(57)【要約】【課題】本発明の目的は、多重特異性抗体、及び複数の異なった抗原又はエピトープに対して特異的に結合する多重特異性活性化可能抗体、及び種々の治療的、診断的及び予防的適用のためへのそれらの多重特異性抗体及び／又は多重特異性活性化可能抗体の製造方法及びそれらへの使用方法を提供することである。【解決手段】本発明は、多重特異性抗体の少なくとも１つの抗原−又はエピトープ結合ドメインに連結される少なくとも１つのマスキング部分（ＭＭ）を含む多重特異性抗体であり、ここでＭＭのカップリングが、抗原−又はエピトープ−結合ドメインのその標的を結合する能力を低める、多重特異性活性化可能抗体を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化された状態で、２つ以上の標的、２つ以上のエピトープ、又は２つ以上の標的及び２つ以上のエピトープの組合せを結合する多重特異性活性化可能抗体であって、
第１標的又はエピトープを特異的に結合する、少なくとも第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ1）；
第２標的又はエピトープを特異的に結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）；
前記多重特異性活性化可能抗体が未切断状態にある場合、前記ＡＢ１のその標的への結合を阻害する少なくとも第１マスキング部分（ＭＭ１）；及び
前記ＡＢ１にカップリングされる少なくとも第１切断部分（ＣＭ１）、ここで前記ＣＭ１はプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである
を含む、抗体。
【請求項２】
前記ＭＭ１が、ＡＢ１のその標的又はエピトープへの結合のための平衡解離定数よりも大きい、ＡＢ１への結合のための平衡解離定数を有する、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項３】
前記ＭＭ１が、前記多重特異性活性化可能抗体が切断された状態にある場合、その標的又はエピトープへの結合のために、前記ＡＢ１を妨害しないか、又は前記ＡＢ１と競争しない、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項４】
前記プロテアーゼが組織において前記第１標的又はエピトープと共局在され、そして前記プロテアーゼが、前記多重特異性活性化可能抗体がプロテアーゼに暴露される場合、前記多重特異性活性化可能抗体におけるＣＭを切断する、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項５】
未切断状態下での前記多重特異性活性化可能抗体の少なくとも一部が、以下のＮ−末端からＣ−末端の構造配置：ＭＭ１−ＣＭ１−ＡＢ１又は ＡＢ１−ＣＭ１−ＭＭ１を有する、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項６】
前記多重特異性活性化可能抗体が、ＭＭ１とＣＭ１との間に結合ペプチドを含む、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項７】
前記多重特異性活性化可能抗体が、ＣＭ１とＡＢ１との間に結合ペプチドを含む、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項８】
前記多重特異性活性化可能抗体が、第１結合ペプチド（ＬＰ１）及び第２結合ペプチド（ＬＰ２）を含み、そして未切断状態下での前記多重特異性活性化可能抗体が、以下のＮ−末端からＣ−末端への構造配置：ＭＭ１−ＬＰ１−ＣＭ１−ＬＰ２−ＡＢ１又はＡＢ１−ＬＰ２−ＣＭ１−ＬＰ１−ＭＭ１を有する、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項９】
前記２種の結合ペプチドがお互い同一である必要はない、請求項８に記載の多重特異性活性化可能。
【請求項１０】
各ＬＰ１及びＬＰ２が、約１〜約２０個の長さのアミノ酸のペプチドである。請求項８に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項１１】
前記ＭＭ１が、約２〜約４０個の長さのアミノ酸のポリペプチドである、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項１２】
前記ＭＭ１ポリペプチド配列が前記第１標的の配列と異なり、そして前記ＭＭ１ポリペプチド配列が、前記ＡＢ１の何れかの天然の結合パートナーと５０％以下の同一である、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項１３】
前記ＣＭ１が、１５個までの長さのアミノ酸のポリペプチドである、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項１４】
前記ＡＢ１及び／又はＡＢ２の抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）2フラグメント、ｓｃＦｖ，ｓｃａｂ、ｄＡｂ、単一ドメインＨ鎖抗体、及び単一ドメインＬ鎖抗体から成る群から選択される、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項１５】
前記ＣＭ１が、表３に列挙されるプロテアーゼから選択されるプロテアーゼのための基質である、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項１６】
前記多重特異性活性化可能抗体が未切断状態にある場合、ＡＢ２のその標的への結合を阻害する第２マスキング成分（ＭＭ２）、及び前記ＡＢ２にカップリングされる第２切断可能部分（ＣＭ２）を含み、ここで前記ＣＭ２が第２プロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項１７】
ＣＭ２が、１５個以下の長さのアミノ酸のポリペプチドである、請求項１６に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項１８】
前記第２プロテアーゼが組織において前記第２標的又はエピトープと共局在され、そして前記第プロテアーゼが、前記多重特異性活性化可能抗体が第２プロテアーゼに暴露される場合、前記多重特異性活性化可能抗体におけるＣＭ２を切断する、請求項１６に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項１９】
前記第１プロテアーゼ及び第２プロテアーゼが、組織において、第１標的又はエピトープ及び第２標的又はエピトープと共局在される、請求項１８に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項２０】
前記第１プロテアーゼ及び前記第２プロテアーゼが、同じプロテアーゼである、請求項１８に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項２１】
ＣＭ１及びＣＭ２が、同じプロテアーゼのための異なった基質である、請求項２０に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項２２】
前記プロテアーゼが、表３に示されるプロテアーゼから成る群から選択される、請求項２０又は２１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項２３】
前記第１プロテアーゼ及び第２プロテアーゼが、異なったプロテアーゼである、請求項１８に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項２４】
前記第１プロテアーゼ及び第２プロテアーゼが、表３に示されるプロテアーゼから成る群から選択される異なったプロテアーゼである、請求項２３に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項２５】
ＡＢ１及びＡＢ２の少なくとも１つに接合される剤を含む、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項２６】
前記剤が、治療剤、抗腫瘍剤、トキシン又はそのフラグメント、検出可能部分、又は診断剤である、請求項２５に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項２７】
前記剤が、ＡＢ１及びＡＢ２の少なくとも１つに、リンカーを介して接合される、請求項２５に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項２８】
前記リンカーが切断可能リンカーである、請求項２７に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項２９】
前記リンカーが非切断可能リンカーである、請求項２７に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項３０】
ＡＢ１及びＡＢ２の少なくとも１つが、標的化抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項３１】
ＡＢ１及びＡＢ２の少なくとも１つが、免疫エフェクター細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項３２】
ＡＢ１及びＡＢ２の少なくとも１つが、白血球動員抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項３３】
ＡＢ１及びＡＢ２の少なくとも１つが、Ｔ−細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項３４】
ＡＢ１及びＡＢ２の少なくとも１つが、ＮＫ−細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項３５】
ＡＢ１及びＡＢ２の少なくとも１つが、マクロファージ動員抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項３６】
ＡＢ１及びＡＢ２の少なくとも１つが、単核細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項３７】
前記多重特異性活性化可能抗体が、（ａ）標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及び（ｂ）免疫エフェクター細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項３８】
前記多重特異性活性化可能抗体が、（ａ）標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及び（ｂ）Ｔ−細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項３９】
前記多重特異性活性化可能抗体、少なくとも２つの標的化抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項４０】
ＡＢ１及びＡＢ２の少なくとも１つが、ｓｃＦｖである、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項４１】
前記標的化抗体がＩｇＧであり、そして免疫エフェクター細胞動員抗体がｓｃＦｖである、請求項３７に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項４２】
前記標的化抗体がＩｇＧであり、そしてＴ−細胞動員抗体がｓｃＦｖである、請求項３８に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項４３】
ＡＢ１及びＡＢ２の少なくとも１つが、抗−ＣＤ３イプシロンｓｃＦｖである、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項４４】
前記抗−ＣＤ３イプシロンｓｃＦｖがＯＫＴ３に由来する、請求項４３に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項４５】
ＡＢ１及びＡＢ２の少なくとも１が、表１における標的群から選択される標的に結合する抗体であるか、又はその抗体に由来する、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項４６】
ＡＢ１及びＡＢ２の少なくとも１つが、抗−Ｊａｇｇｅｄ抗体又は抗−ＥＧＦＲ抗体であるか、又はその抗体に由来する、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項４７】
ＡＢ１及びＡＢ２の少なくとも１つが、抗−ＥＧＦＲ抗体であるか、又はその抗体に由来する、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項４８】
ＡＢ１及びＡＢ２の少なくとも１つが、抗−Ｊａｇｇｅｄ抗体であるか、又はその抗体に由来する、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項４９】
ＡＢ１の少なくとも１つが抗−Ｊａｇｇｅｄ抗体又は抗−ＥＧＦＲ抗体であるか、又はその抗体に由来し、そしてＡＢ２の少なくとも１つが抗−ＣＤ３イプシロンｓｃＦｖであるか、又はそれに由来する、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項５０】
ＡＢ１の少なくとも１つが抗−ＥＧＦＲ抗体であるか、又はその抗体に由来し、そしてＡＢ２の少なくとも１つが抗−ＣＤ３イプシロンｓｃＦｖであるか、又はそれに由来する、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項５１】
ＡＢ１の少なくとも１つが抗−Ｊａｇｇｅｄ抗体であるか、又はその抗体に由来し、そしてＡＢ２の少なくとも１つが抗−ＣＤ３イプシロンｓｃＦｖであるか、又はそれに由来する、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項５２】
ＡＢ１及びＡＢ２の少なくとも１つが、表７に示されるアミノ酸配列の少なくとも１部を含む、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項５３】
ＡＢ１及びＡＢ２の少なくとも１つが、配列番号２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１４、３３６で示されるようなアミノ酸配列、又はその何れかの組合せの少なくとも一部を含む、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項５４】
ＡＢ１が第１標的を結合し、そしてＡＢ２が第２標的に結合し、そして前記第１標的及び第２標的が異なっている、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項５５】
ＡＢ１が第１エピトープを結合し、そしてＡＢ２が第２エピトープを結合する、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項５６】
前記第１エピトープ及び第２エピトープが同じ標的上に存在する、請求項５５に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項５７】
前記第１エピトープ及び第２エピトープが異なった標的上に存在する、請求項５５に記載の多重特異性活性化可能抗体。
【請求項５８】
請求項１に記載される多重特異性活性化可能抗体をコードする、単離核酸分子。
【請求項５９】
請求項５８に記載の単離核酸分子を含むベクター。
【請求項６０】
多重特異性活性化可能抗体の発現をもたらす条件下で、請求項５８に記載の核酸分子を含む細胞を培養することによる、多重特異性活性化可能抗体の製造方法。
【請求項６１】
配列番号２４２、２４４、２４８、２５０、２７０、２７２、２７４、２７８、２８０、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１４、 ３３６で示されるような配列、又はその何れかの組合せを含む、２つ以上の標的を結合する、単離された多重特異性抗体。
【請求項６２】
前記抗体に結合される剤を含む、請求項６１に記載の抗体。
【請求項６３】
前記剤が、治療剤、抗腫瘍剤、トキシン又はそのフラグメント、検出可能部分、又は診断剤である、請求項６１に記載の抗体。
【請求項６４】
前記剤が、リンカーを介して抗体に接合される、請求項６１に記載の抗体。
【請求項６５】
前記リンカーが切断可能リンカーである、請求項６４に記載の抗体。
【請求項６６】
前記リンカーが非切断可能リンカーである、請求項６４に記載の抗体。
【請求項６７】
多重特異性活性化可能抗体の製造方法であって、
（ａ）多重特異性活性化可能抗体をコードする核酸コンストラクトを含む細胞を、多重特異性活性化可能抗体の発現をもたらす条件下で培養し、ここで前記活性化可能抗体が、第１標的又はエピトープを特異的に結合する、少なくとも第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ1）、第２標的又はエピトープを特異的に結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）、前記多重特異性活性化可能抗体が未切断状態にある場合、前記ＡＢ１のその標的への結合を阻害する少なくとも第１マスキング部分（ＭＭ１）、及び前記ＡＢ１にカップリングされる少なくとも第１切断部分（ＣＭ１）を含み、そして
（ｂ）前記活性化可能抗体を回収する
ことを含む、方法。
【請求項６８】
前記ＣＭ１が、プロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＣＭ１は前記活性化可能抗体に位置し、結果的に、未切断状態下で、前記ＭＭ１は第１標的又は第１エピトープへのＡＢ１の特異的結合を妨害し、そして切断された状態下で、ＭＭ１は第１標的又は第１エピトープへのＡＢ１の特異的結合を、妨害しないか、又はそれと競争しない、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
対象における障害に関連する臨床学的徴候の症状を緩和するための方法であって、請求項１に記載の多重特異性活性化可能抗体、又は請求項６１に記載の多重特異性抗体を、前記障害に関連する臨床学的徴候の症状を緩和するために十分な量、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項７１】
前記対象がヒトである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記障害が癌である、請求項７０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１３年７月２５日に提出された米国特許仮出願第６１／８５８，４０２号に対する利益を主張し、その内容は参照により全体が本明細書に組込まれる。
【０００２】
本発明は一般的に、多重特異性抗体、及び複数の異なった標的又はエピトープに対して特異的に結合する多重特異性活性化可能抗体、及び種々の治療的、診断的及び予防的適用のためへのそれらの多重特異性抗体及び／又は多重特異性活性化可能抗体の製造方法及びそれらへの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
モノクローナル抗体は、種々の障害における治療介入のための分子として浮上して来た。しかしながら、単一タンパク質の標的化又は中和は、単一特異性モノクローナル抗体の治療的使用を制限する、特定の障害の効果的治療のためには必ずしも十分ではない。さらに、抗体に基づく治療は、いくつかの疾患のためには効果的治療であることが分かっているが、しかしある場合、広い標的発現による毒性が、それらの治療有効性を制限して来た。さらに、抗体に基づく治療は、他の制限、例えば投与に続く循環からの急速なクリアランスを示してきた。
【０００４】
従って、単一分子による複数の標的及び／又は複数のエピトープの標的化を可能にし、そしてまた、意図される標的のための高められた選択性、及び投与に基づく副作用の軽減を提供する、抗体及び治療剤の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、多重特異性抗体及び多重特異性活性化可能抗体を提供する。多重特異性抗体は、複数の抗原又はエピトープを認識する抗体である。本明細書において提供される多重特異性活性化可能抗体は、多重特異性抗体の少なくとも１つの抗原−又はエピトープ結合ドメインに連結される少なくとも１つのマスキング部分（ＭＭ）を含む多重特異性抗体であり、ここでＭＭのカップリングが、抗原−又はエピトープ−結合ドメインのその標的を結合する能力を低める。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、プロテアーゼのための基質として機能する切断可能部分（ＣＭ）を介して、多重特異性抗体の抗原−又はエピトープ−結合ドメインにカップリングされる。本明細書において提供される多重特異性活性化可能抗体は、循環において安定し、治療及び／又は診断の意図される部位で活性化されるが、しかし正常な、すなわち健康な組織においては活性化されず、そして活性化される場合、その対応する、修飾されていない多重特異性抗体に、少なくとも匹敵する標的への結合を示す。
【０００６】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体及び／又は多重特異性活性化可能抗体は、また本明細書において免疫エフェクター動員多重特異性抗体及び／又は免疫エフェクター動員多重特異性活性化可能抗体としても言及される免疫エフェクター細胞を動員するよう企画される。いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体及び／又は多重特異性活性化可能抗体は、また白血病動員多重特異性抗体及び／又は白血病動員多重特異性活性化可能抗体として本明細書において言及される、白血球を動員するよう企画される。いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体及び／又は多重特異性活性化可能抗体は、またＴ−細胞動員多重特異性抗体及び／又はＴ−細胞動員多重特異性活性化可能抗体として本明細書において言及される、Ｔ−細胞を動員するよう企画される。いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体及び／又は多重特異性活性化可能抗体は、白血球、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄単核細胞、マクロファージ、及び／又は別の免疫エフェクター細胞上の表面抗原を動員する。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞は、白血球である。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞は、単核細胞、例えば骨髄単核細胞である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体及び／又は多重特異性活性化可能抗体は、多抗原標的化抗体及び／又は多抗原標的化、活性化可能抗体としても本明細書において言及される、複数の標的及び／又は複数のエピトープを結合するか、又は他方では、それと反応するよう企画される。本明細書において使用される場合、用語「標的（target）」及び「抗原（antigen）」とは、交換可能的に使用される。
【０００７】
いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞動員多重特異性抗体は、標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及び免疫エフェクター細胞動員抗体又は抗原結合部分を含む。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞動員多重特異性抗体は、癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及び免疫エフェクター細胞動員抗体又は抗原結合部分を含む。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞動員多重特異性抗体は、癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメント、及び免疫エフェクター細胞動員ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞は、白血球である。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞は、骨髄単核細胞である。
【０００８】
いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員多重特異性抗体は、標的化抗原又はその抗原結合フラグメント、及びＴ−細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員多重特異性抗体は、癌標的化抗原又はその抗原結合フラグメント、及びＴ−細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員多重特異性抗体は、癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメント、及びＴ−細胞動員ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員多重特異性抗体は、抗−ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε、又は、本明細書においては、ＣＤ３ｅ及びＣＤ３とも呼ばれる）ｓｃＦｖ、及び標的化抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員多重特異性抗体は、抗―ＣＤ３ε  ｓｃＦｖ、及び癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員多重特異性抗体は、抗―ＣＤ３ε  ｓｃＦｖ、及び癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞結合多重特異性抗体は、ＯＫＴ３由来の抗−ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態によれば、Ｔ細胞動員多重特異性抗体は、抗−ＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態によれば、本開示の免疫エフェクター細胞動員多重特異性活性化可能抗体は、標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及び免疫エフェクター細胞動員抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及び/又は免疫エフェクター細胞動員抗体又はその抗原結合部分の少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントは、第１免疫エフェクター細胞動員標的を結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、前記ＭＭ１のカップリングは、前記第１標的を結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントは、第１免疫エフェクター細胞動員標的を結合する、第１抗体又はその抗原フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的にＭＭ１のカップリングは、第１標的を結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又は抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２は、マスキング成分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、非免疫エフェクター細胞動員抗体は、癌標的化抗体である。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞動員抗体は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態によれば、標的化抗体（例えば、非免疫細胞エフェクター抗体）は、ＩｇＧであり、そして免疫エフェクター細胞動員抗体はｓｃＦｖである。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞は白血球である。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞は骨髄単核細胞である。
【００１０】
いくつかの実施形態によれば、本開示のＴ−細胞動員多重特異性活性化可能抗体は、標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及びＴ−細胞動員抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及び/又はＴ−細胞動員抗体又はその抗原結合部分の少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントは、第１Ｔ−細胞動員標的を結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、前記ＭＭ１のカップリングは、前記第１標的を結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントは、第１Ｔ−細胞動員標的を結合する、第１抗体又はその抗原フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的にＭＭ１のカップリングは、第１標的を結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又は抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２は、マスキング成分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
【００１１】
いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員多重特異性活性化可能抗体は、癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及びＴ−細胞動員抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及び/又はＴ−細胞動員抗体又はその抗原結合部分の少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントは、第１Ｔ−細胞動員標的を結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、前記ＭＭ１のカップリングは、前記第１標的を結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントは、第１Ｔ−細胞動員標的を結合する、第１抗体又はその抗原フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的にＭＭ１のカップリングは、第１標的を結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２癌関連標的を結合する、第２抗体又は抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２は、マスキング成分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
【００１２】
いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員多重特異性活性化可能抗体は、癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメント、及びＴ−細胞動員ｓｃＦｖを含み、ここで癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメント、及び/又はＴ−細胞動員抗体又はその抗原結合部分の少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントは、第１Ｔ−細胞動員標的を結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、前記ＭＭ１のカップリングは、前記第１標的を結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントは、第１Ｔ−細胞動員標的を結合する、第１抗体又はその抗原フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的にＭＭ１のカップリングは、第１標的を結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２癌関連標的を結合する、第２抗体又は抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２は、マスキング成分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
【００１３】
免疫エフェクター動員多重特異性活性化可能抗体のいくつかの実施形態によれば、１つの抗原は典型的には、腫瘍細胞、又は疾患に関連する他の細胞型の表面上に存在する抗原、例えば、表１に列挙されるに任意の標的、例えばＥＧＧＲ、ｅｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、Ｊａｇｇｅｄ、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３又はＣＤ７１（トランスフェリン受容体）であるが、但しそれらだけには限定されず、そして別の抗原は典型的には、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄単核細胞、マクロファージ、及び／又は他の免疫エフェクター細胞の表面上に存在する刺激又は阻害受容体、例えばＢ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ５６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、又は ＶＩＳＴＡであるが、但しそれらだけには限定されない。いくつかの実施形態によれば、抗原は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の表面上に存在する刺激受容体であり；そのような刺激受容体の例は、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７ (又は４−１ＢＢとしても言及される)、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＮＫＧ２Ｄ、及び ＯＸ４０を包含するが、但しそれらだけには制限されない。いくつかの実施形態によれば、抗原は、Ｔ−細胞の表面上に存在する阻害受容体であり；そのような阻害受容体の例は、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＰＤ−1、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３及びＮＫ−発現ＫＩＲを包含するが、但しそれらだけには限定されない。Ｔ−細胞表面抗原に対して特異性を与える抗体エフェクター細胞受容体、例えばＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７Ｈ３、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２又はＴＮＦＳＦ９（但し、それらだけには限定されない）に結合する、リガンド又はリガンドドメインにより置換され得る。
【００１４】
本開示の１つの実施形態は、癌微小環境において活性化でき、そして抗体、例えば腫瘍標的及びアゴニスト抗体に向けられるＩｇＧ又はｓｃＦｖ、例えば活性化されたＴ細胞又はＮＫ細胞の表面上で発現される共刺激受容体に向けられるＩｇＧ又はｓｃＦｖを含む多重特異性活性化可能抗体であり、ここで前記癌標的抗体及び／又はアゴニスト抗体の少なくとも１つはマスキングされている。共刺激受容体の例は、ＣＤ２７、 ＣＤ１３７、 ＧＩＴＲ、 ＨＶＥＭ、 ＮＫＧ２Ｄ及びＯＸ４０を包含するが、但しそれらだけには限定されない。この実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、腫瘍関連プロテーゼにより活性化されると、任意の腫瘍抗原に応答するＴ細胞の活性を、それらの内因性Ｔ細胞抗原又はＮＫ−活性化受容体を介して増強するために、腫瘍依存性態様でＴ細胞又はＮＫ細胞発現共刺激受容体を効果的に架橋し、そして活性化するであろう。それらのＴ細胞又はＮＫ細胞共刺激受容体の活性化−依存性質は、それらの抗原特異性に関係なく、すべてのＴ細胞を活性化しないで、腫瘍特異的Ｔ細胞に、活性化された多重特異性活性化可能抗体の活性の焦点を当てている。１つの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の少なくとも共刺激受容体抗体、多重特異性活性化可能抗体において腫瘍標的指向抗体により認識される抗原をまた発現する組織に存在することができる自己反応性Ｔ細胞の活性化を防止するために、マスキングされているが、しかしそれらの活性は、共受容体の動員の欠如により制限されている。
【００１５】
本開示の１つの実施形態は、Ｔ細胞過剰刺激により特徴づけられる疾患、例えば自己免疫疾患又は炎症性疾患の微小環境（但し、それらだけには限定されない）において活性化できる多重特異性活性化可能抗体である。そのような多重特異性活性化可能抗体は、抗体、例えば自己免疫炎症性疾患においてＴ細胞により標的化される組織において発現される表面抗原を含む標的に向けられたＩｇＧ又はｓｃＦｖ、及び抗体、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の表面上に発現される阻害受容体に向けられるＩｇＧ又はｓｃＦｖを含み、ここで疾患組織標的抗体及び／又はＴ細胞受容体抗体の少なくとも１つはマスキングされている。阻害受容体の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＰＤ−1、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３及びＮＫ−発現ＫＩＲ。自己免疫疾患におけるＴ細胞により標的化される組織抗原の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには制限されない：多発生硬化症におけるミエリン又は神経細胞上に発現される表面抗原、又は１型糖尿病における膵島細胞上に発現される表面抗原。この実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、自己免疫攻撃又は炎症下で組織に局在化される場合、活性化され、そして任意の疾患組織−標的化抗原に応答する自己反応性Ｔ細胞の活性を抑制するために、Ｔ細胞又はＮＫ細胞阻害受容体を、それらの内因性ＴＣＲ又は活性化受容体を介して共同動員する。１つの実施形態によれば、少なくとも１つの又は複数の抗体が、標的抗原がまた発現され得る非疾患組織における所望のＴ細胞応答の抑制を防ぐために、マスキングされる。
【００１６】
いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員多重特異性活性化可能抗体は、抗−ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε、またＣＤ３ｅ及びＣＤ３としても本明細書において言及される）ｓｃＦｖ及び標的化抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここで抗−ＣＤ３εｓｃＦｖ及び／又は標的化抗体又はその抗原結合フラグメントの少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態によれば、前記ＣＤ３ε  ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、前記ＣＤ３ε  ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
【００１７】
いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員多重特異性活性化可能抗体は、抗−ＣＤ３ε  ｓｃＦｖ及び癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここで抗−ＣＤ３εｓｃＦｖ及び／又は癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントの少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態によれば、前記ＣＤ３ε  ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、前記癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２の癌関連標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、前記ＣＤ３ε  ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２癌関連標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
【００１８】
いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員多重特異性活性化可能抗体は、抗−ＣＤ３ε  ｓｃＦｖ及び癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここで抗−ＣＤ３εｓｃＦｖ及び／又は癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントの少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態によれば、前記ＣＤ３ε  ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、前記癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２の癌関連標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、前記ＣＤ３ε  ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２癌関連標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
【００１９】
いくつかの実施形態によればＴ−細胞動員多重特異性活性化可能抗体は、ＯＫＴ３由来の抗−ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）ｓｃＦｖを含み、ここで標的抗体又はその抗原結合フラグメント及び／又はＯＫＴ３  ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖの少なくとも１つがマスキングされている。いくつかの実施形態によれば、前記ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、前記ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
【００２０】
いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員多重特異性活性化可能抗体は、ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖ及び癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここでＯＫＴ３  ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖ及び／又は癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントの少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態によれば、前記ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、前記癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２の癌関連標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、前記ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２癌関連標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
【００２１】
いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員多重特異性活性化可能抗体は、ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖ及び癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここでＯＫＴ３  ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖ及び／又は癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントの少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態によれば、前記ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、前記癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２の癌関連標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、前記ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２癌関連標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
【００２２】
いくつかの実施形態によればＴ−細胞動員多重特異性活性化可能抗体は、抗−ＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖを含み、ここで標的抗体又はその抗原結合フラグメント及び／又は抗−ＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖの少なくとも１つがマスキングされている。いくつかの実施形態によれば、前記抗−ＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ−４を結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＴＬＡ−４を結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、前記抗−ＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ−４を結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＴＬＡ−４を結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
【００２３】
いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員多重特異性活性化可能抗体は、抗−ＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖ、及び標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここで抗−ＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖ及び／又は標的ＩｇＧ抗体又はその抗原結合部分の少なく１つはマスキングされている。いくつかの実施形態によれば、前記抗−ＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ−４を結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＴＬＡ−４を結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、前記標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態によれば、前記抗−ＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ−４を結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＴＬＡ−４を結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
【００２４】
いくつかの実施形態によれば、多重抗原標的化抗体及び／又は多重抗原標的化活性化可能抗体は、第１標的及び／又は第１エピトープを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント、及び第２標的及び／又は第２エピトープを結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメントを少なくとも含む。いくつかの実施形態によれば、多重抗原標的化抗体及び／又は多重抗原標的化活性化可能抗体は、複数の異なった標的を結合する。いくつかの実施形態によれば、多重抗原標的化抗体及び／又は多重抗原標的化活性化可能抗体は、同じ標的上の複数の異なったエピトープを結合する。いくつかの実施形態によれば、多重抗原標的化抗体及び／又は多重抗原標的化活性化可能抗体は、複数の異なった標的及び同じ標的上の複数の異なったエピトープの組合せを結合する。
【００２５】
本開示の多重特異性活性化可能抗体の種々の実施形態が、図３Ａ、及び５−９に示されている。いくつかの実施形態によれば、ＩｇＧを含む多重特異性活性化可能抗体は、マスキングされたＩｇＧ可能ドメインを有する。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖを含む多重特異性活性化可能抗体は、マスキングされたｓｃＦｖドメインを有する。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの両者を有し、ここでＩｇＧ可変ドメインの少なくとも１つは、マスキングのブ部にカップリングされる。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの両者を有し、ここでｓｃＦｖドメインの少なくとも１つはマスキング部分にカップリングされる。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの両者を有し、ここでＩｇＧ可変ドメインの少なくとも１つは、マスキング部分にカップリングされ、そしてｓｃＦｖドメインの少なくとも１つはマスキング部分にカップリングされる。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの両者を有し、ここでＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの個々は、それ自体のマスキング部分にカップリングされる。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の１つの抗体ドメインは、標的抗原に対する特異性を有し、そして別の抗体ドメインは、Ｔ−細胞表面抗原に対する特異性を有する。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の１つの抗体ドメインは、標的抗原に対する特異性を有し、そして別の抗体ドメインは、別の標的抗原に対する特異性を有する。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の１つの抗体ドメインは、標的抗原のエピトープに対する特異性を有し、そして別の抗体ドメインは、標的抗原の別のエピトープに対する特異性を有する。
【００２６】
多重特異性活性化可能抗体においては、ｓｃＦｖは、ＩｇＧ活性可能抗体のＨ鎖のカルボキシル末端に、ＩｇＧ活性化可能抗体のＬ鎖のカルボキシル末端、又はＩｇＧ活性化可能抗体のＨ鎖及びＬ鎖の両鎖のカルボキシル末端に融合され得る。多重特異性活性化可能抗体においては、ｓｃＦｖは、ＩｇＧ活性化可能抗体のＨ鎖のアミノ末端に、ＩｇＧ活性化可能抗体のＬ鎖のアミノ末端に、又はＩｇＧ活性化可能抗体のＨ鎖及びＬ鎖の両鎖のアミノ末端に融合され得る。多重特異性活性化可能抗体においては、ｓｃＦｖは、ＩｇＧ活性可能性抗体の１又は２以上のカルボキシル末端及び１又は２以上のアミノ末端の何れかの組合せに融合され得る。いくつかの実施形態によれば、切断可能胃部分（ＣＭ）に連結されるマスキング部分（ＭＭ）は、ＩｇＧの抗原結合ドメインに結合され、そしてそのドメインをマスキングする。いくつかの実施形態によれば、切断可能部分（ＣＭ）に連結されるマスキング部分（ＭＭ）は、少なくとも１つのｓｃＦｖの抗原結合ドメインに結合され、そしてそのドメインをマスキングする。いくつかの実施形態によれば、切断可能部分（ＣＭ）に連結されるマスキング部分（ＭＭ）は、ＩｇＧの抗原結合ドメインに連結され、そしてそのドメインをマスキングし、そして切断可能部分（ＣＭ）に連結されるマスキング部分（ＭＭ）は、少なくとも１つのｓｃＦｖの抗原結合ドメインに結合され、そしてそのドメインをマスキングする。
【００２７】
本開示は、以下のもの（但し、それらだけには限定されない）を含む多重特異性活性化可能抗体構造の例を提供し：
(VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2; (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2;又は (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2、ここでＶＬ及びＶＨは、ＩｇＧに含まれる、第１特異性のＬ及びＨ可変ドメインを表し；ＶＬ*及びＶＨ*は、ｓｃＦｖに含まれる、第２特異性の可変ドメインを表し；Ｌ１は、マスキング部分（ＭＭ）及び切断可能部分（ＣＭ）を連結するリンカーペプチドであり；Ｌ２は、切断可能部分（ＣＭ）及び抗体を連結するリンカーペプチドであり；Ｌ３は、ｓｃＦｖの可変ドメインを連結するリンカーペプチドであり；Ｌ４は、第２特異性の抗体に、第１特異性の抗体を有するリンカーペプチドであり；ＣＬは、Ｌ鎖不変ドメインであり；そしてＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３は、Ｈ鎖不変ドメインである。前記第１及び第２特異性は、何れかの抗原又はエピトープに対して存在することができる。
【００２８】
Ｔ−細胞動員多重特異性活性化可能抗体のいくつかの実施形態によれば、１つの抗原は典型的には、腫瘍細胞又は疾患に関連する他の細胞型の表面上に存在する抗原、例えば表１に列挙される何れかの標的（但し、それらだけには限定されない）、例えばＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、Ｊａｇｇｅｄ、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３又は ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）（但し、それらだけには制限されない）であり、そして別の抗原は典型的には、Ｔ−細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄単核細胞、マクロファージ及び／又は他の免疫エフェクター細胞の表面上に存在する刺激（また、本明細書においては、活性化として言及される）又は阻害受容体、たとえばＢ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ５６、ＣＤ１３７（または、TNFRSF9としても言及される）、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、又は ＶＩＳＴＡ（但し、それらだけには制限されない）である。Ｔ−細胞表面抗原に対して特異性を提供する抗体ドメインはまた、Ｔ−細胞受容体、ＮＫ−細胞受容体、マクロファージ受容体及び／又は他の免疫エフェクター細胞受容体、例えばＢ７−１、 Ｂ７−２、Ｂ７Ｈ３、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２又はＴＮＦＳＦ９（但し、それらだけには制限されない）に結合するリガンド又はリガンドドメインにより置換され得る。多重抗原標的化活性化可能抗原のいくつかの実施形態によれば、１つの抗原は、表１に列挙される標的群から選択され、そして別の抗原は、表１に列挙される標的群から選択される。
【００２９】
いくつかの実施形態によれば、標的化抗原は、抗−ＥＧＦＲ抗体である。いくつかの実施形態によれば、標的化抗体は、ＥＧＦＲへの結合に対して特異的であるＣ２２５ｖ５である。いくつかの実施形態によれば、標的化抗体は、ＥＧＦＲへの結合に対して特異的であるＣ２２５である。いくつかの実施形態によれば、標的化抗体は、ＥＧＦＲへの結合に対して特異的であるＣ２２５ｖ４である。いくつかの実施形態によれば、標的化抗体は、ＥＧＦＲへの結合に対して特異的であるＣ２２５ｖ６である。いくつかの実施形態によれば、標的化抗体は、抗−Ｊａｇｇｅｄ抗体である。いくつかの実施形態によれば、標的化抗体は、ヒト及びマウスＪａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２への結合に対して特異的である４Ｄ１１である。いくつかの実施形態によれば、標的化抗体は、ヒト及びマウスＪａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２への結合に対して特異的である４Ｄ１１ｖ２である。
【００３０】
いくつかの実施形態によれば、標的化抗体は、活性化可能抗体の形で存在することができる。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、プロ−ｓｃＦｖの形で存在することができる（例えば、国際公開第２００９／０２５８４６号、国際公開第２０１０／０８１１７３号を参照のこと）。
【００３１】
いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、ＣＤ３εの結合に対して特異的であり、そしてＣＤ３ε、例えばＣＨ２５２７、ＦＮ１８、Ｈ２Ｃ、ＯＫＴ３、２Ｃ１１、ＵＣＨＴ１又はＶ９を結合する、抗体又はそのフラグメントであるか、又はそれに由来する。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ−４（また、本明細書においては、ＣＴＬＡ及びＣＴＬＡ４としても言及される）の結合に対して特異的である。
【００３２】
いくつかの実施形態によれば、抗−ＣＤ３ε  ｓｃＦｖは、表７及び／又は実施例５に示されるそれらの配列から成る群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−ＣＤ３ε  ｓｃＦｖは、表７及び／又は実施例５に示されるそれらの配列から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%、又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、１又は２以上のＴ−細胞、１又は２以上のＮＫ細胞及び／又は１又は２以上のマクロファージを結合することに対して特異的である。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ５６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、又は ＶＩＳＴＡから成る群から選択された標的を結合することに対して特異的である。
【００３４】
いくつかの実施形態によれば、本明細書において提供される、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、接合された多重特異性抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体は、Ｊａｇｇｅｄ標的、例えばＪａｇｇｅｄ１及び／又はＪａｇｇｅｄ２を特異的に結合し、そしてＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列及びＶＨ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここでＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、及びＶＨ  ＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、少なくともアミノ酸配列ＳＹＡＭＳ (配列番号 ６)を含むＶＨ  ＣＤＲ１配列；少なくともアミノ酸配列ＳＩＤＰＥＧＲＱＴＹＹＡＤＳＶＫＧ (配列番号７)を含むＶＨ  ＣＤ２配列；少なくともアミノ酸配列ＤＩＧＧＲＳＡＦＤＹ (配列番号８)を含むＶＨ  ＣＤＲ３配列；及びそれらの組合せから選択される。
【００３５】
いくつかの実施形態によれば、本明細書において提供される、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、接合された多重特異性抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体は、Ｊａｇｇｅｄ標的、例えばＪａｇｇｅｄ１及び／又はＪａｇｇｅｄ２を特異的に結合し、そしてＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここでＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列、及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、少なくともアミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹ (配列番号 ９)を含むＶＬ  ＣＤＲ１配列；少なくともアミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ (配列番号１０)を含むＶＬ  ＣＤ２配列；少なくともアミノ酸配列ＱＱＴＶＶＡＰＰＬ (配列番号１１)を含むＶＬ  ＣＤＲ３配列；及びそれらの組合せから選択される。
【００３６】
いくつかの実施形態によれば、本明細書において提供される、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、接合された多重特異性抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体は、Ｊａｇｇｅｄ標的、例えばＪａｇｇｅｄ１及び／又はＪａｇｇｅｄ２を特異的に結合し、そしてＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列及びＶＨ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここでＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、及びＶＨ  ＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、アミノ酸配列ＳＹＡＭＳ (配列番号 ６)に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列ＳＩＤＰＥＧＲＱＴＹＹＡＤＳＶＫＧ (配列番号７) に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含むＶＨ  ＣＤ２配列；アミノ酸配列ＤＩＧＧＲＳＡＦＤＹ (配列番号８) に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３配列；及びそれらの組合せから選択される。
【００３７】
いくつかの実施形態によれば、本明細書において提供される、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、接合された多重特異性抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体は、Ｊａｇｇｅｄ標的、例えばＪａｇｇｅｄ１及び／又はＪａｇｇｅｄ２を特異的に結合し、そしてＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここでＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列、及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹ (配列番号 ９) に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ (配列番号１０) に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含むＶＬ  ＣＤ２配列；アミノ酸配列ＱＱＴＶＶＡＰＰＬ (配列番号１１) に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３配列；及びそれらの組合せから選択される。
【００３８】
いくつかの実施形態によれば、本明細書において提供される、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、接合された多重特異性抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体は、Ｊａｇｇｅｄ標的、例えばＪａｇｇｅｄ１及び／又はＪａｇｇｅｄ２を特異的に結合し、そしてＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列、及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここでＶＨ  ＣＤＲ１配列は、少なくともアミノ酸配列ＳＹＡＭＳ (配列番号 ６)を含み；ＶＨ  ＣＤＲ２配列は、少なくともアミノ酸配列ＳＩＤＰＥＧＲＱＴＹＹＡＤＳＶＫＧ (配列番号７)を含み；ＶＨ  ＣＤＲ３配列は、少なくともアミノ酸配列ＤＩＧＧＲＳＡＦＤＹ (配列番号８)を含み；ＶＬ  ＣＤＲ１配列は、少なくともアミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹ (配列番号 ９)を含み；ＶＬ  ＣＤ２配列は、少なくともアミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ (配列番号１０)を含み；そしてＶＬ  ＣＤＲ３配列は、少なくともアミノ酸配列ＱＱＴＶＶＡＰＰＬ (配列番号１１)を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態によれば、本明細書において提供される、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、接合された多重特異性抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体は、Ｊａｇｇｅｄ標的、例えばＪａｇｇｅｄ１及び／又はＪａｇｇｅｄ２を特異的に結合し、そしてＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列、及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここでＶＨ  ＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＳＹＡＭＳ (配列番号 ６)に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含み；ＶＨ  ＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＳＩＤＰＥＧＲＱＴＹＹＡＤＳＶＫＧ (配列番号７) に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含み；ＶＨ  ＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＤＩＧＧＲＳＡＦＤＹ (配列番号８) に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含み；ＶＬ  ＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹ (配列番号 ９) に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含み；ＶＬ  ＣＤ２配列は、アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ (配列番号１０) に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含み；そしてＶＬ  ＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＱＱＴＶＶＡＰＰＬ (配列番号１１) に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、本明細書において提供される、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、接合された多重特異性抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を特異的に結合し、そしてＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列及びＶＨ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここでＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、及びＶＨ  ＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、少なくともアミノ酸配列ＮＹＧＶＨ (配列番号 １２)を含むＶＨ  ＣＤＲ１配列；少なくともアミノ酸配列ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳ (配列番号１３)を含むＶＨ  ＣＤ２配列；少なくともアミノ酸配列ＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹ (配列番号１４)を含むＶＨ  ＣＤＲ３配列；及びそれらの組合せから選択される。
【００４１】
いくつかの実施形態によれば、本明細書において提供される、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、接合された多重特異性抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体は、ＥＧＦＲを特異的に結合し、そしてＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここでＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列、及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、少なくともアミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨ (配列番号 １５)を含むＶＬ  ＣＤＲ１配列；少なくともアミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ (配列番号１６)を含むＶＬ  ＣＤ２配列；少なくともアミノ酸配列ＱＱＮＮＮＷＰＴＴ (配列番号１７)を含むＶＬ  ＣＤＲ３配列；及びそれらの組合せから選択される。
【００４２】
いくつかの実施形態によれば、本明細書において提供される、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、接合された多重特異性抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体は、ＥＧＦＲを特異的に結合し、そしてＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列及びＶＨ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここでＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、及びＶＨ  ＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ (配列番号 １２)に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳ (配列番号１３) に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含むＶＨ  ＣＤ２配列；アミノ酸配列ＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹ (配列番号１４) に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３配列；及びそれらの組合せから選択される。
【００４３】
いくつかの実施形態によれば、本明細書において提供される、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、接合された多重特異性抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体は、ＥＧＦＲを特異的に結合し、そしてＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここでＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列、及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨ (配列番号 １５) に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ (配列番号１６) に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含むＶＬ  ＣＤ２配列；アミノ酸配列ＱＱＮＮＮＷＰＴＴ (配列番号１７) に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３配列；及びそれらの組合せから選択される。
【００４４】
いくつかの実施形態によれば、本明細書において提供される、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、接合された多重特異性抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体は、ＥＧＦＲを特異的に結合し、そしてＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列、及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここでＶＨ  ＣＤＲ１配列は、少なくともアミノ酸配列ＮＹＧＶＨ (配列番号 １２)を含み；ＶＨ  ＣＤＲ２配列は、少なくともアミノ酸配列ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳ (配列番号１３)を含み；ＶＨ  ＣＤＲ３配列は、少なくともアミノ酸配列ＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹ (配列番号１４)を含み；ＶＬ  ＣＤＲ１配列は、少なくともアミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨ (配列番号 １５)を含み；ＶＬ  ＣＤ２配列は、少なくともアミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ (配列番号１６)を含み；そしてＶＬ  ＣＤＲ３配列は、少なくともアミノ酸配列ＱＱＮＮＮＷＰＴＴ (配列番号１７)を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態によれば、本明細書において提供される、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、接合された多重特異性抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体は、ＥＧＦＲを特異的に結合し、そしてＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列、及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を少なくとも含み、ここでＶＨ  ＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ (配列番号１２)に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含み；ＶＨ  ＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳ (配列番号１３) に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含み；ＶＨ  ＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹ (配列番号１４) に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含み；ＶＬ  ＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨ (配列番号 １５) に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含み；ＶＬ  ＣＤ２配列は、アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ (配列番号１６) に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含み；そしてＶＬ  ＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＱＱＮＮＮＷＰＴＴ (配列番号１７) に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一である配列を含み。
【００４６】
いくつかの実施形態によれば、本明細書において提供される、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、接合された多重特異性抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体は、本明細書における表１１を包含する、表７及び／又は実施例５に示されるそれらの配列から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態によれば、本明細書において提供される、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、接合された多重特異性抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体は、本明細書における表１１を包含する、表７及び／又は実施例５に示されるそれらの配列から成る群から選択されるＬ鎖アミノ酸配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態によれば、本明細書において提供される、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、接合された多重特異性抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体は、本明細書における表１１を包含する、表７及び／又は実施例５に示されるそれらの配列から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列、及び本明細書における表１１を包含する、表７及び／又は実施例５に示されるそれらの配列から成る群から選択されるＬ鎖アミノ酸配列を少なくとも含む。
【００４７】
いくつかの実施形態によれば、本明細書において提供される、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、接合された多重特異性抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体は、本明細書における表１１を包含する、表７及び／又は実施例５に示されるそれらの配列から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一であるＨ鎖アミノ酸配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態によれば、本明細書において提供される、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、接合された多重特異性抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体は、本明細書における表１１を包含する、表７及び／又は実施例５に示されるそれらの配列から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一であるＬ鎖アミノ酸配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態によれば、本明細書において提供される、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、接合された多重特異性抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体は、本明細書における表１１を包含する、表７及び／又は実施例５に示されるそれらの配列から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一であるＨ鎖アミノ酸配列、及び本明細書における表１１を包含する、表７及び／又は実施例５に示されるそれらの配列から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０%、９１%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９%又はそれ以上同一であるＬ鎖アミノ酸配列を少なくとも含む。
【００４８】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体はまた、ＡＢに接合される剤も含む。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、抗腫瘍である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、トキシン又はそのフラグメントである。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、リンカーを介して多重特異性抗体に接合される。いくつかの実施形態によれば、前記リンカーは、非切断性リンカーである。いくつかの実施形態によれば、前記剤は微小管阻害剤である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、核酸損傷剤、例えばＤＮＡアルキル化剤、又はＤＮＡインターカレーター、又は他のＤＮＡ損傷剤である。いくつかの実施形態によれば、前記リンカーは、切断可能リンカーである。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、表４に列挙される群から選択される剤である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、トラスタチンである。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、アウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、メイタンシノイド又はマイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、ＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、デュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、カリケアマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば前記剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。
【００４９】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体はまた、検出可能部分も含むことができる。いくつかの実施形態によれば、前記検出可能部分は、診断剤である。
【００５０】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、天然において、１又は２以上のジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、１又は２以上のジスルフィド結合を含むよう操作され得る。
【００５１】
本開示はまた、本明細書に記載される多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体をコードする単離核酸分子、及びそれらの単離核酸配列を含むベクターを提供する。本開示は、抗体の発現を導く条件下で、そのような核酸分子を含む細胞を培養することによる、多重特異性抗体の生成方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、前記細胞は、そのようなベクターを含む。
【００５２】
本開示はまた、第１標的又は第１エピトープを特異的に結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）、及び第２標的又は第２エピトープを結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を少なくとも含む多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体組成物も提供し、ここで少なくともＡＢ１がマスキング部分（ＭＭ１）にカップリングされるか、又は他方では、結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングが、ＡＢ１のその標的を結合する能力を低める。いくつかの実施形態によれば、ＭＭ１は、プロテアーゼ、例えば対象における治療部位又は診断部位でＡＢ１の標的と共局在されるプロテアーゼのための基質を含む第１切断可能部分（ＣＭ１）配列を介してＡＢ１にカップリングされる。本明細書において提供される多重特異性活性化可能抗体は、循環において安定し、治療及び／又は診断の意図される部位で活性化されるが、しかし正常、すなわち健康組織において活性化されず、そして活性化される場合、その対応する修飾されていない多重特異性抗体に少なくとも匹敵するＡＢ１の標的への結合を示す。
【００５３】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、ＭＭ１とＣＭ１との間に連結ペプチドを含む。
【００５４】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、ＣＭ１とＡＢ１との間に連結ペプチドを含む。
【００５５】
いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体は、第１連結ペプチド（ＬＰ１）及び第２連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、そして多重特異性活性化可能抗体の少なくとも一部が、切断されていない状態で次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置を有する：ＭＭ１−ＬＰ１−ＣＭ１−ＬＰ２−ＡＢ１又はＡＢ１−ＬＰ２−ＣＭ１−ＬＰ１−ＭＭ１。いくつかの実施形態によれば、前記２つの連結ぺプチドはお互い同一である必要はない。
【００５６】
いくつかの実施形態によれば、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つは、（ＧＳ）n、（ＧＧＳ）n、（ＧＳＧＧＳ）n (配列番号１８) 及び（ＧＧＧＳ）n (配列番号１９)（ｎは少なくとも１つの整数である）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つは、ＧＧＳＧ (配列番号２０)、ＧＧＳＧＧ (配列番号２１)、ＧＳＧＳＧ (配列番号２２)、ＧＳＧＧＧ (配列番号２３)、ＧＧＧＳＧ (配列番号２４)、 及び ＧＳＳＳＧ (配列番号２５)から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、第１標的又は第１エピトープを特異的に結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）、及び第２標的又は第２エピトープを特異的に結合する、第２抗体又はその抗体結合フラグメント（ＡＢ２）を少なくとも含む。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体における各ＡＢは、モノクローナル抗体、ドメイン、抗体、一本鎖、Ｆaｂフラグメント、Ｆ（ａb’）2フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ，ｄＡｂ、単一ドメインＨ鎖抗体、及び単一ドメインＬ鎖抗体から成る群から独立して選択される。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体における各ＡＢは、齧歯類（例えば、マウス又はラット）、キメラ性、ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００５８】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体における各ＡＢは、その対応する標的又はエピトープに結合するために、約１００ｎＭ又はそれ以下の平衡解離定数を有する。
【００５９】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭ１は、ＡＢのその対応する標的又はエピトープへの結合のための平衡解離定数よりも高い、その対応するＡＢへの結合のための平衡解離定数を有する。
【００６０】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭ１は、ＡＢのその対応する標的又はエピトープへの結合のための平衡解離定数に過ぎない、その対応するＡＢへの結合のための平衡解離定数を有する。
【００６１】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭ１は、多重特異性活性化可能抗体が切断された状態で存在する場合、その対応する標的又はエピトープに結合するために、その対応するＡＢを阻止しないか、又はそれと競争しない。
【００６２】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭ１は、約２−４０個の長さのアミノ酸のポリペプチドである。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体における各ＭＭは、４０個以下の長さのアミノ酸のポリペプチドである。
【００６３】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭ１は、その対応するＡＢの標的の配列とは異なるポリペプチド配列を有する。
【００６４】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭ１は、その対応するＡＢの任意の天然結合パートナーに対して５０％以下、同一であるポリペプチド配列を有する。いくつかの実施形態によれば、ＭＭ１は、その対応するＡＢの任意の天然結合パートナーに対して２５％以下、同一であるポリペプチド配列を有する。いくつかの実施形態によれば、ＭＭ１は、その対応するＡＢの任意の天然結合パートナーに対して１０％以下、同一であるポリペプチド配列を有する。
【００６５】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭ１のカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープへの結合の能力を低め、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋd）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされない場合のＡＢのＫdよりも少なくとも２０倍、高い。
【００６６】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭ１のカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープへの結合の能力を低め、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋd）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされない場合のＡＢのＫdよりも少なくとも４０倍、高い。
【００６７】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭ１のカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープへの結合の能力を低め、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋd）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされない場合のＡＢのＫdよりも少なくとも１００倍、高い。
【００６８】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭ１のカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープへの結合の能力を低め、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋd）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされない場合のＡＢのＫdよりも少なくとも１０００倍、高い。
【００６９】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭ１のカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープへの結合の能力を低め、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋd）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされない場合のＡＢのＫdよりも少なくとも１０，０００倍、高い。
【００７０】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭ１は、本明細書に提供される実施例に示されるＭＭから選択されるアミノ酸配列である。
【００７１】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、その多重特異性活性化可能抗体が切断されていない状態にある場合、ＡＢ２のその標的への結合を阻害する、第２マスキング部分（ＭＭ２）、及び第２プロテアーゼのための基質として機能する、ＡＢ２にカップリングされる第２切断可能部分（ＣＭ２）を少なくとも含む。いくつかの実施形態によれば、ＣＭ２は、１５個以下の長さのアミノ酸のポリペプチドである。いくつかの実施形態によれば、前記第２プロテアーゼは、組織において第２標的又はエピトープと共局在化され、そして第２プロテアーゼは、多重特異性活性化可能抗体が第２プロテアーゼに暴露される場合、多重特異性活性化可能抗体におけるＣＭ２を切断する。いくつかの実施形態によれば、第１プロテアーゼ及び第２プロテアーゼは、組織において、第１標的又はエピトープ及び第２標的又はエピトープと共局在化される。いくつかの実施形態によれば、第１プロテアーゼ及び第２プロテアーゼは、同じプロテアーゼである。いくつかの実施形態によれば、ＣＭ１及びＣＭ２は、同じプロテアーゼのための異なった基質である。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼは、表３に示されるそれらから成る群から選択される。いくつかの実施形態によれば、第１プロテアーゼ及び第２プロテアーゼは、異なったプロテアーゼである。いくつかの実施形態によれば、第１プロテアーゼ及び第２プロテアーゼは、表３に示されるそれらから成る群から選択される異なったプロテアーゼである。
【００７２】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体における各ＭＭ、例えばＭＭ１及び少なくともＭＭ２は、ＡＢのその対応する標的又はエピトープに結合するための平衡解離定数よりも高い、その対応するＡＢに結合するための平衡解離定数を有する。
【００７３】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体における各ＭＭ、例えばＭＭ１及び少なくともＭＭ２は、ＡＢのその対応する標的又はエピトープに結合するための平衡解離定数以下である、その対応するＡＢに結合するための平衡解離定数を有する。
【００７４】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体における各ＭＭは、多重特異性活性化可能抗体が切断された状態にある場合、対応する標的又はエピトープに結合するためにその対応するＡＢを妨げないか、又はそれと競争しない。
【００７５】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体における各ＭＭは、約２−４０個の長さのアミノ酸のポリペプチドである。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体における各ＭＭは４０個以下の長さのアミノ酸のポリペプチドである。
【００７６】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体における各ＭＭは、対応するＡＢの標的の配列とは異なるポリペプチド配列を有する。
【００７７】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体における各ＭＭは、その対応するＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して５０％同一に過ぎないポリペプチド配列を有する。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体における各ＭＭは、その対応するＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して２５％同一に過ぎないポリペプチド配列を有する。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体における各ＭＭは、その対応するＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して１０％同一に過ぎないポリペプチド配列を有する。
【００７８】
いくつかの実施形態によれば、各ＭＭのカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープを結合する能力を低め、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋd）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップされない場合のＡＢのＫdよりも少なくとも２０倍、高い。
【００７９】
いくつかの実施形態によれば、各ＭＭのカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープを結合する能力を低め、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋd）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップされない場合のＡＢのＫdよりも少なくとも４０倍、高い。
【００８０】
いくつかの実施形態によれば、各ＭＭのカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープを結合する能力を低め、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋd）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップされない場合のＡＢのＫdよりも少なくとも１００倍、高い。
【００８１】
いくつかの実施形態によれば、各ＭＭのカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープを結合する能力を低め、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋd）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップされない場合のＡＢのＫdよりも少なくとも１０００倍、高い。
【００８２】
いくつかの実施形態によれば、各ＭＭのカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープを結合する能力を低め、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋd）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップされない場合のＡＢのＫdよりも少なくとも１０，０００倍、高い。
【００８３】
いくつかの実施形態によれば、各ＭＭは、本明細書に提供される実施例に示されるＭＭから選択されるアミノ酸配列である。
【００８４】
いくつかの実施形態によれば、第１切断可能部分（ＣＭ１）配列を切断するプロテアーゼは、組織において多重特異性活性化可能抗体におけるＡＢ１の標的と共局在し、そしてプロテアーゼは、多重特異性活性化可能抗体がそのプロテアーゼに暴露される場合、多重特異性活性化可能抗体におけるＣＭ１を切断する。
【００８５】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、複数の切断可能部分配列を含み、そして少なくとも１つの切断可能部分配列を切断するプロテアーゼは、組織において多重特異性活性化可能抗体におけるＡＢ領域の少なくとも１つの領域の標的と共局在され、そしてプロテアーゼは、多重特異性活性化可能抗体がプロテアーゼに暴露される場合、多重特異性活性化可能抗体におけるＣＭを切断する。
【００８６】
いくつかの実施形態によれば、各ＣＭ、例えばＣＭ１及び少なくともＣＭ２は、多重特異性活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異性活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも２０倍、高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そしてところが、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
【００８７】
いくつかの実施形態によれば、各ＣＭ、例えばＣＭ１及び少なくともＣＭ２は、多重特異性活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異性活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも４０倍、高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そしてところが、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
【００８８】
いくつかの実施形態によれば、各ＣＭ、例えばＣＭ１及び少なくともＣＭ２は、多重特異性活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異性活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも５０倍、高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そしてところが、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
【００８９】
いくつかの実施形態によれば、各ＣＭ、例えばＣＭ１及び少なくともＣＭ２は、多重特異性活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異性活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも１００倍、高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そしてところが、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
【００９０】
いくつかの実施形態によれば、各ＣＭ、例えばＣＭ１及び少なくともＣＭ２は、多重特異性活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異性活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも２００倍、高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そしてところが、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
【００９１】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体における各ＣＭは、１５個までの長さのアミノ酸のポリペプチドである。
【００９２】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体における少なくとも１つのＣＭは、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＮＨ (配列番号２６)を含む。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの切断可能部分が、特定のプロテアーゼ、例えば多重特異性活性化可能抗体の少なくとも１つの標的と共局在化されることが知られているプロテアーゼとの使用のために選択される。例えば、本開示の多重特異性活性化可能抗体に使用するための適切な切断可能部分は、少なくともプロテアーゼ、例えばウロキナーゼ、レグマイン及び／又はマトリプターゼ（また、ＭＴ−ＳＰ１又はＭＴＳＳＰ１として本明細書において言及される）により切断される。いくつかの実施形態によれば、適切な切断可能部分は、次の配列の少なくとも１つを含む：ＴＧＲＧＰＳＷＶ (配列番号２７); ＳＡＲＧＰＳＲＷ (配列番号２８); ＴＡＲＧＰＳＦＫ (配列番号２９); ＬＳＧＲＳＤＮＨ (配列番号２６); ＧＧＷＨＴＧＲＮ (配列番号３０); ＨＴＧＲＳＧＡＬ （配列番号３１); ＰＬＴＧＲＳＧＧ (配列番号３２); ＡＡＲＧＰＡＩＨ (配列番号３３); ＲＧＰＡＦＮＰＭ (配列番号３４); ＳＳＲＧＰＡＹＬ (配列番号３５); ＲＧＰＡＴＰＩＭ (配列番号３６); ＲＧＰＡ (配列番号３７); ＧＧＱＰＳＧＭＷＧＷ (配列番号３８); ＦＰＲＰＬＧＩＴＧＬ (配列番号３９); ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ (配列番号４０); ＳＰＬＴＧＲＳＧ (配列番号４１); ＳＡＧＦＳＬＰＡ (配列番号４２); ＬＡＰＬＧＬＱＲＲ (配列番号４３); ＳＧＧＰＬＧＶＲ (配列番号４４); 及び/又は ＰＬＧＬ (配列番号４５)。
【００９３】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体における各ＣＭは、表３に示されるそれらから成る群から選択されるプロテアーゼのための基質である。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼは、ｕＰＡ、レグマイン、ＭＴ−ＳＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＢＭＰ−１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、好中球エラスターゼ、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３及びＭＭＰ−１４から成る群から選択される。プロテアーゼは、カテプシン、例えば、カテプシンＳであるが、但しそれだけには限定されない。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体における各ＣＭは、uＰＡ（ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子）、レグマイン及びＭＴ−ＳＰ１（マトリプターゼ）から成る群から選択されるプロテアーゼのための基質である。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼは、ｕＰＡを包含する。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼはレグマインを包含する。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼは、ＭＴ−ＳＰ１を包含する。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を包含する。
【００９４】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体中の少なくとも１つのＣＭは、少なくとも２つのプロテアーゼのための基質である。いくつかの実施形態によれば、各プロテアーゼは、表３に示されるそれらからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体中の少なくとも１つのＣＭは、少なくとも２つのプロテアーゼのための基質であり、ここでプロテアーゼの１つは、ｕＰＡ、レグマイン及びＭＴ−ＳＰ１から成る群から選択され、そして他のプロテアーゼは、表３に示されるそれらから成る群から選択される。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体中の少なくとも１つのＣＭは、ｕＰＡ、レグマイン及びＭＴ−ＳＰ１から成る群から選択され少なくとも２種のプロテアーゼのための基質である。
【００９５】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、第１ＣＭ（ＣＭ１）及び第２ＣＭ（ＣＭ２）を少なくとも含む。いくつかの実施形態によれば、ＣＭ１及びＣＭ２は、ＭＭをＡＢに連結する単一の切断可能リンカーの一部である。いくつかの実施形態によれば、ＣＭ１は、ＭＭ１をＡＢ１に連結する切断可能リンカーの一部であり、そしてＣＭ２は、ＭＭ２をＡＢ２に連結する別の切断可能リンカーの一部である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、２以上のＣＭを含む。いくつかの実施形態によれば、そのような多重特異性活性化可能抗体は、２つ以上のＣＭ及び２つ以上のＭＭを含む。いくつかの実施形態によれば、ＣＭ１及びＣＭ２は、それぞれ、１５個以下の長さのアミノ酸のポリペプチドである。いくつかの実施形態によれば、第１ＣＭ及び第２ＣＭの少なくとも１つは、表３に列挙されるそれらから成る群から選択されるプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである。いくつかの実施形態によれば、第１ＣＭ及び第２ＣＭの少なくとも１つは、ｕＰＡ、レグマイン及びＭＴ−ＳＰ１から成る群から選択されるプロテアーゼのための基質としても機能するポリペプチドである。いくつかの実施形態によれば、第１ＣＭは、標的組織において、ｕＰＡ、レグマイン及びＭＴ−ＳＰ１から成る群から選択される第１切断剤により切断され、そして第２ＣＭは、標的組織において、第２切断剤により切断される。いくつかの実施形態によれば、他のプロテアーゼは、表３に示されるそれらから成る群から選択される。いくつかの実施形態によれば、第１切断剤及び第２切断剤は、表３に列挙されるそれらから成る群から選択される同じプロテアーゼであり、そして第１ＣＭ及び第２ＣＭは、酵素のための異なった基質である。いくつかの実施形態によれば、第１切断剤及び第２切断剤は、ｕＰＡ、レグマイン及びＭＴ−ＳＰ１から成る群から選択される同じプロテアーゼであり、そして第１ＣＭ及び第２ＣＭは、酵素のための異なった基質である。いくつかの実施形態によれば、第１切断剤及び第２切断剤は、表３に列挙される群から選択される同じプロテアーゼであり、そして第１ＣＭ及び第２ＣＭは同じ基質である。いくつかの実施形態によれば、第１切断剤及び第２切断剤は、異なったプロテアーゼである。いくつかの実施形態によれば、第１切断剤及び第２切断剤は、表３に示されるそれらから成る群から選択される異なったプロテアーゼである。いくつかの実施形態によれば、第１切断剤及び第２切断剤は、標的組織において共局在される。いくつかの実施形態によれば、第１ＣＭ及び第２ＣＭは、標的組織において少なくとも１つの切断剤により切断される。
【００９６】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、プロテアーゼに暴露され、そして切断され、結果的に、活性化されたか又は切断された状態下で、活性化された多重特異性活性化可能抗体は、プロテアーゼがＣＭを切断した後、ＬＰ２及び／又はＣＭ配列の少なくとも１部を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む。
【００９７】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体はまた、シグナルペプチドも含む。いくつかの実施形態によれば、シグナルペプチドは、スペーサーを介して多重特異性活性化可能抗体に接合される。いくつかの実施形態によれば、スペーサーは、シグナルペプチドの不在下で多重特異性活性化可能抗体に接合される。いくつかの実施形態によれば、スペーサーは、多重特異性活性化可能抗体のＭＭの少なくとも１つに直接的に結合される。
【００９８】
いくつかの実施形態によれば、切断されていない状態下での多重特異性活性化可能抗体は、第１ＭＭに直接、結合され、そしてＮ末端からＣ末端側にスペーサー−ＭＭ１−ＣＭ−ＡＢ１の構造配置を有するスペーサーを含む。いくつかの実施形態によれば、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＱＧＱＳＧＱ (配列番号４６)を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、その対応する多重特異性抗体の半減期よりも長く；例えば、多重特異性活性化可能抗体のｐＫは、その対応する多重特異性抗体のｐＫよりも長い。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、その対応する多重特異性抗体の半減期に類似する。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１５日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１１日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１０日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも９日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも７日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも５日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２４時間である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２０時間である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１８時間である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１６時間である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１４時間である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２時間である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１０時間である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８時間である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６時間である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４時間である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３時間である。
【０１００】
本開示はまた、標的を特異的に結合する第１抗体又はフラグメント（ＡＢ１）、及び第２抗体又はフラグメント（ＡＢ２）を少なくとも含む多重特異性活性化可能抗体を包含する組成物及び方法も提供し、ここで少なくとも多重特異性活性化可能抗体における第１ＡＢは、ＡＢ１のその標的を結合する能力を低めるマスキング部分（ＭＭ１）にカップリングされている。いくつかの実施形態によれば、各ＡＢは、その対応するＡＢの各標的を結合する能力を低めるＭＭにカップリングされる。例えば多重特異性活性化可能抗体の実施形態によれば、ＡＢ１は、ＡＢ１のその標的を結合する能力を低める第１マスキング部分（ＭＭ１）にカップリングされ、そしてＡＢ２は、ＡＢ２のその標的を結合する能力を低める第２マスキング部分（ＭＭ２）にカップリングされる。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、２つ以上のＡＢ領域を含み；そのような実施形態によれば、ＡＢ１は、ＡＢ１のその標的を結合する能力を低める第１マスキング部分（ＭＭ１）にカップリングされ、ＡＢ２は、ＡＢ２のその標的を結合する能力を低める第２マスキング部分（ＭＭ２）にカップリングされ、ＡＢ３は、ＡＢ３のその標的を結合する能力を低める第３マスキング部分（ＭＭ３）にカップリングされそして多重特異性活性化可能抗体における各ＡＢについても同様である。
【０１０１】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、プロテアーゼのための基質である少なくとも１つの切断可能部分（ＣＭ）をさらに含み、ここでＣＭはＭＭをＡＢに連結する。例えば、いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、標的を特異的に結合する第１抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ１）及び第２抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ２）を少なくとも含み、多重特異性活性化可能抗体における少なくとも第１ＡＢは、ＡＢ１のその標的を結合する能力を低めるマスキング部分（ＭＭ１）に、切断可能部分（ＣＭ１）を介してカップリングされる。いくつかの多重特異性活性化可能抗体の実施形態によれば、ＡＢ１はＣＭ１を介してＭＭ１にカップリングされ、そしてＡＢ２は、ＡＢ２のその標的を結合する能力を低める第２マスキング部分（ＭＭ２）に、第２切断可能部分（ＣＭ２）を介してカップリングされる。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、２以上のＡＢ領域を含み；それらの実施形態のいくつかによれば、ＡＢ１はＣＭ１を介してＭＭ１にカップリングされ、ＡＢ２はＣＭ２を介してＭＭ２にカップリングされ、そしてＡＢ３は第３切断可能部分（ＣＭ３）を介して、ＡＢ３のその標的を結合する能力を低める第３マスキング部分（ＭＭ３）にカップリングされ、そして多重特異性活性化可能抗体における各ＡＢについても同様である。
【０１０２】
本明細書に提供される組成物及び方法は、多重特異性活性化可能抗体の活性（例えば、マスキング、活性化又は結合活性）を損なわないで、ＡＢ領域の何れかにおける１又は２以上のシステイン残基への１又は２以上の剤の結合を可能にする。いくつかの実施形態によれば、本明細書に提供される組成物及び方法は、ＭＭのいずれか内の１又は２以上のジスルフィド結合を減じるか又は他方では、妨害しないで、ＡＢ領域の何れかにおける１又は２以上のシステインへの１又は２以上の剤の結合を可能にする。本明細書に提供される組成物及び方法は、１又は２以上の剤、例えば種々の治療、診断及び／又は予防剤の何れかに接合される多重特異性活性化可能抗体を生成し、好ましくは、前記剤の何れも多重特異性活性化可能抗体のＭＭの何れにも接合されていない。本明細書に提供される組成物及び方法は、各ＭＭが切断されていない状態下で多重特異性活性化可能抗体のその対応するＡＢを効果的且つ効率的にマスキングする能力を保持している、接合された多重特異性活性化可能抗体を生成する。本明細書に提供される組成物及び方法は、活性可能抗体が、ＣＭを切断できるプロテアーゼの存在下で、まだ活性化されている、すなわち切断されている、接合された多重特異性活性化可能抗体を生成する。
【０１０３】
多重特異性活性化可能抗体は、剤のための少なくとも１つの接合点を有するが、本明細書に提供される方法及び組成物においては、すべて未満の可能な接合点が剤への接合のために利用できる。いくつかの実施形態によれば、１又は２以上の接合点は、ジスルフィド接合に含まれる硫黄原子である。いくつかの実施形態によれば、１又は２以上の接合点は、鎖間ジスルフィド結合に含まれる硫黄原子である。いくつかの実施形態によれば、１又は２以上の接合点は、鎖間スルフィド結合に含まれる硫黄原子であるが、しかし鎖内ジスルフィド結合に含まれる硫黄原子ではない。いくつかの実施形態によれば、１又は２以上の接合点は、システイン、又は硫黄原子を含む他のアミノ酸残基の硫黄原子である。そのような残基は、抗体構造で天然において存在することができるか、又は部位特異的突然変異誘発、化学的変換、又は非天然アミノ酸の誤取り込みにより抗体中に組込まれ得る。
【０１０４】
１又は２以上のＡＢに、１又は２以上の鎖間ジスルフィド結合及び対応するＭＭに１又は２以上の鎖内ジスルフィド結合を有する多重特異性活性化可能抗体の接合体の調製方法がまた提供され、そして遊離チオールと反応性の薬剤が提供される。前記方法は一般的に、活性化可能抗体における鎖間ジスルフィド結合を、還元剤、例えばＴＣＥＰにより部分的に還元し；そしてその部分的に還元された活性化可能抗体に、遊離チオールと反応性の薬物を接合することを包含する。本明細書において使用される場合、用語「部分的還元」とは、多重特異性活性化可能抗体が、還元剤と接触され、そしてすべて未満ジスルフィド結合、例えばすべて未満の可能な接合部位が還元される状況を意味する。いくつかの実施形態によれば、９９%、９８%、９７%、９６%、９５%、９０%、８５%、８０%、７５%、７０%、６５%、６０%、 ５５%、５０%、４５%、４０%、３５%、３０%、２５%、２０%、１５%、１０% 又は５%未満のすべての可能な接合部位が還元される。
【０１０５】
さらなる他の実施形態によれば、剤、例えば薬剤を還元し、そして前記剤の置換下で選択をもたらす多重特異性活性化可能抗体に接合する方法が提供される。前記方法は、還元剤により多重特異性活性化可能抗体を還元し、結果的に、活性化可能抗体のマスキング部分又は他の非−ＡＢ部分の何れかにおける任意の接合部位が還元されず、そして多重特異性活性化可能抗体の１又は２以上のＡＢ領域における鎖間チオールに剤を接合することを包含する。接合部位は、所望する部位での接合の発生を可能にする剤の所望する置換を可能にするよう選択される。例えば、還元剤は、ＴＣＥＰである。還元反応条件、例えば還元剤：多重特異性活性化可能抗体の比、インキュベーションの長さ、インキュベーションの間の温度、還元反応溶液のｐＨ、等が、ＭＭが切断されていない状態下で活性化可能抗体のＡＢを抗体を効果的且つ効率的にマスキングする能力を保持している、接合された活性化可能抗体を生成する条件を同定することにより決定される。還元剤：多重特異性活性化可能抗体の比は、活性化可能抗体に依存して変化するであろう。いくつかの実施形態によれば、還元剤：多重特異性活性化可能抗体の比は、約 ２０：１−１：１、約 １０：１−１：１、約 ９：１−１：１、約 ８：１−１：１、約 ７：１−１：１、約 ６：１−１：１、約５：１−１：１、約４：１−１：１、約３：１−１：１、約２：１−１：１、約 ２０：１−１：１．５、約１０：１−１：１．５、約 ９：１−１：１．５、約 ８：１−１：１．５、約７：１−１：１．５、約 ６：１−１：１．５、 約５：１−１：１．５、約 ４：１−１：１．５、約 ３：１−１：１．５、約 ２：１−１：１．５、約 １．５：１−１：１．５又は 約 １：１−１：１．５の範囲下にあるであろう。いくつかの実施形態によれば、前記比は、約５：１−１．５：１の範囲にある。いくつかの実施形態によれば、前記化は、約４：１−１：１の範囲にある。いくつかの実施形態によれば、前記化は、約４：１−１．４：１の範囲にある。いくつかの実施形態によれば、前記比は、約８：１−約１：１の範囲にある。いくつかの実施形態によれば、前記比は、約２．５：１−１：１の範囲にある。
【０１０６】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の１又は２以上のＡＢ領域中の鎖間ジスルフィド結合を還元し、そして得られる鎖間チオールに、剤、例えばチオール含有剤、例えば薬剤を接合し、前記ＡＢ上に剤を選択的に位置決定する方法が提供される。前記方法は、活性化可能抗体中のすべての可能な鎖間チオールを形成しないで、少なくとも２つの鎖間チオールを形成するために、１又は２以上のＡＢ領域を還元剤により部分的に還元し；そして前記部分的に還元されたＡＢの鎖間チオールに、前記剤を接合することを一般的に包含する。例えば、多重特異性活性化可能抗体の１又は２以上のＡＢ領域は、還元剤：活性化可能抗体の所望する比で、約３７℃で約１時間、部分的に還元される。いくつかの実施形態によれば、還元剤：活性化可能抗体の比は、約 ２０：１−１：１、約 １０：１−１：１、約 ９：１−１：１、約 ８：１−１：１、約 ７：１−１：１、約 ６：１−１：１、約５：１−１：１、約４：１−１：１、約３：１−１：１、約２：１−１：１、約 ２０：１−１：１．５、約１０：１−１：１．５、約 ９：１−１：１．５、約 ８：１−１：１．５、約７：１−１：１．５、約 ６：１−１：１．５、 約５：１−１：１．５、約 ４：１−１：１．５、約 ３：１−１：１．５、約 ２：１−１：１．５、約 １．５：１−１：１．５又は 約 １：１−１：１．５の範囲下にあるであろう。いくつかの実施形態によれば、前記比は、約５：１−１．５：１の範囲にある。いくつかの実施形態によれば、前記化は、約４：１−１：１の範囲にある。いくつかの実施形態によれば、前記化は、約４：１−１．４：１の範囲にある。いくつかの実施形態によれば、前記比は、約８：１−約１：１の範囲にある。いくつかの実施形態によれば、前記比は、約２．５：１−１：１の範囲にある。
【０１０７】
チオール含有試薬は、例えばシステイン又はＮ−アセチルシステインであり得る。還元剤は、例えばＴＣＥＰであり得る。いくつかの実施形態によれば、還元された活性化可能抗体は、接合の前、例えばカラムクロマトグラフィー、透析又はダイアフィルトレーションを用いて精製され得る。他方では、還元された抗体は、部分的還元の後、及び接合の前、精製されない。
【０１０８】
前記開示はまた、多重特異性活性化可能抗体における何れかの鎖内ジスルフィド結合も妨害しないで、多重特異性活性化可能抗体における少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合が還元剤により還元されている、部分的に還元された多重特異性活性化可能抗体も提供し、ここで前記多重特異性活性化可能抗体は、標準に対して特異的に結合する第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）、切断されていない状態下で、多重特異性活性化可能抗体のＡＢの前記標的への結合を阻害する第１マスキング成分（ＭＭ１）、ＡＢ１にカップリングされる第１切断可能成分（ＣＭ１）（前記ＣＭ１はプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである）、及び第２標的に対して特異的に結合する第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を少なくとも含む。いくつかの実施形態によれば、前記ＭＭ１は、ＣＭ１を介してＡＢ１にカップリングされる。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体中の１又は２以上の鎖間ジスルフィド結合は、還元剤により妨害されない。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体内のＭＭ１の１又は２以上の鎖間ジスルフィド結合は、還元剤により妨害されない。いくつかの実施形態によれば、還元剤は、ＴＣＥＰである。
【０１０９】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載される多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、１又は２以上の追加の剤又は追加の剤の組合せと共に使用される。適切な追加の剤は、意図される用途、例えば癌のための現医薬品及び／又は外科的治療剤を包含する。例えば、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、追加の化学療法又は抗腫瘍剤と共に使用され得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体、及び追加の剤は、単一の治療組成物に製剤化され、そして多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体、及び追加の剤は、同時に投与される。他方では、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体、及び追加の剤は、お互い別々であり、例えば個々は、別々の治療組成物に製剤化され、そして多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体、及び追加の剤は同時に投与されるか、又は多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体、及び追加の剤は、治療計画の間、異なった時点で投与される。例えば、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、追加の剤の投与の前、投与され、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、追加の剤の投与に続いて投与されるか、又は多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、交互に投与される。本明細書において記載される場合、抗−多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体、及び追加の剤は、単回用量又は複数回用量で投与される。
【０１１１】
本開示はまた、本明細書に記載される多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体をコードする単離核酸分子、及びそれらの単離核酸配列を含むベクターも提供する。本開示は、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体の発現を導く条件下で、そのような核酸分子を含む細胞を培養することによる、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体の生成方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、前記細胞は、そのようなベクターを含む。
【０１１２】
本開示はまた、（ａ）多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体をコードする核酸コンストラクトを含む細胞を、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体の発現を導く条件下で培養し、そして（ｂ）多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体を回収することによる、本開示の多重特異性抗体及び／又は本開示の多重特異性活性化可能抗体の製造方法も提供する。
【０１１３】
本開示はまた、本開示の多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体を、治療又は予防が所望される対象に投与することにより、１又は２以上の病状の症状を治療するか、予防するか、その進行を遅延するか、又は他方では、軽減するか、又はその病状に関連する症状を改善する方法も提供する。治療されるべき対象は、例えばヒト又は他の哺乳類である。いくつかの実施形態によれば、対象は、非ヒト哺乳類、例えば非ヒト霊長類、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、農業用動物、作業用動物又は動物園の動物である。いくつかの実施形態によれば、対象は齧歯動物である。
【０１１４】
本開示はまた、標的依存性Ｔ−細胞活性化及び標的細胞の死滅の誘発が所望される対象に、本開示の多重特異性活性化可能抗体を投与することによる、そのような誘発方法も提供し、ここで多重特異性活性化可能抗体が切断された状態下にある場合、例えば多重特異性活性化可能抗体中の各マスキング部分がもはや結合されていないか、又は他方では、その対応するＡＢドメインに会合されていない場合、標的細胞の標的依存性Ｔ−細胞活性化及び死滅が生じ、そして多重特異性活性化可能抗体が切断されていない状態下にある場合、例えば多重特異性活性化可能抗体中の少なくとも１つのマスキング部分が結合されているか、又は他方では、その対応するＡＢドメインに会合されている場合、標的細胞の標的依存性Ｔ−細胞活性化及び死滅が低められるか、又は他方では、阻害される。本明細書に記載される多重特異性活性化可能抗体の何れでも、そのような方法への使用のために適切である。治療されるべき対象は、例えばヒト又は他の哺乳類である。いくつかの実施形態によれば、対象は、非ヒト哺乳類、例えば非ヒト霊長類、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、農業用動物、作業用動物又は動物園の動物である。いくつかの実施形態によれば、対象は齧歯動物である。
【０１１５】
それらの方法及び使用の実施形態の何れかに使用される多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、疾患の何れの段階でも及び／又はＴ−細胞活性化及び標的細胞の死滅が所望される何れの段階でも投与され得る。例えば、そのような多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、初期から転移性の何れの段階の癌を有する患者にも投与され得る。用語、対象及び患者は本明細書においては、交換可能的に使用され得る。それらの方法及び使用の実施形態の何れかに使用される多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、ネオアジュバント療法を含む治療計画に使用され得る。それらの方法及び使用の実施形態の何れかに使用される多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、単独で、又は１又は２以上の追加の剤、例えば小分子阻害剤、他の抗体に基づく治療、ポリペプチドに基づく治療、核酸に基づく治療及び／又は他の生物製剤と組合して投与され得る。
【０１１６】
本開示はまた、種々の診断及び／又は予防徴候への多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体の使用のための方法及びキットも提供する。例えば、本開示は、（ｉ）第１マスキング部分（ＭＭ１）、節断剤により切断される第１切断部分（ＣＭ１）、及び目的の標的を特異的に結合する第１抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ１）、及び第２標的及び／又は第２エピトープを特異的に結合する第２抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ２）を含む多重特異性活性化可能抗体と、対象又はサンプルとを接触し、（ａ）ここで前記ＭＭ１は標的へのＡＢ１の結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭ２はＡＢ１の天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、ＡＢ１の天然の結合パートナーの修飾形ではなく；そして（ｂ）ここで、切断されていない、非活性化状態下で、ＭＭ１は標的へのＡＢ１の特異的結合を干渉し、そして切断された、活性化状態下で、ＭＭ１は標的へのＡＢ１の特異的結合を干渉しないか、又はそれと競争せず；そして（ii）対象又はサンプルにおける活性化された多重特異性活性化可能抗体のレベルを測定することにより、対象又はサンプルにおける切断剤及び目的の標的の存在又は不在を検出するための方法及びキットを提供し、ここで、前記（ｉｉ）において、対象又はサンプルにおける活性化された多重特異性活性化可能抗体の検出できるレベルは、切断剤及び標的が対象又はサンプルに存在することを示唆し、そして対象又はサンプルにおける活性化された多重特異性活性化可能抗体の検出レベルの不在は、切断剤、標的、又は切断剤及び標的の両者が対象又はサンプルにおいて不在であり、そして／又は十分には存在しないことを示唆する。
【０１１７】
いくつかの実施形態によれば、活性化できる多重特異性活性化可能抗体は、治療剤が接合される活性化できる多重特異性活性化可能抗体である。いくつかの実施形態によれば、活性化できる多重特異性活性化可能抗体は、剤に接合されない。いくつかの実施形態によれば、活性化できる多重特異性活性化可能抗体は、検出できる標識を含む。いくつかの実施形態によれば、検出できる標識は、ＡＢ１上に位置決定される。いくつかの実施形態によれば、対象又はサンプル中の活性化できる多重特異性活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された多重特異性活性化可能抗体に対して特異的に結合する、検出可能標識を含む二次試薬を用いて達成される。いくつかの実施形態によれば、前記二次試薬は、検出できる標識を含む抗体である。
【０１１８】
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、活性化できる多重特異性活性化可能抗体は、検出できる標識を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、検出できる標識は、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１又は２以上の金属イオン、又はリガンドベースの標識を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、イメージング剤は、放射性同位体を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、放射性同位体は、インジウム又はテクネチウムである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウム又は酸化鉄を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はβ−ガラクトシダーゼを含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、蛍光標識は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、修飾された赤色蛍光タンパク質（ＭＲＦＰ）、赤色蛍光タンパク質ｔダイマー２（ＲＦＰ  ｔダイマー２）、ＨＣＲＥＤ、又はユーロピウム誘導体を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、発光標識は、Ｎ−メチルアクリジウム誘導体を含む。それらの方法のいくつかの実施形態によれば、標識は、Alexa Fluor（登録商標）標識, 例えばAlex Fluor（登録商標）680 又はAlexa Fluor（登録商標）750を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、リガンドベースの標識は、ビオチン、アビジン、ストレプタビジン又は１又は２以上のハプテンを含む。
【０１１９】
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、対象は哺乳類である。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、対象はヒトである。いくつかの実施形態によれば、対象は、非ヒト哺乳類、例えば非ヒト霊長類、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、農業用動物、作業用動物又は動物園の動物である。いくつかの実施形態によれば、対象は齧歯動物である。
【０１２０】
それらの方法のいくつかの実施形態によれば、前記方法は、インビボ方法である。それらの方法のいくつかの実施形態によれば、前記方法は、現場方法である。それらの方法のいくつかの実施形態によれば、前記方法は、エキソビボ方法である。それらの方法のいくつかの実施形態によれば、前記方法は、インビトロ方法である。
【０１２１】
それらの方法のいくつかの実施形態によれば、前記方法又はキットは、本開示の多重特異性活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を同定するか又は他方では、さらに絞り込むために使用される。例えば、それらの方法において試験される、標的、及び多重特異性活性化可能抗体中の第１の切断可能部分（ＣＭ１）において基質を切断するプロテアーゼの両者について陽性である患者は、そのようなＣＭ１を含む多重特異性活性化可能抗体による治療のための適切な候補体として同定される。同様に、それらの方法を用いて試験される、標的、及び多重特異性活性化可能抗体中のＣＭ１において基質を切断するプロテアーゼの両者について陰性である患者は、別の形の治療のための適切な候補体として同定され得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性活性化可能抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体（例えば、治療剤が接合されている多重特異性活性化可能抗体）による治療、続く、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体、及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体を、その必要な対象に投与することによる治療のために適切な患者集団を同定するか又は他方では、絞り込むために使用される方法又はキットが使用される。例えば、それらの方法において試験される、標的、及び多重特異性活性化可能抗体及び/又は接合された多重特異性活性化可能抗体中の第１の切断可能部分（ＣＭ１）において基質を切断するプロテアーゼの両者について陽性である患者は、そのようなＣＭ１を含む多重特異性活性化可能抗体及び/又はそのようなＣＭ１を含む世知ゴウされた多重特異性活性化可能抗体による治療のための適切な候補体として同定され、そして次に、患者は、治療的有効量の試験された多重特異性活性化可能抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体を投与される。同様に、それらの方法を用いて試験される、標的、及び多重特異性活性化可能抗体及び/又は接合された多重特異性活性化可能抗体中のＣＭ１において基質を切断するプロテアーゼの何れか又は両者について陰性である患者は、別の形の治療のための適切な候補体として同定され得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態によれば、そのような患者は、治療のための適切な多重特異性活性化可能抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体、例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭを含む、多重特異性活性化可能抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体が同定されるまで、他の多重特異性抗体及び／又は多重特異性活性化可能抗体、及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体により試験され得る。いくつかの実施形態によれば、次に、患者は、治療的有効量の陽性であることが試験されている患者のための多重特異性活性化可能抗体及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体を投与される。
【０１２４】
本開示の医薬組成物は、本開示の多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体及び担体を含むことができる。それらの医薬組成物は、キット、例えば診断キットに含まれ得る。
【０１２５】
当業者は、本開示の抗体が種々の用途を有することを認識するであろう。例えば、本開示のタンパク質は、種々の障害のための治療剤として使用される。本開示の抗体はまた、診断キットにおける試薬として、又は診断ツールとしても使用されるか、又はそれらの抗体は、治療用試薬を生成するために、競争アッセイに使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１Ａ】図１Ａは、種々の二重特異性抗体形式（Chan and Carter, Nat. Rev. Immunol. 2010から採用された）を示す説明図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、種々の二重特異性抗体形式（Chan and Carter, Nat. Rev. Immunol. 2010から採用された）を示す説明図である。
【図２】図２Ａ−２Ｃは、本開示の組成物及び方法への使用のために適切な種々の多重特異性抗体形式を示す一連の説明図である。二重特異性抗体においては、ｓｃＦｖがＩｇＧ抗体のＨ鎖（Ｈｃ）のカルボキシル末端（図２Ａ）；Ｌ鎖（Ｌｃ）のカルボキシル末端（図２Ｂ）；又はＨ鎖及びＬ鎖の両鎖のカルボキシル末端（図２Ｃ）に融合され得る。図２Ｄは、多重特異性抗体融合の発現のための単一の遺伝子コンストラクトの図である。
【図３Ａ】図３Ａは、本開示の組成物及び方法への使用のために適切な種々の多重特異性活性化可能抗体形式を示す一連の説明図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、多重特異性活性化可能抗体融合体の発現のための遺伝子コンストラクトの図である。
【図４】図４のパネルＡ−Ｊは、選択された組の可能な順列の本開示の多重特異性抗体の一連の概略図である。灰色の影付きボックスは、図２に示される構成を包含し、そして完全性及び比較のために本明細書に包含される。
【図５】図５のパネルＡ−Ｊは、選択された組の可能な順列の本開示の多重特異性抗体の一連の概略図である。灰色の影付きボックスは、図３に示される構成を包含し、そして完全性及び比較のために本明細書に包含される。特に、この図は、一次抗原結合部位がマスキングされ（すなわち、活性化できる）、そして追加の抗原結合ドメインがマスキングされていない、多重特異性活性化可能抗体を示す。
【図６】図６のパネルＡ−Ｊは、すべての抗原結合ドメインがマスキングされている多重特異性活性化可能抗体の配列の一連の概略図である。
【図７】図７のパネルＡ−Ｊは、二次抗原結合ドメインがマスキングされ、そして追加の抗原結合ドメインがマスキングされていない、多重特異性活性化可能抗体の配列の一連の概略図である。
【図８】図８のパネルＡ−Ｊは、大部分であるが、しかしすべてではない抗原結合ドメインがマスキングされ、そして少なくとも１つの追加の抗原結合ドメインがマスキングされていない、多重特異性活性化可能抗体の配列の一連の概略図である。
【図９】図９のパネルＡ−Ｄは、一次抗原結合ドメイン及び別の抗原結合ドメインがマスキングされ、そして残る抗原結合ドメインがマスキングされていない、多重特異性活性化可能抗体の配列の一連の概略図である。
【図１０】図１０は、サンプル９−１１における、それぞれ単一特異性抗体又は活性化可能抗体と比較して、サンプル１−８における、ｓｃＦｖ融合されたＨ鎖の分子量を示す多重特異性抗体及び多重特異性活性化可能抗体のＰＡＧＥ分析を示すグラフである。
【図１１】図１１は、多重特異性抗体のそれらの同族抗原に特異的に結合する能力を示すグラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、（Ａ）マウス及び（Ｂ）ヒトＣＴＬＡ−４に対して特異的に結合する、抗−ヒトＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖを含む多重特異性抗体及び多重特異性活性化可能抗体の能力を示す一連のグラフである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、（Ａ）マウス及び（Ｂ）ヒトＣＴＬＡ−４に対して特異的に結合する、抗−ヒトＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖを含む多重特異性抗体及び多重特異性活性化可能抗体の能力を示す一連のグラフである。
【図１３】図１３は、ＥＬＩＳＡ結合実験においてヒトＣＤ３εを特異的に結合する、抗−ＥＧＦＲ多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３及び抗−Ｊａｇｇｅｄ  多重特異性活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１ｖ２−ＯＫＴ３として本明細書において言及されるＯＫＴ３−含有多重特異性活性化可能抗体の能力を示すグラフである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、Ｈ鎖ｓｃＦｖ融合の切断を伴わないで、多重特異性活性化可能抗体の活性化を示すｕＰＡ消化物のＰＡＧＥ分析を示す一連の写真である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、Ｈ鎖ｓｃＦｖ融合の切断を伴わないで、多重特異性活性化可能抗体の活性化を示すｕＰＡ消化物のＰＡＧＥ分析を示す一連の写真である。
【図１５Ａ】図１５Ａは、種々の標的を結合する、活性化された多重特異性活性化可能抗体の能力を示す一連のグラフである。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、種々の標的を結合する、活性化された多重特異性活性化可能抗体の能力を示す一連のグラフである。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、種々の標的を結合する、活性化された多重特異性活性化可能抗体の能力を示す一連のグラフである。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、種々の標的を結合する、活性化された多重特異性活性化可能抗体の能力を示す一連のグラフである。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＣＤ３ε−陽性Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞への本開示の多重特異性抗体の結合を示すグラフである。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ＣＤ３ε−陽性Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞及びＥＧＦＲへの本開示の多重特異性抗体の同時結合を示すグラフである。
【図１７】図１７は、本開示の多重特異性抗体によるＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞のＥＧＦＲ依存性活性化を示す一連のグラフである。
【図１８Ａ】図１８Ａは、本開示の多重特異性抗体による一次ＣＤ８+Ｔ細胞のＥＧＦＲ依存性活性化を示すグラフである。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、本開示の多重特異性抗体による標的細胞のＥＧＦＲ依存性死滅を示すグラフである。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、ＥＧＦＲ−陰性Ｕ２６６細胞における最小活性化に比較して、ＥＧＦＲ発現ＳＷ４８０細胞における多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎによる一次Ｔ細胞のＣＤ６９活性化を示す一連のグラフである。
【図１８Ｄ】図１８Ｄは、ＥＧＦＲ−陰性Ｕ２６６細胞におけるごくわずかな死滅に比較して、ＥＧＦＲ発現ＳＷ４８０細胞における多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎによる標的細胞のＥＧＦＲ依存性死滅を示す一連のグラフである。
【図１９】図１９は、ＥＧＦＲ陰性Ｕ２６６細胞系の溶解が存在しないのに比較して、多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎによる、ＥＧＦＲ発現細胞のパネルの一次Ｔ細胞溶解を示す一連のグラフである。
【図２０Ａ】図２０Ａは、多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−ＮによるＥＧＦＲ結合に比較して、ＥＧＦＲ発現細胞への多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎの低められた結合を示す一連のグラフである。さらに、図２０Ａは、マトリプターゼ（本明細書においては、ＭＴＳＰ１又はＭＴ−ＳＰ１としても呼ばれる）による多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎのプロテアーゼ活性化が、多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎにより示されるレベルと同等のレベルにＥＧＦＲ結合を復元することを示す。図２０Ａはまた、そのような多重特異性活性化可能抗体及び多重特異性抗体が、それぞれの単一特異性活性化可能抗体及び単一特異性抗体の態様に類似する態様でＥＧＦＲを結合することも示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−ＮによるＥＧＦＲ結合に比較して、ＥＧＦＲ発現細胞への多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎの低められた結合を示す一連のグラフである。さらに、図２０Ｂは、マトリプターゼ（本明細書においては、ＭＴＳＰ１又はＭＴ−ＳＰ１としても呼ばれる）による多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎのプロテアーゼ活性化が、多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎにより示されるレベルと同等のレベルにＥＧＦＲ結合を復元することを示す。図２０Ｂはまた、そのような多重特異性活性化可能抗体及び多重特異性抗体が、それぞれの単一特異性活性化可能抗体及び単一特異性抗体の態様に類似する態様でＥＧＦＲを結合することも示す。
【図２１Ａ】図２１Ａは、ＣＤ３ε−陽性Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞への多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ、活性化された多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ及び多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎの結合を示す一連のグラフである。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、ＣＤ３ε−陽性Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞への多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ、活性化された多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ及び多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎの結合を示す一連のグラフである。
【図２２】図２２は、多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎによる活性化に比較して、多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−ＮによるＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の低められたＥＧＦＲ−依存性活性化を示すグラフである。さらに、この図は、マトリプターゼによる多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎのプロテアーゼ活性化が多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎにより示されるレベルに等しいレベルにＥＧＦＲ−依存活性化を復元することを示す。
【図２３Ａ】図２３Ａは、多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎによる活性化に比較して、多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎによる一次ＣＤ８+Ｔ細胞の低められたＥＧＦＲ−依存性活性化を示すグラフである。さらに、この図は、マトリプターゼによる多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎのプロテアーゼ活性化が多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎにより示されるレベルに等しいレベルにＥＧＦＲ−依存活性化を復元することを示す。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎによる死滅に比較して、多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎによる標的細胞の低められたＥＧＦＲ−依存性死滅を示すグラフである。さらに、この図は、マトリプターゼによる多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎのプロテアーゼ活性化が多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎにより示されるレベルに等しいレベルにＥＧＦＲ−依存性死滅を復元することを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２７】
本開示は、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体を提供する。本明細書において使用される場合、多重特異性抗体は、複数の異なった抗原又はエピトープを認識する抗体であり、そして多重特異性活性化可能抗体は、多重特異性抗体の少なくとも１つの抗原−又はエピトープ−結合ドメインに結合される少なくとも１つのマスキング部分（ＭＭ）を含む多重特異性抗体であり、結果的に、前記ＭＭのカップリングが抗原−又はエピトープ−結合ドメインのその標的を結合する能力を低める。本明細書において提供される活性化可能多重特異性抗体は、循環において安定し、治療及び／又は診断の意図される部位で活性化されるが、しかし正常、すなわち健康組織においては活性化されず、そして活性化される場合、その対応する、修飾されていない多重特異性抗体と少なくとも同等である標的への結合を示す。
【０１２８】
多重特異性抗体の非制限的例は、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、及び他の多重特異性抗体を包含する。本明細書に提供される多重特異性抗体は、また、多価であり；本明細書において使用される場合、多価とは、結合部位が同じか又は異なった抗原又はエピトープを認識するかどうかにかかわらず、抗体上の結合部位の総数を意味する。多重特異性活性化可能抗体の非制限的例は、二重特異性活性化可能抗体、三重特異性活性化可能抗体、四重特異性活性化可能抗体、及び他の多重特異性活性化可能抗体を包含する。本明細書において提供される多重特異性活性化可能抗体はまた、多価である。
【０１２９】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体又はそのフラグメント及び／又は多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントは、Ｔ細胞及び／又は他の免疫エフェクター細胞と動員するよう企画される。Ｔ細胞と動員する多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントはまた、Ｔ細胞動員多重特異性抗体又はそのフラグメント及び／又はＴ−細胞動員多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントとして、本明細書において言及される。免疫得エフェクター細胞と動員する多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントは、免疫エフェクター細胞動員多重特異性抗体又はそのフラグメント及び／又は免疫エフェクター細胞動員多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントとして本明細書において言及される。いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体又はそのフラグメント及び／又は多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントは、複数の標的及び／又は複数のエピトープを結合するか、又は他方では、それと相互作用するよう企画され、また、多抗原標的化抗体又はそのフラグメント及び／又は多抗原標的化活性化可能抗体又はそのフラグメントとして、本明細書において言及される。
【０１３０】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体又はそのフラグメントは、ＩｇＧドメイン及びｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体又はそのフラグメントは、ＩｇＧ可能ドメイン及びｃｓＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体又はそのフラグメントの１つの抗体ドメインは、標的抗原に対する特異性を有し、そして別の抗体ドメインは、Ｔ−細胞表面抗原に対する特異性を有する。いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体又はそのフラグメントの１つの抗体ドメインは、標的抗原に対する特異性を有し、そして別の抗体ドメインは別の標的抗原に対する特異性を有する。いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体又はそのフラグメントの１つの抗体ドメインは標的抗原の別のエピトープに対する特異性を有する。
【０１３１】
本開示の多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントの種々の実施形態が、図３Ａ及び５−９に示されている。いくつかの実施形態によれば、ＩｇＧを含む多重特異性活性化可能抗体又はフラグメントは、マスキングされたＩｇＧ可変ドメインを有する。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖを含む多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントは、マスキングされたｓｃＦｖドメインを有する。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントは、ＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの両者を有し、ここでＩｇＧ可変ドメインの少なくとも１つはマスキング部分にカップリングされる。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントは、ＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの両者を有し、ここでｓｃＦｖドメインの少なくとも１つは、マスキング部分にカップリングされる。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントは、ＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの両者を有し、ここでＩｇＧ可変ドメインの少なくとも１つはマスキング部分にカップリングされ、そしてｓｃＦｖドメインの少なくとも１つはマスキング部分にカップリングされる。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントは、ＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの両者を有し、ここでＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの個々は、それ自体のマスキング部分にカップリングされる。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントの１つの抗体ドメインは、標的抗原に対する特異性を有し、そして別の抗体ドメインは、Ｔ−細胞表面抗原に対する特異性を有する。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントの１つの抗体ドメインは、標的抗原に対する特異性を有し、そして別の抗体ドメインは、別の標的抗原に対する特異性を有する。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントの１つの抗体ドメインは標的抗原のエピトープに対する特異性を有し、そして別の抗体ドメインは、同じ標的抗原の別のエピトープに対する特異性を有する。
【０１３２】
いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性抗体又はそのフラグメントは、（ｉ）Ｔ細胞上の表面抗原である第１のＴ−細胞動員標的を結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含む、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメント、及び（ｉｉ）第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを少なくとも含む。いくつかの実施形態によれば、第１及び第２標的は、異なった抗原である。いくつかの実施形態によれば、第１及び第２標的は、同じ抗原上の異なったエピトープである。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、標的−特異性抗体のＨ鎖のＮ−末端に結合される。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、標的−特異性抗体のＨ鎖のＣ−末端に結合される。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、標的−特異性抗体のＬ鎖のＮ−末端に結合される。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、標的−特異性抗体のＬ鎖のＣ−末端に結合される。いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体は、多重特異性抗体の１又は２以上のＮ−末端及び／又は１又は２以上のＣ−末端の組合せに結合されるＴ−細胞動員抗体又はそのフラグメントを含む。本開示はまた、別の免疫エフェクター細胞動員抗体又はそのフラグメント、例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単核細胞、例えば骨髄単核細胞、マクロファージ及び／又は他の免疫エフェクター細胞の表面抗原を結合するそれらの抗体を含む多重特異性抗体も含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性抗体又はそのフラグメントは、１又は２以上のＴ細胞活性化受容体、例えばＴ−細胞動員ｓｃＦｖフラグメント、例えばＯＸ４０/ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７/ ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７/ＯＸ４０、ＣＤ２７/ＮＫＧ２Ｄ（但し、それらだけには限定されない）、及び活性化受容体の追加の組合せを動員する２種のＴ−細胞動員抗体又はそのフラグメント、及びＴ−細胞動員ｓｃＦｖフラグメントが標的結合抗体の両アームに連結されるよう、１つの標的−結合抗体の追加の組合せを少なくとも含む。いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性抗体又はそのフラグメントは、１又は２以上のＴ細胞阻害受容体、及びＴ−細胞動員ｓｃＦｖフラグメントが標的結合抗体の両アームに連結されるよう１つの標的−結合抗体を動員する２つのＴ−細胞動員抗体又はそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態によれば、前記２つのＴ−細胞動員抗体フラグメントは、同じＴ−細胞動員標的を結合する。いくつかの実施形態によれば、前記２つのＴ−細胞動員抗体フラグメントは、異なったＴ−細胞動員標的を結合する。いくつかの実施形態によれば、前記２つのＴ−細胞動員抗体フラグメントは、同じＴ−細胞動員標的上の異なったエピトープを結合する。
【０１３４】
いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性抗体又はそのフラグメントは、（ｉ）第１のＴ−細胞動員標的を結合する第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含むＴ−細胞動員抗体の抗原結合フラグメントを含む第１アーム、及び（ｉｉ）第２標的を結合する第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む標的結合抗体の抗原結合フラグメントを含む第２アームを少なくとも含む。いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体又はそのフラグメントは、（ｉｉｉ）第３標的を結合する第３抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ３）を含む標的結合抗体の第３抗原結合フラグメントを少なくとも含む。いくつかの実施形態によれば、第２及び第３標的又はそれ以上の標的は、同じ抗原である。いくつかの実施形態によれば、第２及び第３標的又はそれ以上の標的は、異なった抗原である。いくつかの実施形態によれば、第２及び第３標的又はそれ以上の標的は、同じ抗原上の異なったエピトープである。
【０１３５】
いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントは、（ｉ）Ｔ細胞上の表面抗原である第１のＴ−細胞動員標的を結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含む、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメント、ここで、ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ）に結合され、結果的に、ＭＭは、ＡＢ１の第１標的を結合する能力を低め、及び（ｉｉ）第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを少なくとも含む。いくつかの実施形態によれば、第１及び第２標的は、異なった抗原である。いくつかの実施形態によれば、第１及び第２標的は、同じ抗原上の異なったエピトープである。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、標的−特異性抗体のＨ鎖のＮ−末端に結合される。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、標的−特異性抗体のＨ鎖のＣ−末端に結合される。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、標的−特異性抗体のＬ鎖のＮ−末端に結合される。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、標的−特異性抗体のＬ鎖のＣ−末端に結合される。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、多重特異性活性化可能抗体の１又は２以上のＮ−末端及び／又は１又は２以上のＣ−末端の組合せに結合されるＴ−細胞動員抗体又はそのフラグメントを含む。本開示はまた、別の免疫エフェクター細胞動員抗体又はそのフラグメント、例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単核細胞、例えば骨髄単核細胞、マクロファージ及び／又は他の免疫エフェクター細胞の表面抗原を結合するそれらの抗体を含む多重特異性活性化可能抗体も含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントは、（ｉ）１又は２以上のＴ細胞活性化受容体、例えばＴ−細胞動員ｓｃＦｖフラグメント、例えばＯＸ４０/ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７/ ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７/ＯＸ４０、ＣＤ２７/ＮＫＧ２Ｄ（但し、それらだけには限定されない）、及び活性化受容体の追加の組合せを動員する２種のＴ−細胞動員抗体又はそのフラグメント、ここで、Ｔ−細胞動員抗体フラグメントの１つのＡＢ１がマスキング部分（ＭＭ）に結合され、結果的に、ＭＭのカップリングが、ＡＢ１のそのそれぞれのＴ−細胞結合標的を結合する能力を低める、及び（ｉi）Ｔ−細胞動員ｓｃＦｖフラグメントが標的結合抗体の両アームに連結されるよう、１つの標的−結合抗体を少なくとも含む。いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性抗体又はそのフラグメントは、１又は２以上のＴ細胞阻害受容体、及びＴ−細胞動員ｓｃＦｖフラグメントが標的結合抗体の両アームに連結されるよう１つの標的−結合抗体を動員する２つのＴ−細胞動員抗体又はそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態によれば、前記２つのＴ−細胞動員抗体フラグメントは、同じＴ−細胞動員標的を結合する。いくつかの実施形態によれば、前記２つのＴ−細胞動員抗体フラグメントは、異なったＴ−細胞動員標的を結合する。いくつかの実施形態によれば、前記２つのＴ−細胞動員抗体フラグメントは、同じＴ−細胞動員標的上の異なったエピトープを結合する。
【０１３７】
いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントは、（ｉ）１又は２以上のＴ細胞活性化受容体、例えばＴ−細胞動員ｓｃＦｖフラグメント、例えばＯＸ４０/ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７/ ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７/ＯＸ４０、ＣＤ２７/ＮＫＧ２Ｄ（但し、それらだけには限定されない）、及び活性化受容体の追加の組合せを動員する２種のＴ−細胞動員抗体又はそのフラグメント、ここで、Ｔ−細胞動員抗体フラグメントの各ＡＢ１がそれ自体のマスキング部分（ＭＭ）に結合され、結果的に、そのそれぞれのＡＢ１への各ＭＭのカップリングが、ＡＢ１のそのそれぞれのＴ−細胞結合標的を結合する能力を低める、及び（ｉi）Ｔ−細胞動員ｓｃＦｖフラグメントが標的結合抗体の両アームに連結されるよう、１つの標的−結合抗体を少なくとも含む。いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性抗体又はそのフラグメントは、１又は２以上のＴ細胞阻害受容体、及びＴ−細胞動員ｓｃＦｖフラグメントが標的結合抗体の両アームに連結されるよう１つの標的−結合抗体を動員する２つのＴ−細胞動員抗体又はそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態によれば、前記２つのＴ−細胞動員抗体フラグメントは、同じＴ−細胞動員標的を結合する。いくつかの実施形態によれば、前記２つのＴ−細胞動員抗体フラグメントは、異なったＴ−細胞動員標的を結合する。いくつかの実施形態によれば、前記２つのＴ−細胞動員抗体フラグメントは、同じＴ−細胞動員標的上の異なったエピトープを結合する。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、１又は２以上のＴ細胞活性化受容体の代わりに、１又は２以上のＴ細胞阻害受容体を動員する。
【０１３８】
いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントは、（ｉ）第１のＴ−細胞動員標的を結合する第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含むＴ−細胞動員抗体の抗原結合フラグメントを含む第１アーム、ここで、ＡＢ１がマスキング部分（ＭＭ）に結合され、結果的に、ＭＭのカップリングが、ＡＢ１の第１標的を結合する能力を低める、及び（ｉｉ）第２標的を結合する第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む標的結合抗体の抗原結合フラグメントを含む第２アームを少なくとも含む。いくつかの実施形態によれば、第１及び第２標的は、同じ抗原である。いくつかの実施形態によれば、第１及び第２標的は、異なった抗原である。いくつかの実施形態によれば、第１及び第２標的は、同じ抗原上の異なったエピトープである。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、１又は２以上のＴ細胞活性化受容体の代わりに、１又は２以上のＴ細胞阻害受容体を動員する。
【０１３９】
いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントは、（ｉ）Ｔ細胞上の表面抗原である第１のＴ−細胞動員標的を結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含む、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメント、及び（ｉｉ）第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメント、ここで、ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ）に結合され、結果的に、ＭＭは、ＡＢ２の第２標的を結合する能力を低める、を少なくとも含む。いくつかの実施形態によれば、第１及び第２標的は、異なった抗原である。いくつかの実施形態によれば、第１及び第２標的は、同じ抗原上の異なったエピトープである。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、標的−特異性抗体のＨ鎖のＮ−末端に結合される。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、標的−特異性抗体のＨ鎖のＣ−末端に結合される。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、標的−特異性抗体のＬ鎖のＮ−末端に結合される。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、標的−特異性抗体のＬ鎖のＣ−末端に結合される。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、多重特異性活性化可能抗体の１又は２以上のＮ−末端及び／又は１又は２以上のＣ−末端の組合せに結合されるＴ−細胞動員抗体又はそのフラグメントを含む。本開示はまた、別の免疫エフェクター細胞動員抗体又はそのフラグメント、例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単核細胞、例えば骨髄単核細胞、マクロファージ及び／又は他の免疫エフェクター細胞の表面抗原を結合するそれらの抗体を含む多重特異性活性化可能抗体も含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントは、（ｉ）１又は２以上のＴ細胞活性化受容体、例えばＴ−細胞動員ｓｃＦｖフラグメント、例えばＯＸ４０/ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７/ ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７/ＯＸ４０、ＣＤ２７/ＮＫＧ２Ｄ（但し、それらだけには限定されない）、及び活性化受容体の追加の組合せを動員する２種のＴ−細胞動員抗体又はそのフラグメント、及び（ｉｉ）第２標的を結合する第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を少なくとも含み、ここで、ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ）に結合され、結果的に、ＭＭのカップリングが、ＡＢ２の第２標的を結合する能力を低め、ここで前記Ｔ−細胞ｓｃＦｖフラグメントが標的結合抗体の両アームに連結される。いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性抗体又はそのフラグメントは、１又は２以上のＴ細胞阻害受容体、及びＴ−細胞動員ｓｃＦｖフラグメントが標的結合抗体の両アームに連結されるよう１つの標的−結合抗体を動員する２つのＴ−細胞動員抗体又はそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態によれば、前記２つのＴ−細胞動員抗体フラグメントは、同じＴ−細胞動員標的を結合する。いくつかの実施形態によれば、前記２つのＴ−細胞動員抗体フラグメントは、異なったＴ−細胞動員標的を結合する。いくつかの実施形態によれば、前記２つのＴ−細胞動員抗体フラグメントは、同じＴ−細胞動員標的上の異なったエピトープを結合する。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、１又は２以上のＴ細胞活性化受容体の代わりに、１又は２以上のＴ細胞阻害受容体を動員する。
【０１４１】
いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントは、（ｉ）Ｔ−細胞動員抗体の抗原結合フラグメントを含む第１アーム、及び（ｉｉ）第２標的を結合する第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む標的結合抗体の抗原結合フラグメントを含む第２アームを少なくとも含み、ここで、ＡＢ２がマスキング部分（ＭＭ）に結合され、結果的に、ＭＭのカップリングが、ＡＢ２の第２標的を結合する能力を低める。いくつかの実施形態によれば、第１及び第２標的は、同じ抗原である。いくつかの実施形態によれば、第１及び第２標的は、異なった抗原である。いくつかの実施形態によれば、第１及び第２標的は、同じ抗原上の異なったエピトープである。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、１又は２以上のＴ細胞活性化受容体の代わりに、１又は２以上のＴ細胞阻害受容体を動員する。
【０１４２】
いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントは、（ｉ）Ｔ細胞上の表面抗原である第１のＴ−細胞動員標的を結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含む、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメント、ここで、ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１は、ＡＢ１の第１標的を結合する能力を低める、及び（ｉｉ）第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメント、ここで、ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２は、ＡＢ２の第２標的を結合する能力を低める、を少なくとも含む。いくつかの実施形態によれば、第１及び第２標的は、異なった抗原である。いくつかの実施形態によれば、第１及び第２標的は、同じ抗原上の異なったエピトープである。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、標的−特異性抗体のＨ鎖のＮ−末端に結合される。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、標的−特異性抗体のＨ鎖のＣ−末端に結合される。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、標的−特異性抗体のＬ鎖のＮ−末端に結合される。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、標的−特異性抗体のＬ鎖のＣ−末端に結合される。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、多重特異性活性化可能抗体の１又は２以上のＮ−末端及び／又は１又は２以上のＣ−末端の組合せに結合されるＴ−細胞動員抗体又はそのフラグメントを含む。本開示はまた、別の免疫エフェクター細胞動員抗体又はそのフラグメント、例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単核細胞、例えば骨髄単核細胞、マクロファージ及び／又は他の免疫エフェクター細胞の表面抗原を結合するそれらの抗体を含む多重特異性活性化可能抗体も含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントは、（ｉ）１又は２以上のＴ細胞活性化受容体、例えばＴ−細胞動員ｓｃＦｖフラグメント、例えばＯＸ４０/ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７/ ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７/ＯＸ４０、ＣＤ２７/ＮＫＧ２Ｄ（但し、それらだけには限定されない）、及び活性化受容体の追加の組合せを動員する２種のＴ−細胞動員抗体又はそのフラグメント、ここで、Ｔ−細胞動員抗体フラグメントの１つのＡＢ１がマスキング部分（ＭＭ）に結合され、結果的に、ＭＭのカップリングが、ＡＢ１のそのそれぞれのＴ−細胞結合標的を結合する能力を低める、及び（ｉｉ）第２標的を結合する第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を少なくとも含み、ここで、ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが、ＡＢ２の第２標的を結合する能力を低め、ここで前記Ｔ−細胞ｓｃＦｖフラグメントが標的結合抗体の両アームに連結される。いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性抗体又はそのフラグメントは、１又は２以上のＴ細胞阻害受容体、及びＴ−細胞動員ｓｃＦｖフラグメントが標的結合抗体の両アームに連結されるよう１つの標的−結合抗体を動員する２つのＴ−細胞動員抗体又はそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態によれば、前記２つのＴ−細胞動員抗体フラグメントは、同じＴ−細胞動員標的を結合する。いくつかの実施形態によれば、前記２つのＴ−細胞動員抗体フラグメントは、異なったＴ−細胞動員標的を結合する。いくつかの実施形態によれば、前記２つのＴ−細胞動員抗体フラグメントは、同じＴ−細胞動員標的上の異なったエピトープを結合する。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、１又は２以上のＴ細胞活性化受容体の代わりに、１又は２以上のＴ細胞阻害受容体を動員する。
【０１４４】
いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントは、（ｉ）１又は２以上のＴ細胞活性化受容体、例えばＴ−細胞動員ｓｃＦｖフラグメント、例えばＯＸ４０/ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７/ ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７/ＯＸ４０、ＣＤ２７/ＮＫＧ２Ｄ（但し、それらだけには限定されない）、及び活性化受容体の追加の組合せを動員する２種のＴ−細胞動員抗体又はそのフラグメント、ここで、Ｔ−細胞動員抗体フラグメントの各ＡＢ１がマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、各ＭＭ１のそのそれぞれのＡＢ１へのカップリングが、ＡＢ１のそのそれぞれのＴ−細胞結合標的を結合する能力を低める、及び（ｉｉ）第２標的を結合する第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を少なくとも含み、ここで、ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが、ＡＢ２の第２標的を結合する能力を低め、ここで前記Ｔ−細胞ｓｃＦｖフラグメントが標的結合抗体の両アームに連結される。いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性抗体又はそのフラグメントは、１又は２以上のＴ細胞阻害受容体、及びＴ−細胞動員ｓｃＦｖフラグメントが標的結合抗体の両アームに連結されるよう１つの標的−結合抗体を動員する２つのＴ−細胞動員抗体又はそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態によれば、前記２つのＴ−細胞動員抗体フラグメントは、同じＴ−細胞動員標的を結合する。いくつかの実施形態によれば、前記２つのＴ−細胞動員抗体フラグメントは、異なったＴ−細胞動員標的を結合する。いくつかの実施形態によれば、前記２つのＴ−細胞動員抗体フラグメントは、同じＴ−細胞動員標的上の異なったエピトープを結合する。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、１又は２以上のＴ細胞活性化受容体の代わりに、１又は２以上のＴ細胞阻害受容体を動員する。
【０１４５】
いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性活性化可能抗体又はそのフラグメントは、（ｉ）第１のＴ−細胞動員標的を結合する第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含むＴ−細胞動員抗体の抗原結合フラグメントを含む第１アーム、ここで、ＡＢ１がマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭのカップリングが、ＡＢ１の第１標的を結合する能力を低める、及び（ｉｉ）第２標的を結合する第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む標的結合抗体の抗原結合フラグメントを含む第２アーム、ここで、ＡＢ２がマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭのカップリングが、ＡＢ２の第１標的を結合する能力を低める、を少なくとも含む。いくつかの実施形態によれば、第１及び第２標的は、同じ抗原である。いくつかの実施形態によれば、第１及び第２標的は、異なった抗原である。いくつかの実施形態によれば、第１及び第２標的は、同じ抗原上の異なったエピトープである。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞動員抗体又はそのフラグメントは、１又は２以上のＴ細胞活性化受容体の代わりに、１又は２以上のＴ細胞阻害受容体を動員する。
【０１４６】
いくつかの実施形態によれば、標的抗原は、正常な、健康組織及び疾患組織の両者上で高度に発現される抗原である。いくつかの実施形態によれば、標的抗原は、正常な健康組織及び疾患組織の両者上で高度に発現される、表１からの抗原である。
【０１４７】
いくつかの実施形態によれば、標的抗原は、疾患組織上で高度に発現されるが、しかし正常な健康組織上では高度に発現されない抗原である。いくつかの実施形態によれば、標的抗原は、疾患組織上で高度に発現されるが、しかし正常な健康組織上では高度に発現されない、表１からの抗原である。標的抗原は、正常な健康組織上で発現され得るが、しかしそれは、正常な健康組織上では、高度に発現されないか、又は他方では、過剰発現される。
【０１４８】
いくつかの実施形態によれば、マスキング部分（ＭＭ）は、プロテアーゼのための基質として機能する切断可能部分（ＣＭ）を介して、抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）にカップリングされる。本開示の多重特異性活性化可能抗体への使用のための適切なプロテアーゼは、治療及び／又は診断の意図される部位でのプロテアーゼ発現に基づいて決定される。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼは、u−タイププラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ、またウロキナーゼともよべれる）、レグマイン及び／又はマトリプターゼ（また、ＭＴ−ＳＰ１又はＭＴＳＰ１とも呼ばれる）である。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）である。
【０１４９】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、非切断可能リンカーを介して抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）にカップリングされるマスキング部分（ＭＭ）を含むよう構築される。例えば、いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、標的化抗体又はその抗原結合フラグメント及びＴ−細胞動員抗体又はその抗原結合部分を含むＴ−細胞動員多重特異性活性化可能抗体であり、ここでＴ−細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントは、第１のＴ−細胞動員標的を結合する第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここでＡＢ１は非切断可能リンカーを介してマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭのカップリングがＡＢ１の第１標的を結合する能力を低め、そして標的化抗体又はその抗原結合フラグメントはマスキングされない。
【０１５０】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、標的化抗体又はその抗原結合フラグメント及びＴ−細胞動員抗体又はその抗原結合部分を含むＴ−細胞動員多重特異性活性化可能抗体であり、ここでＴ−細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントは、第１のＴ−細胞動員標的を結合する第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここでＡＢ１は非切断可能リンカーを介してマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭのカップリングがＡＢ１の第１標的を結合する能力を低め、そして標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここでＡＢ２は切断可能リンカーを介してマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭのカップリングがＡＢ２の第２標的を結合する能力を低める。
【０１５１】
二重特異性抗体の一般的概念は、最初に、少なくとも５０年前、紹介されている（Chan, A.C. and Carter, P.J., Nature Reviews Immunol. 10, 301-316 (2010)に引用されるような、Nisonoff, A. and Mandy, W.J., Nature 194, 355-359 (1962)）。
【０１５２】
種々の二重特異性プラットホームが記載されて来た（例えば、Figure 1; Liu, M.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 8648-8652 (1985)；Kroesen, B.J., et al. Adv. Drug Delivery Rev. 31, 105-129 (1998) により再考される; Marvin, J.S. and Zhu, Z., Acta Pharm. Sinica 26, 649-658 (2005); Chan and Carter, Nat. Rev. Immunol. 2010; Fitzgerald and Lugovsky, MAbs. 3(3):299-309 (2011); Riethmuller, G., Cancer Immunity 12, 12-18 (2012) を参照のこと）。二重特異性抗体の構成のための一般的概念は、複数の標的抗原に結合できる分子を構成し、そしてＩｇＧ様生理学的分布、薬物動態及びエフェクター機能を示すために、通常、複数の免疫グロブリンドメインに基づいて、タンパク質結合ドメインを一緒に連結することである。後者は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、Ｔ−細胞リクルートメント（ＢｉＴＥｓ（登録商標））（例えば、Baeuerle, P.A. and Reinhardt, C., Cancer Res. 69, 4941-4944 (2009)を参照のこと）及びＴａｎｄＡｂｓ（登録商標）（Cochlovius et al., Cancer Res. 60, 4336-4341 (2000)を参照のこと）、及び／又は化学的に接合された部分の形での細胞素性ペイロード、例えば微小管阻害剤、ＤＮＡアルキル化剤、又は抗体−薬剤接合体（ＡＤＣ）の形での他の毒素の送達を包含する。多くの二重特異性抗体形式が、それらの準最適な生成及び薬理学的性質にかかわらず、最も臨床学的に進歩した性質を表わす従来のヘテロダイマーＩｇＧ及びＢｉＴＥｓ（登録商標）を用いて研究されている（Chan and Carter, Nat. Rev. Immunol. 2010を参照のこと）。二重特異性抗体は、特定の形式及び選択される標的抗原の特定の特性に基づいて、多くの可能な用途を有し；必ずしもすべての二重特異性形式がすべての適用のために適切ではない。例えば、Two-in-one Fab 形式(Bostrom, J., et al., Science 323, 1610-1614 (2009))は、何れかの様式で抗原Ａ及びＢに結合するための単一結合ドメインから成り；従って、このタイプの二重特異性抗体は、抗原Ａの２つのコピー、抗原Ｂの２つのコピー、又は各抗原の１つのコピーを動員することができる。他方では、ＤＶＤ形式（Wu, C., et al., Nature Biotechnol. 25, 1290-1297 (2007)）は、抗原Ｂの２つのコピーの他に、抗原Ａのコピーの動員を提供する。各結合ドメインの間隔及び相対的配向がまた、意図される活性を付与するような手段で複数の抗原の動員のためにも重要であり、例えば架橋受容体（Jackman, J., et al., J. Biol. Chem. 285, 20850-20859 (2010)）は、各受容体の１つのコピーの動員が必要とされる場合、２種の異なった抗原の個々との一価の相互作用を必要とする。
【０１５３】
二重特異性抗体適用の機構的に異なった領域は、細胞毒性のために標的化された細胞（例えば、腫瘍の細胞）の表面上の抗原及び細胞毒性免疫細胞（例えば、Ｔ−細胞）の表面上の抗原の両者を動員する二重特異性抗体を構成することにより、腫瘍細胞を、攻撃する免疫エフェクター細胞（例えば、細胞毒性Ｔ−リンパ球、ＮＫ細胞及び／又は骨髄性エフェクター細胞）のリクルーティングを包含する。Catumaxomabは、癌細胞上の腫瘍抗原ＥｐＣＡＭを標的化し、そしてＴ−細胞表面上のＣＤ３への結合を介して、細胞毒性Ｔ−細胞をリクルートする臨床学的に検証された二重特異性抗体の例であり（Linke, R., Klein, A., and Seimetz, D., mAbs 2, 129-136 (2010)）；しかしながら、その使用は、制限されており、そしてそれは腹腔内投与を必要とする。ＢｉＴＥ（登録商標）抗体は、異なった薬理学的性質を伴って、異なった形式でＴ−細胞リクルートメントを達成する二重特異性抗体であり（Baeuerle, P.A. and Reinhardt, C., Anti-Cancer Res. 69, 4941-4944 (2009)）、特にＢｉＴＥ抗体は、２つの一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）から構成され、そしてインビボで非常に短い薬理学的半減期を有し；従って、それらは持続した注入を通しての送達を必要とする。ＴａｎｄＡｂ（登録商標）と呼ばれる類似する形式は、四価の二重特異性ダイアボディコンストラクトであり、ここで２つの可変ドメインが標的抗原に結合し、そして２つの可変ドメインがＴ−細胞の表面上のＣＤ３に結合する（Cochlovius et al., Cancer Res. 60, 4336-4341 (2000)）。この形式は、標的抗原及びＴ−細胞表面抗原の両者の二価動員が、Ｔ−細胞動員及び抗原指向性細胞毒性のために使用され得ることを示す。しかしながら、ＴａｎｄＡｂ形式はまた、インビボで非常に短い半減期を有する。
【０１５４】
Ｔ−細胞動員二重特異性抗体の一般的な制限は、Ｔ−細胞の細胞毒性が非常に強力であり、そして細胞の表面上の相対的に低いレベルの標的抗原により活性化され得る事実に関連する。健康組織上の適度なレベルの標的抗原、例えばＥＧＦＲの発現さえ、有意な毒性を導き、臨床学的治療用途を制限するか、又は妨げる（Lutterbuese, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107, 12605-12610 (2010)）。従って、改善された安全性、例えば低められた毒性を示す効果的な抗体ベースの治療法についての必要性が残っている。
【０１５５】
本開示の多重特異性活性化可能抗体は、その抗体の活性が局在化された疾患の環境に制限されないので、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体よりも安全である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、免疫エフェクター細胞動員多重特異性活性化可能抗体である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、Ｔ−細胞動員多重特異性活性化可能抗体である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、複数の標的を認識する。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、ＩｇＧの長期半減期性質を付与するＩｇＧ−ｓｃＦｖ形式を包含する。いくつかの実施形態によれば、そのような多重特異性活性化可能抗体はさらに、ＦｃＲｎ結合部位におけるＦｃ突然変異の使用を通してモジュレートされる（Petkova, S. B. et al., Intl. Immunol. 18, 1759-1769 (2006)); Deng, R. et al., mAbs 4, 101-109 (2012)); Olafson, T Methods Mol. Biol. 907, 537-556 (2012)）。いくつかの実施形態によれば、そのような多重特異性活性化可能抗体は、Ｆｃドメインにおける突然変異、例えば標的外毒性を減じるために、ＩｇＧエフェクター機能（ＡＤＣＣ及びＣＤＣ）を低めるＮ２９７Ａ突然変異（Lund, J. et al., Mol. Immunol. 29, 53-39 (1992)）を包含する。
【０１５６】
多重特異性活性化可能抗体は、そのような治療の疾患−組織特異的標的化を達成するために、複数の疾患状態の特徴として広く認識されるプロテアーゼ活性のアップレギュレーションを活用する。活性化可能抗体は、切断可能部分（ＣＭ）、例えばプロテアーゼ−切断可能部分を介して抗体に連結されるマスキング部分（ＭＭ）を含むよう修飾されている、ＩｇＧ抗体又はそのフラグメント、例えばｓｃＦｖ領域、Ｆａｂ領域、単一ＶＨ又はＶＬドメインの使用に基づかれる（例えば、２００９年２月２６日に公開されたＰＣＴ国際公開番号２００９／０２５８４６号；２０１０年７月１５日に公開されたＰＣＴ国際公開番号２０１０／０８１１７３号を参照のこと）。他方では、非抗体タンパク質ドメイン（例えば、２０１０年８月２６日に公開されたＰＣＴ国際公開番号２０１０／０９６８３８号；Boersma, Y.L. et al., J. Biol. Chem. 286, 41273-41285 (2011)を参照のこと）が、１又は２以上の結合特異性を達成するために使用され得る。従来のＩｇＧのような多重特異性抗体は、多重特異性活性化可能抗体を生成するために、出発点として使用され得る。そのような多重特異性活性化可能抗体は、親多重特異性抗体により認識されるが、しかし選択的に活性化された切断可能リンカーにより決定される組織特異性を有するすべての抗原の高新和性標的化を可能にする。使用される多重特異性形式に依存して、ＭＭ及びＣＭは、適切なドメインのＮ−又はＣ−末端で配置され得る。
【０１５７】
多重特異性活性化可能抗体は、第２抗原に結合するための特異性を有する別のドメイン（ＩｇＧ又は他のタンパク質から誘導され得る）に、合成的に又は生合成的に連結される、第１抗原に対する特異性を有する少なくとも１つのＩｇＧ−由来のドメインを含む。追加の特異性は、第１抗原、第２抗原又は追加の抗原に対する追加の結合特異性を付与する１又は２以上の追加のドメインに、そのような多重特異性活性化可能抗体を連結することにより付与され得る。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、適切なマスキング部分（ＭＭ）によりマスキングされた１又は２以上のそれらのドメインを有する。図１に記載される多重特異性形式の個々は、１又は２以上の免疫グロブリンドメインの１又は２以上の抗原結合部分をマスキングすることにより、多重特異性活性化可能抗体に潜在的に転換され得る。適切な多重特異性活性化可能抗体形式の例は、図３Ａ及び５−９に示される。
【０１５８】
特定抗原に特異性を付与するためへのｓｃＦｖドメインの使用は、多重特異性抗体及び多重特異性活性化可能抗体のモジュール構成を可能にする。二重特異性抗体の構成のためへのＩｇＧＨ又はＬ鎖の末端に融合されるｓｃＦｖドメインの使用は、これまで記載されている（例えば、Orcutt, K.D. et al., Prot. Eng. Design Select. 23, 221-228 (2010)); Dong et al., (2011)を参照のこと）。この形式（「ＩｇＧ−ｓｃＦｖ」）は、従来のＩｇＧの二重特異性抗体への転換を可能にし、ここで第１特異性はＩｇＧの可変ドメインにコードされ、そして第２特異性は、柔軟リンカー領域を介して結合されるｓｃＦｖドメインにコードされる。この形式の変動は、Ｈ又はＬ鎖のＮ−又はＣ−末端でのｓｃＦｖドメインの融合を包含し；そのｓｃＦｖは同じが又は異なった抗原結合特異性を有することができる（pangler, J. B. et al., J. Mol. Biol. 422, 532-544 (2012)）。さらに、Ｈ鎖へテロダイマーの使用を通して（例えば、ノブ−ホール又は類似するコンストラクトを用いて）、異なった特異性のｓｃＦｖが、各Ｈ鎖のＮ−又はＣ−末端に結合され得る。
【０１５９】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、マスキングされたＩｇＧ可変ドメインを有する。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、マスキングされたｓｃＦｖドメインの両者を有する。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の１つの抗体ドメインは、標的抗原に対する特異性を有し、そして別の抗体ドメインは、Ｔ−細胞表面抗原に対する特異性を有する。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の１つの抗体ドメインは、標的抗原のエピトープに対する特異性を有し、そして別の抗体ドメインは、標的抗原の別のエピトープに対する特異性を有する。
【０１６０】
本開示は、次のもの（但し、それらだけには限定されない）を包含する多重特異性活性化可能抗体構造体の例を提供する：
(VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2; (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; or (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2、ここでＶＬ及びＶＨは、ＩｇＧに含まれる、第１特異性のＬ及びＨ鎖可変ドメインを表し；ＶＬ*及びＶＨ*は、ｓｃＦｖに含まれる、第２特異性の可変ドメインを表し；Ｌ１は、マスキング部分（ＭＭ）及び切断可能部分（ＣＭ）を連結するリンカーペプチドであり；Ｌ２は、切断可能部分（ＣＭ）及び抗体を連結するリンカーペプチドであり；Ｌ３はｓｃＦｖの可変ドメインを連結するリンカーペプチドであり；Ｌ４は、第２特異性の抗体に、第１特異性の抗体を連結するリンカーペプチドであり；ＣＬはＬ鎖不変ドメインであり；そしてＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３はＨ鎖不変ドメインである。第１及び第２特異性は何れかの抗原又はエピトープに対してであり得る。追加の構造体は、次のもの（但し、それらだけには限定されない）を含む：
(VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL--L4-VL*-L3-VH*)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; or (MM-L1-CM-L2-VL-CL--L4-VL*-L3-VH*)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2。
【０１６１】
いくつかの実施形態によれば、ＩｇＧを含む多重特異性活性化可能抗体は、マスキングされたＩｇＧ可変ドメインを有する。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖを含む多重特異性活性化可能抗体は、マスキングされたｓｃＦｖドメインを有する。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの両者を有し、ここで、ＩｇＧ可変ドメインの少なくとも１つがマスキング部分にカップリングされる。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの両者を有し、ここでｓｃＦｖドメインの少なくとも１つがマスキング部分にカップリングされる。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの両者を有し、ここでＩｇＧ可変ドメインの少なくとも１つがマスキング部分にカップリングされ、そしてｓｃＦｖドメインの少なくとも１つがマスキング部分にカップリングされる。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの両者を有し、ここでＩｇＧドメイン及びｓｃＦｖドメインの個々は、それ自体のマスキング部分にカップリングされる。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の１つの抗体ドメインが標的抗原に対する特異性を有し、そして別の抗体ドメインが、Ｔ−細胞表面抗原に対する特異性を有する。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の１つの抗体ドメインは、標的抗原に対する特異性を有し、そして別の抗体ドメインは、別の標的抗原に対する特異性を有する。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の１つの抗体ドメインは、標的抗原のエピトープに対する特異性を有し、そして別の抗体ドメインは、標的抗原の別のエピトープに対する特異性を有する。
【０１６２】
免疫エフェクター細胞動員多重特異性活性化可能抗体、例えばＴ−細胞動員多重特異性活性化可能抗体のいくつかの実施形態によれば、１つの抗原は典型的には、腫瘍細胞又は疾患に関連する他の細胞型の表面上に存在する抗原、例えば表１に列挙される何れかの標的、例えばＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、Jａｇｇｅｄ、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３又は ＣＤ７１ (ランスフェリン受容体)（但し、それらだけには限定されない）であり、そして別の抗原は典型的には、Ｔ−細胞、ナチュナルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄単核細胞、マクロファージ及び／又は他の免疫エフェクター細胞上に存在する刺激性又は阻害性抗原、例えばＢ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ５６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、又はＶＩＳＴＡである。Ｔ−細胞表面抗原に対する特異性を付与する抗体ドメインはまた、Ｔ−細胞受容体、ＮＫ−細胞受容体、マクロファージ受容体、及び／又は他の免疫エフェクター細胞受容体、例えばＢ７−１、Ｂ７−２、 Ｂ７Ｈ３、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２又はＴＮＦＳＦ９（但し、それらだけには限定されない）に結合するリガンド又はリガンドドメインにより置換され得る。多抗原標的化活性可能抗体のいくつかの実施形態によれば、１つの抗原は、表１に列挙される標的グループから選択され、そして別の抗原は、表１に列挙される標的グループから選択される。
【０１６３】
いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞表面表示標的の結合に対して特異的な単鎖可変ドメインは、細胞表面抗原に対する完全なヒトＩｇＧ１抗体（標的化抗体）のカルボキシル末端に融合される。ｓｃＦｖの融合は、Ｈ鎖のカルボキシル末端、Ｌ鎖のカルボキシル末端又は両鎖に対してであり得る（図２）。いくつかの実施形態によれば、Ｔ−細胞表面表示標的の結合に対して特異的な単鎖可変ドメインは、細胞表面抗原に対する完全なヒトＩｇＧ１抗体（標的化抗体）のアミノ末端に融合される。ｓｃＦｖの融合は、Ｈ鎖のアミノ末端、Ｌ鎖のアミノ末端又は両鎖に対してであり得る。融合体は、単一の遺伝子コントラクトとして構成され、そして培養下で細胞において発現される。標的化抗体は、１又は２以上の腫瘍表面抗原、又は枯渇を標的化された何れかの細胞への結合に対して特異的であり得る。ｓｃＦｖは、同じか又は異なった抗原に対して特異的であり得る。
【０１６４】
いくつかの実施形態によれば、標的化抗体は、抗−ＥＧＦＲ抗体である。いくつかの実施形態によれば、標的化抗体は、ＥＧＦＲへの結合に対して特異的であるＣ２２５ｖ５である。いくつかの実施形態によれば、標的化抗体は、ＥＧＦＲへの結合に対して特異的であるｃ２２５である。いくつかの実施形態によれば、標的化抗体は、ＥＧＦＲへの結合に対して特異的であるＣ２２５ｖ４である。いくつかの実施形態によれば、標的化抗体は、ＥＧＦＲへの結合に対して特異的であるＣ２２５ｖ６である。いくつかの実施形態によれば、標的化抗体は、抗−Jagged抗体である。いくつかの実施形態によれば、標的化抗体は、ヒト及びマウスJagged1及びJagged2への結合に対して特異的である４Ｄ１１である。いくつかの実施形態によれば、標的化抗体は、ヒト及びマウスJagged1及びJagged2への結合に対して特異的である４Ｄ１１ｖ２である。
【０１６５】
いくつかの実施形態によれば、標的化抗体は、活性化可能抗体の形で存在することができる。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、Ｐｒｏ−ｓｃＦｖの形で存在することができる（例えば、国際公開第２００９/０２５８４６号、国際公開第２０１０/０８１１７３号を参照のこと）。
【０１６６】
いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、ＣＤ３ε、例えばＯＫＴ３の結合に対して特異的である。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ−４（また、ＣＴＬＡ及びＣＴＬＡ４としても本明細書において呼ばれる）の結合に対して特異的である。
【０１６７】
いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、１又は２以下のＴ−細胞、１又は２以上のＮＫ−細胞及び／又は１又は２以上のマクロファージの結合に対して特異的である。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖは、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ５６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、又はＶＩＳＴＡ及びそれらの組合せから成る群から選択される標的の結合に対して特異的である。
【０１６８】
定義
特にことわらない限り、本開示に関連して使用される科学技術用語は、当業者により通常、理解される意味を有するであろう。さらに、文脈により必要とされない限り、単数形の用語は、複数形も含み、そして複数形の用語は単数形も含むであろう。一般的に、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、及びタンパク質及びオリゴ−又はポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションに関連して及びそれらの技法に関連して使用される命名法は、当業界において良く知られており、そして通常使用されるものである。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、及び組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に関しては、標準技法が使用される。酵素反応及び精製技法は、製造業者の仕様に従って、又は当核技術分野において通常に達成されるようにして、又は本明細書に記載されるようにして、実施される。前述の技法及び手順は、一般的に、当業界において良く知られている従来の技法に従って、及び本明細書を通して引用され、そして議論される種々の一般的な及びより具体的な参考文献に記載されるようにして実施される。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))を参照のこと。本明細書に記載される、分析化学、合成有機化学、及び医薬品及び製薬化学に関連して使用される命名法、及びそれらの実験手順及び技法は、良く知られており、そして一般的に当業界において使用される。化学合成、化学分析、医薬製剤、製剤化及び送達、及び患者の治療についての標準技法が用いられる。
【０１６９】
本開示に従って使用される場合、次の用語は、特にことわらない限り、次の意味を有することが理解されるであろう。
【０１７０】
本明細書において使用される場合、用語「抗体（antibody）」とは、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部分、すなわち抗原を特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を意味する。「特異的に結合する（specifically bind）」又は「〜と免疫反応する（immunoreacts with）」、又は「免疫特異的に結合する（immunospecifically bind）」とは、抗体が所望の抗原の１又は２以上の抗原決定基と反応し、そして他のポリペプチドとは反応しないか、又はより低い親和性（Ｋd＞１０-6）で結合することを意味する。抗体とは、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、完全なヒト、ドメイン抗体、一本鎖、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ′）2フラグメント、ｓｃＦｖ及びＦａｂ発現ライブラリーを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１７１】
基本的抗体構造単位は、テトラマーを含むことが知られている。各テトラマーは、２つの同一対のポリペプチド鎖から構成され、各対は１つの「Ｌ鎖」（約２５ｋＤａ）及び１つの「Ｈ鎖」（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担当する約１００−１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシル末端部分は、エフェクター機能を主に担当する不変領域を定義する。一般的に、ヒトから得られる抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤのいずれかに関し、それらは分子に存在するＨ鎖の性質によりお互い異なる。特定のクラスは、サブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、 ＩｇＧ4及び他のものを有する。さらに、ヒトにおいては、Ｌ鎖は、κ鎖又はλ鎖であり得る。
【０１７２】
用語「モノクローナル抗体（monoclonal antibody）」(ｍＡｂ)又は「モノクローナル抗体組成物（monoclonal antibody composition）」とは、本明細書において使用される場合、ユニークＬ鎖遺伝子生成物及びユニークＨ鎖遺伝子生成物から成る抗体分子の１つの分子種のみを含み抗体分子集団を言及する。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、前記集団の分子全てにおいて同一である。ＭＡｂは、それに対するユニーク結合親和性により特徴づけられる抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含む。
【０１７３】
用語「抗原−結合部位（antigen-binding site）」又は「結合部分（binding portion）」とは、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部を言及する。抗原結合部位は、Ｈ鎖（Ｈ）及びＬ鎖（Ｌ）のＮ−末端可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基により形成される。「超可変領域（hyperrariable regions）」として言及される、Ｈ及びＬ鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチが、「骨格領域（framework regions）」又はＦＲとして知られている、より保存されたフランキングストレッチ間に介在する。従って、用語「ＦＲ」とは、免疫グロブリンにおける超可変領域間に天然において見出され、そしてその領域に隣接して存在するアミノ酸配列を言及する。抗体分子においては、Ｌ鎖の３つの超可変領域及びＨ鎖の３つの超可変領域が、抗原−結合表面を形成するために、立体空間でお互いに対して配置される。抗原結合表面は、結合される抗原の立体表面に相補的であり、そしてＨ鎖及びＬ鎖の個々の３つの超可変領域は、「相補性−決定領域（Complementarity-determining regions）」又は「ＣＤＲ」として言及される。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))又は Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)の定義に従う。
【０１７４】
本明細書において使用される場合、用語「エピトープ（epitope）」は、免疫グロブリン、ｓｃＦｖ又はＴ−細胞受容体に対して特異的結合できる任意のタンパク質決定因子を包含する。用語「エピトープ」は、免疫グロブリン又はＴ−細胞受容体に対して特異的結合できる任意のタンパク質決定因子を包含する。エピトープ決定因子は通常、分子、例えばアミノ酸又は糖側鎖の化学的活性表面基から成り、そして通常、特異的立体構造特性、及び特異的電荷特性を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ−末端又はＣ−末端ペプチドに対して高められる。抗体は、解離定数が≦１μＭである場合、例えば、いくつかの実施形態によれば、≦１００ｎＭ、及びいくつかの実施形態によれば、≦１０ｎＭである場合、抗原を特異的に結合すると言われる。
【０１７５】
本明細書において使用される場合、用語「特異的結合（specific binding）」、「免疫学的結合（immunological binding）」及び「免疫学的結合性質（immunological binding properties）」とは、免疫グロブリン分子と、免疫グロブリンが特異的である抗原との間で生じるタイプの非共有相互作用を言及する。免疫学的結合相互作用の強度又は親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）で表され得、ここでより小さなＫｄがより高い親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合性質は、当業界において良く知られている方法を用いて定量化され得る。１つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成及び解離の速度の測定を必要とし、ここでそれらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性及び両方向にその速度に等しく影響を及ぼす幾何学的パラメーターに依存する。従って、「オン速度定数（on rate constant）」 (Ｋon)及び「オフ速度定数（「off rate constant」）(Ｋoff)の両者は、濃度、及び会合及び解離の実際の速度の計算により決定され得る。（Nature 361:186-87 (1993)を参照のこと）。Ｋoff/Ｋonの比率は、親和性に関係しないすべてのパラメーターの取り消しを可能にし、そして解離定数Ｋdに等しい。（一般的に、Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473を参照のこと）。本開示の抗体は、当業者に知られているアッセイ、例えば放射性リガンド結合アッセイ又は類似するアッセイにより測定される場合、平衡結合定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、例えば、いくつかの実施形態によれば、≦１００ｎＭ、いくつかの実施形態によれば、≦１０ｎＭ、及びいくつかの実施形態によれば、≦１００ｐＭ−約１ｐＭである場合、ＥＧＦＲに対して特異的に結合すると言われる。
【０１７６】
用語「単離されたポリヌクレオチド（isolated polynucleotide）」とは、本明細書において使用される場合、ゲノム、ｃＤＮＡ又は合成起源、又はそれらのいくつかの組合せのポリヌクレオチドを意味し、その起源により、「単離されたポリヌクレオチド」は、（１）「単離されたポリヌクレオチド」が天然で見出される、ポリヌクレオチドのすべて又は一部に関連せず、（２）それが天然において連結されないポリヌクレオチドに操作可能的に連結されるか、又は（３）大きな配列の一部として、天然において存在しない。本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に示されるＨ鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子、及び本明細書に示されるＬ鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を含む。
【０１７７】
本明細書において言及される用語「単離されたタンパク質（isolated protein）」とは、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡ、又は合成起源又はそれらのいくつかの組合せのタンパク質を意味し、その起源又は誘導源により、「単離されたタンパク質」は、（１）天然において見出されるタンパク質とは関連せず、（２）同じ源からの他のタンパク質、例えばネズミタンパク質を有さず、（３）異なった種からの細胞により発現されるか、又は（４）天然において存在しない。
【０１７８】
用語「ポリペプチド（polypeptide）」とは、天然タンパク質フラグメント又はポリペプチドの配列の類似体を言及するための遺伝子用語として、本明細書において使用される。従って、天然タンパク質フラグメント及び類似体は、ポリペプチド属の種である。本開示のポリペプチドは、本明細書に示されるＨ鎖免疫グロブリン分子、及び本明細書に示されるＬ鎖免疫グロブリン分子、並びに、Ｌ鎖免疫グロブリン分子、例えばカッパＬ鎖免疫グロブリンと共に、Ｈ鎖免疫グロブリン分子を含む組合せにより形成される抗体分子を含み、そして逆もまた同様に、及びそれらのフラグメント及び類似体も含む。
【０１７９】
本明細書において使用される、用語「天然に存在する（naturally-occurring）」とは、目的に適用される場合、目的が天然において見出され得る事実を意味する。例えば、天然源から単離され得る生物（ウィルスを含む）に存在し、そして実験室においてヒトにより意図的に修飾されておらず、又は他方では、天然に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を挙げることができる。
【０１８０】
用語「操作可能的に連結される（operably linked）」とは、本明細書において使用される場合、そのように記載される成分の位置が、それらの意図される様式で機能することを可能にする関係にあることを意味する。コード配列に「操作可能的に連結される」制御配列は、そのコード配列の発現が制御配列と適合できる条件下で達成されるような手段で連結される。
【０１８１】
用語「制御配列（control sequence）」とは、本明細書において使用される場合、連結されるコード配列の発現及びプロセッシングに影響を及ぼすのに必要であるポリヌクレオチド配列を意味する。そのような制御配列の性質は、原核生物における宿主生物に依存して異なり、そのような制御配列は一般的に、真核生物では、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含み、一般的に、そのような制御配列はプロモーター及び転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、その存在が発現及びプロセッシングのために必須であるすべての成分を、少なくとも含むよう意図され、そしてまた、その存在が好都合である追加の成分、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列を含むことができる。用語「ポリヌクレオチド（polynucleotide）」とは、本明細書において使用される場合、少なくとも１０個の長さの塩基のヌクレオチド、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチド、又は何れかのタイプのヌクレオチドの修飾形を意味する。この用語は、単鎖及び二本鎖形のＤＮＡを包含する。
【０１８２】
本明細書において言及される用語、ポリヌクレオチドは、天然に存在し、そして天然に存在しないオリゴヌクレオチド結合により一緒に連結される、天然に存在し、そして修飾されたヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドは、２００個又はそれよりも少ない長さの塩基を一般的に含むポリヌクレオチドポリヌクレオチドサブセットである。いくつかの実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは、１０−６０個の長さの塩基、例えば、いくつかの実施形態によれば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０−４０個の長さの塩基である。オリゴヌクレオチドは通常、プローブについては一本鎖であるが、但しオリゴヌクレオチドは、遺伝子変異体の構成への使用に関しては、二本鎖であり得る。本開示のオリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスの何れかのオリゴヌクレオチドである。
【０１８３】
本明細書において言及される用語「天然に存在するヌクレオチド（naturally occurring nucleotides）」は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを包含する。本明細書において言及される用語「修飾されたヌクレオチド（modified nucleotides）」は、修飾されたか又は置換された糖基等を有するヌクレオチドを含む。本明細書において言及される用語「オリゴヌクレオチド結合（oligonucleotide linkages）」は、オリゴヌクレオチド結合、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、ホスホロンミデート及び同様のものを包含する。例えば、LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. U.S. Patent No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)を参照のこと。オリゴヌクレオチドは、所望には、検出のための標識を含むことができる。
【０１８４】
本明細書において使用される場合、２０種の従来のアミノ酸及びそれらの略語は、慣用的用法に従う。Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991))を参照のこと。２０種の従来のアミノ酸、非天然アミノ酸、例えばα−置換されたアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸及び他の非従来型アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）もまた、本開示のポリペプチドのための適切な成分であり得る。非従来型アミノ酸の例は、次のものを包含する：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、δ−Ｎ−メチルアルギニン及び他の類似するアミノ酸、及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書において使用されるポリペプチド表記においては標準の使用法及び慣習によれば、左方向はアミノ末端方向であり、そして右方向はカルボキシ末端方向である。
【０１８５】
同様に、特にことわらない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側端は、５′末端であり、そして二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５′方向として言及される。新生ＲＮＡ転写体の５′から３′への付加の方向は、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖との転写方向配列と称され、そしてＲＮＡ転写体の５′から５′末端への方向は、「上流配列（upstream sequences）」、すなわちＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域と称され、そしてＲＮＡ転写体の３′から３′末端への方向は、「下流配列（downstream sequences）」と称される。
【０１８６】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な同一性（substantial identity）」とは、２種のペプチド配列が、デフォルトギャップウェイト（default gap weights）を用いてプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列される場合、少なくとも８０％の配列同一性、例えば、いくつかの実施形態によれば、少なくとも９０％の配列同一性、いくつかの実施形態によれば、少なくとも９５％の配列同一性、及びいくつかの実施形態によれば、少なくとも９９％の配列同一性を共有することを意味する。
【０１８７】
いくつかの実施形態によれば、同一でない残基位置は、保存性アミノ酸置換により異なる。
【０１８８】
本明細書において論じられる場合、抗体又は免疫グロブリン分子のアミノ酸配列における小さな変動が、本開示により包含されるよう意図され、但しアミノ酸配列における変動が少なくとも７５％、例えば、いくつかの実施形態によれば、少なくとも８０％、９０％、９５％、及びいくつかの実施形態によれば、９９％、維持されるべきである。特に、保存性アミノ酸置換が意図される。保存性置換は、それらの側鎖に関連するアミノ酸ファミリー内で生じるものである。遺伝子的にコードされるアミノ酸は一般的に、次のファミリーに分けられる：（１）酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸であり；（２）塩基性アミノ酸は、リシン、アルギニンヒスチジンであり；（３）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり；そして（４）非荷電極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、セリン及びトレオニンを包含する。疎水性アミノ酸は、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン及びバリンを包含する。アミノ酸の他のファミリーは、次のものを包含する：（ｉ）脂肪族−ヒドロキシファミリーである、セリン及びトレオニン；（ii）アミド含有ファミリーである、アスパラギン及びグルタミン；（iii）脂肪族ファミリーである、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；及び（iv）芳香族ファミリーである、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン、例えば、イソロイシン又はバリンによるロイシンの単離された置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸、セリンによるトレオニン、又は構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の類似する置換が、特に、その置換が骨格部位内にアミノ酸を含まない場合、その得られる分子の結合又は性質に対して主要な影響を与えないであろうことを予測するのは合理的である。アミノ酸変化が機能的ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることにより、容易に決定され得る。アッセイは、本明細書において詳細に記載されている。抗体又は免疫グロブリン分子のフラグメント又は類似体は、当業者により容易に調製され得る。いくつかの実施形態によれば、フラグメント又は類似体のアミノ−及びカルボキシ−末端は、機能的ドメインの境界近くに存在する。構造及び機能ドメインは、公的又は独自の配列データベースに、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列を比較することにより、同定され得る。コンピューター化された比較方法が、既知構造及び／又は機能の他のタンパク質に存在する配列モチーフ又は予測されるタンパク質立体構造ドメインを同定するために使用され得る。既知の三次元構造に折りたたむタンパク質を同定する方法は知られている（Bowie et al. Science 253:164 (1991)）。従って、前述の例は、当業者が本開示に従って構造的及び機能的ドメインを定義するために使用され得る配列モチーフ及び構造コンホメーションを認識できることを示す。
【０１８９】
いくつかの実施形態によれば、アミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低め、（２）酸化に対する感受性を低め、（３）タンパク質複合体を形成するために結合親和性を変更し、（４）結合親和性を変更し、そして（５）そのような類似体の他の物理化学的マタハ機能的性質を付与するか、又は修飾するそれらの置換である。類似体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の種々の突然変異タンパク質を含むことができる。例えば、単一又は複数のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）が、天然に存在する配列において（分子間接触を形成するドメイン外のポリペプチドの部分において）、行われ得る。保存性アミノ酸置換は、親配列の構造特性を実質的に変えるべきではない（例えば、アミノ酸置換は、親配列に存在するへリックスを破壊するか又は親配列を特徴づける他のタイプの二次構造を分裂する傾向があるべきではない）。当技術分野で認識されるポリペプチドの二次及び三次構造の例は、タンパク質、構造及び分子の原則（Creighton, Ed., W. H.  Freeman and Company, New York (1984)）；タンパク質構造の紹介（C. Branden and J.  Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)）；及びThornton et at. Nature 354:105 (1991)に記載されている。
【０１９０】
用語「ポリペプチドフラグメント（polypeptide fragment）」とは、本明細書において使用される場合、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端欠失及び／又は１又は２以上の内部欠失を有するが、しかし残るアミノ酸配列が、例えば完全な長さのｃＤＮＡ配列から推定される天然に存在する配列におけるその対応する位置と同一である、ポリペプチドを意味する。フラグメントは典型的には、少なくとも５、６、８又は１０個の長さのアミノ酸、例えば、いくつかの実施形態によれば、少なくとも１４個の長さのアミノ酸、いくつかの実施形態によれば、少なくとも２０個の長さのアミノ酸、通常、少なくとも５０個の長さのアミノ酸、及びいくつかの実施形態によれば、７０個の長さのアミノ酸である。用語「類似体（analog）」とは、本明細書において使用される場合、推定されるアミノ酸配列の一部に対して実質的な同一性を有し、そして適切な結合条件下でＥＧＦＲに対する特異的結合を有する、少なくとも２５個のアミノ酸のセグメントから構成されるポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然に存在する配列に対して保存性アミノ酸置換（又は付加又は欠失）を含む。類似体は、典型的には、少なくとも２０個の長さのアミノ酸、例えば、いくつかの実施形態によれば、少なくとも５０個又はそれ以上の長さのアミノ酸であり、そしてしばしば、完全な長さの天然に存在するポリペプチドと同じ長さであり得る。
【０１９１】
用語「剤（agent）」は、化合物、化合物の混合物、生体高分子、又は生体材料から製造される抽出物を示すために、本明細書において使用される。
【０１９２】
本明細書において使用される場合、用語「標識（label）」又は「標識された（labeled）」とは、例えば放射性標識されたアミノ酸の組込み、又はマーキングされたアビジン（例えば、光学的又は比色法により検出され得る蛍光マーカー又は酵素活性を含むストレプタビジン）により検出され得るビオチニル部分のポリペプチドへの結合による、検出可能マーカーの組込みを意味する。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する種々の方法が当業界において知られており、そして使用され得る。ポリペプチドのための標識の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：放射性同位体又は放射性核種（例えば、3Ｈ、14Ｃ、15Ｎ、35Ｓ、90Ｙ、99Ｔｃ、111Ｉｎ、125Ｉ、131Ｉ）、蛍光標識（例えば、フルオロフォア、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ標識）。いくつかの実施形態によれば、標識は、潜在的な立体障害を低めるために、種々の長さのスペーサーアームにより結合される。用語「薬剤又は薬物（pharmaceutical agent or drug）」とは、本明細書において使用される場合、患者に正しく投与される場合、所望の治療効果を誘発できる化合物又は組成物を意味する。
【０１９３】
本明細書において使用される場合、「実質的に純粋な（substantially pure）」とは、目的種が存在する主要種であり（すなわち、モル基準で、組成物中のいずれか他の個々の種よりも豊富である）、そして実質的に精製された画分が組成物であり、ここで、目的種が存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を占めることを意味する。
【０１９４】
一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物の存在するすべての高分子種の約８０％以上、いくつかの実施形態によれば、約８５％、９０％及び９９％以上を占めるであろう。いくつかの実施形態によれば、目的種は、本質的に均質に精製され（組成物中の汚染種は、従来の検出法によっては検出され得ない）、ここで組成物は単一の高分子種から本質的に成る。
【０１９５】
用語「患者（patient）」とは、ヒト及び獣医学的対象を含む。
【０１９６】
本明細書における他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))により例示されるように、当業界における従来の用法に従って使用される。
【０１９７】
多重特異性抗体及び多重特異性活性化可能抗体
本開示の典型的な多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は例えば、本明細書に提供される実施例に示されるそれら、及びそれらの変異体を包含する。
【０１９８】
いくつかの非制限的実施形態によれば、多重特異性抗体におけるＡＢの少なくとも１つが、表１に列挙される任意の標的のための結合パートナーである。
【０１９９】
【表１】
2020114872.tif 000002
【０２００】
【表２】
2020114872.tif 000003
【０２０１】
いくつかの非制限的実施形態によれば、多重特異性抗体のＡＢの少なくとも１つは、本明細書において提供される実施例における表７に示される配列に由来する。
【０２０２】
いくつかの非制限的実施形態によれば、多重特異性抗体のＡＢの少なくとも１つは、表２に列挙される抗体に由来する。
【０２０３】
【表３】
2020114872.tif 000004
【０２０４】
【表４】
2020114872.tif 000005
【０２０５】
本明細書に記載される多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体と同じエピトープに結合する多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体がまた、本開示に含まれる。
【０２０６】
当業者は、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体が本開示の多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体と同じか又は類似する特異性を有する場合、前者が後者による標的への結合を防止するかどうかを確認することにより、過度の実験なしに決定することが可能であることを認識するであろう。試験される多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体が、本開示の多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体による結合の低下により示されるように、本開示の多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体と競争する場合、それらの２種の多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、同じか、又は密接に関連するエピトープに結合する。
【０２０７】
多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体が本開示の多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体と同じか又は類似する特異性を有するかどうかを決定するための１つの実施形態は、通常、反応性である可溶性標的と共に、本開示の多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体をプレインキュベートし、そして次に、試験される多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体が、標的を結合するその能力を阻害するかどうかを決定するために、試験される多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体を添加することである。試験される多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体が阻害される場合、たぶん、それは、本開示の多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体と同じか、又は機能的に等しいエピトープ特異性を有する。
【０２０８】
多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、例えば、下記に提供される実施例に記載される手順を用いて生成される。多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体はまた、抗体生成及び／又は精製のための多くの当技術分野で認識されている技術の何れを用いても生成され得る。
【０２０９】
多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体への使用のための抗体フラグメント、例えばＦｖ、Ｆ（ａｂ′）2及びＦａｂは、例えばプロテアーゼ又は化学的切断による完全なタンパク質の切断により調製され得る。他方では、切断された遺伝子が企画される。例えば、Ｆ（ａｂ′）2フラグメントの一部をコードするキメラ遺伝子は、切断された分子を生成するために、ＣＨ１ドメイン及びＨ鎖のヒンジ領域、続いて翻訳停止コドンをコードするＤＮＡ配列を含むであろう。
【０２１０】
発現ベクターは、プラスミド、レトロウィルス、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来のエピソーム、及び同様のものを含む。便利なベクターは、任意のＶＨ又はＶＬ配列が容易に挿入され、そして発現されるよう構築された適切な制限部位と共に、機能的に完全なヒトＣＨ又はＣＬ免疫グロブリン配列をコードするベクターである。そのようなベクターにおいては、スプライシングが、挿入されたＪ領域におけるスプライスドナー部位と、ヒトＣ領域に続くスプライス受容体部位との間で、及びまた、ヒトＣＨエクソン内に存在するスプライス領域で生じる。ポリアデニル化及び転写停止は、コード領域の下流の生来の染色体部位で生じる。得られる抗体は、何れかの強いプロモーター、例えばレトロウィルスＬＴＲ、例えばＳＶ−４０初期プロモーター（Okayama et al. Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)）、ラウス肉腫ウィルスＬＴＲ（Gorman et al. P.N.A.S. 79:6777 (1982)）、及びモロニーマスウ白血病ウィルスＬＴＲ（Grosschedl et al. Cell 41:885 (1985)）に連結され得る。また、認識されるように、生来のＩｇプロモーター及び同様のものも使用され得る。
【０２１１】
さらに、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体が、当業界において良く知られている技法を用いて、表示タイプ技術、例えばファージ表示、レトロウィルス表示、リボソーム表示及び他の技法（但し、それらだけには限定されない）を介して生成され得、そしてその得られる分子は、さらなる成熟、例えば親和性成熟、例えば当業界において良く知られている技法にゆだねられ得る。Wright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992), Hanes and Pluckthun PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (リボソーム表示), Parmley and Smith Gene 73:305-318 (1988) (ファージ表示), Scott, TIBS, vol. 17:241-245 (1992), Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al. Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH; 10:80-8A (1992), 及び米国特許第 5,733,743号。
【０２１２】
疾患及び障害の治療において抗体の有効性を改善するそのような機能を増強するか、又は低めるために、エフェクター機能に関して、本開示の多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体を修飾することが所望される。例えば、システイン残基がＦｃ領域中に導入され、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にされる。このようにして生成されたヘテロダイマー抗体は、改善された内在化能力及び／又は高められた補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有する。（Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) 及び Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照のこと）。他方では、二重Ｆｃ領域を有し、そしてそれにより、増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能力を有することができる抗体が、構築され得る。（Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照のこと）。いくつかの実施形態によれば、Ｆｃ成熟が行われ、グリコシル化部位が除去され、それにより、Ｆｃ機能が低められる。
【０２１３】
多重特異性活性化可能抗体
本明細書において提供される多重特異性活性化可能抗体及び多重特異性活性化可能抗体組成物は、第１標的及び／又は第１エピトープを特異的に結合する第１抗体又はその抗体フラグメント（集合的には、本開示を通してＡＢ１と称される）、及び第２標的及び／又は第２エピトープを特異的に結合する第２抗体又はその抗体フラグメント（集合的には、本開示を通してＡＢ２と称される）を少なくとも含み、ここでＡＢの少なくとも１つはマスキング部分（ＭＭ）により修飾されている。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体における各ＡＢは、それ自体のマスキング部分により修飾される。
【０２１４】
多重特異性活性化可能抗体におけるＡＢの少なくとも１つがＭＭにより修飾され、そしてその標的の存在下にある場合、ＡＢのその標的への特異的結合は、ＭＭにより修飾されていないＡＢの特異的結合又は親ＡＢの標的への特異的結合に比べて、低められるか又は阻害される。
【０２１５】
標的に対する、ＭＭにより修飾されたＡＢのＫdは、ＭＭにより修飾されていないＡＢ、又は標的に対する親ＡＢのＫdよりも、少なくとも５、１０、 ２０、２５、４０、 ５０、１００、２５０、５００、１，０００、 ２，５００、 ５，０００、 １０，０００、 ５０，０００、 １００，０００、 ５００，０００、 １，０００，０００、 ５，０００，０００、 １０，０００，０００、 ５０，０００，０００ 又はそれ以上, 又は ５−１０、 １０−１００、 １０−１，０００、 １０−１０，０００、 １０−１００，０００、 １０−１，０００，０００、１０−１０，０００，０００、 １００−１，０００、 １００−１０，０００、 １００−１００，０００、 １００−１，０００，０００、 １００−１０，０００，０００、 １，０００−１０，０００、 １，０００−１００，０００、 １，０００−１，０００，０００、１０００−１０，０００，０００、 １０，０００−１００，０００、 １０，０００−１，０００，０００、 １０，０００−１０，０００，０００、 １００，０００−１，０００，０００又は１００，０００−１０，０００，０００倍、高い。逆に、ＭＭにより修飾されたＡＢの標的に対する結合親和性は、ＭＭにより修飾されていないＡＢ又は親ＡＢの標的に対する結合親和性によも少なくとも５、１０、 ２０、２５、４０、 ５０、１００、２５０、５００、１，０００、 ２，５００、 ５，０００、 １０，０００、５０，０００、 １００，０００、 ５００，０００、 １，０００，０００、 ５，０００，０００、 １０，０００，０００、 ５０，０００，０００ 又はそれ以上, 又は ５−１０、 １０−１００、 １０−１，０００、 １０−１０，０００、 １０−１００，０００、 １０−１，０００，０００、１０−１０，０００，０００、 １００−１，０００、 １００−１０，０００、 １００−１００，０００、 １００−１，０００，０００、 １００−１０，０００，０００、 １，０００−１０，０００、 １，０００−１００，０００、 １，０００−１，０００，０００、１０００−１０，０００，０００、 １０，０００−１００，０００、 １０，０００−１，０００，０００、 １０，０００−１０，０００，０００、 １００，０００−１，０００，０００又は１００，０００−１０，０００，０００倍、低い。
【０２１６】
多重特異性活性化可能抗体におけるＡＢの少なくとも１つに対するＭＭの解離定数（Ｋd）は一般的に、標的に対するＡＢのＫdよりも高い。ＡＢに対するＭＭのＫdは、標的に対するＡＢのＫdよりも少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、 ２，５００、 ５，０００、 １０，０００、 １００，０００、 １，０００，０００ 又はさらに１０，０００，０００倍、高い。逆に、ＡＢに対するＭＭの結合親和性は、一般的に標的に対するＡＢの結合親和性よりも低い。ＡＢに対するＭＭの結合親和性は、標的に対するＡＢの結合親和性よりも少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、 ２，５００、 ５，０００、 １０，０００、 １００，０００、 １，０００，０００ 又はさらに１０，０００，０００倍、低い。
【０２１７】
多重特異性活性化可能抗体におけるＡＢの少なくとも１つがＭＭにより修飾され、そしてその標的の存在下にある場合、ＡＢのその標的への特異的結合は、ＭＭにより修飾されていないＡＢの特異的結合又は親ＡＢの標的への特異的結合に比べて、低められるか又は阻害される。ＭＭにより修飾されていないＡＢの標的への結合又は親ＡＢの標的への結合に比較される場合、ＭＭにより修飾される場合の標的を結合するＡＢの能力は、インビボ又はインビトロアッセイで測定される場合、少なくとも２、４、 ６、 ８、 １２、 ２８、 ２４、 ３０、 ３６、 ４８、 ６０、 ７２、 ８４又は ９６ 時間、 又は ５、 １０、 １５、 ３０、 ４５、 ６０、 ９０、 １２０、 １５０又は１８０日、 又は１、 ２、 ３、 ４、 ５、 ６、 ７、 ８、 ９、 １０、 １１、又は１２か月又はそれ以上で、少なくとも５０%、６０%、 ７０%、 ８０%、 ９０%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９% 及びさらに １００%、低められ得る。
【０２１８】
ＭＭは、多重特異性活性化可能抗体におけるＡＢの少なくとも１つのその標的に対する結合を阻害する。ＭＭはＡＢの抗原結合ドメインを結合し、そしてＡＢのその標的への結合を阻害する。ＭＭは、ＡＢのその標的への結合を立体的に阻害する。ＭＭはＡＢのその標的への結合をアロステリックに阻害することができる。それらの実施形態によれば、ＡＢが修飾されるか又はＭＭにカップリングされ、そして標的の存在下にある場合、インビボ又はインビトロアッセイで測定される場合、少なくとも２、４、 ６、 ８、 １２、 ２８、 ２４、 ３０、 ３６、 ４８、 ６０、 ７２、 ８４又は ９６ 時間、 又は ５、 １０、 １５、 ３０、 ４５、 ６０、 ９０、 １２０、 １５０又は１８０日、 又は１、 ２、 ３、 ４、 ５、 ６、 ７、 ８、 ９、 １０、 １１、又は１２か月又はそれ以上での間、ＭＭにより修飾されていないＡＢ、親ＡＢ、又はＭＭにカップリングされていないＡＢの標的に対する結合に比べて、ＡＢの標的への結合は存在しないか、又は実質的に存在しないか、又はわずか０．００１%、０．０１%、 ０．１%、 １%、 ２%、 ３%、 ４%、 ５%、 ６%、 ７%、 ８%、 ９%、 １０%、 １５%、 ２０%、 ２５%、 ３０%、 ３５%、 ４０%又は５０%の標的に対するＡＢの結合が存在する。
【０２１９】
多重特異性活性化可能抗体におけるＡＢの少なくとも１つがＭＭにカップリングされるか、又はＭＭにより修飾される場合、ＭＭはＡＢのその標的への特異的結合を「マスキングするか」又は低めるか、又は他方では、阻害する。多重特異性活性化可能抗体におけるＡＢの少なくとも１つがＭＭにカップリングするか又はＭＭにより修飾される場合、そのようなカップリング又は修飾は、ＡＢのその標的への特異的結合能力を低めるか、阻害する構造変化に影響を及ぼすことができる。
【０２２０】
多重特異性活性化可能抗体においては、少なくとも１つのＡＢがＭＭにカップリングされるか、又はＭＭにより修飾される場合、多重特異性活性化可能抗体の少なくとも一部がアミノ（Ｎ）末端領域からカルボキシル（Ｃ）末端領域の順に、次の式により表され得る：
（ＭＭ）−（ＡＢ）
（ＡＢ）−（ＭＭ）
（ＭＭ）−Ｌ−（ＡＢ）
（ＡＢ）−Ｌ−（ＭＭ）
【０２２１】
ここで、ＭＭはマスキング部分であり、ＡＢは抗体又はその抗体フラグメントであり、そしてＬはリンカーである。多くの実施形態によれば、柔軟性を提供するために、組成物中に１又は２以上のリンカー、例えば柔軟リンカーを挿入することが所望される。
【０２２２】
特定の実施形態によれば、ＭＭはＡＢの天然の結合パートナーではない。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーを含まないか又はそのパートナーに対する相同性を含まない。他の実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、せいぜい５%、１０%、 １５%、 ２０%、 ２５%、 ３０%、 ３５%、 ４０%、 ４５%、 ５０%、 ５５%、 ６０%、 ６５%、 ７０%、 ７５%又は８０%しか、同一ではない。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、わずか５%、１０%、 １５%、 ２０%、 ２５%、 ３０%、 ３５%、 ４０%、 ４５%、 ５０%、 ５５%、 ６０%、 ６５%、 ７０%、 ７５%又は８０%しか同一ではない。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、わずか２５％しか同一ではない。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、わずか５０％しか同一ではない。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、わずか２０％しか同一ではない。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、わずか１０％しか同一ではない。
【０２２３】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、ＭＭにより修飾され、そしてまた、１又は２以上の切断可能部分（ＣＭ）も含むＡＢを含む。そのような多重特異性活性化可能抗体は、ＡＢの標的への活性化可能／スイッチング可能結合を示す。多重特異性活性化可能抗体は一般的に、マスキング部分（ＭＭ）及び修飾可能又は切断可能部分（ＣＭ）により修飾されるか又はそれにカップリングされる少なくとも１つの抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含む。いくつかの実施形態によれば、ＣＭは、目的のプロテアーゼのための基質として作用するアミノ酸配列を含む。
【０２２４】
多重特異性活性化可能抗体中の要素は、各ＭＭ及びＣＭが位置決定され、従って、切断された（又は比較的活性）状態下で及び標的の存在下で、その対応するＡＢが標的を結合するが、ところが標的の存在下で、切断されていない（又は相対的に不活性）状態下で、ＡＢのその標的への特異的結合が低められるか又は阻害されるよう、配置される。ＡＢのその標的への特異的結合は、ＭＭによりその標的を特異的に結合するＡＢの能力の阻害又はマスキングのために、低められ得る。
【０２２５】
標的に対する、ＭＭ及びＣＭにより修飾された各ＡＢのＫdは、ＭＭ及びＣＭにより修飾されていないＡＢ、又は標的に対する親ＡＢのＫdよりも、少なくとも５、１０、 ２０、２５、４０、 ５０、１００、２５０、５００、１，０００、 ２，５００、 ５，０００、 １０，０００、 ５０，０００、 １００，０００、 ５００，０００、 １，０００，０００、 ５，０００，０００、 １０，０００，０００、 ５０，０００，０００ 又はそれ以上, 又は ５−１０、 １０−１００、 １０−１，０００、 １０−１０，０００、 １０−１００，０００、 １０−１，０００，０００、１０−１０，０００，０００、 １００−１，０００、 １００−１０，０００、 １００−１００，０００、 １００−１，０００，０００、 １００−１０，０００，０００、 １，０００−１０，０００、 １，０００−１００，０００、 １，０００−１，０００，０００、１０００−１０，０００，０００、 １０，０００−１００，０００、 １０，０００−１，０００，０００、 １０，０００−１０，０００，０００、 １００，０００−１，０００，０００又は１００，０００−１０，０００，０００倍、高い。逆に、ＭＭ及びＣＭにより修飾された各ＡＢの標的に対する結合親和性は、ＭＭ及びＣＭにより修飾されていないＡＢ又は標的に対する親ＡＢの結合親和性によりも少なくとも５、１０、 ２０、２５、４０、 ５０、１００、２５０、５００、１，０００、 ２，５００、 ５，０００、 １０，０００、５０，０００、 １００，０００、 ５００，０００、 １，０００，０００、 ５，０００，０００、 １０，０００，０００、 ５０，０００，０００ 又はそれ以上, 又は ５−１０、 １０−１００、 １０−１，０００、 １０−１０，０００、 １０−１００，０００、 １０−１，０００，０００、１０−１０，０００，０００、 １００−１，０００、 １００−１０，０００、 １００−１００，０００、 １００−１，０００，０００、 １００−１０，０００，０００、 １，０００−１０，０００、 １，０００−１００，０００、 １，０００−１，０００，０００、１０００−１０，０００，０００、 １０，０００−１００，０００、 １０，０００−１，０００，０００、 １０，０００−１０，０００，０００、 １００，０００−１，０００，０００又は１００，０００−１０，０００，０００倍、低い。
【０２２６】
少なくとも１つのＡＢがＭＭ及びＣＭにより修飾され、そしてその標的の存在下にあるが、しかし修飾剤（例えば、プロテアーゼ）の存在下でわない場合、ＡＢのその標的への特異的結合は、ＭＭ及びＣＭにより修飾されていないＡＢの特異的結合又は親ＡＢの標的への特異的結合に比べて、低められるか又は阻害される。親ＡＢの結合、又はＭＭ及びＣＭにより修飾されていないＡＢの標的への結合に比較される場合、ＭＭ及びＣＭにより修飾される場合の標的を結合するＡＢの能力は、インビボ又はインビトロアッセイで測定される場合、少なくとも２、４、 ６、 ８、 １２、 ２８、 ２４、 ３０、 ３６、 ４８、 ６０、 ７２、 ８４又は ９６ 時間、 又は ５、 １０、 １５、 ３０、 ４５、 ６０、 ９０、 １２０、 １５０又は１８０日、 又は１、 ２、 ３、 ４、 ５、 ６、 ７、 ８、 ９、 １０、 １１、又は１２か月又はそれ以上で、少なくとも５０%、６０%、 ７０%、 ８０%、 ９０%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９% 及びさらに １００%、低められ得る。
【０２２７】
本明細書において使用される場合、用語、切断された状態とは、プロテアーゼによりＣＭの修飾に続く多重特異性活性化可能抗体の状態を意味する。用語、切断されていない状態とは、本明細書において使用される場合、プロテアーゼによるＣＭの切断の不在下での多重特異性活性化可能抗体の状態を意味する。上記で論じられたように、用語「多重特異性活性化可能抗体（multispecific activatable antibodies）」とは、その切断されていない（生来）状態及びその切断された状態の両者での多重特異性活性化可能抗体を言及するよう、本明細書において使用される。いくつかの実施形態によれば、切断された多重特異性活性化可能抗体は、プロテアーゼによるＣＭの切断のために、ＭＭを欠いており、少なくともＭＭの放出をもたらす（例えば、ＭＭは、共有結合（例えば、システイン残基間のジスルフィト結合）により多重特異性活性化可能抗体に結合されていない場合）ことは、当業者に明らかであろう。
【０２２８】
活性化可能又はスイッチング可能とは、多重特異性活性化可能抗体が、阻害された、マスキングされた、又は切断されていない状態下で、標的への結合の第１レベル（第１コンホメーション）、及び阻害されていない、マスキングされていない、及び／又は切断された状態下で、標的への結合の第２レベル（すなわち、第２コンホメーション）を示し、ここで標的結合の第２レベルは、結合の第１レベルよりも大きいことを意味する。一般的に、多重特異性活性化可能抗体のその対応するＡＢへの標的のアクセスは、ＣＭを切断できる切断剤の存在下において、そのような切断剤の不在下でよりも高い。従って、多重特異性活性化可能抗体が切断されていない状態下にある場合、少なくとも１つのＡＢが標的結合から阻害され、そして標的結合からマスキングされ得（すなわち、第１コンホメーションは、ＡＢが標的を結合できないようなものである）、そして切断された状態下で、ＡＢは阻害されないか、又は標的結合にマスキングされない。
【０２２９】
多重特異性活性化可能抗体のＣＭ及びＡＢは、第１ＡＢが第１標的及び／又はエピトープのための結合部分を表し、そしてＣＭが対象における治療部位又は診断部位で標的と共局在されるプロテアーゼのための基質を表すよう、選択される。本明細書に開示される多重特異性活性化可能抗体は、例えば、ＣＭにおける部位を切断できるプロテアーゼが、非治療部位の組織においてよりも（例えば、健康組織においてよりも）、治療部位又は診断部位の標的含有組織において、比較的高いレベルで存在する場合、特に有用である。
【０２３０】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、ＡＢがマスキングされないか、又は他方では、その標的の結合から阻害される場合、非治療部位での第１ＡＢの結合に起因する、低められた毒性及び／又は有害な副作用を提供する。
【０２３１】
一般的に、多重特異性活性化可能抗体は、目的の第１ＡＢで選択し、そして活性化可能抗体の残りを構築することにより設計され得、結果的に、コンホメーション的に制約される場合、  ＭＭはＡＢのマスキング、又はＡＢのその標的への結合の低減を提供する。構築設計基準は、この機能的特徴を提供するよう考慮されるべきである。
【０２３２】
阻害されていないコンホメーションに対する阻害されたコンホメーションでの標的結合のための所望するダイナミック範囲のスイッチング可能表現型を示す多重特異性活性化可能抗体が提供される。ダイナミック範囲とは一般的に、（ｂ）第２組の条件下でのパラメーターの最小検出レベルに対する（ａ）第１組の条件下でのパラメーターの最大検出レベルの比率を意味する。例えば、多重特異性活性化可能抗体の場合、ダイナミック範囲は、（ｂ）プロテアーゼの不在下で多重特異性活性化可能抗体に結合する標的タンパク質の最小検出レベルに対する（ａ）活性化可能抗体のＣＭを切断できるプロテアーゼの存在下で多重特異性活性化可能抗体に結合する標的タンパク質の最大検出レベルの比率を意味する。多重特異性活性化可能抗体のダイナミック範囲は、活性化可能抗体切断剤、治療の平衡解離定数に対する、多重特異性活性化可能抗体切断剤（例えば、酵素）治療の平衡解離定数の比率として計算され得る。多重特異性活性化可能抗体のダイナミック範囲が大きいほど、活性化可能抗体のスイッチング可能表現型は良好である。比較的高いダイナミック範囲値（例えば、１よりも高い）を有する活性化可能抗体は、活性化可能抗体により結合する標的タンパク質が、切断剤の不在下においてよりも、活性化可能抗体のＣＭを切断できる切断剤（例えば、酵素）の存在下で、より高い程度に発生する（例えば、主に発生する）ような、より所望のスイッチング表現型を示す。
【０２３３】
多重特異性活性化可能抗体は、種々の構造的構成で提供され得る。多重特異性活性化可能抗体の少なくとも一部についての典型的な式が、下記に提供される。第１ＡＢのＮ−からＣ−末端への順に、その対応するＭＭ及びＣＭが活性化可能抗体内で逆になされ得ることが特に企画される。ＣＭ及びＭＭが、例えばＣＭがＭＭ内に含まれるよう、アミノ酸配列においてオーバーラップすることができることがまた、特に企画される。
【０２３４】
例えば、多重特異性活性化可能抗体の少なくとも一部がアミノ（Ｎ）末端領域からカルボキシル（Ｃ）末端領域の順に、次の式により表され得る：
（ＭＭ）−（ＣＭ）−（ＡＢ）
（ＡＢ）−（ＣＭ）−（ＭＭ）
【０２３５】
ここで、ＭＭはマスキング成分であり、ＣＭは切断可能部分であり、そしてＡＢは第１抗体又はそのフラグメントである。ＭＭ及びＣＭは上記式において異なる成分として示されるが、本明細書において開示されるすべての典型的な実施形態（式を含む）によれば、ＭＭ及びＣＭのアミノ酸配列は、ＣＭがＭＭ内に完全に又は部分的に含まれるよう、オーバーラップできることが企画される。さらに、上記式は、活性化可能抗体要素に対してＮ末端又はＣ末端に位置決定され得る追加のアミノ酸配列を提供する。
【０２３６】
特定の実施形態によれば、ＭＭはＡＢの天然の結合パートナーではない。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーを含まないか又はそのパートナーに対する相同性を含まない。他の実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、せいぜい５%、１０%、 １５%、 ２０%、 ２５%、 ３０%、 ３５%、 ４０%、 ４５%、 ５０%、 ５５%、 ６０%、 ６５%、 ７０%、 ７５%又は８０%しか、同一ではない。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、わずか５%、１０%、 １５%、 ２０%、 ２５%、 ３０%、 ３５%、 ４０%、 ４５%、 ５０%、 ５５%、 ６０%、 ６５%、 ７０%、 ７５%又は８０%しか同一ではない。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、わずか５０％しか同一ではない。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、わずか２５％しか同一ではない。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、わずか２０％しか同一ではない。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、わずか１０％しか同一ではない。
【０２３７】
多くの実施形態によれば、１又は２以上のＭＭ−ＣＭ接合、ＣＭ−ＡＢ接合、又は両者で柔軟性を提供するために、多重特異性活性化可能抗体コンストラクト中に、１又は２以上のリンカー、例えば柔軟リンカーを挿入することが所望される。例えば、ＡＢ、ＭＭ及び／又はＣＭは、所望する柔軟性を提供するために、十分な数の残基（例えば、Ｇｌｙ，Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、特にＧｌｙ及びＳｅｒ、特にＧｌｙ）を含むことはできない。そのような多重特異性活性化可能抗体コンストラクトのスイッチング可能表現型は、柔軟リンカーを提供するために、１又は２以上のアミノ酸の導入から利益を得ることができる。さらに、下記のように、多重特異性活性化可能抗体がコンホメーション的に制約されたコンストラクトとして提供される場合、柔軟リンカーは、切断されていない多重特異性活性化可能抗体における環状構造の形成及び維持を促進するために、操作可能的に導入され得る。
【０２３８】
例えば、特定の実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、次の式の１つを含む（ここで、下記式は、Ｎ−からＣ−末端方向に、又はＣ−からＮ−末端方向に、アミノ酸配列を表す）：
（ＭＭ）−Ｌ１−（ＣＭ）−（ＡＢ）
（ＭＭ）−（ＣＭ）−Ｌ２−（ＡＢ）
（ＭＭ）−Ｌ１−（ＣＭ）−Ｌ２−（ＡＢ）
【０２３９】
ここで、ＭＭ、ＣＭ及びＡＢは、上記に定義された通りであり；Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、及び任意には、存在しても又は不在である良く、少なくとも１つの柔軟アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）を含む同じか又は異なった柔軟リンカーである。さらに、上記式は、多重特異性活性化可能抗体要素に対してＮ末端又はＣ末端に配置され得る追加のアミノ酸配列を提供する。例として、次のものを挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない：標的化部分（例えば、標的組織に存在する細胞の受容体のためのリガンド）及び血清半減期延長部分（例えば、血清タンパク質、例えば免疫グロブリン（すなわち、ＩｇＧ）又は血清アルブミン（例えば、ヒト結成アルブミン（ＨＡＳ））を結合するポリペプチド。
【０２４０】
いくつかの非制限的実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体におけるＡＢの少なくとも１つは、表１に列挙される任意の標的のための結合パートナーである。
【０２４１】
いくつかの非制限的実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体におけるＡＢの少なくとも１つは、本明細書に提供される実施例における表７に示される配列を含み、その配列であるか、又はその配列に由来する。
【０２４２】
いくつかの非制限的実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体におけるＡＢの少なくとも１つは、本明細書に提供される実施例中の実施例５に示される配列を含み、その配列であるか、又はその配列に由来する。いくつかの非制限的実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体におけるＡＢの少なくとも１つは、本明細書に提供される実施例中の表１１に示される配列を含み、その配列であるか、又はその配列に由来する。
【０２４３】
いくつかの非制限的実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体におけるＡＢの少なくとも１つは、表２に列挙される抗体であるか、又はその抗体に由来する。
【０２４４】
いくつかの実施形態によれば、マスキング部分は、特異性抗体又は抗体フラグメントとの使用のために選択される。例えば、ＥＧＦＲを結合する抗体との使用のための適切なマスキング部分は、配列ＣＩＳＰＲＧ（配列番号７５）を含むＭＭを含む。非制限的な例として、ＭＭは、配列、例えばＣＩＳＰＲＧＣ (配列番号３３９)、ＣＩＳＰＲＧＣＧ (配列番号７６); ＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹ (配列番号７７); ＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭ (配列番号７８)、 ＣＩＳＰＲＧＣＥＰＧＴＹＶＰＴ (配列番号７９) 及びＣＩＳＰＲＧＣＰＧＱＩＷＨＰＰ (配列番号８０)を含むことができる。他の適切なマスキング部分は、ＰＣＴ国際公開番号第２０１０／０８１１７３号に開示されるＥＧＦＲ−特異的マスクの何れか、例えば、非制限的例によれば、下記配列を含む：ＧＳＨＣＬＩＰＩＮＭＧＡＰＳＣ (配列番号８１); ＣＩＳＰＲＧＣＧＧＳＳＡＳＱＳＧＱＧＳＨＣＬＩＰＩＮＭＧＡＰＳＣ (配列番号８２); ＣＮＨＨＹＦＹＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ (配列番号８３); ＡＤＨＶＦＷＧＳＹＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ (配列番号８４); ＣＨＨＶＹＷＧＨＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ (配列番号８５); ＣＰＨＦＴＴＴＳＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ (配列番号８６); ＣＮＨＨＹＨＹＹＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ (配列番号８７); ＣＰＨＶＳＦＧＳＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ (配列番号８８); ＣＰＹＹＴＬＳＹＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ (配列番号８９); ＣＮＨＶＹＦＧＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ (配列番号９０); ＣＮＨＦＴＬＴＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ (配列番号９１); ＣＨＨＦＴＬＴＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＰＧ (配列番号９２); ＹＮＰＣＡＴＰＭＣＣＩＳＰＲＧＣＰＧ (配列番号９２)); ＣＮＨＨＹＦＹＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ (配列番号９４); ＣＮＨＨＹＨＹＹＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ (配列番号９５); ＣＮＨＶＹＦＧＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ (配列番号９６); ＣＨＨＶＹＷＧＨＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ (配列番号９７); ＣＰＨＦＴＴＴＳＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ (配列番号９８); ＣＮＨＦＴＬＴＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ (配列番号９９); ＣＨＨＦＴＬＴＴＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ (配列番号１００); ＣＰＹＹＴＬＳＹＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ (配列番号１０１); ＣＰＨＶＳＦＧＳＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ (配列番号１０２); ＡＤＨＶＦＷＧＳＹＧＣＩＳＰＲＧＣＧ (配列番号１０３); ＹＮＰＣＡＴＰＭＣＣＩＳＰＲＧＣＧ (配列番号１０４); ＣＨＨＶＹＷＧＨＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ (配列番号１０５); Ｃ（Ｎ/Ｐ）Ｈ（Ｈ/Ｖ/Ｆ）（Ｙ/Ｔ）（Ｆ/Ｗ/Ｔ/Ｌ）（Ｙ/Ｇ/Ｔ/Ｓ）（Ｔ/Ｓ/Ｙ/Ｈ）ＣＧＣＩＳＰＲＧＣＧ (配列番号１０６); ＣＩＳＰＲＧＣＧＱＰＩＰＳＶＫ (配列番号１０７); ＣＩＳＰＲＧＣＴＱＰＹＨＶＳＲ (配列番号１０８);及び/又はＣＩＳＰＲＧＣＮＡＶＳＧＬＧＳ (配列番号１０９)。
【０２４５】
Jagged標的、例えばJagged１及び／又はJagged２を結合する抗体との使用のための適切なマスキング部分は、非制限的例によれば、次の配列を含むマスキング部分を含む：ＱＧＱＳＧＱＣＮＩＷＬＶＧＧＤＣＲＧＷＱＧ (配列番号３３８); ＱＧＱＳＧＱＧＱＱＱＷＣＮＩＷＩＮＧＧＤＣＲＧＷＮＧ (配列番号１１０); ＰＷＣＭＱＲＱＤＦＬＲＣＰＱＰ (配列番号１１１);  ＱＬＧＬＰＡＹＭＣＴＦＥＣＬＲ (配列番号１１２); ＣＮＬＷＶＳＧＧＤＣＧＧＬＱＧ (配列番号１１３); ＳＣＳＬＷＴＳＧＳＣＬＰＨＳＰ (配列番号１１３)); ＹＣＬＱＬＰＨＹＭＱＡＭＣＧＲ (配列番号１１５); ＣＦＬＹＳＣＴＤＶＳＹＷＮＮＴ (配列番号１１６); ＰＷＣＭＱＲＱＤＹＬＲＣＰＱＰ (配列番号１１７); ＣＮＬＷＩＳＧＧＤＣＲＧＬＡＧ (配列番号１１８); ＣＮＬＷＶＳＧＧＤＣＲＧＶＱＧ (配列番号１１９); ＣＮＬＷＶＳＧＧＤＣＲＧＬＲＧ (配列番号１２０); ＣＮＬＷＩＳＧＧＤＣＲＧＬＰＧ (配列番号１２１); ＣＮＬＷＶＳＧＧＤＣＲＤＡＰＷ (配列番号１２２); ＣＮＬＷＶＳＧＧＤＣＲＤＬＬＧ (配列番号１２３); ＣＮＬＷＶＳＧＧＤＣＲＧＬＱＧ (配列番号１２４); ＣＮＬＷＬＨＧＧＤＣＲＧＷＱＧ (配列番号１２４)); ＣＮＩＷＬＶＧＧＤＣＲＧＷＱＧ (配列番号１２６); ＣＴＴＷＦＣＧＧＤＣＧＶＭＲＧ (配列番号１２７); ＣＮＩＷＧＰＳＶＤＣＧＡＬＬＧ (配列番号１２８); ＣＮＩＷＶＮＧＧＤＣＲＳＦＥＧ (配列番号１２９); ＹＣＬＮＬＰＲＹＭＱＤＭＣＷＡ (配列番号１３０); ＹＣＬＡＬＰＨＹＭＱＡＤＣＡＲ (配列番号１３１); ＣＦＬＹＳＣＧＤＶＳＹＷＧＳＡ (配列番号１３２); ＣＹＬＹＳＣＴＤＳＡＦＷＮＮＲ (配列番号１３３); ＣＹＬＹＳＣＮＤＶＳＹＷＳＮＴ (配列番号１３４); ＣＦＬＹＳＣＴＤＶＳＹＷ (配列番号１３５); ＣＦＬＹＳＣＴＤＶＡＹＷＮＳＡ (配列番号１３６); ＣＦＬＹＳＣＴＤＶＳＹＷＧＤＴ (配列番号１３７); ＣＦＬＹＳＣＴＤＶＳＹＷＧＮＳ (配列番号１３７)); ＣＦＬＹＳＣＴＤＶＡＹＷＮＮＴ (配列番号１３９); ＣＦＬＹＳＣＧＤＶＳＹＷＧＮＰＧＬＳ (配列番号１４０); ＣＦＬＹＳＣＴＤＶＡＹＷＳＧＬ (配列番号１４１); ＣＹＬＹＳＣＴＤＧＳＹＷＮＳＴ (配列番号１４２); ＣＦＬＹＳＣＳＤＶＳＹＷＧＮＩ (配列番号１４３); ＣＦＬＹＳＣＴＤＶＡＹＷ (配列番号１４４); ＣＦＬＹＳＣＴＤＶＳＹＷＧＳＴ (配列番号１４５); ＣＦＬＹＳＣＴＤＶＡＹＷＧＤＴ (配列番号１４６); ＧＣＮＩＷＬＮＧＧＤＣＲＧＷＶＤＰＬＱＧ (配列番号１４７); ＧＣＮＩＷＬＶＧＧＤＣＲＧＷＩＧＤＴＮＧ (配列番号１４８); ＧＣＮＩＷＬＶＧＧＤＣＲＧＷＩＥＤＳＮＧ (配列番号１４９); ＧＣＮＩＷＡＮＧＧＤＣＲＧＷＩＤＮＩＤＧ (配列番号１５０); ＧＣＮＩＷＬＶＧＧＤＣＲＧＷＬＧＥＡＶＧ (配列番号１５１); ＧＣＮＩＷＬＶＧＧＤＣＲＧＷＬＥＥＡＶＧ (配列番号１５２); ＧＧＰＡＬＣＮＩＷＬＮＧＧＤＣＲＧＷＳＧ (配列番号１５３); ＧＡＰＶＦＣＮＩＷＬＮＧＧＤＣＲＧＷＭＧ (配列番号１５４); ＧＱＱＱＷＣＮＩＷＩＮＧＧＤＣＲＧＷＮＧ (配列番号１５５); ＧＫＳＥＦＣＮＩＷＬＮＧＧＤＣＲＧＷＩＧ (配列番号１５６); ＧＴＰＧＧＣＮＩＷＡＮＧＧＤＣＲＧＷＥＧ (配列番号１５７); ＧＡＳＱＹＣＮＬＷＩＮＧＧＤＣＲＧＷＲＧ (配列番号１５８); ＧＣＮＩＷＬＶＧＧＤＣＲＰＷＶＥＧＧ (配列番号１５９); ＧＣＮＩＷ��ＶＧＧＤＣＲＰＦＶＤＧＧ (配列番号１６０); ＧＣＮＩＷＬＮＧＧＤＣＲＡＷＶＤＴＧ (配列番号１６１); ＧＣＮＩＷＩＶＧＧＤＣＲＰＦＩＮＤＧ (配列番号１６２); ＧＣＮＩＷＬＮＧＧＤＣＲＰＶＶＦＧＧ (配列番号１６３); ＧＣＮＩＷＬＳＧＧＤＣＲＭＦＭＮＥＧ (配列番号１６４); ＧＣＮＩＷＶＮＧＧＤＣＲＳＦＶＹＳＧ (配列番号１６５); ＧＣＮＩＷＬＮＧＧＤＣＲＧＷＥＡＳＧ （配列番号１６６）; ＧＣＮＩＷＡＨＧＧＤＣＲＧＦＩＥＰＧ (配列番号１６７); ＧＣＮＩＷＬＮＧＧＤＣＲＴＦＶＡＳＧ (配列番号１６８); ＧＣＮＩＷＡＨＧＧＤＣＲＧＦＩＥＰＧ (配列番号１６９); ＧＦＬＥＮＣＮＩＷＬＮＧＧＤＣＲＴＧ (配列番号１７０); ＧＩＹＥＮＣＮＩＷＬＮＧＧＤＣＲＭＧ (配列番号１７０)); 及び/又は ＧＩＰＤＮＣＮＩＷＩＮＧＧＤＣＲＹＧ (配列番号１７２)。
【０２４６】
インターロイキン６標的、例えばインターロイキン６受容体（ＩＬ−６Ｒ）を結合する抗体との使用のための適切なマスキング部分は、非制限的な例によれば、下記配列を含むマスキング部分を含む：ＱＧＱＳＧＱＹＧＳＣＳＷＮＹＶＨＩＦＭＤＣ (配列番号１７４); ＱＧＱＳＧＱＧＤＦＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＩＴ (配列番号１７５); ＱＧＱＳＧＱＭＧＶＰＡＧＣＶＷＮＹＡＨＩＦＭＤＣ (配列番号１７５)); ＹＲＳＣＮＷＮＹＶＳＩＦＬＤＣ (配列番号１７７); ＰＧＡＦＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＮＴ (配列番号１７８); ＥＳＳＣＶＷＮＹＶＨＩＹＭＤＣ (配列番号１７９); ＹＰＧＣＫＷＮＹＤＲＩＦＬＤＣ (配列番号１８０); ＹＲＴＣＳＷＮＹＶＧＩＦＬＤＣ (配列番号１８１); ＹＧＳＣＳＷＮＹＶＨＩＦＭＤＣ (配列番号１８２); ＹＧＳＣＳＷＮＹＶＨＩＦＬＤＣ (配列番号１８３); ＹＧＳＣＮＷＮＹＶＨＩＦＬＤＣ (配列番号１８４); ＹＴＳＣＮＷＮＹＶＨＩＦＭＤＣ (配列番号１８５); ＹＰＧＣＫＷＮＹＤＲＩＦＬＤＣ (配列番号１８６); ＷＲＳＣＮＷＮＹＡＨＩＦＬＤＣ (配列番号１８７); ＷＳＮＣＨＷＮＹＶＨＩＦＬＤＣ (配列番号１８８); ＤＲＳＣＴＷＮＹＶＲＩＳＹＤＣ (配列番号１８９); ＳＧＳＣＫＷＤＹＶＨＩＦＬＤＣ (配列番号１９０); ＳＲＳＣＩＷＮＹＡＨＩＨＬＤＣ (配列番号１９１); ＳＭＳＣＹＷＱＹＥＲＩＦＬＤＣ (配列番号１９２); ＹＲＳＣＮＷＮＹＶＳＩＦＬＤＣ (配列番号１９３); ＹＧＳＣＳＷＮＹＶＨＩＦＭＤＣ (配列番号１９４); ＳＧＳＣＫＷＤＹＶＨＩＦＬＤＣ (配列番号１９５); ＹＫＳＣＨＷＤＹＶＨＩＦＬＤＣ (配列番号１９６); ＹＧＳＣＴＷＮＹＶＨＩＦＭＥＣ (配列番号１９７); ＦＳＳＣＮＷＮＹＶＨＩＦＬＤＣ (配列番号１９８); ＷＲＳＣＮＷＮＹＡＨＩＦＬＤＣ (配列番号１９９); ＹＧＳＣＱＷＮＹＶＨＩＦＬＤＣ (配列番号２００); ＹＲＳＣＮＷＮＹＶＨＩＦＬＤＣ (配列番号２０１); ＮＭＳＣＨＷＤＹＶＨＩＦＬＤＣ (配列番号２０２); ＦＧＰＣＴＷＮＹＡＲＩＳＷＤＣ (配列番号２０３); ＸＸｓＣＸＷＸＹｖｈＩｆＸｄＣ (配列番号２０４); ＭＧＶＰＡＧＣＶＷＮＹＡＨＩＦＭＤＣ (配列番号２０５); ＲＤＴＧＧＱＣＲＷＤＹＶＨＩＦＭＤＣ (配列番号２０６); ＡＧＶＰＡＧＣＴＷＮＹＶＨＩＦＭＥＣ (配列番号２０７); ＶＧＶＰＮＧＣＶＷＮＹＡＨＩＦＭＥＣ (配列番号２０８); ＤＧＧＰＡＧＣＳＷＮＹＶＨＩＦＭＥＣ (配列番号２０９); ＡＶＧＰＡＧＣＷＷＮＹＶＨＩＦＭＥＣ (配列番号２０９)); ＣＴＷＮＹＶＨＩＦＭＤＣＧＥＧＥＧＰ (配列番号２１１); ＧＧＶＰＥＧＣＴＷＮＹＡＨＩＦＭＥＣ (配列番号２１２); ＡＥＶＰＡＧＣＷＷＮＹＶＨＩＦＭＥＣ (配列番号２１３); ＡＧＶＰＡＧＣＴＷＮＹＶＨＩＦＭＥＣ (配列番号２１４); ＳＧＡＳＧＧＣＫＷＮＹＶＨＩＦＭＤＣ (配列番号２１５); ＭＧＶＰＡＧＣＶＷＮＹＡＨＩＦＭＤＣ (配列番号２１６); ＴＰＧＣＲＷＮＹＶＨＩＦＭＥＣＥＡＬ (配列番号２１７); ＶＧＶＰＮＧＣＶＷＮＹＡＨＩＦＭＥＣ (配列番号２１８); ＰＧＡＦＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＮＴ (配列番号２１９); ＲＧＡＣＤＩＰＦＰＡＨＷＩＰＮＴ (配列番号２２０); ＱＧＤＦＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＩＴ (配列番号２２１); ＸＧａｆＤＩＰＦＰＡＨＷｖＰｎＴ (配列番号２２２); ＲＧＤＧＮＤＳＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＲＴ (配列番号２２３); ＳＧＶＧＲＤＲＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＲＴ (配列番号２２４); ＷＡＧＧＮＤＣＤＩＰＦＰＡＨＷＩＰＮＴ (配列番号２２５); ＷＧＤＧＭＤＶＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＶＴ (配列番号２２６); ＡＧＳＧＮＤＳＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＲＴ (配列番号２２７); ＥＳＲＳＧＹＡＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＲＴ (配列番号２２８); 及び/又はＲＥＣＧＲＣＧＤＩＰＦＰＡＨＷＶＰＲＴ (配列番号１７３)。
【０２４７】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）は、プロテアーゼ、通常細胞外プロテアーゼのための基質として作用することができるアミノ酸を含む。ＣＭは、多重特異性活性化可能抗体中の少なくとも１つのＡＢの所望する標的と共に、組織に共局在されるプロテアーゼに基づいて選択され得る。目的の標的が、プロテアーゼと共に共局在される種々の異なった状態は知られており、ここで前記プロテアーゼの基質は当業界において知られている。癌の例によれば、標的組織は、癌性組織、特に固形腫瘍の癌性組織であり得る。多くの癌、例えば固形腫瘍において、既知基質を有する高められたレベルのプロテアーゼが文献に報告されている。例えば、La Rocca et al, (2004) British J. of Cancer 90(7): 1414-1421を参照のこと。疾患の非制限的例は、次のものを包含する：すべてのタイプの癌（乳癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、黒色腫、頭部及び頚部、膵臓、等）、リウマチ性関節炎、クローン病、SLE、心血管障害、虚血、等。例えば、指標は、白血病、例えばT細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）、リンパ芽球性疾患、例えば多発性骨髄腫、及び固形腫瘍、例えば肺、結腸直腸、前立腺、膵臓及び乳房、例えばトリプルネガティブ乳癌を包含する。例えば、指標は、初期腫瘍起源にかかわらず、骨疾患又は癌における転移；乳癌、例えば非制限的例によれば、ＥＲ／ＰＲ＋乳癌、Ｈｅｒ２＋乳癌、トリプルネガティブ乳癌；結腸直腸癌;子宮体癌;胃癌;神経膠芽腫;頭頸部癌、例えば食道癌; 肺癌、例えば、非制限的例によれば、非小細胞肺癌。多発性骨髄腫、卵巣癌;膵臓癌; 前立腺癌；肉腫、例えば骨肉腫;腎臓癌、例えば、非制限的例によれば、腎細胞癌及び/又は皮膚癌、例えば、非制限的例によれば、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、又は黒色腫を包含する。いくつかの実施形態によれば、癌は、扁平上皮癌である。いくつかの実施形態によれば、癌は、皮膚扁平上皮癌である。いくつかの実施形態によれば、癌は、食道扁平上皮癌である。いくつかの実施形態によれば、癌は、頭頸部扁平上皮癌である。いくつかの実施形態によれば、癌は、肺扁平上皮癌である。
【０２４８】
ＣＭは、約０．００１−１５００ ｘ １０4 Ｍ-1Ｓ-1 又は少なくとも ０．００１、 ０．００５、０．０１、０．０５、 ０．１、 ０．５、１、 ２．５、５、７.５、 １０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１２５０又は １５００ ｘ １０4 Ｍ-1Ｓ-1の速度で酵素により特異的に切断される。
【０２４９】
酵素による特異的切断のためには、酵素とＣＭとの間の接触が行われる。ＭＭ及びＣＭにカップリングされる第１ＡＢを少なくとも含む多重特異性活性化可能抗体が、標的及び十分な酵素活性の存在下にある場合、ＣＭは切断され得る。十分な酵素活性とは、ＣＭと接触し、そして切断をもたらす酵素の能力を意味する。酵素はＣＭの近くにあっても良いが、しかし他の細胞因子又は酵素のタンパク質修飾のために切断できないことが容易に想定される。
【０２５０】
典型的な基質は、表３における次の酵素又はプロテアーゼにより切断できる基質を包含するが、但しそれらだけには限定されない：
【０２５１】
【表５】
2020114872.tif 000006
【０２５２】
例えば、いくつかの実施形態によれば、基質は、１又は２以上の次の酵素又はプロテアーゼにより切断できる：ｕＰＡ、レグマイン、ＭＴ−ＳＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＢＭＰ−１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３及び/又は ＭＭＰ−１４。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼは、uＰＡ、レグマイン及びＭＴ−ＳＰ１の群から選択される。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテイナーゼである。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼは、ｕＰＡを含む。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼは、レグマインを含む。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼは、ＭＴ−ＳＰ１を含む。
【０２５３】
いくつかの実施形態によれば、ＣＭは特定プロテアーゼとの使用のために選択される。いくつかの実施形態によれば、ＣＭは、AＤＡＭ１７、ＢＭＰ−１、システインプロテアーゼ、例えばカテプシン、ＨＴＲＡ１、レグマイン、マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、好中球エラスターゼ、ＴＭＰＲＳＳ、例えばＭＰＲＳＳ３又はＴＭＰＲＳＳ４、トロンビン、及びu型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ、また、ウロキナーゼとも呼ばれる）から成る群から選択された少なくとも１つのプロテアーゼのための基質である。
【０２５４】
いくつかの実施形態によれば、ＣＭは、ＡＤＡＭ１７の基質である。いくつかの実施形態によれば、ＣＭはＢＭＰ−１のための基質である。いくつかの実施形態によれば、ＣＭはカテプシンのための基質である。いくつかの実施形態によれば、ＣＭはシステインのための基質である。いくつかの実施形態によれば、ＣＭはＨｔｒＡ１のための基質である。いくつかの実施形態によれば、ＣＭはレグマインのための基質である。いくつかの実施形態によれば、ＣＭはＭＴ−ＳＰ１のための基質である。いくつかの実施形態によれば、ＣＭはＭＭＰのための基質である。いくつかの実施形態によれば、ＣＭは好中球エラスターゼのための基質である。いくつかの実施形態によれば、ＣＭはトロンビンのための基質である。いくつかの実施形態によれば、ＣＭはＴＭＰＲＳＳのための基質である。いくつかの実施形態によれば、ＣＭはＴＭＰＲＳＳ３のための基質である。。いくつかの実施形態によれば、ＣＭはＴＭＰＲＳＳ４のための基質である。。いくつかの実施形態によれば、ＣＭはｕＰＡのための基質である。
【０２５５】
いくつかの実施形態によれば、切断可能部分は、特定プロテアーゼ、例えば活性化可能抗体の標的と共に共局在されることが知られているプロテアーゼとの使用のために選択される。例えば、本開示の活性化可能抗体への使用のための適切な切断可能部分は、配列ＴＧＲＧＰＳＷＶ （配列番号 ２７）; ＳＡＲＧＰＳＲＷ (配列番号 ２８); ＴＡＲＧＰＳＦＫ (配列番号 ２９); ＬＳＧＲＳＤＮＨ (配列番号 ２６); ＧＧＷＨＴＧＲＮ (配列番号 ３０); HTGRSGAL (配列番号 ３１); ＰＬＴＧＲＳＧＧ (配列番号 ３２); ＡＡＲＧＰＡＩＨ (配列番号 ３３); ＲＧＰＡＦＮＰＭ (配列番号３７)); ＳＳＲＧＰＡＹＬ (配列番号 ３５); ＲＧＰＡＴＰＩＭ (配列番号 ３６); ＲＧＰＡ (配列番号 ３７); ＧＧＱＰＳＧＭＷＧＷ (配列番号 ３８); FPRPLGITGL (配列番号 ３９); ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ (配列番号 ４０); ＳＰＬＴＧＲＳＧ (配列番号 ４１); ＳＡＧＦＳＬＰＡ (配列番号４５)); ＬＡＰＬＧＬＱＲＲ (配列番号 ４３); ＳＧＧＰＬＧＶＲ (配列番号 ４４); 及び/又は ＰＬＧＬ (配列番号 ４５)を包含する。
【０２５６】
いくつかの実施形態によれば、ＣＭは、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のための基質である。ＭＭＰの例は、ＭＭＰ１; ＭＭＰ２; ＭＭＰ３; ＭＭＰ７; ＭＭＰ８; ＭＭＰ９; ＭＭＰ１０; ＭＭＰ１１; ＭＭＰ１２; ＭＭＰ１３; ＭＭＰ１４; ＭＭＰ１５; ＭＭＰ１６; ＭＭＰ１７; ＭＭＰ１９; ＭＭＰ２０; ＭＭＰ２３; ＭＭＰ２４; ＭＭＰ２６;及び ＭＭＰ２７を包含する。いくつかの実施形態によれば、ＣＭは、ＭＭＰ９、 ＭＭＰ１４、 ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１１及びＭＭＰ１９のための基質である。いくつかの実施形態によれば、ＣＭはＭＭＰ７のための基質である。いくつかの実施形態によれば、ＣＭはＭＭＰ９のための基質である。いくつかの実施形態によれば、ＣＭはＭＭＰ１４のための基質である。いくつかの実施形態によれば、ＣＭは複数のＭＭＰのための基質である。いくつかの実施形態によれば、ＣＭは複数の少なくともＭＭＰ９及びＭＭＰ１４のための基質である。いくつかの実施形態によれば、ＣＭｌは同じＭＭＰのための複数の基質を含む。いくつかの実施形態によれば、ＣＭは少なくとも複数のＭＭＰ９基質を含む。いくつかの実施形態によれば、ＣＭは少なくとも複数のＭＭＰ１４基質を含む。
【０２５７】
いくつかの実施形態によれば、ＣＭは、ＭＭＰのための基質であり、そして配列ＩＳＳＧＬＬＳＳ (配列番号３１６); ＱＮＱＡＬＲＭＡ (配列番号３１７); ＡＱＮＬＬＧＭＶ (配列番号３１８); ＳＴＦＰＦＧＭＦ (配列番号３１９); ＰＶＧＹＴＳＳＬ (配列番号３２０); ＤＷＬＹＷＰＧＩ (配列番号３２１); ＭＩＡＰＶＡＹＲ (配列番号３２２); ＲＰＳＰＭＷＡＹ (配列番号２１); ＷＡＴＰＲＰＭＲ (配列番号３２３); ＦＲＬＬＤＷＱＷ (配列番号３２４); ＬＫＡＡＰＲＷＡ (配列番号３２５); ＧＰＳＨＬＶＬＴ (配列番号３２６); ＬＰＧＧＬＳＰＷ (配列番号３２７); ＭＧＬＦＳＥＡＧ (配列番号３２８); ＳＰＬＰＬＲＶＰ (配列番号３２９); ＲＭＨＬＲＳＬＧ (配列番号３３０); ＬＡＡＰＬＧＬＬ (配列番号３３１); ＡＶＧＬＬＡＰＰ (配列番号３３２); ＬＬＡＰＳＨＲＡ (配列番号３３３); ＰＡＧＬＷＬＤＰ (配列番号３３４); 及び/又は IＳＳＧＬＳＳ (配列番号３３５)を含む。
【０２５８】
いくつかの実施形態によれば、本開示の多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、組換えＤＮＡ技法及び真核生物又は原核生物種における発現を用いて、生合成的に製造され得る。多重特異性活性化可能抗体に関しては、マスキング部分、リンカー配列（切断可能部分（ＣＭ）及び抗体鎖（Ｈ又はＬ鎖）を含むことができる）をコードするｃＤＮＡが、５′から３′（翻訳された生成物においてＮ−からＣ−末端）の順序で連結され、核酸コンストラクトが創造され、これは、従来の抗体発現工程に続いて、多重特異性活性化可能抗体タンパク質として発現される。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、ＣＭ−抗体を発現し、そして次に、前記タンパク質のＮ−末端で又はその近くで、マスクを化学的にカップリングすることにより、半合成的に生成され得る。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、抗体を発現し、そして前記タンパク質のＮ−末端で又はその近くで、マスク及びＣＭを化学的にカップリングすることにより生成され得、結果的に、切断されていない状態での多重特異性活性化可能抗体は、次のように、Ｎ−末端からＣ−末端側へ構造配置を有する：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ 又は ＡＢ−ＣＭ−ＭＭ。
【０２５９】
本明細書に記載される組成物への使用のために適切なリンカーは一般的に、標的への少なくとも第１ＡＢの結合の阻害を促進するために、修飾されたＡＢ又は多重特異性活性化可能抗体の柔軟性を提供するリンカーである。適切なリンカーは、容易に選択され、そして何れかの適切な異なった長さのものであり得、例えば１個のアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）−２０個のアミノ酸、２個のアミノ酸−１５個のアミノ酸、３個のアミノ酸−１２個のアミノ酸、４個のアミノ酸−１０個のアミノ酸、５個のアミノ酸−９個のアミノ酸、６個のアミノ酸−８個のアミノ酸、又は７個のアミノ酸−８個のアミノ酸であり得、そして１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の長さのアミノ酸であり得る。
【０２６０】
典型的な柔軟リンカーは、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー(例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ (配列番号 １８) 及び （ＧＧＧＳ）ｎ (配列番号１９)、ここでｎ は、少なくとも１の整数である)、グリシン−アラニンポリマー、アラニン −セリンポリマー、及び当業界において知られている他の柔軟リンカーを包含する。グリシン及びグリシン−セリンポリマーは、比較的構造化されておらず、そして従って、構成成分間で中立的テサー（neutral tether）として作用することができる。グリシンは、あってもアラニンよりも著しくファイ・プサイ空間にアクセスし、そしてより長い側鎖を有する残基よりもはるかに低く制限される（Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)を参照のこと）。典型的な柔軟リンカーは、次の配列を含むが、但しそれらだけには限定されない：Gly-Gly-Ser-Gly(配列番号２０)、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(配列番号２１)、 Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(配列番号２２)、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(配列番号２３)、 Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (配列番号２４)、 Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (配列番号２５)、及び同様のもの。当業者は、活性化可能抗体の企画がすべて又は部分的に柔軟であるリンカーを含むことができ、結果的に、そのリンカーは柔軟リンカー及び所望する多重特異性活性化可能抗体構造を提供するために低い柔軟性の構造を付与する１又は２以上の部分を含むことができることを認識するであろう。
【０２６１】
上記に記載される要素の他に、多重特異性活性化可能抗体は、追加の要素、例えば多重特異性活性化可能抗体のＮ−又はＣ−末端アミノ酸配列を含むことができる。例えば、多重特異性活性化可能抗体は、目的の細胞又は組織への送達を促進する標的部分を含むことができる。多重特異性活性化可能抗体は、剤、例えば治療剤、抗腫瘍剤、毒素又はそのフラグメント、検出可能部分又は診断剤に接合され得る。剤の例は、本明細書に開示される。
【０２６２】
多重特異性活性化可能抗体はまた、接合された剤、リンカー及び本開示の多重特異性活性化可能抗体に関連して本明細書に記載される他の成分の何れか、例えば非制限的例によれば、表４に列挙される剤の何れか、及び／又は表５及び／又は表６に列挙されるリンカーの何れかを含むことができる。
【０２６３】
接合された多重特異性抗体及び接合された多重特異性活性化可能抗体
本開示はまた、細胞毒性剤、例えば毒素（例えば、細菌、菌類、植物又は動物起源の酵素的活性毒素、又はそのフラグメント）、又は放射性同位体（すなわち、放射性接合体）に接合される、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体を含む免疫接合体にも関連する。適切な細胞毒性剤は、例えばドラスタチン及びその誘導体（例えば、アウリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＤ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ）を含む。例えば、細胞毒性剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、表４に列挙される群から選択された剤である。いくつかの実施形態によれば、剤はドラスタチンである。いくつかの実施形態によれば、剤はアウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、剤はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態によれば、剤はメイタンシノイド又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、剤はＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態によれば、剤はデュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、剤はカリケアマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。
【０２６４】
使用され得る酵素的活性毒素及びそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌からの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰII及びＰＡＰ−Ｓ）、ゴーヤー（Momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロトン、サポナリア・オフィシナリス（Sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンを包含する。種々の放射性核種が放射性接合された抗体の生成のために利用できる。例としては、212Ｂｉ、64Ｃｕ、125Ｉ、131Ｉ、131Ｉｎ、99mＴｃ、90Ｙ、186Ｒｅ及び 89Ｚｒを挙げることができる。
【０２６５】
抗体及び細胞毒性剤の接合体は、種々の二官能タンパク質−カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス(p−アジドベンゾイル) ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス − （p−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２,４−ジニトロベンゼン）を用いて製造される。例えば、リシン免疫毒素がVitetta et al., Science 238: 1098 (1987)に記載のようにして調製され得る。14Ｃ−標識された１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性核種の接合のための典型的なキレート剤である。（国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと）。
【０２６６】
表４は、本明細書に記載される開示に使用され得る典型的な薬剤のいくつかを列挙するが、しかし決して網羅的な列挙を意味するものではない。
【０２６７】
【表６】
2020114872.tif 000007
【０２６８】
【表７】
2020114872.tif 000008
【０２６９】
当業者は、多くの種類の可能性ある部分が、得られる本開示の多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体にカップリングされ得ることを認識するであろう（例えば、“Conjugate Vaccines”, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)を参照のこと、この全内容は、引用により本明細書に組込まれる）。
【０２７０】
カップリングは、抗体及び他の部分がそれらのそれぞれの活性をできるだけ長く保持するよう、２つの分子を結合するであろう任意の化学反応により達成される。この結合は、多くの化学機構、例えば共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合及び錯体形成を包含することができる。しかしながら、いくつかの実施形態によれば、好ましい結合は共有結合である。共有結合は、既存の側鎖の直接的縮合により又は外部架橋分子の取り組みにより達成され得る。多くの二価又は多価結合剤が、タンパク質分子、例えば本開示の抗体を、他の分子にカップリングすることにおいて有用である。例えば、代表的なカップリング剤は、有機化合物、例えばチオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン及びヘキサメチレンジアミンを包含することができる。この列挙は、当業界において知られている種々の種類のカップリング剤を網羅することを意図するものではなく、むしろ、より一般的なカップリング剤の例である。（Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); 及び Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)を参照のこと）。
【０２７１】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に提供される組成物及び方法の他に、接合された活性化可能抗体はまた、活性化可能抗体配列に挿入されるか、又は他方では、含まれる修飾されたアミノ酸配列を通して、部位特異的接合のために修飾され得る。それらの修飾されたアミノ酸配列は、接合された活性化可能抗体内での接合された剤の制御された置換及び／又は投与を可能にするよう企画される。例えば、活性化可能抗体は、反応性チオール基を提供し、そしてタンパク質の折りたたみ及びアセンブリーに負の影響を与えず、又は抗原結合も変更しない、Ｌ及びＨ鎖上の位置でのシステイン置換を含むよう操作され得る。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体は、接合のための適切な部位を提供するために、活性化可能抗体内に１又は２以上の非天然のアミノ酸残基を含むか又は他方では、導入するよう操作され得る。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体は、その活性化可能抗体配列内に酵素的に活性化可能ペプチド配列を含むか又は他方では、導入するよう操作され得る。
【０２７２】
適切なリンカーは、文献に記載されている。（例えば、ＭＢＳ（Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用を記載する、Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984)を参照のこと）。また、オリゴペプチドリンカーにより抗体にカップリングされる、ハロゲン化されたアセチルヒドラジド誘導体の使用を記載する米国特許第５，０３０，７１９号も参照のこと。特に適切なリンカーは、次のものを包含する：（ｉ）ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）−トルエン（Pierce Chem. Co., カタログ番号(21558G)）；（ii）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Pierce Chem. Co. カタログ番号21651G）；及び（iii）スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］−ヘキサノエート（Pierce Chem. Co. カタログ番号2165-G）。追加のリンカーは、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ又はスルホ−ＳＰＤＢを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０２７３】
上記に記載されるリンカーは、異なった属性を有する成分を含み、従って、異なった物理−化学性質を有する接合体を導く。例えば、リンカーＳＭＰＴは、立体的にヒンダードされたジスルフィド結合を含み、そして高められた安定性を有する接合体を形成することができる。ジスルフィド結合は一般的に、ジスルフィド結合がインビトロで切断され、低い利用可能な接合体をもたらすので、他の結合よりも安定性が低い。
【０２７４】
試薬ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩は、カルボン酸及び第１又は第２アミンにより出発してカルボキサミドを創造するのに有用である。従って、ＥＤＣは、リンカー又は毒素におけるカルボン酸と、抗体におけるリシン残基とを連結するか、又はリンカー又は毒素におけるアミンと、抗体におけるアスパラギン酸又はグルタミン酸残基とを連結するために、使用され得る。ＥＤＣを使用する、そのような接合反応は、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）又はスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−３−オキシスルホニルスクシンイミド）の添加により増強され得る。そのような接合反応へのＮＨＳ又はスルホ−ＮＨＳの添加は、接合反応の速度、完全性、選択性及び再現性を増強することができる。
【０２７５】
いくつかの実施形態によれば、リンカーは切断可能である。いくつかの実施形態によれば、リンカーは非切断可能である。いくつかの実施形態によれば、複数のリンカーが存在する。それらの複数のリンカーはすべて同じである。例えば切断可能か又は非切断可能であり、又はそれらの複数のリンカーは異なっており、例えば、少なくとも１つは切断可能であり、そして少なくとも１つは非切断可能である。
【０２７６】
本開示は、次のように、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体のＡＢに剤を接合するためのいくつかの方法を利用する：（ａ）ＡＢの炭水化物部分への結合、又は（ｂ）ＡＢのスルフヒドリル基への結合、又は（ｃ）ＡＢのアミノ基への結合、又は（ｄ）ＡＢのカルボキシル基への結合。本開示によれば、ＡＢは、少なくとも２つの反応性基を有する中間リンカーを通して剤に共有結合され得、ここで１つの反応性基はＡＢと反応し、そして１つの基は剤と反応する。任意の適合性有機化合物を含むことができるリンカーは、ＡＢ（又は剤）との反応がＡＢ反応性及び選択性に悪影響を及ぼさないよう選択される。さらに、剤へのリンカーの結合は、剤の活性を破壊しない。酸化された抗体又は酸化された抗体フラグメントとの反応のための適切なリンカーは、第１アミン、第２アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、フェニルヒドラジン、セミカルバジド及びチオセミフルバジド基から成る群から選択されたアミンを含むそれらのリンカーである。そのような反応性官能基は、リンカーの構造の一部として存在するか、又はそのような基を含まないリンカーの適切な化学的修飾により導入され得る。
【０２７７】
本開示によれば、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体の還元されたＡＢへの結合のための適切なリンカーは、還元された抗体又はフラグメントのスルフヒドリル基と反応できる特定の反応性基を有するそれらのリンカーを包含する。そのような反応性基は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：反応性ハロアルキル基（例えば、ハロアセチル基を包含する）、ｐ−マーキュリー安息香酸基及びマイケル型付加反応することができる基（例えば、マレイミド、及びMitra and Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101: 3097-3110により記載されるタイプの基を包含する）。
【０２７８】
本開示によれば、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体の酸化も又は還元もされていないＡＢへの結合のための適切なリンカーは、ＡＢにおける修飾されていないリシン残基に存在する第１アミンと反応することができる特定の官能基を有するそれらのリンカーである。そのような反応性基は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：ＮＨＳカルボン酸又は炭酸エステル、スルホ−ＮＨＳカルボン酸又は炭酸エステル、４−ニトロフェニルカルボン酸又は炭酸エステル、ペンクフルオロフェニルカルボン酸又は炭酸エステル、アシルイミダゾール、イソシアネート及びインチオシアネート。
【０２７９】
本開示によれば、酸化も、還元もされていないＡＢへの結合のための適切なリンカーは、適切な試薬により活性化された、ＡＢにおけるアスパラギン酸又はグルタミン酸残基に存在するカルボン酸基と反応することができる特定の官能基を有するそれらのリンカーを包含する。適切な活性化試薬は、付加されたＮＨＳ又はスルホ−ＮＨＳを有するか又は有さないＥＤＣ、及びカルボキサミド形成のために利用される他の脱水剤を包含する。それらの場合、適切なリンカーに存在する官能基は、第１及び第２アミン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン及びヒドラジドを包含する。
【０２８０】
剤は、リンカーがＡＢに結合される前又は後、リンカーに結合され得る。特定の用途によれば、リンカーが関連する剤を有さないＡｂ−リンカー中間体を、最初に生成することが所望される。特定の用途に依存して、特定の剤がリンカーに共有結合され得る。他の実施形態によれば、ＡＢが、ＭＭ、ＣＭ及び関連するリンカーに、まず結合され、そして次に、接合目的のためにリンカーに結合される。
【０２８１】
分枝状リンカー：特定の実施形態によれば、剤の結合のための複数の部位を有する分枝状リンカーが使用される。複数部位リンカーに関しては、ＡＢへの単一の共有結合が、多数の部位で剤を結合できるＡＢ−リンカー中間体をもたらす。前記部位は、アルデヒド又はスルフヒドリル基であり得るか、又は剤が結合され得る任意の化学部位であり得る。
【０２８２】
他方では、より高い比活性（又はＡＢに対する剤の高い比率）が、ＡＢ上の複数の部位での単一の部位リンカーの結合により達成され得る。この複数の部位は、２種の方法の何れかによりＡＢ中に導入され得る。最初に、１つの方法は、同じＡＢに複数のアルデヒド基及び／又はスルフヒドリル基を生成することができる。第２に、１つの方法は、リンカーへの続く結合のために複数の官能部位を有する「分枝状リンカー」を、ＡＢのアルデヒド又はスルフヒドリルに結合することができる。分枝状リンカー又は複数部位リンカーの官能部位は、アルデヒド又はスルフヒドリル基であり得るか、又はリンカーが結合され得る任意の化学部位であり得る。さらに高い比活性がそれらの２種のアプローチを組合すことにより、すなわちあＢ上のいくつかの部位で複数部位リンカーを結合することにより得られる。
【０２８３】
切断可能リンカー：補体系の酵素、例えばウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、トリプシン、プラスミン、又はタンパク質分解活性を有する別の酵素（但し、それだけには限定されない）による切断に対して敏感であるペプチドリンカーが、本開示の１つの実施形態に使用され得る。本開示の１つの方法によれば、剤が補体による切断に敏感なリンカーを介して結合される。抗体は、補体を活性化できる種類から選択される。従って、抗体−剤接合体は、補体カスケードを活性化し、そして標的部位で剤を開放する。本開示の別の方法によれば、剤は、タンパク質分解活性を有する酵素、例えばウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン、活性化因子、プラスミン又はトリプシンによる切断に対して敏感なリンカーを介して結合される。それらの切断可能リンカーは、細胞外毒素、例えば非制限的例によれば、表４に示される細胞外毒性の何れかを含む、接合された活性化可能抗体において有用である。
【０２８４】
切断可能リンカー配列の非制限的剤が、表５に提供される。
【０２８５】
【表８】
2020114872.tif 000009
【０２８６】
さらに、剤は、ジスルフィド接合（例えば、システイン残基上のジスルフィド結合）を介してＡＢに結合され得る。多くの腫瘍は天然において、高レベルのグルタチオン（還元剤）を放出するので、これがジスルフィド結合を還元し、送達の部位での剤の続く放出を引起す。特定の実施形態によれば、ＣＭを修飾する還元剤はまた、接合された活性化可能抗体のリンカーを修飾するであろう。
【０２８７】
スペーサー及び切断可能要素：さらに別の実施形態によれば、剤と、活性可能抗体のＡＢとの間の空間を最適化するような手段でリンカーを構成する必要がある。これは、下記一般構造のリンカーの使用により達成され得る：
Ｗ−（ＣＨ2）ｎ−Ｑ
ここで、Ｗは、−Ｎ−ＣＨ2−又は−ＣＨ2−のいずれかであり；
Ｑは、アミノ酸、ペプチドであり；そして
ｎは、０−２０の整数である。
【０２８８】
さらに他の実施形態によれば、リンカーはスペーサー要素及び切断可能要素を含むことができる。スペーサー要素は、切断可能要素が切断を担当する酵素により接近できるようＡＢのコアーから離れて、切断可能要素を位置決定するよう作用する。上記に記載される特定の分枝リンカーが、スペーサー要素として作用することができる。
【０２８９】
この議論を通して、剤へのリンカーの結合（又は切断可能要素へのスペーサー要素の、又は剤への切断可能要素の結合）は、結合又は反応の特定のモードである必要はないことが理解されるべきである。適切な安定性及び生物学的適合性の生成物を提供する任意の反応が許容できる。
【０２９０】
血清補体及びリンカーの選択：本開示の１つの方法によれば、剤の放出が所望される場合、補体を活性化できる種類の抗体であるＡＢが使用される。その得られる接合体は、抗原を接合し、そしてカスケードを活性化する両能力を保持する。従って、本開示のこの実施形態によれば、剤は、切断可能リンカー又は切断可能要素の一端に連結され、そしてリンカー基の他端がＡＢ上の特異的部位に結合される。例えば、剤がヒドロキシ基又はアミノ基を有する場合、それは、ペプチド、アミノ酸又は他の適切に選択されたリンカーのカルボキシ末端に、それぞれ、エステル又はアミド結合を介して結合され得る。例えば、そのような剤は、カルボジイミド反応を介してリンカーペプチドに結合され得る。剤が、リンカーへの結合を妨げる官能基を含む場合、それらの妨害官能基は、結合の前、ブロックされ、そして生成物の接合体又は中間体が製造されるとすぐに、脱ブロックされる。次に、リンカーの反対又はアミノ末端が、直接、又は補体を活性化できるＡＢへの結合のために、さらなる修飾の後、使用される。
【０２９１】
リンカー（又はリンカーのスペーサー要素）は何れかの所望する長さのものであり、その一端は、活性化可能抗体のＡＢ上の特異的部位に共有結合される。リンカー又はスペーサー要素の他の末端は、アミノ酸又はペプチドリンカーに結合され得る。
【０２９２】
従って、それらの接合体が補体の存在下で抗原に結合する場合、剤をリンカーに結合するアミド又はエステル結合が切断され、その活性形での剤の放出がもたらされる。それらの接合体は、対象に投与される場合、標的部位での剤の送達又は放出を達成し、そして表４のそれら（但し、それらに制限されない）に提示されるように、薬剤、抗生物質、代謝拮抗剤、抗増殖剤及び同様のもののインビボ送達のために特に効果的である。
【０２９３】
補体活性化なしでの放出のためのリンカー：標的化された送達のさらなる別の用途によれば、補体活性化なしでの剤の放出は、補体カスケードの活性化が最終的には、標的細胞を溶解するので、所望される。従って、このアプローチは、剤の送達及び放出が標的細胞を死滅しないで、達成されるべきである場合、有用である。細胞メディエーター、例えばホルモン、酵素、コルチコステロイド、神経伝達物質、遺伝子又は酵素の標的細胞への送達が所望される場合、そのようなことが目的である。それらの接合体は、血清プロテアーゼによる切断に対して軽度に敏感であるリンカーを介して、補体を活性化できないＡＢに剤を結合することにより調製され得る。この接合体が個人に投与される場合、抗原−抗体補体がすばやく形成するが、ところが剤の切断はゆっくり生じ、従って、標的部位での化合物の放出がもたらされる。
【０２９４】
生化学架橋剤：他の実施形態によれば、活性化可能抗体は、特定の生化学的架橋剤を用いて、１又は２以上の治療剤に接合され得る。架橋試薬は、２種の異なった分子の官能基を一緒に結合する分子橋を形成する。段階的に２つの異なったタンパク質を連結するためには、所望しないホモポリマー形成を排除するヘテロ−二官能性架橋剤が使用され得る。
【０２９５】
リソソームプロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカー、例えばＶａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ａｌａ又は他のジペプチドがまた有用である。さらに、リソソームの低ｐＨ環境下で切断可能な酸−不安定性リンカー、例えばビス−シアリルエーテルが使用され得る。他の適切なリンカーは、カテプシン−不安定性基質、特に酸性ｐＨで最適な機能を示すそれらを包含する。
【０２９６】
典型的なヘテロ−二官能性架橋剤が表６に参照される。
【表９】
2020114872.tif 000010
【０２９７】
非切断可能リンカー又は直接的結合：本開示のさらに他の実施形態によれば、接合体は、剤が標的に送達されるが、しかし放出されないよう企画され得る。これは、ＡＢに剤を、直接的に又は非切断可能リンカーを介して結合することにより達成され得る。
【０２９８】
それらの非切断リンカーは、続いて、本明細書に記載される方法によりＡＢへの結合に利用され得る官能基を含むよう修飾され得る、アミノ酸、ペプチド、Ｄ−アミノ酸又は他の有機化合物を含むことができる。そのような有機リンカーのための一般式は、下記式であり得る：
Ｗ−（ＣＨ2）ｎ−Ｑ
ここで、Ｗは、−Ｎ−ＣＨ2−又は−ＣＨ2−のいずれかであり；
Ｑは、アミノ酸、ペプチドであり；そして
ｎは、０−２０の整数である。
【０２９９】
非切断可能接合体：他方では、化合物は、補体を活性化できないＡＢに結合され得る。補体活性化することができないＡＢを用いる場合、この結合は、活性化された補体による切断に敏感であるリンカーを用いて、又は活性化された補体による切断に敏感ではないリリンカーを用いて、達成され得る。
【０３００】
本明細書に開示される抗体はまた、免疫リポソームとして製剤化され得る。抗体を含むリポソームは、当業界において知られている方法、例えばEpstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号 及び米国特許第4,544,545号に記載される方法により調製される。向上された循環時間を有するリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０３０１】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ−誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて、逆相蒸発方法により生成され得る。リポソームは、所望する直径を有するリポソームを生成するために、定義された孔サイズのフィルターを通して押出される。本開示の抗体のＦａｂ′フラグメントは、ジスルフィド−交換反応を介して、Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載されるリポソームに結合され得る。
【０３０２】
非結合立体部分又は非結合立体部分のための結合パートナーを有する多重特異性活性化可能抗体
本開示はまた、非結合立体部分（ＮＢ）、又は非結合立体部分のための結合パートナー（ＢＰ）を含む多重特異性活性化可能抗体を提供し、ここでＢＰは、多重特異性活性化可能抗体にＮＢをリクルートするか、又は他方では、引き付ける。本明細書に提供される多重特異性活性化可能抗体は例えば、非結合立体部分（ＡＢ）、切断可能胃リンカー（ＣＬ）及び第１標的又はエピトープを結合する少なくとも第１抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ１）を含む多重特異性活性化可能抗体；非結合立体部分（ＢＰ）のための結合パートナー、ＣＬ及びＡＢ１を含む多重特異性活性化可能抗体；及びＮＢがリクルートされているＢＰ、ＣＬ、及び第１標的又はエピトープを結合するＡＢ１を含む多重特異性活性化可能抗体を包含する。ＮＢがＣＬ及びＡＢ１に共有結合されているか、又はＣＬ及びＡＢ１に共有結合されるＢＰとの相互作用により会合される多重特異性活性化可能抗体は、「ＮＢ−含有多重特異性活性化可能抗体」として、本明細書において言及される。活性化可能又はスイッチング可能とは、活性化可能抗体が、阻害された、マスキングされた、又は切断されていない状態下にある場合、標的への結合の第１レベル（第１コンホメーション）、及び阻害されていない、マスキングされていない、及び／又は切断された状態下にある場合、標的への結合の第２レベル（すなわち、第２コンホメーション）を示し、ここで標的結合の第２レベルは、結合の第１レベルよりも大きいことを意味する。多重特異性活性化可能抗体組成物は、従来の抗体療法に比べて、高められた生物学的利用能及びより良好な生体分布を示すことができる。
【０３０３】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、多重特異性活性化可能抗体がマスキングされていないか、又は他方では、そのような部位への結合から阻害されていない場合、非治療部位及び／又は非診断部位での多重特異性活性化可能抗体の結合に起因する、低められた毒性及び／又は有害な副作用を提供する。
【０３０４】
１つの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）；切断可能リンカー（ＣＬ）；及び第１標的又はエピトープに対して特異的に結合する少なくとも第１抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここでＮＢは、ＡＢ１に対して特異的に結合しないポリペプチドであり；ＣＬは、酵素のための基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；ＣＬは、切断されていない状態で、ＮＢがその標的へのＡＢ１の結合を妨害し、そして切断された状態で、ＮＢがＡＢ１のその標的への結合を妨害しないよう位置決定され；そしてＮＢは、酵素によるＣＬの切断を阻害しない。本明細書及びそれを通して使用される場合、用語、ポリペプチドとは、少なくとも２つのアミノ酸残基を含む任意のポリペプチド、例えばより大きなポリペプチド、完全長タンパク質及びそれらのフラグメントを意味し、そして用語、ポリペプチドとは、単鎖ポリペプチドに制限されず、そして複数ユニット、例えば多鎖ポリペプチドを包含することができる。ポリペプチドが短い長さのもの、例えば合計５０個以下のアミノ酸のものである場合、用語、ペプチド及びポリペプチドは、本明細書においては、交換可能的に使用され、そしてポリペプチドがより長いもの、例えば５０個又はそれ以上のアミノ酸のものである場合、用語、ポリペプチド及びタンパク質は、本明細書においては、交換可能的に使用される。
【０３０５】
１つの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）；切断可能リンカー（ＣＬ）；及び第１標的又はエピトープに対して特異的に結合する少なくとも第１抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで（i）ＮＢは、ＡＢ１に対して特異的に結合しないポリペプチドであり；（ii）ＣＬは、酵素のための基質（Ｓ）を含む、５０個までの長さのアミノ酸のポリペプチドであり；（iii）ＣＬは、切断されていない状態で、ＮＢがその標的へのＡＢ１の結合を妨害し、そして切断された状態で、ＮＢがＡＢ１のその標的への結合を妨害しないよう位置決定され；そして（iv）ＮＢは、酵素によるＣＬの切断を阻害しない。例えば、ＣＬは、次の長さのアミノ酸を有する：１５個までの長さのアミノ酸、２０個までの長さのアミノ酸、２５個までの長さのアミノ酸、３０個までの長さのアミノ酸、３５個までの長さのアミノ酸、４０個までの長さのアミノ酸、４５個までの長さのアミノ酸、５０個までの長さのアミノ酸、１０−５０の範囲の長さのアミノ酸、、２０−５０の範囲の長さのアミノ酸、、２５−５０の範囲の長さのアミノ酸、、３０−５０の範囲の長さのアミノ酸、、３５−５０の範囲の長さのアミノ酸、、４０−５０の範囲の長さのアミノ酸、、４５−５０の範囲の長さのアミノ酸、、１０−４０の範囲の長さのアミノ酸、１５−４０の範囲の長さのアミノ酸、２０−４０の範囲の長さのアミノ酸、２５−４０の範囲の長さのアミノ酸、３０−４０の範囲の長さのアミノ酸、３５−４０の範囲の長さのアミノ酸、１０−３０の範囲の長さのアミノ酸、１５−３０の範囲の長さのアミノ酸、２０−３０の範囲の長さのアミノ酸、２５−３０の範囲の長さのアミノ酸、１０−２０の範囲の長さのアミノ酸、又は１０−１５の範囲の長さのアミノ酸。
【０３０６】
１つの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）；切断可能リンカー（ＣＬ）；及び第１標的又はエピトープに対して特異的に結合する少なくとも第１抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで（i）ＮＢは、ＡＢ１に対して特異的に結合しないポリペプチドであり；（ii）ＣＬは、酵素のための基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；（iii）ＣＬは、切断されていない状態で、ＮＢがその標的へのＡＢ１の結合を妨害し、そして切断された状態で、ＮＢがＡＢ１のその標的への結合を妨害しないよう位置決定され；（iv）ＮＢは、酵素によるＣＬの切断を阻害せず；そして（ｖ）多重特異性活性化可能抗体の少なくとも一部が、切断されていない状態で、次の通りのＮ−末端からＣ−末端側に構造配置を有する：ＮＢ−ＣＬ−ＡＢ１又はＡＢ１−ＣＬ−ＮＢ。
【０３０７】
１つの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）；切断可能リンカー（ＣＬ）；及び第１標的又はエピトープに対して特異的に結合する少なくとも第１抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで（i）ＮＢは、ＡＢ１に対して特異的に結合しないポリペプチドであり；（ii）ＣＬは、酵素のための基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；（iii）ＣＬは、切断されていない状態で、ＮＢがその標的へのＡＢ１の結合を妨害し、そして切断された状態で、ＮＢがＡＢ１のその標的への結合を妨害しないよう位置決定され、そして、ここで切断されていない活性化可能抗体におけるＮＢが、切断されたＡＢ１のその標的を結合する能力に比べて、ＡＢ１のその標的を結合する能力を、少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、、低め；そして（iv）ＮＢは、酵素によるＣＬの切断を阻害しない。ＡＢのその標的を結合する能力の低下は、例えば、本明細書に記載されるようなアッセイ、又はインビトロ標的置換アッセイ、例えば国際公開第２００９／０２５８４６号及び第２０１０／０８１１７３号に記載されるアッセイを用いて、決定される。
【０３０８】
１つの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）のための結合パートナー（ＢＰ）；切断可能リンカー（ＣＬ）；及び第１標的及び/又はエピトープに対して特異的に結合する少なくとも第１抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここでＢＰは、ＮＢに暴露される場合、そのＮＢに結合するポリペプチドであり；ＮＢは、ＡＢ１に対して特異的に結合しないポリペプチドであり；ＣＬは、酵素のための基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；ＣＬは、ＮＢの存在下で、切断されていない状態で、ＮＢがその標的へのＡＢ１の結合を妨害し、そして切断された状態で、ＮＢがＡＢ１のその標的への結合を妨害せず、そしてＢＰがＡＢの標的への結合を妨害しないよう位置決定され；そしてＮＢ及びＢＯは、酵素によるＣＬの切断を阻害しない。この実施形態のいくつかの例によれば、活性化可能抗体のＢＰは、任意には、ＮＢに結合される。１つの実施形態によれば、ＮＢは、インビボで、活性化可能抗体のＢＰによりリクルートされる。
【０３０９】
それらの多重特異性活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、多重特異性活性化可能抗体は、組成物として製剤化される。それらの実施形態のいくつかによれば、組成物はまた、ＮＢも含み、ここでＮＢは、ＢＰ、ＣＬ及びＡＢを含む多重特異性活性化可能抗体と同時製剤化される。この実施形態のいくつかの例によれば、ＢＰは、アルブミン結合ペプチド、フィブリノーゲン結合ペプチド、フィブロネクチン結合ペプチド、ヘモグロビン結合ペプチド、トランスフェリン結合ペプチド、免疫グロブリンドメイン結合ペプチド及び他の血清タンパク質結合ペプチドから成る群から選択される。
【０３１０】
それらの多重特異性活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、ＮＢは可溶性球状タンパク質である。それらの多重特異性活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、ＮＢは血流において循環するタンパク質である。それらの多重特異性活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、ＮＢは、アルブミン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ヘモグロビン、トランスフェリン、免疫グロブリンドメイン及び他の血清タンパク質から成る群から選択される。
【０３１１】
それらの多重特異性活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、ＣＬは、プロテマーゼのための基質を含むポリペプチドである。それらの多重特異性活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、プロテアーゼは、組織において、その標的と共局在され、そしてプロテアーゼは、多重特異性活性化可能抗体がプロテアーゼに暴露される場合、多重特異性活性化可能抗体におけるＣＬを切断する。それらの多重特異性活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、ＣＬは、５０個までの長さのアミノ酸のポリペプチドである。それらの多重特異性活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、ＣＬは、１５個までの長さのアミノ酸、例えば３個の長さのアミノ酸、４個の長さのアミノ酸、５個の長さのアミノ酸、６個の長さのアミノ酸、７個の長さのアミノ酸、８個の長さのアミノ酸、９個の長さのアミノ酸、１０個の長さのアミノ酸、１１個の長さのアミノ酸、１２個の長さのアミノ酸、１３個の長さのアミノ酸、１４個の長さのアミノ酸、又は１５個の長さのアミノ酸を有する基質（Ｓ）を含むポリペプチドである。
【０３１２】
それらの多重特異性活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、多重特異性活性化可能抗体の少なくとも一部は、切断されていない状態で次の通りのＮ−末端からＣ−末端側に構造配置を有する：ＮＢ−ＣＬ−ＡＢ、ＡＢ−ＣＬ−ＮＢ、ＢＰ−ＣＬ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＬ−ＢＰ。多重特異性活性化可能抗体がＢＰを含み、そして多重特異性活性化可能抗体がその対応するＮＢの存在下にある実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の少なくとも一部は、切断されていない状態で次の通りのＮ−末端からＣ−末端側に構造配置を有する：ＮＢ：ＢＰ−ＣＭ−ＡＢ又は ＡＢ−ＣＭ−ＢＰ：ＮＢ、ここで「：」は、ＮＢとＢＰとの間の相互作用、例えば結合を表す。
【０３１３】
それらの多重特異性活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、多重特異性活性化可能抗体は、その標的を特異的に結合し、そしてモノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）2フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃａｂ、ｄＡｂ、単一のドメインＨ鎖抗体、及び単一のドメインＬ鎖抗体である、抗体又はその抗原結合抗体を包含する。いくつかの実施形態によれば、その標的を結合する、そのような抗体又はその免疫学的活性フラグメントは、マウス、キメラ、ヒト化、又は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【０３１４】
それらの多重特異性活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、多重特異性活性化可能抗体はまた、ＡＢに接合される剤も含む。いくつかの実施形態によれば、剤は治療剤である。いくつかの実施形態によれば、剤は抗腫瘍剤である。いくつかの実施形態によれば、剤は毒素又はそのフラグメントである。いくつかの実施形態によれば、剤は、リンカーを介してＡＢに接合される。いくつかの実施形態によれば、リンカーは切断可能リンカーである。いくつかの実施形態によれば、剤は、表４に列挙される群から選択された剤である。いくつかの実施形態によれば、剤はドラスタチンである。いくつかの実施形態によれば、剤はアウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態によれば、剤は、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態によれば、剤は、メイタンシノイド又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、剤はＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態によれば、剤はデュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、剤はカリケアマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば剤はピロロベンゾジアゼピンである。
【０３１５】
それらの多重特異性活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、多重特異性活性化可能抗体はまた、検出可能部分も含む。いくつかの実施形態によれば、検出可能部分は、診断剤である。
【０３１６】
それらの多重特異性活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、多重特異性活性化可能抗体はまた、スペーサーも含む。それらの多重特異性活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、多重特異性活性化可能抗体はまた、シグナルペプチドも含む。いくつかの実施形態によれば、シグナルペプチドは、スペーサーを介して多重特異性活性化可能抗体に接合される。それらの多重特異性活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、スペーサーは、多重特異性活性化可能抗体のＭＭに直接、結合される。
【０３１７】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、その対応する多重特異性抗体の半減期よりも長く；例えば、多重特異性抗体のｐＫは、その対応する多重特異性抗体のｐＫよりも長い。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、その対応する多重特異性抗体の半減期に類似する。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１５日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２日である。  いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１１日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも９日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも７日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも５日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２日である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２４時間である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２０時間である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１８時間である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１６時間である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１４時間である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２時間である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１０時間である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８時間である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも７時間である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６時間である。いくつかの実施形態によれば、多重���異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４時間である。いくつかの実施形態によれば、多重特異性活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３時間である。
【０３１８】
本開示はまた、それらの多重特異性活性化可能抗体の何れかをコードする単離された核酸分子、及びそれらの単離された核酸配列を含むベクターも提供する。本開示は、多重特異性活性化可能抗体の発現を導く条件下で、そのような核酸配列を含む細胞を培養することによる、多重特異性活性化可能抗体の生成方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、前記細胞は、そのようなベクターを含む。
【０３１９】
標的に対するＮＢ−含有多重特異性活性化可能抗体の解離例数（Ｋｄ）は、ＡＢがＮＢ又はＮＢ：ＢＰと関連しない場合、標的に対するＡＢのＫｄよりも高い。標的に対するＮＢ−含有多重特異性活性化可能抗体の解離定数は、標的に対する親ＡＢのＫｄよりも高い。例えば、標的に対するＮＢ−含有多重特異性活性化可能抗体のＫｄは、ＡＢがＮＢ又はＮＢ：ＢＰに関連しない場合、ＡＢのＫｄ、又は標的に対する親ＡＢのＫｄよりも、少なくとも１０、 ２０、２５、４０、 ５０、１００、２５０、５００、１，０００、 ２，５００、 ５，０００、 １０，０００、 ５０，０００、 １００，０００、 ５００，０００、 １，０００，０００、 ５，０００，０００、 １０，０００，０００、 ５０，０００，０００ 又はそれ以上, 又は ５−１０、 １０−１００、 １０−１，０００、 １０−１０，０００、 １０−１００，０００、 １０−１，０００，０００、１０−１０，０００，０００、 １００−１，０００、 １００−１０，０００、 １００−１００，０００、 １００−１，０００，０００、 １００−１０，０００，０００、 １，０００−１０，０００、 １，０００−１００，０００、 １，０００−１，０００，０００、１０００−１０，０００，０００、 １０，０００−１００，０００、 １０，０００−１，０００，０００、 １０，０００−１０，０００，０００、 １００，０００−１，０００，０００又は１００，０００−１０，０００，０００倍、高い。逆に、標的に対するＮＢ−含有多重特異性活性化可能抗体の結合親和性は、ＡＢがＮＢ又はＮＢ：ＢＰと関連しない場合、ＡＢの結合親和性よりも低く、又は標的に対する親ＡＢの結合親和性よりも低い。例えば、標的に対するＮＢ−含有多重特異性活性化可能抗体の結合親和性は、ＡＢがＮＢ又はＮＢ：ＢＰに関連しない場合、ＡＢの結合親和性、又は標的に対する親ＡＢの結合親和性よりも、少なくとも１０、 ２０、２５、４０、 ５０、１００、２５０、５００、１，０００、 ２，５００、 ５，０００、 １０，０００、 ５０，０００、 １００，０００、 ５００，０００、 １，０００，０００、 ５，０００，０００、 １０，０００，０００、 ５０，０００，０００ 又はそれ以上, 又は ５−１０、 １０−１００、 １０−１，０００、 １０−１０，０００、 １０−１００，０００、 １０−１，０００，０００、１０−１０，０００，０００、 １００−１，０００、 １００−１０，０００、 １００−１００，０００、 １００−１，０００，０００、 １００−１０，０００，０００、 １，０００−１０，０００、 １，０００−１００，０００、 １，０００−１，０００，０００、１０００−１０，０００，０００、 １０，０００−１００，０００、 １０，０００−１，０００，０００、 １０，０００−１０，０００，０００、 １００，０００−１，０００，０００又は１００，０００−１０，０００，０００倍、低い。
【０３２０】
ＮＢ−含有多重特異性活性化可能抗体が、その標的の存在下にある場合、ＡＢのその標的に対する特異的結合は、ＡＢがＮＢ又はＮＢ：ＢＰに関連しない場合、ＡＢの特異的結合に比べて、低められるか、又は阻害される。ＮＢ−含有多重特異性活性化可能抗体が、その標的の存在下にある場合、ＡＢのその標的に対する特異的結合は、親ＡＢのその標的への特異的結合に比べて、低められるか、又は阻害される。ＮＢ又はＮＢ：ＢＰに関連しないＡＢの結合、又は親ＡＢのその標的への結合に比較される場合、その標的を結合するＮＢ−含有多重特異性活性化可能抗体の能力は、例えばインビトロ及び／又はインビボで測定される場合、その標的を結合するＮＢ−含有多重特異性活性化可能抗体の能力は、インビボ又はインビトロアッセイで測定される場合、少なくとも２、４、 ６、 ８、 １２、 ２８、 ２４、 ３０、 ３６、 ４８、 ６０、 ７２、 ８４又は ９６ 時間、 又は ５、 １０、 １５、 ３０、 ４５、 ６０、 ９０、 １２０、 １５０又は１８０日、 又は１、 ２、 ３、 ４、 ５、 ６、 ７、 ８、 ９、 １０、 １１、又は１２か月又はそれ以上で、少なくとも５０%、６０%、 ７０%、 ８０%、 ９０%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９% 及びさらに １００%、低められ得る。
【０３２１】
ＮＢ−含有多重特異性活性化可能抗体が、その標的の存在下にあるが、しかし修飾剤（例えば、プロテアーゼ又は他の酵素）の存在下ではない場合、ＡＢのその標的に対する特異的結合は、ＡＢがＮＢ又はＮＢ：ＢＰに関連しない場合、ＡＢの特異的結合に比べて、低められるか、又は阻害される。ＮＢ−含有多重特異性活性化可能抗体が、その標的の存在下にあるが、しかし修飾剤（例えば、プロテアーゼ、他の酵素、還元剤又は光）の存在下ではない場合、ＡＢのその標的に対する特異的結合は、親ＡＢのその標的への特異的結合に比べて、低められるか、又は阻害される。ＮＢ又はＮＢ：ＢＰに関連しないＡＢの結合、又は親ＡＢのその標的への結合に比較される場合、その標的を結合するＮＢ−含有多重特異性活性化可能抗体の能力は、例えばインビトロ及び／又はインビボで測定される場合、その標的を結合するＮＢ−含有多重特異性活性化可能抗体の能力は、インビボ又はインビトロアッセイで測定される場合、少なくとも２、４、 ６、 ８、 １２、 ２８、 ２４、 ３０、 ３６、 ４８、 ６０、 ７２、 ８４又は ９６ 時間、 又は ５、 １０、 １５、 ３０、 ４５、 ６０、 ９０、 １２０、 １５０又は１８０日、 又は１、 ２、 ３、 ４、 ５、 ６、 ７、 ８、 ９、 １０、 １１、又は１２か月又はそれ以上で、少なくとも５０%、６０%、 ７０%、 ８０%、 ９０%、 ９２%、 ９３%、 ９４%、 ９５%、 ９６%、 ９７%、 ９８%、 ９９% 及びさらに １００%、低められ得る。
【０３２２】
それらの多重特異性活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、多重特異性活性化可能抗体はまた、多重特異性活性化可能抗体接合体を生成するために、ＡＢに接合される剤も含む。多重特異性活性化可能抗体接合体のいくつかの実施形態によれば、剤は治療剤である。いくつかの実施形態によれば、剤は診断剤である。いくつかの実施形態によれば、剤は検出可能マーカーである。多重特異性活性化可能抗体接合体のいくつかの実施形態によれば、剤は抗腫瘍剤である。多重特異性活性化可能抗体接合体のいくつかの実施形態によれば、剤は毒素又はそのフラグメントである。多重特異性活性化可能抗体接合体のいくつかの実施形態によれば、剤は、リンカーを介してＡＢに接合される。多重特異性活性化可能抗体接合体のいくつかの実施形態によれば、リンカーは切断可能リンカーである。いくつかの実施形態によれば、剤は、表４に列挙される群から選択された剤である。いくつかの実施形態によれば、剤はドラスタチンである。いくつかの実施形態によれば、剤はアウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態によれば、剤は、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態によれば、剤は、メイタンシノイド又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、剤はＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態によれば、剤はデュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、剤はカリケアマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば剤はピロロベンゾジアゼピンである。
【０３２３】
それらの多重特異性活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、多重特異性活性化可能抗体は、二重−標的結合多重特異性活性化可能抗体である。そのような二重標的結合多重特異性活性化可能抗体は、同じが又は異なった標的結合できる２個のＡｂを含む。特定の実施形態によれば、二重−標的化多重特異性活性化可能抗体は、二重特特異性抗体又はそのフラグメントを含む。
【０３２４】
二重標的結合多重特異性活性化可能抗体は、多重特異性活性化可能抗体のＡＢに結合できる１つ又は両標的と共に標的組織において共局在される切断剤により切断できるＣＬを有するよう企画される。同じが又は異なった標的に対する複数のＡＢを有する二重標的結合多重特異性活性化可能抗体は、複数のＣＬを有するよう企画され得、ここで第１ＣＬは第１標的組織において切断剤により切断でき、そして第２ＣＬは、第２標的組織において切断剤により切断でき、そして１又は２以上の標的が多重特異性活性化可能抗体のＡＢに結合する。１つの実施形態によれば、第１及び第２標的組織は、例えば、生物における異なった部位で、空間的に分離されている。１つの実施形態によれば、第１及び第２標的組織は、一時的に分離された同じ組織であり、例えば２種の異なった時点で同じ組織であり、例えば第１時点は、組織が初期段階の腫瘍である場合であり、そして第２時点は、組織が後期段階の腫瘍である場合である。
【０３２５】
本開示はまた、本明細書に記載される多重特異性活性化可能抗体をコードする核酸分子を提供する。本開示はまた、それらの核酸を含むベクターも提供する。本明細書に記載される多重特異性活性化可能抗体は、多重特異性活性化可能抗体の発現を導く条件下で、それらの核酸分子又はベクターを含む細胞を培養することにより生成され得る。
【０３２６】
本開示はまた、多重特異性活性化可能抗体の製造方法も提供する。１つの実施形態によれば、前記方法は、（ａ）多重特異性活性化可能抗体の発現を導く条件下で、多重特異性活性化可能抗体をコードする核酸コンストラクトを含む細胞を培養し、ここで多重特異性活性化可能抗体は、（ｉ）非結合立体部分（ＮＢ）；（ii）切断可能リンカー（ＣＬ）；及び（iii）標的を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（１）ＮＢはＡＢに対して特異的に結合せず；（２）ＣＬは、酵素のための基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；（３）ＣＬは、切断されていない状態で、ＮＢがＡＢの標的への結合を妨害し、そして切断された状態で、ＮＢがＡＢの標的への結合を妨害しないよう、位置決定され；そして（４）ＮＢが酵素によるＣＬの切断を阻害しない；そして（ｂ）多重特異性活性化可能抗体を回収する段階を包含する。
【０３２７】
別の実施形態によれば、前記方法は、（ａ）多重特異性活性化可能抗体の発現を導く条件下で、多重特異性活性化可能抗体をコードする核酸コンストラクトを含む細胞を培養し、ここで多重特異性活性化可能抗体は、（ｉ）非結合立体部分（ＮＢ）のための結合パートナー（ＢP）；（ii）切断可能リンカー（ＣＬ）；及び（iii）標的を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（１）ＮＢはＡＢに対して特異的に結合せず；（２）ＣＬは、酵素のための基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；（３）ＣＬは、切断されていない状態で、及びＮＢの存在下で、ＮＢがＡＢの標的への結合を妨害し、そして切断された状態で、ＮＢがＡＢの標的への結合を妨害せず、そしてＢＰがＡＢの標的への結合を妨害しないよう、位置決定され；そして（４）ＮＢが酵素によるＣＬの切断を阻害しない；そして（ｂ）多重特異性活性化可能抗体を回収する段階を包含する。この実施形態のいくつかの例によれば、多重特異性活性化可能抗体のＢＰは、ＮＢに結合される。
【０３２８】
多重特異性抗体及び多重特異性活性化可能抗体の使用
本開示に従っての治療実態の投与が、改善された伝達、送達、耐性及び同様のものを提供するために製剤中に組込まれる、適切な担体、賦形剤及び他の剤と共に投与されるであろうことは理解されるであろう。多数の適切な製剤は、全ての薬剤師に知られている処方に見出される得る：Blaug, Seymour による、Remington’s Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), 特に 、Chapter 87。それらの製剤は例えば、粉末、ペースト、軟膏、ジェリー、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオン又はアニオン性）含有小胞（例えば、リポフェクチン（登録商標））、ＤＮＡ接合体、無水吸収性ペースト、水中油及び油中水エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル及び半固体混合物含有カーボワックスを包含する。前述の混合物の何れでも、本開示に従っての治療及び療法において適切であるが、但し、製剤中の活性成分は、製剤により不活性化されず、そして製剤は投与経路と生理学的に適合し、且つ許容できるべきである。また、薬剤師に良く知られている、製剤、賦形剤及び担体に関連する追加の情報については、またBaldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.” Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.” Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.” J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)及びこそこにおける引用文献を参照のこと。
【０３２９】
１つの実施形態によれば、本開示の多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、治療剤として使用され得る。そのような剤は一般的に、対象における疾患又は病状を診断し、予後し、モニターし、治療し、軽減し、そして／又は予防するために使用されるであろう。治療計画は、対象、例えばヒト患者、又は障害を罹患している（又は進行の危険性下での）他の哺乳類を、標準方法を用いて同定することにより実施される。多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体製剤、例えば、いくつかの実施形態によれば、その複数の標的抗原のための高い特異性及び高い親和性を有する製剤が、対象に投与され、そして一般的に、標的とのその結合に起因する効果を有するであろう。多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体の投与は、１又は２以上の標的のシグナル機能を抑止するか、又は阻止するか、又は妨害することができる。多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体の投与は、天然において結合する内因性リガンドとの１又は２以上の標的の結合を抑止するか、又は阻止するか、妨害することができる。
【０３３０】
一般的に、疾患又は障害の緩和又は治療は、疾患又は障害に関連する１又は２以上の症状又は医学的問題の軽減を包含する。例えば、癌の場合、治療的有効量の薬剤が、次の現象の１つ又は組合せを達成することができる：癌細胞の数を低め；腫瘍サイズを低め；末梢器官中への癌細胞浸潤を阻害し（すなわち、ある程度まで低め、そして／又は停止するために）；腫瘍増殖を、ある程度まで阻害し；そして／又は癌に関連する１又は複数の症状を、ある程度まで軽減する。いくつかの実施形態によれば、本開示の組成物は対象、例えばヒト又は他の哺乳類、例えば非ヒト霊長類、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、家畜、作業動物又は動物園の動物における疾患又は障害の開始又は再発を妨げるために使用され得る。用語、対象及び患者は、本明細書においては、交換可能的に使用される。
【０３３１】
治療的有効量の本開示の多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体とは、一般的に、治療目的を達成するのに必要な量に関する。上述のように、これは、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体と、特定の場合、標的の機能を妨害するその標的抗原との間の結合相互作用であり得る。投与される必要がある量は、さらに、その特異性抗原に対する多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体の結合親和性に依存し、そしてまた、投与される多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体が、それが投与される他の対象の自由体積から枯渇される速度に依存するであろう。本開示の多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体の治療的有効用量の通常の範囲は、非制限的例によれば、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。通常の投与頻度は例えば、週２度〜週１度であり得る。
【０３３２】
治療の有効性は、特定の障害を診断するか又は治療するための何れか既知の方法に対応して決定される。所望の特異性を有する多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体のスクリーニング方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び当業界において知られている他の免疫学的媒介技法を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０３３３】
別の実施形態によれば、複数の標的を指図された多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、標的の局在化及び／又は定量化に関する当核分野で公知の方法に使用される（例えば、適切な生理学的サンプル内の１又は２以上の標的のレベルの測定への使用のために、診断方法への使用のために、タンパク質のイメージングへの使用のために）。所定の実施形態によれば、複数の標的を指図された多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体、又は抗体由来の抗原結合ドメインを含む、その誘導体、フラグメント、類似体又は相同体は、薬理学的活性化合物（この後、「治療剤」と称する）として使用される。
【０３３４】
別の実施形態によれば、複数の標的を指図された多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、標準技法、例えば免疫親和性、クロマトグラフィー又は免疫沈降により、１又は２以上の標的を単離するために使用される。複数の標的を指図された多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体（又はそのフラグメント）は、例えば所定の治療計画の効率を決定するために、臨床学的試験手順の一部として組織におけるタンパク質レベルをモニターするために、診断的に使用される。検出は、検出可能物質への抗体のカップリング（すなわち、物理的結合）により促進され得る。検出可能物質の例は、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、発光物質、及び放射性物質を包含する。適切な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを包含し；適切な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン/ビオチン及びアビジン/ビオチンを包含し；適切な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジンアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンを包含し；発光物質の例は、ルミノールを包含し；生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを包含し；そして適切な放射性物質の例は、125Ｉ、131Ｉ，35Ｓは又は3Ｈを包含する。
【０３３５】
さらなる別の実施形態によれば、複数の標的を指図された多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、サンプルにおける１又は２以上の標的（又はそのフラグメント）の存在を検出するための剤として使用され得る。いくつかの実施形態によれば、前記抗体は、検出可能標識を含む。抗体はポリクローナル又はいくつかの実施形態によれば、モノクローナルである。損なわれていない抗体又はそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、又はＦ（ａｂ）2）が使用される。プローブ又は抗体に関しての用語「標識された」とは、プローブ又は抗体に検出可能物質をカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことによるプローブ又は抗体の直接的標識化、及び直接的に標識される別の試薬との反応性によるプローブ又は抗体の間接的標識化を包含することが意図される。関接的標識化の例は、蛍光標識された二次抗体を用いての一次抗体の検出、及び蛍光標識されたストレプタビジンにより検出され得るよう、ビオチンによる抗体の末端標識化を包含する。用語「生物学的サンプル」とは、対象から単離された組織、細胞及び生物学的流体、並びに対象内に存在する組織、細胞及び流体を包含することが意図される。従って、血液、及び血液の画分又は成分、例えば血清、血漿又はリンパは、用語「生物学的サンプル」の使用法内に含まれる。すなわち、本開示の検出方法は、インビトロで及びインビボで生物学的サンプルにおけるタンパク質を検出するために使用され得る。例えば、分析タンパク質の検出のためのインビトロ技法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスターンプロット、免疫沈降、及び免疫蛍光を包含する。イムノアッセイを行うための手順は、例えば“ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology”, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; “Immunoassay”, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996;及び“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載される。さらに、分析タンパク質の検出のためのインビボ技法は、標識された抗−分析タンパク質抗体を、対象中に導入することを包含する。例えば、抗体は、対象におけるその存在及び位置が標準のイメージング技法により検出され得る放射性マーカーにより標識され得る。
【０３３６】
本開示の多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体はまた、種々の診断及び予防製剤において有用である。１つの実施形態によれば、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体が、１又は２以上の前述の障害を発症する危険性がある患者に投与される。１又は２以上の障害に対する患者又は器官の素因は、遺伝子型、血清学的または生化学マーカーを用いて決定され得る。
【０３３７】
本開示の別の実施形態によれば、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、１又は２以上の前述の障害に関連する臨床学的徴候を有するものとして診断されたヒト個人に投与される。診断に基づいて、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、臨床学的徴候の効果を軽減するか、又は逆転するために結合される。
【０３３８】
多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体はまた、患者サンプルにおける１又は２以上の標的の検出に有用であり、そして従って、診断剤としても有用である。例えば、本開示の多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、患者サンプルにおける１又は２以上の標的レベルを検出するために、インビトロアッセイ、例えばＥＬＩＳＡに使用される。
【０３３９】
１つの実施形態によれば、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、固体支持体（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）上に固定される。固定された抗体及び／又は活性化可能抗体は、試験サンプルに存在することができる任意の標的のための捕捉抗体として作用する。固定された多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体と患者サンプルとの接触の前、固体支持体は、分析物の非特異的吸着を妨げるために、ブロッキング剤、例えば乳タンパク質により洗浄され、そして処理される。
【０３４０】
続いて、ウェルが、抗原を含む疑いのある試験サンプルにより、又は標準量の抗原を含む溶液により処理される。そのようなサンプルは、例えば病理診断であると思われる循環抗原のレベルを有する疑いのある対象からの血清サンプルである。試験サンプル又は標準を洗い流した後、固体支持体が、検出的に標識される二次抗体により処理される。標識された二次抗体は、検出抗体として作用する。検出可能標識のレベルが測定され、そして試験サンプル中の標的抗原の濃度が、標準サンプルから開発される標準曲線との比較により決定される。
【０３４１】
インビトロ診断アッセイにおいて多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体を用いて得られる結果に基づいて、標的抗原の発現レベルに基づいて患者における疾患を分類することが可能であることが理解されるであろう。所定の疾患に関して、血液サンプルが、疾患の進行での種々の段階で、及び／又は、疾患の治療処理における種々の点で、診断される対象から採取される。進行又は治療の各段階のために統計学的に有意な結果を提供するサンプル集団を用いて、各段階で特徴的であると思われる抗原の濃度範囲が指定される。
【０３４２】
多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体はまた、診断及び／又はイメージング方法に使用され得る。いくつかの実施形態によれば、そのような方法は、インビトロ方法である。いくつかの実施形態によれば、そのような方法は、インビボ方法である。いくつかの実施形態によれば、そのような方法は、現場方法である。いくつかの実施形態によれば、そのような方法は、エクスビボ方法である。例えば、酵素的に切断可能なＣＭを有する多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、ＣＭを切断できる酵素の存在又は不在を検出するために使用され得る。そのような多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体は、所定の宿主生物の所定の細胞又は組織における多重特異性活性化可能抗体（すなわち、多重特異性活性化可能抗体の切断に起因する抗体）の測定される蓄積を通して、酵素活性（又は、いくつかの実施形態によれば、高められた還元電位の環境、例えばジスルフィド結合の還元を提供できる環境）のインビボ検出（例えば、定性的又は定量的）を包含する診断に使用される。活性化された多重特異性抗体のそのような蓄積は、組織が酵素活性（又はＣＭの性質に依存して、高められた還元電位）を発現するのみならず、また組織が、活性化された抗体が結合する少なくとも１つの標的を発現することを示唆する。
【０３４３】
例えば、ＣＭは、腫瘍の部位で、ウィルス又は細菌感染の部位で、生物学的に限られた部位（例えば、膿瘍、器官等において）で、及び同様の部位で見出されるプロテアーゼのためのプロテアーゼ基質であるよう選択され得る。ＡＢの少なくとも１つは、標的抗原を結合するものである。当業者に知られている方法を用いて、検出可能標識（例えば、蛍光標識又は放射性標識又は放射性トレーサー）が、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体のＡＢ又は他の領域に接合され得る。適切な検出可能標識は、上記スクリーニング方法に論じられており、そして追加の特定の例が下記に提供される。その活性が目的の疾患組織において高められているプロテアーゼと共に、疾患状態のタンパク質又はペプチドに対して特異的な少なくとも１つのＡＢを用いて、活性化可能抗体は、組織への疾患組織の高められた相対的結合速度を示し、ここでＣＭ特異性抗体は、検出レベルで存在しないか、又は疾患組織においてよりも低いレベルで存在するか、又は不活性である（例えば、チモーゲン形で、又は阻害剤との複合体形で）。小タンパク質及びペプチドは腎濾過システムにより血液から急速にクリアランスされるので、ＣＭに対して特異的な酵素は検出レベルで存在しない（又は非疾患組織においては低レベルで存在するか、又は不活性コンホメーションで存在する）ので、疾患組織における活性化された多重特異性抗体の蓄積が、非疾患組織と比較して増強される。
【０３４４】
別の例によれば、多重特異性活性化可能抗体は、サンプルにおける切断剤の存在又は不在を検出するために使用され得る。例えば、多重特異性活性化可能抗体が酵素による切断に対して敏感なＣＭを含む場合、多重特異性活性化可能抗体は、サンプルにおける還元状態の存在を検出するために（定性的に又は定量的に）、使用され得る。それらの方法での分析を促進するために、多重特異性活性化可能抗体が、検出可能に標識され得、そして支持体（例えば、固体支持体、例えばスライド又はビーズ）に結合され得る。検出可能標識は、切断に続いて放出されない活性化可能抗体の一部を位置決定し、例えば検出可能標識は、急冷蛍光標識、又は切断が生じるまで、検出できない他の標識であり得る。アッセイは例えば、固定された、検出可能的に標識された多重特異性活性化可能抗体と、酵素及び／又は還元剤を含むことが疑われるサンプルとを、切断が生じるのに十分な時間、接触し、次に、過剰のサンプル及び汚染物を除去するために洗浄することにより実施され得る。次に、サンプルにおける切断（例えば、酵素又は還元剤）の存在又は不在が、サンプルとの接触の前、多重特異性活性化可能抗体の検出可能シグナルの変化、例えばサンプルにおける切断剤による多重特異性活性化可能抗体の切断のために検出可能シグナルの存在及び／又は上昇により評価される。
【０３４５】
そのような検出方法は、切断される場合、多重特異性活性化可能抗体の少なくとも１つのＡＢを結合できる標的の存在又は不在の検出を提供するよう適合され得る。従って、アッセイは、切断剤の存在又は不在、及び目的の標的の存在又は不在を評価するよう適合され得る。接断剤の存在又は不在は、上記のような多重特異性活性化可能抗体の検出可能レベルの存在及び／又は不在により検出され得、そして標的の存在又は不在は、標的−ＡＢ複合体の検出により、例えば検出可能に標識された抗−標的抗体の使用により検出され得る。
【０３４６】
多重特異性活性化可能抗体はまた、例えばプロテアーゼ切断による活性化可能抗体の活性化の検証のために現場イメージング、及び特定の標的への結合においても有用である。現場イメージングは、生物学的サンプル、例えば細胞培養物又は組織切片におけるタンパク質分解活性及び標的の局在化を可能にする技法である。この技法を用いて、検出可能標識（例えば、蛍光標識）の存在に基づいて、所定の標的への結合及びタンパク質分解活性の両者を認識することが可能である。
【０３４７】
それらの技法は、疾患部位（例えば、腫瘍組織）又は健康組織に由来する何れかの凍結された細胞又は組織において有用である。それらの技法はまた、新鮮な細胞又は組織サンプルにおいても有用である。
【０３４８】
それらの技法によれば、検出可能抗体は、検出可能標識により標識される。検出可能標識は、蛍光色素（例えば、蛍光団、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Alexa  Fluor（登録商標））、近赤外（ＮＩＲ）色素（例えば、Qdot（登録商標）ナノクリスタル）、コロイド金属、ハプテン、放射性マーカー、ビオチン、及び増幅試薬、例えばストレプトアビジン、又は酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼ）であり得る。
【０３４９】
標識された多重特異性活性化可能抗体と共にインキュベートされたサンプルにおける標識の検出は、サンプルが標的を含み、そして多重特異性活性化可能抗体のＣＭに対して特異的であるプロテアーゼを含むことを示唆する。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼの存在は、広範囲のプロテアーゼ阻害剤、例えば本明細書に記載されるそれらを用いて、及び／又はプロテアーゼに対して特異的である剤、例えばプロテアーゼマトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）に対して特異的であり、そしてＭＴ−ＳＰ１のタンパク質分解活性を阻害する、抗体、例えばＡ１１を用いて、確認され得る；例えば、２０１０年１１月に公開された国際公開第２０１０／１２９６０９号を参照のこと。広範囲のプロテアーゼ阻害剤、例えば本明細書に記載されるそれらを使用することの、及び／又はより選択的阻害剤を用いることによる同じアプローチが、プロテアーゼ、又は活性化可能抗体のＣＭに対して特異的な種類のプロテアーゼを同定するために使用され得る。いくつかの実施形態によれば、標的の存在は、標的に対して特異的である剤を用いて確かめられ得るか、又は検出可能標識が標識されていない標的と競争され得る。いくつかの実施形態によれば、標識されていない活性化可能抗体が、標識された二次抗体又はより複雑な検出システムによる検出と共に使用され得る。
【０３５０】
類似する技法がまた、インビボイメージングのためにも有用であり、ここで対象、例えば哺乳類、例えばヒトにおける蛍光シグナルの検出は、疾患部位が標的を含み、そして多重特異性活性化可能抗体のＣＭに対して特異的であるプロテアーゼを含むことを示唆する。
【０３５１】
それらの技法はまた、多重特異性活性化可能抗体におけるプロテアーゼ特異的ＣＭに基づいて、種々の細胞、組織及び生物におけるプロテアーゼ活性の検出、同定又は特徴づけのために、キットに、及び／又は試薬としても有用である。
【０３５２】
多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体の治療的投与及び製剤
本開示に従っての治療実態の投与が、改善された伝達、送達、耐性及び同様のものを提供するために製剤中に組込まれる、適切な担体、賦形剤及び他の剤と共に投与されるであろうことは理解されるであろう。多数の適切な製剤は、全ての薬剤師に知られている処方に見出される得る：Blaug, Seymour による、Remington’s Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), 特に 、Chapter 87。それらの製剤は例えば、粉末、ペースト、軟膏、ジェリー、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオン又はアニオン性）含有小胞（例えば、リポフェクチン（登録商標））、ＤＮＡ接合体、無水吸収性ペースト、水中油及び油中水エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル及び半固体混合物含有カーボワックスを包含する。前述の混合物の何れでも、本開示に従っての治療及び療法において適切であるが、但し、製剤中の活性成分は、製剤により不活性化されず、そして製剤は投与経路と生理学的に適合し、且つ許容できるべきである。また、薬剤師に良く知られている、製剤、賦形剤及び担体に関連する追加の情報については、またBaldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.” Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.” Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.” J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)及びこそこにおける引用文献を参照のこと。
【０３５３】
いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体組成物は、１又は２以上の追加の剤と共に、又は追加の剤の組合せと共に投与される。適切な追加の剤は、意図される用途のための現医薬品及び／又は外科的療法を包含する。例えば、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体組成物は、追加の化学療法剤又は抗−腫瘍剤と共に使用され得る。例えば、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体組成物及び追加の剤は、単一の治療組成物中に配合され、そして多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体組成物及び追加の剤は、同時に投与される。他方では、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体組成物及び追加の剤は、お互い別々であり、ｌ例えば個々は、別々の治療用組成物中に配合され、そして多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体組成物及び追加の剤は、同時に投与され、又は多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体組成物及び追加の剤は、治療計画の間、異なった時点で投与される。例えば、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体組成物は、追加の剤の投与の前、投与され、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体組成物は、追加の剤の投与に続いて投与されるか、又は多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体組成物及び追加の剤は、交互に投与される。本明細書に記載される場合、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体組成物及び追加の剤は、単回投与又は複数回投与で投与される。
【０３５４】
いくつかの実施形態によれば、追加の剤は、多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体組成物にカップリングされるか、又は他方では、結合される。
【０３５５】
適切な追加の剤は、意図される用途（すなわち、死滅、細胞増殖の防止、ホルモン療法又は遺伝子療法）のために選択される。そのような剤は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：医薬剤、毒素、毒素のフラグメント、アルキル化剤、酵素、抗生物質、代謝拮抗剤、抗増殖剤、ホルモン、神経伝達物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー、診断薬、放射線不透過性色素、放射性同位体、蛍光性化合物、磁気標識、ナノ粒子、マーカー化合物、レクチン、細胞膜透過性を変化させる化合物、植物化学化合物、小分子、リポソーム、植物化学化合物、小分子、リポソーム、ミセル、遺伝子治療ベクター、ウイルスベクター、及び同様のもの。最終的に、剤の組合せ、又は異なった種類の剤の組合せが使用され得る。
【０３５６】
本開示の多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、及び／又は接合された多重特異性活性化可能抗体組成物（また、本明細書においては、「活性化合物」と称する）、及びその誘導体、フラグメント、類似体及び相同体が、投与のために適切な医薬組成物中に組込まれ得る。そのような組成物の調製に包含される原理及び考慮、並びに成分の選択の手引きは、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995; Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994;及び Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New Yorkに提供されている。
【０３５７】
そのような組成物は典型的には、多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体、及び医薬的に許容できる担体を含む。多重特異性抗体及び/又は多重特異性活性化可能抗体が、ＡＢドメインのフラグメントを含む場合、標的タンパク質の結合ドメインに対して特異的に結合するＡＢの最小フラグメントが使用され得る。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列を結合するＡＢの能力を保持するペプチド分子が企画され得る。そのようなペプチドは、化学的に合成され得、そして／又は組換えＤＮＡ技法により生成され得る（例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照のこと）。
【０３５８】
本明細書において使用される場合、用語「医薬的に許容できる担体（pharmaceutically acceptable carrier）」とは、医薬投与と適合できる、何れか及びすべての溶媒、分散媒体、コーチング、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、及び同様のものを含むことが意図される。適切な担体は、参照により本明細書に組込まれる、この分解においては標準的参考テキストであるRemington’s Pharmaceutical Scienceの最も最新版に記載される。そのような担体又は希釈剤の適切な例は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンを包含するが、但しそれらだけには限定されない。リポソーム及び非水性媒体、例えば固定油がまた使用され得る。医薬活性物質のためのそのような媒体及び剤の使用は、当業界においては良く知られている。任意の従来の媒体又は剤が活性化合物と不適合である場合を除き、組成物へのその使用が企画される。
【０３５９】
インビボ投与のために使用される製剤は、無菌であるべきである、これは、無菌濾過膜を通しての濾過により容易に達成される。
【０３６０】
本開示の医薬組成物は、その意図される投与経路と適合できるよう製剤化される。投与経路の例は、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜、及び直腸投与を包含する。非経口、皮内又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は次の成分を含むことができる：滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒; 抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン; 酸化防止剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（EDTA）；緩衝液、例えば酢酸塩、硝酸塩又はリン酸塩、及び張性の調整のための薬、例えば塩化ナトリウム及びデキストロース。ｐＨは、酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムにより調節され得る。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器、又はガラス又はプラスチックから製造される複数回投与バイアルに封入され得る。
【０３６１】
注射使用に適した医薬組成物は、無菌注射溶液又は分散液の即時調製のための無菌水溶液（水溶性）又は分散液、及び無菌粉末を含む。静脈内投与のためには、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（登録商標）(BASF, Parsippany, N.J.)、又はリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を包含する。すべての場合、組成物は、容易な注射針通過まで無菌で且つ流体であるべきである。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定すべきであり、そして微生物、例えば細菌及び菌類の汚染作用に対して保存されるべきである。担体は、例えば水エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール及び同様のもの）及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えばコーチング、例えばレシチンの使用により、分散液の場合、必要とされる粒度の維持により、及び界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール及び同様のものにより達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含むことが適切であろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延する剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを、組成物に含むことによりもたらされ得る。
【０３６２】
無菌注射用溶液は、適切な溶媒中、必要とされる量での活性成分を、上記に列挙される成分の１つ又は組み合わせと共に組込むことにより、必要な場合、続いて、濾過減菌により調整され得る。一般的に、分散液は、基本的分散媒及び上記の列挙されるそれらからの必要とされる他の成分を含む無菌ビークル中に活性化合物を組込むことにより調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、活性成分及びその前もって減菌濾過された溶液からの任意の追加の所望する成分を生成する、真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０３６３】
経口組成物は一般的に不活性希釈剤又は食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入されるか、又は錠剤に圧縮され得る。経口治療投与のためには、活性化合物は、賦形剤と共に組込まれ、そして錠剤、トローチ又はカプセルの形で使用される。経口組成物はまた、マウスウォッシュとして使用のための液体担体を用いて調製され得、ここで液体担体中の化合物は、経口適用され、そしてスウィッシュされ、そして吐き出されるか、又は飲み込まれる。医薬的に適合できる結合剤、及び／又はアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、ピル、カプセル、トローチ及び同様のものは、次の成分の何れか、又は類似する性質の化合物を含むことができる：結合剤、例えば微晶性セルロース、トラガカントガム又はゼラチン；賦形剤、例えば澱粉又はラクトース；崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル又はコーンスターチ；滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム又はSterotes；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化珪素；甘味剤、例えばスクロース又はサッカリン；又は風味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香料。
【０３６４】
吸入による投与のためには、化合物は、適切な推進剤、例えばガス、例えば二酸化炭素を含む加圧された容器又はディスペンサー、又はネブライザーからエアロゾル噴霧の形で送達される。
【０３６５】
全身性投与はまた、経粘膜又は経皮手段によるものであっても良い。経粘膜又は経皮投与のためには、浸透されるべき障壁に適切な浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は一般的に当業界において知られており、そして例えば、経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体を包含する。経粘膜投与は、鼻腔内スプレー又は坐剤の使用を介して達成され得る。経皮投与のためには、活性化合物は、当業界において一般的に知られているように、軟膏、膏薬、ゲル又はクリーム中に配合される。
【０３６６】
化合物はまた、直腸送達のために、坐剤（例えば、従来の製剤基材、例えばココアバター及び他のグリセリドを含む）又は保持浣腸の形で調製され得る。
【０３６７】
１つの実施形態によれば、活性化合物は、身体からの急速な排除に対して化合物を保護するであろう担体、例えば持続／制御放出製剤、例えばインプラント及びマイクロカプセル化送達システムを用いて調製される。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸が使用され得る。そのような製剤の調製方法は、当業者に明らかであろう。
【０３６８】
例えば、活性成分は、例えばコアセルベーション技法により、又は界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えばそれぞれコロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマイクロエマルジョン中、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入され得る。
【０３６９】
徐放性製剤が調製され得る。徐放性製剤の適切な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを包含し、ここで前記マトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形で存在する。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタノートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−クリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能マイクロスフェア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を包含する。ポリマー、例えばエチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸は１００日間にわたって分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルはより短い期間、タンパク質を放出する。
【０３７０】
材料はまた、Alza Corporation 及びNova Pharmaceuticals, Incから市販されている。リポソーム懸濁液（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体により、感染された細胞に標的化されたリポソームを含む）がまた、医薬的に許容される担体として使用され得る。それらは、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に知られている方法に従って調製され得る。
【０３７１】
投与の容易性及び投与量の均一性のための単位剤形で経口又は非経口組成物を製剤化することが特に好都合である。単位剤形とは、本明細書において使用される場合、治療される対象のための単位用量として適した物理的に別個の単位を意味し；各単位は、必要とされる医薬担体と関連して所望する治療効果を生成するよう計算された所定量の活性化合物を含む。本開示の単位剤形の仕様は、活性化合物のユニーク特徴及び達成されるべき特定の治療効果、及び個体の治療のためのそのような活性化合物を配合する技術的に固有の制限により決定され、そしてそれらに直接的に依存する。
【０３７２】
医薬組成物は、投与のための説明書と共に、容器、パック又はディスペンサーに含まれる。
【０３７３】
製剤はまた、治療される特定の徴候のために必要な場合、お互い悪影響を与えない補完的活性を有する、複数の活性化合物を含むことができる。他方では、又はさらに、組成物は、その機能を増強する剤、例えば細胞毒性剤、サイトカイン、化学療法剤又は増殖阻害剤を含むことができる。そのような分子は、意図される目的のために効果的である量で、組み合わせて適切に存在する。
【０３７４】
１つの実施形態によれば、活性化合物は、併用治療で投与され、すなわち病理学的状態又は障害、例えば自己免疫疾患及び炎症疾患の治療のために有用である他の剤と組合される。用語「組合して（comination in）」とは、剤が実質的に同時に、すなわち同時に又は連続的に与えられることを意味する。連続的に与えられる場合、第２化合物の投与の開始で、２種の化合物のうち第１の化合物は、治療の部位で効果的濃度でまだ検出できる。
【０３７５】
例えば、併用療法は、１又は２以上の追加の治療剤、例えば下記により詳細に記載されるように、１又は２以上のサイトカイン及び成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、及び/又は細胞毒性又は細胞増殖抑制剤と共に同時製剤化され、そして／又は同時投与される本開示の１又は２以上の抗体を含むことができる。さらに、本明細書に記載される１又は２以上の治療剤が、本明細書に記載される複数の治療剤と組合して使用され得る。そのような併用治療法は、好都合には、低い用量の投与される治療剤を利用し、従って、種々の単独療法に関連する可能な毒性又は合併症を回避する。
【０３７６】
他の実施形態によれば、本開示の１又は２以上の抗体が、１又は２以上の抗炎症剤、免疫抑制剤又は代謝又は酵素阻害剤と同時製剤化され、そして／又は同時投与され得る。本明細書に記載される抗体と組合して使用され得る薬剤又は阻害剤の非制限的例は、１又は２以上の次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：非ステロイド性抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤ）、例えば、イブプロフェン、テニダップ、ナプロキセン、メロキシカム、ピロキシカム、ジクロフェナク、及びインドメタシン; スルファサラジン;コルチコステロイド、例えばプレドニゾロン; サイトカイン抑制性抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤ）; ヌクレオチド生合成の阻害剤、例えばプリン生合成の阻害剤、葉酸アンタゴニスト（例えば、メトトレキサート（Ｎ− ［４ − ［［（２，４−ジアミノ−６−ピリジル）メチル]メチルアミノ]ベンゾイル] −Ｌ−グルタミン酸）；及びピリミジン生合成の阻害剤、例えばジヒドロデヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤。
【０３７７】
追加の阻害剤の例は、１又は２以上の次のものを包含する：コルチコステロイド（経口、吸入及び局所注射）；免疫抑制、例えば、シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ５０６）；及びmTOR阻害剤、例えば、シロリムス（ラパマイシン - ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標））又はラパマイシン誘導体、例えば、可溶性ラパマイシン誘導体（例えば、エステルラパマイシン誘導体、例えば、ＣＣＩ−７７９）；炎症性サイトカインによるシグナル伝達を妨害する剤、例えばＴＮＦα又はＩＬ−１（Ｅ ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８又はＭＡＰキナーゼ阻害剤）; ＣＯＸ２インヒビター、例えば、セレコキシブ、ロフェコキシブ、およびその変異体；ホスホジエステラーゼ阻害剤、例えばＲ９７３４０１（ホスホジエステラーゼIV型阻害剤）; ホスホリパーゼ阻害剤、例えば細胞質ゾルホスホリパーゼ２の阻害剤(ｃＰＬＡ２)（例えば、トリフルオロメチルケトン類似体）; 血管内皮細胞増殖因子又は成長因子受容体の阻害剤、例えばVEGF阻害剤及び/又はVEGFR阻害剤;及び血管新生の阻害剤。本開示の抗体と組合して使用するための適切な治療剤は、免疫抑制、例えば、シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ５０６）；mTOR阻害剤、例えば、シロリムス（ラパマイシン）又はラパマイシン誘導体、例えば可溶性ラパマイシン誘導体（例えば、エステルラパマイシン誘導体、例えば、ＣＣＩ−７７９）; ＣＯＸ２阻害剤、例えば、セレコキシブ及びその変異体；及びホスホリパーゼ阻害剤、例えば細胞質ゾルホスホリパーゼ２の阻害剤（ｃＰＬＡ２）、例えば、トリフルオロメチルケトン類似体２である。
【０３７８】
本開示の抗体と組合わされ得る治療剤の追加の例は、１又は２以上の次のものを包含する：６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）；アザチオプリンスルファサラジン;メサラミン;オルサラジン; クロロキン/ヒドロキシクロロキン（PLAQUENIL（登録商標）；ペニシラミン;アウロチオマレイン（筋肉内及び経口）; アザチオプリン;コルヒチン; β−２アドレナリン受容体アゴニスト（サルブタモール、テルブタリン、サルメテロール）；キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）；クロモグリケート; ネドクロミル;ケトチフェン;イプラトロピウム及びオキシトロピウム; ミコフェノール酸モフェチル;アデノシンアゴニスト;抗血栓剤; 補体阻害剤；及びアドレナリン作動薬。
【０３７９】
本明細書において引用されるすべての出版物及び特許文献は、そのような各出版物又は文書が具体的且つ個別に参照により本明細書に組込まれることが示されているかのように、参照により本明細書に組込まれる。出版物及び特許文献の引用は、何れか関連先行技術であり、それが内容又は日付に関する承認を構成するものではありません。本発明は現在、書面による説明により記載されて来たが、当業者は、本発明が様々な実施形態され得、そして前述の記載及び下記実施例が例示の目的であって、特許請求の範囲を制限するものではないことを理解するであろう。
【実施例】
【０３８０】
表７に示される次の配列は、本明細書に提供される実施例を通して使用される配列を包含する。
【０３８１】
【表１０】
2020114872.tif 000011
【０３８２】
【表１１】
2020114872.tif 000012
【０３８３】
【表１２】
2020114872.tif 000013
【０３８４】
【表１３】
2020114872.tif 000014
【０３８５】
【表１４】
2020114872.tif 000015
【０３８６】
【表１５】
2020114872.tif 000016
【０３８７】
【表１６】
2020114872.tif 000017
【０３８８】
【表１７】
2020114872.tif 000018
【０３８９】
【表１８】
2020114872.tif 000019
【０３９０】
【表１９】
2020114872.tif 000020
【０３９１】
【表２０】
2020114872.tif 000021
【０３９２】
【表２１】
2020114872.tif 000022
【０３９３】
【表２２】
2020114872.tif 000023
【０３９４】
【表２３】
2020114872.tif 000024
【０３９５】
【表２４】
2020114872.tif 000025
【０３９６】
【表２５】
2020114872.tif 000026
【０３９７】
【表２６】
2020114872.tif 000027
【０３９８】
【表２７】
2020114872.tif 000028
【０３９９】
【表２８】
2020114872.tif 000029
【０４００】
【表２９】
2020114872.tif 000030
【０４０１】
【表３０】
2020114872.tif 000031
【０４０２】
【表３１】
2020114872.tif 000032
【０４０３】
【表３２】
2020114872.tif 000033
【０４０４】
【表３３】
2020114872.tif 000034
【０４０５】
【表３４】
2020114872.tif 000035
【０４０６】
【表３５】
2020114872.tif 000036
【０４０７】
【表３６】
2020114872.tif 000037
【０４０８】
【表３７】
2020114872.tif 000038
【０４０９】
【表３８】
2020114872.tif 000039
【０４１０】
【表３９】
2020114872.tif 000040
【０４１１】
【表４０】
2020114872.tif 000041
【０４１２】
【表４１】
2020114872.tif 000042
【０４１３】
【表４２】
2020114872.tif 000043
【０４１４】
【表４３】
2020114872.tif 000044
【０４１５】
【表４４】
2020114872.tif 000045
【０４１６】
【表４５】
2020114872.tif 000046
【０４１７】
【表４６】
2020114872.tif 000047
【０４１８】
【表４７】
2020114872.tif 000048
【０４１９】
【表４８】
2020114872.tif 000049
【０４２０】
【表４９】
2020114872.tif 000050
【０４２１】
【表５０】
2020114872.tif 000051
【０４２２】
【表５１】
2020114872.tif 000052
【０４２３】
【表５２】
2020114872.tif 000053
【０４２４】
【表５３】
2020114872.tif 000054
【０４２５】
【表５４】
2020114872.tif 000055
【０４２６】
【表５５】
2020114872.tif 000056
【０４２７】
【表５６】
2020114872.tif 000057
【０４２８】
【表５７】
2020114872.tif 000058
【０４２９】
【表５８】
2020114872.tif 000059
【０４３０】
【表５９】
2020114872.tif 000060
【０４３１】
【表６０】
2020114872.tif 000061
【０４３２】
【表６１】
2020114872.tif 000062
【０４３３】
【表６２】
2020114872.tif 000063
【０４３４】
【表６３】
2020114872.tif 000064
【０４３５】
実施例１：多重特異性抗体の調製
この実施例は、抗−Ｊａｇｇｅｄ−ＣＤ３、抗−Ｊａｇｇｅｄ−ＣＴＬＡ−４、抗−ＥＧＦＲ−ＣＤ３ 及び 抗−ＥＧＦＲ −ＣＴＬＡ−４多重特異性抗体の構成、発現及び精製を示す。
【０４３６】
ベクターを用いて、上記に示されるａｎｔｉ−Ｊａｇｇｅｄ （４Ｄ１１ｖ２）Ｈ鎖、 Ｖ３４２−１２０４−４Ｄ１１ｖ２Ｌ鎖、抗−ＥＧＦＲ Ｃ２２５ｖ５ Ｈ鎖及び ３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５Ｌ鎖配列を発現した。そのようなベクターは、２０１３年４月２６日に提出された同時系続出願ＰＣＴ／ＵＳ１０１３／０３８５４０号（「上皮成長因子受容体を結合する活性化可能抗体及びその使用方法」と題する）、及び２０１３年６月２１日に提出されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０４７１０９号（「抗−Ｊａｇｇｅｄ抗体、活性化可能抗−Ｊａｇｇｅｄ抗体及びその使用方法」と題する）上記載され、各出願の内容は、その全体を引用により本明細書に組込む。
【０４３７】
ベクターを、制限酵素ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩにより消化し、そしてベクターフラグメントを、ゲル電気泳動により単離した。挿入体を次の通りに調製した。ヒトＩｇＧ  ＣＨ２ＣＨ３フラグメントを、反応１において、Ｐｏｐ Ｈｙｇｒｏ ４Ｄ１１ｖ２から、プライマーＨＣＦｏｒＮｈｅ (表８、配列番号３) 及びプライマーＨＣＲｅｖＯＬ (表８、配列番号４)を用いて増幅し、ＣＴＬＡ−４ ｓｃＦｖを、反応２において、ＣＴＬＡ−４ ｓｃＦｖ ｃＤＮＡ (配列番号２２９)から、プライマーＣＴＲｅｖＮｏｔ (表８、配列番号１) 及びプライマーＣＴＦｏｒＯＬ (表８、配列番号２)を用いて増幅し、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖを、反応３において、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ ｃＤＮＡ (配列番号２３１)から、プライマーＯＫＲｅｖＮｏｔ (表８、配列番号５) 及びプライマーＣＴＦｏｒＯＬ (表８、配列番号２)を用いて増幅した。ヒトＩｇＧ、 ＣＨ２ＣＨ３/ＣＴＬＡ−４ ｓｃＦｖ融合体を、反応１の１０％、反応２の１０％を組合し、そしてプライマーＨＣＦｏｒＮｈｅ及びＣＴＲｅｖＮｏｔにより増幅することにより調製した。
【０４３８】
【表６４】
2020114872.tif 000065
【０４３９】
増幅に続いて、得られるＤＮＡを、制限酵素をＮｈｅＩ及びＮｏｔＩにより消化し、そしてＣＨ２ＣＨ３/ＣＴＬＡ−４ ｓｃＦｖ融合ＤＮＡを、ゲル電気泳動により単離した。ヒトＩｇＧ、 ＣＨ２ＣＨ３/ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ融合体を、反応１の１０％、反応３の１０％を組合し、そしてプライマーＨＣＦｏｒＮｈｅ及びＣＴＲｅｖＮｏｔにより増幅することにより調製した。増幅に続いて、得られるＤＮＡを、制限酵素をＮｈｅＩ及びＮｏｔＩにより消化し、そしてＣＨ２ＣＨ３/ＣＴＬＡ−４ ｓｃＦｖ融合ＤＮＡを、ゲル電気泳動により単離した。
【０４４０】
ＣＨ２ＣＨ３／ｓｃＦｖフラグメントを発現ベクター中に挿入するために、表９に示される次の組合せを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Invitrogen Inc., Carlsbad, CA）により一晩、連結した。連結に続いて、そのＤＮＡを用いて、Ｅ．コリ（Ｅ．Coli）株ＭＣ１０６を形質転換し、そしてアンピシリン耐性について選択した。ＤＮＡ配列決定により、正しい多重特異性抗体又は多重特異性活性化可能抗体をコードするＤＮＡ挿入体を含むクローンを同定し、そしてＤＮＡを、哺乳類細胞トランスフェクションのために調製した。
【０４４１】
【表６５】
2020114872.tif 000066
【０４４２】
実施例２：多重特異性抗体及び多重特異性活性化可能抗体の製造
完全ヒトＩｇＧを、一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞から発現した。表１０に示される、明確なＨ鎖及びＬ鎖発現ベクターによる同時トランスフェクションは、多重特異性活性化可能抗体の発現を可能にした。
【０４４３】
【表６６】
2020114872.tif 000067
【０４４４】
ＨＥＫ−２９３細胞に発現された多重特異性抗体及び多重特異性活性化可能抗体を、プロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。
【０４４５】
結合アッセイ：図１１に示されるように、ＥＬＩＳＡ−結合実験は、抗−Ｊａｇｇｅｄ−ＣＴＬＡ−４及び抗−Ｊａｇｇｅｄ−ＯＫＴ３多重特異性抗体及び多重特異性活性化可能抗体がヒトＪａｇｇｅｄ１を結合し、そして抗−ＥＧＦＲ−ＣＴＬＡ−４及び抗−ＥＧＦＲ−ＯＫＴ３多重特異性抗体及び多重特異性活性化可能抗体がヒトＥＧＦＲを特異的に結合したことを示した。
【０４４６】
ヒトＪａｇｇｅｄ １−Ｆｃ (R&D Systems; カタログ番号 1277-JG-050) 及びヒトＥＧＦＲ (R&D Systems, カタログ番号344-ER-050)を、９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートの異なったウェルに吸着した。精製された抗−Ｊａｇｇｅｄ−ＣＴＬＡ及び抗−Ｊａｇｇｅｄ−ＯＫＴ３、抗−ＥＧＦＲ−ＣＴＬＡ 又は 抗−ＥＧＦＲ−ＯＫＴ３抗体を、プレートに適用し、そして結合を可能にした。結合された抗体を、抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ接合体（Fab specific, Sigma, St Louis, MO; カタログ番号A0293-1ML）により可視化し、そして発色性基質ＴＭＢにより展開した。
【０４４７】
図１２Ａ及び１２Ｂに示されるように、ＥＬＩＳＡ−結合実験は、抗−Ｊａｇｇｅｄ−ＣＴＬＡ−４ 及び抗−ＥＧＦＲ−ＣＴＬＡ−４が、ヒト及びマウスＧＴＬＡ−４（抗−ヒトＣＴＬＡ−４抗体はマウス及びヒトＣＴＬＡ−４と交差反応する）を特異的に結合することを示し：ヒトＣＴＬＡ−４（R&D Systems; カタログ番号325-CT-200/CF）又はマウスＣＴＬＡ−４（R&D Systems, カタログ番号434-CT-200/CF）の何れかを、別個の９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに吸着した。精製された抗-Ｊａｇｇｅｄ ４Ｄ１１ｖ２−ＣＴＬＡ−４、 抗−Ｊａｇｇｅｄ 活性化可能抗体 Ｖ３４２−１２０４−４Ｄ１１ｖ２−ＣＴＬＡ−４、抗−ＥＧＦＲ Ｃ２２５ｖ５−ＣＴＬＡ−４ 又は 活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＣＴＬＡ−４を、プレートに適用し、そして結合を可能にした。結合された抗体を、抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ接合体（Fab specific, Sigma, St Louis, MO; カタログ番号A0293-1ML）により可視化し、そして発色性基質ＴＭＢにより展開した。結合の特異性が、ヒトＣＤ３εに対して特異的な抗体−ＯＫＴ３融合体の結合不能により実証された。
【０４４８】
実施例３：ＣＤ３εに結合するＯＫＴ３
図１３に示されるように、ＥＬＩＳＡ−結合実験は、抗−ＥＧＦＲ多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ 及び抗−Ｊａｇｇｅｄ多重特異性活性化可能抗体Ｖ３４２−１２０４−４Ｄ１１ｖ２−ＯＫＴ３がヒトＣＤ３εを特異的に結合することを示した。ヒトＣＤ３ε（NovoProtein, カタログ番号Ｃ５７８）を、９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに吸着した。精製された抗−ＥＧＦＲ多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＣＴＬＡ−４、抗−ＥＧＦＲ多重特異性活性化可能抗体 ３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３、抗−Ｊａｇｇｅｄ多重特異性活性化可能抗体Ｖ３４２−１２０４−４Ｄ１１ｖ２−ＣＴＬＡ−４、 又は抗−Ｊａｇｇｅｄ 多重特異性活性化可能抗体Ｖ３４２−１２０４−４Ｄ１１ｖ２−ＯＫＴ３を、プレートに適用し、そして結合を可能にした。結合された抗体を、抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ接合体（Fab specific, Sigma, St Louis, MO; カタログ番号A0293-1ML）により可視化し、そして発色性基質ＴＭＢにより展開した。
【０４４９】
実施例４：多重特異性活性化可能抗体のプロテアーゼ活性化
活性化
多重特異性抗体及び多重特異性活性化可能抗体を、ＰＢＳに希釈し、０．８ｍｇ／ｍｌの最終濃度にした。組換えヒトｕＰＡ (R&D Systems, カタログ番号1310-SE)を添加し、７００ｎＭの最終濃度にし、そして３７℃で約２０時間インキュベートした。ダイジェストアリコートを除き、そして下記のようにしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために調製し、そして結合ＥＬＩＳＡアッセイでの分析のために、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンにより、１００ｎＭに希釈した。
【０４５０】
ＰＡＧＥのために、サンプルを、１×ＬＤＳサンプル緩衝液において７０℃で１０分間、変性し、そしてＴＣＥＰを添加し、電気泳動の前、４０ｍＭの最終濃度にした。６μｇの抗体を、ＮｕＰＡＧＥ １０% Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ゲル(Invitrogen)上に負荷し、そしてタンパク質を、ＭＯＰＳ電気泳動緩衝液を用いてサイズ的に分離した。電気泳動に続いて、ゲルをクーマシーブルーにより染色し、そして結果は、図１４に示されている。ｕＰＡの存在下での、抗−ＥＧＦＲ多重特異性抗体 ３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５、抗−ＥＧＦＲ多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＣＴＬＡ−４、抗−Jagged活性化可能抗体Ｖ３４２−１２０４−４Ｄ１１ｖ２、 及び抗−Jagged多重特異性活性化可能抗体Ｖ３４２−１２０４−４Ｄ１１ｖ２−ＣＴＬＡ−４ Ｌ鎖の移動度の変化は、多重特異性活性化可能抗体のタンパク質分解活性化を実証する。Ｈ鎖融合体の移動度の変化の欠如は、プロテアーゼ切断に対する耐性を実証する。
【０４５１】
結合アッセイ
図１５におけるパネルＡは、抗−ＥＧＦＲ 多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＣＴＬＡ−４が、Ｃ２２５ｖ５ （３ ｎＭ）又はＣ２２５ｖ５−ＣＴＬＡ−４ （０．３３ ｎＭ）に比べて、低い親和性（Ｋｄ＝１２．８ｎＭ）でＥＧＦＲに結合した（ＥＬＩＳＡによれば）ことを示す。しかしながら、ｕＰＡにより活性化されると、抗−ＥＧＦＲ 多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＣＴＬＡ−４は、Ｃ２２５ｖ５ （３ ｎＭ）又はＣ２２５ｖ５−ＣＴＬＡ−４ （０．３３ ｎＭ）に比べて、類似する親和性（０．４５ｎＭ）で、ＥＧＦＲに結合した。重要なことには、ｕＰＡは、Ｈ鎖のカルボキシル末端に融合された抗−ＣＴＬＡ４  ｓｃＦｖを切断しなかった：図１５のパネルにＢに示されるように、ｕＰＡ処理は、ヒトＣＴＬＡ４への結合の効果を有さなかった。
【０４５２】
同様に、抗−Jagged 多重特異性活性化可能抗体Ｖ３４２−１２０４−４Ｄ１１ｖ２−ＣＴＬＡ−４は、４Ｄ１１ｖ２ （０．４４ ｎＭ） 又は ４Ｄ１１ｖ２−ＣＴＬＡ４ （０．７７ ｎＭ）に比べて、低い親和性（１５ｎＭ）でヒトＪａｇｇｅｄ１に結合した（図１５、ＥＬＩＳＡによれば）。活性化されると、抗−Ｊａｇｇｅｄ 多重特異性活性化可能抗体Ｖ３４２−１２０４−４Ｄ１１ｖ２−ＣＴＬＡ−４は、４Ｄ１１ｖ２ （０．５４ ｎＭ） 及び４Ｄ１１ｖ２−ＣＴＬＡ４ （０．９２ ｎＭ）に類似する親和性でヒトJagged１に結合した（図１５、パネルＣ）。ｕＰＡ処理は、ＣＴＬＡ４結合に対する効果を有さなかった（図１５、パネルＤ）。ＥＬＩＳＡ結合測定を、次の通りに実施した。ヒトＪａｇｇｅｄ １−Ｆｃ (R&D Systems; カタログ番号1277-JG-050)、ヒト ＥＧＦＲ (R&D Systems, カタログ番号344-ER-050) 又は ヒトCTLA4 (R&D Systems; カタログ番号325-CT-200/CF)を、９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェル上に吸着した。処理されていない、及びｕＰＡ処理された抗体、多重特異性抗体及び多重特異性活性化可能抗体の３倍希釈溶液（１００ｎＭで出発する）を、プレートに適用し、そして１時間、プレート−結合された抗原との会合を可能にした。結合に続いて、結合された抗体を、抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ接合体（Fab specific, Sigma, St Louis, MO; カタログ番号A0293-1ML）により可視化し、そして発色性基質ＴＭＢにより展開した。
【０４５３】
実施例５：追加の多重特異性抗体及び多重特異性活性化可能抗体配列
この実施例は、追加の多重特異性抗体及び多重特異性活性化可能抗体の配列を提供する。
【０４５４】
【表６７】
2020114872.tif 000068
【０４５５】
【表６８】
2020114872.tif 000069
【０４５６】
【表６９】
2020114872.tif 000070
【０４５７】
【表７０】
2020114872.tif 000071
【０４５８】
【表７１】
2020114872.tif 000072
【０４５９】
【表７２】
2020114872.tif 000073
【０４６０】
【表７３】
2020114872.tif 000074
【０４６１】
【表７４】
2020114872.tif 000075
【０４６２】
【表７５】
2020114872.tif 000076
【０４６３】
【表７６】
2020114872.tif 000077
【０４６４】
【表７７】
2020114872.tif 000078
【０４６５】
【表７８】
2020114872.tif 000079
【０４６６】
【表７９】
2020114872.tif 000080
【０４６７】
【表８０】
2020114872.tif 000081
【０４６８】
【表８１】
2020114872.tif 000082
【０４６９】
【表８２】
2020114872.tif 000083
【０４７０】
【表８３】
2020114872.tif 000084
【０４７１】
【表８４】
2020114872.tif 000085
【０４７２】
【表８５】
2020114872.tif 000086
【０４７３】
【表８６】
2020114872.tif 000087
【０４７４】
【表８７】
2020114872.tif 000088
【０４７５】
【表８８】
2020114872.tif 000089
【０４７６】
【表８９】
2020114872.tif 000090
【０４７７】
【表９０】
2020114872.tif 000091
【０４７８】
【表９１】
2020114872.tif 000092
【０４７９】
【表９２】
2020114872.tif 000093
【０４８０】
【表９３】
2020114872.tif 000094
【０４８１】
【表９４】
2020114872.tif 000095
【０４８２】
表１１は、本開示の多重特異性抗体又は多重特異性活性化可能抗体を製造するために、Ｈ鎖（ＨＣ）及びＬ鎖（ＬＣ）配列の対合の例を示す。本明細書に使用される場合、Ｌ鎖を言及する場合、Ｃ２２５ｖ５を含む抗体Ｌ鎖はまた、Ｃ２２５を含むＬ鎖としても言及される。
【０４８３】
【表９５】
2020114872.tif 000096
ｖＳは、ｃ２２５のバージョン５を言及する。
【０４８４】
実施例６：Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞上のＣＤ３εへの多重特異性抗体の結合
この実施例は、本開示の多重特異性抗体のＴ細胞に結合する能力を示す。
【０４８５】
次のように多重特異性抗体の３種の形式を試験した：（１）Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ、すなわちＯＫＴ３ｍ  ｓｃＦｖ（Ｔ細胞上のＣＤ３ε（また、本明細書においては、ＣＤ３ｅ及びＣＤ３とも称する）を結合する）が、抗−ＥＧＦＲ 抗体 Ｃ２２５ｖ５のＨ鎖のＮ−末端に結合される多重特異性抗体；（２）Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｃ、すなわちＯＫＴ３ｍ  ｓｃＦｖが、抗−ＥＧＦＲ 抗体 Ｃ２２５ｖ５のＨ鎖のＣ−末端に結合される多重特異性抗体；及び（３））Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｌ−Ｃ、すなわちＯＫＴ３ｍ  ｓｃＦｖが、抗−ＥＧＦＲ 抗体 Ｃ２２５ｖ５のＬ鎖のＣ−末端に結合される多重特異性抗体。それらの多重特異性抗体のアミノ酸配列が、Ｃ２２５ｖ５及びＯＫＴ３抗体のアミノ酸配列であるとして、本明細書に提供される。また、アイソタイプ対照、すなわちヒトＩｇＧ1アイソタイプ対照（Enzo, カタログＡＬＸ−８０４−１３３−Ｃ１００）を試験した。
【０４８６】
３種の多重特異性抗体形式がＣＤ３ε―陽性Jurkat  T細胞（また、本明細書においては、Jurkat細胞及びJarkatsとも称す）に結合するかどうかを決定するために、フローサイトメトリーに基く結合アッセイを実施した。Jurkat T 細胞(クローン E6-1, ATCC, TIB-152)を、ATCCガイドラインに従って、GlutaMAX（登録商標） (Life Technologies, カカタログ番号72400-120), 10% 熱不活性化された-ウシ胎仔血清(HI-FBS, Life Technologies, カタログ番号10438-026)、100 U/mlのペニシリン 及び100 μg/ml のストレプトマイシン(Life Technologies, カタログ番号15140-122) (また、本明細書においては完全培地とも称す)と共にＲＰＭＩ−１６４０において培養した。細胞を遠心分離（２００ｘｇ、４℃、５分）により収穫し、そして２％ＨＩ−ＦＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中、ＰＢＳに再懸濁した。ウェル当たり約２５０，０００個のJurkat細胞を、９６−ウェルＵ−底プレートに移し、収穫し、そして５０μｌ（また、本明細書においては、μｌ又はｕｌとも称する）の試験される抗体に再懸濁した。抗体の開始濃度は、多重特異性抗体について１００ｎＭであり、そしてアイソタイプ対照については、１６６．７ｎＭであり、続いて、各抗体について合計８種の濃度の５倍の連続希釈を行った。
【０４８７】
細胞及び抗体を、４℃で約１時間、振盪しながらインキュベートし、収穫し、そして２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液により３度、洗浄した。得られるＪｕｒｋａｔ細胞を、５０μｌのAlexaFluor（登録商標） 647 接合抗−ヒト IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch, カタログ番号709-606-149)に再懸濁し、そして４℃で約３０分間、振盪しながらインキュベートした。得られるJurkat細胞を収穫し、２００μｌのFACS緩衝液に３度、洗浄し、そして、２．５μｇ／ｍｌの７−ＡＡＤ（BD Pharmigen, カタログ番号559925）を含むＦＡＣＳ緩衝液１５０μｌの最終堆積に再懸濁した。サンプルを、ＢＤ  Accuri C６フローサイトメトリー（ＢＤ Biosciences）上で分析し、そして生存細胞の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、FlowJo  V10（Treestar）を用いて計算した。７−ＡＡＤ染色は、前方側散乱ゲートが生細胞を同定するのに十分であったことを示した。ＥＣ50値を、データを、ｌｏｇ（アゴニス）対  応答（３種のパラメーター）に適合する曲線により、GraphaPad Prism ６で計算した。
【０４８８】
図１６Ａは、すべての３種の多重特異性抗体形式が、一桁台のｎＭ〜副ｎＭの範囲のＥＣ50値を伴って、Jurkat T細胞を結合したことを示した。
【０４８９】
実施例７：多重特異性抗体はＣＤ３ε−発現Ｔ細胞及び組換えヒトＥＧＦＲに結合する
この実施例は、Ｔ細胞及び標的抗原含有細胞の両者に結合する（また、本明細書においては、同時結合すると称する）、本開示の多重特異性抗体の能力を示す。
【０４９０】
多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５-ＯＫＴ３ｍ-Ｈ-Ｎ、Ｃ２２５ｖ５-ＯＫＴ３ｍ-Ｈ−Ｃ又はＣ２２５ｖ５-ＯＫＴ３ｍ−Ｌ−ＣがＣＤ３ε−陽性Jurkat  Ｔ細胞及びＥＧＦＲを結合するかどうかを決定するために、フローサイトメトリーに基くビオチニル化されたＥＧＦＲにより滴定し、そしてストレプトアビジン、Ｒ−フィコエリトリン結合体（ＳＡＰＥ）により検出した。また、アイソタイプタイプ対照、すなわちヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照、Enzo, カタログ ALX-804-133-C100を試験した。
【０４９１】
Jurkat細胞を、本明細書に記載のようにして、培養し、そして収穫した。ウェル当たり約５００，０００個のJurkat細胞を、Ｕ−底プレートに移し、収穫し、そして５０μｌの４０ｎＭの多重特異性抗体又は６７ｎＭのアイソタイプ抗体に再懸濁した。細胞を、４℃で約１時間、振盪しながらインキュベートし、収穫し、そして２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液により３度、洗浄した。得られるJurkat細胞（本開示の多重特異性抗体を結合する）を、約２９０ｎＭで出発し、続いて、合計８種の濃度の５倍連続希釈溶液に、５０μｌのビオチニル化された組換えヒトＥＧＦＲタンパク質（Abcam, カタログ番号ab168702）に再懸濁した。細胞を、４℃で約１時間、振盪しながらインキュベートし、収穫し、そして２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液により３度、洗浄した。得られるJurkat細胞を、５０μｌの１０μｇ／ｍｌのストレプトアビジン、R-フィコエリトリン接合体(Life Technologies, S866)に再懸濁し、そして４℃で約１時間、振盪下でインキュベートした。細胞を収穫し、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液により１度、洗浄し、そして１５０μlのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。サンプルを、ＢＤ  Accuri  Ｃ６及び本明細書に記載されるようにして計算されたＭＦＩ上で分析した。ＥＣ50値を、本明細書に記載のようにして、GraphPad Prism 6で計算した。
【０４９２】
図１６Ｂは、すべての３種の多重特異性抗体形式が、Ｔ細胞上のＣＤ３εへの付随的結合を必要とする、ＥＧＦＲの濃度依存性結合を示したことを実証する。ＥＣ50値は、副−ｎＭ〜一桁台のｎＭの範囲であった。
【０４９３】
実施例８：多重特異性抗体によるＴ細胞の標的依存性活性化
この実施例は、標的−依存性態様でＴ細胞を活性化する、本開示の多重特異性抗体の能力を実証する。
【０４９４】
多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５-ＯＫＴ３ｍ-Ｈ-Ｎ、Ｃ２２５ｖ５-ＯＫＴ３ｍ-Ｈ−Ｃ又はＣ２２５ｖ５-ＯＫＴ３ｍ-Ｌ-ＣによるJurkat  Ｔ細胞及びＥＧＦＲ−陽性標的細胞の同時−動員がJurkat細胞の活性化を誘発するかどうかを決定するために、フローサイトメトリーに基くアッセイを行った。Jurkat細胞及びＣＦＳＥ−標識された標的細胞を、約１５時間、同時培養し、そしてＴ細胞活性化を、初期Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９の表面発現について、染色により評価した。
【０４９５】
ＳＷ４８０細胞とも言及されるＥＧＦＲ−陽性ＳＷ４８０細胞（ＡＴＣＣ、カタログＣＣＬ−２２８）及びＵ２６６細胞とも言及されるＥＧＦＲ−陰性Ｕ２６６細胞（ＡＴＣＣ、カタログＴＩＢ−１９６）を、ＡＴＣＣガイドラインに従って、GlutaMAX（登録商標）、 10% HI-FBS、 100 U/mlのペニシリン及び 100 μg/ml のストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０（完全培地として言及される）において培養した。それらの標的細胞を収穫し、ＰＢＳにより１度、洗浄し、そして２×１０6細胞／ｍｌでＰＢＳに再懸濁した。５ｍＭのＣＦＳＥ原液（Life Technologies, CellTrace（登録商標） CFSE 細胞増殖キット, カタログ番号C34554）を、ＤＭＳＯにおいて調製し、そして次に、ＰＢＳにおいて３０ｎＭに希釈した。ＰＢＳ／ＣＦＳＥ作業用原液を、すぐに使用した。等体積の標的細胞及びＤＦＳＥ原液を、１５ｎＭの最終ＣＦＳＥ濃度及び１×１０6個の細胞／ｍｌの最終細胞密度のために組合した。細胞を３７℃で１５分間、インキュベートした。標識を、等体積のＨＩ−ＦＢＳを添加することによりクエンチした。インキュベートされた標的細胞を収穫し、完全培地により１度、洗浄し、そして５×１０5個の細胞／ｍｌで完全培地に再懸濁した。ウェル当たり５μｌの細胞懸濁を、合計２５，０００個の標的細胞／ウェルを得るために、９６ウェル平底プレートに添加した。
【０４９６】
Jurkat  Ｔ細胞を、本明細書に記載されるようにして、培養した。Jurkat細胞を収穫し、１×１０6個の細胞／ｍｌで完全培地に再懸濁し、そしてウェル当たり５０μｌの細胞懸濁液を、ウェル当たり合計約５０，０００個のJurkat細胞を得るために、標的細胞を含む平底プレートに添加した。エフェクターT細胞：標的細胞の比は、２：１であった。
【０４９７】
三倍濃縮抗体原液を、完全培地において調製した。使用される最高濃度は、各多重特異性抗体形式に関しては、１．２ｎＭであり、そしてＯＫＴ３ (BioLegend, カタログ番号317304)、Ｃ２２５ｖ５ (本明細書において提供されるアミノ酸配列)及び アイソタイプ対照抗体に関しては、１．５ｎＭであった。５倍の連続希釈溶液を、各抗体について合計８種の濃度のために完全培地により調製した。ウェル当たり５０μｌの抗体を、Ｔ細胞及び標的細胞を含む平底プレートに添加し、各多重特異性抗体形式について４００ｐＭ、又はＯＫＴ３、 Ｃ２２５ｖ５及びアイソタイプ対照抗体について５００ｐＭの出発濃度から、全ての原液を３倍希釈した。
【０４９８】
約１５時間後、細胞をＵ−底プレートに移し、そして収穫した。回収を最大にするために、細胞培養プレートを、１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液により洗浄し、そしてその洗浄液を、Ｕ−底プレートに移した。細胞を収穫し、５０μｌの抗−ＣＤ６９ＰＥ接合された抗体（ＢＤ  Biosciences、カタログ５５５５３１、製造業者の推奨濃度で使用される）に再懸濁し、そして４℃で１時間、振盪下で染色した。細胞を、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液により１度、洗浄し、そして次に、１５０μｌの最終体積に再懸濁した。単色対照を用いて、ＢＤ  Accuri  Ｃ６上で補正を設定した。１０，０００個の細胞を、前方側スキャター、すなわちＣＦＳＥ−陰性ゲートに集め、そしてＭＦＩをＦｌｏｗＪｏを用いて計算した。ＥＣ50値を、本明細書に記載のようにして、GraphPad Prism 6で計算した。
【０４９９】
図１７は、サブ−ｐＭ濃度で明らかに開始する最も有能なＣＤ６９活性化が、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ 細胞及びＥＧＦＲ−陽性 ＳＷ４８０ 細胞の両者の存在下で同時培養される各多重特異性抗体形式に依存したことを示す。対照的に、ＥＧＦＲ−陰性Ｕ２６６細胞により誘発されたＴ細胞活性化は、ＥＧＦＲ−陽性細胞により誘発された活性化に対して有意に低い効率であり、サブ−ｎＭのＥＣ50値及び最大ＣＤ９誘発で７５％の低下を示した。Ｕ２６６細胞が使用される場合に見られるように、多重特異性抗体のＥＧＦＲ−非依存性活性化は、ＯＫＴ３抗体の活性化に類似し、そしてごくわずかなＣＤ６９染色がＣ２２５ｖ５及びアイソタイプ対照抗体に関して観察された。
【０５００】
実施例９：多重特異性抗体による一次ＣＤ８+Ｔ細胞の標的−依存性活性化
この実施例は、一次ＣＤ８陽性（ＣＤ８+）Ｔ細胞を活性化する、本開示の多重特異性抗体の能力を示す。
【０５０１】
多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ、 Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｃ又は Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｌ−Ｃが一次ヒトＣＤ８+Ｔ細胞のＥＧＦＲ−依存性活性化に介在できるかどうかを決定するために、フローサイトメトリーに基くアッセイを実施した。ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）由来のＣＤ８+Ｔ細胞及びＤＤＡＯ−ＳＥ標識された標的細胞を、一晩、同時培養し、そして活性化を、初期活性化マーカーＣＤ６９についての染色により評価した。
【０５０２】
ＥＧＦＲ−陰性ＳＷ４８０細胞を、本明細書に記載のようにして、培養し、そして標識したが、但し、（１）ＳＷ４８０標的細胞を、CellTrace（登録商標） FarRed DDAO-SE (Life Technologies, カタログ番号C34553)により標識し、そして（２）完全培地を、２５ U/ml のＩＬ−２ (R&D Systems, カタログ番号202-IL-050/CF)により補充した。５０μｌの標的細胞懸濁液（５×１０5個の細胞／ｍｌ）／ウェルを、合計２５，０００個の標的細胞／ウェルを得るために、９６ウェル平底プレートに添加した。
【０５０３】
新鮮な正常末梢血液ＣＤ８+細胞毒性Ｔ細胞（AllCells, カタログ番号PB009-3）を、AllCells (Alameda, CA)から入手し、遠心分離（２００ｘｇ、ＲＴ、１５分）により収穫し、そして２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２により補充された完全培地に、１．５×１０6個の細胞／ｍｌで再懸濁した。ウェル当たり５０μｌの細胞懸濁液を、標的細胞を含む平底プレートに添加し、ウェル当たり合計約７５，０００のＣＤ８+細胞毒性Ｔ細胞、及び３：１の比のＴ細胞：標的細胞を得た。
【０５０４】
３倍濃縮抗体原液を、２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２により補充された完全培地において調製した。最高濃度は、６００ｐＭであり、続いて各抗体について合計８種の濃度のために５倍連続希釈を実施した。ウェル当たり５０μｌの抗体を、ＣＤ８+細胞及び標的細胞を含む平底プレートに添加し、２００ｐＭの出発濃度のために全原液を３倍に希釈した。
【０５０５】
一晩のインキュベーションの後、平底プレートを遠心分離し、そして１００μｌの上清液を、本明細書に記載される発光細胞毒性アッセイのために除いた。残る上清液を、Ｕ−底プレートに移し、そして平底プレートにおける細胞を、０．２５％トリプシン（Life Technologies, カタログ番号25200-056）により分離した。トリプシン活性を、３体積のＦＡＣＳ緩衝液を添加することによりクエンチし、そして細胞懸濁液を、Ｕ−底プレートに移した。収穫の後、細胞を、５０μｌの何れかの抗−ＣＤ６９ ＰＥ/抗−ＣＤ８ ＦＩＴＣ カクテル (抗−ＣＤ８ ＦＩＴＣ, BD Biosciences, カタログ番号561948)、 ＦＩＴＣ アイソタイプ対照(BD BioSciences, カタログ番号340755)又はＰＥ アイソタイプ対照(BD BioSciences, カタログ番号340761)に再懸濁した。すべての抗体は、製造業者の推奨濃度で使用された。細胞を４℃で１時間、振盪下で染色し、収穫し、そして２．５μｇ／ｍｌの７−ＡＡＤを含む、最終体積１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。単色対照を用いて、ＢＤ  Accuri  Ｃ６上の補正を設定し、そして固定体積の細胞懸濁液を集めた。ＣＤ８+細胞上のゲーティングは、標的細胞と生存Ｔ細胞とを区別するのに十分であった。活性化を、ＰＥアイソタイプ対照以上にＣＤ６９の発現を有するＴ細胞の％として定量化した。
【０５０６】
図１８Ａは、全ての３種の多重特異性抗体形式が、１桁台のｐＭのＥＣ50値を有する一次ＣＤ８+Ｔ細胞の濃度−依存性活性化を示したことを実証する。ＯＫＴ３、Ｃ２２５ｖ５又はヒトＩｇＧ１ アイソタイプ 対照 (Enzo)抗体による処理は、ごくわずかなＣＤ６９誘発をもたらした。
【０５０７】
実施例１０：多重特異性抗体による標的細胞の標的−依存性死滅化
この実施例は、Ｔ細胞−指図された標的−依存性細胞溶解を誘発する、本開示の多重特異性抗体の能力を実証する。
【０５０８】
多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ、Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｃ又はＣ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｌ−ＣがＴ細胞−指図された標的−依存性細胞溶解を誘発できるかどうかを決定するために、ＳＷ４８０細胞を、本明細書に記載されるように、３：１のエフェクター：標的細胞比で、ＣＤ８+Ｔ細胞と共に同時培養した。一晩の培養の後、１００μｌの上清液を、製造業者のプロトコル（CytoTox-Glo（登録商標） Cytotoxicity Assay, カタログ番号G9292, Promega）に従って、細胞毒性に関連する明確なプロテアーゼ活性について、白色壁の９６−ウェルプレート（Greiner Bio One カタログ番号655098）においてアッセイし、このプロトコルにおいては、膜の完全性を失い、そして続いて、細胞溶解を受けた細胞により放出されるプロテアーゼの活性を測定するために発光性ペプチド基質を使用する。標的細胞の多重特異性抗体−依存性細胞毒性を、未処理の値のバックグラウンド減算の後、発光で表し、そしてｌｏｇ（アゴニスト）−対−応答（３種のパラメーター）の曲線適合分析を伴ってＰｒｉｓｍにプロットされた。
【０５０９】
図１８Ｂは、すべての３種の多重特異性抗体形式がＳＷ４８０細胞のＴ−細胞−媒介性死滅を誘発したことを示す。予測されるように、ＯＫＴ３抗体は単独で、ＳＷ４８０細胞の検出できる死滅を示さず、このことは多重特異性抗体による効果的な細胞毒性のためには、Ｄ３及び腫瘍標的の両者の同時動員の必要性を示唆する。
【０５１０】
実施例１１：多重特異性抗体による標的細胞の標的−依存性Ｔ−細胞活性化及び死滅化
この実施例は、ＣＤ８+Ｔ細胞のＴ細胞−指図された、標的−依存性活性化及び標的細胞の死滅化を誘発する多重特異性抗体の能力を実証する。
【０５１１】
観察されるＴ−細胞活性化が、標的細胞によるＥＧＦＲ発現に依存するかどうかを決定するために、ＣＦＳＥ−標識されたＥＧＦＲ−陽性ＳＷ４８０細胞又はＥＧＦＲ−陰性Ｕ２６６細胞を、多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ 又はＯＫＴ３の存在下で、ヒトＣＤ８+Ｔ細胞と共に同時培養し、ここで各抗体は、上記のように、２００ｐＭで開始し、５倍連続希釈された。標的細胞（３０ｎＭ）のＣＦＳＥ標識を、上記方法を用いて、Ｔ細胞と標的細胞とを区別するために使用した。凍結された正常末梢血液ＣＤ８+細胞毒性Ｔ細胞（AllCells, カタログ番号PB009-3F）を、その製造業者により指定されるようにして、融解した。一晩のインキュベーションの後、Ｔ細胞（ＣＦＳＥ陰性細胞）を、上記のようにして、初期活性化マーカーＣＤ６９の表面発現についてアッセイした。手短には、細胞をアッセイプレートから除き、付着細胞を、トリプシン（Life Technologies）を用いて解除し、そして細胞をＦＡＣＳ緩衝液により１度、洗浄した。細胞を、抗−ＣＤ６９−ＰＥ (BD Bioscience)により１時間、染色した。細胞を洗浄し、そして細胞表面ＣＤ６９発現について、BD Accuri C6上で分析した。ＭＦＩ値を、本明細書に記載のようにして計算した。結果は、ＦＣＳ発現分析ソフトウェアを用いて、アイソタイプ対照以上のＣＤ６９の発現を有するＴ細胞の割合として表され、そしてｌｏｇ（アゴニスト）−対−対応（３種のパラメーター）の曲線適合分析を伴ってPrismにプロットされた。
【０５１２】
図１８Ｃに示されるように、多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎは、ＳＷ４８０細胞の存在下で及び２６６細胞による最小のＴ−細胞活性化において、ＳＷ４８０細胞により使用される濃度よりも３ｌｏｇ高い濃度でさえ、副−ｐＭ濃度での強いＴ−細胞活性化を示した。ＯＫＴ抗体は、最小のＴ−細胞活性化を示した。それらの結果は、効果的なＴ−細胞活性化が、ＥＧＦＲの標的細胞発現に依存することを示した。
【０５１３】
標的細胞死滅化についてＥＧＦＲ発現の依存性を決定するために、ＳＷ４８０又はＵ２６６細胞とのＴ細胞同時培養物の上清液１００μｌを、細胞毒性に関連するプロテアーゼ活性について測定した（CytoTox-Glo, Promega）。結果は、ｌｏｇ（アゴニスト）−対−応答（３種のパラメーター）の曲線適合分析を伴ってＰｒｉｓｍにプロットされた。
【０５１４】
図１８Ｄは、多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎが、副−ｐＭ濃度でＥＧＦＲ−発現ＳＷ４８０細胞の細胞毒性を誘発し、ところがＥＧＦＲ−陰性Ｕ２６６細胞の識別可能な死滅化は検出されないことを実証する。ＯＫＴ３抗体はまた、ＳＷ４８０又はＵ２６６細胞の何れの識別可能な死滅化も示さなかった。
【０５１５】
実施例１２：ＥＧＦＲ−発現細胞系のパネルを死滅化するためにＴ細胞を動員する多重特異性抗体の能力
この実施例は、ＥＧＦＲ−発現細胞系のパネルを死滅するためにＴ細胞を動員する、本開示の多重特異性抗体の能力を実証する。
【０５１６】
多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎが追加のＥＧＦＲ−発現細胞系の細胞毒性を誘発できたかどうかを決定するために、ヒトＣＤ８+Ｔ細胞を、５：１のエフェクター：標的の比（但し、９６ウェル平底プレートにおいて培養される、３：１の比で使用されるＵ２６６細胞を除く）、及び多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎの滴定で、次のＥＧＦＲ−発現細胞系と共に、白色壁９６ウェルプレートにおいて、ＲＰＭＩ−１６４０（２％ヒト血清）下で培養した：ＨＥＫ−２９３、ＨＣＴ−１５、ＨＣＴ １１６、Ｈｓ ７６６Ｔ、ＨＴ−２９、 ＮＣＩ−Ｈ２４０５、ＳＷ４８０、 ＳＫ−ＯＶ−３及びＥＧＦＲ 陰性細胞系、Ｕ２６６ (すべての細胞系はＡＴＣＣからである)。抗−ＥＧＦＲ抗体Ｃ２２５ｖ５（２００ｐＭでの）を、負の対照として使用した。一晩のインキュベーションの後、CytoTox-Glo（登録商標）細胞毒性アッセイ(Promega)の発光性ペプチド基質を、プレート（１５０μｌの上清液）に直接、添加し、放出されたプロテーアーゼ活性を測定し、但し、１００μｌのＵ２６６上清液をプロテアーゼ活性をアッセイするために使用したＵ２６６サンプルを除く。結果は、未処理の値のバックグラウンド減算の後、発光で表され、そしてｌｏｇ（アゴニスト）−対−応答（３種のパラメーター）の曲線適合分析を伴って、Prismにプロットされた。
【０５１７】
図１９は、ＣＤ８+Ｔ細胞の存在下で多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎにより処理されたすべてのＥＧＦＲ−発現細胞系が用量−依存性細胞毒性を示したことを実証する。対照的に、ＥＧＦＲ−陰性Ｕ２６６細胞は、抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎにより影響されないまま存続した。２００ｐＭでの抗−ＥＧＦＲ抗体Ｃ２２５ｖ５により処理された細胞系の何れも、それらのＥＧＦＲ発現にもかかわらず、細胞毒性の何れの証拠も示さなかった。
【０５１８】
実施例１３：多重特異性活性化可能抗体によるＥＧＦＲ結合の減衰
この実施例は、本開示の多重特異性活性化可能抗体によるＥＧＦＲ結合が、本開示の多重特異性抗体によるＥＧＦＲ結合に比べて、減衰されることを実証した。この実施例はまた、プロテアーゼ切断部分を含む多重特異性活性化可能抗体のＥＧＦＲ結合が、そのようなプロテアーゼによる多重特異性活性化可能抗体の切断に基いて、復元されることも実証する。
【０５１９】
多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ、活性化された多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ及び多重特異性抗体 Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎを、ＥＧＦＲ−発現ＳＷ４８０細胞に結合するそれらの能力について試験した。
【０５２０】
多重特異性活性化可能抗体の活性化を、次の通りに行った：ＰＢＳ中、８２５μｇの＃多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎを、活性部位−滴定されたマトリプターゼ（また、本明細書においては、ＭＴ−ＳＰ１及びＭＴＳＰ１とも称する；R&D Systems, カタログ番号3946-SE-010から入手できる）の添加により切断し、１００ｎＭの最終濃度にした。消化物を、３７℃で一晩インキュベートし、そして切断を、キャピラリー電気泳動分析（GX-II Capillary Electrophoresis, Perkin Elmer）のためのアリコートを除くことにより確かめた。プロテアーゼ及び切断されたマスキング部分を、プロテインＡ精製により除いた。手短には、消化されたサンプルを、ＰＢＳにより２ｍｌに希釈し、そして平衡化されたMabSelect SuRe（登録商標）ビーズ(GE Healthcare Life Sciences, Product 11-0026-01 AD)上に負荷した。ビーズを、５カラム体積（ＣＶ）の１×ＰＢＳ、続いて５％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）により補充された５×ＰＢＳ（５ＣＶ）、及び最終的に５ＣＶの１×ＰＢＳにより洗浄した。抗体を、１０ＣＶの０．１Ｍのグリシン（ｐＨ３．０）により溶出し、そして画分を、１Ｍのトリス（ｐＨ８．０）により中和し、プールし、濃縮し、そして緩衝液をＰＢＳに交換した。
【０５２１】
ＥＧＦＲを発現するＳＷ４８０細胞を、細胞解離緩衝液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ５７８９）により分離し、洗浄し、そして氷上でのＦＡＣＳ緩衝液中、１０００ｎＭの多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ、 活性化された多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ、多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ、活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５又は 抗体 Ｃ２２５ｖ５の５倍希釈溶液と共に１時間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液により３度、洗浄し、そして氷上でのＦＡＣＳ緩衝液中、１：４００の二次抗体、すなわち抗−ヒトＦｃＧａｍｍa特異的ＡＦ４８８（Jackson ImmunoResearch カタログ番号109-546-098）と共にインキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液により３度、洗浄し、そしてＡＦ４８８のＭＦＩを、BD Accuri (BD Biosciences)フローサイトメトリー上で読み取った。二次抗体対照のみを含むサンプルＭＦＩを、実験ＭＦＩから減算し、そしてｌｏｇ（アゴニスト）−対−応答（３種のパラメーター）の曲線適合分析を伴って、Prismにプロットされた。
【０５２２】
図２０Ａは、多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−ＮによるＥＧＦＲ結合が、多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−ＮによるＥＧＦＲ結合に比べて、減衰されるが、しかし多重特異性活性化可能抗体のＥＧＦＲ結合は、マトリプターゼにより多重特異性活性化可能抗体のプロテアーゼ切断時に十分に回復されたことを実証する。図２０Ｂは、抗体Ｃ２２５ｖ５及び活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５によるＥＧＦＲ結合が、それぞれ多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ 及び多重特異性活性化可能抗体3９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−ＮによるＥＧＦＲ結合と同等であることを示し、このことは、多重特異性形式に存在する抗−ＣＤ３ε部分が多重特異性抗体又は多重特異性活性化可能抗体の何れのＥＧＦＲ結合プロフィールも変更しないことを示す。
【０５２３】
実施例１４：ＣＤ３+Ｔ細胞に結合する多重特異性活性化可能抗体の能力
この実施例は、多重特異性活性化可能抗体、活性化された多重特異性活性化可能抗体、 a及び多重特異性抗体が、すべての実施形態で、それぞれ、ＣＤ３+Ｔ細胞に結合できることを実証する。
【０５２４】
ＣＤ３ε結合が抗−ＥＧＦＲ多重特異性活性化可能抗体のＥＧＦＲ結合部位のマスキングにより影響されたかどうかを決定するために、Jurkat  Ｔ細胞結合アッセイを、本明細書に記載のようにして、多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ、 活性化された多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ及び多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎにより実施した。Jurkat細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中、１０００ｎＭの多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ、マトリプターゼ活性化された多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ又は 多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎの５倍希釈溶液と共に、４℃で１時間インキュベートした。細胞を、３度洗浄し、そして二次抗体、すなわち１：４００の抗−ヒトFcGamma特異的ＡＦ４８８（Jackson ImmunoResearch）インキュベートした。細胞を、３度、洗浄し、そしてＡＦ４８８のＭＦＩを、BD Accuri (BD Biosciences)フローサイトメトリー上で読み取った。二次抗体対照のみを含むサンプルＭＦＩを、実験ＭＦＩから減算し、そしてｌｏｇ（アゴニスト）−対−応答（３種のパラメーター）の曲線適合分析を伴って、Prismにプロットされた。
【０５２５】
図２１Ａは、多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ及び 多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−ＮがJurkat Ｔ細胞に対して同等の結合性を示すことを実証する。図２１Ｂは、多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ 及び 活性化された多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−ＮがJurkat Ｔ細胞に対して同等の結合性を示すことを実証する。それらの結果は、多重特異性活性化可能抗体のＥＧＦＲ結合部分のマスキングがＴ細胞を動員する多重特異性活性化可能抗体の能力に影響を及ぼさないことを示唆する。
【０５２６】
実施例１５：多重特異性活性化可能抗体による標的−依存性Ｔ−細胞活性化
この実施例は、本開示の多重特異性活性化可能抗体による標的−依存性Ｔ−細胞活性化が、本開示の多重特異性抗体により示される活性化に比べて減衰されることを実証する。この実施例はまた、プロテアーゼ切断部分を含む多重特異性活性化可能抗体による標的−依存性Ｔ−細胞活性化が、そのようなプロテアーゼによる多重特異性活性化可能抗体の切断に基いて回復されることを実証する。
【０５２７】
抗−ＥＧＦＲ多重特異性活性化可能抗体のＥＧＦＲ結合部位のマスキングが、標的−依存性Ｔ−細胞活性化を減衰するかどうかを決定するために、及び多重特異性活性化可能抗体のプロテアーゼ活性化が、活性化を回復するかどうかを決定するために、Jurkat活性化アッセイを、本明細書に記載のようにして実施し、多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ、活性化された多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ、多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ、抗−ＥＧＦＲ抗体 Ｃ２２５ｖ５及び Synagis (Medimmune) アイシタイプ対照を試験した。
【０５２８】
図２２は、ＥＧＦＲ−発現ＳＷ４８０細胞と共に同時培養されたJurkat Ｔ細胞のＣＤ６９誘発により決定されるように、多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−ＮによるＥＧＦＲ−依存性活性化が、多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎにより示されるＥＧＦＲ−依存性活性化に比べて減衰されたことを実証する。この図はまた、多重特異性活性化可能抗体によるＥＧＦＲ−依存性活性化が、マトリプターゼにより、多重特異性活性化可能抗体のプロテアーゼ切断に十分に回復されたことも示唆する。抗−ＥＧＦＲ Ｃ２２５ｖ５も、アイソタイプ対照抗体も、Ｔ−細胞の活性化を示さなかった。
【０５２９】
実施例１６：多重特異性活性化可能抗体による標的細胞の標的−依存性Ｔ細胞活性化及び標的細胞の死滅化
この実施例は、本開示の多重特異性活性化可能抗体による標的細胞の標的−依存性Ｔ−細胞活性化及び死滅化が、本開示の多重特異性抗体により示される活性化に比べて、減衰されることを実証する。この実施例は、また、プロテアーゼ切断部分を含む、多重特異性活性化可能抗体による標的細胞の標的−依存性Ｔ−細胞活性化及び死滅化が、そのようなプロテアーゼによる多重特異性活性化可能抗体の切断に基いて回復されることも実証する。
【０５３０】
抗−ＥＧＦＲ多重特異性活性化可能抗体のＥＧＦＲ結合部位のマスキングが、標的−依存性活性化を減衰するかどうかを決定するために、及び多重特異性活性化可能抗体のプロテアーゼ活性化が、活性化を回復するかどうかを決定するために、Jurkat活性化アッセイを、本明細書に記載のようにして実施し、多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ、活性化された多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ、多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ、抗−ＣＤ３ε抗体ＯＫＴ３、抗−ＥＧＦＲ抗体 Ｃ２２５ｖ５及び Synagis (Medimmune) アイシタイプ対照を試験した。
【０５３１】
細胞毒性に対する、抗−ＥＧＦＲ多重特異性活性化可能抗体のＥＧＦＲ結合部位のマスキングの影響、及び活性化された多重特異性活性化可能抗体の細胞毒性活性を回復するプロテアーゼ活性化の能力を決定するために、ＥＧＦＲ−発現ＳＷ４８０細胞を、２００ｐＭから出発して、多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ、活性化された 多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎ又は多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎの連続５倍希釈溶液と共に、５：１のエフェクター：標的細胞の比で、Ｔ−細胞と同時培養した。２００ｐＭのＯＫＴ３、Ｃ２２５ｖ５及びアイソタイプ対照Synagis (Medimmune) ＩｇＧ１ 抗体を、対照として使用した。一晩のインキュベーションの後、１００μｌの上清液を、白壁９６−ウェルプレートにおいて、細胞毒性に関連する独特なプロテアーゼ活性についてアッセイした（CytoTox-Glo, Promega）。結果は、未処理の値のバックグラウンド減算の後、発光で表され、そしてｌｏｇ（アゴニスト）−対−応答（３種のパラメーター）の曲線適合分析を伴って、Prismにプロットされた。
【０５３２】
図２３Ａは、ＥＧＦＲ−発現ＳＷ４８０細胞と共に同時培養された一次Ｔ細胞のＣＤ６９誘発により決定されるように、多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−ＮによるＥＧＦＲ−依存性活性化が、多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎにより示されるＥＧＦＲ−依存性活性化に比べて減衰されたことを実証する。この図はまた、多重特異性活性化可能抗体によるＥＧＦＲ−依存性活性化が、マトリプターゼにより、多重特異性活性化可能抗体のプロテアーゼ切断に十分に回復されたことも示唆する。ＯＫＴ３、抗−ＥＧＦＲ Ｃ２２５ｖ５及び Synagis IgG1アイソタイプ対照抗体は、Ｔ−細胞のごくわずかな活性化を示した。
【０５３３】
図２３Ｂは、多重特異性活性化可能抗体３９５４−１２０４−Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−ＮによるＳＷ４８０細胞のＥＧＦＲ−依存性溶解が、多重特異性抗体Ｃ２２５ｖ５−ＯＫＴ３ｍ−Ｈ−Ｎにより示されるＥＧＦＲ−依存性細胞毒性に比べて、減衰されたことを実証する。この図はまた、多重特異性活性化可能抗体によるＥＧＦＲ−依存性細胞毒性が、マトリプターゼにより、多重特異性活性化可能抗体のプロテアーゼ切断に十分に回復されたことも示唆する。Ｃ２２５ｖ５ 及び ＯＫＴ３ 及びSynagis IgG1アイソタイプ対照抗体は、ごくわずかな細胞毒性を示した。
【０５３４】
他の実施形態
本発明はその詳細な説明と併せて説明して来たが、前述の説明は例示であって、特許請求の範囲を限定するものではない。他の側面、利点及び修飾は、添付の特許請求の範囲内である。
【図１Ａ】
2020114872.tif 000097
【図１Ｂ】
2020114872.tif 000098
【図２】
2020114872.tif 000099
【図３Ａ】
2020114872.tif 000100
【図３Ｂ】
2020114872.tif 000101
【図４】
2020114872.tif 000102
【図５】
2020114872.tif 000103
【図６】
2020114872.tif 000104
【図７】
2020114872.tif 000105
【図８】
2020114872.tif 000106
【図９】
2020114872.tif 000107
【図１０】
2020114872.tif 000108
【図１１】
2020114872.tif 000109
【図１２Ａ】
2020114872.tif 000110
【図１２Ｂ】
2020114872.tif 000111
【図１３】
2020114872.tif 000112
【図１４Ａ】
2020114872.tif 000113
【図１４Ｂ】
2020114872.tif 000114
【図１５Ａ】
2020114872.tif 000115
【図１５Ｂ】
2020114872.tif 000116
【図１５Ｃ】
2020114872.tif 000117
【図１５Ｄ】
2020114872.tif 000118
【図１６Ａ】
2020114872.tif 000119
【図１６Ｂ】
2020114872.tif 000120
【図１７】
2020114872.tif 000121
【図１８Ａ】
2020114872.tif 000122
【図１８Ｂ】
2020114872.tif 000123
【図１８Ｃ】
2020114872.tif 000124
【図１８Ｄ】
2020114872.tif 000125
【図１９】
2020114872.tif 000126
【図２０Ａ】
2020114872.tif 000127
【図２０Ｂ】
2020114872.tif 000128
【図２１Ａ】
2020114872.tif 000129
【図２１Ｂ】
2020114872.tif 000130
【図２２】
2020114872.tif 000131
【図２３Ａ】
2020114872.tif 000132
【図２３Ｂ】
2020114872.tif 000133
【配列表】
2020114872000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月15日(2020.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化された状態で、２つ以上の標的、２つ以上のエピトープ、又は２つ以上の標的及び２つ以上のエピトープの組合せを結合する多重特異性活性化可能抗体であって、
第１標的又はエピトープを特異的に結合する、少なくとも第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ1）；
第２標的又はエピトープを特異的に結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）；
前記多重特異性活性化可能抗体が未切断状態にある場合、前記ＡＢ１のその標的への結合を阻害する少なくとも第１マスキング部分（ＭＭ１）；及び
前記ＡＢ１にカップリングされる少なくとも第１切断部分（ＣＭ１）、ここで前記ＣＭ１はプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである
を含む、抗体。