(57)【要約】【課題】汎用性抗体フレームワークを用いたイエウサギ抗体のヒト化の提供。【解決手段】本発明は、汎用性抗体アクセプターフレームワークと、汎用性抗体アクセプターフレームワークを用いて、非ヒト抗体、例えばイエウサギ抗体を融合させるための方法とに関する。本発明の方法によって生成された抗体は、様々な診断上および治療上の適用に有用である。本発明は、本発明に開示の可溶性かつ安定的な軽鎖および／または重鎖ヒト抗体フレームワーク配列中に、イエウサギＣＤＲおよび他の非ヒトＣＤＲを融合させ、それによって、優れた生物物理特性を有するヒト化抗体を生成する方法を提供する。特に、本発明の方法によって生成されたイムノバインダーは、溶解性および安定性などの優れた機能特性を示す。【選択図】図１
2020114260.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載されるイムノバインダー、イムノバインダーアクセプターフレームワーク、核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、方法、または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連情報）
この出願は、２００８年６月２５日に出願されたＵＳ６１／０７５，６９７への優先権を主張し、さらに２００９年２月２４日に出願されたＵＳ６１／１５５，０４１および２００９年２月２４日のＵＳ６１／１５５，１０５への優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
モノクローナル抗体、それらの結合体および誘導体は、治療剤および診断剤として商業的に非常に重要である。非ヒト抗体は、通常、単一の低用量注射後、患者において強い免疫応答を誘発する（Ｓｃｈｒｏｆｆ、１９８５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、４５巻、８７９〜８５頁、Ｓｈａｗｌｅｒ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８５年、１３５巻、１５３０〜５頁、Ｄｉｌｌｍａｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ、１９９４年、９巻、１７〜２８頁）。したがって、マウスおよび他の齧歯動物の抗体の免疫原性を低減するためのいくつかの方法、ならびに、完全ヒト抗体を、例えば、トランスジェニックマウスまたはファージディスプレイを用いて生成する技術が開発された。齧歯動物の可変領域をヒト定常領域と共に併せ持つキメラ抗体（例えば、Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ  Ｎａｔｕｒｅ、１９８４年、３１２巻、６４３〜６頁）が遺伝子工学的に構築され、免疫原性の問題をかなり低減させた（例えば、ＬｏＢｕｇｌｉｏ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１９８９年、８６巻、４２２０〜４頁；Ｃｌａｒｋ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ、２０００年、２１巻、３９７〜４０２頁）。ヒト化抗体も構築された。ヒト化抗体では、可変領域自体の齧歯動物配列が、少なくとも元のＣＤＲを保存しながら、できるだけヒト配列に近くなるように遺伝子工学的に操作されたか、あるいは齧歯動物抗体のＣＤＲがヒト抗体のフレームワーク中に融合させられた（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９８８年、３３２巻、３２３〜７頁；特許文献１）。イエウサギ（ｒａｂｂｉｔ）ポリクロナール抗体は、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットなどの生物学的アッセイに広く用いられている。ポリクローナルイエウサギ抗体は、それらが通常はるかに高い親和性を有するので、ポリクローナル齧歯動物抗体よりもしばしば好まれる。さらに、イエウサギはしばしば、マウスでは免疫原性が乏しい抗原、および／またはファージディスプレイで用いた場合に良好なバインダーをもたらさない抗原に対して良好な抗体反応を誘発できる。イエウサギ抗体のこれらの周知の利点のため、イエウサギ抗体は、治療用抗体の発見および開発での使用に理想的である。これが一般的になされない理由は、主に、モノクローナルイエウサギ抗体の生成における技術的困難にある。骨髄腫様の腫瘍は、イエウサギでは知られておらず、モノクローナル抗体を生成する従来のハイブリドーマ技術は、イエウサギ抗体には適用できない。イエウサギ抗体発現細胞の融合細胞系パートナーを提供する先駆的仕事は、Ｋｎｉｇｈｔらによって行われ（Ｓｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔら、ＰＮＡＳ、１９９５年、９２巻、９３４８〜５２頁）、改善された融合パートナー細胞系が２００５年にＰｙｔｅｌａらによって記載された（例えば、特許文献２参照）。しかし、対応するノウハウが基本的に単一の研究グループによって制御されているため、この技術は広範に普及していない。ＲＴ−ＰＣＲを介した、選択された抗体発現細胞からの抗体のクローニングを伴うモノクローナル抗体の生成のための代替方法は文献に記載されているが、イエウサギ抗体については一度も成功の報告がなされていない。
【０００３】
イエウサギ抗体は、ヒト治療に用いたならば、マウス抗体と同様に、強い免疫応答を誘発すると予測される。したがって、イエウサギ抗体は、それらが臨床的に使用され得る前に、ヒト化される必要がある。しかし、それぞれ、イエウサギ抗体とマウス抗体との間、およびイエウサギ抗体とヒト抗体との間の構造差のため、ヒト化齧歯動物抗体を作るのに用いられる方法をイエウサギ抗体に対して当てはめることは容易にはできない。例えば、軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）は、以前に知られていたヒトまたはマウス抗体由来のＣＤＲＬ３よりはるかに長いことが多い。
【０００４】
従来技術に記載されたイエウサギ抗体ヒト化アプローチがごくわずかに存在するが、それらは、非ヒトドナーＣＤＲがヒトアクセプター抗体に移植される古典的な融合アプローチではない。特許文献３は、いわゆる「リサーフェーシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」ストラテジーを記載する。「リサーフェーシング」ストラテジーの目標は、非ヒトフレームワークの溶媒アクセス可能残基を、それらが、よりヒト様（ｍｏｒｅ  ｈｕｍａｎ−ｌｉｋｅ）になるように再構築することである。特許文献３に記載されている、イエウサギ抗体のための類似のヒト化技法が当該分野で公知である。特許文献４および特許文献５の両方が、イエウサギモノクローナル抗体をヒト化する方法を開示しており、これらは、親イエウサギ抗体のアミノ酸配列の類似ヒト抗体のアミノ酸配列との比較を含む。続いて、親イエウサギ抗体のフレームワーク領域が、類似ヒト抗体の同等なフレームワーク領域に、配列においてより類似するように、親イエウサギ抗体のアミノ酸配列が改変される。良好な結合能を得るためには、各イムノバインダーについて個々に、手間のかかる開発努力を行う必要がある。
【０００５】
上述のアプローチの潜在的問題は、ヒトフレームワークが使用されておらず、イエウサギフレームワークが、それがよりヒト様に見えるように遺伝子工学的に操作されることである。そのようなアプローチは、タンパク質のコアに埋められているアミノ酸ストレッチがなお免疫原性Ｔ細胞エピトープを含み得るという危険性を有する。
【０００６】
これまでに、本出願者らは、現況技術の融合アプローチを適用することによってヒト化されたイエウサギ抗体を同定していない。これは、イエウサギＣＤＲがヒトまたは齧歯動物ＣＤＲとはかなり異なったものであり得るという事実によって説明され得る。当該分野で公知の通り、多くのイエウサギＶＨ鎖は、マウスおよびヒトの対応物と比較して、追加の対システインを有する。ｃｙｓ２２とｃｙｓ９２との間で形成される保存されたジスルフィド架橋に加えて、ｃｙｓ２１−ｃｙｓ７９架橋もあり、さらに、いくつかのイエウサギの鎖では、ＣＤＲＨ１の最後の残基とＣＤＲＨ２の最初の残基との間で形成されるＣＤＲ間Ｓ−Ｓ架橋もある。その上、対のシステイン残基がＣＤＲ−Ｌ３でしばしば見出される。さらに、多くのイエウサギ抗体ＣＤＲは、以前から公知のいかなる標準的構造にも属さない。特に、ＣＤＲ−Ｌ３は、ヒトまたはマウスの対応物であるＣＤＲ−Ｌ３よりもはるかに長いことが多い。
【０００７】
したがって、ヒトフレームワーク中への非ヒトＣＤＲ抗体の融合は主要なタンパク質工学的課題である。自然進化したフレームワークからの、人工的に選択された異なるヒトフレームワークへの抗原結合ループの移行は、抗原結合のために天然ループコンフォメーションが保持されるように行われなければならない。抗原結合親和性が、ループ融合後に大きく低減するか、または消失することがよくある。抗原結合ループの融合において、慎重に選択されたヒトフレームワークの使用によって、ヒト化分子において結合親和性を保持する確率が最大となる（Ｒｏｇｕｚｋａら、１９９６年）。文献中の利用可能な多くの融合実験はＣＤＲ融合のおおまかな手引きを与えているが、パターンを一般化することは不可能である。典型的な問題は、ＣＤＲループを融合した後に、特異性、安定性または産生能を失うことにある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５６９３７６１号明細書
【特許文献２】米国特許第７４２９４８７号明細書
【特許文献３】国際公開第０４／０１６７４０号
【特許文献４】国際公開第０８／１４４７５７号
【特許文献５】国際公開第０５／０１６９５０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、治療剤および診断剤として使用するため、イエウサギ抗体を確実かつ迅速にヒト化するための改良法について緊急の必要性がある。さらに、イエウサギ抗体を確実にヒト化するためのヒトアクセプターフレームワークの必要性があり、このヒトアクセプターフレームワークは、薬物様生物物理特性を有する機能的抗体および／または抗体フラグメントを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の概要）
驚いたことに、（ＷＯ０１４８０１７およびＡｕｆ  ｄｅｒ  Ｍａｕｒら（２００１年）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、５０８巻、４０７〜４１２頁に開示のような）品質管理（ＱＣ）アッセイによって同定された高可溶性かつ安定的なヒト抗体フレームワークが、他の非ヒト動物種由来のＣＤＲを、例えばイエウサギのＣＤＲを、収容するのに特に適することが見出された。したがって、第１の態様において、本発明は、特定のヒト抗体（いわゆる「ＦＷ１．４」抗体）の軽鎖および重鎖可変領域を提供する。該抗体は、ＣＤＲ中にジスルフィド架橋が存在しているか否かに依存せず、様々な結合特異性の種々の抗体、特にイエウサギ抗体からのＣＤＲのための汎用性アクセプターとして特に適している。さらに、本発明は、前記特定のヒト抗体フレームワークの２つの変異体配列、すなわちｒＦＷ１．４およびｒＦＷ１．４（Ｖ２）を提供する。両者ともイエウサギＣＤＲの融合のための汎用性アクセプターフレームワークとして特に適したフレームワークである。別の態様において、本発明は、他の非ヒト動物種由来のＣＤＲ、特にイエウサギのＣＤＲを収容するのに適したヒトフレームワークをもたらす、フレームワーク残基のモチーフを提供する。
【００１１】
これらの高適合性可変軽鎖フレームワークおよび重鎖フレームワーク中にイエウサギＣＤＲを融合することによって生成されたヒト化イムノバインダーは、イエウサギ抗体（ドナーＣＤＲはこれに由来する）の空間的配向を一貫して、確実に保持する。したがって、ドナーイムノバインダーの構造的に重要な位置をアクセプターフレームワーク中に導入する必要がない。これらの利点のため、結合能の最適化なしで、またはほとんどなしで、ハイスループットな（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）イエウサギ抗体のヒト化を実現することができる。
【００１２】
したがって、別の態様では、本発明は、本明細書に開示の可溶性かつ安定的な軽鎖および／または重鎖ヒト抗体フレームワーク配列中に、イエウサギＣＤＲおよび他の非ヒトＣＤＲを融合させ、それによって、優れた生物物理特性を有するヒト化抗体を生成する方法を提供する。特に、本発明の方法によって生成されたイムノバインダーは、溶解性および安定性などの優れた機能特性を示す。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
（ｉ）ウサギの可変軽鎖ＣＤＲ、および
（ｉｉ）配列番号４に少なくとも５０％の同一性を有するヒト可変重鎖フレームワークを含む、所望の抗原に特異的なイムノバインダー。
（項目２）
前記可変重鎖フレームワークが配列番号４および配列番号６からなる群より選択される、項目１に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
（項目３）
配列番号２に少なくとも８５％の同一性を有する可変軽鎖フレームワークをさらに含む、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
（項目４）
前記軽鎖可変フレームワークの位置８７（ＡＨｏナンバリング）にスレオニン（Ｔ）を含む、項目３に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
（項目５）
可変重鎖フレームワークおよび可変軽鎖フレームワークを含み、両者がリンカー、特に配列番号８のリンカーで連結されている、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
（項目６）
配列番号３、配列番号５もしくは配列番号７に少なくとも７０％の同一性を有するフレームワーク、特に、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号７を含むかまたは配列番号３、配列番号５もしくは配列番号７であるフレームワークを含む、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
（項目７）
位置２４のスレオニン（Ｔ）、位置２５のバリン（Ｖ）、位置５６のアラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）、位置８２のリジン（Ｋ）、位置８４のスレオニン（Ｔ）、位置８９のバリン（Ｖ）および位置１０８のアルギニン（Ｒ）（ＡＨｏナンバリング）からなる群のうち少なくとも３つのアミノ酸を含む、ヒトまたはヒト化イムノバインダー可変重鎖アクセプターフレームワーク。
（項目８）
位置１２、１０３および／または１４４（ＡＨｏナンバリング）のアミノ酸が親水性アミノ酸に置換された、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
（項目９）
前記重鎖フレームワーク中に
（ａ）位置１２のセリン（Ｓ）、
（ｂ）位置１０３のセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）、および／または
（ｃ）位置１４４のセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）
（ＡＨｏナンバリング）を有する、項目８に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
（項目１０）
前記可変軽鎖フレームワークにおいて位置１のグルタミン酸（Ｅ）、位置３のバリン（Ｖ）、位置４のロイシン（Ｌ）、位置１０のセリン（Ｓ）、位置４７のアルギニン（Ｒ）、位置５７のセリン（Ｓ）、位置９１のフェニルアラニン（Ｆ）および／または位置１０３のバリン（Ｖ）（ＡＨｏナンバリング）を有する、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
（項目１１）
ドナーイムノバインダー、特に哺乳動物イムノバインダー、好ましくはイエウサギイムノバインダー由来の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３をさらに含む、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
（項目１２）
抗原結合に関与するドナーフレームワーク残基をさらに含む、項目１１に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
（項目１３）
前記可変重鎖の位置１４１にグリシン（Ｇ）（ＡＨｏナンバリング）をさらに含む、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
（項目１４）
イエウサギＣＤＲの融合のための、項目１〜１３のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワークの使用。
（項目１５）
項目１〜１３のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワークを含むイムノバインダー。
（項目１６）
ｓｃＦｖ抗体である、項目１５に記載のイムノバインダー。
（項目１７）
１つまたは複数の結合分子、特に、細胞毒性剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子もしくは他のシグナル伝達分子などの治療剤、造影剤、または第２のタンパク質、特に転写活性化因子もしくはＤＮＡ結合ドメインをさらに含む、項目１５〜１６のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目１８）
診断適用、治療適用、標的評価または遺伝子療法における、項目１５〜１７のいずれか一項に記載のイムノバインダーの使用。
（項目１９）
項目１〜１３のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワークまたは項目１５〜１７のいずれか一項に記載のイムノバインダーをコードする核酸、特に単離された核酸。
（項目２０）
項目１９に記載の核酸を含むベクター。
（項目２１）
項目２０に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目２２）
遺伝子療法における、項目１９に記載の核酸または項目２０に記載のベクターの使用。
（項目２３）
項目１〜１３のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク、項目１５〜１７のいずれか一項に記載のイムノバインダー、項目１９に記載の核酸、または項目２０に記載のベクターを含む組成物。
（項目２４）
イエウサギイムノバインダーをヒト化する方法であって、前記イエウサギイムノバインダーが重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、前記方法が、
（ｉ）配列番号１に少なくとも５０％の同一性を有するヒト重鎖アクセプターフレームワーク内に、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２およびＣＤＲ  Ｈ３配列からなる群の少なくとも１つの重鎖ＣＤＲを融合させる工程、ならびに／または
（ｉｉ）配列番号２に少なくとも５０％の同一性を有するヒト軽鎖アクセプターフレームワーク、すなわちヒト軽鎖フレームワーク内に、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２およびＣＤＲ  Ｌ３配列からなる群の少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを融合させる工程
を含む、方法。
（項目２５）
（ｉ）前記ヒト重鎖フレームワークが、配列番号１、配列番号４または配列番号６のフレームワークアミノ酸配列を含み、
（ｉｉ）前記ヒト軽鎖フレームワークが、配列番号２または配列番号９のフレームワークアミノ酸配列を含む、
項目２４に記載の方法。
（項目２６）
抗原結合に関与する前記イエウサギイムノバインダーのフレームワーク残基で、フレームワーク残基を置換する工程をさらに含む、項目２４または２５に記載の方法。
（項目２７）
重鎖アミノ位置１２、１０３、および１４４（ＡＨｏナンバリング）の少なくとも１つにおける置換で、特に親水性アミノ酸に置換することによって、好ましくは、（ａ）位置１２のセリン（Ｓ）、（ｂ）位置１０３のスレオニン（Ｔ）、および（ｃ）位置１４４のスレオニン（Ｔ）からなる群より選択される置換によって、重鎖アクセプターフレームワークのフレームワーク残基を置換する工程をさらに含む、項目２４から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
ＡＨｏナンバリングシステムによる、軽鎖可変領域の位置１、３、４、１０、４７、５７、９１および１０３の少なくとも１つにおける安定性強化置換で、特に、（ａ）位置１のグルタミン酸（Ｅ）、（ｂ）位置３のバリン（Ｖ）、（ｃ）位置４のロイシン（Ｌ）、（ｄ）位置１０のセリン（Ｓ）、（ｅ）位置４７のアルギニン（Ｒ）、（ｅ）位置５７のセリン（Ｓ）、（ｆ）位置９１のフェニルアラニン（Ｆ）、および（ｇ）位置１０３のバリン（Ｖ）からなる群より選択される置換で、軽鎖アクセプターフレームワークのフレームワーク残基を置換する工程をさらに含む、項目２４から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
項目２４〜２８のいずれか一項に記載の方法によるヒト化イムノバインダー。
（項目３０）
前記標的抗原がＶＥＧＦまたはＴＮＦαである、項目２９に記載のイムノバインダー。
（項目３１）
ａ）イエウサギＢ細胞を標的抗原と共にインキュベートする工程、ｂ）前記標的抗原に結合するイエウサギＢ細胞を選択する工程、およびｃ）前記Ｂ細胞によって生成された抗体可変ドメインのＣＤＲを同定する工程による、Ｂ細胞によって生成される抗体可変ドメインのドナーＣＤＲの同定をさらに含む、項目２４から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記Ｂ細胞が、好ましくはＤＮＡワクチン接種によって、前記標的抗原に対して免疫化されたイエウサギから単離される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記Ｂ細胞および前記標的抗原が異なって染色され、前記２種の染色の共在が、フローサイトメトリーベースの単一細胞選別によってポジティブ選択される、項目３１または３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記標的抗原が可溶性タンパク質である、項目３１から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記標的抗原が細胞の表面に発現され、特に、前記標的抗原が膜貫通タンパク質、特に複数回膜貫通タンパク質である、項目３１から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
細胞内の蛍光色素による、前記標的抗原を発現する細胞の染色によって、前記標的抗原が間接的に染色される、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記Ｂ細胞が、Ｂ細胞表面マーカーに特異的な１種または複数種の標識抗体で染色される、項目３１から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
Ｂ細胞が、標識された抗ＩｇＧ抗体で染色される、項目３１から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
Ｂ細胞が、標識された抗ＩｇＧ抗体および異なって標識されている抗ＩｇＭ抗体で染色される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記標識された抗ＩｇＭ抗体で染色されたＢ細胞がネガティブに選択される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記生成した抗体が、特にヘルパー細胞系の存在下で、培地中に分泌されるように、項目３１に記載の工程ｂ）で選択された前記Ｂ細胞を培養する工程をさらに含む、項目３１から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記標的抗原への特異的な結合について、前記分泌された抗体を試験する工程をさらに含む、項目４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記抗体のＣＤＲが、特にＲＴ−ＰＣＲによって、増幅させられ、イムノバインダーを産生するためにアクセプターフレームワーク中に融合させられ、続いて前記標的抗原への特異的な結合について試験される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列および／または配列番号２に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むイムノバインダーアクセプターフレームワークの、イエウサギＣＤＲの融合のための使用。
（項目４５）
前記フレームワークが配列番号１および配列番号２を含み、両者がリンカーで、特に配列番号８を有するリンカーによって接続されている、項目４４に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、高度に可溶性かつ安定的なヒト抗体フレームワーク中に、イエウサギモノクローナル抗体由来の抗原結合部位を融合させるためにここで使用されるＣＤＲ  Ｈ１の定義を示す。
【図２】図２は、細胞内色素４で染色された標的発現細胞３と相互作用する、蛍光抗体２で標識されたＢ細胞１を模式的に示す。選択された標的：５；ＢＣＲ：６。
【図３】図３は、ＥＳＢＡ９０３可溶性標的に結合するイエウサギＢ細胞のＦＡＣＳ選択プロセスを示す。図３Ａ：リンパ球は前方散乱および側方散乱によりゲーティングされる。図３Ｂ：それらのなかでＩｇＧ＋ＩｇＭ−細胞（おそらく記憶Ｂ細胞）が選択される（赤色ゲート）。図３Ｃ：ＥＳＢＡ９０３−ＰＥおよびＥＳＢＡ９０３−ＰｅｒＣＰで二重で染色された細胞（緑色ゲート）は、ＥＳＢＡ９０３に対して高親和性のＩｇＧをコードしていると予測される。最も明るい蛍光を示す細胞（ピンク色ゲート）を９６穴プレート中に選別した。
【図４】図４は、抗ＴＮＦα抗体（ＰＥ標識）でコーティングされたビーズはＴＮＦαトランスフェクトＣＨＯ細胞（上側パネル）に結合すること、抗ＣＤ１９抗体（ＡＰＣ標識）でコーティングされた対照ビーズはＴＮＦαトランスフェクトＣＨＯ細胞（中央パネル）に結合しないこと、抗ＴＮＦα抗体（ＰＥ標識）でコーティングされたビーズは野生型（ｗｔ）ＣＨＯ細胞（下側パネル）に結合しないことを示す。左側のドットプロットは、前方散乱および側方散乱を示し、これらはイベントのサイズおよび粒度をそれぞれ示す。単一ビーズ（約３μｍ）集団はＰ２にゲーティングされる。最終的にビーズに結合したＣＨＯ細胞（約３０μｍ）はＰ１にゲーティングされる。中央のドットプロットは、ＰＥまたはＡＰＣ染色に関してＰ１イベント（ＣＨＯ細胞）を示す。したがって、細胞が抗ＴＮＦαビーズと相互作用するならば、それらはＰ３ゲートに示され、それらが抗ＣＤ１９ビーズと相互作用するならば、それらはＰ４ゲートに現れる。右側に、各試料に関する統計の詳細を示す。
【図５】図５は、抗ＴＮＦα−ＰＥでコーティングされたビーズおよび抗ＣＤ１９ＡＰＣでコーティングされたビーズがＴＮＦαトランスフェクトＣＨＯ細胞と混合され、ＣＨＯ細胞がゲーティングされ（Ｐ１）、それらのなかで、抗ＴＮＦαＰＥでコーティングされたビーズまたは抗ＣＤ１９−ＡＰＣでコーティングされたビーズのいずれかに結合する細胞がそれぞれゲートＰ３およびＰ４に示されており、非結合のビーズがゲートＰ２に見えることを示す。
【図６】図６は、Ｋａｂａｔデータベースから抽出されたイエウサギ抗体配列の分析であり、これにより、可変重鎖のＣＤＲ３は通常、、そのマウス対応物より３アミノ酸長いことを確認する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本発明がより容易に理解され得ることを目的として、特定の用語を以下の通りに定義する。さらなる定義は、この詳細な説明全体にわたって記載される。
【００１５】
「抗体」という用語は、完全な抗体および任意の抗原結合フラグメントを指す。「抗原結合ポリペプチド」および「イムノバインダー」という用語は、本明細書で同時に使用される。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続されている少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含み、場合によりグリコシル化されているタンパク質またはその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、すなわちＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域と、超可変領域が散在する、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域とにさらに細区画できる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で、アミノ末端からカルボキシ末端へ配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有している。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含めた、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００１６】
抗体の「抗原結合部分」（または、単純に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ＴＮＦ）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つまたは複数のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は完全長抗体のフラグメントによって行われ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価フラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）１つのＶＨドメインからなる、単一ドメインすなわちｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６）、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または（ｖｉｉ）合成リンカーによって場合により連結されていてもよい２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せが挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、すなわちＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、それらを単一タンパク質鎖として作るのを可能にする合成リンカーによって組換え方法を用いて連結でき、この単一タンパク質鎖では、ＶＬおよびＶＨ領域が対をなして一価の分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻、４２３〜４２６頁；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻、５８７９〜５８８３頁を参照）を形成する。そのような単一鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されるものとする。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技法を用いて得られ、インタクトな抗体と同じ様式において有用性を求めてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技法によって産生されたものでも、インタクトな免疫グロブリンの酵素的または化学的切断によって産生されたものでもよい。抗体は、異なったアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体のものであり得る。
【００１７】
「イムノバインダー」という用語は、抗体の抗原結合部位の全部または一部、例えば、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインの全部または一部を含有する分子を指し、したがって、イムノバインダーは、標的抗原を特異的に認識する。イムノバインダーの非限定的な例として、完全長の免疫グロブリン分子およびｓｃＦｖ、さらに、これらに限定されないが、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわち、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわち、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント；（ｉｉｉ）本質的には、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂであるＦａｂ’フラグメント（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３年）を参照されたい）；（ｉｖ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｖ）抗体の単腕のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖｉ）ＶＨドメインまたはＶＬドメインからなるＤａｂフラグメント（Ｗａｒｄら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１巻：５４４〜５４６頁）、ラクダ抗体（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３巻：４４６〜４４８頁（１９９３年）、およびＤｕｍｏｕｌｉｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１巻：５００〜５１５頁（２００２年）を参照されたい）、またはサメ抗体（例えば、サメＩｇ−ＮＡＲ  Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））等の単一ドメイン抗体；ならびに（ｖｉｉ）単一の可変ドメインを含有する重鎖可変領域および２つの定常ドメインであるナノボディを含めた、抗体フラグメントが挙げられる。
【００１８】
「単鎖抗体」、「単鎖Ｆｖ」、または「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーによって連結されている抗体重鎖可変ドメイン（または領域；ＶＨ）および抗体軽鎖可変ドメイン（または領域；ＶＬ）を含む分子を意味する。このようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨを有することができる。現況技術における適したリンカーは、反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはその改変体からなる。本発明の好ましい実施形態では、配列番号８に記載のアミノ酸配列の（ＧＧＧＧＳ）４リンカーが使用されるが、１〜３反復の改変体も可能である（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻、６４４４〜６４４８頁）。本発明に使用できる他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎら（１９９５年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、８巻、７２５〜７３１頁、Ｃｈｏｉら（２００１年）、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１巻、９４〜１０６頁、Ｈｕら（１９９６年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５６巻、３０５５〜３０６１頁、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９９年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２９３巻、４１〜５６頁およびＲｏｏｖｅｒｓら（２００１年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．によって記載されている。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「機能特性」という用語は、例えば、ポリペプチドの製造上の特性または治療有効性を改善するために、当業者にとって、（例えば、従来のポリペプチドと比べた）改善が望ましくかつ／または好都合であるポリペプチド（例えば、イムノバインダー）の特性である。１つの実施形態では、機能特性は、安定性（例えば、熱安定性）である。別の実施形態では、機能特性は、（例えば、細胞性条件下における）溶解性である。さらに別の実施形態では、機能特性は、凝集挙動である。さらに別の実施形態では、機能特性は、（例えば、原核生物細胞中における）タンパク質発現である。さらに別の実施形態では、機能特性は、製造プロセスにおける封入体の可溶化後のリフォールディング挙動である。特定の実施形態では、機能特性は抗原結合親和性の改善ではない。別の好ましい実施形態では、１つまたは複数の機能特性の改善はイムノバインダーの結合親和性に実質的な影響を与えない。
【００２０】
「ＣＤＲ」という用語は、抗原の結合に主に寄与する抗体の可変ドメイン内の６つの超可変領域の１つを意味する。６つのＣＤＲに対して最も一般的に用いられる定義の１つは、Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら、（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、９１〜３２４２頁によって提供されたものである。本明細書で用いられるように、ＣＤＲのＫａｂａｔの定義は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３（ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｌ３、またはＬ１、Ｌ２、Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインのＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＣＤＲ  Ｈ２、ＣＤＲ  Ｈ３、またはＨ２、Ｈ３）に対してのみあてはまる。しかし、本明細書で用いられる場合、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１（ＣＤＲ  Ｈ１またはＨ１）は、位置２６で始まり位置３６の前で終了する残基の位置（Ｋａｂａｔナンバリング）よって定義される。これは、基本的には、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｉａにより異なって定義されるＣＤＲ  Ｈ１の融合物である（説明のために図１も参照されたい）。
【００２１】
本明細書で用いられる「抗体フレームワーク」という用語は、可変ドメインの抗原結合性ループ（ＣＤＲ）に対する骨格として働く、ＶＬまたはＶＨいずれかの可変ドメインの部分を意味する。本質的に、これはＣＤＲのない可変ドメインである。
【００２２】
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部位を指す（例えば、ＴＮＦ分子上の特定部位）。エピトープは通常、特有の空間的コンフォメーションにある少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の連続または非連続のアミノ酸を含んでいる。例えば、「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、６６巻、Ｇ．  Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓ編集（１９９６年）を参照のこと。
【００２３】
「特異的な結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」という用語は、所定の抗原のエピトープへの抗体結合を指す。通常、抗体は、約１０−８Ｍ未満、約１０−９Ｍ未満もしくは約１０−１０Ｍ未満またはさらに低い値などの、約１０−７Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で結合する。
【００２４】
「ＫＤ」または「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指す。通常、本発明の抗体は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ装置の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて決定した場合、約１０−８Ｍ未満、約１０−９Ｍ未満もしくは約１０−１０Ｍ未満またはさらに低い値などの、約１０−７Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）でＴＮＦに結合する。
【００２５】
「核酸分子」という用語は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を指す。核酸分子は、１本鎖でも、２本鎖でもよいが、２本鎖ＤＮＡであることが好ましい。核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合に、「作動可能に連結されている」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を与える場合に、その配列に作動可能に連結している。
【００２６】
「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を指す。一実施形態では、ベクターは「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲーション（ｌｉｇａｔｅ）され得る環状２本鎖ＤＮＡループを指す。別の実施形態では、ベクターはウイルスベクターであり、この場合、追加のＤＮＡセグメントはウイルスゲノム中にライゲーションされ得る。本明細書に開示のベクターは、導入される宿主細胞において自律複製が可能なものであり得る（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。または、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれて、それによって宿主ゲノムと共に複製され得るものであり得る（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）。
【００２７】
「宿主細胞」という用語は、発現ベクターが導入されている細胞を指す。宿主細胞としては、細菌細胞、微生物細胞、植物細胞または動物細胞、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）またはＮＳ０細胞が挙げられる。
【００２８】
「ウサギ（ｌａｇｏｍｏｒｐｈ）」という用語は、分類学上のＬａｇｏｍｏｒｐｈａ目のメンバーを指し、Ｌｅｐｏｒｉｄａｅ科（例えば、ノウサギおよびイエウサギ（ｒａｂｂｉｔ））およびＯｃｈｏｔｏｎｉｄａｅ科（ナキウサギ）を含む。最も好ましい実施形態では、ウサギはイエウサギである。「イエウサギ」という用語は、本明細書で使用される場合、ｌｅｐｏｒｉｄａｅ科に属する動物を指す。
【００２９】
本明細書で用いられる「同一性」は、２つのポリペプチド間、分子間、または２つの核酸間でマッチする配列を意味する。比較された２つの配列の両方におけるある位置が同じ塩基、または同じアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合（例えば、各々の２つのポリペプチドにおけるある位置がリジンによって占められている場合）、それぞれの分子はその位置で同一である。２つの配列間の「パーセント同一性」は、それら２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である。一般的に、２つの配列を、最大の同一性をもたらすようにアライメントさせた場合に比較が行われる。このようなアラインメントは、例えば、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびにギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、または４およびレングスウェイト１、２、３、４、５、または６を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおいてＧＡＰプログラム中に組み入れられた、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、（４８巻）、４４４〜４５３頁（１９７０年））のアルゴリズムの方法を用いて提供され得る。
【００３０】
別段に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および物質に類似または同等の方法および物質を本発明の実施または試行に用いることができるが、適した方法および物質は下記に記載のものである。相反する場合には、定義を含めた本明細書が優先される。加えて、物質、方法、および実施例は、例示にすぎず、限定することを意図しない。
【００３１】
本発明の様々な態様を、以下のサブセクションにおいてさらに詳しく記載する。様々な実施形態、選択、および範囲を任意に組み合わせることができることが理解される。さらに、特定の実施形態によっては、選択された定義、実施形態、または範囲を適用しなくてもよい。
【００３２】
別段の言及がない場合、アミノ酸位置はＡＨｏナンバリングスキームに従って示される。ＡＨｏナンバリングシステムは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，  Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．（２００１年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３０９巻、６５７〜６７０頁）にさらに記載されている。代わりに、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．ら（１９９１年）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ出版番号９１−３２４２）に、より詳細に記載されたＫａｂａｔナンバリングシステムを使用できる。抗体重鎖および軽鎖可変領域内のアミノ酸残基位置を同定するのに使用される２通りの異なったナンバリングシステムの変換表が、Ａ．  Ｈｏｎｅｇｇｅｒ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３０９巻（２００１年）、６５７〜６７０頁に提供されている。
【００３３】
第１の態様では、本発明は、他の動物種、例えばイエウサギからのＣＤＲを融合させるための汎用性アクセプターフレームワークを提供する。いわゆる「品質管理」スクリーニング（ＷＯ０１４８０１７）で同定されたヒトフレームワークを含む抗体または抗体誘導体が概して高い安定性および／または溶解性を特徴とすることが以前に記載されている。ヒト単一鎖フレームワークＦＷ１．４（配列番号１（ＷＯ０３／０９７６９７でａ４３と命名されている）および配列番号２（ＷＯ０３／０９７６９７でＫ１２７と命名されている）の組合せ）は、品質管理アッセイでは明らかに低成績であったが、驚いたことに、このフレームワークは、異なった様々なＣＤＲと組み合わせても、高度な内因的熱力学的安定性を有し、かつ再現性が良いことが見出された。この分子の安定性は大部分、そのフレームワーク領域に起因すると考えることができる。ＦＷ１．４はイエウサギ抗体の抗原結合部位と本質的に高適合性であることがさらに示されている。したがって、ＦＷ１．４は、イエウサギループの融合から得られる安定したヒト化ｓｃＦｖ抗体フラグメントを構築するのに適した骨格である。したがって、一態様において、本発明は、配列番号１に少なくとも９０％の同一性を有するＶＨ配列および／または配列番号２に少なくとも８５％の同一性を有するＶＬ配列を含み、より好ましくは、イエウサギＣＤＲの融合のためのＦＷ１．４の配列（配列番号３）、または配列番号３に少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の同一性を有する配列を含むイムノバインダーアクセプターフレームワークを提供する。
【００３４】
さらに、ＦＷ１．４の重鎖のいくつかの残基位置を置換することによって、および／またはＦＷ１．４の軽鎖における１つの位置を置換することによって、ＦＷ１．４を最適化できることが見出された。それによって、驚いたことに、ドナーフレームワークの配列に主として非依存的に、ＶＨにおける広範なイエウサギＣＤＲのループコンフォメーションが完全に維持され得ることが見出された。ＦＷ１．４の重鎖における前記残基および軽鎖における１つの位置がイエウサギ抗体で保存されている。重鎖における該位置および軽鎖における１つの位置のコンセンサス残基がイエウサギレパートリーから推測され、ヒトアクセプターフレームワークの配列中に導入された。
【００３５】
結果として、改変フレームワーク１．４（以下、ｒＦＷ１．４と呼ぶ）は、事実上いかなるイエウサギＣＤＲとも適合性である。さらに、様々なイエウサギＣＤＲを含有するｒＦＷ１．４は、イエウサギ野生型単一鎖とは反対に、良好に発現され、良好に産生され、なおかつ元のドナーイエウサギ抗体の親和性をほぼ完全に保持する。
【００３６】
したがって、本発明は、イエウサギイムノバインダー由来のＣＤＲのコンフォメーションを概ね支持する１つまたは複数のアミノ酸残基をさらに含む、配列番号１の可変重鎖フレームワークを提供する。特に、前記残基は、２４Ｈ、２５Ｈ、５６Ｈ、８２Ｈ、８４Ｈ、８９Ｈおよび１０８Ｈ（ＡＨｏナンバリング）からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に存在する。これらの位置は、ＣＤＲコンフォメーションに影響を与えることが判明しており、したがって、ドナーＣＤＲを収容するための変異が企図される。前記１つまたは複数の残基は、位置２４のスレオニン（Ｔ）、位置２５のバリン（Ｖ）、位置５６のグリシンまたはアラニン（ＧまたはＡ）、位置８２のリジン（Ｋ）、位置８４のスレオニン（Ｔ）、位置８９のバリン（Ｖ）および位置１０８のアルギニン（Ｒ）（ＡＨｏナンバリング）からなる群より選択されることが好ましい。少なくとも３残基、より好ましくは４、５、６残基、最も好ましくは７残基すべてが存在することが好ましい。驚いたことに、上述の残基の存在がイムノバインダーの安定性を改善することが見出された。
【００３７】
好ましい実施形態では、本発明は、位置２４のスレオニン（Ｔ）、位置２５のバリン（Ｖ）、位置５６のアラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）、位置８４のスレオニン（Ｔ）、位置８２のリジン（Ｋ）、位置８９のバリン（Ｖ）、および位置１０８のアルギニン（Ｒ）（ＡＨｏナンバリング）からなる群のうち少なくとも１残基、より好ましくは少なくとも３残基、より好ましくは４、５、６残基、最も好ましくは７残基が存在することを条件として、配列番号４に少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、およびさらにより好ましくは１００％の同一性を有するＶＨを含むイムノバインダーアクセプターフレームワークを提供する。好ましい実施形態では、イムノバインダーアクセプターフレームワークは、イエウサギＣＤＲのためのイムノバインダーアクセプターフレームワークである。
【００３８】
好ましい実施形態では、前記可変重鎖フレームワークは、配列番号４もしくは配列番号６であるか、または配列番号４もしくは配列番号６を含む。前記可変重鎖フレームワークは両方とも、例えば、任意の適した軽鎖フレームワークと組み合わされ得る。
【００３９】
したがって、本発明は、
（ｉ）配列番号４に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖フレームワーク、および／または
（ｉｉ）配列番号２に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖フレームワークを含むイムノバインダーアクセプターフレームワークを提供する。
【００４０】
大いに好ましい実施形態では、可変重鎖フレームワークが位置２４のスレオニン（Ｔ）、位置５６のグリシン（Ｇ）、位置８４のスレオニン（Ｔ）、位置８９のバリン（Ｖ）および位置１０８のアルギニン（Ｒ）（ＡＨｏナンバリング）を含む。
【００４１】
好ましい実施形態では、可変軽鎖が位置８７のスレオニン（Ｔ）（ＡＨｏナンバリング）を含む。
【００４２】
好ましい実施形態では、前記イムノバインダーアクセプターフレームワークが、
（ｉ）配列番号１、配列番号４および配列番号６からなる群より選択される可変重鎖フレームワーク、および／または
（ｉｉ）配列番号２もしくは配列番号９の可変軽鎖フレームワーク
を含む。
【００４３】
好ましい実施形態では、可変重鎖フレームワークがリンカーによって可変軽鎖フレームワークに連結される。リンカーは任意の適したリンカー、例えば、１から４反復の配列ＧＧＧＧＳを含むリンカー、好ましくは（ＧＧＧＧＳ）４ペプチド（配列番号８）、またはＡｌｆｔｈａｎら（１９９５年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、８巻、７２５〜７３１頁に開示されているリンカーであり得る。
【００４４】
別の好ましい実施形態では、イムノバインダーアクセプターフレームワークは、配列番号５に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する配列であり、一方、該配列は、好ましくは、配列番号３ではない。イムノバインダーアクセプターフレームワークは、配列番号５を含むか、または配列番号５であることがより好ましい。
【００４５】
別の好ましい実施形態では、イムノバインダーアクセプターフレームワークは、配列番号７に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する配列であり、一方、該配列は、好ましくは、配列番号３ではない。イムノバインダーアクセプターフレームワークは、配列番号７を含むか、または配列番号７であることがより好ましい。
【００４６】
さらに、驚いたことに、上述のアミノ酸モチーフの存在は、フレームワーク、好ましくはヒトフレームワークを、他の非ヒト動物種からのＣＤＲ、特にイエウサギＣＤＲの収容に特に適したものにすることが見出された。前記モチーフは、イムノバインダーの安定性に負のインパクトを与えない。該ＣＤＲは、イエウサギイムノバインダーにおけるそれらの天然の空間的配向に類似したコンフォメーションで現れ、したがって、いかなる構造的に重要な位置も、アクセプターフレームワークに融合される必要性はない。したがって、ヒトまたはヒト化イムノバインダーアクセプターフレームワークは、位置２４のスレオニン（Ｔ）、位置２５のバリン（Ｖ）、位置５６のアラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）、位置８２のリジン（Ｋ）、位置８４のスレオニン（Ｔ）、位置８９のバリン（Ｖ）および位置１０８のアルギニン（Ｒ）（ＡＨｏナンバリング）からなる群のうち少なくとも３アミノ酸、好ましくは４、５、６アミノ酸、より好ましくは７アミノ酸を含む。
【００４７】
本明細書に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワークは、重鎖フレームワーク、好ましくは位置１２、１０３および１４４（ＡＨｏナンバリング）に、溶解性を促進する置換を含み得る。疎水性アミノ酸は、より親水性のアミノ酸によって置換されることが好ましい。親水性アミノ酸とは、例えば、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）である。より好ましくは、重鎖フレームワークは、（ａ）位置１２のセリン（Ｓ）、（ｂ）位置１０３のセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）、および／または（ｃ）位置１４４のセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）を含む。
【００４８】
さらに、可変軽鎖フレームワークの位置１、３、４、１０、４７、５７、９１および１０３（ＡＨｏナンバリング）のうちの１つまたは複数に安定性増強アミノ酸が存在してもよい。可変軽鎖フレームワークは、位置１のグルタミン酸（Ｅ）、位置３のバリン（Ｖ）、位置４のロイシン（Ｌ）、位置１０のセリン（Ｓ）；位置４７のアルギニン（Ｒ）、位置５７のセリン（Ｓ）、位置９１のフェニルアラニン（Ｆ）および／または位置１０３のバリン（Ｖ）を含むことが、より好ましい。
【００４９】
グルタミン（Ｑ）は脱アミノ化（ｄｅｓａｍｉｎａｔｉｏｎ）の傾向があるので、別の好ましい実施形態では、ＶＨが位置１４１にグリシン（Ｇ）を含む。この置換はタンパク質の長期保存を改善し得る。
【００５０】
例えば、本明細書に開示のアクセプターフレームワークは、非ヒトＣＤＲが由来する非ヒト抗体の結合特性を保持するヒトまたはヒト化抗体を生成するのに使用できる。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、ドナーイムノバインダー、好ましくは哺乳動物イムノバインダー、より好ましくはウサギイムノバインダー、最も好ましくはイエウサギからの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３をさらに含む、本明細書に開示のイムノバインダーアクセプターフレームワークを包含する。したがって、一実施形態では、本発明は、
（ｉ）ウサギの可変軽鎖ＣＤＲと、
（ｉｉ）配列番号４に少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有するヒト可変重鎖フレームワークと
を含む、所望の抗原に特異的なイムノバインダーを提供する。
【００５１】
好ましい一実施形態では、前記ヒト可変重鎖フレームワーク配列中に、位置２４のスレオニン（Ｔ）、位置２５のバリン（Ｖ）、位置５６のアラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）、位置８４のスレオニン（Ｔ）、位置８２のリジン（Ｋ）、位置８９のバリン（Ｖ）および位置１０８のアルギニン（Ｒ）（ＡＨｏナンバリング）からなる群のうちの少なくとも１つのアミノ酸が存在するという条件がある。
【００５２】
好ましくは、ウサギはイエウサギである。イムノバインダーは、ドナーイムノバインダー由来の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とを含むことがより好ましい。
【００５３】
当該分野で公知の通り、多くのイエウサギＶＨ鎖が、マウスおよびヒトの対応物と比較して、追加の対システインを有する。ｃｙｓ２２とｃｙｓ９２との間で形成される保存されたジスルフィド架橋に加えて、ｃｙｓ２１−ｃｙｓ７９架橋もあり、さらに、いくつかのイエウサギの鎖では、ＣＤＲＨ１の最後の残基とＣＤＲＨ２の最初の残基との間で形成されるＣＤＲ間Ｓ−Ｓ架橋もある。さらに、ＣＤＲ−Ｌ３において、対システイン残基がしばしば見出される。さらに、多くのイエウサギ抗体ＣＤＲは、以前に公知のいかなる標準構造にも属さない。特に、ＣＤＲ−Ｌ３は、ヒトまたはマウスの対応物であるＣＤＲ−Ｌ３よりもはるかに長いことが多い。
【００５４】
上述の通り、本明細書に開示のフレームワークへの非ヒトＣＤＲの融合は、該ＣＤＲが適切なコンフォメーションで現れる分子を産する。必要な場合、イムノバインダーの親和性は、非ヒトドナーイムノバインダーの抗原相互作用フレームワーク残基を融合させることによって改善され得る。これらの位置は、例えば、
（ｉ）それぞれの生殖細胞系前駆体配列を同定すること、またはその代わりに、高い相同性のフレームワーク配列の場合にはコンセンサス配列を用いること、
（ｉｉ）工程（ｉ）の生殖細胞系前駆体配列またはコンセンサス配列とドナー可変ドメイン配列との配列アラインメントを生成すること、および
（ｉｉｉ）相違している残基を同定すること
によって同定され得る。
【００５５】
分子の表面上の相違している残基は、多くの場合、おそらく抗原への親和性を生成するために、インビボにおける親和性生成プロセス中に変異させられた。
【００５６】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワークを含むイムノバインダーを提供する。例えば、前記イムノバインダーは、ｓｃＦｖ抗体、完全長免疫グロブリン、Ｆａｂフラグメント、Ｄａｂまたはナノボディーであり得る。
【００５７】
好ましい実施形態では、イムノバインダーは、１つまたは複数の分子、例えば、細胞毒性剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子もしくは他のシグナル伝達分子などの治療剤、造影剤、または転写活性化因子もしくはＤＮＡ結合ドメインなどの第２のタンパク質に結合している。
【００５８】
本明細書に開示のイムノバインダーは、例えば、診断適用、治療適用、標的評価または遺伝子療法で使用できる。
【００５９】
本発明は、本明細書に開示のイムノバインダーアクセプターフレームワークまたは本明細書に開示のイムノバインダー（単数または複数）をコードする単離された核酸をさらに提供する。
【００６０】
別の実施形態では、本明細書に開示の核酸を含むベクターを提供する。
【００６１】
本明細書に開示の核酸またはベクターは、例えば、遺伝子療法で用いることができる。
【００６２】
本発明は、本明細書に開示のベクターおよび／または核酸を含む宿主細胞をさらに包含する。
【００６３】
さらに、本明細書に開示のイムノバインダーアクセプターフレームワーク、本明細書に開示のイムノバインダー、本明細書に開示の単離された核酸または本明細書に開示のベクターを含む組成物を提供する。
【００６４】
本明細書に開示の配列は、以下の通りである（Ｘ残基はＣＤＲ挿入部位である）。
【００６５】
【化１】
2020114260.tif 000003
【００６６】
【化２】
2020114260.tif 000004
別の態様では、本発明は、安定的かつ可溶性の抗体フレームワークに非ヒトドナー抗体のＣＤＲを融合させることによって非ヒト抗体をヒト化する方法を提供する。特に好ましい実施形態では、イエウサギ抗体からのＣＤＲステムおよびフレームワークは上述のものである。
【００６７】
参照により全体として本明細書に援用される、米国特許第５２２５５３９号でＷｉｎｔｅｒによって、ＷＯ９００７８６１  Ａ１でＱｕｅｅｎらによって、ヒトアクセプターフレームワーク中にＣＤＲを融合させる一般的方法が開示されている。イエウサギモノクローナル抗体からのＣＤＲを、選択されたフレームワークに融合させる一般戦略は、ＷｉｎｔｅｒらおよびＱｕｅｅｎらのものに関連するが、特定の主要な点で異なっている。特に、本発明の方法は、ヒトまたは非ヒトドナー抗体のための汎用性アクセプターとして、本明細書に開示のヒト抗体フレームワークが特に適している点で、当該分野で公知の典型的なＷｉｎｔｅｒおよびＱｕｅｅｎ方法論とは異なる。したがって、ＷｉｎｔｅｒおよびＱｕｅｅｎの一般的方法とは異なり、本発明のヒト化方法に使用されるフレームワーク配列は、必ずしも、ドナーＣＤＲが由来する非ヒト（例えば、イエウサギ）抗体の配列に最高の配列類似性を示すフレームワーク配列ではない。加えて、ＣＤＲコンフォメーションを支持するためにドナー配列からのフレームワーク残基融合は必要とされない。最大で、フレームワーク中に位置する抗原結合アミノ酸または体細胞超変異中に起きた他の変異が導入され得る。
【００６８】
高い可溶性および安定性を有するヒト化されたイエウサギ由来抗体を生成する融合方法の特定の詳細を以下に記載する。
【００６９】
したがって、本発明は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含むイエウサギＣＤＲドナーイムノバインダーをヒト化する方法を提供する。この方法は、
（ｉ）重鎖上、配列番号１に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するヒト重鎖アクセプターフレームワーク中に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列からなる群のうち少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つのＣＤＲを融合させる工程、および／または
（ｉｉ）軽鎖上、配列番号２に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するヒト軽鎖アクセプターフレームワーク中に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列からなる群のうち少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つのＣＤＲを融合させる工程を含む。
【００７０】
好ましい実施形態では、可変鎖アクセプターフレームワークは、（ｉ）配列番号１、配列番号４、および配列番号６からなる群より選択されるフレームワークアミノ酸配列を含むヒト重鎖フレームワークと、（ｉｉ）配列番号２または配列番号９のフレームワークアミノ酸配列を含むヒト軽鎖フレームワークとを含む。
【００７１】
大いに好ましい実施形態では、該方法は、配列番号３、配列番号５または配列番号７に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するイムノバインダーの、（ｉ）重鎖中に重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を融合させる工程と、（ｉｉ）軽鎖中に、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を融合させる工程とを含む。イムノバインダーは、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号７であるか、または配列番号３、配列番号５もしくは配列番号７を含むことがより好ましい。
【００７２】
別の実施形態では、抗原結合性を改善するために、該方法は、抗原結合性に関与するドナー残基によってアクセプターフレームワーク残基を置換する工程をさらに含み得る。
【００７３】
本発明の方法の例示的実施形態では、ＣＤＲドナー抗体のアミノ酸配列が最初に同定され、該配列は、従来の配列アラインメントツール（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−ＷｕｎｓｃｈアルゴリズムおよびＢｌｏｓｓｕｍマトリックス）を用いてアラインメントされる。ギャップの導入および残基位置の命名は、従来の抗体ナンバリングシステムを用いて行われ得る。例えば、免疫グロブリン可変ドメインについてＡＨｏナンバリングシステムを使用できる。Ｋａｂａｔナンバリングスキームは、抗体中の残基をナンバリングするのに最も広く採用されている標準法であるので、これも適用できる。Ｋａｂａｔナンバリングは、例えば、ＳＵＢＩＭプログラムを用いて割り当てることができる。このプログラムは、抗体配列の可変領域を分析し、Ｋａｂａｔらによって確立されたシステムに従って配列をナンバリングする（Ｄｅｒｅｔら、１９９５年）。フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の定義は、通常、Ｋａｂａｔの定義に従って行われるが、これは配列可変性をベースにしたものであり、最も一般的に使用されている。しかし、ＣＤＲ−Ｈ１については、そのような指定は、Ｋａｂａｔの定義、３Ｄ複合体構造のサブセットの抗体と抗原との間の接触の分析によって生成された平均接触データ（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６年）、および構造的ループ領域の位置に基づくＣｈｏｔｉａの定義の組合せであることが好ましい（図１も参照）。抗体重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸残基位置を同定するのに使用される２つの異なったナンバリングシステムの変換表がＡ．  Ｈｏｎｅｇｇｅｒ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３０９巻（２００１年）、６５７〜６７０頁に提供されている。Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．ら（１９９１年）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ出版番号９１−３２４２）に、より詳細に記載されている。ＡＨｏナンバリングシステムは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，  Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．（２００１年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３０９巻、６５７〜６７０頁で、より詳細に記載されている。
【００７４】
イエウサギモノクローナル抗体の可変ドメインは、例えば、配列分析アルゴリズムのＥＸＣＥＬインプリメンテーション（ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）およびヒト抗体レパートリーの分析に基づいた分類方法を用いて、例えば、対応するヒトサブグループに分類できる（Ｋｎａｐｐｉｋら、２０００年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２月１１日、２９６（１）巻、５７〜８６頁）。
【００７５】
ＣＤＲコンフォメーションをドナー抗原結合領域に割り当てることができ、続いて、様々な標準構造を維持するのに必要な残基位置を同定することもできる。イエウサギ抗体の６つの抗体超可変領域（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１およびＨ２）のうち５つのＣＤＲの標準構造はＣｈｏｔｈｉａ（１９８９年）の定義を用いて決定される。
【００７６】
好ましい実施形態では、以下の方法に従ってＣＤＲの生成、同定および単離を行う：Ｂ細胞（好ましくはイエウサギＢ細胞）を、（ｉ）標的抗原（好ましくは精製されたもの）または（ｉｉ）表面に標的抗原を発現している細胞とインキュベートする。
【００７７】
（ｉｉ）の場合、標的抗原を発現する前記細胞は、例えば、選択した標的を天然で発現するか、または標的タンパク質を表面に発現するように形質転換されている哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞、酵母細胞、好ましくは酵母スフェロプラスト（ｓｐｈｅｒｏｂｌａｓｔ）、または細菌細胞であり得る。発現の際、標的抗原は、細胞膜に組み込まれるか、または細胞膜に結合して細胞表面に発現され得る。細胞は、例えば、細胞培養において単離株として培養されても、それらの自然環境、例えば、組織、臓器または生物から単離されてもよい。
【００７８】
標的抗原が細胞表面で発現されている場合、すなわち（ｉｉ）の場合、膜貫通タンパク質が特に好ましく、ＧＰＣＲ（Ｇタンパク質共役受容体）もしくはイオンチャンネルなどの複数回膜貫通タンパク質、または組換え発現および精製の際に天然のコンフォメーションを維持するのが困難である任意の他のタンパク質がさらに好ましい。組換えタンパク質による伝統的な免疫化は、これらの場合、精製処理中の内在性膜タンパク質／複合体の天然のコンフォメーションの喪失か、純粋なタンパク質の量が不十分であることにより、推奨されないか、または不可能である。本発明の好ましい実施形態では、組換えタンパク質の代わりにＤＮＡで哺乳動物、より好ましくはイエウサギを、例えば、ＷＯ／２００４／０８７２１６に開示のＤＮＡワクチン接種プロトコールにより免疫化する。ＤＮＡワクチン接種は、天然抗原に対する迅速な免疫応答を誘導する。組換えタンパク質は必要ではないので、この技術は、一方では費用対効果に極めて優れており、もう一方では、より重要なことに、この方法は、膜内在性複合体および／または複数回膜貫通膜タンパク質の天然発現を可能にする。Ｂ細胞は、前記免疫化哺乳動物、好ましくは前記イエウサギから単離されたものであり得、または代わりにナイーブＢ細胞であり得る。
【００７９】
前記方法の後続の工程において、Ｂ細胞、好ましくは記憶Ｂ細胞は、免疫化された動物、好ましくは免疫化されたイエウサギのリンパ器管（脾臓またはリンパ節など）から単離される。抗原を表面に発現している細胞、または蛍光標識された可溶性抗原との混合物中でこれらのＢ細胞をインキュベートする。標的特異的抗体をそれらの表面に発現し、その結果、標的抗原、または細胞表面に発現された標的抗原に結合するＢ細胞を単離する。大いに好ましい実施形態では、フローサイトメトリーベースのＢ細胞／標的細胞複合体またはＢ細胞／抗原複合体の選別による単離が可能となるように、Ｂ細胞および／または標的細胞を染色する。フローサイトメトリーは、通常、単一細胞がレーザービームを横切るときに単一細胞から放出される蛍光を測定する。しかし、一部の研究者は既に、細胞間相互作用、例えばカドヘリン（Ｐａｎｏｒｃｈａｎら、２００６年、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１９巻、６６〜７４頁；Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  Ｈｉｂｍａ、２００５年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３０２巻、１１６〜１２４頁）  またはインテグリン（Ｇａｗａｚら、１９９１年、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ、８８巻、１１２８〜１１３４頁）によって媒介される接着を調査するために、サイトメーターを使用している。したがって（ｉｉ）の場合、選択した標的を発現する細胞を細胞内蛍光色素（例えば、カルセイン）で染色する。細胞表面特異的マーカーに結合する蛍光抗体でＢ細胞を染色する。したがって、Ｂ細胞受容体−標的相互作用を介して相互に接着している２つの細胞に存する２色「イベント」を選択できる（図２参照）。
【００８０】
ＩｇＧは通常ＩｇＭより高い親和性を有するので、ＩｇＭではなくＩｇＧをそれらの表面に発現している（これは記憶Ｂ細胞に特有である）陽性Ｂ細胞が選択されるのが好ましい。前記目的のために、ＩｇＧに特異的な抗体とＩｇＭに特異的な抗体とが、示差的に、例えば、それぞれＡＰＣおよびＦＩＴＣで標識される多色染色の使用が好ましい。
【００８１】
特定の一実施形態では、Ｂ細胞選別のためのリードアウト（ｒｅａｄ−ｏｕｔ）は、受容体シグナル伝達を機能的に遮断または活性化する相互作用の能力を求めて選択することもできる。例えば、ＧＰＣＲ（Ｇタンパク質共役受容体）を機能的に発現する細胞と共にＢ細胞をインキュベートすることができる。ＧＰＣＲを介してシグナル伝達するアゴニストを混合物に添加して、ＧＰＣＲ媒介性の小胞体からのＣａ２＋流出を誘導することができる。Ｂ細胞に提示されている抗体がアゴニストのシグナル伝達を機能的に遮断する場合、その結果として、この細胞間相互作用によっても、Ｃａ２＋流出が遮断される。Ｃａ２＋流出は、フローサイトメトリーによって定量的に測定できる。したがって、Ｃａ２＋流出の増加または減少のいずれかを示すＢ細胞／標的細胞集合体のみが選別される。
【００８２】
選択工程に続いて、抗体が培地中に分泌されるのに適した条件下でＢ細胞を培養する。産生される抗体はモノクローナル抗体である。培養は、胸線腫ヘルパー細胞系などのヘルパー細胞系の使用を要し得る（例えばＥＬ４−Ｂ５、Ｚｕｂｌｅｒら、１９８５年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３４（６）巻、３６６２〜３６６８頁参照）。例えば、標的タンパク質以外の細胞表面で発現されているタンパク質に対して産生される抗体を除くために、標的に特異的に結合する抗体の生成を試験する検証工程が行われることが好ましい。例えば、ＣＥＬＩＳＡ、すなわち、コーティング工程が細胞全体で行われる改変酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）が前記目的に適している。前記方法は、リガンドと競合する抗体の選択性および能力の評価を可能にする。
【００８３】
次いで、上述の工程で生成された抗体を、前記抗体のＣＤＲを同定するために分析する。これは、抗体の精製、それらのアミノ酸配列および／または核酸配列の解明などの工程を要し得る。
【００８４】
最後に、例えばオリゴ伸長法を用いた遺伝子合成によって、ＣＤＲをアクセプターフレームワーク、好ましくは上述のアクセプターフレームワークに融合させることができる。一実施形態では、ドナーＣＤＲをアクセプターフレームワーク中に移すのに、当該分野で認識されているＣＤＲ融合の方法を用いることができる。大抵の場合、重鎖由来の３つのＣＤＲすべてをドナー抗体から単一のアクセプターフレームワークに移植し、軽鎖由来の３つのＣＤＲすべてを別のアクセプターフレームワークに移植する。一部のＣＤＲは抗原への結合に関与していない可能性があり、異なった配列（および同じ長さ）を有するＣＤＲが同じフォールディングを有し得る（したがって、異なった配列にも関わらず、抗原から主鎖接触までの接触が保持され得る）ので、これらのＣＤＲすべてを移植する必要が常にあるわけではないと予測される。実際、単一ドメイン（Ｗａｒｄら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４〜５４６頁）または単一ＣＤＲ（Ｒ．  Ｔａｕｂら、１９８９年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６４巻、２５９〜２６５頁）でさえ単独で抗原結合活性を有することができる。しかし、すべてのＣＤＲが移植されようが、またはいくつかのＣＤＲのみが移植されようが、ＣＤＲ融合の意図は、同一またはほとんど同一の抗原結合部位を動物からヒト抗体に移植することである（例えば、米国特許第５２２５５３９号（Ｗｉｎｔｅｒ）参照）。
【００８５】
別の実施形態では、ドナー抗体のＣＤＲは、アクセプターフレームワーク中に組み入れられる前または後に改変され得る。
【００８６】
代わりに、抗体の特徴付けが、それらの最終イムノバインダーフォーマットでのみ行われる。このアプローチのために、選別されたＢ細胞上に発現された抗体のＣＤＲ配列を、選別されたＢ細胞の培養物から、または選別されたＢ細胞の単一細胞から直接的にＲＴ−ＰＣＲによって回収する。前記目的には、Ｂ細胞の増殖および／または上述の検証工程および／または上述の分析工程が不必要であり得る。１つのオリゴヌクレオチドプールがＣＤＲをコードし、第２のプールが、適したイムノバインダー足場のフレームワーク領域をコードする、部分的に重複を有する２つのプールのオリゴヌクレオチドの組合せによって、ワンステップＰＣＲ手順でのヒト化イムノバインダーの生成が可能となる。細胞培養上清中に分泌されたＩｇＧを特徴付ける代わりに、ハイスループット配列決定、クローニング、および産生は、精製されたヒト化イムノバインダーの成績に基づいたクローン選択の実施を可能にする。その好ましい実施形態では、イムノバインダーはｓｃＦｖである。
【００８７】
しかし、ＣＤＲの融合は、抗原に接触しているフレームワーク残基のため、生成されたイムノバインダーの、抗原への親和性の損失をもたらし得る。そのような相互作用は体細胞超変異の結果であり得る。したがって、ヒト化抗体のフレームワークへのそのようなドナーフレームワークアミノ酸の融合がまだ必要であり得る。抗原結合に関与する、非ヒトイムノバインダーのアミノ酸残基は、イエウサギモノクローナル抗体可変領域配列および構造の検査によって同定され得る。生殖系列と異なっている、ＣＤＲドナーフレームワーク中の各残基は重要であるとすることができる。最も近い生殖系列を確定できない場合、サブグループコンセンサスまたは高いパーセントの類似性を有するイエウサギ配列のコンセンサスに対して配列を比較することができる。希少なフレームワーク残基は、体細胞超変異の結果であり得、したがって結合における役割を果たしていると考えられる。
【００８８】
本発明の抗体は、強化された機能特性、例えば、強化された溶解性および／または安定性を示すようにさらに最適化することができる。特定の実施形態では、本発明の抗体は、参照により本明細書に援用される、２００８年３月１２日に出願された、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」という名称のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００１９５８に開示されている「機能的なコンセンサス」法に従って最適化される。
【００８９】
例えば、イムノバインダーにおける対応位置より可変性への耐性が大きいかまたは小さいアミノ酸残基位置を同定するのに使用される機能的に選択されたｓｃＦｖのデータベースと、本発明のイムノバインダーを比較し、それによって、そのような同定された残基位置が、安定性および／または溶解性などの機能性を改善するための操作に適したものであり得ることを示すことができる。
【００９０】
置換のための例示的フレームワーク残基位置および例示的フレームワーク置換は、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」という名称の、２００８年６月２５日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＨ２００８／０００２８５号、および「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」という名称の、２００８年６月２５日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＨ２００８／０００２８４号に記載されている。例えば、以下の置換の１つまたは複数を、本発明のイムノバインダーの重鎖可変領域におけるアミノ酸の位置に導入することができる（以下に列挙する各アミノ酸位置に対してＡＨｏナンバリングが参照される）：
（ａ）アミノ酸位置１のＱまたはＥ；
（ｂ）アミノ酸位置６のＱまたはＥ；
（ｃ）アミノ酸位置７の、Ｔ、Ｓ、またはＡ、より好ましくはＴまたはＡ、さらにより好ましくはＴ；
（ｄ）アミノ酸位置１０の、Ａ、Ｔ、Ｐ、Ｖ、またはＤ、より好ましくはＴ、Ｐ、Ｖ、またはＤ、
（ｅ）アミノ酸位置１２の、ＬまたはＶ、より好ましくはＬ、
（ｆ）アミノ酸位置１３の、Ｖ、Ｒ、Ｑ、Ｍ、またはＫ、より好ましくはＶ、Ｒ、Ｑ、またはＭ；
（ｇ）アミノ酸位置１４の、Ｒ、Ｍ、Ｅ、Ｑ、またはＫ、より好ましくはＲ、Ｍ、ＥまたはＱ、さらにより好ましくはＲまたはＥ；
（ｈ）アミノ酸位置１９の、ＬまたはＶ、より好ましくはＬ；
（ｉ）アミノ酸位置２０の、Ｒ、Ｔ、Ｋ、またはＮ、より好ましくはＲ、Ｔ、またはＮ、さらにより好ましくはＮ；
（ｊ）アミノ酸位置２１の、Ｉ、Ｆ、Ｌ、またはＶ、より好ましくはＩ、Ｆ、またはＬ、さらにより好ましくはＩまたはＬ；
（ｋ）アミノ酸位置４５の、ＲまたはＫ、より好ましくはＫ；
（ｌ）アミノ酸位置４７の、Ｔ、Ｐ、Ｖ、ＡまたはＲ、より好ましくはＴ、Ｐ、Ｖ、またはＲ、さらにより好ましくはＲ；
（ｍ）アミノ酸位置５０の、Ｋ、Ｑ、Ｈ、またはＥ、より好ましくはＫ、Ｈ、またはＥ、さらにより好ましくはＫ；
（ｎ）アミノ酸位置５５の、ＭまたはＩ、より好ましくはＩ；
（ｏ）アミノ酸位置７７の、ＫまたはＲ、より好ましくはＫ；
（ｐ）アミノ酸位置７８の、Ａ、Ｖ、Ｌ、またはＩ、より好ましくはＡ、Ｌ、またはＩ、さらにより好ましくはＡ；
（ｑ）アミノ酸位置８２の、Ｅ、Ｒ、Ｔ、またはＡ、より好ましくはＥ、Ｔ、またはＡ、さらにより好ましくはＥ；
（ｒ）アミノ酸位置８６の、Ｔ、Ｓ、Ｉ、またはＬ、より好ましくはＴ、Ｓ、またはＬ、さらにより好ましくはＴ；
（ｓ）アミノ酸位置８７の、Ｄ、Ｓ、Ｎ、またはＧ、より好ましくはＤ、Ｎ、またはＧ、さらにより好ましくはＮ；
（ｔ）アミノ酸位置８９の、Ａ、Ｖ、Ｌ、またはＦ、より好ましくはＡ、Ｖ、またはＦ、さらにより好ましくはＶ；
（ｕ）アミノ酸位置９０の、Ｆ、Ｓ、Ｈ、Ｄ、またはＹ、より好ましくはＦ、Ｓ、Ｈ、またはＤ；
（ｖ）アミノ酸位置９２の、Ｄ、Ｑ、またはＥ、より好ましくはＤまたはＱ、さらにより好ましくはＤ；
（ｗ）アミノ酸位置９５の、Ｇ、Ｎ、Ｔ、またはＳ、より好ましくはＧ、Ｎ、またはＴ、さらにより好ましくはＧ；
（ｘ）アミノ酸位置９８の、Ｔ、Ａ、Ｐ、Ｆ、またはＳ、より好ましくはＴ、Ａ、Ｐ、またはＦ、さらにより好ましくはＦ；
（ｙ）アミノ酸位置１０３の、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、またはＬ、より好ましくはＲ、Ｑ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、またはＬ、さらにより好ましくはＹ、さらにより好ましくはＬ；および
（ｚ）アミノ酸位置１０７の、Ｎ、Ｓ、またはＡ、より好ましくはＮまたはＳ、さらにより好ましくはＮ。
【００９１】
さらに、またはあるいは、以下の置換の１つまたは複数を、本発明のイムノバインダーの軽鎖可変領域中に導入することができる：
（ａａ）アミノ酸位置１の、Ｑ、Ｄ、Ｌ、Ｅ、Ｓ、またはＩ、より好ましくはＬ、Ｅ、Ｓ、またはＩ、さらにより好ましくはＬまたはＥ；
（ｂｂ）アミノ酸位置２の、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｉ、Ｐ、またはＴ、より好ましくはＡ、Ｙ、Ｉ、Ｐ、またはＴ、さらにより好ましくはＰまたはＴ；
（ｃｃ）アミノ酸位置３の、Ｑ、Ｖ、Ｔ、またはＩ、より好ましくはＶ、Ｔ、またはＩ、さらにより好ましくはＶまたはＴ；
（ｄｄ）アミノ酸位置４の、Ｖ、Ｌ、Ｉ、またはＭ、より好ましくはＶまたはＬ；
（ｅｅ）アミノ酸位置７の、Ｓ、Ｅ、またはＰ、より好ましくはＳまたはＥ、さらにより好ましくはＳ；
（ｆｆ）アミノ酸位置１０の、ＴまたはＩ、より好ましくはＩ；
（ｇｇ）アミノ酸位置１１の、ＡまたはＶ、より好ましくはＡ；
（ｈｈ）アミノ酸位置１２の、ＳまたはＹ、より好ましくはＹ；
（ｉｉ）アミノ酸位置１４の、Ｔ、Ｓ、またはＡ、より好ましくはＴまたはＳ、さらにより好ましくはＴ；
（ｊｊ）アミノ酸位置１８の、ＳまたはＲ、より好ましくはＳ；
（ｋｋ）アミノ酸位置２０の、ＴまたはＲ、より好ましくはＲ；
（ｌｌ）アミノ酸位置２４の、ＲまたはＱ、より好ましくはＱ；
（ｍｍ）アミノ酸位置４６の、ＨまたはＱ、より好ましくはＨ；
（ｎｎ）アミノ酸位置４７の、Ｋ、Ｒ、またはＩ、より好ましくはＲまたはＩ、さらにより好ましくはＲ；
（ｏｏ）アミノ酸位置５０の、Ｒ、Ｑ、Ｋ、Ｅ、Ｔ、またはＭ、より好ましくはＱ、Ｋ、Ｅ、ＴまたはＭ；
（ｐｐ）アミノ酸位置５３の、Ｋ、Ｔ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、またはＰ、より好ましくはＴ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、またはＰ；
（ｑｑ）アミノ酸位置５６の、ＩまたはＭ、より好ましくはＭ；
（ｒｒ）アミノ酸位置５７の、Ｈ、Ｓ、Ｆ、またはＹ、より好ましくはＨ、Ｓ、またはＦ；
（ｓｓ）アミノ酸位置７４の、Ｉ、Ｖ、またはＴ、より好ましくはＶまたはＴ、Ｒ、さらにより好ましくはＴ；
（ｔｔ）アミノ酸位置８２の、Ｒ、Ｑ、またはＫ、より好ましくはＲまたはＱ、さらにより好ましくはＲ；
（ｕｕ）アミノ酸位置９１の、ＬまたはＦ、より好ましくはＦ；
（ｖｖ）アミノ酸位置９２の、Ｇ、Ｄ、Ｔ、またはＡ、より好ましくはＧ、Ｄ、またはＴ、さらにより好ましくはＴ；
（ｘｘ）アミノ酸位置９４の、ＳまたはＮ、より好ましくはＮ；
（ｙｙ）アミノ酸位置１０１の、Ｆ、Ｙ、またはＳ、より好ましくはＹまたはＳ、さらにより好ましくはＳ；および
（ｚｚ）アミノ酸位置１０３の、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｅ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｇ、またはＩ、より好ましくはＨ、Ｅ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｇ、またはＩ、さらにより好ましくはＡまたはＶ。
【００９２】
他の実施形態において、本発明のイムノバインダーは、「Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｅｒｓ」という名称の、２００８年６月２５日出願の、米国仮出願第６１／０７５，６９２号に記載されている、安定性を増強する変異を１つまたは複数含んでいる。ある好ましい実施形態において、イムノバインダーは、１２、１０３、および１４４（ＡＨｏナンバリング法）からなる重鎖アミノ酸位置の群から選択されるアミノ酸位置に溶解性を増強する変異を含んでいる。好ましい一実施形態において、イムノバインダーは、（ａ）重鎖アミノ酸位置１２のセリン（Ｓ）；（ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３のセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）；および（ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４のセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）からなる群より選択される置換を１つまたは複数含んでいる。別の一実施形態において、イムノバインダーは、以下の置換：（ａ）重鎖アミノ酸位置１２のセリン（Ｓ）；（ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３のセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）；および（ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４のセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）を含んでいる。
【００９３】
特定の好ましい実施形態では、イムノバインダーは、ＡＨｏナンバリングシステムによる軽鎖可変領域の位置１、３、４、１０、４７、５７、９１および１０３のうちの少なくとも１つに、軽鎖アクセプターフレームワークのフレームワーク残基で安定性増強変異を含む。好ましい実施形態では、軽鎖アクセプターフレームワークは、（ａ）位置１のグルタミン酸（Ｅ）、（ｂ）位置３のバリン（Ｖ）、（ｃ）位置４のロイシン（Ｌ）、（ｄ）位置１０のセリン（Ｓ）、（ｅ）位置４７のアルギニン（Ｒ）、（ｅ）位置５７のセリン（Ｓ）、（ｆ）位置９１のフェニルアラニン（Ｆ）、および（ｇ）位置１０３のバリン（Ｖ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換を含む。
【００９４】
上述の変異を含むヒト化抗体を産生する様々な利用可能な方法のいずれを用いることもできる。
【００９５】
したがって、本発明は、本明細書に記載の方法に従ってヒト化されたイムノバインダーを提供する。
【００９６】
特定の好ましい実施形態では、前記イムノバインダーの標的抗原はＶＥＧＦまたはＴＮＦαである。
【００９７】
例えば、当該分野で公知の技法を用いて、本発明に記載のポリペプチドまたは本発明の方法で生成されたポリペプチドを合成できる。代わりに、所望の可変領域をコードする核酸分子を合成すること、および組換え法によってポリペプチドを生成することができる。
【００９８】
例えば、ヒト化可変領域の配列がひとたび決定されると、分子生物学の分野で周知の技法によって、その可変領域またはそれを含むポリペプチドを生成することができる。より具体的には、核酸配列で宿主細胞を形質転換することによって、広範なポリペプチドを産生するのに、組換えＤＮＡ技法を用いることができる（例えば、所望の可変領域をコードするＤＮＡ配列（例えば、改変重鎖または軽鎖；その可変ドメインまたはその他の抗原結合性フラグメント））。
【００９９】
一実施形態では、少なくともＶＨまたはＶＬをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結するプロモーターを含む発現ベクターを調製できる。必要または望ましい場合、相補的な可変ドメインをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結するプロモーターを含有する第２の発現ベクターを調製することができる（すなわち、親発現ベクターがＶＨをコードし、第２の発現ベクターがＶＬをコードする場合、およびその逆）。その後、細胞系（例えば、不死化哺乳動物細胞系）を該発現ベクターの一方または両方で形質転換し、キメラ可変ドメインまたはキメラ抗体の発現を可能にする条件下で培養することができる（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒらの国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ８５／００３９２号を参照）。
【０１００】
一実施形態では、ドナーＣＤＲおよびアクセプターＦＲのアミノ酸配列を含む可変領域を作り、次いで、ＣＤＲアミノ酸置換をもたらすように核酸分子に変化を導入し得る。
【０１０１】
ポリペプチドのアミノ酸配列改変体をコードする核酸分子を作るための当該分野で認識されている例示的方法には、部位特異的（またはオリゴヌクレオチド媒介）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、および該ポリペプチドをコードする事前調製ＤＮＡのカセット変異誘発による調製が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０２】
部位特異的変異誘発は、置換改変体を調製するのに好ましい方法である。この技法は、当該分野で周知である（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１３巻、４４３１〜４４４３頁（１９８５年）、Ｋｕｎｋｅｌら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８２巻、４８８巻（１９８７年）を参照）。簡潔には、ＤＮＡの部位特異的変異誘発を行う際に、親ＤＮＡの改変を、最初に、上記親ＤＮＡの単一鎖に所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることによって行う。ハイブリダイゼーションの後に、ハイブダイズしたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、親ＤＮＡの単一鎖を鋳型として用いて、ＤＮＡポリメラーゼを用いて第２鎖全体を合成する。それによって、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドが、結果として得られる２本鎖ＤＮＡに組み込まれる。
【０１０３】
ＰＣＲ変異誘発もポリペプチドのアミノ酸配列改変体を作るのに適している。Ｈｉｇｕｃｈｉ、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１７７〜１８３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０年）；Ｖａｌｌｅｔｔｅら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１７巻、７２３〜７３３頁（１９８９年）参照。簡潔には、ＰＣＲにおける出発物質として少量の鋳型ＤＮＡが用いられる場合、鋳型ＤＮＡの対応する領域と配列が若干異なるプライマーを使用して、プライマーが鋳型と異なっている位置のみで鋳型配列と異なっている、比較的多量の特異ＤＮＡフラグメントを生成することができる。
【０１０４】
改変体を調製するための別の方法であるカセット変異誘発は、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ、３４巻、３１５〜３２３頁（１９８５年）によって記載された技法に基づいている。出発物質は、変異導入されるＤＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。変異導入される親ＤＮＡ中のコドン（単数または複数）を同定する。同定された変異部位（単数または複数）の各側にユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位がなければならない。そのような制限酵素認識部位が存在していない場合、ポリペプチドをコードするＤＮＡ中の適切な位置に制限酵素認識部位を導入する上述のオリゴヌクレオチド媒介変異誘発方法を用いて、生成させることができる。これらの部位でプラスミドＤＮＡを切断して、それを線状化する。制限酵素認識部位間のＤＮＡの配列をコードするが、所望の変異（単数または複数）を含有する２本鎖オリゴヌクレオチドは標準的手順を用いて合成され、ここで、オリゴヌクレオチドの２本の鎖は、標準的な技法を用いて別々に合成され、次いで、互いにハイブリダイズされる。この２本鎖オリゴヌクレオチドはカセットと呼ばれる。このカセットは、プラスミドに直接的にライゲーションされるように、線状化されたプラスミドの末端と適合する５’末端および３’末端を有するように設計される。このプラスミドは、この時点で、変異導入されたＤＮＡ配列を含有する。
【０１０５】
本発明の方法によって生成された可変領域は、リモデリングを行って、抗原結合性がさらに増強するようにさらに改変することができる。したがって、上述の工程は、例えば、親和性成熟を含めた追加工程に先行することも、それらの後にくることもできる。加えて、さらなる最適化に、経験的な結合データを用いることもできる。
【０１０６】
アミノ酸配列は相違するが所望の活性は相違しないように本発明のポリペプチドをさらに改変できることを当業者は理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換を導く、さらなるヌクレオチド置換をタンパク質に加えてもよい。例えば、免疫グロブリンポリペプチド中の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換できる。別の実施形態では、ひと続きのアミノ酸を、順序および／または側鎖ファミリーメンバーの組成が異なる構造的に類似したひと続きで置換することができ、すなわち、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される保存的置換を加えることができる。
【０１０７】
類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当該分野で定義されており、それらとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および、芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。
【０１０８】
アミノ酸置換とは別に、本発明では、例えば、改変されたエフェクター機能を有するＦｃ領域改変体を生成するためのＦｃ領域アミノ酸配列への他の改変も企図されている。例えば、ＦｃＲへの結合を減少または促進するために、Ｆｃ領域の１つまたは複数のアミノ酸残基を除去することができる。一実施形態では、そのようなＦｃ領域改変体を生成するために、１つまたは複数のＦｃ領域残基を改変することができる。通常、本発明のこの実施形態によれば、１〜約１０以下のＦｃ領域残基が除去される。ここで１つまたは複数のアミノ酸欠失を含むＦｃ領域は、好ましくは、開始Ｆｃ領域または天然配列ヒトＦｃ領域の少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％を保持する。
【０１０９】
改変されたエフェクター機能を有するアミノ酸挿入Ｆｃ領域改変体も生成できる。例えば、本明細書でＦｃＲ結合にインパクトを与えるものとして同定された１つまたは複数のＦｃ領域位置に隣接する少なくとも１つのアミノ酸残基（例えば、１から２アミノ酸残基、通常は１０残基以下）を導入できる。「隣接する」とは、本明細書で同定するＦｃ領域残基の１〜２アミノ酸残基以内にあることを意味する。そのようなＦｃ領域改変体は、ＦｃＲｎ結合の強化または低減を示し得る。
【０１１０】
そのようなＦｃ領域改変体は通常、Ｆｃ領域内に少なくとも１つのアミノ酸の改変を含む。一実施形態では、アミノ酸改変が組み合わされ得る。例えば、改変体Ｆｃ領域はその中に、例えば本明細書で同定された特定のＦｃ領域位置のうちの２、３、４、５箇所などの置換を含み得る。別の実施形態では、ポリペプチドは、ＦｃＲｎとの結合および別のＦｃ受容体との結合が改変されたものであり得る。
【０１１１】
一実施形態では、本発明に記載されているポリペプチド、または本発明の方法で生成されたポリペプチド、例えば、ヒト化Ｉｇ可変領域および／またはヒト化Ｉｇ可変領域を含むポリペプチドは、組換え法によって産生されたものであり得る。例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を組換え発現のために適した発現ベクターに挿入できる。ポリペプチドが抗体である場合、定常領域に場合により連結された、追加の軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドが同じかまたは異なった発現ベクターに挿入され得る。親和性タグ配列（例えば、Ｈｉｓ（６）タグ）を、下流の精製を容易にするためにポリペプチド配列に場合により結合または包含させることができる。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする、発現ベクター（単数または複数）中の制御配列に作動可能に連結されている。発現制御配列としては、プロモーター（例えば、天然付随または異種のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメントおよび転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクター中の真核細胞プロモーター系であることが好ましい。ひとたびベクターが適切な宿主に組み入れられれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現ならびにポリペプチドの収集および精製に適した条件下で宿主は維持される。
【０１１２】
これらの発現ベクターは通常、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡに組み込まれた部分として宿主生物内で複製可能である。一般的に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性またはネオマイシン耐性）を含有している（例えば、米国特許第４，７０４，３６２号参照）。
【０１１３】
Ｅ．ｃｏｌｉは、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列）をクローニングするのに特に有用な原核細胞の宿主の１つである。使用に適した他の微生物の宿主には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓなどの桿菌、ならびにＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａおよび様々なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種などの他の腸内細菌科が含まれる。
【０１１４】
酵母などの他の微生物も発現に有用である。ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｉｃｈｉａは例示的酵母宿主であり、適したベクターは、所望により、発現制御配列（例えば、プロモーター）、複製開始点、終止配列などを有する。典型的なプロモーターとしては、３−ホスホグリセレートキナーゼおよび他の解糖系酵素が挙げられる。誘導性酵母プロモーターとしては、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロムＣ由来のプロモーター、ならびにメタノール、マルトースおよびガラクトース利用を担っている酵素群由来のプロモーターが挙げられる。
【０１１５】
本発明の範囲内では、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが好ましい宿主細胞である。
【０１１６】
微生物に加えて、哺乳動物組織培養も、本発明のポリペプチドを発現および産生させるのに使用できる（例えば、免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎ．Ｙ．，  Ｎ．Ｙ（１９８７年）を参照されたい。異種タンパク質（例えば、インタクトな免疫グロブリン）を分泌できる多くの適した宿主細胞系が当該分野で開発されているので、真核細胞が事実上好ましく、それらには、ＣＨＯ細胞系、様々なＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、骨髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマが挙げられる。これらの細胞のための発現ベクターは、複製開始点、プロモーターおよびエンハンサーなどの発現制御配列（Ｑｕｅｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．、８９巻、４９頁（１９８６年））、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネータ配列などの必要なプロセシング情報部位を含むことができる。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サイトメガロウイルスなどから得られたプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８巻、１１４９頁（１９９２年）を参照されたい。
【０１１７】
目的のポリヌクレオチド配列（例えば、重鎖および軽鎖をコードする配列ならびに発現制御配列）を含有するベクターを、周知の方法（細胞宿主のタイプに応じて異なる）によって宿主細胞内に導入できる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核細胞に一般的に利用され、一方、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション、バイオリスティクス（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）またはウイルスベースのトランスフェクションは他の細胞宿主に使用され得る（全般的にＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８９年を参照）。哺乳動物細胞を形質転換するのに使用される他の方法には、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション、および微量注入が挙げられる（全般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上を参照）。トランスジェニック動物の産生には、受精卵母細胞内に導入遺伝子を微量注入すること、または、胚幹細胞のゲノム中に組み入れ、そのような細胞の核を除核卵母細胞内に導入することができる。
【０１１８】
トランスジェニック動物のゲノム中に導入して、それに続いて、例えば、トランスジェニック動物の乳中に発現させるために、対象となるポリペプチドを導入遺伝子に組み入れることもできる（例えば、Ｄｅｂｏｅｒら、５，７４１，９５７；Ｒｏｓｅｎ、５，３０４，４８９；およびＭｅａｄｅ、５，８４９，９９２参照）。適した導入遺伝子には、カゼインまたはベータラクトグロブリンなどの乳腺特異的遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサーに作動可能に連結した、軽鎖および／または重鎖のコード配列が挙げられる。
【０１１９】
ポリペプチドは、単一ベクターを用いて発現させることも、２つのベクターを用いて発現することもできる。例えば、抗体重鎖および軽鎖を、別々の発現ベクターにクローニングして、細胞中に共トランスフェクト（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）してもよい。
【０１２０】
一実施形態では、本発明のポリペプチドの発現を促進するのに、シグナル配列を使用できる。
【０１２１】
ひとたび発現されれば、そのポリペプチドを、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動などを含めた、当該分野の標準的手順（全般的に、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎ．Ｙ．（１９８２年））を参照のこと）に従って精製することができる。
【０１２２】
ヒト化Ｉｇ可変領域またはそれらを含むポリペプチドを宿主細胞または培養細胞系によって発現させることができる。それらは、インビボの細胞で発現させることもできる。改変された抗体を産生するように形質転換（例えば、トランスフェクト）される細胞系は、不死化哺乳動物細胞系であり得、例えば、リンパ球系出自のものである（例えば、骨髄腫、ハイブリドーマ、トリオーマまたはクアドローマ細胞系）。この細胞系としてはまた、ウイルス（例えば、エプスタインーバーウイルス）を用いた形質転換によって不死化された、Ｂ細胞などの正常なリンパ系細胞が挙げられ得る。
【０１２３】
ポリペプチドを産生するのに使用される細胞系は通常、哺乳動物細胞系であるが、他の供給源からの細胞系（細菌および酵母など）も使用できる。特に、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の細菌株を使用でき、とりわけ、例えば、ファージディスプレイを使用できる。
【０１２４】
骨髄腫細胞株など、一部の不死化リンパ系細胞系は、それらの正常な状態で、単離されたＩｇ軽鎖または重鎖を分泌する。本発明の方法中に調製された改変抗体を発現するベクターでそのような細胞系が形質転換された場合、通常分泌される鎖が、事前に調製されたベクターによってコードされたＩｇ鎖の可変ドメインに相補的な鎖であるという条件では、該方法の残りの工程を実行する必要はない。
【０１２５】
不死化細胞系が分泌しない、または相補鎖を分泌しない場合、適切な相補鎖またはそのフラグメントをコードするベクターを細胞内に導入することが必要である。
【０１２６】
不死化細胞系が相補的な軽鎖または重鎖を分泌する場合、形質転換細胞系は、例えば、適した細菌細胞をベクターで形質転換し、次いで、その細菌細胞を不死化細胞系と（例えば、スフェロプラスト融合によって）融合させることによって産生され得る。代わりに、エレクトロポレーションによってＤＮＡが不死化細胞系に直接的に導入され得る。
【０１２７】
一実施形態では、本発明で記載されるヒト化Ｉｇ可変領域、または本発明の方法によって生成されるヒト化Ｉｇ可変領域は、任意の抗体の抗原結合性フラグメント中に存在し得る。これらのフラグメントは、組換えによって産生され得、ならびにタンパク質分解酵素で抗体を消化することによって操作、合成または産生され得る。例えば、フラグメントは、Ｆａｂフラグメントであり得、パパインによる消化は、２本の重鎖を連結する鎖間（すなわち、ＶＨ−ＶＨ）ジスルフィド結合の前の領域で抗体を切断する。これは、軽鎖ならびに重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメインを含有する２つの同一なフラグメントの形成をもたらす。代わりに、このフラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントであり得る。これらのフラグメントは、ペプシンで抗体を消化することによって生成され得る。ペプシンは、鎖間ジスルフィド結合の後で重鎖を切断し、その結果、両方の抗原結合部位を含有するフラグメントをもたらす。さらに別の代替手段は、「単一鎖」抗体を用いることである。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントは、様々な方法で構築できる。例えば、ＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端に連結できる。通常、リンカー（例えば（ＧＧＧＧＳ）４）をＶＨとＶＬとの間で配置する。しかし、鎖が連結され得る順序は、逆にすることができ、検出または精製を容易にするタグ（例えば、Ｍｙｃタグ、ＨｉｓタグまたはＦＬＡＧタグ）が含まれ得る（これらなどのタグを本発明の任意の抗体または抗体フラグメントに追加することができる；それらの使用はｓｃＦｖに限定されない）。したがって、以下に述べるように、タグ付きの抗体は本発明の範囲内にある。代わりの実施形態では、本明細書に記載の抗体または本明細書に記載の方法によって生成される抗体は、重鎖２量体または軽鎖２量体であり得る。さらに、抗体軽鎖もしくは重鎖またはその部分、例えば単一ドメイン抗体（ＤＡｂ）も使用できる。
【０１２８】
別の実施形態では、本発明に記載のヒト化Ｉｇ可変領域、または本発明の方法で生成されるヒト化Ｉｇ可変領域は、単一鎖抗体（ＳｃＦｖ）またはミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）で存在する（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ９４／０９８１７Ａ１参照）。ミニボディーは、それぞれＳｃＦｖ分子（１つまたは複数の抗原結合部位を含む単一ポリペプチド、例えば、接続ペプチドを介してＣＨ３ドメインに融合したＶＨドメインに柔軟なリンカーによって連結されたＶＬドメイン）を含む２本のポリペプチド鎖で作られた２量体分子である。ＳｃＦｖ分子は、ＶＨ−リンカー−ＶＬ配向または、ＶＬ−リンカー−ＶＨ配向で構築できる。抗原結合部位を作るＶＬおよびＶＨドメインを連結する柔軟なヒンジは、約１０〜約５０アミノ酸残基を含むことが好ましい。この目的のための例示的接続ペプチドは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である（Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８年）、ＰＮＡＳ、８５巻、５８７９頁）。他の接続ペプチドは当該分野は公知である。
【０１２９】
単一鎖抗体を生成する方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｈｏら（１９８９年）、Ｇｅｎｅ、７７巻、５１頁；Ｂｉｒｄら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻、４２３頁；Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏら（１９９１年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻、１０１１７頁；Ｍｉｌｅｎｉｃら（１９９１年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５１巻、６３６３頁；Ｔａｋｋｉｎｅｎら（１９９１年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、４巻、８３７頁。ミニボディーは、当該分野で記載されている方法を用いて、ＳｃＦｖ成分および接続ペプチド−ＣＨ３成分を構築することによって生成できる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ９４／０９８１７Ａ１参照）。これらの成分を、別々のプラスミドから制限フラグメントとして単離し、その後、適切なベクター中にライゲーションおよび再クローニングすることができる。適切なアセンブリを制限酵素消化およびＤＮＡ配列分析で確かめることができる。一実施形態では、本発明のミニボディーは接続ペプチドを含む。一実施形態では、接続ペプチドは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー、例えばＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧを含む。
【０１３０】
別の実施形態では、４価のミニボディーを構築できる。例えばアミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）４Ｇ３ＡＳを有する柔軟なリンカーを用いて２個のＳｃＦｖ分子が連結されることを除けばミニボディーと同じ方法で、４価のミニボディーを構築することができる。
【０１３１】
別の実施形態では、本発明で記載するヒト化可変領域、または本発明の方法で生成されるヒト化可変領域はダイアボディーで存在し得る。ダイアボディーはｓｃＦｖ分子に類似しているが、通常、両方の可変ドメインを接続する短い（１０未満、好ましくは１〜５）アミノ酸残基リンカーを有し、それゆえ、同一ポリペプチド鎖上のＶＬドメインとＶＨドメインとは相互作用できない。代わりに、１本のポリペプチド鎖のＶＬおよびＶＨ領域が（それぞれ）第２のポリペプチド鎖上のＶＨおよびＶＬドメインと相互作用する（ＷＯ０２／０２７８１）。
【０１３２】
別の実施形態では、本発明のヒト化可変領域は、ＦｃＲ結合部分に作動可能に連結した抗体（例えば、ｓｃＦｖ分子、ミニボディー、４価のミニボディー、またはダイアボディー）の免疫反応性フラグメントまたは部分に存在し得る。例示的な一実施形態では、ＦｃＲ結合部分は完全なＦｃ領域である。
【０１３３】
本明細書に記載のヒト化法は、ドナー抗体と比較して実質的に抗原の親和性が変化していないＩｇ可変領域をもたらすことが好ましい。
【０１３４】
一実施形態では、本発明の可変ドメインを含むポリペプチドは、約１０５Ｍ−１、約１０６Ｍ−１、約１０７Ｍ−１、約１０８Ｍ−１、約１０９Ｍ−１、約１０１０Ｍ−１、約１０１１Ｍ−１または約１０１２Ｍ−１超の（またはそれに等しい）結合定数Ｋａの結合親和性で抗原に結合する（これらの値の中間値の親和性を含む）。
【０１３５】
様々な方法で親和性、アビディティーおよび／または特異性を測定できる。通常、親和性が定義または測定される正確な方法に関わらず、本発明の方法によって、作製元の抗体（または複数の抗体）よりも臨床適用の任意の側面で優れた抗体が生成される場合、該方法は、抗体親和性を改善するものである（例えば、改変された抗体が、作製元の抗体（または複数の抗体）よりも低用量または低頻度または好都合な投与経路で投与できる場合、本発明の方法は有効または好成果であると考えられる）。
【０１３６】
より詳細には、抗体と、それが結合する抗原との間の親和性は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＢｉａＣｏｒｅアッセイまたはＫｉｎＥｘＡＴＭ３０００アッセイ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ（ＩＤ））から入手可能）を含めた様々なアッセイで測定できる。簡潔には、セファロースビーズを共有結合によって抗原（本発明の方法で使用される抗原は、任意の目的の抗原（例えば、がん抗原；細胞表面タンパク質または分泌タンパク質；病原体の抗原（例えば、細菌またはウイルス抗原（例えば、ＨＩＶ抗原、インフルエンザ抗原または肝炎抗原））；アレルゲンであり得る）でコーティングする。試験される抗体の希釈物を調製し、各希釈物をプレートにおける指定された穴に添加する。次いで、それぞれの穴に検出抗体（例えば、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ結合体）を添加し、続いて色素形成の基質（例えば、ＨＲＰ）を添加する。次いで、プレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーで４５０ｎＭにて読み取り、ＥＣ５０値を計算する（ここに記載された方法は概ね適用可能である；それらは、いかなる特定の抗原または抗原のクラスに結合する抗体の産生にも限定されないと理解される）。
【０１３７】
当業者ならば、親和性の決定が常に単一の数値を見るだけですむほど単純ではないと認識している。抗体は２つの腕を有するので、通常、それらの見かけの親和性は、可変領域と抗原との間の固有の親和性よりはるかに高い（これはアビディティーによるものと考えられている）。ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを用いて固有の親和性を測定できる。
【０１３８】
別の一態様において、本発明は、本発明のヒト化されたイエウサギ抗体またはそのフラグメントを含む二重特異性分子を特徴としている。本発明の抗体、またはその抗原結合部分を、誘導体化するか、または例えば別のペプチドまたはタンパク質（例えば、別の抗体もしくは受容体に対するリガンド）などの別の機能性分子に連結して、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を産生することができる。本発明の抗体を、誘導体化するか、または２つ以上の他の機能性分子に連結して、３つ以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子を産生することができ、このような多重特異性分子は、本明細書で用いられる「二重特異性分子」の用語によって包含されることも意図される。本発明の二重特異性分子を作り出すには、本発明の抗体を、別の抗体、抗体フラグメント、腫瘍特異的もしくは病原体特異的な抗原、ペプチド、または結合性模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ）などの１つまたは複数の他の結合性分子に、二重特異性分子が生じるように、（例えば、化学カップリング、遺伝子融合、非共有性の会合、またはその他によって）機能的に連結してよい。したがって、本発明は、第１の標的に対する特異性を有する少なくとも１つの第１の結合性分子、および１つまたは複数のさらなる標的エピトープに対する特異性を有する第２の結合性分子を含む二重特異性分子を含む。
【０１３９】
一実施形態において、本発明の二重特異性分子は、結合特異性として、少なくとも１つの抗体、またはその抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖを含む）を含む。抗体は、その内容が参照によって明示的に援用されるＬａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されているように、軽鎖もしくは重鎖のダイマー、または任意の最小のそのフラグメント（Ｆｖまたは単鎖の構築物など）であってもよい。
【０１４０】
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、本発明の二重特異性分子に用いることができる他の抗体は、マウスの、キメラの、およびヒト化のモノクローナル抗体である。
【０１４１】
本発明の二重特異性分子を、当該分野では公知の方法を用いて、構成成分の結合特異性を結合体化することによって調製することができる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性を別々に産生し、次いで相互に結合体化してよい。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、様々なカップリング剤またはクロスリンク剤を共有性の結合体化に用いることができる。クロスリンク剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＮＴＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙら、（１９８４年）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１６０巻、１６８６頁；Ｌｉｕ，  ＭＡら（１９８５年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８２巻、８６４８頁を参照されたい）。他の方法としては、Ｐａｕｌｕｓ（１９８５年）Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ．  Ｍｉｔｔ．、７８巻、１１８〜１３２号；Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻、８１〜８３頁、およびＧｌｅｎｎｉｅら（１９８７年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３９巻、２３６７〜２３７５頁に記載されているものが挙げられる。好ましい結合体化剤（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、両方ともＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手できる。
【０１４２】
結合特異性が抗体である場合、２本の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によってこれらは結合体化されてよい。とりわけ好ましい一実施形態において、ヒンジ領域を、奇数個、好ましくは１個のスルフヒドリル残基を含むように修飾した後、結合体化する。
【０１４３】
あるいは、両方の結合特異性を同じベクター中にコードさせ、同じ宿主細胞中で発現、アセンブルさせてもよい。この方法は、二重特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２、またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合にとりわけ有用である。本発明の二重特異性分子は、１つの単鎖抗体および結合決定基を含む単鎖分子、または２つの結合決定基を含む単鎖の二重特異性分子であってよい。二重特異性分子は、少なくとも２つの単鎖分子を含んでいてよい。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，４５５，０３０号、米国特許第４，８８１，１７５号、米国特許第５，１３２，４０５号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４７６，７８６号、米国特許第５，０１３，６５３号、米国特許第５，２５８，４９８号、および米国特許第５，４８２，８５８号に記載されている。
【０１４４】
二重特異性分子によるそれらの特異標的への結合は、例えば酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フローサイトメトリーベースの単一細胞選別（例えば、ＦＡＣＳ分析）、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）、またはウエスタンブロットアッセイで確認できる。これらの各アッセイは、一般的に、目的の複合体に特異的な標識した試薬（例えば、抗体）を用いることによって、特に目的とするタンパク質−抗体複合体の存在を検出するものである。例えば、抗体複合体を、例えば、抗体−ＶＥＧＦ複合体を認識して特異的に結合する、酵素が連結した抗体または抗体フラグメントを用いて検出することができる。あるいは、複合体を、様々な他の任意のイムノアッセイを用いて検出することができる。例えば、抗体は、放射性標識されていてよく、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）において用いられてよい（例えば、参照によって本明細書に援用される、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，  Ｂ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９８６年３月を参照されたい）。放射性同位元素を、γ線計数器、もしくはシンチレーションカウンターの使用などの手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。
【０１４５】
別の一態様において、本発明は、細胞毒、薬物（例えば、免疫抑制薬）、または放射性毒などの治療用部分に結合体化している、ヒト化イエウサギ抗体、またはそのフラグメントを特色としている。このような複合体を、本明細書において「イムノコンジュゲート」と呼ぶ。１つまたは複数の細胞毒を含むイムノコンジュゲートを「免疫毒素」と呼ぶ。細胞毒または細胞毒性剤には、細胞にとって有害な（例えば、死滅させる）あらゆる薬剤が含まれる。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体または同族体が挙げられる。治療剤としては、例えば、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化薬（例えば、メクロレタミン、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）、シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）がやはり挙げられる。
【０１４６】
本発明の抗体に結合体化することができる治療用細胞毒の他の好ましい例としては、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、メイタンシン、およびオーリスタチン、ならびにこれらの誘導体が挙げられる。カリケアマイシン抗体結合体の一例は市販されている（ＭｙｌｏｔａｒｇＴＭ、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）。
【０１４７】
細胞毒を、当該分野で利用可能なリンカー技術を用いて、本発明の抗体に結合体化することができる。細胞毒を抗体に結合体化するのに用いられているリンカーのタイプの例としては、それだけには限定されないが、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド、およびペプチド含有のリンカーが含まれる。リンカーは、例えば、リソソーム区画内の低ｐＨによる切断を受けやすいもの、またはカテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）など、腫瘍組織において優先的に発現されるプロテアーゼなどの、プロテアーゼによる切断を受けやすいものが選択され得る。
【０１４８】
細胞毒、リンカーのタイプ、および治療剤を抗体に結合体化するための方法のさらなる考察に関して、Ｓａｉｔｏ，  Ｇ．ら、（２００３年）Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．、５５巻、１９９〜２１５頁；Ｔｒａｉｌ，  Ｐ．  Ａ．ら、（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ  ｌｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５２巻、３２８〜３３７頁；Ｐａｙｎｅ，  Ｇ．（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、３巻、２０７〜２１２頁；Ａｌｌｅｎ，  Ｔ．  Ｍ．（２００２年）Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２巻、７５０〜７６３頁；Ｐａｓｔａｎ，  Ｉ．  およびＫｒｅｉｔｍａｎ，  Ｒ．  Ｊ．、（２００２年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．  Ｄｒｕｇｓ、３巻、１０８９〜１０９１頁；Ｓｅｎｔｅｒ，  Ｐ．Ｄ．およびＳｐｒｉｎｇｅｒ，  Ｃ．Ｊ．  （２００１年）Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．、５３巻、２４７〜２６４頁も参照されたい。
【０１４９】
本発明の抗体は、また、放射性同位元素に結合体化して、ラジオイムノコンジュゲート（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）とも呼ばれる、細胞毒性の放射性医薬品を産生することもできる。診断に、または治療に用いるための抗体に結合体化することができる放射性同位元素の例としては、それだけには限定されないが、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０、およびルテチウム１７７が挙げられる。ラジオイムノコンジュゲートを調製するための方法は、当該分野において確立されている。ラジオイムノコンジュゲートの例はＺｅｖａｌｉｎＴＭ（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＢｅｘｘａｒＴＭ（Ｃｏｒｉｘａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含めて市販されており、本発明の抗体を用いてラジオイムノコンジュゲートを調製するのに同様の方法を用いることができる。  本発明の抗体結合体を用いて、所与の生物学的応答を調節することができ、薬物部分は古典的な化学療法剤に限定されると解釈してはならない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってよい。このようなタンパク質としては、例えば、酵素的に活性な毒素、またはその活性なフラグメント、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナスの体外毒素、もしくはジフテリア毒素；腫瘍壊死因子もしくはインターフェロン−γなどのタンパク質；または生物学的応答調節物質、例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、もしくは他の成長因子が挙げられ得る。
【０１５０】
このような治療部分を抗体に結合体化するための技術は周知であり、例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編集）、２４３〜５６頁、（Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９８５）における、Ａｒｎｏｎ  ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ら（編集）、６２３〜５３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、１９８７年）における、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編集）、４７５〜５０６頁（１９８５年）における、Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編集）、３０３〜１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５年）における、「Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｒｅｓｕｌｔｓ，  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．、６２巻、１１９〜５８頁（１９８２年）を参照されたい。
【０１５１】
１つの態様では、本発明は、疾患の処置のためのヒト化イエウサギ抗体を含む薬学的処方物を提供する。用語「薬学的処方物」とは、明白に有効である抗体または抗体誘導体の生物活性を可能にするような形態であり、処方物を投与した被験体に毒性のある追加の成分を含まない調製物をいう。「薬学的に許容される」賦形剤（ビヒクル、添加剤）とは、被験体である哺乳動物に合理的に投与し、採用する活性成分の有効用量を実現できるものである。
【０１５２】
「安定的な」処方物とは、処方物中の抗体または抗体誘導体が、保存に際しその物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物活性を本質的に保持するものである。タンパク質の安定性を測定するための様々な分析技法は、当該分野で入手でき、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２４７〜３０１頁、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｐｕｂｓ．（１９９１年）、およびＪｏｎｅｓ，  Ａ．  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０巻：２９〜９０頁（１９９３年）に概説されている。安定性は、選択した期間の間、選択した温度で測定することができる。好ましくは、処方物は、少なくとも１カ月間、室温（約３０℃）または４０℃で安定であり、および／または少なくとも１年間または少なくとも２年間、約２〜８℃で安定である。その上、処方物は、好ましくは、処方物の凍結（例えば−７０℃まで）および解凍の後も安定である。
【０１５３】
色および／または透明さの視覚的検査で、あるいはＵＶ光散乱またはサイズ排除クロマトグラフィーによって測定したときに、凝集、沈殿および／または変性の徴候をまったく示さない場合、抗体または抗体誘導体は、薬学的処方物において「その物理的安定性を保持する」。
【０１５４】
抗体または抗体誘導体は、所与の時間での化学的安定性が、タンパク質が以下に定義されるようなその生物活性をなおも保持すると考えられるほどであれば、薬学的処方物において「その化学的安定性を保持する」。化学的安定性は、化学変化したタンパク質の形態を検出および定量化することによって評価することができる。化学変化は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳ）を用いて評価できる、サイズ変更（例えばクリッピング（ｃｌｉｐｐｉｎｇ））に関わり得る。他のタイプの化学変化には、例えばイオン交換クロマトグラフィーによって評価できる電荷変化（例えば、脱アミドに起因して起こる）が挙げられる。
【０１５５】
抗体または抗体誘導体は、所与の時間での抗体の生物活性が、例えば、薬学的処方物を抗原結合アッセイで決定されるように調製したときに示される生物活性の、約１０％以内（アッセイのエラー内）であれば、薬学的処方物において「その生物活性を保持する」。抗体に関する他の「生物活性」アッセイは、本明細書で以下に詳しく述べる。
【０１５６】
「等張」とは、目的の処方物が、本質的にヒト血液と同じ浸透圧を有することを意味する。等張処方物は、一般的に約２５０から３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。等張性は、例えば、蒸気圧またはアイスフリージング型浸透圧計を用いて測定することができる。
【０１５７】
「ポリオール」は、複数のヒドロキシル基を有する物質であり、糖（還元および非還元糖）、糖アルコールおよび糖酸が挙げられる。本明細書における好ましいポリオールは、約６００ｋＤ未満（例えば、約１２０から約４００ｋＤの範囲）の分子量を有する。「還元糖」とは、金属イオンを還元できるか、またはリジンおよびタンパク質中の他のアミノ基と共有結合的に反応できるヘミアセタール基を含むものであり、「非還元糖」とは、還元糖のこれらの特性をもたないものである。還元糖の例は、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトースおよびグルコースである。非還元糖には、スクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトースおよびラフィノースが挙げられる。マンニトール、キシリトール、エリスリトール、トレイトール、ソルビトールおよびグリセロールは、糖アルコールの例である。糖酸について、これには、Ｌ−グルコネートおよびその金属塩が挙げられる。処方物が凍結−解凍に対して安定であることが望まれる場合、ポリオールは、好ましくは処方物中の抗体が不安定になるような凍結温度（例えば−２０℃）での結晶化をしないものである。スクロースおよびトレハロースなどの非還元糖は、本明細書において好ましいポリオールであり、トレハロースの優れた溶液安定性の理由から、スクロースよりトレハロースが好ましい。
【０１５８】
本明細書で使用するとき、「緩衝液」とは、酸−塩基の結合体化成分の作用によるｐＨの変化に耐える緩衝溶液をいう。本発明の緩衝液は、約４．５から約６．０、好ましくは約４．８から約５．５の範囲のｐＨを有し、最も好ましくは約５．０のｐＨを有する。この範囲でｐＨを制御する緩衝液の例には、酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩および他の有機酸の緩衝液が挙げられる。凍結−解凍に対して安定的な処方物が望まれる場合、緩衝液は、好ましくはホスフェートではない。
【０１５９】
薬理学的な意味において、本発明に関連して、抗体または抗体誘導体の「治療有効量」とは、抗体または抗体誘導体が有効である処置に関して、障害の予防または処置に有効な量をいう。「疾患／障害」とは、抗体または抗体誘導体を用いた処置により利益を得る任意の状態である。これには、哺乳動物を問題の障害にかからせる病理学的状態を含む、慢性および急性の障害または疾患が含まれる。
【０１６０】
「保存剤」とは、処方物中に含まれ得、本質的にそこで細菌の作用を低減できる化合物であり、したがって、例えばマルチユーズ（ｍｕｌｔｉ−ｕｓｅ）の処方物の製造を容易にすることができる。可能性のある保存剤の例には、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド（アルキル基が長鎖の化合物であるアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドの混合物）、およびベンゼトニウムクロリドが挙げられる。保存剤の他のタイプには、フェノール、ブチルおよびベンジルアルコールなどの芳香族アルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノールならびにｍ−クレゾールが挙げられる。本明細書における最も好ましい保存剤は、ベンジルアルコールである。
【０１６１】
本発明はまた、生理学的に許容される少なくとも１つの担体または賦形剤と一緒に、１つまたは複数の抗体または抗体誘導体化合物を含む薬学的組成物も提供する。薬学的組成物は、例えば、１つまたは複数の水、緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水またはホスフェート緩衝生理食塩水）、エタノール、鉱油、植物油、ジメチルスルホキシド、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、アジュバント、ポリペプチド、またはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡもしくはグルタチオンなどのキレート剤、および／または保存剤を含むことができる。上述のように、他の活性成分を、（必ずしも必要ではないが）本明細書で提供される薬学的組成物中に含めることができる。
【０１６２】
担体は、しばしば化合物の安定性または生物学的利用能を制御する目的のため、患者に投与する前に、抗体または抗体誘導体に関連し得る物質である。かかる処方物内部で使用するための担体は、一般的に生体適合性を有し、生分解性も有し得る。担体には、例えば、血清アルブミン（例えばヒトまたはウシ）、卵アルブミン、ペプチド、ポリリジンなどの一価または多価分子、およびアミノデキストランなどの多糖類およびポリアミドアミンが挙げられる。担体はまた、例えば、ポリラクテート、ポリグリコレート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロースまたはデキストランを含む、ビーズおよびミクロ粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）などの固体担体物質も含む。担体は、共有結合（直接的またはリンカー基を介してのいずれか）、非共有結合の相互作用または混合（ａｄｍｉｘｔｕｒｅ）を含む、様々な方法において化合物を有し得る。
【０１６３】
薬学的組成物は、例えば、局所（ｔｏｐｉｏｃａｌ）、経口、経鼻、直腸または非経口投与を含む、任意の適切な投与方式に関して処方することができる。ある種の実施形態では、経口使用に適切な形態の組成物が好ましい。このような形態には、例えば、丸剤、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性もしくは油性懸濁物、分散性粉末もしくは顆粒、エマルジョン、硬もしくは軟カプセル、またはシロップもしくはエリキシル剤が挙げられる。さらなる他の実施形態内では、本明細書で提供される組成物は、凍結乾燥物として処方することができる。本明細書で使用されるような非経口という用語は、皮下、皮内、血管内（例えば静脈内）、筋肉内、脊髄、頭骸内、くも膜下腔内および腹腔内注射、ならびに任意の類似の注射または注入技法を含む。
【０１６４】
経口使用を意図する組成物は、薬学的組成物の製造のための当該分野では公知の任意の方法にしたがって調製することができ、魅力的かつ風味のよい調製物を提供するために、甘味剤、矯味矯臭薬、着色剤、および保存剤などの１つまたは複数の薬剤を含むことができる。錠剤は、錠剤の製造に適する生理学的に許容される賦形剤と混合した有効成分を含む。このような賦形剤としては、例えば、不活性な希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム）、造粒剤および崩壊剤（例えば、コーンスターチ、またはアルギン酸）、結合剤（例えば、デンプン、ゼラチン、またはアカシア）、ならびに潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク）が挙げられる。錠剤はコーティングされていなくてもよく、または消化管における崩壊および吸収を遅らせ、それによって長期間にわたって作用の持続を提供するために公知の技術によってコーティングされていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を使用してもよい。
【０１６５】
経口の使用のための処方物は、有効成分が不活性な固体希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、もしくはカオリン）と混合されている硬ゼラチンカプセル剤として、あるいは有効成分が水または油の媒体（例えば、ピーナツ油、流動パラフィン、もしくはオリーブ油）と混合されている軟ゼラチンカプセル剤として与えられてもよい。水性懸濁物は、水性懸濁物の製造に適する賦形剤と混合された抗体または抗体誘導体を含んでいる。このような賦形剤には、懸濁化剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース（ｈｙｄｒｏｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、およびアカシアゴム）、ならびに分散剤または加湿薬（例えば、レシチンなどの天然に存在するホスファチド、ポリオキシエチレンステアレートなどのアルキレンオキシドの脂肪酸との縮合生成物、ヘプタデカエチレンオキシセタノールなどのエチレンオキシドの長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどの脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、もしくはポリエチレンソルビタンモノオレエートなどの脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物）が挙げられる。水性懸濁物は、１つまたは複数の保存剤（例えば、エチルもしくはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸）、１つまたは複数の着色剤、１つまたは複数の矯味矯臭薬、および１つまたは複数の甘味剤（例えば、ショ糖もしくはサッカリン）を含むこともできる。シロップ剤およびエリキシル剤は、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、またはショ糖などの甘味剤と一緒に処方されてもよい。このような処方物は、１つもしくは複数の粘滑剤、保存剤、矯味矯臭薬、および／または着色剤も含むことができる。
【０１６６】
油性懸濁物は、植物油（例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、胡麻油またはココナツ油）または流動パラフィンなどの鉱油中に活性成分を懸濁することによって処方され得る。油性懸濁物は、蜜蝋、固形パラフィン、またはセチルアルコールなどの増粘剤を含有し得る。風味のよい経口調製物を提供するために、上述のものなどの甘味剤および／または矯味矯臭薬を添加できる。そのような懸濁物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加によって保存され得る。
【０１６７】
水の添加による水性懸濁物の調製に適する分散性の粉末および顆粒は、分散剤または加湿薬、懸濁化剤、および１つまたは複数の保存剤と混合した有効成分を提供する。適切な分散剤または加湿薬、および懸濁化剤は、すでに上記で言及したものによって例示される。さらなる賦形剤、例えば、甘味剤、矯味矯臭薬、および着色剤も存在してよい。
【０１６８】
薬学的組成物は水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は植物油（例えば、オリーブ油もしくはラッカセイ油）、鉱油（例えば、流動パラフィン）、またはこれらの組合せであってよい。適切な乳化剤としては、天然に存在するゴム（例えば、アカシアゴムまたはトラガカントゴム）、天然に存在するホスファチド（例えば、大豆、レシチン、ならびに脂肪酸およびヘキシトールに由来するエステルまたは部分エステル）、無水物（例えば、ソルビタンモノオレエート）、ならびに脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルのエチレンオキシドとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が挙げられる。乳剤はまた、１つまたは複数の甘味剤および／または矯味矯臭薬を含むことができる。
【０１６９】
薬学的組成物は、使用するビヒクルおよび濃度に依存して、モジュレータがビヒクル中に懸濁または溶解されている、無菌注射が可能な水性または油性懸濁物として調製することができる。かかる組成物は、上述のものなどの、適切な分散剤、加湿薬および／または懸濁化剤を使用する公知の技術に従って処方することができる。採用できる許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、１，３−ブタンジオール、リンゲル液および等張食塩水がある。さらに、無菌の固定油は、溶媒または懸濁媒体として採用することができる。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む、刺激の少ない任意の固定油を採用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を、注射可能な組成物の調製に使用でき、局所麻酔剤などのアジュバント、保存剤および／または緩衝剤を、ビヒクル中に溶解することができる。
【０１７０】
薬学的組成物は、持続放出処方物（すなわち、投与後にモジュレータの徐放をもたらすカプセルなどの処方物）として処方することができる。かかる処方物は、一般的に周知の技術を用いて調製でき、例えば、経口、直腸もしくは皮下移植によって、または所望の標的部位に移植することによって投与することができる。かかる処方物内で使用するための担体は、生体適合性を有し、生分解性も有し得て、好ましくは、処方物は比較的一定レベルのモジュレータ放出を可能にする。持続放出処方物内に含まれる抗体または抗体誘導体の量は、例えば、移植の部位、放出の速度および期待される持続期間、ならびに処置または予防する疾患／障害の特性によって決まる。
【０１７１】
本明細書で提供される抗体または抗体誘導体は、一般的に、検出可能な程度に例えばＶＥＧＦなどの標的に結合し、例えばＶＥＧＦ媒介性疾患／障害などの標的媒介性疾患／障害を予防または阻害するのに十分な、体液（例えば、血液、血漿、血清、ＣＳＦ、滑液、リンパ、細胞間質液、涙または尿）中の濃度に達する量で投与する。用量は、本明細書に記載のような認識できる患者の利益をもたらすとき、有効であると考えられる。好ましい全身の用量は、１日につき、体重１キログラムにつき約０．１ｍｇから約１４０ｍｇ（１日につき患者１人につき約０．５ｍｇから約７ｇ）の範囲であり、経口での用量は、一般的に静脈内での用量より約５〜２０倍多い。担体物質と組み合わせて単一投薬形態を産出できる抗体または抗体誘導体の量は、処置される受給者（ｈｏｓｔ）および特定の投与様式によって変化する。投薬単位形態には、一般的に約１ｍｇから約５００ｍｇの間の活性成分が含まれる。
【０１７２】
薬学的組成物は、例えばＶＥＧＦに向けられる抗体または抗体誘導体に応答する状態を処置するためにパッケージすることができる。パッケージされた薬学的組成物は、本明細書に記載のような少なくとも１つの抗体または抗体誘導体の有効量を保持する容器、および患者への投与後に１つの抗体または抗体誘導体に応答する疾患／障害を処置するために含有組成物を使用することを示す説明書（例えばラベル）を含むことができる。
【０１７３】
本発明の抗体または抗体誘導体は、化学的に修飾することもできる。好ましい修飾基は、例えば、場合によって置換した直鎖もしくは分岐鎖ポリアルケン、ポリアルケニレンもしくはポリオキシアルキレンポリマー、または分岐したかもしくは分岐していない多糖類などのポリマーである。かかるエフェクター基は、インビボでの抗体の半減期を長くすることができる。合成ポリマーの特定の例には、場合によって置換した直鎖または分岐鎖ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）またはその誘導体が挙げられる。天然に存在する特定のポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコゲンまたはその誘導体が挙げられる。ポリマーのサイズは、所望のように変化できるが、一般的に平均分子量は５００Ｄａから５００００Ｄａの範囲である。局所（ｌｏｃａｌ）適用のために、抗体を組織に浸透するようにデザインする場合、ポリマーの好ましい分子量は、約５０００Ｄａである。ポリマー分子は、抗体、特に、ＷＯ０１９４５８５に記載のように、共有結合的に連結するヒンジペプチドを介して、Ｆａｂフラグメントの重鎖のＣ末端部に付着することができる。ＰＥＧ部分の付着に関しては、「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９９２年、Ｊ．  Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、および「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１９９８年、Ｍ．  Ａｓｌａｍ  ａｎｄ  Ａ．  Ｄｅｎｔ、Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【０１７４】
上記のように目的の抗体または抗体誘導体を調製した後、それを含む薬学的処方物を調製する。処方される抗体は、事前の凍結乾燥に供さず、本明細書で目的の処方物は、水性処方物である。好ましくは、処方物中の抗体または抗体誘導体は、ｓｃＦｖなどの抗体フラグメントである。処方物中に存在する抗体の治療有効量は、例えば、所望の用量体積および投与様式（複数可）を考慮に入れて決定する。約０．１ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５ｍｇ／ｍｌから約２５ｍｇ／ｍｌ、および最も好ましくは約２ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌが、処方物中の典型的な抗体濃度である。
【０１７５】
水性処方物は、ｐＨ緩衝溶液中の抗体または抗体誘導体を含めて調製する。本発明の緩衝液は、約４．５から約６．０、好ましくは約４．８から約５．５の範囲のｐＨを有し、最も好ましくは約５．０のｐＨを有する。この範囲内でｐＨを制御する緩衝液の例には、酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩および他の有機酸の緩衝液が挙げられる。緩衝液の濃度は、約１ｍＭから約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭから約３０ｍＭであってよく、例えば緩衝液および処方物の所望の等張性によって決めることができる。好ましい緩衝剤は、酢酸ナトリウム（約１０ｍＭ）、ｐＨ５．０である。
【０１７６】
トニシファイアー（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）として働き、抗体を安定化できるポリオールは、処方物中に含まれる。好ましい実施形態では、抗体または抗体誘導体の沈殿を引き起こし得、および／または低ｐＨで酸化を引き起こし得るため、処方物は塩化ナトリウムなどの塩をトニシファイ量（ｔｏｎｉｃｉｆｙｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔ）で含まない。好ましい実施形態では、ポリオールは、スクロースまたはトレハロースなどの非還元糖である。ポリオールは、処方物の所望の等張性に対して変化できる量で処方物中に添加する。好ましくは、水性処方物は等張であり、この場合、処方物中の適切なポリオール濃度は、例えば、約１％から約１５％ｗ／ｖの範囲、好ましくは約２％から約１０％ｗｈｖの範囲である。しかし、高張性または低張性処方物も適切であり得る。添加するポリオールの量も、ポリオールの分子量に対して変えることができる。例えば、二糖（トレハロースなど）と比較して、より少量の単糖（例えばマンニトール）を添加することができる。
【０１７７】
界面活性剤も、抗体または抗体誘導体処方物に添加する。典型的な界面活性剤には、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０など）またはポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。添加する界面活性剤の量は、処方した抗体／抗体誘導体の凝集を減少させ、および／または処方物中の粒子の形成を最小化し、および／または吸着を低下させるほどの量である。例えば、界面活性剤は、約０．００１％から約０．５％、好ましくは約０．００５％から約０．２％、および最も好ましくは約０．０１％から約０．１％の量で処方物中に存在し得る。
【０１７８】
一実施形態では、処方物は、上記で同定した薬剤（すなわち、抗体または抗体誘導体、緩衝液、ポリオールおよび界面活性剤）を含み、本質的に、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノールおよび塩化ベンゼトニウムなどの１つまたは複数の保存剤を含まない。別の実施形態では、特に処方物が複数用量の処方物である場合、保存剤を処方物中に含むことができる。保存剤の濃度は、約０．１％から約２％、最も好ましくは約０．５％から約１％の範囲であってよい。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｏｌ，  Ａ．編（２００６年）に記載のものなどの、１つまたは複数の他の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を、それらが処方物の所望の特徴に悪影響を及ぼさないという条件で、処方物中に含めることができる。許容される担体、賦形剤または安定剤は、採用する投与量および濃度でレシピエントに毒性がなく、追加の緩衝剤、共溶媒、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤、金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）、ポリエステルなどの生分解性ポリマー、ならびに／またはナトリウムなどの塩形成対イオンを含む。
【０１７９】
インビボの投与に使用する処方物は、無菌でなければならない。これは、処方物を調製する前または後に、無菌ろ過膜を通すろ過によって容易に成し遂げられる。
【０１８０】
処方物は、抗体を用いる処置が必要な哺乳動物、好ましくはヒトに、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）、皮下、関節内、滑膜内、鞘内、経口、局所（ｔｏｐｉｏｃａｌ）または吸入経路による、ボーラスとしてかまたはある期間にわたる持続的注入による静脈内投与などの公知の方法に従って投与する。好ましい実施形態では、処方物は、静脈内投与によって、哺乳動物に投与する。かかる目的のために、処方物は、例えば注射器を用いて、またはＩＶラインを介して注射することができる。
【０１８１】
抗体の適切な投与量（「治療有効量」）は、例えば、処置する病状、病状の重症度および経過、抗体を予防または治療のどちらの目的で投与するか、以前の治療、患者の病歴および抗体への応答、使用する抗体のタイプ、ならびに主治医の自由裁量によって決まる。抗体または抗体誘導体は、１回または１連の処置にわたって患者に適切に投与し、診断以降の任意の時間に患者に投与することができる。抗体または抗体誘導体は、単独の処置としてか、または問題とする病状の処置に有用な他の薬物もしくは治療と併せて投与することができる。
【０１８２】
一般的な提案として、投与する抗体または抗体誘導体の治療有効量は、１回投与であろうとまたは複数回投与であろうと、患者の体重に対して約０．１から約５０ｍｇ／ｋｇの範囲となり、使用する抗体の典型的な範囲は、例えば、毎日の投与で約０．３から約２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．３から約１５ｍｇ／ｋｇとなる。しかし、他の投薬レジメンも有用であり得る。この治療の進行は、従来の技法によって容易にモニターされる。
【０１８３】
本発明の別の実施形態では、本発明の薬学的処方物を、好ましくは水性処方物を保持する容器を含む、製造品が提供され、その使用に関する説明書が場合によって提供される。適切な容器には、例えば、ボトル、小瓶および注射器が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。典型的な容器は、３〜２０ｃｃの単回使用のガラスの小瓶である。あるいは、複数用量処方物用に、容器は３〜１００ｃｃのガラス小瓶であってよい。容器は処方物を保持し、容器上のラベルにより、または容器に付随したラベルにより、使用に関する指示を示すことができる。製造品は、商業および使用者の視点から望まれる他の物質をさらに含むことができ、これには、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、注射器、および使用に関する説明の付いた添付文書が挙げられる。
【０１８４】
特定の好ましい実施形態では、製造品は、本明細書に記載されている凍結乾燥したイムノバインダー、または本明細書に記載の方法によって生成された凍結乾燥したイムノバインダーを含む。
【実施例】
【０１８５】
（例示）
本開示を、さらに限定するものと解釈すべきではない以下の実施例によってさらに説明する。全ての図ならびにこの出願全体にわたって引用される全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、それらの全体が参照により本明細書に明示的に援用される。
【０１８６】
（材料および方法）
一般的に、本発明の実施では、特に示さない限り、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば抗体技術）の従来技法、およびポリペプチド調製の標準技法を採用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５１０巻、Ｐａｕｌ，  Ｓ．、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒ（１９９６年）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ、１６９巻）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ編、Ｉｒｌ  Ｐｒ（１９９６年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗら、Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｕｂ．（１９９９年）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９２年）を参照されたい。イエウサギおよび他の非ヒトモノクローナル抗体からの、選択されたヒト抗体フレームワークへのＣＤＲの融合の方法は、上に詳細に記載されている。そのような融合実験の実施例を以下に示す。
【０１８７】
より良い理解を目的として、「ｍｉｎ」と命名された融合片は、ＣＤＲがフレームワーク１．４またはその可変ドメインに融合されているものであり、一方、「ｍａｘ」と名付けられた融合片は、ＣＤＲがフレームワーク１．４またはその可変ドメインに融合されており、かつフレームワークが抗原と相互作用するドナーフレームワーク残基をさらに含むものである。
【０１８８】
（実施例１：ｒＦＷ１．４の設計）
（１．１．一次配列分析およびデータベース探索）
（１．１．１．イエウサギ免疫グロブリン配列の収集）
イエウサギの成熟抗体の可変ドメインおよび生殖系列の配列を様々なオープンソースデータベース（例えば、ＫａｂａｔデータベースおよびＩＭＧＴ）から収集し、１文字コードアミノ酸配列として、カスタマイズされたデータベースに入力した。全分析について、本発明者らはＶ（可変）領域に対応するアミノ酸部分のみを用いた。７０％未満の完全性、またはフレームワーク領域内に複数の未決定残基を含有する、ＫＤＢデータベース中の配列は捨てた。データベース中の任意の他の配列に９５％超の同一性を有する配列も、分析におけるランダムノイズを避けるために除いた。
【０１８９】
（１．１．２．イエウサギ配列のアラインメントおよびナンバリング）
イエウサギ抗体配列は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−ＷｕｎｓｃｈアルゴリズムおよびＢｌｏｓｓｕｍマトリックスに基づく従来の配列アライメントツールを用いてアライメントさせた。ギャップの導入および残基位置の命名法は、免疫グロブリン可変ドメインのＡＨｏナンバリングシステムに従って行った（ＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、２００１年）。Ｋａｂａｔナンバリングスキームは、抗体中の残基をナンバリングするのに最も広く採用されている標準法であるので、これも併用した。Ｋａｂａｔナンバリングは、ＳＵＢＩＭプログラムを用いて割り当てた。このプログラムは、抗体配列の可変領域を分析して、Ｋａｂａｔらによって確立されたシステムに従って配列をナンバリングする（Ｄｅｒｅｔら、１９９５年）。
【０１９０】
フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の定義は、Ｋａｂａｔの定義に従って行われるが、これは配列可変性をベースにしたものであり、最も一般的に使用されている。それにも関わらず、ＣＤＲ−Ｈ１の指定は、ＡｂＭの定義、ｋａｂａｔの定義、３Ｄ複合体構造のサブセットの抗体と抗原との間の接触の分析によって生成された平均接触データ（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６年）および構造的ループ領域の位置に基づくＣｈｏｔｉａの定義を含めた様々な定義間の妥協であった（上述および図１に示す）。
【０１９１】
（１．１．３．残基位置の頻度および保存）
ｋａｂａｔデータベースから得た４２３のイエウサギ配列のセットを用いてアミノ酸配列の多様性を分析した。成熟イエウサギ配列中の各位置ｉの残基頻度ｆ（ｒ）は、特定の残基がデータセット中で観察される回数を配列の総数で割ることによって計算した。各位置ｉの保存の程度は、存在する異なったアミノ酸の数と、各残基の相対存在量とを考慮に入れて、Ｓｉｍｐｓｏｎの指標を用いて計算した。
【０１９２】
【数１】
2020114260.tif 000005
式中、Ｎはアミノ酸の総数、ｒは各位置に存在する異なったアミノ酸の数、ｎは特定のアミノ酸タイプの残基の数である。
【０１９３】
（１．１．４．イエウサギのＶ領域の系列分析）
系統学的分析ツールを用いて、イエウサギレパートリーを調査した。クラスターおよび位相的アルゴリズムの両方を用いて、Ｖ領域のアミノ酸配列をクラスタリングした。アレイ全体について距離行列を計算し、生殖系列使用の指標として用いた。各クラスターのコンセンサス配列を計算し、最も近いイエウサギ生殖系列配列対応物を同定した。総合的コンセンサス配列も、セット全体の配列から得た。
【０１９４】
（１．１．５．ヒトサブグループの割り当て）
様々なクラスターのそれぞれのイエウサギ代表配列について、配列分析アルゴリズムのＥＸＣＥＬインプリメンテーションおよびヒト抗体レパートリーの分析に基づいた分類法（Ｋｎａｐｐｉｋら、２０００年）を用いて、最も相同的なヒトサブグループを同定した。
【０１９５】
（１．２．ヒトアクセプターフレームワークの設計）
上述の配列分析からのイエウサギレパートリーの青写真を用いて、イエウサギＣＤＲの位置決定に一般的に関与する、フレームワーク中の残基を同定した。イエウサギレパートリーに対して高い相同性を有するフレームワークおよびそれぞれのクラスターのなかから、良好な生物物理特性を有するものを１つ完全ヒト配列のプールから選択した。アクセプターフレームワークとして用いるために選択されたフレームワークは、ＥＳＢＡＴｅｃｈのＩＤ  ＫＩ２７、ａ４３に対応する、可変軽鎖サブグループカッパ１および可変重鎖サブグループＩＩＩに属する。この安定的かつ可溶性の抗体フレームワークは、「品質管理」システムと名付けられた酵母ベースのスクリーニング法（Ａｕｆ  ｄｅｒ  Ｍａｕｒら、２００４年）を用いて、ヒト脾臓ｓｃＦｖライブラリーのスクリーニングによって同定され、「ＦＷ１．４」と名付けられた。安定的かつ可溶性のフレームワーク配列ＦＷ１．４は高い相同性を示すが、それは利用可能な最も高い相同性の配列ではなかった。同定された残基を前記アクセプターフレームワーク中に組み込み、ｒＦＷ１．４を生成した。
【０１９６】
イエウサギ抗体のアミノ酸配列多様性、生殖系列使用および構造的特徴についての情報を用いて、本発明者らは、新規のヒトフレームワークにおいてＣＤＲコンフォメーションを保存するのに必要な残基位置の適合性についてＦＷ１．４を分析した。本発明者らは、以下の特徴の適合性についてＦＷ１．４の可変領域を検査した：
ｉ．ループ構造の基準配列の一部である残基
ｉｉ．ＶＬ／ＶＨ境界面に位置するフレームワーク残基
ｉｉｉ．ＣＤＲのすぐ下の残基のプラットフォーム
ｉｖ．上側および下側コア残基ｖ．サブタイプを定義するフレームワーク残基。
【０１９７】
（１．３．イエウサギＣＤＲの融合）
融合片は、１抗体からのＣＤＲ配列（上記の定義による）をＦＷ１．４またはｒＦＷ１．４のフレームワーク配列と単純に結合させることによって生成させた。潜在的に結合に関与する残基を同定した。イエウサギ可変ドメイン配列それぞれについて、最も近いイエウサギの生殖系列対応物を同定した。最も近い生殖系列が確立できなかった場合、配列は、サブグループのコンセンサスまたは高いパーセント値の類似性を有するイエウサギ配列のコンセンサスに対して比較した。希少なフレームワーク残基は、体細胞超変異の結果であり得、それゆえ、結合における役割を果たしていると考えた。したがって、そのような残基をアクセプターフレームワークに融合させた。
【０１９８】
（１．４．結果）
イエウサギ抗体レパートリーを構造、アミノ酸配列多様性および生殖系列使用に関して分析することによって、イエウサギＣＤＲのループコンフォメーションを維持するために改変された、ＦＷ１．４の軽鎖中の５箇所の残基位置を見出した。これらの位置はイエウサギ抗体で高度に保存されている。これら５箇所の位置のコンセンサス残基をイエウサギレパートリーから推論し、ヒトアクセプターフレームワーク１．４中に導入した。これらの保存位置の改変によって、前記フレームワークは、事実上、任意のイエウサギＣＤＲの６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）すべてと適合性となった。様々なイエウサギＣＤＲを含有するマスターｒＦＷ１．４は、野生型の単一鎖とは反対に良好に発現され、よく産生された。このフレームワークとイエウサギＣＤＲとの組合せから得られた１６のメンバーが作製され、詳細な特徴付けによって機能性が示された。
【０１９９】
（実施例２：Ｂ細胞スクリーニング系）
目的とする標的にそれらのＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を介して結合するＢ細胞を選択するためのＦＡＣＳ（フローサイトメトリーベースの単一細胞選別）ベースのスクリーニング系がＥＳＢＡＴｅｃｈで確立されている。１つの標的は、例えば、可溶性タンパク質、すなわち、蛍光色素（ＰＥおよびＰｅｒＣＰ）で標識された単一鎖抗体（ＥＳＢＡ９０３）であった。リンパ球懸濁物は、組換え体標的で免疫化されたイエウサギの脾臓から調製した。次いで、細胞を、ＰＥおよびＰｅｒＣＰ標識されたＥＳＢＡ９０３ならびにＩｇＧに特異的な抗体（ＡＰＣ標識）またはＩｇＭに特異的な抗体（ＦＩＴＣ標識）と共にインキュベートした。それらの表面にＩｇＧを発現するが、ＩｇＭを発現しないＥＳＢＡ９０３陽性Ｂ細胞を９６穴プレート中に選別した（図３；表２）。胸線腫ヘルパー細胞系（ＥＬ４−Ｂ５：Ｚｕｂｌｅｒら、１９８５年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３４（６）巻、３６６２〜３６６８頁を参照）によって、増殖し、形質細胞に分化し、抗体を分泌したＢ細胞を選択した。標的に対するこれらのＩｇＧの親和性は、ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅ測定によって評価した。７株の選択されたクローンの動態パラメータを表１に示す。約２００の選別細胞のプールから得られた、これらのクローンは、低ナノモルからピコモル範囲にある結合親和性を示す。最後に、目的の６クローンからｍＲＮＡを単離し、単鎖フレームワークＦＷ１．４にＣＤＲを融合させた。
【０２００】
【表１】
2020114260.tif 000006
【０２０１】
【表２】
2020114260.tif 000007
（実施例３：抗ＴＮＦα抗体でコーティングされたビーズと、膜結合ＴＮＦαを発現するＣＨＯ細胞との間の相互作用の検出）
フローサイトメトリーストリーム中の高圧によって２つの細胞間の非共有結合が壊れるか否かを評価するために、以下の実験を行った。膜結合ＴＮＦαで安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（Ｂ−２２０細胞）を、ＰＥ標識された抗ＴＮＦα抗体でコーティングされたビーズと共にインキュベートした。このセットアップにおいて、ビーズは記憶Ｂ細胞を模倣する（それらはほぼ同じサイズを有する）。陰性対照として、非トランスフェクトＣＨＯ細胞およびＡＰＣ標識された無関係の抗体（抗ＣＤ１９）でコーティングされたビーズを用いた。撹拌を伴った４℃で２時間のインキュベーションの後に、細胞ビーズ懸濁物をＦＡＣＳ（１３０μｍのノズルを用いた）によって分析した。図４は、抗ＴＮＦαビーズとＴＮＦαトランスフェクトＣＨＯ細胞との間の特異的な結合がＦＡＣＳで明確に検出可能であることを示す。実際、この試料（上側パネル）では、ビーズの約２／３が細胞に結合している（５８５が結合し、対して２６７が非結合であった）。対照的に、対照試料（中央および下側パネル）では、ほとんどのビーズがＣＨＯ細胞に結合しない。さらに、両方のビーズ集団（抗ＴＮＦα−ＰＥおよび抗ＣＤ１９−ＡＰＣ）をＴＮＦαトランスフェクトＣＨＯ細胞と混合した。図５および表４は、抗ＴＮＦαビーズの約半分がＣＨＯ細胞に結合し、一方、抗ＣＤ１９ビーズの大部分が非結合のままであることを示す。各試料中における細胞結合のビーズのパーセントを表５に詳細に示す。したがって、それらのＢ細胞受容体を介して膜内在標的タンパク質に結合する単一Ｂ細胞の特異的選択がフローサイトメトリーを用いて可能であることを実証する。
【０２０２】
【表３−１】
2020114260.tif 000008
【０２０３】
【表４−１】
2020114260.tif 000009
【０２０４】
【表５】
2020114260.tif 000010
（実施例４：抗ＴＮＦαイエウサギドナー抗体のＣＤＲ融合および機能的なヒト化）
４種の抗ＴＮＦαイエウサギ抗体「Ｒａｂｍａｂ」（ＥＰＩ−１、ＥＰＩ−１５、ＥＰ−３４、ＥＰ−３５およびＥＰ−４２）をＣＤＲ融合用に選択した。ヒト化イエウサギドナー抗体のＣＤＲ融合、ヒト化、および予備的特徴付けの一般的実験スキームは、詳細な説明で概説した通りに行った。非ヒトドナー抗体と最大の配列相同性を共有するヒト抗体アクセプターフレームワークを利用する伝統的なヒト化法とは異なり、品質管理アッセイ（ＷＯ０１４８０１７）を用いて、所望の機能特性（溶解性および安定性）について事前選択されたヒトフレームワーク（ＦＷ１．４）にイエウサギＣＤＲを融合させた。これらの安定的かつ可溶性のフレームワーク配列はＲａｂＭａｂに高い相同性を示した。
【０２０５】
本明細書に記載の方法論を用いて、ＲａｂＭａｂのそれぞれについてＣＤＲ融合片を作製した。「Ｍｉｎ」融合片では、イエウサギＣＤＲのみをイエウサギドナー抗体のＶＬおよびＶＨドメインからヒトアクセプターフレームワークＦＷ１．４に移植した。「Ｍａｘ」融合片は、ｒＦＷ１．４へのイエウサギＣＤＲの融合を指す。
【０２０６】
本明細書に記載および特徴付けられているｓｃＦｖを、以下の通り産生した。配列番号８のリンカーを介してヒト化ＶＬ配列をヒト化ＶＨ配列に接続して、ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨという配向のｓｃＦｖをもたらした。多くの場合、様々なｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列を、サービス供給者Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ  ＧｍｂＨ（ｗｗｗ．ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ．ｃｏｍ）で新規に合成した。結果のＤＮＡ挿入フラグメントを、ｓｃＦｖのＤＮＡ配列の５’および３’末端にそれぞれ導入したＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識部位を介して、細菌発現ベクターｐＧＭＰ００２に、クローニングした。ＶＬドメインのＤＮＡ配列とＶＨドメインのＤＮＡ配列との間に、ＢａｍＨＩ制限酵素認識部位が位置する。いくつかの場合、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを新規に合成せず、ｓｃＦｖ発現構築物をドメインシャッフルによってクローニングした。したがって、ＶＬドメインを切り出し、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を介して新しい構築物に導入し、ＶＨドメインを切り出し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位を介して導入した。他の場合、点変異を、先端技術のアセンブリＰＣＲ（ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ＰＣＲ）方法を用いて、ＶＨおよび／またはＶＬドメインに導入した。ＧＭＰ００２のクローニングは、ＷＯ２００８００６２３５の実施例１に記載されている。ｓｃＦｖの産生は、ＷＯ２００８００６２３５の実施例１に記載の、ＥＳＢＡ１０５に関して同様に行った。
【０２０７】
表３は、４種のイエウサギモノクローナル（ＥＰ６、ＥＰ１９、ＥＰ３４、ＥＰ３５およびＥＰ４３）およびそれらのＣＤＲ融合改変体の詳細な特徴付けデータの概要を示す。これらのＣＤＲ融合片はＢＩＡＣｏｒｅ結合アッセイおよびＬ９２９、ＴＮＦα媒介の細胞毒性アッセイで広範な活性を示したが、４種の最大（「ｍａｘ」）融合片のうち３種は治療上重要な活性を示した。ＥＰ４３ｍａｘは、最も好ましい結合親和性（０．２５ｎＭのＫｄ）と細胞毒性アッセイにおける優れたＥＣ５０とを示した。このデータは、ＦＷ１．４（配列番号１および２）が、イエウサギＣＤＲ融合のための例示的な可溶性かつ安定的なヒトアクセプターフレームワーク領域であることを示す。
【０２０８】
（効能アッセイ）
抗ＴＮＦαバインダーの中和活性をＬ９２９  ＴＮＦα媒介細胞毒性アッセイで評価した。アクチノマイシンで処理されたマウスＬ９２９線維芽細胞の毒性を組換型ヒトＴＮＦ（ｈＴＮＦ）で誘導した。最大ｈＴＮＦ誘導細胞毒性の９０％を、１０００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ濃度であると決定した。ウシ胎仔血清（１０％ｖ／ｖ）を補ったＬ−グルタミン培地で、フェノールレッドを含むＲＰＭＩ  １６４０ですべてのＬ９２９細胞を培養した。抗ＴＮＦαバインダーの中和活性は、フェノールレッドなし、５％ウシ胎仔血清のＲＰＭＩ  １６４０中で評価した。アンタゴニスト作用が最大半量阻害（ＥＣ５０％）に達する濃度を決定するために、様々な濃度（０〜３７４ｎｇ／ｍＬ）の抗ＴＮＦバインダーを１０００ｐｇ／ｍｌ  ｈＴＮＦの存在下でＬ９２９細胞に添加する。可変勾配を有する非線形Ｓ字型回帰に用量反応曲線をフィットさせ、ＥＣ５０を計算した。
【０２０９】
（抗ＴＮＦ  ｓｃＦｖのＢｉａｃｏｒｅ結合分析）
結合親和性測定のために、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−Ｔ１００を用いた表面プラズモン共鳴測定を、ＮＴＡセンサーチップおよびＨｉｓタグ付きのＴＮＦ（ＥＳＢＡＴｅｃｈにて生成）を用いて利用した。ＮＴＡセンサーチップの表面は、Ｎｉ２＋ＮＴＡキレート化を介してヒスチジンタグ付き分子を捕捉するために、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）で前固定（ｐｒｅ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ）されたカルボキシメチル化デキストランマトリックスからなる。ヒトＴＮＦα  Ｎ−ｈｉｓ三量体（５ｎＭ）を、それらのＮ末端ｈｉｓタグを介して、ニッケルによって捕捉し、３倍系列希釈ステップにおいて、３０ｎＭから０．０１４ｎＭまで及ぶいくつかの濃度でＥＳＢＡ１０５（分析物）を注入する。再生工程で、ニッケル、リガンドおよび分析物によって形成された複合体を洗い流す。これは、様々な試料に同じ再生条件を用いるのを可能にする。表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）技術によって反応シグナルを生成させ、共鳴単位（ＲＵ）で測定する。すべての測定を２５℃で行う。インライン参照セル補正およびそれに続き緩衝液試料を引いた後、それぞれの抗ＴＮＦ  ｓｃＦｖ試料についてセンサーグラムを作成した。見かけの解離速度定数（ｋｄ）、見かけの会合速度定数（ｋａ）、および見かけの解離平衡定数（ＫＤ）を、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェアバージョン１．１を用いて、１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して計算した。
【０２１０】
【表３−２】
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（実施例５：抗ＶＥＧＦイエウサギドナー抗体のＣＤＲ融合および機能的ヒト化）
８種の抗ＶＥＧＦ  Ｒａｂｍａｂ（３７５、４３５、５０９、５１１、５３４、５６７、５７８および６１０）をＣＤＲ融合用に選択した。非ヒトドナー抗体と最大の配列相同性を共有するヒト抗体アクセプターフレームワークを利用する伝統的なヒト化法とは異なり、品質管理アッセイ（ＷＯ０１４８０１７）を用いて、所望の機能特性（溶解性および安定性）について事前選択されたヒトアクセプターフレームワークＦＷ１．４（配列番号１および２）にイエウサギＣＤＲを融合させた。
【０２１１】
本明細書に記載された方法論を用いて、ＲａｂＭａｂ（イエウサギ抗体）のそれぞれについて多くのＣＤＲ融合片を作製した（実施例４参照）。「Ｍｉｎ」融合片は、最小の融合片を含んでいた。これにおいては、イエウサギＣＤＲのみをイエウサギドナー抗体のＶＬおよびＶＨドメインからヒトアクセプターフレームワークＦＷ１．４（配列番号１）に移植した。「Ｍａｘ」融合片は、ＶＬおよびＶＨについてイエウサギＣＤＲだけでなく、抗原結合性に重要であると予測された、イエウサギドナーからのいくつかの追加のフレームワーク残基も含んでいた。５７８ｍａｘの場合、ＦＷ１．４の重鎖可変ドメインフレームワーク領域は、Ｋａｂａｔ位置２３Ｈ、４９Ｈ、７３Ｈ、７８Ｈおよび９４Ｈに追加のアミノ酸改変を有する。
【０２１２】
表４は、「Ｍｉｎ」および「Ｍａｘ」ＣＤＲ融合改変体の詳細な特徴付けデータに関する概要を示す。ＶＥＧＦＲ競合ＥＬＩＳＡおよび／またはＨＵＶＥＣアッセイを用いて測定される、ＶＥＧＦインヒビターとしてのそれらの効能を示す。このデータは、ＦＷ１．４（配列番号１および２）がイエウサギＣＤＲ融合のための例示的な可溶性かつ安定的なヒトアクセプターフレームワーク領域であることを示す。
【０２１３】
（抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖのＢｉａｃｏｒｅ結合分析）
ｓｃＦｖのＢｉａｃｏｒｅ結合能を試験し、結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−Ｔ１００による、例示的な表面プラズモン共鳴法を用いて測定した。この実施例および後の実施例において、これらのｓｃＦｖ候補による結合を試験したＶＥＧＦタンパク質には、精製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ発現の組換えヒトＶＥＧＦ１６５（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ．）、組換えヒトＶＥＧＦ１２１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ．）、組換えヒトＶＥＧＦ１１０（ＥＳＢＡＴｅｃｈ  ＡＧ）、組換えマウスＶＥＧＦ１６４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ．）、組換えラットＶＥＧＦ１６４（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）、組換えイエウサギＶＥＧＦ１１０（ＥＳＢＡＴｅｃｈ  ＡＧ）、および組換えヒトＰＬＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ．）が挙げられる。表面プラズモン共鳴実験のために、カルボキシメチル化デキストランのバイオセンサーチップ（ＣＭ４、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、供給業者の説明書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて活性化した。上記に例示された６つの異なる各ＶＥＧＦ形態を、標準的なアミンカップリング手順を用いて、ＣＭ４センサーチップ上の４つの異なるフローセルのうちの１つに結合させた。カップリングおよびブロッキング後に、これらの固定されたＶＥＧＦ分子で得られた応答の範囲は、ｈＶＥＧＦ１６５では約２５０〜５００応答単位（ＲＵ）、ｈＶＥＧＦ１１０、ｈＶＥＧＦ１２１、マウスＶＥＧＦ１６４、ラットＶＥＧＦ１６４、およびイエウサギＶＥＧＦ１１０では約２００ＲＵ、ＰＬＧＦでは約４００ＲＵであった。タンパク質をブロッキングの前に固定化しなかったことを除き、各チップの第４のフローセルを同様に処理し、このフローセルをインラインの参照として使用した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）中の様々な濃度の抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖ（例えば、９０ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３．３３ｎＭ、１．１１ｎＭ、０．３７ｎＭ、０．１２ｎＭおよび０．０４ｎＭ）を、５分間、３０μｌ／分の流速でフローセルに注入した。ＣＭ４チップ上のＶＥＧＦからの抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖの解離を、２５℃で１０分間進行させることができた。インライン参照セル補正に続いて緩衝試料を差し引いた後、センサーグラムを各抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖ試料に関して作成した。見かけの解離速度定数（ｋｄ）、見かけの会合速度定数（ｋａ）、および見かけの解離平衡定数（ＫＤ）を、ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００評価ソフトウェアバージョン１．１を用いて、１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して計算した。
【０２１４】
（ＶＥＧＦ阻害のＨＵＶＥＣアッセイ）
ＨＵＶＥＣアッセイは、開示の抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖ候補の、ＶＥＧＦインヒビターとしての効能を測定する方法である。
【０２１５】
数人のドナーからプールしたヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）を、２継代から１４継代で使用した。細胞を、０．４％ＥＣＧＳ／Ｈ、２％ウシ胎仔血清、０．１ｎｇ／ｍｌの上皮細胞増殖因子、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞因子および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含む、５０μｌの完全内皮細胞増殖培地（ＥＣＧＭ）（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）中で、１０００細胞／穴で播種した。７から８時間後、５０μｌの飢餓培地（０．５％熱不活性化ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むサプリメントなしのＥＣＧＭ）を細胞に添加し、細胞を１５から１６時間、飢餓状態にさせた。３倍連続希釈した抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖ（０．０２３〜１５０ｎＭ）、および組換えヒトＶＥＧＦ１６５（０．０８ｎＭ）、組換えマウスＶＥＧＦ１６４（０．０８ｎＭ）または組換えラットＶＥＧＦ１６４（０．３ｎＭ）の１つを飢餓培地中に調製し、室温で３０〜６０分間プレインキュベートした。異なる濃度のＶＥＧＦを、それらの異なる相対的な生物活性を補うために使用した。準最大（ｓｕｂｍａｘｉｍａｌ）のＶＥＧＦ誘導型増殖を刺激する濃度（ＥＣ９０）を使用した。混合物１００μｌを、ＨＵＶＥＣ懸濁物を含む９６穴組織培養プレートに添加し、３７℃／５％ＣＯ２の加湿インキュベータ中で４日間インキュベートした。Ｓｕｎｒｉｓｅマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いて、２０μｌ／穴のＷＳＴ−１細胞増殖試薬（Ｒｏｃｈｅ）を添加した後、ＨＵＶＥＣの増殖を、４５０ｎｍ（参照波長として６２０ｎｍを使用した）での吸光度を測定することによって評価した。データを、４パラメータロジスティックカーブフィット（ｃｕｒｖｅ−ｆｉｔ）を用いて分析し、５０％のＨＵＶＥＣ増殖阻害に必要な抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖの濃度（ＥＣ５０）を、阻害曲線から導き出した。
【０２１６】
【表４−２】
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（均等物）
前述の記載を考慮すると、本発明の多くの修正および代替の実施例が、当業者に明らかである。したがって、この記載は、単なる例示として解釈すべきであり、本発明を実行するのに最良の様式を当業者に教示するためのものである。構造の詳細は、本発明の精神から逸脱することなく実質的に変えることができ、添付の特許請求の範囲内となるすべての修正の独占的使用権を保有する。本発明は、添付の特許請求の範囲および適用可能な法律の規則によって要求される程度にのみ制限されるものであると意図する。
【０２１７】
特許、特許出願、論説、書籍、論文、論述、ウェブページ、図および／または添付書類を含む、この出願に引用された全文献および類似物は、かかる文献および類似物の書式に関わらず、参照によりそれらの全体が明示的に援用される。援用された文献および類似物の１つまたは複数が、定義された用語、用語の使用法、記載された技法または同様のものを含むこの明細書と異なるか相反する場合には、本明細書が優先される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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