(57)【要約】【課題】本発明は、濾過に使用される膜に生じるファウラント等のバイオフィルムを効果的に分解することを目的とする。【解決手段】Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓの菌株１８０１４０−Ｂ２（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５０６）の培養物からの抽出物、Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属の菌株の培養物の５０ｋＤａ以上の可溶性画分、タンパク質、バイオフィルムを分解する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓの菌株１８０１４０−Ｂ２（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５０６）の培養物からの抽出物。
【請求項２】
Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属の菌株の培養物の５０ｋＤａ以上の可溶性画分。
【請求項３】
配列番号１（Ｎｏ．２５６７）、配列番号２（Ｎｏ．７５３）、配列番号３（Ｎｏ．２４６）、配列番号４（Ｎｏ．２５８４）の塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列によりコードされる、タンパク質。
【請求項４】
配列番号１（Ｎｏ．２５６７）、配列番号２（Ｎｏ．７５３）、配列番号３（Ｎｏ．２４６）、配列番号４（Ｎｏ．２５８４）の塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む、遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子を含む、組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターを含む、形質転換体。
【請求項７】
請求項１に記載の抽出物、及び／又は請求項２に記載の可溶性画分を用いて、バイオフィルムを分解する方法。
【請求項８】
請求項３に記載のタンパク質を用いて、バイオフィルムを分解する方法。
【請求項９】
請求項１に記載の抽出物、請求項２に記載の可溶性画分、請求項３に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つを用いて、バイオフィルムを分解する方法。
【請求項１０】
前記バイオフィルムが多糖類を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記多糖類がデンプン、グリコーゲン、ペクチン、グァーガム、アラビアガム、キサンタンガム、ジェランガム、タマリンドガム、ローカストビーンガム、カラギーナン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ゼラチン、寒天、グルコマンナン、ヘパリン、ヒアルロン酸、アルギン酸、アルギン酸プロピレングリコール、プルラン、サイリウム、カードラン、プロピレングリコールからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記多糖類がβ−１，４結合を含有する、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記多糖類がキサンタンガム、ジェランガムからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抽出物、可溶性画分、タンパク質、バイオフィルムを分解する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種設備において濾過工程を担う部分では膜が使用されている。ときに膜にはファウリングによりバイオフィルムが生じ、かかるバイオフィルムが設備の運転の障害となることがある。これまでの研究により、ファウラントにはウロン酸含有多糖の一種が含まれていること、かかる多糖を分解する活性を備える細菌が存在することがわかってきている。近年は、細菌に発現されている酵素によりファウラントを分解する試みも報告されている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−２６８３７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、濾過に使用される膜に生じるファウラント等のバイオフィルムを効果的に分解することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の要旨は以下の通りである。
【０００６】
［１］
Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓの菌株１８０１４０−Ｂ２（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５０６）の培養物からの抽出物。
［２］
Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属の菌株の培養物の５０ｋＤａ以上の可溶性画分。
［３］
配列番号１（Ｎｏ．２５６７）、配列番号２（Ｎｏ．７５３）、配列番号３（Ｎｏ．２４６）、配列番号４（Ｎｏ．２５８４）の塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列によりコードされる、タンパク質。
［４］
配列番号１（Ｎｏ．２５６７）、配列番号２（Ｎｏ．７５３）、配列番号３（Ｎｏ．２４６）、配列番号４（Ｎｏ．２５８４）の塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む、遺伝子。
［５］
［４］に記載の遺伝子を含む、組換えベクター。
［６］
［５］に記載の組換えベクターを含む、形質転換体。
［７］
［１］に記載の抽出物、及び／又は［２］に記載の可溶性画分を用いて、バイオフィルムを分解する方法。
［８］
［３］に記載のタンパク質を用いて、バイオフィルムを分解する方法。
［９］
［１］に記載の抽出物、［２］に記載の可溶性画分、［３］に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つを用いて、バイオフィルムを分解する方法。
［１０］
前記バイオフィルムが多糖類を含む、［７］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］
前記多糖類がデンプン、グリコーゲン、ペクチン、グァーガム、アラビアガム、キサンタンガム、ジェランガム、タマリンドガム、ローカストビーンガム、カラギーナン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ゼラチン、寒天、グルコマンナン、ヘパリン、ヒアルロン酸、アルギン酸、アルギン酸プロピレングリコール、プルラン、サイリウム、カードラン、プロピレングリコールからなる群から選択される少なくとも１つを含む、［１０］に記載の方法。
［１２］
前記多糖類がβ−１，４結合を含有する、［１０］又は［１１］に記載の方法。
［１３］
前記多糖類がキサンタンガム、ジェランガムからなる群から選択される少なくとも１つである、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、濾過に使用される膜に生じるファウラント等のバイオフィルムを効果的に分解することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】活性汚泥から得られた混合菌液の培養上清を用いてキサンタン等を分解する実験を行ったときの結果を示す図である。
【図２】混合菌の培養液の５０ｋＤａ以上の可溶性画分についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったときの結果を示す図である。
【図３】混合菌の培養液の５０ｋＤａ以上の可溶性画分について陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる精製を行ったときの分画プロファイルを示す図である。
【図４】混合菌の培養液の５０ｋＤａ以上の可溶性画分について陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる精製を行ったときの各画分についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったときの結果を示す図である。図中、矢印Ａは７０ｋＤａのバンドの位置を示し、矢印Ｂは５０ｋＤａのバンドの位置を示す。
【図５】精製タンパク質Ａ溶液についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったときの結果を示す図である。
【図６】ファウラント分解活性を有する混合菌を各種ＢＳ培地（グルコース含有ＢＳ培地、グルコース及びマンノース含有ＢＳ培地、キサンタン含有ＢＳ培地）で培養した培養液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったときの結果を示す図である。図中、Ｍはマーカーを示し、レーン１は２０ｍＭグルコース含有ＢＳ培地での培養液を示し、レーン２は１０ｍＭグルコース及び１０ｍＭマンノース含有ＢＳ培地での培養液示しを、レーン３は０．０５％キサンタン含有ＢＳ培地での培養液を示す。図中、レーン１の矢印及びレーン２の矢印はいずれも５０ｋＤａのバンドの位置を示し、レーン３の矢印は５０ｋＤａのバンドの位置及び７０ｋＤａのバンドの位置を示す。
【図７】（Ａ）は、コントロールについてのＧＰＣプロファイルを示す。縦軸に強度（ｍＶ）を示し、横軸に時間経過（分）を示す図である。（Ａ）の右上図に、特に４分後から７分後の部分のプロファイルを拡大して示す。（Ｂ）は、試料についてのＧＰＣプロファイルを示す。縦軸に強度（ｍＶ）を示し、横軸に時間経過（分）を示す図である。（Ａ）の右上図に、特に４分後から７分後の部分のプロファイルを拡大して示す。
【図８】（Ａ）は、ファウラント分解活性を有する混合菌液から単離された６種類の菌（Ｎｏ．Ｂ１〜Ｎｏ．Ｂ６）の生育状態を示す図である。（Ｂ）は、ファウラント分解活性を有する混合菌液から単離された６種類の菌（Ｎｏ．Ｂ１〜Ｎｏ．Ｂ６）のうちＮｏ．Ｂ２の生育状態を示す図である。
【図９】Ｎｏ．Ｂ２培養上清を用いてキサンタンを分解する実験を行ったときの結果を示す図である。
【図１０】Ｎｏ．Ｂ２培養上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったときの結果を示す図である。図中、Ｍはマーカーを示し、レーン１はＮｏ．Ｂ２培養液を示し、レーン２は精製タンパク質Ａ溶液を示し、レーン３はＮｏ．Ｂ２培養上清を示す。
【図１１】大量発現させた配列番号１（Ｎｏ．２５６７）でコードされるタンパク質（未精製の）についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。図中、Ｍはマーカーを示し、Ｃはコントロールを示し、レーン１はペレットを示し、レーン２は培養液上清を示す。また、ｓｕｐｅｒは上清を示し、ｐｐｔは沈殿を示す。
【図１２】大量発現させた配列番号１（Ｎｏ．２５６７）でコードされるタンパク質（Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにより精製）についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。図中、Ｍはマーカーを示し、Ｃはコントロールを示し、ＦＴは洗浄液を示し、レーン１は１回目溶出液を示し、レーン２は２回目溶出液を示し、レーン３は３回目溶出液を示し、レーン４は４回目溶出液を示し、レーン５は５回目溶出液を示す。また、ｓｕｐｅｒは上清を示し、ｐｐｔは沈殿を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」ともいう）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１０】
（抽出物、可溶性画分）
本実施形態の抽出物及び可溶性画分は、Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属に属する細菌の培養物に由来するものである。
【００１１】
Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌の種としては、Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌｏｖｏｒａｎｓ等が挙げられる。
これらの種は、１種単独としても、２種以上の組み合わせとしてもよい。
【００１２】
種としては、特に、高いバイオフィルム分解活性を得ることを可能にするｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓが好ましい。
なお、Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓは、学説的には、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ（アルスロバクター・ニコチノボランス））とされ得る。
【００１３】
Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓに属するものの中でも、より具体的には、１８１４０−Ｂ２が好ましい。
１８１４０−Ｂ２は、２０１７年７月７日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５０６として寄託されている。
【００１４】
特に、本実施形態の抽出物は、Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属の菌株１８１４０−Ｂ２（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５０６）の培養物からの抽出物としてよい。
【００１５】
特に、本実施形態の可溶性画分は、Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属の培養物の５０ｋＤａ以上の画分としてよい。
ここで、可溶性画分とは、培養物の抽出物のうち水に可溶な画分をいう。
【００１６】
本実施形態の抽出物及び可溶性画分によれば、濾過に使用される膜に生じるファウラント等のバイオフィルムを効果的に分解することができる。
【００１７】
［培養方法］
培養方法としては、特に限定されることなく、当該技術分野において通常用いられる方法を用いてよく、バッチ培養（回分培養）、流加培養（半回分培養）、連続培養（灌流培養）等が挙げられる。
【００１８】
［培養条件］
培養条件としては、特に限定されることなく、標準的な細胞培養条件を用いることができる。
宿主細胞の性質に応じて、好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で培養を行うこともできる。
培養温度としては、２０℃〜３７℃が好ましく、培養雰囲気としては、ＣＯ2濃度約６％〜約８４％であることが好ましく、ｐＨとしては、約５〜約９であることが好ましい。
【００１９】
［培地］
用いられる培地としては、特に限定されることなく、天然培地、合成培地が挙げられ、細菌の栄養源たる炭素源を含む培地であり、任意選択的に、窒素源、有機微量栄養源、無機物（ミネラル）等を含む培地としてよい。
炭素源としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、転化糖等の炭水化物；炭素数が１の化合物（以下、Ｃ１化合物という。）；脂質（オイル等）；脂肪酸；グリセリン脂肪酸エステル；ポリペプチド；再生可能な炭素源；酵母エキス；リン脂質；グリセロ脂質；グリセロール；アセテート等が挙げられる。
これらの炭素源は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２０】
炭素源についての詳細を以下に記載する。
炭水化物のうちの単糖類としては、ケトトリオース（ジヒドロキシアセトン）、アルドトリオース（グリセルアルデヒド）等のトリオース；ケトテトロース（エリトルロース）、アルドテトロース（エリトロース、トレオース）等のテトロース；ケトペントース（リブロース、キシルロース）、アルドペントース（リボース、アラビノース、キシロース、リキソース）、デオキシ糖（デオキシリボース）等のペントース；ケトヘキソース（プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース）、アルドヘキソース（アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース）、デオキシ糖（フコース、フクロース、ラムノース）等のヘキソース；セドヘプツロース等のヘプトースが挙げられ、フルクトース、マンノース、ガラクトース、グルコース等のＣ６糖；キシロース、アラビノース等のＣ５糖の炭水化物が好ましい。
二糖類としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等が挙げられ、スクロース、ラクトースが好ましい。
オリゴ糖類としては、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等の三糖類；アカルボース、スタキオース等の四糖類；フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナンオリゴ糖（ＭＯＳ）等のその他のオリゴ糖類が挙げられる。
多糖類としては、具体的には、デンプン、グリコーゲン、ペクチン、グァーガム、アラビアガム、キサンタンガム、ジェランガム、タマリンドガム、ローカストビーンガム、カラギーナン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ゼラチン、寒天、グルコマンナン、ヘパリン、ヒアルロン酸、アルギン酸、アルギン酸プロピレングリコール、プルラン、サイリウム、カードラン、プロピレングリコールが挙げられ、β−１，４結合を含有することが好ましく、キサンタンガム、ジェランガムが好ましい。
転化糖としては、ショ糖を加水分解したものが挙げられる。
炭素数が１の化合物（Ｃ1化合物）としては、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩、一酸化炭素、二酸化炭素等が挙げられる。
脂質としては、Ｃ4以上の飽和脂肪酸及び／又は不飽和脂肪酸を１以上含む物質が挙げられ、特に、室温で液体であるオイルが好ましい。
ここで、オイルとしては、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁、油性微生物細胞、ナンキンハゼ等の植物性オイル、及び動物性オイルが挙げられる。
脂肪酸としては、式ＲＣＯＯＨ（「Ｒ」は炭化水素基を表す。）で表される化合物が挙げられ、不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸が挙げられる。ここで、不飽和脂肪酸は、「Ｒ」に少なくとも１の炭素−炭素二重結合を有する化合物であり、例えば、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、パルミテライジン酸、アラキドン酸等が挙げられる。飽和脂肪酸は、「Ｒ」が飽和脂肪族基である化合物であり、例えば、ドコサン酸、イコサン酸、オクタデカン酸、ヘキサデカン酸、テトラデカン酸、ドデカン酸等が挙げられる。脂肪酸としては、Ｃ2〜Ｃ22の脂肪酸が好ましく、特に、Ｃ12脂肪酸、Ｃ14脂肪酸、Ｃ16脂肪酸、Ｃ18脂肪酸、Ｃ20脂肪酸、Ｃ22脂肪酸が更に好ましい。
これら脂肪酸の塩、誘導体、誘導体の塩も挙げられる。塩としては、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩等が挙げられる。
グリセリン脂肪酸エステルとしては、モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド等が挙げられる。
ポリペプチドとしては、微生物性ポリペプチド、植物性ポリペプチド等が挙げられ、ここで、微生物性ポリペプチドとしては、酵母又は細菌由来のポリペプチド等が挙げられ、植物性ポリペプチドとしては、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁由来のポリペプチド等が挙げられる。
再生可能な炭素源としては、バイオマス炭素源が挙げられ、特に、その全部又は一部が加水分解されたバイオマス炭素源が好ましい。ここで、バイオマス炭素源としては、木、紙、及びパルプの廃材、葉状植物、果肉等のセルロース系基質；柄、穀粒、根、塊茎等の植物の一部分が挙げられる。バイオマス炭素源として用いられる植物としては、コーン、小麦、ライ麦、ソルガム、トリティケイト、コメ、アワ、大麦、キャッサバ、エンドウマメ等のマメ科植物、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、サトウキビ、タピオカ等が挙げられる。なお、バイオマス等の再生可能な炭素源を培地中に用いる際には、前処理を行うことが好ましく、前処理としては、酵素的前処理、化学的前処理、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２１】
例えば、炭素源としては、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、グリセリン脂肪酸エステルとグルコース等の炭水化物との組み合わせが挙げられる。
また、炭素源としては、酵母エキス、又は酵母エキスと、グルコース等の他の炭素源との組み合わせが挙げられ、酵母エキスと、二酸化炭素やメタノール等のＣ1化合物との組み合わせが好ましい。
【００２２】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質又は酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。
無機物（ミネラル）としては、これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００２３】
用いられる培地としては、市販の標準培地が好ましい。特定の宿主の培養に適した培地を適宜選択して用いることができる。
標準培地としては、特に限定されることなく、標準寒天培地、ＳＣＤ寒天培地、Ｒ２Ａ寒天培地等の既成培地が挙げられる。
【００２４】
抽出方法としては、特に限定されることなく、当該技術分野において通常用いられる方法を用いてよく、遠心分離、フィルター濾過等が用いられてよい。
【００２５】
（タンパク質）
本実施形態のタンパク質は、本実施形態の抽出物や本実施形態の可溶性画分に含まれるものである。
【００２６】
本実施形態のタンパク質としては、具体的には、配列番号１（Ｎｏ．２５６７）、配列番号２（Ｎｏ．７５３）、配列番号３（Ｎｏ．２４６）、配列番号４（Ｎｏ．２５８４）の塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列を有する塩基配列によりコードされるタンパク質を含むものとしてよく、これらの塩基配列によりコードされるタンパク質としてよい。
【００２７】
本実施形態のタンパク質のアミノ酸配列は、上述の４種の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列に限定されることなく、上記のタンパク質の改変体も用いることができる。改変体としては、例えば、全アミノ酸に対してアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加等を有するものが挙げられる。
なお、置換、欠失、挿入、付加等の全アミノ酸に対する割合は、アミノ酸残基の種類や、そのアミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置により異なるが、１０％以下としてよく、好ましくは５％以下であり、更に好ましくは２％以下、より更に好ましくは１％以下であり、特に好ましくは０．５％である。
本実施形態のタンパク質のアミノ酸配列の、上述の４種の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列に対する同一性としては、９０％以上としてよく、好ましくは９５％以上であり、更に好ましくは９８％以上であり、より更に好ましくは９９％以上であり、特に好ましくは９９．５％以上である。
【００２８】
置換を有するものとしては、特に、保存的置換を有するものが挙げられる。
「保存的置換」とは、類似の性質を有するアミノ酸間での置換を指し、具体的には、芳香族アミノ酸の場合には、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ間での置換、疎水性アミノ酸の場合には、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ間での置換、極性アミノ酸の場合には、Ｇｌｎ、Ａｓｎ間での置換、塩基性アミノ酸の場合には、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ間での置換、酸性アミノ酸の場合には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ間での置換、ヒドロキシル基を持つアミノ酸の場合には、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ間での置換を指す。
保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、ＡｌａからＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇからＧｌｎ、Ｈｉｓ又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎからＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐからＡｓｎ、Ｇｌｕ又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓからＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕからＧｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙからＰｒｏへの置換、ＨｉｓからＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅからＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕからＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔからＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅからＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒからＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒからＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐからＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒからＨｉｓ、Ｐｈｅ又はＴｒｐへの置換、及び、ＶａｌからＭｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換が挙げられる。
【００２９】
本実施形態のタンパク質によれば、濾過に使用される膜に生じるファウラント等のバイオフィルムを効果的に分解することができる。
【００３０】
（遺伝子）
本実施形態の遺伝子は、本実施形態のタンパク質をコードするものである。
【００３１】
本実施形態の遺伝子としては、配列番号１（Ｎｏ．２５６７）、配列番号２（Ｎｏ．７５３）、配列番号３（Ｎｏ．２４６）、配列番号４（Ｎｏ．２５８４）の塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むものとしてよく、これらの塩基配列にと９０％以上の同一性を有する塩基配列としてよい。
【００３２】
この塩基配列は、その塩基配列にコードされるタンパク質の機能を有する限り、上記の塩基配列そのものに限定されることなく、上記の塩基配列の変異体も用いることができる。
【００３３】
変異体は、天然おいて生じる変異により得られたものでもよく、人工的な変異（例えば、部位特異的変異導入）により得られたものでもよい。
【００３４】
塩基配列の変異体の本来の塩基配列に対する同一性は、前述のとおり９０％以上としてよく、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上、特に好ましくは９９．５％以上である。
【００３５】
上記のタンパク質のアミノ酸をコードするコドンは、タンパク質の発現を行う宿主におけるコドンの使用頻度に応じて、変更することができ、これにより、上記のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を変更することができる。
【００３６】
本実施形態の遺伝子によれば、濾過に使用される膜に生じるファウラント等のバイオフィルムを効果的に分解することができる。
【００３７】
（組換えベクター）
本実施形態の組換えベクターは、本実施形態の遺伝子を含むものである。
【００３８】
ベクターの構築は、制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ライゲース等の酵素を適宜用いて、ＰＣＲ法、クロスオーバーＰＣＲ法、ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ法、λ−Ｒｅｄ法等の遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。
【００３９】
本実施形態の組換えベクターの調製に用いられるベクターとしては、特に限定されることなく、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。ベクターは、ＤＮＡベクターであってもＲＮＡベクターであってもよいが、ＤＮＡベクターが好ましい。ベクターとしては、モノシストロニックベクター、バイシストロニックベクター、ポリシストロニックベクター等が挙げられる。
ベクターは、用いられる宿主に応じて適宜選択されてよく、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の場合には、ｐＢＲ３２２誘導体に代表されるＣｏｌＥ系プラスミド、ｐ１５Ａオリジンを持つｐＡＣＹＣ系プラスミド、ｐＳＣ系プラスミド、Ｂａｃ系等のＦ因子由来ミニＦプラスミド等が挙げられる。
【００４０】
本実施形態の組換えベクターによれば、濾過に使用される膜に生じるファウラント等のバイオフィルムを効果的に分解することができる。
【００４１】
（形質転換体）
本実施形態の形質転換体は、本実施形態のベクターを含むものである。
【００４２】
本実施形態の形質転換体の調製に用いられる遺伝子導入の方法としては、当該技術分野において公知の方法が挙げられる。
【００４３】
このような方法としては、例えば、酵素等の目的タンパク質をコードする遺伝子を有するプラスミドベクターを、塩化カルシウムで処理された菌体（コンピテントセル）を用いる手法やエレクトロポレーション法等により、宿主細胞に導入する方法、目的タンパク質をコードする遺伝子が導入されたファージベクターを菌体に感染させることによって菌の染色体中に導入する方法等が挙げられる。
【００４４】
宿主としては、特に限定されることなく、あらゆる細胞が挙げられが、細菌又は真菌が好ましい。
【００４５】
細菌としては、グラム陽性菌であってもグラム陰性菌であってもよい。
グラム陽性細菌としては、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属細菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌等が挙げられ、特に、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌が好ましい。
グラム陰性細菌としては、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属細菌、ビブリオ（Ｖｉｖｒｉｏ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌等が挙げられ、特に、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌が好ましい。
特に、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌としては、特に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が好ましい。大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の株としては、当該技術分野において公知のものが挙げられ、例えば、ＤＨ５、ＪＭ１０９等が挙げられる。
【００４６】
真菌としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物等が挙げられ、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物が好ましい。
【００４７】
宿主としては、上記細菌及び真菌の他に、例えば、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞等が挙げられる。
【００４８】
なお、上記宿主は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４９】
遺伝子導入では、目的遺伝子の染色体上でのコピー数を増加させることによって、目的タンパク質の活性を強化することが好ましい。宿主となる微生物が本来保有していない酵素の遺伝子を導入する場合は、微生物は染色体上にその遺伝子を１コピー以上備えていることが好ましく、また、宿主となる微生物が保有している酵素の遺伝子を導入する場合は、微生物は染色体上にその遺伝子を複数コピー、望ましくは２コピー以上、更に望ましくは３コピー以上備えていることが好ましい。
本発明における遺伝子導入では、目的遺伝子の導入を、宿主細胞にその遺伝子を搭載しているプラスミドを導入することによっても、達成することができる。
ここで、コピー数の増加は、トランスポゾン、Ｍｕファージ等を利用して、宿主のゲノム上に目的遺伝子を転移させることによっても達成することができる。
【００５０】
なお、前述の遺伝子導入に用いられるシステムは、常法により、下記の培養において目的遺伝子の発現を誘導することが可能となるように、構築することが好ましい。かかる誘導としては、例えば、ＩＰＴＧ誘導、アラビノース誘導等が挙げられる。ここで、ベクター中に用いられるプロモーターとしては、ｔｒｃやｔａｃ等のトリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター等が挙げられる。
【００５１】
以下、形質転換体の培養の詳細について記載する。
【００５２】
［培養方法］
培養方法としては、特に限定されることなく、当該技術分野において通常用いられる方法を用いてよく、バッチ培養（回分培養）、流加培養（半回分培養）、連続培養（灌流培養）等が挙げられる。
【００５３】
［培養条件］
培養条件としては、特に限定されることなく、標準的な細胞培養条件を用いることができる。
宿主細胞の性質に応じて、好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で培養を行うこともできる。
培養温度としては、２０℃〜３７℃が好ましく、培養雰囲気としては、ＣＯ2濃度約６％〜約８４％であることが好ましく、ｐＨとしては、約５〜約９であることが好ましい。
【００５４】
［培地］
用いられる培地としては、特に限定されることなく、天然培地、合成培地が挙げられ、細菌の栄養源たる炭素源を含む培地であり、任意選択的に、窒素源、有機微量栄養源、無機物（ミネラル）等を含む培地としてよい。
炭素源としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、転化糖等の炭水化物；炭素数が１の化合物（以下、Ｃ１化合物という。）；脂質（オイル等）；脂肪酸；グリセリン脂肪酸エステル；ポリペプチド；再生可能な炭素源；酵母エキス；リン脂質；グリセロ脂質；グリセロール；アセテート等が挙げられる。
これらの炭素源は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５５】
炭素源についての詳細は、本実施形態の抽出物や本実施形態の可溶性画分を調製するための培養物の調製について前述したとおりとしてよい。
特に、多糖類としては、具体的には、デンプン、グリコーゲン、ペクチン、グァーガム、アラビアガム、キサンタンガム、ジェランガム、タマリンドガム、ローカストビーンガム、カラギーナン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ゼラチン、寒天、グルコマンナン、ヘパリン、ヒアルロン酸、アルギン酸、アルギン酸プロピレングリコール、プルラン、サイリウム、カードラン、プロピレングリコールが挙げられ、β−１，４結合を切断する活性を備える形質転換体を効率的に得る観点から、キサンタンガム、ジェランガムが好ましい。
【００５６】
本実施形態の形質転換体によれば、濾過に使用される膜に生じるファウラント等のバイオフィルムを効果的に分解することができる。
【００５７】
（バイオフィルムを分解する方法）
本実施形態のバイオフィルムを分解する方法は、本実施形態の抽出物、本実施形態の可溶性画分、又は本実施形態のタンパク質を用いるものである。
【００５８】
本実施形態のバイオフィルムを分解する方法においては、２０℃以上の好気条件で混合を行うことが好ましい。
【００５９】
以上、図面を参照して、本発明の抽出物、可溶性画分、タンパク質、バイオフィルムを分解する方法等の実施形態について例示説明したが、上記実施形態には適宜変更を加えることができ、本発明は上記例示の実施形態に限定されることはない。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【００６１】
＜活性汚泥の発見＞
膜分離活性汚泥法で濾過に用いられている濾過膜にファウリングが生じていた。
ファウラントについて解析したところ、ウロン酸等を含有する多糖の一種が含まれることがわかった。
一方、製糖工場の廃水処理活性汚泥由来の汚泥を上記ファウラントに添加したところ、ファウラントが分解されることがわかった。
【００６２】
上記汚泥約１ｇを２０ｍＬスケールでキサンタン培地中で２８℃で７２時間培養した培養物の培養上清２ｍＬを、それぞれ、キサンタンガム５００ｍｇ、ポリガラクツコン酸５００ｍｇ、グルクロン酸５００ｍｇ、ガラクツロン酸５００ｍｇ、グルコース５００ｍｇに加えて、サンプル溶液を調製し、
これら各溶液を、２８℃で培養し、バイオフィルムの分解により生じるウロン酸の溶液中での濃度（ｐｐｍ）を経時的に測定した。
なお、培養上清のみとしたコントロールも用意した。
ファウラント分解活性を有する汚泥（活性汚泥）から得られた混合菌液の培養上清中に、細胞由来の多糖であるキサンタン等を含むバイオフィルムを分解する活性があることが見出された。
図１に、活性汚泥から得られた混合菌液の培養上清を用いてキサンタン等を分解する実験を行ったときの結果を示す。
【００６３】
＜バイオフィルム分解活性タンパク質の同定＞
キサンタン等を含むバイオフィルムを分解する活性を備えるタンパク質を同定する実験を行った。
【００６４】
上記混合菌を、ＢＳ−キサンタン培地（キサンタン終濃度０．５％）において２週間培養し、その後、ファーメンターにおいて２日間培養した。
培養液について、遠心分離を行い、上清を採取し、この上清について限外濾過膜（旭化成株式会社製、ＡＨＰ−００１３）による分画を行い、約１０倍に濃縮された５０ｋＤａ以上の可溶性画分を得た。
５０ｋＤａ以上の可溶性画分をフィルター滅菌し、タンパク質成分を１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後のゲルについて、ＣＢＢ染色及び銀染色を行った。
図２に、混合菌の培養液の５０ｋＤａ以上の可溶性画分についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったときの結果を示す。
【００６５】
５０ｋＤａ以上の可溶性画分について、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる精製を行い、分子量に応じた画分を得た。
陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる精製は下記に従って行った。
カラム：Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥヘルスケア社製）５ｍＬ
条件及び操作：
・２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．４）を５０ｍＬ（カラムの約１０倍）用いてカラムを平衡化した。
・ＮａＣｌをそれぞれ０．１Ｍ、０．２５Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍで含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．４）４ｍＬずつを用いて、ＮａＣｌ濃度を上げながらステップワイズ溶出を行い、１ｍＬずつサンプリングして、各画分を得た。
図３に、混合菌の培養液の５０ｋＤａ以上の可溶性画分について陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる精製を行ったときの分画プロファイルを示す。
【００６６】
また、各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。電気泳動後のゲルについて銀染色を行った。
図４に、混合菌の培養液の５０ｋＤａ以上の可溶性画分について陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる精製を行ったときの各画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったときの結果を示す。図中、矢印Ａは７０ｋＤａのバンドの位置を示し、矢印Ｂは５０ｋＤａのバンドの位置を示す。
【００６７】
図４に示すとおり、分子量約５０ｋＤａのタンパク質（以下、「タンパク質Ａ」ともいう。）や、分子量約７０ｋＤａのタンパク質（以下、「タンパク質Ｂ」ともいう。）等が、上記精製により見出された。
【００６８】
上述の図４に示される精製により得られた主としてタンパク質Ａを含む画分（図４において画分７等）について、５０ｋＤａカットのスピンカラム（タカラバイオ社製）を使用して、バッファを純水に置換することで脱塩し、調製した精製タンパク質Ａ溶液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後のゲルについて、ＣＢＢ染色を行った。
図５に、精製タンパク質Ａ溶液についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったときの結果を示す。
【００６９】
上述のとおり精製により見出されたタンパク質Ａやタンパク質Ｂ等の特徴的なタンパク質がキサンタン依存性であれば、これらのタンパク質がキサンタンを炭素源とする菌が特徴的に有するものと言える。
そのため、比較実験として、ファウラント分解活性を有する混合菌を、ＢＳ−キサンタン培地で培養すると共に、キサンタン以外の炭素源を含むＢＳ培地でも、培養した。
使用した培地は、２０ｍＭグルコース含有ＢＳ培地、１０ｍＭグルコース及び１０ｍＭマンノース含有ＢＳ培地、０．０５％キサンタン含有ＢＳ培地、とした。
培養液について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後のゲルについて、銀染色を行った。
図６にファウラント分解活性を有する混合菌を各種ＢＳ培地（グルコース含有ＢＳ培地、グルコース及びマンノース含有ＢＳ培地、キサンタン含有ＢＳ培地）で培養した培養液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったときの結果を示す。図中、Ｍはマーカーを示し、レーン１は２０ｍＭグルコース含有ＢＳ培地での培養液を示し、レーン２は１０ｍＭグルコース及び１０ｍＭマンノース含有ＢＳ培地での培養液示しを、レーン３は０．０５％キサンタン含有ＢＳ培地での培養液を示す。図中、レーン１の矢印及びレーン２の矢印はいずれも５０ｋＤａのバンドの位置を示し、レーン３の矢印は５０ｋＤａのバンドの位置及び７０ｋＤａのバンドの位置を示す。
【００７０】
図６に示すとおり、３つのサンプルのいずれにおいても分子量約５０ｋＤａのバンドが観察されたが、０．０５％キサンタン含有ＢＳ培地での培養液（レーン３）におけるバンドが分子量からみて上述のタンパク質Ａに相当するバンドであると結論付けられた。また、レーン３では、分子量約７０ｋＤａのタンパク質Ｂに相当するバンドも確認された。
この結果から、タンパク質Ａやタンパク質Ｂがキサンタンを炭素源とする菌に特有のものであることが示唆された。
【００７１】
次いで、５０ｋＤａ以上の可溶性画分を含む抽出物がバイオフィルム分解活性を備えるかどうかを下記の実験により確認した。
キサンタン溶液は、キサンタン（シグマアルドリッチ社製）０．５ｇに２０ｍＭリン酸バッファ１０００ｍＬに溶かして作製した。
キサンタン溶液１００ｍＬに５０ｍＭリン酸バッファ１ｍＬ添加したコントロールと、キサンタン溶液１００ｍＬに精製タンパク質Ａ溶液１ｍＬを添加し、２４時間インキュベーションした試料とについて、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）による解析を行った。
【００７２】
ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）による解析は下記に従って行った。
装置：日立社製  Ｃｈｒｏｍａｓｔｅｒシリーズ
分別カラム：Ｓｈｏｄｅｘ社製  ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０６  ＨＱ
ガードカラム：Ｓｈｏｄｅｘ社製ＯＨｐａｋ  ＳＢ−Ｇ
測定溶媒：５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ４）
試料濃度：インキュベート後の液を０．４５μｍのフィルターでろ過し、そのまま用いた
注入量：２０μＬ
測定温度：４０℃
流速：１ｍＬ／分
較正曲線の作成には分子量の異なるプルラン８種類（分子量：１６６００００、３８００００、１８６０００、１０００００、４８０００、２３７００、１２２００、５８００）を用いた。３次直線の近似式を用いて検量線を作成した。
図７（Ａ）に、コントロールについてのＧＰＣプロファイルを示す。縦軸に強度（ｍＶ）を示し、横軸に時間経過（分）を示す。右上図に、特に４分後から７分後の部分のプロファイルを拡大して示す。
図７（Ｂ）に、試料についてのＧＰＣプロファイルを示す。縦軸に強度（ｍＶ）を示し、横軸に時間経過（分）を示す。右上図に、特に４分後から７分後の部分のプロファイルを拡大して示す。
【００７３】
図７（Ａ）に示すとおり、コントロールの場合には、キサンタン（分子量約１０6〜１０7）のピークが、保持時間約５分から約６分の間に観察され、ピークトップの保持時間は５．３分であった。
一方、図７（Ｂ）に示すとおり、精製タンパク質Ａ溶液を添加した試料の場合には、保持時間約５分から約６分の間にピークが観察されたが、保持時間が５．４分であるピークトップと共に、保持時間が５．８分であるピークトップも、観察された。
この結果から、キサンタンのピークが低分子量側にシフトしたことから、タンパク質Ａによってキサンタンが分解されたことがわかり、ピーク面積の分析（データ示さず）から約半分のキサンタンが分解されたことが示唆された。
【００７４】
以上から、分子量約５０ｋＤａのタンパク質Ａを含む５０ｋＤａ以上の可溶性画分を含む抽出物にバイオフィルムを分解する活性があることが見出された。
【００７５】
＜ファウラント分解活性を有する菌株の同定＞
前述のファウラント分解活性を有する混合菌液を、ＳＣＤ培地（ベクトン・ディッキンソン社製、ＢＢＬ（登録商標））にて、好気性条件下、３０℃で３〜５日間培養したところ、６種類の菌（Ｎｏ．Ｂ１〜Ｎｏ．Ｂ６）が単離された。なお、カビや酵母は除外した。
図８（Ａ）に、ファウラント分解活性を有する混合菌液から単離された６種類の菌（Ｎｏ．Ｂ１〜Ｎｏ．Ｂ６）の生育状態を示す。
【００７６】
Ｎｏ．Ｂ１〜Ｎｏ．Ｂ６をＢＳ−キサンタン培地にて、好気性条件下３０℃で３〜５日間培養したところ、Ｎｏ．Ｂ２のみが生育した。
図８（Ｂ）に、ファウラント分解活性を有する混合菌液から単離された６種類の菌（Ｎｏ．Ｂ１〜Ｎｏ．Ｂ６）のうちＮｏ．Ｂ２の生育状態を示す。
【００７７】
このＮｏ．Ｂ２は、１８１４０−Ｂ２として、２０１７年７月７日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５０６として寄託した。
【００７８】
Ｎｏ．Ｂ２培養上清にキサンタン分解活性があるかどうかについて解析した。
１ｇ／Ｌのキサンタン水溶液１００ｍＬにＮｏ．Ｂ２培養上清１０ｍＬを添加し、２０日インキュベーションし、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）による解析を行った。
図９に、Ｎｏ．Ｂ２培養上清を用いてキサンタンを分解する実験を行ったときの結果を示す。
【００７９】
図９に示すとおり、培養時間７日でキサンタン濃度はほぼ０となった。
【００８０】
Ｎｏ．Ｂ２培養上清中のタンパク質を解析した。
Ｎｏ．Ｂ２培養上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後のゲルについて、銀染色を行った。このとき、コントロールとして、Ｎｏ．Ｂ２培養液（左図）と、精製タンパク質Ａ溶液（中図）とを用意し、比較検討した。
図１０に、Ｎｏ．Ｂ２培養上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったときの結果を示す。図中、Ｍはマーカーを示し、レーン１はＮｏ．Ｂ２培養液を示し、レーン２は精製タンパク質Ａ溶液を示し、レーン３はＮｏ．Ｂ２培養上清を示す。
図１０に示すとおり、分子量約５０ｋＤａのバンドが検出され、Ｎｏ．Ｂ２培養上清に前述のタンパク質Ａが存在することが示唆された。
【００８１】
また、Ｎｏ．Ｂ２の菌株の同定を行った。
Ｎｏ．Ｂ２の菌体からＭＯ  ＢＩＯ社製ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ＤＮＡキットを製造者のマニュアルに従って用いてＮｏ．Ｂ２の菌のゲノムＤＮＡを抽出した。
ゲノムＤＮＡについて次世代シーケンサを使用して配列解析を行った。
配列解析は下記に従って行った。
装置：Ｉｌｌｕｍｉｎ−ＨｉＳｅｑ
解析方法：Ｐａｉｒｅｄ  Ｅｎｄ
読み取り塩基長：１００塩基／１リード
取得リード数：１０００万リードペア（２０００万リード）／検体
取得データ量：２Ｇｂ／検体
【００８２】
Ｎｏ．Ｂ２の菌のゲノムＤＮＡの配列について１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列解析を行った。
１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列解析は下記に従って行った。
ＤＮＡ抽出：アクロモペプチダーゼ（和光純薬社製）
ＰＣＲ増幅：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）
サイクルシークエンス：ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｗｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）
シークエンス：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１３０  ｘ１  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）
ＢＬＡＳＴ相同性検索；
ソフトウェア：テクノスルガ・ラボ微生物同定システム（テクノスルガ・ラボ社製）
データベース：ＤＢ−ＢＡ１１．０（テクノスルガ・ラボ社）、国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＮＡ（ＥＭＢＬ）／ＧｅｎｅＢａｎｋ）
【００８３】
その結果、ゲノムＤＮＡは、Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ（又は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ（アルスロバクター・ニコチノボランス））と９９．８％の同一性を有する塩基配列を備えることがわかった。Ｎｏ．Ｂ２は、Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓと同定された。
【００８４】
また、Ｎｏ．Ｂ２の菌のゲノムＤＮＡの配列について、ＲＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｒａｓｔ．ｎｍｐｄｒ．ｏｒｇ／）によるアノテーションを行った。
その結果、グルカナーゼをコードする塩基配列に類似性の高い塩基配列が４つ見出された。
４つの塩基配列は、配列番号１（Ｎｏ．２５６７）、配列番号２（Ｎｏ．７５３）、配列番号３（Ｎｏ．２４６）、配列番号４（Ｎｏ．２５８４）であった。
配列番号１の塩基配列は、エンドグルカナーゼＡ前駆体をコードする配列と類似していた。配列番号２の塩基配列は、エンド−１，４−β−グルカナーゼをコードする配列と類似していた。配列番号３の塩基配列は、エンドグルカナーゼ、ファミリー２６、Ｓ層ドメインタンパク質をコードする配列と類似していた。配列番号４の塩基配列は、エンドグルカナーゼ、ファミリー２６、Ｓ層ドメインタンパク質をコードする配列と類似していた。
添付の配列表に、配列番号１〜配列番号４の塩基配列を示す。
【００８５】
特に、配列番号１（Ｎｏ．２５６７）について、遺伝子組換えにより、大腸菌を用いて、大量発現を行った。
【００８６】
常法により、配列番号１（Ｎｏ．２５６７）の塩基配列を含むベクターｐＢＩＣ１を調製した。
【００８７】
常法により、調製したベクターｐＢＩＣ１を大腸菌に導入して形質転換を行った。
【００８８】
常法により、形質転換した大腸菌を培養し、発現誘導をかけて、配列番号１（Ｎｏ．２５６７）でコードされるタンパク質の大量発現を行った。得られたタンパク質をカラムを用いて精製した。
【００８９】
得られたタンパク質を解析した。
得られたタンパク質溶液について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後のゲルについて、抗体染色を行った。
図１１に、大量発現させた配列番号１（Ｎｏ．２５６７）でコードされるタンパク質（未精製の）についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。図中、Ｍはマーカーを示し、Ｃはコントロールを示し、レーン１は１５０ｎｇを示し、レーン２は７５ｎｇを示す。また、ｓｕｐｅｒは上清を示し、ｐｐｔは沈殿を示す。
図１２に、大量発現させた配列番号１（Ｎｏ．２５６７）でコードされるタンパク質（Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにより精製）についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。図中、Ｍはマーカーを示し、Ｃはコントロールを示し、ＦＴは洗浄液を示し、レーン１は１回目溶出液を示し、レーン２は２回目溶出液を示し、レーン３は３回目溶出液を示し、レーン４は４回目溶出液を示し、レーン５は５回目溶出液を示す。また、ｓｕｐｅｒは上清を示し、ｐｐｔは沈殿を示す。
図１１及び図１２に示すとおり、分子量約５０ｋＤａのバンドが検出され、Ｎｏ．Ｂ２培養上清に前述のタンパク質Ａが存在することが示唆された。
【００９０】
上記大量発現させた配列番号１（Ｎｏ．２５６７）によりコードされるタンパク質について、キサンタン分解活性を確認したところ、キサンタン分解活性が見出された。
タンパク質溶液にキサンタン分解活性があるかどうかについて解析した。
１ｇ／Ｌのキサンタン水溶液１００ｍＬに上述のタンパク質溶液１ｍＬを添加し、２４時間インキュベーションし、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）による解析を行った。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明によれば、濾過に使用される膜に生じるファウラント等のバイオフィルムを効果的に分解することができる。
【受託番号】
【００９２】
生物材料寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター
あて名：旭化成株式会社  マイクローザ技術開発部
受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５０６
寄託の日付：２０１７年７月７日
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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