(57)【要約】【課題】流路を通流する微小粒子の流速の個別的なバラつきに関わらず、光検出精度を高水準に保つ技術を提供すること。【解決部】本技術では、流路内を通流する微小粒子から発せられる光学的情報を異なる位置で検出する複数の光検出部と、第１光検出部に備えられた第１基準チャネルで検出されたトリガー信号と、第１光検出部とは異なる位置において前記微小粒子から発せられる光学的情報を検出する第２光検出部に備えられた第２基準チャネルで検出された光信号と、に基づいて、各光検出部の検出タイミングを制御する検出タイミング制御部と、を備える、微小粒子測定装置を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路内を通流する微小粒子から発せられる光学的情報を異なる位置で検出する複数の光検出部と、
第１光検出部に備えられた第１基準チャネルで検出されたトリガー信号と、第１光検出部とは異なる位置において前記微小粒子から発せられる光学的情報を検出する第２光検出部に備えられた第２基準チャネルで検出された光信号と、に基づいて、各光検出部の検出タイミングを制御する検出タイミング制御部と、
を備える、微小粒子測定装置。
【請求項２】
前記検出タイミング制御部では、各光検出部の検出タイミングをリアルタイムで制御する、請求項１記載の微小粒子測定装置。
【請求項３】
前記検出タイミング制御部では、前記第２光検出部の検出処理期間を制御する、請求項１記載の微小粒子測定装置。
【請求項４】
前記検出タイミング制御部では、前記第２光検出部の検出処理期間をリアルタイムで制御する、請求項３記載の微小粒子測定装置。
【請求項５】
前記第１基準チャネルで検出された前記トリガー信号と、前記第２基準チャネルで検出された前記光信号と、が光学的に同等である、請求項１記載の微小粒子測定装置。
【請求項６】
前記第１基準チャネルで検出された前記トリガー信号から変換された電圧信号と、前記第２基準チャネルで検出された前記光信号が変換された電圧信号の、高さ（Height：Ｈ）、面積（Area：Ａ）、及び幅（Width：Ｗ）が同一である、請求項５記載の微小粒子測定装置。
【請求項７】
前記第１基準チャネルで検出された前記トリガー信号と、前記第２基準チャネルで検出された前記光信号と、に基づいて、前記微小粒子の流速を制御する、流速制御部を備える、請求項１記載の微小粒子測定装置。
【請求項８】
前記流速制御部では、前記第１光検出部と前記第２光検出部との間を前記微小粒子が通過する時間が一定になるように、前記微小粒子の流速を制御する、請求項７記載の微小粒子測定装置。
【請求項９】
前記流速制御部では、シース液の送液圧力を制御することにより、前記微小粒子の流速を制御する、請求項７記載の微小粒子測定装置。
【請求項１０】
複数の前記光検出部により検出された光学的情報に基づいて前記微小粒子を分取する分取部が備えられた、請求項１に記載の微小粒子測定装置。
【請求項１１】
前記第１基準チャネルで検出された前記トリガー信号と、前記第２基準チャネルで検出された前記光信号と、に基づいて、前記分取部の分取タイミングを制御する、分取タイミング制御部を備える、請求項１０記載の微小粒子測定装置。
【請求項１２】
前記分取タイミング制御部では、前記分取部の分取タイミングをリアルタイムで制御する、請求項１１記載の微小粒子測定装置。
【請求項１３】
前記第１基準チャネルと前記第２基準チャネルは、前記微小粒子からの散乱光を検出する、請求項１記載の微小粒子測定装置。
【請求項１４】
前記散乱光は、前方散乱光、側方散乱光、及び後方散乱光より選ばれる１種以上の散乱光である、請求項１３記載の微小粒子測定装置。
【請求項１５】
第１光検出部及び第２光検出部とは異なる位置において前記微小粒子から発せられる光学的情報を検出する、１又は複数の第３光検出部が備えられた、請求項１記載の微小粒子測定装置。
【請求項１６】
前記検出タイミング制御部では、前記第１基準チャネルで検出された前記トリガー信号と、前記第２基準チャネルで検出された前記光信号と、前記第３光検出部に備えられた第３基準チャネルで検出された光信号と、に基づいて、各光検出部の検出タイミングが制御される、請求項１５記載の微小粒子測定装置。
【請求項１７】
前記第１光検出部は、前記第２光検出部より上流の位置において前記微小粒子から発せられる光学的情報を検出する、請求項１記載の微小粒子測定装置。
【請求項１８】
前記第１光検出部は、前記第２光検出部より下流の位置において前記微小粒子から発せられる光学的情報を検出する、請求項１記載の微小粒子測定装置。
【請求項１９】
流路内を通流する微小粒子から発せられる光学的情報を、複数の位置において検出する光検出工程と、
第１光検出部に備えられた第１基準チャネルで検出されたトリガー信号と、第１光検出部とは異なる位置において前記微小粒子から発せられる光学的情報を検出する第２光検出部に備えられた第２基準チャネルで検出された光信号と、に基づいて、各光検出部の検出タイミングを制御する検出タイミング制御工程と、
を行う、微小粒子測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、微小粒子測定装置に関する。より詳しくは、流路内を流通する微小粒子から光学的情報を検出するための微小粒子測定装置及び微小粒子測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分析手法の発展に伴い、細胞や微生物等の生体微小粒子、マイクロビーズなどの微小粒子等を流路中に通流させ、通流させる工程において前記微小粒子を個々に測定したり、測定した微小粒子を解析し、分取したりする手法が開発されつつある。
【０００３】
このような微小粒子の解析又は分取の手法の代表的な一例として、フローサイトメトリーと呼ばれる分析手法の技術改良が急速に進んでいる。フローサイトメトリーとは、解析の対象となる微小粒子を流体中に整列させた状態で流し込み、該微小粒子にレーザー光等を照射することにより、各微小粒子から発せられた蛍光や散乱光を検出することで微小粒子の解析、分取を行う分析手法である。
【０００４】
フローサイトメトリーなどに代表される微小粒子の解析では、分析対象となる微小粒子にレーザーなどの光を照射し、微小粒子から発せられる蛍光や散乱光を検出する光学的手法が多く用いられている。そして、検出された光学的情報をもとに、解析用コンピューターとソフトウェアでヒストグラムを抽出し、解析が行われる。
【０００５】
近年の基礎医学及び臨床分野の要請に基づき、複数の色素を使用したマルチカラー分析が可能な装置が望まれている。しかしながら、一ヵ所からの光検出で複数の蛍光色素を検出する、所謂、シングルスポットの場合、光学的干渉によって、分析精度が低下する場合がある。これに対し、微小粒子の解析分野では、流路の複数の位置で光学的検出が可能なマルチスポット化が進められており、より多くの色素を解析できる技術が開発されつつある。
【０００６】
例えば、特許文献１には、試料が通流する流路と、該流路を通流中の試料に対して光を照射する第１光照射手段と、該第１光照射手段による光照射によって、前記試料から発せられる光学的情報を検出する第１光検出手段と、該第１光検出手段により検出された光学的情報を電気的信号に変換する第１電気信号変換手段と、該第１電気信号変換手段により変換された電気的信号をアナログ−デジタル変換する第１ＡＤ変換手段と、前記第１光照射手段より下流において、前記試料に対して光を照射可能な第２光照射手段と、該第２光照射手段による光照射によって、前記試料から発せられる光学的情報を検出可能な第２光検出手段と、該第２光検出手段により検出された光学的情報を電気的信号に変換可能な第２電気信号変換手段と、前記第１ＡＤ変換手段によりアナログ−デジタル変換されたデジタル信号に基づいて、前記第２電気信号変換手段により変換された電気的信号を増幅可能な増幅手段と、該増幅手段により増幅された電気的信号をアナログ−デジタル変換可能な第２ＡＤ変換手段と、が少なくとも備えられた光学的測定装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−２８６３４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
マルチスポットを用いたマルチカラー分析方法では、各スポット間の検出タイミングは、装置立ち上げ直後や流路を備えるチップを交換直後等のタイミングで定めた時間（レーザーディレイタイム）だけ遅らせて行われることが一般的である。
【０００９】
しかしながら、流路内を通流する微小粒子の流速は一定ではなく、流路内の通流位置や微小粒子の大きさ等によって、微小粒子の流速は異なる。例えば、微小粒子が流路断面の中心付近を流れる時は速度が速く、周辺付近を流れる時は遅くなる事が知られている。また、サイズの大きい粒子は遅く、サイズの小さい粒子は早いという事実もある。
【００１０】
例えば、図１２は、マルチスポットを用いたマルチカラー分析方法における光検出処理を行う期間を示す概念図である。Ａは、微小粒子の流速が一定である場合の２ｎｄスポットの光検出タイミングを示し、Ｂは、微小粒子の流速が早い場合の２ｎｄスポットの光検出タイミングを示し、Ｃは、微小粒子の流速が遅い場合の２ｎｄスポットの光検出タイミングを示す。装置立ち上げ直後や流路を備えるチップを交換直後等のタイミングで定めた時間（レーザーディレイタイム）に基づいて、各スポット間の検出タイミングを制御すると、微小粒子の流速が一定である場合には何ら問題はないが、微小粒子の流速が早い場合や遅い場合には、２ｎｄスポットで検出された光学的特徴量が小さくなる可能性がある。
【００１１】
このような現象が起こると、２ｎｄスポットで検出された前記光信号が変換された電圧信号の、高さ（Height：Ｈ）、面積（Area：Ａ）、及び幅（Width：Ｗ）を統計処理したりグラフ化した際に平均値が小さくなったり分散が大きくなったりして、本来ならば分離できる２つ以上の微小粒子集団が１つに見えてしまう問題が発生する場合もある。
【００１２】
そこで、本技術では、流路を通流する微小粒子の流速の個別的なバラつきに関わらず、光検出精度を高水準に保つ技術を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
即ち、本技術では、まず、流路内を通流する微小粒子から発せられる光学的情報を異なる位置で検出する複数の光検出部と、
第１光検出部に備えられた第１基準チャネルで検出されたトリガー信号と、第１光検出部とは異なる位置において前記微小粒子から発せられる光学的情報を検出する第２光検出部に備えられた第２基準チャネルで検出された光信号と、に基づいて、各光検出部の検出タイミングを制御する検出タイミング制御部と、
を備える、微小粒子測定装置を提供する。
本技術に係る微小粒子測定装置において、前記検出タイミング制御部では、各光検出部の検出タイミングをリアルタイムで制御することができる。
本技術に係る微小粒子測定装置において、前記検出タイミング制御部では、前記第２光検出部の検出処理期間を制御することもできる。
この場合、前記検出タイミング制御部では、前記第２光検出部の検出処理期間を前記検出タイミング制御部では、前記第２光検出部の検出処理期間を制御することもできる。制御することもできる。
本技術に係る微小粒子測定装置において、前記第１基準チャネルで検出された前記トリガー信号と、前記第２基準チャネルで検出された前記光信号と、は光学的に同等とすることができる。
この場合、具体的には、例えば、前記第１基準チャネルで検出された前記トリガー信号から変換された電圧信号と、前記第２基準チャネルで検出された前記光信号が変換された電圧信号の、高さ（Height：Ｈ）、面積（Area：Ａ）、及び幅（Width：Ｗ）を同一とすることができる。
本技術に係る微小粒子測定装置には、前記第１基準チャネルで検出された前記トリガー信号と、前記第２基準チャネルで検出された前記光信号と、に基づいて、前記微小粒子の流速を制御する、流速制御部を備えることができる。
本技術に係る微小粒子測定装置において、前記流速制御部では、前記第１光検出部と前記第２光検出部との間を前記微小粒子が通過する時間が一定になるように、前記微小粒子の流速を制御することができる。
本技術に係る微小粒子測定装置において、前記流速制御部では、シース液の送液圧力を制御することにより、前記微小粒子の流速を制御することができる。
本技術に係る微小粒子測定装置には、複数の前記光検出部により検出された光学的情報に基づいて前記微小粒子を分取する分取部を備えることができる。
本技術に係る微小粒子測定装置には、前記第１基準チャネルで検出された前記トリガー信号と、前記第２基準チャネルで検出された前記光信号と、に基づいて、前記分取部の分取タイミングを制御する、分取タイミング制御部を備えることができる。
本技術に係る微小粒子測定装置において、前記分取タイミング制御部では、前記分取部の分取タイミングをリアルタイムで制御することができる。
本技術に係る微小粒子測定装置において、前記第１基準チャネルと前記第２基準チャネルは、前記微小粒子からの散乱光を検出することができる。
この場合、前記散乱光は、前方散乱光、側方散乱光、及び後方散乱光より選ばれる１種以上の散乱光とすることができる。
本技術に係る微小粒子測定装置には、第１光検出部及び第２光検出部とは異なる位置において前記微小粒子から発せられる光学的情報を検出する、１又は複数の第３光検出部を備えることができる。
本技術に係る微小粒子測定装置において、前記検出タイミング制御部では、前記第１基準チャネルで検出された前記トリガー信号と、前記第２基準チャネルで検出された前記光信号と、前記第３光検出部に備えられた第３基準チャネルで検出された光信号と、に基づいて、各光検出部の検出タイミングを制御することができる。
本技術に係る微小粒子測定装置において、前記第１光検出部は、前記第２光検出部より上流の位置において前記微小粒子から発せられる光学的情報を検出することができる。
逆に、前記第１光検出部は、前記第２光検出部より下流の位置において前記微小粒子から発せられる光学的情報を検出することもできる。
【００１４】
本技術では、次に、流路内を通流する微小粒子から発せられる光学的情報を、複数の位置において検出する光検出工程と、
第１光検出部に備えられた第１基準チャネルで検出されたトリガー信号と、第１光検出部とは異なる位置において前記微小粒子から発せられる光学的情報を検出する第２光検出部に備えられた第２基準チャネルで検出された光信号と、に基づいて、各光検出部の検出タイミングを制御する検出タイミング制御工程と、
を行う、微小粒子測定方法を提供する。
【００１５】
本技術において、「微小粒子」には、細胞や微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれるものとする。
【００１６】
生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ（細胞小器官）などが含まれる。細胞には、動物細胞（血球系細胞など）および植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。さらに、生体関連微小粒子には、核酸やタンパク質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。
【００１７】
また、工業用粒子は、例えば有機もしくは無機高分子材料、金属などであってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどが含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料などが含まれる。金属には、金コロイド、アルミなどが含まれる。これら微小粒子の形状は、一般には球形であるのが普通であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本技術に係る微小粒子測定装置１の第１実施形態を模式的に示す模式概念図である。
【図２】本技術に係る微小粒子測定装置１の第２実施形態を模式的に示す模式概念図である。
【図３】本技術に係る微小粒子測定装置１の第３実施形態を模式的に示す模式概念図である。
【図４】本技術に係る微小粒子測定装置１の第４実施形態を模式的に示す模式概念図である。
【図５】本技術に係る微小粒子測定装置１に用いることができる光検出部１２の一例を模式的に示す模式概念図である。
【図６】本技術に係る微小粒子測定装置１に用いることができる光検出部１２の図５とは異なる一例を模式的に示す模式概念図である。
【図７】本技術に係る微小粒子測定装置１に用いることができる光検出部１２の図５及び図６とは異なる一例を模式的に示す模式概念図である。
【図８】図７に例示する光検出部１２を備えた微小粒子測定装置１を用いて光検出処理を行う場合の光検出期間を示す概念図である。
【図９】微小粒子の流速が早い場合の２ｎｄスポットの光検出タイミングを示す概念図である。
【図１０】微小粒子の流速が遅い場合の２ｎｄスポットの光検出タイミングを示す概念図である。
【図１１】第１基準チャネルで検出されるトリガー信号に比べて、第２基準チャネルで検出される光信号が極端に小さい場合の光検出タイミングを示す概念図である。
【図１２】マルチスポットを用いたマルチカラー分析方法における光検出処理を行う期間を示す概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。
１．微小粒子測定装置１
（１）流路Ｐ
（２）光照射部１１
（３）光検出部１２
（４）検出タイミング制御部１３
（５）流速制御部１４
（６）分取部１５
（７）分取タイミング制御部１６
（８）解析部１７
（９）記憶部１８
（１０）表示部１９
２．微小粒子測定方法
【００２０】
＜１．微小粒子測定装置１＞
本技術に係る微小粒子測定装置１は、複数の光検出部１２と、検出タイミング制御部１３と、を少なくとも備える。また、必要に応じて、流路Ｐ、光照射部１１、流速制御部１４、分取部１５、分取タイミング制御部１６、解析部１７、記憶部１８、表示部１９等を備えることができる。以下、各部の詳細について、測定の時系列に沿って説明する。
【００２１】
図１は、本技術に係る微小粒子測定装置１の第１実施形態を模式的に示す模式概念図であり、図２は、本技術に係る微小粒子測定装置１の第２実施形態を模式的に示す模式概念図であり、図３は、本技術に係る微小粒子測定装置１の第３実施形態を模式的に示す模式概念図であり、図４は、本技術に係る微小粒子測定装置１の第４実施形態を模式的に示す模式概念図である。
【００２２】
（１）流路Ｐ
本技術に係る微小粒子測定装置１は、流路Ｐ内を通流する微小粒子から発せられる光学的情報を検出する装置である。流路Ｐは、微小粒子測定装置１に予め備えていてもよいが、市販の流路Ｐや流路Ｐが設けられた使い捨てのチップなどを用いることも可能である。
【００２３】
流路Ｐの形態も特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、図１、３及び４に示す第１、第３及び第４実施形態のような２次元又は３次元のプラスチックやガラス等の基板Ｔ内に形成した流路Ｐに限らず、図２に示す第２実施形態のように、従来のフローサイトメーター等で用いられているような流路Ｐも、本技術に係る微小粒子測定装置１に用いることができる。
【００２４】
また、前記流路Ｐの流路幅、流路深さ、流路断面形状も、層流を形成し得る形態であれば特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、流路幅１ｍｍ以下のマイクロ流路も、本技術に係る微小粒子測定装置１に用いることが可能である。特に、流路幅１０μｍ以上１ｍｍ以下程度のマイクロ流路は、本技術に係る微小粒子測定装置１により好適に用いることができる。
【００２５】
流路Ｐを通流させる微小粒子は、１種又は２種以上の蛍光色素等の色素で標識することができる。この場合、本技術で使用可能な蛍光色素としては、例えば、Cascade Blue、Pacific Blue、Fluorescein isothiocyanate(FITC)、Phycoerythrin(PE)、Propidium iodide(PI)、Texas red(TR)、Peridinin chlorophyll protein(PerCP)、Allophycocyanin(APC)、4’,6-Diamidino-2-phenylindole(DAPI)、Cy3、Cy5、Cy7、Brilliant Violet(BV421)等が挙げられる。
【００２６】
（２）光照射部１１
本技術に係る微小粒子測定装置１には、光照射部１１を備えることができる。光照射部１１では、前記流路Ｐを通流する微小粒子への光の照射が行われる。本技術に係る微小粒子測定装置１において、光照射部１１は必須ではなく、外部の光照射装置等を用いて流路Ｐを通流する微小粒子への光照射を行うことも可能である。
【００２７】
光照射部１１から照射される光の種類は特に限定されないが、微小粒子から蛍光や散乱光を確実に発生させるためには、光方向、波長、光強度が一定の光が望ましい。一例としては、レーザー、ＬＥＤ等を挙げることができる。レーザーを用いる場合、その種類も特に限定されないが、アルゴンイオン（Ar）レーザー、ヘリウム−ネオン（He-Ne）レーザー、ダイ（dye）レーザー、クリプトン（Cr）レーザー、半導体レーザー、または、半導体レーザーと波長変換光学素子を組み合わせた固体レーザー等を、１種又は２種以上、自由に組み合わせて用いることができる。
【００２８】
本技術に係る微小粒子測定装置１は、所謂、マルチスポットを採用する微小粒子測定装置であるため、流路Ｐの複数の位置に対して光照射を行う。そのためには、図１、３及び４に示す第１、第３及び第４実施形態のように、光照射部１１を複数備えてもよいし、図２に示す第２実施形態のように、分光器等の光制御部１１１を介することで、一つの光照射部１１からの光を分光して、流路Ｐの複数の位置に対する光照射を行うことも可能である。
【００２９】
（３）光検出部１２
光検出部１２では、流路Ｐ内を流通する微小粒子から発せられる光学的情報の検出が行われる。本技術に係る微小粒子測定装置１は、この光検出部１２が複数存在し、流路Ｐの複数の位置で微小粒子から発せられる光学的情報の検出が行われる。
【００３０】
本技術に係る微小粒子測定装置１に用いることができる光検出部１２は、微小粒子からの光信号の検出ができれば、その具体的な光検出方法は特に限定されず、公知の光検出器に用いられている光検出方法を自由に選択して採用することができる。例えば、蛍光測定器、散乱光測定器、透過光測定器、反射光測定器、回折光測定器、紫外分光測定器、赤外分光測定器、ラマン分光測定器、ＦＲＥＴ測定器、ＦＩＳＨ測定器その他各種スペクトラム測定器、ＰＭＴやフォトダイオード等の受光素子を一次元に配列したＰＭＴアレイ又はフォトダイオードアレイ、或いはＣＣＤ又はＣＭＯＳ等の２次元受光素子などの独立した検出チャネルが複数並べられたもの、等に用いられている光検出方法を１種又は２種以上自由に組み合わせて採用することができる。
【００３１】
即ち、本技術に係る微小粒子測定装置１には複数の光検出部１２が存在するが、各光検出部１２には、複数の光検出チャネルが設けられていてもよい。複数の光検出チャネルを備えた複数の光検出部で構成される光検出部１２の一例を図５に示す。図５に例示する光検出部１２は、２つの光検出部１２１、１２２それぞれに、６つ又は８つの光検出チャネル１２１ａ〜１２１ｆ、１２２ａ〜１２２ｈを備えている。
【００３２】
本技術に係る微小粒子測定装置１に用いることができる光検出部１２は、図５に例示する光検出部１２の各光検出部１２１、１２２のように、それぞれの光検出部１２１、１２２に、目的等に応じて、任意の数の光検出チャネル１２１ａ〜１２１ｆ、１２２ａ〜１２２ｈを備えることができる。
【００３３】
また、本技術に係る微小粒子測定装置１では、第１光検出部１２１及び第２光検出部１２２とは異なる位置において微小粒子から発せられる光学的情報を検出する、１又は複数の第３光検出部１２３を備えることもできる。図６は、流路Ｐの異なる位置に３つの光検出部１２１、１２２、１２３が備えられた光検出部１２の一例を模式的に示す模式概念図である。図６に例示するように、第３検出部１２３についても、目的等に応じて、任意の数の光検出チャネル１２３ａ〜１２３ｈを備えることができる。
【００３４】
本技術に係る微小粒子測定装置１の各光検出部１２（１２１、１２２、１２３、・・・）の位置は、特に限定されず、流路Ｐの上流からいずれの順番で配置しても良い。例えば、第１光検出部１２１は、第２光検出部１２２より上流の位置において前記微小粒子から発せられる光学的情報を検出できるように配置してもよいし、第２光検出部１２２より下流の位置において前記微小粒子から発せられる光学的情報を検出できるように配置してもよい。
【００３５】
本技術に係る微小粒子測定装置１における光検出部１２の設置箇所は、微小粒子からの光信号の検出ができれば特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、図１〜４に示す第１〜４実施形態のように、流路Ｐを挟んで光照射部１１と逆側に配置することが好ましい。光検出部１２を、流路Ｐを挟んで光照射部１１と逆側に配置することで、光照射部１１や光検出部１２をより自由な構成で配置させることができるからである。また例えば、蛍光は照射光の入射方向とは異なる方向にも放射されるため、流路Ｐを基準に光照射部１１と同じ側や９０度側面の側に光検出部１２を配置してもかまわない。
【００３６】
（４）検出タイミング制御部１３
検出タイミング制御部１３では、複数の光検出部１２の検出のタイミングを制御する。具体的な検出のタイミング方法について、図７及び図８を用いて説明する。図７は、本技術に係る微小粒子測定装置１に用いることができる光検出部１２の一例を模式的に示す模式概念図である。図７に例示する光検出部１２は、２つの光検出部１２１、１２２それぞれに、３つの光検出チャネル１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃ、１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃを備えている。図８は、図７に例示する光検出部１２を備えた微小粒子測定装置１を用いて光検出処理を行う場合の光検出期間を示す概念図である。
【００３７】
（ａ）第１光検出部１２１の光検出処理
まず、いずれかの光検出部１２に備えられた任意のチャネルをトリガーチャネルと定める。トリガーチャネルとしては、ほとんどの粒子が光るチャネルを選択することが望ましい。そのため、蛍光を検出するチャネルであってもよいが、前方散乱光、側方散乱光、及び後方散乱光より選ばれる１種以上の散乱光を検出するチャネルが好ましい。ここでは、トリガー信号を検出するトリガーチャネルを第１基準チャネル１２１ａ、この第１基準チャネル１２１ａが備えられる光検出部を、第１光検出部１２１とする。
【００３８】
トリガーチャネル（第１基準チャネル１２１ａ）には閾値が定められ、検出された波形が、その閾値を超えた場合にのみ、微小粒子が通過したと考える。次に、微小粒子から検出された特徴量（例えば、光信号が変換された電圧信号の高さ（Height：Ｈ）、面積（Area：Ａ）、及び幅（Width：Ｗ）等）の光検出処理を行うタイミング及び期間を定める。光検出処理期間としては、トリガーチャネル（第１基準チャネル１２１ａ）において検出された波形が、閾値を超えている期間と一致させることもできるが、この期間にプラスして、前後に任意の時間を加えた期間とすることが好ましい（図８中「PreFetch1」及び「PostFetch1」参照）。閾値を超えている期間の前後に任意の時間を加えることで、検出精度の更なる向上を図ることができる。また、前後に別の微小粒子が来た場合に、アボートする（処理をやめる）等の時間定義を行うことができる。この時、光検出処理を行う期間は、第１光検出部の他のチャネル（１２１ｂ、１２１ｃ）も同じであり、トリガーチャネル（第１基準チャネル１２１ａ）以外の波形の大小には全く関係なくトリガーチャネルの波形からのみ決定する。
【００３９】
（ｂ）第２光検出部１２２の光検出処理
第２光検出部１２２は、第１光検出部１２１とは異なる位置において、微小粒子から発せられる光学的情報を検出する。従来、第２光検出部１２２における光検出のタイミングは、前記第１光検出部１２１のトリガーチャネル（第１基準チャネル１２１ａ）で検出されたトリガー信号を起点として、装置立ち上げ直後や流路を備えるチップを交換直後等のタイミングで定めた時間（レーザーディレイタイム）に基づいて、制御されていた。しかしながら、前述の通り、レーザーディレイタイムを用いた従来の方法では、測定中において、検出対象となる複数の微小粒子間で流速の違いがあると、検出精度が低下する場合があった。
【００４０】
そこで、本技術では、前記第１光検出部１２１のトリガーチャネル（第１基準チャネル１２１ａ）で検出されたトリガー信号を起点として、従来のレーザーディレイタイムを用いずに、第２光検出部１２２に備えられた第２基準チャネル１２２ａで検出された光信号に基づいて、第２光検出部１２２の他のチャネル（１２２ｂ、１２２ｃ）の光検出タイミング及び光検出期間を制御する。このように制御することで、測定中において、検出対象となる複数の微小粒子間で流速が異なっていても、第２光検出部１２２における光検出のタイミング及び光検出期間をリアルタイムで制御することが可能であるため、検出精度の低下を防止し、高水準に保つことが可能である。
【００４１】
具体的な一例としては、図９では、微小粒子の流速が早い場合の２ｎｄスポットの光検出タイミングを示し、図１０では、微小粒子の流速が遅い場合の２ｎｄスポットの光検出タイミングを示す。図９及び図１０では、従来品との比較のために、１ｎｄスポットと２ｎｄスポットの光検出タイミングの間に、従来の２ｎｄスポットの光検出タイミングも併記している。図９及び図１０に示すように、従来のレーザーディレイタイムを用いた方法では、微小粒子の流速が早い場合や遅い場合、微小粒子から得られる三角波と検出タイミングがズレてしまい、２ｎｄスポットで検出される光学的特徴量が小さくなってしまうという問題があった。しかし、本技術では、レーザーディレイタイムを用いていないため、微小粒子の流速が早い場合や遅い場合でも、検出対象の微小粒子の流速に応じて、光検出処理を行うことができる。その結果、検出精度の低下を防止し、高水準に保つことが可能である。
【００４２】
本技術に係る微小粒子測定装置１に、１又は複数の第３光検出部１２３を備える場合、第３光検出部１２３の検出タイミング及び光検出期間は、第１光検出部に備えられた第１基準チャネルで検出されたトリガー信号と、第２光検出部１２２に備えられた第２基準チャネル１２２ａで検出された光信号に基づいて、制御することが可能である。具体的には、例えば、第１光検出部に備えられた第１基準チャネルで検出されたトリガー信号と、第２光検出部１２２に備えられた第２基準チャネル１２２ａで検出された光信号に基づいて、検出対象の微小粒子の流速を算出し、算出された流速に応じて、第３光検出部１２３の検出タイミング及び光検出期間を制御することが可能である。
【００４３】
また、第３光検出部の検出タイミングは、第１光検出部に備えられた第１基準チャネルで検出されたトリガー信号と、第３検出部１２３に備えられた第３基準チャネル１２３ａで検出された光信号と、に基づいて制御することもできる。具体的には、前述した第２光検出部１２２の検出タイミングを制御する方法と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
【００４４】
このように、１又は複数の第３光検出部１２３の検出タイミング及び光検出期間を、第３光検出部１２３に備えられた第３基準チャネル１２３ａで検出された光信号に基づいて行うことで、例えば、第１光検出部１２１と第２光検出部１２２間での微小粒子の流速から、第２光検出部と第３光検出部１２３間での微小粒子の流速が、変化してしまった場合であっても、第３光検出部１２３を測定対象となる微小粒子が通過する最適なタイミング及び期間で光検出を行うことが可能である。
【００４５】
なお、第３光検出部１２３を複数備える場合（例えば、「第４光検出部」、「第５光検出部」、「第６光検出部」・・・とする）、全ての第３光検出部〜第６光検出部に基準チャネルを備えてもよいし、任意の光検出部にのみ、基準チャネルを備えてもよい。具体的には、例えば、一つ置きに、第４光検出部及び第６光検出部に基準チャネル（第４基準チャネル及び第６基準チャネル）を備える場合、第１光検出部に備えられた第１基準チャネルで検出されたトリガー信号を起点として、第２光検出部及び第３光検出部１２３の検出タイミング及び光検出期間は、第２光検出部１２２に備えられた第２基準チャネル１２２ａで検出された光信号に基づいて制御し、第４光検出部及び第５光検出部の検出タイミング及び光検出期間は、第４検出部に備えられた第４基準チャネルで検出された光信号に基づいて制御し、第６光検出部の検出タイミング及び光検出期間は、第４検出部に備えられた第４基準チャネルで検出された光信号に基づいて制御することができる。
【００４６】
例えば、流路Ｐの長さ等の形状によって、上流と下流とで微小粒子の流速が変化する可能性が高い場合や、用いる検体中の微小粒子の種類によって、層流が不安定な場合等には、各検出部全てに基準チャネル設けることで、より精度の高い測定を実現することができる。
【００４７】
各基準チャネルで検出される光信号は、光学的に同等であることが好ましい。その理由を、図１１を用いて説明する。図１１は、第１基準チャネルで検出されるトリガー信号に比べて、第２基準チャネルで検出される光信号が極端に小さい場合の光検出タイミングを示す概念図である。第２光検出部１２２の光検出タイミングは、第２基準チャネル１２２ａの光信号が閾値を超えたタイミングに合わせて制御されるため、例えば、図１１に示す概念図のように、第１基準チャネルで検出されるトリガー信号と、第２基準チャネル１２２ａで検出される光信号とが、光学的に大きく差がある場合（第２基準チャネルの光信号の方が極端に小さい場合）、第２基準チャネル１２２ａの光信号が閾値を超えるタイミングが遅く、それに伴い、第２光検出部１２２の他のチャネル１２２ｂの検出タイミングも遅れてしまい、最適なタイミングからズレてしまう場合がある。そこで、各基準チャネルで検出される光信号を、光学的に同等にすることで、各基準チャネルで検出される光信号が閾値を超えるタイミングが同等になるため、第２光検出部１２１以降の検出タイミングがズレてしまうことを防止できる。その結果、検出精度の低下を防止し、高水準に保つことが可能である。なお、図１１では、分かり易くするために、第１基準チャネルで検出されるトリガー信号に比べて、第２基準チャネルで検出される光信号が極端に小さい場合を例示したが、この例のように各基準チャネルで検出される光信号に大きな差が無い限りは、各検出部における検出タイミングが大きくずれることはないため、各基準チャネルで検出される光信号は、光学的に同等であることに限定されない。
【００４８】
各基準チャネルで検出される光信号は、光学的に同等とする具体例としては、例えば、各基準チャネルで検出された光信号から変換された電圧信号の、高さ（Height：Ｈ）、面積（Area：Ａ）、及び幅（Width：Ｗ）を同一とすることができる。
【００４９】
各基準チャネルとしては、ほとんどの粒子が光るチャネルを選択することが望ましい。そのため、蛍光を検出するチャネルであってもよいが、前方散乱光、側方散乱光、及び後方散乱光より選ばれる１種以上の散乱光を検出するチャネルが好ましい。
【００５０】
（５）流速制御部１４
本技術に係る微小粒子測定装置１には、前述の通り、各光検出部に基準チャネルを備えることができるため、各基準チャネルで検出された光信号に基づいて、微小粒子の流速を算出することができる。そこで、これを利用して、微小粒子の流速を制御する流速制御部１４を備えることができる。
【００５１】
例えば、流速制御部１４において、第１基準チャネル１２１ａで検出されたトリガー信号と、第２基準チャネル１２２ａで検出された光信号と、に基づいて、第１光検出部１２１と第２光検出部１２２との間を微小粒子が通過する時間が一定になるように、微小粒子の流速を制御することができれば、より最適なタイミング及び期間で光検出を行うことが可能となり、その結果、より精度の高い測定を実現することができる。
【００５２】
また、例えば、図６に例示するように第３光検出部１２３を備える場合、流速制御部１４において、第１基準チャネル１２１ａで検出されたトリガー信号と、第２基準チャネル１２２ａで検出された光信号と、に基づいて、微小粒子の流速を制御することができれば、第３光検出部１２３については、第３基準チャネル１２３ａを設けなくても、微小粒子の流速に基づいて検出タイミングを制御したり、従来のレーザーディレイタイムを用いて制御することも可能である。
【００５３】
なお、従来技術において、レーザーディレイタイムが最適でない場合に、流速を最適に変化させてタイミングを合わせるような技術も存在する。しかし、そのような微小粒子測定装置では、最適な流速に設定しなおすためにキャリブレーション用ビーズ等を使う必要があるため、測定を開始していた場合でも一旦測定を停止させる必要があった。一方、本技術のように、各光測定部１２に備えられた各基準チャネルを用いれば、現在の流速がターゲットより早いのか遅いのかが測定中の微小粒子からも判断する事が可能である。これを利用してフィードバック制御をかけるようにすれば、従来技術のように一旦測定を停止させないで、最適な流速を得られる微小粒子測定装置１が実現できる。
【００５４】
微小粒子の流速の具体的な制御方法は特に限定されず、公知の方法を自由に採用することができるが、例えば、シース液の送液圧力を制御することにより、微小粒子の流速を制御することができる。
【００５５】
（６）分取部１５
本技術に係る微小粒子測定装置１には、図２〜４に示す第２〜４実施形態のように、微小粒子の分取を行う分取部１５を備えることができる。分取部１５では、前記光検出部１２により検出された値から後述する解析部１７によって解析されたデータに基づいて、微小粒子の分取が行われる。例えば、分取部１５では、解析データから導き出された微小粒子の大きさ、形態、内部構造等の解析結果に基づいて、流路Ｐの下流において、微小粒子の分取を行うことができる。
【００５６】
より具体的には、図２及び３に示す第２及び３実施形態のように、例えば、所定の振動数で振動する振動素子１５ａなどを用いて、流路Ｐの全体若しくは一部に振動を加えることで、流路Ｐの吐出口から液滴を発生させる。なお、この場合、用いる振動素子１５ａは特に限定されず、公知のものを自由に選択して用いることができる。一例としては、ピエゾ振動素子などを挙げることができる。また、流路Ｐへの送液量、吐出口の径、振動素子の振動数などを調整することにより、液滴の大きさを調整し、微小粒子を一定量ずつ含む液滴を発生させることができる。
【００５７】
次に、解析部１７によって解析されたデータに基づいて解析された微小粒子の大きさ、形態、内部構造等の解析結果に基づいて、プラスまたはマイナスの電荷を荷電する（図２及び３中符号１５ｂ参照）。そして、荷電された液滴は、電圧が印加された対向電極１５ｃによって、その進路が所望の方向へ変更され、分取される。
【００５８】
また、図４に示す第４実施形態のように、基板Ｔに形成された流路Ｐの下流に、分取流路Ｐ３、及び、２本の廃棄流路Ｐ４の３つの分岐流路を設け、所定の光学特性を満たすと判定された分取対象の微小粒子を分取流路Ｐ３に取り込み、所定の光学特性を満たさないと判定された非分取対象の微小粒子は、分取流路Ｐ３内に取り込まれることなく、２本の廃棄流路Ｐ４のいずれか一方に流れるようにすることで分取することができる。
【００５９】
分取対象の微小粒子の分取流路Ｐ３内への取り込みは、公知の方法を用いて行うことができるが、例えば、ピエゾ素子等の振動素子１５ａによって分取流路Ｐ３内に負圧を発生させ、この負圧を利用して分取対象の微小粒子を含むサンプル液及びシース液を分取流路Ｐ３内に吸い込むことによって行うことができる。また、図示しないが、バルブ電磁力、または流体ストリーム（気体または液体）等を用いて、層流方向の制御または変化を行うことで、分取対象の微小粒子の分取流路Ｐ３内への取り込みを行うことも可能である。
【００６０】
第４実施形態では、図４の模式概念図に示すように、サンプル液流路Ｐ１にサンプル液貯留部Ｂ１を、シース液流路Ｐ２にシース液貯留部Ｂ２を、分取流路Ｐ３に分取液貯留部Ｂ３を、廃棄流路Ｐ４に廃液貯留部Ｂ４を、それぞれ連通させて接続することで、完全閉鎖型の分取装置とすることができる。例えば、分取対象の微小粒子が、細胞製剤等に使用するための細胞等である場合は、滅菌環境を維持し、コンタミネーションを防止するため、第４実施形態のような（外部環境と隔離し）完全閉鎖型になるように設計することが好ましい。
【００６１】
（７）分取タイミング制御部１６
本技術に係る微小粒子測定装置１には、前述の通り、各光検出部に基準チャネルを備えることができるため、各基準チャネルで検出された光信号に基づいて、微小粒子の流速を算出することができる。そこで、これを利用して、微小粒子の分取のタイミングを制御する分取タイミング制御部１６を備えることができる。
【００６２】
本技術に係る微小粒子測定装置１では、検出対象となる複数の微小粒子間で流速が異なっていても、リアルタイムに微小粒子の流速を算出することができるため、分取のタイミングもリアルタイムに制御することができる。
【００６３】
（８）解析部１７
本技術に係る微小粒子測定装置１は、必要に応じて、解析部１７を更に備えていてもよい。解析部１７では、光検出部１２と接続され、光検出部１２で微小粒子から検出した光学的情報を解析する。
【００６４】
解析部１７では、例えば、光検出部１２より受け取った光の光学的情報から、各微小粒子の特徴量を算出する。具体的には、受光した蛍光や散乱光の検出値より微小粒子の大きさ、形態、内部構造等を示す特徴量を算出する。
【００６５】
なお、解析部１７は、本技術に係る微小粒子測定装置１においては必須ではなく、光検出部１２よって検出された光学的情報に基づいて、外部の解析装置等を用いて微小粒子の状態等を解析することも可能である。例えば、解析部１７は、パーソナルコンピュータや、ＣＰＵにて実施してもよく、記録媒体（例えば、不揮発性メモリ（ＵＳＢメモリ）、ＨＤＤ、ＣＤなど）等を備えるハードウェア資源にプログラムとして格納し、パーソナルコンピュータやＣＰＵによって機能させることも可能である。また、解析部１７は微小粒子測定装置１の各部とネットワークを介して接続されていてもよい。
【００６６】
（９）記憶部１８
本技術に係る微小粒子測定装置１には、各種情報を記憶する記憶部１８を備えることができる。記憶部１８には、前記各光検出部１２で検出された値、各制御部における制御データ、前記解析部１７にて生成された解析データ等、測定に関わるあらゆる事項を記憶することが可能である。
【００６７】
本技術に係る微小粒子測定装置１において、記憶部１８は必須ではなく、外部の記憶装置を接続してもよい。記憶部１８としては、例えば、ハードディスクなどを用いることができる。
【００６８】
（１０）表示部１９
本技術に係る微小粒子測定装置１には、各種情報を表示する表示部１９を備えることができる。表示部１９では、前記各光検出部１２で検出された値、各制御部における制御データ、前記解析部１７にて生成された解析データ等、測定に関わるあらゆる事項を表示することができる。
【００６９】
本技術に係る微小粒子測定装置１において、表示部１９は必須ではなく、外部の表示装置を接続してもよい。表示部１９としては、例えば、ディスプレイやプリンタなどを用いることができる。
【００７０】
＜２．微小粒子測定方法＞
本技術に係る微小粒子測定方法は、流路Ｐ内を通流する微小粒子から発せられる光学的情報を、複数の位置において検出する光検出工程と、検出タイミング制御工程と、を少なくとも行う方法である。また、本技術に係る微小粒子測定方法は、必要に応じて、光照射工程、流速制御工程、分取工程、分取タイミング制御工程、解析工程、記憶工程、表示工程等を行うことができる。なお、各工程の詳細は、前述した微小粒子測定装置１の光検出部１２、検出タイミング制御部１３、光照射部１１、流速制御部１４、分取部１５、分取タイミング制御部１６、解析部１７、記憶部１８、表示部１９が行う方法と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
【００７１】
なお、本技術では、以下の構成を取ることもできる。
（１）
流路内を通流する微小粒子から発せられる光学的情報を異なる位置で検出する複数の光検出部と、
第１光検出部に備えられた第１基準チャネルで検出されたトリガー信号と、第１光検出部とは異なる位置において前記微小粒子から発せられる光学的情報を検出する第２光検出部に備えられた第２基準チャネルで検出された光信号と、に基づいて、各光検出部の検出タイミングを制御する検出タイミング制御部と、
を備える、微小粒子測定装置。
（２）
前記検出タイミング制御部では、各光検出部の検出タイミングをリアルタイムで制御する、（１）の微小粒子測定装置。
（３）
前記検出タイミング制御部では、前記第２光検出部の検出処理期間を制御する、（１）又は（２）の微小粒子測定装置。
（４）
前記検出タイミング制御部では、前記第２光検出部の検出処理期間をリアルタイムで制御する、（３）の微小粒子測定装置。
（５）
前記第１基準チャネルで検出された前記トリガー信号と、前記第２基準チャネルで検出された前記光信号と、が光学的に同等である、（１）から（４）いずれかの微小粒子測定装置。
（６）
前記第１基準チャネルで検出された前記トリガー信号から変換された電圧信号と、前記第２基準チャネルで検出された前記光信号が変換された電圧信号の、高さ（Height：Ｈ）、面積（Area：Ａ）、及び幅（Width：Ｗ）が同一である、（５）の微小粒子測定装置。
（７）
前記第１基準チャネルで検出された前記トリガー信号と、前記第２基準チャネルで検出された前記光信号と、に基づいて、前記微小粒子の流速を制御する、流速制御部を備える、（１）から（６）のいずれかの微小粒子測定装置。
（８）
前記流速制御部では、前記第１光検出部と前記第２光検出部との間を前記微小粒子が通過する時間が一定になるように、前記微小粒子の流速を制御する、（７）の微小粒子測定装置。
（９）
前記流速制御部では、シース液の送液圧力を制御することにより、前記微小粒子の流速を制御する、（７）又は（８）の微小粒子測定装置。
（１０）
複数の前記光検出部により検出された光学的情報に基づいて前記微小粒子を分取する分取部が備えられた、（１）から（９）のいずれかの微小粒子測定装置。
（１１）
前記第１基準チャネルで検出された前記トリガー信号と、前記第２基準チャネルで検出された前記光信号と、に基づいて、前記分取部の分取タイミングを制御する、分取タイミング制御部を備える、（１０）の微小粒子測定装置。
（１２）
前記分取タイミング制御部では、前記分取部の分取タイミングをリアルタイムで制御する、（１１）の微小粒子測定装置。
（１３）
前記第１基準チャネルと前記第２基準チャネルは、前記微小粒子からの散乱光を検出する、（１）から（１２）のいずれかの微小粒子測定装置。
（１４）
前記散乱光は、前方散乱光、側方散乱光、及び後方散乱光より選ばれる１種以上の散乱光である、（１３）の微小粒子測定装置。
（１５）
第１光検出部及び第２光検出部とは異なる位置において前記微小粒子から発せられる光学的情報を検出する、１又は複数の第３光検出部が備えられた、（１）から（１４）のいずれかの微小粒子測定装置。
（１６）
前記検出タイミング制御部では、前記第１基準チャネルで検出された前記トリガー信号と、前記第２基準チャネルで検出された前記光信号と、前記第３光検出部に備えられた第３基準チャネルで検出された光信号と、に基づいて、各光検出部の検出タイミングが制御される、（１５）の微小粒子測定装置。
（１７）
前記第１光検出部は、前記第２光検出部より上流の位置において前記微小粒子から発せられる光学的情報を検出する、（１）から（１６）のいずれかの微小粒子測定装置。
（１８）
前記第１光検出部は、前記第２光検出部より下流の位置において前記微小粒子から発せられる光学的情報を検出する、（１）から（１７）のいずれかの微小粒子測定装置。
（１９）
流路内を通流する微小粒子から発せられる光学的情報を、複数の位置において検出する光検出工程と、
第１光検出部に備えられた第１基準チャネルで検出されたトリガー信号と、第１光検出部とは異なる位置において前記微小粒子から発せられる光学的情報を検出する第２光検出部に備えられた第２基準チャネルで検出された光信号と、に基づいて、各光検出部の検出タイミングを制御する検出タイミング制御工程と、
を行う、微小粒子測定方法。
【符号の説明】
【００７２】
１  微小粒子測定装置
Ｐ  流路
１１  光照射部
１２  光検出部
１３  検出タイミング制御部
１４  流速制御部
１５  分取部
１６  分取タイミング制御部
１７  解析部
１８  記憶部
１９  表示部
【図１】
2020051936.tif 000003
【図２】
2020051936.tif 000004
【図３】
2020051936.tif 000005
【図４】
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【図５】
2020051936.tif 000007
【図６】
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【図７】
2020051936.tif 000009
【図８】
2020051936.tif 000010
【図９】
2020051936.tif 000011
【図１０】
2020051936.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
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