(57)【要約】【課題】新規な細胞性免疫誘導剤を提供すること。【解決手段】宿主細胞への付着に関与する細胞付着サブユニット５量体と、毒素本体である毒性サブユニット１量体とからなる細菌毒素の、当該細胞付着サブユニットを２〜５個連結させたポリペプチドを含む第一構成要素と、  MHCクラスI抗原ペプチドを含む第二構成要素と、を含有することを特徴とする、複合体。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞への付着に関与する細胞付着サブユニット５量体と、毒素本体である毒性サブユニット１量体とからなる細菌毒素の、当該細胞付着サブユニットを２〜５個連結させたポリペプチドを含む第一構成要素と、
MHCクラスI抗原ペプチドを含む第二構成要素と、を含有することを特徴とする、複合体。
【請求項２】
MHCクラスI抗原ペプチドが、卵白アルブミンMHCクラスI抗原ペプチド、癌抗原ペプチド、及びウイルス抗原ペプチドから選択される１種類以上であることを特徴とする、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記細菌毒素の細胞付着サブユニットが、志賀毒素、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素、百日咳毒素及びサチラーゼ細胞毒素から選択される１以上の毒素の細胞付着サブユニットであることを特徴とする、請求項１または２に記載の複合体。
【請求項４】
前記細菌毒素の細胞付着サブユニットが、少なくとも志賀毒素２ｅのBサブユニットを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
前記細菌毒素の細胞付着サブユニットが、志賀毒素２ｅのBサブユニットのみを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
前記第一構成要素において、前記２〜５個の細胞付着サブユニットが、１０〜３０のアミノ酸残基からなるそれぞれ独立したペプチドリンカーを介して互いに連結したことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項７】
前記第一構成要素と前記第二構成要素が組成物として含まれることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項８】
前記第一構成要素と前記第二構成要素とが融合タンパク質として含まれることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項９】
前記融合タンパク質は、前記第一構成要素と前記第二構成要素とが１０〜３０のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを介して結合した融合タンパク質であることを特徴とする、請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
宿主細胞への付着に関与する細胞付着サブユニット５量体と、毒素本体である毒性サブユニット１量体とからなる細菌毒素の、当該細胞付着サブユニットを２〜５個連結させたポリペプチドと、MHCクラスI抗原ペプチドと、を含む融合タンパク質をコードするDNAを含むDNA構築物。
【請求項１１】
前記融合タンパク質は、前記ポリペプチドと前記MHCクラスI抗原ペプチドとが１２〜３０のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを介して結合した融合タンパク質であることを特徴とする、請求項１０に記載のDNA構築物。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載のDNA構築物が導入された形質転換体。
【請求項１３】
宿主細胞への付着に関与する細胞付着サブユニット５量体と、毒素本体である毒性サブユニット１量体とからなる細菌毒素の、当該細胞付着サブユニットを２〜５個連結させたポリペプチドを含む第一構成要素をコードするDNAを含む第一DNA構築物と、
MHCクラスI抗原ペプチドを含む第二構成要素をコードするDNAを含む第二DNA構築物と、が導入された、形質転換体。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の複合体を含む、医薬。
【請求項１５】
宿主細胞への付着に関与する細胞付着サブユニット５量体と、毒素本体である毒性サブユニット１量体とからなる細菌毒素の、当該細胞付着サブユニットを２〜５個連結させたポリペプチドを含む第一有効成分と、
MHCクラスI抗原ペプチドを含む第二有効成分と、を含有することを特徴とする、医薬。
【請求項１６】
細胞性免疫誘導剤である、請求項１４または１５に記載の医薬。
【請求項１７】
抗がん剤または抗ウイルス剤である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１８】
注射剤である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１９】
宿主細胞への付着に関与する細胞付着サブユニット５量体と、毒素本体である毒性サブユニット１量体とからなる細菌毒素の、当該細胞付着サブユニットを２〜５個連結させたポリペプチドを含む第一有効成分と、
MHCクラスI抗原ペプチドを含む第二有効成分と、を非ヒト哺乳動物に投与することを特徴とする、非ヒト哺乳動物における細胞性免疫誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞性免疫誘導作用を有する複合体に関し、抗がん剤や抗ウイルス剤などの医薬として使用される複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体によるがん細胞やウイルス感染細胞の排除には細胞性免疫、とりわけ抗原特異的T細胞である細胞傷害性T細胞（キラーT細胞またはCTLと呼ぶ場合もある）やヘルパーT細胞が中心的な働きをしている。抗原特異的T細胞は、樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞の細胞表面のMHC分子（ヒトの場合はHLA分子とも呼ばれる）と、がんやウイルスに由来する抗原タンパク質の断片ペプチドである抗原ペプチドとの結合複合体をT細胞受容体で認識して分化・増殖する。前記MHC分子に提示される抗原ペプチドは、通常8〜20アミノ酸程度の長さであることが知られている。分化・増殖した抗原特異的T細胞は、前記の抗原ペプチド−MHC分子結合複合体を提示しているがん細胞やウイルス感染細胞を特異的に傷害したり、各種サイトカインを産生することにより、抗腫瘍効果や抗ウイルス効果を発揮する。
【０００３】
ワクチンにより効率良く特異免疫を誘導するためには、主体となる抗原タンパク質や抗原ペプチドと組み合わせて非特異的な免疫賦活物質を投与することが有効である。このようなワクチン効果を増強する作用をもつ物質や剤形はアジュバントと呼ばれている。現在、ヒトへの適応が認められたアジュバントとして最も広く用いられているのはアルミニウム製剤であるが、いわゆるTh2型免疫応答を誘導し、液性免疫を増強するが、抗原特異的T細胞の誘導（細胞傷害性T細胞やTh1型免疫応答）は基本的に誘導しない。またIgE産生などの副作用の問題が指摘されている。
【０００４】
特許文献１には抗原ペプチドと志賀毒素2eのBサブユニット（Stx2eB）、大腸菌易熱性毒素のBサブユニット（LTB）及びコレラ毒素のBサブユニット(CTB)から選択される２以上のタンパク質とを含む融合タンパク質が開示されており、当該融合タンパク質がワクチンとして使用できることが開示されている。しかしながら、当該融合タンパク質の薬理作用は、抗原ペプチドに対して特異的に反応する抗体を産生させ、液性免疫（Th2）を増強することであり、細胞性免疫を誘導することは全く開示も示唆もない。
【０００５】
一方、特許文献２には、志賀毒素のBサブユニットと抗原ペプチドを融合したキメラタンパク質（B-X）が開示されており、これにより、細胞性免疫を誘導することが開示されている。しかし、図３や図５の実験データからは志賀毒素のBサブユニットと融合することの効果は見られず、さらに、志賀毒素のBサブユニットを２個以上連結させて用いることは開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2017/094793
【特許文献２】US6613882B
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、細胞性免疫の誘導剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の通り、特許文献１には抗原ペプチドとStx2eB、LTB及びCTBから選択される２以上のタンパク質とを含む融合タンパク質が液性免疫を亢進させ、ワクチンとして使用できることが開示されているが、液性免疫(Th2)を増強するアジュバントが必ずしも同時に細胞性免疫を誘導するとは限らないことがよく知られている。例えば、「次世代アジュバント開発のためのメカニズム解明と安全性評価」石井 健監修；シーエムシー出版（2017）第一章、１頁には、アジュバントの種類や組み合わせによって、主に抗体産生（B細胞活性）を誘導するもの、CD4陽性T細胞の中でもTh1型の獲得免疫を誘導するもの、Th2型を誘導するもの、Th17型を誘導するもの、または細胞傷害性T細胞（Cytotoxic T lymphocyte:CTL）、NKT細胞の活性を誘導するもの、といった様々な獲得免疫の方向性を制御することができることが開示されている。すなわち、獲得免疫の方向性によって採用するアジュバンドの種類や組み合わせを変更すべき事が知られている。したがって、抗原ペプチドに対して特異的に反応する抗体を産生させる効果が知られるStx2eB、LTB及びCTBから選択される２以上のタンパク質がMHCクラスI抗原ペプチドを介した細胞性免疫の誘導するために使用する理由は無い。
また、特許文献２に開示されている志賀毒素のBサブユニット１個と抗原ペプチドを融合したキメラタンパク質は、その効果には疑問があるのは上記のとおりであるが、仮に細胞性免疫誘導効果が正しいとしても、獲得免疫の方向性によって採用するアジュバンドの種類や組み合わせを変更すべきことが知られている本願発明の技術分野において、獲得免疫の方向性が異なる液性免疫に係る技術と細胞性免疫に係る技術とを組み合わせる理由は無い。また、組み合わせたとしても、志賀毒素のBサブユニット１個のところを２個以上にした場合、特許文献１の開示から、液性免疫に対して効果を発揮するようになると思われ、特許文献２のキメラタンパク質において、志賀毒素のBサブユニットを２個以上とする動機づけはない。
【０００９】
このような状況下、本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、Stx2eBやLTBなどの細菌毒素の細胞付着サブユニットを２〜５個連結させたポリペプチドとMHCクラスI抗原ペプチドを組み合わせて投与したところ、液性免疫（Th2）の増強に関係するこれらポリペプチドが、驚くべきことに、細胞性免疫の誘導、特に細胞傷害性T細胞（キラーT細胞）の誘導にも効果があることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明者らは、MHCクラスI抗原部位を含有する抗原ペプチドと、志賀毒素2eのBサブユニット（Stx2eB）、大腸菌易熱性毒素のBサブユニット(LTB)及びコレラ毒素のBサブユニット（CTB）などから選択される2〜5個の毒素タンパク質の細胞付着サブユニットを含むポリペプチドを動物に投与することにより、2〜5個の前記細胞付着サブユニットを含むポリペプチドが細胞性免疫誘導のアジュバントとして作用し、動物体内においてMHCクラスI抗原部位に対する抗原特異的T細胞であるキラーT細胞が誘導されることを見出し、このMHCクラスI抗原ペプチドと前記ポリペプチドとの複合体が優れた細胞性免疫の誘導剤として使用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は以下を提供する。
[１]  宿主細胞への付着に関与する細胞付着サブユニット５量体と、毒素本体である毒性サブユニット１量体とからなる細菌毒素の、当該細胞付着サブユニットを２〜５個連結させたポリペプチドを含む第一構成要素と、
MHCクラスI抗原ペプチドを含む第二構成要素と、を含有することを特徴とする、複合体。
[２]  MHCクラスI抗原ペプチドが、卵白アルブミンMHCクラスI抗原ペプチド、癌抗原ペプチド、及びウイルス抗原ペプチドから選択される１種類以上であることを特徴とする、[１]に記載の複合体。
[３]  前記細菌毒素の細胞付着サブユニットが、志賀毒素、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素、百日咳毒素及びサチラーゼ細胞毒素から選択される１以上の毒素の細胞付着サブユニ
ットであることを特徴とする、[１]または[２]に記載の複合体。
[４]  前記細菌毒素の細胞付着サブユニットが、少なくとも志賀毒素２ｅのBサブユニットを含むことを特徴とする、[１]〜[３]のいずれかに記載の複合体。
[５]  前記細菌毒素の細胞付着サブユニットが、志賀毒素２ｅのBサブユニットのみを含むことを特徴とする、[１]〜[４]のいずれかに記載の複合体。
[６]  前記第一構成要素において、前記２〜５個の細胞付着サブユニットが、１０〜３０のアミノ酸残基からなるそれぞれ独立したペプチドリンカーを介して互いに連結したことを特徴とする、[１]〜[５]のいずれかに記載の複合体。
[７]  前記第一構成要素と前記第二構成要素が組成物として含まれることを特徴とする、[１]〜[６]のいずれかに記載の複合体。
[８]  前記第一構成要素と前記第二構成要素とが融合タンパク質として含まれることを特徴とする、[１]〜[６]のいずれかに記載の複合体。
[９]  前記融合タンパク質は、前記第一構成要素と前記第二構成要素とが１０〜３０のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを介して結合した融合タンパク質であることを特徴とする、[８]に記載の複合体。
[１０]  宿主細胞への付着に関与する細胞付着サブユニット５量体と、毒素本体である毒性サブユニット１量体とからなる細菌毒素の、当該細胞付着サブユニットを２〜５個連結させたポリペプチドと、MHCクラスI抗原ペプチドと、を含む融合タンパク質をコードするDNAを含むDNA構築物。
[１１]  前記融合タンパク質は、前記ポリペプチドと前記MHCクラスI抗原ペプチドとが１２〜３０のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを介して結合した融合タンパク質であることを特徴とする、[１０]に記載のDNA構築物。
[１２]   [１０]または[１１]に記載のDNA構築物が導入された形質転換体。
[１３]  宿主細胞への付着に関与する細胞付着サブユニット５量体と、毒素本体である毒性サブユニット１量体とからなる細菌毒素の、当該細胞付着サブユニットを２〜５個連結させたポリペプチドを含む第一構成要素をコードするDNAを含む第一DNA構築物と、
MHCクラスI抗原ペプチドを含む第二構成要素をコードするDNAを含む第二DNA構築物と、が導入された、形質転換体。
[１４]   [１]〜[９]のいずれかに記載の複合体を含む、医薬。
[１５]  宿主細胞への付着に関与する細胞付着サブユニット５量体と、毒素本体である毒性サブユニット１量体とからなる細菌毒素の、当該細胞付着サブユニットを２〜５個連結させたポリペプチドを含む第一有効成分と、
MHCクラスI抗原ペプチドを含む第二有効成分と、を含有することを特徴とする、医薬。[１６]  細胞性免疫誘導剤である、[１４]または[１５]に記載の医薬。
[１７]  抗がん剤または抗ウイルス剤である、[１４]〜[１６]のいずれかに記載の医薬。[１８]  注射剤である、[１４]〜[１７]のいずれかに記載の医薬。
[１９]  宿主細胞への付着に関与する細胞付着サブユニット５量体と、毒素本体である毒性サブユニット１量体とからなる細菌毒素の、当該細胞付着サブユニットを２〜５個連結させたポリペプチドを含む第一有効成分と、
MHCクラスI抗原ペプチドを含む第二有効成分と、を非ヒト哺乳動物に投与することを特徴とする、非ヒト哺乳動物における細胞性免疫誘導方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、これまで誘導することが難しいとされてきたMHCクラスI抗原に対する細胞傷害性T細胞（キラーT細胞）を誘導することのできる細胞性免疫の誘導剤を提供することができる。これにより抗体産生（B細胞活性）の誘導だけでは効果が不十分であるウイルス、細胞内寄生細菌による病害やがんなどに対して予防や治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】卵白アルブミンMHCクラスIエピトープ（OVAepi）と、LTB、LTB-Stx2eB、Stx2eB-Stx2eBまたはフロイントコンプリートアジュバント（FCA）で処理された脾臓細胞を用いたELISPOT試験の結果を示すグラフ（OVAepiで刺激）。
【図２】OVAepiと、LTB-Stx2eBまたはStx2eB-Stx2eBの融合タンパク質で処理された脾臓細胞を用いたELISPOT試験の結果を示すグラフ（OVAepiで刺激）。
【図３】マウスサバイビン57-64（Msur57）とStx2eB-Stx2eBの融合タンパク質で処理された脾臓細胞を用いたELISPOT試験の結果を示すグラフ（各種がん細胞で刺激）。
【図４】Msur57とStx2eB-Stx2eBの融合タンパク質で処理された脾臓細胞のがん細胞傷害活性を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について説明する。
【００１５】
＜複合体＞
本発明の複合体は、宿主細胞への付着に関与する細胞付着サブユニット５量体と、毒素本体である毒性サブユニット１量体とからなる細菌毒素の、当該細胞付着サブユニットを２〜５個連結させたポリペプチドを含む第一構成要素と、
MHCクラスI抗原ペプチドを含む第二構成要素と、を含有することを特徴とする。
【００１６】
ここで、複合体とは、第一構成要素と第二構成要素の両方を含むものであればよく、第一構成要素と第二構成要素の含有のされ方は特に制限されず、後述のように、第一構成要素と第二構成要素とは、独立して存在する組成物（混合物など）として含有されていてもよいし、それぞれ少なくとも１以上の第一構成要素と第二構成要素とが直列に配列されて融合した融合タンパク質として含有されていてもよい。
【００１７】
＜第一構成要素＞
本発明の複合体の第一構成要素は、宿主細胞への付着に関与する細胞付着サブユニット５量体と、毒素本体である毒性サブユニット１量体とからなる細菌毒素の、当該細胞付着サブユニットを２〜５個連結させたポリペプチドを含む。なお、本発明の細菌毒素とは、前記細胞付着サブユニット５量体と毒性サブユニット１量体とからなる複合体であれば、特に限定されず、例えば、大腸菌、コレラ菌、百日咳菌などの病原性細菌によって産生される毒素タンパク質等が挙げられる。
【００１８】
宿主細胞への付着に関与する細胞付着サブユニット５量体と、毒素本体である毒性サブユニット１量体とからなる細菌毒素は、宿主細胞への付着に関与するサブユニット（Bサブユニットとも呼ばれる）が宿主の腸管粘膜細胞などの細胞表面のレセプターに結合し、それにより毒性サブユニット（Aサブユニットとも呼ばれる）を細胞内に送り込むという毒性作用機序を有するホロ毒素を意味する。ここで、「宿主細胞への付着」とは、宿主細胞の細胞膜への付着、細胞表面のタンパク質への付着だけでなく、宿主細胞表面に付着した後、細胞内に取り込まれる態様も含み、細胞付着サブユニットの宿主細胞への付着を介して、毒素サブユニットを宿主細胞内に送り込むことができる限り、「付着」の態様は特に制限されない。
【００１９】
このような５個の細胞付着サブユニットと１個の毒性サブユニットからなる細菌ホロ毒素は多く知られており、その例としては、志賀毒素、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素、百日咳毒素、サチラーゼ細胞毒素などが挙げられる。
【００２０】
このような細菌毒素の細胞付着サブユニットを２〜５個連結させて使用することにより、第二構成物質であるMHCクラスI抗原ペプチドを細胞内に送りこむ（運搬する）ベクターの働きが期待される。
【００２１】
以下、志賀毒素、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素、百日咳毒素、サチラーゼ細胞毒素とそれらの細胞付着サブユニットについて説明する。
【００２２】
＜志賀毒素＞
志賀毒素（Stx）は、浮腫病の原因となる腸管出血性大腸菌(EHEC, STEC)が産生するタンパク質性毒素で、１型（Stx1）及び２型（Stx2）に分けられる。Stx1は、ａ〜ｄのサブクラスに、Stx2はａ〜ｇのサブクラスにそれぞれ分類される。毒性本体であるAサブユニット１分子と腸管粘膜への結合に働くBサブユニット５分子からなるホロ毒素で、真核細胞のリボソームに作用して、タンパク質合成を阻害する働きを持つ。
【００２３】
本発明においては、Stx2のサブクラスeのBサブユニット（Stx2eB）が好ましく使用され、Stx2eBとしては、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。配列番号２は、Stx2e Bサブユニットタンパク質（GenBank Accession No. AAQ63639）の成熟領域（ペリプラズムへの分泌シグナルペプチドを除く、Ala19〜Asn87）のアミノ酸配列を示す。また、Stx2eBは糖鎖が付加されていてもよいが、Asn73（配列番号２のアミノ酸配列の５５位のAsn残基）がSer残基に置換されている糖鎖非修飾変異型でもよい。
また、Stx2eBは、2〜5個連結してMHCクラスI抗原ペプチドと組み合わせたときに細胞性免疫誘導効果を発揮することができる限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。
また、Stx2eBは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつ2〜5個連結してMHCクラスI抗原ペプチドと組み合わせたときに細胞性免疫誘導効果を発揮することができるものであってもよい。
【００２４】
＜大腸菌易熱性毒素＞
大腸菌性下痢症は、毒素原性大腸菌(ETEC)が生産するタンパク質性毒素LTが原因であり、LTは大腸菌易熱性毒素とも呼ばれる。大腸菌易熱性毒素（LT）は、毒性本体であるAサブユニット１分子とBサブユニット５分子からなるホロ毒素である。LTのAサブユニット（LTA）は細胞質内に侵入し、細胞内cAMP濃度を上昇させ、細胞膜クロライドチャネルを活性化することで腸管内への水の漏出すなわち下痢の病態を引き起こす。LTのBサブユニット（LTB）は無毒であり、LT毒素と腸管細胞との接着に関与する。
【００２５】
本発明で使用されるLTBは、例えば、配列番号４のアミノ酸配列で表される。また、LTBに糖鎖が付加されていてもよい。例えば、LTBの９０位（すなわち、配列番号４の９０位）のAsn残基にN−結合型の糖鎖が付加される。
さらに、LTBは、2〜5個連結してMHCクラスI抗原ペプチドと組み合わせたときに細胞性免疫誘導効果を発揮することができる限り、配列番号４で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。配列番号４で表されるアミノ酸配列は、GenBank Accession No. AAL55672として登録されている。
また、LTBは、配列番号４で表されるアミノ酸配列と、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつ2〜5個連結してMHCクラスI抗原ペプチドと組み合わせたときに細胞性免疫誘導効果を発揮することができるものであってもよい。
【００２６】
＜コレラ毒素＞
コレラ毒素（CT）タンパク質は、コレラ菌（Vibrio cholerae）によって産生される、下痢等の症状を特徴とするコレラ症を引き起こす毒素であり、毒性本体である１つのAサ
ブユニット（CTA）と、腸管粘膜への侵入へ関与する５つのBサブユニット（CTB）からなる。
【００２７】
本発明で使用されるCTBは、例えば、配列番号６のアミノ酸配列で表される。CTBは、2〜5個連結してMHCクラスI抗原ペプチドと組み合わせたときに細胞性免疫誘導効果を発揮することができる限り、配列番号６で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。
また、CTBは、配列番号６で表されるアミノ酸配列と、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつ2〜5個連結してMHCクラスI抗原ペプチドと組み合わせたときに細胞性免疫誘導効果を発揮することができるものであってもよい。
【００２８】
＜百日咳毒素＞
百日咳毒素は百日咳の原因である百日咳菌（Bordetella pertussis）によって産生される毒素であり、S1、S2、S3、S4（2分子）、S5の合計6分子のサブユニットから構成される。S1サブユニットが毒素本体であり、残りのサブユニットが標的細胞への結合に関与する。したがって、本発明においては、S2、S3、S4、S5のいずれかのサブユニットを使用することができる。これらのサブユニットのアミノ酸配列は公知の配列情報を参考にして入手することができる。
【００２９】
＜サチラーゼ細胞毒素＞
サチラーゼ細胞毒素は志賀毒素産生大腸菌によって産生される毒素であり、毒素本体であるAサブユニット１個と、細胞接着に関与するBサブユニット５個から構成される。したがって、本発明においては、このBサブユニットを使用することができる。サチラーゼ細胞毒素のBサブユニットのアミノ酸配列は公知の配列情報を参考にして入手することができる。
【００３０】
第一構成要素は上記のような細菌毒素の細胞付着サブユニットから選択される２〜５個の細胞付着サブユニットタンパク質を含む。好ましくは２〜３個であり、さらに好ましくは２個である。なお、２〜５個の細胞付着サブユニットタンパク質とは、上記のようなStx2eB、LTB等から選択されるいずれか１種類の細胞付着サブユニットが２〜５個含まれる態様でもよいし、Stx2eB、LTB等から選択される２種類以上の細胞付着サブユニットが合計で２〜５個含まれる態様でもよい。
より好ましくは、Stx2eB、LTB及びCTBから選択される２〜５個であり、さらに好ましくはStx2eB及びLTBから選択される２〜５個であり、Stx2eB及びLTBから選択される２〜３個である。
なお、異なる種類の細胞付着サブユニットを連結させる場合、それら細胞付着サブユニットを連結させる順序はいずれが先でもよい。
なお、第一構成要素は少なくともStx2eBを含むことが好ましく、Stx2eBのみを含むものでもよい。
【００３１】
本発明の複合体の第一構成成分を構成する２〜５個の細胞付着サブユニットは、ペプチドリンカーを介して互いにタンデムに連結されていることが好ましい。すなわち、２〜５個の細胞付着サブユニットが、間に１〜４個のペプチドリンカーを介して互いに連結されたポリペプチドであることが好ましい。
【００３２】
ここで、ペプチドリンカーとは、直鎖状にアミノ酸が連結したペプチドからなるリンカーを意味する。ペプチドリンカーのアミノ酸の個数は、例えば１０〜３０個、好ましくは１２〜３０個、さらに好ましくは１２〜２５個、より好ましくは１２〜２２個である。ま
た、本発明で用いるペプチドリンカーにおいて、好ましくは、プロリンの含有率が２０〜３３．３％、より好ましくは２０〜２７％、さらに好ましくは２０〜２５％である。
ペプチドリンカーにおいて、プロリンは、好ましくは２つ又は３つの他のアミノ酸を挟んで配置される。プロリンの間に配置されるアミノ酸は、好ましくは、グリシン、セリン、アルギニンから選択される。但し、ペプチドの一方または両方の末端においては、プロリン以外のアミノ酸が、５つ以内、好ましくは４つ以内の範囲で付加されていてもよい。このような好ましいペプチドリンカーは、例えば、国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されている。
【００３３】
本発明において、ペプチドリンカーは、好ましくは、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（PG12）やWO2017/094793に開示されるPG12v2、PG17、PG22であってもよい。
上記のようなペプチドリンカーを用いることにより、ポリペプチドの安定性を向上させ、宿主細胞において高蓄積させることができる。
【００３４】
＜第二構成要素＞
第二構成要素はMHCクラスI抗原ペプチドを含むオリゴペプチドまたはポリペプチドであるが、オリゴペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列中に少なくとも１以上のMHCクラスI抗原ペプチドを含んでいれば、他のアミノ酸配列を含んでもよい。また、MHCクラスI抗原ペプチドを２種以上含んでもよい。この場合、１つのオリゴペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列中に２種以上のMHCクラスI抗原ペプチドを含んでもよいし、２種以上のMHCクラスI抗原ペプチドが別のオリゴペプチドまたはポリペプチドに含まれてもよい。
MHCクラスI抗原ペプチドとは、細胞表面のMHCクラスIに結合することにより細胞表面に提示され、それがT細胞、特に細胞傷害性T細胞（CTL）の受容体によって認識され、細胞性免疫反応を惹起できるペプチドを意味する。
抗原ペプチドは、投与された哺乳動物において細胞性免疫反応を惹起できるペプチドであれば特に制限されず、その配列や長さも特に制限されないが、一般的には、その長さは、８〜２０アミノ酸である。
第二構成要素は、化学的に合成することもできるし、遺伝子工学的に生産することもできる。
【００３５】
クラスI抗原ペプチドの例としては、卵白アルブミン（OVA）のMHC class Iエピトープ（例えば、配列番号１２）、ガン抗原ペプチド、ウイルス抗原ペプチドが例示される。
ここで、がん抗原ペプチド（クラスI）の例としては、WT1、MUC1（Mucin 1）、HER-2（Human epidermal growth factor receptor 2）、Survivin（例えば、配列番号１５）、Gp100、MAGE（Melanoma-associated antigen）-A3、Tyrosinase、PSA（prostate-specific antigen）等、多くのがん抗原タンパク質が知られており、それらのクラスI抗原ペプチドを使用することができる。ただし、がん抗原ペプチドは治療対象のがんに合わせて適宜選択でき、これらには限定されない。また、治療対象に合わせて、ヒト抗原やマウス抗原などを選択できる。
また、ウイルス抗原ペプチド（クラスI）の例としては、Epstein-barr virus (EBV)、Cytomegalovirus (CMV)、Human Immunodeficiency virus (HIV)、Human T-cell leukemia virus （HTLV）、Influenza  Virus、Respiratory syncytial virus （RSV）などのウイルスの抗原タンパク質のクラスI抗原ペプチド のクラスI抗原ペプチドを使用することができる。ただし、ウイルス抗原ペプチドは治療対象のがんに合わせて適宜選択でき、これらには限定されない。
【００３６】
＜本発明の複合体〜第一の態様＞
本発明の複合体の第一の態様は、第一構成要素と第二構成要素を別成分として含む態様
、すなわち、組成物としての態様である。
この態様においては、第一構成要素と第二構成要素の割合は、例えば、モル比で１：５〜５：１、好ましくは１：２〜２：１、特に好ましくは１：１である。
【００３７】
＜本発明の複合体〜第二の態様＞
本発明の複合体の第二の態様は、第一構成要素と第二構成要素を融合タンパク質として含む態様である。融合タンパク質における第一構成要素と第二構成要素の結合順序はいずれが先（N末側）でもよい。ここで、融合タンパク質とは、１つのポリペプチド鎖の中に２つ以上のタンパク質ユニットを含む多価タンパク質を意味する。
融合タンパク質において、第一構成要素と第二構成要素は直接結合していてもよいが、ペプチドリンカーを介して結合されていることが好ましい。
この場合、ペプチドリンカーとしては、例えば、上記＜第一構成要素＞の項で説明したようなペプチドリンカーを使用することができ、具体的には、PG12に代表される、アミノ酸数１０〜３０で、プロリンの含有率が２０〜３３．３％であり、プロリンが２つ又は３つの他のアミノ酸を挟んで配置されている、ペプチドリンカーを使用することが好ましい。
【００３８】
本発明で用いる融合タンパク質は、例えば、配列番号２３、２５または２７で表されるアミノ酸配列を有する。配列番号２３で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質は、LTBと、Stx2eBと、OVAepiが、PG12を介してタンデムに連結されている。また、配列番号２５で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質は、Stx2eBと、Stx2eBと、OVAepiが、PG12を介してタンデムに連結されている。また、配列番号２７で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質は、Stx2eBと、Stx2eBと、Msur57が、PG12を介してタンデムに連結されている。
【００３９】
本発明で用いる融合タンパク質は、植物で発現させる場合などは、そのアミノ末端に、植物由来の分泌シグナルペプチド又は葉緑体移行シグナルペプチドが付加されていてもよい。分泌シグナルペプチドは、好ましくはタバコのβ-Dグルカンエキソヒドロラーゼ（β-D-glucan exohydrolase）、タバコの38kDa ペルオキシダーゼ(GenBank Accession D42064)に由来する。好ましい葉緑体移行シグナルペプチドは、例えば、国際公開WO2009/004842号パンフレット及び国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されている。
【００４０】
さらに、本発明で用いる融合タンパク質は、植物で発現させる場合などは、そのカルボキシル末端に、小胞体残留シグナルペプチド、液胞移行シグナルペプチド等のシグナルペプチドが付加されていてもよい。
好ましい小胞体残留シグナルペプチドは、例えば、国際公開WO2009／004842号パンフレット及び国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されているが、HDEL配列（配列番号９）を利用することができる。
液胞移行シグナルペプチドは、例えば、国際公開WO2009／004842号パンフレット及び国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されている。
【００４１】
本発明で用いる融合タンパク質は、化学的に合成することもできるし、遺伝子工学的に生産することもできる。
【００４２】
＜融合タンパク質をコードするDNA構築物＞
遺伝子工学的に生産する場合、融合タンパク質をコードするDNAを含むDNA構築物を用いる。本発明で用いるDNA構築物は、OVAepiやSur57などのMHCクラスI抗原ペプチドをコードするDNAと、Stx2eBやLTBやCTBなどの細胞付着サブユニットを２〜５個含むポリペプチドをコードするDNAとが、前記リンカーペプチドをコードするDNAを介してタンデムに連結されているDNAを含む。
前記リンカーペプチドをコードするDNAは、例えば配列番号７（PG12）が挙げられる。Stx2eBをコードするDNAとして、例えば、Stx2eBをコードするDNA（配列番号１）、LTBをコードするDNAとして、例えば、LTBをコードするDNA（配列番号３）、CTBをコードするDNAとして、例えば、配列番号５の塩基配列を有するDNA、それぞれが挙げられる。
MHCクラスI抗原ペプチドをコードするDNAは、公知の情報に基づいてPCR等の手法により入手できるが、例えば、OVAepiをコードするDNAとしては、配列番号２２の塩基番号６０７〜６３３の塩基配列を有するDNAが、Msur57をコードするDNAとしては、配列番号２６の塩基番号４９９〜５２２の塩基配列を有するDNAが、それぞれ挙げられる。
【００４３】
前記MHCクラスI抗原ペプチドをコードするDNA、リンカーペプチドをコードするDNA、細胞付着サブユニットをコードするDNA等は、それぞれ終止コドンを除き、コドンの読み枠が合うように連結される。DNAの連結は、制限酵素やDNAリガーゼを用いる方法、PCRを用いる方法など、一般的な遺伝子工学的な手法により行うことができる。
【００４４】
本発明で用いる融合タンパク質をコードするDNAは、例えば、配列番号２２、２４または２６で表される。
また、融合タンパク質をコードするDNAは、細胞性免疫誘導効果を有するポリペプチドをコードする限り、配列番号２２、２４または２６の塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い二つのDNAどうし、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有する２つのDNAがハイブリダイズするが、それより同一性の低い２つのDNAがハイブリダイズしない条件が挙げられる。例えば2×SSC（330mM NaCl、30mM クエン酸）、４２℃が挙げられ、好ましくは0.1×SSC（330mM NaCl、30mM クエン酸）、６０℃が挙げられる。
【００４５】
融合タンパク質をコードするDNAは、該タンパク質を生産させる宿主細胞に応じて、ハイブリッドタンパク質の翻訳量が増大するように、融合タンパク質を構成するアミノ酸を示すコドンが適宜改変されていることも好ましい。
コドン改変の方法としては、例えばKang et al. (Protein Expr Purif. 2004 Nov;38(1):129-35.)の方法を参考にすることができる。また、宿主細胞において使用頻度の高いコドンを選択したり、GC含量が高いコドンを選択したり、宿主細胞のハウスキーピング遺伝子において使用頻度の高いコドンを選択したりする方法が挙げられる。
【００４６】
本発明で用いるDNA構築物において、好ましくは、前記融合タンパク質をコードするDNAが、エンハンサーに発現可能に連結されている。ここで、「発現可能」とは、本発明で用いるDNA構築物が適切なプロモーターを含むベクターに挿入され、該ベクターが適切な宿主細胞に導入された場合に、宿主細胞内で前記融合タンパク質が生産されることをいう。また、「連結」とは、２つのDNAが直接結合している場合も、他の塩基配列を介して結合している場合も含む概念である。
エンハンサーとしては、Kozak配列や植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’-非翻訳領域が挙げられる。植物で発現させる場合などは、好ましくは、前記ハイブリッドタンパク質をコードするDNAが、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’-非翻訳領域に発現可能に連結されている。植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’-非翻訳領域を得る方法は、例えば、特開2012-19719号公報及び国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されている。
【００４７】
＜組換えベクター＞
本発明で用いる組換えベクターは、前記DNA構築物を含むことを特徴とする。本発明で用いる組換えベクターは、前記融合タンパク質をコードするDNAが、ベクターが導入され
る宿主細胞において発現可能なように、ベクター内に挿入されていればよい。ベクターは、宿主細胞において複製可能なものであれば特に制限されず、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられ、宿主に合わせて適宜選択することができる。また、ベクターは薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを含むことが好ましい。プラスミドベクターやウイルスベクターは、市販のものを使用することができる。
【００４８】
ベクター内で用いられるプロモーターは、ベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。植物細胞で発現させる場合、例えば、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（Odell et al．1985 Nature 313：810）、イネのアクチンプロモーター（Zhang et al．1991 Plant Cell 3：1155）、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Cornejo et al．1993 Plant Mol．Biol．23：567）等が好ましく用いられる。また、ベクター内で用いられるターミネーターも、同様にベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。植物細胞で発現させる場合、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス35Sターミネーター、シロイヌナズナheat shock protein 18.2 遺伝子のターミネーター(HSP-T)等が好ましく用いられる。
【００４９】
本発明で用いる組換えベクターは、例えば、前記DNA構築物を適当な制限酵素で切断又はPCRによって制限酵素部位を付加し、ベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することで調製することができる。
【００５０】
＜形質転換体＞
本発明の形質転換体の第一の態様は、前記組換えベクターで形質転換された形質転換体である。
【００５１】
一方、本発明の形質転換体の第二の態様は、前記第一構成要素をコードするDNAと前記第二構成要素をコードするDNAが別々に導入される態様である。
すなわち、宿主細胞への付着に関与する細胞付着サブユニット５量体と、毒素本体である毒性サブユニット１量体とからなる細菌毒素の、当該細胞付着サブユニットを２〜５個連結させたポリペプチドを含む第一構成要素をコードするDNAを含む第一DNA構築物と、
MHCクラスI抗原ペプチドを含む第二構成要素をコードするDNAを含む第二DNA構築物と、が導入された、形質転換体である。
第一構成要素をコードするDNAを含む第一DNA構築物は上述した各毒素細胞付着サブユニットをコードするDNA配列をもとに構築することができ、その一例としては、配列番号１８、２０の塩基配列を有するDNA構築物が挙げられる。
第二構成要素をコードするDNAを含む第二DNA構築物は上述した各MHCクラスI抗原ペプチドを含むアミノ酸配列をコードするDNA配列をもとに構築することができる。
第二の態様にかかる形質転換体が得るためには、通常、第一DNA構築物及び第二DNA構築物は別々のベクターを用いて宿主細胞に導入されるが、第一DNA構築物及び第二DNA構築物を含み、これらを独立に発現させることのできる単一のベクターを用いて宿主細胞に導入されてもよい。
【００５２】
形質転換に用いられる宿主細胞は真核細胞及び原核細胞の何れでもよい。
真核細胞としては、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞などでもよいが、植物細胞が好ましく用いられ、中でもアキノノゲシ属（Lactuca）などのキク科（Asteraceae）、ナス科、アブラナ科、アカザ科に属する植物の細胞が好ましく用いられる。さらに、アキノノゲシ属（Lactuca）に属する植物の細胞、中でもレタス（Lactuca sativa）細胞が好ましく用いられる。宿主細胞としてレタス細胞を用いる場合は、ベクターは、カリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター等を用いることができる。
原核細胞としては特に制限されるものではないが、例えば、大腸菌（Escherichia coli
）、アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）等が用いられる。
哺乳動物細胞としては特に制限されるものではないが、例えば、チャイニーズハムスター卵母（CHO）細胞等が用いられる。
酵母細胞としては特に制限されるものではないが、例えば、サッカロミセス セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等が用いられる。
【００５３】
本発明で用いる形質転換体は、一般的な遺伝子工学的手法を用いて、本発明で用いるベクターを宿主細胞に導入することにより作製することができる。例えば、アクロバクテリウムを利用した導入方法（Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2：218，Hiei, et al.，1994 Plant J. 6：271）、エレクトロポレーション法（Tada, et al., 1990, Theor．Appl．Genet, 80：475）、ポリエチレングリコール法（Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81：437）、パーティクルガン法（Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci.tech. 5：27）、ポリカチオン法（Ohtsuki, et al., FEBS Lett. 1998 May 29;428(3):235-40.）などの方法を用いることが可能である。
【００５４】
組換えベクターを宿主細胞に導入した後、選択マーカーの表現型によって前記形質転換体を選抜することができる。また、選抜した形質転換体を培養することにより、前記第一構成要素、第二構成要素、またはそれらの融合タンパク質を生産することができる。培養に用いる培地及び条件は、形質転換体の種に応じて適宜選択することができる。
また、宿主細胞が植物細胞の場合には、選抜した植物細胞を常法に従って培養することにより、植物体を再生することができ、植物細胞内又は植物細胞の細胞膜外に前記第一構成要素、第二構成要素、またはそれらの融合タンパク質を蓄積させることができる。例えば、植物細胞の種類により異なるが、ジャガイモであればVisserら（Theor．Appl．Genet
78：594（1989））の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe（Planta 99：12（1971））の方法が挙げられる。
【００５５】
上記第一構成要素、第二構成要素、及びそれらの融合タンパク質は形質転換体より常法に従って精製することができる。
ただし、精製は必須ではなく、形質転換体をそのまま、または乾燥、粉砕するなど加工して用いることもできる。
【００５６】
＜医薬＞
本発明の複合体は、細胞性免疫を誘導する作用を有するため、医薬の有効成分として使用することができる。なお、前記第一構成要素と前記第二構成要素は同時投与することが必須ではなく、順次投与してもよいので、本発明の医薬は前記第一構成要素と前記第二構成要素を含み、どちらか一方が先に投与されて、生体内で複合体を形成する、態様も含まれる。
【００５７】
前記第一構成要素、第二構成要素、またはそれらの融合タンパク質は、そのまま医薬として使用してもよいし、医薬に用いられる担体や添加剤と混合されて医薬組成物として使用してもよい。ここで、担体としては、薬理的に許容される溶媒、希釈剤、賦形剤、結合剤、溶媒などが挙げられ、液体状の医薬組成物の調製には例えば、水、生理食塩水、各種緩衝液が用いられる。添加剤としては、安定剤、pH調整剤、増粘剤、抗酸化剤、等張化剤、緩衝剤、溶解補助剤、懸濁化剤、保存剤、凍害防止剤、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤、制菌剤などが例示される。
【００５８】
本発明の医薬の剤型は、液剤、錠剤、軟膏、顆粒剤などが例示されるが、液剤が好ましく、例えば、医薬として前記第一構成要素、第二構成要素、またはそれらの融合タンパク質を水、生理食塩水、緩衝液、植物油などに懸濁又は溶解し、必要に応じて安定化剤等の添加剤を添加することにより得られる液状医薬組成物が好ましい。
本発明の医薬における前記第一構成要素、第二構成要素、またはそれらの融合タンパク質の濃度は細胞性免疫誘導効果を発揮できる限り特に制限されないが、例えば、それぞれ０．１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬである。
【００５９】
本発明の医薬組成物は、ペプチドに応じた細胞性免疫、とくにCTLを誘導することができ、がんやウイルス性疾患などの治療用または予防用医薬組成物として使用することができる。
治療や予防対象のがんやウイルス疾患の種類は特に制限されず、対象のがんやウイルスに応じて抗原ペプチドを選択することができる。
【００６０】
投与対象としては、ヒト、及びマウス、ラット、豚、牛、ニワトリ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなどの非ヒト哺乳動物や魚類が挙げられる。
投与方法も特に制限されず、経口投与、静脈投与、局所投与、などが挙げられるが、疾患部位に注射等で局所投与することが好ましい。投与量は疾患の種類、症状、程度、患者の年齢、性別、体重などによって適宜調整されるが、例えば、1回の投与量として、体重１ｋｇあたり、０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。投与は単回投与でも複数回投与でもよいが、複数回投与が好ましく、例えば、１〜７日おきに、合計２〜３回投与する方法が挙げられる。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はかかる実施例の態様に限定されるものではない。
【００６２】
＜遺伝子設計と融合タンパク質の作製、精製＞
（１）遺伝子の設計
ワクチン抗原を融合するための骨格として、LTB、LTBとStx2eBを融合したLTB-Stx2eB、またはStx2eBを二連結したStx2eB-Stx2eBを用いた。各骨格のC末端にはTCE（OVAepiまたはMsur57）、精製用Hisタグ、哺乳類細胞内での小胞体への輸送効率を高めるための小胞体残留シグナル(KDEL：配列番号９)を付加した。組換えタンパク質発現用ベクターとしては、IPTGによる転写誘導が可能であるpET28a（Novagen）を用いた。
【００６３】
まず、LTB単体の骨格を元にHisタグとKDEL配列を付加した。具体的には、まず特許文献（PCT/JP2014/081114）のL+発現プラスミドをBglIIとSacIで切断した。PG12-6His-F (5’-cctggttctggtcctggttctcctagatct  ACC ACC TCC ACT AGT cat cac cat cac cat cac cat
aaa gat gaa-3’)（配列番号１０）とpET-SacI-KDEL-R (5’-ggagagggttagggataggcttaccttcaagcttcgaatt gagctcta tta caa ttc atc ttt atg gtg atg gtg atg-3’)（配列番号１１）をアニーリングした後、T4 DNA polymeraseを用いて伸長反応を行い、His-KDEL断片を作製した。前述のBglII-SacI処理プラスミドとHis-KDEL断片を混合し、GeneArt Seamless PLUS Cloning and Assembly Kit (Invitrogen)を用いて相同組換えを行い、LTB-Hisを構築した。一方、LTB-HisをBamHI-BglIIで処理したギャップにStx2eBをコードするBamHI-BglII断片を導入してStx2eB-Hisを構築した。
【００６４】
卵白アルブミンMHC クラスIエピトープ（OVAepi） (ESIINFEKL)（配列番号１２）の融合は以下の通り実施した。OVAepi-F(5’-ggtcctggttctcctagatca GGT ACC ACC  gag tct atc atc aac ttc gag aag ttg-3’, KpnI underlined)（配列番号１３）とOVAepi-R(5’-gtg atg gtg atg gtg atg act agt caa ctt ctc gaa gtt gat gat-3’, SpeI underlined) （配列番号１４）をアニーリングし、T4 DNA polymeraseを用いて伸長反応を行い、PG12-OVAepi-Hisに相当するDNA断片を作製した。次に、LTB-HisもしくはStx2eB-HisをBglIIとSpeIで処理したベクターと、各PG12-OVAepi-His断片を混合し、GeneArt Seamless PLUS
Cloning and Assembly Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて相同組換え反応を行
って、OVAepi-His-KDEL断片をLTBもしくはStx2eBに融合した。
【００６５】
骨格のタンデム化は以下の通り実施した。Stx2eB-OVAepi-HisもしくはStx2eB-HisをXbaI-BamHIで処理したベクターに、LTBもしくはStx2eBのXbaI-BglII断片をライゲーションして、LTB-Stx2eB-OVAepi-His（配列番号２３）、Stx2eB-Stx2eB-OVAepi-His（配列番号２５）を作製した。得られた各ベクターは5’側にNcoI、3’側にXhoIサイトを付加して、pET28aに挿入した。
【００６６】
がん抗原融合タンパク質は以下の通り作製した。マウスサバイビン57-64（Msur57）(CFFCFKEL) （配列番号１５）は以下に示すFプライマーとRプライマーをアニーリングした後、T4DNA polymeraseで伸長した。得られた断片をKpnI及びSpeIで処理し、Stx2eB-Stx2eB-OVAepi-HisのOVAepiと入れ替えた（Stx2eB-Stx2eB-Sur57）（配列番号２７）。
Msur57 -F: 5’-tcctagatca GGT ACC ACC tgt ttt ttc tgt ttc aag gaa ctt-3’, KpnI underlined（配列番号１６）
Msur57 -R: 5’- gtg atg act agt aagttccttgaaacagaaaaaaca-3’ , SpeI underlined（配列番号１７）
【００６７】
（２）大腸菌を用いた組換えタンパク質の発現
得られた発現プラスミドをタンパク質発現用大腸菌株であるBL21(DE3)株に形質転換した。組換えプラスミドを持つ大腸菌のコロニーを100 mg/Lのアンピシリンを含む2×YT培地5mlを入れた試験管4本に植菌し、180 rpm, 37 ℃で一晩培養した。この前培養液20mlを100 mg/Lのアンピシリンを含む2×YT培地1Lに植菌し、180 rpm, 37 ℃でO.D.600が0.4程度になるまで培養した。終濃度1 mMのIPTGを添加し、22℃、120 rpmで4時間培養した。培養液を8,000 rpm、5分間遠心し、得られた菌体を使用時まで-80 ℃で保管した。LTB-Stx2eB-OVAについては、培養中のタンパク質分解を抑えるために、IPTG誘導後は10℃、120 rpmで12時間培養した。
【００６８】
（３）アフィニティーカラムによる精製
ニッケル固定化ビーズを用いた精製を行った。大腸菌からのタンパク質の抽出には8M Ureaを含むPBS pH7.4を用いた。
【００６９】
＜ELISPOT（Enzyme-Linked ImmunoSpot）試験（１）〜OVAepiとLTB-Stx2eBまたはStx2eB-Stx2eBを投与して刺激＞
C57BL/6 J系メスマウス（日本SLC，5週齢）を25℃に保たれた実験室に導入後、基礎飼料を7日間給与した。馴化後、無作為に群に分け、群毎にプラスチックケージ内に収容した。
試験開始時に大腸菌から精製した抗原を所定容量の生理食塩水に懸濁し、表１に示すサンプルを所定量、腹腔内へ投与した（1回目）。なお、既存のアジュバントであるフロイントコンプリートアジュバント（FCA）を加える群には、初回免疫時に所定量の精製抗原を等容量のFCA内に注入後、よく懸濁した乳剤を腹腔内へ注入した。2週間自由摂食・自由飲水条件下で通常飼育後，再び所定量の精製抗原を皮下内へ投与した（2回目）。さらに1週間通常飼育後、再び所定量の精製抗原を皮下内へ投与した（3回目）。1週間通常飼育後、全頭剖検を行い、脾臓を採取した。
脾臓は採取後すぐにPRMI 1640 mediumに浸漬し、氷冷した。セルストレーナーで細胞懸濁液を作成後、赤血球をACK lysing buffer（Thermo Fisher Scientific）を用いて除去した。HBSS（Hank’s balanced Salt solution）で2回洗浄後、PRMI 1640 mediumに細胞を懸濁し、細胞数をカウントした。得られた脾細胞をIFN-γELISPOTキット（MABTECH）へ播種した。方法はMABTECH社取扱説明書に準拠した。個体毎に3反復×抗原添加有無とし、OVAepi抗原添加は全て5 μg/mL濃度とした。
【００７０】
【表１】
2020011916.tif 000003
【００７１】
【表２】
2020011916.tif 000004
【００７２】
試験結果
この結果、表２及び図１に示すように、LTBと比較して、LTB-Stx2eB（配列番号１９）やStx2eB-Stx2eB（配列番号２１）とOVAepi抗原を混合したものを免疫することによって強くOVAepi抗原特異的な細胞傷害性T細胞（キラーT細胞）が誘導されることが判明した。また、Stx2eB-Stx2eBと混合した場合には更に強く誘導されることが判明した。
【００７３】
＜ELISPOT試験（２）〜LTB-Stx2eB-OVAepiまたはStx2eB-Stx2eB-OVAepiを投与して刺激＞
前記実施例と同様に表３に示すサンプルを所定量、腹腔内へ投与し、取り出した脾臓細胞を用いたOVAepi抗原刺激によるELISPOT試験を行った。ここでは、LTB-Stx2eB及びStx2eB-Stx2eBとOVAepi抗原をペプチドリンカーで連結した融合タンパク質を用いた。
【００７４】
【表３】
2020011916.tif 000005
【００７５】
【表４】
2020011916.tif 000006
【００７６】
試験結果
この結果、表４及び図２に示すように、LTB-Stx2eBやStx2eB-Stx2eBにOVAepi抗原をペ
プチドリンカーで連結した融合タンパク質を免疫することによって、強くOVAepi抗原特異的な細胞傷害性T細胞（キラーT細胞）が誘導されることが判明した。
【００７７】
＜ELISPOT試験（３）〜Stx2eB-Stx2eB-Sur57を投与して刺激＞
前記実施例で用いたモデル抗原（OVAepi）を、がん特異的抗原であるSurvivin（サバイビン）のSur57ペプチド（57−64）に変更し、Stx2eB-Stx2eBとペプチドリンカーで連結した融合タンパク質（Stx2eB-Stx2eB-Sur57）を作製し、前記実施例の方法と同様に、ELISPOT試験を行った。取り出した脾臓細胞への添加刺激物質として表記がん細胞を脾臓細胞数の1/100数量添加した。
【００７８】
【表５】
2020011916.tif 000007
【００７９】
【表６】
2020011916.tif 000008
【００８０】
試験結果
その結果、表６及び図３に示すように、使用したすべてのがん細胞の刺激に対して、Sur57抗原特異的な細胞傷害性T細胞（キラーT細胞）の誘導が確認された。
【００８１】
＜Sur57抗原特異的T細胞の細胞傷害活性＞
前記実施例に記載したSur57ペプチド（57−64）をStx2eB-Stx2eBとペプチドリンカーで連結した融合タンパク質（Stx2eB-Stx2eB-Sur57）をマウスに免疫して得られた脾細胞の細胞懸濁液を25 cm2培養フラスコへ播種した（フラスコあたり20mLで培養)。個体毎に1反復とし、全フラスコに抗原(Sur57)をfinalで2 μg/mLとなるように添加した。培地はFBS 10%添加RPMI 1640培地（ペニシリン／ストレプトマイシン含有）とし、37℃，5%CO2雰囲気下で培養を行った。培養開始後2日にフラスコから10 mLを採取し、100 U/mLのHuman IL-2を含む上記RPMI培地を10 mL添加して培養を継続した。
培養6日終了後の脾細胞について、赤血球をACK lysing bufferを用いて除去したのち、PBSで2回洗浄後、PBSに細胞を懸濁し細胞数をカウントした（エフェクター細胞として使用）。一方、継代培養後2〜3日のYAC-1細胞（リンパ腫細胞）懸濁液1 mLに対し1mM Dioc18（細胞の細胞膜を染色）を10 μL添加し、15分間37℃で染色した。HBSS 1 mLでYAC-1細胞を3回洗浄後、細胞数を測定した。DiOC18で蛍光標識したYAC-1細胞に、上記エフェクター細胞を5:1及び25:1の割合（エフェクター細胞数：YAC-1細胞数）で混合し、37℃で4時間，CO2インキュベーター内で培養した。培養終了後、Propidium iodide (PI: 2 mg/mL)を2 μLずつ各ウェルに添加し、死細胞を染色した。染色後、速やかにBD Biosciences社 
Accuri C6 フローサイトメーターで解析を実施した。なお、培養及び解析は2反復で行った。YAC-1細胞集団（DiOC18陽性）にGateをかけ、YAC-1細胞集団を1000 events取得するように設定し、FACS解析を実施した。YAC-1細胞とエフェクター細胞を共培養したサンプルの細胞死数、YAC-1細胞を単独培養したサンプルの細胞死数（自然細胞死数）、及びYAC-1細胞にサポニンを添加したサンプルの細胞死数（最大細胞死数）をそれぞれ算出し、CTL活性を算出した。
【００８２】
試験結果
この結果、図4に示すように、Sur57ペプチド融合タンパク質（Stx2eB-Stx2eB-Sur57）をマウスに免疫することにより、脾臓細胞中に、リンパ腫細胞（YAC-1）に対する強い細胞傷害活性を持つキラーT細胞が誘導されていることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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