(57)【要約】      （修正有）【課題】キメラ重鎖定常領域配列を含む組み換えポリペプチドを含む、特定のＦｃ受容体に結合するが減少したエフェクター機能を有する、抗体、抗原結合タンパク質、およびＦｃ融合タンパク質を作製する方法の提供。【解決手段】野生型ＩｇＧ１または野生型ＩｇＧ４重鎖定常領域を含む対応する抗体と比較してより低い親和性でＦｃγＲに結合することができ、ＦｃγＲＩＩＡおよび場合によりＦｃγＲＩＩＢに結合することができ、およびＦｃγＲＩＩＢへのその結合親和性と比較してより高い親和性でＦｃγＲＩＩＡに結合することができる抗体を作製する方法。【選択図】図２
2020114242.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端からＣ末端で、ＣＨ１ドメイン、キメラヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む重鎖定常（ＣＨ）領域を含む、組み換えポリペプチドであって、
（ａ）前記ＣＨ１ドメインが、少なくとも２１２位〜２１５位（ＥＵ付番）のアミノ酸配列ＤＫＫＶまたはＤＫＲＶを有する、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインまたはヒトＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインを含み、
（ｂ）前記キメラヒンジが、２１６位〜２２７位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４上部ヒンジアミノ酸配列、および２２８位〜２３６位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ２下部ヒンジアミノ酸配列ＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号３）を含み、
（ｃ）前記ＣＨ２ドメインが、２３７位〜３４０位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインアミノ酸配列を含み、
（ｄ）前記ＣＨ３ドメインが、３４１位〜４４７位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン配列を含む、組み換えポリペプチド。
【請求項２】
前記ＣＨ領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３７、または配列番号３８のうち任意の１つと少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項３】
前記ＣＨ１ドメインがアミノ酸配列ＤＫＫＶ（配列番号４）を含み、前記キメラヒンジがアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号８）を含む、請求項１または請求項２に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項４】
前記ＣＨ１ドメインがアミノ酸配列ＤＫＲＶ（配列番号５）を含み、前記キメラヒンジがアミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号９）を含む、請求項１または請求項２に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項５】
前記ＣＨ２ドメインが配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項６】
前記ＣＨ３ドメインが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号４１、および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項７】
前記組み換えポリペプチドが抗原結合タンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項８】
前記組み換えポリペプチドが受容体−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項９】
前記組み換えポリペプチドが抗体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項１０】
前記抗体が、少なくとも１０ｎＭの抗体濃度で、２０％未満の細胞溶解、または１０％未満、あるいは５％、４％、３％、２％、または更に０％のもしくは検出不能な細胞溶解の細胞傷害活性を呈する、請求項９に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項１１】
前記細胞傷害活性が、野生型ＩｇＧ１または野生型ＩｇＧ４  ＣＨ領域を含む対応する抗体の前記細胞傷害活性よりも、少なくとも約５倍少ない、または少なくとも約１０倍少ない、請求項１０に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項１２】
組み換えポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＮ’−ＶＤ１−Ｘ１n−Ｙ１−Ｙ
２−Ｘ２−Ｘ３−Ｃ’を含み、
（ａ）Ｎ’が前記ポリペプチドのＮ末端であり、Ｃ’がＣ末端であり、
（ｂ）ＶＤ１が、抗原結合ドメインを含むアミノ酸配列であり、
（ｃ）Ｘ１が、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン、ＩｇＧ４  ＣＨ１ドメイン、および少なくともＩｇＧ１またはＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインの２１２位〜２１５位（ＥＵ付番）からなる群から選択されるドメインを含むアミノ酸配列であり、
（ｄ）Ｙ１が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４ヒンジ領域の２１６位〜２２７位（ＥＵ付番）からのアミノ酸配列を含み、
（ｅ）Ｙ２が、２２８位〜２３６位（ＥＵ付番）からのヒトＩｇＧ２下部ヒンジ領域アミノ酸配列ＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号３）を含み、
（ｆ）Ｘ２が、ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインを含むアミノ酸配列であり、
（ｇ）Ｘ３が、ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインもしくはＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン、またはそれらの変異体を含むアミノ酸配列であり、
（ｈ）ｎ＝０または１である、組み換えポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３７、または配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項１４】
ｎ＝１であり、Ｘ１がアミノ酸配列ＤＫＫＶ（配列番号４）を含み、Ｙ１〜Ｙ２が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号８）からなるキメラヒンジを含む、請求項１２または請求項１３に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項１５】
ｎ＝１であり、Ｘ１がアミノ酸配列ＤＫＲＶ（配列番号５）を含み、Ｙ１〜Ｙ２が、アミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号９）からなるキメラヒンジを含む、請求項１２または請求項１３に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項１６】
ｎ＝０または１であり、Ｙ１〜Ｙ２が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号８）からなるキメラヒンジを含む、請求項１２に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項１７】
ｎ＝０または１であり、Ｙ１〜Ｙ２が、アミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号９）からなるキメラヒンジを含む、請求項１２に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項１８】
Ｘ２が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項１９】
Ｘ３が、配列番号１１、配列番号１２、配列番号４１、および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項２０】
前記組み換えポリペプチドが、単離した抗原結合タンパク質である、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項２１】
前記組み換えポリペプチドが、Ｆｃ融合タンパク質または受容体−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項２２】
前記組み換えポリペプチドが、単離した抗体である、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項２３】
前記抗体が、少なくとも１０ｎＭの抗体濃度で、２０％未満の細胞溶解、または１０％未満、あるいは５％、４％、３％、２％、または更に０％のもしくは検出不能な細胞溶解の細胞傷害活性を呈する、請求２２に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項２４】
前記細胞傷害活性が、野生型ＩｇＧ１または野生型ＩｇＧ４  ＣＨ領域を含む対応する抗体の前記細胞傷害活性よりも、少なくとも約５倍少ない、または少なくとも約１０倍少ない、請求項２３に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチドを含む、組成物。
【請求項２６】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項２７】
前記組み換えポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３７、および配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の核酸分子。
【請求項２８】
配列番号２８、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、および配列番号３６との９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２６または請求項２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２９】
配列番号２８、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、および配列番号３６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３０】
請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項３１】
前記核酸分子が、宿主細胞中の発現に好適な発現制御配列に作動的に連結される、請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
前記発現制御配列が、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＣＭＶ−ＩＥ、ＣＭＶ−ＭＩＥ、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＳＬ３−３、ＭＭＴＶ、Ｕｂｉ、およびＨＩＶ  ＬＴＲからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項３１に記載のベクター。
【請求項３３】
前記発現制御配列が、ＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターによって駆動されるＴｅｔＲ−ＥＲLBDＴ２融合遺伝子、ＳＶ４０プロモーターによって駆動されるブラストサイジン耐性遺
伝子、およびＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターによって駆動されるＡｒｃ−ＥＲLBDＴ２融合
遺伝子からなる群から選択される、発現カセットを含む、請求項３１に記載のベクター。
【請求項３４】
前記プロモーターが、ＣＭＶ−ＭＩＥ／ＴｅｔＯまたはＣＭＶ−ＭＩＥ／Ａｒｃハイブリッドプロモーターである、請求項３２に記載のベクター。
【請求項３５】
ｂｌａ、ｂｌｓ、ＢＳＤ、ｂｓｒ、Ｓｈ  ｂｌｅ、ｈｐｔ、ｔｅｔＲ、ｔｅｔＭ、ｎｐｔ、ｋａｎＲ、およびｐａｃからなる群から選択される、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項３６】
請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の核酸を含む、細胞。
【請求項３７】
請求項２８〜３３のいずれか一項に記載のベクターを含む、請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
前記核酸が、前記細胞のゲノム中に統合される、請求項３６または請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
タンパク質発現エンハンサーをコードする核酸を含む、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４０】
ＸＢＰポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４１】
前記細胞が真核細胞である、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４２】
前記細胞が動物細胞である、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４３】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４４】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３６〜４３いずれか一項に記載の細胞。
【請求項４５】
前記細胞がＣＨＯ−Ｋ１細胞である、請求項３６〜４４いずれか一項に記載の細胞。
【請求項４６】
キメラヒンジ領域を含む抗体を作製する方法であって、
ａ．宿主細胞を前記抗体の軽鎖をコードする前記核酸分子を用いてトランスフェクトすることであって、前記核酸分子が、選択された抗原特異的抗体のＶL領域をコードするヌ
クレオチド配列、およびＩｇの定常ＣL領域をコードするヌクレオチド配列を含み、前記
選択された抗原特異的抗体のＶL領域をコードする前記ヌクレオチド配列、および前記Ｉ
ｇのＣL領域をコードする前記ヌクレオチド配列が、共に作動可能に連結される、トラン
スフェクトすることと、
ｂ．ステップ（ａ）の宿主細胞を前記抗体の重鎖をコードする核酸分子を用いてトランスフェクトすることであって、前記核酸分子が、選択された抗原特異的抗体のＶH領域を
コードするヌクレオチド配列、およびヒトＩｇの定常ＣH領域をコードするヌクレオチド
配列を含み、前記ＣH領域をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記配列番号１、配列
番号２、配列番号３０、または配列番号３１をコードするヌクレオチド配列を含み、前記選択された抗原特異的抗体のＶH領域をコードする前記ヌクレオチド配列、および前記Ｉ
ｇのＣH領域をコードする前記ヌクレオチド配列が、共に作動可能に連結される、トラン
スフェクトすることと、
ｃ．前記宿主細胞中で（ａ）および（ｂ）の前記核酸分子を共発現させることによって前記抗体を作製することと、を含む、方法。
【請求項４７】
ステップ（ｂ）の前記宿主細胞を培養し、前記抗体が細胞培地中に分泌される、ステップと、前記抗体を前記細胞培地から単離するステップと、を更に含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
キメラヒンジ領域を含む受容体−Ｆｃ融合タンパク質を作製する方法であって、
ａ．宿主細胞を前記受容体−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸分子を用いてトランスフェクトすることであって、前記核酸分子が、ヒトＩｇの定常ＣH領域をコードするヌ
クレオチド配列に融合された、受容体タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ＣH領域をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記配列番号１、配列番号２、配列
番号３０、または配列番号３１をコードするヌクレオチド配列を含み、前記受容体タンパ
ク質をコードする前記ヌクレオチド配列、および前記Ｉｇの前記ＣH領域をコードする前
記ヌクレオチド配列が、共に作動可能に連結される、トランスフェクトすることと、
ｂ．前記宿主細胞中で（ａ）の前記核酸分子を発現させることによって前記受容体−Ｆｃ融合タンパク質を作製することと、を含む、方法。
【請求項４９】
前記ステップ（ｂ）の宿主細胞を培養し、前記受容体−Ｆｃ融合タンパク質が細胞培地中に分泌される、ステップと、前記受容体−Ｆｃ融合タンパク質を前記細胞培地から単離するステップと、を更に含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記宿主細胞が、ＣＨＯ、ＣＯＳ、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃｏｌｏ２５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ細胞、腫瘍細胞、前述の細胞のうちのいずれかに由来する細胞系、およびＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞からなる群から選択される、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
二重特異性抗体であって、
（ａ）第１の標的抗原を認識し、それに結合することができる抗原結合ドメインを含む、第１の重鎖と、
（ｂ）第２の標的抗原を認識し、それに結合することができる抗原結合ドメインを含む、第２の重鎖と、
（ｃ）前記第１または第２の標的抗原を認識し、それに結合することができる共通の軽鎖抗原結合ドメインと、を含み、
（ａ）もしくは（ｂ）または（ａ）と（ｂ）との両方の前記重鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３７、および配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、二重特異性抗体。
【請求項５２】
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３０、または配列番号３１を含む第１の重鎖定常領域を含む、第１の重鎖と、
（ｂ）配列番号３７または配列番号３８を含む第２の重鎖定常領域を含む、第２の重鎖と、を含む、請求項５１に記載の二重特異性抗体。
【請求項５３】
キメラＦｃ領域を含み、前記Ｆｃ領域が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号８）を含むキメラヒンジを含む、組み換えポリペプチド。
【請求項５４】
キメラＦｃ領域を含み、前記Ｆｃ領域が、アミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号９）を含むキメラヒンジを含む、組み換えポリペプチド。
【請求項５５】
前記キメラヒンジが、ＩｇＧ４  ＣＨ２領域に連結される、請求項５３または請求項５４に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項５６】
配列番号２８、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、および配列番号３６からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖定常領域を含む、組み換えポリペプチド。
【請求項５７】
前記配列番号２８、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、および  配列番号３６からなる群から選択されるヌクレオチド配列との９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる重鎖定常領域を含む、組み換えポリペプチド。
【請求項５８】
前記組み換えポリペプチドが、野生型ＩｇＧ１または野生型ＩｇＧ４重鎖定常領域を含む対応するポリペプチドの結合親和性と比較してより低い親和性で、ＦｃγＲに結合することができる、請求項１〜２４または５３〜５７のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項５９】
前記組み換えポリペプチドがＦｃγＲＩＩＡに結合する、請求項５８に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項６０】
前記組み換えポリペプチドがＦｃγＲＩＩＢに結合する、請求項５９に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項６１】
前記組み換えポリペプチドが、ＦｃγＲＩＩＢへのその結合親和性と比較して同様の親和性で、ＦｃγＲＩＩＡに結合する、請求項６０に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項６２】
前記組み換えポリペプチドが、ＦｃγＲＩＩＢへのその結合親和性と比較してより高い親和性で、ＦｃγＲＩＩＡに結合する、請求項６０に記載の組み換えポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２０１３年２月１日に出願された米国仮出願第６１／７５９，５７８号の利益を主張し、その出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、２０１４年１月２９日に作成されたファイル８５５０ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔとしてコンピュータ可読形態で提出された配列表（４３，５１２バイト）を参照により組み込む。
【０００３】
本発明は、キメラ定常領域を含む、より具体的には、重鎖定常領域中のキメラヒンジ領域を含む、組み換えポリペプチドによって操作した、抗体または抗原結合タンパク質に関する。本発明は、エフェクター機能を減少させ、療法における使用に利点を提供する、そのような組み換えポリペプチドを含む抗体および抗原結合タンパク質に関係する。
【背景技術】
【０００４】
ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、治療薬として魅力的である。ＩｇＧは、ヒトにおける４つのサブクラスである、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４として存在する。ＩｇＧ重鎖定常（ＣH）領域は、３つのドメインである、ＣH１、ＣH２、ＣH３を含み、ＣH１およびＣH２は、ヒンジによって連結される。各サブクラスの役割は種の間で異なると思われるが、重鎖定常ドメインは、種々の生物学的エフェクター機能に関与することが知られている。ヒトＩｇＧサブクラスは、細胞殺傷、補体活性化、貧食、およびオプソニン作用などの、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲｓ）とのそれらの相互作用を通して、多量の細胞免疫応答を媒介する。ＦｃγＲｓへのＩｇＧサブクラスの結合の影響を理解し操作するために、研究者らは、ＩｇＧの定常領域に種々の突然変異を起こし、得られたＩｇＧ／ＦｃγＲ相互作用を研究した（例えば、非特許文献１、非特許文献２、および非特許文献３を参照されたい）。
【０００５】
ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ依存性細胞傷害活性は、抗体のＦｃ領域（少なくとも機能的ＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる）が、ナチュラルキラー細胞または活性化マクロファージなどのエフェクター細胞の表面上にあるＦｃγＲに結合することを必要とする。補体媒介性溶解も、種々の補体要素とのＦｃ領域の相互作用によって誘発され得る。ＦｃγＲ結合に関しては、抗体のヒンジ領域中およびＣH２ドメイン中のいくつかのアミノ酸残基が
重要であることが示唆されている（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７を参照されたい）。ＣＨ２ドメイン中の部位（Ｎ２９７）のグリコシル化、およびその炭水化物の組成における多様性も、ＩｇＧ／ＦｃγＲ相互作用に強く影響する（非特許文献７、非特許文献８）。
【０００６】
ある特定の抗体療法に対しては、抗体の薬物動態特性に影響することなく、Ｆｃ受容体結合特性を、利用可能なエフェクター機序の全てまたは一部を活性化するか、あるいは活性化しないように操作することが有利であり得る。治療特性の所望の組み合わせは、天然の抗体レパートリー中で利用可能でない場合がある。エフェクター機能が減少した抗体の設計は、例えば、療法目標が、標的細胞を殺傷することではなく、その表面上の細胞表面分子を、細胞傷害性を誘発することなく妨害または活性化することである場合に、効果的であろう。Ｆｃ受容体への減少した結合が望ましい可能性がある別の状況は、抗体が二重特異性であり、その所望の治療特性が、異なる結合特異性から生じる場合である。例えば
、二重特異性抗体の一般的な用法は、腫瘍特異的Ｔ細胞による殺傷を誘発するために、腫瘍標的化特異性をＴ細胞活性化特異性と組み合わせることである。この場合、Ｆｃ部分がＦｃ受容体に結合すると、可能性として、それがＴ細胞によるＦｃ受容体を保有する細胞の望ましくない殺傷、またはナチュラルキラー細胞もしくはマクロファージなどのＦｃ受容体を保有する細胞によるＴ細胞の殺傷を誘発し得る。
【０００７】
故に、そのような療法で使用するための所望の特性を持つ抗体などの、改善した生物学的療法への必要性が存在する。出願人らは、組み換え抗体および組み換え受容体−Ｆｃ融合タンパク質を含む、置換あるいは修飾された抗体重鎖を含有する組み換えタンパク質が、Ｆｃ受容体結合活性を改変し、それが望まれない副作用のリスクを減少させた故に、改善した治療効果をもたらしたことを発見した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃａｎｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ７３，１４８３−１４９１（１９９１）
【非特許文献２】Ｃｈａｐｐｅｌ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．ＪＢＣ２６８（３３），２５１２４−３１（１９９３）
【非特許文献３】Ａｒｍｏｕｒ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９，２６１３−２４（１９９９）
【非特許文献４】Ｓａｒｍａｙ，Ｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９，６３３−９（１９９２）
【非特許文献５】Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３（５），１０９８（１９９３）
【非特許文献６】Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８６，３１９（１９９５）
【非特許文献７】Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，ＧＴ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５，５７−７２（１９９７）
【非特許文献８】Ｓｉｂｅｒｉｌ  ｅｔ  ａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｔｒｓ  １０６，１１１−１１８（２００６）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書で開示する抗体、抗原結合タンパク質、およびＦｃ融合タンパク質は、Ｆｃ受容体への減少した結合を有するように操作される。
【００１０】
本発明の一態様は、キメラＦｃ領域を含む組み換えポリペプチドを提供し、Ｆｃ領域は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号８）を含むキメラヒンジを含む。本発明はまた、キメラＦｃ領域を含む組み換えポリペプチドを提供し、Ｆｃ領域は、アミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号９）を含むキメラヒンジを含む。
【００１１】
本発明の別の態様は、キメラＦｃ領域を含む組み換えポリペプチドを提供し、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４  ＣＨ２領域に連結されたアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号８）を含むキメラヒンジを含む。本発明のまた別の態様は、キメラＦｃ領域を含む組み換えポリペプチドを提供し、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４  ＣＨ２領域に連結されたアミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号９）を含むキメラヒンジを含む。
【００１２】
一部の実施形態では、組み換えポリペプチドはキメラＦｃ領域を含み、Ｆｃ領域は、Ｉ
ｇＧ１もしくはＩｇＧ４  ＣＨ３領域、またはそれらの変異体を含む。他の実施形態では、組み換えポリペプチドはキメラＦｃ領域を含み、Ｆｃ領域はＦｃγＲＩＩＡに結合する。他の態様では、組み換えポリペプチドはキメラＦｃ領域を含み、Ｆｃ領域はＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢに結合する。
【００１３】
他の実施形態では、本発明は、キメラＦｃ領域を含む組み換えポリペプチドを提供し、Ｆｃ領域は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号８）を含むキメラヒンジを含み、組み換えポリペプチドはＦｃγＲＩＩＡに結合する。
【００１４】
また他の態様では、本発明は、キメラＦｃ領域を含む組み換えポリペプチドを提供し、Ｆｃ領域は、アミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号９）を含むキメラヒンジを含み、組み換えポリペプチドはＦｃγＲＩＩＡに結合する。
【００１５】
本発明の更なる態様は、Ｎ末端からＣ末端で、ＣＨ１ドメイン、キメラヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む重鎖定常（ＣＨ）領域を含む組み換えポリペプチドを提供し、ＣＨ１ドメインは、少なくとも２１２位〜２１５位（ＥＵ付番）のアミノ酸配列ＤＫＫＶまたはＤＫＲＶを有する、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインまたはヒトＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインを含み、キメラヒンジは、２１６位〜２２７位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４上部ヒンジアミノ酸配列、および２２８位〜２３６位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ２下部ヒンジアミノ酸配列ＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号３）を含み、ＣＨ２ドメインは、２３７位〜３４０位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインアミノ酸配列を含み、ＣＨ３ドメインは、３４１位〜４４７位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ１もしくはヒトＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン配列、またはそれらの変異体を含む。
【００１６】
本発明の一部の実施形態は、ＣＨ１ドメインがヒトＩｇＧ１  ＣＨ１アミノ酸配列（配列番号４３）を含み、キメラヒンジがアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号８）を含む、組み換えポリペプチドを提供する。本発明のまた別の実施形態は、ＣＨ１ドメインがヒトＩｇＧ４  ＣＨ１アミノ酸配列（配列番号４４）を含み、キメラヒンジがアミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号９）を含む、組み換えポリペプチドを提供する。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、ＣＨ１ドメインがアミノ酸配列ＤＫＫＶ（配列番号４）を含み、キメラヒンジがアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号８）を含む、組み換えポリペプチドを提供する。本発明のまた別の実施形態は、ＣＨ１ドメインがアミノ酸配列ＤＫＲＶ（配列番号５）を含み、キメラヒンジがアミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号９）を含む、組み換えポリペプチドを提供する。別の態様では、ＣＨ１ドメインは、配列番号４３または４４の変異体を含む。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、ＣＨ２ドメインが配列番号１０のアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチドを提供する。本発明の更に別の実施形態は、ＣＨ３ドメインが、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列を含む、組み替えポリペプチドを提供する。別の態様では、ＣＨ３ドメインは、配列番号４１または４２を含む。
【００１９】
本発明の態様は、組み換えポリペプチドであって、ポリペプチドがＮ’−ＶＤ１−Ｘ１n−Ｙ１−Ｙ２−Ｘ２−Ｘ３−Ｃ’を含み、
Ｎ’がポリペプチドのＮ末端であり、Ｃ’がＣ末端であり、
ＶＤ１が、抗原結合ドメインを含むアミノ酸配列であり、
Ｘ１が、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインまたはその変異体、ＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインまたはその変異体、および少なくともＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインの２１２位〜２１５位（ＥＵ付番）からなる群から選択されるドメインを含むアミノ酸配列であり、
Ｙ１が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４ヒンジ領域の２１６位〜２２７位（ＥＵ付番）からのアミノ酸配列を含み、
Ｙ２が、２２８位〜２３６位（ＥＵ付番）からのヒトＩｇＧ２下部ヒンジ領域アミノ酸配列ＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号３）を含み、
Ｘ２が、ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン、またはその変異体を含むアミノ酸配列であり、
Ｘ３が、ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインもしくはＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン、またはそれらの変異体を含むアミノ酸配列である、組み換えポリペプチドを提供し、式中、ｎ＝０または１である。
【００２０】
本発明の一部の実施形態では、ｎ＝１である。本発明の更に別の実施形態では、Ｘ１は、アミノ酸配列ＤＫＫＶ（配列番号４）を含み、Ｙ１〜Ｙ２は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号８）からなるキメラヒンジを含む。本発明のまた別の実施形態では、Ｘ１は、アミノ酸配列ＤＫＲＶ（配列番号５）を含み、Ｙ１〜Ｙ２は、アミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号９）からなるキメラヒンジを含む。もう１つの実施形態では、Ｘ１は、配列番号４３または配列番号４４を含む。本発明の別の態様では、Ｘ２は、配列番号１０を含む。本発明の別の実施形態では、Ｘ３は、配列番号１１または配列番号１２を含む。更に別の実施形態では、Ｘ３は、配列番号４１または配列番号４２を含む。
【００２１】
本発明の別の態様は、重鎖定常領域（ＣＨ）領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３７、または配列番号３８のうち任意の１つと少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチドを提供する。
【００２２】
一部の実施形態では、ｎ＝０であり、Ｙ１〜Ｙ２は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号８）を有するキメラヒンジを含む。他の実施形態では、ｎ＝０であり、Ｙ１〜Ｙ２は、アミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号９）を有するキメラヒンジを含む。
【００２３】
本発明の別の実施形態では、組み換えポリペプチドは、抗原結合タンパク質である。別の実施形態では、組み換えポリペプチドは、受容体−Ｆｃ融合タンパク質などのＦｃ融合タンパク質である。本発明の更に別の実施形態では、組み換えポリペプチドは抗体である。
【００２４】
本発明の更なる態様は、少なくとも１０ｎＭの濃度で、野生型ＩｇＧ１またはＩｇＧ４重鎖定常領域を含む対応する組み換えポリペプチド、抗原結合タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、または抗体と比較したときに、減少したエフェクター機能を呈する、組み換えポリペプチド、抗原結合タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、または抗体を提供する。本発明は、故に、減少した結合、細胞傷害活性、および細胞増殖を有する、組み換えポリペプチド、抗原結合タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、または抗体を提供する。
【００２５】
本発明は、少なくとも１０ｎＭまたは少なくとも１００ｎＭの濃度で約５０％未満の細胞傷害活性を呈する、組み換えポリペプチド、抗原結合タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、または抗体を更に提供する。本発明はまた、少なくとも１０ｎＭまたは少なくとも１００ｎＭの濃度で、約４０％未満、もしくは約３０％未満、もしくは約２０％未満、もしくは約１０％未満、もしくは約５％未満の、または更に検出不能な細胞傷害活性を呈する、組み換えポリペプチド、抗原結合タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、または抗体を更に提供する。
【００２６】
他の実施形態では、組み換えポリペプチド、抗原結合タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、または抗体は、インビトロまたはエクスビボの細胞殺傷アッセイ中で測定した場合、約
５０％未満の細胞傷害性、または
【００２７】
４０％、３０％、２０％、１０％未満、もしくは５％、４％、３％、２％、もしくは更に０％の、または検出不能な細胞傷害性のＣＤＣ活性を呈する。ある特定の実施形態では、ＣＤＣ活性は、１００ｎＭの濃度で、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％未満、または５％、４％、３％、２％、または更に０％もしくは検出不能である。更なる実施形態では、組み換えポリペプチド、抗原結合タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、または抗体は、インビトロまたはエクスビボにおける細胞殺傷アッセイで測定するとき、約５０％未満の細胞傷害性、または細胞傷害性４０％、３０％、２０％、１０％未満、あるいは５％、４％、３％、２％、または更に０％のもしくは検出不能な細胞傷害性のＡＤＣＣ活性を呈する。ある特定の実施形態では、ＡＤＣＣ活性は、１００ｎＭの濃度で、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％未満、あるいは５％、４％、３％、２％、または更に０％のもしくは検出不能なＡＤＣＣ活性である。
【００２８】
また他の実施形態では、組み換えポリペプチド、抗原結合タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、または抗体は、インビトロまたはエクスビボにおける細胞貧食アッセイで測定するとき、約５０％未満のＡＤＣＰ活性、または４０％、３０％、２０％、１０％未満、あるいは５％、４％、３％、２％、または更に０％のもしくは検出不能なＡＤＣＰ活性のＡＤＣＰ活性を呈する。ある特定の実施形態では、ＡＤＣＰ活性は、１００ｎＭの濃度で、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％未満、あるいは５％、４％、３％、２％、または更に０％のもしくは検出不能なＡＤＣＰ活性である。
【００２９】
本発明は、細胞傷害活性が、野生型ＩｇＧ１または野生型ＩｇＧ４重鎖定常領域を含む対応するポリペプチドの細胞傷害活性よりも少なくとも約１０倍少ない、組み換えポリペプチドを更に提供する。本発明はまた、細胞傷害活性が、野生型ＩｇＧ１または野生型ＩｇＧ４重鎖定常領域を含む対応するポリペプチドの細胞傷害活性よりも少なくとも約１０倍少ない、約２０倍少ない、約５０倍少ない、または約１００倍少ない、または約１０００倍少ない、組み換えポリペプチドを更に提供する。
【００３０】
本発明の態様は、組み換えポリペプチドを含む組成物を提供する。
【００３１】
本発明の別の態様は、本発明の組み換えポリペプチドのうちのいずれかをコードする核酸分子を提供する。本発明は、本発明の組み換えポリペプチドをコードする核酸分子を更に提供し、組み換えポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３８、および配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３２】
本発明は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３２、または配列番号３３との９９％超の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子を更に提供する。本発明はまた、配列番号３６または配列番号３５との９９％超の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子も提供する。
【００３３】
本発明はまた、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３６、および配列番号３５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子も提供する。
【００３４】
本発明の態様は、本発明の核酸分子のうちのいずれかを含むベクターを提供する。本発明は、本発明の核酸分子が宿主細胞中の発現に好適な発現制御配列に作動的に連結される、ベクターを更に提供する。本発明はまた、発現制御配列が、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＣＭＶ−ＩＥ、ＣＭＶ−ＭＩＥ、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＳＬ３−３、ＭＭＴＶ、Ｕｂｉ、およびＨＩ
Ｖ  ＬＴＲからなる群から選択されるプロモーターを含む、ベクターも提供する。本発明は、プロモーターがＣＭＶ−ＭＩＥ／ＴｅｔＯまたはＣＭＶ−ＭＩＥ／Ａｒｃハイブリッドプロモーターである、本発明のベクターを更に提供する。本発明はまた、ｂｌａ、ｂｌｓ、ＢＳＤ、ｂｓｒ、Ｓｈ  ｂｌｅ、ｈｐｔ、ｔｅｔＲ、ｔｅｔＭ、ｎｐｔ、ｋａｎＲ、およびｐａｃからなる群から選択される、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む、本発明のベクターも提供する。
【００３５】
本発明の別の態様は、本発明の核酸を含む細胞を提供する。本発明は、本発明のベクターを含む細胞を更に提供する。
【００３６】
本発明は、本発明の核酸を含む細胞を更に提供し、核酸は、細胞のゲノム中に統合される。本発明はまた、タンパク質発現エンハンサーをコードする核酸を含む細胞も提供する。本発明は、ＸＢＰポリペプチドをコードする核酸を含む細胞をまた更に提供する。
【００３７】
本発明の実施形態では、細胞は真核細胞である。本発明の実施形態では、細胞は動物細胞である。本発明の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。本発明の別の実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞である。本発明の実施形態では、細胞はＣＨＯ−Ｋ１細胞である。
【００３８】
本発明の態様は、キメラヒンジ領域を含む抗体を作製する方法を提供し、該方法は、
（ａ）宿主細胞を該抗体の軽鎖をコードする核酸分子を用いてトランスフェクトすることであって、該核酸分子が、選択された抗原特異的抗体のＶL領域をコードするヌクレオ
チド配列、およびＩｇの定常ＣL領域をコードするヌクレオチド配列を含み、選択された
抗原特異的抗体のＶL領域をコードする該ヌクレオチド配列、およびＩｇのＣL領域をコードする該ヌクレオチド配列が、共に作動可能に連結される、トランスフェクトすることと、（ｂ）ステップ（ａ）の宿主細胞を該抗体の重鎖をコードする核酸分子を用いてトランスフェクトすることであって、該核酸分子が、選択された抗原特異的抗体のＶH領域をコ
ードするヌクレオチド配列、およびヒトＩｇの定常ＣH領域をコードするヌクレオチド配
列を含み、ＣH領域をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２、配列番
号３０、配列番号３１、配列番号３８、または配列番号３７をコードするヌクレオチド配列を含み、選択された抗原特異的抗体のＶH領域をコードする該ヌクレオチド配列、およ
び該ＩｇのＣH領域をコードする該ヌクレオチド配列が、共に作動可能に連結される、ト
ランスフェクトすることと、（ｃ）該宿主細胞中で（ａ）および（ｂ）の核酸分子を共発現させることによって該抗体を作製することと、を含む。
【００３９】
キメラヒンジ領域を含む抗体を作製する方法であって、
（ａ）宿主細胞を該抗体の軽鎖をコードする核酸分子を用いてトランスフェクトすることであって、該核酸分子が、選択された抗原特異的抗体のＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列、およびＩｇの定常ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、選択された抗原特異的抗体のＶＬ領域をコードする該ヌクレオチド配列、およびＩｇのＣＬ領域をコードする該ヌクレオチド配列が、共に作動可能に連結される、トランスフェクトすることと、（ｂ）ステップ（ａ）の宿主細胞を該抗体の重鎖をコードする核酸分子を用いてトランスフェクトすることであって、該核酸分子が、選択された抗原特異的抗体のＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列、およびヒトＩｇの定常ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列が、配列番号８または配列番号９をコードするキメラヒンジヌクレオチド配列を含み、選択された抗原特異的抗体のＶＨ領域をコードする該ヌクレオチド配列、および該ＩｇのＣＨ領域をコードする該ヌクレオチド配列が、共に作動可能に連結される、トランスフェクトすることと、（ｃ）該宿主細胞中で（ａ）および（ｂ）の核酸分子を共発現させることによって該抗体を作製することと、を含む、方法。
【００４０】
本発明の別の態様では、抗体を作製する方法は、上文のステップ（ｂ）の宿主細胞を培養し、抗体が細胞倍地中に分泌される、ステップと、抗体を細胞培地から単離するステップとを更に含む。
【００４１】
本発明の態様は、キメラヒンジ領域を含む受容体−Ｆｃ融合タンパク質を作製する方法を提供し、該方法は、
（ａ）宿主細胞を前記受容体−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸分子を用いてトランスフェクトすることであって、該核酸分子が、ヒトＩｇの定常ＣH領域をコードするヌ
クレオチド配列に融合された、受容体タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ＣH領域をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、配
列番号３１、配列番号３８、または配列番号３７をコードするヌクレオチド配列を含み、受容体タンパク質をコードする該ヌクレオチド配列、および該ＩｇのＣH領域をコードす
る該ヌクレオチド配列が、共に作動可能に連結される、トランスフェクトすることと、（ｂ）該宿主細胞中で（ａ）の核酸分子を発現させることによって該受容体−Ｆｃ融合タンパク質を作製することと、を含む。
【００４２】
本発明の別の態様では、受容体−Ｆｃ融合を作製する方法は、上文のステップ（ｂ）の宿主細胞を培養し、受容体−Ｆｃ融合タンパク質が細胞培地中に分泌される、ステップと、受容体−Ｆｃ融合タンパク質を細胞培地から単離するステップとを含む。
【００４３】
本発明の態様は、キメラヒンジ領域を含む受容体−Ｆｃ融合タンパク質を作製する方法を提供し、該方法は、
（ａ）宿主細胞を前記受容体−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸分子を用いてトランスフェクトすることであって、該核酸分子が、ヒトＩｇの定常ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列に融合された、受容体タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列が、配列番号８または配列番号９をコードするキメラヒンジヌクレオチド配列を含み、受容体タンパク質をコードする該ヌクレオチド配列、および該ＩｇのＣＨ領域をコードする該ヌクレオチド配列が、共に作動可能に連結される、トランスフェクトすることと、（ｂ）該宿主細胞中で（ａ）の核酸分子を発現させることによって該受容体−Ｆｃ融合タンパク質を作製することと、を含む。
【００４４】
他の実施形態では、抗体を作製する方法は、
（ａ）目的とする第１の重鎖ポリペプチドを発現している細胞を含む、第１の細胞培養物を産生することと、
（ｂ）目的とする第２の重鎖ポリペプチドを発現している細胞を含む、第２の細胞培養物を産生することと、
（ｃ）第１および第２の細胞培養物、またはそれらの上清を組み合わせることと、
（ｄ）ヘテロ二量体形態にある第１および第２のポリペプチドを回収することと、を含み、
第１および第２の重鎖ポリペプチドの重鎖は、各々、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３８、および配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。上記の方法では、第１の細胞培養物は目的とする第１の同族軽鎖を更に含み、第２の細胞培養物は目的とする第２の同族軽鎖を含み、第１および第２の同族軽鎖は、第１および第２の重鎖ポリペプチドに共有結合する故に、回収される。上記の方法の他の実施形態では、第１および第２の重鎖ポリペプチドの重鎖は、各々、配列番号８および配列番号９からなる群から選択されるキメラヒンジアミノ酸配列を含む。
【００４５】
他の実施形態では、本発明は、第１の細胞培養物中で産生された第１の一本鎖可変断片−Ｆｃ（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）、および第２の細胞培養物中で産生された第２のｓｃＦｖ−Ｆｃを含む抗体を作製する方法を提供し、第１および第２のｓｃＦｖ−ＦｃのＦｃは、各々
、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３８、および配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、第１および第２の細胞培養物、またはそれらの上清を組み合わせ、ヘテロ二量体形態にある第１および第２のｓｃＦｖ−Ｆｃを回収または単離する。一部の実施形態では、第１および第２のｓｃＦｖ−Ｆｃは、細胞培地（例えば、上清）中に分泌され、本方法は、第１および第２の細胞培地を組み合わせること、およびヘテロ二量体タンパク質を回収または単離することを含む。上記の方法の一部の実施形態では、第１および第２のｓｃＦｖ−ＦｃのＦｃは、各々、配列番号８および配列番号９からなる群から選択されるキメラヒンジアミノ酸配列を含む。
【００４６】
本発明の一部の実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃｏｌｏ２５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ細胞、腫瘍細胞、前述の細胞のうちのいずれかに由来する細胞系、およびＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞からなる群から選択される。
【００４７】
本発明の別の態様は、二重特異性抗体を提供し、この二重特異性抗体は、
（ａ）  第１の標的抗原を認識し、それに結合することができる抗原結合ドメインを含む第１の重鎖と、（ｂ）第２の標的抗原を認識し、それに結合することができる抗原結合ドメインを含む第２の重鎖と、（ｃ）第１または第２の標的抗原を認識し、それに結合することができる共通の軽鎖抗原結合ドメインとを含み、（ａ）もしくは（ｂ）または（ａ）および（ｂ）の両方の重鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、または配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含むか、あるいは、（ａ）もしくは（ｂ）または（ａ）と（ｂ）との両方の重鎖が、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列を含むキメラヒンジ領域を含む。
【００４８】
本発明の更なる態様は、（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３０、または配列番号３１を含む第１の重鎖定常領域を含む、第１の重鎖と、（ｂ）配列番号３８または配列番号３７を含む第２の重鎖定常領域を含む、第２の重鎖とを含む、本発明の二重特異性抗体を提供する。
【００４９】
これらおよび他の目的は、本明細書に開示の本発明の利点および特徴と併せて、続く説明、図面、および特許請求の範囲からより明らかにされるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、およびｈＩｇＧ４についての対応するアミノ酸付番慣例を示す。アミノ酸付番は、最近に更新されたＩＭＧＴ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｈａｒｔ（ＩＭＧＴ（登録商標）、ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ（２００１年５月１７日作製、２０１３年１月１０日最終更新）およびＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５th  ｅｄ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）中で報告されたＥＵインデックスに従う。（ｗｔ＝野生型、−は特定の参照について対応する数が報告されなかったことを意味し、−−は特定の参照についてその位置で対応するアミノ酸が報告されなかったことを意味する。）
【図２】キメラヒンジ領域の構築に使用されたヒンジアミノ酸および対応するアミノ酸慣例を示す。
【図３】ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｐ０１８５７（配列番号１３）においてＩＧＨＧ１として記載される、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含む、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【図４】ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｐ０１８５９（配列番号１４）においてＩＧＨＧ２として記載される、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含む、ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【図５】ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｐ０１８６１（配列番号１５）においてＩＧＨＧ４として記載される、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含む、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【図６】蛍光結合アッセイにおけるＪｕｒｋａｔ細胞上の抗原への抗体結合（最大の％）を示す単一パラメータヒストグラムである。図６Ａは、対照アッセイ、すなわち、二次抗体のみ（ｓｅｃ）でインキュベートしたＪｕｒｋａｔ細胞および無染色Ｊｕｒｋａｔ細胞について、バックグラウンド蛍光を測定した。図６Ｂは、キメラヒンジ重鎖定常領域を含有する抗体（Ａｂ１＝ｓＩｇＧ４）へのＪｕｒｋａｔ細胞結合と、対応する抗原結合ドメインおよび野生型（ｗｔ）ＩｇＧ４定常領域を含有する抗体（対照Ａｂ２）への結合との比較である。図６Ｃは、キメラヒンジ重鎖定常領域を含有する抗体（Ａｂ２＝ｓＩｇＧ１）へのＪｕｒｋａｔ細胞結合と、対応する抗原結合ドメインおよび野生型（ｗｔ）ＩｇＧ１重鎖定常領域を含有する抗体（対照Ａｂ１）への結合との比較である。
【図７】Ｕ９３７細胞に結合するキメラヒンジ抗体能力を示す用量反応曲線である。結合に関する半最大濃度（ＥＣ50）値（平均蛍光強度）が与えられる。（対照抗体１＝ｗｔ  ＩｇＧ１  ＣH、抗体２＝ｓＩｇＧ１、対照Ａｂ２＝ｗｔ  ＩｇＧ４  ＣH、および抗体１＝ｓＩｇＧ４。）
【図８】活性化ＰＢＭＣ（Ｔ細胞）の存在下でＵ９３７細胞に関して細胞傷害性を欠くキメラヒンジ抗体を示す、用量反応曲線である。細胞傷害性％に関する半最大濃度（ＥＣ50）値（平均蛍光強度）を反映する。（対照抗体１＝ｗｔ  ＩｇＧ１  ＣH、抗体１＝ｓＩｇＧ４、対照Ａｂ２＝ｗｔ  ＩｇＧ４  ＣH、および抗体２＝ｓＩｇＧ１、対照Ａｂ３＝ｗｔ  ＩｇＧ１  ＣH。）
【図９】ＰＢＭＣ増殖アッセイにおける細胞生存に関する半最大濃度（ＥＣ50）を示す、用量反応曲線である。（対照抗体１＝ｗｔ  ＩｇＧ１  ＣH、抗体１＝ｓＩｇＧ４、対照Ａｂ２＝ｗｔ  ＩｇＧ４  ＣH、抗体２＝ｓＩｇＧ１、対照Ａｂ３＝ｗｔ  ＩｇＧ１  ＣH、および対照Ａｂ４＝ｗｔ  ＩｇＧ１  ＣHを持つ非特異的Ａｂ）。
【図１０】野生型またはキメラヒンジＣH領域を有する抗体の存在下でのＤａｕｄｉ（図１０Ａ）およびＲａｊｉ（図１０Ｂ）細胞に関するＣＤＣ活性の欠如を示す、用量反応曲線である。（対照抗体５＝ｗｔ  ＩｇＧ１  ＣHを持つ二重特異性Ａｂ、抗体３＝ｓＩｇＧ１*、抗体４＝ｓＩｇＧ１*、ＩｇＧ１アイソタイプ対照＝ｗｔ  ＩｇＧ１  ＣHを持つ非特異的Ａｂ。）
【図１１】野生型またはキメラヒンジＣH領域を有する抗体の存在下でのＤａｕｄｉ（図１１Ａ）およびＲａｊｉ（図１１Ｂ）細胞に関するＡＤＣＣ活性の欠如を示す、用量反応曲線である。（対照抗体５＝ｗｔ  ＩｇＧ１  ＣHを持つ二重特異性Ａｂ、抗体３＝ｓＩｇＧ１*、抗体４＝ｓＩｇＧ１*、ＩｇＧ１アイソタイプ対照＝ｗｔ  ＩｇＧ１  ＣHを持つ非特異的Ａｂ。）
【発明を実施するための形態】
【００５１】
特定の方法および記載される実験条件は変動するため、本発明は、そのような方法および条件に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明の範囲が特許請求の範囲によって定義されるため、限定するよう意図されないことも理解されたい。
【００５２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により別様に明確に示され
ない限り、複数形の指示対象を含む。故に例えば、「方法（ａ  ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、１つ以上の方法、ならびに／または本明細書に記載のおよび／もしくは本開示を読む際に当業者には明らかとなるであろう型のステップを含む。
【００５３】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載のものと同様もしくは同等の任意の方法および物質を本発明の実践において使用することができるが、特定の方法および物質を、これから説明する。本明細書で触れられる全ての出版物は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５４】
「免疫グロブリン」という用語は、ポリペプチドの２つの鎖、軽（Ｌ）鎖の１ペア、および重（Ｈ）鎖の１ペアからなり、４つ全てがジスルフィド結合によって内部接続され得る、構造的に関係した糖タンパク質を指す。免疫グロブリンの構造は、よく特徴付けられている。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。端的には、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＶHまたはＶＨと略記され
る）および重鎖定常領域（ＣHまたはＣＨ）を典型的に含む。本明細書で使用される「重
鎖定常領域」は、３つのドメイン、ＣH１、ＣH２、およびＣH３を典型的に含み、一方で
、ＣH１およびＣH２ドメインは、ヒンジ、またはその機能的断片によって連結される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＶLまたはＶＬと略記される）および軽鎖定常領域を
典型的に含む。ヒトおよび他の哺乳動物における軽鎖は、カッパ（κ）鎖およびラムダ（λ）鎖の２種類がある。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣL）を典型的に含む。ＶHおよびＶL領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存される領域を組み入れ
た、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域（または、配列および／もしくは構造的に画定された輪の形態において超可変であり得る超可変領域）に更に細分され得る。各ＶHおよびＶLは、典型的に、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で、アミノ末端（Ｎ末端）からカルボキシ末端（Ｃ末端）に配列される（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１−９１７（１９８７）を参照されたい）。典型的に、この領域におけるアミノ酸残基の付番は、ＩＭＧＴ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に従うか、または例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５th  ｅｄ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）においてのように、ＫａｂａｔのＥＵ付番方式（「ＥＵ付番」または「ＥＵインデックス」としても知られる）による。
【００５５】
本明細書で使用される「抗体」（Ａｂ）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子またはその誘導体を指す。免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変領域は、「免疫グロブリン」の下で上に概説した通り、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体はまた、二重特異性抗体、ダイアボディ、または同様の分子でもあり得る（ダイアボディの説明については、例えば、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０（１４），６４４４−８（１９９３）を参照されたい）。更に、抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片、すなわち、「抗原結合断片」または「抗原結合タンパク質」によって行われ得ることが示されている。完全抗体分子の場合のように、抗原結合タンパク質は、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であってもよい。「抗体」という用語内に包含される結合分子または断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ’またはＦａｂ断片、ＶL、ＶH
、ＣL、およびＣH１ドメインからなる一価断片、または国際公開第ＷＯ２００７０５９７８２号に記載の一価抗体、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）2断片、ヒンジ領域でジスルフィド橋に
よって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）本質的にＶHおよびＣH１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）本質的にＶLおよびＶHドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９））であって、本質的にＶHドメインからなり、ドメイン抗体（Ｈｏｌｔ  ｅｔ
ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３  Ｎｏｖ；２１（１１）：４８４−９０）とも呼ばれるｄＡｂ断片、（ｖｉ）ラクダ科またはナノボディ（Ｒｅｖｅｔｓ
ｅｔ  ａｌ；Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００５  Ｊａｎ；５（１）：１１１−２４）、ならびに（ｖｉｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでの、もしくは遺伝子再構成中の無作為または部位特異的変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）。
【００５７】
抗体（例えば、二重特異性抗体）の多重特異性抗原結合断片は、典型的に少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、個々の抗原に、または同一の抗原上の異なるエピトープに、特異的に結合することができる。本明細書で開示の二重特異性抗体フォーマットを含む任意の多重特異性抗体フォーマットは、当技術分野で利用できる通常の技法を使用して、本発明の抗体の抗原結合断片の文脈における使用に採用することができる。
【００５８】
また更に、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶLおよびＶHは個々の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶL領域およびＶH領域が対を成して一価分子（一本鎖抗体または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成する単一タンパク質鎖としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって、組み換え方法を使用して、接合され得る。例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，４２３−４２６（１９８８）およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５，５８７９−５８８３（１９８８）を参照されたい。そのような一本鎖抗体は、別途記載されるか、または文脈によって明確に示されない限り、「抗体」という用語内に包含される。そのようなポリペプチドは抗体の意味の内に概して含まれるが、それらは、集合でも各々独立してでも、本発明の固有の特徴であり、異なる生物学的特性および有用性を呈する。これらおよび他の抗体断片、ならびに本発明の文脈において有用である組み換えポリペプチドを、本明細書で更に考察する。また、抗体という用語は、別途指示のない限り、酵素切断、ペプチド合成、および組み換え技法などの任意の既知の技法によって提供される、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、キメラ抗体およびヒト化抗体などの抗体様ポリペプチド、ならびに抗原に特異的に結合する能力を保持する任意の抗体断片（抗原結合断片または分子）も含むことを、理解されたい。生成された抗体は、いかなるＩｇアイソタイプまたはその組み合わせをも処理することができる。いかなるｓｃＦｖも、公知の技法によって本発明の重鎖定常領域に融合され得る。
【００５９】
本発明の文脈において使用され得る他の例示的な二重特異性としては、例えば、ｓｃＦｖ系二重特異性フォーマット、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、クアドローマ、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）、共通軽鎖（例えば、ノブ・イントゥ・ホールを持つ共通軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ｂｏｄｙ、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧ、およびＭａｂ２二重特異性フォーマットを含むが、これらに限定されない（例えば、上述のフォー
マットの再考察については、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ  ４：６，１−１１、および本明細書で引用される参考文献を参照されたい）。二重特異性抗体はまた、例えば、直交化学反応性を持つ非天然アミノ酸を使用して、その後画定された組成物、原子価、形状によって多量体へと自己組織化する部位特異的抗体オリゴヌクレオチド複合体を生成する、ペプチド／核酸複合体を使用して構築され得る（例えば、Ｋａｚａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９；１３５（１）：３４０−６［Ｅｐｕｂ：Ｄｅｃ．２１，２０１２］を参照されたい）。
【００６０】
更なる例示的な多重特異性フォーマットが本発明の文脈において使用され得、例えば、標的分子を特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、および内在化エフェクタータンパク質を特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを伴い、そのような第２の抗原結合ドメインが、エフェクタータンパク質、例えば、受容体を活性化および内在化することができることを含むがこれに限定されない。（参照により組み込まれる、２０１３年９月１９日に公開された、米国出願公開第２０１３／０２４３７７５Ａ１号を参照されたい。）
【００６１】
組み換えタンパク質は、当業者に公知の標準的な分子生物学技法によって産生され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｓ  １，２，ａｎｄ  ３，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照されたい）。
【００６２】
「相補性決定領域」という語句または「ＣＤＲ」という用語は、有機体の免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。ＣＤＲは、通常（すなわち、野生型動物の文脈において）、例えば、抗体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の軽鎖または重鎖の可変領域におけるより保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）内に組み入れられる超可変性の領域である。ＣＤＲは、例えば、生殖細胞系列配列、または再構成もしくは非再構成配列によって、および例えば、未感作もしくは成熟Ｂ細胞またはＴ細胞によってコードされ得る。一部の状況では（例えば、ＣＤＲ３についての）、ＣＤＲは、例えば、配列のスプライスまたは接続（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するためのＶ−Ｄ−Ｊ再構成）の結果として、（例えば、非再構成核酸配列中で）隣接していないがＢ細胞核酸配列中では隣接している、２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系列配列）によってコードされ得る。
【００６３】
本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」という用語は、少なくともマイクロモル範囲のＫDで、選択的に抗原を認識し、それに結合することができる重鎖または軽鎖のアミ
ノ酸配列である。本発明の抗原結合ドメインは、少なくとも１つのＣＤＲを含む。
【００６４】
「可変ドメイン」という語句は、Ｎ末端からＣ末端の配列中（別途指示のない限り）、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４のアミノ酸領域を含む、免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸配列（所望のように修飾）を含む。「可変ドメイン」は、二重ベータシート構造を有する正準（ＶＨまたはＶＬ）へと折り畳むことができるアミノ酸配列を含み、ベータシートは、第１のベータシートおよび第２のベータシートの残基間のジスルフィド結合によって接続される。
【００６５】
本明細書で使用される「重鎖」または「免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖」という語句は、任意の有機体からのＩｇ重鎖定常領域配列を含み、別途指示のない限り、重鎖可変ドメインを含む。重鎖可変ドメインは、別途指示のない限り、３つの重鎖ＣＤＲおよび４つのＦＲ領域を含む。重鎖可変ドメインの断片は、ＣＤＲ、またはＣＤＲとＦＲとの両方を含む
。典型的な重鎖定常領域は、可変領域（Ｎ末端からＣ末端）の後に、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有する。抗原結合タンパク質中の重鎖の機能的断片は、細胞中で発現され、細胞から分泌されることができ、かつ少なくとも１つのＣＤＲを含み、抗原を特異的に認識する（例えば、マイクロモル、ナノモル、またはピコモル範囲のＫDで抗原を認識する）ことができる、断片を含む。本発明の目的に対して
は、重鎖定常領域の機能的断片は、少なくともＦｃドメインまたはその断片を含む。
【００６６】
「Ｆｃ含有タンパク質」という語句は、抗体、二重特異性抗体、抗体結合断片、トラップ分子、および他の受容体−Ｆｃ融合タンパク質、ならびに、リガンド−Ｆｃ融合タンパク質などの、免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３領域の機能部分を少なくとも含む他の結合タンパク質を含む。「機能部分」は、Ｆｃ受容体、例えば、ＦｃγＲ（つまり、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、またはＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ））、またはＦｃＲｎ（抗体にそれらの延長した半減期を授ける新生児Ｆｃ受容体）に結合することができる、ＣＨ２およびＣＨ３領域を指す。ＣＨ２およびＣＨ３領域が、欠失、置換、および／もしくは挿入、または一切のＦｃ受容体の結合を不能にする他の修飾を含む場合、ＣＨ２およびＣＨ３領域は、非機能的であると見なされる。このように、ある特定のエフェクター機能の減衰または排除が所望される場合、一切のＦｃ含有タンパク質は、本明細書に記載のように、キメラ重鎖定常領域または断片を含むように操作され得る。
【００６７】
「Ｆｃ融合タンパク質」という語句、および具体的には「受容体−Ｆｃ融合タンパク質」は、本明細書に記載の機能的Ｆｃ断片を含有するように操作された組み換えタンパク質を含む。例えば、「受容体−Ｆｃ融合タンパク質」は、ＩｇのＦｃドメインのアミノ酸配列に融合した受容体タンパク質のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を含む。融合タンパク質中で使用される受容体タンパク質の例は、当技術分野で既知である（例えば、Ｋｌｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７２（２）：１６３−８（１９９７）、Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．１０（１７）：１９８９−２００１（２００４）、およびＳｃｈｗａｃｈｅ  Ｄ，ａｎｄ  Ｍuｌｌｅｒ−Ｎｅｗｅｎ  Ｇ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９１（６−７）：４
２８−３４（２０１２），ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｊｃｂ．２０１１．０７．００８．Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｓｅｐ  ２９を参照されたい）。
【００６８】
本発明の文脈において、受容体−Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に記載の通り、キメラ重鎖定常領域のヌクレオチド配列に融合した受容体タンパク質をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、受容体タンパク質のヌクレオチド配列は、リガンド結合ドメインまたは受容体の細胞外ドメインをコードする。他の実施形態では、受容体タンパク質のヌクレオチド配列は、受容体の細胞外ドメインおよび受容体の膜貫通ドメインをコードする。受容体−Ｆｃ融合タンパク質はまた、米国第２００９０１３７４１６  Ａ１号で例証される。
【００６９】
ｈＦｃγＲＩを利用するフローサイトメトリー系自家分泌トラップ（ＦＡＳＴＲ）方法は、本発明の抗体または受容体−Ｆｃ融合タンパク質を発現または分泌している高発現クローンの迅速な単離を可能にする。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国第２００９０１３７４１６  Ａ１号を参照されたい。）そのような高発現クローンを採用して、本発明のキメラ重鎖定常領域を含むタンパク質を発現している細胞を単離し得る。ＦＡＳＴＲ方法を利用して、本発明の任意の組み換えポリペプチド、抗原結合タンパク質、抗体、またはＦｃ融合タンパク質を発現している細胞を、直接的にスクリーニングおよび単離し得る。
【００７０】
「軽鎖」という語句は、いかなる有機体からの免疫グロブリン軽鎖定常領域配列をも含
み、別途指示のない限り、ヒトカッパおよびラムダ軽鎖を含む。軽鎖可変（ＶＬ）ドメインは、典型的に、３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。概して（すなわち、野生型動物の文脈において）、完全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含むＶＬドメイン、および軽鎖定常ドメインを含む。
【００７１】
本発明のポリペプチドは、免疫グロブリンドメインに由来するアミノ酸配列を含む。指定のタンパク質「に由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ポリペプチドの起源を指す。
【００７２】
本明細書で使用される「ヒンジ」という用語は、ＣH１のＣ末端を免疫グロブリンのＣH２ドメインのＮ末端に接続する、連続するアミノ酸残基の領域を含むように意図される。ＣH２エクソンによってコードされるＣH２ドメインのＮ末端のいくつかのアミノ酸も、「下部ヒンジ」の一部であると見なされる。どの理論にも束縛されることなく、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４のヒンジ領域のアミノ酸は、別個のヒンジエクソンによってコードされる１２〜１５個の連続するアミノ酸と、ＣH２ドメインのいくつかのＮ末端アミ
ノ酸（ＣH２エクソンによってコードされる）とを含むことを特徴とする（Ｂｒｅｋｋｅ
，Ｏ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １６（２）：８５−９０（１９９５））。一方で、ＩｇＧ３は、ＩｇＧ１のヒンジ領域に類似する１つの上部分節、およびＩｇＧ３に固有の同一のアミノ酸の反復である３つの分節という４つの分節からなるヒンジ領域を含む。
【００７３】
本発明の実践者の便宜のため本開示では、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４についてのヒンジ領域のアミノ酸は、ＩＭＧＴ（登録商標）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｈａｒｔ、ＩＭＧＴ（登録商標），ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ、２００１年５月１７日作成、２０１３年１月１０日最終更新、に従って更新された、「ＥＵ付番」または「ＥＵインデックス」としても知られる、ＫａｂａｔのＥＵ付番方式（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５th  ｅｄ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１））によって、本明細書で識別されている。
【００７４】
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４ヒンジアミノ酸についてのＥＵ付番と、ＩＭＧＴ固有ドメイン付番、ＩＭＧＴエクソン付番、およびＫａｂａｔ付番慣例（上記Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１も参照されたい）との間の対応は、図１および以下に記載される。
【００７５】
【表１】
2020114242.tif 000003
【００７６】
【表２】
2020114242.tif 000004
【００７７】
【表３】
2020114242.tif 000005
【００７８】
【表４】
2020114242.tif 000006
【００７９】
【表５】
2020114242.tif 000007
【００８０】
【表６】
2020114242.tif 000008
【００８１】
本開示の目的に対して、「上部ヒンジ」領域は、ＥＵ付番に従う２１６位〜２２７位のアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ付番に従う２２６位〜２４０位のアミノ酸残基）を含むように意図される（図２も参照されたい）。「下部ヒンジ」領域は、ＥＵ付番に従う２２８位〜２３６位のアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ付番に従う２４１位〜２４９位のアミノ酸残基）を含むように意図される（図２も参照されたい）。
【００８２】
本明細書で使用される「キメラ」という用語は、異なる起源の部分から構成されることを意味する。「キメラタンパク質」という語句は、自然では通常連結されない、第２のアミノ酸タンパク質に連結される第１のアミノ酸タンパク質を含む。アミノ酸配列は通常、個々のタンパク質として、または同一のタンパク質上の異なる配列で存在してもよく、新たな配列の融合ポリペプチドにまとめられる。キメラタンパク質は、当技術分野で公知の種々の方法によって、例えば、化学合成によってか、または所望の配列にあるキメラタンパク質のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを創出することによって、創出し得る。例示的なキメラタンパク質としては、ＩｇＧの重鎖ドメインを接続するキメラヒンジ配列、本発明のヒト抗体、抗原結合タンパク質、および受容体−Ｆｃ融合タンパク質を作製するために操作した融合タンパク質が挙げられる。
【００８３】
本明細書で開示のキメラタンパク質は、例えば、野生型ＩｇＧのＦｃ領域またはドメインと比較して、接合部における免疫原性エピトープの創出を最小化するように操作した。本発明の操作したタンパク質は、したがって、減少した免疫原性を有し、Ｆｃ受容体への結合の減少、およびエフェクター機能の減少または喪失を示す。
【００８４】
本明細書で使用される「キメラヒンジ」は、１つのＩｇ分子のヒンジ領域に由来する第１のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質と、異なるクラスまたはサブクラスのＩｇ分子のヒンジ領域に由来する第２のアミノ酸配列とを含むように意図される。本発明の例示的なキメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する、第１のアミノ酸配列、または「上部ヒンジ」配列、およびヒトＩｇＧ２ヒンジ領域に由来する、第２のアミノ酸配列、または「下部ヒンジ」配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のまたは「上部ヒンジ」配列は、ＥＵ付番に従う２１６位〜２２７位のアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、第２のまたは「下部ヒンジ」配列は、ＥＵ付番に従う２２８位〜２３６位のアミノ酸残基を含む。
【００８５】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、ＣＤＲ配列が、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来し、ヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含むように意図される。ヒト化モノクローナル抗体は、不死化細胞に融合させた、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、遺伝子導入マウスなどの遺伝子導入または染色体導入非ヒト動物から採取したＢリンパ球細胞を含むハイブリドーマによって生成し得る。例えば、非ヒト抗体を特定の抗原に関して調製する場合、非ヒト抗体に由来するＣＤＲをヒト抗体中に存在するＦＲ上に移植して修飾することによって、可変領域を「再形成」または「ヒト化」することができる。この手法の適用は、Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：８５１−８５６（１９９３）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：７７３−３７８３（１９９１）、Ｍａｅｄａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：１２４−１３４（１９９１）、Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：４１８１−４１８５（１９９１）、Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６−２７１（１９９１）、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ
ＳＡ  ８８：２８６９−２８７３（１９９１）、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５−４２８９（１９９２）、およびＣｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：１１４９−１１５４（１９９２）によって報告されている。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体からの６つ全てのＣＤＲを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、元の抗体からの１つ以上のＣＤＲ「に由来する」とも言われる、元の抗体に関して改変される１つ以上のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）を有する。ヒト化抗体は、組み換え技法を使用して調製したキメラ分子を指してもよい。
【００８６】
別の実施形態では、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥマウスによって生成される細胞系によって産生されるものなどのネズミ科の定常領域に連結されたヒト可変領域を含むキメラ抗体は、ネズミ科の定常領域を、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３８、または配列番号３７を含むヒト定常領域に代置することによって、ヒト化される。
【００８７】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープへの単一結合特異性および親和性を示す。そのため、「マウスまたはネズミ科のモノクローナル抗体」という用語は、ネズミ科またはマウスの生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する、単一結合特異性を示す抗体を指す。
【００８８】
本明細書で使用される場合、例えば所定の抗原かＦｃＲかのどちらかへの、抗体、Ｉｇ、抗体結合断片、またはＦｃ含有タンパク質の結合という文脈における「結合」という用語は、典型的に、抗体抗原相互作用またはＦｃ含有タンパク質対ＦｃγＲなどの、最低２つの実体または分子構造間の相互作用または会合を指す（ここでＦｃ含有タンパク質は、抗体、Ｉｇ、抗体結合断片、またはＦｃ含有タンパク質、例えば、受容体−Ｆｃ融合である）。
【００８９】
例えば、結合親和性は、典型的に、リガンドとして抗原またはＦｃＲを、分析物（または抗リガンド）として抗体、Ｉｇ、抗体結合断片、またはＦｃ含有タンパク質を使用して、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００計器中で、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技法によって判定される場合に、１０-9Ｍ以下など、約１０-8Ｍ以下など、約１０-7Ｍ以下のＫD
値に対応する。そのため、抗体または他の結合タンパク質は、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対するその親和性よりも、少なくとも１０，０００倍低い、例えば少なくとも１００，０００倍低いなど、少なくとも１００倍低い、例えば少なくとも１，０００倍低いなど、少なくとも１０倍低いＫD値に対応する親和性を持つ、所定の
抗原または受容体に結合する。
【００９０】
本明細書で使用される「ＫD」（Ｍ）という用語は、特定の抗体抗原相互作用の解離平
衡定数、または抗体、Ｉｇ、抗体結合断片、もしくはＦｃ含有タンパク質のＦｃγＲに対する解離平衡定数を指す。ＫDと結合親和性との間には反比例関係があるため、ＫD値が小さいほど、親和性は高くなる。故に、「より低い親和性」という用語は、より低い相互作用を形成する能力、およびそれによるより大きいＫD値に関係する。
【００９１】
本明細書で使用される「ｋd」（ｓｅｃ-1または１／ｓ）という用語は、特定の抗体抗
原相互作用の解離速度定数、または抗体、Ｉｇ、抗体結合断片、もしくはＦｃ含有タンパク質のＦｃγＲに対する解離速度定数を指す。該値はまた、ｋoff値としても言及される
。
【００９２】
本明細書で使用される「ｋa」（Ｍ-1×ｓｅｃ-1または１／Ｍ）という用語は、特定の
抗体抗原相互作用の会合速度定数、または抗体、Ｉｇ、抗体結合断片、もしくはＦｃ含有タンパク質のＦｃγＲに対する会合速度定数を指す。
【００９３】
本明細書で使用される「ＫA」（Ｍ-1または１／Ｍ）という用語は、特定の抗体抗原相
互作用の会合平衡定数、または抗体、Ｉｇ、抗体結合断片、もしくはＦｃ含有タンパク質のＦｃγＲに対する会合平衡定数を指す。会合平衡定数は、ｋaをｋdで割ることによって得られる。
【００９４】
本明細書で使用される「ＥＣ50」または「ＥＣ５０」という用語は、指定の露出時間後の基準値と最大値との中間の応答を含む抗体の濃度を誘導する、半最大有効濃度を指す。ＥＣ50は、その最大効果の５０％が観察される抗体の濃度を実質的に表す。故に、増加したＥＣ50または半最大有効濃度値と共に、減少した結合が観察される。
【００９５】
一実施形態では、減少した結合を、半最大量の標的細胞への結合を可能にする増加したＥＣ50抗体濃度として画定することができる。
【００９６】
一部の実施形態では、減少した細胞傷害活性を、半最大量の標的細胞の溶解を可能にする減少したＥＣ50抗体濃度として画定することができる。
【００９７】
他の実施形態では、減少した増殖を、半最大量の標的細胞の増殖を可能にする減少したＥＣ50抗体濃度として画定することができる。
【００９８】
本明細書で使用される「二重特異性抗体」という語句は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的である抗体、または２つ以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る抗体を含む。例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９を参照されたい。例えば、ヒト抗体は、別の機能分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質に連結するか、またはそれと共発現することができる。例えば、抗体またはその断片は、別の抗体または抗体断片などの１つ以上の他の分子実体に機能的に連結して（例えば、化学的結合、遺伝子融合、非共有結合性会合、またはその他の方法によって）、第２の結合特異性を持つ二重特異性または多重特異性抗体を産生することができる。このように、二重特異性抗体は、異なる特異性の２つの抗体も含む。
【００９９】
例えば共通軽鎖を使用する別の方策を、異なる特異性の２つの抗体が同一の軽鎖を使用するという米国特許出願公開第２０１００３３１５２７Ａ１号に記載のように採用してもよい。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体におけるＩｇ重鎖のうち少なくとも１つの重鎖を、本発明の組み換えポリペプチドを含むキメラ重鎖定常領域を含むように修飾する。一部の実施形態では、重鎖のうち少なくとも１つをＣＨ３ドメイン中で修飾することで、単離の利便性のために、タンパク質Ａなどの親和性試薬に対する二重特異性抗体への分化親和性をもたらす。別の実施形態では、そのような二重特性抗体における重鎖のうち少なくとも１つは、ＩＭＧＴ付番方式におけるｉ）９５Ｒまたはｉｉ）９５Ｒおよび９６Ｆ（９５Ｒおよび９６Ｆは、ＥＵ付番方式における４３５Ｒおよび４３６Ｆに対応する）、例えば、配列番号３７および配列番号３８でアミノ酸修飾を含む。（その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国第２０１００３３１５２７Ａ１号を参照されたい。）抗体の多重特異性抗原結合断片は、典型的に、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、個々の抗原に、または同一の抗原上の異なるエピトープに、特異的に結合することができる。任意の多重特異性抗体フォーマットは、当技術分野で利用できる通常の技法を使用して、本発明の抗原結合タンパク質または抗体という文脈における使
用に採用することができる。
【０１００】
本明細書で使用される「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ）を指す。
【０１０１】
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的結合を可能にする抗原決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の表面分類からなり、通常、特定の３次元構造特性ならびに特定の電荷特性を有する。立体構造および非立体構造エプトープは、後者ではなく前者への結合が、変性溶媒の存在中で失われることにおいて区別される。エピトープは、結合に直接的に関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優勢成分とも呼ばれる）、および、特定の抗原結合ペプチドによって効果的に妨害されるアミノ酸残基（言い換えると、アミノ酸残基は特定の抗原結合ペプチドのフットプリント内にある）などの、結合に直接的に関与しない他のアミノ酸残基を含み得る。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、ヒト化抗体は、抗体が、ヒト免疫グロブリン配列を使用して、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を担持する遺伝子導入マウスに免疫性を与えることにより、またはヒト免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングすることにより、系から採取される場合、特定の生殖細胞系列配列「に由来」し、ここで、選択したヒト抗体Ｖドメイン配列は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸Ｖドメイン配列において、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％など、少なくとも９７％、例えば、少なくとも９８％など、または少なくとも９９％など、少なくとも９０％同一である。
【０１０３】
典型的に、重鎖ＣＤＲ３の外側では、特定のヒト生殖細胞系列配列に由来するヒト抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列との、２０アミノ酸以下の差異、例えば、９、８、７、６、または５以下、例えば、４、３、２、または１アミノ酸以下の差異など、１０アミノ酸以下の差異を示す。
【０１０４】
「遺伝子導入非ヒト動物」という用語は、１つ以上のヒト重鎖および／または軽鎖導入遺伝子または導入染色体（動物の天然ゲノムＤＮＡ中に統合されるか、あるいは統合されない）を含み、完全ヒト抗体を発現することができるヒトゲノムを有する、非ヒト動物を指す。完全にヒトであるか、または部分的にヒトであり部分的にマウスである抗体を発現するマウスが、これまでに報告されている。例えば、遺伝子導入マウスは、ヒト軽鎖導入遺伝子と、ヒト重鎖導入遺伝子かヒト重鎖導入染色体かのどちらかとを有することで、マウスが、標的抗原および／または標的抗原を発現している細胞で免疫性を与えられるときに、ヒト抗体を産生できるようにし得る。ヒト重鎖導入遺伝子は、遺伝子導入マウス、例えば、ＨＣｏ７またはＨＣｏｌ２マウスなどのＨｕＭＡｂマウスの場合のように、マウスの染色体ＤＮＡ中に統合されてもよく、あるいはヒト重鎖導入遺伝子は、国際公開第ＷＯ０２／４３４７８に記載のような染色体導入ＫＭマウスの場合のように、染色体外で維持されてもよい。そのような遺伝子導入および染色体導入マウス（本明細書では「遺伝子導入マウス」として総称される）は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組み換えおよびアイソタイプスイッチングを受けることにより、所与の抗原（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及び／またはＩｇＥなど）に複数のアイソタイプのヒトモノクローナル抗体を産生することができる。
【０１０５】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）遺伝子操作マウスは、内生マウス座位での再構成されていないＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子分節の、ヒトＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子区分との代置を含む。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有するキメラ抗体を発現する（例えば、米国特許第７，６０５，２３７号を参照されたい）。大部分の他の報告は、無効な内生免疫グロブリン座位を持つマウス中の完全ヒト導
入遺伝子からの完全ヒト抗体を発現するマウスに関する。
【０１０６】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、マウスが、抗原性刺激に反応してヒト重鎖可変領域およびマウス重鎖定常領域を含む抗体を産生できるように、内生マウス定常領域座位に作動可能に連結されたヒト可変領域を含むゲノムを有することを、一部に含む。抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡは、単離し、本発明のヒト重鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に連結することができる。その後、ＤＮＡを、抗体の完全ヒト重鎖の発現が可能な細胞中で発現させることができる。
【０１０７】
遺伝子導入の非ヒト動物はまた、そのような特定の抗体をコードする動物遺伝子中に取り込むことによって、例えば、遺伝子を、動物の乳中で発現される遺伝子に作動的に連結することによって、特定の抗原に対する抗体の産生に使用することもできる。
【０１０８】
本明細書で使用される「エフェクター機能」という語句は、ＦｃγＲへの結合の際にＦｃ含有タンパク質によって授けられる機能的能力を含むように意図される。どの理論にも束縛されることなく、Ｆｃ／ＦｃγＲ錯体の形成によって種々のエフェクター細胞が結合抗原部位に補充されることにより、典型的に、細胞内の多様なシグナル伝達事象および重要な後続の免疫応答がもたらされる。
【０１０９】
「エフェクターのないポリペプチド」は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプの野生型重鎖定常領域を含む、対応する組み換えポリペプチド、抗原結合タンパク質、または抗体と比較したときに、改変されたまたは減少したエフェクター機能を有する、組み換えポリペプチド、抗原結合タンパク質、または抗体を指す。一部の実施形態では、減少するまたは改変されるエフェクター機能は、細胞傷害性エフェクター機能、例えば、細胞傷害性、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、または抗体依存性細胞貧食（ＡＤＣＰ）である。一実施形態では、減少するまたは改変されるエフェクター機能は、補体依存性細胞傷害性である。別の実施形態では、減少するまたは改変されるエフェクター機能は、抗体依存性細胞傷害性である。他の実施形態では、減少するまたは改変されるエフェクター機能は、細胞増殖である。
【０１１０】
いくつかの抗体エフェクター機能は、典型的な免疫グロブリンの定常ドメイン（具体的には、ＣH２およびＣH３ドメイン）における抗体のＦｃ領域に結合するＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって、少なくとも一部媒介される。免疫グロブリンの異なるクラス、すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＤに特異的な、ある数のＦｃ受容体がある。ヒトＩｇＧのＦｃ受容体ファミリーは、高親和性を持つＩｇＧに結合することができるＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、共に低親和性受容体であるＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）という３つの群に分けられる。各ＦｃγＲサブクラスは２つまたは３つの遺伝子によってコードされ、代替的なＲＮＡスプライシングは複数の転写産物を導くため、ＦｃγＲアイソフォームの幅広い多様性が存在する（例えば、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４、ＦＣＧＲ１Ａ）、ＦｃγＲＩＢ（ＣＤ６４、ＦＣＲＧ１Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２、ＦＣＧＲ２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２、ＦＣＧＲ２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＣ  （ＣＤ３２、ＦＣＧＲ２Ｃ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ、ＦＣＧＲ３Ａ）、およびＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ、ＦＣＧＲ３Ｂ））。加えて、ＦｃＲｎ、または新生児Ｆｃ受容体（Ｆｃ受容体輸送体、アルファ、またはＦＣＧＲＴとしても知られる）は、胎盤を通過して母親から胎児へＩｇＧ抗体を移送することができる。また更に、Ｆｃ受容体は、例えば、Ｂ細胞、単球、樹枝状細胞、好中球、およびある特定のリンパ球を含む、種々の細胞上で発現される。例えば、ヒト単球細胞系であるＵ９３７細胞は、ＦｃγＲＩとＦｃγＲＩＩＡとの両方を発現する（例えば、Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３５（５）：３３４８−５３（１９８５）およびＢｒｏｏｋｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７０：１３６９−８５（Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９８９）を参照
されたい）。
【０１１１】
Ｉｇ  Ｆｃのその受容体への結合は、これらのエフェクター細胞を結合抗原の部位へと持って行き、Ｂ細胞活性化、炎症応答、細胞傷害性応答、および食細胞応答を含む、種々のシグナル応答および免疫応答を最終的に引き起こす。このように、Ｉｇ  Ｆｃのその受容体への結合の減少または改変は、エフェクター機能の減少をもたらす。
【０１１２】
あるいは、細胞傷害性、補体依存性細胞傷害性（「ＣＤＣ」）、抗体依存性細胞傷害性（「ＡＤＣＣ」）、および異常抗体産生などの「エフェクター機能」の増大は、ある特定の治療用抗体と関連付けられる不要な副作用であり得る。
【０１１３】
「抗体依存性細胞傷害性」、「抗体依存性細胞依存性細胞傷害性」、または「ＡＤＣＣ」は、特異的抗体が標的細胞の細胞表面抗原に付着したときに、Ｆｃγ受容体を保有する細胞（免疫細胞など）がＦｃγ受容体を通して特異的抗体のＦｃ部分に結合するときの、標的細胞を損傷する活性を意味する。故に、ＡＤＣＣは、それによりＦｃ受容体陽性エフェクター細胞が付着性抗原特異的分子を有する標的細胞を溶解することができる、機序である。ＡＤＣＣ活性は、カルセインＡＭ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，３４９−０７２０１）などの蛍光染料を使用して蛍光強度を測定することを含む、ある数の公知の方法によって評価することができる。この手法を採用する場合には、細胞傷害活性（％）は、方程式（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００に従い、得られた値を使用して計算することができ、式中、Ａは各試料中の蛍光値であり、Ｂは、溶解され、１％の最終濃度を有するＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０を伴う媒体中に放出された細胞の平均蛍光値であり、Ｃは、媒体のみを添加したときの平均蛍光値である。
【０１１４】
本明細書で使用される「抗体依存性細胞貧食」または「ＡＤＣＰ」という語句は、細胞溶解を誘導するのではなく、標的細胞を取り込むことによって標的細胞を排除する（または殺傷する）エフェクター機能に関係する。ＡＤＣＰは、腫瘍細胞を殺傷するための重要なインビボにおける機序であり得る。ＡＤＣＰは、２色蛍光フローサイトメトリー法、例えば、試験細胞を差別化するために異なる細胞表面タンパク質に対してＰＫＨ２（緑色蛍光染料）およびフィコエリトリン共役（赤色）モノクローナル抗体を利用することで、貧食活性および貧食率を判定する方法によって、測定することができる。ＦｃγＲＩＩｂと比べてＦｃγＲＩＩａを選択的に活性化する治療方策は、マクロファージ貧食作用を促進し得る（Ｒｉｃｈａｒｄｓ，ＪＯ，ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ７（８）：２５１７−２７）。
【０１１５】
本明細書で使用される「補体対象細胞傷害性」または「ＣＤＣ」という語句は、補体系による細胞傷害活性を含む。ＣＤＣ活性は、公知の方法、例えば、標準的なプロトコルに従って、標的細胞、抗体、および補体溶液（子ウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）など）をインキュベートし、反応させること（ＮＩＡＩＤ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９７９−１９８０，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊ．Ｇ．Ｒａｙ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＩＨ−８３−５４５）によって測定する。細胞傷害活性は、ＡＤＣＣ活性の測定と同一の様式で計算することができる。細胞傷害活性はまた、ＡＤＣＣに関する上記と同様に、蛍光染料（カルセインなど）または放射性染料を使用して測定することもできる。
【０１１６】
「細胞傷害性」または「直接細胞傷害性」という語句は、ＮＫ細胞に非依存であるものを含む、一切の細胞傷害活性を含む。細胞傷害性は、当技術分野で公知の技法、例えば、細胞溶解または細胞死滅、すなわち、アポトーシスを判定することによって、測定し得る。直接細胞溶解、または細胞殺傷は、カルセインを使用し、上文でＡＤＣＣに関して記載したものと同様の様式で平均蛍光値を計算して、蛍光強度を測定することを含む、ある数
の公知の方法によって評価することができる。あるいは、抗体などの細胞傷害性分子は、制御された細胞死滅の遺伝的プログラムを活性化することによって、アポトーシスアッセイ中で有効である。アポトーシスは、細胞の屈折率、細胞質収縮、核凝縮、および一定サイズの断片へのＤＮＡの切断における変化を含む、明確に画定された細胞学的および分子事象を特徴とする。アポトーシスを受けている細胞は、代謝を停止し、膜統合性を喪失し、膜ブレブを形成する。アポトーシス活性は、死滅しかけているおよび／または死滅した細胞の標準的な判定方法を使用して測定する。アポトーシスを測定するために、細胞傷害性アッセイを採用し得る。死滅しかけている細胞は漏れやすいため、これらのアッセイは、細胞膜透過性の増大を測定する放射性または非放射性アッセイであってもよく、死滅した細胞中のミトコンドリアは染料を代謝できないが生きた細胞中のミトコンドリアはできるという事実に基づいて、ミトコンドリアの代謝活性の減少を測定する比色アッセイを採用してもよい。生物発光細胞傷害性アッセイ（例えば、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ）は、安定したプロテアーゼマーカーの細胞培地への放出を測定するために開発された。プロテアーゼ活性は、強固な酵素細胞死滅マーカーであり、生存および死滅細胞のレシオメトリック測定として使用し得る（Ｎｉｌｅｓ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，３６６（２）：１９７−２０６，１５  Ｊｕｌｙ  ２００７）。
【０１１７】
細胞表面の外側にホスファチジルセリンを発生させる、膜非対称における改変などのアポトーシスの早期指標を測定することもできる（アネキシンＶ系アッセイ）。あるいは、カスパーゼの活性化などのアポトーシスの後期は、細胞の集団中または個別の細胞中で測定することができる。加えて、ミトコンドリア、または染色体ＤＮＡの断片化による、シトクロムＣおよびＡＩＦの細胞質への放出の測定値を判定することができる。末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識法（ＴＵＮＥＬ）は、アポトーシスシグナル伝達カスケードに起因するＤＮＡ断片化を検出するための一般的な方法である。アッセイは、特異的に標識された抗体によって二次的に検出されるブロモ化ｄＵＴＰの添加を触媒する酵素である末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼによって特定することができる、ＤＮＡ中のニックの存在に依存する。
【０１１８】
細胞傷害性は、補体を対象としてもよく、または抗体を対象としてもよく、または細胞傷害性分子もしくは細胞の結合と直接的に関連付けられてもよい。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、インビトロまたはエクスビボにおける細胞殺傷アッセイ中で測定したとき、２０％未満の細胞溶解（すなわち、細胞傷害性％）、または１０％未満、あるいは５％、４％、３％、２％、または更に０％のもしくは検出不能な細胞溶解（細胞傷害性）の細胞傷害性を呈する。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、１０ｎＭの抗体濃度で、２０％、１０％未満、あるいは５％、４％、３％、２％、または更に０％のもしくは検出不能な細胞傷害性を呈する。
【０１２０】
他の実施形態では、抗体は、インビトロまたはエクスビボにおける細胞殺傷アッセイ中で測定したとき、２０％未満の細胞溶解（すなわち、細胞傷害性％）、または１０％未満、あるいは５％、４％、３％、２％、または更に０％のもしくは検出不能な細胞溶解（細胞傷害性）のアポトーシス活性を呈する。また他の実施形態では、ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、１０ｎＭの抗体濃度で、２０％、１０％未満、あるいは５％、４％、３％、２％、または更に０％のもしくは検出不能なアポトーシス活性を呈する。
【０１２１】
また他の実施形態では、抗体は、インビトロまたはエクスビボにおける細胞殺傷アッセイ中で測定したとき、約５０％未満の細胞傷害性、細胞傷害性４０％、３０％、２０％、１０％未満、あるいは５％、４％、３％、２％、または更に０％のもしくは検出不能な細胞傷害性のＣＤＣ活性を呈する。また他の実施形態では、ある特定の実施形態では、本発
明の抗体は、１００ｎＭの抗体濃度で、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％未満、あるいは５％、４％、３％、２％、または更に０％のもしくは検出不能なＣＤＣ活性を呈する。更なる実施形態では、抗体は、インビトロまたはエクスビボにおける細胞殺傷アッセイ中で測定したとき、約５０％未満の細胞傷害性、細胞傷害性４０％、３０％、２０％、１０％未満、あるいは５％、４％、３％、２％、または更に０％のもしくは検出不能な細胞傷害性のＡＤＣＣ活性を呈する。また他の実施形態では、ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、１００ｎＭの抗体濃度で、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％未満、あるいは５％、４％、３％、２％、または更に０％のもしくは検出不能なＡＤＣＣ活性を呈する。
【０１２２】
本発明は、キメラヒンジを含む組み換えポリペプチドを含む、抗体、抗原結合タンパク質、およびＦｃ融合タンパク質を提供し、減少したエフェクター機能を更に提供する。本発明のそのような組み換えポリペプチドの特性は、１つ以上の参照タンパク質の特性と比較し得る。本発明のキメラ抗体と比較して、対応する可変領域および定常領域を有し（例えば、野生型ＩｇＧ１  ＣH領域（配列番号１３）または野生型ＩｇＧ４  ＣH領域（配列番号１５）を有する）、かつ本発明の抗体および抗原結合タンパク質に対する機能特性または薬物動態特性の比較のためのある特定の試験法において使用し得る、参照または対照の抗体および抗原結合タンパク質については、以下の例を参照されたい。対応する野生型ＩｇＧ  ＣH領域は、「野生型」ＩｇＧ  ＣH領域が、Ｎ末端からＣ末端で、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインに接触している天然ＩｇＧアミノ酸配列に由来することにおいて、本発明のキメラＣH領域とは異なることが理解される。野
生型ＩｇＧは、天然ＩｇＧと実質的に同一の特徴を保持しながら、１つ以上のアミノ酸修飾を有する変異体を含み得る。対応する抗体またはポリペプチドは、キメラＣH領域を有
する抗体またはポリペプチドと同一の標的結合ドメイン（例えば、ＶHおよび／またはＶL）を有するように組織化され得るか、あるいはある特定のアッセイにおける比較目的で実質的に同一の機能性を有する。
【０１２３】
本発明の単離した抗体は、ＦｃγＲを発現している細胞、例えば、エフェクター細胞に弱く結合するが、しかしながら、野生型ＩｇＧ１またはＩｇＧ４  ＣH領域を含む対応す
る抗体のエフェクター機能と比較して、細胞傷害性および増殖などのエフェクター機能を欠くことが、実施例で示された。
【０１２４】
本発明の更なる態様
一態様では、本発明は、キメラヒンジ領域を含む組み換えポリペプチドを提供する。一部の態様では、キメラヒンジ領域は、２２８位〜２３６位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ２下部ヒンジアミノ酸配列ＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号３）を含む。他の態様では、キメラヒンジ領域は、Ｎ末端からＣ末端で、２１６位〜２２７位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４上部ヒンジアミノ酸配列、および２２８位〜２３６位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ２下部ヒンジアミノ酸配列ＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号３）を含む。
【０１２５】
他の態様では、キメラヒンジ領域は、Ｎ末端からＣ末端で、配列番号４および５からなる群から選択される、２１６位〜２２７位（ＥＵ付番）の上部ヒンジアミノ酸配列、および２２８位〜２３６位（ＥＵ付番）の下部ヒンジアミノ酸配列ＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号３）を含む。
【０１２６】
本発明は、Ｎ末端からＣ末端で、ＣＨ１ドメイン、キメラヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む組み換えポリペプチドを提供し、ＣＨ１ドメインは、少なくとも２１２位〜２１５位（ＥＵ付番）のアミノ酸配列ＤＫＫＶまたはＤＫＲＶを含み、キメラヒンジは、２１６位〜２２７位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４上部ヒンジアミノ酸配列、および２２８位〜２３６位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ２下部ヒンジア
ミノ酸配列ＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号３）を含み、ＣＨ２ドメインは、２３７位〜３４０位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインアミノ酸配列を含み、ＣＨ３ドメインは、３４１位〜４４７位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ１もしくはヒトＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン配列、またはそれらの変異体を含む。一実施形態では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、または配列番号３１を含むまたはそれらからなる重鎖定常領域を含む、モノクローナル抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、配列番号３８または３７を含むまたはそれらからなる定常領域を持つ少なくとも１つの重鎖を含む、モノクローナル抗体を提供する。
【０１２７】
【表７】
2020114242.tif 000009
【０１２８】
一部の実施形態では、組み換えポリペプチドは、抗体、抗原結合タンパク質、および受容体−Ｆｃ融合タンパク質からなる群から選択される。
【０１２９】
一部の実施形態では、単離した抗体、抗原結合タンパク質、または受容体−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端までのＣＨ領域、ＣＨ１ドメイン、キメラヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む重鎖構築物を含み、ＣＨ１ドメインは、アミノ酸配列ＤＫＫＶまたはＤＫＲＶを含み、キメラヒンジは、２１６位〜２２７位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４上部ヒンジアミノ酸配列、またはその自然変異体、および２２８位〜２３６位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ２下部ヒンジアミノ酸配列を含み、ＣＨ２ドメインは、２３７位〜３４０位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン配列、またはその自然変異体を含み、ＣＨ３ドメインは、３４１位〜４４７位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン配列、またはその自然変異体を含み、ＣＨ領域は、配列番号１または配列番号２との、少なくとも約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％の同一性を持つアミノ酸配列を有する。
【０１３０】
別の実施形態では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端までのＣＨ領域、ＣＨ１ドメイン、キメラヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む重鎖構築物を含む、単離した抗体、抗原結合タンパク質、または受容体−Ｆｃ融合タンパク質を提供し、ＣＨ１ドメインは、アミノ酸配列ＤＫＫＶまたはＤＫＲＶを含み、キメラヒンジは、２１６位〜２２７
位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４上部ヒンジアミノ酸配列、またはその自然変異体、および２２８位〜２３６位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ２下部ヒンジアミノ酸配列を含み、ＣＨ２ドメインは、２３７位〜３４０位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン配列、またはその自然変異体を含み、ＣＨ３ドメインは、３４１位〜４４７位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン配列、またはその自然変異体を含み、ＣＨ領域は、配列番号３０または配列番号３１との、少なくとも約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％の同一性を持つアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＣＨ領域は、少なくとも約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％の配列番号３８または配列番号３７との同一性を持つアミノ酸配列を有する。
【０１３１】
そのような本発明の「変異体」または「自然変異体」ＣHドメイン、例えば、Ｆｃドメ
インおよびＦｃドメイン断片は、そのような本発明のＣHドメインが由来する野生型配列
と比較するとき、アミノ酸の１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、実質的に所望のように機能する。一部の例では、ＣHドメインまたはＦｃドメインは、ある特定のＦｃ
γＲを発現している細胞、例えば、エフェクター細胞への弱い結合を呈するか、または結合を呈さず、細胞傷害性および増殖などの改変されたエフェクター機能をもたらす。一例では、そのような変異体は、二重特異性分子の単離のために操作されたＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸の付加、欠失、または置換などの修飾を含む。
【０１３２】
一実施形態では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３８、もしくは配列番号３７、またはそのような重鎖定常領域との少なくとも約９５％、もしくは約９６％、もしくは約９７％、もしくは約９８％、もしくは約９９％を持つ配列を含むか、あるいはそれらからなる重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む、モノクローナル抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３８、もしくは配列番号３７、またはそのような重鎖定常領域との少なくとも約９５％、もしくは約９６％、もしくは約９７％、もしくは約９８％、もしくは約９９％を持つ配列を含むか、あるいはそれらからなる、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、および重鎖定常領域を含む、モノクローナル抗体を提供する。
【０１３３】
別の実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列、もしくは配列番号３３によってコードされるアミノ酸配列を有する、または（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列、もしくは配列番号２９によってコードされるアミノ酸配列を有する、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に記載の配列との、少なくとも約９５％、もしくは約９６％、もしくは約９７％、もしくは約９８％、もしくは約９９％の同一性を持つ配列を有する、重鎖定常領域（ＣH）を含む、単離した抗体、またはその抗原結合断片である。別の実
施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、もしくは配列番号３２によってコードされるアミノ酸配列を有する、または（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列、もしくは配列番号２８によってコードされるアミノ酸配列を有する、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に記載の配列との、少なくとも約９５％、もしくは約９６％、もしくは約９７％、もしくは約９８％、もしくは約９９％の同一性を持つ配列を有する、重鎖定常領域（ＣH）を含む、単離した抗体、またはその抗原結合断片である。
【０１３４】
また別の実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列、もしくは配列番号３６によってコードされるアミノ酸配列を有する、または（ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列、もしくは配列番号３５によってコードされるアミノ酸配列を有する、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に記載の配列との、少なくとも約９５％、もしくは約９６％、もしくは約９７％、もしくは約９８％、もしくは約９９％の同一性を持つ配列を有する、重鎖定常領域（ＣH）を含む、単離した抗体、またはその抗原結合断片である。
【０１３５】
一部の実施形態では、単離した抗体は、モノクローナル抗体である。他の実施形態では、単離した抗体、またはその抗原結合断片は、ヒト化キメラ一本鎖抗体または二重特異性抗体である。
【０１３６】
別の実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列、もしくは配列番号３３によってコードされるアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列、もしくは配列番号２９によってコードされるアミノ酸配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に記載の配列との、少なくとも約９５％、もしくは約９６％、もしくは約９７％、もしくは約９８％、もしくは約９９％の同一性を持つ配列を含む、Ｆｃ含有タンパク質である。別の実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、もしくは配列番号３２によってコードされるアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列、もしくは配列番号２８によってコードされるアミノ酸配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に記載の配列との、少なくとも約９５％、もしくは約９６％、もしくは約９７％、もしくは約９８％、もしくは約９９％の同一性を持つ配列を含む、Ｆｃ含有タンパク質である。
【０１３７】
別の実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列、もしくは配列番号３６によってコードされるアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列、もしくは配列番号３５によってコードされるアミノ酸配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に記載の配列との、少なくとも約９５％、もしくは約９６％、もしくは約９７％、もしくは約９８％、もしくは約９９％の同一性を持つ配列を含む、Ｆｃ含有タンパク質である。
【０１３８】
別の実施形態では、本発明は、記載の抗体、抗原結合タンパク質、またはＦｃ融合タンパク質を含む組成物を提供する。
【０１３９】
本発明は、細胞傷害性または細胞溶解エフェクター機能を欠く抗体または抗原結合タンパク質を提供する。一部の態様では、抗体または抗原結合タンパク質は、細胞傷害性または細胞溶解エフェクター機能を欠き、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３８、または配列番号３７を含む。
【０１４０】
本発明は、野生型ＩｇＧ１または野生型ＩｇＧ４  ＣＨ領域を含む対応する抗体の細胞傷害活性よりも、少なくとも約１０倍少ない、または少なくとも５０倍少ない、または少なくとも１００倍少ない、または少なくとも１０００倍少ない、または少なくとも１００００倍少ない細胞傷害活性を有する、抗体または抗原結合タンパク質を提供する。
【０１４１】
本発明は、ＦｃγＲに結合することができる抗体を提供し、そのような抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３８、または配列番号３７を含む組み換えポリペプチドを含む。一部の実施形態では、抗体は、野生型ＩｇＧ１または野生型ＩｇＧ４重鎖定常領域を含む対応する抗体の結合親和性と比較してより低い親和性で、ＦｃγＲに結合することができる。一部の実施形態では、抗体は、約１０ｎＭ、または約２０ｎＭ、または約３０ｎＭ、または約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約１００ｎＭ超の半最大濃度（ＥＣ50）でＦｃγＲを活性化することができる。一部の実施形態では、ＦｃγＲは、ヒトまたはカニクイザルＦｃγＲＩＩである。他の実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＢである。一部の実施形態では、抗体は、約１０μＭ、または約２０μＭ、または約３０μＭ、または約４０μＭ、約５０μＭ、約１００μＭの親和性（ＫD値）を有するＦｃγＲＩＩＡに結合することができる。他の実施形態では、
抗体または組み換えポリペプチドは、ＦｃγＲＩＩＢへの抗体または組み換えポリペプチドの親和性より大きい親和性で、ＦｃγＲＩＩＡに結合する。
【０１４２】
一部の実施形態では、抗体は、約１０μＭ、または約２０μＭ、または約３０μＭ、または約４０μＭ、約５０μＭ、約１００μＭの親和性（ＫＤ値）を有するＦｃγＲＩＩＢに結合することができる。一部の実施形態では、抗体または組み換えポリペプチドは、ＦｃγＲＩＩＢへの抗体または組み換えポリペプチドの親和性と実質的に同様の親和性（ＫD値）で、ＦｃγＲＩＩＡに結合する。
【０１４３】
ある特定の実施形態については、キメラ抗体がＦｃγＲＩＩＡに対して野生型親和性を有し得るとしても、本発明のキメラ抗体が、ＦｃγＲＩＩＡによって媒介される活性に携わり、更にはそれを間接的に増強することが望ましい場合がある。どの理論にも束縛されることなく、ある特定の抗体、および故に治療法は、活性化ＦｃγＲＩＩＡ受容体と抑制性ＦｃγＲＩＩＢ受容体との間の均衡を活性化寄りに変化させ得る、抑制性受容体ＦｃγＲＩＩＢとの弱化した相互作用（野生型抗体と比較して）の恩恵を受け得る。
【０１４４】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３８、または配列番号３７を含み、種々の標的抗原への特異性を有する組み換えポリペプチドを含む、モノクローナル抗体の産生を含有する。本発明は、ａ）本発明の抗体またはその断片をコードする核酸分子を含むベクターを、哺乳動物宿主細胞に導入すること、ｂ）抗体を発現することができる宿主細胞を培養すること、およびｃ）抗体を細胞培地から単離することを含む、抗体を産生する方法を提供する。
【０１４５】
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
２５６，４９５（１９７５）によって最初に説明されたハイブリドーマ方法によって産生してもよく、または組み替えＤＮＡ方法によって産生してもよい。モノクローナル抗体はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２２，５８１−５９７（１９９１）に記載の技法を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。モノクローナル抗体は、任意の好適な起源から採取し得る。故に、例えば、モノクローナル抗体は、例えば表面で抗原を発現している細胞の形態にある目的とする抗原、または目的とする抗原をコードする核酸で免疫性を与えたマウスから採取した脾臓Ｂリンパ球細胞から調製したハイブリドーマから、採取し得る。モノクローナル抗体はまた、免疫性を与えたヒト、またはラット、ウサギ、イヌ、霊長類などの非ヒト哺乳動物の抗体を発現している細胞に由来するハイブリドーマから採取してもよい。
【０１４６】
一実施形態では、本発明の抗体は、ヒト抗体である。ヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の部分を担持する遺伝子導入または染色体導入マウスを使用して生成し得る。そのような遺伝子導入および染色体導入マウスとしては、それぞれ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥマウス、ＨｕＭＡｂマウス、およびＫＭマウスとして本明細書で言及されるマウスが挙げられ、「遺伝子導入マウス」として本明細書で総称され、上文に記載される。
【０１４７】
これらの遺伝子導入マウスからの脾細胞を使用して、公知の技法に従い、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成し得る。本発明のヒトモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、または他の種に起源する本発明の抗体も、目的の免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列について遺伝子導入である別の非ヒト哺乳動物または植物の生成、ならびにそれから回収可能な形態にある抗体の産生を通して、遺伝子導入で生成し得る。哺乳動物における遺伝子導入産生に関連して、抗体は、ヤギ、ウシ、または他の哺乳動物の乳中で産生、およびそれから回収し得る。例えば、米国第５，８２７，６９０号、同第５，７５６，６８７号、同第５，７５０，１７２号、および同第５，７４１，９５７号を参照されたい。目的とするＩｇ重鎖および軽鎖配列をコードするＤＮＡに作動的に連結されるマウスＵＰ−ＩＩプロモーターを含む発現ベクターは、遺伝子導入動物の尿における目
的とするタンパク質の発現および分泌について操作し得る（例えば、米国第５，８２４，５４３号を参照されたい）。
【０１４８】
更に、本発明のヒト抗体、または他の種からの本発明の抗体は、当技術分野で公知の技法を使用して、ファージディスプレイ法、レトロウイルスディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、および他の技法を含むがこれらに限定されないディスプレイ型技術によって生成してもよく、得られた分子は、当技術分野で公知の技法などの親和性成熟など、更なる成熟に供してもよい（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２７，３８１（１９９１）（ファージディスプレイ法）、Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４，３０９（１９９６）（ファージディスプレイ法）、Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｔｈａｕ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９４，４９３７−４９４２（１９９７）（リボソームディスプレイ法）、Ｐａｒｍｌｅｙ  ａｎｄ
Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ７３，３０５−３１８（１９８８）（ファージディスプレイ）、Ｓｃｏｔｔ  ＴＩＢＳ  １７，２４１−２４５（１９９２）、Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８７，６３７８−６３８２（１９９０）、Ｒｕｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１，１０８１−１０８５（１９９３）、Ｈｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３０，４３−６８（１９９２）、Ｃｈｉｓｗｅｌｌ  ａｎｄ  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ＴＩＢＴＥＣＨ  １０，８０−８４（１９９２）、および米国第５，７３３，７４３号を参照されたい）。ディスプレイ技術を利用してヒトではない抗体を産生する場合、そのような抗体はヒト化し得る。
【０１４９】
本発明の操作した重鎖定常（ＣH）領域は、エフェクター機能の減少をもたらすであろ
う。ヒト軽鎖定常（ＣL）領域であるカッパまたはラムダのうちのいずれをも使用し得る
。所望の場合、本発明の抗体のクラスを、既知の方法により切り替えてもよい。
【０１５０】
本発明は、宿主細胞によって産生された本発明の抗体を提供する。一実施形態では、本発明は、ａ）抗体免疫応答を引き起こすのに十分な抗原でＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを免疫化することと、ｂ）そのようなマウスから血清を採取し、該抗原に対する抗体価を試験することと、ｃ）上昇した抗体価を有することが示されているそのような免疫化マウスの脾臓からＢ細胞を採取し、該Ｂ細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させてそのようなハイブリドーマを形成させることと、ｄ）タンパク質Ａクロマトグラフィーによってそのようなハイブリドーマからヒト可変領域およびマウス定常領域を有するキメラ抗体を単離することと、ｅ）望ましい特徴を有するキメラ抗体を選択することと、ｆ）そのような抗体のマウス定常領域を、本発明のヒト定常領域、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３８、または配列番号３７を含むヒト定常領域で代置することと、を含むモノクローナル抗体を産生する方法を提供する。
【０１５１】
一実施形態では、本発明の抗体は、完全長ＩｇＧ抗体である。別の実施形態では、本発明の抗体は、抗体断片または一本鎖抗体である。また別の実施形態では、本発明の抗体は、完全ヒトＩｇＧ抗体である。
【０１５２】
本発明の一部の態様では、抗体は、そのような分子または抗体の各抗原結合ドメインがＶL領域と対になったＶH領域を含む、二重特異性抗体である。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、異なる別個のＶH領域と共通のＶL領域とを各々含む、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、第１の抗原に対する第１の抗体に由来するＶH領域／ＶL領域ペアを含む、第１の抗原に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、第１の抗体に由来するＶL領域（例えば、
第１の抗体の抗原結合ドメイン中に含まれる、同一のＶL領域）と対になった、第２の抗
原に対する第２の抗体に由来するＶH領域を含む、第２の抗原に特異的に結合する第２の
抗原結合ドメインとを含んで構築される。一部の実施形態では、二重特異性抗体中の抗体のうち少なくとも１つの重鎖、すなわち、第１の抗体、もしくは第２の抗体、または両方の抗体は、キメラ重鎖定常領域（ＣH領域）を含むように修飾される。他の実施形態では
、二重特異性抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３８、または配列番号３７を含む。
【０１５３】
本発明の一部の態様では、異なる特異性の２つの抗体は、同一の軽鎖を使用する。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体におけるＩｇ重鎖のうち少なくとも１つの重鎖を、本発明の組み換えポリペプチドを含むキメラ重鎖定常領域を含むように修飾する。一部の実施形態では、重鎖のうち少なくとも１つをＣＨ３ドメイン中で修飾することで、単離の利便性のために、タンパク質Ａなどの親和性試薬に対する二重特異性抗体への分化親和性をもたらす。別の実施形態では、そのような二重特異性抗体中の重鎖のうち少なくとも１つは、ＩＭＧＴ付番方式でのｉ）９５Ｒまたはｉｉ）９５Ｒおよび９６Ｆ（９５Ｒおよび９６Ｆは、ＥＵ付番方式では４３５Ｒおよび４３６Ｆに対応する）で、アミノ酸修飾を含む。
【０１５４】
他の態様では、抗体は二重特異性抗体であり、二重特異性抗体は、
（ａ）第１の標的抗原を認識し、それに結合することができる抗原結合ドメインを含む、第１の重鎖と、
（ｂ）第２の標的抗原を認識し、それに結合することができる抗原結合ドメインを含む、第２の重鎖と、
（ｃ）第１または第２の標的抗原を認識し、それに結合することができる共通の軽鎖抗原結合ドメインと、を含み、
（ａ）もしくは（ｂ）または（ａ）と（ｂ）との両方の重鎖は、配列番号１または配列番号３１を含む重鎖定常領域を更に含む。
【０１５５】
また他の態様では、抗体は二重特異性抗体であり、二重特異性抗体は、
（ａ）第１の標的抗原を認識し、それに結合することができる抗原結合ドメインを含む、第１の重鎖と、
（ｂ）第２の標的抗原を認識し、それに結合することができる抗原結合ドメインを含む、第２の重鎖と、
（ｃ）第１または第２の標的抗原を認識し、それに結合することができる共通の軽鎖抗原結合ドメインと、を含み、
（ａ）もしくは（ｂ）または（ａ）と（ｂ）との両方の重鎖は、配列番号２または配列番号３０を含む重鎖定常領域を更に含む。
【０１５６】
別の態様では、そのような二重特異性抗体中の（ａ）または（ｂ）の重鎖のうち少なくとも１つは、（ｉ）４３５Ｒまたは（ｉｉ）４３５Ｒおよび４３６Ｆ（ＥＵ付番）（ＩＭＧＴ付番方式での（ｉ）９５Ｒまたは（ｉｉ）９５Ｒおよび９６Ｆ）で、アミノ酸修飾を含む。
【０１５７】
他の態様では、抗体は二重特異性抗体であり、二重特異性抗体は、（ａ）第１の標的抗原を認識し、それに結合することができる抗原結合ドメインを含む第１の重鎖、および配列番号１、配列番号２、配列番号３０、または配列番号３１を含む第１の重鎖定常領域、（ｂ）第２の標的抗原を認識し、それに結合することができる抗原結合ドメインを含む第２の重鎖、および配列番号３８または配列番号３７を含む第２の重鎖定常領域、ならびに（ｃ）第１または第２の標的抗原を認識し、それに結合することができる共通の軽鎖抗原結合ドメイン、を含む。
【０１５８】
一実施形態では、抗体は一価抗体である。そのため、一実施形態では、抗体は一価抗体
であり、該抗体は、ｉ）該一価抗体の軽鎖をコードする核酸分子を提供し、該構築物が、選択された抗原特異性抗体のＶL領域をコードするヌクレオチド配列と、Ｉｇの定常ＣL領域コードするヌクレオチド配列とを含み、選択された抗原特異性抗体のＶL領域をコード
する該ヌクレオチド配列と、ＩｇのＣL領域をコードする該ヌクレオチド配列とが、共に
作動可能に連結され、ＣL領域をコードするヌクレオチド配列が修飾されて、ＣL領域が、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で、または動物もしくはヒトに投与されるときに、ＣL領域の同一のアミノ酸配列を含む他のペプチドとジスルフィド結合または共有結合する
ことができる任意のアミノ酸を含有しないようにすることと、ｉｉ）該一価抗体の重鎖をコードする核酸構築物を提供し、該構築物が、選択された抗原特異性抗体のＶH領域をコ
ードするヌクレオチド配列と、ヒトＩｇの定常ＣH領域をコードするヌクレオチド配列と
を含み、ＣH領域をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号
３０、配列番号３１、配列番号３８、または配列番号３７をコードする核酸を含み、そのようなヌクレオチド配列が修飾され、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で、またはヒトなどの動物に投与されるときに、ヒトＩｇのＣH領域の同一のアミノ酸配列を含む他のペ
プチドとのジスルフィド結合または共有もしくは安定した非共有重鎖間結合の形成に参加する一切のアミノ酸残基を含まず、選択された抗原特異性抗体のＶH領域をコードする該
ヌクレオチド配列と、該ＩｇのＣH領域をコードする該ヌクレオチド配列とが、共に作動
可能に連結されることと、ｉｉｉ）該一価抗体を産生するための細胞発現系を提供することと、ｉｖ）（ｉｉｉ）の細胞発現系の細胞中で（ｉ）および（ｉｉ）の核酸構築物を共発現させることによって、該一価抗体を産生することと、を含む方法によって構築される。
【０１５９】
同様に、一実施形態では、抗体は、ｉ）可変領域、または該領域の抗原結合ドメインと、ｉｉ）ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で、同一のＣH領域とのジスルフィド結合、
または同一のＣH領域との他の共有もしくは安定した非共有重鎖間結合を形成することが
できる一切のアミノ酸残基を含まないように修飾された、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３８、または配列番号３７を含む免疫グロブリンのＣH領域またはその断片とを含む、一価抗体である。
【０１６０】
別の更なる実施形態では、該一価抗体の配列は、Ｎ−結合型グリコシル化のための一切の受容部位を含まないように修飾されている。
【０１６１】
概して、本明細書に記載の抗体は、任意の好適な数のそのような修飾アミノ酸を含むこと、および／または共役された置換基との関連によって、修飾され得る。この文脈における適合性は、抗体もしくは抗原結合断片の関連した選択性および／または特異性を少なくとも実質的に保持する能力によって、概して判定される。修飾アミノ酸は、例えば、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、脂質部分に共役されたアミノ酸、または有機誘導体化剤に共役されたアミノ酸から選択され得る。１つ以上の修飾アミノ酸を含むことは、例えば、ポリペプチドの血清半減期を更に増大させること、ポリペプチドの抗原性を減少させること、またはポリペプチドの貯蔵安定性を増大させることにおいて有利である得る。アミノ酸（複数可）は、例えば、翻訳時に、または翻訳後組み換え産生中に修飾されるか（例えば、哺乳類細胞における発現中のＮ−Ｘ−Ｓ／ＴモチーフでのＮ−結合型グリコシル化）、あるいは合成手段によって修飾される。修飾アミノ酸の非限定的な例としては、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、プレニル化（例えば、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化）アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸などが挙げられる。アミノ酸の修飾についての当業者を導くのに適切な参照は、文献全体で豊富である。例示的なプロトコルは、Ｗａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｏｎ  ＣＤ−Ｒｏｍ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ中で見出される。
【０１６２】
本発明の抗体はまた、ポリマーへの共有的共役によって化学修飾することで、例えばその循環半減期を更に増大させ得る。例示的なポリマー、およびそれらをペプチドに付着させるための方法は、例えば、米国第４，７６６，１０６号、同第４，１７９，３３７号、同第４，４９５，２８５号、および同第４，６０９，５４６号中で例証される。更なる例証的ポリマーとしては、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、約２，０００〜約２０，０００、例えば約３，０００〜１２，０００など、約１，０００〜約４０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を持つＰＥＧ）が挙げられる。
【０１６３】
一実施形態では、１つ以上の放射性標識したアミノ酸を含む抗体を提供する。放射性標識した抗体は、診断目的および治療目的の両方に使用することができる。別の実施形態では、本発明の抗体は、治療薬または検出可能マーカーである分子に共役し得る。一実施形態では、治療薬は、放射性同位体などの細胞傷害性薬剤である。ポリペプチドのための放射性同位体の例としては、3Ｈ、14Ｃ、15Ｎ、35Ｓ、90Ｙ、99Ｔｃ、ならびに125Ｉ、131
Ｉ、186Ｒｅ、および225Ａｃが挙げられるが、これらに限定されない。放射性標識したアミノ酸および関係するペプチド誘導体を調製するための方法は、当技術分野で既知である（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６５５−６８６（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｆｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ，ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｒａｖｅｎ（１９９６））、ならびにＵＳ  ４，６８１，５８１、ＵＳ  ４，７３５，２１０、ＵＳ  ５，１０１，８２７、ＵＳ  ５，１０２，９９０（ＵＳ  ＲＥ３５，５００）、ＵＳ  ５，６４８，４７１およびＵＳ  ５，６９７，９０２を参照されたい）。
例えば、放射性同位体は、クロラミンＴ法によって共役してもよい。更なる実施形態では、検出可能なマーカーは、放射性標識、酵素、発色団、または蛍光標識であり得る。
【０１６４】
更なる態様では、本発明は、ポリペプチド、例えば、本発明の抗体、抗原結合タンパク質、または受容体−Ｆｃ融合タンパク質をコードする発現ベクターに関する。そのような発現ベクターは、本発明のポリペプチドの組み換え産生に使用することができる。
【０１６５】
本発明の文脈における発現ベクターは、染色体、非染色体、および合成核酸ベクター（発現制御要素の好適なセットを含む核酸配列）を含む、任意の好適なベクターであり得る。そのようなベクターの例としては、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、ならびにウイルス核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ベクターが挙げられる。一実施形態では、抗体をコードする核酸分子は、例えば、線形発現要素（例えば、Ｓｙｋｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １２，３５５−５９（１９９７）に記載のような）、凝縮核酸ベクター（例えば、米国第６，０７７，８３５号および／または国際公開第ＷＯ００／７００８７号に記載のような）、またはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９／１８、もしくはｐＵＣ１１８／１１９などのプラスミドベクターを含む、裸のＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に含まれる。そのような核酸ベクターおよびそれらの使用は、当技術分野で公知である（例えば、米国第５，５８９，４６６号および同第５，９７３，９７２号を参照されたい）。
【０１６６】
別の実施形態では、ベクターは、記載の核酸分子を含む発現ベクターを含む、本発明の抗体またはポリペプチドをコードする核酸分子を含み、核酸分子は、発現制御配列に作動的に連結される。
【０１６７】
一実施形態では、ベクターは、細菌細胞中の本発明のポリペプチドまたは抗体の発現に好適である。そのようなベクターの例としては、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ  Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ  ２６４，５５０３−５５０９（１９８９））、およびｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）などの発現ベクターが挙げられる。
【０１６８】
発現ベクターはまた、または代替的に、酵母系における発現に好適なベクターであってもよい。酵母系における発現に好適ないかなるベクターも採用することができる。好適なベクターとしては、例えば、酵母アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨなどの、構成型プロモーターまたは誘導型プロモーターを含むベクターが挙げられる（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）、およびＧｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５３，５１６−５４４（１９８７）中で概説される）。
【０１６９】
本発明の核酸分子を含むベクターを提供し、核酸分子は、哺乳動物宿主細胞中の発現に好適な発現制御配列に作動的に連結される。
【０１７０】
発現制御配列は、種々の細胞系における目的とする遺伝子の転写および後続のタンパク質の発現を制御および駆動するように操作される。プラスミドは、例えば、プロモーター、エンハンサー、選択可能なマーカー、オペレーターなどの、望ましい要素を含む発現制御配列（すなわち、発現カセット）を持つ、目的とする発現可能な遺伝子を組み合わせる。本発明の発現ベクター中では、抗体をコードする核酸分子は、任意の好適なプロモーター、エンハンサー、選択可能なマーカー、オペレーター、リプレッサータンパク質、ポリＡ終結配列、および他の発現促進要素を含むか、またはそれらと関連付けられる。
【０１７１】
本明細書で使用される「プロモーター」は、それが作動可能に連結される、すなわち、適切なシグナルが存在するときに、抗体をコードするヌクレオチド配列の転写を可能にするように連結する、ＤＮＡ配列の転写を導くのに十分なＤＮＡ配列を示す。抗体をコードするヌクレオチド配列の発現は、当技術分野で既知のいかなるプロモーターまたはエンハンサーの制御下にも置かれ得る。そのような要素の例としては、強発現プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶ  ＩＥプロモーター／エンハンサー、またはＣＭＶ主要ＩＥ（ＣＭＶ−ＭＩＥ）プロモーター、ならびにＲＳＶ、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＬ３−３、ＭＭＴＶ、ユビキチン（Ｕｂｉ）、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）、およびＨＩＶ  ＬＴＲプロモーター）が挙げられる。
【０１７２】
一部の実施形態では、ベクターは、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＣＭＶ−ＩＥ、ＣＭＶ−ＭＩＥ、ＲＳＶ、ＳＬ３−３、ＭＭＴＶ、Ｕｂｉ、ＵｂＣ、およびＨＩＶ  ＬＴＲからなる群から選択されるプロモーターを含む。
【０１７３】
本発明の核酸分子はまた、有効なポリ（Ａ）終結配列、大腸菌中のプラスミド産生のための複製起点、選択可能なマーカーとしての抗生物質抵抗性遺伝子、および／または簡便なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）に作動的に連結され得る。核酸はまた、ＣＭＶ  ＩＥなどの構成型プロモーターとは対照的な、調節可能な誘導型プロモーター（誘導性、抑制性、発生的に調節された）も含み得る（当業者は、そのような用語は、実際には、ある特定の条件下の遺伝子発現の程度の記述語であることを認識するであろう）。
【０１７４】
選択可能なマーカーは、当技術分野で公知の要素である。選択的条件下では、適切な選択可能なマーカーを発現する細胞のみが生存できる。一般に、選択可能なマーカー遺伝子は、細胞培養において種々の抗生物質への耐性を授けるタンパク質、通常は酵素、を発現する。他の選択的条件では、蛍光タンパク質マーカーを発現する細胞は、可視化され、故に選択可能である。実施形態としては、ベータラクタマーゼ（ｂｌａ）（ベータラクタム
抗生物質耐性またはアンピリシン耐性遺伝子もしくはａｍｐＲ）、ｂｌｓ（ブラストサイジン耐性アセチルトランスフェラーゼ遺伝子）、ｂｓｄ（ブラストサイジン−Ｓデアミナーゼ耐性遺伝子）、ｂｓｒ（ブラストサイジン−Ｓ耐性遺伝子）、Ｓｈ  ｂｌｅ（Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）耐性遺伝子）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）（ハイグロマイシン耐性遺伝子）、ｔｅｔＭ（テトラサイクリン耐性遺伝子またはｔｅｔＲ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔ）（ネオマイシン耐性遺伝子またはｎｅｏＲ）、ｋａｎＲ（カナマイシン耐性遺伝子）、およびｐａｃ（ピューロマイシン耐性遺伝子）が挙げられる。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、ベクターは、ｂｌａ、ｂｌｓ、ＢＳＤ、ｂｓｒ、Ｓｈ  ｂｌｅ、ｈｐｔ、ｔｅｔＲ、ｔｅｔＭ、ｎｐｔ、ｋａｎＲ、およびｐａｃからなる群から選択される１つ以上の選択可能なマーカーを含む。他の実施形態では、ベクターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、高感度シアン蛍光タンパク質（ｅＣＦＰ）、または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）をコードする１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。
【０１７６】
本発明の目的のため、真核細胞中の遺伝子発現は、調節融合タンパク質（ＲＦＰ）によって同様に調節されるオペレーターによって制御される強力なプロモーターを使用して、綿密に調節され得る。ＲＦＰは、実質的に、転写抑制ドメイン、およびその活性を調節するリガンド結合ドメインからなる。そのような発現系の例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国第２００９０１６２９０１Ａ１号に記載される。
【０１７７】
本明細書で使用される「オペレーター」は、遺伝子がオペレーターへのＲＦＰの結合によって調節され得、結果として、目的とする遺伝子、すなわち、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチドの転写を防止または許可し得るような方法で、遺伝子中または遺伝子付近に導入されるＤＮＡ配列を示す。原核細胞およびバクテリオファージ中のある数のオペレーターは、よく特徴付けられている（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，ｅｄ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｄ．Ｖｏｌ  ２  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．１９９６）。これらとしては、ＬｅｘＡペプチドに結合する、大腸菌のＬｅｘＡ遺伝子のオペレーター領域、ならびに大腸菌のＬａｃＩおよびｔｒｐＲ遺伝子によってコードされるリプレッサータンパク質に結合する、ラクトースオペレーターおよびトリプトファンオペレーターが挙げられるが、これらに限定されない。これらとしてはまた、ラムダｃＩおよびＰ２２  ａｒｃによってコードされるリプレッサータンパク質に結合するラムダＰRおよびファージＰ２２  ａｎｔ／ｍｎｔ遺伝子からの、バクテリ
オファージオペレーターが挙げられる。一部の実施形態では、ＲＦＰ転写抑制ドメインが、ＮｏｔＩなどの制限酵素である場合、オペレーターは、その酵素の認識配列である。当業者であれば、オペレーターが、プロモーターによる転写の制御が可能なように、プロモーターに隣接して、またはプロモーターの３’方向に位置する必要があることを認識するであろう。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９７２，６５０号は、ｔｅｔＯ配列がＴＡＴＡボックスから特定の距離内にあることを規定する。特定の実施形態では、オペレーターは、プロモーターの直下流に置かれることが好ましい。他の実施形態では、オペレーターは、プロモーターの１０塩基ペア内に置かれる。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、オペレーターは、ｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）、ＮｏｔＩ認識配列、ＬｅｘＡオペレーター、ラクトースオペレーター、トリプトファンオペレーター、およびＡｒｃオペレーター（ＡＯ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リプレッサータンパク質は、ＴｅｔＲ、ＬｅｘＡ、ＬａｃＩ、ＴｒｐＲ、Ａｒｃ、ＬａｍｂｄａＣ１、およびＧＡＬ４からなる群から選択される。他の実施形態では、転写抑制ドメインは、真核生物リプレッサータンパク質、例えば、ＧＡＬ４に由来するリプレッ
サードメインに由来する。
【０１７９】
例示的な細胞発現系において、細胞は、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）を発現するように操作され、目的とするタンパク質は、その活性がＴｅｔＲによって調節されるプロモーターの転写制御下に置かれる。２つの縦列ＴｅｔＲオペレーター（ｔｅｔＯ）は、ベクター中のＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター／エンハンサーの直下流に置かれる。そのようなベクター中でＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターによって導かれる目的とされるタンパク質をコードする遺伝子の転写は、テトラサイクリンまたは一部の他の好適な誘導物質（例えば、ドキシサイクリン）の不在においてＴｅｔＲによって妨害され得る。誘導物質の存在下では、ＴｅｔＲタンパク質は、ｔｅｔＯを結合することができず、よって、目的とするタンパク質の転写、次いで翻訳（発現）が発生する。（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４３５，５５３号を参照されたい。）
【０１８０】
別の例示的な細胞発現系としては、融合タンパク質の転写抑制ドメインがＴｅｔＲであり、リガンド結合ドメインがＴ２突然変異を持つエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ＥＲLBD）である、ＴｅｔＲ−ＥＲLBDＴ２融合タンパク質などの調節融合タンパク質が挙げられる（ＥＲLBDＴ２、Ｆｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３７：７５２−７５７）。ｔｅｔＯ配列が強力なＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターの下流および近位に置かれた場合、ＣＭＶ−ＭＩＥ／ｔｅｔＯプロモーターからの目的とするヌクレオチド配列の転写は、タモキシフェンの存在下で妨害され、タモキシフェンの除去によって妨害を解除される。別の例では、１５アミノ酸リンカーによって接続される２つのＡｒｃタンパク質からなる一本鎖二量体およびＥＲLBDＴ２（上記）からなる融合タンパク質である、融合タンパク質Ａｒｃ２−ＥＲLBDＴ２の使用は、Ａｒｃオペレーター（ＡＯ）、より具体的には、ＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター／エンハンサーの直下流にある２つの縦列ａｒｃオペレーターを伴う。細胞系は、Ａｒｃ２−ＥＲLBDＴ２によって調節され得、目的とするタンパク質を発現している細胞は、Ｃ
ＭＶ−ＭＩＥ／ＡｒｃＯ２プロモーターによって駆動され、タモキシフェンの除去によって誘導可能である。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国第２００９０１６２９０１Ａ１号を参照されたい。）
【０１８１】
一部の実施形態では、本発明のベクターは、ＣＭＶ−ＭＩＥ／ＴｅｔＯまたはＣＭＶ−ＭＩＥ／ＡＯ２ハイブリッドプロモーターを含む。
【０１８２】
本発明のベクターはまた、目的とする遺伝子の複製を促進するために、組み換え技術にＣｒｅ−ｌｏｘツールを採用してもよい。Ｃｒｅ−ｌｏｘ戦略は、１）２つのｌｏｘＰ部位間の組み換えを触媒する酵素であるＣｒｅリコンビナーゼ、および２）ｌｏｘＰ部位（例えば、組み換えが起こる場所である８ｂｐのコア配列と、２つの隣接した１３ｂｐの逆方向反復とからなる特異的な３４塩基ペアｂｐ配列）または突然変異ｌｏｘ部位、という少なくとも２つの構成要素を要する。（全て参照により本明細書に組み込まれる、例えば、Ａｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ９２：１６０−４（１９９５）、Ｎａｇｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓｉｓ  ２６：９９−１０９（２０００）、Ａｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０（１９）：ｅ１０３（２００２）、および米国第２０１００２９１６２６Ａ１号を参照されたい）。別の組み換え戦略では、酵母由来のＦＬＰリコンビナーゼを共通配列ＦＲＴと共に利用してもよい（例えば、Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｓ．ＰＮＡＳ  ９３（１２）：６１９１−６１９６も参照されたい）。
【０１８３】
別の態様では、遺伝子（すなわち、本発明の組み換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）は、発現カセットの発現増強配列内に挿入され、任意にプロモーターに作動可能に連結され、プロモーターに連結した遺伝子は、第１のリコンビナーゼ認識部位に５
’方向に隣接し、第２のリコンビナーゼ認識部位に３’方向に隣接する。そのようなリコンビナーゼ認識部位は、発現系の宿主細胞におけるＣｒｅが媒介する組み換えを可能にする。一部の例では、第２のプロモーターに連結した遺伝子は、第１の遺伝子の下流（３’方向）にあり、第２のリコンビナーゼ認識部位に３’方向に隣接する。また他の例では、第２のプロモーターに連結した遺伝子は、第２のリコンビナーゼ部位に５’方向に隣接し、第３のリコンビナーゼ認識部位に３’方向に隣接する。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識部位は、ｌｏｘＰ部位、ｌｏｘ５１１部位、ｌｏｘ２２７２部位、およびＦＲＴ部位から選択される。他の実施形態では、リコンビナーゼ認識部位は異なる。更なる実施形態では、宿主細胞は、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現することができる遺伝子を含む。
【０１８４】
一実施形態では、ベクターは、本発明の抗体の軽鎖または抗体の重鎖をコードする第１の遺伝子と、本発明の抗体の軽鎖または抗体の重鎖をコードする第２の遺伝子を含む。
【０１８５】
一部の実施形態では、ベクターは、小胞体（ＥＲ）中でのタンパク質の折り畳みに関与する遺伝子の発現の制御を通して、タンパク質産生／タンパク質分泌を増強することができるＸ−ｂｏｘ結合タンパク質１（ｍＸＢＰ１）遺伝子を更に含む。（例えば、Ｒｏｎ  Ｄ，ａｎｄ  Ｗａｌｔｅｒ  Ｐ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：５１９−５２９（２００７）を参照されたい）。
【０１８６】
「細胞」という用語は、組み換え核酸配列を発現するのに好適ないかなる細胞をも含む。細胞としては、原核生物および真核生物のもの（単細胞または多細胞）、細菌細胞（例えば、大腸菌、バシラス属、ストレプトミセス属などの株）、マイコバクテリウム細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、サッカロミセスセレヴィシエ、シゾサッカロミセスポンベ、ピキアパストリス、ピキアメタノリカなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、イラクサギンウワバなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または例えば、ハイブリドーマまたはクアドローマなどの細胞融合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。他の実施形態では、細胞は、真核性であり、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３  ＥＢＮＡ、ＭＳＲ  ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃｏｌｏ２５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ細胞、腫瘍細胞、および上文の細胞由来の細胞系から選択される。一部の実施形態では、細胞は、１つ以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）を含む。
【０１８７】
また更なる態様では、本発明は、本明細書で定義の本発明の抗体または本明細書で定義の本発明の二重特異性分子を産生する、トランスフェクトーマなどの組み換え真核または原核宿主細胞に関する。宿主細胞の例としては、酵母、細菌、およびＣＨＯまたはＨＥＫ細胞などの哺乳動物細胞が挙げられる。例えば、一実施形態では、本発明は、本発明の組み換えポリペプチドを含む抗体の発現をコードする配列を含む細胞ゲノム中に安定して統合される核酸を含む細胞を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の組み換えポリペプチドを含む抗体の発現をコードする配列を含む、プラスミド、コスミド、ファージミドまたは線形発現要素などの、統合されていない（すなわち、エピソーム性）核酸を含む細胞を提供する。他の実施形態では、本発明は、本発明の発現ベクターを含むプラスミドで宿主細胞を安定してトランスフェクトすることによって産生される細胞系を提供する。
【０１８８】
更なる態様では、本発明は、本発明の抗体、または抗原結合タンパク質、または受容体
−Ｆｃ融合タンパク質を産生するための方法に関係し、該方法は、ａ）本明細書で上述の通り、本発明のハイブリドーマまたは宿主細胞を培養するステップと、ｂ）抗体、または抗原結合タンパク質、または受容体−Ｆｃ融合（上記）を培地から精製するステップとを含む。
【０１８９】
また更なる態様では、本発明は、本明細書に定義の抗体もしくはその抗原結合断片、抗原結合タンパク質、または受容体−Ｆｃ融合タンパク質、あるいは本明細書に定義の二重特異性分子を含む組成物に関する。
【０１９０】
組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ
ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５中で開示のものなどの従来技法に従って、薬学的に許容される担体または希釈物、ならびに任意の他の既知のアジュバントおよび賦形剤を用いて調合し得る。
【０１９１】
薬学的に許容される担体または希釈物、ならびに任意の他の既知のアジュバントおよび賦形剤は、選択した本発明の抗体および選択した投与様式に好適であるべきである。本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、原薬の適切な安定性、特定の患者、組成物、および投与様式に対する所望の治療反応を達成するために有効である活性成分の量を得るために、変化させてもよい。選択した用量レベルは、種々の薬物動態因子による。
【０１９２】
薬学的組成物は、任意の好適な経路および様式で投与し得る。インビボにおける本発明の抗体の投与の好適な経路は、当技術分野で公知であり、当業者が選択し得る。（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，ＡＬ，ａｎｄ  Ｍｓｒｎｙ，ＲＪ，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ
Ｒｅｖ，５８（５−６）：６８６−７０６（２００６））。
【０１９３】
標識した本発明の抗体は、疾患または障害を検出、診断、またはモニタリングするために、診断目的で使用することができる。本発明は、（ａ）標的抗原に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体を使用して、対象の細胞または組織試料中の抗原の存在をアッセイすることと、（ｂ）抗原のレベルを対照レベル、例えば、正常な組織試料におけるレベルと比較すること（対照の抗原レベルと比較してのアッセイした抗原レベルの増加は、疾患または障害を示すか、あるいは疾患または障害の重症度を示す）とを含む、疾患または障害の検出または診断を提供する。
【０１９４】
本発明の抗体は、当技術分野で公知の免疫組織化学方法を使用して生体試料中の抗原レベルをアッセイするために、使用することができる。タンパク質の検出に有用な他の抗体による方法としては、酵素結合免疫アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫アッセイ法（ＲＩＡ）などの免疫アッセイ法が挙げられる。好適な抗体標識をそのようなキットおよび方法において使用してもよく、当技術分野で既知の標識としては、アルカリホファターゼおよびグルコースオキシダーゼなどの酵素標識、ヨード（125Ｉ、131Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（121Ｉｎ）、およびテクネチウム（99mＴｃ）などの放射性同位体標識、ルミノールおよびルシフェラーゼなどの発光標識、
ならびにフルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識が挙げられる。
【０１９５】
標識した抗体の存在は、診断目的でインビボにおいて検出し得る。一実施形態では、診断は、ａ）有効量の標識した抗体を対象に投与すること、ｂ）抗原が検出され得る部位に標識した抗体を集中させるため、および非結合の標識した抗体をバックグラウンドレベルまで澄ませるために、投与後にある時間間隔待つこと、ｃ）バックグラウンドレベルを判定すること、およびｄ）バックグラウンドレベルを上回る標識した抗体の検出が、対象が
疾患もしくは障害を有することを示すか、または疾患もしくは障害の重症度を示すように、対象中の標識した抗体を検出することを含む。そのような実施形態に従い、当業者に既知の特定の撮像システムを使用しての検出に好適な撮像部分を用いて、抗体を標識する。バックグラウンドレベルは、標識した抗体の検出量を、特定の撮像システムのためにあらかじめ定められた標準値と比較することを含む、当技術分野で既知の種々の方法によって判定し得る。本発明の診断目的に使用し得る方法およびシステムとしては、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）などの全身スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および超音波検査が挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【０１９６】
次の実施例は、本発明の方法および組成物を作製および使用する方法を当業者に説明するために提供され、発明者が発明者の発明とするものの範囲を限定することは意図しない。使用される数値（例えば、量、濃度、温度など）に対する正確さを確保する努力がなされているが、いくつかの実験による誤差および偏差が計上されるはずである。
【０１９７】
実施例１：組み換えポリペプチドの調製
組み換えポリペプチド、例えば、キメラＣH  ＩｇＧ４（配列番号３１）およびキメラ
ＣH  ＩｇＧ１（配列番号３０）の生成を、標準的なクローニング技法を使用して行った
。まず、キメラＩｇＧ４  ＣHを、２段階ＰＣＲ増幅プロセスによって生成した。２つの
ＰＣＲ断片、断片１および断片２を、出発構築物ｐＲ８５５０１（野生型ｈＩｇＧ４  ＣH  ＤＮＡ含有）を使用し、それぞれ、プライマーｏＳＰ０３０−ｏＳＰ０３１およびｏ
ＳＰ０３２−ｏＳＰ０３３（表８を参照）を使用して、増幅させた。プライマーによって、所望のＩｇＧ２下部ヒンジ配列（配列番号３をコードする）および隣接制限部位を断片中に導入した。次に、これら２つの断片を、ＰＣＲプライマーｏＳＰ０３１およびｏＳＰ０３３を使用して接合した。得られた配列をＸｈｏ１−Ｎｏｔ１制限部位を介してｐＲ８５５０１中に挿入し、ＩｇＧ２下部ヒンジ配列を有するキメラＩｇＧ４  ＣHを含有する
ベクター構築物ｐＲ８５５０２を生成した。プライマーＫＯ＿ｏＬＲＣ１２０およびｏＫＯ０２１を使用して、配列を確定した。
【０１９８】
加えて、キメラＩｇＧ１  ＣHを、多段階ＰＣＲ増幅によって生成した。断片１ａを、
鋳型ｐＲ８５５０３（野生型ヒトＩｇＧ  １  ＣH  ＤＮＡ含有）から、プライマーｏＳ
Ｐ０３１およびｏＳＰ０３５（以下表８を参照されたい）を使用して生成した。断片２ａを、ｐＲ８５５０２（キメラＩｇＧ４  ＣH  ＤＮＡ含有）を鋳型として使用して、プラ
イマーｏＳＰ０３６およびｏＳＰ０３８を用いて増幅した。断片３を、鋳型ｐＲ８５５０３（野生型ｈＩｇＧ１  ＣH  ＤＮＡ）から、プライマーｏＳＰ０３７およびｏＳＰ０３
９を使用して作製した。断片１ａおよび２ａを、プライマーｏＳＰ０３１およびｏＳＰ０３８を使用して接合することで、断片４を生成した。プライマーｏＳＰ０３６およびｏＳＰ０３９を使用して断片２ａと３とを接合することにより、断片５を創出した。次に、プライマーｏＳＰ０３１およびｏＳＰ０３９を使用して、断片４と５とを融合した。得られた配列をＸｈｏ１−Ｎｏｔ１制限部位を介してｐＲ８５５０１中に挿入し、ＩｇＧ２下部ヒンジおよびＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインを持つＩｇＧ１定常領域を有する構築物ｐＲ８５５０４を生成した。プライマーＫＯ＿ｏＬＲＣ１２０およびｏＫＯ０２１を使用して、配列を確定した。
【０１９９】
【表８】
2020114242.tif 000010
【０２００】
実施例２：キメラ重鎖抗体の生成
標準的な手法を使用して、例示的な抗体を採取した。抗ｈＣＤ３抗体（抗ｈＣＤ３抗体「Ｌ２Ｋ」）を使用して、この実施例のキメラ抗体を構築した。Ｌ２Ｋを、国際公開第ＷＯ２００４／１０６３８０号に基づく公知の方法によって採取した。対照抗体１として本明細書で指定する抗ｈＣＤ３＿Ｌ２Ｋは、野生型ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号１３）を含有する。
【０２０１】
本実施例に従って創出した二重特異性抗体は、２つの個々の抗原結合ドメイン（すなわち、結合アーム）を含む。対照抗体２として本明細書で指定する抗ｈＣＤ３×抗ｈＣＤ２０（二重特異性抗体）は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１００３３１５２７Ａ１号に記載の通りに採取した。国際公開第ＷＯ２００４／１０６３８０号の「Ｌ２Ｋ」抗ＣＤ３抗体からの重鎖および軽鎖を抗ＣＤ２０抗体からの重鎖と組み合わせる標準的な手法を使用して、二重特異性抗体を構築した（例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１３年９月１９日出願のＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１３／６０５１１号を参照されたい）。対照抗体２は、野生型ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域（配列番号１５）を含有するが、抗ＣＤ３アームは、精製を容易にするために修飾ＣＨ３ドメイン（配列番号４２）を有する。
【０２０２】
対照Ａｂ２（抗ｈＣＤ３×抗ｈＣＤ２０二重特異性Ａｂ）の可変領域を、抗ＣＤ３重鎖アーム中に修飾ＣＨ３ドメイン（配列番号４１）を有する野生型ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号１３）と組み合わせるための、本明細書に記載のものと同一の手法を使用して、対照抗体３を採取した。
【０２０３】
対照抗体４は、ＣＡ９抗原と野生型ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号１３）とを結合することができる抗原結合ドメインを含有する。
【０２０４】
対照抗体５は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１３年９月１９日出願のＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１３／６０５１１号の方法に従って採取した、抗ｈＣＤ３×抗ｈＣＤ２０二重特異性抗体である。端的には、抗ＣＤ２０抗体（「ＣＤ２０−ＶＨ」）に由来する重鎖可変領域を含む第１の抗原結合ドメインを、抗ＣＤ３抗体（「ＣＤ３−ＶＬ」）に由来する軽鎖可変領域と対合する。ＣＤ２０−ＶＨ／ＣＤ３−ＶＬ対合により、ＣＤ２０を特異的に認識する抗原結合ドメインを創出する。抗ＣＤ３抗体（「ＣＤ３−ＶＨ」）に由来する重鎖可変領域を含む第２の抗原結合ドメインを、抗ＣＤ３抗体（「ＣＤ３−ＶＬ」）に由来する軽鎖可変領域と対合する。ＣＤ３−ＶＨ／ＣＤ３−ＶＬ対合により、ＣＤ３を特異的に認識する抗原結合ドメインを創出する。対照抗体５は、野生型ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号１３）を用いて操作するが、抗ＣＤ３アームは、精製を容易にするために重鎖定常領域において修飾ＣＨ３ドメイン（配列番号４１）を有する。
【０２０５】
試験した抗体と同一の標的抗原に結合しない、例えば、ＣＤ３またはＣＤ２０抗原に結合しない、アイソタイプを作製した。野生型ＩｇＧ１アイソタイプ対照は、配列番号１３のｗｔ重鎖定常領域アミノ酸配列を含有する。野生型ＩｇＧ４「ＣＰＰＣ」アイソタイプ対照は、「ＣＰＰＣ」ヒンジ突然変異Ｓ２２８Ｐ（ＥＵ付番に従う）を有することを除いて、配列番号１５のｗｔ  ＣＨアミノ酸配列を有する。
【０２０６】
対照抗体１の定常領域を、本発明のキメラヒト定常領域、例えば、配列番号３１または配列番号３０で代置した。定常領域の代置は、プライマーｏＫＯ０１４およびｏＫＯ０１５（表８を参照されたい）を使用して増幅したＬ２Ｋ可変領域核酸配列（プラスミドｐＲ８５５０５）を採取することにより行った。次に、Ｌ２Ｋ可変領域（配列番号３４）を、クローニングのためのＳａｐ１制限部位を使用して、プラスミドｐＲ８５５０２中に導入した。プライマーＫＯ＿ｏＬＲＣ１２０およびｏＫＯ＿Ｆｃ＿４−３を使用して、得られたプラスミドｐＲ８５５０６の配列を確定した。この構築物を使用し、抗体を単離するため標準的な手法を使用して、本発明の抗体１、ｓＩｇＧ４抗ＣＤ３＿Ｌ２Ｋ（本明細書ではｓＩｇＧ４としても知られる）（配列番号３１を含む）を生成した。
【０２０７】
第２の実施例では、鋳型としてプラスミドｐＲ８５５０５を使用し、プライマーｏＫＯ０１４およびｏＫＯ０１５（表８を参照されたい）を使用して、Ｌ２Ｋ可変領域を増幅した。次に、可変領域を、クローニングのためのＳａｐ１制限部位を使用して、プラスミドｐＲ８５５０４中に導入した。プライマーＫＯ＿ｏＬＲＣ１２０およびｏＫＯ＿Ｆｃ＿４−３を使用して、得られたプラスミドｐＲ８５５０７の配列を確定した。この構築物を使用し、標準的な手法を使用して、本発明の抗体２、ｓＩｇＧ１抗ＣＤ３＿Ｌ２Ｋ（本明細書ではｓＩｇＧ１としても知られる）（配列番号３０を含む）を生成した。
【０２０８】
抗体３を、対照抗体（Ａｂ）５の抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０二重特異性抗体から構築した。対照Ａｂ５の重鎖定常領域を、キメラ定常重鎖領域、配列番号３０を含む重鎖定常領域アミノ酸配列を有する抗ＣＤ２０アーム、およびＣＨ（配列番号３７）のＣＨ３ドメインにおいて突然変異を有する抗ＣＤ３アームで代置して、抗体３（本明細書ではｓＩｇＧ１*
としても知られる）を創出した。
【０２０９】
同様に、抗体４を二重特異性抗体対照Ａｂ５から創出し、一方で、重鎖定常領域を、キメラＣＨ、配列番号３１を含む重鎖定常領域アミノ酸配列を有する抗ＣＤ２０アーム、およびＣＨ（配列番号３８）のＣＨ３ドメインにおいて突然変異を有する抗ＣＤ３アームで代置して、抗体４（本明細書ではｓＩｇＧ４*としても知られる）を創出した。
【０２１０】
配列番号３０または配列番号３１の定常領域を含むキメラ抗体（または配列番号３０／３７もしくは配列番号３１／３８を含む二重特異性抗体）および対照抗体を、続く実施例で試みたある特定の実験中で使用した。
【０２１１】
実施例３：Ｊｕｒｋａｔ細胞に特異的に結合するキメラ抗体
キメラ抗体を完全ヒトＩｇＧに変換した後、特異的抗原結合特性を判定した。実施例２に記載の例示的な抗体構築物および対照抗体を、Ｊｕｒｋａｔ細胞（標的抗原であるＣＤ３＋、ＣＤ２０を発現している、ヒトＴ細胞系）に結合するその能力に対して、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を使用して試験した。ウェル辺り２×１０5の細胞を、連続希釈
した抗体および１００μｌの補足物を用いて４℃で１時間インキュベートするというプロトコルを使用して、ＦＡＣＳデータを取得した。インキュベーション後、細胞を２度洗浄し、適切な二次抗体（例えば、蛍光タグ付けしたＦＩＴＣ抗ヒトＩｇＧ）を添加し、４℃で更に３０分間インキュベートし、その後、２度洗浄した。細胞を、１％のＢＳＡを含有する冷ＰＢＳ中で再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でフローサイトメトリーによって分析した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、側方および前方散乱分類によってゲーティングした。細胞結合滴定に対する各ＥＣ50を、４パラメータ非線形回帰分析を使用して計算した値によってＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、判定した。
【０２１２】
キメラ抗体が、野生型ＣH領域を有する対照抗体と比較して等しい濃度でＪｕｒｋａｔ
細胞に結合するため、改変ＣH領域を持つキメラ抗体は、抗原に結合するその能力を喪失
していないと判定した。図６を参照されたい。
【０２１３】
実施例４：抗体の特性評価−Ｕ９３７細胞への結合
ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＡを発現している単球細胞系であるＵ９３７細胞を蒔き、Ａｂの連続希釈物を用いてインキュベートさせた（使用したＡｂの最高濃度は５０ｎＭである）。細胞を、Ａｂを用いて４℃で１時間インキュベートし、次に２度洗浄した。次に、Ｕ９３７細胞を、二次Ａｂ（ＦＩＴＣヤギ抗ヒトＦａｂ）を用いて４℃で３０分間インキュベートした後、２度洗浄した。標準的な方法を使用してフローサイトメトリーによって細胞を分析し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を記録した。キメラＡｂ、抗体１（ｓＩｇＧ４）、および抗体２（ｓＩｇＧ１）が、高濃度でＵ９３７細胞に結合することを示す結果を、表９および図７にまとめる。
【０２１４】
【表９】
2020114242.tif 000011
【０２１５】
実施例５：抗体の特性評価−Ｕ９３７細胞傷害性アッセイ
Ｕ９３７細胞を、次の細胞アッセイにおいて陽性キラーエフェクター対照として使用した。このように、Ｆｃ／ＦｃγＲ相互作用によってＵ９３７細胞を殺傷する、キメラＣH
領域を持つ抗体の能力を試験した。ヒトおよびカニクイザルの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、それぞれ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上、またはＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍａｍｍａｌ密度細胞分離培媒体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって単離するというプロトコルを使用して、カルセイン殺傷アッセイを実行した。単離したＰＢＭＣを、組み換えヒトＩＬ−２（３０Ｕ／ｍｌ）およびＴ細胞活性化ビーズ（ヒトＰＢＭＣに対しては抗ＣＤ３／ＣＤ２８、カニクイザルＰＢＭＣに対しては抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８）を含有する媒体を用いて、数日かけて活性化した。活性化したＴ細胞を、遠心分離によってＰＢＭＣから単離し、次に、１ｍｌの媒体中で再懸濁した。磁化ビーズをＴ細胞から除去した。標的細胞（Ｕ９３７）をカルセインで標識し、次いで、抗体の３倍連続希釈物を使用し、３７℃で３時間かけて、単離した活性化Ｔ細胞（１０：１のエフェクター：標的比）および抗体でインキュベートした。インキュベーション後、プレートを遠心分離させ、上清を蛍光分析のために半透明の黒色透明底プレートに移した。５０％の細胞傷害性を誘導する抗体のモル濃度として画定される各ＥＣ50を、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して判定した。値を、４パラメータ非線形回帰分析を使用して計算した。結果を図８にまとめる。
【０２１６】
抗体１（ｓＩｇＧ４）および抗体２（ｓＩｇＧ１）の細胞傷害性活性は、野生型ＩｇＧ４およびＩｇＧ１ヒンジ領域を含有する対応する抗体と比較したとき、著しく減衰する。図８を参照されたい。興味深いことに、実施例４で示した通り、キメラＡｂはより高い濃度で弱く結合するが、それらは細胞アッセイにおいてＵ９３７細胞を殺傷しない。
【０２１７】
実施例６−抗体の特性評価−ｈＰＢＭＣの増殖
キメラ抗体および対照構築物が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激して増殖を誘導する能力を、ＡＴＰ触媒定量化（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標））を使用して評定した。ＰＢＭＣの活性化は、細胞増殖を駆動するサイトカインの放出を引き起こす。ヒトまたはカニクイザル由来のＰＢＭＣ（５×１０5 ／ウェル）を、抗ＣＤ２０×ＣＤ３または対照抗体（ＣＡ９抗原に特異的な対照Ａｂ４を含む）の３倍連続希釈物を用いて、９６ウェルプレート中３７℃で７２時間インキュベーションするというプロトコルを使用して、増殖データを得た。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）を添加し、ＶＩＣＴＯＲ  Ｘ５  ｍｕｌｔｉ−ｌａｂｅｌ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して発光を測定した。細胞生存のＥＣ50（ＡＴＰ触媒定量化）を、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して判定した。値を、４パラメータ非線形回帰分析を使用して計算し、図９に示す。
【０２１８】
抗体１（ｓＩｇＧ４）および抗体２（ｓＩｇＧ１）は、野生型ＩｇＧ４およびＩｇＧ１ヒンジ領域を含有する対応する抗体と比較して、細胞増殖を活性化しない。図９を参照されたい。
【０２１９】
実施例７−表面プラズモン共鳴によって得たキメラ抗体の結合親和性および速度定数
キメラ定常重鎖領域を有する抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０二重特異性抗体ｓＩｇＧ１*（および
３）およびｓＩｇＧ４*（抗体４）を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｂｉａｃｏｒｅ
）技術を使用して分析し、ヒトおよびカニクイザルＦｃγ受容体へのそれらの動態結合パラメータを判定した。アイソタイプ対照、つまりｗｔ−ＩｇＧ１アイソタイプ対照およびｗｔ−ＩｇＧ４  ＣＰＰＣアイソタイプ対照を、同様の様式で試験した。
【０２２０】
端的には、ＳＰＲ実験は、カルボキシメチルデキストランで被膜した（ＣＭ−５）チッ
プを採用して、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００計器上で２５℃で行った。マウスモノクローナル抗ペンタヒスチジン抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、標準的なアミン結合化学を使用して、ＣＭ−５センサーチップの表面上に固定化した。１４０ＲＵ〜３７６ＲＵのＨｉｓでタグ付けしたヒトまたはサルＦｃγＲタンパク質を、抗ペンタヒスチジンのアミン結合ＣＭ−５チップ上で捕捉し、抗体の原液を、２０μｌ／分で２．５分間、捕捉したタンパク質上に注入した。ｍＡｂ結合応答をモニタリングし、低親和性受容体について定常状態結合平衡を計算した。動態会合速度定数（ｋa）および解離速度定数（ｋd）を、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ  ２．０曲線適合ソフトウェアを使用してデータを処理し１：１の結合モデルに適合させることによって判定した。結合解離平衡定数（ＫD）および解離性半減期
（ｔ1/2）を、ＫD  （Ｍ）＝ｋd／ｋa、およびｔ1/2（分）＝（ｌｎ２／（６０*ｋd）と
して動態速度定数から計算した。
【０２２１】
【表１０】
2020114242.tif 000012
【０２２２】
表１中の結果が示す通り、ｓＩｇＧ１*およびｓＩｇＧ４*二重特異性抗体は、野生型（ｗｔ）ｈＩｇＧ１またはｈＩｇＧ４−ＣＰＰＣ  ＣＨ領域を有する抗体と比較して、ヒトＦｃγＲＩへの結合を見せなかった。本発明のキメラ重鎖抗体も、ｗｔ  ｈＩｇＧ１またはｈＩｇＧ４−ＣＰＰＣ  Ｆｃ配列を持つ抗体と比較して、低親和性ＦｃＲγ受容体（例えば、ＦｃＲγＩＩａ、ＦｃＲγＩＩｂ）のいくつかに対して弱い結合を示すか、または結合を示さなかった（表１１）。
【０２２３】
【表１１】
2020114242.tif 000013
【０２２４】
実施例８−キメラＣＨ領域を有するＩｇＧ１およびＩｇＧ４抗体は、ＣＤＣアッセイ中で減少したエフェクター機能を示す。
上記のキメラＣＨ領域を持つ抗体（ｓＩｇＧ１*およびｓＩｇＧ４*）を生成して、改変されたまたは減少したエフェクター機能を持つｍＡｂを産生した。ＩｇＧ１アイソタイプの野生型（ｗｔ）重鎖定常領域を含む抗体と比較して、ＣＨ領域におけるアミノ酸置換は、Ｉｇ  Ｆｃがその受容体に結合する能力を妨げ得る。よって、Ｂ細胞活性化または貧食などのシグナル応答および免疫応答は、改変され得る。補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）（この実施例中）および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）エフェクター機能（実施例９を参照されたい）に与える、ＣＨ領域におけるアミノ酸修飾の影響を調査した。
【０２２５】
ＣＤＣエフェクター機能に与える抗体３（ｓＩｇＧ１*）および抗体４（ｓＩｇＧ４*）の影響を検査するために、ＣＤ２０発現Ｒａｊｉ（標的）細胞（５０００／ウェル）またはＤａｕｄｉ細胞を、５％のヒト血清補体の存在下で蒔いた。ｓＩｇＧ１*、ｓＩｇＧ４*、および対照抗体の連続希釈物を、１００ｎＭから開始して、３７℃で４時間、細胞に添加した。ＣｙｔｏＴｏｘ  Ｇｌｏ（商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して標的細胞溶解を判定し、細胞傷害性のパーセントを計算した。
【０２２６】
以下の方程式を使用して、細胞傷害性のパーセントを計算した。
細胞傷害性％＝（（ＬS−ＬSR）／（ＬMR−ＬSR））*１００％、式中、ＬSRは、標的細胞発光基準値であり、ＬMRは、ジギトニンによって溶解された細胞からのカルセイン放出最大値である。細胞傷害性に対するＥＣ50を、Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して判定した。値を、４パラメータ非線形回帰分析を使用して計算し、表１２ならびに図１０Ａおよび１０Ｂに示す。
【０２２７】
ＤａｕｄｉおよびＲａｊｉ細胞に対する抗体３（ｓＩｇＧ１*）および抗体４（ｓＩｇ
Ｇ４*）のＣＤＣ活性は、ｗｔ重鎖定常ドメインを有する対応する抗体と比較したとき、
著しく減衰する。表１２および図１０Ａ／Ｂを参照されたい。一部のＣＤＣ活性がＲａｊｉ細胞に対してｓＩｇＧ４*で観察されたが、全体的な結果は、キメラ抗体が、ｗｔ  Ｉ
ｇＧ１  Ｆｃ対照抗体よりも弱いエフェクター応答を備えることを示す。
【０２２８】
【表１２】
2020114242.tif 000014
【０２２９】
実施例９−キメラＣＨ領域を有するＩｇＧ１およびＩｇＧ４抗体は、ＡＤＣＣアッセイ中で減少したエフェクター機能を示す。
ＡＤＣＣエフェクター機能に与える抗体３（ｓＩｇＧ１*）および抗体４（ｓＩｇＧ４*）対野生型ＣＨ領域を持つ抗体の影響を検査するために、ＦｃγＲＩＩＩａのより高い親和性のＶ対立遺伝子を発現するように操作した、新たに単離した刺激していないＣＤ５６陽性ＮＫ細胞またはＮＫ９２細胞を、カルセインで標識したＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞またはＤａｕｄｉ細胞と共に、キメラＣＨ抗体およびｗｔ−ＣＨ対照抗体の存在下で蒔いた。標的細胞からのカルセイン放出をモニタリングし、細胞傷害性パーセントを判定した。細胞傷害性パーセントおよびＥＣ50を、上でＣＤＣアッセイについて記載した通りに計算した。結果を、表１３ならびに図１１Ａおよび１１Ｂに示す。
【０２３０】
キメラＣＨ抗体であるｓＩｇＧ１*およびｓＩｇＧ４*は、Ｒａｊｉ細胞またはＤａｕｄｉ細胞に対するＡＤＣＣ活性（表１３）を媒介しない。
【０２３１】
【表１３】
2020114242.tif 000015
【０２３２】
実施例１０−キメラ抗体の薬物動態プロファイル
単回の３０分間のＩＶ注射を受け、その後１２週間の観察期間を経た雄のカニクイザル（処置群当たり３頭の動物）からの血液試料を採取することによって、抗体３（本明細書ではｓＩｇＧ１*としても知られる）および抗体４（ｓＩｇＧ４*としても知られる）の毒物動態プロファイルを評価した。血清中の総薬物濃度の毒物動態分析のための血液試料を、投与前と、投与後５分、ならびに５、２４、４８、７２、および１６８時間、ならびに１４、２１、３５、４９、６６、および８４日目とに収集した。結果の血清試料を、直接酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）によって分析して、ｓＩｇＧ１*またはｓＩ
ｇＧ４*抗体の総薬物濃度を判定した。非コンパートメント解析（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｗｉ
ｎＮｏｎＬｉｎ）を使用して被験物質の毒物動態を評定し、薬物動態パラメータを判定した。結果を表１４に示す（ＡＵＣ＝濃度時間曲線下面積、Ｃ最大＝観察された血清中の最大濃度）。
【０２３３】
【表１４】
2020114242.tif 000016
【０２３４】
カニクイザルにおけるｓＩｇＧ１*およびｓＩｇＧ４*の１．０ｍｇ／ｋｇの単回静脈投与後、それぞれ３３．４および２６．０μｇ／ｍＬの平均ピーク濃度（Ｃ最大）、ならびにそれぞれ１００および６１．１日*ｕｇ／ｍＬの平均ＡＵＣ0〜168h値を観察した。見かけの終末相半減期を、これら２つの分子の８．１４〜１４．０日であると推定した。データは、ｓＩｇＧ１*およびｓＩｇＧ４*への継続的な露出が全ての動物において１２週間の観察期間の大部分で維持され、露出は処置群全体で同等であったことを示す。被験物質では見かけの免疫原性は観察されなかった。ｓＩｇＧ１*およびｓＩｇＧ４*の全体的な薬物
動態プロファイルは、カニクイザルに投与したモノクローナル抗体に特有である。
【図１】
2020114242.tif 000017
【図２】
2020114242.tif 000018
【図３】
2020114242.tif 000019
【図４】
2020114242.tif 000020
【図５】
2020114242.tif 000021
【図６】
2020114242.tif 000022
【図７】
2020114242.tif 000023
【図８】
2020114242.tif 000024
【図９】
2020114242.tif 000025
【図１０】
2020114242.tif 000026
【図１１】
2020114242.tif 000027
【配列表】
2020114242000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月1日(2020.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を作製する方法であって、
前記方法は：
（ａ）宿主細胞を、前記抗体の軽鎖をコードする核酸分子を用いてトランスフェクトするステップであって、前記核酸分子が、選択された抗原特異的抗体の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列と免疫グロブリンの軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列とを含み、前記選択された抗原特異的抗体の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列と前記免疫グロブリンの軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列とが、共に作動可能に連結される、前記トランスフェクトするステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の宿主細胞を、前記抗体の重鎖をコードする核酸分子を用いてトランスフェクトするステップであって、前記核酸分子が、選択された抗原特異的抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列とヒト免疫グロブリンの重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列とを含み、前記重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列が：
（ｉ）ヒトＩｇＧ４  ＣＨ１ドメイン、２１６位〜２２７位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ４上部ヒンジ、２２８位〜２３６位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ２下部ヒンジ、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン、およびヒトＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン、を含む、キメラＩｇＧ４重鎖定常領域；または
（ｉｉ）ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン、２１６位〜２２７位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ１上部ヒンジ、２２８位〜２３６位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ２下部ヒンジ、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン、およびヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン、を含む、キメラＩｇＧ１重鎖定常領域、を含み、
前記選択された抗原特異的抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列と前記免疫グロブリンの重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列とが、共に作動可能に連結される、前記トランスフェクトするステップと；
（ｃ）前記宿主細胞中で、ステップ（ａ）と（ｂ）との前記核酸分子を共発現させることによって前記抗体を作成するステップであって、前記宿主細胞を培養し、前記抗体を細胞培地中に分泌させる、前記抗体を作成するステップと；
（ｄ）前記抗体を前記細胞培地から単離するステップと；
を含み、
前記抗体が、野生型ＩｇＧ１または野生型ＩｇＧ４重鎖定常領域を含む対応する抗体と比較してより低い親和性で、ＦｃγＲに結合することができ、前記抗体が、ＦｃγＲＩＩＡおよび場合によりＦｃγＲＩＩＢに結合することができ、および、前記抗体が、ＦｃγＲＩＩＢへのその結合親和性と比較してより高い親和性で、ＦｃγＲＩＩＡに結合することができる、
上記方法。
【請求項２】
ＩｇＧ２下部ヒンジが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上部ヒンジと下部ヒンジが一緒になって、配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上部ヒンジと下部ヒンジが一緒になって、配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＣＨ２ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＣＨ３ドメインが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号４１、および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
重鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３７、および配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
抗体が単一特異性である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
抗体が二重特異性である、請求子１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
二重特異性抗体が：
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３０、または配列番号３１を含む第１の重鎖定常領域を含む、第１の重鎖と、
（ｂ）配列番号３７または配列番号３８を含む第２の重鎖定常領域を含む、第２の重鎖と
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第１の重鎖が、配列番号３０のアミノ酸配列を含む定常領域を含み、第２の重鎖が、配列番号３７のアミノ酸配列を含む定常領域を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第１の重鎖が、配列番号３１のアミノ酸配列を含む定常領域を含み、第２の重鎖が、配列番号３８のアミノ酸配列を含む定常領域を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
Ｆｃ融合タンパク質を作製する方法であって、
前記方法は：
（ａ）宿主細胞を、前記Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸分子を用いてトランスフェクトするステップであって、前記核酸分子が、免疫グロブリンの重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列に融合された、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列が：
（ｉ）ヒトＩｇＧ４  ＣＨ１ドメイン、２１６位〜２２７位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ４上部ヒンジ、２２８位〜２３６位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ２下部ヒンジ、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン、およびヒトＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン、を含む、キメラＩｇＧ４重鎖定常領域；または
（ｉｉ）ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン、２１６位〜２２７位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ１上部ヒンジ、２２８位〜２３６位（ＥＵ付番）のヒトＩｇＧ２下部ヒンジ、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン、およびヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン、を含む、キメラＩｇＧ１重鎖定常領域、を含み、
前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列と前記免疫グロブリンの重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列とが、共に作動可能に連結される、前記トランスフェクトするステップと、
（ｂ）前記宿主細胞中で、ステップ（ａ）の前記核酸分子を発現させることによって前記Ｆｃ融合タンパク質を作成するステップであって、前記宿主細胞を培養し、前記Ｆｃ融合タンパク質を細胞培地中に分泌させる、前記Ｆｃ融合タンパク質を作成するステップと；
（ｃ）前記Ｆｃ融合タンパク質を前記細胞培地から単離するステップと；
を含み、
前記Ｆｃ融合タンパク質が、野生型ＩｇＧ１または野生型ＩｇＧ４重鎖定常領域を含む対応するＦｃ融合タンパク質と比較してより低い親和性で、ＦｃγＲに結合することができ、前記Ｆｃ融合タンパク質が、ＦｃγＲＩＩＡおよび場合によりＦｃγＲＩＩＢに結合することができ、および、前記Ｆｃ融合タンパク質が、ＦｃγＲＩＩＢへのその結合親和性と比較してより高い親和性で、ＦｃγＲＩＩＡに結合することができる、
上記方法。
【請求項１４】
ＩｇＧ２下部ヒンジが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上部ヒンジと下部ヒンジが一緒になって、配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
上部ヒンジと下部ヒンジが一緒になって、配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＨ２ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＨ３ドメインが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号４１、および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
重鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３７、および配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質が受容体タンパク質である、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
宿主細胞が、哺乳動物細胞、ＣＨＯ細胞、またはＣＨＯ−Ｋ１細胞である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【外国語明細書】
2020114242000001.pdf