(57)【要約】【課題】ＤＮＡ構築物からインフルエンザウイルスを調製するための新しい方法を提供すること。【解決手段】上記方法では、リバースジェネティクス法の要素を、古典的再集合体技法および２つまたはそれよりも多くの異なるＶＬＰの使用と組み合わせて、複製能力のある完全感染性ウイルスを生成する。上記方法は、宿主細胞の第１の集団を、ウイルスセグメント、例えば、８つのインフルエンザゲノムセグメントの７つ、または８つのゲノムセグメントの８つをコードするプラスミドまたは他のベクター、例えばアデノウイルスベクターと接触させるステップを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年８月２８日に出願された米国特許出願第６２／２１１，１２５号の出願日の利益を請求し、その開示は、本明細書に参照によって組み込まれる。
【０００２】
政府の権利の声明
本発明は、米国国立衛生研究所により授与されたＨＨＳＮ２７２２０１４００００８Ｃの下、政府支援によりなされた。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザＡ型、Ｂ型、およびＣ型ウイルスは、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のメンバーであり、オルトミクソウイルス科は、分節型一本鎖ネガティブセンスＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスのファミリーである。インフルエンザＡ型、Ｂ型、およびＣ型ウイルスは、ビリオン内に存在する核タンパク質（ＮＰ）およびマトリックスタンパク質（Ｍ１）の抗原性の差異により分類される。インフルエンザＡ型ウイルスは、それらのＨＡおよびＮＡの抗原性に基づいて、１８種の赤血球凝集素（ＨＡ）サブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１８）および１１種のノイラミニダーゼ（ＮＡ）サブタイプ（Ｎ１〜Ｎ１１）にさらに分類される。ほとんどのサブタイプは、野生水鳥の自然保有者に見出すことができるが、ヒト、ブタ、およびウマ等の哺乳動物種にも感染する場合がある。インフルエンザＡ型ウイルスは、ヒトにおいて流行を毎年のように引き起こし、また世界的規模でまん延してヒトの健康に深刻な影響を及ぼすパンデミックを引き起こすことがある。インフルエンザＢ型ウイルスは、天然でヒトに感染し、アシカに感染することもあり、インフルエンザＡ型ウイルスよりも限定的であるが、数年毎にヒトにおいて流行を引き起こす。インフルエンザＣ型ウイルスは、ヒトおよびブタに感染する。血清疫学的研究によると、インフルエンザＣ型ウイルスは世界的に分布しているが、ヒトでは臨床的に良性であることが示唆されている。
【０００４】
インフルエンザＡ型ビリオンは、出芽プロセス中の感染細胞の頂端形質膜から獲得した脂質エンベロープを有する。感染細胞から放出されたビリオンは全体的に球状であり、直径がおよそ８０〜１２０ｎｍの範囲である。その一方で、感染細胞表面上の出芽中ビリオンは、ほとんどが細長く伸びた粒子として、場合によっては均一な直径を有する線維状粒子として存在する。こうしたビリオンは、スパイクと呼ばれる突起で覆われている。多数の２種類の糖タンパク質ＨＡおよびＮＡ、ならびに少量のイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）が、エンベロープに挿入されている。この２種類の糖タンパク質が、ウイルス表面のスパイクを形成している。ＨＡスパイクは棒状であり、ＮＡスパイクは、茎部により脂質膜に接続されている箱形頭部を有するマッシュルーム形状である。Ｍ１、末梢膜タンパク質は、ビリオンにおいて最も豊富なウイルスタンパク質の１つである。Ｍ１は、脂質エンベロープと結合し、その下に層を形成して、ビリオンの球状または線維状構造を維持すると考えられている。ウイルスゲノムは、Ｍ１タンパク質、ＨＡおよびＮＡスパイク、ならびに脂質エンベロープの層で主に構成されているシェルに封入されている。
【０００５】
インフルエンザＡ型およびＢ型ウイルスのゲノムは、８つの一本鎖ネガティブセンスＲＮＡセグメントで構成されており、インフルエンザＣ型ウイルスのゲノムは、７つのＲＮＡセグメントで構成されている。各ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）セグメントは、それ自体に対して折り畳まれてコイル状になっている捻れた棒状構造物を生成するリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。ＲＮＰは転写的に活性であるが、ゲノムＲＮＡ単独では転写的に活性ではない。ＲＮＰ複合体では、ｖＲＮＡは、ＮＰおよび、塩基性ポリメラーゼタンパク質１（ＰＢ１）、塩基性ポリメラーゼタンパク質２（ＰＢ２）、および酸性ポリメラーゼタンパク質（ＰＡ）で構成されるヘテロ三量体ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ複合体に結合している。ＰＢ１は、ヘテロ三量体ＲＮＡポリメラーゼ複合体のコア構造を形成する。ＰＢ１のＮ末端領域はＰＡのＣ末端領域と結合し、ＰＢ１のＣ末端領域はＰＢ２のＮ末端領域と結合する。
【０００６】
ほとんどのネガティブセンスＲＮＡウイルスとは異なり、インフルエンザウイルスゲノムの転写および複製は、感染細胞の核で生じる。ゲノムＲＮＡおよびウイルスタンパク質の合成後、ＲＮＰは、核内で合成され、細胞性染色体領域維持１（Ｃｒｍ１）タンパク質依存性経路を介して、２つのウイルスタンパク質Ｍ１および核輸送タンパク質（ＮＥＰ／ＮＳ２）により媒介され、細胞質へと送り出される。ＲＮＰは、出芽部位（つまり、極性細胞の頂端形質膜の脂質ラフト）へと細胞内輸送され、膜貫通型ＨＡ、ＮＡ、およびＭ２タンパク質は、標準的なエキソサイトーシス経路により細胞表面へと運搬される。ＲＮＰは、Ｍ１タンパク質ならびに／または形質膜のＨＡ、ＮＡ、およびＭ２の細胞質尾部と相互作用して、ウイルス粒子へとパッケージングされると推定される。最後に、全てのウイルス成分が組み立てられて子孫ビリオンとなり、膜分裂により頂端形質膜からの出芽をもたらす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＤＮＡ構築物からインフルエンザウイルスを調製するための新しい方法に関する。上記方法では、リバースジェネティクス法の要素を、古典的再集合体技法および２つまたはそれよりも多くの異なるＶＬＰの使用と組み合わせて、複製能力のある完全感染性ウイルスを生成する。上記方法は、宿主細胞の第１の集団を、ウイルスセグメント、例えば、８つのインフルエンザゲノムセグメントの７つ、または８つのゲノムセグメントの８つをコードするプラスミドまたは他のベクター、例えばアデノウイルスベクターと接触させるステップであって、ここで、これら８つのセグメントの少なくとも１つは、機能性タンパク質（複数可）が、細胞中のそのセグメントから、ならびにウイルス複製および転写を開始させる４つのインフルエンザタンパク質のための、およびキメラタンパク質、例えば、Ｈ２Ａ等の１つの供給源に由来する細胞膜係留ペプチドを有し、異なる供給源に由来し任意選択で細胞膜係留ペプチドを欠如する宿主細胞結合タンパク質に融合されているキメラタンパク質を含む、インフルエンザＨＡタンパク質、エボラＧＰタンパク質、ラブドウイルスＧＰタンパク質、または抗体等の宿主細胞結合タンパク質のためのタンパク質発現プラスミドから発現されないように修飾されているステップを含む。本明細書で使用される場合、ウイルスの「ウイルスセグメント」は、インフルエンザｖＲＮＡ配列を意味し、ウイルスセグメントを産生するための転写カセットの「ウイルスセグメント」は、細胞または適切な無細胞系に導入され、転写されると、インフルエンザｖＲＮＡまたはｃＲＮＡを産出する配列を意味する。任意選択で、欠失セグメント（複数可）に対応する他のタンパク質産物（複数可）は、例えば、形質移入されたプラスミドから、または（owr）
宿主ゲノムに安定的に組み込まれているベクターとして、宿主細胞で発現されてもよく、そのため、一実施形態では、１つまたは複数のタンパク質が、別の実施形態では、完全セットのタンパク質が、ウイルス複製に利用可能である。例えば、ＮＳ１以外のウイルスタンパク質は、トランスで提供されていてもよい。一実施形態では、得られるＶＬＰは、ウイルスセグメントの完全未満のゲノムを担持し、例えば、８つのセグメントの１つまたは最大７つのみを担持する。一実施形態では、得られるＶＬＰは、８つのセグメントの８つを担持し、ここで、セグメントの少なくとも１つは、細胞にてそのセグメントから機能性タンパク質（複数可）が発現されないように修飾されている。したがって、こうしたＶＬＰは、新鮮細胞（欠失セグメント（複数可）または機能性タンパク質（複数可）を欠如する）に感染することはできるが、欠失セグメント（複数可）または機能性タンパク質（複数可）が欠如しているため、追加のラウンドの増殖を起こすことはない。したがって、ＶＬＰは感染性であるが（細胞と結合し、細胞に進入し、ウイルスＲＮＡを送達する）、複製能力がない場合がある。並行して、別の（第２の）細胞集団を、８つのセグメント（インフルエンザＡ型およびＢ型ウイルスの場合）の異なる１つを欠失しているか、または７つのセグメント（インフルエンザＣ型ウイルスの場合）の１つを欠乏しているか、または第１の細胞集団で修飾されていない少なくとも１つの修飾セグメントを有するように、同様に処理して、それにより異なるＶＬＰを生成する。例えば、ＶＬＰの２つの集団（例えば、ＨＡウイルスセグメントを欠如する７セグメントＶＬＰ、およびＰＢ２ウイルスセグメントを欠如する７セグメントＶＬＰ）を混合し、新鮮細胞に接種する。細胞の一部は、両タイプのＶＬＰに感染することになるため、８つのｖＲＮＡ全てがそれら細胞内で産生されるかまたは存在することになり、感染性複製インフルエンザウイルスが生成されることになる。２つのＶＬＰ集団間で共通するセグメントをマッチさせることにより、予測可能なウイルスゲノムを設計および産生することができる。一部の実施形態では、より少数のセグメントがＶＬＰに含まれている。例えば、２セットの４セグメントＶＬＰ、または８セットの１セグメントＶＬＰ等を使用することができる。プールされているＶＬＰに完全なゲノムが存在する限り、セグメントの数がミスマッチしているＶＬＰを組み合わせてもよい。
【０００８】
したがって、本発明は、１セグメントから最大８セグメントのインフルエンザＡ型ＶＬＰを調製するための組成物を提供する。組成物は、インフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＡ  ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、またはインフルエンザウイルスＨＡ  ＤＮＡもしくは非インフルエンザ細胞結合タンパク質ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、少なくとも１つから最大８つのインフルエンザＡ型ウイルスセグメント（例えば、ｖＲＮＡまたはｃＲＮＡの配列）を産生するための少なくとも１つから最大８つの転写カセットを含む１つまたは複数のベクター；ならびにインフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、およびインフルエンザウイルスＨＡまたは非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含むｍＲＮＡ産生用転写カセットを含む１つまたは複数のベクターを含む。ウイルスセグメント産生用の１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、Ｍ１およびＭ２のｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれる。ウイルスセグメント産生用の１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、ＮＳ１およびＮＳ２のｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれる。ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＮＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、ＮＡのｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれる。
【０００９】
また、本発明は、１セグメントから最大８セグメントのインフルエンザＢ型ＶＬＰを調製するための組成物を提供する。組成物は、インフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＡおよびＮＢ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＨＡ  ＤＮＡまたは非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、少なくとも１つから最大８つのインフルエンザＢ型ウイルスセグメントを産生するための少なくとも１つから最大８つの転写カセットを含む１つまたは複数のベクター；ならびにインフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、およびインフルエンザウイルスＨＡまたは非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含むｍＲＮＡ産生用転写カセットを含む１つまたは複数のベクターを含む。ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、Ｍ１およびＢＭ２のｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれる。ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、ＮＳ１およびＮＳ２のｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれる。ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＮＡおよびＮＢ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、ＮＡおよび任意選択でＮＢのｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれる。
【００１０】
また、組成物は、追加のウイルスセグメント、例えば、目的の遺伝子産物、例えば、微生物の抗原またはがん抗原等の予防用または治療用タンパク質をコードするものを産生するためのベクターを含んでいてもよい。
【００１１】
さらに、ＶＬＰを産生するためのベクターを有する単離された宿主細胞が提供される。一実施形態では、宿主細胞は、インフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＭ
ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、またはインフルエンザウイルスＨＡ  ＤＮＡもしくは非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、少なくとも１つから最大８つのインフルエンザＡ型ウイルスセグメントを産生するための少なくとも１つから最大８つの転写カセットを含む１つまたは複数のベクター；ならびにインフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、およびインフルエンザウイルスＨＡまたは非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含むｍＲＮＡ産生用転写カセットを含む１つまたは複数のベクターを含む。一実施形態では、ウイルスセグメント産生用の１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、Ｍ１およびＭ２のｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれ、ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、ＮＳ１およびＮＳ２のｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれ、ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＮＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、ＮＡのｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれる。一実施形態では、宿主細胞は、１つまたは複数のｍＲＮＡ産生用ベクターで安定的に形質転換された組換え宿主細胞である。
【００１２】
一実施形態では、宿主細胞は、インフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＡおよびＮＢ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、またはインフルエンザウイルスＨＡもしくは非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、少なくとも１つから最大８つのインフルエンザＢ型ウイルスセグメントを産生するための少なくとも１つから最大８つの転写カセットを含む１つまたは複数のベクター；ならびにインフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＨＡまたは非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含むｍＲＮＡ産生用転写カセットを含む１つまたは複数のベクターを含み、ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、Ｍ１およびＢＭ２のｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれ、ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、ＮＳ１およびＮＳ２のｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれ、ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＮＡおよびＮＢ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、ＮＡおよび任意選択でＮＢのｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれる。一実施形態では、宿主細胞は、１つまたは複数のｍＲＮＡ産生用ベクターで安定的に形質転換された組換え宿主細胞である。
【００１３】
したがって、一実施形態では、本発明は、１ゲノムセグメントから最大８ゲノムセグメントのインフルエンザＡ型またはＢ型ＶＬＰを調製するための組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、インフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＨＡ  ＤＮＡまたは非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、インフルエンザＡ型ウイルスのゲノムに由来する少なくとも１つから最大８つのウイルスセグメントを産生するための少なくとも１つから最大８つの転写カセットを含む１つまたは複数のベクター；ならびにインフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、およびインフルエンザウイルスＨＡ  ＤＮＡまたは非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含むｍＲＮＡ産生用転写カセットを含む１つまたは複数のベクターを含む。
【００１４】
ウイルスセグメントまたはウイルスタンパク質発現（ｍＲＮＡ産生）用の転写カセットのプロモーターまたは転写終結配列は、任意の他のカセットのプロモーターまたは転写終結配列と比べて同じであってもよくまたは異なっていてもよい。一実施形態では、インフルエンザウイルスゲノムセグメントを発現するカセットは、少なくとも１つの特定の宿主細胞、例えば、イヌ細胞、ネコ細胞、ウマ細胞、ウシ細胞、ヒツジ細胞、またはヒト細胞を含む霊長類細胞等の、トリまたは哺乳動物宿主細胞での発現に、または１つよりも多くの宿主での発現に好適なプロモーターを含む。
【００１５】
一実施形態では、ウイルスセグメントを産生するための１つまたは複数の転写カセットは、これらに限定されないが、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、例えば、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、Ｔ７プロモーター、またはＴ３プロモーターを含むプロモーターを有する。例えば、ベクターの転写終結配列としては、これらに限定されないが、ＲＮＡポリメラーゼＩ転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写終結配列、またはリボザイムが挙げられる。本発明の範囲内のリボザイムとしては、これらに限定されないが、テトラヒメナリボザイム、ＲＮａｓｅ  Ｐ、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、肝炎リボザイム、ならびに合成リボザイムが挙げられる。各転写カセットの各プロモーターまたは転写終結配列は、他のカセットのプロモーターまたは転写終結配列と同じであってもよく、または異なっていてもよい。例えば、各転写カセットの各ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターまたは転写終結配列は、任意の他の転写カセットのＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターまたは転写終結配列と同じであってもよく、または異なっていてもよく、各転写カセットの各ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターまたは転写終結配列は、任意の他の転写カセットのＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターまたは転写終結配列と同じであってもよく、または異なっていてもよく、各転写カセットの各リボザイム配列は、任意の他のカセットのリボザイム配列と同じであってもよく、または異なっていてもよい。一実施形態では、ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットは、任意選択でＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列に連結した別のリボザイム配列に連結したウイルスコード配列に連結したリボザイム配列に連結したＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む。一実施形態では、単一カセットのリボザイム配列は、同じではない。一実施形態では、少なくとも２つおよびそれよりも多くの、例えば、３、４、５、６、または７つのウイルスセグメント産生用転写カセットは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ウイルスコード配列を含むウイルス配列に対応する配列に対して５’であり、第２のリボザイム配列に対して５’であり、転写終結配列に対して５’である第１のリボザイム配列を含む。
【００１６】
複数の本発明の転写カセットは、物理的に連結されていてもよく、または各転写カセットは、プラスミドまたは他の、例えば線形核酸送達ビヒクル等の個々のベクターに存在してもよい。
【００１７】
さらに、本発明のベクター、組成物、および宿主細胞を使用して、例えばワクチンを調製するための方法が提供される。
【００１８】
本発明は、単離された宿主細胞のセットを提供する。上記セットは、インフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＡ（またはＮＡおよびＮＢ）ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、またはインフルエンザウイルスＨＡもしくは非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、インフルエンザＡ型ウイルスのゲノムに由来する少なくとも１つから最大８つのウイルスセグメントを産生するための最大少なくとも１つから最大８つの転写カセットを含む１つまたは複数のベクター；ならびにインフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、およびインフルエンザウイルスＨＡまたは非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含むｍＲＮＡ産生用転写カセットを含む１つまたは複数のベクターを含む、少なくとも１つから最大８つのインフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスのセグメントを有する第１のＶＬＰを産生するための第１の宿主細胞を含む。ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、Ｍ１およびＭ２のｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれ、ウイルスセグメント産生用の１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、ＮＳ１およびＮＳ２のｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれ、ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＮＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、ＮＡのｍＲＮＡ産生用ベクターが含まれる。
【００１９】
少なくとも１つから最大８つのインフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスセグメントを有する第２のＶＬＰを産生するための第２の宿主細胞は、インフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＡ（またはＮＡおよびＮＢ）ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＨＡまたは非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、インフルエンザＡ型のゲノムに由来する少なくとも１つから最大８つのウイルスセグメントを産生するための少なくとも１つから最大７つの転写カセットを含む１つまたは複数のベクター；およびインフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２
ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＨＡまたは非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含むｍＲＮＡ産生用転写カセットを含む１つまたは複数のベクターを含む。ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、Ｍ１およびＭ２のｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれ、ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、ＮＳ１およびＮＳ２のｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれ、ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＮＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、ＮＡのｍＲＮＡ産生用ベクターが含まれる。
【００２０】
一実施形態では、上記セットでは、第１の宿主細胞は、第２の宿主細胞に存在しない少なくとも１つのウイルスセグメントを発現するための少なくとも１つの転写カセットを有し、第２の宿主細胞は、第１の宿主細胞に存在しない少なくとも１つのウイルスセグメントを発現するための少なくとも１つの転写カセットを有する。一実施形態では、第１の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの７つを有し、第２の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの７つを有する。一実施形態では、第１の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの少なくとも２つを有し、第２の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの少なくとも６つを有する。一実施形態では、第１の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの少なくとも３つを有し、第２の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの少なくとも５つを有する。一実施形態では、第１の宿主細胞は、ｖＲＮＡ産生用発現カセットの少なくとも４つを有し、第２の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの少なくとも４つを有する。一実施形態では、第１の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの少なくとも５つを有し、第２の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの少なくとも３つを有する。一実施形態では、第１の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの少なくとも６つを有し、第２の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの少なくとも２つを有する。一実施形態では、第１の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの７つ未満を有し、第２の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの７つ未満を有する。一実施形態では、第１および第２の宿主細胞のウイルスセグメントのための転写カセットが、８つのウイルスセグメント全てを含まない場合、上記セットは、各々が、上記セットに存在しないウイルスセグメント（複数可）を有するＶＬＰを産生する１つまたは複数の宿主細胞をさらに含む。
【００２１】
少なくとも１つから最大８つのインフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスセグメントを有する単離されたＶＬＰがさらに提供される。上記ＶＬＰは、インフルエンザウイルスＰＡセグメント、インフルエンザウイルスＰＢ１セグメント、インフルエンザウイルスＰＢ２セグメント、インフルエンザウイルスＮＰセグメント、インフルエンザウイルスＭセグメント、インフルエンザウイルスＮＳセグメント、インフルエンザウイルスＮＡ（またはＮＡおよびＮＢ）セグメント、またはインフルエンザウイルスＨＡセグメントもしくは非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質を含むように修飾されているＨＡセグメントから選択される１つから最大８つのインフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスセグメントを有し、上記ＶＬＰは、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、およびＨＡ、または非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質を含む。
【００２２】
少なくとも１つから最大７つのインフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスセグメントを有する単離されたＶＬＰがさらに提供される。上記ＶＬＰは、インフルエンザウイルスＰＡセグメント、インフルエンザウイルスＰＢ１セグメント、インフルエンザウイルスＰＢ２セグメント、インフルエンザウイルスＮＰセグメント、インフルエンザウイルスＭセグメント、インフルエンザウイルスＮＳセグメント、インフルエンザウイルスＮＡ（またはＮＡおよびＮＢ）セグメント、またはインフルエンザウイルスＨＡセグメントもしくは非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質を含むように修飾されているＨＡセグメントから選択される１つから最大７つのインフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスセグメントを有し、上記ＶＬＰは、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、およびＨＡ、または非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質を含む。
【００２３】
また、インフルエンザＡ型ウイルスを調製するための方法が提供される。上記方法は、宿主細胞を、少なくとも２つの異なるＶＬＰに感染させることを含み、上記ＶＬＰは、少なくとも１つから最大８つのインフルエンザＡ型ウイルスセグメントを有する第１の単離されたＶＬＰ、ならびに少なくとも１つから最大８つのインフルエンザＡ型ウイルスセグメントを有する第２のＶＬＰを含む。第１のＶＬＰおよび第２のＶＬＰは、インフルエンザウイルスＰＡセグメント、インフルエンザウイルスＰＢ１セグメント、インフルエンザウイルスＰＢ２セグメント、インフルエンザウイルスＮＰセグメント、インフルエンザウイルスＭセグメント、インフルエンザウイルスＮＳセグメント、インフルエンザウイルスＮＡセグメント、またはインフルエンザウイルスＨＡセグメントもしくは非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質の配列を有する修飾ＨＡセグメントから選択される１つから最大８つのインフルエンザＡ型ウイルスセグメントを含み、第１のＶＬＰおよび第２のＶＬＰは、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、およびＨＡ、または非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質を含む。一実施形態では、第１のＶＬＰは、第２のＶＬＰでは機能性インフルエンザウイルスタンパク質をコードしないように修飾されている少なくとも１つのウイルスセグメントを有する。一実施形態では、第１のＶＬＰは、第２のＶＬＰに存在しない少なくとも１つのウイルスセグメントを有し、第２のＶＬＰは、第１のＶＬＰに存在しない少なくとも１つのウイルスセグメントを有する。一実施形態では、第１のＶＬＰのセグメントの少なくとも１つは、第２のＶＬＰの対応するセグメントと同じウイルス分離株に由来する。一実施形態では、第１のＶＬＰのセグメントの少なくとも１つは、第２のＶＬＰの対応するセグメントとは異なるウイルス分離株に由来する。一実施形態では、第１のＶＬＰは７つのセグメントを有し、第２のＶＬＰは７つのセグメントを有する。一実施形態では、第１のＶＬＰは７つのセグメントを有し、第２のＶＬＰは６つのセグメントを有する。一実施形態では、第１のＶＬＰは少なくとも３つのセグメントを有し、第２のＶＬＰは７つのセグメントを有する。一実施形態では、第１のＶＬＰは少なくとも４つのセグメントを有し、第２のＶＬＰは少なくとも４つのセグメントを有する。一実施形態では、第１のＶＬＰは７つ未満のセグメントを有し、第２のＶＬＰは７つ未満のセグメントを有する。一実施形態では、第１および第２のＶＬＰのセグメントが、８つのｖＲＮＡ全てを含む訳ではない場合、宿主細胞は、第１および第２のＶＬＰに存在しないセグメント（複数可）を有する１つまたは複数の他のＶＬＰでさらに感染される。
【００２４】
本発明は、単離された宿主細胞のセットをさらに提供する。一実施形態では、上記セットは、インフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＡおよびＮＢ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、またはインフルエンザウイルスＨＡ  ＤＮＡもしくは非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、インフルエンザＢ型ウイルスのゲノムに由来する少なくとも１つから最大７つのウイルスセグメントの、最大少なくとも１つから最大７つのｖＲＮＡ産生用転写カセットを含む１つまたは複数のベクター；ならびにインフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＨＡまたは非インフルエンザウイルス細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含むｍＲＮＡ産生用転写カセットを含む１つまたは複数のベクターを含む、８つ未満のインフルエンザＢ型ウイルスセグメントを有する第１のＶＬＰを産生するための第１の宿主細胞を含む。ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、Ｍ１およびＢＭ２のｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれ、ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、ＮＳ１およびＮＳ２のｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれ、ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＮＡおよびＮＢ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、ＮＡおよびＮＢのｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれる。
【００２５】
一実施形態では、８つ未満のインフルエンザＢ型ウイルスセグメントを有する第２のＶＬＰを産生するための第２の宿主細胞は、インフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２
ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＡおよびＮＢ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＨＡ  ＤＮＡまたは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、インフルエンザＢ型のゲノムに由来する少なくとも１つから最大７つのウイルスセグメントの、少なくとも１つから最大７つのｖＲＮＡ産生用転写カセットを含む１つまたは複数のベクター；ならびにインフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、およびインフルエンザウイルスＨＡまたは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含むｍＲＮＡ産生用転写カセットを含む１つまたは複数のベクターを含む。ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、Ｍ１およびＢＭ２のｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれ、ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、ＮＳ１およびＮＳ２のｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれ、ｖＲＮＡの１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＮＡおよびＮＢ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含まない場合、ＮＡおよびＮＢのｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれる。
【００２６】
上記セットでは、一実施形態では、第１の宿主細胞は、第２の宿主細胞に存在しない少なくとも１つのウイルスセグメントを発現するための少なくとも１つの転写カセットを有し、第２の宿主細胞は、第１の宿主細胞に存在しない少なくとも１つのウイルスセグメントの、少なくとも１つのｖＲＮＡ発現用転写カセットを有する。一実施形態では、第１の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの７つを有し、第２の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの７つを有する。一実施形態では、第１の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの少なくとも２つを有し、第２の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの少なくとも６つを有する。一実施形態では、第１の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの少なくとも３つを有し、第２の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの少なくとも５つを有する。一実施形態では、第１の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの少なくとも４つを有し、第２の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの少なくとも４つを有する。一実施形態では、第１の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの少なくとも５つを有し、第２の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの少なくとも３つを有する。一実施形態では、第１の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの少なくとも６つを有し、第２の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの少なくとも２つを有する。一実施形態では、第１の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの７つ未満を有し、第２の宿主細胞は、ウイルスセグメント産生用発現カセットの７つ未満を有する。一実施形態では、第１および第２の宿主細胞のｖＲＮＡの転写カセットが、８つのウイルスセグメント全てを含む訳ではない場合、上記セットは、各々が、上記セットに存在しないウイルスセグメント（複数可）を有するＶＬＰを産生する１つまたは複数の宿主細胞をさらに含む。
【００２７】
８つ未満のインフルエンザＢ型ウイルスセグメントを有する単離されたＶＬＰがさらに提供される。上記ＶＬＰは、インフルエンザウイルスＰＡセグメント、インフルエンザウイルスＰＢ１セグメント、インフルエンザウイルスＰＢ２セグメント、インフルエンザウイルスＮＰセグメント、インフルエンザウイルスＭセグメント、インフルエンザウイルスＮＳセグメント、インフルエンザウイルスＮＡおよびＮＢセグメント、またはインフルエンザウイルスＨＡセグメントもしくは非インフルエンザ細胞結合タンパク質をコードする配列を有する修飾ＨＡセグメントから選択される１つから最大７つのインフルエンザＢ型ウイルスセグメントを有し、上記ＶＬＰは、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、およびＨＡ、または非インフルエンザ細胞結合タンパク質を含む。
【００２８】
また、インフルエンザＢ型ウイルスを調製するための方法が提供される。上記方法は、宿主細胞を、少なくとも２つの異なるＶＬＰに感染させることを含み、上記ＶＬＰは、８つ未満のインフルエンザＢ型ウイルスセグメントを有する第１の単離されたＶＬＰ、および８つ未満のインフルエンザＡ型ウイルスセグメントを有する第２のＶＬＰを含む。第１のＶＬＰおよび第２のＶＬＰは、インフルエンザウイルスＰＡセグメント、インフルエンザウイルスＰＢ１セグメント、インフルエンザウイルスＰＢ２セグメント、インフルエンザウイルスＮＰセグメント、インフルエンザウイルスＭセグメント、インフルエンザウイルスＮＳセグメント、インフルエンザウイルスＮＡセグメント、またはインフルエンザウイルスＨＡセグメントから選択される１つから最大７つのインフルエンザＢ型ウイルスセグメントを含み、第１のＶＬＰおよび第２のＶＬＰは、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、およびＨＡを含む。第１のＶＬＰは、第２のＶＬＰに存在しない少なくとも１つのウイルスセグメントを有し、第２のＶＬＰは、第１のＶＬＰに存在しない少なくとも１つのウイルスセグメントを有する。一実施形態では、第１のＶＬＰのセグメントの少なくとも１つは、第２のＶＬＰの対応するセグメントと同じウイルス分離株に由来する。一実施形態では、第１のＶＬＰのセグメントの少なくとも１つは、第２のＶＬＰの対応するセグメントとは異なるウイルス分離株に由来する。一実施形態では、第１のＶＬＰは７つのセグメントを有し、第２のＶＬＰは７つのセグメントを有する。一実施形態では、第１のＶＬＰは７つのセグメントを有し、第２のＶＬＰは６つのセグメントを有する。一実施形態では、第１のＶＬＰは少なくとも３つのセグメントを有し、第２のＶＬＰは７つのセグメントを有する。一実施形態では、第１のＶＬＰは少なくとも４つのセグメントを有し、第２のＶＬＰは少なくとも４つのセグメントを有する。一実施形態では、第１のＶＬＰは７つ未満のセグメントを有し、第２のＶＬＰは７つ未満のセグメントを有する。一実施形態では、第１および第２のＶＬＰのセグメントが、８つのｖＲＮＡ全てを含む訳ではない場合、宿主細胞は、８つ未満のインフルエンザＢ型ウイルスセグメントを有するが、第１および第２のＶＬＰに存在しないセグメントを有する１つまたは複数の他のＶＬＰでさらに感染される。
【００２９】
同様の組成物、宿主細胞、および方法をインフルエンザＣ型ウイルスに使用して、例えば、インフルエンザＣ型ウイルスセグメントの１つから最大７つを有するＶＬＰを調製してもよい。
本発明は、以下の項目を提供する。
(項目１）
少なくとも１つから最大８つのインフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスセグメントを有する第１のＶＬＰを産生するための第１の宿主細胞と、
少なくとも１つから最大８つのインフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスウイルスセグメントを有する第２のＶＬＰを産生するための第２の宿主細胞と
を含む単離された宿主細胞のセットであって、
該第１の宿主細胞は、
インフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＮＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、もしくは
インフルエンザウイルスＨＡ  ＤＮＡもしくは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、インフルエンザＡ型ウイルスのゲノムに由来する少なくとも１つから最大８つのウイルスセグメントを産生するための少なくとも１つから最大８つの転写カセットを含む１つまたは複数のベクター；または
インフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＮＡおよびＮＢ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、もしくはインフルエンザウイルスＨＡ  ＤＮＡもしくは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、インフルエンザＢ型ウイルスのゲノムに由来する少なくとも１つから最大８つのウイルスセグメントを産生するための少なくとも１つから最大８つの転写カセットを含む１つまたは複数のベクター；
ならびに
インフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、および任意選択で、インフルエンザウイルスＨＡまたは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質に作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含むｍＲＮＡ産生用転写カセットを含む１つまたは複数のベクター
を含み、
該第２の宿主細胞は、
インフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＮＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＨＡ  ＤＮＡもしくは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、インフルエンザＡ型のゲノムに由来する少なくとも１つから最大８つのウイルスセグメントを産生するための少なくとも１つから最大８つの転写カセットを含む１つまたは複数のベクター；または
インフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＮＡおよびＮＢ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＨＡ  ＤＮＡもしくは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、インフルエンザＢ型のゲノムに由来する少なくとも１つから最大８つのウイルスセグメントを産生するための少なくとも１つから最大８つの転写カセットを含む１つまたは複数のベクター；
ならびに
インフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、およびインフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、および任意選択で、インフルエンザウイルスＨＡまたは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質に作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含むｍＲＮＡ産生用転写カセットを含む１つまたは複数のベクター
を含み、
該第１の宿主細胞が、該第２の宿主細胞に存在しない少なくとも１つのウイルスセグメントを産生するための少なくとも１つの転写カセットを有するか、または該第１の宿主細胞が、該第２の宿主細胞において対応するウイルスセグメントが修飾されることにより該対応するセグメントから機能性インフルエンザウイルスタンパク質が発現されないようになっている少なくとも１つのウイルスセグメントを産生するための少なくとも１つの転写カセットを有する、セット。
(項目２）
前記第２の宿主細胞が、前記第１の宿主細胞に存在しない少なくとも１つのウイルスセグメントを産生するための少なくとも１つの転写カセットを有する、項目１に記載のセット。
(項目３）
前記第１の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの７つを有するか、または前記第２の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの７つを有する、項目１に記載のセット。
(項目４）
前記第１の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの少なくとも２つを有し、前記第２の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの少なくとも６つを有する、項目１に記載のセット。
(項目５）
前記第１の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの少なくとも３つを有し、前記第２の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの少なくとも５つを有する、項目１に記載のセット。
(項目６）
前記第１の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの少なくとも４つを有し、前記第２の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの少なくとも４つを有する、項目１に記載のセット。
(項目７）
前記第１の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの少なくとも５つを有し、前記第２の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの少なくとも３つを有する、項目１に記載のセット。
(項目８）
前記第１の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの少なくとも６つを有し、前記第２の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの少なくとも２つを有する、項目１に記載のセット。
(項目９）
前記第１の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの７つ未満を有するか、または前記第２の宿主細胞が、前記ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの７つ未満を有する、項目１に記載のセット。
(項目１０）
前記第１および第２の宿主細胞におけるウイルスセグメントのための前記転写カセットが、８つのインフルエンザＡ型ウイルスセグメント全てを含まない場合、該第１および第２の宿主細胞に存在しないインフルエンザＡ型ウイルスセグメントを有するＶＬＰを各々が産生する１つまたは複数の宿主細胞をさらに含む、項目１に記載のセット。
(項目１１）
前記第１の宿主細胞が、前記ｍＲＮＡ産生用転写カセットの１つまたは複数を安定して発現する、項目１から１０のいずれか一項に記載のセット。
(項目１２）
前記第２の宿主細胞が、前記ｍＲＮＡ産生用転写カセットの１つまたは複数を安定して発現する、項目１から１１のいずれか一項に記載のセット。
(項目１３）
各転写カセットが、プラスミドまたは非インフルエンザウイルスベクターに存在する、項目１から１２のいずれか一項に記載のセット。
(項目１４）
１つまたは複数の転写カセットが、１つまたは複数のプラスミドまたは非インフルエンザウイルスベクターに存在する、項目１から１２のいずれか一項に記載のセット。
(項目１５）
前記第１または第２の宿主細胞が、転写終結配列に連結した３’インフルエンザウイルス非コード配列を含む３’インフルエンザウイルス配列に連結した目的のＤＮＡに連結した５’インフルエンザウイルス非コード配列を含む５’インフルエンザウイルス配列に連結したプロモーターを含む転写カセットをさらに含む、項目１から１４のいずれか一項に記載のセット。
(項目１６）
前記第１の宿主細胞には、ウイルスセグメントのための前記１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含んでいない場合、Ｍ１およびＭ２のｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれ、ウイルスセグメントのための前記１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含んでいない場合、ＮＳ１およびＮＳ２のｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれ、ｖＲＮＡのための前記１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＮＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含んでいない場合、ＮＡのｍＲＮＡ産生用ベクターが含まれる、項目１から１４のいずれか一項に記載のセット。
(項目１７）
前記第２の宿主細胞には、ウイルスセグメントのための前記１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含んでいない場合、Ｍ１およびＭ２のｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれ、ウイルスセグメントのための前記１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含んでいない場合、ＮＳ１およびＮＳ２のｍＲＮＡ産生用ベクターが任意選択で含まれ、ｖＲＮＡのための前記１つまたは複数の転写カセットが、インフルエンザウイルスＮＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含んでいない場合、ＮＡのｍＲＮＡ産生用ベクターが含まれる、項目１から１４のいずれか一項に記載のセット。
(項目１８）
前記非インフルエンザウイルス宿主細胞結合タンパク質が、フィロウイルスタンパク質、抗体、アルファウイルスタンパク質、レンチウイルスタンパク質、レトロウイルスタンパク質、アルブミン、またはラブドウイルスタンパク質を含む、項目１から１７のいずれか一項に記載のセット。
(項目１９）
単離された宿主細胞であって、少なくとも１つから最大８つのインフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスセグメントを有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生し、
インフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＮＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、または
インフルエンザウイルスＨＡ  ＤＮＡもしくは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、インフルエンザＡ型ウイルスのゲノムに由来する少なくとも１つから最大８つのウイルスセグメントを産生するための少なくとも１つから最大８つの転写カセットを含む１つまたは複数のベクターを有するか；または
インフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＭ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＮＳ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＮａおよびＮＢ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、またはインフルエンザウイルスＨＡ  ＤＮＡもしくは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットから選択される、インフルエンザＢ型ウイルスのゲノムに由来する少なくとも１つから最大８つのウイルスセグメントを産生するための少なくとも１つから最大８つの転写カセットを含む１つまたは複数のベクター；
ならびに
インフルエンザウイルスＰＡ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＮＰ  ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、および任意選択で、インフルエンザウイルスＨＡまたは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセットを含むｍＲＮＡ産生用転写カセットを含む１つまたは複数のベクター
を有し、
該宿主細胞が１つのウイルスセグメントのみの転写カセットを有する場合、該セグメントは、機能性インフルエンザウイルスタンパク質をコードし、該宿主細胞が、７つのウイルスセグメントのための転写カセットを有する場合、該宿主細胞は、ＮＡウイルスセグメントを産生するためのＮＡコードまたは非コード配列に対応する配列を含まず、ＮＡのｍＲＮＡを産生するための配列を含まず、該宿主細胞が、８つのウイルスセグメントのための転写カセットを有する場合、該セグメントの少なくとも１つは、機能性インフルエンザウイルスタンパク質がそのセグメントから発現されないように修飾されており、該修飾されたセグメントが、ＰＢ２セグメントではない、宿主細胞。
(項目２０）
ウイルスセグメントを産生するための発現カセットの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つを有する、項目１９に記載の宿主細胞。
(項目２１）
前記ｍＲＮＡ産生用転写カセットの１つまたは複数を安定して発現する、項目１９または２０に記載の宿主細胞。
(項目２２）
転写終結配列に連結した３’インフルエンザウイルス非コード配列を含む３’インフルエンザウイルス配列に連結した目的のＤＮＡに連結した５’インフルエンザウイルス非コード配列を含む５’インフルエンザウイルス配列に連結したプロモーターを含む転写カセットをさらに含む、項目１９から２１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
(項目２３）
単離されたＶＬＰのセットであって、該セットの１つのＶＬＰが、
インフルエンザウイルスＰＡセグメント、
インフルエンザウイルスＰＢ１セグメント、
インフルエンザウイルスＰＢ２セグメント、
インフルエンザウイルスＮＰセグメント、
インフルエンザウイルスＭセグメント、
インフルエンザウイルスＮＳセグメント、
インフルエンザウイルスＮＡセグメント、もしくはインフルエンザＮＡおよびＮＢセグメント、または
インフルエンザウイルスＨＡもしくは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質の配列を有する修飾ＨＡセグメントから選択される１つまたは最大８つのインフルエンザＡ型ウイルスセグメントを有し、
該ＶＬＰが、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、およびＨＡ、または非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質を含み、
前記セットの第２のＶＬＰが、
インフルエンザウイルスＰＡセグメント、
インフルエンザウイルスＰＢ１セグメント、
インフルエンザウイルスＰＢ２セグメント、
インフルエンザウイルスＮＰセグメント、
インフルエンザウイルスＭセグメント、
インフルエンザウイルスＮＳセグメント、
インフルエンザウイルスＮＡセグメント、もしくはインフルエンザＮＡおよびＮＢセグメント；または
インフルエンザウイルスＨＡセグメントもしくは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質の配列を有する修飾ＨＡセグメントから選択される１つから最大８つのインフルエンザＡ型ウイルスウイルスセグメントを有し、
該第２のＶＬＰが、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、およびＨＡ、または非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質を含み、
第１のＶＬＰが、該第２のＶＬＰに存在しない少なくとも１つのセグメントを有するか、または該第１のＶＬＰが、該第２のＶＬＰにおいて修飾されることによりその修飾セグメントから機能性インフルエンザウイルスタンパク質が発現されないようになっている少なくとも１つのセグメントを有する、セット。
(項目２４）
前記第２のＶＬＰが、前記第１のＶＬＰに存在しない少なくとも１つのウイルスセグメントを有する、項目２３に記載のセット。
(項目２５）
前記ＶＬＰの少なくとも１つが、５’インフルエンザウイルス非コード配列に連結した非インフルエンザ配列に連結した３’インフルエンザウイルス非コード配列を含むインフルエンザウイルスセグメントをさらに含む、項目２３または２４に記載のセット。
(項目２６）
インフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスを調製するための方法であって、
宿主細胞を、少なくとも２つの異なるＶＬＰで感染させるステップであって、該ＶＬＰが、少なくとも１つから最大８つのインフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスセグメントを有する第１の単離されたＶＬＰ、および少なくとも１つから最大８つのインフルエンザＡ型ウイルスウイルスセグメントを有する第２のＶＬＰを含み、該第１のＶＬＰおよび該第２のＶＬＰが、
インフルエンザウイルスＰＡセグメント、
インフルエンザウイルスＰＢ１セグメント、
インフルエンザウイルスＰＢ２セグメント、
インフルエンザウイルスＮＰセグメント、
インフルエンザウイルスＭセグメント、
インフルエンザウイルスＮＳセグメント、
インフルエンザウイルスＮＡセグメント、または
インフルエンザウイルスＨＡセグメントもしくは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質の配列を有する修飾ＨＡセグメントから選択される１つまたは最大８つのインフルエンザＡ型ウイルスセグメントを含み、または該第１のＶＬＰおよび該第２のＶＬＰが、
インフルエンザウイルスＰＡセグメント、
インフルエンザウイルスＰＢ１セグメント、
インフルエンザウイルスＰＢ２セグメント、
インフルエンザウイルスＮＰセグメント、
インフルエンザウイルスＭセグメント、
インフルエンザウイルスＮＳセグメント、
インフルエンザウイルスＮＡおよびＮＢセグメント、または
インフルエンザウイルスＨＡセグメントもしくは非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質の配列を有する修飾ＨＡセグメントから選択される１つまたは最大８つのインフルエンザＢ型ウイルスウイルスセグメントを含み、
該第１のＶＬＰおよび該第２のＶＬＰが各々、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、およびＨＡ、または非インフルエンザ宿主細胞結合タンパク質を含み、
該第１のＶＬＰが、該第２のＶＬＰに存在しない少なくとも１つのウイルスセグメントを有するか、または該第１のＶＬＰが、該第２のＶＬＰにおいて修飾されることによりその修飾セグメントから機能性インフルエンザウイルスタンパク質が発現されないようになっている少なくとも１つのセグメントを有する、ステップ；および
子孫ウイルスを単離するステップ
を含む方法。
(項目２７）
前記第２のＶＬＰが、前記第１のＶＬＰに存在しない少なくとも１つのウイルスセグメントを有する、項目２６に記載の方法。
(項目２８）
前記第１のＶＬＰのウイルスセグメントの少なくとも１つが、前記第２のＶＬＰにおける対応するウイルスセグメントと同じウイルス分離株に由来する、項目２６に記載の方法。
(項目２９）
前記第１のＶＬＰのウイルスセグメントの少なくとも１つが、前記第２のＶＬＰにおける対応するセグメントとは異なるウイルス分離株に由来する、項目２６に記載の方法。
(項目３０）
前記第１のＶＬＰが、７つのウイルスセグメントを有するか、または前記第２のＶＬＰが、７つのウイルスセグメントを有する、項目２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
(項目３１）
前記第１のＶＬＰが、７つのウイルスセグメントを有し、前記第２のＶＬＰが、６つのウイルスセグメントを有する、項目２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
(項目３２）
前記第１のＶＬＰが、少なくとも３つのウイルスセグメントを有し、前記第２のＶＬＰが、７つのウイルスセグメントを有する、項目２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
(項目３３）
前記第１のＶＬＰが、少なくとも４つのウイルスセグメントを有し、前記第２のＶＬＰが、少なくとも４つのウイルスセグメントを有する、項目２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
(項目３４）
前記第１のＶＬＰが、８つ未満のウイルスセグメントを有し、前記第２のＶＬＰが、８つ未満のウイルスセグメントを有する、項目２６に記載の方法。
(項目３５）
前記第１のＶＬＰが、８つ未満のウイルスセグメントを有する、項目２６に記載の方法。
(項目３６）
前記第２のＶＬＰが、８つ未満のウイルスセグメントを有する、項目２６に記載の方法。
(項目３７）
前記第１および第２のＶＬＰのウイルスセグメントが、８つのゲノムウイルスセグメントを含んでいない場合、前記宿主細胞が、該第１および第２のＶＬＰに存在しないウイルスセグメントを有する１つまたは複数の他のＶＬＰにさらに感染する、項目２６から３６のいずれか一項に記載の方法。
(項目３８）
ＨＡおよびＮＡのためのウイルスセグメントが、同じウイルス分離株に由来する、項目２６から３７のいずれか一項に記載の方法。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義
「ＶＬＰ」は、本明細書で使用される場合、１つもしくは最大８つの（インフルエンザＡ型およびＢ型ウイルスの場合）または１つもしくは最大７つ（インフルエンザＣ型ウイルスの場合）のインフルエンザウイルスゲノムセグメントを含むインフルエンザウイルス様粒子である。一実施形態では、ＶＬＰは、８つ未満のゲノムセグメント（インフルエンザＡ型およびＢ型ウイルスの場合）または７つ未満のゲノムセグメント（インフルエンザＣ型ウイルスの場合）を有する。ＶＬＰは、細胞に感染することができるが、それ自体では、例えば補完的ＶＬＰを提供することにより、何か（something）がトランスで提供さ
れることを除いて、子孫ウイルスを産生することができない。一実施形態では、ＶＬＰは、８つ未満のゲノムセグメント（インフルエンザＡ型およびＢ型ウイルスの場合）を有しており、それらインフルエンザＡ型ウイルスまたはインフルエンザＢ型ウイルスセグメントの各々は、機能性インフルエンザウイルスタンパク質（複数可）をコードする配列を有する。一実施形態では、ＶＬＰは、７つ未満のゲノムセグメント（インフルエンザＣ型の場合）を有しており、それらインフルエンザＣ型ウイルスセグメントの各々は、機能性インフルエンザウイルスタンパク質（複数可）をコードする配列を有する。一実施形態では、１つを超えるゲノムセグメントが存在する場合、少なくとも１つのインフルエンザウイルスゲノムセグメントは、例えば１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換による、例えばゲノムセグメントの修飾の結果として、それぞれのセグメントによりコードされている主なウイルスタンパク質（複数可）（つまり、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＳ２タンパク質）の機能型をコードしていなくともよい。一実施形態では、ＶＬＰは、野生型インフルエンザウイルスと同数のウイルスセグメントを有し得、例えばインフルエンザＡ型またはＢ型では８つのセグメントであるが、ＶＬＰの少なくとも１つのセグメントは、非機能であり、例えば、複製のための、またはパッケージングのための、または感染性ウイルス産生のためのウイルスタンパク質を発現しない。１つまたは複数のウイルスゲノムセグメント（複数可）に加えて、ＶＬＰは、少なくとも、宿主細胞との結合に必要なタンパク質（例えば、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、エボラウイルスＧＰタンパク質、またはＶＳＶ  Ｇタンパク質）、およびウイルスＲＮＡ複製および転写に必要なウイルスタンパク質（つまり、ウイルスＲＮＡと共にウイルスリボ核タンパク質複合体を形成する、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、およびＮＰタンパク質）を含んでいてもよい。ほとんどのＶＬＰは、複製能力がない（つまり、ヘルパー機能依存性）。一部のＶＬＰは、複製能力があり得る（つまり、ＮＡまたはＮＳ１等のインフルエンザウイルスタンパク質を発現する能力を欠如し得るが、依然として感染性子孫ウイルスを形成することが可能であり得る）。複製能力のあるＶＬＰは、弱毒化され得る。ＶＬＰのセットを使用して、細胞を共感染させ、上記セットが、Ａ型またはＢ型の場合の８つのセグメントの各々について少なくとも１つの「機能性セグメント」（機能性ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、またはＮＢ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、またはＮＳ２タンパク質をコードするセグメントと定義される）またはＣ型の場合は７つのセグメントの各々について少なくとも１つの機能性セグメントを含む限り、複製能力のあるインフルエンザウイルスを産出することができる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、ｉｎ  ｖｉｖｏの物質が付随しないかまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ物質から実質的に精製されるように、本発明のベクターもしくはプラスミド等の核酸分子または本発明のウイルスをｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製、単離することを指す。単離されたウイルス調製物は、一般的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養および増殖により得られ、他の感染性因子を実質的に含まない。本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」は、特定の感染性因子が、その因子の標準的検出方法を使用して検出レベル未満であることを意味する。「組換え」ウイルスは、例えば、組換えＤＮＡ技術を使用して、配列またはセグメント全体の欠失等の変更をウイルスゲノムに導入して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作されているウイルス、またはそうでなければ人為的に生成されたウイルスである。本明細書で使用される場合、用語「組換え核酸」または「組換えＤＮＡ配列もしくはセグメント」は、供給源に由来するかまたは供給源から単離され、その後、その配列が、天然に存在しないように、または天然ゲノムに配置されるようには配置されていない天然に存在する配列に対応するように、化学的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで変更されてもよい核酸、例えばＤＮＡを指す。供給源に「由来する」ＤＮＡの一例は、有用な断片であると同定されており、その後本質的に純粋な形態で化学的に合成されるＤＮＡ配列であろう。供給源から「単離された」そのようなＤＮＡの一例は、遺伝子工学の方法により、本発明で使用するためにさらに操作、例えば増幅することができるように、化学的な手段により、例えば制限エンドヌクレアーゼを使用することにより、上記供給源から切除または取り出される有用なＤＮＡ配列であろう。
【００３２】
ネガティブセンスＲＮＡウイルス
ネガティブセンスＲＮＡウイルスは、ＲＳウイルス（respiratory  syncytial  virus
）、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、およびエボラウイルス等の一般的なヒト病原体、ならびに家禽および畜牛産業に多大な経済的影響を及ぼす動物ウイルス（例えば、ニューカッスル病ウイルスおよび牛疫ウイルス）を含む、７つの科に分類される（ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、ボルナウイルス科（Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、およびアレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ））。最初の４つの科は、非分節ゲノムにより特徴付けられ、後の３つは、それぞれ、６〜８つの、３つの、または２つのネガティブセンスＲＮＡセグメントで構成されるゲノムを有する。ネガティブセンスＲＮＡウイルスの共通特徴は、それらのＲＮＡゲノムの負極性である。つまり、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）は、ｍＲＮＡに対して相補的であり、したがってそれ自体は感染性ではない。ウイルス転写および複製を開始するためには、ｖＲＮＡが、それぞれウイルスポリメラーゼ複合体および核タンパク質により、プラスセンスｍＲＮＡまたはｃＲＮＡへと転写されなければならない。インフルエンザＡ型ウイルスの場合、ウイルスポリメラーゼ複合体は、３つのポリメラーゼタンパク質ＰＢ２、ＰＢ１、およびＰＡで構成されている。ウイルス複製中、ｃＲＮＡは、新しいｖＲＮＡ分子を合成するための鋳型としての役目を果たす。全てのネガティブ鎖ＲＮＡウイルスでは、ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡの５’および３’末端の両方の非コード領域は、ウイルスゲノムの転写および複製に重要である。細胞性またはウイルス性ｍＲＮＡ転写物とは異なり、ｃＲＮＡおよびｖＲＮＡはいずれも、５’末端でのキャッピングがされておらず、まさに３’末端でのポリアデニル化もされていない。
【００３３】
多くのウイルスタンパク質の基本的機能は、生化学的におよび／またはウイルス感染の状況において解明されている。しかしながら、リバースジェネティクス系は、ウイルス複製および病原性ならびに弱毒生ウイルスワクチンの開発に関して、ネガティブ鎖分節および非分節ＲＮＡウイルスについての本発明者らの知識を劇的に増加させてきた。リバースジェネティクスは、この用語が分子ウイルス学で使用される場合、クローニングされたｃＤＮＡに由来するゲノムを有するウイルスを生成することであると定義される（総論については、Neumannら、２００２年を参照されたい）。
【００３４】
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルスである。インフルエンザＡ型ウイルスは、合計で少なくとも１０〜１１個のタンパク質をコードする８つの一本鎖ネガティブセンスウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）のゲノムを有する。インフルエンザウイルスのライフサイクルは、赤血球凝集素（ＨＡ）が、宿主細胞の表面にあるシアル酸含有受容体に結合し、その後、受容体媒介性エンドサイトーシスが起こることから始まる。後期エンドソームでのｐＨ低下が、ＨＡの立体構造変化を引き起こし、それにより、ＨＡ２サブユニットのＮ末端（いわゆる融合ペプチド）が露出する。融合ペプチドは、ウイルス膜およびエンドソーム膜の融合を開始させ、マトリックスタンパク質（Ｍ１）およびＲＮＰ複合体が、細胞質内へと放出される。ＲＮＰは、ｖＲＮＡをカプシド封入する核タンパク質（ＮＰ）、ならびにＰＡ、ＰＢ１、およびＰＢ２タンパク質により形成されるウイルスポリメラーゼ複合体で構成されている。ＲＮＰは、核内へと輸送され、そこで転写および複製が起こる。ＲＮＡポリメラーゼ複合体は、３つの異なる反応：５’キャップおよび３’ｐｏｌｙＡ構造を有するｍＲＮＡの合成、全長相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の合成、および鋳型としてｃＤＮＡを使用するゲノムｖＲＮＡの合成を触媒する。その後、新しく合成されたｖＲＮＡ、ＮＰ、およびポリメラーゼタンパク質は、ＲＮＰへと組み立てられ、核から送り出され、形質膜へと輸送され、そこで子孫ウイルス粒子の出芽が生じる。ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質は、シアリルオリゴ糖からシアル酸を除去し、したがって新しく組み立てられたビリオンを細胞表面から放出させ、ウイルス粒子の自己凝集を防止することにより、感染後期で重要な役割を果たす。ウイルス組立てには、タンパク質間相互作用およびタンパク質−ｖＲＮＡ相互作用が関与するが、こうした相互作用の特性は、大部分が不明である。
【００３５】
インフルエンザＢ型およびＣ型ウイルスは、構造的および機能的にインフルエンザＡ型ウイルスと類似しているが、一部が異なる。例えば、インフルエンザＢ型ウイルスのＭセグメントは、タンデムシストロンの終止−再開始スキームにより、２つのタンパク質Ｍ１およびＢＭ２をコードしている。また、ＮＡセグメントは、バイシストロン性ｍＲＮＡに由来するＮＡタンパク質およびＮＢタンパク質をコードする。インフルエンザＣ型ウイルスは、７つのｖＲＮＡセグメントを有しており、スプライシング転写物に依拠してＭ１タンパク質を産生し、非スプライシングｍＲＮＡの産物は、タンパク分解的に切断されて、ＣＭ２タンパク質を産出する。加えて、インフルエンザＣ型ウイルスは、個々のＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質ではなく、ＨＡ−エステラーゼ（「ＨＥＦ」）をコードする。
【００３６】
インフルエンザワクチン
季節性インフルエンザに対する現行ワクチンは三価であり、Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１サブタイプの２つのインフルエンザＡ型ウイルス株およびインフルエンザＢ型ウイルスを含むか、または四価である。こうしたワクチンは、ＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質に点変異が蓄積されて、ウイルスがヒト免疫応答を回避することが可能になるため、平均して２〜３年毎に更新される。現行のインフルエンザワクチンは、不活化ワクチンまたは弱毒生ワクチンのいずれかである。インフルエンザウイルスワクチン市場では不活化ワクチンが主流であり、優勢株または標的株の表面タンパク質をコードする遺伝子、最もよく知られているものとしてはＨＡ遺伝子およびＮＡ遺伝子を含む再集合体ウイルスで作られている。こうしたウイルスは、典型的には、鶏卵で過剰産生され、その後、化学的に、例えばホルムアルデヒドで処理して不活化される。不活化されているが完全なビリオンを導入することにより、ＨＡおよびＮＡの組合せ（ＨおよびＮ、例えばＨ５Ｎ１とも呼ばれる）に特異的な免疫応答が誘導される。
【００３７】
最近まで、不活化ウイルス製剤は、利用可能な唯一のインフルエンザワクチンだった。ほとんどの不活化ワクチンは安全であり、体液性免疫応答を誘発するが、強力な細胞免疫応答を誘発しない。種株を産生するために、有胚鶏卵を、流行株と高増殖特性を提供するＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（ＰＲ８）ウイルスとで共感染させる。インフルエンザＢ型ウイルスワクチン産生の場合、ウイルス骨格を提供するために野外株が使用される。ウイルス集団は、流行株のＨＡ遺伝子およびＮＡ遺伝子を含み、卵中で良好に増殖する再集合体についてスクリーニングされる。適切なワクチン種ウイルスを選択したら、それを、卵中で増幅し、精製し、処理して、不活化されたスプリット（つまり、破壊された）またはサブユニット（つまり、ウイルスリボ核タンパク質複合体の除去により部分的に精製された）ワクチンが生成される。その後、ワクチン量を標準化し、１株当たり１５μｇ  ＨＡに調整される。
【００３８】
不活化インフルエンザワクチンの効力は、６５歳よりも若い健常成人では、典型的には６０％から９０％までの範囲である（Beyerら、２００２年）。しかしながら、効力は、
低年齢児では未感作免疫状態（naive  immune  status）のため（Smithら、２００６年）、高齢者では免疫機能低下のため（Grossら、１９９５年；Nicholら、１９９８年）、有
意に低い可能性があり、したがって、２つの主要なリスク群は、部分的に無防備のままである。
【００３９】
生であるが弱毒化されているワクチンは、体液性免疫応答および細胞性免疫応答を両方とも誘発するが、一部のシナリオでは、数週間にわたって患者による生ウイルス流出を伴うため、より論争の的になっている。この生ウイルスは、変異を含むため、複製はできるが、病原性はないと考えられ、つまり疾患を引き起こさないと考えられる。
【００４０】
インフルエンザワクチンを生産するためのリバースジェネティクス技術
不活化インフルエンザワクチンおよび生インフルエンザワクチンの生産は両方とも、ある特定の遺伝子配置を有する再集合体ウイルスを単離することに依拠する。２つの異なるインフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスによる細胞の共感染は、２８＝２５６通りの異なる遺伝子組合せをもたらすため、所望の再集合体の単離は煩雑である。１９９９年には、クローニングされたｃＤＮＡに由来するインフルエンザウイルスの人為的生成を可能にする系が開発された（Neumannら、１９９９年）。この手法では、細胞を、インフルエンザ
ｖＲＮＡをコードするプラスミド、およびウイルス複製複合体の成分（つまり、ポリメラーゼおよびＮＰタンパク質）をコードするプラスミドで共形質移入する。前者のプラスミドは、ｖＲＮＡ産生用プロモーター、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター配列、ネガティブセンス配向性の全長ウイルスＲＮＡをコードするｃＤＮＡ、およびＲＮＡターミネーター配列、例えばＲＮＡポリメラーゼＩターミネーター配列を含む。ＲＮＡポリメラーゼＩによる細胞内転写は、したがって、ウイルスポリメラーゼおよび核タンパク質により増幅され得るインフルエンザウイルスＲＮＡと同一の転写物を産出する。形質移入の４８時間後、細胞培養上清の１ｍｌ当たり最大１０８個の感染性ウイルスが検出される。この系は、インフルエンザウイルスゲノムへの任意の（生存可能な）変異の導入を可能にする。さらに、この系を使用すると、特注の（tailor-made）再集合体ウイルスを生成す
ることができる。ワクチンウイルスを産生するため、細胞を、流行株のＨＡ遺伝子およびＮＡ遺伝子をコードする２つのプラスミド、およびＰＲ８ウイルス（不活化ワクチンを生産する場合）または弱毒Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０ウイルス（弱毒生ウイルスを生産する場合）のいずれかの内部遺伝子をコードする６つのプラスミドで形質移入することができる。本明細書に記載されているように、リバースジェネティクスは、ＮＡ活性を欠如し、任意選択で他のウイルス遺伝子に変異、例えば得られるウイルスの病原性能力を低減するＨＡ遺伝子の変異を含む弱毒生インフルエンザウイルスワクチンを開発するための基盤である。
【００４１】
ＨＡ切断部位のアミノ酸組成は、インフルエンザウイルスの毒性の決定因子であると認識されている（Boschら、１９７９年）。高病原性鳥インフルエンザＡ（ＨＰＡＩ）ウイ
ルスは、遍在性細胞プロテアーゼにより認識される複数の塩基性アミノ酸をＨＡ切断部位に含み（Kawaokaら、１９８４年）、（Horimotoら、１９９７年；Stieneke-Groberら、１９９８年）、それにより全身感染がもたらされる。対照的に、低病原性を有するウイルスは、ＨＡ切断部位に単一のアルギニン残基を含み（Kawaokaら、１９８４年）、その切断
部位は、ほんの少数の器官でのみ切断され、その結果、限局性感染がもたらされる。「有毒型」ＨＡ切断部位を「非病原性型」ＨＡ切断部位で置き換えると、高病原性鳥インフルエンザウイルスが低病原性バリアントに変換されたため、ＨＡ切断部位の複数の塩基性アミノ酸は毒性に関連している可能性がある（Horimotoら、１９９０年）。したがって、高病原性鳥インフルエンザウイルスは、「有毒型」ＨＡ切断配列を「非病原性型」配列で置き換えることにより、低病原性形態に変換することができる（Horimotoら、１９９４年）。これら「無毒化」変異をウイルスゲノムに導入して、例えば、高増殖性ＰＲ８ウイルスのバックグラウンドに弱毒化Ｈ５ウイルスＨＡ遺伝子を含む候補ワクチンを生成することができる。
【００４２】
ビリオン内部のＲＮＰの構造
ビリオン内部のＲＮＰの立体構造は、注目すべき論争の的だった。陰性染色法で検査するときに、直径７〜８ｎｍの連続鎖が、破壊されたビリオン内にヘリックスの形態で配置されている。ヘリックスは、ターン数および全体的な直径に関して、ビリオン毎にかなり異なっている。連続鎖は、陰性染色法によりビリオン内で観察される唯一構造だったため、ウイルスＲＮＰの天然組織（natural  organization）を表わすと考えられていた。し
たがって、ウイルスＲＮＰは、単一連続ヘリックスとしてビリオン内に存在し、連続ヘリックスは、精製プロセス中に複数のＲＮＰに断片化されたと考えられると提唱された。しかしながら、単一連続ヘリックスを、ＲＮＰをビリオンから抽出するときに観察される捻れた棒状構造物と形態学的に一致させるのは難しい。加えて、連続ヘリックスが、実際にＮＰ分子で構成されているという証拠はない。その後、陰性染色電子顕微鏡観察により、ビリオン内の多種多様な連続ヘリックスが、４×４ｎｍの寸法を有する同じユニットで構成されていることが明らかにされた。また、単離されたＭ１タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで脂質と再結合させたときに、リポソームで規則正しい鎖を形成することが示された。インフルエンザウイルスは、２つの主要な内部タンパク質ＮＰおよびＭ１を有し、ＮＰモノマーは、６．２×３．５ｎｍの寸法を有するため、４ｎｍ×４ｎｍのユニットは、Ｍ１分子に該当すると結論付けられた。したがって、陰性染色された破壊ビリオンで観察される直径が７〜８ｎｍの連続ヘリックスは、脂質エンベロープの下のＭ１タンパク質の層に該当する、Ｍ１鎖の対である可能性が高い。クライオ電子顕微鏡観察により精製ビリオンで観察される同様の連続ヘリックスも、Ｍ１分子の層に該当する可能性がある。
【００４３】
陰性染色電子顕微鏡観察によりインフルエンザビリオンの内部構造を解明する際の難しさの１つは、染色溶液の浸透不良により説明することができる。陰性染色電子顕微鏡観察によりビリオン内部のＲＮＰを観察するため、精製ビリオンが、トリプシンで短期間処理され、エンベロープの糖タンパク質が部分的に除去された。トリプシン処理ビリオンは、感染性であり、ＨＡ活性を有していたが、ＮＡ活性が欠けていた。ビリオンから抽出されたＲＮＰの中央部切片の直径と同様の直径を有する不規則に圧縮された棒状構造物が、これらトリプシン処理ビリオン内部で観察された。さらに、捻れた棒状構造物は、精製ＲＮＰと形態学的に同一だったが、トリプシン処理ビリオンの幾つかからは「流出」していた。また、そのような捻れた棒状構造物は、凍結乾燥により破壊されたビリオンから突き出ており、抗ＮＰモノクローナル抗体と反応し、このことは、ＲＮＰが、断片化された棒状構造物としてビリオン内に存在することを示唆していた。精製ビリオンの薄切片電子顕微鏡観察も、この概念を支持している。精製ビリオンの薄切片電子顕微鏡観察では、直径が１０〜１３ｎｍの幾らかの圧縮された棒状構造物がビリオン内部に示された。それらは、陰性染色電子顕微鏡観察によると、精製ＲＮＰおよびトリプシン処理ビリオンで観察されるＲＮＰの両方と形態学的に類似していた。精製ビリオンの陰性染色により得られる画像と、ペレット化ビリオンの薄切片化により得られる画像との間の良好な一致は、ＲＮＰが、完全ビリオン内では別々の棒状構造物として存在することを示唆している。
【００４４】
ビリオン内部のＲＮＰの配置
断片化ＲＮＰがビリオン内でどのように組織化されるかは依然として不明である。この問題が解決されれば、ｖＲＮＡセグメントが各ビリオンに組み込まれるゲノムパッケージング機序を最終的に解明することができる。初期の提唱では、ｖＲＮＡセグメントは、単一の骨格と結合して、分節ｖＲＮＡが協同的にパッケージングされると予想されていた。しかしながら、この考えは、陰性染色された破壊ビリオンでは単一の連続ヘリックスが観察されるという電子顕微鏡観察に基づいており、それは、その後Ｍ１分子の層に該当することが示されているため、見込みのないシナリオである。ビリオン内の断片化棒状ＲＮＰの組織化に関する情報はわずかである。
【００４５】
感染細胞の形質膜から出芽中の細長く伸びたビリオンは、別個に配置されたＲＮＰを内部に含むことが、薄切片電子顕微鏡観察により実証された。細長く伸びた出芽中のビリオンを縦方向に切片化すると、それらのほぼ全ては、細長く伸びたビリオンの遠位端部のウイルスエンベロープ内部から常に吊下げられ、出芽先端に対して垂直に配向されている棒状ＲＮＰを含んでいた。それらは、幅が約１２ｎｍで、長さが最大１３０ｎｍだった。これは、精製ＲＮＰのサイズと一致した。ＲＮＰは、出芽したビリオンだけでなく、出芽の過程にあるビリオンでも同様に観察された。これは、断片化ＲＮＰの組込みが、芽成長と協同的であることを示唆する。横方向に切片化された出芽中ビリオンでは、直径が約１２ｎｍの高電子密度ドットが観察され、これは、抗ＮＰモノクローナル抗体による免疫電子顕微鏡観察によりＲＮＰであることが確認された。これらドットは、棒状ＲＮＰの断面に該当し、各出芽中ビリオン内部にあることが明白だった。興味深いことには、横方向に切片化された出芽中ビリオンの多くは、中央のＲＮＰが７つの他のＲＮＰに囲まれている（７＋１）立体配置である、８つのＲＮＰの規則的配置を含んでいたことが本発明者らにより見出された。本発明者らの研究では、８つ以下のＲＮＰが、ビリオンで観察された。特に、出芽中ビリオン全体の連続横方向切片では、出芽中ビリオンが全て、最大で８つのＲＮＰを含むが、それらが長さは異なることが明らかにされた。ＲＮＰの長さは、各ｖＲＮＡセグメントの長さと相関するため［６］、こうした結果は、各ビリオンが、異なる種類のｖＲＮＡセグメントで構成されている８つのＲＮＰの高度に組織化されたセットを含むことを示唆する。８つのＲＮＰの（７＋１）立体配置は、巨大線維状ビリオン、ならびにヒト、ブタ、およびトリから単離された異なるウイルスでも観察された。一部の横方向に切片化された線維状ビリオンでは、８つのＲＮＰの典型的な立体配置が示されたが、ほとんどは空だった。縦方向断面では、ＲＮＰは、各線維状ビリオンの遠位端部および８つのＲＮＰのセットに限局されていた。こうした結果は、出芽中ビリオン全てには、ビリオン形状とは無関係に、ビリオンの遠位端部の内側エンベロープと結合している８つの断片化ＲＮＰの組織化セットが組み込まれていることを示唆する。
【００４６】
対照的に、環境溶液内へと放出され、超遠心分離により精製された、単離されたビリオンは、ビリオン内のＲＮＰの組織化が幾分異なっていることを示した。初期の報告では、直径がおよそ１００ｎｍで均一に球状だった精製ビリオンの内部構造が、薄切片電子顕微鏡観察により調査された。ビリオンペレットの薄切片は、一部のビリオンは（７＋１）立体配置のＲＮＰを示したが、精製ビリオンのほとんどでは、圧縮された棒状ＲＮＰの多種多様な組織化パターンを示した。理論的には、棒状ＲＮＰが電子ビームに対して垂直である場合、ビリオンでは棒状構造物が観察される。その一方で、棒状ＲＮＰが電子ビームと平行である場合、ビリオンでは丸形ドットが観察される。精製ビリオンは、ペレットにおいて電子ビームに対して無作為に配向されるため、一部の粒子のみが、８つのＲＮＰの（７＋１）立体配置を示すのは自然である。加えて、一部のＲＮＰ（長さがおよそ３０から１２０ｎｍまで）は、典型的な球状ビリオン（表面スパイクを含む直径がおよそ８０〜１２０ｎｍ）よりも大型であるため、一部のＲＮＰが圧縮され、出芽のときに有していた立体配置が、球状ビリオン内では部分的に破壊されることが起こり得る。したがって、精製後の球状ビリオンは、ＲＮＰの不規則な配置ならびに８つのＲＮＰの規則的配置を示すが、細胞表面上の細長く伸びた出芽中ビリオンは、横方向に切片化される場合、ビリオン内で（７＋１）立体配置を示すと考えられる。まとめると、８つの断片化ＲＮＰは、ビリオンが出芽しているときでは、良好に組織化された立体配置を保持するが、この立体配置は、細胞表面から離れると、球状ビリオン内で部分的に歪められるかまたは完全に破壊される。
【００４７】
最近、精製ビリオンの詳細な内部構造が、クライオ電子断層撮影法により解明された。この場合も精製ビリオン内に８つのＲＮＰの（７＋１）立体配置が見出されたが、８つのＲＮＰは、ほとんどのビリオンで、それほど良好にはアラインしておらず、（７＋１）立体配置は、低頻度で観察されたに過ぎなかった。８つのＲＮＰがこのように不規則に配置されていたこと、ならびに（７＋１）立体配置の観察が限定的であることは、精製ビリオンが、電子ビームに対して無作為に配向されており、一部のＲＮＰが、上述のように球状ビリオンでは圧縮されていたことを示唆する。なお、この実験では、精製ビリオンのサイズおよび形状が異なり、実質的に多形性であり、ビリオンのほとんどが、８つ未満のＲＮＰを含んでいたことにも特に注目された。８つのＲＮＰの完全なセットの組込みは、各々のビリオンでは生じない可能性があり、ビリオン内の断片化ＲＮＰの配置は、ビリオン間で一様ではない可能性があると結論付けられた。出芽中ビリオンと精製ビリオンとの間のこうした不一致は、ビリオン精製での試料処理に伴うビリオン形態の差異に起因する可能性がある。感染細胞の形質膜上にある出芽中ビリオンは、均一な直径を有する細長く伸びたまたは巨大な線維状粒子等の、比較的規則的な構造を示し、多形性ではない。その一方で、精製ビリオンは、典型的な球状構造を示すだけでなく、形質膜での出芽中ビリオンの薄切片電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察では全く報告されていない様々なサイズの多形性構造も示している。放出されたビリオンでの形態学的変化は、精製プロセス中に４８℃で数日間維持されている場合でも容易に生じるため、精製試料にのみ観察されるこうした多形性粒子は、精製中に人為的に導入されたものであり得る。したがって、これら粒子中のＲＮＰの配置は変更されている可能性があるため、こうした多形性粒子は、ビリオンの天然構造を反映することはできない。
【００４８】
ゲノムパッケージングの考え得る機序
ｖＲＮＡセグメントがビリオン内にパッケージングされる機序を説明するために、これまで２つのモデル：無作為パッケージングモデルおよび選択的パッケージングモデルが提唱されている。前者のモデルでは、全てのｖＲＮＡセグメントに共通したパッケージングシグナルが仮定されており、ｖＲＮＡと細胞性ＲＮＡとは区別されるが、ｖＲＮＡの間は区別されず、任意の数および組合せのｖＲＮＡのビリオン内への無作為組込みが可能である。選択的パッケージングモデルでは、各ｖＲＮＡセグメントに特異的なパッケージングシグナルの存在が予測されており、ｖＲＮＡと細胞性ＲＮＡとが区別されるだけでなく、個々のｖＲＮＡ間も区別され、８つのｖＲＮＡセグメントの完全セットのビリオン内への組込みをもたらす。いずれかのモデルを支持する決定的な証拠はなく、ゲノムパッケージングの機序に関する論争は続いている。最近、リバースジェネティクスにより、８つのｖＲＮＡセグメントが全て、ビリオン内への効率的組込みのためのセグメント特異的パッケージングシグナルを有することが明らかにされた。こうしたパッケージングシグナルは、保存されたプロモーター配列だけでなく、プロモーター領域に隣接するコード領域およびセグメント特異的非コード領域を収容する二部構成の配列を、ｖＲＮＡの５’末端および３’末端に含む。こうした知見は、インフルエンザビリオン内部の電子顕微鏡観察と共に、選択的パッケージングモデルを支持しており、無作為パッケージングモデルの誤りを証明する。
【００４９】
ビリオンで観察される８つのＲＮＰの（７＋１）立体配置は、この立体配置を安定的に維持するためにｖＲＮＡ（ＲＮＰ）間の特異的な相互作用を必要とする可能性がある。リバースジェネティクス研究では、ｖＲＮＡセグメントのパッケージングシグナルの変異または欠失は、他のｖＲＮＡセグメントのビリオン内への組込みを低減することが示された。これは、８つのｖＲＮＡセグメントの組込みは、独立したものである可能性は低く、むしろセグメント間の相互作用を伴う協同的事象であることを示唆する。しかしながら、ビリオンの８つのＲＮＰ間に特異的な相互作用が存在するか否かは依然として不明である。横方向に切片化された出芽中ビリオンの断層画像で観察された８つのＲＮＰ間の物理的接触は、ＲＮＰ間の相互作用の存在を支持する有望な形態学的証拠を提供する［５４］。ｖＲＮＡは、ＮＰスキャフォールドの周りに巻き付いているため、そのような接触は、ビリオン内への効率的な組込みに必要な、それぞれのｖＲＮＡセグメントにおけるパッケージングシグナルによる、ｖＲＮＡ−ｖＲＮＡ相互作用に該当し得る。推測ではあるが、パッケージングシグナルによるＲＮＰ間の相互作用は、８つのＲＮＰの完全なセットの動員ならびに（７＋１）立体配置に寄与し得る。ビリオン内のＲＮＰの微細構造、ならびにＲＮＰのパッケージングシグナルの三次元的位置関係の解明は、インフルエンザウイルスゲノムのパッケージング機序の未だ解明されていない詳細を提供し得る。
【００５０】
本発明の例示的なベクター
一実施形態では、本発明は、１つまたは複数の単離されたベクター、または１つもしくは複数の単離されたベクターを含む組成物であって、インフルエンザｖＲＮＡ（ウイルスセグメント）を産生するための、およびタンパク質産生用のインフルエンザウイルスｍＲＮＡのための複数の転写カセットを有するが、ウイルスゲノムのセグメントの完全未満の相補体を有するか、または少なくとも１つの機能性インフルエンザウイルスタンパク質をコードしないウイルスセグメントを有するベクターまたは組成物を提供する。一実施形態では、ベクター（複数可）または組成物は、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＰ
ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ならびに任意選択で、インフルエンザウイルスＨＡのＤＮＡセグメント、例えば全長インフルエンザウイルスＨＡ
ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結を含む転写カセット、インフルエンザウイルスＭのＤＮＡセグメント、例えば全長インフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、および／またはインフルエンザウイルスＮＳのＤＮＡセグメント、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーター配列およびＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセットを有する、１つまたは複数のベクターを含む。
【００５１】
一実施形態では、本発明のベクターは、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１
ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡ、例えば全長ＨＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、およびＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセットから選択される２つまたはそれよりも多くの転写カセットを含んでいてもよい。
【００５２】
一実施形態では、本発明のベクターは、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、およびＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセットから選択される２つまたはそれよりも多くの転写カセットを含む。
【００５３】
本発明は、インフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡセグメント、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡに各々が作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターおよびＰｏｌＩ転写終結配列ならびにＰｏｌＩＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡセグメント、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡに各々が作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターおよびＰｏｌＩ転写終結配列ならびにＰｏｌＩＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡセグメント、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡに各々が作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターおよびＰｏｌＩ転写終結配列ならびにＰｏｌＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、ならびに／またはインフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡセグメント、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡに各々が作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターおよびＰｏｌＩ転写終結配列ならびにＰｏｌＩＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセットから選択される少なくとも２つの転写カセットを有するベクターをさらに含む。
【００５４】
また、本発明は、複数の転写カセットを有する１つまたは複数の単離されたベクターであって、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したリボザイム配列に連結したインフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡに連結したリボザイム配列に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したリボザイム配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡに連結したリボザイム配列に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したリボザイム配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡに連結したリボザイム配列に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したリボザイム配列に連結したインフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡに連結したリボザイム配列に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したリボザイム配列に連結したインフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡに連結したリボザイム配列に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したリボザイム配列に連結したインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに連結したリボザイム配列に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したリボザイム配列に連結したインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに連結したリボザイム配列に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ならびに任意選択で、以下：インフルエンザウイルスＨＡのＤＮＡセグメント、例えば全長インフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結を含む転写カセット、インフルエンザウイルスＭのＤＮＡセグメント、例えば全長インフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、および／またはインフルエンザウイルスＮＳのＤＮＡセグメント、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーター配列およびＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセットの��つまたは複数を有する、１つまたは複数のベクターを提供する。
【００５５】
一実施形態では、ある特定のプラスミドベクターの使用は、インフルエンザウイルス等の分節ウイルスの生成に必要なプラスミドの数を有意に低減し、高効率で形質移入することができる細胞株でのインフルエンザウイルスのレスキュー効率を増加させ、および／またはヒトワクチン産生用細胞株（例えば、ベロ細胞）を含む、高効率で形質移入することができない細胞株でのインフルエンザウイルスの生成を可能にする。したがって、本発明のベクターの使用は、ウイルス生成の変数の数を低減し、インフルエンザウイルスのより一貫した生成をもたらし、プラスミド履歴、純度、および毒性の適切な記録を提供する負担を減少させる。こうした利点は、特にパンデミックの場合、ワクチンウイルスの迅速な生成を可能にする。
【００５６】
本発明の例示的な組成物
本発明は、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、および／またはＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセットから選択されるｖＲＮＡ産生用（しかし、一実施形態では、ｖＲＮＡの完全未満の相補体）またはｃＲＮＡ産生用の１つまたは複数の転写カセットを含む、少なくとも１つのベクター、例えば少なくとも１つのプラスミド；ならびにＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、および／またはＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセットから選択される１つまたは複数のｍＲＮＡ産生用転写カセットを含む、少なくとも１つのベクター、例えば少なくとも１つのプラスミドを含む組成物を提供する。一実施形態では、各ＰｏｌＩプロモーターは、同じである。一実施形態では、各ＰｏｌＩＩプロモーターは、同じである。一実施形態では、各ＰｏｌＩ転写ターミネーター配列は同じである。一実施形態では、各ＰｏｌＩＩ転写ターミネーター配列は同じである。
【００５７】
一実施形態では、これらに限定されないが、アデノウイルスベクター（例えば米国特許第８，０４３，８５６号を参照。この文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれる）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ポックスウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、泡沫状ウイルス（foamivirus）ベクター、またはレトロウイルスベクターを含む少なくとも１つのベクター、例えばプラスミドまたはウイルスベクターは、インフルエンザウイルスＰＡセグメント、インフルエンザウイルスＰＢ１セグメント、インフルエンザウイルスＰＢ２セグメント、インフルエンザウイルスＨＡセグメント、インフルエンザウイルスＮＰセグメント、インフルエンザウイルスＭセグメント、およびインフルエンザウイルスＮＳセグメントの１つまたは複数の転写カセットを含む。一実施形態では、少なくとも１つのｍＲＮＡ産生用プラスミドは、インフルエンザウイルスＰＡ、インフルエンザウイルスＰＢ１、インフルエンザウイルスＰＢ２、またはインフルエンザウイルスＮＰの１つまたは複数の転写カセットを含み、例えば、少なくとも１つのｍＲＮＡ産生用プラスミドは、インフルエンザウイルスＰＡ、インフルエンザウイルスＰＢ１、インフルエンザウイルスＰＢ２、およびインフルエンザウイルスＮＰのカセットを含む。一実施形態では、１つのｍＲＮＡ産生用プラスミドは、上記カセットの３つを含み、ここで、上記組成物は、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルス遺伝子のＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを有する別のｍＲＮＡ産生用プラスミドをさらに含む。例えば、１つのｍＲＮＡ産生用プラスミドは、インフルエンザウイルスＰＡ、インフルエンザウイルスＰＢ１、インフルエンザウイルスＰＢ２の転写カセットを含み、別のプラスミドは、インフルエンザウイルスＮＰの転写カセットを含む。別の実施形態では、少なくとも１つのｖＲＮＡ産生用プラスミドは、インフルエンザウイルスＰＡ、インフルエンザウイルスＰＢ１、インフルエンザウイルスＰＢ２、インフルエンザウイルスＮＰ、インフルエンザウイルスＭ、およびインフルエンザウイルスＮＳの転写カセットを含む。また、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセットを含むｖＲＮＡ産生用プラスミドが含まれる。例えば、１つのｍＲＮＡ産生用プラスミドは、インフルエンザウイルスＰＡ、インフルエンザウイルスＰＢ１、インフルエンザウイルスＰＢ２、およびインフルエンザウイルスＮＰのカセットを含む。別の実施形態では、１つのｍＲＮＡ産生用プラスミドは、上記カセットの３つを含み、上記組成物は、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルス遺伝子のＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを有する別のｍＲＮＡ産生用プラスミドをさらに含み、ここで、上記ＤＮＡコード領域は、上記３つのカセットを含むプラスミドに存在しないインフルエンザウイルス遺伝子のためのものであり、例えば、少なくとも一方のｍＲＮＡ産生用プラス���ドは、インフルエンザウイルスＰＡ、インフルエンザウイルスＰＢ１、インフルエンザウイルスＰＢ２のカセットを含み、他方のプラスミドは、インフルエンザウイルスＮＰのカセットを含む。
【００５８】
一実施形態では、本発明の組成物は、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＡ  ｃＤＮＡ（またはＮＡおよびＮＢ  ｃＤＮＡ）、例えば全長インフルエンザウイルスＮＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、およびＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセットから選択される最大７つの転写カセットを含むベクターを含む。一実施形態では、転写カセット中のＨＡは、Ａ型ＨＡである。別の実施形態では、転写カセット中のＨＡは、Ｂ型ＨＡである。一実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターは、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターである。一実施形態では、組成物は、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結した、Ｍ１およびＢＭ２の、またはＭ１およびＭ２の両方のインフルエンザウイルスＤＮＡ配列に作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセットを含む。
【００５９】
また、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、および／またはＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセットから選択される１つまたは複数の転写カセットを含むベクターを含む組成物が提供される。
【００６０】
別の実施形態では、本発明は、１つまたは複数のウイルスセグメント産生用転写カセット（一実施形態では、インフルエンザＡ型およびＢ型ウイルスの場合は８つ未満のウイルスセグメントまたはインフルエンザＣ型ウイルスの場合は７つ未満のウイルスセグメントのため、別の実施形態では、少なくとも１つの修飾セグメントであって、少なくとも２つのセグメントが存在し、その修飾セグメントは、その修飾セグメントから機能性インフルエンザタンパク質（複数可）が発現されないように修飾されている）、および１つまたは複数のｍＲＮＡ産生用転写（trasncption）カセットを含むプラスミドを含む組成物を提
供する。上記カセットは、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＨＡ
ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＡ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、およびＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット；ならびにインフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡに各々が作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターおよびＰｏｌＩ転写終結配列ならびにＰｏｌＩＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡに各々が作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターおよびＰｏｌＩ転写終結配列ならびにＰｏｌＩＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２
ｃＤＮＡに各々が作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターおよびＰｏｌＩ転写終結配列ならびにＰｏｌＩＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、およびインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰ
ｃＤＮＡに各々が作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターおよびＰｏｌＩ転写終結配列ならびにＰｏｌＩＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセットから選択される１つまたは複数の転写カセットから選択される。一実施形態では、転写カセット中のＨＡは、Ａ型ＨＡである。別の実施形態では、転写カセット中のＨＡは、Ｂ型ＨＡである。一実施形態では、ＲＮＡ  ＰｏｌＩプロモーターは、ヒトＲＮＡ  ＰｏｌＩプロモーターである。一実施形態では、組成物は、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡ、例えばＭ１およびＢＭ２を有するものに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセットをさらに含む。
【００６１】
インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡに各々が作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターおよびＰｏｌＩ転写終結配列ならびにＰｏｌＩＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡに各々が作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターおよびＰｏｌＩ転写終結配列ならびにＰｏｌＩＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡに各々が作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターおよびＰｏｌＩ転写終結配列ならびにＰｏｌＩＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、およびインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡに各々が作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターおよびＰｏｌＩ転写終結配列ならびにＰｏｌＩＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセットを含むベクターを含む組成物がさらに提供される。
【００６２】
本発明の組成物は、追加の弱毒化変異を含む１つまたは複数の追加の変異を有するインフルエンザウイルス配列を有するベクターを含んでいてもよい。例えば、追加の弱毒化変異は、ワクチン内で使用される幾つかの組換えヒトインフルエンザウイルスに、例えば、ＨＡＡｖウイルスを含むＨ５ウイルスに望ましい場合がある。例えば、追加の変異としては、これらに限定されないが、ＨＡ切断部位における置換、Ｍ２の膜貫通（ＴＭ）ドメインにおける置換または欠失（米国特許第６，８７２，３９５号および米国特許出願第６０／９４４，６８０号を参照されたい）を挙げることができ、例えば、インフルエンザＡ型ウイルスの場合、置換は、以下のものの任意の１つまたは複数であってもよい：Ｍ２のＴＭドメインの残基２５〜４３、例えば、Ｍ２のＴＭドメインの２７、３０、３１、３４、３８、および／もしくは４１位（例えば、Ｖ２７Ｔ、Ａ３０Ｐ、Ｓ３１Ｎ、またはＷ４１Ａ置換）、またはＭ２のＴＭドメインにおける欠失、例えば、Ｍ２のＴＭドメインの少なくとも残基２９、３０、もしくは３１、もしくはそれらの任意の組合せの欠失、例えば、Ｍ２細胞質尾部の１１個のＣ末端アミノ酸の欠失等の、Ｍ２の細胞質尾部の２つもしくはそれよりも多くの残基から最大２１個の残基の欠失を含む、Ｍ２の細胞質尾部における欠失、またはＰＢ１における置換、例えば、Ｋ３９１Ｅ、Ｅ５８１Ｇ、もしくはＡ６６１Ｔ、ＰＢ２における置換、例えば、Ｎ２６５Ｓ、および／もしくはＮＰにおける置換、例えば、Ｄ３４Ｇ等の、温度感受性（例えば、低温適応ウイルス）に関連する１つもしくは複数の置換（Jinら、Virology、３０６巻：１８頁（２００３年）を参照）。
【００６３】
例示的な方法
また、本発明は、インフルエンザウイルスを調製するための方法を提供する。上記方法は、細胞を、少なくとも２つのＶＬＰと接触させることを含み、各ＶＬＰは、インフルエンザウイルスＰＡセグメント、インフルエンザウイルスＰＢ１セグメント、インフルエンザウイルスＰＢ２セグメント、インフルエンザウイルスＮＰセグメント、インフルエンザウイルスＭセグメント、インフルエンザウイルスＮＳセグメント、インフルエンザウイルスＮＡセグメント、またはインフルエンザウイルスＨＡセグメントから選択される１つから最大８つのセグメントを有し、上記ＶＬＰは、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、およびＨＡまたは非インフルエンザウイルス宿主細胞結合タンパク質、およびＮＡを含み、一実施形態では、第１のＶＬＰは、第２のＶＬＰに存在しない少なくとも１つのセグメントを有し、第２のＶＬＰは、第１の宿主細胞に存在しない少なくとも１つのウイルスセグメントを有する。ＨＡセグメントは、Ｈ１〜Ｈ１８のいずれか１つであってもよく、ＮＡは、Ｎ１〜Ｎ１１のいずれか１つであってもよい。
【００６４】
各ＶＬＰは、細胞を、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＡ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、および／またはＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、および／またはＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセットから選択される１つまたは最大８つのウイルスセグメント産生用転写カセット；ならびに転写カセット、インフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、および／またはインフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に作動可能に連結したＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセットから選択される１つまたは複数の転写カセットを含むプラスミドと接触させることにより調製することができる。
【００６５】
一実施形態では、ＶＬＰを調製するための方法は、細胞を、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＡ
ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＡ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＡ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセットから選択される１つから最大８つのｖＲＮＡ産生用転写カセットを含み、任意選択で、インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡに各々が作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターおよびＰｏｌＩ転写終結配列ならびにＰｏｌＩＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡに各々が作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターおよびＰｏｌＩ転写終結配列ならびにＰｏｌＩＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡに各々が作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターおよびＰｏｌＩ転写終結配列ならびにＰｏｌＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、および／またはインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡに各々が作動可能に連結したＰｏｌＩプロモーターおよびＰｏｌＩ転写終結配列ならびにＰｏｌＩＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセットから選択される１つまたは複数の転写カセットを含むベクターと接触させることを含む。
【００６６】
一実施形態では、本発明の方法は、細胞を、転写終結配列に連結した３’インフルエンザウイルス非コード配列および任意選択で、コード配列の隣接部分を含む３’インフルエンザウイルス配列に連結した目的のＤＮＡに連結した（ＰＣＴ／ＵＳ０３／０４２３３号を参照されたい）、５’インフルエンザウイルス非コード配列および任意選択で、コード配列の隣接部分を含む５’インフルエンザウイルス配列に連結したプロモーターを含む転写カセットを含む１つまたは複数のベクターと接触させることを含む（参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ０３／０４２３３号を参照されたい）。一実施形態では、目的のＤＮＡは、センス配向にある。別の実施形態では、目的のＤＮＡは、ネガティブセンス配向にある。目的のＤＮＡは、病原体の免疫原性ポリペプチドもしくはペプチド、または治療用ポリペプチドもしくはペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含んでいてもよい。目的のＤＮＡは、ＰｏｌＩプロモーターおよびＰｏｌＩ転写終結配列に作動可能に連結していてよく、および／または目的のＤＮＡは、ＰｏｌＩＩプロモーターおよびＰｏｌＩＩ転写終結配列に作動可能に連結している。
【００６７】
本発明の方法は、組換えインフルエンザウイルスを調製するために使用することができる。一実施形態では、上記方法は、追加の弱毒化変異を含む変異を有するインフルエンザウイルス配列を有するベクターの使用を含む。例えば、弱毒化変異は、ワクチン内で使用される幾つかの組換えヒトインフルエンザウイルスに、例えば、ＨＡＡｖウイルスを含むＨ５ウイルスに望ましい場合がある。例えば、追加の変異としては、これらに限定されないが、ＨＡ切断部位における置換、Ｍ２の膜貫通（ＴＭ）ドメインにおける置換または欠失（米国特許第６，８７２，３９５号および米国特許出願第６０／９４４，６８０号を参照）を挙げることができ、例えば、インフルエンザＡ型ウイルスの場合、置換は、以下のものの任意の１つまたは複数であってもよい：Ｍ２のＴＭドメインの残基２５〜４３、例えば、Ｍ２のＴＭドメインの２７、３０、３１、３４、３８、および／もしくは４１位（例えば、Ｖ２７Ｔ、Ａ３０Ｐ、Ｓ３１Ｎ、またはＷ４１Ａ置換）、またはＭ２のＴＭドメインにおける欠失、例えば、Ｍ２のＴＭドメインの少なくとも残基２９、３０、もしくは３１、もしくはそれらの任意の組合せの欠失、例えば、Ｍ２細胞質尾部の１１個のＣ末端アミノ酸の欠失等の、Ｍ２の細胞質尾部の２つもしくはそれよりも多くの残基から最大２１個の残基の欠失を含む、Ｍ２の細胞質尾部における欠失、またはＰＢ１における置換、例えば、Ｋ３９１Ｅ、Ｅ５８１Ｇ、もしくはＡ６６１Ｔ、ＰＢ２における置換、例えば、Ｎ２６５Ｓ、および／もしくはＮＰにおける置換、例えば、Ｄ３４Ｇ等の、温度感受性（例えば、低温適応ウイルス）に関連する１つもしくは複数の置換（Jinら、Virology、３
０６巻：１８頁（２００３年）を参照）。
【００６８】
本発明に使用することができる細胞株およびインフルエンザウイルス
本発明によると、インフルエンザウイルスの受容体である１つまたは複数のシアル酸の発現レベルが低減または減少した変異体細胞を含む、インフルエンザウイルスの効率的な複製を支援する任意の細胞を本発明で使用することができる。上記方法により得られるウイルスは、再集合体ウイルスにすることができる。
【００６９】
一実施形態では、細胞は、ＷＨＯ認定または認定可能な連続細胞株、例えばベロ細胞である。そのような細胞株が認定されるための要件としては、系統学、増殖特徴、免疫学的マーカー、ウイルス感受性、腫瘍形成性、および保管条件の少なくとも１つに関する特徴付け、ならびに動物、卵、および細胞培養での試験による特徴付けが挙げられる。そのような特徴付けは、細胞が、検出可能な外来性因子を含んでいないことを確認するために使用される。一部の国では、核学的特徴も必要とされる場合がある。加えて、腫瘍形成性は、ワクチン生産に使用されるものと同じ継代レベルの細胞で試験することができる。ワクチンウイルスは、一貫した結果をもたらすことが示されているプロセスにより精製することができる（例えば、世界保健機関、１９８２年を参照）。
【００７０】
一実施形態では、最終産物の純度に関する適切な試験が含まれ得るように、使用される細胞株の完全な特徴付けが確立されている。本発明で使用される細胞の特徴付けに使用することができるデータとしては、以下：（ａ）その起源、派生（derivation）、および継代履歴に関する情報；（ｂ）その増殖および形態学的特徴に関する情報；（ｃ）外来性因子の試験結果；（ｄ）細胞を他の細胞株の中で明確に認知することを可能にする生化学的、免疫学的、および細胞遺伝学的パターン等の識別特徴；および（ｅ）腫瘍形成性の試験結果が挙げられる。一実施形態では、使用される宿主細胞の継代レベルまたは集団倍加は、可能な限り低い。
【００７１】
一実施形態では、細胞中で産生されるウイルスは、ワクチン製剤化または遺伝子治療製剤化の前に、高度に精製される。一般的に、精製手順は、細胞ＤＮＡ、他の細胞成分、および外来性因子の広範な除去をもたらすことになる。ＤＮＡを広範に分解または変性させる手順も使用することができる。例えば、Mizrahi、１９９０年を参照されたい。
【００７２】
インフルエンザウイルスを増幅または産生するための例示的な細胞としては、これらに限定されないが、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＤＦ−１細胞、Ａ５４９細胞、ベロ細胞、またはＭＤＣＫ細胞が挙げられる。
【００７３】
ワクチン
本発明のワクチンは、任意の病原体の糖タンパク質を含む免疫原性タンパク質、例えば、１つまたは複数の細菌、ウイルス、酵母、または真菌に由来する免疫原性タンパク質を含んでいてもよい。したがって、一実施形態では、本発明のインフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルス、またはこれらに限定されないが、ＨＩＶ等のレンチウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＣＭＶもしくはＨＳＶ等のヘルペスウイルス、もしくは口蹄疫ウイルスを含む他のウイルス病原体のワクチンベクターであってもよい。
【００７４】
完全ビリオンワクチンは、限外ろ過により濃縮され、その後ゾーン遠心分離またはクロマトグラフィーにより精製される。完全ビリオンワクチンは、精製前または精製後に、例えば、ホルマリンまたはベータ−プロピオラクトンを使用して不活化される。
【００７５】
サブユニットワクチンは、精製糖タンパク質を含む。そのようなワクチンは、以下のように調製することができる：界面活性剤で処理することにより断片化されたウイルス懸濁液を使用して、例えば超遠心分離により表面抗原を精製する。したがって、サブユニットワクチンは、主にＨＡタンパク質を含み、ＮＡも含む。使用される界面活性剤は、例えば、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Bachmeyer、１９７５年）等の陽イオ
ン性界面活性剤、デオキシコール酸アンモニウム（Websterら、１９７７年）等の陰イオ
ン性界面活性剤、またはＴＲＩＴＯＮ  Ｘ１００という名称で市販されているもの等の非イオン性界面活性剤であってもよい。また、ブロメリン等のプロテアーゼでビリオンを処理した後、赤血球凝集素を単離し、その後、ある方法により精製してもよい。
【００７６】
スプリットワクチンは、脂質を溶解する作用剤による処理に供されたビリオンを含む。スプリットワクチンは、以下のように調製することができる：不活化されているまたは不活化されていない上述のようにして得られた精製ウイルスの水性懸濁液を、界面活性剤と共に、エチルエーテルまたはクロロホルム等の脂質溶媒により、撹拌下で処理する。ウイルスエンベロープ脂質の溶解は、ウイルス粒子の断片化をもたらす。主に、元の脂質環境から取り出された赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ、ならびにコアまたはその分解産物で構成されているスプリットワクチンを含む水相を回収する。その後、まだ行われていない場合は、残留感染性粒子を不活化する。
【００７７】
不活化ワクチン。本発明の不活化インフルエンザウイルスワクチンは、これらに限定されないが、ホルマリンまたはβ−プロピオラクトン処理等の公知の方法を使用して、本発明の複製ウイルスを不活化することにより提供される。本発明で使用することができる不活化ワクチンタイプとしては、全ウイルス（ＷＶ）ワクチンまたはサブビリオン（ＳＶ）（スプリット）ワクチンを挙げることができる。ＷＶワクチンは、完全な不活化されたウイルスを含み、ＳＶワクチンは、脂質含有ウイルスエンベロープを可溶化する界面活性剤で破壊し、その後残留ウイルスの化学的不活性化を行った精製ウイルスを含む。
【００７８】
加えて、使用することができるワクチンとしては、表面抗原ワクチンまたはサブユニットワクチンと呼ばれる、単離されたＨＡおよびＮＡ表面タンパク質を含むものが挙げられる。一般的に、ＳＶおよび表面抗原（つまり、精製されたＨＡまたはＮＡ）ワクチンに対する応答は類似している。流行性ウイルスと免疫学的に関連するＮＡ抗原および無関連のＨＡを含む実験的不活化ＷＶワクチンは、従来のワクチンほど効果的ではないようである（Ograら、１９７７年）。関連表面抗原を両方とも含む不活化ワクチンを使用することができる。
【００７９】
医薬組成物
接種、または非経口投与、または経口投与に好適な本発明の医薬組成物は、弱毒化または不活化インフルエンザウイルスを含み、任意選択で、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、およびエマルジョンをさらに含む。組成物は、当技術分野で公知の助剤または賦形剤をさらに含んでいてもよい。例えば、Berkowら、１９８７年；Avery's  Drug  Treatment、１９８７年を参照されたい。本発明の組成物は、一般的に、個々の用量（単位用量）の形態で提供される。
【００８０】
従来のワクチンは、一般的に、組成物に含まれる株の各々に由来するＨＡを、約０．１〜２００μｇ、例えば、１０〜１５μｇ含む。本発明のワクチン組成物の主成分を形成するワクチンは、Ａ型、Ｂ型、またはＣ型のウイルス、またはそれらの任意の組合せ、例えば、３つの型の少なくとも２つ、異なる亜型の少なくとも２つ、同じ型の少なくとも２つ、同じ亜型の少なくとも２つ、または異なる分離株（複数可）、または再集合体（複数可）を含んでいてもよい。ヒトインフルエンザウイルスＡ型は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、およびＨ３Ｎ２亜型を含む。
【００８１】
非経口投与用の製剤は、当技術分野で公知の助剤または賦形剤を含んでいてもよい無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、および／またはエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。担体または閉鎖包帯を使用して、皮膚浸透性を増加させ、抗原吸収を増強することができる。経口投与用の液体剤形は、一般的に、液体剤形を含むリポソーム溶液を含んでいてもよい。懸濁リポソームに好適な形態としては、精製水等の当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含むエマルジョン、懸濁液、溶液、シロップ、およびエリキシルが挙げられる。また、そのような組成物は、不活性希釈剤の他に、アジュバント、湿潤剤、乳化剤、および懸濁化剤、または甘味剤、香味剤、もしくは芳香剤を含んでいてもよい。例えば、Avery's、１９８７年を参照
されたい。
【００８２】
本発明の組成物は、個体への投与に使用される場合、塩、緩衝剤、アジュバント、または組成物の効力向上に望ましい他の物質をさらに含んでいてもよい。ワクチンの場合、特異的免疫応答を増大することができる物質であるアジュバントを使用してもよい。通常は、アジュバントおよび組成物は、免疫系に提示される前に混合されるか、または免疫されている生物の同じ部位に別々に提示される。ワクチン組成物での使用に好適な物質の例は、提供されている。
【００８３】
ワクチンの不均質性は、２〜５０種類の株またはその中の任意の範囲もしくは値等の、少なくとも２つのインフルエンザウイルス株についての複製インフルエンザウイルスを混合することにより提供することができる。現代的抗原組成を有するインフルエンザＡ型またはＢ型ウイルス株を使用してもよい。本発明によると、ワクチンには、当技術分野で公知の技法を使用して、インフルエンザウイルスの単一株にバリエーションを提供することができる。
【００８４】
本発明による医薬組成物は、さらにまたは加えて、少なくとも１つの化学療法化合物、例えば、遺伝子治療の場合は、免疫抑制剤、抗炎症剤、または免疫賦活剤、およびワクチンの場合は、これらに限定されないが、ガンマグロブリン、アマンタジン、グアニジン、ヒドロキシベンズイミダゾール、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子アルファ、チオセミカルバゾン（thiosemicarbarzone）、メチサゾン、リファンピン、リバビリン、ピリミジン類似体、プリン類似体、ホスカルネット、ホスホノ酢酸、アシクロビル、ジデオキシヌクレオシド、プロテアーゼ阻害剤、またはガンシクロビルを含む化学療法剤を含んでいてもよい。
【００８５】
また、組成物は、様々であるが少量のエンドトキシンフリーホルムアルデヒド、および組成物が投与される生物に対して安全であり、望ましくない効果に寄与しないことが判明している保存剤を含んでいてもよい。
【００８６】
医薬品の目的
組成物（またはそれが誘発する抗血清）の投与は、「予防」または「治療」目的のいずれであってもよい。予防的に提供される場合、ワクチンである本発明の組成物は、病原体感染の任意の症状が顕在化する前に提供される。組成物の予防的な投与は、その後のあらゆる感染を予防または減じる役目を果たす。本発明の遺伝子治療組成物は、疾患の任意の症状が顕在化する前に提供されてもよい。組成物の予防的な投与は、疾患に関連する１つまたは複数の症状を予防または減じる役目を果たす。
【００８７】
治療的に提供される場合、弱毒化または不活化ウイルスワクチンは、実際の感染の症状が検出された際に提供される。化合物（複数可）の治療的投与は、任意の実際の感染症を減じる役目を果たす。例えば、Avery、１９８７年を参照されたい。治療的に提供される
場合、遺伝子治療組成物は、疾患の症状または徴候が検出された際に提供される。化合物（複数可）の治療的投与は、その疾患の症状または徴候を減じる役目を果たす。
【００８８】
したがって、本発明の弱毒化または不活化ワクチン組成物は、感染症の発症前（予想される感染を予防または減じるために）または実際の感染症の開始後のいずれで提供してもよい。同様に、遺伝子治療の場合、組成物は、障害または疾患の任意の症状が顕在化する前に、または１つもしくは複数の症状が検出された後に提供してもよい。
【００８９】
組成物は、レシピエント患者がその投与に耐容性を示すことができる場合、「薬理学的に許容される」と言われる。そのような作用剤は、投与される量が生理学的に有意である場合、「治療上有効量」で投与されると言われる。本発明の組成物は、その存在がレシピエント患者の生理学的特徴に検出可能な変化をもたらす場合、例えば、感染性インフルエンザウイルスの少なくとも１つの株に対する、少なくとも１つの一次または二次体液性または細胞性免疫応答を増強する場合、生理学的に有意である。
【００９０】
提供される「防御」は、絶対的である必要はない。つまり、患者の対照集団または集合と比較して統計的に有意な改善がある場合、インフルエンザ感染を完全に予防または根絶する必要はない。防御は、インフルエンザウイルス感染症の症状の重症度または発症の迅速さの緩和に限定されていてもよい。
【００９１】
医薬品投与
本発明の組成物は、受動免疫または能動免疫のいずれかにより、１つまたは複数の病原体、例えば、１つまたは複数のインフルエンザウイルス株に対する耐性を付与することができる。能動免疫では、不活化または弱毒化された生ウイルスワクチン組成物は、宿主（例えば、哺乳動物）に予防的に投与され、投与に対する宿主の免疫応答は、感染および／または疾患に対して防御する。受動免疫の場合、誘発された抗血清を回収し、少なくとも１つのインフルエンザウイルス株により引き起こされた感染症を有する疑いのあるレシピエントに投与することができる。本発明の遺伝子治療組成物は、能動免疫により、予防レベルまたは治療レベルの所望の遺伝子産物を産出することができる。
【００９２】
一実施形態では、ワクチンは、雌および胎児もしくは新生児を両方とも防御する役目を果たす（胎盤経由した、または母乳中の抗体の受動取込みにより）免疫応答の生成を引き起こすのに十分な時間および量の条件下で、哺乳動物雌に提供される（妊娠または分娩時にまたはその前に）。
【００９３】
したがって、本発明は、障害または疾患、例えば、病原体の少なくとも１つの株による感染を予防または減じるための方法を含む。本明細書で使用される場合、ワクチンは、その投与が、疾患の症状または状態の完全なまたは部分的な減弱化（つまり、抑制）、または疾患に対する個体の完全なまたは部分的な免疫のいずれかをもたらす場合、疾患を予防または減じると言われる。本明細書で使用される場合、遺伝子治療組成物は、その投与が、疾患の症状または状態の完全なまたは部分的な減弱化（つまり、抑制）、または疾患に対する個体の完全なまたは部分的な免疫のいずれかをもたらす場合、疾患を予防または減じると言われる。
【００９４】
少なくとも１つの本発明の不活化または弱毒化インフルエンザウイルスまたはその組成物は、先に記載されている医薬組成物を使用して意図されている目的を達成する任意の手段により投与することができる。
【００９５】
例えば、そのような組成物の投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経口、または経皮経路等の、種々の非経口経路によるものであってもよい。非経口投与は、ボーラス注入または経時的に徐々である潅流によるものであってもよい。本発明の医薬組成物を使用する１つの様式は、筋肉内または皮下適用による。例えば、Avery、１９８
７年を参照されたい。
【００９６】
インフルエンザウイルス関連病理を予防、抑制、または処置するための典型的なレジメンは、単一処置として投与される、または１週間〜約２４か月間までの期間またはその中の任意の範囲もしくは値を含む期間にわたって強化投与もしくはブースター投与として反復される、本明細書に記載の有効量のワクチン組成物の投与を含む。
【００９７】
本発明によると、「有効量」の組成物は、所望の生物学的効果を達成するのに十分な量である。有効投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康、および体重、該当する場合は併用処置の種類、処置の頻度、および所望の効果の性質に依存することが理解される。下記に提供されている有効用量の範囲は、本発明を限定するためのものではなく、推奨される用量範囲を表わすものである。しかしながら、投与量は、個々の被験体に応じて調整され、当業者が理解および決定可能である。例えば、Avery's、１９８７年；およびEbadi、１９８５年を参照されたい。
【００９８】
哺乳動物（例えば、ヒト）またはトリ成体生物用の弱毒ウイルスワクチンの投与量は、約１０３〜１０７プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｋｇ、またはその中の任意の範囲もしくは値であってもよい。不活化ワクチンの用量は、約０．１から２００までの範囲の、例えば５０μｇの血球凝集素タンパク質であってもよい。しかしながら、投与量は、出発点として既存のワクチンを使用して従来法により決定した場合に、安全で有効な量であるべきである。
【００９９】
複製ウイルスワクチンの各用量中の免疫反応性ＨＡの投与量は、好適な量、例えば、１〜５０μｇまたはその中の任意の範囲もしくは値、あるいは米国公衆衛生局（ＰＨＳ）が推奨する量、通常は、年齢が＜３歳の年長児の場合は１成分当たり１５μｇおよび年齢が＜３歳の年長児の場合は１成分当たり７．５μｇを含むように標準化されていてもよい。ＮＡの量も標準化されていてもよいが、この糖タンパク質は、取り扱う者（processor）
による精製および保管中に不安定である場合がある。ワクチンの各０．５ｍｌ用量は、およそ１０〜５００億個のウイルス粒子、例えば１００億個の粒子を含んでいてもよい。
【実施例】
【０１００】
（実施例Ｉ）
７セグメントのインフルエンザＡ型ウイルスの特徴付け
ＮＡ  ｖＲＮＡを欠如するＮＡ欠損ウイルスは、幾つかの魅力的な特徴：（ｉ）高レベルの弱毒化；（ｉｉ）リバースジェネティクスによる生成の容易さ、および（ｉｉｉ）野生型表現型への復帰変異を引き起こし得る点変異が存在しないことによるバイオセイフティー、を併せ持つ。さらに、循環野生型株との７セグメントウイルスの再集合は、７セグメントウイルスが由来した野生型株を再生成するに過ぎないだろう。そのようなウイルスは、Ｈ５およびＨ３インフルエンザウイルスの場合に、特に重要であり得る。幾つかの候補Ｈ５Ｎ１ウイルスワクチンが開発されているが（Bressonら、２００６年；Treanorら、２００６年）、不活化サブビリオンまたはスプリットワクチンによる前臨床試験および臨床試験により、適切な免疫応答を達成するためには高用量のＨＡが必要であることが示された（Treanorら、２００６年）。アジュバントが存在する場合でさえ、非アジュバント
化Ｈ３  ＨＡワクチンで典型的に見出されるものと同等の免疫応答を達成するには、３０μｇのＨＡが必要とされた（Bressonら、２００６年）。
【０１０１】
以前に、ＮＡ分子に対する抗体の存在下で継代するが、ＮＡを発現する細胞株によりまたは外因的に適用された細菌シアリダーゼによりシアリダーゼ活性を提供することにより、ＮＡ活性を欠如したウイルスが調製された。両手法は、それらのＮＡ遺伝子に大きな内部欠失を含むウイルスをもたらした。これらウイルスは、内部に欠失したＮＡセグメントを有し、機能性ＮＡを発現しないが（それらはＮＡ欠損ウイルスである）、細胞培養、卵、およびマウスで複製した。また、ＮＡが欠損しているウイルスは、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１０／０８１，１７０号に開示されているもの、例えば、ＭａＫＳ細胞、およびBrandiら、J.  Biol.  Chem.、２６３巻：１６２８３頁（１９８８年）に開示されているもの等の変異体細胞で継代してもよい。
【０１０２】
材料および方法
ウイルス。ヒトＨ５Ｎ１ウイルス［Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（ＶＮ１２０３）およびＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（ＶＮ１２０４）］を使用した。ヒト分離株を、メイディンダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞で増殖させ、５％新生仔ウシ血清を有する最小必須培地で維持した。生ウイルスによるおよびリバースジェネティクスにより生成された形質移入体による実験は全て、ＣＤＣおよび米国農務省によりそのような使用が承認されているバイオセイフティーレベル３封じ込め実験室で実施した。
【０１０３】
プラスミド構築およびリバースジェネティクス。ＶＮ１１９４および別のヒトＨ５Ｎ１ウイルスＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／７／２００５（Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ７）のｃＤＮＡを、Hattaら（２００１年）に記載のように、ウイルスＲＮＡの保存されている３’末端に
相補的なオリゴヌクレオチド（Ｕｎｉ１２）を用いたウイルスＲＮＡの逆転写により合成した。ｃＤＮＡを、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲにより増幅し、その後配列決定した。ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターに挟まれたＶＮ１１９４およびＩｎｄｏｎｅｓｉａ７ウイルスの遺伝子を含む、ウイルスＲＮＡ産生用のプラスミド構築物（ｐＰｏｌＩ）の生成は、Neumannら（１９９９年）に記載されている。構築物は全て、望ましくない変異の非存
在を確認するために配列決定した。自動化配列決定は、ウィスコンシン大学マジソン校バイオテクノロジーセンターで実施された。形質移入体ウイルスを、Neumannら（１９９９
年）に記載のようにリバースジェネティクスにより産生した。
【０１０４】
実験的感染。ＶＮ１１９４およびＶＮ１１９４ＮＡ−ウイルス（ＮＡ  ｖＲＮＡを欠如する７セグメントウイルス）のＭＬＤ５０、すなわちマウスの５０％に致死性のウイルス用量は、麻酔をかけた４週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ウイルスの１０倍系列希釈物を鼻腔内接種することにより決定した。感染マウスを、１４日間毎日観察した。器官のウイルス力価測定の場合、Gaoら（１９９９年）に記載のように、１００（ＶＮ１１９４）また
は１０５ＰＦＵ（ＶＮ１１９４ＮＡ−）のウイルスでマウスを鼻腔内感染させ、感染後３日目および６日目に安楽死させた。
【０１０５】
致死用量の高病原性Ｈ５Ｎ１ウイルスでの負荷に対するＶＮ１１９４ＮＡ−の防御効力を評価するため、各マウスを、１０５ＰＦＵのＶＮ１１９４ＮＡ−で鼻腔内感染させた。対照として、マウスに、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を鼻腔内接種した。１４日後に、血清試料ならびに気管−肺および鼻洗浄液をマウスのサブセットから収集し、抗原としてＶＮ１１９４を使用し、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用することにより、ウイルス特異的免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）またはＧ（ＩｇＧ）抗体を検査した。ワクチン接種後２１日目に、残りのマウスに、１００ＭＬＤ５０の野生型ＶＮ１１９４、ＶＮ１２０３、またはＩｎｄｏｎｅｓｉａ７ウイルスを鼻腔内負荷し、生存および体重を１４日間にわたって毎日モニターした。負荷後３および６日に、ウイルス力価を、１群当たり６匹のマウスの器官で決定した。
【０１０６】
結果
ＮＡセグメントを欠如する変異体Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４（Ｈ５Ｎ１）ウイルス（「ＶＮ１１９４ＮＡ−」）、およびＮＡセグメントが、ｅＧＦＰ遺伝子を有する変異体ＮＡセグメントで置き換えられているウイルス（「ＶＮ１１９４ＮＡｅＧＦＰ」）は、外因性ノイラミニダーゼ処理を行わなくともＭＤＣＫ細胞で複製することが見出された（表１）。
【表１】
2020114250.tif 000002
【０１０７】
得られたウイルスを、ＮＡ、ｅＧＦＰ、またはＮＳセグメントの存在または非存在について特徴付けた。マウスでのＶＮ１１９４ＮＡ−ウイルスについてのＭＬＤ５０は、＞１０５（Ｐ１０：４．３×１０６ｐｆｕ／ｍｌ）だったが、野生型ウイルスについてのそれは、３．１だった。野生型ＶＮ１１９４ウイルスは、脳を含む様々な器官から単離された。ＶＮ１１９４ＮＡ−は、鼻甲介からのみ単離された。これは、ＶＮ１１９４ＮＡ−ウイルスがマウスで弱毒化されていることを示す。
【０１０８】
ＮＡ−ウイルスをワクチンとして試験するため、Ｂａｌｂ／ｃ（４週齢雌）マウスを、ＶＮ１１９４ＮＡ−ウイルスで免疫した。負荷ウイルスは、ＶＮ１１９４野生型、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４、およびＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／７／０５（１００ＬＤ５０）だった。ワクチン接種スケジュールは、以下の通りだった：０日目、ワクチン接種；３および６日目、３匹マウス／群からの器官試料採取；１４日目、血清、肺およびＮＴ洗浄液収集（５匹マウス／群）；２１日目、負荷；２４および２７日目、器官試料採取、６匹マウス／群；２１日目〜３５日目、体重測定および病的状態の検査、８匹マウス／群、毎日；および３５日目、終了。
【０１０９】
ＶＮ１１９４ＮＡ−でワクチン接種したマウスは全て、高病原性Ｈ５Ｎ１ウイルス［野生型ＶＮ１１９４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（クレード１；ＶＮ１２０３）およびＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／７／０５（クレード２；Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ７）］による致死性負荷（１００ＬＤ５０）を生き残ったが、対照マウスは全て死亡したか、または負荷後８日目までに疾患により安楽死させなければならなかった。野生型ＶＮ１１９４に対する高力価のＩｇＧおよびＩｇＡ抗体が、免疫の１４日後に、ワクチン接種したマウスの血清、肺および鼻洗浄液で検出された。ＶＮ１１９４ウイルスおよびＶＮ１２０３ウイルスで負荷したワクチン接種マウスの体重は、負荷後４日目にわずかに低下したが、マウスは回復した。同様に、Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ７で負荷したワクチン接種マウスの体重は、負荷後６日目まで低下したが、マウスは全て再び完全に回復した。対照的に、対照マウスは、回復しなかった。対照マウスでは、様々な器官からウイルスが単離されたが、ワクチン接種マウスでは、ウイルス複製は呼吸器に限定されていた。
【０１１０】
要約
ＮＡ遺伝子を完全に欠如するＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４（Ｈ５Ｎ１）（ＶＮ１１９４）変異体ウイルス（ＶＮ１１９４ＮＡ−）を生成した。すなわち、このウイルスは、７つのＲＮＡセグメントのみを含む。このウイルスは、ＭＤＣＫ細胞では、細胞培養上清の１ｍｌ当たり約１０２プラーク形成単位（ｐｆｕ）に増殖した。しかしながら、ＭＤＣＫ細胞中で１０回連続継代した後では、ウイルス力価は、細胞培養上清の１ｍｌ当たり約１０６ｐｆｕに増加した。これは、ＶＮ１１９４ＮＡ−が、細胞培養での効率的増殖を可能にする変異を獲得したことを示唆していた。しかしながら、このバリアントは、マウスでは高度に弱毒化のままであり、＞１０５ｐｆｕのＭＬＤ５０（感染動物の５０％を死亡させるのに必要なウイルス量）を有した。対照的に、親ＶＮ１１９４ウイルスのＭＬＤ５０は、３．１ｐｆｕだった。したがって、７セグメントウイルスは、細胞培養では適当な力価に増殖するが、マウスでは高度に弱毒化されており、弱毒生ワクチンとしての使用可能性が示唆される。
ＮＡ−  ＶＬＰを、実施例ＩＩＩおよび特許請求の範囲に記載されているもの等の補完的ＶＬＰと共に使用して、細胞を感染させ、複製能力のあるインフルエンザウイルスを産生することができる。
【０１１１】
（実施例ＩＩ）
７セグメントのインフルエンザウイルスおよび追加の弱毒化変異
ＮＡ欠損インフルエンザウイルスを弱毒生ワクチンとして確立するために、ＮＡ欠損インフルエンザウイルスＨ３およびＨ５サブタイプの組換えウイルスを生成および評価する。弱毒生ＮＡ欠損Ｈ３ワクチンウイルスは、「季節性インフルエンザ」に対する防御を提供することができる。対照的に、弱毒生ＮＡ欠損Ｈ５ワクチンウイルスは、このワクチンの使用が新しいＨＡサブタイプをヒト集団に導入することができるため、このサブタイプのウイルスにより引き起こされるパンデミックのために確保される可能性がある。Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスパンデミックの場合、このサブタイプのウイルスが既にヒト中で循環していれば、弱毒生Ｈ５Ｎ１ワクチンは、その免疫原性が不活化ワクチンのそれよりも優れていると予想されるため、非常に貴重であろう。
【０１１２】
弱毒生ＮＡ欠損Ｈ５Ｎ１ウイルスの生成
高病原性Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスは、今では複数のクレードに分類されており、こうしたクレードの２つの候補ワクチンウイルス：ＮＡ欠損Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４（ＶＮ１１９４、クレード１）およびＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｉｎｄ／０５、クレード２）の生成が促進される。
【０１１３】
ワクチンとして使用するためのＮＡ欠損ＶＮ１１９４ウイルスを生成するため、非病原性型ＨＡ切断部位配列をコードする修飾ＨＡタンパク質を発現するためのＲＮＡポリメラーゼＩに基づくプラスミドを調製する。ＶＮ１１９４  ＨＡのＨＡタンパク質は、表２に示されている多塩基性切断部位を含む（切断は、矢印により示されているＡｒｇおよびＧｌｙ残基間で生じる）。
【表２】
2020114250.tif 000003
【０１１４】
非病原性型ＨＡ切断配列を生成するため、多塩基性配列を、非病原性型配列であるＲＥＴＲに変更する。「病原性」型から「非病原性」型へのＨＡ切断部位の変換は、７セグメントワクチンウイルスをさらに弱毒化する。Ｈ５およびＨ３ウイルス等のワクチンウイルスに有用な他の弱毒化変異は、実施例ＩＩＩに開示されている。
【０１１５】
ＮＡ欠損Ｉｎｄ／０５ウイルスを生成するため、ｖＲＮＡを単離し、逆転写し、クローニングし、配列決定する。このウイルスのコンセンサス配列を確立するため、１セグメント当たり少なくとも３つのクローンを配列決定する。コンセンサス配列と接着する全長ウイルスｃＤＮＡを、Hattaら（２００１年）およびNeumannら（１９９９年）に記載されているように、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターとターミネーター配列との間にクローニングする。また、Ｉｎｄ／０５の「無毒化」ＨＡタンパク質を発現するＲＮＡポリメラーゼＩプラスミドを調製する。
【０１１６】
ヒトワクチンウイルス産生に適格なベロ細胞を使用して、ウイルスを生成する。この目的に好適なベロ細胞は、ＡＴＣＣから得ることができる。具体的には、ベロ細胞を、ＶＮ１１９４またはＩｎｄ／０５ｖＲＮＡを合成するための７つのＲＮＡポリメラーゼＩプラスミド（野生型ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳセグメント、ならびに修飾ＨＡセグメントをコードする；ＮＡセグメントプラスミドは含まれていない）ならびに核タンパク質および３つのポリメラーゼタンパク質を発現するための４つのプラスミドで形質移入する。細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されたら、ウイルス含有細胞培養上清を回収し、７つのｖＲＮＡセグメントを全て配列決定して、ウイルス（それぞれ、ＶＮ１１９４ＨＡＡｖＮＡ−またはＩｎｄ／０５ＨＡＡｖＮＡ−）が真正であること（authenticity）を確認する。ＶＮ１１９４ＨＡＡｖＮＡ−およびＩｎｄ／０５ＨＡＡｖＮＡ−の初期力価は低い場合があるため、ＣＰＥは、初期にはプラスミド形質移入細胞で観察されない場合がある。その場合、プラスミド形質移入ベロ細胞からの細胞培養上清を、感染９６時間後に収集し、新鮮なベロ細胞で１回継代する。ＣＰＥが観察されたら、上清を収集し、ウイルスが真正であることを試験する。元のＶＮ１１９４ＨＡＡｖＮＡ−およびＩｎｄ／０５ＨＡＡｖＮＡ−ウイルスストックについて、それらの力価をＭＤＣＫ細胞でのプラークアッセイで決定する。
【０１１７】
細胞培養にて適当な力価まで増殖するバリアントを得るため、ウイルスを、ベロ細胞およびＭＤＣＫ細胞の両方で、並行して連続継代する。手短に言えば、細胞を０．０１の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）で感染させ、ほとんどの細胞がウイルス感染により溶解したら、ウイルス含有細胞培養上清を回収する。各継代後、ウイルス力価をＭＤＣＫ細胞で決定する。力価が、細胞培養上清の１ｍｌ当たり少なくとも１０６ｐｆｕに達するまで、例えば、約８〜１２回の連続継代で、ウイルスを継代する。最も高い力価に増殖するバリアント（つまり、ベロまたはＭＤＣＫ増殖ウイルス）を使用する。
【０１１８】
細胞培養で高力価に増殖するＶＮ１１９４ＨＡＡｖＮＡ−バリアントおよびＩｎｄ／０５ＨＡＡｖＮＡ−バリアントが得られたら、ストックウイルスを生成し、等分し、−８０℃で保管する。ストックウイルスを完全に配列決定して、それらが真正であることを確認し、ベロ細胞またはＭＤＣＫ細胞への適応から生じた変異を同定する。
【０１１９】
並行して、両野生型ウイルス（つまり、ＶＮ１１９４およびＩｎｄ／０５）を、ベロ細胞で生成する。これらウイルスは、対照として生形態のおよびホルマリン不活化形態の両方で使用する。ホルマリン不活化ワクチンについて、Katzら（１９８９年）に記載されているように、ＨＡ濃度を確立する。
【０１２０】
ＮＡ欠損Ｈ３ウイルスの生成
ＮＡ欠損Ｈ５ウイルスを生成するための上記で概説した戦略に従い、ＮＡ欠損Ｈ３ウイルスを「季節性インフルエンザ」に対する使用のために生成する。具体的には、最近のヒトＨ３Ｎ２ウイルスであるＡ／Ｙｏｋｏｈａｍａ／２０１７／０３（Ｙｏｋ）ウイルスに基づくＮＡ欠損ウイルスを、リバースジェネティクスを使用して調製する。ＮＡセグメントを欠如するＹｏｋウイルス（ＹｏｋＮＡ−）を生成し、高増殖性バリアントを、ベロ細胞およびＭＤＣＫ細胞で調製する。高増殖性ＹｏｋＮＡ−バリアントを、マスター種ウイルスへと発展させてもよい。ベロ細胞およびＭＤＣＫ細胞で開発した高増殖性ＹｏｋＮＡ−バリアントを完全に配列決定し、高増殖性ベロ細胞増殖ＹｏｋＮＡ−バリアントに見出される全ての変異を、部位特異的変異誘発を使用して、ＹｏｋＮＡ−を生成するためのＲＮＡポリメラーゼＩプラスミドに導入する。高増殖性ＭＤＣＫ細胞増殖ＹｏｋＮＡ−バリアントに見出される全ての変異を、部位特異的変異誘発を使用して、ＹｏｋＮＡ−を生成するための別のセットのＲＮＡポリメラーゼＩプラスミドに導入する。
【０１２１】
また、Ｈ５Ｎ１ウイルスについて上述したように、野生型Ｙｏｋウイルスをベロ細胞で生成する。生Ｙｏｋウイルスおよびホルマリン不活化Ｙｏｋウイルスは両方とも対照としての役目を果たす。ホルマリン不活化ワクチンについてＨＡ濃度を確立する。
【０１２２】
高増殖性バリアントが１５回の連続継代後に得られない場合、低減された量のシアル酸を産生する（したがって、ＮＡ活性の必要性が軽減される）細胞株、例えば、少量のシアル酸を発現し（Hughesら、２００１年）、ＮＡ欠損ウイルスの効率的な増殖を支援する（Shinyaら、２００４年）ＭＤＣＫ細胞株を使用して、ＮＡを欠如するウイルスの増殖を支援する。同様の戦略を使用して、少量のシアル酸を発現するベロ細胞株を樹立することができる。
【０１２３】
ＮＡ欠損Ｈ５およびＨ３インフルエンザウイルスの病原性および免疫原性
弱毒生ワクチンは、十分に弱毒性であり（疾患症状を引き起こさないかまたは軽度である）、免疫原性であり（強力な体液性免疫応答および細胞性免疫応答を刺激する）、および防御性である（免疫個体に防御免疫を提供する）。
【０１２４】
以下のウイルスを、病原性および免疫原性について評価する：
【表３】
2020114250.tif 000004
【０１２５】
ＮＡ欠損Ｈ５ウイルス（ＶＮ１１９４ＨＡＡｖＮＡ−、Ｉｎｄ／０５ＨＡＡｖＮＡ−）の病原性および毒性
ＶＮ１１９４およびＩｎｄ／０５等の高病原性Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスは、典型的には、感染の８日以内にマウスを死亡させる。ＶＮ１１９４ＨＡＡｖＮＡ−およびＩｎｄ／０５ＨＡＡｖＮＡ−の弱毒化レベルを評価するため、それらのＬＤ５０値を決定する。また、ＬＤ５０値は、親ＶＮ１１９４およびＩｎｄ／０５ウイルスについて決定するが、ホルマリン不活化ウイルスについて決定しない。
【０１２６】
手短に言えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス（５匹動物／群）および／またはフェレット（３匹動物／群）に、弱毒生ウイルス（ＶＮ１１９４ＨＡＡｖＮＡ−およびＩｎｄ／０５ＨＡＡｖＮＡ−）または生の親ウイルスの１０倍希釈物（１０５ｐｆｕから開始）を鼻腔内接種し、疾患の徴候を毎日観察する。対照動物には、同量の生の親ウイルスを接種する。追加の対照を偽感染させる。高病原性Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスが全身感染を引き起こすことは公知であるため、感染後３日目および６日目に、肺、鼻甲介、心臓、脾臓、腎臓、肝臓、結腸、膵臓、および脳でウイルス力価を決定する。対照的に、ＶＮ１１９４ＨＡＡｖＮＡ−およびＩｎｄ／０５ＨＡＡｖＮＡ−ウイルスは有意な弱毒化を示す。つまり、呼吸器を越えるウイルスの広がりはなく、全体的なウイルス力価が低い。
【０１２７】
ＮＡ欠損Ｈ３ウイルス（ＹｏｋＮＡ−）の病原性および毒性
高病原性Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスとは対照的に、ヒトＨ３Ｎ２ウイルスは、典型的には、マウスまたはフェレットでは全身感染を引き起こさず、これら動物を死亡させない。親Ｙｏｋウイルスと比較したＹｏｋＮＡ−の弱毒化レベルを確立するため、マウスおよびフェレットを、上述のように鼻腔内感染させる。動物は、体重減少、活動低下、またはくしゃみ（フェレットの場合）等の疾患徴候を毎日観察する。並行して、感染後１日目、３日目、および６日目に、感染動物の鼻甲介および肺でウイルス力価を決定する。Ｙｏｋウイルスの場合、軽度疾患の徴候が感染初期に生じ、徴候は、感染後６日目までに解消される場合がある。ＹｏｋＮＡ−ウイルスの場合、低ウイルス力価が１日目に観察され（ウイルスの限定的な複製能力を反映する）、無疾患症状でない場合でもそれほど著しくなく、ウイルス複製が幾らかある場合でも非常に低い力価が、感染後３日目に観察される。
【０１２８】
ＮＡ欠損Ｈ５およびＨ３インフルエンザウイルスの免疫原性
弱毒生ワクチンについては、弱毒化と免疫原性とのバランスが重要である。ＶＮ１１９４ＨＡＡｖＮＡ−、Ｉｎｄ／０５ＨＡＡｖＮＡ−、およびＹｏｋＮＡ−の免疫原性を評価するため、体液性免疫応答および細胞性免疫応答をマウスで試験し、体液性応答をフェレットで試験する。
【０１２９】
赤血球凝集阻害（ＨＩ）および中和試験。ＨＡに対する血清抗体レベルを決定するため、赤血球凝集阻害および中和試験を実施する。マウスおよびフェレットを、ＶＮ１１９４ＨＡＡｖＮＡ−ウイルス、Ｉｎｄ／０５ＨＡＡｖＮＡ−ウイルス、またはＹｏｋＮＡウイルスの１０倍希釈物（１０５ｐｆｕから開始）で感染させる。並行して、対照動物を、同量の生の親ウイルス、または不活化親ウイルスの３０μｇのＨＡで感染させる。偽感染動物は、陰性対照としての役目を果たす。感染後７日目、１４日目、３０日目、および９０日目に、マウスの眼窩下細静脈から血清試料を収集する（またはフェレットの頚静脈から；後者の場合、この手順のために麻酔をかける）。生ＶＮ１１９４ウイルスまたは生Ｉｎｄ／０５ウイルスに感染したマウスは、感染後７〜８日以内に死亡する。
【０１３０】
生ウイルス、弱毒化ウイルスおよび不活化ウイルスについては、２用量レジメンも試験する。上述のように動物を感染させ、その後、３０日後に同用量のウイルスで追加免疫する。高用量で感染させたマウスは初回免疫の７〜８日以内に死亡するが、低用量で感染させたマウスは生存し、無菌免疫を発生させるため（Katzら、２０００年）、この２用量レジメンは、生の親ウイルスでは実施しない。
【０１３１】
ＨＩアッセイでは、血清試料を、レセプター破壊酵素および過ヨウ素酸ナトリウムで処理してから、Ｈ５およびＨ３ウイルスで試験する。Ｈ５ウイルスの場合、１９９７年以来トリおよびヒトから単離され、両クレードを包含する代表的な株が含まれる。Ｈ３ウイルスの場合、２０００年以降の代表的なヒト分離株が含まれる。ＨＩアッセイは、典型的にはニワトリまたはシチメンチョウの赤血球で実施されるが、これらの赤血球は、Ｈ５  ＨＡに対する抗体について感度が低い。ウマ赤血球は感度が高いため（Stephensonら、２００４年）、Ｈ５ウイルスによるＨＩアッセイには、ウマ赤血球を使用する。さらに、一部のヒトＨ３ウイルスは、ニワトリ赤血球を効率的には凝集させないが、モルモット赤血球に結合する（Stephensenら、２００３年）。Ｈ３ウイルスの場合、モルモット赤血球でＨＩアッセイを実施する。血清のＨＩ力価は、抗原の４赤血球凝集単位の完全な阻害を引き起こす血清の最高希釈度の逆数として表される。ＨＩ力価の４倍増加を有意であると見なし、１：４０またはそれよりも高い力価は、防御性であると考えられる（Porterら、１９７９年）。
【０１３２】
中和アッセイの場合、確立されているプロトコール（Bridgesら、２００２年）に従っ
て、血清試料を、ＨＩアッセイについて記載されているように処理し、次に同容積の同種ウイルスまたは異種ウイルス（各１００ｐｆｕ）と混合し、室温で１時間インキュベートし、その後、ＭＤＣＫ細胞に接種する。ＭＤＣＫ細胞を、Ｈ５Ｎ１ウイルスともＨ３Ｎ２ウイルスとも反応しない対照血清の存在下で１００ｐｆｕのウイルスを感染させる。中和抗体力価は、プラーク数を５０％低減する血清の最高希釈度の逆数である。
【０１３３】
不活化インフルエンザワクチンは、弱毒生ワクチンウイルスよりも高い血清ＨＩ力価をもたらす（Coxら、２００４年）。したがって、ＶＮ１１９４ＨＡＡｖＮＡ−、Ｉｎｄ／
０５ＨＡＡｖＮＡ−、およびＹｏｋＮＡ−により誘導される血清ＨＩ力価は、低い場合がある。ＮＡ−欠損ウイルスに感染した動物で抗体応答が検出されないことがあり得る。検出可能な血清抗体力価は、不活化ワクチンの免疫原性の指標を提供するが、そのような力価の欠如は、ワクチンの防御効力を必ずしも除外しない。
【０１３４】
抗体応答。ＶＮ１１９４ＨＡＡｖＮＡ−ウイルス、Ｉｎｄ／０５ＨＡＡｖＮＡ−ウイルス、またはＹｏｋＮＡ−ウイルスによる感染に対する体液性応答をさらに評価するため、感染マウスおよびフェレットからの血清および気管支肺胞洗浄物（ＢＡＬ）の試料で、ＩｇＡおよびＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡを実施する。
【０１３５】
上述のように血清試料を得る。ＢＡＬ流体を得るため、動物を安楽死させ、カテーテル留置し、気管および肺をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、カテーテルに取り付けたシリンジに流体を吸い込む。ＩｇＡ抗体およびＩｇＧ抗体のレベルを、確立されているプロトコールを使用することにより決定する（Kidaら、１９８２年）。手短に言えば、免疫に使用したウイルスを、マイクロタイタープレートに吸収させ、段階希釈した血清またはＢＡＬ試料と共にインキュベートし、洗浄し、抗マウスペルオキシダーゼコンジュゲートＩｇＡまたはＩｇＧ抗体と共にインキュベートする。その後、試料を、ペルオキシダーゼ基質と共にインキュベートする。反応産物を、ＥＬＩＳＡリーダーで４０５ｎｍにて定量する。偽感染動物に由来する試料を使用してベースラインを確立する。
【０１３６】
不活化インフルエンザウイルスワクチンは、弱毒生ワクチンよりも明らかに高いレベルの血清抗体を誘導する（Coxら、２００４年）。しかしながら、弱毒生インフルエンザウ
イルスワクチンは、鼻洗浄液ではＩｇＡのより強力な誘導因子であり、不活化ワクチンは、主にＩｇＧ粘膜抗体を誘導する。弱毒生ＮＡ欠損ウイルスおよび生の親ウイルスに感染させた動物の場合、不活化ウイルスに感染させた動物と比べて、比較的低レベルの血清抗体が予想される。しかしながら、生ウイルスは、粘膜ＩｇＡ抗体の誘導に関して、不活化ウイルスよりも優れていると予想される。
【０１３７】
細胞性免疫応答。弱毒生ＮＡ欠損Ｈ５またはＨ３ウイルスによる感染に対する細胞性免疫応答を評価するため、マウスにおけるウイルス特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答を測定する。動物に、生の親ウイルス、弱毒生ウイルス、または不活化ウイルスを、上述のように接種する。感染後７日目、１４日目、３０日目、および９０日目に（親Ｈ５ウイルスの場合、動物は感染後７日目または８日目までに死亡するため、試験することができるのは、最初の時点のみである）、ＢＡＬ流体、ならびに肺、脾臓、頚部リンパ節、および縦隔リンパ節を、上述のように収集する。リンパ節および脾臓の場合、単核細胞の単一細胞懸濁液を、Hoganら（２００１年）に記載のように調製する。肺の場合、細胞懸濁液を、確立され
ているプロトコール（Masopustら、２００１年）に従って生成し、パーコール勾配を使用して単核細胞を得る。その後、単核細胞は全て、インフルエンザエピトープ（ＢＡＬＢ／ｃマウスのＫｄ  ＮＰ１４７〜１５５：ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ（配列番号１）；Ｋｄ  ＨＡ５１８〜５２６：ＩＹＳＴＶＡＳＳＬ（配列番号２））に特異的な標識ＭＨＣ  Ｉ四量体で、ならびに抗ＣＤ８抗体、抗ＬＦＡ−１抗体、および抗ＣＤ６２Ｌ抗体で染色する。ウイルス特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の数を、フローサイトメトリーにより決定する。
【０１３８】
並行して、細胞内サイトカイン染色を使用して、機能的細胞障害性Ｔ細胞を測定する。単核細胞を、サイトカイン分泌を阻害するブレフェルジンＡの存在下にて、エピトープペプチドで刺激する。細胞表面ＣＤ８、および細胞内ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−２の染色は、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で達成し、サイトカイン産出ＣＤ８  Ｔ細胞の数を、フローサイトメトリーにより測定する。
【０１３９】
弱毒生インフルエンザウイルスは、典型的には、不活化ウイルスよりも強力な細胞性免疫応答を誘発する。より強力なウイルス特異的ＣＤ８  Ｔ細胞刺激が、不活化ウイルスで感染させた動物におけるよりも、生の親ウイルスまたは弱毒生ウイルスに感染させた動物で予想される。
【０１４０】
ＮＡ欠損Ｈ５Ｎ１ウイルスの防御効力
ＮＡ欠損ウイルスの防御効力を評価するため、マウス群（またはフェレット群；９匹動物／群）を、免疫原性について試験した同用量の弱毒生ＮＡ欠損ウイルスまたは不活化ウイルスで鼻腔内免疫する。免疫原性研究により、追加免疫を伴う２用量レジメンが、単回免疫よりも効率的であることが示される場合、防御研究では、追加免疫も実施される。両レジメンの効力が同等である場合、マウスを１回のみ免疫する。偽感染動物は、対照としての役目を果たす。免疫の１〜３か月後、動物を、致死量（マウスの場合、１０または１００ＭＬＤ５０；フェレットの場合、１０６ｐｆｕ）の同種ＶＮ１１９４ウイルスまたはＩｎｄ／０５ウイルスで負荷する。動物を、疾患の徴候について毎日観察する。負荷後３日目および６日目に、１群当たり３匹の動物を安楽死させる。器官でのウイルス力価および血清抗体力価を決定する。
【０１４１】
マウス実験の場合、偽ワクチン接種動物は、ＶＮ１１９４ウイルスまたはＩｎｄ／０５ウイルスにより引き起こされる全身感染に陥ると予想される。フェレット実験の場合、Ｉｎｄ／０５ウイルスで負荷した偽ワクチン接種動物は死亡すると予想され、それに反して、ＶＮ１１９４を感染させた偽ワクチン接種動物は、体重は減少するが、ウイルス感染から回復すると予想される。対照的に、ワクチン接種動物は全て、致死的負荷または体重減少から防御されると予想される。弱毒生ＮＡ欠損ウイルスは、不活化ウイルスよりも良好な防御を提供すると予想される。より良好な防御は、より高い生存率、より低いウイルス力価、限定的なウイルス拡散、および／または負荷後の体重減少の低減を含んでいてもよい。
【０１４２】
高病原性Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスに対するワクチンは、両クレードに由来する分離株からの防御を提供することができる。弱毒生ＮＡ欠損Ｈ５Ｎ１ワクチンウイルスが、交差防御を提供するかどうかを評価するため、動物を、上述のように免疫し、１０もしくは１００ＭＬＤ５０（マウスの場合）または１０６ｐｆｕ（フェレットの場合）のそれぞれの異種ウイルスで負荷する（つまり、ＶＮ１１９４ＨＡＡｖＮＡ−（クレード１）ウイルスで免疫した動物を、Ｉｎｄ／０５（クレード２）ウイルスで負荷する、およびその逆も同じである）。ある程度の交差防御が予想されるが、防御効力は、同種ウイルスで観察されるものよりも低い場合がある。
【０１４３】
ＮＡ欠損Ｈ３Ｎ２ウイルスの防御効力
ＮＡ欠損Ｈ３Ｎ２ウイルスの防御効力を確立するため、免疫および負荷研究を、Ｈ５Ｎ１ウイルスについて上述したものと本質的に同様に実施する。免疫原性を試験した同用量のＹｏｋＮＡ−またはＹｏｋＩｎａｃｔで、マウス群（およびフェレット群；９匹動物／群）を鼻腔内免疫する。偽感染動物は、対照としての役目を果たす。免疫の１〜３か月後、動物を、１０６ｐｆｕのＹｏｋウイルスで負荷する。動物を、疾患の徴候について毎日観察する。負荷後３日目および６日目に、１群当たり３匹の動物を安楽死させる。鼻甲介および肺のウイルス力価および血清抗体力価を決定する。
【０１４４】
偽免疫対照動物では、疾患の徴候が予想されるが、ワクチン接種動物では予想されない。ワクチン接種動物の鼻甲介および肺では、限定的なウイルス複製が予想される。
【０１４５】
ＶＮ１１９４ＨＡＡｖＮＡ−、Ｉｎｄ／０５ＨＡＡｖＮＡ−、および／またはＹｏｋＮＡ−の病原性が高すぎる場合、追加の弱毒化変異を、それらのゲノムに導入する。ＮＡ欠損ウイルスが弱毒性過ぎる場合、８つのｖＲＮＡｓを全て含むが、機能性ＮＡを欠如するウイルスを、例えば、ＮＡリーディングフレームの大部分を欠失させることにより生成する。
【０１４６】
以下の非限定的な実施例により、本発明をさらに説明する。
【０１４７】
（実施例ＩＩＩ）
インフルエンザＡ型ウイルスのリバースジェネティクス系を、１つの細胞内にて８つのインフルエンザＡ型ウイルスゲノムセグメント全てを合成するためのプラスミドで細胞を形質移入するという概念に基づいて構築する。プラスミドからインフルエンザウイルスを生成するための異なる戦略が、本明細書で提供される。細胞を、７つのＲＮＡポリメラーゼＩプラスミド（例えば、ＨＡ  ｖＲＮＡをコードするプラスミドが省略される）で形質移入する。細胞を、ポリメラーゼおよびＮＰのタンパク質を発現するプラスミドで共形質移入して、ウイルス複製および転写を開始させる。ＨＡタンパク質は、タンパク質発現プラスミドまたは安定細胞株から供給される。７つのｖＲＮＡセグメントのみを有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）が放出される。これら粒子は、新鮮な細胞を感染させることができるが、ＨＡ  ｖＲＮＡを欠如するため、追加のラウンドの増殖を起こさない。
【０１４８】
並行して、細胞を、７つのＲＮＡポリメラーゼＩプラスミドの異なるセットで形質移入する（並行実験で欠如させるものを除く任意のセグメントを省略することができる。本明細書に記載されている例では、ＨＡを除く任意のセグメントを省略することができる）。「欠失」タンパク質は、タンパク質発現プラスミドまたは細胞株から供給し、また、ポリメラーゼおよびＮＰのためのタンパク質発現プラスミドで形質移入する。上述のように、７つのｖＲＮＡを有するＶＬＰが放出される。
【０１４９】
ＶＬＰの２つの集団（一方はＨＡウイルスＲＮＡを欠如し、他方は、他の７つのウイルスＲＮＡの１つを欠如する）を混合し、新鮮な細胞に接種する。両タイプのＶＬＰに感染させた細胞では、８つのｖＲＮＡ全てが存在し、感染性インフルエンザウイルスが生成される。
【０１５０】
同様に、感染性インフルエンザウイルスを、７つ未満のウイルスＲＮＡを有するＶＬＰから生成することができる。８つの異なるｖＲＮＡが全てＶＬＰ感染細胞に存在する限り、ＶＬＰの任意の組合せを使用することができる。例えば、各々が１つのｖＲＮＡを有する８つの異なるＶＬＰを生成することができる。ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ、またはＮＳウイルスＲＮＡを別々に有するＶＬＰに細胞を感染させれば、感染性ウイルスが生成される。別の例では、ＶＬＰの１つの集団が、４つのウイルスＲＮＡを有していてもよく、ＶＬＰの第２の集団が、残りの４つのウイルスＲＮＡを有していてもよい。この場合も、ＶＬＰのこれらの２つの集団で細胞を共感染させると、複製ウイルスの生成がもたらされる。
【０１５１】
手順
１．ＶＬＰ（それぞれ、ＰＢ２またはＨＡ  ｖＲＮＡセグメントを欠如する）を２９３Ｔ細胞で生成する。
【表４】
2020114250.tif 000005
【０１５２】
２．  ＭＤＣＫ細胞を混合ＶＬＰで共感染させる。対照として、ＭＤＣＫ細胞を、ＶＬＰ−１またはＶＬＰ−２のみで感染させた。
【０１５３】
３．  プラークアッセイを実施し、複製ウイルスを配列決定する。
【０１５４】
結果
・感染性ウイルス（＞１０８ｐｆｕ／ｍＬ）は、ＶＬＰ−１およびＶＬＰ−２で共感染させたＭＤＣＫ細胞では検出されたが、いずれかのＶＬＰで感染させたＭＤＣＫ細胞では検出されなかった。
【０１５５】
・ＶＬＰ−１および−２で共感染させたＭＤＣＫ細胞に由来するプラークの配列解析により、ＰＢ２遺伝子がＰＲ８ウイルスに由来し、ＨＡ遺伝子がＷＳＮウイルスに由来することが確認された。
【０１５６】
結論
・感染性ウイルスは、異なるｖＲＮＡを欠如する２つの７セグメントウイルスで細胞を共感染させると生成することができる。
【０１５７】
これは、ｃＤＮＡから感染性の複製能力があるインフルエンザウイルス／ワクチンを生産するための新しい方法であり、季節性／パンデミックインフルエンザに対応する任意のＨＡ／ＮＡ組合せ、ならびに種々の弱毒化、安定化、または増殖強化変異、ならびに／または異種配列の導入、ならびにインフルエンザ研究およびワクチン生産に関する他の技術革新の宿主を組み込むように設計することができる方法である。
【０１５８】
（実施例ＩＶ）
実験１
７つのウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）の異なるセットを有する２つのＶＬＰを生成した。具体的には、２９３Ｔ細胞を、ウイルスタンパク質を全て発現するプラスミド、および７つのｖＲＮＡを発現するプラスミドで形質移入した。
ａ．  ＶＬＰ−１では、ＰＢ２−ｖＲＮＡが省略されていた。
ｂ．  ＶＬＰ−２では、ＨＡ−ｖＲＮＡが省略されていた。
【表５】
2020114250.tif 000006
【０１５９】
プラスミドで形質移入した細胞のＶＬＰ含有上清を収集し、混合した。ＶＬＰ混合物を使用してＭＤＣＫ細胞を感染させた。対照として、ＭＤＣＫ細胞を、ＶＬＰ−１またはＶＬＰ−２のみで感染させた。高力価の複製ウイルス（３×１０８ＰＦＵ／ｍＬ）が、両ＶＬＰで感染させたＭＤＣＫ細胞で検出された。配列解析により、複製ウイルスが、ＷＳＮウイルスのＨＡセグメントおよびＰＲ８ウイルスのＰＢ２セグメントを有することが確認された。複製ウイルスは、１つのＶＬＰのみで感染させたＭＤＣＫ細胞では検出されなかった。
【０１６０】
このように、感染性インフルエンザウイルスを、２つの複製能力がないＶＬＰから生成することができる。
【０１６１】
実験２
４つのｖＲＮＡの異なるセットを有する２つのＶＬＰを生成した。ＶＬＰ−４は、ＰＢ１  ｖＲＮＡ、ＰＢ２  ｖＲＮＡ、ＰＡ  ｖＲＮＡ、およびＨＡ  ｖＲＮＡを有し、ＶＬＰ−３は、ＮＰ  ｖＲＮＡ、ＮＡ  ｖＲＮＡ、Ｍ  ｖＲＮＡ、およびＮＳ  ｖＲＮＡを有していた。実験は、上述のように実施した。
【０１６２】
ＶＬＰ−３およびＶＬＰ−４で共感染させたＭＤＣＫ細胞では、高いウイルス力価（１．８×１０８ＰＦＵ／ｍＬ）が検出された。
【０１６３】
このように、感染性インフルエンザウイルスを、それぞれ４つのｖＲＮＡを有する２つの複製能力がないＶＬＰから生成することができる。
【表６】
2020114250.tif 000007
【０１６４】
実験３
【０１６５】
各々が１つのｖＲＮＡを有する８つのＶＬＰを生成した（表７を参照）。実験は、上述のように実施した。細胞変性効果または赤血球凝集力価は、ＶＬＰ感染ＭＤＣＫ細胞では検出されなかった。
【表７】
2020114250.tif 000008
【０１６６】
参考文献
【化１】
2020114250.tif 000009
【化２】
2020114250.tif 000010
【化３】
2020114250.tif 000011
【化４】
2020114250.tif 000012
【０１６７】
刊行物、特許、および特許出願は全て、参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、前述の明細書では、そのある特定の実施形態に関して記載されており、説明の目的のために多くの詳細が示されているが、本発明は、追加の実施形態を受け入れる余地があり、本明細書に記載の詳細のあるものは、本発明の基本原理から逸脱せずに、相当程度変更することができることは、当業者であれば明白であろう。
【配列表】
2020114250000001.app
【外国語明細書】
2020114250000001.pdf