(57)【要約】      （修正有）【課題】新規の修飾された、多重特異性を持つ抗体及び抗体様分子の設計及び生産に有用な効率的プラットフォームの提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有する、ネイティブ配列のＪ鎖に導入される外来性の結合部分を含む修飾Ｊ鎖、前記修飾Ｊ鎖またはその抗原結合断片を含む抗体、前記抗体を含む組成物、および、前記抗体を使用する腫瘍またはウイルス性疾患の治療方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネイティブ配列のＪ鎖に導入される外来性の結合部分を含む修飾Ｊ鎖。
【請求項２】
ネイティブ配列のＪ鎖が、配列番号１のヒトのネイティブＪ鎖配列またはその機能的断片である請求項１に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項３】
ネイティブ配列のＪ鎖が、配列番号１のヒトのネイティブＪ鎖配列である請求項２に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項４】
外来性の結合部分が、直接的なまたは間接的な融合によって配列番号１の前記ヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される請求項３に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項５】
結合部分が、ペプチドリンカーを介した間接的な融合によって導入される請求項４に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項６】
間接的な融合が、結合部分のＣ末端及び／またはＮ末端にてまたはその近傍にてペプチドリンカーを介する請求項５に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項７】
外来性の結合部分が、Ｃ末端にてまたはその近傍にて配列番号１のヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される請求項６に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項８】
外来性の結合部分が、Ｃ末端から約１０残基以内で配列番号１のヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される請求項７に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項９】
外来性の結合部分が、Ｎ末端にてまたはその近傍にて配列番号１のヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される請求項６に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項１０】
外来性の結合部分が、Ｎ末端から約１０アミノ酸残基以内で配列番号１のヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される請求項９に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項１１】
外来性の結合部分が、配列番号１のシステイン残基９２と１０１の間でヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される請求項５に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項１２】
外来性の結合部分が、グリコシル化部位にてまたはその近傍にて配列番号１のヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される請求項５に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項１３】
前記ペプチドリンカーが約１０〜２０のアミノ酸の長さである請求項５に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項１４】
前記ペプチドリンカーが約１５〜２０のアミノ酸の長さである請求項１３に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項１５】
前記ペプチドリンカーが１５のアミノ酸の長さである請求項１４に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項１６】
外来性の結合部分が、化学的誘導体化または化学酵素的誘導体化によって配列番号１のヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される請求項３に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項１７】
外来性の結合部分が、化学リンカーによって配列番号１のヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される請求項１６に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項１８】
化学リンカーが切断可能なリンカーまたは切断可能ではないリンカーである請求項１７に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項１９】
切断可能なリンカーが化学的に不安定なリンカーまたは酵素に不安定なリンカーである請求項１８に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項２０】
前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体、活性エステル、アルデヒド、ビス−アジド化合物、ビス−ジアゾニウム誘導体、ジイソシアネート、及びビス−活性フッ素化合物から成る群から選択される請求項１８に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項２１】
酵素認識部位の挿入によって、及びペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーを介して酵素認識部位にて外来性の結合部分を翻訳後に連結することによって修飾される請求項１６に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項２２】
外来性の結合部分が、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体−薬剤コンジュゲート、抗体様分子、抗体様分子の抗原結合断片、可溶性タンパク質及び膜結合型タンパク質、リガンド、受容体、ウイルス様粒子、タンパク質毒素、酵素、及び代替足場から成る群から選択される請求項１〜２１のいずれか１項に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項２３】
代替足場が、ダルピン、フィブロネクチンドメイン、アドネクチン及びノッティンから成る群から選択される請求項２２に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項２４】
抗原結合断片が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び単一ドメイン抗体から成る群から選択される請求項２２に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項２５】
抗原結合断片がｓｃＦｖである請求項２４に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項２６】
外来性の結合部分がエフェクター細胞に結合する請求項１〜２１のいずれか１項に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項２７】
エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ及び好中球から成る群から選択される請求項２６に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項２８】
エフェクター細胞がＴ細胞である請求項２７に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項２９】
外来性の結合部分がＴ細胞上のＣＤ３εに結合する請求項２８に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項３０】
エフェクター細胞がＮＫ細胞である請求項２７に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項３１】
外来性の結合部分が、ＮＫ細胞上のＣＤ１６、ＣＤ６４及びＮＫＧ２Ｄから成る群から選択される標的を結合する請求項３０に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項３２】
エフェクター細胞がマクロファージである請求項２７に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項３３】
外来性の結合部分が、マクロファージ上のＣＤ１４に結合する請求項３２に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項３４】
エフェクター細胞が好中球である請求項２７に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項３５】
外来性の結合部分が、好中球上のＣＤ１６ｂまたはＣＤ１７７に結合する請求項３５に記載の修飾Ｊ鎖。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の修飾Ｊ鎖またはその抗原結合断片を含む抗体。
【請求項３７】
尾部を含むＩｇＭ抗体、ＩｇＡ抗体またはＩｇＧ抗体、またはその抗原結合断片である請求項３６に記載の抗体。
【請求項３８】
ＩｇＭ抗体またはその抗原結合断片である請求項３７に記載の抗体。
【請求項３９】
ＩｇＡ抗体またはその抗原結合断片である請求項３７に記載の抗体。
【請求項４０】
多重特異性である、またはその抗原結合断片である請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４１】
二重特異性である、またはその抗原結合断片である請求項４０に記載の抗体。
【請求項４２】
前記抗体が、標的細胞、可溶性結合標的、細胞表面受容体、マトリックスタンパク質、輸送体受容体から成る群から選択される１以上の結合標的に対する結合特異性を有する請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４３】
前記抗体が腫瘍細胞に結合する請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４４】
前記抗体が、図１９に列挙された腫瘍標的関連抗原に結合する請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４５】
Ｊ鎖が、図１９に列挙されたエフェクター細胞標的のいずれかを結合するように修飾される請求項４４に記載の抗体。
【請求項４６】
修飾Ｊ鎖がＶ−リンカー−Ｊの方向である請求項４５に記載の抗体。
【請求項４７】
修飾Ｊ鎖がＪ−リンカー−Ｖの方向である請求項４５に記載の抗体。
【請求項４８】
腫瘍が血液癌または固形腫瘍である請求項４３に記載の抗体。
【請求項４９】
血液癌が、白血病、リンパ腫、骨髄腫及び骨髄異形成症候群から成る群から選択される請求項４８に記載の抗体。
【請求項５０】
白血病が、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、または慢性リンパ性白血病である請求項４８に記載の抗体。
【請求項５１】
リンパ腫が、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫である請求項４８に記載の抗体。
【請求項５２】
抗体が、ＣＤＩＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ５６、ＣＤ１３８の１以上に結合する請求項４８に記載の抗体。
【請求項５３】
修飾Ｊ鎖がＣＤ３εに結合する請求項５２に記載の抗体。
【請求項５４】
抗体がＣＤ２０に結合し、修飾Ｊ鎖がＣＤ３εを結合する請求項５３に記載の抗体。
【請求項５５】
Ｖ−リンカー−Ｊの方向で修飾Ｊ鎖を含む請求項５４に記載の抗体。
【請求項５６】
Ｊ−リンカー−Ｖの方向で修飾Ｊ鎖を含む請求項５５に記載の抗体。
【請求項５７】
腫瘍が上皮腫瘍である請求項４４に記載の抗体。
【請求項４８】
抗体が腫瘍上の糖質系標的に結合する請求項４５に記載の抗体。
【請求項４９】
抗体がウイルス抗原に結合する請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５０】
ウイルス抗原がＨＢＶ抗原またはＨＩＶ抗原である請求項４９に記載の抗体。
【請求項５１】
抗原がＰｒｅＳ１である請求項５０に記載の抗体。
【請求項５２】
抗原がＧＰ１２０である請求項５０に記載の抗体。
【請求項５３】
請求項３６〜５２のいずれか１項に記載の抗体を含む組成物。
【請求項５４】
さらに薬学上許容可能な担体を含む医薬組成物である請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
診断用組成物である請求項５３に記載の組成物。
【請求項５６】
腫瘍またはウイルス性疾患の治療方法であって、必要とする対象に有効量の請求項３６〜５２のいずれか１項に記載の抗体を投与することを含む、治療方法。
【請求項５７】
腫瘍またはウイルス性疾患の治療のための薬物の調製における請求項３６〜５２のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項５８】
腫瘍またはウイルス性疾患の治療における請求項３６〜５２のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる２０１４年４月３日に出願された米国仮特許出願番号６１／９７４，７３８号の優先権及び利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、修飾された組換えＪ鎖ポリペプチド及びそれを含む抗体のような結合分子に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｊ鎖は、ＩｇＭのμ重鎖またはＩｇＡのα重鎖のＣ末端での１８アミノ酸の分泌型尾部（ｔｐ）における最後から２番目のシステイン残基が関与するジスルフィド結合を介して五量体ＩｇＭ及び二量体ＩｇＡと会合する酸性１５ｋＤａのポリペプチドである。それぞれＣｙｓ１２と１００、Ｃｙｓ７１と９１及びＣｙｓ１０８と１３３の間で３つのジスルフィド架橋が形成される。たとえば、Ｆｒｕｔｉｇｅｒら．１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，１２６４３−１２６４７（非特許文献1）を参照のこと。ヒトのＩｇＭとＩｇＡへのＪ鎖の組み込みのための及びＪ鎖との高分子免疫グロブリンの集合と会合のための構造的な要件はそれぞれ、Ｓｏｒｅｎｓｅｎら．２０００，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（１）：１９−２７（非特許文献2）及びＹｏｏら．１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（４７）：３３７７１−３３７７７（非特許文献3）によって報告されている。大腸菌における可溶性Ｊ鎖の組換え生産はＲｅｄｗａｎら．２００６，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１５：９５−１０２（非特許文献4）によって報告されている。
【０００４】
ハイブリッドＩｇＡ／ＩｇＧ抗体及びＩｇＭ／ＩｇＧ抗体を作製する方法は当該技術で既知である。従って、ハイブリッドＩｇＡ２／ＩｇＧ１抗体の組換え生産はＣｈｉｎｔａｌａｃｈａｒｕｖｕら．２００１，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０１（１）：２１−３１（非特許文献5）によって報告されている。ＩｇＧγ重鎖の末端でのαｔｐまたはμｔｐの付加は重合を促進し、補体の活性化のようなエフェクター機能を高めることが報告されている（Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５，１５４：２２２６−２２３６（非特許文献6））。ＩｇＡ／ＩｇＧハイブリッド抗体はＩｇＡ及びＩｇＧ双方の特性を持つ。
【０００５】
抗体の設計で為された前進にもかかわらず、たとえば、改善された親和性、特異性及び／または結合特性のような改善された特性を持つ修飾された抗体に対するニーズが残っている。
【０００６】
分野が進歩するにつれて、たとえば、さらに高い親和性、さらに長い半減期及び／またはさらに良好な組織分布を提供するようなタンパク質工学の創造的な手段を介して、と同様に毒性ペイロード送達（たとえば、抗体／薬剤の結合体）を介した焦点を定めた細胞破壊のための小分子技術と大分子技術の組み合わせを介して抗体の機能が高められている。抗体の機能を改善する別のアプローチは、１つのＩｇＧ分子を２つの抗原に結合させる免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）構造の２価の結合を利用する。実際、特定の適用では、２つの異なる標的抗原を同時に結合することによって有用な機能を発揮する非対称の抗体についての良好な潜在性が存在する。このニーズを扱うために、種々の構築物を作り、２つの異なる抗原を結合することができ、自然界で今までに見たことがない機能を可能にする単一分子が得られている。この二重特異的なアプローチの例は、それぞれＴ細胞とＢ細胞上のＣＤ３受容体とＣＤ１９受容体を結合する「ブリナツモマブ」（ＭＴ１０３またはＡＭＧ１０３）である。癌様Ｂ細胞への細胞傷害性Ｔ細胞のこの連結はＢ細胞白血病の有効な治療を可能にする。
【０００７】
しかしながら、二重特異性抗体の構築、発現及び生産には重大な技術的困難が残っている。二重特異性抗体は、２つの異なる抗原を同時に結合するその能力の故に有望な治療剤と見なされるが、安定性及び製造の煩雑さに関する問題のためにその有用性は限定されている。
【０００８】
タンパク質工学の種々の形態を用いて、異質の重鎖を一致させ、重鎖と軽鎖の適当な対という点での整合を加えて二重特異性のＩｇＧを効率的に得ている。加えて、クアドローマ、化学的ヘテロ結合体、選択されたヘテロ二量体化ドメインを用いた組換え構築物および２つの最小抗原結合部位から成る最小サイズの組換え構築物を含む種々の二重特異性抗体の形式。
【０００９】
しかしながら、これらの取り組みのすべては困難が伴っている。
【００１０】
従って、たとえば、二重特異性のような操作された抗体の開発に向けた取り組みにかかわらず、さらに効率的なプラットフォームを開発する大きなニーズが残っている。新規の修飾された、多重特異性を持つ抗体及び抗体様分子の設計及び生産が、そのような治療剤の発見と臨床への導入の間のスケジュールを短縮することができる治療用抗体の場合、これは特に真実である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｆｒｕｔｉｇｅｒら．１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，１２６４３−１２６４７
【非特許文献２】Ｓｏｒｅｎｓｅｎら．２０００，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（１）：１９−２７
【非特許文献３】Ｙｏｏら．１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（４７）：３３７７１−３３７７７
【非特許文献４】Ｒｅｄｗａｎら．２００６，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１５：９５−１０２
【非特許文献５】Ｃｈｉｎｔａｌａｃｈａｒｕｖｕら．２００１，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０１（１）：２１−３１
【非特許文献６】Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５，１５４：２２２６−２２３６
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、ネイティブＪ鎖配列に１以上の結合部分を導入することによってＩｇＭ抗体またはＩｇＡ抗体のＪ鎖を修飾することができ、レシピエント抗体の機能性またはその標的への修飾Ｊ鎖の結合を損なうことなく、修飾Ｊ鎖をＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡ抗体に導入することができるという認識に少なくともある程度基づく。これによって結合部分を持つ修飾Ｊ鎖が１セットの標的抗原と相互作用するのが可能になる一方で、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は異なるセットの標識抗原と反応することができる。
【００１３】
本発明はさらに、たとえば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージまたは好中球のようなエフェクター細胞に修飾Ｊ鎖を向けることによって生体の免疫応答を活性化することができ、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の応答を改善することができるという認識に基づく。
【００１４】
態様の１つでは、本発明は、ネイティブ配列のＪ鎖に導入された外来性の結合部分を含む修飾Ｊ鎖に関する。
【００１５】
一実施形態では、ネイティブ配列のＪ鎖は、配列番号１のヒトのネイティブＪ鎖配列またはその機能的断片である。
【００１６】
別の実施形態では、外来性の結合部分は、直接的なまたは間接的な融合によって配列番号１のヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される。
【００１７】
さらに別の実施形態では、結合部分はペプチドリンカーを介した間接的な融合によって導入される。
【００１８】
一実施形態では、間接的な融合は、結合部分のＣ末端及び／またはＮ末端でのまたはその近傍でのペプチドリンカーを介して達成される。
【００１９】
別の実施形態では、外来性の結合部分は、Ｃ末端及び／またはＮ末端でのまたはその近傍で、たとえば、Ｃ末端及び／またはＮ末端から約１０残基の範囲内で配列番号１のヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される。
【００２０】
さらなる実施形態では、外来性の結合部分は、配列番号１のシステイン残基９２と１０１の間でヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される。
【００２１】
もっとさらなる実施形態では、外来性の結合部分は、グリコシル化部位でまたはその近傍で配列番号１のヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される。
【００２２】
ペプチドリンカーは存在するならば、たとえば、約１０〜２０アミノ酸の長さ、または約１５〜２０アミノ酸の長さ、または１５アミノ酸の長さであってもよい。
【００２３】
さらなる実施形態では、外来性の結合部分は、化学的なまたは化学酵素的な誘導体化によって配列番号１のヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される。化学リンカーは切断可能なリンカーまたは切断可能ではないリンカーであってもよく、その際、切断可能なリンカーは化学的に不安定なリンカーまたは酵素的に不安定なリンカーであってもよい。
【００２４】
さらなる実施形態では、リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体、活性エステル、アルデヒド、ビス−アジド化合物、ビス−ジアゾニウム誘導体、ジイソシアネート、及びビス−活性フッ素化合物から成る群から選択される。
【００２５】
異なる実施形態では、Ｊ鎖は、酵素認識部位の導入によって、及びペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーを介して酵素認識部位で外来性の結合部分を翻訳後に連結することによって修飾される。
【００２６】
実施形態すべてにおいて、外来性の結合部分は、たとえば、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体／薬剤の結合体、抗体様分子、抗体様分子の抗原結合断片、可溶性タンパク質及び膜結合型タンパク質、リガンド、受容体、ウイルス様粒子、タンパク質毒素、酵素、及び代替足場から成る群から選択されてもよい。代替足場の例には、ダルピン、フィブロネクチンドメイン、アドネクチン及びノッティンが挙げられる。典型的な抗原結合断片にはＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び単一ドメイン抗体が挙げられる。好まれる実施形態では、抗原結合断片はｓｃＦｖである。
【００２７】
一実施形態では、修飾Ｊ鎖の外来性の結合部分はエフェクター細胞に結合し、その際、エフェクター細胞は、たとえば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ及び好中球から成る群から選択されてもよい。
【００２８】
一実施形態では、エフェクター細胞はＴ細胞であり、外来性の結合部分は、たとえば、Ｔ細胞上のＣＤ３εに結合してもよい。
【００２９】
別の実施形態では、エフェクター細胞はＮＫ細胞であり、修飾Ｊ鎖の外来性の結合部分にとっての標的は、例えば、ＮＫ細胞上のＣＤ１６、ＣＤ６４及びＮＫＧ２Ｄから成る群から選択されてもよい。
【００３０】
さらに別の実施形態では、エフェクター細胞はマクロファージであり、修飾Ｊ鎖の外来性の結合部分は、たとえば、マクロファージ上のＣＤ１４に結合してもよい。
【００３１】
さらなる実施形態では、エフェクター細胞は好中球であり、修飾Ｊ鎖の外来性の結合部分は、たとえば、好中球上のＣＤ１６ｂまたはＣＤ１７７に結合してもよい。
【００３２】
別の態様では、本発明は、上文に記載されたような修飾Ｊ鎖を含む抗体またはそのような抗体の抗原結合断片に関する。抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡの抗体であることができ、多重特異性、たとえば、二重特異性の抗体を含む。
【００３３】
一実施形態では、抗体は尾部を含むＩｇＭ抗体、ＩｇＡ抗体またはＩｇＧ抗体、またはその抗原結合断片である。
【００３４】
別の実施形態では、抗体は、標的細胞、可溶性結合標的、細胞表面受容体、マトリクスタンパク質、輸送体受容体から成る群から選択される１以上の結合標的に対する結合特異性を有する。
【００３５】
さらに別の実施形態では、抗体は腫瘍細胞に結合する。
【００３６】
さらなる実施形態では、抗体は、図１９にてリストにした腫瘍標的に関連する抗原に結合し、その際、Ｊ鎖は、たとえば、図１９にてリストにしたエフェクター細胞標的のいずれか結合するように修飾されてもよい。
【００３７】
もっとさらなる実施形態では、修飾Ｊ鎖はＶ−リンカー−Ｊの方向でまたはＪ−リンカー−Ｖの方向で抗体に存在する。
【００３８】
一実施形態では、腫瘍は血液癌または固形腫瘍であり、血液癌は、たとえば、具体的には、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病または慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含む白血病、リンパ腫、骨髄腫、及び骨髄異形成症候群であってもよい。そのような実施形態では、抗体は、たとえば、ＣＤＩＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ５６、ＣＤ１３８の１以上に結合してもよく、修飾Ｊ鎖はＣＤ３εに結合してもよい。
【００３９】
別の実施形態では、腫瘍は上皮腫瘍である。
【００４０】
さらに別の実施形態では、抗体は腫瘍上の糖質系標的に結合する。
【００４１】
さらなる実施形態では、抗体は、たとえば、ＨＢＶ抗原またはＨＩＶ抗原、たとえば、ＰｒｅＳ１またはＧＰ１２０のようなウイルス抗原に結合する。
【００４２】
さらなる態様では、本発明は記載されているような修飾Ｊ鎖を含む、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭ、ＩｇＧ／ＩｇＡの抗体を含む組成物に関する。組成物は、たとえば、医薬組成物または診断用組成物であってもよい。
【００４３】
もっとさらなる態様では、本発明は、必要とする対象に本明細書で記載されているような修飾Ｊ鎖を伴った、有効量のＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭ、ＩｇＧ／ＩｇＡの抗体を投与することを含む腫瘍またはウイルス性疾患を治療する方法に関する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、腫瘍またはウイルス性疾患の治療のための薬物の調製における、本発明に記載されているような修飾Ｊ鎖を伴うＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭ、ＩｇＧ／ＩｇＡの抗体の使用に関する。
【００４５】
さらに別の態様では、本発明は、腫瘍またはウイルス性疾患の治療における、本発明は記載されているような修飾Ｊ鎖を伴うＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭ、ＩｇＧ／ＩｇＡの抗体の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ネイティブＩｇＭにてＡ鎖とＢ鎖が同一である、Ｊ鎖を含むＩｇＭ五量体の構造を示す。
【図２】ＩｇＡ、二量体ＩｇＡ及び分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）の模式的構造を示す。
【図３】成熟ヒトＪ鎖のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図４−１】成熟ヒトＪ鎖（配列番号１）及び種々の動物種由来のＪ鎖（配列番号１〜４４）の配列比較を示す。Ｈｕｍ＝ヒト  ＮＰ＿６５３２４７  ２３−１５９（配列番号１）Ｃｈｍ＝チンパンジー  ＸＰ＿００１１６０１３５  ３９−１７５（配列番号２）Ｇｏｒ＝ゴリラ  ＸＰ＿００４０３８８３０  ２３−１５９（配列番号３）Ｏｒａ＝オランウータン  ＮＰ＿００１１２５３８１  ２３−１５９（配列番号４）Ｇｉｂ＝ギボン  ＸＰ＿００３２６５７６１  ３９−１７５（配列番号５）Ｍａｒ＝マーモセット  ＸＰ＿００３７３２５３８  ３２−１６８（配列番号６）Ｃｙｎ＝カニクイザル  ＮＰ＿００１２４７８１５  ２３−１５９（配列番号７）Ｂａｂ＝ヒヒ  ＸＰ＿００３８９８８４４  ２３−１５９（配列番号８）Ｓｑｕ＝リスザル  ＸＰ＿００３９３１９７８  ２３−１５９（配列番号９）Ｓｈｒ＝ツパイ  ＸＰ＿００６１４２９５５  ２５−１６０（配列番号１０）Ｄｏｌ＝イルカ  ＸＰ＿００４３２８９６１  ２５−１５８（配列番号１１）Ｋｉｌ＝シャチ  ＸＰ＿００４２８３６２９  ２５−１５８（配列番号１２）Ｅｌｅ＝ゾウ  ＸＰ＿００３４１４１１０  ２５−１５８（配列番号１３）Ｓｅａ＝アシカ  ＸＰ＿００６７２９３８８  ２５−１５８（配列番号１４）Ｒｈｉ＝サイ  ＸＰ＿００４４１９２０２  ２５−１５７（配列番号１５）Ｃａｔ＝イエネコ  ＸＰ＿００３９８５３５０  ２５−１５８（配列番号１６）Ｗｏｌ＝オオカミ  ＸＰ＿５３２３９８  ２６−１５９（配列番号１７）Ｐａｎ＝パンダ  ＥＦＢ２３２５３  １−１３４（配列番号１８）Ｆｅｒ＝フェレット  ＸＰ＿００４７６６３７６  ２６−１５８（配列番号１９）Ｈｏｒ＝ウマ  ＮＰ＿００１２７１４６４  ２５−１５８（配列番号２０）Ｇｕｉ＝モルモット  ＮＰ＿００１２６５７０５  ２５−１６０（配列番号２１）Ｃａｍ＝ラクダ  ＸＰ＿００６１８８７３８  ２５−１５８（配列番号２２）Ｇｏａ＝ヤギ  ＸＰ＿００５６８１７８６  ２５−１５８（配列番号２３）Ｃｈｎ＝チンチラ  ＸＰ＿００５３９２８３８  ９４−２２９（配列番号２４）Ｈａｍ＝ハムスター  ＸＰ＿００５０６８２２８  ２４−１６０（配列番号２５）Ｓｈｅ＝ヒツジ  ＸＰ＿００４００９９３７  ２５−１５８（配列番号２６）ＢＢａ＝食虫コウモリ  ＸＰ＿００６０９４４７５  ２５−１５８（配列番号２７）Ａｎｔ＝レイヨウ  ＸＰ＿００５９８３８３６  ２５−１５８（配列番号２８）Ｃｏｗ＝ウシ  ＮＰ＿７８６９６７  ２５−１５７（配列番号２９）Ｍｏｕ＝マウス  ＮＰ＿６９００５２  ２３−１５９（配列番号３０）Ｒａｔ＝ラット  ＥＤＬ８８５１６  ２３−１５９（配列番号３１）Ｈｅｄ＝ハリネズミ  ＸＰ＿００４７０３２３７  ２５−１５７（配列番号３２）Ｒａｂ＝ウサギ  Ｐ２３１０８  １−１３６（配列番号３３）Ｏｐｏ＝オポッサム  ＸＰ＿００３３４１４１５  ２９−１６２（配列番号３４）Ａｌｌ＝アメリカワニ  ＸＰ＿００６２７００９４  ２６−１５９（配列番号３５）Ｔｕｒ＝カメ  ＸＰ＿００５３０４１６７  ２６−１５９（配列番号３６）Ｔａｓ＝タスマニアデビル  ＸＰ＿００３７７２８６３  ２７−１６０（配列番号３７）Ｐｌａ＝カモノハシ  ＸＰ＿００３４３０９５４  ３６−１６０（配列番号３８）Ｐａｒ＝インコ  ＸＰ＿００��１４２７８７  ２８−１６０（配列番号３９）Ｄｕｃ＝アヒル  ＸＰ＿００５０３１３７０  ２８−１６０（配列番号４０）Ｃｈｉ＝ニワトリ  ＮＰ＿９８９５９４  ２６−１５８（配列番号４１）Ｔｕｒ＝シチメンチョウ  ＸＰ＿００３２０５７１７  ２７−１５９（配列番号４２）Ｆａｌ＝ハヤブサ  ＸＰ＿００５２４３２３６  ２９−１６０（配列番号４３）Ｓｐａ＝スズメ  ＸＰ＿００５４９２２１７  ２９−１５８（配列番号４４）
【図４−２】成熟ヒトＪ鎖（配列番号１）及び種々の動物種由来のＪ鎖（配列番号１〜４４）の配列比較を示す。
【図４−３】成熟ヒトＪ鎖（配列番号１）及び種々の動物種由来のＪ鎖（配列番号１〜４４）の配列比較を示す。
【図５】ヒト及びコウモリ（クロオオコウモリ、Ｐｔｅｒｏｐｕｓ  ａｌｅｃｔｏ）のＪ鎖アミノ酸配列（それぞれ配列番号１及び４５）の配列比較を示す。
【図６】そのＪ鎖を欠くＩｇＭ抗体（陰性対照）及びＪ鎖を含むＩｇＭ抗体を還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗Ｊ鎖抗体を用いたウエスタンブロットによって検出した図を示す。抗Ｊ鎖抗体はＪ鎖を含むＩｇＭとのみ反応した。
【図７】形質移入したＣＨＯ細胞から回収した上清を抗ｍｕまたは抗ｍｙｃの親和性マトリックスによる免疫沈降のために等分した。これらのＣＨＯ細胞はＣＤＩＭ（細胞死誘導分子）として知られる抗Ｂ細胞特異性を持つＩｇＭを発現していた。このＩｇＭ抗体はＩＧＭ−５５．５として知られる。免疫沈降したタンパク質を還元性ＳＤＳＰＡＧＥで分離し、抗Ｊ抗体または抗ｍｙｃ抗体によるウエスタンブロットによって検出した。Ｎ末端にタグを付けた抗ＣＤ３ｓｃＦｖＪ及びＣ末端にタグを付けたＪ−抗ＣＤ３ｓｃＦｖを形質移入した細胞は双方とも５１ｋＤ付近で陽性のバンドを示し、それは抗Ｊ及び抗ｍｙｃ抗体の双方に反応した。
【図８】Ｔ細胞（Ｔ細胞抗原ＣＤ３）に対して結合特異性を持つ修飾Ｊ鎖を含む二重特異性ＩｇＭ五量体の２つの異なる方向を示す。
【図９】Ｃ末端でＪ鎖を含む抗ＣＤ３単鎖Ｆｖ（抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−Ｊ）の配列（配列番号４６）及び構造を示す。ＳＰ＝シグナルペプチド
【図１０】Ｎ末端でＪ鎖を含む抗ＣＤ３単鎖Ｆｖ（Ｊ−抗ＣＤ３ｓｃＦｖ）の配列（配列番号４７）及び構造を示す。ＳＰ＝シグナルペプチド
【図１１】エフェクター細胞に対して結合特異性を持つＪ鎖に共有結合された結合ドメインを含む、標的抗原に対して結合特異性を持つ非対称性の二重特異性ＩｇＭ五量体の模式図である。
【図１２】ＣＤ３ｓｃＦｖ結合ドメインで共有結合により修飾されたＪ鎖を持つ抗ＣＤ２０−ＩｇＭ五量体のウエスタンブロットを示す。クマシーブルーで染色した非還元性ＰＡＧＥによっておよそ１００万ダルトンのＭＷのフルサイズのＩｇＭが見られる。修飾Ｊ鎖は双方の方向ＣＤ３−Ｊ及びＪ−ＣＤ３にてＩｇＭ五量体に統合する。
【図１３】ＣＤ３に対する結合特異性（ＣＤ３Ｊ）を提供する修飾Ｊ鎖を持つ二重特異性抗ＣＤ２０−ＩｇＭ（ＣＤ２０ＩｇＭ）の重鎖（ＨＣ）、軽鎖（ＬＣ）及び修飾Ｊ鎖による一時的な形質移入の結果を示す。
【図１４】抗ＣＤ２０ＩｇＭへの修飾Ｊ鎖の組み込みがＣＤＣ活性に否定的な効果を有さないことを示す。加えて、データは、いずれかの方向（Ｖ１５ＪまたはＪ１５Ｖ、「１５」はリンカーの長さを示す）で修飾Ｊ鎖を含むＩｇＭ分子は抗ＣＤ２０ＩｇＧ抗体よりも有意にさらに強力であることを示す。
【図１５】二重特異性のＣＤ２０ＩｇＭ×ＣＤ３Ｊ鎖分子は、修飾Ｊ鎖のＣＤ３特異性のために活性のあるＴ細胞によるＢ細胞の殺傷の結果、Ｂ細胞の枯渇で高度に強力であることを示す。ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋のＢ細胞株であるＲａｊｉを、ＣＤ２０−ＩｇＭ×Ｊ野生型またはＣＤ２０ＩｇＭ×ＣＤ３−Ｊ鎖を伴ったＣＤ８＋細胞溶解性Ｔ細胞株であるＴ−ＡＬＬと共に３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間、共培養した。細胞を回収し、ＣＤ３及びＣＤ１９に対する蛍光抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析し、生存Ｂ細胞を評価した。
【図１６】ＣＤ３への結合特異性を提供する修飾Ｊ鎖を伴った二重特異性抗ＣＤ２０−ＩｇＭ分子は、野生型Ｊ鎖を伴った抗ＣＤ２０ＩｇＭ五量体よりも有意に改善された細胞傷害性活性を有することを示す。Ｔ細胞と連動する二重特異性ＩｇＭ五量体は１ｎｇ／ｍＬの濃度で有効であり、野生型Ｊ鎖を伴った抗ＣＤ２０−ＩｇＭに比べて３００倍強力である。
【図１７】抗ＣＤ２０のＩｇＧ、ＩｇＭ、及び二重特異性ＩｇＭによる生体内でのＢ細胞の枯渇を示す。ヒトＣＤ３４＋幹細胞で再構築されたヒト化ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ストック番号：００７７９９）を購入し、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の投与前レベルについて全血を解析した。０．５ｍｇ／ｋｇで動物に静脈投与するためにＣＤ２０ＩｇＭ×ＣＤ３−Ｊ鎖を調製した。投与の６時間後に続いて、動物から全血を採取し、蛍光標識したＣＤ１９＋抗体を用いてヒトＢ細胞の循環レベルについてフローサイトメトリーによって解析した。
【図１８】ＣＤ１６に特異的なＶｈｈラクダＪ鎖のウエスタンブロットである。
【図１９】修飾Ｊ鎖についてのＩｇＭ抗体標識及びエフェクター細胞標的のリストである。表の左欄に載せたＩｇＭ抗体標的のいずれかを右欄に載せた修飾Ｊ鎖標的のいずれかと組み合わせることができる。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
Ｉ．定義
本発明がさらに詳細に記載される前に、本発明は記載される特定の実施形態に限定されないので、当然変化してもよいことが理解されるべきである。本発明の範囲は添付のクレームによってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の実施形態のみを記載する目的のためのものであって、限定を意図するものではないことも理解されるべきである。
【００４８】
値の範囲が提供される場合、その範囲及び他の述べられた範囲の上限と下限の間で文脈が明瞭に指示しない限り下限の１０分の１までの介在する各値またはその述べられた範囲における介在する値は本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのさらに小さい範囲の上限及び下限は、本発明の範囲内に包含され、述べられた範囲における具体的に排除される限界の対象となるさらに小さい範囲に独立して含まれてもよい。
【００４９】
定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は本発明が属する技術における当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９４）は本出願で使用される用語の多くに対する一般的な指針を当業者に提供している。
【００５０】
本明細書で言及される出版物はすべて参照によって明白に本明細書に組み入れられ、どの出版物が引用されるのかと併せて方法及び／または材料を開示し、記載する。
【００５１】
用語「抗体」には、モノクローナル抗体（免疫グロブリンのＦｃ領域を有する完全長の抗体を含む）、単鎖分子、と同様に抗体断片（たとえば、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２，及びＦｖ）が含まれる。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は本明細書では「抗体」と相互交換可能に使用される。基本的な４鎖抗体単位は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成されるヘテロ四量体の糖タンパク質である。言及されない限り、用語「抗体」は本明細書では広義で使用され、具体的には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥの抗体及びそれらの断片、好ましくは抗原結合断片を含む、抗体のすべてのアイソタイプ、サブクラス及び形態が含まれる。本明細書で好まれる抗体には、ＩｇＭ抗体及びＩｇＡ抗体及びその抗原結合断片が挙げられ、たとえば、ＩｇＧのような他のアイソタイプ配列を含んでキメラ抗体を作出するように修飾されてもよい。
【００５２】
ＩｇＧの場合、４鎖単位は一般に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は１つのジスルフィド共有結合によってＨ鎖に連結される一方で、２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じて１以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。各Ｈ鎖及びＬ鎖は定期的に間隔を空けた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖はＮ末端で可変ドメイン（ＶＨ）を有し、α鎖及びγ鎖のそれぞれについては３つの定常ドメイン（ＣＨ）が続き、μ及びεアイソタイプについては４つのＣＨドメインが続く。各Ｌ鎖はＮ末端で可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他の末端で定常ドメインが続く。ＶＬはＶＨと並び、ＣＬは重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）と並ぶ。特定のアミノ酸残基が重鎖及び軽鎖の可変ドメイン間の界面を形成すると考えられる。ＶＨとＶＬの対合は一緒に単一の抗原結合部位を形成する。
【００５３】
ＩｇＭは複数の免疫グロブリンがジスルフィド結合によって一緒に共有結合するポリマーを形成する糖タンパク質である。ＩｇＭはほとんど五量体として存在するが、六量体としても存在するので１０〜１２の抗原結合部位を含有する。五量体の形態は通常、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドを含有するが、Ｊ鎖の非存在下で作製することもできる。五量体のＩｇＭ分子は約９７０ｋＤａの分子量を有する。そのポリマーの性質の故に、ＩｇＭは高い結合活性を持ち、補体の活性化で特に有効である。ＩｇＧとは異なって、ＩｇＭ単量体の重鎖は１つの可変ドメインと４つの定常ドメインで構成される。ＩｇＭの定常ドメインは本明細書ではＣＭ１またはＣμ１、ＣＭ２またはＣμ２、ＣＭ３またはＣμ３、及びＣＭ４またはＣμ４と名付け、その際、「ＣＭ」と「Ｃμ」は相互交換可能に使用される。ＩｇＭ五量体の構造を図１にて説明する。
【００５４】
用語「ＩｇＭ」は本明細書では広義で使用され、具体的には、単一特異性のＩｇＭ分子、及び、たとえば、その開示が明白に参照によって本明細書に組み入れられるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５４０７９にて開示された多重特異性ＩｇＭ結合分子のような多重特異性（二重特異性を含む）ＩｇＭ分子を含む。
【００５５】
用語「ＩｇＭ結合単位」または「ＩｇＭ抗体結合単位」は広義で使用され、具体的には、関連する抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を伴ったまたは伴わない、標的（たとえば、抗原）に結合する可変ドメイン配列（ＶＨ）に融合された少なくとも１つのＣＭ４定常ドメインを含むＩｇＭ抗体重鎖定常領域のポリペプチドを対象にする。
【００５６】
用語「二重特異性ＩｇＭ結合単位」または「二重特異性ＩｇＭ抗体結合単位」は広義で使用され、具体的には、関連する抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を伴ったまたは伴わない、各可変ドメイン配列が異なる標的に結合する可変ドメイン配列（ＶＨ）に融合された少なくとも１つのＣＭ４定常ドメインを含むＩｇＭ抗体重鎖定常領域のポリペプチドの対を対象にする。一実施形態では、二重特異性ＩｇＭ抗体は２つのＶＨＶＬ抗原結合領域を含み、それぞれが１つの抗原上の異なるエピトープまたは２つの異なる抗原上のエピトープに結合することができる。二重特異性ＩｇＭ抗体結合単位は単一種の完全長であることができ、またはキメラ化若しくはヒト化されることができる。本発明の二重特異性ＩｇＭ抗体は５又は６の二重特異性ＩｇＭ結合単位を含む五量体または六量体の環構造を有する。
【００５７】
用語「多重特異性ＩｇＭ」は本明細書では広義で使用され、２以上の結合特異性を持つＩｇＭ抗体を指す。従って、用語「多重特異性」には、それぞれ異なる抗原（ＡＡ、ＢＢ）に結合する少なくとも２つの単一特異性を含む、またはそれぞれ２つの異なる抗原（ＡＢ、ＡＢ）に結合する５または６の二重特異性サブユニットを含むＩｇＭ五量体を含む、二重特異性の、たとえば、二重特異性の抗体または二重特異性の結合単位が含まれる。従って、二重特異性の及び多重特異性のＩｇＭ五量体には、５つの同一の二重特異性結合単位、単一特異性ＩｇＭ結合単位が含まれてもよく、それらの少なくとも２つは異なる結合特異性またはそれらの組み合わせを有する。
【００５８】
「完全長のＩｇＭ抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向にて抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と抗体定常重鎖定常ドメイン１（ＣＭ１またはＣμ１）と抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＭ２またはＣμ２）と抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＭ３またはＣμ３）と抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＭ４またはＣμ４）とから成るポリペプチドである。本明細書で定義されるような二重特異性の完全長ＩｇＭ抗体は、それぞれ２つの抗原結合部位を持ち、２つの異なる結合標的（エピトープ）に特異的に結合する５または６の単量体（結合単位）を含む。完全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端は、重鎖または軽鎖のＣ末端での最後のアミノ酸を意味する。完全長抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端は重鎖または軽鎖のＮ末端での最初のアミノ酸を意味する。
【００５９】
ネイティブＩｇＡは２つの同一の軽鎖（κまたはλ）と２つの同一の重鎖（α）を含む四量体タンパク質である。ヒトでは、２つのＩｇＡアイソタイプ、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２がある。ＩｇＡはＩｇＧに似て、Ｃα１ドメインとＣα２ドメインの間でヒンジ領域を伴って３つの定常ドメイン（ＣＡ１〜ＣＡ３またはＣα１〜Ｃα３）を含有し、その際、「ＣＡ」及び「Ｃα」の記号は相互交換可能に使用される。ＩｇＡアイソタイプはすべて１８アミノ酸の「尾部」を有し、それはＣα３ドメインのＣ末端に位置し、高分子Ｉｇの形成を可能にする（たとえば、Ｇａｒｃｉａ−Ｐａｒｄｏら，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６，１１７３４−１１７３８及びＤａｖｉｓら，１９８８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８，１００１−１００８を参照のこと）。血清ＩｇＡは単量体であるが、重合することもできる。分泌型では、ＩｇＡは、尾部を含んでもよい及び分泌成分によって会合されてもよい、Ｊ鎖によって連結された２〜５の基本４鎖単位を含む。尾部、二量体ＩｇＡ及び分泌成分と会合した分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）の構造を図２で説明する。ＩｇＡ抗体はさらにＩｇＡ１及びＩｇＡ２のサブクラスに分けることができる。用語「ＩｇＡ」抗体を本明細書で用いて具体的に、分泌成分を伴った及び伴わない二量体または多量体の形態を含むサブクラスすべて、すなわち、ＩｇＡ１抗体及びＩｇＡ２抗体、と同様にそのような抗体の断片、好ましくは抗原結合断片を含める。本発明の目的で、ＩｇＡ抗体は好ましくは二量体であり、その際、２つの尾部はＪ鎖によって接続される（図２を参照のこと）。
【００６０】
用語「ＩｇＡ」は本明細書では広義で使用され、具体的には、単一特異性のＩｇＡ分子及び、たとえば、その開示全体が明白に参照によって本明細書に組み入れられるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１５２６８号にて開示された多重特異性ＩｇＡ結合分子のような多重特異性ＩｇＡ分子が含まれる。
【００６１】
用語「多重特異性ＩｇＡ」は本明細書では広義で使用され、２以上の結合特異性を持つＩｇＡ抗体を指す。従って、用語「多重特異性」には、それぞれ異なる抗原（ＡＡ、ＢＢ）に結合する２つの単一特異性サブユニット、またはそれぞれ２つの異なる抗原（ＡＢ、ＡＢ）に結合する２つの二重特異性サブユニットを含むＩｇＡ二量体を含む「二重特異性の」、たとえば、二重特異性抗体または二重特異性の結合単位が含まれる。
【００６２】
一実施形態では、二量体の多重特異性ＩｇＡ分子は２つの単一特異性結合単位から成り、各結合単位は異なる結合標的（ＡＡ、ＢＢ）に対して結合特異性を有する。別の実施形態では、二量体ＩｇＡ分子にて、２つの結合単位の少なくとも一方が２つの異なる結合特異性（すなわち、二重特異性である、たとえば、ＡＡ、Ａ、ＢまたはＡＡ、ＢＣ）を有する。別の実施形態では、２つの結合単位のそれぞれが２つの特異性を有し、それは同一（ＡＢ、ＡＢ）であってもよいし、または異なっていてもよい（たとえば、ＡＣ、ＣＤまたはＡＢ、ＡＣ）。
【００６３】
用語「二重特異性ＩｇＡ抗体の結合単位」は広義で使用され、具体的には、関連する抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を伴ったまたは伴わない、各可変ドメイン配列が異なる標的に結合する、可変ドメイン配列（ＶＨ）に融合された少なくとも１つのＣＡ３定常ドメインを含むＩｇＡ抗体の重鎖定常領域のポリペプチドの対を対象にする。一実施形態では、二重特異性のＩｇＡ抗体は１つの抗原上の異なるエピトープまたは２つの異なる抗原上のエピトープにそれぞれ結合することができる２つのＶＨＶＬ抗原結合領域を含む。二重特異性のＩｇＡ抗体の結合単位は単一種の完全長であることができ、またはキメラ化若しくはヒト化されることができる。
【００６４】
「完全長のＩｇＡ抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端への方向にて抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＡ１またはＣα１）と抗体定常重鎖定常ドメイン２（ＣＡ２またはＣα２）と抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＡ３またはＣα３）とから成るポリペプチドである。本発明に係る二重特異性または多重特異性の完全長ＩｇＡ抗体は、分泌成分を伴ってまたは伴わずにそのそれぞれが単一特異性または二重特異性であってもよい２つの単量体（結合単位）を含む。従って、本発明の多重特異性ＩｇＡ抗体は、得られるＩｇＡ抗体が少なくとも２つの結合特異性を有するという条件で単一特異性の及び二重特異性の結合単位を含んでもよい。完全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端は重鎖または軽鎖のＣ末端での最後のアミノ酸を意味する。完全長抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端は重鎖または軽鎖のＮ末端での最初のアミノ酸を意味する。
【００６５】
抗体の様々なクラスの構造及び特性のさらなる詳細については、たとえば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第８版，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ  Ｉ．Ｔｅｒｒ及びＴｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（編），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，１９９４，７１ページ及び第６章を参照のこと。
【００６６】
用語「界面」は本明細書で使用されるとき、第２のＩｇＭ重鎖定常領域における１以上の「接触」アミノ酸残基（または他の非アミノ酸基）と相互作用する第１のＩｇＭ重鎖定常領域における「接触」アミノ酸残基（または他の非アミノ酸基、たとえば、糖質基）を含む領域を指す。
【００６７】
用語「非対称性の界面」は、２つの抗体鎖の間、たとえば、第１と第２のＩｇＭ重鎖定常領域の間、及び／またはＩｇＭ重鎖定常領域とそれに対応する軽鎖の間で形成される界面（上文で定義されたような）を指すのに使用され、第１の鎖と第２の鎖における接触残基は設計によって異なり、相補性の接触残基を含む。非対称性の界面は、ノブ／ホール相互作用及び／または塩架橋カップリング（電荷交換）によって、及び／または当該技術で既知の他の技法、たとえば、μ重鎖をそれに対応する軽鎖にカップリングするＣｒｏｓｓＭａｂ法によって創り出すことができる。
【００６８】
「空洞」または「ホール」は、第２のポリペプチドの界面からくぼみを作る少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指すので、第１のポリペプチドの隣接界面上での対応する突出部（「ノブ」）を収容する。空洞（ホール）は元々の界面に存在してもよいし、または合成で導入されてもよい（たとえば、界面をコードする核酸を変えることによって）。通常、第２のポリペプチドの界面をコードする核酸が変更されて空洞をコードする。これを達成するには、第２のポリペプチドの界面における少なくとも１つの「元々の」アミノ酸残基をコードする核酸を、元々のアミノ酸残基よりも小さな側鎖容量を有する少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基をコードするＤＮＡで置き換える。１を超える元々の残基及び対応する移入残基があり得ることが十分に理解されるであろう。置き換えられる元々の残基の数の上限は第２のポリペプチドの界面における残基の総数である。空洞の形成に好まれる移入残基は普通、天然に存在するアミノ酸残基であり、好ましくはアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、及びグリシン（Ｇ）から選択される。最も好まれるアミノ酸残基はセリン、アラニンまたはスレオニンであり、最も好ましくはアラニンである。好まれる実施形態では、突出部の形成のための元々の残基は、たとえば、チロシン（Ｙ）、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）のように大きな側鎖容量を有する。
【００６９】
「元々の」アミノ酸残基は、元々の残基よりも小さいまたは大きい側鎖容量を有することができる「移入」残基によって置き換えられるものである。移入アミノ酸残基は天然に存在するアミノ酸残基または天然に存在しないアミノ酸残基であることができるが、好ましくは前者である。
【００７０】
「天然に存在しない」アミノ酸残基によって意味されるのは、遺伝子コードによってコードされないが、ポリペプチド鎖にて隣接アミノ酸残基を共有結合することができる残基である。天然に存在しないアミノ酸残基の例は、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン及び、たとえば、Ｅｌｌｍａｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）にて記載されたもののような他のアミノ酸残基の類似体である。そのような天然に存在しないアミノ酸残基を生成するには、Ｎｏｒｅｎら．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２（１９８９）及びＥｌｌｍａｎら、上記、の手順を使用することができる。手短には、これには、天然に存在しないアミノ酸残基でサプレッサｔＲＮＡを化学的に活性化し、その後そのＲＮＡの試験管内の転写及び翻訳を行うことが含まれる。本発明の方法には、特定の実施形態では、ＩｇＭ重鎖における少なくとも１つの元々のアミノ酸残基を置き換えることが関与するが、１を超える元々の残基を置き換えることができる。通常、第１または第２のポリペプチドの界面における全残基までが置き換えられる元々のアミノ酸残基を含むであろう。置き換えについて好まれる元々の残基は「埋め込まれる」。「埋め込まれる」によって意味されるのは、残基が本質的に溶媒にアクセスできないことである。好まれる移入残基は考えられる酸化またはジスルフィド結合の誤対合を防ぐためにシステインではない。
【００７１】
突出部は、それぞれ第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの界面上の突出部及び空洞の空間的な位置と突出部及び空洞のサイズが凄いので、界面にて第１及び第２のポリペプチドの正常な会合を有意に乱すことなく突出部が空洞内に位置することができることを意味する空洞にて「位置決め可能である」。たとえば、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、及びＴｒｐのような突出部は通常、界面の軸から垂直に伸びず、好まれる構成を有するので、対応する空洞との突出部の位置合わせは、たとえば、Ｘ線結晶学または核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって得られるもののような三次元構造に基づいて突出部／空洞の対をモデル化することに頼る。このことは、分子モデル化の技法を含む当該技術で広く受け入れられている技法を用いて達成することができる。
【００７２】
「元々の核酸」によって意味されるのは、「変化させて」（すなわち、遺伝子操作してまたは変異させて）突出部または空洞をコードすることができる対象とするポリペプチドをコードする核酸である。元々の核酸または出発核酸は天然に存在する核酸であってもよく、または事前の変化に供された（たとえば、ヒト化抗体断片）核酸を含んでもよい。核酸を「変化させること」によって意味されるのは、元々の核酸が対象とするアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンを挿入する、欠失させるまたは置換することによって変異させられることである。通常、元々の残基をコードするコドンは移入残基をコードするコドンによって置き換えられる。この方法でＤＮＡを遺伝子操作する技法は、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｅｄ．，（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ．（１９９１）にて概説されており、それには、たとえば、部位特異的変異誘発、カセット変異誘発及びポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）変異誘発が挙げられる。
【００７３】
突出部または空洞は、合成手段によって、たとえば、組換え法、試験管内ペプチド合成、以前記載された天然に存在しないアミノ酸残基を導入する技法によって、ペプチドの酵素的若しくは化学的カップリング、またはこれらの技法の幾つかの組み合わせによって第１のまたは第２のポリペプチドの界面に「導入する」ことができる。従って、「導入される」突出部または空洞は「天然に存在しない」または「非ネイティブであり」、それは、自然界または元々のポリペプチドに存在しないことを意味する（たとえば、ヒト化モノクローナル抗体）。
【００７４】
好ましくは、突出部を形成するための移入アミノ酸残基は相対的に少数の「回転異性体」（たとえば、約３〜６）を有する。「回転異性体」はアミノ酸側鎖のエネルギー上好都合な構成である。種々のアミノ酸残基についての回転異性体の数は、Ｐｏｎｄｅｒｓ及びＲｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９３：７７５−７９１（１９８７）にて概説されている。
【００７５】
特に述べられない限り、用語「抗体」には具体的に、天然に存在する変異体を含む、ヒト及び非ヒトのネイティブＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＭ抗体が含まれる。従って、たとえば、ヒトのＩｇＭ配列はＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ１４９４０．１のもとで利用可能である一方で、変異体はＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＢ３７８３８．１、ＣＡＣ２０４５８．１、ＡＦＭ３７３１２．１、Ｘ５７３３１．１及びＪ００２６０．１として報告されている。
【００７６】
ポリペプチド（たとえば、抗体またはＪ鎖）を参照した用語「ネイティブの」は、その調製法にかかわらず、自然界に存在する配列を有するポリペプチドを指すのに本明細書で使用される。従って、用語「ネイティブの」及び「ネイティブ配列」は本明細書では相互交換可能に使用され、自然界で見いだされる配列を持つ組換えポリペプチドを明白に包含する。
【００７７】
用語「ネイティブ配列のＪ鎖」または「ネイティブＪ鎖」は本明細書で使用されるとき、そのアミノ酸配列が図３（配列番号１）で示される成熟ヒトＪ鎖、及び限定しないで、図４で示される配列番号２〜４４のネイティブ配列のＪ鎖ポリペプチドまたは図５で示されるコウモリＪ鎖ポリペプチド（配列番号４５）を含む非ヒト動物種のＪ鎖を含む任意の動物種のネイティブ配列のＩｇＭ抗体またはＩｇＡ抗体のＪ鎖を指す。
【００７８】
用語「修飾Ｊ鎖」は、ネイティブ配列に導入された外来性の結合部分を含むネイティブ配列Ｊ鎖ポリペプチドの変異体を指すのに本明細書で使用される。導入は、外来性の結合部分の直接的なまたは間接的な融合を含む任意の手段によって、または化学リンカーを介した連結によって達成することができる。用語「修飾されたヒトＪ鎖」は、限定しないで具体的に、結合部分の導入によって修飾された配列番号１のアミノ酸配列のネイティブ配列ヒトＪ鎖を包含する。その用語は限定しないで具体的に、ＩｇＭまたはＩｇＡの効率的な重合（二量体化）及びそのようなポリマー（二量体）の標的への結合を妨害しない外来性の結合部分の導入によって修飾された配列番号１のアミノ酸配列のネイティブ配列ヒトＪ鎖を包含する。
【００７９】
用語「結合部分」は、本明細書では広義で使用されて、抗原のような標的への特異的な結合が可能である任意の化学的実体を包含する。結合部分の例には限定しないで、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体／薬剤の結合体、抗体様分子、抗体様分子の抗原結合断片、可溶性タンパク質及び膜結合型タンパク質、リガンド、受容体、ウイルス様粒子、タンパク質毒素、酵素、及び代替足場が挙げられる。好まれる結合部分は、好ましくは生物機能を持つポリペプチド（ペプチドを含む）である。例となる生物機能は、たとえば、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のようなエフェクター細胞に結合し、活性化する結合部分の能力である。
【００８０】
用語「ポリペプチド」は、本明細書では広義で使用され、ペプチド配列を含む。用語「ペプチド」は一般に、ペプチド結合によって共有結合した約６０までの、好ましくは約３０までのアミノ酸を含有するアミノ酸の線状分子鎖を記載する。
【００８１】
「結合部分」を参照した用語「外来性の」は、同一位置での参照のネイティブポリペプチド配列には存在しない結合部分を指すのに本明細書で使用される。従って、外来性のポリペプチド配列（ペプチド配列を含む）は、対応するが、異なる位置で対応するネイティブ配列の範囲内に含まれる可能性がある。好まれる実施形態では、「外来性の」配列はどの位置でも対応するネイティブ配列には存在しない。
【００８２】
用語「モノクローナル抗体」は本明細書で使用されるとき、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、軽微な量で存在してもよい考えられる天然に存在する突然変異を除いて集団を構成する個々の抗体は同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に向けられ、高度に特異的である。さらに、通常、様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられる。修飾語「モノクローナル」は抗体の実質的に均質な集団から得られるような抗体の特徴を示し、特定の方法による抗体の作出を必要とすると解釈されるべきではない。たとえば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒら．（１９７５），Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよいし、または組換えＤＮＡ法（たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製されてもよい。モノクローナル抗体は、たとえば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら．（１９９１），Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８及びＭａｒｋｓら．（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７にて記載された技法を用いてファージ抗体ライブラリから単離されてもよい。
【００８３】
本明細書のモノクローナル抗体には具体的には、それらが所望の生物活性を示す限り、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種に由来する抗体における対応する配列と同一であるまたは相同である一方で、鎖の残りが別の種に由来する抗体における対応する配列と同一であるまたは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、及びそのような抗体の断片が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎら．（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５）。
【００８４】
非ヒト（たとえば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する抗体である。ほとんどは、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）の超可変領域の残基が、所望の特異性、親和性及び容量を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域の残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基も対応する非ヒト残基で置き換えられる。さらに、ヒト化抗体はレシピエント抗体及びドナー抗体で見いだされない残基を含んでもよい。これらの修飾を行って抗体の性能をさらに改良する。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、超可変ループの実質的にすべては非ヒト免疫グロブリンのそれらに相当し、ＦＲ領域の実質的にすべてはヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は任意で、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）、通常ヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部も含むであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら．（１９８６），Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら．（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９；及びＰｒｅｓｔａ（１９９２），Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６を参照のこと。
【００８５】
本明細書の「単離された」抗体は、組換え宿主細胞におけるその自然環境の成分から特定され、分離され、及び／または回収されているものである。その自然環境の混入成分は、抗体についての診断上または治療上の使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様または非タンパク質様の溶質、と同様に製造の望ましくない副産物が含まれ得る。好まれる実施形態では、本明細書の単離された抗体は、（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法若しくはＳＥＣ−ＨＰＬＣ法によって測定した際、９５重量％を超えて、若しくは９８重量％を超えて、若しくは９９重量％を超えて精製され、（２）アミノ酸シークエンサーの使用によってＮ末端若しくは内部アミノ酸の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に精製され、または（３）クマシーブルー染色、若しくは好ましくは銀染色を用いた還元性若しくは非還元性の条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性まで精製されるであろう。普通、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程によって調製されるであろう。
【００８６】
用語「特異的な結合」または「〜に特異的に結合する」または「〜に特異的な」は、特定のポリペプチド、ペプチドまたは他の標的（たとえば、糖タンパク質標的）上の結合標的に対する結合部分の結合、たとえば、標的抗原、たとえば、エピトープに対する抗体の結合を指し、非特異的な相互作用（たとえば、非特異的な相互作用はウシ血清アルブミンまたはカゼインに対する結合であってもよい）とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的な結合は、たとえば、対照分子に対する結合と比べて結合部分または抗体または結合部分の導入によって修飾された抗体の標的分子に対する結合を決定することによって測定することができる。たとえば、特異的な結合は、標的に類似する対照分子、たとえば、過剰な非標識の標的との競合によって決定することができる。この場合、標識された標的のプローブへの結合が過剰な非標識の標的によって競合的に阻害されれば特異的な結合が示される。特定のポリペプチド標的上の特定のポリペプチドまたはエピトープに対する用語「特異的な結合」または「〜に特異的に結合する」または「〜に特異的な」は本明細書で使用されるとき、たとえば、少なくとも約２００ｎＭ、代わりに少なくとも約１５０ｎＭ、代わりに少なくとも約１００ｎＭ、代わりに少なくとも約６０ｎＭ、代わりに少なくとも約５０ｎＭ、代わりに少なくとも約４０ｎＭ、代わりに少なくとも約３０ｎＭ、代わりに少なくとも約２０ｎＭ、代わりに少なくとも約１０ｎＭ、代わりに少なくとも約８ｎＭ、代わりに少なくとも約６ｎＭ、代わりに少なくとも約４ｎＭ、代わりに少なくとも約２ｎＭ、代わりに少なくとも約１ｎＭ以上の標的に対するＫｄを有する分子によって示すことができる。特定の例では、用語「特異的な結合」は、分子が他のどんなポリペプチドまたはポリペプチドエピトープにも実質的に結合することなく、特定のポリペプチド上の特定のポリペプチドまたはエピトープに結合する結合を指す。
【００８７】
「結合親和性」は、分子（たとえば、抗体）の単一の結合部位とその結合相手（たとえば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総計の強さを指す。特に指示されない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」は、結合対（たとえば、抗体と抗原）のメンバー間での１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘのその相手Ｙに対する親和性は一般に解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。たとえば、Ｋｄは約２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭまたはさらに強力であることができる。親和性は本明細書で記載されるものを含む、当該技術で既知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性の抗体は一般にゆっくり抗原を結合し、解離し易い傾向があるのに対して、高親和性の抗体は一般に迅速に抗原を結合し、長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法が当該技術で既知である。
【００８８】
本明細書で使用されるとき、「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、抗体と標的の対にとって適した技法によって、たとえば、表面プラスモン共鳴アッセイを用いて、たとえば、約１０の反応単位（ＲＵ）で不動化した抗原ＣＭ５チップと共に２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いて測定される解離定数を指す。
【００８９】
用語「結合する」、「結合された」及び「結合」は共有結合または非共有結合の形態のいずれか及びすべてを指し、限定しないで直接的な遺伝子融合または化学融合、リンカーまたは架橋剤を介したカップリング、及び非共有結合性会合が含まれる。
【００９０】
用語「融合」は、コーディングヌクレオチド配列のインフレームでの組み合わせによる１つのポリペプチド鎖における異なる起源のアミノ酸配列の組み合わせを指すのに本明細書で使用される。用語「融合」は、その末端の一方への融合に加えて、ポリペプチド鎖の中での内部融合、すなわち、異なる起源の配列の挿入を明白に包含する。用語「融合」は異なる起源のアミノ酸配列の組み合わせを指すのに本明細書で使用される。
【００９１】
用語「原子価の」は本明細書で使用されるとき、抗体における特定された数の結合部位の存在を示す。そのようなものとして、用語「２価」、「４価」及び「６価」はそれぞれ、２つの結合部位、４つの結合部位及び６つの結合部位の存在を示す。従って、本発明に係る二重特異性ＩｇＡ抗体にて各結合単位が２価であるならば、二重特異性ＩｇＡ抗体は４の価数を有するであろう。
【００９２】
用語「エピトープ」には、抗体に対する特異的な結合が可能である分子決定基が含まれる。特定の実施形態では、エピトープ決定基には、たとえば、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルのような分子の化学的に活性のある表面分類が挙げられ、特定の実施形態では、特定の三次元構造特性及び／または特定の電荷特性を有してもよい。エピトープは抗体が結合する抗原の領域である。「結合領域」は結合分子が結合する結合標的上の領域である。
【００９３】
「ポリエピトープ特異性」は同一のまたは異なる標的上の２以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。「単一特異性」は１つだけのエピトープを結合する能力を指す。一実施形態によれば、二重特異性ＩｇＭ抗体は少なくとも１０−７Ｍまたは１０−８Ｍのまたはさらに良好な親和性で各エピトープに結合する。
【００９４】
用語「標的」または「結合標的」は広義で使用され、具体的にはそれらが自然界で存在するような生物機能を伴ったまたは伴わないポリペプチド、限定しないで核酸、糖質、脂質、細胞及び他の分子が含まれる。
【００９５】
用語「抗原」は、抗体に結合することができる、または細胞性の免疫応答を引き起こすことができる実体またはその断片を指す。免疫原は、生物で、特に動物で、さらに特にヒトを含む哺乳類で免疫応答を引き起こすことができる抗原を指す。用語、抗原には上記で定義されたような抗原決定基またはエピトープとして知られる領域が含まれる。
【００９６】
本明細書で使用されるとき、用語「免疫原性の」は、抗体の産生を引き出す、及び／またはＴ細胞及び／または免疫原の抗原に向けられた他の反応性免疫細胞を活性化する物質を指す。
【００９７】
本発明の抗体の「抗原結合部位」または「抗原結合領域」は通常、抗原に対する結合部位の親和性に種々の程度で寄与する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。３つの重鎖可変ドメインのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）及び３つの軽鎖可変ドメインのＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）がある。ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）の範囲は、抗体／抗原複合体からの配列及び／または構造の情報の間での変動性に従ってそれらの領域が定義されているアミノ酸配列の編集されたデータベースへの比較によって決定される。本発明の範囲の中に含められるのはまた、わずかなＣＤＲで構成される機能的な抗原結合部位である（すなわち、結合特異性が３、４または５のＣＤＲによって決定される）。６つのＣＤＲの完全なセットに満たないものが一部の結合標的への結合に十分であってもよい。従って、一部の例では、ＶＨまたはＶＬだけのＣＤＲで十分であろう。さらに特定の抗体は抗原に対してＣＤＲに関連しない結合部位を有してもよい。そのような結合部位は本発明の範囲内に具体的に含められる。
【００９８】
用語「宿主細胞」は本出願で使用されるとき、本発明に係る抗体を生成するように操作することができる任意の種類の細胞系を示す。一実施形態では、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞が宿主細胞として使用される。
【００９９】
本明細書で使用されるとき、表現「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」は相互交換可能に使用され、そのような表現のすべてには子孫が含まれる。従って、単語「形質転換体」及び「形質転換された細胞」には、移行の数にはこだわらずに一次対象細胞及びそれらに由来する培養物が含まれる。故意のまたは故意ではない突然変異のために子孫すべてがＤＮＡ内容で正確に同一であるわけではないことも理解される。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされたものと同じ機能または生物活性を有する変異体子孫は包含される。
【０１００】
別の核酸配列と機能的な関係で配置される場合、核酸は「操作可能に連結される」。たとえば、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるのであれば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡがポリペプチドのＤＮＡに操作可能に連結され；それが配列の転写に影響を与えるのであれば、プロモータまたはエンハンサがコーディング配列に操作可能に連結され；それが翻訳を促進するように位置づけられるのであれば、リボソーム結合部位がコーディング配列に操作可能に連結される。一般に、「操作可能に連結される」は、連結されるＤＮＡ配列が隣接し、分泌リーダーの場合、隣接して読み取りフレーム内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサは隣接しなくてもよい。連結は利便性のある制限部位におけるライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しないならば、従来の慣例に従って合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーが使用される。
【０１０１】
詳細な説明
修飾Ｊ鎖を持つ抗体の設計及び作出
ＩｇＭは、抗原による刺激に応答してＢ細胞によって産生される最初の免疫グロブリンであり、５日間の半減期で血清中にて１．５ｍｇ／ｍＬ前後で存在する。ＩｇＭは五量体または六量体の分子である。ＩｇＧと全く同じように、ＩｇＭの単量体は２つの軽鎖と２つの重鎖から成る。しかしながら、ＩｇＧが３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含有する一方で、ＩｇＭの重（μ）鎖は、ＩｇＥのε重鎖に類似してさらに第４の定常ドメイン（ＣＨ４）を含有する。この追加の定常ドメインは、ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体のＦｃドメインに比べて抗原結合Ｆａｂドメインの回転自由度に関与するＩｇＧ及びＩｇＡのプロリンが豊富なヒンジ領域の代わりに位置する。
【０１０２】
５つのＩｇＭ単量体は追加の小さなポリペプチド鎖（Ｊ鎖）と複合体を形成し、ネイティブＩｇＭ分子を形成する。Ｊ鎖は、ＩｇＭが抗体産生細胞から分泌される前にμ鎖の重合を促進すると見なされている。ＩｇＭの結晶化は悪評の高い難題であることが判明している一方で、Ｃｚａｊｋｏｗｓｋｙ及びＳｈａｏ（ＰＮＡＳ，１０６（３５）：１４９６０−１４９６５，２００９）は最近、ＩｇＥのＦｃドメインの構造と既知のジスルフィド対合に基づいてＩｇＭの相同性に基づく構造モデルを公開した。著者らは、ヒトＩｇＭ五量体は曲げバイアスを伴ったキノコ形状の分子であることを報告している。ＩｇＭ重（μ）鎖は５つのＮ結合グリコシル化部位：Ａｓｎ−１７１、Ａｓｎ−３３２、Ａｓｎ−３９５、Ａｓｎ−４０２及びＡｓｎ−５６３を含有する。
【０１０３】
ほとんどの哺乳類の粘膜からの分泌物に存在する主要なクラスの抗体としての免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）は吸入された及び摂取された病原体による侵襲に対する防御の重要な最前線を表す。ＩｇＡは多数の種の血清でも有意な濃度で見いだされ、それは、粘膜表面を破壊している病原体の除去に介在する副次的な防御手段として機能する。ＩｇＡのＦｃ領域に特異的な受容体であるＦｃαＲはＩｇＡのエフェクター機能の重要なメディエータである。ヒトＩｇＡは、２つのサブクラスＩｇＡ１及びＩｇＡ２を生じる２つの異なるＩｇＡ重鎖定常領域（Ｃα）の遺伝子を有してもよい。ＩｇＡ１とＩｇＡ２との間での主な差異は、２つのＦａｂアームとＦｃ領域との間にあるヒンジ領域に存在する。ＩｇＡ１は、ＩｇＡ２には存在しないアミノ酸の重複ストレッチの挿入のために伸びたヒンジ領域を有する。ＩｇＡは二量体を形成する容量を有し、それぞれ２つの重鎖と軽鎖を含む２つの単量体単位は、ジスルフィド架橋とＪ鎖の組み込みとによって安定化される端から端までの構成で配置されると仮定されている。粘膜部位で局所的に産生される二量体ＩｇＡは上皮細胞の境界を越えて、高分子免疫グロブリン受容体（ｐＩｇＲ）との相互作用によって分泌物に輸送される。この過程の間に、ｐＩｇＲは切断され、分泌成分（ＳＣ）と呼ばれる主要な断片はＩｇＡ二量体と共有結合するようになる。
【０１０４】
ＩｇＡ及びＩｇＭは双方とも、Ｃ末端で「尾部」（ｔｐ）と呼ばれる１８アミノ酸の伸長を持つ。ＩｇＭの尾部（μｔｐ）及びＩｇＡの尾部（αｔｐ）は７つのアミノ酸位置で異なる。ＩｇＭ及びＩｇＡの尾部は種々の動物種の間で高度に保存されている。ＩｇＡ及びＩｇＭの尾部における保存された最後から２番目のシステイン残基は重合に関与することが実証されている。双方の尾部はＮ結合の糖質付加部位を含有し、その存在は、ＩｇＡにおける二量体形成及びＪ鎖の組み込み及びＩｇＭにおける五量体形成に必要とされる。しかしながら、尾部におけるＮ結合糖質の構造及び組成が異なるということは、グリコシルトランスフェラーゼによるプロセッシングへのグリカンのアクセスのしやすさにおける差異を示唆している。
【０１０５】
ヒト、及び種々の脊椎動物種、たとえば、ウシ、マウス、鳥類、両生類、及びウサギのＪ鎖のヌクレオチド配列及び／またはタンパク質配列が報告されている。ヒトＪ鎖は８つのシステイン残基を含有し、２つ（Ｃｙｓ１３及びＣｙｓ６９）はα鎖またはμ鎖（それぞれＩｇＡ及びＩｇＭ）とのジスルフィド架橋に関与し、６つは鎖内ジスルフィド架橋に関与する（Ｃｙｓ１３：Ｃｙｓ１０１、Ｃｙｓ７２：Ｃｙｓ９２、Ｃｙｓ１０９：Ｃｙｓ１３４）。Ｊ鎖の三次元結晶構造は報告されていない。
【０１０６】
本発明は、ＩｇＭ抗体またはＩｇＡ抗体の結合標的に結合する能力を妨害することなく、結合特異性（結合部分）を導入することによってＩｇＭ抗体及びＩｇＡ抗体のＪ鎖を修飾することができるという認識に少なくともある程度基づく。従って、本発明は、ネイティブ配列のＪ鎖、たとえば、配列番号１のネイティブ配列のヒトＪ鎖に導入された結合部分を含む修飾Ｊ鎖に関する。本発明はさらに修飾Ｊ鎖を含む結合分子に関する。結合分子は、たとえば、ＩｇＭ抗体、ＩｇＡ抗体またはＩｇＧ／ＩｇＭ若しくはＩｇＧ／ＩｇＡのハイブリッド抗体であることができ、それは、ＩｇＧの重鎖にてＩｇＭまたはＩｇＡの尾部を含有するので、本発明の修飾Ｊ鎖を組み込み、それとのポリマーを形成する能力を含む、ＩｇＧとＩｇＡまたはＩｇＡの特性を組み合わせてもよい。ＩｇＧ／ＩｇＭ及びＩｇＧ／ＩｇＡのハイブリッド抗体のさらなる詳細については、Ｋｏｔｅｓｗａｒａら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００１，１０１（１）：２１−３１を参照のこと。
【０１０７】
修飾Ｊ鎖は、結合標的または酵素様のプロテイナーゼのような触媒成分に特異的に結合することができるポリペプチド（ペプチドを含む）を含むが、これらに限定されない外来性の結合部分を含む。以前議論したように、結合部分には、限定しないで、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体／薬剤の結合体、抗体／薬剤の結合体の抗原結合断片、抗体様分子、抗体様分子の抗原結合断片、可溶性タンパク質及び膜結合型タンパク質、リガンド、受容体、ウイルス様粒子、タンパク質毒素、酵素のような触媒成分、及び酵素様のプロテイナーゼ及び代替足場が挙げられる。付加の位置、種類（たとえば、直接的な融合または間接的な融合、化学的な連結等）を適当に選択することによって、本開示の教示に従って、任意の種類の結合部分をＪ鎖に導入することができることが強調される。
【０１０８】
好まれる実施形態では、結合部分は、単一特異性の、二重特異性の及び多重特異性の抗体及び抗体断片を含む抗体または抗体の抗原結合断片（「抗体断片」とも呼ばれる）である。用語「抗体断片」は広義で使用され、それには、限定しないで、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、及び（ｓｃＦｖ）２断片、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。好まれる実施形態では、抗体断片はｓｃＦｖである。
【０１０９】
別の好まれる実施形態では、結合部分は、たとえば、ヒトドメイン抗体（ｄＡｂ）、二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）分子、二重特異性抗体、四価二重特異性抗体、二重可変ドメイン抗体、積み上げ可変ドメイン抗体、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）、サロボディ、鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）−ボディ、またはＴａｎｄＡｂのような抗体様分子である。
【０１１０】
結合部分は、たとえば、神経栄養因子、インターロイキン、可溶性分子因子または増殖因子のようなリガンドであってもよい。
【０１１１】
結合分子としての受容体には、イオンチャンネル結合型、Ｇタンパク質結合型、及び酵素結合型の細胞表面受容体が挙げられる。具体例には、限定しないでＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＴＮＦＲ、ＰＤＬ１、及びＣＴＬＡ−４が挙げられる。
【０１１２】
さらに好まれる実施形態では、結合部分は代替足場である。この文脈では、用語「足場」は、特定の標的を結合する能力をタンパク質変異体に付与する変化したアミノ酸または配列の挿入を保有することができるタンパク質フレームワークを記載することにする。タンパク質の代替足場には、限定しないで、ＣＴＬＡ−４、テンダミスタット、フィブロネクチン、ネオカルチノスタチン、リポカリン、Ｔ−細胞受容体、ＣＢＭ４−２、プロテインＡドメイン、ｌｍ９、設計されたＡＲタンパク質、設計されたＴＰＲタンパク質、亜鉛フィンガー、ｐＶＩＩＩ、鳥類膵臓ポリペプチド、ＧＣＮ４、ＷＷドメイン、ＳＲＣ相同性ドメイン２及び３、ＰＤＺドメイン、ＴＥＭ−１、β−ラクタマーゼ、ＧＦＰ、チオレドキシン、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、ＰＨＤ−フィンガー、ｃｌ−２、ＢＰＴＩ、ＡＰＰＩ、ＨＰＳＴＩ、エコチン、ＬＡＣＩ−Ｄ１、ＬＤＴＩ、ＭＴＩ−ＩＩ、サソリ毒素、ノッティン、昆虫デフェンシンＡペプチド、ＥＥＴＩ−ＩＩ、Ｍｉｎ−２３、ＣＢＤ、ＰＢＰ、チトクロームｂ５６２、ＬＤＬ受容体ドメインＡ、γ−クリスタリン、ユビキチン、トランスフェリン、Ｃ−型レクチン様ドメインが挙げられる。好まれる代替足場はダルピン、フィブロネクチンドメイン及びアドネクチンである。さらなる詳細については、Ｂｉｎｚ，ＨＫら，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２３（１０）：１２５７−１２６８を参照のこと。
【０１１３】
レシピエントＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡ分子のその結合標的（単数）または結合標的（複数）への結合を妨害することなく、結合部分のその結合標的への結合を可能にする位置にて結合部分をネイティブＪ鎖配列に導入してもよい。好まれる位置には、Ｊ鎖の三次元構造に基づいてアクセス可能であるＣ末端またはその近傍、Ｎ末端またはその近傍、または内部位置が挙げられる。好まれる実施形態では、結合部分は、Ｃ末端から約１０残基外でまたはＮ末端から約１０残基外でネイティブ配列のＪ鎖に導入され、ネイティブ配列のＪ鎖は好ましくは配列番号１のヒトＪ鎖である。別の実施形態では、結合部分は、配列番号１のシステイン残基９２と１０１の間で配列番号１のネイティブ配列のヒトＪ鎖に、または別のネイティブ配列のＪ鎖の同等の位置で導入される。さらなる実施形態では、結合部分は、グリコシル化部位でまたはその近傍で配列番号１のＪ鎖のようなネイティブ配列のＪ鎖に導入される。最も好ましくは、結合部分は、Ｃ末端から約１０アミノ酸残基以内で配列番号１のネイティブ配列のヒトＪ鎖に導入される。
【０１１４】
導入は、直接的なまたは間接的な融合によって、すなわち、ペプチドリンカーを伴ったまたは伴わない、そのコーディングヌクレオチド配列のインフレーム結合による１つのポリペプチド鎖におけるＪ鎖と結合部分のアミノ酸配列の組み合わせによって達成することができる。ペプチドリンカー（間接的な融合）は使用するならば、たとえば、約１〜５０、または約１〜４０、または約１〜３０、または約１〜２０、または約１〜１０、または約１０〜２０のアミノ酸残基であってもよく、Ｊ鎖配列に導入される結合部分の一方の末端または双方の末端に存在してもよい。好まれる実施形態では、ペプチドリンカーは約１０〜２０または１０〜１５のアミノ酸の長さである。別の好まれる実施形態では、ペプチドリンカーは約１５のアミノ酸の長さである。
【０１１５】
結合部分はまた、それら自体の反応性及び選択性を有する２つの異なる官能基を含有するヘテロ二官能性タンパク質架橋剤を用いて化学結合によってネイティブＪ鎖配列に付加されてもよい。これらの架橋剤は一工程法で使用することができ、またはそれを使用して活性化されたタンパク質を創り出すことができ、それが保存され、別の工程で第２の生体分子と反応できることが多い。従って、たとえば、ヘテロ二官能性の架橋試薬を用いてＪ鎖と結合部分との結合体を形成することができる。反応基には、限定しないで、イミン反応基（たとえば、ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳ）、マレイミド基等が挙げられる。切断可能または切断不可能であり得るそのような架橋剤は、たとえば、ハプテンキャリアタンパク質の形成及び酵素／抗体の結合体の調製で使用されている。化学的に、切断可能な架橋剤には、限定しないで、具体的にジスルフィド系リンカー、ヒドラゾン及びペプチドリンカーが挙げられる。周知の及びよく研究された酵素に不安定なリンカーはバリン／シトルリンリンカーであるが、他のペプチドリンカーも既知であり、好適である。切断できないリンカーの典型的な代表には、たとえば、ＳＭＣＣ（Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート）のようなチオエーテルが挙げられる。さらなる詳細については、たとえば、その開示全体が明白に参照によって本明細書に組み入れられるＤｕｃｒｙ，Ｌ及びＳｔｕｍｐ，Ｂ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０１０，２１：５−１３を参照のこと。さらなる好適なリンカーのリストについては、たとえば、その開示全体が明白に参照によって本明細書に組み入れられるＫｌｅｉｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ；２０１４，２７（１０）：３２５−３３０を参照のこと。
【０１１６】
修飾Ｊ鎖が普通、１つの外来性結合部分を含有する一方で、１を超える結合部分をＪ鎖に導入することも可能である。
【０１１７】
修飾Ｊ鎖は、組換えＤＮＡ技術の周知の技法によって、たとえば、ＣＨＯ細胞または大腸菌のような好適な原核または真核の宿主生物にて修飾Ｊ鎖をコードする核酸を発現させることによって作出されてもよい。従って、修飾Ｊ鎖は、たとえば、Ｓｙｍｅｒｓｋｙら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００，３７：１３３−１４０によって記載されたように大腸菌で発現されてもよい。
【０１１８】
一実施形態では、Ｊ鎖は先ず酵素認識部位の挿入によって修飾され、ペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーによって翻訳後修飾されることができ、リンカーが、たとえば、細胞傷害性小分子のような外来性結合部分をＪ鎖に繋ぎ、抗体／薬剤結合体（ＡＤＣ）を作製することができる。
【０１１９】
修飾Ｊ鎖は、レシピエントＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡ抗体の重鎖及び軽鎖と同時発現させることもできる。その複雑な構造の故に、組換えＩｇＭの大規模な製造は困難であるけれども、Ｃ６グリア細胞、ＣＨＯ細胞及びＨｅＬａ細胞におけるＩｇＭの重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）の同時発現を含む、非リンパ系細胞を用いたＩｇＭのための幾つかの組換え産生系が報告されている（たとえば、ＣＨＯ細胞における発現についてはＷ０８９／０１９７５及びＷｏｏｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５，３０１１−３０１６（１９９０）を参照のこと）。Ｊ鎖を伴ったまたは伴わない、大腸菌におけるＩｇＭモノクローナル抗体の発現は、たとえば、Ａｚｕｍａら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７，１３（９）：２７４５−２７５０にて記載されている。アデノウイルスのＥ１Ａ及びＥ１Ｂのタンパク質を発現している不死化ヒト網膜細胞株におけるＩｇＭの産生は、米国特許出願公開番号２００６００６３２３４にて記載されている。
【０１２０】
レシピエント抗体は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であってもよい。抗体を含む二重特異性及び多重特異性のＩｇＭ及びＩｇＡ結合分子は、たとえば、その内容全体が明白に参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願番号６１／８７４，２７７号及び６１／９３７，９８４号にて記載されている。
【０１２１】
修飾Ｊ鎖を持つ抗体の適用
本発明の修飾Ｊ鎖を含む抗体は幅広い治療応用及び診断応用を有する。
【０１２２】
一実施形態では、修飾Ｊ鎖を含む抗体は、同一可溶性標的、たとえば、ＶＥＧＦ、ＴＮＦαまたはＩＬ６における２以上の部位に結合する。目的は、たとえば、タンパク質上の複数の部位に拮抗すること及び／または所与の標的への結合活性を高めることであってもよい。
【０１２３】
別の実施形態では、本明細書の修飾Ｊ鎖を含む抗体は、たとえば、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）のような同一細胞表面（受容体）標的上の２以上の部位を結合する。従って、たとえば、そのような抗体はＨＥＲ２分子上で４Ｄ５及び２Ｃ４双方のエピトープを標的としてもよい。このアプローチは所与の標的への生体効果及び／または結合活性を高めてもよい。
【０１２４】
さらに別の実施形態では、本発明の修飾Ｊ鎖を含む抗体は、２以上の異なる可溶性標的（球状のタンパク質またはペプチド）、たとえば、ＴＮＦαとＩＬ６、ＶＥＧＦαとＡｎｇ２または２つのサイトカインを結合する。このアプローチは、たとえば、特定の経路をさらに完全に遮断すること；いわゆる「サイトカインストーム」、すなわち、ＣＤ３抗原に対する二重特異性抗体のような特定の多価の二重特異性抗体から生じる望ましくないＴ細胞の活性化の遮断を生じ、または、酵素とその基質、たとえば、第ＩＸａ因子と第Ｘ因子を調和させ得る。具体例には、限定しないで、修飾Ｊ鎖を伴った二重特異性抗体が挙げられ、その際、第１の特異性はＶＥＧＦに向けられ、第２の特異性はＡｎｇ２若しくはＤＬＬ４（抗血管形成）に向けられ、または第１の特異性はＴＮＦに向けられ、第２の特異性はＡｎｇ２若しくはＩＬ−１７（抗炎症特性）に向けられ、いずれかの特異性が、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡ抗体またはその抗原結合断片のＪ鎖に導入されてもよい。
【０１２５】
さらなる実施形態では、修飾Ｊ鎖を含む抗体は、１以上の可溶性標的と１以上の細胞表面の受容体標的、たとえば、血管形成因子及び新血管特異的受容体とを結合してもよい。このアプローチの目的は特定の部位または組織での送達の増加及び遮断であってもよい。
【０１２６】
もっとさらなる実施形態では、修飾Ｊ鎖を含む抗体は、たとえば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）及びＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）のような２以上の異なる細胞表面の受容体標的を結合し、同一のまたは異なる経路を介して複数の標的を阻害するように設計される。これによって、特異性及び選択性の上昇及び／または所与の経路のさらに完全な遮断を生じてもよい。そのような抗体の具体例には、限定しないで修飾Ｊ鎖を伴った二重特異性抗体が挙げられ、その際、一方の特異性はＨＥＲ２に向けられ、別の特異性はＨＥＲ３向けられ；または一方の特異性はＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）に向けられ、別の特異性はＨＥＲ２に向けられる。修飾Ｊ鎖を伴った他の二重特異性のＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は、たとえば、ＥＧＦＲとＨＥＲ３、ＩＬ−１αとＩＬ−１β、ＩＬ−４とＩＬ−１３、Ａｎｇ−２とＶＥＧＦ−Ａ、第ＩＸＡ因子と第Ｘ因子、またはＩＬ−１７ＡとＩＬ−１７Ｆに結合してもよい。
【０１２７】
本発明の修飾Ｊ鎖を含む抗体はまた、１以上の可溶性標的または細胞表面受容体標的と１以上の長滞留時間標的とを、たとえば、ＴＮＦα及び／またはＶＥＧＦと血清アルブミンとを結合するようにも設計されてもよい。これらの分子は、アルブミン特異性を持たない結合分子よりも長い循環半減期を有することが期待される。
【０１２８】
さらなる実施形態では、本明細書の修飾Ｊ鎖を含む抗体は、１以上の可溶性標的と１以上のマトリックスタンパク質及び／または基質、たとえば、ＶＥＧＦαとヒアルロン酸とを結合してもよい。得られる多重特異性の結合分子は、眼内空間におけるその長い滞留時間の故に、たとえば、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）のような眼の状態の抗血管形成療法で有用性が見いだされてもよい。
【０１２９】
修飾Ｊ鎖を含み、且つ１以上の可溶性標的または受容体標的に加えて１以上の輸送体受容体（すなわち、トランスフェリン受容体）を結合する抗体、たとえば、抗トランスフェリン特異性と組み合わせた膠芽細胞腫で見られる抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ（エクソンＩＩＩの欠失を伴った変異体形態）は、脳血管関門を横切る抗体の送達で有用性を見いだすことができる。
【０１３０】
好まれる実施形態では、本明細書のＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭ及びＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は、免疫細胞、たとえば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージまたは好中球に対して結合特異性を持つ修飾Ｊ鎖を含み、病んだ細胞または病原体上で発現される抗原に結合する。ＩｇＭ分子は５つの結合単位を含み、ＩｇＡ分子は２つの結合単位を含む二量体なので、そのような分子はその大きな結合活性の故に二重特異性のＩｇＧ抗体よりも有意に強力である。加えて、エフェクター細胞、たとえば、エフェクターＴ細胞を活性化し、標的とされる病んだ細胞、組織または病原体に向け直すことによって、本明細書のＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭ及びＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は標的に対する免疫応答を誘導し、それによって効能及び有効性をさらに高める。これらの有益な特性の故に、修飾Ｊ鎖を含む本明細書のＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭ及びＩｇＧ／ＩｇＡ抗体はＩｇＧ抗体が低い親和性でその標的に結合する状況で特に有利である。従って、一実施形態では、本明細書のＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭ及びＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は治療用ＩｇＧ抗体の結合ドメインを含んでもよい。
【０１３１】
特定の実施形態では、修飾Ｊ鎖を含む本明細書のＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭ及びＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は癌の治療に使用されてもよい。どんな種類の腫瘍及びどんな種類の腫瘍関連抗原も標的とされてもよいことが十分に理解される。癌の例となる種類には、限定しないで、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、胆嚢癌、乳癌、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頚部の癌、ホジキンリンパ腫、肺癌、甲状腺髄様癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、腎癌、卵巣癌、膵臓癌、神経膠腫、黒色腫、肝臓癌、前立腺癌、及び膀胱癌が挙げられる。しかしながら、技量の有る熟練者は、実際上どんな種類の癌についても腫瘍関連抗原が当該技術で既知であることに気付くであろう。
【０１３２】
本発明のＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡ抗体によって標的とされてもよい腫瘍関連抗原には、限定しないで、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、関連抗原、Ｂａ７３３、ＢＡＧＥ、ＢｒＥ３−抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１ａ、結腸特異抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ１）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥｒｂＢ４（ＨＥＲ３）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ−β、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）及びそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ−１、低酸素症誘導性因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４−抗原、ＫＳ−１−抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ移動阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＡＧ−３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ４抗原、膵臓癌ムチン、ＰＤ−１受容体、胎盤増殖因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ−抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管形成マーカー、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、Ｋｒａｓが挙げられる。
【０１３３】
上記で議論したように、腫瘍学の応用については、修飾Ｊ鎖を含む抗体は、標的とされた癌細胞に対する免疫細胞の殺傷機能をもたらすように設計することができる。従って、たとえば、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡ抗体またはその抗原結合断片のＪ鎖は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のような免疫細胞に対する結合特異性をネイティブＪ鎖に導入することによって修飾することができる一方で、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は、標的細胞、たとえば、上記でリストにした腫瘍関連抗原のいずれかまたはそれ以上を含む、腫瘍細胞の表面上の腫瘍マーカー、たとえば、腫瘍遺伝子に対する結合特異性を提供する。
【０１３４】
Ｔ細胞の場合、分化抗原群３（ＣＤ３）は、Ｔ３複合体として歴史的に知られる多量体タンパク質複合体であり、３対の二量体（εγ、εδ、ζζ）として集合し、機能する４つの異なるポリペプチド鎖（ε、γ、δ、ζ）で構成される。ＣＤ３複合体はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と非共有結合で会合するＴ細胞共受容体として役立つ。このＣＤ３複合体、特にＣＤ３εの成分は腫瘍関連抗原を特異的に結合するＩｇＭ抗体の修飾Ｊ鎖にとっての標的である。エフェクターＴ細胞に特異的な修飾Ｊ鎖は好ましくはＣＤ３（ＣＤ３ε）抗原に結合するけれども、エフェクターＴ細胞上で発現される他の抗原が知られており、修飾Ｊ鎖によって標的とされてもよい。例となるＴ細胞抗原には、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６９及びＣＤ９０が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
ＣＤ３結合特異性を持つ修飾Ｊ鎖を含む例となるＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡ抗体には、腫瘍関連抗原に対する既知のＩｇＧ抗体の結合領域、たとえば、その開示が明白に参照によって本明細書に組み入れられるブリナツモマブ（ＭＴ１０３としても知られる）（抗−ＣＤ１９）、ＣＤ１９ｈＡ１９（抗−ＣＤ１９，米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＰＡＭ４（抗−ムチン，米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（抗−ＣＤ２０，米国特許第７，２５１，１６４号）、ｈＩＭＭＵ３１（抗−ＡＦＰ，米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（抗−ＣＤ７４，米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（抗−ＣＤ２２，米国特許第７，０７４，４０３号）、ｈＭｕ−９（抗−ＣＳＡｐ，米国特許第７，３８７，７７３号）、ｈＬ２４３（抗−ＨＬＡ−ＤＲ，米国特許第７，６１２，１８０号）、ｈＭＮ−１４（抗−ＣＥＡＣＡＭ５，米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ−１５（抗−ＣＥＡＣＡＭ６，米国特許第７，５４１，４４０号）、ｈＲＳ７（抗−ＥＧＰ−１，米国特許第７，２３８，７８５号）、ｈＭＮ−３（抗−ＣＥＡＣＡＭ６，米国特許第７，５４１，４４０号）、Ａｂ１２４及びＡｂ１２５（抗−ＣＸＣＲ４，米国特許第７，１３８，４９６号）が挙げられてもよい。
【０１３６】
特定の実施形態では、ブリナツモマブのＣＤ１９結合領域を含むＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は、ブリナツモマブのＣＤ３結合領域を含む修飾Ｊ鎖を含む。この抗体は、たとえば、非ホジキンリンパ腫、またはＢ細胞シリーズの急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）の治療に使用することができる。
【０１３７】
別の特定の実施形態では、リツキシマブのＣＤ２０結合領域を含むＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は、ブリナツモマブのＣＤ３結合領域を含む修飾Ｊ鎖のようなＣＤ３特異性を持つ修飾Ｊ鎖を含む。
【０１３８】
さらに別の特定の実施形態では、ＭＴ１１０のＥｐＣＡＭ結合領域を含むＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は、ＭＴ１１０のＣＤ３結合領域を含む修飾Ｊ鎖のようなＣＤ３特異性を持つ修飾Ｊ鎖を含む。そのような二重特異性抗体は消化器癌の治療に使用することができる。
【０１３９】
ＣＤ３結合特異性を持つ修飾Ｊ鎖との併用で使用するために結合領域を提供することができる代替抗体には、たとえば、アブシキマブ（抗−糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ）、アレムツズマブ（抗−ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗−ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗−ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗−ＣＤ３３）、イブリツモマブ（抗−ＣＤ２０）、パニツムマブ（抗−ＥＧＦＲ）、トシツモマブ（抗−ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗−ＥｒｂＢ２）、ラムブロリズマブ（抗−ＰＤ−１受容体）、ニボルマブ（抗−ＰＤ−１受容体）、イピリムマブ（抗−ＣＴＬＡ−４）、アバゴボマブ（抗−ＣＡ−１２５）、アデカツムマブ（抗−ＥｐＣＡＭ）、アトリズマブ（抗−ＩＬ−６受容体）、ベンラリズマブ（抗−ＣＤ１２５）、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１、抗−ＣＤ２０）、ＣＣ４９（抗−ＴＡＧ−７２）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（抗−ＰＳＭＡ、米国特許出願番号１１／９８３，３７２、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４０５及びＰＴＡ−４４０６として寄託された）、Ｄ２／Ｂ（抗−ＰＳＭＡ、ＷＯ２００９／１３０５７５）、トシリズマブ（抗−ＩＬ−６受容体）、バシリキシマブ（抗−ＣＤ２５）、ダクリズマブ（抗−ＣＤ２５）、エファリズマブ（抗−ＣＤ１１ａ）、ＧＡ１０１（抗−ＣＤ２０；Ｇｌｙｃａｒｔ  Ｒｏｃｈｅ）、アタリズマブ（抗−α４インテグリン）、オマリズマブ（抗−ＩｇＥ）；ＣＤＰ５７１（Ｏｆｅｉら、２０１１、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４５：８８１−８５）のような抗−ＴＮＦ−α抗体、ＭＴＮＦＡＩ、Ｍ２ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＢＩ、Ｍ３０２Ｂ、Ｍ３０３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）、インフリキシマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｐａ．）、セルトリズマブペゴール（ＵＣＢ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、抗−ＣＤ４０Ｌ（ＵＣＢ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、アダリムマブ（Ａｂｂｏｔｔ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、Ｉｌｌ．）、ＢＥＮＬＹＳＴＡ（登録商標）（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；Ａｌｚ５０（Ｋｓｉｅｚａｋ−Ｒｅｄｉｎｇら、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：７９４３−４７）のようなアルツハイマー病の治療のための抗体、ガンテネルマブ、ソラネズマブ及びインフリキシマブ；５９Ｄ８、Ｔ２Ｇ１ｓ、ＭＨ１のような抗−フィブリン抗体；ＭＯＲ０３０８７（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＡＧ）、ＭＯＲ２０２（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、ＨｕＭａｘ−ＣＤ３８（ゲンマブ）またはダラツムマブ（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）のような抗−ＣＤ３８抗体；Ｐ４／Ｄ１０（米国特許第８，３３３，９７１号）、Ａｂ７５、Ａｂ７６、Ａｂ７７（Ｐａｕｌｉｋら、１９９９、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５８：１７８１−９０）のような抗−ＨＩＶ抗体、と同様に米国特許第５，８３１，０３４号、米国特許第５，９１１，９８９号、及びＶｃｅｌａｒら、ＡＩＤＳ，２００７；２１（１６）：２１６１−２１７０及びＪｏｏｓら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００６；５０（５）：１７７３−９にて記載された抗−ＨＩＶ抗体が挙げられる。
【０１４０】
図１９は、血液癌、上皮腫瘍及びグリコシルが豊富な腫瘍の治療のための例となる標的抗原及び修飾Ｊ鎖による標的化のためのＴ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ及び好中球上の例となる抗原を載せている。載せられた腫瘍抗原のいずれかに結合するＩｇＭ分子を載せられた結合特異性のいずれかを持つ修飾Ｊ鎖と組み合わせることができることが理解されるべきである。従って、表の左欄に載せられた抗体標的を右欄に載せられた修飾Ｊ鎖の標的と組み合わせることができる。
【０１４１】
好まれる実施形態では、ＩｇＭ五量体は、Ｂ細胞のような標的細胞に対する結合特異性を提供する一方で、エフェクター細胞、たとえば、Ｔ細胞に対する結合ドメインはＩｇＭ抗体のＪ鎖に共有結合することができる。従って、Ｊ鎖はＣＤ３（ＣＤ３ε）の結合ドメインの共有結合によって修飾することができる。この構成では、ＩｇＭ五量体（１０コピーの重鎖と１０コピーの軽鎖を含む）は標的Ｂ細胞への結合特異性を提供する一方で、Ｊ鎖のＴ細胞連結は細胞傷害能を送達する。言い換えれば、腫瘍標的に結合するＩｇＭ抗体はＴ細胞の結合機能をさらに獲得する。ネイティブＪ鎖またはネイティブＪ鎖の変異体に共有結合したＣＤ３結合ドメインは、たとえば、抗ＣＤ３抗体の単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、または天然に存在する重鎖のみの抗体、たとえば、ラクダ科動物（ラクダ、ラマ、アルパカ）の抗体、または軟骨魚類（サメ、エイ）の単鎖抗体、足場、たとえば、ＣＤ３結合特異性を持つフィブロネクチン（たとえば、フィブロネクチンＩＩＩ）であり得る。特定の好まれる実施形態が本明細書で具体的に引用される一方で、腫瘍抗原のような標的に対する結合特異性を持ち、Ｔ細胞マーカーに結合する修飾Ｊ鎖を含むＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭ及びＩｇＧ／ＩｇＡ抗体が熟考され、それらは本発明の範囲の範囲内にある。
【０１４２】
一実施形態では、多重特異性のＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は上記でリストにされた腫瘍抗原の１以上に結合する一方で、Ｊ鎖はＣＤ３εに結合するように修飾される。好まれる実施形態では、多重特異性のＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は図１９にてリストにされた腫瘍抗原の１以上に結合する一方で、Ｊ鎖はＣＤ３εに結合するように修飾される。
【０１４３】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は自然免疫の重要な成分であり、サイトカインを放出し、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞に対する細胞溶解活性に介在する能力によって宿主防御で重要な役割を担う。ＮＫ細胞抗原には、限定しないで、ＣＤ１６、ＣＤ３２ａ、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６４、ＣＤ１１７（またはｃ−キット）、リンパ球関連分子−２（ＬＦＡ−２またはＣＤ２）、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）、及びＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）を含む接着分子が挙げられる。
【０１４４】
ＮＫ細胞が関与する、修飾Ｊ鎖を持つ二重特異性抗体の例には、ＮＫ細胞に結合する修飾Ｊ鎖を含む、上記でリストにされた腫瘍抗原のいずれかに対して結合特異性を持つＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭ及びＩｇＧ／ＩｇＡ抗体が挙げられる。特定の実施形態では、ＨＥＲ２結合特異性を持つ二重特異性のＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭ及びＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は、ＣＤ１６、ＣＤ３２ａ、ＣＤ５６、またはＣＤ６４を結合するように修飾されたＪ鎖を含む。別の好まれる実施形態では、多重特異性のＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は、図１９の表の左欄に載せられた腫瘍標的のいずれかに結合し、Ｊ鎖はＮＫ細胞上のＣＤ１６、ＣＤ６４またはＮＫＧ２Ｄを結合するように修飾される。
【０１４５】
たとえば、ＣＤ１４特異性をＪ鎖に導入することによって、本発明のＪ鎖で修飾された抗体におけるマクロファージの関与が提供され得る。
【０１４６】
一実施形態では、多重特異性のＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は、上記でリストにした腫瘍標的の１以上に結合する一方で、Ｊ鎖はＣＤ１４に結合するように修飾される。好まれる実施形態では、多重特異性のＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は、図１９にてリストにした腫瘍標的の１以上に結合する一方で、Ｊ鎖はＣＤ１４に結合するように修飾される。
【０１４７】
修飾Ｊ鎖を伴ったＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭ及びＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は、糖質系抗原を標的とすることができる。たとえば、Ｃａｚｅｔら，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；２０１０，１２：２０４による概説論文を参照のこと。糖質系の腫瘍抗原は、理に適った特異性を持つが、必ずしも高い親和性ではないそのような抗原に結合するＩｇＧ抗体の作出を可能にするグリコシル化の代替型と共に確実な腫瘍との関連を有することが示されている。このクラスの抗原に対して関連する高い結合活性を持つＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡ抗体を使用することは、特にＪ鎖の修飾によって達成されたエフェクター細胞の移動と併せた新規の治療用抗体についての大きな機会を表す。好まれる一実施形態では、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭ及びＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は１以上の糖質系腫瘍抗原に結合する一方で、Ｊ鎖は図１９にてリストにしたエフェクター細胞のいずれかを結合するように修飾される。
【０１４８】
別の好まれる実施形態では、修飾Ｊ鎖を伴ったＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭ及びＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は、病原体に向けられたＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭまたはＩｇＧ／ＩｇＡ抗体の一部として使用することができる。好まれる実施形態では、病原体は、ＨＩＶウイルス、ヒト型結核菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、化膿連鎖球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、インフルエンザ菌Ｂ、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、緑膿菌、らい菌、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純性ヘルペスウイルスＩ、単純性ヘルペスウイルスＩＩ、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ−細胞白血病ウイルス、エプステイン−バーウイルス、マウス白血病ウイルス、おたふく風邪ウイルス、水疱性口炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イボウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、サルウイルス４０、マウス乳癌ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、西ナイルウイルス、マラリア原虫、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒａｎｇｅｌｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｅｌｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｐａｒｖａ、Ｔａｅｎｉａ  ｈｙｄａｔｉｇｅｎａ、Ｔａｅｎｉａ  ｏｖｉｓ、Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ、Ｍｅｓｏｃｅｓｔｏｉｄｅｓ  ｃｏｒｔｉ、関節炎マイコプラズマ、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍ．ｏｒａｌｅ、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ、Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ及び米国特許第６，４４０，４１６号にて開示されたような肺炎マイコプラズマから成る群から選択される。
【０１４９】
この実施形態では、免疫エフェクター細胞は、たとえば、好中球であってもよい。
【０１５０】
図１９は、修飾Ｊ鎖によって標的化され得る好中球マーカーと組み合わせて、本明細書のＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭ及びＩｇＧ／ＩｇＡ抗体についての標的としてのウイルス抗原を具体的に載せている。
【０１５１】
本明細書のＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭ及びＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は、糖質の豊富な癌における糖質抗原も標的とすることができることが言及される。そのような抗原には、たとえば、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＴＡＤＧ７８、シアリルルイス−Ｘ（ＣＤ１５）が挙げられる。
【０１５２】
実施形態すべてにおいて、ネイティブＪ鎖を修飾するために使用される結合部分（結合単位）はＪ鎖の前または後に導入されてもよい。従って、ＣＤ３結合特異性を伴った修飾Ｊ鎖は抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−ＪまたはＪ−抗ＣＤ３ｓｃＦｖの構成を有してもよい。Ｃ末端にてＪ鎖を含む抗ＣＤ３単鎖Ｆｖ（抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−Ｊ）の配列（配列番号４６）及び構造を図８に示す。Ｎ末端にてＪ鎖を含む抗ＣＤ３単鎖Ｆｖ（Ｊ−抗ＣＤ３ｓｃＦｖ）の配列（配列番号４７）及び構造を図９に示す。その高い結合活性の故に、そのような抗体は二重特異性のＩｇＧ抗体よりも優れている。たとえば、その結果、低レベルのＣＤ２０の発現を特徴とするリツキサン耐性のバーキットリンパ腫細胞のようなコピー数の少ない標的を標的とするのにそれらは好適である。加えて、修飾Ｊ鎖を含む本明細書のＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭ及びＩｇＧ／ＩｇＡ抗体は、二重特異性のＩｇＧ抗体に比べて大きく向上した効能を有する。
【０１５３】
修飾Ｊ鎖を伴った抗体の医薬組成物
治療用途について、修飾Ｊ鎖を含む抗体を医薬組成物に製剤化してもよい。本発明の医薬組成物は当該技術で既知の種々の方法によって投与することができる。技量のある熟練者によって十分に理解されるように、投与の経路及び／または方式は標的の疾患または状態及び所望の成績に応じて変化するであろう。投与の特定の経路によって本発明の化合物を投与するには、その不活化を防ぐ物質によって化合物を被覆する、またはその物質と化合物を同時投与することが必要であってもよい。たとえば、化合物は、適当なキャリア、たとえば、リポソームまたは希釈剤にて対象に投与されてもよい。薬学上許容可能な希釈剤には生理食塩水及び水性緩衝溶液が挙げられる。医薬キャリアには、無菌の水溶液または水性分散液及び無菌の注射用の溶液または分散液の即時調製のための無菌の粉末が挙げられる。薬学上活性のある物質のためのそのような媒体及び作用剤の使用は当該技術で既知である。
【０１５４】
組成物は、たとえば、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び／または分散剤のような補助剤も含有してもよい。微生物の存在の予防は、無菌化手順によって、及び種々の抗菌剤や抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の包含によっての双方で保証されてもよい。等張剤、たとえば、糖類、塩化ナトリウム等を組成物に含めることも望ましくてもよい。加えて、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅らせる作用剤の包含によって注射用医薬形態の延長された吸収がもたらされてもよい。
【０１５５】
本発明の医薬組成物における有効成分の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性であることなく、特定の患者のための所望の治療応答、組成物及び投与の方式を達成するのに有効である有効成分の量を得るために変化してもよい。選択される投与量レベルは、採用される本発明の特定の組成物の活性、投与の経路、投与の時間、採用される特定の化合物の排泄の速度、治療の持続時間、採用される特定の化合物と併用して使用される他の薬剤、化合物及び／または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身状態及び既往症、及び医療技術で周知の同様の因子を含む種々の薬物動態因子に左右されるであろう。
【０１５６】
組成物は無菌でなければならず、且つ、組成物が注射器によって送達可能な程度に流体でなければならない。水に加えて、キャリアは好ましくは等張の緩衝化された生理食塩水溶液である。
【０１５７】
以下の実施例の配列表及び図は本発明の理解に役立つように提供され、その真の範囲は添付のクレームで述べられる。本発明の精神から逸脱することなく述べられた手順にて改変を行うことができることが理解される。
【０１５８】
本発明のさらなる詳細は以下の非限定の実施例によって説明される。
【実施例】
【０１５９】
実施例１
ＣＤ３を結合する修飾Ｊ鎖を含む二重特異性抗ＣＤＩＭＩｇＭ抗体の調製
（１）設計された変異を持つＤＮＡ構築物の生成
（ａ）ＤＮＡ構築物の合成：設計された変異を持つＤＮＡ構築物はすべて、各発現ベクターへのサブクローニング用の両端での適合性の制限部位と共に供給業者（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）によって合成される。
（ｂ）発現ベクターの構築：合成されたＤＮＡ構築物を１μｇ／ｍｌでＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液に再懸濁する。ＤＮＡ（１μｇ）を酵素消化に供し、合成された遺伝子を電気泳動によってキャリアプラスミドＤＮＡから分離する。消化されたＤＮＡを標準的な分子生物学の技法によって事前に消化したプラスミドＤＮＡ（Ｊ鎖についてはｐＣＡＧＧＳ、Ｇｅｎｅ，１０８（１９９１），１９３−２００）にライゲーションする。ライゲーションしたＤＮＡでコンピテント細菌を形質転換し、複数の選抜抗生剤を伴ったＬＢプレートに播く。幾つかの細菌コロニーを採取し、標準的な分子生物学の技法によってＤＮＡ調製物を作製する。調製されたＤＮＡを配列決定によって検証する。設計されたＤＮＡ配列と１００％一致したＤＮＡ配列を持つ細菌クローンだけをプラスミドＤＮＡの調製及びその後の細胞の形質移入に使用する。
（ｃ）異なるＪ鎖：Ｊ鎖変異体がＩｇＭと結合することができることを実証するために、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３ｓｃＦｖ）を組み込む別個の融合部位を持つ２つの異なるＪ鎖変異体を構築する。
（ｉ）この構築物は、ヒトＪ鎖のＮ末端に融合されたＯＫＴ３（抗ＣＤ３）のｓｃＦｖで構成される（ＣＤ３ｓｃＦｖ−１５ａａリンカー−Ｊ）。
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＳＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＥＤＥＲＩＶＬＶＤＮＫＣＫＣＡＲＩＴＳＲＩＩＲＳＳＥＤＰＮＥＤＩＶＥＲＮＩＲＩＩＶＰＬＮＮＲＥＮＩＳＤＰＴＳＰＬＲＴＲＦＶＹＨＬＳＤＬＣＫＫＣＤＰＴＥＶＥＬＤＮＱＩＶＴＡＴＱＳＮＩＣＤＥＤＳＡＴＥＴＣＹＴＹＤＲＮＫＣＹＴＡＶＶＰＬＶＹＧＧＥＴＫＭＶＥＴＡＬＴＰＤＡＣＹＰＤＧＧＧＳＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＳＡＶＤＨＨＨＨＨＨ−（配列番号４６）
【０１６０】
この構築物は、約４５ｋＤの分子量を有し、ＣＤ３の可溶性イプシロン鎖（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）またはＴ細胞に結合することができ、及び抗ｍｙｃモノクローナル抗体４Ａ６または他の抗ｍｙｃ抗体に結合することができる。
（ｉｉ）この構築物は、ヒトＪ鎖のＣ末端に融合されたＯＫＴ３（抗ＣＤ３）のｓｃＦｖで構成される（Ｊ−１５ａａリンカー−ＣＤ３ｓｃＦｖ）。
ＱＥＤＥＲＩＶＬＶＤＮＫＣＫＣＡＲＩＴＳＲＩＩＲＳＳＥＤＰＮＥＤＩＶＥＲＮＩＲＩＩＶＰＬＮＮＲＥＮＩＳＤＰＴＳＰＬＲＴＲＦＶＹＨＬＳＤＬＣＫＫＣＤＰＴＥＶＥＬＤＮＱＩＶＴＡＴＱＳＮＩＣＤＥＤＳＡＴＥＴＣＹＴＹＤＲＮＫＣＹＴＡＶＶＰＬＶＹＧＧＥＴＫＭＶＥＴＡＬＴＰＤＡＣＹＰＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＳＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＳＡＶＤＨＨＨＨＨＨ−（配列番号４７）
【０１６１】
このＪ−ＣＤ３ｓｃＦｖ構築物は約４５ｋＤの分子量を有し、ＣＤ３の可溶性イプシロン鎖（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）またはＴ細胞に結合することができ、及び抗ｍｙｃモノクローナル抗体４Ａ６または他の抗ｍｙｃ抗体に結合することができる。
（ｄ）ＩｇＭ重鎖：この重鎖構築物は、Ｂ細胞の表面上のＣＤＩＭを結合するＩＧＭ５５．５についての完全長μ鎖を有する。
ＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＹＧＧＳＦＳＧＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＭＡＷＧＡＳＶＮＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＡＳＡＰＴＬＦＰＬＶＳＣＥＮＳＰＳＤＴＳＳＶＡＶＧＣＬＡＱＤＦＬＰＤＳＩＴＦＳＷＫＹＫＮＮＳＤＩＳＳＴＲＧＦＰＳＶＬＲＧＧＫＹＡＡＴＳＱＶＬＬＰＳＫＤＶＭＱＧＴＤＥＨＶＶＣＫＶＱＨＰＮＧＮＫＥＫＮＶＰＬＰＶＩＡＥＬＰＰＫＶＳＶＦＶＰＰＲＤＧＦＦＧＮＰＲＫＳＫＬＩＣＱＡＴＧＦＳＰＲＱＩＱＶＳＷＬＲＥＧＫＱＶＧＳＧＶＴＴＤＱＶＱＡＥＡＫＥＳＧＰＴＴＹＫＶＴＳＴＬＴＩＫＥＳＤＷＬＳＱＳＭＦＴＣＲＶＤＨＲＧＬＴＦＱＱＮＡＳＳＭＣＶＰＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ（配列番号３）。
【０１６２】
この重鎖構築物は、分子量約６４ｋＤを有し、軽鎖と同時発現させると、得られるＩｇＭはＣＤＩＭ陽性Ｂ細胞に結合することができる。
（ｅ）Ｂ細胞の表面上のＣＤＩＭ（細胞死誘導分子）を結合するＩＧＭ−５５．５として知られるＩＧＭ−５５．５の軽鎖
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号５）
【０１６３】
軽鎖構築物は分子量約２４ｋＤを有し、適当な重鎖（配列番号３）と同時発現させるとＣＤＩＭ陽性Ｂ細胞に結合することができる。
【０１６４】
（２）タンパク質の発現、精製及び性状分析
（ａ）形質移入：重鎖、軽鎖及び修飾Ｊ鎖のＤＮＡでＣＨＯ細胞に形質移入する。発現ベクターのＤＮＡを通常１：１：１の比率でＰＥＩと混合し、次いでＣＨＯ−Ｓ細胞に加える。ＣＨＯ−Ｓ細胞によるＰＥＩ形質移入は、確立された技法（「ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．８７，５５３−５４５」を参照のこと）に従って実施する。
（ｂ）免疫沈降
（ｉ）Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＩｇＭ（ＢＡＣ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）：製造元のプロトコール（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従ってＣａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＩｇＭ親和性マトリクスによる免疫沈降によって、形質移入したＣＨＯ細胞上清からのＩｇＭタンパク質を部分的に精製する。室温にて２時間インキュベートした後、遠心分離によって親和性マトリクスを上清から分離する。マトリクスをＰＢＳで３回さらに洗浄した後、ＰＢＳを慎重に取り除く。捕捉したタンパク質を、ＮｕＰａｇｅＬＤＳタンパク質緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に５分間インキュベートすることによってマトリクスから溶出する。
【０１６５】
（ｉｉ）抗ｍｙｃアガロース親和性マトリクス（Ｓｉｇｍａ）：製造元のプロトコールに従って抗ｍｙｃ親和性マトリクスによる免疫沈降によって、形質移入したＣＨＯ細胞上清からのＩｇＭタンパク質を部分的に精製する。室温にて２時間インキュベートした後、遠心分離によって親和性マトリクスを上清から分離する。マトリクスをＰＢＳで３回さらに洗浄した後、最後の洗浄後ＰＢＳを慎重に取り除く。捕捉したタンパク質を、ＮｕＰａｇｅＬＤＳタンパク質緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に５分間インキュベートすることによってマトリクスから溶出する。
【０１６６】
（ｃ）ゲル電気泳動
（ｉ）非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
【０１６７】
（ｉｉ）非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥはサイズに従ってネイティブＩｇＭ及びその変異体形態を分離する。ホモ二量体の重鎖及び軽鎖で構成される五量体ＩｇＭはおよそ１，０００，０００の分子量のタンパク質バンドを生じる。ＮｕＰａｇｅＬＤＳ試料緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を２５℃で３０分間ＩｇＭタンパク質試料に加えた後、ゲル上に負荷する。ＮａｔｉｖｅＰａｇｅ  Ｎｏｖｅｘ  ３−１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＮｏｖｅｘ  Ｔｒｉｓ−酢酸ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に使用する。染料の先端がゲルの底に達するまでゲルを泳動させる。
【０１６８】
（ｉｉｉ）還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ＮｕＰａｇｅＬＤＳ試料緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＮｕＰａｇｅ還元剤ジチオスレイトール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＩｇＭタンパク質試料に加え、８０℃に１０分間加熱した後、ＮｕＰａｇｅ  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上に負荷する。ＮｕＰａｇｅＭＥＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をゲル電気泳動に使用する。染料の先端がゲルの底に達するまでゲルを泳動させる。電気泳動が完了した後、ゲルを装置から外し、コロイド状ブルー染色（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてゲルを染色する。
（ｉｖ）ウエスタンブロット検出：電気泳動が完了した後、ゲルをＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ  Ｍｉｎｉ−セルから外す。３０ボルトで１時間ＰＶＤＦ膜に移す（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのマニュアルを参照）。ＰＢＳＴ中３％ＢＳＡ２０ｍＬにて２５℃で１時間ブロックする。
【０１６９】
抗Ｊ鎖のウエスタンブロットについては、ＰＢＳＴ中３％ＢＳＡにて１：５００での抗Ｊ（ＳＰ１０５，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を４℃で一晩加える。室温にてＰＢＳＴで４回洗浄する。ＰＢＳＴ中３％ＢＳＡにて１：５，０００でのＨＲＰ−ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）を室温で１時間加える。室温にてＰＢＳＴで４回洗浄する。ＨＲＰ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）１０ｍlを１０分間加えた後、ブロットをフィルムに露光する。抗Ｊ鎖抗体は未修飾Ｊ鎖（図６）または修飾Ｊ鎖（図７）と同時発現したＩｇＭとのみ反応する。
【０１７０】
抗ｍｙｃのウエスタンブロットについては、ＰＢＳＴ中３％ＢＳＡにて１：２００での抗ｍｙｃ（４Ａ６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を４℃で一晩加える。室温にてＰＢＳＴで４回洗浄する。ＰＢＳＴ中３％ＢＳＡにて１：５，０００でのＨＲＰ−ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）を室温で１時間加える。室温にてＰＢＳＴで４回洗浄する。ＨＲＰ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）１０ｍＬを１０分間加えた後、ブロットをフィルムに露光する。抗ｍｙｃ抗体はｍｙｃタグを持つ修飾Ｊ鎖とのみ反応する（図２）。
【０１７１】
（３）二重特異性機能解析
（ａ）標的結合のＦＡＣＳ解析：Ｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ、ＣＤ３陽性細胞株）及びＢ細胞株（Ｎａｌｍ６、陰性対照細胞株）への抗体の結合によって、Ｔ細胞に結合するＣＤ３ｓｃＦｖ−Ｊを伴ったＩＧＭ−５５．５またはＪ−ＣＤ３ｓｃＦｖを伴ったＩＧＭ−５５．５を確認する。洗浄の後、ローダミン標識した４Ａ６を細胞浮遊液に加える。細胞の標的結合は、ＣＤ３抗原を伴ったまたは伴わない陽性対照細胞及び陰性対照細胞双方のＭＦＩによって検出される。陽性細胞株（Ｄａｕｄｉ、陽性細胞株）及び陰性細胞株（Ｐｅｅｒ）への抗体の結合によって、ＣＤＩＭ発現細胞に結合するＣＤ３ｓｃＦｖ−Ｊを伴ったＩＧＭ−５５．５またはＪ−ＣＤ３ｓｃＦｖを伴ったＩＧＭ−５５．５を確認する。洗浄後、ローダミン標識した４Ａ６を細胞浮遊液に加える。細胞の標的結合は、ＣＤＩＭ抗原を伴ったまたは伴わない陽性細胞及び陰性対照細胞双方のＭＦＩによって検出される。
（ｂ）共培養におけるＴ細胞が介在するＢ細胞の殺傷のＦＡＣＳ解析：ＣＤ２０ＩｇＭ×Ｊ−野生型またはＣＤ２０ＩｇＭ×ＣＤ３−Ｊ鎖と共に、ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋Ｂ細胞株であるＲａｊｉをＣＤ８＋細胞溶解性Ｔ細胞株であるＴ−ＡＬＬと３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間共培養した。細胞を回収し、ＣＤ３に対する蛍光抗体（５５２８５２／ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＣＤ１９に対する蛍光抗体（５５５４１３／ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって染色し、フローサイトメトリーによって解析し、生きているＢ細胞を評価した。
（ｃ）Ｂ細胞の補体依存性の細胞傷害：９６ウェルハーフエリアホワイトプレートにて２５，０００個／ウェルでＣＤ２０＋細胞株であるＲａｍｏｓを播いた。抗体及びヒト補体（最終５％、Ｑｕｉｄｅｌ）を加え、補体依存性の細胞傷害を開始し、細胞タイターＧｌｏ及び製造元のプロトコールを用いて生細胞の数を測定した。ウェル当たり０．１秒の積分時間を用いたＥｎｖｉｓｉｏｎマルチモードリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）にて発光を測定した。薬剤を加えなかったウェルに対して発光値を基準化すること（相対発光単位、ＲＬＵ）によって生細胞の比率を算出した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍと、それぞれ１００％及び０％で固定された最上及び最下の値を伴った４パラメータ適合とを用いてデータを解析した。
【０１７２】
上述のもののような当該技術で既知の技法を用いて多重特異性結合解析及び多重特異性機能解析を同様に行うことができる。
【０１７３】
実施例２
抗ＣＤ３結合ｓｃＦｖを保有する修飾Ｊ鎖を伴った二重特異性抗ＣＤ２０−ＩｇＭの分子クローニング、発現及び精製
この実施例は、異なるＢ細胞抗原（ＣＤ２０）を標的とするさらなるＩｇＭ抗体及びＣＤ３に結合する修飾Ｊ鎖の分子クローニングの調製、発現及び精製を記載する。実施例１にて記載されたような方法を用いて以下の重鎖及び軽鎖の配列に相当するＤＮＡを調製した。
配列番号４８：抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ）のＩｇＭ軽鎖の配列
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＩＶＬＳＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨＷＦＱＱＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＴＳＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号４９：抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ）のＩｇＭ重鎖の配列
ＭＧＷＳＹＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＮＭＨＷＶＫＱＴＰＧＲＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＧＳＡＳＡＰＴＬＦＰＬＶＳＣＥＮＳＰＳＤＴＳＳＶＡＶＧＣＬＡＱＤＦＬＰＤＳＩＴＦＳＷＫＹＫＮＮＳＤＩＳＳＴＲＧＦＰＳＶＬＲＧＧＫＹＡＡＴＳＱＶＬＬＰＳＫＤＶＭＱＧＴＤＥＨＶＶＣＫＶＱＨＰＮＧＮＫＥＫＮＶＰＬＰＶＩＡＥＬＰＰＫＶＳＶＦＶＰＰＲＤＧＦＦＧＮＰＲＫＳＫＬＩＣＱＡＴＧＦＳＰＲＱＩＱＶＳＷＬＲＥＧＫＱＶＧＳＧＶＴＴＤＱＶＱＡＥＡＫＥＳＧＰＴＴＹＫＶＴＳＴＬＴＩＫＥＳＤＷＬＳＱＳＭＦＴＣＲＶＤＨＲＧＬＴＦＱＱＮＡＳＳＭＣＶＰＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ
【０１７４】
これらの重鎖及び軽鎖に相当するＤＮＡと同様に野生型（ｗｔ）Ｊ鎖、実施例１で記載されたＯ１５ＪまたはＪ１５ＯのＪ鎖配列に相当するものをＨＥＫ２９３細胞に同時形質移入し、タンパク質を発現させ、前に記載されたようなラクダ樹脂を用いて精製した。図１３に示すように４つのタンパク質はすべて上手く発現する。Ｊ鎖を伴わない抗ＣＤ２０のＩｇＭ六量体は、野生型Ｊ鎖を伴ったＩｇＭ五量体について、並びに抗ＣＤ３ｓｃＦｖがいずれかの方向でＪ鎖に連結されている（Ｏ１５ＪまたはＪ１５Ｏ）二重特異性ＩｇＭについてのＪ鎖含有五量体から明らかに分割される。
【０１７５】
実施例３
異なる抗ＣＤ３結合ｓｃＦｖを保有する修飾Ｊ鎖を含む二重特異性抗ＣＤ２０−ＩｇＭの分子クローニング、発現及び精製
二重特異性ＩｇＭの集合体が、実施例１及び２で使用されたものとは異なる配列の抗ＣＤ３ｓｃＦｖを保有する修飾Ｊ鎖によって実現可能であることを立証するために、抗体ビシリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）に由来する可変領域を保有するＪ鎖を機能させた。以下に示すのは、２つの異なる方向で１５ａａを含有するリンカーを介してＪ鎖に融合されるビシリズマブ（Ｖ）に相当するｓｃＦｖを伴った２つのＪ鎖の配列−Ｖ１５Ｊ及びＪ１５Ｖである。
配列番号５０：Ｖ１５ＪについてのＪ鎖の配列
ＭＧＷＳＹＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＩＳＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＮＰＲＳＧＹＴＨＹＮＱＫＬＫＤＫＡＴＬＴＡＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＡＹＹＤＹＤＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＥＤＥＲＩＶＬＶＤＮＫＣＫＣＡＲＩＴＳＲＩＩＲＳＳＥＤＰＮＥＤＩＶＥＲＮＩＲＩＩＶＰＬＮＮＲＥＮＩＳＤＰＴＳＰＬＲＴＲＦＶＹＨＬＳＤＬＣＫＫＣＤＰＴＥＶＥＬＤＮＱＩＶＴＡＴＱＳＮＩＣＤＥＤＳＡＴＥＴＣＹＴＹＤＲＮＫＣＹＴＡＶＶＰＬＶＹＧＧＥＴＫＭＶＥＴＡＬＴＰＤＡＣＹＰＤ
配列番号５１：Ｊ１５ＶについてのＪ鎖の配列
ＭＫＮＨＬＬＦＷＧＶＬＡＶＦＩＫＡＶＨＶＫＡＱＥＤＥＲＩＶＬＶＤＮＫＣＫＣＡＲＩＴＳＲＩＩＲＳＳＥＤＰＮＥＤＩＶＥＲＮＩＲＩＩＶＰＬＮＮＲＥＮＩＳＤＰＴＳＰＬＲＴＲＦＶＹＨＬＳＤＬＣＫＫＣＤＰＴＥＶＥＬＤＮＱＩＶＴＡＴＱＳＮＩＣＤＥＤＳＡＴＥＴＣＹＴＹＤＲＮＫＣＹＴＡＶＶＰＬＶＹＧＧＥＴＫＭＶＥＴＡＬＴＰＤＡＣＹＰＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＩＳＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＮＰＲＳＧＹＴＨＹＮＱＫＬＫＤＫＡＴＬＴＡＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＡＹＹＤＹＤＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
【０１７６】
実施例１に記載されたように、これらの配列に相当するＤＮＡを合成し、抗ＣＤ２０のＩｇＭの重鎖及び軽鎖と共にＨＥＫ２９３細胞に形質移入し、タンパク質を産生させ、次いでＩｇＭに特異的なラクダ抗体親和性マトリクスを用いて精製した。図１３に示すように、１５ａａのリンカーと共に新規の抗ＣＤ３ｓｃＦｖに融合されたＪ鎖はＩｇＭに組み込むことができ、相当するＪ鎖を持つ二重特異性ＩｇＭの五量体形態はＪ鎖を伴わない六量体形態から明らかに区別できる。
【０１７７】
実施例４
第２のエフェクター細胞結合ドメインの抗ＣＤ１６ラクダ修飾Ｊ鎖型−抗ＣＤ１６ラクダを含むＩｇＭの分子クローニング、発現及び精製
この実施例は、異なるエフェクター細胞集団における異なる標的に向けられるｓｃＦｖからＪ鎖まで異なる結合部分を連結することが可能であることを実証する。以下に示すラクダのＶｈｈ配列を使用したが、それはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）上のＣＤ１６抗原に結合するために選択された。今一度、この配列は柔軟な１５ａａのリンカーを用いてＪ鎖に連結されてＣ１５Ｊを生じた。二重特異性のＩｇＭを発現させ、実施例１で記載されたように精製し、ハイブリッドゲル上で解析した。五量体種の形成が明らかに見られた。さらに、ウエスタンブロットを用いて五量体ＩｇＭへのＣ１５ＪのＪ鎖の組み込みを立証した（図１８）。
配列番号５２：Ｃ１５ＪのＪ鎖配列
ＭＧＷＳＹＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＥＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＬＴＦＳＳＹＮＭＧＷＦＲＲＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＳＩＴＷＳＧＲＤＴＦＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＮＰＷＰＶＡＡＰＲＳＧＴＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＥＤＥＲＩＶＬＶＤＮＫＣＫＣＡＲＩＴＳＲＩＩＲＳＳＥＤＰＮＥＤＩＶＥＲＮＩＲＩＩＶＰＬＮＮＲＥＮＩＳＤＰＴＳＰＬＲＴＲＦＶＹＨＬＳＤＬＣＫＫＣＤＰＴＥＶＥＬＤＮＱＩＶＴＡＴＱＳＮＩＣＤＥＤＳＡＴＥＴＣＹＴＹＤＲＮＫＣＹＴＡＶＶＰＬＶＹＧＧＥＴＫＭＶＥＴＡＬＴＰＤＡＣＹＰＤ
【０１７８】
実施例５
組み込まれたＪ鎖を伴った及び伴わないＩｇＭのファミリーについての補体依存性の細胞傷害の解析
補体依存性の細胞傷害は抗体による細胞の殺傷についての極めて重要なメカニズムである。ＩｇＭ抗体はその多量体形態の故に高い補体依存性の細胞殺傷（ＣＤＣ）を有することが知られている。本発明の極めて重要な態様は、そのＣ末端またはＮ末端でのエフェクター細胞のｓｃＦｖ結合因子またはラクダＶｈｈ結合因子を保有する修飾Ｊ鎖の組み込みが、補体の極めて重要な成分であるＣ１ｑの結合の妨害を引き起こすので、ＣＤＣを阻害し得るかどうかを調べることであった。ＩｇＭ及び二重特異性ＩｇＭの構築物それぞれのＣＤＣ活性を測定した。図１４に示すように、修飾Ｊ鎖の組み込みが予想外に、二重特異性ＩｇＭのＣＤＣ活性に有害効果を有さないことを見いだしている。さらに、調べたリンカーの長さで、二重特異性ＩｇＭがモル基準で相当するＩｇＧよりも６０〜１００倍高いＣＤＣ活性を有することを見いだしている。（図１４）。
【０１７９】
実施例６
試験管内の共培養における二重特異性ＩｇＭによるＴ細胞依存性のＢ細胞の殺傷の解析
修飾Ｊ鎖を伴った二重特異性ＩｇＭ抗体によるエフェクターＴ細胞の関与は、Ｊ鎖を保有しないまたは野生型Ｊ鎖を保有するＩｇＭに比べて標的Ｂ細胞集団の殺傷を大きく高めることが予想される。共培養における細胞の殺傷を調べるために、実施例１に記載されたような細胞殺傷アッセイを実施した。単一高濃度（１００ｎｇ／ｍＬ）の抗体をＣＤ２０＋Ｒａｊｉ細胞及びＣＤ３＋エフェクターＴ−ＡＬＬ細胞と共にインキュベートした。図１５に示すように、そのＪ鎖にＣＤ３結合ｓｃＦｖを保有する二重特異性ＩｇＭはＢ細胞の完全な殺傷を生じることができる。用量反応として行われた同じ実験は、Ｔ細胞を関与させることができるｓｃＦｖを保有しないＩｇＭに比べてＢ細胞の殺傷で３００倍を超える改善があることを示している。二重特異性ＩｇＭによるＢ細胞の完全な殺傷は１０ｎｇ／ｍＬほどの低濃度で認められる。
【０１８０】
実施例７
ＮＳＧマウスモデルにおける生体内でのＴ細胞依存性のＢ細胞殺傷の実証
作製した二重特異性ＩｇＭを生体内の背景で調べるために、ヒト化非肥満重症複合免疫不全無ガンマ（ＮＳＧ）マウスによる実験を行った。これらのマウスは重度に損傷された免疫機能を有し、マウスのＴ及びＢリンパ球を欠く。それらをヒトＣＤ３４＋幹細胞で再構築して本質的にヒトのリンパ球集団を持つマウスを創り出す。ＣＤ２０−ＩｇＭ×ＣＤ３−Ｊ鎖を０．５ｍｇ／ｋｇでこれらの動物に静脈内投与し、全血を得て、ヒトＢ細胞の循環レベルについてフローサイトメトリーによって解析した場合、６時間という短い処理でさえ、Ｂ細胞集団の完全な枯渇を認めた（図１７）。
【０１８１】
幾つかの実施形態が本開示で提供されている一方で、開示された系及び方法は、本開示の精神または範囲から逸脱することなく多数の他の具体的形態で具体化され得ることが理解されるべきである。本実施例は制約ではなく説明と見なされるべきであり、本発明は本明細書で付与された詳細に限定されるべきではない。変化、置換及び変更の種々の例は当業者によって解明可能であり、本明細書で開示される精神及び範囲から逸脱することなく為されてもよい。
【図１】
2020114828.tif 000002
【図２】
2020114828.tif 000003
【図３】
2020114828.tif 000004
【図４−１】
2020114828.tif 000005
【図４−２】
2020114828.tif 000006
【図４−３】
2020114828.tif 000007
【図５】
2020114828.tif 000008
【図６】
2020114828.tif 000009
【図７】
2020114828.tif 000010
【図８】
2020114828.tif 000011
【図９】
2020114828.tif 000012
【図１０】
2020114828.tif 000013
【図１１】
2020114828.tif 000014
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2020114828.tif 000017
【図１５】
2020114828.tif 000018
【図１６】
2020114828.tif 000019
【図１７】
2020114828.tif 000020
【図１８】
2020114828.tif 000021
【図１９】
2020114828.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月9日(2020.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願の明細書の記載される発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
さらに別の態様では、本発明は、腫瘍またはウイルス性疾患の治療における、本発明は記載されているような修飾Ｊ鎖を伴うＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ／ＩｇＭ、ＩｇＧ／ＩｇＡの抗体の使用に関する。
[本発明1001]
ネイティブ配列のＪ鎖に導入される外来性の結合部分を含む修飾Ｊ鎖。
[本発明1002]
ネイティブ配列のＪ鎖が、配列番号1のヒトのネイティブＪ鎖配列またはその機能的断片である本発明1001の修飾Ｊ鎖。
[本発明1003]
ネイティブ配列のＪ鎖が、配列番号1のヒトのネイティブＪ鎖配列である本発明1002の修飾Ｊ鎖。
[本発明1004]
外来性の結合部分が、直接的なまたは間接的な融合によって配列番号1の前記ヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される本発明1003の修飾Ｊ鎖。
[本発明1005]
結合部分が、ペプチドリンカーを介した間接的な融合によって導入される本発明1004の修飾Ｊ鎖。
[本発明1006]
間接的な融合が、結合部分のＣ末端及び／またはＮ末端にてまたはその近傍にてペプチドリンカーを介する本発明1005の修飾Ｊ鎖。
[本発明1007]
外来性の結合部分が、Ｃ末端にてまたはその近傍にて配列番号1のヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される本発明1006の修飾Ｊ鎖。
[本発明1008]
外来性の結合部分が、Ｃ末端から約10残基以内で配列番号1のヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される本発明1007の修飾Ｊ鎖。
[本発明1009]
外来性の結合部分が、Ｎ末端にてまたはその近傍にて配列番号1のヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される本発明1006の修飾Ｊ鎖。
[本発明1010]
外来性の結合部分が、Ｎ末端から約10アミノ酸残基以内で配列番号1のヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される本発明1009の修飾Ｊ鎖。
[本発明1011]
外来性の結合部分が、配列番号1のシステイン残基92と101の間でヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される本発明1005の修飾Ｊ鎖。
[本発明1012]
外来性の結合部分が、グリコシル化部位にてまたはその近傍にて配列番号1のヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される本発明1005の修飾Ｊ鎖。
[本発明1013]
前記ペプチドリンカーが約10〜20のアミノ酸の長さである本発明1005の修飾Ｊ鎖。
[本発明1014]
前記ペプチドリンカーが約15〜20のアミノ酸の長さである本発明1013の修飾Ｊ鎖。
[本発明1015]
前記ペプチドリンカーが15のアミノ酸の長さである本発明1014の修飾Ｊ鎖。
[本発明1016]
外来性の結合部分が、化学的誘導体化または化学酵素的誘導体化によって配列番号1のヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される本発明1003の修飾Ｊ鎖。
[本発明1017]
外来性の結合部分が、化学リンカーによって配列番号1のヒトのネイティブＪ鎖配列に導入される本発明1016の修飾Ｊ鎖。
[本発明1018]
化学リンカーが切断可能なリンカーまたは切断可能ではないリンカーである本発明1017の修飾Ｊ鎖。
[本発明1019]
切断可能なリンカーが化学的に不安定なリンカーまたは酵素に不安定なリンカーである本発明1018の修飾Ｊ鎖。
[本発明1020]
前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル−3−（2−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−4−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−1−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−4−（2−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体、活性エステル、アルデヒド、ビス−アジド化合物、ビス−ジアゾニウム誘導体、ジイソシアネート、及びビス−活性フッ素化合物から成る群から選択される本発明1018の修飾Ｊ鎖。
[本発明1021]
酵素認識部位の挿入によって、及びペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーを介して酵素認識部位にて外来性の結合部分を翻訳後に連結することによって修飾される本発明1016の修飾Ｊ鎖。
[本発明1022]
外来性の結合部分が、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体−薬剤コンジュゲート、抗体様分子、抗体様分子の抗原結合断片、可溶性タンパク質及び膜結合型タンパク質、リガンド、受容体、ウイルス様粒子、タンパク質毒素、酵素、及び代替足場から成る群から選択される本発明1001〜1021のいずれかの修飾Ｊ鎖。
[本発明1023]
代替足場が、ダルピン、フィブロネクチンドメイン、アドネクチン及びノッティンから成る群から選択される本発明1022の修飾Ｊ鎖。
[本発明1024]
抗原結合断片が、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び単一ドメイン抗体から成る群から選択される本発明1022の修飾Ｊ鎖。
[本発明1025]
抗原結合断片がｓｃＦｖである本発明1024の修飾Ｊ鎖。
[本発明1026]
外来性の結合部分がエフェクター細胞に結合する本発明1001〜1021のいずれかの修飾Ｊ鎖。
[本発明1027]
エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ及び好中球から成る群から選択される本発明1026の修飾Ｊ鎖。
[本発明1028]
エフェクター細胞がＴ細胞である本発明1027の修飾Ｊ鎖。
[本発明1029]
外来性の結合部分がＴ細胞上のＣＤ3εに結合する本発明1028の修飾Ｊ鎖。
[本発明1030]
エフェクター細胞がＮＫ細胞である本発明1027の修飾Ｊ鎖。
[本発明1031]
外来性の結合部分が、ＮＫ細胞上のＣＤ16、ＣＤ64及びＮＫＧ2Ｄから成る群から選択される標的を結合する本発明1030の修飾Ｊ鎖。
[本発明1032]
エフェクター細胞がマクロファージである本発明1027の修飾Ｊ鎖。
[本発明1033]
外来性の結合部分が、マクロファージ上のＣＤ14に結合する本発明1032の修飾Ｊ鎖。
[本発明1034]
エフェクター細胞が好中球である本発明1027の修飾Ｊ鎖。
[本発明1035]
外来性の結合部分が、好中球上のＣＤ16ｂまたはＣＤ177に結合する本発明1035の修飾Ｊ鎖。
[本発明1036]
本発明1001〜1035のいずれかの修飾Ｊ鎖またはその抗原結合断片を含む抗体。
[本発明1037]
尾部を含むＩｇＭ抗体、ＩｇＡ抗体またはＩｇＧ抗体、またはその抗原結合断片である本発明1036の抗体。
[本発明1038]
ＩｇＭ抗体またはその抗原結合断片である本発明1037の抗体。
[本発明1039]
ＩｇＡ抗体またはその抗原結合断片である本発明1037の抗体。
[本発明1040]
多重特異性である、またはその抗原結合断片である本発明1036〜1039のいずれかの抗体。
[本発明1041]
二重特異性である、またはその抗原結合断片である本発明1040の抗体。
[本発明1042]
前記抗体が、標的細胞、可溶性結合標的、細胞表面受容体、マトリックスタンパク質、輸送体受容体から成る群から選択される1以上の結合標的に対する結合特異性を有する本発明1036〜1039のいずれかの抗体。
[本発明1043]
前記抗体が腫瘍細胞に結合する本発明1036〜1039のいずれかの抗体。
[本発明1044]
前記抗体が、図19に列挙された腫瘍標的関連抗原に結合する本発明1036〜1039のいずれかの抗体。
[本発明1045]
Ｊ鎖が、図19に列挙されたエフェクター細胞標的のいずれかを結合するように修飾される本発明1044の抗体。
[本発明1046]
修飾Ｊ鎖がＶ−リンカー−Ｊの方向である本発明1045の抗体。
[本発明1047]
修飾Ｊ鎖がＪ−リンカー−Ｖの方向である本発明1045の抗体。
[本発明1048]
腫瘍が血液癌または固形腫瘍である本発明1043の抗体。
[本発明1049]
血液癌が、白血病、リンパ腫、骨髄腫及び骨髄異形成症候群から成る群から選択される本発明1048の抗体。
[本発明1050]
白血病が、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、または慢性リンパ性白血病である本発明1048の抗体。
[本発明1051]
リンパ腫が、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫である本発明1048の抗体。
[本発明1052]
抗体が、ＣＤＩＭ、ＣＤ19、ＣＤ20、ＣＤ22、ＣＤ33、ＣＤ70、ＣＤ56、ＣＤ138の1以上に結合する本発明1048の抗体。
[本発明1053]
修飾Ｊ鎖がＣＤ3εに結合する本発明1052の抗体。
[本発明1054]
抗体がＣＤ20に結合し、修飾Ｊ鎖がＣＤ3εを結合する本発明1053の抗体。
[本発明1055]
Ｖ−リンカー−Ｊの方向で修飾Ｊ鎖を含む本発明1054の抗体。
[本発明1056]
Ｊ−リンカー−Ｖの方向で修飾Ｊ鎖を含む本発明1055の抗体。
[本発明1057]
腫瘍が上皮腫瘍である本発明1044の抗体。
[本発明1048]
抗体が腫瘍上の糖質系標的に結合する本発明1045の抗体。
[本発明1049]
抗体がウイルス抗原に結合する本発明1036〜1039のいずれかの抗体。
[本発明1050]
ウイルス抗原がＨＢＶ抗原またはＨＩＶ抗原である本発明1049の抗体。
[本発明1051]
抗原がＰｒｅＳ1である本発明1050の抗体。
[本発明1052]
抗原がＧＰ120である本発明1050の抗体。
[本発明1053]
本発明1036〜1052のいずれかの抗体を含む組成物。
[本発明1054]
さらに薬学上許容可能な担体を含む医薬組成物である本発明1053の組成物。
[本発明1055]
診断用組成物である本発明1053の組成物。
[本発明1056]
腫瘍またはウイルス性疾患の治療方法であって、必要とする対象に有効量の本発明1036〜1052のいずれかの抗体を投与することを含む、治療方法。
[本発明1057]
腫瘍またはウイルス性疾患の治療のための薬物の調製における本発明1036〜1052のいずれかの抗体の使用。
[本発明1058]
腫瘍またはウイルス性疾患の治療における本発明1036〜1052のいずれかの抗体の使用。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020114828000001.app
【外国語明細書】
2020114828000001.pdf
2020114828000002.pdf
2020114828000003.pdf
2020114828000004.pdf