(57)【要約】      （修正有）【課題】本発明は、ＨＥＲ３のベータヘアピンに結合するＨＥＲ３／ＨＥＲ２二重特異性抗体、それらの調製及び医薬としての使用に関する。【解決手段】ＨＥＲ３抗体又は二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体の生成において使用のための結合を得るために、ＳｌｙＤスキャフォールド内で３次元的に配向して機能的に提示されるＨＥＲ３（及びＨＥＲ４）のベータヘアピンの使用を提供する。【選択図】図３０Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体の生成における使用のためのヒトＨＥＲ３に結合する抗体を選択するための方法における、
配列番号１３   ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ−Ｈｅｒ３、
配列番号１７   ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ３、
配列番号１８   ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３、
配列番号１９   ＴｇＳｌｙＤｓｅｒ−Ｈｅｒ３、及び
配列番号２０   ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３
からなる群から選択され、配列番号１のアミノ酸配列を含む、少なくとも一のポリペプチドの使用であって、
ここで、ＨＥＲ３抗体は、ヒトＨＥＲ３のＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）のアミノ酸配列内に結合し；
次いでそのようなＨＥＲ３抗体が二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体を生成するために使用される、使用。
【請求項２】
配列番号１３  ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ−Ｈｅｒ３、
配列番号１７  ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ３、
配列番号１８  ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３、
配列番号１９  ＴｇＳｌｙＤｓｅｒ−Ｈｅｒ３、及び
配列番号２０  ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３
からなる群から選択されるポリペプチドに含まれるＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）のアミノ酸配列内に結合する、ヒトＨＥＲ３及びヒトＨＥＲ２に対する単離された二重特異性抗体。
【請求項３】
配列番号１８（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３）のポリペプチドに含まれるＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）のアミノ酸配列内に結合する、ヒトＨＥＲ３及びヒトＨＥＲ２に対する単離された二重特異性抗体。
【請求項４】
ヒトＨＥＲ３のベータヘアピン（配列番号１）に結合し、かつヒトＨＥＲ２のドメインＩＩ（配列番号５９）に結合する単離された二重特異性抗体。
【請求項５】
配列番号１８（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３）のポリペプチドに含まれるＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）のアミノ酸配列内でヒトＨＥＲ３に結合し、かつヒトＨＥＲ２のドメインＩＩ（配列番号５９）に結合する、ヒトＨＥＲ３及びヒトＨＥＲ２に対する単離された二重特異性抗体。
【請求項６】
アミノ酸配列ＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）を含む配列番号１８（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３）のポリペプチドに結合し、かつペルツズマブと同じヒトＨＥＲ２上のエピトープに結合する単離された二重特異性抗体。
【請求項７】
アミノ酸配列ＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）を含む配列番号１８（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３）のポリペプチドに結合し、かつヒトＨＥＲ２への結合についてペルツズマブと競合する単離された二重特異性抗体。
【請求項８】
ヒトＨＥＲ３のベータヘアピンＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）に結合し、かつヒトＨＥＲ２に結合し、並びにペルツズマブの６つ全ての重鎖及び軽鎖ＨＶＲ（配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５）を含む単離された二重特異性抗体。
【請求項９】
ヒトＨＥＲ４のベータヘアピンＰＱＴＦＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥＨＮＦＮＡ（配列番号２）と交差反応しない、請求項１から８の何れか一項に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体。
【請求項１０】
アミノ酸配列ＰＱＴＦＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥＨＮＦＮＡ（配列番号２）を含む配列番号２２のポリペプチド（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ４）と交差反応しない、請求項１から９の何れか一項に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体。
【請求項１１】
ａ）ヒトＨＥＲ３に結合し、
配列番号２５  重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｍ−０５−７４、
配列番号２６  重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｍ−０５−７４、及び
配列番号２７  重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｍ−０５−７４
の重鎖ＨＶＲを含み、
かつ
配列番号２８  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｍ−０５−７４、
配列番号２９  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｍ−０５−７４、及び
配列番号３０  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｍ−０５−７４
の軽鎖重鎖ＨＶＲを含み；
並びに
ｂ）ヒトＨＥＲ２に結合し、
配列番号６０  重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、ペルツズマブ、
配列番号６１  重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、ペルツズマブ、
配列番号６２  重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、ペルツズマブ
の重鎖ＨＶＲを含み、
かつ
配列番号６３  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、ペルツズマブ、
配列番号６４  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、ペルツズマブ、及び
配列番号６５  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、ペルツズマブ
の軽鎖重鎖ＨＶＲを含む、単離された二重特異性抗体。
【請求項１２】
ａ）ヒトＨＥＲ３に結合し、かつ
ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号４１のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインＶＬ、
ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号３９のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインＶＬ、又は
ｉｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号４２のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインＶＬを含み；
並びに
ｂ）ヒトＨＥＲ２に結合し、かつ
配列番号６６のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインＶＬを含む、単離された二重特異性抗体。
【請求項１３】
二重特異性抗体が二価である、請求項１から１２の何れか一項に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体。
【請求項１４】
請求項１から１３の何れか一項に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体をコードする単離された核酸。
【請求項１５】
請求項２２に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１６】
抗体が生成されるように宿主細胞を培養することを含む、請求項１から１５の何れか一項に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体を生成する方法。
【請求項１７】
請求項１から１６の何れか一項に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体及び細胞傷害性薬物を含むイムノコンジュゲート。
【請求項１８】
請求項１から１７の何れか一項に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的製剤。
【請求項１９】
がんの治療における使用のための、請求項１から１８の何れか一項に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体、又は二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体及び細胞傷害性薬物を含むイムノコンジュゲート。
【請求項２０】
ＨＥＲ３／ＨＥＲ２二量体化及び／又はＨＥＲ２／ＨＥＲ２二量体化の阻害における使用のための請求項１から１９の何れか一項に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＥＲ３のベータヘアピンに結合するＨＥＲ３／ＨＥＲ２二重特異性抗体、それらの調製及び医薬としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＨＥＲタンパク質ファミリーは、４つのメンバー：上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）又はＥｒｂＢ−１とも称されるＨＥＲ１、ＥｒｂＢ−２とも称されるＨＥＲ２、ＨＥＲ３とも称されるＥｒｂＢ−３、及びＨＥＲ４とも称されるＥｒｂＢ−４からなる。ＥｒｂＢファミリータンパク質は、受容体チロシンキナーゼであり、細胞増殖、分化及び生存の重要なメディエーターを表している。ＨＥＲファミリーは、ニューレグリン（ＮＲＧ）ファミリー、アンフィレグリン、ＥＧＦ及び（ＴＧＦ−α）のような異なるリガンドの受容体タンパク質を表す。ヘレグリン（ＨＲＧ又はニューレグリンＮＲＧ−１とも称される）は、例えばＨＥＲ３及びＨＥＲ４に対するリガンドである。
【０００３】
ヒトＨＥＲ３（ＥｒｂＢ−３、ＥＲＢＢ３、ｃ−ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｅｒｂＢ３、受容体チロシンプロテインキナーゼｅｒｂＢ−３、配列番号３）は、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲとしても知られる）、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ４を含む、受容体チロシンキナーゼの上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーをコードする（Kraus, M.H. et al, PNAS 86 (1989) 9193-9197; Plowman, G.D. et al, PNAS 87 (1990) 4905-4909; Kraus, M.H. et al, PNAS 90 (1993) 2900-2904）。プロトタイプの上皮成長因子受容体と同様に、膜貫通受容体ＨＥＲ３は、細胞外リガンド結合ドメイン（ＥＣＤ）、ＥＣＤ内の二量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内タンパク質チロシンキナーゼドメイン（ＴＫＤ）及びＣ末端リン酸化ドメインからなる。この膜結合タンパク質は、細胞外ドメイン内にヘレグリン（ＨＲＧ）結合ドメインを有しているが、活性なキナーゼドメインは有していない。従って、このリガンドに結合できるが、タンパク質のリン酸化を介して細胞内にシグナルを伝達することはできない。しかし、それはキナーゼ活性を持っている他のＨＥＲファミリーメンバーとヘテロダイマーを形成する。ヘテロ二量体化は、受容体媒介性シグナル伝達経路の活性化とその細胞内ドメインのトランスリン酸化へと導く。ＨＥＲファミリーメンバーとの間の二量体形成は、ＨＥＲ３のシグナル伝達の可能性を拡大し、シグナル多様化のためだけでなくシグナル増幅のための手段である。例えば、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体は、ＨＥＲファミリーメンバー間のＰＩ３ＫとＡＫＴ経路を介して、最も重要な有糸分裂シグナルの一つを誘導する（Sliwkowski M.X., et al, J. Biol. Chem. 269 (1994) 14661-14665; Alimandi M, et al, Oncogene. 10 (1995) 1813-1821; Hellyer, N.J., J. Biol. Chem. 276 (2001) 42153-4261; Singer, E., J. Biol. Chem. 276 (2001) 44266-44274; Schaefer, K.L., Neoplasia 8 (2006) 613-622）。ＨＥＲ３及びＨＥＲ受容体ファミリー及びＮＧＲリガンドファミリー内のその様々な相互作用の概要については、例えばG Sithanandam et al Cancer Gene Therapy (2008) 15, 413-448を参照。
【０００４】
この遺伝子の増幅及び／又はそのタンパク質の過剰発現は、前立腺がん、膀胱がん、及び乳がんを含む多くのがんで報告されている。異なるアイソフォームをコードする代替的転写スプライスバリアントが特徴づけられている。１つのアイソフォームは、膜間領域を欠き細胞外に分泌される。この形態は膜結合型の活性を調節するように働く。更なるスプライスバリアントも報告されているが、それらは十分に特徴づけられてはいない。
【０００５】
興味深いことに、その平衡状態において、ＨＥＲ３受容体は、その「閉じたコンホメーション」で存在し、このことは、ヘテロ二量体化ＨＥＲ３ベータヘアピンモチーフはＨＥＲ３ＥＣＤドメインＩＶへの非共有結合性相互作用を介して係留されていることを意味する（図１ｃ及び１ｄを参照）。これは、「閉じた」ＨＥＲ３コンホメーションは、特異的なＨＥＲ３ヘレグリン結合部位でのリガンドヘレグリンの結合を介して開くことができると想定される。これは、ＨＥＲ３のＥＣＤドメインＩとドメインＩＩＩによって形成されたＨＥＲ３界面で起こる。この相互作用により、ＨＥＲ３受容体は活性化され、その「開いたコンホメーション（ｏｐｅｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」へと変えられると考えられている（図１ｅ及び１ｂ、並びにBaselga, J. et al, Nat Rev Cancer 9 (2009). 463-475 and Desbois-Mouthon, C., at al, Gastroenterol Clin Biol 34 (2010) 255-259を参照）。この開いたコンホメーションにおいて、ヘテロ二量体化とＨＥＲ２によるトランシグナル（ｔｒａｎｓｉｇｎａｌ）誘導が可能である（図１ｂを参照）。
【０００６】
国際公開第２００３／０１３６０２号は、ＨＥＲ抗体を含む、ＨＥＲ活性の阻害剤に関する。国際公開第２００７／０７７０２８号及び国際公開第２００８／１００６２４号はまたＨＥＲ３抗体に関する。
【０００７】
国際公開第９７／３５８８５号及び国際公開第２００８／１２７１８１号はＨＥＲ３抗体に関する。
【０００８】
ヒトＨＥＲ４（ＥｒｂＢ−４  ＥＲＢＢ４、ｖ−ｅｒｂ−ａ赤芽球性白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ４、ｐ１８０ｅｒｂＢ４トリ赤芽球性白血病ウイルス（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２）がん遺伝子ホモログ４；配列番号５としても知られる）は、複数のフューリン様システインリッチドメイン、チロシンキナーゼドメイン、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ結合部位及びＰＤＺドメイン結合モチーフを有する単一通過のタイプＩ膜貫通タンパク質である（Plowman G D, wt al, PNAS 90:1746-50(1993); Zimonjic D B, et al, Oncogene 10:1235-7(1995); Culouscou J M, et al, J. Biol. Chem. 268:18407-10(1993)）。タンパク質は、ニューレグリン−２及び−３、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子、及びベータセルリンに結合し、活性化される。リガンド結合は、有糸分裂及び分化を含む種々の細胞応答を誘導する。複数のタンパク質分解事象は、細胞質断片及び細胞外断片の放出を可能にする。この遺伝子における変異はがんと関連している。異なるタンパク質アイソフォームをコードする選択的スプライシング変異体が記載されているが；しかしながら、全変異体が完全に特徴付けられているわけではない。
【０００９】
抗がん治療における使用のための抗ＨＥＲ４の抗体は、例えば、米国特許第５８１１０９８号、米国特許第７３３２５７９号、又はHollmen M, et al, Oncogene. 28 (2009) 1309-19 （抗ＥｒｂＢ−４抗体ｍＡｂ  １４７９）から知られている。
【００１０】
これまでは、ＨＥＲ３（又はＨＥＲ４）のベータヘアピンは両方とも隠されたエピトープを表しており、それらはこれらの受容体の平衡状態においてアクセス可能ではないので、ＨＥＲ３（及び／又はＨＥＲ４）のベータヘアピンに特異的に結合する抗体を選択することはできなかった（図１参照）。
【００１１】
ヒトＨＥＲ２は、膜貫通型表面結合受容体チロシンキナーゼであり、通常、細胞増殖及び分化を導くシグナル伝達経路に関与する。ＨＥＲ２は、乳がん患者の約４分の１で過剰発現していることが判明しているため、乳がん治療の有望な標的である（Bange et al, 2001, Nature Medicine 7:548）。ＨＥＲ２腫瘍遺伝子及びこの受容体の過剰発現又は突然変異は、その構成的活性化をもたらす。これは、乳がん、口腔がん、膵がん及び肺がんのような様々ながんの形成を促進する（Schneider et al. 1989, Weiner et al. 1990, Hou et al. 1992, Revillion et al. 1998）。ＨＥＲ２は、ＨＥＲファミリーの唯一の受容体であり、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４のような係留コンフォメーションでは発現されない。その代わりに、それは細胞表面上で開いた、伸張されたコンフォメーションで発現される。このコンフォメーションはサブドメインＩＩのβヘアピンは接近可能である。抗体ペルツズマブ（Ｐｅｒｊｅｔａ（登録商標））は、ＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のβヘアピン及びサブドメインＩＩの周囲の領域に直接結合することが示された。βヘアピンは、他のＨＥＲ受容体との二量体の形成に必須である。このエピトープに結合することにより、ペルツズマブは二量体形成を阻害することができ、従ってその後のシグナル伝達カスケードの活性化を阻害することができる。
【００１２】
ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体は、ＨＥＲファミリーメンバー間のＰＩ３ＫとＡＫＴ経路を介して、最も重要な有糸分裂シグナルの一つを誘導する（Sliwkowski M.X., et al, J. Biol. Chem. 269 (1994) 14661-14665; Alimandi M, et al, Oncogene. 10 (1995) 1813-1821; Hellyer, N.J., J. Biol. Chem. 276 (2001) 42153-4261; Singer, E., J. Biol. Chem. 276 (2001) 44266-44274; Schaefer, K.L., Neoplasia 8 (2006) 613-622）。特に、ＨＲＧ１β誘導ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体の形成は、自己分泌ＨＲＧループを有するがんにおいて中心的な役割を果たす（Gollamudi et al. 2004）。更に、現在の臨床研究の結果は、抗ＨＥＲ２抗体治療の成功がＨＲＧ１βの存在下で減少することを示している（ＭｃＤｏｎａｇｈら、２０１２）。ペルツズマブ（ｒｈｕＭａｂ  ２Ｃ４、米国特許第７，８６２，８１７号、例えばＰＥＲＪＥＴＡＴＭとして市販されている）は、腫瘍の増殖及び生存において役割を果たすと考えられるプロセスである、ＨＥＲ２受容体が細胞の表面上の他のＨＥＲ受容体（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４）と対形成（二量体化）するのを特異的に防止するように設計されているヒト化モノクローナル抗体である。ペルツズマブは、二量化に必須のＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する。ペルツズマブは、トラスツズマブと同様に、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン上の異なるエピトープである２Ｃ４エピトープに特異的に結合する。ペルツズマブは、新しいクラスのＨＥＲ二量体化阻害剤（ＨＤＩ）の第１号である。ＨＥＲ２細胞外ドメインへのその結合を介して、ペルツズマブは、ＨＥＲ２の他のＨＥＲファミリーメンバーとのリガンド活性化ヘテロ二量化をブロックし、それにより、腫瘍成長及び進行に関連する下流シグナル伝達経路及び細胞プロセスを阻害する（Franklin, M.C., et al. Cancer Cell 5 (2004) 317-328及びFriess, T, et al. Clin Cancer Res 11 (2005) 5300-5309）。ペルツズマブは、マウス抗ＨＥＲ２抗体２Ｃ４（ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４又はペルツズマブと呼ばれる）の組換えヒト化型であり、国際公開第０１／００２４５号及び国際公開第２００６／００７３９８号におけるそれぞれの調製方法とともに記載されている。
【発明の概要】
【００１３】
発明の要旨
本発明は、ヒトＨＥＲ３のベータヘアピン（配列番号１）及びヒトＨＥＲ２のドメインＩＩ（配列番号５９）に結合する二重特異性抗体に関する。両方のドメインは、それぞれのＨＥＲ受容体の二量体化（ホモ−及び／又はヘテロ二量体化）を担っている。
【００１４】
本発明は、ＨＥＲ３抗体又は二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体の生成において使用のための結合を得るために、ＳｌｙＤスキャフォールド内で３次元的に配向して機能的に提示されるＨＥＲ３（及びＨＥＲ４）のベータヘアピンの使用を提供する（例えば図２、及び配列番号１３、及び１７から２４のポリペプチドを参照）。
【００１５】
本発明は抗体、特に二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体の生成に使用のためにヒトＨＥＲ３に結合する（及びヒトＨＥＲ４に結合する）抗体を選択するための方法において、
ａ）配列番号１３  ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ−Ｈｅｒ３、
配列番号１７  ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ３、
配列番号１８  ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３、
配列番号１９  ＴｇＳｌｙＤｓｅｒ−Ｈｅｒ３、及び
配列番号２０  ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３
からなる群から選択され、配列番号１のアミノ酸配列を含む、少なくとも一のポリペプチド
（及び、任意で
ｂ）配列番号２１  ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ４、
配列番号２２  ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ４、
配列番号２３  ＴｇＳｌｙＤｓｅｒ−Ｈｅｒ４、及び
配列番号２４  ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ４
からなる群から選択される少なくとも一のポリペプチド）の使用を提供し、
ここで、抗体は、ヒトＨＥＲ３のＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）のアミノ酸配列内に結合し；
次いでそのようなＨＥＲ３抗体は二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体を生成するために使用される。
【００１６】
本発明は、ヒトＨＥＲ３及びヒトＨＥＲ２に結合する二重特異性抗体を提供し、ここで抗体は、
配列番号１３  ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ−Ｈｅｒ３、
配列番号１７  ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ３、
配列番号１８  ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３、
配列番号１９  ＴｇＳｌｙＤｓｅｒ−Ｈｅｒ３、及び
配列番号２０  ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３
からなる群から選択されるポリペプチドに含まれるＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）のアミノ酸配列内に結合する。
【００１７】
本発明は、ヒトＨＥＲ３及びヒトＨＥＲ２に結合する二重特異性抗体を提供し、ここで抗体は、配列番号１８（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３）のポリペプチドに含まれるＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）のアミノ酸配列内に結合する。
【００１８】
本発明の一実施態様は、ヒトＨＥＲ３のベータヘアピンＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）に結合し、かつヒトＨＥＲ２のドメインＩＩ（配列番号５９）に結合する二重特異性抗体である。本発明の一実施態様は、アミノ酸配列ＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）を含む配列番号１８（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３）のポリペプチドに結合し、かつヒトＨＥＲ２のドメインＩＩ（配列番号５９）に結合する二重特異性抗体である。
【００１９】
本発明の一実施態様は、ヒトＨＥＲ３のベータヘアピンＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）に結合し、かつペルツズマブと同じヒトＨＥＲ２上のエピトープに結合する二重特異性抗体である。本発明の一実施態様は、アミノ酸配列ＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）を含む配列番号１８（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３）のポリペプチドに結合し、かつペルツズマブと同じヒトＨＥＲ２上のエピトープに結合する二重特異性抗体である。
【００２０】
本発明の一実施態様は、ヒトＨＥＲ３のベータヘアピンＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）に結合し、かつヒトＨＥＲ２への結合についてペルツズマブと競合する二重特異性抗体である。本発明の一実施態様は、アミノ酸配列ＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）を含む配列番号１８（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３）のポリペプチドに結合し、かつヒトＨＥＲ２への結合についてペルツズマブと競合する二重特異性抗体である。
【００２１】
本発明の一実施態様は、ヒトＨＥＲ３のベータヘアピンＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）に結合し、かつヒトＨＥＲ２に結合し、並びにペルツズマブの６つ全ての重鎖及び軽鎖ＨＶＲ（配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５）を含む二重特異性抗体である。本発明の一実施態様は、ヒトＨＥＲ３のベータヘアピンＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）に結合し、かつヒトＨＥＲ２に結合し、並びにペルツズマブのＶＨ及びＶＬ（配列番号６６及び配列番号６７）を含む二重特異性抗体である。
【００２２】
一実施態様は、ヒトＨＥＲ４にも結合する上述されるようなヒトＨＥＲ３及びヒトＨＥＲ２に結合する多重特異性抗体である。一実施態様において、ヒトＨＥＲ３及びヒトＨＥＲ２に結合するそのような多重特異性抗体は、ヒトＨＥＲ４のベータヘアピンＰＱＴＦＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥＨＮＦＮＡ（配列番号２）にも結合する。一実施態様において、ヒトＨＥＲ３及びヒトＨＥＲ２に結合するそのような多重特異性抗体は、アミノ酸配列ＰＱＴＦＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥＨＮＦＮＡ（配列番号２）を含む配列番号２２（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ４）のポリペプチドにも結合する。
【００２３】
一実施態様において、そのような二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２は、ヒトＨＥＲ４と交差反応しない。一実施態様において、そのような二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２は、ヒトＨＥＲ４  ＰＱＴＦＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥＨＮＦＮＡ（配列番号２）のベータヘアピンと交差反応しない。一実施態様において、そのような二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２は、アミノ酸配列ＰＱＴＦＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥＨＮＦＮＡ（配列番号２）を含む配列番号２２のポリペプチド（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ４）と交差反応しない。
【００２４】
本発明の一実施態様は、
ａ）ヒトＨＥＲ３に結合し、
配列番号２５  重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｍ−０５−７４、
配列番号２６  重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｍ−０５−７４、及び
配列番号２７  重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｍ−０５−７４
の重鎖ＨＶＲを含み、
かつ
配列番号２８  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｍ−０５−７４、
配列番号２９  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｍ−０５−７４、及び
配列番号３０  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｍ−０５−７４
の軽鎖重鎖ＨＶＲを含み；
並びに
ｂ）ヒトＨＥＲ２に結合し、
配列番号６０  重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、ペルツズマブ、
配列番号６１  重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、ペルツズマブ、
配列番号６２  重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、ペルツズマブ
の重鎖ＨＶＲを含み、
かつ
配列番号６３  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、ペルツズマブ、
配列番号６４  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、ペルツズマブ、及び
配列番号６５  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、ペルツズマブ
の軽鎖重鎖ＨＶＲを含む、二重特異性抗体である。
【００２５】
本発明の一実施態様は、
ａ）ヒトＨＥＲ３に結合し、かつ
ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号４１のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインＶＬ、
ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号３９のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインＶＬ、又は
ｉｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号４２のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインＶＬを含み；
並びに
ｂ）ヒトＨＥＲ２に結合し、かつ
配列番号６６のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインＶＬを含む、二重特異性抗体である。
【００２６】
好ましい一実施態様において、そのような二重特異性抗体は二価である。
【００２７】
本発明は、そのような二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体をコードする単離された核酸を更に提供する。
【００２８】
本発明は更に、そのような核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００２９】
本発明は更に、抗体が生成されるように、そのような宿主細胞を培養することを含む、そのような抗体を生成する方法を提供する。
【００３０】
一実施態様において、そのような方法は宿主細胞からそのような抗体を回収することを更に含む。
【００３１】
本発明は更に、そのような二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２及び細胞傷害性薬物を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【００３２】
本発明は更に、そのような二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的製剤を提供する。
【００３３】
本発明は更に、医薬として使用するための、本明細書に記載される二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体を提供する。本発明は更に、がんの治療において使用のための、本明細書に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体、又は二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体及び細胞傷害性薬物を含むイムノコンジュゲートを提供する。本発明は更に、ＨＥＲ３／ＨＥＲ２二量体化及び／又はＨＥＲ２／ＨＥＲ２二量体化の阻害において使用のための本明細書に記載される二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体を提供する。
【００３４】
医薬の製造における、そのような二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体、又は二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体及び細胞傷害性薬物を含むイムノコンジュゲートの使用。医薬はがんの治療用である、そのような使用。医薬はＨＥＲ３／ＨＥＲ２二量体化及び／又はＨＥＲ２／ＨＥＲ２二量体化の阻害用である、そのような使用。
【００３５】
本発明は更に、本明細書に記載される二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体、又は二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体及び細胞傷害性薬物を含むイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法を提供する。
【００３６】
本発明は更に、本明細書に記載される二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体の有効量を個体に投与し、それにより個体における腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、がんに罹患している個体の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。
【００３７】
開示されるのは、
ｉ）配列番号１３  ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ−Ｈｅｒ３、
ｉｉ）配列番号１７  ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ３、
ｉｉｉ）配列番号１８  ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３、
ｉｖ）配列番号１９  ＴｇＳｌｙＤｓｅｒ−Ｈｅｒ３、及び
ｖ）配列番号２０  ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３
からなる群から選択されるポリペプチドであり、
そのポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００３８】
開示されるのは、
ｉ）配列番号２１  ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ４、
ｉｉ）配列番号２２  ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ４、
ｉｉｉ）配列番号２３  ＴｇＳｌｙＤｓｅｒ−Ｈｅｒ４、及び
ｉｖ）配列番号２４  ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ４、
からなる群から選択されるポリペプチドであり、
そのポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００３９】
ＳｌｙＤスキャフォールド内で３次元的に配向して機能的に提示されるＨＥＲ３（及びＨＥＲ４）のベータヘアピンを使用して（例えば図２、及び配列番号１３、及び１７から２４のポリペプチドを参照）、これらのベータヘアピンに結合する、本明細書に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体が選択され得る。
【００４０】
本発明による抗体は、ＨＥＲ３発現がん細胞の強力な増殖阻害、がん細胞の増殖に関連するＨＥＲ３媒介性シグナル伝達（例えばＨＥＲ３のリン酸化など）の強力な阻害又は非常に特異的な薬物動態学的特性（ヘレグリンの非存在下（「閉じたコンホメーション」）と比較した場合、ヘレグリンの存在下（「開いたコンホメーション」）での活性化したＨＥＲ３への結合の、より高速な会合速度及びより高いモル比など）などの非常に有益な特性を有することができる。更に、それらは強力な腫瘍増殖阻害を示し、ＨＥＲ３／ＨＥＲ２二量体化及び／又はＨＥＲ２／ＨＥＲ２二量体化を効率的に阻害することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】コンホメーション変化における「閉じた」及び「開いた」コンホメーション並びにニューレグリンファミリーリガンド（例えば本明細書でＨＲと略されるヘレグリンなど）の影響の概略図。
【図２】サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）のＳｌｙＤスキャフォールド内で３次元的に配向して機能的に提示されるＨＥＲ３のベータヘアピンの３Ｄ構造。
【図３】ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ−Ｈｅｒ３のＮｉ−ＮＴＡ精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析Ｅ１及びＥ２は、精製された画分１２及び１３を示している。ＳＮ：精製前の大腸菌溶解物の上清。
【図４】サーマス・サーモフィラスのＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ−Ｈｅｒ−３のＮｉ−ＮＴＡ精製された画分のＳＥＣ溶出プロフィール。
【図５】選択されたクローンのＩＨＣにおける特異性と反応性の試験。３つ全てのクローンは、ＨＥＲ３への結合とＨＥＲ４に対する交差反応性を示した。Ｈｅｒ１及びＨＥＲ２に対する交差反応性は検出されなかった。
【図６】Ｔ４７Ｄ細胞におけるＭ−０５−７４抗体誘導型時間依存性ＨＥＲ３内部移行のＦＡＣＳ分析。
【図７】ビアコアセンサーグラムの重ね合わせプロット。１：１００ｎＭ  Ｍ−０５−７４＊ヘレグリン／Ｈｅｒ−３  ＥＣＤ相互作用。２：１００ｎＭ  Ｍ−０８−１１＊ヘレグリン／Ｈｅｒ−３  ＥＣＤ相互作用。３＆４：１００ｎＭ  Ｍ−０５−７４及び１００ｎＭ  Ｍ−０８−１１＊Ｈｅｒ−３  ＥＣＤ相互作用。５：緩衝液の基準。
【図８】ビアコアエピトープビニング実験のセンサーグラムの重ね合わせ。一次抗体Ｍ−０５−７４（図中のＭ−０７４）は、二次抗体Ｍ−２０８、ＧＴ（＝８Ｂ８）、Ｍ−０５−７４及びＭ−０８−１１（図８中のＭ−０１１）にＨｅｒ−３  ＥＣＤを提示した（Ｍ−．測定のノイズは５ＲＵであった）。
【図９】ビアコアセンサーグラムの重ね合わせプロット。１：Ｍ−０５−７４に対する９０ｎＭのヘレグリン＊Ｈｅｒ−３  ＥＣＤ複合体。２：Ｍ−０８−１１に対する９０ｎＭのヘレグリン＊Ｈｅｒ−３  ＥＣＤ複合体。３：８Ｂ８抗体に対する９０ｎＭのヘレグリン＊Ｈｅｒ−３  ＥＣＤ複合体。
【図１０】ビアコア機能アッセイにより同定された作用機序の略図。１：Ｍ−０８−１１はヘレグリン活性化Ｈｅｒ−３  ＥＣＤに結合し、遅延したヘレグリン解離を誘導し、それによってＭ−０８−１１はＨｅｒ−３  ＥＣＤ受容体複合体に留まることになる。２：Ｍ−０５−７４はヘレグリン活性化Ｈｅｒ−３  ＥＣＤに結合する。ヘレグリンは、複合体にトラップされ、抗体は、複合体３のままである：８Ｂ８はヘレグリン活性化Ｈｅｒ−３  ＥＣＤに結合する。複合体全体は、抗体から解離する。
【図１１】エピトープマッピング及びアラニンスキャンアプローチの戦略。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２  ＥＣＤ、ＨＥＲ−３  ＥＣＤ及びＨｅｒ−４  ＥＣＤのペプチドヘアピン配列（ペプチドヘアピン）は、それらの構造的埋め込み（構造）を含み、調べられた。システインは、セリンによって置換された。
【図１２】ＨＥＲ３及びＨＥＲ４に対する抗体Ｍ−０５−７４のエピトープのＣｅｌｌｕＳｐｏｔｓＴＭ合成及びエピトープマッピング。抗ＨＥＲ３／ＨＥＲ４抗体のＭ−０５−７４はＨＥＲ３  ＥＣＤ結合エピトープＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰ（配列番号４３）及びＨＥＲ４  ＥＣＤ結合エピトープＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥ（配列番号４４）に結合する。
【図１３】抗ＨＥＲ３／ＨＥＲ４抗体のＭ−０５−７４（図ではＭ−０７４と命名）及びＨＥＲ４と交差反応性を持たない抗ＨＥＲ３抗体Ｍ−０８−１１（Ｍ−０１１と命名）のＣｅｌｌｕＳｐｏｔｓＴＭ Ａｌａ−Ｓｃａｎからの結果−抗ＨＥＲ３／ＨＥＲ４抗体Ｍ−０５−７４のそのＨＥＲ３  ＥＣＤ結合エピトープＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰ（配列番号４３）及びそのＨＥＲ４  ＥＣＤ結合エピトープＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥ（配列番号４４）への結合に最も貢献するアミノ酸は下線が引かれ／太字体である。
【図１４】Ｍ−０５−７４（Ｍ−０７４）の結合は、ＨＲＧのＨＥＲ３−ＥＣＤへの結合を誘導／促進する。
【図１５】ＭＣＦ７細胞におけるＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体／ヘテロ二量体化の阻害（免疫沈降及びウエスタンブロット）（ＨＥＲ３−ＩＰ＝ＨＥＲ３抗体を用いた免疫沈降／ＨＥＲ２−ＩＰ＝ＨＥＲ３抗体を用いた免疫沈降）。
【図１６】Ｍ−０５−７４によるＭＤＡ−ＭＢ１７５細胞の処置は、細胞増殖の阻害をもたらした。
【図１７】Ｍ−０５−７４（Ｍ−０７４）による処置（１０ｍｇ／ｋｇ  ｑ７ｄ、ｉ．ｐ．）は、ＦａＤｕ  ＨＮＳＣＣの移植された異種移植片の腫瘍静止状態を生じた。
【図１８】Ｍ−０５−７４−Ｆａｂ−シュードモナス外毒素コンジュゲート（Ｍ−０７４−ＰＥ）による処置（１０ｍｇ／ｋｇ  ｑ７ｄ、ｉ．ｐ．）は、ＨＲＧの非存在下（細線）よりもＨＲＧの存在下（太線）で細胞増殖の強力な阻害をもたらした。
【図１９】Ｍ−０５−７４−Ｆａｂ−シュードモナス外毒素コンジュゲート（Ｍ−０７４−ＰＥ）によるインビボでの腫瘍細胞増殖阻害。説明文：閉じた線（ビヒクル）；点線（Ｍ−０５−７４−Ｆａｂ−シュードモナス外毒素コンジュゲート（Ｍ−０７４−ＰＥ））。
【図２０】ビアコアセンサーグラム重ね合わせプロット：国際公開第２０１２／２２８１４号に記載される抗ＨＥＲ３抗体ＭＯＲ０９８２３（２）と比較した、本発明の抗体Ｍ−０５−７４（１）のＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３（配列番号１８）に対する結合。本Ｍ−０５−７４（１）の抗体は、ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３（配列番号１８）に対する明らかな結合シグナルを示すが、抗体である抗ＨＥＲ３抗体ＭＯＲ０９８２３（２）は、ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３（配列番号１８）に対して全く結合を示さない。全く抗体無しの対照の測定（３）は、ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３（配列番号１８）に対して全く結合を示さなかった。
【図２１】リボソームディスプレイを介して最適化されたヒト化Ｍ−０５−７４抗体の選択：ディスプレイ選択中に濃縮されたＲＮＡの逆転写後に得られたＰＣＲ生成物の分析用ＤＮＡチップの電気泳動。得られたゲルの画像は、レーン１において選択されたコンストラクトのＤＮＡの濃縮を示し、レーン２において、陰性対照−抗原を用いないパニング−については濃縮を示さない。予想通りに残りの対照も陰性である。ＤＮＡの消化は完了した（標的についてレーン３、バックグラウンドについてレーン４）。従ってレーン１において得られた全てのＤＮＡは、パニング工程で選択された結合変異体及びそれらの対応するＲＮＡに由来する。逆転写の負の対照、又はＰＣＲの陰性対照のどちらもバンドを示していない。レーン７は、精製後のプールされたＰＣＲ反応の生成物を示す。
【図２２】発現ベクターコンストラクト−ＤＩＢ軽鎖（ＶＬ−ＣＫ）。
【図２３】ＣＨ３（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（ノブ））に「ノブ」アミノ酸を有する発現ベクターコンストラクト−ＤＩＢ重鎖。
【図２４】発現ベクターコンストラクト−ペルツズマブ交差軽鎖（ＶＬ−ＣＨ１）。
【図２５】ＣＨ３（ＶＨ−ＣＫ−ＣＨ２−ＣＨ３（ホール））に「ホール」突然変異を有する発現ベクターコンストラクト−ペルツズマブ交差重鎖。
【図２６】（Ａ）ＤＩＢ−７４とペルツズマブのハイブリッドとしての二重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ  ＤＩＢｘＰＥＲＴのレイアウト：このスキームは、二重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ  ＤＩＢｘＰＥＲＴ及びその親抗体ＤＩＢ−７４とペルツズマブを示す。ＤＩＢ−７４及びペルツズマブは、それぞれ、ＨＥＲ３−ＥＣＤ及びＨＥＲ２−ＥＣＤのβヘアピンに結合する。暗い色はＩｇ重鎖を示し、明るい色はＩｇ軽鎖を示す。ＣＨ３  Ｉｇドメインは、「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅ）」技術に従って、「ノブ」又は「ホール」突然変異を含む。ペルツズマブ重鎖及び軽鎖のＣＨ１及びＣＫのドメインクロスオーバーは、正しい軽鎖−重鎖の同化を促進するように設計された。（Ｂ）ＤＩＢ−ＭｏＡｂのスキーム、ＤＩＢ−７４の誘導体としての人工一価抗体フォーマット。「ノブ・イントゥ・ホール」技術とＣＨ１−ＣＫドメインクロスオーバーが適用された。
【図２７】ＧＰＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製されたＤＩＢｘＰＥＲＴ  ＣｒｏｓｓＭａｂの定性分析：ＧＰＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、ＤＩＢｘＰＥＲＴ最終生成物の品質が評価された。（Ａ）分析用ＧＰＣピークは連続して番号が付けられた（１−７）。（Ｂ）保持時間、２８０ｎｍでの吸収及びパーセンテージ単位の相対ピーク面積を一覧する全７つのＧＦ３０ピークの表形式の提示。（Ｃ）還元性（＋）及び非還元性（−）条件下でのＤＩＢｘＰＥＲＴ最終生成物を示す４−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシー染色。ＤＩＢｘＰＥＲＴ及びＤＩＢｘＰＥＲＴ重鎖及び軽鎖は矢印で示される。
【図２８】ＳＰＲによるＤＩＢｘＰＥＲＴ及び親抗体の動力学的特性の比較：抗体をＣＭ５センサーチップ表面に捕捉し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｂ３０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｕｅｎｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて可溶性検体との２５℃での動力学的相互作用を測定した。分析物を５分間注入し、解離を１０分間記録した。分析物ＨＥＲ２−ＥＣＤ及びＨＥＲ３−ＥＣＤ／ＨＲＧ１βを、最高濃度２７０ｎＭの５段階１：３系列希釈で注入した。
【図２９】溶液中のＤＩＢｘＰＥＲＴによるＨＥＲ２−ＥＣＤと活性化ＨＥＲ３−ＥＣＤの同時複合体形成：抗体をＣＭ５センサーチップ表面に捕捉し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｂ３０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｕｅｎｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて可溶性検体との２５℃での動力学的相互作用を測定した。分析物ＨＥＲ２−ＥＣＤ及びＨＥＲ３−ＥＣＤ／ＨＲＧ１βを８分間連続して注入し、解離を５分間記録した。（Ａ及びＣ）センサーグラム（Ｂ）及び（Ｄ）のそれぞれのアッセイ設定。（Ｂ及びＤ）センサーグラムは、両方の分析物の逐次結合を示す。分析注入及びモル比は、それぞれ矢印及び「ＭＲ」で示される。
【図３０】親抗体と比較した、ＤＩＢｘＰＥＲＴによるＭＤＡ−ＭＢ−１７５  ＶＩＩがん細胞の生育増殖阻害。ＭＤＡ−ＭＢ−１７５  ＶＩＩ乳がん細胞を、以下の抗体のいずれかの系列希釈で６日間インキュベートした：ＤＩＢｘＰＥＲＴ、ＤＩＢ−ＭｏＡｂ、ＤＩＢ−７４、ペルツズマブ（ＰＥＲＴ）、ＲＧ７１１６、ＤＩＢ−７４及びペルツズマブ、ＲＧ７１１６及びペルツズマブ及びアイソタイプ対照。各抗体濃度について３通りの手段を用いてＥＣ５０値を算出した。正規化された４パラメータＳ字状用量−応答曲線が描かれる。標準偏差はエラーバーとして示される。
【００４２】
本発明の実施態様の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、Ｖはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
【００４３】
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）において一又は複数の改変を持つものである。
【００４４】
用語「二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体」、「（ヒト）ＨＥＲ３に結合し、（ヒト）ＨＥＲ２に結合する二重特異性（ＨＥＲ３／ＨＥＲ２）抗体」、及び「（ヒト）ＨＥＲ３に特異的に結合し、（ヒト）ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性（ＨＥＲ３／ＨＥＲ２）抗体」とは、ＨＥＲ３を標的化する際の診断薬及び／又は治療薬として有用であるように十分な親和性でＨＥＲ３に結合することができ、かつ抗体がＨＥＲ２を標的化する際の診断薬及び／又は治療薬として有用であるように、十分な親和性でＨＥＲ２に結合することができる抗体を指す。一実施態様において、二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２の、無関係な、非ＨＥＲ３タンパク質（ＨＥＲ４を除く）への結合の程度は、例えば、表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）によって測定される場合、抗体のＨＥＲ３又はＨＥＲ２への結合の約１０％未満である。ある実施態様において、ヒトＨＥＲ３又はＨＥＲ２に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の、ヒトＨＥＲ３又はＨＥＲ２に対する結合の結合親和性ＫＤ値を有する。ある実施態様において、本発明による抗体は、ヒトＨＥＲ４に（も）結合し、かつ≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の、ヒトＨＥＲ４に対する結合の結合親和性ＫＤ値を有する。好ましい一実施態様において、結合親和性の各ＫＤ値は、ＨＥＲ３結合親和性又はＨＥＲ２結合親和性のそれぞれについてはヒトＨＥＲ３又はＨＥＲ２の野生型細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＨＥＲ３−ＥＣＤ又はＨＥＲ２−ＥＣＤ）を、及びＨＥＲ４結合親和性については野生型ヒトＨＥＲ４−ＥＣＤをそれぞれ使用する表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定される。二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体が（ヒト）ＨＥＲ４にも結合する場合、用語「二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体」、「（ヒト）ＨＥＲ３に結合し、（ヒト）ＨＥＲ２に結合する二重特異性（ＨＥＲ３／ＨＥＲ２）抗体」及び「（ヒト）ＨＥＲ３に特異的に結合し、（ヒト）ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性（ＨＥＲ３／ＨＥＲ２）抗体」は、「（ヒト）ＨＥＲ４にも結合する多重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体」、「（ヒト）ＨＥＲ４にも結合する、（ヒト）ＨＥＲ３に結合しかつ（ヒト）ＨＥＲ２に結合する多重特異性（ＨＥＲ３／ＨＥＲ２）抗体」、及び「（ヒト）ＨＥＲ４にも結合する、（ヒト）ＨＥＲ３に特異的に結合しかつ（ヒト）ＨＥＲ２に特異的に結合する多重特異性（ＨＥＲ３／ＨＥＲ２）抗体」と呼ばれる。
【００４５】
本明細書において用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００４６】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００４７】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原に対する結合を、５０％又はそれ以上遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいて、抗体のその抗原に対する結合を、５０％又はそれ以上遮断する。例示的な競合アッセイが、本明細書において提供される。
【００４８】
抗体特異性は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。例えば、天然の抗体は単一特異性である。
【００４９】
本発明による「二重特異性抗体」は、２つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。本発明の抗体は、２つの異なる抗原、第１の抗原としてのＶＥＧＦ及び第２の抗原としてのＡＮＧ−２に特異的である。
【００５０】
本明細書で使用される用語「単一特異性」抗体は、それぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する一又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。
【００５１】
本出願において使用される用語「価（ｖａｌｅｎｔ）」は、抗体分子中の特定の数の結合部位の存在を示す。このように、用語「二価」、「四価」及び「六価」は、抗体分子中にそれぞれ２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を示す。本発明の１つの好ましい実施態様において、本発明による二重特異性抗体は「二価」である。
【００５２】
本明細書で使用する用語「がん」は、例えば、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管のがん、子宮内膜がん、子宮頸部がん、膣のがん、外陰部のがん、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞がん、腎盂がん、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮がん、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ性白血病であって良く、上記がんの何れかの難治性バージョン、又は上記がんのうちの一又は複数の組み合わせを含む。好ましい一実施態様において、がんは、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、肺がん又は前立腺がんである。好ましい一実施態様において、そのようながんは、ＨＥＲ３の発現（又は過剰発現）によって更に特徴付けられる。好ましい一実施態様において、そのようながんは、ＨＥＲ２の発現（又は過剰発現）によってその上更に特徴付けられる。更なる一実施態様において、本発明は、原発腫瘍及び新たな転移の同時治療における使用のための本発明の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体である。
【００５３】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種から由来する抗体を指す。
【００５４】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００５５】
本明細書で用いられる「細胞傷害性薬物」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死若しくは破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性薬物は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；増殖阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など；抗生物質；小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）；及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗がん剤を包含する。好ましい一実施態様において、「細胞傷害性薬物」は、シュードモナス外毒素Ａ又はその変異体である。好ましい一実施態様において、「細胞傷害性薬物」は、アマトキシン又はその変異体である。
【００５６】
「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００５７】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」は、例えば、所望の治療的又は予防的結果を達成するために、必要な用量及び期間で有効な量を指す。
【００５８】
用語「エピトープ」とは、抗体に対して特異的に結合できる任意のポリペプチド決定基を含む。ある実施態様においては、エピトープ決定基は、分子、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルなどの化学的活性表面基を含み、そしてある実施態様においては、特定の三次元構造特性及び／又は比電荷特性を有することができる。エピトープは、抗体により結合される抗原の領域である。
【００５９】
用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、 Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００６０】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に現れる。
【００６１】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００６２】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。
【００６３】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００６４】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。
【００６５】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化変異体」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。好ましい一実施態様では、マウスＨＶＲが、「ヒト化抗体」を調製するためのヒト抗体のフレームワーク領域に移植される。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327；及び Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照。マウス可変領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列抗体Ｖ遺伝子のコレクションへ整列され、配列同一性及び相同性に従って分類された。アクセプター配列は、高い全配列相同性に基づいて、任意でアクセプター配列中に既存の正しい標準残基の存在に基づいて選択される（Poul, M-A. and Lefranc, M-P., in “Ingenierie des anticorps banques combinatores” ed. by Lefranc, M-P. and Lefranc, G., Les Editions INSERM, 1997を参照）。生殖系列Ｖ遺伝子は、重鎖のＨＶＲ３の開始までの領域のみと、軽鎖のＨＶＲ３の真ん中までとをコードする。従って、生殖系列Ｖ遺伝子の遺伝子は、Ｖドメイン全体に対しては整列されない。ヒト化コンストラクトは、ヒトフレームワーク１から３、マウスＨＶＲ、及びヒトＪＫ４由来のヒトフレームワーク４配列、及び軽鎖及び重鎖のＪＨ４配列をそれぞれ含む。一つの特定のアクセプター配列を選択する前に、ドナー抗体のいわゆる標準的ループ構造を決定することができる（Morea, V., et al., Methods, Vol 20, Issue 3 (2000) 267-279を参照）。これらの標準的なループ構造は、いわゆる標準的な位置に存在する残基の種類によって決定される。これらの位置は、ＨＶＲ領域の外に（部分的に）に存在し、親（ドナー）抗体のＨＶＲコンホメーションを維持するために、最終的なコンストラクト中で機能的に同等に維持されるべきである。
【００６６】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触」）を含む、抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲ：ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つを含む。本明細書における典型的のＨＶＲは、以下を含む：（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）、及び９３−１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；及び
（ｄ）ＨＶＲのアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（Ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）、及び９４−１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組合せ。
【００６７】
特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。
【００６８】
「イムノコンジュゲート」は、一以上の異種分子にコンジュゲートした抗体であり、限定されないが、細胞傷害性薬物を含む。
【００６９】
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。ある実施態様において、個体又は被検体はヒトである。
【００７０】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上又は９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えば、Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87を参照のこと。
【００７１】
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００７２】
「二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
【００７３】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」なる修飾語句は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないと解釈されるべきものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００７４】
用語「Ｍａｂ」はモノクローナル抗体を指し、用語「ｈＭａｂ」はこのようなモノクローナル抗体のヒト化変異体を指す。
【００７５】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は、薬学的製剤中に存在してもよい。（先行技術がイムノコンジュゲートを有する場合に含まれる）。
【００７６】
「天然型抗体」は、様々な構造を有する、天然に生じる免疫グロブリンを指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
【００７７】
用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
【００７８】
「参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはジェネンテク社、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通して公的に入手可能であり、ソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、特にデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【００７９】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラムアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと一致しない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは一致しないと評価されるであろう。特に断らない限りは、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、直前のパラグラフに記載したように、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて得られる。
【００８０】
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
【００８１】
「薬学的に許容可能な担体」は、被験体に非毒性であり、有効成分以外の製剤処方中の成分を指す。薬学的に許容可能な担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
【００８２】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「ＨＥＲ３」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＨＥＲ３を指す。その用語は、「完全長」で未処理のＨＥＲ３、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＨＥＲ３を含む。その用語はまた、ＨＥＲ３の天然に生じる変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を含む。典型的なヒトＨＥＲ３のアミノ酸配列は、配列番号３に示される。「ヒトＨＥＲ３」（ＥｒｂＢ−３、ＥＲＢＢ３、ｃ−ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｅｒｂＢ３、受容体チロシンプロテインキナーゼｅｒｂＢ−３、配列番号３）は、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲとしても知られる）、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ４をも含む、受容体チロシンキナーゼの上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーをコードする（Kraus, M.H. et al, PNAS 86 (1989) 9193-9197; Plowman, G.D. et al, PNAS 87 (1990) 4905-4909; Kraus, M.H. et al, PNAS 90 (1993) 2900-2904）。プロトタイプの上皮成長因子受容体と同様に、膜貫通受容体ＨＥＲ３は、細胞外リガンド結合ドメイン（ＥＣＤ）、ＥＣＤ内の二量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内タンパク質チロシンキナーゼドメイン（ＴＫＤ）及びＣ末端リン酸化ドメインからなる。この膜結合タンパク質は、細胞外ドメイン内にヘレグリン（ＨＲＧ）結合ドメインを有しているが、活性なキナーゼドメインは有していない。従って、このリガンドに結合できるが、タンパク質のリン酸化を介して細胞内にシグナルを伝達することはできない。しかし、それはキナーゼ活性を持っている他のＨＥＲファミリーメンバーとヘテロダイマーを形成する。ヘテロ二量体化は、受容体媒介性シグナル伝達経路の活性化とその細胞内ドメインのトランスリン酸化へと導く。ＨＥＲファミリーメンバーとの間の二量体形成は、ＨＥＲ３のシグナル伝達の可能性を拡大し、シグナル多様化のためだけでなくシグナル増幅のための手段である。例えば、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体は、ＨＥＲファミリーメンバー間のＰＩ３ＫとＡＫＴ経路を介して、最も重要な有糸分裂シグナルの一つを誘導する（Sliwkowski M.X., et al, J. Biol. Chem. 269 (1994) 14661-14665; Alimandi M, et al, Oncogene. 10 (1995) 1813-1821; Hellyer, N.J., J. Biol. Chem. 276 (2001) 42153-4261; Singer, E., J. Biol. Chem. 276 (2001) 44266-44274; Schaefer, K.L., Neoplasia 8 (2006) 613-622）。ＨＥＲ３及びＨＥＲ受容体ファミリー及びＮＧＲリガンドファミリー内のその様々な相互作用の概要については、例えばG Sithanandam et al Cancer Gene Therapy (2008) 15, 413-448を参照。
【００８３】
興味深いことに、その平衡状態において、ＨＥＲ３受容体は、その「閉じたコンホメーション」で存在し、このことは、ヘテロ二量体化ＨＥＲ３ベータヘアピンモチーフはＨＥＲ３のＥＣＤドメインＩＶへの非共有結合性相互作用を介して係留されていることを意味している（図１ｃを参照）。これは、「閉じた」ＨＥＲ３コンホメーションは、特異的なＨＥＲ３ヘレグリン結合部位でのリガンドヘレグリンの結合を介して開くことができると想定される。これは、ＨＥＲ３のＥＣＤドメインＩとドメインＩＩＩによって形成されたＨＥＲ３界面で起こる。この相互作用により、ＨＥＲ３受容体が活性化され、その「開いたコンホメーション」へと移行されると考えられる（図１ｂ及びBaselga, J. et al, Nat Rev Cancer 9 (2009). 463-475及びDesbois-Mouthon, C., at al, Gastroenterol Clin Biol 34 (2010) 255-259を参照）。この開いたコンホメーションにおいて、ヘテロ二量体化とＨＥＲ２によるトランシグナル（ｔｒａｎｓｉｇｎａｌ）誘導が可能である（図１ｂを参照）。
【００８４】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「ＨＥＲ２」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＨＥＲ２を指す。その用語は、「完全長」で未処理のＨＥＲ２、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＨＥＲ２を含む。その用語はまた、ＨＥＲ４の天然に生じる変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を含む。典型的なヒトＨＥＲ２のアミノ酸配列は、配列番号５に示される。「ヒトＨＥＲ２」（ｃ−ｅｒｂ  Ｂ２／ｎｅｕタンパク質、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、プロトオンコジーンＮｅｕ、プロトオンコジーンｃ−ＥｒｂＢ−２、受容体チロシンタンパクキナーゼｅｒｂＢ−２、ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ２、神経／神経膠芽腫由来がん遺伝子ホモログ；配列番号９としても知られる）は、膜貫通型表面受容体チロシンキナーゼであり、通常、細胞増殖及び分化をもたらすシグナル伝達経路に関与する。ＨＥＲ２は、乳がん患者の約４分の１で過剰発現していることが判明しているため、乳がん治療の有望な標的である（Bange et al, 2001, Nature Medicine 7:548）。ＨＥＲ２腫瘍遺伝子及びこの受容体の過剰発現又は突然変異は、その構成的活性化をもたらす。これは、乳がん、口腔がん、膵がん及び肺がんのような様々ながんの形成を促進する（Schneider et al. 1989, Weiner et al. 1990, Hou et al. 1992, Revillion et al. 1998）。ＨＥＲ２は、ＨＥＲファミリーの唯一の受容体であり、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４のような係留コンフォメーションでは発現されない。その代わりに、それは細胞表面上で開いた、伸張されたコンフォメーションで発現される。このコンフォメーションはサブドメインＩＩのβヘアピンは接近可能である。抗体ペルツズマブ（Ｐｅｒｊｅｔａ（登録商標））は、ＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のβヘアピン及びサブドメインＩＩの周囲の領域に直接結合することが示された。βヘアピンは、他のＨＥＲ受容体との二量体の形成に必須である。このエピトープに結合することにより、ペルツズマブは二量体形成を阻害することができ、従ってその後のシグナル伝達カスケードの活性化を阻害することができる。
【００８５】
ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体は、ＨＥＲファミリーメンバー間のＰＩ３ＫとＡＫＴ経路を介して、最も重要な有糸分裂シグナルの一つを誘導する（Sliwkowski M.X., et al, J. Biol. Chem. 269 (1994) 14661-14665; Alimandi M, et al, Oncogene. 10 (1995) 1813-1821; Hellyer, N.J., J. Biol. Chem. 276 (2001) 42153-4261; Singer, E., J. Biol. Chem. 276 (2001) 44266-44274; Schaefer, K.L., Neoplasia 8 (2006) 613-622）。特に、ＨＲＧ１β誘導ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体の形成は、自己分泌ＨＲＧループを有するがんにおいて中心的な役割を果たす（Gollamudi et al. 2004）。更に、現在の臨床研究の結果は、抗ＨＥＲ２抗体治療の成功がＨＲＧ１βの存在下で減少することを示している（ＭｃＤｏｎａｇｈら、２０１２）。
【００８６】
「ペルツズマブのエピトープ」は、抗体ペルツズマブが結合するＨＥＲ２の細胞外ドメインの領域である。ペルツズマブと同じエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、例えば、“Ed. Harlow and David Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)”に記載されているような慣用の交差ブロッキングアッセイを実施することができる。あるいは、抗体がＨＥＲ２のペルツズマブエピトープ（例えば、ＨＥＲ２の約２２残基から約５８４残基までの領域の任意の一以上の残基）に結合するかどうかを評価するために、エピトープマッピングを行うことができる。ペルツズマブの結合エピトープは、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中のドメインＩＩ由来の残基を含む。ペルツズマブは、ドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩの接合部でＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する。Franklin, et al., Cancer Cell 5 (2004) 317-328も参照。
【００８７】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「ＨＥＲ４」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＨＥＲ４を指す。その用語は、「完全長」で未処理のＨＥＲ４、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＨＥＲ４を含む。その用語はまた、ＨＥＲ４の天然に生じる変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を含む。典型的なヒトＨＥＲ４のアミノ酸配列は、配列番号５に示される。ヒトＨＥＲ４（ＥｒｂＢ−４  ＥＲＢＢ４、ｖ−ｅｒｂ−ａ赤芽球性白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ４、ｐ１８０ｅｒｂＢ４トリ赤芽球性白血病ウイルス（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２）がん遺伝子ホモログ４；配列番号５としても知られる）は、複数のフューリン様システインリッチドメイン、チロシンキナーゼドメイン、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ結合部位及びＰＤＺドメイン結合モチーフを有する単一通過のタイプＩ膜貫通タンパク質である（Plowman G D, wt al, PNAS 90:1746-50(1993); Zimonjic D B, et al, Oncogene 10:1235-7(1995); Culouscou J M, et al, J. Biol. Chem. 268:18407-10(1993)）。タンパク質は、ニューレグリン−２及び−３、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子、及びベータセルリンに結合し、活性化される。リガンド結合は、有糸分裂及び分化を含む種々の細胞応答を誘導する。複数のタンパク質分解事象は、細胞質断片及び細胞外断片の放出を可能にする。この遺伝子における変異はがんと関連している。異なるタンパク質アイソフォームをコードする選択的スプライシング変異体が記載されているが；しかしながら、全変異体が完全に特徴付けられているわけではない。
【００８８】
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のため又は臨床病理の過程においてのどちらかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【００８９】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。
【００９０】
天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt, T.J., et al., Kuby Immunology、第６版、W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), 91頁）を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照。
【００９１】
本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それがリンクされている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【００９２】
ＩＩ．組成物及び方法
一態様において、本発明は一部が、ＳｌｙＤスキャフォールド内で３次元的に配向して機能的に提示されるＨＥＲ３（及び場合によりＨＥＲ４）のベータヘアピンを使用して（例えば図２、配列番号１３及び１７から２４のポリペプチドを参照）、ＨＥＲ３（及びＨＥＲ４）のベータヘアピンに特異的である抗体を選択することが可能であるという知見にもとづいている。これらは、ヒトＨＥＲ３に及びヒトＨＥＲ２に結合する二重特異性抗体を生成するために、ＨＥＲ２に対する抗体、特にヒトＨＥＲ２のドメインＩＩに対する抗体と一緒に用いられ、ここで該抗体は、ヒトＨＥＲ３に対してＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１：ヒトＨＥＲ３のベータヘアピン）のアミノ酸配列内で結合し、かつヒトＨＥＲ２のドメインＩＩ（配列番号５９）に結合する。
【００９３】
本発明の二重特異性抗体は、例えばがんの診断又はがんの治療のために有用である。
【００９４】
Ａ．例示的な二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体
本発明は、ヒトＨＥＲ３に結合し、かつヒトＨＥＲ２に結合する単離された二重特異性抗体を提供し、
ここで抗体は、
配列番号１３  ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ−Ｈｅｒ３、
配列番号１７  ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ３、
配列番号１８  ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３、
配列番号１９  ＴｇＳｌｙＤｓｅｒ−Ｈｅｒ３、及び
配列番号２０  ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３
からなる群から選択されるポリペプチドに含まれるＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）のアミノ酸配列内に結合する。
【００９５】
本発明は、ヒトＨＥＲ３に結合し、かつヒトＨＥＲ２に結合する単離された二重特異性抗体を提供し、
ここで抗体は、配列番号１８のポリペプチド（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３）に含まれるＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）のアミノ酸配列内に結合する
【００９６】
本発明は、ヒトＨＥＲ３のベータヘアピン（配列番号１）に結合し、かつヒトＨＥＲ２のドメインＩＩ（配列番号５９）に結合する単離された二重特異性抗体を提供する。
【００９７】
本発明は、ヒトＨＥＲ３に結合しかつヒトＨＥＲ２に結合する単離された二重特異性抗体を提供し、ここで抗体は、配列番号１８（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３）のポリペプチドに含まれるＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）のアミノ酸配列内でヒトＨＥＲ３に結合し、かつ抗体はヒトＨＥＲ２のドメインＩＩ（配列番号５９）に結合する。
【００９８】
本発明は、アミノ酸配列ＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）を含む配列番号１８（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３）のポリペプチドに結合し、かつヒトＨＥＲ２のドメインＩＩ（配列番号５９）に結合する単離された二重特異性抗体を提供する。
【００９９】
本発明は、ヒトＨＥＲ３のベータヘアピンＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）に結合し、かつペルツズマブと同じヒトＨＥＲ２上のエピトープに結合する単離された二重特異性抗体を提供する。
【０１００】
本発明は、アミノ酸配列ＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）を含む配列番号１８（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３）のポリペプチドに結合し、かつペルツズマブと同じヒトＨＥＲ２上のエピトープに結合する単離された二重特異性抗体を提供する。
【０１０１】
本発明は、ヒトＨＥＲ３のベータヘアピンＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）に結合し、ヒトＨＥＲ２への結合についてペルツズマブと競合する単離された二重特異性抗体を提供する。
【０１０２】
本発明は、アミノ酸配列ＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）を含む配列番号１８（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３）のポリペプチドに結合し、かつヒトＨＥＲ２への結合についてペルツズマブと競合する単離された二重特異性抗体を提供する。
【０１０３】
本発明は、ヒトＨＥＲ３のベータヘアピンＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）に結合し、かつヒトＨＥＲ２に結合し、並びにペルツズマブの６つ全ての重鎖及び軽鎖ＨＶＲ（配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５）を含む単離された二重特異性抗体を提供する。
【０１０４】
本発明は、ヒトＨＥＲ３のベータヘアピンＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）に結合し、かつヒトＨＥＲ２に結合し、並びにペルツズマブのＶＨ及びＶＬ（配列番号６６及び配列番号６７）を含む単離された二重特異性抗体を提供する。
【０１０５】
本発明の一実施態様において、本明細書に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体は、ヒトＨＥＲ４にも結合する（そして、多重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体と称される）。
【０１０６】
本発明の一実施態様において、本明細書に記載の多重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体はヒトＨＥＲ４のベータヘアピンＰＱＴＦＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥＨＮＦＮＡ（配列番号２）にも結合する。
【０１０７】
本発明の一実施態様において、本明細書に記載の多重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体はアミノ酸配列ＰＱＴＦＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥＨＮＦＮＡ（配列番号２）を含む配列番号２２のポリペプチド（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ４）にも結合する。
【０１０８】
ヒトＨＥＲ３のベータヘアピンに結合し、かつヒトＨＥＲ４、ヒトＨＥＲ４のベータヘアピンＰＱＴＦＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥＨＮＦＮＡ（配列番号２）及びアミノ酸配列ＰＱＴＦＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥＨＮＦＮＡ（配列番号２）を含む配列番号２２のポリペプチド（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ４）にも結合する例示的な抗体は、配列番号３１のＶＨ（重鎖可変ドメインＶＨ、Ｍ−０５−７４）及び配列番号３２のＶＬ（軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｍ−０５−７４）を含む抗体である。
【０１０９】
本発明の一実施態様において、本明細書に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体は、ヒトＨＥＲ４と交差反応しない。
【０１１０】
本発明の一実施態様において、本明細書に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体は、ヒトＨＥＲ４のベータヘアピンＰＱＴＦＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥＨＮＦＮＡ（配列番号２）と交差反応しない。
【０１１１】
本発明の一実施態様において、本明細書に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体は、アミノ酸配列ＰＱＴＦＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥＨＮＦＮＡ（配列番号２）を含む配列番号２２のポリペプチド（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ４）と交差反応しない。
【０１１２】
ヒトＨＥＲ３のベータヘアピンに結合し、かつヒトＨＥＲ４と、ヒトＨＥＲ４のベータヘアピンＰＱＴＦＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥＨＮＦＮＡ（配列番号２）と及びアミノ酸配列ＰＱＴＦＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥＨＮＦＮＡ（配列番号２）を含む配列番号２２のポリペプチド（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ４）と交差反応しない（結合しない）例示的な抗体は、配列番号５１のＶＨ（重鎖可変ドメインＶＨ、＜Ｈｅｒ３＞Ｍ−０８−１１）及び配列番号５２のＶＬ（軽鎖可変ドメインＶＬ、＜Ｈｅｒ３＞Ｍ−０８−１１）を含む抗体である。
【０１１３】
本発明は、
ａ）ヒトＨＥＲ３に結合し、
配列番号２５  重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｍ−０５−７４、
配列番号２６  重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｍ−０５−７４、及び
配列番号２７  重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｍ−０５−７４
の重鎖ＨＶＲを含み、
かつ
配列番号２８  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｍ−０５−７４、
配列番号２９  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｍ−０５−７４、及び
配列番号３０  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｍ−０５−７４
の軽鎖重鎖ＨＶＲを含み；
並びに
ｂ）ヒトＨＥＲ２に結合し、
配列番号６０  重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、ペルツズマブ、
配列番号６１  重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、ペルツズマブ、
配列番号６２  重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、ペルツズマブ
の重鎖ＨＶＲを含み、
かつ
配列番号６３  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、ペルツズマブ、
配列番号６４  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、ペルツズマブ、及び
配列番号６５  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、ペルツズマブ
の軽鎖重鎖ＨＶＲを含む、単離された二重特異性抗体を提供する。
【０１１４】
本発明は、
ａ）ヒトＨＥＲ３に結合し、
かつｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号４１のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインＶＬ、
ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号３９のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインＶＬ、又は
ｉｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号４２のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインＶＬを含み；
並びに
ｂ）ヒトＨＥＲ２に結合し、
かつ配列番号６６のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインＶＬを含む、単離された二重特異性抗体を提供する。
【０１１５】
本発明の一実施態様において、本明細書に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体は、該二重特異性抗体は二価である。
【０１１６】
本発明の一実施態様において、本明細書に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体は以下の特性のうちの一又は複数を有する（単独で又は任意の組み合わせで）：
抗体は
ａ）配列番号１３  ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ−Ｈｅｒ３、
配列番号１７  ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ３、
配列番号１８  ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３、
配列番号１９  ＴｇＳｌｙＤｓｅｒ−Ｈｅｒ３、及び
配列番号２０  ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３
からなる群から選択されるポリペプチドに含まれるＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）のアミノ酸配列内に結合する；
ｂ）配列番号１３  ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ−Ｈｅｒ３、
配列番号１７  ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ３、
配列番号１８  ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３、
配列番号１９  ＴｇＳｌｙＤｓｅｒ−Ｈｅｒ３、及び
配列番号２０  ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３
からなる群から選択されるポリペプチドに結合する；
ｃ）ＨＥＲ３／ＨＥＲ２の共沈殿アッセイでＭＣＦ−７細胞におけるＨＥＲ３／ＨＥＲ２のヘテロ二量体のヘテロ二量体化を阻害する；
ｄ）インビボで腫瘍増殖阻害活性を示す；
ｅ）ＨＥＲ３−ＥＣＤに、ＫＤ値≦１ｘ１０−８Ｍの親和性で結合する（一実施態様において、１ｘ１０−８Ｍから１ｘ１０−１３ＭのＫＤ値で；（一実施態様において、１ｘ１０−９Ｍから１ｘ１０−１３ＭのＫＤ値で）；
ｆ）ＨＥＲ２−ＥＣＤに、ＫＤ値≦１ｘ１０−８Ｍの親和性で結合する（一実施態様において、１ｘ１０−８Ｍから１ｘ１０−１３ＭのＫＤ値で；（一実施態様において、１ｘ１０−９Ｍから１ｘ１０−１３ＭのＫＤ値で）。
【０１１７】
好ましい一実施態様において、抗体はＩｇＧ１又はＩｇＧ４アイソタイプである。好ましい一実施態様において、抗体は、ヒト起源の定常ドメイン（ヒト定常ドメイン）を含む。各ヒト定常ドメインを含む本発明の意味の範囲内の典型的なヒト定常領域は、配列番号５３から配列番号５８（部分的にアミノ酸置換を含む）のアミノ酸配列を有する。
【０１１８】
１：抗体親和性
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数ＫＤを有する。
【０１１９】
一つの好ましい実施態様において、〜１０反応単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用してＫＤを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｉｎｃ．）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５°Ｃで、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入する。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ又はｋａ）と解離速度（ｋｏｆｆ又はｋｄ）を算出する。平衡解離定数ＫＤは、ｋｄ／ｋａ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）の比として計算される。例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる会合速度が１０６Ｍ−１ ｓ−１を上回る場合、会合速度は、分光計、例えばストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される漸増濃度の抗原の存在下、２５℃で、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて測定することができる。
【０１２０】
２：抗体断片
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ，及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【０１２１】
ダイアボディーは、二価又は二重特異性であってもよい２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第０４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号; Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134；及びHolliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照。トリアボディ及びテトラボディもまた、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134)に記載されている。
【０１２２】
単一ドメイン抗体は、抗体の、重鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ、Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６号（Ｂ１）を参照）。
【０１２３】
抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
【０１２４】
好ましい一実施態様において、抗体断片はＦａｂ断片である。好ましい一実施態様において、（定常ドメインが断片に含まれている場合）抗体断片は、ヒト起源の定常ドメイン（ヒト定常ドメイン）を含む。
【０１２５】
３：キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体はキメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号、及びMorrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０１２６】
ある実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部を含む。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、例えば抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。
【０１２７】
ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633に総説され、更に、 Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；米国特許第５８２１３３７号、第７５２７７９１号、第６９８２３２１号及び第７０８７４０９号； Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）；Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 （「リサーフェシング」を記述）； Dall’Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 （「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及び Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68 and Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。Morea, V., et al., Methods, Vol 20, Issue 3 (2000) 267-279及び国際公開第２００４／００６９５５号（標準構造を介したアプローチ）。
【０１２８】
４：ヒト抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で周知の様々な技術を用いて生成することができる。ヒト抗体は一般的に、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374及びLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459に記載されている。
【０１２９】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している、米国特許第６０７５１８１号及び６１５０５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）も参照のこと。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変される可能性がある。
【０１３０】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ細胞株が記載されている。（例えば、 Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63; and Boerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95)；及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成されたヒト抗体はまた、Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937及びVollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191に記載されている。
【０１３１】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に説明する。
【０１３２】
５：ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性又は活性（複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。その方法は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-3７に概説され、更に、McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472；及びLee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132に記載されている。
【０１３３】
所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734に記載されるように、ナイーブなレパートリーが、任意の免疫感作無しで、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対して、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最後に、ナイーブなライブラリーはまた、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載されるように、非常に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞由来の非再配列Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０号を含む。
【０１３４】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書でヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。
【０１３５】
６：多重特異性抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つはＨＥＲ３／ＨＥＲ４に対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。多重特異性抗体はまたＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ２（及びＨＥＲ４）を発現する細胞に細胞傷害性薬物を局所化するために用いることができる。二重特異性又は多重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０１３６】
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659を参照）及び「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」エンジニアリング（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号）；２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及び Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83を参照）；２重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553を参照）；二重特異性抗体フラグメントを作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374を参照）；及び、例えばTutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
【０１３７】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号を参照）。
【０１３８】
本明細書中の抗体又は断片はまた、ＨＥＲ３並びにその他の異なる抗原（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用（Ｄｕａｌ  Ａｃｔｉｎｇ）Ｆａｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。
【０１３９】
本明細書中の抗体又は抗体断片はまた、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号、及び国際公開第２０１０／１４５７９３号に記載される多重特異性抗体を含む。
【０１４０】
７：抗体変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
【０１４１】
ａ）置換、挿入、及び欠失変異体
ある実施態様において、一以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。保存的置換は、表１の「好ましい置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その生成物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
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【０１４２】
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１４３】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【０１４４】
置換変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性を減少）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０１４５】
改変（例えば、置換）を、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーから構築され再選択することによる親和性成熟は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーが、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するする別の方法は、幾つかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲを標的としたアプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、又はモデリングを用いて、特異的に同定され得る。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
【０１４６】
ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で生じる可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列のある実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個又は３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。
【０１４７】
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０１４８】
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【０１４９】
ｂ）グリコシル化変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成又は削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
【０１５０】
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により一般的に付着した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えば、Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は、一定の改善された特性を有する抗体変異体を作成するために行われ得る。
【０１５１】
一実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、又は２０％から４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着している全ての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流又は下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させた可能性がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；米国特許第２００４／００９３６２１号を参照。「非フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622が含まれる。非フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ripka, J., et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えば、アルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞など（例えば、Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
【０１５２】
抗体変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を更に備えている。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。このような抗体変異体の例は、例えば国際公開第２００３／０１１８７８号；米国特許第６６０２６８４号；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号に記述される。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は、例えば国際公開第１９９７／３００８７号；国際公開第１９９８／５８９６４号；及び国際公開第１９９９／２２７６４号に記述される。
【０１５３】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある実施態様において、一又は複数のアミノ酸修飾を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、一又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
【０１５４】
ある実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）が不要又は有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えばHellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063；及びHellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502を参照）；米国特許第５，８２１，３３７号（Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361を参照）に説明される。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743を参照）。ＦｃＲｎ結合及びインビボでのクリアランス／半減期の測定は、当該分野で公知の方法を用いても行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006): 1759-1769を参照）。
【０１５５】
エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の一又は複数の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０１５６】
ＦｃＲへの改善又は減少した結合を持つ特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照）。
【０１５７】
ある実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する一又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。
【０１５８】
幾つかの実施態様において、改変された（すなわち改善されたか又は減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされ、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に説明される。
【０１５９】
増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593、及びKim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一以上の置換、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換（米国特許第７３７１８２６号）を有するものが含まれる。
【０１６０】
Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び、Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０１６１】
ｄ）システイン操作抗体変異体
ある実施態様において、抗体の一以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で存在する。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中で更に記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、以下の残基の任意の一以上がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号づけ）；重鎖のＡ１１８（ＥＵの番号づけ）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵの番号づけ）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【０１６２】
ｅ）抗体誘導体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手可能な付加的な非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性に起因して製造における利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であることができる。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が限定された条件下で治療に使用されるのか等を含む考慮に基づいて決定することができる。
【０１６３】
その他の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい抗体と非タンパク質性部分とのコンジュゲートが、提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
【０１６４】
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号で説明したように、組換えの方法及び組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む一以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、及び必要に応じて、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
【０１６５】
二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
【０１６６】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で産生することができる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、第５７８９１９９号及び第５８４０５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体断片の発現を記述しているCharlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, 248巻， Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003),頁245-254も参照。）発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され、更に精製することができる。
【０１６７】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414；及びLi, H., et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照。
【０１６８】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
【０１６９】
植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
【０１７０】
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えば、Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74に記載される２９３又は２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚がん細胞（ＨｅＬａ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えば、Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−  ＣＨＯ細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照。
【０１７１】
Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２（並びにそれらの親の抗ＨＥＲ３及び抗ＨＥＲ２）は、当技術分野で公知の様々なアッセイによって、同定され、その物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴づけることができる。
【０１７２】
開示されるのは二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体を生成することにおいて使用のためのヒトＨＥＲ３に結合する抗体を選択する方法であり、ここで抗ＨＥＲ３抗体は、ヒトＨＥＲ３のＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）のアミノ酸配列内に結合し；ここで
ａ）配列番号１３  ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ−Ｈｅｒ３、
配列番号１７  ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ３、
配列番号１８  ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３、
配列番号１９  ＴｇＳｌｙＤｓｅｒ−Ｈｅｒ３、及び
配列番号２０  ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３
からなる群から選択され、配列番号１のアミノ酸配列を含む、少なくとも一のポリペプチドが
ａ）に記載の少なくとも一のポリペプチドに対する結合を示す抗体を選択するために（結合アッセイにおいて）使用され
それにより（ヒトＨＥＲ３内の）ＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）のアミノ酸配列内に結合する抗体を選択する。
【０１７３】
一実施態様において、選択法は、
選択された抗体が、ＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）のアミノ酸配列を含んでいないポリペプチドスキャフォールドに結合しないことを確認するために、
選択された抗体が、
配列番号１４  ＴｔＳｌｙＤ−野生型
配列番号１５  ＴｔＳｌｙＤｃａｓ
配列番号１６  ＴｇＳｌｙＤΔＩＦ
からなる群から選択されるポリペプチドによりカウンタースクリーニングされる（ポリペプチドに対する結合について試験される）工程を更に含む。
【０１７４】
１：結合アッセイ及びその他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えば、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）を含み、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
【０１７５】
その他の態様において、競合アッセイを、ＨＥＲ３（及び／又はＨＥＲ４）への結合について、Ｍ−０５−７４と競合する抗体を同定するために、またＨＥＲ２への結合についてペルツズマブと競合する抗体を同定するために用いることができる。ある実施態様では、このような競合する抗体は、Ｍ−０５−７４によって結合される同じエピトープ（例えば線状又はコンホメーションエピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris, G.E. (ed.), Epitope Mapping Protocols, In: Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996)に提供されている。更なる方法は、ＣｅｌｌｕＳｐｏｔＴＭ技術を用いた実施例４に詳細に記載される。
【０１７６】
典型的な競合アッセイにおいて、固定化ＨＥＲ３（／ＨＥＲ４）又はＨＥＲ２は、ＨＥＲ３（／ＨＥＲ４）又はＨＥＲ２にそれぞれ結合する第一の標識抗体（例えば、Ｍ−０５−７４又はペルツズマブ）、及びＨＥＲ３（／ＨＥＲ４）へ又はＨＥＲ２への結合について第一の抗体と競合する能力について試験されている第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化ＨＥＲ３又はＨＥＲ４が、第二の未標識抗体でなく、第一の標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。ＨＥＲ３（／ＨＥＲ４）又はＨＥＲ２への第一の抗体の結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の非結合抗体が除去され、固定化されたＨＥＲ３（／ＨＥＲ４）又はＨＥＲ２に結合した標識の量が測定される。もし、固定化されたＨＥＲ３（／ＨＥＲ４）又はＨＥＲ２に結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、ＨＥＲ３（／ＨＥＲ４）又はＨＥＲ２への結合において第一の抗体と競合していることを示している。Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)を参照。
【０１７７】
２：活性のアッセイ
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するそれらの二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体を同定するために与えられる。生物学的活性は、例えば、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ２のリン酸化の阻害、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ２（及び／又はＨＥＲ４）を発現又は過剰発現するがん細胞のがん細胞増殖の阻害、ＨＥＲ３／ＨＥＲ２のヘテロ二量体化の阻害、ＦＡＣＳアッセイを介した（時間依存性）内部移行、異種移植されたＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ２（及び／又はＨＥＲ４）を発現又は過剰発現するがん細胞を持つ異種移植動物（例えば、マウス又はラット）モデルにおけるインビボ腫瘍増殖阻害が含まれ得る。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
【０１７８】
ある実施態様において、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。特定された生物学的活性についての典型的なビトロ又はインビトロのアッセイが、実施例２ｅ、３、５から９及び１１又は１７に記載される。
【０１７９】
Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素など、一以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書に記載される抗ＨＥＲ３／ＨＥＲ４抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０１８０】
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、そこでは抗体は、限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許第ＥＰ０４２５２３５号（Ｂ１）を参照）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号及び第５７８０５８８号及び第７４９８２９８号を参照）などのアウリスタチン；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、米国特許第５７１４５８６号、米国特許第５７３９１１６号、米国特許第５７６７２８５号、米国特許第５７７０７０１号、米国特許第５７７０７１０号、米国特許第５７７３００１、及び米国特許第５８７７２９６を参照；Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342; 及びLode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928）；ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343；及び米国特許第６６３０５７９号を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；及びＣＣ１０６５を含む一つ以上の薬物とコンジュゲートしている。
【０１８１】
その他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートした、本明細書に記載の抗体を含み、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が含まれる。
【０１８２】
その他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、シュードモナス外毒素Ａ又はその変異体にコンジュゲートした本明細書に記載されるような抗体を含む。シュードモナス外毒素Ａ又はその変異体は、例えば、国際公開第２０１１／３２０２２号、国際公開第２００９／３２９５４号、国際公開第２００７／０３１７４１号、国際公開第２００７／０１６１５０号、国際公開第２００５／０５２００６号及びLiu W, et al, PNAS 109 (2012) 11782-11787に記載される。
【０１８３】
その他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートした本明細書に記載されるような抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの生産のために入手可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体を含む。放射性コンジュゲートが検出に使用される場合、それは、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばＴｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ＭＲＩとしても周知）用のスピン標識、例えば、再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
【０１８４】
抗体と細胞傷害性薬物のコンジュゲートは、ａ）組換え発現技術を使用して（例えば、大腸菌において、Ｆａｂ又はＦｖ抗体断片に融合した、アミノ酸配列に基づく毒素の発現のために）、又はｂ）ポリペプチドカップリング技術を使用して（Ｆａｂ又はＦｖ抗体断片への、アミノ酸配列に基づく毒素のソルターゼ酵素ベースのカップリング等）、又はｃ）Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミダートＨＣＬなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン−２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用しての何れかにより作製することができる。例えば、Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104に記載されるように、リシンイムノトキシンを調製することができる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは、細胞中に細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131；米国特許第５，２０８，０２０号）が使用され得る。
【０１８５】
本明細書において、イムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販の（例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．、Ｕ．Ｓ．Ａからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明示的に意図する。
【０１８６】
Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
ある実施態様において、本明細書で提供される二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体の何れかは、生物学的試料中のＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４のそれぞれの存在を検出するために有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。ある実施態様において、生物学的試料は、腫瘍組織などの細胞又は組織を含む。
【０１８７】
一実施態様において、診断又は検出の方法において使用のための二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体が提供される。更なる態様において、生物学的試料中のＨＥＲ３又はＨＥＲ２のそれぞれの存在を検出する方法が提供される。ある実施態様において、本方法は、抗二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体のＨＥＲ３又はＨＥＲ２のそれぞれへの結合を許容する条件下で、本明細書に記載のように二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体と生物学的試料を接触させること、及び複合体が抗二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体とＨＥＲ３又はＨＥＲ２のそれぞれとの間に形成されているかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボでの方法であり得る。一実施態様において、例えばＨＥＲ３及びＨＥＲ２のそれぞれが双方とも患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体が二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体による治療にふさわしい被験体を選択するために使用される。
【０１８８】
本発明の抗体を用いて診断され得る典型的な障害はがんを含む。
【０１８９】
ある実施態様において、標識された二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体が提供される。標識は、限定されるものではないが、（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識など）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。典型的な標識は、限定されないが、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体を酸化する過酸化水素を利用する酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼと共役したもの、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどが含まれる。
【０１９０】
Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するその抗体と任意の薬学的に許容される一以上の担体（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)）とを、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容可能な担体は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリ（ビニルピロリドン）；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容可能な担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標））、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒｈｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８号に開示されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ又は複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
【０１９１】
典型的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０１９２】
本明細書における製剤はまた、治療される特定の適応症のために必要な一以上の活性成分を含有し得る。
【０１９３】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中に、又はマクロエマルジョン中に、封入され得る。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)に開示される。
【０１９４】
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態をしている。
【０１９５】
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。
【０１９６】
Ｇ．治療法及び組成物
本明細書において提供される二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体又は細胞傷害性薬物にコンジュゲートした抗二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体のイムノコンジュゲートの何れかが、治療法で使用され得る。
【０１９７】
一態様において、医薬として使用のための、二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体又は細胞傷害性薬物にコンジュゲートした抗ｖ抗体のイムノコンジュゲートが提供される。更なる一態様において、がんの治療において使用のための、二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体又は細胞傷害性薬物にコンジュゲートした二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体のイムノコンジュゲートが提供される。ある実施態様において、治療の方法において使用のための、二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体又は細胞傷害性薬物にコンジュゲートした二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体のイムノコンジュゲートが提供される。ある実施態様において、本発明は、二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体又は細胞傷害性薬物にコンジュゲートした二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体のイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法において使用のための、二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体又は細胞傷害性薬物にコンジュゲートした二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体のイムノコンジュゲートを提供する。更なる実施態様において、本発明は、がん細胞においてアポトーシスを誘導すること／又はがん細胞増殖を阻害することにおける使用のための、二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体又は細胞傷害性薬物にコンジュゲートした二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体のイムノコンジュゲートを提供する。ある実施態様において、本発明は、がん細胞中でアポトーシスを誘導するために／又はがん細胞増殖を阻害するために、二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体又は細胞傷害性薬物にコンジュゲートした二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体のイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与することを含む、個体において、がん細胞中でアポトーシスを誘導する／又はがん細胞増殖を阻害する方法において使用のための、二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体又は細胞傷害性薬物にコンジュゲートした二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体のイムノコンジュゲートを提供する。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。
【０１９８】
更なる態様において、本発明は、医薬の製造又は調製における、二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体又は細胞傷害性薬物にコンジュゲートした二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体のイムノコンジュゲートの使用を提供する。一実施態様において、本医薬はがんの治療用である。更なる実施態様において、本医薬は、がんを有する個体に、医薬の有効量を投与することを含む、がんを治療する方法で使用するためのものである。更なる実施態様において、医薬は、がん細胞においてアポトーシスを誘導するため／又はがん細胞増殖を阻害するためのものである。更なる実施態様において、医薬は、がん細胞中でアポトーシスを誘導するための／又はがん細胞増殖を阻害するための、医薬の有効量を個体に投与することを含む、がんに罹患している個体において、がん細胞中でアポトーシスを誘導する／又はがん細胞増殖を阻害する方法における使用のためである。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
【０１９９】
更なる態様にて、本発明は、がんを治療するための方法を提供する。一実施態様において、本方法は、がんを有する個体に、二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体の有効量を投与することを含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
【０２００】
更なる態様において、本発明は、がんに罹患している個体において、がん細胞中でアポトーシスを誘導する／又はがん細胞増殖を阻害するための方法を提供する。一実施態様において、本方法は、がんに罹患している個体において、がん細胞中でアポトーシスを誘導する／又はがん細胞増殖を阻害するための、二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体又は細胞傷害性化合物にコンジュゲートした二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体のイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与することを含む。一実施態様において、「個体」はヒトである。
【０２０１】
更なる態様において、本発明は、例えば、上記の治療法の何れかに使用される、本明細書で提供される二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体の何れかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体の何れか、及び薬学的に許容可能な担体を含む。
【０２０２】
本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、任意の適切な手段によって投与することができ、経口、肺内、及び鼻腔内、及び局所治療が所望される場合、病巣内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。
【０２０３】
本発明の抗体は良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この文脈における考慮因子としては、治療すべき具体的な障害、治療すべき具体的な哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医師にとって既知の他の因子が挙げられる。抗体は、必要ではないが任意で、問題となる障害の予防又は治療のために、現在使用中の一又は複数の薬剤ともに処方される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
【０２０４】
疾患の予防又は治療のためには、本発明の抗体の適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は治療すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴及び抗体に対する応答性、及び担当医の判断に依存する。抗体は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、抗体約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．５ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。１つの例示される抗体用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が抗体の約２投与量から約２０投与量、又は例えば約６投与量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷投与量の後に一以上の低投与量が投与され得る。典型的な投薬レジメンは、抗体の、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量の投与と、その後の約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量の投与を伴う。しかしながら、他の投薬レジメンを使用してもよい。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
【０２０５】
上記の製剤又は治療方法のいずれかが、抗ＨＥＲ３（及び抗ＨＥＲ４）抗体の代わりか又は抗ＨＥＲ３（及び抗ＨＥＲ４）抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを用いて行うことができることが理解される。
【０２０６】
ＩＩＩ．製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベル又は容器上にある又は容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）組成物が本発明の抗体を包含する組成物を含む第一の容器；及び（ｂ）組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物を更に含んでいてもよい。別法として、又は加えて、製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含んでもよい。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの立場から望まれる他の物質を更に含んでもよい。
【０２０７】
上記の製造品のいずれかは、抗ＨＥＲ３（及び抗ＨＥＲ４）抗体の代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含み得ることが理解される。
【０２０８】
アミノ酸配列の記述
配列番号１  ヒトＨＥＲ３のβヘアピン
配列番号２  ヒトＨＥＲ４のβヘアピン
配列番号３  ヒトＨＥＲ３
配列番号４  ヒトＨＥＲ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）
配列番号５  ヒトＨＥＲ４
配列番号６  ヒトＨＥＲ４細胞外ドメイン（ＥＣＤ）
配列番号７  ヒトＨＥＲ１
配列番号８  ヒトＨＥＲ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）
配列番号９  ヒトＨＥＲ２
配列番号１０  ヒトＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）
配列番号１１  ヒトヘレグリン断片（ＨＲＧ）
配列番号１２  ヒトヘレグリンβ−１断片（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈから提供）
配列番号１３  ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ−Ｈｅｒ３
配列番号１４  ＴｔＳｌｙＤ−野生型
配列番号１５  ＴｔＳｌｙＤｃａｓ
配列番号１６  ＴｇＳｌｙＤΔＩＦ
配列番号１７  ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ３
配列番号１８  ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３
配列番号１９  ＴｇＳｌｙＤｓｅｒ−Ｈｅｒ３
配列番号２０  ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３
配列番号２１  ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ４
配列番号２２  ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ４
配列番号２３  ＴｇＳｌｙＤｓｅｒ−Ｈｅｒ４
配列番号２４  ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ４
配列番号２５  重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｍ−０５−７４
配列番号２６  重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｍ−０５−７４
配列番号２７  重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｍ−０５−７４
配列番号２８  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｍ−０５−７４
配列番号２９  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｍ−０５−７４
配列番号３０  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｍ−０５−７４
配列番号３１  重鎖可変ドメインＶＨ、Ｍ−０５−７４
配列番号３２  軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｍ−０５−７４
配列番号３３  重鎖可変ドメインＶＨのヒト化変異体Ａ、Ｍ−０５−７４＿ＶＨ−Ａ
配列番号３４  重鎖可変ドメインＶＨのヒト化変異体Ｂ、Ｍ−０５−７４＿ＶＨ−Ｂ
配列番号３５  重鎖可変ドメインＶＨのヒト化変異体３、Ｍ−０５−７４＿ＶＨ−Ｃ
配列番号３６  重鎖可変ドメインＶＨのヒト化変異体Ａ、Ｍ−０５−７４＿ＶＨ−Ｄ
配列番号３７  重鎖可変ドメインＶＨのヒト化変異体Ｂ、Ｍ−０５−７４＿ＶＨ−Ｅ
配列番号３８  軽鎖可変ドメインＶＬのヒト化変異体Ａ、Ｍ−０５−７４＿ＶＨ−Ａ
配列番号３９  軽鎖可変ドメインＶＬのヒト化変異体Ｂ、Ｍ−０５−７４＿ＶＨ−Ｂ
配列番号４０  軽鎖可変ドメインＶＬのヒト化変異体Ｃ、Ｍ−０５−７４＿ＶＨ−Ｃ
配列番号４１  軽鎖可変ドメインＶＬのヒト化変異体Ｄ、Ｍ−０５−７４＿ＶＨ−Ｄ
配列番号４２  軽鎖可変ドメインＶＬのヒト化変異体Ｅ、Ｍ−０５−７４＿ＶＨ−Ｅ
配列番号４３  ヒトＨＥＲ３のβヘアピン内の結合エピトープ
配列番号４４  ヒトＨＥＲ４のβヘアピン内の結合エピトープ
配列番号４５  シュードモナス外毒素変異体ＰＥ２４ＬＲ８Ｍ＿３Ｇ（ＧＧＧリンカーを含む）
配列番号４６  Ｍ−０５−７４の軽鎖（Ｍ−０５−７４＿ＬＣ）
配列番号４７  ソルターゼタグを有するＭ−０５−７４  ＨＣの重鎖（Ｍ−０５−７４＿ＨＣ）
配列番号４８  シュードモナス外毒素変異体ＰＥ２４ＬＲ８ＭにコンジュゲートしたＭ−０５−７４  ＨＣの重鎖（Ｆａｂ−０７４−ＰＥの重鎖１）
配列番号４９  シュードモナス外毒素変異体ＰＥ２４ＬＲ８Ｍに、直接のＰＥ２４ＬＲ８Ｍ融合として、コンジュゲートしたＭ−０５−７４  ＨＣの重鎖（Ｆａｂ−０７４−ＰＥの重鎖２）
配列番号５０  可溶性黄色ブドウ球菌ソルターゼＡ
配列番号５１  重鎖可変ドメインＶＨ、＜Ｈｅｒ３＞Ｍ−０８−１１
配列番号５２  軽鎖可変ドメインＶＬ、＜Ｈｅｒ３＞Ｍ−０８−１１
配列番号５３  ヒトカッパ軽鎖定常領域
配列番号５４  ヒトラムダ軽鎖定常領域
配列番号５５  ＩｇＧ１由来のヒト重鎖定常領域
配列番号５６  Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａに関して変異されたＩｇＧ１由来のヒト重鎖定常領域
配列番号５７  Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇに関して変異されたＩｇＧ１由来のヒト重鎖定常領域
配列番号５８  ＩｇＧ４由来のヒト重鎖定常領域
配列番号５９  ヒトＨＥＲ２のドメインＩＩ
配列番号６０  重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、ペルツズマブ
配列番号６１  重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、ペルツズマブ
配列番号６２  重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、ペルツズマブ
配列番号６３  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、ペルツズマブ
配列番号６４  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、ペルツズマブ
配列番号６５  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、ペルツズマブ
配列番号６６  重鎖可変ドメインＶＨ、ペルツズマブ
配列番号６７  軽鎖可変ドメインＶＬ、ペルツズマブ
配列番号６８  重鎖１、二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体ＤＩＢｘＰＥＲＴ
配列番号６９  軽鎖１、二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体ＤＩＢｘＰＥＲＴ
配列番号７０  重鎖２、二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体ＤＩＢｘＰＥＲＴ
配列番号７１  軽鎖２、二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体ＤＩＢｘＰＥＲＴ
【０２０９】
以下の実施例及び図は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神から逸脱することなく、改変は記載された手順で行うことができることが理解される。
【０２１０】
以下に、本発明の幾つかの実施態様が記載される。
【０２１１】
１：二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体の生成に使用のためにヒトＨＥＲ３に結合する抗体を選択するための方法における、
配列番号１３   ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ−Ｈｅｒ３、
配列番号１７   ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ３、
配列番号１８   ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３、
配列番号１９   ＴｇＳｌｙＤｓｅｒ−Ｈｅｒ３、及び
配列番号２０   ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３
からなる群から選択され、配列番号１のアミノ酸配列を含む、少なくとも一のポリペプチドの使用であって、
ここで、ＨＥＲ３抗体は、ヒトＨＥＲ３のＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）のアミノ酸配列内に結合し；
次いでそのようなＨＥＲ３抗体が二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体を生成するために使用される使用。
【０２１２】
２：配列番号１３  ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ−Ｈｅｒ３、
配列番号１７  ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ３、
配列番号１８  ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３、
配列番号１９  ＴｇＳｌｙＤｓｅｒ−Ｈｅｒ３、及び
配列番号２０  ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３
からなる群から選択されるポリペプチドに含まれるＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）のアミノ酸配列内に結合するヒトＨＥＲ３及びヒトＨＥＲ２に対する単離された二重特異性抗体。
【０２１３】
３：配列番号１８（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３）のポリペプチドに含まれるＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）のアミノ酸配列内に結合する、ヒトＨＥＲ３及びヒトＨＥＲ２に対する単離された二重特異性抗体。
【０２１４】
４：ヒトＨＥＲ３のベータヘアピン（配列番号１）に結合し、かつヒトＨＥＲ２のドメインＩＩ（配列番号５９）に結合する単離された二重特異性抗体。
【０２１５】
５：抗体が、配列番号１８（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３）のポリペプチドに含まれるＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）のアミノ酸配列内でヒトＨＥＲ３に結合し、かつ抗体がヒトＨＥＲ２のドメインＩＩ（配列番号５９）に結合する、ヒトＨＥＲ３に対する及びヒトＨＥＲ２に対する単離された二重特異性抗体。
【０２１６】
６：アミノ酸配列ＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）を含む配列番号１８（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３）のポリペプチドに結合し、かつヒトＨＥＲ２のドメインＩＩ（配列番号５９）に結合する単離された二重特異性抗体。
【０２１７】
７：ヒトＨＥＲ３のベータヘアピンＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）に結合し、かつペルツズマブと同じヒトＨＥＲ２上のエピトープに結合する単離された二重特異性抗体。
【０２１８】
８：抗体がアミノ酸配列ＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）を含む配列番号１８（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３）のポリペプチドに結合し、かつ抗体がペルツズマブと同じヒトＨＥＲ２上のエピトープに結合する単離された二重特異性抗体。
【０２１９】
９：ヒトＨＥＲ３のベータヘアピンＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）に結合し、ヒトＨＥＲ２への結合についてペルツズマブと競合する単離された二重特異性抗体。
【０２２０】
１０：抗体がアミノ酸配列ＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）を含む配列番号１８（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３）のポリペプチドに結合し、かつ抗体がヒトＨＥＲ２への結合についてペルツズマブと競合する単離された二重特異性抗体。
【０２２１】
１１：ヒトＨＥＲ３のベータヘアピンＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）に結合し、かつヒトＨＥＲ２に結合し、並びにペルツズマブの６つ全ての重鎖及び軽鎖ＨＶＲ（配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５）を含む単離された二重特異性抗体。
【０２２２】
１２：ヒトＨＥＲ３のベータヘアピンＰＱＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴ（配列番号１）に結合し、かつヒトＨＥＲ２に結合し、並びにペルツズマブのＶＨ及びＶＬ（配列番号６６及び配列番号６７）を含む単離された二重特異性抗体。
【０２２３】
１３：ヒトＨＥＲ４にも結合する先の実施態様の何れか一に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体。
【０２２４】
１４：ヒトＨＥＲ４のベータヘアピンＰＱＴＦＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥＨＮＦＮＡ（配列番号２）にも結合する先の実施態様の何れか一に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体。
【０２２５】
１５：アミノ酸配列ＰＱＴＦＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥＨＮＦＮＡ（配列番号２）を含む配列番号２２のポリペプチド（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ４）にも結合する先の実施態様の何れか一に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体。
【０２２６】
１６：ヒトＨＥＲ４と交差反応しない、先の実施態様の何れか一に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体。
【０２２７】
１７：ヒトＨＥＲ４のベータヘアピンＰＱＴＦＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥＨＮＦＮＡ（配列番号２）と交差反応しない、先の実施態様の何れか一に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体。
【０２２８】
１８：アミノ酸配列ＰＱＴＦＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥＨＮＦＮＡ（配列番号２）を含む配列番号２２のポリペプチド（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ４）と交差反応しない、先の実施態様の何れか一に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体。
【０２２９】
１９：ａ）ヒトＨＥＲ３に結合し、
配列番号２５  重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、Ｍ−０５−７４、
配列番号２６  重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、Ｍ−０５−７４、及び
配列番号２７  重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、Ｍ−０５−７４
の重鎖ＨＶＲを含み、
かつ
配列番号２８  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、Ｍ−０５−７４、
配列番号２９  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、Ｍ−０５−７４、及び
配列番号３０  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、Ｍ−０５−７４
の軽鎖重鎖ＨＶＲを含み；
並びに
ｂ）ヒトＨＥＲ２に結合し、
配列番号６０  重鎖ＨＶＲ−Ｈ１、ペルツズマブ、
配列番号６１  重鎖ＨＶＲ−Ｈ２、ペルツズマブ、
配列番号６２  重鎖ＨＶＲ−Ｈ３、ペルツズマブ
の重鎖ＨＶＲを含み、
かつ
配列番号６３  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ１、ペルツズマブ、
配列番号６４  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ２、ペルツズマブ、及び
配列番号６５  軽鎖ＨＶＲ−Ｌ３、ペルツズマブ
の軽鎖重鎖ＨＶＲを含む、単離された二重特異性抗体。
【０２３０】
２０：ａ）ヒトＨＥＲ３に結合し、かつ
ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号４１のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインＶＬ、
ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号３９のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインＶＬ、又は
ｉｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号４２のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインＶＬを含み；
並びに
ｂ）ヒトＨＥＲ２に結合し、かつ
配列番号６６のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインＶＬを含む、単離された二重特異性抗体。
【０２３１】
２１：二重特異性抗体が二価である、先の実施態様の何れか一に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体。
【０２３２】
２２：先の実施態様の何れか一に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体をコードする単離された核酸。
【０２３３】
２３：実施態様２２に記載の核酸を含む宿主細胞。
【０２３４】
２４：抗体が生成されるように宿主細胞を培養することを含む、先の実施態様の何れか一に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体を生成する方法。
【０２３５】
２５：宿主細胞からそのような抗体を回収することを更に含む、実施態様２４に記載の方法。
【０２３６】
２６：先の実施態様の何れか一に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体及び細胞傷害性薬物を含むイムノコンジュゲート。
【０２３７】
２７：先の実施態様の何れか一に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的製剤。
【０２３８】
２８．医薬として使用のための先の実施態様の何れか一に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体。
【０２３９】
２９：がんの治療において使用のための、先の実施態様の何れか一に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体、又は二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体及び細胞傷害性薬物を含むイムノコンジュゲート。
【０２４０】
３０：ＨＥＲ３／ＨＥＲ２二量体化及び／又はＨＥＲ２／ＨＥＲ２二量体化の阻害において使用のための先の実施態様の何れか一に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体。
【０２４１】
３１：医薬の製造における、先の実施態様の何れか一に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体、又は二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体及び細胞傷害性薬物を含むイムノコンジュゲートの使用。
【０２４２】
３２：医薬ががんの治療用である、実施態様３１の使用。
【０２４３】
３３：医薬がＨＥＲ３／ＨＥＲ２二量体化及び／又はＨＥＲ２／ＨＥＲ２二量体化の阻害用である、実施態様３１の使用。
【０２４４】
３４：先の実施態様の何れか一に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体、又は二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体及び細胞傷害性薬物を含むイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法。
【０２４５】
３５：先の実施態様の何れか一に記載の二重特異性ＨＥＲ３／ＨＥＲ２抗体の有効量を個体に投与し、それにより個体における腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、がんに罹患している個体の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【実施例】
【０２４６】
材料及び一般的な方法
組換えＤＮＡ技術
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記述されるように、標準的な方法がＤＮＡを操作するために使用された。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。
【０２４７】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントを、化学合成によって作られたオリゴヌクレオチドから調製した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接した４００−１６００ｂｐ長の遺伝子セグメントは、アニーリング及びＰＣＲ増幅を含むオリゴヌクレオチドの連結によって構築され、続いて示された制限部位、例えばＥｃｏＲＩ／ＢｌｐＩ又はＢｓｍＩ／ＸｈｏＩを介して以下に記載の発現ベクターへクローニングされた。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子合成断片は、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で指定された仕様に基づいて発注された。
【０２４８】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ  ＧｍｂＨ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った二本鎖配列決定により決定した。
【０２４９】
ＤＮＡ及びタンパク質配列分析及び配列データ管理
インフォマックスのベクターＮＴ１アドバンススイートバージョン１１．５．０が、配列の作成、マッピング、解析、注釈及び説明のために使用された。
【０２５０】
実施例１
抗原及びスクリーニングタンパク質の調製−ＨＥＲ３のβヘアピン及びＨＥＲ４のβヘアピンに結合する抗体を選択するための機能的βヘアピンＨＥＲ３及びβヘアピンＨＥＲ４コンストラクトの生成
機能的βヘアピンＨＥＲ３及びＨＥＲ４コンストラクトを生成するために、ＨＥＲ３のβヘアピン（配列番号１）及びＨＥＲ４のβヘアピン（配列番号４）のアミノ酸配列は、ＦＫＢＰドメインを含むポリペプチドのＳｌｙＤフレームワークに移植された。このようなコンストラクトにおいて、移植されたβヘアピンは、（例えば、ＨＲＧなどのリガンドの非存在下で）ＨＥＲ３又はＨＥＲ４の天然の非活性化型コンホメーションにおける隠れた構造とは対照的に、自由にアクセス可能である（ＨＥＲ３のβヘアピンが隠れている図１ｃ及び１ｄを参照）。
【０２５１】
全ての融合ＳｌｙＤポリペプチドは、ほとんど同一のプロトコルを用いて精製し、リフォールディングすることができる。特定の発現プラスミドで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を選択的成長のための各抗生物質（カナマイシン３０μｇ／ｍｌ、又はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ））を含むＬＢ培地中３７℃で、ＯＤ６００が１．５まで増殖させ、細胞質ゾル過剰発現を、１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって誘導した。誘導後３時間で、細胞を、遠心分離（５０００ｇで２０分間）により回収し、凍結し、−２０℃で保存した。細胞溶解のために、凍結したペレットを、７ＭのＧｄｍＣｌ及び５ｍＭのイミダゾールを補充した冷却した５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁した。その後、懸濁液を、氷上で２〜１０時間撹拌し、細胞溶解を完了した。遠心分離（２５０００ｇ、１ｈ）及び濾過（硝酸セルロース膜、８．０μｍ、１．２μｍ、０．２μｍ）の後、溶解物を、溶解緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラムにプライした。続く洗浄工程において、（７ＭのＧｄｍＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中）イミダゾールの濃度を１０ｍＭに上昇させ、チオール部分を還元型に維持し、早期のジスルフィド架橋を防ぐために、５ｍＭのＴＣＥＰを添加した。還元性洗浄緩衝液の少なくとも１５から２０体積を適用した。その後、ＧｄｍＣｌ溶液を、マトリックス結合のＳｌｙＤ融合ポリペプチドのコンホメーションリフォールディングを誘導するために、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、及び５ｍＭのＴＣＥＰを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に交換した。同時に精製するプロテアーゼの再活性化を回避するために、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡフリー、Ｒｏｃｈｅ）をリフォールディング緩衝液に添加した。リフォールディング緩衝液の計１５から２０カラム体積を、一晩の手順で適用した。その後、ＴＣＥＰ及びＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡフリー阻害剤カクテルの両方を、１００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのイミダゾールを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）の１０カラム体積で洗浄することにより除去した。最後の洗浄工程では、粘り強い汚染物質を除去するために、イミダゾール濃度を３０ｍＭ（１０カラム体積）まで上げた。リフォールディングしたポリペプチドは、次いで、同じ緩衝液中２５０ｍＭイミダゾールを適用することにより溶出した。タンパク質含有画分を、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度について評価した（Schaegger, H. and von Jagow, G., Anal. Biochem. 166 (1987) 368-379）。その後、緩衝系（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）としてリン酸カリウムを使用して、タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ  ＨｉＬｏａｄ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけた。最後に、タンパク質含有画分をプールし、約５ｍｇ／ｍｌの濃度までアミコンセル（ＹＭ１０）で濃縮した。ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ−Ｈｅｒ３のＮｉ−ＮＴＡ精製の典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が図３に示��れ、サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ−Ｈｅｒ−３のニッケルＮＴＡ精製された画分のＳＥＣ溶出プロファイルが図４に示される。サーマス・サーモフィラスのＳｌｙＤ（ＴｔＳｌｙＤ）−Ｈｅｒ−３融合ポリペプチドは、そのモノマー形態で、可溶性で安定したポリペプチドとして正常に精製することができた。最終収量は、画分１２と１３から１６．４ｍｇの精製タンパク質で定量された。
【０２５２】
表２：（挿入体としてＨＥＲ３二量体化ドメイン断片（ＨＥＲ３のβヘアピン（配列番号１））又は挿入体としてＨＥＲ４二量体化ドメイン断片（ＨＥＲ４のβヘアピン（配列番号２））を保有する）開発されたＳｌｙＤベースのエピトープスキャフォールドのアミノ酸配列の概要。
【０２５３】
ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ−Ｈｅｒ３、ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ３、ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｍｍａｔｏｌｅｒａｎｓ  ＴｇＳｌｙＤｓｅｒ−Ｈｅｒ３及びＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３は、挿入体としてＨｅｒ３二量体化ドメイン断片（ＨＥＲ３のβヘアピン（配列番号１））を保有し、免疫原として及びＥＬＩＳＡスクリーニングにおける陽性対照として使用された。
【０２５４】
ＴｔＳｌｙＤ−野生型、ＴｔＳｌｙＤｃａｓ、ＴｇＳｌｙＤΔＩＦは、（挿入体としてＨｅｒ３二量体化ドメイン断片（ＨＥＲ３のβヘアピン（配列番号１））又はＨｅｒ４二量体化ドメイン断片（ＨＥＲ４のβヘアピン（配列番号２）を含まない）ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいて、陰性対照として使用された。
【０２５５】
ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ４、ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ４、ＴｇＳｌｙＤｓｅｒ−Ｈｅｒ４及びＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ４（挿入体としてＨＥＲ４二量体化ドメイン断片（ＨＥＲ４のβヘアピン（配列番号２）を保有する）が、ＨＥＲ４の交差反応性のために開発されたクローンを確認するためにＥＬＩＳＡスクリーニングに使用された。
【０２５６】
エピトープスキャフォールドは、大腸菌で発現されるので、Ｎ末端メチオニン残基が存在するか又はしない場合がある。（Ｎｔ＝Ｎ末端；Ｃｔ＝Ｃ末端）
2020114221.tif 000004
2020114221.tif 000005
【０２５７】
実施例２
ａ）免疫化とＨＥＲ３抗体の選択
ＨＥＲ３及びＨＥＲ４のβヘアピンに対する抗体の生成のために、Ｂａｌｂ／Ｃ、ＮＭＲＩ又はＳＪＬマウスを異なる抗原で免疫した。抗原として、以下のタンパク質を使用した：完全長Ｈｅｒ３  ＥＣＤ、又はエピトープスキャフォールドタンパク質ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ１２−Ｈｅｒ３、ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３、ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ３、ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３及びＴｇＳｌｙＤｓｅｒ−Ｈｅｒ３。ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ１２−ＨＥＲ３変異体は、ＨＥＲ３二量体化ドメイン特異的抗体の生成のために使用される第一世代のエピトープスキャフォールドを表す。エピトープスキャフォールドとしてＳｌｙＤ変異体を使用することの一般原理は、既に第一世代のＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ１２スキャフォールドを使用して実証することができたが、高い安定性を有するスキャフォールドの改善された変異体が開発された。これらのＳｌｙＤ変異体は、サーマス・サーモフィラス及びＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｍｍａｔｏｌｅｒａｎｓから由来する。
【０２５８】
全てのマウスは、免疫化キャンペーンの開始後の時間点０週、６週及び１０週目で３回の免疫化に供された。各時点で、各マウスを、１００μｌのＰＢＳに溶解した１００μｇのエンドトキシンを含まない免疫原で免疫した。１回目の免疫化のため、免疫原を１００μｌのＣＦＡと混合した。２回目及び３回目の免疫化のため、免疫原をＩＦＡと混合した。１回目と３回目の免疫化は、腹腔内経路を介して適用され、２回目の免疫化は皮下に適用された。ハイブリドーマ技術を用いた抗体の開発のための脾臓細胞の調製の前に、マウスは、アジュバントを含まない１００μｌのＰＢＳ中の１２．５μｇの免疫原によって、静脈内追加免疫に供された。
【０２５９】
力価分析
それぞれの免疫原に対する及びスクリーニングタンパク質に対する血清力価の測定のため、各マウスの血清の少量が、免疫化キャンペーンの開始後１１週目に採取された。ＥＬＩＳＡのため、免疫原又はスクリーニングのスキャフォールドタンパク質をプレート表面上に固定化した。ＨＥＲ３  ＥＣＤは１μｇ／ｍｌの濃度で固定化し、スキャフォールドタンパク質ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ１２−Ｈｅｒ３、ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ１２、ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３、ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ３、ＴｔＳｌｙＤｃａｓ、ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３、ＴｇＳｌｙＤｓｅｒ−Ｈｅｒ３及びＴｇＳｌｙＤΔＩＦは、０．５／ｍｌの濃度で使用した。スキャフォールドタンパク質ＴｔＳｌｙＤｃａｓ及びＴｇＳｌｙＤΔＩＦは、陰性対照として使用された。各マウスからの血清を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に希釈し、希釈液をプレートに添加した。血清は、希釈１：３００、１：９００、１：２７００、１：８１００、１：２４３００、１：７２９００、１：２１８７００及び１：６５６１００で試験された。結合した抗体は、基質としてＨＲＰ標識Ｆ（ａｂ｀）２ヤギ抗マウスＦｃγ（Ｄｉａｎｏｖａ）及びＡＢＴＳ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて検出された。
【０２６０】
血清滴定のレベルにおいてさえも、免疫化マウスは、ＨＥＲ３のβヘアピンドメインに対する抗体を生じることは既に明らかであった。Ｈｅｒ３  ＥＣＤで免疫したマウスでは、これは、二量化β−ヘアピンループを含有するスキャフォールドタンパク質の一つに対しての滴定により示すことができる。強く低減されたシグナルは、Ｈｅｒ３  ＥＣＤを用いた免疫化によって産生された抗体の大部分は、ＥＣＤ内の他の部分を標的としており、ごく一部のみが二量体化β−ヘアピンドメインに結合しているという事実により説明することができる。Ｈｅｒ３二量体化ループを含むスキャフォールドで免疫したマウスにおいて、ループを標的とする抗体の割合は、Ｈｅｒ３  ＥＣＤに対する滴定（陽性対照）及びＨｅｒ３挿入体を含まない対照スキャフォールドに対する滴定（陰性対照）により示すことができる。
【０２６１】
ｂ）抗体の開発及びＥＬＩＳＡスクリーニング／選択
ここで説明するエピトープスキャフォールド技術の使用は、Ｈｅｒ３二量体化ドメイン（ＨＥＲ３のβヘアピン（配列番号１））を標的とする抗体の開発のための主要な２つの戦略を提供する。１つの戦略は、完全長Ｈｅｒ３  ＥＣＤで免疫し、二量体化ドメインに特異的な抗体をスクリーニングするためのスキャフォールドを使用することである。他の戦略は、免疫化のためのスキャフォールドの直接の使用、及びＨｅｒ３  ＥＣＤ、他の骨格を持つスキャフォールド又はカウンタースクリーニングのための挿入体を含まないスキャフォールドを使用することである。抗体は、初代Ｂ細胞をＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と融合することによるハイブリドーマ技術を用いて開発された。２日後、最終追加免疫の後、免疫したマウスを屠殺し、脾臓細胞集団を調製した。脾臓細胞は、ＰＥＧ融合技術を用いて、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３と融合させた。融合からの細胞のバッチ培養は、５％ＣＯ２下、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、融合細胞を含む細胞のバッチを４００ｇで１０分間遠心分離した。その後、細胞を、０．１×アザセリン−ヒポキサンチン（Ｓｉｇｍａ）を補充したハイブリドーマ選択培地に懸濁し、９６ウェルプレートにウェル当たり２．５ｘ１０４細胞の濃度で播種した。プレートを、５％ＣＯ２下、３７℃で少なくとも１週間培養した。ＥＬＩＳＡ分析の３日前に選択培地を交換した。
【０２６２】
初代培養上清を、Ｈｅｒ３  ＥＣＤ及び種々のスキャフォールドタンパク質に対するＥＬＩＳＡで試験した。スキャフォールドタンパク質に対する試験は、選択されたクローンが、天然のＨｅｒ３  ＥＣＤの二量体化ドメインのβヘアピンに結合していることを実証するために行われた。対照スキャフォールドのＴｔＳｌｙＤｃａｓ及びＴｇＳｌｙＤΔＩＦに対する試験は、選択されたクローンは、スキャフォールド骨格ではなく挿入されたＨｅｒ３由来の配列に結合していることを示すために行われた。交差反応性を確認するために、得られたクローンは、Ｈｅｒファミリーの他のメンバー、すなわち、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２及びＨｅｒ４の完全長のＥＣＤに対して試験された。示されるように、全ての選択されたクローンは、Ｈｅｒ３に対して高度に特異的であり、そしてＨｅｒ４に高度に特異的な交差反応性を検出することができたが、一方、Ｈｅｒファミリーの他のメンバーとの交差反応性は検出されなかった。ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいて、抗原ダウンフォーマットが使用された。ＨＥＲ３  ＥＣＤは１μｇ／ｍｌの濃度で固定化し、スキャフォールドタンパク質ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ１２−Ｈｅｒ３、ＴｔＳｌｙＤ−ＦＫＢＰ１２、ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３、ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ３、ＴｔＳｌｙＤｃａｓ、ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３、ＴｇＳｌｙＤｓｅｒ−Ｈｅｒ３及びＴｇＳｌｙＤΔＩＦは、０．５／ｍｌの濃度で固定化した。ハイブリドーマ上清をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。結合した抗体は、ＨＲＰ標識Ｆ（ａｂ｀）２ヤギ抗マウスＦｃγ（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いて検出され、ＡＢＴＳ（Ｒｏｃｈｅ）がＨＲＰ基質として使用された。
【０２６３】
2020114221.tif 000006
【０２６４】
ｃ）免疫組織化学
全ての選択されたクローンは、ＩＨＣにおいて反応性及び特異性について試験された。従って、ＨＥＫ２９３細胞は、完全長ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４をそれぞれコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトされた。トランスフェクションの２日後、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４を今や発現する異なる細胞株は回収され、続いて、ホルマリンで固定され、ＩＨＣ対照を生成するためにアガロースに包埋された。ホルマリン中で一晩更に固定した後、アガロースブロックはパラフィンに包埋された。トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３細胞を陰性対照として使用し、トランスフェクトされた細胞に応じて処置された。パラフィン包埋した後、３μｍの薄い切片をミクロトームを用いて調製した。切片をガラス顕微鏡スライド上にマウントし、２時間乾燥させた。免疫組織化学の染色手順の全ての更なる工程は、ベンタナベンチマークＸＴを用いて行われた。スライドを脱脂し、抗原回復は１時間加熱することによって行われた。抗原回復のために、ベンタナ緩衝液ＣＣ１を使用した。抗体は、１μｇ／ｍｌの濃度で使用した結合した抗体の検出のためにベンタナＵｌｔｒａＶｉｅｗ検出キットを使用した。結果を図５に示す。３つ全てのクローンは、ＨＥＲ３への結合とＨＥＲ４に対する交差反応性を示した。ＨＥＲ１及びＨＥＲ２に対する交差反応性は検出されなかった。
【０２６５】
ｄ）選択された抗ＨＥＲ３ハイブリドーマのＤＮＡ配列決定
選択されたハイブリドーマクローンのＤＮＡ配列を得るために、５｀Ｒａｃｅ  ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲのために、全ＲＮＡは、全ＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、５×１０６細胞から調製した。逆転写及びＰＣＲは５｀ｐｒｉｍｅ  ＲＡＣＥ  ＰＣＲキットを使用して行った（Ｒｏｃｈｅ）。重鎖及び軽鎖から得られたＰＣＲ断片をゲル電気泳動及び続くゲル精製によって精製した。ＰＣＲ断片をＴｏｐｏ  Ｚｅｒｏ−Ｂｌｕｎｔクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローンし、コンピテント細胞に形質転換した。各々のハイブリドーマからの幾つかのクローンが、選択されたクローンのコンセンサス配列を得るために配列決定に供された。Ｍ−０５−７４  Ｍ−１５−０２  Ｍ−１５−０４が、配列決定のために提出され、３つ全てのクローンについて同一のＶＨ及びＶＬ配列が得られた。Ｍ−１５−０３、Ｍ−１５−０５、Ｍ−１５−０８、Ｍ−１５−０９、Ｍ−１５−１１、Ｍ−１６−０１が同様に配列決定され、全てのクローンについて同一のＶＨ及びＶＬ配列をもたらした。
【０２６６】
ｅ）ＦＡＣＳを介したＭ−０５−７４の時間依存性内部移行の解析
ＨＥＲ３に対して選択されたクローンＭ−０５−７４によるＨＥＲ３の結合及び内部移行が、ＨＥＲ３を発現する腫瘍細胞株Ｔ４７Ｄを用いてＦＡＣＳで分析された。５×１０５細胞が、５０ｎｇの組換えヒトヘレグリン断片（ＨＲＧ）（配列番号１１）により処置された。配列番号１１のアミノ酸を含む断片１１が、ｐＣＤＮＡ．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングされた。ＨＲＧ断片は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより記載されたプロトコルに従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ ２９３−Ｆ細胞中で発現された。（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ ２９３発現システムのカタログ番号Ｋ９０００−０１）。精製されたＨＲＧ断片は、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ６．０中に溶解され、−８０℃で保存された。
【０２６７】
未処置（−）の細胞を陰性対照として使用した。ヘレグリン誘導活性化のすぐ後で、Ｍ−０５−７４を１μｇ細胞に添加した。細胞を、３７℃で０、５、１５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５、１２０、１８０分間２４０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を直ちに氷上に置いた。細胞を、３ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、その後１μｇのＲ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体で３０分間染色した。フローサイトメトリーが、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行われた。結果は、Ｔ４７Ｄ細胞における、Ｍ−０５−７４誘導型、時間依存性ＨＥＲ３受容体の内部移行のＦＡＣＳ解析である。Ｍ−０５−７４は、追加された組換えヒトヘレグリン断片（ＨＲＧ）の有無にかかわらず発現されたＨＥＲ３  ＥＣＤへの結合を示している。Ｍ−０５−７４は、４時間かけてＨＥＲ３受容体の内部移行へと導く。結果を図６に示す。アイソタイプ対照は、一定の水平の黒い棒として表示される。Ｍ−０５−７４は、ヒトヘレグリン断片（−）及び（＋ＨＲＧ）の有無にかかわらず発現されたＨｅｒ３  ＥＣＤへの結合を示す。Ｍ−０５−７４は、４時間かけてＨＥＲ３受容体の内部移行へと導く。アイソタイプ対照は、一定の水平の黒い棒として表示される。ＨＲＧの存在下では、ＨＲＧの非存在下での値（−）と比較した場合、ＨＥＲ３の抗体誘導型内部移行は速かった（例えば１時間後に、少なくとも２５％以上のＨＥＲ３がＨＲＧの存在下（＋ＨＲＧ）で内部移行した）。
【０２６８】
実施例３
ａ） ＨＥＲ３抗体の速度論的スクリーニング／結合特性
速度論的スクリーニングは、ビアコアＣＭ５センサーを備えたＢＩＡｃｏｒｅ４０００装置で、Ｓｃｈｒａｅｍｌらに従って行われた（Schraml, M. and M. Biehl, Methods Mol Biol 901 (2012) 171-181）。全てのアッセイにおいて試験抗体が捕捉された。そのシステムは、ソフトウェアバージョンＶ１．１の制御下にあった。機器の緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）のＰ２０）であった。システムは、２５℃で操作された。１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中の３０／ｍｌのウサギポリクローナル抗体（ＲＡＭ  ＩｇＧ、（Ｆｃガンマ特異性を有するウサギ抗マウスＩｇＧ）ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が、フローセル１、２、３、及び４のスポット１、２、４及び５において、製造業者の指示に従ってＥＤＣ／ＮＨＳ化学を用いて固定化された。センサーは、１Ｍのエタノールアミンを用いて飽和された。各フローセルにおいて、参照シグナルは、スポット１−２及びスポット５−４を用いて計算され、スポット３はブランク対照とした。抗原（ヒト組換えＨｅｒ−３  ＥＣＤ（６８ｋＤａ）、及びＨＥＲ３のβ−ヘアピンペプチド（配列番号１）を含む、組換えサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ  ＦＫＢＰ−ＨＥＲ３（１５ｋＤａ）は、非特異的結合を抑制するために、１ｍｇ／ｍｌのＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン、Ｓｉｇｍａ）を補充した機器の緩衝液で１５０ｎＭに希釈された。それらの適用の前に、ハイブリドーマ培養上清は、機器の緩衝液で１：５に希釈された。希釈された混合物を２分間、３０μｌ／分の流速で注入した。抗体捕捉レベル（ＣＬ）は応答単位でモニターされた。その直後に、各抗原を、３分間、３０μｌ／分の流速で注入した。その後、抗体−抗原複合体の解離シグナルを５分間記録した。センサーは、３０μｌ／分の流速で２分間、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ溶液（ｐＨ１．７）を注入することによって再生した。抗原の注入の終了の直前に記録されたシグナルは、応答単位で結合遅延（ＢＬ）として記された。解離の記録の終了の直前に記録されたシグナルは、応答単位で安定性遅延（ＳＬ）として記された。解離速度定数を算出して決定した。分単位での抗体−抗原複合体の安定性は、以下の式：ｌｎ（２）／６０＊ｋｄを用いて計算した。モル比は、式：ＭＷ（抗体）／ＭＷ（抗原）＊ＢＬ（抗原）／ＣＬ（抗体）を用いて計算した。
【０２６９】
結合遅延（ＢＬ）は、分析物注入の終了時での応答単位を表す。センサー表面上でリガンドとして捕捉された抗体の量は、反応単位で捕捉レベル（ＣＬ）として測定される。試験される分析物の分子量の情報と共に、溶液中の抗体及び分析物、モル比を計算することができる。センサーは、適切な量の抗体リガンド捕捉レベルと共に形作られる場合、各抗体は、溶液中で少なくとも一分析物に機能的に結合することができる必要がある（これはＭＲ＝１．０のモル比で表される）。そして、モル比はまた、分析物結合の結合価モードについての指標である。最大結合価は、各Ｆａｂ結合価により一つで、２つの分析物に結合する抗体について、ＭＲ＝２とすることができる。立体的制限又は機能不全分析物の結合の場合、モル比は、Ｈｅｒ−３  ＥＣＤが、その「閉じた」コンホメーションで結合される場合であるように、化学量論未満の結合を示し得る。モル比の決定における最大のアッセイ偏差はＭＲ＝０．２である。
【０２７０】
抗ＨＥＲ３／ＨＥＲ４抗体Ｍ−０５−７４のスクリーニング／選択：
一実験において、速度論的スクリーニングは、ヒト組換えＨｅｒ−３  ＥＣＤによるマウスの免疫化から得られた、異なる融合からのハイブリドーマ一次培養を用いて開始された。目的は、Ｈｅｒ−３のヘテロ二量体化ドメインのβ−ヘアピンペプチド（配列番号１）に対する結合特異性を有する培養物を選択することであった。溶液中の抗原として、ヒト組換えＨｅｒ−３  ＥＣＤ（６８ｋＤａ）、及びＨＥＲ３のβヘアピンペプチド（配列番号１）を含有する組換えサーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ  ＦＫＢＰ−ＨＥＲ３（１５ｋＤ）が使用された。正の的中は、両方の抗原に対する結合活性を有する一次培養上清として分類された。
【０２７１】
表４は、例示的に、一次培養上清を示し、そこから、Ｍ−０５−７４はこれらの要件を満たしており、ＨＥＲ３のβヘアピンに対するエピトープ特異性を示している。従って、これは、配列番号１のＨｅｒ−３ヘアピンに結合する抗ＨＥＲ３抗体のスクリーニングの適切な方法である。
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【０２７２】
Ｍ−０５−７４は、そのヒトＨｅｒ−３  ＥＣＤ分析物に対する、その結合におけるモル比の減少を示しており（ＭＲ＝０．５）、一方、ＨＥＲ３のβヘアピン（配列番号１）を含む分析物サーマス・サーモフィラスＳｌｙＤ  ＦＫＢＰ−Ｈｅｒ３への結合においては、Ｍ−０５−７４は改善されたモル比（ＭＲ＝１．１）を示し、（ヒトＨｅｒ−３  ＥＣＤに比べて）改善されたエピトープの接触性による、機能的、化学量論１：１結合を示している。
【０２７３】
ｂ）ヘレグリン（ＨＲＧ）の非存在下及び存在下でのＭ−０５−７４の作用機序を調べるための、ＨＥＲ３抗体Ｍ−０５−７４、Ｍ−２０５及びＭ−２０８の速度論
その平衡状態において、Ｈｅｒ−３  ＥＣＤは、その「閉じたコンホメーション」で存在し、このことは、ヘテロ二量体化Ｈｅｒ３ベータヘアピンモチーフはＨｅｒ−３  ＥＣＤドメインＩＶへの非共有結合性相互作用を介して係留されていることを意味している（図１ｃ及び１ｄを参照）。これは、「閉じた」Ｈｅｒ３コンホメーションは、特異的なＨｅｒ３ヘレグリン結合部位でのリガンドヘレグリンの結合を介して開くことができると想定される。これは、Ｈｅｒ３のＥＣＤドメインＩとドメインＩＩＩによって形成されたＨｅｒ３界面で起こる。この相互作用により、Ｈｅｒ−３  受容体が活性化され、その「開いたコンホメーション」へと移行されると考えられる（図１ｂ及びｅを参照）。これが生じると、Ｈｅｒ−３のベータヘアピンは記載された抗体に対して接触可能となる。この作用機序は、ビアコア実験によりインビトロでシミュレートすることができる。
【０２７４】
ビアコアＴ１００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、モノクローナル抗体を、ヘレグリン活性化Ｈｅｒ−３細胞外ドメイン（Ｈｅｒ３＿ＥＣＤ）に対するそれらの挙動について、速度論的に評価するために使用された。ＣＭ５シリーズセンサーをシステムに装着し、製造業者の指示に従ってＨＢＳ−ＥＴ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０）で正規化した。試料緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌのＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン、Ｓｉｇｍａ ＃８６５２４）を補充したシステム緩衝液であった。そのシステムは、２５℃で操作された。６５００ＲＵ−ＲＡＭのＦｃγ（Ｆｃγ断片ＲａｍＩｇＧの相対単位、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、４つ全てのフローセル上に、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を用いて、製造元の指示に従って固定化された。センサーは、１Ｍのエタノールアミンを用いて不活性化された。
【０２７５】
分析物に対する各抗体の結合活性は速度論的に試験された。抗体は、５μｌ／分で１分間の注入により３５ｎＭの濃度で捕捉された。流速は１００μｌ／分に設定された。
【０２７６】
試験された溶液中の分析物は、ヒトヘレグリン断片（ＨＲＧ）（配列番号１１）、４４ｋＤａのホモ二量体タンパク質（実施例２ｅに従って調製）、ヒト組換えＨＥＲ２  ＥＣＤ（配列番号１０）（６９．６ｋＤａ）、ヒト組換えＨＥＲ３  ＥＣＤ（配列番号４）（６８ｋＤａ）、ヒト組換えＨＥＲ４  ＥＣＤ（配列番号６）、及び各々ヘレグリンの５倍モル濃度過剰で６０分間、室温でインキュベートされ、ＨＥＲ３  ＥＣＤ−ＨＲＧ複合体及びＨＥＲ４  ＥＣＤ−ＨＲＧ複合体を生じる（複合体におけるＭＷの追加）１００ｎＭのＨｅｒ−３  ＥＣＤ及びＨｅｒ−４  ＥＣＤであった。
【０２７７】
溶液中の分析物を、３．５分間、０ｎＭ、１．１ｎＭ、３．７ｎＭ、１１．１ｎＭ、３３．１ｎＭ及び９０ｎＭの異なる濃度の工程で注入した。解離は１５分間モニターされた。可能な場合には、速度論的シグネチャは、ラングミュアフィットに従って評価された。
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【０２７８】
抗体Ｍ−２０５は、Ｈｅｒ−３  ＥＣＤヘレグリン結合部位近くのエピトープに対する結合活性を有するマウスモノクローナル抗体である（国際公開第２０１１／０７６６８３号にＭａｂ２０５．１０．２と記載）。Ｍ−２０５はＨｅｒ−３  ＥＣＤ上の結合部位の周囲でヘレグリンと競合する。
【０２７９】
抗体Ｍ−２０８は、Ｈｅｒ−３  ＥＣＤのドメインＩＶに対して結合活性を有するマウスモノクローナル抗体である。Ｍ−２０８は、Ｈｅｒ−３  ＥＣＤの立体構造のＨｅｒ−３  ＥＣＤに独立に結合する。
【０２８０】
Ｍ−０５−７４（表５で＝Ｍ−０７４）は、その「開いた」コンホメーションにおけるＨｅｒ−３ヘアピンのより良好な接触性に起因して、（リガンド（例えば、ヘレグリンＨＲＧ）の存在下で）改善された速度論によってその活性な「開いた」コンホメーションでＨｅｒ−３  ＥＣＤに結合する。ＭＲは、少なくとも２倍高い。
【０２８１】
抗体結合は、陰性対照分析物のヘレグリンベータ（ＨＲＧ）及び細胞外ＨＥＲ−２ドメイン（ＨＥＲ２＿ＥＣＤ）に対して観察されなかった（ｎ．ｄ．）。試験された抗体は、Ｈｅｒ３−ＥＣＤ（ＨＥＲ３＿ＥＣＤ）へ全て結合するが、ＢＬ値は大きく異なることを示した。
【０２８２】
Ｍ−０５−７４は、速いｋａ＝４．９Ｅ＋０４  １／ＭｓとＢＬ（２３５ＲＵ）で高いシグナル振幅を持つクローンＭ−２０５、及び速いｋａ＝５．８Ｅ＋０４  １／ＭｓとＢＬ（３６７ＲＵ）で高いシグナル振幅を持つクローンと比較した場合に、遅い会合速度定数ｋａ＝１．３Ｅ＋０４  １／Ｍｓ及び小さいＢＬ（７０ＲＵ）で、その「閉じた」コンホメーションでＨｅｒ−３  ＥＣＤに結合する。これは、結合（ＭＲ）の化学量論を暗示しており、ここではＭ−２０５（ＭＲ＝１．０）とＭ−２０８（ＭＲ＝１．０）の両方ともＨＥＲ３−ＥＣＤに対する機能的１：１結合を示すが、Ｍ−０５−７４は非機能的結合（ＭＲ＝０．２）を示している。ここでは、Ｈｅｒ−３  ＥＣＤに対するＭ−０５−７４の相互作用は、構造的に不利なＨｅｒ−３  ＥＣＤ分析物の一部分の残留結合であると想定される。これはまた、ＢＬ（２７ＲＵ）及び（ＭＲ＝０．１）により非機能的結合を示す、Ｈｅｒ−４  ＥＣＤに対するＭ−０５−７４の相互作用においても想定される。
【０２８３】
驚くべき結果は、「閉じた」Ｈｅｒ−３  ＥＣＤから「開いた」Ｈｅｒ−３  ＥＣＤ／ヘレグリン複合体への、Ｍ−０５−７４の会合速度定数Ｋａの４倍を超える（ほぼ５倍）増加である；；ｋａ＝１．３Ｅ＋０４  １／Ｍｓ（Ｈｅｒ３＿ＥＣＤ）からｋａ＝６．３Ｅ＋０４  １／Ｍｓ（Ｈｅｒ３−ＥＣＤ−ＨＲＧ）。Ｍ−０５−７４は、ヘレグリンの存在下（Ｋａ（＋ヘレグリン））とヘレグリンの非存在下（Ｋａ（−ヘレグリン））での会合定数（Ｋａ）の比が、４．０又はそれ以上でＨＥＲ３−ＥＣＤに結合する（Ｋａ（＋ヘレグリン））／（Ｋａ（−ヘレグリン）＝ｋａ（Ｈｅｒ３−ＥＣＤ−ＨＲＧ）／ｋａ（Ｈｅｒ３−ＥＣＤ）＝６．３Ｅ＋０４  ［１／Ｍｓ］／１．３Ｅ＋０４  ［１／Ｍｓ］）＝４．８５））。それにより、モル比は３倍改善し、Ｈｅｒ−３  ＥＣＤヘレグリン複合体とのＭ−０５−７４の１：１相互作用を示している。このようにして、Ｍ−０５−７４は、ヘレグリンの存在下での結合のモル比ＭＲ（ＭＲ（＋ヘレグリン））とヘレグリンの非存在下での結合のモル比ＭＲ（ＭＲ（−ヘレグリン））の比（ＭＲ（＋ヘレグリン））／（ＭＲ（−ヘレグリン））が３．０（ＭＲ（＋ヘレグリン））／（ＭＲ（−ヘレグリン）＝０．６／０．２＝３）でＨＥＲ３−ＥＣＤに結合する。
【０２８４】
これは、またＨｅｒ−４  ＥＣＤ／ヘレグリン複合体に対しても有効であり、ここではモル比は６倍改善し、Ｈｅｒ−４  ＥＣＤヘレグリン複合体とのＭ−０５−７４の１：１相互作用を示している。このようにして、Ｍ−０５−７４は、ヘレグリンの存在下での結合のモル比ＭＲ（ＭＲ（＋ヘレグリン））とヘレグリンの非存在下での結合のモル比ＭＲ（ＭＲ（−ヘレグリン））の比（ＭＲ（＋ヘレグリン））／（ＭＲ（−ヘレグリン））が３．０（ＭＲ（＋ヘレグリン））／（ＭＲ（−ヘレグリン）＝０．６／０．１＝６）でＨＥＲ４−ＥＣＤに結合する。更に驚くべきことに、Ｍ−０５−７４会合定数ｋａは、「閉じた」Ｈｅｒ−４  ＥＣＤから「開いた」Ｈｅｒ−４  ＥＣＤ／ヘレグリン複合体に、ｋａ＝６．７Ｅ＋０３  １／Ｍｓ（Ｈｅｒ３＿ＥＣＤ）からｋａ＝１．６Ｅ＋０５に、２０倍以上増加する。従って、Ｍ−０５−７４は、ヘレグリンの存在下（Ｋａ（＋ヘレグリン））とヘレグリンの非存在下（Ｋａ（−ヘレグリン））での会合定数（Ｋａ）の比が、２０．０又はそれ以上でＨＥＲ４−ＥＣＤに結合する（Ｋａ（＋ヘレグリン））／（Ｋａ（−ヘレグリン）＝ｋａ（Ｈｅｒ４−ＥＣＤ−ＨＲＧ）／ｋａ（Ｈｅｒ４−ＥＣＤ）＝６．７Ｅ＋０４  ［１／Ｍｓ］／１．６Ｅ＋０５  ［１／Ｍｓ］）＝２３．８８））。
【０２８５】
予想されるように、ヘレグリン置換物Ｍ−２０５は、そのＢＬ値とモル比を減少させる。モル比は、ＢＬでＭＲ＝１．０（Ｈｅｒ３−ＥＣＤ）と２３５ＲＵを持つ完全に機能的な１：１相互作用から、ＢＬで１６４ＲＵを持つ機能性の少ないＭＲ＝０．４（Ｈｅｒ３−ＥＣＤ−ＨＲＧ）へと２．５倍減少する。これは、過剰なヘレグリンの競合する存在に起因する機能性の減少を示している。
【０２８６】
Ｈｅｒ−３  ＥＣＤドメインＩＶに結合する抗体Ｍ−２０８は、ヘレグリンの存在によって完全に影響を受けないままである。モル比のＭＲの有意な変化を検出することはできなかった。
【０２８７】
図７は、ヘレグリン活性化Ｈｅｒ−３  ＥＣＤ複合体への抗ＨＥＲ３／ＨＥＲ４βヘアピン抗体の結合様式を示している。Ｍ−０５−７４（プロット１を参照）は、複合体からのヘレグリン解離を捕捉し及び防止する。Ｍ−０５−７４は、ヘレグリンに対するトラップ（「ヘレグリンシンク」）である。Ｍ−２０５はＨｅｒ−３  ＥＣＤ上の結合部位についてヘレグリンと競合しない。比較のため、Ｍ−０８−１１（プロット２）が示される；Ｍ−０８−１１（ＶＨとＶＬ、配列番号５１と５２を参照）は、Ｍ−０５−７４とは異なるエピトープに結合する、ＨＥＲ４  ＥＣＤ及びＨＥＲ４のβヘアピン交差反応性を持たない、別のＨＥＲ３のβヘアピンバインダーである。
【０２８８】
更なる実験において、ＨＥＲ１  ＥＣＤ、Ｔ．Ｔ．ＳｌｙＤ−ｃｙｓＨｅｒ３及びＨＥＲ３のβヘアピンを含まないＴ．Ｔ．ＳｌｙＤ−ｃａｓが測定に含められ、その結果は表５ｂに示され、Ｍ−０５−７４の同一の結合特性を実質的に明らかにしている。
【０２８９】
ビアコアＴ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）はＣＭ５シリーズセンサーを備えていた。センサーは、製造業者の指示に従ってＨＢＳ−ＥＴ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０）で正規化された。試料緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌのＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン、Ｓｉｇｍａ ＃８６５２４）を補充したシステム緩衝液であった。システムは、２５℃で操作された。６５００ＲＵ−ＲＡＭのＦｃγ（Ｆｃγ断片ＲａｍＩｇＧの相対単位、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、４つ全てのフローセル上に、アミンカップリングＥＤＣ／ＮＨＳ化学を用いて、製造元の指示に従って固定化された。センサーは、１Ｍのエタノールアミンを用いて不活性化された。モノクローナル抗体は、１０μｌ／分で１分間注入することによって、センサー表面上で捕捉された（ＣＬ、捕捉レベル）。濃度依存性の反応速度が測定された。分析物ＨＥＲ−１−ＥＣＤ、ＨＥＲ−２−ＥＣＤ、ＨＥＲ−３−ＥＣＤ、ＨＥＲ−４−ＥＣＤ、Ｔ．Ｔ．ＳｌｙＤ−ｃｙｓＨｅｒ３及びＴ．Ｔ．ＳｌｙＤ−ｃａｓの濃度系列は、０ｎＭ、１．１ｎＭ、３．３ｎＭ、２×１０ｎＭ、３０ｎＭ及び９０ｎｍでそれぞれ注入された。ヘレグリンβ（ＨＲＧ）は、０ｎＭ、１７ｎＭ、２ｘ５０ｎＭ、１５０ｎＭ及び４５０ｎＭで注入され、９０ｎＭのＨＥＲ−３  ＥＣＤ及び９０ｎＭのＨＥＲ−４  ＥＣＤは、ＨＲＧβの５倍過剰と共に２時間レインキュベートされ、０ｎＭ、１．１ｎＭ、３．３ｎＭ、２ｘ１０ｎＭ、３０ｎＭ及び９０ｎＭのＨＥＲ濃度のステップで注入された。全ての分析物は、１００μｌ／分の流速で５分間の会合時間と１０分間の解離時間で注入された。センサー捕捉システムは、１０ｍＭのグリシンｐＨ１．７で、１０μｌ／分で３分間の注入によって再生された。可能であれば、速度論的データは、ビアコアＴ２００評価ソフトウェアを用いて評価された。ＨＥＲ−３−ＥＣＤ、ＨＥＲ−４−ＥＣＤ及びＴ．Ｔ．ＳｌｙＤ−ｃｙｓＨｅｒ３の速度論は、ラングミュアフィッティングモデルを用いて評価した。ＨＥＲ−３−ＥＣＤ−ＨＲＧ及びＨＥＲ−４−ＥＣＤ−ＨＲＧの速度論は、ラングミュアフィッティングモデルに従って評価した。
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【０２９０】
実施例４
抗ＨＥＲ３抗体Ｍ−０５−７４のエピトープマッピングと作用機序の分析
ユニークなエピトープ（ＨＥＲ３及びＨＥＲ４のβヘアピン）を有するＭ−０５−７４
ビアコア２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）装置は、アクセス可能なエピトープクローンの培養上清を、それらの結合特異性について評価するために使用された。ＣＭ５センサーをシステムに装着し、製造業者の指示に従ってＨＢＳ−ＥＴ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０）で正規化した。試料緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌのＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン、Ｓｉｇｍａ）を補充したシステム緩衝液であった。システムは、３７℃で操作された。１００００ＲＵ−ＲＡＭのＦｃγ（Ｆｃγ断片ウサギ抗マウスＩｇＧ／ジャクソン研究所の相対単位）は、４つ全てのフローセル上に、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を用いて、製造元の指示に従って固定化された。センサーは、１Ｍのエタノールアミンを用いて不活性化された。
【０２９１】
１０μｌ／分の流速で、５０ｎＭの抗ＨＥＲ３  Ｍ−０５−７４一次抗体は、全てのフローセル上で１分間捕捉された。流速は３０μｌ／分に設定され、ＩｇＧをブロッキング溶液（５０μｇ／ｍｌのＩｇＧの（２０：２：１のＩｇＧ１−Ｆｃγ、ＩｇＧ２ａ−Ｆｃγ、ＩｇＧ２ｂ）、Ｒｏｃｈｅ）を５分間注入した。抗原のＨｅｒ−３  ＥＣＤは、３分間１．５μＭで注入された。
【０２９２】
その後、１００ｎＭの各抗ＨＥＲ３二次抗体（ａ）Ｍ−０５−７４、ｂ）国際公開第９７／３５８８５号からの８Ｂ８（図ではＧＴと命名、ｃ）ＨＥＲ３のドメインＩＶに結合するＭ−２０８、及びｄ）Ｍ−０８−１１；ＨＥＲ４  ＥＣＤ及びＨＥＲ４のβヘアピン交差反応性を持たない別のＨＥＲ３のβヘアピンバインダー）が３０μｌ／分で３分間注入された。センサー表面の酸性再生は、６０秒間、３０μｌで、１０ｍＭのグリシンｐＨ１．７の３回の連続注射を使用して達成された。
【０２９３】
測定のノイズは、すでに解離している一次性Ｍ−０５−７４を再飽和させる二次性Ｍ−０５−７４注入の再結合によって定義される。実験は、二次性Ｍ−２０８のシグナルは、Ｍ−０５−７４の存在下で完全にＨｅｒ−３  ＥＣＤを飽和するので、Ｍ−２０８及びＭ−０５−７４は、Ｈｅｒ−３  ＥＣＤ上の別個のエピトープを占有することを示した（図８を参照）。Ｍ−０８−１１の結合は、Ｍ−０５−７４の存在によって完全にブロックされる。Ｍ−０８−１１の二次性シグナルはノイズの更に下にある。それにもかかわらず、Ｍ−０８−１１は、ヒトＨＥＲ４  ＥＣＤ及びＨＥＲ４のβヘアピンに結合しないので、Ｍ−０８−１１は、Ｍ−０５−７４とは異なるエピトープに結合する。（また、以下の、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４のβヘアピンによる正確なエピトープマッピングデータも参照）。８Ｂ８（＝ＧＴ）二次抗体は、Ｍ−０５−７４の存在下で、ノイズの上にある有意なシグナルを生成する。従って、８Ｂ８（＝ＧＴ）抗体は、Ｍ−０５−７４及びＭ−０８−１１以外の別のエピトープに結合する。
【０２９４】
ユニークなエピトープと作用機序を持つＭ−０５−７４
ビアコアＢ３０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、Ｈｅｒ−３  ＥＣＤの「閉じた」コンホメーションと「開いた」ヘレグリン活性化Ｈｅｒ−３  ＥＣＤに対して、クローン培養Ｍ−０５−７４及び抗体８Ｂ８（国際公開第９７／３５８８５号、図中でＧＴと命名）を速度論的に評価するために使用された。ＣＭ５シリーズセンサーをシステムに装着し、製造業者の指示に従ってＨＢＳ−ＥＴ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０）で正規化した。試料緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌのＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン）を補充したシステム緩衝液であった。システムは、２５℃で操作された。１００００ＲＵ−ＲＡＭのＦｃγ（Ｆｃγ断片ウサギ抗マウスＩｇＧ／ジャクソン研究所の相対単位）は、全てのフローセル上に、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を用いて、製造元の指示に従って固定化された。センサーは、１Ｍのエタノールアミンを用いて不活性化された。溶液中の分析物は、２分間、０ｎＭ、１．１ｎＭ、３．７ｎＭ、１１．１ｎＭ、３３．１ｎＭ及び９０ｎＭの異なる濃度のステップで注入した。解離は５分間モニターされた。センサー表面の酸性再生は、６０秒間、３０μｌで、１０ｍＭのグリシンｐＨ１．７の３回の連続注射を使用して達成された。速度論的データは、ラングミュアフィットに従って評価された。
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【０２９５】
上記の表には、抗体クローンＭ−０５−７４及び抗体８Ｂ８の速度論的データが一覧される。Ｍ−０５−７４は、高い機能性のＭＲ＝０．８を持つヘレグリン活性化のＨｅｒ−３  ＥＣＤに結合する。Ｍ−０５−７４はヘレグリントラップとして機能する。（実施例３ｂと図７のビアコアセンサーグラムの図も参照）。
【０２９６】
ｔ１／２ ｄｉｓｓ＝０．８分を有する８Ｂ８抗体の複合体の安定性は弱い。８Ｂ８は、ＭＲ＝０．４で結合する。８Ｂ８抗体及びヘレグリン解離の分離された解離相は同定することはできない。ヘレグリンは、８Ｂ８のように、同じ時間枠内で及び同じ速度で完全に解離する。８Ｂ８抗体は、ヘレグリン解離を遅延させない。
【０２９７】
Ｍ−０５−７４は、配列番号１のＨＥＲ３のβヘアピンを含むサーマス・サーモフィラスのＳｌｙＤ  ＦＫＢＰ−Ｈｅｒ３に機能的にＫＤ＝２７ｎＭで結合する（ＭＲ＝１．５）。抗体８Ｂ８は、サーマス・サーモフィラスのＳｌｙＤ  ＦＫＢＰ  ＨＥＲ−３融合ポリペプチドを含むＨＥＲ３のβヘアピンに結合しないので、この抗体は、Ｍ−０５−７４以外の別のエピトープを標的としている。
【０２９８】
図９は、異なる結合の作用機序を示す、抗ＨＥＲ３／ＨＥＲ４抗体Ｍ−０５−７４、抗ＨＥＲ３抗体Ｍ−０８−１１及び抗ＨＥＲ３抗体８Ｂ８（国際公開第９７／３５８８５号から）のビアコアセンサーグラムの重ね合わせプロットである。抗ＨＥＲ３／ＨＥＲ４抗体Ｍ−０５−７４は、ヘレグリン活性化Ｈｅｒ−３  ＥＣＤ（１）をｔ１／２ ｄｉｓｓ＝１８分でトラップし、ヘレグリン・シンクとして機能する。抗ＨＥＲ３抗体Ｍ−０８−１１  ＨＥＲ３（ＨＥＲ４  ＥＣＤ及びＨＥＲ４のβヘアピン交差反応性を持たないβヘアピンバインダー）は、ヘレグリン解離を遅延させ（２）、複雑な二状態の動態を生みだす。８Ｂ８抗体（３）は、ヘレグリンをトラップせず、また、Ｈｅｒ−３  ＥＣＤ／ヘレグリン複合体からのヘレグリン解離を遅延させない。それは完全なラングミュア相互作用であるため、ヘレグリン／Ｈｅｒ−３  ＥＣＤ複合体は、８Ｂ８抗体からのインタクトな複合体として、迅速かつ完全に解離する。
【０２９９】
図１０では、これらの結合の作用機序のスキームが示されている。１：Ｍ−０８−１１はヘレグリン活性化Ｈｅｒ−３  ＥＣＤに結合し、遅延したヘレグリン解離を誘導し、それによってＭ−０８−１１はＨｅｒ−３  ＥＣＤ受容体複合体に留まることになる。２：Ｍ−０５−７４はヘレグリン活性化Ｈｅｒ−３  ＥＣＤに結合する。ヘレグリンは、複合体にトラップされ、抗体は、複合体のままである：３：８Ｂ８はヘレグリン活性化Ｈｅｒ−３  ＥＣＤに結合する。複合体全体は、抗体から解離する。
【０３００】
ペプチドベースの２Ｄエピトープマッピング
別の実施態様において、ＣｅｌｌｕＳｐｏｔｓＴＭ合成及びエピトープマッピング技術を使用してＨｅｒ−３  ＥＣＤエピトープを特徴づけるために、ペプチドベースの２Ｄエピトープマッピング実験が行われた。エピトープマッピングは、ヒトＨｅｒ−１  ＥＣＤ、Ｈｅｒ−２  ＥＣＤ、Ｈｅｒ−３  ＥＣＤ及びＨｅｒ−４  ＥＣＤペプチドヘアピンの配列に対応する、重複する、固定化されたペプチド断片（長さ：１５アミノ酸）のライブラリーを用いて実施された。図１１において、エピトープマッピング及びアラニンスキャンアプローチの戦略が示される。ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）ＥＣＤ、ＨＥＲ２  ＥＣＤ、ＨＥＲ３  ＥＣＤ及びＨＥＲ４  ＥＣＤのペプチドヘアピンの配列（βヘアピン）は、それらの構造的埋め込み（構造）を含めて、調べられた。システインは、セリンによって置換された。このようなβヘアピンへの結合を介した抗体の抗体選択のために、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４のβヘアピンは、配列番号１及び配列番号２により定義される。
【０３０１】
合成された各ペプチドは、一アミノ酸だけシフトされた；すなわち、１４個のアミノ酸は、それぞれ、前及び次のペプチドと重複している。ペプチドアレイの調製のため、Ｉｎｔａｖｉｓ  ＣｅｌｌｕＳｐｏｔｓＴＭ技術を使用した。このアプローチでは、ペプチドは、合成後に溶解される変性セルロースディスク上で自動合成（Ｉｎｔａｖｉｓ  ＭｕｌｔｉＰｅｐ  ＲＳ）を用いて合成される。高分子セルロースに共有結合した個々のペプチドの溶液は、その後、コーティングされた顕微鏡スライド上にスポットされる。ＣｅｌｌｕＳｐｏｔｓＴＭ合成は、３８４ウェルの合成プレート中のアミノ変性セルロースディスク上で９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を利用して段階的に行った。各カップリングサイクルにおいては、対応するアミノ酸はＤＭＦ中のＤＩＣ／ＨＯＢｔの溶液で活性化した。カップリング工程の間、未反応のアミノ基を、無水酢酸、ジイソプロピルエチルアミン及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの混合物でキャップした。合成が完了すると、セルロースディスクを、９６ウェルプレートに移し、側鎖の脱保護のため、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジクロロメタン、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）と水との混合物で処理した。開裂溶液を除去した後、セルロースに結合したペプチドは、ＴＦＡ、ＴＦＭＳＡ、ＴＩＳ及び水の混合物に溶解され、ジイソプロピルエーテルで沈殿させ、ＤＭＳＯ中に再懸濁された。ペプチド溶液は、その後、Ｉｎｔａｖｉｓスライドスポッティングロボットを使用して、ＣｅｌｌｕＳｐｏｔｓＴＭスライド上にスポットした。
【０３０２】
エピトープ解析のために、上記のように調製したスライドをエタノールで、次にＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ；５０ｍＭトリス、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ミリモルのＫＣｌ、ｐＨ８）で洗浄し、５ｍＬの１０倍ウェスタンブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＴＢＳ中２．５ｇのスクロース、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を用いて、４℃で１６時間、ブロッキングした。スライドをＴＢＳ及び０．１％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄し、その後、環境温度で２時間、ＴＢＳ中の１μｇ／ｍＬの対応するＩＧＦ１抗体及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０と共にインキュベートし、その後ＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。検出のために、スライドは、抗ウサギ／抗マウスＨＲＰ二次抗体（ＴＢＳ−Ｔ中で１：２００００）とインキュベートし、続いて化学発光基質ルミノールとインキュベートし、ＬｕｍｉＩｍａｇｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で可視化した。ＥＬＩＳＡ陽性のスポットを定量化し、対応するペプチド配列のアサインメントを通じて、抗体結合エピトープを同定した。
【０３０３】
図１２に示すように、Ｍ−０５−７４は、アミノ酸配列ＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰ（配列番号４３）を有するＨＥＲ３  ＥＣＤエピトープ、及びＥＧＦＲ及びＨＥＲ２  ＥＣＤのヘアピンモチーフに対して検出可能なシグナルを持たない、アミノ酸配列ＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥ（配列番号４４）を有するＨＥＲ４  ＥＣＤエピトープに対する交差反応性を示す。８Ｂ８抗体では全くシグナルが検出されず、従って、８Ｂ８抗体は、ヘアピンペプチドモチーフとは異なるエピトープを標的とする。Ｍ−０８−１１は、Ｈｅｒファミリーの他のヘアピン配列に対して検出可能な交差反応性を持たない、アミノ酸配列ＰＬＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥを有するＨＥＲ３  ＥＣＤ特異的エピトープを示す。
【０３０４】
図１３では、抗ＨＥＲ３／ＨＥＲ４抗体Ｍ−０５−７４の、そのＨＥＲ３  ＥＣＤ結合エピトープＶＹＮＫＬＴＦＱＬＥＰ（配列番号４３）へ、及びＨＥＲ４  ＥＣＤ結合エピトープＶＹＮＰＴＴＦＱＬＥ（配列番号４４）への結合に最も貢献しているＡｌａスキャンによって同定されたアミノ酸は下線が引かれ／太字である。
【０３０５】
実施例５
ＨＥＲ３抗体の存在下でのＨＥＲ３−ＥＣＤに対するＨＲＧの結合（ＥＬＩＳＡ）
ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレートを、ＳＢＰタグ付きＨＥＲ３−ＥＣＤを含有する細胞培養上清とともに４℃でインキュベートした。翌日、ウェルは洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄され、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで１時間ブロックされた。洗浄緩衝液で更に３回洗浄した後、（デルフィア結合緩衝液中）４０μｌの抗体溶液を、所望の最終濃度の２倍ストック（１０−３から１０３ｎＭ、あるいは１０−４から１０２ｎＭ）として各ウェルに加えた。直ちに、４０μｌの２０ｎＭのユーロピウム標識ヘレグリンβ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ＃１００−０３）が、１０ｎＭの最終濃度を達成するために添加された。プレートを２時間室温でシェーカー上でインキュベートした。デルフィア洗浄緩衝液（Ｄｅｌｆｉａ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ）で３回洗浄した後、デルフィア増強溶液（Ｄｅｌｆｉａ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が添加され、１５分間シェーカー上でインキュベートされた（光防護されて）。最後に、プレートを、時間分解蛍光測定プロトコルを用いて、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００リーダーで測定した。Ｍ−０５−７４（図１４でＭ−０７４と命名）の結合は、プラトーが６５０のシグナルに達するまで、ＨＲＧのＨＥＲ３−ＥＣＤへの結合を促進することができる。結果を図１４に示す。
【０３０６】
実施例６
ａ）ＺＲ−７５−１細胞におけるＨＥＲ３リン酸化の阻害
アッセイは、以下のプロトコルに従ってＺＲ−７５−１細胞において行われた：細胞を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、ポリ−Ｄ−リジンを被覆した６ウェルプレートに、５００，０００細胞／ウェルで播種する。２４時間インキュベートする。吸引により培地を除去し、０．５％ＦＣＳを含む５００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ１６４０で一晩インキュベートする。０．５％ＦＣＳを含む５００μｌのＲＰＭＩ１６４０中に抗体を添加する。１時間インキュベートする。ヘレグリンベータ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ＃１００−０３））を１０分間添加する（最終濃度５００ｎｇ／ｍｌ）。細胞を溶解するため、培地を除去し、８０μｌの氷冷Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００細胞溶解緩衝液を添加し、氷上で５分間インキュベートする。１．５ｍｌの反応チューブに溶解物を移した後、４℃で１５分間１４０００ｒｐｍで遠心分離し、新鮮な反応チューブに上清を移す。ＳＤＳローディング緩衝液中で等量のタンパク質を含有する試料はＳＤＳ  ＰＡＧＥ上で分離され、ニトロセルロース膜にセミドライウエスタンブロットを使用してブロットされた。膜は１時間、１ｘＮＥＴ緩衝液＋０．２５％ゼラチンによってブロックされ、ｐＨＥＲ３は、抗体αホスホ−ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３（Ｔｙｒ１２８９）（２１Ｄ３）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃４７９１によって検出され、ＨＥＲ３は抗体αＥｒｂＢ３（Ｃ−１７）はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、＃ｓｃ−２８５によってそれぞれ検出される。洗浄及びＰＯＤ結合二次抗体によるシグナルの検出後、バンドは密度的にスキャンされた。ｚｒ−７５−１細胞における受容体リン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体Ｍ−０５−７４の阻害の割合（％）は以下の表７に示される。
2020114221.tif 000012
【０３０７】
ｂ）二価親Ｍ−０５−７４及びＭ−０５−７４のＦａｂ断片（Ｆａｂ−７４）のＨＥＲ３リン酸化の阻害
ＭＣＦ−７細胞を２４ウェルプレートに播種し（１ｍｌのＲＰＭＩ、１０％のＦＣＳ、ウェル当たり３×１０５細胞）、一晩３７℃／５％のＣＯ２でインキュベートした。２４時間後、培地を、０．５％ＦＣＳを含有する１ｍｌの培地と交換した。４８時間後、抗体は、１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ及び０．１μｇ／ｍｌ（Ｍ−０５−７４）及び６．６６μｇ／ｍｌ、０．６６μｇ／ｍｌ及び０．０６６μｇ／ｍｌ（Ｆａｂ−０７４）の最終濃度まで添加された。プレートを５０分間３７℃でインキュベートし、次いで、ヘレグリンβ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ＃１００−０３）が、５００ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで添加された。プレートを３７℃／５％ＣＯ２で更に１０分間インキュベートした。細胞はＰＢＳで洗浄し、アプロチニン（１０μｇ／ｍｌ）、オルトバナジウム酸（０．４ｍＭ）、フッ化フェニルメチル（１ｍＭ）を含む、４０μｌのトリトン溶解緩衝液（１％トリトン）で溶解した。収集された溶解物の２６μｌが反応チューブに移され、１４μｌの試料緩衝液（ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料緩衝液  ４ｘ、ＮｕＰＡＧＥ試料還元剤  １０ｘ）が添加された。試料は７０℃で１０分間インキュベートされ、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ、４−１２％のビス−トリス−ミニゲル）によって分析された。エレクトロブロッティングはｉＢｌｏｔドライブロッティングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行われた。ニトロセルロース膜は、ホスホＨＥＲ３抗体（α Ｐｈｏｓｐｈｏ Ｈｅｒ３、Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＃４７９１、Ｒａｂｂｉｔ １：１０００）とインキュベートされ、その後、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（ヤギ抗ウサギ１：５０００、ＢｉｏＲａｄカタログ：１７０−６５１５）とのインキュベーションが続いた。シグナルは、Ｘ線フィルム（ロシュルミフィルム化学発光検出フィルム１１６６６６５７００１）上でＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＲＰＮ２２０９）を使用して現像された。抗ＨＥＲ３抗体Ｍ−０５−７４（ハイブリドーマから精製された全長）と（全長のＭ−０５−７４からパパイン切断で得られた）抗体Ｆａｂ−７４のＦａｂ断片が等モル量で検討された。Ｆａｂ断片は、抗体のパパイン消化によって生成された。簡潔には、約２ｍｇ／ｍｌの抗体を含む溶液１ｍｌに、２５ｍＭのシステインと７０μｇのパパイン（Ｒｏｃｈｅ）が補充された。１．５時間３７℃でインキュベートした後、消化反応は、ヨードアセトアミドの添加により停止され、反応混合物はＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製された。Ｆａｂ含有フロースルー画分が、更にサイズ排除クロマトグラフィーによって精製された（スーパーデックス２００；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。
【０３０８】
ＭＣＦ７細胞における受容体リン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体のパーセント（％）阻害を以下及び表８に要約する。抗体Ｍ−０５−７４（ハイブリドーマからの全長）及びこの抗体Ｆａｂ−７４のＦａｂ断片は、等モル濃度でＨＥＲ３のリン酸化を同等程度に阻害することができる。
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【０３０９】
実施例７
ＭＣＦ７細胞におけるＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体の阻害（免疫沈降及びウエスタンブロット）
ＭＣＦ−７細胞を６ウェルプレートに播種し（２ｍｌのＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ、ウェルあたり８ｘ１０５細胞）、一晩増殖させた。翌日に、培地は０．５％のＦＣＳを含有する２ｍｌの飢餓培地により交換された。３日目に、抗体は１０μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加され、プレートは３７℃でインキュベートされた。５０分後、ヘレグリンβ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ＃１００−０３）が５００ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで添加され、プレートは３７℃で更に１０分間インキュベートされた。細胞はＰＢＳで洗浄され、１％ジギトニンを含有する２５０μｌのトリトン溶解緩衝液中で溶解された。収集された溶解物の６０μｌが反応チューブに移され、４０μｌの抗体結合セファロース（ハーセプチン又はＨＥＲ３抗体＃２０８の何れか）及び０．３％ジギトニンを含有する５００μｌの緩衝液と共にインキュベートされた。反応混合物は、４℃で一晩ホイール回転装置上でインキュベートされた。翌日、反応混合物は、０．３％ジギトニンを含有する５００μｌの緩衝液で３回洗浄された。最後の洗浄後、上清は捨てられ、１０μｌの４Ｘローディング緩衝液が添加された。チューブは７０℃で１０分間インキュベートされ、上清は、結果としてＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のゲルにロードされた。次のセミドライウエスタンブロットの後、ＨＥＲ２抗体で免疫沈降した試料を含む膜は、抗ＨＥＲ３／ＨＥＲ４抗体Ｍ−０５−７４（図１５のＭ−０７４）でインキュベートされ、逆も同様であった。次いで、膜はＨＲＰコンジュゲート二次抗体と共にインキュベートされ、ＥＣＬシグナルはＸ線フィルム上に転写された。結果は、図１５に示され、Ｍ−０５−７４によるＨＥＲ２／ＨＥＲヘテロ二量体形成（ＨＥＲ２／ＨＥＲヘテロ二量体化）の強い阻害を示している。
【０３１０】
実施例８
ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞におけるＭ−０５−７４の腫瘍細胞増殖の阻害。
ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞（ＶＩＩヒト乳がん細胞、ＡＴＣＣのカタログ番号ＨＴＢ−２５）を用いた、細胞増殖アッセイにおけるＨＥＲ３抗体Ｍ−０５−７４の抗腫瘍効果が評価された。ウェルあたり２０，０００細胞が、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２細胞培地を含む滅菌９６ウェル組織培養プレートに播種され、一日５％±１％のＣＯ２によって、３７℃±１℃でインキュベートされた。細胞は、約３日間の倍増時間を持つ、低速増殖細胞である。抗ＨＥＲ３抗体は、希釈系列で添加され、更に６日間インキュベートされた。細胞生存率は、その後、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）の読み出しを使用して評価された。ＥＣ５０値が算出された。
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【０３１１】
実施例９
抗ＨＥＲ３抗体Ｍ−０５−７４のインビボでの抗腫瘍効果
抗ＨＥＲ３抗体Ｍ−０５−７４（Ｍ−０７４）のインビボでの抗腫瘍効果は、ＳＣＩＤベージュに移植された様々な腫瘍起源（例えば、ＳＣＣＨＮ及び膵臓がん）の細胞ベースのモデルで検出することができた。例として、データは、ＳＣＣＨＮ異種移植モデルのＦａＤｕ（細胞株に基づく）について示される。
【０３１２】
試験薬剤
Ｍ−０５−７４は、発現され、ハイブリドーマ細胞から精製され、Ｒｏｃｈｅ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙからストック溶液として提供された。抗体緩衝液はヒスチジンを含んでいた。抗体溶液は、注射前に、ストックから緩衝液中に適切に希釈された。
【０３１３】
細胞株及び培養条件
ＦａＤｕヒトＨＮＳＣＣ細胞は元々はＡＴＣＣから入手した。腫瘍細胞株は、規定通りに、５％ＣＯ２で水飽和した大気中３７℃で、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び０．１ｍＭのＮＥＡＡを補充したＭＥＭイーグル培地中で培養された。培養継代は、３日ごとにトリプシン／ＥＤＴＡ  １×分割により行った。
【０３１４】
動物
メスのＳＣＩＤベージュマウス又はヌードマウスは、ブリーダー（例えば、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入され、確約されたガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、特定の病原体フリーの条件下で、１２時間明所／１２時間暗所の日々のサイクルで維持された。実験研究プロトコルはレビューされ、地方政府によって承認された。到着後、動物は、新しい環境に慣れるため、及び観察のために、１週間動物施設の検疫部で維持された。連続的な健康モニタリングを定期的に行った。規制食（Ｐｒｏｖｉｍｉ  Ｋｌｉｂａ  ３３３７）及び水（ｐＨ２．５−３に酸性化）が自由に与えられた。
【０３１５】
動物は、臨床症状や副作用の検出のために毎日管理された。実験を通して監視するため、動物の体重が記録された。
【０３１６】
動物の処置は、細胞移植後の動物の無作為化後に、腫瘍サイズの中央値が約１００−１５０ｍｍ３であるときに開始された。抗体は、モデルによっては数週間にわたって毎週１回（ｑ７ｄ）、１０ｍｇ／ｋｇで腹腔に投与された。対応するビヒクルは同日に投与された。
【０３１７】
ＨＮＳＣＣのＦａＤｕ異種移植片担持マウスは、試験日の１０日目から２４日目に抗体Ｍ−０５−７４で処置された。その結果、Ｈ−７４抗体による処置は、皮下のＦａＤｕ異種移植片の腫瘍がほぼ静止し、有意な抗腫瘍効果を示した。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は８９％と計算された。
【０３１８】
Ｍ−０５−７４による処置（１０ｍｇ／ｋｇでｑ７ｄｘ３、腹腔内）は、ＦａＤｕの腫瘍のほとんどの静止をもたらした。結果は図１７に示され、ここではＭ−０５−７４はＭ−０７４と命名される。
【０３１９】
実施例１０
Ｍ−０５−７４−Ｆａｓ−シュードモナス外毒素コンジュゲートの生成（Ｍ−０５−７４−ＰＥ）
Ｍ−０５−７４のＦａｂ断片、ＰＥ２４変異体、及び配列番号４５、４６、４７、４８（又は４９）の配列に基づいたシュードモナス外毒素変異体ＰＥ２４ＬＲ８ＭにコンジュゲートしたＭ−０５−７４のＦａｂ断片の発現、精製及び再生。
【０３２０】
Ｆａｂの発現（例えば、ソルターゼカップリングのため）−発現ベクター
記載されたＦａｂ断片の発現のため、ＣＭＶイントロンＡプロモーターを含む又は含まないｃＤＮＡ構成、又はＣＭＶプロモーターを含むゲノム構成の何れかに基づいた一過性発現（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ）細胞のための発現プラスミドの変異体が適用された。
【０３２１】
抗体発現カセットの他に、ベクターは以下を含む：
−  大腸菌でこのプラスミドの複製を可能にする複製起点、及び
−  大腸菌においてアンピシリン耐性を付与する、β−ラクタマーゼ遺伝子
【０３２２】
抗体遺伝子の転写ユニットは、以下の要素で構成された：
−  ５’末端におけるユニークな制限酵素部位（複数可）
−  ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−  ｃＤＮＡ構成の場合には続いてイントロンＡの配列、
−  ヒト抗体遺伝子の５’非翻訳領域、
−  免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−  ｃＤＮＡ、又は免疫グロブリンエキソン−イントロン構成の何れかとしてのヒト抗体鎖、
−  ポリアデニル化シグナル配列を有する３’非翻訳領域、及び
−  ３’末端におけるユニークな制限酵素部位（複数可）。
【０３２３】
以下に記載する抗体鎖を含む融合遺伝子がＰＣＲ及び／又は遺伝子合成によって生成され、既知の組換え法及び係る核酸セグメントの連結による、例えば各ベクター中のユニークな制限部位を使用した技術によって構築された。サブクローニングした核酸配列をＤＮＡ配列決定により確認した。一過性トランスフェクションのために、大量のプラスミドが、形質転換された大腸菌培養物（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＡＸ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）からのプラスミド調製により調製された。
【０３２４】
細胞培養技術
Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.に記載のように標準的な細胞培養技術を使用した。
【０３２５】
Ｆａｂ断片は、以下に説明するように懸濁液中で増殖しているＨＥＫ２９−Ｆ細胞中で、重鎖及び軽鎖の発現プラスミドの一過性同時トランスフェクションにより発現された。
【０３２６】
ＨＥＫ２９３−Ｆシステムにおける一過性トランスフェクション
Ｆａｂ断片は、各プラスミド（例えば、重鎖及び修飾重鎖、並びに対応する軽鎖と修飾型軽鎖をコードする）により、製造業者の指示に従ってＨＥＫ２９３−Ｆシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、一過性トランスフェクションにより作製された。簡潔には、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の振盪フラスコ内又は攪拌発酵槽内の何れかの懸濁液中で増殖するＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が、４つの発現プラスミドと２９３−ＦｒｅｅＴＭ（Ｎｏｖａｇｅｎ）又はフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）との混合物によりトランスフェクトされた。２Ｌの振盪フラスコの場合（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を、６００ｍｌ中に１．０Ｅ＊６細胞／ｍＬの密度で播種し、８％ＣＯ２で１２０ｒｐｍでインキュベートした。翌日、細胞は、Ａ）重鎖又は修飾型重鎖のそれぞれ及びその対応する軽鎖を等モル比でコードする計６００μｇのプラスミドＤＮＡ（１μｇ／ｍＬ）を含む２０ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＢ）２０ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ＋１．２ｍＬの２９３−Ｆｒｅｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）又はフェクチン（２μＬ／ｍＬ）の約４２ｍＬの混合物を用いて、約１．５Ｅ＊６細胞／ｍＬの細胞密度でトランスフェクトされた。グルコース消費に応じて、グルコース溶液が発酵の過程で添加された。分泌された抗体を含む上清を５−１０日後に回収し、抗体が直接上清から精製されたか又は上清は凍結保存された。
【０３２７】
ソルターゼカップリング−発現ベクターのためのシュードモナス外毒素変異体ＰＥ２４−ＬＲ８Ｍの発現
ＰＥ２４−ＬＲ８Ｍの発現のため、大腸菌発現プラスミドを使用した。
【０３２８】
シュードモナス外毒素ＡドメインＩＩＩのための発現カセットの他、ベクターは以下を含む：
−   大腸菌での複製のためのベクターｐＢＲ３２２由来の複製起点（Sutcliffe, G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90による）、
−   大腸菌からのｌａｃＩリプレッサー遺伝子（Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769）、
−  大腸菌のｐｙｒＦ欠失株（ウラシル要求性）の相補性により、プラスミドの選択を可能にする、オロチジン５’−リン酸脱炭酸酵素をコードするサッカロマイセス・セレビシエのＵＲＡ３遺伝子（Rose, M. et al. Gene 29 (1984) 113-124）。
【０３２９】
毒素遺伝子の転写ユニットは、以下の要素で構成された：
−  ５’末端におけるユニークな制限酵素部位（複数可）、
−  Ｓｔｕｅｂｅｒ、Ｄらによる合成リボソーム結合部位を含む、Ｔ５ハイブリッドプロモーター（Bujard, H., et al. Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433 and Stueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152によるＴ５−ＰＮ２５／０３／０４ハイブリッドプロモーター）（前を参照）、
−  Ｎ末端結合タグ続いてフリン部位を伴うシュードモナス外毒素ＡドメインＩＩＩ（ソルターゼカップリングのためのＧＧＧリンカーを含む、配列番号４５のシュードモナス外毒素変異体ＰＥ２４ＬＲ８Ｍ＿３Ｇ）、
−  ２つのバクテリオファージ由来の転写ターミネーター、λ−Ｔ０ターミネーター（Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414) 及びfd-ターミネーター (Beck E. and Zink, B. Gene 1-3 (1981) 35-58）、
−  ３’末端におけるユニークな制限酵素部位（複数可）。
【０３３０】
化学的に定義された培地における大腸菌流加プロセスにおける、シュードモナス外毒素Ａコンストラクト変異体ＰＥ２４−ＬＲ８Ｍ＿３Ｇの発現及び培養
ＰＥ２４−ＬＲ８Ｍ＿３Ｇ＿Ｅｃｏｌｉ（２５ｋＤａ）の発現のために、大腸菌の栄養要求性（ＰｙｒＦ）の相補性により、抗生物質無しのプラスミド選択を可能にする大腸菌の宿主／ベクター系が使用された（欧州特許第０９７２８３８号及び米国特許第６２９１２４５号）。
【０３３１】
大腸菌Ｋ１２株は、発現プラスミドで電気穿孔により形質転換された。形質転換された大腸菌細胞は、最初に寒天プレート上で３７℃で増殖された。このプレートから採取されたコロニーを３ｍＬのローラー培地に移し、３７℃で１−２の光学密度まで（５７８ｎｍで測定）増殖させた。次いで、１０００μｌの培養物を１０００μｌの滅菌８６％−グリセロールと混合し、直ちに長期保存のために−８０℃で凍結された。このクローンの生成物の正確な発現は最初に小規模振盪フラスコ実験で検証され、１０Ｌの発酵槽に移送する前に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された。
【０３３２】
予備培養：
予備発酵用に、化学的に定義された培地が使用されている。予備発酵用に、４つのバッフル付きの１０００ｍｌの三角フラスコ内の２２０ｍｌの培地に、初代種子バンク（ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｅｅｄ  ｂａｎｋ）アンプルのうち１．０ｍｌが播種された。培養は、２．９の光学密度（５７８ｎｍ）が得られるまで、３２℃、１７０ｒｐｍで８時間、ロータリーシェーカー上で実施された。予備培養の１００ｍｌが、１０Ｌバイオリアクターのバッチ培地に播種するために用いられた。
【０３３３】
発酵：
１０ｌのＢｉｏｓｔａｔ  Ｃ、ＤＣＵ３発酵槽（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内での発酵のために、化学的に定義バされたバッチ培地が使用された。全ての成分は脱イオン水に溶解された。ｐＨ調節のためのアルカリ溶液は、１１．２５ｇ／ｌのＬ−メチオニンを補充した水性の１２．５％（ｗ／ｖ）ＮＨ３溶液であった。
【０３３４】
４．２リットルの滅菌バッチ培地と予備培養からの１００ｍｌの播種物で開始し、バッチ発酵は、３１℃、ｐＨ６．９±０．２、８００ｍｂａｒの背圧、及び１０ｌ／分の初期通気速度で行われた。溶解酸素の相対値（ｐＯ２）は、攪拌速度を１５００ｒｐｍまで増加させることにより、発酵を通じて５０％に維持された。溶解酸素値の急な増加によって示される、最初に補充したグルコースが枯渇した後、温度は２５℃にシフトされ、１５分後、発酵は、両方の供給の開始と共に（それぞれ６０ｇ／ｈと１４ｇ／ｈ）流加モードに入った。供給２の速度は、一定に保たれるが、供給１の速度は、事前に定義された供給プロファイルを使用して、７時間以内に６０ｇ／ｈから最終的に１６０ｇ／ｈまで段階的に増加された。二酸化炭素排ガス濃度が２％を上回るとき、通気速度は、５時間以内に１０ｌから２０ｌ／分まで一定に増加された。組換えＰＥ２４−ＬＲ８Ｍ＿３Ｇ＿Ｅｃｏｌｉタンパク質の発現は、光学密度が約１２０で２．４ｇのＩＰＴＧの添加によって誘導された。標的タンパク質は、細胞質内で可溶性で発現される。
【０３３５】
培養の２４時間後、光学密度２０９が達成され、全ブロスは４−８℃に冷却される。細菌は、フロースルー遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１３ｌ／ｈ）により遠心分離により回収され、得られたバイオマスは、更なる処理（細胞破壊）まで−２０℃で保存される。収量は、リットル当たり６７．５ｇの乾燥細胞である。
【０３３６】
生成物形成の分析：
発酵槽から取り出された試料、一つは誘導の前、他方はタンパク質の発現の時点のものが、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析された。全ての試料から同量の細胞が（ＯＤＴａｒｇｅｔ＝１０）、５ｍＬのＰＢＳ緩衝液中に懸濁させ、氷上で超音波処理を経て破壊された。次に、各懸濁液の１００μＬが（１５，０００ｒｐｍで５分間）遠心分離され、各上清は回収され別のバイアルに移された。これは、可溶性及び不溶性の発現された標的タンパク質とを区別することである。各上清（＝可溶性タンパク質画分）１００μｌと各ペレット（＝不溶性タンパク質画分）２００μＬに、ＳＤＳ試料緩衝液（Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685）が添加された。試料は可溶化され、試料中の全てのタンパク質を可用化し還元するため、９５℃での激しい混合下１５分間加熱された。室温に冷却した後、各試料の５μＬが、４−２０％ＴＧＸＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｓｔａｉｎ  Ｆｒｅｅポリアクリルアミドゲルに移された（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。更に、５μｌの分子量標準物質（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）が適用された。
【０３３７】
電気泳動は２００Ｖで６０分間行われ、その後、ゲルはＧｅｌＤＯＣ  ＥＺ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移され、ＵＶ照射で５分間処理された。ゲルの画像は、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ分析ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて分析された。タンパク質発現の相対的定量化は、分子量標準物質の２５ｋＤａバンドの体積に対して生成物バンドの量を比較することによって行われた。
【０３３８】
化学的に定義された培地上での大腸菌流加プロセスにおけるシュードモナス外毒素Ａ変異体融合体（Ｆａｂ−ＰＥ２４）の抗体断片の軽鎖コンストラクト（ＶＬ）及び抗体断片の重鎖の発現及び培養
Ｆａｂ−軽鎖（２３．４ｋＤａ）及びＦａｂ−重鎖ＰＥ２４融合体（４８．７ｋＤａ）の発現のために、大腸菌の栄養要求性（ＰｙｒＦ）の相補性により、抗生物質無しのプラスミド選択を可能にする大腸菌の宿主／ベクター系が使用された（欧州特許第０９７２８３８号及び米国特許第６２９１２４５号）。
【０３３９】
大腸菌Ｋ１２株は、それぞれの発現プラスミドで電気穿孔により形質転換された。形質転換された大腸菌細胞は、最初に寒天プレート上で３７℃で増殖された。それぞれの形質転換のために、このプレートから採取されたコロニーは３ｍＬのローラー培地に移され、３７℃で１−２の光学密度まで（５７８ｎｍで測定）増殖された。次いで、１０００μｌの培養物を１０００μｌの滅菌８６％−グリセロールと混合し、直ちに長期保存のために−８０℃で凍結された。これらのクローンの生成物の正確な発現は最初に小規模振盪フラスコ実験で検証され、１０Ｌの発酵槽に移送する前に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された。
【０３４０】
予備培養：
予備発酵用に、化学的に定義された培地が使用されている。予備発酵用に、４つのバッフル付きの１０００ｍｌの三角フラスコ内の２２０ｍｌの培地に、初代種子バンク（ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｅｅｄ  ｂａｎｋ）アンプルのうち１．０ｍｌが播種された。培養は、７から８の光学密度（５７８ｎｍ）が得られるまで、３７℃、１７０ｒｐｍで９時間、ロータリーシェーカー上で実施された。予備培養の１００ｍｌが、１０Ｌバイオリアクターのバッチ培地に播種するために用いられた。
【０３４１】
発酵（ＲＣ５２＃００３）：
１０ｌのＢｉｏｓｔａｔ  Ｃ、ＤＣＵ３発酵槽（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内での発酵のために、化学的に定義バされたバッチ培地が使用された。ｐＨ調節のためのアルカリ溶液は、１１．２５ｇ／ｌのＬ−メチオニンを補充した水性の１２．５％（ｗ／ｖ）ＮＨ３溶液であった。
【０３４２】
４．２リットルの滅菌バッチ培地と予備培養からの１００ｍｌの播種物で開始し、バッチ発酵は、３１℃、ｐＨ６．９±０．２、８００ｍｂａｒの背圧、及び１０ｌ／分の初期通気速度で行われた。溶解酸素の相対値（ｐＯ２）は、攪拌速度を１５００ｒｐｍまで増加させることにより、発酵を通じて５０％に維持された。溶解酸素値の急な増加によって示される、最初に補充したグルコースが枯渇した後、温度は３７℃にシフトされ、１５分後、発酵は、両方の供給の開始と共に（それぞれ６０ｇ／ｈと１４ｇ／ｈ）流加モードに入った。供給２の速度は、一定に保たれるが、供給１の速度は、事前に定義された供給プロファイルを使用して、７時間以内に６０ｇ／ｈから最終的に１６０ｇ／ｈまで段階的に増加された。二酸化炭素排ガス濃度が２％を上回るとき、通気速度は、５時間以内に１０ｌから２０ｌ／分まで一定に増加された。細胞質内に位置する不溶性の封入体としての組換え標的タンパク質の発現は、光学密度が約４０で２．４ｇのＩＰＴＧの添加によって誘導された。
【０３４３】
培養の２４時間後、光学密度１８５が達成され、全ブロスは４−８℃に冷却される。細菌は、フロースルー遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１３ｌ／ｈ）により遠心分離により回収され、得られたバイオマスは、更なる処理（細胞破壊）まで−２０℃で保存される。収量は、リットル当たり４０から６０ｍｇの間の乾燥細胞である。
【０３４４】
生成物形成の分析：
発酵槽から取り出された試料、一つは誘導の前、他方はタンパク質の発現の時点のものが、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析された。全ての試料から同量の細胞が（ＯＤＴａｒｇｅｔ＝１０）、５ｍＬのＰＢＳ緩衝液中に懸濁させ、氷上で超音波処理を経て破壊された。次に、各懸濁液の１００μＬが（１５，０００ｒｐｍで５分間）遠心分離され、各上清は回収され別のバイアルに移された。これは、可溶性及び不溶性の発現された標的タンパク質とを区別することである。各上清（＝可溶性タンパク質画分）１００μｌと各ペレット（＝不溶性タンパク質画分）２００μＬに、ＳＤＳ試料緩衝液（Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685）が添加された。試料は可溶化され、試料中の全てのタンパク質を可用化し還元するため、９５℃での激しい混合下１５分間加熱された。室温に冷却した後、各試料の５μＬが、４−２０％ＴＧＸＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｓｔａｉｎ  Ｆｒｅｅポリアクリルアミドゲルに移された（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。更に、５μｌの分子量標準物質（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）及び既知の標的タンパク質濃度（０．１μｇ／μｌ）を含む３つの量（０．３μｌ、０．６μｌ及び０．９μｌ）の定量標準物質が適用された。
【０３４５】
電気泳動は２００Ｖで６０分間行われ、その後、ゲルはＧｅｌＤＯＣ  ＥＺ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移され、ＵＶ照射で５分間処理された。ゲルの画像は、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ分析ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて分析された。３つの標準物質により、線形回帰曲線は、＞０．９９の係数を用いて計算され、元の試料中の標的タンパク質の濃度が算出された。
【０３４６】
（Ｍ−０５−７４のＦａｂ断片、ＰＥ２４変異体、及びシュードモナス外毒素変異体ＰＥ２４ＬＲ８ＭにコンジュゲートしたＭ−０５−７４のＦａｂ断片の）精製、ソルターゼカップリング及び再生
Ｆａｂ断片
Ｆａｂ断片は、製造業者の説明に従って、アフィニティークロマトグラフィーによりニッケル（ＮｉセファロースＴＭ高性能ＨｉｓＴｒａｐＴＭ）により精製した。簡潔には、上清を、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌで平衡化したカラムにロードした。タンパク質の溶出は、４ｍＭのイミダゾール及びその後に最大１００ｍＭのイミダゾールまでの勾配を含む洗浄工程により、ｐＨ７．０で、同じ緩衝液を用いて行なわれた。所望のＦａｂ断片を含む画分をプールし、２０ｍＭのＨｉｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０に対して透析された。
【０３４７】
ソルターゼカップリングのためのＰＥ２４
ＰＥ２４を発現する大腸菌細胞は、２０ｍＭのトリス、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨは８．０＋コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル錠（Ｒｏｃｈｅ）中で高圧ホモジナイゼーションにより溶解された（詳細が必要な場合：Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｓｃｈａｎｔｚ）。溶解物は濾過され、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４中で平衡化したＱセファロースＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードされた。タンパク質は、同じ緩衝液中で最大５００ｍＭのＮａＣｌまでの勾配により溶出された。ＰＥ２４含有画分はＳＤＳ  ＰＡＧＥにより同定された。組み合わされたプールは濃縮され、２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で平衡化されたＨｉＬｏａｄＴＭ ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ７５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用された。ＰＥ２４を含む画分はＳＤＳ  ＰＡＧＥに従ってプールされ、−８０℃で凍結された。
【０３４８】
ＰＥ２４へのＦａｂ断片のソルターゼカップリング
Ｆａｂ断片及びＰＥ２４は、アミコン（登録商標）ウルトラ４遠心分離フィルター装置（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５へ別々に透析濾過され、５−１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮された。タンパク質及びソルターゼの両方が１：１：０．８で混合された。３７℃で１時間インキュベートした後、混合物は、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ中で平衡化されたＮｉ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｍａｎｃｅ  ＨｉｓＴｒａｐＴＭにロードされた。溶出液は、同じ緩衝液中で最大１００ｍＭのイミダゾールまでの勾配により溶出された。最終生成物のＦａｂ−ＰＥ２４を含むフロースルー画分は濃縮され、２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中でＨｉＬｏａｄＴＭＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードされた。所望の結合タンパク質を含有する画分がプールされ、−８０℃で保存された。ソルターゼとして可溶性黄色ブドウ球菌のソルターゼＡ、が使用された（配列番号５０）。可溶性黄色ブドウ球菌ソルターゼＡは、以下の発現プラスミドを用いて発現され精製された。ソルターゼ遺伝子は、Ｎ末端切断型黄色ブドウ球菌ソルターゼＡ（２０ー２０６）分子をコードする。ＨＥＫ２９３細胞における可溶性ソルターゼの一過性発現のための発現プラスミドは、可溶性ソルターゼ発現カセットの他に、大腸菌においてこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、及び大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含んでいた。可溶性ソルターゼの転写ユニットは、以下の機能要素を含む：
−  イントロンＡを含む（Ｐ−ＣＭＶ）ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−  ヒト重鎖免疫グロブリンの５’-非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
−  マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−  Ｎ末端切断型黄色ブドウ球菌ソルターゼＡをコードする核酸、及び
−  ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ  ｐＡ）。
【０３４９】
大腸菌封入体から誘導されたＦａｂ−ＰＥ２４の再生
ＶＨ−ＰＥ２４及びＶＬ−ｃカッパの封入体は、８Ｍのグアニジン塩酸塩、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０＋１００ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）で別々に可溶化された。室温で１２−１６時間後、可溶化物のｐＨは３．０に調整され、遠心分離された溶液は８Ｍ塩酸グアニジン、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ３．０に対して透析された。タンパク質の濃度は、ビウレット反応によって決定され、封入体調製物の純度はＳＤＳ  ＰＡＧＥにより評価された。両鎖の等モル量は、２段階で０．５Ｍのアルギニン、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ１０＋１ｍＭのＧＳＨ／１ｍＭのＧＳＳＧへ、０．２−０．３ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈された。４−１０℃で１６時間、再生されたタンパク質は、Ｈ２Ｏで＜３ｍＳ／ｃｍに希釈され、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．４で平衡化されたＱセファロースＦＦ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードされた。溶出は、同じ緩衝液中で最大４００ｍＭのＮａＣｌへの勾配により行われた。正確な生成物を含有する画分が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により同定された。プールした画分は濃縮され、２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中又は代わりに２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０中で、ＨｉＬｏａｄＴＭ ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードされた。画分は、分析用ＳＥＣに応じて分析され、プールされ、−８０℃で保存された。
【０３５０】
配列番号４６及び４９に基づいて、Ｍ−０５−７４のＦａｂ断片の、シュードモナス外毒素変異体ＰＥ２４ＬＲ８Ｍとのイムノコンジュゲート（Ｍ−０５−７４−ＰＥ）を、組換えにより発現させ、精製され、直接ＰＥ２４ＬＲ８Ｍ融合物としても再生させることができる。
【０３５１】
実施例１１
Ｍ−０５−７４−Ｆａｂ−シュードモナス外毒素コンジュゲート（Ｍ−０５−７４−ＰＥ）による異なる腫瘍細胞株の細胞死滅
ＨＥＲ３を過剰発現するＡ５４９細胞は、白色９６ウェルプレートに播種され（平らな、透明底、ウェル当たり１×１０４細胞）、一晩ＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ）中で増殖された。翌日に、培地は５０μｌの飢餓培地（ＲＰＭＩ、０．５％ＦＣＳ）で交換された。少なくとも４時間後、５μｌのヘレグリンβ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ＃１００−０３）（ＨＲＧベータ）が５００ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで添加された。５０μｌのＦａｂ−７４−ＰＥ溶液が、１０、３．３、１．１、０．３７、０．１２、０．０４、０．０１４、０．００５及び０．００２μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加された。プレートは７２時間インキュベートされた。２４時間及び４８時間後、５μｌのヘレグリン−βが、５００ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるように再び添加された。７２時間後に、発光は、ＰｒｏｍｅｇａによるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ（カタログ＃Ｇ７５７１）を使用して、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００リーダーで測定された。ＨＲＧベータの非存在下でのＭ−０５−７４−Ｆａｂ−シュードモナス外毒素コンジュゲート（Ｍ−０５−７４−ＰＥ）のＥＣ５０値は、１，９３μｇ／ｍｌであって、その存在下では０，１３μｇ／ｍｌであった。
2020114221.tif 000015
【０３５２】
実施例１２ａ
抗ＨＥＲ３抗体Ｍ−０５−７４のヒト化変異体
類似するヒト抗体可変ドメインを検索するために、マウス抗体Ｍ−０５−７の重鎖及び軽鎖可変ドメインを使用した。各鎖について得られた２００の結果から、約半分が非ヒト供給源からのものとして拒絶された。残りのヒト抗体の全てが、ＶＨ／Ｖｌ界面に関与するフレームワーク内の重要な残基について、及びＣＤＲループ構造にとって重要である残基について分析された。可能な限り、ＶＨ／ＶＬ界面及びカノニカルループ構造にとって重要なこれらの重要な残基はヒト化変異体において維持されているが、ただし、これらの位置の一部の変化は時々含まれる。マウス抗体鎖のＣＤＲが、これらのヒト抗体のフレームワークに移植された。上位５つの移植ドメインが、以前の基準に基づいて、また更なる開発のためのイン・シリコ・スクリーンにおけるＴ細胞エピトープの結果に基づいて選択された。従って、マウスの抗ＨＥＲ３抗体Ｍ−０５−７４は、Ｍ−０５−７４の以下のヒト化変異体ＶＨ及びＶＬドメインを与えるためにヒト化された。
2020114221.tif 000016
【０３５３】
これらの５つのＶＨ及びＶＬドメインの２５の理論的に可能な組み合わせから、最も強力なバインダーを以下のように選択した：
【０３５４】
好ましい動態特性を有する＜Ｈｅｒ３＞Ｍ−０５−７４抗体の最も最適化されたヒト化変異体を見出すために、各重鎖及び軽鎖の５つの変異体を上記のように設計した。得られた配列は、ｓｃＦｖ−リボソームディスプレイコンストラクト中において全ての組み合わせ（合計２５個）で生成された。
【０３５５】
２５個のｓｃＦｖコンストラクトを、リボソームディスプレイに必要な線状の鋳型ＤＮＡを得るために、プライマーを隣接させることによって増幅した。各ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動で精製し、続いてＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｋｉｔを用いて製造業者の指示に従って抽出した。生成物のＤＮＡ濃度を測定し、全ての線状鋳型ＤＮＡの等モル混合物２００ｎｇを３７℃で６０分間のインビトロ転写／翻訳の基礎とした。使用したキットは、両方のジスルフィド結合エンハンサー（ＤＢＥ１＆２）を含むＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓインビトロタンパク質合成キット（ＮＥＢ）を含んでいた。２つの反応試料が試料あたり２倍の反応量で処理された。第１の試料は、その後のパニング工程においてビオチン化及びヘレグリン活性化標的（Ｈｅｒ３−ＥＣＤ）が含まれた。第２の試料は、パニング工程において標的タンパク質を含まない、陰性対照であった。両方の試料は同様に扱われた。転写及び翻訳後に得られた三元複合体（ｍＲＮＡ−リボソーム−ｓｃＦｖ変異体）のプールが、採用した磁性ビーズ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍ−２７０  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて４℃で３０分間プレパニング工程に供され、非特異的結合変異体を除去した。プレパニングビーズを遠心分離によって除去し、残りの三元複合体を含む上清を、調製した標的／ヘレグリン混合物に添加して、パニング工程において４℃で３０分間インキュベートした。標的／ヘレグリン複合体を、１：６のモル比で、パニング工程の前に６０分間インキュベートして、受容体ドメインの開いたコンフォメーションを得て、７４の親抗体のエピトープを露出させた。パニング反応におけるビオチン化Ｈｅｒ３−ＥＣＤの最終濃度は１００ｎＭであった。以後使用した全ての緩衝液は３００ｎＭのヘレグリンを含有していた。
【０３５６】
標的及び全ての結合三次元複合体を、標的ビオチンタグ（ｔａｑ）及び上記のストレプトアビジンビーズを介して捕捉した。捕捉のためのインキュベーション時間は４℃で２０分であった。ビーズの磁気特性を利用して、複合体は、反復されるインキュベーション及び洗浄緩衝液の除去によって洗浄することができる。弱い結合変異体を除去するために、洗浄圧力は洗浄工程にわたって増加させた。５００ｕＬの洗浄緩衝液（Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎを含む）を用いた計５回の洗浄工程がその間の磁場中で２分間の捕捉を伴って用いられた（２、４、５、５及び１分）。最終工程は、溶出工程（１０分間、４℃、１００μＬのＥＤＴＡを含有する溶出緩衝液）用の清浄な新しい反応チューブ中に残りの強い結合変異体を移し、その後遠心分離してビーズを除去するために使用された。得られた上清中のＲＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＲＮＥａｓｙ  ＲＮＡ精製キットを用いて製造者の指示に従って精製した。逆転写によって後に生成されたＤＮＡの起源を確実にするために、ＲＮＡを予めＤＮＡｓｅ消化に供した。消化（Ａｍｂｉｏｎ  ＤＮＡフリーキット）を１２ｕＬの精製ＲＮＡで開始し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＤＮａｓｅを除去した後、試料あたり３回の逆転写反応をそれぞれ１２μＬで開始し、３７℃で１時間インキュベートした。各消化ＲＮＡ試料（消化生成物）１２μＬを、最初のＰＣＲの陰性対照として使用し、ＤＮＡ痕跡の完全除去を証明した。
【０３５７】
逆転写反応の生成物を各試料についてプールし、ＤＮＡ選択プールを増幅するために５回の１００μＬのＰＣＲ反応を開始するために使用した。生成物をプールし、ゲル電気泳動（１％分取アガロースゲル及び分析用Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ  ７５００チップ、１μＬ試料容量）及びＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｋｉｔによって、製造業者のプロトコルに従って精製した。図１の得られたゲルの画像は、レーン１において選択されたコンストラクトのＤＮＡの濃縮を明らかに示し、レーン２において、陰性対照−標的を用いないパニング−については濃縮を示さない。予想通りに残りの対照も陰性である。ＤＮＡの消化は完了した（標的についてレーン３、バックグラウンドについてレーン４）。従ってレーン１において得られた全てのＤＮＡは、パニング工程で選択された結合変異体及びそれらの対応するＲＮＡに由来する。逆転写の負の対照、又はＰＣＲの陰性対照のどちらもバンドを示していない。レーン７は、精製後のプールされたＰＣＲ反応の生成物を示す。
【０３５８】
ＰＣＲ生成物を増幅して、クローニングのための十分なＤＮＡを生成した。選択プール及び発現ベクターＨｅｒ＿ｓｃＦｖ＿ｈｕＦｃ（それぞれ１μｇ）をＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（全てＮＥＢ）中のＭｆｅＩ−ＨＦ及びＮｏｔＩ−ＨＦで３７℃で１時間消化した。選択インサート及びカットベクターを最初に精製し、次いで室温で３０分間ＮＥＢクイックリガーゼと連結した。カットインサート対ベクターのモル比は５：１（２５ｎｇのカットインサート及び５０ｎｇのカットベクター）であった。ライゲーション生成物の２マイクロリットルを、ＤＨ５α（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）コンピテント細胞の５０μＬを形質転換するために直接使用した。増殖後、アンピシリン耐性（ＬＢａｍｐ）を有するＬＢプレート上に５０μＬを播種し、３７℃で１６時間インキュベートした。３４個のコロニーが５ｍＬのＬＢａｍｐ培地に３７℃で１６時間播種するために使用された。細胞を回収し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて製造者の指示に従ってＤＮＡを単離し、各試料の３００ｎｇのプラスミドＤＮＡを配列決定のためにＳｅｑｕｉｓｅｒｖｅ  ＧｍｂＨに送った。
【０３５９】
結果−＜Ｈｅｒ３＞Ｍ−０５−７４抗体の最も最適化されたヒト化変異体
配列決定の結果は、１つの特定の変異体：ＶＨ−Ａ／ＶＬ−Ｄの濃縮を示す。対応する配列は３４の試料から６回得られ、これは明らかに上記アッセイにおけるＨＥＲ−ＥＣＤに対する最も強力な結合特性を示す。
【０３６０】
また、ＶＨ−Ａ／ＶＨ−Ｂ及びＶＨ−Ａ／ＶＨ−Ｅの組合せが２回生じ、残りの低濃縮のＶＨ／ＶＬの組み合わせと比較して、ＨＥＲ３  ＥＣＤに対する幾つかの優れた結合特性を示した。
【０３６１】
驚くべきことに、全ての濃縮された変異体はＶＨ−Ａを含んでいた。結果的に、ＶＨ−Ａは、特に、好ましい組合せであるＶＨ−Ａ／ＶＬ−Ｄ、ＶＨ−Ａ／ＶＨ−Ｂ及びＶＨ−Ａ／ＶＨ−Ｅにおいて、＜Ｈｅｒ３＞Ｍ−０５−７４の全てのＨＥＲ３結合性ヒト化変異体の重要な特徴である。
【０３６２】
残りの２４個の配列は全て異なり、小さな欠損及び／又は点変異の組み合わせを特徴とした。３つの配列は完全に編集することはできず、分析されなかった。
【０３６３】
ＶＨ−Ａ／ＶＬ−Ｄ、ＶＨ−Ａ／ＶＨ−Ｂ及びＶＨ−Ａ／ＶＨ−Ｅの組み合わせの各々は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ（Ｃカッパ軽鎖定常ドメインを有する）で発現されるか又は代替的に、例えば、上記のシュードモナス外毒素（免疫毒素）との融合タンパク質として発現される。結合特性及び生物学的特性は、例えば実施例２，３，５，６，７，８，９，１１に上述されるように又は以下の実施例１３に記載されるように決定される。
【０３６４】
実施例１２ｂ
抗ＨＥＲ３抗体Ｍ−０５−７４のヒト化変異体の結合
抗ＨＥＲ３抗体Ｍ−０５−７４（実施例１２ａに記載）のヒト化変異体ＶＨ−Ａ／ＶＬ−ＤのＨＥＲ３−ＥＣＤ及びＨＥＲ４−ＥＣＤへの結合を調べるために、リガンドのヘレグリンの存在下及び非存在下で、ＳＰＲ分析をＢｉａｃｏｒｅ  ３０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて３７℃で行った（表１１）。
2020114221.tif 000017
2020114221.tif 000018
【０３６５】
抗ＨＥＲ３抗体Ｍ−０５−７４のヒト化変異体ＶＨ−Ａ／ＶＬ−Ｄは、増加したエピトープ接触性に起因して、リガンド活性化ＥＣＤ複合体に優先的に結合した。これは、ＨＥＲ３−ＥＣＤ／ＨＲＧ複合体に対してＫＤ １０ｎＭの親和性で結合した。
【０３６６】
驚くべきことに、抗ＨＥＲ３抗体Ｍ−０５−７４のヒト化変異体ＶＨ−Ａ／ＶＬ−Ｄは、親抗体Ｍ−０５−７４（（ＫＤ ４ｎＭ））と比較して、著しく減少したＨＥＲ４−ＥＣＤ／ＨＲＧ反応性（ＫＤ ２１１ｎＭ）を示し、一方そのＨＥＲ３−ＥＣＤ／ＨＲＧ反応性は保持していた（ＫＤ ７ｎＭと比較してＫＤ １０ｎＭ）。
【０３６７】
実施例１３
Ｍ−０５−７４−Ｆａｂ−シュードモナス外毒素コンジュゲート（Ｍ−０７４−ＰＥ）によるインビボでの腫瘍細胞増殖阻害
ヒトＡ４３１−Ｂ３４の非小細胞肺がん細胞株は、ヒトＨＥＲ３をコードする発現ベクターで安定的にトランスフェクトされた細胞株であり、雌のＳＣＩＤベージュマウスの右脇腹に皮下接種された（動物当たり１×１０７細胞）。
【０３６８】
腫瘍接種後２１日目に、動物は無作為化され、治療群、及び群あたり〜１１０ｍｍ３の平均腫瘍体積を生じる一のビヒクル群に割り当てられた。同日に、動物は、２サイクル（各サイクルは、Ｍ−０５−７４−Ｆａｂ−シュードモナス外毒素コンジュゲート（Ｍ−０５−７４−ＰＥ）（１．０ｍｇ／ｋｇ）による３ｑ７ｄ（隔日）からなる）、静脈注射により処置された。対照は、ビヒクル（トリス緩衝液）を投与された。２つのサイクルは、１週間の処置休止によって分けられた。
【０３６９】
原発腫瘍体積（ＴＶ）は、ＮＣＩプロトコルに従って計算され（ＴＶ＝（長さ×幅２）／２）、ここで、「長さ」及び「幅」は、ｍｍ単位での腫瘍塊の長い直径及び短い直径である（Corbett et al., 1997）。計算は、ステージ分類（腫瘍接種後２１日目）から腫瘍接種後４２日目まで実行され、値は、中央値及び第３と第１四分位点の差として定義される四分位範囲（ＩＱＲ）として記録された。
【０３７０】
処置期間中の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）のパーセンテージを計算するために、全ての処置群はそれぞれのビヒクル対照と比較された。ＴＶｄａｙ ｚは、定義された試験日（ｚ日）における個々の動物の腫瘍体積を表し、ＴＶｄａｙ ｘは、ステージ分類の日（ｘ日）における個々の動物の腫瘍体積を表す。
【０３７１】
以下の式が適用された。
2020114221.tif 000019
【０３７２】
信頼区間（ＣＩ）による、対照に対する処置の比（ＴＣＲ）の計算が、ノンパラメトリック法を用いて適用された。四分位範囲による、腫瘍体積の中央値の結果が図１９に示される。腫瘍増殖阻害は、ＴＣＲが０．５０９（ＣＩ：０．３３−０．７３４）で、Ｍ−０５−７４−Ｆａｂ−シュードモナス外毒素コンジュゲート（Ｍ−０５−７４−ＰＥ）の６６％であった。
【０３７３】
実施例１４
国際公開第２０１２／２２８１４号に記載される抗ＨＥＲ３抗体ＭＯＲ０９８２３（２）と比較した、抗体Ｍ−０５−７４（１）のＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３（配列番号１８）に対する結合。
ビアコアＴ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）はＣＭ５シリーズセンサーを備え、製造業者の指示に従って、ＨＢＳ−ＥＴ＋緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０）で正規化された。試料緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌのＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン）を補充したシステム緩衝液であった。システムは、３７℃で操作された。二重抗体捕捉システムは、センサー表面上に構築された。６５００ＲＵのｍＡｂ＜Ｍ−ＩｇＧ＞Ｒが、全てのフローセル上でＥＤＣ／ＮＨＳ化学を用いて、製造業者の指示に従って固定化された。センサーは、１Ｍのエタノールアミンを用いて不活性化された。フローセル１は、基準としての役割を果たし、抗ＴＳＨ  ＩｇＧ１抗体により１０μｌ／分で１分間捕捉された。フローセル２に、Ｍ−５−７４は、１０μｌ／分で１分間捕捉された。フローセル３には、マウス抗ヒトＦＣパン抗体が１０μｌ／分で１分間捕捉され、その後、抗ＨＥＲ３抗体Ｍ−０５−７４（１）又は抗ＨＥＲ３抗体ＭＯＲ０９８２３抗体が、１分間、１０μｌ／分で注入された。流速は６０μｌ／分に設定された。ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ３（配列番号１８）の溶液中の分析物は、５分間、０ｎＭ及び１５０ｎＭの濃度で注入され、その解離は６００秒モニターされた。センサーは、１０ｍＭのグリシン、ｐＨが１．７緩衝液による３分間、１０μｌ／分での１回の注入により完全に再生された。
【０３７４】
図２０は、ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３及び緩衝液の１５０ｎｍでの結合シグナルを示している、センサーグラム重ね合わせプロットを示す。上記の重ね合わせプロットは、抗体Ｍ−５−７４の、１５０ｎＭのＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３への結合を示している（１）。ＭＯＲ０９８２３抗体は、ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ３には結合しない（２）。（３）は、ｍＡｂ＜Ｍ−ＩｇＧ＞Ｒ捕捉表面に対するＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ３の結合シグナルのバックグランドを示している。国際公開第２０１２／２２８１４号に記載の抗ＨＥＲ３抗体ＭＯＲ０９８２３（２）は、１５０ｎＭのＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ３とのいかなる相互作用をも示さない。陽性対照抗体Ｍ−０５−７４（１）は、ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−Ｈｅｒ３に対して有意な結合を示す。１５０ｎＭのＴｔＳｌｙＤｃｙｓ（ＨＥＲ−３の挿入無し）を注入する場合、両方の抗体との相互作用は特定できなかった（データ非表示）。
【０３７５】
実施例１５
ＨＥＲ３／ＨＥＲ２二重特異性抗体ＤＩＢｘＰＥＲＴの生成並びにＨＥＲ３のベータヘアピン及びＨＥＲ２のドメインＩＩへの結合の評価
材料及び方法
組換えＤＮＡ技術
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記述されるように、標準的な方法がＤＮＡを操作するために使用された。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。
【０３７６】
遺伝子合成
所望の遺伝子合成断片は、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で指定された仕様に基づいて発注された。
【０３７７】
特異的制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接される６００−１５００ｂｐの長さの遺伝子セグメントを、示された制限部位を介してｐＵＣ発現ベクターに、例えばＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ、クローニングされた（図２２−２５）。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０３７８】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ  ＧｍｂＨ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った二本鎖配列決定により決定した。
【０３７９】
ＤＮＡ及びタンパク質配列分析及び配列データ管理
インフォマックスのベクターＮＴ１アドバンススイートバージョン１１．５．０が、配列の作成、マッピング、解析、注釈及び説明のために使用された。
【０３８０】
ＣｒｏｓｓＭａｂの設計
ＣｒｏｓｓＭａｂ技術（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、２０１１）は、異なる特異性を有する異なる親抗体の２つの重鎖及び軽鎖を１つのＩｇＧ様フォーマットに組み合わせる。２つの異なる重鎖のヘテロ二量化を促進するために、「ノブ・イン・ホール」技術が適用され、これにより、１つのより小さいアミノ酸が、１つのＣＨ３ドメイン内のより大きなアミノ酸（「ノブ」）によって交換される。第２抗体のＣＨ３ドメインにおいて、より大きなアミノ酸はより小さいアミノ酸（「ホール」）によって交換される。対応する重鎖との軽鎖の正確な同化を保証するために、１つの重鎖のＣＨ１ドメインは、各軽鎖のＣＫａｐｐａ（ＣＫ）ドメインと交換される。最終生成物は一般にＣｒｏｓｓＭａｂと呼ばれる。ここでは、Ｍ−０５−７４（ＤＩＢ−７４）抗体軽鎖（図２２）及び重鎖（図２３）が使用され、これにより、ＤＩＢ重鎖のＣＨ３ドメインに「ノブ」変異が導入された。第２の親抗体として、ペルツズマブを用いた。ここでは、軽鎖のＣＫドメイン（図２４）と重鎖のＣＨ１ドメイン（図２５）との間で交差が誘導された。ＣＨ３ドメインに、「ホール」変異が導入された。得られたＣｒｏｓｓＭａｂはＤＩＢｘＰＥＲＴと呼ばれ（配列番号６８−７１を参照）、ここでＰＥＲＴ（ペルツズマブ）の前のｘは、交差がペルツズマブ部位に導入されたことを示している（図２６）。
【０３８１】
ＤＩＢｘＰＥＲＴの発現
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞によるＤＩＢｘＰＥＲＴの発現のために、プラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって製造者の指示に従って得た。細胞はＧｉｂｃｏ（登録商標）ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３発現培地１ｍｌ当たり１．０Ｅ＋０６細胞で播種された。１リットルの細胞に、４つのプラスミド（ＣＢ０１＿ＤＩＢ−ＬＣ＿ＶＬ−ＣＫ、ＣＢ０２＿ＤＩＢ−ＨＣ＿ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３＿ｋｎｏｂ、ＮＮ２１  ｐＵＣ−Ｅｘｐ＿ｘＭａｂ＿Ｐｅｒｔｕｚｕ＿ＬＣ、ＮＮ２４  ｐＵＣ−ｘＰｅｒｔｕｚｕ−ＳＳＫＨＣ２−ＲＳＥ）のそれぞれ２２ｐｍｏｌを２９３−ＦｒｅｅＴＭトランスフェクション試薬を使用して、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。細胞を３７℃、８％ＣＯ２及び８０％の空気湿度で７日間、１５０ｒｐｍで振動させてインキュベートした（ＬａｂＴｈｅｒｍ  ＬＴ−ＸＣ、Ｋｕｅｈｎｅｒ  ＡＧ、Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ、Ｓｃｈｗｅｉｚ）。インキュベーション後、５０ｍＭのＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１ｎｇのＭｇＣｌ２（Ｍｅｒｃｋ  ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及び１０Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が添加され、細胞を３０分間インキュベートした。抗体を含有する上清を、８９０×ｇ（Ｒｏｔａｎｔａ  ４６０Ｒ、Ａｎｄｒｅａｓ  Ｈｅｔｔｉｃｈ  ＧｍｂＨ、Ｔｕｔｔｌｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で３０分間細胞をペレット化することによって回収した。精製まで、上清を−２０℃で保存した。
【０３８２】
ＤＩＢｘＰＥＲＴの精製
抗体は、ＡｋｔａＡｖａｎｔ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｕｅｎｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単離した。プロテインＡ  ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（５ｍｌ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｕｅｎｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４のシステム緩衝液で平衡化した。上清を０．２２μｍの滅菌フィルターユニットで予めろ過し、次いで流速０．９ｍｌ／分で一晩カラムに適用した。続いて、システム緩衝液を用いて流速２ｍｌ／分で非結合物質を除去した。次いで、結合した抗体を、流速１ｍｌ／分で０．１Ｍクエン酸Ｎａ ｐＨ３．７を用いてカラムから溶出させ、１ＭのＬ−アルギニン緩衝液で直接中和した。所望の画分をプールし、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により精製し、これにより緩衝液を２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０保存緩衝液中に透析した。ＤＩＢｘＰＥＲＴ最終生成物の量を、２８０ｎｍでの分光分析によって分析した。品質は、ＴＳＫ−Ｇｅｌ（登録商標）ＱＣ−ＰＡＫ  ＧＦ３０カラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００  Ｄｉｏｎｅｘ機器（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＧｍｂＨ、Ｓｃｈｗｅｒｔｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＧＰＣによって管理した（図２７Ａ及びＢ）。第２の品質管理として、４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を還元及び非還元条件下で使用した（図２７Ｃ）。還元条件によって重鎖と軽鎖との間の共有結合性ジスルフィド架橋が破壊される。
【０３８３】
ＤＩＢｘＰＥＲＴの純度及び凝集状態を評価するために、ＴＳＫ−Ｇｅｌ（登録商標）ＱＣ−ＰＡＫ  ＧＦ３０カラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分析用ＧＰＣを実施した。ＤＩＢｘＰＥＲＴを９６％の相対的ＧＰＣピーク面積で精製した（図２７Ａ）。標準曲線参照との比較により、１４５ｋＤａのモル質量を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２７Ｂ）は、非還元条件下で約１４５ｋＤａのタンパク質バンドを示した。還元条件下で重鎖と軽鎖との間のジスルフィド架橋が破壊される。従って、重鎖（約５０ｋＤａ）及び軽鎖（約２５ｋＤａ）の抗体鎖に割り当てられ得る２つのバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥに見出された（図２７Ｃ）。ＤＩＢｘＰＥＲＴ最終生成物の純度は、その後の実験及び分析に適切であった。
【０３８４】
実施例１６
ＳＰＲ分析によるＨＥＲ３／ＨＥＲ２二重特異性抗体ＤＩＢｘＰＥＲＴの動力学的特徴の決定
その平衡状態において、ＨＥＲ３−ＥＣＤは、その「閉じたコンホメーション」にあり、このことは、ヘテロ二量体化ＨＥＲ３のβヘアピンモチーフはＨＥＲ３−ＥＣＤドメインＩＶへの非共有結合性相互作用を介して係留されていることを意味している。これは、「閉じた」ＨＥＲ３コンホメーションは、特異的なＨＥＲ３ヘレグリン結合部位でのリガンドヘレグリンの結合を介して開くことができると想定される。これは、ＨＥＲ３のＥＣＤドメインＩとドメインＩＩＩによって形成されたＨＥＲ３界面で起こる。この相互作用により、ＨＥＲ３受容体が活性化され、その「開いたコンホメーション」へと移行されると考えられる。これが生じると、ＨＥＲ３のβヘアピンは記載された抗体に対して接触可能となる。この作用機序は、ビアコア実験によりインビトロでシミュレートすることができる。
【０３８５】
研究のために、親抗体ＤＩＢ−７４及びペルツズマブの動力学的特徴がＤＩＢｘＰＥＲＴによって保持された場合、ＳＰＲ分析を用いてリアルタイムデータを収集し、モノクローナル抗体を、ヘレグリン活性化ＨＥＲ３細胞外ドメイン（ＨＥＲ３−ＥＣＤ）及び構成的に開いたＨＥＲ２−ＥＣＤに対するそれらの挙動について２５℃で動力学的に評価するためにＢｉａｃｏｒｅ  Ｂ３０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が使用された。ＣＭ５シリーズセンサーをシステムに装着し、製造業者の指示に従ってＨＢＳ−ＥＴ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０）で正規化した。試料緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌのＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン、Ｓｉｇｍａ ＃８６５２４）を補充したシステム緩衝液であった。システムは、２５℃で操作された。１００００ＲＵモノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＭＡＫ＜ｈ−Ｆｃ＞Ｍ−Ｒ１０Ｚ８Ｅ９、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は４つのフローセル全てについてＥＤＣ／ＮＨＳ化学を用いて固定化された。センサーは、１Ｍのエタノールアミンを用いて不活性化された。
【０３８６】
試験した溶液中の分析物は、２７０ｎＭのヒト組換えＨＥＲ２−ＥＣＤ（６９．６ｋＤａ）及び２７０ｎＭのヒト組換えＨＥＲ３−ＥＣＤ（６８ｋＤａ）であり、これを室温で６０分間、３倍モル過剰のヒトヘレグリン１β（ＨＲＧ１β）４４ｋＤａホモ二量体タンパク質と共にインキュベートし、ＨＥＲ３−ＥＣＤ／ＨＲＧ１β複合体が得られた。溶液中の分析物は、５分間、０ｎＭ、３．３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、９０ｎＭ及び２７０ｎＭの異なる濃度の工程で注入した（図２８）。解離を１０分間モニターした。可能であればラングミュアフィットに従って、動力学的シグネチャーを評価した。
【０３８７】
ＨＥＲ２−ＥＣＤ及びＨＥＲ３−ＥＣＤ／ＨＲＧ１β複合体の両方に対するＤＩＢｘＰＥＲＴの同時結合能力を評価するために、第２のアッセイ設定が使用された。ここでは、分析物であるＨＥＲ２−ＥＣＤ（２７０ｎＭ）及びＨＥＲ３−ＥＣＤ／ＨＲＧ１β複合体（３倍過剰のＨＲＧ１βを含む２７０ｎＭのＨＥＲ３−ＥＣＤ）がその後注入されたか又はその逆であった（図２９）。会合速度及び解離速度をそれぞれ１０分間及び８分間モニターした。
【０３８８】
ＤＩＢｘＰＥＲＴは、親抗体の特異性を保持していた
ＤＩＢｘＰＥＲＴ及び親抗体である一価ＭｏＡｂフォーマットのＤＩＢ−７４及び二価ＩｇＧフォーマットのペルツズマブを、ＳＰＲ分析を用いて比較した。ＤＩＢｘＰＥＲＴは、その親抗体であるペルツズマブ及びＤＩＢ−７４の特異性を保持し、ＨＥＲ２−ＥＣＤ並びにＨＥＲ３−ＥＣＤ／ＨＲＧ１β複合体に結合した（図７）。このデータは、ＨＥＲ２−ＥＣＤに対するペルツズマブの親和性（ＫＤ１．７ｎＭ）がＤＩＢｘＰＥＲＴにおいて保持されている（ＫＤ１．６ｎＭ）ことを示している。ペルツズマブのモル比（ＭＲ＝１．３）は、ＤＩＢｘＰＥＲＴ（ＭＲ＝０．６ｎＭ）よりも２倍高かった。開いたＨＥＲ３−ＥＣＤ（ＨＥＲ３−ＥＣＤ／ＨＲＧ１β）に結合する能力もＤＩＢｘＰＥＲＴにおいて保持された。ＨＥＲ３−ＥＣＤ／ＨＲＧ１β複合体に対するＤＩＢｘＰＥＲＴの親和性（ＫＤ３．９ｎＭ）は、ＨＥＲ３−ＥＣＤ／ＨＲＧ１β複合体に対するＤＩＢ−ＭｏＡｂの親和性（ＫＤ２．１ｎＭ）に匹敵した。両方の抗体は、準化学量論的モル比がそれぞれ０．６及び０．５で結合した（表１２）。
2020114221.tif 000020
【０３８９】
可溶性ＨＥＲ２−ＥＣＤ及びＨＥＲ３−ＥＣＤ／ＨＲＧ１β複合体へのＤＩＢｘＰＥＲＴの同時結合
可溶性ＨＥＲ２−ＥＣＤ及びＨＥＲ３−ＥＣＤ／ＨＲＧ１β複合体に対するＤＩＢｘＰＥＲＴの同時結合能力を、ＳＰＲ分析を用いて評価した（図２９）。我々は、ＤＩＢｘＰＥＲＴが、既に第二の結合価（ＭＲ＝０．８）でＨＥＲ２−ＥＣＤに結合していても、ＨＥＲ３−ＥＣＤ／ＨＲＧ１β複合体に一の結合価（ＭＲ＝０．７）で結合できることを見出した。相反的に、ＤＩＢｘＰＥＲＴは、既に第二の結合価（ＭＲ＝０．８）でＨＥＲ３−ＥＣＤ／ＨＲＧ１β複合体に結合していても、ＨＥＲ２−ＥＣＤに一の結合価（ＭＲ＝０．８）で結合した。データは、ＤＩＢｘＰＥＲＴは、可溶性分析物を使用するとき、同時に両方の標的（ＨＥＲ２−ＥＣＤ及びＨＥＲ３−ＥＣＤ／ＨＲＧ１β）に結合できることを示す。
【０３９０】
実施例１７
ＭＤＡ−ＭＢ−１７５  ＶＩＩ細胞におけるＨＥＲ３／ＨＥＲ２二重特異性抗体ＤＩＢｘＰＥＲＴの腫瘍細胞増殖の阻害
ＤＩＢｘＰＥＲＴの抗腫瘍効果が、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞（ＶＩＩヒト乳がん細胞、ＡＴＣＣのカタログ番号ＨＴＢ−２５）を用いて、細胞増殖アッセイにおいて評価された。ウェルあたり２０，０００細胞が、１０％ＦＣＳ及び２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２細胞培地を含む滅菌９６ウェル組織培養プレートに播種され、３７℃、５％ＣＯ２で１日間インキュベートされた。細胞は、約３日間の倍増時間を有する低速増殖細胞である。細胞を、２ｍＭのＬ−グルタミンを含む０．５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２細胞培養培地で飢餓状態にした。ＤＩＢｘＰＥＲＴ及び対照抗体が希釈系列で添加され、更に６日間インキュベートされた。適用された抗体が表１３に列挙される。細胞生存率は、その後、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）の読み出しを使用して評価された。各抗体濃度について３通りの手段を用いてＥＣ５０値を計算した（図３０）。
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【０３９１】
ＭＤＡ−ＭＢ−１７５  ＶＩＩ細胞におけるＤＩＢｘＰＥＲＴの腫瘍細胞増殖の阻害
ＭＤＡ−ＭＢ−１７５  ＶＩＩ細胞を用いて、ＤＩＢｘＰＥＲＴの腫瘍細胞増殖の阻害をインビトロで試験した。ＭＤＡ−ＭＢ−１７５  ＶＩＩ細胞株（倍増時間３日）では、発がん性シグナルは自己分泌ＨＲＧ増殖ループから生じる。細胞を、一連の希釈抗体ＤＩＢｘＰＥＲＴ、ＤＩＢ−ＭｏＡｂ、ＤＩＢ−７４、ペルツズマブ、ＲＧ７１１６、ＤＩＢ−７４とペルツズマブの組み合わせ、及びＲＧ７１１６とペルツズマブの組み合わせ並びにアイソタイプ対照とインキュベートした（図３０）。６日後、他の単一及び併用処置とは対照的に、ＤＩＢｘＰＥＲＴにより７９％の最大増殖阻害が達成された（表１４）。ＤＩＢ−７４とペルツズマブの組み合わせ（７６％）及びＲＧ７１１６とペルツズマブの組み合わせ（７６％）で処置した細胞で２番目に高い最大阻害効果が見られた。ＤＩＢｘＰＥＲＴ媒介成長阻害のＥＣ５０は１ｎＭであり、従って対照抗体のＥＣ５０よりも優れていた。ペルツズマブ単一処置又はＤＩＢ−７４若しくはＲＧ７１１６と組み合わせたペルツズマブは、２ｎＭの増殖阻害ＥＣ５０を示した。これと比較して、ＲＧ７１１６（ＥＣ５０ ７ｎＭ）及びＤＩＢ（ＥＣ５０ ２６ｎＭ）単独はインビトロで低い腫瘍増殖阻害を媒介した。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2020114221.tif 000037
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ−Ｂ】
2020114221.tif 000051
【図２９Ｃ−Ｄ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月27日(2020.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発明の詳細な説明に記載の発明。
【外国語明細書】
2020114221000001.pdf