(57)【要約】      （修正有）【課題】サンプル中の複数の核酸（例えば標的核酸及び内部コントロール核酸）を検出するための適切な方法の提供。【解決手段】サンプル中の核酸の存在及び／又は量を決定する方法であって、（ａ）所定量の第１の核酸；所定量の第２の核酸；第１の核酸の領域に特異的な結合部分と、複合体を形成していない状態では第１の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態では第２の検出可能な特徴を有する第１の検出可能な標識とを含み、第１の核酸と複合体を形成することができる所定量のＦＲＥＴ化合物；それぞれが第２の核酸の領域に特異的な結合部分と、第２の検出可能な標識とを含み、第２の核酸と複合体を形成することができる所定量のレポーター化合物；及びレポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材を提供すること、ここで、第２の核酸とレポーター化合物との複合体の形成により、結合部材によるレポーター化合物の捕捉が阻害されることを含む、方法。【選択図】図２
2020114225.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の核酸の存在および／または量を決定する方法であって、
（ａ）所定量の第１の核酸；
所定量の第２の核酸；
第１の核酸の領域に特異的な結合部分と、複合体を形成していない状態では第１の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態では第２の検出可能な特徴を有する第１の検出可能な標識とを含み、第１の核酸と複合体を形成することができる所定量のＦＲＥＴ化合物；
それぞれが第２の核酸の領域に特異的な結合部分と、第２の検出可能な標識とを含み、第２の核酸と複合体を形成することができる所定量のレポーター化合物；および
レポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材
を提供すること、
ここで、第２の核酸とレポーター化合物との複合体の形成により、結合部材によるレポーター化合物の捕捉が阻害される、
（ｂ）第１の核酸および／第２の核酸を増幅させること、
（ｃ）第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
（ｄ）所定量のレポーター化合物の一部と第２の核酸との複合体を形成すること、
（ｅ）前記所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
（ｆ）ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定すること、および
（ｇ）結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定すること
を含む、方法。
【請求項２】
結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を基準として、第２の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の検出可能な標識が蛍光標識である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第２の検出可能な標識が蛍光標識である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
第１の検出可能な標識および第２の検出可能な標識が両方とも蛍光標識である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
第１の検出可能な標識および第２の検出可能な標識が両方とも３００ｎｍから８５０ｎｍの範囲の波長で発光する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第１の検出可能な標識と第２の検出可能な標識が同じである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値が、複合体を形成した状態のＦＲＥＴ化合物で決定される、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第１の核酸が検体である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
第２の核酸が、第２の検体およびコントロール核酸からなる群から選択される、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
第１の核酸が、サンプルあたり１００コピー数に満たない量で存在する、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
第２の核酸が、サンプルあたり１００コピー数以上の量で存在する、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成する工程、（ｉｉ）所定量のレポーター化合物の一部と、所定量の第２の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程、および（ｉｉｉ）所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程が、同時に行われる、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
第１の核酸および第２の核酸の増幅が、所定量のレポーター化合物の一部と、所定量の第２の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程の前に開始される、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
（ｉ）第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成する工程、（ｉｉ）所定量のレポーター化合物の一部と、所定量の第２の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程、（ｉｉｉ）所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程、および（ｉｖ）第１の核酸および／または第２の核酸を増幅させる工程が、同時に行われる、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
第２の核酸が、陽性増幅コントロールおよび陰性増幅コントロールからなる群から選択される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
結合部材は、レポーター化合物を結合部材に捕捉することができる、１つ以上の異なるレポーターに特異的な捕捉化合物を含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
レポーターに特異的な捕捉化合物がオリゴヌクレオチドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
異なるレポーターに特異的な捕捉化合物が、結合部材に対して異なる位置に配置されている、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
レポーターに特異的な捕捉化合物との複合体を形成することによって、レポーター化合物が結合部材に捕捉される、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
第２の核酸と複合体を形成することができるレポーター化合物の相互作用部位の少なくとも一部が、レポーターに特異的な捕捉化合物との複合体を形成することもできる、請求項１７から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
レポーターに特異的な捕捉化合物と第２の核酸が、レポーター化合物との複合体の形成について競合する、請求項１７から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値および／または結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値が、結合部材とカバー要素とを備える反応チャンバー中で決定され、任意選択により、反応チャンバーが緩和された状態の内容積と圧縮された状態の内容積を有するように、カバー要素が少なくとも部分的に変形可能なように構成されている、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値および／または結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値が、第１の表面と、第２の表面と、レポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材とを備える反応チャンバー中で決定され、第１の表面と第２の表面との距離は、反応チャンバーが緩和された状態の内容積と圧縮された状態の内容積を有するように変動可能である、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値が、緩和された状態の内容積を有する反応チャンバー中で決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値が、圧縮された状態の内容積を有する反応チャンバー中で決定される、請求項２３から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値と、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値が、連続して、または同時に決定される、請求項１から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
レポーター化合物がオリゴヌクレオチドである、請求項１から２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
第１の核酸および／または第２の核酸を増幅させる前に、第１の核酸および／または第２の核酸を逆転写させることをさらに含む、請求項１から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
増幅が、二本鎖の核酸を変性する工程を含み、この二本鎖の核酸は、レポーター化合物と第２の核酸との複合体、レポーター化合物とレポーターに特異的な捕捉化合物との複合体、レポーター化合物の二本鎖および第１の核酸および／または第２の核酸の二本鎖を含み、および／または増幅は、プライマー化合物を第１の核酸および／または第２の核酸にアニーリングする工程を含み、任意選択により、アニーリングする工程は、所定量のレポーター化合物の一部と、第２の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程、および／または所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程と同時に行われる、請求項１４から２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
増幅は、等温増幅法であり、等温増幅法は、任意選択により、等温ＮＥＡＲである、請求項１４から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
増幅は、周期的な増幅であり、周期的な増幅は、任意選択により、ＰＣＲであり、ＰＣＲを行うことは、任意選択により、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いることを含み、任意選択により、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値は、周期的な増幅の少なくとも１つの周期の後に、任意選択により、周期的な増幅のそれぞれの周期の後に決定され、任意選択により、第１の核酸および／または第２の核酸の存在および／または量の指標となる値が、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定した後に、それぞれの時間で決定される、請求項１４から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
第２の核酸の存在および／または量の指標となる値が、レポーター化合物の存在および／または量の指標となる値と、第２の核酸の存在および／または量の指標となる値との相関関係を示す検量曲線に基づいて決定される、請求項２から３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
サンプル中の核酸の存在および／または量を決定する方法であって、
所定量の第１の核酸；
所定量の第２の核酸；
第１の核酸の領域に特異的な結合部分と、複合体を形成していない状態で第１の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態で第２の検出可能な特徴を有する第１の検出可能な標識とを含み、第１の核酸と複合体を形成することができる所定量のＦＲＥＴ化合物；および
それぞれが第２の核酸の領域に特異的な結合部分と、第２の検出可能な標識とを含み、第２の核酸と複合体を形成することができる所定量のレポーター化合物
を反応チャンバー中に提供すること、ここで、反応チャンバーは、レポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材と、反応チャンバーが緩和された状態の内容積と圧縮された状態の内容積を有するように少なくとも部分的に変形可能なように構成されるカバー要素とを備え、第２の核酸とレポーター化合物との複合体の形成により、結合部材によるレポーター化合物の捕捉が阻害される；
第１の核酸および／または第２の核酸を等温増幅させること；
第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること；
所定量のレポーター化合物の一部と第２の核酸との複合体を形成すること；
所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること；
緩和された状態の内容積を有する反応チャンバー中で、溶液中におけるＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定すること；および
圧縮された状態の内容積を有する反応チャンバー中で、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定し、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を基準として、第２の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定すること
を含む、方法。
【請求項３５】
サンプル中の核酸の存在および／または量を決定する方法であって、
所定量の第１の核酸；
所定量の第２の核酸；
第１の核酸の領域に特異的な結合部分と、複合体を形成していない状態では第１の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態では第２の検出可能な特徴を有する第１の検出可能な標識とを含み、第１の核酸と複合体を形成することができる所定量のＦＲＥＴ化合物；および
第２の核酸と複合体を形成することができる所定量のレポーター化合物
を反応チャンバーに導入すること、ここで、それぞれのレポーター化合物は、第２の核酸および第２の検出可能な標識の領域に特異的な結合部分を含み、反応チャンバーは、第１の表面と、第２の表面と、レポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材とを備え、第１の表面と第２の表面との距離は、反応チャンバーが緩和された状態の内容積と圧縮された状態の内容積を有するように変動可能であり、第２の核酸とレポーター化合物との複合体の形成により、結合部材によるレポーター化合物の捕捉が阻害される、
第１の核酸および／または第２の核酸を等温増幅させること、
第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
所定量のレポーター化合物の一部と第２の核酸との複合体を形成すること、
所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
緩和された状態の内容積を有する反応チャンバー中で、溶液中においてＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定すること、および
圧縮された状態の内容積を有する反応チャンバー中で、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定し、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を基準として、第２の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定すること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中の複数の核酸の存在および／または量を決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リアルタイムＰＣＲによって、ＰＣＲ産物の生成中に標識を連続的にモニタリングすることができる。現在、利用可能な方法は、標識されたプローブまたはＤＮＡにインターカレートする染料を利用し、ＰＣＲ産物の増幅をモニタリングする。この目的のために、例えば１０から３０塩基離れた位置に蛍光体と消光体を含有する単一のオリゴヌクレオチドプローブを使用してもよい。このようなＴａｑＭａｎプローブは、消光体から蛍光体を分離するＴａｑポリメラーゼの５’−３’二本鎖に特異的なエキソヌクレアーゼ活性に起因して、増幅中に加水分解させることができ、蛍光が増大する。典型的には、陽性反応のために、蛍光検出器と、蛍光がバックグラウンド蛍光よりも大きくなるサイクル数であるｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｃｔ）を概算することができるソフトウェアとを組み込んだリアルタイムＰＣＲ装置が、使用される。
【０００３】
しかし、ＰＣＲサーモサイクラーの性能の変動、異なるＤＮＡポリメラーゼの効率の悪さ、人員、サンプルマトリックス中のＰＣＲ阻害剤の存在に起因して、公開されている試験を再現する際に十分に認識されている困難さは、実験室での実施、特に、広範囲にわたる品質保証プログラムを用いた実施の妨げとなる場合がある。再現可能な方法がないことは、多くは、公開されている試験の適応にかなりの資源を費やす思考実験を強要する。従って、標的遺伝子、性能特徴および検証基準が知られており、代替的な微生物学的な方法の検証のためのＩＳＯ基準に従うような、国際的に検証され、手順が公開されているＰＣＲに基づく方法を利用可能にすることが必要である。
【０００４】
幾つかの公開されたＰＣＲの主な欠点は、内部増幅コントロールを含まないことである。（外部の）陽性コントロールとは対照的に、内部増幅コントロールは、同じサンプル中に存在する、標的ではないＤＮＡ配列であり、標的配列と同時に増幅される。内部増幅コントロールを含まないＰＣＲにおいて、陰性応答（バンドまたはシグナルがない。）は、反応中に標的配列が存在しないことを意味するだろう。しかし、陰性応答は、サーマルサイクラーの不調、誤ったＰＣＲ混合物、低いＤＮＡポリメラーゼ活性または特にサンプルマトリックス中の阻害物質の存在に起因して、反応が阻害されたことを意味する場合がある。特に、核酸抽出の後に、臨床サンプル（例えば、ヘモグロビン）、環境サンプル（例えば、フミン酸およびフルボ酸）および核酸抽出中に使用される化学物質（例えば、エタノール洗剤またはカオトロピック剤）に由来する阻害剤がまだ存在している場合がある。ＰＣＲが増幅阻害剤によって影響を受ける場合、正しい陰性結果を誤った陰性結果と区別することが望ましい。
【０００５】
診断アッセイの信頼性は、ＰＣＲ阻害剤の存在および影響を示すことができる内部コントロール核酸を入れることによって高めることができる。内部陽性コントロールは、通常、標的配列存在下、標的配列アッセイのために使用される蛍光体とは異なる波長で光を発する標識された蛍光体を用いて同時に増幅され、この２つの蛍光体は、リアルタイムＰＣＲ装置によって異なるチャンネルで検出される。ＰＣＲのために一般的に使用される内部コントロールは、プローブ領域以外はアッセイ標的の配列と類似の配列を含むプラスミドである。制限された数の内部陽性コントロール分子を、個々のアッセイ標的に添加し、標的核酸と一緒に増幅させてもよい。従って、内部陽性コントロールのシグナルは、非常に少量の標的核酸から陽性シグナルを作成するのに十分なほど増幅反応が進行したことの証拠である。
【０００６】
しかし、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  １．２およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ２（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、インディアナポリス、ＩＮ、ＵＳＡ）、Ｒｕｇｇｅｄｉｚｅｄ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  病原体  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｒ．Ａ．Ｐ．Ｉ．Ｄ．）装置（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ソルトレイクシティ、ＵＴ、ＵＳＡ）および携帯用リアルタイムＰＣＲ装置のような幾つかのデバイスには、光源および関連する発光チャンネルが１つしか取り付けられていない。
【０００７】
この不足分を克服するために、Ｐ．Ｊｏｔｈｉｋｕｍａｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４６：５１９−５２４（２００９）は、三重標識されたプローブを内部陽性コントロール（ＩＰＣ）として作成し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）とＴａｑＭａｎ技術の組み合わせを利用するための案を開発した。５’末端でＦＡＭおよびＣｙ５．５蛍光体で標識され、３’末端でＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ消光体（ＢＨＱ）で標識されたＩＰＣプローブによって、ＦＡＭ蛍光体からのエネルギー移動によるＣｙ５．５発光が可能になった。この多重物中の２番目の標的特異的なＴａｑＭａｎアッセイは、５’末端および３’末端にそれぞれＦＡＭおよびＢＨＱ１で標識されたプローブを使用した。従って、１つの励起源を使用し、２つの異なる蛍光発光（ＦＡＭおよびＣｙ５，５）を作成し、これをリアルタイムＰＣＲ装置によって２つの別個のチャンネルで測定した。
【０００８】
Ｒｏｓｅｎｓｔｒａｕｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、３６、１９１−１９７（１９９８）は、通常の診断ＰＣＲのための内部コントロールを記載し、特異的な標的および内部コントロールは、別個の標的特異的なオリゴヌクレオチド捕捉プローブおよび内部コントロールに特異的なオリゴヌクレオチド捕捉プローブを用い、別個の反応で検出された。
【０００９】
Ｇｒｕｂｅｒら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６７、２８３７−２８３９（２００１）は、外部標準曲線を作成する必要なく、二重の増幅、内部標準化および二色蛍光検出を含む、ウイルスＤＮＡを定量化するためのリアルタイムＰＣＲ方法を記載する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｐ．Ｊｏｔｈｉｋｕｍａｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ４６：５１９−５２４（２００９）
【非特許文献２】Ｒｏｓｅｎｓｔｒａｕｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、３６、１９１−１９７（１９９８）
【非特許文献３】Ｇｒｕｂｅｒら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６７、２８３７−２８３９（２００１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、サンプル中の複数の核酸（例えば、標的核酸および内部コントロール核酸）を検出するための適切な方法が当該技術分野で依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、アッセイ、例えば、サンプル中の複数の検体のためのアッセイに関する。
【００１３】
一態様において、サンプル中の核酸の存在および／または量を決定する方法は、
（ａ）所定量の第１の核酸；
所定量の第２の核酸；
第１の核酸の領域に特異的な結合部分と、複合体を形成していない状態では、第１の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態では、第１の検出可能な特徴とは異なる第２の検出可能な特徴を有する第１の検出可能な標識とを含み、第１の核酸と複合体を形成することができる所定量のＦＲＥＴ化合物、
それぞれが第２の核酸の領域に特異的な結合部分と、第２の検出可能な標識とを含み、第２の核酸と複合体を形成することができる所定量のレポーター化合物、および
レポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材を提供すること、
ここで、第２の核酸とレポーター化合物との複合体の形成により、結合部材によるレポーター化合物の捕捉が阻害される、
（ｂ）第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
（ｃ）所定量のレポーター化合物の一部と第２の核酸との複合体を形成すること、
（ｄ）前記所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
（ｅ）ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定すること、および
（ｆ）結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定することとを含む。
【００１４】
本方法は、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を基準として、第２の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定することをさらに含んでいてもよい。
【００１５】
ある実施形態において、ＦＲＥＴ化合物の第１の検出可能な標識および／または第２の検出可能な標識は、蛍光標識である。特に、第１の検出可能な標識および第２の検出可能な標識は両方とも、３００ｎｍから８５０ｎｍ、例えば、４５０ｎｍから７５０ｎｍ、または５５０から６５０ｎｍの範囲の波長で発光する。例示的な実施形態において、第１の検出可能な標識と第２の検出可能な標識は同じである。
【００１６】
ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値は、複合体を形成した状態のＦＲＥＴ化合物で決定されてもよい。
【００１７】
さらに、第１の核酸は、検体、例えば、第１の検体であってもよい。第２の核酸は、検体（例えば、第２の検体）およびコントロール核酸からなる群から選択されてもよい。コントロール核酸は、陽性増幅コントロールおよび陰性増幅コントロールからなる群から選択されてもよい。
【００１８】
ある実施形態において、第１の核酸は、サンプルあたり１００コピー数に満たない量で存在していてもよい。これに加えて、またはこれに代えて、第２の核酸は、サンプルあたり１００コピー数以上の量で存在していてもよい。
【００１９】
さらに、（ｉ）第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成する工程、（ｉｉ）所定量のレポーター化合物の一部と、所定量の第２の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程、（ｉｉｉ）所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程が、同時に行われてもよい。
【００２０】
別の実施形態によれば、本方法は、さらに、第１の核酸および／または第２の核酸を増幅させることを含む。任意選択により、例えば、第１の核酸および／または第２の核酸に周期的な増幅反応を行う場合、第１の核酸および第２の核酸の増幅は、所定量のレポーター化合物の一部と、所定量の第２の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程の前に開始される。さらに、例えば、第１の核酸および／または第２の核酸に等温増幅反応を行う場合、（ｉ）第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成する工程、（ｉｉ）所定量のレポーター化合物の一部と、所定量の第２の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程、（ｉｉｉ）所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程、（ｉｖ）第１の核酸および／または第２の核酸を増幅させる工程が、同時に行われてもよい。
【００２１】
さらに、結合部材は、レポーター化合物を結合部材に捕捉することができる、１つ以上の異なるレポーターに特異的な捕捉化合物を含んでいてもよい。レポーターに特異的な捕捉化合物は、オリゴヌクレオチドであってもよい。特に、異なるレポーターに特異的な捕捉化合物（例えば、オリゴヌクレオチド）は、結合部材に対して異なる位置に配置されていてもよい。
【００２２】
レポーターに特異的な捕捉化合物との複合体を形成することによって、レポーター化合物が結合部材に捕捉されてもよい。
【００２３】
具体的な実施形態によれば、第２の核酸と複合体を形成することができるレポーター化合物の相互作用部位の少なくとも一部が、レポーターに特異的な捕捉化合物との複合体を形成することもできる。特に、レポーターに特異的な捕捉化合物と第２の核酸が、レポーター化合物との複合体の形成について競合してもよい。
【００２４】
ある実施形態において、ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値および／または結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値は、結合部材とカバー要素とを備える反応チャンバー中で決定される。反応チャンバーが緩和された状態の内容積と圧縮された状態の内容積を有するように、カバー要素は、少なくとも部分的に変形可能なように構成されていてもよい。
【００２５】
具体的な実施形態において、ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値は、緩和された状態の内容積を有する反応チャンバー中で決定される。さらに、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値が、圧縮された状態の内容積を有する反応チャンバー中で決定されてもよい。例えば、ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値は、緩和された状態の内容積を有する反応チャンバー中で決定され、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値は、圧縮された状態の内容積を有する反応チャンバー中で決定される。
【００２６】
さらに、ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値と、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値が、連続して、または同時に決定されてもよい。
【００２７】
別の実施形態において、レポーター化合物は、オリゴヌクレオチドである。
【００２８】
本方法は、さらに、第１の核酸および／または第２の核酸を増幅させる前に、第１の核酸および／または第２の核酸を逆転写させることを含んでいてもよい。
【００２９】
具体的な実施形態において、サンプル中の核酸の存在および／または量を決定する方法は、所定量の第１の核酸；所定量の第２の核酸；第１の核酸の領域に特異的な結合部分と、複合体を形成していない状態では第１の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態では第１の検出可能な特徴とは異なる第２の検出可能な特徴を有する第１の検出可能な標識とを含み、第１の核酸と複合体を形成することができる所定量のＦＲＥＴ化合物；それぞれが第２の核酸の領域に特異的な結合部分と、第２の検出可能な標識を含み、第２の核酸と複合体を形成することができる所定量のレポーター化合物；およびレポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材を提供すること、ここで、第２の核酸とレポーター化合物との複合体の形成により、結合部材によるレポーター化合物の捕捉が阻害される、
第１の核酸および／または第２の核酸を増幅させること、
第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
所定量のレポーター化合物の一部と第２の核酸との複合体を形成すること、
前記所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定すること、および
結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定することとを含む。
【００３０】
ある実施形態において、増幅は、二本鎖の核酸を変性する工程を含み、この二本鎖の核酸は、レポーター化合物と第２の核酸との複合体、レポーター化合物とレポーターに特異的な捕捉化合物との複合体、レポーター化合物の二本鎖および第１の核酸および／または第２の核酸の二本鎖を含む。これに代えて、またはこれに加えて、増幅は、プライマー化合物を第１の核酸および／または第２の核酸にアニーリングする工程を含んでいてもよく、任意選択により、アニーリングする工程は、所定量のレポーター化合物の一部と、第２の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程、および／または所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程と同時に行われる。
【００３１】
具体的な実施形態において、増幅は、等温増幅法である。例えば、等温増幅法は、等温ＮＥＡＲである。
【００３２】
このような実施形態において、サンプル中の核酸の存在および／または量を決定する方法は、所定量の第１の核酸；所定量の第２の核酸；第１の核酸の領域に特異的な結合部分と、複合体を形成していない状態では第１の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態では第１の検出可能な特徴とは異なる第２の検出可能な特徴を有する第１の検出可能な標識とを含み、第１の核酸と複合体を形成することができる所定量のＦＲＥＴ化合物；それぞれが第２の核酸の領域に特異的な結合部分と、第２の検出可能な標識を含み、第２の核酸と複合体を形成することができる所定量のレポーター化合物；およびレポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材を提供すること、ここで、第２の核酸とレポーター化合物との複合体の形成により、結合部材によるレポーター化合物の捕捉がされる、
第１の核酸および／または第２の核酸を等温増幅（例えば、等温ＮＥＡＲ）させること、
第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
所定量のレポーター化合物の一部と第２の核酸との複合体を形成すること、
前記所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定すること、
結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定することとを含んでいてもよく、
任意選択により、（ｉ）第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成する工程、（ｉｉ）所定量のレポーター化合物の一部と、所定量の第２の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程、（ｉｉｉ）所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程、（ｉｖ）第１の核酸および／または第２の核酸を増幅させる工程が、同時に行われてもよい。
【００３３】
他の実施形態において、増幅は、周期的な増幅であり、周期的な増幅は、任意選択により、ＰＣＲであり、ＰＣＲを行うことは、任意選択により、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いることを含む。例えば、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値は、周期的な増幅の少なくとも１つの周期の後に決定され、任意選択により、周期的な増幅のそれぞれの周期の後に、決定される。次いで、第１の核酸および／または第２の核酸の存在および／または量の指標となる値は、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定した後に、それぞれの時間で決定されてもよい。
【００３４】
このような実施形態において、サンプル中の核酸の存在および／または量を決定するための方法は、所定量の第１の核酸；所定量の第２の核酸；第１の核酸の領域に特異的な結合部分と、複合体を形成していない状態では第１の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態では第１の検出可能な特徴とは異なる第２の検出可能な特徴を有する第１の検出可能な標識とを含み、第１の核酸と複合体を形成することができる所定量のＦＲＥＴ化合物；それぞれが第２の核酸の領域に特異的な結合部分と、第２の検出可能な標識とを含み、第２の核酸と複合体を形成することができるレポーター化合物；およびレポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材を提供すること、ここで、第２の核酸とレポーター化合物との複合体の形成により、結合部材によるレポーター化合物の捕捉が阻害される、
第１の核酸および／または第２の核酸に周期的な増幅（例えば、ＰＣＲ）を行うことと；
第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
所定量のレポーター化合物の一部と第２の核酸との複合体を形成すること、
前記所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定すること、
結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定することとを含み、
任意選択により、第１の核酸および第２の核酸の増幅は、所定量のレポーター化合物の一部と、所定量の第２の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程の前に開始される。
【００３５】
上述の方法において、第２の核酸の存在および／または量の指標となる値は、レポーター化合物の存在および／または量の指標となる値と、第２の核酸の存在および／または量の指標となる値との相関関係を示す検量曲線に基づいて決定されてもよい。
【００３６】
具体的な実施形態において、サンプル中の核酸の存在および／または量を決定する方法は、所定量の第１の核酸；所定量の第２の核酸；第１の核酸の領域に特異的な結合部分と、複合体を形成していない状態では第１の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態では第２の検出可能な特徴を有する第１の検出可能な標識とを含み、第１の核酸と複合体を形成することができる所定量のＦＲＥＴ化合物；および、それぞれが第２の核酸の領域に特異的な結合部分と、第２の検出可能な標識とを含み、第２の核酸と複合体を形成することができる所定量のレポーター化合物を反応チャンバーに提供すること、ここで、反応チャンバーは、レポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材を備え、第２の核酸とレポーター化合物との複合体の形成により、結合部材によるレポーター化合物の捕捉が阻害され、反応チャンバーが、少なくとも部分的に変形可能なように構成されるカバー要素を備え；
第１の核酸および／または第２の核酸を増幅（例えば、等温増幅または周期的な増幅）させること、
第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
所定量のレポーター化合物の一部と第２の核酸との複合体を形成すること、
前記所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉することと、
溶液中でＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定すること、および
結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定し、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を基準として、第２の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定することとを含む。
【００３７】
別の具体的な実施形態において、サンプル中の核酸の存在および／または量を決定する方法は、所定量の第１の核酸；所定量の第２の核酸；第１の核酸の領域に特異的な結合部分と、複合体を形成していない状態では第１の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態では第２の検出可能な特徴を有する第１の検出可能な標識とを含み、第１の核酸と複合体を形成することができる所定量のＦＲＥＴ化合物；およびそれぞれが第２の核酸の領域に特異的な結合部分と、第２の検出可能な標識とを含み、第２の核酸と第２の核酸と複合体を形成することができる所定量のレポーター化合物を反応チャンバーに提供すること、ここで、反応チャンバーは、レポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材を備え、第２の核酸とレポーター化合物との複合体の形成により、結合部材によるレポーター化合物の捕捉が阻害され、反応チャンバーが緩和された状態の内容積と圧縮された状態の内容積を有するように少なくとも部分的に変形可能なように構成されるカバー要素を備え；
第１の核酸および／または第２の核酸を増幅（例えば、等温増幅または周期的な増幅）させること、
第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
所定量のレポーター化合物の一部と第２の核酸との複合体を形成すること、
前記所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
緩和された状態の内容積を有する反応チャンバー中、ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定すること、
圧縮された状態の内容積を有する反応チャンバー中、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定し、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を基準として、第２の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定することとを含む。
【００３８】
別の具体的な実施形態において、サンプル中の核酸の存在および／または量を決定する方法は、所定量の第１の核酸；所定量の第２の核酸；第１の核酸の領域に特異的な結合部分と、複合体を形成していない状態では第１の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態では第２の検出可能な特徴を有する第１の検出可能な標識とを含み、第１の核酸と複合体を形成することができる所定量のＦＲＥＴ化合物；およびそれぞれが第２の核酸の領域に特異的な結合部分と、第２の検出可能な標識とを含み、第２の核酸と複合体を形成することができる所定量のレポーター化合物を反応チャンバーに提供すること、ここで、反応チャンバーは、レポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材を備え、第２の核酸とレポーター化合物との複合体の形成により、結合部材によるレポーター化合物の捕捉が阻害され、反応チャンバーが緩和された状態の内容積と圧縮された状態の内容積を有するように少なくとも部分的に変形可能なように構成されるカバー要素を備え；
第１の核酸および／または第２の核酸を増幅（例えば、等温増幅または周期的な増幅）させること、
第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
所定量のレポーター化合物の一部と第２の核酸との複合体を形成すること、
前記所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
緩和された状態の内容積を有する反応チャンバー中、溶液中でＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定すること、
圧縮された状態の内容積を有する反応チャンバー中、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定し、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を基準として、第２の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定することとを含む。
【００３９】
別の具体的な実施形態において、サンプル中の核酸の存在および／または量を決定する方法は、反応チャンバーに、所定量の第１の核酸；所定量の第２の核酸；第１の核酸の領域に特異的な結合部分と、複合体を形成していない状態では第１の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態では第２の検出可能な特徴を有する第１の検出可能な標識とを含み、第１の核酸と複合体を形成することができる所定量のＦＲＥＴ化合物；およびそれぞれが、第２の核酸の領域に特異的な結合部分と、第２の検出可能な標識とを含み、第２の核酸と複合体を形成することができる所定量のレポーター化合物を反応チャンバーに導入すること、ここで、反応チャンバーは、第１の表面と、第２の表面と、レポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材とを備え、第１の表面と第２の表面との距離は、反応チャンバーが緩和された状態の内容積と圧縮された状態の内容積を有するように変動可能であってもよく、第２の核酸とレポーター化合物との複合体の生成が、結合部材によるレポーター化合物の捕捉を阻害すること、
第１の核酸および／または第２の核酸を増幅（例えば、等温増幅または周期的な増幅）させること、
第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
所定量のレポーター化合物の一部と第２の核酸との複合体を形成すること、
前記所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
緩和された状態の内容積を有する反応チャンバー中、溶液中でＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定すること、
圧縮された状態の内容積を有する反応チャンバー中、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定し、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を基準として、第２の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定することとを含む。
【００４０】
上に定義された態様およびさらなる態様は、以下に記載される実施形態の例から明らかであり、これらの実施形態の例を参照しつつ説明される。
【００４１】
例示的な実施形態を本明細書で以下に詳細に記載するが、本発明はこれに限定されない。図面中の実例は、模式的である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本明細書に記載されるような例示的な試験デバイスの模式図である。
【図２】本明細書に記載されるような反応チャンバーの模式図である。
【図３】本明細書に記載される方法の例示的な実施形態で交互に行われた、バルク（溶液）とマイクロアレイの蛍光画像を示す。
【図４】バルクから得られる図３の蛍光画像（溶液、図４ａを参照）およびマイクロアレイから得られる画像（図４ｂを参照）を用いて別個に行われたデータ分析を示す。
【図５ａ】標的ＤＮＡ存在下、競争的なレポーターによってモニタリングされた増幅と分子ビーコンの比較を示す。
【図５ｂ】標的ＤＮＡを含まないコントロール反応において、競争的なレポーターによってモニタリングされた増幅と分子ビーコンの比較を示す。
【図６】溶液中の蛍光シグナル強度の時間経過を示す（第１の核酸／標的核酸の検出）。
【図７】ＩＰＣ（内部陽性コントロール）およびＰＨＣ（陽性ハイブリダイゼーションコントロール）について、アレイでの蛍光シグナル強度の時間経過を示す。溶液中に競争剤が存在しないことに起因して、ＰＨＣの一連のシグナル強度は、二次速度論を有する。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が、本記載および特許請求の範囲で使用される場合、他の要素または工程を除外しない。本開示の目的のために、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、「〜を構成する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｏｆ）」という用語の任意の実施形態であると考えられる。以下、ある群が、少なくとも特定の数の実施形態を含むと定義されている場合、これは、任意選択によりこれらの実施形態のみからなる群を開示するとも理解すべきである。
【００４４】
単数形の名詞を参照しつつ不定冠詞または定冠詞（例えば、「ａ」または「ａｎ」、「ｔｈｅ」）が使用される場合、具体的に述べられていない限り、この名詞の複数形の形態を含む。例えば、第１の核酸または第２の核酸が述べられている場合、これは、第１の核酸または第２の複数の核酸と理解されてもよい。逆に、ある名詞の複数形の形態が使用されている場合、単数形の形態も指す。
【００４５】
さらに、本記載および特許請求の範囲における第１、第２、第３または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）などの用語は、同様の要素間を区別するために用いられ、必ずしも順番に、または番号順に記載するためのものではない。このように使用される用語は、適切な状況で相互に置き換え可能であり、本明細書に記載される実施形態は、本明細書に記載または図示される以外の順序で操作することができることが理解されるべきである。
【００４６】
用語のさらなる定義は、この用語が使用される文章の中で、以下に与えられる。
【００４７】
生体サンプルの分析は、１つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡ）がサンプル中に存在するかどうかを決定することを含んでいてもよい。例えば、サンプルを分析し、特定の病原体の存在の指標となる核酸が存在するかどうかを決定してもよい。
【００４８】
例示的な態様によれば、サンプル中の複数の核酸の存在および／または量を決定する方法であって、
（ａ）所定量の第１の核酸；
所定量の第２の核酸；
第１の核酸の領域に特異的な結合部分と、複合体を形成していない状態では、第１の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態では、第２の検出可能な特徴を有する第１の検出可能な標識とを含み、第１の核酸と複合体を形成することができる所定量のＦＲＥＴ化合物；
それぞれが第２の核酸の領域に特異的な結合部分と、第２の検出可能な標識とを含み、第２の核酸と複合体を形成することができる所定量のレポーター化合物；および
レポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材を提供し、
ここで、第２の核酸とレポーター化合物との複合体の形成により、結合部材によるレポーター化合物の捕捉が阻害される、
（ｂ）第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
（ｃ）所定量のレポーター化合物の一部と第２の核酸との複合体を形成すること、
（ｄ）前記所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
（ｅ）ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定すること、
（ｆ）結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定することとを含む方法である。
【００４９】
特に、第１の核酸は、溶液中でＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定することによって検出されてもよく、一方、第２の核酸（例えば、コントロール核酸）は、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定することによって検出されてもよい。これにより、溶液中の複数の核酸を検出するための異なる発色団の使用が避けられるだろう。さらに、表面に結合した基材またはプローブを介し、コントロールの存在および／または量の指標となる値を検出することによって、増幅と関係がないコントロール（例えば、酵素コントロール）を用いることができ、これによって、対応する偽アンプリコンの合成を避けることができる。
【００５０】
「核酸」または「標的核酸」または「標的検体」という用語は、本明細書で使用される場合、方法を用いることによって検出可能な任意の核酸分子（例えば、ＦＲＥＴ化合物と複合体を形成することができる標的核酸、またはレポーター化合物と複合体を形成することができる標的核酸またはコントロール核酸。以下を参照）を示す。このような核酸分子の例としては、天然に発生する核酸、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）および人工的に設計された核酸、例えば、化学合成されているか、または組み換え遺伝子技術によって作られる核酸アナログ、特に、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックされた核酸（ＬＮＡ）（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ＮＹを三章）。天然に発生する核酸の具体例としては、ＤＮＡ配列、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子およびＲＮＡ配列、例えば、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡ分子、またはこれらの逆相補核酸配列が挙げられる。これらの核酸は、任意の長さを有していてもよく、一本鎖または二本鎖の分子であってもよい。典型的には、標的核酸は、長さが１０から１００００ヌクレオチド、例えば、２０から２０００ヌクレオチド、３０から１０００ヌクレオチド、または５０から５００ヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド（即ち、ＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子）の両方を指すと理解すべきである。
【００５１】
標的検体または標的核酸は、細菌感染またはウイルス感染と関係がある核酸であってもよい。
【００５２】
細菌感染と関係がある核酸は、１つ以上の細菌種に感染した分析対象の液体サンプル中に存在する細菌由来の任意の核酸分子を意味してもよい（例えば、ヌクレオチド配列が、細菌ゲノム内の対応する配列と同一であるか、または相補的である。）。細菌感染させる細菌の例としては、特に、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａが挙げられる。疾病負荷が最も高い細菌疾患の１つは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ菌によって引き起こされる結核であり、年に約２百万人が、ほとんどがサハラ砂漠南側のアフリカ地域で亡くなっている。従って、ある実施形態において、検出される標的核酸または標的検体は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ菌によって引き起こされる感染と関係がある。
【００５３】
ウイルス感染と関係がある核酸は、１つ以上のウイルス種に感染した分析対象の液体サンプル中に存在するウイルス由来の任意の核酸分子を意味してもよい（例えば、ヌクレオチド配列が、ウイルスゲノム内の対応する配列と同一であるか、または相補的である。）。宿主を感染させ、液体サンプルから得られるウイルスは、任意のＤＮＡウイルス（即ち、ＤＮＡゲノムを有するウイルス）またはＲＮＡウイルス（即ち、ＲＮＡゲノムを有するウイルス）であってもよい（例えば、Ｂｕｃｈｅｎ−Ｏｓｍｏｎｄ，Ｃ．（２００３）．Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ．のＭａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第８版、第２巻、ｐ．１２１７−１２２６、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、ワシントンＤＣ）にまとめられている。）。ＤＮＡウイルスの例としては、特に、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、パピローマウイルス）、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アデノウイルス）およびＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、サイトメガロウイルス）のファミリーが挙げられる。ＲＮＡウイルスの例としては、特に、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス）、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、Ｍａｒｂｕｒｇウイルス、エボラウイルス）およびＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））が挙げられる。ある実施形態において、検出される標的核酸は、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅのメンバーによって引き起こされる感染と関係があり、特に、これらはＨＩＶ感染と関係がある。「ＨＩＶ」という用語は、本明細書で使用される場合、ＨＩＶ−１種およびＨＩＶ−２種、およびこれらから誘導される任意のサブタイプを指す。
【００５４】
多くのＤＮＡウイルスおよびＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（特に、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅの複製は、一般的に、ＲＮＡウイルスゲノムからＤＮＡへの逆転写を必要とする。）は、この遺伝情報を潜在的なプロウイルスの形態で宿主細胞のゲノムに組み込むことができるため、「ウイルス感染と関係がある核酸」という用語は、遊離物に由来する核酸および細胞に関係があるウイルスに由来する核酸を指すだけではなく、宿主のゲノムに組み込まれるプロウイルスＤＮＡ分子、逆転写されたウイルスＤＮＡ分子（即ち、ウイルス複製の「中間体」）およびプロウイルスＤＮＡから誘導される転写物（即ち、宿主ＤＮＡゲノムの転写によって得られるＲＮＡ分子）も指す。
【００５５】
典型的には、標的核酸は、単離された形態ではなく、標的核酸の１つ以上の種を含むと思われるサンプルの形態で、本明細書に開示される方法が行われる。「１つ以上の種」という用語は、本明細書で使用される場合、１つ以上の異なる種類の核酸、例えば、異なるヌクレオチド配列を有する分子および／または異なる由来からの系統の分子（例えば、異なる病原体に感染する宿主細胞から誘導される核酸）を指す。
【００５６】
典型的には、本明細書で使用される第１の核酸は、上述の標的検体または標的核酸である。
【００５７】
ある実施形態において、第２の核酸は、上述の標的検体であってもよい。これに加えて、またはこれに代えて、第２の核酸は、コントロール核酸であってもよい。コントロール核酸は、陽性増幅コントロールおよび陰性増幅コントロールを含んでいてもよく、以下にさらに詳細に記載される。
【００５８】
第１の核酸および第２の核酸が両方とも標的検体である場合、第２の核酸は、典型的には、第１の核酸とは異なり、例えば、異なる種類の核酸、例えば、異なるヌクレオチド配列を有する分子および／または異なる由来からの系統の分子（例えば、異なる病原体に感染する宿主細胞から誘導される核酸）である。この実施形態において、第１の核酸は、第１の標的検体と呼ばれることもあり、第２の核酸は、第２の標的検体と呼ばれることもある。例えば、第１の標的検体は、ＨＩＶ感染と関係があり、第２の標的検体は、ＨＣＶ感染と関係がある。
【００５９】
典型的には、第１の核酸および／または第２の核酸のアンプリコン（例えば、標的検体および／またはコントロール核酸のアンプリコン）は、長さが１０から３００ヌクレオチド、例えば、１５から２５０ヌクレオチド、３０から２００ヌクレオチド、または５０から１００ヌクレオチドである。
【００６０】
さらに、本明細書で使用される「第２の核酸」は、１種類より多い核酸、例えば、第１の標的検体とは異なる１つ以上の標的検体（例えば、第２、第３、第４、第５などの標的検体）と、１つ以上のコントロール核酸（例えば、陽性増幅コントロール核酸および陰性増幅コントロール核酸）とを含んでいてもよい。
【００６１】
「サンプル」という用語は、本明細書で使用される場合、任意の液体を指し、本明細書に記載される方法を用いることによって分析される予定であり、検出対象となる標的核酸の１つ以上の種を含むと考えられる。従って、サンプルは、水または適切なバッファー（例えば、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ）に溶解した、精製された核酸調製物を含んでいてもよく、種々の生体サンプルを含んでいてもよい。本明細書に記載される方法を用いて分析することができる液体サンプルとしては、特に、有機および無機の化学物質の溶液、飲料水、下水、ヒトおよび非ヒトの体液、例えば、全血、血漿、血清、尿、痰、唾液または髄液、動物、植物または組織培養物からの細胞抽出物、原核細胞および真核細胞の懸濁物、ファージ調製物などが挙げられる。
【００６２】
具体的な実施形態において、例えば、標的核酸が、細菌感染（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって引き起こされる感染）と関係がある場合には、本明細書に記載を用いることによって分析することができる液体サンプルは、ヒト痰サンプルまたはヒト尿サンプルである。
【００６３】
別の具体的な実施形態において、例えば、標的核酸が、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶまたはＣ型肝炎ウイルスによって引き起こされる感染）と関係がある場合には、本明細書に記載を用いることによって分析することができる液体サンプルは、ヒト全血サンプルまたはヒト血漿サンプルである。
【００６４】
「全血」という用語は、本明細書で使用される場合、すべての構成物質を含む血液を指す。言い換えると、全血は、血球（例えば、赤血球、白血球および血小板）と、血球を懸濁させる血漿とを含む。
【００６５】
サンプルは、さらに、本明細書に記載される方法を行う前に、サンプルの任意の精製および／または処理から生じ得る希釈剤、溶媒またはバッファーといった１つ以上のさらなる薬剤を含んでいてもよい。しかし、ある実施形態において、分析されるサンプルは、未処理のサンプル、例えば、未処理の全血サンプルである。「未処理の」という用語は、本明細書で使用される場合、（例えば、患者から血液を抜き取ることによって）サンプルを集めた後、以下に記載する試験デバイス中で本明細書に記載される方法を行う前に、さらなるサンプル処理（例えば、分画、乾燥／再構築など）を行わないことを意味する。
【００６６】
このような未処理のサンプルに関する典型的な核酸検出方法を以下に記載する。
【００６７】
分析される流体サンプルの体積は、１μｌから３０ｍｌ、例えば、５μｌから２０ｍｌ、または１０μｌから１０ｍｌの範囲であってもよい。
【００６８】
特に、分析される尿サンプルまたは痰サンプルの体積は、１ｍｌから３０ｍｌの範囲、典型的には、１ｍｌから２５ｍｌ、または１ｍｌから２０ｍｌ、または１ｍｌから１５ｍｌ、または１ｍｌから１０ｍｌの範囲であってもよい。特定の実施形態において、尿サンプルまたは痰サンプルの体積は、５ｍｌから１５ｍｌの範囲、例えば、約１０ｍｌであってもよい。しかし、３０ｍｌを超えるサンプル体積も同様に本開示の範囲内である。
【００６９】
さらに、分析される全血サンプルまたは血漿サンプルの体積は、１μｌから５０μｌの範囲、典型的には、１μｌから４５μｌ、または１μｌから４０μｌ、または１μｌから３０μｌ、または１μｌから２５μｌ、または１μｌから２０μｌ、または１μｌから１５μｌの範囲であってもよい。特定の実施形態において、ヒト全血サンプルのような流体サンプルの体積は、１μｌから１０μｌの範囲である。しかし、全血サンプルが分析される場合には、５０μｌを超えるサンプル体積も、同様に本開示の範囲内である。
【００７０】
「レポーター分子」または「レポーター化合物」という用語は、本明細書で使用される場合、１つ以上の第２の核酸と複合体を形成することができ、支持部材（例えば、結合部材）に捕捉することが可能な任意の分子を意味してもよく、第２の核酸との複合体の形成は、支持部材（例えば、結合部材）へのレポーター化合物の捕捉を阻害する。これによって、「複合体を形成することができる」という用語は、本明細書で使用される場合、レポーター化合物と第２の核酸との任意の相互作用を指す。特に、この用語は、（例えば、相補的なヌクレオチド配列間のワトソン−クリック塩基対形成を介する。）標的との相互作用に介在するレポーター分子中に含まれる共通の結合領域または異なる結合領域を介して達成され得る分子同士の結合を意味していてもよい。典型的には、この相互作用は、可逆的である。これと類似して、「支持部材に捕捉することができる」または「結合部材に捕捉される」という用語も、レポーター分子と所与の結合部材との任意の直接的または間接的な相互作用（例えば、捕捉分子を介する。以下を参照）を意味する。この相互作用も、一般的に可逆的である。
【００７１】
一般的に、レポーター化合物は、長さが１０から１００ヌクレオチド、例えば、１５から５０ヌクレオチド、１５から４０ヌクレオチド、または２０から３０ヌクレオチドの核酸分子（即ち、上述のＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子）であってもよい。通常は、レポーター分子は、一本鎖の核酸分子またはオリゴヌクレオチドである。レポーター化合物は、検出対象の第２の化合物に対するこのようなレポーター化合物の結合が、結合部材へのレポーター化合物の捕捉を阻害するように構成される。核酸レポーター分子は、第２の核酸と相互作用することができるだけではなく（例えば、第２の核酸の少なくとも部分的に相補的な領域に結合することによって、例えば、レポーター化合物と検出対象の第２の核酸とのワトソン−クリック塩基対を形成することができる。）、結合部材に捕捉される能力も有する少なくとも１つの特異的な結合領域（本明細書では、「相互作用部位」とも呼ばれる。）も含んでいてもよい。典型的には、レポーター化合物中に含まれる特異的な結合領域は、長さが少なくとも１２ヌクレオチド、例えば、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、または少なくとも２２ヌクレオチドである。特定の実施形態において、レポーター化合物の結合部分のヌクレオチド配列は、第２の核酸の対応するヌクレオチド配列に相補的である。
【００７２】
例えば、決定される異なる種類の核酸（例えば、第２の核酸）の数に依存して、レポーター分子の１つ以上の種が使用されてもよい。「１つ以上の種」という用語は、異なるヌクレオチド配列を有する１つ以上の核酸分子のような、１つ以上の異なる種類のレポーター化合物を意味する。
【００７３】
本明細書で使用される「結合部材」は、レポーター分子を捕捉することができる任意の固体マトリックスを指していてもよい。このようなマトリックスの例は、特に、合成粒子、例えば、磁気ビーズ（例えば、常磁性のポリスチロールビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｒ）としても知られる。）およびラテックスビーズを含む。「結合部材」は、本明細書で使用される場合、例えば、任意の固体マトリックスを指していてもよく、レポーター化合物が、これに直接的に（例えば、レポーター化合物に含まれる固定基を介し）、または共有結合または非共有結合による相互作用によって、レポーター化合物を結合部材に捕捉することができるレポーターに特異的な捕捉化合物の１つ以上の種を介して間接的な様式で捕捉することができる。使用可能な結合部材の例は、特に、アレイ要素の基材（例えば、顕微鏡スライド、ウエハまたはセラミック材料）を含む。
【００７４】
「レポーターに特異的な捕捉化合物」または「レポーターに特異的な捕捉分子」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、結合部材に接続するか、または固定され、特定の結合挙動および／または特徴的な反応性を示す任意の化合物または分子を意味し、レポーター化合物との複合体を形成（即ち、レポーター化合物の結合）するのに適したものになる。核酸またはオリゴヌクレオチドは、典型的には、レポーターに特異的な捕捉分子として用いられる。レポーターに特異的な捕捉分子として使用可能な核酸の例としては、天然に発生する核酸、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、および核酸アナログ、特に、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックされた核酸（ＬＮＡ）が挙げられる。天然に発生する核酸の具体例としては、ＤＮＡ配列、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子、およびＲＮＡ配列、例えば、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡ分子、またはこれらの逆相補核酸配列が挙げられる。これらの核酸は、任意の長さを有していてもよく、一本鎖または二本鎖の分子であってもよい。典型的には、レポーターに特異的な捕捉化合物は、長さが１０から１００ヌクレオチド、例えば、１５から５０ヌクレオチド、または２０から３０ヌクレオチドの一本鎖のオリゴヌクレオチドである。
【００７５】
レポーターに特異的な捕捉化合物は、少なくとも１つの特異的な配列領域（即ち、結合領域）を含んでいてもよく、レポーター化合物に結合し、例えば、レポーターに特異的な捕捉分子と検出対象の核酸との間の塩基対形成を介し、レポーター分子の相補的な配列領域と相互作用するように構成される。典型的には、特異的な結合領域は、長さが少なくとも１２ヌクレオチド、例えば、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、または少なくとも２２ヌクレオチドである。特定の実施形態において、レポーターに特異的な捕捉化合物の結合領域のヌクレオチド配列は、レポーター化合物の対応するヌクレオチド配列に相補的である。
【００７６】
ある実施形態において、レポーター化合物の相互作用部位の少なくとも一部は、第２の核酸と複合体を形成することができ、レポーターに特異的な捕捉化合物との複合体を形成することもできる。特に、レポーターに特異的な捕捉化合物と第２の核酸が、レポーター化合物との複合体の形成について競合し、例えば、レポーターに特異的な捕捉分子および第２の核酸に含まれるそれぞれの結合領域は、レポーター分子の同一または少なくとも類似の対応する配列を認識する。「類似の配列」という用語は、本明細書で使用される場合、１つ以上の単一のヌクレオチドミスマッチ（即ち、非相補的なヌクレオチド対）のみが異なるか、または１つ以上の単一のヌクレオチドの付加、挿入または欠失（即ち、さらなるヌクレオチド残基または欠失したヌクレオチド残基）によって異なる配列を意味する。従って、レポーターに特異的な捕捉分子および第２の核酸に含まれるそれぞれの結合領域は、少なくとも部分的に同一であってもよい。「部分的に同一」という用語は、本明細書で使用される場合、上述のように１つ以上の単一のヌクレオチドのみが異なる配列、または重なり合う結合部位を有する配列、即ち、共通のヌクレオチド配列を有するが、この配列領域の少なくとも１つの他の部分が異なる配列を意味する。しかし、レポーターに特異的な捕捉分子および標的核酸に含まれるそれぞれの結合領域が、レポーター化合物の異なる、重なり合っていない（例えば、隣接する。）配列を認識するが、レポーター分子に対する、レポーターに特異的な捕捉分子または標的核酸の結合が、他方への結合を立体的に妨害するということも可能である。
【００７７】
ある実施形態において、一方で、レポーター化合物と第２の核酸との複合体を形成する工程と、他方で、（例えば、レポーターに特異的な捕捉分子との複合体を形成することによって）レポーター化合物を結合部材に捕捉する工程の化学平衡は、レポーターに特異的な捕捉分子の配列（レポーター化合物の配列に対する。）とレポーター化合物の配列（第２の核酸に対する。）の類似度および／または部分的な同一性をそれぞれ変えることによって影響を受けるだろう。
【００７８】
例えば、レポーターに特異的な捕捉分子配列は、レポーター化合物の配列に対する結合領域が、第２の核酸配列に対するレポーター化合物の配列の結合領域よりも短いか、または長いように選択されてもよい。この様式で、第２の核酸に対するレポーター化合物の結合アフィニティは、レポーターに特異的な捕捉分子に対するレポーター化合物の結合アフィニティと比較して、大きくてもよく、または小さくてもよい。
【００７９】
レポーターに特異的な捕捉分子の１つ以上の種を使用してもよい。「１つ以上の種」という用語は、１つ以上の異なる種類のレポーターに特異的な捕捉分子、例えば、異なるヌクレオチド配列を有する１つ以上の核酸分子を意味する。同時に使用されるレポーターに特異的な捕捉分子の２つより多い種は、「ライブラリー」とも呼ばれる。このようなライブラリーは、少なくとも２つの異なる分子を含むが、もっと多くの異なる分子、例えば、少なくとも１０の異なる種、少なくとも２０の異なる種、少なくとも５０の異なる種などを含んでいてもよい。異なるレポーターに特異的な捕捉化合物またはライブラリーも、結合部材に対して異なる位置に配置されていてもよい。例えば、これらは、アレイの形態または任意の他の空間配置で存在していてもよい。
【００８０】
「アレイ」という用語（「マイクロアレイ」とも呼ばれる。）は、本明細書で使用される場合、結合部材（「基材」とも呼ばれる。）の上での捕捉分子（例えば、レポーターに特異的な捕捉分子）の規定された空間配置（レイアウト）を指し、アレイ中の分子のそれぞれの種の位置は、別個に決定される。典型的には、マイクロアレイは、規定された部位または所定の領域（即ち、いわゆる「アレイ要素」または「スポット」）を含み、これらが特定のパターンで配置されていてもよく、それぞれのアレイ要素は、典型的には、レポーターに特異的な捕捉分子を１つの種しか含まない。結合部材へのレポーターに特異的な捕捉分子の配置は、共有結合または非共有結合による相互作用によって作成することができる。
【００８１】
ＦＲＥＴ効率を測定し、これを使用して、第１の核酸と本明細書で使用されるＦＲＥＴ化合物との相互作用を同定してもよい。ＦＲＥＴドナーまたはＦＲＥＴアクセプター（これらは当業者によく知られている。）によって発せられる蛍光の変化をモニタリングすることによってＦＲＥＴ効率を測定する幾つかの方法がある。
【００８２】
特に、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）または電子エネルギー移動（ＥＥＴ）は、２つの発色団の間のエネルギー移動を記述する機構である。ドナー発色団（本明細書で単にドナーまたは発色団とも呼ばれる。）は、最初は、電子が励起された状態であり、非放射性双極子−双極子カップリングによって、アクセプター発色団（本明細書でアクセプターまたは消光体とも呼ばれる。）にエネルギーを移動してもよい。ＦＲＥＴ効率の測定を使用し、（ドナー）発色団と消光体が、互いに特定の距離以内にあるか同化を決定することができる。ドナーとアクセプター発色団が両方とも蛍光である場合、「蛍光共鳴エネルギー移動」という用語が使用されることが多い。
【００８３】
本明細書で使用されるＦＲＥＴ化合物は、第１の核酸との複合体を形成することができ、光源によって励起され得るドナー発色団（例えば、蛍光標識）を含む化合物を指してもよい。さらに、この実施形態において、第１の核酸は、アクセプター発色団または消光体を伴っていてもよい。別の実施形態において、ＦＲＥＴ化合物は、アクセプター発色団または消光体を含み、第１の核酸は、ドナー発色団を含む。別の実施形態において、ＦＲＥＴ化合物は、ドナー発色団とアクセプター発色団を両方とも含んでいてもよく、または、言い換えると、発色団と消光体を両方とも含んでいてもよい。
【００８４】
本明細書で使用される第１の検出可能な標識は、ＦＲＥＴ化合物のドナー発色団または発色団と呼ばれてもよい。典型的には、ＦＲＥＴ化合物の第１の検出可能な標識またはドナー発色団は、蛍光標識または蛍光体である。
【００８５】
複合体を形成した状態のＦＲＥＴ化合物は、ＦＲＥＴ化合物が第１の核酸との複合体になっている状態を指す。複合体化されていない状態のＦＲＥＴ化合物は、ＦＲＥＴ化合物が第１の核酸と複合体になっていない状態を指す。
【００８６】
本明細書で使用されるＦＲＥＴ化合物の第１の検出可能な特徴は、発色団（例えば、蛍光体）の発光が消光している状態を指してもよい。この実施形態において、第２の検出可能な特徴は、発色団（例えば、蛍光体）の発光が存在する状態を指していてもよい。従って、溶液中のＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値は、複合体を形成した状態のＦＲＥＴ化合物で決定されてもよい。
【００８７】
他の実施形態において、本明細書で使用される第１の検出可能な特徴は、発色団（例えば、蛍光体）の発光が存在する状態を指してもよい。この実施形態において、第２の検出可能な特徴は、発色団（例えば、蛍光体）の発光が消光している状態を指してもよい。
【００８８】
ある実施形態において、ＦＲＥＴ化合物が、複合体を形成していない状態、即ち、第１の核酸と複合体になっていない場合、発色団（例えば、蛍光体）の発光は、ドナー発色団とアクセプター発色団が近接している（例えば、１から１０ｎｍの距離）ために消光し、ドナー発色団とアクセプター発色団の間のＦＲＥＴが可能になる。ＦＲＥＴ化合物が、複合体を形成した状態、即ち、第１の核酸との複合体になっている場合には、ドナー発色団とアクセプター発色団が、ドナー発色団とアクセプター発色団の間のＦＲＥＴが可能な距離内にないため、発色団（例えば、蛍光体）の発光が存在するだろう。
【００８９】
他の実施形態において、ＦＲＥＴ化合物が複合体を形成した状態、即ち、第１の核酸との複合体になっている場合には、発色団（例えば、蛍光体）の発光は、ドナー発色団とアクセプター発色団が近接している（例えば、１から１０ｎｍの距離）ために消光し、ドナー発色団とアクセプター発色団の間のＦＲＥＴが可能になる。ＦＲＥＴ化合物が、複合体を形成していない状態、即ち、第１の核酸と複合体になっていない場合には、ドナー発色団とアクセプター発色団が、ドナー発色団とアクセプター発色団の間のＦＲＥＴが可能な距離内にないため、発色団（例えば、蛍光体）の発光が存在するだろう。
【００９０】
ある実施形態において、ＦＲＥＴ化合物は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒプローブ系を含む。この実施形態において、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒプローブ系は、ＦＲＥＴドナー化合物と、ＦＲＥＴアクセプター化合物とを含む。典型的には、ＦＲＥＴドナー化合物およびＦＲＥＴアクセプター化合物は、両方ともオリゴヌクレオチドである。ＦＲＥＴドナー化合物およびＦＲＥＴアクセプター化合物は、ＦＲＥＴに十分に近接した位置で第１の核酸に結合してもよい。
【００９１】
具体的な実施形態において、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒプローブ系は、一対の一本鎖の蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブからなる。片方のオリゴヌクレオチドプローブは、３’末端で、ドナー蛍光染料で標識されていてもよく、他方のオリゴヌクレオチドプローブは、５’末端で、アクセプター蛍光染料で標識されていてもよい。２番目のプローブの遊離した３’末端ヒドロキシル基は、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を防ぐために、ホスフェート基で保護されていてもよい。典型的には、２つのプローブを互いに分離するために、１から５ヌクレオチドのスペーサーが存在する。ＰＣＲのアニーリング工程中、ＰＣＲプライマーおよびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒプローブは、この特異的な標的領域にハイブリダイズし、ドナー染料をアクセプター染料に近接させてもよい。ドナー染料が、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置からの光によって励起する場合、蛍光共鳴エネルギー移動によって、ドナー染料からアクセプター染料へとエネルギーが移動する。２つのプローブが自由に浮いており、溶液中で互いに分離されているときには、エネルギー移動は起こらないはずである。プローブのハイブリダイゼーションは、ドナー蛍光シグナルの減少またはアクセプター蛍光シグナルの増加によって測定される。
【００９２】
別の実施形態において、ＦＲＥＴ化合物は、分子ビーコンであってもよい。分子ビーコンは、溶液中の第１の核酸の存在を報告し得るオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを含んでいてもよい。分子ビーコンは、分子ビーコンプローブと呼ばれることも多い。典型的には、分子ビーコンは、標的核酸配列に結合したときに発光（例えば、蛍光）が復活する、分子内で消光する発色団（例えば、蛍光体）を含むヘアピン形状の分子である。典型的な分子ビーコンは、長さが２０から３０ヌクレオチド、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２０または３０ヌクレオチド、例えば、２５ヌクレオチドであってもよい。中間のヌクレオチド、例えば、中間の１５ヌクレオチドは、典型的には、標的核酸に相補的であり、互いに塩基対を生成しないが、それぞれの末端にあるヌクレオチド（例えば、それぞれの末端にある５ヌクレオチド）は、標的核酸に相補的ではなく、互いに相補的である。
【００９３】
特に、典型的な分子ビーコン構造は、標的配列に相補的な、分子ビーコンの典型的には１８から３０塩基対領域のループと、互いに相補的なオリゴヌクレオチドである２つの短い残基（例えば、５から７ヌクレオチド残基）がループの両末端に接続することによって作られるステム（またはビーコンステム）とを含み、分子ビーコンの５’末端に蛍光染料が共有結合しており、非蛍光性であり、分子ビーコンの３’末端に共有結合していてもよい３’消光体を含む、４つの部分に分けることができる。これに代えて、分子ビーコンの３’末端に蛍光染料が共有結合しており、非蛍光性であり、分子ビーコンの５’末端に共有結合していてもよい５’消光体が結合していてもよい。分子ビーコンの調製は、当業者のために十分に記載されている。
【００９４】
上述の分子ビーコンが閉じたループ形状である場合、消光体は、蛍光体に近接した位置にあり、蛍光体の蛍光発光を消光させる。この実施形態において、検出される第１の核酸が、このループの鎖に相補的である場合、ハイブリダイゼーション事象が起こる。第１の核酸とループとの間に作られる二本鎖は、この二本鎖の塩基対が多いため、ステムの二本鎖より安定であろう。分子ビーコンプローブは、構造変化を受け、ステムハイブリッドが解離し、蛍光体と消光体が互いに分離し、蛍光が復活する。従って、蛍光体が消光体から所定距離離れると、ハイブリッドへの光の照射によって、蛍光が発光する。発光の存在は、ハイブリダイゼーション事象が起こったことを報告するものであり、従って、第１の核酸配列が試験サンプル中に存在する。
【００９５】
他の実施形態において、ＦＲＥＴ化合物は、ループタグプローグ、ストランド置換プローブまたはＴａｑＭａｎプローブから選択されてもよい。
【００９６】
これらのＦＲＥＴ化合物および他のＦＲＥＴ化合物は、当業者によく知られている。ＦＲＥＴの使用は、例えば、Ｍａｒｒａｓ、Ｓ．Ａ．Ｅ．（２００６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３３５、３−１６；Ｌｉｕ，Ｂ．ら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２、５８９−５９３；およびＳｚｏｌｌｏｓｉ，Ｊ．ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８２、２５１−２６６に記載され、関連する内容が一緒に明示的に言及されている。例えば、Ｍａｒｒａｓ、Ｓ．Ａ．Ｅ．（２００６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３３５、３−１６は、異なる種類の蛍光ハイブリダイゼーションプローブおよび分光蛍光サーマルサイクラーについて適切な蛍光体と消光体の組み合わせを選択する際に従うことが可能なガイドラインを詳細に記載し、蛍光ハイブリダイゼーションプローブについて例示的な蛍光体標識と消光体標識も記載する。
【００９７】
ＦＲＥＴ化合物の量は、典型的には、レポーター化合物の種と比較して過剰に、例えば、５倍から１００倍過剰、または１０倍から８０倍過剰、または２０倍から５０倍過剰、または３０倍から４０倍過剰に存在していてもよい。
【００９８】
さらに、第１の核酸は、低いコピー数でサンプル中に存在していてもよい。ある実施形態において、第１の核酸は、サンプルあたり１００コピー数に満たない量で存在していてもよい。例えば、第１の核酸化合物は、サンプルあたり８０コピー数以下、またはサンプルあたり７０コピー数以下、またはサンプルあたり６０コピー数以下、またはサンプルあたり５０コピー数以下、またはサンプルあたり４０コピー数以下、またはサンプルあたり２０コピー数以下、またはサンプルあたり１０コピー数以下の量で存在していてもよい。
【００９９】
別の実施形態において、第２の核酸は、サンプルあたり１００コピー数以上の量、例えば、サンプルあたり２００コピー数以上の量、またはサンプルあたり少なくとも３００コピー数、またはサンプルあたり少なくとも４００コピー数、またはサンプルあたり少なくとも５００コピー数、またはサンプルあたり少なくとも６００コピー数、またはサンプルあたり少なくとも７００コピー数、またはサンプルあたり少なくとも８００コピー数、またはサンプルあたり少なくとも９００コピー数、または少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも５０００または少なくとも１００００コピー数の量で存在していてもよい。
【０１００】
「結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定する」との用語は、本明細書で使用される場合、結合部材に捕捉された（または再び捕捉された）レポーター化合物の定性的および／または定量的な測定を可能にする、導電性、酸化還元電位、光吸収、蛍光強度または生物発光のようなパラメータの検出／決定を指してもよい。これらのパラメータのうち、１つだけが検出されてもよいが、１つより多いパラメータ（例えば、導電性、適切な標識によって生じる蛍光シグナルの強度）を同時に、または連続して決定することも可能である。
【０１０１】
検出反応を行うために、レポーター化合物は、１つ以上の検出可能な標識（本明細書で「第２の検出可能な標識」とも呼ばれる。）で標識されていてもよい。「第２の検出可能な標識」という用語は、本明細書で使用される場合、１つ以上の適切な化学物質または酵素を含み、化学反応、物理反応または酵素反応で、検出可能な化合物またはシグナルを直接的または間接的に生成する任意の化合物または部分を指す。従って、このような標識が、前記レポーター化合物との相互作用を生成することによって目的のレポーター化合物の検出のために必須な場合があり、この検出を容易にするだろう。本明細書で使用される場合、この用語は、両方の検出可能な標識（「マーカー」とも呼ばれる。）をこのまま含み、１つ以上のこのような検出可能なマーカーに接続する任意の化合物を含むと理解されるべきである。さらに、標識による検出可能なシグナルの生成を妨害する部分（例えば、消光体と蛍光体が互いに近接した状態にある限り、蛍光体の励起から生じる発光を「奪う」消光体）も、検出可能な標識に属していてもよい。検出可能な標識は、例えば、改変および／または標識されたリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの形態で標的核酸に組み込まれてもよく、または接続してもよい。
【０１０２】
使用可能な検出可能なマーカーまたは標識としては、化学反応、物理反応または酵素反応で、検出可能な化合物またはシグナルを直接的または間接的に生成する任意の化合物が挙げられる。標識化は、当該技術分野でよく知られた方法によって達成することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（前出）；およびＬｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．およびＺｏｒｂａｓ  Ｈ．（前出）を参照）。標識は、特に、蛍光標識、酵素標識、着色した標識、色素生成標識、発光標識、放射性標識、ハプテン、ビオチン、金属錯体、金属およびコロイド状の金から選択されてもよい。これらすべての種類の標識は、当該技術分野で十分に確立されている。このような標識が介在する物理反応の一例は、照射または励起の際の蛍光または燐光の発光、または放射性標識を用いたときのＸ線の発光である。アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびβ−ラクタマーゼは、酵素標識の例であり、色素を生成する反応生成物の生成を触媒する。
【０１０３】
具体的な実施形態において、第２の検出可能な標識は、蛍光標識である。多くの蛍光標識が当該技術分野で十分に確立されており、異なる供給業者から市販されている（例えば、Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ−Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、第１０版（２００６）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カールスバート、ＣＡ、ＵＳＡを参照）。
【０１０４】
ある実施形態において、ＦＲＥＴ化合物の第１の検出可能な標識と、レポーター化合物の第２の検出可能な標識が、両方とも蛍光標識である。これらの実施形態において、第１の検出可能な標識および第２の検出可能な標識は、両方とも、３００ｎｍから８５０ｎｍ、例えば、４５０ｎｍから７５０ｎｍ、または５５０から６５０ｎｍの波長範囲で発光してもよい。具体的な実施形態において、第１の検出可能な標識および第２の検出可能な標識は、同じ波長で発光し、例えば、同一であり、例えば、Ｃｙ５（Ｒ）のような同じ蛍光体である。第１の検出可能な標識と第２の検出可能な標識が同じ波長で発光し、例えば、同一である具体的な実施形態において、ＦＲＥＴ化合物の量は、典型的には、レポーター化合物の種と比較して過剰に、例えば、５倍から１００倍過剰、または１０倍から８０倍過剰、または２０倍から５０倍過剰、または３０倍から４０倍過剰に存在する。
【０１０５】
このような標識を検出するために、ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値と、結合部材（例えば、マイクロアレイ）に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を両方決定するのに適した検出システムを使用してもよい。検出システムを、以下に記載する試験デバイスを保持するように調整してもよい。典型的には、検出システムは、結合部材に対向するように配置される。適切な検出システムの選択は、例えば、検出に使用する標識の種類または行われる分析の種類といった種々のパラメータに依存する。種々の光学検出システムは、当該技術分野で十分に確立されている。この方法と共に使用可能な検出システムの一般的な記載は、例えば、Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．およびＺｏｒｂａｓ  Ｈ．（前出）の中に見出すことができる。
【０１０６】
典型的には、検出システムは、蛍光体で標識された、分光的に励起された核酸の蛍光強度の比較に基づく。蛍光は、特定の波長の光によって励起されると、特定の分子自身が発光し、特徴的な吸収と発光挙動を生じる能力である。特に、蛍光シグナルの定量的な検出は、改変された蛍光顕微鏡法を用いることによって行われる（総説について、例えば、Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ｊ．Ｗ．およびＣｏｎｃｈｅｌｌｏ，Ｊ．Ａ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２、９１０−９１９；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｔ．（２００５）Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９５、２４５−２６５を参照）。これによって、光の吸収および発光から生じるシグナルは、それぞれ、１つ以上のフィルタおよび／またはダイクロアイトによって分割され、適切な検出器で画像化されてもよい。データ分析は、デジタル画像処理によって行われる。画像処理は、当該技術分野でよく知られた幾つかのソフトウェアパッケージを用いて達成されてもよい（例えば、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、ＥＩＫＯＮＡ、またはＩｍａｇｅ−ＰＲＯ）。このような目的のための適切なソフトウェアは、Ｉｃｏｎｏｃｌｕｓｔソフトウェア（Ｃｌｏｎｄｉａｇ  Ｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ、イェーナ、ドイツ）である。
【０１０７】
適切な検出システムは、エピ蛍光のような蛍光シグナルを測定するための「伝統的な」方法または暗視野観察法に基づいていてもよい（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．（１９９９）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、第２版、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、ＮＹにまとめられている。）。
【０１０８】
使用可能な別の光学検出システムは、共焦点顕微鏡法であり、点光源を介し、レンズの焦点面で物体に照射する。点光源、物体および点光検出器は、光学的に共役な面に配置されてもよい。このような共焦点システムの例は、例えば、Ｄｉａｓｐｒｏ，Ａ．（２００２）Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ａｎｄ  ２−ｐｈｏｔｏｎ−ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｄｖａｎｃｅｓ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｈｏｂｒｏｋｅｎ、ＮＪに詳細に記載されている。この蛍光光学システムは、通常、オートフォーカスのついていない蛍光顕微鏡、例えば、焦点が固定された蛍光顕微鏡である。
【０１０９】
さらに使用可能なさらなる蛍光検出方法としては、特に、全内部反射蛍光顕微鏡（例えば、Ａｘｅｌｒｏｄ，Ｄ．（１９９９）Ｓｕｒｆａｃｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｗｉｔｈ  ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ、Ｌａｃｅｙ，Ａ．（編集）Ｌｉｇｈｔ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３９９−４２３を参照）、蛍光寿命画像顕微法（例えば、Ｄｏｗｌｉｎｇ，Ｋ．ら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｄ．Ｏｐｔｉｃｓ  ４６、１９９−２０９を参照）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ；例えば、Ｐｅｒｉａｓａｍｙ，Ａ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔｉｃｓ  ６、２８７−２９１を参照）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ；例えば、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｔ．およびＨａｓｔｉｎｇｓ，Ｊ．Ｗ．（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１４、１９７−２３０）および蛍光相関分光法（例えば、Ｈｅｓｓ，Ｓ．Ｔ．ら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１、６９７−７０５を参照）が挙げられる。
【０１１０】
ある実施形態において、本方法は、さらに、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を基準として、第２の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定することを含む。特に、特定のサンプル中に存在する１つ以上の第２の核酸の存在および／または量は、第２の核酸／レポーター分子の複合体を形成する前に存在するレポーター化合物の存在および／または量と、複合体を形成した後の結合部材に捕捉されたレポーター化合物の量との差に基づいて計算されてもよい。
【０１１１】
検出反応を行うために、レポーター化合物は、上述のような１つ以上の検出可能な標識を含んでいてもよい。例えば、レポーター化合物は、２つの検出可能な標識を含んでいてもよい。具体的な実施形態において、検出可能な標識は、上述のような蛍光標識である。検出可能な標識は、例えば、改変および／または標識されたリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの形態でレポーター分子に組み込まれてもよく、または接続してもよい。
【０１１２】
このような標識を検出するために、本方法を行うために使用される試験デバイスは、さらに、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定するのに適した検出システムを備えていてもよい。例えば、上述のような、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定するのに適した検出システムを使用してもよい。
【０１１３】
第１の核酸および／または第２の核酸の存在および／または量の指標となる値の検出／決定は、アッセイを行う間に１回だけ、または１回より多く行われてもよい。１回のアッセイ中に１回より多い検出工程が行われる場合、ある実施形態において、得られる結果の平均値が計算されてもよい。特に、１つ以上の第１の核酸または第２の核酸の存在、長さまたは配列を決定し、この量を計算するために、１回以上の検出サイクルで得られるデータが分析され、当業者に知られている適切なコンピュータソフトウェアを用いた計算により処理されてもよい。
【０１１４】
ある実施形態において、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定することは、指標となる値の時間依存的なモニタリング、例えば、決定／検出工程の反復実施および時間経過に伴う一連の目標となる値のモニタリングを含む。これに加え、またはこれに代えて、ＦＲＥＴ化合物の存在および／または量の指標となる値を決定することは、指標となる値の時間依存的なモニタリング、例えば、決定／検出工程の反復実施および時間経過に伴う一連の目標となる値のモニタリングを含む。
【０１１５】
幾つかの実施形態において、第１の核酸および／または第２の核酸に等温増幅を行い、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値および／またはＦＲＥＴ化合物の存在および／または量の指標となる値の時間依存的なモニタリングは、毎秒、２秒ごと、３秒ごと、５秒ごと、１０秒ごと、２０秒ごと、３０秒ごと、６０秒ごと、９０秒ごと、または１２０秒ごとに決定／検出工程を行うことを含んでいてもよい。
【０１１６】
幾つかの実施形態において、第１の核酸および／または第２の核酸に等温増幅を行い、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値および／またはＦＲＥＴ化合物の存在および／または量の指標となる値の時間依存的なモニタリングは、毎周期、２周期ごと、３周期ごと、４周期ごと、または５周期ごとに決定／検出工程を行うことを含んでいてもよい。
【０１１７】
さらなる実施形態において、第２の核酸の存在および／または量の指標となる値は、レポーター化合物の存在および／または量の指標となる値と、第２の核酸の存在および／または量の指標となる値との相関関係を示す検量曲線に基づいて決定される。
【０１１８】
ある実施形態において、本方法は、さらに、所定量のレポーター化合物の一部と所定量の第２の核酸の少なくとも一部との複合体を形成した後に、前記所定量のレポーター化合物の残りの部分を結合部材から放出させることと、前記所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉することと、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定することとを含む。「放出させる」という用語は、本明細書で使用される場合、レポーター分子を結合部材から脱離すること、または結合を解くことを意味する。このことは、例えば、任意の共有結合の開裂を介し、酵素的に達成されてもよく、または、核酸レポーター分子が、相補的な塩基対形成を介し、レポーターに特異的な核酸捕捉分子によって結合部材に結合している場合には、アッセイを行う反応チャンバー内の温度を上げることによって、核酸鎖の分離（即ち、変性）が行われる。
【０１１９】
さらなる実施形態において、放出させ、複合体を形成し、捕捉し、決定する工程は、さらにＮ回繰り返され、ここで、Ｎは、１以上の整数である。言い換えると、本方法は、周期的な様式で行われる。具体的な実施形態において、整数Ｎは、５以上、１０以上または２０以上である。
【０１２０】
さらに、所定量のレポーター化合物の一部と所定量の第２の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程と、前記所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程は、同時に行われてもよい。
【０１２１】
他の実施形態において、（ｉ）第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成する工程、（ｉｉ）所定量のレポーター化合物の一部と、所定量の第２の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程、（ｉｉｉ）所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程が、同時に行われてもよい。
【０１２２】
ある実施形態において、本方法は、さらに、第１の核酸および第２の核酸を増幅させること、即ち、さらなる検出を容易にするために、第１の核酸および第２の核酸にさらなる分析を行う前に、サンプル中に存在する量を増やすことを含む。
【０１２３】
第１の核酸および第２の核酸の増幅は、所定量のレポーター化合物の一部と、所定量の第２の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程の前に開始されてもよい。特に、レポーター化合物と第２の核酸との複合体を形成し、レポーター化合物は、第２の核酸と複合体を形成せず、結合部材に再び捕捉される状態で、複数の核酸が増幅されてもよい。
【０１２４】
具体的な実施形態において、（ｉ）第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成する工程、（ｉｉ）所定量のレポーター化合物の一部と、所定量の第２の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程、（ｉｉｉ）所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程、（ｉｖ）第１の核酸および／または第２の核酸を増幅させる工程が、同時に行われる。
【０１２５】
典型的には、核酸増幅は、等温増幅法によって達成される。等温条件で核酸を増幅すると、サーモサイクリング装置の使用を避けることができる。転写が介在する増幅、核酸配列に基づく増幅、シグナルが介在するＲＮＡ増幅技術、ストランド置換増幅、ローリングサークル増幅、ループが介在する等温増幅、等温の複数置換増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、単一プライマーによる等温増幅、環状ヘリカーゼ依存性増幅を含め、当業者に知られている等温核酸増幅方法が何種類か存在する。等温核酸増幅技術は、例えば、Ｐ．ＧｉｌｌおよびＡ．Ｇｈａｅｍｉ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、２７（３）：２２４−２４３（２００８）にまとめられている。
【０１２６】
本明細書に記載される方法で使用するための例示的な等温増幅は、ニッキング酵素によって作られるニックで開始し、標的配列から多くの短い核酸を迅速に産生するストランド置換ＤＮＡポリメラーゼを使用してもよいニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）である。
【０１２７】
本明細書に記載される方法で使用するための別の例示的な等温増幅は、標的ＤＮＡの例えば６から８個の別個の領域を認識する、例えば４から６のプライマーを使用するループが介在する等温増幅（ＬＡＭＰ）である。ストランド置換ＤＮＡポリメラーゼは、合成を開始し、プライマーのうち、２つがループ構造を形成し、次の回の増幅を促進する。
【０１２８】
本明細書に記載される方法で使用するための別の例示的な等温増幅は、ストランド置換ＤＮＡポリメラーゼ、典型的には、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｌａｒｇｅ  ＦｒａｇｍｅｎｔまたはＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（３’−５エキソ−）に依存し、ストランドによって制限される制限エンドヌクレアーゼまたはニッキング酵素によって、プライマー中に含まれる部位に作られるニックで開始するストランド置換増幅（ＳＤＡ）である。ニッキング部位は、それぞれのポリメラーゼ置換工程で再生され、指数関数的な増幅が得られる。
【０１２９】
本明細書に記載される方法で使用するための別の例示的な等温増幅は、ヘリカーゼが二本鎖ＤＮＡを解き、鎖を分離する活性を使用し、ストランド置換ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーアニーリングおよび伸長を可能にするヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）である。ＰＣＲと同様に、この系は、２つのプライマーのみを必要とする。
【０１３０】
ある実施形態において、第１の核酸の存在および／または量を決定するために上述のＦＲＥＴ化合物（例えば、分子ビーコン）が使用され、等温増幅中に第２の核酸の存在および／または量を決定するために上述のレポーター化合物が使用される。このような実施形態において、第１の核酸の存在および／または量は、第１の核酸に特異的に結合し、溶液中に存在する増幅された第１の核酸の量に依存して、上述の溶液中でシグナルを生成するＦＲＥＴ化合物（例えば、分子ビーコン）を用いることによって決定されてもよい。第２の核酸の存在および／または量は、第２の核酸と、結合部材（例えば、マイクロアレイ）の表面に接続したレポーターに特異的な捕捉分子とに特異的に結合する標識されたレポーター化合物によって、結合部材（例えば、マイクロアレイ）の表面で作られるシグナルを検出することによって決定されてもよい。
【０１３１】
代替的な実施形態において、核酸増幅は、周期的な増幅によって達成される。周期的な増幅は、２回以上の増幅周期を含んでいてもよい。通常は、周期的な増幅反応は、少なくとも１０回または少なくとも２０回の周期を含む。例示的な周期的な増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。ＰＣＲは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（前出）に詳細に記載される分子生物学で確立された標準的な方法である。典型的には、ＰＣＲは、熱に安定なＤＮＡポリメラーゼを使用することによって、二本鎖のＤＮＡ分子の増幅に使用される。
【０１３２】
ある実施形態において、増幅に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性、特に、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。このようなＤＮＡポリメラーゼの例としては、特に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼまたはＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（複数の供給業者から市販されている。）が挙げられる。この５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を用いることによって、ＤＮＡポリメラーゼは、第２の核酸に結合するレポーター分子の標識された５’末端を核酸分解するように攻撃し、このようなレポーター分子の段階的な変性が起きる。結果として、結合部材に捕捉されるレポーター化合物の量は、増幅反応中にさらに減少する。任意選択により、使用されるＤＮＡポリメラーゼは、初期のＤＮＡ鎖に特定の配列位置で加えられた正しくないヌクレオチドを除去するために、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性（「較正活性」）も示してもよい。この両方のエンドヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの例としては、特に、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる（酵素は両方とも種々の供給業者から市販されている。）。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、典型的には、検出可能なシグナルを作成し、および／または強めるためにレポーター化合物の変性が望ましい場合に使用される。
【０１３３】
ある実施形態において、上述のようなＦＲＥＴ化合物（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）は、第１の核酸の存在および／または量を決定するために使用され、上述のようなレポーター化合物は、周期的な増幅中に第２の核酸の存在および／または量を決定するために使用される。このような実施形態において、第１の核酸の存在および／または量は、第１の核酸に特異的に結合し、溶液中に存在する増幅された第１の核酸の量に依存して、上述の溶液中でシグナルを生成するＦＲＥＴ化合物（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）を用いることによって決定されてもよい。第２の核酸の存在および／または量は、第２の核酸と、結合部材（例えば、マイクロアレイ）の表面に接続したレポーターに特異的な捕捉分子とに特異的に結合する標識されたレポーター化合物によって、結合部材（例えば、マイクロアレイ）の表面で作られるシグナルを検出することによって決定されてもよい。
【０１３４】
第１の核酸および／または第２の核酸がＲＮＡ分子である場合、本方法は、第１の核酸および／または第２の核酸を増幅させる前に、上述のように第１の核酸および／または第２の核酸を逆転写させることをさらに含んでいてもよい。逆転写は、分子生物学における別の標準的な方法であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（前出）にも記載される。
【０１３５】
核酸（例えば、サンプル中の第１の核酸）の存在および／または量を決定する方法の典型的な実施形態において、増幅コントロールを使用し、増幅の阻害剤を検出してもよい。特に、第２の核酸は、内部陽性増幅コントロールおよび内部陰性増幅コントロールからなる群から選択される内部コントロール核酸であってもよい。このようなコントロール核酸を、サンプル、例えば、上述の体液サンプルに加えてもよい。
【０１３６】
内部増幅コントロールの構築は、当業者の選択および行動により、幾つかの様式で行うことができる。内部増幅コントロールの供給源は、クローン化された内部増幅コントロール配列を保有するプラスミドＤＮＡまたは精製されたＰＣＲ産物であってもよい。ある実施形態において、内部コントロール核酸は、通常の条件下で、通常は分析対象の体液サンプル中に存在しない人工核酸である。例えば、内部コントロール核酸は、増幅前に逆転写させることができるアーマードＲＮＡである。
【０１３７】
内部陽性増幅コントロール核酸または競争的な内部増幅コントロール核酸または内部陽性コントロールは、標的検体の部分的な配列または全配列から設計されてもよい。特に、第１の核酸および内部陽性増幅コントロール核酸は、同一のプライマー結合部位を有していてもよい。例えば、内部陽性増幅コントロール核酸は、第１の核酸の部分配列に対応する配列を有していてもよい。同じプライマーに結合する部位を共有することで、類似または実質的に同じ増幅条件が可能になるだろう。第１の核酸と内部陽性増幅コントロール核酸の競争を避けるために、対応するアンプリコンプライマーを過剰に与えてもよい。
【０１３８】
さらに、この実施形態において、結合部材の上のレポーター化合物に結合する部位（例えば、レポーターに特異的な捕捉プローブ）は、内部陽性増幅コントロール核酸と、任意選択により、結合部材の上の他のコントロール核酸との間の識別を可能にするために、内部陽性増幅コントロール核酸に特異的であってもよい。
【０１３９】
内部陰性増幅コントロール核酸または非競争的な内部増幅コントロール核酸は、標的検体または内部陽性増幅コントロール核酸と相同性を有する配列を本質的に含まない核酸であってもよい。例えば、内部陰性増幅コントロール核酸は、標的検体または第１の核酸または内部陽性増幅コントロール核酸を増幅させるために使用されるアンプリコンプライマーのためのプライマー結合部位を含まない配列を有していてもよい。
【０１４０】
さらに、この実施形態において、結合部材の上のレポーター化合物に結合する部位は、結合部材の上の陰性増幅コントロール核酸、内部陽性増幅コントロール核酸および他のコントロール核酸を識別することができるように、内部陰性増幅コントロール核酸に特異的であってもよい。内部陰性増幅コントロール核酸の増幅が存在しない状態で、内部陰性増幅コントロール核酸との複合体を形成することができるレポーター化合物に特異的なレポーター化合物に結合する部位でのシグナルは、この工程中に本質的に一定のままであると予想される。例えば、妥当性試験のために、内部陰性増幅コントロール核酸との複合体を形成することができるレポーター化合物に特異的なレポーター化合物に結合する部位でのシグナルは、報告されているＣｔ値が存在せず、一定のままである必要があり、さもなければ、この試験は、妥当ではないと考えられるだろう。
【０１４１】
本明細書に記載される方法に他のコントロールを使用してもよい。例えば、本明細書に記載する内部増幅コントロールに加えて、またはこれに代えて、コントロールは、陽性ハイブリダイゼーションコントロール、処理陽性コントロール、処理陰性コントロールおよび試薬コントロールから選択されてもよい。
【０１４２】
陽性ハイブリダイゼーションコントロールは、第１の核酸および第２の核酸のいずれかと複合体を形成することができないレポーター化合物であってもよい。
【０１４３】
処理陽性コントロールは、十分な量の標的検体が添加され、プロトコル全体で処理された陰性サンプルであってもよい。
【０１４４】
処理陰性コントロールは、プロトコル全体で処理され、密接に関係があるが、十分な量の標的検体ではない検体が添加された陰性サンプルを指していてもよい。
【０１４５】
非テンプレートコントロール（ブランク）は、すべての試薬を含有するが、標的または内部増幅コントロール核酸を含まないコントロールを指していてもよい。
【０１４６】
核酸増幅のために、構造または反応チャンバー内の温度を制御および／または調整するための１つ以上の温度制御ユニットおよび／または温度調整ユニットを含んでいてもよい方法を行うために、試験デバイスを使用してもよい。このような温度制御ユニットおよび／または温度調整ユニットは、１つ以上の別個の加熱および／または冷却要素を備えていてもよく、この要素が試験デバイスの反応チャンバーに直接接続していてもよい。典型的には、１つ以上の加熱および／または冷却要素は、熱伝導性材料から作られる。このような熱伝導性材料の例としては、特に、ケイ素、酸化アルミニウムセラミックのようなセラミック材料、および／または高品質の鋼鉄、アルミニウム、銅または真鍮のような金属が挙げられる。本明細書に記載される方法を行うのに適した温度制御ユニットおよび／または温度調整ユニットの例示的な詳細な記載は、ＷＯ０１／０２０９４中にも見出すことができ、関連する内容は、ここに明示的に言及されている。
【０１４７】
反応チャンバー中の温度の測定は、例えば、組み込まれた抵抗センサ、半導体センサ、光導波センサ、多色染料または液晶を用いることによって、当該技術分野で十分に確立された種々の方法によって行うことができる。さらに、反応チャンバー内の温度は、チャンバー本体に組み込まれた温度センサ、高温計または赤外線センサによって、または検出が行われる表面での屈折率またはサンプルのｐＨ値のようなパラメータの温度依存的変化を測定することによって、例えば、ｐＨ感受性の指示薬の色変化を測定することによって、決定することができる。
【０１４８】
ある実施形態において、例えば、安全性の理由のために、反応チャンバーは、核酸の増幅を開始する前に不可逆的に密封されてもよい。反応チャンバーの不可逆的な密封は、反応チャンバーの入口と、任意選択により出口を密封することによって達成されてもよい。例えば、反応チャンバーと接続する経路および／またはバルブは、熱によって密封されてもよく、または溶接されてもよい。プラスチックの経路またはバルブは、プラスチックが溶融し、経路またはバルブが閉じられるように、熱したピンと経路またはバルブとを接触させることによって、熱によって密封されてもよい。
【０１４９】
第１の核酸および／または第２の核酸を与える工程は、サンプル中に含まれる生体材料から第１の核酸および／または第２の核酸を放出させることを含んでいてもよい。この目的のために、（例えば、温度制御ユニットおよび／または温度調整ユニットを使用することによって）細胞膜および／またはウイルスカプシドを破壊するためにサンプルを加熱してもよい。ある実施形態において、この放出させる工程は、流体サンプルと、溶解試薬（例えば、細胞膜および／またはウイルスカプシドを分解する１つ以上の洗剤を含む試薬）と接触させることを含む。このような溶解試薬は、当該技術分野でよく知られており（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照）、多くの供給業者から市販されている。
【０１５０】
本方法は、混入材料から第１の核酸および／または第２の核酸を分離することをさらに含んでいてもよい。
【０１５１】
ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値と、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値は、連続して、または同時に決定されてもよい。
【０１５２】
次に、典型的には最も良く実施することができ、例えば、本明細書に記載される方法のすべての工程を実施することができる試験デバイスまたはアッセイシステムまたは微小流体カートリッジの実施形態を記載する。例示的な試験デバイス、反応チャンバーおよび対応する方法は、ＷＯ２００５／１０８６０４、ＷＯ２００８／０５５９１５、ＷＯ２００８／１３５５６４およびＴ．Ｕｌｒｉｃｈら、ＰｌｏＳ  ＯＮＥ、７、４、ｅ３５４３８（２０１２）にも記載され、関連する内容は、ここに明示的に言及されている。特に、本明細書に記載される方法は、溶液からのバックグラウンドシグナルを除去することによって、増幅中に結合部材に捕捉されるレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定することができる試験デバイスで行われてもよい。一実施形態において、試験デバイスの反応チャンバーからの溶液の除去は、可逆的である。例えば、増幅および検出のために、以下に記載される反応チャンバーを備える試験デバイスを使用してもよい。
【０１５３】
特に、溶液中のＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値および／または結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値は、結合部材とカバー要素とを備える反応チャンバー中で決定されてもよい。結合部材は、カバー要素の上に配置されていてもよく、またはカバー要素と対向する表面に配置されていてもよい。これらの実施形態において、カバー要素は、反応チャンバーが緩和された状態の内容積と圧縮された状態の内容積を有するように少なくとも部分的に変形可能なように構成されてもよい。
【０１５４】
具体的な実施形態において、溶液中のＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値および／または結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値は、第１の表面と、第２の表面と、レポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材とを備える反応チャンバー中で決定されてもよく、第１の表面と第２の表面との距離は、反応チャンバーが緩和された状態の内容積と圧縮された状態の内容積を有するように変動可能であってもよい。
【０１５５】
特に、圧縮された状態の内容積を有する反応チャンバーにおいて、結合部材に結合しなかった検出可能な標識を含む液体は、結合部材と、結合部材と対向する反応チャンバー表面との間の領域から除去される。従って、緩和された状態の内容積を有する反応チャンバーにおいて、結合部材に結合しなかった検出可能な標識を含む液体は、結合部材と、結合部材と対向する反応チャンバー表面との間の領域から除去されない。
【０１５６】
特に、ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値は、緩和された状態の内容積を有する反応チャンバー中で決定される。さらに、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値は、圧縮された状態の内容積を有する反応チャンバー中で決定されてもよい。
【０１５７】
例えば、捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定することは、可撓性のカバー要素を変形させるように駆動するアクチュエーターを用いて行われてもよい。カバー要素は、反応チャンバーの体積が減少するような様式で変形してもよい。このような実施形態において、反応チャンバーの体積は、捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定した後に、再び増加してもよい。これに加えて、またはこれに代えて、検出中に、アクチュエーターが反応チャンバーを圧縮し、可撓性のカバー要素と基材との距離を小さくすることによって、結合部材に結合しなかった材料を含む液体を検出ゾーンから除去してもよい。
【０１５８】
例示的な実施形態において、結合部材は、反応チャンバー中に与えられ、第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成する工程；所定量のレポーター化合物の一部と第２の核酸との複合体を形成する工程；および前記所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程が、反応チャンバー中で行われる。さらに、第１の核酸および／または第２の核酸を増幅させ、および／またはレポーター化合物を結合部材に（再）捕捉することも、反応チャンバー中で行われてもよい。
【０１５９】
第１の核酸および／または第２の核酸を与えることは、第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成する工程；所定量のレポーター化合物の一部と第２の核酸との複合体を形成する工程；第１の核酸および／または第２の核酸を増幅させる工程；前記所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程；ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定する工程；結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定する工程から、空間的に分離した状態で行われてもよい。
【０１６０】
本明細書に記載される方法は、例えば、液体を収容するように調整された反応チャンバーを備える試験デバイスで行われてもよく、反応チャンバーは、少なくとも１つの結合部材を含み、例えば、微小流体のネットワークによって液体が流れる状態になっている。例えば、本方法は、剛性基材と、この基材を少なくとも部分的に覆う可撓性のカバー要素と、液体を収容するように調整された基材に作られる構造または反応チャンバーとを備え、レポーター化合物を捕捉するように調整され、レポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定するための少なくとも１つの結合部材と、任意選択により、少なくとも反応チャンバーとさらなる構造（例えば、第１の核酸および／または第２の核酸を与えるための構造）とを相互に接続する微小流体のネットワークを備える試験デバイスで行われてもよい。試験デバイスは、検出システムに対して配置されてもよく、または検出システムの中に配置されてもよい。このような検出システムは、可撓性のカバー要素を剛性基材に押しつけるように調整されたアクチュエーターユニットを備えていてもよい。
【０１６１】
例示的な試験デバイスは、図１に模式的に示される。このような試験デバイスの機械モジュールは、試験デバイスの反応チャンバーを可逆的に搾り、緩和するために使用されるプランジャーまたはアクチュエーター（ａ）を備えていてもよい。温度制御モジュールは、中央に開口部を有する２つのペルチェ要素（ｂ）を備えていてもよい。結合部材（例えば、アレイ）の蛍光画像（ｃ）は、光学検出モジュール（ｄ）によって獲得されてもよい。すべての要素の同期された同時実施は、プロセス制御モジュール（ｅ）によって制御されてもよく、このモジュールは、増幅反応の熱レジームも制御する。画像を獲得した後、ハイブリダイゼーションパターンは、画像分析モジュールによって分析される。結果は、結合部材のそれぞれの個々のプローブについて、反応時間に対する強度のプロットとして視覚化されてもよい。
【０１６２】
例示的な反応チャンバーは、図２に模式的に示される。試験デバイスの圧縮されていない反応チャンバーは、高濃度の蛍光標識されたレポータープローブを含む反応混合物で満たされていてもよい。このため、バックグラウンドに対する結合部材（例えば、捕捉プローブアレイ）でのハイブリダイゼーションパターンの画像作成は、実行可能ではない（ａ）。画像獲得のために、プランジャーまたはアクチュエーター（ｂ）を用いることによって圧力が加えられてもよく、結合部材（ｃ）は、反応チャンバーの上側に対して強く圧縮されるため、蛍光液体（ｄ）を移動する。移動した液体は、組み込まれた油圧スプリング（ｅ）に圧縮されてもよい。画像獲得（ｆ）の後、反応チャンバーが緩和され、液体サンプルを、緩和された反応チャンバーに戻すことができる。
【０１６３】
上述の試験デバイスおよび反応チャンバーで行われる例示的な方法において、サンプルは、競争的なレポーター化合物と、ドナー発色団に特異的なアンプリコンが作られるとすぐにサンプル中の蛍光シグナルを変える分子ビーコンとを含んでいてもよい。結合部材は、レポーター化合物との複合体を形成するのに適したレポーターに特異的な捕捉化合物を含むマイクロアレイを備え、マイクロアレイ上で蛍光シグナルを作成してもよい。レポーター化合物は、さらに、増幅産物（例えば、内部陽性増幅コントロールまたは内部陰性増幅コントロールとして使用される模倣フラグメント）中の配列に特異的である。反応を開始させた後、溶液の画像およびマイクロアレイの画像は、交互に作られる（図３を参照）。
【０１６４】
データ分析は、溶液から得られる画像およびマイクロアレイから得られる画像を用い、別個に行われる（図４を参照）。
【０１６５】
図４（ａ）に記載されるように、溶液中の蛍光強度は、分子ビーコンと、第１の核酸の合成された増幅産物との複合体を形成することに起因して大きくなる。図４（ａ）には、ＮＥＡＲ増幅の特徴的な曲線が示されている。図４（ｂ）は、溶液中の第２の核酸の合成された増幅産物に対するレポーター化合物の結合に起因する蛍光シグナルの減少を示す。
【０１６６】
本明細書に記載する方法を、イムノアッセイおよびポイントオブケア核酸試験で使用してもよい。
【０１６７】
以下の実施例は、単に具体的な実施形態を示すためのものであり、本開示の範囲をいかなる様式にも限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１６８】
［実施例１］
圧縮可能な反応チャンバーと、レポーター化合物を捕捉することができる結合部材としてアレイを備える図１および図２に記載される試験デバイス中、等温ＮＥＡＲを用いることによって、結核ＤＮＡを増幅した。このサンプルは、プライマー（逆プライマー：Ｔｂ＿ＤＲ＿Ｒ２５ｃ  ５’−ＡＧＡＣＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＴＣＴＣＡＴＣＴＴＴＣＣＧＴＣＣＣＣ−３’、順プライマー：Ｔｂ＿ＤＲ＿Ｆ１６  ５’−ＣＧＡＣＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＴＣＧＴＣＧＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＡＡ−３’）；分子ビーコンＭＢ＿Ｐ２＿７（５’−ＴＣＧＧＧＧＣＡＧＡＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＣＧＡ−３’）；レポーター化合物Ａｎｔｉ＿Ｔｂ＿Ｔａｒｇｅｔ＿ＣＭＡ（５’−ＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＣＧＡＧＡＧＧ−３’）；酵素（ニッキング酵素およびストランド置換酵素）および標的ＤＮＡを含んでいた。コントロール反応として、標的ＤＮＡを用いずに、即ち、テンプレートコントロールを用いずに増幅を行った。増幅を５６℃で６００秒間行った。画像を１５秒ごとに撮った。結果を図５（ａ）および図５（ｂ）に示す。
【０１６９】
競争的なレポーターによってモニタリングされた増幅と分子ビーコンの比較を示す図５（ａ）からわかるように、溶液中の蛍光は、分子ビーコンと標的ＤＮＡとの複合体を形成することに起因して大きくなる。さらに、アレイでのレポーター化合物のシグナルは、レポーター化合物がＮＥＡＲ増幅産物との複合体を形成するため、減少することもわかるだろう。
【０１７０】
標的ＤＮＡを用いないコントロール反応において、競争的なレポーターによってモニタリングされた増幅と分子ビーコンの比較を示す図５（ｂ）からわかるように、標的ＤＮＡが存在しないことに起因して、溶液中の蛍光は、時間経過に伴って一定のままであることがわかるだろう。さらに、典型的な光漂白効果とは異なり、アレイでのレポーター化合物のシグナルは減少しない。
【０１７１】
［実施例２］
内部陽性コントロール（ＩＰＣ）および陽性ハイブリダイゼーションコントロール（ＰＨＣ）の存在下、結核ＤＮＡの検出
圧縮可能な反応チャンバーと、レポーター化合物を捕捉することができる結合部材としてアレイを備える図１および図２に記載される試験デバイス中、等温ＮＥＡＲを用いることによって、結核ＤＮＡ（標的ＤＮＡ）および内部陽性コントロールＤＮＡ（ＩＰＣ）を増幅した。標的検体とＩＰＣのテンプレートは、プライマー結合部位に同じ配列を有していたが、レポーター化合物とＦＲＥＴ化合物（ここでは分子ビーコン）のための結合部位の配列はそれぞれ異なっていた。従って、両アンプリコンは、同じプライマーによって増幅させることができ、異なるプローブによって互いに独立して検出することができた。
【０１７２】
この増幅反応混合物は、プライマー（逆プライマーＴＢ＿ＤＲ＿２５ｃ、順プライマーＴｂＤＲ＿Ｆ１６）、分子ビーコンＭＢ＿ＰＳ＿７、ＩＰＣレポーター化合物およびＩＰＣを含んでいた。さらに、ＩＰＣレポーターのシグナル強度の変化が、ＩＰＣアンプリコンの存在に特異的であることを示すために、ＩＰＣアンプリコンと複合体を形成することができないレポーター化合物を、陽性ハイブリダイゼーションコントロール（ＰＨＣ：５’−ｃｃｇａｃｔａｃｔａｃｇｇｇａｃｇｃｔｇｇｇａ−３’）として加えた。従って、このＰＨＣコントロールは、このハイブリダイゼーション動態がＩＰＣレポーターとは異なる。
【０１７３】
標的テンプレート：１００  ＧＥ（ゲノム等価物）
標的  ＩＰＣ  ５００  ＧＥ
順プライマーの濃度  ７５０ｎｍ
逆プライマーの濃度  ５０ｎｍ
レポーターＩＰＣの濃度：１０ｎｍ
レポーターＰＨＣの濃度：１０ｎｍ
分子ビーコンの濃度  ２００ｎＭ
増幅を５６℃で約６００秒間行った。画像を１５秒ごとに撮った。結果を図６および図７に示す。
【０１７４】
内部陽性コントロールＤＮＡは、標的ＤＮＡと比較して、初期に５倍過剰に存在するが、標的ＤＮＡは、内部陽性コントロールＤＮＡと同じアッセイで検出することができる（溶液中のＦＲＥＴ化合物によって捕捉された標的検体の検出と、アレイでの内部陽性コントロールレポーターの検出）。溶液中に競争剤が存在しないことに起因して、ＰＨＣの一連のシグナル強度は、二次速度論を有する。
【０１７５】
ある実施形態は、以下のものに関する。
【０１７６】
１．
サンプル中の核酸の存在および／または量を決定するための方法であって、
（ａ）
所定量の第１の核酸；
所定量の第２の核酸；
第１の核酸の領域に特異的な結合部分と、複合体を形成していない状態では、第１の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態では、第２の検出可能な特徴を有する第１の検出可能な標識とを含み、第１の核酸と複合体を形成することができる所定量のＦＲＥＴ化合物、
それぞれが第２の核酸の領域に特異的な結合部分と、第２の検出可能な標識とを含み、第２の核酸と複合体を形成することができる所定量のレポーター化合物；および
レポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材を提供すること、
ここで、第２の核酸とレポーター化合物との複合体の形成により、結合部材によるレポーター化合物の捕捉が阻害される、
（ｂ）第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
（ｃ）所定量のレポーター化合物の一部と第２の核酸との複合体を形成すること、
（ｄ）前記所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
（ｅ）ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定すること、
（ｆ）結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定することとを含む、方法。
【０１７７】
２．
結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を基準として、第２の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定することをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
【０１７８】
３．
第１の検出可能な標識が蛍光標識である、実施形態１または２に記載の方法。
【０１７９】
４．
第２の検出可能な標識が蛍光標識である、実施形態１から３のいずれか１項に記載の方法。
【０１８０】
５．
第１の検出可能な標識および第２の検出可能な標識が両方とも蛍光標識である、実施形態１から４のいずれか１項に記載の方法。
【０１８１】
６．
第１の検出可能な標識および第２の検出可能な標識が両方とも３００ｎｍから８５０ｎｍの範囲の波長で発光する、実施形態５に記載の方法。
【０１８２】
７．
第１の検出可能な標識と第２の検出可能な標識が同じである、実施形態５または６に記載の方法。
【０１８３】
８．
ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値が、複合体を形成した状態のＦＲＥＴ化合物で決定される、実施形態１から７のいずれか１項に記載の方法。
【０１８４】
９．
第１の核酸が検体である、実施形態１から８のいずれか１項に記載の方法。
【０１８５】
１０．
第２の核酸が、第２の検体およびコントロール核酸からなる群から選択される、実施形態１から９のいずれか１項に記載の方法。
【０１８６】
１１．
第１の核酸が、サンプルあたり１００コピー数に満たない量で存在する、実施形態１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【０１８７】
１２．
第２の核酸が、サンプルあたり１００コピー数以上の量で存在する、実施形態１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【０１８８】
１３．
（ｉ）第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成する工程、（ｉｉ）所定量のレポーター化合物の一部と、所定量の第２の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程、（ｉｉｉ）所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程が、同時に行われる、実施形態１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【０１８９】
１４．
第１の核酸および第２の核酸を増幅させることをさらに含み、任意選択により、第１の核酸および第２の核酸の増幅が、所定量のレポーター化合物の一部と、所定量の第２の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程の前に開始される、実施形態１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【０１９０】
１５．
（ｉ）第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成する工程、（ｉｉ）所定量のレポーター化合物の一部と、所定量の第２の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程、（ｉｉｉ）所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程、および（ｉｖ）第１の核酸および／または第２の核酸を増幅させる工程が、同時に行われる、実施形態１４に記載の方法。
【０１９１】
１６．
第２の核酸が、陽性増幅コントロールおよび陰性増幅コントロールからなる群から選択される、実施形態１４または１５に記載の方法。
【０１９２】
１７．
結合部材は、レポーター化合物を結合部材に捕捉することができる、１つ以上の異なるレポーターに特異的な捕捉化合物を含む、実施形態１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【０１９３】
１８．
レポーターに特異的な捕捉化合物がオリゴヌクレオチドである、実施形態１７に記載の方法。
【０１９４】
１９．
異なるレポーターに特異的な捕捉化合物が、結合部材に対して異なる位置に配置されている、実施形態１７または１８に記載の方法。
【０１９５】
２０．
レポーターに特異的な捕捉化合物との複合体を形成することによって、レポーター化合物が結合部材に捕捉される、実施形態１７から１９のいずれか１項に記載の方法。
【０１９６】
２１．
第２の核酸と複合体を形成することができるレポーター化合物の相互作用部位の少なくとも一部が、レポーターに特異的な捕捉化合物との複合体を形成することもできる、実施形態１７から２０のいずれか１項に記載の方法。
【０１９７】
２２．
レポーターに特異的な捕捉化合物と第２の核酸が、レポーター化合物との複合体の形成について競合する、実施形態１７から２１のいずれか１項に記載の方法。
【０１９８】
２３．
ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値および／または結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値が、結合部材とカバー要素とを備える反応チャンバー中で決定される、実施形態１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【０１９９】
２４．
反応チャンバーが緩和された状態の内容積と圧縮された状態の内容積を有するように、カバー要素は、少なくとも部分的に変形可能なように構成されている、実施形態２３に記載の方法。
【０２００】
２５．
ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値が、緩和された状態の内容積を有する反応チャンバー中で決定される、実施形態２４に記載の方法。
【０２０１】
２６．
結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値が、圧縮された状態の内容積を有する反応チャンバー中で決定される、実施形態２３から２５のいずれか１項に記載の方法。
【０２０２】
２７．
ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値と、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値が、連続して、または同時に決定される、実施形態１から２６のいずれか１項に記載の方法。
【０２０３】
２８．
レポーター化合物がオリゴヌクレオチドである、実施形態１から２７のいずれか１項に記載の方法。
【０２０４】
２９．
第１の核酸および／または第２の核酸を増幅させる前に、第１の核酸および／または第２の核酸を逆転写させることをさらに含む、実施形態１から２８のいずれか１項に記載の方法。
【０２０５】
３０．
増幅が、二本鎖の核酸を変性する工程を含み、この二本鎖の核酸は、レポーター化合物と第２の核酸との複合体、レポーター化合物とレポーターに特異的な捕捉化合物との複合体、レポーター化合物の二本鎖および第１の核酸および／または第２の核酸の二本鎖を含み、および／または増幅は、プライマー化合物を第１の核酸および／または第２の核酸にアニーリングする工程を含み、任意選択により、アニーリングする工程は、所定量のレポーター化合物の一部と、第２の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程、および／または所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程と同時に行われる、実施形態１４から２９のいずれか１項に記載の方法。
【０２０６】
３１．
増幅は、等温増幅法であり、等温増幅法は、任意選択により、等温ＮＥＡＲである、実施形態１４から３０のいずれか１項に記載の方法。
【０２０７】
３２．
増幅は、周期的な増幅であり、周期的な増幅は、任意選択により、ＰＣＲであり、ＰＣＲを行うことは、任意選択により、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いることを含み、任意選択により、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値は、周期的な増幅の少なくとも１つの周期の後に決定され、任意選択により、周期的な増幅のそれぞれの周期の後に、任意選択により、第１の核酸および／または第２の核酸の存在および／または量の指標となる値が、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定した後に、それぞれの時間で決定される、実施形態１４から３０のいずれか１項に記載の方法。
【０２０８】
３３．
第２の核酸の存在および／または量の指標となる値が、レポーター化合物の存在および／または量の指標となる値と、第２の核酸の存在および／または量の指標となる値との相関関係を示す検量曲線に基づいて決定される、実施形態２から３２のいずれか１項に記載の方法。
【０２０９】
３４．
サンプル中の核酸の存在および／または量を決定する方法であって、
所定量の第１の核酸；所定量の第２の核酸；第１の核酸の領域に特異的な結合部分と、複合体を形成していない状態で第１の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態で第２の検出可能な特徴を有する第１の検出可能な標識とを含み、第１の核酸と複合体を形成することができる所定量のＦＲＥＴ化合物を提供すること、第２の核酸の領域に特異的な結合部分と、第２の検出可能な標識とを含み、第２の核酸と複合体を形成することができる所定量のレポーター化合物を反応チャンバー中に提供すること；反応チャンバーは、レポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材と、反応チャンバーが緩和された状態の内容積と圧縮された状態の内容積を有するように少なくとも部分的に変形可能なように構成されるカバー要素とを備え、第２の核酸とレポーター化合物との複合体の形成により、結合部材によるレポーター化合物の捕捉が阻害されること、
第１の核酸および／または第２の核酸を増幅させること、
第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
所定量のレポーター化合物の一部と第２の核酸との複合体を形成すること、
所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
緩和された状態の内容積を有する反応チャンバー中で、溶液中におけるＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定すること、
圧縮された状態の内容積を有する反応チャンバー中で、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定し、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を基準として、第２の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定することとを含む、方法。
【図１】
2020114225.tif 000003
【図２】
2020114225.tif 000004
【図３】
2020114225.tif 000005
【図４】
2020114225.tif 000006
【図５ａ】
2020114225.tif 000007
【図５ｂ】
2020114225.tif 000008
【図６】
2020114225.tif 000009
【図７】
2020114225.tif 000010
【配列表】
2020114225000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月10日(2020.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の核酸の存在および／または量を決定する方法であって、
（ａ）所定量の第１の核酸；
所定量の第２の核酸；
第１の核酸の領域に特異的な結合部分と、複合体を形成していない状態では第１の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態では第２の検出可能な特徴を有する第１の検出可能な標識とを含み、第１の核酸と複合体を形成することができる所定量のＦＲＥＴ化合物；
それぞれが第２の核酸の領域に特異的な結合部分と、第２の検出可能な標識とを含み、第２の核酸と複合体を形成することができる所定量のレポーター化合物；および
レポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材
を提供すること、
ここで、第２の核酸とレポーター化合物との複合体の形成により、結合部材によるレポーター化合物の捕捉が阻害される、
（ｂ）第１の核酸および／第２の核酸を増幅させること、
（ｃ）第１の核酸およびＦＲＥＴ化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
（ｄ）所定量のレポーター化合物の一部と第２の核酸との複合体を形成すること、
（ｅ）前記所定量のレポーター化合物のうち、第２の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
（ｆ）ＦＲＥＴ化合物によって捕捉された第１の核酸の存在および／または量の指標となる値を決定すること、および
（ｇ）結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および／または量の指標となる値を決定すること
を含む、方法。
【外国語明細書】
2020114225000001.pdf