(57)【要約】【課題】  本出願は、概して、Ｆｖドメインの特異的な抗原結合性特性を有するポリペプチドの提供に関する。【解決手段】本出願は、Ｆｖドメインの特異的な抗原結合性特性を有するポリペプチド例えば抗体の挿入可能な可変フラグメント、およびＮＫＧ２Ｄリガンドの改変α１−α２ドメインの製造に関する。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の天然ＭＨＣクラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）分子由来の非天然、改変α１−α２ドメイン分子であって、ＭＩＣ分子の天然α１−α２ドメインに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして、該ドメイン分子が、２０、６８、１２５、１５２、１６１、および１６６位から成る群から選択される位置にて置換されたその天然アミノ酸を２つ以上有する改変α１−α２ドメイン分子。
【請求項２】
前記天然ＭＩＣ分子が、配列番号６４〜７６から成る群から選択される、請求項１に記載の改変α１−α２ドメイン分子。
【請求項３】
前記ドメイン分子が、天然α１−α２ドメインと比較して、ヒトＮＫＧ２Ｄに対するその結合親和性を変更するように改変される、請求項１に記載の改変α１−α２ドメイン分子。
【請求項４】
その変更されたＮＫＧ２Ｄに対する結合親和性が、変更された解離速度による影響を受けている、請求項３に記載の改変α１−α２ドメイン分子。
【請求項５】
その変更されたＮＫＧ２Ｄに対する結合親和性が、より遅い解離速度による影響を受けている、請求項３に記載の改変α１−α２ドメイン分子。
【請求項６】
２０位のアミノ酸が、Ｐ、Ｔ、Ｄ、Ａ、Ｌ、もしくはＮであるか；
６８位のアミノ酸が、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｉ、Ｅ、Ｔ、もしくはＷであるか；
１２５位のアミノ酸が、Ｌ、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｙ、Ｉ、もしくはＳであるか；
１５２位のアミノ酸が、Ｅ、Ｔ、Ｖ、Ｇ、Ｆ、Ｙ、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、Ｍ、もしくはＰであるか；
１６１位のアミノ酸が、Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｋ、Ｇ、Ｌ、Ｆ、もしくはＹであるか；または
１６６位のアミノ酸が、Ｆ、Ｓ、Ｈ、Ｙ、Ｗ、Ｖ、Ｌ、もしくはＭであるか、あるいは
斯かる位置における変更のその組み合わせである、請求項１に記載の改変α１−α２ドメイン分子。
【請求項７】
配列番号３１、３２、３３、３４、３９、４０および４１から成る群から選択されるアミノ酸配列を含有する、請求項６に記載の改変α１−α２ドメイン分子。
【請求項８】
天然α１−α２ドメインと比較して、ＮＫＧ２Ｄに対してより強い親和性結合を示す、請求項１に記載の改変α１−α２ドメイン分子。
【請求項９】
ＮＫＧ２Ｄを発現する細胞の増強された活性化を示し、そして、より優れた標的細胞殺滅効果を有する細胞をもたらす、請求項８に記載の改変α１−α２ドメイン分子。
【請求項１０】
付加された異種ペプチドをさらに含む、請求項１に記載の改変α１−α２ドメイン分子。
【請求項１１】
付加された異種ペプチドが、抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、またはそのフラグメントである、請求項１０に記載の分子。
【請求項１２】
前記ペプチドがＮＫＧ２Ｄに送達される、請求項１０に記載の改変α１−α２ドメイン分子。
【請求項１３】
前記異種ペプチドが、標的細胞上の標的分子へのドメイン分子の結合を導き、その結果、ドメイン分子を標的細胞に送達する、請求項１０に記載の改変α１−α２ドメイン分子。
【請求項１４】
前記分子が、抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、またはそのフラグメントに付加した天然α１−α２ドメインと比較して、より優れた標的細胞殺滅効果を示す、請求項１３に記載の分子。
【請求項１５】
前記分子が、生体内においてより優れた標的細胞殺滅効果を示す、請求項１４に記載の分子。
【請求項１６】
請求項１に記載の改変α１−α２ドメイン分子、および担体または賦形剤を含む組成物。
【請求項１７】
治療薬または診断薬をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記治療薬または診断薬が、改変α１−α２ドメイン分子に付加される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１に記載の改変α１−α２ドメイン分子をコードする核酸分子。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸分子を含む発現カセット。
【請求項２１】
悪性腫瘍またはウイルス感染が疑われるまたは罹患している哺乳動物を処置するための医薬組成物であって、有効量の請求項１２に記載の改変α１−α２ドメイン分子を含み、該標的細胞が、悪性細胞またはウイルス感染細胞である医薬組成物。
【請求項２２】
悪性腫瘍またはウイルス感染に罹患している疑いのある哺乳動物を処置するための医薬組成物であって、有効量の請求項１０に記載の改変α１−α２ドメイン分子を含む医薬組成物。
【請求項２３】
抗体の可変フラグメント（Ｆｖ）を備えた、特異的な抗原結合特性を示す挿入可能なＦｖ（ｉＦｖ）ポリペプチドであって、ここで、Ｆｖの特異的抗原結合ドメインが、それぞれ１〜３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有し、かつ、それぞれＣ末端およびＮ末端を有する、抗体可変領域を２つ、軽鎖（ＶＬ）由来の可変ドメインを１つ、重鎖（ＶＨ）由来の可変ドメインを１つ備え；およびここで、ＶＬおよびＶＨドメインが、ＶＬドメインの標準的な末端の両方をＶＨドメインの標準的な末端の両方に接続する２つのリンカー領域によって連結されるｉＦｖ。
【請求項２４】
非天然のＮ末端とＣ末端の対が、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかの中に作り出されて、受容分子内への結合または挿入のための付加部位を提供する、請求項２３に記載のｉＦｖ。
【請求項２５】
非天然のＮ末端とＣ末端が、互いに空間的に近位に配置される、請求項２４に記載のｉＦｖ。
【請求項２６】
溶媒に晒されたループを１つもしくは複数含む受容ポリペプチドまたはタンパク質をさらに含み、ここで、前記ｉＦｖが該ループの１つもしくは複数の中に挿入される、請求項２４に記載のｉＦｖ。
【請求項２７】
溶媒に晒されたループを１つもしくは複数含む受容ポリペプチドまたはタンパク質をさらに含み、ここで、前記ｉＦｖが、ＶＬまたはＶＨドメイン内の非天然Ｎ末端とＣ末端が互いに空間的に近位に配置されるように、該ループの１つもしくは複数の中に挿入される、請求項２４に記載のｉＦｖ。
【請求項２８】
ＶＬドメインのＣ末端がＶＨドメインのＮ末端に接続され、かつ、ＶＬドメインのＮ末端がＶＨドメインのＣ末端に接続されるか；または、ＶＬドメインのＮ末端がＶＨドメインのＣ末端に接続され、かつ、ＶＬドメインのＣ末端がＶＨドメインのＮ末端に接続される、請求項２３に記載のｉＦｖ。
【請求項２９】
非天然のＮ末端とＣ末端の間の距離が、約０．２〜約２．０ｎｍである、請求項２７に記載のｉＦｖ。
【請求項３０】
前記末端間の距離が、約０．５ｎｍ〜約１．５ｎｍである、請求項２９に記載のｉＦｖ。
【請求項３１】
前記２つのリンカー領域が、約１０〜２５個のアミノ酸から成る同一または非同一のペプチドを含む、請求項２３に記載のｉＦｖ。
【請求項３２】
前記受容ポリペプチドまたはタンパク質が、抗体、Ｉｇ折り畳み、Ｉｇドメイン、グロブリン、アルブミン、フィブロネクチン、フィブロネクチンドメイン、インテグリン、蛍光タンパク質、酵素、外膜タンパク質、受容体タンパク質、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体、ウイルス抗原、ウイルスカプシド、細胞受容体のウイルス性リガンド、高分子量バクテリオシン、ヒストン、ホルモン、ノッティン、環状ペプチド、ＵＬＢタンパク質、レクチン、およびレクチンのリガンドである、請求項２７に記載のｉＦｖ。
【請求項３３】
ｉＦｖがその中に挿入されるかまたは付加される非タンパク質分子をさらに含む、請求項２３に記載のｉＦｖ。
【請求項３４】
前記非タンパク質分子が、多糖、デンドリマー、ポリグリコール、ペプチドグリカン、化学療法薬、毒素、フルオロフォア、発色団、ファルマコホア、抗生物質またはポリケチドである、請求項３３に記載のｉＦｖ。
【請求項３５】
非天然Ｎ末端および非天然Ｃ末端の一方または両方に結合された非タンパク質分子または原子をさらに含む、請求項２４に記載のｉＦｖ。
【請求項３６】
受容分子の溶媒に晒された１つもしくは複数のループのすべてまたはそのうちの一部が削除されるかまたはｉＦｖに置換される、請求項２７に記載のｉＦｖ。
【請求項３７】
ヒト天然ＮＫＧ２Ｄリガンド分子由来の非天然、改変α１−α２ドメイン分子であって、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして、該ドメイン分子が、８０、１５１、１５２、および１５３位から成る群から選択される位置にて置換されたその天然アミノ酸を１もしくは複数有する改変α１−α２ドメイン分子。
【請求項３８】
前記天然リガンド分子が、配列番号１５、１６、１９から成る群から選択される、請求項３７に記載の改変α１−α２ドメイン分子。
【請求項３９】
前記ドメイン分子が、天然α１−α２ドメインと比較して、ヒトＮＫＧ２Ｄに対するその結合親和性を変更するように改変される、請求項３８に記載の改変α１−α２ドメイン分子。
【請求項４０】
８０位のアミノ酸が、Ｌ、Ｗ、Ｖ、Ｆ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｐ、もしくはＴであるか；
１５１位のアミノ酸が、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｒ、もしくはＴであるか；
１５２位のアミノ酸が、ＬもしくはＷであるか；
１５３位のアミノ酸が、Ｅ、Ｋ、Ｇ、もしくはＰであるか；または
斯かる位置における変更のその組み合わせである、請求項３９に記載の改変α１−α２ドメイン分子。
【請求項４１】
ヒト天然ＮＫＧ２Ｄリガンド分子由来の非天然、改変α１−α２ドメイン分子であって、配列番号１７に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして、該ドメイン分子が、１６２および１６５位から成る群から選択される位置にて置換されたその天然アミノ酸を１もしくは複数有する改変α１−α２ドメイン分子。
【請求項４２】
前記天然リガンド分子が、配列番号１７および１８から成る群から選択される、請求項４１に記載の改変α１−α２ドメイン分子。
【請求項４３】
前記ドメイン分子が、天然α１−α２ドメインと比較して、ヒトＮＫＧ２Ｄに対するその結合親和性を変更するように改変される、請求項４２に記載の改変α１−α２ドメイン分子。
【請求項４４】
１６２位のアミノ酸が、Ｇ、Ａ、もしくはＹであるか；および／または
１６５位のアミノ酸が、Ｓ、Ｐ、Ａ、Ｔ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、もしくはＧである、
請求項４３に記載の改変α１−α２ドメイン分子。
【請求項４５】
免疫原に付加され、ここで、該α１−α２ドメインが、免疫原に対する受容動物の免疫応答の効果を促進および／または増強するようなアジュバント活性を提供する、請求項８に記載の改変α１−α２ドメイン分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、概して、Ｆｖドメインの特異的な抗原結合性特性を有するポリペプチド、例えば抗体の挿入可能な可変フラグメント、およびＮＫＧ２Ｄリガンドの改変α１−α２ドメインの製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含めた多くの哺乳動物において、免疫グロブリン（Ｉｇ）としても知られている図１の抗体（Ａｂ）は、細菌やウイルスなどの異物を同定して、中和するために免疫系によって使用される、大きくてＹ形のタンパク質である（Charles Janeway (2001). Immunobiology. (5th ed.), Chapter 3. Garland Publishing. ISBN 0-8153-3642-X.（NCBI Bookshelfを通した電子テキスト全文））。抗体は、抗原と呼ばれる外来標的の独特な部分を認識する。抗体の「Ｙ」の２本のアームの各先端は、抗原結合部位、またはパラトープ（錠前に対する構造類似物）（抗原の１つの特定のエピトープ（同様に鍵に対する類似物）に特異的であり、これらの２つの構造物が厳密に一つに結合することを可能にする）を含んでいる。この結合機構を使用することで、抗体は、免疫系の他の部分による攻撃のために微生物または感染細胞にタグを付与できるか、または例えば、その侵襲および生存に不可欠な微生物の一部分をブロックすることによって、その標的を直接中和できる。抗体の産生は、液性、または「適応」、免疫系の主要な機能である。抗体は形質細胞によって分泌される。天然の抗体は、細胞から分泌される可溶性型、およびＹの「ステム」によってＢ細胞の表面に結合している膜結合型の２つの物理的形態で生じる。
【０００３】
抗体は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する糖タンパク質であり、一般的に、それぞれ２つの大きい重鎖および２つの小さい軽鎖を有する−基本的な構造単位からできている。いくつかの異なったタイプの抗体重鎖、およびいくつかの異なった種類の抗体が存在し、そしてそれらは、それらがどの重鎖を有しているかに基づいて異なったアイソタイプに分類される。哺乳動物では５つの異なった抗体アイソタイプが知られている（Market E, Papavasiliou FN (October 2003). "V(D)J recombination and the evolution of the adaptive immune system". PLoS Biol. 1 (1): E16. doi:10.1371/journal.pbio.0000016. PMC 212695. PMID 14551913）。すべての抗体の一般構造は非常に似ているが、Ｙ形タンパク質のそれぞれのアームの先端における小領域は非常に可変であり、わずかに異なった先端構造、または抗原結合部位を有する何百万もの抗体が存在することを可能にする。この領域は、超可変または可変領域として知られている。これらの天然の変異型のそれぞれが、異なった抗原に結合する。抗体のこの莫大な多様性が、免疫系が同様に幅広く異なった抗原に適合し、認識することを可能にしている（Hozumi N, Tonegawa S (1976). "Evidence for somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73 (10): 3628-3632. doi:10.1073/pnas.73.10.3628. PMC 431171. PMID 824647.）。
【０００４】
天然の「Ｙ」形Ｉｇ分子は４個のポリペプチド鎖；ジスルフィド結合によって接続された２つの同一の重鎖および２個の同一の軽鎖、から成る、図１。各重鎖には、２つの主要領域、定常領域（ＣＨ）および可変領域（ＶＨ）がある。定常領域は、同じアイソタイプの抗体すべてで実質的に同一であるが、しかし、異なったアイソタイプの抗体において異なる。また、軽鎖にも、２つの連続するドメイン：より小さい定常領域（ＣＬ）および可変領域（ＶＬ）がある（Woof J, Burton D (2004). "Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures." Nat Rev Immunol 4 (2): 89-99. doi:10.1038/nril266. PMID 15040582）。
【０００５】
抗体のいくつかの部分は同じ機能を有する。例えば、Ｙの２つのアームのそれぞれは、抗原に結合できる部位を含み、そのため、特定の異物を認識する。抗体のこの領域はＦｖ（フラグメント、可変）領域と呼ばれる。それは、抗体の重鎖の１つの可変領域（ＶH）および軽鎖の１つの可変ドメイン（ＶL）で構成される（Hochman J, Inbar D, Givol D (1973). An active antibody fragment (Fv) composed of the variable portions of heavy and light chains. Biochemistry 12 (6): 1130-1135. doi:10.1021 bi00730a018. PMID 4569769）。パラトープは、Ｆｖの一端にて形作られるので、抗原に結合するための領域である。それには、それぞれＶL上およびＶH上の３つのβ鎖の可変ループが含まれて、抗原への結合に関与する、図２。これらの６個のループは、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる（North B, Lehmann A, Dunbrack RL (2010). "A new clustering of antibody CDR loop conformations". J Mol Biol 406 (2): 228-256. doi:10.1016/j.jmb.2010.10.030. PMC 3065967. PMID 21035459）。
【０００６】
特異的な抗原結合機能を有する有用なポリペプチドは、抗体の可変領域のＣＤＲから得られる。それぞれ３つのＣＤＲを有するこれらの２つの抗体可変領域、軽鎖の１つ（ＶL）と重鎖（ＶH）の１つは、１０〜約２５アミノ酸から成る単一の、短いリンカーペプチドを使用して、タンデムで、いずれかの順序で融合されて、重鎖および軽鎖可変ドメインのそれぞれ１つを含む直鎖一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ポリペプチドを作成できる、図３（Bird, R. E., Hardman, K. D., Jacobson, J. W., Johnson, S., Kaufman, B. M., Lee, S. M., Lee, T., Pope, S. H., Riordan, G. S., and Whitlow, M. (1988) Single-chain antigen-binding proteins, Science 242, 423-426; Huston, J. S., Levinson, D, Mudgett-Hunter, M, Tai, M-S, Novotny, J, Margolies, M.N., Ridge, R., Bruccoleri, RE., Haber, E., Crea, R., and Opperman, H. (1988). Protein engineering of antibody binding sites: Recovery of specific activity in an anti-digoxin single- chain Fv analogue produced in Escherichia coli. PNAS 85: 5879-5883）。
【０００７】
リンカーは、通常、柔軟性のためにグリシンが多く、ならびに溶解性のためにセリン、トレオニン、または荷電アミノ酸が多く、かつ、ＶHのＮ末端をＶLのＣ末端と接続するか、またはその逆のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域の除去と一つのリンカーの導入にもかかわらず、本来の免疫グロブリンの特異性を維持している。この形式は、ｓｃＦｖの抗原結合特性を親タンパク質に与えるために、組換えＤＮＡ技術の当業者が親タンパク質のＮまたはＣ末端に直鎖ｓｃＦｖを遺伝的に融合することを可能にする。数多くの他の多価およびタンデムｓｃＦｖ領域の配置の提案または作製が存在するが、重要なことには、以下で記載するように、すべてが少なくとも２つの空間的に離れた末端を有する、図４（Le Gall, F.; Kipriyanov, SM; Moldenhauer, G; Little, M (1999). "Di-, tri- and tetramenc single chain Fv antibody fragments against human CD 19: effect of valency on cell binding". FEBS Letters 453 (1): 164-168. doi:10.1016/S0014-5793(99)00713-9. PMID 10403395）。
【発明の概要】
【０００８】
今の開示は、ポリペプチドに付加した、いくつかの実施形態において、抗体または抗体のフラグメントに付加したＮＫＧ２Ｄリガンドの改変α１−α２ドメインに関する。いくつかの態様において、本開示は、軽鎖および重鎖抗体可変領域から得られた抗原結合性ペプチドに関し、そしてそれは、２つのリンカー領域と分割された可変ドメインを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】そのＹ形の構造と構造成分を示す典型的な哺乳類の抗体のコンピューター画像プリントアウト（cartoon）。
【００１０】
【図２】ＶHの３つの標識された（相補性決定領域）ＣＤＲおよびＶL ＣＤＲの３つの非標識ループ（それらはパラトープまたは抗原結合部位を形成する）を示す天然の哺乳類の抗体のＦｖ領域の構造のコンピューター画像プリントアウト。
【００１１】
【図３】左側にＮ末端および右側にＣ末端を含んでいる抗原結合部位を有する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の２種類の可能な構造のコンピューター画像プリントアウト。各ｓｃＦｖの単一リンカー領域、またはリンカーペプチドが矢印として示されている。
【００１２】
【図４】（ｓｃＦｖの）多価の一本鎖可変フラグメント。二価（上部）および三価（下部）ｓｃＦｖｓ、タンデム（左側）および二量化／三量化形式（右側）の構造。それぞれが２以上の空間的に離れた自由端を有することに注意する。
【００１３】
【図５】挿入可能な可変フラグメント、ｉＦｖの略図。挿入可能な可変フラグメント、ｉＦｖの略図。（Ａ）ｉＦｖ形式のドメイントポロジーを示す、ＦＧＦＲ３結合抗体からの可変軽（ＶＬ）および可変重（ＶＨ）ドメインの構造。灰色の矢印は２つのリンカー領域（ＬＲ）を表しているが、そのうちの一方のみが、伝統的にＶＬとＶＨの末端を接続するのに使用されて、ｓｃＦｖを作り出す。点線の縁を有するＬＲは、ＶＨ（分子の後ろに見える）のＮ末端にＶＬのＣ末端を接続した。棒線の縁を有するＬＲは、ＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端に接続した。分割されたＶＬドメインのセグメントが、テキストで記載したようにＮｔおよびＣｔと標識される。鎖１（ＳＩ）および鎖２（Ｓ２）の間のＮ末端とＣ末端の非天然対の作成の結果として、ＶＬがＮ末端セグメント（ＶＬＮ）とＣ末端セグメント（ＶＬＣ）に分割された。ＶＬおよびＶＨの６つのＣＤＲが図面上部にループとして表されている。（Ｂ）スペーサー領域（ＳＲ）の有無に関わらずＭＩＣＡ−α３のループ１（ＬＩ）内にｉＦｖを挿入するためのドメインレイアウトのスキーム。また、ｉＦｖは同様にループ２（Ｌ２）および／またはループ３（Ｌ３）内にも挿入される場合がある。
【００１４】
【図６】改変ｓＭＩＣＡ分子のＦＧＦＲ３コートウェルへの結合に関する滴定曲線。結合したｓＭＩＣＡを、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃを使用したＥＬＩＳＡによって検出して、二重特異性活性を確認した。両バージョンの挿入可変フラグメント（ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．１およびＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．２）が、ｓｃＦｖのＣ末端融合物（ＭＩＣＡ−ｓｃＦｖ）に匹敵するくらいＦＧＦＲ３を結合した。
【００１５】
【図７】ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．２の熱安定性。表示した温度（摂氏度）に１時間晒した後の、ＦＧＦＲ３コートウェルに結合したＭＩＣＡ−ｓｃＦｖ（Ａ）またはＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．２（Ｂ）のＥＬＩＳＡ滴定曲線。ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖは８０℃に晒した後にＦＧＦＲ３への強い結合を示したが、ＭＩＣＡ−ｓｃＦｖは７０℃に晒した後に著しく活性を失った。
【００１６】
【図８】ＮＫ媒介標的細胞溶解アッセイ。ＮＫＬエフェクター細胞を、１５：１のエフェクター：標的比にてカルセイン添加ＦＧＦＲ３発現Ｐ８１５標的細胞と共にインキュベートした。陰性対照ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）の濃度増大は標的細胞溶解に対して効果がなかったが、表示したＦＧＦＲ３結合ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ変異型は、標的細胞溶解を刺激した。ＭＩＣＡ−ｓｃＦｖと比較して、両ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ変異型は、より多くの標的細胞溶解を誘導した。
【００１７】
【図９】ＣＤ２０特異的ｓＭＩＣＡ変異型の標的結合活性および細胞溶菌活性。ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．３は、ＥＬＩＳＡにおいてＣＤ２０コートウェルへの滴定可能な結合を示し（Ａ）、かつ、ＣＤ２０発現Ｒａｍｏｓ細胞のＮＫ媒介性細胞溶解も促進した（Ｂ）。（Ｂ）では、ＮＫＬエフェクター細胞を、１５：１のエフェクター：標的比にてカルセイン添加ＣＤ２０発現Ｒａｍｏｓ細胞と共にインキュベートし、そして、陰性対照（ｓＭＩＣＡ）またはＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．３のいずれかの濃度を高めた。
【００１８】
【図１０】ＦＧＦＲ３コートウェルに結合するＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２タンパク質に関する滴定曲線。結合タンパク質を、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃを使用したＥＬＩＳＡによって検出して、二重特異性活性を確認した。試験したＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２タンパク質のすべてのバージョン（ＯＭＣＰ、ＵＬＢＰ１、２、３、４、６）が同様にＦＧＦＲ３に結合した。
【００１９】
【図１１】ＮＫ媒介性標的細胞溶解アッセイ。ＮＫＬエフェクター細胞を、１５：１のエフェクター：標的比にてカルセイン添加ＦＧＦＲ３発現Ｐ８１５標的細胞と共にインキュベートした。陰性対照ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）の濃度増大は標的細胞溶解に対して効果がなかったが、それぞれ表示したＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２タンパク質は標的細胞溶解を刺激した。
【００２０】
【図１２】ＮＫＧ２Ｄ親和性を促進するためのＭＩＣＡのα１−α２ドメインの構造特異的突然変異。（Ａ）ＮＫＧ２Ｄ結合表面を有するＭＩＣＡ（ＰＤＢ１ＨＹＲ）のα１−α２ドメインの構造を、暗灰色に色づけされた５７個の残基に対してマッピングした。（Ｂ）６つの位置が、ＮＫＧ２Ｄ親和性突然変異のために重要な位置と同定された。野生型アミノ酸残基を標識し、それらの側鎖を暗灰色の球で示した。
【００２１】
【図１３】α１−α２変異型を親和性で格付けするためのＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ競合ＥＬＩＳＡ。（Ａ）ヒトＮＫＧ２Ｄ−ＦｃのＭＩＣＡをコートしたプレートへの結合を阻害するα１−α２親和性変異型（１５〜１８）、野生型（ＷＴ）、またはＷＥＤ可溶性ＭＩＣＡタンパク質のパネルに関する滴定データ。（Ｂ）（Ａ）と同じタンパク質セットをマウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対して滴定した。両アッセイにおいて、変異型１５、１６、１７、および１８が、ＷＴおよびＷＥＤタンパク質の両方より有意に少ないＩＣ50値を示した。平衡状態のＩＣ50値が表３に示されている。
【００２２】
【図１４】Ｏｃｔｅｔ機器によるバイオレイヤー干渉法によって計測されるように、ＮＫＧ２Ｄへのα１−α２変異型の結合に関する結合速度および解離速度の分析。反応速度をα１−α２変異型のパネルに関して追跡する。結合相と解離相を、単一指数１：１結合方程式を使用して適合させ、その適合から得られた結合および解離速度定数が表３に示されている。
【００２３】
【図１５】α１−α２変異型標的ＦＧＦＲ３発現細胞に関するＮＫ媒介性標的細胞殺滅アッセイ。ＮＫＬエフェクター細胞を、１５：１のエフェクター：標的比にてカルセイン添加ＦＧＦＲ３発現Ｐ８１５標的細胞と共にインキュベートした。陰性対照ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）の濃度増大は標的細胞溶解に対して効果がなかったが、表紙したα１−α２変異型は標的細胞溶解を刺激した。ＷＴおよびＷＥＤ−ＭＩＣＡに対して、変異型１６、１７、および１８は低濃度にて著しく増強された殺滅を示した。
【００２４】
【図１６】Ｏｃｔｅｔ機器によるバイオレイヤー干渉法によって計測されるように、ＮＫＧ２Ｄへのα１−α２変異型２０、２５、および４８の結合に関する結合速度および解離速度の分析。結合相と解離相を、単一指数１：１結合方程式を使用して適合させ、その適合から得られた結合および解離速度定数が表５に示されている。
【００２５】
【図１７】α１−α２変異型１６、２５およびＷＥＤ標的ＦＧＦＲ３発現Ｐ８１５標的細胞に関するＮＫ媒介性標的細胞殺滅の、カルセインベースのアッセイ。
【００２６】
【図１８】ＭＩＣＡおよびＵＬＢＰからのα１−α２ドメインのタンパク質配列アラインメント（配列番号７７〜８３）。灰色で強調したアミノ酸が、ＵＬＢＰ２（６０個のアミノ酸）およびＵＬＢＰ３（３６個のアミノ酸）におけるＮＮＫ突然変異誘発のために選択された。黒色で強調した残基は、ＮＫＧ２Ｄに対する結合親和性を調節する突然変異と選択および同定されるのに重要な位置と同定された（表６および７）。
【００２７】
【図１９】ＮＫＧ２Ｄに結合するＵＬＢＰ変異型のファージＥＬＩＳＡ力価測定。（Ａ）ファージ上に提示されたＵＬＢＰ２変異型が、ＮＫＧ２Ｄに対して滴定され、そして、相対的結合親和性が天然ＵＬＢＰ２（ＷＴ、黒丸）に対して計測された。（Ｂ）ファージ上に提示されたＵＬＢＰ３変異型が、ＮＫＧ２Ｄに対して滴定され、そして、相対的結合親和性が天然ＵＬＢＰ３（ＷＴ、黒丸）に対して計測された。
【００２８】
【図２０】ＦＧＦＲ３特異的抗体の重鎖（Ａ）または軽鎖（Ｂ）への天然（ＷＴ）、改変された変異型ＷＥＤ、２５または４８α１−α２ドメイン融合物が、ＮＫ依存性標的細胞殺滅に影響を及ぼした。重鎖（Ｃ）または軽鎖（Ｄ）のいずれかと変異型２５および４８との融合が、ＷＥＤ変異型および天然（ＷＴ）融合物と比較して、殺滅の程度および殺滅の効果を有意に高めた。
【００２９】
【図２１】ヒトＥＧＦＲ（Ａ）、ＨＥＲ２（Ｂ）、またはＰＤＬ１（Ｃ）を標的とする抗体の重鎖または軽鎖と変異型２５α１−α２ドメインとの融合が、ＮＫＬ細胞媒介性標的細胞殺滅をそれぞれ高めた。それぞれの親抗体、セツキシマブ（Ａ）、トラスツズマブ（Ｂ）、および抗ＰＤＬ１（Ｃ）によるわずかな殺滅または殺滅の欠如が示されている。
【００３０】
【図２２】変異型２５α１−α２ドメインのトラスツズマブベースの融合物は、生体内においてＮＫ細胞を作動状態にする。親トラスツズマブ、トラスツズマブＨＣ＿２５融合物、およびトラスツズマブＬＣ＿２５融合物を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒと結合させた。３匹のＣ５７ＢＬ／６マウスから成る群に、単回投与の１００μｇの親、ＨＣ融合物またはＬＣ融合物を注射し；そして、血液を、血漿ＰＫ ＥＬＩＳ Ａｓ（Ａ）および末梢ＮＫ細胞に結合した蛍光標識分子のフローサイトメトリー分析（Ｂ）のための表示した時間にて各動物から抜いた。
【００３１】
【図２３】変異型２５と融合したトラスツズマブ親（Ａ）、トラスツズマブベースのＨＣ（Ｂ）およびトラスツズマブ−ＬＣ（Ｃ）を投与した、実施例７および図２１に記載したのと同じ動物で生じた抗薬物抗体。対照（Ｃｔｒｌ）血漿は、どの抗体含有剤も投与しなかったマウス由来の血漿であった。
【００３２】
【図２４】実施例７および図２１〜２２に記載のように、トラスツズマブ−ＨＣおよび−ＬＣと融合した変異型２５α１−α２ドメインを投与した動物で産生される抗体は、親抗体（Ａ）およびα１−α２ドメイン（Ｂ）の両方に結合した。
【００３３】
【図２５】変異型２５への抗ＰＤＬ１融合物の抗腫瘍活性。同種同系ＭＣ３８腫瘍をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下移植し、そして、腫瘍を平均１００ｍｍ3まで増殖させた後に処置を開始した。処置開始時に、１群あたり１０匹のマウスから成る４つのコホートを、１、４、および７日目にビヒクル、抗ＣＴＬＡ４（１００μｇ ｉ．ｐ．）、親抗ＰＤＬ１（３００μｇ ｉ．ｖ．）、または抗ＰＤＬ１ ＨＣ＿２５融合物（３００μｇ ｉ．ｖ．）で非経口的に処置した。腫瘍体積（立方ｍｍ）を表示した時点にて各動物で計測した。  発明の詳細な説明
【００３４】
いくつかの態様において、本発明は、挿入可能な可変フラグメント（ｉＦｖ）ペプチドに関する。多価ｓｃＦｖ構造を含むｓｃＦｖ分子のＣ末端およびＮ末端は空間的に離れているので、（単数もしくは複数の）その折り畳みを乱すかまたは不安定化することなしに、および／またはそれらの抗原結合性特性を維持するためにＣＤＲまたは超可変領域を適切に配置するのに必要とされるＦｖフレームワークを乱すことなしに、親または受容タンパク質のタンパク質折り畳み内に埋め込まれたループ領域内に、ｓｃＦｖ構造を挿入できない。
【００３５】
可変フラグメントまたは親タンパク質の構造的な折り畳みを乱すことなく初期の親タンパク質分子の１もしくは複数のループ領域内に最大６つのＣＤＲを含む抗体の可変フラグメントを挿入するために、我々は、軽鎖およびと重鎖抗体可変ドメインから得られた新しいクラスの抗原結合ペプチドを発明した。新構造は、分割された可変ドメインに加えて、ｓｃＦｖ構造の従来の一つのリンカーよりむしろ、２つのリンカー領域を含む。概念的に、可変軽（ＶＬ）重（ＶＨ）ドメインの標準的な末端を、連続または「円形」ペプチド内に融合した。次に、Ｆｖの６つのＣＤＲのすべてを含むその円形ペプチド構造を、いくつかの可能な新規部位の１つにて概念的に分割して、挿入可能なＦｖ（ｉＦｖ）を作成する。非天然の分割された部位が、ループの先端または湾曲部にまたはその付近にて軽鎖または重鎖可変ドメインのいずれかの中に作成されて、構造、安定性、または望ましい機能を乱すことなく他の（親または受容）タンパク質またはポリペプチドのループ内に挿入可能なように、互いに空間的に近位に、好ましくは０．５〜１．５ｎｍ以内に新しく、独特なＮまたはＣ末端を作り出すことができる。ペプチドのこの新しいクラスは、挿入可能な可変フラグメント（ｉＦｖ）と呼ばれる。ｉＦｖによって受容分子に伝えらる結合または標的化特異性は、異なった抗体もしくはｓｃＦｖベースの別のまたは異なったｉＦＶの受容個体への挿入、あるいは、既存の挿入可能なｉＦｖの１つ以上のＣＤＲを置換することによって変更できる。
【００３６】
他のタンパク質内にＦｖドメインの特異的な抗原結合特性を示す１もしくは複数のｉＦｖポリペプチドを挿入し、その結果新規な結合特性を与えることは、複数の有用性を有する。斯かる用途としては、これだけに限定されるものではないが、親タンパク質が特定の抗原に結合すること、抗原を標的化すること、抗原の存在を検出すること、抗原を取り除くこと、抗原または抗原を発現する細胞にペイロードを送達するために抗原と接触するかまたは近づくこと、抗原を動員すること、および抗原の存在を画像化することを可能にすることが挙げられる。ペイロードは、ｉＦｖのアミノ末端とカルボキシ末端の一方にまたはその両方に直接結合されても、または親タンパク質またはペプチドを介して間接的に結合されてもよい。ペイロードの例としては、これだけに限定されるものではないが、発色団、フルオロフォア、ファルマコホア、原子、重同位体または放射性同位体、造影剤、化学療法薬、または毒素が挙げられる。ペイロードを添加したｉＦｖは、ｉＦｖが特異的に結合する標的分子の場所を突き止めおよび存在を同定し、そして、小さくて、安定した試験管内または生体内における造影剤または診断薬としての役目を果たす。加えて、例えば、悪性腫瘍または感染の処置としてｉＦｖ−薬剤コンジュゲートを作成するために、化学療法薬または毒性分子を、ｉＦｖペプチドのアミノ末端とカルボキシ末端の一方または両方に結合させる。一つのペイロードは、２つの末端にまたがるかまたは接続するようにｉＦｖペプチドのアミノ末端とカルボキシ末端の両方に結合されてもよい；斯かるまたがりは、エクソペプチダーゼ溶解から末端をブロックするかまたは変性またはアンフォールディングからｉＦｖを保護することによってｉＦｖをさらに安定化させ得る。
【００３７】
ｉＦｖペプチドの挿入の候補である親または受容タンパク質またはポリペプチドの例としては、これだけに限定されるものではないが、抗体、Ｉｇ折り畳みまたはＩｇドメインから成るタンパク質、グロブリン、アルブミン、フィブロネクチンおよびフィブロネクチンドメイン、インテグリン、蛍光タンパク質、酵素、外膜タンパク質、受容体タンパク質、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体、ウイルス抗原、ウイルスカプシド、細胞受容体のウイルス性リガンド、高分子量バクテリオシン、ヒストン、ホルモン、ノッティン（knottins）、環状ペプチドまたはポリペプチド、主要組織適合性（ＭＨＣ）ファミリータンパク質、ＭＩＣタンパク質、レクチン、およびレクチンのリガンドが挙げられる。また、ｉＦｖ構造を、例えば多糖質、デンドリマー、ポリグリコール、ペプチドグリカン、抗生物質、およびポリケチドなどの非タンパク質受容分子の中に挿入することも可能である。
【００３８】
免疫系のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および特定の（ＣＤ８＋αβおよびγδ）Ｔ細胞は、ヒトおよび他の哺乳動物において、新生細胞およびウイルス感染細胞に対する最前線の先天性防御としての重要な役割を有する（Cerwenka, A., and L.L. Lanier. 2001. NK cells, viruses and cancer.Nat.Rev.Immunol.1:41-49）。ＮＫ細胞および特定のＴ細胞は、それらの表面上に、標的細胞を認識して病的細胞に対する先天性防御を活性化させることに寄与する、優れたホモ二量体の表面免疫受容体であるＮＫＧ２Ｄを示す（Lanier,LL,1998.NK cell receptors.Ann.Rev.Immunol.16:359-393;Houchins JP et al.1991.DNA sequence analysis of NKG2,a family of related cDNA clones encoding type II integral membrane proteins on human NK cells.J.Exp.Med.173:1017-1020;Bauer,S et al.,1999.Activation of NK cells and T cells by NKG2D,a receptor for stress-inducible MICA. Science 285:727-730）。ヒトＮＫＧ２Ｄ分子は、配列が８４％同一または相同な同族リガンドである単量体ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ（主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ鎖関連糖タンパク質（ＭＩＣ）の多形類似体）に結合するＣ型レクチン様細胞外ドメインを有する（Weis et al.1998.The C-type lectin superfamily of the immune system.Immunol.Rev.163:19-34; Bahram et al.1994.A second lineage of mammalian MHC class I genes. PNAS 91:6259-6263; Bahram et al.1996a.Nucleotide sequence of the human MHC class I MICA gene. Immunogentics 44:80-81; Bahram and Spies TA.1996.Nucleotide sequence of human MHC class I MICB cDNA. Immunogenetics 43:230-233）。ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢの非病的発現は、腸上皮、ケラチノサイト、内皮細胞、および単球に限定されているが、増殖、酸化、および心ショック等の多くの種類の細胞ストレスに応答して、これらのＭＩＣタンパク質の異常な表面発現が起こり、その細胞を病的であると特徴付ける（Groh et al. 1996. Cell stress-regulated human MHC class I gene expressed in GI epithelium. PNAS 93:12445-12450; Groh et al.1998.Recognition of stress-induced MHC molecules by intestinal γδΤ cells.Science 279:1737-1740; Zwirner et al.1999.Differential expression of MICA by endothelial cells, fibroblasts, keratinocytes and monocytes. Human Immunol.60:323-330）。また、ＭＩＣタンパク質の病的発現も、いくつかの自己免疫疾患に関与していると考えられる（Ravetch, JV and Lanier LL. 2000. Immune Inhibitory Receptors. Science 290:84-89; Burgess, SJ. 2008. Immunol. Res. 40:18-34）。不要な攻撃から健康な細胞を保護する一方で、様々な緊急の合図を同定してそれに応答するための手段を免疫系に提供するために、例えば多形ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢなどのＮＫＧ２Ｄリガンドの特異的制御は重要である（Stephens HA,(2001)MICA and MICB genes: can the enigma of their polymorphism be resolved? Trends Immunol.22:378-85; Spies, T.2008. Regulation of NKG2D ligands: a purposeful but delicate affair. Nature Immunol.9:1013-1015）。
【００３９】
ウイルス感染は、ＭＩＣタンパク質の発現の一般的な誘導因子であり、ＮＫ細胞またはＴ細胞の攻撃のためにウイルスに感染した細胞を同定する（Groh et al.1998;Groh et al. 2001. Co-stimulation of CD8+αβΤ-cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat. Immunol. 2: 255-260; Cerwenka, A., and L.L. Lanier. 2001）。実際、宿主細胞に対するそのような攻撃を回避するために、サイトメガロウイルスおよび他のウイルスは、先天性免疫系の逆襲から逃れるために、それらが感染する細胞の表面上のＭＩＣタンパク質の発現を防止する機構を発達させた（Lodoen, M., K. Ogasawara, J. A. Hamerman, H. Arase, J.P. Houchins, E.S. Mocarski, and L.L. Lanier. 2003. NKG2D-mediated NK cell protection against cytomegalovirus is impaired by gp40 modulation of RAE-1 molecules.J.Exp.Med.197:1245-1253; Stern-Ginossar et al,(2007)Host immune system gene targeting by viral miRNA. Science 317:376-381;Stern-Ginossar et al,(2008)Human micro RNAs regulate stress-induced immune responses mediated by the receptor NKG2D. Nature Immunology 9:1065-73;Slavuljica,I A Busche, M Babic, M Mitrovic, I Gasparovic, D Cekinovic, E Markova Car, EP Pugel, A Cikovic, VJ Lisnic, WJ Britt, U Koszinowski, M Messerle, A Krmpotic and S Jonjic.2010.Recombinant mouse cytomegalovirus expressing a ligand for the NKG2D receptor is attenuated and has improved vaccine properties. J. Clin. Invest. 120: 4532-4545）。
【００４０】
肺癌および神経膠芽腫脳腫瘍等の悪性細胞等の多くの悪性細胞も、それらのストレスにもかかわらず、ＭＩＣタンパク質の発現を回避し、その結果、それらも先天性免疫系を逃れるため、ことさら悪性度が高くなり得る（Busche, A et al. 2006, NK cell mediated rejection of experimental human lung cancer by genetic over expression of MHC class I chain-related gene A. Human Gene Therapy 17:135-146; Doubrovina, ES, MM Doubrovin, E Vider, RB Sisson, RJ O’Reilly, B Dupont, and YM Vyas, 2003. Evasion from NK Cell Immunity by MHC Class I Chain-Related Molecules Expressing Colon Adenocarcinoma(2003) J. Immunology 6891-99; Friese, M. et al. 2003. MICA/NKG2D-mediated immunogene therapy of experimental gliomas. Cancer Research 63:8996-9006;Fuertes, MB, MV Girart, LL Molinero, CI Domaica, LE Rossi, MM Barrio, J Mordoh, GA Rabinovich and NW Zwirner. (2008) Intracellular Retention of the NKG2D Ligand MHC Class I Chain-Related Gene A in Human Melanomas Confers Immune Privilege and Prevents NK Cell-Mediated Cytotoxicity.J.Immunology,180:4606-4614）。
【００４１】
ＮＫＧ２Ｄに結合したヒトＭＩＣＡの高分解能構造が解明されており、ＭＩＣＡのα３ドメインは、ＮＫＧ２Ｄと直接的には相互作用しないことが示されている（Li et al. 2001. Complex structure of the activating immunoreceptor NKG2D and its MHC class I-like ligand MICA. Nature Immunol.2:443-451;Protein Data Bank accession code 1HYR）。ＭＩＣＡのα３ドメインは、ＭＩＣＢのα３ドメインと同様に、短い可撓性のリンカーペプチドによってα１−α２プラットフォームドメインに接続され、それ自体がプラットフォームと、ＭＩＣを発現する細胞の表面との間の「スペーサー」として天然に位置する。ヒトＭＩＣＡおよびＭＩＣＢのα３ドメインの三次元構造は、ほぼ同一であり（９４Ｃ−αα’ｓ上で平均二乗距離の平方根＜１Å）、機能的に交換可能である（Holmes et al. 2001. Structural Studies of Allelic Diversity of the MHC Class I Homolog MICB, a Stress-Inducible Ligand for the Activating Immunoreceptor NKG2D.J Immunol.169:1395-1400）。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「可溶性ＭＩＣタンパク質」、「可溶性ＭＩＣＡ」、および「可溶性ＭＩＣＢ」は、ＭＩＣタンパク質のα１、α２、およびα３ドメインを含むが、貫通膜または細胞内ドメインを含まないＭＩＣタンパク質を指す。
【００４３】
可溶性ＭＩＣタンパク質のα１−α２プラットフォームドメインは、α３ドメインに繋ぎ止められ、哺乳動物の細胞間または血管内の空間において拡散性である。好ましくは、本発明の非天然ＭＩＣタンパク質のα１−α２プラットフォームドメインは、ヒトＭＩＣＡまたはＭＩＣＢタンパク質の野生型または天然のα１−α２ドメインと少なくとも８０％同一または相同であり、ＮＫＧ２Ｄに結合する。いくつかの実施形態において、α１−α２プラットフォームドメインは、ヒトＭＩＣＡまたはＭＩＣＢタンパク質の野生型または天然のα１−α２プラットフォームドメインと８０％同一であり、ＮＫＧ２Ｄに結合する。他の実施形態において、α１−α２プラットフォームドメインは、ヒトＭＩＣＡまたはＭＩＣＢタンパク質の野生型または天然のα１−α２プラットフォームドメインと９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、ＮＫＧ２Ｄに結合する。
【００４４】
いくつかの実施形態において、異種ペプチドタグは、可溶性ＭＩＣタンパク質の精製を補助するために、α１−α２ドメインまたは可溶性ＭＩＣタンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合されてもよい。タグ配列は、ポリヒスチジン、ｍｙｃ−ペプチド、またはＦＬＡＧタグ等のペプチドを含む。そのようなタグは、当業者に既知の方法によってＭＩＣ分子の単離後に除去されてもよい。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は互換的に使用され；「異種分子」、「異種ペプチド」、「異種配列」または「異種原子」は、それぞれ天然にまたは通常、対象分子との物理的な関連が見られない分子、ペプチド、核酸、アミノ酸配列、または原子である。
【００４６】
「〜を含む（including）」、「〜を含む（containing）」、または「〜によって特徴付けられる」と交換可能に使用される「含む（comprising）」という用語は、包括的または開放型言語であり、追加の列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。「〜からなる」という句は、特許請求の範囲に規定されていないあらゆる要素、ステップ、または成分を除外する。「〜から本質的になる」という句は、特許請求の範囲の範囲を、規定される材料またはステップ、および請求される発明の基盤および新規特徴に大きな影響を及ぼすことのないものに限定する。本発明の開示は、これらの句の各々の範囲に対応する本発明の実施形態、組成物、および方法を企図する。よって、列挙される要素またはステップを含む組成物または方法は、組成物または方法が、これらの要素またはステップから本質的になるかまたはなる具体的な実施形態を企図する。
【００４７】
本明細書に列挙される全ての参考文献は、以前に明示的に組み込まれているかまはいないかにかかわらず、参照によって、それらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される場合、「a」、「an」、および「any」という用語は、各々、単数形および複数形の両方を含むことを意図する。
【００４８】
本発明について十分に説明してきたが、当業者は、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく、また過度な実験を行うことなく、様々な同等のパラメータ、濃度、および条件においてそれを実施することができることを理解するであろう。本発明は、その特定の実施形態に関連して説明されてきたが、さらなる変更が可能であることを理解されたい。本出願は、一般に本発明の原理に従い、また本発明が関連する技術における既知のまたは一般的な慣行に属するような、本発明の開示からのそのような逸脱を含む、本発明のいかなる変形、使用、または改作も包含することを意図し、上文に記載される本質的な特徴に適用されてもよい。
【実施例】
【００４９】
ｉＦｖおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの改変α１−α２ドメインに関する実施例
実施例１（ｉＦｖ）．具体例として、我々は、以下の順：（親ペプチドとして）ヒトＭＩＣＡのα３ドメインの第１８２アミノ酸〜第１９４アミノ酸（α３ドメインのループ１の始まり）、スペーサーなしまたはＧＧＳアミノ酸スペーサー領域（ＳＲ）、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）結合抗体の構造に基づくｉＦｖペプチド（MAbR3; Qing, J., Du, X., Chen, Y., Chan, P., Li, H., Wu, P., Marsters, S., Stawicki, S., Tien, J., Totpal, K., Ross, S., Stinson, S., Dornan, D., French, D., Wang, Q. R., Stephan, J. P., Wu, Y., Wiesmann, C, and Ashkenazi, A. (2009) Antibody-based targeting of FGFR3 in bladder carcinoma and t(4;14)-positive multiple myeloma in mice, The Journal of clinical investigation 119, 1216-1229）、スペーサーなしまたは別のＧＧＳスペーサー領域、第１９６アミノ酸で始まるα３ドメインのループ１の遠位部、でコードし、かつ、可溶性ＭＩＣＡ分子の第２７６アミノ酸までのα３ドメインの残りのカルボキシ末端部分を含む、１１２６ｂｐおよび１１４４ｂｐのＤＮＡ断片を合成した（それぞれ配列番号１および２）。次に、それぞれの合成の、二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドはＭＩＣＡのα３ドメインのループ１内に挿入されたｉＦｖの形態で６つのＣＤＲを含むポリペプチドをコードした。
【００５０】
配列番号４によってコードされるこのｉＦｖペプチド（配列番号３）自体は、残基ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号５）に相当する２つの同一の典型的なリンカー領域（ＬＲ）を含んだ（Andris-Widhopf, J., Steinberger, P., Fuller, R., Rader, C, and Barbas, C. F., 3rd. (2011) Generation of human Fab antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences, Cold Spring Harbor protocols 2011）。１つのＬＲがＶＬのＣ末端をＶＨドメインのＮ末端につなぎ合わせ、そして、第二のＬＲが、ＶＨドメインのＣ末端をＶＬのＮ末端につなぎ合わせた。概念的に、この新構造は、先に参照した連続または「円形」ペプチドであり、始めのＦｖの６つのＣＤＲが含まれた。抗体の可変のＶＬ鎖は、β鎖１と２（Ｓ１とＳ２）の間のループ領域内で効果的に分割され、その結果、付随する一対の新規、非天然Ｃ末端およびＮ末端のそれぞれを有する新しいＮ末端セグメント（ＶＬＮ）および新しいＣ末端セグメント（ＶＬＣ）を作り出した、図５Ａ。末端のこの対は、例えばタンパク質などの受容分子へのｉＦｖの付加または結合のための１つの部位を作り出した。親α３ドメイン内に挿入されたｉＦｖの図解を図５Ｂに示す。
【００５１】
α３ドメイン内に挿入された異種ｉＦｖペプチドを用いて可溶性ＭＩＣＡタンパク質を作製するために、我々は、それぞれα３−ｉＦｖ．１（配列番号６）およびα３−ｉＦｖ．２（配列番号７）をコードするＤＮＡ配列（配列番号１および２）が入ったバキュロウイルス発現ベクターを作り出した。ＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって増幅し、ＮｃｏｌおよびＥｃｏＲＩ制限酵素を使用して消化し、バキュロウイルス発現ベクター、ＳＷ４０３内にサブクローニングし、そして、野生型α３ドメインを置換した。ＳＷ４０３は、その中に野生型ｓＭＩＣＡ（第１〜２７６残基）が５’ＢａｍＨＩおよび３’ＥｃｏＲＩ部位を使用してあらかじめクローニングされた、ｐＶＬ１３９３（Invitrogen, Inc.）由来のバキュロウイルス発現ベクターである。新しい発現ベクターを、バキュロウイルスＤＮＡと共にＳＦ９昆虫細胞内に形質移入し、バキュロウイルスを、２増幅サイクルにわたり培養し、そして、製造業者のプロトコール（Invitrogen）に従って、Ｔ．ｎｉ昆虫細胞におけるＨｉｓタグ付与ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖタンパク質の発現に使用した。発現を、１００ｍＬの体積中で３日間実施し、そして、Ｎｉ親和性クロマトグラフィーを使用した分泌可溶性タンパク質の精製のために、成長培地を採集した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによてｔ決定した場合に、６０．９ｋＤａの予想分子量を有する＞９０％の純度まで、単量体ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖを精製した。機能の特徴づけを、結合ＥＬＩＳＡおよび試験管内における標的細胞殺滅アッセイを使用して実施した。
【００５２】
精製したＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖタンパク質をＦＧＦＲ３結合ＥＬＩＳＡで試験して、ＦＧＦＲ３標的およびＮＫＧ２Ｄ受容体への同時結合を確認した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のＦＧＦＲ３を、２μｇ／ｍｌの濃度でＭａｘｉｓｏｒｐプレート上にコートした。それぞれのＭＩＣＡタンパク質を、滴定し、１時間ＦＧＦＲ３に結合させ、そして、洗浄して、非結合ｓＭＩＣＡタンパク質を取り除いた。結合したＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖタンパク質を、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃおよび抗Ｆｃ−ＨＲＰコンジュゲートを使用して検出した。図６は、ＦＧＦＲ３へのＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．１およびＭＩＣＡα３−ｉＦｖ．２の両方の結合が、ＭＡｂＲ３から構築された従来のｓｃＦｖを可溶性ＭＩＣＡのＣ末端と融合することによって作られたＭＩＣＡ−ｓｃＦｖの結合に匹敵していたことを示す。これらのＥＬＩＳＡ結果はまた、それぞれ、ｓｃＦｖおよびα１−α２ドメインのＦＧＦＲ３およびＮＫＧ２Ｄ結合特異性の両方が、改変したＭＩＣＡによって維持され、そして、異なったスペーサー形式を使用して挿入されたｉＦｖペプチドが機能的であったことを実証した。
【００５３】
我々は、ｓＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．２の熱安定性を試験し、そして、ｓＭＩＣＡ−ｓｃＦｖのものと比較した。両方のタンパク質を、６０−９０℃の高温に１時間さらし、次に、１時間室温と平衡状態にさせ、その後、ＥＬＩＳＡによって結合特性についてアッセイした。図７の結果は、ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．２がＦＧＦＲ３に対する特異的結合を失うことなく８０℃程度の高い温度にさらされ得ることを示した。従来のＭＩＣＡ−ｓｃＦｖは７０℃にて結合活性を失った。この結果は、本発明のｉＦｖ形式を含む可溶性ＭＩＣＡが、従来のｓｃＦｖ末端融合物より有意に安定していることを示した（Miller, B. R., Demarest, S. J., Lugovskoy, A., Huang, F., Wu, X., Snyder, W. B., Croner, L. J., Wang, N., Amatucci, A., Michaelson, J. S., and Glaser, S. M. (2010) Stability engineering of scFvs for the development of bispecific and multivalent antibodies, Protein engineering, design & selection : PEDS 23, 549-557; Weatherill, E. E., Cain, K. L., Heywood, S. P., Compson, J. E., Heads, J. T., Adams, R., and Humphreys, D. P. (2012) Towards a universal disulphide stabilised single chain Fv format: importance of interchain disulphide bond location and vL-vH orientation, Protein engineering, design & selection : PEDS 25, 321-329）。
【００５４】
ＦＧＦＲ３発現標的細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を再誘導するＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖの能力を、試験管内におけるカルセイン遊離アッセイで実証した。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株、ＮＫＬを、ＦＧＦＲ３を異所的に発現するカルセイン添加Ｐ８１５標的細胞と共に培養した。図８の結果は、従来のＭＩＣＡ−ｓｃＦｖ融合物と比較して、２つのＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ分子がした有意に多量のＮＫ媒介性溶解を誘発し、その一方で、非標的可溶性ＭＩＣＡ対照が殺滅活性を有しなかったことを示した。これらの結果は、本発明のｉＦｖが、標的細胞上のＦＧＦＲ３を結合し、そして、完全な親タンパク質分子、可溶性ＭＩＣＡに照らして、強力なＮＫ細胞媒介性溶解を引き起こしたことを確認した。
【００５５】
他の抗体可変領域へのｉＦｖ形式の適用性を、ＣＤ２０特異的抗体から得られたｉＦｖを含んだα３−ｉＦｖ．３（配列番号８）を同様に構築することによって実証した（Du, J., Wang, H., Zhong, C, Peng, B., Zhang, M., Li, B., Huo, S., Guo, Y., and Ding, J. (2007) Structural basis for recognition of CD20 by therapeutic antibody Rituximab, The Journal of biological chemistry 282, 15073-15080）。図９は、ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．３が、先に記載したプレートベースのＥＬＩＳＡにおいてＣＤ２０でコートしたウェルに特異的に結合でき、さらに、カルセイン遊離アッセイにおいて、ＣＤ２０を発現しているＲａｍｏｓ細胞のＮＫ媒介性溶解も誘発したことを示す。
【００５６】
実施例２（ＮＫＧ２Ｄリガンドの改変α１−α２ドメイン）
ＵＬＢＰ−１からＵＬＢＰ−６で示されるヒトタンパク質は、ＭＩＣＡやＭＩＣＢのように、天然の、ストレス誘発性であって、その上にＮＫＧ２Ｄ受容体を結合し、そして、ヒトＮＫ細胞および特定のＴ細胞を活性化する細胞表面リガンドである（15; Cerwenka A, Lanier LL (2004). NKG2D ligands: unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer. Tissue Antigens 61 (5): 335-43. doi.T0.1034/j.l399-0039.2003.00070.x. PMID 12753652）。加えて、牛痘ウイルスタンパク質ＯＭＣＰは、ＭＩＣタンパク質のα１−α２ドメインのようにＮＫＧ２Ｄに結合する分泌ドメインである。ＯＭＣＰはＮＫＧ２Ｄに対して非常に高い親和性を示し、ＮＫＧ２Ｄがその感染宿主細胞においてウイルスによって誘発される天然ストレスリガンドを認識するのを妨げるほどである（Eric Lazear, Lance W. Peterson, Chris A. Nelson, David H. Fremont. J Virol. 2013 January; 87(2): 840-850. doi: 10.1128/JVI.01948-12）。ＵＬＢＰおよびＯＭＣＰは標準的α１−α２ドメイン構造を共有するＮＫＧ２Ｄリガンド（ＮＫＧ２ＤＬ）であると考えられるが、ＭＩＣＡα１−α２との配列相同性は２７％未満であるので、それらは皆、標的化ドメインをつなぎ留めるα３ドメインを天然には欠いている。我々は、その中に標的化ｉＦｖが挿入されたＭＩＣＡの改変α３ドメインの、ＵＬＢＰ−１、ＵＬＢＰ−２、ＵＬＢＰ−３、ＵＬＢＰ−４、ＵＬＢＰ−６およびＯＭＣＰのそれぞれとの融合の結果として、ＦＧＦＲ３発現細胞を特異的に標的とし、殺滅した異種ポリペプチドを付加することによって、一連の非天然ＵＬＢおよびＯＭＣＰタンパク質を構築した。加えて、我々は、ＭＩＣＡのα１−α２ドメインを改変して、ＮＫＧ２Ｄに対するα１−α２ドメインの親和性を高め、次に、ポリペプチドなどの異種分子に改変α１−α２ドメインを付加した。改変α３−ｉＦｖドメインに付加したＵＬＢＰおよびＯＭＣＰα１−α２ドメインから成るタンパク質を作製するために、我々は、ＵＬＢＰ−１、ＵＬＢＰ−２、ＵＬＢＰ−３、ＵＬＢＰ−４、ＵＬＢＰ−６、およびＯＭＣＰ（それぞれ配列番号１５〜２０）の異なるα１−α２ドメインをコードしたＤＮＡ断片（配列番号９〜１４）の入ったバキュロウイルス発現ベクターを作り出した。ＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって増幅し、ＢｌｐＩおよびＮｃｏＩ制限酵素を使用して消化し、バキュロウイルス発現ベクター、ＫＬＭ４４内に個別にサブクローニングし、そして、ＭＩＣＡα１−α２ドメインを置換した。ＫＬＭ４４は、その中にＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．２があらかじめクローニングされた、ＳＷ４０３由来のバキュロウイルス発現ベクターである。α３−ｉＦｖ．２（ＵＬＢＰｌ−α３−ｉＦｖ．２、ＵＬＢＰ２−α３−ｉＦｖ．２、ＵＬＢＰ３−α３−ｉＦｖ．２、ＵＬＢＰ４−α３−ｉＦｖ．２、ＵＬＢＰ６−α３−ｉＦｖ．２、およびＯＭＣＰ−α３−ｉＦｖ．２；それぞれ配列番号２１〜２６）に融合したＵＬＢＰおよびＯＭＣＰα１−α２ドメインを含む新しいＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２構築物を、バキュロウイルスＤＮＡと共にＳＦ９昆虫細胞内に形質移入した。バキュロウイルスを、２増幅サイクルにわたり培養し、そして、製造業者のプロトコール（Invitrogen）に従って、Ｔ．ｎｉ昆虫細胞におけるＨｉｓタグ付与ＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２タンパク質の発現に使用した。発現を、１００ｍＬの体積中で３日間実施し、そして、Ｎｉ親和性クロマトグラフィーを使用した分泌可溶性タンパク質の精製のために、成長培地を採集した。正しい分子量の単量体タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによてｔ決定した場合に＞９０％の純度まで精製した。機能の特徴づけを、結合ＥＬＩＳＡおよび試験管内における標的細胞殺滅アッセイを使用して実施した。
【００５７】
６種類の精製ＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２タンパク質を、ＦＧＦＲ３結合ＥＬＩＳＡで試験して、ＦＧＦＲ３標的およびＮＫＧ２Ｄ受容体への同時結合を確認した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のＦＧＦＲ３を、２μｇ／ｍｌの濃度でＭａｘｉｓｏｒｐプレート上にコートした。それぞれのＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２タンパク質を、滴定し、１時間ＦＧＦＲ３に結合させ、そして、洗浄して、非結合タンパク質を取り除いた。結合したＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２タンパク質を、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃおよび抗Ｆｃ−ＨＲＰコンジュゲートを使用して検出した。図１０は、ｉＦｖ．２ドメインとの相互作用で予想されるように、６種類のＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２タンパク質のすべてがＦＧＦＲ３に強力に結合し、そして、ＮＫＧ２Ｄ結合活性は、結合させたＮＫＧ２ＤＬα１−α２ドメインによって維持されたことを示し、そしてそれは、付加したα３−ｉＦｖドメインが、ＭＩＣタンパク質のようにＮＫＧ２Ｄを結合する機能的なＦＧＦＲ３結合活性をＵＬＢＰおよびＯＭＰＣタンパク質に与えたことを実証した。
【００５８】
ＦＧＦＲ３発現標的細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を再誘導するＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２タンパク質の能力を、試験管内におけるカルセイン遊離アッセイで実証した。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株、ＮＫＬを、ＦＧＦＲ３を異所的に発現するカルセイン添加Ｐ８１５標的細胞と共に培養した。図１１の結果は、ＯＭＣＰ−α３−ｉＦｖ．２が最大のＮＫ媒介性溶解を引き起こすことを示した、一方で、他のＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２タンパク質はすべて、溶解の効果および量の程度がさまざまな特異的殺滅活性を示した。これらの結果は、本発明のｉＦｖが、それら自身の機能的特性を維持した他のタンパク質に特異的結合活性を与え、そして、ｉＦｖ標的細胞の異なったレベルの細胞媒介性溶解を誘発したことを確認した。
【００５９】
実施例３（ＮＫＧ２Ｄリガンドの改変α１−α２ドメイン）
これらは、ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体へのそれらの結合親和性を有意に高めるために改変したＮＫＧ２ＤＬへのポリペプチドの付加に関する実施例である。ＭＩＣタンパク質のα１−α２ドメインは、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対するＮＫＧ２ＤＬである。この親和性は、ＮＫ細胞の生理的活性化に十分であり、「標的細胞」の二次元的血漿細胞膜表面に不可逆的につなぎ留められた天然の完全長ＭＩＣタンパク質を発現する細胞の溶解を刺激する（Bauer S, Groh V, Wu J, Steinle A, Phillips JH, Lanier LL, Spies T., Science. 1999 Jul 30;285(5428):727-9.）。しかしながら、本発明の遺伝子操作した可溶性ＭＩＣタンパク質が標的細胞表面の標的抗原に可逆的に特異的に結合するので、ＮＫＧ２Ｄに対する遺伝子操作した可溶性ＭＩＣタンパク質の結合親和性は、ＮＫ細胞と標的抗原を発現する細胞との間で形成された可溶性ＭＩＣ依存性複合体の安定性に直接影響する。特に、ｓＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの間の親和性が、ＮＫＧ２Ｄから改変したｓＭＩＣＡの実質的に遅い分離速度または解離速度によって増強されている場合、ＮＫ細胞ベースの殺滅は、標的細胞に結合した可溶性ＭＩＣ分子の密度が低いほどより優れていると予想される。本発明以前には、可溶性ＭＩＣタンパク質の殺滅活性を有意に変更するか、またはＮＫＧ２Ｄに対するＭＩＣタンパク質の親和性を高めるために結合の解離速度を低減するどんなα１−α２突然変異も同定されていなかった。コンピューター設計の取り組みは、組み合わせた状態で、野生型ＭＩＣＡのα１−α２ドメインの３つの突然変異：Ｎ６９Ｗ、Ｋ１５２Ｅ、およびＫ１５４Ｄ（ＷＥＤ−ＭＩＣＡ）が、非結合ＭＩＣＡの安定性に影響することによってＮＫＧ２Ｄ結合親和性に適度に影響し、その結果、会合速度またはＮＫＧ２Ｄへの結合の結合速度に適度に影響すること（Lengyel CS, Willis LJ, Mann P, Baker D, Kortemme T, Strong RK, McFarland BJ.J Biol Chem. 2007 Oct 19;282(42):30658-66. Epub 2007 Aug 8）；公開された構造作図に従った、理論的にＮＫＧ２Ｄに接触するＭＩＣＡの２２個のアミノ酸位置の繰り返し計算により同じ群を走査することによるその後の大規模なコンピューター設計は（Li P, Morris DL, Willcox BE, Steinle A, Spies T, Strong RK., Nat Immunol. 2001 May;2(5):443-451）、より以前に設計された３種類の変更と組み合わせたとき、ＭＩＣＡの更なる合理的で、繰り返しのコンピューター設計が、ＮＫＧ２Ｄに対するその親和性を弱いもの（Ｋd〜２．５μΜ）から合計で７つの組み合わせられ突然変異を有する中程度にしっかりしたもの（Ｋd＝５１ｎＭ）へと質的に変化させたことを実験的に示した（Henager, Samuel H., Melissa A. Hale, Nicholas J. Maurice, Erin C. Dunnington, Carter J. Swanson, Megan J. Peterson, Joseph J. Ban, David J. Culpepper, Luke D. Davies, Lisa K. Sanders, and Benjamin J. McFarland, 2102, Combining different design strategies for rational affinity maturation of the MICA-NKG2D interface. Protein Science 21:1396-1402）。対照的に、本発明に記載した実験的なアプローチは、ＭＩＣＡのα１−α２ドメインとＮＫＧ２Ｄとの間の解離速度を遅くしたＭＩＣＡのアミノ酸修飾を実験的に選択し、Lengyelら（Lengyel CS, Willis LJ, Mann P, Baker D, Kortemme T, Strong RK, McFarland BJ., J Biol Chem. 2007 Oct 19;282(42):30658-66. Epub 2007 Aug 8）の３つのＷＥＤ変更によって安定化させたＭＩＣＡを用いて開始した。
【００６０】
本発明のこの実施例は、解離速度の結合速度論に影響を及ぼして、その結果、本発明の非天然、標的ＭＩＣ分子のＮＫ細胞媒介性殺滅活性を変更するα１−α２ドメイン内の選択したアミノ酸位置における特異的突然変異を遺伝子操作することによって可溶性ＭＩＣタンパク質のＮＫＧ２Ｄ結合親和性を改変することに関する。
【００６１】
ＮＫＧ２Ｄに対する変更された親和性を有する可溶性の非天然α１−α２ドメインを遺伝子操作するために、α１−α２ドメイン内の５７個の残基を大規模な突然変異誘発のために選択した（図１２）。α１−α２ドメインをコードし、および５７個のアミノ酸位置のそれぞれにＮＮＫ変異原性コドンを入れるための合成ＤＮＡライブラリを合成し、Ｍｌ３ファージのｐＩＩＩマイナーコートタンパク質との融合物として個別にクローニングし、そして、α１−α２変異型を提示する突然変異誘発ファージ粒子を、標準的な方法論に従ってＳＳ３２０ Ｅ．コリ（E. coli）細胞に産生させた（Andris-Widhopf, J., Steinberger, P., Fuller, R., Rader, C, and Barbas, C. F., 3rd. (2011) Generation of human Fab antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences, Cold Spring Harbor protocols 2011）。α１−α２ファージライブラリーを、標的抗原として遺伝子組み換え型ビオチン化ＮＫＧ２Ｄを使用して高い結合親和性に関して選別し、そして、遅い分解または解離速度について高められた高親和性変異型を選択するために、意図的に長い結合、延長された洗浄、そして、ファージクローンの溶解の繰り返しラウンドを反復した。１セットの特定のアミノ酸突然変異が、α１−α２内の６つに位置において高頻度で起こったので、高いＮＫＧ２Ｄ結合親和性を有する好ましいアミノ酸置換と選定した（図１２、表１）。
【００６２】
表１．ＭＩＣのα１−α２ドメインの表示した６つのアミノ酸位置にて選択された親和性突然変異。それぞれの６つの位置における配列番号３５のアミノ酸を、表の最初の行にボールド体で示す。同定した親和性突然変異を上から下に向かって頻度が低くなるように列挙する。すべてのアミノ酸を一文字ＩＵＰＡＣ略記によって表す。
【表１】
2020114854.tif 000003
【００６３】
我々は、特定の発見した突然変異の異なった組み合わせを含んだ４つの代表的な変異型１５、１６、１７、１８のα１−α２ドメインをコードするＤＮＡポリヌクレオチド（配列番号２７〜３０）を合成した（表２）。
【００６４】
表２．特定のα１−α２ドメイン変異型の配列。変異型１５、１６、１７、および１８（それぞれ配列番号３１〜３４）に関する特定のアミノ酸置換を、ボールド体で配列番号３５のアミノ酸に対して列挙する。すべてのアミノ酸を一文字ＩＵＰＡＣ略記によって表す。
【表２】
2020114854.tif 000004
【００６５】
上記の実施例におけるＮＫＧ２ＤＬに対して、我々は、リンカーペプチドを使用してこれらの４つの改変α１−α２ＮＫＧ２ＤＬのそれぞれに対して、例えばポリペプチドなどの異種分子を直接付加した。付加した異種分子を伴った改変ＮＫＧ２ＤＬから成る４つのＨｉｓタグ付与タンパク質（配列番号３１〜３４）を昆虫細胞で発現させ、それらのＮＫＧ２Ｄ結合親和性および速度論的結合パラメータを特徴づけるために精製した。競合結合ＥＬＩＳＡを使用して、我々は、４つの改変α１−α２変異型の相対ＮＫＧ２Ｄ結合親和性を測定した。可溶性の野性型（ＷＴ）ＮＫＧ２ＤＬであるｓＭＩＣＡタンパク質をｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレートのすべてのウェルにコートして、ヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ試薬に結合パートナーを提供した。４つのα１−α２変異型、ならびにＷＴおよびＷＥＤα１−α２ドメイン（配列番号３５）の溶液を、ＥＬＩＳＡウェル内で滴定し、２ｎＭのヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃのプレート上にコートしたＷＴ ｓＭＩＣＡへの結合を拮抗阻害させた。プレート上のＷＴ ＮＫＧ２ＤＬに結合したヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃのレベルを、抗Ｆｃ−ＨＲＰ抗体を使用して検出した。図１３Ａは、変異型１６、１７、および１８が０．７、０．６、０．５ｎＭのＩＣ50値を示し、一方で、変異型１５が１．７ｎＭのＩＣ50値を示し、すべてが、それぞれＷＴ ＮＫＧ２ＤＬに比べて、２７、３２、３８、および１１倍良好なＮＫＧ２Ｄに対する有意に優れた結合を有し、ならびに実質的にＷＥＤ−ＭＩＣＡ（表３）より良好であったことを示す。
【００６６】
表３．α１−α２変異型に関する平衡および速度論的結合パラメータ。ＩＣ50値を競合結合力価測定に対する４パラメータ適合から得（図１２）、そして、速度論的結合パラメータを結合速度論に対する単一指数の適合から得た（図１３）。平衡結合定数（Ｋd）を、方程式Ｋd＝ｋOFF／ｋONを使用して速度論的結合パラメータから得た。
【表３】
2020114854.tif 000005
【００６７】
重要なことには、相対ＩＣ50の違いはまた、マウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃへのより優れた結合にも移されたので（図１３Ｂ）、可溶性の、改変α１−α２ドメインの結合を改善する能力が、ヒトとヒト以外のＮＫＧ２Ｄ受容体を超えた、発症前医薬品の開発にとって重要な特性であることを実証した。
【００６８】
変更された親和性に関する速度論的な基礎を理解するために、ビオチン化ヒトＮＫＧ２Ｄをコートした表面に結合するα１−α２変異型ＮＫＧ２ＤＬの結合速度および解離速度の両方を、１００ｎＭのそれぞれ改変α１−α２タンパク質にてバイオレイヤー干渉法（Octet）を使用して計測した。ＩＣ50 ＥＬＩＳＡの結果と一致して、変異型１６、１７、および１８のそれぞれが、解離速度の有意な低減を示し（ＷＴに対して１８倍）、そしてそれは、親和性の増強に大きく関与した（ＷＴα１−α２に対して〜３０倍）（図１４；表３）。変異型１５は１６、１７、および１８と同様の遅い解離速度を示したが、その結合速度は低下し、ＷＴよりより強い親和性をもたらしたが、変異型１６、１７、および１８より弱かった。変異型１５（配列番号３１）と１６（配列番号３２）の唯一の相違点はＫ１２５Ｎ対Ｋ１２５Ｌであったので、１２５位の突然変異は結合速度を明らかに変化させ、一方で、解離速度の減少はＨＩ６１Ｒ突然変異の結果と考えられた。そのため、ＮＫＧ２ＤＬ突然変異の選択したセット（表１）は、解離速度の有意な低減によってＮＫＧ２Ｄに対するα１−α２親和性を増強するのに使用されたが、特定の置換はまた、結合速度も変化させ、以下で記載するように、ＮＫ細胞媒介性殺滅アッセイにおける活性の差分を有することを本願発明において我々が示した親和性増大の増分範囲をもたらした。
【００６９】
ＦＧＦＲ３を発現する標的細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を再誘導するα１−α２親和性変異型の能力を、カルセイン遊離アッセイによって試験管内において実証した。ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株であるＮＫＬを、ＦＧＦＲ３を異所的に発現しているカルセイン添加Ｐ８１５標的細胞と共に培養し、可溶性改変ＭＩＣタンパク質で滴定した。図１５の結果は、ＦＧＦＲ３特異的可溶性ＭＩＣ変異型の殺滅活性が、それらの遺伝子操作したα１−α２親和性と相関したことを示した。具体的には、変異型１６、１７、および１８は、０．７８ｎＭにてＷＴに比べて〜１５倍超の殺滅を示した。ＷＥＤ−ＭＩＣＡ（配列番号３５）はＷＴよりわずかだけ良かった。そのため、本発明は、ヒトＮＫＧ２Ｄに結合する可溶性ＭＩＣタンパク質の解離速度を低減することによってＮＫＧ２Ｄ結合親和性を増強し、そして、結果的に予想どおりに殺滅効果の増強につながったα１−α２ドメイン内のアミノ酸置換に記載する。解離速度を低減するよりむしろ結合速度を増強することによってＮＫＧ２Ｄに対するＷＴ ＭＩＣＡ（図１３Ａ）よりいくらか強い親和性を示した（図１４）ＷＥＤ−ＭＩＣＡは、標的細胞殺滅（図１５）の実質的な改善を示さなかった。さらに、図１３Ｂに示したように、ＷＥＤ−ＭＩＣＡが、ＷＴ ＭＩＣＡよりさらに実質的に乏しいマウスＮＫＧ２Ｄに対する結合を示したが、一方、それぞれ変異型１５、１６、１７、および１８は、ヒトおよびマウスの両方のＮＫＧ２Ｄに対してより優れた親和性を示した、図１３Ａ〜Ｂ。
【００７０】
これらのα１−α２ＮＫＧ２ＤＬ親和性変異型１５、１６、１７、および１８は、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対して付加したポリペプチドの結合親和性を高め、その結果、標的細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を高めた、図１５。
【００７１】
実施例４（ＮＫＧ２Ｄリガンドの改変α１−α２ドメイン）
本発明のこの実施形態は、実施例３に記載したとおり、可溶性ＭＩＣ分子のα１−α２ドメイン内の選択したアミノ酸位置における特異的突然変異を操作することによって得られた追加のＮＫＧ２ＤＬ親和性変異型α１−α２ドメインに関し（表１）、そしてそれはまた、解離速度の結合速度論にも影響を及ぼし、その結果、非天然α１−αのＮＫ細胞媒介性殺滅活性が変化する。変異型１５〜１８が、Ｓ２０、Ｇ６８、Ｋ１２５、およびＨ１６１位に見出された特異的突然変異に注目する一方で、別の変異型セットを、Ｅ１５２、Ｈ１５８、およびＱ１６６位における追加の変異を用いて単離した（表４）。
【００７２】
表４．具体的なα１−α２ドメイン変異型の配列。変異型２０、２５、および４８の特異的アミノ酸置換を、表の最初の行にボールド体で示した配列番号３５のアミノ酸に対して列挙する。すべてのアミノ酸を一文字ＩＵＰＡＣ略記によって表す。
【表４】
2020114854.tif 000006
【００７３】
特定の発見した突然変異の異なった組み合わせ（表４）を含んだ３つの代表的な変異型２０、２５、４８（それぞれ配列番号３９〜４１）のα１−α２ドメインをコードするＤＮＡポリヌクレオチド（配列番号３６〜３８）を合成した。上記の実施例のＮＫＧ２ＤＬに対して、例えばＦＧＦＲ３結合ポリペプチドなどの異種分子を、リンカーペプチドを使用して、これらの３つの改変α１−α２ＮＫＧ２ＤＬのそれぞれに直接付加した。構築物を、ｐＤ２５０９、ＣＭＶベースの哺乳動物細胞発現ベクターのＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位内にクローニングした。ＦＧＦＲ３に結合する異種分子を付加した改変ＮＫＧ２ＤＬから成る３つのＨｉｓタグ付与タンパク質（配列番号３９〜４１）を、製造業者のプロトコール（Life Technologies)に従ってＥｘｐｉ２９３発現系を使用してＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現させ、Ｎｉ親和性クロマトグラフィーを使用して精製して、生化学および活性ベースの分析のための単離タンパク質を得た。
【００７４】
ＮＫＧ２Ｄ結合親和性を特徴づけるために、表面コートしたビオチン化ヒトＮＫＧ２Ｄに結合する３つのα１−α２変異型ＮＫＧ２ＤＬの結合速度および解離速度の両方を、バイオレイヤー干渉法（Octet）を使用して計測した。結合力価測定を、１〜１００ｎＭの力価測定範囲を使用して各タンパク質について実施し、そして、速度データを適合させて、結合速度、解離速度、および平衡結合定数を得た。
【００７５】
変異型２５（配列番号４０）は、変異型１６（配列番号３２）に対してＱ１６６Ｓ突然変異の付加だけを含み（表２）、そして、主に減少する解離速度によって６２ｐＭのＮＫＧ２Ｄ結合親和性を示した（図１６および表５）。これは、Ｑ１６６Ｓ突然変異による平衡結合親和性の８倍の向上を表し（表３と表５を比較）、そして、Ｑ１６６における特異的突然変異が解離速度の減少によって結合親和性に影響を及ぼしたことを実証した。
【００７６】
表５．α１−α２変異型に関する速度論的結合パラメータ。速度論的結合パラメータを、結合速度論に対する単一指数の適合から得た（図１６）。平衡結合定数（Ｋd）を、方程式Ｋd＝ｋOFF／ｋONを使用して速度論的結合パラメータから得た。
【表５】
2020114854.tif 000007
【００７７】
変異型２０（配列番号３９）は、特異的突然変異Ｇ６８Ａ、Ｅ１５２Ｑ、Ｈ１５８ＲおよびＱ１６６Ｆを含み、かつ、変異型２５と同様のパラメータを維持し（表５）、そして、特異的突然変異のこの独特な組み合わせもまた、解離速度の低減によりＮＫＧ２Ｄ結合親和性を改善したことを示唆する。
【００７８】
変異型４８（配列番号４１）は変異型１６に見られるＫ１２５ＬおよびＨ１６１Ｒ突然変異を含むが（表２）；しかしながら、突然変異Ｅｌ５２Ａ、ＨＩ５８１、およびＱ１６６Ａ（表４）の付加は、解離速度を有意に増強し、そして、ＮＫＧ２Ｄ結合親和性の２５０倍の低減をもたらした（図１６および表５）。Ｑ１６６Ａ突然変異は、Ｑ１６６位について選択される好まれる親和性向上突然変異の１つではく（表１）、観察した解離速度の低減に貢献し得る。これらのデータは、α１−α２ドメイン内の規定された位置にて選択および同定された、独特な組み合わせの操作された、突然変異が、解離速度の修飾によってＮＫＧ２Ｄ結合親和性を調整したことを明確に実証した。
【００７９】
ポリペプチドを付加した非天然α１−α２親和性変異型は、カルセイン遊離アッセイにおいて試験管内において実証されたように、ＦＧＦＲ３発現標的細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を再誘導した。ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株であるＮＫＬを、ＦＧＦＲ３を異所的に発現しているカルセイン添加Ｐ８１５標的細胞と共に培養し、可溶性改変ＮＫＧ２Ｄリガンドα１−α２タンパク質で滴定した。図１７の結果は、ＦＧＦＲ３標的可溶性ＭＩＣ変異型の殺滅効果が、それらの遺伝子操作α１−α２親和性と相関したことを示した。具体的には、変異型２５は、０．２ｎＭにて変異型１６より〜３倍多い殺滅を示し、細胞殺滅に関してＥＣ50において〜５倍の改善を示した。加えて、データは、変異型２５＞１６＞ＷＥＤの順で代表的な可溶性ＭＩＣ変異型の間で好ましい殺滅活性を明確に示した（図１７）。
【００８０】
実施例５（ＮＫＧ２Ｄリガンドのを改変α１−α２ドメイン）
この実施形態は、ＵＬＢＰタンパク質のα１−α２ドメインを遺伝子操作することによって得られた追加のα１−α２ＮＫＧ２ＤＬ親和性変異型に関する。ＵＬＢＰタンパク質はα１−α２ドメインを含み、そしてそれは、ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合することができるＮＫＧ２Ｄリガンドである（Cerwenka A, Lanier LL (2004). NKG2D ligands: unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer. Tissue Antigens 61 (5): 335-43. doi:10.1034/j.l399-0039.2003.00070.x.PMID 12753652）。ＮＫＧ２Ｄ結合のこの親和性は、ＮＫ細胞の生理的活性化に十分であり、「標的細胞」の二次元的血漿細胞膜表面に不可逆的につなぎ留められた天然の、天然完全長ＵＬＢＰタンパク質を発現する細胞の溶解を刺激する（Cerwenka A, Lanier LL (2004). NKG2D ligands: unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer. Tissue Antigens 61 (5): 335-43. doi:10.1034/j.l399-0039.2003.00070.x. PMID 12753652）。しかしながら、異種ポリペプチドと融合した遺伝子操作した可溶性α１−α２ドメインが、本発明の特定の実施形態において、標的細胞表面の標的抗原に可逆的に特異的に結合するので、遺伝子操作した可溶性ＭＩＣタンパク質によって既に示したように（実施例２〜４）、ＮＫＧ２Ｄに対する遺伝子操作したＵＬＢＰα１−α２ドメインの結合親和性は、ＮＫ細胞と標的抗原を発現する細胞との間で形成された人工シナプスの安定性に直接影響する。ＮＫＧ２Ｄリガンドとしての遺伝子操作した非天然α１−α２ドメインのレパートリーを多様化させるために、ＵＬＢＰタンパク質を、それらのＮＫＧ２Ｄ結合親和性についてファージディスプレイベースの遺伝子操作のための基質または出発点として使用した。ＵＬＢＰとＭＩＣＡとの間で観察された構造上の相同性にもかかわらず（Radaev, S., Rostra, B., Brooks, AG., Colonna, M., Sun, PD. (2001) Conformational plasticity revealed by the cocrystal structure of NKG2D and its class I MHC- like Ligand ULBP3. Immunity 15, 1039-49.）、ＭＩＣＡに対するＵＬＢＰα１−α２ドメインに関して、配列相同性は＜５０％であった（図１８）。これにより、我々は、ＮＫＧ２Ｄ結合親和性を改善するＵＬＢＰα１−α２ドメイン内のコドン位置の同一性を求めた。
【００８１】
ＵＬＢＰタンパク質からの可溶性、非天然α１−α２ドメインを遺伝子操作するために、ＵＬＢＰ２およびＵＬＢＰ３を、ファージディスプレイおよび高親和性ＮＫＧ２Ｄ結合を有する突然変異の選択により選択した。ＵＬＢＰ２のα１−α２ドメイン（配列番号１６）中の６０個のアミノ酸位置、およびＵＬＢＰ３のα１−α２ドメイン（配列番号１７）中の３６個のアミノ酸位置を大規模な突然変異誘発に選択した（図１８）。加えて、ファージパンニングを妨げる場合がある不対遊離システインを取り除くために、保存的な
システインからセリンへの突然変異を、ＵＬＢＰ２中のＣ１０３Ｓ（配列番号１６）およびＵＬＢＰ３中のＣ８Ｓ（配列番号１７）で実施した。これらのα１−α２ドメインをコードし、および選択されたアミノ酸位置のそれぞれにＮＮＫ変異原性コドンを入れるための合成ＤＮＡライブラリを合成し、Ｍｌ３ファージのｐＩＩＩマイナーコートタンパク質との融合物として個別にクローニングし、そして、α１−α２ＵＬＢＰ２またはＵＬＢＰ３変異型を提示する突然変異誘発ファージ粒子を、標準的な方法論に従ってＳＳ３２０ Ｅ．コリ（E. coli）細胞に産生させた（Andris-Widhopf, J., Steinberger, P., Fuller, R., Rader, C, and Barbas, C. F., 3rd. (2011) Generation of human Fab antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences, Cold Spring Harbor protocols 2011）。α１−α２ファージディスプレイライブラリーを、標的タンパク質としてヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃを使用してＮＫＧ２Ｄに対する高い結合親和性に関して選別し、そして、遅い分解または解離速度について高められた高親和性変異型を選択するために、意図的に長い結合、延長された洗浄、そして、ファージクローンの溶解の繰り返しラウンドを反復した。ＵＬＢＰ２に関して、特定のアミノ酸突然変異が、α１−α２内のＲ８０、Ｖ１５１、Ｖ１５２、およびＡ１５３位において高頻度で見られたので、高いＮＫＧ２Ｄ結合親和性を有する好ましいアミノ酸置換と見なした（図１９Ａおよび表６）。
【００８２】
表６．ＵＬＢＰ３のα１−α２ドメインの表示した４つのアミノ酸位置にて選択された親和性突然変異。それぞれの４つの位置における配列番号１６のアミノ酸を、表の最初の行にボールド体で示す。同定した親和性突然変異を上から下に向かって頻度が低くなるように列挙する。すべてのアミノ酸を一文字ＩＵＰＡＣ略記によって表す。
【表６】
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【００８３】
ＵＬＢＰ３に関して、特異的アミノ酸突然変異が、ＵＬＢＰ２に対して別の場所にて高頻度で見られた（図１８）。ＵＬＢＰ３のα１−α２ドメインのＲ１６２およびＫ１６５位は、高いＮＫＧ２Ｄ結合親和性を有する好ましいアミノ酸置換として同定された特異的突然変異を含んでいた（図１９Ｂおよび表７）。ＵＬＢＰ２およびＵＬＢＰ３から得た改変された非天然α１−α２ドメインは、単独のタンパク質または異種ペプチドもしくはポリペプチドとの融合物として複数の治療学的な形式で高められたＮＫＧ２Ｄ結合のために使用できる。
【００８４】
表７．ＵＬＢＰ３のα１−α２ドメインの表示した２つのアミノ酸位置にて選択された親和性突然変異。それぞれの２つの位置における配列番号１７のアミノ酸を、表の最初の行にボールド体で示す。同定した親和性突然変異を上から下に向かって頻度が低くなるように列挙する。すべてのアミノ酸を一文字ＩＵＰＡＣ略記によって表す。
【表７】
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【００８５】
実施例６（抗体ペプチドと融合させた改変α１−α２ドメイン）
これらは、ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体へのそれらの結合親和性を有意に高めるために改変したＮＫＧ２ＤＬへの抗体ポリペプチドの付加に関する実施例である。ＭＩＣタンパク質のα１−α２ドメインは、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対するＮＫＧ２ＤＬである。抗体は、２本の大きい重鎖および２本の小さい軽鎖からできた非常に安定した糖タンパク質である（図１）。可変ドメインのＣＤＲ領域内で作り出すことができる多くの多様性は、特異的抗体が特異的抗原標的に対して産生されることを可能にする（Hozumi N, Tonegawa S (1976). "Evidence for somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73 (10): 3628-3632. doi:10.1073/pnas.73.10.3628. PMC 431171. PMID 824647.）。抗体は、医薬品開発のための重要な治療薬プラットフォームになり、標的の結合および中和の両方を媒介でき、ならびに補体およびＦｃ受容体結合を通じて免疫系を調節できる（Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. (2014) IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Frontiers in Immunology 5, 520.）。本発明以前に、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対して天然ＮＫＧ２ＤＬより厳密に結合する非天然α１−α２ドメインを使用して免疫細胞を直接活性化するＩｇＧ抗体形式は存在しなかった。先行研究は、マウスＮＫＧ２ＤリガンドであるＲａｅｌβが、マウスにおける抗腫瘍薬として使用するために抗Ｈｅｒ２抗体と融合できることが実証した（Cho, HM., Rosenblatt, JD., Tolba, K., Shin, SJ., Shin, D., Calfa, C, Zhang, Y., Shin, SU. (2010) Delivery of NKG2D ligand using and anti-Her2 antibody-NKG2D ligand fusion protein results in an enhanced innate and adaptive antitumor response. Cancer Research 70, 10121- 30.）。しかしながら、マウスＮＫＧ２ＤリガンドはヒトＮＫＧ２Ｄに結合しないので、ヒトおよびマウスＮＫＧ２Ｄに対して高親和性を有する天然ヒトＮＫＧ２Ｄリガンドは存在しない。本発明の遺伝子操作したα１−α２ＮＫＧ２ＤリガンドとＩｇＧ抗体の重鎖または軽鎖との間の融合（図２０ＡおよびＢ）は、これらの限界を克服し、そして、改変α１−α２ドメインの異種タンパク質またはペプチドとの融合物の多用途性を際立たせた。
【００８６】
抗体への変異型α１−α２ドメイン融合物を作り出すために、ＭＩＣ ＷＴ、変異型ＷＥＤ、２５、および４８のα１−α２ドメインをコードするＤＮＡ配列を合成し、ＦＧＦＲ３特異的抗体からの重鎖（ＨＣ＿ＷＴ、ＨＣ＿ＷＥＤ、ＨＣ＿２５、ＨＣ＿４８）または軽鎖（ＬＣ＿ＷＴ、ＬＣ＿ＷＥＤ、ＬＣ＿２５、ＬＣ＿４８）配列のいずれかとのＣ末端融合物としてクローニングした（Qing, J., Du, X., Chen, Y., Chan, P., Li, H., Wu, P., Marsters, S., Stawicki, S., Tien, J., Totpal, K., Ross, S., Stinson, S., Dornan, D., French, D., Wang, Q. R., Stephan, J. P., Wu, Y., Wiesmann, C, and Ashkenazi, A. (2009) Antibody-based targeting of FGFR3 in bladder carcinoma and t(4;14)-positive multiple myeloma in mice, The Journal of clinical investigation 119, 1216-1229.）（それぞれ配列番号４２〜４９）。得られた融合物を、哺乳動物発現ベクターｐＤ２５０９内にクローニングし、改変したα１−α２ドメインの重鎖または軽鎖融合物のいずれかと対合した完全ＩｇＧ抗体として発現させた（それぞれ配列番号５０〜５７）。一過性の発現を、製造業者のプロトコール（Life Technologies）に従ってＥｘｐｉ２９３発現系を使用してＨＥＫ２９３細胞において実施し、そして、標準的なプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。ＦＧＦＲ３発現標的細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を再誘導する非天然α１−α２−抗体融合物の能力を、カルセイン遊離アッセイによって試験管内において実証した。ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株であるＮＫＬを、ＦＧＦＲ３を異所的に発現しているカルセイン添加Ｐ８１５標的細胞と共に培養し、遺伝子操作した抗体融合物タンパク質で滴定した。図２０Ｃおよび２０Ｄの結果は、ＦＧＦＲ３特異的非天然α１−α２−抗体融合物の殺滅活性が、それらの遺伝子操作したＮＫＧ２Ｄ親和性と相関したことを示した。具体的には、非天然変異型２５および４８の重鎖または軽鎖融合物（ＨＣ＿２５、ＨＣ＿４８およびＬＣ＿２５、ＬＣ＿４８）のいずれかを含む抗体が、ＷＴまたはＷＥＤα１−α２ドメインのいずれかを含む抗体融合物より効果的にＦＧＦＲ３発現細胞を殺滅した。
【００８７】
これは、変異型２５のα１−α２ドメインをＥＧＦＲ特異的抗体セツキシマブ（米国特許第６２１７８６６号）、Ｈｅｒ２特異的抗体トラスツズマブ（Carter, P., Presta, L., Gorman, CM., Ridgway, JB., Henner, D., Wong, WL., Rowland, AM., Kotts, C, Carver, ME., Shepard, HM. (1992) Proc Natl Acad Sci 15, 4285-9）、または抗ＰＤＬ１抗体（米国特許第２０１４０３４１９１７号）の重鎖または軽鎖のいずれかのＣ末端と融合することによって改変α１−α２ドメインを抗体に融合するために一般的かつ有用なアプローチであることをさらに実証した（それぞれ配列番号５８〜６３）。得られた融合物を、変異型２５のα１−α２ドメインの重鎖または軽鎖融合物のいずれかと対合した完全ＩｇＧ抗体の重鎖または軽鎖として発現させた。一過性の発現を、製造業者のプロトコール（Life Technologies）に従ってＥｘｐｉ２９３発現系を使用してＨＥＫ２９３細胞において実施し、そして、標準的なプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。標的発現細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を再誘導する変異型２５のα１−α２−抗体融合物の能力を、カルセイン遊離アッセイによって試験管内において実証した。ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株であるＮＫＬを、カルセイン添加Ａ４３１ ＥＧＦＲ発現標的細胞、ＳＫＢＲ３ Ｈｅｒ２発現標的細胞、またはＰＤＬ１発現Ｂ１６細胞と共に培養し、それぞれの標的特異的な遺伝子操作した抗体融合タンパク質で滴定した。図２１Ａ、２１Ｂ、および２１Ｃの結果は、標的特異的な変異型２５−抗体融合物の殺滅活性が、あらゆる場合において、非融合親抗体を超えて抜本的に改善され、サブナノモル濃度のＥＣ50値を伴い非常に強力であることを示した。これらのデータは、改変α１−α２変異型−抗体融合物が、ＩｇＧ抗体がＮＫＧ２Ｄに強く結合し、抗原特異的細胞溶解を導くことを可能にするための普遍的なプラットフォームであることを示す。
【００８８】
実施例７（トラスツズマブは、生体内においてα１−α２変異型２５結合ＮＫ細胞と融合し、そして、強力な抗原提示を誘発する）
高い親和性でＮＫＧ２Ｄに結合するα１−α２ドメイン変異型を含む融合物タンパク質は、生体内においてＮＫ細胞と結合する。これにより、改変したα１−α２融合物を含む抗原特異的抗体は、ＮＫＧ２Ｄに強く結合し、その結果、特定の抗原を発現する標的細胞を捜し出すために、生体内において抗体を用いてＮＫ細胞表面を効果的に作動状態にする。この活性は、遺伝子操作したＣＡＲ細胞と同様であったが（Gill, S., and June, CH. (2015) Going viral: chimeric antigen receptor T-cell therapy for hematological malignancies. Immunol Rev 263, 68-89.）、しかし、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞型の遺伝的修飾を必要としなかった。
【００８９】
改変したα１−α２融合物を含む抗体が生体内においてＮＫ細胞に結合するか実証するために、トラスツズマブと変異型２５の対応する重鎖および軽鎖の融合物を、血清薬物動態学的（ＰＫ）プロファイルおよびＮＫ細胞標識の薬力学（ＰＤ）について生体内において分析した。３つの抗体：親トラスツズマブ；トラスツズマブ＿ＨＣ２５融合物；およびトラスツズマブ＿ＬＣ２５融合物のすべてを、製造業者のプロトコール（Life Technologies）に従ってＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７と結合させた。３匹のＣ５７ＢＬ／６マウスから成る群に、１００μｇのそれぞれの抗体の単回投与を注射し、そして、血漿ＰＫ ＥＬＩＳＡおよび末梢ＮＫ細胞のフローサイトメトリーのために表示した時点にて採血した。親トラスツズマブ抗体のＰＫプロファイルは、マウスにおける抗体の２４時間以内の典型的なアルファ相分布、および１週間を超える半減期と一致するベータ相消失を示した（図２２Ａ）。変異型２５を用いた重鎖および軽鎖融合物の両方に関しては、初期アルファ相は、親抗体に対してはるかに大きい分布を示し、ＮＫＧ２Ｄ低下と一致したが、一方で、ベータ相消失もマウスにおける典型的な抗体クリアランスと一致していた（図２２Ａ）。マウス血液からの末梢ＮＫ細胞のフローサイトメトリーを使用することで、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７で染色したＮＫ細胞のレベルは、抗体融合物で標識したＮＫ細胞のパーセントにおいて、明らかな時間依存性増大を示したが、親抗体ではそうでなかった（図２２Ｂ）。融合による標識の増大は２４時間以内にピークを迎え、融合物に関するＰＫプロファイルで観察された低下と一致し、そして、注射後、少なくとも３日間安定していた。ＰＫデータとＰＤデータの組み合わせは、変異型２５のα１−α２融合物を含むトラスツズマブ抗体が生体内においてＮＫ細胞上でＮＫＧ２Ｄとの安定な複合体を形成したことを実証する。
【００９０】
ヒトＩｇＧトラスツズマブ抗体に対して抗薬物抗体（ＡＤＡ）の外観を評価するために、ＰＫ／ＰＤ試験からの血漿サンプルをＡＤＡについてＥＬＩＳＡを使用して評価した。図２３Ａ〜Ｃでは、３種類のそれぞれの用量の抗体でコートしたウェルへのマウスＩｇＧ結合に関するＥＬＩＳＡは、変異型２５と融合した抗体だけが、抗体の単回投与後７日以内にＡＤＡを誘導したことを明らかにした。親トラスツズマブ抗体はＡＤＡシグナルを与えなかった。トラスツズマブ抗体自体が免疫応答を誘発しなかったとき、抗体融合物がα１−α２ドメインおよび抗体（トラスツズマブ）成分の両方に対して免疫（ＡＤＡ）応答を誘発したかどうか判定するために、抗体融合物からのＡＤＡ陽性血漿を、親抗体および変異型２５のα１−α２ドメインに対して個別に試験し；両部分を血漿からのＡＤＡと反応させた（図２４Ａおよび２４Ｂ）。これらのデータは、親抗体との高親和性変異型２５の融合が、ＮＫＧ２Ｄ依存性取り込みおよび抗原提示を媒介して、親抗体に対する強力かつ急速な免疫応答を誘発することを実証したが、マウスにおいて単独でそれほど免疫原性はなかった。これにより、抗原または免疫原に付加された高親和性変異型α１−α２ドメインが、強力な抗原提示およびエピトープ拡大を提供して、免疫化のための強力なアジュバントとして効果的に役目を果たした。
【００９１】
誘発される標的細胞溶解のために循環ＮＫ細胞を作動状態にする、および抗原提示を促進する実証された組み合わせ効果は、治療効果を提供する改変されたα１−α２ドメインと抗体融合物の重要な活性である。
【００９２】
実施例８（α１−α２変異型２５との抗体重鎖融合物は、生体内において抗腫瘍活性を示した）
改変したα１−α２と融合した抗原特異的抗体について抗標的細胞活性を有する可能性を調べるために、変異型２５のα１−α２と抗ＰＤＬ１抗体重鎖との融合を、同種同系ＭＣ３８腫瘍モデルで評価した。ＭＣ３８腫瘍を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮下に移植し、そして、腫瘍を平均１００ｍｍ3まで増殖させた後に処置した。処置開始時に、１群あたり１０匹のマウスから成る４つのコホートを、ビヒクル、抗ＣＴＬＡ４（１００μｇ ｉ．ｐ．）、親抗ＰＤＬ１（３００μｇ ｉ．ｖ．）、または抗ＰＤＬ１ ＨＣ＿２５融合物（３００μｇ ｉ．ｖ．）で１、４、および７日目に処置した。図２５では、腫瘍増殖曲線は、抗ＰＤＬ１ ＨＣ＿２５が処置の最初の２週間以内に最も効果的な抗腫瘍活性を媒介したことを示した。腫瘍増殖阻害は、処置開始後から最初の１２日間にわたって確立した抗ＣＴＬＡ４処置および親抗ＰＤＬ１抗体よりも有意に良好であった。１６日目までに、抗ＰＤＬ１ ＨＣ２５処置は、トラスツズマブ融合物に関して観察したＡＤＡ応答の出現と一致して（実施例７）、有効性を失い始めた。有意な抗腫瘍活性は、親抗体および標準的な抗ＣＴＬＡ４処置の両方と比較して変異型２５との抗体重鎖融合物で観察され、高親和性ＮＫＧ２Ｄリガンドとしての役目を果たした改変α１−α２ドメインとの抗体融合物の印象的な治療効果を実証した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月27日(2020.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の可変フラグメント（Ｆｖ）を備えた、特異的な抗原結合特性を示す挿入可能なＦｖ（ｉＦｖ）ポリペプチドであって、ここで、Ｆｖの特異的抗原結合ドメインが、２つの抗体可変ドメイン、軽鎖（ＶＬ）由来の１の可変ドメイン及び重鎖（ＶＨ）由来の１の可変ドメインを１を含み、その各々は１〜３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有し、かつ、それぞれＣ末端およびＮ末端を有し；そしてここで、前記ＶＬおよびＶＨドメインが、ＶＬドメインの標準的な末端の両方をＶＨドメインの標準的な末端の両方に接続する２つのリンカー領域によって連結されるｉＦｖ。
【請求項２】
非天然のＮ末端とＣ末端の対が、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかの中に作り出されて、受容分子内への結合または挿入のための付加部位を提供する、請求項１に記載のｉＦｖ。
【請求項３】
非天然のＮ末端とＣ末端が、互いに空間的に近位に配置される、請求項２に記載のｉＦｖ。
【請求項４】
１つもしくは複数の溶媒に晒されたループを含む受容ポリペプチドまたはタンパク質をさらに含み、ここで、前記ｉＦｖが該ループの１つもしくは複数の中に挿入される、請求項２に記載のｉＦｖ。
【請求項５】
溶媒に晒された１つもしくは複数のループを含む受容ポリペプチドまたはタンパク質をさらに含み、ここで、前記ｉＦｖが、ＶＬまたはＶＨドメイン内の非天然Ｎ末端とＣ末端が互いに空間的に近位に配置されるように、該ループの１つもしくは複数の中に挿入される、請求項２に記載のｉＦｖ。
【請求項６】
ＶＬドメインのＣ末端がＶＨドメインのＮ末端に接続され、かつ、ＶＬドメインのＮ末端がＶＨドメインのＣ末端に接続されるか；または、ＶＬドメインのＮ末端がＶＨドメインのＣ末端に接続され、かつ、ＶＬドメインのＣ末端がＶＨドメインのＮ末端に接続される、請求項１に記載のｉＦｖ。
【請求項７】
非天然のＮ末端とＣ末端の間の距離が、約０．２〜約２．０ｎｍである、請求項５に記載のｉＦｖ。
【請求項８】
前記末端間の距離が、約０．５ｎｍ〜約１．５ｎｍである、請求項７に記載のｉＦｖ。
【請求項９】
前記２つのリンカー領域が、約１０〜２５個のアミノ酸から成る同一または非同一のペプチドを含む、請求項１に記載のｉＦｖ。
【請求項１０】
前記受容ポリペプチドまたはタンパク質が、抗体、Ｉｇ折り畳み、Ｉｇドメイン、グロブリン、アルブミン、フィブロネクチン、フィブロネクチンドメイン、インテグリン、蛍光タンパク質、酵素、外膜タンパク質、受容体タンパク質、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体、ウイルス抗原、ウイルスカプシド、細胞受容体についてのウイルス性リガンド、高分子量バクテリオシン、ヒストン、ホルモン、ノッティン、環状ペプチド、ＵＬＢタンパク質、レクチン、又はレクチンのリガンドである、請求項５に記載のｉＦｖ。
【請求項１１】
前記ｉＦｖがその中に挿入されるかまたは付加される非タンパク質分子をさらに含む、請求項１に記載のｉＦｖ。
【請求項１２】
前記非タンパク質分子が、多糖、デンドリマー、ポリグリコール、ペプチドグリカン、化学療法薬、毒素、フルオロフォア、クロモフォア、ファルマコホア、抗生物質またはポリケチドである、請求項１１に記載のｉＦｖ。
【請求項１３】
前記非天然Ｎ末端および非天然Ｃ末端の一方または両方に結合された非タンパク質分子または原子をさらに含む、請求項２に記載のｉＦｖ。
【請求項１４】
受容分子の溶媒に晒された１つもしくは複数のループのすべてまたはそのうちの一部が削除されるかまたはｉＦｖに置換される、請求項５に記載のｉＦｖ。
【外国語明細書】
2020114854000001.pdf