(57)【要約】      （修正有）【課題】白血病の非経口的治療に使用するのに適した化合物の提供。【解決手段】下式Ｉ2020011947.tif 000017［式中、Ｘは結合又は−ＣＨ２−である］で表される化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2020011947.tif 000014
［式中、Ｘは結合又は−ＣＨ２−である］の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
式IA：
【化２】
2020011947.tif 000015
を有する、請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３】
式IB：
【化３】
2020011947.tif 000016
を有する、請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項４】
請求項１に定義された式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容可能な塩と非経口投与用に適応されたそのためのビヒクル又は担体とを含む医薬組成物。
【請求項５】
請求項１に定義された式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容可能な塩の、白血病、骨髄異形成症候群又はリンパ腫の非経口治療における使用。
【請求項６】
白血病がＡＭＬである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
ＡＭＬがシタラビン耐性である及び／又は年齢≧６０歳の患者に発症している、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
ヒトを含む哺乳動物における白血病、骨髄異形成症候群又はリンパ腫の治療法であって、有効量の請求項１に定義された式Ｉの化合物、又はその薬学的に許容可能な塩を哺乳動物に非経口投与することを含む方法。
【請求項９】
白血病がヒトにおけるＡＭＬである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＡＭＬがシタラビン耐性である及び／又は年齢≧６０歳の患者に発症している、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な塩基修飾シチジンヌクレオチド及び造血（白血球）細胞系統のがん治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
国際特許出願第ＷＯ９２／１４７２９号に、ジオキソランシチジン及びそれらの５’−フルオロ類似体の各種ジアステレオマーの分割を可能にするエナンチオマー合成技術が記載されている。ある種のジアステレオマーは、ＨＩＶなどのレトロウィルス感染の治療に有用であると述べられている。
【０００３】
国際特許出願第ＷＯ９７／２１７０６号には更なるエナンチオマー合成が記載され、Ｌ−ヌクレオシド  ５’−フルオロトロキサシタビン（当時（−）−ｄＯＴＦＣとして知られた）が例示されている。これはＨＩＶに対して活性があると記述されている。
【０００４】
国際特許出願第ＷＯ００／５７８６１号には、１２人を対象にした、シタラビン治療が奏功しない進行白血病におけるトロキサシタビンの臨床試験が記載されている。
【０００５】
【化１】
2020011947.tif 000002
【０００６】
１２人の患者のうち４人が末梢血及び骨髄芽球に一過性の減少を示した。トロキサシタビンの５−フルオロシチジン類似体、及び各種の単純５’−リン酸エステルは、ＷＯ００／２１７０６号の開示にまとめて包含されているが、それ以外は記載も製造もされていない。トロキサシタビンは、２００５年８月に急性骨髄性白血病で第II相／第III相臨床試験に入ったが、独立データ安全性モニタリング委員会(independent data and safety monitoring board)によって早期に中止された。トロキサシタビンは何の適応においても薬物として登録されたことはなく、５−フルオロトロキサシタビンは臨床試験に全く入っていない。
【０００７】
国際特許出願第ＷＯ２０１６／０３０３３５号には、経口投与され、肝臓を標的とするトロキサシタビンのホスホロアミデートエステルが開示されている。肝臓に到達すると、ホスホロアミデートは肝細胞がんの細胞によって選択的に取り込まれ、代謝されることにより、トロキサシタビンホスフェートが肝臓に捕捉される。ＷＯ２０１６／０３０３３５号には、さらに、２つの５−フルオロトロキサシタビンホスホロアミデート（その構造は、以下の比較実施例１に記載されている）の製造が記載され、肝がん株におけるそれらの活性が開示されている。
【０００８】
白血病（leukemia、leukaemiaと綴られることもある）は、通常骨髄で発生し、多数の異常白血球を生じる造血細胞系統のがんの一種である。これらの白血球は十分成熟しておらず、芽球又は白血病細胞と呼ばれる。症状としては、出血及び紫斑の問題、疲労感、発熱、及び感染の危険性の増大などが挙げられる。診断は典型的には血液検査又は骨髄生検によって行われる。このように、白血病は、血液中に網状に形成している、そして主に骨髄で産生される広く分散した組織型を冒す。これは、特定臓器中に固形腫瘍として局在しているＷＯ２０１６／０３０３３５号で治療される肝細胞がんとは対照をなすはずである。
【０００９】
白血病の正確な原因は不明である。遺伝的要因と環境（非遺伝的）要因の組合せが役割を果たしていると考えられている。リスク因子は、喫煙、電離放射線、一部の化学物質（例えばベンゼン）、以前の化学療法、及びダウン症候群などである。白血病の家族歴を有する人も高リスクである。白血病には４つの主要タイプ、すなわち急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）のほか、いくつかの稀なタイプがある。
【００１０】
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、無効造血を特徴とするクローン性骨髄障害の一種で、血球減少及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）発症のリスク増大をもたらす。症状は、一般的に、正常血液細胞の不足によるもので、疲労、感染エピソード、出血及び紫斑の問題を含みうる。診断は骨髄評価によって行われる。以前の化学療法、放射線、及びベンゼンなどの化学物質への暴露がリスク因子であるが、大部分の場合、明らかな原因は見つけられない。
【００１１】
リンパ腫は、免疫防御の一部であるリンパ系における悪性腫瘍の総称である。症状は、腫瘍の位置及びリンパ腫のサブタイプによるが、リンパ節又は脾臓の肥大、正常血液細胞の不足、発熱、体重減少及び寝汗などでありうる。大部分の場合、根本原因は見つからないが、一部のサブタイプはある種の感染状態又は自己免疫状態に関連する。
【００１２】
白血病、骨髄異形成症候群及びリンパ腫はいずれも、血液、骨髄、及びリンパ系を冒す広義の腫瘍群に属し、造血組織及びリンパ組織の腫瘍として知られている。
白血病、ＭＤＳ及びリンパ腫の治療は、化学療法、放射線療法、標的療法、及び骨髄移植のいくつかの組合せと、それに加えて必要に応じて支持療法及び緩和療法を含みうる。治療の成功は、がんの種類及びその人の年齢に依存する。転帰は、先進国世界では一般的に改良されている。白血病の場合、平均５年生存率は米国では５７％である。１５歳未満の小児では、５年生存率は白血病の種類にもよるが６０〜８５％を超える。急性白血病の小児では、５年後に無がん状態であると、がんが再発する可能性は低い。
【００１３】
２０１５年、ＷＨＯの報告によれば、２３０万人が白血病に罹患し、３５３，５００人が死亡している。２０１２年、新たに３５２，０００人が発症している。白血病は小児の最も一般的なタイプのがんであり、小児における白血病例の４分の３が急性リンパ芽球性のタイプである。しかしながら、全白血病の約９０％は成人で診断されており、成人ではＡＭＬ及びＣＬＬが最も一般的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際特許出願第ＷＯ９２／１４７２９号
【特許文献２】国際特許出願第ＷＯ９７／２１７０６号
【特許文献３】国際特許出願第ＷＯ００／５７８６１号
【特許文献４】国際特許出願第ＷＯ００／２１７０６号
【特許文献５】国際特許出願第ＷＯ２０１６／０３０３３５号
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、上記肝臓標的特許の一般的範囲内に含まれる新規塩基修飾シチジンヌクレオチドが白血病の非経口的治療に使用するのに適した性質を有するという発見に基づく。
従って、本発明の第一の側面において、式Ｉ：
【００１６】
【化２】
2020011947.tif 000003
【００１７】
［式中、Ｘは結合又は−ＣＨ２−である］の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を提供する。
従って、本発明の一態様において、式IA：
【００１８】
【化３】
2020011947.tif 000004
【００１９】
の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を提供する。
本発明の別の態様において、式IB：
【００２０】
【化４】
2020011947.tif 000005
【００２１】
の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を提供する。
本発明の更なる側面において、白血病、骨髄異形成症候群又はリンパ腫の治療における式Ｉ、IA又はIBの化合物、又はその薬学的に許容可能な塩の非経口的使用を提供する。関連側面は、白血病、骨髄異形成症候群又はリンパ腫の治療用の非経口医薬の製造における式Ｉ、IA又はIBの化合物、又はその薬学的に許容可能な塩の使用、及び白血病、骨髄異形成症候群又はリンパ腫に冒されている哺乳動物に有効量の式Ｉ、IA又はIBの化合物、塩の非経口投与を含む白血病、骨髄異形成症候群又はリンパ腫の治療法を含む。
【００２２】
明確にするために、式Ｉ、IA及びIBの化合物及び塩は、以後単に本発明の化合物と呼ぶことにする。
本発明の化合物は、リンパ球性及び骨髄性の白血病に適用された場合、思いがけず有益な有効性／毒性バランスを示し、そのようながんを有する温血動物、特にヒトの治療において医薬として使用することができる。本発明が適用できるリンパ球性のがんは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症などである。本発明が適用できる骨髄性の悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病及び骨髄異形成症候群などである。他の白血病はヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）を含む。
【００２３】
本発明は特にＡＭＬの治療に焦点を当てている。特に、従来の高強度標準治療（ＳｏＣ）に対して一般的に十分頑強でない高齢者（≧６０歳）における治療である。現在のＳｏＣは以下のように要約できる。
【００２４】
＞６０  寛解導入：シタラビン（低用量）及びアントラサイクリン／ミトキサントロン、低メチル化レジメン、クロファラビン±シタラビン。
＞６０  寛解後地固め：反復寛解療法、高用量シタラビン（適格な場合＝良好な状態、正常腎機能、良好なリスク又は好適な分子マーカーを有する正常核型）、低メチル化レジメン。
【００２５】
＞６０  再発／難治性：一般的ＳｏＣなし、予後不良、利用可能な化学療法薬：クラドリビン、シタラビン、ミトキサントロン、フルダラビン、イダルビシン、エトポシド、クロファラビン、アザシチジン、デシタビンを組み合わせた各種の最終手段レジメン。
【００２６】
明らかに、現在の白血病療法の要であるシタラビンより忍容性の高い新規化学療法薬を求める需要がある。
高齢のＡＭＬ患者はさらにシタラビン耐性を伴うことが多いが、本発明の化合物は典型的には一般的なシタラビン耐性機序、例えばシチジンデアミナーゼ（ＣＤＡ）発現増大、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）発現減少などに対する活性を保持している。
【００２７】
別の側面において、本発明は、式Ｉ、IA又はIBの化合物又はその薬学的に許容可能な塩と共に、非経口投与に適した薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤、賦形剤又は担体を含む医薬組成物も提供する。
【００２８】
更なる側面において、本発明は、すぐ上の段落で定義された、白血病の治療に使用するための医薬組成物にさらに一つ又は複数の追加治療薬、典型的には抗がん剤も含む医薬組成物を提供する。そのような追加の治療薬は、≧６０歳の年齢群のためのＳｏＣのほか、より若く、より頑強な患者群専用のＳｏＣも含む。例を挙げると、シタラビン、クロファラビン、ミトキサントロン、アントラサイクリン類（イダルビシン、ダウノルビシン）及び低メチル化レジメン（５−アザシタビン、デシタビン）などである。
【００２９】
以下の実施例で示されているように、本発明の化合物は顕著な相乗作用を示す。それと同じくらい重要なことは、一般的な白血病化学療法薬のアザシチジン、デシタビン、ミドスタウリン、ベネトクラックス、イダルビシン、ダウノルビシン又はドキソルビシンと共投与された場合に拮抗作用を示さないことである。
【００３０】
従って、本発明の態様は、白血病の治療法、又は治療における使用法を含み、本発明の化合物を用いた治療過程には、一つ又は複数の従来の治療過程、例えば、シタラビン、クロファラビン、ミトキサントロン、アントラサイクリン類（イダルビシン、ダウノルビシン）及び低メチル化レジメン（５−アザシタビン、デシタビン）が組み込まれている。治療過程は、がん治療におけるその従来的意味において使用され、通常、本発明の化合物又は従来の化学療法薬の１日２回、毎日、１日おきもしくは２日おき、又は毎週の注入を一般的に１〜４週間、その後１〜４週間の休薬期間を経て、次の過程の投与／注入を行うことを含む。
【００３１】
上記医薬組成物は、典型的には、有効量（例えばヒトにとって）の式Ｉ、IA又はIBの化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有するが、名目上準治療量の本発明の化合物も、他の抗白血病薬と組み合わせて又は複数回の使用が意図される場合にはなお有益でありうる。
【００３２】
この文脈において、治療有効量は、意図する結果を生み出すのに十分な量である。治療有効量は、各特定の場合における個人の要件に応じて変動する。用量に影響を及ぼす特徴は、例えば、治療される疾患の重症度、治療される対象の年齢、体重、一般的健康状態などである。抗がん効果に関しては、その効果は、更なる白血病又はリンパ腫増殖の阻害、又は患部組織（骨髄及び他の白血球生成部位を含みうる）における細胞死の発生であり、これは、悪性細胞集団の縮小、又は患者の状態の寛解後の悪性細胞の再増殖防止をもたらすものでありうる。
【００３３】
更なる側面において、本発明は、ヒトを含む哺乳動物における白血病、骨髄異形成症候群又はリンパ腫の治療に使用するための式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、一つ又は複数の追加のがん治療、例えばその他の抗がん薬（その例は上に提供されている）、手術又は免疫療法と組み合わせて提供する。その他の追加の治療は、チェックポイント阻害薬などのがん免疫剤(immunooncology agent)、例えばペムブロリズマブ又はニボルマブなどのＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１モノクローナル類などである。
【００３４】
一態様において、追加の抗がん治療は、強力な抗腫瘍活性を示す一つ又は複数のその他のヌクレオシド類似体である。例を挙げると、シタラビン、クロファラビン、及び低メチル化レジメン（５−アザシタビン、デシタビン）などである。
【００３５】
本発明の化合物は、投与目的のために様々な剤形(pharmaceutical form)に製剤化できる。適切な組成物として、本発明の化合物のような親油性（従って水性製剤に難溶性）イオン性部分含有活性物のガレヌス製剤(galenic formulation)に従来使用されている組成物を挙げることができる。本発明の医薬組成物を製造するためには、活性成分として有効量の特定化合物（任意に付加塩形でもよい）を、薬学的に許容可能な担体（該担体は投与のために所望される剤形に応じて様々な形態を取りうる）と緊密混合して組み合わせる。
【００３６】
式Ｉ、IA又はIBの化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、非経口投与用（例えば、ボーラス注射又は連続注入などの注入による）に製剤化でき、アンプル、充填済みシリンジ、少量注入剤中に単位剤形として、又は添加された保存剤と共に複数回投与用の容器中に提供できる。組成物は、懸濁液、溶液、又は油性もしくは水性ビヒクル中のエマルションなどの形態を取ることができ、懸濁化剤、安定剤及び／又は分散剤などの製剤化用薬剤を含有しうる。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば無菌の発熱性物質除去水で構成するための粉末形でもよく、それらは無菌固体の無菌的単離によって又は溶液からの凍結乾燥によって得られる。
【００３７】
前述の医薬組成物は投与の容易性及び用量の均一性のために、単位剤形で製剤化されるのが特に好都合である。本明細書中で使用されている単位剤形とは、単位用量として適切な物理的に別個の単位、例えば、規定量の液体担体、典型的には、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）などの極性非プロトン性溶媒（任意に更なる可溶化剤を含有していてもよい）中に溶解又は懸濁された規定量の式Ｉ、IA又はIBの化合物を含有するバイアル、フラスコ又はパウチのことを言う。
【００３８】
単位用量は、典型的には、所定量の活性成分の形態であり、これを投与の直前、又は投与の少なくとも１時間、３時間、１２時間又は２４時間前以内に水性ビヒクルで希釈することによって注入パウチ又は他の形態の剤形中に即席で作製する。適切な水性ビヒクルは、生理食塩水、例えば０．９％生理食塩水又は０．４５％生理食塩水、グルコース溶液又は注入用水（ＷＦＩ(water-for-infusion)）などである。用意のできた注入液は血液と実質的に等張にする、すなわち２００ｍｏｓｍ／ｌ〜６００ｍｏｓｍ／ｌ、好ましくは２５０〜４００ｍｏｓｍ／ｌにするのが一般的に望ましい。溶液をポンプ装置、すなわち中心静脈投与装置（ＣＶＡＤ）による投与用に製剤化する場合、水性ビヒクルの割合は、一般的には末梢静脈を通じて投与する場合よりも実質的に低い。ＣＶＡＤを意図する一定の態様において、製剤は即席の希釈を必要としない。
【００３９】
製剤は、一つ又は複数の薬学的に許容可能な可溶化剤、例えば薬学的に許容可能な非イオン性可溶化剤も含みうる。可溶化剤は界面活性剤と呼ばれることもある。例示的可溶化剤は、ポリエトキシ化脂肪酸及び脂肪酸エステル及びそれらの混合物などである。適切な可溶化剤は、ポリエトキシ化ヒマシ油（例えば、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬＰの商品名で販売されているもの）；又はポリエトキシ化ステアリン酸（例えば、Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）又はＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＨＳ１５の商品名で販売されているもの）；又はポリエトキシ化（例えばポリオキシエチレン（２０））ソルビタンモノオレエート（例えば、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０又はＴｗｅｅｎ（登録商標）８０の商品名で販売されているもの）などである。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ポリエトキシ化ソルビタンモノオレエート）が可溶化剤として選択されることが多い。一定の好適な態様において、製剤は２種類以上の薬学的に許容可能な可溶化剤を含む。
【００４０】
一般に、有効１日量は、約０．０１〜約７００ｍｇ／ｋｇ、又は約０．５〜約４００ｍｇ／ｋｇ、又は約１〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、又は約２〜約２００ｍｇ／ｋｇ、又は約１０〜約１５０ｍｇ／ｋｇ体重と考えられる。所要量を一日を通じて適切な間隔で２回、３回、４回以上に分けた分割量(sub-dose)として投与するのが適切であろう。前記分割量は、例えば、単位剤形あたり約１〜約５０００ｍｇ、又は約５０〜約３０００ｍｇ、又は約１００〜約１０００ｍｇ、又は約２００〜約６００ｍｇ、又は約１００〜約４００ｍｇの活性成分を含有する単位剤形として製剤化できる。
【００４１】
本発明の化合物は単独で抗がん効果を示すことができる及び／又は別の抗がん剤の能力を増強して抗がん効果を示すことができる。
本発明の化合物は、カーン・インゴルド・プレローグ順位則に従ってリン原子の位置で特にＳである規定の立体異性体として表される。そのような化合物の絶対配置は、当該技術分野で公知の方法、例えばＸ線回折又はＮＭＲ及び／又は立体化学が分かっている出発物質からの推測を用いて決定できる。本発明による医薬組成物は、好ましくは、示された立体異性体の実質的に立体異性体的に純粋な調製物を含む。
【００４２】
本明細書中で言及される化合物及び中間体の純粋な立体異性体は、前記化合物又は中間体の同じ基本的分子構造の他のエナンチオマー形又はジアステレオマー形を実質的に含まない異性体と定義される。特に、“立体異性体的に純粋な”という用語は、少なくとも８０％の立体異性体過剰率（すなわち一つの異性体が最低９０％で他の可能な異性体が最大１０％）から１００％の立体異性体過剰率（すなわち一つの異性体が１００％で他の異性体はない）までを有する化合物又は中間体、さらに特に９０％から１００％までの立体異性体過剰率を有する化合物又は中間体、なおさらに特に９４％から１００％まで、及び最も特に９７％から１００％までの立体異性体過剰率を有する化合物又は中間体のことを言う。“エナンチオマー的に純粋な”及び“ジアステレオマー的に純粋な”という用語も同様に理解されるべきであるが、それぞれ、問題の混合物のエナンチオマー過剰率及びジアステレオマー過剰率のことを言う。
【００４３】
本発明の化合物及び中間体の純粋な立体異性体は、当該技術分野で公知の手順を適用することによって得られる。例えば、エナンチオマーは、光学活性酸又は塩基を用いて、それらのジアステレオマー塩の選択的結晶化によって互いに分離することができる。その例は、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸及びカンファースルホン酸である。あるいは、エナンチオマーは、キラル固定相を用いてクロマトグラフィー技術によって分離することもできる。前記立体異性体的に純粋な異性体は、反応が立体特異的に起こるならば、適切な出発物質の対応する立体異性体的に純粋な異性体から誘導することもできる。好ましくは、特定の立体異性体が所望の場合、前記化合物は立体特異的製造法によって合成される。これらの方法は、エナンチオマー的に純粋な出発物質を使用するのが好都合である。
【００４４】
本発明の化合物のジアステレオマーラセミ化合物は、従来法によって別々に得ることができる。都合よく利用できる適切な物理的分離法は、例えば選択的結晶化及びクロマトグラフィー、例えばカラムクロマトグラフィーである。
【００４５】
本発明の他の態様において、ジアステレオマー混合物、すなわちリン原子の位置でＲ−又はＳ−配置を有する化合物の混合物、好ましくはリン原子の位置で少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％のｅｅ率のＳジアステレオマーが含まれる。
【００４６】
本発明は、１個又は複数個の原子が、その原子の同位体、すなわち同じ原子番号を有するが原子質量がそれとは異なる、典型的には天然に存在する原子によって置換されている式（Ｉ）の同位体標識化合物も含む。式（Ｉ）の化合物に組み込まれうる同位体の例は、水素の同位体、例えば２Ｈ及び３Ｈ（それぞれジュウテリウムに対してはＤ及びトリチウムに対してはＴとも表示される）、炭素の同位体、例えば１１Ｃ、１３Ｃ及び１４Ｃ、窒素の同位体、例えば１３Ｎ及び１５Ｎ、酸素の同位体、例えば１５Ｏ、１７Ｏ及び１８Ｏ、リンの同位体、例えば３１Ｐ及び３２Ｐ、硫黄の同位体、例えば３５Ｓ、フッ素の同位体、例えば１８Ｆ、塩素の同位体、例えば３６Ｃｌ、臭素の同位体、例えば７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ及び８２Ｂｒ、及びヨウ素の同位体、例えば１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ及び１３１Ｉなどであるが、これらに限定されない。同位体標識化合物に含められる同位体の選択は、その化合物の特定の用途に依存する。例えば、薬物又は基質の組織分布アッセイの場合、３Ｈ又は１４Ｃなどの放射性同位体を組み込んだ化合物が一般的に最も有用であろう。放射線画像用途、例えば陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）の場合、１１Ｃ、１８Ｆ、１３Ｎ又は１５Ｏなどの陽電子放出同位体が有用であろう。より重い同位体、例えばジュウテリウム、すなわち２Ｈの組込みは、式（Ｉ）の化合物により大きい代謝安定性を提供できるので、例えば該化合物のインビボ半減期の増大又は必要用量の低減がもたらされうる。
【００４７】
本発明の同位体標識化合物は、適当な同位体標識試薬又は出発物質を対応する非同位体標識試薬又は出発物質の代わりに使用することにより、又は当業者に公知の慣用技術により、本明細書中の以下のスキーム及び／又は実施例に記載されている方法と類似の方法によって製造することができる。
【００４８】
薬学的に許容可能な付加塩は、式（Ｉ）の化合物の治療上活性な酸及び塩基付加塩形を含む。興味深いのは、式（Ｉ）の化合物又はその任意のサブグループの遊離形、すなわち非塩形である。
【００４９】
薬学的に許容可能な酸付加塩は、塩基形をそのような適切な酸で処理することにより都合よく得ることができる。適切な酸は、例えば、無機酸、例えば塩酸又は臭化水素酸などのハロゲン化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など；有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸（すなわちエタン二酸）、マロン酸、コハク酸（すなわちブタン二酸）、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸（すなわちヒドロキシブタン二酸）、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、パモ酸及び類似の酸を含む。反対に、前記塩形は適切な塩基で処理することにより遊離塩基形に変換できる。
【００５０】
酸性プロトンを含有する式（Ｉ）の化合物も、適切な有機及び無機塩基で処理することにより、それらの非毒性金属又はアミン付加塩形に変換できる。適切な塩基塩形は、例えばアンモニウム塩、アルカリ及びアルカリ土類金属塩、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム塩など、有機塩基との塩、例えばベンザチン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ヒドラバミンの塩、及び例えばアルギニン、リシンなどのアミノ酸との塩を含む。
【００５１】
式（Ｉ）の化合物の一部はそれらの互変異性体でも存在しうる。例えば、アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）の互変異性体はイミノアルコール（−Ｃ（ＯＨ）＝Ｎ−）で、これは芳香族の特徴を有する環で安定化できる。そのような形態も、本明細書中に示された構造式中に明示的に示されてはいないが、本発明の範囲内に含まれるものとする。
【００５２】
要約書、明細書及び特許請求の範囲全体を通じて本明細書中で使用されている用語及び表現は、特に明記されない限り、以下に定義されている通りに解釈されるものとする。各用語の意味は、出現するごとに独立である。これらの定義は、特に明記されない限り、用語が単独で使用されているか又は他の用語と組み合わせて使用されているかにかかわらず適用される。本明細書中で使用されている用語又は表現で明示的に定義されていないものは、当該技術分野で使用されているその通常の意味を有すると解釈されるものとする。化学名、一般名（通称）、及び化学構造は、同じ構造を説明するために互換的に使用されうる。化合物が化学構造及び化学名の両方を用いて呼ばれ、構造と名称の間に曖昧さが存在する場合、構造が優先される。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、本発明の化合物を表すマウス適応モデル化合物を投与された異種移植片移植マウスの生存を、ＷＯ２０１６／０３０３３５に記載の先行技術の肝臓標的化合物を表す対応マウス適応モデル化合物と比較して示す。
【図２】図２は、実施例２とアザシチジンのアイソボログラムを示す。
【図３】図３は、実施例１とアザシチジンのアイソボログラムを示す。
【図４】図４は、実施例２とデシタビンのアイソボログラムを示す。
【図５】図５は、実施例１とデシタビンのアイソボログラムを示す。
【図６】図６は、実施例２とミドスタウリンのアイソボログラムを示す。
【図７】図７は、実施例１とミドスタウリンのアイソボログラムを示す。
【図８】図８は、実施例２とベネトクラックスのアイソボログラムを示す。
【図９】図９は、実施例１とベネトクラックスのアイソボログラムを示す。
【図１０】図１０は、実施例２とイダルビシンのアイソボログラムを示す。
【図１１】図１１は、実施例１とイダルビシンのアイソボログラムを示す。
【図１２】図１２は、実施例２とダウノルビシンのアイソボログラムを示す。
【図１３】図１３は、実施例１とダウノルビシンのアイソボログラムを示す。
【図１４】図１４は、実施例２とドキソルビシンのアイソボログラムを示す。
【図１５】図１５は、実施例１とドキソルビシンのアイソボログラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明の様々な態様を、単に例示の目的で、添付の実施例及び図１を参照しながら記載する。図１は、本発明の化合物を表すマウス適応モデル化合物を投与された異種移植片移植マウスの生存を、ＷＯ２０１６／０３０３３５に記載の先行技術の肝臓標的化合物を表す対応マウス適応モデル化合物と比較して描いている。
【００５５】
化合物名は、ＣｈｅｍＤｒａｗ  Ｕｌｔｒａソフトウェア，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｏｆｔ，バージョン１２．０．２によって生成させた。
上記定義に加えて、下記略語が上記合成スキーム及び以下の実施例で使用されている。本明細書中で使用されている略語が定義されていない場合、それはその一般に受け入れられている意味を有している。
Ｂｎ    ベンジル
ＢＯＰ−Ｃｌ    ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド
ＣＯＭＵ    （１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ−モルホリノ−カルベニウムヘキサフルオロホスフェート
ＤＣＣ    ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ    ジクロロメタン
ＤＩＥＡ    ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ    ４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ    Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＦ−ＤＭＡ    Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール
ＤＭＰＵ    Ｎ，Ｎ’−ジメチルプロピレンウレア／１，３−ジメチルテトラヒドロピリミジン−２（１Ｈ）−オン
ＥＤＡＣ    Ｎ−エチル−Ｎ’−［（３−ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド
ＥｔＯＡｃ    酢酸エチル
Ｅｔ３Ｎ    トリエチルアミン
ＥｔＯＨ    エタノール
Ｅｔ２Ｏ    ジエチルエーテル
ＬＣ    液体クロマトグラフィー
ＨＡＴＵ    Ｏ−（７−アザベンゾトリゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵ    Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＡｃ    酢酸
ＨＯＡｔ    １−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール
ＨＯＢｔ    １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ    高速液体クロマトグラフィー
ＭｅＣＮ    アセトニトリル
ＭｅＯＨ    メタノール
ｏｎ    一晩
Ｐｇ    保護基
Ｐｈ    フェニル
ＰｙＢＯＰ    （ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ｒｔ    室温
ＴＨＦ    テトラヒドロフラン
ＴＦＡ    トリフルオロ酢酸
ＴＦＡＡ    無水トリフルオロ酢酸
ＴＩＰＳ    トリイソプロピルシリル
ヌクレオシド：５−Ｆ−Ｔｒ−ｄｅｒの製造
【００５６】
【化５】
2020011947.tif 000006
【００５７】
工程ａ）（Ｓ）−（４−アセトキシ−１，３−ジオキソラン−２−イル）メチルブチレート（５−Ｆ−Ｔｒ−ａ）
ＬｉＡｌＨ（ＯｔＢｕ）３（ＴＨＦ中１Ｍ）（１．２３Ｌ、１２３０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、化合物（Ｓ）−（４−オキソ−１，３−ジオキソラン−２−イル）メチルブチレート１（１６３ｇ、８６６．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５００ｍＬ）中溶液を、９０分かけて−２０℃で滴加し（内部温度に４℃の上昇が観察された）、−２０℃で９０分間撹拌した。トリエチルアミン（４２５ｍＬ、３０２９．７ｍｍｏｌ）を上記反応混合物に６０分かけて−２０℃で滴加し（内部温度に４℃の上昇が観察された）、−２０℃で１５分間撹拌した。次に、反応混合物を水（９０ｍＬ、４９９５．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５００ｍＬ）中溶液でクエンチングした（９０分かけて滴加した）。次いで、ＤＭＡＰ（５３ｇ、４３３．８３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５００ｍＬ）中溶液を−２５℃で３０分かけて滴加し、その後無水酢酸（５２０ｍＬ、５５０１．１ｍｍｏｌ）を−２５℃で２時間かけて滴加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌した後、濃縮し、３０％酒石酸カリウムナトリウム溶液（６Ｌ）を残渣に添加し、酢酸エチルで抽出し（２×１．５Ｌ）、ブラインで洗浄した（２×１．５Ｌ）。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗製物を１２２〜１３６℃（０．０１ｍｍＨｇ真空）で分別蒸留することによって精製し、標記化合物（１４２ｇ）を無色油として得た。
１H NMR (500 MHz, CDCl３): δ 6.39 (m, 1 H) 5.36 (m, 1 H) 4.27-4.20 (m, 3 H) 3.99 (m, 1 H) 2.31 (m, 2 H) 2.08 (s, 3 H) 1.68 (m, 2 H) 0.95 (m, 3 H)。
【００５８】
工程ｂ）（Ｓ）−（４−（４−ベンズアミド−５−フルオロ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−１，３−ジオキソラン−２−イル）メチルブチレート（５−Ｆ−Ｔｒ−ｂ）
Ｎ−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）ベンズアミド（４８ｇ、４１２．０７ｍｍｏｌ）のクロロベンゼン（２５０ｍＬ）中撹拌懸濁液に、 １，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザン（８７ｍＬ、２８６．２６ｍｍｏｌ）及び硫酸アンモニウム（１ｇ、７．５６ｍｍｏｌ）を加えた後、１４０℃に６０分間加熱した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固し、残渣をＤＣＭ（１５０ｍＬ）中に取り、化合物５−Ｆ−Ｔｒ−ａ（３９ｇ、１５１．１４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２５０ｍＬ）中溶液を０℃で加え、次いでヨードトリメチルシラン（２３ｍＬ、１６１．６１ｍｍｏｌ）を滴加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。０．２Ｎ  ＨＣｌ（１００ｍＬ）を加え、Ｃｅｌｉｔｅ床を通してろ過し、ろ液をＤＣＭで抽出し（２×５００ｍＬ）、飽和チオ硫酸ナトリウム溶液（２×１５０ｍＬ）、水（２×１５０ｍＬ）及びブライン（１×１５０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。得られた粗化合物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィーにより、ヘキサン中４０〜５０％酢酸エチルで溶出して精製し、標記化合物（３５ｇ、５１％）を固体として得た。MS (ES+) 287.1 [M+H]＋。
【００５９】
工程ｃ）及びｄ）（４−ベンズアミド−１−（（２Ｓ，４Ｓ）−２−（ブチリルオキシメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）−５−フルオロピリミジン−２（１Ｈ）−イリデン）オキソニウム（５−Ｆ−Ｔｒ−ｂシス異性体）
粗化合物５−Ｆ−Ｔｒ−ｂ（７０ｇ）をシリカゲル上カラムクロマトグラフィーにより、石油エーテル(pet ether)中２５％酢酸エチルで溶出して精製し、フラクションを減圧下で蒸発させて、５−Ｆ−Ｔｒ−ｂトランス異性体（２５ｇ、３６％）をオフホワイト色固体として得た。再度、石油エーテル中４０％酢酸エチルで溶出し、フラクションを減圧下で蒸発させ、これをジエチルエーテルで粉砕して標記化合物５−Ｆ−Ｔｒ−ｂシス異性体（３０ｇ、４３％）を白色固体として得た。
【００６０】
工程ｄ）
Ｎ−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）ベンズアミド（１６ｇ、６８．６１ｍｍｏｌ）のクロロベンゼン（１５０ｍＬ）中撹拌懸濁液に、 １，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザン（３５ｍＬ、１６７ｍｍｏｌ）及び硫酸アンモニウム（４２０ｍｇ、３．１７８ｍｍｏｌ）を加えた後、１４０℃に６０分間加熱した。反応混合物を減圧下で完全に蒸発乾固させ、残渣をトルエン（３００ｍＬ）中に取った。
【００６１】
別のフラスコで、化合物５−Ｆ−Ｔｒ−ｂトランス異性体（２５ｇ、６１．０５ｍｍｏｌ）のトルエン（２００ｍＬ）中溶液を０℃に冷却し、ヨードトリメチルシラン（１５ｍＬ、１０４．９５ｍｍｏｌ）を滴加し、反応混合物を０℃で３０分間撹拌した後、上記懸濁液を３０分かけて滴加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。０．２Ｎ  ＨＣｌ（１００ｍＬ）を加え、Ｃｅｌｉｔｅ床を通してろ過し、ろ液をＤＣＭで抽出し（２×３５０ｍＬ）、飽和チオ硫酸ナトリウム溶液（２×１５０ｍＬ）、水（２×１５０ｍＬ）及びブライン（１×１５０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。得られた粗化合物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィーにより、ヘキサン中４０〜５０％酢酸エチルで溶出して精製し、標記化合物シス異性体（９ｇ、３６％）を固体として得た。
１H NMR (400 MHz, DMSO): δ 11.81 (d, J = 343.8 Hz, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.99 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 6.22 (s, 1H), 5.24 (s, 1H), 4.37 (m, J = 7.5 Hz, 3H), 4.19 (s, 1H), 2.30 (s, 2H), 1.53 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 0.85 (s, 3H)。
【００６２】
工程ｅ）４−アミノ−５−フルオロ−１−（（２Ｓ，４Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（５−Ｆ−Ｔｒ）
化合物５−Ｆ−Ｔｒ−ｂシス異性体（２０ｇ、４９．３４ｍｍｏｌ）のメタノール（１６０ｍＬ）とエタノール（１６０ｍＬ）中撹拌溶液に、メタノール中１Ｍ  ＮａＯＭｅ（１６ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）を室温で加え、反応混合物を室温で４８時間撹拌した後、イソ酪酸（５ｇ）で酸性化した。
【００６３】
不溶物をろ過し、ろ液を濃縮乾固した。粗化合物を熱イソプロパノール（１３５ｍＬ）中に溶解し、前に単離した標記化合物の播種量（１０ｍｇ）を加え、室温に２時間放置した。得られた結晶をろ過し、イソプロパノールで洗浄し（２×５０ｍＬ）、乾燥させて、標記化合物（９．３ｇ、８１．５％）を白色固体として得た。
１H NMR (500 MHz, DMSO-d６): δ 8.17 (d, J=7.32 Hz, 1H), 7.71-7.82 (m, 1H), 7.47-7.58 (m, 1H), 6.09-6.16 (m, 1H), 5.27-5.34 (m, 1H), 4.89-4.94 (m, 1H), 4.11-4.16 (m, 1H), 4.04-4.11 (m, 1H), 3.66-3.71 (m, 2H)。
【００６４】
工程ｆ）（Ｅ）−Ｎ’−（５−フルオロ−１−（（２Ｓ，４Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムイミドアミド
化合物５−Ｆ−Ｔｒ（３００ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）中撹拌溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（０．９ｍＬ、６．７２ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で３時間撹拌した後、減圧下で濃縮した。得られた粗製物をペンタンで洗浄し、デカンテーションして高真空下で乾燥させ、標記化合物（３５０ｍｇ、８９％）を固体として得た。MS (ES+) 287.1 [M+H]＋。
【００６５】
中間体１
【００６６】
【化６】
2020011947.tif 000007
【００６７】
工程ａ）（Ｓ）−シクロペンチル  ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパノエート（Ｉ−１ａ）
Ｌ−Ｂｏｃ−アラニン（４．０ｇ、２１．１４ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（６０ｍＬ）中に溶解し、シクロペンタノール（２．２ｍＬ、２４．０１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５℃に冷却し、ＥＤＣ  ＨＣｌ（４．５ｇ、２３．４７ｍｍｏｌ）を一度に加え、次いでＤＭＡＰ（２５８ｍｇ、２．１１４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１６時間撹拌した後、水で希釈し、水性層を酢酸エチルで抽出した（２×２００ｍＬ）。合わせた有機層を炭酸水素ナトリウム溶液（５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。得られた粗化合物をＳｉＯ２上カラムクロマトグラフィーにより、ヘキサン中２０％ＥｔＯＡｃで溶出して精製し、標記化合物（５ｇ、９１％）を固体として得た。
１H NMR (500 MHz, DMSO): δ 7.22 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.06 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 3.90 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 1.80 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.58 (m, J = 6.3 Hz, 6H), 1.38 (s, 9H),1.19 (t, J = 6.4 Hz, 3H)。
【００６８】
工程ｂ）（Ｓ）−１−（シクロペンチルオキシ）−１−オキソプロパン−２−アミニウムクロリド（Ｉ−１ｂ）
化合物Ｉ−１ａ（５ｇ、１９．４３ｍｍｏｌ）の乾燥１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）中撹拌溶液に、１，４−ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（３０ｍＬ、１２０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を２２℃で３０分間撹拌した後、減圧下で濃縮して、標記化合物（３．７ｇ、９８％）を固体として得た。
１H NMR (500 MHz, DMSO): δ 8.43 (s, 3H), 5.18 (m, J = 2.9 Hz, 1H), 4.01 (q, J = 7.2Hz, 1H), 1.86 (m, J = 3.5 Hz, 2H), 1.62 (m, J = 4.4 Hz, 6H), 1.38 (d, J = 7.2 Hz, 3H)。
【００６９】
工程ｃ）（Ｓ）−シクロペンチル  ２−（（Ｓ）−（パーフルオロフェノキシ）（フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエート（Ｉ−１ｃ）
化合物Ｉ−１ｂ（３．７ｇ、１８．９３ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＣＭ（３０ｍＬ）中撹拌溶液に、トリエチルアミン（６．５ｍＬ、４６．７６ｍｍｏｌ）を−７０℃で３０分かけて滴加し、次いでフェニルジクロロホスフェート（４ｇ、１８．９６ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＣＭ（３０ｍＬ）中溶液を２１分かけて添加した。反応混合物を−７０℃でさらに３０分間撹拌した後、２時間かけて０℃に温まらせ、０℃で１時間撹拌した。この混合物に、ペンタフルオロフェノール（３．１ｇ、１７．００ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（３ｍＬ、２１．５８ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）中溶液を１時間かけて添加した。混合物を０℃で４時間撹拌した。反応をろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。得られた粗化合物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィーにより、ヘキサン中１２％ＥｔＯＡｃで溶出して精製した。（Ｓ）−異性体２をヘキサン中１０％ＥｔＯＡｃで再結晶化することにより単離し、標記化合物（１．５ｇ、１４％）を固体として得た。MS m/z 480.13 [M+H]＋。
１H NMR (500 MHz, DMSO) : δ 1.27 (d, J=7.34 Hz, 3H), 1.49-1.65 (m, 6H), 1.72-1.86 (m, 2H), 3.92 (m, J=10.33, 7.13 Hz, 1H), 4.99-5.08 (m, 1H), 6.86 (dd, J=14.18, 9.78 Hz, 1H), 7.16-7.31 (m, 3H), 7.39-7.47 (m, 2H)
３１P NMR (500 MHz, DMSO): δ 0.300。
【００７０】
中間体２
【００７１】
【化７】
2020011947.tif 000008
【００７２】
工程ａ）（Ｓ）−シクロヘキシル  ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパノエート（Ｉ−２ａ）
Ｌ−Ｂｏｃ−アラニン（５．７ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（７５ｍＬ）中に溶解し、シクロヘキサノール（２．６ｍＬ、２５．０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を０℃に冷却し、ＥＤＣ  ＨＣｌ（５．２５ｇ、２７．５ｍｍｏｌ）を一度に加え、次いでＤＭＡＰ（４６０ｍｇ、３．７４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１６時間撹拌した後、水で希釈し、水性層を酢酸エチルで抽出した（２×２００ｍＬ）。合わせた有機層を炭酸水素ナトリウム溶液（５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。粗化合物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィーにより、ヘキサン中１０％ＥｔＯＡｃで溶出して精製し、標記化合物（５．５ｇ、６３％）を固体として得た。MS (ES+)572.26 [M+H]＋。
１H NMR (500 MHz, CDCl３): 5.06 (m, 1 H) 4.81 (m, 1 H) 4.27 (m, 1 H) 1.84 (m, 2 H) 1.72 (m, 2 H) 1.53 (m, 1 H) 1.44 (m, 11 H) 1.34 (m, 5 H) 1.25 (m, 1 H)。
【００７３】
工程ｂ）（Ｓ）−シクロヘキシル  ２−アミノプロパノエート（Ｉ−２ｂ）
化合物Ｉ−２ａ（５．５ｇ、２０．２７ｍｍｏｌ）の乾燥１，４−ジオキサン（６０ｍＬ）中撹拌溶液に、１，４−ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（３１ｍＬ、１２２．０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を２２℃で２時間撹拌した後、減圧下で濃縮して、標記化合物（４．５ｇ）を固体として得た。これをそれ以上精製せずに次の工程に取り入れた。
１H NMR (500 MHz, DMSO): δ 8.62 (s, 3H), 4.79 (m, J = 4.2 Hz, 1H), 4.01 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 1.78 (s, 2H), 1.68 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 1.41 (m, J = 8.2 Hz, 9H)。
【００７４】
工程ｃ）（Ｓ）−シクロヘキシル  ２−（（Ｓ）−（パーフルオロフェノキシ）（フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエート
化合物Ｉ−２ｂ（４．５ｇ、２２．０ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＣＭ（１２５ｍＬ）中撹拌溶液に、トリエチルアミン（６．４ｍＬ、４５．０ｍｍｏｌ）を−７８℃で３０分かけて滴加し、次いでフェニルジクロロホスフェート（４．６ｇ、２２．００ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＣＭ（７５ｍＬ）中溶液を３０分かけて添加した。反応混合物を−７８℃でさらに３０分間撹拌した後、２時間かけて０℃に温まらせ、０℃で１時間撹拌した。この混合物に、ペンタフルオロフェノール（３．６ｇ、１９．００ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（３．３ｍＬ、２４ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＣＭ（５０ｍＬ）中溶液を１５分かけて添加した。混合物を室温で５時間撹拌した。反応をろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。得られた粗化合物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィーにより、ヘキサン中１２％ＥｔＯＡｃで溶出して精製した。（Ｓ）−異性体２をヘキサン中１０％ＥｔＯＡｃで再結晶化することにより単離し、標記化合物（２．４ｇ、２０％）を固体として得た。MS m/z 494.18 [M+H]＋。
１H NMR (500 MHz, CDCl３): δ 7.37 (m, 2 H) 7.30 (br d, J=8.07 Hz, 1 H) 7.23 (m, 2 H) 4.81 (m, 1 H) 4.15 (m, 1 H) 3.95 (m, 1 H) 1.76 (m, 4 H) 1.63 (m, 1 H) 1.37 (m, 10 H)。
31P NMR (500 MHz, CDCl3): δ -1.587
【実施例】
【００７５】
実施例１
【００７６】
【化８】
2020011947.tif 000009
【００７７】
工程ａ）（Ｓ）−シクロペンチル  ２−（（Ｓ）−（（（２Ｓ，４Ｓ）−４−（４−アミノ−５−フルオロ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−１，３−ジオキソラン−２−イル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエート（１ａ）
化合物５−Ｆ−Ｔｒ−ｄｅｒ（３５０ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（２０ｍＬ）中撹拌溶液に、ＤＭＰＵ（１．４ｍＬ、１１．６２ｍｍｏｌ）及びｔｅｒｔ−ブチルマグネシウムクロリド（１．４ｍＬ、１．４０ｍｍｏｌ、ＴＨＦ中１Ｍ）を室温で滴加した。混合物を室温で３０分間撹拌した。化合物Ｉ−１ｃ（７０３ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）中溶液を室温で加え、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を１Ｎ  ＨＣｌ溶液（２．５ｍＬ）でクエンチングし、酢酸エチルで抽出した（２×２０ｍＬ）。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２０ｍＬ）、ブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。粗化合物を逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィーにより、アセトニトリル／０．１％ギ酸水溶液で溶出し、次いでキラルＳＦＣにより精製し、標記化合物（４２０ｍｇ、６５％）をオフホワイト色固体として得た。MS (ES+)527.29 [M+H]＋。
【００７８】
分取ＳＦＣ条件
カラム／寸法：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＸ−Ｈ（３０×２５０ｍｍ），５μ
％ＣＯ２：７０．０％
％共溶媒：３０．０％（１００％イソプロパノール）
総流量：１００．０ｇ／分
背圧：１００．０ｂａｒ
ＵＶ：２１４ｎｍ
スタック時間：４．１分
負荷／注入：１１．７５ ｍｇ
工程ｂ）１−（（２Ｓ，４Ｓ）−２−（（（Ｓ）−（（Ｓ）−１−（シクロペンチルオキシ）−１−オキソプロパン−２−イルアミノ）（フェノキシ）ホスホリルオキシ）メチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）−５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−アミニウムクロリド（１ｂ）
化合物１ａ（４２０ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）の乾燥１，４−ジオキサン（６ｍＬ）中撹拌溶液に、１，４−ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（０．４ｍＬ、１．６ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、混合物を２２℃で３０分間撹拌した後、濃縮した。得られた粗製物をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄し、デカンテーションして高真空下で乾燥させ、標記化合物（２９０ｍｇ、６７％）を固体として得た。MS (ES+) 527.27 [M+H]＋。
３１P NMR (500 MHz, DMSO): δ 3.781
１９F NMR (500 MHz, DMSO, カップリング) : δ -166.64 (d, 1F)
１９F NMR (500 MHz, DMSO, デカップリング): δ -166.64 (s, 1F)
１H NMR (500 MHz, DMSO) : δ 8.20 (s, 2H), 7.88 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 7.36 (t, J = 7.9 Hz, 2H),7.18 (q, J = 7.4 Hz, 3H), 6.19 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 6.10 (q, J = 7.9 Hz, 1H), 5.16 (s, 1H), 5.03 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 4.28 (q, J = 5.4 Hz, 1H), 4.20 (t, J = 8.9 Hz, 2H), 4.14 (q, J = 5.2 Hz, 1H), 3.73(m, J = 5.5 Hz, 1H), 1.77 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 1.56 (m, J = 7.7 Hz, 6H), 1.18 (d, J = 7.1 Hz, 3H)。
【００７９】
実施例２
【００８０】
【化９】
2020011947.tif 000010
【００８１】
工程ａ）（Ｓ）−シクロヘキシル  ２−（（Ｓ）−（（（２Ｓ，４Ｓ）−４−（４−アミノ−５−フルオロ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−１，３−ジオキソラン−２−イル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエート（２ａ）
化合物５−Ｆ−Ｔｒ−ｄｅｒ（３５０ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（１５ｍＬ）中撹拌溶液に、ＤＭＰＵ（１．４ｍＬ、１１．４４ｍｍｏｌ）及びｔｅｒｔ−ブチルマグネシウムクロリド（１．３５ｍＬ、１．３５ｍｍｏｌ、ＴＨＦ中１Ｍ）を−５℃で滴加した。混合物を−５℃で３０分間、次いで室温で３０分間撹拌した。化合物Ｉ−２ｃ（７２４ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（１５ｍＬ）中溶液を−５℃で加え、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を１Ｎ  ＨＣｌ溶液（２．５ｍＬ）でクエンチングし、酢酸エチルで抽出した（２×２０ｍＬ）。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２０ｍＬ）、ブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。粗化合物を逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィーにより、アセトニトリル／０．１％ギ酸水溶液で溶出し、次いでキラルＳＦＣにより精製し、標記化合物（３２０ｍｇ、４８％）をオフホワイト色固体として得た。MS (ES+)541.24 [M+H]＋。
【００８２】
分取ＳＦＣ条件
カラム／寸法：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＸ−Ｈ（３０×２５０ｍｍ），５μｍ
％ＣＯ２：６５．０％
％共溶媒：３５．０％（１００％イソプロパノール）
総流量：１００．０ｇ／分
背圧：９０．０ｂａｒ
ＵＶ：２１４ｎｍ
スタック時間：６．５分
負荷／注入：１５．０ ｍｇ
工程ｂ）１−（（２Ｓ，４Ｓ）−２−（（（（Ｓ）−（（（Ｓ）−１−（シクロヘキシルオキシ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）（フェノキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）−５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−アミニウムクロリド（２ｂ）
化合物２ａ（３２０ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）の乾燥１，４−ジオキサン（６ｍＬ）中撹拌溶液に、１，４−ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（０．３ｍＬ、１．１３ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、混合物を２２℃で３０分間撹拌した後、濃縮した。得られた粗製物をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄し、デカンテーションして高真空下で乾燥させ、標記化合物（２８０ｍｇ、８５％）を固体として得た。MS (ES+) 541.32 [M+H]＋。
３１P NMR (500 MHz, DMSO): δ 3.753
１９F NMR (500 MHz, DMSO, カップリング): δ -166.64 (d, 1F)
１９F NMR (500 MHz, DMSO, デカップリング): δ -166.65 (d, 1F)
１H NMR (500 MHz, DMSO): δ 8.28 (d, J = 24.3 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 7.36 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.18 (q, J = 8.2 Hz, 3H), 6.18 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 6.12 (q, J = 7.9 Hz, 1H), 5.16 (s, 1H), 4.63 (t, J = 4.0 Hz, 1H), 4.28 (q, J = 5.5 Hz, 1H), 4.20 (t, J = 8.8 Hz, 2H), 4.15 (q, J = 5.2 Hz, 1H), 3.76 (q, J = 9.1 Hz, 1H), 1.70 (s, 2H), 1.62 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 1.46 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 1.31 (m, J = 8.8 Hz, 4H), 1.21 (d, J = 7.1 Hz, 4H)。
【００８３】
参考文献：
１ＷＯ２００５０７４６５４。
２Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１１，７６（２０），ｐｐ８３１１−８３１９。
【００８４】
生物学実施例１
本発明の化合物の、様々な白血病細胞株に対する活性を下記のアッセイを用いて評価した。
【００８５】
材料
細胞及び細胞培養
ＡＴＣＣから入手したカタログ番号ＴＩＢ−２０２のＴＨＰ−１細胞（ヒト急性単球性白血病）を完全細胞培地中で増殖させた。すなわち、ＲＰＭＩ−１６４０培地、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１１８３５−０６３（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＶ３０１６０．０３、ロット番号ＲＡＢ３５９２４（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ペニシリン５０ｕ／ｍｌ／ストレプトマイシン０，０５ｍｇ／ｍｌ  ＰＡＡカタログ番号Ｐ１１−０１０（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【００８６】
ＡＴＣＣから入手したカタログ番号ＣＲＬ−９５９１のＭＶ４−１１細胞（ヒトＢ−骨髄単球性白血病）を完全細胞培地中で増殖させた。すなわち、ＩＭＤＭ（ＧＬＵＴＡＭＡＸ−１入り）、カタログ番号３１９８００２２（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＶ３０１６０．０３、ロット番号ＲＡＢ３５９２４（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ペニシリン５０ｕ／ｍｌ／ストレプトマイシン０，０５ｍｇ／ｍｌ  ＰＡＡカタログ番号Ｐ１１−０１０（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【００８７】
ＡＴＣＣから入手したカタログ番号ＣＣＬ−２４０のＨＬ６０細胞（ヒト急性前骨髄球性白血病）を完全細胞培地中で増殖させた。すなわち、ＩＭＤＭ  カタログ番号３３０−２００５（ＡＴＣＣ）、２０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＶ３０１６０．０３、ロット番号ＲＡＢ３５９２４（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ペニシリン５０ｕ／ｍｌ／ストレプトマイシン０，０５ｍｇ／ｍｌ  ＰＡＡカタログ番号Ｐ１１−０１０（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【００８８】
ＡＴＣＣから入手したカタログ番号ＣＲＬ−１５９３．２の Ｕ−９３７細胞（ヒト組織球性リンパ腫）を完全細胞培地中で増殖させた。すなわち、ＲＰＭＩ−１６４０培地、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１１８３５−０６３（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＶ３０１６０．０３、ロット番号ＲＡＢ３５９２４（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ペニシリン５０ｕ／ｍｌ／ストレプトマイシン０，０５ｍｇ／ｍｌ  ＰＡＡカタログ番号Ｐ１１−０１０（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【００８９】
ＡＴＣＣから入手したカタログ番号ＣＣＬ−２４３のＫ−５６２細胞（ヒト慢性骨髄性白血病）を完全細胞培地中で増殖させた。すなわち、ＩＭＤＭ（Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ入り、フェノールレッドなし）、カタログ番号２１０５６−０２３（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＶ３０１６０．０３、ロット番号ＲＡＢ３５９２４（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ペニシリン５０ｕ／ｍｌ／ストレプトマイシン０，０５ｍｇ／ｍｌ、カタログ番号ＳＶ３００１０  ＨｙＣｌｏｎｅ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【００９０】
ＡＴＣＣから入手したカタログ番号ＣＲＬ−１５８２のＭＯＬＴ−４細胞（ヒトＴ−細胞、急性リンパ芽球性白血病）を完全細胞培地中で増殖させた。すなわちＲＰＭＩ−１６４０培地、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１１８３５−０６３（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＶ３０１６０．０３、ロット番号ＲＡＢ３５９２４（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ペニシリン５０ｕ／ｍｌ／ストレプトマイシン０，０５ｍｇ／ｍｌ  ＰＡＡカタログ番号Ｐ１１−０１０（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【００９１】
ＡＴＣＣから入手したカタログ番号ＣＣＬ−８６のＲａｊｉ細胞（バーキットリンパ腫のＢ−リンパ球）を完全細胞培地中で増殖させた。すなわち、ＲＰＭＩ−１６４０培地、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１１８３５−０６３（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＶ３０１６０．０３、ロット番号ＲＡＢ３５９２４（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ペニシリン５０ｕ／ｍｌ／ストレプトマイシン０，０５ｍｇ／ｍｌ  ＰＡＡカタログ番号Ｐ１１−０１０（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【００９２】
スウェーデン感染症管理研究所(Swedish Institute for Infectious Disease Control)（ＳＭＩ）から得たＣＥＭ細胞（急性リンパ芽球性白血病のＴ−リンパ芽球）を完全細胞培地中で増殖させた。すなわち、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌ−グルタミンなし）、カタログ番号Ｒ７５０９（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＶ３０１６０．０３、ロット番号ＲＡＢ３５９２４（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ペニシリン５０ｕ／ｍｌ／ストレプトマイシン０，０５ｍｇ／ｍｌ  ＰＡＡカタログ番号Ｐ１１−０１０（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭ  ウルトラグルタミン１、カタログ番号ＢＥ１７−６０５Ｅ／Ｕ１（Ｌｏｎｚａ）。
【００９３】
細胞培養フラスコ７５ｃｍ２、カタログ番号８３．１８１３（Ｓａｒｓｔｅｄｔ  ＡＢ）。
化合物希釈プレート、９６ウェル、Ｖ字底ＰＰプレート、Ｎｕｎｃカタログ番号２４９９４４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【００９４】
細胞アッセイプレート、９６ウェル、カタログ番号１２８００９２９６（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
細胞数測定キットＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８  ＣＫ０４（Ｄｏｊｉｎｄｏ）。
【００９５】
試験化合物はＤＭＳＯ中１０ｍＭまでのストック溶液製造
方法
白血病細胞をおよそ１００ｍｌの完全細胞培地入り細胞培養フラスコ７５ｃｍ２中で増殖させた。細胞は、６０μｍセンサーを用い、Ｓｃｅｐｔｅｒハンディ型自動セルカウンター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で計数し、完全細胞培地中に懸濁させて２×１０５細胞とした。細胞懸濁液１００μｌを全ウェルに播種した（２×１０４細胞／ウェル）。
【００９６】
試験化合物希釈：
化合物は、１０倍段階希釈、５０μＭ〜５×１０−１０μＭの１２の濃度で試験した。
化合物希釈プレートから１００μｌを細胞アッセイプレートに移し（総量２００μｌ／ウェル)、５日間、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。
【００９７】
５日後、１０μｌのＫＩＴ−８を加え、培養物を３〜４時間、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。
プレートを、６２０ｎｍの参照フィルターを用い、波長４５０ｎｍで分光光度計で読んだ。
【００９８】
データ分析
化合物濃度の対数に対して阻害の程度（ビヒクル対照と比較した）をプロットすることにより、ＣＣ５０値を計算する。段階希釈における結果の値を下記表現によって説明される４パラメータＳ字状用量反応曲線に当てはめる。
【００９９】
Ｆ（ｘ）＝Ｄ＋（Ａ−Ｄ）／（１＋（ｘ／Ｃ）＾Ｂ）
式中、
Ａ＝最小
Ｂ＝傾き
Ｃ＝変曲点。変曲点は、曲率の方向又は符号が変化する曲線上の点と定義される。
Ｄ＝最大
Ｆ＝分数阻害(fraction inhibition)
ＣＣ５０値は、Ｆ＝０．５をもたらすｘ値で、以下の表１にまとめた。
【０１００】
本発明の化合物は、上記の肝臓を標的とした肝細胞がん特許出願第ＷＯ２０１６／０３０３３５号中の最も構造的に類似した化合物、特に実施例２９のｄｉａ−２及び３２のｄｉａ−２と比較した。
【０１０１】
【化１０】
2020011947.tif 000011
【０１０２】
【表１】
2020011947.tif 000012
【０１０３】
本発明の化合物は、幅広い白血病細胞株において極めて強力であり、先行技術の化合物の効力を平均して及び大部分の株ではるかに上回っていることが明らかである。
生物学実施例２
血中安定性
血液中の化合物の安定性を、マウス又はヒトの全血中での最大１２０分間のインキュベーション後に評価した。残留化合物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量し、得られたデータを用いて固有クリアランス（ＣＬｉｎｔ）値を計算した。
【０１０４】
【表２】
2020011947.tif 000013
【０１０５】
本発明の化合物はヒトの血液中で非常に安定であるが、マウスの血液中では極めて迅速に代謝されることが明らかである。
生物学実施例３
忍容性
生物学実施例２から、本発明の化合物はマウス血中での安定性を欠くことが明らかであるため、忍容性及び異種移植片に対する有効性の従来のインビボアッセイを実施することができない。化合物は、投与の数分以内に極めて単純に分解される。しかしながら、本発明の化合物の有望性は、基本の親ヌクレオシド５−フルオロトロキサシタビン（これはマウス血中で安定である）を代用品として用いたマウス異種移植片ＴＧＩモデルから暗示されうる。化合物はＰＢＳ中に調製され、マウスは１群あたりｎ＝９であった。３つのＳＣＩＤマウス集団で体重を毎日モニターした。
【０１０６】
Ｇ１  ビヒクル対照、ｉ．ｐ．（腹腔内）  ＢＩＤ（１日２回）×５
Ｇ２  トロキサシタビン親  ２５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．  ＢＩＤ×５（比較例）
Ｇ３  ５−フルオロトロキサシタビン親  １０８ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．  ＢＩＤ×５（本発明）
５日間のＢＩＤは、ヒトＨｅｐ３ｂ異種移植片を皮下移植した２１日後に開始した。結果を日数に対する体重（投与前体重の％）として以下にプロットする。
【０１０７】
ビヒクル群は、腫瘍体積（ＴＶ）が最終サイズ（平均直径１５ｍｍ、ＴＶ≒１５００ｍｍ３）になった研究第３８／４１日目まで追跡された。トロキサシタビン群は、持続的な体重減少及び臨床徴候（立毛、猫背の姿勢及び不活発な挙動を含む）のために移植後２８〜２９日目にすべて死亡した。これに対し、５−フルオロトロキサシタビン群は、腫瘍体積が最終サイズに達した５９日目まで追跡され、その時点でマウスは投与前体重と実質的に同じであった。上記の本発明の背景技術で述べたように、トロキサシタビンは様々な適応で臨床試験に入ったが、薬物としての登録には至らなかった。それは大まかに言えば不適切な安全性プロフィールのためである。このＴＧＩ実験におけるトロキサシタビンの結果もその臨床経験と一致している。しかしながら、本研究の驚きは、５−フルオロトロキサシタビン群の増強された忍容性で、このことは、直接的ではあるが、本発明の化合物が、よく忍容され、ゆえに脆弱なことで有名な年齢≧６０歳のＡＭＬ集団への投与に並外れて適していることを裏付けている。
【０１０８】
生物学実施例３
インビトロ組合せ分析
実施例１及び２の化合物を様々なＡＭＬ薬物と組み合わせてＭＶ−４１１細胞でアッセイし、Ｂｌｉｓｓ独立性分析に付した。
【０１０９】
細胞株
・ＭＶ−４−１１（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−９５９１）ヒトＢ−骨髄単球性白血病、ワーキングセルバンクのバイアルを２０１８−０３−２０に解凍
完全ＭＶ−４−１１細胞培養培地（５００ｍｌ）：
・ＩＭＤＭ（Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ入り、フェノールレッドなし）、カタログ番号２１０５６−０２３（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）−アッセイ
・１０％ＦＢＳ（５０ｍｌ）、Ｈｙｃｌｏｎｅカタログ番号ＳＶ３０１６０．０３、ロット：ＲＡＢ  ３５２９４（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
・０．５×ＰＥＳＴ（１００倍溶液２．５ｍｌ）、カタログ番号Ｐ１１−０１０（ＰＡＡ）又はカタログ番号１５１４０−１２２（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
細胞試薬：
・ＰＢＳ（カタログ番号Ｈ１５−００２）
・５０ｍｌ試験管、カタログ番号６２．５４８．００４（Ｓａｒｓｔｅｄｔ  ＡＢ）
・１５ｍｌ試験管、カタログ番号６２．５５４．００１（Ｓａｒｓｔｅｄｔ  ＡＢ）
・組織培養フラスコＴ２５／Ｔ７５／Ｔ１７５、カタログ番号８３．３９１０／８３．３９１１／８３．３９１２（Ｓａｒｓｔｅｄｔ  ＡＢ）
・細胞アッセイプレート平底９６ウェル、 ＴＰＰ  ９２０９６（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
細胞計数：
・Ｓｃｅｐｔｅｒハンディ型自動セルカウンター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、６０μｍセンサー使用
化合物：
・ＤＭＳＯ中１０ｍＭストック溶液
Ｅｃｈｏプレート
・送り元(Source)：Ｌａｂｃｙｔｅ  ３８４ＰＰ（ポリプロピレン）、カタログ番号Ｐ−０５５２５（プレートに残される最小体積：２０μｌ、最大体積：５０μｌ 
・送り先(Destination)：Ｃｏｓｔａｒ  ３３６３、透明ＰＰ、蓋なし
ソフトウェア（無料シェアウェア）
・ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ 
https://www.uab.edu/medicine/peds/macsynergyよりダウンロード（Ｐｒｉｃｈａｒｄ，Ｍ．Ｎ．及びＣ．Ｓｈｉｐｍａｎ，Ｊｒ． １９９０．（レビュー）薬物−薬物相互作用を分析するための３次元モデル、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．１４：１８１−２０６．）
細胞の調製
・１００μＬ（２×１０５細胞／ｍｌ）のＭＶ４−１１細胞を平底９６ウェルアッセイプレートに播種。結果の統計分析のためにプレートを三重に準備。カラム１２から細胞除外、培地のみ添加。
【０１１０】
化合物希釈プレートはＥｃｈｏを用いて三重に準備
実施例２の化合物とベネトクラックスを用いたプロトコル例
初期希釈：
実施例２：１／８３．３３にして１２０μＭ（７μｌ＋５９１μｌ、５８４μｌ）
ベネトクラックス：１／２０８にして４８μＭ（２μｌ＋４１８μｌ、４２０μｌ）
Ｅｃｈｏプレート中０．５μＬ×２、次に１４９μＬの完全ＭＶ４−１１培地を添加（１／３００希釈）、１００μＬをアッセイプレートに移動（１／２希釈）＝０．２μＭ（ＭＶ０８８８０９）及び０．０８μＭ（ＭＶ０８３９２７）
ソース（送り元）プレート位置（プレート３０／８）
実施例２  Ａ：１３−１５中（３４μｌ）、ＤＭＳＯ  Ｂ−Ｆ：１３−１５中（各３５μｌ）
ベネトクラックス  Ａ：１６−１８中（３４μｌ）、ＤＭＳＯ  Ｂ−Ｆ：１６−１８中（各３５μｌ）
実施例２は７点２倍希釈２００〜３．１ｎＭで試験し、ベネトクラックスは９点２倍希釈８０〜０．３ｎＭで試験した。上記プレートのセットアップに従って二つの化合物の濃度の組合せを含有する３枚の化合物プレートをＥＣＨＯアコースティック液体ハンドラー（分注システム）を用いて作製した。完全ＭＶ４−１１培地（１４９μＬ）を１μｌ／ウェル入りエコープレートに添加し、最終サンプル体積１５０μｌにする（カラム１２から１１へ開始、全プレート、次いでカラム１〜１０）。１００μｌを３枚の細胞含有アッセイプレートに移す（カラム１２から１１へ開始、全３枚のプレート、次いでカラム１〜１０、３回混合、同じ先端(tip)を使用）。プレートを５日間、３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０１１１】
プレートの読み
１０μｌのＣＣＫ  Ｋｉｔ−８を各ウェルにマルチチャンネルピペットを用いて添加し（先端を各ウェルの表面下に浸す）、プレートを３〜６時間、３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。プレートシールを追加して封止し、プレートを混合した後、Ｔｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅ分光光度計で、６５０ｎｍの参照フィルターを用い、波長４５０ｎｍで読み取った。
【０１１２】
平均吸光度は細胞対照に対し＞１となるはずである。
計算
各組合せの三重の生データをＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩシェアウェアに入力し、併用効果を計算して、以下の図２〜１５に示されているように、９９．９％の信頼度で３Ｄ用量反応面グラフ(surface graph)にプロットした。最終結果は、ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩのマニュアルに示されたガイドラインに従って、相乗作用体積又は拮抗作用体積(synergy or antagonism volumes)（μＭ２％）で示されている。
【０１１３】
結果
図２は、実施例２とアザシチジンのアイソボログラムを示す。９５％の信頼度で２２８．６３μＭ２％の相乗作用体積（対数体積０）は、強い相乗作用と有意でない拮抗作用を示している。
【０１１４】
図３は、実施例１とアザシチジンのアイソボログラムを示す。９５％の信頼度で相乗作用体積２６７．１６μＭ２％（対数体積２４．２１）は、強い相乗作用を示している。
図４は、実施例２とデシタビンのアイソボログラムを示す。９５％の信頼度で相乗作用体積２３９．１８μＭ２％（対数体積２１．６７）は、強い相乗作用と有意でない拮抗作用を示している。
【０１１５】
図５は、実施例１とデシタビンのアイソボログラムを示す。９５％の信頼度で相乗作用体積１６３．５２μＭ２％（対数体積−２．６４）及び−２９．０９μＭ２％（対数体積−２．６４）は、強い相乗作用とわずかな拮抗作用を示している。
【０１１６】
図６は、実施例２とミドスタウリンのアイソボログラムを示す。９５％の信頼度で相乗作用体積４８５．１６μＭ２％（対数体積４３．９６）及び−３．６２μＭ２％（対数体積−０．３３）は、強い相乗作用を示している。
【０１１７】
図７は、実施例１とミドスタウリンのアイソボログラムを示す。９５％の信頼度で相乗作用体積１７８．４３μＭ２％（対数体積１６．７）及び０μＭ２％（対数体積０）は、強い相乗作用とわずかな拮抗作用を示している。
【０１１８】
図８は、実施例２とベネトクラックスのアイソボログラムを示す。９５％の信頼度で相乗作用体積４０１．９９μＭ２％（対数体積３６．４３）及び−０．５９μＭ２％（対数体積−０．２７）は、強い相乗作用と有意でない／無の拮抗作用を示している。
【０１１９】
図９は、実施例１とベネトクラックスのアイソボログラムを示す。９５％の信頼度で相乗作用体積２０９．７６μＭ２％（対数体積１９．０１）及び−０．４３μＭ２％（対数体積−０．０４）は、強い相乗作用を示している。
【０１２０】
図１０は、実施例２とイダルビシンのアイソボログラムを示す。９５％の信頼度で相乗作用体積１９２．８４μＭ２％（対数体積１７．４７）及び−２．９２μＭ２％（対数体積−０．２７）は、強い相乗作用と有意でない／無の拮抗作用を示している。
【０１２１】
図１１は、実施例１とイダルビシンのアイソボログラムを示す。９５％の信頼度で相乗作用体積１２０．９６μＭ２％（対数体積１０．９６）及び−０．５９μＭ２％（対数体積−０．０５）は、強い相乗作用を示している。
【０１２２】
図１２は、実施例２とダウノルビシンのアイソボログラムを示す。９５％の信頼度で相乗作用体積２７７．８９μＭ２％（対数体積２５．１８）及び−４．０２μＭ２％（対数体積−０．３６）は、強い相乗作用と有意でない拮抗作用を示している。
【０１２３】
図１３は、実施例１とダウノルビシンのアイソボログラムを示す。９５％の信頼度で相乗作用体積６６．６８μＭ２％（対数体積６．０４）及び−３６．１４μＭ２％（対数体積−３．２７）は、中程度の相乗作用とわずかな拮抗作用を示している。
【０１２４】
図１４は、実施例２とドキソルビシンのアイソボログラムを示す。９５％の信頼度で相乗作用体積１７９．１１μＭ２％（対数体積１６．２３）及び０μＭ２％（対数体積０）は、強い相乗作用と有意でない拮抗作用を示している。
【０１２５】
図１５は、実施例１とドキソルビシンのアイソボログラムを示す。９５％の信頼度で相乗作用体積１２０．８３μＭ２％（対数体積１０．９８）は、強い相乗作用を示している。
【０１２６】
本発明の化合物は顕著な相乗作用を示すこと、それと同じくらい重要なことに、従来の白血病治療薬と共投与された場合に有意でない〜ゼロの拮抗作用を示すことが明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【外国語明細書】
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