(57)【要約】【課題】感度の良い抗体ベースのアッセイを使用して、様々な細胞の表面に存在するタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を検出し、定量的に測定する方法を提供すること。【解決手段】各々の標的タンパク質に特異的な抗体は、直接的に標識されている、または標識された二次抗体によって検出される。抗体は、標的タンパク質が互いに近接距離範囲内にある場合に放出可能である検出可能なタグで標識される。また、目的とする標的タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を検出するために、このアッセイを使用してがんの診断、予後および処置を容易にするための方法が提供される。タンパク質−タンパク質相互作用に影響を及ぼす試験薬剤をスクリーニングする方法もまた提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年３月１５日に出願された米国仮出願第６２／３０８，５８７号（その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）に対する米国特許法第１１９条（ｅ）のもとの利益および優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、細胞内のすべての生物学的システムを制御する。多数のタンパク質は独立してその機能を果たすが、大多数のタンパク質は、適切な生物学的活性のために他のタンパク質と相互作用する。タンパク質の機能および活性は、それが相互作用する他のタンパク質によってしばしばモジュレートされる。細胞は無数の刺激に応答するため、タンパク質発現は、一時的または動的な過程であり得る。さらに、異なるタイプの細胞は、異なるタイプのタンパク質（細胞タイプ依存性または特異的発現）を発現することができる。タンパク質−タンパク質相互作用を特徴付けることは、タンパク質の機能および細胞の生物学を理解するために重要である。タンパク質−タンパク質相互作用を評価するために使用することができる様々な方法があるが、相互作用するタンパク質が異なる細胞上で発現される場合、課題はより困難になる可能性がある。本明細書に記載されている方法は、細胞間のこのようなタンパク質−タンパク質相互作用の検出および定量化を容易にするための手段を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
一態様では、試料中のタンパク質−タンパク質相互作用を定量化する方法が提供され、本方法は、（ａ）細胞表面上に第１のタンパク質を発現している第１の細胞、および細胞表面上に第２のタンパク質を発現している第２の細胞を含む試料を提供するステップ；（ｂ）第１のタンパク質に特異的な第１の抗体結合組成物を提供するステップであって、第１の抗体結合組成物が、切断可能な連結を介してそれに付着した分子タグを有する、ステップ；（ｃ）第２のタンパク質に特異的な第２の抗体結合組成物を提供するステップであって、第２の結合組成物が、それに付着した切断誘導部分を有する、ステップ；（ｄ）試料を第１の抗体結合組成物および第２の抗体結合組成物と接触させるステップ；（ｅ）第１の抗体結合組成物が第２の抗体結合組成物に付着した切断誘導部分の有効な近接距離範囲内にある場合に、第１の抗体結合組成物からの分子タグの切断を誘導し、それによって分子タグを放出させるステップ；ならびに（ｆ）第１のタンパク質と第２のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用の量の尺度として、放出された分子タグの量を定量化するステップを含む。
【０００４】
別の態様では、試料中のタンパク質−タンパク質相互作用を定量化する方法が提供され、本方法は、（ａ）細胞表面上に第１のタンパク質を発現している第１の細胞、および細胞表面上に第２のタンパク質を発現している第２の細胞を含む試料を提供するステップ；（ｂ）第１のタンパク質に特異的な第１の抗体結合組成物を提供するステップであって、第１の抗体結合組成物が、切断可能な連結を介してそれに付着した分子タグを有する、ステップ；（ｃ）第２のタンパク質に特異的な第２の抗体結合組成物を提供するステップ；（ｄ）第２の抗体組成物に結合する第３の抗体組成物を提供するステップであって、第３の抗体組成物が、それに付着した切断誘導部分を有する、ステップ；（ｅ）試料を第１の抗体結合組成物、第２の抗体結合組成物、および第３の抗体結合組成物と接触させるステップ；（ｆ）第１の抗体結合組成物が第３の抗体結合組成物に付着した切断誘導部分の有効な近接距離範囲内にある場合に、第１の抗体結合組成物からの分子タグの切断を誘導し、それによって分子タグを放出させるステップ；ならびに（ｇ）第１のタンパク質と第２のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用の量の尺度として、放出された分子タグの量を定量化するステップを含む。
【０００５】
別の態様では、試料中のタンパク質−タンパク質相互作用を定量化する方法が提供され、本方法は、（ａ）細胞表面上に第１のタンパク質を発現している第１の細胞、および細胞表面上に第２のタンパク質を発現している第２の細胞を含む試料を提供するステップ；（ｂ）第１のタンパク質に特異的な第１の抗体結合組成物を提供するステップであって、第１の抗体組成物が、それに付着した切断誘導部分を有する、ステップ；（ｃ）第２のタンパク質に特異的な第２の抗体結合組成物を提供するステップ；（ｄ）第２の抗体組成物に結合する第３の抗体組成物を提供するステップであって、第３の抗体結合組成物が、切断可能な連結を介してそれに付着した分子タグを有する、ステップ；（ｅ）試料を第１の抗体結合組成物、第２の抗体結合組成物、および第３の抗体結合組成物と接触させるステップ；（ｆ）第３の抗体結合組成物が第１の抗体結合組成物に付着した切断誘導部分の有効な近接距離範囲内にある場合に、第３の抗体結合組成物からの分子タグの切断を誘導し、それによって分子タグを放出させるステップ；ならびに（ｇ）第１のタンパク質と第２のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用の量の尺度として、放出された分子タグの量を定量化するステップを含む。
【０００６】
さらに別の態様では、試料中のタンパク質−タンパク質相互作用を定量化する方法が提供され、本方法は、（ａ）細胞表面上に第１のタンパク質を発現している第１の細胞、および細胞表面上に第２のタンパク質を発現している第２の細胞を含む試料を提供するステップ；（ｂ）第１のタンパク質に特異的な第１の抗体結合組成物を提供するステップ；（ｃ）第２のタンパク質に特異的な第２の抗体結合組成物を提供するステップ；（ｄ）第１の抗体組成物に結合する第３の抗体組成物を提供するステップであって、第３の抗体組成物が、切断可能な連結を介してそれに付着した分子タグを有する、ステップ；（ｅ）第２の抗体組成物に結合する第４の抗体組成物を提供するステップであって、第４の抗体組成物が、それに付着した切断誘導部分を有する、ステップ；（ｅ）試料を第１の抗体結合組成物、第２の抗体結合組成物、第３の抗体結合組成物、および第４の抗体結合組成物と接触させるステップ；（ｆ）第３の抗体結合組成物が第４の抗体結合組成物に付着した切断誘導部分の有効な近接距離範囲内にある場合に、第３の抗体結合組成物からの分子タグの切断を誘導し、それによって分子タグを放出させるステップ；ならびに（ｇ）第１のタンパク質と第２のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用の量の尺度として、放出された分子タグの量を定量化するステップを含む。
【０００７】
一部の場合では、第１の抗体結合組成物は、第１のタンパク質の細胞外ドメインエピトープまたは細胞内ドメインエピトープに結合し得る。他の場合では、第２の抗体結合組成物は、第２のタンパク質の細胞外ドメインエピトープまたは細胞内ドメインエピトープに結合し得る。一部の場合では、切断誘導部分による分子タグの切断は、光によって誘導される。
【０００８】
一部の場合では、試料は、組織試料、培養細胞、または末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）であり得る。試料は、がん生検試料であり得る。試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料であり得る。試料は、血液試料であり得る。
【０００９】
一部の場合では、第１の細胞はＴ細胞であり得、第２の細胞は腫瘍細胞であり得る。一部の場合では、第１のタンパク質はＰＤ−１であり、第２のタンパク質はＰＤ−Ｌ１である。
【００１０】
別の態様では、ＰＤ−１作用剤またはＰＤ−Ｌ１作用剤に対する、がんを有する被験体の応答性を予測するための方法が提供され、本方法は、（ａ）上記に記載される方法のいずれかを使用して、被験体のがん由来の生物学的試料中のＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量を測定するステップ；（ｂ）被験体の試料中のＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量が閾値レベルを上回るかまたはそれを下回るかを決定するステップ；および（ｃ）被験体の試料中のＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量が閾値レベルに等しいまたはそれを上回る場合は、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量が閾値レベルを下回る場合よりも、被験体はＰＤ−１作用剤またはＰＤ−Ｌ１作用剤に応答する可能性が高いことを示すステップを含む。
【００１１】
別の態様では、試料中の２つの細胞間のタンパク質−タンパク質相互作用の形成を妨害するまたは促進する能力について試験薬剤をスクリーニングする方法が提供され、本方法は、（ａ）試験細胞培養物を試験薬剤と接触させるステップであって、試験細胞培養物が、細胞表面上に第１のタンパク質を発現している第１の細胞、および細胞表面上に第２のタンパク質を発現している第２の細胞を含む、ステップ；（ｂ）上記に記載される方法のいずれかを使用して、第１のタンパク質と第２のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用の量を測定するステップ；ならびに（ｃ）ステップ（ｂ）において測定されたタンパク質−タンパク質相互作用の量を、試験薬剤と接触していない対照細胞培養物中の第１タンパク質と第２タンパク質の間で測定されたタンパク質−タンパク質相互作用の量と比較するステップであって、対照細胞培養物が、細胞表面上に第１のタンパク質を発現している第１の細胞、および細胞表面上に第２のタンパク質を発現している第２の細胞を含む、ステップを含む。
【００１２】
一部の場合では、タンパク質−タンパク質相互作用の量が、対照細胞培養物と比較して試験細胞培養物において減少している場合、試験薬剤は、第１タンパク質と第２タンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用の阻害剤であり得る。他の場合では、タンパク質−タンパク質相互作用の量が、対照細胞培養物と比較して試験細胞培養物において増加している場合、試験薬剤は、第１タンパク質と第２タンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用の促進剤であり得る。
【００１３】
一部の場合では、第１の細胞および第２の細胞は異なる細胞タイプであり得る。一部の場合では、第１の細胞および第２の細胞は異なるがん細胞株であり得る。一部の場合では、第１の細胞および第２の細胞の一方は接着性細胞株であり、他方は非接着性細胞株である。一部の場合では、第１の細胞はＪｕｒｋａｔ細胞であり、第２の細胞は接着性がん細胞である。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
試料中の２つの細胞間のタンパク質−タンパク質相互作用を定量化する方法であって、
（ａ）細胞表面上に第１のタンパク質を発現している第１の細胞、および細胞表面上に第２のタンパク質を発現している第２の細胞を含む試料を提供するステップ；
（ｂ）前記第１のタンパク質に特異的な第１の抗体結合組成物を提供するステップであって、前記第１の抗体結合組成物が、切断可能な連結を介して前記第１の抗体結合組成物に付着した分子タグを含む、ステップ；
（ｃ）前記第２のタンパク質に特異的な第２の抗体結合組成物を提供するステップであって、前記第２の結合組成物が、前記第２の結合組成物に付着した切断誘導部分を含む、ステップ；
（ｄ）前記試料を前記第１の抗体結合組成物および前記第２の抗体結合組成物と接触させるステップ；
（ｅ）前記第１の抗体結合組成物が前記第２の抗体結合組成物に付着した前記切断誘導部分の有効な近接距離範囲内にある場合に、前記第１の抗体結合組成物からの前記分子タグの切断を誘導し、それによって前記分子タグを放出させるステップ；ならびに
（ｆ）前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用の量の尺度として、放出された分子タグの量を定量化するステップ
を含む、方法。
（項目２）
試料中の２つの細胞間のタンパク質−タンパク質相互作用を定量化する方法であって、
（ａ）細胞表面上に第１のタンパク質を発現している第１の細胞、および細胞表面上に第２のタンパク質を発現している第２の細胞を含む試料を提供するステップ；
（ｂ）前記第１のタンパク質に特異的な第１の抗体結合組成物を提供するステップであって、前記第１の抗体結合組成物が、切断可能な連結を介して前記第１の抗体結合組成物に付着した分子タグを含む、ステップ；
（ｃ）前記第２のタンパク質に特異的な第２の抗体結合組成物を提供するステップ；
（ｄ）前記第２の抗体組成物に結合する第３の抗体組成物を提供するステップであって、前記第３の抗体組成物が、前記第３の抗体組成物に付着した切断誘導部分を含む、ステップ；
（ｅ）前記試料を前記第１の抗体結合組成物、前記第２の抗体結合組成物、および前記第３の抗体結合組成物と接触させるステップ；
（ｆ）前記第１の抗体結合組成物が前記第３の抗体結合組成物に付着した前記切断誘導部分の有効な近接距離範囲内にある場合に、前記第１の抗体結合組成物からの前記分子タグの切断を誘導し、それによって前記分子タグを放出させるステップ；ならびに
（ｇ）前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用の量の尺度として、放出された分子タグの量を定量化するステップ
を含む、方法。
（項目３）
試料中の２つの細胞間のタンパク質−タンパク質相互作用を定量化する方法であって、
（ａ）細胞表面上に第１のタンパク質を発現している第１の細胞、および細胞表面上に第２のタンパク質を発現している第２の細胞を含む試料を提供するステップ；
（ｂ）前記第１のタンパク質に特異的な第１の抗体結合組成物を提供するステップであって、前記第１の抗体組成物が、前記第１の抗体組成物に付着した切断誘導部分を含む、ステップ；
（ｃ）前記第２のタンパク質に特異的な第２の抗体結合組成物を提供するステップ；
（ｄ）前記第２の抗体組成物に結合する第３の抗体組成物を提供するステップであって、前記第３の抗体結合組成物が、切断可能な連結を介して前記第３の抗体結合組成物に付着した分子タグを含む、ステップ；
（ｅ）前記試料を前記第１の抗体結合組成物、前記第２の抗体結合組成物、および前記第３の抗体結合組成物と接触させるステップ；
（ｆ）前記第３の抗体結合組成物が前記第１の抗体結合組成物に付着した前記切断誘導部分の有効な近接距離範囲内にある場合に、前記第３の抗体結合組成物からの前記分子タグの切断を誘導し、それによって前記分子タグを放出させるステップ；ならびに
（ｇ）前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用の量の尺度として、放出された分子タグの量を定量化するステップ
を含む、方法。
（項目４）
試料中の２つの細胞間のタンパク質−タンパク質相互作用を定量化する方法であって、
（ａ）細胞表面上に第１のタンパク質を発現している第１の細胞、および細胞表面上に第２のタンパク質を発現している第２の細胞を含む試料を提供するステップ；
（ｂ）前記第１のタンパク質に特異的な第１の抗体結合組成物を提供するステップ；
（ｃ）前記第２のタンパク質に特異的な第２の抗体結合組成物を提供するステップ；
（ｄ）前記第１の抗体組成物に結合する第３の抗体組成物を提供するステップであって、前記第３の抗体組成物が、切断可能な連結を介して前記第３の抗体組成物に付着した分子タグを含む、ステップ；
（ｅ）前記第２の抗体組成物に結合する第４の抗体組成物を提供するステップであって、前記第４の抗体組成物が、前記第４の抗体組成物に付着した切断誘導部分を含む、ステップ；
（ｆ）前記試料を前記第１の抗体結合組成物、前記第２の抗体結合組成物、前記第３の抗体結合組成物、および前記第４の抗体結合組成物と接触させるステップ；
（ｇ）前記第３の抗体結合組成物が前記第４の抗体結合組成物に付着した前記切断誘導部分の有効な近接距離範囲内にある場合に、前記第３の抗体結合組成物からの前記分子タグの切断を誘導し、それによって前記分子タグを放出させるステップ；ならびに
（ｈ）前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用の量の尺度として、放出された分子タグの量を定量化するステップ
を含む、方法。
（項目５）
前記試料が、組織試料、培養細胞、または末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）である、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記試料ががん生検試料である、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である、項目１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記試料が血液試料である、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記第１の細胞がＴ細胞であり、前記第２の細胞が腫瘍細胞である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記第１のタンパク質がＰＤ−１であり、前記第２のタンパク質がＰＤ−Ｌ１である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記切断誘導部分による前記分子タグの切断が光によって誘導される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
ＰＤ−１作用剤またはＰＤ−Ｌ１作用剤に対する、がんを有する被験体の応答性を予測するための方法であって、
（ａ）項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法を使用して、前記被験体のがん由来の生物学的試料中のＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量を測定するステップ；
（ｂ）前記被験体の試料中の前記ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量が閾値レベルを上回るかまたはそれを下回るかを決定するステップ；および
（ｃ）前記被験体の試料中の前記ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量が前記閾値レベルに等しいまたはそれを上回る場合は、前記ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量が前記閾値レベルを下回る場合よりも、前記被験体が前記ＰＤ−１作用剤または前記ＰＤ−Ｌ１作用剤に応答する可能性が高いことを示すステップ
を含む、方法。
（項目１３）
試料中の２つの細胞間のタンパク質−タンパク質相互作用の形成を妨害するまたは促進する能力について試験薬剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験細胞培養物を試験薬剤と接触させるステップであって、前記試験細胞培養物が、細胞表面上に第１のタンパク質を発現している第１の細胞、および細胞表面上に第２のタンパク質を発現している第２の細胞を含む、ステップ；
（ｂ）項目１〜４、９、１０、または１１のいずれか１項に記載の方法を使用して、前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用の量を測定するステップ；ならびに
（ｃ）ステップ（ｂ）において測定されたタンパク質−タンパク質相互作用の量を、前記試験薬剤と接触していない対照細胞培養物中の前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の間で測定されたタンパク質−タンパク質相互作用の量と比較するステップであって、前記対照細胞培養物が、細胞表面上に前記第１のタンパク質を発現している前記第１の細胞、および細胞表面上に前記第２のタンパク質を発現している前記第２の細胞を含む、ステップ
を含む、方法。
（項目１４）
前記タンパク質−タンパク質相互作用の量が、前記対照細胞培養物と比較して前記試験細胞培養物において減少している場合、前記試験薬剤は、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の間の前記タンパク質−タンパク質相互作用の阻害剤である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記タンパク質−タンパク質相互作用の量が、前記対照細胞培養物と比較して前記試験細胞培養物において増加している場合、前記試験薬剤は、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の間の前記タンパク質−タンパク質相互作用の促進剤である、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記第１の細胞および前記第２の細胞が異なる細胞タイプである、項目１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
前記第１の細胞および前記第２の細胞が異なるがん細胞株である、項目１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記第１の細胞および前記第２の細胞の一方が接着性細胞株であり、他方が非接着性細胞株である、項目１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記第１の細胞がＪｕｒｋａｔ細胞であり、前記第２の細胞が接着性がん細胞である、項目１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｅは、本開示の一部の態様による様々なＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットの概略図を示す図である。図１Ａおよび図１Ｂは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料の分析を示し、図１Ａは光放出アッセイフォーマットを示し、図１Ｂは還元（例えば、ＤＴＴ）アッセイフォーマットを示す。光放出フォーマットにおいて、反応性一重項酸素の拡散を使用して、光による切断誘導剤の光誘導（「ｈｖ」）に応答して、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子（「Ｔａｇ」）と標的特異的抗体（「１°Ａｂ」）の間の共有結合リンカーを切断し得る。還元フォーマットにおいて、還元剤を使用して、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子（「Ｔａｇ」）と二次抗体（「２°Ａｂ」）の間の共有結合リンカーの切断を誘導する。切断後、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分離を実施し、電気泳動図によって評価し得る。ｘ軸は、切断されたＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子がキャピラリーから溶出される時間を示し、蛍光強度をｙ軸に示す。蛍光ピークＭＦおよびＭＬは、２つの異なる、内部のＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子の溶出を示す。
【００１５】
【図１−２】図１Ａ〜１Ｅは、本開示の一部の態様による様々なＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットの概略図を示す図である。図１Ｃは、レポーター分子（例えば、Ｐｒｏ１１）および切断誘導部分が、異なるエピトープに結合する別個の標的特異的抗体に連結されている単一のタンパク質を検出するための光放出アッセイフォーマットの概略図を示す。切断誘導部分は、「分子はさみ」とも称され、第２の一次抗体に付着される。例示的な部分は、ストレプトアビジン（ほぼ四角の形状）がコンジュゲートしたメチレンブルー（ＭＢ）である。図１Ｄは、レポーター分子に連結した第１の標的特異的抗体、第１の標的特異的抗体とは別のエピトープに結合する第２の標的特異的抗体、および第２の標的特異的抗体に結合し、切断誘導部分が連結している二次抗体を使用して、単一のタンパク質を検出するための別の光放出アッセイフォーマットの概略図を示す。図１Ｅは、標的特異的抗体、および標的特異的抗体に結合し、レポーター分子が、還元剤（例えば、ＤＴＴ）によって切断可能であるジスルフィド結合を含有するリンカーを介して連結している二次抗体を使用して、単一タンパク質を検出するための還元アッセイフォーマットの概略図を示す。
【００１６】
【図１−３】図１Ｆおよび図１Ｇは、第１の細胞の表面に発現された第１のタンパク質と第２の細胞の表面に発現された第２のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための光放出アッセイフォーマットの概略図を示し、図１Ｆは、第１および第２のタンパク質の細胞外ドメインにそれぞれ結合する２つの標的特異的抗体の使用を示し、図１Ｇは、第１のタンパク質の細胞外ドメインに結合する第１の標的特異的抗体および第２のタンパク質の細胞内ドメインに結合する第２の標的特異的抗体の使用を示す。レポーター分子および切断誘導部分は、それぞれ標的特異的抗体の１つに連結される。図１Ｈは、第１の細胞の表面に発現された第１のタンパク質と第２の細胞の表面に発現された第２のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための別の光放出アッセイフォーマットの概略図を示し、このアッセイフォーマットは、第１のタンパク質に結合し、それに連結したレポーター分子を有する第１の標的特異的抗体、第２のタンパク質に結合する第２の標的特異的抗体、および第２の標的特異的抗体に結合し、それに連結された切断誘導部分を有する二次抗体を使用する。図１Ｉは、第１の細胞の表面に発現された第１のタンパク質と第２の細胞の表面に発現された第２のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための別の光放出アッセイフォーマットの概略図を示し、アッセイフォーマットは、第１のタンパク質に結合する第１の標的特異的抗体、第１の標的特異的抗体に結合し、レポーター分子に連結している第１の二次抗体、第２の標的特異的抗体、および第２の標的特異的抗体に結合し、切断誘導部分に連結されている第２の二次抗体を使用する。
【００１７】
【図１−４】図１Ｊは、本開示の一部の態様による、抗体へのコンジュゲーション（ＮＨＳ部分がコンジュゲーション時に失われる）前のＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子Ｐｒｏ１１−ＮＨＳおよびＰｒｏ１２５−ＮＨＳの化学構造を示す。
【００１８】
【図２Ａ】図２Ａは、本開示の一部の態様による、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｃｌｅ／ｈｏｍｅで入手可能なデータ）の１０３６種の細胞株からのＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ発現レベル間の関係を説明する散布図の分布を示す。ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡレベルは約２５０倍のダイナミックレンジを示し、一方、ＰＤ−１のｍＲＮＡレベルは非常に変化が少なく、ダイナミックレンジは約５倍である。上段のグラフにおいて、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ発現レベルをｘ軸に別々にプロットし、一方、下段のグラフはこのデータを互いに対して再プロットしたものを示す。本開示に記載されている実施例において使用される５つの細胞株は、星印によって示されている。それらは、細胞株の全ＣＣＬＥ集団を反映する、ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ発現の広いダイナミックレンジを表すように選択された。
【００１９】
【図２Ｂ】図２Ｂは、本開示の一部の態様による、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを使用して得られたタンパク質測定値、ならびにがんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）およびＣＣＬＥから得られたｍＲＮＡ測定値に基づく、乳がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、および頭頸部の扁平上皮癌腫（ＳＣＣＨＮ）の間のＰＤ−Ｌ１発現レベルを比較する散布図を示す。ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを使用して分析された試料は、Ａｓｔｅｒａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから得られた（ｎ＝３８；ＮＳＣＬＣ、ｎ＝１４；ＳＣＣＨＮ、ｎ＝２７）。ＴＣＧＡは、以下の腫瘍試料由来のデータを含む：ｎ＝１，１００；ＮＳＣＬＣ、ｎ＝１，０１８；ＳＣＣＨＮ、ｎ＝５２２。ＣＣＬＥは、以下の細胞株由来のデータを含む：ｎ＝５９；ＮＳＣＬＣ、ｎ＝１３３；ＳＣＣＨＮ、ｎ＝３２。乳がんにおけるＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイで測定した場合、肺ＮＳＣまたはＳＣＣＨＮよりも統計学的に異なる低レベルのＰＤ−Ｌ１タンパク質が存在する（乳房対ＮＳＣＬＣまたはＳＣＣＨＮについてｐ＜０．０００１）。これらの差異は、腫瘍由来のＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡレベル（ＴＣＧＡ）（乳房対ＮＳＣＬＣまたはＳＣＣＨＮについてｐ＜０．０００１）、および細胞株由来のＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡレベル（ＣＣＬＥ）（乳房対ＳＣＣＨＮについてｐ＜０．０００１、乳房対ＮＳＣＬＣについてｐ＜０．０００２）と一致する。
【００２０】
【図３】図３は、本開示の一部の態様による、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイにおいて使用される場合、９つの異なる抗ＰＤ−１抗体がＰＤ−１を検出する能力を評価する抗ＰＤ−１抗体評価実験の結果を示す。アッセイフォーマットは、図１Ｅに示されるように、抗ＰＤ−１一次抗体およびＤＴＴで放出可能なタグで標識された二次抗体を使用した。エピトープ賦活化（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）は、ｐＨ６．２またはｐＨ９のいずれかの熱誘導エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）緩衝液を用いて行われた。抗体は、フィトヘマグルチニン−Ｌ（ＰＨＡ−Ｌ）で刺激された、５００，０００個または２５，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞について試験された。抗体を使用して検出されたＰＤ−１の量を相対ピーク面積（ＲＰＡ）（「ＰＤ１  ＶｅｒａＴａｇ  ＲＰＡ」）として決定した。
【００２１】
【図４】図４は、本開示の一部の態様による、図３に記載されている５００，０００個または２５，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞実験間のＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ（ＲＰＡ）によって検出されたＰＤ−１の倍数変化（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ）を示す。
【００２２】
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、本開示の一部の態様による、フィトヘマグルチニン−Ｌ（ＰＨＡ−Ｌ）で刺激された５００，０００個または２５，０００個のいずれかのＪｕｒｋａｔ細胞においてＰＤ−１を検出するための、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイにおける３つの異なる抗ＰＤ−１抗体を評価する抗体滴定実験の結果を示す。アッセイフォーマットは、図１Ｅに示されるように、抗ＰＤ−１一次抗体およびＤＴＴで放出可能なタグで標識された二次抗体を使用した。アッセイに使用される抗体の量が増加するにつれて、増加する量のＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイシグナルが検出された。ｘ軸は抗体濃度であり、ｙ軸はＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイシグナル（ＲＰＡ；「ＰＤ−１  ＶｅｒａＴａｇ  ＲＰＡ」）である。
【００２３】
【図６】図６Ａは、本開示の一部の態様による、図５Ａ〜５Ｃに記載されている５００，０００個または２５，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞実験の間のＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ（ＲＰＡ）によって検出されたＰＤ−１の倍数変化を示す。ｘ軸は抗体濃度を示し、ｙ軸は、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ（ＲＰＡ）によって検出されたＰＤ−１の量の倍数変化を示す。図６Ｂは、本開示の一部の態様による、ＰＨＡで刺激されたＪｕｒｋａｔ細胞の数と、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイによって検出可能なＰＤ−１の量の間の関係を説明するグラフを示す。アッセイフォーマットは、図１Ｄに模式的に示される、近接距離ベースの光放出アッセイにおいてマウス抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体ＮＡＴ１０５、ヤギ抗マウスＩｇＧ１（ビオチンにコンジュゲートされた）、およびヤギ抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体ＡＦ１０８６（タグ標識された）を使用した。ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイによって検出された増加した量のＰＤ−１（ｙ軸）は、増加した量の、刺激されたＪｕｒｋａｔ細胞（ｘ軸）で観察された。対照的に、マウス抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体ＮＡＴ１０５のマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照での置き換えは、増加した量の、刺激されたＪｕｒｋａｔ細胞によるシグナル変化をほとんどもたらさず、これは、検出されたシグナルがＰＤ−１特異的であった（抗体バックグラウンド結合だけでは起因しない）ことを示した。
【００２４】
【図７】図７は、本開示の一部の態様による、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイのための細胞株対照を作製するために使用されるＪｕｒｋａｔおよび接着性細胞株を用いた共培養手順を示す概略図である。接着性細胞株を一晩培養し、洗浄し、ＰＨＡで刺激したＪｕｒｋａｔ細胞を、接着性細胞株に対して１倍または５倍過剰で培養物に添加する。共培養物を２日間増殖させ、次に、冷ＰＢＳで３回洗浄する。最後の洗浄ステップは、共培養皿から付着していないＪｕｒｋａｔ細胞を除去する。次に、細胞をＮＢＦで一晩固定し、その後、８０％エタノールに移し、４℃で保存する。
【００２５】
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、本開示の一部の態様による、１×または５×量のＪｕｒｋａｔ細胞を用いて、図７に記載される共培養された２つの異なる細胞株（ＭＤ−ＭＢＡ−２３１およびＲＫＯ）においてＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイにより測定したＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量をプロットした棒グラフを示す。検出されたタンパク質またはタンパク質複合体の量（ｙ軸）は、Ｊｕｒｋａｔ細胞の各比率（ｘ軸）で各細胞株についての相対ピーク面積（ＲＰＡ）としてプロットされる。これらの実験に使用されたアッセイフォーマットを図１Ｅ（ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１）ならびに図１Ｉ（ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体）に模式的に示す。図８Ｄは、本開示の一部の態様による、４つのがん細胞株とＪｕｒｋａｔ細胞との共培養後、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイによって測定した場合の、ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡとＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量の間の相関を実証していているプロットを示す。評価されたがん細胞株は、図２Ａ（下段）に示される、ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ発現の増加しているレベルおよびＰＤ−１のｍＲＮＡ発現の比較的類似しているレベルを有するＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＢＴ２０、ＭＢ−２３１、およびＲＫＯであった。ｍＲＮＡ発現レベルは、ＣＣＬＥデータベースから得られた。ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量は、ウサギ抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体Ｅ１Ｌ３Ｎ、タグにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＰＤ−１抗体、およびビオチンにコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧを採用した図１Ｈに示されるＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを使用して測定された。ＰＤ−Ｌ１発現の量が増加するにつれて、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを使用して検出されたＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量も同様に増加した（偏差バーを有する黒丸）。ウサギ抗ヒトＰＤＬ１抗体Ｅ１Ｌ３ＮをウサギＩｇＧ（アイソタイプ対照）に置き換えて行った並行実験は、アッセイにおけるバックグラウンドシグナル（灰色の四角）を反映して、ＰＤ−Ｌ１発現量が増加してもシグナル変化はほとんど生じなかった。
【００２６】
【図９】図９Ａは、本開示の一部の態様による腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の存在について予め選択された１２個のヒト乳がん腫瘍（Ａｓｔｅｒａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）におけるＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイによるＰＤ−１タンパク質レベルの分析を示す。使用されるＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットは、図１Ｄに示される近接距離ベースの光放出アッセイであり、マウス抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体ＮＡＴ１０５、ヤギ抗マウスＩｇＧ１（ビオチンにコンジュゲートされた）、およびタグにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体ＡＦ１０８６を採用した。Ｘ軸：腫瘍試料；ｙ軸：ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイシグナル（ＲＰＡ）。また、一部の試料をＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ（図２Ｂに示される）を使用してＰＤ−Ｌ１タンパク質発現について分析した。図９Ｂは、本開示の一部の態様による、図９Ａにおいて評価したのと同じ１２個のヒト乳がん腫瘍における、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイによるＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体レベルの分析を示す。使用されるＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットは、図１Ｈに示される近接距離ベースの光放出アッセイであり、ウサギ抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体Ｅ１Ｌ３Ｎ、ビオチンにコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧ、およびタグにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＰＤ−１抗体ＡＦ１０８６を採用した。ｘ軸：腫瘍試料；ｙ軸：ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイシグナル（ＲＰＡ）。黒色のバーは、検出された複合体の量であり、一方、灰色のバーは、対照アイソタイプ抗体を使用する、並行ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイにおいて検出されたバックグラウンドの量を示す。
【００２７】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、本開示の一部の態様による、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイにより測定した場合の、それぞれのＰＤ１：ＰＤ−Ｌ１複合体レベル対ＰＤ−１発現、ＰＤ１：ＰＤ−Ｌ１複合体レベル対ＰＤ−Ｌ１発現、およびＰＤ−Ｌ１発現対ＰＤ−１発現のペアワイズ比較を説明するグラフを示す。ＰＤ−１データおよびＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体データは、図９Ａおよび図９Ｂに示される分析からのものである。各比較のピアソン相関係数およびｐ値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
提供される技術の実施形態の特徴および付随する利点は、添付の図面と併せて考慮すると、以下の詳細な説明を参照することによって明らかになり、さらには理解される。
【００２９】
異なる細胞上で発現されるタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用の量を検出および定量化する方法が提供される。特に、記載されている方法は、細胞外受容体−リガンド相互作用を検出および定量化するために有用である。患者の病状（がんの状態など）を分類すること、患者の予後を示すこと、または処置に対する患者の応答性を示すことのいずれかについて臨床的にこのような測定を使用する方法もまた提供される。
【００３０】
一態様では、試料中のタンパク質−タンパク質相互作用を定量化する方法が提供され、本方法は、（ａ）細胞表面上に第１のタンパク質を発現している第１の細胞、および細胞表面上に第２のタンパク質を発現している第２の細胞を含む試料を提供するステップ；（ｂ）第１のタンパク質に特異的な第１の抗体結合組成物を提供するステップであって、第１の抗体結合組成物が、切断可能な連結を介してそれに付着した分子タグを含む、ステップ；（ｃ）第２のタンパク質に特異的な第２の抗体結合組成物を提供するステップであって、第２の結合組成物は、それに付着した切断誘導部分を含む、ステップ；（ｄ）試料を第１の抗体結合組成物および第２の抗体結合組成物と接触させるステップ；（ｅ）第１の抗体結合組成物が第２の抗体結合組成物に付着した切断誘導部分の有効な近接距離範囲内にある場合に、第１の抗体結合組成物からの分子タグの切断を誘導し、それによって分子タグを放出させるステップ；ならびに（ｆ）第１のタンパク質と第２のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用の量の尺度として、放出された分子タグの量を定量化するステップを含む。このタイプのアッセイの例を図１Ａ、図１Ｆ、および図１Ｇに模式的に示す。試料は、組織試料、培養細胞、または末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）であり得る。第１の抗体結合組成物は、第１のタンパク質の細胞外ドメインエピトープまたは細胞内ドメインエピトープに結合し得る。第２の抗体結合組成物は、第２のタンパク質の細胞外ドメインエピトープまたは細胞内ドメインエピトープに結合し得る。
【００３１】
別の態様では、試料中のタンパク質−タンパク質相互作用を定量化する方法が提供され、本方法は、（ａ）細胞表面上に第１のタンパク質を発現している第１の細胞、および細胞表面上に第２のタンパク質を発現している第２の細胞を含む試料を提供するステップ；（ｂ）第１のタンパク質に特異的な第１の抗体結合組成物を提供するステップであって、第１の抗体結合組成物が、切断可能な連結を介してそれに付着した分子タグを含む、ステップ；（ｃ）第２のタンパク質に特異的な第２の抗体結合組成物を提供するステップ；（ｄ）第２の抗体組成物に結合する第３の抗体組成物を提供するステップであって、第３の抗体組成物が、それに付着した切断誘導部分を含む、ステップ；（ｅ）試料を第１の抗体結合組成物、第２の抗体結合組成物、および第３の抗体結合組成物と接触させるステップ；（ｆ）第１の抗体結合組成物が第３の抗体結合組成物に付着した切断誘導部分の有効な近接距離範囲内にある場合に、第１の抗体結合組成物からの分子タグの切断を誘導し、それによって分子タグを放出させるステップ；ならびに（ｇ）第１のタンパク質と第２のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用の量の尺度として、放出された分子タグの量を定量化するステップを含む。このタイプのアッセイの例を図１Ｈに模式的に示す。試料は、組織試料、培養細胞、または末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）であり得る。第１の抗体結合組成物は、第１のタンパク質の細胞外ドメインエピトープまたは細胞内ドメインエピトープに結合し得る。第２の抗体結合組成物は、第２のタンパク質の細胞外ドメインエピトープまたは細胞内ドメインエピトープに結合し得る。
【００３２】
別の態様では、試料中のタンパク質−タンパク質相互作用を定量化する方法が提供され、本方法は、（ａ）細胞表面上に第１のタンパク質を発現している第１の細胞、および細胞表面上に第２のタンパク質を発現している第２の細胞を含む試料を提供するステップ；（ｂ）第１のタンパク質に特異的な第１の抗体結合組成物を提供するステップであって、第１の抗体組成物が、それに付着した切断誘導部分を含む、ステップ；（ｃ）第２のタンパク質に特異的な第２の抗体結合組成物を提供するステップ；（ｄ）第２の抗体組成物に結合する第３の抗体組成物を提供するステップであって、第３の抗体結合組成物が、切断可能な連結を介してそれに付着した分子タグを含む、ステップ；（ｅ）試料を第１の抗体結合組成物、第２の抗体結合組成物、および第３の抗体結合組成物と接触させるステップ；（ｆ）第３の抗体結合組成物が第１の抗体結合組成物に付着した切断誘導部分の有効な近接距離範囲内にある場合に、第３の抗体結合組成物からの分子タグの切断を誘導し、それによって分子タグを放出させるステップ；ならびに（ｇ）第１のタンパク質と第２のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用の量の尺度として、放出された分子タグの量を定量化するステップを含む。このタイプのアッセイの概略図を示していないが、図１Ｈに示されるアッセイから容易に想像される。試料は、組織試料、培養細胞、または末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）であり得る。第１の抗体結合組成物は、第１のタンパク質の細胞外ドメインエピトープまたは細胞内ドメインエピトープに結合し得る。第２の抗体結合組成物は、第２のタンパク質の細胞外ドメインエピトープまたは細胞内ドメインエピトープに結合し得る。
【００３３】
さらに別の態様では、試料中のタンパク質−タンパク質相互作用を定量化する方法が提供され、本方法は、（ａ）細胞表面上に第１のタンパク質を発現している第１の細胞、および細胞表面上に第２のタンパク質を発現している第２の細胞を含む試料を提供するステップ；（ｂ）第１のタンパク質に特異的な第１の抗体結合組成物を提供するステップ；（ｃ）第２のタンパク質に特異的な第２の抗体結合組成物を提供するステップ；（ｄ）第１の抗体組成物に結合する第３の抗体組成物を提供するステップであって、第３の抗体組成物が、切断可能な連結を介してそれに付着した分子タグを含む、ステップ；（ｅ）第２の抗体組成物に結合する第４の抗体組成物を提供するステップであって、第４の抗体組成物が、それに付着した切断誘導部分を含む、ステップ；（ｅ）試料を第１の抗体結合組成物、第２の抗体結合組成物、第３の抗体結合組成物、および第４の抗体結合組成物と接触させるステップ；（ｆ）第３の抗体結合組成物が第４の抗体結合組成物に付着した切断誘導部分の有効な近接距離範囲内にある場合に、第３の抗体結合組成物からの分子タグの切断を誘導し、それによって分子タグを放出させるステップ；ならびに（ｇ）第１のタンパク質と第２のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用の量の尺度として、放出された分子タグの量を定量化するステップを含む。このタイプのアッセイの例を図１Ｉに模式的に示す。試料は、組織試料、培養細胞、または末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）であり得る。第１の抗体結合組成物は、第１のタンパク質の細胞外ドメインエピトープまたは細胞内ドメインエピトープに結合し得る。第２の抗体結合組成物は、第２のタンパク質の細胞外ドメインエピトープまたは細胞内ドメインエピトープに結合し得る。
【００３４】
一態様では、提供される方法は、免疫細胞（Ｔ細胞など）の表面に発現されるタンパク質とがん細胞の表面に発現されるタンパク質の間の相互作用を検出するのに有用である。Ｔ細胞と、抗原に対するＴ細胞応答を調節する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の間には、様々なリガンド−受容体相互作用が存在する。免疫チェックポイント分子は、刺激性（シグナルを上げる）または阻害性（シグナルを下げる）であり得る。免疫細胞上の阻害性チェックポイント分子は、それらのリガンドによって係合される場合、阻害シグナルを伝達し、自己寛容を維持し、末梢組織の免疫応答の持続時間および大きさを調節して組織病理学を最小限に抑える。がん細胞は、これらの経路を使用して、Ｔ細胞シグナル伝達を阻害することによって免疫系からそれら自身を保護することができる。典型的な免疫チェックポイント分子を表１に列挙する。一般的に、チェックポイント分子はＴ細胞上で発現され、一方、リガンドはがん細胞などの抗原提示細胞上で発現される。これに対する例外は、ＣＤ４０ががん細胞上で発現され、一方、ＣＤ４０ＬはＴ細胞上で発現されることである（以下の表１では例外に＊印が付されている）。なお、他の例外があり得る。試料、特に腫瘍試料中のこのようなタンパク質−タンパク質相互作用の検出は、免疫細胞が試料中に存在する程度を反映し得る。試料が腫瘍試料である場合、タンパク質−タンパク質相互作用の量は、試料中の活性化された免疫チェックポイント複合体の量を表す。
【表１】
2020073911.tif 000002
【００３５】
一部の場合では、第１のタンパク質は受容体であり得、第２のタンパク質は受容体に対するリガンドであり得る。一部の場合では、第１の細胞はＴ細胞であり得、第２の細胞は抗原提示細胞であり得る。一例では、抗原提示細胞は腫瘍細胞であり得る。別の例では、第１のタンパク質はＰＤ−１（本明細書においてＰＤ１とも称する）であり得、第２のタンパク質はＰＤ−Ｌ１（本明細書においてＰＤＬ１とも称する）であり得る。別の例では、第１のタンパク質はＣＤ２８またはＣＴＬＡ４であり得、第２のタンパク質はＣＤ８０またはＣＤ８６であり得る。別の例では、第１のタンパク質はＢＴＬＡ４であり得、第２のタンパク質はＨＶＥＭであり得る。別の例では、第１のタンパク質はＴＩＭ３であり得、第２のタンパク質はＧＡＬ９であり得る。別の例では、第１のタンパク質はＣＤ２７であり得、第２のタンパク質はＣＤ７０であり得る。別の例では、第１のタンパク質はＣＤ４０Ｌであり得、第２のタンパク質はＣＤ４０であり得る。別の例では、第１のタンパク質はＣＤ１３７であり得、第２のタンパク質はＣＤ１３７Ｌであり得る。別の例では、第１のタンパク質はＯＸ４０であり得、第２のタンパク質はＯＸ４０Ｌであり得る。別の例では、第１のタンパク質はＩＣＯＳであり得、第２のタンパク質はＢ７ＲＰ１であり得る。別の例では、第１のタンパク質はＧＩＴＲであり得、第２のタンパク質はＣＩＴＲＬであり得る。一部の場合では、第１の細胞はＴ細胞であり得、第１のタンパク質は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、またはＧＩＴＲであり得る。一部の場合では、第２の細胞は腫瘍細胞であり得、第２のタンパク質は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＶＥＭ、ＧＡＬ９、ＣＤ７０、ＣＤ４０、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、Ｂ７ＲＰ１、またはＧＩＴＲＬであり得る。
【００３６】
一部の場合では、第１のタンパク質、第２のタンパク質、またはそれらの両方の量は、２つのタンパク質間の複合体の量の定量化に加えて、決定され得る。例えば、これは、第１のタンパク質および／または第２のタンパク質が試料中に存在するかどうかを決定するために取られた閾値測定値であり得る。一部の場合では、このステップは、タンパク質の一方が他方よりもより制限されているかどうか、一部の場合では、どの程度までであるかを決定するために実施され得る。一部の場合では、試料が腫瘍試料であり、第１の細胞がＴ細胞である場合、この方法は、腫瘍におけるＴ細胞浸潤の量を決定するために、第１のタンパク質の量を定量化することを伴う。大量の第１のタンパク質が存在する場合、それは、腫瘍に浸潤した活性化Ｔ細胞が多数存在することを示し得る。少量の第１のタンパク質が存在する場合、それは、腫瘍中に存在する活性化Ｔ細胞がほとんどないことを示し得る。一部の場合では、（例えば、患者がこのような療法にどれくらい迅速に応答するかに関して）第１のタンパク質または第２のタンパク質に指向された療法に対する患者の応答性は増加し得、その場合、大多数の活性化Ｔ細胞が腫瘍に存在する。
【００３７】
ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイの特徴
ある特定の実施形態では、試料中のタンパク質複合体の量は、試料を、切断可能な連結を介して抗体結合組成物に付着した分子タグを有する抗体結合組成物、および抗体結合組成物に付着した切断誘導部分を有する抗体結合組成物と接触させ、放出される分子タグの量を検出することによって決定される。図１Ａ、１Ｃ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、および１Ｉは、例示的なＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットの概略図を提供する。一例では、図１Ａに示されるように、試料（組織切片、培養細胞）を固定し、次に、切断誘導剤を有する第１の抗体結合組成物、および分子タグ（例えば、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子）などの検出可能な部分に連結された第２の抗体結合組成物と結合させる。第１の抗体は、ビオチンにコンジュゲートされ得、次に、切断誘導部分、例えば、ストレプトアビジン官能化増感色素（メチレンブルー）と結合される。第２の抗体結合組成物は、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子または他の適切な検出可能な部分にコンジュゲートされる。切断誘導剤の光誘導は、一重項酸素の放出を引き起こすように実施されてよく、切断可能な連結の切断およびＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子のアッセイ溶液への放出を誘導する。次に、溶液を回収し、キャピラリー電気泳動によって分析する。このアッセイフォーマットの例示的な模式図を図１Ｃ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、および１Ｉに示す。図１Ｄ、１Ｇ、および１Ｉは、異なる抗体結合組成物の対を有するが、図１Ａについて記載したのと同じ例示的なＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ化学を用いて示される。
【００３８】
一部の場合では、例えば図１Ｆおよび図１Ｇに示されるように、第１の抗体結合組成物は、第１のタンパク質に特異的に結合し得、第２の抗体結合組成物は、第２のタンパク質に特異的に結合し得る。このアッセイフォーマットは、第１の抗体結合組成物に付着した分子タグが、第２の抗体結合組成物に付着した切断誘導部分の有効な近接距離内にある場合、分子タグを切断し得るため、第１のタンパク質と第２のタンパク質の間に形成される複合体の検出を可能にする。一部の例では、例えば図１Ｈに示されるように、分子タグは、第１の抗体に付着される代わりに、第１の抗体組成物に結合する第３の抗体組成物に付着され得る。他の場合では、切断誘導部分は、第２の抗体に付着される代わりに、第２の抗体組成物に結合する第３の抗体組成物に付着され得る。他の場合では、例えば図１Ｉに示されるように、分子タグは、第１の抗体に付着される代わりに、第１の抗体組成物に結合する第３の抗体組成物に付着され得、分子タグは、第２の抗体に付着される代わりに、第２の抗体組成物に結合する第４の抗体組成物に付着され得る。
【００３９】
ある特定の場合では、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイは、試料中のタンパク質の総量を検出するために使用され得る。このようなアッセイにおいて、第１の抗体結合組成物および第２の抗体結合組成物は両方、同一のタンパク質標的に特異的に結合するが、異なるエピトープに結合し得る。ある特定の実施形態では、第１の抗体結合組成物に付着した分子タグを有する第１の抗体結合組成物、および第２の抗体結合組成物に付着した切断誘導部分を有する第２の抗体結合組成物は、同じ標的タンパク質に結合するが、標的タンパク質の同じエピトープに結合しない。このようなアッセイフォーマットは、例えば図１Ｃに示されている。別のフォーマットでは、第１の抗体結合組成物に付着した分子タグを有する第１の抗体結合組成物は、第１のエピトープに結合し、第２の抗体結合組成物は、第１のエピトープとは異なる第２のエピトープに結合し、第３の抗体組成物に付着した切断誘導部分を有する第３の抗体組成物は、第２の抗体結合組成物に結合する。このようなアッセイフォーマットは、例えば図１Ｄに示されている。別のフォーマットでは、第１の抗体結合組成物は、第１のエピトープに結合し、第２の抗体結合組成物に付着した分子タグを有する第２の抗体結合組成物は、第１の抗体結合組成物に結合し、第３の抗体組成物に付着した切断誘導部分を有する第３の抗体組成物は、第１のエピトープとは異なる第２のエピトープに結合する。これらのフォーマットの各々では、分子タグが切断誘導部分の有効な近接距離内にある場合、切断誘導部分は切断可能なリンカーを切断し得、それにより分子タグが放出される。一部の場合では、このタイプのアッセイフォーマットは、試料中の標的タンパク質の総量を測定する。類似のアッセイフォーマットを使用する総ＨＥＲ２の検出の例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、共有の米国特許出願公開第２００９／０１９１５５９号に記載されている。米国特許第７，６４８，８２８号および同第８，３４９，５７４号に記載されている、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴなどのバイオマーカーの総量を測定することに関して記載されている同様のアッセイフォーマットもまた使用され得る。
【００４０】
代替の実施形態では、タンパク質の総量は、図１Ｅに示されている還元フォーマットアッセイを使用して検出され得、第１の抗体結合組成物は標的タンパク質に特異的に結合し、第２の抗体組成物は第１の抗体結合組成物に結合し、第２の抗体結合組成物は、ＤＴＴなどの還元剤を介して切断可能であるジスルフィド結合（−ＳＳ−）などの切断可能な連結を介して、第２の抗体結合組成物にコンジュゲートした検出可能部分を含む。
【００４１】
「抗体結合組成物」とは、１つもしくは複数の抗体、または分子に結合する抗原結合断片を含み、その結合特異性がこのような抗体または抗体結合断片に由来する、分子または分子複合体を指すように本明細書で使用される。抗体結合組成物には、これらに限定されないが、（ｉ）第１の抗体が標的分子に特異的に結合し、第２の抗体が第１の抗体の定常領域に特異的に結合する抗体対；標的分子およびストレプトアビジンタンパク質（このタンパク質は、ビオチン部分を介して、分子タグまたは光増感剤などの部分により誘導体化されている）に特異的に結合するビオチン化抗体；（ｉｉ）標的分子に特異的であり、デキストランなどのポリマー（これは、次に共有結合により直接的にまたはストレプトアビジン−ビオチン連結を介して間接的に、分子タグまたは光増感剤などの部分により誘導体化されている）にコンジュゲートした抗体；（ｉｉｉ）標的分子に特異的であり、ビーズ、もしくはマイクロビーズ、または他の固相支持体（これは、次に分子タグもしくは光増感剤、または後者を含有するポリマーなどの部分により直接的または間接的に誘導体化されている）にコンジュゲートした抗体が含まれる。
【００４２】
「切断誘導部分」または「切断剤」は、本明細書において互換的に使用され、例えば、酸化により切断可能な連結を切断することが可能な活性種を生成する基を指す。好ましくは、活性種は、その切断誘導効果が、その発生部位の近接距離内にのみ存在するように、短命の活性を示す化学種である。
【００４３】
「分子タグ」または「タグ」または「レポーター分子」または「検出可能な部分」とは、本明細書において使用される場合、これらに限定されないが、電気泳動移動度、分子量、形状、溶解度、ｐＫａ、疎水性、電荷、電荷／質量比、極性などを含む、分離される分子間における１つまたは複数の物理的、化学的または光学的差違に基づき、他の分子から区別することができる分子を指す。一態様では、複数の分子タグまたは分子タグのセットは、電気泳動移動度および光学的検出特性において相違し、電気泳動により分離することができる。別の態様では、複数の分子タグまたは分子タグのセットは、分子量、形状、溶解度、ｐＫａ、疎水性、電荷、極性において相違し得、順相もしくは逆相のＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣ、キャピラリー電気クロマトグラフィー、質量分析、気相クロマトグラフィーなどの技法により分離することができる。本明細書に記載されるように、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子は、あるタイプの分子タグである。
【００４４】
「光増感剤」とは、光により活性化されると、酸素分子を一重項酸素に転換する、光吸収分子を意味する。本明細書において使用される場合、「ジチオスレイトール」または「ＤＴＴ」は、光増感剤の代わりに、還元によってＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子を切断するために使用され得る。
【００４５】
用語「試料」、「組織試料」、「患者試料」、「患者の細胞試料もしくは組織試料」または「標本」は各々、被験体または患者の組織から得られる同様の細胞の収集物を指す。組織試料の供給源は、新鮮な、凍結した、および／もしくは保存した臓器もしくは組織試料または生検材料もしくは吸引物に由来する固体組織；血液または任意の血液構成成分；脳脊髄液、羊水、腹水または間質液などの体液；あるいは被験体の妊娠または発生の任意の時点に由来する細胞であり得る。組織試料は、防腐剤、抗凝固剤、緩衝液、固定剤、栄養物、抗生物質などの、天然の組織と天然では混合しない化合物を含有し得る。細胞は、従来の方法（例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ））により固定され得る。
【００４６】
「ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）」および「ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ」は、本明細書において互換的に使用され、単一および多重標識フォーマットの両方の単一および多重化イムノアッセイ、ならびにこのようなアッセイを実施および利用するための材料、試薬および技法を指し、これらに限定されないが、それらのアッセイに関連する試薬、分析手順およびソフトウェアが含まれる。ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイの文脈における標識は、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子と称される検出可能な部分である。このようなアッセイは、本出願、ならびにその全てが参照によりその全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，６４８，８２８号；同第８，４７０，５４２号；および同第８，３４９，５７４号；ならびに米国特許出願第２０１２−０２９５２５９号および同第２０１６−００４１１７１号に開示されている。
【００４７】
本明細書において使用される場合、「ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子」または「ｖＴａｇ」とは、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイにおいて使用される抗体に付着されるあるタイプの分子タグ（上記で定義されている）を指す。例示的なＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子は、Ｐｒｏ１１およびＰｒｏ１２５であり、これらは図１Ｊに示されている。他のＶｅｒａＴａｇ（登録商標）分子は、米国特許第６，６２７，４００号；同第７，１０５，３０８号；同第７，２５５，９９９号；同第９，１１０，９７５号；同第７，４０２，３９７号；および同第８，３５７，２７７号に記載されており、これらの各々はすべての目的のためにその全体として本明細書に組み込まれる。
【００４８】
多数の利点は、放出可能な分子タグを使用してタンパク質−タンパク質相互作用を測定することによって提供され、（１）アッセイ混合物から放出された分子タグの分離は、バックグラウンドを大幅に低減させ、感度が顕著に増加する；（２）分離および検出を容易にするために特別に設計された分子タグの使用は、複数の受容体複合体成分が同じアッセイにおいて同時に容易に測定され得るように、便利な多重化能力を提供する。このようなタグを採用するアッセイは、様々な形態を有することができ、以下の参考文献：各々が参照によりその全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１０５，３０８号および同第６，６２７，４００号；公開された米国特許出願第２００２／００１３１２６号、同第２００３／０１７０９１５号、同第２００２／０１４６７２６号、同第２００９／０１９１５５９号、同第２０１０／０１４３９２７号、同第２０１０／０２３３７３２号および同第２０１０／０２１００３４号に開示されている。例えば、広範な分離技法が採用され得、分離される分子間における、電気泳動移動度、分子量、形状、溶解度、ｐＫａ、疎水性、電荷、電荷／質量比または極性を含む、１つまたは複数の物理的、化学的または光学的差違に基づいて、分子を区別することができる。一態様では、複数の分子タグまたは分子タグのセットは、電気泳動移動度および光学的検出特性において相違し、電気泳動により分離される。別の態様では、複数の分子タグまたは分子タグのセットは、分子量、形状、溶解度、ｐＫａ、疎水性、電荷、極性において相違し得、順相もしくは逆相のＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣ、キャピラリー電気クロマトグラフィー、質量分析、または気相クロマトグラフィーにより分離される。
【００４９】
結合化合物から放出された後、分離技法により異なるバンドまたはピークに分離することができる分子タグのセットが提供される。このようなピークの同定および定量化は、タンパク質、タンパク質複合体および転写後の修飾されたタンパク質の存在および／または量の尺度またはプロファイルを提供する。セット内の分子タグは、化学的に多様であり得る；しかしながら、簡便のため、分子タグのセットは、通常、化学的に関連付けられる。例えば、それらはすべてペプチドであり得、またはそれらは同じ基本要素（ｂａｓｉｃ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）もしくは単量体の異なる組み合わせからなり得、あるいはそれらは、異なる分離特性を付与するために異なる置換基を有する同じ基本的足場を使用して合成され得る。複数の分子タグの数は、採用される分離方式、検出用の分子タグにおいて使用される標識、結合部分の感度、および切断可能な連結が切断される効率を含む、複数の因子に依存して変化し得る。
【００５０】
組織試料に対して直接なされた測定は、試料中の総細胞数、および／または試料中の特定のサブタイプの細胞の数を表わす細胞標的または組織標的についての測定を含むことにより、正規化され得る。実質的な割合の正常細胞を含み得る患者試料、特に腫瘍試料において、細胞および組織が不均質であるため、さらなる測定が好ましい場合もあり、またはさらに必要な場合もある。
【００５１】
一部の場合では、組織試料には、これらに限定されないが、乳房、前立腺、卵巣、結腸、肺、子宮内膜、胃、唾液腺、喉頭、咽頭、舌、または膵臓組織試料が含まれる。組織試料は、手術による切除、吸引または生検などの各種の手順により得ることができる。組織は、新鮮であってもよくまたは凍結されていてもよい。一実施形態では、本発明のアッセイは、固定され、パラフィンに包埋された組織試料について行われ、脱パラフィンステップが行われる。組織試料は、従来の方法により固定（すなわち、保存）され得る。例えば、Ｌｅｅ  Ｇ．  Ｌｕｎａ、ＨＴ  （ＡＳＣＰ）編、１９６０年、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  第３版、Ｔｈｅ  Ｂｌａｋｓｔｏｎ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｕｌｒｅｋａ  Ｖ．  Ｍｉｋｅｌ編、１９９４年、Ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．を参照されたい。当業者は、組織を組織学的に染色するか、または他の方法で分析する目的によって、固定剤の選択が決定されることを認識する。当業者はまた、固定化の長さが、組織試料のサイズおよび使用される固定剤に依存することも認識する。
【００５２】
一般的に、最初に組織試料を固定し、次に、濃度を上昇させた一連のアルコールにより脱水し、組織試料を切片化し得るように、パラフィンまたは他の切片化媒体を浸透させ、包埋する。代替的に、組織を切片化し、得られた切片を固定し得る。例として、組織試料は、上記に提供された参考文献に記載されている従来の技法に従って、従来の方法によりパラフィンに包埋され、加工され得る。使用され得るパラフィンの例には、これらに限定されないが、Ｐａｒａｐｌａｓｔ、Ｂｒｏｌｏｉｄ、およびＴｉｓｓｕｅｍａｙが含まれ得る。組織試料を包埋したら、従来の技法に従って、ミクロトームにより試料を切片化し得る。切片は、厚さが約３ミクロン〜約１２ミクロンの範囲であり得、好ましくは約５ミクロン〜約１０ミクロンの範囲の厚さであり得る。一態様では、切片は、面積が約１０ｍｍ２〜約１ｃｍ２であり得る。切断したら、切片は、いくつかの標準的な方法によりスライドに付着させ得る。スライド接着剤の例には、これらに限定されないが、シラン、ゼラチン、およびポリ−Ｌ−リジンが含まれる。パラフィン包埋切片は、正に荷電したスライドおよび／またはポリ−Ｌ−リジンで被覆したスライドに付着され得る。
【００５３】
パラフィンを包埋材料として使用した場合は、組織切片は、一般的に、バイオマーカーを検出する前に脱パラフィンおよび再湿潤化（ｒｅｈｙｄｒａｔｅ）される。組織切片は、いくつかの従来の標準的な方法により脱パラフィンされ得る。例えば、キシレンおよび段階的に濃度を低下させる一連のアルコールは、上記に提供された参考文献に記載されている従来の技法に従って使用され得る。代替的に、Ｈｅｍｏ−Ｄｅ（登録商標）（ＣＭＳ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘ．）などの市販の脱パラフィン非有機剤を使用し得る。
【００５４】
上記で言及した通り、複数の異なる結合化合物を含有する混合物を提供し得、ここで、異なる結合化合物の各々は切断可能な連結を介して付着した１つまたは複数の分子タグを有する。結合化合物、切断可能な連結および分子タグの性質は、大きく異なり得る。一態様では、抗体結合組成物を、以下の式：
Ｂ−（Ｌ−Ｅ）ｋ
［式中、Ｂは、結合部分（抗体）であり；Ｌは、切断可能な連結であり；Ｅは、分子タグである］
により表わすことができる。ホモジニアスアッセイにおいて、切断可能な連結Ｌは、酸化に不安定な連結であり得、より好ましくは、それは、例えば図１Ａに示されるように、一重項酸素によって切断され得る連結である。代替的に、それは、例えば図１Ｂに示されるように、還元による切断、例えばＤＴＴによる切断に感受性である連結であり得る。部分「−（Ｌ−Ｅ）ｋ」は、単一の結合化合物が、切断可能な連結を介して付着された複数の分子タグを有し得ることを示す。一態様では、ｋは１を超えるまたは１に等しい整数であるが、他の実施形態では、ｋが数百より大きく、例えば１００〜５００であり得、またはｋは数百より大きく、数千ほどにもなり、例えば５００〜５０００である。通常、複数の異なるタイプの結合化合物の各々は、異なる分子タグＥを有する。切断可能な連結、例えば、酸化に不安定な連結、および分子タグＥは、従来の化学によりＢに付着される。
【００５５】
好ましくは、Ｂは、標的に特異的に結合する抗体結合組成物である。抗体組成物は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかの広範な市販の抗体から容易に形成される。ある特定の実施形態では、Ｂは、短い距離にわたって作用する切断プローブによって生じる切断剤によって切断される、切断可能な連結Ｌを有し、そのため、切断プローブのごく近接距離内の切断可能な連結のみが切断される。
【００５６】
切断可能な連結Ｌは、放出された分子タグＥの構造を分解せず、その検出特性に影響を与えることのない条件下で切断され得る、実際上、任意の化学連結基であることができる。典型的には、このような薬剤が、拡散して、切断可能な連結に至り、切断を実行する短命の活性種を生成するように、反応混合物に物理的または化学的な変化をもたらすことにより、薬剤を活性化する必要がある。ホモジニアスフォーマットでは、切断剤は、抗体などの結合部分に付着することが好ましく、この結合部分により、切断剤は、活性化する前に、放出可能な分子タグを伴う結合化合物の近接距離内にある特定の部位に標的化される。このような実施形態では、切断剤は、本明細書において「切断誘導部分」と称される。
【００５７】
切断可能な連結には、過酸化水素、一重項酸素など、局所的に作用する反応種との反応に不安定である連結だけでなく、塩基に不安定な連結、光切断可能な連結、還元により切断可能な連結、酸化により切断される連結、酸に不安定な連結、および特定のプロテアーゼにより切断可能なペプチド連結など、反応混合物全体に作用する薬剤に対して不安定な連結もまた含まれる。多数のこのような連結について記載する参考文献には、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、１９９１年、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；および米国特許第５，５６５，３２４号が含まれる。
【００５８】
一態様では、市販の切断可能な試薬システムを本発明とともに採用し得る。例えば、ジスルフィド連結は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）などの販売元から入手可能である、Ｎ−スクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）などのヘテロ官能性薬剤を用いて、抗体結合組成物と分子タグの間に導入され得る。このような連結により導入されたジスルフィド結合は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、２−メルカプトエタノールまたは水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤で処理することにより破壊することができる。ジスルフィド結合の切断を実行するための還元剤の典型的な濃度は、約１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲にある。酸化に不安定な連結は、ホモ二官能性ＮＨＳエステル架橋試薬、過ヨウ素酸ナトリウム（例えば、生理学的ｐＨにおいて４時間にわたる１５ｍＭ過ヨウ素酸塩）による切断に感受性であるｃｉｓ−ジオールを中央部に含有する酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）（Ｐｉｅｒｃｅから入手可能）を使用して、抗体結合組成物と分子タグの間に導入され得る。エステル化されたスペーサー成分を含有する連結は、ヒドロキシルアミン、例えば、３７℃で３〜６時間にわたる、ｐＨ８．５の０．１Ｎヒドロキシルアミンなどの、強力な求核剤により切断され得る。このようなスペーサーは、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手可能なエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）などのホモ二官能性の架橋剤により導入することができる。塩基に不安定な連結は、スルホン基により導入することができる。切断可能な連結にスルホン基を導入するために使用することができるホモ二官能性の架橋剤には、ビス［２−（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、および４，４−ジフルオロ−３，３−ジニトロフェニルスルホン（ＤＦＤＮＰＳ）が含まれる。切断のための例示的な塩基性条件には、３７℃で２時間のインキュベーションを伴う、６Ｍ尿素、０．１％ＳＤＳ、および２ｍＭ  ＤＴＴを含有するＴｒｉｓ塩基を添加することによりｐＨ１１．６に調整された０．１Ｍリン酸ナトリウムが含まれる。光切断可能な連結にはまた、米国特許第５，９８６，０７６号において開示される連結も含まれる。
【００５９】
Ｌが酸化に不安定である場合、Ｌは、チオエーテルまたはそのセレン類似体；またはオキソ基に対する二重結合が切断され、分子タグＥを放出する、炭素−炭素の二重結合を含有するオレフィンであり得る。例示的な酸化に不安定な連結は、それらの各々が、参照によりその全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６２７，４００号および同第５，６２２，９２９号；ならびに公開された米国特許出願第２００２／００１３１２６号および同第２００３／０１７０９１５号に開示されている。
【００６０】
ガスクロマトグラフィーまたは質量分析により複数の分子タグの分離が行われる場合、本発明における分子タグＥは、以下の参考文献に記載されている電気泳動タグ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｉｃ  ｔａｇ）を含み得る；例えば、それらの各々が参照によりその全体として本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇら、２００２年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １３巻：１００２〜１０１２頁；Ｇｉｅｓｅ、１９８３年、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２巻：１６５〜１６８頁；ならびに米国特許第４，６５０，７５０号；同第５，３６０，８１９号；同第５，５１６，９３１号；および同第５，６０２，２７３号を参照されたい
【００６１】
分子タグＥは、好ましくは、活性種、とりわけ、一重項酸素に対して安定であり、検出基またはレポーター基を含む、水溶性の有機化合物である。他の点では、Ｅは、サイズおよび構造が大きく異なり得る。一態様では、Ｅは、約５０〜約２５００ダルトン、より好ましくは、約５０〜約１５００ダルトンの範囲にある分子量を有する。Ｅは、電気化学シグナル、蛍光シグナルまたは発色シグナルを発生させるための検出基を含み得る。質量による検出を採用する実施形態では、Ｅは、検出の目的で別個の部分を有し得ない。好ましくは、検出基は、蛍光シグナルを発生させる。例示的な分子タグＰｒｏ１１およびＰｒｏ１２５を図１Ｃおよび図１Ｊに示す。
【００６２】
一態様では、分子タグＥは（Ｍ、Ｄ）であり、ここで、Ｍは、移動度修飾部分であり、Ｄは検出部分である。「（Ｍ、Ｄ）」という表記を使用して、そのいずれの部分も切断可能な連結Ｌに隣接し得るように、Ｍ部分およびＤ部分の順序づけがなされ得ることを示す。すなわち、「Ｂ−Ｌ−（Ｍ、Ｄ）」とは、結合化合物が、２つの形態：「Ｂ−Ｌ−Ｍ−Ｄ」または「Ｂ−Ｌ−Ｄ−Ｍ」のうちのいずれかであることを示す。
【００６３】
検出部分Ｄは、蛍光標識または蛍光色素であり得、発色標識もしくは発色色素また電気化学標識であり得る。好ましくは、Ｄは、蛍光色素である。本発明とともに使用するための例示的な蛍光色素には、以下の参考文献：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ、第８版（２００２年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、  ＯＲ；米国特許第６，１９１，２７８号；同第６，３７２，９０７号；同第６，０９６，７２３号；同第５，９４５，５２６号；同第４，９９７，９２８号；および同第４，３１８，８４６号；ならびにＬｅｅら、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５巻：２８１６〜２８２２頁において開示されている、水溶性ローダミン色素、フルオレセイン、４，７−ジクロロフルオレセイン、ベンゾキサンテン色素およびエネルギー移動色素が含まれる。好ましくは、Ｄは、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体である。
【００６４】
切断誘導部分または切断剤は、好ましくは酸化により、切断可能な連結を切断することが可能な活性種を生成する基である。好ましくは、活性種は、その切断誘導効果が、その発生部位の近接距離内にのみ存在するように、短命の活性を示す化学種である。活性種が創出される近接距離を越えて顕著なバックグラウンドを創出しないように、活性種を固有に短命とするか、またはその発生部位からの短距離を越えて、切断可能な連結と反応することが可能でないように、活性種を効果的に除去するスカベンジャーを採用する。例示的な活性種には、一重項酸素、過酸化水素、ＮＡＤＨおよびヒドロキシルラジカル、フェノキシラジカル、スーパーオキシドなどが含まれる。酸化を引き起こす活性種に対する例示的なクエンチャーには、ポリエン、カロテノイド、ビタミンＥ、ビタミンＣ、チロシン、ヒスチジンおよびグルタチオンのアミノ酸−ピロールＮ−コンジュゲートが含まれる。例えば、Ｂｅｕｔｎｅｒら、２０００年、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３１９巻：２２６〜２４１頁を参照されたい。
【００６５】
切断誘導部分および切断可能な連結を採用するアッセイを設計する際の１つの考慮点は、タンパク質−タンパク質複合体と結合したとき、切断誘導部分により発生される活性種が切断可能な連結を効果的に切断することが不可能となる程度に遠く、切断誘導部分および切断可能な連結が互いから引き離されないようにすることである。一態様では、切断可能な連結は、好ましくは、結合した切断誘導部分の約１０００ｎｍ以内にあり、好ましくは約２０〜２００ｎｍ以内にある。より好ましくは、一重項酸素を発生させる、光増感剤の切断誘導部分について、切断可能な連結は、受容体複合体において光増感剤の約２０〜１００ｎｍ以内にある。切断誘導部分が切断可能な連結を有効に切断し得る（すなわち、検出可能なシグナルを発生させるのに十分な分子タグを切断する）範囲は、本明細書において、その「有効な近接距離」と称する。当業者は、特定の光増感剤の有効な近接距離が、特定のアッセイ設計の詳細に依存する場合があり、日常的な実験により決定または修飾され得ることを認識する。
【００６６】
増感剤は、反応中間体、または種、通常一重項酸素を発生させるように誘導することができる化合物である。好ましくは、本発明により使用される増感剤は、光増感剤である。本発明の範囲内に含まれる他の増感剤は、熱、光、電離放射線または化学的活性化により励起されると、一重項酸素分子を放出する化合物である。このクラスの化合物のうちで最も公知のメンバーには、１，４−ビスカルボキシエチル−１，４−ナフタレンエンドペルオキシド、９，１０−ジフェニルアントラセン−９，１０−エンドペルオキシドおよび５，６，１１，１２−テトラフェニルナフタレン  ５，１２−エンドペルオキシドなどのエンドペルオキシドが含まれる。これらの化合物を加熱しまたはこれらの化合物が直接的に光を吸収すると、一重項酸素が放出される。さらなる増感剤は、Ｄｉ  Ｍａｓｃｉｏら、１９９４年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３５５巻：２８７頁；およびＫａｎｏｆｓｋｙ、１９８３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５８巻：５９９１〜５９９３頁；Ｐｉｅｒｌｏｔら、２０００年、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３１９巻：３〜２０頁により開示されている。
【００６７】
光増感剤は、共有結合性連結または非共有結合性連結により、直接的または間接的にクラス特異的な試薬による結合剤と付着し得る。このような組成物を構築するための指針、特に、結合剤としての抗体についての指針は、例えば、光線力学療法、免疫診断学などの分野の文献において利用可能である。例示的な指針は、Ｕｌｌｍａｎら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１巻、５４２６〜５４３０頁；Ｓｔｒｏｎｇら、１９９４年、Ａｎｎ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７４５巻：２９７〜３２０頁；Ｙａｒｍｕｓｈら、１９９３年、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．  １０巻：１９７〜２５２頁；ならびに米国特許第５，３４０，７１６号；同第５，５１６，６３６号；同第５，７０９，９９４号；および同第６，２５１，５８１号において見出すことができる。
【００６８】
一部の場合では、切断誘導部分による分子タグの切断は、光誘導によって誘導される。光増感剤を光活性化して一重項酸素を発生させるには、多種多様な光源が利用できる。光源が、実用的な時間内で十分な一重項酸素を生成させるのに十分な強度である限りにおいて、多色光源と単色光源の両方を用いることができる。照射の距離は、光増感剤の性質、切断可能な連結の性質、照射光源の出力、および試料からの距離に依存する。一般的に、照射時間は、約１マイクロ秒間超から約１０分間もの長さであり得、通常、約１ミリ秒間〜約６０秒間の範囲内である。照射の強度および距離は、光増感剤分子のうちの少なくとも約０．１％、通常、光増感剤分子のうちの少なくとも約３０％、ならびに、好ましくは、光増感剤分子のうちの実質的にすべてを励起するのに十分であるものとする。例示的な光源には、レーザー、例えば、ヘリウム−ネオンレーザー、アルゴンレーザー、ＹＡＧレーザー、Ｈｅ／Ｃｄレーザーおよびルビーレーザー；光ダイオード；水銀灯、ナトリウム灯およびキセノン蒸気灯；ならびに、例えば、タングステン灯およびタングステン／ハロゲン灯および閃光灯などの白熱灯が含まれる。本発明の方法において使用するのに適した例示的な光活性化デバイスは、国際特許公開第ＷＯ０３／０５１６６９号において開示されている。このような実施形態では、光活性化デバイスは、９６ウェルプレートのすべてのウェルを同時に照射することが可能な、ハウジング内に設置された発光ダイオード（ＬＥＤ）のアレイである。
【００６９】
本発明において利用され得る光増感剤の例は、上記の特性を有する増感剤、ならびに、米国特許第５，５３６，８３４号；同第５，７６３，６０２号；同第５，５６５，５５２号；同第５，７０９，９９４号；同第５，３４０，７１６号；同第５，５１６，６３６号；同第６，２５１，５８１号；および同第６，００１，６７３号；公開された欧州特許出願第０４８４０２７号；Ｍａｒｔｉｎら、１９９０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８６巻：６３５〜６４５頁；およびＹａｒｍｕｓｈら、１９９３年、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．  １０巻：１９７〜２５２頁により開示される増感剤である。増感剤の場合と同様、ある特定の実施形態では、光増感剤は、固相支持体の表面に共有結合もしくは非共有結合により付着させるか、または固相支持体の本体に組み込むことにより固相支持体と会合され得る。一般的に、光増感剤は、必要量の一重項酸素を達成するのに必要な量で支持体と会合させる。一般的に、光増感剤の量は、日常的な方法に従って、経験的に決定される。
【００７０】
記載されている方法を行う際に、試験される試料および抗体結合化合物を含む、アッセイ成分の組み合わせを作製する。一般的に、アッセイ成分は、任意の順序で組み合わせ得る。しかしながら、ある特定の適用において、添加の順序が重要となり得る。例えば、競合的結合を定量的にモニタリングしたい場合がある。または、組み立てた複合体の安定性をモニタリングしたい場合もある。このような適用において、反応物を段階的に組み立て得る。
【００７１】
各々の試薬の量は、一般的には、経験的に決定することができる。アッセイに使用される試料の量は、存在する標的複合体の予測される数、ならびにアッセイのシグナルをモニタリングするために使用される分離および検出の手段によって決定される。一般的に、結合化合物および切断プローブの量は、試料中の標的分子の期待される量と比べてモル過剰で、一般的には、少なくとも約１．５倍過剰、より望ましくは約１０倍過剰、またはそれを超えるモル過剰で提供することができる。特定の適用において、使用される濃度は、結合剤の親和性、および単一の細胞において存在する標的分子の期待される数に応じて高くまたは低くてもよい。細胞表面のタンパク質複合体の形成に対する化学化合物の効果を決定しようとする場合、モニタリングされる効果に応じて、プローブを添加する前に、これと同時に、またはこの後において、化合物を細胞に添加し得る。
【００７２】
アッセイ混合物は、通常、約１０〜２００ｍＭの範囲の濃度の緩衝液により維持される、一般的には、生理学的ｐＨ（細胞が培養物であるｐＨと同等のｐＨ）にある水性媒体において、細胞表面分子へのプローブの結合を提供する条件下で合わせられ、インキュベートされ得る。従来の緩衝液は、必要に応じて、塩、成長培地、安定化剤など、他の従来の添加剤と同様に使用され得る。生理学的な一定温度が、普通、採用される。インキュベーション温度は、普通、約４℃〜７０℃、通常、約１５℃〜４５℃の範囲であり、より通常には約２５℃〜３７℃の範囲である。
【００７３】
アッセイ混合物を組み立て、インキュベートして、プローブを細胞表面分子に結合させた後、混合物を処理して、切断剤を活性化させ、切断剤の有効な近接距離内にある結合化合物からタグを切断し、細胞表面から対応するタグを溶液に放出させることができる。この処理の性質は、切断剤の作用機構に依存する。例えば、光増感剤を切断剤として採用する場合、切断の活性化は、使用される特定の増感剤に適切な光の波長で、混合物を照射することを含み得る。
【００７４】
次に、切断後、試料を分析して、放出されたタグの正体を決定することができる。複数の結合化合物を採用するアッセイを用いる場合、放出されたタグの分離が、一般的には、それらの検出に先行する。分離と検出の両方のための方法は、アッセイのためにタグを設計する過程で決定される。好ましい分離方式は電気泳動を採用し、様々なタグが、それらの電気泳動移動度における公知の差違に基づき分離される。
【００７５】
上記で言及した通り、一部の実施形態では、アッセイ反応条件が、採用される分離技法に干渉し得る場合、分子タグを切断および分離する前に、アッセイ反応緩衝液を除去または交換することが必要であり得る。例えば、アッセイ条件には、電気泳動移動度に基づいて、分子タグを分離する場合、分離性能を劣化させる塩濃度（例えば、特異的な結合に必要とされる）が含まれ得る。したがって、このような高塩緩衝液は、例えば、分子タグを切断する前に除去され、濾過、吸引、希釈または他の手段により、電気泳動による分離に適した別の緩衝液で置き換えられてもよい。
【００７６】
ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１相互作用の測定
本明細書において提供される方法を使用して検出され得る例示的なタンパク質−タンパク質相互作用は、プログラム死１（「ＰＤ−１」）を発現しているＴ細胞とＰＤリガンド１（「ＰＤ−Ｌ１」）を発現しているがん細胞の間の相互作用である。上記されるように、Ｔ細胞とがん細胞などの抗原提示細胞の間に生じる他の同様のタンパク質−タンパク質複合体がいくつか存在する。このセクションにおける検討は、例としてＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１の相互作用に重点を置く。他のこのような複合体は、同様に検出および測定され、同様の目的で使用され得ることが理解される。
【００７７】
ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１相互作用は、ＰＤ−１を発現しているＴ細胞とＰＤ−Ｌ１を発現している腫瘍細胞の間で生じる。ＰＤ−Ｌ１を発現している腫瘍とＰＤ−１を発現しているＴ細胞の間の相互作用は、腫瘍に対する免疫応答を低減する。（一般的には、Ｃｈｅｎ、Ｄ．Ｓ．およびＭｅｌｌｍａｎ、Ｉ．、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｍｅｅｔｓ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：  ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ−ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｃｙｃｌｅ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３９巻：１〜１０頁（２０１３年）；Ｋｅｉｒ、Ｍ．Ｅ．ら、ＰＤ−１  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｎ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２６巻：６７７〜７０４頁（２００８年）；Ｔｅｎｇ、ＭＷＬら、Ｃｌａｓｓｉｆｙｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＰＤ−Ｌ１．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７５巻：２１３９〜２１４５頁（２０１５年）を参照されたい。）ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の間の相互作用の阻害は、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を回復し得る。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかと結合し、それらの相互作用を阻害する治療用抗体などのチェックポイント阻害剤は臨床開発中である。免疫組織化学（ＩＨＣ）は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のバイオマーカーアッセイとして使用されている。しかしながら、これまで、ＩＨＣ状況は、応答性を明確に示すものではない。例えば、すべてのＩＨＣ陽性患者が抗ＰＤ−１療法または抗ＰＤ−Ｌ１療法に応答するわけではないが、一方、一部のＩＨＣ陰性患者が確かに応答する。
【００７８】
ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１のバイオマーカーアッセイとしてＩＨＣを使用することにはいくつかの欠点がある。標準化されていない複数のＩＨＣ方法および試薬があり、これらのタンパク質の発現に「陽性である」ものとして同定される標準発現レベルは存在しない。さらに、ＩＨＣによる定量化は、視覚的スコア化システムのために主観的である。標準的なＩＨＣアッセイの欠如は、ＩＨＣ陰性患者における観察された臨床応答に対して少なくとも部分的に関与している可能性がある。
【００７９】
本開示の一態様では、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の間のタンパク質−タンパク質複合体相互作用の正確な定量化は、抗ＰＤ−１療法または抗ＰＤ−Ｌ１療法に応答する可能性がある患者に対して、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれか単独またはその両方よりも良好な予測因子であり得る。このようにして、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の間の相互作用を検出し、患者が抗ＰＤ−１療法または抗ＰＤ−Ｌ１療法に応答し得るかどうかを決定する方法が提供される。
【００８０】
本明細書において記載されるように、異なる細胞上で発現されるＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の相互作用は、本開示に記載されているフォーマットを有するＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを使用して検出され得る。特に、複合体は、細胞間（異なる細胞上のタンパク質間）で生じるＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子の近接依存性放出に基づいて検出される。このタイプのアッセイを使用するシグナルの検出は、２つの細胞であるＴ細胞および腫瘍細胞の近い近接距離に依存する。本開示に記載されているＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ法は、広いダイナミックレンジにわたってＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量を直接定量的におよび連続的に測定することをもたらす。
【００８１】
例えば、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体形成は、近接距離依存性の光放出ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットを使用して検出することができ、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子は、抗ＰＤ−１抗体に付着され、ビオチン化された抗ＰＤ−Ｌ１抗体と対になる。別の例では、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体形成は、近接距離依存性の光放出ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットを使用して検出することができ、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体に付着され、ビオチン化された抗ＰＤ−１抗体と対になる。図１Ｆおよび図１Ｇに示される概略図は、これらのアッセイフォーマットの両方を代表するものである。別の例では、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体形成は、近接距離依存性の光放出ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットを使用して検出することができ、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体に結合する二次抗体に付着され、ビオチン化された抗ＰＤ−１抗体と対になる。別の例では、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体形成は、近接距離依存性の光放出ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットを使用して検出することができ、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子は、抗ＰＤ−１抗体に結合する二次抗体に付着され、ビオチン化された抗ＰＤ−Ｌ１抗体と対になる。図１Ｈに示される概略図は、これらのアッセイフォーマットの両方を代表するものである。別の例では、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体形成は、近接距離依存性の光放出ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットを使用して検出することができ、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体に結合する第１の二次抗体に付着され、抗ＰＤ−１抗体に結合するビオチン化された二次抗体と対になる。別の例では、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体形成は、近接距離依存性の光放出ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットを使用して検出することができ、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子は、抗ＰＤ−１抗体に結合する第１の二次抗体に付着され、抗ＰＤ−Ｌ１抗体に結合するビオチン化された二次抗体と対になる。図１Ｉに示される概略図は、これらのアッセイフォーマットの両方を代表するものである。
【００８２】
一部の場合では、本明細書に記載されている方法において使用されるＰＤ−Ｌ１抗体は、ウサギ抗ヒトＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体Ｅ１Ｌ３Ｎ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）またはウサギ抗ヒトＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体２８−８（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ２０５９２１）であり得る。一部の場合では、本明細書に記載されている方法において使用されるＰＤ−１抗体は、表２に列挙された抗体のいずれかであり得る。本明細書に記載されているアッセイにおいて採用される分子タグは、米国特許第６，６２７，４００号、同第７，１０５，３０８号；同第７，２５５，９９９号；同第９，１１０，９７５号；同第７，４０２，３９７号；および同第８，３５７，２７７号に記載されているタグのいずれかであり得る。
【００８３】
一部の場合では、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の間のタンパク質−タンパク質相互作用は、細胞培養系において検出され得、接着性がん細胞は、図７に関して記載されるように、Ｊｕｒｋａｔ細胞などのＴリンパ球細胞の不死化株と共培養される。接着性細胞株は一晩培養され、洗浄され得、次に、ＰＨＡで刺激されたＪｕｒｋａｔ細胞は、接着性細胞株と１：１またはそれよりも過剰（例えば２×、５×、１０×）で培養物に添加され得る。共培養物を１、２、３、４または５日間増殖させ、次に、洗浄して未結合細胞（主にリンパ球細胞であることが予想される）を除去し得る。その後、共培養した細胞を分析前に固定し得る。類似のアッセイフォーマットは、がん細胞上に発現される他のチェックポイント阻害タンパク質のタンパク質相互作用を評価するために容易に採用され得る。一部の場合では、このアッセイフォーマットは、２つの標的タンパク質間の相互作用を変化させる試験化合物、例えば、化学化合物、ペプチド、または抗体もしくは抗体断片の能力を評価し、それにより治療用分子の同定を促進するために使用され得る。このようなアッセイは、異なる試験分子を試験するためのスクリーニングアッセイとして使用され得る。一部の場合では、試験分子は、標的タンパク質間の相互作用を低減する、タンパク質−タンパク質相互作用の阻害剤であり得る。例えば、標的分子は、他の標的タンパク質が相互作用するのと同じ領域内の標的タンパク質の１つの一部に結合し得る。一部の場合では、試験分子は、標的タンパク質のタンパク質−タンパク質相互作用を促進する刺激分子であり得る。
【００８４】
別の態様では、試料中の２つの細胞間のタンパク質−タンパク質相互作用の形成を妨害するまたは促進する能力について試験薬剤をスクリーニングする方法が提供され、（ａ）試験細胞培養物を試験薬剤と接触させるステップであって、試験細胞培養物が、細胞表面上に第１のタンパク質を発現している第１の細胞、および細胞表面上に第２のタンパク質を発現している第２の細胞を含む、ステップ；（ｂ）上述される方法のいずれかを使用して、第１のタンパク質と第２のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用の量を測定するステップ；ならびに（ｃ）ステップ（ｂ）において測定されたタンパク質−タンパク質相互作用の量を、試験薬剤と接触していない対照細胞培養物中の第１タンパク質と第２タンパク質の間で測定されたタンパク質−タンパク質相互作用の量と比較するステップであって、対照細胞培養物が、細胞表面上に第１のタンパク質を発現している第１の細胞、および細胞表面上に第２のタンパク質を発現している第２の細胞を含む、ステップを有する。
【００８５】
一部の場合では、タンパク質−タンパク質相互作用の量が、対照細胞培養物と比較して試験細胞培養物において減少している場合、試験薬剤は、第１のタンパク質と第２のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用の阻害剤であり得る。他の場合では、タンパク質−タンパク質相互作用の量が、対照細胞培養物と比較して試験細胞培養物において増加している場合、試験薬剤は、第１のタンパク質と第２のタンパク質の間のタンパク質−タンパク質相互作用の促進剤であり得る。
【００８６】
一部の場合では、第１の細胞および第２の細胞は異なる細胞タイプであり得る。いくつか場合において、第１の細胞および第２の細胞は異なるがん細胞株であり得る。一部の場合では、第１の細胞および第２の細胞の一方が接着性細胞株であり、他方が非接着性細胞株である。一部の場合では、第１の細胞はＪｕｒｋａｔ細胞であり、第２の細胞は接着性がん細胞である。
【００８７】
一部の場合では、本明細書に記載されている方法を使用して検出可能なＰＤ−Ｌ１タンパク質およびＰＤ−１タンパク質の量は、例えば図２Ｂに記載されているように、これらのタンパク質のｍＲＮＡ発現の量に比例する。一部の場合では、本明細書に記載されている方法を使用して検出可能なＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量は、例えば図８Ｄに示されているように、試料中のＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡの量が増加するにつれて増加する。他の場合では、検出される複合体の量は、試料中のＰＤ−１のｍＲＮＡの量が増加するにつれて増加し得る。これらの実施形態は、図８Ａ〜８Ｃにおいて説明され、提供された方法によって検出された試料中のＰＤ−１タンパク質の量は、接着性がん細胞株が共培養されるＪｕｒｋａｔ細胞の量として増加する。また、図１０Ａ〜１０Ｃに示されるように、提供された方法によって検出された複合体の量は、試料中のＰＤ−１タンパク質の量と統計学的に有意な様式で相関される。
【００８８】
腫瘍試料において、記載された方法を使用するＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の検出は、Ｔ細胞による腫瘍の浸潤を明らかにし得る。一部の場合では、患者由来の腫瘍試料における、記載されたアッセイにより検出されたＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量は、抗ＰＤ−１療法または抗ＰＤ−Ｌ１療法に応答する患者の可能性を予測し得る。一部の場合では、患者由来の腫瘍試料における、記載されたアッセイにより検出されたＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量は、抗ＰＤ−１療法または抗ＰＤ−Ｌ１療法に応答する患者の可能性と相関し得る。
【００８９】
一態様では、免疫チェックポイント標的化療法に対する、がんを有する被験体の応答性を予測するための方法が提供され、（ａ）本開示に記載されるタンパク質−タンパク質相互作用を定量化する方法を使用して、被験体のがん由来の生物学的試料中のチェックポイント分子−リガンド複合体の量を測定するステップ；（ｂ）被験体の試料中の複合体の量が閾値レベルを上回るかまたはそれを下回るかを決定するステップ；および（ｃ）被験体の試料中の複合体の量が閾値レベルに等しいまたはそれを上回る場合は、複合体の量が閾値レベルを下回る場合よりも、被験体がチェックポイント標的化療法に応答する可能性が高いことを示すステップを含む。
【００９０】
一態様では、ＰＤ−１作用剤またはＰＤ−Ｌ１作用剤に対する、がんを有する被験体の応答性を予測するための方法が提供され、（ａ）本開示に記載されるタンパク質−タンパク質相互作用を定量化する方法を使用して、被験体のがん由来の生物学的試料中のＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量を測定するステップ；（ｂ）被験体の試料中のＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量が閾値レベルを上回るかまたはそれを下回るかを決定するステップ；および（ｃ）被験体の試料中のＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量が閾値レベルに等しいまたはそれを上回る場合は、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量が閾値レベルを下回る場合よりも、被験体がＰＤ−１作用剤またはＰＤ−Ｌ１作用剤に応答する可能性が高いことを示すステップを含む。
【００９１】
一部の場合では、第１のタンパク質、第２のタンパク質、またはその両方の量は、２つのタンパク質間の複合体の量の定量化に加えて、決定され得る。一部の場合では、この方法は、腫瘍におけるＴ細胞浸潤の量を決定するために、第１のタンパク質の量を定量化することを伴う。例えば、第１のタンパク質が多量に存在する場合、腫瘍に浸潤する活性化Ｔ細胞が多数存在することを示し得る。別の例では、少量の第１のタンパク質が存在する場合、腫瘍中に存在する活性化Ｔ細胞がほとんどないことを示し得る。一部の場合では、（例えば、患者がこのような療法にどれくらい迅速に応答するかに関して）第１のタンパク質または第２のタンパク質に指向された療法に対する患者の応答性は増加し得、その場合、大多数の活性化Ｔ細胞が腫瘍に存在する。
【００９２】
本明細書において使用される場合、用語「被験体」および「患者」は互換的に使用される。本明細書において使用される場合、用語「被験体」および「複数の被験体」とは、動物、好ましくは非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ロバ、ヤギ、ラクダ、ネコ、イヌ、モルモット、ラット、マウス、ヒツジ）および霊長類（例えば、サル、例えばカニクイザル、ゴリラ、チンパンジーおよびヒト）を含む哺乳動物を指す。
【００９３】
いくつかの例では、閾値レベルは、被験体と同じ種類のがんを有する患者の参照集団において決定されたＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体のメジアン量である。別の場合では、閾値レベルは、被験体と同じ種類のがんを有する患者の参照集団において決定されたＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の最適量である。本明細書で使用される「最適なカットオフ」は、属性の２つのカテゴリー間の最良の識別を可能にするある特定の属性を示す被験体に関する所定の尺度の値を指す。例えば、全生存を決定するために患者の２つのカテゴリー（サブグループ）間を最も良く識別できる最適なカットオフの値を見出すこと。最適なカットオフを使用して、予測モデルを最適化する、例えば、限定されないが、モデルの特異性を最大にし、モデルの感度を最大にし、転帰（ｏｕｔｃｏｍｅ）の差を最大にし、またはハザード比もしくは応答の差からのｐ値を最小にする、最適なカットオフよりも低いまたはそれよりも高い値を有する被験体を分離する。
【００９４】
処置への「応答性」、処置に「応答する」、およびこの動詞の他の形態は、本明細書において使用される場合、Ｈｅｒ−２作用剤による処置に対する被験体の反応を指す。例として、被験体における腫瘍の増殖が約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれらを超えて遅延される場合、被験体は、ＰＤ−１作用剤またはＰＤ−Ｌ１作用剤による処置に応答する。別の例では、被験体の腫瘍が、任意の適切な尺度によって決定されるとき、例えば質量または体積で、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれらを超えて収縮する場合、被験体は、Ｈｅｒ−２作用剤による処置に応答する。別の例では、被験体が、処置を施さない場合に予測される平均余命を約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれらを超えて延長された平均余命を経験する場合、被験体はＰＤ−１作用剤またはＰＤ−Ｌ１作用剤による処置に応答する。別の例では、被験体が、無病生存期間（ｄｉｓｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）の増加、全生存または無増悪期間（ｔｉｍｅ  ｔｏ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）の増加を有する場合、被験体は、ＰＤ−１作用剤またはＰＤ−Ｌ１作用剤による処置に応答する。患者が全生存率、無増悪期間、無進行生存、および／またはＲＥＣＩＳＴ基準もしくは他の医学的に許容される応答基準の使用を含む処置に応答するかどうかを決定するためのいくつかの方法が使用され得る。ＲＥＣＩＳＴ基準は、「固形腫瘍の応答評価基準（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｕｒｓ）」を表し、がん患者が、処置中に改善し（「応答」）、同じ状態であり（「安定」）または悪化（「進行」）する場合を定義する一連の公表された規則である。ＲＥＣＩＳＴ基準によって定義される応答は、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、９２巻、３号、２０００年２月２日に公開されている。これらのガイドラインは定期的に更新され、いずれものこのような更新は本開示の範囲内で企図される。また、ＲＥＣＩＳＴ基準以外の基準、規則、またはガイドラインが、将来、臨床腫瘍応答を特徴付けるために開発され得ることが企図され、あらゆるこのような基準、規則、またはガイドラインが、本開示の範囲内にあることが企図される。当業者は、部分奏効（「ＰＲ」）、完全奏効（「ＣＲ」）、安定病態（「ＳＤ」）および進行性疾患（「ＰＤ」）を含むＲＥＣＩＳＴ基準に調和する定義を理解する。
【実施例】
【００９５】
本発明は、以下の非制限的な実施例を参照することによってより良く理解され得る。
（実施例１  抗体、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）−抗体、ビオチン、および分子はさみ）
ヒトＰＤ−Ｌ１の細胞内ドメインを認識するモノクローナル抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した（ウサギ抗ヒトＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体Ｅ１Ｌ３Ｎ）。市販のウサギ抗ヒトＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体２８−８（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ２０５９２１）などの他の抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体は、ＦＦＰＥ試料を用いた使用に適合する場合、本明細書に記載されるアッセイに適している。以下の表２は、研究された１０種の抗ヒトＰＤ−１抗体、ならびにそれらのアイソタイプおよび免疫原を示す（ｒｈＰＤ−１は組換えヒトＰＤ−１を指す）。
【表２】
2020073911.tif 000003
【００９６】
ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子であるＰｒｏ１１およびＰｒｏ１２５（図１Ｊ）およびストレプトアビジンをコンジュゲートしたメチレンブルー（「分子はさみ」）は、参照により本明細書に組み込まれ、いずれの図面も含む、米国特許第７，１０５，３０８号に以前に記載されているプロトコールに従って合成および精製された。抗体−ビオチンコンジュゲートは、製造業者のプロトコールに従って、リンカーとしてスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して作製され、抗体−ビオチンおよび抗体−タグコンジュゲーション生成物は、ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、またはＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上の１ｃｍ×１０ｃｍのＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０サイズ排除カラムによって精製された。ある特定の実験において、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子またはビオチンは、図１Ｃ、１Ｆ、１Ｇ、および１Ｈに示されているものなどの一次抗体にコンジュゲートされた。他の実験において、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）タグまたはビオチンは、図１Ｄ、１Ｅ、１Ｈ、および１Ｉに示されているものなどの、一次抗体に結合する二次抗体にコンジュゲートさせた。
【００９７】
（実施例２  細胞培養）
すべての細胞株は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）およびペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補充したＬ−グルタミン成長培地を含むＧｉｂｃｏのＲＰＭＩ  １６４０中で３７℃、５％ＣＯ２にて維持された。すべての細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。
【００９８】
（実施例３  Ｊｕｒｋａｔ細胞株の培養および刺激）
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、Ｔ−１７５細胞培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の１００ｍＬの培地中で１〜２×１０６細胞／ｍＬで培養した。刺激のために、フィトヘマグルチニン−Ｌ（ＰＨＡ−Ｌ、Ｒｏｃｈｅ）を最終濃度３μｇ／ｍＬで添加し、３７℃、５％ＣＯ２で２日間インキュベートした。細胞を４℃にて３００×ｇで１０分間遠心分離して回収し、冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を固定するために、細胞ペレットを２０ｍＬの１０％中性緩衝ホルマリン（１０％ＮＢＦ、Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に再懸濁し、４℃で一晩（＞１６時間）ロティサリー（ｒｏｔｉｓｓｅｒｉｅ）上に置いた。細胞を３００×ｇで１０分間遠心分離し、固定溶液を除去し、細胞ペレットを最小量の８０％エタノール（３〜４ｍＬ）に再溶解し、４℃にて保存した。
【００９９】
（実施例４  接着性細胞株およびＪｕｒｋａｔ細胞株の共培養）
接着性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ４５３、ＢＴ−２０、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、およびＲＫＯの各々を懸濁Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞と共培養した。この共培養実験の概要を図７に示す。接着性細胞株を１５０ｍｍ培養皿中の２０ｍＬ培地で１０×１０６細胞で播種し（およそ５０％コンフルエント）、一晩接着させた。翌日、培地を除去し、細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）で１回洗浄した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、２０ｍＬの培地中の５×１０５細胞／ｍＬまたは２．５×１０６細胞／ｍＬのいずれか、全体で１０×１０６または５０×１０６のＪｕｒｋａｔ細胞（接着性細胞の量よりも１倍または５倍多い量に等しい；それぞれ培養条件１および培養条件２）のいずれかで、３μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン−Ｌ（ＰＨＡ−Ｌ、Ｒｏｃｈｅ）とともに接着性細胞株に添加され、共培養物を４８時間増殖させた。培地を除去した後、培養皿を冷ＰＢＳで３回洗浄して、全ての非接着性細胞を除去し、２０ｍＬの１０％中性緩衝ホルマリン（１０％ＮＢＦ、Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１時間、４℃にて培養皿に添加して、細胞を固定し、接着性細胞株と相互作用するあらゆるＪｕｒｋａｔ細胞を固定化した。次に、細胞を５０ｍＬ遠心管（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に擦過して入れ、１０％ＮＢＦを３５ｍＬに添加し、４℃で一晩（＞１６時間）、ロティサリー上に置いた。細胞を３００×ｇで１０分間遠心分離し、固定溶液を除去し、細胞ペレットを最小量の８０％エタノール（１〜２ｍＬ）に再溶解し、４℃で保存した。
【０１００】
（実施例５  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ用のスライドの調製）
固定組織：ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）乳房、ＮＳＣＬＣ、およびＳＣＣＨＮ組織試料ブロックをＡｓｔｅｒａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。５ミクロンの組織切片を正に荷電したガラススライド（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ（商標）Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（商標）プラス顕微鏡スライド、カタログ番号１２−５５０−１５）上に置き、次に７０℃に設定した加熱オーブン中で２０分間焼成した。すべての試料スライドを将来のアッセイのために４℃で保存した。
【０１０１】
培養細胞：固定された細胞を、４０％エタノール中で１２，５００細胞／ｍＬまたは６２５細胞／ｍＬに希釈し、４０μＬ（合計５００，０００または２５，０００細胞）を正に荷電したガラススライド（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ（商標）Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（商標）プラス顕微鏡スライド、カタログ番号１２−５５０−１５）上に置き、次に７０℃に設定した加熱オーブン中で２０分間焼成する。すべての試料スライドを将来のアッセイのために４℃で保存した。
【０１０２】
（実施例６  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイプロトコール）
１．ＤＴＴ放出アッセイ
スライド（ＦＦＰＥ組織試料または培養細胞のいずれか）は、Ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒ（商標）Ｐｒｏ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）中、９５℃で４０分間および９０℃で１０秒間、２５０ｍｌのＤｉｖａ  Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ、ｐＨ６．２（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ＃ＤＶ２００４ＭＭ）を用いて熱誘導エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）に供された。スライドをＤｅｃｌｏａｋｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒから取り出し、１時間、室温で冷却した。スライドを脱イオン水で６回すすぎ、ゆっくりと回転するように変更させた遠心分離機（Ｔｏｍｙ  ＰＭＣ−０８２）で部分的に乾燥させた。試料上に試薬を保持するために、ミニＰＡＰペン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号００−８８７７）を使用して疎水性の円を試料の周りに描いた。次に、試料をＰＢＳ中の１０％ヤギ血清（Ｓｉｇｍａ＃Ｇ９０２３）および１．５％ウシ血清アルブミンを含有するブロッキング緩衝液で１時間覆った。吸引によりブロッキング緩衝液を除去した後、ブロッキング緩衝液に一次抗体を含有する溶液をスライドに添加し、穏やかに振とうしながら加湿チャンバー内で４℃にて一晩放置した。抗体溶液を吸引し、試料を０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳで５分間洗浄し、その後、ＰＢＳで５分間洗浄した。吸引後、ブロッキング緩衝液中の二次抗体を添加した。二次抗体を加湿チャンバー内で室温にて１時間インキュベートさせた。次に、スライドを脱イオン水中のスライドラックに移し、その後、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳで５分間すすぎ、続いて、それぞれ１分間、脱イオン水で６回洗浄した。スライドを遠心分離機（Ｔｏｍｙ  ＰＭＣ−０８２）中で部分的に乾燥させ、次に０．０１×ＰＢＳ中の１．０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、３ｐＭのフルオレセインおよび２つのＣＥ内部マーカー（ＭＦおよびＭＬ）を含有する放出緩衝液を試料切片に添加した。スライドを加湿チャンバー内で３時間インキュベートして、ＶｅｒａＴａｇの放出を可能にした。各々のスライドからの放出緩衝液を９６ウェルプレートに移し、次にＤＴＴを含有しない放出緩衝液中で適切に（一般的には１０倍に）希釈した。放出緩衝液に放出されたＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子を分離し、６ｋＶおよび５０秒のＣＥ注入条件下、６５０秒間、３０℃で作動させたＡＢＩ３１３０  ＣＥ機器（２２ｃｍキャピラリーアレイ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で検出した。ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）の同定および定量化は、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）Ｉｎｆｏｒｍｅｒソフトウェアを使用して行われた（例えば、参照により本明細書に組み込まれ、いずれの図面も含む、米国公開番号０２０３４０８−Ａ１を参照されたい）。生のＣＥ電気泳動図中のＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子シグナルを分析するために、２つのＣＥ内部マーカーであるＭＦ（最初のマーカー）およびＭＬ（最後のマーカー）を使用して、以下の式：［ｔ（ＶｅｒａＴａｇ）−ｔ（ＭＦ）］／［ｔ（ＭＬ）−ｔ（ＭＦ）］に従い、２つのマーカーと比較したそれらの電気泳動移動度または移動時間（ｔ）に応じてＶｅｒａＴａｇ（登録商標）ピークを同定した。次に、同定されたＶｅｒａＴａｇ（登録商標）ピークを各々のＶｅｒａＴａｇについてピーク面積計算によって定量化した。組織切片からのＶｅｒａＴａｇ（登録商標）回復の変動性、ならびにキャピラリーアレイにわたるＣＥ注入効率および／または検出感度の試行変動性を補正するために、フルオレセイン（３ｐＭ）をＶｅｒａＴａｇ（登録商標）Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＣＢ）中に含め、各々の試料試行において内部参照対照として同時に電気泳動した。次に、各々のＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子ピークの面積を、内部フルオレセインピーク（フルオレセインピーク面積）に対するＶｅｒａＴａｇ（登録商標）ピーク（ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）ピーク面積）の面積正規化によって、相対ピーク面積（ＲＰＡ）として報告した。
【０１０３】
スライドをヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて標準的な技法により染色した。簡単に説明すると、スライドを染色ラックに入れ、最初に水道水ですすいだ。スライドをヘマトキシリン、清澄剤（ｃｌａｒｉｆｉｅｒ）および青色染色剤（ｂｌｕｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）にそれぞれ４５秒間、連続して浸漬し、続いて、各々のステップの後に水道水ですすいだ。次に、スライドをアルコール中の５％水（２つの新鮮な溶液）、その後、１００％アルコール（３つの新鮮な溶液）、その後、キシレン（３つの新鮮な溶液、それぞれ５分間）で処理した。最後に、切片を保護するためにカバースリップを適用した。
【０１０４】
ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイによって検出された標的タンパク質の最終的な定量化条件は、同一の捕捉緩衝液体積を使用する同様の試料（細胞培養試料）のＲＰＡとして、またはスライド上の異なる量の腫瘍を説明するためのＲＰＡ＊ＣＢ体積／腫瘍面積（ｍｍ２）のいずれかとして計算される。
【０１０５】
図３および図４に記載されている実験について、同様のプロトコールが、熱誘導エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）緩衝液としてＤｉｖａ  Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ、ｐＨ６．２（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、＃ＤＶ２００４ＭＭ）と並行して、標的賦活化溶液、ｐＨ９．０（Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐ．、＃Ｓ２３６８）を使用して実施され、様々なＰＤ１抗体を試験するときに２つの緩衝液を比較するようにした。
【０１０６】
２．光放出アッセイ
光放出ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットは、Ｄｉｖａ  Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ、ｐＨ６．２（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、＃ＤＶ２００４ＭＭ）が熱誘導エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）緩衝液として使用されることを除いて、二次抗体の添加およびインキュベーションを含み、そこまでのＤＴＴ放出アッセイフォーマットに関して上述した手順に従う。二次抗体とのインキュベーション後、次に、試料は、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳで５分間、その後、ＰＢＳで５分間洗浄され、吸引された。吸引後、１×ＰＢＳ中の２．５μｇ／ｍＬ濃度のストレプトアビジンをコンジュゲートしたメチレンブルーを添加し、加湿チャンバー内で室温にて１時間インキュベートした。次に、スライドを脱イオン水中のスライドラックに移し、その後、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳで５分間すすぎ、続いて、それぞれ１分間、脱イオン水で６回洗浄した。スライドを遠心分離機（Ｔｏｍｙ  ＰＭＣ−０８２）中で部分的に乾燥させ、０．００２×ＰＢＳ中の３ｐＭフルオレセインおよび２つのＣＥ内部マーカー（ＭＦおよびＭＬ）を含有する照明緩衝液を試料切片に添加した。結合したＶｅｒａＴａｇ（登録商標）は、電子アイスキューブ（Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を装備した社内の高出力ＬＥＤアレイイルミネーターを使用して、光活性化切断によって約４℃で放出された。照明後、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）中間体は、水素化ホウ素ナトリウムの添加によって定量化可能な形態に還元された。ＣＥ試料に放出されたＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子を分離し、６ｋＶおよび６５秒のＣＥ注入条件下、６５０秒間、３０℃で作動させたＡＢＩ３１３０  ＣＥ機器（２２ｃｍキャピラリーアレイ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で検出した。放出されたＶｅｒａＴａｇ（登録商標）タグの同定および定量化は、ＤＴＴ放出アッセイについて上述したように実施された。
【０１０７】
（実施例７  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマット−抗体の組み合わせ）
１．ＤＴＴ放出アッセイ
図２Ａ−２Ｂおよび図８Ａに示される実験について、ＰＤ−Ｌ１  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイは、（１）０．６μｇ／ｍＬのウサギ抗ヒトＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体Ｅ１Ｌ３Ｎ、および（２）０．４μｇ／ｍＬのＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子Ｐｒｏ１２５にコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ二次抗体を使用して行われた。分子タグは、ＤＴＴを用いた還元により放出された。このアッセイフォーマットの例示的な模式図を図１Ｅに示す。
【０１０８】
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、６Ａ、および８Ｂに示されている実験について、ＰＤ１  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイは、（１）図に示された濃度のマウス抗ヒトモノクローナル抗体ＮＡＴ１０５（Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ）またはＥＨ３３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＪ１２１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、および（２）Ｐｒｏ１２５  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーターにコンジュゲートした、１μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カタログ番号１１５−００５−１４６）を使用して行われた。分子タグは、ＤＴＴを使用した還元により放出された。このアッセイフォーマットの例示的な模式図を図１Ｅに示す。
【０１０９】
２．光放出アッセイ
図６Ｂおよび図９Ａに示されている実験について、ＰＤ−１抗体ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイは、（１）１μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体ＮＡＴ１０５（Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ）、（２）ビオチンにコンジュゲートした、１μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧ１二次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）、および（３）ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子Ｐｒｏ１１にコンジュゲートした、１μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＰＤ−１  ＡＦ１０８６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行われた。分子タグは、光により放出された。このアッセイフォーマットの例示的な模式図を図１Ｄに示す。
【０１１０】
図８Ｃに示されている実験について、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイは、（１）１μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体ＮＡＴ１０５（Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ）、（２）０．５μｇ／ｍＬのウサギ抗ヒトＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体Ｅ１Ｌ３Ｎ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、（３）ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子Ｐｒｏ１１にコンジュゲートした、１μｇ／ｍＬのヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）、および（４）ビオチンにコンジュゲートした、０．６μｇ／ｍＬのヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して行われた。分子タグは、光により放出された。このアッセイフォーマットの例示的な模式図を図１Ｉに示す。
【０１１１】
図８Ｄおよび図９Ｂに示されている実験について、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイは、（１）ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子Ｐｒｏ１１にコンジュゲートした、１μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＰＤ−１ポリクローナル抗体ＡＦ１０８６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、（２）０．６μｇ／ｍＬのウサギ抗ヒトＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体Ｅ１Ｌ３Ｎ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、（３）ビオチンにコンジュゲートした、１μｇ／ｍＬのヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）を使用して行われた。分子タグは、光により放出された。このアッセイフォーマットの例示的な模式図を図１Ｈに示す。アイソタイプ対照アッセイは、ウサギモノクローナル抗体Ｅ１Ｌ３Ｎを等量のウサギＩｇＧで置き換えることにより実施された。
【０１１２】
（実施例８  ＣＣＬＥデータベースからのＰＤ１およびＰＤＬ１のｍＲＮＡの発現）
図２Ａ上段は、プロットされたＣＣＬＥから入手可能な１，０３６個のがん細胞株由来のＰＤ１およびＰＤＬ１のｍＲＮＡ発現レベルを示す。データは、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｃｌｅ／ｈｏｍｅで利用可能なデータ）から入手可能である。ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡレベルは約２５０倍のダイナミックレンジを示し、一方、ＰＤ−１  ｍＲＮＡレベルは、はるかに変動性が小さく、約５倍のダイナミックレンジを有する。
【０１１３】
図２Ａ下段は、互いに対してプロットされた、図２Ａ上段と同じＣＣＬＥデータセットからのＰＤ１とＰＤＬ１のｍＲＮＡ発現レベル間の関係を示し、４つの接着性細胞株（ＭＢ４５３、ＢＴ２０、ＭＢ２３１およびＲＫＯ）およびＪｕｒｋａｔ懸濁細胞株が同様にプロットされている（星印を付して特定した）。これらの接着性細胞株は、細胞株の全ＣＣＬＥ集団を反映する、ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ発現の広いダイナミックレンジを表すように選択された。
【０１１４】
また、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイによって決定されたＰＤＬ１タンパク質の発現は、公開データベースＴＣＧＡおよびＣＣＬＥから得られた乳がん、ＮＳＣＬＣおよびＳＣＣＨＮにおけるＰＤＬ１のｍＲＮＡ発現レベルと比較された。ＰＤ−Ｌ１  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイは、上述されるようにＡｓｔｅｒａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得られたＦＦＰＥ乳房、ＮＳＣＬＣおよびＳＣＣＨＮブロックについて実施され、腫瘍面積で正規化されたＰＤ−Ｌ１  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）シグナル（ＲＦ／ｍｍ２）を各がんタイプの各試料についてプロットした。有意なマン−ホイットニーｐ値（ｐ＜０．００１、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６）は、ＮＳＣＬＣまたはＳＣＣＨＮのいずれかと比較して乳房からのＰＤ−Ｌ１タンパク質レベルの差異を示唆した（図２Ｂ、左パネル）。ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）からのＰＤ−Ｌ１タンパク質レベルは、同じがんタイプのＴＣＧＡ（図２Ｂ、中央パネル）またはＣＣＬＥ（図２Ｂ、右パネル）のいずれかから利用可能なｍＲＮＡレベルと比較される。がんタイプ間のＰＤＬ１タンパク質レベルにおいて観察された差異と一致して、ｍＲＮＡレベルはまた同様の差異を実証した。
【０１１５】
（実施例９  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを用いた細胞株におけるＰＤ−１タンパク質レベルの評価）
試験したヒトＰＤ−１を認識するモノクローナル抗体は、表２において上記される。ヤギ抗マウス二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓから購入した。
【０１１６】
ｐＨ６．２およびｐＨ９．０のＨＩＥＲ緩衝液と、５００，０００個または２５，０００個の刺激されたＪｕｒｋａｔ細胞に関する抗ヒトＰＤ−１抗体の選択との比較は図３に示され、対照（二次抗体のみ）と比較される。抗ＰＤ−１抗体１２Ａ７Ｄ７は、試験したすべての条件において非常に強いシグナルを生成し、固定された試料に対する有意な量の非特異的結合を示唆し、抗ＰＤ−１抗体の残りは、２つの細胞の量とＨＩＥＲ緩衝液の間のシグナルにおける様々な量の差を実証した。図４は、図３の結果を、各々のＨＩＥＲ緩衝液について５００，０００細胞／２５，０００細胞の比としてＲＰＡの倍数変化に変形する。ＨＩＥＲ  ｐＨ６．２緩衝液中の抗ＰＤ−１抗体ＮＡＴ１０５、Ｊ１２１およびＥＨ３３は、最大の倍数変化を実証した。これは、ＨＩＥＲ  ｐＨ６．２緩衝液とともに使用した場合、これらの抗体がＰＤ−１に対して最も高い感度を有することを示唆した。
【０１１７】
ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイにおいて抗ＰＤ−１抗体ＮＡＴ１０５（図５Ａ）、ＥＨ３３（図５Ｂ）およびＪ１２１（図５Ｃ）を滴定して、このようにして図３に示される結果を拡大した別の実験を行った。実験は、ＮＡＴ１０５（図５Ａ）、ＥＨ３３（図５Ｂ）およびＪ１２１（図５Ｃ）抗ＰＤ−１抗体の滴定を含んでいるため、図５Ａ〜５Ｃに示される実験結果は、図３に示される実験結果を拡大する。倍数変化の比較を図６Ａに示す。上述されるように、ＨＩＥＲ  ｐＨ６．２緩衝液を５００，０００個および２５，０００個の固定され、刺激されたＪｕｒｋａｔ細胞／スライドに使用し、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイをヤギ抗マウス−Ｐｒｏ１２５抗体を使用して実施した。抗ＰＤ−１抗体ＮＡＴ１０５およびＥＨ３３は、５００，０００個の細胞試料からの抗体滴定を通して同様のＲＰＡを示し、一方、抗体ＮＡＴ１０５およびＪ１２１は２５，０００個の細胞試料から類似したＲＰＡを有した。これはまた、倍数変化を反映し（図６Ａ）、ＮＡＴ１０５が抗体滴定を通して最大の倍数変化を有し、これは、この抗体がＰＤ−１に対する最良の感度を有することを示唆する。
【０１１８】
追加実験を行い、上述した方法を使用して、異なるＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットを使用して、増加した数の刺激されたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＰＤ−１タンパク質レベルを測定した。この実験において、アッセイフォーマットは、マウス抗ヒトＰＤ−１抗体ＮＡＴ１０５（Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ）およびビオチンにコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）と対になったヤギ抗ヒトＰＤ−１抗体ＡＦ１０８６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）にコンジュゲートしたＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子Ｐｒｏ１１の近接距離依存性の光放出を伴った。このアッセイフォーマットの例示的な模式図を図１Ｄに示す。
【０１１９】
図６Ｂは、ＰＨＡで刺激され、固定された漸増量のＪｕｒｋａｔ細胞について、ＰＤ１  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを使用してアッセイしたことを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞の量の増加に伴って、ＰＤ１  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）シグナルが直線的に増加した。対照的に、マウス抗ヒトＰＤ１モノクローナル抗体ＮＡＴ１０５をマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照で置き換えると、刺激されたＪｕｒｋａｔ細胞の量が増加しても、シグナル変化はほとんどなくなり、検出されたシグナルはＰＤ１特異的であり、抗体バックグラウンド結合によるものでは全くないことを示した。
【０１２０】
（実施例１０  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを使用するＰＤ１、ＰＤＬ１およびＰＤ１−ＰＤＬ１複合体の共培養物のアッセイ）
Ｊｕｒｋａｔ懸濁細胞株とのＭＤ−ＭＢ２３１接着性細胞株またはＲＫＯ接着性細胞株の共培養から生成された固定試料を、ＰＤ−Ｌ１（図８Ａ）、ＰＤ−１（図８Ｂ）、およびＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体（図８Ｃ）を検出するためにＶｅｒａＴａｇ（登録商標）を用いて分析した。ＰＤ−Ｌ１  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを、上述されるウサギ抗ヒトＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体Ｅ１Ｌ３Ｎ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびヤギ抗ウサギ二次抗体−Ｐｒｏ１２５  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）コンジュゲートを用いて実施した（ＤＴＴ放出ＰＤＬ−１  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ、図１Ｅの模式図を参照されたい）。ＭＤＡ−ＭＢ２３１−ＪｕｒｋａｔとＲＫＯ−Ｊｕｒｋａｔの固定された共培養物において、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）ＰＤ−Ｌ１シグナルは、培養物中のいずれの細胞株から潜在的に由来する可能性がある。ＭＤＡ−ＭＢ２３１−Ｊｕｒｋａｔ共培養物とＲＫＯ−Ｊｕｒｋａｔ共培養物の間のＰＤ−Ｌ１  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）シグナルはおよそ１６倍の差異があり、以下の表３に示されるように、個々のＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞株およびＲＫＯ細胞株とは異なるｍＲＮＡ発現レベルと一致した。さらに、同様のＰＤ−Ｌ１  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）シグナルがＪｕｒｋａｔ細胞の量の増加とともに見られ（共培養条件１×対５×）、追加されたＪｕｒｋａｔが、ＰＤ−Ｌ１  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）シグナル全体に対して最小限にしか寄与せず、それらの低ｍＲＮＡ発現レベルと一致していることを示唆した（表３参照）。まとめると、これらの共培養物からのＰＤ−Ｌ１  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）シグナルの大部分は、ＭＤＡ−ＭＢ２３１接着性細胞株またはＲＫＯ接着性細胞株に由来する可能性がある。
【表３】
2020073911.tif 000004
【０１２１】
図８Ｂは、共培養実験のＰＤ−１  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイの結果を示す。ＭＤＡ−ＭＢ２３１−Ｊｕｒｋａｔ共培養よりも大きなＰＤ−１  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）シグナルが、ＲＫＯ−Ｊｕｒｋａｔ共培養条件の両方において観察された。接着性細胞株とＪｕｒｋａｔ細胞株の両方が、非常に少ない量のＰＤ−１  ｍＲＮＡを発現し（表３参照）、以前の研究は、ＰＤ−１タンパク質発現がＰＨＡを用いた刺激によってＪｕｒｋａｔ細胞に誘導され得ることを示している（Ｖｉｂｈａｋａｒ．  Ｒ．ら、Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３２巻（１号）：２５〜２８頁（１９９７年））。ＲＫＯ−Ｊｕｋａｔ共培養物中のより大きいＰＤ−１  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）シグナルは、共培養後に固定されたＰＤ−１発現Ｊｕｒｋａｔ細胞の量が、接着性細胞株のＰＤ−Ｌ１発現レベルに比例するという考えと一致する。図８Ｂはまた、ＭＤＡ−ＭＢ２３１−Ｊｕｒｋａｔ共培養物とＲＫＯ−Ｊｕｒｋａｔ共培養物の両方における漸増量のＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞（共培養条件１×および５×Ｊｕｒｋａｔ）とともにＰＤ−１  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）シグナルの増加を示す。これは、共培養後に固定されたＰＤ−１発現Ｊｕｒｋａｔ細胞の量がまた、ＰＤ−１の量を反映することを示唆する。
【０１２２】
図８Ｃは、共培養実験のＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイの結果を示す。ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイは、図１Ｉに模式的に示されように、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子Ｐｒｏ１１の近接距離依存性の光放出を採用する。図８ＣにおけるＪｕｒｋａｔ細胞と共培養したＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＲＫＯ細胞株のＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ結果は、図８ＢにおけるＰＤ−１  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ結果に追随している。ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイによって測定されたＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１タンパク質複合体の量は、ＰＤ−Ｌ１発現（ＲＫＯ−Ｊｕｒｋａｔ共培養）の増加とともに増加し、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量は、ＰＤ−１発現（条件１×対５×）の増加とともに増加した。この固定された共培養モデル系の可能性のある限界は、Ｊｕｒｋａｔ細胞が接着性細胞と相互作用して、それらが最終的な固定調製物中に存在するための要件である。ＦＦＰＥ乳房、ＮＳＣＬＣおよびＳＣＣＨＮ腫瘍試料の調査は、これらの３つのＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１およびＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１複合体）間の関係のより完全な理解を提供することが予測される。
【０１２３】
異なるＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマット（図１Ｈに模式的に示す）を用いて、ＰＤ１−ＰＤ−Ｌ１複合体を測定するために追加の実験を行った。図８Ｄに示すように、Ｊｕｒｋａｔ細胞と共培養したＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＢＴ２０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＲＫＯ細胞株におけるＰＤ１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量は、ＣＣＬＥ由来のＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡに追随している。ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイによって測定されたＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１タンパク質複合体の量は、ＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡ発現が増加するにつれて増加した。対照的に、ウサギ抗ヒトＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体Ｅ１Ｌ３ＮをウサギＩｇＧアイソタイプ対照抗体で置き換えることにより、ＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡの量が増加しても、最小のＰＤ１−ＰＤ−Ｌ１複合体ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）シグナル変化しかもたらさなかった（灰色の四角、アイソタイプ対照）。上記したように、この固定された共培養モデル系の可能性のある限界は、Ｊｕｒｋａｔ細胞が最終的な固定調製物中に存在するために、それらが接着性細胞と相互作用するための要件である。この研究に使用される接着性細胞株はＰＤ−Ｌ１発現の量が増加しているため、本発明者らは、ＰＤ１−ＰＤ−Ｌ１複合体の量が増加するものと予想した。
【０１２４】
（実施例１１  ヒト乳がん腫瘍におけるＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体の検出および定量化）
ＰＤ１およびＰＤ１−ＰＤＬ１複合体の量は、１２種のヒト乳がん腫瘍（Ａｓｔｅｒａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）におけるＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイによって測定された。試料は、隣接するＨ＆Ｅ染色スライドの病理学的検査によるＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイの前に、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の存在について予め選択された。さらに、選択されたセットの試料は、マウス抗ヒトＰＤ１モノクローナル抗体ＮＡＴ１０５およびウサギ抗ヒトＰＤＬ１モノクローナル抗体Ｅ１Ｌ３Ｎを使用して、ＰＤ１について免疫組織化学染色に供された。これにより、それぞれＰＤ１およびＰＤＬ１のＴＩＬ上の腫瘍細胞膜発現が確認された（データを示せず）。使用されたＰＤ１  ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットは、図１Ｄに示され、図６Ｂに関しては上述されるように、近接距離ベースの光放出アッセイであった。使用されたＰＤ１−ＰＤＬ１複合体ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットは、図１Ｈに模式的に示され、図８Ｄに関しては上述されるように、近接距離ベースの光放出アッセイであった。ＰＤ１−ＰＤＬ１複合体ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイについて、バックグラウンドシグナルは、図８Ｄに関して上述されるように、アイソタイプ対照アッセイフォーマットを用いて、並行して評価された。
【０１２５】
ＰＤ−１タンパク質発現量を図９Ａに示す。検出されたＰＤ１−ＰＤＬ１複合体の量を図９Ｂに示す（黒色のバー）。アイソタイプ対照アッセイ結果（灰色のバー）については、２の最小アッセイシグナル対バックグラウンド比が許容可能であると考えられ、すべての試料が合格した。アッセイシグナルが増加するにつれて、アッセイシグナル対バックグラウンド比が増加するという一般的傾向があった。
【０１２６】
図１０Ａ〜１０Ｃは、乳がん試料からの、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを使用して検出されたＰＤ１、ＰＤＬ１およびＰＤ１−ＰＤＬ１複合体の量の間のすべてのペアワイズ比較を示す。各比較のピアソン相関係数（Ｒ２）およびｐ値は、グラフの右側に示されている。プロットされたデータは、図９Ａ（ＰＤ−１）、図９Ｂ（ＰＤ１−ＰＤＬ１複合体）、および図２Ｂの左パネル（ＰＤ−Ｌ１；１２個の乳がん試料のうち８個）からのものであった。ＰＤ１とＰＤ１：ＰＤ−Ｌ１複合体の間に最も強い相関（ピアソンＲ２＝０．７６３８）が観察され、これは、ＰＤ−Ｌ１ではなくＰＤ１が複合体形成の主要な駆動因子であり得ることを示唆した。
【０１２７】
本開示において検討した全ての特許、特許公開公報、特許出願、雑誌論文、書籍、技術的参考文献などは、すべての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２８】
本発明の明確な理解に関連する要素を説明するために、本発明の図面および説明は簡略化されていることを理解されたい。図は説明の目的で提示されており、構成図面として提示されていないことを認識されたい。省略された詳細および変更または代替の実施形態は、当業者の知識の範囲内である。
【０１２９】
本発明のある特定の態様では、要素もしくは構造を提供し、または所定の機能もしくは複数の機能を実施するために、単一の基本要素を複数の基本要素に置き換えることができ、複数の基本要素を単一の基本要素に置き換えることができることを認識し得る。このような置換が本発明のある特定の実施形態を行うために有効でない場合を除いて、このような置換は本発明の範囲内にあると考えられる。
【０１３０】
本明細書に提示されている実施例は、本発明の潜在的および具体的な実施を説明することを意図している。実施例は、主に、当業者に対して本発明の説明を目的として意図されることを認識し得る。本発明の精神から逸脱することなく、これらの略図または本明細書に記載されている操作に変更があってもよい。例えば、ある特定の場合において、方法のステップまたは操作を異なる順序で実行もしくは遂行してもよく、または操作を追加、削除または修飾してもよい。
【０１３１】
図面に記述されているまたは上述されている基本要素の様々な配置、ならびに示されておらずまたは記載されていない基本要素およびステップが可能である。同様に、いくつかの特徴およびサブコンビネーションは有用であり、他の特徴およびサブコンビネーションを参照することなく採用され得る。本発明の実施形態は、例示的であって限定的な目的で記載されておらず、代替の実施形態は、本特許の読者に明らかになる。したがって、本発明は、上述されているまたは図面に記述されている実施形態に限定されず、以下の特許請求の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態および修正を行うことができる。
【図１−１】
2020073911.tif 000005
【図１−２】
2020073911.tif 000006
【図１−３】
2020073911.tif 000007
【図１−４】
2020073911.tif 000008
【図２Ａ】
2020073911.tif 000009
【図２Ｂ】
2020073911.tif 000010
【図３】
2020073911.tif 000011
【図４】
2020073911.tif 000012
【図５】
2020073911.tif 000013
【図６】
2020073911.tif 000014
【図７】
2020073911.tif 000015
【図８】
2020073911.tif 000016
【図９】
2020073911.tif 000017
【図１０】
2020073911.tif 000018
【外国語明細書】
2020073911000001.pdf