(57)【要約】【課題】プロテオグリカンを天然に近い形態のまま得られるようにした、プロテオグリカン含有組成物の製造方法、並びにこれにより得られるプロテオグリカン含有組成物を提供する。【解決手段】魚由来の生軟骨を原料とし、前記原料を冷凍する冷凍工程と、前記冷凍工程で得られた凍結物を凍結乾燥する凍結乾燥工程とを含むことを特徴とするプロテオグリカン含有組成物の製造方法である。得られた凍結乾燥物に、更に、水性溶媒を添加して抽出する抽出工程を含んでいてもよい。また、魚由来の生軟骨を原料とし、前記原料をすり身にするミンチ工程と、前記ミンチ工程で得られたすり身に水性溶媒を添加して抽出する抽出工程とを含むことを特徴とするプロテオグリカン含有組成物の製造方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚由来の生軟骨を原料とし、前記原料を冷凍する冷凍工程と、前記冷凍工程で得られた凍結物を凍結乾燥する凍結乾燥工程とを含むことを特徴とするプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項２】
前記冷凍工程において、前記原料が−５℃以上０℃未満の温度帯を３０分間以上経るようにして冷凍する、請求項１記載のプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項３】
前記凍結乾燥工程で得られた凍結乾燥物に、更に、水性溶媒を添加して抽出する抽出工程を含む、請求項１又は２記載のプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項４】
魚由来の生軟骨を原料とし、前記原料をすり身にするミンチ工程と、前記ミンチ工程で得られたすり身に水性溶媒を添加して抽出する抽出工程とを含むことを特徴とするプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項５】
前記抽出工程で得られた抽出物を、更に乾燥する乾燥工程を含む、請求項３又は４記載のプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項６】
前記乾燥工程で得られた乾燥物がプロテオグリカンを３６質量％以上含有し、コラーゲンを３６質量％以上含有する、請求項５記載のプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項７】
魚由来の軟骨抽出物からなり、プロテオグリカンを３６質量％以上含有し、コラーゲンを３６質量％以上含有し、前記プロテオグリカンと前記コラーゲンとの質量比が１：１．７〜１．２５：１である、プロテオグリカン含有組成物。
【請求項８】
前記プロテオグリカンの重量平均分子量は２００〜４１５万ダルトンである、請求項７記載のプロテオグリカン含有組成物。
【請求項９】
脂質の含有量が１質量％以下である、請求項７又は８記載のプロテオグリカン含有組成物。
【請求項１０】
前記重量平均分子量の２００〜３４０万ダルトンの範囲に入るものが、３０質量％以上を占める、請求項７〜９のいずれか１項に記載のプロテオグリカン含有組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロテオグリカン含有組成物に関し、より詳細には魚由来の軟骨から得られるプロテオグリカン含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオグリカンは、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸などのグリコサミノグリカンと呼ばれる硫酸化多糖が、芯構造を形成するコアタンパクに共有結合してできる広義糖タンパクの一種である。プロテオグリカンは動物の細胞外マトリックスや細胞表面に存在し、ヒアルロン酸やコラーゲン等の繊維質のマトリックスタンパク質と複合体を形成している。
【０００３】
プロテオグリカンについては、種々の機能性が報告されている、例えば、特許文献１には、ＴＮＦ−α産生抑制作用、ＩＦＮ−γ産生抑制作用、ＩＬ−１０産生促進作用等を示すことが記載されている。また、例えば、特許文献２には、プロテオグリカンに皮膚線維芽細胞の増殖促進作用があることが記載されている。また、例えば、特許文献３には、プロテオグリカンが毛乳頭細胞のＦＧＦ−７の産生を促進して、その細胞の賦活化作用を示すことが記載されている。
【０００４】
一方、プロテオグリカンの調製方法についても、さまざまな報告がある。例えば、特許文献４には、鮭の鼻軟骨を粉砕、脱脂処理を施して得た脱脂乾燥粉末を抽出溶媒で抽出し、得られた抽出液から粗プロテオグリカンを分離精製し、しかる後、透析を行う調製方法が記載されている。また、例えば、特許文献５には、粗プロテオグリカンの溶出溶媒に酢酸を用い、得られた溶出液を濾過後遠心分離し、上澄み液に食塩飽和エタノールを加えて再度遠心分離してプロテオグリカンを濃縮する調製方法が記載されている。また、例えば、特許文献６には、プロテオグリカンを含有する動物組織を少なくとも過酢酸を含む溶液に浸漬する工程と、浸漬後の溶液を回収する工程とを含むプロテオグリカンの調製方法が記載されている。また、例えば、特許文献７には、分子量が２０００ｋＤａ以上の酸性糖成分を含むプロテオグリカン含有物が記載され、当該プロテオグリカン含有物が、エタノール処理により脱脂された魚類軟骨から水抽出することにより調製されることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−１３１５４８号公報
【特許文献２】特開２００８−２４７８０３号公報
【特許文献３】特開２０１６−２０４２９７号公報
【特許文献４】特開２００１−１７２２９６号公報
【特許文献５】特開２００２−６９０９７号公報
【特許文献６】特開２０１２−２０１６１４号公報
【特許文献７】国際公開第２０１１／００７８８５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来のプロテオグリカンの調製方法では、有機溶媒や水浸漬やエタノール洗浄などによる脱脂の工程等が一定程度必要であって、手間がかかり、一方でそのような工程を経るにつれてプロテオグリカンの天然のままの存在形態が壊れてしまうという側面があった。
【０００７】
本発明の目的は、プロテオグリカンを天然に近い形態のまま得られるようにした、プロテオグリカン含有組成物の製造方法、並びにこれにより得られるプロテオグリカン含有組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、魚由来の生軟骨を原料にして凍結融解の過程を経ることなく抽出すると、原料からの脂質の混入が抑えられるとともに、プロテオグリカンが天然に近い形態のまま収率よく得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、第１の観点としては、魚由来の生軟骨を原料とし、前記原料を冷凍する冷凍工程と、前記冷凍工程で得られた凍結物を凍結乾燥する凍結乾燥工程とを含むことを特徴とするプロテオグリカン含有組成物の製造方法を提供するものである。
【００１０】
上記第１の観点の製造方法によれば、魚由来の生軟骨を原料とし、その原料を冷凍したうえ、得られた凍結物を融解させずに凍結乾燥するので、原料の変性や分解が抑えられ、ひいてはプロテオグリカンが天然に近い形態のまま含まれ、これを利用し得る素材を提供することができる。
【００１１】
上記第１の観点の製造方法においては、前記冷凍工程において、前記原料が−５℃以上０℃未満の温度帯を３０分間以上経るようにして冷凍することが好ましい。これによれば、氷の結晶が生成される温度帯（氷結晶生成温度帯）である−５℃以上０℃未満の温度帯を、原料が所定時間以上経ることによって、その原料中では氷結晶が十分に成長し、肥大化する。これにより、軟骨組織がより十分に破壊され、ひいては天然に近い形態のプロテオグリカンを更により利用し易い素材と成すことができる。
【００１２】
上記第１の観点の製造方法においては、前記凍結乾燥工程で得られた凍結乾燥物に、更に、水性溶媒を添加して抽出する抽出工程を含むことが好ましい。これによれば、魚由来の生軟骨を原料にして凍結融解の過程を経ることなく抽出するので、原料の変性や分解が抑えられ、ひいては原料からの脂質の混入が抑えられているとともに、プロテオグリカンを天然に近い形態のまま含有するプロテオグリカン含有組成物が得られる。また、有機溶媒を使用せずに効率のよい抽出が可能であり、ヒトへの経口摂取用や皮膚塗布用などとして安全性に問題がない。
【００１３】
また、本発明は、第２の観点としては、魚由来の生軟骨を原料とし、前記原料をすり身にするミンチ工程と、前記ミンチ工程で得られたすり身に水性溶媒を添加して抽出する抽出工程とを含むことを特徴とするプロテオグリカン含有組成物の製造方法を提供するものである。
【００１４】
上記第２の観点の製造方法によれば、魚由来の生軟骨を原料にして凍結融解の過程を経ることなく抽出するので、原料の変性や分解が抑えられ、ひいては原料からの脂質の混入が抑えられているとともに、プロテオグリカンを天然に近い形態のまま含有するプロテオグリカン含有組成物が得られる。また、有機溶媒を使用せずに効率のよい抽出が可能であり、ヒトへの経口摂取用や皮膚塗布用などとして安全性に問題がない。
【００１５】
上記第１及び第２の観点の製造方法においては、前記抽出工程で得られた抽出物を、更に乾燥する乾燥工程を含むことが好ましい。これによれば、腐敗等が防がれて、保存性が向上する。
【００１６】
上記第１及び第２の観点の製造方法においては、前記乾燥工程で得られた乾燥物がプロテオグリカンを３６質量％以上含有し、コラーゲンを３６質量％以上含有することが好ましい。
【００１７】
一方、本発明は、第３の観点としては、魚由来の軟骨抽出物からなり、プロテオグリカンを３６質量％以上含有し、コラーゲンを３６質量％以上含有し、前記プロテオグリカンと前記コラーゲンとの質量比が１：１．７〜１．２５：１である、プロテオグリカン含有組成物を提供するものである。
【００１８】
上記組成物においては、前記プロテオグリカンの重量平均分子量は２００〜４１５万ダルトンであることが好ましい。
【００１９】
上記組成物においては、脂質の含有量が１質量％以下であることが好ましい。
【００２０】
上記組成物においては、前記重量平均分子量の２００〜３４０万ダルトンの範囲に入るものが、３０質量％以上を占めることが好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、化粧品や機能性食品や医薬品などに適用可能な、高品質のプロテオグリカン素材が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明にかかるプロテオグリカン含有組成物の製造方法の一実施形態を示す工程図である。
【図２】本発明にかかるプロテオグリカン含有組成物の製造方法の他の実施形態を示す工程図である。
【図３】本発明にかかるプロテオグリカン含有組成物の製造方法の更に他の実施形態を示す工程図である。
【図４】本発明にかかるプロテオグリカン含有組成物の製造方法の更に別の実施形態を示す工程図である。
【図５】試験例１において行ったＨＰＬＣ分析の結果であり、実施例１〜３、比較例１の紛体状組成物を分析したときに得られたそれぞれのＨＰＬＣチャートの一例である。
【図６】試験例２において凍結条件の影響を調べた結果を示す写真であり、図６（ａ）はサケ氷頭（頭部の軟骨）の断片の生のものの断面をアルシャンブルー（青染色）で染色したときの顕微鏡写真であり、図６（ｂ）は急速冷凍したものの断面をアルシャンブルー（青染色）で染色したときの顕微鏡写真であり、図６（ｃ）は実施例１，３の紛体状組成物の調製時と同じく、緩慢凍結の条件で冷凍したものの断面をアルシャンブルー（青染色）で染色したときの顕微鏡写真である。
【図７】プロテオグリカンの生体での存在状態を模式的に表す説明図である。
【図８】本発明にかかるプロテオグリカン含有組成物の製造方法により得られるプロテオグリカン素材の構造を模式的に示す説明図であり、図８（ａ）はプロテオグリカンが２量体で存在する状態を模式的に示す説明図であり、図８（ｂ）はプロテオグリカンが３量体で存在する状態を模式的に示す説明図であり、図８（ｃ）はプロテオグリカンが４量体で存在する状態を模式的に示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明においては、魚由来の生軟骨が、プロテオグリカンの基原として用いられる。魚類の種類やその軟骨組織の部位等に特に制限はなく、例えば、サケの鼻軟骨（氷頭）、サメの軟骨、エイの軟骨、イカの軟骨等が挙げられる。特にサケの鼻軟骨（氷頭）は、プロテオグリカン含量が高いうえ、水産加工の分野で通常廃棄される部位として安価に入手可能であるのでより好ましい。例えば、サケのイクラ加工やフィレ加工では水揚げされたサケから頭部は大量に廃棄処分されるので、これを入手し、その頭部から鼻軟骨を摘出して用いることができる。
【００２４】
なお、本明細書において「生軟骨」とは、３０℃以上の達温経歴を経ない原料であって、なお且つ凍結融解の過程を経ないものいうものとする。後述する実施例で示されように、凍結融解によりプロテオグリカンに変性や分解が起こり、天然に近い形態のまま抽出することが困難である。また、一般に３０℃以上の達温経歴を経た原料には、タンパク質等の生体分子に変性や分解が起こりやすくなり、プロテオグリカンについても、天然に近い形態のまま抽出することが難しくなるので、好ましくない。また、雑菌の繁殖等を避けるため、水揚げから期間をおかないで、提携水産加工業者等から入荷したうえ、軟骨にまで調製することが好ましい。
【００２５】
図１には、本発明にかかるプロテオグリカン含有組成物の製造方法の一実施形態が示される。この実施形態にあっては、プロテオグリカン含有組成物は、魚由来の生軟骨を原料にして、その原料を冷凍する工程と（図１中、Ｓ１で示す。）、冷凍して得られた凍結物を凍結乾燥する工程と（図１中、Ｓ２で示す。）を経ることにより得られる。冷凍は、通常当業者に周知の冷凍装置を使用したり、冷凍庫の庫内に静置したりする等の手段で行うことができる。冷凍の温度条件としては、特に制限はなく、原料が−４０℃〜−１０℃に達温するまで冷凍することなどが適当であり、より完全に冷凍して部分的あるいは一時的であっても凍結融解が起こることを避けるには、−４０℃〜−３０℃に達温するまで冷凍することがより好ましい。乾燥は、通常当業者に周知の真空凍結乾燥機等の手段で行ことができる。通常、凍結乾燥の設定条件としては、棚温度として−４０℃〜５０℃などであり、庫内真空度としては０．１Ｐａ〜２０００Ｐａなどである。
【００２６】
本発明においては、そのより好ましい冷凍工程の態様としては、上記の冷凍工程における原料の冷凍は、緩慢凍結の条件下に行うことが好ましい。ここで緩慢凍結とは、原料の凍結過程において、原料が、氷結晶生成温度帯である−５℃以上０℃未満の温度帯を所定時間かけて凍結することにより、その原料中における氷結晶を十分に成長させ、肥大化させることをいう。これにより、軟骨組織がより十分に破壊され、ひいては天然に近い形態のプロテオグリカンを更により利用し易い素材と成すことができる。具体的には、緩慢凍結は、温度変遷条件を設定した冷凍装置を使用したり、あるいは適当な温度条件に設定した冷凍庫の庫内に静置したりするなどして、例えば原料が−５℃以上０℃未満の温度帯を３０分間以上経るようにして冷凍すること等により行うことができる。
【００２７】
このように調製された凍結乾燥後の乾燥物には、プロテオグリカンが利用し易い状態で含まれている。すなわち、プロテオグリカンが、例えば水等の水性溶媒で容易に溶出される状態で含まれている。また、例えばヒトに経口投与したり皮膚塗布したりすることにより、プロテオグリカンが容易に生体に接触し、ひいては生体に利用される状態で含まれている。更に、水分が除かれているので、腐敗等が防がれて、保存安定性にも優れている。よって、プロテオグリカン供給用の素材としてきわめて利用価値が高い。
【００２８】
なお、上記凍結乾燥後の乾燥物は、通常当業者に周知の粉砕機、ミル、マスコローダー等の手段により粉砕してもよい。これによれば、プロテオグリカン供給用の素材として、より利用し易い形態となる。粉砕後の粉砕物の粒度としては、全体のおよそ９０質量％以上が３０メッシュパス（目開き：５００μｍ）となる程度に粉砕することが好ましく、全体のおよそ９０質量％以上が６０メッシュパス（目開き：２５０μｍ）となる程度に粉砕することがより好ましい。あるいは、全体のおよそ９０質量％以上が０．３ｍｍ経以上０．７５ｍｍ径以下のスクリーンをパスするように粉砕物を調製することが好ましい。
【００２９】
図２には、本発明にかかるプロテオグリカン含有組成物の製造方法の他の実施形態が示される。この実施形態にあっては、プロテオグリカン含有組成物は、魚由来の生軟骨を原料にして、その原料を冷凍する工程と（図２中、Ｓ１で示す。）、冷凍して得られた凍結物を凍結乾燥する工程と（図２中、Ｓ２で示す。）、凍結乾燥して得られた凍結乾燥物に水性溶媒を添加して抽出する工程と（図２中、Ｓ４で示す。）を経ることにより得られる。冷凍及び凍結乾燥の手段等については、上述したとおりである。抽出のための水性溶媒としては、水や水を主体とする溶媒であればよく、特に制限はないが、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸アンモニウム等のアルカリ剤によりアルカリ側に調整された水性溶媒を用いることが好ましい。そのｐＨとしてはｐＨ７〜１２程度が好ましく、ｐＨ８〜１２程度がより好ましく、ｐＨ９〜１２程度が更により好ましい。アルカリ剤としては水酸化ナトリウムが好ましい。抽出条件としては、水性溶媒を凍結乾燥物の粉砕物に対して１００〜１４０倍量添加し、１０．５〜１４．５℃で、０．５〜１０時間処理することなどにより行なうことができる。この場合、抽出処理は、凍結乾燥物の粉砕物を添加した水性溶媒を適当な容器入れて静置することにより行ってもよく、より効率よく抽出させるためには、容器ごと振盪させたり、適当な攪拌手段で攪拌したりしながら行ってもよい。ただし、あまり激しい攪拌は、天然に近い形態のプロテオグリカンの変性や分解を引き起こすおそれがあるので好ましくない。
【００３０】
図３には、本発明にかかるプロテオグリカン含有組成物の製造方法の更に他の実施形態が示される。この実施形態にあっては、プロテオグリカン含有組成物は、魚由来の生軟骨を原料にして、その原料を冷凍する工程と（図３中、Ｓ１で示す。）、冷凍して得られた凍結物を凍結乾燥する工程と（図３中、Ｓ２で示す。）、凍結乾燥して得られた凍結乾燥物を粉砕する工程と（図３中、Ｓ３で示す。）、前記粉砕工程で得られた凍結乾燥粉砕物に水性溶媒を添加して抽出する工程と（図３中、Ｓ４で示す。）を経ることにより得られる。冷凍及び凍結乾燥の手段や水性溶媒による抽出の手段等については、上述したとおりである。凍結乾燥物の粉砕は、通常当業者に周知の粉砕機、ミル、マスコローダー等の手段で行うことができる。粉砕後の粉砕物の粒度としては、全体のおよそ９０質量％以上が３０メッシュパス（目開き：５００μｍ）となる程度に粉砕することが好ましく、全体のおよそ９０質量％以上が６０メッシュパス（目開き：２５０μｍ）となる程度に粉砕することがより好ましい。あるいは、全体のおよそ９０質量％以上が０．３ｍｍ経以上０．７５ｍｍ径以下のスクリーンをパスするように粉砕物を調製することが好ましい。
【００３１】
図４には、本発明にかかるプロテオグリカン含有組成物の製造方法の更に別の実施形態が示される。この実施形態にあっては、プロテオグリカン含有組成物は、魚由来の生軟骨を原料にして、その原料をミンチする工程と（図４中、Ｓ５で示す。）、ミンチして得られたすり身に水性溶媒を添加して抽出する工程と（図４中、Ｓ６で示す。）を経ることにより得られる。ミンチは、通常当業者に周知の挽肉機、ミートチョッパー、ホモジナイザー等の手段で行うことができる。水性溶媒による抽出の手段等については、上記凍結乾燥後の乾燥物をすり身に代えた以外、上述したとおりである。
【００３２】
上記した水性溶媒による抽出により得られた抽出物は、通常当業者に周知の減圧乾燥機、噴霧乾燥機等の手段により乾燥してもよく、その乾燥物を更に解砕、粉砕等して乾燥ともに粉末化してもよい。乾燥物の形態であれば、上記した凍結乾燥後の乾燥物と同様に、水分が除かれているので、腐敗等が防がれて、保存安定性に優れている。乾燥に際しては、製剤的にテキストリン等の賦形剤や結晶セルロース、シリカ等を添加してもよい。
【００３３】
粉末化のためには、上記した軟骨の凍結乾燥物と同様にして、通常当業者に周知の粉砕機、ミル、マスコローダー等の手段を利用することができる。粉末化後の粒度としては、全体のおよそ９０質量％以上が３０メッシュパス（目開き：５００μｍ）となる程度に粉末化することが好ましく、全体のおよそ９０質量％以上が６０メッシュパス（目開き：２５０μｍ）となる程度に粉末化することがより好ましい。あるいは、全体のおよそ９０質量％以上が０．３ｍｍ経以上０．７５ｍｍ径以下のスクリーンをパスするように粉末化することが好ましい。
【００３４】
以上に説明したような調製により、プロテオグリカンを高含有に含むプロテオグリカン素材を得ることができる。好ましくは、プロテオグリカンを３６質量％以上含有し、コラーゲンを３６質量％以上含有するプロテオグリカン含有組成物を得ることが可能である。組成物中でプロテオグリカンは、重量平均分子量として２００〜４１５万ダルトンの分子量範囲で存在しており、２〜４量体の形態で存在していることが考えられる。また、プロテオグリカンとコラーゲンとの質量比が１：１．７〜１．２５：１程度である。すなわち、プロテオグリカンをより天然に近い形態で含有するプロテオグリカン素材となっている。原料からの脂質の混入も少なく、組成物中での脂質含量は、好ましくは１質量％以下である。
【００３５】
なお、プロテオグリカン含有量の測定方法としては、ＨＰＬＣ分析や、あるいはガランボス法（カルバゾール硫酸法）によって、プロテオグリカンの分解物であるウロン酸量を測定して、その値から換算する方法などが挙げられる。また、コラーゲン含有量の測定方法としては、アミノ酸組成分析によりヒドロキシプロピル含量を測定して、その値から換算する方法などが挙げられる。また、脂質含量の測定方法としては、食品の脂質含量と測定法として周知の、酸分解法などが挙げられる。
【００３６】
また、後述するように、より正確に生体高分子の分子量の測定としては、例えば、多角度光散乱検出器を利用した静的光散乱法による構造解析などが挙げられる。
【００３７】
本発明により得られるプロテオグリカン含有組成物には、上記プロテオグリカンや上記コラーゲンに加え、更にビタミンＣ、イミダゾールペプチド、コラーゲンペプチド、鮭卵巣外皮ペプチド、β−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）等を添加してもよい。
【００３８】
本発明により得られるプロテオグリカン含有組成物は、例えば、化粧品、健康食品やサプリメント、医薬品、医薬部外品等に向けた利用が可能であり、特にその原料素材として好適に利用され得る。また、ヒトだけでなくペット動物等の動物に向けた利用も可能である。
【実施例】
【００３９】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００４０】
＜実施例１＞
水産加工工場から排出されるサケの頭部を入手し、その頭部から鼻軟骨を摘出して、サケ１匹分の頭部からおよそ２８ｇの生軟骨を採取した。これを設定温度−３０℃に設定した冷凍庫の庫内に静置して冷凍して、サケ鼻軟骨の凍結物を得た。このとき、凍結条件としては、緩慢凍結の条件（急速冷凍でなく）で行った。具体的には、原料の品温が氷結晶生成温度帯である−５℃以上０℃未満の温度帯を３０分間程度かけて凍結させた。得られた凍結物を真空凍結乾燥装置にて凍結乾燥して、更に、ピンミル粉砕機（商品名「サンプルミル（ＳＡＭ）」、奈良機械製作所製）を使用して、全体のおよそ９０質量％以上が０．３ｍｍ経以上０．７５ｍｍ径以下のスクリーンをパスするように粉砕した。得られた凍結乾燥粉砕物を純水（蒸留水）１２０ｍＬに終濃度１０ｗ／ｖ％となるように添加し、容器ごと１１℃で１５時間振盪させた。その後、遠心分離により固液分離して液部を回収し、真空乾燥装置にて乾燥して、乳白色の紛体状組成物を得た。
【００４１】
＜実施例２＞
水産加工工場から排出されるサケの頭部を入手し、その頭部から鼻軟骨を摘出して、サケ４４匹分の頭部からおよそ１ｋｇの生軟骨を採取した。これをミートチョッパー装置（設定温度：１０℃）にかけてミンチし、ペースト状のすり身を得た。得られたすり身は、品温が上がりすぎないよう注意しながら、純水（蒸留水）１２０ｍＬに終濃度１０ｗ／ｖ％となるように添加し、容器ごと１１℃で１５時間振盪させた。その後、遠心分離により固液分離して液部を回収し、真空乾燥装置にて乾燥して、乳白〜淡黄の色調の紛体状組成物を得た。
【００４２】
＜実施例３＞
実施例１における凍結乾燥粉砕物からの抽出溶媒を、純水（蒸留水）ではなく０．００５％ＮａＯＨ水溶液（ｐＨ１１．１）に代えた以外は、実施例１と同様にして、乳白色の紛体状組成物を得た。
【００４３】
＜比較例１＞
採取した生軟骨を、一旦冷凍装置（設定温度：−２５℃）にて急速冷凍し、これを１０℃の流水で解凍して用いた以外は、実施例２と同様にして、紛体状組成物を調製した。得られた紛体状組成物の色調は、乳白〜淡黄であった。
【００４４】
［試験例１］
実施例１〜３、比較例１で得られた紛体状組成物について、常法に従い、組成物中に含まれるプロテオグリカン量とその分子量について調べた。以下はＨＰＬＣ分析による主な分析条件である。
【００４５】
（分析条件）
・サイズ排除クロマトカラム： TSKgel G6000 PWXL（7.8mm×300mm）、排除限界5000万
・ガードカラム： TSKgel guardcolumn PWXL（6.0mm×40mm）
・カラム温度： 40℃
・移動相： 0.1M Phosphate buffer in 0.1MNaCl (pH7.0)
・流量： 0.4mL/min
・検出器： RI （示差屈折）
・定量用プロテオグリカン標品： Salmon Nasal Cartilage proteoglycan（コスモ・バイオ株式会社製）
・分子量用プルラン標品： STD P-800 Mw80.5×104、P-400 Mw36.6x104、P-200 Mw20.0×104（昭和電工株式会社製）
【００４６】
なお、プロテオグリカンの定量分析については、上記標品を使用して、既知濃度のサンプルについてのＨＰＬＣチャートから、ピーク面積あるいはピーク高さに基づいて検量線を作製して定量する方法とともに、ガランボス法（カルバゾール硫酸法）によってウロン酸量を測定することにより定量する方法についても併用した。
【００４７】
一方、分子量分析については、上記３種類の分子量の標品を使用して、ＨＰＬＣチャートのピーク位置のリテンションタイム（保持時間）に基づいて検量線を作製した。
【００４８】
結果を表１及び図５に示す。
【００４９】
【表１】
2020114185.tif 000002
【００５０】
その結果、サケの生軟骨を原料にして凍結乾燥の後に抽出した実施例１では、ＨＰＬＣチャート上で３５７．４万ダルトンの位置にピークを示した（図５）。また、サケの生軟骨を原料にしてミンチしてペースト状のすり身にした後に抽出した実施例２では、ＨＰＬＣチャート上で４１０．５万ダルトンの位置にピークを示した（図５）。さらに実施例３では、ＨＰＬＣチャート上で３４８．５万ダルトンの位置にピークを示した（図５）。これに対して、一旦急速冷凍して解凍したサケの生軟骨を原料に用いた比較例１では、ＨＰＬＣチャート上で１２２．５万ダルトンの位置にピークを示し（図５）、収率も実施例１や実施例３に比べて悪くなり、実施例２とほぼ同等であった。よって、凍結融解の過程を経ることなく抽出したほうが、凍結融解の過程を経た場合に比べて、プロテオグリカンが分解や変性を起すことなく、より天然に近い形態のまま抽出できると考えられた。
【００５１】
［試験例２］
凍結条件の影響を調べた。具体的には、サケ氷頭（頭部の軟骨）の断片の生のものと、−２０℃に急速冷凍したもの、実施例１，３の紛体状組成物の調製時と同じく、緩慢凍結の条件（−５℃以上０℃未満の温度帯を３０分間程度かけて凍結）で冷凍したもの、のそれぞれの切片を作成し、プロテオグリカン染色試薬であるアルシャンブルー（青染色）で染色して、顕微鏡で観察した。
【００５２】
その結果、急速冷凍の条件では、染色の様子は凍結前と同様で、プロテオグリカンが組織にとどまっていた（図６ｂ）。それに対して、緩慢凍結の条件で凍結した場合には、染色が弱く、組織からプロテオグリカンが溶出していた（図６ｃ）。よって、凍結乾燥物を調製する際には、緩慢凍結の条件を採用することにより、急速冷凍の場合より、より収率よく、天然に近い形態のプロテオグリカンを抽出できると考えられた。
【００５３】
［試験例３］
実施例１で得られた紛体状組成物について、アミノ酸組成分析を行った。アミノ酸組成分析は、常法に従い、試料を酸加水分解した後の加水分解物について、アミノ酸自動分析装置に供して、各アミノ酸量を測定した。その結果得られたヒドロキシプロリンの含有量（ｍｇ／１００ｇ）に１２．５１の換算係数を用いてコラーゲン量を算出したところ、コラーゲンの含有量は４１質量％であった。
【００５４】
また、実施例１で得られた紛体状組成物について、常法に従い、酸分解法により脂質含量を測定したところ、脂質含量は０．６質量％であった。なお、酸分解法に脂質含量の測定は、試料を塩酸で加熱し加水分解を行った後、マジョニア管を使用して、ジエチルエーテルと石油エーテルで抽出し、得られた抽出液を乾燥させ重量を測定することにより行った。
【００５５】
更に、実施例１で得られた紛体状組成物について、試料を放線菌ヒアルロニダーゼで処理した後のヒアルロン酸分解物（低分子化糖類）の検出により見積られたヒアルロン酸含量は、１質量％未満であった。
【００５６】
［試験例４］
試験例１ではサイズ排除クロマトカラムを利用し、プルラン標品との相対比較で求められた分子量であったために誤差が大きいと考えられた。また、剛体球状、棒状、ランダムコイル状等の分子形状を予測することはできなかった。そこで、より絶対的な分子量測定法であり、分子形状に関する情報も得ることができる、SEC-MALS法を用いた静的光散乱法による構造解析を実施した。なお、SECはSize Exclusion Chromatograph（サイズ排除クロマトグラフ）の略であり、「MALS」はMulti Angle Light Scattering（多角度光散乱検出器）の略である。
【００５７】
試料としては、実施例１で得られた紛体状組成物について分析し、加えて、比較対照として、市販のプロテオグリカン素材製品の２種製品についても分析した。分析は常法に従い行った。以下は主な分析条件である。
【００５８】
（分析条件）
・多角度光散乱検出器： DAWNHELEOSII（Wyatt Technology社製）
・サイズ排除クロマトカラム：ShodexSB-807 （排除限界5000万）
・検出器１：示差屈折率検出器OptilabT-rEX（Wyatt Technology社製）
・検出器２：粘度検出器ViscoStarIII（Wyatt Technology社製）
・移動相：０．１Ｍリン酸バッファー
・流量０．５ｍL／min
・温度４０℃
・dn/dc値：０．１６ｍｇ／Ｌ（文献値）
【００５９】
結果を表２に示す。
【００６０】
【表２】
2020114185.tif 000003
【００６１】
その結果、実施例１で得られた紛体状組成物に含まれるプロテオグリカンの重量平均分子量は３０１万ダルトンであったのに対して、市販のプロテオグリカン素材製品のうちの１つは１１７万ダルトンで、他の１つは４１万ダルトンであり、いずれも実施例１のものよりも低分子量を示した。また、分子形状に関するパラメータである回転半径やRMSコンフォメーションプロットにおけるSlopeの値は、実施例１で得られた紛体状組成物に含まれるプロテオグリカンではランダムコイルの分子形状であることを示す結果であったのに対し、製品では市販のプロテオグリカン素材製品では、剛体球もしくは超剛体球の分子形状であることを示す結果であった。
【００６２】
以上の結果によると、実施例１で得られた紛体状組成物は凍結融解の過程を経ないで調製されたので、天然に近い状態でプロテオグリカンが得られたのに対して、市販のプロテオグリカン素材製品ではそのような調製法がとられなかったために、調製の過程で、少なくとも１５０万ダルトンの分子量以下への変性や分解を起こしてしまった結果であると考えられた。
【００６３】
なお、図７に模式的に示すように、プロテオグリカン（図７中、１の符号で示す）は生体組織中ではコラーゲン分子（図７中、２の符号で示す）とヒアルロン酸分子（図７中、３の符号で示す）とともに細胞外マトリックスを構成している。よって、プロテオグリカンは、コラーゲンやヒアルロン酸を介して複数連なり多量体を形成していると理解することができる。この点、上記で測定した分子量から見積ると、実施例１では、その天然の多量体の形態のうち２〜４量体のものが得られたものと考えられた（図８参照）。なお、図８中、符号３で示すヒアルロン酸の含有量としては、上記試験例３の結果では１質量％未満であり、プロテオグリカンやコラーゲンの含有量に比べると、あまり多量には含まれてないものと考えられた。
【図１】
2020114185.tif 000004
【図２】
2020114185.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2020114185.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月8日(2019.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚由来の、３０℃以上の達温及び冷凍の経歴を経ない生軟骨を原料とし、前記原料を冷凍する冷凍工程と、前記冷凍工程で得られた凍結物を凍結乾燥する凍結乾燥工程と、前記凍結乾燥工程で得られた凍結乾燥物に、水性溶媒を添加して抽出する抽出工程とを含むことを特徴とするプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項２】
前記冷凍工程において、前記原料が−５℃以上０℃未満の温度帯を３０分間以上経るようにして冷凍する、請求項１記載のプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項３】
魚由来の、３０℃以上の達温及び冷凍の経歴を経ない生軟骨を原料とし、前記原料をすり身にするミンチ工程と、前記ミンチ工程で得られたすり身に水性溶媒を添加して抽出する抽出工程とを含むことを特徴とするプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項４】
前記抽出工程で得られた抽出物を、更に乾燥する乾燥工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項５】
前記乾燥工程で得られた乾燥物がプロテオグリカンを３６質量％以上含有し、コラーゲンを３６質量％以上含有する、請求項４記載のプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項６】
前記プロテオグリカンと前記コラーゲンとの質量比が１：１．７〜１．２５：１である、請求項５記載のプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項７】
前記プロテオグリカンの重量平均分子量は２００〜４１５万ダルトンである、請求項５又は６記載のプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項８】
前記乾燥工程で得られた乾燥物の脂質の含有量が１質量％以下である、請求項５〜７のいずれか１項に記載のプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項９】
前記プロテオグリカンのうち重量平均分子量の２００〜３４０万ダルトンの範囲に入るものが、３０質量％以上を占める、請求項５〜８のいずれか１項に記載のプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月23日(2019.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚由来の、３０℃以上の達温及び冷凍の経歴を経ない生軟骨を原料とし、前記原料を冷凍する冷凍工程と、前記冷凍工程で得られた凍結物を凍結乾燥する凍結乾燥工程と、前記凍結乾燥工程で得られた凍結乾燥物に、水性溶媒を添加して抽出する抽出工程とを含むことを特徴とするプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項２】
前記冷凍工程において、前記原料が−５℃以上０℃未満の温度帯を３０分間以上経るようにして冷凍する、請求項１記載のプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項３】
前記抽出工程で得られた抽出物を、更に乾燥する乾燥工程を含む、請求項１又は２記載のプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項４】
前記乾燥工程で得られた乾燥物がプロテオグリカンを３６質量％以上含有し、コラーゲンを３６質量％以上含有する、請求項３記載のプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項５】
前記プロテオグリカンと前記コラーゲンとの質量比が１：１．７〜１．２５：１である、請求項４記載のプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項６】
前記プロテオグリカンの重量平均分子量は２００〜４１５万ダルトンである、請求項４又は５記載のプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項７】
前記乾燥工程で得られた乾燥物の脂質の含有量が１質量％以下である、請求項４〜６のいずれか１項に記載のプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項８】
前記プロテオグリカンのうち重量平均分子量の２００〜３４０万ダルトンの範囲に入るものが、３０質量％以上を占める、請求項４〜７のいずれか１項に記載のプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項９】
魚由来の、３０℃以上の達温及び冷凍の経歴を経ない生軟骨を原料とし、前記原料をすり身にするミンチ工程と、前記ミンチ工程で得られたすり身であって、乾燥を経ない該すり身に水性溶媒を添加して抽出する抽出工程とを含むことを特徴とするプロテオグリカン含有組成物の製造方法。
【請求項１０】
前記抽出工程で得られた抽出物を、更に乾燥する乾燥工程を含む、請求項９記載のプロテオグリカン含有組成物の製造方法。