(57)【要約】      （修正有）【課題】対象の生理活性薬剤を送達するのに適した標的化されたサブ−５０ナノメートルナノ粒子、ならびに療法用ナノ粒子の製造、安定性、有効性および他の側面を向上させる、関連する組成物、方法、およびシステムの提供。【解決手段】ナノ粒子を含む組成物であって、該ナノ粒子が、少なくとも１種類の生理活性薬剤、６．０単位未満のＨＬＢ値を有する界面活性剤、リガンド、ならびにＬｉ＋およびＣｓ＋を含み、ここで；ｉ）該少なくとも１種類の生理活性薬剤および界面活性剤が、界面活性剤ミセルコアを形成し；ｉｉ）該リガンドが、シェルを形成し；ｉｉｉ）該Ｌｉ＋が、Ｃｓ＋で前処理されており；そして、ｉｖ）該ナノ粒子が、約５０ナノメートル未満の平均直径を有する組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子を含む組成物であって、該ナノ粒子が、以下：
少なくとも１種類の生理活性薬剤、６．０単位未満のＨＬＢ値を有する界面活性剤、リガンド、ならびにＬｉ＋およびＣｓ＋を含み、ここで：
ｉ）該少なくとも１種類の生理活性薬剤および界面活性剤が、界面活性剤ミセルコアを形成し；
ｉｉ）該リガンドが、シェルを形成し；
ｉｉｉ）該Ｌｉ＋が、Ｃｓ＋で前処理されており；そして
ｉｖ）該ナノ粒子が、約５０ナノメートル未満の平均直径を有する組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、該ナノ粒子が、滅菌水を用いて調製される組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、該少なくとも１種類の生理活性薬剤が、ポリヌクレオチドまたはプラスミドＤＮＡである組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物であって、ここで：
ｉ）該少なくとも１種類の生理活性薬剤が、複数のポリヌクレオチドを含み、それぞれが、３’ＲＮＡ部分および５’の主にＤＮＡの部分を含み、それぞれのポリヌクレオチドの５’末端から第２位が、２’−ＯＭｅ修飾ＲＮＡであり、該複数のポリヌクレオチドの平均で約４０％より多く約６０％未満の配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含み、かつ該複数のポリヌクレオチドの平均で残りの割合の配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９を含み、そして
ｉｉ）該リガンドが、テネイシン受容体を標的化するタンパク質である組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の組成物であって、該タンパク質が、テンフィブゲンである組成物。
【請求項６】
少なくとも１種類の生理活性薬剤を対象に投与する方法であって、該方法が、該対象に請求項１に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項７】
固形腫瘍癌を有する患者を処置するための方法であって、該患者に療法上有効量の請求項１に記載の組成物を投与することを含み、ここで
ｉ）該少なくとも１種類の生理活性薬剤が、複数のポリヌクレオチドを含み、それぞれが、３’ＲＮＡ部分および５’の主にＤＮＡの部分を含み、それぞれのポリヌクレオチドの５’末端から第２位が、２’−ＯＭｅ修飾ＲＮＡであり、該複数のポリヌクレオチドの平均で約４０％より多く約６０％未満の配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含み、かつ該複数のポリヌクレオチドの平均で残りの割合の配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９を含み、そして
ｉｉ）該リガンドが、テネイシン受容体を標的化するタンパク質である方法。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物を調製するための方法であって、該方法が、以下の工程：
ｉ）少なくとも１種類の生理活性薬剤を凝縮剤と複合体化させて凝縮した生理活性薬剤を形成し；
ｉｉ）該凝縮した生理活性薬剤を、６．０未満のＨＬＢを有する界面活性剤を含む水混和性溶媒中に分散させて界面活性剤ミセルを形成し；
ｉｉｉ）リガンドを該界面活性剤ミセルの外部表面に吸着させて、リガンド粒子を形成し；そして
ｉｖ）該リガンド粒子をＣｓ＋で前処理されたＬｉ＋および滅菌水と混合してインキュベートして該組成物を形成する；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利に関する記載
[0001]  本発明は、国立衛生研究所により裁定された契約番号ＨＨＳＮ２６１２０１３０００３０Ｃの下での政府支援によりなされた。従って、政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
配列リスト
[0002]  本出願は、配列リストを含み、それは、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、本明細書に参照によりそのまま援用される。２０１５年９月１日に作成された前記のＡＳＣＩＩコピーは、０２６９．１３ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられており、大きさは９，８２２バイトである。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  対象の薬剤の細胞、組織、器官、および生物への有効な送達は、生物医学、イメージング、ならびに様々な大きさおよび寸法の分子の予め決定された標的への送達が望ましい他の分野において課題となっている。病理学的検査、療法的処置、または基礎生物学研究のいずれに関しても、対象の生物学的および／または化学的活性と典型的に関係している様々なクラスの生体材料および生体分子を送達するためのいくつかの方法が知られており、用いられている。化学的または生物学的薬剤（例えば薬物、生物製剤、療法剤またはイメージング剤）として用いられるのに適した分子の数は増大しているため、様々な複雑さ、寸法、および化学的性質の化合物と共に使用するのに適した送達系の開発は、特に困難であることが分かっている。
【０００４】
[0004]  ナノ粒子は、様々な送達法により薬剤を送達するためのキャリヤーとして有用な構造である。いくつかのナノ粒子送達システムが存在し、それは、薬剤を包装、輸送して特異的な標的に送達するために一連の異なる戦略を利用する。しかし、疾患の処置を向上させるために療法的レベルの薬物を細胞および分子標的に送達することができるナノ粒子療法（およびそのようなナノ粒子を作製する方法）に関する必要性が存在する。
【０００５】
[0005]  ポリヌクレオチドは、医学における重要な療法的適用を有する。ポリヌクレオチドは、特定の疾患の原因である遺伝子の発現を調節する（増大または減少させる）ために用いられることができる。遺伝子サイレンシング技術は、標的核酸にハイブリダイズして遺伝子発現活性または機能、例えば転写もしくは翻訳を調節するポリヌクレオチドを用いる。重要なことだが、遺伝子サイレンシング剤は、疾患につながるタンパク質の機能を阻害する伝統的な低分子有機化合物に対する有望な代替物である。ＲＮアーゼＨ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、遺伝子サイレンシングによりタンパク質の形成を妨げる遺伝子サイレンシング化合物および機序の例である。
【０００６】
[0006]  疾患の処置を向上させるために遺伝子発現を特異的に調節することができる送達系および療法剤に関する必要性が存在し続けている。
【発明の概要】
【０００７】
[0007]  本明細書において、様々な大きさ、寸法、および化学的性質の広い範囲の分子を担持および送達する（予め決定された標的への送達を含む）ために用いられることができる非ウイルス性ナノ粒子ならびに関連する組成物、方法、およびシステムが提供される。当業者は、一度この開示を用いて武装する（ａｒｍｅｄ）と、過度の実験操作なしで、
これらの使用および他の使用のための非ウイルス性ナノ粒子を同定、調製、および利用することができるであろう。
【０００８】
[0008]  一側面において、本発明は、療法、ワクチン、および／または診断剤の所望の標的への送達のためのシステムを提供する。ナノ粒子が、例えば薬学的に許容可能な療法用ナノ粒子を開発または製造する過程において滅菌水およびセシウムで前処理されたリチウムドーパントを用いて配合される場合、重要な利益および意外な利点が達成される。そのような重要な利益および意外な利点は、ナノ粒子の信頼できる輸送に関する増大した能力を含むナノ粒子のより大きい安定性、薬物開発、例えば多数の現場における製造における開示されるナノ粒子の利用におけるより大きい柔軟性および効率、ならびに当業者に明らかな他の利点を含むが、それらに限定されない。
【０００９】
[0009]  本明細書で開示される組成物および方法は、好ましいリガンドおよびカーゴをうまく収容する（ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｅ）本発明のナノ粒子の柔軟性を実証する。一態様において、ナノ粒子は、任意の凝縮剤（コアを実質的に取り囲んで界面活性剤でコートされた複合体を形成する界面活性剤、ここで、その界面活性剤は、約６．０単位未満の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）値を有する）を伴う例えば薬物、ワクチン、および／または診断剤を含む生理活性薬剤で構成されるコアならびにその界面活性剤でコートされた複合体に非共有結合的に接着して実質的にそれを取り囲むシェルを含み、ここで、そのシェルは、標的化部分（リガンド）を含み、ここで、そのシェルは、セシウムで前処理されたリチウムを含む陽イオン性薬剤を用いて形成されている。ナノ粒子の平均直径は、約５０ナノメートル未満である（すなわち、サブ−５０ｎｍ粒子）。
【００１０】
[0010]  約５０ヌクレオチドまでの長さでありカゼインキナーゼ２（ＣＫ２）アルファの対応するＲＮＡ核酸配列に特異的にハイブリダイズすることができるＤＮＡ／ＲＮＡキメラ一本鎖ポリヌクレオチドおよび約５０ヌクレオチドまでの長さでありＣＫ２アルファプライムの対応するＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズすることができるＤＮＡ／ＲＮＡキメラ一本鎖ポリヌクレオチド、ならびにＣＫ２アルファおよびＣＫ２アルファプライムの発現を低下させ、または阻害し、そして固形腫瘍の成長を阻害するための異なる配列を含む前記のポリヌクレオチドの組み合わせ（“混合物”）を調製および使用する方法も、本明細書で開示される。そのようなポリヌクレオチドの限定的でない例は、ＣＫ２アルファに対するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８およびＣＫ２アルファプライムに対するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９を含む。
【００１１】
[0011]  加えて、５’末端からの第２位を２’Ｏ−メチル化（２’Ｏ−Ｍｅ）ＲＮＡヌクレオチドに置換するように改変された主鎖を有するＣＫ２標的化ポリヌクレオチドが、本明細書において開示される。そのような主鎖を改変されたポリヌクレオチドの限定的でない例が、下記の表２において提供されている。
【００１２】
[0012]  本発明の別の側面において、そのように改変されたＣＫ２標的化ポリヌクレオチドの混合物の腫瘍標的化サブ−５０ナノメートルカプセルにおける組み合わせおよび組み込みは、結果として、対象への投与の際に腫瘍成長、腫瘍細胞増殖、および／または炎症を有意に低減または阻害するナノ粒子の療法組成物をもたらす。
【００１３】
[0013]  従って、一側面において、本発明は、ナノ粒子を含む組成物を提供し、ここで、ナノ粒子は、以下のものを含む：少なくとも１種類の生理活性薬剤、６．０単位未満のＨＬＢ値を有する界面活性剤、リガンド、ならびにＬｉ＋およびＣｓ＋、ここで：ｉ）その少なくとも１種類の生理活性薬剤および界面活性剤は、界面活性剤ミセルコアを形成し、ｉｉ）リガンドは、シェルを形成し、そしてｉｉｉ）ナノ粒子は、５０ナノメートル未満の平均直径を有する。一態様において、リガンドは、外部のシェルを形成する。別の態
様において、ナノ粒子は、滅菌水を用いて調製される。
【００１４】
[0014]  さらに別の態様において、少なくとも１種類の生理活性薬剤は、ポリヌクレオチドである。さらに別の態様において、少なくとも１種類の生理活性薬剤は、プラスミドＤＮＡである。さらに別の態様において、Ｌｉ＋は、Ｃｓ＋で前処理されている。
【００１５】
[0015]  別の側面において、本発明は、少なくとも１種類の生理活性薬剤を標的に送達するためのシステムを提供し、そのシステムは、少なくとも１種類の生理活性薬剤を標的に送達するために用いられるべきナノ粒子において組み立てられるべき少なくとも１種類の生理活性薬剤、６．０単位未満のＨＬＢ値を有する界面活性剤、リガンド、およびＣｓ＋で前処理されたＬｉ＋を含む。一態様において、生理活性薬剤は、ポリヌクレオチドである。別の態様において、標的は、哺乳類の体内の細胞である。
【００１６】
[0016]  さらなる側面において、本発明は、少なくとも１種類の生理活性薬剤を対象に投与する方法を提供し、その方法は、本発明に従うナノ粒子を含む組成物を対象に投与することを含む。
【００１７】
[0017]  さらなる側面において、本発明は、少なくとも１種類の生理活性薬剤を対象に投与するためのシステムを提供し、そのシステムは、対象に投与されるべきナノ粒子において組み立てられるべき少なくとも１種類の生理活性薬剤、６．０単位未満のＨＬＢ値を有する界面活性剤、リガンド、およびＣｓ＋で前処理されたＬｉ＋を含む。
【００１８】
[0018]  本発明に従う組成物の一態様において、ｉ）：ナノ粒子は、複数のポリヌクレオチドを含み、それぞれが、３’ＲＮＡ部分および５’の主にＤＮＡの部分を含み、ここで、それぞれのポリヌクレオチドの５’末端から第２位は、２’−ＯＭｅ修飾ＲＮＡであり、ここで、ナノ粒子の組成物に関する複数のポリヌクレオチドの平均で約４５％より多く約５５％未満の、約４０％より多く約６０％未満の、または約３０％より多く約７０％未満の配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含み、かつ複数のポリヌクレオチドの残りの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９を含み、そしてｉｉ）リガンドは、テネイシン受容体を標的とするタンパク質である。別の態様において、テネイシン受容体を標的とするリガンドは、テンフィブゲン（ｔｅｎｆｉｂｇｅｎ）である。
【００１９】
[0019]  句“ナノ粒子を含む組成物”または類似の句は、本明細書で用いられる際、限定ではなく、本発明のナノ粒子を含む用量、試料、配合物、製造ロット、および物質の他の組成物を指す。
【００２０】
[0020]  一側面において、本発明は、３’ＲＮＡ部分および５’の主にＤＮＡの部分を含むポリヌクレオチドを提供し、ここで、５’末端から第２位は、２’−ＯＭｅ修飾ＲＮＡであり、ここで、ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の約５０個までの連続したヌクレオチドを含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の少なくとも８個の連続したヌクレオチドの部分を含む。別の態様において、ポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチドの長さであり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含む。
【００２１】
[0021]  別の側面において、本発明は、３’ＲＮＡ部分および５’の主にＤＮＡの部分を含むポリヌクレオチドを提供し、ここで、５’末端から第２位は、２’−ＯＭｅ修飾ＲＮＡであり、ここで、ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の約５０までの連続したヌクレオチドを含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の少なくとも８の連続したヌクレオチドの部分を含む。別の態様において、ポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチドの長さであり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９を含む。
【００２２】
[0022]  一側面において、本発明は、患者を処置するための方法であって、対象に療法上有効量の本発明に従う組成物を投与することを含む方法を提供し、ここで、その患者は、固形腫瘍癌を有すると診断されている。
【００２３】
[0023]  別の側面において、本発明は、固形腫瘍癌を有すると診断された患者を処置するための方法であって、その患者に療法上有効量の本発明に従う組成物を投与することを含む方法を提供し、ここで、ナノ粒子は、複数のポリヌクレオチドを含み、ここで、複数のポリヌクレオチドのそれぞれは、３’ＲＮＡ部分および５’の主にＤＮＡの部分を含み、ここで、複数のポリヌクレオチドのそれぞれの５’末端から第２位は、２’−ＯＭｅ修飾ＲＮＡであり、ここで、複数のポリヌクレオチドの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のどちらかを含み、ここで、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含むポリヌクレオチドを含むナノ粒子の百分率は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％であり、ナノ粒子の残りは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９を含むポリヌクレオチドを含み、ここで、リガンドは、テネイシン受容体を標的とするタンパク質である。
【００２４】
[0024]  一態様において、百分率は、１以上の対象からの腫瘍組織において測定されたＣＫ２アルファ酵素およびＣＫ２アルファプライム酵素の相対レベルに基づいて、場合により参照組織および／または細胞培養物中のＣＫ２アルファおよびＣＫ２アルファプライム酵素の相対レベルと比較して決定される。別の態様において、百分率は、約５０％のナノ粒子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含み、約５０％がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９を含む。
【００２５】
[0025]  一側面において、本発明は、本発明に従う組成物を調製するための方法を提供し、その方法は、以下の工程を含む：ｉ）生理活性薬剤を凝縮剤と複合体化して凝縮した生理活性薬剤を形成し；ｉｉ）凝縮した生理活性薬剤を６．０未満のＨＬＢを有する界面活性剤を含む水混和性溶媒中に分散させて界面活性剤ミセルを形成し；ｉｉｉ）リガンドを界面活性剤ミセルの外部表面に吸着させてリガンドで安定化された粒子（リガンド粒子としても知られている）を形成し；そしてｉｖ）リガンド粒子をＣｓ＋で前処理されたＬｉ＋および滅菌水と混合してインキュベートして組成物を形成する。
【００２６】
[0026]  別途定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明を実施または試験するための適切な方法および材料は、下記で提供されるが、当業者は、本明細書で記載される方法および材料に類似した、またはそれと均等な他の方法および材料が、本発明の実施または試験において用いられることができることを、認識しているであろう。加えて、本明細書で繰り返し述べられる材料、方法、および例は、単に説明的なものであり、限定的であることは意図されていない。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
[0027]  ナノ粒子
[0028]  一側面において、本発明は、生理活性薬剤の特定の組織および細胞への標的化された送達のための安定なナノ粒子を提供する。本発明のナノ粒子は、リガンドコーティングまたはシェルおよび５０ナノメートル未満の平均直径を有し、生理活性薬剤カーゴの体の生物学的障壁を通した送達および／または対象の細胞もしくは組織中への送達を可能にする。
【００２８】
[0029]  本明細書で用いられる際、“サブ−５０ｎｍナノ粒子”は、一般にナノ粒子の組成物の文脈において言及され、前記のナノ粒子は、（ｉ）生理活性薬剤および疎水性界面活性剤を含む界面活性剤ミセルならびに（ｉｉ）リガンドを含むシェルを含み、約５０ナノメートル未満の平均直径を有する。特定の態様において、本発明に従う組成物のナノ
粒子は、約５〜約５０ナノメートル、約５〜約４０ナノメートル、約５〜約３０ナノメートル、約５〜約２０ナノメートル、約１０〜約４０ナノメートル、約１０〜約３０ナノメートル、または約１０〜約２０ナノメートルの平均直径を有する。
【００２９】
[0030]  本明細書で用いられる際、用語“シェル”は、一般にナノ粒子の外部または外側のシェルを指し、コーティングまたはコロナの層を含み、それは、コア界面活性剤ミセルの外側表面の少なくとも一部を取り囲んでいる。一態様において、シェルは、１以上のリガンドを含む。ナノ粒子の所与の配合物または組成物（本明細書において互換的に用いられている）に関して、不十分な重量のリガンドの組み込みは、典型的には結果として例えば不規則な薬物凝縮体または融合したミセルにより示される不均一な粒子をもたらすと考えられ、一方で、過剰な重量のリガンドは、典型的には、大質量または例えば、例えばＴＥＭもしくはＡＦＭ顕微鏡写真の分析により決定されるような細長い構造により示される球状もしくは立方体の形状の喪失をもたらすであろう。当業者は、一度本開示を用いて武装すると、過度の実験操作なしで、本発明のナノ粒子における組み込みのためのリガンドを同定、調製および利用することができるであろう。
【００３０】
[0031]  一側面において、本発明は、生理活性薬剤を含むナノ粒子を含む組成物を提供する。当業者は、句“（ある特定の特徴、特性等）を含むナノ粒子を含む組成物”は、組成物の複数のナノ粒子がその特定の特徴、特性等を含むことを示すことを理解しているであろう。
【００３１】
[0032]  一態様において、ナノ粒子は、滅菌水を用いて調製される。用語“調製される”、“合成される”、“作成される”、“製造される”等は、本明細書において互換的に用いられている。句“滅菌水を用いて調製されたナノ粒子（ナノ粒子は滅菌水を用いて調製される）”は、本明細書で用いられる際、本発明のナノ粒子の合成において用いられる塩を受け入れる溶液が、滅菌水を用いて調製されることを意味する。当業者は、最終的な塩を受け入れる溶液の調製におけるあらゆる工程（単数または複数）において添加される滅菌水の体積は、合計で最終的な塩を受け入れる溶液の総水体積の少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％を含むことを理解しているであろう。この文脈において、“最終的な塩を受け入れる溶液”は、リガンドで安定化されたナノ粒子の添加前の溶液を指す。この枠組み内で、他のグレードの水が、例えば塩を受け入れる溶液に添加される賦形剤のためのストック溶液として用いられることができる。句“滅菌水を用いて調製されたナノ粒子”および“滅菌水を含む塩を受け入れる溶液”は、滅菌水が最終的な塩を受け入れる溶液の総水体積の約８０％〜１００％を占めることを意図している。“滅菌水”は、“滅菌水を用いて調製されたナノ粒子”および“滅菌水を含む塩を受け入れる溶液”の文脈において用いられる際、以下の金属のレベルが合計で約０．２百万分率より多くない水を指す：アルミニウム、ヒ素、バリウム、カドミウム、クロム、銅、鉄、鉛、マンガン（ｍａｇｎａｎｅｓｅ）、ニッケル、ルビジウム（ｒｕｂｉｎｉｕｍ）、硫黄、バナジウム、および亜鉛。一態様において、“滅菌水”は、以下の金属のレベルが合計で約０．１百万分率より多くない水を指す：アルミニウム、ヒ素、バリウム、カドミウム、クロム、銅、鉄、鉛、マンガン（ｍａｇｎａｎｅｓｅ）、ニッケル、ルビジウム（ｒｕｂｉｎｉｕｍ）、硫黄、バナジウム、および亜鉛。この枠組みにおいて、それぞれの金属のレベルおよび金属の合計のレベルは、方法検出限界（ＭＤＬ）に至るまで下がることが報告された結果に基づいている。金属試験は、例えば米国環境保護庁の方法６０１０および６０２０のような利用可能な方法に従って実施されることができる。
【００３２】
[0033]  ある態様において、高純度の水、例えば滅菌水の使用は、医薬製品の規制基準を満たすために必要とされる。ある態様において、滅菌水の使用は、例えば透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）または原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）により決定されるようなナノ粒子の
特徴、例えば大きさ、形状、安定性、および機能性を変化させ得る混入物のレベルを低減することによりナノ粒子の製造の制御を向上させるために望ましい。ある態様において、滅菌水の使用は、賦形剤のような成分が大きさ、形状、安定性、および機能性のようなナノ粒子の特徴を向上させるために添加されることができる一貫した（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ）基剤を提供することによりナノ粒子の製造の制御を向上させるために望ましい。当業者は、医薬研究、開発、および製造における水の試験、グレード、および使用に関する方法および手引き、例えば米国薬局方および類似の組織により作成された方法および手引きが入手可能であることも、理解しているであろう。
【００３３】
[0034]  一態様において、用いられる滅菌水は、医薬グレードの水である。別の態様において、滅菌水は、薬学的に許容可能な療法用ナノ粒子を調製するために用いられる。句“薬学的に許容可能な”は、本明細書において、適切な医学的判断の範囲内で過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは厄介な問題を伴わずに対象の組織と接触する使用に適しており、合理的な便益／リスク比と釣り合う化合物、材料、組成物、および／または剤形を指して用いられている。一態様において、滅菌水は、ナノ粒子調製プロセスにおける他の工程、例えば塩を受け入れる溶液の組み立てにおいて、またはナノ粒子の１以上の構成要素の調製においてそれらを塩を受け入れる溶液に添加する前に用いられるあらゆる試薬の溶液調製においても用いられる。
【００３４】
[0035]  一態様において、ナノ粒子は、リチウムイオン（Ｌｉ＋）およびセシウムイオン（Ｃｓ＋）を含む。別の態様において、ナノ粒子は、Ｃｓ＋で前処理されているＬｉ＋を含む。句“Ｃｓ＋で前処理されたＬｉ＋”および類似の句は、本明細書で用いられる際、Ｌｉ＋およびＣｓ＋イオンを予め混合した、または接触させた後、前記の予め混合した、または接触させたイオンを、塩を受け入れる溶液を調製するために用いられた、または用いられるであろう滅菌水の量と合わせることを指す。前処理工程におけるＬｉ＋の濃度は、典型的には少なくとも１Ｍであるべきである。一態様において、濃度は２Ｍである。一態様において、濃度は３Ｍである。一態様において、濃度は３〜５Ｍである。一態様において、濃度は４Ｍである。一態様において、濃度は５Ｍである。一態様において、ナノ粒子を形成するために用いられる塩を受け入れる槽へのＬｉ＋の添加前のＬｉ＋のイオンによる前処理は、Ｃｓ＋イオンに限定される。前記の態様において、前処理イオンのＣｓ＋への限定は、プレミックスに添加される他のイオンを明確に排除することが意図されているが、Ｌｉ＋をＣｓ＋により前処理するために用いられる水源中に存在し得る他のイオンを排除することは意図されていないことは、理解されている。Ｌｉ＋およびＣｓ＋イオンの予備混合または接触は、本明細書で開示および意図される目的に関して、イオンの水、例えば滅菌水中における所望の濃度での単純な混合を含め、当業者に既知のイオンおよび類似の分子を組み合わせるための方法に従って容易に実施されることができる。一態様において、約０．１μｇ／１ｍｌでのＣｓ＋が、約４ＭのＬｉ＋に、重量によりＬｉ＋に対して約２．５ｐｐｂのＣｓ＋で、５０ｍｌチューブ中で滅菌水中で添加され、約２分間回転させられる。当業者は、用いられるＣｓ＋のＬｉ＋に対する比率および／または５０ｍｌチューブ中の例えば滅菌水中の組み合わせられるイオンの濃度は、その後生成されるナノ粒子の形態または安定性または一部の他の特徴を操作するためにルーチン的に変更されることができることを、理解しているであろう。
【００３５】
[0036]  別の態様において、Ｃｓ＋は、Ｌｉ＋と約０．１〜約１００十億分率（ｐｐｂ）の比率で予備混合される。さらに別の態様において、予備混合比率は、約０．１〜約５ｐｐｂである。さらに別の態様において、予備混合比率は、約１〜約４ｐｐｂである。これらの範囲のそれぞれは、その範囲内の部分範囲を含む。例えば、約１〜約４ｐｐｂは、以下のような範囲を含む：約１．２〜約２．５ｐｐｂ、約２〜約４ｐｐｂ等。驚くべきことに、滅菌水を用いて調製されたナノ粒子に関して、Ｌｉ＋と予備混合されたＣｓ＋を用いて配合された粒子は、望ましい球状、立方体状、または楕円形のサブ−５０ナノメート
ルナノ粒子を形成したが、単に塩を受け入れる溶液中で混合しただけで予備混合しなかったＣｓ＋およびＬｉ＋を用いて配合された粒子は、一般に使用に適さない解けた（ｕｎｗｏｕｎｄ）長い棒様の組成物を形成した。当業者は、一度本開示を用いて武装すると、ルーチン的な実験法により、標的化されたナノ粒子のためのＣｓ＋およびＬｉ＋の予備混合物を同定、調製および利用することができるであろう。
【００３６】
[0037]  開示されたナノ粒子は、所与の標的、例えば所与の組織または細胞標的に関して、標的化部分をナノ粒子にキレートさせる、コンジュゲートさせる、または共有結合させる工程を用いずに容易に合成されることができる。当業者は、意図される標的ならびに当該技術で既知の方法および組成物に基づく標的化部分の賢明な選択により、本発明のナノ粒子は、生理活性薬剤を予め決定された標的組織および細胞に送達することができることを、理解しているであろう。
【００３７】
[0038]  一態様において、シェルは、リガンドを含む。用語“リガンド”は、本明細書で用いられる際、標的受容体に結合する物質を指す。ある態様において、リガンドは、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、抗体、もしくは生体適合性ポリマー、またはその断片、または小分子を含む。一態様において、サブ−５０ｎｍナノ粒子は、少なくとも１種類の組織または細胞特異的リガンドでコートされている。“コートされたナノ粒子”は、リガンドがコア界面活性剤ミセルに非共有結合的会合により結合しているナノ粒子を指す。本発明のナノ粒子に関するリガンド選択肢の柔軟性は、部分的に、リガンドをナノ粒子にキレート形成、コンジュゲーション、または共有結合により結合させるような複雑な工程が存在せず、代わりに、リガンドを疎水性のミセル表面に吸着させ、続いて標的化された粒子を塩結晶化溶液中で安定化させる単純な工程を用いることにより可能になる。従って、例えば、リガンドのコア界面活性剤ミセルへの吸着は、リガンドがコア粒子にコンジュゲートまたはキレートされるナノ粒子よりも大きいリガンドのより効率的な組み込みを可能にする。例えばテンフィブゲン、ヒアルロナン、および合成ポリマー、例えばＰＶＰを含む多様なリガンドが、本発明のＣｓ＋処理されたナノ粒子の配合においてリガンドとして利用されることができる。例えば、ＰＶＰを含む粒子は、４μｌの２５ｋＤ  ＰＥＩを凝縮剤（ｃｏｎｄｅｎｓｅｒ）として、３．３μｇの１０ｋＤ  ＰＶＰをコアミセルに吸着させるリガンドとして用いて、受け入れ槽を１．５ｎＭ  Ｍｇ２＋および１．８８ｎＭ  Ｓｒ２＋に修正する（全ての他のイオンは同じである）ことを除いて、５．５ｋｂのプラスミドに関する配合物Ｊ（実施例、下記）と同様に配合されるであろう。
【００３８】
[0039]  一態様において、リガンドは、テネイシン受容体を有する細胞を標的とする。別の態様において、リガンドは、テンフィブゲンである。
[0040]  さらに別の態様において、リガンドは、ヒアルロナンである。
【００３９】
[0041]  一側面において、本発明は、生理活性薬剤を標的に送達する、または生理活性薬剤を対象に投与するためのシステムを提供する。一態様において、システムは、少なくとも１種類の生理活性薬剤、例えばポリヌクレオチド、６．０単位未満のＨＬＢ値を有する界面活性剤、リガンド、ならびにＬｉ＋およびＣｓ＋を含み、それは少なくとも１種類の生理活性薬剤を標的に送達する、または少なくとも１種類の生理活性薬剤を対象に投与するために用いられるべきサブ−５０ナノメートルナノ粒子において組み立てられるべきである。用語“システム”は、本明細書で用いられる際、対象の体における生理活性薬剤の導入を可能にし、その有効性または性能を向上させる配合物または組成物を指す。
【００４０】
[0042]  一態様において、本ナノ粒子は、遺伝子発現を調節して特定の遺伝子産物（例えばタンパク質またはＲＮＡ）の産生を増大または低下させるために有用な生理活性薬剤（単数または複数）を組み込む。別の態様において、生理活性薬剤（単数または複数）は
、ＲＮアーゼＨ、ＲＮＡｉ、およびｄｓＲＮＡ酵素のような作用機序、ならびに標的の分解または標的の占有に基づく他の調節機序と連動する（ｅｎｇａｇｅ（ｓ））。
【００４１】
[0043]  生理活性薬剤
[0044]  本発明のＣｓ処理されたナノ粒子は、生理活性薬剤を担持して標的とされる組織および細胞に送達するために用いられることができる。句“生理活性薬剤（単数または複数）”は、本明細書で用いられる際、細胞、組織、または器官に投与または送達された際に、その細胞、組織、または器官の１以上の生理学的、生化学的、または病理学的プロセスを真似る、変化させる、または調節する１種類以上の薬剤を指す。好ましくは、その変化または調節は、医学的に望ましい変化または調節である。より具体的には、生理活性薬剤は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、アンチセンス分子、またはリボザイムを含むがそれらに限定されないあらゆる核酸ベースの分子、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、抗体または小分子のような生理活性薬剤を含むがそれらに限定されないイメージングまたはモニタリングまたは療法的もしくは予防的使用を含む目的のためのいくつかの異なる化合物または分子のあらゆる１以上であることができる。
【００４２】
[0045]  理論により束縛されることを望むわけではないが、生理活性剤の選択肢の柔軟性は、部分的に、ナノ粒子のコアを形成する疎水性界面活性剤でコートされたミセルの特徴を分割および凝縮させることにより可能になる。当業者は、これらの特徴を、本発明のナノ粒子をオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、アンチセンス分子、またはリボザイムを含むあらゆる核酸ベースの分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、抗体、または他のカーゴ、より好ましくは（排他的にではないが）親水性および／または負にもしくはおおよそ中性に荷電したカーゴを用いて配合する目的に関して適切および機能的であるものとして認識するであろう。異なる配合物におけるある範囲の生理活性薬剤の組み込みに関する本発明のナノ粒子のこの柔軟性は、例えば、結果として生じる２２．７ナノメートルの平均直径および−６．４ｍｅｖの電荷を伴う１０．５ｋｂのプラスミドＤＮＡおよびヒアルロナンナノ粒子シェルの配合ならびに結果として生じる１９．５ナノメートルの平均直径および−５．８ｍｅｖの電荷を伴う６８００ダルトンの一本鎖オリゴヌクレオチドおよびテンフィブゲンナノ粒子シェルの配合により実証される（実施例参照）。
【００４３】
[0046]  従って、他の多様な生理活性薬剤が、ルーチン的な実験法によりセシウムで前処理されたナノ粒子中に組み込まれることができる。例えば、小分子エリトリトール（分子量１２２）は、一切の凝縮剤なしの５００μｇのエリトリトールが８．７５μｇの界面活性剤によりミセル化され、５．５ｍｃｇのＴＢＧによりコートされ、６．２５ｎＭのＭｇ２＋および９．３８ｎＭのＳｒ２＋により改変された（全ての他のイオンは同じである）受け入れ槽中に噴霧されるであろうことを除いて、配合Ａ（実施例）に類似して配合されるであろう。結果として生じるナノ粒子の大きさは、直径おおよそ２５ｎｍであると考えられ、表面電荷は、おおよそ−１２ｍｅｖであろう。
【００４４】
[0047]  句“疎水性界面活性剤でコートされた”は、本明細書で用いられる際、界面活性剤ミセルを形成するために用いられる疎水性界面活性剤のコーティングまたは層を指し、それは、生理活性薬剤の少なくとも一部および任意の凝縮剤を取り囲んでいる。所与の配合物に関して、不十分な界面活性剤の組み込みは、典型的には不規則な薬物凝縮体をもたらすと考えられ、一方で過剰な界面活性剤は、典型的には例えばＴＥＭまたはＡＦＭ顕微鏡写真の分析により決定されるような界面活性剤の小球体をもたらすであろう。特定の態様において、生理活性薬剤は、一本鎖キメラオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレ
オチドを含む生理活性薬剤は、一般に当該技術で周知の技法を用いて調製されるが、商業的な製造業者から得られることもできる。
【００４５】
[0048]  一態様において、生理活性薬剤は、分子標的に対する複数の生理活性薬剤である。別の態様において、生理活性薬剤は、異なる分子標的および／または作用機序を有する２種類以上の生理活性薬剤の混合物を含む。
【００４６】
[0049]  ある態様において、生理活性薬剤は、ポリエチレンイミン、ポリオルニチン、ポリアルギニン、スペルミン、または当該技術で周知の他の陽イオン性凝縮剤（単数または複数）を含む陽イオン性凝縮剤を用いて凝縮させられる。
【００４７】
[0050]  “特異的にハイブリダイズ可能な”および“相補的な”は、安定かつ特異的な結合が本発明のポリヌクレオチドおよび標的ＲＮＡ分子の間で起こるような十分な程度の相補性を示すために用いられている用語である。当該技術において、ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるべきその標的ＲＮＡ分子の配列に対して１００％相補的である必要はないことが、理解されている。当業者は、本明細書で提供される化合物は、標的核酸に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％相補的であることを認識するであろう。ポリヌクレオチドは、（ａ）ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡ分子への結合が標的ＲＮＡ分子の正常な機能に干渉し、かつ（ｂ）特異的結合が望まれる条件下、すなわちインビトロアッセイが実施される条件下、またはインビボアッセイもしくは療法的使用に関する生理的条件下において、ポリヌクレオチドの標的ＲＮＡ分子への結合が高度に選択的であり、かつそのポリヌクレオチドの非標的配列への非特異的結合をおおむね回避するように、十分な相補性が存在する場合、特異的にハイブリダイズ可能である。本発明において有用であるために十分に相補的であるオリゴヌクレオチドを設計するための方法の例およびそのような設計技術は、当業者の理解の範囲内である。
【００４８】
[0051]  用語“ＲＮＡ”または“ＲＮＡ分子”または“リボ核酸分子”は、リボヌクレオチドのポリマーを指す。“標的ＲＮＡ”は、本発明の十分に相補的なポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるあらゆるＲＮＡを指す。標的ＲＮＡは、限定ではなく、プレ−ｍＲＮＡ、プレ−ｍｉＲＮＡ、プリ−ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、低分子核または細胞質ゾル性非コード調節ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、ｍＲＮＡプロセシング経路におけるあらゆる段階のｈｎＲＮＡ、またはミトコンドリアＲＮＡを含むことができる。“ｍＲＮＡ”または“メッセンジャーＲＮＡ”は、１以上のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を指定する一本鎖ＲＮＡである。一態様において、本発明の標的ｍＲＮＡは、細胞タンパク質（例えば核、細胞質、ミトコンドリア、膜貫通、または膜結合タンパク質）のアミノ酸配列を指定する。別の態様において、本発明の標的ｍＲＮＡは、細胞外タンパク質（例えば細胞外マトリックスタンパク質または分泌タンパク質）のアミノ酸配列を指定する。用語“ＤＮＡ”または“ＤＮＡ分子”または“デオキシリボ核酸分子”は、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。
【００４９】
[0052]  用語“核酸分子”または“ポリヌクレオチド”は、１ヌクレオチドより多くのＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むがそれらに限定されないあらゆる核酸含有分子を指し、それは一本鎖、二本鎖、または多鎖形態のいずれでもよい。その用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基類似体のいずれかを含む配列を包含する。用語“ポリヌクレオチド”は、２’−デオキシ−Ｄ−リボースもしくはその修飾形態、ＲＮＡおよびプリンもしくはピリミジン塩基のＮ−グリコシドもしくはＣ−グリコシドであるあらゆる他のタイプのポリヌクレオチド、または修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基もしくは塩基性ヌクレオチドを含有するポリデオキシリボヌクレオチドを包含することも意味されている。ポリ
ヌクレオチドは、ある態様において、プロモーター領域、オペレーター領域、構造領域、終結領域、その組み合わせ、またはクロマチンもしくは他のポリヌクレオチドを制御もしくは修飾するあらゆる他の遺伝子的に関連する物質をコードしていることができる。同様に、用語“遺伝子的”は、本明細書で用いられる際、遺伝子発現を改変することができるあらゆる物質を指す。
【００５０】
[0053]  用語“オリゴヌクレオチド”は、短い長さの一本鎖ポリヌクレオチド鎖を指す。オリゴヌクレオチドは、典型的には２００残基長未満（例えば約８〜１００）である。用語“ポリヌクレオチド”および“オリゴヌクレオチド”は、本明細書において互換的に用いられている。
【００５１】
[0054]  本明細書で用いられる際、“遺伝子サイレンシング”、“遺伝子サイレンシング分子”、“遺伝子サイレンシング化合物”等は、ポリヌクレオチドであって、少なくともその一部が少なくとも部分的にそれがハイブリダイズする標的核酸に相補的であるポリヌクレオチドを指す。特定の態様において、遺伝子サイレンシング化合物は、標的核酸の発現または量を調節する（例えば低下させる）。特定の態様において、遺伝子サイレンシング化合物は、標的プレ−ｍＲＮＡのスプライシングを変化させ、結果として異なるスプライスバリアントをもたらす。特定の態様において、アンチセンス化合物は、１以上の異なる標的タンパク質の発現を調節する。本明細書で意図される遺伝子サイレンシングの機序は、ＲＮアーゼＨ機序、ＲＮＡｉ機序、スプライシング調節、翻訳停止、ＲＮＡプロセシングの変更、マイクロＲＮＡの機能の阻害、およびマイクロＲＮＡの機能の模倣、ならびに当業者が本開示を読んだ際に同定可能な追加の機序を含むが、それらに限定されない。
【００５２】
[0055]  用語“低分子干渉ＲＮＡ（“ｓｉＲＮＡ”）（当該技術において“短鎖干渉ＲＮＡ”とも呼ばれる）は、ＲＮＡ干渉を方向付けまたは媒介することができる約１０〜５０ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含むＲＮＡ（またはＲＮＡ類似体）を指す。本明細書で用いられる際、用語“ＲＮＡ干渉”（“ＲＮＡｉ”）は、ＲＮＡの選択的な細胞内分解を指す。ある態様において、生理活性薬剤は、二本鎖ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドである。
【００５３】
[0056]  本明細書で用いられる際、“発現”は、遺伝子が最終的にタンパク質をもたらすプロセスを指す。発現は、転写、スプライシング、転写後修飾、および翻訳を含むが、それらに限定されない。
【００５４】
[0057]  用語“遺伝子”は、ポリペプチド、前駆体、またはＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および他のｎｃＲＮＡ）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えばＤＮＡ）配列を指す。ポリペプチドは、完全長または断片の所望の活性または機能的特性（例えば酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性等）が保持されている限り、完全長コード配列により、またはコード配列のあらゆる部分によりコードされることができる。
【００５５】
[0058]  用語“遺伝子発現”は、遺伝子にコードされている遺伝情報を遺伝子の“転写”により（すなわちＲＮＡポリメラーゼの酵素作用により）ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｓｎＲＮＡ）に変換し、タンパク質をコードする遺伝子に関してはｍＲＮＡの“翻訳”によりタンパク質に変換するプロセスを指す。遺伝子発現は、そのプロセスにおける多くの段階で制御され得る。“上方制御”または“活性化”は、遺伝子発現産物（すなわちＲＮＡまたはタンパク質）の産生を増大させる制御を指し、一方で“下方制御”または“抑制”は、産生を低下させる制御を指す。上方制御または下方制御に関わる分子（例えば転写因子）は、しばしばそれぞれ“活性化因子”および“抑制因子
”と呼ばれる。
【００５６】
[0059]  用語“遺伝子発現の阻害”は、本発明のポリヌクレオチドが標的ＲＮＡにハイブリダイズして前記の遺伝子の機能の部分的または完全な喪失を提供する状態を指す。ポリヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるべきその標的ＲＮＡ配列に対して１００％相補的である必要はないことが、理解されている。特定の態様において、本発明の二機能性キメラ一本鎖ポリヌクレオチドの非存在下での発現のレベルと比較した少なくとも約１０％、２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の標的遺伝子発現の低減が望ましい。本発明は、特定の遺伝子の発現の阻害に限定されない。
【００５７】
[0060]  用語“ヌクレオシド”は、リボースまたはデオキシリボース糖に共有結合したプリンまたはピリミジン塩基を有する分子を指す。典型的なヌクレオシドは、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジンおよびチミジンを含む。用語“ヌクレオチド”は、糖部分にエステル結合で連結された１個以上のホスフェート基を有するヌクレオシドを指す。典型的なヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸、二リン酸および三リン酸を含む。用語“ポリヌクレオチド”および“核酸分子”は、本明細書において互換的に用いられ、ヌクレオチドのポリマーを指し、本発明の一態様において、糖部分の５’および３’炭素原子間でホスホジエステル結合により一緒に連結されている。
【００５８】
[0061]  用語“ヌクレオチド類似体”または“変化したヌクレオチド”または“改変ヌクレオチド”は、天然および非天然存在リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含め、あまり一般的に存在しないヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、あらゆる位置において、ヌクレオチドの特定の化学的特性を変化させてなおそのヌクレオチド類似体のその意図される機能を実施する能力を保持するように改変されることができる。ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの糖部分に対する改変も含み得る。ヌクレオチドのホスフェート基も、例えばホスフェート基の酸素の１個以上を硫黄で置換することにより（例えばホスホロチオエート類）、またはヌクレオチドがその意図される機能を実施することを可能にする他の置換を行うことにより、改変されることができる。
【００５９】
[0062]  本発明の化合物のヌクレオシド構造サブユニットの調製における使用に関して、これらのヌクレオシドサブユニットにおける組み込みのための適切な核酸塩基は、プリン類およびピリミジン類、例えばアデニン、グアニン、シトシン、ウリジン、およびチミン、ならびに他の合成および天然核酸塩基、例えばキサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニン類およびグアニン類、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシル類およびシトシン類、７−メチルグアニンを含む。さらなるプリン類およびピリミジン類は、米国特許第３，６８７，８０８号において開示されているプリン類およびピリミジン類、Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 858-859ページ, Kroschwitz, J. I., 編者 John Wiley & Sons, 1990において開示されているプリン類およびピリミジン類、ならびにEnglisch, et al. 1991 Angewandte Chemie, International Edition 30:613により開示されているプリン類およびピリミジン類（全て参照により本明細書に援用される）を含む。
【００６０】
[0063]  “ホスホジエステル”は、連続したヌクレオチドを連結する酸素原子を有するポリヌクレオチドを指す。“ホスホロチオエート”は、通常は２個の連続するヌクレオチドを連結している酸素原子が硫黄により置き換えられており、細胞性酵素による分解に抵
抗するポリヌクレオチドを指す。本発明のポリヌクレオチドは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または−５’）チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート類（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎａｔｅｓ）、３’−（または−５’）デオキシホスフィネート類、ボラノホスフェート類、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または５’−）アミノホスホロアミダイト類、水素ホスホネート類、ボラノホスフェートエステル類、ホスホロアミデート類、アルキルまたはアリールホスホネート類およびホスホトリエステルリン結合を含むリストからのリン結合により連結されたそれらのヌクレオシドサブユニットを有する。増大した安定性のためのヌクレオシド結合のホスホロチオエート改変は、サイレンシング活性に最低限にしか影響を及ぼさないことが報告されている(2007 Nat Rev Mol Cell Biol 8:23-6)。一態様において、ＰＳ／２−Ｏ−Ｍｅを含む主鎖は、ＰＯ／２−Ｏ−Ｍｅが限定
されると思われる状況において価値がある可能性がある。
【００６１】
[0064]  用語“リン酸化された”は、少なくとも１つのホスフェート基が化学（例えば有機）化合物に結合していることを意味する。ホスフェート基は、例えば、以下の反応によりタンパク質に、または糖部分に結合することができる：遊離ヒドロキシル基＋ホスフェート→供与体リン酸エステル結合。天然にあるモノ−、ジ−、またはトリホスフェート基と同じまたは類似の様式で機能するホスフェート基類似体も、本発明の範囲内に含まれることが意図されている。一態様において、本明細書で開示されるキメラポリヌクレオチドは、外因性の５’リン酸化を含む。別の態様において、本明細書で開示されるキメラポリヌクレオチドは、外因性の５’リン酸化を含まない。用語“外因性の５’リン酸化”は、一般に、合成法によって、天然の生物学的プロセスによらずに実施されるリン酸化を指す。
【００６２】
[0065]  “キメラ”は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、および／またはヌクレオチドもしくは類似体がそれらの意図される機能を保持することを可能にするあらゆる他の天然存在もしくは合成結合により連結された天然に存在するかまたはヌクレオチド類似体であるＲＮＡおよびＤＮＡ部分両方で構成される分子を指すが、それらに限定されない。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、少なくとも２個の区分を有するものとして言及されることができる。１つの区分は、ポリヌクレオチドの３’末端において開始する部分として定義され、リボ核酸区分であり、少なくとも約３個の連続するリボヌクレオチドを含むべきであり、そして第２区分は、ポリヌクレオチドの５’末端において終了する部分として定義され、主にデオキシリボ核酸部分であり、少なくとも約６、７、８、９、または１０個のデオキシリボヌクレオチドを含み、ここで、合計で０、１、２、または３個のリボヌクレオチドが、少なくとも約６、７、８、９、または１０個のデオキシリボヌクレオチドの間に配置されていることができる。一態様において、第２区間は、少なくとも５個の連続するデオキシリボヌクレオチドを含む。一態様において、５’末端からの第２部分は、２’−ＯＭｅ修飾ＲＮＡである。
【００６３】
[0066]  本発明に従う好ましい一本鎖キメラポリヌクレオチドは、好ましくは、約８〜約５０ヌクレオシドサブユニットを含む。本発明の文脈において、これは、約８〜５０ヌクレオシドサブユニットを有する本明細書において前に記載されたような非天然存在オリゴマーを包含することは、理解されている。本発明の一本鎖キメラポリヌクレオチドが、約１５〜約２５ヌクレオシドサブユニットを含むことは、より好ましい。従って、一本鎖キメラポリヌクレオチドは、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長、２７ヌクレオチド長、２８ヌクレオチド長、２９ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長
、３１ヌクレオチド長、３２ヌクレオチド長、３３ヌクレオチド長、３４ヌクレオチド長、３５ヌクレオチド長、３６ヌクレオチド長、３７ヌクレオチド長、３８ヌクレオチド長、３９ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、４１ヌクレオチド長、４２ヌクレオチド長、４３ヌクレオチド長、４４ヌクレオチド長、４５ヌクレオチド長、４６ヌクレオチド長、４７ヌクレオチド長、４８ヌクレオチド長、４９ヌクレオチド長、または５０ヌクレオチド長であることができる。理解されるであろうように、“ヌクレオシドサブユニット”は、オリゴリボヌクレオチド中でリン結合を通して、およびオリゴリボヌクレオシド中で非リン結合を通して隣接するサブユニットに適切に結合した核酸塩基および糖または糖代替物の組み合わせである。この文脈において、用語“ヌクレオシドサブユニット”は、用語“ヌクレオシド単位”または“ヌクレオシド”と互換的に用いられている。より好ましくは、本発明のキメラオリゴヌクレオチドは、天然存在ホスホジエステル結合により連結されたヌクレオシドを有するであろう。
【００６４】
[0067]  特定の態様において、生理活性薬剤は、一本鎖ポリヌクレオチドであり、そのポリヌクレオチドは、標準的な最適化ｓｉＲＮＡ技法から獲得されたガイド鎖である。従来のｓｉＲＮＡ配列選択の論考が、本明細書に含まれている。
【００６５】
[0068]  ｓｉＲＮＡにより導かれる標的ＲＮＡ切断反応は、高度に配列特異的である。一般に、標的遺伝子のヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列の一部と同一のヌクレオチド配列を含有するｓｉＲＮＡが、阻害のために好まれる。しかし、ｓｉＲＮＡおよび標的遺伝子の間の１００％の配列同一性は、本発明の実施に必要とされない。従って、本発明は、遺伝子変異、系統の多型、または進化分岐により予想され得る配列のバリエーションを許容することができる利点を有する。例えば、標的配列と比較して挿入、欠失、および単一の点変異を有するｓｉＲＮＡ配列が、阻害に関して有効であることも分かっている。あるいは、ヌクレオチド類似体の置換または挿入を有するｓｉＲＮＡ配列が、阻害に関して有効であり得る。
【００６６】
[0069]  さらに、ｓｉＲＮＡの全ての位置が、標的認識に等しく寄与しているわけではない。ｓｉＲＮＡの中央におけるミスマッチは、最も決定的であり、本質的に標的ＲＮＡの切断を消失させる。対照的に、ｓｉＲＮＡの３’ヌクレオチドは、標的認識の特異性に有意に寄与しない。特に、標的ＲＮＡに相補的であるｓｉＲＮＡ配列（例えばガイド配列）の３’残基は、標的ＲＮＡの切断に重要ではない。
【００６７】
[0070]  配列同一性は、当該技術で既知の配列比較およびアラインメントアルゴリズムにより決定されることができる。２つの核酸配列（または２つのアミノ酸配列）のパーセント同一性を決定するために、配列は、最適比較目的に関してアラインメントされる（例えば、最適なアラインメントのために第１配列または第２配列中にギャップが導入されることができる）。次いで、対応するヌクレオチド（またはアミノ酸）位置におけるヌクレオチド（またはアミノ酸残基）が比較される。第１配列中のある位置が第２配列中の対応する位置と同じ残基により占められている場合、その分子は、その位置において同一である。２つの配列の間のパーセント同一性は、配列により共有される同一な位置の数の関数であり（すなわち、％相同性＝同一な位置の数／位置の総数×１００）、場合により導入されたギャップの数および／または導入されたギャップの長さに関するスコア分のペナルティーを科す（ｐｅｎａｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｃｏｒｅ）。
【００６８】
[0071]  配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて成し遂げられることができる。一態様において、アラインメントは、十分な同一性を有するアラインメントされた配列の特定の部分にわたって生成されるが、低い程度の同一性を有する部分にわたっては生成されない（すなわち局所的アラインメント）。配列の比較のために利用される局所的アラインメントアルゴリズムの好ましい限定的でな
い例は、参照により本明細書に援用されるKarlinおよびAltschulのアルゴリズム（(1990)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68、参照により本明細書に援用されるKarlin and
Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77におけるように修正されたもの；そのようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれている）である。
【００６９】
[0072]  別の態様において、アラインメントは、適当なギャップを導入することにより最適化され、パーセント同一性が、アラインメントされた配列の長さにわたって決定される（すなわちギャップありのアラインメント（ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ））。比較目的のためにギャップありのアラインメントを得るために、Altschul, et al., ((1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402)において記載されているようなギャップありのＢＬＡＳＴが利用されることができる。さらに別の態様において、アラインメントは、適当なギャップを導入することにより最適化され、パーセント同一性が、アラインメントされた配列の全長にわたって決定される（すなわちグローバルアライメント）。配列の包括的な比較のために利用される数学的アルゴリズムの限定的でない例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプロ
グラム（バージョン２．０）中に組み込まれており、それは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティが用いられることができる。
【００７０】
[0073]  ｓｉＲＮＡおよび標的遺伝子の一部の間の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％の配列同一性が好ましい。あるいは、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の転写産物の一部とハイブリダイズ（例えば、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間のハイブリダイゼーション；その後洗浄）することができるヌクレオチド配列（またはオリゴヌクレオチド配列）として機能的に定義されることができる。追加の典型的なハイブリダイゼーション条件は、１×ＳＳＣ中で７０℃もしくは１×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド中で５０℃においてハイブリダイズさせた後０．３×ＳＳＣ中で７０℃において洗浄、または４×ＳＳＣ中で７０℃もしくは４×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド中で５０℃においてハイブリダイズさせた後１×ＳＳＣ中で６７℃において洗浄を含む。長さが５０塩基対未満であると予想されるハイブリッドに関するハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低いべきであり、ここで、Ｔｍは、以下の方程式に従って決定される。長さが１８塩基対未満のハイブリッドに関して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）である。長さが１８〜４９塩基対のハイブリッドに関して、Ｔｍ（（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎは、ハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣに関する［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションに関するストリンジェンシー条件の追加の例が、本明細書に参照により援用されるSambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク
州コールドスプリングハーバー、第９および１１章、ならびにCurrent Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et al., 編者, John Wiley & Sons, Inc., 節２
．１０および６．３−６．４において提供されている。同一のヌクレオチド配列の長さは、少なくとも約１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７、３０、３２、３５、３７、４０、４２、４５、４７または５０塩基であることができる。
【００７１】
[0074]  処理法
[0075]  一側面において、本発明は、固形腫瘍におけるカゼインキナーゼ２の発現を阻害する方法を提供する。本発明の方法は、ポリヌクレオチドを腫瘍に送達する標的化されたナノ粒子を投与することを含み、ここで、ポリヌクレオチドは、カゼインキナーゼ２核酸配列にハイブリダイズしてその発現を低減または阻害する。
【００７２】
[0076]  一側面において、本発明は、固形腫瘍におけるカゼインキナーゼ２の下流の標的の活性を調節する方法を提供する。ある態様において、カゼインキナーゼ２の下流の標的は、限定ではなく、ＮＦ−κＢ  ｐ６５、Ｃｄｃ３７、およびＡＫＴを含む。本発明の方法は、ポリヌクレオチドを腫瘍に送達する標的化されたナノ粒子を投与することを含み、ここで、ポリヌクレオチドは、カゼインキナーゼ２核酸配列にハイブリダイズして下流の標的の活性を低減もしくは阻害し、および／または例えばＫｉ−６７を含むカゼインキナーゼ２活性の下流のマーカーを低減もしくは阻害する。
【００７３】
[0077]  別の側面において、本発明は、対象における固形腫瘍の大きさを低減する、または固形腫瘍の成長を阻害もしくは安定化する方法を提供する。本発明の方法は、ポリヌクレオチドを腫瘍に送達する標的化されたナノ粒子を投与することを含み、ここで、ポリヌクレオチドは、カゼインキナーゼ２核酸配列にハイブリダイズしてその発現を低減または阻害する。特定の態様において、ポリヌクレオチドを腫瘍に送達する標的化されたナノ粒子は、結果として固形腫瘍の大きさにおける低減またはその成長の安定化もしくは阻害をもたらす。
【００７４】
[0078]  本明細書で用いられる際、用語“対象”は、特定の処置の受容者である予定のヒト、非ヒト霊長類、脊椎動物、齧歯類等を含むがそれらに限定されないあらゆる動物（例えば哺乳類）を指す。用語“対象”、“患者”、および“個人”は、本明細書において互換的に用いられている。
【００７５】
[0079]  ある態様において、標的は、インビトロの生物学的系、例えばインビトロの組織または細胞であり、方法は、その標的を本明細書で記載されるナノ粒子と接触させることを含む。
【００７６】
[0080]  一態様において、カゼインキナーゼ２に結合するためのオリゴヌクレオチドは、（標的カゼインキナーゼ２アルファに関して）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８または（標的カゼインキナーゼ２アルファプライムに関して）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９において示されている配列を有する。本発明に従うナノ粒子の組成物の一態様において、ナノ粒子は、複数のポリヌクレオチドを含み、ここで、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含む複数のポリヌクレオチドの百分率は、平均で約１％より大きく約１００％未満、約３０％より大きく７０％未満、約４０％より大きく約６０％未満、約４５％より大きく約５５％未満、約４８％より大きく約５２％未満、約４９％より大きく約５１％未満、または約５０％であり、複数のポリヌクレオチドの残りは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９を含む。それぞれのポリヌクレオチド配列の百分率に影響を及ぼす要因は、例えば、ナノ粒子を配合する際に組み込まれるそれぞれのポリヌクレオチドの相対的な量またはそれぞれのポリヌクレオチドの相対的封入百分率を含む。組成物のポリヌクレオチドの構成は、当該技術で既知のサンプリング法、例えばハイブリダイゼーションアッセイおよび機能的細胞アッセイを用いて決定されることができる。
【００７７】
[0081]  本発明に従うナノ粒子の組成物の一態様において、ナノ粒子の混合物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のどちらかを含むポリヌクレオチドを含む。本発明に従うナノ粒子の組成物の別の態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含むポリヌクレオチドを含むナノ粒子の百分率は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０
％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％であり、組成物のナノ粒子の残りは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９を含むポリヌクレオチドを含む。
【００７８】
[0082]  本発明の方法による処置に関して意図される代表的な腫瘍は、特定の癌と関係する腫瘍を含み、限定ではなく、乳癌、肺癌（非小細胞肺癌を含む）、前立腺癌、結腸直腸癌、脳癌、食道癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮頸癌、頭頸部癌、皮膚癌、鼻咽頭癌、脂肪肉腫、上皮癌、腎細胞癌、胆嚢腺癌、耳下腺腺癌、卵巣癌、黒色腫、リンパ腫、神経膠腫、および間質性肉腫を含む。
【００７９】
[0083]  一態様において、本発明の方法による処置は、固形腫瘍癌を有すると診断された患者への投与を含む。“固形腫瘍”は、本明細書で用いられる際、細胞の増殖の結果もたらされる組織の異常な塊を指す。固形腫瘍は、体のあらゆる部分で生じる可能性があり、良性（非癌性）または悪性（癌性）である可能性がある。白血病以外のほとんどのタイプの癌は、固形腫瘍を形成し得る。固形腫瘍は、限定ではなく、腺癌、癌腫、血管腫、脂肪肉腫、リンパ腫、黒色腫、および肉腫を含む。句“固形腫瘍”は、子宮内膜症、すなわち細胞の制御されない増殖により引き起こされる病気のような病気を指すためにも用いられることができる。
【００８０】
[0084]  テネイシンは、固形腫瘍の微小環境において過剰発現されていることが示されている大きい糖タンパク質である(Brellier , et al. 2011 J Cell Molec Med 16: 32-40)。テネイシンに関する受容体は、腫瘍細胞上に見られ、テネイシンで方向付けられたリ
ガンドを有する療法用ナノ粒子を用いることにより固形腫瘍癌を処置するための魅力的な標的である。腫瘍細胞上にあるテネイシンに関する受容体の限定的でない例は、インテグリンアルファＶ、アルファ２、ベータ１、およびベータ３を含む。当業者は、一度本開示により武装すれば、過度の実験操作なしで、生理活性薬剤を固形腫瘍に対して標的化および送達する目的のために固形腫瘍に対するテネイシンで方向付けられたリガンドナノ粒子を同定、調製および利用することができるであろう。そのようなテネイシンで方向付けられたリガンドの限定的でない例は、テネイシン−Ｃ、テネイシン−Ｗ、およびテンフィブゲンを含むがそれに限定されないその断片である。
【００８１】
[0085]  一態様において、本発明のナノ粒子組成物は、標的遺伝子の発現の阻害が有用である可能性のあるあらゆる病気を処置するために有用である。別の態様において、組成物は、増殖性疾患を患っている対象を処置するために用いられることができる。“増殖性疾患”により、器官、腔、または体の一部のあらゆる１つまたはあらゆる組み合わせを冒すあらゆるヒトまたは動物の疾患または障害が意味され、それは、良性であれ悪性であれ、細胞、細胞の群、または組織の単一または多数の局所的な異常増殖を特徴とする。
【００８２】
[0086]  用語“処置”、“処置すること”等は、療法、ワクチン、または診断を、１以上の場合において、対象において所望の薬理的および／または生理的作用を得る、または評価する目的のために施すことを意味することが意図されている。作用は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に防ぐ点で予防的であることができ、ならびに／または疾患および／もしくは疾患に帰せられる有害な作用（症状）に関する部分的もしくは完全な治療の点で療法的であることもできる。“処置”は、本明細書で用いられる際、対象における疾患のあらゆる処置を含み、限定ではなく（ａ）疾患にかかりやすい可能性があるがまだそれを有すると診断されていない個人において疾患もしくは病気が生じるのを防ぐこと；（ｂ）疾患を排除もしくは阻害すること（例えばその発達の停止）；または（ｃ）疾患の緩和（例えば疾患と関係する症状の低減または排除）を含むが、それらに限定されない。
【００８３】
[0087]  別の側面において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の少なくとも８個の連
続するヌクレオチドの部分を含む約５０ヌクレオチド長までの一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチドを提供し、ここで、そのｓｓオリゴヌクレオチドは、ヒトカゼインキナーゼ２アルファの発現を阻害する。別の側面において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の少なくとも８個の連続するヌクレオチドの部分を含む約５０ヌクレオチド長までのｓｓオリゴヌクレオチドを提供し、ここで、そのｓｓオリゴヌクレオチドは、ヒトカゼインキナーゼ２アルファプライムの発現を阻害する。
【００８４】
[0088]  投与
[0089]  本発明の療法組成物の配合およびそれらのその後の投与は、本明細書において記載されており、当業者により実施されることができる。一般に、療法に関して、療法を必要とする患者は、本発明に従う組成物を、本明細書の他の箇所において記載されているような投与量および新規の投与戦略において提供される。本発明のある態様において、投与は、患者の体重または体表面積、年齢、および処置されている疾患または障害の重症度の１以上に基づいて決定される。
【００８５】
[0090]  一態様において、対象は、例えばポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物を適切な対照に対して標的遺伝子の発現を低減、安定化、または阻害するために十分な用量で／量で用いて処置される。別の態様において、対象は、一本鎖ポリヌクレオチドを適切な対照に対して標的病変を低減、安定化、または阻害するために十分な用量で／量で用いて処置される。別の態様において、生理活性薬剤（例えばポリヌクレオチド）の用量は、約２０ｍｇ／ｋｇ体重以下、約１０ｍｇ／ｋｇ体重以下、または約５ｍｇ／ｋｇ体重以下である。他の態様において、生理活性薬剤、例えば一本鎖キメラポリヌクレオチドは、約４ｍｇ／ｋｇ体重未満、約３ｍｇ／ｋｇ体重未満、約２ｍｇ／ｋｇ体重未満、約１ｍｇ／ｋｇ体重未満、約１００μｇ／ｋｇ体重未満、約１００ナノグラム（ｎｇ）／ｋｇ体重未満、約１０ｎｇ／ｋｇ体重未満、約１ｎｇ／ｋｇ体重未満、約１００ピコグラム（ｐｇ）／ｋｇ体重未満、約１０ｐｇ／ｋｇ体重未満、約１ｐｇ／ｋｇ体重未満、約１００フェムトグラム（ｆｇ）／ｋｇ体重未満、約１０ｆｇ／ｋｇ体重未満、約１ｆｇ／ｋｇ体重未満、約１００アトグラム（ａｇ）／ｋｇ体重未満、約１０ａｇ／ｋｇ体重未満、または約１ａｇ／ｋｇ体重未満の用量で送達される。同様の投与量範囲が、例えば対象の体表面積に基づいて開発および使用されることができる。
【００８６】
[0091]  処置計画は、特定の疾患の性質、その重症度、および患者の全体的な状態に依存して異なるであろう期間の間継続することができ、１日１回から３０年ごとに１回までに及び得る。処置の後、患者は、彼／彼女の病気における変化に関して、そして疾患または障害状態の症状の軽減に関してモニターされることができる。生理活性薬剤の投与量は、患者が現在の投与量レベルに有意に応答しない場合に増大させることができ、または投与量は、疾患もしくは障害の症状の軽減が観察された場合に、もしくは疾患もしくは障害が切除された場合に減少させることもできる。
【００８７】
[0092]  投与は、数日から数ヵ月まで継続する処置の過程で処置されるべき疾患状態の重症度および応答性に依存し、または治癒が達成される、もしくは疾患もしくは障害の減少が達成されるまでである。最適な投与スケジュールは、例えば、患者の体における生理活性薬剤の蓄積の測定から計算されることができる。当業者は、最適な投与量、投与方法論、および繰返し率を容易に決定することができる。最適な投与量は、個々の化合物の相対的な力価に依存して異なる可能性があり、一般に、例えばインビトロおよびインビボ動物モデルにおいて有効であることが分かったＥＣ５０に基づいて推定されることができる。投与量は、例えば、１日１回以上、週１回以上、月１回以上、もしくは年１回以上、またはさらには２〜３０年ごとに１回与えられることができる。
【００８８】
[0093]  ある態様において、本発明の方法は、値、レベル、特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）、
特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）、特性等を、本明細書において互換的に“適当な（ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ）対照”とも呼ばれる“適切な（ｓｕｉｔａｂｌｅ）対照”に対して比較することを含む工程を含む。“適切な対照”または“適当な対照”は、比較目的のために有用な当業者によく知られるあらゆる対照または標準である。一態様において、“適切な対照”または“適当な対照”は、本明細書で記載されるナノ粒子の組成物を投与する前に決定される値、レベル、特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）、特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）、特性等である。例えば、転写速度、ｍＲＮＡレベル、翻訳速度、タンパク質レベル、生物学的活性、病変の大きさ、細胞の特徴または特性、遺伝子型、表現型等が、本発明のナノ粒子の組成物を細胞または生物中に導入する前に決定されることができる。別の態様において、“適切な対照”または“適当な対照”は、例えば正常な形質を示す細胞または生物、例えば対照または正常細胞または生物において決定される値、レベル、特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）、特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）、特性等である。さらに別の態様において、“適切な対照”または“適当な対照”は、予め定められた値、レベル、特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）、特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）、特性等である。
【００８９】
[0094]  別の側面において、本発明は、本発明に従うナノ粒子の配合された組成物中の療法上有効量の生理活性薬剤をそれを必要とする対象に投与することを含む処置の方法を提供する。例えば生理活性薬剤の“療法上有効量”という用語により、所望の表現型を得ることができる、または所望の療法的機能、例えば疾患もしくは障害（またはそのような疾患もしくは障害の症状）の安定化、減速、低減、排除、もしくは予防を実施することができるような量が、意味される。必要とされる正確な量は、既知の変数、例えば用いられる生理活性薬剤、対象の状態、および療法計画のパラメーターに依存して異なるであろう。従って、正確な“療法上有効量”を明記することは、必ずしも可能ではなく、必要でもない。むしろ、適当な有効量は、当業者によりルーチン的な実験操作を用いて決定されることができる。
【００９０】
[0095]  本発明の組成物は、局所的または全身的処置のどちらが所望されるかおよび処置されるべき領域に応じて、いくつかの経路を経て投与されることができる。投与は、局所的（眼、膣、直腸、鼻内、経皮を含む）、経口、または非経口であることができる。非経口投与は、静脈内、皮下、腹腔内もしくは筋内注射、腫瘍内、または髄腔内もしくは脳室内投与を含むが、それらに限定されない。理論により束縛されることを望むわけではないが、粒子（組成物）投与の選択肢の柔軟性は、部分的に、本発明の組成物の高度に安定なナノ粒子の小さい大きさおよび低い表面電荷により可能になり、それは、粒子およびその薬物カーゴが生物的障壁および大きさの限られた構造、例えば血流壁、リンパ管、および皮膚を横切って細胞および分子標的に到達することを可能にする。
【００９１】
[0096]  本発明の組成物のナノ粒子の“低い表面電荷”は、一般に、約−２０〜約＋４ミリ電子ボルト（ｍｅｖ）の平均表面電荷を意味するが、当業者は、この範囲の外の平均表面電荷を有する本発明のナノ粒子も、ナノ粒子がそれらの球形または楕円形の形状、サブ−５０ナノメートルの大きさ、および結晶化した形態を保持しているならば、なお療法目的のために利用されることができることを、理解しているであろう。
【００９２】
[0097]  一態様において、本発明は、対象において疾患または障害を処置する方法であって、所望の表現型を得る、または所望の機能、例えばそのような疾患もしくは障害（またはそのような疾患もしくは障害の症状）、例えば、限定ではなく、増殖性疾患、例えば、限定ではなく、癌の安定化、減速、低減、もしくは排除を実施する目的のための、対象にその疾患または障害の処置に適した条件下で療法上有効量のナノ粒子組成物を投与することを含む方法を提供し、ここで、ナノ粒子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の混合物を含む生理活性薬剤、約６．０以下のＨＬＢ値を有する界面活性剤を含むミセルコア、ミセルコアに吸着し、テンフィブゲン、Ｌｉ＋およびＣｓ＋を含む
シェルを含み、約５０ナノメートル未満の平均直径を有し、ここで、ナノ粒子は、上記の経路の１以上により投与される。別の態様において、本発明の方法は、Ｌｉ＋のＣｓ＋による前処理を含む。一態様において、本発明のポリヌクレオチドは、標的細胞あたり少なくとも約１、５、１０、５０、１００、５００、または５０００ポリヌクレオチドの送達を可能にする量で導入されることができる。
【００９３】
[0098]  以下の記載は、本発明の利益および利点の一部を下記の実施例において記載される研究に基づいて説明する。滅菌水およびＬｉ＋で前処理されたＣｓ＋で作られ、２Ｒ改変抗ＣＫ２  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９を含むオリゴヌクレオチドの混合物を封入する安定なテンフィブゲンシェルサブ−５０ナノメートルナノ粒子は、マウスにおける腫瘍成長を３０日の期間にわたって有意に阻害した（表３、下記）。その混合物で処置された腫瘍の分析は、細胞増殖のマーカーであるＫｉ−６７および炎症のマーカーであるＮＦ−κＢの有意な阻害も示した。類似の実験条件下で、ナノ封入された（ｎａｎｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）２Ｒ改変ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のみで処置されたマウスは、対照に対して腫瘍重量およびＮＦ−κＢにおける低減を示したが、その変化は有意ではなく、処置群に関するＫｉ−６７指数は、対照に対して増大した。同様に、ナノ封入された未改変のオリゴヌクレオチド混合物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）のみで処置されたマウスは、腫瘍重量における増大を、Ｋｉ−６７およびＮＦ−κＢにおける小さい変化と共に示した。
【００９４】
[0099]  ナノ粒子の調製
[00100]  標的化されたサブ−５０ナノ粒子を作製するために用いられることができる
方法の以下の記載は、代表的なものであることのみが意図されており、限定することは意図されていない。本明細書に参照により援用される米国特許第６，６３２，６７１号、米国特許第７，７４１，３０４号、および米国特許公開第２０１３／０２６７５７７号は、未改変のナノ粒子の調製を開示している。簡潔には、例えば腫瘍細胞に対して標的化および送達されるべき負に荷電した生理活性薬剤、例えば核酸は、凝縮させてその大きさを約５０ｎｍ以下に低減するためにポリカチオン性ポリマーと複合体形成させることができる。いくつかの異なるポリカチオン性ポリマー（“凝縮”剤または“凝縮性”タンパク質としても知られている）が、用いられることができ、当該技術で周知である(Rolland 1998,
Crit. Rev. Therapeutic Drug Carr. Syst., 15:143-198)。例えば、十分なポリカチオ
ン性凝縮性タンパク質が、負に荷電したカーゴ部分と複合体形成して、負に荷電したカーゴ部分の少なくとも約７５％（例えば、約８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％）を中和することができ、それは、核酸に関して、エチジウム色素排除により測定されることができる（例えば、(1998, J. Controlled Release, 53:289-99)を参照）。単に例として、１２５μｇの１０ｋＤポリオルニチンが、５００μｇの２０塩基長オリゴヌクレオチドを凝縮させるために用いられることができ、または８７．５μｇのスペルミンが、２５０μｇの１４ｋＤ  ｓｉＲＮＡオリゴを凝縮させるために用いられることができる。負電荷を欠く、または正電荷を有するカーゴ部分に関しては、凝縮性ポリカチオン性ポリマーは、必要ではない可能性がある。
【００９５】
[00101]  複合体形成した、または複合体形成していないカーゴ部分の水溶液は、まず
カーゴ部分を生体適合性水混和性溶媒中に反転ミセルまたは逆ミセルの調製に適した生体適合性水不溶性界面活性剤系を用いて分散させることにより封入されることができる。適切な界面活性剤系は、配合の技術分野において両親媒性物質として周知であり、それは、本質的に疎水性であり、約６未満の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）、約２００μＭ未満の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）、または１より大きい臨界充填直径を特徴とする。ある態様において、ＨＬＢは、約５未満である。逆ミセルを調製するのに適した疎水性界面活性剤および疎水性水混和性溶媒は、本明細書に参照により援用されるPashley & Karaman (2004, In Applied Colloid and Surface Chemistry, John Wiley, pp. 60-85)、Rosen (20
04, in Surfactants and Interfacial Phenomena, John Wiley)、The Handbook of Industrial Surfactants (1993, Ash, 編者, Gower Pub)、およびPerry's Chemical Engineer's Handbook (1997, Perry & Green, 第７版, McGraw-Hill Professional)において記載されている。
【００９６】
[00102]  ある態様において、界面活性剤構成要素は、２，４，７，９−テトラメチル
−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭ−ジオール）、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭ−ジオール）、１個以上のアセチレン系ジオール基を有する分子のブレンド、セチルアルコール、またはこれらのいずれかのあらゆる組み合わせであることができる。ある態様において、食品またはＵＳＰグレードの油、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ヒマシ油、またはそれらのあらゆる組み合わせを含む水混和性溶媒が、用いられることができる。一態様において、疎水性界面活性剤は、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭ−ジオール）またはその製剤、例えばＳＥ−３０（Ａｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）であることができ、界面活性剤ミセル量の約０．５重量％までの濃度で用いられ、水混和性溶媒は、ＤＭＳＯであることができる。選択される界面活性剤の濃度は、光学的に透明なナノエマルジョンを調製するために十分であるべきであるが、凝集は過度に大きいナノ粒子をもたらし得るため、凝集を誘導するほどは大きくないべきである。
【００９７】
[00103]  カーゴ部分を担持するミセル（すなわち界面活性剤ミセル）は、１以上の標
的化部分をナノ粒子の水性希釈液と混合することにより、腫瘍標的化部分（例えばテンフィブゲン）でコートされることができる。ある態様において、標的化部分は、標的化部分およびナノ粒子が溶解または分解することが所望される速度を含む要因に応じて、ナノ粒子と約１：５００〜約１：０．１の標的化部分対生理活性薬剤の（重量による）比率で混合されることができる。一態様において、標的化部分対生理活性薬剤の重量比は、約１：９０（すなわち、１／９０ｔｈ）である。一態様において、標的化部分対生理活性薬剤の重量比は、約１：４０である。
【００９８】
[00104]  ナノ粒子リガンドは、最終的なナノ粒子の機能を高めるように設計されたプ
ロセスにより改変されることができる。限定的でない例として、コーティングリガンドは、薬学的に許容可能な重金属を用いて、既知のレベルの重金属で調製された飽和硫酸アンモニウム溶液中でタンパク質を再沈殿させることにより、容易に改変されることができる。タンパク質リガンドの約０．１〜１ｍｇ／ｍｌ溶液の、飽和硫酸アンモニウム溶液と１：１の比率でのインキュベーションが、最も迅速には約４〜３６時間実施された後、金属で改変されたコーティングリガンドを遠心分離により回収する。超高純度の硫酸アンモニウム中の金属濃度は、例えば１０００分の１〜１兆分の１の範囲であることができる。さらなる限定的でない例として、テネイシンポリペプチドは、細胞培養上清から、金属含有硫酸アンモニウムを用いて、酸化的ストレスを促進することが知られている金属がナノ粒子の調製の前にコーティングリガンド上に吸着されるように沈殿させられることができる。
【００９９】
[00105]  リガンドが吸着したナノ粒子を安定化するため、１以上のリガンドによりコ
ートされたナノ粒子の水性懸濁液は、コートされたナノ粒子を沈殿させる、結晶化させる、またはそれとイオン導入的交換（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）することができる金属イオンの水溶液（すなわち“安定化溶液”）中に混合させられることができる。コートされたナノ粒子を形成するために用いられることができる溶質の代表的な限定的でない例は、周期表において列挙されている元素に由来するイオン種を含む。イオンは、水性安定化組成物中に、例えば約１兆分の０．１〜約１モル濃度（Ｍ）の範囲で含まれることができる。コートされたナノ粒子がイオンと十分に接触しているが、過度に大きいナノ粒子をもたらし得る凝集が起こるほど多くはないように、十分な量のイオンが
含まれるべきである。
【０１００】
[00106]  一態様において、安定化（または結晶化または受け入れ）溶液は、約１０ミ
リモル濃度（ｍＭ）のＣａ２＋および約１２６ｍＭのＬｉ＋を含むことができる。超高純度の試薬が安定化溶液において用いられる場合、非常に少量（例えば約１ｍＭ未満）のイオン、例えばＢａ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｓｒ、ＰｂおよびＺｎが、コートされたナノ粒子の安定化を最適化するために添加されることができる。一態様において、ナノ粒子は、滅菌水を用いて調製され、１２６ｍＭのＬｉ＋が、増大した安定性のために２．５ｐｐｂのＣＳ＋で前処理される。一態様において、安定化溶液は、１０ｍＭ  Ｃａ２＋、１２６ｍＭ  Ｌｉ＋（２．５ｐｐｂのＣｓ＋と予め混合されている）、０．０４２ｍＭ  Ｂａ２＋を１４ｎＭ  Ｓｒ２＋、６．２５ｎＭ  Ｍｇ２＋と共に含む（全て超高純度であり、実験室グレードの水を用いて調製されるＳｒ２＋およびＭｇ２＋を除いて全て滅菌水を用いてストック溶液として調製され、全ての金属は、塩化物塩として用いられ、総槽容積は、おおよそ３０ｍｌである）。システムの柔軟性は、本明細書で記載されたリチウムレベルよりも約１０倍低いリチウムレベルで合成された高レベルの細胞取り込みを示すナノ粒子により実証されている（データは示されていない）。当業者は、様々な対イオンが、安定化溶液においてこれらの金属と共に用いられることができる（例えば塩化物、硫酸塩、および硝酸塩）ことを、理解しているであろう。
【０１０１】
[00107]  用語“超高純度”は、塩類および金属を参照して用いられる際、純度約９９
％もしくは９９％より大きい純度または利用可能な最高純度である塩類および金属を指す。当業者は、超高純度の塩類および金属は、一般に商業的に入手可能であること、ならびに、必要である場合、ナノ粒子配合物に対するそのような超高純度物質の含有量におけるバリエーションの変動作用（ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）は、例えば以前の配合物において用いられた他の塩類および金属のベースラインレベルを調節することにより、過度の実験操作なしで取り組まれることができることを、理解しているであろう。例えば、配合物中のバリウムのレベルの低減は、塩化カルシウム二水和物中の不純物のレベルにおける増大を相殺し、配合されたナノ粒子の大きさ、形状、および／または機能を維持することができる。本明細書で用いられる際、“実験室グレードの”塩類および金属は、超高純度ではない塩類および金属を指す。所与の配合のラインに関するナノ粒子の大きさ、形状、および／または機能の一貫性を維持するため、実験室グレードの塩類および金属の使用は、最小限、例えば最終的な塩を受け入れる溶液に添加される塩類および金属の総重量の２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満にされることが推奨される。
【０１０２】
[00108]  一態様において、セシウム（Ｃｓ）で前処理されたリチウムナノ粒子は、Ｃ
ｓで前処理されていないナノ粒子と区別される多形形態を含む。この区別は、例えば、下記の表１において示されるＣｓおよび非Ｃｓナノ粒子間の融点およびＦＴＩＲスペクトルにおける実質的な違いにより証明される。本明細書で用いられる際、用語“多形”および“多形形態”は、化合物または複合体の固体の結晶秩序形態を指す。
【０１０３】
[00109]  対象の化合物の１以上の固体状態形態、例えばナノ粒子は、結晶化により生
成されることができる。１以上の固体状態形態は、化学物質の異なるゲスト分子（すなわち、結晶格子の主要構成要素ではない構成要素）との共結晶化によっても生成されることができる。１以上の固体形態は、元素もしくは元素の組み合わせの超分子集合体中への包含または新規の超分子集合体を生成するための新規の元素もしくは元素の組み合わせの添加により生成されることもできる。
【０１０４】
[00110]  結晶化における現象には、核形成および成長のプロセスがある。結晶の核形
成は、液体、過飽和溶液、飽和蒸気、または非晶質相からの規則正しい固相の形成である。成長は、分子の既存の表面上への堆積により引き起こされる結晶の拡張である。核形成
は、“種”結晶の存在により誘導されることができる。一部の固体粒子は、触媒作用を提供して新しい相の形成に対するエネルギー障壁を低減するために存在する。結晶は、例えば、微量の核形成部位として作用する異物（例えば、不純物または容器の壁の上のかき傷のどちらでもよい）上で始まり得る。核形成は、外的もしくは非化学的手段、例えば結晶化環境の攪拌により、または例えば極小のナノスケールミセルを塩類溶液中に噴霧するプロセスにより観察され得るように開始表面を物理エネルギーと一緒に両方適用することにより促進されることもできる。
【０１０５】
[00111]  実際、化合物の多形および新規形態、例えばナノ粒子は、医薬の技術分野に
おいて、例えば化合物の可溶性、安定性、流動性、扱いやすさ（ｆｒａｃｔａｂｉｌｉｔｙ）、および圧縮性に影響を及ぼすことが知られている(Knapman, K. 2000 Modern Drug Discovery 3: 53-58)。従って、ナノ粒子薬物の新規の多形または高度に関連する構造形
態のどちらの発見も、様々な利点を提供することができる。
【０１０６】
[00112]  多形は、周知の技法、例えば（それらに限定されないが）、示差走査熱量測
定（ＤＳＣ）、熱重量測定（ＴＧＡ）、Ｘ線粉末回折法（ＸＲＰＤ）、単結晶Ｘ線回折測定、振動スペクトル分析、溶液熱量計、固相核磁気共鳴（ＮＭＲ）、赤外（ＩＲ）分光分析、フーリエ変換赤外分光分析（ＦＴＩＲ）、ラマン分光分析、ホットステージ光学顕微鏡法、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、電子結晶解析および定量分析、粒径分析（ＰＳＡ）、表面積分析、可溶性、ならびに溶解の速度を用いて検出、同定、分類、および特性付けされることができる。
【０１０７】
[00113]  本明細書で用いられる際、最初にグラフ形態で生成されたスペクトルまたは
データ（例えば、ＸＲＰＤ、ＩＲ、ＦＴＩＲ、ラマンおよびＮＭＲスペクトル）に関して、別途示されない限り、用語“ピーク”は、当業者がバックグラウンドノイズに帰せられないと認識するであろうピークまたは他の特別な特徴を指す。ピークの位置の解釈または読み取りにおけるいくらかの限定された変動が、ピーク検出における機械および／またはアルゴリズムの変動性により起こり得る。
【０１０８】
[00114]  理論により束縛されることを望むわけではないが、下記の表１において示さ
れている物質科学のデータは、（元素の組み合わせ、すなわちセシウムで処理されたリチウムの形態の）痕跡量のセシウムの添加は、驚くべきことに、本発明のナノ粒子の融点およびＦＴＩＲスペクトルにおける非セシウムナノ粒子と比較した有意な変化を誘導したことを示している。融点における変化は、物理状態における変化に対応する新規の多形形態を示している。表１において示されているデータは、融点における測定された変化を、向上した輸送性能および延長されたバートン（Ｂｕｒｔｏｎ）由来インビトロ放出時間により示されるように、ナノ粒子の安定性における増大と結び付けている。
【０１０９】
[00115]  本明細書の他の箇所で論じられているように、セシウムで処理されたリチウ
ムを用いて配合されたナノ粒子は、大きさおよび形状に関して適切なナノ粒子を形成し（サブ−５０ｎｍの回転楕円形、立方体、または楕円形）、一方で塩を受け入れる槽中で単にリチウムと混合しただけのセシウムを用いて配合されたナノ粒子は、大きさおよび形状に関して適切なナノ粒子を形成しなかった。これは、上記の融点における有意な変化および同時に向上した安定性を誘導したのは、元素の組み合わせ、すなわちセシウムで処理されたリチウムの導入であり、単にセシウムの添加ではないという観察を支持している。
【０１１０】
[00116]  一態様において、疎水性ミセルコア、リガンドシェルおよび封入された生理
活性薬剤を有するＣｓ前処理リチウムサブ−５０ナノメートルナノ粒子は、１０，０００ダルトンより大きい、２０，０００ダルトンより大きい、または３０，０００ダルトンより大きい見かけ分子量の超分子集合体（本明細書においてＣｓ多形ナノ粒子と呼ばれる）
の新規の多形形態を含む。当業者は、例えば、例えばＹａｒｒａ  ３ｕ  ＳＥＣ−２０００、３０ｃｍ×７．８ｍｍカラムおよびＵＶ検出を０．１Ｍリン酸緩衝（ｐＨ７）中０．３Ｍ  ＮａＣｌの移動相と一緒に用いる超高分解能水性サイズ排除クロマトグラフィーのような標準的な方法により、見かけ分子量を決定することができる。
【０１１１】
[00117]  一態様において、セシウムおよびリチウムの元素の組み合わせは、水性環境
中で形成、使用、および／または貯蔵される／され得るＣｓ多形ナノ粒子を生成する。
[00118]  別の態様において、Ｃｓ多形ナノ粒子のリガンドシェルは、テンフィブゲン
を含む。さらに別の態様において、Ｃｓ多形ナノ粒子のリガンドシェルは、ヒアルロナンを含む。
【０１１２】
[00119]  好ましくは可能な限り中性に近い、またはさらにはわずかに負である低い表
面電荷を有し、かつ／またはコンパクトな、もしくはおおよそ回転楕円形、立方体、もしくは楕円形の形状の形態を有するナノ粒子は、最適化された安定性を例示する。加えて、ナノ粒子の安定性を増大させることができるあらゆる他の化合物は、ナノ粒子の最終的な平均直径が例えば約５〜５０ｎｍの範囲であるように、安定化溶液の一部として含めれられることができる。特定の態様において、本発明に従う組成物のナノ粒子は、約５〜約５０ナノメートル、約５〜約４０ナノメートル、約５〜約３０ナノメートル、または５〜約２０ナノメートルの平均直径を有する。
【０１１３】
[00120]  粒径は、例えば塩を受け入れる溶液中の結晶化後のインキュベーション時間
の長さを含むパラメーターのルーチン的な変動により操作されることができる。一態様において、ナノ粒子は、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）により測定される。別の態様において、ナノ粒子は、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）により測定される。別の態様において、ナノ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定される。別の態様において、ナノ粒子は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定される。別の態様において、ナノ粒子は、乾燥状態で当該技術で既知の方法により測定される。別途記載されない限り、平均直径は、本明細書において、乾燥状態で測定されたナノ粒子の長径および短径の平均として表される。一般に、約１０：１、約５：１、または約３：１より大きい平均長対短寸法比を有するナノ粒子の配合物または組成物は、本明細書において意図される使用に適していない。
【０１１４】
[00121]  より一貫したナノ粒子の大きさのため、ナノ粒子は、場合によりノズルを通
して受け入れ溶液中に噴霧されることができる。噴霧は、硬い凝集体を誘発するほど大きな力を用いずにフロック形成した凝集体を解体することができる剪断力をかけるために十分であるべきである。当業者は、特定のノズル直系は、ナノ粒子を噴霧して適切かつ一貫した大きさにするのに適したフィード圧の範囲をもたらすであろうことを、理解しているであろう。一態様において、約１０ｐｓｉ未満のフィード圧を伴う約２５０ミクロン以下のノズル直系は、適切なナノ粒子を生成する。
【０１１５】
[00122]  安定化されたナノ粒子は、最終使用における粒子の溶解または分解に必要と
される、または望ましい時間の長さに応じた変動する時間および温度でインキュベートされることができる。インキュベーション時間は、約８時間〜約７日間に及ぶことができる。ある態様において、ナノ粒子は、丸底チューブ中で４℃において公称回転速度（ｎｏｍｉｎａｌ  ｒｏｔａｔｉｏｎ）を用いて３６〜４８時間インキュベートされる。理論により束縛されることを望むわけではないが、より長いインキュベーション時間は、結果として粒子の大きさおよび安定性の両方を増大させるより高い結晶化をもたらす。ナノ粒子を安定化溶液中で噴霧および／またはインキュベートした後、ナノ粒子は、濾過、遠心分離されて、および／または乾燥させられて、分離した別々のサブ−５０ｎｍナノ粒子を含む組成物を得ることができる。一態様において、ナノ粒子は、４℃において２０，０００×
ｇで２時間遠心分離され、０．２μｍフィルターを通して滅菌濾過される。結果として得られるナノ粒子は、約−２０℃で凍結され、または乾燥させられて、後の使用のために再構成される。キメラポリヌクレオチドとして製造された配列は、場合によりプロピルで３’末端をブロックされている。
【０１１６】
[00123]  一態様において、ナノ粒子は、ナノ粒子を安定化するために典型的に用いら
れるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および類似の種なしで調製される。別の態様において、ナノ粒子は、当該技術で既知の標準的な方法を用いて凍結乾燥され、より低い、同じ、またはより高い濃度で再懸濁されることができる。
【０１１７】
[00124]  本発明は、特にいくつかの態様に関連して示され、記載されてきた。形態お
よび詳細における変化が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく本明細書で開示された様々な態様に対してなされることができること、ならびに本明細書で開示された様々な態様は、特許請求の範囲を限定することを意図されていないことは、当業者により理解されている。
【０１１８】
[00125]  本発明は、以下の実施例においてさらに記載されると考えられ、それは、同
様に、特許請求の範囲において記載される本発明の範囲を限定することを意図されていない。
【実施例】
【０１１９】
[00126]  実施例１−標的化された療法用ナノ粒子の配合。
[00127]  多様なカーゴおよび標的化部分を含む典型的なナノ粒子は、以下のように生
成された。
【０１２０】
[00128]  配合物Ａ：２ｍＬのコニカルチューブ中で、滅菌水（ＨＰＬＣグレード、Ｆ
ｉｓｈｅｒ）中で１ｍｇ／ｍｌの濃度の５００μｇのＣＫ２に対するキメラオリゴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）ポリヌクレオチド（ホスホジエステル３’およびプロピル末端ブロック−２’−ＯＭｅ  ＲＮＡキメラ、“ＬＣＫ−６”（米国特許第７，７４１３０４号、本明細書に参照によりそのまま援用される））を、短時間ボルテックスし、次いで２００μｇの１０ｋＤポリオルニチン（Ｓｉｇｍａ）と複合体形成させ、水不溶性界面活性剤系（ＴＭ−ジオールブレンド（ＳＥ−３０、Ａｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔ）、１０μｇ  ＤＭＳＯ中１０μｇ）を用いて１５０μｌの滅菌水中に分散させた。水混和性溶媒（ＤＭＳＯ）を用いた乳化（１５０μｌのＤＭＳＯを添加することによる）後、ボルテックスし、続いて超音波処理槽中に５分間置き、次いで複合体を反転させ、７００μｌのＰＢＳの添加により希釈した。
【０１２１】
[00129]  結果として得られた疎水性ミセルを、本明細書で記載されたように改変され
たAukhill, et al. (J. Biol Chem., 268:2542-53 (1993))の方法により調製された５．
５μｇのテネイシンの組み換えフィブリノーゲン断片（ＴＢＧ）の添加により（非共有結合的に）コートし、超音波処理槽中に１５分間置き、５ｍｌポリプロピレンチューブに移し、ＰＢＳで３ｍｌまで希釈し、次いで直径おおよそ２５０μｍの開口部を用いる手動のアクチュエーターにより約１０ｐｓｉ未満のフィード圧を用いて主にＬｉ＋を含有する滅菌水の塩を受け入れる溶液（１２６ｍＭ  Ｌｉ＋（Ｌｉ＋上で２．５ｐｐｂ  Ｃｓ＋と予め混合したもの）、１０ｍＭ  Ｃａ２＋、０．０４２ｍＭ  Ｂａ２＋、１４ｎＭ  Ｓｒ２＋、６．２５ｍＭ  Ｍｇ２＋を伴う（全て超高純度であり、実験室グレードの水を用いて調製されるＳｒ２＋およびＭｇ２＋を除いて全て滅菌水を用いてストック溶液として調製され、全ての金属は、塩化物塩として用いられ、総槽容積はおおよそ３０ｍｌである））中に噴霧した。総反応体積は、３６ｍｌであった。安定化溶液を調製するために用いられた滅菌水中の試験された以下の金属のレベルは、合計で０．１百万分率未満であることが
決定された：アルミニウム、ヒ素、バリウム、カドミウム、クロム、銅、鉄、鉛、マンガン、ニッケル、ルビジウム（ｒｕｂｉｎｉｕｍ）、硫黄、バナジウム、および亜鉛。
【０１２２】
[00130]  予備混合工程は、５０ｍｌチューブ中で滅菌水中での約０．１μｇ／１ｍｌ
のＣｓ＋の約４ＭのＬｉ＋への、重量により約２．５ｐｐｍのＣｓ＋のＬｉ＋への添加、および約２分間の回転を含んでいた。低温室における４０ｍｌ丸底チューブ中で公称回転速度での約４８時間のインキュベーション（４℃）（それは塩溶液中でコートされたミセルをさらに安定化した）後、サブ−５０ｎｍナノ粒子を、４℃において２０，０００×ｇで２時間の遠心分離により回収し、ＰＢＳ＋１０％ラクチトール（１μｇ／μｌの濃度のもの）中で再懸濁し、２ｍｌコニカルチューブに移し、最大速度で４℃で５分間遠心沈殿させ、ペレットをＰＢＳ／１０％ラクチトール中で再懸濁し、０．２μｍフィルターを通して滅菌し、−２０℃で凍結させた。
【０１２３】
[00131]  本実施例において記載された全ての配合物において、抗シリアンハムスター
抗体によるナノ粒子の取り込みの免疫検出を可能にするために、少量（コーティング重量の１％）のシリアンハムスターＩｇＧがリガンドコート中に“スパイクされた（ｓｐｉｋｅｄ）”。平均粒径は、雲母のシート上にドライダウンした（ｄｒｉｅｄ  ｄｏｗｎ）１ｅ（−２７）ｇ／ｍｌの試料の楕円径を用いるタッピングモード原子間力顕微鏡法により測定した際に、５０ｎｍ未満であった。平均粒径は、測定されたナノ粒子の長径および短径の平均として記載される。ＡＦＭ測定は、さらに、ＴＥＭネガティブ染色により支持され、ここで、１ｎｇ／ｍｌの懸濁液が、炭素格子上にスポットされた。ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｊが、平均粒径を計算するために用いられた。最も典型的には、平均粒径は、約８ナノメートル〜約３０ナノメートルの範囲であった。配合物Ａは、ＴＥＭによる１６±２．３ｎｍの平均粒径を−２．４±２．３ｍｅｖの表面電荷と共に有し、それは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ４動的光散乱デバイスにより、２０ボルトの電位において、２μｇ／ｍｌにおける１ｍＭ  ＫＣｌ中で測定の間２分間のパルスを用いて測定された。
【０１２４】
[00132]  テネイシンベースのリガンド：テネイシンは、癌の活動に関わっていること
が示されており、平滑筋細胞に特異的であることも示されており；さらに、テネイシンのペプチドドメインは、例えば米国特許第６，１２４，２６０号におけるように同定されており、当該技術で既知である。一態様において、本発明に適したテネイシンは、Ｈ．サピエンステネイシンＣ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００２１６０である。さらに、テネイシンペプチドおよび特定の細胞型との接着のためのドメイン、ならびにテネイシンの機能的および構造的側面は、当該技術において開示されており、既知である（例えば、Aukhill, et al. 1993 J Biol Chem 268:2542-2553）。テネイシンおよび／またはそのドメインの全てが、本発明に関するリガンドとして適切である。一態様において、テネイシンのフィブリノーゲン断片（本明細書においてテネイシン−ＣのＦｂｇ−ＬドメインまたはテンフィブゲンまたはＴＢＧとも呼ばれる；本発明の一態様において用いられるテンフィブゲンのヌクレオチド配列は、以下の通りである：
【０１２５】
【化１】
2020114835.tif 000002
【０１２６】
）が、リガンドとして用いられる。テネイシン、そのサブドメイン、またはあらゆる他の生体適合性ポリマーリガンドは、当該技術において既知の方法または当業者が容易に適応することができる方法により、発現または生成されることができる。説明目的のため、ＴＢＧを生成するための方法が、下記で提供される。
【０１２７】
[00133]  テンフィブゲン（ＴＢＧ）の調製：全てのＴＢＧ配合物に関して、別途特筆
されない限り、ＴＢＧは、Aukhilの方法(J Biol Chem (268): 2542-2553 (1993))により
、改変を加えて調製された（すなわち、ＴＢＧを単離し、不溶性ペレットを２Ｍ尿素を含有する溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．２ｍｇ／ｍｌリゾチーム、０．１％トリトンＸ−１００、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、ｐＨ８．０）で一度洗浄し、０．０２Ｍトリス−ＨＣＩ、ｐＨ８．０中４Ｍ  ＧｕＣＬ、５ｍＭ  ＤＴＴ中で再懸濁することにより、細菌溶解物から単離およびリフォールディングされた）。追加の遠心分離後の後、澄んだＴＢＧ溶液を２Ｍグアニジン−ＨＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で希釈して、約１の最終的なＯＤ２８０をもたらし、Ｎ２を注入した２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍアルギニン−ＨＣｌ中に滴加して約１０倍希釈し、一夜攪拌インキュベーション（４℃）した。２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に対する透析濾過（濃度におけるおおよそ４〜５倍の低減および０．４５μＭ濾過）後、最後の精製を、ヘパランセファロース上で２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中で実施し、ＮａＣｌ濃度を０．６Ｍにすることにより溶離した。内毒素を、陰イオン交換クロマトグラフィー工程においてｐＨ１０．５テンフィブゲンを２０ｍＭ  ＮａＨ２ＣＯ３、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝１０．５で平衡化したＱ
Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂に適用することにより除去し、次いでｐＨをＨ３ＰＯ４により７に再調整した後、最後の０．２ｕｍ濾過を行った。療法用腫瘍標的化配合物において、ＴＢＧを２５０ｐｐｂ  Ａｓ＋３、２５ｐｐｍ  Ｓｅ＋４、２．５ｐｐｍ  Ｈｇ＋２および２５ｐｐｍ  Ｍｏ＋５を含有する超高純度４０％硫酸アンモニウム中で約１６時間再沈殿させた。
【０１２８】
[00134]  配合物Ｂ：ＴＢＧでコートされたサブ−５０ｎｍナノ粒子を、６．３ｍｃｇ
のＴＢＧを５００ｍｃｇの２Ｒ−改変キメラオリゴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）に添加し、１２５ｍｃｇの１０ｋＤポリオルニチン（Ｓｉｇｍａ）を用いて凝縮させたことを除いて、配合物Ａにおいて記載されたように生成した。これらのナノ粒子を精製する際に、ＴＢＧコートされたミセルを、以下の改変された濃度：４．５ｎＭ  Ｓｒ２＋、２．２５ｎＭ  Ｍｇ２＋を除いて配合物Ａの塩を受け入れる溶液中に噴霧した。平均粒径は、炭素格子上にスポットされた１ｎｇ／ｍｌの試料の楕円径を用いるネガティブ染色ＴＥＭにより測定した際に、５０ｎｍ未満（１７．８±３．１ｎｍ）であり、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ４動的光散乱デバイスにより測定の間２０ボルトの電位において２分間のパルスを用いて１
ｍＭ  ＫＣｌ中で２μｇ／ｍｌで測定した際に、−７．７±４．２ｍｅｖの表面電荷を有していた。
【０１２９】
[00135]  配合物Ｃ：ＴＢＧでコートされたサブ−５０ｎｍナノ粒子を、２．６ｍｃｇ
のＴＢＧを２５０ｍｃｇのキメラオリゴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および６、重量により１：１）に添加し、１００ｍｃｇの１０ｋＤポリオルニチン（Ｓｉｇｍａ）を用いて凝縮させ、７．５ｕｇの界面活性剤を用いてミセル化したことを除いて、配合物Ａにおいて記載されたように生成した。これらのナノ粒子を精製する際に、ＴＢＧコートされたミセルを、以下の濃度：３．７５ｎＭ  Ｓｒ２＋、４．６８ｎＭ  Ｍｇ２＋に関して改変された配合物Ａの塩を受け入れる溶液中に噴霧した。平均粒径は、炭素格子上にスポットされた１ｎｇ／ｍｌの試料の楕円径を用いるネガティブ染色ＴＥＭにより測定した際に、５０ｎｍ未満（１７．８±１．５ｎｍ）であり、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ４動的光散乱デバイスにより測定の間２０ボルトの電位において２分間のパルスを用いて１ｍＭ  ＫＣｌ中で２μｇ／ｍｌで測定した際に、−１２．３±３．５ｍｅｖの表面電荷を有していた。
【０１３０】
[00136]  配合物Ｄ：ＴＢＧでコートされたサブ−５０ｎｍナノ粒子を、オリゴヌクレ
オチド混合物がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および７（重量により１：１）で構成されていたことを除いて、配合物Ｃにおいて記載されたように生成した。平均粒径は、炭素格子上にスポットされた１ｎｇ／ｍｌの試料の楕円径を用いるネガティブ染色ＴＥＭにより測定した際に、５０ｎｍ未満（１７±１．６ｎｍ）であり、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ４動的光散乱デバイスにより測定の間２０ボルトの電位において２分間のパルスを用いて１ｍＭ  ＫＣｌ中で２μｇ／ｍｌで測定した際に、−７．１±５．４ｍｅｖの表面電荷を有していた。
【０１３１】
[00137]  配合物Ｅ：ＴＢＧでコートされたサブ−５０ｎｍナノ粒子を、３．１ｍｃｇ
のＴＢＧを２５０ｍｃｇの２Ｒ−改変キメラオリゴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８および９、重量により１：１）に添加し、６２．５ｍｃｇの１０ｋＤポリオルニチン（Ｓｉｇｍａ）を用いて凝縮させ、７．５ｕｇのＴＭ−ジオールを用いてミセル化したことを除いて、配合物Ａにおいて記載されたように生成した。これらのナノ粒子を精製する際に、ＴＢＧコートされたミセルを、以下の濃度：２．５ｎＭ  Ｓｒ２＋、０．２５ｎＭ  Ｍｇ２＋に関して改変された配合物Ａの塩を受け入れる溶液中に噴霧した。平均粒径は、炭素格子上にスポットされた１ｎｇ／ｍｌの試料の楕円径を用いるネガティブ染色ＴＥＭにより測定した際に、５０ｎｍ未満（１９．５±１．５ｎｍ）であり、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ４動的光散乱デバイスにより測定の間２０ボルトの電位において２分間のパルスを用いて１ｍＭ  ＫＣｌ中で２μｇ／ｍｌで測定した際に、−５．８±３．９ｍｅｖの表面電荷を有していた。リチウム含有量は、ＩＣＰ−ＡＥＳにより１μｇのオリゴあたり５．３９ｎｇのＬｉ＋と評価された。（類似の配合物に関して、２９２ｐｇ／オリゴ１ｕｇのリチウム含有量がより高感度のＩＣＰ−ＭＳ法により測定されたことを特筆する。）
[00138]  配合物Ｆ：ＴＢＧでコートされたサブ−５０ｎｍ対照ナノ粒子を、６．３ｍ
ｃｇのＴＢＧを５００ｍｃｇの２Ｒ−改変キメラオリゴ（抗凝固因子ＶＩＩ、Akinc, et al. 2008 Nat Biotechnol 26:5(561-9)において報告されている通りのもの）に添加し、
１２５ｍｃｇの１０ｋＤポリオルニチン（Ｓｉｇｍａ）を用いて凝縮させ、５ｕｇのＴＭ−ジオールを用いてミセル化したことを除いて、配合物Ａにおいて記載されたように生成した。これらのナノ粒子を精製する際に、ＴＢＧコートされたミセルを、以下の濃度：１．１７ｎＭ  Ｓｒ２＋、４．６８ｎＭ  Ｍｇ２＋に関して改変された配合物Ａの塩を受け入れる溶液中に噴霧した。平均粒径は、炭素格子上にスポットされた１ｎｇ／ｍｌの試料の楕円径を用いるネガティブ染色ＴＥＭにより測定した際に、５０ｎｍ未満（２４．７±３ｎｍ）であり、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ４動的光散乱デバイスにより測定の間２０ボルトの電位において２分間のパルスを用いて１ｍＭ  ＫＣｌ中で２μｇ／ｍｌで測定した際に、−７．６±２．４ｍｅｖの表面電荷を有していた。
【０１３２】
[00139]  配合物Ｇ：ＴＢＧでコートされたサブ−５０ｎｍナノ粒子を、安定化溶液が
非滅菌の実験室グレードの水で構成されており、塩化リチウムストックがセシウムまたはいずれかの他のイオンにより前処理されなかったことを除いて、配合物Ａにおいて記載されたように生成した。安定化溶液を調製するために用いられた水における試験された以下の金属イオンのレベルは、合計で約０．９百万分率であることが決定された：アルミニウム、ヒ素、バリウム、カドミウム、クロム、銅、鉄、鉛、マンガン（ｍａｇｎａｎｅｓｅ）、ニッケル、ルビジウム（ｒｕｂｉｎｉｕｍ）、硫黄、バナジウム、および亜鉛。ナノ粒子は、遠心分離後にＰＢＳ＋１０％ラクチトール中で再懸濁された。平均粒径は、炭素格子上にスポットされた１ｎｇ／ｍｌの試料の楕円径を用いるネガティブ染色ＴＥＭにより測定した際に、５０ｎｍ未満（２１．８±４ｎｍ）であり、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ４動的光散乱デバイスにより測定の間２０ボルトの電位において２分間のパルスを用いて１ｍＭ  ＫＣｌ中で２μｇ／ｍｌで測定した際に、−９．６±３．８ｍｅｖの表面電荷を有していた。
【０１３３】
[00140]  配合物Ｈ：ＴＢＧでコートされたサブ−５０ｎｍナノ粒子を、同じＬＣＫオ
リゴを用いて配合物Ａにおいて記載されたように生成した。これらのナノ粒子を生成する際に、ＴＢＧでコートされたミセルを、塩化リチウムではなく硝酸リチウムベースであり以下の濃度：７．５ｎＭ  Ｓｒ２＋、５．０ｎＭ  Ｍｇ２＋に関して改変された配合物Ａの塩を受け入れる溶液中に噴霧した。平均粒径は、炭素格子上にスポットされた１ｎｇ／ｍｌの試料の楕円径を用いるネガティブ染色ＴＥＭにより測定した際に、５０ｎｍ未満（２１．５±２ｎｍ）であり、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ４動的光散乱デバイスにより測定の間２０ボルトの電位において２分間のパルスを用いて１ｍＭ  ＫＣｌ中で２μｇ／ｍｌで測定した際に、−１２．４±４ｍｅｖの表面電荷を有していた。
【０１３４】
[00141]  配合物Ｉ：２０ｋＤの分子量のヒアルロナン(ＨＰＬＣ水中で再懸濁されたヒアルロン酸ナトリウム粉末、Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｌｈａ、低分子量ヒアルロナン）でコートされたサブ−５０ｎｍナノ粒子を、３．１ｍｃｇのＨＡ（ＴＢＧの代わりに用いられた）を１２５ｍｃｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＶｉｖｏβｇａｌ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、１０．５ｋｂ）（オリゴヌクレオチドの代わりに用いられた）に添加し、まず１９．４μｇの２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ミズーリ州セントルイス）（分枝状陽イオン性ポリマー）と複合体形成させ、次いで６．２５ｕｇのＴＭ−ジオールを用いてミセル化したことを除いて、配合物Ｇにおいて記載されたように生成した。これらのナノ粒子を精製する際に、Ｌｈａでコートされたミセルを、以下の濃度および添加に関して改変された配合物Ｇの塩を受け入れる溶液中に噴霧した：２ｎＭ  Ｓｒ２＋、０．５ｎＭ  Ｍｇ２＋、０．５４μＭ  Ｂｉ２＋、および０．４０ｍＭ  Ｎｉ２＋（超高純度、４０ｍｌの総量に基づく）の添加。平均粒径は、炭素格子上にスポットされた１ｎｇ／ｍｌの試料の楕円径を用いるネガティブ染色ＴＥＭにより測定した際に、５０ｎｍ未満（２０．４±２ｎｍ）であり、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ４動的光散乱デバイスにより測定の間２０ボルトの電位において２分間のパルスを用いて１ｍＭ  ＫＣｌ中で２μｇ／ｍｌで測定した際に、−８．１±４．７ｍｅｖの平均表面電荷を有していた。
【０１３５】
[00142]  配合物Ｊ：２０ｋＤの分子量のヒアルロナン(ＨＰＬＣ水中で再懸濁されたヒアルロン酸ナトリウム粉末、Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｌｈａ、低分子量ヒアルロナン）でコートされたサブ−５０ｎｍナノ粒子を、３．１ｍｃｇのＨＡ（ＴＢＧの代わりに用いられた）を１２５ｍｃｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＶｉｖｏβｇａｌ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、１０．５ｋｂ）（オリゴヌクレオチドの代わりに用いられた）に添加し、まず１９．４μｇの２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ミズーリ州セントルイス）（分枝状陽イオン性ポリマー）と複合体形成させ、次いで６．２５μｇのＴＭ−ジオールを用いてミセル化したことを
除いて、配合物Ａにおいて記載されたように生成した。これらのナノ粒子を精製する際に、Ｌｈａでコートされたミセルを、以下の濃度および添加に関して改変された配合物Ａの塩を受け入れる溶液中に噴霧した：２ｎＭ  Ｓｒ２＋、０．５ｎＭ  Ｍｇ２＋、０．５４ｕＭ  Ｂｉ２＋、および０．４０ｍＭ  Ｎｉ２＋の添加（超高純度、４０ｍｌの総量に基づく）。平均粒径は、炭素格子上にスポットされた１ｎｇ／ｍｌの試料の楕円径を用いるネガティブ染色ＴＥＭにより測定した際に、５０ｎｍ未満（２２．７±５ｎｍ）であり、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ４動的光散乱デバイスにより測定の間２０ボルトの電位において２分間のパルスを用いて１ｍＭ  ＫＣｌ中で２μｇ／ｍｌで測定した際に、−６．４±４．２ｍｅｖの平均表面電荷を有していた。８．１〜１３．１ｎｇ／プラスミド１μｇのＬｉ＋含有量が、ＩＣＰによる類似の配合物において測定された（データは示されていない）。ルーチン的な特性付けおよびＴＥＭにより、配合物ＩおよびＪのプラスミドｓ５０粒子は、物理的特性および比較可能なＴＥＭの点で、配合物Ａ〜ＨのＴＢＧコートされたオリゴ粒子に類似していることが分かった。例えば、核酸カーゴにかかわらず、本明細書で記載された配合物に関するナノ粒子の封入収率は、改変されたＢｕｒｔｏｎの方法(Kren, et al.2009 JCI 119 :2086-99)により決定された際に、９５％より大きかった（データは
示されていない）。オリゴヌクレオチド生理活性薬剤およびタンパク質シェルを含むナノ粒子およびプラスミドＤＮＡ生理活性薬剤および炭水化物シェルを含むナノ粒子の間のこの特性の類似は、ナノ粒子配合プロセスおよび結果として得られるナノ粒子組成物の異なる生理活性薬剤、ポリマー、およびリガンド部分を収容する柔軟性を実証している。
【０１３６】
[00143]  実施例２−ナノ粒子合成におけるリチウムイオンのセシウム改変は、安定性
を向上させる。
[00144]  有効である他にも、ナノ粒子剤形は、規制および他の実体からの医薬製造の
要求および製品の要求に従わなければならず、例えば、ナノ粒子の物理的安定性は、その規制上の認可、衝撃配合（ｉｍｐａｃｔｉｎｇ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）、製造、および貯蔵プロトコルの重要な構成要素である。セシウムのナノ粒子合成への微量の添加は、滅菌水中で実施された場合、驚くべきことに、高められた輸送性能およびバートン由来安定性尺度により示されるように、結果として向上した物理的安定性をもたらすことがわかっている。
【０１３７】
[00145]  非常に意外にも、リガンドで安定化されたミセルが添加される受け入れ溶液
を組み立てる前のリチウムの２．５ｐｐｂセシウムでの前処理は、オリゴヌクレオチドまたはプラスミドＤＮＡのどちらかを有するナノ粒子が空輸により−４℃で液体配合物として輸送されることができる濃度を４倍にすることが発見されている。これらの観察は、表１において要約されている。これらの空輸試験において、ナノ粒子の懸濁液は、凍結乾燥により濃縮され、輸送され、続いて戻した際に空輸負荷後の粒径における変化に関してＴＥＭ顕微鏡法により調べられた。ＴＥＭにおいて、本発明のナノ粒子は、標的化リガンドからなる可視であるが屈折性の乏しいコロナ中に取り囲まれた立方体またはフラクタルの超分子集合体として見える（データは示されていない）。例えば、２０ｍｇ／ｍｌの懸濁液濃度が、低電力（１ｍＷ）動的光散乱（ＤＬＳ）においてナノ粒子（直径おおよそ２５ナノメートルの大きさである）に関する光散乱データを獲得する（すなわち検出する）ために必要とされる。対照的に、セシウムで処理されたリチウム塩を受け入れる溶液中でのインキュベーション前のリガンドでコートされたミセルは、同様に大きさが小さい（直径２８ｎｍ、表１）が、類似のＤＬＳ条件下で約１ｍｇ／ｍｌの濃度において容易に検出され、これは、ナノ粒子超分子集合体における有意な変化がインキュベーション／安定化工程の間に起こることを示唆している（データは示されていない）。
【０１３８】
[00146]  輸送および対照試料において、粒径は、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｊにおける画
像分析により、ＴＥＭ顕微鏡写真からの粒子に当てはめられた楕円軸の平均として定量化された。オリゴを有する非改変のセシウム配合物（配合物Ｇ）に関して、平均粒径が、対
照配合物から３ｍｇ／ｍｌで空輸された同配合物へと１６１％増大したことを示す結果が、表１において要約されている。同時に生じる多面的な複屈折の粒子を取り囲むタンパク質コロナにおける喪失も、輸送後に観察された（データは示されていない）。対照的に、類似のセシウム改変配合物（配合物Ａ）は、４ｍｇ／ｍｌにおいて形状およびコロナを維持していた（データは示されていない）。
【０１３９】
[00147]  同じ分析を、商業的なレポーター遺伝子プラスミドを有し、ヒアルロナンで
コートされた一対の配合物に関して実施し、類似の結果が得られた。受け入れ槽中でのリチウムのセシウムによる前処理を用いて調製された配合物Ｊに関して、粒子は、濃度における８倍の増大（２対０．２５ｍｇ／ｍｌ）においても輸送されることができ、セシウム前処理なしで調製された配合物Ｉと比較して粒径における増大は１５％未満であった。リガンドコロナにおける喪失は、やはり増大した輸送濃度が用いられたセシウムで前処理されていない粒子においても観察された（データは示されていない）。塩化リチウムではなく硝酸リチウムを用いて調製された配合物Ｈに関して実証された輸送濃度における向上は、多数のリチウムの塩類が、ナノ粒子合成において用いられることができることを示している。セシウムおよびリチウムのそれらの塩を受け入れる溶液への添加の前の予備混合は、結果として適切な球形または立方体様の極小の（ＬＴＥ５０ｎｍ乾燥直系）形態をもたらしたが、セシウムおよびリチウムの塩を受け入れる溶液への未混合での添加は、そうではなかった（データは示されていない）。
【０１４０】
[00148]  
【０１４１】
【表１−１】
2020114835.tif 000003
【０１４２】
【表１−２】
2020114835.tif 000004
【０１４３】
[00149]  受け入れ溶液の組み立て前のリチウムのセシウム前処理の影響を、配合物を
インビトロ放出に関して調べることにより、さらに研究した。インビトロ放出は、改変比色分析Ｂｕｒｔｏｎアッセイ(Kren, et al. 2009 JCI 119:2086-99)に基づいて粒子分解
と合わせて評価された。このアッセイにおいて、粒子は６Ｍ  ＮａＯＨではなく１Ｍ  ＮａＯＨ中で５６℃で一夜インキュベートされる。次いで、ナノ粒子は、中性化され、Ｂｕｒｔｏｎ試薬が添加されて、放出されたＤＮＡとの反応の際に青い信号を作り出す。パーセント収率は、ナノ粒子が完全に分解されてそれらの内容物を放出した際に１００％収率に近付くように、標準曲線からの理論値と比較して表される。次いで、インビトロ放出は、およそ１００％収率の時点から内挿されたエンドポイントとして表される。従って、インビトロ放出の時間は、ナノ粒子の分解への抵抗の尺度であり、それは、オリゴおよびプラスミド系列両方に関してＣｓ処理されたナノ粒子対ＣＳ処理されていないナノ粒子に関して観察された輸送安定性における増大に対応している（表１  インビトロ放出時間；Ｃｓ対非Ｃｓオリゴ、１０４時間対６２時間；Ｃｓ対非ＣｓプラスミドＤＮＡ、＞１２０時間対１１７時間）。
【０１４４】
[00150]  ナノ粒子組成物における違いがどのように本発明のナノ粒子に物理的（放出
）および機能的（輸送）レベルで影響を及ぼし得るかを研究するため、オリゴおよびプラスミドを有するナノ粒子の乾燥および粉砕粉末の熱プロフィールを、示差走査熱量測定により約２５℃〜約４００℃の範囲にわたって１分につき１０℃で特徴的な遷移における可能性のある変化に関して調べた（上記の表１において要約されている）。多数回の運転において、１５８℃における小さい遷移、続いて１８０℃における最下点を伴う強く広い吸熱（１７２〜２００℃）が、Ｃｓ改変されていない配合物Ｇにおいて観察され、一方で、２７５℃における唯一の強い吸熱のみが、Ｃｓ改変された配合物Ａに関して観察され、これは、形態学的状態における変化を示している。同様に、８．５ｋｂのレポーター遺伝子プラスミドを有するヒアルロナンナノ粒子に関して、Ｃｓ改変されていない化合物（配合物Ｉに相当する）では、１５８℃における小さい遷移、続いて１７８℃における最下点を伴う強く広い吸熱（１７２〜２２７）が、（１５０℃における非常に小さい遷移が１９３、２０６、および２２７℃における強く非常に鋭い吸熱と共に観察された）Ｃｓ改変された化合物（配合物Ｊに相当する）と比較して観察され、これもやはり形態学的状態における変化を示している。対照的に、希釈剤であるＰＢＳ＋１０％ラクチトール（非還元糖）の走査は、約１６０℃における非常に小さい遷移および１８６℃における強く鋭い吸熱を、約３１０℃付近に中心のある分解吸熱と共に示した。全てのナノ粒子化合物は、およそ３０７〜３１３℃に中心のあるそのような吸熱を示した。噴霧およびその後の主にリチウム塩の溶液中でのインキュベーション前のＴＢＧコートされたミセル（“リガンドでコートされたミセル”）の熱走査は、およそ１００℃に中心のあるピーク（９８、１０５℃）を有する広い吸熱を示した。このサーモグラムがセシウムで処理されたリチウム溶液中でのインキュベーション後に走査されたナノ粒子と明らかに異なっていたという観察は、セシウムで処理されたリチウム溶液が、安定化されたミセルおよびナノ粒子に時間の経過にわたって秩序および再編成を与えて独特の超分子集合体を作り出すという記載を支持する。
【０１４５】
[00151]  リチウムのセシウム前処理の安定化槽への導入における化合物の違いを、Ｆ
ＴＩＲ分光法によりさらに研究した。非Ｃｓ配合物ＧおよびＣｓ含有配合物ＡのＦＴＩＲスペクトルを、６００〜４０００ｃｍ−１から読み取った。構成要素およびライブラリーの走査から得られたピーク割り当てに基づいて、カプセル走査は、一般に、３３９０ｃｍ−１における水のＯ−Ｈの伸縮振動に相当する３３００付近の広く強いバンド、界面活性剤に帰せられるバンドの群（４：約２９５６〜２８３２ｃｍ−１における、３：約１４４９〜１２６０ｃｍ−１における）、ならびに約１１００〜１１１０ｃｍ−１におけるＬｉ−ＯおよびＬｉ−ＯＨに帰せられる強い集中的なバンドにより特性付けられた。安定化槽のセシウム前処理において観察された主なピークの違い（配合物Ｇ対配合物Ａ）は、以下のものであった：１）約１６４７ｃｍ−１における広いピークが、約１７４０、１６４０におけるピークへと狭くなっていること；２）界面活性剤由来と思われる２９５２〜２８３９における４重線の、約２９５２〜２８５３における３重線への修正、および３）水振
動バンドにおける約３３２９から３３７７ｃｍ−１へのシフト。
【０１４６】
[00152]  吸光度のシフトに関して、セシウム前処理は、結果として水吸光度の強さに
おける５０％より大きい低下をもたらし、これは、再編成されたカプセル集合体内に捕えられた水の量における可能性のある減少と一致している。特に、疎水性界面活性剤は、この領域における吸光度を欠いていた。リチウム領域に最も近い約１２６０および７９５ｃｍ−１における界面活性剤に帰せられるバンドにおける５０％より大きい吸光度の増大も存在し、これは、集合体のこれらの重要な構成要素の間の相互作用における可能性のある変化を示唆している。リガンドでコートされたミセルのセシウム処理されたリチウムからなる受け入れ槽中への噴霧の後、これらの構成要素は、反応が停止する前に、数時間の間密接に接触している。
【０１４７】
[00153]  熱遷移およびＩＲスペクトルにおける有意な変化は、結晶性化合物、医薬化
合物、およびナノスケールの超分子集合体における多形的変化の重要な指標であり、それは、異なる形態学的状態において重要な物理的および機能的変化を経ることが知られている。理論により束縛されることを望むわけではないが、未改変のナノ粒子と比較されたＣｓで改変されたナノ粒子に関する形態学的状態における示された違い（表１）は、Ｃｓで改変されたナノ粒子に関して観察された向上した輸送安定性および拡張されたＢｕｒｔｏｎ由来インビトロ安定性の基礎となる重要な機序を提供する可能性がある。
【０１４８】
[00154]  本実施例は、本発明のナノ粒子が多様なカーゴおよびナノ粒子多形に関して
輸送濃度およびＢｕｒｔｏｎ由来安定性を実質的に増大させることを示す。
[00155]  実施例３−改変されたキメラポリヌクレオチド混合物は、マウス腫瘍モデル
において驚くべき有効性を示す。
【０１４９】
[00156]  ＴＢＧリガンドおよび抗ＣＫ２キメラポリヌクレオチド生理活性薬剤を含む
セシウム改変されたナノ粒子が、腫瘍および腫瘍間質細胞中のカゼインキナーゼ２アルファ（Ｃｓｎｋ２ａ１）およびカゼインキナーゼ２アルファプライム（Ｃｓｎｋ２ａ２）タンパク質のレベルの操作に対して向けられ、これは、ナノ粒子送達システムにおけるＴＢＧリガンドは粒子およびオリゴカーゴを両方の組織型に向けるためである。カゼインキナーゼ２（ＣＫ２）は、腫瘍細胞により過剰に駆動されて多数の経路により生存を促進する遍在する酵素であり、それは、ストレス条件下で、および腫瘍において、細胞核中に蓄積する。ＣＫ２の核区画からのシャトリング（Ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ）が、アポトーシスの前に起こり、腫瘍細胞の核ＣＫ２の維持の不能が、腫瘍死の前に起こる。腫瘍学療法は、しばしば免疫無防備状態のマウス中で成長したヒト腫瘍（異種移植モデル）において評価される。下記で表２において概説されているように、Ａｇｏ２およびＲＮアーゼＨをかみ合わせた（ｅｎｇａｇｉｎｇ）２機能性オリゴ（米国特許公開第２０１３／０２６７５７７号、本明細書に参照によりそのまま援用される）を用いて標的化された遺伝子の領域において、３個までのミスマッチが、ヒトおよびマウスの間に存在することができる（ｈｕ  Ｃｓｎｋ２ａ１およびｍｕ  Ｃｓｎｋ２ａ２の間で３個）。ｈｕ  Ｃｓｎｋ２ａ１に対するミスマッチは、影付きおよび太字の下線、白抜き、または特大の文字のいずれかにより強調されている。
【０１５０】
[00157]  単一ヌクレオチド改変の本明細書で記載される一本鎖オリゴ設計（ＳＥＱ  
ＩＤ  ＮＯ：８）中への組み込み、ならびにＣｓｎｋ２ａ２に向けられた新規の一本鎖オリゴ設計（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）中への組み込み、ならびにＴＢＧコートされたｓ５０粒子においてこれらの一本鎖オリゴを組み合わせてＣＫ２抗癌療法混合物を形成した際に、腫瘍成長、細胞増殖、および炎症の阻害に関する重要な結果が、腫瘍を有するマウスにおいて達成された。２Ｒ主鎖改変は、単一ヌクレオチドの変更（５’末端から２位におけるＤＮＡヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル修飾ＲＮＡヌクレオチドへの変更）で構成さ
れていた。これらのオリゴにおける全ての主鎖の結合は、ホスホジエステルであった。この実験において、類似のマウス標的領域をミスマッチさせる影響を評価するための努力もなされた。下記の表２は、本実施例において使用および参照された配列を記載している：
[00158]  
【０１５１】
【表２】
2020114835.tif 000005
【０１５２】
[00159]  ヌードマウスの２つの系統（ＦｏｘＮ、Ｂａｌｂ／ＣａＮＣＲ（ＢＮ））お
よび１つの腫瘍株（ＦａＤｕ、下咽頭）を用いて、マウスに５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ中の２ｅ６個（ＦｏｘＮ）または２ｅ５個（ＢＮ）の腫瘍細胞を皮内接種し、皮下処置を７日後に開始した。処置の開始時の平均腫瘍サイズは、おおよそ６９〜８６ｃｕ  ｍｍであった。５匹のマウスのコホートを、週２回１０μｇ／ｋｇで処置した。一部の場合において、処置のおおよそ１０日後に、処置群からの２匹のマウスを屠殺した。処置の３０日後（Ｄ３０）に、群あたり残りの３〜５匹の動物を屠殺し、残留する生存可能な腫瘍の重量を量った。
【０１５３】
[00160]  分子の変化を評価するため、それぞれのマウスからの生存可能な腫瘍領域か
らの凍結切片を、Ｋｉ−６７およびｐ６５  ＮＦ−κＢレベルに関して顕微鏡法によりアッセイし、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いてバックグラウンド対照に対して閾値設定された（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｅｄ）信号面積割合として定量化した。２通りの代表的な領域を、全てのＤ３０マウスに相当する生存可能な腫瘍切片から収集した。Ｋｉ−６７は、腫瘍
増殖速度の一般的な臨床指標であり、生存可能な細胞核の面積の割合または百分率として表され、ｐ６５  ＮＦ−κＢは、炎症における主要なシグナル伝達および制御タンパク質であり、ＣＫ２の重要な下流の標的である。ＮＦ−κＢは、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）において異常に活性化されており、ＮＦ−κＢの阻害は、細胞死を誘導し、腫瘍発生を阻害する(Yu, et al. 2006 Cancer Research 66:6722-6731)。従って、当業者は、腫瘍モデルにおける抗ＣＫ２戦略の効力および結果の多くは、抗ＮＦ−κＢ活性の点から理解されることができることを、認識している。細胞生物学の点で、ｐ６５  ＮＦ−κＢは、（ＣＫ２に類似して）炎症条件およびストレス条件下で細胞核に局在しており、炎症の低減が進むと、細胞質性またはそれほど検出可能ではなくなる。表３は、３つの分析に関する処置および結果を要約している。
【０１５４】
[00161]  
【０１５５】
【表３】
2020114835.tif 000006
【０１５６】
[00162]  
特に、実験群のオリゴヌクレオチド構成要素間の限られた違いにもかかわらず、ＴＢＧでナノ封入された（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）２Ｒ  ｈｕＭｉｘオリゴは、処置の開始の３０日後に対照に対して腫瘍重量、細胞増殖（Ｋｉ−６７）および炎症指数（ＮＦ−κＢ）の３つのカテゴリー全てにおいて有意な低減をもたらした唯一のアプローチであった
（表２、Ｅ３実験、配合物Ｅ）。封入された単一ヌクレオチド２Ｒ改変（Ｅ１実験、配合物Ｂ）も、封入されたｈｕＭｉｘアプローチ（Ｅ２実験、配合物Ｃ）も、処置の３０日後に腫瘍重量における有意な低下を示さなかった。実際、ｈｕＭｉｘ処置群（配合物Ｃ）は、腫瘍重量において対照と比較して３４％の有意な増大を示した。逆に、ナノ封入された２ＲｈｕＭｉｘ（配合物Ｅ）で処置されたマウスからの腫瘍は、プールされたＢＮ対照腫瘍に対して腫瘍重量における有意な５６％の低減を示し、それは、細胞増殖および炎症指数における大きく劇的な低減と一致していた（−７３％  Ｋｉ−６７指数、−９９．７％
ｐ６５  ＮＦ−ｋＢ信号割合、ｐ＜０．０５）。他の処置群は、細胞増殖指数およびｐ６５  ＮＦ−ｋＢ信号の両方において対照に対して有意な低減を示さず、それらの２つの尺度および腫瘍重量における有意な低減を示した処置群はなおさらなかった。Ｅ２実験におけるｍｕＭｉｘ処置は、ＮＦ−ｋＢ信号面積割合における対照に対する有意な５９．７％の低減を示したが、これは、腫瘍重量における対照に対する２６．２％の増大を伴っており、明らかに望ましくない結果であった。さらに特筆すると、Ｅ３実験において、２Ｒ
ｈｕＭｉｘコホートにおいて対照に対してｐ６５  ＮＦ−ｋＢ信号における有意な低減（９９．７％）があり、一方で、マウス配列に対するミスマッチが２Ｒ  ｈｕＭｉｘのミスマッチと等しかったＥ２実験においては、ｈｕＭｉｘコホートにおけるｐ６５  ＮＦ−ｋＢ信号における変化はほとんどなかった（表２、上記）。
【０１５７】
[00163]  Ｅ３実験におけるマウスに関するＣＫ２アルファおよびＣＫ２アルファプラ
イムのタンパク質レベルにおける変化を、顕微鏡法により評価した。収縮、増殖、および炎症指数における有意な低減と一致して、ＣＫ２アルファおよびＣＫ２アルファプライムの信号レベルにおける有意な低減（それぞれ−５２％および−４５％）（ｐ＜０．０５）が、処置されたマウスの生存可能な腫瘍切片において対照と比較して観察された（データは示されていない）。ＣＫ２アルファおよびＣＫ２アルファプライムの信号割合における有意な変化は、実験Ｅ１およびＥ２における全ての他の処置では観察されなかった。
【０１５８】
[00164]  Ｅ３実験における処置されたマウスは、３０日間の観察期間の間、有意な体
重の低下または不都合な作用を示さなかった（データは示されていない）。まとめると、観察された結果は、オリゴヌクレオチド主鎖および配列における限られた改変の組み合わせは、結果として腫瘍を有するマウスにおける表現型および分子マーカーにおける有意かつ驚くべき変化をもたらしたことを示している。
【０１５９】
[00165]  実施例４−改変されたキメラポリヌクレオチド混合物は、侵襲性の異種移植
マウス腫瘍モデルにおいて驚くべき有効性を示す。
[00166]  ナノ粒子のＣｓ改変と一緒でのオリゴヌクレオチド主鎖および配列における
限られた改変の作用を、別のモデルにおいて研究するため、ヒト腫瘍株（ＵＭ−ＳＣＣ−４７、ＨＰＶ−（＋）舌組織由来）およびＮＩＨ非近交系無胸腺ヌードマウスを含む異種移植腫瘍モデルを試験した。この実験において、ヌードマウスに２ｅ６個の細胞を皮下接種し、腫瘍が６０〜８０ｃｕ．ｍｍまで成長する間、２週間維持した後、１００μｇ／ｋｇでの毎日のＳＱ処置を開始した。腫瘍を１４日間の処置後に回収し、上記のＦａＤｕ実験と同様に試験した。結果が、下記で表４において要約されている。
【０１６０】
[00167]  この実施例において、実施例３と同様に、同じ方法を用いて、Ｃｓ改変され
たＴＢＧナノ封入された２Ｒ  ｈｕＭｉｘオリゴは、腫瘍重量、細胞増殖（Ｋｉ−６７）および炎症指数（ＮＦ−κＢ）の３つのカテゴリー全てにおいて、処置の開始後（３０日ではなく）１４日の時点で、対照に対して最大の低減をもたらした（表４、配合物Ｅ）。追加の対照、すなわち対照オリゴおよび糖カーゴを用いたＣｓ改変ナノ粒子が、腫瘍成長反応に対する非特異的な介入ストレスの負の影響を説明するために含まれていた。マウスおよび細胞株のこの組み合わせにおいて、腫瘍は、全てのマウスにおいてリンパ節に即時に転移性であり、かつ腹膜腔に著しく浸潤したが、配合物Ｅで処置されたマウスではそう
ではなかった（データは示されていない）。従って、腫瘍重量は、原発腫瘍の腹膜への拡張および主要リンパ節との組み合わせとして報告された。まとめると、実施例３および４は、２Ｒ改変ならびにＣｓｎｋ２ａ１およびＣｓｎｋ２ａ２配列の新規の組み合わせの異なる腫瘍株およびマウスモデルにわたる有利な有効性を示している。
【０１６１】
[00168]  
【０１６２】
【表４】
2020114835.tif 000007
【０１６３】
[00169]  配列
[00170]  ＣＫ２アルファ（ホモ・サピエンス２０番染色体、GRCh38 Primary Assembly; NCBI参照配列: NC_000020.11; 塩基473322〜543838の70.52kbの領域; Intl Hu Genome Seq Consort; 2004 Nature 431(7011):931-945）
[00171]  ＣＫ２アルファプライム（ホモ・サピエンス１６番染色体、GRCh38 Primary 
Assembly; NCBI参照配列: NC_000016.10; 塩基58157907〜58197878の39.97kbの領域; Martin, et al. 2004 Nature 432(7011):988-994）
[00172]  NM_001896; ＣＫ２アルファプライムのｍＲＮＡ配列に関するｃＤＮＡ配列; ホモ・サピエンスカゼインキナーゼ２、アルファプライムポリペプチド(CSNK2A2)、mRNA (17-March-2008) (SEQ ID NO:11)
[00173]  NM_177560; ＣＫ２アルファのｍＲＮＡ配列に関するｃＤＮＡ配列; ホモ・サピエンスカゼインキナーゼ２、アルファ１ポリペプチド(CSNK2A1)、転写産物バリアント
３、mRNA (12-March-2008) (SEQ ID NO:12)
【配列表】
2020114835000001.app