(57)【要約】【課題】タンパク質の非特異吸着が少なく、カラムとして用いたときの通液性に優れる分離材を提供する。【解決手段】多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層とを備え、前記被覆層が、水酸基を有する架橋重合体を含み、前記架橋重合体が、重合性の二重結合を１つ有する単官能モノマと重合性の二重結合を２つ以上有する多官能モノマとの共重合体である、分離材を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層とを備え、
前記被覆層が、水酸基を有する架橋重合体を含み、前記架橋重合体が、重合性の二重結合を１つ有する単官能モノマと重合性の二重結合を２つ以上有する多官能モノマとの共重合体である、分離材。
【請求項２】
前記架橋重合体が、−ＣＨ２−ＣＲ１Ｚ−（Ｒ１は、水素原子又はメチル基を表し、Ｚは、水酸基、−ＣＯＮＨＲ２又は−ＣＯＯＲ２を表し、Ｒ２は、水酸基を１つ以上有する炭素数２〜４のアルキル基を表す）で表される、水酸基を有するモノマ単位を含む、請求項１に記載の分離材。
【請求項３】
前記多官能モノマが、２官能以上の（メタ）アクリルアミド、及び２官能以上の（メタ）アクリレートの少なくとも１種を含む、請求項１又は２に記載の分離材。
【請求項４】
前記多孔質ポリマ粒子が、ジビニルベンゼンに由来するモノマ単位を含有するポリマを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離材を備える、カラム。
【請求項６】
多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層とを備え、前記被覆層が、水酸基を有する架橋重合体を含む分離材を製造するための方法であって、
前記多孔質ポリマ粒子、重合性の二重結合を１つ有する単官能モノマ、及び重合性の二重結合を２つ以上有する多官能モノマを含有する反応液中で、前記単官能モノマと前記多官能モノマとを共重合させて、前記多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層を形成させる工程を備える、分離材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分離材、カラム、及び分離材の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質に代表される生体高分子を分離精製する場合、一般的には多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体、親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体等が用いられている。多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体の場合、塩濃度による体積変化が小さいため、カラムに充填してクロマトグラフィーで用いると、通液時の耐圧性に優れる傾向がある。しかし、このイオン交換体を、タンパク質等の分離に用いると、疎水的相互作用に基づく不可逆吸着等の非特異吸着が起きるため、ピークの非対称化が発生する、又は該疎水的相互作用でイオン交換体に吸着されたタンパク質が吸着されたまま回収できないという問題点がある。
【０００３】
一方、デキストラン、アガロース等の多糖に代表される親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体の場合、タンパク質の非特異吸着がほとんどないという利点がある。ところが、このイオン交換体は、水溶液中で著しく膨潤し、溶液のイオン強度による体積変化、及び、遊離酸形と負荷形との体積変化が大きく、機械的強度も充分ではないという欠点を有する。特に、架橋ゲルをクロマトグラフィーで使用する場合、通液時の圧力損失が大きく、通液によりゲルが圧密化するといった欠点がある。
【０００４】
親水性天然高分子の架橋ゲルが持つ欠点を克服するために、いろいろな試みがこれまでになされている（例えば、下記特許文献１〜７を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第４９６５２８９号明細書
【特許文献２】米国特許第４３３５０１７号明細書
【特許文献３】米国特許第４３３６１６１号明細書
【特許文献４】米国特許第３９６６４８９号明細書
【特許文献５】特開平１−２５４２４７号公報
【特許文献６】米国特許第５１１４５７７号明細書
【特許文献７】特開２００９−２４４０６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の分離材は、タンパク質の非特異吸着が少ないこと、及びカラムとして用いたときの通液性に優れることを充分なレベルで満足するものではない。
【０００７】
そこで、本発明は、タンパク質の非特異吸着が少なく、カラムとして用いたときの通液性に優れる分離材、該分離材を備えるカラム、及び該分離材の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一側面は、多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層とを備え、前記被覆層が、水酸基を有する架橋重合体を含み、前記架橋重合体が、重合性の二重結合を１つ有する単官能モノマと重合性の二重結合を２つ以上有する多官能モノマとの共重合体である、分離材を提供する。
【０００９】
また、本発明の別の一側面は、多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層とを備え、前記被覆層が、水酸基を有する架橋重合体を含む分離材を製造するための方法であって、前記多孔質ポリマ粒子、重合性の二重結合を１つ有する単官能モノマ、及び重合性の二重結合を２つ以上有する多官能モノマを含有する反応液中で、前記単官能モノマと前記多官能モノマとを共重合させて、前記多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層を形成させる工程を備える、分離材の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の一側面に係る分離材は、水酸基を有する架橋重合体が多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆していることにより、タンパク質の非特異吸着を低減し、カラムとして用いたときの通液性を向上させることができる。本発明のいくつかの側面は、タンパク質の吸着量を向上できる分離材を提供することができる。
【００１１】
また、本発明の別の一側面に係る分離材の製造方法は、多孔質ポリマ粒子、重合性の二重結合を１つ有する単官能モノマ、及び重合性の二重結合を２つ以上有する多官能モノマを含有する反応液中で、前記単官能モノマと前記多官能モノマとを共重合させて、水酸基を有する架橋重合体を含む被覆層を形成することにより、水酸基を有する架橋重合体が多孔質ポリマ粒子の表面に密に被覆している分離材を製造することができる。よって、本発明の別の一側面に係る分離材の製造方法は、タンパク質の非特異吸着を低減し、カラムとして用いたときの通液性を向上させる分離材を提供することができる。本発明のいくつかの側面は、タンパク質の吸着量を向上できる分離材の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の好適な実施形態を説明するが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されるものではない。
【００１３】
＜分離材＞
一実施形態に係る分離材は、多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備える。なお、本明細書中、「多孔質ポリマ粒子の表面」とは、多孔質ポリマ粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。また、本明細書中、（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸又はメタクリル酸を意味し、（メタ）アクリレート等の他の類似の表現においても同様である。
【００１４】
（多孔質ポリマ粒子）
一実施形態に係る多孔質ポリマ粒子は、例えば、多孔質化剤の存在下でモノマを重合させて得られるポリマを含む粒子であり、従来の懸濁重合、シード重合等によって合成することができる。すなわち、多孔質ポリマ粒子は、例えば、上記モノマに由来するモノマ単位を含有するポリマを含む。モノマとしては、特に限定されないが、例えば、アクリル系モノマ、スチレン系モノマを使用することができる。具体的なモノマとして以下のようなモノマが挙げられる。
【００１５】
例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン、ジビニルフェナントレン等のジビニル化合物；（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）テトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の（ポリ）アルキレングリコール系ジ（メタ）アクリレート；トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタントリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルプロパントリアクリレート等の３官能以上の（メタ）アクリレート；エトキシ化ビスフェノールＡ系ジ（メタ）アクリレート、プロポキシ化エトキシ化ビスフェノールＡ系ジ（メタ）アクリレート、トリシクロデカンジメタノールジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタンジ（メタ）アクリレート、エトキシ化シクロヘキサンジメタノールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリレート；ジアリルフタレート及びその異性体；トリアリルイソシアヌレート及びその誘導体が挙げられる。これらモノマの中で、例えば、新中村化学工業株式会社製のＮＫエステル（Ａ−ＴＭＰＴ−６Ｐ０、Ａ−ＴＭＰＴ−３Ｅ０、Ａ−ＴＭＭ−３ＬＭＮ、Ａ−ＧＬＹシリーズ、Ａ−９３００、ＡＤ−ＴＭＰ、ＡＤ−ＴＭＰ−４ＣＬ、ＡＴＭ−４Ｅ、Ａ−ＤＰＨ）等が、商業的に入手可能である。これらのモノマは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。耐久性、耐酸性、耐アルカリ性及び弾性率を向上させる観点、並びに、カラム充填時及び粒子取り扱い時における粒子の破壊を抑制する等の観点からは、モノマがジビニルベンゼンを含有することが好ましい。すなわち、多孔質ポリマ粒子は、ジビニルベンゼンに由来するモノマ単位を含有するポリマを含むことが好ましい。
【００１６】
多孔質ポリマ粒子は、モノマとしてジビニルベンゼンを含む場合、ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で６０質量％以上含むことが好ましく、７０質量％以上含むことがより好ましく、８０質量％以上含むことがさらに好ましい。ジビニルベンゼンを６０質量％以上含むことにより、耐アルカリ性がより良好となる傾向がある。
【００１７】
また、モノマとしては、例えば、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等のスチレン及びその誘導体；アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ｎ−オクチル、アクリル酸ドデシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸２−クロロエチル、アクリル酸フェニル、α−クロロアクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸ｎ−オクチル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸ステアリル等の（メタ）アクリル酸エステル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、安息香酸ビニル、酪酸ビニル等のビニルエステル；Ｎ−ビニルピロール、Ｎ−ビニルカルバゾール、Ｎ−ビニルインドール、Ｎ−ビニルピロリドン等のＮ−ビニル化合物；フッ化ビニル、フッ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレン、アクリル酸トリフルオロエチル、アクリル酸テトラフルオロプロピル等の含フッ素化モノマ；ブタジエン、イソプレン等の共役ジエンが挙げられる。これらのモノマは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。上記の中でも、耐酸性及び耐アルカリ性に優れるという観点から、スチレンを使用することが好ましい。また、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等の官能基を有するスチレン誘導体も使用することができる。
【００１８】
多孔質化剤としては、重合時に相分離を促し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒が用いられる。有機溶媒である多孔質化剤としては、例えば、脂肪族又は芳香族の炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類等が挙げられる。多孔質化剤として、具体的には、トルエン、キシレン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられる。これらの多孔質化剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００１９】
上記多孔質化剤は、例えば、モノマ全質量に対して０を超え３００質量％以下の範囲で使用することができる。多孔質化剤の量によって、多孔質ポリマ粒子の空隙率をコントロールすることができる。さらに、多孔質化剤の種類によって、多孔質ポリマ粒子の細孔の大きさ及び形状をコントロールすることができる。
【００２０】
溶媒として使用する水を多孔質化剤とすることもできる。水を多孔質化剤とする場合は、モノマに油溶性界面活性剤を溶解させ、水を吸収することによって、粒子を多孔質化することが可能である。
【００２１】
多孔質化に使用される油溶性界面活性剤としては、分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のソルビタンモノエステル、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノミリステート又はヤシ脂肪酸から誘導されるソルビタンモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のジグリセロールモノエステル、例えば、ジグリセロールモノオレエート（例えば、Ｃ１８：１（炭素数１８個、二重結合数１個）脂肪酸のジグリセロールモノエステル）、ジグリセロールモノミリステート、ジグリセロールモノイソステアレート又はヤシ脂肪酸のジグリセロールモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４アルコール（例えば、ゲルベアルコール）、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２アルコール又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４アルコール（例えば、ヤシ脂肪アルコール）のジグリセロールモノ脂肪族エーテル;及びこれらの混合物が挙げられる。
【００２２】
これらのうち、ソルビタンモノラウレート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）２０、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、さらに好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノラウレート）、ソルビタンモノオレエート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）８０、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、さらに好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノオレエート）、ジグリセロールモノオレエート（例えば、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、さらに好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノオレエート）、ジグリセロールモノイソステアレート（例えば、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、さらに好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノイソステアレート）、ジグリセロールモノミリステート（純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、さらに好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノミリステート）、ジグリセロールのココイル（例えば、ラウリル基、ミリストイル基等）エーテル、又はこれらの混合物が好ましい。
【００２３】
これらの油溶性界面活性剤は、モノマ全質量に対して５〜８０質量％の範囲で用いることが好ましい。油溶性界面活性剤の使用量が５質量％以上であると、水滴の安定性が充分となることから、大きな単一孔を形成しにくくなる傾向がある。また、油溶性界面活性剤の使用量が８０質量％以下であると、重合後に多孔質ポリマ粒子の形状をより保持し易くなる傾向がある。カラムに充填して使用する場合の通液性及び動的吸着性に優れる観点から、油溶性界面活性剤の使用量は、１５質量％以上が好ましく、２０質量％以上がより好ましく、２５質量％以上がさらに好ましく、３０質量％以上が特に好ましく、３５質量％以上が極めて好ましい。
【００２４】
重合反応に用いられる水性媒体としては、水、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体等が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系及び両性イオン系の界面活性剤のうち、いずれも用いることができる。
【００２５】
アニオン系界面活性剤としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸油、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸エステル塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等のジアルキルスルホコハク酸塩、アルケルニルコハク酸塩（ジカリウム塩）、アルキルリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩及びポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩が挙げられる。
【００２６】
カチオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルアミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のアルキルアミン塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等の第四級アンモニウム塩などが挙げられる。
【００２７】
ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル類、ポリエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールソルビタンエステル類、ポリアルキレングリコールアルキルアミン又はアミド類等の炭化水素系ノニオン界面活性剤、シリコンのポリエチレンオキサイド付加物類、ポリプロピレンオキサイド付加物類等のポリエーテル変性シリコン系ノニオン界面活性剤、パーフルオロアルキルグリコール類等のフッ素系ノニオン界面活性剤などが挙げられる。
【００２８】
両性イオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等の炭化水素界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤及び亜リン酸エステル系界面活性剤が挙げられる。
【００２９】
界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記界面活性剤の中でも、モノマの重合時の分散安定性に優れる観点から、アニオン系界面活性剤が好ましい。
【００３０】
必要に応じて添加される重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物が挙げられる。重合開始剤は、例えば、モノマ１００質量部に対して、０．１〜７．０質量部の範囲で使用することができる。
【００３１】
重合温度は、モノマ及び重合開始剤の種類に応じて適宜選択することができる。重合温度は、２５〜１１０℃が好ましく、５０〜１００℃がより好ましい。
【００３２】
多孔質ポリマ粒子の合成において、粒子の分散安定性を向上させるために、高分子分散安定剤を添加してもよい。
【００３３】
高分子分散安定剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリカルボン酸、セルロース類（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、ポリビニルピロリドンなどが挙げられ、トリポリリン酸ナトリウム等の無機系水溶性高分子化合物も併用することができる。これらのうち、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンが好ましい。高分子分散安定剤の添加量は、モノマ１００質量部に対して１〜１０質量部が好ましい。
【００３４】
モノマが単独で重合することを抑えるために、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を用いてもよい。
【００３５】
多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、好ましくは５００μｍ以下、より好ましくは３００μｍ以下、さらに好ましくは１００μｍ以下である。また、多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上であり、さらに好ましくは５０μｍ以上である。多孔質ポリマ粒子の平均粒径が１０μｍ以上であると、カラム充填後のカラム圧を抑制できる傾向がある。
【００３６】
多孔質ポリマ粒子又は分離材の粒径の変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、通液性の向上の観点から、５〜１５％であることが好ましく、５〜１４％であることがより好ましく、５〜１３％であることがさらに好ましい。粒径のＣ．Ｖ．を低減する方法としては、マイクロプロセスサーバー（株式会社日立製作所社製）等の乳化装置により単分散化することなどが挙げられる。
【００３７】
多孔質ポリマ粒子又は分離材の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．は、以下の測定法により求めることができる。
１）多孔質ポリマ粒子又は分離材を、超音波分散装置を使用して水（界面活性剤等の分散剤を含む）に分散させ、１質量％の多孔質ポリマ粒子又は分離材を含む分散液を調製する。
２）粒度分布計（シスメックスフロー、シスメックス株式会社製）を用いて、上記分散液中の多孔質ポリマ粒子又は分離材約１万個の画像により平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．を測定する。
【００３８】
多孔質ポリマ粒子の空隙率（細孔容積）は、多孔質ポリマ粒子の全体積基準で３０体積％以上７０体積％以下であることが好ましく、４０体積％以上７０体積％以下であることがより好ましい。多孔質ポリマ粒子は、マクロポアー（マクロ孔）を有することが好ましい。多孔質ポリマ粒子の細孔径（モード径）は、０．０５μｍ以上０．５μｍ未満であることが好ましく、０．０５μｍ以上０．３μｍ未満であることがより好ましい。上記細孔径が０．０５μｍ以上であると、細孔内に物質が入り易くなる傾向があり、上記細孔径が０．５μｍ未満であると、比表面積が充分なものになる傾向がある。細孔容積及び細孔径は上述の多孔質化剤により調整可能である。
【００３９】
多孔質ポリマ粒子の比表面積は、３０ｍ２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ２／ｇ以上であることがさらに好ましい。比表面積が３０ｍ２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向がある。
【００４０】
多孔質ポリマ粒子又は分離材の細孔径（モード径）、比表面積及び空隙率は、水銀圧入測定装置（オートポア：株式会社島津製作所社製）を用いて、例えば以下のようにして測定することができる。試料約０．０５ｇを、標準５ｍＬ粉体用セル（ステム容積０．４ｍＬ）に加え、初期圧２１ｋＰａ（約３ｐｓｉａ、細孔直径約６０μｍ相当）の条件で測定する。水銀パラメータは、装置デフォルトの水銀接触角１３０ｄｅｇｒｅｅｓ、水銀表面張力４８５ｄｙｎｅｓ／ｃｍに設定する。また、細孔径０．０５〜５μｍの範囲に限定してそれぞれの値を算出する。
【００４１】
（被覆層）
被覆層は、水酸基を有する架橋重合体を含む。該架橋重合体は、重合性の二重結合を１つ有する単官能モノマと、重合性の二重結合を２つ以上有する多官能モノマとの共重合体である。該架橋重合体は、多孔質ポリマ粒子に結合していることが好ましく、水酸基を有する３次元架橋網目構造を有することがより好ましい。このような被覆層で被覆されている多孔質ポリマ粒子を備える分離材は、タンパク質の非特異吸着を抑制することができるとともに、カラムとして用いたときの通液性を向上させることができる。また、このような分離材は、カラムとして用いたときのカラム圧の向上を抑制することができるとともに、タンパク質吸着量を、天然高分子を用いた場合以上にすることが可能となる傾向がある。
【００４２】
水酸基を有する架橋重合体は、−ＣＨ２−ＣＲ１Ｚ−（Ｒ１は、水素原子又はメチル基を表し、Ｚは、水酸基、−ＣＯＮＨＲ２又は−ＣＯＯＲ２を表し、Ｒ２は、水酸基を１つ以上有する炭素数２〜４のアルキル基を表す）で表される、水酸基を有するモノマ単位を含むことが好ましい。Ｒ２は、端末に水酸基を有する炭素数２〜４のアルキル基が好ましい。
【００４３】
架橋重合体は、１分子中に２個以上の水酸基を有することが好ましく、親水性高分子であることがより好ましい。架橋重合体がこのような構造を含むことにより、タンパク質の動的吸着量が大きくなる傾向がある。架橋重合体としては、例えば、−ＣＨ２−ＣＲ１Ｚ−（Ｒ１は、水素原子を表し、Ｚは、水酸基を表す）で表される水酸基を有するモノマ単位を含むポリビニルアルコール又はその変性体；−ＣＨ２−ＣＲ１Ｚ−（Ｒ１は、水素原子又はメチル基を表し、Ｚは、−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨを表す）で表される水酸基を有するモノマ単位を含むポリグリセリンモノ（メタ）アクリレート又はその変性体；−ＣＨ２−ＣＲ１Ｚ−（Ｒ１は、水素原子又はメチル基を表し、Ｚは、−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨを表す）で表される水酸基を有するモノマ単位を含むポリ２−ヒドロキシエチルアクリルアミド又はその変性体；−ＣＨ２−ＣＲ１Ｚ−（Ｒ１は、水素原子又はメチル基を表し、Ｚは、−ＣＯＯＲ２を表す）で表される水酸基を有するモノマ単位を含むポリモノ（メタ）アクリレート又はその変性体、及びこれらの混合物などが挙げられる。これらの中で、通液性により優れる観点から、ポリビニルアルコール、ポリグリセリンモノメタクリレート又はポリ２−ヒドロキシエチルアクリルアミドが好ましく、ポリグリセリンモノメタクリレート又はポリ２−ヒドロキシエチルアクリルアミドがより好ましい。また、タンパク質の動的吸着量を向上させる観点から、ポリビニルアルコール、ポリグリセリンモノメタクリレート又はポリ２−ヒドロキシエチルアクリルアミドが好ましく、ポリビニルアルコールがより好ましい。
【００４４】
多孔質ポリマ粒子を被覆している被覆層の量は、例えば、被覆層形成の前後でのＸＰＳ、重量変化、熱重量分析、アンスロン法等により算出できる。細孔が閉口することを低減する観点、及び、タンパク吸着量がさらに向上する観点から、多孔質ポリマ粒子１ｇ当たりの被覆層の量は、２０〜４００ｍｇであることが好ましく、２５〜２００ｍｇであることがより好ましく、３０〜１５０ｍｇであることがさらに好ましい。被覆層の割合が多孔質ポリマ粒子１ｇに対して４００ｍｇ以下であると、被覆層を薄膜とすることができ、カラムとして用いたときの通液性がより向上する傾向がある。また、被覆層の割合が多孔質ポリマ粒子１ｇに対して２０ｍｇ以上であると、タンパク質吸着量がより高まる傾向がある。
【００４５】
＜分離材の製造方法＞
一実施形態に係る分離材の製造方法は、多孔質ポリマ粒子、重合性の二重結合を１つ有する単官能モノマ、及び重合性の二重結合を２つ以上有する多官能モノマを含有する反応液中で、前記単官能モノマと前記多官能モノマとを共重合させて、前記多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層を形成させる工程を備える。当該製造方法により、単官能モノマ又は当該単官能モノマにより合成された重合体を多孔質ポリマ粒子に導入すると同時に、多官能モノマと単官能モノマ又は当該単官能モノマにより合成された重合体との架橋反応が起こるので、多孔質ポリマ粒子の表面に架橋重合体を密に被覆させることができる。以下、被覆層を形成する工程の具体例について説明する。
【００４６】
まず、単官能モノマと多官能モノマとを水性媒体などに添加してモノマ混合液を調製する。モノマ混合液には、必要に応じて重合開始剤、界面活性剤、触媒等を含むことができる。モノマ混合液は、乳化されてもよい。乳化は、通常の乳化方法、例えば超音波ホモジナイザーを使用して行ってもよい。
【００４７】
単官能モノマとしては、例えば、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート等の水酸基を有するモノ（メタ）アクリレート；２−ヒドロキシエチルアクリルアミド等の水酸基を有するモノ（メタ）アクリルアミド；酢酸ビニル等の重合後加水分解等により水酸基を有する高分子を合成することができる単官能モノマなどが挙げられる。例えば、酢酸ビニルは、水酸基を有していないが、重合して得られるポリ酢酸ビニルを加水分解することで、水酸基を有する高分子であるポリビニルアルコールが得られる。これらの単官能モノマは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００４８】
単官能モノマの使用量は、モノマ全質量基準で７０〜９９質量％であることが好ましく、８０〜９９質量％であることがより好ましく、８５〜９８質量％であることがさらに好ましい。単官能モノマの使用量がこの範囲内であると、カラムとして用いたときのタンパク質の動的吸着量及び通液速度が高くなる傾向がある。
【００４９】
多官能モノマとしては、例えば、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビス（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビス（メタ）アクリルアミド等の２官能以上の（メタ）アクリルアミド；エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリセロールジ（メタ）アクリレート（グリセロール−１，２−ジ（メタ）アクリレートとグリセロール−１，３−ジ（メタ）アクリレートとの混合物）、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート等の２官能以上の（メタ）アクリレート；及びこれらの混合物が挙げられる。これらの多官能モノマは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。タンパク質の非特異吸着の低減、タンパク質の吸着量の向上、及び、通液性の向上の観点から、多官能モノマは、２官能以上の（メタ）アクリルアミド、及び２官能以上の（メタ）アクリレートの少なくとも１種を含むことが好ましい。なお、多官能モノマは、上記多官能モノマ以外の架橋剤と併用してもよい。
【００５０】
多官能モノマの使用量は、モノマ全質量基準で１〜１５質量％であることが好ましく、１〜１０質量％であることがより好ましく、１〜５質量％であることがさらに好ましい。多官能モノマの使用量がこの範囲内であると、カラムとして用いたときのタンパク質の動的吸着量及び通液速度が高くなる傾向がある。
【００５１】
重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物などが挙げられる。重合開始剤は、例えば、モノマ１００質量部に対して、０．１〜１５．０質量部の範囲で使用することが好ましく、１．０〜１５．０質量部の範囲がより好ましく、２．０〜１４．０質量部の範囲で使用することがさらに好ましい。
【００５２】
水性媒体としては、水、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体等が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系及び両性イオン系の界面活性剤のうち、いずれも用いることができる。触媒としては、架橋反応に用いられる通常の触媒を使用することができる。
【００５３】
次いで、モノマ混合液を多孔質ポリマ粒子に添加し、単官能モノマと多官能モノマとを共重合させて、水酸基を有する架橋重合体を含む被覆層を形成させる。
【００５４】
共重合の方法は、例えば、ラジカル重合などが挙げられる。共重合の温度は、モノマ及び重合開始剤等の種類に応じて、適宜選択することができ、２５〜１１０℃が好ましく、５０〜１００℃がより好ましい。共重合の時間は、１〜３０時間かけて行うことが好ましく、６〜２４時間かけて行うことがより好ましい。
【００５５】
共重合反応終了後、生成した粒子をろ別し、水、又はメタノール、エタノール、アセトン等の親水性有機溶媒で洗浄し、未反応の高分子、懸濁用媒体等を除去すれば、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部が、水酸基を有する架橋重合体を含む被覆層により被覆された分離材が得られる。
【００５６】
単官能モノマとして、酢酸ビニル等の重合後加水分解等により水酸基を有する高分子を合成することができる単官能モノマを使用する場合には、共重合反応終了後、生成した粒子を加水分解する工程をさらに備えてもよい。加水分解は、通常の方法で行うことができ、例えば、水酸化ナトリウム水溶液を添加して加熱することにより行うことができる。
【００５７】
なお、被覆層の表面又は内部に多糖類をさらに結合させてもよい。多糖類としては、デキストラン、プルラン、アガロース、キトサン等が挙げられ、各々平均分子量１万〜１００万程度のものが使用できる。多糖類を被覆層の表面又は内部に結合させる方法として、例えば、多糖類に、水酸基を有する架橋重合体の水酸基と反応性を有する官能基（エポキシ基、グリシジル基等）を導入した後、当該多糖類を溶媒に溶解した溶液を、水酸基を有する架橋重合体を含む被覆層で被覆された多孔質ポリマ粒子に含浸させて反応させる方法がある。これら反応性を有する官能基を導入した多糖類の溶媒としては、溶解することのできるものであれば、何でも使用できるが、通常、水、アルコール類が最も一般的である。溶媒に溶解させる多糖類の濃度は、５〜２０ｍｇ／ｍＬが好ましい。その溶液を、被覆層を備える多孔質ポリマ粒子に含浸させる。含浸方法は、前記多糖類溶液に前記の方法で形成された多孔質ポリマ粒子を加えて一定時間攪拌する等の方法がある。攪拌時間は多孔質ポリマ粒子の表面状態によっても変わるが、１〜１２ｈ含浸すれば多糖類濃度が多孔質ポリマ粒子の内部で外部濃度と平行状態となる。その後、反応触媒等を加えて、加熱等により反応を開始させることができる。反応終了後、粒子を濾別し、次いで水、メタノール、エタノール等の親水性有機溶媒で洗浄し、未反応の多糖類や分散、懸濁媒体を除去すれば、被覆層の表面又は内部に多糖類が結合された分離材が得られる。
【００５８】
（イオン交換基の導入）
水酸基を有する架橋重合体を含む被覆層を備える分離材は、イオン交換基、リガンド（例えばプロテインＡ等）などを分離材表面上の水酸基等を介して導入することにより、イオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基を導入する方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。
【００５９】
ハロゲン化アルキル化合物としては、モノハロゲノカルボン酸及びそのナトリウム塩、ハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する１級、２級又は３級アミン及びその塩酸塩、ハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する４級アンモニウム塩等が挙げられる。モノハロゲノカルボン酸としては、例えば、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等が挙げられる。ハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する３級アミンとしては、例えば、ジエチルアミノエチルクロライド等が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物は、臭化物又は塩化物であることが好ましい。ハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、イオン交換基を導入する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。
【００６０】
イオン交換基の導入には、反応を促進させるために、有機溶媒を用いるのが有効である。有機溶媒としては、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、イソブタノール、１−ペンタノール、イソペンタノール等のアルコール類が挙げられる。
【００６１】
通常、イオン交換基の導入は、分離材表面の水酸基に行われるので、湿潤状態の粒子を、ろ過等により水切りした後、所定濃度のアルカリ性水溶液に浸漬し、一定時間放置した後、水−有機溶媒混合系で、上記ハロゲン化アルキル化合物を添加して反応させることができる。アルカリ性水溶液としては、例えば、水酸化ナトリウム水溶液が挙げられる。この反応は温度４０〜９０℃で、還流下、０．５〜１２時間行うことが好ましい。上記の反応で使用されるハロゲン化アルキル化合物の種類により、付与されたイオン交換基が決定される。
【００６２】
イオン交換基として弱塩基性基であるアミノ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物のうち、アルキル基のうちの少なくとも１つがハロゲン化アルキル基で置換されている、モノ−、ジ−又はトリ−アルキルアミン、モノ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、ジ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−ジ−アルカノールアミン等を反応させる方法、又はアルカノール基のうちの少なくとも１つがハロゲン化アルカノール基で置換されている、モノ−、ジ−又はトリ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、ジ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−ジ−アルカノールアミンを反応させる方法等が挙げられる。
【００６３】
イオン交換基として強塩基性基である４級アンモニウム基を導入する方法としては、まず３級アミノ基を導入し、該３級アミノ基にエピクロルヒドリン等のハロゲン化アルキル基含有化合物を反応させ、４級アンモニウム基に変換させる方法などが挙げられる。また、４級アンモニウムクロライド等の４級アンモニウムハロゲナイドなどを分離材に反応させてもよい。
【００６４】
イオン交換基として弱酸性基であるカルボキシル基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物として、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸又はそのナトリウム塩を反応させる方法などが挙げられる。
【００６５】
イオン交換基として強酸性基であるスルホン酸基を導入する方法としては、分離材に対してエピクロロヒドリン等のグリシジル化合物を反応させ、さらに亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩又は重亜硫酸塩の飽和水溶液に該分離材を添加する方法などが挙げられる。反応条件は、３０〜９０℃で１〜１０時間であることが好ましい。
【００６６】
一方、イオン交換基の導入方法として、アルカリ性雰囲気下で、分離材に１，３−プロパンスルトンを反応させる方法も挙げられる。１，３−プロパンスルトンは、分離材の全質量に対して０．４質量％以上使用することが好ましい。反応条件は、０〜９０℃で０．５〜１２時間であることが好ましい。
【００６７】
本実施形態の分離材は、タンパク質等の生体高分子の静電的相互作用による分離、アフィニティ精製に用いるのに好適である。例えば、タンパク質を含む混合溶液の中に本実施形態の分離材を添加し、静電的相互作用によりタンパク質だけを該分離材に吸着させた後、該分離材を溶液からろ別し、塩濃度の高い水溶液中に添加すれば、分離材に吸着しているタンパク質を容易に脱離して回収することができる。また、本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーにおいて使用することも可能である。
【００６８】
本実施形態の分離材を用いて分離できる生体高分子としては、水溶性物質が好ましい。
具体的には、例えば、血清アルブミン、免疫グロブリン等の血液タンパク質などのタンパク質、生体中に存在する酵素、バイオテクノロジーにより生産されるタンパク質生理活性物質、ＤＮＡ、生理活性を有するペプチド等の生体高分子などが挙げられる。生体高分子の分子量は、２００万以下が好ましく、５０万以下がより好ましい。また、公知の方法に従い、タンパク質の等電点、イオン化状態等によって、分離材の性質、分離条件等を選ぶことができる。公知の方法として、例えば、特開昭６０−１６９４２７号公報等に記載の方法が挙げられる。
【００６９】
本実施形態の分離材は、被覆層を形成した後、分離材の表面にイオン交換基、プロテインＡを導入することにより、タンパク質等の生体高分子の分離において、天然高分子からなる粒子又は合成ポリマからなる粒子のそれぞれの利点を有する。特に本実施形態の分離材における多孔質ポリマ粒子は、上述の方法で得られるものであるため、耐久性及び耐アルカリ性を有する。また、本実施形態の分離材は、上記のような被覆層を備えることにより、タンパク質等の非特異吸着を低減し、タンパク質の吸脱着が起こり易いとともに、通液速度が速く、通液性に優れる。さらに、本実施形態の分離材は、同一流速下でのタンパク質等の吸着量（動的吸着量）が大きい傾向がある。
【００７０】
本明細書における通液速度とは、φ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに本実施形態の分離材を充填し、液を通した際の通液速度を表す。カラムクロマトグラフィーでタンパク質等の分離を行う場合、カラムに通液されるタンパク質溶液等の通液速度としては、一般に４００ｃｍ／ｈ以下の範囲である。一方、本実施形態の分離材を使用した場合は、従来のタンパク質分離用の分離材よりも速い８００ｃｍ／ｈ以上の通液速度で使用しても高吸着量を維持することができる。本実施形態の分離材は、カラムに充填した場合、カラム圧０．３ＭＰａのときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上であることが好ましい。
【００７１】
本実施形態の分離材の平均粒径は、１０〜３００μｍであることが好ましく、分取用又は工業用のクロマトグラフィーで使用する場合、カラム内圧の極端な増加を避けるために、１０〜１００μｍであることがより好ましく、５０〜１００μｍであることがさらに好ましい。
【００７２】
本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーでカラム充填材として使用した場合、使用する溶出液の性質に依らず、カラム内での体積変化がほとんどないため、操作性に優れる。
【００７３】
分離材の空隙率は、分離材の全体積基準で３０体積％以上７０体積％以下であることが好ましく、４０体積％以上７０体積％以下であることがより好ましい。分離材は、マクロポアー（マクロ孔）を有することが好ましい。分離材の細孔径（モード径）は、０．１〜０．５μｍであることが好ましく、０．２〜０．５μｍであることがより好ましい。上記細孔径が０．１μｍ以上であると、細孔内に物質が入り易くなる傾向があり、上記細孔径が０．５μｍ以下であると、比表面積が充分なものになる傾向がる。
【００７４】
分離材の比表面積は、３０ｍ２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ２／ｇ以上であることがさらに好ましい。比表面積が３０ｍ２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向がある。
【００７５】
なお、本実施形態では、イオン交換基を導入する形態の分離材について説明したが、イオン交換基を導入しなくても分離材として用いることができる。このような分離材は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーに利用することができる。
【００７６】
＜カラム＞
一実施形態に係るカラムは、上述の分離材を備える。該カラムは、カラム内に上述の分離材を充填させることで製造することができる。カラム内に分離材を充填させる方法は、特に制限させるものではなく、例えば、公知の方法を採用することができる。
【実施例】
【００７７】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７８】
（実施例１）
１−１．多孔質ポリマ粒子の合成
５００ｍＬの三口フラスコに、純度９６質量％のジビニルベンゼン（ＤＶＢ９６０、新日鉄住金化学株式会社製）１６ｇ、Ｓｐａｎ８０（商品名）６ｇ、及び過酸化ベンゾイル０．６４ｇを混合し、モノマ溶液を調製した。０．５質量％のポリビニルアルコール水溶液を溶媒として用いた。マイクロプロセスサーバー（株式会社日立製作所製）を使用して上記モノマ溶液及び上記溶媒を乳化させた後、得られた乳化液（モノマ濃度２５体積％）をフラスコに移し、８０℃のウォーターバスで加熱しながら、攪拌機を用いて約８時間撹拌した。得られた粒子をろ過により取り出した後、アセトンで洗浄し、多孔質ポリマ粒子１を得た。
【００７９】
１−２．多孔質ポリマ粒子の評価
多孔質ポリマ粒子の粒径をフロー型粒径測定装置で測定し、平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を算出した。また、細孔径（モード径）は水銀圧入法にて測定した。多孔質ポリマ粒子は、平均粒径が９１μｍ、粒径Ｃ．Ｖ．値が９％、細孔径（モード径）が０．２８μｍのものであった。
【００８０】
２−１．被覆層の形成
５００ｍＬの三口フラスコに、単官能モノマとして酢酸ビニル４０ｇ、多官能モノマとしてＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡ）２ｇ、重合開始剤として２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）２ｇ、及び界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）０．４ｇを純水３００ｍＬに溶解した。得られた溶液を超音波ホモジナイザー（アズワン製）で乳化させた後、多孔質ポリマ粒子１を１０ｇ計量した５００ｍＬの三口フラスコに、得られた乳化液を添加した。攪拌機を用いて室温で約２４時間撹拌した後、ウォーターバスを用いて７０℃に加熱しながら、約２４時間撹拌した。得られた粒子をろ過後、純水とアセトンで洗浄した。洗浄後の粒子を５質量％ＮａＯＨ水溶液に分散して、４０℃で３時間攪拌することで、被覆層が形成された粒子を得た。得られた粒子は以下の方法により評価した。
【００８１】
２−２．被覆層が形成された粒子の評価
（被覆層の量の評価）
被覆層形成の前後の粒子を熱重量分析することにより、多孔質ポリマ粒子１ｇ当たりの被覆層の量（ｍｇ）を算出した。結果を表１に示す。
【００８２】
（タンパク質の非特異吸着性の評価）
被覆層が形成された粒子０．５ｇをＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）濃度２０ｍｇ／ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍＬに投入し、２４時間室温で撹拌した。その後、遠心分離を行って上澄み液をとった。分光光度計で上澄み液の２８０ｎｍの吸光度を測定することによって求めた上澄み液中のＢＳＡ濃度から、粒子に吸着したＢＳＡ量を算出した。結果を表２に示す。
【００８３】
（界面活性剤の吸着性の評価）
被覆層が形成された粒子０．５ｇをアニオン系界面活性剤であるドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムネオペレックスＧ−１５（商品名、花王株式会社製）１質量％水溶液に投入し、２４時間室温で撹拌した。その後、遠心分離を行って上澄み液をとった。分光光度計で上澄み液の２５９ｎｍの吸光度を測定することによって求めた上澄み液中の界面活性剤濃度から、粒子に吸着した界面活性剤量を算出した。結果を表２に示す。
【００８４】
３−１．イオン交換基の導入
被覆層が形成された粒子の分散液から、遠心分離により水を除去した。得られた粒子１０ｇを、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩の水溶液（ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩６０ｇを水に溶解し１００ｇとした水溶液）に分散させ、７０℃で１０分攪拌した後、７０℃に加温した５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を１００ｍＬ添加し、１時間反応させた。反応終了後、生成物をろ過により取り出し、水／エタノール（体積比８／２）の混合液で２回洗浄し、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基をイオン交換基として有する分離材（ＤＥＡＥ変性分離材）を得た。
【００８５】
３−２．カラム特性の評価
（通液性の評価）
ＤＥＡＥ変性分離材を溶媒メタノールに分散して濃度３０質量％のスラリーを調製した。このスラリーをφ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに１５分かけて充填した。その後、カラムに流速を変えながら水を通し、流速とカラム圧との関係を測定し、カラム圧０．３ＭＰａの時点の通液速度（線流速）を測定した。結果を表２に示す。
【００８６】
（動的吸着量の評価）
動的吸着量を以下のようにして測定した。２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）をカラムに１０カラム容量通した。その後、ＢＳＡ濃度２ｍｇ／ｍＬの２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を通し、ＵＶ測定によってカラム出口でのＢＳＡ濃度を測定した。カラム入口と出口のＢＳＡ濃度が一致するまで緩衝液を通し、その後、５カラム容量分の１Ｍ  ＮａＣｌ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液で希釈した。１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量を以下の式を用いて算出した。結果を表２に示す。
ｑ１０＝ｃｆＦ（ｔ１０−ｔ０）／ＶＢ
ｑ１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量（ｍｇ／ｍＬ  ｗｅｔ  ｒｅｓｉｎ）
ｃｆ：注入しているＢＳＡ濃度
Ｆ：流速（ｍＬ／ｍｉｎ）
ＶＢ：ベッド体積（ｍＬ）
ｔ１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける時間（ｍｉｎ）
ｔ０：ＢＳＡ注入開始時間（ｍｉｎ）
【００８７】
（実施例２）
被覆層の形成に用いる単官能モノマである酢酸ビニルをグリセリンモノメタクリレート（ＧＭＭＡ）に変更したこと以外は実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。なお、被覆層の形成工程でのＮａＯＨ水溶液による加水分解処理は行わなかった。
【００８８】
（実施例３）
被覆層の形成に用いる単官能モノマである酢酸ビニルを２−ヒドロキシエチルアクリルアミド（ＨＥＡＡ）に変更したこと以外は実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。なお、被覆層の形成工程でのＮａＯＨ水溶液による加水分解処理は行わなかった。
【００８９】
（実施例４）
被覆層の形成に用いる多官能モノマであるＭＢＡをエチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）に変更したこと以外は実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。
【００９０】
（実施例５）
被覆層の形成に用いる酢酸ビニルの添加量を１５ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。
【００９１】
（実施例６）
被覆層の形成に用いる酢酸ビニルの添加量を８０ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。
【００９２】
（比較例１）
多孔質ポリマ粒子をそのまま分離材として用い、実施例１と同様に評価した。
【００９３】
（比較例２）
被覆層の形成において多官能モノマを用いなかったこと以外は実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。
【００９４】
（比較例３）
３００ｍＬの三口フラスコに、純水１００ｇを入れ、ポリビニルアルコール（重量平均分子量Ｍｗ：１２０００）２ｇを溶解した。多孔質ポリマ粒子を１０ｇフラスコ中に入れ、室温で攪拌しながら、架橋剤グルタルアルデヒド（ＧＡ）５０質量％溶液を１ｇ入れ、次いで１Ｎ−塩酸水溶液をｐＨ２．０以下になるように約２ｍＬ入れた。６０℃のウォーターバスで加熱しながら、攪拌機を用いて４時間撹拌した。反応終了後、７０℃温水で洗浄し、ポリビニルアルコール架橋粒子を得た。得られた粒子は実施例１と同様に評価した。
【００９５】
（比較例４）
被覆層の形成に用いる多官能モノマであるＭＢＡを架橋剤エピクロルヒドリン（ＥｐＣｌ）に変更したこと以外は実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。なお、被覆層の形成工程でのＮａＯＨ水溶液による加水分解処理は行わなかった。
【００９６】
【表１】
2020011212.tif 000002
【００９７】
【表２】
2020011212.tif 000003
【００９８】
表２の結果から、実施例１〜６の分離材は、比較例１〜４の分離材と比べて、タンパク質の非特異吸着及び界面活性剤の吸着が少なく、且つ、カラムとして用いたときのタンパク質の動的吸着量及び通液速度が高いことが確認された。