(57)【要約】【課題】本発明は、ヤギ亜科属動物由来の免疫グロブリンＧ等とヤギ亜科属動物以外の動物由来の免疫グロブリンＧ等とを含む液体試料を分離し、免疫グロブリンＧ等を効率的に製造することができる方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係る免疫グロブリンＧ等の製造方法は、ヤギ亜科属動物由来の免疫グロブリンＧ等と野生型プロテインＡに結合するヤギ亜科属動物以外の動物由来の免疫グロブリンＧ等とを含む液体試料を、リガンドが担体に固定化されたアフィニティ分離マトリックスに接触させることにより、ヤギ亜科属動物以外の動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体をリガンドに吸着させる工程、アフィニティ分離マトリックスを洗浄する工程、および、リガンドに吸着されたヤギ亜科属動物以外の動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体を、溶出液を使ってリガンドから分離する工程を含み、リガンドが、特定の変異を有するプロテインＡのドメインであることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンＧまたはその誘導体を製造するための方法であって、
ヤギ亜科属動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体と野生型プロテインＡに結合するヤギ亜科属動物以外の動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体とを含む液体試料を、リガンドが担体に固定化されたアフィニティ分離マトリックスに接触させることにより、ヤギ亜科属動物以外の動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体をリガンドに吸着させる工程、
アフィニティ分離マトリックスを洗浄する工程、および、
リガンドに吸着されたヤギ亜科属動物以外の動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体を、溶出液を使ってリガンドから分離する工程を含み、
リガンドが、プロテインＡのＥドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、ＢドメインまたはＣドメインから選択される１以上のドメインのＦｃ結合部位における１以上の疎水性アミノ酸残基が他の疎水性アミノ酸残基または極性無電荷アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
置換されるべき疎水性アミノ酸残基が、配列番号５の上記Ｃドメインの５位のＰｈｅ、１３位のＰｈｅ、１７位のＬｅｕ、または３１位のＩｌｅである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
置換されるべき疎水性アミノ酸残基が、配列番号４の上記Ｂドメインの３１位のＩｌｅである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
他の疎水性アミノ酸残基が、Ａｌａ、Ｌｅｕ、またはＩｌｅである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
極性無電荷アミノ酸残基がＴｈｒである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
リガンドのアミノ酸配列において、配列番号５の上記Ｃドメインの第９位のＧｌｎ、第１０位のＧｌｎ、第１４位のＴｙｒ、第２０位のＰｒｏ、第２１位のＡｓｎ、第２２位のＬｅｕ、第２６位のＧｌｎ、第２７位のＡｒｇ、第３０位のＰｈｅ、第３４位のＬｅｕ、第３８位のＰｒｏ、第３９位のＳｅｒ、第４５位のＬｅｕ、第５１位のＬｅｕ、第５２位のＡｓｎ、第５５位のＧｌｎ、および第５７位のＰｒｏに相当するアミノ酸残基が９０％以上保持されている請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
リガンドが、上記ドメインを２個以上連結して得られる複数ドメインからなる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
液体試料が、ヤギ亜科属動物の乳汁である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヤギ亜科属動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体とヤギ亜科属動物以外の動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体とを分離し、免疫グロブリンＧまたはその誘導体を効率的に製造することができる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、抗原と呼ばれる物質に特異的に結合する機能、および、他の生体分子や細胞と協同して抗原を有する因子を無毒化・除去する機能を有する。抗体という名は、このような抗原に結合するという機能を重視した名前であり、物質としては「免疫グロブリン（Ｉｇ）」と呼ばれる。
【０００３】
近年、遺伝子工学、タンパク質工学、および細胞工学の発展に伴い、抗体医薬と呼ばれる、抗体の有する機能を利用した医薬品の開発が盛んに行われている。抗体医薬は、従来の医薬と比較して、標的分子に対してより特異的に働くために、副作用を軽減させ、且つ高い治療効果が得られることが期待されており、実際に様々な病態の改善に寄与している。
【０００４】
一方、抗体医薬は、生体に大量に投与されることから、他の組み換えタンパク質医薬品と比較してその純度が品質に与える影響は大きいと言われている。 よって、純度の高い抗体を製造するために、抗体に特異的に結合する分子をリガンドとして用いた吸着材料を利用するアフィニティークロマトグラフィー等の手法が一般的に用いられている。
【０００５】
現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスである。ＩｇＧ抗体にアフィニティーを有する免疫グロブリン結合性タンパク質として、プロテインＡがよく知られている。プロテインＡは、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）によって生産される細胞壁タンパク質の１種であり、シグナル配列Ｓ、５つの免疫グロブリン結合性ドメイン（Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン）、および、細胞壁結合ドメインであるＸＭ領域から構成されている（非特許文献１）。抗体医薬製造工程における初期精製工程には、プロテインＡがリガンドとして水不溶性担体に固定化されたアフィニティークロマトグラフィー用カラム（以下、「プロテインＡカラム」という）が一般的に利用されている（非特許文献１〜３）。
【０００６】
プロテインＡカラムの性能を改良するために、様々な技術開発がなされてきた。リガンドの側面からの技術開発も進んでいる。最初は天然型のプロテインＡがリガンドとして利用されてきたが、タンパク質工学的に改変を加えた組み換えプロテインＡをリガンドとして、カラムの性能を改良する技術も多数見られるようになった。
【０００７】
プロテインＡの変異導入については数多く研究されているが、プロテインＡの抗体結合部位、特にＦｃ結合部位については、アミノ酸置換変異導入により、抗体結合活性の著しい低下を引き起こすことがある。その中でも１３位のＰｈｅ、１７位のＬｅｕ、３１位のＩｌｅといった疎水性アミノ酸残基は、Ｆｃとの結合に不可欠なアミノ酸残基とされている（非特許文献４，５）。
【０００８】
抗体医薬品は、多くの場合、ＣＨＯ細胞を生産宿主として培養生産されるのが一般的であるが、トランスジェニック動物を宿主とした抗体生産の研究も進められている。例えば、マウスやラットを宿主としたヒト抗体を生産するシステムは、医薬品候補となる抗体のスクリーニングツールとして有用である（非特許文献６）。また、トランスジェニックヤギやトランスジェニックヒツジは、ミルクタンパク質のプロモーター下流に目的遺伝子を導入することにより、目的組換えタンパク質を高発現することが可能である（特許文献１）。しかし、このようなトランスジェニック動物を用いたヒト抗体生産では、宿主由来抗体と目的とするヒト抗体との分離精製が課題となる。既存のプロテインＡ担体はヤギＩｇＧ２やヒツジＩｇＧ２に結合することが知られており、複数のクロマトグラフィーの組み合わせや溶出条件を工夫してヒトＩｇＧと分離する試みがなされている。例えば、トランスジェニックヤギで生産されたヒト抗体から、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーを組み合わせてヤギ由来の抗体を低減した報告がある（非特許文献７）。また、プロテインＡクロマトグラフィーを用いて、ｐＨリニアグラジエント溶出により、ヤギ抗体やヒツジ抗体からヒト抗体を分離した例もある（特許文献２）。
【０００９】
また、抗体製造では形質転換したＣＨＯ細胞を無血清培地で培養することが一般化しているが、研究分野では血清を添加した培地で細胞を培養することが一般的である。血清は細胞増殖の促進に重要な因子であるが、抗体を含む血清の成分が不純物となり、抗体の精製が困難となることがある。よって、抗体の精製の観点からはＣＨＯ細胞を無血清培地で培養することが望ましいが、その場合には細胞を無血清培地でも培養できるよう馴化する必要が生じる。一方、特定動物の血清由来の抗体を除去が可能であれば、ハイブリドーマなどを血清培地で培養して抗体を製造することが容易になると言える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２０１６−５１３１０５号公報
【特許文献２】国際公開第２００４／０８７７６１号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｈｏｂｅｒ  Ｓ．他，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，２００７年，８４８巻，４０−４７頁
【非特許文献２】Ｌｏｗ  Ｄ．他，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，２００７年，８４８巻，４８−６３頁
【非特許文献３】Ｒｏｑｕｅ  Ａ．Ｃ．Ａ．他，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，２００７年，１１６０巻，４４−５５頁
【非特許文献４】Ｏ’Ｓｅａｇｈｄｈａ  Ｍ．他，ＦＥＢＳ  Ｊ，２００６年，２７３巻，４８３１−４８４１頁
【非特許文献５】Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ  Ｍ．他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｅｎｇ．，２０１４年，８巻，１５頁
【非特許文献６】Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  Ｍ．他，Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．，２０１５年，６３巻，１０１−１０８頁
【非特許文献７】Ｐｏｌｌｏｃｋ  Ｄ．他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９９年，２３１巻，１４７−１５７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述したように、異種の動物由来の抗体を互いに分離することができれば、抗体の製造効率が一層向上する場合がある。
そこで本発明は、ヤギ亜科属動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体とヤギ亜科属動物以外の動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体とを含む液体試料を分離し、免疫グロブリンＧまたはその誘導体を効率的に製造することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、特定の変異を有する変異型プロテインＡのドメインが、ヤギ亜科属動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体に対しては比較的低い親和性を示す一方で、それ以外の動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体への親和性を維持していることから、かかる変異型プロテインＡを用いれば、免疫グロブリンＧまたはその誘導体を効率的に製造できることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。
【００１４】
［１］  免疫グロブリンＧまたはその誘導体を製造するための方法であって、
ヤギ亜科属動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体と野生型プロテインＡに結合するヤギ亜科属動物以外の動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体とを含む液体試料を、リガンドが担体に固定化されたアフィニティ分離マトリックスに接触させることにより、ヤギ亜科属動物以外の動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体をリガンドに吸着させる工程、
アフィニティ分離マトリックスを洗浄する工程、および、
リガンドに吸着されたヤギ亜科属動物以外の動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体を、溶出液を使ってリガンドから分離する工程を含み、
リガンドが、プロテインＡのＥドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、ＢドメインまたはＣドメインから選択される１以上のドメインのＦｃ結合部位における１以上の疎水性アミノ酸残基が他の疎水性アミノ酸残基または極性無電荷アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする方法。
【００１５】
［２］  置換されるべき疎水性アミノ酸残基が、配列番号５の上記Ｃドメインの５位のＰｈｅ、１３位のＰｈｅ、１７位のＬｅｕ、または３１位のＩｌｅである上記［１］に記載の方法。
【００１６】
［３］  置換されるべき疎水性アミノ酸残基が、配列番号４の上記Ｂドメインの３１位のＩｌｅである上記［１］または［２］に記載の方法。
【００１７】
［４］  他の疎水性アミノ酸残基が、Ａｌａ、Ｌｅｕ、またはＩｌｅである上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
【００１８】
［５］  極性無電荷アミノ酸残基がＴｈｒである上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
【００１９】
［６］  リガンドのアミノ酸配列において、配列番号５の上記Ｃドメインの第９位のＧｌｎ、第１０位のＧｌｎ、第１４位のＴｙｒ、第２０位のＰｒｏ、第２１位のＡｓｎ、第２２位のＬｅｕ、第２６位のＧｌｎ、第２７位のＡｒｇ、第３０位のＰｈｅ、第３４位のＬｅｕ、第３８位のＰｒｏ、第３９位のＳｅｒ、第４５位のＬｅｕ、第５１位のＬｅｕ、第５２位のＡｓｎ、第５５位のＧｌｎ、および第５７位のＰｒｏに相当するアミノ酸残基が９０％以上保持されている上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
【００２０】
［７］  リガンドが、上記ドメインを２個以上連結して得られる複数ドメインからなる上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
【００２１】
［８］  液体試料が、ヤギ亜科属動物の乳汁である上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明方法によれば、ヤギ亜科属動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体とヤギ亜科属動物以外の動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体とを含む液体試料を分離し、免疫グロブリンＧまたはその誘導体を効率的に製造することが可能になる。よって本発明は、免疫グロブリンＧまたはその誘導体の効率的な製造に寄与できるものとして、産業上非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、プロテインＡのＥドメイン，Ｄドメイン，Ａドメイン，ＢドメインおよびＣドメインのアミノ酸配列のアラインメントである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明方法を工程毎に説明する。
１．吸着工程
本工程では、ヤギ亜科属動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体と野生型プロテインＡに結合するヤギ亜科属動物以外の動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体とを含む液体試料を、リガンドが担体に固定化されたアフィニティ分離マトリックスに接触させることにより、ヤギ亜科属動物以外の動物由来の免疫グロブリンＧまたはその誘導体をリガンドに吸着させる。以下、免疫グロブリンＧまたはその誘導体をまとめて「ＩｇＧ」と略記する場合がある。
【００２５】
ヤギ亜科属動物は、大家畜に比べると取扱いが容易で多胎であり、世代交代が短く、形質転換により乳汁中などから標的ＩｇＧを効率良く得られる。ヤギ亜科属動物としては、例えば、ヤギ属動物やヒツジ属動物などが挙げられる。
【００２６】
ヤギ亜科属動物以外の動物は、有用な抗体を生産するものであれば特に制限されない。例えば、ヒト；マウスやラット等のネズミ科動物；ウサギ等のウサギ亜科動物；ウシ等のウシ亜科動物；ウマ等のウマ科動物；イヌ等のイヌ科動物；ネコ等のネコ科動物；ブタ等のイノシシ属ブタ亜種動物；ラクダ、ラマ、アルパカ等のラクダ科動物を挙げることができる。
【００２７】
本工程で用いる液体試料は、ヤギ亜科属動物由来のＩｇＧと野生型プロテインＡに結合するヤギ亜科属動物以外の動物由来のＩｇＧとを含むものであれば特に制限されない。例えば、ヤギ亜科属動物以外の動物由来の標的ＩｇＧを生産するよう形質転換されたヤギ亜科属動物由来の血液、乳汁、卵白などの液体試料を挙げることができる。特に、カゼイン遺伝子などの乳汁タンパク質遺伝子のプロモーターを利用して標的ＩｇＧ遺伝子を導入した場合には、標的ＩｇＧが乳汁中に有効に分泌される。これらは、リガンドに接触させる前に、予備精製してもよい。例えば血液試料としては、血清や血漿を用いてもよい。
【００２８】
上記動物の形質転換は、常法を用いて行えばよい。例えば、標的遺伝子を上記動物の受精卵の前核に顕微注入する方法；標的ＩｇＧ遺伝子と精子を共培養し、体外受精または顕微受精する方法；標的ＩｇＧ遺伝子をＥＳ細胞に導入し、キメラ動物の作製を経由して形質転換動物を得る方法；標的ＩｇＧ遺伝子を体細胞や始原生殖細胞（ＰＧＣ）に導入し、更に体細胞核移植によりクローン個体を作製する方法などを挙げることができる。
【００２９】
また、ヤギ亜科属動物以外の動物由来の標的ＩｇＧを生産するよう形質転換された細胞を、ヤギ亜科属動物の血清を含む培地で培養した培養培地を液体試料としてもよい。細胞の形質転換は、常法により行うことができる。
【００３０】
本発明において、ヤギ亜科属動物以外の動物由来のＩｇＧを選択的に吸着するためのリガンドは、プロテインＡのＥドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、ＢドメインまたはＣドメインから選択される１以上のドメインのＦｃ結合部位における１以上の疎水性アミノ酸残基が他の疎水性アミノ酸残基または極性無電荷アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する。当該リガンドは、野生型プロテインＡまたは野生型プロテインＡリガンドに比べて、野生型プロテインＡに結合するヤギ亜科属動物以外の動物由来のＩｇＧに対する親和性が少なくとも維持されている一方で、ヤギ亜科属動物由来のＩｇＧに対する親和性が低下している。以下、プロテインＡを「ＳｐＡ」と略記する場合がある。
【００３１】
ＳｐＡは、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）によって生産される細胞壁タンパク質の１種であり、シグナル配列Ｓ、５つの免疫グロブリン結合性ドメイン（Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン）、および、細胞壁結合ドメインであるＸＭ領域から構成されている（非特許文献１）。ＳｐＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインは、免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域に結合することができる免疫グロブリン結合性ドメインであり、いずれのドメインも、免疫グロブリンのＦｃ領域、Ｆａｂ領域、およびＦａｂ領域中の特にＦｖ領域に結合する活性を有する。本発明で用いる変異型ＳｐＡは、上記免疫グロブリン結合性ドメインのうち１以上のドメインのＦｃ結合部位における疎水性アミノ酸残基が他の疎水性アミノ酸残基または極性無電荷アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する。
【００３２】
また、本発明で用いる変異型ＳｐＡドメインは、上記免疫グロブリン結合性ドメインから選択される１つのドメインであってもよいし、２以上のドメインが結合した多量体であってもよい。当該多量体は、１種の免疫グロブリン結合性ドメインが結合したホモ多量体であってもよいし、２種以上の免疫グロブリン結合性ドメインが結合したヘテロ多量体であってもよい。免疫グロブリン結合性ドメイン多量体におけるドメインの数としては、２個以上が挙げられ、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上であり、また、１０個以下が挙げられ、好ましくは８個以下、より好ましくは６個以下である。
【００３３】
免疫グロブリン結合性ドメイン多量体における各ドメインの連結のされ方としては、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法、および、アミノ酸残基を挟まず直接連結する方法が挙げられる。連結のためのアミノ酸残基数に特に制限は無いが、好ましくは２０残基以下であり、より好ましくは１５残基以下であり、更により好ましくは１０残基以下であり、更により好ましくは５残基以下であり、更により好ましくは２残基以下である。これらのアミノ酸配列は、各ドメインの３次元立体構造を不安定化しないものが好ましい。
【００３４】
Ｆｃ結合部位の疎水性アミノ酸残基が他の疎水性アミノ酸残基または極性無電荷アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異型ＳｐＡまたは変異型ＳｐＡドメインのアミノ酸配列は、野生型ＳｐＡのＥドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、ＢドメインまたはＣドメイン、即ち配列番号１〜５のアミノ酸配列に限定されず、アミノ酸の置換、挿入、欠失および化学修飾により部分的に改変されたアミノ酸配列であっても、Ｆｃ領域への結合能を有しているドメインである限りこれに含まれる。かかる変異（置換、挿入、欠失および化学修飾）の数としては、１０以下が好ましく、５以下がより好ましく、１または２がより更に好ましい。改変されたアミノ酸配列としては、例えば、野生型ＳｐＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインに対して、Ｃドメインの２９位に対応するＧｌｙをＡｌａに置換する変異を導入したアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。また、ＢドメインにＡ１ＶとＧ２９Ａという変異を導入したＺドメインもＦｃ領域への結合能を有しているので、ドメインに由来するアミノ酸配列に該当する。ドメインに由来するアミノ酸配列は、化学安定性が高いドメイン、またはその変異体であることが好ましい。
【００３５】
本発明で用いる変異型ＳｐＡおよび変異型ＳｐＡドメインは、Ｆｃ領域への結合能を有する。これら変異型ＳｐＡと変異型ＳｐＡドメインのアミノ酸配列は、野生型ＳｐＡまたは野生型ＳｐＡドメインのアミノ酸配列（配列番号１〜５）に対して、８５％以上の配列同一性を有することが好ましい。当該配列同一性としては、９０％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または９５％以上が好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上がより好ましく、９９．５％以上または９９．８％以上がより更に好ましい。
【００３６】
アミノ酸の置換は、元のアミノ酸を削除し、その位置に種類の異なる別のアミノ酸を追加する変異のことを意味する。なお、アミノ酸を置換する変異の表記について、置換位置の番号の前に、野生型または非変異型のアミノ酸を付し、置換位置の番号の後に、変異したアミノ酸を付して表記する。例えば、２９位のＧｌｙをＡｌａに置換する変異は、Ｇ２９Ａと記載する。
【００３７】
野生型ＳｐＡのＥドメイン，Ｄドメイン，Ａドメイン，ＢドメインおよびＣドメインのアミノ酸配列のアラインメントを図１に示す。図１中、「−」は、Ｃドメインの同列のアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基を示し、四角枠で囲んだ部分はＦｃ結合部位を示す。Ｅドメイン（配列番号１）において、Ｆｃ結合部位の疎水性アミノ酸残基は３位のＨｉｓ、１１位のＰｈｅ、１５位のＬｅｕ、２９位のＩｌｅである。Ｄドメイン（配列番号２）において、Ｆｃ結合部位の疎水性アミノ酸残基は８位のＰｈｅ、１６位のＰｈｅ、２０位のＬｅｕ、３４位のＩｌｅである。Ａドメイン（配列番号３）において、Ｆｃ結合部位の疎水性アミノ酸残基は５位のＰｈｅ、１３位のＰｈｅ、１７位のＬｅｕ、３１位のＩｌｅである。Ｂドメイン（配列番号４）において、Ｆｃ結合部位の疎水性アミノ酸残基は５位のＰｈｅ、１３位のＰｈｅ、１７位のＬｅｕ、３１位のＩｌｅである。Ｃドメイン（配列番号５）において、Ｆｃ結合部位の疎水性アミノ酸残基は５位のＰｈｅ、１３位のＰｈｅ、１７位のＬｅｕ、３１位のＩｌｅである。本発明では、リガンドに含まれるドメインの上記Ｆｃ結合部位の疎水性アミノ酸残基のうち１以上が他の疎水性アミノ酸残基または極性無電荷アミノ酸残基に置換されている。
【００３８】
ＳｐＡのＦｃ結合部位の疎水性アミノ酸残基を置換する他の疎水性アミノ酸残基としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐが挙げられ、中でもＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅが好ましく、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅがより好ましい。ここで、他の疎水性アミノ酸残基とは、置換の対象となる元の疎水性アミノ酸残基とは異なる疎水性アミノ酸残基を意味する。例えば、置換の対象となる元のアミノ酸残基がＣドメインの５位または１３位のＰｈｅである場合には、他の疎水性アミノ酸残基としては、前述した他のアミノ酸残基のうちＰｈｅ以外のアミノ酸残基が挙げられる。置換の対象となる元のアミノ酸残基がＣドメインの１７位のＬｅｕである場合には、他の疎水性アミノ酸残基としては、前述した他のアミノ酸残基のうちＬｅｕ以外のアミノ酸残基が挙げられる。置換の対象となる元のアミノ酸残基がＣドメインの３１位のＩｌｅである場合には、他の疎水性アミノ酸残基としては、前述した他のアミノ酸残基のうちＩｌｅ以外のアミノ酸残基が挙げられる。
【００３９】
ＳｐＡのＦｃ結合部位の疎水性アミノ酸残基を置換する極性無電荷アミノ酸残基としては、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓが挙げられ、中でもＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｙｒが好ましく、Ｔｈｒがより好ましい。
【００４０】
より具体的な置換態様としては、Ｃドメインの５位のＰｈｅのＡｌａまたはＴｙｒへの置換、Ｃドメインの１３位のＰｈｅのＴｙｒへの置換、Ｃドメインの１７位のＬｅｕのＩｌｅ、ＶａｌまたはＴｈｒへの置換、Ｃドメインの３１位のＩｌｅのＬｅｕ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌが挙げられる。この中でも、ＣドメインにおけるＦ５Ａ、Ｆ５Ｙ、ＣドメインにおけるＦ１３Ｙ、ＣドメインにおけるＬ１７Ｉ、Ｌ１７Ｖ、Ｌ１７Ｔ、ＣドメインにおけるＩ３１Ｌ、Ｉ３１Ｓ、Ｉ３１Ｔ、Ｉ３１Ｖ、ＢドメインにおけるＩ３１Ｌ、Ｉ３１Ｔが好ましい。
【００４１】
また、より具体的な置換態様としては、Ｂドメインの３１位のＩｌｅのＬｅｕへの置換が挙げられる。その他、Ｅドメイン、Ｄドメイン、ＡドメインおよびＢドメインにおいて、Ｃドメインにおける上記置換位置に対応する位置における置換も好ましい。各ドメイン間の対応する位置は、図１に示すアラインメントで把握することができる。
【００４２】
Ｆｃ結合部位のアミノ酸置換の数は、置換前と比較してＦｃ領域に対する親和性が維持または向上していれば特に限定されないが、変異導入前のタンパク質の立体構造の維持や中性領域での抗体結合能の維持の観点からは、４個以下または３個以下が好ましく、２個以下または１個であることがより好ましい。２個のアミノ酸置換の態様としては、例えばＣドメインにおけるＬ１７ＩとＩ３１Ｌの置換や、Ｅ、Ｄ、Ａ、またはＢドメインにおいて、Ｃドメインの１７位および３１位に対応する位置のアミノ酸を同様に置換する方法が挙げられる。
【００４３】
置換前と比較してＦｃ領域に対する親和性が維持または向上している限り、Ｆｃ結合部位の疎水性アミノ酸残基の他の疎水性アミノ酸残基または極性無電荷アミノ酸残基への置換以外に、任意のアミノ酸置換を含んでいてもよい。このようなアミノ酸置換としては、ＣドメインにおけるＧ２９Ａの置換が挙げられる。また、Ｅ、Ｄ、Ａ、またはＢドメインにおいて、Ｃドメインの２９位に対応する位置に対応する位置での置換が挙げられる。更に、任意のアミノ酸置換としては、Ｃドメインの４０位に対応するＶａｌのＶａｌ以外のアミノ酸残基への置換が挙げられ、具体的にはＣドメインにおけるＶ４０Ｑの置換が挙げられる。また、疎水性アミノ酸残基、酸性アミノ酸残基、または極性無電荷アミノ酸残基の塩基性アミノ酸残基への置換が挙げられ、具体的にはＣドメインにおけるＡ１２Ｒ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ２２Ｒ、Ｑ２６Ｒ、Ｑ３２Ｒ、Ｓ３３Ｈ、Ｖ４０Ｈの置換、またはＥ、Ｄ、Ａ、またはＢドメインにおける対応位置での置換が挙げられる。
【００４４】
Ｆｃ結合部位の疎水性アミノ酸残基を他の疎水性アミノ酸残基または極性無電荷アミノ酸残基に置換して得られるアミノ酸配列と、配列番号１〜５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインとの配列同一性としては、８５％以上の配列同一性を有することが好ましい。当該配列同一性としては、９０％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または９５％以上が好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上がより好ましく、９９．５％以上または９９．８％以上がより更に好ましい。
【００４５】
本発明で用いる変異型ＳｐＡおよび変異型ＳｐＡドメインにおいて、以下に示すＣドメインの位置、およびＥ、Ｄ、Ａ、Ｂドメインにおける以下に示す位置に相当する位置のアミノ酸残基が９０％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または９５％以上保持されていることが好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上保持されていることがより好ましく、９９．５％以上または９９．８％以上がより更に好ましい。：９位Ｇｌｎ、１０位Ｇｌｎ、１４位Ｔｙｒ、２０位Ｐｒｏ、２１位Ａｓｎ、２２位Ｌｅｕ、２６位Ｇｌｎ、２７位Ａｒｇ、３０位Ｐｈｅ、３４位Ｌｅｕ、３８位Ｐｒｏ、３９位Ｓｅｒ、４５位Ｌｅｕ、５１位Ｌｅｕ、５２位Ａｓｎ、５５位Ｇｌｎ、および５７位Ｐｒｏ。
【００４６】
本発明で用いる変異型ＳｐＡおよび変異型ＳｐＡドメインは、リガンドとして水不溶性担体に固定化し、アフィニティ分離マトリックスとすることが好ましい。本発明に用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体；架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や；結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体；さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。但し、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
【００４７】
また、本発明に用いる水不溶性担体は、本アフィニティ分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
【００４８】
上記リガンドは、直接またはリンカー基を介して、共有結合により上記水不溶性担体に固定化されている。当該リンカー基としては、例えば、Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基（−ＮＨ−）、エーテル基（−Ｏ−）、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、エステル基（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（＝Ｏ）−）、アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−または−ＮＨＣ（＝Ｏ）−）、ウレア基（−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−）；Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基、エーテル基、カルボニル基、エステル基、アミド基およびウレア基からなる群より選択される２以上１０以下の基が連結された基；アミノ基、エーテル基、カルボニル基、エステル基、アミド基およびウレア基からなる群より選択される基を一端または両端に有するＣ1-6アルキレン基を挙げることができる。上記の連結数としては、８以下または６以下が好ましく、５以下がより好ましく、４以下がさらに好ましい。また、上記Ｃ1-6アルキレン基は、水酸基などの置換基などにより置換されていてもよい。
【００４９】
リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシ基またはチオール基を利用した、従来のカップリング法で担体に結合してよい。カップリング法としては、臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンまたは過ヨウ素酸ナトリウムなどと担体とを反応させて担体を活性化するか、或いは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
【００５０】
また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。従って、固定化のために、本発明に係るＶＬ−κ結合性ペプチドを化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。本発明の本質は、本発明においてペプチドに付与したＶＬ−κ結合性が、当該ペプチドをリガンドとして固定化したマトリックスにおいても同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように修飾・改変しても、本発明の範囲に含まれる。
【００５１】
液体試料とアフィニティ分離マトリックスを接触させる方法としては、常法を用いることができる。例えば、液体試料とアフィニティ分離マトリックスを単に混合するのみでもよいが、効率の観点から、アフィニティ分離マトリックスをカラムに充填することによりアフィニティカラムを作製し、当該カラムに免疫グロブリン含有試料を流すことが好ましい。
【００５２】
本発明で用いるリガンドは、ヤギ亜科属動物由来のＩｇＧに対する親和性が比較的低い一方で、ヤギ亜科属動物以外の動物由来のＩｇＧに対する親和性は比較的高い。よって、かかるリガンドを含むアフィニティ分離マトリックスと、ヤギ亜科属動物由来のＩｇＧおよびヤギ亜科属動物以外の動物由来のＩｇＧを含む液体試料を接触させることにより、ヤギ亜科属動物以外の動物由来のＩｇＧを選択的に当該リガンドに吸着させることができ、ヤギ亜科属動物由来のＩｇＧとヤギ亜科属動物以外の動物由来のＩｇＧとを分離させることができる。
【００５３】
液体試料をアフィニティ分離マトリックスに接触させる際の液体試料は、中性に調整することが好ましい。液体試料のｐＨとしては、具体的には、６．５以上、８．５以下が好ましく、７以上、８以下がより好ましい。また、液体試料をアフィニティ分離マトリックスに吸着させる際の温度としては１℃以上、４０℃以下が好ましく、４℃以上、２５℃以下がより好ましい。
【００５４】
２．洗浄工程
上記選択的吸着工程によりヤギ亜科属動物以外の動物由来のＩｇＧが吸着保持されたアフィニティ分離マトリックスを洗浄し、ヤギ亜科属動物由来のＩｇＧに加えて、ヤギ亜科属動物以外の動物由来のＩｇＧ以外の不純物を除去する。なお、この時点では、ヤギ亜科属動物以外の動物由来のＩｇＧはリガンドに吸着されている。
【００５５】
本洗浄工程において、アフィニティ分離マトリックスの洗浄に用いられる洗浄液としては、ヤギ亜科属動物以外の動物由来のＩｇＧと上記リガンドとの相互作用を妨げないものを使用する。例えば、ｐＨが６以上８以下の緩衝液のみを洗浄液として用いることができる。
【００５６】
３．溶出工程
本工程では、酸性緩衝液を使って、ヤギ亜科属動物以外の動物由来のＩｇＧが吸着された上記アフィニティ分離マトリックスから当該ＩｇＧを分離する。本溶出工程によって、精製されたヤギ亜科属動物以外の動物由来のＩｇＧが得られる。
【００５７】
本溶出においてヤギ亜科属動物以外の動物由来のＩｇＧをリガンドから分離するために用いられる酸性緩衝液のｐＨは適宜調整すればよいが、例えば、２．０以上４．０以下程度とすることができる。また、ヤギ亜科属動物以外の動物由来のＩｇＧを溶出するために用いられる酸性緩衝液には、リガンドからの解離を促進する物質を添加してもよい。
【００５８】
４．アフィニティ分離マトリックスの再生工程
本工程では、上記溶出工程においてヤギ亜科属動物以外の動物由来のＩｇＧを分離したアフィニティ分離マトリックスをアルカリ性水溶液で洗浄することによって、アフィニティ分離マトリックスを再生する。但し、本再生工程は、上記溶出工程の後に必須的に実施する必要はなく、上記選択的吸着工程〜溶出工程の３回に１回、５回に１回、または１０回に１回の実施でも構わない。
【００５９】
アフィニティ分離マトリックスの再生に用いる「アルカリ性水溶液」は、洗浄または殺菌の目的を達成し得る程度のアルカリ性を示す水溶液である。より具体的には、０．０１Ｍ以上１．０Ｍ以下、または、０．０１Ｎ以上１．０Ｎ以下の水酸化ナトリウム水溶液などが該当するが、これに限定されるものではない。水酸化ナトリウムを例とした場合、その濃度の下限は、０．０１Ｍが好ましく、０．０２Ｍがより好ましく、０．０５Ｍがさらにより好ましい。一方、水酸化ナトリウムの濃度の上限は、１．０Ｍが好ましく、０．５Ｍがより好ましく、０．３Ｍがさらにより好ましく、０．２Ｍがさらにより好ましく、０．１Ｍがさらにより好ましい。アルカリ性水溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液である必要はないが、そのｐＨは１２以上１４以下が好ましい。ｐＨの下限に関し、１２．０以上が好ましく、１２．５以上がより好ましい。ｐＨの上限に関し、１４以下が好ましく、１３．５以下がさらにより好ましく、１３．０以下がさらにより好ましい。
【００６０】
上記溶出工程を経たアフィニティ分離マトリックスをアルカリ性水溶液により処理する時間は、アルカリ性水溶液の濃度や処理時の温度によってペプチドの受けるダメージは異なるので、特に限定はされず、適宜調整すればよい。例えば、水酸化ナトリウムの濃度が０．０５Ｍで、浸漬時の温度が室温の場合、アルカリ性水溶液に浸漬する時間の下限は、１時間が好ましく、２時間がより好ましく、４時間がより好ましく、１０時間がより好ましく、また、上限としては２０時間が好ましいが、特に限定はされない。
【００６１】
本発明に係るアフィニティ分離マトリックスに固定化されているリガンドは、ヤギ亜科属動物以外の動物由来のＩｇＧに対して比較的高い親和性を示す一方で、ヤギ亜科属動物由来のＩｇＧに対しては比較的低い親和性を示すことから、例えば、ヤギ亜科属動物以外の動物由来のＩｇＧを生産するよう形質転換されたヤギ亜科属動物から得られた試料から、ヤギ亜科属動物以外の動物由来のＩｇＧを選択的に吸着することができる。よって、上記選択的吸着工程、洗浄工程、および溶出工程により、上記形質転換動物などからヤギ亜科属動物以外の動物由来のＩｇＧを有効に精製することができる。
【実施例】
【００６２】
以下に実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６３】
以下の実施例では、組換えＤＮＡの作製や操作などは、特に断わらない限り下記の実験書に従って実施した。
参考文献１：  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら著，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊（米国），１９８９
参考文献２：  村松正實編著「ラボマニュアル遺伝子工学  第３版」，丸善株式会社刊，１９９６
【００６４】
また、以下の実施例で用いた試薬や制限酵素などについては、特に明記しない限り、市販品を用いた。
【００６５】
実施例で取得した各種タンパク質を「ドメインを示すアルファベット−導入した変異」の形で表記する。変異を導入していない野生型タンパク質は、「導入した変異」の代わりに「Ｗｉｌｄ」と表記する。例えば、プロテインＡの野生型Ｃドメインは「Ｃ−ｗｉｌｄ」、変異Ｇ２９Ｅを導入したＣドメイン変異体は「Ｃ−Ｇ２９Ｅ」と表記する。２種類の変異を同時に導入した変異体の表記は、スラッシュを用いて併記する。例えば、変異Ｇ２９Ｅおよび変異Ｓ１３Ｌを導入したＣドメイン変異体は、「Ｃ−Ｇ２９Ｅ／Ｓ１３Ｌ」と表記する。また、単ドメインを複数連結したタンパク質は、ピリオドの後に、連結した数に「ｄ」をつけて表記する。例えば、変異Ｇ２９Ｅおよび変異Ｓ１３Ｌを導入したＣドメイン変異体を５連結したタンパク質は「Ｃ−Ｇ２９Ｅ／Ｓ１３Ｌ．５ｄ」と表記する。
【００６６】
実施例１：  プロテインＡリガンドの抗体結合能の評価
表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサー（「Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００」ＧＥヘルスケア社製）を用いて、プロテインＡリガンドと免疫グロブリンとの親和性を解析した。本実施例１では、リーク測定用プロテインＡリガンド標準品（「ＫＡＮＥＫＡ  ＫａｎＣａｐＡTM  ３Ｇ」カネカ社製）と、市販の各種動物由来の抗体を使用した。また、特開２００６−３２０２２０号公報に記載の方法に準じて、スタフィロコッカス・アウレウスＡＴＣＣ６５３８Ｐ株由来プロテインＡからシグナル配列（Ｓドメイン）と細胞壁結合ドメイン（Ｘドメイン）の一部を除いた部分を遺伝子組換えにより生産し、クロマトグラフィーで精製して野生型プロテインＡを得て使用した。なお、ＫＡＮＥＫＡ  ＫａｎＣａｐＡTMとＫＡＮＥＫＡ  ＫａｎＣａｐＡTM  ３Ｇのアミノ酸配列は公表されていないが、少なくとも、ＫＡＮＥＫＡ  ＫａｎＣａｐＡTM  ３Ｇは、ＷＯ２０１７／０１４２５７に記載された特徴のアミノ酸配列を有し、配列番号１〜５に記載のプロテインＡのＥ，Ｄ，Ａ，ＢまたはＣドメインに由来するアミノ酸配列において、Ｆｃ結合部位の疎水性アミノ酸残基を他の疎水性アミノ酸残基または極性無電荷アミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を有するプロテインＡを含む。更に、上記特徴を有さない対照プロテインＡも用いた。
各種プロテインＡをセンサーチップに固定化し、各種抗体をチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。プロテインＡリガンド標準品のセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、およびＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いてＢｉａｃｏｒｅ  ３０００付属のプロトコルに従い、実施した。センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケア社製のものを用いた。また、チップ上の別のフローセルに対して、ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した後にエタノールアミンを固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。
具体的には、各種抗体をランニング緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．００５％  Ｐ−２０，ｐＨ７．４）に溶解し、１０〜１０００ｎＭの範囲で濃度の異なる３種の溶液を調製し、各抗体溶液を、流速２０μＬ／ｍｉｎでセンサーチップに３０秒間添加した。測定温度２５℃にて、添加時（結合相，３０秒間）、および添加終了後（解離相，６０秒間）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、１０ｍＭグリシン塩酸塩溶液（ＧＥヘルスケア社製，ｐＨ２．０）を３０秒間添加することにより、センサーチップ上に残った添加抗体を除去し、センサーチップを再生した。固定化したヒトＩｇＧの結合活性がほぼ完全に回復することを確認した。
得られた結合反応曲線（リファレンスセルの結合反応曲線を差し引いた結合反応曲線）に対して、システム付属ソフトＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、結合速度定数（ｋon）、解離速度定数（ｋoff）、および親和定数（ＫA＝ｋon／ｋoff）を算出した。結果を表１に示す。
【００６７】
【表１】
2020117454.tif 000002
【００６８】
表１に示す結果の通り、本発明に係るＫＡＮＥＫＡ  ＫａｎＣａｐＡTM  ３ＧのプロテインＡリガンドは、Ｇｏａｔ  ＩｇＧとＳｈｅｅｐ  ＩｇＧに対する抗体結合能が著しく低下していた。一方、野生型プロテインＡや対照プロテインＡリガンドは、Ｇｏａｔ  ＩｇＧとＳｈｅｅｐ  ＩｇＧへの結合能が確認された。本結果より、ＫＡＮＥＫＡ  ＫａｎＣａｐＡTM  ３Ｇに導入されているＦｃ結合部位の疎水性アミノ酸残基を他の疎水性アミノ酸残基または極性無電荷アミノ酸残基に置換する変異により、Ｇｏａｔ  ＩｇＧとＳｈｅｅｐ  ＩｇＧに対する抗体結合能が低下することが示された。
【００６９】
実施例２：  プロテインＡのＣドメイン変異体の抗体結合能の評価
プロテインＡのＣドメイン体にＧ２９Ａ変異を導入したＣ−Ｇ２９Ａ．２ｄ（配列番号６）をコードするＤＮＡの５’末端にＰｓｔＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号７）に、表２に記載のアミノ酸置換変異を導入した改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄの人工合成遺伝子を、ユーロフィンジェノミクス社への外注によって全合成した。各人工合成遺伝子を導入するサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩ（タカラバイオ社製）で消化し、取得したＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で消化したブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２（タカラバイオ社製）へライゲーションし、改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄのアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挿入された発現プラスミドを調製した。なお、プラスミドの調製にはエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を用いた。
ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株（タカラバイオ社製）を得られたプラスミドで形質転換し、改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄを分泌生産する遺伝子組換え体を育種した。この遺伝子組換え体を、６０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含む３０ｍＬのＡ培地（ポリペプトン３．０％，酵母エキス０．５％，グルコース３％，硫酸マグネシウム０．０１％，硫酸鉄０．００１％，塩化マンガン０．００１％，塩化亜鉛０．０００１％）にて、３０℃で３日間振盪培養した。培養後、培養液を１５，０００ｒｐｍ、２５℃で５分間遠心分離することにより菌体を除去した後、得られた培養上清からクロマトグラフィーにより改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄとＣ−Ｇ２９Ａ．２ｄの精製品を得た。精製品を高速液体クロマトグラフィーで分析し、各Ｃドメイン変異体の濃度を測定した。
次に、表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサー（「Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００」ＧＥヘルスケア社製）を用いて、取得した各Ｃドメイン変異体の免疫グロブリンとの親和性を解析した。ヒトＩｇＧ、Ｇｏａｔ  ＩｇＧ、Ｓｈｅｅｐ  ＩｇＧをそれぞれセンサーチップに固定化し、各Ｃドメイン変異体をチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。ＩｇＧのセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、およびＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた。センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケア社製のものを用いた。ＩｇＧ溶液は、標準緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）に１．０ｍｇ／ｍＬになるよう溶解して調製した。ＩｇＧ溶液を、固定化用緩衝液（１０ｍＭ  ＣＨ3ＣＯＯＨ−ＣＨ3ＣＯＯＮａ，ｐＨ５．０）で１００倍に希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００付属のプロトコルに従い、ＩｇＧをセンサーチップへ固定した。また、チップ上の別のフローセルに対して、ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した後にエタノールアミンを固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。
各Ｃドメイン変異体をランニング緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．００５％  Ｐ−２０，ｐＨ７．４）に溶解し、１０〜１０００ｎＭの範囲で濃度の異なる３種の溶液を調製し、各Ｃドメイン変異体溶液を、流速２０μＬ／ｍｉｎでセンサーチップに３０秒間添加した。測定温度２５℃にて、添加時（結合相，３０秒間）、および添加終了後（解離相，６０秒間）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、１０ｍＭグリシン塩酸塩溶液（ＧＥヘルスケア社製，ｐＨ３．０）を３０秒間添加することにより、センサーチップ上に残った添加抗体を除去し、センサーチップを再生した。固定化したヒトＩｇＧの結合活性がほぼ完全に回復することを確認した。
得られた結合反応曲線（リファレンスセルの結合反応曲線を差し引いた結合反応曲線）に対して、システム付属ソフトＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、結合速度定数（ｋon）、解離速度定数（ｋoff）、および親和定数（ＫA＝ｋon／ｋoff）を算出した。結果を表２に示す。
【００７０】
【表２】
2020117454.tif 000003
【００７１】
表２に示す結果の通り、本発明に係る改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄのヒトＩｇＧに対する結合パラメータは、Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄ（対照）と同程度であった。なお、プロテインＡのＣドメイン（配列番号５）の第２９位のグリシンは、Ｆａｂ結合部位に含まれる。
一方、変異Ｇ２９Ａに加えて、Ｆｃ結合部位に含まれる配列番号５の第５位、第２９位または第３１位の疎水性アミノ酸残基を他の疎水性アミノ酸残基または極性無電荷アミノ酸残基に置換した本発明に係る改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄのＧｏａｔ  ＩｇＧとＳｈｅｅｐ  ＩｇＧに対する結合能は、検出できないほど低下していることが分かった。
【００７２】
実施例３：  Ｂドメイン変異体の抗体結合能の評価
プロテインＡのＢドメイン体にＧ２９Ａ変異を導入したＢ−Ｇ２９Ａ．２ｄ（配列番号８）をコードするＤＮＡの５’末端にＰｓｔＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号９）に、表３に記載のアミノ酸置換変異を導入した改変型Ｂ−Ｇ２９Ａ．２ｄの人工合成遺伝子をユーロフィンジェノミクス社への外注によって全合成した。次いで、実施例２と同様にして、改変型Ｂ−Ｇ２９Ａ．２ｄとＢ−Ｇ２９Ａ．２ｄの精製品を得た。精製品を高速液体クロマトグラフィーで分析し、各Ｂドメイン変異体の濃度を測定した。Ｂドメイン変異体の免疫グロブリンとの親和性を実施例２と同様にして解析した。結果を表３に示す。
【００７３】
【表３】
2020117454.tif 000004
【００７４】
表３に示す結果の通り、改変型Ｂ−Ｇ２９Ａ．２ｄのヒトＩｇＧに対する結合パラメータは、Ｂ−Ｇ２９Ａ．２ｄ（対照）と同程度であった。なお、プロテインＡのＢドメイン（配列番号４）の第２９位のグリシンは、Ｆａｂ結合部位に含まれる。
一方、変異Ｇ２９Ａに加えて、Ｆｃ結合部位に含まれる配列番号４の第３１位のイソロイシンをロイシンに置換した本発明に係る改変型Ｂ−Ｇ２９Ａ．２ｄのＧｏａｔ  ＩｇＧとＳｈｅｅｐ  ＩｇＧに対する結合能は、実施例２の結果と同様に検出できないほど低下していることが分かった。
【００７５】
実施例４：  市販担体を用いた血清からの抗体精製実験
トランスジェニックヤギやトランスジェニックヒツジを用いた抗体の生産を想定し、本発明に係る変異体とヤギ由来抗体およびヒツジ由来抗体との親和性を測定した。配列番号１〜５に記載のプロテインＡのＥ，Ｄ，Ａ，ＢまたはＣドメインに由来するアミノ酸配列において、Ｆｃ結合部位の疎水性アミノ酸残基を他の疎水性アミノ酸残基または極性無電荷アミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を有するプロテインＡが担持された担体であるＫＡＮＥＫＡ  ＫａｎＣａｐＡTM  ３Ｇ（カネカ社製）を用いて、ヤギ血清（Ｇｉｂｃｏ社製）とヒツジ血清（Ｓｉｇｍａ社製）からの抗体精製実験を実施した。対照として、上記変異を有さないプロテインＡクロマト担体ＫＡＮＥＫＡ  ＫａｎＣａｐＡTM（カネカ社製）についても試験した。
具体的には、カラム（「Ｔｒｉｃｏｒｎ」ＧＥヘルスケア社製，０．５ｃｍ径×高さ５ｃｍ）に各担体を１ｍＬ充填し、３カラムボリューム（ＣＶ）のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（シグマ・アルドリッチ社製）を流速１ｍＬ／ｍｉｎで流してカラムを平衡化した。各血清をそれぞれダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（シグマ・アルドリッチ社製）で５倍希釈し、５ｍＬを流速０．２５ｍＬ／ｍｉｎで流した。次いで、流速を１ｍＬ／ｍｉｎに戻し、３ＣＶの平衡化緩衝液を流した後、５ＣＶの５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を流してカラムを洗浄し、更に５ＣＶの５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）を流して抗体を溶出した。抗体回収率は、溶出液の吸光度を測定して算出した。製品カタログに記載されている各プロテインＡのヒトＩｇＧに対する動的結合容量と、各血清からの抗体回収量の結果を表４に示す。また、ヒトＩｇＧに対する動的結合容量の製品カタログ値を１００％とした場合の、各抗体の回収率を相対値で括弧内に示す。
【００７６】
【表４】
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【００７７】
表４に示す結果の通り、プロテインＡのＦｃ結合部位に特定の変異が導入されているＫＡＮＥＫＡ  ＫａｎＣａｐＡTM  ３Ｇは、その様な変異が導入されていないＫＡＮＥＫＡ  ＫａｎＣａｐＡTMに比べてヤギ血清およびヒツジ血清からのヤギＩｇＧおよびヒツジＩｇＧの回収率が低く、ヒトＩｇＧに対する動的結合容量と比較すると２０％以下となった。本結果より、ＫＡＮＥＫＡ  ＫａｎＣａｐＡTM  ３Ｇが担持されたアフィニティ分離マトリックスは、ヤギ由来ＩｇＧやヒツジ由来ＩｇＧとヒトＩｇＧとを効率的に分離することが可能なプロテインＡ担体であることが分かった。
【図１】
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【配列表】
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