をも含んでもよい。これに関連しては、本発明による医薬組成物は、本発明による疾患の療法において、更なる「活性成分」を含む更なる医薬組成物と組み合わせることもできる。例えば、本発明によるＪＮＫ阻害剤及び／又はキメラペプチドを含む医薬組成物は、独立型療法として、又はコルチコステロイド、好ましくは、グルココルチコイド、例えば、デキサメタゾンと組み合わせて、術後眼内炎症において使用することができる。更に、例えば、本発明によるＪＮＫ阻害剤及び／又はキメラペプチドを含む医薬組成物は、好ましくは、独立型療法として、又はＰＫＲ阻害剤と組み合わせて、場合により、本発明によるＪＮＫ阻害剤及びＰＫＲ阻害剤に加えて、アミロイド低下剤と組み合わせて、アルツハイマー病及び／又は軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因するＭＣＩの防止及び／又は処置において使用することができる。ＰＫＲ阻害剤は、特に、ペプチド、例えば、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｇｒｏｕｐによる「ＳＣ１４８１」である。アミロイド低下剤としては、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）阻害剤、γ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）及びモジュレーター（ＧＳＭ）が挙げられる。現在、臨床試験中にある、そのようなアミロイド低下剤の例を、Ｖａｓｓａｒ  Ｒ．（２０１４）ＢＡＣＥ１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．；６（９）：８９頁から、又はＪｉａ  Ｑ、Ｄｅｎｇ  Ｙ、Ｑｉｎｇ  Ｈ（２０１４）Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｒ  ｂｅｙｏｎｄ  β−ａｍｙｌｏｉｄ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．２０１４；２０１４：８３７１５７頁から回収することができ、例えば、ピオグリタゾン、ＣＴＳ−２１１６６、ＭＫ８９３１、ＬＹ２８８６７２１、ＡＺＤ３２９３、Ｅ２６０９、ＮＩＣ５−１５、ベガセスタット、ＣＨＦ５０７４、ＥＶＰ−０９６２、アトルバスタチン、シンバスタチン、エタゾレート、エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣｇ）、シロ−イノシトール（ＥＬＮＤ００５／ＡＺＤ１０３）、トラミプロセート（３ＡＰＳ）、ＰＢＴ２、アフィトープＡＤ０２、及びアフィトープＡＤ０３がある。組合せ療法の場合、活性成分のために別々の医薬組成物を組み合わせるのが、より良好な個々の投薬にとって好ましいが、便宜上、活性成分を含む単一の医薬組成物を組み合わせるのも想定できる。活性成分のために別々の医薬組成物を組み合わせる場合、本発明によるＪＮＫ阻害剤の投与は、別々の医薬組成物中に含まれる他の活性成分、例えば、ＰＫＲ阻害剤、アミロイド低下剤又はグルココルチコイドの投与の前、間（同時若しくは重複投与）又は後であって���よい。ＪＮＫ阻害剤の投与「前」の投与は、好ましくは、ＪＮＫ阻害剤の投与が開始する前の２４ｈ以内、より好ましくは１２ｈ以内、更により好ましくは３ｈ以内、特に好ましくは、１ｈ以内及び最も好ましくは３０ｍｉｎ以内を意味する。ＪＮＫ阻害剤の投与「後」の投与は、好ましくは、ＪＮＫ阻害剤の投与が終了した後の２４ｈ以内、より好ましくは１２ｈ以内、更により好ましくは３ｈ以内、特に好ましくは、１ｈ以内及び最も好ましくは３０ｍｉｎ以内を意味する。
【０１６７】
本発明の発明者らは更に、それぞれ、本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列及びキメラペプチドが、本発明の疾患に関与する細胞において特に良好な取込み率を示すことを見出した。したがって、対象に投与される医薬組成物中の、それぞれ、ＪＮＫ阻害剤配列及びキメラペプチドの量は、限定されるものではないが、非常に低用量を有してもよい。したがって、用量は、ＤＴＳ−１０８（Ｆｌｏｒｅｎｃｅ  Ｍｅｙｅｒ−Ｌｏｓｉｃら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００８、２１４５〜５３頁）などの、当技術分野で公知のペプチド薬物よりもはるかに低いものであってもよい。これは、いくつかの肯定的な側面、例えば、潜在的な副反応の減少及び費用の減少を有する。
【０１６８】
好ましくは、用量（体重１ｋｇあたり）は、１０ｍｍｏｌ／ｋｇまで、好ましくは、１ｍｍｏｌ／ｋｇまで、より好ましくは、１００μｍｏｌ／ｋｇ、更により好ましくは、１０μｍｏｌ／ｋｇまで、更により好ましくは、１μｍｏｌ／ｋｇまで、更により好ましくは、１００ｎｍｏｌ／ｋｇまで、最も好ましくは、５０ｎｍｏｌ／ｋｇまでの範囲にある。
【０１６９】
したがって、用量範囲は、好ましくは、約０．０１ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約０．１ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約１．０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１μｍｏｌ／ｋｇ、約５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約３００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約５００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、約７５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、又は前記値のいずれか２つの組合せであってもよい。
【０１７０】
これに関連して、上記の医薬組成物を使用する場合の処置の処方、例えば、用量の決定などは、典型的には、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内にあり、典型的には、処置される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法及び医師には公知の他の因子を考慮に入れる。上記の技術及びプロトコールの例を、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．（編）、１９８０に見出すことができる。したがって、本発明に従って使用される医薬組成物の成分のための上記で定義された「安全かつ有効な量」とは、本明細書で定義されるＪＮＫシグナリングと強く関連する疾患又は障害の正の改変を有意に誘導するのに十分なものである、これらの成分のそれぞれ又は全部の量を意味する。しかしながら、同時に、「安全かつ有効な量」は、重篤な副作用を回避する、すなわち、利益とリスクとの道理にかなった関係を可能にするのに十分に小さいものであると言える。これらの限界の決定は、典型的には、道理にかなった医学的判断の範囲内にある。そのような成分の「安全かつ有効な量」は、付随する医師の知識及び経験の範囲内で、処置される特定の状態及びまた、処置される患者の年齢及び身体状態、状態の重症度、処置の持続期間、付随する療法の性質、使用される特定の薬学的に許容される担体、及び同様の因子と関連して変化する。本発明による医薬組成物は、ヒトのため、及びまた、獣医学的目的で本発明に従って使用することができる。
【０１７１】
本発明に従って使用される医薬組成物は更に、これらの物質の１つに加えて、（適合性の）薬学的に許容される担体、賦形剤、バッファー、安定剤又は当業者には周知の他の材料を含んでもよい。
【０１７２】
これに関連して、「（適合性の）薬学的に許容される担体」という表現は、好ましくは、液体又は非液体ベースの組成物を含む。用語「適合性」とは、本明細書で使用される医薬組成物の構成要素を、通常の使用条件下で組成物の薬学的有効性を実質的に低下させる相互作用が起こらないような様式で、上記で定義された薬学的に活性な成分及び１つの別の成分と混合することができることを意味する。薬学的に許容される担体は、勿論、それらを処置される人への投与にとって好適なものにするのに十分に高い純度及び十分に低い毒性を有する必要がある。
【０１７３】
本明細書で使用される医薬組成物が液体形態で提供される場合、薬学的に許容される担体は、典型的には、１つ又は複数の（適合性の）薬学的に許容される液体担体を含む。組成物は、（適合性の）薬学的に許容される液体担体として、例えば、発熱源を含まない水；等張食塩水、すなわち、０．９％ＮａＣｌの溶液、又は緩衝化（水性）溶液、例えば、リン酸、クエン酸などで緩衝化された溶液、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及びカカオ油などの植物油；例えば、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；アルギン酸などを含んでもよい。特に、本明細書で使用される医薬組成物の注射及び／又は輸注のために、バッファー、好ましくは水性バッファー、及び／又は０．９％ＮａＣｌを使用することができる。
【０１７４】
本明細書で使用される医薬組成物が固体形態で提供される場合、薬学的に許容される担体は、典型的には、１つ又は複数の（適合性の）薬学的に許容される固体担体を含む。組成物は、（適合性の）薬学的に許容される固体担体、例えば、１つ若しくは複数の適合性固体若しくは液体充填剤若しくは希釈剤を含んでもよく、又は人への投与にとって好適である封入化合物を同様に使用してもよい。そのような（適合性の）薬学的に許容される固体担体のいくつかの例は、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖；例えば、コーンスターチ又はジャガイモデンプンなどのデンプン；例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体；粉末状トラガカント；モルト；ゼラチン；獣脂；例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムなどの固体流動促進剤；硫酸カルシウムなどである。
【０１７５】
（適合性の）薬学的に許容される担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に依存してもよい。したがって、（適合性の）薬学的に許容される担体の選択を、原理的には、本発明に従って使用される医薬組成物が投与される様式によって決定することができる。様々な可能な投与経路が、参照により本明細書に組み込まれるＦＤＡの「Ｒｏｕｔｅ  ｏｆ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ」（ＦＤＡ：Ｄａｔａ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｍａｎｕａｌ  −  Ｄｒｕｇ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  −  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  Ｎｕｍｂｅｒ：Ｃ−ＤＲＧ−００３０１；Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ００４を参照）の一覧に列挙されている。特に、非ヒト動物のための適切な投与経路を選択するための更なる指針を、参照により本明細書に組み込まれるＴｕｒｎｅｒ  ＰＶら（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．５０、Ｎｏ  ５、６００〜６１３頁に見出すことができる。投与経路に関する好ましい例としては、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、若しくは経皮経路などの非経口経路（例えば、注射による）、経口、若しくは直腸経路などの経腸経路、経鼻、若しくは鼻内経路などの局所経路、又は表皮経路若しくはパッチ送達などの他の経路が挙げられる。また、（特に、眼関連疾患について）滴下、硝子体内、及び結膜下投与も企図される。同様に、例えば、どのような耳関連疾患を処置する場合であっても、投与は、鼓室内で行ってもよい。
【０１７６】
本発明に従って使用される医薬組成物は、例えば、全身的に投与することができる。一般に、全身投与のための経路としては、例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮下、皮内、経皮、若しくは経粘膜経路などの非経口経路（例えば、注射及び／又は輸注による）、及び経口、消化管若しくは直腸経路などの経腸経路（例えば、錠剤、カプセル、坐剤、栄養チューブによるもの、胃瘻として）が挙げられる。全身投与により、全身での作用を達成することができ、全身投与は非常に便利であることが多いが、環境によっては、それは望ましくない「副作用」を誘発することもあり、及び／又は局部投与と比較して高い濃度の本発明によるＪＮＫ阻害剤が必要となることもある。全身投与は、一般に、その全身作用のため、上記の疾患／障害の防止及び／又は処置に適用可能である。全身投与の好ましい経路は、静脈内、筋肉内、皮下、経口及び直腸投与であり、静脈内及び経口投与が特に好ましい。
【０１７７】
本発明に従って使用される医薬組成物は、例えば、局部的に、例えば、局所的に投与することもできる。局所投与とは、典型的には、皮膚又は粘膜などの体表面への適用を指すが、より一般的な用語「局部投与」は、身体の特定の部分での、及び／又はその中への適用を更に含む。局所投与は、本明細書で定義される皮膚及び／又は皮下組織の疾患及び／又は障害並びに口腔のある特定の疾患及び／又は粘膜と関連する、若しくは粘膜によって接近可能である疾患の処置及び／又は防止にとって特に好ましい。
【０１７８】
局部投与のための経路としては、例えば、経鼻、又は鼻内経路などの吸入経路、眼科用薬及び耳用薬、例えば、点眼薬及び点耳薬、身体の粘膜を介する投与など、又は表皮経路、経皮経路（皮膚への適用）若しくはパッチ送達などの他の経路及び他の局部適用、例えば、処置される臓器又は組織への注射及び／又は輸注などが挙げられる。局部投与においては、副作用は典型的には大部分回避される。ある特定の投与経路、例えば、吸入は、局部効果と全身効果の両方を提供することができることは注目すべきことである。
【０１７９】
本発明に従って使用される医薬組成物のための投与経路を、防止又は処置される障害／疾患に応じて、所望の適用位置に従って選択することができる。
【０１８０】
例えば、経腸投与とは、適用位置としての消化管を指し、経口（ｐ.ｏ．）、消化管及び直腸投与を含み、これらのものは典型的には全身投与経路であり、一般的に上記の疾患の防止／処置に適用可能である。更に、経腸投与は、上記の消化管の疾患／障害、例えば、消化管の炎症性疾患、代謝疾患、がん及び腫瘍疾患、特に、消化管のがん及び腫瘍疾患などを防止及び／又は処置するのに好ましい。例えば、経口経路は通常、患者にとって最も好都合であり、かかる費用は最も低い。したがって、経口投与は、適用可能な場合、都合のよい全身投与にとって好ましい。経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末又は液体形態にあってもよい。錠剤は、ゼラチンなどの上記で定義された固体担体と、場合により、アジュバントとを含んでもよい。経口投与のための液体医薬組成物は一般に、水、石油、動物又は植物油、ミネラルオイル又は合成油などの、上記で定義された液体担体を含んでもよい。生理食塩水溶液、デキストロース又は他の糖溶液又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含有させることができる。
【０１８１】
更に、経腸投与はまた、腸に達しない近位消化管中の適用位置、例えば、舌下、唇下、頬又は歯肉内適用も含む。そのような投与経路は、口腔病、すなわち、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤を用いて処置及び／又は防止することができる口腔の疾患／障害、例えば、一般的な歯髄炎、特に、急性歯髄炎、慢性歯髄炎、増殖性歯髄炎、潰瘍性歯髄炎、不可逆性歯髄炎及び／又は可逆性歯髄炎；インプラント周囲炎；一般的な歯周症、特に、慢性歯周炎、複合歯周炎、単純歯周炎、侵襲性歯周炎、及び／又は例えば、歯髄起源の根尖性歯周炎；歯周症、特に、若年性歯周炎；一般的な歯肉炎、特に、急性歯肉炎、慢性歯肉炎、プラーク性歯肉炎、及び／又は非プラーク性歯肉炎；歯冠周囲炎、特に、急性及び慢性歯冠周囲炎；唾液腺炎；耳下腺炎、特に、感染性耳下腺炎及び自己免疫性耳下腺炎；一般的な口内炎、特に、アフタ性口内炎（例えば、マイナー若しくはメジャー）、ベドナーアフタ、再発性壊死性粘膜腺周囲炎、再発性アフタ性潰瘍、疱疹状口内炎、壊疽性口内炎、義歯性口内炎、潰瘍性口内炎、水疱性口内炎及び／又は歯肉口内炎；粘膜炎、特に、抗新生物療法に起因する、（他の）薬物に起因する、若しくは放射線に起因する粘膜炎、潰瘍性粘膜炎及び／又は口腔粘膜炎；一般的な口唇炎、特に、唇のひび割れ、光線口唇炎、口角炎、湿疹性口唇炎、感染性口唇炎、肉芽腫性口唇炎、薬物関連口唇炎、剥脱性口唇炎、腺性口唇炎、及び／又は形質細胞性口唇炎；特に、口腔及び／又は口唇の蜂巣炎（細菌感染）；剥離性障害、特に、剥離性歯肉炎；及び／又は顎関節障害における適用にとって好ましい。これらの投与経路によって本発明に従って処置及び／又は防止される特に好ましい疾患は、歯周症、特に、慢性歯周炎、粘膜炎、口腔剥離性障害、口腔扁平苔癬、尋常性天疱瘡、歯髄炎、口内炎、顎関節障害、及びインプラント周囲炎から選択される。
【０１８２】
例えば、歯茎（歯肉）への注射による、例えば、歯肉内投与は、例えば、歯周炎を防止及び／又は処置するための口腔病学適用において好ましい。例えば、口腔の障害／疾患、特に、歯周炎を、１００ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの用量（体重１ｋｇあたり）の本発明によるＪＮＫ阻害剤を含む上記で定義された医薬組成物の、舌下、唇下、頬又は歯肉内適用、特に、歯肉内適用により防止又は処置することができ、配列番号１１の配列のキメラペプチドが特に好ましい。
【０１８３】
あるいは、上記の口腔の疾患を、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤又はそれぞれの医薬組成物の全身投与、好ましくは、局所投与によって処置及び／又は防止することもできる。
【０１８４】
更に、経腸投与はまた、厳密な経腸投与、すなわち、腸への直接の投与も含み、全身並びに局部投与のために使用することができる。
【０１８５】
更に、本発明による疾患及び／又は障害の防止及び／又は処置において使用される本発明によるＪＮＫ阻害剤を、中枢神経系（ＣＮＳ）に投与することができる。そのような投与経路としては、特に、硬膜外（ｅｐｉｄｕｒａｌ  （ｐｅｒｉｄｕｒａｌ））、ＣＳＦ内（脳脊髄液内）、脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  （ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ））、くも膜下腔及び大脳内投与、例えば、特定の脳領域への投与が挙げられ、それにより、血液脳関門に関する問題を回避することができる。そのようなＣＮＳ投与経路は、処置される疾患／障害が、上記で特定された神経、神経系及び／又は神経変性疾患である場合に好ましい。
【０１８６】
更に、本発明による疾患及び／又は障害の防止及び／又は処置において使用される本発明によるＪＮＫ阻害剤を、眼に、眼の中に、又は眼の上に投与することができる。そのような投与経路としては、滴下、例えば、局所に、例えば、結膜上に適用される点眼薬、並びに、例えば、注射、輸注及び／又は滴下による、特に、硝子体内（ＩＶＴ）、結膜下、及び後部強膜近傍投与及び／又は局部持続放出薬物送達（例えば、結膜下経路の場合）が挙げられ、点眼（局所適用のため）、硝子体内（ＩＶＴ）及び結膜下投与経路が特に好ましい。結膜下経路は、硝子体内経路よりも安全であり、侵襲性が低いが、硝子体内経路は結膜及び眼窩血管及び組織の存在のため、結膜下経路よりも全身曝露が少ない。
【０１８７】
眼の上への／眼の中への局部投与は、本明細書に開示される処置及び／又は防止される眼関連疾患／障害、例えば、特に、滲出型及び非滲出型の加齢黄斑変性（ＡＭＤ）；網膜色素線条；前眼部虚血性視神経症；前眼部ブドウ膜炎；白内障、特に、加齢型白内障；中心性滲出性脈絡網膜症；中心性漿液性網脈絡膜症；霰粒腫；先天性脈絡膜欠如；脈絡膜炎；脈絡膜硬化症；結膜炎；毛様体炎；糖尿病性網膜症；ドライアイ症候群；眼内炎；上強膜炎；眼感染症；白点状眼底；脳回転状網膜脈絡膜萎縮；麦粒腫；眼瞼の炎症性疾患；脈絡膜の炎症性疾患；毛様体の炎症性疾患；結膜の炎症性疾患；角膜の炎症性疾患；虹彩の炎症性疾患；涙腺の炎症性疾患；眼窩骨の炎症性疾患；強膜の炎症性疾患；硝子体の炎症性疾患；ブドウ膜の炎症性疾患；網膜の炎症性疾患；中間部ブドウ膜炎；虹彩炎；角膜炎；レーバー病；多巣性脈絡膜炎；眼筋の筋炎；新生血管黄斑症（例えば、高度近視、傾斜乳頭症候群、脈絡膜骨腫などにより引き起こされる）；ＮＭＤＡ誘導性網膜毒性；非慢性又は慢性炎症性眼疾患；小口病；視神経疾患；眼窩蜂巣炎；全眼球炎；全ブドウ膜炎；後発白内障；後嚢混濁（ＰＣＯ）（白内障術後合併症）；後眼部ブドウ膜炎；眼内炎症、特に、術後又は外傷後眼内炎症、好ましくは、前眼部及び／又は後眼部手術後の眼内炎症；増殖性硝子体網膜症；網膜動脈閉塞；網膜剥離；網膜疾患；網膜傷害；網膜細動脈瘤；網膜色素上皮剥離；網膜静脈閉塞；網膜炎；網膜色素変性；白点状網膜炎；網膜症、特に、未熟児網膜症及び糖尿病性網膜症；強膜炎；スタルガルト病；炎症した眼外傷及び／又は眼外傷端部の処置；眼の手術又は外傷後の眼内炎症の処置；ブドウ膜炎；卵黄様黄斑ジストロフィーなどにとって特に好ましい。
【０１８８】
特に、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、特に、滲出型及び非滲出型のＡＭＤ、ブドウ膜炎、特に、前眼部及び／又は後眼部ブドウ膜炎、網膜症、特に、未熟児網膜症及び糖尿病性網膜症、及び術後又は外傷後の眼の炎症、特に、術後又は眼内炎症、好ましくは、前眼部及び／又は後眼部手術後の眼内炎症が、眼の中での、及び／又は眼の上への局部投与により、好ましくは、滴下、例えば、点眼により、及び／又は例えば、注射若しくは滴下による、硝子体内及び／又は結膜下投与により、本発明に従って使用されるＪＮＫ阻害剤によって防止及び／又は処置される。それにより、滴下、例えば、点眼、及び／又は例えば、注射による結膜下投与は、好ましい投与経路であり、例えば、結膜下注射による結膜下投与が特に好ましい。これらの投与経路、特に、硝子体内及び／又は結膜下投与について、本発明によるそれぞれの医薬組成物は、好ましくは、眼あたり、１００ｎｇ〜１０ｍｇの範囲、より好ましくは１μｇ〜５ｍｇの範囲、更により好ましくは５０μｇ〜１ｍｇの範囲の用量の本発明によるＪＮＫ阻害剤、好ましくは、配列番号１１の配列のキメラペプチド（すなわち、眼あたりに投与される１００ｎｇ〜１０ｍｇの範囲、より好ましくは１μｇ〜５ｍｇの範囲、更により好ましくは５０μｇ〜１ｍｇの範囲の用量のＪＮＫ阻害剤）を含む。そのような用量の１回の投与又はより多くの投与、特に、２、３、４又は５回の投与を実施することができ、１回の投与が好ましいが、例えば、処置スケジュールの異なる日に、その後の用量を投与してもよい。例えば、ヒトにおける硝子体内及び／又は結膜下投与については、ＪＮＫ阻害剤の単回用量（眼あたり）は、好ましくは、１μｇ〜５ｍｇ、好ましくは５０μｇ〜１．５ｍｇ、より好ましくは５００μｇ〜１ｍｇ、最も好ましくは８００μｇ〜１ｍｇの範囲にある。特に結膜下注射のための注射容量は、例えば、１００μｌ〜５００μｌ、例えば、２５０μｌであってもよい。そのような用量の単回結膜下注射は、例えば、ヒトにおける術後眼内炎症、好ましくは、前眼部及び／又は後眼部手術後の眼内炎症を処置及び／又は防止するのに特に有用である。
【０１８９】
両眼又は一方の眼のみに適用することができる、特に、滴下、好ましくは点眼薬としての局所眼投与のために、必要に応じて、本発明によるＪＮＫ阻害剤を含む医薬組成物は、典型的には、例えば、（滅菌）０．９％ＮａＣｌを含む、溶液、好ましくは、眼科用溶液である。そのような医薬組成物は、特に、０．００１％〜１０％の本明細書に記載されるＪＮＫ阻害剤、好ましくは、０．０１％〜５％の本明細書に記載のＪＮＫ阻害剤、より好ましくは、０．０５％〜２％の本明細書に記載のＪＮＫ阻害剤、更により好ましくは、０．１％〜１％の本明細書に記載のＪＮＫ阻害剤を含む。点眼薬を１回又は反復的に投与してもよく、反復投与が好ましい。一般に、投与は、必要性に依存し、例えば、要求に応じるものであってもよい。反復投与においては、その後の用量を、処置スケジュールの同じ日及び／又は異なる日に投与してもよく、同じ日に、単回用量又は１回を超える単回用量、特に、２、３、４又は５、好ましくは２〜４回用量を投与してもよく、そのような反復投与は、好ましくは、１又はそれ以上の時間、例えば、２、３、４、５、６、７又は８時間の間隔を空ける。例えば、点眼薬を、数週間、例えば、２、３、４、５又は６週間にわたって１日あたり３又は４回投与してもよい。
【０１９０】
更に、本明細書に記載の眼疾患は、勿論、本発明によるＪＮＫ阻害剤の全身適用によって処置及び／又は防止することもできる（本明細書に記載の他の疾患／障害にも適用される）。眼疾患における全身投与、特に、静脈内投与のための用量は、好ましくは、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇの範囲である。そのような用量は、例えば、ブドウ膜炎を処置及び／又は防止するのに特に有用であり、処置スケジュールは、単回用量又は反復用量を含んでもよく、その後の用量を処置スケジュールの異なる日に投与してもよい。
【０１９１】
好ましくは、ブドウ膜炎、好ましくは、前眼部ブドウ膜炎、より好ましくは、急性前眼部ブドウ膜炎の防止及び／又は処置のために、単回用量又は反復用量の本発明によるＪＮＫ阻害剤、好ましくは、配列番号１１のＪＮＫ阻害剤を、結膜下投与する。好ましくは、単回用量が投与される。しかしながら、反復用量を、好ましくは、毎週又は２週間毎に投与するのも好ましい。好ましくは、本発明によるＪＮＫ阻害剤、好ましくは、配列番号１１のＪＮＫ阻害剤を、０．０１μｇ／眼〜１０ｍｇ／眼、より好ましくは０．１μｇ／眼〜５ｍｇ／眼、更により好ましくは１μｇ／眼〜２ｍｇ／眼、特に好ましくは１００μｇ／眼〜１．５ｍｇ／眼、最も好ましくは５００μｇ／眼〜１ｍｇ／眼の範囲、例えば、９００μｇ／眼で、例えば、（結膜下）注射のための用量で適用する。
【０１９２】
例えば、ブドウ膜炎の処置及び／又は防止において、特に、静脈内に、単回用量より多いものを適用する場合、用量は典型的には、少なくとも１日の間隔、好ましくは少なくとも２日の間隔、より好ましくは少なくとも３日の間隔、更により好ましくは少なくとも４日、少なくとも５日、又は少なくとも６日の間隔、特に好ましくは少なくとも１週間の間隔、最も好ましくは少なくとも１０日の間隔を空ける。
【０１９３】
典型的には、防止及び／又は処置される疾患並びにそれぞれの薬物動態に従って選択される、本発明によるＪＮＫ阻害剤の使用のための他の投与経路としては、限定されるものではないが、例えば、特に、乾癬、湿疹、皮膚炎、座瘡、口腔潰瘍、紅斑、扁平苔癬、サルコイドーシス、血管炎、及び成人線状ＩｇＡ病から選択される、本明細書で定義される（上記の）皮膚疾患のための、経皮適用（皮膚への）及び／又は病変内適用（皮膚病変中への）；例えば、呼吸器系の疾患、特に、肺疾患、例えば、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、喘息、呼吸器系を含む慢性疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、炎症性肺疾患、肺炎、及び肺線維症のための経鼻投与；例えば、関節炎、特に、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎及び関節リウマチ、及び関節症、及び変形性関節症における関節内投与（関節腔への）；例えば、泌尿器系、特に、膀胱の疾患のための膀胱内投与（すなわち、膀胱中への）；心臓内投与、静脈内投与、膣内投与、並びに皮内投与が挙げられる。
【０１９４】
一般に、投与方法は、上記の様々な因子、例えば、選択される薬学的担体及び医薬調製物の性質（例えば、液体、錠剤などとして）並びに投与経路に依存する。例えば、本発明によるＪＮＫ阻害剤を含む医薬組成物は、液体として、例えば、０．９％ＮａＣｌ中の、本発明によるＪＮＫ阻害剤、好ましくは、配列番号１１の配列のキメラペプチドの溶液として調製することができる。液体医薬組成物は、様々な方法により、例えば、スプレー（例えば、吸入、鼻内などの経路について）として、局所適用のための流体として、ボーラス注射などの注射により、輸注により、例えば、ポンプを使用することにより、滴下により投与することができるが、ｐ．ｏ．、例えば、ドロップ又は飲用溶液として、パッチ送達系などにおいても投与することができる。したがって、投与のために、特に、注射及び／又は輸注のために、様々なデバイス、例えば、注射筒（予め充填された注射筒など）；注射デバイス（例えば、ＩＮＪＥＣＴ−ＥＡＳＥＴ（商標）及びＧＥＮＪＥＣＴＴ（商標）デバイス）；輸注ポンプ（例えば、Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ（商標）など）；インジェクターペン（ＧＥＮＰＥＮＴ（商標）など）；無針デバイス（例えば、ＭＥＤＤＥＣＴＯＲ（商標）及びＢＩＯＪＥＣＴＯＲ（商標））；又は自己注射器を使用することができる。
【０１９５】
使用される医薬組成物の好適な量を、動物モデルを用いる所定の実験によって決定することができる。そのようなモデルとしては、限定を意味するものではないが、例えば、ウサギ、ヒツジ、マウス、ラット、スナネズミ、イヌ、ブタ及び非ヒト霊長類モデルが挙げられる。投与のため、特に、注射及び／又は輸注のための好ましい単位剤形は、水、生理食塩水又はその混合物の滅菌溶液を含む。そのような溶液のｐＨを、約７．４に調整するべきである。投与のため、特に、注射及び／又は輸注のための好適な担体としては、ヒドロゲル、制御放出又は遅延放出のためのデバイス、ポリ乳酸及びコラーゲンマトリックスが挙げられる。局所適用のための好適な薬学的に許容される担体としては、ローション、クリーム、ゲルなどにおける使用にとって好適であるものが挙げられる。化合物を経口投与しようとする場合、錠剤、カプセルなどが好ましい単位剤形である。経口投与のために使用することができる単位剤形の調製のための薬学的に許容される担体は、先行技術において周知である。その選択は、本発明の目的にとって重要ではない、味、費用及び保存性などの二次的考察に依存し、当業者は困難を伴わずに行うことができる。
【０１９６】
静脈内、筋肉内、腹腔内、皮膚又は皮下注射及び／又は輸注、又は罹患部位での注射及び／又は輸注、すなわち、局部注射／輸注のために、活性成分は、発熱源を含まず、好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容される水性溶液の形態にある。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、特に、０．９％ＮａＣｌ、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを使用して、好適な溶液を調製することができる。必要に応じて、保存剤、安定剤、バッファー、酸化防止剤及び／又は他の添加剤を含有させることができる。それがポリペプチド、ペプチド、又は核酸分子、個体に与えられる本発明による他の薬学的に有用な化合物であろうと、投与は、好ましくは、「予防有効量又は治療有効量」（場合によって）にあり、これは個体に対して利益を示すのに十分なものである。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間経過は、処置されるものの性質及び重症度に依存する。例えば、ヒトにおけるｉ．ｖ．投与のためには、１ｍｇ／ｋｇ体重までの単回用量が好ましく、より好ましくは、５００μｇ／ｋｇ体重まで、更により好ましくは１００μｇ／ｋｇ体重まで、例えば、１００ｎｇ〜１ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、より具体的には、１μｇから５００μｇ／ｋｇ体重の範囲、更により具体的には、５μｇ〜１００μｇ／ｋｇ体重の範囲が好ましい。そのような用量を、例えば、注射及び／又は輸注として、特に、輸注として投与することができ、輸注の持続時間は、例えば、１〜９０ｍｉｎ、好ましくは１０〜７０ｍｉｎ、より好ましくは３０〜６０ｍｉｎで変化する。
【０１９７】
特に、本明細書で定義される医薬組成物中の、本発明によるＪＮＫ阻害剤、例えば、配列番号１１の配列を有するキメラペプチドの使用の特定の好ましい実施形態としては、限定されるものではないが、以下の疾患／障害の防止及び／又は処置が挙げられる：
（ｉ）呼吸器疾患、特に、肺炎症及び線維症、具体的には、ＣＯＰＤ、ここで、ＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、１０ｎｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは、１μｇ／ｋｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇの範囲の用量（体重１ｋｇあたり）で適用され、そのような単回用量を１、２、３又は４回反復してもよく、好ましくは、全身的に、例えば、ｉ．ｖ．若しくはｓ．ｃ．で、又は鼻内に適用される；
（ｉｉ）代謝疾患及び障害、例えば、一般的な糖尿病、特に、１型糖尿病、２型糖尿病、原因となる状態に起因する、例えば、先天性風疹、クッシング症候群、嚢胞性線維症、悪性新生物、栄養不良、又は膵炎及び膵臓の他の疾患に起因する糖尿病、薬物又は化学物質誘発性糖尿病、及び／又は他の糖尿病、ここで、代謝疾患の処置及び／又は防止のために、ＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、１００μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは、５ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量（体重１ｋｇあたり）で適用され、そのような単回用量を１〜数週間、例えば、４週間にわたって毎日反復してもよく、好ましくは、全身的に、例えば、ｉ．ｖ．又はｓ．ｃ．で適用される；
（ｉｉｉ）口腔及び／又は顎骨の疾患、特に、（ｉ）一般的な歯髄炎、特に、急性歯髄炎、慢性歯髄炎、増殖性歯髄炎、潰瘍性歯髄炎、不可逆性歯髄炎及び／又は可逆性歯髄炎；（ｉｉ）インプラント周囲炎；（ｉｉｉ）一般的な歯周症、特に、慢性歯周炎、複合歯周炎、単純歯周炎、侵襲性歯周炎、及び／又は例えば、歯髄起源の根尖性歯周炎；歯周症、特に、若年性歯周炎；（ｉｖ）一般的な歯肉炎、特に、急性歯肉炎、慢性歯肉炎、プラーク性歯肉炎、及び／又は非プラーク性歯肉炎；（ｖ）歯冠周囲炎、特に、急性及び慢性歯冠周囲炎；唾液腺炎；耳下腺炎、特に、感染性耳下腺炎及び自己免疫性耳下腺炎；（ｖｉ）一般的な口内炎、特に、アフタ性口内炎（例えば、マイナー若しくはメジャー）、ベドナーアフタ、再発性壊死性粘膜腺周囲炎、再発性アフタ性潰瘍、疱疹状口内炎、壊疽性口内炎、義歯性口内炎、潰瘍性口内炎、水疱性口内炎及び／又は歯肉口内炎；（ｖｉｉ）粘膜炎、特に、抗新生物療法に起因する、（他の）薬物に起因する、若しくは放射線に起因する粘膜炎、潰瘍性粘膜炎及び／又は口腔粘膜炎；（ｖｉｉｉ）一般的な口唇炎、特に、唇のひび割れ、光線口唇炎、口角炎、湿疹性口唇炎、感染性口唇炎、肉芽腫性口唇炎、薬物関連口唇炎、剥脱性口唇炎、腺性口唇炎、及び／又は形質細胞性口唇炎；並びに（ｉｘ）特に、口腔及び／又は口唇の蜂巣炎（細菌感染）；剥離性障害、特に、剥離性歯肉炎；及び／又は顎関節障害から選択される口腔及び／又は顎骨の炎症性疾患、それにより、歯周炎、インプラント周囲炎、歯肉炎、口内炎及び粘膜炎が好ましく、歯周炎が特に好ましい；ここで、口腔及び／又は顎骨の疾患の処置及び／又は防止のために、ＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、１００μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは２ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量（体重１ｋｇあたり）で適用され、好ましくは、歯肉内又は局所、特に好ましくは歯肉内に適用される；
（ｉｖ）特に、（ｉ）糸球体腎炎、例えば、非増殖性糸球体腎炎、特に、微小変化型疾患、巣状分節状糸球体硬化症、巣状分節状糸球体ヒアリン変性及び／又は硬化症、巣状糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、及び／又は菲薄基底膜病、及び増殖性糸球体腎炎、特に、膜性増殖性糸球体腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、管内増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、デンスデポジット病（膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型）、管外糸球体腎炎（半月体形成性糸球体腎炎）、急速進行性糸球体腎炎（ＲＰＧＮ）、特に、Ｉ型ＲＰＧＮ、ＩＩ型ＲＰＧＮ、ＩＩＩ型ＲＰＧＮ、及びＩＶ型ＲＰＧＮ、急性増殖性糸球体腎炎、感染後糸球体腎炎、及び／又はＩｇＡ腎症（ベルガー病）；急性腎炎症候群；急速進行性腎炎症候群；反復性及び持続性血尿；慢性腎炎症候群；ネフローゼ症候群；特定の形態学的病変を有するタンパク尿；糸球体炎；糸球体症；糸球体硬化症；（ｉｉ）一般的な急性腎臓傷害（「ＡＫＩ」、「急性腎不全」若しくは「急性腎臓不全」とも呼ばれる）、特に、腎前性ＡＫＩ、内因性ＡＫＩ、腎後性ＡＫＩ、腎尿細管壊死、例えば、急性腎尿細管壊死、腎尿細管壊死を伴うＡＫＩ、皮質壊死、例えば、急性皮質壊死及び腎皮質壊死を伴うＡＫＩ、髄質壊死、例えば、髄質（乳頭）壊死、急性髄質（乳頭）壊死及び慢性髄質（乳頭）壊死を伴うＡＫＩ、若しくは他のＡＫＩ；慢性腎臓疾患；又は（ｉｉｉ）特に、膜性腎症、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、遺伝性腎症、鎮痛薬性腎症、ＣＦＨＲ５腎症、造影剤誘導腎症、アミロイド腎症、逆流性腎症及び／又はメソアメリカ腎症、糖尿病性腎症、糖尿病性腎症から選択される腎症から選択される腎疾患（腎臓疾患）、それにより、好ましくは、防止及び／又は処置される障害／疾患は、糸球体腎炎又は糖尿病性腎症であり、より好ましくは、防止及び／又は処置される障害／疾患は、糸球体腎炎である；ここで、腎疾患（腎臓疾患）、好ましくは、糸球体腎炎、より好ましくは、巣状分節状糸球体硬化症及び／又は線維症を伴う糸球体腎炎の処置及び／又は防止のために、ＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、１０μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１００μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量（体重１ｋｇあたり）で適用され、ＪＮＫ阻害剤、好ましくは、配列番号１１の配列を有するキメラペプチドは、好ましくは、適用可能な場合、１回又は反復的に、好ましくは、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間以上にわたって毎週（週１回）、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間以上にわたって２週間毎に（２週間に１回）、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間以上にわたって毎月（月に１回）、数カ月、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０カ月以上にわたって６週間毎に（６週間に１回）、数カ月、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０カ月以上にわたって２カ月毎に（２カ月に１回）、又は数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間以上にわたって３カ月毎に（３カ月に１回）、より好ましくは、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９��しくは１０週間以上にわたって毎週（週に１回）、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間以上にわたって２週間毎に（２週間に１回）、数カ月、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０カ月以上にわたって毎月（月に１回）、更により好ましくは、数カ月、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０カ月以上にわたって毎月（月に１回）投与され、好ましくは、全身的に、例えば、ｉ．ｖ．又はｓ．ｃ．で適用される；
（ｖ）特に、（ｉ）一般的な肝臓がん及び肝臓癌、特に、肝臓転移、肝臓細胞癌、肝細胞癌、ヘパトーマ、肝内胆管癌、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫（肝臓の）、及び他の特定若しくは不特定の肝臓の上皮性悪性腫瘍及び非上皮性悪性腫瘍；（ｉｉ）前立腺がん及び／又は前立腺癌；及び／又は（ｉｉｉ）一般的な結腸がん及び結腸癌、特に、盲腸癌、虫垂癌、上行結腸癌、肝湾曲部癌、横行結腸癌、脾湾曲部癌、下行結腸癌、Ｓ状結腸癌、結腸の重複部位の癌腫及び／又は結腸の悪性カルチノイド腫瘍から選択されるがん及び腫瘍疾患、ここで、がん及び腫瘍疾患の処置及び／又は防止のために、ＪＮＫ阻害剤は、好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量（体重１ｋｇあたり）で、反復的に適用可能な場合、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０週間にわたって、例えば、毎日、２又は３日又は週毎に、適用され、好ましくは、全身的に、例えば、ｐ．ｏ．、ｉ．ｖ．又はｓ．ｃ．で適用される；
（ｖｉ）眼の疾患、特に、（ｉ）滲出性及び／又は非溢出性加齢黄斑変性、好ましくは、滲出型若しくは非滲出型の加齢黄斑変性を含む、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）；（ｉｉ）特に、糖尿病性網膜症、（動脈高血圧誘発性）高血圧性網膜症、滲出性網膜症、放射線誘発性網膜症、日光誘発性日光網膜症、外傷誘発性網膜症、例えば、プルチェル網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）及び／又は過粘稠度関連網膜症、非糖尿病性増殖性網膜症、及び／又は増殖性硝子体網膜症から選択される網膜症、それにより、糖尿病性網膜症及び未熟児網膜症（ＲＯＰ）が好ましく、糖尿病性網膜症が特に好ましい；（ｉｉｉ）特に、眼に対して、及び／又は眼の中で行われた手術の後の、眼の術後及び／又は外傷後炎症、好ましくは、前眼部及び／又は後眼部手術の後、例えば、白内障手術、レーザー眼科手術（例えば、レーザー原位置角膜切開反転術（ＬＡＳＩＫ））、緑内障手術、屈折矯正手術、角膜手術、硝子体−網膜手術、眼筋手術、眼形成手術、眼腫瘍手術、翼状片を含む結膜手術、及び／又は涙器を含む手術の後、特に、複雑な眼の手術及び／又は複雑ではない眼の手術の後の眼内炎症；及び／又は（ｉｖ）ブドウ膜炎、特に、前眼部、中間部及び／又は後眼部ブドウ膜炎、交感性ブドウ膜炎及び／又は全ブドウ膜炎、好ましくは、前眼部及び／又は後眼部ブドウ膜炎；ここで、眼の疾患の処置及び／又は防止のための糖尿病性網膜症、前眼部及び／又は後眼部ブドウ膜炎又は術後及び／又は外傷後の眼の炎症の処置及び／又は防止のために、ＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、例えば、注射については、０．０１μｇ／眼〜１０ｍｇ／眼、より好ましくは０．１μｇ／眼〜５ｍｇ／眼、更により好ましくは１μｇ／眼〜２ｍｇ／眼、特に好ましくは１００μｇ／眼〜１．５ｍｇ／眼、最も好ましくは５００μｇ／眼〜１ｍｇ／眼の範囲、例えば、９００μｇ／眼の用量で、好ましくは、単回注射によって、しかしながら、必要に応じて、反復的に、例えば、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間にわたって、毎日、２若しくは３日若しくは週毎に、又は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２週以上毎に１回、好ましくは、２、３、４、６、８、１０若しくは１２週毎に１回適用され、好ましくは、ｉ．ｖ．で、又は眼の中に、若しくは眼の上に、より好ましくは、硝子体内に、又は結膜下に、更により好ましくは、結膜下に適用される。例えば、術後眼内炎症、特に、前眼部及び／又は後眼部手術後、例えば、白内障手術、レーザー眼科手術（例えば、レーザー原位置角膜切開反転術（ＬＡＳＩＫ））、緑内障手術、屈折矯正手術、角膜手術、硝子体−網膜手術、眼筋手術、眼形成手術、眼腫瘍手術、翼状片を含む結膜手術、及び／又は涙器を含む手術の後、特に、複雑な眼の手術及び／又は複雑ではない眼の手術の後の眼内炎症を処置及び／又は防止するためには、結膜下投与及び／又は滴下、例えば、点眼薬が特に好ましい。それにより、結膜下投与のためには、手術後の、好ましくは、手術後３時間以内の、例えば、患者がまだ手術室にいる場合は手術手順の終了の直後の単回注射が特に好ましい。滴下のためには、例えば、２〜４週、好ましくは３週にわたって１日あたり２〜４回用量、好ましくは３回用量の適用が好ましく、第１の用量を、例えば、手術の直後に適用することができる。更に、術後眼内炎症、特に、前眼部及び／又は後眼部手術後の眼内炎症を処置及び／又は防止するために、本発明のＪＮＫ阻害剤を、独立型療法として投与することができるが、特に、炎症が所定の期間を超えて持続する場合、本発明のＪＮＫ阻害剤を、他の薬剤、例えば、コルチコステロイド、好ましくは、グルココルチコイド、例えば、デキサメタゾンと組み合わせて投与することもできる。例えば、本発明のＪＮＫ阻害剤を最初に単独で使用し、炎症が持続する場合、それらをコルチコステロイドと組み合わせるか、又はコルチコステロイドを最初に使用した場合、炎症が持続する場合にそれらを本発明のＪＮＫ阻害剤と組み合わせることができる；
（ｖｉｉ）泌尿器系の疾患及び／又は障害、特に、尿管炎；尿路感染（膀胱感染、急性膀胱炎）；一般的な膀胱炎、特に、間質性膀胱炎、ハナー潰瘍、三角炎及び／又は出血性膀胱炎；尿道炎、特に、非淋菌性尿道炎若しくは淋菌性尿道炎；膀胱痛症候群；ＩＣ／ＰＢＳ；尿道症候群；及び／又は後腹膜線維化症；好ましくは、ＩＣ／ＰＢＳ；ここで、泌尿器系の疾患及び／又は障害の処置及び／又は防止のために、好ましくは、ＩＣ／ＰＢＳの処置及び／又は防止のために、ＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、（ｉ）全身的に、より好ましくは静脈内に、例えば、静脈内注射により、１００ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量（体重１ｋｇあたり）で適用され、好ましくは、１回の単回用量で投与されるが、適用可能な場合、また好ましくは、反復的に、例えば、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間にわたって、毎日、２若しくは３日毎若しくは週毎に投与される；又はＪＮＫ阻害剤はまた好ましくは、（ｉｉ）膀胱内に、より好ましくは、膀胱内輸注により、好ましくは、１０μｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは５０μｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌ、更により好ましくは１００μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、特に好ましくは、０．５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは、０．１〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．５〜５００ｍｇ、更により好ましくは１〜１００ｍｇ、特に好ましくは２〜１０ｍｇの単回用量で適用され、好ましくは、１回の単回用量で投与されるが、適用可能な場合、また好ましくは、反復的に、例えば、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間にわたって、毎日、２若しくは３日毎若しくは週毎に投与される；並びに
（ｖｉｉｉ）神経、神経系又は神経変性障害、特に、神経変性疾患、好ましくは、アルツハイマー病、例えば、早発型アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病、老年型及び初老期型アルツハイマー認知症、及び／又は軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害、ここで、神経、神経系又は神経変性障害の処置及び／又は防止のために、ＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは１００μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲の用量（体重１ｋｇあたり）で適用され、ＪＮＫ阻害剤は、好ましくは、適用可能な場合、１回又は反復的に、好ましくは、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間以上にわたって毎週（週１回）、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間以上にわたって２週毎に（２週に１回）、数カ月、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０カ月以上にわたって毎月（月１回）、数カ月、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０カ月以上にわたって６週毎に（６週毎に１回）、数カ月、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０カ月以上にわたって２カ月毎に（２カ月に１回）又は数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間以上にわたって３カ月毎に（３カ月に１回）、より好ましくは、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間以上にわたって毎週（週１回）、数週間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週間以上にわたって２週毎に（２週に１回）、数カ月、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０カ月以上にわたって毎月（月１回）、更により好ましくは、数カ月、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０カ月以上にわたって毎月（月１回）投与され、好ましくは、全身的に、例えば、ｉ．ｖ．、ｐ．ｏ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．又はＣＳＦ内（脳脊髄液内）で適用され、更に、神経、神経系又は神経変性障害、特に、神経変性疾患、好ましくは、アルツハイマー病、例えば、早発型アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病、老年型及び初老期型アルツハイマー認知症、及び／又は軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害を処置及び／又は防止するために、本発明のＪＮＫ阻害剤を、独立型療法として投与してもよいが、本発明のＪＮＫ阻害剤を、他の薬剤、例えば、ＰＫＲ阻害剤、例えば、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｇｒｏｕｐによる「ＳＣ１４８１」と組み合わせて、場合により、本発明によるＪＮＫ阻害剤及びＰＫＲ阻害剤に加えて、アミロイド低下剤と組み合わせて投与してもよく、ここで、アミロイド低下剤としては、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）阻害剤、γ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）及びモジュレーター（ＧＳＭ）が挙げられ、現在、臨床試験中であるそのような阻害剤の例を、Ｖａｓｓａｒ  Ｒ．（２０１４）  ＢＡＣＥ１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ��；６（９）：８９頁から、又はＪｉａ  Ｑ、Ｄｅｎｇ  Ｙ、Ｑｉｎｇ  Ｈ（２０１４）  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｒ  ｂｅｙｏｎｄ  β−ａｍｙｌｏｉｄ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．２０１４；２０１４：８３７１５７頁から回収することができる。
【０１９８】
本明細書で定義される疾患の防止及び／又は処置は、典型的には、上記で定義された医薬組成物の投与を含む。用語「モジュレート」は、ＪＮＫが上記疾患のいずれかにおいて過剰発現される場合に、ＪＮＫの発現の抑制を含む。それはまた、細胞における天然のｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２及びＮＦＡＴ４結合部位の競合的阻害剤として、例えば、配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかの少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列及び／又は配列番号９〜１２及び２３〜３２の配列のいずれか（配列番号１１が特に好ましい）の少なくとも１つのキメラペプチド及び／又は配列番号５〜８及び２１〜２２のいずれかの輸送配列を含む配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかの少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列、又は上記定義内にあるそのバリアント若しくは断片を使用することによる、上記疾患のいずれかにおけるｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２又はＮＦＡＴ４のリン酸化の抑制を含む。用語「モジュレート」はまた、限定されるものではないが、ｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２、又はＮＦＡＴ４及びその関連するパートナー、例えば、ｃ−ｊｕｎ、ＡＦＴ２及びｃ−ｆｏｓから構成されるＡＰ−１複合体などから構成される転写因子のヘテロ及びホモマー複合体の抑制も含む。上記で定義されたＪＮＫシグナリングと強く関連する疾患又は障害がＪＮＫ過剰発現と関連する場合、そのような抑制的ＪＮＫ阻害剤配列を細胞に導入することができる。いくつかの場合、次いで、「モジュレート」は、例えば、ＩＢ−ペプチドのＪＮＫへの結合を遮断し、したがって、ＩＢ−関連ペプチドによるＪＮＫ阻害を防止するＩＢペプチド特異的抗体の使用による、ＪＮＫ発現の増加を含んでもよい。
【０１９９】
上記で開示された医薬組成物を用いる対象の防止及び／又は処置を、典型的には、（「治療有効」）量の前記医薬組成物を対象に（ｉｎ  ｖｉｖｏで）投与することによって達成することができ、ここで、対象は、例えば、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ又はブタであってもよく、ヒトが特に好ましい。用語「治療有効」とは、医薬組成物の活性成分が、上記で定義されたＪＮＫシグナリングと強く関連する疾患又は障害を改善するのに十分な量のものであることを意味する。
【０２００】
したがって、上記で定義された任意のペプチド、例えば、配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかの少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列及び／又は配列番号９〜１２及び２３〜３２の配列のいずれか、好ましくは配列番号１１の少なくとも１つのキメラペプチド、及び／又は配列番号５〜８及び２１〜２２のいずれかの輸送配列を含む配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかの少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列、又は上記定義内にあるそのバリアント若しくは断片を、本発明の特定の実施形態において使用して、例えば、活性化ＪＮＫシグナリング経路をモジュレートすることにより、上記で定義されたＪＮＫシグナリングと強く関連する疾患又は障害を処置することができる。
【０２０１】
しかしながら、上記で定義されたペプチドはまた、例えば、遺伝子療法のために、後に本発明の医薬組成物の一部を形成し得る核酸によってコードされていてもよい。これに関連して、遺伝子療法とは、例えば、核酸がＬ−アミノ酸のみを含む、上記で定義された医薬組成物を用いて、上記で定義された特異的核酸の対象への投与によって実施される療法を指す。本発明のこの実施形態においては、核酸は、そのコードされるペプチドを産生し、次いで、疾患又は障害の機能をモジュレートすることによって治療効果を発揮するのに役立つ。当技術分野で利用可能な遺伝子療法に関する方法のいずれかを、本発明の実施において使用することができる（例えば、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、１９９３、Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍ  １２：４８８〜５０５頁を参照されたい）。
【０２０２】
好ましい実施形態においては、上記で定義され、遺伝子療法のために使用される核酸は、好適な宿主内で、上記で定義されたＩＢ関連ペプチドのいずれか１つ又は複数、すなわち、配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列及び／又は配列番号９〜１２及び２３〜３２の配列のいずれかのキメラペプチド、及び／又は配列番号５〜８及び２１〜２２のいずれかの輸送配列を含む配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列、又は上記定義内にあるそのバリアント若しくは断片をコードし、発現する発現ベクターの一部である。特定の実施形態においては、そのような発現ベクターは、ＪＮＫ阻害剤配列のコード領域に作動可能に連結されたプロモーターを有する。プロモーターは、上記で定義されたものであってよく、例えば、誘導性又は構成的、場合により、組織特異的であってもよい。
【０２０３】
別の特定の実施形態においては、上記で定義された核酸分子は、上記で定義された核酸分子のコード配列（及びその任意の他の所望の配列）が、ゲノム内での所望の部位で相同組換えを促進する領域に隣接し、したがって、これらの核酸の染色体内発現を提供する、遺伝子療法のために使用される（例えば、Ｋｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈｉｅｓ、１９８９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：８９３２〜８９３５頁を参照されたい）。
【０２０４】
特に、上記で定義されたＪＮＫシグナリングと強く関連する上記の疾患又は障害の状況における、遺伝子療法の目的のための患者への本発明による上記で定義された核酸の送達は、直接的なものであっても（すなわち、患者は核酸若しくは核酸含有ベクターに直接曝露される）又は間接的なものであってもよく（すなわち、細胞を最初はｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸で形質転換した後、患者に移植する）、一般には、医薬組成物について上記の投与経路が適用されるが、同様に、例えば、処置される組織又は臓器への局部注射による局部投与が好ましい。これらの２つの手法は、それぞれ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法として公知である。本発明の特定の実施形態においては、核酸はｉｎ  ｖｉｖｏで直接投与され、そこで発現されて、コードされる産物を産生する。これを、例えば、適切な核酸発現ベクターの一部として核酸を構築すること、及びそれが細胞内となるような様式でそれを投与すること（例えば、欠損性若しくは弱毒化レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス若しくは他のウイルスベクターを使用する感染による；米国特許第４，９８０，２８６号を参照されたい）；裸のＤＮＡを直接注入すること；微粒子ボンバードメントを使用すること（例えば、「ＧｅｎｅＧｕｎ」；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、ＤｕＰｏｎｔ）；核酸を脂質でコーティングすること；関連する細胞表面受容体／トランスフェクト剤を使用すること；リポソーム、微粒子、若しくはマイクロカプセル中に封入すること；それを、核に進入することが知られるペプチドと連結させて投与すること；又はそれを、目的の受容体を特異的に発現する細胞型を「標的化する」ために使用することができる受容体媒介性エンドサイトーシスを受けやすくしたリガンドに連結させて投与すること（例えば、Ｗｕ及びＷｕ、１９８７、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：４４２９〜４４３２頁を参照されたい）などを含む、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって達成することができる。
【０２０５】
本発明の実施における遺伝子療法に対する更なる手法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、ウイルス感染などの方法によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組織培養中の細胞に遺伝子（上記で定義された核酸を含む）を導入することを含む。一般に、導入方法は、選択マーカーの細胞への同時的導入を含む。次いで、細胞を選択圧（例えば、抗生物質耐性）下に置いて、導入される遺伝子を取り込んだ、それを発現している細胞の単離を容易にする。次いで、これらの細胞を患者に送達する。特定の実施形態においては、得られた組換え細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの投与の前に、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、目的の核酸配列を含有するウイルス又はバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、微小細胞媒介性遺伝子導入、スフェロプラスト融合、並びにレシピエントの細胞の必要な発達機能及び生理的機能が導入によって破壊されないことを確保する同様の方法を含む、当技術分野で公知の任意の方法によって、核酸を細胞中に導入する。例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ及びＢｅｈｒ、１９９３、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２１７：５９９〜６１８頁を参照されたい。選択される技術は、核酸が細胞によって発現可能であるような、細胞への核酸の安定な導入を提供するべきである。好ましくは、導入される核酸は、細胞子孫によって遺伝され、発現される。
【０２０６】
本発明の好ましい実施形態においては、得られる組換え細胞を、例えば、上皮細胞の注射（例えば、皮下的）、患者への皮膚移植片としての組換え皮膚細胞の適用、及び組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞又は前駆細胞）の静脈内注射を含む当技術分野で公知の様々な方法によって患者に送達することができる。使用について想定される細胞の総量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者は決定することができる。核酸を遺伝子療法の目的のために導入することができる細胞は、任意の望ましい、利用可能な細胞型を包含し、異種性、異種遺伝子型、同系、又は自己性であってもよい。細胞型としては、限定されるものではないが、上皮細部、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞及び血液細胞などの分化した細胞、又は様々な幹細胞若しくは前駆細胞、特に、胚性心筋細胞、肝臓幹細胞（国際特許出願公開ＷＯ９４／０８５９８）、神経幹細胞（Ｓｔｅｍｐｌｅ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９２、Ｃｅｌｌ  ７１：９７３〜９８５頁）、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られるような造血幹細胞若しくは前駆細胞が挙げられる。好ましい実施形態においては、遺伝子療法のために使用される細胞は、患者にとって自己性である。
【０２０７】
あるいは、及び／又は更に、本明細書に記載の疾患を処置するために、標的化療法を使用して、（標的化）抗体又は細胞特異的リガンドなどの標的化系の使用により、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、及び／又は核酸を、より具体的には、ある特定の細胞型に送達することができる。標的化のために使用される抗体は、典型的には、以下に定義される疾患のいずれかと関連する細胞の細胞表面タンパク質に特異的である。例えば、これらの抗体は、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲタンパク質、ＣＤ１８（ＬＦＡ−１ベータ鎖）、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４０若しくはＢｇｐ９５などのＢ細胞関連表面タンパク質、又は例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ７１、ＣＤ１３８などから選択される細胞表面タンパク質などの、細胞表面抗体に対するものであってもよい。標的化コンストラクトを、典型的には、本発明に従って本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、及び核酸を、細胞表面タンパク質に特異的な抗体に共有結合させることにより、又は細胞特異的リガンドに結合させることにより調製することができる。タンパク質を、例えば、そのような抗体に結合させるか、又はペプチド結合若しくは化学的カップリング、架橋などによりそれに結合させることができる。次いで、薬学的に有効な量の標的化コンストラクトを、以下に定義される投与経路のいずれか、例えば、腹腔内、鼻内、静脈内、経口及びパッチ送達経路によって患者に投与することにより、標的化療法を実行することができる。好ましくは、上記で定義された標的化抗体又は細胞特異的リガンドに結合される、本発明に従って本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、又は核酸を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、共有結合の加水分解により、ペプチダーゼにより、又は任意の他の好適な方法により放出させることができる。あるいは、本発明に従って本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、又は核酸が低分子細胞特異的リガンドに結合される場合、リガンドの放出を実行しなくてもよい。細胞表面に存在する場合、キメラペプチドは、その輸送配列の活動時に細胞に進入することができる。標的化は、様々な理由から望ましいものであってよい；例えば、本発明に従って本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、及び核酸が許容不可能に毒性的である場合、又はその他それが高すぎる用量を必要とする場合である。
【０２０８】
本発明に従って本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドを直接的に投与する代わりに、それらを、細胞中に導入されたコード遺伝子から、例えば、投与されるウイルスベクターからの発現によって標的細胞において産生させることができる。ウイルスベクターは、典型的には、本発明に従って本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドをコードする。ベクターを、処置される特定の細胞に標的化することができる。更に、ベクターは、規定の調節の際に標的細胞により多かれ少なかれ選択的にスイッチされる調節エレメントを含有してもよい。この技術は、その前駆体形態の代わりに成熟タンパク質を使用する、ＶＤＥＰＴ技術（ウイルス誘導性酵素プロドラッグ療法）のバリアントである。
【０２０９】
あるいは、本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドを、抗体又はウイルスの使用によって前駆体形態で投与することができる。次いで、これらのＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドを、処置される細胞において産生される、又はそれに対して標的化される活性化剤によって活性形態に変換することができる。この型の手法は、ＡＤＥＰＴ（抗体誘導性酵素プロドラッグ療法）又はＶＤＥＰＴ（ウイルス誘導性酵素プロドラッグ療法）として知られることもある；前者は、細胞特異的抗体へのコンジュゲーションによって活性化剤を細胞に標的化することを含むが、後者は、ウイルスベクター中のコードＤＮＡからの発現によってベクター中で活性化剤、例えば、ＪＮＫ阻害剤配列又はキメラペプチドを産生させることを含む（例えば、ＥＰ−Ａ−４１５７３１及びＷＯ９０／０７９３６を参照されたい）。
【０２１０】
別の好ましい実施形態によれば、本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸配列又はＪＮＫ阻害剤配列若しくはキメラペプチドに対する抗体、例えば、配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列及び／又は配列番号９〜１２及び２３〜３２、好ましくは配列番号１１の配列のいずれかのキメラペプチド、及び／又は配列番号５〜８及び２１〜２２のいずれかの輸送配列を含む配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列、又は上記定義内のそのバリアント若しくは断片を、移植前に組織又は臓器の処置のために使用することができる。好ましくは、移植される臓器及び／又は組織の単離、輸送、かん流、埋め込みなどのための溶液は、好ましくは１〜１０００μＭの範囲、より好ましくは１０〜５００μＭの範囲、更により好ましくは５０〜１５０μＭの範囲の濃度の本発明によるＪＮＫ阻害剤を含む。本発明のこの態様について、移植片は、腎臓、心臓、肺、膵臓、特に膵島（ランゲルハンス島とも呼ばれる）、肝臓、血液細胞、骨髄、角膜、事故で切断された四肢、特に、指、手、足、顔、鼻、骨、心臓弁、血管又は腸移植片、好ましくは、腎臓、心臓、膵臓、特に、膵島（ランゲルハンス島とも呼ばれる）、又は皮膚移植片である。例えば、本発明によるＪＮＫ阻害剤を、膵島の単離のための溶液中に含有させることができる。そのような溶液を、例えば、単離前に膵管中に注射することができる。更に、本発明によるＪＮＫ阻害剤を含有する溶液が臓器及び／又は組織の単離、輸送、かん流、移植などにおいて適用される場合、特に、虚血の時間が１５ｍｉｎを超える場合、より好ましくは、虚血の時間が２０ｍｉｎを超える場合、更により好ましくは、虚血の時間が少なくとも３０ｍｉｎである場合、それが好ましい。これらの虚血時間は温虚血時間及び／又は冷虚血時間にも適用されるが、それらが温虚血時間（ＷＩＴ）にのみ適用される場合が特に好ましく、ここで、ＷＩＴは、ドナーの死亡の間、特に、交差クランピング又は心臓が鼓動していないドナーにおける心停止の時間から、冷かん流が開始されるまでに経過する時間の長さ及び氷からの臓器の取り出しから、再かん流までの、埋め込みの間の虚血を指す。
【０２１１】
更なる実施形態によれば、本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸配列又はＪＮＫ阻害剤配列若しくはキメラペプチドに対する抗体、例えば、配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列及び／又は配列番号９〜１２及び２３〜３２の配列のいずれかのキメラペプチド、及び／又は配列番号５〜８及び２１〜２２のいずれかの輸送配列を含む配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列、又は上記定義内のそのバリアント若しくは断片を、上記で定義されたＪＮＫシグナリングと強く関連する疾患若しくは障害から選択される様々な状態及び疾患状態を検出、予後診断、診断若しくはモニタリングするため、又はその処置をモニタリングするための（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アッセイ（例えば、イムノアッセイ）において使用することができる。免疫特異的結合が起こるような条件下で、患者由来試料と、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、又は核酸配列に対する抗体とを接触させた後、前記抗体により任意の免疫特異的結合の量を検出又は測定することを含む方法によって、イムノアッセイを実施することができる。特定の実施形態においては、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド又は核酸配列に特異的な抗体を使用して、ＪＮＫ又はＪＮＫ阻害剤配列の存在について患者由来組織又は血清試料を分析することができる；ここで、ＪＮＫの異常なレベルは疾患状態を示す。使用することができるイムノアッセイとしては、限定されるものではないが、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、蛍光イムノアッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射測定アッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイなどの技術を使用する競合的及び非競合的アッセイシステムが挙げられる。あるいは、上記で定義された、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸配列又はＪＮＫ阻害剤配列若しくはキメラペプチドに対する抗体を、典型的には、例えば、培養動物細胞、ヒト細胞又は微生物から選択される標的細胞に送達し、典型的には、当業者には公知の生物物理学的方法によって細胞応答をモニタリングすることにより、（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アッセイを実施することができる。典型的には、その中で使用される標的細胞は、（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで）培養された細胞又はｉｎ  ｖｉｖｏの細胞、すなわち、生きている動物若しくはヒトの臓器若しくは組織を構成する細胞、又は生きている動物若しくはヒトに見出される微生物であってもよい。
【０２１２】
本発明は更に、診断又は治療目的のため、特に、上記で定義されたＪＮＫシグナリングと強く関連する疾患又は障害の処置、防止又はモニタリングのためのキットであって、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸配列及び／又はこれらのＪＮＫ阻害剤配列若しくはキメラペプチドに対する抗体、例えば、配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列に対する、配列番号９〜１２及び２３〜３２の配列のいずれかのキメラペプチドに対する、配列番号５〜８及び２１〜２２のいずれかの輸送配列を含む配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列に対する、又は上記定義内のそのバリアント若しくは断片に対する抗ＪＮＫ阻害剤配列抗体を含有する１つ又は複数の容器、又はそのような抗ＪＮＫ阻害剤配列抗体、及び、場合により、前記抗体に対する標識された結合パートナーを含む前記キットの使用を提供する。抗体中に組み込まれる標識は、限定されるものではないが、化学発光部分、酵素部分、蛍光部分、比色部分又は放射活性部分を含んでもよい。別の特定の実施形態においては、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドをコードするか、又はあるいは、それと相補的である核酸を含有する１つ又は複数の容器を含む、上記で定義されたＪＮＫシグナリングと強く関連する疾患又は障害の処置、防止又はモニタリングにおける診断的使用のためのキットが提供され、場合により、これらの核酸に対する標識された結合パートナーも提供される。代替的な特定の実施形態においては、キットを、１つ又は複数の容器、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば、Ｉｎｎｉｓら、１９９０、ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡを参照されたい）、リガーゼ連鎖反応、環状プローブ反応など、又は上記で定義された核酸に関連して使用される他の公知の方法のための増幅プライマーとして作用することができる一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、それぞれ６〜３０ヌクレオチド長）を含むキットとして、上記目的のために使用することができる。キットは、場合により、上記目的のためのアッセイにおける診断、標準又は対照としての使用のための、所定量の精製された上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列、上記で定義されたキメラペプチド、又はこれらをコードする核酸を更に含んでもよい。
【０２１３】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によってその範囲を制限されない。実際、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の様々な改変が、前記説明及び添付の図面から当業者には明らかとなる。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内にある。
【０２１４】
様々な刊行物が本明細書で引用され、それらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１５】
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似するか、又は等価である方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が制御するものとする。更に、材料、方法、及び実施例は例示に過ぎず、限定を意図するものではない。本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１】示される転写因子中の保存されたＪＢＤドメイン領域のアラインメントを示す略図である。ここで使用されるＪＮＫ阻害剤は、配列アラインメントを実行することによって同定されたものである。このアラインメントの結果を、図１Ａ〜図１Ｃ中に例示的に示す。図１Ａは、ＩＢ１、ＩＢ２、ｃ−Ｊｕｎ及びＡＴＦ２のＪＢＤ間の最も高い相同領域を記載する。パネルＢは、比較のためにＬ−ＩＢ１（ｓ）とＬ−ＩＢ１のＪＢＤのアミノ酸配列を記載する。完全に保存された残基は星印で示されるが、ＧＦＰ−ＪＢＤ２３Ｍｕｔベクター中でＡｌａに変化させた残基は白丸で示される。図１Ｃは、ＪＮＫ阻害剤配列と輸送配列とを含むキメラタンパク質のアミノ酸配列を示す。示される例においては、輸送配列はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＴＡＴポリペプチドに由来し、ＪＮＫ阻害剤配列はＩＢ１（ｓ）ポリペプチドに由来する。ヒト、マウス、及びラットの配列は、パネルＢ及びＣ中で同一である。
【図２】ヒト、マウス及びラットに由来する一般的なＴＡＴ−ＩＢ融合ペプチドの配列を示す略図である。
【図３】１ウェル手法における配列番号９及び配列番号１１の融合ペプチドを使用するＨｅｐＧ２細胞における内因性ＪＮＫ活性の阻害の結果を記載する図である。図３、特に、図３中のパネルｄから見られるように、配列番号１１のＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）（ここではＤ−ＪＮＫＩと省略される）は、配列番号９のＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）（ここではＬ−ＪＮＫＩと省略される）よりも更に良好に、ＪＮＫ活性を効率的に阻害する。
【図４】ＸＧ−１０２とも呼ばれる、配列番号１１のキメラＪＮＫ阻害剤配列を用いる細胞傷害アッセイの結果を示す図である（実施例１２を参照されたい）。見られるように、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、ＨＦＦに対して細胞傷害性ではない。ＨＦＦを、９６ウェル組織培養プレート中に播種した。ＤＭＳＯ（５μＭの薬物と同じレベル）、又は１、２及び５μＭのＸＧ−１０２を含有する培地を、２４ｈ添加した。ニュートラルレッドを簡便に添加し、細胞を固定した後、染料を抽出した。５４０ｎｍで吸光度を測定した。ＤＭＳＯと１μＭのＸＧ−１０２との間に差異は観察されなかった。
【図５】水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）に対する、ＸＧ−１０２とも呼ばれる配列番号１１のキメラＪＮＫ阻害剤配列の活性を試験するために実行されたプラーク減少アッセイの結果を記載する図である（実施例１２を参照されたい）。見られるように、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、特に、０．５μＭ及び１μＭの濃度で、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の強力な阻害剤である。
【図６】ＸＧ−１０２とも呼ばれる、配列番号１１のキメラＪＮＫ阻害剤配列を使用する培養ヒト線維芽細胞における水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の阻害の結果を示す図である（実施例１２を参照されたい）。見られるように、ＶＺＶは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）に対する有意な感受性を示す。ＶＺＶ複製は、陰性対照（ＸＧ−１００、Ｔａｔペプチドのみ）の存在下で正常であった。したがって、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、０．２５μＭの試験した最も低い濃度で既にＶＺＶ複製を防止した。
【図７】ブレオマイシン誘発性急性肺炎症の動物モデルを使用する慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置における肺ホモジェナイゼーション中のＭＰＯを使用する肺での細胞動員に対するＸＧ−１０２（配列番号１１）の活性を記載する図である。見られるように、ＭＰＯはブレオマイシン投与後に有意に誘導されなかった。ＸＧ−１０２（配列番号１１）はしたがって、肺におけるＭＰＯレベルに対してほんのわずかな効果しか有していなかった。
【図８】ブレオマイシン誘発性急性肺線維症の動物モデルを使用する慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置におけるＴＮＦレベルに対するＸＧ−１０２（配列番号１１）の活性を記載する図である。ＴＮＦレベルを測定する場合、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の投与後のＢＡＬＦ中でのＴＮＦレベルの減少に対する傾向がＢＬＭモデルにおいて観察された。ＴＮＦレベルは、ＢＬＭ後に非常に低い。
【図９】ブレオマイシン誘発性急性肺線維症の動物モデルを使用する慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置における気管支肺胞洗浄空間中での細胞動員に対するＸＧ−１０２（配列番号１１）の活性を記載する図である。０．１ｍｇ／ｋｇで、ＸＧ−１０２（配列番号１１）はリンパ球動員及びリンパ球動員によるこの点で特徴付けられた炎症段階の間に動員された総細胞数を有意に減少させる。０．１ｍｇ／ｋｇで、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、気管支肺胞空間へのリンパ球動員又は総細胞数を増強する（ｎ＝５匹のマウス／群；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．００１）。
【図１０】ブレオマイシン誘発性急性肺線維症の動物モデルを使用する慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置における組織学検査の結果を記載する図である。３μｍの肺切片を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。炎症細胞蓄積、線維症面積、肺構造物の喪失が、ＢＬＭ投与の１０日後に観察された。見られるように、これらのパラメータの低下は、低用量（０．００１ｍｇ／ｋｇ）のＸＧ−１０２の投与後には観察されるが、高用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）では観察されない。
【図１１】ＥＬＩＳＡにより決定された脳Ａβ１−４０及びＡβ１−４２レベルに対するＸＧ−１０２（配列番号１１）を用いる処置の効果を示す図である。グラフは、Ｔｒｉｔｏｎ  ４０及びＴｒｉｔｏｎ  ４２を含む異なる脳ホモジェネート画分中でＥＬＩＳＡにより決定されたＡβ１−４０（左）及びＡβ１−４２（右）レベルを表す。データを、個々の値（黒色）及び群平均±ＳＥＭと共に散乱ドットプロットとして表す。有意差は星印で示される（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。有意な群差は、Ａβ１−４２に関するＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００画分においてのみ観察された。
【図１２】ＥＬＩＳＡにより決定されたＣＳＦ  Ａβ１−４０及びＡβ１−４２レベルに対するＸＧ−１０２（配列番号１１）を用いる処置の効果を示す図である。グラフは、ＣＳＦ中でＥＬＩＳＡにより決定されたＡβ１−４０（左）及びＡβ１−４２（右）レベルを表す。データを、個々の値（黒色）及び群平均±ＳＥＭと共に散乱ドットプロットとして表す。有意差は星印で示される（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。両用量でのＸＧ−１０２（配列番号１１）を用いる処置は、ＣＳＦ中のＡβ１−４０及びＡβ１−４２の有意な低下をもたらした。
【図１３】ｈＡＰＰ  ＴｇマウスにおけるチオフラビンＳ染色可視化されたプラーク数に対する処置の効果を示す図である。グラフは、大脳皮質及び海馬における１ｍｍ２あたりのチオフラビンＳ染色されたプラークの数を表す。ＸＧ−１０２（配列番号１１）処置は、海馬中では負に用量依存的にプラーク数を減少させた。データは平均±ＳＥＭとして表される。Ｎ＝８／群。＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１。
【図１４】ｈＡＡＰ  ＴｇマウスにおけるチオフラビンＳ可視化プラーク面積［％］に対する処置の効果を記載する図である。グラフは、大脳皮質及び海馬におけるチオフラビンＳ陽性プラークのプラーク面積［％］を表す。ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、海馬中でプラークによって得られた面積を有意に減少させた。データは平均±ＳＥＭとして表される。Ｎ＝８／群。
【図１５】２型糖尿病の動物モデルにおける空腹時血糖値（絶対値及び相対値）に対するＸＧ−１０２（配列番号１１）の投与の結果を記載する図である。空腹時血糖を、群Ａ及びＣにおいて、６８日目まで３日毎に、１１１日目での終結まで規則的に測定した。本発明者らは、ビヒクル対照と比較して、ＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスの空腹時血糖値の明確かつ有意な（ｐ＜０．００１）低下を観察した。ＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置されたマウスの空腹時血糖値は、約５ｍｍｏｌ／Ｌの低いプラトーに達した。この効果は、投薬の１４日後に明らかとなり、試験を通して、このように、２１日目から１１１日目までの全ウォッシュアウト期間の間持続した。対照的に、本発明者らは、２８日の投薬の間に低用量のＸＧ−１０２（配列番号１１）（１ｍｇ／ｋｇ）に効果がないことを観察した。
【図１６】２型糖尿病の動物モデルにおける体重に対するＸＧ−１０２（配列番号１１）、１０ｍｇ／ｋｇの投与の結果を記載する図である。本発明者らは、ビヒクル対照と比較して、ＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスにおける体重増加の明確かつ有意な（ｐ＜０．００１）防止を観察した。この効果は、投薬の２８日目から明らかとなり、１１１日目の終結日まで残存した。対照的に、本発明者らは、２８日の投薬の間に体重について低用量のＸＧ−１０２（配列番号１１）（１ｍｇ／ｋｇ）に効果がないことを観察した。
【図１７】試験６８日目に代謝ケージ中で測定された２４時間の食物及び水の摂取、並びに尿及び糞便産生（ｇ）に対する、２型糖尿病の動物モデルにおけるビヒクル又はＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果を記載する図である。本発明者らは、ビヒクル対照と比較していずれかの測定パラメータに対するＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）の有意な効果を観察しなかったが、食物摂取及び尿産生の減少に向かう傾向が観察された。
【図１８】試験６８日目に代謝ケージ中で測定された２４時間の食物及び水の摂取、並びに尿及び糞便産生（ｇ体重に対して正規化）に対する、２型糖尿病の動物モデルにおけるビヒクル又はＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果を記載する図である。本発明者らは、ビヒクル対照と比較していずれかの測定パラメータに対するＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）の有意な効果を観察しなかったが、食物摂取及び尿産生の減少に向かう傾向が観察された。
【図１９】インスリン、ＭＣＰ−１及びＩＬ−６の血漿レベルに対する、５７、７７及び１０８日目に測定された２型糖尿病の動物モデルにおけるビヒクル又はＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果を記載する図である。本発明者らは、７７日目及び１０８日目にＸＧ−１０２（配列番号１１）で処置された動物において有意により高かった、血漿レジスチンのレベルを除いて、ビヒクル対照と比較していずれかの測定パラメータに対するＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）の有意な効果を観察しなかった。
【図２０】ｔＰＡＩ−１、ＴＮＦ及びレジスチンの血漿レベルに対する、５７、７７及び１０８日目に測定された２型糖尿病の動物モデルにおけるビヒクル又はＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果を記載する図である。本発明者らは、７７日目及び１０８日目にＸＧ−１０２（配列番号１１）で処置された動物において有意により高かった、血漿レジスチンのレベルを除いて、ビヒクル対照と比較していずれかの測定パラメータに対するＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）の有意な効果を観察しなかった。
【図２１】精巣上体、鼠径部皮下、及び後腹膜脂肪体の組織重量に対する２型糖尿病の動物モデルにおけるビヒクル又はＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果を示す図である。本発明者らは、ビヒクル対照と比較してＸＧ−１０２で処置されたマウスにおいて精巣上体（ｐ＜０．０５）及び後腹膜（ｐ＜０．０１）脂肪質量の有意な減少を観察した。
【図２２】脳、脾臓及び心臓の組織重量に対する、２型糖尿病の動物モデルにおけるビヒクル又はＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果を記載する図である。本発明者らは、ビヒクル対照と比較してこれらのパラメータに対するＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）の有意な効果を観察しなかった。
【図２３】腎臓及び肝臓の組織重量に対する、２型糖尿病の動物モデルにおけるビヒクル又はＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果を記載する図である。本発明者らは、ビヒクル対照と比較してＸＧ−１０２（配列番号１１）で処置したマウスにおける腎臓（ｐ＜０．０５）及び肝臓（ｐ＜０．０１）質量の有意な減少を観察した。
【図２４】初代培養されたマクロファージを、ＸＧ−１０２（配列番号１１）と共にインキュベートし、十分に洗浄した図である。ＸＧ−１０２（配列番号１１）の存在を、ＸＧ−１０２に対する特異的抗体を使用して示した。ＸＧ−１０２は、初代マクロファージ中に強く取り込まれる。
【図２５】マウスを、Ｃ１４で放射標識されたペプチド（１ｍｇ／ｋｇ）を用いて３つの異なる投与経路（ｓ．ｃ．、ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．）により処置した図である。動物を、注射の７２時間後に屠殺し、イムノラジオグラフィーのためにプロセシングした。矢状断面を露出させ、主に肝臓、脾臓、及び骨髄中でのＸＧ−１０２ペプチドの蓄積を示した（ＸＧ−１０２；配列番号１１）。
【図２６】１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２をｉ．ｖ．で注射したラットの肝臓中でのＸＧ−１０２（配列番号１１）に対する免疫染色を示す図である。動物を、注射の２４時間後に屠殺した。ＤＡＢ基質を使用して示した。この図面は、肝臓、特に、クッパー細胞（マクロファージ）中でのＸＧ−１０２の顕著な蓄積を再度示すものである。
【図２７】２つの細胞株におけるサイトカイン及びケモカイン放出の阻害を示す図である。ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、骨髄細胞株とリンパ系細胞株の両方においてサイトカイン放出を阻害し、ＴＨＰ−１細胞におけるＬＰＳ誘導性ＴＮＦａ、ＩＬ−６及びＭＣＰ−１放出を減少させ（パネルＡ〜Ｃ）、ジャーカット細胞におけるＰＭＡ及びイオノマイシン誘導性ＩＦＮｇ、ＩＬ−６及びＩＬ−２産生を減少させる（パネルＤ〜Ｆ）。対照（ＸＧ−１０１）は、そのより低い安定性のため、あまり有効ではない。
【図２８】初代細胞におけるサイトカイン放出の阻害を示す図である。ＸＧ−１０２（配列番号１１）はまた、初代リンパ系細胞及び骨髄系細胞においてサイトカイン放出を阻害し、マウスマクロファージにおけるＬＰＳ誘導性ＴＮＦａ、ＩＬ−６及びＲａｎｔｅｓ放出を減少させ（パネルＡ〜Ｃ）、マウスＴ細胞におけるＰＭＡ及びイオノマイシン誘導性ＴＮＦａ及びＩＦＮｇ産生を減少させる（パネルＤ〜Ｅ）。効果は、非細胞傷害濃度のＸＧ−１０２で生じる（パネルＦ）。
【図２９−１】ラットに由来するＩＢ１のｃＤＮＡ配列及びその予測アミノ酸配列（配列番号１０２）を示す図である。
【図２９−２】ラットに由来するＩＢ１のｃＤＮＡ配列及びその予測アミノ酸配列（配列番号１０２）を示す図である。
【図３０−１】ｒＩＢ１遺伝子のエクソン−イントロン境界によりコードされるラット由来ＩＢ１タンパク質配列−スプライスドナー（配列番号１０３）を示す図である。
【図３０−２】ｒＩＢ１遺伝子のエクソン−イントロン境界によりコードされるラット由来ＩＢ１タンパク質配列−スプライスドナー（配列番号１０３）を示す図である。
【図３０−３】ｒＩＢ１遺伝子のエクソン−イントロン境界によりコードされるラット由来ＩＢ１タンパク質配列−スプライスドナー（配列番号１０３）を示す図である。
【図３１−１】ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来ＩＢ１タンパク質配列（配列番号１０４）を示す図である。
【図３１−２】ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来ＩＢ１タンパク質配列（配列番号１０４）を示す図である。
【図３１−３】ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来ＩＢ１タンパク質配列（配列番号１０４）を示す図である。
【図３２−１】ヒト由来ＩＢ１  ｃＤＮＡ配列（配列番号１０５）を示す図である。
【図３２−２】ヒト由来ＩＢ１  ｃＤＮＡ配列（配列番号１０５）を示す図である。
【図３３】ＪＮＫ／ｐ３８活性化に対する膵島単離の効果を示す図である。その実験は、ＪＮＫ又はｐ３８などに対する単離プロセスによって誘発されるすべての効果を同定するために設計されたものである。対照として、チューブリン検出を使用した。消化時間（ｍｉｎ）の関数としてのウェスタンブロット染色を示す。
【図３４】単離中のＪＮＫ活性化に対するＸＧ−１０２の効果を示す図である。
【図３５】単離中のＪＮＫ活性化に対するＸＧ−１０２の効果を示す図である。
【図３６】単離中のＯＣＲ／ＤＮＡに対するＸＧ−１０２の効果を示す図である。
【図３７】ＨＰＬＣ分析によるＡＴＰ／タンパク質に対するＸＧ−１０２（ＤＪＮＫ阻害剤）の効果を示す図である。
【図３８】ＸＧ−１０３が培養の７日後に測定された膵島生存能（ＯＣＲ／ＤＮＡ）を有意に増大させることを示す図である。
【図３９】図４１（Ａ）：フルオレセイン注射の１０分後のフルオレセイン血管造影評価（平均スコア）を示す図である。平均スコアは、５群（ＸＧ−１０２  ３００マイクログラム／ｍｌ、ＸＧ−１０２  ３ｍｇ／ｍｌ、Ｋｅｎｃｏｒｔ  ｒｅｔａｒｄ、０．９％ＮａＣｌ溶液、未処置）に関して１４日目及び２１日目について提示される。図４１（Ｂ）：１４日目及び２１日目での５群（ＸＧ−１０２  ３００マイクログラム／ｍｌ、ＸＧ−１０２  ３ｍｇ／ｍｌ、Ｋｅｎｃｏｒｔ  ｒｅｔａｒｄ、０．９％ＮａＣｌ溶液、未処置）に関するフルオレセイン注射の１０分後のフルオレセイン血管造影評価（平均スコア）の割合を示す図である。図４１（Ｃ）：５群（ＸＧ−１０２  ３００マイクログラム／ｍｌ、ＸＧ−１０２  ３ｍｇ／ｍｌ、Ｋｅｎｃｏｒｔ  ｒｅｔａｒｄ、０．９％ＮａＣｌ溶液、未処置）に関する、１４日目及び２１日目でのフルオレセイン注射の１０分後のＣｈＮＶ形成の発生率を示す図である。図４１（Ｄ）：５群（ＸＧ−１０２  ３００マイクログラム／ｍｌ、ＸＧ−１０２  ３ｍｇ／ｍｌ、Ｋｅｎｃｏｒｔ  ｒｅｔａｒｄ、０．９％ＮａＣｌ溶液、未処置）に関する、１４日目及び２１日目でのフルオレセイン漏出延長の発生率を示す図である。
【図４０】アドリアマイシン誘発性腎症誘導時の腎臓組織に対するＸＧ−１０２の効果を評価するための実験の設計を示す図である。ラット群及びその処置レジメンを示す。
【図４１】ＸＧ−１０２がタンパク尿に関するいかなる有害効果も誘発しないことを示す図である。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、観察期間（５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、２５、３８、４１日目）の関数としての第１群、第４群及び第５群のアルブミン濃度を決定した。
【図４２】実験開始の８日後の組織学的分析を示す図である。第１群のアドリアマイシンで処置されたラット（左側）と、第４群のアドリアマイシン及びＸＧ−１０２で処置されたラット（右側）との比較。
【図４３】実験開始の１４日後の組織学的分析を示す図である。第１群のアドリアマイシンで処置されたラット（左側）と、第４群のアドリアマイシン及びＸＧ−１０２で処置されたラット（右側）との比較。
【図４４】実験開始の１９日後の組織学的分析を示す図である。第１群のアドリアマイシンで処置されたラット（左側）と、第４群のアドリアマイシン及びＸＧ−１０２で処置されたラット（右側）との比較。
【図４５】実験開始の４１日後の組織学的分析を示す図である。第１群のアドリアマイシンで処置されたラット（左側）と、第４群のアドリアマイシン及びＸＧ−１０２で処置されたラット（右側）との比較。
【図４６】実験開始の８日後のｃ−ｊｕｎ発現の組織学的分析（染色）を示す図である。左側：アドリアマイシンで処置された組織学的調製物、中央：アドリアマイシン及びＸＧ−１０２で処置されたもの（間質中でのｃ−ｊｕｎ発現の有意な低下をもたらす）、並びに右側：対照。
【図４７】実験開始の１４日後のｃ−ｊｕｎ発現の組織学的分析（染色）を示す図である。左側：アドリアマイシンで処置された組織学的調製物、中央：アドリアマイシン及びＸＧ−１０２で処置されたもの（間質中でのｃ−ｊｕｎ発現の有意な低下をもたらす）、並びに右側：対照。
【図４８】ＡＤＲ投与後、８、１４、２９、４１及び５６日目でのアドリアマイシン（ＡＤＲ）誘発性腎症モデルにおけるラットの血中タンパク質（Ａ）及び尿素レベル（Ｂ）により評価された腎機能を示す図である。第１群（「ＡＤＲ」）及び第２群（「ＡＤＲ＋ＸＧ−１０２」）を、０日目にＡＤＲで処置して腎症を誘導するために処置し、第３群（「ＮａＣｌ」）及び第４群（「ＸＧ−１０２」）は０．９％ＮａＣｌを投与した。更に、第２群及び第４群を、０日目にＸＧ−１０２で処置し、第１群及び第３群はビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）を投与した。
【図４９】過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）で染色されたアドリアマイシン（ＡＤＲ）誘発性腎症モデルにおけるラットの腎臓切片を示す図である（元の倍率ｘ４０）。左カラムに示される切片については、ラットをＡＤＲ投与後８日目に屠殺し、左カラムに示される切片については、ラットを５６日目に屠殺した。ＡＤＲは「ＡＤＲ」群及び「ＡＤＲ＋ＸＧ１０２」群にのみ投与し、「ＮａＣｌ」群は０．９％ＮａＣｌのみを投与した。「ＡＤＲ＋ＸＧ１０２」群を０日目にＸＧ−１０２で処置し、他の群（「ＡＤＲ」及び「ＮａＣｌ」）はビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）を投与した。
【図５０】０日目にＡＤＲ及びビヒクルで処置された「ＡＤＲ」群（上パネル）に関して、並びに０日目にＡＤＲ及びＸＧ−１０２で処置された「ＡＤＲ＋ＸＧ１０２」群（下パネル）に関して、ＡＤＲ投与後、８日目（左の４つのパネル）及び５６日目（右の４つのパネル）にマッソントリクローム染色（青色）で評価されたＡＤＲ腎症における腎臓線維症を示す図である。元の倍率ｘ１０をそれぞれの日について左パネルに記載し、元の倍率ｘ４０をそれぞれの日について右パネルに記載する。
【図５１】ピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮ）誘発性腎症に対するＸＧ−１０２の効果を精査する実験の試験設計を示す図である。０日目及び１４日目に、ＰＡＮ又はそのビヒクルを、腎症の誘導のために注射した。０日目及び１４日目に、ＰＡＮを最初に投与した後、ＸＧ−１０２を投与した。０日目から４２日目まで、ＸＧ−１０２又はそのビヒクルを、上記のようなｉ．ｖ．経路により週１回投与した。５６日目に、動物を屠殺し、試料（血液及び腎臓）を収集した。
【図５２】ピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮ）誘発性腎症における糸球体硬化傷害に対するＸＧ−１０２の効果を示す図である。ＸＧ−１０２を第３群〜第６群に投与した（凡例中で「ｃｐｄ」と標識されている）。第２群と第６群は、実施例２０の試験計画に記載されるようにｉｖ注射の回数に関して異なる。第２群のスコアは同じ実験プロトコールを使用するＮａｊａｋｉｍａら（２０１０）により報告されたものと非常に類似することに留意されたい。＊＊＊対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用する第１群に対するＰ＜０．００１；＃Ｐ＜０．０５；＃＃＃一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を使用する第２群に対するＰ＜０．００１；§§§対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用する第２群に対するＰ＜０．００１。
【図５３】ピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮ）誘発性腎症における糸球体損傷に対するＸＧ−１０２の効果を示す図である。ＸＧ−１０２を第３群〜第６群に投与した（凡例中で「ｃｐｄ」と標識されている）。第２群と第６群は、実施例２０の試験計画に記載されるようにｉｖ注射の回数に関して異なる。＊＊＊対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用する第１群に対するＰ＜０．００１；＃＃＃一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を使用する第２群に対するＰ＜０．００１；§§§対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用する第２群に対するＰ＜０．００１。
【図５４】糖尿病性腎症のラットモデルにおけるＸＧ−１０２の慢性投与の効果を精査する実施例２１の試験スケジュールを示す図である。動物を、到着の直後に高脂肪食に置いた。Ｅ群及びＦ群の動物に、ベースライン期から前方へそれぞれの日に毎日投与する。
【図５５】ラットの体重に対する、糖尿病性腎症のラットモデルにおけるＸＧ−１０２の慢性投与の効果を示す図である。非ＳＴＺ処置ラットのみが、体重の増加を示した。ＸＧ−１０２で処置されたラットは、ＳＴＺモデルにおいてビヒクル処置ラットと比較して体重の差異を示さなかった。しかしながら、陽性参照（ロサルタン）で処置されたラットの体重は、有意により低かった。
【図５６】ＸＧ−１０２が、膵島単離／移植におけるＸＧ−１０２に対する用量応答を評価する実験において１５ｍｉｎの虚血によって誘導されるＪＮＫ（Ａ）及びＰＡＦ２（Ｂ）リン酸化を用量依存的に減少させたことを示す図である（実施例２２）。ラット膵島の単離を、動物の屠殺の直後に、又は１５分間の温虚血の後に実行した。単離プロセスの終わりにウェスタンブロットによってＪＮＫ活性化を評価した。陰性対照として、プロセシングされていないラット膵臓上でＪＮＫ活性化を評価した。
【図５７】膵島が１５ｍｉｎの虚血ラット及び虚血なしのラットに由来する単離された膵島であった、ラット膵島の機能及び生存に対するＸＧ−１０２の効果を示す図である。静的インスリン分泌試験（基底又はグルコースを使用して刺激）を、膵島単離の直後及び３７℃で培養した１８ｈ後に実施した。単離は膵島機能に影響し、基底インスリン分泌は、どのような条件でも１８ｈインキュベートされた膵島と比較して、単離の直後に使用された膵島においてより高かった。しかしながら、培養後では、虚血及び阻害剤ＸＧ−１０２は、この実験において膵島機能に影響しなかった。
【図５８】虚血を３０ｍｉｎまで行い（ｐｕｓｈｅｄ）、ＸＧ−１０２を１００μＭで使用した別の実験を示す図である。インスリン分泌試験を単離の直後に実施した場合、依然として高い基底分泌が観察される。更に、３０ｍｉｎの虚血は膵島機能に負に影響した。これらの予備的な結果は、３０ｍｉｎの虚血がＪＮＫ活性化を誘導するために１５ｍｉｎよりも良好なモデルであると考えられることを示唆していた。虚血ラットから膵島を単離し、ＸＧ−１０２と共にインキュベートした場合、グルコース誘導性インスリン分泌は虚血ラットと比較してより高かった。
【図５９】実施例２７の試験、すなわち、術後眼内炎症におけるデキサメタゾン点眼剤と比較した、ＸＧ−１０２の単回結膜下注射の効能及び安全性を評価するための無作為化、二重盲検、平行群、対照、多施設試験（第ＩＩ相臨床試験）に含まれる患者の性質を示す図である。
【図６０】実施例２７の試験に関する、３つの処置群ＸＧ−１０２  ９０μｇ、ＸＧ−１０２  ９００μｇ及びデキサメタゾンのＰＰ分析集団の試験処置についての結膜下注射の投与後２８日までの平均前房細胞等級を示す図である。垂直線は標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図６１】実施例２７の試験に関する、２８日目での前房細胞等級に関するＰＰとＦＡＳデータセットの両方に関する第１の二次転帰に加えた一次転帰の結果を示す図である：信頼区間と非劣性マージン。
【図６２】実施例２７の試験に関する、３つの処置群ＸＧ−１０２  ９０μｇ、ＸＧ−１０２  ９００μｇ及びデキサメタゾンの試験処置の結膜下注射の投与後、２８日目までに得られた前房フレア等級（ＦＡＳに関する）を示す図である。垂直線は標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図６３】実施例２７の試験に関する、ＦＡＳに関する２８日目までの試験を通して規定の時点で得られたＬＦＭ（レーザーフレアメーター）測定値を示す図である。垂直線は標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図６４】実施例２７の試験に関する、用量群ごとの報告された有害事象（重篤及び非重篤）の概説を示す図である。
【図６５】実施例２７の試験に関する、３つの試験群のいずれかに無作為化された患者の少なくとも２％について報告されたＡＥ（ＭｅｄＤＲＡ  ＳＯＣ及びＰＴタームによって選別される）の概要を示す図である。
【図６６】実施例２７の試験に関する、報告された重篤な有害事象（ＳＡＥ）の概説を示す図である。
【図６７】実施例２８に関する、ＸＧ−１０２（図面中では「Ｄ−ＪＮＫＩ１」と記載される）又はＰＢＳで処置されたＭａｐｋ１４ｆ／ｆ及びＭａｐｋ１４Δｌｉ＊マウス（左パネル）並びにＸＧ−１０２（すなわち、「Ｄ−ＪＮＫＩ１」）で処置されたＭａｐｋ１４ｆ／ｆＪｕｎｆ／ｆ及びＭａｐｋ１４Δｌｉ＊ＪｕｎΔｌｉ＊マウス（右パネル）における肝細胞の増殖を示す図である。適用可能な場合、ＤＥＮ処置の前に、マウスに、ＸＧ−１０２（２０ｍｇ／ｋｇ体重）又はＰＢＳのいずれかを注射した。肝細胞の増殖を、ＤＥＮ処置の４８ｈ後にＫｉ６７染色によって分析した。Ｋｉ６７陽性細胞の定量を示す。
【図６８】３ｘ１０６個のＨｕｈ７ヒト肝臓がん細胞を、４週齢のヌードマウスの両側面に皮下的に注射した（実施例２９）。ヌードマウスを、Ｈｕｈ７注射後、５ｍｇ／ｋｇで週に２回、腹腔内にＸＧ−１０２で処置した。腫瘍容積を週に２回測定した。マウスを、異種移植の４週間後に殺傷した。点線の丸印は異種移植された腫瘍を示す。
【図６９】実施例３０に関する、正所的に注射されたＨＥＰ  Ｇ２腫瘍を担持するマウスの平均体重及び平均体重変化曲線を示す図である。マウスを、Ｄ１０及びＤ４１で２回反復されるＱ４Ｄｘ４処置スケジュール後に１ｍｇ／ｋｇ／注射でＸＧ−１０２でＩＶ処置した。したがって、図７０において、それぞれの統計データが提示される。
【図７０】実施例３０に関する、ＸＧ−１０２に対するマウスの寛容性を示す図である。平均体重及びＭＢＷＣ±ＳＤを示す。ＭＢＷＣ％は、考慮される日と、１回目の処置の日（Ｄ１０）との間の平均体重の変動に対応する。参照としてビヒクル処置群を取って、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−Ｄｕｎｎ検定を用いて統計分析を実施した。
【図７１】実施例３０に関する、屠殺日（Ｄ１８５）までの群あたりの生存マウスの割合を記載する、マウスの長期生存曲線を示す図である。マウスを、Ｄ１０及びＤ４１の２回反復されるＱ４Ｄｘ４処置スケジュール後に示された用量のＸＧ−１０２で処置した。
【図７２】実施例３１に関する、単独で、又は組み合わせた、ＸＧ−１０２及びＸＧ−４１４処置に対するマウスの寛容性を示す図である。平均体重及び平均体重変化±ＳＤを示す。ＭＢＷＣ％は、考慮日と１回目の処置の日（ＤＩＯ）との間の平均体重の変動に対応する。
【図７３】実施例３１に関する、屠殺日（Ｄ１７１）までの群あたりの生存マウスの割合を記載する、マウスの長期生存曲線を示す図である。Ｄ６７で解剖のため屠殺したマウスは計算から除いた。マウスを、Ｄ１０及びＤ４１の２回反復されるＱ４Ｄｘ４処置スケジュール後に示された用量のＸＧ−１０２で処置した。
【図７４】実施例３１に関する、ヒストグラムで表示された、Ｄ６７又はＤ６７と最後の屠殺との間に屠殺されたマウスの顕微鏡評価により観察された腫瘍侵襲を示す図である。腫瘍取込みのレベルを、図面の凡例に特定された４つの異なるカテゴリーに分類した。
【図７５】実施例３２に関する、抗腫瘍活性実験中のＰＣ−３腫瘍担持マウスの平均腫瘍容積を示す図である。Ｄ３３で、５匹の動物の３群を、ビヒクル及びＸＧ−１０２（０．１及び１ｍｇ／ｋｇ／注射、Ｑ４Ｄｘ４）で処置した。
【図７６】実施例３３に関する、Ｑ１Ｄｘ１４処置スケジュール後にビヒクル又は０．１及び１ｍｇ／ｋｇ／ａｄｍのＸ０−１０２でＰＯ又はＳＣ処置された、異なる群における、マウス盲腸へのＨＣＴ  １１６腫瘍異種移植の２６日後の肝臓内又はその末梢（門）で観察された転移性腫瘍侵襲のヒストグラム表示を示す図である。顕微鏡観察の分類を、凡例内に記載されたように実施した。
【図７７】実施例３４に関する、アルビノラットの右眼における網膜電図写真（ＥＲＧ）測定を示す図である。
【図７８】傷を付けないクランプで４０ｍｉｎ、両方の腎茎をクランピングすることによりＧ２群及びＧ３群のラットにおいて腎虚血を誘導し、Ｇ１群のラットにおいては虚血を誘導しなかった。Ｇ３群のラットは、単回用量の２ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（ビヒクルとしての０．９％ＮａＣｌ中）を投与し、Ｇ１群及びＧ２群のラットは、それぞれ、傷を付けないクランプで両方の腎茎をクランピングした１時間後（再かん流後）、０日目に尾静脈中でのＩＶ注射によりビヒクルを投与した。血清クレアチニン（図７８Ａ）及び尿素（図７８Ｂ）は、虚血しないビヒクル処置された対照ラット（Ｇ１）と比較して、虚血の２４ｈ後にビヒクル処置された虚血ラット（Ｇ２）において増加した。他方、ＸＧ−１０２で処置された虚血ラット（Ｇ３）は、未処置の虚血ラット（Ｇ２）と比較して、より低い血清クレアチニンを示した。
【図７９】実施例４０に関する、膵島生存能に対する、３０ｍｉｎの虚血及び１００μＭのＸＧ−１０２による処置の影響を示す図である。ＸＧ−１０２による処置はアポトーシス及び壊死を減少させる。これらの結果は、ＸＧ−１０２が膵島生存能に対する有益な効果を有することを示している。
【図８０】実施例４０に関する、ウェスタンブロットを示す図である。これらの実験において、単離の１８ｈ後、膵島をＸＧ−１０２  １００μＭで１ｈ、予備処置したか、又は処置せず、次いで、４ｈの低酸素状態にかけたところ、ＸＧ−１０２は４時間の低酸素状態（「Ｈ４」）の間に依然として存在していた（又は対照群中には存在しなかった）。予想通り、低酸素状態（「Ｈ４」）は、正常酸素状態（「Ｎ４」）に維持された膵島と比較してＪＮＫ及びＪＵＮリン酸化を誘導する。しかしながら、ＪＮＫ阻害剤ＸＧ−１０２は、低酸素状態により誘導されるＪＮＫ及びＪＵＮのリン酸化を阻害しなかった（図８０の「Ｈ４＋ＸＧ１０２」を参照されたい）。
【図８１】実施例４０に関する、低酸素状態実験における膵島生存能を示す図である。低酸素状態は、アポトーシス及び壊死を増加させた（Ｈ４対Ｎ４）。しかしながら、膵島をＸＧ−１０２で処置した場合、アポトーシス及び壊死は正常酸素条件及び低酸素条件において減少した。結論として、ＸＧ１０２はまた、この低酸素状態モデルにおいて膵島生存能に対する有益な効果を有していた。
【図８２】実施例４１に関する試験設計を示す図である。
【図８３】実施例４１に関する、ＰＡＮ誘発性腎症のラットモデルにおける４９日目（第１群〜第５群）及び７７日目（第６群〜第８群）での糸球体傷害指数に対するビヒクル及びＸＧ−１０２（４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の効果を示す図である。＊＊＊対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｎ＝１２〜１５／群）を使用する第２群及び第７群（ＰＡＮ／ビヒクル）対第１群及び第６群（食塩水／ビヒクル）のＰ＜０．００１；＃＃Ｐ＜０．０１；＃＃＃一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定（ｎ＝１５／群）を使用する第３〜５群（ＰＡＮ／ＸＧ−１０２）対第２群（ＰＡＮ／ビヒクル）のＰ＜０．００１。§§§対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｎ＝１２〜１４／群）を使用する第８群（ＰＡＮ／ＸＧ−１０２）対第７群（ＰＡＮ／ビヒクル）のＰ＜０．００１。
【図８４】実施例４１に関する、ＰＡＮ誘発性腎症のラットモデルにおける４９日目（第１群〜第５群）及び７７日目（第６群〜第８群）での傷害された糸球体のパーセンテージに対するビヒクル及びＸＧ−１０２（４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の効果を示す図である。＊＊＊対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｎ＝１２〜１５／群）を使用する第２群及び第７群（ＰＡＮ／ビヒクル）対第１群及び第６群（食塩水／ビヒクル）のＰ＜０．００１。＃＃＃一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定（ｎ＝１５／群）を使用する第３〜５群（ＰＡＮ／ＸＧ−１０２）対第２群（ＰＡＮ／ビヒクル）のＰ＜０．００１。§§§対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｎ＝１２〜１４／群）を使用する第８群（ＰＡＮ／ＸＧ−１０２）対第７群（ＰＡＮ／ビヒクル）のＰ＜０．００１。
【図８５】実施例４１に関する、例示的動物３（Ａ〜Ｃ）、８（Ｄ〜Ｆ）、１３（Ｇ〜Ｉ）、５７（Ｊ〜Ｌ）、及び６３（Ｍ〜Ｏ）についての４９日目での腎臓に由来する糸球体硬化傷害の代表的な画像（第１〜５群；ＰＡＳ、４０ｘ）を示す図である。第１群（Ａ〜Ｃ）：Ａ及びＢにおける正常な糸球体（等級０）並びにＣにおける巣状分節状マトリックス沈着（等級１）（矢印）。第２群（Ｄ〜Ｆ）：等級１の糸球体（Ｄ）、等級２の糸球体（Ｅ）及び等級３の糸球体（Ｆ）。マトリックス沈着及び過形成が見られる（矢印）。第３群（Ｇ〜Ｉ）：等級０の糸球体（Ｇ）、等級１の糸球体（Ｈ）及び等級１の糸球体（Ｉ）。マトリックス沈着及び過形成が見られる（矢印）。第４群（Ｊ〜Ｌ）：等級１の糸球体（Ｊ）、等級１の糸球体（Ｋ）及び等級２の糸球体（Ｌ）。マトリックス沈着及び過形成が見られる（矢印）。第５群（Ｍ〜Ｏ）：等級１の糸球体（Ｄ）、等級２の糸球体（Ｅ）及び等級３の糸球体（Ｆ）。マトリックス沈着及び過形成が見られる（矢印及び丸印）。
【図８６】実施例４１に関する、例示的動物２８（Ａ〜Ｃ）、３４（Ｄ〜Ｆ）、及び３７（Ｇ〜Ｉ）についての７７日目での腎臓に由来する糸球体硬化傷害の代表的な画像（第６〜８群；ＰＡＳ、４０ｘ）を示す図である。第６群（Ａ〜Ｃ）：Ａ及びＢにおける正常な糸球体（等級０）並びにＣにおける巣状分節状マトリックス沈着（等級１）（矢印）。第７群（Ｄ〜Ｆ）：等級１の糸球体（Ｄ）、等級２の糸球体（Ｅ）及び等級３の糸球体（Ｆ）。マトリックス沈着及び過形成が見られる（矢印及び丸印）。第８群（Ｇ〜Ｉ）：等級０の糸球体（Ｇ）、等級１の糸球体（Ｈ）及び等級１の糸球体（Ｉ）。マトリックス沈着及び過形成が見られる（矢印）。
【図８７】実施例４２に関する、ヒト膵島の生存能に対する低酸素状態及びＸＧ−１０２の影響を示す図である。図８７Ａは、ＸＧ−１０２が、正常酸素条件及び低酸素条件のいずれかにおいて壊死を減少させることを示す。図８７Ｂは、ＸＧ−１０２もまた、低酸素状態により誘導されるアポトーシスも減少させることを示す。これらの結果は、ＸＧ−１０２がｄ低酸素状態モデルにおいて膵島生存能に対する有益な効果を有することを示している。
【図８８】実施例４３に関する、眼科的評価（Ａ）及び房水中への細胞浸潤（Ｂ）の結果を示す図である。図８８Ａは、誘導の２４ｈ後の眼科的評価の中央値を示す。図８８Ｂは、誘導の２４ｈ後の房水中の白血球数（細胞／μｌ）を示す。
【図８９】実施例３９に関する、７１日目（Ａ）、８５日目（Ｂ）、９９日目（Ｃ）及び１１３日目（Ｄ）でのＳＦＴ値（視力）を示す図である。＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１；ビヒクル群と比較したＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定。
【図９０】実施例３９に関する、７１日目（Ａ）、８５日目（Ｂ）、９９日目（Ｃ）及び１１３日目（Ｄ）でのコントラスト閾値を示す図である。＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１；ビヒクル群と比較したＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定。
【図９１】実施例３９に関する、レチナール組織の２３のユニークなサイトカインの多重サイトカイン分析の結果を示す図である。ＳＴＺ誘発性糖尿病は、観察された２３のサイトカインのうちの１３に関するビヒクル処置された動物中のレチナールレベルを上昇させた。１３の上昇したサイトカインのうちの７つは、２μｇ／眼のＸＧ−１０２で処置されたＳＴＺ糖尿病動物において減少した。全てのサイトカインは、２０μｇ／眼又は２００μｇ／眼のＸＧ−１０２を投与するラットの群から収集された網膜組織においてＢＬＱであった。
【図９２】実施例２４に関する、臨床パラメータＧＩ（歯肉炎症）及びＰＰ（歯周深度ポケット）に対する処置の効果を示す図である。最初のグラフは、陰性対照群（結紮していないラット）における臨床パラメータを示す。結果を平均±ＳＥＭとして表す。ｎ＝１０匹のラット／群。＊１０日目対０日目のｐ＜０．０５。＄１７日目対１０日目のｐ＜０．０５。
【図９３】実施例２４に関する、総細菌叢に対するプラセボ及びＸＧ−１０２投与の効果を示す図である。第３群（ＸＧ−１０２）は、１０日目と比較して１７日目に総細菌叢を有意に減少させた。結果を平均±ＳＥＭとして表す。ｎ＝１０匹のラット／群。＊１７日目対１０日目のｐ＜０．０５。
【図９４】実施例２４に関する、ＥＬＩＳＡアッセイを使用するＩＬ１−β定量化を示す図である。ＩＬ１−βは、プラセボ群よりも第３群においてより低かった。「ＳＤＤ−１００２」とは、ＸＧ−１０２を指す。実験を２回行った。＊結紮群対非結紮群のｐ＜０．０５。＄プラセボ群対第３群のｐ＜０．０５。
【図９５】実施例２４に関する、ＡＢＨＬに対するプラセボ及びＸＧ−１０２投与の効果を示す図である。「ＳＤＤ−１００２」はＸＧ−１０２を表す。それぞれの測定を２回行った。結果を平均±ＳＥＭとして表す。ｎ＝６匹のラット／群。＊結紮群対非結紮群のｐ＜０．０５。
【図９６】実施例４５に関する、試験設計を示す図である。
【図９７】実施例４５に関する、両側ＩＲのラットモデルにおける尿細管損傷に対するビヒクル及びＸＧ−１０２（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の効果を示す図である。＊＊＊Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定ｎｓによる第１群（疑似／ビヒクル）に対するＰ＜０．００１；＋一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定による第２群（ＩＲ／ビヒクル）に対するＰ＜０．０５。
【図９８】実施例４５に関する、両側ＩＲのラットモデルにおける合計尿細管組織学的スコアに対するビヒクル及びＸＧ−１０２（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の効果を示す図である。合計尿細管スコアは、変性及び壊死、尿細管円柱、尿細管上皮空胞形成及び再生（好塩基性尿細管）を含むあらゆる尿細管変化を表す。＊＊＊Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定による第１群（疑似／ビヒクル）に対するＰ＜０．００１；＋一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定による第２群（ＩＲ／ビヒクル）に対するＰ＜０．０５。
【図９９】実施例４５に関する、ヘマトキシリン／エオシン染色された腎臓切片の代表的な画像：第２群（ＩＲ／ビヒクル）と第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０２）との間の比較を示す図である。動物５３（左上）、動物１５（右上）、動物１７（左下）及び動物３３（右下）：１０ｘ。第２群及び第３群における尿細管変性／壊死及び尿細管円柱の代表的な顕微鏡写真。１〜４のスコアを有する動物を表示する。群間の主な差異は、第２群における尿細管壊死及び円柱の重症度が、第３群において観察されるものよりも一般に高いということである。第２群においては、病変は部分的に、又は皮質の大部分に伸長している。比較すると、第３群においては、病変は皮髄境界部に限定される。病変は、活発な壊死、細胞性尿細管円柱、硝子円柱、及び時折の好塩基性尿細管の混合物からなる。
【図１００】実施例４６に関する、試験設計（Ａ）並びに異痛症及び痛覚過敏症を評価するためのＡＵＣ法（Ｂ）を示す図である。
【図１０１】実施例４６に関する、ＣＹＰ注射後２４ｈの侵害受容パラメータに対するＸＧ−１０２（５０ｍｇ／ｍＬ、ｉ．ｖｅｓ．）及びイブプロフェン（５０ｍｇ／ｍＬ、ｉ．ｖｅｓ．）処置の効果を示す図である。ＣＹＰ注射後２４ｈの侵害受容閾値（Ａ）、侵害受容スコア（Ｂ）、ＡＵＣ１−８ｇ（Ｃ）又はＡＵＣ８−６０ｇ（Ｄ）。結果を平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝１０）として表す。ビヒクル処置群に対する＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（Ａ及びＣ）、二元配置ＲＭ  ＡＮＯＶＡ（Ｂ）、並びに対応のないｔ検定及びＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（Ｄ）。
【図１０２】実施例４６に関する、ＣＹＰ注射後２４ｈの膀胱壁の厚さ並びに出血スコアに対するＸＧ−１０２（５０ｍｇ／ｍＬ、ｉ．ｖｅｓ．）及びイブプロフェン（５０ｍｇ／ｍＬ、ｉ．ｖｅｓ．）処置の効果を示す図である。ＣＹＰ注射後２４ｈの膀胱壁の厚さ（Ａ）又は出血スコア（Ｂ）。結果を平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝１０）として表す。ｎｓ＝ｐ＞０．０５、ビヒクル処置群に対する＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、及び対応のないｔ検定（Ａ）又はＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（Ｂ）。
【図１０３】実施例４７に関する、ＣＹＰ注射後２４ｈの侵害受容パラメータに対するＸＧ−１０２（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）及びイブプロフェン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）処置の効果を示す図である。ＣＹＰ注射後２４ｈの侵害受容閾値（Ａ）、侵害受容スコア（Ｂ）、ＡＵＣ１−８ｇ（Ｃ）又はＡＵＣ８−６０ｇ（Ｄ）。結果を平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝１０）として表す。ビヒクル処置群に対する＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（Ａ）、二元配置ＲＭ  ＡＮＯＶＡ（Ｂ）、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定及び対応のないｔ検定（Ｃ）並びに対応のないｔ検定（Ｄ）。
【図１０４】実施例４８に関する、試験設計（Ａ）及び分析された膀胱パラメータ（Ｂ）を示す図である。
【図１０５】実施例４８に関する、ＣＹＰで処置された意識のあるメスのラットにおける膀胱パラメータに対するビヒクル（ｉ．ｖ．）の効果を示す図である。反復測定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定に関する基底値に対する有意差なし。
【図１０６】実施例４８に関する、ＣＹＰで処置された意識のあるメスのラットにおける膀胱パラメータに対するＸＧ−１０２（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の効果を示す図である。＊＊反復測定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定に関する基底値に対するＰ＜０．０１。
【図１０７】実施例３７に関する、ＭＴＳアッセイを使用するＨｅｐＧ２（Ａ）及びＰＬＣ／ＰＲＦ／５（Ｂ）腫瘍細胞株に対するＸＧ−１０２の細胞傷害活性の決定の結果を示す図である。
【図１０８】実施例４９に関する、ＪＮＫ活性化に対するＪＮＫ阻害剤ＸＧ−１０２の効果を示す図である。（Ａ）１５分の間に１ｍＭの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）に曝露された初代マウス皮質ニューロン培養物のイムノブロット分析。ニューロンを、５μＭ又は１０μＭのＪＮＫの特異的阻害剤ＸＧ−１０２で予備処理したか、又はしなかった。（Ｂ）酸化ストレスの誘導後の、総ＪＮＫに対するリン酸化ＪＮＫの比（ｐＪＮＫ／ＪＮＫ）により測定された、ＪＮＫ活性の３４％の増加を示す対応するヒストグラム。５μＭで使用した場合、阻害剤ＸＧ−１０２による皮質ニューロンの予備処理はＪＮＫ活性を防止し、酸化ストレス条件において、１０μＭの濃度でＪＮＫ活性を４５％減少させた。ｎ＝３／条件。エラーバー＝平均の標準誤差（ＳＥＭ）。
【図１０９】実施例４９に関する、神経細胞アポトーシスに対するＪＮＫ阻害の効果を示す図である。（Ａ）５時間の間に２μＭのＡβ１−４２（Ａβ４２）に曝露された初代マウス皮質ニューロン培養物のイムノブロット分析。ニューロンを、１０μＭの特異的阻害剤ＸＧ−１０２で予備処理したか、又はしなかった。（Ｂ）Ａβ４２細胞ストレスの条件においてＪＮＫ活性の改変がないことを示す対応するヒストグラム。ＸＧ−１０２による皮質ニューロンの予備処理は、ＪＮＫ活性を改変しなかった。（Ｃ）神経細胞アポトーシスは、アポトーシスの間に増加する、切断されたＰＡＲＰ（ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ）タンパク質のレベルによって測定される。Ａβ４２ストレスはアポトーシスを誘導し、培養物をＸＧ−１０２で予備処理した場合を除いて、切断されたＰＡＲＰを４０％増加させた。その場合、アポトーシスは３７％減少する。ｎ＝３／条件。エラーバー＝平均の標準誤差（ＳＥＭ）。
【図１１０】実施例５１に関する、ＸＧ−１０２によるＰＫＲダウンレギュレーション及び／又はＪＮＫ阻害後の神経細胞アポトーシスの減少を示す図である。（Ａ）１０μＭのＸＧ−１０２によるＪＮＫの予備的阻害の後、又はそれなしでの２μＭのＡβ４２により処置された、ＷＴ及びＰＫＲ−／−マウスの初代ニューロン培養物中のＪＮＫ及びｃ−Ｊｕｎ活性化、カスパーゼ３及びＰＡＲＰ切断活性化断片のレベルのイムノブロットの結果。（Ｂ〜Ｄ）ＪＮＫ活性（Ｂ）、ホスホｃ−Ｊｕｎ（Ｃ）、及び総ｃ−Ｊｕｎ（Ｄ）の対応するヒストグラム。（Ｅ〜Ｇ）アポトーシスは、切断されたカスパーゼ３のレベル（Ｅ）、細胞培養上清中で測定されたカスパーゼ３活性（Ｆ）及び切断されたＰＡＲＰ（Ｇ）により測定される。データは平均±ＳＥＭ（ｎ≧３／条件）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【０２１７】
実施例
実施例１
ＪＮＫ阻害配列の特定
ＪＮＫとの効率的な相互作用に関して重要なアミノ酸配列を、公知のＪＮＫ結合ドメインＪＢＤの間の配列のアラインメントによって特定した。ＩＢ１［配列番号１３］、ＩＢ２［配列番号１４］、ｃ−Ｊｕｎ［配列番号１５］及びＡＴＦ２［配列番号１６］のＪＢＤの間の配列比較によって、弱く保存された８つのアミノ酸配列が定義された（図１Ａを参照のこと）。ＩＢ１及びＩＢ２のＪＢＤは、ＪＮＫ結合においてｃ−Ｊｕｎ又はＡＴＦ２の約１００倍効率的であるので（Ｄｉｃｋｅｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７：６９３（１９９７）、これが、ＩＢ１とＩＢ２との間で保存された残基は、最大結合を付与するのに重要でなければならない理由であった。ＩＢ１とＩＢ２のＪＢＤの間の比較によって、２つの配列の間で高度に保存されている７つのアミノ酸及び３つのアミノ酸の２つのブロックを決定した。
【０２１８】
これらの２つのブロックは、Ｌ−ＩＢ１（ｓ）中の１９アミノ酸のペプチド配列［配列番号１］内に含まれ、またＩＢ１由来の２３ａａのペプチド配列［配列番号１７］中の比較の根拠も示される。これらの配列は、図１Ｂに示してあり、Ｌ−ＩＢ１配列中のダッシュは、保存された残基とＬ−ＩＢ１（ｓ）とを整列するための配列中のギャップを示す。
【０２１９】
実施例２
ＪＮＫ阻害融合タンパク質の調製
配列番号９のＪＮＫ阻害融合タンパク質は、２つのプロリン残基からなるリンカーを介して、配列番号１のＣ末端を、配列番号５のＨＩＶ−ＴＡＴ４ｇ５７（Ｖｉｖｅｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１６０１０頁（１９９７年））由来のＮ末端の１０アミノ酸長担体ペプチドに対して共有結合することによって合成した。このリンカーを使用することで、最大可塑性が可能になり、望ましくない二次的な構造の変化が防がれる。基本的なコンストラクトもまた調製し、それぞれ、Ｌ−ＩＢ１（ｓ）（配列番号１）及びＬ−ＴＡＴ［配列番号５］と命名した。
【０２２０】
配列番号１１の全Ｄレトロ−インベルソペプチドを、適宜合成した。基礎的コンストラクトもまた調製し、それぞれ、Ｄ−ＩＢ１（ｓ）［配列番号２］及びＤ−ＴＡＴ［配列番号６］と命名した。
【０２２１】
配列番号９、１０、１１及び１２の全てのＤ及びＬの融合ペプチドは、古典的なＦｍｏｃｋ合成によって生成し、更に質量分析法によって分析した。それらは最終的には、ＨＰＬＣによって精製した。プロリンリンカーの効果を決定するために、一方は２つのプロリンがあり、もう一方には２つのプロリンがない２種類のＴＡＴペプチドを生成した。２つのプロリンの追加は、細胞内側のＴＡＴペプチドの進入も局在化も変更するようには見えなかった。保存されたアミノ酸残基を示す一般的なペプチドを図２に示す。
【０２２２】
実施例３
ＪＢＤ１９による細胞死の阻害
ＪＮＫの生物学的活性に対するＩＢ１（ｓ）の１９ａａ長のＪＢＤ配列の効果を研究した。この１９ａａの配列のＮ末端を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ  ＪＢＤ１９コンストラクト）に連結し、ＩＬ１によって誘発される膵臓β細胞アポトーシスに対するこのコンストラクトの効果を評価した。この方式のアポトーシスは、ＪＢＤ１−２８０によるトランスフェクションによってブロックされることが以前に示されているが、当該分野で公知のＥＲＫ１／２又はｐ３８の特異的な阻害剤は保護しなかった。
【０２２３】
ＪＢＤ１９に対応し、１９アミノ酸の保存された配列を含むオリゴヌクレオチド、及び完全に保存された領域で変異された配列を合成し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈより）をコードするｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターのＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ部位に一方向に挿入した。インスリン産生ＴＣ−３細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００単位／ｍＬのペニシリン及び２ｍＭのグルタミンを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。インスリン産生ＴＣ−３細胞を、示したベクターでトランスフェクトして、ＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）を細胞培養培地に添加した。アポトーシス細胞の数は、倒立蛍光顕微鏡を使用して、ＩＬ−１の添加の４８時間後にカウントした。アポトーシス細胞を、細胞質の特徴的な「ブレブ形成（ｂｌｅｂｂｉｎｇ  ｏｕｔ）」によって正常な細胞から区別し、２日後にカウントした。
【０２２４】
ＧＦＰは、対照として使用される緑色蛍光タンパク質発現ベクターであり；ＪＢＤ１９は、ＩＢ１のＪＢＤ由来の１９のａａ配列に連結されたキメラＧＦＰを発現するベクターであり；ＪＢＤ  １９Ｍｕｔは、ＧＦＰ−ＪＢＤ１９と同じベクターであるが、ただし図１Ｂに示されるように４つの保存された残基でＪＢＤが変異されており；ＪＢＤ１−２８０は、ＪＢＤ全体（ａａ１〜２８０）に連結されたＧＦＰベクターである。ＧＦＰ−ＪＢＤ１９発現コンストラクトは、全体のＪＢＤ１−２８０と同じ程度に効率的にＩＬ−１誘発性の膵臓細胞のアポトーシスを抑えた。
【０２２５】
追加の対照として、完全に保存されたＩＢ１（ｓ）残基で変異された配列は、アポトーシスを抑える能力が大きく低下していた。
【０２２６】
実施例４
ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドの細胞内導入
ＴＡＴ及びＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（「ＴＡＴ−ＩＢペプチド」）のＬ−及びＤ−鏡像異性形態が細胞に入る能力を評価した。Ｌ−ＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）及びＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド［それぞれ、配列番号５、６、９及び１２］を、フルオレセインにコンジュゲートされたグリシン残基のＮ末端付加によって標識した。標識されたペプチド（１μＭ）をＴＣ−３細胞培養物に添加し、これを実施例３に記載のとおり維持した。所定の時点で、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、氷冷メタノール−アセトン（１：１）中で５分間固定した後に、蛍光顕微鏡下で検査した。フルオレセイン標識したＢＳＡ（１μＭ、１２モル／１モルのＢＳＡ）を、対照として用いた。結果から、上記のフルオレセイン標識ペプチドの全てが、培養培地に一旦添加されれば、効率的かつ急速に（５分未満）で細胞に入ったことが示された。逆に、フルオレセイン標識されたウシ血清アルブミン（１μＭのＢＳＡ、１２モルのフルオレセイン／１モルのＢＳＡ）は、細胞に入らなかった。
【０２２７】
経時的な研究によって、Ｌ−鏡像異性体ペプチドの蛍光シグナルの強度は、続く２４時間の期間に７０％低下したことが示された。４８時間ではシグナルは、ほとんど又は全く示されなかった。対照的に、Ｄ−ＴＡＴ及びＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）は細胞内で極めて安定であった。
【０２２８】
これらの全Ｄレトロ−インベルソペプチドからの蛍光シグナルは、１週後もまだ極めて強力であり、シグナルは処置後２週でごくわずかに低下しただけであった。
【０２２９】
実施例５
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｃ−ＪＵＮ、ＡＴＦ２及びＥｌｋ１リン酸化の阻害
それらの標的転写因子のＪＮＫ媒介性リン酸化に対するペプチドの効果を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで検討した。組み換え及び不活性化のＪＮＫ１、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３を、ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮウサギ網状赤血球溶解液キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して生成し、単独か、又は基質としてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合したかのいずれかで、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２及びＥｌｋ１を用いる固相キナーゼアッセイで、使用した。用量反応試験を行い、ここでは、Ｌ−ＴＡＴ又はＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（０〜２５μＭ）を、組み換えＪＮＫ１、ＪＮＫ２、又はＪＮＫ３キナーゼと、反応バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−アセテート、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのｐ−ニトロフェニル−ホスフェート（ｐＮＰＰ）、５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭのｐ−グリセロリン酸エステル、１ｍＭのジチオスレイトール）中で、２０分間混合した。次いで、キナーゼ反応を、１０ｍＭのＭｇＣｌ２及び５ｐＣｉの３３Ｐ−ガンマ−ｄＡＴＰ及び１μｇのＧＳＴ−Ｊｕｎ（ａａ１〜８９）、ＧＳＴ−ＡＦＴ２（ａａ１〜９６）又はＧＳＴ−ＥＬＫ１（ａａ３０７〜４２８）のいずれかの添加によって開始した。ＧＳＴ−融合タンパク質は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から購入した。
【０２３０】
１０μｌのグルタチオン−アガロースビーズも、この混合物に添加した。次いで、反応生成物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、変性１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルを乾燥して、その後、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）に曝露した。ＪＮＫによるｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２及びＥｌｋ１リン酸化のほぼ完全な阻害が、２．５μＭ程度の低いＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチド用量で観察された。しかし、Ｅｌｋ１のＪＮＫ３リン酸化のＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）阻害の顕著な除外はなかった。全体的に、ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドは、それらの標的転写因子のＪＮＫファミリーのリン酸化を阻害するのに優れた効果を示した。Ｄ−ＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）及びＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（０−２５０μＭ投与量の試験）が、組み換えＪＮＫ１、ＪＮＫ２、及びＪＮＫ３によるＧＳＴ−Ｊｕｎ（ａａ１〜７３）リン酸化を阻害する能力を、上記のように分析した。全体的に、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドは、ｃ−ＪｕｎのＪＮＫ媒介性リン酸化を低下したが、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）よりは約１０〜２０分の１の低い効率のレベルであった。
【０２３１】
実施例６
活性化ＪＮＫによるｃ−ＪＵＮリン酸化の阻害
ストレス刺激によって活性化されたＪＮＫに対する、本明細書で定義されたようなＬ−ＴＡＴ又はＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドの効果を、ＧＳＴ−Ｊｕｎを使用してＵＶ光照射ＨｅＬａ細胞又はＩＬ−１処理ＰＴＣ細胞からＪＮＫを引き出すことにより評価した。ＰＴＣ細胞を、上記のとおり培養した。ＨｅＬａ細胞は、１０％のウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００単位／ｍｌのペニシリン及び２ｍＭのグルタミンを補充したＤＭＥＭ培地中で培養した。細胞抽出物調製に使用する１時間前、ＰＴＣ細胞を、上記のようにＩＬ−１で活性化し、一方、ＨｅＬａ細胞は、ＵＶ光（２０Ｊ／ｍ２）で活性化した。細胞抽出物を、溶解バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−アセテート、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＭのｐ−ニトロフェニル−リン酸塩、５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＰ−グリセロリン酸エステル、１ｍＭのジチオスレイトール）中で細胞培養物を剥離することによって、対照ＵＶ光照射のＨｅＬａ細胞及びＩＬ−１処理のＴＣ−３細胞から調製した。デブリスを、ＳＳ−３４  Ｂｅｃｋｍａｎローター中で１５，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離によって除去した。１００μｇの抽出物を、１μｇのＧＳＴ−ｊｕｎ（アミノ酸１〜８９）及び１０μＬのグルタチオン−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）とともに室温で１時間インキュベートした。前記剥離バッファーを用いて４回洗浄した後、ビーズを、Ｌ−ＴＡＴ又はＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（２５μＭ）を補充した同じバッファー中に２０分間再懸濁した。次いで、キナーゼ反応を、１０ｍＭのＭｇＣｌ２及び５ｐＣｉの３３Ｐ−ガンマ−ｄＡＴＰの添加によって開始し、３０℃で３０分間インキュベートした。
【０２３２】
次いで、反応生成物を、変性１０％のポリアクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ゲルを乾燥し、その後、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）に曝露した。ＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドは、これらの実験において、活性化されたＪＮＫによるｃ−Ｊｕｎのリン酸化を効率的に防いだ。
【０２３３】
実施例７
ｉｎ  ｖｉｖｏでの本明細書において定義されたＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドによるｃ−ＪＵＮリン酸化の阻害
本明細書において定義された細胞透過性ペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏでＪＮＫシグナリングをブロックし得るか否かを決定するため、本発明者らは、異種のＧＡＬ４系を用いた。上記のとおりに培養したＨｅＬａ細胞を、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに連結されたｃ−Ｊｕｎの活性化ドメイン（アミノ酸１〜８９）を含むＧＡＬ−Ｊｕｎ発現コンストラクト（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と共に５×ＧＡＬ−ＬＵＣレポーターベクターで同時トランスフェクトした。ＪＮＫの活性化は、直接上流のキナーゼＭＫＫ４及びＭＫＫ７を発現するベクターの同時トランスフェクションによって達成した（Ｗｈｉｔｍａｒｓｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５７３頁（１９９９年）を参照のこと）。要するに、３×１０５個の細胞を、製造業者の指示に従って、ＤＯＴＡＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して３．５ｃｍの培養皿の中でプラスミドを用いてトランスフェクトした。ＧＡＬ−Ｊｕｎを含む実験のために、２０ｎｇのプラスミドを、１μｇのレポータープラスミドｐＦＲ−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、及び０．５μｇのＭＫＫ４又はＭＫＫ７のいずれかの発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後、細胞培地を交換し、ＴＡＴ及びＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（１μＭ）を添加した。ルシフェラーゼ活性を、タンパク質含量に対する正規化後に、Ｐｒｏｍｅｇａの「二重レポーターシステム（Ｄｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）」を使用して１６時間後に測定した。ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドの追加は、ＪＮＫのＭＫＫ４及びＭＫＫ７媒介性活性後のｃ−Ｊｕｎの活性化をブロックした。ＨｅＬａ細胞は、ＪＮＫ１及びＪＮＫ２のアイソフォームを発現するが、ＪＮＫ３は発現しないので、本発明者らは、細胞をＪＮＫ３でトランスフェクトした。ここでも、ＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドは、ｃ−ＪｕｎのＪＮＫ２媒介性活性化を阻害した。
【０２３４】
実施例８
全Ｄレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチド及びそのバリアントの合成
本発明のペプチドは、自然なタンパク分解を妨げるために逆方向に合成された全Ｄアミノ酸ペプチドであってもよい（すなわち、全Ｄレトロ−インベルソペプチド）。本発明の全Ｄレトロ−インベルソペプチドは、天然のペプチドと同様の機能的な特性をペプチドに与え、成分のアミノ酸の側基は、天然のペプチドのアラインメントに相当するが、プロテアーゼ耐性骨格を保持する。
【０２３５】
本発明のレトロ−インベルソペプチドは、ペプチド鎖中でアミノ酸を結合することによってＤ−アミノ酸を使用して合成されるアナログであり、その結果、レトロ−インベルソペプチドアナログ中のアミノ酸の配列は、モデルとして役立つ選択されたペプチド中の配列と正確に対向する。例示するために、天然に存在するＴＡＴタンパク質（Ｌ−アミノ酸から形成される）が、配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ［配列番号５］を有する場合、このペプチドのレトロ−インベルソペプチドアナログ（Ｄ−アミノ酸から形成される）は、配列ＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ［配列番号６］を有する。レトロ−インベルソペプチドを形成するためにＤ−アミノ酸の鎖を合成する手順は、当該分野で公知である（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、７４４〜７４６頁（１９９４年）；Ｂｒａｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、６９２〜６９３頁（１９９４年）；Ｇｕｉｃｈａｒｄら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９、２０３０〜２０３９頁（１９９６年）を参照のこと）。具体的には、配列番号２、４、６、８、１１〜１２、１８、２０、２２及び２５〜２６によるレトロ−ペプチドは、古典的なＦ−ｍｏｃｋ合成によって生成し、更に、質量分析法によって分析した。それらをＨＰＬＣによって最終的に精製した。
【０２３６】
天然のペプチドによる固有の問題は、自然なプロテアーゼによる分解及び固有の免疫原性であるので、本発明の異種の二価又は異種の多価化合物は、所望のペプチドの「レトロ−インベルソアイソマー」を含むように調製する。したがって、自然なタンパク質分解からペプチドを保護することは、半減期を延長すること、及びペプチドを能動的に破壊する目的の免疫応答の程度を低下することの両方によって、特定の異種の二価又は異種の多価化合物の有効性を増大する。
【０２３７】
実施例９
全Ｄレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチド及びそのバリアントの長期の生物学的活性
実施例５に示されるように、天然のプロテアーゼによる分解からのＤ−ＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドの保護のため天然のＬ−アミノ酸アナログと比較した場合、ペプチドの異種コンジュゲート（上記のキメラ配列を参照のこと）を含むＤ−ＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）レトロ−インベルソに関しては、長期生物学的活性が予想される。
【０２３８】
Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドによるＩＬ−１誘発性の膵臓のβ細胞死の阻害を分析した。ＴＣ−３細胞を、示したペプチド（１μＭ）の単回の添加を用いて上記のように３０分間インキュベートし、次いでＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。
【０２３９】
次いで、アポトーシス細胞を、ヨウ化プロピジウム及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２核染色の使用によって、ＩＬ−１とのインキュベーションの２日後にカウントした。最小で１，０００個の細胞を、各々の実験についてカウントした。平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す（ｎ＝５）。Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドは、ＩＬ−１誘発性アポトーシスを、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドと同様の程度まで低下した。
【０２４０】
Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドによるＩＬ−１Ｐ誘発性細胞死の長期阻害もまた分析した。ＴＣ−３細胞を、示したペプチド（１μＭ）の単回の添加によって３０分間上記のようにインキュベートし、次いで、ＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、続いて、２日ごとにサイトカインを添加した。次いで、アポトーシス細胞を、ヨウ化プロピジウム及びＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２核染色の使用によってＩＬ−１とのインキュベーションの１５日後にカウントした。ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドの単回の添加は、長期間の保護をもたらさないことに注意のこと。最小で１，０００個の細胞を各々の実験についてカウントした。結果として、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）は、長期間（１５日）保護をもたらすことができたが、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）は、できなかった。
【０２４１】
実施例１０
本発明にしたがって使用されるＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドによるＪＮＫ転写因子の抑制
ゲル遅延アッセイは、ＡＰ−１二重標識プローブ（５’−ＣＧＣ  ＴＴＧ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＡ−３’（配列番号１０１）で行った。示したとおり、５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを用いて１時間処置するか又はしなかったＨｅＬａ細胞核抽出物。本発明にしたがって使用されるＴＡＴ及びＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドを、ＴＮＦ−アルファの３０分前に添加した。特定のＡＰ−１のＤＮＡ複合体（非標識の特異的及び非特異的な競合因子との競合実験によって示される）を有するゲルの一部のみを示す。
【０２４２】
本発明にしたがって使用されるＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドは、ＴＮＦ−アルファの存在下でＡＰ−１  ＤＮＡ結合複合体の形成を低下する。
【０２４３】
実施例１１
オールインワンのウェルのアプローチを使用するＨｅｐＧ２細胞における内因性ＪＮＫ活性の阻害（図３を参照のこと）
ＨｅｐＧ２細胞を、実験前日に３’０００細胞／ウェルで播種した。次いで、インターロイキン−１［ＩＬ−１ベータν）］又は腫瘍壊死因子［ＴＮＦアルファ］（ａ）のいずれかの漸増濃度を添加して、ＪＮＫを３０分間活性化した。細胞を、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．５％のＴｗｅｅｎ（ｐＨ７．４）中で溶解し、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ  ＪＮＫについて処理した。（ｂ）１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１によって誘発され、３８４ウェル／プレート（ｎ＝９６）で測定されたＪＮＫ活性のＺ’。（ｃ）化学ＪＮＫ阻害剤［スタウロスポリン及びＳＰ６００１２５］での内因性ＩＬ−１ベータ誘発性ＪＮＫ活性の阻害。（ｄ）配列番号９によるペプチド阻害剤Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）［ここでは、Ｌ−ＪＮＫｉ（ν）と略称）及び配列番号１１のＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）（ここではＤ−ＪＮＫｉと略称）及びＪＢＤ（ＴＡＴ配列なしのＬ−ＪＮＫＩに相当する）］のＩＬ−１依存性ＪＮＫ活性に対する効果。全てのパネルは、３つの独立した実験の代表である（ｎ＝３）。
【０２４４】
方法：アルファスクリーンキナーゼアッセイ
原理：アルファスクリーンは、マイクロプレート形式で生体分子の相互作用を研究するために使用される非放射性ビーズに基づく技術である。アクロニムＡＬＰＨＡは、Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ａｓｓａｙの略である。これは、「ドナー」及び「アクセプター」のビーズを近位にさせ、次いで、化学的反応のカスケードが、シグナルの増幅を生じるように作用する生物学的相互作用に関与する。６８０ｎｍでのレーザー励起の際、「ドナー」ビーズ中の光増感剤（フタロシアニン）は、周囲の酸素を励起した一重項の状態に変換する。その４μ秒の半減期のうちに、一重項の酸素分子は、溶液中でほぼ２００ｎｍまで拡散し得、アクセプタービーズがその近位内にあれば、一重項酸素は、「アクセプター」ビーズ中のチオキセン誘導体と反応して、３７０ｎｍで化学発光を生じ、これが更に同じ「アクセプター」ビーズに含まれるフルオロフォアを活性化する。励起したフルオロフォアは引き続き、５２０〜６２０ｎｍで光を放射する。アクセプタービーズの非存在下で、一重項酸素は、基底状態に入り、シグナルは生成されない。
【０２４５】
キナーゼ試薬（Ｂ−ＧＳＴ−ｃＪｕｎ、抗Ｐ−ｃＪｕｎ抗体及び活性なＪＮＫ３）を最初に、キナーゼバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１００μＭのＮａ３ＶＯ４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中に希釈し、ウェル（１５μｌ）に添加した。次いで、反応を、２３℃で１時間、１０μＭのＡＴＰの存在下でインキュベートした。検出は、１０μｌのビーズミックス（プロテインＡアクセプター２０μｇ／ｍｌ及びストレプトアビジンドナー２０μｇ／ｍｌ）の添加によって行い、検出バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭのＮａＣｌ、８０ｍＭのＥＤＴＡ、０．３％ＢＳＡ）中で希釈し、続いて暗所で、２３℃で更に１時間インキュベーションした。ＪＮＫの内因性活性の測定のために、キナーゼアッセイを、活性なＪＮＫ３を細胞溶解液で置き換え、かつ反応キナーゼ成分を、細胞溶解の後に添加した以外は、上記のとおり行った。Ｂ−ＧＳＴ−ｃｊｕｎ及びＰ−ｃＪｕｎ抗体を同じ濃度で使用したが、ＡＴＰは１０μＭの代わりに５０μＭで使用した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎシグナルを、Ｆｕｓｉｏｎ又はＥｎ  Ｖｉｓｉｏｎ装置で直接分析した。
【０２４６】
実施例１２
ウイルス感染−水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の処置における全Ｄレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチド及びそのバリアントの活性の決定
本発明にしたがって使用されるＩＢ（ｓ）ペプチド及び全Ｄレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドの活性の決定は、培養された宿主細胞（ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ））において試験化合物としてＪＮＫ阻害剤ペプチドＸＧ−１０２（配列番号１１）を使用して試験した。ウイルスは、そのライフサイクルを完全にするために機能的な細胞環境を必要とする偏性の細胞内寄生生物であり；死んでいる細胞は、ウイルスの複製を支持しない。更に、細胞機能の阻害剤は、細胞に毒性であり得、ウイルスの増殖を非特異的に妨げ得る。したがって、病気又は死んでいる宿主細胞は、非特異的に低下したウイルス力価を示し得る。これによって結果が誤ることになる場合があるので、細胞傷害性アッセイを最初に行って、試験化合物に対する培養細胞の耐性を決定する。その後、プラーク減少アッセイを行い、次いで、ＪＮＫ阻害剤ペプチドＸＧ−１０２（配列番号１１）の活性を、感染した細胞中の水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）に関して試験した。
【０２４７】
Ａ）全Ｄレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドの細胞傷害性の決定：
毒性の決定のために、培養細胞（ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ））を、９６ウェル組織培養プレートに播種した。ＤＭＳＯを含有する培地（５μＭのＸＧ−１０２（配列番号１１）と同じレベル）、又はＸＧ−１０２（配列番号１１）を、いくつかの濃度（１、２、及び５μＭ）で２４時間添加した。引き続き、ニュートラルレッドアッセイを行った。細胞傷害性アッセイのためのニュートラルレッド比色アッセイ（６つの複製のセット）を使用して、その後の有効性アッセイの最大用量を設定した（Ｔａｙｌｏｒら、２００４年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７８：２８５３−２８６２頁で行われたとおり）。生きている細胞は、ニュートラルレッドを吸収し、したがって、吸収のレベルは、細胞の生存度及び数の定量的な指標である。ニュートラルレッド取り込みは、細胞数に正比例し、また正常な食作用も反映する。したがって、短いパルスのニュートラルレッドを、０時間又は２４時間で培地に添加した。固定及び抽出の後、色素を添加して、各々の試料中の色素の量をＥＬＩＳＡプレートリーダーで、５４０ｎｍで測定した（図４を参照のこと）。どの量のＸＧ−１０２（配列番号１１）でも細胞傷害性は観察されず、細胞増殖は、ＤＭＳＯ希釈剤単独（対照）と比較して制限されなかった。したがって、１μＭという標準濃度は、ＨＦＦ細胞に明白な影響はなく、より高用量でも十分耐容されるであろう。
【０２４８】
Ｂ）水痘帯状疱疹（ＶＺＶ）に対するＸＧ−１０２（配列番号１１）の抗ウイルス効果を評価するためのプラーク低下アッセイ
ＸＧ−１０２（配列番号１１）が用量依存性の抗ウイルス効果を有するか否かを決定するために、標準の１μＭ用量付近の濃度範囲を試験した。このプラーク低下アッセイでは、２４ウェルプレート中のコンフルエントなヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）を、ＶＺＶ−感染のＨＦＦと、１：１００の比（感染多重度ＭＯＩ＝０．０１）で接種し、細胞に２時間吸着させた。過剰のウイルスを洗い流し、０（ＤＭＳＯのみ）、０．５、１、又は２μＭのＸＧ−１０２（配列番号１１）を含有する培地を添加した。１つの試料をこの時点で採取して、感染の最初のレベルを測定し；ここでは各々のウェルが約１５０ｐｆｕを含んだ。２４時間後、二重のウェルをトリプシン処理し、次いで細胞懸濁液を三連で、ＭｅＷｏ細胞単層で滴定して、各々の試料中のＶＺＶ感染細胞の数を決定した。制限のない増殖の間、ＶＺＶは、細胞間で伝播することで増殖するので、通常、１日に１０倍増大する。これは、ＤＭＳＯ単独で処理された培養物で観察されたものであり、１２００±４３０ｐｆｕが生じた（図５）。決定の結果は以下のとおりであった：
【０２４９】
【表３】
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【０２５０】
このように、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、試験された全ての濃度で強力な抗ウイルス効果を有し、ＶＺＶは、ほぼ２００〜３００ｐｆｕを生じる。ＥＣ５０を内挿するためにこれらの結果のグラフを使用して、約０．３μＭのＸＧ−１０２（配列番号１１）は、ＶＺＶ収率を５０％低下させるということが計算された。
【０２５１】
細胞傷害性及び有効性のデータから、５．０μＭ／０．３μＭという予備的選択係数（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ）（Ｔｏｘ／ＥＣ５０）が算出され、これは、約１７という値を生じ、ここで真のＳＩは更に高いとみなされる。なぜなら細胞の５０％を殺傷するＸＧ−１０２（配列番号１１）の濃度にはまだ達していなかったからである。
【０２５２】
Ｃ）ＸＧ−１０２（配列番号１１）によるヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）における水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の複製の測定
ＸＧ−１０２（配列番号１１）によるヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）における水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の複製を妨げるＸＧ−１０２の最小有効用量を決定するために、ＨＦＦのコンフルエントな単層に、ＶＺＶ−ＢＡＣ−Ｌｕｃ株を２時間接種し、次いでＸＧ−１０２（配列番号１１）を、０．２５、０．５、若しくは１．０μＭの濃度で、又は陰性対照（ＸＧ−１００、１．０μＭ）を用いて２４時間処置した。ウイルスの収率は、ルシフェラーゼアッセイによって測定した。試料は三連であり、平均の発光を示す；エラーバーは、平均の標準偏差に相当する。
【０２５３】
結果として、ＶＺＶ複製は、陰性対照（Ｔａｔペプチド単独）の存在下で正常であった。ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、試験された最低濃度である０．２５μＭでＶＺＶ複製を妨げた。最小有効用量は、この実験では決定できなかった。ＶＺＶが感染の間、ＪＮＫ活性になぜ依存しないのかはまだ知られていないが、この酵素についての重大な要件であると思われる。このように低濃度（０．２５μＭ）のＸＧ−１０２（配列番号１１）は、培養中でのＶＺＶ伝播を完全にブロックするのに十分である。この効果の１つの可能性のある説明は、この量のＸＧ−１０２（配列番号１１）が、感染した細胞中の全てのＪＮＫ分子に結合するということである。あるいは、０．２５μＭのＸＧ−１０２（配列番号１１）は、ＶＺＶ複製に最適である閾値レベルより下にＪＮＫ活性を低下し得る。この実験の結果を図６にまとめる。
【０２５４】
実施例１３
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置における全Ｄレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチド及びそのバリアントの活性の決定
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置における例示的な全Ｄレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドＸＧ−１０２（配列番号１１）の活性を決定するために、ＸＧ−１０２（配列番号１１）を、ブレオマイシン誘発の急性肺炎症及び線維症の動物モデルで使用する。ブレオマイシン誘発の炎症及び線維症のプロトコールは、文献中で以前に記載されている。実験の目的は、ブレオマイシン誘発の炎症及び線維症における気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）及び肺での好中球の補充に対する皮下（ｓ．ｃ．）経路によるＸＣ−１０２（配列番号１１）の効果を検討することであった。
−単回ブレオマイシン投与（１０ｍｇ／ｋｇ）の１日後で
−及び線維症の発症の１０日目で。
【０２５５】
１）方法及び実験的アプローチ
２用量の試験化合物ＸＧ−１０２（配列番号１１）及びビヒクル対照を、ブレオマイシンの単回の鼻腔内投与とともに、皮下投与（ｓ．ｃ．）で与え、マウスを１日後、及び１０日後に分析した。このモデルで使用した動物は、１群あたり１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）であった。この実験群は、ビヒクル、０．００１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）及び０．１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）を含み、この処置は、ブレオマイシン投与の前、次いで３日ごとの、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の反復性の皮下投与から構成された。２４時間での急性の肺炎症を、ＢＡＬ洗浄液、細胞学、細胞カウント、及び肺ミエロペルオキシダーゼ活性によってモニターした。化合物の効果は、ビヒクル対照と比較した。肺線維症は、ブレオマイシンの単回投与後の１０日目にヘマトキシリン及びエオシン染色を使用して組織学的に評価した。
【０２５６】
１．１）ブレオマイシン投与
Ｂｅｌｌｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍｏｎｔｒｏｕｇｅ、Ｆｒａｎｃｅ）の食塩水中の硫酸ブレオマイシン（体重１ｋｇあたり１０ｍｇ）又は食塩水を、軽度のケタミン−キシラジン（ｘｙｌａｓｉｎｅ）麻酔下で４０μＬの容積中の鼻腔内滴下によって気道を通じて与えた。ブレオマイシン誘発の炎症及び線維症の両方のためのブレオマイシン投与の群は以下を含んだ：ビヒクル、０．００１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）及び０．１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）。ブレオマイシン誘発の炎症のための経路は、皮下（ｓ．ｃ．）経路であって、投与は、単回投与として行われた。ブレオマイシン誘発の線維症のための経路は、皮下（ｓ．ｃ．）経路であり、投与は、１０日で３回行われた。
【０２５７】
１．２）気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）
気管の切開後、プラスチックカニューレを挿入し、空隙を、０．３ｍｌのＰＢＳ溶液を使用して洗浄し、３７℃まで加熱した。収集した試料を２つの画分中で送り出した：第１のもの（２つの第１の洗浄液に相当する１ｍｌ）はメディエーター測定のために使用し、第２のものは細胞決定（４ｍｌ）のために使用した。第１の画分を遠心分離し（６００ｇで１０分間）、上清を分画し、メディエーター決定まで−８０℃で保持した。次いで、細胞ペレットを、０．４ｍｌの無菌ＮａＣｌ、０，９％中に再懸濁し、第２の画分とともにプールし、細胞カウントのために使用した。
【０２５８】
１．３）肺のホモジナイゼーション
ＢＡＬの後、全肺を取り出し、１ｍｌのＰＢＳを含むマイクロチューブ（Ｌｙｓｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ  Ｄ、Ｑ  Ｂｉｏ  Ｇｅｎｅ、Ｉｌｌｋｒｉｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）の中に入れ、総肺組織抽出物を、Ｆａｓｔｐｒｅｐ（登録商標）システム（ＦＰ１２０、Ｑ  Ｂｉｏ  Ｇｅｎｅ、Ｉｌｌｋｒｉｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して調製し、次いで、抽出物を遠心分離し、上清を、メディエーター測定及びＳｉｒｃｏｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ａｓｓａｙ（Ｆｒａｎｃｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）によるコラーゲンアッセイの前に−８０℃で保管した。
【０２５９】
１．４）細胞カウント及び決定
総細胞カウントは、Ｍａｌａｓｓｅｚ血球計を使用してＢＡＬ液中で決定した。分画細胞カウントを、ＭＧＧ  Ｄｉｆｆ−ｑｕｉｃｋ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  ＡＧ）による染色後、サイトスピン調製物（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ  ３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｈａｎｄｏｎ）で行った。分画細胞カウントを、標準的な形態学的基準を使用して２００個の細胞で行った。
【０２６０】
１．５）ＴＮＦ測定
ＢＡＬＦ中のＴＮＦレベルを、製造業者の指示に従って、ＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｍｏｕｓｅ  ＤｕｏＳｅｔ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）を使用して決定した。結果は、ｐｇ／ｍｌとして報告する。
【０２６１】
１．６）ＭＰＯ−測定
ＭＰＯ−レベルを、ＸＧ−１０２の投与の際に測定した。ＭＰＯは、この実験ではブレオマイシン後に有意に誘発されなかった。更に、ＸＧ−１０２は、肺におけるＭＰＯレベルに影響がなかった。
【０２６２】
１．７）組織学的
ＢＡＬ及び肺のかん流の後、大葉を、標準的な顕微鏡分析のために４％の緩衝化ホルムアルデヒド中で固定した。３−ｍの切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【０２６３】
２．）結果
Ａ）第１の試験：ブレオマイシン（ＢＬＭ）誘発の急性肺炎症
群：ビヒクル、ＸＧ−１０２（配列番号１１）０．００１ｍｇ／ｋｇ及びＸＧ−１０２（配列番号１１）０．１ｍｇ／ｋｇ
経路：ｓ．ｃ．経路、単回投与
【０２６４】
ａ）気管支肺胞洗浄空間における細胞補充
０．１ｍｇ／ｋｇで、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、炎症段階の間、好中球補充及び補充される総細胞数を有意に減らす。０．００１ｍｇ／ｋｇでは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、気管支肺胞空間への好中球補充にも、他の細胞種にも影響はない（１群あたりｎ＝５匹のマウスでの１つの代表的な実験；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．００１）。
【０２６５】
ｂ）肺ホモジナイゼーションにおいてＭＰＯを使用する肺での細胞補充
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）は、宿主の防御システムにおいて重要な役割を果たす。５３ｋＤａの２つの重鎖及び１５ｋＤａの２つの軽鎖から構成されるこの１４０ｋＤａのタンパク質は、最初は１９６０年代に発見された。白血球の活性化に応答する好中球及び単球の顆粒からのＭＰＯの放出は、強力な酸化剤である次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）への過酸化水素及び塩素イオンの変換を可能にする。ＭＰＯは、防御系において重要な目的を果たすが、種々の研究によって、ＭＰＯはまた、いくつかの炎症条件である役割を果たすことが示され、ここではＭＰＯレベルの上昇は、例えば、冠動脈疾患と関連している。更に、組織ＭＰＯレベルは、好中球の活性化の状態を反映し、好中球組織浸潤に対する指標を与える。
【０２６６】
本実験では、ＭＰＯは、ブレオマイシン投与後に有意に誘発されなかった。このように、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、肺においてＭＰＯレベルに影響を有さなかった（図７を参照のこと）。
【０２６７】
ｃ）ＴＮＦ測定
ＴＮＦレベルを測定する際、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の投与後、ＢＡＬＦ中のＴＮＦレベルの低下する傾向が観察されたが、ＴＮＦレベルは、ＢＬＭ投与後は極めて低かった（図８を参照のこと）。
【０２６８】
ｄ）結論
０．１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）は、気管支肺胞空間への好中球及び総細胞補充を低下し、かつＴＮＦレベルを低下する傾向を誘発することを観察することができた。更に、組織学的スライドの研究によって、気管支周囲空間への炎症性細胞蓄積の低下が示された。したがって、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、ブレオマイシン誘発性の炎症を低減すると結論され得る。
【０２６９】
得られた結果に応じて、この実験を、線維症モデルで更に行った。
【０２７０】
Ｂ）第２の試験：ブレオマイシン（ＢＬＭ）誘発性の肺線維症
群：ビヒクル、ＸＧ−１０２（配列番号１１）０．００１ｍｇ／ｋｇ及びＸＧ−１０２（配列番号１１）０．１ｍｇ／ｋｇ
経路：ｓ．ｃ．経路、１０日で３回
【０２７１】
ａ）気管支肺胞洗浄空間における細胞補充
０．００１ｍｇ／ｋｇでは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、リンパ球補充によりこの時点で特徴付けられた炎症ステージの間、リンパ球補充及び補充される総細胞数を有意に低下した。０．１ｍｇ／ｋｇ、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、影響がなかった（１群あたりｎ＝５匹のマウス；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．００１）（図９を参照のこと）。
【０２７２】
ａ）組織学
肺の３μｍの切片を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。炎症性細胞蓄積、線維性の領域、肺構造の喪失が、ＢＬＭ投与１０日後に観察された。これらのパラメータの低下は、低用量（０．００１ｍｇ／ｋｇ）のＸＧ−１０２の投与後に観察されたが、高用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）の投与後には観察されなかった（図１０を参照のこと）。
【０２７３】
ｂ）結論：
０，００１ｍｇ／ｋｇという低用量で３回投与されたＸＧ−１０２（配列番号１１）は、ブレオマイシン誘発性の後期の炎症、具体的には、この時点で観察されたリンパ球補充を低下すると結論され得る。更に、この用量で３回投与された試験物質は、ブレオマイシン誘発性の線維症を軽減する。肺の構造がより保存されている伸長した線維性の領域が少ないことを観察することができた。
【０２７４】
実施例１４
アルツイマー病の処置における全Ｄレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチド及びそのバリアントの活性の決定
アルツイマー病において例示的な全Ｄレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドＸＧ−１０２（配列番号１１）の活性を決定するために、ＸＧ−１０２（配列番号１１）を、ロンドン変異及びスウェーデン変異を有するＡＰＰ７５１を過剰発現するｈＡＰＰ−トランスジェニックマウスモデルにおいて、行動的なモリス水迷路試験を使用して評価し、同様に、プラークロードを測定する免疫組織学的試験並びにマウスの脳におけるβ−アミロイド１−４０及びβ−アミロイド１−４２レベルを測定するＥＬＩＳＡ試験で評価した。
【０２７５】
ａ）方法
ｉ）序論
本試験は、５か月（±２週）齢の雌性ｈＡＰＰ  Ｔｇマウスを使用して、行動的、生化学的及び組織学的マーカーに対する試験物質（ＸＧ−１０２、配列番号１１）の有効性を評価するように設計した。したがって、マウスは、最大４か月まで２週又は３週ごとに処置し、処置期間の終わりに、行動をモリス水迷路試験で評価した。屠殺した脳で、ＣＳＦ及び血液を収集した。Ａβ４０及びＡβ４２のレベルを４つの異なる脳ホモジネート画分で、同様に、ＴｇマウスのＣＳＦで決定した。プラークロードは、１つの処置群あたり８匹のＴｇの動物の皮質及び海馬で定量した。
【０２７６】
ｉｉ）動物
Ｃ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡの背景を有し、５か月（±２週）齢の雌性Ｔｇマウスを、処置群１〜３に無作為に割り当てた（ｎ＝１２）。動物に、ビヒクル又はＸＧ−１０２（配列番号１１）を２つの異なる濃度の投与で与え、これは５か月齢で開始して、最大４か月間、２又は３週目ごとに皮下（ｓ．ｃ．）適用によって継続した。本試験に使用した全ての動物は、黒い目であり、ＭＷＭプールの外側の目標物を認識するようであった。しかし、この試験に含まれる予備を含む全ての動物について処置開始前に、可視のプラットフォームトレーニング、いわゆる予備試験で管理された、視力が劣っている動物は排除しなければならなかった。特定の動物について視力のハンディキャップが確認された場合、そのマウスは試験から除外した。
【０２７７】
ｉｉｉ）動物の特定及び飼育
マウスは耳のマーキングで個々に特定した。それらは、個々のベンチレーションケージ（ＩＶＣ）の中で、Ｒｅｔｔｅｎｍａｉｅｒ（登録商標）が供給した標準のげっ歯類の寝床の上で飼育した。各々のケージには、最大５匹のマウスがいた。マウスは、国際標準に基づいて記載されたＪＳＷ標準操作手順（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）（ＳＯＰ  ＧＥＮ０１１）に従って保持した。各々のケージを、色つきのカードで特定し、このカードで、試験の番号、性別、動物の個体登録番号（ＩＲＮ）、誕生日、並びにスクリーニング日及び処置群割り当てを示した。この試験中の温度は、約２４℃に維持し、相対湿度は、約４０〜７０％で維持した。動物は、一定の光サイクル（１２時間の明／暗）のもとで飼育した。通常の水道水を動物に自由に利用させた。
【０２７８】
ｉｖ）処置
４か月にわたって、４０匹の雌性ｈＡＰＰトランスジェニックマウスを、２週ごとに体重１ｋｇあたり０．１ｍｇか、又は３週ごとに体重１ｋｇあたり１０ｍｇのいずれかの試験物質ＸＧ−１０２（配列番号１１）を、２つの異なる投与量（ｎ＝１２／群）で処置するか、又はビヒクル（ｎ＝１２）ｓ．ｃ．で３週ごとに１回処置した。
【０２７９】
ｖ）モリス水迷路（ＭＷＭ）
モリス水迷路（ＭＷＭ）タスクを、１００ｃｍの直径の黒い円形のプールで行った。水道水を２２±１℃の温度で満たし、そのプールを仮想的に４つのセクターに分けた。透明なプラットフォーム（８ｃｍの直径）を、水面の約０．５ｃｍ下に置いた。試験期間全体の間、予備試験を除いて、プラットフォームは、プールの西南側の四分円に配置した。４日持続するトレーニング期間の１日前に、動物にいわゆる「予備試験」（２つの６０秒継続トライアル）を行って、各々の動物の視力が正常であることを確認した。このタスクを全うした動物のみを、ＭＷＭ試験に入れた。ＭＷＭタスクでは、各々のマウスは、４連続日で３つのトライアルを行わなければならなかった。１回のトライアルは最大１分続けた。この時間中、マウスは隠れている透けて見える目標を見つける機会があった。動物が水から出る「道」を見つけることができなかった場合、研究者は、マウスをプラットフォーム上に導くか、配置した。各々のトライアル後、マウスをプラットフォーム上で１０〜１５秒間休ませた。この時間中、マウスは、周囲を方向付ける能力があった。検討は、調光条件下で行い、追跡システムが負に影響されることを防いだ（Ｋａｍｉｎｓｋｉ；ＰＣＳ、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。プールを囲む壁の上で、黒い太字の幾何形状のシンボル（例えば、円形及び四角）のある貼り紙を固定し、マウスは、そのシンボルをその方向付けのための道標として使用することができた。１つのトライアルあたり１つの水泳群は、５〜６匹のマウスから構成され、その結果、トライアル間の時間を、約５〜１０分に保証した。逃避潜時（時間［秒］−マウスが隠れたプラットフォームを見つけて、それによって水から逃避するのに必要）、経路（標的に達する軌跡の長さ［メートル］）及び目標の四分円における滞在の定量のために、コンピュータ化したトラッキングシステムを使用した。コンピュータは、プールの中央の上に置いたカメラに接続した。このカメラで、マウスの尾の上に小さいヘアピンで固定した発光ダイオード（ＬＥＤ）のシグナルを検出した。４日目の最終トライアルの１時間後、マウスは、いわゆるプローブトライアルを満たさなければならなかった。この時点で、プラットフォームをプールから取り出し、１分のプローブトライアルの間；実験者は、前者の標的位置上の交差の数をカウントした。更に、この四分円中及び３つの他の四分円の滞在を算出した。このトライアルを通じて、マウスは、プラットフォームから、どんな方法であろうと、なんのてがかりも得ることはできなかった。
【０２８０】
ｖｉ）組織サンプリング
処置期間、及び続く全ての行動的な試験の終わりに、全ての残りのマウス（ｎ＝２８）を屠殺した。したがって、全てのマウスは、ＳＯＰ  ＭＥＴ０３０に記載のとおり、標準的な吸入麻酔（イソフルラン、Ｂａｘｔｅｒ）で鎮静させた。脳脊髄液（ＣＳＦ）を、鈍的切開及び大後頭孔の露出によって得た。曝露の際、パスツールピペットを大後頭孔の中へ約０．３〜１ｍｍの深さまで挿入した。ＣＳＦを、流れが完全に停止するまで、吸引及び毛細管作用によって収集した。各々の試料の２つのアリコートを直ちに凍結させて、ＥＬＩＳＡ技術によるさらなる分析のために準備するまで−８０℃で保持した。ＣＳＦのサンプリング後、各々のマウスを、背臀位にして、胸郭を開けて、１ｃｃのシリンジに接続した２６ゲージの針を右心室腔に挿入した。軽度吸引を針に与えて、血液をＥＤＴＡ内に収集し、引き続きこれを使用して血漿を得た。血漿を得るために、各々のマウス由来の血液試料を、スイングバケット（ＧＨ−３．８  Ｂｅｃｋｍａｎ）を備えるローターを使用して遠心分離器（ＧＳ−６  Ｂｅｃｋｍａｎ）中で１０分間、１，７５０ｒｐｍ（７００ｇ）でスピンした。血漿を凍結し、更に分析するまで−２０℃で保管した。血液サンプリング後、トランスジェニックマウスを、０．９％塩化ナトリウムを用いて心臓内でかん流させた。脳を迅速に取り出し、小脳を切り取った。全てのマウスの右半球を、室温で１時間、新鮮に生成した４％パラホスムアルデヒド／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で浸漬固定した。その後、脳を１５％スクロースＰＢＳ溶液に２４時間移して、凍結保護を確保した。翌日、脳をイソペンタン中で凍結し、組織学的検討のために使用するまで−８０℃で保管した（ＳＯＰ  ＭＥＴ０４２）。左の半球を秤量して、液体窒素中で凍結し、生化学的分析のために−８０℃で保管した。
【０２８１】
ｖｉｉ）Ａβ１−４０及びＡβ１−４２の決定
各々のＴｇマウスの４つの異なる脳ホモジネート画分中で、及びＣＳＦ試料において、Ａβ１−４０及びＡβ１−４２のレベルを、ＥＬＩＳＡ技術を用いて評価した。高度に鋭敏なＡβ１−４０及びＡβ１−４２、ＥＬＩＳＡ試験キットは、Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ（商標）、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（ＳＯＰ  ＭＥＴ０５８）から購入した。ＣＳＦは、上記のとおり調製した。脳ホモジネートのために凍結した半球を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＴＲＩＳ緩衝化食塩水（ＴＢＳ）−バッファー（５ｍｌ）中でホモジナイズした。１．２５ｍｌのこの最初の脳ＴＢＳホモジネートを、−８０℃で保管し、１．２５ｍｌを更に検討した。残りの脳ホモジネート（２．５ｍｌ）を遠心分離し、得られた上清（＝ＴＢＳ画分）を、アリコートにし、ＥＬＩＳＡ決定まで−２０℃で保持した。ペレットを、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（２．５ｍｌ）中に懸濁し、遠心分離し、その上清（＝Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００画分）をアリコートにし、−２０℃で保持した。これらのステップを、ＳＤＳ（２．５ｍｌ）を用いて繰り返した。ＳＤＳ画分からのペレットを、７０％ギ酸（０．５ｍｌ）中に懸濁した後、続けて遠心分離した。得られた上清を、１ＭのＴＲＩＳ（９．５ｍｌ）を用いて中性にし、アリコートにし、−２０℃で（＝ＦＡ画分）保持した。４つの脳ホモジネート画分（ＴＢＳ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＳＤＳ、及びＦＡ）の試料を、ＥＬＩＳＡ技術でのＡβ１−４０及びＡβ１−４２決定のために使用した。ＥＬＩＳＡ試験キットは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ（商標）、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（ＳＯＰ  ＭＥＴ０６２）から購入した。ＴＢＳ及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、モノマー構造からオリゴマー構造へ可溶化すると仮定できる。ポリマー、例えば、プロトフィブリル及び水不溶性のフィブリルは、ＳＤＳ及びＦＡに溶解できる。これに関して、４つ全ての画分の検討によって、またＡ重合化状態の洞察が得られる。
【０２８２】
ｖｉｉｉ）脳の形態学的評価
検討した全てのＴｇ動物の脳組織は、この手順のばらつきによるバイアスを除くために正確に同じ方法で取り扱った。２４匹のＴｇマウス（各群８匹）のうち半分の脳から、１層あたり２０の凍結切片（全部で５つの層）、各々１０μｍの厚さ（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ  ３０５０Ｓ）を矢状に切断して、５つ（各々の層から１つ）を処理し、プラークロードの定量のために評価した。この５つの矢状層は、Ｐａｘｉｎｏｓ及びＦｒａｎｋｌｉｎ（第２版）の形態学アトラス「マウス脳（Ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ）」による図１０４〜１０５、１０７〜１０８、１１１〜１１２、１１５〜１１６及び１１８〜１１９と対応していた。第１の層は、全海馬を、その領域ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３、ＧＤｌｂ及びＧＤｍｂとともに含むための要件で特定された。免疫反応性は、海馬中で、及び皮質中で、モノクローナルヒトＡβ特異的抗体６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ）、同様にチオフラビンＳ染色を使用して定量的に評価した。使用しなかった残りの脳半球又は組織は、残しておいて、計画の終わりまでＪＳＷ  ＣＮＳに保管した。
【０２８３】
ｂ）評価
ｉ）行動
モリス水迷路トライアルでは、水泳通路の長さ、逃避潜時、水泳速度、及びプローブトライアルにおける前のプラットフォーム位置との交差、及びプールの各々の四分円で過ごした時間を、専門的なコンピュータソフトウェアで各々のＴｇ動物について測定した。
【０２８４】
ｉｉ）生化学的評価
全てのＴｇマウス由来のＣＳＦ試料、同様に脳調製物由来の試料を、市販のＡβ１−４０及びＡβ１−４２のＥＬＩＳＡで分析した。適切な標準の測定は、同時に行った。脳調製物由来の試料は２連で分析した。試料の量がわずかだったので、ＣＳＦ試料は、１回の測定のみで分析した。
【０２８５】
ｉｉｉ）組織学
アミロイド沈着及びプラークロードの測定
６Ｅ１０免疫組織化学のために以下の評価手順を使用した：
ａａ）画像にコントラストを適用することのない切片境界の可視化のための画像の造影。
ｂｂ）皮質の輪郭のインタラクティブドローイング及び皮質領域（＝領域面積）の以降の測定。
ｃｃ）目的領域（ＡＯＩ）のインタラクティブドローイングであって、ここで染色された物体は、特定強度ベースの閾値レベル（各々の画像について同じである）を超え、８μｍ２のサイズを上回って検出される。
ｄｄ）各々の物体の面積の測定、ＡＯＩ中の染色された面積の合計、及びシグナル／ノイズ比を増強する平滑造影後の物体の数（各々の画像について同じ）。
ｅｅ）海馬についてａａ）〜ｄｄ）の反復。
ｆｆ）平均プラークサイズの算出（＝「プラークの合計面積／プラークの数」）、相対プラーク数及び面積（＝「プラークの数／領域面積」及び「プラークの合計面積／領域面積＊１００」）。
ｇｇ）パラメータ「画像タイトル、領域面積、プラーク数、プラーク面積の合計、相対プラーク数、相対プラーク面積及び平均プラークサイズを含む、Ｅｘｃｅｌスプレッドシートへの自動化データエクスポート。所見のフィールドを使用して、画像の質及び除外基準をそれぞれ、記録した。除外基準は、切片の失われた部分、シワの多さ、優勢な欠陥又は染色の不一致（例えば、ブロッキング試薬の完全な反応を邪魔し得る隆起に起因する）であった。
ｈｈ）保存することなく画像を閉じる（生のデータを生で保持するため）。
【０２８６】
ｃ）結果
ｉ）一般的な観察
全部で４０匹の雌性ｈＡＰＰ  Ｔｇマウスを試験に含んだ。これらのマウスから、１２匹の動物が、処置期間の終了前に未知の理由で死亡した。
【０２８７】
ｉｉ）行動的な結果
ＭＷＭでの空間的学習は、ＸＧ−１０２（配列番号１１）処置によって広く影響されなかった。０．１ｍｇ／ｋｇで処置されたマウスは、１日目〜４日目の間、有する学習能力が悪い傾向を示した。１日目及び４日目の平均能力の二元ＡＮＯＶＡでは、全群について高度に有意な学習が明らかになったが（ｐ＜０．００１）、因子処置の有意な影響も明らかになった（ｐ＝０．０４５）。しかし、ボンフェローニの事後検定は、有意差には達しなかった。
【０２８８】
ｉｉｉ）生化学的結果
ａａ）脳ホモジネート画分中のＡβレベル
試験化合物ＸＧ−１０２（配列番号１１）での処置は、脳ホモジネートのＡβ１−４０レベルに影響しなかった（図１１を参照のこと）。Ａβ１−４２レベルにおける群の差異は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００画分でのみ生じた。低用量の試験化合物ＸＧ−１０２（配列番号１１）（０．１ｍｇ／ｋｇ）で処置された動物は、ビヒクル群と比較して（ｐ＜０．０５）、同様に高用量群と比較して（ｐ＜０．０１）有意な低下を特徴とした。
ｂｂ）ＣＳＦのＡβレベル
試験物質ＸＧ−１０２（配列番号２）での処置後、Ａβ１−４０及びＡＢ１−４２レベルは、ビヒクル群と比較してＣＳＦで有意に低下した。Ａβ１−４０及びＡβ１−４２の両方に関して、ｐ値は、ＸＧ−１０２（配列番号２）の高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）についてはｐ＜０．０１で、低用量（１０ｍｇ／ｋｇ）についてはｐ＜０．０５であった（図１２を参照のこと）。
【０２８９】
ｉｖ）脳組織学及び免疫組織化学の結果
ａａ）アミロイド沈着及びプラークロード
プラークロードは、２つの異なる方法で定量した。一方では、ヒトアミロイドペプチドのＡＡ１−１７に主に関する６Ｅ１０でのＩＨＣ染色を行い、他方では、ベータ−シート構造及び成熟老人斑のコアを印すチオフラビンＳ染色を行った。まず第１に、測定した領域の面積、皮質及び海馬は、全群を通じて高度に一定であって、これによって、切断及びＩＨＣ手順の問題が排除され得、特定の程度まで、また処置は、委縮を誘発したことが示された（５％を超える変化がこの方法で検出可能であろう）。６Ｅ１０及びチオフラビンＳ定量で、ＸＧ−１０２（配列番号１１）処置後のプラークの中心におけるベータシート構造の選択的な低下が明らかになったが、ヒトアミロイドは、処置の影響を受けないままであったか、又はわずかに増大した。具体的には、皮質６Ｅ１０ＩＲプラークロードは、１０ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）処置マウスにおいてビヒクルに対して増大されたが、海馬のプラークの数に関しては有意なレベルに達した。図１３及び１４は、６Ｅ１０  ＩＨＣとは対照的に、ＸＧ−１０２（配列番号１１）処置が、海馬のチオフラビンＳ陽性プラークの数、及び面積のパーセンテージの負の用量依存性の低下につながったことを示す（プラークの数：ＸＧ−１０２（配列番号１１）の１０ｍｇ／ｋｇについてｐ＜０．０５、０．１ｍｇ／ｋｇについてｐ＜０．０１）。０．１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）処置はまた、平均プラークサイズを低下したが、この効果は、ＡＮＯＶＡでは有意なレベルに達しなかった（対応のない、両側Ｔ検定：ｐ＝０．０７４）。これらの効果は、皮質のプラークに関しては生じず、この環境は、皮質よりも海馬でのプラークの病理の後期の発生におそらくは最も起因する。５か月齢での処置の開始は、海馬でのプラーク沈着の時点を正確にヒットするが、皮質プラークは、３か月齢で定量に使用される倍率で可視になり始める。定性的に、チオフラビンＳ染色プラークに対する６Ｅ１０の割合は、増大し、ベータ−シートプラークコアは、二重に標識された切片でわかるとおり、サイズがより小さくなる。まとめると、これらのデータは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）処置は、それぞれ、プラーク沈着の早期段階でのベータ−シート形成、及びプラークコアにおけるベータシート形成に対して作用することをサポートする。
【０２９０】
ｄ）効果のまとめ及び結論
・モリス水迷路で測定した空間ナビゲーションは、処置から広く影響されないままであった。０．１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）の処置によって、最初のトレーニング日と最後のトレーニング日との間でわずかに劣った学習能力が生じた。
・０．１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）群におけるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００画分の低下を除いて、Ａβ１−４０及びＡβ１−４２の脳レベルは安定に維持された。
・Ａβレベルの低下は、投与量及び画分の両方に関してＣＳＦで検出可能であった。
・ＸＧ−１０２（配列番号１１）処置は、６Ｅ１０定量において、高用量投与群ではヒトアミロイドベータの偏向した増大をもたらし、これはＡβのＥＬＩＳＡで得られたデータと一致している。
・チオフラビンＳ染色で検出された海馬のベータ−シートロードが、ＸＧ−１０２（配列番号１１）処置後に用量に依存して、低用量の０．１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）で高い程度まで低下されたことと対照的に、皮質のプラークロードは未変化のままであった。処置開始での海馬中のプラーク沈着の年齢依存性の発症と一致して、これは、プラーク沈着の早期段階でのベータ−シート形成に対する早期の作用をほのめかす。
【０２９１】
実施例１５
２型糖尿病の処置における全Ｄレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチド及びそのバリアントの活性の決定
実施例１５は、２型糖尿病の処置におけるＩＢ（ｓ）ペプチド及び全Ｄレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチド及びそのバリアントの活性を決定するために、特に３日ごとに（２８日）空腹時血糖値を評価することによって２型糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスモデルでＸＧ−１０２（配列番号１１）を用いる持続的処置の効果を決定するために設計される。
【０２９２】
ａ）材料及び方法
ｉ）動物
全部で２０匹の雄性ｄｂ／ｄｂマウス（８週齢）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。到着した際、動物を群で飼育し（ｎ＝６〜７匹／群）、標準的なげっ歯類の固形飼料（Ａｌｔｒｏｍｉｎ標準＃１３２４固形飼料；Ｃ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ、Ｒｉｎｇｓｔｅｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）及び水を別段注記しない限り自由に与えた。マウスは、１２：１２のＬ／Ｄサイクル（４：００に照明点灯し、１６：００に消灯）で、かつ温度及び湿度を管理した部屋で飼育した。
【０２９３】
ｉｉ）群及び無作為化
−４日目、マウスを、血糖値に応じて無作為化した（絶食した；Ｂｉｏｓｅｎ  Ｓライン分析装置（ＥＫＦ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定した血糖で、以下の薬物処置群（ｎ＝６）の１つに入れる：
１）ビヒクル対照、Ｓ．Ｃ．（生理食塩水）
２）ＸＧ−１０２（配列番号１１）；１ｍｇ／ｋｇ；ｓ．ｃ．
３）ＸＧ−１０２（配列番号１１）；１０ｍｇ／ｋｇ；ｓ．ｃ
【０２９４】
列挙した全ての用量は、遊離塩基について算出した。薬物純度：９５．２８％、ペプチド含量：７８．０％。全ての化合物は、皮下に（ｓ．ｃ．）３ｍｌ／ｋｇの容積で投与した。ビヒクル対照及びＸＧ−１０２（配列番号１１）の処方指示は以下のとおりであった。
【０２９５】
第１に、ＸＧ−１０２（配列番号１１）を、ビヒクルに溶解した。処方物（０．３３及び３．３ｍｇ／ｍｌの濃度は、それぞれ、１及び１０ｍｇ／ｋｇの用量に相当する）を、下記の詳細な手順に従って調製した。濃度を試験品の純度及びペプチド含量を考慮して、算出し表す（乗数係数は１．３４６であった）。
・ストック溶液の調製：凍結乾燥した試験化合物ＸＧ−１０２（配列番号１１）を最低１時間解凍して、ビヒクル中で１ｍＭ（３．８２３ｍｇ／ｍＬに相当する）のストック溶液として調製する。アリコートを、各々の処置日について調製し、約−８０℃で保管する。このストック溶液の必要な濃度までの希釈を、各々の処置日に行う；
・ストック溶液の保管：約−８０℃で；
・希釈した調製物の保管：室温で最大２４時間。
【０２９６】
可溶化の前に、粉末を−２０℃で保管した。ストック溶液の安定性は、約−８０℃で３か月である；動物の投与のための希釈処方物の安定性は、室温で２４時間である。未使用の希釈材料は、４〜８℃で保持する場合、最大７日まで保管可能であろう。
【０２９７】
ｃ）実験手順
馴化させた８日後、マウスを、アウトライン群に従い午後０４．００時の消灯の８時間前にＳＣ投与によって、２１日間、午前０８．００時に毎日処置した。次いで、試験の２１日目に、最高濃度のＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）の投与を停止したが、ビヒクル対照及びＸＧ−１０２（配列番号２）（１ｍｇ／ｋｇ）の毎日の投与は、試験２８日目まで継続した。２８日目から、１１１日目の終わりまで、ビヒクル及びＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）処置したマウスは、ウォッシュアウト期間（投与なし）で観察したが、ＸＧ−１０２（配列番号２）（１ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスは処置の２８日後に終わった。
【０２９８】
ｉ）血糖
尾静脈からヘマトクリット管中への１０μｌの血液試料の収集によって、７時間絶食した動物から投与６時間後、血糖を測定し、引き続いて、Ｂｉｏｓｅｎ  ｓ−ライン分析装置（ＥＫＦ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ；Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析した。
【０２９９】
ｉｉ）代謝ケージ
第１＋３群：マウスを、２４時間の食物及び水の取り込み、並びに２４時間の尿及び糞便の生成を記録するために代謝ケージに入れた。マウスをｎ＝６〜７匹の２つの小チームに層別化し、引き続き代謝の特徴付けを試験の７１〜７２日目に行った。
【０３００】
ｉｉｉ）アディポカインパネル
第１＋３群：３つの機会（試験５７、６６及び１０８日目）に、血液を、ＥＤＴＡでコーティングしたヘマトクリット管（１００μｌ）を使用して尾静脈から収集した。血液の遠心分離後、血漿を収集し、測定するまで−２０℃で保管した。次いで、アディポカイン／サイトカインの以下のパネルを、Ｌｕｍｉｎｅｘベースの７−ｐｌｅｘ：レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）、レジスチン（ｒｅｓｉｓｔｉｎ）、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＴＮＦ、インスリン及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）を使用して決定した。
【０３０１】
ｉｖ）終了
第１＋３群（１１１日目）：以下の臓器を切り出して、秤量した：鼠径部皮下脂肪、精巣上体脂肪、後腹膜脂肪、脳、肝臓、腎臓、脾臓及び心臓。上記の全ての臓器は、潜在的な特徴の組織病理学的検査のために４％ＰＦＡ中の試料であった。また、膵臓（ひとかたまり）を、可能な立体分析学及び免疫組織化学的分析のためにサンプリングし、眼を網膜症の潜在的な後の分析のためにサンプリングした。第２群（２８日目）：組織も血漿も収集しなかった。
【０３０２】
ｃ）結果
ｉ）一般的な観察
急性の投与期間の間、動物は、正常なレベルの注意力及び活動を示し、薬物処置した動物で鎮静の徴候はなかった。食物及び水の取り込みは、ビヒクル処置した動物の間では正常な範囲内であった。しかし、およそ２週の投与の後、結節性線維症が、高用量のＸＧ−１０２（配列番号２）化合物に対する反応として皮下組織で観察され、これらは、Ｃ群由来の全てのマウスで開放傷に進行した。Ｂ群では、軽度の結節性線維症が観察された。結果として、注射部位の変更を行った。動物の投与の終わりの後、その動物は、治癒し、結節性線維症は徐々に消失していった。本発明者らは、ビヒクル処置した動物では臨床的な効果を観察しなかった。
【０３０３】
ｉｉ）血糖
空腹時血糖値（絶対値及び相対値）を図１５に示す。空腹時血糖は、６８日目まで３日ごとに、Ａ群及びＣ群では１１１日目に終わるまで規則的に測定した。本発明者らは、ビヒクル対照と比較して、ＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスの空腹時血糖のレベルに明確かつ有意な（ｐ＜０．００１）低下を観察した。ＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスの空腹時血糖値は、約５ｍｍｏｌ／Ｌという低いプラトーに達した。この効果は、投与の１４日後に明らかになり、本試験全体にわたって、したがって、２１日目から１１１日目のウォッシュアウト期間全体にわたって続いた。対照的に、本発明者らは、投与の２８日の間、低用量のＸＧ−１０２（配列番号２）（１ｍｇ／ｋｇ）の効果は観察されなかった。
【０３０４】
ｉｉｉ）体重
体重決定（絶対値及び相対値）は図１６に示す。本発明者らは、ビヒクル対照と比較して、ＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスでは体重増大の明確かつ有意な（ｐ＜０．００１）防止を観察した。この効果は、投与の２８日目から明らかになり、終了日の１１１日目の日まで続いた。対照的に、本発明者らは、投与の２８日の間、低用量のＸＧ−１０２（配列番号２）（１ｍｇ／ｋｇ）の体重に対する効果は観察されなかった。
【０３０５】
ｉｖ）代謝ケージ
試験の６８日目に代謝ケージで測定した、２４時間の食物及び水の取り込み、並びに尿及び糞便の生成に対する、ビヒクル又はＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）の影響を、図１７（ｇ）及び図１８に示す（体重のｇに対して正規化した）。本発明者らは、食物取り込み、及び尿の生成の低下に向かう傾向を通じて、ビヒクル対照と比較して、測定したパラメータのいずれに対してもＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）の有意な効果は観察しなかった。
【０３０６】
ｖ）アディポカイン
５７、７７及び１０８日目に測定した、ビヒクル又はＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）の、インスリン、ＭＣＰ−１及びＩＬ−６の血漿レベルに対する効果を、図１９に；ｔＰＡＩ−１、ＴＮＦ及びレジスチンの血漿レベルに対する効果を図２０に示す；本発明者らは、７７及び１０８日目にＸＧ−１０２（配列番号２）で処置した動物で有意に高かった血漿レジスチンのレベルを除いて、ビヒクル対照と比較して、測定したパラメータのいずれに対してもＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）の有意な効果は観察しなかった。
【０３０７】
ｖｉ）終了時の組織重量
精巣上体、鼠径部皮下脂肪、及び後腹膜脂肪体の組織重量に対するビヒクル又はＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果を図２１に示す。本発明者らは、ビヒクル対照と比較して、ＸＧ−１０２で処置したマウスでは、精巣上体（ｐ＜０．０５）及び後腹膜（ｐ＜０．０１）の脂肪質量の有意な低下を観察した。脳、脾臓及び心臓の組織重量に対するビヒクル又はＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果を図２２に示す。本発明者らは、ビヒクル対照と比較して、これらのパラメータに対するＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）の有意な効果は観察しなかった。最後に、腎臓及び肝臓の組織重量に対するビヒクル又はＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果を、図２３に示す。本発明者らは、ビヒクル対照と比較して、ＸＧ−１０２（配列番号２）で処置したマウスでは、腎臓（ｐ＜０．０５）及び肝臓（ｐ＜０．０１）の質量の有意な低下を観察した。
【０３０８】
結果をまとめると、ＸＧ−１０２（配列番号１１）、１０ｍｇ／ｋｇの投与は、血糖値の有意な低下をもたらすように思われ、したがって、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、糖尿病及び血糖値の上昇を処置するための見込みのある新しいツールであると思われる。
【０３０９】
実施例１６
無作為化、二重盲検、プラシーボ対照の用量漸増第Ｉ相治験において健常男性ボランティアに投与した１０、４０及び８０μｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）の単回静脈内注入の安全性、耐容性及び薬物動態
この治験の主な目的は、健常男性ボランティアに対するＸＧ−１０２の単回漸増用量の静脈内（ｉｖ）注入後のＸＧ−１０２の安全性及び耐容性を評価することであった。この試験の二次的な目的は、健常男性ボランティアに対するＸＧ−１０２の単回漸増用量のｉｖ注入後のＸＧ−１０２の薬物動態を評価することであった。用量は、６０分のｉｖ注入として投与した。対照の目的で、プラシーボのｉｖ注入を対照の対象に投与した。
【０３１０】
これは、単一施設、無作為化、二重盲検、プラシーボ対照の漸増性の単一用量の連続的な群の治験であった。ＸＧ−１０２の３つの用量レベル（１０、４０及び８０μｇ／ｋｇ）を、漸増する順序の用量で研究し、ここで各々の群の対象は、６人の対象がＸＧ−１０２を投与され、２人の対象がプラシーボを投与されるように無作為化した。スクリーニングは、投与前の３週間の期間に行った。投与は、各々の対象について０日目に行った。治験者は、全ての対象の健康状態を、彼らがＣＲＵから出る前にチェックした（投与２４時間後）。対象は、治験後の評価のために投与後８±２日及び２８±５日でＣＲＵに戻った。
【０３１１】
８人の３つの群において全部で２４人の対象（１８〜４５歳の健常な男性対象）。２４人の対象が試験に入って、完了した。全ての対象についてのデータを安全性分析に含めた；ＸＧ−１０２を投与された全ての対象についてのデータを、薬物動態学的分析に含めた。
【０３１２】
【表４】
2020073573.tif 000008
【０３１３】
ｔ１／２の観察された値は短かった。Ｃｍａｘで測定したピーク曝露及びＡＵＣ０−ｌａｓｔで測定した累積曝露は両方とも、用量とともに増大した。最高８０μｇ／ｋｇの用量の後に、他の用量について９０％信頼区間を上回る、Ｃｍａｘの用量増大は、図解及びその用量正規化値の幾何平均に基づいて線形比例より大きいようである。ＡＵＣ０−ｌａｓｔの用量での増大は、４０〜８０μｇ／ｋｇと線形比例よりも明確に大きい。なぜなら、その幾何平均用量正規化値についての９０％信頼区間は、他の試験用量後の区間とは重複しないからである；しかし、１０及び４０μｇ／ｋｇの後の値を比較するとき、９０％信頼区間は重複するが１０μｇ／ｋｇの用量後のその幾何平均用量正規化値は、４０μｇ／ｋｇの用量後の対応する９０％信頼区間における全ての値よりも低い。
【０３１４】
ＸＧ−１０２は、健常な男性対象に対して１０、４０又は８０μｇ／ｋｇの単回ｉｖ用量として投与された場合、安全であり、かつ十分に耐容された。ＸＧ−１０２を投与された対象における有害事象の頻度は、プラシーボを投与された対象での頻度と同様であった。臨床実験データ、バイタルサイン、ＥＣＧ、健康診断又は眼科検査（眼底及びＩＯＰ）に臨床上有意な知見はなかった。
【０３１５】
ＸＧ−１０２の静脈内注入の終了後、その血漿濃度は急速に低下し、１０μｇ／ｋｇのＸＧ−１０２のｉｖ注入の開始後、長くても２時間後まで、４０μｇ／ｋｇのＸＧ−１０２のｉｖ注入の開始の３時間後、及び８０μｇ／ｋｇのＸＧ−１０２静脈内注入の開始後長くとも７時間後までに定量の下限未満の値をもたらした。測定されたｔ１／２及びＭＲＴ値は短く、１用量レベルあたりの幾何平均の値は、それぞれ、０．３６〜０．６５時間及び０．７６〜１．０２時間におよぶ。
【０３１６】
ＸＧ−１０２のＡＵＣ０−ｌａｓｔは、試験した用量範囲における用量との線形比例よりも大きく増大し、４０μｇ／ｋｇ及び８０μｇ／ｋｇの用量の間のその幾何平均用量正規化値についての９０％信頼区間は重複しておらず、かつ１０μｇ／ｋｇ及び４０μｇ／ｋｇの間のその幾何平均用量正規化値についての９０％信頼区間の間の重複はごく限られている。
【０３１７】
ＸＧ−１０２のＣｍａｘは、４０μｇ／ｋｇ〜８０μｇ／ｋｇの用量での線形比例よりも大きく増大すると思われる。８０μｇ／ｋｇの用量群での幾何平均用量正規化Ｃｍａｘは、他の用量群における幾何平均用量正規化Ｃｍａｘについての９０％信頼区間よりも高く、かつ外側であるが、幾何平均用量正規化Ｃｍａｘについての９０％信頼区間は、全ての用量レベルの間で重複する。
【０３１８】
ＸＧ−１０２の薬物動態学的パラメータの対象の間での変動は、１０及び４０μｇ／ｋｇの用量で処置された対象では中度であった（ほとんどのパラメータについて幾何平均のＣＶ％、ほぼ１５〜３０％の範囲で、例外は、１０μｇ／ｋｇ用量群でのｔ１／２及び総Ｖｓｓであった）、しかし、８０μｇ／ｋｇの用量群ではより高く、ＭＲＴ（１４．７％）以外は、約２９〜４４％の範囲であった。この高度の変動は、試料サイズが低い影響、又はこの用量ではより明確である観察された非線形性の結果のいずれかであり得る。
【０３１９】
実施例１７
ブタの膵島分離の転帰を改善するＸＧ−１０２（配列番号１１）の使用
この目的は、ＸＧ−１０２が、（ａ）細胞のストレス及び死滅につながる膵島分離の間に生じるＪＮＫの大規模な活性化をブロックする能力；（ｂ）分離後の膵島生存度の改善につながる、膵島の死滅を低減する能力を、ブタモデルを使用して評価することであった。
【０３２０】
ブタの膵島分離は、膵島分離手順の開始の約２０分後、組織試料中で最初に観察されたＪＮＫの劇的な活性化を生じる（図３３）。既存のデータの分析は、調達の間及び分離実験室への輸送の間の膵臓レベルでＸＧ−１０２ＪＮＫ阻害剤の添加、及び膵島分離溶液（１０マイクロモル濃度）への添加は、ＪＮＫの活性化をブロックし（図３４）、ｃ−ｆｏｓ遺伝子の相対的発現を低下し（図３５）、かつＯＣＲ／ＤＮＡによって測定される新鮮に分離された膵島の生存度（図３６）及びＡＴＰ／タンパク質［総細胞タンパク質］（図３７）に対して統計学的に有意かつ重要な影響を有することが実証される。比較は常に、同じ膵臓ドナーに由来する対の未処置の対照で行った。図３６及び図３７で示される膵島生存度に対するデータは、分離の間に通常観察されるＪＮＫの活性化の減少（図３３）及び得られたｃ−ｆｏｓ遺伝子発現の減少（図３５）と一致している。生存度、ＪＮＫ活性化及びｃ−ｆｏｓ発現における差異は、培養の７日後には更に小さくなった。
【０３２１】
分離体の６／６（１００％）は、カットオフを上回るＯＣＲ／ＤＮＡ値を生じ、首尾よくＮＨＰに移植された（図３８）。これによって、このモデルでは、生存度の適度な改善でさえ、調製物の移植可能性に顕著な影響を有し得ることが確認される。利用可能なデータに基づいて、ＸＧ−１０２は、臨床的なヒト又はブタの膵島分離に使用される優れた薬剤であることが分かった。
【０３２２】
ブタモデルは、以下の理由のために適している：（１）ブタ膵臓の大きさは、ラット又はイヌの膵臓よりもヒトの膵臓の大きさに近い；（２）ブタの膵島は、将来の臨床的な膵島異種移植のための実行可能な選択肢とみなされる−したがって、決定的に必要である膵島分離の改善は、最終的に臨床的に関連し得る。
【０３２３】
脳死ドナー由来の臨床の膵島同種移植のためのヒト膵臓は、典型的には、ＷＩＴには供されないが、８〜１２時間のＣＩＴ（調達した病院から分離の実験室までの移送に必要な時間）を有する。
【０３２４】
心停止ドナー由来のヒト膵臓は、約１５分のＷＩＴに曝され、ＷＩＴに起因する障害に関する懸念のために、現在は慣用的に）利用されておらず、それらはまた、８〜１２時間のＣＩＴを経験し得る。
【０３２５】
膵島自己移植のために慢性膵炎患者から取り出した臓器は、ＷＩＴを経験し得、限定され得る（１〜２時間のＣＩＴ）。下のブタモデルで報告された改善は、慢性膵炎患者由来の膵臓は通常は炎症状態であって既にストレスを受けているので、臨床的な自己移植の場合には更に大きいと予想される。これはまた、長期の低温虚血時間の臨床的な同種移植の症例でも当てはまると期待され、これは、異なるＪＮＫ阻害剤を使用する他の群で報告されている。ＪＮＫ活性化は、膵臓調達の時間からのＣＩＴとともに増大し；ＪＮＫ阻害剤でのＪＮＫ活性化のブロックは、膵島の収率、生存度及び移植の転帰を改善し、これは試験された最長の低温虚血時間で最も顕著である。
【０３２６】
実施例１８
ラットのアルゴンレーザー誘発性脈絡膜新血管形成モデルを使用する脈絡膜新血管形成低減におけるＸＧ−１０２（配列番号１１）の有効性
この実施例の目的は、２つの用量でのＸＧ−１０２の２つの硝子体内投与が、レーザー誘発性の脈絡膜新血管形成（ＣｈＮＶ）のラットモデルにおける脈絡膜新血管形成の低下を生じたか否かを決定することであった。そのモデルによって、加齢性黄斑変性症の処置のための試験化合物の潜在的な使用に対する予測が可能になる。
【０３２７】
４０匹（＋１０匹の予備）の有色Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットを、各々８匹の動物の５つの群に分けた。脈絡膜新血管形成は、右眼に５３２ｎｍのアルゴンレーザー光凝固装置（１５０ｍＷで１００ｍｓの間、６つの７５μｍサイズのスポット）を使用して誘発した。試験、参照及び対照品は、０日目（誘発直後）及び７日目に硝子体内注射によって投与した。血管造影法を、処置動物及び非処置動物での誘発後１４及び２１日目に、フルオレセイン（トレーサー）皮下注射の１０分後に行った。２３日目の屠殺後、全ての動物からの処置した右眼をサンプリングして、脈絡膜をフラットマウントした。スポンサーの要求で、ＣｈＮＶの容積の数量化は行わなかった。
【０３２８】
実験のセットアップ：
ＸＧ−１０２：３０００μｇ／ｍｌ（１つの眼あたり１５μｇと等量）及び３００μｇ／ｍｌ（１つの眼あたり１．５μｇと等量）。対照の参照としてＫｅｎａｃｏｒｔ（登録商標）Ｒｅｔａｒｄ（４％トリアムシノロンアセトニド）。対照ビヒクル：食塩水（０．９％ＮａＣｌ）。
【０３２９】
動物
種：ラット。これは、この実験モデルで最も一般的に用いられる種である。
株：Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ（有色）。
年齢：約８週。
体重：１７５〜２００ｇ（発注の際）。
数／性別：５０匹の雄（試験４０；予備１０）。
ブリーダー：「ＨＡＲＬＡＮ  ＦＲＡＮＣＥ」−ＦＲ−０３８００  ＧＡＮＮＡＴ。
【０３３０】
試験設計
Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ株由来の４０匹（＋１０匹の予備）の有色ラットを、８匹（＋２匹の予備）の動物の５つの群に分けた。脈絡膜新血管形成は、右眼に５３２ｎｍのアルゴンレーザー光凝固装置（１５０ｍＷで１００ｍｓの間の６つの７５μｍサイズのスポット）を使用して誘発した。
【０３３１】
試験品（２用量、第１〜２群）、ビヒクル及び参照（５μｌ）を、０日目に（同じ麻酔下で新血管形成の誘発後）及び７日目に右眼に硝子体内注射によって投与した。眼底の新血管形成を、処置動物及び非処置動物について右眼で、ハイデルベルグ網膜血管造影（ＨＲＡ）を使用して１４及び２１日目に評価した。
【０３３２】
下の表に、処置群における動物の割り当てをまとめる。
【０３３３】
【表５】
2020073573.tif 000009
【０３３４】
動物の選択
４０匹＋１０匹の予備の動物を、この試験に含んだ。眼の欠陥の可視の徴候がない動物のみを選択した。次いで、処置群の割り当ては、Ｅｘｃｅｌ（登録商標）ソフトウェアでランダム関数によって行った。５０匹の動物を誘発させ、続けた。処置群における無作為な割り当てでは、１群あたりの８匹の動物及び予備動物を決定した。これらの予備の動物は、正常に含まれる１匹又は２匹の動物が、死ぬか、投与手順の間にレンズに影響があるか、又は角膜混濁（反復した麻酔のため）があった場合にのみ、結果の計算に含めた。
【０３３５】
新血管形成の誘発
０日目に、動物をキシラジン／ケタミン混合物の筋肉内注射によって麻酔した。右眼の瞳孔を、１滴の０．５％トロピカミドの滴下によって拡張した。次いで、６つの脈絡膜の火傷（７５μｍのスポットサイズ）を、アルゴンレーザー光凝固装置（５３２ｎｍ；１５０ｍＷ；１００ｍｓ）を使用して主要血管分岐の間で、視神経の周囲で、コンタクトレンズを用いて、細隙灯を通して行った。レーザー処置の時点でバブルの生成によって、ブルッフ膜の破裂を確認した。
【０３３６】
投与の経路及び方法
動物を、キシラジン／ケタミン混合物の筋肉内注射によって麻酔した。試験品、参照及びビヒクル（５μｌ）を、右眼に硝子体内に注射し、投与レジメンは０日目及び７日目であった。その注射は、操作顕微鏡下で行った。０日目に計画した硝子体内注射は、同じ麻酔下で、新生血管形成の誘発後に行った。
【０３３７】
硝子体内注射は、経毛様体扁平部で側頭上部の領域に位置され、１０μｌのハミルトン上に装着された３０Ｇの針を使用して行った。次いで、充填シリンジをＵｌｔｒａＭｉｃｒｏＰｕｍｐ  ＩＩＩ中に装着して、マイクロリットルの範囲で正確な注射を達成した。
【０３３８】
体重
全ての動物の体重を、試験の開始前、次いで１週に１回記録した。誘発及び処置の前（ベースライン）、次いで７、１４及び２１日目に記録された動物の体重は、全てベースラインで正常範囲内であった：１８０，６±１２，３ｇ（平均±ＳＤ、ｎ＝４０）。２１日目に、試験品、ビヒクル及び未処置群の間で関連のある差異は観察されなかった。動物は、ビヒクル群及び未処置群についてそれぞれ、＋５６ｇ（＋３１％）及び＋５９ｇ（＋３４％）に対して、３００μｇ／ｍｌ及び３０００μｇ／ｍｌでのＸＧ−１０２についてはそれぞれ、＋５３ｇ（＋２９％）及び＋６２ｇ（＋３４％）体重が増加した。
【０３３９】
Ｋｅｎａｃｏｒｔ（登録商標）ｒｅｔａｒｄで処置した動物は、ベースラインと誘発後２１日目との間で＋２１ｇ（＋１２％）体重が増加した。
【０３４０】
フルオレセイン血管造影法
フルオレセイン血管造影法は、ＨＲＡを使用して１４及び２１日目に行った。キシラジン／ケタミン混合物の筋肉内注射による麻酔及び瞳孔の拡張後、２５０μｌ／１００ｇ（体重）の１０％フルオレセインナトリウムを、２６Ｇのインスリンシリンジを使用して皮下注射し、フルオレセインの写真を、色素注射１０分後に記録した。
【０３４１】
本研究は、４０匹のＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットで行った。アルゴンレーザーを使用して、右眼でＣｈＮＶを誘発した。ＣｈＮＶの発症は、フルオレセイン血管造影法（ＦＡ）で評価した。処置（試験、参照及び対照品）を、誘発後０及び７日目に硝子体内投与によって行った。血管造影法は、誘発後１４及び２１日目で、フルオレセイン（トレーサー）注射１０分後に行った。等級付けは、各々の病変におけるフルオレセインの最高強度に基づき、漏出面積の大きさによっては決定しなかった。
【０３４２】
結果は、１時点あたりの群平均スコアとして、各々の処置についての所定の強度スコア、及び両方の時点の各々での、スポットの数の頻度によって表した。マン・ホイットニー検定を使用して、処置群と対照群との間のＦＡスコアに統計学的に有意な差異があったか否かを決定した。統計学的有意差は、マン・ホイットニーＵ検定でｐ＜０．０５が得られた場合とした。
【０３４３】
図３９Ａは、フルオレセイン漏出の強度（平均スコア±ＳＤ）を示し、図３９Ｂは、両方の時点での試験品で処置した眼の漏出スポットの割合を図示する。図３９Ｃ及び図３９Ｄは、それぞれ、漏出スポット（スコア＞０）のパーセンテージ、及び最大漏出スポット（スコアが３）を図示する。
【０３４４】
フルオレセイン血管造影法による評価
血管造影図でのフルオレセインの漏出は、マスクした方式で２人の試験者が評価し、以下のように等級付けした：スコア０、漏出無し；スコア１、わずかに染色；スコア２、中度に染色；スコア３、強力に染色。もし、特定の病変に割り当てられた２つのスコアが一致しなければ、分析には高い方のスコアを使用した。
【０３４５】
フラットマウント標本のＣｈＮＶのイソレクチンＢ４での評価（任意選択で数値化）
２３日目に、Ｄｏｌｅｔｈａｌ（登録商標）のｉ．ｐ．注射による安楽死の後、処置した右眼を取り出して、４％パラホルムアルデヒド溶液で室温で１時間固定した。洗浄後、網膜、脈絡膜及び強膜を解剖した。網膜を注意深くはがした。強膜−脈絡膜をフラットマウントし、ＦＩＴＣ−イソレクチンＢ４ｉ抗体でブロッキングした後にインキュベートした。
【０３４６】
統計学的分析
群の平均値及び標準偏差を、全てのパラメータについて算出した。種々の濃度の試験品とビヒクルとの間の差異の統計学的有意性を評価するため、マン・ホイットニーＵ検定を使用した。
【０３４７】
結果
（１）参照化合物ケナコルト（Ｋｅｎａｃｏｒｔ）対ビヒクル及び未処置群
以下の表は、１４及び２１日目の１０分のＦＡの結果をまとめる（１群あたりｎ＝８匹の動物、右眼）
【０３４８】
【表６】
2020073573.tif 000010
【０３４９】
１４日目に、スポットの９０％は、未処置の右眼で漏出しており、ＣｈＮＶの形成が示された。平均スコアは２．１±１．０（ｎ＝４８）であった。２１日目に、未処置の動物は、９６％の漏出スポット及び平均スコア２．１±０．９（ｎ＝４８）を示し、ＣｈＮＶの持続が示された。
【０３５０】
１４日目に、１００％のスポットが、ビヒクル処置した眼で漏出し、平均スコアは２．９±０．５（ｎ＝４８）であり、ＣｈＮＶの形成及び重症度が示された。２１日目までに、漏出スポットの頻度に関連の変化はなく、漏出しているスポットは９４％で、平均スコアは２．２±１．０（ｎ＝４８）であり、ＣｈＮＶの継続が示された。
【０３５１】
ＦＡのスコア付けによって、０及び７日目の２つの硝子体内投与後のＫｅｎａｃｏｒｔ（登録商標）ｒｅｔａｒｄは、０．１±０．３（ｎ＝４６）対ビヒクル群について２．９±０．５という平均スコアによって示されるように、１４日目でビヒクルと比較して、フルオレセイン漏出を９７％有意に低下した（ｐ＜０．００１、マン・ホイットニー−Ｕ検定）。
【０３５２】
漏出スポットの頻度は、Ｋｅｎａｃｏｒｔ（登録商標）ｒｅｔａｒｄ群で低下し、１４日目で１００％の漏出スポットを示したビヒクル処置した動物に比較して、１３％の漏出スポットであった
【０３５３】
２１日目までに、Ｋｅｎａｃｏｒｔ（登録商標）ｒｅｔａｒｄで２回処置した動物は、それぞれ、０．３±０．５（ｎ＝４５）対２．２±１．０という平均スコアによって示されるように、ビヒクル−処置した動物と比較して血管漏出の８６％の関連の低下を示した（ｐ＜０．００１、マン・ホイットニー検定）。
【０３５４】
２１日目でビヒクル群と比較した漏出スポットの割合は、ビヒクルについての９４％に対して、Ｋｅｎａｃｏｒｔ（登録商標）ｒｅｔａｒｄの漏出スポットの３１％によって示されるように不変であった。
【０３５５】
（２）ＸＧ−１０２処置群対ビヒクル群
以下の表は、１４及び２１日目の１０分のＦＡの結果をまとめる（１群あたりｎ＝８匹の動物、右眼）。
【０３５６】
【表７】
2020073573.tif 000011
【０３５７】
結果のまとめを図３９に示す。
【０３５８】
動物の一般行動は、ＸＧ−１０２の硝子体内投与後、両方の用量とも変化しなかった。臨床の追跡期間の間、関連の合併症は見出されなかった。動物の体重は、試験期間の間、増大した：ビヒクル群及び未処置の群についてそれぞれ、＋５６ｇ（＋３１％）及び＋５９ｇ（＋３４％）に対して、３００μｇ／ｍｌ及び３０００μｇ／ｍｌのＸＧ−１０２についてそれぞれ、＋５３ｇ（＋２９％）及び＋６２ｇ（＋３４％）。Ｋｅｎａｃｏｒｔ（登録商標）で処置した動物は、２１ｇ（＋１２％）の体重増加を示した。
【０３５９】
ビヒクル群では、誘発された眼は、レーザー損傷の１４及び２１日後に一貫したフルオレセイン漏出を示した。平均のフルオレセイン漏出は、１４日目に２．９±０．５（ｎ＝４８インパクト）であって、漏出スポットが１００％で、ＣｈＮＶの形成及び重症度を示した。２１日目に、ＣｈＮＶの形成は、９４％の漏出スポット及び２．２±１．０（ｎ＝４８インパクト）という平均フルオレセイン漏出と一致したままであった。
【０３６０】
０及び７日目のＫｅｎａｃｏｒｔ（登録商標）の２回の硝子体内投与（２００μｇ／投与）は、誘発後１４及び２１日目でのＣｈＮＶ形成の頻度を阻害し、平均スコアは、１４及び２１日目に、それぞれ、ビヒクルについての２．９±０．５及び２．２±１．０に対して、Ｋｅｎａｃｏｒｔ（登録商標）ｒｅｔａｒｄについて、０．１±０．３（ｐ＜０．００１）及び０．３±０．５（ｐ＜０．００１）であった。１４日目に、病変の１３％が、参照−処置群で漏出を示したが、１００％が、ビヒクル群で漏出を示した。２１日目までに、漏出スポットの頻度は、ビヒクル（９４％）と比較して、Ｋｅｎａｃｏｒｔ（登録商標）ｒｅｔａｒｄでは低下したままであった（３１％）。
【０３６１】
ＸＧ−１０２を、３００μｇ／ｍＬ及び３０００μｇ／ｍＬで用いて処置した動物は、１４日目の血管漏出を、ビヒクルと比較して、ＸＧ−１０２の低用量について２．４±０．９という平均スコアで１７％（ｐ＜０．０５）、及びＸＧ−１０２の高用量について１．７±０．７という平均スコアで４１％（ｐ＜０．００１）、有意に低下することが示された。２１日目に、ＸＧ−１０２は、両方の用量とも、ビヒクルと比較して血管漏出の関連した低下は示さなかった。
【０３６２】
スコア３のスポットの割合の低下を、ビヒクル群について３とスコア付けされた９０％のスポットと比較して、低濃度及び高濃度のＸＧ−１０２についてそれぞれ６６％及び１２％のスコア３で示されるように、１４日目に３００μｇ／ｍｌ及び３０００μｇ／ｍｌのＸＧ−１０２群について記録した。
【０３６３】
ＣｈＮＶ測定の解剖学的及び機能的なメトリクスを使用し、かつ所定の実験条件下で、３００及び３０００μｇ／ｍｌで硝子体内投与されたＸＧ−１０２は、最終投与の７日後（試験の１４日目）血管漏出を阻害した。
【０３６４】
実施例１９
アドリアマイシン誘発性の腎症に対するＸＧ−１０２の効果
本実施例の目的は、炎症性腎臓疾患、腎症に対するＸＧ−１０２の効果を研究することであった。アドリアマイシン処置は、ヒト巣状分節状及び糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を模倣して、ラット及びマウスにおける糸球体疾患を誘発する。このモデルでは、部分的には重度のタンパク尿のために、疾患経過の間に、管状及び間質性炎症性病変が生じる。治療がなければ、腎疾患は、８週間内に末期腎不全に進行する。有足細胞損傷は、糸球体硬化症につながる順序の最初のステップの１つである。この研究の目的は、ＸＧ−１０２が、腎病変及び腎不全の発症を防ぎ得るか否かを検討することであった。
【０３６５】
ＸＧ−１０２（対照、０，９％のＮａＣｌ）を、ラットにｉ．ｖ．投与した。全部で５０匹のラットを処置し、これによって３つの群（１０匹のラットの）には、ＸＧ−１０２（低用量（２０μｇ／ｋｇ）、中用量（２００μｇ／ｋｇ）及び高用量（２０００μｇ／ｋｇ）を与えた。これらの３つの群の全て（及びプラシーボ群）を、０日目に１０ｍｇ／ｋｇのアドリアマイシンで処置した。１０匹の動物の第５の群には、アドリアマイシンを投与せず、ＮａＣｌ対照で処置した。組織学的調製物は、８、１４、２９及び４１日目に提供した。
【０３６６】
これらの組織学的調製物では、ＸＧ−１０２は、観察期間全体にまたがって、アドリアマイシン誘発性の腎症に対して有意にポジティブな影響を有することが明確に示された。腎臓学的組織は、細胞喪失から有意に救済される、図４２〜４５を参照のこと）。ＸＧ−１０２による処置なし、又はＸＧ−１０２による処置ありでのｃ−ｊｕｎ発現に対する効果を、それぞれ、図４６及び図４７に示す。
【０３６７】
さらなる試験では、４０匹の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を使用した（１０匹のラットの４つの群に分けた）。腎症は、０日目のアドリアマイシン１０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内注射によって誘発された。ＸＧ−１０２（配列番号１１；２ｍｇ／ｋｇ；０．９％ＮａＣｌ中）を、０日目に尾静脈に静脈内投与した。投与容積は、０．２ｍｌであった。
【０３６８】
下の表に、無作為な割り当てをまとめる。
【０３６９】
【表８】
2020073573.tif 000012
【０３７０】
各々の日に、全ての動物の一般行動及び外観を観察した。動物の健康度を、モニターした（瀕死の動物、体重の異常な重大な低下、物質の主な不耐性など）。取り除いたラットはいなかった。
【０３７１】
血液を、１群あたり４匹のラットから７、１４、２８、４２及び５６日目に尾静脈から収集した。血清クレアチニン濃度、血液尿素及び血中タンパク質を、Ａｄｖｉａ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６５０の適切なキット（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＡＧ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。１群あたり２匹のラットを、７、１４、２８、４２及び５６日に麻酔後に屠殺した。動物の屠殺後、両方の腎臓を収集した。組織病理学的検査のために、固定した組織標品を段階的アルコール溶液中で脱水し、トルエン中で浄化し、パラフィンに包埋した。切片（４μｍ）を、過ヨウ素酸（ＰＡＳ）で染色し、マッソン（Ｍａｓｓｏｎ）トリクローム染色を行って、コラーゲン沈着を検出した。糸球体及び尿細管間質性硬化症を、顕微鏡下で定量した。
【０３７２】
結果を、個別の形態で表し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）ソフトウェアを用いてデータの表にまとめた。数値の結果は、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。試験した動物が少数だったので、統計的な分析は行わなかった。
【０３７３】
疾患の進行中の腎機能に対するＸＧ−１０２の効果：
尿及びクレアチニン血清レベルを測定して、腎臓疾患の経過の間の腎機能を研究した。クレアチニンは、熱量測定の投与を邪魔するので、腎機能の繊細な指標である尿素のみを分析した。尿の血清レベルは未処置のラットでは顕著に安定であるが（５ｍｍｏｌ／ｌ未満）、ＡＤＲは尿素レベルの進行性の増大を誘発し、これは２８日目から４１日目の２５ｍｍｏｌ／ｌまで、次いで５６日目の４８ｍｍｏｌ／ｌまで急激に上昇し、これは末期腎不全を反映している（図３８Ｂ）。他方では、ＸＧ−１０２処置したラットは、疾患の経過を通して１０ｍｍｏｌ／ｌ未満の尿血清レベルを示した（図４８Ｂ）。他方では、ＸＧ−１０２処置したラットは、疾患の経過を通して１０ｍｍｏｌ／ｌ未満の尿素血清レベルを示した（図４８Ｂ）。ＸＧ−１０２単独で処置したラットの腎機能は、０．９％ＮａＣｌ処置したラットと同様であった。これらの結果によって、ＸＧ−１０２は、腎臓疾患及び腎不全の進行を防ぐことが示唆される。
【０３７４】
組織病理学的知見（ＰＡＳ及びマッソントリクローム染色）：
ＡＤＲ誘発性の構造変化を、光学顕微鏡下で評価した。食塩水処理した対照のラットは、形態学的に正常な糸球体及び小管を示した。８日目に、光学顕微鏡の検査によって、ＡＤＲネフローゼ群における巣状分節状糸球体硬化及びタンパク性円柱を有するいくつかの領域が示された。対照的に、いくつかの小管は、ＸＧ−１０２処置したラットではタンパク質で充填され、糸球体は、メサンギウム細胞過多がないか又は離散している正常な構造を示したが、小管構造及び間質は、病理学的変化を示さなかった（図４９）。１４日目までに、ＡＤＲ処置したラットは、進行性の糸球体硬化症、ヒアリン沈着、管拡張及び円柱形成を示した。糸球体硬化症の程度は、この群では劇的に悪化して、２９及び４１日目までにほとんどの糸球体で、重症の尿細管萎縮及び間質性線維症に関連する、糸球体房とボーマン腔との間の明らかな接着を伴いびまん性になった。５６日目に、びまん性糸球体硬化が、全ての糸球体で観察された（図５０）。しかし、ＸＧ−１０２処置したラットは、８日目に相対的に正常な外観を有し、ＡＤＲ処置したラットと比較して５６日目に、少数の限局性かつ部分的な糸球体硬化症及び尿細管間質性線維症を発症した。全体として、これらの結果によって、ＸＧ−１０２が糸球体及び尿細管間質性の線維症の発症を防ぐことが強く示唆され、かつこの群における腎機能の保存を説明し得る。
【０３７５】
この研究の結果、ＸＧ−１０２が、ＡＤＲによって誘発される糸球体及び尿細管間質性損傷の進行を防ぐという証拠が得られる。更に、この分子は、腎機能を保存する。
【０３７６】
実施例２０
ピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮ）誘発性の腎症に対するＸＧ−１０２の効果
この研究の目的は、５６日の間にラットにおける慢性のピューロマイシンアミノヌクレオシド誘発性の腎症に対するＸＧ−１０２の効果を評価することであった。ピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮ）は、有足細胞の足突起の喪失及び融合を誘発する有足細胞毒素である。ＰＡＮ誘発性の腎症は、ヒト特発性腎炎症候群及び巣状分節状糸球体硬化症のよく記載されているモデルである（Ｐｉｐｐｉｎ  ＪＷ、２００８年）。ＰＡＮネフローゼを有するラットで見られる糸球体の形態学的変化は、ヒトの微小変化群（ＭＣＤ）及び巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の形態学的変化とよく似ている。ラットにおけるＰＡＮの腹腔内投与は、タンパク尿、低アルブミン血症及び高コレステロール血症（急性期）によって特徴付けられる腎炎症候群の迅速な発症を生じる。これは、ヒトＭＣＤの十分確立された動物モデルである。巣状分節状糸球体硬化症の病理学的病変は、反復性の腹腔内ＰＡＮ注射によって誘発される慢性ＰＡＮ腎炎で観察されている（Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｔ．、Ｋａｎｏｚａｗａ，Ｋ．、＆  Ｍｉｔａｒａｉ，Ｔ．（２０１０年）慢性のピューロマイシンアミノヌクレオシド腎炎を有するラットでの糸球体損傷に対するエダラボンの効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｄａｒａｖｏｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｎｅｐｈｒｏｓｉｓ）、Ｊ  Ｓａｉｔａｍａ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、３７（１））。損傷の機序に応じて、ＰＡＮは、反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成を介した直接的なＤＮＡ損傷及び組織障害、例としては、慢性期の糸球体硬化症及び間質性線維症を生じる（Ｈｅｗｉｔｓｏｎ  ＴＤ、２０１２年）。
【０３７７】
この実験では、９０例の雄性Ｗｉｓｔａｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用した（１５匹のラットの６つの群に分けた）。腎症を誘発するため、ピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮ）を、０日目に１３０ｍｇ／ｋｇ（５ｍｌ／ｋｇ）の用量で、及び１４日目に６０ｍｇ／ｋｇ（５ｍｌ／ｋｇ）の用量で腹腔内に投与した（Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｔ．、Ｋａｎｏｚａｗａ，Ｋ．、＆  Ｍｉｔａｒａｉ，Ｔ．（２０１０年）、慢性のピューロマイシンアミノヌクレオシド腎炎を有するラットでの糸球体損傷に対するエダラボンの効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆｅｄａｒａｖｏｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｎｅｐｈｒｏｓｉｓ、Ｊ  Ｓａｉｔａｍａ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、３７（１））。対照のラット（第１群）は、０日目及び１４日目に等量の食塩水（ｉ．ｐ．）を投与された。ＸＧ−１０２又はそのビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）を、０、７、１４、２１、２８、３５及び４２日目の全部で７回の注射のために、０日目の最初のＰＡＮ注射から開始して、週に１回（第１〜５群）、尾静脈（ｉ．ｖ．）に投与した。別の実験群（第６群）では、ＸＧ−１０２は、０日目のＰＡＮ注射の後２１、２８、３５及び４２日目の全部で４回の注射のために、２１日目から開始して、週に１回、尾静脈（ｉ．ｖ．）に投与した。
【０３７８】
ＸＧ−１０２投与のために、ＸＧ−１０２粉末を、試験する最高濃度でビヒクルの０．９％ＮａＣｌ中に溶解した。したがって、最高濃度は、最低濃度のためのストック溶液に相当した。各々のストック溶液を、ろ過（０．２μｍ）滅菌した。投与する最低濃度の溶液は、ｉ．ｖ．注射のための容積に応じて、食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に含まれるろ過したストック溶液を希釈することによって調製した。
【０３７９】
下の表に、実験群をまとめる：
【０３８０】
【表９】
2020073573.tif 000013
【０３８１】
試験設計は、図５１に示す。要するに、０日目及び１４日目に、ＰＡＮ又はそのビヒクル（食塩水）を、腎症の誘発のために注射した。０日目及び１４日目に、ＰＡＮを最初に投与し、続いてＸＧ−１０２を投与した。０〜４２日目に、ＸＧ−１０２又はそのビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）を、上記のように、ｉ．ｖ．経路によって週に１回投与した。
【０３８２】
動物は週に１回秤量した。全てのＰＡＮ処置した動物が、体重の低下を示した。しかし、全てのＰＡＮ処置した動物は、体重に関して均一であり、すなわち、ＰＡＮ／食塩水群（第２群）と比較して、体重に対して、ＸＧ−１０２の効果は観察されなかった。５６日目に、動物を屠殺して、試料（血液及び腎臓）を収集した。
【０３８３】
具体的には、血液及び腎臓のサンプリングのため、動物をペントバルビタール（６０ｍｇ／ｋｇ；Ｃｅｖａ  Ｓａｎｔｅ  Ａｎｉｍａｌｅ；Ｌｉｂｏｕｒｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）の注射によって麻酔した。血液試料は、腹部静脈から収集し、凝固用の管に移し（ＥＤＴＡ  ３Ｋ；３０分、４℃）、次いで血漿収集のために遠心分離した（１０分、３０００ｒｐｍ、４℃）。血漿を、バイオマーカーのアッセイ、例えば、クレアチニン及び尿素のアッセイのために使用するまで−２０℃で保管した。
【０３８４】
バイオマーカーの定量のために、血漿ＬＤＬレベルは、ＡＢＸ  Ｐｅｎｔｒａ  ４００臨床化学分析装置（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎａｌｙｚｅｒ）（株式会社堀場製作所）を使用して、Ｇｅｎｏｔｏｕｌの表現型プラットフォーム（Ｒａｎｇｕｅｉｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）によって定量した。
【０３８５】
腎臓を取り出し、全ての結合組織及び被膜を清浄し、電子天秤（Ｍｅｔｔｌｅｒ、Ｔｏｌｅｄｏ）で秤量した。腎臓の試料は、１０％ホルマリン溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）中で２４〜７２時間、具体的には４８時間固定し、次いでパラフィンに包埋した。１ブロックあたり３つの切片（３〜５μｍ）を作製した。スライドは、形態学的変化の組織学的評価、糸球体硬化症、及び間質性線維症の定量のために、それぞれヘマトキシリン／エオシン（ＨＥ）、ＰＡＳ−メセナミン銀及びシリウスレッドによって染色した。全てのスライドを、浜松ホトニクス株式会社（日本）のＮａｎｏｚｏｏｍｅｒ  ２．０  ＨＴを使用して×２０でデジタル化した。組織学的調整及び画像化は、Ｈｉｓｔａｌｉｍ（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）によって行った。血漿クレアチニン及び尿素は、ＡＢＸ  Ｐｅｎｔｒａ  ４００臨床化学分析装置（株式会社堀場製作所）を使用して、Ｇｅｎｏｔｏｕｌの表現型プラットフォーム（Ｒａｎｇｕｅｉｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）によって定量した。
【０３８６】
結果を、専門的な組織病理学者の評価に従って半定量的にスコアリングすることによって表現する。糸球体硬化症の組織学的検査のために糸球体変化を、本明細書に参照により組み込まれる、Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｔ．、Ｋａｎｏｚａｗａ，Ｋ．、＆  Ｍｉｔａｒａｉ，Ｔ（２０１０年）、慢性のピューロマイシンアミノヌクレオシド腎炎を有するラットでの糸球体損傷に対するエダラボンの効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｄａｒａｖｏｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｎｅｐｈｒｏｓｉｓ）、Ｊ  Ｓａｉｔａｍａ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、３７（１）に記載のような半定量的スコアリングシステムを使用して評価した。要するに、糸球体損傷の程度を、１動物あたり全部で５０の糸球体について１つの腎臓切片あたり、２５の糸球体（１動物あたり２つの切片）で評価した。個々の糸球体における損傷の程度は、糸球体の関与のパーセンテージに基づいて、０〜４のスケールを用いて等級付けした。
スコア０：正常、
スコア１：糸球体の最大２５％の病変、
スコア２：糸球体の２５〜５０％の病変、
スコア３：糸球体の５０〜７５％の病変、及び
スコア４：糸球体の７５〜１００％の病変
【０３８７】
全てのデータは、平均値±平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として算出した。統計学的分析は、ＣｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｌａｊｏｌｌａ，ＵＳＡ）を使用して行った。全ての群の比較は、体重の結果について、二元ＡＮＯＶＡを使用し、続いてボンフェローニ事後検定を使用した。第１群（食塩水／食塩水）と第２群（ＰＡＮ／食塩水）との間の比較は、対応のないスチューデントｔ検定を使用して行った。ビヒクル及びＸＧ−１０２の効果は、一元ＡＮＯＶＡを使用し、続いて、ニューマン−コイルス検定を使用して比較した。Ｐ＜０．０５の値を、統計学的有意差として許容した。第２群（ＰＡＮ／ビヒクル）と第６群（ＰＡＮ／ＸＧ−１０２が４ｍｇ／ｋｇ、４×のｉｖ）との間の比較を、対応のないスチューデントｔ検定を使用して行った。
【０３８８】
糸球体硬化症損傷の結果を図５２に示す。この研究の主な目的の１つは、ラットにおいて反復性のピューロマイシンアミノヌクレオシド注射によって誘発された巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）のよく確立されたモデルで糸球体硬化症損傷を評価することであった。この結果、ＸＧ−１０２の７回のｉｖ注射は、用量依存性の方式でＰＡＮ誘発性の糸球体硬化症を有意に低下することが示された。しかし、１ｍｇ／ｋｇの用量は、この病理学的特徴に影響を有さなかった。２１日目から開始する、４ｍｇ／ｋｇの用量でのＸＧ−１０２の４回のｉｖ注射は、ＰＡＮによって誘発される糸球体硬化症の低下においてＸＧ−１０２の強力な効果を生じた（図５２）。
【０３８９】
糸球体損傷の結果を、図５３に示す。この研究の主な目的の１つは、ラットにおいて反復性のＰＡＮ注射によって誘発された糸球体損傷に対するＸＧ−１０２の効果を評価することであった。この結果、ＸＧ−１０２は、（ｉ）２ｍｇ／ｋｇ及び４ｍｇ／ｋｇの用量での７回のｉｖ注射が、病変の重症度（糸球体損傷スコア）に関してＰＡＮ誘発性の糸球体硬化症を有意に低減するが、また糸球体障害頻度（損傷された糸球体のパーセンテージ）も有意に低減するという点で、予防効果を有し、並びに（ｉｉ）ＸＧ−１０２が、ＰＡＮ投与後２１日目に開始して、４ｍｇ／ｋｇの用量でＸＧ−１０２の４回のｉｖ注射が、病変の重症度（糸球体損傷スコア）及び糸球体障害頻度（損傷された糸球体のパーセンテージ）の両方に関して、糸球体硬化症に対する強力な効果をもたらすという点で、治療効果を有することが示された。まとめると、ＸＧ−１０２は、糸球体硬化症損傷に対して用量応答効果、すなわち、病変の重症度及び糸球体障害頻度に対して予防的及び治療的な効果を示した。
【０３９０】
バイオマーカーの分析に関して、血清ＬＤＬは、このモデルにおけるＦＳＧＳ及び酸化的ストレスの進行の良好なマーカーである。ＬＤＬの血清レベルは、増大し、ＰＡＮ注射後２１日目〜２８日目の間でピークになり、慢性期には高いまま残る（Ｎａｋａｊｉｍａら、２０１０年を参照のこと）。したがって、本研究では、ＰＡＮ処置した動物は、食塩水処置した動物（第１群）と比較してＬＤＬ血漿レベルの有意な増大を示した。ＸＧ−１０２処置した動物では、血漿ＬＤＬの低下が、特に４ｍｇ／ｋｇの群（第５群及び第６群）で観察されたが、それは有意ではなかった。したがって、ＸＧ−１０２は、血清ＬＤＬの低下、及び主な脂質過酸化生成物（４−ＨＮＥ：４−ヒドロキシ−２−ノネナール）の低下によって示されるように、酸化的ストレスを低下する傾向がある。更に、抗ＣＤ６８でバイオマーカーＥＤ−１（ラットＣＤ−６８）に関して得られた結果では、ＸＧ−１０２がまた浸潤性マクロファージを減少する傾向もあることが示された。
【０３９１】
実施例２１
糖尿病性腎症のラットモデルにおけるＸＧ−１０２の長期投与の効果
この研究の目的は、糖尿病性腎症のラットモデルにおいて、ＪＮＫ阻害剤ペプチドであるＸＧ−１０２の長期投与（１、２、４ｍｇ／ｋｇ、９週間、毎週静脈内投与）の効果を評価することであった。ロサルタンを陽性対照として使用した。
【０３９２】
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｍａｒｇａｔｅ、Ｋｅｎｔ）の７４匹の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜２５０ｇ；４匹の予備の動物を含む）を使用した。ラットを対にしてポリプロピレンのケージで飼育し、高脂質の食餌（Ｄ１２４９２、ｋｃａｌの６０％が脂肪由来）及び水道水には常に自由にアクセスさせた。この食餌は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡから購入した。全ての動物は、２１±４℃及び５５±２０％の湿度で、正常光で維持した（点灯：０７：００〜１９：００）。
【０３９３】
試験のスケジュールは、図５４に示す。動物は、この試験全体を通じて対で飼育した。３週間の期間、この間、動物は毎週秤量した（食物及び水は、第３週の間だけ２回秤量する（すなわち、月曜日及び木曜日に、ＳＴＺ投与の前の週）。馴化の３週の間、血液試料を、手持ち型グルコースメーター（Ｏｎｅ  Ｔｏｕｃｈ  Ｕｌｔｒａ  ２）を使用して自由給餌状態で尾静脈側方から採取した。血液サンプリングは、ほぼ０９：００に開始した。
【０３９４】
試験の大きさのために、動物は、２つの別のコホートとして７２時間の位相をずらして行った（対にした飼育のためにできるだけ、各々がｎ＝４又は６）（図５４を参照のこと）。約４０匹の動物をコホートＡに割り当て、残りの３０匹をコホートＢに割り当て、体重、血漿グルコース並びに食物及び水の取り込みに関してできるだけバランスをとった。糖尿病の誘発のために、ストレプトゾシン（ＳＴＺ）を使用した。ＳＴＺを投与された動物の糖尿病表現型は、ＳＴＺのバッチに大きく依存するので、パイロット試験を行って、最適のＳＴＺ用量を確認した（３５又は４５ｍｇ／ｋｇでｉｐ）。ＳＴＺ又はビヒクルを、図５４に詳述するように、約３週間その食餌で動物を維持した後に、与えた。予備の動物にはＳＴＺを投与する（１コホートあたり１対）。
【０３９５】
【表１０】
2020073573.tif 000014
【０３９６】
各々の対の動物に、同じ処置を施した（すなわち、両方ビヒクル処置又は両方ＳＴＺ処置する）。ＳＴＺ投与後７日間、動物を毎日秤量し、食物及び水の取り込みは毎週２回決定した。残りの試験期間については、毎週２回動物を秤量し、水及び食物の取り込みを評価した（常に静脈内投与の日、かつ通常は水の補給日に）。引き続き、ＳＴＺ後の体重及び利用可能な食物及び水の取り込みに基づいて、動物を、投与レジメンにおける差異に照らして、下に詳細にあるとおりＢ〜Ｆ群に割り当てた。
【０３９７】
【表１１】
2020073573.tif 000015
【０３９８】
ＳＴＺ（又はビヒクル）処置の１週後、血液試料を、自由に給餌する状態でグルコメーター（Ｏｎｅ  Ｔｏｕｃｈ  Ｕｌｔｒａ２）を使用して尾静脈側方から採取した（血液試料はほぼ０９：００に採取を開始）。引き続き、Ａ〜Ｅ群の動物には、静脈経路からビヒクルを投与し、Ｆ〜Ｇ群の動物には、経口経路で１％のメチルセルロースを投与した。Ｆ〜Ｇ群の動物は、毎日ほぼ０９：００に開始して毎日１回投与を継続した。動物を投与前に秤量した（この重量は記録した）。食物と水とは、静脈内群（Ａ〜Ｅ）と同じ日にだけ記録した。
【０３９９】
このベースラインの期間は１週間続いた。週の終わりに向けて、動物を血糖、並びに利用可能な体重及び食物及び水の取り込みデータに基づいて薬物処置に割り当てた。割り当ては下の表に詳細であるとおりであった。
【０４００】
【表１２】
2020073573.tif 000016
【０４０１】
投与は期間中９週間であった（全部で９回の投与、図５４を参照のこと）。Ｆ群及びＧ群の動物を秤量して、ほぼ０９：００時に毎日投与した。Ａ〜Ｅ群の動物は、静脈内経路で毎週１回投与した（詳細は図５４のとおり）。全群で、食物及び水の取り込みは、毎週２回決定した（ｉｖ投与の日、及び水補給日に。血糖は、毎月決定した。試料をグルコメーター（Ｏｎｅ  Ｔｏｕｃｈ  Ｕｌｔｒａ２）によって、前の詳述どおり収集した。血液試料は、自由給餌状態で採取した（ほぼ０９：００に開始）。動物には指定時刻のスケジュールまでそれぞれの経路によって直後に投与した。投与に続いて、各々の動物を、代謝ケージに入れて、２４時間の期間、食物及び水に自由にアクセスさせた。蒸発を減らすために、ガラスの尿収集器は、氷を満たしたポリスチレン容器（Ｓｃａ−ｏｎｌｉｎｅ、ＵＫ）に入れた。ＳＴＺによる毎日の尿容積の予想の上昇のために、尿は、間隔（例えば、８時間ごと）に収集し（かつ凍結保管し）て、各々の代謝ケージの２４時間の総尿容積を確実に記録できるようにした。各々の時点のアリコートをプールし、それによって１動物あたりの１回、２４時間、試料を収集する。プールした２４時間の尿のうち３００μｌのアリコートを採取し、−８０℃で凍結した。クレアチニン、糖、尿素、総タンパク質及び電解質（Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ及びＣａ）を、ＣＯＢＡＳ  Ｃ１１１及び関連の試薬を使用して尿試料で決定した（全ての尿の分析に関してｎ＝２）。尿収集の期間について、ラットはケージに入れた時点、及び取り出した時点に秤量した。消費した食物及び飲んだ水も算出した。血糖及び尿のパラメータ（クレアチニン、糖、尿素、総タンパク質及び電解質）を、前に記載のように投与のその後の月の後に再度決定した（図５４を参照のこと）。
【０４０２】
処置の週８の間（図５４を参照のこと）、動物の糸球体ろ過率（ＧＦＲ）を、ＦＩＴＣ−インスリン法を使用して評価した。これは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｒｉｄｈ，Ｓ．、Ｓａｌｌｓｔｒｏｍ，Ｊら、（２００９年）：「Ｃ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｓ  Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｒａｔｅ  ｉｎ  Ｈｙｐｅｒｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｃｏｎｓｃｉｏｕｓ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｒａｔｓ」Ｏｘｙｇｅｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｔｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ＸＸＸ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ、６４５：２１９−２５頁（これは）の方法に基づいて行った。具体的には、ＦＩＴＣ−インスリン（１．５％）を食塩水に溶解し、０．４５μｍのシリンジフィルターを通してろ過した。残留の遊離ＦＩＴＣを除去するために、溶液を２０００ｍｌの食塩水中で４℃で一晩、１０００Ｄａのカットオフの透析膜（Ｆｉｓｈｅｒ  ＵＫのＳｐｅｃｔｒａ  Ｐｏｒ  ６）を使用して透析し、光から保護した。透析したインスリンは使用前に０．２２μｍのシリンジフィルターを通してろ過した。各々の動物に１ｍｌ（１５ｍｇ）のＦＩＴＣ−インスリンを、尾静脈を介して（すなわち、静脈内に）投与した。投与の２、５、９、１５、２４、３５、５５、８０分後、血液試料（８０μｌ）をリチウム−ヘパリン収集管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ  ＣＢ３００ＬＨ）に採取した。各々の血液試料は、冷却した遠心分離器で遠心分離を行い、血漿試料は、後で４９６ｎｍの励起及び５２０ｎｍの発光での蛍光を決定するために清浄なアリコートのバイアルに分注した。
【０４０３】
終わりに、動物及び食品及び水を秤量した。次いで、動物を殺傷して、終末血液試料（ＥＤＴＡコーティング管中で約４．５ｍＬ）を、心臓穿刺によって採取した）。血液試料を、冷却遠心分離でスピンし、アリコート（０．５ｍＬの５アリコート）を凍結保存した（−８０℃）。剖検では、左右の腎臓を取り出し、秤量した。各々の腎臓を矢状に２等分し、１０％の中性の緩衝化ホルマリンのポットに入れて、約５日間固定した。次いで、腎臓をワックス包埋して、各々の腎臓の二分の一を、各々のカセットに入れて引き続く処理のための１つのワックスブロックを得た（すなわち、右の腎臓の２分の１と、左腎臓の２分の１とを含む１つのブロック）。残りの腎臓半分は廃棄した。ワックスブロックのために、全ての組織は、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ  ＶＩＰプロセッサーを使用して調製した（脱水のために段階的アルコール及び除去剤としてキシレンを使用した）。次いでブロックを、パラフィン組織−ワックスで含浸させた後に、新鮮な組織−ワックスに包埋した。腎臓組織を、約４〜５μｍで切片にし、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）及び過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）の方法を使用して染色した。引き続き、スライドを、病理学者によるアセスメントのために（例えば、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．、ＵＫに）送る。病理学者は、「＋、＋、＋＋＋」システム（又は同様のもの）を使用して、糸球体硬化症，尿細管委縮及び間質性の拡張について、Ｈ＆Ｅ及びＰＡＳによって染色した全てのスライドを半定量的に評価した。
【０４０４】
ＸＧ−１０２は、市販の滅菌食塩水中で１ｍｌ／ｋｇの容積で投与した。この目的のために、ＸＧ−１０２を、滅菌食塩水の添加によって最初の投与のまえに処方し、それによって最高用量を処方し（４ｍｇ／ｍｌ）、低い用量はこの４ｍｇ／ｍｌのストックの希釈によって調製した。次いで、アリコートを各々の投与期間のために調製し、使用まで凍結保存した（−８０℃、−８０℃で３か月安定性）。投与の朝に、各々のアリコートを、冷蔵庫から取り出し、投与前に（例えば、３０分）室温で解凍させた。溶けた溶液を、投与前に反転して混合した。全ての投与は、解凍後できるだけ早く、ただし全ての場合に８時間内に完了した。なぜなら試験品は、食塩水中で、室温で、１０μｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で８時間安定であるからである。無菌ポリプロピレンプラスチック（ピペット先端部を含む）を使用した。ストック溶液は、使用前に、かつ希釈前に低用量までろ過滅菌する（０．２μｍ）。ロサルタンカリウムは、化学の供給業者（例えば、Ｔｏｃｒｉｓ  ＵＫ）から購入し、毎朝、投与のために、１％メチルセルロースのビヒクル中で、５ｍｌ／ｋｇの容積で調製した。投与倍数は、必要に応じて適用した。
【０４０５】
研究の終わりに、体重並びに食物の重量及び水のボトルを分析した。結果を体重、最初の４週間は１週あたり、及びその後は４週あたり、並びに薬物投与期間全体にわたる体重の変化として、対照群に比較した試験及び薬物処置の終わりの時点での体重の低下％、食物及び水の取り込み、累積食物取り込み、並びに最初の４週間について１週あたり及びその後４週あたり、及び給餌試験の期間にわたる平均の食物及び水の取り込みとして表した。体重及び食物、累積の食物及び水の取り込みに対する異なる処置の効果は、因子として処置及びコホートとの共分散、並びに共分散としてベースライン（１日目の体重又は−６〜０日目の平均の食物又は水の消費）の二元分析によって、続いて、適切なＳＴＺビヒクル群に対して各群を比較するための適切な多重比較検定（両側）によって分析した。血糖は、因子として処置及びコホートを用いる一般線形モデル、並びに共分散としてベースライン体重、出血程度及び試験前血漿レベルによって分析した。適切な変換及び／又はロバスト回帰技術を使用して、異常値の影響を減らした。適切な多重比較検定（両側）を使用して、各々の群を適切なＳＴＺビヒクル群に対して比較した。尿クレアチニン、糖、尿素、総タンパク質及び電解質を、処置群平均±ＳＥＭとして表した。分析は、因子として処置及びコホートを用いる一般線形モデルによった。適切な変換及び／又はロバスト回帰技術を使用して、異常値の影響を減らした。適切な多重比較検定（両側）を使用して、各々の群を適切なＳＴＺビヒクル群に対して比較した。腎臓重量は、因子として処置及びコホート、並びに共分散として１日目の体重を用いて一般線形モデルによって分析した。効果を決定するために、体重の変化によって生じた効果に加えて分析は、因子として処置及びコホート、並びに共分散として最終の体重を用いて一般線形モデルによって行った。対数変換及び／又はロバスト回帰技術を必要に応じて使用した。適切な多重比較技術を使用して、各々の群を適切なＳＴＺビヒクル群に対して比較した。病理学的アセスメントのために、各々の処置を、正確なウィルコクソン順位和検定によって適切なＳＴＺビヒクル群と比較した。
【０４０６】
ＧＦＲは、ＦＩＴＣインスリンの用量／ＡＵＣ０−∞として算出した。ＡＵＣ（ＦＩＴＣインスリン濃度）は、０分への２〜５分のラインの外挿及び２４〜８０分の終末期の間、対数変換データの線形回帰を用いる対数線形台形公式（Ｓｔｒｉｄｈ）によって算出した。算出したＧＦＲ値は、因子として処置及びコホートを用いる分散の二元分析によって分析した。対数変換及び／又はロバスト回帰技術を必要に応じて使用した。
【０４０７】
ＧＦＲを除いて全ての分析で、ｉｖ投与された動物は、ｐｏで投与された動物とは別に分析された。なぜならベースラインの週の間、異なる経路での投与は、共分散として使用されるベースライン値に影響し得るからである。非ＳＴＺ群は、上記の全ての分析から排除した。別の分析は、分析中の全ての群を含む、非ＳＴＺ群との比較のために、ただし、投与前の週の間のものではなく、ＳＴＺでの処置の前にベースラインの共変量を使用して行った。全ての分析では、０．０５未満のｐ値が統計学的に有意とみなされる。
【０４０８】
ラットの体重に対する糖尿病性腎症のこのラットモデルにおけるＸＧ−１０２の長期投与の効果を図５５に示す。非ＳＴＺ処置したラットのみが体重の増大を示した。ＸＧ−１０２で処置したラットは、ＳＴＺモデルにおいてビヒクル処置したラットと比較して体重の差異は示さなかった。しかし、陽性の参照であるロサルタンで処置したラットの体重は、有意に低かった。これらの結果、ＸＧ−１０２は十分耐容されるが、陽性の参照であるロサルタンは、体重の有意な低下を生じたことが示される。
【０４０９】
実施例２２
膵島分離／移植におけるＸＧ−１０２に対する用量応答の評価
この研究は、膵島分離に対する以前の研究（実施例１７を参照のこと）に、及びＮｏｇｕｃｈｉらによる刊行物（Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ｈ．、Ｓ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、（２００９年）、「Ｄｕｃｔａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＪＮＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｂｅｆｏｒｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｉｓｌｅｔ  ａｐｏｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｉｓｌｅｔ  ｇｒａｆｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０（１）：７３−８５頁）に基づく。これらの研究は、膵島が、膵島分離手順の開始後に２０分程度の早期で開始するＪＮＫの劇的な活性化を受けるブタ膵島分離モデルで示された。この活性化は、既に脆弱な組織に対する温虚血、酵素消化及び機械的ストレスを組み合わせる方法の結果である。実施例１７の試験によって、調達の時点でブタ膵臓へフラッシュした保存溶液へのＸＧ−１０２（１０μＭ）の静脈内添加が、酸素消費速度（ＯＣＲ）及びＡＴＰ濃度によって評価される膵島細胞の生存度及び機能性に有意な影響を有し、かつＪＮＫ活性化及びｃ−ｆｏｓ遺伝子発現の減少と相関することが示された。Ｎｏｇｕｃｈｉらは、異なる阻害剤を使用し、その阻害剤を同じモル濃度で、調達の直後に膵管に添加した。ブタ及びヒトの膵臓を用いた。それらによって、ＡＴＰ濃度によって評価される膵島生存度に対する同様の効果が示されたが、糖尿病マウスの腎臓被膜の下の移植後に、糖尿病の逆転に対するｉｎ  ｖｉｖｏの影響も示された。実験の本発明の設定の目的は、膵島分離においてそれを利用するための、ＸＧ−１０２の用量応答曲線及び最適濃度を決定することであった。この問題に答えるために、げっ歯類モデルを利用した。ヒトとげっ歯類の膵臓及び膵島との間の差異は、知られているが、このモデルは、その単純さ及び高いコスト効率のおかげで選択された。これらの実験の目的は、単に必要なＸＧ−１０２の最適濃度の決定であって、ラットモデルは妥当とみられる。主な目的は、臨床的な同種異系の膵島移植転帰の改善のためのヒト膵臓におけるＪＮＫ阻害であるので、これらの実験では阻害剤の導管内の注射を行った。これは、化合物が臨床設定で使用される最も見込みのある方法で効果を有する。
【０４１０】
分離後のラット膵島におけるＪＮＫ活性化を評価するために、ランゲルハンスの膵島を、コラゲナーゼを使用して古典的な酵素法によってＬｅｗｉｓラットから分離した。分離は、動物の屠殺直後、又は温虚血の１５分の期間の後のいずれかに行った。ＪＮＫ活性化は、分離プロセスの終わりにウエスタンブロッティングによって評価した。ＪＮＫ活性化は、陰性対照として未処置のラット膵臓で評価した。実験は、虚血の各々の条件について３匹のラット、プラス陰性対照について１匹で行い、３回繰り返した。これは、全部で２１匹のＬｅｗｉｓラットに相当する。図５６に示される結果によって、ＸＧ−１０２は、１５分の虚血によって誘発されたＪＮＫ（図５６Ａ）及びＰＡＦ２（図５６Ｂ）リン酸化を用量依存性に低下したことが示される。
【０４１１】
膵島の生存度に対するＸＧ−１０２の効果を研究するため、虚血の期間（温虚血なし対１５分の温虚血）に関する最高のモデル、すなわち、ＪＮＫ阻害後の差異を示す可能性が最も高いモデルを、前の実験の結果に基づいて選択した。分離は、ある設定濃度又はビヒクルでＸＧ−１０２を使用して行い、コラゲナーゼ溶液中で希釈し、膵臓の酵素消化のまえに膵臓管に注射した。同じモル濃度のＸＧ−１０２又はビヒクルを、分離手順全体を通じて、利用された種々の洗浄又は精製溶液中で、及び培養培地中で使用した。分離された膵島を、ＲＰＭＩベースの培養培地中で一晩培養した。各セットの実験について、以下のＸＧ−１０２濃度を利用した：１μＭ、３μＭ、１０μＭ、５０μＭ及び１００μＭ。３匹の動物を、各々の濃度について各々の群で利用して、実験は、結果次第で２〜３回繰り返した。これは、全部で６０〜９０匹のＬｅｗｉｓラットに相当する。膵島の収率を決定した。膵島生存度の以下のアセスメントを行った：ＪＮＫ活性化、ＯＣＲ、ＡＴＰ濃度、カスパーゼ放出など。
【０４１２】
膵島機能に対するＸＧ−１０２の効果を研究するために、ｉｎ  ｖｉｖｏの補充的分離を行って、ｉｎ  ｖｉｖｏの膵島機能に対するＪＮＫ阻害の効果を評価した。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験は、上記で詳述したｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験で最も有効なＸＧ−１０２モル濃度、又はビヒクルを使用して、分離した膵島でのみ行った。膵島分離は上記のとおり行った。各々の分離のために、１０００及び２０００のＩＥＱを、ストレプトゾシン誘発性の糖尿病性免疫不全マウスの腎臓被膜下に移植した。糖尿病を逆転する動物の割合、及び糖尿病の逆転に必要な時間を、ＸＧ−１０２処置した膵島又は対照の膵島を移植した動物の間で比較した。移植は、３回繰り返した。必要な動物数は、約３０匹のＬｅｗｉｓラットと、２４匹のＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスである。
【０４１３】
図５７に示されるとおり、ラット膵島の機能及び生存度に対するＸＧ−１０２の効果を研究するため、１５分虚血のラットから、及び虚血していないラットから膵島を分離した。統計的インスリン分泌試験（基礎又はグルコースを使用して刺激）を、膵島分離の直後、及び３７℃での培養１８時間後に行った。分離は膵島機能に影響することが観察され得る。実際、基礎のインスリン分泌は、どんな条件でも１８時間インキュベートした膵島と比較して分離直後に用いた膵島ではより高かった。これらの高い基礎レベルは、膵島の疲労を反映する。しかし、培養後、虚血及び阻害剤ＸＧ−１０２は、この実験では膵島機能に影響がなかった。
【０４１４】
前の実験では、１５分虚血のラットの膵島は、グルコースに応答して対照のラット由来の膵島と同じ量のインスリンを分泌したことが示されたので、新しい実験を行って、ここでは虚血は、３０分まで押し、ＪＮＫ阻害剤ＸＧ−１０２を１００マイクロＭで使用した（図５８）。この実験では、インスリン分泌試験を分離の直後に行った場合、高い基本分泌がやはり観察される。更に、３０分の虚血は、膵島機能に負の影響を有した。これらの予備的な結果によって、３０分の虚血は、ＪＮＫ活性化を誘発するのに１５分の虚血よりもよいモデルであるとみなされることが示唆される。虚血ラット由来の膵島を分離し、ＸＧ−１０２とともにインキュベートした場合、グルコース誘発性のインスリン分泌は、虚血性ラットと比較してより高く（図５８）、このことは、膵島機能に対するＸＧ−１０２の正の効果を示唆している。
【０４１５】
実施例２３
結膜下注射後のラットのレーザー誘発性脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）モデルにおけるＸＧ−１０２（配列番号１１）の有効性
この研究の目的は、ＪＮＫ阻害剤であるＸＧ−１０２の有効性を、レーザー誘発性の脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）のモデルで、ラットに対して結膜下注射によって投与した場合決定することであった。実施例１８の文脈で概説されるとおり、このモデルによって、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の処置のための化合物の可能性のある使用についての予測が可能になる。実施例１８に記載の研究とは対照的に、投与の結膜下経路は、ヒトにおける投与のための別の好ましい経路であるので、この経路を、本試験のために選択した。
【０４１６】
以下の実験群を割り当てた：
【０４１７】
【表１３】
2020073573.tif 000017
【０４１８】
ビヒクル対照である０．９％ＮａＣｌを受け取ったまま投与した。トリアムシノロンアセトニド４％は、「参照品２」として使用し、これも受け取ったまま投与した。ＸＧ−１０２調製に関しては、最高の用量レベルに等しいストック溶液を、ビヒクル、０．９％の注射用塩化ナトリウム中に調製し、０．２２μｍのポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）フィルターを通して滅菌ろ過した。低い方の用量レベルは、ストック溶液を直接希釈することによって調製した。投与処方物は、投与量のレベルの要件を満たすために一旦、適切な濃度で調製した。全ての希釈物は、ストック溶液をビヒクルで直接希釈することによって調製した。アリコートの２回の投与（１及び８日目）を調製し、−２０℃を維持するように設定した冷蔵庫に保管した。各々の用量レベルのアリコート（複数可）を、投与の各日に周囲温度で解凍し、溶液は室温で６時間以下維持した。
【０４１９】
４４匹の雄性Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ；１０週齢）を使用した。１４日という最小の馴化期間をおいて、動物の受け入れと処置の開始との間で、動物を実験環境に慣れさせた。動物を、同様の群の平均体重が得られるように設計した層別化無作為スキームによって群に割り当てた。健康度が劣るか、又は体重幅が極端な動物は、群に割り当てなかった。投与開始前に、この試験で使用するのに適切ではないとみなした割り当て動物はいずれも、同じ搬送から入手し、かつ同じ環境条件下で維持した代替の動物で置き換えた。投与の開始後、試験動物は、偶発的な傷害、非試験品関連の健康問題、又は同様の状況にある場合、代替の動物と置き換え期間の間に置き換えた。代替の動物は、３日内に、試験の置き換えとして使用した。到着時に、動物は、無作為化するまで個々に飼育した。無作為化後、動物は、自動給水弁を装備したステンレス鋼の孔開きフロアのケージで群飼育した（同じ投与群は一緒に最大３匹の動物まで）。動物は、指定した手順／行為の間、分けておいた。ＰＭＩ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｃｈｏｗ  Ｎｏ．５ＣＲ４（タンパク質１４％）を、指定した手順の間を除いて、この試験を通じて自由に与えた。逆浸透及び紫外照射によって処理した後の地元の水道水を、自動給水システムを介して各々の動物に自由に利用可能にさせた（ただし指定した手順の間を除く）。動物は、心理学的／環境的な強化のために社会的に飼育して、試験手順／行為の間を除けば、隠れチューブ及び咀嚼物などの品物を与えた。
【０４２０】
試験の１日目、レーザー誘発性脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）手順を行った。ＣＮＶ手順の前に、散瞳性の点眼剤（１％トロピカミド）を両眼に適用した。獣医学の眼科医が適切とみなした場合、更に適用を行った。動物は、手順の前及び間に、イソフルラン／酸素の混合物で麻酔した。麻酔下で、３００ｍＷの初期パワー設定（レーザーパワーはバブルの形成のために増大され得る）、初期スポットサイズ８０μｍ及び０．１秒の期間で、８１０ｎｍのダイオードレーザーを使用して各々の眼の視神経周囲の主な網膜血管の間で４−スポットのパターンを作製した。レーザーパラメータは、ブルッフ膜の破裂（バブル形成と相関する）を確実にするために必要に応じて調節した。ブルッフ膜の破裂が特定のスポットに関して確認されない事象では、これは記録された。この場合、又は出血の場合には、獣医学の眼科医が適切とみなした場合、追加のスポットを加えてもよい。任意の顕著な事象、例えば、網膜の出血を、各レーザースポットに関して記録した。出血がひどすぎる場合、動物を試験から除外し、取り除いた。眼の水分は、必要に応じてこの手順の間、食塩水溶液及び／又はカルボキシメチルセルロースナトリウム１．０％で維持した。
【０４２１】
ビヒクル対照、試験品又は参照品は、上記の実験設計で示されたように、１及び８日目に各々の動物の左右の眼に結膜下注射によって投与される。動物は、用量投与のために麻酔され（イソフルラン）、これは資格のある獣医学の眼科医によって行われた。局所的な抗生物質（ゲンタマイシン眼科溶液）を、処置の前日に両眼に２回、注射後、及び注射翌日に少なくとも１回適用した。投与前に散瞳性点眼剤（１％トロピカミド及び／又は２．５％フェニレフリン）を、各々の眼に適用した（さらなる適用は、獣医学の眼科医が適切とみなした場合に行ってもよい）。投与の間、動物は、イソフルラン／酸素ガスでの麻酔下に維持する。結膜は、注射用０．９％塩化ナトリウムＵＳＰでフラッシュした。０．５ｃｃのＴｅｒｕｍｏインスリンシリンジに取り付けた２９ゲージ、１／２インチの針を、各々の結膜下注射（１シリンジ／群／処置）に使用した。ＸＧ−１０２、ビヒクル対照又は参照品を、１及び８日目に、５０μｌ／眼の投与容積で各々の動物の眼に投与した。両眼を、各々の処置の直後に検査して、その投与手順によって生じるなんらかの異常を記録した。
【０４２２】
下に列挙した生存中の手順、観察及び測定を行った。適切とみなされる場合、更に頻繁な観察を、行ってもよい。１日２回、朝に１回及び午後に１回、試験全体にわたって、死亡率／瀕死のチェック（Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ／Ｍｏｒｉｂｕｎｄｉｔｙ  Ｃｈｅｃｋ）を行い、ここでは動物を全体的な健康／死亡率及び瀕死について観察した。動物は、可能性のある知見の特定又は確認のために必要でない限り、観察の間ケージから取り出さなかった。毎日１回、−１週目で開始して、ケージサイド観察（Ｃａｇｅｓｉｄｅ  Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ）を行い、それによって動物は、可能性のある知見の特定又は確認のために必要でない限り、観察の間ケージから取り出さなかった。毎週、−１週目で開始して、詳細な臨床観察を行い、それによって動物は、検査のためにケージから取り出した。毎週、−２週目で開始して、体重を健康モニタリング目的のためだけに記録し、それによって動物は、個々に秤量した。毎週、前処置期間の最終週の間に開始して、摂食量は、健康モニタリング目的だけのために、計画した安楽死の日以外は、定量的に測定した。スクーニングのための予備試験を１回、眼科検査を行い、それによって全ての動物を、眼底検査（間接的検眼鏡検査）及び生体顕微鏡検査（細隙灯）にかけた。使用した散瞳剤は、１％トロピカミドであった。予備試験１回、並びに１週、２週及び３週の終わりに、フルオレセイン血管造影法を行い、それによって散瞳性点眼剤（１％トロピカミド）を、試験の少なくとも１０分前に各々の眼に適用した（さらなる適用は、必要とみなされる場合に施してもよい）。眼の水分補給は、食塩水溶液を用いた頻繁なかん注によって維持した。動物は、必要に応じて、イソフルラン／酸素混合物下で、及び／又は鎮静カクテル（ケタミン７５ｍｇ／ｋｇ；キシラジン７．５ｇ／ｋｇ）を用いて維持した。単一及び／又はＡＲＴ眼底画像を赤外線及び／又はレッドフリーモードで得て、血管造影法の参照画像として使用した。０．２ｍｌの１０％フルオレセインナトリウム注射液ＵＳＰを、迅速な尾静脈注射を介して（ａｂｂｏｃａｔｈを介して）投与し、続いて０．５ｍｌの食塩水でフラッシュした。静止画像を、両眼から、フルオレセイン注射の少なくとも２分後で、かつフルオレセイン注射後５分以内で記録した。評価のために、静止画像上で個々のレーザースポットを、その後一致したスコアを決定する、２人の独立した読み取り者が０〜４のスケールで漏出について半定量的に評価した。
【０４２３】
フルオレセイン血管造影図スコアリング手順では、最初に血管造影法画像（ＪＰＥＧ又はＢＭＰ）をＨＲＡ２からエクスポートし、ＣＤ又は他の適切な媒体にコピーし、適切なコンピュータで再検討した。等級付け手順では、画像を、等級付けに適切な焦点レベルで選択した。（全てのレーザースポットを等級付けするためには、１つの眼あたりに１超の画像が、必要である場合がある）。血管造影図は、２人の科学者が独立して等級付けし、各々のレーザースポットについての等級を記録した。各人による等級付けの終了後、その等級を比較し、なんらかの矛盾は両者が再検討して、等級を一致させ、記録した。等級付けスケールは下に示すとおり０〜４である。
０＝漏出なし（レーザーの傷のみ、又は極めてびまん性の小さい過蛍光領域が可視）。
１＝最小限の漏出（小領域のびまん性又は中実の過蛍光が概してレーザー誘発性の欠損領域内に残っている）。
２＝わずかな漏出（半固体の過蛍光が概してレーザー誘発性の欠損領域内に残っている）。
３＝中度の漏出（半固体から固体の過蛍光が概してレーザー誘発性の欠損領域の境界内に残っている）。
４＝実質的な漏出（固体の過蛍光領域がレーザー誘発性の欠損領域の境界を超えて伸びている）。
【０４２４】
動物が死ぬか、又は試験中に安楽死させられるならば、剖検を行って、死体を廃棄した。計画した安楽死までは、生きている動物は、最終の体重を記録した。動物は、イソフルラン麻酔後に腹部大動脈から放血させる。可能である場合、動物は、交差する用量群をローテーションして安楽死させ、それによって、対照を含む各々の群由来の同様の動物数を、１日にわたって剖検した。下の組織の収集及び保存の表で特定される組織の代表的なサンプルを全ての動物から収集し、他に示さない限り、１０％の中性の緩衝化ホルマリン中に保存した。
【０４２５】
【表１４】
2020073573.tif 000018
【０４２６】
以下の重要な計算システムをこの試験で使用した。
【０４２７】
【表１５】
2020073573.tif 000019
【０４２８】
平均及び標準偏差は、体重、摂食量及びフルオレセイン血管造影法について算出した。他のデータは、個々に基づいて報告した。
【０４２９】
実施例２４
ラット歯周炎モデルにおける炎症性応答に対するＪＮＫ阻害剤ＸＧ−１０２の阻害性効果
この研究の目的は、ラットにおける歯周炎モデルで誘発された炎症に対するＸＧ−１０２（配列番号１１）の影響を検討することである。
【０４３０】
３０匹のＷｉｓｔａｒラット（雄性、６〜８週齢）をこの試験で用いる（１０匹のラットの３群に分けた）。
【０４３１】
実験的な歯周炎は、０日目に第一臼歯（動物１匹あたり１つの臼歯）の周囲に配置した結紮糸によって誘発する。各々の動物の下顎の第一臼歯の１つを、首の位置に４／０の絹の結紮糸を受けるように無作為に割り当てた（左／右）。結紮糸を固定するために、２つの結び目を第一臼歯の近心面で作った。結紮糸を適所に保持して、１０日にわたってバイオフィルムを蓄積させた。この手順は、塩酸ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）及び塩酸キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって全身麻酔下で行った。
【０４３２】
１用量の１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（ビヒクルとして０．９％ＮａＣｌ中に溶解）を、１０日目に歯肉内に（ＩＧＶ）投与する。第２群では、ビヒクルを１０日目にＩＧＶ投与した。投与容積は１０μｌである。投与は、第一臼歯周囲に付着した歯肉にＩＧＶ投与し、ここでは細い皮下注射針（Ｔｅｒｕｍｏ、Ｍｙｊｅｃｔｏｒ）を、第一臼歯の頬側に付着した歯肉に挿入した。注射の総容積は、歯肉の組織に首尾よく導入した。
【０４３３】
下の表に、無作為な割り当てをまとめる。
【０４３４】
【表１６】
2020073573.tif 000020
【０４３５】
毎日、全動物の一般行動及び外観を観察する。動物の健康が研究の継続と適合しない場合（瀕死の動物、体重の異常で重大な低下、物質の主な不耐性など）、動物は、治験医師の責任のもとで倫理的に屠殺する。歯周炎の炎症の様相は、０、１０及び１７日目で歯肉組織の巨視的観察によって分析し、それによって、歯肉炎（ＧＩ）、歯周部深部ポケット（ＰＰ）及び歯垢指数（ＩＰ）は、歯周部の臨床指数として０、１０及び１７日目に、実験の歯科医によって、盲検的に注目された。歯周の炎症は、臨床スコアリングを使用して歯肉指数の巨視的観察によって評価した：０）歯肉炎症なし、１）わずかな炎症、２）中度の炎症、３）重度の炎症。深部ポケットを、段階的プローブ（ＨＵ−Ｆｒｉｅｄｙ、ＵＳＡ）を使用して推定した。最後に、歯垢指数を、０〜３のスコア等級である、０）プラーク形成なし、１）薄いバイオフィルムの歯垢、２）可視の歯垢、３）厚い歯垢を使用して推定した。
【０４３６】
口腔の細菌の特定のために、歯周ポケットの細菌集団を、９つの歯周病原体（Ａａ：アグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter actinomycetemcomitan）、Ｐｇ：ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、Ｔｆ：タンネレラ・フォーサイセンシス（Tannerella forsythensis）、Ｔｄ：トレポネーマ・デンチコラ（Treponema denticola）、Ｐｉ：プレボテラ・インターメディア（Prevotella intermedia）、Ｐｍ：ペプトストレプトコッカス・ミクロス（Peptostreptococcus micros）、Ｆｎ：フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、Ｃｒ：カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）、Ｅｃ：エイケネラ・コローデンス（Eikenella corrodens））について、０、１０及び１７日目、同様に総細菌叢（Ｐｅｒｉｏ−ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｃｌｉｎｉｄｅｎｔ）に対するＤＮＡプローブ（リアルタイムＰＣＲ）によって特定する。コラーゲンフレームワークのために、総コラーゲン量の測定は、偏光顕微鏡を使用して行う。コラーゲンＩ／コラーゲンＩＩＩ比は、組織形態計測的な分析によって評価する。
【０４３７】
１７日目に、動物を屠殺して、試料を収集する。歯肉の組織を、全動物で生体分子分析のために切り出す。安楽死の後、下顎骨を、組織学的評価のために切り出す。頬舌の連続切片を、骨喪失の測定のため、及び炎症スコアを評価するために、改変ゴールドナーマッソントリクローム溶液で染色した。
【０４３８】
炎症性細胞の評価のために、炎症性細胞の定量は、組織形態計測的な測定によって行う。炎症性スコアを評価するために、スライドを、光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ａｘｉｏｓｋｏｐ、Ｇｅｒｍａｎｙ）下で観察した。結紮糸を置いた第一臼歯と第二臼歯との間の領域を、０〜３のスコア等級を使用して光学顕微鏡下で分析して、前に記載のとおり炎症性細胞流入とみなす［Ｂｉｔｔｏ  Ａ、Ｏｔｅｒｉ  Ｇ、Ｐｉｓａｎｏ  Ｍ、Ｐｏｌｉｔｏ  Ｆ、Ｉｒｒｅｒａ  Ｎ、Ｍｉｎｕｔｏｌｉ  Ｌ、Ｓｑｕａｄｒｉｔｏ  Ｆ、Ａｌｔａｖｉｌｌａ  Ｄ、Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（ＰＤＲＮ）ｒｅｄｕｃｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．２０１３；４０（１）：２６−３２頁］：スコア０：細胞炎症なし又はわずかに分散の（炎症性細胞浸潤は、まばらで、かつ辺縁歯肉の領域に限られる）。スコア１：最小細胞浸潤（挿入歯肉全体に存在する炎症性細胞浸潤）。スコア２：中度の細胞浸潤（歯肉及び歯周靭帯の両方に存在する炎症性細胞浸潤）。スコア３：強調された細胞の浸潤。実験データを承知していない単一の試験者が組織形態計測的測定を行った。
【０４３９】
組織破壊の評価のために、骨組織破壊は、放射線学的分析（マイクロ−ＣＴ）によって１群あたり３匹の動物で評価する。歯周の複雑な破壊を、組織学的分析によって評価する。その画像を、×２．５の倍率でデジタル化した（Ｅｘｐｌｏｒａ−Ｎｏｖａ  Ｍｏｒｐｈｏ−Ｅｘｐｅｒｔ、ｓｏｆｔｗａｒｅ）。歯周の骨の喪失に対する処置の影響は、歯槽骨高喪失（ＡＢＨＬ）を測定することによって組織測量的に評価した。測定は、前に報告された方法に［Ｂｉｔｔｏ  Ａ、Ｏｔｅｒｉ  Ｇ、Ｐｉｓａｎｏ  Ｍ、Ｐｏｌｉｔｏ  Ｆ、Ｉｒｒｅｒａ  Ｎ、Ｍｉｎｕｔｏｌｉ  Ｌ、Ｓｑｕａｄｒｉｔｏ  Ｆ、Ａｌｔａｖｉｌｌａ  Ｄ、Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（ＰＤＲＮ）ｒｅｄｕｃｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．２０１３；４０（１）：２６−３２頁］従い、第一臼歯の根の頬側及び舌側に沿って（図６）、セメントエナメル境（ＣＥＪ）から歯槽骨頂部（ＡＢＣ）まで行った（ミリメートルで）。対照群由来の歯槽骨標品（結紮してない）も、また測定して、両方の結紮群からの結果を比較した。平均のエナメル−セメント境から歯槽骨までの高さを各群の動物について算出した。度量衡換算を確証するために、ミリメートルの定規を写真に写して、校正器として使用した。評価は、画像分析システム（Ｉｍａｇｅ  Ｊ、ＵＳＡ）を使用し、処置割り当てを知らない２人の試験者によって行い、次いで、２名の観察者からの平均値を平均した。
【０４４０】
炎症性マーカーの評価のために、炎症性タンパク質（ｐ−ＪＮＫ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９）のレベルを、歯肉組織のホモジネートから、製造業者の指示に従って、市販のキット（Ｂｉｏｒａｄ、Ｂｉｏｐｌｅｘ  Ｐｒｏ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｓｓａｙｓ、Ｆｒａｎｃｅ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０用；Ｕｓｃｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９用、及びＮｏｖａｔｅｉｎｂｉｏ、ＵＳＡ、ＪＮＫ用）を使用してＥＬＩＳＡによって測定する。
【０４４１】
骨微細構造の評価のために、骨小柱測定（厚さ、分離）を、０、１０及び１７日目に１群あたり３匹の動物で放射線学的分析（マイクロ−ＣＴ）によって評価する。
【０４４２】
結果：
１用量のみのＸＧ−１０２処置を、１０日目に与えた。第１の下方臼歯の頸部の周囲の絹糸の配置によって誘発した実験的な歯周病は、２つの結紮群について、及びＧＩ及びＰＰの両方で、第３群のみ（ＸＧ−１０２）で、図９２に示されるとおり、ＧＩの有意な増大（ｐ＜０．０５）を生じた。１７日目の臨床パラメータに対してプラシーボの有意な効果は見出されなかった。第３群では、ＸＧ−１０２注射後１週（１７日目）、処置はＧＩレベルを確実に低下した（図９２）。
【０４４３】
微生物学的定量に関して、その結果、１０日目に有意な値に達しなかった全群において総細菌叢の増大が示された（ｐ＞０．０５）。興味深いことに、ＸＧ−１０２のみが、１０日目に比較して１７日目に総細菌叢を有意に（ｐ＜０．０５）低下した（図９３）。この変化は実験的処置の投与と一致していた。第３群では、ＸＧ−１０２は、ベースラインレベルまで総細菌叢を有意に減らすことを達成した。
【０４４４】
ＩＬ１−βの発現について、ＸＧ−１０２処置群（第３群）は、プラシーボ群と比較してＩＬ１−β発現を有意に低下した。これによって、炎症促進性のサイトカイン発現を低下することによって得られる歯周炎についてＸＧ−１０２処置の有益な効果が注目される（図９４）。
【０４４５】
更に、歯周骨喪失／歯槽骨高喪失（ＡＢＨＬ）を１７日目に評価した。ＡＢＨＬは、組織学的変化／再構築だけでなく、骨再吸収の指標でもある。この結果、結紮は、対照群と比較して結紮群２において臼歯のＡＢＨＬを有意に増大した（ｐ＜０．０５）ことが示された。群間の分析によって、骨破壊は、ＸＧ−１０２処置した動物で重症度が低かったことが明らかになった（図９５）。実際、第３群は、陰性対照群と統計学的に匹敵するＡＢＨＬレベルを有した。したがって、ＸＧ−１０２投与は、骨変性を防ぎ、かつ骨喪失を回避する。これらのデータによって、歯周炎に対するＸＧ−１０２の抗炎症性特性（防御効果）が確認される。群間の分析によって、全ての結紮群は、ほぼ同じレベルのＡＢＨＬを有することが明らかになり（ｐ＞０．０５）これによって、ラット歯周炎モデルが確証された。
【０４４６】
したがって、この試験のデータによって、実験的な歯周炎に対するＸＧ−１０２の防御効果が示される。
【０４４７】
実施例２５
ストレプトゾトシン処置したラット（ＩＶＴ）における糖尿病性網膜症予防試験におけるＸＧ−１０２（配列番号１１）の効果
この試験の目的は、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処置した（高血糖性）ラットに対して硝子体内注射によって投与した場合、ＸＧ−１０２が糖尿病性網膜症を防ぐ能力を決定することであった。
【０４４８】
この試験設計は、以下のとおりであった：
【０４４９】
【表１７】
2020073573.tif 000021
【０４５０】
第２、３、４群由来の全動物には、−７日目にＳＴＺの５５ｍｇ／ｋｇ静脈内（ＩＶ）投与した。
【０４５１】
０．０４１２ｇの誘導剤（ＳＴＺ）を含む無菌バイアルを、事前秤量し、密閉し、−７日目に第２〜４群の動物及び予備の動物への投与のために投与室に移した。空の適切に標識した滅菌バイアルの二重のセットを提供した。再構成されたＳＴＺ溶液を、投与のためにこれらのバイアル中にろ過した。参照品である０．９％ＮａＣｌを受け取ったまま投与した。ＸＧ−１０２を、補正率１．３８３を使用して調製した。最高用量レベルに等しいストック溶液を、ビヒクルである注射用０．９％塩化ナトリウム中に調製し、０．２２μｍのポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）フィルターを通して滅菌ろ過した。低い方の投与レベルは、ストック溶液を直接希釈することによって調製した。投与処方物は、投与レベルの要件を満たすために適切な濃度で一旦調製した。全ての希釈液を、ビヒクルでストック溶液を直接希釈することによって調製した。３つの投与のアリコート（１、８及び１５日目）を、調製し、−２０℃を維持するように設定された冷蔵庫で保管した。各々の投与レベルのアリコートを、毎日の投与では周囲温度で解凍し、溶液は室温で６時間以下維持した。
【０４５２】
６０匹の雄性Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｏｒｔａｇｅ，ＩＩから入手した。その動物は、約８週齢であって、１６６ｇ〜２２８ｇと秤量された。Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットは、ＳＴＺ誘発性糖尿病性網膜症モデルでの使用のための許容される種であるので、この試験の動物モデルとして選択した。この試験で使用した動物の総数は、試験品の効果を適切に特徴付けるのに必要な最小量であるとみなした。この試験は、その目的を達成するために不必要な動物の数を必要としないように設計した。動物の受け入れと処置の開始との間には、２０日の最小馴化期間をおいて、動物を実験環境に慣れさせた。動物を、同様の群平均体重を達成するために設計した層別無作為化スキームによって群に割り当てた。健康度が劣るか、又は体重幅が極端な動物は、群に割り当てなかった。投与開始前に、この試験で使用するのに適切でないとみなした割り当て動物はいずれも、同じ搬送から入手し、かつ同じ環境条件下で維持した代替の動物と置き換えた。代替の動物は、開始の３日内にこの試験の置き換えとして使用した。到着時に、動物は、無作為化するまで個々に飼育した。無作為化後、動物は、自動給水弁を装備したステンレス鋼の孔開きフロアのケージで群飼育した（同じ投与群は一緒に最大３匹の動物まで）。動物を入れた部屋は、試験の記録の中に記載した。動物は、指定した手順／行為の間、分けておいた。３０％〜７０％の相対湿度で１９℃〜２５℃の温度を維持した。指定した手順で中断される場合を除いて、１２時間の明／１２時間の暗のサイクルを維持した。ＰＭＩ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｃｈｏｗ  Ｎｏ．５ＣＲ４（タンパク質１４％）を、指定した手順の間を除いて、この試験を通じて自由に与えた。逆浸透及び紫外照射によって処理した後の地元の水道水を、自動給水システムを介して各々の動物に自由に利用可能にさせた（ただし指定した手順の間を除く）。動物は、心理学的／環境的な強化のために社会的に飼育して、試験手順／行為によって中断される時を除けば、隠れデバイス及び咀嚼物などの品物を与えた。
【０４５３】
誘導剤の投与のため（第２〜４群、−７日目）、１匹の動物あたり１バイアルのＳＴＺ（予備を含む）を、１．５ｍＬの注射用滅菌水、ＵＳＰを用いた注射の３分内に再構成して、２７．５ｍｇ／ｍＬの濃度を得た。バイアルを反転するか、又は旋回させて、ＳＴＺを溶解した。得られた溶液を０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルターを介して、空の無菌の適切に標識したバイアル中にろ過した。ＳＴＺ（５５ｍｇ／ｋｇ）を、−７日目に、シリンジによる処方の３分内に、静脈内注射によって投与した。投与容積は、２ｍＬ／ｋｇであって、実際の用量投与は、各動物の直近の実際の体重に基づいた。動物は、注射の間は拘束した。
【０４５４】
試験品又は参照品は、実験設計の表に示したとおり、１、８及び１５日目に各動物の左右の眼に、硝子体内注射によって投与した。動物は、用量投与のために麻酔し（イソフルラン）、これは正式な資格のある獣医学の眼科医が行った。局所の抗生物質（ゲンタマイシン眼科溶液）を、注射後、処置の前日に、両眼に２回、及び注射翌日に少なくとも１回適用した。投与前に、散瞳性点眼剤（１％トロピカミド及び／又は２．５％フェニレフリン）を、各々の眼に適用した（さらなる適用は、獣医学の眼科医が適切とみなした場合に行った）。投与の間、動物を、イソフルラン／酸素ガスでの麻酔下に維持した。結膜を、注射用０．９％塩化ナトリウムＵＳＰでフラッシュした。３２ゲージ、１／２インチの針を備えた１０μＬのハミルトンシリンジを、各々の硝子体内注射に使用した（１シリンジ／１群／１処置）。投与容積は、５μＬ／眼であった。両眼とも、細隙灯生体顕微鏡及び／又は間接的な検眼鏡によって各処置の直後に検査して、投与手順によって生じるなんらかの異常（特に水晶体、硝子体、及び網膜）を記録した。角膜混濁は、麻酔を含む実験的手順に対して二次的とみなされた。これらの混濁のある程度は、角膜血管新生とも関連していた。他の眼の所見が注目されたが、全般には低頻度若しくは群にまたがって散発性であるか、及び／又は持続しなかった。これらの知見には、限定するものではないが、以下が挙げられる：多巣性／散発性の角膜混濁、硝子体気泡、限局性／散発性／多巣性の硝子体混濁、及び局所性網膜混濁。
【０４５５】
ストレプトゾトシンは、ラットにおいて糖尿病性網膜症を誘発するために静脈内注射によって投与した。硝子体内注射経路は、これが、ヒトでの投与の意図した経路であるので、この試験品のために選択した。投与レベルは、以前の概念実証試験で得た情報、並びにＩＶＴ経路の投与を使用するＭＴＤ及び毒性試験に基づいて選択した。
【０４５６】
下に列挙した生存中の手順、観察及び測定を、試験動物について行った。この試験を通じて、動物を、全体的な健康／死亡率及び瀕死について毎日２回、朝に１回、及び午後に１回観察した。動物は、可能性のある知見の特定又は確認のために必要でない限り、観察の間ケージから取り出さなかった。動物をケージから取り出して、−１週目で開始して、毎週、詳細な臨床観察を行った。動物は、−１週目の間に開始して、毎週２回、個々に秤量した。摂食量は、前処置期間の最後の週の間に開始して毎週定量的に測定した。全ての動物を、処置前に１回及び２２日目に再度、眼底検査（間接的検眼鏡検査）及び生体顕微鏡検査（細隙灯）にかけた。使用した散瞳剤は、１％トロピカミドであった。眼内圧を、各々の眼科的検査の後、試験前に１回、及び２２日目に、ＴｏｎｏＶｅｔ（商標）リバウンドトノメーターを使用して測定した。処置前の圧力測定読み取りは、日周の変動を減らすために最終測定について予想されるのと同じ時刻で行った。
【０４５７】
網膜電図の評価は、処置前に１回、並びにフルオレセイン血管造影法の前に、６、１３、及び２０日目に行った。動物は、ＥＲＧ記録の前に一晩暗順応させ、次いで７５ｍｇ／ｋｇのケタミン及び７．５ｍｇ／ｋｇのキシラジンの筋肉内注射で麻酔した。トロピカミド（１％）を試験前に各眼に適用した（必要とみなされた場合さらなる適用を施した）。まぶたを、開瞼器で引込めさせて、コンタクトレンズ又は金ループ電極を各眼の表面に置いた。ニードル電極を、皮膚に、各々の眼の下に（参照）及び頭部に、眉毛よりも後ろに、又は尾の基部に（グラウンド）置いた。カルボキシメチルセルロース（１％）点眼剤を、コンタクトレンズ電極の内面に、眼にそれを置く前に適用した。各々のＥＲＧ事象は、暗順応の単回フラッシュ刺激の以下のシリーズから構成された：
１）−３０ｄＢの単回フラッシュ、ａ波の振幅及び潜時、５回の単一フラッシュの平均、フラッシュ間は１０秒。
２）−１０ｄＢの単回フラッシュ、ａ及びｂ波の振幅及び潜時、５回の単一フラッシュの平均、フラッシュ間は１５秒。
３）０ｄＢ、２回の単一フラッシュの平均、ａ及びｂ波の振幅及び潜時、フラッシュ間は約１２０秒（より長い時間間隔が許容される）。
【０４５８】
暗順応の応答の評価後、動物は、約５分の期間にわたって（それより長い時間間隔が許容された）、約２５〜３０ｃｄ／ｍ２で背景光に適合させ、その後、平均２０掃引の明順応のホワイトフリッカーを１Ｈｚで（ａ及びｂ波の振幅及び潜時）続け、次いで２０掃引の明順応のフリッカーを２９Ｈｚで（ｂ波の振幅及び潜時）続けた。波形を、ａ及びｂ波の振幅及び潜時について分析し、０ｄＢの暗順応の刺激からの律動様小波（ＯＰ）１〜４をフィルターし、振幅及び潜時について分析した。
【０４５９】
フルオレセイン血管造影法評価を、処置前に１回、並びに７、１４、及び２１日目、網膜電図写真後に行った。イソフルラン／酸素混合物を、手順の前に及び間に麻酔として使用した。散瞳性剤である１％トロピカミドを必要に応じて使用した。眼の水分補給は、必要に応じて食塩水溶液を用いたかん注によって維持した。０．２ｍＬの１０％のフルオレセインナトリウム注射液Ｕ．Ｓ．Ｐ．を急速尾静脈注射によって投与し、その後０．５ｍＬの食塩水フラッシュを続けた。眼底の静止画像を、フルオレセイン注射後、１０〜１５分の間に両眼から記録した。画像は最初に右眼から撮り、続いて左眼を撮った。局所的な無刺激性の眼科軟膏を、血管造影法の後に眼に投与した。画像を、血管の完全性／びまん性の漏出について定性的に評価した。
【０４６０】
血糖値の決定は、ＳＴＺ処置前に１回、−６日目（ＳＴＺ投与の翌日）、及びその後は１週あたり３回行った（全動物）。追加の血糖測定は、必要に応じて行い、動物の健康状態をモニターした。レベルは、尾静脈から採取した血液の滴を使用してグルコメーターによって決定した。値は、ｍｍｏｌ／Ｌで測定し、報告の目的で１８を掛けてｍｇ／ｄＬに変換した。尿中グルコース値の決定は、−１週目で開始して、毎週であり、一晩収集に従った。動物は、この収集期間の間、食物と水とにアクセスさせた。尿中グルコースは、イソフルラン麻酔後の腹部大動脈から、Ｐ８００分析装置を使用して臨床検査部門が測定した。可能である場合、動物は、交差する用量群をローテーションして安楽死させ、それによって、対照を含む各々の群由来の同様の動物数を、１日にわたって同様の時間に剖検した。
【０４６１】
主な試験動物には、完全な解剖検査を行い、これには死体及び筋骨格系；全ての外面及び開口部；頭蓋腔及び脳の外面；並びに胸部、腹部及び骨盤腔（それらの関連する臓器及び組織とともに）の評価を含んだ。剖検手順は、適切な訓練並びに動物解剖学及び肉眼的病理学の経験のある資格のある人が行った。獣医学の病理学者、又は他の適切な資格のある人が担当可能であった。
【０４６２】
以下で特定された組織の代表的な試料を全ての動物から収集して、別段示さない限り、１０％の中性緩衝化ホルマリン中に保存した。
【０４６３】
【表１８】
2020073573.tif 000022
【０４６４】
この試験では、以下のパラメータ及びエンドポイントを評価した：死亡率、臨床徴候、体重、体重変化、摂食量、眼科学、眼内圧、網膜電図写真（ＥＲＧ）、フルオレセイン血管造影法、血液及び尿中グルコース決定、肉眼的剖検検査。
【０４６５】
糖尿病性網膜症ラットモデルと一致して、高血糖症関連死、悪化している状態の臨床徴候、及び体重の低下、体重増加、摂食量増加、並びに血糖値及び尿中グルコースレベルの重度の増大があった。ＳＴＺ誘発性の群で注目される多数の眼の変化は、高血糖状態の性質に対して二次的なものであった（とりわけ、前方皮質白内障）。研究の間にＸＧ−１０２関連の死亡はなかった。体重、体重増加、又は摂食量に対して、ＸＧ−１０２関連の臨床徴候も影響もなかった。フルオレセイン血管造影法の画像では、なんら血管漏出は明らかにならず、剖検では、明白なＸＧ−１０２関連の肉眼的所見もなかった。
【０４６６】
６、１３及び２０日目、１つの眼あたり≦２μｇのＸＧ−１０２を与えられた動物の暗順応及び明順応のＥＲＧアセスメントのある程度の振幅は、軽度に増大するか、又はＳＴＺ処置した対照動物と匹敵したが、これらの応答は一般には、対照の変動内におさまっていた。ＸＧ−１０２群の潜時は、対照及び／又は処置前の変動内と匹敵し、かつその中におさまっていた。１つの眼あたり≦２μｇのＸＧ−１０２を与えられた動物と、ＳＴＺ処置した対照とを比較した場合、律動様小波の振幅にはある程度の散発的な差異があった。
【０４６７】
以下の表は、事象による全てのＥＲＧ刺激について振幅のまとめを含む（それぞれ、処置前、６、１３及び２０日目）。この値は、群の平均及び標準偏差（下）を示す。
【０４６８】
【表１９】
2020073573.tif 000023
【０４６９】
【表２０−１】
2020073573.tif 000024
【表２０−２】
2020073573.tif 000025
【０４７０】
これらのデータから読み取ることができるように、ＸＧ−１０２は、波の振幅の低下を逆転させる傾向がある。
【０４７１】
実施例２６
ストレプトゾトシン処置したアルビノラット（結膜下）における糖尿病性網膜症予防試験におけるＸＧ−１０２（配列番号１１）の効果
この研究の目的は、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処置した（高血糖症）ラットに対して３週間、毎週の結膜下注射によって投与した場合、ＸＧ−１０２が糖尿病性網膜症を予防する能力を決定することであった。
【０４７２】
実験の設計を以下に示す。
【０４７３】
【表２１】
2020073573.tif 000026
【０４７４】
ナイーブなＬｏｎｇ  Ｅｖａｎｓ（ロングエバンス）ラットを使用した（４２匹の雄性動物；投与の時点で１０週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｓｔ．Ｃｏｎｓｔａｎｔ、ＱＣ）。このＬｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラットは、ＳＴＺ誘発性の糖尿病性網膜症モデルでの使用のための許容される種であるので、この試験のための動物モデルとして選択した。この試験で用いた動物の総数は、試験品の効果を適切に特徴付けるのに必要な最小量であるとみなし、その目的を達成するために不必要な動物の数を必要としないように設計した。この時点で、実験動物における試験で、ヒトに対する外挿のために最も利用可能な基礎が得られる。生きた動物を使用しない許容できるモデルは、現在存在しない。代替の計画的な放出は４日目である。動物は、ステンレス鋼のケージで飼育する。ＰＭＩ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｃｈｏｗ  Ｎｏ．５ＣＲ４（タンパク質１４％）を、動物の大きさと年齢とに適切な量で毎日提供した。逆浸透ろ過を通して処理し、かつＵＶ光処理を通した地元の水道水を、各々の動物に自由に利用可能にさせた。動物は、心理学的／環境的な強化のために社会的に飼育して（１ケージあたり最大３匹までの動物）、試験手順／行為の間を除いて、隠れチューブ及び咀嚼物などの品物を与えた。試験での使用に適切と確認された動物のみを割り当てた。到着時に、動物は無作為化するまで個々に飼育した。無作為化後、動物を社会生活させる。
【０４７５】
０．０４１２ｇの誘導剤（ＳＴＺ）を含む滅菌バイアルを、事前秤量し、密閉し、−７日目に第２〜５群の動物及び選択された予備の動物への投与のために投与室に移した。空の適切に標識した滅菌バイアルの二重のセットを提供する。再構成されたＳＴＺ溶液を、投与のためにこれらのバイアル中にろ過する。試験品であるＸＧ−１０２は、提供された補正率を使用して調製した。最高用量レベルに等しいストック溶液を、ビヒクルである注射用０．９％塩化ナトリウム中に調製し、０．２２μｍのポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）フィルターを通して滅菌ろ過した。低い方の用量レベルは、このストック溶液を食塩水で直接希釈することによって調製した。投与アリコートを調製し、−２０℃を維持するように設定した冷蔵庫で保管した。各々の投与レベルのアリコート（複数可）を、毎日の投与で、周囲温度で解凍し、溶液は室温で６時間以下維持した。ビヒクルである、注射用の０．９％塩化ナトリウムを、受け取ったまま投与した。１匹の動物あたり１バイアルのＳＴＺ（予備を含む）を、１．５ｍＬの注射用滅菌水、ＵＳＰを用いた注射の３分内に再構成して、２７．５ｍｇ／ｍＬの濃度を得た。バイアルを反転するか、又は旋回させて、ＳＴＺを溶解した。再構成されたＳＴＺ溶液を０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルターを介して、投与のための空の無菌バイアル中にろ過した。ＳＴＺを、−７日目に、シリンジによる処方の３分間以内に、静脈内注射によって投与した。投与容積は、２ｍＬ／ｋｇであり、実際の用量投与は、各動物の直近の実際の体重に基づいた。動物は、注射の間は拘束する。ＳＴＺ処置した動物は、血糖値が≧２５０ｍｇ／ｄＬである場合に糖尿病とみなした。試験品又はビヒクルは、各々の動物の左右の眼に結膜下注射によって、１、８及び１５日目、並びに再度２４日目（Ｒｅｐ１）、２３日目（Ｒｅｐ２及び３）、２２日目（Ｒｅｐ４）並びに３４日目（Ｒｅｐ１）３３日目（Ｒｅｐ２及び３）並びに３２日目（Ｒｅｐ４）に投与した。その動物は、用量投与のために麻酔し（イソフルラン）、これは正式な資格のある獣医学の眼科医が行った。局所の抗生物質（０．３％トブラマイシン軟膏）を、注射後、処置の前日に、両目に２回、及び注射の翌日に少なくとも１回適用した。投与前に、散瞳性点眼剤（１％トロピカミド及び／又は２．５％フェニレフリン）を、各々の眼に適用した（さらなる適用は、獣医学の眼科医が適切とみなした場合に行ってもよい）。投与の間、動物を、イソフルラン／酸素ガスでの麻酔下に維持した。結膜を、注射用０．９％塩化ナトリウムＵＳＰでフラッシュした。０．５ｃｃのＴｅｒｕｍｏインスリンシリンジに取り付けた２９ゲージ、１／２インチの針を、各々の結膜下注射に使用した（１シリンジ／１群／１処置）。試験品又は参照品を、各々の動物の眼に、５０μＬ／眼の投与容積で投与した。両眼とも各処置の直後に検査して、投与手順で生じたいずれの異常も記録した。
【０４７６】
ストレプトゾトシンは、ラットにおいて糖尿病性網膜症を誘発するためにＩＶ投与する。結膜下経路は、これが、ヒトでの投与の意図した経路であるので、この試験品のために選択した。投与レベルは、以前の概念実証試験で得た情報、並びに結膜下経路の投与を使用するＭＴＤ及び毒性試験に基づいて選択した。罹患率／死亡率のチェックは、少なくとも毎日２回（午前及び午後）行った。ケージサイド観察は、毎日１回行った。詳細な臨床検査を毎週行った。摂食量の定量は毎週行った。体重を毎週２回記録した。眼科的検査は、試験前に１回、並びに３７日目（Ｒｅｐ１）、３６日目（Ｒｅｐ２及び３）及び３５日目（Ｒｅｐ４）に再度行った。全ての動物を、眼底検査（間接的検眼鏡検査）及び生体顕微鏡検査（細隙灯）にかけた。用いた散瞳剤は、１％トロピカミドである。眼内圧を、試験前に１回、並びに３７日目（Ｒｅｐ１）、３６日目（Ｒｅｐ２及び３）、及び３５日目（Ｒｅｐ４）に測定した。処置前の圧力測定読み取りは、日周の変動を減らすために最終測定を予定したのと同じ時刻で行った。眼内圧は、眼科的検査の後、ＴｏｎｏＶｅｔ（商標）リバウンドトノメーターを使用して測定した。
【０４７７】
網膜電図の評価は、処置前に１回、並びに７、１４、２１日目並びに３６日目（Ｒｅｐ１）、３５日目（Ｒｅｐ２及び３）及び３４日目（Ｒｅｐ４）に行った。動物は、ＥＲＧ記録の前に一晩暗順応させ、次いで７５ｍｇ／ｋｇのケタミン及び７．５ｍｇ／ｋｇのキシラジンの筋肉内注射で麻酔した。トロピカミド（１％）を試験前に各眼に適用した（必要とみなされた場合さらなる適用を施してもよい）。まぶたを、開瞼器で引込めさせて、コンタクトレンズ又は金ループ電極を各眼の表面に置いた。ニードル電極を、皮膚に、各々の眼の下に（参照）及び頭部の、眉毛よりも後ろに、又は尾の基部に（グラウンド）置いた。カルボキシメチルセルロース（１％）点眼剤を、コンタクトレンズ電極の内面に、眼にそれを置く前に適用した。
１）−３０ｄＢの単回フラッシュ、５回の単一フラッシュの平均、フラッシュ間は１０秒。
２）−１０ｄＢの単回フラッシュ、５回の単一フラッシュの平均、フラッシュ間は１５秒。
３）０ｄＢ、２回の単一フラッシュの平均、フラッシュ間は約１２０秒（より長い時間間隔が許容される）。
【０４７８】
暗順応の応答の評価後、動物は、約５分の期間にわたって（それより長い時間間隔が許容される）、約２５〜３０ｃｄ／ｍ２で背景光に適合させ、その後、平均２０掃引の明順応のホワイトフリッカーを１Ｈｚで続け、次いで２０掃引の明順応のフリッカーを２９Ｈｚで続けた。波形を、ａ及びｂ波の振幅及び潜時について分析し、０ｄＢの暗順応の刺激からの律動様小波１〜４をフィルターし、振幅及び潜時について分析した。
【０４７９】
インドシアニングリーン血管造影法評価を、処置前に１回（−２又は−１日目）、並びに８、１５、２２日目並びに３５日目（Ｒｅｐ１）、３４日目（Ｒｅｐ２及び３）、及び３３日目（Ｒｅｐ４）に行った。イソフルラン／酸素混合物を、手順の前及び間に麻酔として使用した。用いた散瞳性剤は、必要に応じて１％トロピカミドであった。眼の水分補給は、必要に応じて食塩水溶液を用いたかん注によって維持した。０．２ｍＬの０．５％インドシアニングリーンを急速尾静脈注射によって投与し、その後０．５ｍＬの食塩水をフラッシュした。眼底の静止画像を、ＩＣＧ注射後、１０〜１５分の間に両眼から記録した。画像は最初に右眼から撮り、続いて左眼を撮った。局所的な無刺激性の眼科軟膏を、血管造影法の後に眼に投与した。画像を、血管の完全性／びまん性の漏出について定性的に評価した。
【０４８０】
血糖値レベルは、ＳＴＺ処置前に１回、−６日目（ＳＴＺ投与の翌日）、及び再度−１日目に測定した。追加の血糖測定を必要に応じて行い、動物の健康状態をモニターしてもよい。レベルは、尾静脈から採取した血液の滴を使用してグルコメーターによって決定した。値は、ｍｍｏｌ／Ｌで測定し、報告の目的で１８を掛けてｍｇ／ｄＬに変換した。
【０４８１】
計画的な安楽死まで、生存している主な試験動物は、イソフルラン麻酔後の腹部大動脈からの放血によって安楽死させた。可能である場合、動物は、交差する用量群をローテーションして安楽死させ、それによって、対照を含む各々の群由来の同様の動物数を、１日にわたって同様の時間に剖検した。組織（眼、視神経）の代表的な試料を全ての動物から収集し、他に示さない限り、１０％の中性の緩衝化ホルマリン中で保存した。眼及び視神経を両側から収集し、ダビッドソン固定液中で２４〜４８時間固定し、次いで７０％エタノール中に保管した（安楽死させた動物のみ）。
【０４８２】
実施例２７
術後眼内炎症におけるデキサメタゾン点眼剤に比較した、ＸＧ−１０２の単回結膜下注射の有効性及び安全性を評価するための無作為二重盲検の並行群対照、多施設治験（臨床第ＩＩ相）
眼科手術における技術的進歩にかかわらず、この手順の身体的外傷によって、処置を正当化する術後眼炎症が誘発され続ける。眼の組織では、アラキドン酸をシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）によって、炎症の最も重要な脂質由来のメディエーターであるプロスタグランジン（ＰＧ）に代謝する。外科的外傷は、アラキドン酸カスケードのトリガーを生じ、これが次に、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の活性化によってＰＧ類を生成する。細胞膜中のリン脂質は、それから化学的に別個のＰＧ類及びロイコトリエン類のファミリーが生成されるアラキドン酸を生成する、ホスホリパーゼＡの基質である。眼の炎症の処置のための「ゴールデンスタンダード」は、局所のコルチコステロイド類及び／又は非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である。（短期間の）コルチコステロイド使用で報告された副作用としては、白内障形成、眼内圧（ＩＯＰ）上昇、ウイルス感染感受性の増大、並びに角膜上皮及び間質創傷治癒の遅延が挙げられる。更に、コルチコステロイド類での長期の処置は、糖機能障害、高血圧、緑内障の発症、視力障害、視野の喪失、及び後嚢下白内障形成などの全身的な副作用を誘発することが公知である。検討中の治験医薬品（ＩＭＰ）（ＸＧ−１０２）は、非アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）競合方式でｃ−ＪｕｎのＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）活性を選択的に阻害するプロテアーゼ耐性ペプチドである。ＸＧ−１０２は、Ｄ形状でグリシン（アキラルである）を除く全てのアミノ酸を有する３１のＤ−アミノ酸ＪＮＫ阻害剤ペプチドである。この選択は、通常は投与の直後にペプチドを分解する、プロテアーゼに対する化合物の耐性を増大するために行った。ＪＮＫ活性化は、アクチベータタンパク質−１（ＡＰ−１）転写因子ファミリー並びに自己免疫及び炎症性疾患に関与する他の細胞因子のリン酸化及び活性化をもたらすので、ＪＮＫ経路を阻害する化合物は、示した治療値を有し得る。ラット及びウサギにおける眼のＭＴＤ（最大耐容用量）試験、並びにウサギでの眼の局所耐容性によって、ＸＧ−１０２は、結膜下、硝子体内（ＩＶＴ）及び静脈内（ｉｖ）投与後に十分耐容されたことが示された。結膜下投与後のラット及びウサギでの眼のＭＴＤ試験によって、無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）は、ラットでほぼ２０μｇ及びウサギではほぼ６００μｇであったことが示された。単回及び反復の（７日間毎日）の結膜下投与後の眼の薬物動態を、ウサギで研究し、ＸＧ−１０２は、やはり、眼の構造に応じて１〜４時間の間、ｔｍａｘで投与した７日後、脈絡膜、眼球結膜及び虹彩−毛様体に存在したが、ＸＧ−１０２は、血漿中ではいずれの時点でも検出可能ではなかったことが示された。（術後）眼内炎症を処置するための現在の「ゴールデンスタンダード」の有害な副作用を仮定すると、一方では、炎症を減らすのに有効であるが、他方ではコルチコステロイド使用に関連する（有害な）副作用を有さない、他の処置代替を見出すことが臨床的に正当化される。ＸＧ−１０２は、現在までに行われた前臨床試験及び第Ｉ相／Ｉｂ試験の両方で見込みのある結果を示した。
【０４８３】
前の治験は非盲検の単一施設、用量漸増／用量決定試験であって、術後又は外傷後の眼内炎症を有する患者における「通常」の術後抗炎症療法に加えて、投与したＸＧ−１０２の単回の結膜下注射の安全性及び耐容性を評価するように設計した。検討したＸＧ−１０２の用量は、４５、９０、４５０及び９００μｇであった。全部で２０人の患者（各々の用量群で５人の患者）を、この試験に登録した。前の試験の結論は、最近の術後又は外傷の眼内炎症を有する患者において結膜下注射として投与されたＸＧ−１０２が安全かつ、よく耐容されるということであった。前の研究の首尾よい完了後、眼の炎症におけるＸＧ−１０２の開発を続けること、及び本試験を行うことを決定し、その目的は、眼房細胞の等級で評価した場合、術後眼内炎症の進行における術直後に投与されたＸＧ−１０２の単回結膜下用量の有効性及び安全性を、デキサメタゾン点眼剤と比較して評価することであった。これは、術後眼内炎症の進行における独立した治療として施した場合のＸＧ−１０２の有効性を検討する最初の試験であった。
【０４８４】
本試験の目的は、術後の眼内炎症において２１日間に１日あたり４回投与したデキサメタゾン点眼剤と比較した、外科的手順の終了後最大３時間内に投与したＸＧ−１０２の９０又は９００μｇの単回の結膜下注射の有効性及び安全性を評価することであった。
【０４８５】
本試験の主な目的は、９００μｇのＸＧ−１０２の単回結膜下注射が、術後の眼内炎症の進行において２１日間に１日あたり４回投与したデキサメタゾン点眼剤での処置に対して劣っていないか否かを評価することであった。この治験の主な目的に従って、主な転帰は、試験の処置の結膜下注射の投与後２８日目の平均の前房細胞等級によって評価して、デキサメタゾン点眼剤とＸＧ−１０２の９００μｇとを比較した。
【０４８６】
二次的な目的は、以下に対してデキサメタゾン点眼剤（４回／日、２１日間投与）と比較した９０μｇ又は９００μｇのいずれかのＸＧ−１０２の単回結膜下注射の効果を評価することであった：
有効性の転帰のパラメータ
ａ）２８日目の前房細胞の等級（ＸＧ−１０２の９０μｇ対デキサメタゾン）
ｂ）７日目及び１４日目の前房細胞の等級（ＸＧ−１０２の９００μｇ対デキサメタゾン）
ｃ）７日目及び１４日目の前房細胞の等級（ＸＧ−１０２の９０μｇ対デキサメタゾン）
ｄ）７日目、１４日目及び２８日目の前房フレア等級（ＸＧ−１０２の９００μｇ対デキサメタゾン）
ｅ）７日目、１４日目及び２８日目の前房フレア等級（ＸＧ−１０２の９０μｇ対デキサメタゾン）
ｆ）救急薬の使用
ｇ）経時的な眼内炎症の進行
【０４８７】
安全性及び耐容性の転帰のパラメータ：
ａ）ＥＴＤＲＳ法による視力
ｂ）細隙灯検査所見
ｃ）眼底検査の結果
ｄ）眼内圧（ＩＯＰ）測定
ｅ）バイタルサイン（血圧（ＢＰ）、心拍（ＰＲ）及び律動）
ｆ）血液学及び化学実験室の試験の結果
ｇ）有害事象の発生
ｈ）患者のサブセット（約３０）における試験処理の投与１時間後の血漿中のＸＧ−１０２の存在（又はなし）
【０４８８】
本治験は、無作為化（１：１：１）、対照、二重盲検、多施設非劣性臨床治験であり、同じ大きさの３つの平行な群があった。無作為化は施設がブロックし、ウェブベースの確実な無作為化システムを使用して行った。適格な患者は、男性又は女性（閉経後、又は卵管結紮若しくは子宮摘出術によって不妊）であり、１８歳を超えており、かつ以下の眼の手術のうち１つを受けた：（ａ）前眼部及び後眼部の併用手術、これは白内障及び網膜剥離、白内障及び黄斑部網膜及び／又は白内障及び黄斑円孔の手術を含み得る、又は（ｂ）緑内障手術又は（ｃ）複雑な後眼部手術又は（ｄ）糖尿病性網膜症に関連する白内障手術及び／又は複雑な網膜剥離の眼の手術を含み得る、複雑な眼内手術。患者は、以下の除外基準のいずれかが無作為化の時に存在した場合、参加は不適格であった。
１．試験処置の投与の前１２週以内のなんらかの治験薬の投与。
２．デキサメタゾン点眼剤を処方する禁忌の存在。
３．抗感染性の処置に抵抗性である、持続的な真菌又は細菌の眼の感染の存在。
４．コルチコステロイド使用によって引き起こされることが公知の眼内高血圧の病歴。
５．角膜潰瘍、角膜穿孔又は不完全な上皮再形成に関連する病変の存在。
６．治験医の判定で、この試験に干渉し得るなんらかの外科的又は医学的条件の存在。
７．タンパク質型の薬物又はワクチンに対するなんらかの重度の有害反応又は過敏性の病歴。
８．季節性アレルギー反応（例えば：枯草熱、喘息）の現在の処置。
９．出産の可能性のある女性。
１０．試験において最大２８日目（すなわち、最終の訪問が行われる日）まで閉経期でない女性のパートナーとの有効な避妊法（例えば、併用した経口避妊薬又はバリア法）を使用する気がない男性。
１１．このプロトコールの条項に従う気がない患者。
【０４８９】
この試験は、１３８人の患者を、無作為化し、試験処置の結膜下注射を投与するように計画した。これは、試験処置の結膜下注射を投与しなかった無作為化した患者を置き換える試験プロトコールでも述べた。患者は、眼の手術の終わった後最大３時間内に２５０μｌの単回の結膜下注射として投与する、ＸＧ−１０２の９０μｇ若しくはは９００μｇのいずれかに、又は２１日間に１日あたり４回滴下するデキサメタゾン点眼剤に無作為に割り当てた。この最初の試験処置の点眼剤は、試験処置の結膜下注射後最大１５分内に滴下した。盲検を維持するために、ＸＧ−１０２群に無作為化した患者には、０．９％ＮａＣｌ溶液を含有する点眼剤を投与し、デキサメタゾン群に無作為化した患者には、０．９％ＮａＣｌを含有する結膜下注射を投与した。患者は全体で、試験処置の結膜下注射の投与後２８（±５）日間追跡した。患者は、試験プロトコールによって必要な場合、外来患者の診療所に戻って、訪問／検査を行った。下の表は、各訪問で行った手順／検査に加えて、計画した訪問スケジュールを示す。この試験プロトコールは、データ安全性モニタリング委員会（ＤＳＭＢ）が患者の安全性を監視することを担うものと計画した。これは、重篤な有害事象（ＳＡＥ）が、この試験の間に累積する患者データの再検討に加えて発生したので、ＳＡＥを再検討することによって達成される。データ再検討のタイミングに関する詳細は、ＤＳＭＢの趣意書に詳細であった。
【０４９０】
【表２２】
2020073573.tif 000027
【０４９１】
患者は、３つの試験群のうちの１つに無作為化した：
１．ＸＧ−１０２の９０μｇの単回結膜下注射＋２１日間の１日に４回のプラシーボ点眼剤、又は
２．ＸＧ−１０２の９００μｇの単回結膜下注射＋２１日間の１日に４回のプラシーボ点眼剤、又は
２．０．９％ＮａＣｌの単回結膜下注射＋２１日間の１日に４回のデキサメタゾン点眼剤。
【０４９２】
無作為化は施設がブロックし、ウェブベースの（すなわち、ｅ−ＳＯＣＤＡＴＴＭ）無作為化システムを使用して中央で行った。
【０４９３】
ＸＧ−１０２は、９０及び９００μｇの用量（２５０μｌの単回投与）で使用した。投与方式は、単回の結膜下注射であった。処置期間は、１回の単価投与（結膜下注射）であった。
【０４９４】
参照生成物デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）（Ｄｅｘａｆｒｅｅ（登録商標））は、１ｍｇ／ｍｌの用量で使用した。投与方式は、点眼剤であった（４回／日、２１日）。処置の期間は、２１日で、４回／日であった。
【０４９５】
プラシーボのＮａＣｌを、０．９％の用量で使用した。投与の方式は、単回結膜下注射（２５０μＬ）又は点眼剤（４回／日、２１日）であった。処置の期間は、１つの単回投与（結膜下注射）、及び点眼剤に関しては、２１日、４回／日であった。
【０４９６】
前の試験から得られた安全性及び予備の有効性データに加えて、前臨床の薬理学及び毒物学的な試験に基づいて、２つの用量（９０及び９００μｇのＸＧ−１０２）を、この治験に選択した。以前の試験では、９０及び９００μｇの用量の安全性プロフィールは同様であった。更に、眼内炎症の低下は、コルチコステロイド点眼剤と組み合わせて、両方の用量の群で同じ様式で挙動した。この研究でとった予防手段（ＤＳＭＢの役割、及び持続的な炎症の場合に非盲検の抗炎症処置を誘発する可能性）を考慮して、この試験に選択したＸＧ−１０２の用量は、一方では、患者の安全性を損なうとはみなされなかったが、他方では、この試験の目的のための意味のあるデータを提供するのに十分高かった。投与の結膜下経路は、治験中の診断された患者について意図した投与経路の１つである。なぜならば、この投与経路を使用する動物及びヒトで、安全性及び有効性の両方ともが示されているからである。この研究で選択された使用のための頻度（すなわち、１日あたり４滴）及び期間（すなわち、２１日）に加えて、デキサメタゾン用量（すなわち、０．４ｍｌの点眼剤あたり１ｍｇ／ｍｌ）が、術後眼炎症の臨床診療で使用される場合の、デキサメタゾン点眼剤に関する使用の標準的な用量／期間である。
【０４９７】
この試験プロトコールでは、試験処置の結膜下注射が、眼の手術の終わりの最大３時間内に投与されること、及びこの後、最大１５分内に最初の試験処置の点眼剤の滴下が続けられることを規定した。眼の手術の終わりの試験処置の投与は、試験の内容の一部である眼の外科手術に続く、抗炎症処置の投与のための標準的な慣用に従った。
【０４９８】
治験者も、患者も、ＣＣ（コーディネーティングセンター）の作業チームもスポンサーの人（市販後調査のスタッフ以外）も、無作為化の計画にはかかわらなかった。ＸＧ−１０２の溶液又はプラシーボ（すなわち、０．９％ＮａＣｌ溶液）を含む試験処置のバイアルは、外観及び稠度が同一であった。デキサメタゾン溶液又は０．９％ＮａＣｌのいずれかを含有する単回投与容器中の点眼剤溶液は、外観及び稠度が同一であった。試験処置の包装及び表示は、ＧＭＰ（製造管理及び品質管理に関する基準）及びＧＣＰ（医薬品臨床試験の実施基準）に従って行った。更に、試験処置パックに固定した表示の内容は、臨床治験のための地方条例に従った。各々の患者について、２つの同一に番号付けした試験処置パックを供給した。１つの試験処置「パック」は、患者の無作為化された処置群に応じて、１バイアルのＸＧ−１０２溶液（９０若しくは９００μｇ）又は１バイアルのプラシーボ（０．９％ＮａＣｌ）を含み、第２の「パック」は、２１日の間１日に４回の処置を可能にするのに十分な供給である、デキサメタゾン又はプラシーボ（０．９％ＮａＣｌ）のいずれかを含む単回用量の容器中に点眼剤溶液を含んだ。一旦患者に割り当てれば、試験処置パックの番号は、別の患者には割り当てなかった。患者の試験識別番号（すなわち、患者識別番号）は、試験処置を配った人が手でラベルに書いた。外側の試験処置ボックスのサイズ及び形状は、ＸＧ−１０２及びプラシーボ溶液に関して同一であった。患者の試験処置割り当ての情報が、関係する患者のさらなる医薬管理を決定するのに必要である緊急状態では、又は患者の処置の割り当ての情報が規制当局への報告目的に必要である場合は、盲検状態の治験者又はスポンサーが委託した市販後調査の担当者がそれぞれ、ｅ−ＳＯＣＤＡＴＴＭ内の保護されたウェブベースの治験特異的処置割り当てシステムを介して関係する患者の試験処置コードに対するユーザーアクセス権を有した。もし処置コードがいずれか１名の患者についてアクセスされた場合、試験処置コードアクセスに関係する全ての情報（すなわち、処置コードにアクセスした人の名前、理由、日付及び時間並びにコードにアクセスされた患者）は、試験処置コードがアクセスされた場合、追跡され、ウェブベースのシステムに記憶される。
【０４９９】
主な目的は、試験処置の結膜下投与の投与後２８日目での平均前房細胞等級で評価した。主な目的の評価の基準は以下であった。
ａ．２８日目の前房細胞等級（ＸＧ−１０２の９００μｇ対デキサメタゾン）。
【０５００】
二次的な目的の評価のための基準は、
ａ．２８日目の前房細胞等級（ＸＧ−１０２の９０μｇ対デキサメタゾン
ｂ．７日目及び１４日目の前房細胞等級（ＸＧ−１０２の９００μｇ対デキサメタゾン）
ｃ．７日目及び１４日目の前房細胞等級（ＸＧ−１０２の９０μｇ対デキサメタゾン）
ｄ．７日目、１４日目、及び２８日目の前房フレア等級（ＸＧ−１０２の９００μｇ対デキサメタゾン）
ｅ．７日目、１４日目、及び２８日目の前房フレア等級（ＸＧ−１０２の９０μｇ対デキサメタゾン）
ｆ．救急薬の使用
ｇ．取り除かれた眼の炎症によって評価した、眼内炎症の経時的な進行
であった。
【０５０１】
眼科的試験は、ベースラインで行った（すなわち、手術の日のいずれか、ただし手術前に行った）。その後、患者を、結膜下注射を施した２１（±３）時間後、次いで７（±１）、１４（±２）及び２８（±５）日後に見た。担当者による変動を低減するため、可能であれば、サイトを、同じ担当者がこの治験全体にわたって同じ患者について全ての眼科検査を行うべきであると指示した。眼科の測定は、試験に特有の指示に従って行った。後者は、開始の訪問の間、及び各モニタリングの訪問の間にサイトチームで再検討し、考察した。細胞／フレアカウント及び細胞／フレア等級の決定のために、ＳＵＮワーキンググループの意見を、ＳＵＮワーキンググループの定義を使用してサイトによって使用した（「Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｖｅｉｔｉｓ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄａｔａ．  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｒｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ．」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、第１４０巻、第３号、５０９〜５１６頁、２００５年）。
【０５０２】
安全性の評価のための基準は、
ａ．ＥＴＤＲＳ法による視力
ｂ．細隙灯検査の所見
ｃ．眼底検査の結果
ｄ．眼内圧（ＩＯＰ）測定
ｅ．バイタルサイン（血圧（ＢＰ）、心拍（ＰＲ）及び律動）
ｆ．血液学及び化学的実験の試験の結果
ｇ．有害事象の発生
ｈ．患者のサブセット（約３０）における試験処置の投与１時間後の血漿中のＸＧ−１０２の存在（又はなし）
【０５０３】
有害事象についての定義は以下であった：
有害事象（ＡＥ）とは、「医薬品を投与された患者におけるなんらかの有害な医学的事象であり、この処置との因果関係を必ずしも有しない事象」として定義される。したがって、ＡＥとは、医薬品と関連するとみなされようと、みなされまいと、その医薬品の使用と時間的に関連する、なんらかの好ましくない、かつ意図しない徴候、症状又は疾患である。
【０５０４】
ＡＥは、その事象が以下である場合に重篤とみなされた：
・死亡につながった
・命の危険があった
・そのために入院するか、又は現在の入院を延長する必要があった
・持続的又は重大な機能障害／就労不能を生じた
・処置期間の間に妊娠した子供での先天性の異常／出生異常を生じた
・医学的に重大で、かつ患者を危うくするか、又は、上記の転帰の１つを防ぐための介入を要する
【０５０５】
「重篤」の定義における「命の危険」という用語は、対象がその事象の時点で死亡のリスクがある事象を指した；これは、もしそれがより重度であれば、仮定として死亡の原因であり得たという事象を指すのではなかった。疑わしい、予期できない重篤な有害事象（ＳＵＳＡＲ）とは、予期されず（すなわち、投与されている試験処置の予想される転帰と一致しない）、かつ重篤である、処置に関する疑わしい有害反応として定義される。
【０５０６】
血漿中のＸＧ−１０２の定量（血漿）は、１つのサイトに位置する３２人の患者のサブセットで評価した。静脈血試料（２ｍｌ）は、試験処置の結膜下投与６０分後にＬｉ−Ｈｅｐａｒｉｎチューブを使用して得た。サンプリングを行った正確な時間は、ｅ−ＣＲＦで得られるスペースに入れた。血液試料を、室温で１０分間、２，５００ＲＰＭで遠心分離した。遠心分離後、ピペットを使用して、血漿を１．５ｍｌの凍結チューブに移した。次いで、その凍結チューブを−８０℃の冷凍庫に入れ、次いで、引き続き、温度データ自動記録装置とともにドライアイス中で、分析を担当する中央実験室に送った。中央実験室での受け入れの際に、その試料は、分析するまで−８０℃で保管した。
【０５０７】
統計学的方法：主な目的は、試験処置の結膜下注射後の２８日目、前房細胞等級に対するＸＧ−１０２の９００μｇとデキサメタゾン点眼剤との間の非劣性比較であった。この主な転帰は、計画書に適合した（ＰＰ）集団について分析し、最大分析対象集団（ＦＡＳ）で感受性の理由について繰り返した。デキサメタゾンに対するＸＧ−１０２の９００μｇの非劣性は、推定の差異の周囲の９５％ＣＩの上限が、０．５前房細胞等級を下回る場合に宣告され得る。第１の二次的なエンドポイント、ＸＧ−１０２の９０μｇ及びデキサメタゾンを比較する２８日目の前房細胞等級は、一次の転帰についてと同じ方式で分析した。全ての他の二次転帰を、０．００５という両側α値を使用してＦＡＳでの優性試験で評価した。安全性分析は、受けた処置によって、ＦＡＳ群で行った。
【０５０８】
本試験に含まれる患者の素因を図５９に示す。まとめると、１５７人の患者にインフォームドコンセントを行い、そのうち１５１人を無作為化した。１５１人の無作為化した患者のうち、６人には、試験処置の結膜下注射を施さなかった。試験プロトコールの要件に従って、これらの無作為化した患者を置き換えた。合計で、１４５人の患者には、試験処置の結膜下注射（すなわち、ＸＧ−１０２又はプラシーボ）を投与し、１４４人の患者が、この試験プロトコールで計画されたとおり試験を完了した。合計で、１人の患者が追跡を脱落した。以下の表に、３つの研究群について追跡の完全性を示す：
【０５０９】
【表２３】
2020073573.tif 000028
【０５１０】
最大分析対象集団（ＦＡＳ）は、試験処置の結膜下注射が開始／投与された全ての無作為化患者を含んだ。ＦＡＳ対象集団は、治療企図分析（ｉｎｔｅｎｔｉｏｎ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ）原理に従って分析し、すなわち、患者は、彼らが受けた処置に関わりなく無作為化された処置群で評価した。更に、データは、許された時間ウインドウの外で行った訪問についてはＦＡＳ解析対象集団から除いた。
【０５１１】
ＰＰ分析対象集団は、ＦＡＳのサブセットであった。追跡の間、非盲検抗炎症処置の無作為化及び／又は導入後、いずれかの主要な違反のために念のため、ＰＰ解析データ対象集団から患者を除外した。更に、データは、許された時間ウインドウの外で行った訪問についてはＰＰ分析対象集団から除いた。
【０５１２】
安全性対象集団は、試験処置の結膜下注射が開始／投与された全ての無作為化患者を含んだ。患者は、処置どおり、すなわち、彼らが受けた処置に応じて分析した。安全性対象集団は、安全性分析の主な分析対象集団であった。
【０５１３】
ベースラインの特徴及び同時罹患率は、ＦＡＳ及びＰＰ集団の両方に関して３つの処置群の間でバランスをとった。下の表は、ＰＰ分析集団のための処置群による主なベースライン同時罹患率のいくつかを示す。網膜剥離を有する患者のパーセンテージは、ＸＧ−１０２の９００μｇ（４１％）及びデキサメタゾン群（４０％）に比較して、ＸＧ−１０２の９０μｇ（５２％）に割り当てられた患者では高かったが、糖尿病を有する患者のパーセンテージは、ＸＧ−１０２の９０μｇ群（２２％）及びデキサメタゾン群（２６％）に比較してＸＧ−１０２の９００μｇ群（３３％）に無作為化された患者では高かった。
【０５１４】
【表２４】
2020073573.tif 000029
【０５１５】
以下の表は、処置群によって、ＰＰ分析集団について行った手術の種類に加えて、ベースラインでの眼の手術の特定を示す。複雑な後眼部手術を受けた患者のパーセンテージは、ＸＧ−１０２の９００μｇ（４６％）及びデキサメタゾン群（４２％）に割り当てられた患者に比較して、ＸＧ−１０２の９０μｇ（５０％）に割り当てられた患者では高かった。ベースラインで行われた手術の間に、ガス（ＳＦ６又はＣ２Ｆ６）が注入された各処置群の患者のパーセンテージは、それぞれ、４３％（ＸＧ−１０２の９０μｇ）、３７％（ＸＧ−１０２の９００μｇ）及び３８％（デキサメタゾン）であった。
【０５１６】
【表２５】
2020073573.tif 000030
【０５１７】
２８日目での前房細胞等級−ＸＧ−１０２の９００μｇ対デキサメタゾン：
主要エンドポイントを、調節した反復測定モデルを使用して、ＸＧ−１０２の９００μｇの用量を、デキサメタゾン群と比較して、２８日目の前房細胞等級の平均の差異として分析した。７、１４及び２８日目の訪問で収集したデータのみを、反復モデルで使用した。主な分析は、ＰＰ分析データ対象集団で行い、感度分析は、ＦＡＳデータ対象集団で行った。第１の二次的な転帰のために、すなわち、２８日目の前房細胞等級（ＸＧ−１０２の９０μｇ対デキサメタゾン）非劣性を、主要エンドポイントと同じ方式で、０．５前房細胞等級という同じ非劣性マージンを使用して決定した。ＰＰ分析集団のための試験処置の結膜下注射の投与後２８日目までの平均の前房細胞等級を、図６０に、３つの処置群、すなわち、ＸＧ−１０２の９０μｇ、ＸＧ−１０２の９００μｇ及びデキサメタゾンについて示すが、統計学的モデルの結果は、以下の表に示す：
【０５１８】
【表２６】
2020073573.tif 000031
【０５１９】
第１の二次的転帰に加えて、主な転帰の結果を、ＰＰ及びＦＡＳデータ対象集団の両方について図６１に示す。ＸＧ−１０２の９００μｇは、２８日目の前房細胞等級で評価したように、術後眼内炎症の進行におけるデキサメタゾン点眼剤に対して非劣性であった（−０．０５４の前房細胞等級の差異、９５％の信頼区間（ＣＩ）−０．３５０−０．２４２、ｐ＜０．００１）。同じ分析をＦＡＳで繰り返し、ＸＧ−１０２の９００μｇは、デキサメタゾン点眼剤に対して非劣性であることが見出された（差異−０．０３２細胞等級、９５％のＣＩ−０．３０１−０．２３８、ｐ＜０．００１）。もし上限境界がＦＡＳ及びＰＰ分析対象集団についてゼロと交差したならば、ＸＧ−１０２の９００μｇは、２８日目の前房細胞等級について、デキサメタゾン点眼剤に対して優性ではなかった（ＦＡＳについてｐ＝０．８１８、及びＰＰ分析対象集団についてｐ＝０．７２０）。
【０５２０】
２８日目の前房細胞等級−ＸＧ−１０２の９０μｇ対デキサメタゾン：
ＸＧ−１０２の９０μｇとデキサメタゾン点眼剤とを比較する二次的エンドポイントを考慮すれば、ＸＧ−１０２の９０μｇは、術後眼内炎症の進行においてデキサメタゾンに対して非劣性であった（差異０．０８６前房細胞等級、９５％のＣＩ−０．２１４−０．３８５、ｐ＝０．００３）。同じ分析を、ＦＡＳで繰り返し、及びＸＧ−１０２の９０μｇは、デキサメタゾン点眼剤に対して非劣性であることが見出された（０．０５３前房細胞等級の差異、９５％のＣＩ−０．２１５−０．３２１  ｐ＜０．００１）。
【０５２１】
ＸＧ−１０２の９０μｇ対デキサメタゾン及びＸＧ−１０２の９００μｇ対デキサメタゾンについて７及び１４日目の前房細胞等級：
ＸＧ−１０２の９０μｇ対デキサメタゾン及びＸＧ−１０２の９００μｇ対デキサメタゾンについて７日目及び１４日目の前房細胞等級についての統計学的分析を、ＦＡＳデータ対象集団で行った。ＸＧ−１０２の９０μｇとデキサメタゾンとの間の前房細胞等級、及びＸＧ−１０２の９００μｇとデキサメタゾンとの間の前房細胞等級には、７日目又は１４日目のいずれでも、統計学的に有意な差異はなかった。
【０５２２】
ＸＧ−１０２の９０μｇ対デキサメタゾン及びＸＧ−１０２の９００μｇ対デキサメタゾンについて７、１４及び２８日目の前房フレア等級：
２８日目までに得た前房フレア等級（ＦＡＳについて）を、図６２に示し、そのモデルの結果を、下の表に示す。ＸＧ−１０２の９０μｇとデキサメタゾンとの間の前房フレア等級、及びＸＧ−１０２の９００μｇとデキサメタゾンとの間の前房フレア等級には、７日目又は１４日目又は２８日目のいずれでも統計学的に有意な差異はなかった。
【０５２３】
【表２７】
2020073573.tif 000032
【０５２４】
除去された眼の炎症：
眼の炎症の経時的な評価を、除去された眼の炎症によって評価した。この炎症は、前房細胞等級＝０及び前房フレア等級＝０として定義された等級０のまとめられた眼の炎症スコアを有した対象の割合として定義された。この転帰は、７、１４及び２８日目に評価し、ＸＧ−１０２の９００μｇとデキサメタゾン、及びＸＧ−１０２の９０μｇとデキサメタゾンとを比較する。ＦＡＳ及びＰＰ集団のまとめた統計的結果を、下の表に示す。ＸＧ−１０２の９００μｇ群に割り当てた患者について、通常のケア群と比較して、ＦＡＳで行った分析を考慮して、炎症が除去されているオッズは、術後７日目には、０．７６（９５％のＣＩ  ０．２５−２．２８）、術後１４日目は、１．２５（９５％のＣＩ  ０．４７−３．３２）及び術後２８日目は、１．１３（９５％のＣＩ  ０．４９−２．６０）であった。通常のケア群と比較して、ＸＧ−１０２の９０μｇ群に割り当てられた患者を考慮すれば、炎症が除去されているオッズは、術後７日目には、０．５２（９５％のＣＩ  ０．１５−１．８３）、術後１４日目には、０．８５（９５％のＣＩ  ０．３０−２．４０）及び術後２８日目には、１．２４（９５％のＣＩ  ０．５４−２．８７）であった。ＸＧ−１０２の９００μｇ群に割り当てられた患者について、通常のケア群と比較して、ＰＰ分析対象集団で行った分析を考慮して、炎症が除去されているオッズは、術後７日目には、０．８４（９５％のＣＩ  ０．２８−２．４６）、術後１４日目には、１．１２（９５％のＣＩ  ０．４１−３．０５）及び術後２８日目には、１．２６（９５％のＣＩ  ０．５２−３．０４）であった。通常のケア群と比較して、ＸＧ−１０２の９０μｇ群に割り当てられた患者を考慮すれば、炎症が除去されているオッズは、術後７日目には、０．５６（９５％のＣＩ  ０．１６−１．９７）、術後１４日目には、０．９７（９５％のＣＩ  ０．３４−２．７７）及び術後２８日目には、１．４５（９５％のＣＩ  ０．５８−３．６１）であった。
【０５２５】
【表２８】
2020073573.tif 000033
【０５２６】
レーザーフレアメーター（ＬＦＭ）：
試験全体にわたって規定の時点で得られたＬＦＭ測定を、図６３においてＦＡＳについて経時的にかつ２８日目までＬＦＭ測定として示す。
【０５２７】
救急医薬は、治験者が判定するように持続的な眼の炎症のために、追跡の間に患者に処方された、なんらかの非盲検の抗炎症性の眼の処置として試験プロトコールで定義した。この試験プロトコールでは、試験処置点眼剤が、非盲検の抗炎症性の眼の処置の導入で停止されることを規定した。救急医薬がＸＧ−１０２の９０μｇ群に導入された患者のパーセンテージは、デキサメタゾン群と比較した場合、統計的に異なったが（それぞれ、ＸＧ−１０２の９０μｇ及びデキサメタゾン群について２１．３％対４．０％（ｐ＝０．０１３））、ＸＧ−１０２の９００μｇとデキサメタゾンとの間の差異（２つの群についてそれぞれ、１４．６％及び４．０％）は、統計学的に有意ではなかった（ｐ＝０．８８）。
【０５２８】
血漿中の薬物動態：
ＸＧ−１０２の定量のための血液サンプリングは、３２人の患者のサブセットにおいてＸＧ−１０２の結膜下投与６０分後に行った。血漿中のＸＧ−１０２の定量の分析的な報告によって、ＸＧ−１０２は、どの患者についても血漿試料中で検出されなかったことが示される（以下の表を参照のこと）：
【０５２９】
【表２９】
2020073573.tif 000034
【０５３０】
まとめると、ＸＧ−１０２の９００μｇは、術後の眼内炎症の進行において、デキサメタゾン点眼剤に対して非劣性であった（−０．０５４の前房細胞等級の差異、９５％のＣＩ−０．３５０−０．２４２、ｐ＜０．００１）。同じ分析を、ＦＡＳに対して繰り返し、ＸＧ−１０２の９００μｇが、デキサメタゾン点眼剤に対して非劣性であることを見出した（差異−０．０３２細胞等級、９５％のＣＩ−０．３０１−０．２３８、ｐ＜０．００１）。もし上限境界がＦＡＳ及びＰＰ分析対象集団についてゼロと交差したならば、ＸＧ−１０２の９００μｇは、２８日目の前房細胞等級について、デキサメタゾン点眼剤に対して優性ではなかった（ＦＡＳについてｐ＝０．８１８、及びＰＰ分析対象集団についてｐ＝０．７２０）。
【０５３１】
ＸＧ−１０２の９０μｇとデキサメタゾン点眼剤とを比較する二次的なエンドポイントを考慮すれば、ＸＧ−１０２の９０μｇは、術後の眼内炎症の進行においてデキサメタゾン眼に対して非劣性であった（差異０．０８６前房細胞等級、９５％のＣＩ−０．２１４−０．３８５、ｐ＝０．００３）。同じ分析を、ＦＡＳで繰り返し、ＸＧ−１０２の９０μｇは、デキサメタゾン点眼剤に対して非劣性であることが見出された（０．０５３の差異、前房細胞等級、９５％のＣＩ−０．２１５−０．３２１ｐ＜０．００１）。
【０５３２】
ＸＧ−１０２の９０μｇとデキサメタゾンとの間の前房細胞等級及びＸＧ−１０２の９００μｇとデキサメタゾンとの間の前房細胞等級には、７日目又は１４日目のいずれでも統計学的に有意な差異はなかった。ＸＧ−１０２の９０μｇとデキサメタゾンとの間の前房フレア等級及びＸＧ−１０２の９００μｇとデキサメタゾンとの間の前房フレア等級に７日目、又は１４日目、又は２８日目のいずれでも統計学的に有意な差異はなかった。
【０５３３】
眼の炎症の経時的な評価は、眼の炎症の除去によって評価された。この炎症は、前房細胞等級＝０及び前房フレア等級＝０として定義された等級０のまとめられた眼の炎症スコアを有した対象の割合として定義された。この転帰は、７、１４及び２８日目に評価し、ＸＧ−１０２の９００μｇとデキサメタゾン、及びＸＧ−１０２の９０μｇとデキサメタゾンとを比較する。ＸＧ−１０２の９００μｇ群に割り当てた患者について、通常のケア群と比較して、ＦＡＳで行った分析を考慮して、炎症が除去されているオッズは、術後７日目には、０．７６（９５％のＣＩ  ０．２５−２．２８）、術後１４日目は、１．２５（９５％のＣＩ  ０．４７−３．３２）及び術後２８日目は、１．１３（９５％のＣＩ  ０．４９−２．６０）であった。通常のケア群と比較して、ＸＧ−１０２の９０μｇ群に割り当てられた患者を考慮すれば、炎症が除去されているオッズは、術後７日目には、０．５２（９５％のＣＩ  ０．１５−１．８３）、術後１４日目には、０．８５（９５％のＣＩ  ０．３０−２．４０）及び術後２８日目には、１．２４（９５％のＣＩ  ０．５４−２．８７）であった。
【０５３４】
安全性評価
曝露の程度：
この試験は、二重盲検試験であった。無作為化され、結膜下注射が開始された全ての患者は、用量群による安全性分析に含まれる。処置の救急のＡＥのみ、すなわち、試験処置の結膜下注射の開始後に生じたＡＥのみを分析した。試験処置の点眼剤が時期を早めて停止された場合（すなわち、２１日目の前）、関係する患者は、試験プロトコールに従って、２８日目まで追跡を続けた。試験処置の結膜下注射を、１４５人の患者に投与し、全部で４７人の患者に、ＸＧ−１０２を９０μｇ投与し、４８人の患者にＸＧ−１０２の９００μｇを投与し、デキサメタゾン群に割り当てた５０人の患者には０．９％ＮａＣｌを投与した。試験処置の結膜下注射を開始した全ての患者について、試験処置の総量（すなわち、２５０μＬ）を投与した。
【０５３５】
試験処置点眼剤のための患者による曝露を、下の表に示す。試験処置点眼剤を考慮すれば、試験プロトコールによって必要とされる場合、試験処置点眼剤の滴下との全体的なコンプライアンスが３つの試験群で９０％を超えていた。ＸＧ−１０２処置群に割り当てられた患者は、コンプライアンスは９１％であったデキサメタゾン群に対して割り当てられた患者と比較して、試験処置点眼剤の滴下とわずかに高いコンプライアンスを有した（ＸＧ−１０２の９０μｇ及びＸＧ−１０２の９００μｇについてそれぞれ、９５％及び９４％）。５０人の患者は、平均２０日の間、デキサメタゾン点眼剤を投与され（６〜２１日、最小−最大）、最大累積用量は８１滴であった（８１×０．０５ｍｇ＝４．０５ｍｇ）。
【０５３６】
【表３０】
2020073573.tif 000035
【０５３７】
有害事象
用量群による有害事象のまとめ：
報告された有害事象の概要（重篤及び非重篤）を用量群によって図６４に示す。ＸＧ−１０２の９０μｇとデキサメタゾン群との間、及びＸＧ−１０２の９００μｇとデキサメタゾン群との間にＡＥが報告された患者の数に関して、統計学的に有意な差異はなかった。ＸＧ−１０２の９０μｇに割り当てられた患者については、全部で７８例のＡＥが、この群に割り当てられた３１／４７（６６％）の患者について報告され、ＸＧ−１０２の９００μｇに割り当てられた患者については、全部で６９例のＡＥが３２／４８（６７％）の患者について報告された。デキサメタゾン群に割り当てられた患者については、全部で５５例のＡＥが、２９／５０（５８％）の患者について報告された。試験処置の投与後２４時間内にＡＥを経験した患者のパーセンテージは、３つの試験処置群の間で同様であった（すなわち、ＸＧ−１０２の９０μｇ、ＸＧ−１０２の９００μｇ及びデキサメタゾン群についてそれぞれ、３４％、２７％及び３０％）。
【０５３８】
重症度及び用量群による報告されたＡＥの分布を、下の表に示す。報告されたＡＥのほとんど（約７０％）が、治験者によって３つの用量群について「軽度」であるとみなされた。
【０５３９】
【表３１】
2020073573.tif 000036
【０５４０】
試験処置の点眼剤の中断をもたらしたＡＥのまとめた概要を、以下の表に用量群によって示す。
【０５４１】
【表３２】
2020073573.tif 000037
【０５４２】
ＸＧ−１０２の９０μｇ用量群に割り当てられた患者については、１１の事象（この用量群における全ての報告されたＡＥのうち１４％）が、試験処置の早期の離脱につながったが、ＸＧ−１０２の９００μｇ及びデキサメタゾン用量群では、試験処置の点眼剤は、それぞれ、８つの事象（この用量群の全ての報告されたＡＥのうち１２％）及び３つの事象（この用量群の全ての報告されたＡＥのうち６％）について中断された。
【０５４３】
治験者らは、任意の試験処置に対する各々の報告されたＡＥの関係を（盲検式で）評価した。治験者が「可能性がある（ｐｏｓｓｉｂｌｅ）」又は「おそらく（ｐｒｏｂａｂｌｅ）」のいずれかにこの質問に対する返事としてチェックを付けた場合、ある事象が試験処置に関連するとみなした。更に、治験者は、その事象が関連するとみなした試験処置（すなわち、ＸＧ−１０２又はデキサメタゾン）を特定しなければならなかった（下の表を参照のこと）。ＡＥは、治験者によって、ＸＧ−１０２の９０μｇの患者について報告された１８の事象について、ＸＧ−１０２の９００μｇの患者で報告された１３の事象について、及びデキサメタゾン群の患者で報告された１５の事象について、試験医薬に関連する可能性があるか、又はおそらく関連すると（盲検の評価で）みなされた（下の表を参照のこと）。報告されたＳＡＥのうちで、試験処置のいずれかに関連する可能性があるか、又はおそらく関連すると治験者がみなしたＳＡＥの報告はなかった。
【０５４４】
【表３３】
2020073573.tif 000038
【０５４５】
有害事象の提示：
報告された事象は、治験者が「可能性がある」又は「おそらく」のいずれかに、ｅ−ＣＲＦに対する「試験処置に関連する」質問に対する返事としてチェックを付けた場合、試験処置に関連するとみなした。３つの試験群のいずれかに対して無作為化された患者のうち少なくとも２％について報告されたＡＥのまとめ（ＭｅｄＤＲＡ  ＳＯＣ及びＰＴ期間によってソートした）を図６５に見出し得る。
【０５４６】
有害事象の分析
全体として、ＡＥが報告された患者の数に関して、ＸＧ−１０２用量群及びデキサメタゾン用量群のいずれの間にも統計学的に有意な差異はなかった。ＸＧ−１０２の９０μｇに割り当てられた患者については、全部で７８例のＡＥが、この群に割り当てられた３１／４７（６６％）の患者について報告され、及びＸＧ−１０２の９００μｇに割り当てられた患者については、全部で６９例のＡＥが３２／４８（６７％）について報告された。デキサメタゾン群に割り当てられた患者については、全部で５５例のＡＥが、２９／５０（５８％）について報告された。試験処置の投与後２４時間内にＡＥを経験した患者のパーセンテージは、３つの試験処置群の間で同様であった（すなわち、ＸＧ−１０２の９０μｇ、ＸＧ−１０２の９００μｇ及びデキサメタゾン群についてそれぞれ、３４％、２７％及び３０％）。
【０５４７】
最も高頻度に報告されたＡＥは、ＳＯＣ’ＥＹＥ  ＤＩＳＯＲＤＥＲＳにあった。このＳＯＣの中で、４９例の事象が、ＸＧ−１０２の９０μｇに割り当てられた２６人（５５％）の患者について報告され、４３例の事象が、ＸＧ−１０２の９００μｇに割り当てられた２４人（５０％）の患者について報告され、そして３０例の事象が、デキサメタゾンに割り当てられた１６人（３２％）の患者について報告された。このＳＯＣである事象が報告された患者の数に関してＸＧ−１０２の９０μｇとデキサメタゾン群との間に統計学的に有意な差異はなかった（ｐ＝０．０２５）。炎症を思わせる事象（例えば、「眼の炎症」、「角膜浮腫」、「眼瞼の浮腫」）は、ＸＧ−１０２の９００μｇ又はデキサメタゾン用量群のいずれかに割り当てられた患者と比較してＸＧ−１０２の９０μｇに割り当てられた患者にはより高頻度に報告された。眼の疼痛は、ＸＧ−１０２の９００μｇ群に割り当てられた患者にはより高頻度に報告され、デキサメタゾン群と比較した場合、この事象が報告された患者の数の差異は、統計学的に有意であった（ｐ＝０．０２９）。ＳＯＣ「検討」のうちで、「眼内圧上昇」は、ＸＧ−１０２の９０μｇに割り当てられた患者については、ＸＧ−１０２の９００μｇ及びデキサメタゾン群についてのそれぞれ１０％及び１４％と比較して、より高頻度に報告された（２３％）。この事象が報告された患者の数の差異（ＸＧ−１０２の９０μｇとデキサメタゾンとの間）は、統計学的に有意ではなかった。試験処置点眼剤は、ＸＧ−１０２の９０μｇに割り当てられた１１人の患者について、ＸＧ−１０２の９００μｇに割り当てられた８人の患者について、及びデキサメタゾンに割り当てられた３人の患者についてのＡＥのために中断された。図６５は、無作為化群にかかわらず、少なくとも２％の患者について生じたＡＥのまとめ（ＭｅｄＤＲＡ  ＳＯＣ及び好ましい期間（ＰＴ）によってソートした）を提示する。
【０５４８】
重篤な有害事象
懸念される重篤な有害事象を、図６６に列挙する。全部で、９つのＳＡＥが９人の患者に関して（すなわち、ＸＧ−１０２の９０μｇ用量群に無作為化された４人の患者について、ＸＧ−１０２の９００μｇ用量群に無作為化された３人の患者について、及びデキサメタゾン用量群に対して無作為化された２人の患者について）報告された。全部で、１例のＳＡＥ（ＸＧ−１０２の９０μｇ用量群に対して無作為化された患者に関して）が、試験処置の結膜下注射の投与後最初の２４時間内に報告された。治験者が試験処置に関連するとみなした報告されたＳＡＥはなかった。全ての報告されたＳＡＥについて「重篤性の理由」は「入院」であった。報告されたＳＡＥの概説を図６６に示す。
【０５４９】
臨床実験室評価
この試験に行った血液学及び化学アッセイを、以下の表に示す。全ての実験室の試験は、地方で行った。
【０５５０】
【表３４】
2020073573.tif 000039
【０５５１】
安全性の結論
全体として、ＸＧ−１０２の９０μｇ及びＸＧ−１０２の９００μｇは、複雑な眼科手術を行った患者でよく耐容された。試験処置の点眼剤は、ＸＧ−１０２の９０μｇに対して無作為化された１１人の患者について、ＸＧ−１０２の９００μｇに対して無作為化された８人の患者について、及びデキサメタゾン対して無作為化された３人の患者について時期を早めて停止された。試験処置の早期の離脱の理由は、主に、治験者の意見で、抗炎症性処置の増強が必要な持続的な眼の炎症のためであった。懸念される患者に関しては、非盲検の抗炎症の眼の処置による処置が開始された。この試験で報告された致死性の事象はなかった。全部で、９例のＳＡＥが９人の患者に報告され、これらの事象のうち試験処置に関連するとみなされたものはなかった。
【０５５２】
報告されたＡＥの全体的な数を考慮すると、ＸＧ−１０２用量群のいずれかとデキサメタゾン群との間に、ＡＥが報告された患者の数に関して統計学的に有意な差異はなかった。ＸＧ−１０２の９０μｇに割り当てられた患者に関して、全部で７８例のＡＥが、この群に割り当てられた３１／４７（６６％）の患者について報告され、ＸＧ−１０２の９００μｇに割り当てられた患者について、全部で６９例のＡＥが３２／４８（６７％）の患者について報告された。デキサメタゾン群に割り当てられた患者については、全部で５５例のＡＥが、２９／５０（５８％）の患者について報告された。試験処置の投与後２４時間内にＡＥを経験した患者のパーセンテージは、３つの試験処置群の間で同様であった（すなわち、ＸＧ−１０２の９０μｇ、ＸＧ−１０２の９００μｇ及びデキサメタゾン群についてそれぞれ、３４％、２７％及び３０％）。眼の炎症を思わせるＡＥを経験した患者の数は、ＸＧ−１０２の９００μｇ及びデキサメタゾン群に比較して、ＸＧ−１０２の９０μｇ群に割り当てられた患者では高く、これによって、ＸＧ−１０２の９０μｇは、複雑な眼の手術に対する二次的な眼の炎症の処置では有効性が劣る場合があることが示唆される。眼の疼痛を思わせるＡＥを経験した患者の数は、ＸＧ−１０２の９０μｇ及びデキサメタゾン群に比較して、ＸＧ−１０２の９００μｇ群に割り当てられた患者では高かった。ＸＧ−１０２の９０μｇ群における２人の患者について、眼の疼痛が試験処置の結膜下注射の後２４時間未満で報告され−これらの患者のうち１人については、鎮痛剤処置は、術後には処方されなかった。これらの患者のうち１人については、眼の疼痛は再度、３５日後、ＡＥとして報告され、これは患者がＩＯＰの上昇があったと報告されたのと同じ時点であった。
【０５５３】
ＸＧ−１０２の９００μｇ群における３人の患者について、眼の疼痛が試験処置の結膜下注射の注射２４時間未満の後に報告され、これらの患者のうちの１人について、眼の疼痛が再度、５日後にＡＥとして報告された。同じ用量群の４人の患者について、眼の疼痛は、同時の試験処置の結膜下注射の後２４時間を超えて報告された。これらの患者のうちの３人について、眼の疼痛は、他のＡＥと同時に報告された。眼の疼痛は、同時の試験処置の結膜下注射の後２４時間を超えてデキサメタゾン群で１人の患者について報告された。この事象は、別のＡＥと同時に報告された。複雑な手術が行われるならば、眼の疼痛はまた、手術後の縫合の存在にも関連し得る。
【０５５４】
要約
コンプライアンス：試験処置の結膜下注射を開始した全ての患者について、総量（すなわち、２５０μＬ）を投与した。３つの試験処置群では、試験処置点眼剤との全体的なコンプライアンスは９０％超であった。
【０５５５】
安全性：有害事象が報告された患者の数に関して、いずれのＸＧ−１０２用量群及びデキサメタゾン群の間にも統計学的に有意な差異はなかった。ＸＧ−１０２の９０μｇに割り当てられた患者について、全部で７８例の有害事象が、この群に割り当てられた３１／４７（６６％）の患者について報告され、ＸＧ−１０２の９００μｇに割り当てられた患者について、全部で６９例の有害事象が３２／４８（６７％）の患者について報告された。デキサメタゾン群に割り当てられた患者については、全部で５５例の有害事象が、２９／５０（５８％）の患者について報告された。試験処置の投与後２４時間内に有害事象を経験した患者のパーセンテージは、３つの試験処置群の間で同様であった（すなわち、ＸＧ−１０２の９０μｇ、ＸＧ−１０２の９００μｇ及びデキサメタゾン群についてそれぞれ、３４％、２７％及び３０％）。ＸＧ−１０２の９００μｇ及びデキサメタゾン群に比較して、ＸＧ−１０２の９０μｇ群に割り当てられた患者では眼の炎症を思わせる有害事象を経験した患者が、より多く、これによって、ＸＧ−１０２の９０μｇは、複雑な眼の手術に対する二次的な眼の炎症の処置では有効性が劣る（９００μｇ及びデキサメタゾン投与群に比較して）場合があることが示唆され得る。眼の疼痛を思わせる有害事象を経験した患者の数は、ＸＧ−１０２の９０μｇ及びデキサメタゾン群に比較して、ＸＧ−１０２の９００μｇ群に割り当てられた患者では高かった。眼の疼痛は、手術後の縫合の存在にも関連し得る。「眼内圧上昇」は、ＸＧ−１０２の９０μｇに割り当てられた患者については、ＸＧ−１０２の９００μｇ及びデキサメタゾン群についてのそれぞれ１０％及び１４％と比較して、より高頻度に報告された（２３％）。この事象が報告された患者の数の差異（ＸＧ−１０２の９０μｇとデキサメタゾンとの間は、統計学的に有意ではなかった）。
【０５５６】
全ての報告された有害事象（ＡＥ）のほとんど（約７０％）が、治験者によって「軽度」であるとみなされた。全部で、ＡＥは、治験者によって、ＸＧ−１０２の９０μｇの患者について報告された１８の事象について、ＸＧ−１０２の９００μｇの患者で報告された１３の事象について、及びデキサメタゾン群の患者で報告された１５の事象について、試験医薬に関連する可能性があるか、又はおそらく関連すると（盲検の評価で）みなされた。この試験で報告された致死性の事象はなかった。全部で、９つのＳＡＥが、９人の患者について報告され、これらの事象のうちで、試験処置に関連するとみなされたものはなかった。
【０５５７】
ＸＧ−１０２の定量は、３２人の患者のサブセットで行った。血液試料は、試験処置の結膜下注射の１時間後に得た。得られた全ての試料について（割り当てられた用量群にかかわらず）、ＸＧ−１０２濃度は、１０ｎｇ／ｍｌ未満という定量下限（ＬＬＯＱ）未満であると分析された。
【０５５８】
非劣性の我々の定義によれば、単回の結膜下注射として投与されたＸＧ−１０２の９００μｇ及びＸＧ−１０２の９０μｇの両方とも、複雑な眼の手術を受けた患者において、前房細胞等級で評価した場合、術後の眼内炎症の処置において２１日間に１日あたり４回滴下されたデキサメタゾン点眼剤での処置に対して非劣性であった。
【０５５９】
全体として、ＸＧ−１０２の９０μｇ及びＸＧ−１０２の９００μｇはよく耐容された。ＸＧ−１０２の耐容不能か、又は不可逆的な副作用を思わせる報告された有害事象はなかった。ＸＧ−１０２の９０μｇで報告された眼の炎症を思わせる事象の数の増大によって、この用量は、複雑な眼内手術後の患者の術後眼内炎症の処置に有効性が低いことが示唆される。これはまた、ＸＧ−１０２の９０μｇにおける持続的な眼の炎症に起因して救急医薬が導入された患者の割合によってもおそらく支持される。試験処置の結膜下注射の投与１時間後に評価したＸＧ−１０２の血漿定量によって、ＸＧ−１０２の全身的な通過は無いことが実証された。
【０５６０】
実施例２８
ｐ−３８（Ｍａｐｋ１４）欠損マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの肝細胞癌に対するＸＧ−１０２の効果
Ｍａｐｋ１４は、ｐ−３８としても公知であり、細胞増殖及び腫瘍形成の周知の負の調節因子である。この試験では、Ｍａｐｋ１４ｆ／ｆ及びＭａｐｋ１４Δｌｉ＊マウス、同様にＭａｐｋ１４ｆ／ｆＪｕｎｆ／ｆ及びＭａｐｋ１４Δｌｉ＊ＪｕｎΔｌｉ＊マウスを使用した。「Ｍａｐｋ１４Δｌｉ＊」、及び「Ｍａｐｋ１４Δｌｉ＊ＪｕｎΔｌｉ＊」はそれぞれ、本明細書においてポリＩＣ処置したＭｘ−ｃｒｅ／Ｍａｐｋ１４ｆ／ｆマウス、及びＭｘ−ｃｒｅ欠失Ｍａｐｋ１４ｆ／ｆＪｕｎｆ／ｆマウスをそれぞれ意味し、これによって、Ｍａｐｋ１４「欠失」及びＪｕｎ欠失を、それぞれ、Ｍｘ−ｃｒｅプロセスによって、すなわち、「Ｍａｐｋ１４−／−」マウス、及び「Ｍａｐｋ１４−／−Ｊｕｎ−／−」マウスをそれぞれ生じた。
【０５６１】
ＸＧ−１０２は、２０ｍｇ／ｋｇの用量で週に２回腹腔内に投与して、ジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）誘発性の肝細胞の過剰増殖及び肝腫瘍細胞に対するその効果を研究した（Ｈｕｉ  Ｌ．ら、ｐ３８ａ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ＪＮＫ−ｃ−Ｊｕｎ  ｐａｔｈｗａｙ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００７；３９：７４１−７４９頁を参照のこと）。ＰＢＳを対照として使用した。具体的には、Ｍａｐｋ１４ｆ／ｆ及びＭａｐｋ１４Δｌｉ＊マウスに、ＤＥＮ処置の前にＰＢＳ又はＸＧ−１０２（体重１ｋｇあたり２０ｍｇ）のいずれかを注射した。次いで、マウスにおける肝細胞増殖を、ＤＥＮ処置の４８時間後Ｋｉ６７染色によって分析し、定量した。
【０５６２】
図６７は、左側のパネルにおいて、肝細胞の増殖（Ｋｉ６７陽性細胞の定量）を、ＸＧ−１０２（この図では「Ｄ−ＪＮＫＩ１」と呼ばれる）又はＰＢＳ処置したＭａｐｋ１４ｆ／ｆ及びＭａｐｋ１４Δｌｉ＊マウスにおいて示す。ＰＢＳ条件（対照）では、Ｍａｐｋ１４−／−細胞（Ｍａｐｋ１４Δｌｉ＊）は、Ｍａｐｋ１４＋／＋細胞（Ｍａｐｋ１４ｆ／ｆ）よりも集中的に増殖している。なぜなら、細胞増殖及び腫瘍形成に対するＭａｐｋ１４（ｐ３８）の負の調節は、存在しないからである。ＸＧ−１０２の投与は、ＸＧ−１０２（ＤＪＮＫＩ１）の活性によって、（Ｍａｐｋ１４−／−細胞において）Ｍａｐｋ１４のこの「非活性」を逆戻しする。
【０５６３】
図６７の右のパネルでは、ＸＧ−１０２（この図では「Ｄ−ＪＮＫＩ１」と呼ばれる）で処置したＭａｐｋ１４ｆ／ｆＪｕｎｆ／ｆ（Ｍａｐｋ１４＋／＋Ｊｕｎ＋／＋を意味する）及びＭａｐｋ１４Δｌｉ＊ＪｕｎΔｌｉ＊マウス（Ｍａｐｋ１４−／−Ｊｕｎ−／−を意味する）における肝細胞の増殖（Ｋｉ６７陽性細胞の定量）を示す。この結果は、ＰＢＳ条件におけるＭａｐｋ１４ｆ／ｆの結果、及びＸＧ−１０２（ＤＪＮＫＩ１）条件におけるＭａｐｋ１４Δｌｉ＊の結果と等価でかつ似ている。したがって、ＸＧ−１０２活性は、この細胞株ではＪｕｎ遺伝子を欠失するのに「等価」である。
【０５６４】
まとめると、これらの結果、ＸＧ−１０２は、癌細胞株の増殖に対する活性を有し（Ｍａｐｋ１４欠失によって誘発される過剰な増殖を逆転する）、これは、おそらくＪｕｎによって媒介されることが確認される。
【０５６５】
実施例２９
ｉｎ  ｖｉｖｏでの移植されたヒト肝臓癌細胞に対するＸＧ−１０２の効果
ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト肝臓癌細胞に対するＸＧ−１０２の効果を研究するために、３×１０６個のＨｕｈ７ヒト肝臓癌細胞を、４週齢のヌードマウスの両方のわき腹に皮下に注射した。ヌードマウスは、Ｈｕｈ７注射後に、ＸＧ−１０２を用いて腹腔内に週に２回５ｍｇ／ｋｇで処置した。腫瘍容積は、週に２回測定した。マウスは、異種移植の４週後に殺傷した。
【０５６６】
図６８に示されるとおり、ヌードマウスにおけるヒト肝細胞癌の皮下注射後毎週２回腹腔内投与したＸＧ−１０２は、５ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍増殖を顕著に低下した。
【０５６７】
実施例３０
同所性のＨＥＰ  Ｇ２ヒト肝臓癌を保有するＳｗｉｓｓヌードマウスにおける１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２の抗腫瘍活性
この研究の目的は、同所性のＨｅｐ  Ｇ２ヒト肝臓癌腫瘍を保有するＳＷＩＳＳヌードマウスのモデルにおける１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２の抗腫瘍活性を決定することであった。
【０５６８】
２０匹の健常な雌性ＳＷＩＳＳヌードマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。動物実験は、動物実験の欧州の倫理ガイドライン、及び実験的新生物における動物の福祉に関する英国のガイドラインに従って行った。その動物は、温度（２３±２℃）、湿度（４５＋５％）、光周期（１２時間明／１２時間暗）及び空気交換という制御された条件下で、室内で維持した。動物は、ＳＰＦ条件で維持し、かつ室温及び湿度は連続してモニターした。空気取扱いシステムは、１時間あたり１４回の空気交換にプログラムし、再循環はしなかった。新鮮な外側の空気を一連のフィルターを通過させた後に、各部屋に均一に拡散させた。実験室では高圧（２０±４Ｐａ）を維持して、汚染も、マウスのコロニー内の病原体の伝播も防いだ。ＳＰＦ条件下で働く全ての人は、彼らが動物飼育エリアに入るとき、衛生及び衣類に関する特定のガイドラインに従った。動物を、食物と水を提供するように装備されている、ポリカーボネートケージ（ＵＡＲ、Ｅｐｉｎａｙ  ｓｕｒ  Ｏｒｇｅ、Ｆｒａｎｃｅ）で飼育した。使用した標準のエリアのケージは、８００ｃｍ２であり、内部の標準操作手順に従って１ケージあたり最大１０匹のマウスとした。動物の寝床は、無菌の木の削りくず（ＳＥＲＬＡＢ、Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）であり、週に１回置き換えた。動物の食物は、ＳＥＲＬＡＢ（Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。無菌の制御された細粒の種類は、ＤＩＥＴＥＸであった。食物は自由に与え、ケージの上の金属の蓋に入れておいた。水も、ゴム栓とシッパーチューブとを装備した水ボトルから自由に摂らせた。水ボトルは、洗浄し、水を充填し、ろ過によって滅菌し、週に２回置き換えた。
【０５６９】
ＸＧ−１０２投与のために、ストック溶液は、滅菌水（ＷＦＩ、Ａｇｕｅｔｔａｎｔ）中で、１０ｍＭで調製した（３８．２２ｍｇ／ｍｌに相当する）。アリコートを、各処置日に調製し、約−８０℃で保管した。このストック溶液の、ＷＦＩを用いた０．２ｍｇ／ｍｌまでの希釈を、各処置日に行い、２〜４℃で最大２４時間保管した。ストック溶液の安定性は、約−８０℃で１００日を超え；動物投与のための希釈された処方物の安定性は、２〜４℃で２４時間である。希釈された処方物は、使用するまで氷上で維持し、未使用の希釈された物質は廃棄した。ＸＧ−１０２の処置用量は、１ｍｇ／ｋｇ／注射で注射した。注射は、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１８、Ｄ２２、Ｄ４１、Ｄ４５、Ｄ４９及びＤ５３の日に行った（［Ｑ４Ｄ×４］×２）。ＸＧ−１０２物質は、マウスの尾静脈を介して５ｍｌ／ｋｇを静脈内に（ＩＶ）注射した。注射容積は、マウスの直近の個々の体重に応じて適合させた。
【０５７０】
腫瘍細胞株及び培養培地は、Ｏｎｃｏｄｅｓｉｇｎから購入した。
【０５７１】
【表３５】
2020073573.tif 000040
【０５７２】
Ｈｅｐ  Ｇ２細胞株は、１９７５年に肝細胞癌を有する１５歳のアルゼンチン人の少年の腫瘍組織から樹立した（ＡＤＥＮ  Ｄ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，２８２：６１５〜６１６頁、１９７９年）。腫瘍細胞は、加湿された雰囲気で（５％ＣＯ２、９５％空気）、３７℃で、付着単層として増殖した。培養培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｒｅｆ  ＢＥ１２−７０２Ｆ、Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含み、かつ１０％ＦＢＳ（Ｒｅｆ  ＤＥ１４−８０１Ｅ、Ｌｏｎｚａ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０であった。実験的な使用のために、細胞を、培養フラスコから、トリプシン−ヴェルセン（ｔｒｙｐｓｉｎ−ｖｅｒｓｅｎｅ）（Ｒｅｆ  ０２−００７Ｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ）での５分の処理によって剥がし、カルシウム、マグネシウム不含ハンクス培地（Ｒｅｆ  ＢＥ１０−５４３Ｆ、Ｃａｍｂｒｅｘ）中で希釈し、完全培養培地の添加によって中和した。細胞を、血球計でカウントし、それらの生存度を、０．２５％トリパンブルー排除で評価した。マイコプラズマ検出は、製造業者の指示に従って、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）マイコプラズマ検出キット（Ｒｅｆ  ＬＴ０７−３１８、Ｌｏｎｚａ）を使用して行った。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）アッセイは、マイコプラズマの酵素の活性を活用する選択的な生化学試験である。生きているマイコプラズマは溶解され、その酵素が、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）基質と反応し、ＡＴＰへのＡＤＰの変換を触媒する。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）基質の添加の前後の両方で試料中のＡＴＰのレベルを測定することによって、マイコプラズマの有無の指標である比を得てもよい。マイコプラズマ試験は、細胞株の培養上清から二連でアッセイし、陰性及び陽性の対照と比較した（ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）Ａｓｓａｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｅｔ  Ｒｅｆ  ＬＴ０７−５１８、Ｌｏｎｚａ）（社内標準操作手順番号ＴＥＣ−００７／００２、データは示さないが、記録した）。
【０５７３】
実験設計：
腫瘍誘発２４時間前、２０匹の雌性ＳＷＩＳＳヌードマウスに、γ線源（２．５Ｇｙ、Ｃｏ６０、ＩＮＲＡ、Ｄｉｊｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を照射した。Ｄ０に、Ｈｅｐ  Ｇ２腫瘍を、２０匹の雌性ＳＷＩＳＳヌードで同所性に誘発した。麻酔下で、動物の腹部を、正中切開によって無菌条件下で開いた。５０μｌのＲＰＭＩ  １６４０培養培地中に懸濁した一千万個（１０７）のＨｅｐ  Ｇ２腫瘍細胞を、肝臓の被膜下領域に注射した。腹腔を続いて、５〜０の縫合糸を用いて２つの層で閉じた。
【０５７４】
Ｄ１０に、マウスをその体重によって処置開始の前に無作為化して、１０匹のマウスの２つの群を形成した。各々の群の体重は、他の群の体重と統計学的に異なることはなかった（分散分析）。第１群由来のマウスには、ビヒクルを１回のＩＶ注射の５ｍｌ／ｋｇ／注射で、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１８、Ｄ２２、Ｄ４１、Ｄ４５、Ｄ４９及びＤ５３に（［Ｑ４Ｄ×４］×２）及び第２群由来のマウスには、１回のＩＶ注射のＸＧ−１０２を１ｍｇ／ｋｇ／注射で、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１８、Ｄ２２、Ｄ４１、Ｄ４５、Ｄ４９及びＤ５３（［Ｑ４Ｄ×４］ｘ２）に与えた。：
【０５７５】
【表３６】
2020073573.tif 000041
【０５７６】
生きているマウスを、Ｄ１８５に屠殺した。
【０５７７】
マウスを、行動及び生存について試験全体にわたって毎日モニターした。体重は、全てのマウスについて、試験全体にわたって週に２回モニターした。イソフルラン（登録商標）Ｆｏｒｅｎｅ（Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ、Ｂｏｎｄｏｕｆｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して動物を麻酔した後に、細胞注射、ＩＶ処置及び屠殺した。実験の経過の間、以下のいずれかが起きた場合、イソフルラン（登録商標）での麻酔下で頸椎脱臼によって動物を殺傷した：
・苦痛の徴候（悪液質、衰弱、動くか又は食べることが困難）、
・化合物の毒性（丸くなる、けいれん）、
・３連続する日に２０％の体重低下、又はいずれかの日に２５％の体重低下。
【０５７８】
剖検は、各々の場合に行った。マウスが瀕死に見えた場合、それらを屠殺して、剖検した。肝臓を収集し、秤量した。
【０５７９】
体重分析のために、マウスの体重曲線を引いた。平均体重変化（ＭＢＷＣ）：処置した動物の平均体重変化のグラム数（Ｘ日目の体重マイナスＤ１０の体重）を算出した。
【０５８０】
有効性パラメータは、パーセント（Ｔ／Ｃ％）として表した。Ｔは、薬物で処置した動物の中央生存時間であり、Ｃは、ビヒクルで処置した対照動物の中央生存時間である。生存システムによって、Ｔ／Ｃパーセントが１２５を超えるとき、成功の程度が示された。Ｔ／Ｃ％は以下のように表した：Ｔ／Ｃ％＝［Ｔ／Ｃ］×１００。マウスの生存曲線を引いた。平均生存時間は、死亡の日数の平均として各群の処置について算出した。中央生存時間は、死亡の日数の中央値として各群の処置について算出した。ログランク（カプラン−マイヤー）検定を使用して、生存曲線を比較した。体重及びＭＢＷＣの統計学的分析を、ＳｔａｔＶｉｅｗ（登録商標）ソフトウェア（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＵＳＡ）を使用してボンフェローニ／ダン検定（ＡＮＯＶＡ比較）を使用して行った。ｐ値＜０．０５を有意とみなす。全ての群を、それ自体と比較した。
【０５８１】
図６９では、同所性に注射したＨＥＰ  Ｇ２腫瘍を保有するマウスの平均体重及び平均体重変化曲線を示す。マウスは、Ｑ４Ｄ×４処置スケジュールを、２回、Ｄ１０及びＤ４１に繰り返した後、ＸＧ−１０２を用いて、１ｍｇ／ｋｇ／注射でＩＶ処置した。図６９に示されるとおり、体重について出現した見かけの差異はなく、このことは、ＸＧ−１０２がよく耐容されることを示している。したがって、図７０では、それぞれの統計学的データが示される。
【０５８２】
図７１は、マウスの長い生存曲線を示しており、ここでは、屠殺日（Ｄ１８５）までの１群あたりの生存マウスの割合を示す。マウスは、２回、Ｄ１０及びＤ４１に繰り返したＱ４Ｄ×４処置スケジュール後に示した用量のＸＧ−１０２で処置した。これらのデータによって、ＸＧ−１０２で処置したマウスについての生存の延長が明確に示される。したがって、統計学的データが下に示される（ＨｅｐＧ２腫瘍を異種移植し、ＸＧ−１０２で処置したマウスの生存分析）：
【０５８３】
【表３７】
2020073573.tif 000042
【０５８４】
マウス生存時間は、中央生存時間として、Ｔ／Ｃ（％）値（処置群の死亡の日の中央値と、腫瘍を保有する未処置の対照群の死亡の日の中央値との間の比）で表した。統計学的分析は、ログランク検定で行い、参照としてビヒクル処置群をとった。
【０５８５】
まとめると、これらのデータによって、ＸＧ−１０２の投与は、ＨｅｐＧ２腫瘍を異種移植されたマウスの生存時間を延長することが示される。
【０５８６】
実施例３１
同所性ＨＥＰ  Ｇ２ヒト肝臓癌を保有するＳｗｉｓｓヌードマウスでのＸＧ−１０２（用量／応答）の抗腫瘍活性
この試験の目的は、同所性のＨｅｐ  Ｇ２ヒト肝臓癌腫瘍を保有するＳＷＩＳＳヌードマウスのモデルで、ＸＧ−１０２の抗腫瘍活性（用量／応答）を決定することであった。
【０５８７】
３２匹の健常な雌性ＳＷＩＳＳヌードマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。動物実験は、動物実験の欧州の倫理ガイドライン、及び実験的新生物における動物の福祉に関する英国のガイドラインに従って行った。その動物は、温度（２３±２℃）、湿度（４５＋５％）、光周期（１２時間明／１２時間暗）及び空気交換という制御された条件下で、室内で維持した。動物は、ＳＰＦ条件で維持し、かつ室温及び湿度は連続してモニターした。空気取扱いシステムは、１時間あたり１４回の空気交換にプログラムし、再循環はしなかった。新鮮な外側の空気を一連のフィルターを通過させた後に、各部屋に均一に拡散させた。実験室では高圧（２０±４Ｐａ）を維持して、汚染も、マウスのコロニー内の病原体の伝播も防いだ。ＳＰＦ条件下で働く全ての人は、彼らが動物飼育エリアに入るとき、衛生及び衣類に関する特定のガイドラインに従った。動物を、食物と水を提供するように装備されている、ポリカーボネートケージ（ＵＡＲ、Ｅｐｉｎａｙ  ｓｕｒ  Ｏｒｇｅ、Ｆｒａｎｃｅ）で飼育した。使用した標準のエリアのケージは、８００ｃｍ２であり、内部の標準操作手順に従って１ケージあたり最大１０匹のマウスとした。動物の寝床は、無菌の木の削りくず（ＳＥＲＬＡＢ、Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）であり、週に１回置き換えた。動物の食物は、ＳＥＲＬＡＢ（Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。無菌の制御された細粒の種類は、ＤＩＥＴＥＸであった。食物は自由に与え、ケージの上の金属の蓋に入れておいた。水も、ゴム栓とシッパーチューブとを装備した水ボトルから自由に摂らせた。水ボトルは、洗浄し、水を充填し、ろ過によって滅菌し、週に２回置き換えた。
【０５８８】
ＸＧ−１０２投与のために、ＸＧ−１０２は、滅菌水（ＷＦＩ、Ａｇｕｅｔｔａｎｔ、Ｆｒａｎｃｅ）中で、１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した。次いで、これを、滅菌水を用いて０．２及び０．０２ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。これらのステップ全ては、マウスに注射する前１時間内に行った。ＸＧ−１０２は、０．１、１及び５ｍｇ／ｋｇ／注射で注射した。各々４日間で区切った４回の注射を行った（Ｑ４Ｄ×４）。ＸＧ−１０２物質は、マウスの尾静脈を介して５ｍｌ／ｋｇを静脈内に（ＩＶ）注射した。注射容積は、マウスの直近の個々の体重に応じて適合させた。
【０５８９】
腫瘍細胞株及び培養培地は購入し、Ｏｎｃｏｄｅｓｉｇｎから提供された。
【０５９０】
【表３８】
2020073573.tif 000043
【０５９１】
Ｈｅｐ  Ｇ２細胞株は、１９７５年に肝細胞癌を有する１５歳のアルゼンチン人の少年の腫瘍組織から樹立した（ＡＤＥＮ  Ｄ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，２８２：６１５〜６１６頁、１９７９年）。腫瘍細胞は、加湿された雰囲気で（５％ＣＯ２、９５％空気）、３７℃で、付着単層として増殖した。培養培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｒｅｆ  ＢＥ１２−７０２Ｆ、Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含み、かつ１０％ＦＢＳ（Ｒｅｆ  ＤＥ１４−８０１ＥＬｏｎｚａ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０であった。実験的な使用のために、細胞を、培養フラスコから、トリプシン−ヴェルセン（ｔｒｙｐｓｉｎ−ｖｅｒｓｅｎｅ）（Ｒｅｆ  ０２−００７Ｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ）での５分の処理によって剥がし、カルシウム、マグネシウム不含ハンクス培地（Ｒｅｆ  ＢＥ１０−５４３Ｆ、Ｃａｍｂｒｅｘ）中で希釈し、完全培養培地の添加によって中和した。細胞を、血球計でカウントし、それらの生存度を、０．２５％トリパンブルー排除で評価した。マイコプラズマ検出は、製造業者の指示に従って、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）マイコプラズマ検出キット（Ｒｅｆ  ＬＴ０７−３１８、Ｌｏｎｚａ）を使用して行った。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）アッセイは、マイコプラズマの酵素の活性を活用する選択的な生化学試験である。生きているマイコプラズマは溶解され、その酵素が、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）基質と反応し、ＡＴＰへのＡＤＰの変換を触媒する。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）基質の添加の前後の両方で試料中のＡＴＰのレベルを測定することによって、マイコプラズマの有無の指標である比を得てもよい。マイコプラズマ試験は、細胞株の培養上清から二連でアッセイし、陰性及び陽性の対照と比較した（ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）Ａｓｓａｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｅｔ  Ｒｅｆ  ＬＴ０７−５１８、Ｌｏｎｚａ）（社内標準操作手順番号ＴＥＣ−００７／００２）。
【０５９２】
実験設計：
腫瘍誘発２４時間前、３２匹の雌性ＳＷＩＳＳヌードマウスに、γ線源（２．５Ｇｙ、Ｃｏ６０、ＩＮＲＡ、Ｄｉｊｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を照射した。Ｄ０に、Ｈｅｐ  Ｇ２腫瘍を、３２匹の雌性ＳＷＩＳＳヌードマウスで同所性に誘発した。麻酔下で、動物の腹部を、正中切開によって無菌条件下で開いた。５０μｌのＲＰＭＩ  １６４０培養培地中に懸濁した一千万個（１０７）のＨｅｐ  Ｇ２腫瘍細胞を、肝臓の被膜下領域に注射した。腹腔を続いて、５〜０の縫合糸を用いて２つの層で閉じた。
【０５９３】
Ｄ１０に、マウスをその体重によって処置開始の前に無作為化して、８匹のマウスの４つの群を形成した。各々の群の体重は、他の群の体重と統計学的に異なることはなかった（分散分析）。第１群由来のマウスには、ビヒクルを１回のＩＶ注射の５ｍｌ／ｋｇ／注射で、４日ごとに１回を４回繰り返して与え（Ｑ４Ｄ×４）、第２群由来のマウスには、１回のＩＶ注射のＸＧ−１０２を０．１ｍｇ／ｋｇ／注射で、４日ごとに１回を４回繰り返して与え（Ｑ４Ｄ×４）、第３群由来のマウスには、１回のＩＶ注射のＸＧ−１０２を１ｍｇ／ｋｇ／注射で、４日ごとに１回を４回繰り返して与え（Ｑ４Ｄ×４）、第４群由来のマウスには、１回のＩＶ注射のＸＧ−１０２を５ｍｇ／ｋｇ／注射で、４日ごとに１回を４回繰り返して与えた（Ｑ４Ｄ×４）。
【０５９４】
【表３９】
2020073573.tif 000044
【０５９５】
生存マウスを、Ｄ１７１に屠殺した。
【０５９６】
マウスを、行動及び生存について試験全体にわたって毎日モニターした。体重は、全てのマウスについて、試験全体にわたって週に２回モニターした。イソフルラン（登録商標）Ｆｏｒｅｎｅ（Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ、Ｂｏｎｄｏｕｆｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して動物を麻酔した後に、細胞注射、ＩＶ処置及び屠殺した。実験の経過の間、以下のいずれかが起きた場合、イソフルラン（登録商標）での麻酔下で頸椎脱臼によって動物を殺傷した：
・苦痛の徴候（悪液質、衰弱、動くか又は食べることが困難）、
・化合物の毒性（丸くなる、けいれん）、
・３連続する日に２０％の体重低下、又はいずれかの日に２５％の体重低下。
剖検は各々の場合に行った。
【０５９７】
Ｄ６７に、無作為化の間に１群あたりに無作為に選択された３匹のマウスを、巨視的な発達の観察のために屠殺した。各々の群における残りのマウスを、生存モニタリングのために保持した。最終の屠殺は、Ｄ１７１に行った。原発性の腫瘍及び肝臓を、屠殺した動物から収集し、秤量した。各々の肝臓を１０％の中性の緩衝化ホルマリン中で固定した。収集の４８時間後、それらをパラフィン（Ｈｉｓｔｏｓｅｃ（登録商標））中に包埋し、解剖病理学分析に使用した。組織学的分析によるマウス肝臓の転移性浸潤の評価のために、パラフィン包埋切片（５μｍ）を、キシレン中で脱パラフィンし、１００％、９５％、及び７０％エタノール中の連続インキュベーションによって再水和した。全ての切片を、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）（Ｒｅｆ．Ｓ３３０９、Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｔｒａｐｐｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、組織学的分析のために染色した。カバースリップを、水性の包埋剤（Ａｑｕａｔｅｘ、Ｒｅｆ  １．０８５６２、Ｍｅｒｃｋ）でマウントし、切片を光学顕微鏡（ＤＭＲＢ  Ｌｅｉｃａ）下で見た。組織学的切片は、病理学者の専門家が分析して肝臓での転移性浸潤を決定した。
【０５９８】
体重分析のために、マウスの体重曲線を引いた。平均体重変化（ＭＢＷＣ）：処置した動物の平均体重変化のグラム数（Ｘ日目の体重マイナスＤ１０の体重）を算出した。
【０５９９】
有効性パラメータは、パーセント（Ｔ／Ｃ％）として表した。Ｔは、薬物で処置した動物の中央生存時間であり、Ｃは、ビヒクルで処置した対照動物の中央生存時間である。生存システムによって、Ｔ／Ｃパーセントが１２５を超えるとき、成功の程度が示された。Ｔ／Ｃ％は以下のように表した：Ｔ／Ｃ％＝［Ｔ／Ｃ］×１００。マウスの生存曲線を引いた。平均生存時間は、死亡の日数の平均として各群の処置について算出した。中央生存時間は、死亡の日数の中央値として各群の処置について算出した。ログランク（カプラン−マイヤー）検定を使用して、生存曲線を比較した。体重及びＭＢＷＣの統計学的分析を、ＳｔａｔＶｉｅｗ（登録商標）ソフトウェア（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＵＳＡ）を使用してボンフェローニ／ダン検定（ＡＮＯＶＡ比較）を使用して行った。ｐ値＜０．０５を有意とみなす。全ての群を、それ自体と比較した。
【０６００】
図７２では、同所性に注射したＨＥＰ  Ｇ２腫瘍を保有するマウスの平均体重及び平均体重変化曲線に関する統計学的なデータを示す。マウスは、Ｑ４Ｄ×４処置スケジュールを、２回、Ｄ１０及びＤ４１に繰り返した後、ＸＧ−１０２を用いてＩＶ処置した。図７２に示されるとおり、体重について出現した見かけの差異はなく、このことは、ＸＧ−１０２がよく耐容されることを示している。
【０６０１】
図７３は、マウスの長い生存曲線を示しており、ここでは、屠殺日（Ｄ１７１）までの１群あたりの生存マウスの割合を示す。剖検のためにＤ６７に屠殺したマウスは、算出から除外した。マウスは、２回、Ｄ１０及びＤ４１に繰り返したＱ４Ｄ×４処置スケジュール後に示した用量のＸＧ−１０２で処置した。これらのデータによって、ＸＧ−１０２で処置したマウスについての用量依存性の方式での生存の延長が明確に示される。したがって、統計学的データが下に示される（ＨｅｐＧ２腫瘍を異種移植し、ＸＧ−１０２で処置したマウスの生存分析）：
【０６０２】
【表４０】
2020073573.tif 000045
【０６０３】
剖検のためにＤ６７に屠殺したマウスは、算出から除外した。マウス生存時間は、中央生存時間として、Ｔ／Ｃ（％）値（処置群の死亡の日の中央値と、腫瘍を保有する未処置の対照群の死亡の日の中央値との間の比）で表した。１２５％を超えるＴ／Ｃ％値が、抗腫瘍有効性の指標である。
【０６０４】
下の表は、肝臓へのＨｅｐＧ２癌細胞の腫瘍発達を示す。肝臓での腫瘍質量の検出は、Ｄ１７１に屠殺されたマウスでのＨＥ染色後の顕微鏡的観察によって行った：
【０６０５】
【表４１】
2020073573.tif 000046
【０６０６】
図７４では、Ｄ６７に、又はＤ６７と最終の屠殺との間で屠殺されたマウスの顕微鏡評価で観察される腫瘍浸潤を、ヒストグラム提示として示す。腫瘍取り込みのレベルは、図の凡例に特定した４つの異なるカテゴリーに分類した。
【０６０７】
実施例３２
皮下のＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍を保有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＸＧ−１０２の抗腫瘍活性
この試験の目的は、皮下のＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍を保有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスのモデルにおけるＸＧ−１０２の抗腫瘍活性（用量／応答）を決定することであった。
【０６０８】
１５匹の健常雄性Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。動物実験は、動物実験の欧州の倫理ガイドライン、及び実験的新生物における動物の福祉に関する英国のガイドラインに従って行った。その動物は、温度（２３±２℃）、湿度（４５＋５％）、光周期（１２時間明／１２時間暗）及び空気交換という制御された条件下で、室内で維持した。動物は、ＳＰＦ条件で維持し、かつ室温及び湿度は連続してモニターした。空気取扱いシステムは、１時間あたり１４回の空気交換にプログラムし、再循環はしなかった。新鮮な外側の空気を一連のフィルターを通過させた後に、各部屋に均一に拡散させた。実験室では高圧（２０±４Ｐａ）を維持して、汚染も、マウスのコロニー内の病原体の伝播も防いだ。ＳＰＦ条件下で働く全ての人は、彼らが動物飼育エリアに入るとき、衛生及び衣類に関する特定のガイドラインに従った。動物を、食物と水を提供するように装備されている、ポリカーボネートケージ（ＵＡＲ、Ｅｐｉｎａｙ  ｓｕｒ  Ｏｒｇｅ、Ｆｒａｎｃｅ）で飼育した。使用した標準のエリアのケージは、８００ｃｍ２であり、内部の標準操作手順に従って１ケージあたり最大１０匹のマウスとした。動物の寝床は、無菌の木の削りくず（ＳＥＲＬＡＢ、Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）であり、週に１回置き換えた。動物の食物は、ＳＥＲＬＡＢ（Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。無菌の制御された細粒の種類は、ＤＩＥＴＥＸであった。食物は自由に与え、ケージの上の金属の蓋に入れておいた。水も、ゴム栓とシッパーチューブとを装備した水ボトルから自由に摂らせた。水ボトルは、洗浄し、水を充填し、ろ過によって滅菌し、週に２回置き換えた。
【０６０９】
ＸＧ−１０２投与のために、ＸＧ−１０２は、滅菌水（ＷＦＩ、Ａｇｕｅｔｔａｎｔ）中で、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した。次いで、これを、滅菌水を用いて０．０２ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。これらのステップ全ては、マウスに注射する前１時間内に行った。ＸＧ−１０２は、０．１、及び１ｍｇ／ｋｇ／注射で注射した。各々４日間で区切った４回の注射を行った（Ｑ４Ｄ×４）。ＸＧ−１０２物質は、マウスの尾静脈を介して５ｍｌ／ｋｇを静脈内に（ＩＶ）注射した。注射期間の間の尾の壊死の場合、腹腔内（ＩＰ）経路を使用した。注射容積は、マウスの直近の個々の体重に応じて適合させた。
【０６１０】
腫瘍細胞株及び培養培地は、Ｏｎｃｏｄｅｓｉｇｎから購入した。
【０６１１】
【表４２】
2020073573.tif 000047
【０６１２】
ＰＣ−３は、６２歳の白人男性由来の等級ＩＶの膵臓腺癌の骨転位から生じた（ＶＯＬＥＮＥＣ  Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  １９８０；１３（１）：３９〜４４頁）。腫瘍細胞は、加湿された雰囲気で（５％ＣＯ２、９５％空気）、３７℃で、付着単層として増殖した。培養培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｒｅｆ  ＢＥ１２−７０２Ｆ、Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含み、かつ１０％ＦＢＳ（Ｒｅｆ  ＤＥ１４−８０１Ｅ、Ｌｏｎｚａ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０であった。実験的な使用のために、細胞を、培養フラスコから、トリプシン−ヴェルセン（ｔｒｙｐｓｉｎ−ｖｅｒｓｅｎｅ）（Ｒｅｆ  ０２−００７Ｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ）での５分の処理によって剥がし、カルシウム、マグネシウム不含ハンクス培地（Ｒｅｆ  ＢＥ１０−５４３Ｆ、Ｃａｍｂｒｅｘ）中で希釈し、完全培養培地の添加によって中和した。細胞を、血球計でカウントし、それらの生存度を、０．２５％トリパンブルー排除で評価した。マイコプラズマ検出は、製造業者の指示に従って、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）マイコプラズマ検出キット（Ｒｅｆ  ＬＴ０７−３１８、Ｌｏｎｚａ）を使用して行った。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）アッセイは、マイコプラズマの酵素の活性を活用する選択的な生化学試験である。生きているマイコプラズマは溶解され、その酵素が、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）基質と反応し、ＡＴＰへのＡＤＰの変換を触媒する。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）基質の添加の前後の両方で試料中のＡＴＰのレベルを測定することによって、マイコプラズマの有無の指標である比を得てもよい。マイコプラズマ試験は、細胞株の培養上清から二連でアッセイし、陰性及び陽性の対照と比較した（ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）Ａｓｓａｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｅｔ  Ｒｅｆ  ＬＴ０７−５１８、Ｌｏｎｚａ）（社内標準操作手順番号ＴＥＣ−００７／００２）。
【０６１３】
実験設計：
腫瘍誘発４８時間前、１５匹のＢａｌｂ／ｃヌードマウスに、γ線源（２．５Ｇｙ、Ｃｏ６０、ＩＮＲＡ、Ｄｉｊｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を照射した。Ｄ０に、２００μｌのＲＰＭＩ培地中に懸濁した二千万（２×１０７）個のＰＣ−３細胞を、６０匹の雄性Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの右わき腹に皮下注射した。
【０６１４】
平均腫瘍容積が８０±３８ｍｍ３に達したとき、マウスをその腫瘍容積によって処置開始の前に無作為化して、５匹のマウスの３つの群を形成した。各々の群の腫瘍容積は、他の群と有意に異なることはなかった（分散分析）。
【０６１５】
試験物質の処置スケジュールは以下のとおりであった：第１群由来のマウスには、ビヒクルを１回のＩＶ注射の５ｍｌ／ｋｇ／注射で、４日ごとに１回を４回繰り返して与え（Ｑ４Ｄ×４）、第２群由来のマウスには、ＸＧ−１０２を１回のＩＶ注射の０．１ｍｇ／ｋｇ／注射で、４日ごとに１回を４回繰り返して与え（Ｑ４Ｄ×４）、第３群由来のマウスには、ＸＧ−１０２を１回のＩＶ注射の１ｍｇ／ｋｇ／注射で、４日ごとに１回を４回繰り返して与えた（Ｑ４Ｄ×４）。
【０６１６】
【表４３】
2020073573.tif 000048
【０６１７】
腫瘍が２０００ｍｍ３という最大容積に達したとき、マウスを屠殺した。
【０６１８】
マウスを、行動及び生存について試験全体にわたって毎日モニターした。体重及び腫瘍容積は、全てのマウスについて、試験全体にわたって週に２回モニターした。イソフルラン（登録商標）Ｆｏｒｅｎｅ（Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ、Ｂｏｎｄｏｕｆｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して動物を麻酔した後に、細胞注射、ＩＶ処置及び屠殺した。実験の経過の間、以下のいずれかが起きた場合、イソフルラン（登録商標）での麻酔下で頸椎脱臼によって動物を殺傷した：
・苦痛の徴候（悪液質、衰弱、動くか又は食べることが困難）、
・化合物の毒性（丸くなる、けいれん）、
・３連続する日に２０％の体重低下、又はいずれかの日に２５％の体重低下。
・腫瘍２０００ｍｍ３を超える腫瘍容積
剖検は各々の場合に行った。
【０６１９】
体重分析のために、マウスの体重曲線を引いた。少なくとも１つの群で４０％を超える死亡したマウスが記録されたとき、曲線を終わりにした。平均体重変化（ＭＢＷＣ）：処置した動物の平均体重変化のグラム数（Ｘ日目の体重マイナスＤ３３の体重）を算出した。
【０６２０】
腫瘍容積は、長さが最大腫瘍径に相当し、かつ幅が最小腫瘍径に相当する以下の式で算出した：ＴＶ＝（長さ×幅２）／２。腫瘍増殖曲線は、平均腫瘍容積（ＭＴＶ）＋／−ＳＤを使用して引いた。４０％を超えるマウスが死亡したとき、曲線を終わりにした。個々の腫瘍容積の曲線も引いた。下に示すように算出した異なる時点の相対的な腫瘍容積（ＲＴＶ）を使用して、相対的な腫瘍容積曲線を引いた。曲線は、マウスのうち４０％超が死亡した時に終わりにした。ＲＴＶは以下の式に従って算出した：
ＲＴＶ＝（ＤＸの腫瘍容積）／（Ｄ３３の腫瘍容積）×１００
対数腫瘍増殖期の間の２００％のＭＴＶに達するのに必要な期間として定義された腫瘍倍加時間（ＤＴ）は、Ｖｉｖｏ  Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェアを使用して算出した。Ｖに達する時間を算出した。容積Ｖは、実験データから推定され、腫瘍増殖の指数関数期に選択された標的容積として定義した。容積Ｖは、各々の群の全てのマウスについてできるだけ狭く選択し、この容積Ｖに達するまでの時間は、実験データから推定した。ビヒクル処置群に対する処置群の中央腫瘍容積の比として定義した腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ％）を算出した。ＮＣＩ標準によるＴ／Ｃ％比についての有効な基準は、約４２％である（ＢＩＳＳＥＲＹ  Ｍ．Ｃ．ら、Ｂｕｌｌ．Ｃａｎｃｅｒ  １９９１、７８：５８７〜６０２頁）。全ての統計学的分析は、Ｖｉｖｏ  Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェアを使用して行った。毒性及び処置の有効性（ＢＷＣ、ＭＢＷＣ、ＴＶ、ＲＴＶ、ＴＴＲＶ及びＤＴ）の統計学的分析は、ボンフェローニ／ダン検定（ＡＮＯＶＡ比較）を使用して行った。全ての群を、お互いに対して比較した。
【０６２１】
図７５では、抗腫瘍活性実験の間のＰＣ−３腫瘍保有マウスの平均腫瘍容積を示す。Ｄ３３に、５匹の動物の３つの群を、ビヒクル及びＸＧ−１０２（０．１及び１ｍｇ／ｋｇ／注射、Ｑ４Ｄ×４）で処置した。これらのデータは、ＸＧ−１０２処置について経時的な腫瘍容積の低下を用量依存方式で示し、これによって、この効果は１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２について更に顕著であった。
【０６２２】
実施例３３
同所性のＨＣＴ  １１６ヒト結腸腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスにおける腫瘍増殖に対するＸＧ−１０２の効果
この研究の目的は、ＳＣＩＤマウスにおける同所性に異種移植されたＨＣＴ  １１６ヒト結腸腫瘍の増殖に対するＸＧ−１０２の効果を決定することであった。
【０６２３】
８０匹の健常な雌性ＳＣＩＤマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。動物実験は、動物実験の欧州の倫理ガイドライン、及び実験的新生物における動物の福祉に関する英国のガイドラインに従って行った。その動物は、温度（２３±２℃）、湿度（４５＋５％）、光周期（１２時間明／１２時間暗）及び空気交換という制御された条件下で、室内で維持した。動物は、ＳＰＦ条件で維持し、かつ室温及び湿度は連続してモニターした。空気取扱いシステムは、１時間あたり１４回の空気交換にプログラムし、再循環はしなかった。新鮮な外側の空気を一連のフィルターを通過させた後に、各部屋に均一に拡散させた。実験室では高圧（２０±４Ｐａ）を維持して、汚染も、マウスのコロニー内の病原体の伝播も防いだ。ＳＰＦ条件下で働く全ての人は、彼らが動物飼育エリアに入るとき、衛生及び衣類に関する特定のガイドラインに従った。動物を、食物と水を提供するように装備されている、ポリカーボネートケージ（ＵＡＲ、Ｅｐｉｎａｙ  ｓｕｒ  Ｏｒｇｅ、Ｆｒａｎｃｅ）で飼育した。使用した標準のエリアのケージは、８００ｃｍ２であり、内部の標準操作手順に従って１ケージあたり最大１０匹のマウスとした。動物の寝床は、無菌のトウモロコシの穂軸の寝床（ＬＡＢ  ＣＯＢ１２、ＳＥＲＬＡＢ、ＣｅｒｇｙＭＰｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）であり、週に１回置き換えた。動物の食物は、ＤＩＥＴＥＸから購入した。無菌の制御された細粒の種類は、ＤＩＥＴＥＸであった。食物は自由に与え、ケージの上の金属の蓋に入れておいた。水も、ゴム栓とシッパーチューブとを装備した水ボトルから自由に摂らせた。水ボトルは、洗浄し、水を充填し、ろ過によって滅菌し、週に２回置き換えた。
【０６２４】
ＸＧ−１０２投与のために、必要な量のＸＧ−１０２を、ビヒクル中に溶解した。処方物は、下に詳細に記載した手順に従って調製した。濃度は、試験品の純度及びペプチド含量を考慮して、算出し、表した（乗数率は７４．６％であった）。ＸＧ−１０２の解凍後、ストック溶液を、滅菌水（ＷＦＩ、バッチ５００１１１００Ｊ、Ａｇｕｅｔｔａｎｔ、Ｆｒａｎｃｅ）中で、１０ｍＭ（３８．２２ｍｇ／ｍｌに相当する）で調製し、室温に対して最低２０分間平衡にさせた。アリコートを、各処置日に調製し、約−８０℃で保管した。このストック溶液の必要な濃度までの希釈を、各処置日に行い、２〜４℃で最大２４時間保管した。ストック溶液の安定性の期間は、約−８０℃で１００日を超える。動物投与のための希釈された処方物の安定性の期間は、２〜４℃で２４時間である。希釈された溶液は、使用するまで氷上で維持した。未使用の物質は廃棄した。ＸＧ−１０２は、毎日１回、０．１及び１ｍｇ／ｋｇ／注射で、全部で１４連続投与の間、注射した（Ｑ１Ｄ×１４）。物質投与の経路は、以下であった：５ｍｌ／ｋｇ／注射で皮下（ＳＣ）注射し、カニューレを介して５ｍｇ／ｋｇ／投与で経口栄養によってマウスに経口（ＰＯ）投与した。注射及び投与の容積は、マウスの毎日の個々の体重に応じて適合させた。
【０６２５】
腫瘍細胞株及び培養培地は、Ｏｎｃｏｄｅｓｉｇｎから購入した。
【０６２６】
【表４４】
2020073573.tif 000049
【０６２７】
ＨＣＴ１１６バリアント細胞株は、男性患者の単一コロニーの癌腫の初代細胞培養から分離された（ＢＲＡＴＴＡＩＮ  Ｍ．Ｇ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８１、４１：ｌ７５１Ｍ１７５６）。
【０６２８】
腫瘍細胞は、加湿された雰囲気で（５％ＣＯ２、９５％空気）、３７℃で、付着単層として増殖した。培養培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｒｅｆ  ＢＥ１２−７０２Ｆ、Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含み、かつ１０％ＦＢＳ（Ｒｅｆ  ＤＥ１４−８０１Ｅ、Ｌｏｎｚａ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０であった。実験的な使用のために、細胞を、培養フラスコから、トリプシン−ヴェルセン（ｔｒｙｐｓｉｎ−ｖｅｒｓｅｎｅ）（Ｒｅｆ  ０２−００７Ｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ）での５分の処理によって剥がし、カルシウム、マグネシウム不含ハンクス培地（Ｒｅｆ  ＢＥ１０−５４３Ｆ、Ｃａｍｂｒｅｘ）中で希釈し、完全培養培地の添加によって中和した。細胞を、血球計でカウントし、それらの生存度を、０．２５％トリパンブルー排除で評価した。マイコプラズマ検出は、製造業者の指示に従って、ＭｙｃｏＡｉｅｒｔ（登録商標）マイコプラズマ検出キット（Ｒｅｆ  ＬＴ０７−３１８、Ｌｏｎｚａ）を使用して行った。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）アッセイは、マイコプラズマの酵素の活性を活用する選択的な生化学試験である。生きているマイコプラズマは溶解され、その酵素が、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）基質と反応し、ＡＴＰへのＡＤＰの変換を触媒する。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）基質の添加の前後の両方で試料中のＡＴＰのレベルを測定することによって、マイコプラズマの有無の指標である比を得てもよい。マイコプラズマ試験は、細胞株の培養上清から二連で分析し、陰性及び陽性の対照と比較した（ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標）Ａｓｓａｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｅｔ  Ｒｅｆ  ＬＴ０７−５１８、Ｌｏｎｚａ）（社内標準操作手順番号ＴＥＣ−００７／００２）。
【０６２９】
実験設計：
腫瘍誘発２４〜４８時間前、５匹のＳＣＩＤマウスに、γ線源（１．８Ｇｙ、Ｃｏ６０、ＩＮＲＡ、Ｄｉｊｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を照射した。２００μｌのＲＰＭＩ培地中に懸濁した一千万（１０７）個のＨＣＴ  １１６細胞を、５匹の雌性ＳＣＪＤマウスの右わき腹に皮下注射した。腫瘍が１０００〜２０００ｍｍ３に達した時、マウスを屠殺した。腫瘍を動物から外科的に切り出して、新鮮な腫瘍断片（２０〜３０ｍｇ）を得て、Ｄ０に７５匹のマウスの盲腸に同所性に埋め込んだ。
【０６３０】
腫瘍を埋め込む２４〜４８時間前、７５匹のＳＣＩＤマウスに、ｙ線源（１．８Ｇｙ、Ｃｏ６０、ＩＮＲＡ、Ｄｉｊｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を照射した。手術は、午後に行い、７回目のＸＧ−１０２処置後２時間という最小の遅延であった。麻酔された動物の腹部を、正中切開によって無菌条件下で開いた。盲腸を露出させて、盲腸の壁に小さい病変を生じた。腫瘍の断片を病変上に置いて、６／０縫合糸で固定した。続いて、腹腔を４／０の縫合糸を用いて２つの層で閉じた。
【０６３１】
Ｄ−７に、マウスをその体重によって処置開始の前に無作為化して、１５匹のマウスの５つの群を形成した。各々の群の体重は、他の群の体重と統計学的に異なることはなかった（分散分析）。処置は、以下の処置スケジュールに従ってＤ−７に開始した。
・第１群由来のマウスには、ＸＧ−１０２ビヒクルを１回のＰＯ投与の５ｍｌ／ｋｇ／注射で、全部で１４日の連続投与の間、毎日１回与えた（Ｑ１Ｄ×１４）、
・第２群由来のマウスには、ＸＧ−１０２を１回のＰＯ投与の０．１ｍｇ／ｋｇ／注射で、全部で１４日の連続投与の間、毎日１回与えた（Ｑ１Ｄ×１４）、
・第３群由来のマウスには、ＸＧ−１０２を１回のＰＯ投与の１ｍｇ／ｋｇ／注射で、全部で１４日の連続投与の間、毎日１回与えた（Ｑ１Ｄ×１４）、
・第４群由来のマウスには、ＸＧ−１０２を１回のＳＣ注射の０．１ｍｇ／ｋｇ／注射で、全部で１４日の連続投与の間、毎日１回与えた（Ｑ１Ｄ×１４）、
・第５群由来のマウスには、ＸＧ−１０２を１回のＳＣ注射の１ｍｇ／ｋｇ／注射で、全部で１４日の連続投与の間、毎日１回与えた（Ｑ１Ｄ×１４）。
【０６３２】
【表４５】
2020073573.tif 000050
【０６３３】
マウスを、行動及び生存について試験全体にわたって毎日モニターした。体重及び腫瘍容積は、全てのマウスについて、試験全体にわたって週に２回モニターした。イソフルラン（登録商標）Ｆｏｒｅｎｅ（Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ、Ｂｏｎｄｏｕｆｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して動物を麻酔した後に、細胞注射、手術（同所性腫瘍埋め込み）及び屠殺した。
ＳＣ腫瘍増殖の間、腫瘍容積は、試験全体にわたって全てのマウスについて週に２回モニターした。
【０６３４】
マウスをＤ２６に、屠殺した。肝臓及び腫瘍を回収し、全ての動物について秤量した。腫瘍小結節による肝臓の浸潤を巨視的に評価した。肝臓及び腫瘍を１０％の中性の緩衝化ホルマリン中で固定した。回収の４８時間後、それらをパラフィン（Ｈｉｓｔｏｓｅｃ（登録商標））中に包埋し、組織学的分析に使用した。２つのスライドは、２つの異なる部分から、各々の腫瘍のコアに由来した。各々のスライドは、マウス識別番号で特定した。１つのスライドは、１つの肝臓に由来し、その中央に局在させた。これはマウス識別番号で特定した。Ｋｉ６７マーカーによる増殖係数の決定のために、パラフィン包埋切片（５μｍ）を、キシレン（Ｒｅｆ．１１６９９０２７、Ｌａｂｏｂｏｒｄ、Ｔｅｍｐｌｅｍａｒｓ、Ｆｒａｎｃｅ）中で脱パラフィンし、１００％、９５％、及び７０％のエタノール（Ｒｅｆ．１３０９９５００、Ｌａｂｏｎｏｒｄ）中の連続インキュベーションによって再水和した。内因性のペルオキシダーゼは、一次抗体の添加の前に、過酸化水素含有溶液中で、１０分間室温で組織をインキュベートすることによって阻害された。ビオチンブロッキングシステムを使用して、バックグラウンドを減らした。切片を、３％ヤギ血清を補充したＰＢＳ（１×）中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて２０分間、室温で処理して、一次抗体の添加前に交差反応性を阻害した。組織切片は、マウス抗ヒトＫｉ−６７クローンＭＩＢ−１モノクローナル抗体（Ｒｅｆ  Ｍ７２４０、Ｄａｋｏ  ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ；１：１００希釈、８０μｇ／ｍｌ）とともに室温で１時間インキュベートした。関連のないビオチン化マウスＩｇＧＩ抗体（Ｒｅｆ  Ｘ０９３１、Ｄａｋｏ  ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、１：１２０希釈、１００μｇ／ｍｌ）を、陰性対照スライドとして使用して、反応の特異性を確実にした。その切片を更に、ビオチンにカップリングした二次のヤギの抗マウス抗体（Ｒｅｆ．８９９０４、Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートした。次いで、組織切片を、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｒｅｆ  ＰＫ−６１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１：５０希釈）とともに室温で３０分間インキュベートした。ＤＡＢペルオキシダーゼ基質（Ｒｅｆ  ＳＫ−４１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、色素原として使用して、反応を可視化した。切片を、メイヤーのヘマトキシリンを用いて組織学的試験のために対比染色した。各々のインキュベーション後、切片を、１×ＰＢＳを用いて２回洗浄した。カバースリップを、水性の包埋剤でマウントし、切片を光学顕微鏡（ＤＭＲＢ  Ｌｅｉｃａ）下で可視化した。
【０６３５】
組織学的分析によるマウスの肝臓での転移の検出のために、パラフィン包埋切片（５μｍ）を、キシレン中で脱パラフィンして、１００％、９５％、及び７０％のエタノール中の連続インキュベーションによって再水和した。全ての切片を、組織学的分析のために、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）（Ｒｅｆ．８３３０９、Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｔｒａｐｐｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、染色した。カバースリップを、水性の包埋剤（Ａｑｕａｔｅｘ、Ｒｅｆ  １．０８５６２、Ｍｅｒｃｋ）でマウントし、切片を光学顕微鏡（ＤＭＲＢ  Ｌｅｉｃａ）下で見た。組織学的切片は、経験のある病理学者が分析して肝臓での転移性の浸潤を決定した。
【０６３６】
体重分析のために、マウスの体重曲線を引いた。少なくとも１つの群で４０％を超える死亡したマウスが記録されたとき、曲線を終わりにした。平均体重変化（ＭＢＷＣ）：処置した動物の平均体重変化のグラム数（Ｘ日目の体重マイナスＤ−７の体重）を算出した。
【０６３７】
腫瘍重量を算出した。腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ％）は、ビヒクル処置群に対する処置群の中央腫瘍重量の比として定義した。ＮＣＩ標準によるＴ／Ｃ％比についての有効な基準は、４２％以下である。増殖指数の半定量（Ｋｉ−６７染色）のために、染色した腫瘍切片の数値画像を、盲検的に分析し、染色なし（染色領域なしに相当するレベル０）、低染色（１０％未満という染色領域に相当するレベル１）、中度染色（１０〜３０％という染色領域に相当するレベル２）、及び強染色（３０％超という染色領域に相当するレベル３）として分類した。代表的な写真を撮った。肝臓中の転移の検出のために、平均肝臓重量を測定し、１つの肝臓あたりの転移の数を、肝臓全体で巨視的に、及び切片で組織学的分析によって推定した。結果を、表に報告した。代表的な写真を撮った。全ての統計学的分析は、Ｖｉｖｏ  ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェアを使用して行い、毒性及び処置の有効性（ＭＢＷＣ、ＴＶ、容積Ｖ及びＶに達する時間、ＤＴ）の統計学的分析は、ボンフェローニ／ダン検定（ＡＮＯＶＡ比較）を使用して行った。全ての群を、お互いに対して比較した。
【０６３８】
一千万（１０７）個のＨＣＴ  １１６細胞を、５匹の放射線照射した雌性ＳＣＩＤマウスにＳＣ注射した。マイコプラズマは、細胞において検出されず、それらの生存度は注射前には９９％であった。３９日後、平均腫瘍容積が８６４±４２６ｍｍ３であったとき、マウスを屠殺した。それらの腫瘍を分離し、約２０〜３０ｍｇの小片に切断した。それらの小片を、７５匹の処置動物の盲腸上にＤ０に埋め込んだ。Ｄ０〜０９まで、腫瘍の移植による手術の完了で、ビヒクル処置群ではマウスの３３％の死が誘発された。処置群では、死亡したパーセンテージは、４０％、３４％、４７％及び４０％であり、用量関連の効果はなかった。ＸＧ−１０２での処置は、ビヒクル処置群と比較して致死性を有意に改変しなかったという事実によって、処置が動物に耐容されたことが示唆される。更に、処置開始の日（Ｄ−７）と手術２日前（Ｄ−２）との間、６回の毎日の処置は、なんら有意な体重の低下を誘発せず、これによってＸＧ−１０２はよく耐容されたことが再度示された。Ｄ−２では、ＭＢＷＣは、ビヒクル処置群についての＋５．２±４．６％から、０．１ｍｇ／ｋｇ／投与で処置したＰＯ群における＋７．１±４．６％まで分布した。更にビヒクルで処置した群と、種々の用量のＸＧ−１０２で処置した群との間でＭＢＷＣの差異は、手術後、手術によって生じた有意な低下が、手術前後のＭＢＷＣを比較したとき、全ての群について観察された場合でさえ、観察されなかった。
【０６３９】
Ｄ２６に屠殺したマウスでの平均肝臓重量は、ビヒクル処置群における０．８２±０．１７ｇから、０．１ｍｇ／ｋｇで処置したＰＯ群における０．９１±０．１７ｇまで分布した。それらは有意な差異ではなかった。ビヒクル処置群では、２０％は肝臓でなんら転移を生じなかった。図７６に示されるとおり、この対照群は、肝臓で２つ以上に転移を発症しているマウスの数が最高（４０％）の群であった。処置群では、このスコアは、１ｍｇ／ｋｇで処置されたＰＯ群の１２．５％から、０．１ｍｇ／ｋｇでＰＯ処置された群、又は１ｍｇ／ｋｇでＳＣ処置された群についての２５％まで分布した。著しいことに、１ｍｇ／ｋｇで処置されたＰＯ群は、肝臓転移のないマウスの数が最も多く、これによって、ＸＧ−１０２は、ＨＣＴ  １１６同所性腫瘍の転移能力を低下し得ることが示唆された。
【０６４０】
実施例３４
ラット（ＡＭＤモデル）における光受容器の光損傷の低減におけるＸＧ−１０２の有効性の評価
この試験の目的は、光誘発性の光受容器細胞死に対するＸＧ−１０２の用量効果を検討することであった。
【０６４１】
５０匹の雄性ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（アルビノラット）；約８週；２００〜２５０ｇ（注文時））を使用した。ラットは、この実験モデルで最も一般的に使用される。動物を試験前に検査して、眼に特別な注意を払った。動物は、その到着後に２週間観察を続けた。動物は、病気の兆候について毎日観察した。眼の異常のない健常な動物のみを実験の使用に受け入れた。動物は、標準のケージ（４２０×２７０×１９０ｍｍ）ｉｉ中に個々に収容した。全ての動物を、同一の環境条件下で飼育した。温度２２±２℃及び相対湿度５５±１０％で保持した。部屋は連続換気した（１時間に１５回）。１２時間の明（２００−３００ルクス）及び１２時間の暗のサイクルを自動的に制御した。これらのパラメータを連続的に制御し、記録した。試験全体にわたって、動物は、食物及び水に自由にアクセスさせた。それらには、標準的な乾燥ペレット食餌を供給した。水道水を、プラスチックボトルから自由に摂らせた。
【０６４２】
試験設計：
４８匹のラットを、各々８匹の動物の６つの群に無作為に分けた。試験品（ＸＧ−１０２：３０ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、及び０．３ｍｇ／ｍｌ）及びビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）を、導入前日に右眼に硝子体内注射によって投与した。参照（フェニル−Ｎ−ｔｅｓｔ−ブチルニトロン（ＰＢＮ）（５０ｍｇ／ｋｇ））及びビヒクルを、導入３０分前に、次いで、露光の１２時間の間に３回、次いで誘発後に１回、腹腔内に注射した。動物は、２４時間、一定の光（７０００ルクス）の中に置いた。網膜電図（ＥＲＧ）は、光処理の前、並びに誘発後９、１６及び２３日目に記録した。次いで、眼を、組織学及び外核層（ＯＮＬ）厚のアセスメントに供された。下の表は、処置群における動物の割り当てをまとめる。
【０６４３】
【表４６】
2020073573.tif 000051
【０６４４】
５０匹のうち４８匹の動物を、この試験で使用した。眼の欠陥の兆候が見られなかった動物のみを選択した。次いで、処置群の無作為化を、Ｅｘｃｅｌ（登録商標）ソフトウェア中でランダム関数によって行った。
【０６４５】
投与の経路及び方法
硝子体内注射のために、動物を、キシラジン／ケタミンの混合物の筋肉内注射によって麻酔した。試験品（５μｌ）及びビヒクル（５μｌ）を、右眼に注射した。この注射は、５０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎに装着した３３Ｇの針を使用して経毛様体扁平部で側頭上部の領域において手術用顕微鏡下で行った。充填したシリンジを、ＵｌｔｒａＭｉｃｒｏＰｕｍｐ  ＩＩＩに装着して、正確な注射をマイクロリットルの範囲で達成した。参照及びビヒクルを、１ｍｌのシリンジに装着した３０Ｇの針を使用して、２．５ｍｌ／ｋｇの投与容積で腹腔内注射した。
【０６４６】
露光：一晩暗順応させたラットを、透明なプラスチックケージ中で連続白色蛍光灯（７０００ルクス）に２４時間曝露した。各々のケージは、１匹のラットを含んだ。曝露後、ラットは周期的な光条件での飼育に戻した。
【０６４７】
全ての動物の体重を、試験開始前に、次いで、試験の終わりに記録した。毎日、全動物の一般行動及び外観を観察した。
【０６４８】
ＥＲＧは、誘発前、並びに曝露の中止７、１４及び２１日後（９、１６及び２３日）に、暗順応して麻酔した動物の右眼目に記録した。潜時（ａ及びｂ波について）並びにａ及びｂ波の振幅を、各ＥＲＧについて測定し；潜時は、ミリ秒として表し、並びにａ及びｂ波は、露光前に得たベースライン値のパーセンテージとして表した。測定１５分前、１０μｌのＭｙｄｒｉａｔｉｃｕｍ（登録商標）（０．５％トロピカミド）を瞳孔拡張のために滴下した。
【０６４９】
ＥＲＧパラメータ：
・色：ホワイトマキシマム（ｗｈｉｔｅ  ｍａｘｉｍｕｍ）。
・最大強度：２．６ｃｄ．ｓ／ｍ２（０ｄＢ）；期間０．２４ｍｓ；フラッシュの数：１。
・フィルター：５０Ｈｚ。
・インピーダンス閾値：９０ｋΩ。
【０６５０】
ＯＮＬの厚さの測定：ＥＲＧ試験後、動物を過量のペントバルビタールによって安楽死させ、右眼を摘出し、固定し、パラフィン中に包埋した。切片（５μｍ厚）を垂直子午線に沿って行い、Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ−Ｍａｓｓｏｎで染色した。垂直子午線は、視神経を含んだ。ＯＮＬの厚さは、標準的な顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を使用して下側網膜中の視神経から５００〜３５００μｍの間で５００μｍごとに（７ポイント）行った。
【０６５１】
結果は、個々の形態で表し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してデータ表をまとめた。群の平均値及び標準偏差を算出した。統計学的マン・ホイットニー検定を使用して、ペアワイズ群の間の差異を評価した。各ビヒクル群への時点の間の比較のために、フリードマン検定を使用した。
【０６５２】
結果
一般行動及び外観は、全ての動物で正常であった。
動物の体重は全てが、ベースラインでは正常範囲内であった：３７９±１３ｇ（平均±ＳＤ；ｎ＝４８）。屠殺日（２３日目）、試験物とビヒクルとの間に目に見える差異は観察されなかった。試験の開始直前（ベースライン）及び安楽死の日、各群で記録された平均体重は、正常範囲内であって、体重は約３１±５％（平均±ＳＤ；ｎ＝４８）増えていた。
【０６５３】
網膜電図
光受容器に対する防御効果を検討するために、試験、ビヒクル及び参照品を、光誘発性の光崩壊モデルで評価した。網膜の機能的な状況を、網膜電図写真によって評価した。網膜電図写真の波の振幅を、ベースライン値に正規化し、ベースラインのパーセントとして表した。図７７は、異なる群についての回復の時間経過を図示する。
【０６５４】
光誘発性の光受容器死滅からアルビノラットを保護することが示された合成の抗酸化物質であるフェニル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンをこのアッセイにおける参照として使用した。３つの用量のＸＧ−１０２を試験した：１．５μｇ／眼（０．３ｍｇ／ｍｌ、低用量）、１５μｇ／眼（３ｍｇ／ｍｌ、中用量）及び１５０μｇ／眼（３０ｍｇ／ｍｌ、高用量）。ａ及びｂ波の振幅についての平均値（％で；平均±ＳＤ）を、以下の表にまとめる。
【０６５５】
【表４７】
2020073573.tif 000052
【０６５６】
【表４８】
2020073573.tif 000053
【０６５７】
また図７７に示されるとおり、腹腔内又は硝子体内注射によってビヒクルとともに注射した誘発性の群における平均のａ波振幅は、ベースラインに対して対照値と比較して、９、１６及び２３日目に低下を示した。ａ波は、９日目（ｐ＜０．０１）、１６日目（ｐ＜０．０１）及び２３日目に（ｐ＜０．０５）対照値の５０％未満まで低下した。ｂ波は、９日目（ｐ＜０．０１）及び１６日目（ｐ＜０．０１）に対照値の５０％未満まで有意に低下した。２３日目に、低下は統計学的に有意ではなかった。ＰＢＮで処置し、有害な光に曝した群では、網膜の機能はかなりの程度まで保存された。ａ波の回復は、ビヒクルと比較して、９日目（ｐ＜０．０１）、１６日目（ｐ＜０．０１）及び２３日目（ｐ＜０．０１）に有意に改善されており、それぞれ、７０．４％、７９．６％及び７６．２％であった。同様に、ｂ波の回復は、９、１６及び２３日目に、それぞれ、１００％、１０３．６％及び１０２．４％、ビヒクルよりも有意に大きかった（ｐ＜０．０１）。
【０６５８】
最大１５μｇ／眼までの異なる用量の硝子体内ＸＧ−１０２で処置し、有害光に曝したラットでは、９、１６及び２３日目にビヒクルと比較して網膜の機能がより大きい程度まで保存されたことが示された。ａ波の回復は、それぞれ低用量及び中用量で、１６日目に、４７．５％（ｐ＜０．０１）及び５１．１％（ｐ＜０．０１）、並びに２３日目に、４８．３％（ｐ＜０．０１）及び４１．８％（ｐ＜０．０５）であった。同様に、ｂ波の回復は、ビヒクルよりも大きく、低用量及び中用量についてそれぞれ、９日目に５５．３％及び６０．６％、１６日目に、６１．７％及び６２．３％、２３日目に、７３．５％及び５６．５％であった。他方では、高用量（１５０μｇ／眼の群）のＸＧ−１０２は、光損傷を防ぐのに効果は示さなかった。ａ波の回復は、９、１６及び２３日目でそれぞれ、ビヒクル群についての５．７％、１３．２％及び２２．５％に対して２３．６％、２４．１％及び２３．７％であった。同様に、ｂ波の回復は、９日、１６日及び２３日目でそれぞれ、ビヒクル群についての１５％、２４．８％及び３０．６％に対して３１．９％、３８．９％及び３７．１％であった。
【０６５９】
ＯＮＬの厚さ
処置が、光受容器構造を保存する能力を評価するために、ＯＮＬの厚さを、曝露の中止の２１日後（２３日目）に評価した。平均値を以下の表にまとめる：
【０６６０】
【表４９】
2020073573.tif 000054
【０６６１】
ＯＮＬの厚さの低下は、ビヒクル処置したラットの眼で観察した。平均ＯＮＬ厚の６６％〜６９％の喪失が、未処置の眼と比較して曝露後にビヒクル処置した眼で観察された。ＰＢＮの投与は、ビヒクル群と比較して有意な保護を示した（ｉｖｔ及びｉｐ、ｐ＜０．００１）。ラットをＰＢＮで処置したとき、ＯＮＬは保存された。正常な条件での未処置の眼と比較してごくわずかな低下（１６％）が観察された（４０．６±４．６μｍ、内部データ）。ＯＮＬの厚さの低下は、低用量及び中用量によってＸＧ−１０２処置したラットでは阻害された（ビヒクルと比較してｐ＜０．０１）。高用量のＸＧ−１０２では保護は観察されなかった。平均ＯＮＬ厚の４０％低下が、低用量及び中用量のＸＧ−１０２処置の眼で観察された。
【０６６２】
したがって、これらの実験条件下では、以下と言うことができる：
・ビヒクル処置群（２経路の投与：ｉｖｔ、ｉｐ）では、明るい光の曝露が、網膜機能の低下及び光受容器の喪失を誘発した。曝露２３日後、ａ波の回復は、１８．６％（ｉｐ）及び２２．５％（ｉｖｔ）であり；平均ＯＮＬ厚の６９％（ｉｐ）及び６６％（ｉｖｔ）の喪失が観察された。
・ＰＢＮの全身投与（ｉ．ｐ．）は、光の損傷から網膜を有意に保護する。ＰＢＮ処置した群は、ａ波の７６．２％を維持し、平均ＯＮＬ厚のわずかな喪失（１６％）しか観察されなかった。
・１．５及び１５μｇ／眼のＸＧ−１０２の硝子体内注射は、光の損傷から網膜を有意に保護する。ＸＧ−１０２処置した群は、ａ波の４８．３％及び４１．８％を維持し、平均ＯＮＬ厚の４０％喪失が観察された。
【０６６３】
まとめると、統計学的分析によれば、ＸＧ−１０２（１．５及び１５μｇ／眼）の硝子体内注射は、網膜の機能を保護するのに有効であった。これらの実験的な条件下では、この結果によって、ＸＧ−１０２は、ＩＶＴによって、１．５μｇ及び１５μｇ／眼の用量で、網膜の構造及び機能を急性の光誘発性の損傷から保護することが示される。
【０６６４】
実施例３５
白内障手術後の眼内炎症の低減におけるＸＧ−１０２の有効性及び安全性（臨床第ＩＩＩ相）
多施設、無作為化、二重盲検、ビヒクル対照の並行群の第ＩＩＩ相試験は、白内障手術後眼内炎症の低減のためのＸＧ−１０２の単回結膜下注射の有効性及び安全性を評価するように働いた。この試験の目的は、単純な白内障手術後に炎症及び疼痛を有する対象の処置におけるビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）と比較したＸＧ−１０２（９００μｇ）の臨床上の有効性及び安全性を評価することである。
【０６６５】
この試験は、眼の手術、具体的には、試験の眼における超音波乳化（ｐｈａｃｏｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を介した片側の白内障抽出及び後房眼内レンズ（ＰＣＩＯＬ）埋め込みの後の炎症及び疼痛に重点的に取り組む。９００μｇのＸＧ−１０２の単回結膜下注射による処置を、プラシーボ（ビヒクル：０．９％ＮａＣｌ）結膜下注射に対して比較する。訪問＃３、４、５、６及び７は、それぞれ２、８、１５、２２及び８５日目に計画する。
【０６６６】
具体的には、ビヒクルと比較して９００μｇのＸＧ−１０２結膜下注射のための前房細胞が、好ましくは、１５日目の訪問５にないこと、及びビヒクルと比較して９００μｇのＸＧ−１０２について疼痛が、好ましくは２日目の訪問３にないことは、主な転帰の指標として役立つ。二次的な転帰の測定は、具体的には、前房細胞が、好ましくは、訪問３、４及び６（それぞれ、２、８及び２２日目）に存在しないこと、疼痛が、好ましくは、訪問４、５及び６（それぞれ、８、１５及び２２日目）にないこと、フレアが、好ましくは、訪問３、４、５及び６（それぞれ、２、８、１５及び２２日目）にないこと、前房細胞及びフレアが、好ましくは訪問３、４、５及び６（それぞれ、２、８、１５及び２２日目）にないこと、並びに各訪問の際又は前、及び全体で救急医薬の使用である。他の事前に特定された転帰の指標としては、具体的には、好ましくは、訪問３、４、５、６及び７（それぞれ、２、８、１５、２２及び８５日目）のピンホール視力、好ましくは、訪問３、４、５、６及び７（それぞれ、２、８、１５、２２及び８５日目）の細隙灯生体顕微鏡、好ましくは、訪問６（２２日目）の拡張型間接検眼鏡、好ましくは訪問３、４、５及び６（それぞれ、２、８、１５及び２２日目）の眼内圧（ＩＯＰ）、好ましくは訪問７（８５日目）の反射顕微鏡、並びに好ましくは、訪問３、４、５、６及び７（それぞれ、２、８、１５、２２及び８５日目）の有害事象（ＡＥ）モニタリングが挙げられる。
【０６６７】
実施例３６
網膜虚血／再かん流病変に対するＸＧ−１０２（配列番号１１）の効果
腎虚血／再かん流（腎臓Ｉ／Ｒ）障害は、急性腎不全としても公知の急性の腎障害（ＡＫＩ）の一般的に使用されるモデルである。急性腎障害に対する腎臓Ｉ／Ｒ障害を検査する試験の臨床的関連性に加えて、実験的な腎蔵のＩ／Ｒ障害も、腎移植を受けている患者で生じる条件を評価するために用いられる重要なモデルである。ドナー次第で、移植された腎臓は、移植前に種々の時間の間、血液をかん流されない。ＡＫＩは、患者でこのような重篤な影響を有し、かつ全ての移植された腎臓が、腎Ｉ／Ｒ障害をある程度まで経験するので、ヒトの健康に対するこの種の研究の臨床的関連性及び変換の重要性は、極めて高い。したがって、この試験の目的は、ラットにおける実験的な腎虚血／再かん流に対するＪＮＫ阻害剤ＸＧ−１０２（配列番号１１）の影響を検討することである。
【０６６８】
２６匹の雄性Ｗｉｓｔａｒラット（５〜６週齢）を、この試験で使用した（１０匹のラットの２つの群、及び６匹のラットの１つの群に分けた）。ラットは、標準的なケージ中で飼育し、食物と水道水には自由にアクセスさせた。各々の日に、全ての動物の一般行動及び外観を観察した。動物の健康をモニターした（瀕死の動物、体重の異常な重大な低下、物質の主な不耐性など）。取り除いたラットはなかった。
【０６６９】
腎虚血は、傷をつけないクランプで両方の腎茎をクランプすることによって誘発した。それぞれ、２ｍｇ／ｋｇ単回用量のＸＧ−１０２（ビヒクルとして０．９％ＮａＣｌ中）又はビヒクルを、０日目に、傷をつけないクランプで両方の腎茎をクランプする期間の後（再かん流後）１時間で、尾静脈にＩＶ注射によって投与した。投与容積は、２ｍｌ／ｋｇであった。ヘパリン（５０００Ｕｌ／ｋｇ）は、クランピングの１時間前に（全ての群で）腹腔内に投与した。
【０６７０】
下の表に、無作為な割り当てをまとめる：
【０６７１】
【表５０】
2020073573.tif 000055
【０６７２】
試料回収のために、ラットを、代謝ケージ（Ｔｅｃｈｎｉｐｌａｓｔ、Ｆｒａｎｃｅ）中で個々に飼育した。尿は、７２時間で回収した。血液試料は、かん流の前及び２４時間後、尾静脈から得た。動物屠殺後、両方の腎臓を回収した。
【０６７３】
タンパク尿及びアルブミン尿の評価のために、Ａｄｖｉａ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６５０（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＡＧ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の適切なキットを使用した。
【０６７４】
腎機能の評価のために、血液を再かん流２４時間後に尾静脈から回収した。血清クレアチニン（μｍｏｌ／ｍＬ）及び尿素濃度（ｍｍｏｌ／ｍＬ）は、適切なキット（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＡＧ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。
【０６７５】
組織学的病変の評価は、再かん流の２４時間後及び７２時間後に行った。
【０６７６】
光学顕微鏡のために、腎臓をＤｕｂｏｓｑ−Ｂｒａｚｉｌ中で１６時間インキュベートし、脱水し、パラフィン中に包埋し、切片に切断し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）、又は過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）を用いて染色した。
【０６７７】
免疫組織化学のために、腎臓試料を、Ｄｕｂｏｓｑ  Ｂｒａｚｉｌ中で１６時間固定し、引き続き、脱水し、パラフィン中に包埋した。抗原回復は、１５分間にわたって５００Ｗのマイクロ波オーブン中で、煮沸中の０．０１Ｍのクエン酸バッファーにスライドを浸漬することによって行った。内因性のペルオキシダーゼ活性は、メタノール中の０．３％のＨ２Ｏ２を用いて３０分間ブロックした。スライドは、アビジン−ビオチン溶液からなるブロッキング試薬とともに３０分間、及び正常なブロッキング血清とともに２０分間インキュベートした。免疫検出のために、スライドを、抗体とともに、次いでビオチン化二次的な抗体とともに一晩インキュベートした。アビジンビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）及び３，３’−ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を色素原として、免疫反応の可視化のために適用した。スライドをヘマトキシリンで対比染色した。一次抗体の省略を陰性対照とみなした。
【０６７８】
免疫蛍光標識を、１０分間アセトン中で固定した腎臓組織の４ｍｍ厚のクリオスタット切片で行い、室温で３０分間風乾し、次いでＰＢＳ中で３分間インキュベートし、ＰＢＳ中で１％のＢＳＡ中でブロックした。その切片を、示した抗体とともに室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳ中で洗浄し、レッドテキサスコンジュゲートの二次抗体とともにインキュベートした。切片を、蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）によって試験する。
【０６７９】
更に、有足細胞損傷、炎症及び腎線維症に特異的ないくつかのマーカー（ＲｅｌＡ、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、マッソントリクローム）の発現を、免疫組織化学及び免疫蛍光によって評価した。腎臓におけるＴＮＦα、ＩＬ６、ＣＸＣＬ１（ＫＣ）、ＣＸＣＬ２（ＭＩＰ−２）及びＭＣＰ１の定量的転写プロフィールを決定した。
【０６８０】
結果：
結果を図７８に示す。血清クレアチニン（図７８Ａ）及び尿素（図７８Ｂ）は、虚血なしのビヒクル処置対照ラット（Ｇ１）と比較した場合、虚血２４時間後にビヒクル処置した虚血性ラット（Ｇ２）では、増大された。他方では、ＸＧ−１０２処置した虚血性ラット（Ｇ３）は、未処置の虚血性ラット（Ｇ２）に対して、低い血清クレアチニンを示した。これらの結果によって、ＸＧ１０２は、虚血誘発性腎不全を防ぎ得ることが示唆される。
【０６８１】
実施例３７
ヒト肝臓腫瘍細胞株に対するＸＧ−１０２（配列番号１１）の抗腫瘍活性
この試験の目的は、ヒト肝細胞癌及びヒト肝臓癌細胞に対するＸＧ−１０２（配列番号１１）の細胞傷害性活性を、ＭＴＳアッセイを使用して決定することである。
【０６８２】
ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２（由来：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡ；ＨｅｐＧ２細胞株は、１９７５年に肝細胞癌を有する１５歳のアルゼンチン人の少年の腫瘍組織から樹立し、この細胞株にＢ型肝炎ウイルスのゲノムの証拠はない）、ヒト肝癌細胞株ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（由来：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡ；ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞株は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を分泌する）を使用する。腫瘍細胞は、加湿された雰囲気で（５％ＣＯ２、９５％空気）、３７℃で、付着単層として増殖する。培養培地は、１０％のウシ胎仔血清（ｒｅｆ：３３０２、Ｐａｎ）、０．１ｍＭのＮＥＡＡ（ｒｅｆ：ＢＥ１３−１１４Ｅ、Ｌｏｎｚａ）及び１ｍＭのＮａＰｙｒ（ｒｅｆ：ＢＥ１３−１１５Ｅ、Ｌｏｎｚａ）を補充したＥＭＥＭ（ｒｅｆ：ＢＥ１２−６１１Ｆ、Ｌｏｎｚａ）である。細胞をプラスチックフラスコに付着させる。実験的な使用のために、腫瘍細胞を、培養フラスコから、カルシウム、マグネシウム不含ハンクス培地（Ｒｅｆ  ＢＥ１０−５４３Ｆ、Ｌｏｎｚａ）中のトリプシン−ヴェルセン（ｔｒｙｐｓｉｎ−ｖｅｒｓｅｎｅ）（Ｒｅｆ  ０２−００７Ｅ、Ｌｏｎｚａ）での５分の処理によって剥がし、完全培養培地の添加によって中和する。細胞を、血球計でカウントし、それらの生存度を、０．２５％トリパンブルー排除で評価する。
【０６８３】
腫瘍細胞を、平底マイクロタイトレーション９６ウェルプレート（ｒｅｆ  １６７００８、Ｎｕｎｃ、Ｄｕｔｓｃｈｅｒ、Ｂｒｕｍａｔｈ、Ｆｒａｎｃｅ）中で最適播種密度でプレートして、１９０μＬの薬物なしの培養培地中で、＋３７℃で、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で、処置前に２４時間インキュベートする。
【０６８４】
ＸＧ−１０２（配列番号１１）の希釈、及び細胞を含むプレートの分布を、手技的に行う。処置開始の際に、１０μＬのＸＧ−１０２（配列番号１１）希釈液を、以下の最終濃度でウェルに添加する（両方の細胞株について）：０、３．８×１０−３、１．５×１０−２、６．１×１０−２、０．２４、０．９８、３．９、１５．６、６３、２５０及び１０００μＭ。次いで、細胞を、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で、＋３７℃で、ＸＧ−１０２を含有する培養培地の２００μＬの最終容積中で７２時間インキュベートする。処置の終わりに、細胞傷害性活性を、ＭＴＳアッセイによって評価する。
【０６８５】
ＸＧ−１０２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性活性は、ＭＴＳアッセイによって、テトラゾリウム化合物（ＭＴＳ、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）及びＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）という名称の電子カップリング試薬を用いて明らかにする。ＭＴＴと同様に、ＭＴＳは、細胞によってホルマザン生成物に生体還元され、これはＭＴＴとは異なり、処理なしで培養培地に直接溶解される。細胞処置の終わりに、４０μＬの０．２２μｍの新たにろ過された、ダルベッコのリン酸緩衝化食塩水（ＤＰＢＳ、ｒｅｆ：１７−５１３Ｆ、Ｃａｍｂｒｅｘ）に含有される、ＭＴＳ（２０ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、ｒｅｆ：Ｇｌｌ  １１、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）及びＰＭＳ（１ｍＬ、０．９２ｍｇ／ｍＬ、ｒｅｆ：Ｐ９６２５、Ｓｉｇｍａ）の合わせた溶液を、各ウェルに添加する。吸光度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ、ＯＤ）は、ＶＩＣＴＯＲ３（商標）１４２０マルチラベルのカウンター（Ｗａｌｌａｃ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、各々のウェル中で、４９０ｎｍで測定する。
【０６８６】
ＭＴＳアッセイの個々のＯＤ値を与える。細胞傷害性指数（ＩＣ）に関する用量反応は、以下のように表現され：
ＩＣ＝（ＯＤ薬物曝露されたウェル／ＯＤビヒクル曝露されたウェル）×１００
これによって、ＩＣ５０は、細胞増殖の５０％阻害を得るための薬物濃度を指す。ＩＣ５０とは、５０％の細胞の細胞傷害性を得るために必要な薬物濃度である。用量応答曲線は、ＸＬＦｉｔ５（ＩＤＢＳ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用してプロットし、示す。ＩＣ５０決定値は、片対数曲線からＸＬＦｉｔ５ソフトウェアを使用して算出する。各々の個々のＩＣ５０決定値、同様に平均±ＳＤ  ＩＣ５０値を示す。
【０６８７】
図１０７は、ＭＴＳアッセイを使用する、ＨｅｐＧ２及びＰＬＣ／ＰＲＦ／５腫瘍細胞株に対するＸＧ−１０２の細胞傷害性活性の決定の結果を示す。
【０６８８】
実施例３８
実験的な自己免疫ブドウ膜炎（後方ブドウ膜炎）のラットモデルにおけるＸＧ−１０２（配列番号１１）の効果
米国では、１年あたり約７０，０００症例のブドウ膜炎があり、自己免疫ブドウ膜炎は、重度の視力低下の約１０％を占める（Ｃａｓｐｉら、２０１２年）。実験的な自己免疫ブドウ膜炎（ＥＡＵ）は、神経網膜を標的する臓器特異的な自己免疫疾患であり、すなわち、これは、後方ブドウ膜炎のモデルである。この自己免疫反応は、動物が、網膜抗原、例えば、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）で免疫されるときに誘発される。この試験では、動物は、ＩＲＢＰで免疫される。９〜１４日の期間後、動物は、眼でブドウ膜炎を発症する。試験の終わりに、動物を屠殺し、眼を組織学のために提出する。
【０６８９】
６４匹の雄性Ｌｅｗｉｓラット（８週、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を、試験群に無作為に割り当てる。第１〜６群を、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）に含有される光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）のエマルジョンで免疫する。
【０６９０】
群割り当て：
【０６９１】
【表５１】
2020073573.tif 000056
【０６９２】
ＦＴＹ７２０を陽性対照（第５群）として使用する。動物（第５群）には、１０％ＰＥＧ及び滅菌水に含有されるＦＴＹ  ７２０を０．３ｍｇ／ｋｇ／日で与える（−３日目〜１３日目まで毎日１回；経路；経口栄養管）。１日あたりの総容積は、１０ｍＬ／ｋｇ／日以下である。ラットは、月曜、水曜及び金曜ごとに秤量し、投与される容積は、群の平均重量で決定する。
【０６９３】
ＸＧ−１０２は、−１日目に単回投与で、２０μｇ／眼を結膜下に（第２群）又は２μｇ／眼を硝子体内に（第４群）与える。この目的のために、動物を、３３．３ｍｇ／ｋｇのケタミン及び６．７ｍｇ／ｋｇのキシラジンという濃度のケタミン及びキシラジン（ｋ／ｘ）の混合物の腹腔内（ＩＰ）注射で鎮静する。一旦完全に鎮静されれば（つま先つまみ反射がないことで確認される）、各眼にプロパラカインを与える。解剖顕微鏡下で、５μＬのＸＧ−１０２（上記のとおり）を各眼の硝子体又は結膜下に注意深く投与する。潤滑剤（例えば、Ｐｕｒａｌｕｂｅ（登録商標））を眼に与えて、角膜の潰瘍形成を防ぐ。次に、動物を温かい加熱パッドの上に置いて、完全に覚醒するまでモニターする。
【０６９４】
０日目に、第１〜第６群を、ＩＲＢＰ／ＣＦＡの単回皮下投与によって免疫する。この目的のために、ＣＦＡに含有されるＩＲＢＰのエマルジョンを、注射の日に作製する。動物をイソフルランで軽度に麻酔して、２００μＬのＣＦＡに含有される５０μｇのＩＲＢＰを与える。
【０６９５】
全ての動物は、全体的な健康／死亡率及び罹患率について毎日チェックする。なんらかの投与の前（又は未処置だが、免疫され、及びナイーブな群については−３日目）、及び１４日目の安楽死の前、眼底検査を行う。この目的のために、動物を、ｋ／ｘ（上記で特定したのと同じ量）で鎮静する。一旦、鎮静すれば、ＧＯＮＡＫの液滴を、各眼に入れて、穏やかにプラットフォーム上に置く。眼は、眼底画像化のための専門的なレンズと穏やかに接触するように配置する。画像は、Ｍｉｃｒｏｎ  ＩＩＩで撮る。ＩＶＴ注射を受ける動物は、それらが既に鎮静されたとき、注射の直前にベースラインの眼底検査をする。ＩＶＴ注射を受けていない全ての他の動物を、−３日目に鎮静する。臨床評価のために、１３日目に、動物を、解剖顕微鏡下で観察し、それらの臨床疾患に基づいて０〜４のスコアにスコア付けする。１４日目の屠殺後、及び死亡の確認の際、各動物の両眼を鉗子で注意深く取り出し、できるだけ多くの眼の神経をまるごと保つことを確実にする。眼を、２４時間、ダビッドソン固定液に入れる。組織学用に眼を７０％エタノールに移す。各眼を、組織学的分析用にヘマトキシリン及びエオシンで染色する。
【０６９６】
実験設計は下にまとめる。
【０６９７】
【表５２】
2020073573.tif 000057
【０６９８】
実施例３９
糖尿病性網膜症のラットモデルにおけるＸＧ−１０２（配列番号１１）の効果
この試験の目的は、視力の喪失、眼の臨床徴候及びサイトカインプロファイリングに対するＸＧ−１０２の用量依存性の効果を、ストレプトゾシン（ＳＴＺ）誘発性の糖尿病のラットモデルにおいて反復性の結膜下投与後に決定することである。
【０６９９】
この目的のために、３０匹のラット（雌性、Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ、ＳＴＺ処置の時点で６〜８週齢を、以下の５群（１群あたり６匹の動物）に割り当てる。
【０７００】
【表５３】
2020073573.tif 000058
【０７０１】
「処置」（ビヒクル又はＸＧ−１０２）は、２２、３６、５０、６４、７８、９２、及び１０６日目の各群の両側結膜下投与（それぞれ、ビヒクル又はＸＧ−１０２）についてである。
【０７０２】
実験設計は以下である。
１日目：ストレプトゾシンのＩＰ注射（第２〜５群）
４日目：血糖定量
２２日目：ビヒクル又はＸＧ−１０２の両側結膜下注射（第２〜５群）
３６日目：ビヒクル又はＸＧ−１０２の両側結膜下注射（第２〜５群）
４３日目：コントラスト感度及び空間周波数閾値のＯＫＴ＊アセスメント
５０日目：ビヒクル又はＸＧ−１０２の両側結膜下注射（第２〜５群）
５７日目：コントラスト感度及び空間周波数閾値のＯＫＴアセスメント
６４日目：ビヒクル又はＸＧ−１０２の両側結膜下注射（第２〜５群）
７１日目：コントラスト感度及び空間周波数閾値のＯＫＴアセスメント
７８日目：ビヒクル又はＸＧ−１０２の両側結膜下注射（第２〜５群）
８５日目：コントラスト感度及び空間周波数閾値のＯＫＴアセスメント
９２日目：ビヒクル又はＸＧ−１０２の両側結膜下注射（第２〜５群）
９９日目：コントラスト感度及び空間周波数閾値のＯＫＴアセスメント
１０６日目：ビヒクル又はＸＧ−１０２の両側結膜下注射（第２〜５群）
１１３日目：コントラスト感度及び空間周波数閾値のＯＫＴアセスメント
１１４日目：暗順応及び明順応のＥＲＧ分析
１１４日目：多重サイトカイン分析のための網膜の摘出
＊ＯＫＴ：視運動性追跡（ｏｐｔｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｔｒａｃｋｉｎｇ）。
【０７０３】
ストレプトマイシン投与のために、同じ年齢のラットを注射前日に秤量し、一晩絶食させ、ケージを、動物施設で黄色のカードを用いて印す。体重を平均し、単一用量は、全てのラットについて平均体重に基づいて算出する。１０匹以下の動物に、溶液中のＳＴＺ活性の急速な低下のためにＳＴＺの単回調製物を注射し、この手順を１０匹の動物の各バッチについて繰り返す。ＳＴＺ粉末は、注射の直前に１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中に溶解し、ラットには、胃及びなんらかの重要な臓器を避けるように注意を払って２２ゲージのシリンジを使用して１ｍＬの容積で５０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺを腹腔内に投与する。
【０７０４】
結膜下投与のために、動物をケタミン／キシラジンで麻酔し（ケタミン及びキシラジンを、２０単位のケタミン（１００ｍｇ／ｍＬ）及び１００単位のキシラジン（２０ｍｇ／ｍＬ）を利用して、Ｕ−１００シリンジを使用して混合し、麻酔混合物を、ＩＰ注射によって１ｍＬ／ｋｇ（体重）で適用する）、シクロゲル（Ｃｙｃｌｏｇｅｌ）及び／又はトロピカミドの局所投与で瞳孔を拡張する。鎮静及び拡張の後、１つの眼あたり５０μＬの総容積を、インスリンシリンジに連結した３１ゲージの針を使用して結膜に注射する。
【０７０５】
充血、結膜浮腫、及び分泌物のドレーズ（Ｄｒａｉｚｅ）スコアリングのため、動物を手で拘束して、充血、結膜浮腫、及び分泌物のスコアは、「ＥｙｅＣＲＯの眼のスコアリングシステム」を使用して盲検の観察者が記録する。
【０７０６】
全ての視運動性追跡実験は、げっ歯類の使用のために設計した視力計測法を使用して行った（Ｃｅｒｅｂｒａ）Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．）。この非侵襲性のアセスメントでは、ラットを、光遮断ボックス内にある４つのＬＣＤスクリーンに囲まれたプラットフォームに置く。次いで、視覚的刺激を、ＬＣＤスクリーンによってラットに提示し、盲検の観察者が、ボックスの上部に装着されているデジタルのカムコーダーから視運動性追跡反射を可視化してスコア付けする。空間周波数閾値の測定のために、ラットは、０．０３４〜０．６６４サイクル／度の空間周波数の範囲で試験する。この視力計測法装置は、専用のアルゴリズムを使用して、盲検の観察者からの入力を受け取り、動物が正確な追跡反射を示したか不正確な追跡反射を示したか次第で、試験刺激を自動的に調節する。コントラスト閾値の全ての測定は、０．０６４サイクル／度という空間周波数閾値で行う。
【０７０７】
網膜電図写真（ＥＲＧ）のために、最低１２時間の暗順応の後、動物を８５ｍｇ／ｋｇのケタミン及び１４ｍｇ／ｋｇのキシラジンの腹腔内注射によって麻酔する。動物の準備は、薄暗い赤い光（＜５０ルクス）のもとで行う。ＥＲＧ分析は、ＤｉａｇｎｏｓｙｓのＥｓｐｉｏｎシステムを使用して行う。暗順応の応答のアセスメントのために、４０（Ｓ）ｃｄ．ｓ／ｍ２の刺激強度を、暗順応した拡張した眼に与える。次いで、暗順応のａ波の振幅を、刺激前のベースラインからａ波のトラフまで測定する。次いで、ｂ波の振幅を、ａ波のトラフからｂ波の頂点まで測定する。明順応の応答を評価するため、動物を１０分間明順応させ、次いで１０（Ｓ）ｃｄ．ｓ／ｍ２の強度で拡張した眼にストロボのフラッシュを与える。全部で２５回の繰り返したフラッシュ及び測定を平均して、最終の波形を得る。次いで、明順応のｂ波の振幅を、ａ波のトラフからｂ波の頂点まで測定する。
【０７０８】
多重サイトカイン分析のために、試験終了時、網膜を個々に分離して、液体Ｎ２中で直ちに急速凍結する。Ｂｉｏ−Ｒａｄ「Ｂｉｏ−ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ  Ｒａｔ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２３−ｐｌｅｘアッセイ（カタログ番号Ｌ８０−０１Ｖ１１Ｓ５）を、この試験で分離された各々の網膜のＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＲＯ／ＫＣ、ＩＦＮ−ｙ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−３α、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−α、及びＶＥＧＦのタンパク質発現を定量するために製造業者の仕様に従って使用する。
【０７０９】
結果：
ＸＧ−１０２の両側の結膜下投与の眼の耐容性を決定するために、結膜浮腫、充血、又は分泌物によって示される眼の刺激作用の徴候の包括的な眼科検査を、試験期間の間、週に１回行った。ラットを、各指標について０（正常）から４（重度）というスケールでスコア付けした。ビヒクル又はＸＧ−１０２のいずれを投与された動物でもいずれの時点でも眼の刺激作用は観察されなかった。
【０７１０】
視運動性追跡を用いて、４３日目（ＳＴＺ後６週）に開始して２週間間隔でＳＴＺ−糖尿病性Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットで識別される最大空間周波数を測定した。ビヒクルを投与した非糖尿病性群で視力の喪失はない。４３日目に、群にまたがって視力に差異はなかった。視力は、５７日目にビヒクルで処置したＳＴＺ−糖尿病性ラットでは低下する。全てのＳＴＺ−糖尿病性ラットは、５７日目〜９９日目の間に視力の低下を示す（図８９Ａ〜Ｃ）。しかし、２０ｇ／眼又は２００μｇ／眼のいずれかのＸＧ−１０２での処置は、これらの時点の各々で視力の進行性の低下を有意に遅らせる（図８９Ａ〜Ｃ）。１１３日目に、ＸＧ−１０２を投与した全群が、ビヒクル処置のＳＴＺ−糖尿病性群に対してより高い視力スコアを示し、この群では、２μｇ／眼又は２００μｇ／眼のいずれかを投与されて、有意に高い空間周波数閾値を有した（図８９Ｄ）。
【０７１１】
視運動性追跡を使用して、閾値を測定し、ここでは、ＳＴＺ−糖尿病性ラットは、４３日目に開始して２週間間隔で、視覚的に示される刺激でコントラストを識別できた。ビヒクルを投与した非糖尿病性群でコントラスト感度の喪失はない。４３日目及び５７日目に、ビヒクル又は２μｇ／眼のＸＧ−１０２のいずれかを投与されたＳＴＺ糖尿病群は、全ての他の群に対してコントラスト閾値が低下していた。全てのＳＴＺ糖尿病群は、この試験の経過にまたがってコントラスト閾値の低下を示すが、この低下は、２００μｇ／眼で処置された群では有意に低下した（図９０Ａ、Ｂ）。９９日目に、全てのＸＧ−１０２処置した群は、ビヒクル群に対して有意に高いコントラスト閾値を有し（図９０Ｃ）、この値は、１１３日目にわたって高いままである（図９０Ｄ）。
【０７１２】
１１４日目に、眼を摘出し、網膜の組織を採取して、２３の固有のサイトカインの多重サイトカイン分析のために処理した。ＳＴＺ誘発性の糖尿病は、観察された２３のサイトカインのうち１３について、ビヒクル処置した動物では網膜のレベルを上昇した（図９１）。１３の上昇したサイトカインのうち７つが、２μｇ／眼のＸＧ−１０２で処置したＳＴＺ−糖尿病性動物では低下した（図９１）。全てのサイトカインは、２０μｇ／眼、又は２００μｇ／眼のいずれかのＸＧ−１０２を投与されたラットの群から採取された網膜組織中のＢＬＱであった（図９１）。総タンパク質濃度は、サイトカインを検出するために使用される全ての試料について等しく、各々の個々のサイトカインについての標準曲線は、高いｒ−平方値を有した。したがって、このアッセイ自体では、タンパク質変性又は欠損の証拠がない。ビヒクル処置した糖尿病性動物でアップレギュレーションされ、２μｇ／眼のＸＧ−１０２での処置によってダウンレギュレーションされたサイトカンは：ＩＬ−β、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＳＦ、及びＩＬ−７であった。これらのサイトカインの各々は、炎症関連の糖尿病性網膜症疾患の進行に関連する。
【０７１３】
まとめると、ＸＧ−１０２の両側の結膜下送達は、Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットではよく耐容され、したがって、試験全体にわたっていずれの時点でも結膜浮腫、充血、又は分泌物の徴候はなかった。視力及びコントラスト感度は、全ての処置群においてＳＴＺ−糖尿病性ラットで進行性の低下を示す。この視力低下は、ビヒクル単独で処置したラットでは最大である。ＸＧ−１０２の全ての処置用量は、ビヒクル単独に対して視覚の改善をもたらした。２μｇ／眼又は２００μｇ／眼のいずれかのＸＧ−１０２を用いた処置は、ＳＴＺ投与後１１３日目の視力を有意に救済し；２μｇ／眼のＳＤＤ−１００２での処置は、ビヒクル処置のＳＴＺ−糖尿病性ラットに対してＳＴＺ投与後１１３日目にコントラスト感度を有意に救済する。ＳＴＺ誘発性の糖尿病は、この試験で分析された２３のサイトカインのうち１８では、より高い網膜サイトカインレベルを生じた。１８の上昇したサイトカインレベルのうち１０が、２μｇ／眼のＸＧ−１０２での処置では低下した。全てのサイトカインレベルは、２つの最高用量のＸＧ−１０２（２０及び２００μｇ／眼）を投与されているＳＴＺ−糖尿病性ラットの網膜の組織において定量限界未満（ＢＬＱ）であった。
【０７１４】
この試験の結果、ＸＧ−１０２の結膜下送達は、ラットに十分耐容され、有害事象を生じないことが示される。ＸＧ−１０２は、ラットでのＳＴＺ誘発性の糖尿病性網膜症において１６週間にわたって視力及びコントラスト感度の両方の喪失を改善するのに有効である。
【０７１５】
実施例４０
ランゲルハンス膵島分離及び移植におけるＸＧ−１０２（配列番号１１）の評価
この試験は、膵島分離及び移植に対する以前の試験（参照、実施例１７及び２２）に基づき、かつ膵島生存度に対するＸＧ−１０２の効果を決定することを目的とする。
【０７１６】
この試験の最初の部分では、実施例２２に記載のモデルを使用し、すなわち、３０分の期間の虚血及びＸＧ−１０２を１００μＭで与えた。
【０７１７】
膵島生存度に対する虚血及びＸＧ−１０２の影響に関与する図７９に示されるように、ＸＧ−１０２はアポトーシス及び壊死を低下することがここでも観察された。これらの結果によって、ＸＧ−１０２は、膵島の生存度に有益な影響を有することが示される。
【０７１８】
膵島分離は、異なる経路が、膵島の機能及び生存度に影響するように活性化され得る長いプロセスであるので、この試験の第２の部分では、虚血とは別のモデルを使用して、膵島生存度に対するＪＮＫ阻害剤ＸＧ−１０２の効果を検討した。したがって、低酸素症を、膵島分離／移植のためのモデルとして使用した。なぜなら、低酸素症は、ＪＮＫリン酸化を誘導することが公知であるからである。これらの実験では、分離１８時間後、膵島をＸＣ−１０２  １００μＭを用いて１時間処置するか、又は処置せず、次いで４時間低酸素に供し、それによって、４時間の低酸素（「Ｈ４」）の間、ＸＧ−１０２は依然として存在した（又は対照群では存在しなかった）。
【０７１９】
図８０に示されるウエスタンブロットに示されるとおり、低酸素症（「Ｈ４」）は、期待どおり、酸素正常状態条件（「Ｎ４」）で維持された膵島と比較してＪＮＫ及びＪＵＮリン酸化を誘発する。しかし、驚くべきことに、ＪＮＫ阻害剤ＸＧ−１０２は、低酸素症によって誘発されるＪＮＫ及びＪＵＮのリン酸化を阻害しなかった（図８０「Ｈ４＋ＸＧ１０２」を参照のこと）。
【０７２０】
生存度に関して、低酸素症は、図８１に示されるとおり、アポトーシス及び壊死を増大した（Ｈ４対Ｎ４）。しかし、膵島がＸＧ−１０２で処置された場合、アポトーシス及び壊死は、酸素正常状態及び低酸素症条件のいずれかで低下された。結論として、ＸＧ１０２はまた、この低酸素症モデルで膵島生存度に有益な効果を有した。
【０７２１】
実施例４１
ピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮ）誘発性の腎症に対するＸＧ−１０２の効果（投与頻度）
この試験の目的は、糸球体腎炎のモデルにおける、すなわち、ラットにおける長期ピューロマイシンアミノヌクレオシド誘発性の腎症におけるＸＧ−１０２の投与の頻度を決定することであった。したがって、この試験は、実施例２０に記載の試験に基づき、かつ４ｍｇ／ｋｇの用量のＸＧ−１０２を、実施例２０に記載の試験の結果に基づいて選択した。
【０７２２】
したがって、この試験は、以下の各々１５匹のラットの８つの群を含み、ここでは「ＳＤＤ−１００２」は、ＸＧ−１０２を指す。
【０７２３】
【表５４】
2020073573.tif 000059
【０７２４】
ＸＧ−１０２の投与は、全ての群（第３、４、５、及び８群）で単回投与について４ｍｇ／ｋｇである。したがって、この群は、上記で特定されたｉ．ｖ．投与の数において変化する。
【０７２５】
雄性Ｗｉｓｔａｒラットを、食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に含有されるＰＡＮ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈｔ、Ｆｒａｎｃｅ）２回の反復性の腹腔内注射（ｉ．ｐ．）で０日目に（体重あたり１３０ｍｇ／ｋｇ）及び１４日目に（体重あたり６０ｍｇ／ｋｇ）で処置する。対照ラット（第１及び６群）に、等量の食塩水（ｉ．ｐ）を０日目及び１４日目に投与する。
【０７２６】
ＸＧ−１０２又はそのビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）は、上記で挙げられた異なる時点で尾静脈（ｉ．ｖ．）に投与する。ＸＧ−１０２又はビヒクル投与は、０日目の第１のＰＡＮ注射後２１日目に開始する。ＸＧ−１０２は、４ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。
【０７２７】
時間的なスケジュールを以下のとおりまとめる：
０日目及び１４日目：腎症の誘発のためのＰＡＮ又はそのビヒクル（食塩水）注射。
２１日目から４２日目：上記のようなｉ．ｖ．経路によるＸＧ−１０２又はそのビヒクルの投与。
２１日目：クレアチニン及び尿素定量のための意識のある動物における血液試料採取（ビヒクル処置動物（ｎ＝６）及びＰＡＮ処置動物（ｎ＝６）での無作為化によって選択されるｎ＝１２）。
４９日目又は７７日目：血液試料採取、動物の屠殺及び試料採取（腎臓）。
【０７２８】
試験設計を、図８２に模式的に示す。
【０７２９】
血液試料は、０日目の第１のＰＡＮ注射後の２１日目に、意識のある動物で採取する。血液及び腎臓サンプリングのために、４９日目及び７７日目に、動物を、ペントバルビタールの注射によって麻酔する（６０ｍｇ／ｋｇ；Ｃｅｖａ  Ｓａｎｔｅ  Ａｎｉｍａｌｅ；Ｌｉｂｏｕｒｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）。血液試料を採取し、ＥＤＴＡ  ３Ｋでコーティングしたチューブ中に移し（４℃）、次いで、血漿採取のために遠心分離する（１０分、３０００ｒｐｍ、４℃）。血清は、クレアチニン及び尿素アッセイのために使用まで−２０℃で保管する。
【０７３０】
腎臓を取り出し、全ての結合組織及び被膜を清浄し、電子微量天秤（Ｍｅｔｔｌｅｒ、Ｔｏｌｅｄｏ）で秤量する。腎臓を、１０％ホルマリン溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）中に４８時間移し、次いで７０％エタノール中に、さらなる組織学的調製及びＨｉｓｔａｌｉｍ（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）による画像化のために移す。プロトコールの終わりに、動物を、頸部脱臼によって屠殺する。
【０７３１】
バイオマーカー定量のために、例えば、血漿クレアチニン及び尿素を、Ｇｅｎｏｔｏｕｌの表現型（Ｐｈｅｎｏｔｙｐａｇｅ）プラットフォーム（Ｒａｎｇｕｅｉｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）によって、ＡＢＸ  Ｐｅｎｔｒａ  ４００  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙアナライザー（株式会社堀場製作所）を使用して定量する。
【０７３２】
組織学的調製及び画像は、Ｈｉｓｔａｌｉｍ（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）によって行う。パラフィン包埋された組織の腎臓切片を、ヘマトキシリン／エオシン、ＰＡＳ−メセナミン銀及びＳｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄによって、それぞれ、形態学的変更の組織学的評価、糸球体損傷評価及び間質性線維症定量のために染色する。結果を、専門的な組織病理学者評価に従って半定量的スコアリングによって表す。線維症は、全腎臓切片表面上のＲｅｄ  Ｓｉｒｉｕｓ染色領域のパーセンテージとして表す。全てのスライドを、浜松ホトニクス株式会社（日本）のＮａｎｏｚｏｏｍｅｒ  ２．０ＨＴを用いてＸ２０でデジタル化する。
【０７３３】
糸球体硬化症の組織学的検査
糸球体変化を、Ｎａｋａｊｉｍａら（２０１０）から適合された半定量的スコアリングシステムを使用してＨ＆Ｅ、ＰＡＳ及びＰＡＳ−Ｍ染色切片で評価した。要約すると、糸球体損傷の程度は、１匹の動物あたり全部で５０の糸球体について１つの腎臓切片あたり２５の糸球体（１匹の動物あたり２つの切片）で評価した。個々の糸球体中の損傷の程度は、糸球体関与のパーセンテージに基づいて、０〜４のスケールを使用して等級付けした。
スコア０：正常、
スコア１：糸球体の最大２５％の病変、
スコア２：糸球体の２６〜５０％の病変、
スコア３：糸球体の５１〜７５％の病変、及び
スコア４：糸球体の７６〜１００％の病変。
【０７３４】
糸球体障害の頻度は、評価された糸球体の総数（５０／動物）の損傷された糸球体（スコア１〜４）のパーセンテージ（％）として表した。スコアは、組織病理学者がＨｉｓｔａｌｉｍによって盲検的に決定した。
【０７３５】
結果の表現及び分析
各群について、結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．として表した。
【０７３６】
使用した統計学的検定：
−体重の結果について二元ＡＮＯＶＡを用いる全群の比較。
−第１又は６群（食塩水／ビヒクル）と第２又は７群（ＰＡＮ／ビヒクル）との間の比較を、対応のないスチューデントｔ検定を使用して行った。
−第２群（ＰＡＮ／ビヒクル）と第３〜５群（ＰＡＮ／ＸＧ−１０２）との間の比較は、一元ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニ又はニューマン−コイルス事後検定を使用して行った。
−第７群（ＰＡＮ／ビヒクル）と第８群（ＰＡＮ／ＸＧ−１０２）との間の比較は、対応のないスチューデントｔ検定を使用して行った。
−組織学的スコアの統計学的分析のために、全てのデータがゼロと同一であるか、又は等しい場合、ある値を改変して（例えば：０から０．０００１）、統計学的試験を行うことを可能にした。
【０７３７】
Ｐ＜０．０５値を、統計学的有意差として許容した。
【０７３８】
結果：糸球体損傷のスコア及び頻度
糸球体損傷を、４９日目で（第１〜５群）及び７７日目で（第６〜８群）の採取後に評価した。
【０７３９】
糸球体損傷スコア（図８３）は、糸球体障害及び硬化症の重症度の評価に相当する。損傷された糸球体のパーセンテージとして表現される糸球体損傷の頻度の定量は（図８４）、病変の頻度の指数であり、かつ残りの機能的な腎単位とは間接的な指標である。
【０７４０】
４９日目（第１〜５群）：
ナイーブな対照ラット（第１群：食塩水／ビヒクル；図８５Ａ〜Ｃ）では、９０％超の糸球体は、組織学的に正常な外観であるが、糸球体のうちわずかな割合は、メサンギウム基質及び局所的細胞増多の増大が最小であることによって主に特徴付けられた糸球体硬化症のわずかな分節状の証拠を示した。糸球体変化の程度における個々の間の変動は低かった。第１群（食塩水／ビヒクル）における糸球体損傷スコア（ＧＩＳ）は、０．０９±０．０１であった（図８３）。
【０７４１】
対照的に、ピューロマイシン単独を投与された動物（第２群）は、糸球体のうち９０％超が組織学的変化を示し（図８４）、ＧＩＳは１．５０±０．０６であった（図８３）。変化（図８５Ｄ〜Ｆ）は、糸球体係蹄の変動のある細胞増多を伴うメサンギウム基質の軽度から中度の増大を含んだ。糸球体間質細胞の数は、わずかに増大する場合が多いようであった。大きい淡明細胞の存在も注目された。これらの淡明細胞は、偶発的なマクロファージの存在をともなう拡大された有足細胞である可能性が高い。わずかなパーセンテージの糸球体が、より大きい程度の糸球体損傷を示し、糸球体係蹄の変化に加えて、ボーマン嚢の肥厚及び側壁上皮細胞の肥大／過形成を伴う。ある場合には、糸球体変化は主に、糸球体係蹄のＰＡＳ陽性物質の増大、及び細胞質のわずかな増大を伴う。糸球体のうち８０％超が、２又は３のスコアに分類され、いくつかの等級４の糸球体が観察された。これらの等級４の糸球体は、ほぼ全体的な硬化症及び細胞質の有意な低下によって特徴付けられた。それらは、末端の糸球体硬化症の代表であった。
【０７４２】
第３群の糸球体（ＰＡＮ／ＸＧ−１０２、４回のｉ．ｖ．）は、第２群（ＰＡＮ／ビヒクル）動物と比較して、パーセンテージ（７６．９％、図８４）及び重症度に影響が少なかった。第３群（ＰＡＮ／ＸＧ−１０２）ＧＩＳは、０．９４±０．０５であり（図８３）、かつ第２群と比較して有意に異なった（Ｐ＜０００１）。糸球体変化は、第２群（ＰＡＮ／ビヒクル）の動物について記載されたように、メサンギウム基質沈着におけるわずかな増大を伴う場合が多い、糸球体間質細胞の分節状の細胞増多を伴った（図８５Ｇ〜Ｉ）。特定の糸球体は、第４群及び第５群で主に観察されるように、ただし第２群（ＰＡＮ／ビヒクル）では大きくなかったが、大型の淡明の有足細胞のわずかな数の増大を示した。罹患した糸球体のパーセンテージは、第２群で観察されるよりも有意に低かった（図７、Ｐ＜０．００１）。等級１及び等級２糸球体のパーセンテージにおける明確な差異が群の間で注目された：第３群動物は、第２群についての３７％と比較して等級１の糸球体のうち６１％という平均、及び等級２を有する糸球体のうち１５％という平均を示し、一方では、第２群では平均は４６％であった。
【０７４３】
第４群（ＰＡＮ／ＸＧ−１０２、２回のｉ．ｖ．；図８５Ｊ〜Ｌ）では、糸球体変化は、増殖性の糸球体硬化症をより拡散させる分節状の膜性増殖性の混合物であった。ＧＩＳは、１．２６±０．０６（図８３）であり、第２群についての１．５０±０．０６と比較して有意に異なった（Ｐ＜０．０１）。この差異はほとんどが、第２群と比較した場合、等級２の糸球体の低いパーセンテージと組み合わされた等級１の糸球体のより高いパーセンテージに、起因した。
【０７４４】
第５群（ＰＡＮ／ＸＧ−１０２、１回のｉ．ｖ．；図８５Ｍ〜Ｏ）では、ＧＩＳは、第２群（１．５３±０．０５、図８３）に匹敵した。組織学レベルで、糸球体変化は、第２群で観察されるように、細胞増多（メサンギウム細胞）及びメサンギウム基質の増大の両方に起因する場合が多い。各々の等級における罹患した糸球体のそれぞれの割合（図８４）は、２つの群の間で極めて似ていた。
【０７４５】
７７日目（第６〜８群）。
４９日目に観察されるとおり、全てのナイーブな対照動物（第６群：食塩水／ビヒクル；図８６Ａ〜Ｃ）は、高いパーセンテージの正常な糸球体であった（＞６０〜９０％の等級０、図８４）。組織学的に、糸球体変化は、第１群（食塩水／ビヒクル、４９日目）で観察される変化と同一であり、かつ、存在する場合、メサンギウム基質及び細胞性の両方で最小かつ分節状の増大を構成した。
【０７４６】
第７群（ＰＡＮ／ビヒクル；図８６Ｄ〜Ｆ）は、１．３９±０．１０のＧＩＳを示し（図８３）、かつ第６群（食塩水／ビヒクル、Ｐ＜０．００１）と比較して有意に異なる。この群の３匹の動物（ラットｎ°７４、１１１、及び１１５）を、群平均との大きい差異に起因して除外した（平均から＞２ＳＤ）。組織学的に、糸球体の病変は、最小から軽度の分節状の膜性増殖性糸球体硬化症（等級１及び２）から、中度から重度の末端の糸球体硬化症（等級３及び４）にわたった。罹患した糸球体のパーセンテージ（９１％）は、４９日目に第２群で観察されたパーセンテージ（９０％）に匹敵した（図８４）。
【０７４７】
第７群（ＰＡＮ／ビヒクル）と比較して、第８群（ＰＡＮ／ＸＧ−１０２、１回のｉ．ｖ．）の動物は、ＧＩＳの有意な低下を示した（０．８２±０．０４対１．３９±０．１０、図８３；Ｐ＜０．００１）。第８群（ＰＡＮ／ＸＧ−１０２、１回のｉ．ｖ．）はまた、第７群（ＰＡＮ／ビヒクル，図８５；Ｐ＜０．００１）の９１％に比較して罹患した糸球体のパーセンテージ（６９％）が低かった。組織学的に、糸球体変化は第８群に存在する場合、４９日目の第３群（ＰＡＮ／ＸＧ−１０２、４回のｉ．ｖ．）の動物で記載されるとおり、分節状の膜性増殖性糸球体硬化症という特徴であった（図８６Ｇ〜Ｉ）。
【０７４８】
要するに、ピューロマイシンを投与されたラットで観察された糸球体変化は、文献（Ｈｉｌｌ、１９８６）、及び実施例２１に記載されたものと組織学的に一致していた。この病変は、メサンギウム細胞の増加所見のある膜性増殖性及び進行性の糸球体症、大型かつ淡明細胞の存在、並びにメサンギウム基質の増大からなる。ＸＧ−１０２は、（ｉ）４９日目に、第２群（ＰＡＮ／ビヒクル）と比較して、４回のｉ．ｖ．（毎週、第３群）及び２回のｉ．ｖ．（２週ごと、第４群）によって；並びに（ｉｉ）７７日目（投与後２か月）で第７群（ＰＡＮ／ビヒクル）と比較して１回のｉ．ｖ．によって（第８群）投与された場合、糸球体変化の程度及び重症度を有意に低下した。
【０７４９】
これらの結果、ＸＧ−１０２は治療的効果を有することが示される：（ｉ）４回（毎週投与）及び２回（２週ごとの投与）のＸＧ−１０２の４ｍｇ／ｋｇの用量でのｉ．ｖ．注射は、病変の重症度（糸球体損傷スコア）に関してＰＡＮ誘発性の糸球体硬化症を有意に低下し、ただしまた、４９日目に、糸球体損傷の頻度（損傷した糸球体のパーセンテージ）を有意に低下した；（ｉｉ）４ｍｇ／ｋｇの用量でのＸＧ−１０２の単回ｉ．ｖ．注射はまた、７７日目（投与後２か月）で病変の重症度（糸球体損傷スコア）及び糸球体損傷の頻度（損傷した糸球体のパーセンテージ）の両方に関して糸球体硬化症に対する強力な影響をもたらし；そして（ｉｉｉ）ＸＧ−１０２の作用の期間は、最大２か月までとみなされる。まとめると、ＸＧ−１０２は単回注射でさえ、７７日目に観察される強力な長期効果を生じた。
【０７５０】
実施例４２
ランゲルハンス膵島分離及び移植におけるＸＧ−１０２（配列番号１１）の評価
この試験は、ブタ及びラットの膵島分離及び移植に対する以前の試験に基づき（実施例１７、２２及び４０を参照のこと）、かつヒト膵島機能に対するＸＧ−１０２の効果を決定することを目的とする。この目的のために、同じ低酸素症モデルを、ラット膵島について実施例４０に記載されるとおり使用した。
【０７５１】
要するに、ヒト膵島を、１００マイクロＭのＸＧ−１０２で１時間前処理するか、又は処理せず、次いで、阻害剤ＸＧ−１０２の有無のもとで更に２４時間の間、低酸素症に供した。
【０７５２】
膵島の生存度に対する虚血及びＸＧ−１０２の影響に関して図８７に示されるとおり、ここでも、ＸＧ−１０２は、低酸素症条件下でアポトーシス及び壊死を低減することが観察された。具体的には、図８７Ａによって、ＸＧ−１０２は、正常酸素条件でも低酸素条件でも壊死を低減したことが示される。図８７Ｂによって、ＸＧ−１０２はまた、低酸素症によって誘発されるアポトーシスを低減することも示される。これらの結果によって、ＸＧ−１０２は、低酸素症モデルにおいて、膵島生存度に有益な影響を有することが示される。
【０７５３】
実施例４３
結膜下投与後のエンドトキシン誘発性のブドウ膜炎のラットモデルにおけるＸＧ−１０２（配列番号１１）の作用期間の評価
急性前部ブドウ膜炎は、一般的に生じる眼の再発性の炎症疾患であって、潜在的な失明の続発症を生じ得る。この疾患の病原性は、理解が乏しい。急性の前部ブドウ膜炎に罹患している患者は、光恐怖症（光過敏症）を訴え、これは重篤である場合が多い。他の症状としては、眼の発赤、流涙及び弱視が挙げられる。検査の知見は、特徴的であって、血管のうっ血、眼房水中の細胞及びタンパク質のフレア、並びに縮瞳を包含する。重篤な場合、前房蓄膿（ｈｙｐｏｐｉｏｎ）及び／又はフィブリンが形成し得る。臨床的には、非感染性のブドウ膜炎の長期的な進行性又は再発性の形態を、局所及び／又は全身性のコルチコステロイド類で処置する。しかし、これらの薬物の長期使用は、緑内障、白内障、骨粗しょう症、高血圧及び糖尿病のような有害な眼の及び全身の副作用を生じ得る。代替的なステロイド節約の免疫抑制剤の使用はまた、臨床的利益を示し得るが、それ自体が有害なリスクを保持する。これらの制限を考慮すれば、新しい治療ストラテジーの開発について明白な需要がある。炎症の解消の機構の知識及びいくつかの炎症メディエーターの発見における近年の進歩は、潜在的な治療の可能性という全く新しい範疇につながっている。
【０７５４】
ラットにおけるエンドトキシン誘発性のブドウ膜炎（ＥｌＵ）は、ヒト前部ブドウ膜炎の有用な動物モデルである。ＬＰＳの全身的投与は、血液−眼障壁の破壊及び炎症性の細胞浸潤を伴う、眼の前方及び後眼部の急性の炎症性応答を生じる。ＥＩＵの臨床的徴候は、ヒト疾患に見られる変化を反映する。眼房水中の特徴的なタンパク質フレア及び細胞、縮瞳及び虹彩後癒着は、フィブリン塊及び前房蓄膿が生じるのと同様に生じる。
【０７５５】
この試験の目的は、ＥＩＵのラットモデルにおける結膜下投与後のＳＤＤ−１００２の作用期間を評価することであった。
【０７５６】
９０匹の雄性Ｌｅｗｉｓラットを使用し、週齢は、約６〜８週（誘発時に）、４週（−２８日目の注射で）、５週（−２１日目の注射で）、６週（−１４日目、−７日目、及び０日目の注射で）、７週（−２日目及び−１日目の注射で）であり、標準的なケージ中で５匹ずつ飼育した。動物は以下の群に割り当てた。
【０７５７】
【表５５】
2020073573.tif 000060
【０７５８】
したがって、各動物は、ＸＧ−１０２（２０μｇ／眼）、食塩水（０．９％ＮａＣｌ）ビヒクル対照、又はＳｏｌｕｍｅｄｒｏｌ（登録商標）（２０μｇ／眼）のいずれかの単回結膜下注射を各眼に投与された。メチルプレドニゾロン（Ｓｏｌｕｍｅｄｒｏｌ（登録商標））は、結膜下処置としてブドウ膜炎で最も一般的に使用される。
【０７５９】
この試験のスケジュールを以下に示す：
【０７６０】
【表５６】
2020073573.tif 000061
【０７６１】
０日目に、眼の炎症を、麻酔した動物に対するリポサッカライド（ＬＰＳ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍＬ／ｋｇ  Ｓｉｇｍａ＃Ｌ６５１１）の単回足蹠注射によって誘発した。ＬＰＳ粉末は、誘発の日に再溶解した。ＸＧ−１０２は、−２８日目又は−２１日目又は−１４日目又は−７日目又は−２日目又は−１日目又は０日目（誘発の直前）に各々の眼に単回注射（２０マイクログラム／５マイクロＬ）で投与した。食塩水対照及び参照品（Ｓｏｌｕｍｅｄｒｏｌ（登録商標）；２０μｇ／眼）を、０日目（誘発直前）に各眼に単回注射によって投与した。
【０７６２】
動物は、細隙灯を用いて、ＸＧ−１０２投与前（ベースライン）、誘発前（０日目）次いで誘発２４時間後（１日目）に検査した。炎症は、Ｄｅｖｏｓ  Ａ．、Ｖａｎ  Ｈａｒｅｎ  Ｍ．、Ｖｅｒｈａｇｅｎ  Ｃ．、Ｈｏｅｋ  Ｚｅｍａ  Ｒ．、Ｋｉｊ  ｌｓｔｒａ  Ａ：Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｓ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｕｖｅｉｔｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ、Ｅｘｐ．Ｅｙｅ．Ｒｅｓ．１９９５；６１：６６７〜６７５頁が記載するスコアリングシステムを使用して等級付けした。要するに、フレア、縮瞳及び前房蓄膿を、無し（０）、又は有り（１）にスコア付けし、前房中の虹彩充血及び細胞を、無し（０）、又は軽度（１）又は重度の存在（２）にスコア付けした。最大スコア（５つのパラメータのスコアの合計）は７であった。
【０７６３】
評価の終わり（誘発２４時間後）に、動物を、過量投与のペントバルビタールの静脈内注射によって安楽死させた。眼房水は、各眼について直ちに採取した。眼房水（ＡＨ）中での細胞浸潤の定量のために、試料は検出前にＰＢＳを用いて１０倍に希釈した。浸潤した細胞の数はギムザ染色後に顕微鏡下で、手でカウントした。
【０７６４】
結果：
１．眼の評価
ＬＰＳを注射して、ビヒクル、試験品又は参照で処置したＬｅｗｉｓラットにおけるＥＩＵの眼の病理学的症状を、細隙灯顕微鏡を用いて盲検方式で等級付けして、その有効性を評価した。その結果を図８８Ａに図示して、下にまとめる。
【０７６５】
【表５７】
2020073573.tif 000062
【０７６６】
ＬＰＳ誘発の２４時間後、ビヒクル処置したラットの臨床スコアは、４．０±０．２（平均±ＳＥＭ、ｎ＝２０）であり、中央値は４であった（範囲、２〜５）。
【０７６７】
眼の炎症の重症度の低下が、ＸＧ−１０２による誘発及び処置の２４時間後に検出された。その低下は、特に誘発と処置との間の遅れが短い場合に高かった。最大の低下は、ＸＧ−１０２を誘発の１日前に投与した場合に観察された。平均スコアは１．６±０．１であって、中央値は１．５（−６０％、ビヒクルと比較してｐ＜０．００１）であった。低下は、ＸＧ−１０２を７、２１又は２８日前に投与した場合、顕著ではなくなった（１８〜２３％）が、誘発の１４日前にＸＧ−１０２を投与した場合は有意であった（２８％、ｐ＜０．０５）。陽性対照薬として用いたメチルプレドニゾロン（２０μｇ／眼、処置した両眼）での結膜下処置も、臨床スコアを５０％まで有意に低下した（平均スコア：２．０±０．２、中央値：２）。
【０７６８】
２．眼房水中の細胞浸潤
ＬＰＳ誘発２４時間後、眼房水中に浸潤した炎症性細胞の数を各群についてカウントした。その結果を図８８Ｂに図示し、下にまとめる。
【０７６９】
【表５８】
2020073573.tif 000063
【０７７０】
ビヒクル処置した眼の眼房水中の炎症性細胞の数の中央値は、３２３６細胞／μＬ（範囲２７０〜６１４０細胞／μＬ）であった。眼房水の吸引は、ビヒクル群では２０の損傷した眼のうち２つでは行うことができなかった；フィブリン塊の形成が、吸引過程の間、針をブロックした。ＸＧ−１０２で処置したラットは、処置と誘発日との間の遅れがどうであれ、ビククル処置ラットと比較して浸潤細胞の数の有意な低下を示した。メチルプレドニゾロンで処置したラットは、ビククル処置ラットと浸潤細胞の数に有意な差異はなかった。デキサメタゾン（２０μｇ）及び試験品と同様の用量を使用した。白血球浸潤に関して、メチルプレドニゾロンは、同じ用量のデキサメタゾンよりも作用が弱かった（前の試験からのデータ）。臨床的には、メチルプレドニゾロンは、４０〜１２５ｍｇの範囲の一般的用量で局部的に使用されるが、デキサメタゾンアセテートは、４〜８ｍｇの範囲の用量で使用される。
【０７７１】
結論：
本明細書の結果によって、両眼のＸＧ−１０２の単回結膜下注射は、前房で観察されるエンドトキシン誘発性の炎症を部分的に防ぐことが実証される。なぜなら、臨床スコア及び細胞浸潤の有意な低下が観察されたからである。ＸＧ−１０２は、ラットの炎症性ＥＩＵモデルで最大２８日まで活性である。臨床スコアに対する有効性を、最大４週まで観察し、最初の２日の顕著な効果があり、最大４週までの眼房水における細胞浸潤には、２、３及び４週に顕著な効果があった。メチルプレドニゾロン（２０μｇ／眼、処置した両眼）は、臨床スコアの低下が観察された場合でも、細胞浸潤になんら有意な有効性を示すことができなかった。この有効性の欠失（デキサメタゾンでの以前のデータと比較して）は、投与量の低さに関連しているかもしれない。
【０７７２】
実施例４４
糖尿病性網膜症のラットモデルにおけるＸＧ−１０２（配列番号１１）の効果
この試験は、実施例２５、２６及び３９に記載のような糖尿病性網膜症におけるＸＧ−１０２の以前の試験に基づく。この試験の目的は、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発性の糖尿病性網膜症のラットモデルにおいて種々の頻度で反復して結膜下投与した後の視力の喪失、眼の臨床徴候、網膜層の厚さ、及びサイトカインプロファイリングに対するＸＧ−１０２の作用期間を決定することである。
【０７７３】
この目的のために、３６匹のラット（雌性，Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ、ＳＴＺ処置の時点で６〜８週を、以下の６群（１群あたり６匹の動物）に割り当てる。
【０７７４】
【表５９】
2020073573.tif 000064
【０７７５】
第１、２及び５群を、２２及び６４日目に（上記参照）、それぞれ、ビヒクル又はＸＧ−１０２の両側の結膜下投与によって処置した。第３群は、２２、４３、６４及び８５日目にＸＧ−１０２の両側の結膜下投与によって処置した。第４群は、２２、５０及び７８日目にＸＧ−１０２の両側の結膜下投与によって処置した。第６群は、２２日目にＸＧ−１０２の両側の結膜下投与によって処置した。
【０７７６】
実験設計は以下のとおりである：
１日目：ストレプトゾシンのＩＰ注射（第２〜６群）
４日目：血糖定量
２２日目：ビヒクル又は試験薬剤の両側結膜下注射（第１〜６群）
４３日目：コントラスト感度及び空間周波数閾値のＯＫＴアセスメント
４３日目：ビヒクル又は試験薬剤の両側結膜下注射（第３群）
５０日目：ビヒクル又は試験薬剤の両側結膜下注射（第４群）
５７日目：コントラスト感度及び空間周波数閾値のＯＫＴアセスメント
６４日目：ビヒクル又は試験薬剤の両側結膜下注射（第１〜３群、及び第５群）
７１日目：コントラスト感度及び空間周波数閾値のＯＫＴアセスメント
７８日目：ビヒクル又は試験薬剤の両側結膜下注射（第４群）
８５日目：コントラスト感度及び空間周波数閾値のＯＫＴアセスメント
８５日目：ビヒクル又は試験薬剤の両側結膜下注射（第３群）
９９日目：コントラスト感度及び空間周波数閾値のＯＫＴアセスメント
１０６日目：コントラスト感度及び空間周波数閾値のＯＫＴアセスメント
１０７日目：組織の収集
ｎ＝４眼／群（定量的網膜の組織学のために収集）
ｎ＝８網膜／群（多重サイトカイン分析収集）
＊ＯＫＴ：視運動性追跡
【０７７７】
ストレプトマイシン投与のために、同年齢のラットを注射の前日に秤量して、一晩絶食させ、ケージを、動物施設で黄色のカードを用いて印す。体重を平均し、単一用量は、全てのラットについて平均体重に基づいて算出する。１０匹以下の動物に、溶液中のＳＴＺ活性の急速な低下のためにＳＴＺの単回調製物を注射し、この手順を１０匹の動物の各バッチに繰り返す。ＳＴＺ粉末は、注射の直前に１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中に溶解し、ラットには、胃及びなんらかの重要な臓器を避けるように注意を払って２２ゲージのシリンジを使用して１ｍＬの容積で５０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺを腹腔内に投与する。
【０７７８】
結膜下投与のために、動物をケタミン／キシラジンで麻酔し（ケタミン及びキシラジンを、２０単位のケタミン（１００ｍｇ／ｍＬ）及び１００単位のキシラジン（２０ｍｇ／ｍＬ）を利用して、Ｕ−１００シリンジを使用して混合し、麻酔混合物を、ＩＰ注射によって１ｍＬ／ｋｇ（体重）で適用する）、シクロゲル（Ｃｙｃｌｏｇｅｌ）及び／又はトロピカミドの局所投与で瞳孔を拡張する。鎮静及び拡張の後、１つの眼あたり３０μＬの総容積を、インスリンシリンジに連結した３１ゲージの針を使用して結膜に注射する。
【０７７９】
充血、結膜浮腫、及び分泌物のドレーズ（Ｄｒａｉｚｅ）スコアリングのため、動物を手で拘束して、充血、結膜浮腫、及び分泌物のスコアは、「ＥｙｅＣＲＯの眼のスコアリングシステム」を使用して盲検の観察者が記録する。
【０７８０】
全ての視運動性追跡実験は、げっ歯類の使用のために設計した視力計測法を使用して行った（Ｃｅｒｅｂｒａ）Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．）。この非侵襲性のアセスメントでは、ラットを、光遮断ボックス内にある４つのＬＣＤスクリーンに囲まれたプラットフォームに置く。次いで、視覚的刺激を、ＬＣＤスクリーンによってラットに提示し、盲検の観察者が、ボックスの上部に装着されているデジタルのカムコーダーから視運動性追跡を可視化してスコア付けする。空間周波数閾値の測定のために、ラットを、０．０３４〜０．６６４サイクル／度の空間周波数の範囲で試験する。この視力計測法装置は、専用のアルゴリズムを使用して、盲検の観察者からの入力を受け取り、動物が正確な追跡反射を示したか不正確な追跡反射を示したか次第で、試験刺激を自動的に調節する。コントラスト閾値の全ての測定は、０．０６４サイクル／度という空間周波数閾値で行う。
【０７８１】
多重サイトカイン分析のために、試験終了時、網膜を個々に分離して、液体Ｎ２中で直ちに急速凍結する。Ｂｉｏ−Ｒａｄ「Ｂｉｏ−ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ  Ｒａｔ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２３−ｐｌｅｘアッセイ（カタログ番号Ｌ８０−０１Ｖ１１Ｓ５）を、この試験で分離された各々の網膜におけるＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＲＯ／ＫＣ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−３α、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−α、及びＶＥＧＦのタンパク質発現を定量するために製造業者の仕様に従って使用する。
【０７８２】
実施例４５
腎臓の両側の虚血再かん流のラットモデルにおけるＸＧ−１０２（配列番号１１）の効果
この試験は、腎の虚血／再かん流におけるＸＧ−１０２の以前の試験（実施例３６）に基づく。この試験の目的は、腎臓の両側の虚血再かん流のラットモデルにおける組織学的損傷に対するＸＧ−１０２の効果を評価することであった。
【０７８３】
虚血再かん流（ＩＲ）障害は、複雑な現象であり、ヒトでは、血管手術、臓器の調達及び移植で遭遇する場合が多い。げっ歯類での腎臓の両側の虚血再かん流（ＩＲ）の実験モデルは、損なわれた腎機能及び尿細管変性によって特徴付けられる急性の尿細管損傷をもたらす。本モデルは、腎臓のＩＲ損傷を防ぐことにおける薬物候補の使用のための概念という迅速な証明を提供するために頻繁に使用される。
【０７８４】
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（出荷時体重２００〜２５０ｇ）を使用した（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）。動物は、実験の少なくとも５日前に実験室に届けられ、この間、実験条件に馴化させた。この試験には、以下のように各１１〜１２匹のラットの３つの群を含んだ。
【０７８５】
【表６０】
2020073573.tif 000065
【０７８６】
試験設計は、図９６に示す。
【０７８７】
腎臓の温虚血のプロトコールは、以前に記載されたプロトコールと同様であった（Ｐｅｃｈｍａｎ  ＫＲら、２００９）。要するに、全身麻酔下で（ペントバルビタール；６０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．及びアトロピン；１ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）、両方の腎茎を、分離し、無傷クランプを使用して４０分間クランプした。この時間後、クランプを解放して、再かん流を開始した。動物は、手術の間、熱調節システム（ＴＣＡＴ−２ＬＶ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ、Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）を使用して３７℃に維持した。全ての動物を、両方の血管クランプを解放（再かん流）した２４時間後に屠殺した。疑似手術をした動物には、腎血管のクランプなしで同じ外科手順を行った。
【０７８８】
ＸＧ−１０２又はビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）を、第２の血管クランプの解放の２０分後に２ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈（ｉ．ｖ．）に投与した。尾静脈への静脈内投与は、１ｍＬ／ｋｇの容積を使用して行った。
【０７８９】
屠殺後、腎臓を取り出し、全ての結合組織及び被膜を清浄し、電子天秤（ＶＷＲ、Ｆｒａｎｃｅ）で秤量した。１つの腎臓を、１０％ホルマリン溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）中に少なくとも２４時間移し、次いで、Ｈｉｓｔａｌｉｍ（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）によって行うさらなる組織学的分析のために７０％エタノール中に移した。左右の腎臓を無作為に選択した。腎臓試料は、７２時間の間、１０％ホルマリン中で固定し、７０％エタノール中に移し、次いでＨｉｓｔａｌｉｍ（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）によってパラフィンブロック中に包埋した。１ブロックあたり１つの細長い切片（３〜５μｍ）を作製した。パラフィン包埋した組織の腎臓切片を、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）によって染色した。全てのスライドを、浜松ホトニクス株式会社（浜松、日本）のＮａｎｏｚｏｏｍｅｒ  ２．０ＨＴを用いて×２０でデジタル化した。各々の組織切片を、盲検方式で組織学的に検査して、尿細管変化が存在するか否かを決定した。次に、各々の知見の重症度を以下のとおり、等級付けした。
尿細管損傷スコアは、変性／壊死、尿細管上皮空胞形成、再生（好塩基性尿細管）、及び尿細管円柱のいずれかから構成された。
０：罹患した尿細管が５％未満（バックグラウンド）
１：罹患した尿細管が５〜２０％
２：罹患した尿細管が２１〜４０％
３：罹患した尿細管が４１〜７５％
４：罹患した尿細管が７５％超
【０７９０】
図９７に示されるとおり、第２群（ＩＲ／ビヒクル）の動物は、疑似／ビヒクル処置の動物と比較して、尿細管変性及び壊死，尿細管円柱形成、及び好塩基性尿細管を含む尿細管損傷の有意な増大を示した。ＸＧ−１０２は、尿細管損傷に、特に尿細管の変性、壊死及び尿細管円柱形成に対して（図９７）並びに総尿細管スコアに対して（図９８）有意に有益な効果を示した。ＸＧ−１０２処置ラット（第３群）とビヒクル処置ラット（第２群）の動物の間の尿細管変性及び壊死に関する主な差異は、罹患した尿細管の数が少なく、病変がほとんど皮質髄質移行部に限られており、表面の皮質に伸びなかったということである。第３群の腎臓（ＩＲ／ＸＧ−１０２）は、第２群（ＩＲ／ビヒクル）と比較した場合、尿細管円柱に対して示すスコアの重症度が低かった。これらの組織学的変化の代表的な画像は図９９にある。
【０７９１】
具体的には、第１群（疑似／ビヒクル）の尿細管変化は、３／１２の動物における少数の好塩基性尿細管（スコア１）に対して単一の存在に限定された（図９７）。この頻度は、ナイーブな若い成体の対照ラットにおける予想される正常限界内であり、かつもともと偶発的とみなされた。比較して、第２群（ＩＲ／ビヒクル）の全ての動物は、中度から顕著な（スコア３及び４）尿細管の上皮の変性及び壊死を示した（３．４５±０．５２）。ほとんどの罹患した尿細管は、皮質髄質移行部に集中しており、かつ脱落及び壊死性の上皮細胞の大きいクランプを含む尿細管によって組織学的に特徴付けられた。尿細管変性病変はまた、最も重度の病変を有する動物のほとんどの皮質にも存在した（スコア４）。尿細管変性に加えて、全ての動物が、管腔で多数の尿細管円柱を示した（スコア３）。少数から中程度の数の好塩基性尿細管の存在（スコア１及び２、平均＝１．３６±０．６７）も、第２群（ＩＲ／ビヒクル）の１０／１１の動物の皮質全体で観察された。好塩基性尿細管は、尿細管における早期の上皮再生の指標であった。第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０２）に関しては、尿細管病変は本質的に、第２群（ＩＲ／ビヒクル）で観察されるものと同じ性質及び外観であったが、一般に分布の重症度は低かった。
【０７９２】
更に具体的には、平均尿細管上皮変性／壊死スコアは、第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０２）では、２．６７±０．６５であった。第２群（ＩＲ／ビヒクル）と第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０２）との間の主な差異は、第３群のいく匹かの動物が、２というスコアを示したということであった（第３群では５／１２及び第２群では０／１１）。最終的に、第３群のうち１／１２の動物のみが、第２群での５／１１と比較して４というスコアを有した。組織学的には、第２群（ＩＲ／ビヒクル）に比較して、第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０２）の動物との間の尿細管変性及び壊死に関する主な差異は、罹患した尿細管の数が少なく、その病変がほとんど、皮質髄質移行部に限定されており、かつ表面の皮質に伸びなかったということである。第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０２）及び腎臓はまた、第２群（ＩＲ／ビヒクル）と比較した場合、尿細管円柱に対して示すスコアの重症度が低かった。実際に、尿細管円柱スコアは、第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０２）では２．５０±０．５２であった。比較して、第２群（ＩＲ／ビヒクル）の尿細管円柱スコアは、３．００±０．００であった。第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０２）の好塩基性尿細管の数は、第２群で観察されたものとよく似ていた。第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０２）の平均好塩基性尿細管スコアは、１．３３±０．６５であり；第２群のスコアは１．３６±０．６７であった（図９７）。
【０７９３】
４つの実験群のいずれでも尿細管空胞形成は観察されなかった。したがって、第１群（疑似／ビヒクル）の総尿細管スコアは、少数の動物のみが、なんら他の尿細管変化なしで好塩基性尿細管を呈したので、予想よりも極めて低かった（０．２５±０．４５）。第２群では、総尿細管スコアは、４つの実験群の中で最高であり、６〜９（７．８２±０．９８）に及んだ。第３群の総尿細管スコアは、第２群（ＩＲ／ビヒクル）で観察されるスコアよりも比較的低く、スコアは５〜８におよんだ（６．５０±０．８０）。第２群（ＩＲ／ビヒクル）と第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０２）との間で観察される差異は、生物学的に有意とみなされた。
【０７９４】
まとめると、ＸＧ−１０２は、尿細管損傷に対して、並びに具体的には、尿細管変性、壊死及び尿細管円柱形成に対して有意な有益な効果を示した。ＸＧ−１０２処置したラット（第３群）とビヒクル（第２群）ＩＲ動物の動物の間の尿細管変性及び壊死に関する主な差異は、罹患した尿細管の数が少なく、その病変はほとんど、皮質髄質移行部に限定されており、かつ表面の皮質に伸びなかったということである。第３群（ＩＲ／ＸＧ−１０２）の腎臓はまた、第２群（ＩＲ／ビヒクル）と比較した場合、尿細管円柱に対して示すスコアの重症度が低かった。
【０７９５】
実施例４６
意識のあるラットでのシクロホスファミドによって誘発された急性の膀胱炎モデルに対して膀胱内で投与されたＸＧ−１０２（配列番号１１）の効果：内臓痛及び膀胱炎の評価
この試験の目的は、雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける急性のＣＹＰ誘発性の膀胱炎における膀胱痛及び炎症に対するＸＧ−１０２（５０ｍｇ／ｍＬ）を用いた膀胱内処置の効果を評価することであった。この前臨床モデルは、間質性膀胱炎／膀胱痛症候群（ＩＣ／ＰＢＳ）の処置のための治療アプローチを試験するためによく使用されている。
【０７９６】
成体雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ  Ｓａｉｎｔ  Ｉｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）（実験の開始時点で体重２１５±２０ｇ）を使用した。動物は、実験開始前の少なくとも３日間、実験条件に馴化させた。動物は、以下の４つの実験群に割り当てた（１群あたりｎ＝１０匹の動物）。
【０７９７】
【表６１】
2020073573.tif 000066
【０７９８】
急性の膀胱炎を誘発するために、５ｍＬ／ｋｇの最終容積中で１５０ｍｇ／ｋｇの用量のＣＹＰの単回ｉ．ｐ．注射を行った。対照のラットには、ＣＹＰと同じ実験条件下で生理食塩水を与えた（５ｍＬ／ｋｇ，ｉ．ｐ．の最終容積）。
【０７９９】
各実験の日に、ラットの体重を記録した。次いで、無作為化した方法で、５００μＬのＸＧ−１０２（５０ｍｇ／ｍＬ）、イブプロフェン（５０ｍｇ／ｍＬ）又はビヒクルを、イソフルラン麻酔（２％〜３％）下で３０分間、膀胱内に注入した。
【０８００】
ｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントを使用する言及された（ｒｅｆｅｒｒｅｄ）内臓痛のアセスメント：
固定した時間帯（行動応答における潜在的な日内変動を最小限にするため午前）及び全動物の一人の実験者の試験を含む標準条件を適用して、行動に基づく疼痛試験の変動を最小限にした。異痛症及び痛覚過敏を含む内臓痛は、５秒の刺激間隔で漸増力（１、２、４、６、８、１０、２６及び６０ｇ）の８つの校正されたｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントのセットを、膀胱に近い下腹部に適用することによって評価した。試験前、各動物の機械的刺激のために意図した腹部領域を剃毛した。次いで、動物を個々の透明なＰｌｅｘｉｇｌａｓボックスの下の持ち上がったワイヤメッシュフロア上に置いて、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験を開始する前に少なくとも３０分間馴化させた。次いで、フィラメントを、フィラメントがわずかに曲がるのに十分な強度でメッシュのフロアを通して１〜２秒適用した。各フィラメントを３回試験した。脱感作を回避するために、膀胱の近位で下腹部領域内の異なる領域を刺激するように注意を払った。
【０８０１】
侵害受容行動を、以下のとおり各動物及び各フィラメントについてスコア付けした。
【０８０２】
【表６２】
2020073573.tif 000067
【０８０３】
試験設計は、図１００Ａに模式的に示す。要するに、急性の膀胱炎を、Ｄ０のＣＹＰ注射（ｉ．ｐ．）によって誘発した（上記のとおり）。ＸＧ−１０２、イブプロフェン又はビヒクルを、ＣＹＰ注射直後に１回膀胱内に投与した（上記のとおり）。ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験は、以下のとおり非盲検方式で行った。
・Ｄ−１に、個々のＰｌｅｘｉｇｌａｓボックスに対して最低３０分間、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメント適用に対してラットを馴化させて、新しい環境に起因するストレスのレベルを低下させた。
・Ｄ０に、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験を、ＣＹＰ又は食塩水注射の１５分前に行って、基本値を得た（Ｄ０、Ｔ＝−１５分）。
・Ｄ１に、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験を、ＣＹＰ又は食塩水注射の２４時間後に行って、ＣＹＰ誘発性の内臓痛に対する試験化合物の効果を分析した（Ｄ１、Ｔ＝＋２４時間）。
・ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験の直後（＋２４時間）、ラットを血液試料採取のために麻酔し、次いで屠殺し、膀胱を下記のとおり採取した。
【０８０４】
実験の終わりに、ラットをペントバルビタール（５４．７ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍＬ／ラット、ｉ．ｐ．）の注射、続けて頸椎脱臼によって屠殺した。膀胱を迅速に採取して、リポイド組織を清浄した。膀胱を秤量し、膀胱の頸部で切断し、出血のスコアリングを行った（下の表を参照のこと）。最後に、壁の厚さを、デジタルノギスを使用して、２つの外側の顎部の間に膀胱壁を置くことによって測定した。膀胱の出血スコアは、以下のとおりＧｒａｙの基準から適合された（Ｇｒａｙら、１９８６）。
【０８０５】
【表６３】
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【０８０６】
侵害受容パラメータは以下のとおり表す。
【０８０７】
【表６４】
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【０８０８】
ＡＵＣは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して算出した。異痛症及び痛覚過敏を評価するためのＡＵＣ法は、図１００Ｂに模式的に示す。
【０８０９】
巨視的パラメータは以下のように表される。
【０８１０】
【表６５】
2020073573.tif 000070
【０８１１】
結果：
ＣＹＰ注射の前に、３つの異なるＣＹＰ注射群の間で観察される侵害受容パラメータに有意な差異はなかった。ＣＹＰ誘発性の内臓痛に対するＸＣ−１０２の効果を分析するために、侵害受容パラメータを、ビヒクル処置群とＸＧ−１０２処置群との間で比較した。ＣＹＰ注射の２４時間後、侵害受容閾値は、ビヒクルと比較してＸＧ−１０２処置によって有意に増大された（ｐ＜０．０１、図１０１Ａ）。ＸＧ−１０２処置はまた、ビヒクルと比較してＣＹＰ注射ラットにおいて侵害受容スコアを有意に低下した（ｐ＜０．００１、図１０１Ｂ）。更に、ＡＵＣ１〜８ｇは、ビヒクルと比較してＸＧ−１０２処置によって有意に低下された（ｐ＜０．００１、図１０１Ｃ）。同様に、ＡＵＣ８〜６０ｇは、ビヒクルと比較してＸＧ−１０２処置によって低下された（ｐ＜０．０１、図１０１Ｄ）。ＣＹＰ誘発性の内臓痛に対するイブプロフェンの効果を分析するために、侵害受容パラメータを、ビヒクル処置群とイブプロフェン処置群との間で比較した。侵害受容閾値は、ＣＹＰ注射したラットにおいてビヒクルと比較してイブプロフェンによって有意に増大された（ｐ＜０．０１、図１０１Ａ）。同様に、イブプロフェン群では、侵害受容スコアの有意な低下が、ビヒクルと比較して観察された（ｐ＜０．０１、図１０１Ｂ）。更に、ＡＵＣ１〜８ｇ及びＡＵＣ８〜６０ｇは、ビヒクルと比較してイブプロフェン処置によって有意に低下された（ｐ＜０．００１及びｐ＜０．０５、それぞれ、図１０１Ｃ及び１０１Ｄ）。
【０８１２】
更に、泌尿器の壁厚は、ＸＧ−１０２処置したラットでは有意に低下された（ｐ＜０．０１、図１０２Ａ）。ＸＧ−１０２処置はまた、出血スコアの低下に向かう傾向を示したが、それは統計学的有意差には達しなかった（図１０２Ｂ）。イブプロフェンに関してもまた、膀胱の壁厚で有意な低下が観察された（ｐ＜０．００１、図１０２Ａ）。しかし、イブプロフェン処置群では出血スコアに関して有意な変化は観察されなかった（ｐ＞０．０５、図１０２Ｂ）。赤色尿が、イブプロフェン処置した群の数匹の動物で注目されたことに注目すべきである。
【０８１３】
まとめると、ＸＧ−１０２（５０ｍｇ／ｍＬ）の膀胱内処置は、その注射２４時間後、ＣＹＰによって誘発される内臓痛を有意に逆転させた。ＸＧ−１０２は、異痛症及び痛覚過敏の両方を効率的に阻害した。分析された炎症性パラメータでは、ＸＧ−１０２は、膀胱炎症（壁厚）を低下した。結論として、膀胱内に投与された場合、ＸＧ−１０２は、強力な抗侵害受容効果及び有意な抗炎症性特性を、ＩＣ／ＰＢＳの実験モデルで示した。
【０８１４】
実施例４７
意識のあるラットでのシクロホスファミドによって誘発された急性の膀胱炎モデルに対して膀胱内で投与されたＸＧ−１０２（配列番号１１）の効果：内臓痛の評価
この試験の目的は、雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける急性のＣＹＰ誘発性の膀胱炎における膀胱痛に対するＸＧ−１０２（２ｍｇ／ｋｇ）を用いた静脈内処置の効果を評価することであった。この前臨床モデルは、間質性膀胱炎／膀胱痛症候群（ＩＣ／ＰＢＳ）の処置のための治療アプローチを試験するためによく使用されている。
【０８１５】
成体雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ  Ｓａｉｎｔ  Ｉｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）（実験の開始時点で体重２１５±２０ｇ）を使用した。動物は、実験開始前の少なくとも３日間、実験条件に馴化させた。動物は、以下の４つの実験群に割り当てた（１群あたりｎ＝１０匹の動物）。
【０８１６】
【表６６】
2020073573.tif 000071
【０８１７】
急性の膀胱炎を誘発するために、５ｍＬ／ｋｇの最終容積中で１５０ｍｇ／ｋｇの用量のＣＹＰの単回ｉ．ｐ．注射を行った。対照のラットには、ＣＹＰと同じ実験条件下で生理食塩水を与えた（５ｍＬ／ｋｇ，ｉ．ｐ．の最終容積）。
【０８１８】
各実験の日に、ラットの体重を記録した。次いで、無作為化した方法で、ＸＧ−１０２（２ｍｇ／ｋｇ）、イブプロフェン（１０ｍｇ／ｍＬ）又はビヒクルを、１ｍＬ／ｋｇの容積で静脈内に投与した。
【０８１９】
ｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントを使用する言及された内臓痛のアセスメント：
固定した時間帯（挙動応答における潜在的な日内変動を最小限にするため午前）及び全動物の一人の実験者の試験を含む標準条件を適用して、挙動に基づく疼痛試験の変動を最小限にした。異痛症及び痛覚過敏を含む内臓痛は、５秒の刺激間隔で漸増力（１、２、４、６、８、１０、２６及び６０ｇ）の８つの校正されたｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントのセットを、膀胱に近い下腹部に適用することによって評価した。試験前、各動物の機械的刺激のために意図した腹部領域を剃毛した。次いで、動物を個々の透明なＰｌｅｘｉｇｌａｓボックスの下の持ち上がったワイヤメッシュフロア上に置いて、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験を開始する前に少なくとも３０分間馴化させた。次いで、フィラメントを、フィラメントがわずかに曲がるのに十分な強度でメッシュのフロアを通して１〜２秒適用した。各々のフィラメントは３回試験した。脱感作を回避するために、膀胱の近位で下腹部領域内の異なる領域を刺激するように注意を払った。
【０８２０】
侵害受容行動を、以下のとおり各動物及び各フィラメントについてスコア付けした。
【０８２１】
【表６７】
2020073573.tif 000072
【０８２２】
試験設計は、上記で特定した投与経路（膀胱内ではなく静脈内）及び用量のみが、実施例４６のものと異なる（図１００Ａを参照）。要するに、急性の膀胱炎を、Ｄ０のＣＹＰ注射（ｉ．ｐ．）によって誘発した（上記のとおり）。ＸＧ−１０２、イブプロフェン又はビヒクルを、ＣＹＰ注射直後に１回膀胱内に投与した（上記のとおり）。ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験は、以下のとおり非盲検方式で行った。
・Ｄ−１に、個々のＰｌｅｘｉｇｌａｓボックスに対して最低３０分間、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメント適用に対してラットを馴化させて、新しい環境に起因するストレスのレベルを低下させた。
・Ｄ０に、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験を、ＣＹＰ又は食塩水注射の１５分前に行って、基本値を得た（Ｄ０日目、Ｔ＝−１５分）。
・Ｄ１に、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験を、ＣＹＰ又は食塩水注射の２４時間後に行って、ＣＹＰ誘発性の内臓痛に対する試験化合物の効果を分析した（Ｄ１、Ｔ＝＋２４時間）。
・ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験の直後（＋２４時間）、ラットを血液試料採取のために麻酔し、次いで屠殺して、膀胱を下記のとおり採取した。
【０８２３】
侵害受容パラメータは以下のとおり表す。
【０８２４】
【表６８】
2020073573.tif 000073
【０８２５】
ＡＵＣは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して算出した。異痛症及び痛覚過敏を評価するためのＡＵＣ法は、図１００Ｂに模式的に示す。
【０８２６】
結果：
ＣＹＰ注射の前に、３つの異なるＣＹＰ注射群の間で観察される侵害受容パラメータに有意な差異はなかった。ＣＹＰ誘発性の内臓痛に対するＸＣ−１０２の効果を分析するために、侵害受容パラメータを、ビヒクル処置群とＸＧ−１０２処置群との間で独立して比較した。ＣＹＰ注射の２４時間後、侵害受容閾値は、ビヒクルと比較してＸＧ−１０２処置によって有意に増大された（ｐ＜０．０１、図１０３Ａ）。ＸＧ−１０２処置は、ビヒクルと比較してＣＹＰ注射ラットにおいて侵害受容スコアを有意に低下した（ｐ＜０．００１、図１０３Ｂ）。更に、ＡＵＣ１〜８ｇは、ビヒクルと比較してＸＧ−１０２処置によって有意に低下された（ｐ＜０．００１、図１０３Ｃ）。同様に、ＡＵＣ８〜６０ｇは、ビヒクルと比較してＸＧ−１０２処置によって低下された（ｐ＜０．００１、図１０３Ｄ）。ＣＹＰ誘発性の内臓痛に対するイブプロフェンの効果を分析するために、侵害受容パラメータを、ビヒクル処置群とイブプロフェン処置群との間で比較した。侵害受容閾値は、ＣＹＰ注射したラットにおいてビヒクルと比較してイブプロフェン処置によって有意に増大された（ｐ＜０．０１、図１０３Ａ）。イブプロフェン処置は、ビヒクルと比較して、侵害受容スコアを有意に低下する（ｐ＜０．００１、図１０３Ｂ）。更に、ＡＵＣ１〜８ｇ及びＡＵＣ８〜６０ｇは、ビヒクルと比較してイブプロフェン処置によって有意に低下された（ｐ＜０．００１、図１０３Ｃ及び１０３Ｄ）。
【０８２７】
まとめると、このようにＸＧ−１０２（２ｍｇ／ｍＬ）の静脈内処置は、その注射後、ＣＹＰによって誘発される内臓痛を有意に逆転させた。ＸＧ−１０２は、異痛症及び痛覚過敏の両方を効率的に阻害した。イブプロフェン（１０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内投与と同様の効果が観察された。結論として、実験的な膀胱炎の前臨床モデルでは、ＸＧ−１０２は、有意な抗侵害受容特性を示した。
【０８２８】
実施例４８
シクロホスファミドによって誘発された急性の膀胱炎を有する意識のあるラットでの膀胱内圧パラメータに対する静脈内投与されたＸＧ−１０２（配列番号１１）の効果
この試験の目的は、意識のある雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットにおけるＣＹＰ誘発性の膀胱炎における膀胱内圧パラメータに対するＸＧ−１０２（２ｍｇ／ｋｇ）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与の効果を評価することであった。この前臨床モデルは、間質性膀胱炎／膀胱痛症候群（ＩＣ／ＰＢＳ）の処置のための治療アプローチを試験するためによく使用されている。
【０８２９】
雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２１１〜２８１ｇ）を、使用した（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ  Ｓａｉｎｔ  Ｉｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）。それらのラットは、実験開始前の少なくとも５日前に実験室に届けられ、実験条件に馴化させた。動物は、以下の３つの実験群に割り当てた。
【０８３０】
【表６９】
2020073573.tif 000074
【０８３１】
ラットをイソフルラン（１．５〜３％）で麻酔した。開腹術の後、膀胱を露出させ、ポリエチレンカテーテル（内径及び外径がそれぞれ０．５８及び０．９６ｍｍ）を、円蓋を通じて膀胱に埋め込み、肩甲骨のレベルで外に出した。頸部ポリエチレンカテーテル（内径及び外径がそれぞれ０．５８及び０．９６ｍｍ）も埋め込み、ｉ．ｖ．（静脈内）投与のために肩甲骨レベルで外に出した。Ｄ−１（術後２４時間）、単回投与の１５０ｍｇ／ｋｇのＣＹＰ又はそのビヒクル（生理食塩水：０．９％ＮａＣｌ）を、５ｍＬ／ｋｇでｉ．ｐ．（腹腔内）投与した。
【０８３２】
下部泌尿器管機能に対する試験物質の効果を評価する方法は、Ｌｌｕｅｌ  Ｐ、Ｂａｒｒａｓ  Ｍ、Ｐａｌｅａ  Ｓ、Ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｉｃｔｕｒｉｔｉｏｎ  ｒｅｆｌｅｘ  ｉｎ  ｃｏｎｓｃｉｏｕｓ  ｒａｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｏｕｔｌｅｔ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ、Ｎｅｕｒｏｕｒｏｌ  Ｕｒｏｄｙｎ．２００２；２１：１４２〜１５３頁に記載されている。膀胱内圧の検討は、ＣＹＰ又はビヒクルの腹腔内注射後２４時間で意識のあるラットで行った。実験の日に、動物を、拘束器具で部分的な拘束のもとで保持した。膀胱カテーテルを、Ｔ−チューブを介して、圧力トランスデューサーに接続して、膀胱内圧を測定し、及びインジェクションポンプに接続して、膀胱を２ｍＬ／時間の速度で満たした。膀胱圧を１２０分間連続的に記録した：静脈内投与前の基本期間として６０分、及び投与後期間として６０分。
【０８３３】
ＸＧ−１０２又はビヒクル（５分で１ｍＬ）を、基本期間の１時間後に静脈内に投与した。
【０８３４】
試験設計は、図１０４Ａに模式的に示す。
【０８３５】
以下の膀胱内圧のパラメータを分析した（図１０４Ｂを参照のこと）：
・閾値圧（ＴｈＰ、ｍｍＨｇ）、排尿直前の圧、
・排尿の振幅（ＡＭ）、すなわち、閾値圧力（ＴｈＰ）と排尿の最大圧力（ＭＰ）との間の圧力（ｍｍＨｇ）、
・収縮の間の間隔（ＩＣＩ）、すなわち、２回の連続する排尿の間の時間（秒）、及び
・膀胱容量（ＢＣ）、すなわち、ＩＣＩ×注入速度（ｍＬ）。
【０８３６】
結果：
基本の値と比較して、ＣＹＰで処置された意識下のラットで、膀胱内圧のパラメータＩＣＩ、ＢＣ、ＴｈＰ及びＡＭのパラメータに対してビヒクル（ｉ．ｖ．）の効果は観察されなかった（図１０５Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）。対照的に、ＸＧ−１０２（２ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｖ．）は、基本の値と比較して、ＣＹＰで処置されたラットで、投与後３０〜６０分でＩＣＩ及びＢＣを有意に増大した（Ｐ＜０．０１、図１０６Ａ及びＢ）。この増大は、同じ時点でＴｈＰの有意な低下を伴っていた（Ｐ＜０．０１、図１０６Ｃ）。
【０８３７】
まとめると、ＸＧ−１０２（２ｍｇ／ｋｇ）の静脈内処置は、投与後３０〜６０分の期間、有意にＩＣＩ及びＢＣを増大し、ＴｈＰを低下した。
【０８３８】
実施例４９
β−アミロイド誘発性の神経細胞アポトーシス（アルツハイマー病モデル）に対するＸＧ−１０２（配列番号１１）の効果
ＪＮＫ活性化及び神経細胞アポトーシスに対するＪＮＫ阻害剤ＸＧ−１０２の効果を、２つの実験で検討した。第１の実験では、酸化ストレスの誘導後のＪＮＫ活性化に対する種々の用量のＸＧ−１０２の効果を決定した。第２の実験では、Ａβ４２細胞ストレス後のＪＮＫ活性化及び神経細胞アポトーシスに対するＸＧ−１０２の効果を、決定した。
【０８３９】
実験１では、初代マウス皮質ニューロン培養物を、１５分間１ｍＭの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）に曝露して、酸化的ストレスを誘発した。神経細胞を、ＪＮＫ特異的な阻害剤、ＸＧ−１０２（配列番号１１）を５μＭ若しくは１０μＭで用いるか、又はなしで前処理した。リン酸化ＪＮＫ（ｐＪＮＫ）、総ＪＮＫ（ＪＮＫ）及びチューブリン（対照）のレベルを決定した。ｐＪＮＫ／ＪＮＫの比を、ＪＮＫ活性の指標として使用した。
【０８４０】
ＸＧ−１０２を５μＭ若しくは１０μＭで用いるか、又はなしで前処理し、１ｍＭの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）に１５分間曝露した初代マウス皮質ニューロン培養物のイムノブロット分析の結果を図１０８（Ａ）に示す。図１０８（Ｂ）では、対応するヒストグラムを、総ＪＮＫ（ｐＪＮＫ／ＪＮＫ）に対するリン酸化ＪＮＫの比を用いて、異なる実験群について示す。このヒストグラムから読み取れるように、酸化的ストレスの誘発後、ＪＮＫ活性は、３４％まで増大した（「対照」対「Ｈ２Ｏ２」）。阻害剤ＸＧ−１０２による皮質ニューロンの事前処置は、５μＭで使用した場合、ＪＮＫ活性を妨げた。ＪＮＫ活性の低下（対照の４５％）は、酸化的ストレス条件では、１０μＭの濃度で認められた。
【０８４１】
実験２では、初代マウス皮質ニューロン培養物を、２μＭのβ−アミロイド１−４２（Ａβ４２）に５時間曝露して、Ａβ４２細胞ストレスを誘発した。神経細胞を、ＪＮＫの特異的な阻害剤ＸＧ−１０２（配列番号１１）の１０μＭを用いるか又はなしで前処理した。リン酸化ＪＮＫ（ｐＪＮＫ）、総ＪＮＫ（ＪＮＫ）、ｃ−Ｊｕｎ、切断されたＰＡＲＰ及びチューブリン（対照）のレベルを決定した。ｐＪＮＫ／ＪＮＫの比は、ＪＮＫ活性の指標として使用した。アポトーシスの間に増大することが公知の切断されたタンパク質ＰＡＲＰのレベルは、神経細胞アポトーシスの指標として使用した。
【０８４２】
ＸＧ−１０２を１０μＭで用いるか、又はなしで前処理し、２μＭのβアミロイド１−４２（Ａβ４２）に５時間曝露した初代マウス皮質ニューロン培養物のイムノブロット分析の結果を、図１０９（Ａ）に示す。図１０９（Ｂ及びＣ）では、対応するヒストグラムを示しており、ここでは異なる実験群での総ＪＮＫ（ｐＪＮＫ／ＪＮＫ）に対するリン酸化ＪＮＫの比、（Ｂ）及び切断タンパク質ＰＡＲＰのレベル（Ｃ）について示す。興味深いことに、Ａβ４２細胞ストレスの条件では、ＪＮＫ活性の改変は、ＸＧ−１０２の前処置がありでもなしでも、観察されなかった（図１０９Ｂ）。神経細胞アポトーシスを、アポトーシスの間に増大される切断タンパク質ＰＡＲＰのレベルで測定した（図１０９Ｃ）。したがって、β−アミロイド１−４２（Ａβ４２）処置は、切断されたＰＡＲＰの４０％増大を生じ、これによって、Ａβ４２ストレスがアポトーシスを誘発したことが示された。しかし、培養物を、ＸＧ−１０２（１０μＭ）で前処置した場合、アポトーシスは、３７％低下した。
【０８４３】
まとめると、このようにＸＧ−１０２は、Ｈ２Ｏ２によって生じた酸化的ストレス条件においてＪＮＫ活性を妨げ、かつＡβ４２によって誘発される神経細胞アポトーシスを低下した。
【０８４４】
実施例５０
５ＸＦＡＤマウス（アルツハイマー病のマウスモデル）における脳病変及びアポトーシスに対するＸＧ−１０２（配列番号１１）の効果
この試験の目的は、アルツハイマー病（ＡＤ）のマウスモデルである５ＸＦＡＤマウスにおけるＪＮＫペプチド阻害剤ＸＧ−１０２の注射による脳病変及びアポトーシスの調節を分析することである。
【０８４５】
この目的のために、雄性３カ月齢Ｃ５７ＢＩ／６５ＸＦＡＤ、Ｃ５７ＢＩ／６野性型同腹仔、及びＣ５７ＢＩ／６  ５ＸＦＡＤ／ＰＫＲノックアウトマウスを使用する。各遺伝子型のマウスを、各々５匹の動物の１０の群に無作為に分ける。２５匹の動物をＸＧ−１０２で処置し、２５匹の動物は食塩水対照で処置する。ＸＧ−１０２の効果は、１０ｍｇ／ｋｇで尾の尾静脈の（２１日ごと）の反復注射の３カ月又は６カ月後に評価する。下の表は、無作為の割り当てをまとめる。
【０８４６】
【表７０】
2020073573.tif 000075
【０８４７】
投与は、尾静脈（尾）に静脈内注射によって行う。各アリコートを、０．９％ＮａＣｌ中で１０倍希釈して、溶液を１．４ｍｇ／ｍＬで得る。注射容積は、２００μＬを超えず、マウスの体重によって調節する。投与容積は、７．１ｍＬ／ｋｇである。
【０８４８】
実験の終わりに、注射の３カ月又は６か月後、マウスを、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で麻酔し、屠殺する。次いで、脳を取り出し、氷上で解剖し、次いで免疫組織化学のために４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に入れるか、又はイムノブロッティング及びＥＬＩＳＡ試験のために液体窒素中で直ちに凍結する。イムノブロット及びＥＬＩＳＡ分析のために、脳試料をホモジナイズし、放射性免疫沈降アッセイバッファー（ＲＩＰＡ）中で超音波処理する。
【０８４９】
ＪＮＫ活性、Ａβ経路（Ａβ、ｓＡＰＰα、ｓＡＰＰβ、ＢＡＣＥ１、ＮＥＰ）、タウ経路（タウリン酸化、ＣＤＫ５活性化、ＧＳＫ３活性化、ｐ３５、ｐ２５）及びアポトーシス（切断されたＰＡＲＰ、切断されたカスパーゼ３）をイムノブロットによって分析する。Ａβ生成及びカスパーゼ３活性をＥＬＩＳＡによって分析する。老人斑の数及びサイズ、炎症（ＧＦＡＰ、ＩＢＡ１）、及びアポトーシス（Ｔｕｎｎｅｌ、ＮｅｕＮ、カスパーゼ３）を、免疫組織化学で分析する。
【０８５０】
実施例５１
βアミロイド誘発性の神経細胞アポトーシス（アルツハイマー病モデル）に対する、ＸＧ−１０２（配列番号１１）単独又はＰＫＲダウンレギュレーションと組合せの効果
初代皮質ニューロン培養物を得るために、Ｅ１５．５マウス胚を、ＰＢＳ（リン酸化緩衝化食塩水）６％グルコース中で、氷上で解剖した。胚の皮質を小片に刻んで、ＰＢＳグルコーストリプシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ−Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）を用いて２０分間、３７℃で処理した。分離した皮質細胞を、Ｂ２７、Ｇｌｕｔａｍａｘ及びペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で培養した。神経細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２で、ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）でプレコーティングしたペトリ皿で培養した。神経細胞を培養して、使用前に成熟まで（７日）培養した。
【０８５１】
Ａβ４２ストレスを誘発するため２μＭのＡβ１−４２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）を、皮質ニューロン上で５時間使用した。Ａβ４２−１インバースペプチド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を陰性対照として使用した。Ａβ１−４２及びＡβ４２−１を、純水中に溶解して、使用前に４８時間３７℃でインキュベートした。
【０８５２】
ＪＮＫを阻害するために、皮質ニューロンを、細胞のストレス処理１時間前に１０μＭのＸＧ−１０２で前処理した。
【０８５３】
イムノブロット分析のために、細胞を、１０ｎＭのＮａＰｉ（ｐＨ７．８）、５９ｎＭのＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ、０．５％ＤＯＣ、０．１％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．１μＭのカリキュリンＡ、１ｍＭのＮａ３Ｖ０４及び１×のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む溶解バッファー中で、氷上で溶解した。溶解液を、超音波処理し、１０分間、１５０００ｇで、４℃で遠心分離した。上清のタンパク質濃度を、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて決定した。３０マイクログラムのタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に転写した。ＴＢＳ５％スキムミルクでのブロッキング後、膜を、ＪＮＫ  ｆｕｌｌ、ｃ−Ｊｕｎ、ＰＫＲ、ｅｌＦ２ａ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＵＳＡ）、ｐＪＮＫ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＵＳＡ）、ホスホ（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）ｅｌＦ２ａ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＰＡＲＰ及びチューブリン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＵＳＡ）に対する一次抗体でプローブした。ＩＲ  Ｄｙｅｓ  ８００及び７００（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｃ、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＵＳＡ）抗体を二次抗体として使用した。ブロットは、Ｏｄｙｓｓｅｙ画像化システムで明らかになった（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＵＳＡ）。
【０８５４】
カスパーゼ３活性分析のために、変性した神経細胞及び死んだ神経細胞、並びに細胞培地を含む培養細胞上清を、接着性の神経細胞溶解液と並行して収集した。培養細胞上清を、４℃で１５０００ｇで１０分、遠心分離した。次いで、ペレットを溶解バッファー中に再懸濁し、カスパーゼ３活性を、カスパーゼ３アッセイキット試薬及びプロトコール（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を使用して測定した。
【０８５５】
結果：
Ａβ４２ストレスを受けたＷＴ及びＰＫＲ−／−神経細胞におけるＸＧ−１０２を用いるＪＮＫ及びｃ−ＪＮＫ活性化の低下
Ａβ４２ペプチドよってストレスを与えられた神経細胞培養物において、ＸＧ−１０２の有効性を検討した。ＸＧ−１０２を１０μＭで使用し、Ａβ４２ストレスの誘導１時間前に細胞培地に添加した。ＷＴ神経細胞では、ＪＮＫ活性化は、Ａβ４２ストレスを受けた培養物中でＪＮＫｉ曝露後にのみ低下する（−６０％、図３Ａ）。両方のペプチドが、ペプチドなしのストレスを受けたＷＴ神経細胞と比較して、ｃ−Ｊｕｎリン酸化：ＸＧ−１０２で−７４％（図２Ｃ）及びＪＮＫｉで−２９％（図３Ｃ）、並びにｃ−Ｊｕｎ発現：ＸＧ−１０２で−６５％（図２Ｄ）及び−６２％（図３Ｄ）を低下する有効性を示した。ＰＫＲ−／−神経細胞では、ＪＮＫ活性化は、ＸＧ−１０２（−３５％、図２Ａ）及びＪＮＫｉ（−６０％、図３Ａ）によって、Ａβ４２ストレスを受けた培養物において低下される。ＰＫＲ−／−培養物では、両方のペプチドの使用ともｃ−Ｊｕｎ活性化を改変せず（図２Ｃ及び図３Ｃ）、しかし、ＪＮＫｉの使用は、Ａβ４２ストレス誘発後ｃ−Ｊｕｎタンパク質発現の６２％までの低下を示した（図３Ｄ）。
【０８５６】
ＸＧ−１０２は、ペプチドなしのストレスを受けたＷＴ神経細胞と比較して、ｃ−Ｊｕｎリン酸化を低下するのに−７４％の有効性（図１１０Ｃ）及びｃ−Ｊｕｎ発現を低下するのに−６５％の有効性（図１１０Ｄ）を示した。
【０８５７】
ＰＫＲ−／−神経細胞では、ＪＮＫ活性化は、Ａβ４２ストレスを受けた培養物においてＸＧ−１０２によって低下される（−３５％、図１１０Ａ）。ＰＫＲ−／−培養物では、ＸＧ−１０２の使用は、ｃ−Ｊｕｎ活性化を変更しなかった（図１１０Ｃ）。
【０８５８】
Ａβ４２−ストレスを受けたＷＴ神経細胞におけるＪＮＫ阻害後の神経細胞アポトーシスの低下
Ａβ４２ペプチドよって処置されたＷＴ神経細胞培養物において、ＸＧ−１０２の使用は、アポトーシスを低下した。ＸＧ−１０２を用いた場合、Ａβ４２処置したＷＴ神経細胞と比較して、切断されたカスパーゼ３発現レベルの９３％低下（図１１０Ｅ）、カスパーゼ３活性の７１％低下（図１１０Ｆ）、及び切断されたＰＡＲＰ発現レベルの５５％低下（図１１０Ｇ）が認められた。
【０８５９】
Ａβ４２に起因する神経細胞死は、神経細胞においてＰＫＲ及びＪＮＫの二重阻害後に劇的に低下した。
Ａβ４２及びＸＧ−１０２で処置したＰＫＲ−／−神経細胞において、ＰＫＲ及びＪＮＫの二重阻害の有効性を、神経細胞アポトーシスについて評価した。ＰＫＲ及びＪＮＫについて二重に阻害された神経細胞では、切断されたカスパーゼ３、カスパーゼ３活性及びＰＡＲＰ発現レベルは、処置されたＷＴ神経細胞と比較して、それぞれ８３％、８７％及び９３％低下した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３１−３】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【配列表】
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