(57)【要約】      （修正有）【課題】視覚機能の再生能を有する視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤の提供。【解決手段】微生物由来のイオン輸送型受容体ロドプシンのアミノ酸配列と動物由来のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンのアミノ酸配列とを有するキメラタンパク質を有効成分として含有する、視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロドプシンは、ヒトの動物の網膜中に７回膜貫通型構造を有する光感受性の受容体であるが、微生物に由来するイオンチャネル型やイオンポンプ型のロドプシンも知られている。
【０００３】
例えば、非特許文献１には、イオンチャネル型のロドプシンであるチャネルロドプシン２（ＣｈＲ２）が開示されている。また、非特許文献２において、変異型チャネルロドプシンを網膜神経節細胞に導入することで、マウス・ラットにおいて一定の視覚機能が再生することが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｃｔｏｐｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ−ｔｙｐｅ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｖｉｓｕａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．”  Ｎｅｕｒｏｎ．  ２００６；  ５０（１）：２３−３３
【非特許文献２】Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｂｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖｏｌｖｏｘ  Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−１”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  （２０１４）；  ２２  ８，  １４３４−１４４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、イオンチャネル型ロドプシンは、視覚機能の再生効果が未だ十分とはいえず、改善の余地があった。
【０００６】
本発明は以上の実情に鑑みてなされたものであり、優れた視覚機能の再生能を有する視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、微生物に由来するイオン輸送型ロドプシンと、動物由来のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンという全く異なる２種類のロドプシンを融合させたキメラタンパク質が、実際に優れた視覚機能の再生能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下の構成からなる。
【０００８】
（１）  微生物由来のイオン輸送型受容体ロドプシンのアミノ酸配列と動物由来のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンのアミノ酸配列とを有するキメラタンパク質を有効成分として含有する、視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤。
【０００９】
（２）  前記キメラタンパク質は、微生物由来のイオン輸送型受容体ロドプシンのアミノ酸配列のうち、細胞質側の第２ループ及び／又は細胞質側の第３ループのアミノ酸配列が、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第２ループ及び／又は細胞質側の第３ループのアミノ酸配列に置き換えられたものである、（１）に記載の視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤。
【００１０】
（３）  前記微生物由来のイオン輸送型受容体ロドプシンがグロエオバクター（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物由来のロドプシンであり、かつ、前記Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンがウシ又はヒト由来のロドプシンである、（１）又は（２）に記載の視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤。
【００１１】
（４）  前記キメラタンパク質が、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有する、（１）〜（３）のいずれかに記載の視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤。
（ａ）配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつ、視覚機能再生能又は視覚機能低下予防能を有する、ＤＮＡ
（ｄ）配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなり、かつ、視覚機能再生能又は視覚機能低下予防能を有するＤＮＡ
【００１２】
（５）  （１）〜（４）のいずれかに記載のキメラタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡが組み込まれた発現ベクターを有効成分として含有する、視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤。
【００１３】
（６）  網膜色素変性症の治療又は予防に用いられる、（１）〜（５）のいずれかに記載の視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤。
【００１４】
（７）  微生物由来のイオン輸送型受容体ロドプシンのアミノ酸配列と動物由来のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンのアミノ酸配列とを有するキメラタンパク質の配列が挿入されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルスベクター。
【００１５】
（８）  視覚機能再生又は視覚機能低下予防する医薬を製造するための、微生物由来のイオン輸送型受容体ロドプシンのアミノ酸配列と動物由来のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンのアミノ酸配列とを有するキメラタンパク質の配列が挿入されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルスベクターの使用。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、優れた視覚機能の再生能を奏することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＡＡＶ２−ＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥ−ｐＡを硝子体内に注射した野生型マウスの網膜について蛍光顕微鏡で観察した画像である。
【図２】（ａ）コントロールの網膜色素変性症モデル（ｒｄ１）マウスについて多電極アレイ（ＭＥＡ）により網膜神経節細胞の細胞外電位記録を行った結果のグラフである。（ｂ）ＡＡＶ２−ＣＡＧＧＳ−ＧＲ／ＢｖＲｈ−ＷＰＲＥ−ｐＡを注射した網膜色素変性症モデル（ｒｄ１）マウスについてＭＥＡにより網膜神経節細胞の細胞外電位記録を行った結果のグラフである。
【図３】（ａ）コントロールの網膜色素変性症モデル（ｒｄ１）マウス、及び、（ｂ）ＡＡＶ２−ＣＡＧＧＳ−ＧＲ／ＢｖＲｈ−ＷＰＲＥ−ｐＡを注射した網膜色素変性症モデル（ｒｄ１）マウスについて多電極アレイ（ＭＥＡ）により網膜神経節細胞の細胞外電位記録を行った結果を示す図である。図３の上段は、１０回分の網膜神経節細胞の発火をラスタープロット表示であり、図３の下段は、縦軸に１秒間あたりの発火頻度をとったヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の具体的な実施形態について詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。なお、説明が重複する箇所については、適宜説明を省略する場合があるが、発明の要旨を限定するものではない。
【００１９】
＜視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤＞
本発明の視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤は、微生物由来のイオン輸送型受容体ロドプシンのアミノ酸配列と動物由来のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンのアミノ酸配列とを有するキメラタンパク質を有効成分として含有する。
【００２０】
ロドプシンは、レチナールという色素を内部に有し、これが光を受けることで活性化して、視覚シグナルが脳へと伝えられる。微生物由来のイオン輸送型受容体ロドプシンは、光を照射してもレチナールが外れることがないため、光を吸収することで繰り返し活性化させることができるが、動物由来のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンのように、Ｇタンパク質を活性化することができない。これに対し、本発明によると、繰り返し使用できる微生物由来のイオン輸送型受容体ロドプシンに、動物由来のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンを融合することで、微生物由来のイオン輸送型受容体イオンチャネル型受容体ロドプシンが持つ繰り返し活性化する機能を保持しつつ、Ｇタンパク質共役型受容体による内在性のＧタンパク質を介した高い活性を得ることができ、優れた視覚再生効果を得られるものと推測される。このように、微生物由来のロドプシンと動物由来のＧタンパク質共役型受容体は全く機能の異なるタイプの受容体であり、このような２種の受容体を組み合わせたキメラタンパク質が、優れた視覚機能の再生能を有することを本発明者らは現実に見出した。また、上述のとおり、高い活性を得ながら繰り返し活性化できるため、視覚機能の低下の予防効果（例えば、網膜色素変性症等の網膜疾患の進行抑制）も期待できる。
【００２１】
イオン輸送型受容体ロドプシンとしては、イオンポンプ型受容体ロドプシン、イオンチャネル型受容体ロドプシンが挙げられる。
【００２２】
本発明のキメラタンパク質は、微生物由来のイオン輸送型受容体ロドプシンとＧタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質であり、７回膜貫通型構造を有する。本発明において、微生物由来のイオン輸送型受容体ロドプシンとＧタンパク質共役型受容体ロドプシンとのキメラタンパク質は、微生物由来のイオン輸送型受容体ロドプシンの繰り返し活性化させる機能とＧタンパク質共役型受容体ロドプシンによるＧタンパク活性の両方を高く有するように設計されることが好ましい。この観点で、両者の活性を高く維持し、特に、高い視覚機能再生能を奏することから、本発明のキメラタンパク質は、微生物由来のイオン輸送型受容体ロドプシンのアミノ酸配列のうち、細胞質側の第２ループ及び／又は細胞質側の第３ループのアミノ酸配列が、Ｇタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第２ループ及び／又は細胞質側の第３ループのアミノ酸配列に置き換えられたものであることが好ましい。なお、「細胞質側の第２ループ」、「細胞質側の第３ループ」とは、それぞれが７つのループのうちＮ末端側から２番目、Ｎ末端側から３番目に位置するループのことを指す。
【００２３】
微生物由来のイオン輸送型受容体ロドプシンとしては、例えば、グロエオバクター（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）属等の真正細菌、ボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属、グィラルディア（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ）属等の真核生物等に属する微生物由来のロドプシンが挙げられる。グロエオバクター（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）属としては、グロエオバクター・ビオラセウス（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）等が挙げられる。ボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）属としては、ボルボックス・カルテリ（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ）等が挙げられる。クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属としては、クラミドモナス・ラインハーティ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）等が挙げられる。グィラルディア（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ）属としては、グィラルディア・セータ（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ  ｔｈｅｔａ）等が挙げられる。より高い視覚再生・予防効果を得るためには、Ｇタンパク質活性化ループとの立体構造的相性と膜移行効率が重要であると考えられるが、微生物由来のイオン輸送型受容体ロドプシンは、特に、Ｇタンパク質活性化ループとの立体構造的相性と膜移行効率が良好であるため、グロエオバクター（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）属であることが好ましい。特に、グロエオバクター（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物のうち、グロエオバクター・ビオラセウスが好ましい。また、グロエオバクター属に属する微生物は、動物由来のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンのうち、ウシ又はヒト由来のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンと組み合わせて融合させることが好ましい。また、グロエオバクター（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）属は、真正細菌である大腸菌でも真核生物であるヒトの細胞でもよく発現するという重要な性質を有する点においても好ましい。
【００２４】
動物由来のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンとしては、例えば、ウシ、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ等由来のロドプシンが挙げられる。これらのうち、ウシ又はヒト由来のロドプシンが、特に好ましい。
【００２５】
より具体的には、キメラタンパク質は、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有するものが好ましい。
（ａ）配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつ、視覚機能再生能又は視覚機能低下予防能を有する、ＤＮＡ
（ｄ）配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなり、かつ、視覚機能再生能又は視覚機能低下予防能を有するＤＮＡ
【００２６】
上述のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第２ループとしては、以下の（ｅ）〜（ｈ）に記載のＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有するものが好ましい。
（ｅ）配列番号５又は６に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号５又は６に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｇ）配列番号５又は６に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｈ）配列番号５又は６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
【００２７】
上述のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンの細胞質側の第３ループとしては、以下の（ｉ）〜（ｌ）に記載のＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有するものが好ましい。
（ｉ）配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｊ）配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｋ）配列番号７に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ｌ）配列番号７に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
【００２８】
配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、本発明のキメラタンパク質をコードする塩基配列の好ましい配列である。この配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、視覚機能再生能又は視覚機能低下予防能を有する。なお、本明細書において、「塩基配列が視覚機能再生能又は視覚機能低下予防能を有する」とは、塩基配列がコードするポリペプチドが視覚機能再生能又は視覚機能低下予防能を有することを意味する。また、配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡには、更に、視覚機能再生能又は視覚機能低下予防能を有する種々の変異体やホモログが含まれる。配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡの変異体やホモログには、例えば、配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。また、配列番号５〜７のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡの変異体やホモログには、配列番号５〜７のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。「ストリンジェントな条件」としては、例えば、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中、４０〜７０℃（好ましくは、５０〜６７℃、より好ましくは、６０〜６５℃）で反応を行い、塩濃度１５〜３００ｍＭ（好ましくは、１５〜１５０ｍＭ、より好ましくは１５〜６０ｍＭ、更に好ましくは、３０〜５０ｍＭ）の洗浄液中で洗浄を行う条件が挙げられる。
【００２９】
配列番号１〜４のいずれかは、本発明のキメラタンパク質のアミノ酸配列として使用できる。本発明のキメラタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡには、かかる配列番号１〜４のいずれか記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡも含まれる。ここで配列番号１〜４のいずれかにおいて、「１もしくは複数」とは、通常、５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、更に好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、１アミノ酸）である。また、配列番号５〜７のいずれかにおいて、「１もしくは複数」とは、通常、６アミノ酸以内であり、好ましくは５アミノ酸以内であり、更に好ましくは４アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。キメラタンパク質の視覚機能再生能又は視覚機能低下予防能を維持する場合、変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。なお、あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することは公知である（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
【００３０】
配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡの変異体やホモログには、配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列と高い相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡが含まれる。このようなＤＮＡは、好ましくは、配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列と９０％以上、更に好ましくは９５％以上（９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有する。また、配列番号５〜７のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡの変異体やホモログには、配列番号５〜７のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列と高い相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡが含まれる。このようなＤＮＡは、好ましくは、配列番号５〜７のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列と９０％以上、更に好ましくは９５％以上（９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有する。アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
【００３１】
本発明における「ＤＮＡ」は、センス鎖又はアンチセンス鎖（例えば、プローブとして使用できる）のいずれでもよく、その形状は一本鎖又は二本鎖のいずれでもよい。また、ゲノムＤＮＡであっても、ｃＤＮＡであってもよく、あるいは合成されたＤＮＡであってもよい。
【００３２】
本発明のＤＮＡを取得する方法としては、特に限定されないが、ｍＲＮＡから逆転写することでｃＤＮＡを得る方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法）、ゲノムＤＮＡから調整する方法、化学合成により合成する方法、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから単離する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【００３３】
本発明の視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤で使用されるキメラタンパク質の調製は、例えば、前述のキメラタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターが導入された形質転換体を使用することで行うことができる。例えば、まず、この形質転換体を適宜の条件で培養し、このＤＮＡがコードするキメラタンパク質を合成させる。そして、合成されたタンパク質を形質転換体又は培養液から回収することにより、本発明のキメラタンパク質を得ることができる。
【００３４】
より具体的に説明すると、適当な発現ベクターに上述のキメラタンパク質をコードするＤＮＡを挿入することにより、作製できる。「適当なベクター」とは、原核生物及び／又は真核生物の各種の宿主内で複製保持又は自己増殖できるものであればよく、使用の目的に応じて適宜選択できるものである。例えば、ＤＮＡを大量に取得したい場合には高コピーベクターを選択でき、ポリペプチド（キメラタンパク質）を取得したい場合には発現ベクターを選択できる。その具体例としては、特に限定されず、例えば、特開平１１−２９５９９号公報に記載された公知のベクターが挙げられる。
【００３５】
また、発現ベクターは、キメラタンパク質を合成するのみならず、本発明の視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤においても利用することができる。すなわち、本発明の視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤は、上述のキメラタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡが組み込まれた発現ベクターを有効成分として含有するものであってもよい。かかる発現ベクターをヒトに直接導入することで、視覚機能再生、視覚機能低下予防に用いることができる。この場合におけるベクターは、ヒトの細胞内に導入可能なベクターを用いる。かかるベクターとしては、例えば、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）、レンチウイルスベクターが好適である。
【００３６】
ベクターの導入方法は、ベクターや宿主の種類等に応じて適宜選択できる。その具体例としては、特に限定されないが、例えば、細菌を宿主とした場合、プロトプラスト法、コンピテント法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。また、発現ベクターを本発明の視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤の有効成分として用いる場合、例えば、上述のＡＡＶベクター等を眼内に注射することで導入することができる。
【００３７】
発現ベクターを導入する宿主は、発現ベクターに適合し形質転換され得るものであればよく、その具体例としては、特に限定されないが、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の、公知の天然細胞もしくは人工的に樹立された細胞（特開平１１−２９５９９号公報参照）、あるいは、ヒト、マウス等の動物が挙げられる。形質転換体の培養は、キメラタンパク質が大量にかつ容易に取得できるように、形質転換体の種類等に応じて、公知の栄養培地から適宜選択し、温度、栄養培地のｐＨ、培養時間等を適宜調整して行うことができる（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）。
【００３８】
キメラタンパク質の単離方法及び精製方法としては、特に限定されず、溶解度を利用する方法、分子量の差を利用する方法、荷電を利用する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【００３９】
本明細書における「有効成分」は、視覚機能再生効果又は視覚機能低下予防効果を得るために必要な量で含有される成分を指し、効果が所望のレベル未満にまで損なわれない限りにおいて、他の成分も含有されてよい。また、本発明の視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤は製剤化されたものであってもよい。また、本発明の視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤の投与経路は、経口又は非経口のいずれであってもよく、製剤の形態等に応じて適宜設定することができる。
【００４０】
経口投与の場合、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤等の種々の形状に製剤化して用いてもよく、製剤中に一般に使用される結合剤、包含剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤のような添加剤を含有させてもよい。また、これらのほか、経口投与の場合における製剤は、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等の液体状態として製剤化してもよく、使用時に再溶解される乾燥状態のものとして製剤化してもよい。
【００４１】
非経口投与の場合、単位投与量アンプルもしくは多投与量容器又はチューブ内に収容された状態に製剤化してもよく、また、安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤も含有させてもよい。また、非経口投与の場合における製剤は、使用時に、適当な担体（滅菌水等）で再溶解可能な粉体に製剤化されてもよい。
非経口投与としては、硝子体内投与、結膜下投与、前房内投与、点眼投与等が挙げられ、硝子体内投与であることが好ましい。
【００４２】
以上で述べた本発明の視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤は、上記で述べたような方法で、ヒトに投与することにより、視覚機能再生又は視覚機能低下予防に用いることができる。
【００４３】
本発明において、「視覚機能再生」とは、低下した視覚機能が改善されること指し、視覚機能の一部の再生であってもよく、完全な再生であってもよい。また、「視覚機能低下予防」とは、視覚機能低下を防ぐこと、あるいは、視覚機能低下の進行を抑制すること等を指す。このような視覚機能としては、視力、コントラスト感度、明暗順応、色覚等が挙げられる。
【００４４】
本発明の視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤は、視覚機能再生又は視覚機能低下予防により期待される用途として用いてもよく、例えば、視覚機能低下に関連する疾患の治療又は予防に用いてもよい。視覚機能低下に関連する疾患としては、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、近視性黄斑症、黄斑ジストロフィー、糖尿病網膜症、ぶどう膜炎、網膜剥離等が挙げられる。
【００４５】
＜ベクター＞
本発明は、微生物由来のイオン輸送型受容体ロドプシンのアミノ酸配列と動物由来のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンのアミノ酸配列とを有するキメラタンパク質の配列が挿入されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルスベクターを包含する。
【００４６】
また、本発明は、視覚機能再生又は視覚機能低下予防する医薬を製造するための、微生物由来のイオン輸送型受容体ロドプシンのアミノ酸配列と動物由来のＧタンパク質共役型受容体ロドプシンのアミノ酸配列とを有するキメラタンパク質の配列が挿入されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルスベクターの使用を包含する。
【００４７】
キメラタンパク質は、上述のものと同様のものを用いることができる。
【実施例】
【００４８】
以下のとおりに、マウスを用いて視覚機能に関する実験を行った。
【００４９】
（実験動物）
実験には、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ，日本クレア株式会社）と網膜色素変性症モデル（ｒｄ１）マウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ  Ｊｃｌｓ，日本クレア株式会社）を用い、ともに３週齢オスのものを使用した。
【００５０】
（キメラタンパク（ＧＲ／ＢｖＲｈ）をコードするＤＮＡの作製）
グロエオバクター・ビオラセウスのロドプシン（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ  Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ（ＧＲ）、配列番号８）の細胞質側の第２ループに相当するＮ末端より１３７−１４５番目のアミノ酸に相当する配列を、ウシロドプシン（ＢｖＲｈ）（配列番号９）の１３７−１４５番目のアミノ酸相当配列に置換し、また、グロエオバクター・ビオラセウスのロドプシンの細胞質側の第３ループに相当するＮ末端より１９８−２０６番目のアミノ酸に相当する配列を、ウシロドプシンの２２５−２５２番目のアミノ酸相当配列に置換し、さらにグロエオバクター・ビオラセウスのロドプシンの１３２番目のアミノ酸であるグルタミン酸をグルタミンに置換したキメラタンパク質をコードするＤＮＡをｐＣＤＮＡ３．１ベクターに挿入した。変異体の作製はクイックチェンジ法により行った。
【００５１】
（キメラタンパク質の配列が挿入されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの作製）
ＡＡＶ２シャトルプラスミドに、ＥＧＦＰ、又はＧＲ／ＢｖＲｈ遺伝子をサブクローニングし、ウイルス発現コンストラクトとして、ＡＡＶ２−ＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥ−ｐＡ（ＥＧＦＰの発現用のベクター）、及び、ＡＡＶ２−ＣＡＧＧＳ−ＧＲ／ＢｖＲｈ−ＷＰＲＥ−ｐＡ（キメラタンパク質発現用のベクター）を作製した。ウイルスベクターのパッケージングはＨＥＫ２９３細胞にベクタープラスミド、ＡＡＶベクタープラスミド、アデノウイルスヘルパープラスミドの３種類のプラスミドをトランスフェクションすることにより行い、ウイルスベクターの精製には塩化セシウム法を用いた。なお、ベクター中、「ＩＴＲ」は、「Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ」の略である。「ＣＡＧＧＳ」は、ＣＡＧプロモーターの領域の配列である。「ＷＰＲＥ」は、「ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ」の略である。「ｐＡ」は、ペプチド・タグを意味する。「ＥＧＦＰ」は、「ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ」の略である。
【００５２】
（硝子体注射）
野生型マウス又は網膜色素変性症モデル（ｒｄ１）マウスに対し、塩酸メデトミジン（０．７５ｍｇ／ｋｇ）、ミダゾラム（４ｍｇ／ｋｇ）、酒石酸ブトルファノール（５ｍｇ／ｋｇ）の混合液を腹腔内投与し、全身麻酔下にて、３２ゲージ針を装着したマイクロシリンジを用いて鋸状縁付近から硝子体内に上述のＡＡＶベクター（「ＡＡＶ２−ＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥ−ｐＡ」又は「ＡＡＶ２−ＣＡＧＧＳ−ＧＲ／ＢｖＲｈ−ＷＰＲＥ−ｐＡ」）をそれぞれ１×１０１２ｖｇ／ｍｌ  １μｌ注射施行した。
【００５３】
（レポーター観察）
ＡＡＶ２−ＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥ−ｐＡを注射した野生型マウスに注射してから７週後に網膜を摘出し、４％パラホルムアルデヒドで１時間固定し、ｗｈｏｌｅ  ｍｏｕｎｔした網膜を蛍光顕微鏡で観察した。その結果を図１に示す。図１中、ＧＣＬ：神経節細胞層、ＩＮＬ：内顆粒層、ＯＮＬ：外顆粒層を意味する。観察の結果、緑の蛍光（例えば、図１の矢印）が網膜中に見られたことから、ベクターの導入、目的遺伝子の発現は正常に行われることが確認できた。
【００５４】
（Ｍｕｌｔｉｅｌｅｃｔｏｒｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ（ＭＥＡ）：多電極アレイ測定）
ＡＡＶ２−ＣＡＧＧＳ−ＧＲ／ＢｖＲｈ−ＷＰＲＥ−ｐＡを網膜色素変性症モデル（ｒｄ１）マウスに注射してから７週後に全身麻酔下で眼球を摘出し、その後９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２でバブリングしたＡｍｅｓ  ｍｅｄｉｕｍ  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ；  Ａ１４２０）内に静置して網膜を摘出した。網膜について神経節細胞層が下向きに電極に接触するようにマウントし、光刺激を行い（白色光、１０００ｃｄ／ｍ２、１秒間）網膜神経節細胞の細胞外電位記録を行った。また、ＡＡＶ２−ＣＡＧＧＳ−ＧＲ／ＢｖＲｈ−ＷＰＲＥ−ｐＡを注射していない網膜色素変性症モデル（ｒｄ１）マウスをコントロールとして、同様の方法で網膜神経節細胞の細胞外電位記録を行った。多電極アレイ測定には、ＭＥＡ２１００−Ｌｉｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｌｔｉ−Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。その結果を図２に示す。図２中、（ａ）がコントロールのマウスについてのグラフを示し、図２中、（ｂ）がＡＡＶ２−ＣＡＧＧＳ−ＧＲ／ＢｖＲｈ−ＷＰＲＥ−ｐＡを注射したマウスについてのグラフを示す。なお、図２のグラフ中、横軸は経過時間を示し、矢印で示した領域が光刺激を行った領域を示す。
【００５５】
図２に示すように、コントロールにおいては光刺激を行った領域において何の変化もみられなかったが、ＡＡＶ２−ＣＡＧＧＳ−ＧＲ／ＢｖＲｈ−ＷＰＲＥ−ｐＡを注射したマウスにおいては、電位が増加したことがわかった。この結果より、ＧＲ／ＢｖＲｈが、網膜色素変性症に対して視覚機能再生効果を有することがわかった。
【００５６】
また、上記と同様の手法により多電極アレイ測定を行い、１０回分の網膜神経節細胞の発火をラスタープロット表示したもの（図３の上段）と、縦軸に１秒間あたりの発火頻度をとったヒストグラム（図３の下段）を得た。光刺激は０〜１秒で行った。図３中、（ａ）がコントロールのマウスについてのグラフを示し、図３中、（ｂ）がＡＡＶ２−ＣＡＧＧＳ−ＧＲ／ＢｖＲｈ−ＷＰＲＥ−ｐＡを注射したマウスについてのグラフを示す。
【００５７】
図３に示すように、コントロールマウスにおいては、光応答がみられなかったのに対し、ＡＡＶ２−ＣＡＧＧＳ−ＧＲ／ＢｖＲｈ−ＷＰＲＥ−ｐＡを注射したマウスでは神経節細胞の発火が見られ、視覚再生効果を認められた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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