(57)【要約】      （修正有）【課題】神経機能再生に係わる新規な技術を提供する。【解決手段】タンパク質分解酵素による豚の肝臓分解物を含有することを特徴とする、神経機能再生促進剤。経口投与され、特定病原菌不在豚、特にシュガーポーク（登録商標）の肝臓から得られることを特徴とする、前記神経機能再生促進剤。前記豚の肝臓分解物を含有することを特徴とする、脳由来神経栄養因子の産生促進剤、炎症性サイトカインの産生抑制剤、神経疾患の治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質分解酵素による豚の肝臓分解物を含有することを特徴とする、神経機能再生促進剤。
【請求項２】
経口投与されることを特徴とする請求項１に記載の神経機能再生促進剤。
【請求項３】
前記豚の肝臓分解物が特定病原菌不在豚の肝臓から得られることを特徴とする、請求項１または２に記載の神経機能再生促進剤。
【請求項４】
前記特定病原菌不在豚がシュガーポーク（登録商標）であることを特徴とする、請求項３に記載の神経機能再生促進剤。
【請求項５】
タンパク質分解酵素による豚の肝臓分解物を含有することを特徴とする、脳由来神経栄養因子の産生促進剤。
【請求項６】
タンパク質分解酵素による豚の肝臓分解物を含有することを特徴とする、炎症性サイトカインの産生抑制剤。
【請求項７】
タンパク質分解酵素による豚の肝臓分解物を含有することを特徴とする、神経疾患の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経機能の再生等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、損傷した神経の機能再生は困難とされてきたが、近年、幹細胞を利用した細胞療法などが提案され、注目が集まっている。細胞療法においてはまず、ドナーから得られた幹細胞を培養し、さらに必要に応じて分化誘導を行い、これを治療対象となる生体内に投与することで神経機能の再生を図る。また、そのための技術が提案されており、例えば特許文献１に記載の技術などが知られている。特許文献１は、歯髄幹細胞などの幹細胞を培養することによって得られた幹細胞培養上清を含む、標的組織の損傷部を修復するための損傷部治療用組成物とこれを用いた治療方法に関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第2011/118795号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
以上のような神経機能再生についての報告がこれまでにある一方で、神経機能再生についてのさらなる要求が存在する。
本発明は、神経機能再生に係わる新規な技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、これまでに、認知機能の維持または改善剤についての出願を行っている（特開2016-135757号公報）。該認知機能の維持または改善剤は、タンパク質分解酵素による豚の肝臓分解物を含み、対象に経口投与される。
鋭意研究の結果、本発明者は、豚の肝臓分解物の投与により、損傷した神経機能の再生促進が引き起こされることを新たに見出した。
さらに、本発明者は、豚の肝臓分解物の投与により、脳由来神経栄養因子（BDNF）の産生が促進されたり、炎症性サイトカインの産生が抑制されることも見出した。
【０００６】
本発明の要旨は以下のとおりである。
[１]      タンパク質分解酵素による豚の肝臓分解物を含有することを特徴とする、神経機能再生促進剤。
[２]      経口投与されることを特徴とする[１]に記載の神経機能再生促進剤。
[３]      前記豚の肝臓分解物が特定病原菌不在豚の肝臓から得られることを特徴とする、[１]または[２]に記載の神経機能再生促進剤。
[４]     前記特定病原菌不在豚がシュガーポーク（登録商標）であることを特徴とする、[３]に記載の神経機能再生促進剤。
[５]     タンパク質分解酵素による豚の肝臓分解物を含有することを特徴とする、脳由来神経栄養因子の産生促進剤。
[６]     タンパク質分解酵素による豚の肝臓分解物を含有することを特徴とする、炎症性サイトカインの産生抑制剤。
[７]     タンパク質分解酵素による豚の肝臓分解物を含有することを特徴とする、神経疾患の治療剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、神経機能再生に係わる新規な技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】豚の肝臓分解物とアストロサイトにおけるBDNF産生との関係を示すグラフである。
【図２】豚の肝臓分解物と炎症性サイトカインの産生との関係を示すグラフである。
【図３】豚の肝臓分解物を投与したときのラット脊髄損傷モデルにおけるBasso-Beattie-Bresnaham (BBB)評価を示すグラフである。
【図４】豚の肝臓分解物投与後の脳内及び血漿中のリン脂質濃度を示すグラフである。
【図５】豚の肝臓分解物投与後の脳内及び血漿中のリン脂質濃度を示すグラフである。
【図６】豚の肝臓分解物投与後の脳内及び血漿中のリン脂質濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本実施形態は、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）による豚の肝臓分解物を含有することを特徴とする、神経機能再生促進剤に関する。以下、本実施形態の神経機能再生促進剤について、詳細に説明する。
なお、本明細書において、神経機能再生とは、損傷した軸索が損傷部を超えて伸展し、２次ニューロンにシナプスを形成することによって神経機能を取り戻すことをいう。
【００１０】
本実施形態の神経機能再生促進剤の摂取により神経機能の再生が促進されることの機構については、現在のところ必ずしも明確でないが、豚肝臓由来のペプチドやリン脂質などの複合的な作用と考えられる。
【００１１】
本実施形態の神経機能再生促進剤に係わる豚の肝臓分解物は、例えば特開2016-135757号公報に記載の方法により得ることができる。
【００１２】
本実施形態に係る豚の肝臓を入手する豚の種類、品種などは特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。
一方で、本実施形態に係る豚は、特定病原菌不在豚（Specific Pathogen Free豚、SPF豚）であることが好ましい。
特定病原菌不在豚とは、妊娠末期の母豚から帝王切開により取り出された豚の子孫で、豚の発育に大きな影響を及ぼす病気、具体的にはトキソプラズマ感染症、マイコプラズマ肺炎、萎縮性鼻炎、オーエスキー病、豚赤痢にかかっていない豚をいう。
【００１３】
さらに、本実施形態においては、上記の特定病原菌不在豚が、シュガーポークであることがより好ましい。
シュガーポークは３代かけて衛生管理された特定病原菌不在豚である。具体的には、親豚が分娩する直前に帝王切開して子豚を取り出し、これを上述の５つの病原体がいない安全な原々種にし、つぎにこの豚から普通分娩で生まれた子どもを原種にし、さらにこの豚から生まれた豚が、シュガーポークの親豚となる。
またシュガーポークは、徹底した衛生管理の基、植物性飼料のみによって飼育され、抗生物質、抗菌剤、化学薬品などが投与されることなく生育される。
【００１４】
本実施形態に係る肝臓分解物は、例えば、シュガーポーク等の豚の肝臓を酵素処理した後、処理液を濾過する方法等により得ることができる。
【００１５】
製造方法の一例について、より具体的に説明する。
まず、肝臓原料をホモジナイザーあるいはミンチカッター等を用いて粉砕し、得られた粉砕物に水を加え、反応液とする。添加される水の量は特に限定されず、当業者が適宜設定できる。
なお、本実施形態に係る豚の肝臓の形態は特に限定されず、豚から得られた肝臓であれば生のものでも冷凍等の処理がされていてもよい。また、反応液の調製過程についても上述のものに限らず、例えば豚の肝臓を予め粉砕等の処理に供したものを入手し、これを水に懸濁させて反応液を調製するようにしてもよい。
【００１６】
次に、反応液にタンパク質分解酵素を加え、酵素処理を行う。
本実施形態において、使用されるタンパク質分解酵素は適宜選択でき、エンドペプチダーゼあるいはエキソペプチダーゼのいずれであってもよく、また、これらを組み合わせて使用してもよい。
エンドペプチダーゼとしては、ニュートラーゼ（ノボザイムス）、アルカラーゼ（ノボザイムス）、ヌクレイシン（エイチヴィアイ）、スミチームMP（新日本化学工業）、ブロメラインF（天野製薬）、オリエンターゼ20A（エイチヴィアイ）、モルシンF（キッコーマン）、ニューラーゼF（天野製薬）、スミチームAP（新日本化学工業）等が挙げられる。
また、エキソペプチダーゼとしては、フレーバーザイム（ノボザイムス）、スミチームFP（新日本化学工業）、アクチナーゼ（科研製薬）、コクラーゼP（ジェネンコア）等が挙げられる。反応条件は特に限定されないが、例えば、５０〜５５℃の温度で１２〜２４時間程度の反応時間として行うことができる。また、酵素の使用量も適宜設定できるが例えば肝臓重量の０．１〜０．５質量％程度とすることができる。
【００１７】
次いで、酵素処理を行った反応液に含まれているタンパク分解酵素を失活させる。当該失活処理における条件も特に限定されないが、例えば、反応液を９０℃の温度で１時間程度加熱処理することにより行うことができる。
【００１８】
続いて、タンパク質分解酵素を失活させた反応液を濾過に供して未分解物を除去し、本実施形態の豚の肝臓分解物を得る。なお、得られた豚の肝臓分解物は乾燥させて例えば粉末状として用いることもできるほか、液体状のまま用いることも可能である。また、例えば乾燥処理の前に液体状の肝臓分解物（濾液）に添加するなどして、デキストリンなどの賦形剤などを加えるようにすることもできる。
【００１９】
本実施形態の神経機能再生促進剤は、例えば上述のようにして得られる豚の肝臓分解物を含有する。その含有量は特に限定されず、当業者が適宜設定できるが、例えば、神経機能再生促進剤あたり、３０質量％以上、より好ましくは３０質量％以上８０質量％以下含有する。
また、豚の肝臓分解物のほか１００質量％とする量の他の成分を含んでいてもよく、例えば、上述の賦形剤のほか、基剤、滑択剤、香料、などから構成されていてもよい。
【００２０】
本実施形態の神経機能再生促進剤の形態（剤型）については特に限定されず、医薬品、医薬部外品または食品などとして製造することができる。剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤、座薬、懸濁剤、溶液剤等が可能であり経口または非経口に投与することができる。このうち、投与方法として経口投与が容易であるため、好ましい。具体的には、例えば、ハードゼラチンカプセル等に上述の豚の肝臓分解物を充填した形態や上述の豚の肝臓分解物を液体成分に分散させた態様とすることができる。
また、本実施形態の神経機能再生促進剤が服用される量は、特に限定されず、その形態などを考慮して適宜設定可能であり、例えばハードゼラチンカプセルあたりにおいて豚の肝臓分解物が１００〜５００ｍｇ含有されるようにすることができる。
一日あたりの服用量についても、神経機能再生促進の観点から、例えば本実施形態に係る豚の肝臓分解物が２６６ｍｇ以上、好ましくは７９０ｍｇ以上、より好ましくは１５８０ｍｇ以上服用されるようにすることができる。また、当該一日当たりの服用量の上限値についても特に限定されないが、これ以上摂取しても効果に差がないと考えられるため、２６６０ｍｇ以下の量で服用されるようにすることができる。
【００２１】
以上、本実施形態によれば、個人差はあるが、神経機能の再生を促進することができる、神経機能再生促進剤を提供することができる。
また、本実施形態の神経機能再生促進剤は経口投与により神経機能の再生を促進することも可能であるため、比較的簡単な投与が可能であり、負担軽減に寄与できる。
【００２２】
[他の実施形態]
本発明の一つの実施形態について説明したが、本発明においては他の態様とすることもできる。
タンパク質分解酵素による豚の肝臓分解物の経口投与は、脳由来神経栄養因子（BDNF）の産生を促進する。そのため、他の態様として、本発明はBDNFの産生促進剤に関する。
また、タンパク質分解酵素による豚の肝臓分解物の経口投与は、炎症性サイトカインの産生を抑制する。そのため、他の態様として、本発明は炎症性サイトカインの産生抑制剤に関する。
また、タンパク質分解酵素による豚の肝臓分解物はBDNFの産生促進作用、炎症性サイトカインの産生抑制作用を有するため、精神疾患または神経疾患の治療にも寄与するものと考えられる。したがって、他の態様として精神疾患または神経疾患の治療剤とすることもできる。具体的な精神疾患、神経疾患としては、うつ病、統合失調症、パーキンソン病、脳卒中、ギランバレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、神経細胞死の防御を挙げることができる。
なお、BDNFの産生促進剤、炎症性サイトカインの産生抑制剤、あるいは精神疾患または神経疾患の治療剤とするとき、その組成や投与量などは例えば上記のとおり説明した神経機能回復促進剤と同様とすることができる。
【実施例】
【００２３】
[豚肝臓分解物（PLDP）エキスの調製]
シュガーポークから採取した肝臓原料（冷凍）７５０ｇをホモジナイザー、あるいはミンチカッターでペースト状になるまで粉砕し、イオン交換水８．０Ｌを加えたものを反応液とした。
５Ｌ容反応槽に、得られた反応液と、タンパク質分解酵素（ニュートラーゼ（ノボサイムス））３．７５ｇ添加し、５０℃、３００ｒｐｍの条件で１５時間程度攪拌し、酵素反応を行った。
反応終了後、９０℃で１時間加熱処理を行い、酵素を失活させた。次いで、反応液を濾過し、未分解物を除去し、実施例に係わるPLDPエキスを得た。
【００２４】
[アストロサイトにおける脳由来神経栄養因子（BDNF）産生]
RCR-1ラットアストロサイトを10%牛胎児血清入DMEM培地で6ウェルプレートに3×105/wellとなるように蒔いた。24時間後、1% PLDPエキスまたは10%PLDPエキスを暴露し、24時間後と72時間後のBDNFの発現量をコントロール（PLDPエキス未添加）と比較した。
結果を図１に示す。24時間で1% PLDPエキスでは1.7倍、10% PLDPエキスでは6.8倍にまでBDNFの発現量が上昇した。72時間になるとコントロールよりも低下していた。この結果から、PLDPがアストロサイトに作用してBDNFの分泌を促進し、神経保護の初期に機能する可能性がある。
【００２５】
[BV-2による炎症性サイトカインの産生]
ミクログリアは定常状態においても非常に活発な活動をしており、脳内環境維持のみならず、その発達、学習にも重要な役割がある。マウス脳マイクログリア由来の細胞株であるBV-2細胞 (3×105/well) に0.05&及び1%で調製したPLDPエキスを24時間暴露させた。培地除去後、各細胞から精製したtotal RNAよりcDNAを合成し、炎症性サイトカインであるIL-6、IL-1β、CCL-2 (MCP-1) の発現変動をリアルタイムPCRで確認した。
結果を図２に示す。いずれの炎症性サイトカインもPLDP処理により発現低下が危険率1%で有意に認められた。一方で、PLDPの主要リゾリン脂質であるリゾホスファチジルコリン（LPC）を生理的濃度 (10 μM) でBV-2細胞へ暴露した場合、IL-1βのみ発現の低下が観察され、その他の炎症性サイトカインの発現には影響を及ぼさなかった。また、炎症性リゾリン脂質の一つと考えられているリゾホスファチジン酸（LPA）を10 μMの濃度でBV-2細胞へ暴露しても、炎症性サイトカインの発現変動は認められなかった。以上の結果より、PLDPは細胞非刺激時 (定常状態) において、複数の炎症性マーカーの発現を低下させることが明らかとなった。PLDPには多種多様なリン脂質を含まれることが明らかとなっているが、少なくともその構成リン脂質の一つであるLPCがIL-1βの発現を抑制する抗炎症性分子として機能していることが予想された。
【００２６】
[ラット脊髄損傷モデルにおけるPLDPの効果]
11週齢のWistar雄性ラットを使ってGrunerらの方法を参考に全身麻酔下で脊椎損傷モデルラットを作製した。作製当日からPLDPエキス（全量群：5 ml/kg、半量群：2.5 ml/kg）を2週間連続で経口投与した。この間の0, 1, 3, 5, 7, 10, 14目に22段階評価のBasso-Beattie-Bresnaham (BBB)評価（スコア0（完全麻痺）〜スコア21（正常な後肢運動）の22段階で評価、A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma 12:1-21, 1995）を行った。
結果を図３に示す。全量群では6匹中3匹がスコア7以上であり、そのうちの1匹は最高スコアである21であった。なお、個体差は脊髄切断の程度に依存していると考えられた。
【００２７】
[PLDP投与後の脳内及び血漿中のリン脂質濃度]
6週齢のSPF-ddY雄性マウスにPLDPエキス（1匹あたり100mg）を7日間経口投与した。7日目の経口投与から2時間後に、イソフルレン全身麻酔科で心臓採血より全採血を行い、同時に全脳を採取した。これらの血漿サンプルと全脳サンプルについてリン脂質を測定した。
結果を図４〜６に示す。ホスファチジルコリン（PC）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、ホスファチジルセリン（PS）、ホスファチジルイノシトール（PI）、ホスファチジン酸（PA）、ホスファチジルグリセロール（PG）のいずれのリン脂質の脳内濃度は対象に比較して高値であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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