(57)【要約】【課題】本発明は、蛍光シグナルの判定精度を向上させた組織染色用染色剤およびこれを含む組織染色用キットを提供することを課題とする。【解決手段】熱硬化性樹脂の樹脂粒子および該樹脂粒子に固定された蛍光色素からなる色素樹脂粒子を染色成分として含有する組織染色用染色剤であって、前記樹脂粒子が前記蛍光色素と逆の電荷の置換基を有して前記蛍光色素とイオン結合、または、共有結合しており、前記色素樹脂粒子の粒径の変動係数が１５％以下とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
共有結合を形成可能な反応基を２つ以上有する蛍光色素が、熱硬化性樹脂の樹脂粒子に固定されてなる組織染色用樹脂粒子であって、
前記色素樹脂粒子の粒径の変動係数が１５％以下である、組織染色用樹脂粒子。
【請求項２】
前記熱硬化性樹脂の樹脂粒子が、アミノ基またはフェノール性水酸基を有するものである、請求項１に記載の組織染色用樹脂粒子。
【請求項３】
前記熱硬化性樹脂の樹脂粒子が、メラミン、尿素、グアナミン、フェノール、およびこれらの誘導体からなる群から選択された少なくとも１つのモノマーから形成される構成単位を含む、請求項１または２に記載の組織染色用樹脂粒子。
【請求項４】
前記共有結合を形成可能な反応基が、スルホ基又はＮＨＳ（N-Hydroxysuccinimide）エステル基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組織染色用樹脂粒子。
【請求項５】
前記蛍光色素が、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、スクアリリウムまたは芳香族炭化水素系色素分子である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組織染色用樹脂粒子。
【請求項６】
前記熱硬化性の樹脂粒子がメラミンを用いて形成され、前記蛍光色素がローダミンまたは芳香族炭化水素系色素分子である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組織染色用樹脂粒子。
【請求項７】
前記共有結合が、アミド結合、エステル結合、エーテル結合およびＣ−Ｎ結合のいずれかである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組織染色用樹脂粒子。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組織染色用樹脂粒子を含有する組織染色用染色剤であって、
前記組織染色用樹脂粒子が抗体と直接結合しているか、
前記組織染色用樹脂粒子がリンカーと結合しているか、
前記組織染色用樹脂粒子がリンカーと結合しており、さらに前記組織染色用樹脂粒子と抗体とが前記リンカーを介して結合していることを特徴とする、組織染色用染色剤。
【請求項９】
請求項８に記載の組織染色用染色剤を構成品として含む、組織染色用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織染色用染色剤、組織染色用染色剤の製造方法および組織染色用染色剤を含む組織染色用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
医学的診断の１つとして、病理診断が行なわれている。病理診断では、病理医は人体から採取した組織片から病気を診断し、治療や手術の要否を臨床医に伝える。患者の状態と病理診断によって、内科系医師は薬物治療方針を決定し、外科系医師は手術を行うか否かを決定する。
【０００３】
病理診断では、臓器摘出や針生検によって得た組織検体を厚さ数ミクロン程度に薄切して組織標本を作成し、様々な所見を得るために光学顕微鏡を用いて拡大観察することが広く行われている。多くの場合、組織標本は、採取した組織を固定するために脱水し、パラフィンブロック化した後、数μｍの厚さに薄切りし、パラフィンを取り除いて作製される。
【０００４】
病理診断では、免疫染色と呼ばれる、組織標本に含まれる検出対象の抗原や遺伝子の発現を確認するための染色を行なった後、遺伝子やタンパクの発現異常といった機能異常を診断する免疫観察が行なわれている。
【０００５】
免疫染色には、例えば、酵素を用いた色素染色法（ＤＡＢ染色等）が用いられる（特許文献１）。ＤＡＢ染色は、ペルオキシダーゼで修飾された抗体を用いて観察対象となる抗原を当該発色により染色し、ペルオキシダーゼの基質であるジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を添加して発色させ、これを観察することで抗原量を測るものである。
【０００６】
しかしながら、ＤＡＢ染色のような酵素による染色は、染色濃度が温度・時間などの環境条件により大きく左右されるため、染色濃度から実際の抗原等の量を見積もることが難しいという課題がある。
【０００７】
そのため、病理診断における免疫観察では、酵素標識による染色の代わりに、蛍光標識体を用いる蛍光標識法が行われている。この方法はＤＡＢ染色と比べて定量性に優れるという特徴がある（非特許文献１）。蛍光色素が修飾された抗体を用いて対象となる抗原を染色して観察することで抗原量を測るものである。
【０００８】
なお、組織標本は、殆ど光を吸収および散乱せず、無色透明に近いため、観察に先立って、形態観察のために色素による染色を施されることがある。染色手法としては種々のものが提案されている。特に組織標本に関しては、形態を観察するための形態観察染色として、ヘマトキシリンおよびエオジンの２つの色素を用いるヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）が標準的に用いられている（非特許文献１）。
【０００９】
ヘマトキシリン染色により細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色〜淡青色に染色され、エオジン染色により細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤〜濃赤色に染色される。
【００１０】
病理医は、染色された組織標本の顕微鏡画像の中で、細胞の核の大きさや形の変化、組織としてのパターンの変化などの形態学的な情報および染色情報をもとに診断を行っている。なお、この他の形態観察染色としては、例えば、細胞診断に用いられるパパニコロウ染色（Ｐａｐ染色）等がある。一つの切片に対して形態染色と免疫染色の両方を行なうことにより、標本の形態観察と免疫観察を同時に行うこともできる。
【００１１】
組織標本の作製において、染色後の病理切片を封入するための封入剤としては、水系封入剤および油系封入剤が知られている。水系封入剤は一般に標本との屈折率差が大きいため、組織標本を透明にしにくいという課題がある。一方、油系封入剤は、組織標本との屈折率差が小さく、組織標本を透明にすることができる上に、形態染色の色味や発色が良いため、永久標本用として用いられている。このため、油系封入剤が組織標本作成に好適に用いられる。
【００１２】
蛍光標識法で用いられる組織染色用染色剤として、蛍光物質が固定され蛍光色素標識法に用いられる樹脂粒子（以下、色素樹脂粒子という。）を含むものが知られている。この染色剤を用いて組織標本である切片を免疫染色および蛍光顕微鏡による観察をして抗原の定量を行う場合、色素樹脂粒子の吸着量は色素樹脂粒子由来の輝点数により評価することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２０１０−１３４１９５号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Robbins Basic Pathology: With STUDENT CONSULT Online Acess, 9e (Robbins Pathology) Saunders, (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
色素樹脂粒子由来の輝点数を評価する際に、輝点強度にバラツキが生じると、蛍光シグナルの判定精度が悪化する。本発明者らは、輝点のバラツキの原因について鋭意検討した結果、色素樹脂粒子の粒子径のバラツキが蛍光シグナルの判定精度を悪化させることを見出した。
【００１６】
具体的には、色素樹脂粒子の粒子径の大小により色素樹脂粒子の輝度が変化するため、例えば設定した蛍光シグナル検出閾値未満の輝度の粒子径となる色素樹脂粒子が存在する場合、本来検出すべき蛍光シグナルが検出されない問題が発生する。
【００１７】
逆に、設定した蛍光シグナル検出閾値をはるかに超える輝度となる粒子径となる色素樹脂粒子が存在する場合、サチレーションにより輝点同士が融合して個々の輝点の判別がつかなくなる問題が発生する。
【００１８】
また、永久切片を作成する際に（図２参照）、切片の水分をエタノール・キシレンで置換する透徹を行うため、透徹によっても蛍光色素の溶出の問題が発生する。例えば、蛍光色素を内包する電荷を有しないポリスチレン粒子を色素樹脂粒子として含む染色剤を用いて染色した切片を透徹すると、蛍光色素が滲み出て、輝点の観察が困難となって蛍光シグナルの判定精度が悪化する問題が存在する。特に、化学構造中にベンゼン環を含む蛍光色素の場合、永久切片の作成に使用される油系封入剤に蛍光色素が滲み出やすいため、蛍光シグナルの判定精度を悪化させる問題がある。
【００１９】
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであって、蛍光シグナルの判定精度を向上させた組織染色用染色剤、及び該組織染色用染色剤の製造方法およびこれを含む組織染色用キットの提供をすることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
すなわち、上述した目的のうち、少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した組織染色用染色剤は、熱硬化性樹脂の樹脂粒子および該樹脂粒子に固定された蛍光色素を有する色素樹脂粒子を染色成分として含有する組織染色用染色剤であって、前記樹脂粒子が前記蛍光色素と逆の電荷の置換基を有して前記蛍光色素とイオン結合、または、共有結合しており、前記色素樹脂粒子の粒径の変動係数が１５％以下である。
【００２１】
また、本発明の一側面を反映した組織染色用染色剤の製造方法は、前記樹脂粒子を合成反応により製造する際の反応系に界面活性剤を添加することにより前記色素樹脂粒子の変動係数を１５％以下とする工程を含む。
【００２２】
また、本発明の一側面を反映した組織染色用キットは、上記のいずれかの組織染色用染色剤を構成品として含む。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、色素樹脂粒子の粒径の変動係数が１５％以下であることにより、上記輝点のバラツキの問題が解消される。また、蛍光色素と熱可塑性樹脂とがイオン結合または共有結合をすることで蛍光観察時の蛍光色素の滲みが防止される。これらの結果、蛍光シグナルの判定精度が改善された組織染色用染色剤、該組織染色用染色剤の製造方法および組織染色用染色剤を含む組織染色用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明に係る色素樹脂粒子を含む組織染色用染色剤により、組織標本の切片を免疫染色した状態を示す模式図であり、色素樹脂粒子の樹脂粒子と色素との結合状態を説明する図である。
【図２】図２は、染色、透徹および封入を行って、図１の切片を作製する流れを示す図である。
【図３】図３（Ａ）は、従来の組織染色用染色剤を用いて、組織標本の切片の細胞を免疫染色して蛍光観察をした状態を示す模式図である。図３（Ｂ）は、本発明に係る組織染色用染色剤を用いて、組織標本の切片の細胞を免疫染色して蛍光観察をした状態を示す模式図である。
【図４】図４（Ａ）は、比較例に係る色素樹脂粒子で標識した２次抗体で染色した写真である。図４（Ｂ）は、実施例に係る色素樹脂粒子で標識した２次抗体で染色した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明に係る組織染色用染色剤、組織染色用染色剤の製造方法および組織染色用染色剤を含む組織染色用キットについて、図１〜図４を参照しながら説明する。
【００２６】
本発明に係る組織染色用染色剤は、熱硬化性樹脂の樹脂粒子および該樹脂粒子に固定された蛍光色素を有する色素樹脂粒子を染色成分として含有する組織染色用染色剤であって、前記色素樹脂粒子の粒径の変動係数が１５％以下である。
【００２７】
前記組織染色用染色剤において、前記蛍光色素が前記樹脂粒子に内包されていてもよい。また、前記イオン結合に寄与している置換基が、前記蛍光色素はマイナス電荷の置換基であり、前記樹脂粒子はプラス電荷の置換基であってもよい。
【００２８】
さらに、前記蛍光色素全体の電荷および前記樹脂粒子全体の電荷が、前記イオン結合に寄与している置換基の電荷と同一の電荷であってもよい。また、前記蛍光色素は、蛍光色素１分子の分子量／電荷を有する置換基数＜４００であってもよい。
【００２９】
また、前記蛍光色素は、蛍光色素１分子あたりにマイナス電荷の置換基を少なくとも２つ有していてもよい。また、前記プラス電荷の置換基がアミノ基であり、前記マイナス電荷の置換基がスルホ基またはカルボキシル基であってもよい。
【００３０】
前記蛍光色素のマイナス電荷の置換基の少なくとも１つがスルホ基であってもよい。また、前記蛍光色素が、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、スクアリリウムまたは芳香族炭化水素系色素分子であってもよい。
【００３１】
前記樹脂粒子がメラミンを用いて形成され、前記蛍光色素がローダミンまたは芳香族炭化水素系色素分子であってもよい。また、前記樹脂粒子と前記蛍光色素とが、アミド結合、エステル結合、エーテル結合およびＣ−Ｎ結合のいずれかによって共有結合していてもよい。
【００３２】
前記熱硬化性樹脂が、メラミン、尿素、グアナミン、フェノールおよびキシレンからなる群から選択された少なくとも１つのモノマーから形成される構成単位を含んでいてもよい。
【００３３】
本発明に係る組織染色用染色剤の製造方法は、前記樹脂粒子を合成反応により製造する際の反応系に界面活性剤を添加することにより前記色素樹脂粒子の変動係数を１５％以下とする工程を含む。
【００３４】
本発明に係る組織染色用キットは、上述したいずれかの組織染色用染色剤を構成品として含む。
【００３５】
＜色素樹脂粒子＞
この色素樹脂粒子は、図１に示すように、樹脂粒子と蛍光色素とがイオン結合または共有結合したものである。前者の例は、樹脂粒子を構成する樹脂が有するアミノ基に対してプロトンが付加したアンモニウム基と、蛍光色素が有するスルホ基がイオン結合して、色素樹脂粒子を構成しているものである（図１の左側矩形内の破線参照）。一方、後者の例は、樹脂粒子を構成するモノマー由来の部分が有するアミノ基と、蛍光色素が有するスルホ基とが共有結合して、色素樹脂粒子を構成しているものである（図１の右側矩形内の破線参照）。
【００３６】
樹脂粒子と蛍光色素との各結合は、樹脂粒子の内部および／または外表面と色素分子との間で行われる。図１に示す例は、それぞれイオン結合または共有結合により色素を内包および／または外表面に固定している例を示している（表面固定については図示省略）。ここで、樹脂粒子と蛍光色素との結合は、イオン結合と共有結合との双方を含むものであってもよい。
【００３７】
また、樹脂粒子に内包および／または表面固定させる蛍光色素は、樹脂粒子に対して、後述する蛍光色素のいずれか一種を単独で固定しても、複数種を混合して固定させるようにしてもよい。例えば、励起波長と発光波長とにおいて、それぞれ相互に異なる２種以上の蛍光色素を含ませてもよい。
【００３８】
また、樹脂粒子に蛍光色素を固定する方法は、特に限定されるものではない。樹脂粒子の原料であるモノマーやオリゴマーに蛍光色素分子をイオン結合および／または共有結合させて、これを重合することにより色素樹脂粒子を合成する方法、製造した樹脂粒子に対して色素を吸着せて導入する方法等、樹脂粒子への蛍光色素の導入にはいかなる方法を用いても構わない。
【００３９】
色素樹脂粒子の平均粒径は、特に限定されないが、通常１０〜５００ｎｍであり、好ましくは、５０〜２００ｎｍである。
【００４０】
また、色素樹脂粒子を免疫染色に用いる場合、図１に示すように、例えば、樹脂粒子に対してストレプトアビジンまたはビオチン等のリンカーの一方を付加して、２次抗体にリンカーの他方を付加することにより、免疫染色に用いる構成としてもよい。
【００４１】
＜熱硬化性樹脂＞
本発明に係る色素樹脂粒子を構成する熱硬化性樹脂は、蛍光色素を上述したイオン結合および／または共有結合により固定することができる熱硬化性樹脂を含むものであれば、特に限定されない。
【００４２】
蛍光色素とのイオン結合に用いられる熱硬化性樹脂は、その構成単位に含まれる水素の少なくとも一部が電荷を有する置換基に置き換えられているか、その化学構造の一部に電荷を有する部分が存在するものである。一方、蛍光色素との共有結合に用いられる熱硬化性樹脂は、上記電荷を有する置換基の有無に関係なく、化学構造の一部に色素と共有結合可能な部位があり、ここを利用して色素と共有結合していればよい。なお、「電荷を有する置換基または部分」とは、水または酸性または塩基性の水に溶解させたときにプラスまたはマイナスに帯電する置換基または化学構造上の部分を意味する。
【００４３】
上記熱硬化性樹脂としては、メラミン、尿素、グアナミン、フェノール、キシレン、およびこれらの誘導体からなる群から選択された少なくとも１つのモノマーから形成される構成単位を含む熱硬化性樹脂を好適に用いることができる。
【００４４】
このうち、メラミン、尿素およびグアナミンは、プラス電荷の置換基としてアミノ基を構造の一部に有するモノマーである。フェノールは、マイナス電荷の置換基としてフェノール性水酸基を構造の一部に有するモノマーである。キシレンは、電荷を有する置換基や部分のないモノマーであるので、それらが有する水素の一部をプラス電荷またはマイナス電荷の置換基に置換して蛍光色素とのイオン結合に用いることができる。
【００４５】
これらの熱硬化性樹脂は、電荷を有する置換基ないし部位を含むモノマー、または、蛍光色素が有する官能基と共有結合を生じる反応性基を有する熱硬化性樹脂のモノマーを、公知の重合法により重合させることで製造することができる。
【００４６】
メラミンのように、最初から電荷を有する置換基が構造に含まれているものであれば、置換基を導入する必要がなく、好適に用いることができる。
【００４７】
熱硬化性樹脂のモノマーが有するマイナス電荷の置換基としては、スルホ基（−ＳＯ3-）、カルボキシル基（−ＣＯＯ-）等を例示できる。また、熱硬化性樹脂のモノマーが有するプラス電荷の置換基としては、アンモニウム基（−ＮＲ3+）を挙げることができる。ここでＲは水素またはアルキル基である。
【００４８】
熱硬化性樹脂のモノマー等に電荷を有する置換基を導入する方法としては、例えば、カルボキシル基の導入については、フリーデルクラフツ反応により直接導入してもよく、あるいは、カルボキシル基を持ったアルキル化合物とモノマーをハロゲン化物とボロン酸に変換して鈴木カップリング反応によって結合して導入してもよく、あるいは、カルボキシル基を持ったアルキル化合物とモノマーをハロゲン化物に変換してグリニャール反応等のカップリング反応で結合して導入してもよい。
【００４９】
スルホ基の導入については、モノマーを発煙硫酸やクロロ硫酸により直接スルホン化してもよく、あるいはスルホ基を持ったアルキル化合物とモノマーをハロゲン化物とボロン酸に変換して鈴木カップリング反応によって導入してもよく、あるいはスルホ基を持ったアルキル化合物とモノマーをハロゲン化物に変換してグリニャール反応等のカップリング反応で結合して導入してもよい。
【００５０】
アミノ基の導入については、発煙硝酸によるニトロ化とニトロ基の還元反応によってアミノ基に変換してもよく、あるいはモノマーをハロゲン化の形に導きアンモニアとの直接反応やガブリエル反応によってアミノ化してもよく、あるいはアミノ基を持ったアルキル化合物とモノマーをハロゲン化物とボロン酸に変換して鈴木カップリング反応によって結合して導入してもよく、あるいはカルボキシル基を持ったアルキル化合物とモノマーをハロゲン化物に変換してグリニャール反応等のカップリング反応で結合して導入してもよい。
【００５１】
上記反応の際には適宜保護基を導入し、保護されたカルボキシル基やスルホ基、アミノ基としてモノマーに導入後、脱保護を行なって、カルボキシル基やスルホ基、アミノ基としてもよい。
【００５２】
熱硬化性樹脂の分子構造は三次元的な網目構造であり、高分子同士が架橋することによって作られる。このため、熱硬化性樹脂の樹脂粒子に内包された蛍光色素は樹脂粒子の外側に溶出しにくく、蛍光観察の際に輝点の滲みを抑制する効果が得られる。
【００５３】
熱硬化性樹脂は、ホモポリマーに限定されず、コポリマーであってもよい。具体的には、上記のポリメラミン等を構成する複数種のモノマーまたはオリゴマーを組み合わせて共重合させたコポリマーや、これらのモノマーまたはオリゴマーと、それ以外種類のモノマーまたはオリゴマーとを共重合させたコポリマーであってもよい。
【００５４】
＜蛍光色素＞  本発明で用いることが可能な蛍光色素としては、既存のいかなるものを用いても構わない。ただし、熱硬化性樹脂の合成反応の加熱条件下であっても該加熱により悪影響を受けない蛍光色素を用いることが望ましい。蛍光色素は、公知の方法により入手または作製することができる。
【００５５】
樹脂粒子と蛍光色素とをイオン結合させる場合、図１の左側の矩形内に示すように、樹脂材料のモノマーまたはオリゴマーと蛍光色素とは反対の電荷を有していることが好ましい。これにより、樹脂材料を熱硬化させる前の段階で、樹脂材料と色素分子とがイオン結合して会合し、蛍光色素を樹脂粒子に内包させやすくすることができる。
【００５６】
樹脂粒子と蛍光色素とが会合することにより、蛍光色素の分子が樹脂粒子に固定されるので、樹脂粒子からの色素の溶出が起こり難くなる。同じ会合様式で樹脂粒子と色素を固定する場合、会合部位が多い程、色素と樹脂の固定が強くなるので、色素の溶出は起こり難くなる。このため、蛍光色素は、２以上の置換基を有していることが好ましい。
【００５７】
また、蛍光色素が隣接する樹脂と樹脂との置換基の間に入り込んで、両者をつなぐ架橋剤のように機能して、樹脂構成単位同士の結合が強固となり、また、樹脂粒子と蛍光色素との結合も強固となるため、色素と樹脂の会合物の溶出も起こり難くなる。さらに、蛍光色素の分子が安定し蛍光色素の耐熱性がさらに上昇するため、熱硬化により重合反応させて樹脂粒子を形成する際に、蛍光色素が熱による悪影響をより受けにくいものとなり、樹脂粒子から蛍光色素が溶出しにくいものとなる。
【００５８】
樹脂粒子と蛍光色素とを共有結合させる場合も、上述と同様の理由から蛍光色素が２つ以上の反応基を有していることが好ましい。
【００５９】
蛍光色素としては、例えば、ローダミン系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）、スクアリリウム系色素分子、芳香族炭化水素系色素分子等の各系統の色素分子の中から選択することができる。
【００６０】
このうち、芳香環系色素分子（芳香族炭化水素系色素分子）、ローダミン系色素分子などの蛍光色素は、比較的耐光性が高いため好ましく、なかでも芳香環系色素分子に属するペリレン（ｐｅｒｙｌｅｎｅ）やピレン（Ｐｙｒｅｎｅ）、ペリレンジイミド（ｐｅｒｙｌｅｎｅ  ｄｉｉｍｉｄｅ）が好ましい。さらにローダミン系色素やペリレンジイミドは量子収率や吸光等が優れており、発光効率が優れるため、これらを内包した樹脂粒子は、他の色素を内包した樹脂粒子と比べて発光強度が優れる。
【００６１】
ローダミン系色素分子の具体例としては、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン  ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、テキサスレッド、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ、ＬＤ７００ ＰＥＲＣＨＬＯＲＡＴＥ、それらの誘導体などが挙げられる。
【００６２】
ＢＯＤＩＰＹ系色素分子の具体例としては、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、それらの誘導体などが挙げられる。
【００６３】
スクアリリウム系色素分子の具体例としては、ＳＲｆｌｕｏｒ６８０−Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ、１，３−Ｂｉｓ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］−２，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｂｕｔｅｎｅｄｉｙｌｉｕｍ  ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ，  ｂｉｓ、１，３−Ｂｉｓ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ］−２，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｂｕｔｅｎｅｄｉｙｌｉｕｍ  ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ，  ｂｉｓ、２−（４−（Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−４−（４−（ｄｉｅｔｈｙｌｉｍｉｎｉｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａ−２，５−ｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）−３−ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ−１−ｅｎｏｌａｔｅ、２−（４−（Ｄｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−４−（４−（ｄｉｂｕｔｙｌｉｍｉｎｉｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａ−２，５−ｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）−３−ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ−１−ｅｎｏｌａｔｅ、２−（８−Ｈｙｄｒｏｘｙ−１，１，７，７−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−１，２，３，５，６，７−ｈｅｘａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｏ［３，２，１−ｉｊ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ−９−ｙｌ）−４−（８−ｈｙｄｒｏｘｙ−１，１，７，７−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２，３，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−１Ｈ−ｐｙｒｉｄｏ［３，２，１−ｉｊ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ−９（５Ｈ）−ｙｌｉｄｅｎｅ）−３−ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ−１−ｅｎｏｌａｔｅ、それらの誘導体などが挙げられる。
【００６４】
芳香族炭化水素系色素分子の具体例としては、Ｎ, Ｎ−Ｂｉｓ−（２，６−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）−１，６，７，１２−（４−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）−ｐｅｒｙｌｅｎｅ−３，４，９，１０−ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｎａｃｉｄｄｉｉｍｉｄｅ、Ｎ,Ｎ'−Ｂｉｓ（２，６−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）−１，６，７，１２−ｔｅｔｒａｐｈｅｎｏｘｙｐｅｒｙｌｅｎｅ−３，４：９，１０−ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｄｉｉｍｉｄｅ、Ｎ，Ｎ'−Ｂｉｓ（２，６−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｅｒｙｌｅｎｅ−３，４，９，１０−ｂｉｓ（ｄｉｃａｒｂｉｍｉｄｅ）、１６，Ｎ,Ｎ'−Ｂｉｓ（２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｅｒｙｌｅｎｅ−３,４,９,１０−ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃｄｉｉｍｉｄｅ、４，４'−[（８，１６−Ｄｉｈｙｄｒｏ−８,１６−ｄｉｏｘｏｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ−２,１０−ｄｉｙｌ）ｄｉｏｘｙ]ｄｉｂｕｔｙｒｉc ａｃｉｄ、２，１０−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ−８,１６−ｄｉｏｎｅ、２，１０−Ｂｉｓ（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｏｘｙ）ｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ−８,１６−ｄｉｏｎｅ, ３，３'−[（８，１６−Ｄｉｈｙｄｒｏ−８,１６−ｄｉｏｘｏｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎ−２,１０−ｄｉｙｌ）ｄｉｏｘｙ]ｄｉｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ、１７−ＢＩＳ（Ｏｃｔｙｌｏｘｙ）Ａｎｔｈｒａ［９，１，２−ｃｄｅ−］Ｂｅｎｚｏ［ＲＳＴ］Ｐｅｎｔａｐｈｅｎｅ−５−１０−Ｄｉｏｎｅ、Ｏｃｔａｄｅｃａｎｏｉｃａｃｉｄ, ５，１０−ｄｉｈｙｄｒｏ−５,１０−ｄｉｏｘｏａｎｔｈｒａ[９，１，２−ｃｄｅ]ｂｅｎｚｏ[ｒｓｔ]ｐｅｎｔａｐｈｅｎｅ−１６,１７−ｄｉｙｌｅｓｔｅｒ、Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｄｉｂｅｎｚａｎｔｈｒｏｎｅ、Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ, ４，４'，４''，４'''−[[２，９−ｂｉｓ[２，６−ｂｉｓ(１−ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ)ｐｈｅｎｙｌ]−１,２,３,８,９,１０−ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−１,３,８,１０−ｔｅｔｒａｏｘｏａｎｔｈｒａ[２，１，９−ｄｅｆ：６，５，１０−ｄ'ｅ'ｆ']ｄｉｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−５，６，１２，１３−ｔｅｔｒａｙｌ]ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｏｘｙ）]ｔｅｔｒａｋｉｓ-，Ｂｅｎｚｅｎｅｅｔｈａｎａｍｉｎｉｕｍ、４，４'，４''，４'''−［［２，９−ｂｉｓ［２，６−ｂｉｓ（１−ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−１,２,３,８,９,１０−ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−１,３,８,１０−ｔｅｔｒａｏｘｏａｎｔｈｒａ[２，１，９−ｄｅｆ：６，５，１０−ｄ'ｅ'ｆ']ｄｉｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−５，６，１２，１３−ｔｅｔｒａｙｌ]ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｏｘｙ）]ｔｅｔｒａｋｉｓ[Ｎ,Ｎ,Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−］、それらの誘導体などが挙げられる。
【００６５】
＜色素樹脂粒子の製造方法＞
本発明に係る変動係数１５％以下、好ましくは１５％未満の色素樹脂粒子は、例えば以下の各工程に沿って製造され、１種または２種以上のモノマーまたはオリゴマーを熱硬化させて色素樹脂粒子を製造する際に、界面活性剤が所定量存在した状態で重合反応を行うことにより製造することができる。樹脂原料に対し、１０〜６０重量％の範囲で乳化作用を有する界面活性剤を加える事で、任意の粒子径を得る事ができ、例えば、３０〜３００ｎｍの粒子を作製できる。また、界面活性剤の割合を増やすと更に小さい粒子も作製可能で３０ｎｍ以下とすることができる。あるいは、界面活性剤の割合を減らすと更に大きい粒子も作製可能で３００ｎｍ以上の粒子も作製可能である。また、粒子作製時の界面活性剤は０．１から３．０重量％で任意に変更できる。好ましくは０．２５から１．０重量％である。これら界面活性剤の割合と添加量は一例であり、任意の範囲で変更できる。
【００６６】
（１）混合工程  混合工程は、上記蛍光色素と、界面活性剤と、プロトン供給剤と、樹脂粒子を構成するモノマーまたはオリゴマーの１種または２種以上等とを混合する工程である。
【００６７】
（界面活性剤）
本発明者らは、製造される色素樹脂粒子の粒径の変動係数が、界面活性剤とモノマー（樹脂構成単位としてのモノマー）とのモル比や、界面活性剤の種類により変化することを見出している。このため、色素樹脂粒子の変動係数が１５％以下となるように、界面活性剤の種類やモノマーとのモル比を調節して樹脂を重合させる必要がある。
【００６８】
界面活性剤の種類としては、アニオン系、ノニオン系およびカチオン系の全ての界面活性剤を用いることができる。このうち、樹脂粒子の粒径の変動係数に与える界面活性剤の電荷の影響の大きさは、カチオン系の樹脂モノマーに対しては、ノニオン系＞アニオン系＞カチオン系の関係となるため、アニオン系、ノニオン系の界面活性剤を用いることが好ましい。逆に、アニオン系の樹脂モノマーに対する界面活性剤の電荷の影響の大きさは、ノニオン系＞カチオン系＞アニオン系の関係となるため、カチオン系、ノニオン系の界面活性剤を用いることが好ましい。
【００６９】
界面活性剤としては、以下のものを用いることができるがこれらに限定されない。アニオン系の界面活性剤としては、例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。ノニオン系の界面活性剤としては、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンアルキルエーテル等が挙げられる。カチオン系の界面活性剤としては、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド等を挙げることができる。
【００７０】
また、重合反応系におけるモノマーと界面活性剤との重量比は、モノマー：界面活性剤＝１０：１〜１０：６となるように設定することが好ましい。実施例に示すように、モノマー単位：界面活性剤（モル比）が、１００：１．５〜１００：３．５程度となるように設定することが、より好ましい。
【００７１】
界面活性剤としては、例えば、エマルゲンやネオペレックス（登録商標、花王社製）を好適に用いることができる。なお、エマルゲンの有効成分はポリオキシエチレンアルキルエーテルであり、ネオペレックスの有効成分はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムである。界面活性剤により、外側が水相で内側が油相のミセルが形成され、ミセル内側の油相に上記樹脂を構成するモノマーが包含された状態となり、このミセル内側で重合反応が行われることとなる。
【００７２】
ミセル内側の油相で重合反応が進み油相内のモノマーが枯渇してくると、水相に分散しているモノマーが油相に移動するようになるが、この際に水と油の界面に位置する界面活性剤が、水相からのモノマー流入量を調節する役割を果たし、製造される樹脂粒子の粒径が揃うと考えられる。
【００７３】
ミセル内側の油相とミセル外側の水相との界面に位置する界面活性剤の電荷が、水相から油相へ供給されるモノマーの電荷と反対の場合には、水相のモノマーが界面活性剤に電気的に引き付けられて、ミセル内側の油相へ供給されやすくなる。そのため、カチオン系のモノマーを用いる場合、使用する界面活性剤は、アニオン系、ノニオン系のものを好適に用いることができる。
【００７４】
また、使用する乳化重合用乳化剤は、重合工程で行う熱硬化反応温度より曇点が高いものを選択する必要がある。熱硬化反応温度より曇点が低いものを選択すると、界面活性剤が水との水和力を失って、その機能を果たさなくなり、樹脂粒子ができずに、樹脂の塊状物となってしまうからである。
【００７５】
（プロトン供給剤）
熱硬化性樹脂と蛍光色素とをイオン結合させる場合、プラス電荷となる熱硬化性樹脂の置換基や蛍光色素の置換基にＨ+を積極的に供給してプラス電荷とするプロトン供給剤を用いる事もできる。例えば、ギ酸や酢酸、パラトルエンスルホン酸等、これらに類するものが挙げられる。色素に付いている置換基がカルボン酸やスルホン酸等の酸の場合、これがプロトン供給剤として機能する事もできる。逆に熱硬化樹脂のマイナス電荷となる置換基や蛍光色素の置換基からＨ+を積極的に抜き取るプロトン受容剤を用いる事もできる。例えば、水酸化ナトリウム等の塩基の場合、これがプロトン受容剤として機能する。
【００７６】
（重合反応促進剤）
熱硬化性樹脂の反応促進剤として、例えば酸を用いる事ができる。メラミン樹脂や尿素樹脂、キシレン樹脂、フェノール樹脂は、いずれも酸触媒により反応が促進される事が知られている。酸としては、例えば、ギ酸、酢酸、硫酸、塩酸、硝酸、パラトルエンスルホン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸、等が知られている。熱硬化性樹脂の反応は加温のみでも進行するが、反応促進剤を加えるとより低温で進行するので、反応や性能を制御できる範囲で添加することができる。
【００７７】
（２）重合工程
重合工程は、モノマーまたはオリゴマーを熱硬化、即ち重合させて色素樹脂粒子を形成する工程である。重合工程の反応条件（熱硬化温度、重合時間）は、重合させるモノマーまたはオリゴマーの組成から決定され、公知の方法に即して行うことができる。ここで、蛍光色素の性能が低下しない反応条件（蛍光色素の耐熱温度範囲内）とする必要がある。
【００７８】
例えば、熱硬化性樹脂にメラミン樹脂を選択する場合、メラミン樹脂の生成反応は７０℃〜２００℃で行われる。好ましくは１５０〜２００℃加熱である。蛍光色素の耐熱温度は、ローダミン系色素分子２００℃、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）２００℃、スクアリリウム系色素分子２００℃、芳香族炭化水素系色素分子３００℃以上であり、生成反応に耐えうる蛍光色素を用いる必要がある。
【００７９】
重合工程により、内包されている蛍光色素が色素樹脂粒子から溶出しにくいものとなる。万が一、重合反応が不十分で色素樹脂粒子からの蛍光色素の滲みの問題が生じる場合には、製造した色素樹脂粒子を、用いた樹脂の分解温度や溶融温度以下の温度の色素と樹脂粒子に悪影響が出ない範囲でさらに加熱処理にて熱硬化、つまり架橋を促進させて、蛍光色素の滲みを抑制させる処理を行ってもよい。
【００８０】
（３）洗浄工程
洗浄工程は、得られた色素樹脂粒子の分散液から、余剰の樹脂原料や蛍光色素、乳化剤等の不純物を除く工程である。例えば、反応液から樹脂成分を遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再度分散させることで洗浄を行う。遠心分離、上澄み除去、超純水への再分散の一連の洗浄操作は、上澄みに樹脂や色素に由来する吸光・蛍光が見られなくなるまで、複数回繰り返し行うことが好ましい。
【００８１】
（４）付加工程
付加工程は、色素樹脂粒子に免疫染色用のリンカー等を付加する工程である。色素樹脂粒子に付加するリンカーの種類は、ストレプトアビジン−ビオチン等のリンカーを用いることができるが、これに限定されない。
【００８２】
例示したストレプトアビジン−ビオチンのリンカーの付加は、例えば、以下のように行われる。まず、ストレプトアビジンに対してチオール基導入試薬によりチオール基を付加する一方で、色素樹脂粒子の表面に対してアミノ基導入試薬によりアミノ基を導入した後、アミノ基と反応する活性エステルとチオール基と反応するマレイミド基を両端に有するＰＥＧ等のリンカーを用いて、色素樹脂粒子とストレプトアビジンとをリンクさせる方法である。
【００８３】
アミノ基導入試薬としては、アミノプロピルトリメトキシシラン等が挙げられる。チオール基導入試薬としては、Ｎ−スクシミジルＳアセチルチオ酢酸が挙げられ、該試薬と上記の付加自体は公知の方法で行うことができる。
【００８４】
＜製造した色素樹脂粒子の確認＞
（樹脂粒子の粒径と変動係数）
色素樹脂粒子の粒径は、製造した色素樹脂粒子を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し、色素樹脂粒子の断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径（面積円相当径）として測定することができる。色素樹脂粒子の集団の粒子径の平均（平均粒径）および変動係数は、十分な数（たとえば３００個）の色素樹脂粒子について、上記のように粒子径を測定した後、平均粒径はその算術平均として算出され、変動係数は式：１００×粒径の標準偏差／平均粒径により算出される。
【００８５】
［組織染色］
組織染色の方法としては、上記色素樹脂粒子を免疫染色用の蛍光標識体として検出対象の生体物質を染色する蛍光染色法が用いられる。たとえば、特定の抗原に対して免疫染色を行う際には、上記リンカーを介して色素樹脂粒子と１次抗体を直接結合した蛍光標識体（コンジュゲート）を作製し、抗原を染色する方法（１次抗体法）、色素樹脂粒子と２次抗体とを直接結合した蛍光標識体を作製し、抗原に１次抗体を結合したものを染色する方法（２次抗体法）、図１を参照して上述したように、色素樹脂粒子とビオチンを直接結合した蛍光標識体を作製し、抗原に１次抗体、及び、アビジンあるいはストレプトアビジン修飾した２次抗体を結合したものを用いて染色する方法、同様に色素樹脂粒子にアビジンあるいはストレプトアビジンを直接結合した蛍光標識体を作製し、抗原に1次抗体、及び、ビオチン修飾した２次抗体を結合したものを用いて染色する方法（ビオチン−アビジン法またはサンドイッチ法）、等を用いることができる。
【００８６】
免疫染色に用いる１次抗体はいかなるものでも構わず、免疫染色を行いたい対象によって変わる。例えばＨＥＲ２を抗原とする免疫染色を行う場合には、抗ＨＥＲ２抗体を用いる。また、２次抗体はいかなるものを用いても構わず、１次抗体によって変わる。例えば、抗マウス、抗ラビット、抗牛、抗ヤギ、抗羊、抗イヌ、および、抗チキン抗体が挙げられる。
【００８７】
色素樹脂粒子と抗体やビオチンとの結合は既存のいかなる方法を用いても構わない。例えば、アミンとカルボン酸の反応におけるアミド化、マレイミドとチオールの反応によるスルフィド化、アルデヒドとアミンの反応によるイミン化、および、エポキシとアミンの反応によるアミノ化等を用いることができる。
【００８８】
なお、上記の免疫染色は、組織染色に限定されるものではなく、細胞染色に適用することも可能である。また、検出対象とする生体物質は、それと特異的に結合する物質が存在するものであれば限定されるものではない。典型的には、上記のように抗原および抗体の組み合わせが用いられるが、たとえば核酸分子（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）およびそれにハイブリダイズしうる配列の核酸分子の組み合わせを用いることも可能である。
【００８９】
［蛍光観察］
上記工程により組織染色が施された病理切片に用いられている色素樹脂粒子の蛍光色素に応じた適切な波長を有する励起光を照射することで、蛍光色素が発する蛍光を観察する。このような工程により、その病理切片に存在する所定の生体分子を検出することができ、抗体医薬（たとえばＨＥＲ２を標識とするハ―セプチン）の適用の要否を判断するための情報として利用することができる。励起光の照射には、一般的な蛍光観察と同様の照射手段を用いればよく、例えば、蛍光顕微鏡が備えるレーザ光源から、必要に応じて所定の波長を選択すればよい。
【００９０】
蛍光の観察は、蛍光顕微鏡の鏡筒から行ってもよいし、蛍光顕微鏡に設置されたカメラが撮影した画像を別途表示手段（モニタ等）に表示して行ってもよい。蛍光色素によるが、蛍光顕微鏡の鏡筒から目視によっては十分に蛍光を観察することができない場合があっても、カメラによる画像の撮影を通じて蛍光を観察することが可能な場合もある。必要に応じて所定の波長を選択的に通過させるフィルターを用いてもよい。
【００９１】
ここで、免疫染色部の輝度は、免疫染色用の蛍光標識体によって染色された部位の輝度の平均値として取得される値である。また、免疫染色部の輝点とは、図３に示すように、免疫染色用の蛍光標識体によって染色された部位で輝く点を意味する（図３（Ａ）および（Ｂ）参照）。
【００９２】
＜組織染色用キット＞
本発明に係る組織染色用キットは、上述した組織染色用染色剤を構成品として含む。他の構成品は免疫染色に関する抗体等の試薬等を含んでいてよい。
【００９３】
以下、本発明に係る組織染色用染色剤、組織染色用染色剤の製造方法および組織染色用キットによる作用・効果について、図１〜図４を参照しながら説明する。
(1)色素樹脂粒子の粒径の変動係数が１５％以下の場合、輝点の大きさが揃う結果、変動係数が１５％を超えるものと異なり、蛍光観察を行った場合の各輝点の大きさが一様となる（図３（Ａ）と（Ｂ）または図４（Ａ）と（Ｂ）を対比して参照）。このため、蛍光観察で設定するダイナミックレンジに全ての輝点からの蛍光シグナルが収まるようになる。この結果、隣接する輝点同士がサチレーションにより融合する等の上記問題が解消され、輝点同士の判別が担保される。この結果、蛍光シグナルの判定精度が改善される。
【００９４】
蛍光色素がプラス電荷またはマイナス電荷の置換基を有し、色素樹脂粒子の樹脂を構成する熱硬化性樹脂が前記蛍光色素とは逆の電荷の置換基を有してイオン結合していることで(図１参照)、色素樹脂粒子により組織切片を染色した後の透徹の際に、樹脂粒子に内包された色素が樹脂粒子の外側に滲み出にくいものとなる。
【００９５】
(2)蛍光色素が前記樹脂粒子に内包されていることで、不必要に蛍光色素が光に曝されず、これによる蛍光色素の分解・蛍光標識として性能低下を防止することができる。
【００９６】
(3) 特に、前記イオン結合に寄与している置換基が、前記蛍光色素はマイナス電荷の置換基であり、前記樹脂粒子はプラス電荷の置換基であることにより、組織染色後の蛍光観察における蛍光色素の滲みを特に抑制することができ、染色像の明るさを確保することができる。
【００９７】
(4)前記蛍光色素全体の電荷および前記樹脂粒子全体の電荷が、前記イオン結合に寄与している置換基の電荷と異なる電荷である場合、蛍光色素と樹脂の両分子が互いに電気的に引き寄せられて、各分子の置換基がイオン結合するため、より蛍光色素が樹脂に固定されやすいものとなる。
【００９８】
(5)蛍光色素１分子の分子量／電荷を有する置換基数＜４００であることで、他の分子量頻度で前記置換基を有しているものよりも、組織染色像の蛍光色素の滲み、明るさおよび輝点における性能バランスを高めることができる。
【００９９】
(6)前記蛍光色素は、蛍光色素１分子あたりにマイナス電荷の置換基を少なくとも２つ有することにより、図１の左側の矩形に示すように、樹脂が有する複数のプラス電荷の置換基に挟持されるように固定される。また、場合によっては、蛍光色素が架橋剤のように固定されて機能する。この結果、より強固に固定される点で１つの置換基を有する場合よりも組織染色像の蛍光色素の滲みを防止することができる。加えて、明るさの性能を確保することができ、輝点の融合等を防止することができる。
【０１００】
(7,8)プラス電荷の置換基がアミノ基であり、マイナス電荷の置換基がスルホ基またはカルボキシル基であることにより、アミノ基（−ＮＨ+−）に対して、強いマイナス電荷のスルホ基（ＳＯ3-）の電子対を配位結合させて樹脂と蛍光色素とを強固に結合させることができる。例えば、メラミン等のアミノ基を有する熱硬化性樹脂に対して、スルホ基を有する蛍光色素を強固に結合させることができる。
【０１０１】
(9)前記蛍光色素が、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、スクアリリウムまたは芳香族炭化水素系色素分子であることで、蛍光色素と樹脂の疎水性部分の相互作用により、置換基のイオン結合と共に、強固に色素分子と樹脂とを結合させることができる。これにより、組織染色像の蛍光色素の滲みをより一層防止することができる。
【０１０２】
(10,12)前記熱硬化性樹脂がメラミンを用いて形成され、前記蛍光色素がローダミンまたは芳香族炭化水素系色素分子であることにより、メラミン樹脂とローダミンまたは芳香族炭化水素系色素分子がそれぞれ有するベンゼン環同士の疎水的相互作用により、上述した置換基のイオン結合に加えて、より強固に色素分子と樹脂とを結合させることができる。これにより、組織切片作成（図２）後の組織染色像の蛍光色素の滲みをより一層防止することができる。また、輝度と耐光性の観点からも、ローダミンや芳香族炭化水素は好適に用いられる。
【０１０３】
(11)前記熱硬化性樹脂と前記蛍光色素とが、アミド結合、エステル結合、エーテル結合およびＣ−Ｎ結合のいずれかによって共有結合していることで、色素樹脂粒子により組織切片を染色した後の透徹の際に、蛍光色素が樹脂粒子に内包され強固に維持されるので、樹脂粒子の外側に滲み出ることが抑制される。
【０１０４】
(13)前記樹脂粒子を合成反応により製造する際の反応系に界面活性剤を所定量添加することにより前記樹脂粒子の変動係数を１５％以下とする工程を含むことで、変動係数１５％以下の色素樹脂粒子を製造することができ、上記効果を有する組織染色用染色剤を提供することができる。
【０１０５】
(14)上記組織染色用染色剤を構成品として含む組織染色用キットであれば、上記効果を有する組織染色用キットを提供することができる。
【実施例】
【０１０６】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
［色素］
以下の実施例、比較例に用いた色素を表１に示す。
【０１０７】
【表１−１】
2020073879.tif 000002
【０１０８】
【表１−２】
2020073879.tif 000003
【０１０９】
【表１−３】
2020073879.tif 000004
【０１１０】
表１−１〜表１−２の化合物１−１〜４−４は、それぞれ、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、スクアリリウム、ピレン、または、ペリレンジイミドの骨格（表１−３参照）を持ち、且つ、置換基としてカルボン酸やスルホン酸、アンモニウム基、共有結合部位を持つ色素、あるいは前記置換基が無い色素である。このうち、化合物１−１〜１−８は、カルボキシル基やスルホ基を有しており、分子全体としてマイナスの電荷をもっている。化合物２−１〜２−２はアンモニウム基を有しており、分子全体としてプラスの電荷を持っている。化合物３−１〜３−２は、共有結合部位を有している。化合物４−１〜４−４は前記置換基がない。なお、表１−３の通り、ローダミンは骨格にアンモニウム基を一つ含むが、骨格に含まれる置換基については寄与が小さいので、色素の電荷（置換基）の数にはカウントしない。スクアリリウムも同様である。
【０１１１】
［化合物１−１］
市販のスルホローダミン１０１（シグマアルドリッチ社）を使用した。
［化合物１−２］
ＡｌＥＸＡ５９４に近い構造式を有する化合物１−２に係る蛍光色素を、既報の特開２０１０−１８０４９に従って作製して使用した。
［化合物１−３］
前記化合物１−２をＮＨＳエステル化した後、2-Aminoethanesulfonic Acid（東京化成工業社）とＤＦＭ中で９０℃、１時間反応し、カラムクロマトグラフィーで精製後、使用した。
［化合物１−４］
市販のＤｉｓｏｄｉｕｍ−１,３,５,７,８−ｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ−２,６−ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ‐ｄｉｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ（Exiton社）を使用した。
［化合物１−５］
文献（J. Phys. Chem. A 2005, 109, 5571）に記載の方法に従い合成し、使用した。
［化合物１−６］
市販の8-Methoxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt（シグマアルドリッチ社）を使用した。
［化合物１−７，１−８，３−１，３−２，４−４］
既報のAngew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 1528に従って作製し、使用した。
［化合物２−１］
市販のローダミンＢ（和光純薬工業社）を使用した。
［化合物２−２］
市販のスルホローダミン１０１アシッドクロライド（同仁化学社）とエチルアミン（東京化成工業社）をＤＦＭ中で９０℃、１時間反応し、カラムクロマトグラフィーで精製後、使用した。
［化合物４−１］
市販のテトラメチルローダミンエチルエステル過塩素酸塩（シグマアルドリッチ社）を使用した。
［化合物４−２］
市販の1,3,5,7,8-pentamethyl-2,6-diethylpyrromethene-difluoroborate complex（Exiton社）を使用した。
［化合物４−３］
市販の1,3-ビス[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-2,4-ジヒドロキシシクロブテンジイリウム二水酸化物, ビス(分子内塩)（シグマアルドリッチ社）を使用した。
【０１１２】
なお、上記化合物の構造は分子内塩として表記しているが、例えばハロゲン化物イオンやメタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホナート等のアニオンがカウンターイオンとして付いている形式でも良い。また、カルボン酸、スルホン酸は酸の形で表記しているが、アルカリ金属等の塩としても良い。また、分子内のカルボン酸、スルホン酸、アンモニウム基の個数を表記しているが、この数には色素骨格自体が含む酸やアンモニウム塩の数は含まない。例えば、ローダミンは色素骨格に１つのアンモニウム基を含むがこれは数えない。同様にスクアリリウムは色素骨格に四角酸とアンモニウム基を含むがこれは数えない。
【０１１３】
《蛍光色素と熱硬化性樹脂とをイオン結合または共有結合した変動係数15%以下の色素樹脂粒子の製造、組織染色等》
［実施例１］（化合物１−１内包ポリメラミン粒子）
蛍光色素として化合物１−１であるＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）１４．４ｍｇを水２２ｍＬに加えて溶解した。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルゲン（登録商標）４３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製）の５％水溶液を２ｍＬ加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）を０．６５ｇ加えた。
【０１１４】
さらに、この溶液に界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）の１０％水溶液を１０００μＬ加え、７０℃で５０分間加熱撹拌した。その後、９０℃に昇温して２０分間加熱撹拌した。得られた色素樹脂粒子の分散液から、余剰の樹脂原料や蛍光色素等の不純物を除くため、純水による洗浄を行った。
【０１１５】
具体的には、遠心分離機（クボタ社製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで１５分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。得られたメラミン粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含むことから、プラス電荷となった。樹脂粒子の電荷の評価は、ＮＭＲやＩＲ等による樹脂組成分析と、ゼータ電位測定により行なった。
【０１１６】
得られた色素樹脂粒子０．１ｍｇをエタノール１．５ｍＬ中に分散し、アミノプロピルトリメトキシシラン（ＬＳ−３１５０、信越化学工業社製）２μＬを加え、８時間反応させることにより、樹脂粒子の樹脂表面に存在するヒドロキシル基をアミノ基に変換する表面アミノ化処理を行った。
【０１１７】
２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有したリン酸緩衝液生理的食塩水（ＰＢＳ）を用いて、得られた色素樹脂粒子の濃度を３ｎＭに調整した。濃度調整した色素樹脂粒子の分散液に対して、終濃度１０ｍＭとなるように、ＳＭ（ＰＥＧ）１２（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅоｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔeｒ、サーモサイエンティフィック社製）を混合し、２０℃１時間反応させて、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する色素樹脂粒子を含む混合液を得た。
【０１１８】
この混合液を１００００Ｇで２０分間遠心分離を行い、上澄みを除去した後、２ｍＭのＥＤＴＡを含有したＰＢＳを加えて沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による上記洗浄を３回行った。
【０１１９】
（ストレプトアビジンの調製）
一方、ストレプトアビジン（和光純薬工業社製）とＮ−スクシミジルＳアセチルチオ酢酸（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ、略称：ＳＡＴＡ）を用いて、ストレプトアビジンに対してチオール基の付加処理を行い、ゲル濾過を行って色素樹脂粒子に結合可能なストレプトアビジンを別途用意した。
【０１２０】
（樹脂粒子とストレプトアビジンの結合）
上記色素樹脂粒子とストレプトアビジンを、２ｍＭのＥＤＴＡを含有したＰＢＳ中で混合後、室温で１時間反応させて、両者を結合させる反応を行った。反応後、１０ｍＭメルカプトエタノールを添加して反応を停止させた。得られた溶液をφ＝０．６５μｍの遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲル濾過カラムを用いて未反応のストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジンが結合した色素樹脂粒子を得た。
【０１２１】
（免疫組織染色）
この色素樹脂粒子を含む組織染色用染色剤を用いて、ヒト乳房組織の免疫染色を行った。ここで組織染色用染色剤は、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液等の緩衝液を用いた。染色切片は組織アレイスライド（コスモ・バイオ社製、品番ＣＢ−Ａ７１２）を用いた。組織アレイスライドを脱パラフィン処理後、水に置換洗浄し、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。抗原の賦活化処理後の組織アレイスライドを、ＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で０．０５ｎＭに稀釈した抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（４Ｂ５）を組織切片と２時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で稀釈したビオチン標識抗ウサギ抗体と、３０分間反応させた。さらに、上記組織染色用染色剤を用いて、すなわち上記製造したストレプトアビジンを有する色素樹脂粒子と２時間反応させ、その後洗浄を行うことにより、免疫組織化学染色切片が得られた。得られた免疫組織化学染色切片を４％中性パラホルムアルデヒド水系緩衝液に１０分間浸漬することにより、固定処理を行った。
【０１２２】
（形態染色）
上記固定処理をした各免疫組織化学染色切片に対してヘマトキシリン染色を行い、染色後の切片をエタノールに浸漬することにより脱水し、脱水切片をさらにキシレンに浸漬して透徹し、封入剤で封入して風乾させることにより、二重染色切片が得られた。ヘマトキシリン染色は、後述の評価において影響はなかった。また、形態染色を行わない場合はエタノール浸漬とキシレン浸漬による透徹のみ、あるいは形態染色としてエオシン染色を追加することもできた。
【０１２３】
（組織像の評価）
市販の蛍光顕微鏡を用いて色素内包樹脂粒子の蛍光組織画像を取得し、輝点計測への影響、組織像の色素にじみ、染色像の明るさについて評価した。
【０１２４】
なお、表２，４〜７の「蛍光色素の溶出量」は、色素樹脂粒子をエタノール浸漬し、エタノール中に溶出した色素量を評価した値である。具体的には、色素樹脂粒子０．１ｍｇを１ｍＬのエタノールに浸漬してバス式超音波装置（アズワン社）で１０分間超音波を掛けた後、遠心分離をして粒子を除き、上澄み液を蛍光光度計Ｆ７０００（日立社）で測定し、予め作製した色素濃度と蛍光光度計のピーク値の検量線から、１ｍＬ中の色素量（pmol）を算出した値である。この値から、評価１：Ｈｅｒ２染色像の色素にじみを間接的に類推できる。
【０１２５】
また、表２中、評価１について、「○」は、蛍光色素の滲みが無いことを示し、「△」は蛍光色素の滲みがあるが輝点を認識することができることを示し、「×」は蛍光色素の滲みにより輝点が確認できないことを示す。
【０１２６】
また、表２中、評価２については、「◎」は、特にＨｅｒ２染色像が明るいことを示している。「○」は蛍光観察の露光条件を４００ｍｓとした場合に像に輝点が確認できることを意味し、「△」は、輝点が見えにくいことを意味し、「×」は輝点が確認できないことを意味する。
【０１２７】
また、表２中、評価３については、「○」は蛍光観察画像で輝点数を計測できることを意味し、「△」は計測しにくいことを意味し、「×」は計測不可能であることを意味する。なお、これらの基準は以下の表３〜表７および他の例においても同様である。
【０１２８】
［実施例２］（化合物１−１内包ポリ尿素粒子）
実施例１において、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）０．６５ｇの代わりに、尿素樹脂原料０．８０ｇを使用した以外は、実施例１と同様に色素樹脂粒子の製造等を行った。本尿素樹脂は、骨格自体にアミノ基を多く含有することで樹脂がプラス電荷となった。なお、尿素樹脂原料は既存の方法により作製した、メチロール化度が４０〜７０％の尿素であった。
【０１２９】
［実施例３］（化合物１−１内包ポリキシレン粒子）
実施例１において、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．６５ｇの代わりに、キシレン樹脂原料ニカラックＹ−５０（フドー社製）０．８０ｇ、ブチルイソシアネート０．２０ｇ、および、ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）０．２０ｇを使用した点以外は、実施例１と同様に色素樹脂粒子の製造等を行った。本ポリキシレン樹脂は、アミノ基を多く含有することで樹脂がプラス電荷となった。
【０１３０】
［実施例4,7,10,13,16,19,24,27,30,34］（化合物1-2〜3-2内包ポリメラミン粒子）  実施例1において、化合物１−１を、化合物１−２（実施例４）、化合物１−３（実施例７）、化合物１−４（実施例１０）、化合物１−５（実施例１３）、化合物１−６（実施例１６）、化合物１−７（実施例１９）、化合物２−１（実施例２４）、化合物２−２（実施例２７）、化合物３−１（実施例３０）、化合物３−２（実施例３４）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
【０１３１】
［実施例5,8,11,14,17,20,25,28,31,35］（化合物1-2〜3−2内包ポリ尿素粒子）  実施例２において、化合物１−１を、化合物１−２に変更（実施例５）、化合物１−３（実施例８）、化合物１−４（実施例１１）、化合物１−５（実施例１４）、化合物１−６（実施例１７）、化合物１−７（実施例２０）、化合物２−１（実施例２５）、化合物２−２（実施例２８）、化合物３−１（実施例３１）および化合物３−２（実施例３５）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
【０１３２】
［実施例6,9,12,15,18,21,26,29,33,37］（化合物1-2〜3-2内包ポリキシレン粒子）  実施例３において、化合物１−１を、化合物１−２（実施例６）、化合物１−３（実施例９）、化合物１−４（実施例１２）、化合物１−５（実施例１５）、化合物１−６（実施例１８）、化合物１−７（実施例２１）、化合物２−１（実施例２６）、化合物２−２（実施例２９）、化合物３−１（実施例３３）および化合物３−２（実施例３７）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
【０１３３】
［実施例２２］（化合物１−８内包ポリフェノール粒子）
実施例１において、蛍光色素を化合物１−１から化合物１−８に変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業製）０．６５ｇの代わりにフェノール樹脂原料ニカノールＰＲ−１４４０Ｍ（フドー社製）０．８０ｇとフェノール０．２０ｇを用いた点、ドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）１０％水溶液を１０００μＬ添加した後の加熱撹拌（７０℃で５０分間加熱撹拌）を行わずに、９０℃、２０分間の加熱撹拌のみ行い、その後、オートクレーブにて１２５℃で５分間加熱した点以外は、実施例１と同様に色素樹脂粒子の製造等を行った。なお、樹脂粒子はフェノールを含むためマイナス電荷となった。
【０１３４】
［実施例２３］（化合物１−８内包ポリキシレン粒子）
実施例１において、化合物１−１を化合物１−８に変更し、メラミン樹脂ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）０．６５ｇの代わりに、キシレン樹脂原料ニカノールＹ−５０（フドー社製）０．２０ｇ、フェノール樹脂原料ニカノールＰＲ−１４４０Ｍ（フドー社製）０．２０ｇ、３−（４−Hydroxyphenil）propionic Acid ０．２０ｇ、を用いた点、ドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）１０％水溶液を１０００μＬ添加した後の加熱撹拌（７０℃で５０分間加熱撹拌）を行わずに、９０℃、２０分間の加熱撹拌のみ行い、その後、オートクレーブにて１２５℃、５分間加熱した点以外は実施例１と同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。なお、本樹脂粒子は、フェニル基とカルボキシル基を有するため、マイナス電荷となった。
【０１３５】
［実施例３２，３６］（化合物３−１，化合物３−２内包ポリフェノール粒子）
実施例２２において、化合物１−８を、化合物３−１（実施例３２）、化合物３−２（実施例３６）に変更した以外実施例は同様に色素樹脂粒子の作製等を行った。
【０１３６】
【表２】
2020073879.tif 000005
【０１３７】
（考察）
蛍光色素と樹脂の電荷が逆であり、且つ、色素樹脂粒子の変動係数が１５％以下であることから、蛍光観察時の蛍光色素の滲みがほとんどなく、輝度や輝点計測の結果がよいものとなった（実施例１〜３７）。
【０１３８】
《熱可塑性樹脂または半導体を用いて形成した蛍光色素粒子による組織染色等》
［比較例１，２］
実施例１で製造した色素樹脂粒子の代わりに、市販のインビトロジェン社製の末端にアミノ基が付いたポリスチレン製の色素樹脂粒子（比較例１）、末端にアミノ基が付いた市販の半導体ナノ粒子「Ｑ−ｄоｔ」（比較例２）を用いて実施例１と同様に免疫組織染色および形態染色を行った。
【０１３９】
【表３】
2020073879.tif 000006
【０１４０】
（考察）
熱可塑性樹脂であるポリスチレン粒子に蛍光色素を固定した色素樹脂粒子であり、色素溶出が生じて組織像の評価３では色素が滲んで組織像が見えない結果となった（比較例１）。
【０１４１】
また、変動係数が１０％以下であっても、市販の半導体ナノ粒子である「Ｑ−ｄоｔ」では単体輝度が低いため、染色像が見えない結果となった（比較例２）。
【０１４２】
《各種電荷の蛍光色素および熱硬化性樹脂で形成した変動係数１５％を超える色素樹脂粒子の場合》
［比較例３］（化合物１−１内包ポリメラミン粒子）
蛍光色素として化合物１−１であるＳｕｌｆоＲｈоｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）２．５ｍｇを水２２．５ｍＬに加え溶解した。その後、ホットスターラー上で７０℃まで昇温させた後、メラミン樹脂ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）１．５ｇを加え、５分間加熱撹拌した。ギ酸１００μＬを加え、７０℃で２０分間、加熱撹拌した後、室温放冷した。冷却後、反応混合物を遠心用チューブに入れて遠心分離機に２００００Ｇで２０分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散させた。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。得られたメラミン樹脂粒子は実施例１で作成した粒子と比べて、粒子の変動係数が大きい特徴を有していた。得られた色素樹脂粒子を用いて、実施例１と同様に免疫組織染色および形態染色を行った。
【０１４３】
［比較例４］（化合物1-1内包ポリ尿素粒子）
比較例３において、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）１．５ｇの代わりに、尿素樹脂原料１．６ｇを使用した点以外は、実施例１と同様に色素樹脂粒子を製造した。なお、尿素樹脂原料は既存の方法により作製した、メチロール化度が４０〜７０％の尿素である。
【０１４４】
［比較例５］（化合物1-1内包ポリキシレン粒子）
比較例３において、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）１．５ｇの代わりに、フェノール樹脂原料Ｋ−１００（フドー社製）０．８０ｇと3,5-Dimethylaniline０．２０ｇを使用した以外は実施例１と同様に色素樹脂粒子の製造等を行った。本キシレン樹脂はアミノ基を多く含有する事で樹脂がプラス電荷となった。
【０１４５】
［比較例6,9,12,15,18,21,26,29,32,36］（化合物1-2〜3-2内包ポリメラミン粒子）
比較例３において、化合物１−１を、化合物１−２（比較例６）、化合物１−３（比較例９）、化合物１−４（比較例１２）、化合物１−５（比較例１５）、化合物１−６（比較例１８）、化合物１−７（比較例２１）、化合物２−１（比較例２６）、化合物２−２（比較例２９）、化合物３−１（比較例３２）、化合物３−２（比較例３６）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
【０１４６】
［比較例7,10,13,16,19,22,27,30,33,37］（化合物1-2〜3-2内包ポリ尿素粒子）
比較例４において、化合物１−１を、化合物１−２（比較例７）、化合物１−３（比較例１０）、化合物１−４（比較例１３）、化合物１−５（比較例１６）、化合物１−６（比較例１９）、化合物１−７（比較例２２）、化合物１−８（比較例２７）、化合物２−１（比較例３０）、化合物２−２（比較例３３）、化合物３−１（比較例３７）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
【０１４７】
［比較例8,11,14,17,20,23,28,31,35,39］（化合物1-2〜3-2内包ポリキシレン粒子）
比較例５において、化合物１−１を化合物１−２（比較例８）、化合物１−３（比較例１１）、化合物１−４（比較例１４）、化合物１−５（比較例１７）、化合物１−６（比較例２０）、化合物１−７（比較例２３）、化合物２−１（比較例２８）、化合物２−２（比較例３１）、化合物３−１（比較例３５）、化合物３−２（比較例３９）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
【０１４８】
［比較例２４］（化合物1-8内包ポリフェノール粒子）
比較例３において、化合物１−１を化合物１−８に変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）１．５ｇの代わりに、フェノール樹脂原料ニカノールＰＲ−１４４０Ｍ（フドー社製）０．８０ｇおよびフェノール０．２０ｇを用いた点、ドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）１０％水溶液を１０００μＬ添加した後の加熱撹拌（７０℃で５０分間加熱撹拌）を行わずに、９０℃、２０分間の加熱撹拌のみ行い、その後、オートクレーブにて１２５℃で５分間加熱した点以外は比較例３と同様に色素樹脂粒子の製造等を行った。なお、樹脂粒子はフェノールを含み、分子全体としてマイナス電荷となった。
【０１４９】
［比較例２５］（化合物1-8内包ポリキシレン粒子）
比較例３において、化合物１−１を化合物１−８に変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）１．５ｇの代わりに、フェノール樹脂原料ニカノールＰＲ−１４４０（フドー社製）０．８０ｇおよびフェノール０．２０ｇを用いた点、ドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）１０％水溶液を１０００μＬ添加した後の加熱撹拌（７０℃で５０分間加熱撹拌）を行わずに、９０℃、２０分間の加熱撹拌のみ行い、その後、オートクレーブにて１２５℃５分間加熱した点以外は、比較例３と同様に色素樹脂粒子の製造等を行った。なお、樹脂粒子はフェノールとカルボキシル基を含み、分子全体としてマイナス電荷となった。
【０１５０】
［比較例３４、３８］
比較例２４において、化合物１−８を、化合物３−１（比較例３４）、化合物３−２（比較例３８）に変更した以外は同様に色素樹脂粒子の製造、形態染色等を行った。
【０１５１】
【表４】
2020073879.tif 000007
【０１５２】
（考察）
蛍光色素と樹脂の電荷が逆の電荷であっても、色素樹脂粒子の粒径サイズにバラツキがあり、変動係数１５％を超える場合、輝点計測等が困難となった（比較例３〜３９）。
【０１５３】
《無電荷の蛍光色素とプラス電荷の樹脂から形成した変動係数15%以下の色素樹脂粒子の場合》
［比較例40,43,46,49］（化合物4-1〜4-4内包ポリメラミン粒子）
実施例１において、化合物１−１を、無電荷の化合物４−１（比較例４０）、化合物４−２（比較例４３）、化合物４−３（比較例４６）、化合物４−４（比較例４９）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
【０１５４】
すなわち、比較例４０，４３，４６，４９は、変動係数は１５％以下であるが、尿素樹脂の粒子に対して電荷を有しない蛍光色素（化合物４−１〜４−４）を内包した色素樹脂粒子を製造して、免疫組織染色、形態染色および組織像の評価等を行った例である。
【０１５５】
［比較例41,44,47,50］（化合物4-1〜4-4内包ポリ尿素粒子）
実施例２において、化合物１−１を、無電荷の化合物４−１（比較例４１）、化合物４−２（比較例４４）、化合物４−３（比較例４７）、化合物４−４（比較例５０）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
【０１５６】
すなわち、比較例４１，４４，４７，５０は、変動係数１５％以下であるが、ポリ尿素製の樹脂粒子に対して、電荷を有しない蛍光色素（化合物４−１〜４−４）を固定した場合の例である。
【０１５７】
［比較例42,45,48,51］（化合物4-1〜4-4内包ポリキシレン粒子）
実施例３において、化合物１−１を、無電荷の化合物４−１（比較例４２）、化合物４−２（比較例４５）、化合物４−３（比較例４８）、化合物４−４（比較例５１）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
【０１５８】
すなわち、比較例４２，４５，４８，５１は、変動係数１５％以下であるが、ポリキシレン製の樹脂粒子に対して、電荷を有しない蛍光色素（化合物４−１〜４−４）を固定した場合の例である。
【０１５９】
【表５】
2020073879.tif 000008
【０１６０】
（考察）
蛍光色素が電荷を有しておらず樹脂とイオン結合しない上に、共有結合もしないことから色素溶出量が大きく、染色後の蛍光観察時の色素にじみが多くなるため、輝点計測等が困難となった（比較例４０〜５１）。
【０１６１】
《マイナス電荷の樹脂にマイナス電荷の蛍光色素を固定した変動係数15％以下の色素樹脂粒子の場合》
［比較例52］（化合物1-1内包ポリフェノール粒子）
実施例１において、使用したプラス電荷のポリメラミン樹脂の代わりに、蛍光色素（化合物１−１）の電荷と同じマイナス電荷を有するポリフェノール樹脂を用いた以外は同様に色素樹脂粒子の製造、ストレプトアビジンの調製および形態染色等を行った（表６参照）。
【０１６２】
［比較例53］（化合物1-1内包ポリキシレン粒子）
実施例１において、使用した樹脂をプラス電荷のポリメラミン樹脂の代わりにマイナス電荷のポリキシレン樹脂を用いた以外は同様に色素樹脂粒子の製造、ストレプトアビジンの調製および形態染色等を行った（表６参照）。
【０１６３】
［比較例54,56,58,60,62,64］（化合物1-2〜1-7内包ポリフェノール粒子）
比較例５２において、化合物１−１を、化合物１−２（比較例５４）、化合物１−３（比較例５６）、化合物１−４（比較例５８）、化合物１−５（比較例６０）、化合物１−６（比較例６２）、化合物１−７（比較例６４）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
【０１６４】
すなわち、比較例５２，５４，５８，６０，６２，６４は、変動係数は１５％以下であるが、マイナス（−）電荷のポリフェノール樹脂の粒子に対して、同一のマイナス（−）電荷を有する蛍光色素（化合物１−１〜１−７）を内包させた色素樹脂粒子を製造して、免疫組織染色、形態染色および組織像の評価等を行った例である。
【０１６５】
［比較例55,57,59,61,63,65］（化合物1-2〜1-7内包ポリキシレン粒子）
比較例５３において、化合物１−１を、化合物１−２（比較例５５）、化合物１−３（比較例５７）、化合物１−４（比較例５９）、化合物１−５（比較例６１）、化合物１−６（比較例６３）、化合物１−７（比較例６５）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
【０１６６】
すなわち、比較例５３，５５，５７，５９，６１，６３，６５は、変動係数は１５％以下であるが、マイナス（−）電荷のポリキシレン樹脂の粒子に対して、同一のマイナス（−）電荷を有する蛍光色素（化合物１−１〜１−７）を内包させた色素樹脂粒子を製造して、免疫組織染色、形態染色および組織像の評価等を行った例である。
【０１６７】
【表６】
2020073879.tif 000009
【０１６８】
（考察）
蛍光色素と樹脂の電荷が同一のマイナス電荷の場合、電気的に反発し合って、蛍光色素が樹脂にイオン結合で固定されず、また、共有結合もしていないので、染色後の蛍光観察において蛍光色素の滲みが生じて、輝度や輝点の計測が困難となった（比較例５２〜６５）。
【０１６９】
《プラス電荷の樹脂にプラス電荷の蛍光色素を固定した変動係数15％以下の色素樹脂粒子の場合》
［比較例66］（化合物1-8内包ポリメラミン粒子）
実施例１において、マイナス電荷の蛍光色素（化合物１−１）の代わりに、樹脂と同じプラス電荷の蛍光色素（化合物１−８）を用いた以外は同様に色素樹脂粒子の製造、組織染色等を行った（表７参照）。
【０１７０】
［比較例67］（化合物1-8内包のポリ尿素粒子）
実施例２において、化合物１−１の代わりに化合物１−８を用いた以外は同様に色素樹脂粒子の製造、組織染色等を行った（表７参照）。
【０１７１】
［比較例68］（化合物1-8内包のポリキシレン粒子）
実施例３において、化合物１−１の代わりに化合物１−８を用いた以外は同様に色素樹脂粒子の製造、組織染色等を行った（表７参照）。
【０１７２】
【表７】
2020073879.tif 000010
【０１７３】
（考察）
蛍光色素と樹脂の電荷が同一のプラス電荷の場合、電気的に反発し合って、蛍光色素が樹脂にイオン結合で固定されず、染色後の蛍光観察において蛍光色素の滲みが生じて、輝度や輝点の計測が困難となった（比較例６６〜６８）。
【０１７４】
【表８】
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【０１７５】
［実施例３８］（化合物１−１内包ポリメラミン粒子）
実施例１において、色素樹脂粒子の純水による洗浄の遠心分離の時間を１５分から１０分に短縮した。また、実施例１と同様に５回の遠心分離と上澄み除去と超純水への再分散の操作の後、新たに遠心分離を１分行ない、沈殿物を取り除いた。それ以外は実施例１と同様とした。
【０１７６】
［実施例３９〜４８］（化合物1-2〜3-2内包ポリメラミン粒子）
実施例３８において、化合物１−１を、化合物１−２（実施例３９）、化合物１−３（実施例４０）、化合物１−４（実施例４１）、化合物１−５（実施例４２）、化合物１−６（実施例４３）、化合物１−７（実施例４４）、化合物２−１（実施例４５）、化合物２−２（実施例４６）、化合物３−１（実施例４７）、化合物３−２（実施例４８）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
【０１７７】
以上、本発明を実施の形態および実施例に基づいて説明してきたが、本発明はこれら実施例等に限定されず、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨を逸脱しない限り、設計変更等は許容される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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