(57)【要約】      （修正有）【課題】非天然型立体構造を形成したＩｇＧのＦｃ領域に特異的な親和性を示し、実使用に適した物性を有する新規なポリペプチドの提供。【解決手段】ｘｘＧＶＶＲＱＷＳＧＹＤＰＲＴＧＴＷＲＳＳＩＡＹＧＧＧ（式中、各ｘはＲ、Ｄ、Ｅ、及びＫからなる群よりそれぞれ独立して選ばれる任意のアミノ酸残基を表す）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式1:
xxGVVRQWSGYDPRTGTWRSSIAYGGG  （配列番号1）   （1)
（式中、各xはR、D、E、及びKからなる群よりそれぞれ独立して選ばれる任意のアミノ酸残基を表す）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
xxがKKかEEである、請求項１に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非天然型立体構造を有する抗体のFcドメインを部分として含むタンパク質に特異的な親和性を示すポリペプチド、及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体分子は各種の物理的あるいは化学的ストレスによって、通常の天然型立体構造とは異なるalternatively folded state（AFS） と呼ばれる非天然型立体構造を形成することが報告されている。このような非天然型立体構造は抗体の活性の喪失を招くだけでなく、タンパク質凝集の原因ともなり得、その結果、薬効の低下のみならず、免疫原性の惹起による副作用の原因となりうる。そのため、非天然型立体構造を有する抗体の分析技術及び分離精製技術は、抗体医薬品の品質管理を実施する上で必要不可欠である。
【０００３】
坂本らは、酸処理によって非天然型立体構造を形成したヒトIgGのFc領域に親和性を示すペプチドを作製した（非特許文献1）。伊藤らは、このペプチドを用いてヒト抗体医薬、免疫グロブリン製剤、IgG試薬に含まれる酸処理によって生じた非天然型立体構造の含有率を調査できることを開示している（特許文献1）。
【０００４】
渡邊らは、10残基の微小タンパク質シニョリンを含む人工タンパク質ライブラリ（特許文献2）を用いてヒトIgGのFc領域に親和性を示す25残基の人工タンパク質AF.2A1を作製した（非特許文献2）。AF.2A1は、酸処理、熱処理、還元剤処理等で生じる非天然型立体構造を形成した抗体のFc領域に特異的な高親和性を示し、Fc領域の天然型立体構造と非天然型立体構造を厳密に識別し、それらの分離、精製、除去に使用できる（特許文献3、非特許文献3）。
【０００５】
抗体分子を対象とした分析技術及び分離精製技術のさらなる高度化には、利用状況に適した特性を有する抗体親和性分子が必要である。具体的には、抗体上の結合部位、分子認識の特異性や親和性に加えて、結合/解離の制御可能性、溶解性や安定性、大量生産可能性、などの点において適切な特性を有する抗体親和性分子が必要である。タンパク質の物性の改良については、さまざまな技術が知られているが、特定の構造に対する親和性・特異性を維持したまま物性を改良することは容易ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2008/054030
【特許文献２】WO2014/103203
【特許文献３】WO2014/115229
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Sakamoto et al., (2009) Discovery and characterization of a peptide motif that specifically recognizes a non-native conformation of human IgG induced by acidic pH conditions. J Biol Chem. 284(15) 9986-9993
【非特許文献２】Watanabe et al., (2014) Tracing primordial protein evolution through structurally guided stepwise segment elongation. J Biol Chem. 289 (6) 3394-3404
【非特許文献３】Senga et al., (2018) Suppression of Aggregation of Therapeutic Monoclonal Antibodies during Storage by Removal of Aggregation Precursors Using a Specific Adsorbent of Non-Native IgG Conformers. Bioconjug Chem. 29(10) 3250-3261
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、非天然型立体構造を形成したIgGのFc領域に特異的な親和性を示し、実使用に適した物性を有する新規なポリペプチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、非天然型立体構造を有するIgGのFc領域に特異的に結合する人工タンパク質AF.2A1の配列を基に、その結合特異性に影響を与えることなく、可溶性や分散性等を向上させることに成功した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の[1]−[13]を包含する。
[1]  下記式1:
xxGVVRQWSGYDPRTGTWRSSIAYGGG  （配列番号1）
（式中、各xはR、D、E、及びKからなる群よりそれぞれ独立して選ばれる任意のアミノ酸残基を表す）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
[2]  各xはK及びEからそれぞれ独立して選ばれる任意のアミノ酸残基である、[1]に記載のポリペプチド。
[3]  xxがKKかEEである、[1]に記載のポリペプチド。
[4]  免疫グロブリンGのFcドメインを部分として含み当該Fcドメインが非天然型立体構造を形成しているタンパク質を検出するための方法であって、
(1)Fcドメイン含有タンパク質の混入が疑われる試料を、[1]〜[3]のいずれかに記載のポリペプチドと接触させる工程、及び
(2)前記ポリペプチドとFcドメイン含有タンパク質との間で結合が生じたか否かを判定する工程、
を含む方法。
[5]  免疫グロブリンGのFcドメインを部分として含み当該Fcドメインが非天然型立体構造を形成しているタンパク質を精製するための方法であって、
(1)Fcドメイン含有タンパク質を含む試料を[1]〜[3]のいずれかに記載のポリペプチドと結合させる工程、及び
(2)前記ポリペプチドと結合したFcドメイン含有タンパク質を試料から回収する工程、
を含む方法。
[6]  免疫グロブリンG のFcドメインを部分として含み当該Fcドメインが非天然型立体構造を形成しているタンパク質を除去するための方法であって、
(1)Fcドメイン含有タンパク質を含む試料を[1]〜[3]のいずれかに記載のポリペプチドと結合させる工程、及び
(2)前記ポリペプチドと結合したFcドメイン含有タンパク質を試料から除去する工程、
を含む方法。
[7]  ポリペプチドが、以下のいずれかの形態である、[4]〜[6]のいずれかに記載の方法：
1) ポリペプチドが有機化合物あるいは無機化合物あるいは有機化合物と無機化合物の両方により修飾されている；
2)ポリペプチドが、水不溶性の固相支持体に固定化されている；
但し、前記ポリペプチドは非天然型構造を有する免疫グロブリンGのFcドメインに結合する。
[8]  [1]〜[3]のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
[9]  [8]に記載の核酸を含む組換えベクター。
[10]  [9]に記載の組換えベクターを含有する形質転換体（例えばファージ）。
[11]  [1]〜[3]のいずれかに記載のポリペプチドを水不溶性の固相支持体に固定化した固相化ポリペプチド。
[12]  [1]〜[3]のいずれかに記載のポリペプチドを有機化合物あるいは無機化合物あるいは有機化合物と無機化合物の両方により修飾した修飾ポリペプチド。
[13]  [1]〜[3]のいずれかに記載のポリペプチドを含む、免疫グロブリンG のFcドメインを部分として含み当該Fcドメインが非天然型立体構造を形成しているタンパク質を検出、精製又は除去するためのキット。
【００１１】
なお、本明細書においては、「ペプチド」と「ポリペプチド」と「タンパク質」との用語は互換的に用いられる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のポリペプチドは、非天然型立体構造を形成したIgGのFcドメインを部分として含むタンパク質に特異的な親和性を有することに加えて、高い可溶性と単分散性、カラム吸着性を有する。したがって、非天然型立体構造を形成したFcドメインを部分として含むタンパク質の検出、固定化、分析、除去、分離精製における利用に適している。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、AF.2A1ポリペプチドへの荷電性アミノ酸の付加数とその等電点との関係を示す。等電点はProtParamソフトウェアを用いて予測した。
【図２】図２は、2A1ポリペプチド、K2-AF.2A1ポリペプチド、及びE2-AF.2A1ポリペプチド溶液（1mg/mL）を、サイズ排除クロマトグラフィに供した結果を示す。横軸は溶出時間（min）、縦軸は吸光度（280nm）。
【図３】図３は、2A1ポリペプチド、K2-AF.2A1ポリペプチド、及びE2-AF.2A1ポリペプチドの抗体Fc領域に対する親和性を表面プラズモン共鳴（SPR）法を用いた相互作用測定で評価した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、例えばIgGあるいはそのFab領域など、抗体のFcドメインを含有するタンパク質の内、非天然型立体構造を形成したFcドメインを部分として含むタンパク質に特異的な親和性を示すポリペプチドと、これを利用した、非天然型立体構造を形成したFcドメインを部分として含むタンパク質の検出、固定化、又は除去方法に関する。
【００１５】
本明細書において「Fcドメイン」とは、IgGの重鎖および軽鎖の定常領域で構成されている。Fcドメインは、これのみで単独に存在してもよいし、あるいは、例えばIgGのように、本発明のポリペプチドが親和性を示すものである限り、Fcドメインがタンパク質の一部として包含されていてもよい。定常領域のアミノ酸配列は、生物種内、あるいは生物種間においても、相同性を示すことが知られている。
【００１６】
本明細書において「非天然型立体構造」とは、例えば熱処理；低温処理；酸処理；変性剤、還元剤、酸化剤、酸若しくは塩基、酵素、触媒などによる化学的処理；イオン強度の変化、若しくは撹拌、若しくはせん断、光照射などによる物理的処理、によって生じる、天然型立体構造とは異なる立体構造群の総称である。
【００１７】
熱処理とは、限定するものではないが、好ましくは60℃以上、より好ましくは70℃以上、さらに好ましくは75℃以上の条件下に晒されることを意味し、低温処理とは、好ましくは0℃以下の条件下に晒されることを意味する。
酸処理とは、限定するものではないが、好ましくはpH4.0以下、より好ましくはpH 3.0以下、さらに好ましくはpH2.0以下の条件下に晒されることを意味する。
化学的処理としては、例えば、塩酸グアニジンなどの変性剤による処理、還元剤（ジチオトレイトール、βメルカプトエタノール、2-メルカプトエチルアミンなど）の添加によるジスルフィド結合の開裂を挙げることができる。
物理的処理として、せん断や撹拌、例えばIgG溶液を撹拌子を用いて700 rpmの速度で回転させることによってアミノ酸残基の酸化、タンパク質立体構造の変性、それによるタンパク質凝集を挙げることができる。
【００１８】
本発明のポリペプチドは、配列番号1：xxGVVRQWSGYDPRTGTWRSSIAYGGG（式中、各xはR、D、E、及びKからなる群よりそれぞれ独立して選ばれる任意のアミノ酸残基を表す）で示されるアミノ酸配列を有する。
【００１９】
上記ポリペプチドの好ましい例は、配列番号2又は3（ｘｘがKKかEE）で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、より好ましい例は、配列番号2（XXがKK）で示されるポリペプチドである。
【００２０】
本発明のポリペプチドのコア配列であるGVVRQWSGYDPRTGTWRSSIAYGGG（配列番号4）で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドAF.2A1は、酸処理、熱処理、還元剤処理等で生じる非天然型立体構造を形成した抗体のFc領域に特異的な高親和性を示し、Fc領域の天然型立体構造と非天然型立体構造を厳密に識別するため、それらの分離、精製、除去に使用できる。
【００２１】
発明者らは、上記コア配列のN末端であれば、AF.2A1の結合特異性に影響を与えることなく、アミノ酸の付加が可能であることを確認した。そして、ｘとして、R、D、E、及びKからなる群より選ばれる荷電アミノ酸を付加すれば、AF.2A1の結合特異性を維持したまま、可溶性や単分散性、カラム吸着性を向上させうること、また付加するアミノ酸の数は、2個が好ましいことを確認した。
【００２２】
ポリペプチドの親和性を測定する方法としては、酵素結合免疫吸着法（ELISA）、表面プラズモン共鳴法（SPR）、等温滴定型熱量計（ITC）、水晶振動子マイクロバランス（QCM）、原子間力顕微鏡（AFM）、プルダウン法、電気泳動法、蛍光偏光度測定法などが挙げられる。本明細書において親和性を示すとは、上記測定装置のいずれかを用いて結合信号／ノイズ比にして10倍以上の値を示す結合信号が得られることを意味する。
【００２３】
本発明のポリペプチド、は公知の方法、例えば、有機化学的合成や、遺伝子組換えによる方法で製造することができる。
【００２４】
本発明のポリペプチドは、本発明の目的を損なわない限り（すなわち、非天然型構造を形成したIgGのFc領域に特異的な親和性を有する限り）、そのアミノ末端あるいはカルボキシル末端あるいは両末端に第2のポリペプチドを伸張した連結型ポリペプチドであってもよい。そのような第2のポリペプチドとしては、たとえば、多価効果による親和性向上を目的として連結する本発明のポリペプチド、または多重特異性の付与を目的として連結する他の分子に親和性示すポリペプチド、またはポリペプチドの精製や検出を目的として連結するFLAGタグ、c-mycタグ、もしくはヒスチジンタグなどのタグポリペプチド、またはポリペプチドの構造安定化を目的として連結するロイシンジッパーもしくはβヘアピンなどの２次構造形成ポリペプチド、または細胞小器官への局在化や細胞外への分泌を促すことを目的として連結する小胞体シグナルペプチドなどのシグナルペプチド、または細胞表面への接着を目的として連結するRGDモチーフなどを含む接着性ポリペプチドを挙げることができる。ある機能性ポリペプチドに、これと同一または異なるポリペプチドを連結することで、機能向上または多機能化することは当該分野においてすでに知られている（Watanabe H, Honda S. (2015) Chem Biol. 22(9) 1165-1173; Khan, F. et al., (2006) Anal. Chem. 78, 3072-3079; Silverman, J. et al., (2005) Nat. Biotechnol. 23, 1556-1561; Bell, M. R. et al., (2013) Protein Sci. 22, 1466-1477）。
【００２５】
本発明のポリペプチドは、本発明の目的を損なわない限り、そのアミノ末端あるいはカルボキシル末端あるいは両末端にタンパク質を結合した融合タンパク質であってもよい。融合させるタンパク質としては、たとえば、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質、もしくはグルタチオン-S-トランスフェラーゼなどポリペプチドの可溶性を高めるために用いられるタンパク質、またはペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、もしくは蛍光タンパク質など発色・発光・蛍光検出に用いられるタンパク質、または抗体、黄色ブドウ球菌プロテインA、もしくは連鎖球菌プロテインGなど親和性を有するタンパク質を挙げることができる。ある機能を有するポリペプチドに、タンパク質を結合することで、溶解度を向上または多機能化することは当該分野においてすでに知られている（Gerdes, H. H. et al., (1996) FEBS Lett. 389, 44-47; Uhlen, M. et al., (1992) Curr. Opin. Biotechnol. 3, 363-369; Nilsson, J. et al., (1994) Eur. J. Biochem. 224, 103-108）。
【００２６】
本発明ポリペプチドおよび融合タンパク質は標識されていてもよい。すなわち本発明は、非天然型立体構造を形成したFcドメインに対する親和性が損なわれない範囲で、上記のポリペプチド、融合タンパク質、又はこれらポリペプチド若しくは融合タンパク質をコードする核酸を有する形質転換体に対し、有機化合物あるいは無機化合物あるいは有機化合物と無機化合物の両方を結合させた修飾ポリペプチド又は修飾タンパク質又は修飾形質転換体を含む。上記有機化合物等を結合することで、下段に記す本発明の用途の一例である非天然型立体構造を形成したFcドメインを部分として含むタンパク質の検出を効果的に行うことができる。用いる有機化合物等としては、ビオチン、フルオレセイン等の蛍光性有機化合物、安定同位体、リン酸基、アシル基、アミド基、エステル基、エポキシ基、ポリエチレングリコール（PEG）、脂質、糖鎖、核酸、量子ドット等の蛍光性無機化合物、金コロイドなどが好適（Basle E JH et al., 2010, 17(3), 213-227）であるが、技術的に適用可能な他のいかなる化合物も排除しない。
【００２７】
本発明は、本発明のポリペプチドは固相担体に固定化されていてもよい。好適な固相担体の例としては、限定するものではないが、ポリスチレンやポリエステルなどの樹脂、デキストランやアガロースなどの生体高分子化合物、金属やガラスなどの無機材料が挙げられる。これらの固相担体の形状は、粒子、プレート、膜、チップ、試験管など任意の形状で良い。固相担体へのポリペプチドの固定化は、共有結合法、物理吸着法、イオン結合法、分子間相互作用法によって行うことができる。例えば、本発明のポリペプチドを表面プラズモン共鳴測定装置のセンサーチップへ固定化することにより、非天然型立体構造を形成したFcを部分として含むIgGを検出することができるが、これに限定されるものではなく、磁性粒子などの粒子類、フィルター膜などに固定化し、後述する検出、分離、除去方法に利用することができる。
【００２８】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸、及び前記核酸を含む形質転換体も提供する。本発明のポリペプチドを表層に提示した組換えファージも非天然型立体構造を形成したFcドメインに対する親和性を有し、後述する本発明の検出、分離、除去方法に利用することができる。
【００２９】
本発明のポリペプチドは、非天然型立体構造を形成したIgGのFcドメインを含有するタンパク質の検出、固定化、分離精製、除去に利用できる。
【００３０】
被験試料中の非天然型立体構造を形成したFcドメインを部分として含むタンパク質を検出するための方法は、次の工程を含むことができる：
(1)Fcドメイン含有タンパク質の混入が疑われる被検試料を、本発明のポリペプチドと接触させる工程、及び
(2)前記ポリペプチドとFcドメイン含有タンパク質との間で結合が生じたか否かを判定する工程。
【００３１】
上記結合が生じたか否かを判定する工程に用いる方法としては、ELISA、SPR、ITC、QCM、AFM、プルダウン法、電気泳動法、蛍光偏光度測定法、蛍光共鳴エネルギー移動法（FRET）、カラムクロマトグラフィー、イムノクロマトグラフィー法などが挙げられる。後記実施例ではSPRの例を示しているが、上記技術を含む技術的に適用可能な他の方法も排除しない。
【００３２】
免疫グロブリンGのFcドメインを部分として含み当該Fcドメインが非天然型立体構造を形成しているタンパク質を精製するための方法は、次の工程を含むことができる：
(1)Fcドメイン含有タンパク質を含む試料を、本発明のポリペプチドと結合させる工程、及び
(2)前記ポリペプチドと結合したFcドメイン含有タンパク質を試料から回収する工程。
【００３３】
被検試料中の非天然型立体構造を形成したFcドメインを部分として含むタンパク質を除去するための方法は、次の工程を含むことができる：
(1)Fcドメイン含有タンパク質を含む試料を、本発明のポリペプチドと結合させる工程、及び
(2) 前記ポリペプチドと結合したFcドメイン含有タンパク質を試料から除去する工程。
【００３４】
上記試料から回収する工程に用いる方法としては、アフィニティクロマトグラフィー法、アフィニティビーズ法、アフィニティフィルター法、免疫沈降法などが挙げられる。上記技術を含む技術的に適用可能な他の方法も排除しない。
【００３５】
上記検出、精製、除去方法において、非天然型構造を形成している免疫グロブリンGのFcドメインに結合する限り、本発明のポリペプチドは：
1）有機化合物あるいは無機化合物あるいは有機化合物と無機化合物の両方により修飾されていてもよいし、
2）水不溶性の固相支持体に固定化されていてもよい。
【００３６】
本発明のポリペプチドは、非天然型立体構造を形成したFcドメインを部分として含むIgGとこれを含まないIgGとを特異的に識別できることから、IgGのFcドメイン特異的な立体構造変化を検出することができる。また、本発明のポリペプチドは、酸処理、熱処理、還元剤処理等で生じる非天然型立体構造を形成した抗体のFc領域に特異的な高親和性を示すことから、IgGなどFcドメインを部分として含むタンパク質の製造あるいは保管時における物理的あるいは化学的ストレスの程度に応じて生じる、立体構造の変化やその度合いを検出することができる。
【００３７】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
実施例１：AF.2A1ポリペプチド改変体の等電点予測
まずAF.2A1ポリペプチドの等電点を、スイスインスティテュートオブバイオインフォマティクス（Swiss Institute of Bioinformatics）が公開しているProtParamソフトウェアを用いて予測した。ProtParamはアミノ酸配列をもとに、ポリペプチドの物性値（例えば、分子量、280nmの吸光係数、等電点など）を計算するソフトウェアである。荷電性アミノ酸を付加することの等電点に対する効果は、付加するアミノ酸数に従って増大するが、1アミノ酸あたりの程度は減少する（図１）。期待する効果に対して、少なくとも2アミノ酸の付加が必要であると予測し、以下の実施例を進めることとした。またリジンとアルギニン、グルタミン酸とアスパラギン酸の間において、効果の傾向は同等であった。
【００３９】
実施例２：AF.2A1ポリペプチド改変体の溶解度測定
AF.2A1ポリペプチド改変体のうち、N末端に2つのリジン残基を付加した改変体（以下、K2-AF.2A1：KKGVVRQWSGYDPRTGTWRSSIAYGGG（配列番号2）とする）と、N末端に2つのグルタミン酸残基を付加した改変体（以下、E2-AF.2A1とする：EEGVVRQWSGYDPRTGTWRSSIAYGGG（配列番号3））を、化学合成により取得した。また、対照として、AF.2A1ポリペプチドの12番目のアルギニン残基をグルタミン酸残基に置換した改変体（以下、R12E-AF.2A1： GVVRQWSGYDPETGTWRSSIAYGGG（配列番号5）とする）を、化学合成により取得した。R12E-AF.2A1の等電点はProtParamにおいて6.07と見積もられた。上記したAF.2A1ポリペプチドおよび、その改変体について、その物性を評価した。
【００４０】
以下の手順で、AF.2A1ポリペプチド改変体の溶解度を決定した。
粉末状態のAF.2A1、K2-AF.2A1、E2-AF.2A1に、溶媒として10 mMリン酸ナトリウム、150mM 塩化ナトリウム−緩衝液（pH 7.4）を、沈殿が見られる程度に添加した。次に、15,000gにて30分間遠心分離し、回収した上澄み液をポアサイズ0.22μmのフィルターでろ過した。以上の工程で調製した試料を飽和濃度の水溶液と見なし、280nmにおける吸光度を測定することにより各AF.2A1改変体の濃度を定量した。
【００４１】
AF.2A1の溶解度を100%とした時に、K2-AF.2A1、E2-AF.2A1、R12E-AF.2A1の溶解度はそれぞれ305%、122%、41％となった（表１）。K2-AF.2A1、E2-AF.2A1において溶解度の向上が観察できた。一方で、R12E-AF.2A1では、溶解度は低下しており、荷電性残基を末端に付加することが有効であることが示された。
【００４２】
【表１】
2020117467.tif 000002
【００４３】
実施例３：AF.2A1ポリペプチド改変体の分散性の評価
実施例２で用いたAF.2A1ポリペプチド改変体溶液を、同溶媒で1mg/mLに希釈し、サイズ排除クロマトグラフィによって分画した（図２）。カラムにはSuperdex 75 5/150 GL（GEヘルスケア）を用いた。20mM リン酸ナトリウム、500mM 塩化ナトリウム−緩衝液（pH 7.0）を溶媒として、流速0.1mL/minで溶出した。いずれも単量体を示す主ピーク以外のピークは観察されず、高分子量の会合体を形成しないことが確認できた。また、K2-AF.2A1、E2-AF.2A1、R12E-AF.2A1の溶出時間（それぞれ32.6分、30.3分、32.1分）は、AF.2A1の溶出時間（39.3分）と比較して、顕著に早かった。これは、荷電性アミノ酸を付加することによって、カラム担体との非特異的な吸着が低減した結果によるものと判断できる。また、R12E-AF.2A1においては、溶出時間24.5分に高分子量のピークが観察された。これはR12E-AF.2A1が自己集合している可能性を示唆している。同様のピークはK2-AF.2A1には観察されず、E2-AF.2A1には僅かに観察される。この結果は、K2-AF.2A1、E2-AF.2A1が、R12E-AF.2A1と比べて、水溶液中でより安定に分散することを示している。
【００４４】
実施例４：AF.2A1ポリペプチド改変体の変性抗体に対する親和性の評価
次に、AF.2A1の機能、即ち異常構造化した抗体Fc領域に対する親和性が、改変によって失われていないことを表面プラズモン共鳴（SPR）法を用いた相互作用測定により確認した。（図３、表２）
【００４５】
なお、SPR法は、生体高分子間の特異的相互作用を経時的に測定し、定量的に解釈できる優れた方法であることが認識されているものであり、特に標準試料を用いることなく結合分子の濃度を計測できる優れた方法であることが認識されているものである。
【００４６】
SPRの測定にはBiacore T200（GE Health care）を使用した。まず、センサーチップCM5（GE Health care）のフローセルにアミドカップリング反応を用いて異常構造化CH3を固定化した。ここで異常構造化CH3とは、発明者が発明した異常構造化した抗体Fc領域を模倣した分子である（特願２０１８−４３５０５）。ランニング緩衝液には、HBS-P（10 mM HEPES-NaOH pH 7.4、150 mM NaCl、0.05% v/v Surfactant P20）を使用し、反応温度25℃で測定した。試料溶液は、公比2倍の希釈系列を12.5 nMから200 nMまで調製し、シングルカイネティクスモードで測定、解析した。
K2-AF.2A1とE2-AF.2A1、R12E-AF.2A1の解離定数は、それぞれ55.1 nM、93.3 nM、374nMであったことから、AF.2A1の機能を保持していることが確認された。
【００４７】
【表２】
2020117467.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明のポリペプチドは、免疫グロブリンGのFcドメインを部分として含み当該Fcドメインが非天然型立体構造を形成しているタンパク質に特異的に親和性を示すことから、これらタンパク質の検出、精製又は除去に有用である。
【００４９】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【００５０】
配列番号1：IgG 結合ペプチド
配列番号2：IgG 結合ペプチド（K2-AF.2A1）
配列番号3：IgG 結合ペプチド（E2-AF.2A1）
配列番号4：IgG 結合ペプチド（AF.2A1）
配列番号5：IgG 結合ペプチド（R12E-AF.2A1）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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