(57)【要約】【課題】  本明細書で提供されるのは、環状プロサポシンペプチドならびにその組成物および使用である。【解決手段】  例示の使用としては、がんの処置または炎症性疾患もしくは障害の処置における使用が挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを有する対象を処置するための方法であって、方法が、
がんを有する対象に対して、がんを処置するための環状ペプチドの有効量を投与することを含み、ここで、該環状ペプチドのアミノ酸配列が、ＤＷＬＰＫ（配列番号１）である、前記方法。
【請求項２】
がんが、卵巣がんまたは黒色腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
がんの処置に使用するための組成物であって、組成物が環状ペプチドを含み、ここで該環状ペプチドのアミノ酸配列が、ＤＷＬＰＫ（配列番号１）である、前記組成物。
【請求項４】
がんが、卵巣がんまたは黒色腫である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
炎症性疾患または障害を有する対象を処置するための方法であって、方法が、
炎症性疾患または障害を有する対象に対して、炎症性疾患または障害を処置するための環状ペプチドの有効量を投与することを含み、ここで、該環状ペプチドのアミノ酸配列が、ＤＷＬＰＫ（配列番号１）である、前記方法。
【請求項６】
炎症性疾患または障害が、関節リウマチ、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、クローン病、乾癬、またはアテローム性動脈硬化症である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
炎症性疾患または障害が、クローン病である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
炎症性疾患または障害の処置に使用するための組成物であって、組成物が環状ペプチドを含み、ここで該環状ペプチドのアミノ酸配列が、ＤＷＬＰＫ（配列番号１）である、前記組成物。
【請求項９】
炎症性疾患または障害が、関節リウマチ、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、クローン病、乾癬、またはアテローム性動脈硬化症である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
炎症性疾患または障害が、クローン病である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
トロンボスポンジン−１（Ｔｓｐ−１）の発現を刺激するための方法であって、方法が、
必要とする対象に対して、Ｔｓｐ−１の発現を刺激するための環状ペプチドの有効量を投与することを含み、ここで、該環状ペプチドのアミノ酸配列が、ＤＷＬＰＫ（配列番号１）である、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、35 U.S.C. § 119(e)の下で、２０１４年３月２６日に出願された米国仮出願番号61/970,853の利益を主張し、この仮出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所から授与されたR01CA135417の下で、政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
がんは、公衆衛生の主要な問題である。例えば、２００８年には推定７６０万人のがんによる死亡が発生した。多くのがんはいまだ処置不可能であるか、または処置は準最適であって、部分的にのみ有効であるか、もしくは毒性などの望ましくない副作用を有する。
炎症性疾患および障害もまた、公衆衛生の主要な問題であり、がんと同様の処置に関する問題を有する。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の側面は、環状プロサポシンペプチド、例えば配列ＤＷＬＰＫ（配列番号１）を有する環状ペプチドが、直鎖プロサポシンペプチドより、がんの動物モデルの処置により安定かつより効果的であるという発見に、部分的に基づいている。驚くべきことに、環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）ペプチドは、in vitroでトロンボスポンジン−１（Ｔｓｐ−１）を刺激することにおいて、３位にグリシンの置換を有する環状ペプチド（すなわち、ＤＷＧＰＫ、配列番号２）と比較して、より有効であることが見出された。このデータは予想外であり、なぜならば、逆の結果が直鎖プロサポシンペプチドを用いて得られたから、すなわち直鎖ＤＷＧＰＫ（配列番号２）は、直鎖ＤＷＬＰＫ（配列番号１）よりも良好な活性を有することが見出されたからある。さらに、環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）ペプチドは、ペプチドで処置したマウスの肝臓または脾臓に対して毒性を引き起こさなかったことも見出された。
本開示の他の側面は、環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）が、クローン病のマウスモデルの処置に有効であるとの発見に、部分的に基づく。
【０００５】
したがって、本開示の側面は、環状プロサポシンペプチド、例えばＤＷＬＰＫ（配列番号１）に、およびかかるペプチドを利用する組成物および方法に関する。
本開示のいくつかの側面は、がんを有する対象を処置するための方法であって、方法が、がんを有する対象に対して、がんを処置するための環状ペプチドの有効量を投与することを含み、ここで、該環状ペプチドのアミノ酸配列がＤＷＬＰＫ（配列番号１）である、前記方法に関する。いくつかの態様において、がんは、卵巣がんまたは黒色腫である。
他の側面は、がんの処置に使用するための組成物であって、組成物が環状ペプチドを含み、ここで該環状ペプチドのアミノ酸配列がＤＷＬＰＫ（配列番号１）である、前記組成物に関する。いくつかの態様において、がんは、卵巣がんまたは黒色腫である。
本開示のさらに他の側面は、炎症性疾患または障害を有する対象を処置するための方法であって、方法が、炎症性疾患または障害を有する対象に対して、炎症性疾患または障害を処置するための環状ペプチドの有効量を投与することを含み、ここで、該環状ペプチドのアミノ酸配列がＤＷＬＰＫ（配列番号１）である、前記方法に関する。いくつかの態様において、炎症性疾患または障害は、関節リウマチ、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、クローン病、乾癬、またはアテローム性動脈硬化症である。いくつかの態様において、炎症性疾患または障害は、クローン病である。
【０００６】
本開示の他の側面は、炎症性疾患または障害の処置に使用するための組成物であって、組成物が環状ペプチドを含み、ここで該環状ペプチドのアミノ酸配列がＤＷＬＰＫ（配列番号１）である、前記組成物に関する。いくつかの態様において、炎症性疾患または障害は、関節リウマチ、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、クローン病、乾癬、またはアテローム性動脈硬化症である。いくつかの態様において、炎症性疾患または障害は、クローン病である。
本開示の他の側面は、トロンボスポンジン−１（Ｔｓｐ−１）の発現を刺激するための方法であって、方法が、必要とする対象に対して、Ｔｓｐ−１の発現を刺激するための環状ペプチドの有効量を投与することを含み、ここで、該環状ペプチドのアミノ酸配列がＤＷＬＰＫ（配列番号１）である、前記方法に関する。
【０００７】
本開示の側面は、環状Ｐｓａｐペプチドに関する。いくつかの態様において、環状Ｐｓａｐペプチドは、アミノ酸配列ＤＷＬＰＫ（配列番号１）、ｄＷＬＰＫ（配列番号３、小文字ｄはＤ−アミノ酸を示す）、ＤＷＧＰＫ（配列番号２）、またはｄＷＧＰＫ（配列番号４、小文字ｄはＤ−アミノ酸を示す）を含む。いくつかの態様において、環状Ｐｓａｐペプチドのアミノ酸配列は、ＤＷＬＰＫ（配列番号１）、ｄＷＬＰＫ（配列番号３、小文字ｄはＤ−アミノ酸を示す）、ＤＷＧＰＫ（配列番号２）、またはｄＷＧＰＫ（配列番号４、小文字ｄはＤ−アミノ酸を示す）である。いくつかの態様において、環状Ｐｓａｐペプチドは、アミノ酸配列ＤＷＬＰＫ（配列番号１）を含む。いくつかの態様において、環状Ｐｓａｐペプチドのアミノ酸配列は、ＤＷＬＰＫ（配列番号１）である。
本開示の他の側面は、本明細書に記載の環状Ｐｓａｐペプチドを含む、組成物に関する。いくつかの態様において、組成物は、医薬組成物である。いくつかの態様において、組成物は、本明細書に記載の環状Ｐｓａｐペプチドおよび薬学的に許容し得る担体を含む。
本開示の１または２以上の態様の詳細を、以下の説明に記載する。本開示の他の特徴や利点は、以下の図面およびいくつかの態様の詳細な説明から、また添付の特許請求の範囲から、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の側面をさらに実証するために含まれ、本開示は、これらの図面の１または２以上を、本明細書に示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせて参照することにより、よりよく理解することができる。
【図１】図１は、環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）の例示的な概略図である。
【図２】図２は、異なる環状または直鎖ペプチド（上から下へそれぞれ、配列番号１、３、２、および４）に応答した、細胞におけるトロンボスポンジン−１（Ｔｓｐ−１）の活性化のレベルを示すウエスタンブロットの写真である。
【図３】図３は、環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）または直鎖ｄＷｌＰ（配列番号５）の、ヒト血漿中でのインキュベーション後のＴｓｐ−１を活性化する能力を示すグラフである。
【図４】図４は、環状ペプチドまたは直鎖ペプチドで処置したマウスにおける、腫瘍体積を示すグラフである。
【０００９】
【図５】図５は、環状ペプチドまたは直鎖ペプチドで処置したマウスにおける、腫瘍体積を示すグラフである。
【図６】図６は、環状ペプチドまたは対照で処理した後に、マウスに注射されたルシフェラーゼ発現腫瘍細胞の、全光束を示すグラフである。
【図７】図７は、Ｔｓｐ−１が、Ｆ４／８０を発現するマクロファージにおいて発現していることを示す、一連の写真である。
【図８】図８は、対照または環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）を注射したマウスにおける肝臓および脾臓試料の組織学を示す、一連の写真である。
【図９】図９は、対照で処置、未処置、または環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）で処置した、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発性のクローン病のマウスモデルにおける、ＭＰＯ酵素活性（結腸粘膜への好中球浸潤の指標）を示すグラフである。
【００１０】
【図１０】図１０は、対照で処置、未処置、または環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）で処置したクローン病のマウスモデルにおける、体重パーセントを示すグラフである。
【図１１】図１１は、対照で処置、未処置、または環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）で処置したクローン病のマウスモデルにおける、腸の組織学およびマクロファージの局在を示す、一連の写真である。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｅは、Ｔｓｐ−１の刺激ならびに、卵巣がん細胞増殖および生存に及ぼすその影響を示す図である。図１２Ａは、未処置の（−）、または、天然のＤＷＬＰ（配列番号６）、Ｌ−アミノ酸、プロサポシンペプチド（ＷＴ）、ｄＷｌＰ（配列番号５、小文字のｄおよび１はＤ−アミノ酸を示す）プロサポシンペプチド（ｄ１，３）、もしくはＤｗＬｐ（配列番号７、小文字のｗおよびｐはＤ−アミノ酸を示す）プロサポシンペプチド（ｄ２，４）で処置したＷＩ−３８肺繊維芽細胞における、Ｔｓｐ−１およびβアクチンのウエスタンブロットの図である；図１２Ｂは、転移性前立腺がん細胞馴化培地単独で（−）、またはＤＷＬＰ（配列番号６）プロサポシンペプチド（ＷＴ）、もしくはｄＷｌＰ（配列番号５、小文字のｄおよび１はＤ−アミノ酸を示す）プロサポシンペプチド（ｄ１，３ペプチド）と組み合わせて、１０または３０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で３日間処置したマウスから採取したマウスの肺組織中の、Ｔｓｐ−１およびβアクチンのウエスタンブロットの図である；図１２Ｃは、８つの、患者由来の卵巣がん細胞株における、ＣＤ３６およびβアクチンのウエスタンブロットの図である；図１２Ｄは、１μＭの組換えヒトＴｓｐ−１（ｒｈＴｓｐ−１）で２４、４８および７２時間処置された患者由来卵巣がん細胞株の、Ｗｓｔ−１アッセイによって測定される細胞数のプロットである；および図１２Ｅは、１μＭの組換えヒトＴｓｐ−１（ｒｈＴｓｐ−１）で４８時間処置された患者由来卵巣がん細胞株の、アネキシンＶおよびＰＩのＦＡＣＳ分析の図である。
【００１１】
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｅは、ｄ−アミノ酸プロサポシンペプチドの、転移性卵巣がんのＰＤＸモデルに対する効果を示す図である。図１３Ａは、生理食塩水（対照）、シスプラチン４ｍｇ／ｋｇ／ＱＯＤ（シスプラチン）、およびｄＷｌＰ（配列番号５）プロサポシンペプチド４ｍｇ／ｋｇＱＤで処置した転移性ＰＤＸ卵巣腫瘍の、相対ルシフェラーゼ強度のプロットである；図１３Ｂは、対照で処置した２匹のマウス、およびｄＷｌＰ（配列番号５）プロサポシンペプチドで処置した２匹のマウスの、１７日目（処置０日目）および４８日目（処置３１日目）における、ルシフェラーゼ画像を示し、各画像は、画像の右にルシフェラーゼのスケールを有し、これはラジアンスの×１０８単位（ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒ）で示され、スケールの最小は０．０５ｅ６であり、スケールの最大は１．００ｅ８である；図１３Ｃは、生理食塩水（対照）またはｄＷｌＰ（配列番号５）プロサポシンペプチド（ペプチド）で処置した転移性ＰＤＸ卵巣腫瘍を有するマウスの肝臓の写真の図であり；図１３Ｄは、生理食塩水（対照）またはｄＷｌＰ（配列番号５）プロサポシンペプチド（ペプチド）で処置した転移性ＰＤＸ卵巣腫瘍を有するマウスの肝臓の、Ｈ＆Ｅ染色を示す図である。右パネルは５倍の倍率であり、左パネルは２０倍の倍率である；および、図１３Ｅは、マウス対照および、ｄＷｌＰ（配列番号５）プロサポシンペプチドで処置した転移性ＰＤＸ卵巣腫瘍を有するマウスの４８日後の、腹水中のＧＲ１＋／Ｃｄ１１ｂ＋細胞の、ＦＡＣＳ分析の図である。
【００１２】
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｆは、環状プロサポシンペプチドの、Ｔｓｐ−１発現および転移性卵巣がんのＰＤＸモデルに対する効果を示す図である。図１４Ａは、未処置（−）、ｄＷｌＰ（配列番号５）プロサポシンペプチドで処置（ｄ１，３、「Ｌ」）、または環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）プロサポシンペプチドで処置した（「Ｃ」）、ＷＩ−３８肺線維芽細胞における、Ｔｓｐ−１およびβアクチンのウエスタンブロットの図であり；図１４Ｂは、未処置（−）、ｄＷｌＰ（配列番号５）プロサポシンペプチドで処置（ｄ１，３）、または環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）プロサポシンペプチドで処置したＷＩ−３８肺線維芽細胞における、ヒト血漿中３７℃で２４時間までのインキュベーション後の、Ｔｓｐ−１発現のＥＬＩＳＡの図であり；図１４Ｃは、生理食塩水（対照）または環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）プロサポシンペプチド（１０ｍｇ／ｋｇＱＤ）で処置した、転移性ＰＤＸ卵巣腫瘍の相対ルシフェラーゼ強度のプロットの図であり；図１４Ｄは、生理食塩水（対照）で処置したマウスおよび環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）プロサポシンペプチドで処置したマウス（ペプチド）における、平均の転移性病変のプロットの図であり；図１４Ｅは、生理食塩水（対照）で処置したマウスおよび環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）プロサポシンペプチドで処置したマウス（ペプチド）の転移性病変における、Ｇｒ１およびＴｓｐ−１発現の免疫蛍光染色図であり；および図１４Ｆは、対照および環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）プロサポシンペプチドで処置したマウス（ペプチド）における、Ｔｓｐ−１発現の免疫組織化学（一番左のパネル）ならびに、転移性病変のＴＵＮＥＬおよびＤＡＰＩの免疫蛍光染色を示す図である。
【００１３】
【図１５】図１５Ａ〜Ｎは、ヒト卵巣がん患者のＴＭＡにおける、ＣＤ３６およびプロサポシンの発現を示す図である。図１５Ａ〜１５Ｃは、正常なヒト卵巣におけるＣＤ３６の発現を示す（倍率：Ａ＝５倍、Ｂ＝１０倍、Ｃ＝２０倍）；図１５Ｄ〜１５Ｆは、原発ヒト卵巣腫瘍におけるＣＤ３６の発現を示す（倍率：Ａ＝５倍、Ｂ＝１０倍、Ｃ＝２０倍）；図１５Ｇ〜１５Ｉは、ヒト卵巣がん転移におけるＣＤ３６の発現を示す（倍率：Ａ＝５倍、Ｂ＝１０倍、Ｃ＝２０倍）；図１５Ｊ〜１５Ｌは、ヒト卵巣がんリンパ節転移におけるＣＤ３６の発現を示す（倍率：Ａ＝５倍、Ｂ＝１０倍、Ｃ＝２０倍）；図１５Ｍは、正常なヒト卵巣、原発ヒト卵巣腫瘍、ヒト卵巣がん転移、およびヒト卵巣がんリンパ節転移の、ＣＤ３６染色指数のプロットの図である；図１５Ｎは、正常なヒト卵巣、原発ヒト卵巣腫瘍、ヒト卵巣がん転移、およびヒト卵巣がんリンパ節転移の、プロサポシン（Ｐｓａｐ）染色指標のプロットの図である。
【００１４】
【図１６】図１６は、ｐｓａｐペプチドが、体重に影響を及ぼさなかったことを示す図である。
【図１７】図１７は、Ｔｓｐ−１受容体を発現する膵臓がん細胞を示す図である。
【図１８】図１８は、環状プロサポシンペプチドＤＷＬＰＫ（配列番号１）が、直鎖ペプチドよりも約２倍高い活性を有することを示す図である。
【図１９】図１９は、環状プロサポシンペプチドＤＷＬＰＫ（配列番号１）が、膵臓がんに対して顕著な抗腫瘍活性を有することを示す図である。
【図２０】図２０は、環状プロサポシンペプチドＤＷＬＰＫ（配列番号１）が、転移性膵臓がんを退縮させ、転移を阻害することを示す図である。
【００１５】
発明の詳細な説明
最初はサポシンＡの断片から誘導されたプロサポシンペプチド（本明細書においてＰｓａｐペプチドと呼ぶ）は、直鎖状で使用される場合に複数種類のがんの処置に有効であることが、以前から示されていた（例えば、ＰＣＴ公開WO2009002931、WO/2011/084685およびWO/2013/096868、および米国特許出願12/640,788および13/516,511を参照、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
本明細書に記載されるように、環状Ｐｓａｐペプチド、特に環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）ペプチドは、直鎖Ｐｓａｐペプチドよりも予想外に安定かつより効果的である。さらに、環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）は、肝臓または脾臓に毒性作用を有さないことが見出された。さらに、環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）は、アミノ酸置換ペプチドの他の環状バージョン（例えば、ＤＷＧＰＫ、配列番号２）よりも、よりよい活性を有していた。この所見は驚くべきことであり、なぜならば、置換ペプチドの直鎖バージョンは、ＤＷＬＰＫ（配列番号１）の直鎖バージョンよりも活性であることが見出されていたからである。
【００１６】
さらに本明細書に記載されるように、環状ＰｓａｐペプチドＤＷＬＰＫ（配列番号１）は、クローン病のマウスモデルにおいて有効であることが発見された。理論に束縛されることを意図しないが、環状Ｐｓａｐペプチドは、Ｔｓｐ−１の発現を活性化または増強し、Ｔｓｐ−１の発現は、クローン病に関連する炎症を減少させると考えられる。Ｔｓｐ−１は以前に、炎症に応答して分泌され、炎症プロセスの解消を促進し、損傷した細胞の食作用を促進することが示されている（例えば、Lopez-Dee et al. Thrombospondin-1: Multiple Paths to Inflammation. (2011) Mediators of Inflammation; Vol. 2011; Article ID 296069を参照）。このように、環状Ｐｓａｐペプチドの治療効果が、典型的な炎症性疾患であるクローン病のモデルで見られたため、環状Ｐｓａｐペプチドはまた、他の炎症性疾患、例えば関節リウマチおよび乾癬、ならびに炎症が関与する他の疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症、および加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）などの炎症性疾患を処置するためにも、有効であろうと考えられている。
したがって、本開示の側面は、環状Ｐｓａｐペプチド、および、がんおよび炎症性障害または疾患、ならびに炎症が関与する他の疾患などの疾患を処置するための、組成物および方法におけるそれらの使用に関する。
【００１７】
環状Ｐｓａｐペプチド
プロサポシン（Ｐｓａｐ）は、約５２４〜５２７個のアミノ酸からなるサポシン前駆体タンパク質であり、１６アミノ酸のシグナルペプチドを含む。完全長の前駆体ポリペプチドは、小胞体およびゴルジシステムにおいて同時翻訳グリコシル化および修飾を受け、７０〜７２ｋＤａの前駆体タンパク質を生成する。リソソームへの輸送後、カテプシンＤは、そのタンパク質分解処理に関与して、３５〜５３ｋＤａの中間の分子形態を、次に１３ｋＤａの糖タンパク質を生成し、最終的には個々のサポシン分子の８〜１１ｋＤａの成熟した部分的グリコシル化形態を生成する（O’Brien J. S., and Kishimoto Y, The FASEB J., 5: 301-8, 1991; Kishimoto Y. et al., J. Lipid Res. 33:1255-67, 1992）。プロサポシンは、４つの切断産物、サポシンＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤに加工される。Ｐｓａｐプレプロタンパク質アイソフォームＡ、Ｂ、およびＣのアミノ酸配列、および切断産物サポシンＡのアミノ酸配列は、以下の通りである。
【００１８】
Ｐｓａｐプレプロタンパク質アイソフォームＡ
MYALFLLASLLGAALAGPVLGLKECTRGSAVWCQNVKTASDCGAVKHCLQTVWNKPTVKSLPCDICKDVVTAAGDMLKDNATEEEILVYLEKTCDWLPKPNMSASCKEIVDSYLPVILDIIKGEMSRPGEVCSALNLCESLQKHLAELNHQKQLESNKIPELDMTEVVAPFMANIPLLLYPQDGPRSKPQPKDNGDVCQDCIQMVTDIQTAVRTNSTFVQALVEHVKEECDRLGPGMADICKNYISQYSEIAIQMMMHMQPKEICALVGFCDEVKEMPMQTLVPAKVASKNVIPALELVEPIKKHEVPAKSDVYCEVCEFLVKEVTKLIDNNKTEKEILDAFDKMCSKLPKSLSEECQEVVDTYGSSILSILLEEVSPELVCSMLHLCSGTRLPALTVHVTQPKDGGFCEVCKKLVGYLDRNLEKNSTKQEILAALEKGCSFLPDPYQKQCDQFVAEYEPVLIEILVEVMDPSFVCLKIGACPSAHKPLLGTEKCIWGPSYWCQNTETAAQCNAVEHCKRHVWN（配列番号９）
【００１９】
Ｐｓａｐプレプロタンパク質アイソフォームＢ
MYALFLLASLLGAALAGPVLGLKECTRGSAVWCQNVKTASDCGAVKHCLQTVWNKPTVKSLPCDICKDVVTAAGDMLKDNATEEEILVYLEKTCDWLPKPNMSASCKEIVDSYLPVILDIIKGEMSRPGEVCSALNLCESLQKHLAELNHQKQLESNKIPELDMTEVVAPFMANIPLLLYPQDGPRSKPQPKDNGDVCQDCIQMVTDIQTAVRTNSTFVQALVEHVKEECDRLGPGMADICKNYISQYSEIAIQMMMHMQDQQPKEICALVGFCDEVKEMPMQTLVPAKVASKNVIPALELVEPIKKHEVPAKSDVYCEVCEFLVKEVTKLIDNNKTEKEILDAFDKMCSKLPKSLSEECQEVVDTYGSSILSILLEEVSPELVCSMLHLCSGTRLPALTVHVTQPKDGGFCEVCKKLVGYLDRNLEKNSTKQEILAALEKGCSFLPDPYQKQCDQFVAEYEPVLIEILVEVMDPSFVCLKIGACPSAHKPLLGTEKCIWGPSYWCQNTETAAQCNAVEHCKRHVWN（配列番号１０）
【００２０】
Ｐｓａｐプレプロタンパク質アイソフォームＣ
MYALFLLASLLGAALAGPVLGLKECTRGSAVWCQNVKTASDCGAVKHCLQTVWNKPTVKSLPCDICKDVVTAAGDMLKDNATEEEILVYLEKTCDWLPKPNMSASCKEIVDSYLPVILDIIKGEMSRPGEVCSALNLCESLQKHLAELNHQKQLESNKIPELDMTEVVAPFMANIPLLLYPQDGPRSKPQPKDNGDVCQDCIQMVTDIQTAVRTNSTFVQALVEHVKEECDRLGPGMADICKNYISQYSEIAIQMMMHMDQQPKEICALVGFCDEVKEMPMQTLVPAKVASKNVIPALELVEPIKKHEVPAKSDVYCEVCEFLVKEVTKLIDNNKTEKEILDAFDKMCSKLPKSLSEECQEVVDTYGSSILSILLEEVSPELVCSMLHLCSGTRLPALTVHVTQPKDGGFCEVCKKLVGYLDRNLEKNSTKQEILAALEKGCSFLPDPYQKQCDQFVAEYEPVLIEILVEVMDPSFVCLKIGACPSAHKPLLGTEKCIWGPSYWCQNTETAAQCNAVEHCKRHVWN（配列番号１１）
【００２１】
サポシンＡ
SLPCDICKDVVTAAGDMLKDNATEEEILVYLEKTCDWLPKPNMSASCKEIVDSYLPVILDIIKGEMSRPGEVCSALNLCES（配列番号１２）
本開示の側面は、環状Ｐｓａｐペプチド、環状Ｐｓａｐペプチドを含む組成物、およびその使用に関する。いくつかの態様において、環状Ｐｓａｐペプチドは、アミノ酸配列ＤＷＬＰＫ（配列番号１）、ｄＷＬＰＫ（配列番号３、小文字ｄはＤ−アミノ酸を示す）、ＤＷＧＰＫ（配列番号２）、またはｄＷＧＰＫ（配列番号４、小文字ｄはＤ−アミノ酸を示す）を含む。いくつかの態様において、環状Ｐｓａｐペプチドのアミノ酸配列は、ＤＷＬＰＫ（配列番号１）、ｄＷＬＰＫ（配列番号３、小文字ｄはＤ−アミノ酸を示す）、ＤＷＧＰＫ（配列番号２）、またはｄＷＧＰＫ（配列番号４、小文字ｄはＤ−アミノ酸を示す）である。いくつかの態様において、環状Ｐｓａｐペプチドは、アミノ酸配列ＤＷＬＰＫ（配列番号１）を含む。いくつかの態様において、環状Ｐｓａｐペプチドのアミノ酸配列は、ＤＷＬＰＫ（配列番号１）である。
【００２２】
いくつかの態様において、環状ペプチドは、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、または５個のアミノ酸の長さである。いくつかの態様において、環状ペプチドは、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７または５〜６の間のアミノ酸の長さである。いくつかの態様において、環状ペプチドは、５個のアミノ酸の長さである。
本明細書に記載のペプチドは、当技術分野で知られている生化学的方法により化学的に合成し単離することができ、該方法は例えば、ｔ−ＢＯＣ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）またはＦＭＯＣ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）保護基を使用する固相ペプチド合成などであって、以下に記載のものである：John Howlによる“Peptide synthesis and applications”、Methods in molecular biology Vol. 298, Ed.およびN. Leo Benoiton, 2005による“Chemistry of Peptide Synthesis”, CRC Press, (ISBN-13: 978-1574444544)およびP. Lloyd-Williams, et al., 1997による“Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins”, CRC-Press, (ISBN-13: 978-0849391422)。R. B. Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85 (14): 2149-2154が開発した固相ペプチド合成は、ペプチドおよび小タンパク質の化学合成を可能にする、画期的な成果であった。
【００２３】
環状Ｐｓａｐペプチドは、当技術分野で知られている任意の方法を用いて合成することができる。合成方法の例としては、限定はされないが、組換え合成、液相合成、固相合成、または化学的ライゲーションが挙げられる（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001；Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds.,  John Wiley & Sons, Inc., New York；Schnolzer, M. A., P.; Jones, A.; Alewood, D.; Kent, S.B.H. (2007). "In Situ Neutralization in Boc-chemistry Solid Phase Peptide Synthesis". Int. J. Peptide Res. Therap. 13 (1-2): 31-44；Albericio, F. (2000). Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide (1 ed.). Boca Raton: CRC Press. p. 848；およびNilsson BL, Soellner MB, Raines RT (2005). "Chemical Synthesis of Proteins". Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 34: 91-118；および米国特許第4,749,742号、第4,794,150号、第5,552,471号、第5,637,719号、第6,001,966号、第7,038,103号、第7,094,943号、第7,176,282号、および第7,645,858号を参照、これらの全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。ＰｓａｐペプチドおよびＰｓａｐペプチドを作製する方法もまた、当技術分野で知られている（例えば、ＰＣＴ公開WO2009002931、WO/2011/084685およびWO/2013/096868を参照、これらの全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。環状ペプチドは、ペプチド結合または他の共有結合で共に連結され、環状構造を形成するポリペプチド鎖である。環状ペプチドの設計および合成の方法は、当分野でよく知られており（例えば、米国特許第5,596,078号、第5,990,273号、第7,589,170号および米国特許公開第20080287649号参照）、市販されている（例えば、環状ペプチドの合成サービスは、次により提供されている：Selleck Chemicals、Abbiotec、Abgent、AnaSpec Global Peptide Services、LLC., INVITROGEN（商標）およびrPeptide、LLCまたはGenScript）。環状ペプチドは、例えば、頭−尾（Ｃ末端−Ｎ末端）で、頭−側鎖で、側鎖−尾で、または側鎖−側鎖で、環状化することができる（例えば、White et al. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry (2011); 3:509-524を参照）。環化試薬、例えば、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩）、ＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）、ＤＭＴＭＭ ＢＦ４（４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムテトラフルオロボレート）またはＦＤＰＰ（ペンタフルオロフェニルジフェニルホスフィナート）、またはそれらの組み合わせを、ペプチド合成の間、またはペプチド合成後に使用して、環化を誘導することができる。例示的な方法としては、ペンタペプチドを環化するリング収縮戦略における、光分解性補助剤、例えばＨｎＢ（２−ヒドロキシ−６−ニトロベンジル）の使用を含む。この補助剤のペプチドのＮ末端への導入後、ペプチドをＢＯＰおよびＤＩＰＥＡと接触させると、分子内ＯからＮへのアシル転移がもたらされ、これは次に、環状ペンタペプチドをもたらす。光分解性補助剤は、その後除去することができる。
【００２４】
いくつかの態様において、Ｐｓａｐペプチドは修飾されてもよく、例えば、オリゴマー化または重合（例えば、二量体、三量体、多量体など）、アミノ酸残基またはペプチド骨格の修飾、架橋、コンジュゲーション、ペグ化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、追加の異種アミノ酸配列（例えば、抗体または抗体Ｆｃドメイン、血清トランスフェリンもしくはその部分、アルブミン、またはトランスサイレチン）への融合、または、治療活性を実質的に保持または向上させつつ、ペプチドの安定性、溶解性、または他の特性を実質的に変化させる他の修飾などによる。コンジュゲーションは、例えばポリマーに対するものであってもよい。適切なポリマーとしては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、硫酸デキストランを含むデキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖類、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含むセルロースおよびセルロース誘導体、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコールのコポリマーおよびその誘導体、ポリビニルエチルエーテル、およびα，βポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミドなど、またはこれらの混合物が挙げられる。コンジュゲーションは、リンカー、例えば、ペプチドまたは化学リンカーを介してもよい。ペプチドを修飾する方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、米国特許第5,180,816号、第5,596,078号、第5,990,273号、第5,766,897号、第5,856,456号、第6,423,685号、第6,884,780号、第7,610,156号、第7,256,258号、第7,589,170号、および第7,022,673号、およびＰＣＴ公開WO 2010/014616を参照；これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００２５】
いくつかの態様において、環状Ｐｓａｐペプチドは、安定性を増強するように機能的に修飾されている。いくつかの態様において、Ｐｓａｐペプチドへの化学修飾としては、限定はされないが、以下の包含を含む：アルキル、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アミノジアルキル、ハロゲン、ヘテロ原子、炭素環、カルボシクリル、カルボシクロ、炭素環式、アリール、アラルキル、アラルコキシ、アリールオキシアルキル、複素環、ヘテロシクリル、複素環式、ヘテロアリール、および／または脂肪族基。
いくつかの態様において、環状ペプチドは、少なくとも１つの治療分子に融合／コンジュゲートされている。
【００２６】
いくつかの態様において、１または２以上のＤ−アミノ酸の類似のＬアミノ酸への置換から生じる、環状Ｐｓａｐペプチドのアミノ酸置換バリアントが、本明細書において企図される。いくつかの態様において、１つのＤ−アミノ酸置換が存在する。いくつかの態様において、２または３以上のＤ−アミノ酸置換が存在する。いくつかの態様において、３、４、または５個のＤ−アミノ酸置換が存在する。いくつかの態様において、Ｄ−アミノ酸置換は、均一の間隔、例えば１つ置きのアミノ酸である。いくつかの態様において、Ｄ−アミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）に対する。アミノ酸構成についてのＬおよびＤの慣例は、アミノ酸自体の光学活性ではなく、そのアミノ酸を理論的にはこれから合成できるところのグリセルアルデヒドの異性体の光学活性を指す（Ｄ−グリセルアルデヒドは右旋性であり；Ｌ−グリセルアルデヒドは左旋性である）。例示のＤアミノ酸置換バリアントとしては、環状ｄＷＬＰＫ（配列番号３、小文字ｄはＤ−アミノ酸を示す）および環状ｄＷＧＰＫ（配列番号４、小文字ｄはＤ−アミノ酸を示す）が挙げられる。
【００２７】
本明細書に記載の環状ペプチドは、さらに修飾または誘導体化することができる。修飾または誘導体化ポリペプチドは、典型的には、ベースのポリペプチド（修飾／誘導体化の前）の活性を実質的に保持するであろう。修飾および誘導体の例は、ペグ化、グリコシル化、アセチル化、アミド化、およびリン酸化である。アセチル化（例えば、Ｎ末端アセチル化）およびアミド化（例えば、Ｃ末端アミド化）の方法は、当業者によく知られている。ポリペプチドの修飾、誘導体、および誘導体化の方法は、公開国際出願WO 2010/014616に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、本明細書に記載の環状ペプチドをコンジュゲートするか、またはそうでなければ共有結合で（例えば、化学的リンカーを使用して）他の分子に結合することができる。結合のかかる形態の１つは、非アミド結合（例えば、ジスルフィド結合）を介する。いくつかの態様において、環状ペプチドは、血清半減期を増強するポリマーに連結される。いくつかの態様において、環状ペプチドは、分子の半減期を増強するのに適切な抗体またはそのドメイン（例えば、Ｆｃドメイン内の１つまたは２以上の定常ドメイン）に、共有的に結合されている（例えば、リンカー分子を介して）。いくつかの態様において、ポリペプチドは、Ｆｃドメインに連結されている（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）。
【００２８】
いくつかの態様において、本明細書に記載の環状ペプチドは、非アミノ酸ポリマーに連結されている。ポリエチレングリコールなどのポリマーを、血清半減期を向上させる目的のために使用することができる。適切なポリマーとしては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、硫酸デキストランを含むデキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖類、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含むセルロースおよびセルロース誘導体、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコールのコポリマーおよびその誘導体、ポリビニルエチルエーテル、およびα，βポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミドなど、またはこれらの混合物が挙げられる。かかるポリマーは、独自の生物活性を有してもよく、有しなくてもよい。ポリマーは、共有的または非共有的に、環状ペプチドにコンジュゲートすることができる。血清半減期を増加させるためのコンジュゲーションの方法は当技術分野で知られており、例えば、米国特許第5,180,816号、第6,423,685号、第6,884,780号、および第7,022,673号、にあり、これらはその全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２９】
いくつかの態様において、環状ペプチドは、治療用分子にコンジュゲートされる。いくつかの態様において、治療用分子は、抗血管新生治療用分子、抗ＶＥＧＦ剤、化学療法剤、または抗炎症剤である。
本明細書に記載の環状ペプチドの様々なバージョン、例えば、本開示に包含される、修飾された、コンジュゲートされた、または誘導体化された環状ペプチドは、環状ペプチドにより示される生物学的活性（例えば本明細書の実施例の節で報告されるなど）の、かなりの量を保持することが予想される。いくつかの態様において、約１００％の活性が、所与のアッセイにおいて保持される。いくつかの態様において、約９０％、８０％、７０％、６０％、または５０％の活性が保持される。かかる活性の１つは、Ｔｓｐ−１の発現を刺激する能力である。発現の刺激とは、本明細書に記載の環状ペプチドの適切な標的細胞との接触から生じる、環状ペプチドと接触していない同一または十分に類似した標的細胞（対照標的細胞）と比較しての、有意な、再現可能な量の発現の増加である。Ｔｓｐ−１の発現誘導活性を決定するための方法は、本明細書に記載されており、また当業者によく知られている。
【００３０】
アミノ酸の略号を、以下に示す。
アラニン、Ａｌａ、Ａ
イソロイシン、Ｉｌｅ、Ｉ
ロイシン、Ｌｅｕ、Ｌ
バリン、Ｖａｌ、Ｖ
フェニルアラニン、Ｐｈｅ、Ｆ
トリプトファン、Ｔｒｐ、Ｗ
チロシン、Ｔｙｒ、Ｙ
アスパラギン、Ａｓｎ、Ｎ
システイン、Ｃｙｓ、Ｃ
グルタミン、Ｇｌｎ、Ｑ
メチオニン、Ｍｅｔ、Ｍ
セリン、Ｓｅｒ、Ｓ
スレオニン、Ｔｈｒ、Ｔ
アスパラギン酸、Ａｓｐ、Ｄ
グルタミン酸、Ｇｌｕ、Ｅ
アルギニン、Ａｒｇ、Ｒ
ヒスチジン、Ｈｉｓ、Ｈ
リシン、Ｌｙｓ、Ｋ
グリシン、Ｇｌｙ、Ｇ
プロリン、Ｐｒｏ、Ｐ
【００３１】
その他の環状ペプチド修飾
本明細書に記載の環状ペプチドの修飾バージョンは、本開示に包含されることが、理解されるべきである。本明細書に記載の環状ペプチドへの修飾は、米国公開出願20080090760および／または米国公開出願20060286636に記載のように実施することができ、これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。以下は、本開示の範囲内に包含される種々の他のペプチド修飾の、非限定的な説明を提供する。
【００３２】
本開示に包含されるのは、本明細書に記載の環状ペプチドの化学的誘導体であるが、ただし非誘導体化環状ペプチドの活性を実質的に保持する限りにおいてである。「化学的誘導体」は、本明細書に記載のペプチド誘導体のサブセットであり、官能側基の反応によって化学的に誘導体化された１または２以上の残基を有する、対象環状ペプチドを指す。化学的誘導体は、側基の誘導体化に加えて、１または２以上の骨格修飾を有することができ、例えば、Ｎ−メチル、Ｎ−エチル、Ｎ−プロピルなどのα−アミノ置換、およびチオエステル、チオアミド、グアニジノなどのα−カルボニル置換が挙げられる。かかる誘導体化分子としては、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するような分子が挙げられる。遊離カルボキシル基は誘導体化されて、塩、メチルおよびエチルエステル、または他の種類のエステルもしくはヒドラジドを形成することができる。遊離ヒドロキシル基は誘導体化されて、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は誘導体化されて、Ｎ−ｉｍ−ベンジルを形成することができる。化学的誘導体としてさらに含まれるのは、２０種の標準アミノ酸の１または２以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドである。化学的誘導体としてさらに含まれるのは、１または２以上の非限定的な、非天然アミノ酸を含有するペプチドであり、例としては、商業的供給業者（例えば、Bachem Catalog, 2004 pp. 1-276）からのペプチド合成のために利用可能なものが挙げられる。例としては：４−ヒドロキシプロリンは、プロリンと置換されてもよく；５−ヒドロキシリシンは、リシンと置換されてもよく；３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンと置換されてもよく；ホモセリンは、セリンと置換されてもよく；オルニチンは、リシンと置換されてもよく；β−アラニンは、アラニンと置換されてもよく；ノルロイシンは、ロイシンと置換されてもよく；フェニルグリシンは、フェニルアラニンと置換されてもよく；および、Ｌ−１，２，３，４−テトラヒドロノルハルマン−３−カルボン酸またはＨ−β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ−ＯＨは、トリプトファンと置換されてもよい。
【００３３】
特定の態様において、ペプチドへの化学修飾としては、限定はされないが、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アミノジアルキル、ハロゲン、ヘテロ原子、炭素環、カルボシクリル、カルボシクロ、炭素環式、アリール、アラルキル、アラルコキシ、アリールオキシアルキル、複素環、ヘテロシクリル、複素環式、ヘテロアリール、および／または脂肪族基の含有が挙げられる。
用語「アルキル」、「アルコキシ」、「ヒドロキシアルキル」、「アルコキシアルキル」、および「アルコキシカルボニル」は、単独でまたはより大きな部分の一部として使用される場合、１〜１２個の炭素原子を含有する直鎖および分枝鎖両方を含む。用語「アルケニル」および「アルキニル」は、単独でまたはより大きな部分の一部として使用される場合、２〜１２個の炭素原子を含有する直鎖および分枝鎖両方を含むものとする。用語「シクロアルキル」は、単独でまたはより大きな部分の一部として使用される場合、完全に飽和されたか、または１もしくは２以上の不飽和単位を含むが、芳香族ではない、環式Ｃ３〜Ｃ１２の炭化水素を含むものとする。低級アルキルは、１〜６個の炭素を含有するアルキル基を指す。
【００３４】
用語「アミノ」は、ＮＨ２基を指す。用語「アルキルアミノ」または「アミノアルキル」は、水素原子の１つがアルキル基で置き換えられているアミノ基を指す。用語「ジアルキルアミノ」または「アミノジアルキル」は、水素原子がアルキル基によって置き換えられているアミノ基を指し、ここでアルキル基は、同一または異なっていてもよい。用語「ハロゲン」は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩを意味する。用語「ヘテロ原子」は、炭素環構造を有する窒素、酸素、または硫黄を意味し、窒素および硫黄の任意の酸化形態、ならびに任意の塩基性窒素の四級化形態を含む。また、用語「窒素」は、複素環の置換可能な窒素を含む。一例として、酸素、硫黄または窒素から選択される０〜３個のヘテロ原子を有する飽和または部分不飽和の環において、窒素は、Ｎ（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロリルにおけるような）、ＮＨ（ピロリジニルにおけるような）、またはＮＲ＋（Ｎ−置換ピロリジニルにおけるような）であってよい。本明細書で使用される用語「炭素環」、「カルボシクリル」、「カルボシクロ」、または「炭素環式」は、３〜１４員を有する脂肪族環系を意味する。用語「炭素環」、「カルボシクリル」、「カルボシクロ」、または「炭素環式」で飽和かまたは部分的に不飽和のものは、任意に置換された環も指す。用語「炭素環」、「カルボシクリル」、「カルボシクロ」、または「炭素環式」はまた、１または２以上の芳香環または非芳香環に縮合している脂肪族環を含み、例えば、デカヒドロナフチルまたはテトラヒドロナフチルにおける場合であり、ここでラジカルまたは結合点は脂肪族環上にある。
【００３５】
用語「アリール」は、単独でまたはより大きな部分の一部として使用される場合、例えば「アラルキル」、「アラルコキシ」、または「アリールオキシアルキル」におけるような場合、６〜１４員を有する芳香環基を指し、例えばフェニル、ベンジル、フェネチル、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントラシルおよび２−アントラシルである。用語「アリール」はまた、任意に置換された環を指す。用語「アリール」は、用語「アリール環」と交換可能に使用されてもよい。「アリール」はまた、芳香環が１または２以上の環に縮合している、縮合多環式芳香環系を含む。例としては、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントラシルおよび２−アントラシルが挙げられる。「アリール」という用語の範囲内にさらに含まれるのは、本明細書中で使用する場合、芳香環が１または２以上の非芳香環に縮合している基、例えば、インダニル、フェナントリジニル、またはテトラヒドロナフチルなどの場合であり、ここでラジカルまたは結合点は芳香環上にある。
【００３６】
本明細書で使用される用語「複素環」、「ヘテロシクリル」、または「複素環式」は、４〜１４員、好ましくは５〜１０員を有する非芳香環系であって、ここで１または２個以上の、好ましくは１〜４個の環炭素がそれぞれ、ヘテロ原子によって置き換えられているものを含む。複素環の例としては、３−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン、（１−置換）−２−オキソ−ベンズイミダゾール−３−イル、２−テトラヒドロ−フラニル、３−テトラヒドロフラニル、２−テトラヒドロピラニル、３−テトラヒドロピラニル、４−テトラヒドロピラニル、［１，３］−ジオキサラニル、［１，３］−ジチオラニル、［１，３］−ジオキサニル、２−テトラヒドロチオフェニル、３−テトラヒドロチオフェニル、２−モルホリニル、３−モルホリニル、４−モルホリニル、２−チオモルホリニル、３−チオモルホリニル、４−チオモルホリニル、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル、４−チアゾリジニル、ジオゾロニル、Ｎ−置換ジオゾロニル、１−フタリミジニル、ベンズオキサニル、ベンゾピロリジニル、ベンゾピペリジニル、ベンズオキソラニル、ベンゾチオラニル、およびベンゾチアニルが挙げられる。本明細書で使用する場合、用語「ヘテロシクリル」または「複素環式」の範囲内にさらに含まれるのは、非芳香族ヘテロ原子含有環が、１または２以上の芳香環または非芳香環に縮合している基であり、例えば、インドリニル、クロマニル、フェナントリジニル、またはテトラヒドロキノリニルにおける場合であり、ここでラジカルまたは結合点は、非芳香族ヘテロ原子含有環上にある。用語「複素環」、「ヘテロシクリル」、または「複素環式」は、飽和もしくは部分的不飽和であっても、任意に置換された環も指す。
【００３７】
用語「ヘテロアリール」は、単独でまたはより大きな部分の一部として使用される場合、例えば「ヘテロアラルキル」または「ヘテロアリールアルコキシ」におけるような場合、５〜１４員を有する複素芳香環基を指す。ヘテロアリール環の例としては、２−フラニル、３−フラニル、３−フラザニル、Ｎ−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、５−イミダゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−オキサジアゾリル、５−オキサジアゾリル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、１−ピラゾリル、２−ピラゾリル、３−ピラゾリル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ピリミジル、３−ピリダジニル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、５−テトラゾリル、２−トリアゾリル、５−トリアゾリル、２−チエニル、３−チエニル、カルバゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、インドリル、キノリニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイミダゾリル、イソキノリニル、インダゾリル、イソインドリル、アクリジニル、およびベンゾイソオキサゾリルが挙げられる。本明細書で使用する場合、用語「ヘテロアリール」の範囲内にさらに含まれるのは、複素芳香環が１または２以上の芳香環または非芳香環に縮合している基であって、ここでラジカルまたは結合点が複素芳香環上にあるものである。例としては、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、およびピリド［３，４−ｄ］ピリミジニルが挙げられる。用語「ヘテロアリール」はまた、任意に置換された環も指す。用語「ヘテロアリール」は、用語「ヘテロアリール環」または用語「複素芳香族」と交換可能に使用されてよい。
【００３８】
アリール（アラルキル、アラルコキシ、アリールオキシアルキルなどを含む）基またはヘテロアリール（ヘテロアラルキルおよびヘテロアリールアルコキシなどを含む）基は、１または２以上の置換基を含んでいてもよい。アリール、ヘテロアリール、アラルキル、またはヘテロアラルキル基の任意の不飽和炭素原子上の適切な置換基の例としては、ハロゲン、−−Ｒ０、−−ＯＲ０、−−ＳＲ０、１，２−メチレンジオキシ、１，２−エチレンジオキシ、保護ＯＨ（アシルオキシなど）、フェニル（Ｐｈ）、置換Ｐｈ、−−Ｏ（Ｐｈ）、置換−−Ｏ（Ｐｈ）、−−ＣＨ２（Ｐｈ）、置換−−ＣＨ２（Ｐｈ）、ＣＨ２ＣＨ２（Ｐｈ）、置換−−ＣＨ２ＣＨ２（Ｐｈ）、−−ＮＯ２、−−ＣＮ、−−Ｎ（Ｒ０）２、−−ＮＲ０Ｃ（Ｏ）Ｒ０、ＮＲ０Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ０）２、ＮＲ０ＣＯ２Ｒ０、−−ＮＲ０ＮＲ０Ｃ（Ｏ）Ｒ０、−−ＮＲ０ＮＲ０Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ０）２、−−ＮＲ０ＮＲ０Ｃ２Ｒ０、Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ０、Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ０、−−ＣＯ２Ｒ０、−−Ｃ（Ｏ）Ｒ０、−−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ０）２、−−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ０）２、Ｓ（Ｏ）２Ｒ０、−−ＳＯ２Ｎ（Ｒ０）２、−−Ｓ（Ｏ）Ｒ０、−−ＮＲ０ＳＯ２Ｎ（Ｒ０）２、−−ＮＲ０ＳＯ２Ｒ０、−−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒ０）２、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｒ０）２、（ＣＨ２）ｙＮＨＣ（Ｏ）Ｒ０、および−−（ＣＨ２）ｙＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ（Ｖ−−Ｒ０）（Ｒ０）が挙げられ；式中、各Ｒ０は、独立して、水素、置換もしくは非置換脂肪族基、非置換ヘテロアリールまたは複素環、フェニル（Ｐｈ）、置換Ｐｈ、Ｏ（Ｐｈ）、置換−−Ｏ（Ｐｈ）、−−ＣＨ２（Ｐｈ）、または置換−−ＣＨ２（Ｐｈ）から選択され；ｙは０〜６であり；およびＶはリンカー基である。Ｒ０の脂肪族基またはフェニル環上の置換基の例としては、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノカルボニル、ハロゲン、アルキル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルオキシ、ジアルキルアミノカルボニルオキシ、アルコキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ヒドロキシ、ハロアルコキシ、およびハロアルキルが挙げられる。
【００３９】
脂肪族基、または非芳香族複素環、または縮合アリールもしくはヘテロアリール環は、１または２以上の置換基を含んでいてもよい。脂肪族基、または非芳香族複素環、または縮合アリールもしくはヘテロアリール環の任意の飽和炭素上の好適な置換基の例としては、アリールまたはヘテロアリール基の不飽和炭素について上に列挙されたもの、および以下が挙げられる：＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮＨＲ＊、＝ＮＮ（Ｒ＊）２、＝Ｎ−、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）Ｒ＊、＝ＮＮＨＣＯ２（アルキル）、＝ＮＮＨＳＯ２（アルキル）、または＝ＮＲ＊、式中、各Ｒ＊は独立して、水素、非置換脂肪族基、または置換脂肪族基から選択される。脂肪族基上の置換基の例としては、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノカルボニル、ハロゲン、アルキル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルオキシ、ジアルキルアミノカルボニルオキシ、アルコキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ヒドロキシ、ハロアルコキシ、およびハロアルキルが挙げられる。
【００４０】
非芳香族複素環の窒素上の適切な置換基としては、Ｒ＋、−−Ｎ（Ｒ＋）２、−−Ｃ（Ｏ）Ｒ＋、−−ＣＯ２Ｒ＋、−−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ＋、−−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ＋、−−ＳＯ２Ｒ＋、−−ＳＯ２Ｎ（Ｒ＋）２、Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒ＋）２、−−Ｃ（＝ＮＨ）−−Ｎ（Ｒ＋）２、および−−ＮＲ＋ＳＯ２＋が挙げられ；式中、各Ｒ＋は、独立して、水素、脂肪族基、置換脂肪族基、フェニル（Ｐｈ）、置換Ｐｈ、−−Ｏ（Ｐｈ）、置換−−Ｏ（Ｐｈ）、−−ＣＨ２（Ｐｈ）、置換−−ＣＨ２（Ｐｈ）、または非置換のヘテロアリールもしくは複素環から選択される。脂肪族基またはフェニル環上の置換基の例としては、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノカルボニル、ハロゲン、アルキル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルオキシ、ジアルキルアミノカルボニルオキシ、アルコキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ヒドロキシ、ハロアルコキシ、およびハロアルキルが挙げられる。
【００４１】
特定の態様において、本明細書に記載のペプチドモノマーは、少なくとも１つのリンカー部分への共有結合によって二量体化または多量体化されている。リンカー部分は好ましくは、Ｃ１〜１２連結部分であって、１または２の−−ＮＨ−−結合で任意に終結され、１または２個以上の利用可能な炭素原子において低級アルキル置換基で任意に置換されたものであるが、ただし必ずしもそうでなくてもよい。好ましくは、リンカーは、−−ＮＨ−−Ｒ−−ＮＨ−−を含み、この式中、Ｒは、別の分子部分（例えば、ペプチド合成中の固体支持体の表面上またはＰＥＧなどの薬物動態改質剤に存在することができるようなもの）への結合を可能にする、カルボキシル基またはアミノ基などの官能基で置換された低級（Ｃ１〜６）アルキレンである。特定の態様において、リンカーは、リシン残基である。特定の他の態様において、リンカーは、各モノマーのＣ末端アミノ酸に同時に結合することによって、２つのペプチドモノマーのＣ末端を架橋する。他の態様において、リンカーは、Ｃ末端においてではないアミノ酸の側鎖に結合することによって、ペプチドを架橋する。リンカーが、ペプチドのＣ末端におけるものではないアミノ酸の側鎖に結合する場合、側鎖は好ましくは、リシンに見出されるようなアミンを含み、リンカーは、ペプチドとアミド結合を形成することのできる、２または３以上のカルボキシ基を含む。
【００４２】
本開示のペプチドモノマーは、ビオチン／ストレプトアビジン系を用いてオリゴマー化されてもよい。オリゴマー化は、本明細書に記載のペプチドの１または２以上の活性を増強することができる。ペプチドモノマーのビオチン化類似体は、当業者に知られている標準的な技術によって合成することができる。例えば、ペプチドモノマーは、Ｃ末端でビオチン化することができる。これらのビオチン化モノマーは、次いで、ストレプトアビジンとのインキュベーション（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはＨＥＰＥＳ緩衝ＲＰＭＩ培地（Invitrogen）中、４：１のモル比および室温で１時間）によって、オリゴマー化される。この方法の変形では、ビオチン化ペプチドモノマーは、多数の市販の抗ビオチン抗体のいずれかとインキュベートすることによって、オリゴマー化されてもよい［例えば、Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. (Washington, D.C.)からのヤギ抗ビオチンＩｇＧ］。
【００４３】
いくつかの側面において、本明細書に記載の環状ペプチドは、物理的に直列に連結されて、ポリマーを形成することができる。かかるポリマーを構成する環状ペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに離間することができる。有用なリンカーペプチドの例としては、これらに限定されないが、グリシン−セリンおよびグリシン−アラニンポリマーを含むグリシンポリマー（（Ｇ）ｎ）が挙げられる（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ反復、ここで、ｎ＝１〜８（配列番号８）、好ましくは、ｎ＝３、４、５、または６）。本明細書に記載の環状ペプチドはまた、化学結合の結合によって、例えばジスルフィド結合または化学的架橋による結合によって、接合することができる。当業者によく知られている分子生物学的技術を使用して、環状ペプチドのポリマーを作成することができる。本開示のペプチド配列はまた、非ペプチド架橋剤（Pierce 2003-2004 Applications Handbook and Catalog, Chapter 6）、または他の足場、例えばＨＰＭＡ、ポリデキストラン、多糖類、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、糖、および糖アルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール）を使用して、一緒に連結することができる。
【００４４】
いくつかの態様において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、リンカーとして機能することができる。さらに別の態様において、リンカー部分は、２つのカルボン酸を含有し、かつ１または２以上の利用可能な原子において追加の官能基、例えば１または２以上のＰＥＧ分子に結合することができるアミンなどと任意に置換される分子を、含んでよい。かかる分子は、−−ＣＯ−−（ＣＨ２）ｎ−ｕＸ−−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−−で表すことができ、式中、ｎは、０〜１０の間の整数であり、ｍは、１〜１０の間の整数であり、Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＣＨ２）ｐＮＲ１、ＮＣＯ（ＣＨ２）ｐＮＲ１、およびＣＨＮＲ１から選択され、Ｒ１は、Ｈ、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）、Ｃｂｚから選択され、ｐは、１〜１０の間の整数である。特定の態様において、各ペプチドの１つのアミノ基は、リンカーとアミド結合を形成する。任意に、リンカーは、脂肪酸、ホーミングペプチド、輸送剤、細胞浸透剤、器官標的化剤、またはキレート剤などの好適に活性化された薬物動態（ＰＫ）改質剤を用いて誘導体化されることが可能な、１または２以上の反応性アミン含む。
【００４５】
本明細書に記載の環状ペプチドはさらに、１または２以上の水溶性ポリマー部分を含んでよい。いくつかの態様において、これらのポリマーは、本開示の環状ペプチドに共有結合している。いくつかの態様において、最終生成調製物の治療的使用のために、ポリマーは、薬学的に許容し得る。当業者は、ポリマー−ペプチドコンジュゲートが治療的に使用されるかどうか、そしてもしそうであれば、所望の用量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性、およびその他の考慮事項などの考慮事項に基づき、所望のポリマーを選択することができるであろう。水溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、およびポリオキシエチル化ポリオールであってよい。好ましい水溶性ポリマーは、ＰＥＧである。
【００４６】
ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝または非分枝であってよい。本開示で使用するのに好ましいＰＥＧは、約５キロダルトン（ｋＤａ）から約６０ｋＤａの分子量を有する、直鎖状、非分枝状のＰＥＧである（用語「約」は、ＰＥＧの製剤中、一部の分子は示された分子量より多い重量、および一部はこれより少ない重量であることを示す）。より好ましくは、ＰＥＧは、約１０ｋＤａから約４０ｋＤａの分子量を有し、さらにより好ましくは、ＰＥＧは、２０〜３０ｋＤａの分子量を有する。他のサイズも、所望の治療プロファイル（例えば、所望の持続放出の持続時間；もしあれば生物学的活性に対する効果；取り扱いの容易さ；抗原性の程度または欠如；および、当業者に知られている治療ペプチドに対する、ＰＥＧの他の効果）に応じて用いてよい。
【００４７】
結合したポリマー分子の数は、変化し得る；例えば、１、２、３または４以上の水溶性ポリマーが、本開示のペプチドに結合することができる。複数の結合したポリマーは、同一または異なる化学部分であってよい（例えば、異なる分子量のＰＥＧ）。
当技術分野で知られているペプチドを安定化するための方法を、本明細書に記載の方法および組成物に使用することができる。例えば、Ｄ−アミノ酸を使用し、ペプチド骨格のための還元アミド結合を使用して、および側鎖を連結する非ペプチド結合を使用して、例えばこれに限定はされないが、ピロリノンおよび糖模倣体は、それぞれ安定化を提供することができる。糖足場ペプチド模倣体の設計および合成は、Hirschmann et al.（J. Med. Chem., 1996, 36, 2441-2448, その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されている。さらに、ピロリノンベースのペプチド模倣体は、改善された生物学的利用能特性を有する安定した背景にペプチドファルマコフォアを提示する（例えば、Smith et al., J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 11037-11038を参照）、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４８】
本明細書中に包含されるのは、本明細書中に記載の環状のコンジュゲートである。これらのペプチドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に加えて、他のポリマーにコンジュゲートすることができる。ポリマーは、独自の生物活性を有してもよく、有しなくてもよい。ポリマーコンジュゲーションのさらなる例としては、限定はされないが、以下のようなポリマーが挙げられる：ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、硫酸デキストランを含むデキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖類、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含むセルロースおよびセルロース誘導体、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコールのコポリマーおよびその誘導体、ポリビニルエチルエーテル、およびα，β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミドなど、またはこれらの混合物。ポリマーへのコンジュゲーションは、他の効果のうち、血清半減期を向上させることができる。様々なキレート剤を、本明細書に記載のペプチドをコンジュゲートするために使用することができる。これらのキレート剤としては、限定はされないが、以下を含む：エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミノ五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレングリコール−０，０’−ビス（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＨＢＥＤ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロトリデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＴＩＴＲＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＴＥＴＡ）、および１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（ＴＥＴＲＡ）。コンジュゲーションの方法はよく知られており、例えば、P. E. Thorpe, et. al, 1978, Nature 271, 752-755；Harokopakis E., et. al., 1995, Journal of Immunological Methods, 185:31-42；S. F. Atkinson, et. al., 2001, J. Biol. Chem., 276:27930-27935；ならびに米国特許第5,601,825号、第5,180,816号、第6,423,685号、第6,706,252号、第6,884,780号、および第7,022,673号にあり、これらはその全体が本明細書中に参照により組み込まれる。
【００４９】
遺伝的にコードされたアミノ酸（または立体異性Ｄアミノ酸）の天然側鎖を、他の側鎖で、例えば、次のような基：アルキル、低級（Ｃ１〜６）アルキル、環状４−、５−、６−から７員アルキル、アミド、アミド低級アルキルアミド、ジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびそれらの低級エステル誘導体、ならびに４−、５−、６−、から７員ヘテロ環で、置き換えることができる。特に、プロリン類似体であって、プロリン残基の環の大きさが、５員から４、６、または７員に変更されたものを使用することができる。環状基は、飽和または不飽和であることができ、不飽和の場合、芳香族または非芳香族であることができる。複素環基は、好ましくは、１または２個以上の窒素、酸素および／または硫黄ヘテロ原子を含む。かかる基の例としては、フラザニル、フリル、イミダゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、モルホリニル（例えばモルホリノ）、オキサゾリル、ピペラジニル（例えば、１−ピペラジニル）、ピペリジル（例えば１−ピペリジル、ピペリジノ）、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル（例えば、１−ピロリジニル）、ピロリニル、ピロリル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、チオモルホリニル（例えば、チオモルホリノ）、およびトリアゾリル基が挙げられる。これらの複素環基は、置換または非置換であることができる。基が置換されている場合、置換基は、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、酸素、または置換もしくは非置換のフェニルであることができる。
ペプチドをリン酸化、または他の方法によって、容易に修飾することもできる（例えば、Hruby, et al. (1990) Biochem J. 268:249-262に記載のようにして）。
【００５０】
処置
開示の側面は、がんを有する対象を処置するための方法に関する。いくつかの態様において、方法は、がんを有する対象に対して、本明細書に記載の環状Ｐｓａｐペプチドを投与することを含む。いくつかの態様において、環状ペプチドは、アミノ酸配列ＤＷＬＰＫ（配列番号１）、ｄＷＬＰＫ（配列番号３、小文字ｄはＤ−アミノ酸を示す）、ＤＷＧＰＫ（配列番号２）、またはｄＷＧＰＫ（配列番号４、小文字ｄはＤ−アミノ酸を示す）を含む。いくつかの態様において、環状ペプチドのアミノ酸配列は、ＤＷＬＰＫ（配列番号１）、ｄＷＬＰＫ（配列番号３、小文字ｄはＤ−アミノ酸を示す）、ＤＷＧＰＫ（配列番号２）、またはｄＷＧＰＫ（配列番号４、小文字ｄはＤ−アミノ酸を示す）である。いくつかの態様において、環状ペプチドは、アミノ酸配列ＤＷＬＰＫ（配列番号１）を含む。いくつかの態様において、環状ペプチドのアミノ酸配列は、ＤＷＬＰＫ（配列番号１）である。
【００５１】
本開示の他の側面は、がんを有する対象を処置するための、組成物および医薬の製造における組成物の使用に関する。いくつかの態様において、組成物は、本明細書に記載の環状Ｐｓａｐペプチド、例えば、アミノ酸配列ＤＷＬＰＫ（配列番号１）を有する環状ペプチドを含む。
本明細書で使用する場合、がんを「処置する」または「処置」とは、限定はされないが、がんの発症を予防する、低減する、または停止させる、がんの症状を軽減する、または除去する、がんの増殖を抑制する、または阻害する、既存のがんの転移および／または浸潤を、予防する、または低減する、がんの退縮を促進する、または誘導する、がん細胞の増殖を阻害する、または抑制する、血管新生を低減する、および／またはアポトーシスがん細胞の量を増加させることが挙げられる。
【００５２】
本開示の他の側面は、炎症性疾患または障害を有する対象を処置するための方法に関する。いくつかの態様において、炎症性疾患または障害は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、例えばクローン病である。いくつかの態様において、方法は、炎症性疾患または障害（例えば、クローン病）を有する対象に対して、本明細書に記載の環状Ｐｓａｐペプチドを投与することを含む。いくつかの態様において、環状ペプチドは、アミノ酸配列ＤＷＬＰＫ（配列番号１）、ｄＷＬＰＫ（配列番号３、小文字ｄはＤ−アミノ酸を示す）、ＤＷＧＰＫ（配列番号２）、またはｄＷＧＰＫ（配列番号４、小文字ｄはＤ−アミノ酸を示す）を含む。いくつかの態様において、環状ペプチドのアミノ酸配列は、ＤＷＬＰＫ（配列番号１）、ｄＷＬＰＫ（配列番号３、小文字ｄはＤ−アミノ酸を示す）、ＤＷＧＰＫ（配列番号２）、またはｄＷＧＰＫ（配列番号４、小文字ｄはＤ−アミノ酸を示す）である。いくつかの態様において、環状ペプチドは、アミノ酸配列ＤＷＬＰＫ（配列番号１）を含む。いくつかの態様において、環状ペプチドのアミノ酸配列は、ＤＷＬＰＫ（配列番号１）である。
【００５３】
本開示の他の側面は、炎症性疾患または障害、例えばクローン病を有する対象を処置するための、組成物および、医薬の製造における組成物の使用に関する。いくつかの態様において、組成物は、本明細書に記載の環状Ｐｓａｐペプチド、例えばアミノ酸配列ＤＷＬＰＫ（配列番号１）を有する環状ペプチドを含む。
本明細書で使用する場合、炎症性疾患または障害を「処置する」または「処置」とは、限定はされないが、炎症性疾患または障害の発症を予防する、低減する、または停止させる、あるいは炎症性疾患または障害の症状を軽減する、または除去することが挙げられる。
【００５４】
有効量は、医学的に望ましい結果、例えばがんまたは炎症性疾患もしくは障害の処置などを提供するのに十分な、環状Ｐｓａｐペプチドの投与量である。有効量は、処置される特定の疾患または障害、処置される対象の年齢および健康状態、状態の重症度、処置の期間、任意の併用療法の性質、投与の特定の経路、および医師の知識と経験の範囲内の類似の要因などに応じて、変化するであろう。ヒトなどの対象への投与のために、約０．００１、０．０１、０．１、または１ｍｇ／ｋｇから、５０、１００、１５０、または５００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の投与量を、一般的に使用することができる。
【００５５】
いくつかの態様において、有効量は、対象に毒性を生じない、環状Ｐｓａｐペプチドの投与量である。いくつかの態様において、有効量は、直鎖Ｐｓａｐペプチドと比較して、対象に低減された毒性を引き起こす、環状Ｐｓａｐペプチドの投与量である。本明細書で使用する場合、用語「無毒性」または「低減された毒性」は、環状Ｐｓａｐペプチドが、投与された対象または、対象の細胞、組織もしくは臓器において、１または２以上の有害反応の発生を誘発しないか、またはその程度を低減することを示す。例えば、本明細書に記載の環状Ｐｓａｐペプチドは、器官もしくは器官系の機能障害を引き起こさないか、または細胞死をもたらさない。例えば、環状Ｐｓａｐペプチドは腎毒性ではなく、脾臓に毒性でなく、および／また肝毒性ではない。毒性を測定するための方法は、当技術分野で知られている（例えば、肝臓、脾臓、および／または腎臓の生検／組織学；肝臓毒性に対するアラニントランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼおよびビリルビンアッセイ；および腎臓毒性に対するクレアチニンレベル）。
【００５６】
環状Ｐｓａｐペプチドおよびその組成物は、全身、局所または局部的な投与を含む、種々な投与様式のために製剤化することができる。種々の投与経路が利用可能である。選択された特定の様式は、処置されるがんの種類、および治療効果のために必要な投与量に依存するであろう。本開示の方法は、一般的には、医学的に許容し得る任意の投与様式を用いて実施することができ、これは、臨床的に容認できない副作用を引き起こすことなく、活性化合物の有効レベルを生じさせる任意の様式を意味する。かかる投与様式としては、限定することなく、経口、直腸、局所、経鼻、皮内、または非経口の経路を含む。用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、または注入を含む。本明細書に記載の医薬組成物はまた、腫瘍内、腫瘍周辺、病変内または病変部周辺の経路によって投与されて、局所的ならびに全身的効果を発揮する。
【００５７】
技術および処方は、一般に、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Pharmaceutical Press; 22nd editionおよび他の類似の参考文献に見出すことができる。投与された場合、Ｐｓａｐペプチドは、薬学的に許容し得る量で、薬学的に許容し得る組成物中で適用することができる。医薬組成物および薬学的に許容し得る担体は、本明細書に記載されている。かかる製剤は、日常的に、塩、緩衝剤、保存剤、適合性担体、および任意に他の治療剤を含有してもよい。医薬において使用される場合、塩は、薬学的に許容し得るべきであるが、薬学的に許容し得ない塩も好都合に、その薬学的に許容し得る塩を調製するために使用されてもよく、本開示の範囲から排除するものではない。かかる薬理学的および薬学的に許容し得る塩としては、限定はされないが、以下の酸から調製されるものが挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。また、薬学的に許容し得る塩は、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などの、アルカリ金属またはアルカリ土類塩として調製することができる。
【００５８】
いくつかの態様において、環状Ｐｓａｐペプチドによる処置は、化学療法剤、放射線、細胞増殖抑制剤、抗ＶＥＧＦ剤、抗血管新生因子、ｐ５３再活性剤、および／またはがんの手術、炎症性疾患または障害のための抗炎症剤などの、別の療法と組み合わせることができる。
いくつかの態様において、環状Ｐｓａｐペプチド（例えば、ＤＷＬＰＫ（配列番号１））を使用して、必要とする対象においてＴｓｐＰ−１の発現を刺激することができる。いくつかの態様において、方法は、対象に対して、ＴｓｐＰ−１の発現を刺激するための環状Ｐｓａｐペプチドの有効量を、投与することを含む。
【００５９】
組成物および薬学的に許容し得る担体
本開示の他の側面は、本明細書に記載の環状Ｐｓａｐペプチドを含む組成物に関する。いくつかの態様において、組成物は、医薬組成物である。いくつかの態様において、組成物は、本明細書に記載の環状Ｐｓａｐペプチドおよび薬学的に許容し得る担体を含む。いくつかの態様において、組成物は、がんまたは炎症性疾患もしくは障害の処置に使用するためのものである。いくつかの態様において、組成物は、必要とする対象においてＴｓｐ−１を刺激するのに使用するためのものである。いくつかの態様において、組成物は、追加の薬剤、例えば、化学療法剤、細胞増殖抑制剤、抗ＶＥＧＦ剤、抗血管新生因子、ｐ５３再活性剤、および／または抗炎症剤を含む。
【００６０】
本明細書で使用する用語「薬学的に許容し得る担体」は、１または２以上の、適合性の固体または液体の増量剤、希釈剤、または封入物質であって、ヒトなどの対象への投与に適しているものを意味する。薬学的に許容し得る担体は、製剤の他の成分と適合性であり、対象の組織に有害ではない（例えば、生理学的に適合性、滅菌、生理学的ｐＨ値など）という意味で、「許容し得る」。「担体」という用語は、活性成分と組み合わされて適用を容易にする、天然または合成の、有機または無機成分を意味する。医薬組成物の成分はまた、本開示の分子と、および互いに、所望の薬学的有効性を実質的に損なう相互作用がないような様式で、共混入されることができる。薬学的に許容し得る担体として機能できる材料のいくつかの例としては、以下が挙げられる：（１）糖類、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロースおよび酢酸セルロース；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク；（８）賦形剤、例えばカカオバターおよび坐薬ワックス；（９）油、例えば落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油；（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；（１２）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質非含有水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）増量剤、例えばポリペプチドおよびアミノ酸；（２３）血清成分、例えば血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬ；（２２）Ｃ２〜Ｃ１２アルコール、例えばエタノール；および（２３）医薬製剤に用いられる他の非毒性適合性物質。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、香料剤、保存剤および酸化防止剤もまた、製剤中に存在することができる。
【００６１】
医薬組成物は、好都合には単位剤形で提供することができ、薬学の分野で知られている方法のいずれかによって調製することができる。本開示の医薬組成物に関連して使用される用語「単位用量」は、対象に対する単位投薬量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な希釈剤、すなわち、担体、またはビヒクルとの関連で所望の治療効果を生じるように計算された、活性物質の所定量を含む。
【００６２】
医薬組成物の製剤化は、投与経路に依存してもよい。非経口投与または腫瘍内、腫瘍周辺、病変内または病変部周辺の投与に適した注射剤は、例えば、滅菌の注射用水性または油性懸濁液を含み、既知の技術に従って、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて製剤化することができる。滅菌の注射用製剤はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の、滅菌注射溶液、懸濁液またはエマルジョンであってもよく、例えば、１，３−プロパンジオールまたは１，３−ブタンジオール中の溶液である。使用可能な許容し得るビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌の固定油は、溶媒または懸濁媒体として従来から使用されている。この目的のために、任意の無刺激性の固定油を使用してよく、合成モノ−またはジ−グリセリドを含む。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製に用途を見出す。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過により、または滅菌剤を組み込むことにより滅菌固体組成物の形態で、滅菌することができ、後者は、使用前に滅菌水または他の滅菌注射媒体に溶解または分散することができる。
【００６３】
局所投与のために、医薬組成物は、当技術分野で一般に知られているように、軟膏、膏薬、ゲル剤、またはクリーム剤に製剤化することができる。局所投与には、当分野で知られている経皮送達システムを利用することができる。例としては、皮膚パッチである。
経口投与に適した組成物は、それぞれが抗炎症剤の所定量を含む、カプセル剤、錠剤、トローチ剤などの各個別の単位として提供することができる。他の組成物としては、シロップ、エリキシルまたはエマルジョンなどの、水性液体または非水性液体中の懸濁液が挙げられる。
【００６４】
他の送達システムとしては、時間放出、遅延放出または持続放出送達システムを含むことができる。かかるシステムは、抗炎症薬の反復投与を回避することができ、対象および医師の利便性を増加させる。多くの種類の放出送達システムが利用可能であり、当業者に知られている。それらはポリマーベースのシステムを含み、例えばポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ無水物などである。薬物を含む前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許5,075,109に記載されている。送達システムはまた、非ポリマーシステムを含み、これらは以下である：コレステロールなどのステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸またはモノ−、ジ−およびトリ−グリセリドなどの中性脂肪を含む、脂質；ヒドロゲル放出システム；シラスティックシステム；ペプチドベースのシステム；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤；部分的に融合されたインプラント；など。具体的な例としては、限定はされないが、以下が挙げられる：（ａ）抗炎症剤がマトリックス内の形で含まれている侵食システム、例えば、米国特許第4,452,775号、第4,667,014号、第4,748,034号および第5,239,660号に記載されたものなど、および（ｂ）活性成分がポリマーから制御された速度で浸透する拡散システム、例えば、米国特許第3,832,253号および第3,854,480号に記載されたものなど。さらに、ポンプベースのハードウェア送達システムも使用することができ、そのいくつかは移植に適合されている。
【００６５】
長期持続放出インプラントの使用は、慢性状態の処置に特に適切であり得る。長期放出とは、本明細書中で使用する場合、インプラントが、活性成分の治療レベルを少なくとも３０日間、好ましくは６０日間、送達するように構築され配置されていることを意味する。長期持続放出インプラントは当業者によく知られており、上述した放出システムのいくつかを含む。
いくつかの態様において、治療的投与のために使用される医薬組成物は、滅菌でなければならない。滅菌性は、滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロン膜）を通して濾過することによって、容易に達成される。代替的に、保存剤を使用して、微生物の増殖または作用を防止することができる。様々な保存剤が知られており、例えば、フェノールおよびアスコルビン酸である。環状Ｐｓａｐペプチドおよび／または医薬組成物は、熱および酸化的変性に対して非常に安定である場合、通常は凍結乾燥形態または水溶液として保存されるであろう。製剤のｐＨは、典型的には約６〜８であり、ただし、これより高いかまたはより低いｐＨ値も、特定の場合に適切であり得る。
【００６６】
対象
本開示の側面は、がんを有するヒトなどの対象、およびかかる対象を処置する方法に関する。がんは、良性または悪性であることができ、これは転移していても、転移していなくてもよい。任意の種類のがんが本明細書において意図され、これには、限定はされないが、白血病、リンパ腫、骨髄腫、がん腫、転移性がん腫、肉腫、腺腫、神経系のがんおよび尿生殖器がんを含む。例示的ながんの種類としては、限定はされないが、以下が挙げられる：成人および小児の急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、肛門がん、虫垂のがん、星状細胞腫、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨肉腫、線維性組織球腫、脳がん、脳幹神経膠腫、小脳星細胞腫、悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視床下部神経膠腫、乳がん、男性乳がん、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、原因不明のがん、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、悪性神経膠腫、子宮頸がん、小児がん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸直腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、ユーイングファミリー腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢がん、胃がん、消化管間質腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、ヘアリーセル白血病、
【００６７】
頭頸部がん、肝細胞がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、視床下部および視覚経路の神経膠腫、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん、腎細胞がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、原発性中枢神経系リンパ腫、ヴァルデンストレーム型マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、髄芽細胞腫、黒色腫、メルケル細胞がん、悪性中皮腫、扁平上皮頸部がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、口腔咽頭がん、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体がん、形質細胞腫瘍、胸膜肺芽細胞腫、前立腺がん、直腸がん、横紋筋肉腫、唾液腺がん、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非黒色腫皮膚がん、小腸がん、扁平上皮がん、扁平上皮頸部がん、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣がん、咽喉がん、胸腺腫および胸腺がん、甲状腺がん、移行上皮がん、絨毛性腫瘍、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣のがん、外陰部がん、またはウィルムス腫瘍。いくつかの態様において、がんは、黒色腫または卵巣がんである。
【００６８】
がんを有する対象は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて同定することができる（例えば、血液検査、組織学、ＣＴスキャン、Ｘ線、ＭＲＩ、身体検査、細胞遺伝学分析、尿検査、または遺伝子検査）。がんを有する疑いのある対象は、疾患の１または２以上の症状を示す可能性がある。がんの徴候および症状は、当業者に知られている。いくつかの例示的な臨床検査としては、限定はされないが、がんバイオマーカーのテスト、例えば、乳がんのためのがん抗原（ＣＡ）１５−３、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）およびＨＥＲ−２、子宮頸がんのためのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６およびＥ７がんタンパク質、肝細胞がん（ＨＣＣ）のためのα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＡＦＰ画分Ｌ３、Ｐ４／５および＋ＩＩバンド、および肝細胞がん（ＨＣＣ）のための超音波検査、前立腺がんのための前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、および卵巣がんおよびＨＣＣのための血清ＣＡ−１２５が挙げられる。
【００６９】
本開示の他の側面は、炎症性疾患または障害を有するヒトなどの対象、およびかかる対象を処置する方法に関する。例示的な炎症性疾患または障害としては、限定はされないが、以下が挙げられる：関節リウマチ、黄斑変性症（例えば、加齢性黄斑変性、ＡＭＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ、例えばクローン病または潰瘍性大腸炎）、乾癬、アテローム性動脈硬化症、全身性エリテマトーデス、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック病−皮膚炎、慢性疲労症候群、免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集疾患、クレスト症候群、Degos病、皮膚筋炎、皮膚筋炎−若年性、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）、若年性関節炎、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡尋常性、悪性貧血、結節性多発動脈炎、軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症。いくつかの態様において、炎症性疾患または障害は、関節リウマチ、黄斑変性症（例えば、加齢性黄斑変性、ＡＭＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ、例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）、乾癬、またはアテローム性動脈硬化症である。
【００７０】
炎症性疾患または障害を有する対象は、当分野で知られている任意の方法（例えば、血液検査、身体検査、ＣＴスキャン、またはＭＲＩ）を用いて同定され得る。炎症性疾患または障害を有することが疑われる対象は、疾患または障害の１または２以上の症状を示す可能性がある。炎症性疾患または障害の徴候および症状は、当業者によく知られている。
いくつかの態様において、炎症性疾患または障害は、クローン病などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。ＩＢＤ、例えばクローン病を有する対象は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて同定され得る（例えば、血液検査、身体検査、便潜血検査、大腸内視鏡検査、フレキシブルＳ状結腸鏡検査、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、カプセル内視鏡検査、ダブルバルーン内視鏡検査、小腸画像診断、またはバリウム注腸）。ＩＢＤを有することが疑われる対象は、疾患の１または２以上の症状を示す可能性がある。ＩＢＤの徴候および症状は、当業者によく知られている。
【実施例】
【００７１】
例１
ペプチドの環式バージョンＤＷＬＰＫ（配列番号１）、ｄＷＬＰＫ（配列番号３）、ＤＷＧＰＫ（配列番号２）、およびｄＷＧＰＫ（配列番号４）を、当分野で知られている方法に従って合成し（小文字ｄはＤ−アミノ酸を示す）、直鎖ペプチドｄＷｌＰ（配列番号５、小文字のｄおよびｌはＤ−アミノ酸を示す）と比較した。
細胞を培養し、４μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌの各ペプチドに接触させ、トロンボスポンジン１（Ｔｓｐ−１）活性化のレベルを、ウエスタンブロットによって測定した。Ｔｓｐ−１は、サポシンＡタンパク質によって活性化されることが、以前に示されている。図２は、環状ペプチドＤＷＬＰＫ（配列番号１）が、Ｔｓｐ−１のレベルを高めるのに最も効果的であり、ｄＷＧＰＫ（配列番号４）がその次に効果的であり、ｄＷＬＰＫ（配列番号３）およびＤＷＧＰＫ（配列番号２）が、最も効果的ではなかったことを示す。これは驚くべきことであり、なぜならば、これらのペプチドの直鎖バージョンでの同様の試験では、直鎖ＤＷＧＰＫ（配列番号２）が直鎖ＤＷＬＰＫ（配列番号１）よりも効果的であることが示されたからである。
【００７２】
環状ペプチドＤＷＬＰＫ（配列番号１）を、次に、ヒト血漿中での安定性について、直鎖ペプチドｄＷｌＰ（配列番号５）と比較して試験した。各ペプチドは、ヒト血漿中３７℃で、２、４、８、または２４時間インキュベートした。環状ペプチドは、Ｔｓｐ−１を活性化する能力を、血漿中での２４時間のインキュベーション後にも保持することが見出された（図３）。直鎖ペプチドは、Ｄ−アミノ酸置換により分解に対して安定化されているにもかかわらず、有意に低い活性を２４時間後に有した。
環状ペプチドｄＷＧＰＫ（配列番号４）を、黒色腫のマウスモデルにおいて試験した。黒色腫モデルでは、５×１０５のＢ１６−ＢＬ６黒色腫細胞を、同系のＣ５７ＢＬ６マウスに注射した。マウスはその後、環状ペプチドまたは直鎖ｄＷｌＰ（配列番号５）または対照のいずれかで処置した。最初の実験では、ペプチドでの処置をおよそ１２日目に開始し、腫瘍の体積を、細胞注射後約２０〜２５日まで経時的に測定した（図４）。第２の実験では、ペプチドでの処置を１５日目に開始し、腫瘍の体積は、細胞注射後約２７日まで経時的に測定した（図５）。環状ペプチドは、直鎖ペプチドより４倍効果的であることが見出だされたが、これは、環状ペプチドの用量１０ｍｇ／ｋｇが、直鎖ペプチドの用量４０ｍｇ／ｋｇと同程度に効果的であったことによる（図４）。これは、第２の実験で確認された（図５）。
【００７３】
次に、環状ペプチドＤＷＬＰＫ（配列番号１）を、卵巣がんのマウスモデルにおいて試験した。卵巣がんのマウスモデルでは、ルシフェラーゼを発現する１００万個の患者由来の卵巣がん細胞を、マウスに腹腔内注射した。腫瘍負荷は、ルシフェラーゼを用いてin vivoで測定した。環状ペプチドでの処置は４０日後に開始し、１０ｍｇ／ｋｇで１０日間投与した。処置の１０日後にマウスを安楽死させ、腫瘍を組織学的に分析した。図６に示すように、環状ペプチドで処置したマウスにおけるルシフェラーゼ出力は、処置の１０日間にわたって低下し、腫瘍の退縮を示した。環状ペプチド処置したすべての腫瘍は、Ｔｓｐ−１を発現し、組織学的に観察により、未処置の腫瘍の大きさの２５％＜であった。
環状ペプチド（配列番号１）はまた、マウスのマクロファージにおけるＴｓｐ−１を刺激したことが示され（図７）、環状ペプチドが間質内のＴｓｐ−１の発現も誘導できることを示す。
【００７４】
最後に、環状ペプチドＤＷＬＰＫの投与は、組織学を用いて測定されるように、肝臓または脾臓に対していかなる毒性も生じなかった（図８）。
まとめると、これらのデータは、環状Ｐｓａｐペプチドが、直鎖Ｐｓａｐペプチドよりも安定かつ効果的であったことを示す。さらに、環状ペプチドＤＷＬＰＫ（配列番号１）は、in vitroで最大の活性を有するようであり、毒性を誘発しなかった。
【００７５】
例２
クローン病のモデルを使用して、環状ペプチドＤＷＬＰＫ（配列番号１）の、クローン病を処置における有効性を試験した。環状ペプチドは、クローン病のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発モデルにおいて試験し、ここでＤＳＳはマウスに対して、飲料水中（３．５％重量：容積）で７日間与えられた。１群のマウスは、環状ペプチドとＤＳＳで同時に処置し、一方他の群は、ＤＳＳのみで処置した。環状ペプチドは、このモデルにおける炎症を有意に減少させた（図９）。環状ペプチドで処置したマウスはまた、ＤＳＳのみで処置したマウスよりも、体重減少が少なかった（図１０）。最後に、環状ペプチドは、Ｔｓｐ−１を刺激し、これらのマウスにおけるマクロファージの浸潤を阻害することが示された（図１１）。これらのデータは、環状Ｐｓａｐペプチド、特に環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）が、クローン病を処置するのに有効であることを示唆する。
【００７６】
例３
（ｉ）ＡＭＤのモデルを使用して、本明細書に記載の環状Ｐｓａｐペプチドの、ＡＭＤの処置における有効性を試験する。病変は、マウスの網膜上に、レーザーを用いて作製する。次にマウスを、本明細書に記載の環状Ｐｓａｐペプチド、例えば１０または４０ｍｇ／ｋｇの環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）で、またはスクランブルペプチド対照で処置する。処置は、全身的（例えば、静脈内もしくは腹腔内注射）、または硝子体内注射のいずれかによる。病変の治癒速度を経時的に測定する。病変は、環状Ｐｓａｐペプチドで処置したマウスにおいて、対照で処置したマウスよりも早く治癒することが予想される。
【００７７】
（ｉｉ）コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）のげっ歯類モデル、すなわち関節リウマチに類似する自己免疫モデルを使用して、関節リウマチを処置するための、本明細書に記載の環状Ｐｓａｐペプチドの有効性を試験する。ＣＩＡは、近交系ＤＢＡ／１雄マウスを、フロイント完全アジュバント中の異種または同種コラーゲンＩＩ（約５０μｇ）で皮内プライミングし、２週間後にフロイント不完全アジュバント中の同量のコラーゲンＩＩでブーストすることにより、誘導可能である。関節炎は、プライミング投与後約３週間で発症し、プライミング後８週間以内で最大に達する。マウスは、コラーゲンＩＩ特異的抗体、コラーゲンＩＩ特異的Ｔ細胞ならびに全身性炎症（例えばＩＬ−６、ＴＮＦなどの産生）の徴候の高いレベルを有する。関節において局所的に、圧倒的な炎症性浸潤（Ｔ細胞、マクロファージ、好中球および線維芽細胞からなる）ならびに軟骨および軟骨下骨の重篤な破壊の両方が、観察される。これらの特徴は、ヒトの関節リウマチで見られるプロセスを良好に模倣する（Myers et al., Life Sciences 61, p 1861-1878, 1997）。次にマウスを、本明細書に記載の環状Ｐｓａｐペプチド、例えば１０または４０ｍｇ／ｋｇの環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）で、またはスクランブルペプチド対照で処置する。処置は、全身的（例えば、静脈内または腹腔内注射）、または局所投与のいずれかによる。疾患のいくつかのパラメータ（例えば、臨床徴候および症状、症状の発症、進行、重症度、および寛解）を測定する。環状Ｐｓａｐペプチドで処置したマウスにおいて、対照で処置したマウスよりも、これらのパラメータの１または２以上が改善されること（例えば、臨床的徴候および症状の低減、発症の遅延、進行の遅延、重症度の低減、および／または寛解）が予想される。
【００７８】
（ｉｉｉ）乾癬のモデルを使用して、本明細書に記載の環状Ｐｓａｐペプチドの、乾癬の処置における有効性を試験する。イミキモド（ＩＭＱ）をマウスの皮膚に適用して、乾癬様皮膚炎を誘導する（例えば、van der Fits et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. (2009) J. Immunol.;182(9):5836-45を参照）。次にマウスを、本明細書に記載の環状Ｐｓａｐペプチド、例えば１０または４０ｍｇ／ｋｇの環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）で、またはスクランブルペプチド対照で処置する。処置は、全身的（例えば、静脈内または腹腔内注射）、または局所的のいずれかによる。皮膚炎の治癒速度を経時的に測定する。ＩＬ−２３、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆの上皮発現も、実験の終了時に測定する。環状Ｐｓａｐペプチドで処置したマウスにおいては、対照で処置したマウスよりも、皮膚炎はより早く治癒し、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７Ａおよび／またはＩＬ−１７Ｆのレベルは低下することが予想される。
【００７９】
（ｉｖ）アテローム性動脈硬化症のモデルを使用して、本明細書に記載の環状Ｐｓａｐペプチドの、アテローム性動脈硬化症の処置における有効性を試験する。アポＥまたはＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子が欠損したマウスを、アテローム性動脈硬化症のモデルとして使用する。マウスには、高脂肪、高コレステロール西洋型食餌または通常の固形飼料を、８週間以上、好ましくは少なくとも１５週間与える。マウスを、本明細書に記載の環状Ｐｓａｐペプチド、例えば１０または４０ｍｇ／ｋｇの環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１）で、またはスクランブルペプチド対照で処置する。処置は、全身的に送達される（例えば、静脈内または腹腔内注射により）。大動脈基部、腕頭動脈（腕頭）および大動脈の他の枝管、ならびに肺および頚動脈に発症した病変を、マウスにおいて少なくとも８週間後に測定する。環状Ｐｓａｐペプチドで処置したマウスにおいて、対照で処置したマウスよりも、病変はより早く治癒することが予想される。
【００８０】
例４
要約
卵巣がんに関連した死亡のほぼ１００％が、原発腫瘍からの細胞の転移性播種によりもたらされる、その後の臓器不全によって引き起こされる。しかし、腫瘍転移に関与する生理的プロセスへの理解の深まりにもかかわらず、進行した転移性卵巣がんの処置に重要な有効性を示す、臨床的に承認された薬物はない。Ｐｓａｐは、ｐ５３の、および転移部位に動員された骨髄由来細胞における抗腫瘍形成タンパク質トロンボスポンジン−１（Ｔｓｐ−１）の刺激を介した、腫瘍転移の強力な阻害剤として同定されている。ヒトの漿液性卵巣腫瘍の〜１００％が、ＣＤ３６、すなわちＴｓｐ−１のアポトーシス促進活性を媒介する受容体を発現することが実証されている。卵巣がんのこの形態の処置に有効であろうＰｓａｐに由来するペプチドを調査した。ペプチドの活性および安定性は、Ｐｓａｐ由来の薬物様特性を有する、新規環状ペプチドを開発することによって調査した。環状Ｐｓａｐペプチドは、転移性卵巣がんのＰＤＸモデルを大幅に退縮させることができた。
【００８１】
緒言
卵巣がんは、最も致命的な婦人科の悪性腫瘍であり、女性のがん死の第４の主要な原因である。病理学的には、卵巣がんは複数のサブタイプに分類され、上皮性卵巣がん（ＥＯＣ）が症例の９０％を占める。ＥＯＣの進行を支配する生物学についての理解の増加にもかかわらず、ステージＩＶのＥＯＣの患者の生存率は、わずか１７％である。このように、進行した転移性卵巣がんを特に処置することができる、有効な治療法が必要とされている。多くの患者は、第一選択療法としての白金薬剤に応答を示すが、７０％は耐性を生じる（１、２）。現在、これらの患者に対して、全体的な生存率を大きく増加させる、承認された治療法は存在しない。
【００８２】
Ｐｓａｐに由来する小ペプチドの開発が、複数種類の腫瘍モデルにおいて腫瘍転移を強力に阻害することが、以前に報告されている（３、４）。具体的には、Ｐｓａｐ、およびそれに由来するペプチドは、ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１＋／Ｌｙｓ６Ｃｈｉ単球において、広く作用する抗腫瘍形成タンパク質トロンボスポンジン−１（Ｔｓｐ−１）を刺激することにより、腫瘍の転移を阻害する（３）。これらの単球は、前転移ニッチと呼ばれる将来の転移性病変部位に動員され、そこでコロニー形成後も持続して、腫瘍の成長を刺激する。しかしＰｓａｐペプチドの全身投与は、これらの細胞におけるＴｓｐ−１の産生を刺激し、これが、その部位を将来の転移性コロニー形成に対して不応性にする（３）。これらの結果は、腫瘍微小環境におけるＴｓｐ−１の刺激が、将来の転移事象を防ぎ得ることを実証する。多数の卵巣がん患者は、最初の診断時に、転移性疾患を呈する。したがって、転移性病変を退縮させる、または安定化させることができる治療薬が必要である。
転移性かつ白金耐性卵巣がんＰＤＸモデルの微小環境において、Ｔｓｐ−１を刺激することは、確立された病変の顕著な退縮を誘導できることが実証されている。かかる著名な効果は、漿液性卵巣がん細胞が、Ｔｓｐ−１に対する受容体であるＣＤ３６を発現し、これが内皮細胞で以前に観察されたアポトーシス促進効果を媒介するという事実によって達成される（５）。
【００８３】
結果
ｄ−アミノ酸の組み込みは、in vivoでＰｓａｐペプチドの活性を高める
全身投与された場合に、ルイス肺がん転移の尾静脈モデルおよび乳がん転移のアジュバントモデルの両方を阻害することができたＰｓａｐのサポシンＡドメインに由来する４−および５−アミノ酸ペプチド両方の同定は、以前に記載されている（３）。ペプチドの治療有効性は、多くの場合、それらの安定性、またはプロテアーゼによる分解に対する抵抗性により、制限される。in vivoでのペプチドの安定性を高める１つの一般的な方法は、ｄ−アミノ酸を配列中に組み込むことであり、なぜならば、ｄ−アミノ酸は天然に存在するタンパク質中に組み込まれておらず、プロテアーゼはそれらを基質として認識しないからである（６〜１０）。ｄ−アミノ酸を異なる部分に組み込むことによる、４−アミノ酸Ｐｓａｐペプチドの安定性を調査した。２つのペプチドを、ｄ−アミノ酸を組み合わせて、第１（アスパラギン酸）と第３（ロイシン）または第２（トリプトファン）と第４（プロリン）残基に組み込んで、合成した。これらのペプチドと、天然のｌ−アミノ酸ペプチドの活性を、in vitroで、ＷＩ−３８肺繊維芽細胞におけるトロンボスポンジン−１（Ｔｓｐ−１）を刺激するそれらの能力を測定することにより、試験した。ウエスタンブロット分析により、Ｔｓｐ−１刺激について、in vitroで３つのペプチドの間に差がなかったことが見出された（図１２Ａ）。
【００８４】
１，３−ｄ−アミノ酸Ｐｓａｐペプチドおよび天然Ｐｓａｐペプチドの活性を、in vivoで試験した。ペプチドを、ＰＣ３Ｍ−ＬＮ４（ＬＮ４）細胞からの馴化培地（ＣＭ）で前処理したＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、全身的に投与した；これは以前に、マウスの肺においてＴｓｐ−１の発現を抑制することにより、転移性腫瘍の全身的特性を模倣している（３，４）。ＬＮ４ ＣＭ単独で、またはｄ−およびｌ−アミノ酸ペプチド（独立して）の２つの異なる用量（１０ｍｇ／ｋｇ／日および３０ｍｇ／ｋｇ／日）と組み合わせての処置の３日後に、タンパク質プールを、各処置群の収集した肺から調製した。これらのマウスの肺におけるＴｓｐ−１発現のレベルは、ウエスタンブロット分析によって評価した。１，３−ｄ−アミノ酸ペプチドは、Ｔｓｐ−１を、天然ペプチドよりも３倍刺激したことが観察された（図１２Ｂ）。天然ペプチドの１０ｍｇ／ｋｇの用量は、Ｔｓｐ−１を顕著に刺激しなかった（図１２Ｂ）。逆に、ｄ−アミノ酸ペプチドの１０ｍｇ／ｋｇの用量は、天然ペプチドの３０ｍｇ／ｋｇの用量と同程度にＴｓｐ−１を刺激し、ｄ−アミノ酸ペプチドの３０ｍｇ／ｋｇの用量は、天然ペプチドの同じ用量よりもおよそ３倍強く、Ｔｓｐ−１を刺激した。２つのペプチドのin vitro活性が、実質的に同一であったという観察に基づいて、in vivoでの活性の違いは、安定性の差によるものであると結論付けた。
【００８５】
ヒト漿液性卵巣がん細胞は、Ｔｓｐ−１媒介性の死滅に感受性である
ｄ−アミノ酸Ｐｓａｐペプチドの有効性を試験するために、ペプチドについての潜在的な臨床適用を表すであろう適切な腫瘍モデルを決定した。Ｐｓａｐ、およびそれに由来するペプチドが、転移部位に動員された骨髄由来細胞においてＴｓｐ−１を刺激することを考えると、そのアポトーシス促進活性を媒介するＴｓｐ−１の受容体であるＣＤ３６を発現した特定の種類のがんを、識別することが求められた（５）。漿液性卵巣上皮細胞およびヒト卵巣がん細胞は、ＣＤ３６を発現することが報告されている（１１〜１３）。ＣＤ３６の発現のため、白金耐性卵巣がん患者の腹水に由来する、１４の初代ヒト卵巣がん細胞株を調査した。患者由来の細胞の全ては、ヒト微小血管内皮細胞で発現されるレベルとほぼ同等の、ＣＤ３６のレベルを発現した（図１２Ｃ）。これらの細胞株のうちの３つは、組換えヒトＴｓｐ−１で最大７２時間まで処置し、細胞数およびアポトーシスに対するその効果を決定した。ＲｈＴｓｐ−１処置は、３つ全ての細胞株について、播種した細胞の元の数の５０％までの、全細胞数の減少をもたらした（図１２Ｄ）。さらに、ＦＡＣＳ分析により、処置した細胞の３０％〜６０％は、アネキシンＶ陽性によって明示されるように、Ｔｓｐ−１処置後にアポトーシス性であることが観察された（図１２Ｅ）。対照的に、シスプラチン処置の後、卵巣がん細胞のはるかに大きな割合が壊死したことが、低アネキシンＶおよび高ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって明示されるとおりに観察された（図１２Ｅ）。これらの所見は、卵巣がん細胞が、Ｐｓａｐペプチドによる処置に良好に応答し得ることを示唆する。
【００８６】
Ｐｓａｐペプチドは、卵巣がん転移の確立されたＰＤＸモデルを退縮させる
ＰｓａｐおよびＰｓａｐペプチドは、転移形成を阻害できることが以前に実証された（３，４）。卵巣がん患者の７５％は、最初の診断時にすでに、散在する疾患を有する（E. Lengyel, Ovarian cancer development and metastasis. Am J Pathol 177, 1053-1064 (2010)）。これらの患者に対し、転移の阻害は、治療上の有益性は限定的であろう。むしろこれらの患者は、既存の転移を退縮させるか、または少なくとも安定化することができる治療薬を必要とする。ｄ−アミノ酸Ｐｓａｐペプチドが、確立された転移性播種のモデルにおいて治療有効性を有するかどうかを調査した。ホタルルシフェラーゼを発現する１×１０６のＤＦ１４細胞を、ＳＣＩＤマウスの腹腔内に注射し、ヒト卵巣がんの伝播経路を模倣した。リアルタイムでのマウスにおける転移性コロニーの成長は、相対ルシフェラーゼ強度を介してモニタリングし、ルシフェラーゼシグナルの平均強度が０．５〜１×１０８ＲＬＵの時に、ビヒクル（生理食塩水）、ｄ−アミノ酸ペプチド（４０ｍｇ／ｋｇＱＤ）、またはシスプラチン（４ｍｇ／ｋｇＱＯＤ）による処置を開始した。ペプチドおよびシスプラチンの両方が、ルシフェラーゼ強度によって決定されるように、処置の最初の２０日間に、腫瘍体積を退縮することができた（図１３Ａおよび１３Ｂ）。しかしこの２０日間、シスプラチンで処置したマウスの半分は、４０％減少した総体重によって明示されるように、薬物の副作用で死亡した（図１３Ｃ）。さらに、２０日後に、生存したシスプラチン処置マウスの群における腫瘍は、シスプラチンによる継続的な処置にもかかわらず、成長し始め、残りのすべてのマウスは、１０日以内に死亡した（図１３Ａ）。
【００８７】
逆に、体重の損失は、ペプチド処置マウスでは観察されず（図１３Ｃ）、腫瘍は、４８日目にマウスのいずれにおいても検出可能なルシフェラーゼシグナルが存在しなくなるまで、縮小し続けた（図１３Ａおよび１３Ｂおよび図１６）。これらのマウスは、追加の３５日間（合計８３日間）、対照処置群が病的状態に関連する状態を示すまで、処置した。この処置期間の間、ルシフェラーゼシグナルは再上昇せず、マウスの肉眼的検査では、転移性病変は明らかにならなかった（図１３Ａおよび１３Ｄ）。Ｐｓａｐペプチド処置したマウスの肝臓および脾臓を、組織学的に（Ｈ＆Ｅ）検査して、任意の微小転移があったかどうかを決定した。Ｐｓａｐペプチド処置したマウスにおける転移性病変は、特定できなかった（図１３Ｅ）。
【００８８】
腹腔内転移が、肺転移と同様に、Ｃｄ１１ｂ＋／Ｇｒ１＋骨髄由来細胞を動員することを調査した（３）。ＤＦ１４転移を有する対照処置マウスの腹腔から腹水を採取し、および転移の徴候を示さなかったＰｓａｐペプチドで処置したマウスの腹腔から体液を採取した。体液はこれらのマウスからＦＡＣＳで選別し、Ｃｄ１１ｂ＋／Ｇｒ１＋骨髄由来細胞の集団を評価した。ＦＡＣＳ分析により、対照処置したマウスの腹水中の７１〜７７％の細胞が、Ｃｄ１１ｂ＋／Ｇｒ１＋であり（図１３Ｅおよび図１６）、一方ペプチドで処置したマウスからの腹水中の細胞の３１．４％のみが、Ｃｄ１１ｂ＋／Ｇｒ１＋である（図１３Ｅ）ことが、明らかになった。これらの知見に基づいて、Ｐｓａｐペプチドが、検出可能な病変が発見できなくなるまで、確立された転移を劇的に退縮可能であると、結論付けた。
【００８９】
環化は、活性を高めつつＰｓａｐペプチドをさらに安定化する
卵巣がんのＰＤＸモデルのペプチドによる処置の結果は、非常に有望であったが、ペプチドの安定性および活性は、より高めることができると仮定された。Ｐｓａｐに由来するペプチドは、ジスルフィド結合（３）によって安定化された２つのヘリックス間の１３アミノ酸ループを含有するタンパク質の領域に位置していた。したがって、骨格（Ｎ−Ｃ）の環化を介して環化された５アミノ酸ペプチドが合成された（図１４Ａ、環状ＤＷＬＰＫ（配列番号１））。このペプチドのin vitroでの活性を、Ｔｓｐ−１を刺激する能力に基づいて試験した。環状ペプチドは、Ｔｓｐ−１を、ｄ−アミノ酸直鎖ペプチドよりも３倍刺激した（図１４Ｂ）。
【００９０】
環化はまた、ペプチドをほとんどの天然に存在するプロテアーゼによって認識されない立体配座に強制することにより、その安定性を高める効果を有する（９、１０、１４〜１８）。ヒト血漿中の直鎖ｄ−アミノ酸ペプチドに対して、環状ペプチドの安定性を比較した。ヒト血漿中の両方のペプチドを、３７℃で最大２４時間までインキュベートし、その後、血漿／ペプチド混合物の、ＷＩ−３８線維芽細胞でのＴｓｐ−１を刺激する能力を試験した。分泌されたＴｓｐ−１のレベルを、ペプチド／血漿混合物を用いた処置の後ＥＬＩＳＡにより測定し、２つのペプチドによるＴｓｐ−１の刺激は、インキュベーションの８時間後まではほぼ同等であることが見出された（図１４Ｃ）。しかし、ヒト血漿中での２４時間のインキュベーションの後に、環状ペプチドは、そのＴｓｐ−１刺激活性の７０％以上を保持しているが、一方で直鎖ペプチドを含む血漿は、もはやＴｓｐ−１を刺激することができなかった（図１４Ｃ）。このように、環状ペプチドは、直鎖ｄ−アミノ酸ペプチドよりもはるかに活性かつ安定であると結論付けられた。
【００９１】
これらの知見に基づき、ＤＦ１４モデルを用いた環状ペプチドの有効性を試験した。ペプチドの転移性病変に対する効果をさらに調査するために、マウスに、１×１０７細胞を注射し、ルシフェラーゼシグナルを９×１０９ＲＬＵに到達させた。マウスを、環状ペプチドで１０日間だけ処置し、分析するのに十分な腫瘍組織が存在することを確実にした。重要なことには、わずか１０日の処置の後に、ペプチド処置したマウスでの平均ルシフェラーゼシグナルは、４×１０８に減少した（図１４Ｄ）。肝臓、脾臓および大網を、ペプチドおよび対照で処理したマウス両方で、Ｈ＆Ｅ、およびＴｓｐ−１、Ｇｒ１およびＴＵＮＥＬについてＩＨＣで分析した。対照処置マウスにおける転移性病変は、平均して、ペプチド処置したマウスのものよりも２．３倍大きかった（図１４Ｅ）。Ｐｓａｐペプチドの作用機序（ＭＯＡ）に整合して、ペプチド処置した腫瘍のすべては、Ｔｓｐ−１（図１４Ｆ）発現について陽性に染色された。また以前の観察に整合して、Ｔｓｐ−１発現細胞の全てはまた、Ｇｒ１陽性であることが判明した（図１４Ｇ）（３）。さらに、ペプチド処置したマウスにおける病変のすべては、かなりの割合のＴＵＮＥＬ陽性細胞を含んでおり、平均で４０％のＴＵＮＥＬ陽性細胞／病変であった（図１４Ｈおよび１４Ｉ）。逆に、対照処置腫瘍は、平均してわずか１．４％のＴＵＮＥＬ陽性細胞／病変を含んでいた（図１４Ｈおよび１４Ｉ）。
【００９２】
転移性漿液性卵巣腫瘍は、低レベルのＰｓａｐを発現するが、ＣＤ３６発現は原発腫瘍よりも高い
患者由来の卵巣がん細胞によって形成された腫瘍に対するＰｓａｐペプチドの活性が、ＣＤ３６を発現したことが以前に示された。ヒト卵巣がん患者におけるＣＤ３６発現の有病率、したがって潜在的なＰｓａｐに基づく治療薬が、この疾患のために如何に広く適用可能であるかを、調査した。プロサポシンの発現は、腫瘍が転移性のステージに進むにつれて減少するはずであると仮定された。そこで、転移性漿液性卵巣がんを有する１３９人の患者および、４６人の患者からの正常卵巣組織からなる、腫瘍組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を用いた。ＣＤ３６およびＰｓａｐの発現について組織を染色し、次いで強度を、染色指数（ＳＩ）法を使用してスコア付けした（R. Catena et al., Bone marrow-derived Gr1+ cells can generate a metastasis-resistant microenvironment via induced secretion of thrombospondin-1. Cancer Discov 3, 578-589 (2013)）。正常な卵巣からの組織の６１％は、ＣＤ３６を、２．３９の平均ＳＩで発現した（可能な最大スコアは９）（図１５Ａ〜１５Ｃ、１５Ｍおよび表１）。１３４の原発性卵巣腫瘍の分析により、腫瘍の９７％（１３０／１３４）がＣＤ３６について陽性染色され、平均ＳＩは５．３２であった（図１５Ｄ〜１５Ｆ、１５Ｍおよび表１）ことが明らかになった。１３４人の患者からの１２１の内臓転移を調べた。転移性病変の９７％（１１７／１２１）は、ＣＤ３６について陽性染色され、平均ＳＩは６．６１であった（図１５Ｇ〜１５Ｉ、１５Ｍおよび表１）。最後に、リンパ節転移の１００％（１３／１３）は、ＣＤ３６について陽性染色され、平均ＳＩは６．６９であった（図１５Ｊ〜１５Ｌ、１５Ｍおよび表１）。
【００９３】
【表１】
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【００９４】
ヒト卵巣がん患者におけるプロサポシンの発現を、そのレベルがその作用機序に基づき腫瘍の進行とともに低下すると推測して、調査した。卵巣がんＴＭＡ試料におけるプロサポシンレベルを調査した。正常な卵巣は、比較的低いレベルのプロサポシンを発現し、平均ＳＩは４．２９であった（図１５Ｎおよび表２）。原発性卵巣腫瘍はより高いレベルのプロサポシンを発現し、平均ＳＩは５．１７であった（図１５Ｎおよび表２）。驚くべきことに、内臓およびリンパ節転移において、プロサポシンレベルは顕著に低下し、平均ＳＩはそれぞれ４．１４および４．０７であった（図１５Ｎおよび表２）。したがってこれらを一緒にすると、ＣＤ３６の発現は原発性卵巣腫瘍において、正常卵巣と比較して増加しており、転移性病変におけるＣＤ３６発現は、原発性腫瘍と比較してさらに増加し、一方、プロサポシン発現は、腫瘍の進行とともに減少する。これらの知見は、転移性卵巣腫瘍が、プロサポシンの発現を抑制するがＣＤ３６を保持し、これを用いて、プロサポシン由来療法により卵巣がんを効果的に標的化できることを示唆する。
【表２】
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【００９５】
考察
プロサポシンおよびこれに由来する短い５アミノ酸ペプチドが、転移を強力に阻害できることが、以前に実証された（３、４）。プロサポシン由来の環状ペプチドの開発プロセスは、天然ペプチドよりも顕著に高い活性および安定性で描写されている。ｄ−アミノ酸の、天然の直鎖ペプチドの第１および第３残基における組み込みは、in vivo活性を増加させることが実証された。ペプチドは、これをより薬剤様にするために、骨格Ｎ−Ｃ環化を介して５アミノ酸ペプチドを環化することによって、さらに修飾された。環状ペプチドは、ｄ−アミノ酸の直鎖ペプチドよりもさらに高いin vivo活性を示す。両方の修飾ペプチドは、卵巣がんのＰＤＸモデルにおける確立された転移を、より強力に退縮できることが実証された。このＰＤＸモデルで使用される細胞は、卵巣がん患者の最も一般的な第一選択の処置である白金に対して抵抗性の患者に由来した。
【００９６】
患者の腹水から直接由来するヒト卵巣がん細胞株の分析によって、全ての試験した細胞株は、ＣＤ３６、すなわちＴｓｐ−１の受容体、Ｐｓａｐの下流標的かつ骨髄由来細胞中のペプチドを、発現することが見出された。組換えＴｓｐ−１は、ＣＤ３６を発現するこれらの漿液性卵巣がん細胞において、アポトーシスを誘導することが実証された。Ｔｓｐ−１の卵巣がん細胞に対するin vitro活性は、卵巣がんのＰＤＸモデルで再現され、ここでは、環状Ｐｓａｐペプチドが、転移保有マウスの腹腔に動員されたＣｄ１１ｂ＋／Ｇｒ１＋骨髄由来細胞におけるＴｓｐ−１の発現を刺激した。これらの細胞におけるＴｓｐ−１の発現の誘導は、腫瘍細胞におけるアポトーシスの顕著な誘導と、顕著な退縮をもたらした。
【００９７】
これらの結果に基づき、Ｐｓａｐペプチドは、すべてがＴｓｐ−１の誘導によって媒介される３つの異なるメカニズムを介して、卵巣がんの進行を阻害する可能性を有すると考えられる。ここで実証された第１は、Ｔｓｐ−１によってトリガーされたＣＤ３６からの下流のシグナル伝達によって媒介される、直接細胞死滅である。第２は、Ｔｓｐ−１の広く確立された抗血管新生活性を介するものである（D. J. Good et al., A tumor suppressor-dependent inhibitor of angiogenesis is immunologically and functionally indistinguishable from a fragment of thrombospondin. Proc Natl Acad Sci U S A 87, 6624-6628 (1990)）。第３は、Ｔｓｐ−１がその別の細胞表面受容体、ＣＤ４７に結合し、ＣＤ４７のマクロファージ上のＳＩＲＰαへの結合により媒介される「私を食べないで」シグナルを遮断することを介したものである（P. Burger, P. Hilarius-Stokman, D. de Korte, T. K. van den Berg, R. van Bruggen, CD47 functions as a molecular switch for erythrocyte phagocytosis. Blood 119, 5512-5521 (2012)；A. Saumet, M. B. Slimane, M. Lanotte, J. Lawler, V. Dubernard, Type 3 repeat/C-terminal domain of thrombospondin-1 triggers caspase-independent cell death through CD47/alphavbeta3 in promyelocytic leukemia NB4 cells. Blood 106, 658-667 (2005)）。
【００９８】
最後に、漿液性卵巣がんを有する１３４人の患者からの腫瘍組織の分析は、９７％がＣＤ３６を発現していること、およびこの発現が、転移性病変で維持されるだけでなく、ＣＤ３６発現のレベルが、腫瘍の進行に伴って実際に増加することを明らかにした。卵巣がん患者の最も一般的な第１選択の治療戦略は、白金ベースの化学療法である（E. Lengyel, Ovarian cancer development and metastasis. Am J Pathol 177, 1053-1064 (2010)）。卵巣がん患者の７０％が、この処置に抵抗性を生じる（E. Lengyel, Ovarian cancer development and metastasis. Am J Pathol 177, 1053-1064 (2010)）。これらの患者に対して、効果的なＦＤＡ承認治療薬は存在せず、したがって生存率は〜１７％である（E. Lengyel, Ovarian cancer development and metastasis. Am J Pathol 177, 1053-1064 (2010)）。ここで提示された所見は、Ｐｓａｐベースの治療薬が、その作用機序および、これらの患者の腫瘍細胞におけるＣＤ３６発現の広播性に基づいて、大部分の卵巣がん患者に対して重要な効果を有し得ることを示唆する。
【００９９】
参考文献
【表３】
2020117504.tif 000004
【０１００】
【表４】
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【０１０１】
さらに詳述することなく、当業者は、上記の説明に基づいて、本開示を最大限に利用することができると考えられる。したがって特定の態様は、単に例示として解釈され、いかなる方法においても本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書で引用した全ての刊行物は、本明細書に参照された目的または主題について、参照により組み込まれる。
本明細書および特許請求の範囲において使用される不定冠詞「a」および「an」は、明らかに逆が示されない限り、「少なくとも1つ」を意味すると理解される。
上記の説明から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、およびその精神および範囲から逸脱することなく、本開示に様々な変更および改変を加えて、種々の用途および条件に適合させることができる。したがって、他の態様もまた、特許請求の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ−Ｃ】
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【図１２Ｄ−Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ−Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１４Ｃ−Ｄ】
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【図１４Ｅ−Ｆ】
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【図１５Ａ−Ｆ】
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【図１５Ｇ−Ｌ】
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【図１５Ｍ−Ｎ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月26日(2020.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2020117504000001.pdf