(57)【要約】      （修正有）【課題】プロテアーゼ阻害剤の活性が最適化された医薬組成物を提供する。【解決手段】油ベースの液体製剤を含む経口医薬組成物であって、該油ベースの液体製剤は１００キロダルトンまでの治療用タンパク質、二価陽イオンのキレート剤及び分離したＢＢＩを含む、経口医薬組成物。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
油ベースの液体製剤を含む経口医薬組成物であって、該油ベースの液体製剤は１００キロダルトンまでの治療用タンパク質、二価陽イオンのキレート剤及び分離したＢＢＩを含む、経口医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年２月１日に出願された米国仮特許出願第６１／６３２，８６８号と、２０１２年３月６日に出願された米国仮特許出願第６１／６３４，７５３号の利益を主張するものであり、これらは引用されることによってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書で提供されるのは、治療用タンパク質の経口投与のための方法及び組成物、改善されたプロテアーゼ阻害剤調製物、該調製物を生成するための方法及び該調製物を含む組成物である。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質／ペプチドベースの薬物は、胃腸管における分解に典型的に影響を受けやすい及び／又は生体活性のある形態で小腸から血流へと効率的に吸収されない。インスリンのようなタンパク質に基づいた薬物のための経口送達された製剤が開発されている（Ｚｉｖら１９９４年、Ｎｉｓｓａｎら２０００年、Ｋｉｄｒｏｎら２００４年、Ｅｌｄｏｒら２０１０Ａ、Ｅｌｄｏｒら２０１０Ｂ）。そのような経口インスリン生成物の１つは、第ＩＩ相試験で試験されることが計画されており、ＩＮＤステータスを得るために現在調査されている。
【０００４】
大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）に由来するトリプシン阻害剤は容易に利用可能で、ヒトが摂取する上でも安全であると考えられる。それらは、ＫＴＩ（クニッツトリプシン阻害剤、トリプシンを阻害する）及びＢＢＩ（ボーマン−バーク阻害剤、トリプシンとキモトリプシンを阻害する）からなるＳＢＴＩ（ダイズトリプシン阻害剤）を含んでいる。そのようなトリプシン阻害剤は、例えばＳｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｏ．，  ＵＳＡから入手可能である。ＢＢＩを調製する方法は、例えば米国特許第７，４０４，９７３号に記載されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の発明者は、医薬組成物において使用された時市販のＳＢＴＩ調製物は非常に可変性の高い結果を生むことを発見した。医薬組成物の活性を改善するために、ＫＴＩとＢＢＩの活性を個々に最適化するべきことが想定された。この目的のために、ＳＢＴＩはＫＴＩとＢＢＩの別々の調製物として商業的供給源から得られた。しかしながら、これらの調製物の各々は別の活性によって汚染されていることが見出された。問題点を総合すると、腸の酵素によってタンパク質（例えばインスリン）の分解を防ぐ可変性の能力によって証拠づけられるように、著しい可変性が調製物（特に大規模な調製物）のＢＢＩ活性において見出された。
【０００６】
したがって、本明細書に記載されている特定の実施形態によると、ＳＢＴＩの精製のための改善された方法、つまりそれぞれの生成物を、高いレベルの活性を得られ、高分子（ＭＷ）−汚染物質を最小化した、それ自身の最適な条件下で調製する方法が開発された。他の実施形態によると、該方法は、ＰＥＧおよび二次クロマトグラフィ工程の使用を回避し、より高い収量が得られることを特徴とする。また他の実施形態によると、生成物は例えば治療用タンパク質の経口投与のための組成物のような薬学的組成物における使用に特に適している。加えて、また他の実施形態に従って、ＫＴＩとＢＢＩの活性の完全な分離は、治療用タンパク質およびＢＢＩおよび／またはＫＴＩを含む医薬組成物の抗トリプシンおよび抗キモトリプシン活性のより正確な調節を可能にするので、医薬組成物のより強健なおよび／またはより複製可能なインビボ活性を可能にする。
【０００７】
ペプチド／タンパク質−含有薬物の大規模な調製物を便利に調製するためには、乳化剤が必要であることがさらに発見された。しかしながら、製剤の経口での効能に影響せずに、特定の乳化剤の追加が油をベースとした調製物での沈澱反応を有効に防ぐことができるかどうかを実験的に試験することが必要だった。他の記載された実施形態は、したがって治療用ペプチドおよびタンパク質を包含している、油ベースの医薬組成物内における改善されたＳＢＴＩを伴う特定の乳化剤または乳化剤の組み合わせの存在に関連する。
【０００８】
用語「タンパク質」及び「ペプチド」は、本明細書中では同義語として用いられる。どちらの用語も、限定が明示的に示される場合以外では、存在するアミノ酸数の限定を与えるようには意図されない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
以下の図は具体例として示されるものであり、特許請求の範囲の発明を限定するものではない。
【００１０】
【図１Ａ−１】ＳＢＴＩ精製のフローチャートを示す。図１ＡはＳＢＴＩ中間体の生成を示す。
【図１Ａ−２】ＳＢＴＩ精製のフローチャートを示す。図１ＡはＳＢＴＩ中間体の生成を示す。
【図１Ｂ】ＳＢＴＩ精製のフローチャートを示す。図１ＢはＢＢＩ及びＫＴＩを生成するための精製の後半を示す。
【図２】図２はＤＥＡＥセファロース（商標）カラム分離のクロマトグラムを示す。０．３Ｌの画分をＤＥＡＥカラム溶出の最中に回収した。
【図３】図３は精製されたＢＢＩ及びＫＴＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。電気泳動を行い、ゲルをスキャンし、バンドはＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）ＴＬと結合したＩｍａｇｅＳｃａｎｎｅｒ（商標）ＩＩ（両方ともＧｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ社製）を用いて定量化した。１ミリグラム／ミリリットル（ｍｇ．／ｍｌ．）のサンプルを２０％  Ｐｈａｓｔｇｅｌ（商標）に充填した。レーン１：対照（古いＳＢＴＩ調製物）、レーン２：精製したＫＴＩ、バンドの量＝１００％、レーン３：精製したＢＢＩ、下部バンドの量＝８９．２％、上部バンドの量＝１０．８％。
【図４】図４は、改善した手順を使用した、小規模カラムクロマトグラフィ実行のレポートを示す。伝導率のプロット、ｐＨ、ＯＤ２８０がそれぞれ四角、丸、三角で示されている。縦軸：伝導率プロット（ｍｉｌｌｉＳｉｅｍｅｎｓ）、ｐＨ及びＯＤ２８０（任意の単位）。横軸：カラム容量及び画分番号。
【図５Ａ】図４に示されているクロマトグラフィからの画分の２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図５Ａは、画分４−１８及びプール画分５−１１の、左から右への表示を示す。「Ｃ」は先行研究のトリプシン阻害剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｃａｔ  ｎｏ．  Ｔ９００３）を示す。
【図５Ｂ】図４に示されているクロマトグラフィからの画分の２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図５Ｂは、洗浄画分＋通過画分（Ｗ＋ＦＴ）及び標準（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（大豆）からのトリプシン阻害剤；ＳＴ）を含む、画分６−１５の右から左への表示を示す。
【図６】図６は、ＢＢＩのみの追加の精製工程のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ＳＴ＝標準（図５の説明を参照）、２ｍｇ／ｍｌ、レーン１：カラムからのＢＢＩプール、２：３０ｋＤａ濾過でのろ液、３：１：４０で希釈した３０ｋＤａろ過での残留物、４：１：４で希釈した５ｋＤａ濃度の残留物。
【図７】図７は、ＢＢＩのみの精製の最終生成物の１ｍｇ／ｍｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ＳＴ＝標準（図５の説明を参照）、１ｍｇ／ｍｌ。
【図８】図８は、ＢＢＩ及び下流ＫＴＩ精製の修正されたプロトコルのフローチャートを示す。
【図９】図９は、代替的な手順を使用したカラムクロマトグラフィランのレポートを示す。
【図１０】図１０は、代替的な手順を使用して精製したＢＢＩの２連サンプル（レーン１、２）対標準（レーン３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１１−１】図１１は、様々な乳化製剤の試験結果を示す。起泡スコアは１−５から得られ、１に泡がないことを示し、５が泡のせいで液体が目に見えないことを示す。懸濁液試験では、番号１−５は完全な相の分離、幾つかの大きい油の泡を伴う部分的な相の分離、小さい油の泡と乳状の固さ（ｍｉｌｋｙ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）、開始時に泡はなくその後相の分離、安定した乳化をそれぞれ示す。
【図１１−２】図１１は、様々な乳化製剤の試験結果を示す。起泡スコアは１−５から得られ、１に泡がないことを示し、５が泡のせいで液体が目に見えないことを示す。懸濁液試験では、番号１−５は完全な相の分離、幾つかの大きい油の泡を伴う部分的な相の分離、小さい油の泡と乳状の固さ（ｍｉｌｋｙ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）、開始時に泡はなくその後相の分離、安定した乳化をそれぞれ示す。
【図１２Ａ】様々な乳化剤を含む、経口インスリン製剤の投与後の血糖プロファイルを示す。図１２Ａは、製剤Ａ（左上）、Ｂ（左下）、Ｃ（右上）及びＤ（右下）を示す。
【図１２Ｂ】様々な乳化剤を含む、経口インスリン製剤の投与後の血糖プロファイルを示す。図１２Ｂは、製剤Ｅ（左）及びＦ（右）を示す。
【図１３Ａ】患者記録シートを示す。図１３Ａは、血糖記録を示す。
【図１３Ｂ】患者記録シートを示す。図１３Ｂはアンケートを示す。
【図１４】図１４は、低血糖症調査シートを示す。確認された低血糖症が発症する度にポイントを付し、神経低糖症の症状の経験したあるいはその欠如に依存してさらにポイントを付す。症状の定義の例を以下に示す：視覚、焦点が合わない眼、視覚障害、複視；行動、不眠、過敏、ストレスが多い、緊張、「座りたくて何もやりたくない」、その他の神経的なもの、めまい、ふらふらする、虚弱、疲労、眠さ、歩行又は会話の困難、反応の遅さ、運動能力の後退、バランス感覚の喪失；混乱、簡単な算数を解く力の低下、「だるさ」（ｏｕｔ  ｏｆ  ｉｔ）を感じる。神経低糖症の症状が存在しても、切迫した低血糖症を十分警告している自律神経系の症状があればポイントを付さない。事象を認識又は処置するのに外部の助けの必要であったことに対して追加ポイントが付される。
【図１５】図１５は、様々な用量の経口インスリンで処置された被験体におけるグルコース反応を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１つの態様において、大豆生成物から分離したＢＢＩが提供され、様々な実施形態においてＢＢＩは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ブリリアントブルー染色又は撮像装置による定量化で測定されると、少なくとも８５％の純度である。特定の実施形態において、大豆生成物は大豆粉末である。
【００１２】
また他の態様において、大豆粉末から分離したＢＢＩが提供され、ＢＢＩのタンパク含有量はＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイによって測定すると９５％よりも多い。
【００１３】
また他の態様において、分離したＢＢＩにおいて存在する抗トリプシン活性の抗キモトリプシン活性に対する比は、１．５：１及び１：１の間を含む。より特定の実施形態において、前記比は１．４：１及び１．１：１の間を含む。より特定の実施形態において、前記比は１．３５：１及び１．２：１の間を含む。より特定の実施形態において、前記比は１．２８：１及び１：１の間を含む。特に示されていない限り、本明細書中に言及される抗キモトリプシン活性は、キモトリプシン１ｍｇ当たり４０ＢＴＥＥ単位の活性を有するキモトリプシンを使用して測定され、試験されたタンパク質の１ｍｇ当たり阻害されたキモトリプシンのｍｇで表される。ＢＴＥＥはＮ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンエチルエステル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．  Ｂ６１２５の説明書を参照）を指す。
【００１４】
特に示されていない限り、本明細書中に言及される抗トリプシン活性は、トリプシン１ｍｇ当たり１０，０００ＢＡＥＥ単位の活性を有するトリプシンを使用して測定され、試験されたタンパク質の１ｍｇ当たり阻害されるトリプシンのｍｇで表される。ＢＡＥＥはＮａ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．Ｂ４５００の説明書を参照）を指す。例えば、典型的なアッセイにおいて、１単位は１つのベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル単位（ＢＡＥＥ−Ｕ）でトリプシン活性を減少させる阻害剤の量に相当する。１つのＢＡＥＥ−ＵはｐＨ７．６及び２５℃において２５３ｎｍでの吸光度を０．００１／分で増加させる酵素の量である。例えば、Ｋ．  Ｏｚａｗａ，  Ｍ．  Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，  １９６６，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４１  ：３９５５；  ａｎｄ  Ｙ．  Ｂｉｒｋ，  １９７６，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ４５：７００を参照されたい。
【００１５】
当業者は、上記の精製の要件の各々が、タンパク質含有量、汚染物質の量又は効能に関して、ＢＢＩを医薬組成物の１つ以上の他の成分と混合する前に典型的に評価されると理解するだろう。
【００１６】
追加の態様において、大豆から分離したＫＴＩ３が提供され、様々な実施形態においてＫＴＩ３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ブリリアントブルー染色又は撮像装置による定量化で測定されると、少なくとも８５％の純度である。
【００１７】
また他の態様において、大豆粉末から分離したＫＴＩ３が提供され、ＫＴＩ３のタンパク質含有量はＢＣＡアッセイで測定されると９５％よりも多い。
【００１８】
また他の態様において、大豆粉末から分離したＫＴＩ３が提供され、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ  及び撮像装置による定量化で測定されると、ＫＴＩ３は０．１％よりも少ない高ＭＷ−汚染物質を含む。
【００１９】
当業者は、上記の精製の要件の各々が、タンパク質含有量、汚染物質の量又は効能に関して、ＫＴＩ３を医薬組成物の１つ以上の他の成分と混合する前に典型的に評価されると理解するだろう。
【００２０】
特定の実施形態において、ＫＴＩ３−含有医薬組成物は、医薬組成物の１つ以上の他の成分と混合する前に少なくとも上記精製の要件の１つを満たすＢＢＩをさらに含む。
【００２１】
特定の実施形態において、上記の医薬組成物は経口投与用に製剤される。より特定の実施形態において、医薬組成物は胃での分解を抑えるコーティングをさらに含む。またさらに特定の実施形態において、コーティングはｐＨ−感受性カプセル、又は代替的にソフトゼラチンカプセルである。
【００２２】
他の実施形態において、上記医薬組成物は１００キロダルトンまでの治療用タンパク質を活性成分としてさらに含む。他の実施形態において活性成分は、ヒトの消化管において分解又は不活性化しやすい非タンパク質分子である。
【００２３】
他の実施形態において、油ベースの液体製剤を含む経口医薬組成物が提供され、該油ベースの液体製剤は１００キロダルトン（ｋＤａ）までの治療用タンパク質、二価陽イオンのキレート剤及び分離したＢＢＩを含む。他の実施形態において、液体製剤は１００ｋＤａまでの治療用タンパク質、二価陽イオンのキレート剤、分離したＢＢＩ及び油から本質的になる。他の実施形態において、液体製剤は１００ｋＤａまでの治療用タンパク質、二価陽イオンのキレート剤、分離したＢＢＩ、油及び乳化剤から本質的になる。他の実施形態において、液体製剤は１００ｋＤａまでの治療用タンパク質、二価陽イオンのキレート剤、分離したＢＢＩ、油及び２つの乳化剤から本質的になる。
【００２４】
別の態様において、油ベースの液体製剤が含む経口医薬組成物が提供され、該油ベースの液体製剤は１００ｋＤａまでの治療用タンパク質、二価陽イオンのキレート剤及び大豆由来のＢＢＩを含み、液体製剤は３０，０００より大きいＭＷを有する０．０５％よりも少ない大豆由来の物質を含む。
【００２５】
他の実施形態において、油ベースの液体製剤を含む経口医薬組成物が提供され、該油ベースの液体製剤は１００キロダルトン（ｋＤａ）までの治療用タンパク質及び二価陽イオンのキレート剤を含み、液体製剤は液体製剤１ｍｌ当たり少なくとも５０ｍｇのキモトリプシンを阻害する抗キモトリプシン活性を有する。他の実施形態において、液体製剤は液体製剤１ｍｌ当たり少なくとも３５、４０、４５、５５又は６０ｍｇのキモトリプシンを阻害する抗キモトリプシン活性を有する。他の実施形態において、液体製剤は液体製剤１ｍｌ当たり３５−７０、４０−７０、４５−７０、５０−７０又は４０−６０ｍｇの範囲のキモトリプシンを阻害する抗キモトリプシン活性を有する。他の実施形態において、液体製剤は液体製剤１ｍｌ当たり少なくとも２５ｍｇのトリプシンを阻害する抗トリプシン活性を有する。他の実施形態において、液体製剤は液体製剤１ｍｌ当たり少なくとも３０、３５、４０、４５又は５０ｍｇのトリプシンを阻害する抗トリプシン活性を有する。代替的に、液体製剤は液体製剤１ｍｌ当たり２５−５０、３０−５０、３５−５０、２５−４０又は２５−４５ｍｇのトリプシンを阻害する抗トリプシン活性を有する。
【００２６】
別の態様において、医薬組成物を製造する方法が提供され、該方法は（ａ）分離したＢＢＩ、１００キロダルトンまでの治療用タンパク質及び二価陽イオンのキレート剤の調製物を提供する工程、及び（ｂ）油ベースの液体製剤に分離したＢＢＩ、１００キロダルトンまでの治療用タンパク質及び二価陽イオンのキレート剤を混合する工程を含む。本明細書中に記載されている分離したＢＢＩの同定、純度及び効能の実施形態の各々は、この方法に組み込まれ得る。加えて、本明細書中に記載されている他の成分、及び存在し得る追加の成分の実施形態の各々は、この方法に組み込まれ得る。他の実施形態において、この方法で製造した医薬組成物が提供される。
【００２７】
別の態様において、医薬組成物を製造する方法が提供され、該方法は油ベースの液体製剤に分離したＢＢＩ、１００キロダルトンまでの治療用タンパク質及び二価陽イオンのキレート剤を混合する工程を含む。本明細書中に記載されている分離したＢＢＩの同一性、純度及び効能の実施形態の各々は、この方法に組み込まれ得る。加えて、本明細書中に記載されている他の成分、及び存在し得る追加の成分の実施形態の各々は、この方法に組み込まれ得る。他の実施形態において、この方法で製造した医薬組成物が提供される。
【００２８】
本明細書中で使用される「液体」は、２０℃で１−１０００ミリパスカル秒の範囲を含むことを意味する。例えば魚油は周囲条件下で液体である。この用語は油ベースの溶液、懸濁液及びその組み合わせを含む。
【００２９】
本明細書中で使用される「分離した」ＢＢＩは、他の成分と比較してＢＢＩが濃縮された調製物を意味する。より特定の実施形態において、ＢＢＩはボーマン−バーク阻害剤、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０１０５５（２０１３年１月２８日にアクセスしたデータベース）を意味する。
【００３０】
ＢＢＩの代表的な前駆体配列は以下の通りである。
【００３１】
【化１】
2020117518.tif 000003
【００３２】
これらの１１０残基の内、残基１−１９はシグナルペプチド、２０−３９はプロペプチド及び成熟鎖ＢＢＩ鎖は残基４０−１１０（７１ＡＡ）からなる。
【００３３】
様々な実施形態において、記載されている方法及び組成物において使用されるＢＢＩの調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥブリリアントブルー染色又は撮像装置による定量化（例えば本明細書中に記載されているプロトコルに従って）で評価すると少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％又は９５％の純度である。医薬組成物との関連で、この値は、医薬組成物の１つ以上の他の成分と混合される前のＢＢＩの特徴を表す。代替的な実施形態において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色、随意にその次に撮像装置による定量化を使用し得る。
【００３４】
他の実施形態において、分離したＢＢＩは１ｍｇの阻害剤当たり少なくとも０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３又は１．４ｍｇのキモトリプシンを阻害する抗キモトリプシン活性を有する。他の実施形態において、分離したＢＢＩは１ｍｇの阻害剤当たり０．８−１．８、０．９−１．８、１．０−１．８、１．１−１．８、１．２−１．８、１．３−１．８又は１．４−１．８ｍｇの範囲内のキモトリプシンを阻害する抗キモトリプシン活性を有する。他の実施形態において、活性は１ｍｇの阻害剤当たり０．８−１．５の範囲内のキモトリプシンを阻害する。医薬組成物との関連で、この値は、医薬組成物の１つ以上の他の成分と混合される前のＢＢＩの特徴を表す。
【００３５】
様々な実施形態において、ＢＢＩ調製物はＳＤＳ−ＰＡＧＥブリリアントブルー染色又は撮像装置による定量化（例えば本明細書中に記載されているプロトコルに従って）で評価すると、５％より少ないＫＴＩを含む。代替的な実施形態において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色、随意にその次に撮像装置による定量化を使用し得る。
【００３６】
より特定の実施形態において、本明細書中で使用されているＫＴＩはＫＴＩ３、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０１０７０（２０１３年１月３日にアクセスしたデータベース）を意味する。
【００３７】
ＫＴＩ３の代表的な前駆体配列は以下の通りである。
【００３８】
【化２】
2020117518.tif 000004
【００３９】
これらの１１０残基の内、残基１−２４はシグナルペプチド、２０６−２１６はプロペプチド及び成熟鎖ＫＴＩ鎖は残基２５−２０５（１８１ＡＡ）からなる。
【００４０】
他の実施形態では、ＢＢＩ調製物のタンパク質含有量は、ＢＣＡアッセイ（例えばミクロＢＣＡタンパク質アッセイキット［ｃａｔ．＃２３２２５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ］）を使用して９５％より多い。医薬組成物との関連で、この値は、医薬組成物の１つ以上の他の成分と混合される前のその特徴を表わす。他の実施形態では、ＢＢＩ調製物は０．１％未満の高−ＭＷ汚染物質（言いかえれば３０，０００を超えるＭＷを有する物質）を包含している。他の実施形態において、ＢＢＩはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の使用せずに分離された。
【００４１】
他の実施形態では、記載された方法および組成物における分離されたＢＢＩは組み換え型ＢＢＩであって、例えばそれを発現するように改変された細菌のような微生物によって生成され、その後分離される。他の実施形態において、ＢＢＩは合成ＢＢＩである。合成ＢＢＩの一例は、ペプチド合成機械のような細胞を用いない装置内で生産されたＢＢＩである。ペプチド合成機械（例えば自動ペプチド合成機械）は当該技術分野において周知で、市販されている。組み換え型のＢＢＩを含む医薬組成物も本明細書中で提供される。また、合成ＢＢＩを含む医薬組成物も本明細書中で提供される。
【００４２】
特定の実施形態において、記載されたＢＢＩが記載された方法および組成物における唯一のプロテアーゼ阻害剤である。ヒトの消化管で特定の治療用タンパク質を効率よく保護するために、効力の低いＳＢＴＩはアプロチニンのような追加プロテアーゼ阻害剤を必要とする一方、記載されている分離したＢＢＩはこの点に関して追加のプロテアーゼ阻害剤の必要性を減らすことができると考えられる。
【００４３】
＜追加プロテアーゼ阻害剤＞
特定の実施形態において、記載された方法および組成物内で使用された油ベースの液体製剤は、分離したＢＢＩ以外にトリプシン阻害剤をさらに含む。他の実施形態において、記載された方法および組成物内で使用された油ベースの液体製剤は、分離されたＫＴＩ３以外にトリプシン阻害剤をさらに含む。当業者は、様々なトリプシン阻害剤が利用されるかもしれないことを現在の開示に照らして理解するだろう。タンパク質であるトリプシン阻害剤の場合には、大きさは典型的にはｌ００ｋＤａまである。
【００４４】
本明細書で使用されているように、用語「トリプシン阻害剤」は、基質上のトリプシンの作用を阻害することができる任意の薬剤を指す。薬剤がトリプシンを阻害する能力は当該技術分野において周知のアッセイを使用して測定することができる。
【００４５】
当該技術分野において既知のいくつかのトリプシン阻害剤は、トリプシンに特異的である一方、他のものはトリプシン、およびキモトリプシンのような他のプロテアーゼを阻害する。トリプシン阻害剤は動物または植物に由来し得る：例えば大豆、トウモロコシ、ライマメおよび他の豆、カボチャ、ヒマワリ、牛及び他の動物の膵臓及び肺、鶏および七面鳥の卵白、大豆ベース乳児用調合乳および哺乳類の血液。トリプシン阻害剤はまた微生物由来でもあり得る：例えばアンチパイン；例えば、Ｈ．  Ｕｍｅｚａｗａ，  １９７６，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ４５，  ６７８．を参照されたい。トリプシン阻害剤はまたアルギニンまたはリジンの模倣体または他の合成化合物であり得る：例えばアリールグアニジン、ベンズアミジン、３、４−ジクロロイソクマリン、ジイソプロピルフルオロリン酸、メシル酸ガベキサート（ｇａｂｅｘａｔｅ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）またはフッ化フェニルメチルスルホニル。本明細書で使用されているように、アルギニンまたはリジン模倣体は、トリプシンのＰ１ポケットに結合するおよび／またはトリプシン活性部位機能に干渉することができる化合物である。
【００４６】
特定の実施形態において、記載された方法および組成物内で使用される追加トリプシン阻害剤は、以下からなる群から選択される：アオイマメトリプシン阻害剤、アプロチニン（別名膵臓トリプシン阻害剤または塩基性膵臓トリプシン阻害剤［ＢＰＴＩ］、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ００９７４［２０１３年１月２日にアクセスされたデータベース］、Ｋａｚａｌ阻害剤（膵分泌性トリプシン阻害剤）、Ｋａｚａｌ阻害剤（膵分泌性トリプシン阻害剤）、オボムコイド、アルファ１−抗トリプシン、コルチゾール結合グロブリン、センテリン（Ｃｅｎｔｅｒｉｎ）（［ＳＥＲＰＩＮＡ９／ＧＣＥＴ１（胚中心のＢ細胞で発現された転写物１）］、ＰＩ−６（Ｓｕｎら１９９５）、ＰＩ−８（Ｓｐｒｅｃｈｅｒら１９９５）、ボマピン、クレードＡセルピン［例えばＳｅｒｐｉｎａ３（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１２）、Ｓｅｒｐｉｎａ６（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：８６６）、Ｓｅｒｐｉｎａ１２（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１４５２６４）、Ｓｅｒｐｉｎａ１０（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５１１５６）、Ｓｅｒｐｉｎａ７（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６９０６）、Ｓｅｒｐｉｎａ９（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３２７６５７）、Ｓｅｒｐｉｎａ１１（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２５６３９４）、Ｓｅｒｐｉｎａ１３（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３８８００７）、Ｓｅｒｐｉｎａ２（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３９０５０２）、Ｓｅｒｐｉｎａ４（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５１０４）、ユコピン（Ｓｅｒｐｉｎｂｌ２、遺伝子ＩＤ：８９７７７）、アンチパイン、ベンズアミジン、３、４−ジクロロイソクマリン、ジイソプロピルフルオロリン酸及びメシル酸ガベキサート。
他の実施形態において、上記の阻害剤のうちの１つが選択されている。
【００４７】
アプロチニンの代表的な前駆体配列は以下のとおりである：
【００４８】
【化３】
2020117518.tif 000005
【００４９】
これらの１００残基の内、残基１−２１はシグナルペプチド、２２−３５及び９４−１００はプロペプチド及び成熟鎖ＢＢＩ鎖は残基３６−９３（５８ＡＡ）からなる。
【００５０】
他の実施形態において、記載された方法及び組成物において使用する油ベースの液体製剤は、分離したＢＢＩ及び分離したＫＴＩの両方を含み、より特定の実施形態においては分離したＢＢＩ及び分離したＫＴＩ３の両方を含む。本明細書中で使用される「分離した」ＫＴＩは、他の成分と比較してＫＴＩが濃縮される調製物を意味する。様々な実施形態において、本明細書中に記載されている方法及び組成物に使用されるＫＴＩの調製物は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ブリリアントブルー染色又は撮像装置による定量化によって測定されたように、少なくとも８５％の純度である。他の実施形態において、ＫＴＩ調製物のタンパク質含有量はＢＣＡアッセイで９５％より多い。医薬組成物との関連で、これらの値は、医薬組成物の１つ以上の他の成分と混合される前のＫＴＩの特徴を表す。他の実施形態において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価されるように、ＫＴＩ調製物は５％以下のＢＢＩを含む。他の実施形態において、他の実施形態では、ＫＴＩ調製物は０．１％未満の高−ＭＷ汚染物質（言いかえれば３０，０００を超えるＭＷを有する物質）を包含している。他の実施形態において、ＫＴＩはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の使用せずに分離された。
【００５１】
さらに特定の実施形態において、記載された方法および組成物は、唯一のプロテアーゼ阻害剤として記載されたＢＢＩおよびＫＴＩを含み、より特定の実施形態において、唯一のプロテアーゼ阻害剤としてＢＢＩ及びＫＴＩ３を含む。他の実施形態において、記載された方法および組成物は、ＫＴＩとアプロチニンを含み、より特定の実施形態においては唯一のプロテアーゼ阻害剤としてＫＴＩ３およびアプロチニンを含む。他の実施形態において、分離されたＢＢＩ、分離したＫＴＩとアプロチニンが全て油ベースの液体製剤中に存在する。
【００５２】
他の実施形態において、分離されたＫＴＩ３は、１ｍｇの阻害剤当たり少なくとも０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、または１．３ｍｇのトリプシンを阻害する活性を有する。他の実施形態において、ＫＴＩ３の活性は、１ｍｇの阻害剤当たり０．８−１．８、０．９−１．８、１．０−１．８、１．１−１．８、１．２−１．８、又は１．３−１．８ｍｇのトリプシンの阻害の範囲内にある。より多くの特定の実施形態において、ＫＴＩ３の活性は１ｍｇの阻害剤当たり０．８−１．７ｍｇのトリプシンを阻害する。他の実施形態において、活性は１ｍｇの阻害剤当たり０．８−１．４ｍｇのトリプシンの阻害の範囲内である。
【００５３】
他の好ましい実施形態において、分離したＫＴＩは組み換え型ＫＴＩであって、例えばそれを発現するように改変された細菌のような微生物によって生成されたＫＴＩである。
他の実施形態において、ＫＴＩは合成ＫＴＩである。合成ＫＴＩの一例は、ペプチド合成機械のような細胞を用いない装置内で生産されたＫＴＩである。
【００５４】
他の実施形態は、記載されている医薬組成物に存在する抗キモトリプシン活性の、医薬組成物の抗トリプシン活性に対する比率に関係する。幾つかの実施形態において、このパラメータは１．５：１と１：１の間を含む。より特定の実施形態において、比率は１．４：１−１．１：１の間を含み得る。より特定の実施形態において、比率は１．３５：１−１．２：１の間を含み得る。
【００５５】
特定の実施形態において、記載された方法および組成物中で使用されるＢＢＩ、および／またはもし存在するならＫＴＩは、防腐剤とともに保存された。他の実施形態において、ＢＢＩおよび／またはＫＴＩは調製され、防腐剤を使用せずに保存された。
【００５６】
特定の実施形態において、記載された方法および組成物中で使用されたＢＢＩ、および／またはもし存在するならＫＴＩは大豆粉から得られる。用語「大豆粉」は、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ種から得られた粉末を指す。他の実施形態において、Ｇｌｙｃｉｎ属からの任意の種が使用され得る。大豆粉を得る方法は、当該技術分野において周知である。記載された方法は、それがどのように生成されたとしても、任意のタイプの大豆粉に適用可能である。
【００５７】
＜治療用タンパク質＞
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている組成物および方法のための治療用タンパク質は、記載されている医薬組成物に含有させる前に分離される。これに関連した「分離した」は、均質化された組織の調製物、又は相当な量の汚染タンパク質を含む他の形態としての治療用タンパク質の供給を除外する。分離したタンパク質またはペプチドの好ましい例は組換え型タンパク質またはペプチドである。さらにより好ましい実施形態は、合成タンパク質であり、言い換えれば細胞を用いない装置内で生成されたタンパク質である。当業者は、野生型及び変異型の治療用タンパク質が利用され得ることを現在の開示に照らして理解するだろう。
【００５８】
特定のタンパク質およびペプチドは、トリプシンおよび／またはキモトリプシンに特異的な阻害剤であることが知られており、限定されないが本明細書中でトリプシンおよび／またはキモトリプシン阻害剤として記載されているものを含む。そのようなタンパク質は記載された組成物における治療成分として使用を意図せず、本明細書に使用されるような「治療用タンパク質」の定義から除外される。
【００５９】
当業者は、様々な治療用タンパク質が記載された方法および組成物において使用され得ることを現在の開示に照らして理解するだろう。特定の実施形態において、治療用タンパク質は大きさが１００キロダルトン（ｋＤａ）までであり、典型的には１−１００ｋＤａの間を含む。より特定の実施形態において、大きさは９０ｋＤａまでである。他の実施形態において、大きさは８０ｋＤａまでである。他の実施形態において、大きさは７０ｋＤａまでである。他の実施形態において、大きさは６０ｋＤａまでである。他の実施形態において、大きさは５０ｋＤａまでである。好ましくは、大きさは１−９０ｋＤａの間を含む。他の実施形態において、大きさは１−８０ｋＤａの間を含む。他の実施形態において、大きさは１−７０ｋＤａの間を含む。他の実施形態において、大きさは１−６０ｋＤａの間を含む。他の実施形態において、大きさは１−５０ｋＤａの間を含む。
【００６０】
本明細書中の使用に適している治療用タンパク質は、修飾された（すなわちタンパク質への非アミノ酸部分の共有結合による連結による）誘導体を含む。例えば、限定はされないがタンパク質は、既知の保護基／ブロッキング基によるグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化または誘導体化によって修飾されたタンパク質を含む。高−ＭＷＰＥＧは、ＰＥＧのＮ末端又はＣ末端への部位特異的な結合を通じて、あるいはリジン残基に存在するイプシロンアミノ基を介した多機能リンカーによって又は多機能リンカーなしで治療用タンパク質と結合し得る。さらに、誘導体は１つ以上の標準的でないアミノ酸を包含し得る。
【００６１】
特定の、より具体的な実施形態において、記載されている方法及び組成物に使用される治療用タンパク質は、以下からなる群から選択される：インスリン、インフルエンザ赤血球凝集素、インフルエンザノイラミニダーゼ、グルカゴン、インターフェロンガンマ、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ、成長ホルモン、エリトロポイエチン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１アナログ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、レニン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、濾胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、凝固因子（例えば第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩＣ因子、ＤＣ因子、組織因子（ＴＦ）およびトロンビン）、抗凝固因子（例えばプロテインＣ）心房性ナトリウム利尿因子、サーファクタントタンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）、サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）、プラスミノゲン活性化因子（例えばウロキナーゼまたはヒトの尿、あるいは組織型プラスミノゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ））、ボンベシン、血液生成増殖因子（別名コロニー刺激因子、複数）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク質（例えばＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＴＮＦベータ−２、４−１ＢＢＬ）、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（通常Ｔ細胞の発現及び分泌の活性を調節する）、ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）、血清アルブミン、ミュラー管抑制物質、リラキシン、マウス性腺刺激−放出ホルモン、デオキシリボヌクレアーゼ、インヒビン、アクチビン、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経栄養因子（例えば脳由来神経栄養因子［ＢＤＮＦ］）、ニューロトロフィン−３、−４、−５または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）、神経成長因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（例えばアルファ−ＦＧＦおよびベータ−ＦＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）（例えばＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−１、ＴＧＦ−２、ＴＧＦ−３、ＴＧＦ−４及びＴＧＦ−５を含むＴＧＦベータ）、インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ｄｅｓ（ｌ−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５およびＩＧＦＢＰ−６）、角化細胞増殖因子、骨誘導因子、骨形成因子タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−７、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えばＭ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）（例えばＩＬ−１からＩＬ−１３及びＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３）、スーパーオキシドジスムターゼ、解離促進因子、ケモカインファミリーメンバー（例えばイオタキシンおよびＭＣＰ−１）、及び補体因子（例えばＣ３とＣ５）。
【００６２】
さらに特定の実施形態において、治療用タンパク質はインスリンである。代替的に、治療用タンパク質はＧＬＰ−１阻害剤であり得る。より特定の実施形態において、治療用タンパク質はエクセナチドである。他の実施形態において、インスリンとエクセナチドの両方が記載された組成物中に存在する。他の実施形態において、液体製剤は、インスリン、エクセナチド、二価陽イオンのキレート剤、分離したＢＢＩおよび油から本質的に成る。他の実施形態において、液体製剤はインスリン、エクセナチド、二価陽イオンのキレート剤、分離したＢＢＩ、少なくとも１つの乳化剤および油から本質的に成る。また他の実施形態において、液体製剤はインスリン、エクセナチド、二価陽イオンのキレート剤、分離したＫＴＩ３、アプロチニンおよび油から本質的に成る。また他の実施形態において、液体製剤はインスリン、エクセナチド、二価陽イオンのキレート剤、分離したＫＴＩ３、アプロチニン、少なくとも１つの乳化剤および油から本質的に成る。
【００６３】
当業者は、記載された方法および組成物に様々なタイプのインスリンが適していることを現在の開示に照らして理解するだろう。典型的なインスリンタンパク質は、限定されないが野生型及び変異型インスリンタンパク質の両方を含み、合成ヒトインスリン、合成ウシインスリン、合成ブタインスリン、合成クジラインスリン、インスリン亜鉛複合体、及びプロタミン亜鉛インスリン及びグロビン亜鉛のようなインスリン金属複合体を含む。
【００６４】
様々なクラスのインスリンが使用され得、例えば即効性インスリン、インスリン亜鉛水性懸濁液、無晶性インスリン亜鉛水性懸濁液、ウルトラレンテインスリン、ＮＰＨインスリン、グラルギンインスリン、リスプロインスリン、アスパルトインスリン、または上記の型のインスリンの２つ以上の組み合わせを使用し得る。
【００６５】
特に好ましい実施形態において、記載された方法および組成物のインスリンは、野生型ヒトインスリン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ０１３０８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４）である。１１０アミノ酸のうち、１−２４はシグナルペプチドであり、２５−５４はインシュリンＢ鎖を形成し、５７−８７はＣペプチドを形成し、そして９０−１１０はインスリンＡ鎖を形成する。好ましい実施形態の１つにおいてヒトインスリンは、細菌細胞の組換えタンパク質として生成される。別の好ましい実施形態において、ヒトインスリンは合成的に生成される。
【００６６】
ＧＬＰ−１アナログは当該技術分野においてＧＬＰ−１模倣体とも呼ばれる。当業者は、記載された組成物が以下のＧＬＰ−１アナログの少なくとも１つを含み得ることを現在の開示に照らして理解するだろう：エクセナチド（Ｂｙｅｔｔａ＊；）ＣＡＳｎｏ．  １４１７３２−７６−５；ＳＥＱ  ＩＤ、Ｎｏ：５）、リキセナチド（ＣＡＳｎｏ．３２０３６７−１３−３）、リラグルチド（ＣＡＳｎｏ．２０４６５６−２０−２）、エキセンディン−９（ＣＡＳｎｏ．１３３５１４−４３−９）、ＡＣ３１７４（［Ｌｅｕ（１４）］エキセンディン−４、Ａｍｙｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）、タスポグルチド（ＣＡＳｎｏ．２７５３７１−９４−３）、アルビグルチド（ＣＡＳｎｏ．７８２５００−７５−８）、セマグルチド（ＣＡＳｎｏ．９１０４６３−６８−２）、ＬＹ２１８９２６５（グラグルチド＊；ＣＡＳｎｏ．９２３９５０−０８−７）、およびＣＪＣ−１１３４−ＰＣ（ＣｏｎｊｕＣｈｅｍ＊によって製造された組み換え型ヒトアルブミンに結合した修飾されたエキセンディン−４アナログ）。ＣＡＳの記録はすべて２０１１年１２月１９日にアクセスした。したがって、特定の実施形態において、記載された方法または組成物は、上記にリストされたＧＬＰ−１アナログのいずれかを利用する。他の実施形態において、上記にリストされたＧＬＰ−１アナログのうちの１つが選択されている。当業者は、記載された方法および組成物中で他のＧＬＰ−１アナログを利用し得ることを本明細書中で示された発見に照らして理解するだろう。
【００６７】
＜乳化剤＞
本明細書中で言及される乳化剤と洗剤の「重量／重量」割合は、製剤中の油ベース、例えば魚油、の量を分母として利用する。したがって、５００ｍｇの魚油への６０ｍｇのＧｅｌｕｃｉｒｅは他の成分の重量にかかわらず１２％ｗ／ｗと見なされる。同様に、５０ｍｇのＴｗｅｅｎ８０を伴う５００ｍｇの魚油は、１０％のＴｗｅｅｎ８０と見なされる。
【００６８】
特定の実施形態において、記載された方法および医薬組成物で使用された油ベースの液体製剤、または他の実施形態において、存在する油ベースの液体製剤の各々は、治療用タンパク質に加えて、キレート剤、およびＢＢＩ、脂肪酸のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）エステル、例えばモノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドのＰＥＧエステルまたはその混合物を含む。より特定の実施形態において、ＰＥＧエステルは（ａ）遊離モノアシルグリセロール、遊離ジアシルグリセロール、遊離トリアシルグリセロール、またはその混合物、及び（ｂ）脂肪酸のＰＥＧエステル、例えばモノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドのＰＥＧエステルまたはその混合物、の混合物として提供され得る。これに関連して、用語「モノアシルグリセロール」、「ジアシルグリセロール」および「トリアシルグリセロール」の各々は、単一の化合物を指す必要がないが、むしろ化合物の混合物（例えば様々な長さの脂肪酸を有するモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールまたはトリアシルグリセロールの混合物）を含み得る。特定の好ましい実施形態において、記載された方法および組成物において使用されるモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、またはトリアシルグリセロール、例えば一般的なＰＥＧエステルに使用されるもの、は一般に安全と認められている（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ、ＧＲＡＳ）油に由来する。ＧＲＡＳ油の例は、やし油、トウモロコシ油、落花生油、ダイズ油、Ｍｙｖａｃｅｔ  ９−４５（Ｃ−１８脂肪酸のジアセチル化モノアシルグリセロール）である。（ａ）のより特定な実施形態は、Ｃ８−Ｃ１８モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロールの混合物である。成分（ｂ）のより特定の実施形態において、１つ以上のＣ８−Ｃ１８脂肪酸のＰＥＧモノエステル及びジエステルの混合物である。
【００６９】
より特定の実施形態において、液体製剤は脂肪酸のＰＥＧエステルに加えてさらに遊離ＰＥＧを含む。さらに特定の実施形態において、追加の非イオン洗剤、例えばポリソルベートベースの洗剤、がＰＥＧエステルおよび遊離ＰＥＧに加えて存在する。
【００７０】
記載された方法および組成物のまたさらに特定の実施形態において、液体製剤は次のものを含む：（ａ）Ｃ８−Ｃ１８モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロールの混合物、（ｂ）Ｃ８−Ｃ１８脂肪酸の混合物のＰＥＧ−３２モノエステルおよびジエステル、及び（ｃ）遊離ＰＥＧ−３２。またさらに特定の実施形態において、成分（ｂ）＋（ｃ）の和に対する成分（ａ）の重量／重量の比は、１０：９０−３０：７０の間を含み、より具体的には１５：８５−２５：７５の間を含み、より具体的には、２０：８０である。特定の実施形態において、成分（ａ）−（ｃ）はともに、油ベースの液体製剤に包含される８−１６％の重量／重量を構成する。より特定の実施形態において、量は９−１５％を含む。より特定の実施形態において、量は１０−１４％を含む。より特定の実施形態において、量は１１−１３％を含む。より特定の実施形態において、量は１２％である。
【００７１】
他の実施形態において、記載された方法および医薬組成物中で使用される油ベースの液体製剤は、治療用タンパク質、キレート化剤およびＢＢＩに加えて自己乳化成分を含む。自己乳化成分のいくつかの実施形態が前節に述べられている成分の混合物である一方、これらの混合物は用語「自己乳化部品」の定義を本明細書に使用されるように制限しない。本明細書中で使用されている「自己乳化部品」は、自然にエマルジョンを形成する成分を指す。典型的には、そのような成分は水性溶媒との接触でエマルジョンを形成し、微細分散、すなわちマイクロエマルジョン（ＳＭＥＤＤＳ）を形成する。
【００７２】
そのような成分の特定の実施形態は、トリアシルグリセロールとおよび高い吸湿性の／脂溶性のバランス（ＨＬＢ；Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＷＣ：  “Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＢ  Ｖａｌｕｅｓ  ｏｆ  Ｎｏｎ−  Ｉｏｎｉｃ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ，”  Ｊ  Ｓｏｃ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  ５：２５９  （１９５４）を参照）界面活性剤のトリアシルグリセロール混合物を含む。自己乳化成分の他の実施形態は滑らかな、半固体の堅さ（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）を有する。
【００７３】
好ましくは、記載された方法および組成物中で使用された自己乳化成分のＨＬＢは、１０以上である。他の実施形態において、それは１１−１９の間を含む。他の実施形態において、それは１２−１８の間を含む。他の実施形態において、それは１２−１７の間を含む。
【００７４】
他の実施形態において、それは１２−１６の間を含み、それは水中油型（Ｏ／Ｗ）乳化剤を示す。他の実施形態において、それは１３−１５の間を含む。他の実施形態において、それは１４である。自己乳化成分のより特定の実施形態は、１２−１６のＨＬＢを包括的に有し、ＰＥＧに結合する中程度及び長鎖のトリアシルグリセロール、遊離トリアシルグリセロール及び遊離ＰＥＧを含む。他の実施形態において、自己乳化成分は、１２−１６のＨＬＢを含み、ＰＥＧに結合する中程度及び長鎖のトリアシルグリセロール、遊離トリアシルグリセロール及び遊離ＰＥＧの混合物からなる。他の実施形態において、自己乳化成分は、１４のＨＬＢを有しており、ＰＥＧに結合する中程度及び長鎖のトリアシルグリセロール、遊離トリアシルグリセロール及び遊離ＰＥＧを含む。他の実施形態において、自己乳化成分は、１４のＨＬＢを有しており、ＰＥＧに結合する中程度及び長鎖のトリアシルグリセロール、遊離トリアシルグリセロール及び遊離ＰＥＧの混合物からなる。
【００７５】
特定の、より具体的な実施形態は、（ａ）モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロール、またはその混合物、及び（ｂ）脂肪酸のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）エステル、を含む自己乳化成分を使用する。これに関連して、用語「モノアシルグリセロール」、「ジアシルグリセロール」および「トリアシルグリセロール」の各々は、単一の化合物を指す必要がなく、むしろ化合物の混合物（例えば様々な長さの脂肪酸を有するモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール又はトリアシルグリセロールの混合物）を含み得る。より特定の実施形態は、Ｃ８−Ｃ１８モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロールの混合物である。成分（ｂ）のより特定の実施形態は、Ｃ８−Ｃ１８脂肪酸の混合物のＰＥＧモノエステル及びジエステルの混合物である。
【００７６】
他の、より特定の実施形態において、自己乳化成分は遊離ＰＥＧをさらに含む。
【００７７】
記載されている組成物及び方法において使用するための特定のＰＥＧ部分は５−１００モノマーの間を含む。より特定の実施形態において、ＰＥＧは１５−５０モノマーの間を含み得る。さらに特定の実施形態において、ＰＥＧは２５−４０モノマーの間を含み得る。より特定の実施形態において、ＰＥＧは３２モノマーを含みうる。
【００７８】
記載された方法および組成物のより特定の実施形態において、使用される自己乳化成分は、（ａ）  Ｃ８−Ｃ１８モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール及びトリアシルグリセロールの混合物、（ｂ）  Ｃ８−Ｃ１８脂肪酸の混合物のＰＥＧ−３２モノエステルおよびジエステル；及び（ｃ）遊離ＰＥＧ−３２、を含み、成分（ｂ）＋（ｃ）に対する成分（ａ）の重量／重量の比は、２０：８０である。特定の実施形態において、そのような成分は油ベースの液体製剤の８−１６％重量／重量を構成する。より特定の実施形態において、量は９−１５％を含む。より特定の実施形態において、量は１０−１４％を含む。より特定の実施形態において、量は１１−１３％を含む。より特定の実施形態において、量は１２％である。
【００７９】
上記明細書の内容と合致する自己乳化成分の例は、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ（商標）４４／１４、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ（商標）５３／１０およびＧｅｌｕｃｉｒｅ（商標）５０／１３である。より特定の実施形態はＧｅｌｕｃｉｒｅ（商標）４４／１４である。接尾語４４および１４は、それぞれその融点およびその親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）を指す。Ｇｅｌｕｃｉｒｅ（商標）４４／１４（Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ  ＳＡＳ、セイント−プリースト、フランス）は、水素化したやし油のポリ解糖（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）（ＰＥＧ−３２を備えた、中程度および長鎖のトリアシルグリセロール）によって得られる。それは１４の親水性／親油性バランスを有する。それはＣ８−Ｃ１８モノ−、ジ−、及びトリアシルグリセロール（２０％ｗ／ｗ）、ＰＥＧ−３２モノ−及びジエステル、そして遊離ＰＥＧ−３２（８０％ｗ／ｗ）の定義された混合物からできている。存在する主な脂肪酸は、全脂肪酸含有量の平均の４５％を占めるラウリン酸である。それはらせん構造を有する１２０Ａのラメラ相下のＰＥＧエステル画分及び六方充填（ｈｅｘａｇｏｎａｌ  ｐａｃｋｉｎｇ）下のグリセロール画分からできている固体の分散液である。Ｇｅｌｕｃｉｒｅ（商標）４４／１４のシミュレートされた胃腸脂肪分解の主な生成物は、ＰＥＧ−３２モノおよびジエステルである。より特定の実施形態において、記載された組成物は唯一の乳化剤として約１２％  Ｇｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４を含み、また別の実施形態においては他の乳化剤を一緒に含む。他の実施形態において、記載された組成物は約１２％  Ｇｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４および約１０％Ｔｗｅｅｎ８０を含む。
【００８０】
＜非イオン洗剤＞
特定の実施形態において、記載された方法および医薬組成物内で使用される油ベースの液体製剤は、自己乳化成分に加えて非イオン洗剤をさらに含む。特定の実施形態において、非イオンの洗剤は以下からなる群から選択される：ポリソルベート−２０、ポリソルベート−４０、ポリソルベート８０、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアレイト、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、５０および６０、グリセロールモノステアリン酸、ポリソルベート４０、６０、６５および８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグリコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）−Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）−Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（商標）、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）およびＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩。他の実施形態において、上記にリストされた非イオン洗剤のうちの１つが選択されている。
【００８１】
特定の、より具体的な実施形態において、記載された方法および組成物の中で使用した非イオン洗剤は、ポリソルベートベースの洗剤である。ポリソルベートベースの洗剤の例は、脂肪酸にポリエトキシル化したソルビタンを共有結合させることによって得られた洗剤である。ポリソルベートベースの洗剤のより特定の実施形態は、ポリソルベート−２０、ポリソルベート−４０およびポリソルベート８０である。
【００８２】
例えば、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）は、ポリエトキシル化したソルビタンおよびオレイン酸に由来し、以下の構造を有している非イオン洗剤である。
【００８３】
【化４】
2020117518.tif 000006
【００８４】
ポリソルベート８０の場合では、右側に示された部分が６０−７０％のオレイン酸（表わされているように）、及びそれとバランスをとるように主にリノール酸、パルミチン酸及びステアリン酸を含む脂肪酸の混合物である。
【００８５】
より特定の実施形態において、ポリソルベートは記載された方法および組成物の中で使用される、油ベースの液体製剤の３−１５％重量／重量を構成する。より特定の実施形態において、割合は５−１４％を含む。より特定の実施形態において、割合は７−１２％を含む。より特定の実施形態において、割合は１０％、または代替的に５％である。
【００８６】
＜二価陽イオンのキレート剤＞
記載された方法および組成物中で使用される二価陽イオンのキレート剤は、１つの実施形態においてカルシウム、マグネシウムおよびマンガンイオンの少なくとも１つへの高い親和性がある任意の生理学的に許容可能な化合物である。別の実施形態において、キレート剤は以下のクエン酸塩または塩から成る群から選択される：エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはその塩（例えば二ナトリウムＥＤＴＡおよびカルシウム二ナトリウムＥＤＴＡ）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）またはその塩、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはその塩、及びＢＡＰＴＡ（１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシド）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸）またはその塩。他の実施形態では、上記にリストされたキレート剤のうちの１つが使用される。より特定の実施形態において、キレート剤はＥＤＴＡである。
【００８７】
＜油＞
当業者は、本明細書中の発見に照らして、記載された組成物の液相の基礎として様々な油が利用され得ることを理解するだろう。特定の実施形態において、油は周囲温度で液体である、任意の生理学的に許容可能な油であり得る。
【００８８】
より特定の実施形態において、油はオメガ−３脂肪酸を含む。他の実施形態において、オメガ−３脂肪酸はオメガ−３多価不飽和脂肪酸である。別の実施形態において、オメガ−３脂肪酸は、オメガ−３、ポリ不飽和、２２−炭素の脂肪酸であって、４、７、１０、１３、１６、１９−ドコサヘキサエン酸である。別の実施形態において、オメガ−３脂肪酸は−−リノレン酸（９，１２，１５−オクタデカトリエン酸）である。別の実施形態において、オメガ−３脂肪酸はステアリドン酸（６、９、１２、１５−オクタデカテトラエン酸）である。別の実施形態において、オメガ−３脂肪酸はエイコサトリエン酸（ＥＴＡ；１１、１４、１７−エイコサトリエン酸）である。別の実施形態において、オメガ−３脂肪酸はエイコサテトラエン酸（８、１１、１４、１７−エイコサテトラエン酸）である。１つの実施形態において、オメガ−３脂肪酸はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；  ５、８、１１、１４、１７−エイコサペンタエン酸）である。別の実施形態において、オメガ−３脂肪酸は、エイコサヘキサエン酸（５、７、９、１１、１４、１７−エイコサヘキサエン酸とも呼ばれる）である。別の実施形態において、オメガ−３脂肪酸はドコサペンタエン酸（ＤＰＡ；７、１０、１３、１６、１９−ドコサペンタエン酸）である。別の実施形態において、オメガ−３脂肪酸はテトラコサヘキサノエン酸（６、９、１２、１５、１８、２１−テトラコサヘキサノエン酸）である。
【００８９】
他の実施形態において、油はオメガ−３脂肪酸を含む、天然の油である。より特定の実施形態において、油は、魚油、キャノーラ油、アマニ油、藻油およびタイマ油から成る群から選択される。より特定の実施形態において、油は、魚油である。いくつかのタイプの魚油は記載された組成物中で試験され、同様に良く機能することがすべて見出された。
【００９０】
他の実施形態において、記載された方法又は組成物において使用した液体製剤は水がない。「水がない」は、特定の実施形態において、水性成分が故意に加えられていない製剤を指す。それは、その成分中に空気から吸収された微量の水の存在を妨げない。他の実施形態において、液体製剤は水性成分がない。また他の実施形態において、１つ以上の油が液体製剤の唯一の液体成分である。より特定の実施形態において、魚油は液体製剤の唯一の液体成分がある。
【００９１】
＜コーティング＞
当業者は本明細書中の発見に照らして、様々なｐＨ感受性コーティングが記載された方法および組成物内で使用され得ることを理解するだろう。特定の実施形態において、被験体の胃の中での組成物の消化を阻害する任意のコーティングが利用され得る。
【００９２】
他の実施形態において、コーティングは生分解性多糖類を含む。他の実施形態において、ヒドロゲルが使用される。他の実施形態において、コーティングは、以下の賦形剤のうちの１つを含む：キトサン、アクアコートＥＣＤコーティング、アゾ−架橋重合体、酢酸フタル酸セルロース、トリメリト酸酢酸セルロース（ＣＡＴ）、酢酸酪酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタル酸塩またはポリ酢酸ビニルフタル酸塩。
【００９３】
他の実施形態において、Ｐｕｌｓｉｎｃａｐ（商標）のような徐放性の系が使用される。
【００９４】
好ましい実施形態において、ｐＨが、胃のｐＨと比較してアルカリである腸において見出される範囲に達する場合、記載された被覆剤形はコア（油ベースの製剤を含む）を放出する。より特定の実施形態において、コーティングはｐＨ感受性ポリマーを含む。様々な実施形態において、単層または多重層コーティングのいずれかは利用し得る。
【００９５】
１つの実施形態において、コーティングは腸溶コーティングである。腸溶コーティングのための方法は、当該技術分野（例えば、ＳｉｅｐｍａｎｎＦら２００５を参照）において周知である。より特定の実施形態において、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）コーティングは腸溶コーティングとして使用される。Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）コーティングはアクリルポリマーであり、その使用は当該技術分野において周知である。
【００９６】
別の実施形態において、記載された組成物の胃耐性コーティングとしてマイクロカプセル化が使用される。マイクロカプセル化のための方法は当該技術分野において周知である。
【００９７】
他の実施形態において、コーティングはカプセルであり、ゼラチンカプセルがより特定の実施形態である。ゼラチンカプセルに油ベースの製剤を入れる方法は、当該技術分野において周知である。また他の実施形態において、コーティングはソフトゲル腸溶コーティングカプセルである。
【００９８】
別の実施形態において、油ベースの液体製剤を含む経口医薬組成物が提供され、油ベースの液体製剤は１００キロダルトンまでの治療用タンパク質、二価陽イオンのキレート剤、分離したキモトリプシン／トリプシン阻害剤、分離したトリプシン阻害剤及び脂肪酸のＰＥＧエステルを含む。他の実施形態において、液体製剤は、１ｍｌの液体製剤当たり少なくとも５０ｍｇのキモトリプシンを阻害する抗キモトリプシン活性を有する。他の実施形態において、液体製剤は１ｍｌの液体製剤当たり少なくとも５０ｍｇのキモトリプシンを阻害する抗キモトリプシン活性、および１ｍｌの液体製剤当たり少なくとも２５のトリプシンを阻害する抗トリプシン活性の両方を有する。他の実施形態において、遊離ＰＥＧも存在する。他の実施形態において、非イオン洗剤も存在する。他の実施形態において、液体製剤は１００キロダルトンまでの治療用タンパク質、二価陽イオンのキレート剤、キモトリプシン／トリプシン阻害剤、トリプシン阻害剤および脂肪酸のＰＥＧエステルから本質的に成る。他の実施形態において、液体製剤は１００キロダルトンまでの治療用タンパク質、二価陽イオンのキレート剤、キモトリプシン／トリプシン阻害剤、トリプシン阻害剤、脂肪酸のＰＥＧエステル及び遊離ＰＥＧから本質的に成る。他の実施形態では、液体製剤は１００キロダルトンまでの治療用タンパク質、二価陽イオンのキレート剤、キモトリプシン／トリプシン阻害剤、トリプシン阻害剤、脂肪酸のＰＥＧエステル、遊離ＰＥＧ及び非イオン洗剤から本質的に成る。
【００９９】
＜代表的な製剤＞
特定の代表的なインスリン製剤は、カプセルに覆われ、魚油中にインスリン、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４、ＥＤＴＡ、ＳＢＴＩおよびアプロチニンを含む。特定の代表的なエクセナチド製剤はカプセルに覆われ、魚油中にエクセナチド、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４、ＥＤＴＡ、ＳＢＴＩおよびアプロチニンを包含している。もう１つの特定の実施形態は、８−２０％のＧｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４；１個のカプセル当たり５０−１００ｍｇの分離したＢＢＩ、または分離したＢＢＩ／分離したＫＴＩの混合物；１個のカプセル当たり２０−３０ｍｇのアプロチニン；及び１００−２００ｍｇのＥＤＴＡを、１個のカプセル当たり８−３２ｍｇのインスリンおよび／または１個のカプセル当たり１５０−６００μｇのエクセナチドであり得る治療用タンパク質とともに有し、０．５−０．７ｍｌの魚油に全て混ぜ合わせた製剤である。別の代表的な液体インスリン製剤は、魚油中にインスリン、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４、ＥＤＴＡ、ＢＢＩ、ＫＴＩおよびアプロチニンを含む。他の実施形態において、液体製剤はインスリン、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４、ＥＤＴＡ、ＢＢＩ、ＫＴＩ、アプロチニンおよび魚油から本質的に成る。より特定の製剤は、０．５−０．７ｍｌの魚油中に８ｍｇのインスリン、１２％  Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４、１５０ｍｇのＥＤＴＡ、合計７５ｍｇのＢＢＩとＫＴＩおよび２４ｍｇのアプロチニンを含む；０．５−０．７ｍｌの魚油中に１６ｍｇのインスリン、１２％  Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４、１５０ｍｇのＥＤＴＡ、合計７５ｍｇのＢＢＩとＫＴＩおよび２４ｍｇのアプロチニンを含む；及び、０．５−０．７ｍｌの魚中に１６ｍｇのインスリン、１２％  Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４、１５０ｍｇのＥＤＴＡ、合計１５０ｍｇのＢＢＩとＫＴＩおよび２４ｍｇのアプロチニンを含む。またより特定の製剤において、組成物の抗トリプシン活性と抗キモトリプシン活性の比率は約１．２８：１である。他の実施形態において、上記組成物はさらに非イオン洗剤を含む。より特殊な実施形態において、非イオン洗剤はポリソルベートベースの洗剤である。より特殊な実施形態において、ポリソルベートベースの洗剤はポリソルベート８０である。好ましくは、ポリソルベート８０は油ベースの液体製剤の３−１０％重量／重量を構成する。液体製剤はソフトゲルで被覆された腸溶コーティングカプセルであり得る。この段落に述べられている特定の製剤は、特定の実施形態において、同じ成分を同じ割合で含むスケールアップ及びスケールダウンした製剤も包含する。
【０１００】
いくつかの代表的な経口エクセナチド製剤は、魚油中にエクセナチド、ＥＤＴＡ、ＢＢＩ、ＫＴＩおよびアプロチニンを含む。他の実施形態において、液体製剤はエクセナチド、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４、ＥＤＴＡ、ＢＢＩ、ＫＴＩ、アプロチニンおよび魚油から本質的に成る。より特定の製剤は、０．５−０．７ｍｌの魚油中に１５０マイクログラム（ｍｃｇ）のエクセナチド、１５０ｍｇのＥＤＴＡ、合計７５ｍｇのＢＢＩとＫＴＩおよび２４ｍｇのアプロチニンを含む；０．５−０．７ｍｌの魚油中に３００ｍｃｇのエクセナチド、１５０ｍｇのＥＤＴＡ、合計７５ｍｇのＢＢＩとＫＴＩおよび２４ｍｇのアプロチニンを含む；また、０．５−０．７ｍｌの魚内での３００ｍｃｇエクセナチド、１５０ｍｇのＥＤＴＡ、合計１５０ｍｇのＢＢＩとＫＴＩおよび２４ｍｇのアプロチニンを含む。
【０１０１】
さらに特定の製剤において、組成物の抗トリプシン活性と抗キモトリプシン活性の比率は、１．５：１と１：１の間を含む。より特定の実施形態において、比率は約１．２８：１である。液体製剤はソフトゲルで被覆された腸溶コーティングカプセルである。他の実施形態において、上記組成物は非イオン洗剤をさらに含む。より特定の実施形態において、非イオン洗剤はポリソルベートベースの洗剤である。より特定の実施形態において、ポリソルベートベースの洗剤はポリソルベート８０である。好ましくは、ポリソルベート８０は油ベースの液体製剤の３−１０％重量／重量を構成する。液体製剤はソフトゲルで被覆した腸溶コーティングカプセルであり得る。
【０１０２】
＜治療指標＞
別の態様において、被験体へ活性成分を経口で投与するための医薬の調製に、本明細書中に記載されているＢＢＩの使用が提供される。別の態様において、被験体へ活性成分を経口で投与するための医薬の調製に、本明細書中に記載されているＢＢＩの使用が提供される。
【０１０３】
また別の態様において、医薬組成物を作る方法が提供され、該方法は、（ａ）  本明細書中に記載されているＢＢＩ及び活性成分を含む混合物を生成する工程、及び（ｂ）混合物を薬学的に許容可能な製剤に調剤する工程、を含む。
【０１０４】
また別の態様において、医薬組成物を作る方法が提供され、該方法は、（ａ）  本明細書中に記載されているＫＴＩ３及び活性成分を含む混合物を生成する工程、及び（ｂ）混合物を薬学的に許容可能な製剤に調剤する工程、を含む。
【０１０５】
本明細書中で示されているように、調剤する工程は、所望の医薬組成物に適切なように、賦形剤、削合、コーティングなどを随意に加える工程を含む。これらの工程は当業者の能力の範囲内である。
【０１０６】
特定の実施形態において、本明細書に示されているように活性成分はヒト消化管での分解または不活性化に影響を受けやすい。
【０１０７】
別の態様において、被験体へ活性成分を経口で投与するために、本明細書中に記載されている経口医薬組成物が提供される。特定の好ましい実施形態において、活性成分はヒト消化管での分解または不活性化に影響を受けやすい。より特定の実施形態において、活性成分は治療用タンパク質であり得る。他の実施形態において、活性成分はヒト消化管での分解または不活性化に影響を受けやすい、非タンパク質分子である。
【０１０８】
別の態様において、被験体へ治療用タンパク質を経口で投与するための医薬の調製に、本明細書中に記載の経口医薬組成物の使用を提供する。
【０１０９】
別の態様において、被験体に治療用タンパク質を経口投与する方法が提供され、該方法は本明細書中に記載されている経口医薬組成物を被験体に投与し、その結果被験体に治療用タンパク質を口から投与する工程を含む。
【０１１０】
別の態様において、ヒトにおける糖尿病を処置するために本明細書中に記載されている医薬組成物が提供され、幾つかの実施形態において治療用タンパク質は様々な実施形態においてインスリン、エクセナチド又はその組み合わせである。
【０１１１】
また別の態様において、ヒトにおける糖尿病を処置するために本明細書中に記載されている医薬組成物が提供され、幾つかの実施形態において治療用タンパク質は様々な実施形態においてインスリン、エクセナチド又はその組み合わせである。
【０１１２】
また別の態様において、糖尿病を処置するための方法が提供され、該方法はそのような処置を必要としている被験体に本明細書中に記載されている医薬組成物を投与する工程を含み、幾つかの実施形態では、治療用タンパク質が様々な実施形態においてインスリン、エクセナチドまたはその組み合わせであり、その結果糖尿病を処置する。特定の実施形態において、被験体はヒト被験体である一方、他の実施形態において、被験体はヒト以外の哺乳類である。
【０１１３】
追加の態様において、ヒトにおける不安定型糖尿病を処置するために本明細書中に記載されている医薬組成物が提供される。別の態様において、本明細書中に記載されている医薬組成物は、ヒトにおける高い空腹時血糖値を処置するために提供される。
【０１１４】
また別の態様において、ヒトにおける不安定型糖尿病を処置するための医薬の調製への、本明細書中に記載されている成分の組み合わせの使用が提供される。さらに、ヒトにおける高い空腹時血糖値の処置のための医薬の調製への、本明細書中に記載されている成分の組み合わせの使用が提供される。
【０１１５】
さらに、不安定型糖尿病を処置するための方法が提供され、該方法はそのような処置を必要としている被験体に本明細書中に記載されている医薬組成物を投与する工程を含み、結果として不安定型糖尿病を処置する。高い空腹時血糖値を下げる方法がさらに提供され、該方法はそのような処置を必要としている被験体に本明細書中に記載されている医薬組成物を投与する工程を含み、結果として高い空腹時血糖値を下げる。特定の好ましい実施形態において、被験体はヒト被験体である。
【０１１６】
＜不安定型糖尿病＞
当該技術分野に熟練している医師は、多くの許容可能な標準的な手順によって、血糖変動（ｇｌｙｃｅｍｉｃ  ｌａｂｉｌｉｔｙ）として知られている不安定型糖尿病を診断することができることを理解するだろう。そのような手順の１つがＲｙａｎら２００４年に表わされている。この手順では、被験体は１日当たり最低２回の末梢血の血糖測定によって血糖値をモニターするように依頼される。患者は、シート上の４週間の期間にわたる低血糖の発生に関する、測定されたグルコース値および詳細をすべて記録する（図１１Ａ−Ｂ）。血糖値が＜３．０ｍｍｏｌ／ｌと記録されたらどのような場合で被験体は、その症状が起きたか及び低血糖反応を認識又は処置のいずれかを行うために第三者からの外部の助けが得られたかどうかを含むアンケートに、事象の詳細を記載するように依頼される。個体が状況を制御できなくなり、低血糖事象を処置するために外部の助けが必要であれば、反応は重度であると考えられる。他のそのような方法は、ＭＡＧＥ指標（Ｓｅｒｖｉｃｅら１９７０）または「Ｍ値」（Ｓｃｈｌｉｃｈｔｋｒｕｌｌら）あるいは連続的なグルコースモニタリングシステム（Ｋｅｓｓｌｅｒら）を使用した計算を含んでいる。不安定型糖尿病は典型的に高い空腹時血糖および／または低血糖症状の出現に関係している。
【０１１７】
＜プロテアーゼ阻害剤を分離する方法＞
また別の態様において、大豆生成物（例えば大豆粉）からＢＢＩを精製する方法が提供され、該方法は次の工程を含む：ａ）大豆生成物から抽出物を含む液体の混合物を得る工程であって、液体の混合物がｐＨバッファーを用いた水溶液であり、ｐＨ５．５−７．５の間を含むｐＨを有し、５０ｍＭ未満の塩濃度である工程、及びｂ）サイズ排除クロマトグラフィに溶液を供し、正電荷を持つレジン及び多糖類高分子材料を含む定常期を使用する工程であって、サイズ排除クロマトグラフィが不連続な塩ステップ勾配（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｓｔｅｐ  ｓａｌｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）を含み、最初の工程で使用される溶液の塩濃度は４０ｍＭよりも低く、好ましくは２０ｍＭよりも低く、次の工程（典型的には第２ステップだがそうである必要はない）で使用される溶液の塩濃度は４０−８５ｍＭの間であり、より好ましくは５０−８０ｍＭ，より好ましくは６０−８０ｍＭ、より好ましくは６５−７５ｍＭ、最も好ましくは７０ｍＭである、工程。
【０１１８】
代替的にまたは付加的に、上記の方法は、８０−１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、より好ましくは１００ｍＭ  ＮａＣｌが存在するｐＨ４．５のバッファー中で大豆粉末を抽出する前工程であって、幾つかの実施形態においてｐＨを４．５に調節した後、代替的に又は付加的にフィルタープレスを清澄化する、前工程をさらに含む。代替的に又は追加的に、前記方法は、幾つかの実施形態においては例えば１２−１７℃の低い温度下で行う、３０−４０％、より好ましくは３５％飽和硫酸アンモニウム（ＡＳ）を用いた、大豆粉末の最初の液体調製物を沈殿させる前工程（５．５−７．５のｐＨを有する液体混合物を得る、前述の工程の前であって、大豆粉末を抽出する工程の後）をさらに含む。さらなる実施形態において、その後沈殿物は、例えば連続的な円筒型遠心分離機によって遠心分離することで回収した。また他の実施形態において、ＡＳペレットは特定の実施形態ではｐＨ  ７．０−８．０のリン酸塩緩衝液中で抽出され、次に遠心分離によって随意に清澄化した。様々な他の実施形態において、結果として生じる上清は、水、または代替的に遠心分離及び／又は凍結乾燥によって清澄化したｐＨ６．０−７．０の１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーに対して透析した。
【０１１９】
より特定の実施形態において、上記の方法は、９０−１２０  ｍＭ、より好ましくは１００ｍＭのバッファーでカラムを洗浄することによりＫＴＩを分離し、１５０ｍＭよりも高い、好ましくは１８０ｍＭのバッファーでＫＴＩを溶出する工程をさらに含む。代替的に又は付加的に、該方法は、ろ過（限定されない例は０．４５／０．２μｍフィルタ）によって微生物を除去する工程をさらに含む。代替的に又は付加的に、該方法は２０，０００−４０，０００  ＭＷＣＯフィルタ、好ましくは３０，０００のＭＷＣＯを介してろ過し、ろ液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）を保存する工程をさらに含む。この工程は、０．１５−０．５Ｍ、より好ましくは０．１８Ｍの塩濃度の存在下で行われるのが好ましい。代替的に又は付加的に、該方法は、５０００ＭＷＣＯフィルタで結果として生じた溶液を濃縮し、濃縮液を保存する工程をさらに含む。代替的に又は付加的に、該方法は、例えばｐＨ７．０−８．０を有するリン酸ナトリウムバッファー中で１０，０００ＭＷＣＯフィルタで結果として生じた溶液を透析する工程をさらに含む。
【０１２０】
代替的にまたは付加的に、該方法は、最終の液体生成物を凍結乾燥する工程をさらに含む。また別の態様において、大豆生成物からのＫＴＩ３（クニッツトリプシン阻害剤３）を精製するための方法が提供され、次の工程を含む：ａ）大豆生成物から抽出物を含む液体の混合物を得る工程であって、液体の混合物がｐＨバッファーを用いた水溶液であり、ｐＨ６−７の間を含むｐＨを有し、５０ｍＭ未満の塩濃度である工程、及びｂ）サイズ排除クロマトグラフィに溶液を供し、正電荷を持つレジン及び多糖類高分子材料を含む定常期を使用する工程であって、サイズ排除クロマトグラフィが不連続な塩ステップ勾配（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｓｔｅｐ  ｓａｌｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）を含み、洗浄工程（第１工程又はその後の工程のいずれか）で使用される溶液の塩濃度は８０ｍＭよりも高く、次の工程（ＫＴＩ３が溶出される）で使用される溶液の塩濃度は１４０−２５０ｍＭの間であり、より好ましくは１６０−２２０ｍＭ，より好ましくは１７０−２００ｍＭ、より好ましくは１８０ｍＭである、工程。
【０１２１】
代替的にまたは付加的に、上記の方法は、８０−１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、より好ましくは１００ｍＭ  ＮａＣｌが存在するｐＨ４．５のバッファー中で大豆粉末を抽出する前工程をさらに含む。代替的に又は追加的に、前記方法は、３０−４０％、より好ましくは３５％飽和硫酸アンモニウム（ＡＳ）を用いた、大豆粉末の最初の液体調製物を沈殿させる前工程をさらに含む。代替的に又は付加的に、該方法は、ろ過（限定されない例は０．４５／０．２μｍフィルタ）によって微生物を除去する工程をさらに含む。代替的に又は付加的に、該方法は、５０００ＭＷＣＯフィルタで結果として生じた溶液を濃縮し、濃縮液を保存する工程をさらに含む。代替的に又は付加的に、該方法は１０，０００ＭＷＣＯフィルタで結果として生じた溶液を透析する工程をさらに含む。代替的にまたは付加的に、該方法は、最終の液体生成物を凍結乾燥する工程をさらに含む。
【０１２２】
上で示された「液体混合物」は、特定の実施形態において溶液、懸濁液またはその組み合わせであり得る。好ましい実施形態において、塩濃度は４０ｍＭより低く、より好ましくは３０ｍＭより低く、より好ましくは２０ｍＭより低く、より好ましくは１０ｍＭよりも低い。最も好ましくは、塩は加えられていない。他の実施形態において、液体混合物のｐＨは６−７の間を含む。
【０１２３】
上記の方法の中で使用される正電荷を持つレジンは、いくつかの実施形態において、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）第３級アミン官能基である。代替的に又は付加的に、多糖類高分子材料はリジン側鎖を通じて架橋している。そのような材料の限定しない１つの例は、海藻から抽出された架橋したビーズ状の多糖類高分子材料のＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）である。
【０１２４】
特定の実施形態において、プロテアーゼ阻害剤を分離する記載された方法は、ＰＥＧ−包含試薬を利用しない。
【０１２５】
＜医薬組成物を生成する方法＞
本明細書中には医薬組成物を生成する方法も提供される。特定の実施形態において、方法は随意に溶解したＧｅｌｕｃｉｒｅ（例えばＧｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４）を魚油で混ぜ合わせ、その後粉末状のＥＤＴＡ、ＳＢＴＩ、アプロチニン及び例えばインスリン、又は他の実施形態においてはエクセナチドである治療用タンパク質又はペプチドを加える工程を含むが、当業者は本明細書中の発見に照らして他の治療用タンパク質又はペプチドが同様に使用され得ることを理解するだろう。他の実施形態において、該方法は、随意に溶解したＧｅｌｕｃｉｒｅ（例えばＧｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４）を魚油で混ぜ合わせ、混合物を冷やし、その後粉末状のＥＤＴＡ、ＳＢＴＩ、アプロチニン及び治療用タンパク質又はペプチドを加える工程を含む。特定の実施形態において、粉末成分はリストされた順に加えられる。他の実施形態において、結果として生じる混合物は、随意に混合および／または均質化される。
【０１２６】
ＢＢＩ純度、ＫＴＩ純度、タンパク質の性質又は液体成分の性質等の単一の特徴の選択肢が「実施形態」として示された場合はいつでも、本明細書中に提供される全ての製剤とは異なる実施形態を形成するために、そのような選択肢は自由に組み合わせることができると理解される。
【０１２７】
「から本質的に成る」は、本明細書に使用されているように、発明の範囲を、特許請求の範囲の発明の基本的な及び新規の特徴に実質的に影響せずに、特定の材料又は工程に限定する。
【０１２８】
それを許可する管轄に関して、本明細書中の上述及び下述の両方で言及される特許、特許出願および出版物は、引用によって本明細書中に組み込まれる。
【実施例】
【０１２９】
実験の詳細
＜実施例１：改善されたＫＴＩおよびＢＢＩ製剤の小規模生成＞
概観
大豆粉末からＳＢＴＩを生成するための以前のプロトコルは、１％の収量で未精製のプロテアーゼ阻害剤を生成した。トリプシン阻害剤（ＴＩ）活性を有するＫＴＩ（クニッツトリプシン阻害剤）及びトリプシン／キモトリプシン阻害剤（ＣＴＩ）活性を有するＢＢＩ（ボーマン−バーク阻害剤）の別々のバルク材の生成方法を開発するために以下の実験が行われ、各生成物は高レベルの酵素活性、改善された収量及び高分子量（ＭＷ）−汚染物質を最小化するためのそれ自身の仕様（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の下で調製した。
【０１３０】
生産工程は２つの主な段階を含んでいる：
段階１：
大豆粉末からのＳＢＴＩ中間物の生成
未精製のＳＢＴＩを硫酸アンモニウム（ＡＳ）を用いて上清から沈殿させ、遠心分離によって回収した。タンパク質は超過したＡＳを除去するために抽出され透析された。
透析された抽出は凍結乾燥させ、分析し、「ＳＢＴＩ中間体」と名付けた（図１Ａ）。
【０１３１】
段階２：
精製されたＢＢＩおよびＫＴＩを生成するためのＳＢＴＩ中間体の後半の精製。
ＳＢＴＩ中間体をＤＥＡＥ−セファロース（商標）速流カラムに充填した。ＫＴＩとＢＢＩは、塩ステップ勾配によって別々に溶出した。高−ＭＷ汚染物質を少なくするために、ＢＢＩは３０，０００分子量カット（ＭＷＣＯ）フィルタを通じたろ過によってさらに精製した。最終的な製剤は凍結乾燥前にリン酸塩緩衝液内で調製した（図１Ｂ）。
【０１３２】
図１に示されるプロセスの様々なパラメータは変更され、それは以下を含む：大豆粉末のタイプは、出発物質、抽出バッファーのｐＨ及び塩のレベル、沈澱反応に使用するＡＳの割合、カラム充填に使用されるバッファーのｐＨ及び塩レベル及び溶出条件（連続的な塩の勾配対ステップ勾配）。
【０１３３】
７Ｂ大豆粉（脱脂した及び最小限に加熱した大豆粉末、Ａｒｃｈｅｒ  Ｄａｎｉｅｌｓ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｄｅｃａｔｕｒ，  ＩＬ製）を使用した。抽出のための好ましいｐＨは、適切でないタンパク質のレベルを下げる一方、ＫＴＩ及びＢＢＩのレベルを比較的高く保つ４．５である。連続的な材料沈澱反応が、塩を含まない状態で観察され、抽出バッファーへの塩の追加は、沈澱反応を防ぐことによりプロセスを著しく改善した。タンパク質沈殿のための３５％ＡＳの使用は結果としてより低いレベルの高−ＭＷタンパク質をもたらす一方、ＫＴＩ及びＢＢＩのレベルへの影響は最小限だった。ｐＨ−６．５カラム充填バッファーの使用は、ＤＥＡＥ−セファロースカラムに結合する適切でないタンパク質の量を減らした。塩ステップ勾配中の溶出は、結果的にＫＴＩおよび他の適切でないタンパク質からのＢＢＩのより良い分離をもたらした。ＢＢＩは、０．５Ｍ  ＮａＣｌがある状態で３０，０００のＭＷＣＯフィルタを通してろ過することにより効率的に精製された。
【０１３４】
＜実施例２：より大規模な改善されたＳＢＴＩ生成＞
２５キログラム（ｋｇ）の大豆粉末を使用する、より大規模な３つの実験を行った。分離板型遠心分離機（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ、最初の２つつの実験）又はフィルタープレス（３つ目の実験）を用いて抽出物の回収を行った。材料の５０％はＷｅｓｔｆａｌｉａ遠心分離で失われた一方、抽出物の損失はフィルタープレスでは観察されなかった。３つ目の実験のプロトコルおよび分析的な結果は、表１−２にそれぞれ示される。
【０１３５】
【表１】
2020117518.tif 000007
【０１３６】
【表２】
2020117518.tif 000008
【０１３７】
次に、ＳＢＴＩ中間体を表３に示される下流の精製プロセスに供した。得られたＫＩＴ及びＢＢＩの分析結果はそれぞれ表４−５に示される。
【０１３８】
【表３】
2020117518.tif 000009
【０１３９】
【表４】
2020117518.tif 000010
【０１４０】
【表５】
2020117518.tif 000011
【０１４１】
ＫＴＩとＢＢＩの画分の明瞭な分離を達成した（図２）。溶出は、０から０．１４Ｍまで、０．１４から０．１８Ｍまでおよび０．１８から０．４のＭまでの勾配で行った．各画分の伝導率及びＯＤ２８０を測定した。ＢＢＩのプールは画分１８−２８から回収した。ＫＴＩのプールは画分４２−５７から回収した。
【０１４２】
各プールの生成物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。高純度生成物をそれぞれのケースで得た（図３）。
【０１４３】
したがって、合成方法及び結果として生じる生成物の著しい改善を達成した。
【０１４４】
【表６】
2020117518.tif 000012
【０１４５】
＜実施例３：代替的なＢＢＩ及びＫＴＩの下流精製プロトコル＞
下流精製プロトコルをいくつか変更した。
【０１４６】
１．カラムから回収したプールへのチメロサールの追加
チメロサールなしで調製したＢＢＩロットは、バイオバーデンの規格である＜１００ＣＦＵ／Ｇのよりも上である高い総好気性微生物数（ＣＦＵ／Ｇ）が検出された。総好気性微生物数の結果（ＣＦＵ／Ｇ）は次のとおりだった：ＫＴＩロット１：０、ＢＢＩロット２：１５．４、ＢＢＩロット３：６１．６、ＢＢＩロット４：１５．４。それ故に、カラムから回収したプールに０．０１％最終濃度になるようチメロサールを加えた。その後のロットはバイオバーデンの規格内であった。全てのロットで酵母及びカビの総数はゼロだった。
【０１４７】
２．改善された塩勾配
よりよくＫＴＩからＢＢＩを分離するために、既知の伝導率を備えた調製済バッファーを使用して段階的塩勾配を行った。
【０１４８】
３．  改善されたろ過プロセス
３０，０００ＭＷＣＯろ過プロセスはＵｎｉｆｌｕｘ１０（商標）システムの代わりにシステムの外側のＫＶＩＣＫ（商標）ホルダーを使用するために適用した。ＫＶＩＣＫホルダーの使用は、一度にフィルタを通した材料の循環および一度に大容量を扱うことを可能にした。ろ過は可能な程度まで穏やかな方法で行なわれた。
【０１４９】
この変更はタンパク質およびＢＢＩ活性の損失を最小化することが見出された。変更前に、１つの精製ロットにつき０．４−０．６／ｍｇのＢＢＩ活性を有する４０−７０グラムの最終生産物が得られていた。その後は、０．８−１．４／ｍｇのＢＢＩ活性を有する８５−１３５グラムの最終生産物が得られた。また、限外濾過に使用された溶液を、０．５ＭのＮａＣｌから０．１８ＭのＮａＣｌに変更した。
【０１５０】
詳細なプロトコル
下流精製は、ＳＢＴＩ中間体の８００  ｇｒおよび３５０ｇｒのバッチから出発し、ｃＧＭＰ施設内で行った。中間体を４０ＬのバッファーＡに懸濁し、ＤＥＡＥカラム（３７Ｌ＝ＣＶ）に充填した。充填した材料の品質管理（ＱＣ）結果は３１．４７  ｍｇＰ／ｍｌ；ＫＴＩ：０．９７；ＢＢＩ：０．０９であった。カラムを以下のように連続的に洗浄した：
１）４ｘＣＶバッファーＡ（１０ｍＭリン酸ナトリウム  ｐＨ６．５、１．５ｍＳｉ（１つのメーター当たりｍｉｌｌｉＳｉｅｍｅｎｓ）
２）２．１ｘＣＶバッファー、Ａｌ（１０ｍＭリン酸ナトリウム  ｐＨ６．５＋７５ｍＭ  ＮａＣｌ、９．９ｍＳｉ）
３）３ｘＣＶバッファーＡ２（１０ｍＭリン酸ナトリウム  ｐＨ６．５＋１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１２ｍＳｉ）
および
４）４ｘＣＶバッファーＡ３（１０ｍＭリン酸ナトリウム  ｐＨ６．５＋１８０ｍＭ  ＮａＣｌ、２１ｍＳｉ）。
【０１５１】
ＢＢＩプールは画分Ｆ５−Ｆ１１からなり、１３０Ｌの容量および１．４６ｍｇＰ／ｍｌを有する。ＫＴＩプールは画分Ｆ１５−Ｆ１８からなり、８５Ｌ容量を有する。０．０１％の最終濃度になるように両方のプールにチメロサールを加えた。ストックＮａＣｌ溶液を、０．５ＭＮａＣｌの最終濃度になるようにＢＢＩプールに加えた。
【０１５２】
次に、ＢＢＩプールは５本の３０，０００ＭＷＣＯカセットを備えたＫｖｉｃｋホルダーを使用した濾過に供した。ろ液を保存した。ＫＴＩプールを、１０，０００ＭＷＣＯの３本のカセットを備えたＵｎｉｆｌｕｘシステムによって５倍に濃縮し、最終容量が１７．５Ｌとなった。濃縮したプールを、３つの１０，０００ＭＷＣＯカセットを備えたＵｎｉｆｌｕｘ１０システムによって水に対して透析した。
【０１５３】
上記プロトコルの効能を試験するために、小規模カラムクロマトグラフィを行い、異なる画分を試験し、それぞれ図４−５に示される、改善された結果が得られた。これらの結果はいくつかのランに関して複製可能であるために見出された。
【０１５４】
ＢＢＩのみを精製するために、１２．４ｍＳｉを有する３．５ｘバッファーＡを使用し、バッファーＡ３溶出を行わなかったこと以外は同様のプロトコルを繰り返した。さらに、３０，０００ＭＷＣＯフィルタ（２×０．５５ｍ）を使用した２つのＫＶＩＣＫホルダーでＢＢＩプール（１３５Ｌ）を限外ろ過した後、同じシステムだが５，０００ＭＷＣＯフィルタで４．５倍に濃縮した。濃縮残留物を、Ｕｎｉｆｌｕｘシステムで水に対して透析した。各精製工程および最終生産物のサンプルは、以下のプロトコルに従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験され、結果はそれぞれ図６と７に示されている。
【０１５５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、すぐに使えるゲル（ＰｈａｓｔＧｅｌｓ（商標）、２０％、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａより）を使用し、Ｐｈａｓｔ（商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でランを行った。染色液は、５０％メタノール、１０％酢酸および０．０５％ブリリアントブルーであった。脱染色液は３０％のメタノール、１０％酢酸）であった。
【０１５６】
各工程からのサンプルはタンパク濃度およびＢＢＩ活性のために分析された。結果は表７に要約する。最終生産物については、定量化された撮像は、ＢＢＩバンドが８４．４％−８４．９％であることを示した。
【０１５７】
【表７】
2020117518.tif 000013
【０１５８】
改善されたプロトコルのフローチャートを図８に示す。
【０１５９】
実施例１−３で述べた改善の前は、大規模なＳＢＴＩ精製は、精製ロットにつき０．４−０．６／ｍｇのＢＢＩ活性の、４０−７０グラムの最終生産物が得られた（小規模調製で多少高い活性が得られた一方、スケールアップに成功したとはいえない）。変更は、０．８−１．４／ｍｇのＢＢＩ活性での８５−１３５グラムの最終生産物の収量を可能にした。
【０１６０】
＜実施例４：限外ろ過を使用した下流ＢＢＩ及びＫＴＩ精製プロトコル＞
この実施例におけるプロトコルはチメロサールなしで行った。ＳＢＴＩ中間体から出発して、以下のわずかに異なるパラメータを用いて前の実施例（実施例３）と同様にＤＥＡＥカラムクロマトグラフィを行った。
３ｘＣＶバッファーＡ（１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ  ６．５、１．５ｍＳｉ）
２．１ｘＣＶバッファー、Ａｌ（１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ  ６．５＋７０  ｍＭ  ＮａＣｌ、９．９  ｍＳｉ）
３．５ｘＣＶバッファーＡ２（１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５＋１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１２．４ｍＳｉ）
３．５ｘＣＶバッファーＡ３（１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５＋１８０ｍＭ  ＮａＣｌ、２１  ｍＳｉ）
【０１６１】
その結果を図９に示す。
【０１６２】
ＢＢＩプール
ＢＢＩプール、１３０Ｌを回収し、Ｓａｒｔｏｂｒａｎ（商標）０．４５／０．２μｍフィルタ（０．６ｍ２）を通してろ過した。
【０１６３】
ＫＴＩプール
ＫＴＩ、９５Ｌを回収し、Ｓａｒｔｏｂｒａｎ（商標）０．４５／０．２μｍフィルタ（０．６ｍ２）を通してろ過し、−２０°Ｃで保存した。最終容量＝２０Ｌ。
【０１６４】
ＢＢＩ精製：
３０，０００ＭＷＣＯろ過
ＢＢＩプールを０．１８ＭＮａＣｌ濃度になるよう調節し、それぞれが３０，０００ＭＷＣＯの５本のカセットを有する、２×Ｋｖｉｃｋ（商標）ホルダーを使用し、ろ過に供した。４回洗浄した後の計１９５Ｌのろ液を回収した。
【０１６５】
濃縮
３０，０００ＭＷＣＯのろ液は、それぞれ５本の５，０００ＭＷＣＯカセットを有する、２ＫＶＩＣＫホルダーを通して５倍に濃縮した。最終容量＝３４Ｌ。
【０１６６】
透析
濃縮した材料は、伝導率が１ｍＳｉ／ｃｍよりも低くなるまで５×１０，０００ＭＷＣＯフィルタを有するＵｎｉｆｌｕｘ１０システムを使用して、精製水に対して透析した。調剤バッファー（０．５Ｍリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．６）を加え、サンプルをＧｏｒｅ（登録商標）Ｌｙｏｇｕａｒｄ（登録商標）凍結乾燥トレーへ０．４５／０．２μｍフィルタに直接通した。
【０１６７】
凍結乾燥
凍結乾燥後、９５ｇｒ．の乾燥した材料が得られ、ガラスの褐色ボトルに回収した。
ボトルはすべてＱＣ回収した：Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ方法によって水分は８％であることが見出された。
【０１６８】
２連のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験し、ゲルが撮像装置を使用して定量化された。両方のレーンのＢＢＩは９３．５−９３．８％の純度だった（図１０）。
【０１６９】
各ＢＢＩ精製工程からのサンプルのタンパク質濃度、ＢＢＩ活性およびバイオバーデンに関して試験した。
【０１７０】
【表８】
2020117518.tif 000014
【０１７１】
ＫＴＩ精製：
ＫＴＩの濃縮
精密ろ過されたＫＴＩプールを、冷蔵から取り出し、５  ５ＫＤａＭＷＣＯフィルタをそれぞれ有する２ｘＫＶＩＣＫホルダーを使用して濃縮した。最終容量＝１７Ｌ。
【０１７２】
ＫＴＩの透析
濃縮した材料を、５×１０，０００ＭＷＣＯフィルタを備えたＵｎｉｆｌｕｘを用いて水に対して透析した。最終容量＝２０Ｌ。
【０１７３】
調剤バッファーを加え、サンプルを０．４５／０．２μｍフィルタを通してＧｏｒｅ凍結乾燥トレーへ直接入れた。
【０１７４】
凍結乾燥
凍結乾燥した生成物を除去し、４つの褐色ガラスビンへ移した。
【０１７５】
各ＫＴＩ精製工程からのサンプルのタンパク質濃度、ＫＴＩ活性およびバイオバーデンに関して試験した。表９は、精製工程に沿ったＫＴＩ量および質を要約する：
【０１７６】
【表９】
2020117518.tif 000015
【０１７７】
結論
１．  ＳＢＴＩ中間体は比較的高いバイオバーデンを有し、これは第２の精密ろ過によって除去することができる。
２．  精密ろ過後の最終生産物は、要求される規格の範囲内である。
３．  精密ろ過の使用はＢＢＩとＫＴＩの収量または特異的な活性に著しい効果はない。
【０１７８】
＜実施例５：均質のインスリン／魚油調製に有効な乳化剤の同定＞
魚油中にインスリンを含む前の製剤はゆっくり沈殿することが見出されており、それ故大規模な薬学的剤形の調製に適さなかった。新しい製剤は２２．５ｇの魚油当たり３．３７５ｇのＳＢＴＩを包含しており、以下の乳化剤を包含しているものを試験した：レシチン（試験順１）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）（順２）またはＧｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４（順３）を単独でまたは互いにあるいはグリセロール・モノステアレート（ＧＭＳ）との組み合わせ（図１１）。続いて、最も有望な製剤（アスタリスクで示された）を、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ（周囲温度で滑らかな固体だった）を溶かし、その後魚油を加えることにより再び生成した。この混合物を冷やした後に、固体成分の粉末形態を以下の順で加えた：ＥＤＴＡ、ＳＢＴＩ、アプロチニンおよびインスリン。そして、結果として生じる液体をローラーミル上で混合し均質化した。
【０１７９】
＜実施例６：様々な乳化剤の製剤のインビボ動物テスト＞
材料と実験的方法
製剤
試験した製剤を、以下の表１０に示す。任意の乳化剤の割合は存在する液体の重量に関して重量／重量である。
【０１８０】
【表１０】
2020117518.tif 000016
【０１８１】
【表１１】
2020117518.tif 000017
【０１８２】
畜産
動物：臨床的な獣医によって認定された健康なブタのみを研究に使用した。
畜舎：ＣＶＣでいる場合単独、他の場合はグループで飼育。
寝床：コンクリート＋木材チップ。
照明：１２−１２時間の光サイクル。
温度：１９−２５°Ｃ。
【０１８３】
識別
動物はそれぞれ、耳札によって一意的に同定された。
【０１８４】
実験デザイン
動物は、試験の２４−３６時間前及びその後の監視時間中食物を与えられなかった。水の利用は無制限だった。
【０１８５】
動物に、２０ｍｇ／ｋｇケタミン＋２ｍｇ／ｋｇキシラジンで麻酔をかけた。内視鏡検査法のガイダンスの下で液体製剤が十二指腸に直接投与する前に、断食および麻酔をかけたブタをそれらの左側に置いた。製剤の注入の後、１ｍｌの魚油を注入し、その後１０ｍｌ空気を注入することによって装置を洗い流し、その結果すべての材料の投与が保証された。その後、麻酔処置から完全に回復させるためにブタを囲いに戻し、それには１０−１５分を要した。血液サンプル（試験されたものの０．５ｍｌ）を、２４０分の監視時間の間中心静脈カテーテル（ＣＶＣ）から周期的に取り出した。血糖濃度は各時間点で各サンプルから測定した。子豚は、感染症を回避するためにすべての実験後にゲンタマイシン（１００ｍｇ／１０ｋｇ）を静脈内投与して処置した。グルコース濃度が３０ｍｇ／ｄＬ未満に落ちた場合、子豚に市販のブタ用の餌を与え、グルコース濃度をさらにその後３０分間監視した。少なくとも２日の洗い出し期間を検査日の間に行った。
【０１８６】
結果
異なる乳化剤を備えた１０のインスリン−魚油製剤を、２つの別々の試験で血糖値のインビボ活性に関して試験した。その結果を表１１に示す。
【０１８７】
【表１２】
2020117518.tif 000018
【０１８８】
図１２に記載された試験６Ｂの結果は、全ての製剤が効果的である一方、表１０の製剤Ｅ及びＦが最も一様なグルコースレベルの急落を示す。
【０１８９】
実施例７：改善されたＳＢＴＩを包含している経口タンパク質製剤の臨床実験
研究は健康なボランティアにおける記載された経口インスリン製剤の安全性、薬物動態および薬効を決定するために行なわれた。被験体は、個別の来院中に以下の経口インスリン錠剤製剤のうちの１つの１回量を受け取った。各服用後７２時間の洗い出し期間があった。用量は、８時間の一晩絶食後朝に投与した。
【０１９０】
処理群
１．８ｍｇのインスリン製剤の１個のカプセル：
８ｍｇインスリン、１５０ｍｇＥＤＴＡ、合計７５ｍｇの精製したＢＢＩ及び精製したＫＴＩの混合物、１５００００Ｕアプロチニンおよび１２％Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４。
２．１６ｍｇのインスリン製剤の１個のカプセル：
１６ｍｇインスリン、１５０ｍｇＥＤＴＡ、合計７５ｍｇの精製したＢＢＩ及び精製したＫＴＩの混合物、１５００００Ｕの組み換え型アプロチニンおよび１２％Ｇｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４。
３．８ｍｇインスリン製剤の２つのカプセル。
【０１９１】
スクリーニング段階：
被験体がインフォームドコンセントに署名した後、以下の評価を行った：
・病歴
・健康診断
・薬歴
・ＥＣＧ
・生命徴候（血圧、心拍数）。生命徴候は少なくとも５分間の休息の後に座った姿勢で測定した。
・臨床検査値の評価（化学、血液学）
【０１９２】
処置段階
被験体は８時間の一晩絶食後投薬した日の朝にクリニックに来院した。
治験薬の投与前に：
・血液サンプル採取のために留置カテーテルを挿入した。
・グルコース検査（１滴）を治験薬の投与の１５分（ｍｉｎ）前に行った。
・生命徴候を、治験薬の投与２０分前に記録した。
生命徴候は少なくとも５分間の休息の後に座った姿勢で測定した。
・インスリン、血漿グルコースおよびｃ−ペプチド分析のための血液サンプルを、治験薬の投与１５分前に回収した。
【０１９３】
投薬のためのプロトコル：
実験薬剤を、少なくとも３００ｍＬ水とともに経口投与した。
被験体は研究薬物を受けた後に少なくとも１時間直立したまたは座った姿勢を保った。
・生命徴候（血圧、心拍数）を、治験薬の投与後約２および５時間（時間）に記録した。
生命徴候は少なくとも５分間の休息の後に座った姿勢で測定した。
・インスリン、血漿グルコースおよびｃ−ペプチド分析のための血液サンプルを、最初の１時間は２０分毎に、その後治験薬の投与後５時間までは１５毎に回収した。
各期間の評価を完了した後に、被験体は食事を与えられ退院し、最低７２時間の洗い出し期間の後次の期間のために戻ってくるよう依頼された。
【０１９４】
研究の終了／初期の中止：
調査単位からの退院前に、被験体は以下の研究終了時の評価を受けた：
・生命徴候は少なくとも５分間の休息の後に座った姿勢で測定した。
・臨床検査値の評価（血液学、化学）
初期に中止した被験体は中止した時に研究終了時の評価を完了した。
【０１９５】
結果
インスリンの様々な用量は、その後任意の処置を受けるような、報告又は観察された有害事象もなく、よく許容された。投与から≧６０分のラグの後、全ての処置に対して最大の血糖反応が７／１０の患者で見られた。８＋８ｍｇ（４７．９±１１．３ｍｇ／ｄＬ、ｐ＝０．００６）および１６ｍｇ（５７．３±８．４ｍｇ／ｄＬ、ｐ＝０．００１）の処置後、８ｍｇ群（６４．６±６．２ｍｇ／ｄＬ）と比較して著しく低い平均血糖値Ｃｍｉｎが観察された。８ｍｇ（それぞれｐ＝０．００３および０．００８）と比較した時、グルコース曲線下面積（ＡＵＣ）値の著しい低下が、８＋８ｍｇおよび１６ｍｇの処置（それぞれ１３．２％および８．１％）の両方の後に観察された（図１５および下記表）。
そのような違いは先行技術のＳＢＴＩ調製物を含む製剤では見い出されなかった。
【０１９６】
【表１３】
2020117518.tif 000019
【０１９７】
【表１４】
2020117518.tif 000020
【０１９８】
＜実施例８：改善されたＳＢＴＩを包含する経口タンパク質製剤の動物試験＞
追加の動物試験を、高度に精製されたＳＢＴＩ及びタンパク質薬剤（例えばインスリン又はエクセナチド）を含む製剤について、本明細書に記載されている１つ以上のプロトコルと同様の様式で行った。いくつかの実験において、液体製剤はゼラチンで覆われたおよび／または腸溶性被覆でカプセルが覆われたものであり、経口で投与され得る。他の実験において、液体製剤は、カニューレまたはその他同種のものによって十二指腸に直接投与される。特定の実験において動物は、食事前又は食事後の状態をシミュレーションするために製剤の投与前又は投与後に餌を食べることができる。また別の実験において、上に記載されたように組み換え型ＳＢＴＩが使用される。
【０１９９】
他の実験において、上に記載されたように、合成ＳＢＴＩが使用される。
【０２００】
＜実施例９：ヒト被験体における改善されたＳＢＴＩを包含する経口エクセナチド製剤の試験＞
以下の試験を、実施例７で行ったスクリーニング及び処置と同様に健康なボランティア及びＴ２Ｄ被験体における、精製したＢＢＩ及びＫＴＩ、及び随意に１２％  Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４を含む経口エクセナチド製剤の安全性、薬物動態及び薬効を評価するために行った。
【０２０１】
第１期：第１期は２つの区分からなる：区分１では健康なボランティアにおける、漸増用量の安全性、耐性、及びＰＫ／ＰＤを評価する。最初の区分では、全ての健康で絶食した被験体に２つの低い用量のエクセナチド（１５０及び３００μｇ）を無作為に投与する。
もし安全とみなされれば、さらなる用量漸増（４５０および６００μｇエクセナチド）が区分２で認可される。その後、標準的な食事（来院５）の６０分前に最高耐性用量を全ての患者に投与する。
【０２０２】
第２期：この段階では、Ｔ２ＤＭ患者のエクセナチドの漸増用量が標準的な食事の６０分前に送達された時の反応を評価する。プラセボ対照をこの研究に包含することができ、実対照薬のＢｙｅｔｔａ（５μｇ）も標準的な食事の３０分前に静脈内に送達して処置し得る。加えて、全てのＴ２ＤＭ被験体を別々の試験のための来院で標準的な食事が出る６０分前に、１６ｍｇのインスリンを含む、及び経口インスリン／経口エクセナチドの組み合わせを含む経口インスリンカプセルで処置する。
【０２０３】
説明：
グルコース減少およびインスリン偏差（ｅｘｃｕｒｓｉｏｎ）のＡＵＣを異なる処置間で計算し比較した。製剤の効能は、非−ＧＬＰ−１−処置群よりも大きい経口ＧＬＰ−１−処置群のインスリン偏差によっておよび／または、非−ＧＬＰ−１−処置群よりも小さい経口ＧＬＰ−１−処置群のグルコース偏差によって示される。さらに別の実験において、上で精製したＢＢＩおよびＫＴＩを記載した箇所で、組み換え型ＢＢＩ（随意にＫＴＩおよび／またはアプロチニンを備えた）を使用する。
【０２０４】
他の実験において、上で精製したＢＢＩおよびＫＴＩを記載した箇所で、合成ＢＢＩ（随意にＫＴＩおよび／またはアプロチニンを備えた）を使用する。
【０２０５】
実施例１０：ヒト被験体における改善されたＳＢＴＩを包含する経口インスリン製剤の試験
以下の試験を、実施例７で行ったスクリーニング及び処置と同様にＴ２ＭＤを有する、食事やメタホルミンによる制御が不十分である成人患者における、精製したＢＢＩ及びＫＴＩ、及び随意に１２％  Ｇｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４を含む経口インスリン製剤の就寝時の複数回用量の安全性及び薬効を評価するために行った。
【０２０６】
主な目的：平均夜間グルコース値および安全パラメータ（例えば低血糖症）における製剤の薬効を評価し、低血糖症と心血管系事象の発生を含む安全性を評価すること。主要有効性エンドポイントは次のものによって決定される：
・次のものの比較により決定した、２晩の（連続的なグルコース監視（ＣＧＭ））データ＊に基づいた加重平均夜間グルコース値に対する２４ｍｇインスリンの効果：
ａ）ベースライン（試走期間）と２４ｍｇインスリン処置間の変化の割合の平均
ｂ）プラセボを受けている群のベースラインとプラセボ処置間の変化の割合の平均
＊本明細書中に使用されている「ＣＧＭデータ」は、経口投与処置後最初の６時間に採集したデータに常に完全に基づいている。
・次のものの比較により決定した、２晩のＣＧＭデータ＊に基づいた加重平均夜間グルコース値に対する１６ｍｇインスリンの効果：
ａ）ベースライン（試走期間）と１６ｍｇインスリン処置間の変化の割合の平均
ｂ）プラセボを受けている群のベースラインと４週間のプラセボ処置間の変化の割合の平均
【０２０７】
副次的な目的：
空腹時血糖（ＦＢＧ）、朝絶食した場合の血清インスリン、ｃ−ペプチド、トリグリセリド及びＨｂＡｌｃにおけるベースラインの変化を評価すること。
副次的エンドポイントは次のものによって決定される：
・加重平均夜間グルコース値に対する２４ｍｇインスリン及び／又は１６ｍｇインスリンの効果は、インスリン処置群対プラセボを受け取った群の加重平均夜間グルコース値の比較によって決定される。
・  朝絶食した場合の血清インスリン、朝絶食した場合のｃ−ペプチド、ＨｂＡｌｃ及びトリグリセリドにおけるベースラインから処置段階までの変化に対する２４ｍｇインスリン及び／又は１６ｍｇインスリンの効果。
・  ＣＧＭによって評価された平均グルコースのベースラインから処置段階までの変化に対する２４ｍｇのインスリンおよび／または１６ｍｇのインスリンの効果。
【０２０８】
さらに別の実験において、精製したＢＢＩ及びＫＴＩを使用した上記のような箇所で、組み換え型ＢＢＩ（随意にＫＴＩおよび／またはアプロチニンを備えた）が使用される。
他の実験において、精製したＢＢＩ及びＫＴＩを使用した上記のような箇所で、合成ＢＢＩ（随意にＫＴＩおよび／またはアプロチニンを備えた）が使用される。
【０２０９】
実施例１１：不安定型糖尿病の処置にするおける改善されたＳＢＴＩを包含経口インスリン製剤の試験
不安定型糖尿病を有する被験体（例えば８−１０％の糖化ヘモグロビン［ＨｇＡｌｃ］レベルを有する被験体）は、ベースラインを確立するために盲検の連続グルコースモニター（ＣＧＭ）を使用して、数日間監視した。その後数日間、被験体に本明細書中に記載されているインスリン含有製剤を食前に投与し、随意に対照群として先行技術の製剤を使用した。盲検ＣＧＭを製剤の効能を決定するために行った。
【０２１０】
さらに別の実験において、精製したＢＢＩ及びＫＴＩを使用した上記のような箇所で、組み換え型ＢＢＩ（随意にＫＴＩおよび／またはアプロチニンを備えた）が使用される。他の実験において、精製したＢＢＩ及びＫＴＩを使用した上記のような箇所で、合成ＢＢＩ（随意にＫＴＩおよび／またはアプロチニンを備えた）が使用される。
【０２１１】
実施例１２：他のプロテアーゼ阻害剤の欠如における、改善されたＢＢＩを包含する経口インスリン製剤の試験
上記と同様に、しかしＫＴＩ欠如下で本明細書中に記載されているように調製したＢＢＩを用いて（例えばＢＢＩ及びアプロチニンを唯一のプロテアーゼ阻害剤として）、他の実験においては任意の他のプロテアーゼ阻害剤の欠所下で追加の研究を行った。他のプロテアーゼ阻害剤の欠如下で記載された製剤におけるタンパク質薬物を保護する、改善されたＢＢＩ単独の能力は、本明細書中に記載されているように調製したＢＢＩが優れていることを裏付ける。
【０２１２】
特許請求の範囲において単語「含む」及び「含まれる」、「含んでいる」のようなそのバリエーションはリストされた成分が含まれているが、一般的に他の成分を除外しないことを示す。
【０２１３】
引用文献
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【図１Ａ−１】
2020117518.tif 000021
【図１Ａ−２】
2020117518.tif 000022
【図１Ｂ】
2020117518.tif 000023
【図２】
2020117518.tif 000024
【図３】
2020117518.tif 000025
【図４】
2020117518.tif 000026
【図５Ａ】
2020117518.tif 000027
【図５Ｂ】
2020117518.tif 000028
【図６】
2020117518.tif 000029
【図７】
2020117518.tif 000030
【図８】
2020117518.tif 000031
【図９】
2020117518.tif 000032
【図１０】
2020117518.tif 000033
【図１１−１】
2020117518.tif 000034
【図１１−２】
2020117518.tif 000035
【図１２Ａ】
2020117518.tif 000036
【図１２Ｂ】
2020117518.tif 000037
【図１３Ａ】
2020117518.tif 000038
【図１３Ｂ】
2020117518.tif 000039
【図１４】
2020117518.tif 000040
【図１５】
2020117518.tif 000041
【配列表】
2020117518000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月27日(2020.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆生成物からＢＢＩを精製する方法であって、
（ａ）大豆生成物から抽出物を含む液体の混合物を得る工程であって、液体の混合物がｐＨバッファーを用いた水溶液であり、ｐＨ５．５−７．５の間を含むｐＨを有し、５０ｍＭ未満の塩濃度である工程、及び
（ｂ）サイズ排除クロマトグラフィに溶液を供し、正電荷を持つレジン及び多糖類高分子材料を含む定常期を使用する工程であって、サイズ排除クロマトグラフィが不連続な塩ステップ勾配（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ    ｓｔｅｐ    ｓａｌｔ    ｇｒａｄｉｅｎｔ）を含み、前記工程（ａ）で使用される溶液の塩濃度は４０ｍＭよりも低く、本工程で使用される溶液の塩濃度は４０−８５ｍＭの間である、工程
を含んでなる
ことを特徴とする大豆生成物からＢＢＩを精製する方法。
【外国語明細書】
2020117518000001.pdf