(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞外組織および血管石灰化、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症ならびに動脈石灰化を治療するための医薬の提供。【解決手段】血液、血漿または血清中のヒト骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）に特異的に結合する受容体分子の有効量を含む医薬であって、受容体分子がヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体またはラットモノクローナル抗体である医薬。【選択図】図１
2020114823.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液、血漿または血清中のヒト骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）に特異的に結合する受容体分子の有効量を含む、細胞外組織および血管石灰化、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症ならびに動脈石灰化を治療するための医薬。
【請求項２】
受容体分子がヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体またはラットモノクローナル抗体である、請求項１記載の医薬。
【請求項３】
抗体が、配列番号４、５、６、７、８および９のいずれかに開示されているタンパク質配列の機能的部分の１以上を含む、請求項２記載の医薬。
【請求項４】
受容体分子または抗体が、配列番号４、５、６、７、８および９のタンパク質配列のいずれかに含有される機能的相補性決定領域（ＣＤＲ）の１以上を含む、請求項２または３記載の医薬。
【請求項５】
受容体分子が、配列番号４、５、６、７、８および９のタンパク質配列のいずれかを有する抗体により結合され、血漿中で接近可能である、ＢＳＰの抗原決定基またはエピトープを認識する、請求項１記載の細胞外組織および血管石灰化を治療するための医薬。
【請求項６】
ビーズ、アガロース、アフェレーシスに使用される物質、血漿交換に使用される物質、マイクロタイタープレート、容器壁から選択されるいずれかの固相物質に結合している又は含有されている、請求項２〜５のいずれか１項記載の受容体分子または抗体。
【請求項７】
診断系またはキット、好ましくは、腎代替療法、透析、ＣＫＤ、ＥＳＲＤ、組織および血管石灰化、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、動脈石灰化のコンパニオン診断のためのキット内に含まれる、請求項２〜５のいずれか１項記載の受容体分子または抗体。
【請求項８】
患者から血液を採取するための手段、
血液細胞および血漿を分離するための手段、
可溶性ＢＳＰ用のトラップを介して血漿を輸送するための手段、ここで、ＢＳＰトラップは、固定化種を有する基質を含み、固定化種は、血管および組織石灰化を妨げる濃度まで血中の可溶性ＢＳＰ濃度を低下させてＢＳＰ枯渇血漿を得るのに適合している、および
処理された血漿および血液細胞を患者に戻すための手段
を含む体外血液処理系。
【請求項９】
血液および／または血漿を、カルシウムトラップを介して輸送するための手段、ここで、カルシウムトラップは、固定化種を有する基質を含み、固定化種は、体外血液処理系におけるカルシウムおよびＢＳＰの沈殿物の形成を妨げる濃度まで血中のカルシウム濃度を低下させてカルシウム枯渇血液を得るのに適合している、
骨シアロタンパク質用のトラップをも含み得る体外血漿処理装置によりカルシウムトラップの下流のカルシウム枯渇血液または血漿を処理するための手段、および
体外血液処理装置の下流の処理されたカルシウム枯渇血液中にカルシウムを注入して、処理されたカルシウム枯渇血液にカルシウムを添加するための手段
をさらに含む、請求項８記載の体外血液処理系。
【請求項１０】
可溶性ＢＳＰ用のトラップの使用を含む血漿交換のための方法。
【請求項１１】
過剰なＢＳＰを循環から排除する血漿交換介入を含む、血管および軟部組織石灰化を低減する方法。
【請求項１２】
血液透析法において循環から過剰物を排除する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＢＳＰに対する治療用抗体の使用を含む、動脈および血管石灰化を低減する方法。
【請求項１４】
ＣＫＤまたはＥＳＲＤを有する腎障害患者の全体的な結果が改善する、請求項１１または１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性腎疾患を治療するための医薬、装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性腎疾患（ＣＫＤ）は慢性腎臓病（ＣＲＤ）としても公知であり、欧州および北米における集団の約１０％を冒す。ＣＫＤは、数カ月または数年の期間にわたる腎機能の進行性喪失により特徴づけられる。ＫＤＩＧＯ（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ）の声明は、３カ月以上持続する６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２未満への糸球体濾過率（ＧＦＲ）の低下または腎損傷のいずれかとしてＣＫＤを定義している（ＫＤＩＧＯ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ−Ｍｉｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｏｎｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ（ＣＫＤ−ＭＢＤ，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ７６；Ｓｕｐｐｌ．１１３，２００９）を参照されたい）。血管炎のようなＣＫＤを引き起こす特定の根本原因が存在する場合を除き、ＣＤＫの悪化を遅らせることが明白に示されている具体的な治療法は存在しない。したがって、持続的な腎不全は、腎移植または透析の一形態でありうる腎代替療法を要する。ＣＫＤが進行し、ＧＦＲが低下するにつれて、ミネラル代謝障害が増強し、高リン酸血症が、２５−ヒドロキシビタミンＤの腎性１ａ−ヒドロキシル化の低下およびカルシトリオールの低循環レベルと共に生じ、今度はこれが腸カルシウム吸収の低下を引き起こす。カルシウムおよびホスファートホメオスタシスの障害は、付随的な骨代謝異常および代謝性骨疾患と共に、種々の度合の低カルシウム血症および続発性副甲状腺機能亢進症を引き起こす。ミネラルおよび骨障害（ＭＢＤ）はＣＫＤの一般的症状である。ＣＫＤの他の症状には、血圧上昇、鉄欠乏性貧血、代謝性アシドーシス、高窒素血症および尿毒症、交感神経緊張の活性化、炎症ならびに酸化ストレスが含まれる。したがって、ＣＤＫは高い罹患率および死亡率をもたらす。ＣＫＤ患者は、特に、加速したアテローム性動脈硬化症および組織石灰化に罹患する。透析を受けている又は末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を有するＣＫＤ患者は腎不全よりも心血管合併症で死亡する可能性が高い（Ｋｅｔｔｌｅｒ  Ｍら，Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ２００９，１４：３８９−３９４）。
【０００３】
動脈および血管の石灰化の進行はミネラル代謝の調節不全ならびに血清カルシウムおよびカルシウム−リン産物のレベルの変化に関連している。更に、これらのミネラルの細胞外レベルの上昇は血管平滑筋細胞および心筋細胞の生存および表現型に影響を及ぼす。石灰化は、大部分はカルシウムヒドロキシルアパタイト沈着物としてのものであり、血管、心筋および心臓弁において生じうる。動脈血管壁では、石灰化は内膜または中膜において生じる。中膜石灰化（メンケベルグ中膜石灰化硬化症とも称される）は、年齢、糖尿病およびＣＫＤに古くから関連づけられている形態である。
【０００４】
従来の治療アプローチは、通常、生化学的パラメータを、より低い死亡率に関連した範囲へと導くことに向けられたものである。それらは、（ａ）適切な透析液カルシウム濃度の使用、（ｂ）ホスファート結合物質の使用、（ｃ）カルシトリオールもしくはビタミンＤ類似体の投与、（ｄ）カルシウム模倣物質の使用、（ｄ）食事推奨（食事ホスファート摂取を低減し、ホスファート結合物質およびカルシウムサプリメントを投与する）、および／または（ｅ）天然ビタミンＤサプリメントの摂取を含む。ＷＯ  ２０１１／００００８６  Ａ１（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌｂｅｒｔａ）は、血液透析により患者における血清ホスファートレベルおよびカルシウム産物を低減するための方法および装置を開示している。なぜなら、観察データは、より高い用量のカルシウム系ホスファート結合物質が血管石灰化に寄与しうることを示唆しているからである。一般に、経口カルシウム負荷を最小にする一方で血清ホスファートを制御することに相当な関心が持たれている。一方、ほとんどのホスファートは細胞内に存在し、したがって血液透析に利用できない。ＷＯ  ２０１１／１３０５２８  Ａ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｈｏｌｄｉｎｇｓ  Ｉｎｃ．，ＵＳ）は、カルシウムトラップを含む体外血液処理系を開示しており、この場合、血液凝固を妨げる濃度まで血中カルシウム濃度を低減し、それによりカルシウム枯渇血液が得られるように、固定化種が適合化されている。しかし、血管および組織の石灰化の病因を妨げるのに利用可能な具体的な薬物または介入方法は存在しない。また、ＣＫＤ、ＥＳＲＤおよび腎代替療法に伴う心血管リスクに対する、より多数の薬物および介入方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１１／００００８６号
【特許文献２】国際公開第２０１１／１３０５２８号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＣＫＤ−ＭＢＤ，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ７６；Ｓｕｐｐｌ．１１３，２００９
【非特許文献２】Ｋｅｔｔｌｅｒ  Ｍら，Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ２００９，１４：３８９−３９４
【発明の概要】
【０００７】
発明の概括
本発明の目的は、血液、血漿または血清中のヒト骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）を認識する受容体分子の有効量を含む、細胞外組織および血管石灰化、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症および動脈石灰化、ならびにＣＫＤ、ＥＳＲＤおよび腎代替療法に伴う心血管リスクを治療するための医薬により達成される。該医薬はヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体またはラットモノクローナル抗体でありうる。該医薬は、好ましくは、配列番号１、２、３、４、５および６のいずれかに開示されているタンパク質配列の機能的部分の１以上を含む抗体でありうる。これに関する機能的または必須部分は、血漿中のヒトＢＳＰの検出および結合に関与する分子の部分を意味する。したがって、リンカー部分、タンパク質の成熟中に切断されるリーダー配列、または抗体の互換性部分は含まれない。したがって、受容体分子または抗体の必須部分は、配列番号１、２、３、４、５および６の配列のいずれかに含有される相補性決定領域（ＣＤＲ）の１以上に関するものである。なぜなら、それらは血漿または血清中のヒトＢＳＰの認識および結合に要求されるからである。保存的タンパク質置換および挿入は当業者に公知である。
【０００８】
本発明は更に、細胞外組織および血管石灰化を治療するための医薬を含み、ここで、配列番号１、２、３、４、５および６のいずれかのタンパク質配列を有する抗体により結合され血漿中で接近可能である、ＢＳＰの抗原決定基またはエピトープを、該受容体分子が認識する。組織および血管石灰化なる語は、ＣＫＤ、ＥＳＲＤおよび腎代替療法に伴う心血管リスクを含み、動脈硬化およびアテローム性動脈硬化症なる語をも含む。ＣＫＤは冠動脈心疾患のリスクの増大に一般に関連しているが、ＣＫＤを有する個体における冠動脈アテローム性動脈硬化症の組織病理学的特徴に関する知見は不十分であり、動脈硬化およびアテローム性動脈硬化症なる語は、異なる病因に本質的に関連したものであるが、互換的に用いられることが多い。しかし、動脈石灰化による進行したアテローム性動脈硬化病変の頻度はＧＴＲの付随的減少と共に増加する。一方、総コレステロール、カルシウム−リン産物、糖尿病、高血圧、血清クレアチニンと心血管リスクとの間にも強い関連性が認められる。
【０００９】
本発明のもう１つの実施形態は更に、ビーズ、アガロース、アフェレーシスに使用される物質、血漿交換に使用される物質、マイクロタイタープレート、容器壁から選択されるいずれかの固相物質に結合している又は含有されている、記載されている受容体分子または抗体に関する。診断系またはキット、好ましくは、腎代替療法、透析、ＣＫＤ、ＥＳＲＤ、組織および血管石灰化、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、動脈石灰化のコンパニオン診断のためのキット内にいずれかの受容体分子または抗体が含まれうる。該コンパニオン診断はまた、特に、ＣＫＤまたはＥＳＲＤを有する個体における動脈硬化病変のリスクの評価、および心血管リスク全般の評価に関するものでありうる。
【００１０】
本発明のもう１つの態様は、患者から血液を採取するための手段、血液細胞および血漿を分離するための手段、可溶性ＢＳＰ用のトラップを介して血漿を輸送するための手段、ここで、該ＢＳＰトラップは、固定化種を有する基質を含み、該種は、血管および組織石灰化を妨げる濃度まで血中の可溶性ＢＳＰ濃度を低下させてＢＳＰ枯渇血漿を得るのに適合している、ならびに処理された血漿および血液細胞を患者に戻すための手段を含む体外血液処理系に関する。好ましい実施形態においては、体外血液処理系は更に、血液および／または血漿を、カルシウムトラップを介して輸送するための手段、ここで、該カルシウムトラップは、固定化種を有する基質を含み、該種は、体外血液処理系におけるカルシウムおよびＢＳＰの沈殿物の形成を妨げる濃度まで血中のカルシウム濃度を低下させてカルシウム枯渇血液を得るのに適合している、骨シアロタンパク質用のトラップをも含み得る体外血漿処理装置によりカルシウムトラップの下流のカルシウム枯渇血液または血漿を処理するための手段、および体外血液処理装置の下流の処理されたカルシウム枯渇血液中にカルシウムを注入して、処理されたカルシウム枯渇血液にカルシウムを添加するための手段を含みうる。したがって、本明細書に開示されているもう１つの態様は、可溶性ＢＳＰ用のトラップの使用を含む血漿交換のための方法に関する。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、好ましくは血漿交換または血漿中のＢＳＰに対する抗体の投与による、慢性腎疾患（ＣＫＤ）を有する患者の血漿からの循環ＢＳＰ（骨シアロタンパク質）の除去に基づく新規治療概念を提供する。本発明は更に、血漿交換用のＢＳＰ吸収物質、およびヒトにおいて生体適合性である直接投与用の医薬組成物を提供する。この治療の有益な効果は、ＣＫＤ患者の死亡率と循環遊離ＢＳＰレベルとが対応することが観察されたことにより証明されている。
【００１２】
動脈石灰化のメカニズムは複雑であり、いずれの理論によっても束縛されることを望むものではないが、第１段階は血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の骨芽細胞／軟骨細胞表現型への脱分化または形質転換であるらしい。ＶＳＭＣは、骨芽細胞に類似した間葉系幹細胞に由来する。転写因子コア結合因子ａ１（Ｃｂｆａ−１；ＲＵＮＸ２遺伝子によりコードされる）がＶＳＭＣから骨芽細胞への表現型形質転換をもたらすと考えられている。しかし、骨芽細胞／軟骨細胞表現型への形質転換を誘導するシグナルは複合的である。骨および動脈のどちらにおいても、マトリックスｇｌａタンパク質、ピロホスファートおよびオステオポンチンを含む石灰化のインヒビター、ならびにフェチュインＡのような循環インヒビターが存在する。石灰化のインヒビターと、ＶＳＭＣ脱分化を刺激するミネラル化促進因子との間の不均衡が存在する場合に、石灰化が生じる。
【００１３】
リン酸化糖タンパク質である骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）は細胞外マトリックスの重要な成分である。ＢＳＰは、通常、象牙質、骨および軟骨の形成に関与する細胞により発現されるが、組織マトリックス上の細胞の接着をもたらしうる接着分子でもある。ＢＳＰはインテグリン受容体にその認識配列（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸，ＲＧＤ）を介して結合する。ＢＳＰはインビトロでは生物学的アパタイトのための結晶化核を形成し、インビボでは、それはミネラル化に関与する。しかし、ノックアウトマウスにおけるＢＳＰ遺伝子のスイッチの切断は骨格の構築および機能の認識可能な破壊を引き起こさない。一方、ＢＳＰは組織石灰化に関与している。なぜなら、骨ミネラル化およびミネラル化マトリックスへの骨芽細胞の接着を開始するためには、コラーゲンへのその結合が必要だからである（Ｏｇａｔａ  Ｙ，Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓ．２００８，４３（２）：１２７−１３５）。ＷＯ  ００／３６９１９は、石灰化を促進する結合組織細胞および腫瘍におけるＢＳＰの発現の抑制を開示している。インビトロ研究は、ＢＳＰがＶＳＭＣから骨芽様細胞への形質転換に関与すること、および薬理学的に低下したＢＳＰ発現がこの形質転換過程の減速を招きうることを示唆している。免疫組織学的方法により、本発明者らはまた、尿毒症性カルシトリオール処理ラットからの大動脈石灰化のコアにおいてＢＳＰを見出した（Ｈａｆｆｎｅｒ  Ｄら，Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ  ２００５，２３（５）：１０６７−７５）。ＶＳＭＣを使用する細胞培養実験は、カルシトリオールが、ＢＳＰを含むミネラル化促進性遺伝子のアップレギュレーションを引き起こすことを示唆している（Ｚｅｂｇｅｒ−Ｇｏｎｇ  Ｈら，Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２０１１，２９（２）：３３９−４８）。
【００１４】
ＢＳＰは骨ターンオーバーにおいて重要な役割を果たしているが、文献は、循環ＢＳＰの排除は骨の健康に関するリスクをもたらさないことを示唆している。ＢＳＰノックアウトマウスは破骨細胞のリクルートメントの低減と共に骨ターンオーバーの低減を示すに過ぎない。ＢＳＰを過剰発現するマウスは、カルシウムレベルの上昇およびＰＴＨレベルの低下により示されるとおり、骨ターンオーバーの上昇を示す。しかし、血漿からのＢＳＰの排除が骨粗鬆症を引き起こしうるという臨床的な又は他の証拠は存在しない。骨粗鬆症に罹患している閉経後の女性は、閉経期前後の健康な対照と比較して上昇した血清ＢＳＰレベルを示す。アレンドロン酸（Ｒ）（ＩＮＮ）での治療およびホルモン補充療法は、共に確立された骨粗鬆症治療選択肢であり、閉経後の女性における血清ＢＳＰレベルの低下をもたらす。
【００１５】
石灰化病変は骨芽細胞、破骨細胞、骨梁、ならびに石灰化を調節する多数のタンパク質、例えばオステオポンチン、アルカリホスファターゼおよび骨シアロタンパク質を含有する。より厳密には、本発明者らは、ＥＳＲＤ患者の動脈における明白な石灰化の前に、ＢＳＰ、および石灰化を調節する他のミネラル化促進性タンパク質に関する免疫染色を見出した。これにより導かれる仮説は、石灰化の前にＢＳＰの沈着が生じて、それが組織および動脈石灰化の特異的抑制の標的になりうるというものである。ＢＳＰは石灰化の進行においてそのような中心的な役割を有するため、本発明者らは、治療用抗体を使用してこのタンパク質を阻害することにより、血管および軟部組織の石灰化が低減し、ＣＫＤまたはＥＳＲＤを有する腎障害患者の全体的結果が改善するかどうかに関して、実験を開始した。あるいは、ＢＳＰは、血漿交換を用いて、循環から除去されうる。本発明者らの新規治療アプローチは、血漿中の循環ＢＳＰの濃度を調節することにより、尿毒症性血管および軟部組織石灰化を低減し、ＣＫＤの全体的結果を改善することを目的とする。これは、血液透析法において過剰なＢＳＰを循環から排除する血漿交換介入の開発により達成されうる。
【００１６】
５／６腎摘出術（５／６Ｎｘ）に付された尿毒症ラットにおいて行った初期実験は、抗ＢＳＰ抗体の投与が、石灰化の低減、腎内血管の中膜対管腔比の減少および腎内血管の血管周囲線維症の低減をもたらすことを示している。したがって、本発明者らは、ＢＳＰを患者から除去するために、血漿交換を用いて、医療装置に該新規治療概念を適合させた。
【００１７】
本発明は、好ましい実施形態を例示するのに役立つ添付図面と共に読むと最も良く理解される。しかし、本発明は、図面に開示されている特定の実施形態には限定されないと理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例２に記載されている５週間の尿毒性石灰化食（高ホスファート、カルシウムおよびカルシトリオール）の摂取期間中の偽手術（健常）、５／６  Ｎｘ腎摘出術５（尿毒性石灰化）および５／６  Ｎｘならびに抗ＢＳＰ−ＩＤＫ１  ｍＡｂ療法に付されたラットの体重のグラフである。
【図２】この場合も、記載されている５週間の尿毒性石灰化食の摂取の後の偽手術（健常）、５／６  Ｎｘ腎摘出術５（尿毒性石灰化）および５／６  Ｎｘならびに抗ＢＳＰ−ＩＤＫ１  ｍＡｂ療法に付されたラットに関する、中膜対管腔比（腎内動脈）および腎血管周囲線維症に基づく抗ＢＳＰ  ｍＡｂ療法の効果を要約した柱状図である。
【図３】実施例２に記載されている健常および腎損傷ラットに関するシスタチンＣの血漿レベルに対する抗ＢＳＰ  ＩＤＫ１  ｍＡｂ治療の効果を要約した柱状図である。
【図４】糸球体硬化指数に対する抗ＢＳＰ  ＩＤＫ１  ｍＡｂ治療の効果を要約した柱状図である。
【図５】、腎コラーゲンＩＩＩに対する抗ＢＳＰ  ＩＤＫ１  ｍＡｂ治療の効果を要約した柱状図である。
【図６】心臓間質性線維症に対する抗ＢＳＰ  ＩＤＫ１  ｍＡｂ治療の効果を要約した柱状図である。
【図７】心臓血管周囲線維症に対する抗ＢＳＰ  ＩＤＫ１  ｍＡｂ治療の効果を要約した柱状図である。
【図８】大動脈の石灰化に対する抗ＢＳＰ  ＩＤＫ１  ｍＡｂ療法の効果を要約した柱状図である。
【図９】ＲＴ大動脈−ＭＭＰ９に対する抗ＢＳＢ  ＩＤＫ１  ｍＡｂ療法の効果を要約した柱状図である。
【図１０】抗ＢＳＰ  ｍＡｂアガロースに対するＢＳＰの結合動力学に関する図である。
【図１１】抗ＢＳＰ  ＩＤＫ  ｍＡｂアガロースに対するＢＳＰの結合動力学に対する温度の効果に関する図である。
【図１２】抗ＢＳＰ  ＩＤＫ  ｍＡｂアガロースに対するＢＳＰの結合動力学に関するアフェレーシスの数に関する図である。
【実施例】
【００１９】
実施例１  −  ラットにおいて血管および組織石灰化を誘導する方法
利用可能な実験モデルのうち、ラットの５／６腎摘出術（５／６Ｎｘ）が進行性腎疾患の研究に最もよく用いられている。これは、この実験手法の特徴が、ヒトにおいて観察されるＣＫＤに一般的なものだからである［Ｋｒｅｎ  Ｓら，Ｔｈｅ  ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｍｎａｎｔ  ｋｉｄｎｅｙ  ｍｏｄｅｌ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１９９９；５６：３３３−３３７］。５／６腎摘出術は、新規療法を試験するためにも確立されており、臨床的に意義があることが証明されている［Ｆｕｊｉｈａｒａ  ＣＫら，Ｌｏｓａｒｔａｎ−ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｉａｚｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｌａｓｔｉｎｇ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ａｒｒｅｓｔｓ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｒｅｎａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ５／６  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００７；２９２：Ｆ１８１０−１８１８；Ｔｅｒｚｉ  Ｆら，Ｓｏｄｉｕｍ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ＡＰ−１  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｎｅｐｈｒｏｎ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ：ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｎａｌ  ｌｅｓｉｏｎｓ．Ｅｘｐ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０００；８：１０４−１１４；Ｗａａｎｄｅｒｓ  Ｆら，Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｒｅｎｉｎ−ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ｄｉｅｔａｒｙ  ｓｏｄｉｕｍ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ，ａｎｄ／ｏｒ  ｄｉｕｒｅｔｉｃｓ  ｏｎ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｊｕｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １  ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｎｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｕｒｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ：ａ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．２００９；５３：１６−２５］。５／６腎摘出術は片側腎摘出術および残りの腎臓の極の部分的梗塞または切断により行われうる［Ｓａｎｔｏｓ  ＬＳら，Ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｎａｌ  ｍａｓｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ：ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｍｎａｎｔ  ｋｉｄｎｅｙ．Ａｃｔａ  Ｃｉｒ  Ｂｒａｓ．２００６；２１：２５２−２５７］。
【００２０】
体重約１００ｇの雄Ｗｉｓｔａｒラットを全実験に使用した。それらを２週間以内の２回の手術による５／６腎摘出術に付した。１回目の手術の１週間後、組織および血管の石灰化を誘発するために、１．２％  ホスファートおよび０．９％  カルシウムを含む食餌を腎臓残存ラットに更に与えた。２回目の手術の１週間後、副甲状腺ホルモンの産生を抑制する０．２５ｍｇ／ｋｇのカルシトリオールの経口用量を該動物に更に与えた。該カルシトリオール投与は以下の幾つかのメカニズムにより血管石灰化を更に促進する：（ｉ）腸カルシウムおよびホスファート吸収の増加、（ｉｉ）副甲状腺ホルモンの過剰抑制による低い骨ターンオーバー疾患および骨へのカルシウム運搬の低減、ならびに（ｉｉｉ）血管壁に対する直接的効果。したがって、本発明者らは、この動物実験においては、ホスファートおよびカルシウムに富む食餌ならびに活性ビタミンＤの追加投与に付された偽ならびに残存腎臓ラット（Ｗｉｓｔａｒ）の動脈血管の石灰化を特に精査した。循環可溶性骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）に特異的なラットＩｇＧモノクローナル抗体の種々の用量の皮下投与により腎臓残存ラットを治療（処理）することにより、本発明の療法を試験した。可溶性ＢＳＰに対する該ｍＡｂ療法の過敏症または有害な副作用、特に、アレルギー反応または炎症は観察されなかった。全身応答は良好であり、副作用は観察されなかった。試験期間中に健常ラットと腎摘出ラットとの間で血圧の変化は観察されなかった。
【００２１】
偽手術および食餌のみに付されたラット（ｎ＝１０）、プラセボの投与を受けた５／６Ｎｘラット（ｎ＝１４）、ならびに循環性可溶性骨シアロタンパク質に特異的な５モノクローナルラット抗体（抗ＢＳＰ−ｍＡｂ）の低用量（ｎ＝１４；３ｍｇ  ｍＡｂ／ｋｇ／週）、中等度用量（ｎ＝１４；１０ｍｇ  ｍＡｂ／ｋｇ／週）および高用量（ｎ＝１４；３０ｍｇ  ｍＡｂ／ｋｇ／週）での治療を受けた５／６Ｎｘラットに関する結果を得た。尿毒症対照は、高ホスファートおよびカルシウム食を摂取したがカルシトリオールを摂取しなかった５／６Ｎｘラット（ｎ＝１０）により表された。マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター、例えばドキシサイクリンでの１０回の全身的処理によって、未処理対照と比べて大動脈中膜石灰化が低減しうる（Ｑｉｎ  Ｘら，Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｉｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ａｏｒｔｉｃ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＡｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒＴｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ  ２００６；２６：１５１０−１５１６）。したがって、もう１つの対照群は、亜リン酸カルシウム食（ｎ＝１４）およびドキシサイクリン（ｎ＝１４）、対照（ｎ＝６）を摂取した５／６Ｎｘラットからなるものであった。
【００２２】
抗ＢＳＰ  ｍＡｂでの最初の処理の３日後に初めて、センサーおよび閉塞尾部カフで尾部血液量を測定することにより、ラットの血圧を非侵襲的に測定した。それぞれ低用量、中等度用量および高用量を用いて、抗ＢＳＰ  ｍＡｂによる処理を週間隔で繰返した。抗ＢＳＰ  ｍＡｂによる最初の処理の５週間後、尾部血液を採取し、動物２０をイソフルランガスの使用により殺した。以下の更なる組織学的分析のために、器官（腎臓、心臓、大動脈）を採取した：組織切片におけるミネラル化および石灰化を定量するためのフォン・コッサ染色；間質および血管周囲線維症を定量するためのシリウス・レッド染色（結合組織染色）；心臓２５および腎臓血管における中膜対管腔比を決定するためのエラスチカ・ワンギーソン染色（結合組織染色溶液）；糸球体硬化を測定するためのＰＡＳジアスターゼ染色；カルシウムおよびホスファート産物の存在に関する湿式化学によるもの；コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、ＴＧＦ−β１、ＳＭＡＤ−２、ＣＴＧＦに関するウエスタンブロット法によるもの；ならびにＴＲＰ５、Ｐ２１、ＶＤＲ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、オステオポンチン、ＡＮＰ、ＴＲＰＶ６、カルビンジン、ＢＳＰ、ＣＢＦＡ１、オステリックス、オステオカルシンに関するＲＴ−ＰＣＲによるもの。測定した血漿パラメータ：クレアチニン、カルシウム、ホスファート、マグネシウム、フェチュインＡ、ＦＧＦ−２３、ベータ２−ミクログロブリン；カルビンジン、クラステリン、シスタチンＣ、ＮＧＡＬ、オステオポンチン、ＴＩＭＰ−１、ＶＥＧＦ。
【００２３】
実施例２  −  ラットにおける抗ＢＳＰ  ｍＡｂ療法の結果
大動脈および残存腎臓の目視検査
該器官を最後に採取し、目視検査した。健常（偽処理）動物からの大動脈は大動脈石灰化の徴候、アテローム性動脈硬化内膜病変および「動脈硬化性」内膜／中膜病変を示さなかった。リンカルシウム食およびカルシトリオールを摂取していた５／６Ｎｘ腎臓残存ラットからの大動脈は大規模な大動脈石灰化および拡張した大動脈ブラケットを示した。Ｎｘラットの大動脈の胸部および腹部領域は更に、拡張した石灰化ブラケットを示した。健常（偽処理）動物は腎疾患の症状を示さなかったが、５／６Ｎｘラットの残存腎臓は尿毒症石灰化に典型的な浮腫状肥大および白っぽい色を示した。
【００２４】
体重
健常（偽処理）ラットおよび５／６Ｎｘラットの体重は５週間後に有意に異なっていた。健常動物の体重はその５週間で次第に増加したが、プラセボ処理５／６Ｎｘラットの体重は最初は増加し、石灰化処理の進行につれて減少した。一方、抗ＢＳＰ  ｍＡｂ処理５／６Ｎｘラットの体重は５週間の全期間にわたって増加し、その結果、抗ＢＳＰ  ｍＡｂ処理動物の体重は未処理動物の体重より有意に高かった。これらの結果は図１に要約されている。したがって、抗ＢＳＰ  ｍＡｂ療法を受けた５／６Ｎｘラットは５週間後に対照より有意に高い体重を有していた（＊ｐ＜０．０５；５／６Ｎｘ対照と比較した場合のプール化されたｍＡｂ−ＢＳＰ療法）。
【００２５】
死亡率
プラセボ処理５／６Ｎｘラットの死亡率（４週間後に１４匹中４匹）は、低用量、中等度用量もしくは高用量の抗ＢＳＰ  ｍＡｂ処理を受けたラット（２／１４および４／１４および２／１４）または偽処理のみを受けたラット（０／１０）と比較して有意に高かった。
【００２６】
シスタチンＣおよび腎機能
シスタチンＣの血漿レベルは、糸球体濾過率（ＧＦＲ）および腎機能を反映するパラメータである。図２は、抗ＢＳＰ  ｍＡｂ療法を受けた５／６Ｎｘラット（低用量、中等度用量および高用量療法に関してプール化されたもの）およびプラセボでの処理を受けた５／６Ｎｘラットに関する血漿シスタチンＣレベルを比較した柱状図である。該データのマン−ホイットニーＵ検定（ＭＷＵ）は、抗ＢＳＰ  ｍＡｂ療法を受けた５／６Ｎｘ動物（プール化されたもの）の場合には、未処理５／６  Ｎｘ対照と比較して有意に低いシスタチンＣ値を支持している（＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【００２７】
腎臓の組織学的検査
染色後に腎臓を組織学的に検査した。カルシウム産物に関するフォン・コッサ染色の後には、大きな相違は検出できなかった。抗ＢＳＰ療法を受けた５／６Ｎｘラットにおいては、シリウス・レッド染色は間質性線維症の低減の傾向を示し、ＰＡＳ染色は糸球体硬化症の有意な低減（図４を参照されたい）および中膜対管腔比の有意な減少（図３  Ａ／Ｂ）を示した。より厳密には、抗ＢＳＰ  ｍＡｂ療法に付された５／６Ｎｘラットは、未処理５／６Ｎｘ対照と比較して有意に低い糸球体硬化症を示し（＊＊＊ｐ＜０．０００１；＊ｐ＜０．０５）、抗ＢＳＰ処理５／６Ｎｘラットは、腎内血管において、未対照と比較して有意に低い中膜対管腔比、および低減した血管周囲線維症をも示した。
【００２８】
マトリックスタンパク質の分析およびビタミンＤ受容体の発現
抗ＢＳＰ  ｍＡｂ療法に付された５／６Ｎｘラットは、ウエスタンブロット分析により分析された場合に、プラセボ処理ラットおよび偽処理体と比較してマトリックスタンパク質コラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩの発現の低下の傾向を示した（図５）。しかし、該結果の標準偏差は高く、該結果はコラーゲンＩＩＩに関して有意であるに過ぎない。腎ビタミンＤ受容体のＲＴ−ＰＣＲ発現分析は、抗ＢＳＰ  ｍＡｂ療法が、プラセボ処理５／６Ｎｘラットおよび偽処理体と比較して、ビタミンＤ受容体のアップレギュレーションをもたらすらしいことを示している（図４を参照されたい）。腎カルシウムリン産物の湿式化学分析は有意な相違を示さなかった。
【００２９】
心臓および大動脈
心臓の組織学的検査は、抗ＢＳＰ  ＩＤＫ１  ｍＡｂ療法を受けた５／６Ｎｘラットにおいて、有意に低減した間質性線維症を示した（図６）。該療法は心臓血管周囲線維症をも有意に低減した（図７を参照されたい）。該結果はプラセボ処理対照および偽処理体と比較して有意であった（＊ｐ＜０．０００１；＊ｐ＜０．０５）。タンパク質の分析は再び、記載されている療法が、プラセボ処理５／６Ｎｘ対照および偽処理体と比較して、線維症過程に通常関連しているマトリックスタンパク質コラーゲンＩＩＩおよびＴＧＦβ−１の心臓発現の低減を招きうることを示した。
【００３０】
全大動脈石灰化（図８）は大動脈において有意には異なっていなかったが、湿式化学分析はリン沈着の量の有意な減少を示した。ＲＴ−ＰＣＲ分析は更に、プラセボ処理５／６Ｎｘラットと比較して低下した、メタロプロテアーゼＭＭＰ９の発現を支持している（図９）。
【００３１】
したがって、該結果は、血漿中の骨シアロタンパク質の非沈殿または可溶性形態に結合する抗体の投与が、選択されたＣＫＤ動物モデルにおいて、組織および血管の石灰化に対して有意な効果を及ぼすことを支持している。要約すると、大動脈切片のフォン・コッサ染色は、カルシトリオール処理尿毒症ラットにおいて広範な大動脈石灰化が存在することを示した。これとは対照的に、偽処理動物においては石灰化は観察されず、抗ＢＳＰ抗体処理は石灰化を低減することが可能であった。抗ＢＳＰ抗体処理動物はまた、腎内血管の中膜対管腔比の有意な減少および腎内血管の血管周囲線維症の低減を示した。これらの結果は非常に有望であり、ＣＫＤまたはＥＳＲＤを有する患者において血管および動脈石灰化を予防するために抗ＢＳＰ抗体を使用する可能性を信じる根拠を与える。
【００３２】
行った実験における抗ＢＳＰ抗体によるＢＳＰの排除に関する結果はまた、腎臓および心臓における優れた抗線維症効果を示した。しかし、観察された抗線維症効果が石灰化の低減によるものかどうか、または該抗体が抗線維症活性を有するのかどうかは明らかではない。したがって、糖尿病性腎疾患の動物モデルにおける抗ＢＳＰ抗体の抗線維症特性を調べることが考慮され、ここで、線維症は、選択されるモデルの主要特徴の１つである。このために、本発明者らは、種々の状況における抗ＢＳＰ抗体の有益な効果を証明するために、血管石灰化のもう１つの異なるラットモデルを使用することを想定している。
【００３３】
実施例３  −  血漿中のＢＳＰに結合する抗体
ＢＳＰは血漿中で高いアフィニティで補体因子Ｈと結合する。ＢＳＰのペプチド部分構造体に対する抗体（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｌ．Ｗ．ら，Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｓｃａｎｄ  Ｓｕｐｐｌ．，１９９５，２６６，６１−６５５）、組換えＢＳＰに対する抗体（Ｓｔｕｂｂｓ  ＪＴ  ３ｒｄら，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１９９７  １２（８），１２１０−２２）、および骨から単離されたＢＳＰに対する抗体（該抗体は血漿または血清中ではいずれのＢＳＰにも結合しなかった）が製造されている。１５０ｋＤａの、より大きな因子Ｈは、約６５ｋＤａの、より小さなＢＳＰを遮蔽するらしく（Ｆｅｄａｒｋｏ  ＮＳら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００，２７５，１６６６６−１６６７２；ＷＯ  ００／０６２０６５）、本発明者らは、血清または血漿中で、そして因子Ｈまたは内因性ＢＳＰ受容体の存在下でさえも、ＢＳＰ（ラットまたはヒト）またはそのＢＳＰ断片と交差反応する抗体をスクリーニングした。
【００３４】
この目的のために、本発明者らは、ヒトＢＳＰ配列由来、より厳密には、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：Ｐ２１８１５（ＳＩＡＬ ＨＵＭＡＮ）に開示されているヒトＢＳＰ  ＩＩ由来の保存されたペプチドエピトープならびに１９５、２１３、２１９、２５６、２６８および２７０位におけるその自然変異体を使用した。ヒトＢＳＰは更に、３１、６７、７４、７５、９４、１００、１４９、２８０位におけるリン酸化セリン、硫酸化チロシンおよび多重複合グリコシル化を有するリン酸化糖タンパク質であるため、潜在的なペプチドエピトープを詳細に探索した。更に、ラットおよびヒトにおいて共通のＢＳＰエピトープに対する複数のラットモノクローナル抗体を製造し、担体に結合させ、血漿中のヒトＢＳＰへの結合に関して該ラットｍＡｂを試験した。抗原性を増強するために、ＥＰ１８８８６３１  Ｂ１に記載されているとおりに合成的に結合されたＢＳＰエピトープ、およびベータ−アラニンに結合したＢＳＰエピトープを更に使用した。免疫化および抗体ライブラリーのスクリーニングのための好ましい人工ＢＳＰエピトープを以下に示す。
【００３５】
配列番号１
【００３６】
【化１】
2020114823.tif 000003
ここで、Ｚは１以上のベータ−アラニンを表す。
【００３７】
配列番号２
【００３８】
【化２】
2020114823.tif 000004
ここで、Ｚは１以上のベータ−アラニンを表す。
【００３９】
配列番号３
【００４０】
【化３】
2020114823.tif 000005
ここで、Ｚは１以上のベータ−アラニンを表す。配列番号３のペプチドはヒトＢＳＰに由来し、ここで、複数の利用可能なＢＳＰエピトープが、ＳＧＧＧＧＳのようなスペーサー配列を使用して連結されている。
【００４１】
本発明者らは、ラットまたはヒトＢＳＰに由来しそれらに共通である血漿中で利用可能と考えられる合成ペプチドエピトープと反応する抗体に関して、合成ヒト抗体ライブラリーを差次的にスクリーニングした。更に、示されている可溶性ペプチド抗原およびヒトＢＳＰを血漿中で使用して、ＢＳＰペプチドエピトープに結合するファジミド発現一本鎖抗体に関して、ＤＥ  ４１２２５９９  Ｃ２およびＷＯ  ９３／０１２８８（ＰＣＴ／ＥＰ９２／０１５２４）に従い合成された専有合成ヒト抗体ライブラリー（ｍＡＢ−Ｆａｃｔｏｒｙ  ＧｍｂＨ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，ＤＥ）をスクリーニングした。血漿中でヒトＢＳＰに特異的なそれぞれの完全ヒト抗体（ＡＦ１６５Ｒ４．２−Ｅ２）を得、再構築した。
【００４２】
更に、ラットモノクローナル抗体（抗ＢＳＰ ＩＤＫ１）および部分的専有ヒト化抗体ライブラリー（血漿中でヒトＢＳＰに高いアフィニティで結合するラット相補性決定領域のヒト化変異体を含むもの）を単離し、配列決定した。更に、キメラＣＤＲグラフティングヒトモノクローナル抗体を得た。
【００４３】
ドナーＣＤＲをグラフティングするヒトアクセプターフレームワークを選択するための鉄則のようなものは存在しないため、本発明者らは、血漿中でヒトＢＳＰに結合する本発明者らの完全ヒト抗ｈＢＳＰ抗体の配列、およびＣＤＲグラフティングキメラ抗体の配列、およびラットモノクローナル抗体（抗ＢＳＰ  ＩＤＫ１）のＣＤＲに基づくＣＤＲを有するヒト化モノクローナル抗体の配列を以下に開示する。
【００４４】
配列番号４  −  重鎖（ＡＦ  １６５Ｒ４．２−Ｅ２）
【００４５】
【化４】
2020114823.tif 000006
【００４６】
下線部分はシグナルペプチド（イントロンは除去されている）を表し、太字（点線の下線）の部分はＣＤＲを含む。
【００４７】
配列番号５  −  軽鎖（ラムダ）
【００４８】
【化５】
2020114823.tif 000007
【００４９】
下線部分はシグナルペプチドを表す。重鎖のシグナルペプチドにおける翻訳のためにイントロンは除去されている。太字の部分は抗体の定常ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域である。
【００５０】
更に、血漿中でＢＳＰの可溶性形態に結合するモノクローナルラット抗体のヒトキメラ形態を製造した。
【００５１】
配列番号６  −  ラットｍＡＢ（重鎖）（ＩＤＫ１）のキメラ形態
【００５２】
【化６】
2020114823.tif 000008
【００５３】
配列番号７  −  軽鎖（カッパ）
【００５４】
【化７】
2020114823.tif 000009
【００５５】
下線部分はシグナルペプチドを表す。太字の部分は抗体の定常ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域である。
【００５６】
配列番号８  −  ＩＤＫ  １のヒト化ｍＡＢ（ＡＦ  １７７．３）−重鎖
【００５７】
【化８】
2020114823.tif 000010
【００５８】
配列番号９  −  軽鎖（カッパ）
【００５９】
【化９】
2020114823.tif 000011
【００６０】
血漿中のヒトＢＳＰへの結合に関してモノクローナルラット抗体をスクリーニングするのに使用するペプチドを、アフィニティを増強するためにベータ−アラニンで修飾し、あるいは、多コピーのＢＳＰエピトープを有するペプチドを使用した。このようにして、本発明者らはまた、本発明者らの専有ヒト抗体ファジミドライブラリーにおいてヒトモノクローナル抗体を見出し、ついで、組換え技術（Ｓｔｅｆａｎ  Ｄｕｂｅｌ編，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  ２０１０；ＩＳＢＮ  ９７８−５−５２７−３２９０２−１）を用いて完全ヒト体にした。モノクローナル抗体（抗ＢＳＰ  ＪＤＫ１）およびそのキメラ形態、抗ＢＳＰ ＩＤＫ２ヒトｍＡｂ（クローンＡＦ１６５Ｒ４．２−Ｅ２）、およびヒト化抗体抗ＢＳＰ ＩＤＫ３（クローンＡＦ１７７．３）は、血漿中でヒトＢＳＰに、同じエピトープでない場合に間近で結合し、一方、ラットｍＡｂ（抗ＢＳＰ  ＩＤＫ１）は最高のアフィニティを有することを、滴定および競合実験は示している。
【００６１】
実施例４  −  ＢＳＰ血漿交換物質
血漿交換による循環ＢＳＰの排除が骨粗鬆症または骨疾患を引き起こしうるといういずれかの臨床的証拠が存在する。これに関して、本発明者らは、骨粗鬆症に罹患している閉経後の女性が、閉経期前後の健常対照と比較して上昇した血清ＢＳＰレベルを示すことさえあることに注目している。更に、確立された骨粗鬆症治療法であるアレンドロン酸（Ｒ）（ＩＮＮ）での治療およびホルモン補充療法は全て、閉経後の女性における血清ＢＳＰレベルの低下をもたらす。したがって、血漿交換による血清または血漿からのＢＳＰの排除が、ＣＫＤまたはＥＳＲＤに罹患した患者に対する受け入れられる療法となりうると考える正当な理由が存在する。
【００６２】
更に、ＬＤＬ−コレステロール、リポタンパク質および／またはアポリポタンパク質をヒト血漿から排除するための確立されたプロセスが存在するため、立証されたアフェレーシス物質に頼ることが可能である。適当な固定免疫吸着物質は商業的に入手可能であり、例えば、ＧＬＯＢＡＦＦＩＮ（Ｒ）およびＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂａ（Ｒ）（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  ＡＧ，ＤＥ）が挙げられる。簡潔に説明すると、循環ＢＳＰを除去するための治療方法は、まず、機械を使用して患者の血液を血液細胞および血漿へと分離することを要するであろう。もう１つの工程において、ＢＳＰを含有する血漿を体外で１以上の免疫吸着カラムに通過させる。該カラムは、循環ＢＳＰに対するモノクローナル抗体を含有する。第１カラムにＢＳＰをローディングする間に、第２カラムを洗浄（再生）して、更なるローディングサイクルで再び利用可能となるようにする。循環ＢＳＰの除去の後、血漿を再び血液細胞と混合し、患者に戻す。血液のそのような体外処理は通常３〜５時間を要し、例えばＯｃｔｏ−Ｎｏｖａ（Ｒ）装置（Ｄｉａｍｅｄ  Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ，ｏｌｎ，ＤＥ）を使用して行われうる。
【００６３】
本発明者らは、ラットおよびズッカー（Ｚｕｃｋｅｒ）糖尿病性肥満ラットを使用して、アデニン誘発性腎症における血管石灰化の低減および糖尿病性腎症における血管石灰化の低減を得ることにより、動物研究においてこの体外処理を試験することを意図している。更に、動物およびヒト血液においてＢＳＰおよび抗ＢＳＰ抗体をスクリーニングするために、実施例３の抗体を使用して、新規付随的試験を開発している。記載されているとおり、Ｏｃｔｏ−Ｎｏｖａアフェレーシス系（Ｄｉａｍｅｄ  Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において、血漿交換のための免疫吸着物質が使用されるであろう。後の工程においては、血漿ＢＳＰレベルが、ＣＫＤまたはＥＳＲＤを有する患者の死亡率に関連していることを実証することを意図している。ＢＳＰ吸着物質の効力および生体適合性（安全性）はエクスビボ研究で証明され、最終的に、ＣＫＤ患者におけるアフェレーシスの後のＢＳＰの低減およびヒトに対する安全性を証明するための許容性アフェレーシス研究段階が実施されるであろう。ＢｒＣＮによる結合より有効であることが証明されているＮＨＳ法を用いて、試験抗体（抗ＢＳＰ  ＩＤＫ２）を固定相（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｒ））に結合させた。ホウ酸バッファー（ＢＢＳ，ｐＨ１０．０）中のＮＨＳ活性化カラム物質と共に１ｍｇ／ｍｌの該抗体の溶液を４℃で使用して、該結合を行った。ブラッドフォード法を用いて、固相に結合していない抗体の量で、７８％の結合効率が測定された。２ｍｇ／ｍｌの抗体濃度を用いた場合、結合効率は４３％であり、これはＳｅｐｈａｄｅｘ（Ｒ）１ｍｌ当たり０．８６ｍｇのｍＡｂに相当する。したがって、抗体濃度の増加は固定相上のｍＡｂの量の実質的な増加を招かなかった。固定相としてＮＨＳ活性化アガロースを使用した場合、１ｍｇ／ｍｌ  ｍＡｂを含む溶液においては７７％の、そして２ｍｇ／ｍｌ  ｍＡｂを含むｍＡｂ溶液においては６２％の結合効率を得た。したがって、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｒ）上よりもアガロース上で、より多くのｍＡｂが結合可能であったが、これは、ｍＡｂが固定相の内部にも結合していたことにより説明されうる。
【００６４】
充填カラムの他のパラメータは、流体圧力に関する流体フロースルー、ならびに温度および濃度に関するＢＳＰの吸着速度論であった（図１０および１１を参照されたい）。ＢＳＰ結合が最大になるためには、１０℃の温度が最適であった。一方、結合速度論は３０℃において遥かに良好であり、これはより短い適用時間を可能にした。
【００６５】
ＢＳＰ物質は、ｐＨ２．８〜４のシトラートおよびビタミンＣの混合物を使用して、本発明者らの試験カラムから再び解離されることが可能であった。該結合能および速度論は８ラウンドのアフェレーシスの過程で８５％から７３％に減少したに過ぎず、これはこれらの初期試験に許容されるものである（図１２を参照されたい）。
【００６６】
要約すると、免疫吸着カラム物質に関する最適パラメータはビーズ状架橋ＮＨＳ活性化アガロースである。なぜなら、これは、再使用可能で安全なカラム物質を与えるからである。結合は、好ましくは、アルカリ性炭酸またはホウ酸バッファーにおいて４〜８℃で行われる。結合温度は３０℃が最適であり、１５ｍｌのカラム物質を使用して、ＢＳＰから約７５ｍｌの血液が精製されうるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月3日(2020.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液、血漿又は血清中のヒト骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）に特異的に結合する受容体分子の治療有効量を含む、動脈及び血管石灰化を低減する又は細胞外組織及び血管石灰化、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症ならびに動脈石灰化を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
受容体分子は、血液、血清又は血漿中で接近可能であるＢＳＰの抗原決定基又はエピトープを認識するヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体であって、前記抗原決定基又はエピトープは、
配列番号４及び５に示すアミノ酸配列を有する抗体、
配列番号６及び７に示すアミノ酸配列を有する抗体、又は
配列番号８及び９に示すアミノ酸配列を有する抗体
に由来する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を配列中に含む前記モノクローナル抗体により結合される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
大動脈石灰化、アテローム性動脈硬化内膜病変、及びアテローム性動脈硬化内膜／中膜病変の治療のための請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
腎間質性線維症及び糸球体硬化症の低減及び中膜対管腔比を減少させるための請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
心臓間質性線維症及び血管周囲線維症の低減させるための請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
慢性腎疾患（ＣＫＤ）及び末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を罹患する患者における動脈及び血管石灰化を阻害するための請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
糖尿病性腎疾患の進行のリスクのある患者における抗線維症活性をもたらすための請求項１に記載の医薬組成物。