(57)【要約】【課題】１つには、タンパク質の生産と関連して細胞培養条件の調節および最適化を通じて、タンパク質生産量の増加やミスフォルド／凝集したタンパク質生成抑制、タンパク質の脱アミド体やアミノ酸の置換・欠失体の生成を抑制して免疫原性などの安全性問題および動物細胞の培養における精製工程の複雑化を防止できる方法を提供すること。【解決手段】本発明は、ＩｇＧ  Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の生産方法に関し、具体的には、本発明は、ＩｇＧ  Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の製造方法において、低減された培養温度で前記融合タンパク質を生産する細胞を培養する段階を追加することにより、細胞成長および細胞生存率を増加させて、前記融合タンパク質の生産性を増加させ、凝集体生成を抑制することができ、品質および生産収率を向上させることを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養において融合タンパク質を生産する方法であって、前記タンパク質の発現レベルを増加させるために２８．０℃以上３５．０℃以下の低減された温度で細胞を培養することを含み、前記融合タンパク質が、血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）（ＶＥＧＦ）受容体の可溶性細胞外ドメイン及びヒト免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ）（ＩｇＧ）Ｆｃドメインを含む、方法。
【請求項２】
前記方法によって製造される前記タンパク質が、凝集体の量が減少したタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞培養が、大規模細胞培養である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞培養が、回分培養（ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、反復回分培養（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、反復流加培養（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ）及び灌流培養（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）からなる群から選択されるいずれか一つ以上である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞培養が、流加（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）細胞培養である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、哺乳類細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳類細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＨＯ細胞が、ＤＧ４４、ＤＸＢ−１１、Ｋ−１及びＣＨＯ−Ｓからなる群から選択されるいずれか一つの細胞株である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
培養開始日から温度変更までの培養温度が、３３．０℃〜３８．０℃の温度範囲に含まれる温度である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記低減された温度が、３０．０℃〜３５．０℃の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
培養開始日から温度変更までの培養期間が、１日〜５日である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
温度低減後の培養期間が、２日〜１５日である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
温度変更前の培養期間及び温度変更後の培養期間の合計が、３日以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＶＥＧＦ受容体の前記可溶性細胞外ドメインが、第１のＶＥＧＦ受容体の免疫グロブリン様ドメイン２及び第２のＶＥＧＦ受容体の免疫グロブリン様ドメイン３を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
生産されるタンパク質が、治療用タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
標的タンパク質を製造する方法であって、前記方法が、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法によって、前記標的タンパク質を生産する細胞を培養することを含む、方法。
【請求項１７】
前記標的タンパク質を生産する前記細胞が培養された培養液から前記標的タンパク質を回収する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的タンパク質が、治療用タンパク質である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法によって製造される治療用タンパク質及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項２０】
前記標的タンパク質が、治療用タンパク質である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法によって製造される治療用タンパク質及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年１０月１５日付けで出願された韓国特許出願第１０−２０１５−０１４４３３０号および２０１６年１０月１３日付けで出願された韓国特許出願第１０−２０１６−０１３２６３３号を優先権として主張して利益を享受し、前記明細書の全体は、本明細書中に参考として引用される。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃドメインを有する融合タンパク質、特に、血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）受容体の可溶性細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃドメインが融合したタンパク質（例えば、アフリベルセプト）の生産方法に関する。
【０００３】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、血管新生と血管透過性を増加させる重要な因子である。特に、ＶＥＧＦは、腫瘍細胞で過発現し、異常な血管新生および腫瘍増殖を促進させる（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００４，２３，１７４５−１７５３）。また、異常な血管新生が、腫瘍発生の他に、他の病気にも重要に関連していると報告されている。ＶＥＧＦを介したメカニズムにおいて異常な血管新生は、眼科的疾患である滲出型黄斑変性、糖尿病性網膜症、および網膜静脈閉塞症に伴う黄斑浮腫などに関連している（Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，２０１４，５７，７，６１４−６２３）。
【０００４】
このような眼科的疾患に対する治療剤としては、ペガプタニブ（ＲＮＡアプタマー）、ラニビズマブ（モノクロナールＩｇＧ抗体断片（Ｆａｂ））、ベバシズマブ（モノクロナールＩｇＧ抗体）が使用されており、アフリベルセプト（ＩｇＧ１  Ｆｃで融合したＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２）が、滲出型黄斑変性の治療剤として２０１１年に米国で承認された（Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０１２．２．３．１−２２；Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１３，３，７，７１１−７２２）。
【０００５】
このような治療用組換えタンパク質に対する需要が増加しているため、細胞の選別、培地の最適化および培養工程の制御の改善による細胞成長、生存力およびタンパク質の生産および品質の向上に多くの検討がなされている。細胞培養で生産される多くのタンパク質とポリペプチドは、細胞を一定時間中に一定温度やｐＨで回分式または流加式方法で培養して生産し分離する方法で製造される。したがって、生産量と品質は、細胞の培養条件によって影響される。タンパク質の生産と関連して細胞培養条件の調節および最適化を通じて、タンパク質生産量の増加やミスフォルド／凝集したタンパク質生成抑制、タンパク質の脱アミド体やアミノ酸の置換・欠失体の生成を抑制して免疫原性などの安全性問題および動物細胞の培養における精製工程の複雑化を防止できる方法が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００４，２３，１７４５−１７５３
【非特許文献２】Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，２０１４，５７，７，６１４−６２３
【非特許文献３】Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０１２．２．３．１−２２
【非特許文献４】Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１３，３，７，７１１−７２２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前述の課題を解決するためになされたものであって、タンパク質発現量を増加させるための、ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質の生産方法を提供する。
【０００８】
本発明の他の目的は、前述した生産方法で標的タンパク質を生産する細胞を培養することを含む標的タンパク質の製造方法を提供することにある。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、前述した製造方法で製造された治療用タンパク質および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供することにある。
【００１０】
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、前述した課題に限定されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明は、ＩｇＧ  Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を生産する細胞の培養条件を最適化させることにより、前記融合タンパク質の生産性および品質を向上させることを確認した。具体的には、一定期間中に通常の培養温度（３５．０℃〜３８．０℃）で培養した後、培養温度を２８．０℃〜３５．０℃に低減して培養することにより、前記融合タンパク質の生産性の増加および前記融合タンパク質の凝集体の生成抑制を確認し、これに基づいて本発明を完成した。
【００１２】
上記目的を達成するために、本発明は、細胞培養で血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体の可溶性細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ）Ｆｃドメインが融合したタンパク質の生産方法であって、前記融合タンパク質の発現量を増加させるために細胞を２８．０℃〜３５．０℃未満の低減された温度で培養する方法を提供する。
【００１３】
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記方法で製造された融合タンパク質は、凝集体が減少したものであってもよい。
【００１４】
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記細胞培養は、大規模細胞培養であってもよい。
【００１５】
本発明の好ましい他の一実施形態によれば、前記細胞培養は、回分培養法（ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、反復回分培養法（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養法（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、反復流加培養法（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養法（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ）および灌流培養法（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）よりなる群から選択されたいずれか一つであってもよい。
【００１６】
本発明の好ましいさらに他の一実施形態によれば、前記細胞培養は、流加細胞培養であってもよい。
【００１７】
本発明の好ましい他の一実施形態によれば、前記細胞は、哺乳類細胞であってもよい。
【００１８】
本発明の好ましいさらに他の一実施形態によれば、前記哺乳類細胞は、ＣＨＯ細胞であってもよい。
【００１９】
本発明の好ましい他の一実施形態によれば、前記ＣＨＯ細胞は、ＤＧ４４、ＤＸＢ−１１、Ｋ−１およびＣＨＯ−Ｓよりなる群から選択されたいずれか一つの細胞株であってもよい。
【００２０】
本発明の好ましいさらに他の一実施形態によれば、培養開始日から温度変更まで培養温度は３３．０℃〜３８．０℃未満の温度範囲を含んでいてもよい。
【００２１】
本発明の好ましいさらに他の一実施形態によれば、前記低減された温度は、３０．０℃〜３４．０℃であってもよい。
【００２２】
本発明の好ましい他の一実施形態によれば、培養開始日から温度変更まで培養期間が１日〜５日であってもよい。
【００２３】
本発明の好ましいさらに他の一実施形態によれば、温度低減後に培養期間が２日〜１５日であってもよい。
【００２４】
本発明の好ましい他の一実施形態によれば、温度変更前の培養期間および温度変更後の培養期間の合計が３日以上であってもよい。
【００２５】
本発明の好ましい他の一実施形態によれば、前記ＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインは、第１のＶＥＧＦ受容体の免疫グロブリン様ドメイン２および第２のＶＥＧＦ受容体の免疫グロブリン様ドメイン３を含んでいてもよい。
【００２６】
本発明の好ましいさらに他の一実施形態によれば、生産されたタンパク質は、治療用タンパク質であってもよい。
【００２７】
また、本発明は、前述した生産方法で標的タンパク質を生産する細胞を培養することを含む標的タンパク質の製造方法を提供する。
【００２８】
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記標的タンパク質を生産する細胞が培養された培養液から前記標的タンパク質を回収する工程をさらに含んでいてもよい。
【００２９】
本発明の好ましいさらに他の一実施形態によれば、前記標的タンパク質は、治療用タンパク質であってもよい。
【００３０】
また、本発明は、前述した製造方法で製造された治療用タンパク質および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
【００３１】
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、前述の課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は、下記記載から当業者に明確に理解され得る。
【発明の効果】
【００３２】
本発明は、ＩｇＧ  Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を生産する細胞を低減された培養温度で培養する段階を追加することにより、細胞成長および細胞生存率を増加させ、前記融合タンパク質の発現量を増加させ、凝集体の生成を抑制して、結果的に、前記融合タンパク質の生産性を増加させ、品質を向上させることにより、前記融合タンパク質の大量製造および供給を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】アフリベルセプトを生産する細胞の培養温度による細胞成長および細胞生存率の変化を分析したグラフである。
【図２】時間（Ｘ軸；培養時間［日］）によるアフリベルセプトを生産する細胞の、ＩＶＣで正規化された、統合生存細胞数（Ｙ軸；ＩＶＣ［正規化された１０９細胞×日／Ｌ］）を示すグラフである。
【図３】アフリベルセプトを生産する細胞の培養温度による特定生産率（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）の変化を示すグラフである。
【図４】アフリベルセプトを生産する細胞の培養温度による発現量の変化をＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）で分析したグラフである。
【図５】アフリベルセプトを生産する細胞の低温培養温度による細胞成長および細胞生存率の変化を分析したグラフである。
【図６】アフリベルセプトを生産する細胞の低温培養温度による発現量の変化をＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）で分析したグラフである。
【図７】２Ｌのバイオリアクターでアフリベルセプトを生産する細胞の培養温度による細胞成長および細胞生存率の変化を分析したグラフである。
【図８】２Ｌのバイオリアクターで時間（Ｘ軸；培養時間［日］）によるアフリベルセプトを生産する細胞の、ＩＶＣで正規化された、統合生存細胞数（Ｙ軸；ＩＶＣ［正規化された１０９細胞×日／Ｌ］）を示すグラフである。
【図９】２Ｌのバイオリアクターでアフリベルセプトを生産する細胞の培養温度による特定生産率の変化を示すグラフである。
【図１０】２Ｌのバイオリアクターでアフリベルセプトを生産する細胞の培養温度による発現量の変化をプロテインＡ−ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）で分析したグラフである。
【図１１】２Ｌのバイオリアクターでアフリベルセプトを生産する細胞の培養温度による凝集したタンパク質の変化をＳＥ−ＨＰＬＣ（サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー）で分析したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明をより詳細に説明する。
前述したように、治療用組換えタンパク質に対する需要の増加に伴い、細胞の選別、培地の最適化および培養工程の制御の改善による細胞成長、生存力およびタンパク質の生産と品質の向上に多くの検討がなされており、タンパク質の生産と関連して細胞培養条件の調節および最適化を通じてタンパク質生産量の増加またはミスフォルド／凝集したタンパク質の生成抑制、タンパク質の脱アミド体やアミノ酸の置換・欠失体の生成を抑制して、免疫原性などの安全性問題および動物細胞の培養における精製工程の複雑化を防止できる方法が必要である。
【００３５】
これにより、本発明者らは、一定期間中に通常の培養温度（３５．０℃〜３８．０℃）で培養した後、培養温度を２８．０℃〜３５．０℃に低減して培養することにより、ＩｇＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ）Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の生産性が増加し、前記融合タンパク質の凝集体の生成が抑制されることを確認し、細胞培養でタンパク質の発現量が増加した、ＩｇＧ  Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の生産方法を提供することにより、前述した課題の解決方法を見い出した。本発明のＩｇＧ  Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の生産方法は、ＩｇＧ  Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を生産する細胞を低減された培養温度で培養する段階を行うことにより、細胞成長および細胞生存率を増加させ、前記融合タンパク質の発現量を増加させ、凝集体の生成を抑制して、結果的に、前記融合タンパク質の生産性を増加させ、品質を向上させることにより、前記融合タンパク質の大量製造および供給を可能にする。
【００３６】
本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する技術分野における当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。
【００３７】
本発明において「ＩｇＧ  Ｆｃドメインを有する融合タンパク質」は、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の不変領域であるＦｃ領域に結合したタンパク質を意味する。この際、本発明において「タンパク質」は、ペプチド結合で数個以上のアミノ酸重合体を意味する。
【００３８】
本発明において「アミノ酸重合体」は、ヒトＶＥＧＦ受容体１と２が使用され得、好ましくは、ＶＥＧＦ受容体１と２の細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）が使用され得る。
【００３９】
本発明において「Ｆｃ領域」は、抗体の不変領域であって、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２，ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が使用され得、好ましくは、ＩｇＧ１のＦｃ領域が使用され得る。
【００４０】
本発明は、細胞培養で血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体の可溶性細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ）Ｆｃドメインが融合したタンパク質の生産方法であって、前記融合タンパク質の発現量を増加させるために、細胞を２８．０℃〜３５．０℃未満の低減された温度で培養する方法を提供する。
【００４１】
前記融合タンパク質の生産方法において、前記細胞培養は、大規模細胞培養であってもよく、細胞培養方法は、通常使用される細胞培養法を使用することができる。例えば、前記細胞培養方法は、これに限定されるものではないが、回分培養法、反復回分培養法、流加培養法、反復流加培養法、連続培養法および灌流培養法よりなる群から選択されたいずれか一つ以上であってもよい。
【００４２】
前記「回分培養法」は、培地に少量の種培養液を添加し、培養中に新しく培地を追加したりまたは培養液を排出したりすることなく、細胞を増殖させる培養方法である。前記「連続培養法」は、培養中に連続的に培地を追加し、且つ連続的に排出させる培養方法である。また、連続培養法には、灌流培養も含まれる。前記「流加培養法」は、回分培養法と連続培養法の中間に該当するので、半回分培養法（ｓｅｍｉ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）とも呼ばれ、培養中に連続的にまたは逐次的に培地が追加されるが、連続培養法のような連続的な培養液の排出が実施されるものの、細胞が流出されない培養方法である。本発明では、前記培養方法のうちいずれの培養方法を使用してもよいが、好ましくは、流加培養法または連続培養法を使用してもよく、特に好ましくは、流加培養法を使用してもよい。
【００４３】
本発明においてＦｃ融合タンパク質の発現に使用する細胞は、前記融合タンパク質を持続的に発現できる安定した細胞株であれば、制限なしに使用でき、好ましくは、哺乳類細胞であってもよい。より好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＣＯＳ細胞、３Ｔ３細胞、ミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞など一般的に使用されている動物培養細胞を使用し、大量発現を目的とする場合には、特にＣＨＯ細胞が好ましい。また、所望のタンパク質を製造するためには、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８０，７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ  Ｋ−１細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９６８，６０，１２７５）など所望の遺伝子を導入するのに適した細胞であることが好ましい。前記ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＧ４４株、ＤＸＢ−１１株、Ｋ−１株またはＣＨＯ−Ｓ株が好ましく、特にＫ−１株が好ましく、宿主細胞へのベクターの導入は、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法などの方法で実施することが可能である。
【００４４】
本発明のＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインとヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが融合したタンパク質の生産方法において、培養開始日から温度変更までの培養温度は、細胞種類によって通常使用される培養温度を選択して使用することができる。例えば、哺乳類細胞を培養するために通常使用される温度範囲は、３３．０℃〜３８．０℃未満であってもよく、特に好ましくは、３７．０℃である。本発明の好ましい一実施形態では、組換え型アフリベルセプトを過発現する細胞を培養開始日から温度変更まで３７．０℃で培養して細胞を成長させた。
【００４５】
本発明において温度変更のタイミングは、標的タンパク質の発現量によって決定される。具体的には、実施例３に示す実験を実施することにより、最適の温度変更タイミングが決定されるが、使用する細胞や培養条件によって最終細胞密度が異なるため、一般的には、１×１０６細胞／ｍＬ〜１×１０８細胞／ｍＬ程度が好ましい。
【００４６】
本発明は、前記融合タンパク質の製造を目的として、タンパク質をコードする遺伝子を導入したＣＨＯ細胞を培養する時、細胞当たり生産性の増加と凝集体発生を抑制するための方法であって、培養開始日から１日後から５日後まで通常の培養温度で細胞を培養し、その後、培養温度を低減することを特徴とする。温度変更された後から培養を終了するまでの期間としては、一般的には、１日から３０日であってもよく、好ましくは、２日から１５日であってもよい。温度変更前の培養期間と温度変更後の培養期間の合計は、３日以上であってもよい。具体的には、前記融合タンパク質を生産する細胞を培養して前記タンパク質を生産する方法において、一定期間中に通常の培養温度で細胞を培養した後、低減された温度で続いて細胞を培養することを特徴とする。ここで通常の培養温度は、恒温動物由来細胞の細胞増殖に適した温度である３３．０℃〜３８．０℃が一般的であり、３７．０℃が最も一般的である。
【００４７】
本発明のＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインとヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが融合したタンパク質の生産方法において、低減された培養温度は、通常の培養温度より低い温度範囲を意味し、最適の低減された培養温度は、標的タンパク質の発現量によって決定される。したがって、本発明では、実施例２に記載されたように、実験を行って標的タンパク質が最大に発現する最適の低減された培養温度範囲を導き出した。実施例２のような実験を通じて最適の変更温度が分かるが、使用する細胞の種類や培養条件によって最終細胞密度が異なるため、最適の低減された培養温度は、好ましくは、２８．０℃〜３５．０℃、より好ましくは、３０．０℃〜３４．０℃であってもよい。
【００４８】
本発明のＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインとヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが融合したタンパク質の生産方法において、前記ＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインは、第１のＶＥＧＦ受容体の免疫グロブリン様ドメイン２および第２のＶＥＧＦ受容体の免疫グロブリン様ドメイン３を含んでいてもよい。具体的に、本発明の生産方法で生産されたタンパク質は、治療用タンパク質であってもよい。
【００４９】
本発明の好ましい一実施形態では、組換え型アフリベルセプトを過発現する細胞を培養開始日から温度変更までの培養温度を３７．０℃としてフラスコで細胞の密度が８×１０６細胞／ｍＬに到達するまで３日間培養した。その後、３２．０℃に温度を低減して表１の供給スケジュールによって流加培養した。
【００５０】
図１に示されたように、フラスコで通常の培養温度より低い温度で成長する細胞は、３７．０℃で続いて培養した細胞より（対照群）さらに高い生存能力を示して培養期間が増加し、そのため、図４に示されたように、タンパク質の発現量が増加した。他方、図２および図３に示されたように、フラスコで通常の培養温度より低い温度で成長する細胞は、ＩＶＣ数と発現したタンパク質の総量（ＰＶ＝培養体積×発現量）に影響を与えないため、特定生産率（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）が増加しなかった。
【００５１】
本発明の好ましい他の一実施形態では、組換え型アフリベルセプトを過発現する細胞を培養開始日から温度変更までの培養温度を３７．０℃としてフラスコで細胞の密度が８×１０６細胞／ｍＬに到達するまで２日間培養した。その後、３０．０℃または３２．０℃または３４．０℃に温度を低減して、表１の供給スケジュールによって流加培養した。
【００５２】
図５に示されたように、フラスコで３４．０℃に低減された培養温度の培養で他の温度に比べて細胞濃度は増加するが、図６に示されたように、３２．０℃に低減された培養温度の培養においてタンパク質の発現量が最も多く増加した。
【００５３】
本発明の好ましい他の一実施形態では、組換え型アフリベルセプトを過発現する細胞を培養開始日から温度変更までの培養温度を３７．０℃としてバイオリアクターで細胞の密度が４×１０６細胞／ｍＬまたは８×１０６細胞／ｍＬに到達するまで１日または２日間培養した。その後、３２．０℃に温度を低減して表１の供給スケジュールによって流加培養した。前記バイオリアクター内培養液のｐＨは、培養する細胞によって異なるが、一般的には、ｐＨ６．８〜７．６、好ましくはｐＨ６．８〜７．４であってもよい。また、前記バイオリアクター内培養液の溶存酸素（ＤＯ）は、一般的に２０％〜６０％、好ましくは３０％〜５０％、より好ましくは４０％が使用される。
【００５４】
フラスコ培養（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ  ｆｌａｓｋ）とは異なって、バイオリアクターを使用して通常の培養温度（３７．０℃）で８×１０６細胞／ｍＬの細胞密度まで培養した後、通常の培養温度より低い温度に変更して培養された細胞は、図８に示されたように、ＩＶＣの数には影響を与えないが、図９に示されたように、発現したタンパク質の総量（ＰＶ＝培養体積×発現量）が増加して特定生産率が増加し、図７に示されたように、培養期間が増加して、結果的に、図１０に示されたように、タンパク質発現量が増加した。また、図１１に示されたように、凝集体が少なく生成されて、モノマー純度が増加することを確認した。
【００５５】
したがって、本発明のＩｇＧ  Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の生産方法は、細胞培養条件の最適化を通じてＩｇＧ  Ｆｃドメインを有する融合タンパク質を生産する細胞の成長および生存率を増加させて、前記融合タンパク質の生産性を増加させることができる。
【００５６】
また、本発明のＩｇＧ  Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の生産方法は、哺乳動物細胞の培養方法を改善して、前記融合タンパク質の生産性を増加させ、前記融合タンパク質の品質に影響を及ぼすタンパク質凝集体の生成を抑制して、品質が向上した融合タンパク質を提供することができる。
【００５７】
本発明の方法は、所望のタンパク質を生産する細胞を培養して前記融合タンパク質を製造する時、所望のタンパク質の生産性を増加させ、凝集体成分の生成を抑制することを特徴とする。したがって、ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ受容体のリガンド結合部分がＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したタンパク質であるアフリベルセプトの生産性と凝集体成分の生成を抑制して、精製工程の改善に役に立つ。
【００５８】
また、本発明は、前述した生産方法で標的タンパク質を生産する細胞を培養することを含む標的タンパク質の製造方法を提供する。
【００５９】
本発明の標的タンパク質の製造方法は、前記標的タンパク質を生産する細胞が培養された培養液から前記標的タンパク質を回収する工程をさらに含んでいてもよい。
【００６０】
前記標的タンパク質の製造方法で製造された標的タンパク質は、治療用タンパク質であってもよく、製造された治療用タンパク質は、薬学的に許容可能な担体と共に医薬組成物で提供され得る。
【００６１】
本発明の医薬組成物は、有効成分以外に、薬剤学的に適合し、生理学的に許容される補助剤を使用して製造され得、前記補助剤としては、賦形剤、崩解剤、甘味剤、結合剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤または香味剤などの可溶化剤が使用できる。本発明の医薬組成物は、投与のために有効成分以外に、さらに薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで医薬組成物で好適に製剤化することができる。液状溶液で製剤化される組成物において許容可能な薬剤学的担体としては、滅菌および生体に適合したものであって、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれら成分のうち１成分以上を混合して使用でき、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤をさらに添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤で製剤化することができる。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、製造された治療用タンパク質の種類によって、ヒトを含む哺乳動物に多様な経路で投与され得る。例えば、経口または非経口で投与することができ、非経口的な投与方法としては、これらに限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下、直腸内または硝子体内（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）投与であってもよい。
【００６３】
本発明の医薬組成物の適当な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様であり、通常の熟練した医師は、希望する治療または予防に効果的な投与量を容易に決定および処方することができる。
【００６４】
以下、本発明の実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００６５】
［製造例］
組換え型アフリベルセプト発現ベクターおよび発現細胞株の製造
ｐＳＧＨＶ０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ２８５１８３）からｓｈＧＨ，Ｈｉｓ  ｔａｇ，ＴＥＶ  ｓｉｔｅを除去した改良ベクターを利用して融合タンパク質として組換え型アフリベルセプトをクローニングし、タンパク質固有の信号配列（ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を利用して細胞外に分泌されるようにした。
【００６６】
また、前記融合タンパク質を持続的に発現する細胞株（ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を構築するための選別マーカーとしてＧＳシステムを導入し、このために、マウスグルタミンシンテアーゼ遺伝子をベクターに挿入した。発現量を増大させるために信号配列にＫｏｚａｃ配列をさらに挿入した。次に、このように製造されたクローンをＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣ，Ｃａｔ．ＣＣＬ−６１）に遺伝子導入して、メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）の選別を進めて、安定した細胞株を確保した。ただし、この分野における通常の知識を有する者は、与えられた状況に応じて通常使用されるベクターおよび細胞株を適宜選択して適用することができる。
【００６７】
［実施例１］
低減された温度培養による細胞状態およびＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質の生産に対する効果の確認
前記製造例で製造された、組換え型アフリベルセプトを過発現する細胞を２個の１２５ｍＬの三角フラスコ（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ  ｆｌａｓｋ）で植物由来の加水分解タンパク質が添加された培地に同じ濃度および条件で接種し、３７．０℃でＣＯ２インキュベーター振とう培養した。細胞を回分培養に成長させた後、細胞濃度が約８×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬである時、３２．０℃に温度を低減して流加培養した。実験条件に対する供給スケジュールは、下記表１に要約されている。流加供給物の体積は、バイオリアクター内の培養開始体積の百分率で記載されている。細胞サンプルは、培養から毎日取って生存細胞数、細胞生存率、発現量および特定生産率の水準を測定した。「統合生存細胞数」または「ＩＶＣ（Ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌ）」は、培養が実行される時間を乗算した培養の過程にわたる生存細胞の平均密度を意味する。生産されたタンパク質の量が培養の過程にわたって存在する生存細胞の数に比例する時、統合生存細胞の密度は、培養の過程にわたって生産されたタンパク質の量を推定するのに使用された。統合生存細胞数（ＩＶＣ）は、トリパンブルーで染色して顕微鏡で測定する細胞密度検査を利用して測定することにより計算し、ＩＶＣで正規化した。ＩＶＣは、試験されたすべての実験条件に対して収穫日統合生存細胞密度の算術平均を計算することにより決定した。発現量は、プロテインＡ−ＨＰＬＣで測定して特定生産率を計算した。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
その結果、１２５ｍＬの三角フラスコ（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ  ｆｌａｓｋ）で低温培養された細胞は、ＩＶＣ数と発現したタンパク質の総量（ＰＶ＝培養体積×発現量）に影響を与えないため、特定生産率が増加しなかった（図２および図３）。しかし、低温で成長する細胞は、さらに高い細胞生存能力を発生させることにより（図１）、培養期間と発現量を増加させた（図４）。
【００７０】
［実施例２］
ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質の発現量による最適の変更温度確認
前記製造例で製造された、組換え型アフリベルセプトを過発現する細胞を３個の１２５ｍＬの三角フラスコ（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ  ｆｌａｓｋ）で植物由来の加水分解タンパク質が添加された培地に同じ濃度および条件で接種し、３７．０℃でＣＯ２インキュベーター振とう培養した。細胞を回分培養で成長させた後、細胞濃度が約８×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬである時、３０．０℃、３２．０℃または３４．０℃にそれぞれ温度を低減して流加培養した。実験条件に対する供給スケジュールは、実施例１の表１のように進めた。細胞の多様な状態は、実施例１に記載されたように測定した。
【００７１】
その結果、３４．０℃で低温培養された細胞は、生存率の変化なしに細胞濃度が最も多く増加した（図５）。しかし、３２．０℃で低温培養された細胞の発現量が他の温度に比べて最も多く増加した（図６）。
【００７２】
［実施例３］
バイオリアクター確認実験
前記製造例で製造された、組換え型アフリベルセプトを過発現する細胞をＮＢＳ（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）バイオリアクター内で植物由来の供給物培地に接種し、ｐＨ６．８〜７．４と８０ｒｐｍの速度で撹拌した。バイオリアクターは、１日や２日目に４×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬや８×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬの細胞濃度に到達すると、３７．０℃から３２．０℃に温度を変化させて培養した。実験条件に対する供給スケジュールは、実施例１の表１のように進めた。細胞の多様な状態は、実施例１に記載されたように測定した。
【００７３】
その結果、１２５ｍＬの三角フラスコ培養（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ  ｆｌａｓｋ）とは異なって、８×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬで低温培養された細胞は、ＩＶＣ数には影響を与えないが、発現したタンパク質の総量（ＰＶ＝培養体積×発現量）が増加して特定生産率が増加し、培養期間の増加に伴い発現量が増加した（図７〜図１０）。前記温度条件で培養された試料をプロテインＡカラムでタンパク質を分離し、ＳＥ−ＨＰＬＣで分析した。ＳＥ−ＨＰＬＣで分析した結果からモノマーの比率を計算し、高分子不純物である凝集体と低分子不純物である断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）の比率を計算した。該実験結果、温度を低減した培養において凝集体が少なく生成されて、モノマー純度が増加することが確認することができた（図１１）。
【００７４】
以上の結果は、本発明のＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインとヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが融合したタンパク質の生産方法を通じて前記融合タンパク質と代表されるアフリベルセプトを、凝集体の生成を抑制して高品質で生産できるだけでなく、低減された温度での培養を通じて発現量が顕著に増加して、生産性も増加させることができることを立証する。
【００７５】
細胞培養を用いた融合タンパク質の生産において、タンパク質の品質および生産性を同時に満たす培養条件は、タンパク質の種類によって異なり、最適化された条件を探すためには、数多くの試行錯誤が必要である。前記実施例で立証されたように、本発明の融合タンパク質の生産方法は、ＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインとヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが融合したタンパク質（例えば、アフリベルセプト）の生産に最適化されたものであって、タンパク質の種類が変わると、当該タンパク質の生産性と品質が顕著に変わり得る。したがって、生産しようとする標的タンパク質の種類が変わると、品質および生産性を向上させるための最適化された条件を再設定し、これを検証する過程が必須的に要求される。
【００７６】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における当業者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で簡単に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明において提供するＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインとヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが融合したタンパク質の生産方法は、前記融合タンパク質を生産する細胞を低減された培養温度で培養する段階を追加することにより、細胞成長および細胞生存率を増加させて、前記融合タンパク質の生産性を増加させ、前記融合タンパク質の凝集体生成を抑制することができ、品質を向上させることで、前記融合タンパク質の大量製造および供給を可能にする。
【００７８】
また、本発明の生産方法で生産されたタンパク質は、治療用タンパク質であって、治療目的に応じて適合な形態の医薬組成物を提供することができ、産業上の利用可能性が大きい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月8日(2020.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アフリベルセプトを生産する方法であって、前記方法が、
ａ）３５．０℃〜３８．０℃の温度範囲で、アフリベルセプトを生産することができる細胞を培養すること；および
ｂ）アフリベルセプトの発現量を増加させるために、細胞密度が１×１０６細胞／ｍＬ〜１×１０８細胞／ｍＬに到達したときに、３０．０℃以上３５．０℃以下の低減された温度で前記細胞を培養すること
を含み、
ｂ）の前記低減された温度は、ａ）において選択される温度より低く、前記方法が、細胞生存能力およびアフリベルセプトの生産性を増加させる、方法。
【請求項２】
前記方法で製造されるアフリベルセプトが、凝集体の量が減少したアフリベルセプトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞培養が、大規模細胞培養である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞培養が、流加（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）細胞培養である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、哺乳類細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳類細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＨＯ細胞が、ＤＧ４４、ＤＸＢ−１１、Ｋ−１およびＣＨＯ−Ｓよりなる群から選択されたいずれか一つの細胞株である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ａ）の培養期間が、１日〜５日である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ｂ）の培養期間が、２日〜１５日である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）およびｂ）の培養期間の合計が、３日以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アフリベルセプトを生産する前記細胞が培養された培養液から前記アフリベルセプトを回収する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。