(57)【要約】【課題】ホウ素中性子捕捉療法を行う際に、大量に１０Ｂを腫瘍細胞内に送り込む必要がある。しかし、ＥＰＲ効果を奏し、１０Ｂを大量に腫瘍細胞内に運搬できる化合物は従来なかった。【解決手段】担持粒子にホウ素の安定同位体と、細胞透過性ペプチド（細胞内運搬ペプチド）と、凝集阻害剤を担持させたことを特徴とするホウ素含有化合物は、担持粒子に金を選び、ホウ素の安定同位体としてＢＳＨを選ぶことで、腫瘍細胞への選択的な侵入能を有し、なおかつ担持粒子同士が凝集しないホウ素含有化合物を得ることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
担持粒子にホウ素の安定同位体と、細胞透過性ペプチドと、凝集阻害剤を担持させたことを特徴とするホウ素含有化合物。
【請求項２】
前記担持粒子の粒径が２０〜２００ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載されたホウ素含有化合物。
【請求項３】
前記ホウ素の安定同位体は、チオール基で修飾されたホウ素クラスターであることを特徴とする請求項１または２の何れかの請求項に記載されたホウ素含有化合物。
【請求項４】
前記細胞透過性ペプチドがＴａｔタンパク質であることを特徴とする請求項１乃至３の何れか一項に記載されたホウ素含有化合物。
【請求項５】
前記凝集阻害剤は、前記細胞透過性ペプチドを介して前記担持粒子に担持されていることを特徴とする請求項１乃至４の何れか一項に記載されたホウ素含有化合物。
【請求項６】
前記凝集阻害剤は、ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項１乃至５の何れか一項に記載されたホウ素含有化合物。
【請求項７】
前記担持粒子は金であることを特徴とする請求項１乃至６の何れか一項に記載されたホウ素含有化合物。
【請求項８】
前記ホウ素の安定同位体と、前記細胞透過性ペプチドは、チオール基によって前記担持粒子と結合していることを特徴とする請求項１乃至７の何れか一項に記載されたホウ素含有化合物。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか一項に記載されたホウ素含有化合物を含む薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホウ素中性子捕捉療法に用いるホウ素含有化合物に関するものであり、またホウ素含有化合物を含む薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホウ素の安定同位体（以後「１０Ｂ」とも記載する。）は、中性子線を照射することで、核分裂反応が進行して、α線を放出する。ホウ素中性子捕捉療法（Ｂｏｒｏｎ  Ｎｅｕｔｒｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：以下「ＢＮＣＴ」）は、その放出したα線によって細胞内のＤＮＡに損傷を与え、がん細胞を死滅させる技術であり、放射線療法と化学療法を掛け合わせた新しいがん治療法である。
【０００３】
ＢＮＣＴは、１０ＢがＤＮＡのより近い位置に存在することでその効果が向上するので、１０Ｂを細胞内へ運搬することが重要となる。このことから、細胞内に侵入できるホウ素含有化合物およびそれを用いた薬剤（以下「ホウ素製剤」とも呼ぶ。）の発明は重要となる。
【０００４】
一方、ＢＮＣＴのホウ素製剤は、これまでにＢＰＡ（ボロノフェニルアラニン）が使用されてきている。しかし、ＢＰＡは、１分子中に１個の１０Ｂしか含んでおらず、細胞内に１０Ｂを運搬する上で効率が悪い。
【０００５】
特許文献１には、希土類元素とホウ素を組み込んだ（１）式の含ホウ素希土類化合物とそれを有効成分として含有するホウ素中性子捕捉療法用組成物が開示されている。
【０００６】
【化１】
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【０００７】
なお、ここで、Ｒは希土類原子であり、ｘおよびｙはそれぞれ０．５≦ｘ≦１．５および０≦ｙ≦３を満たす数である。
【０００８】
（１）式の化合物は１分子中に１つ以上のホウ素を組み込むことが可能である。しかし、多量のホウ素を組み込めるほどではない。
【０００９】
一方、１０Ｂを多数含んでいる物質として、１分子中に１２個の１０Ｂが含まれるホウ素クラスター（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ  Ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｈｙｄｒｏｄｏｄｅｃａｂｏｒａｔｅ：以下「ＢＳＨ」と呼ぶ。）が知られている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１４−１７２８２２号公報
【特許文献２】特開２０１８−０１６５９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＢＳＨは、一度に大量の１０Ｂを細胞内に運搬できるので新しいＢＮＣＴのためのホウ素製剤として期待できる。しかし、１０Ｂは単独で細胞内に侵入することができないので、細胞内に運搬するための手段を必要とする。
【００１２】
また、ホウ素中性子捕捉療法では、中性子線を受けた１０Ｂが短距離（およそ１０μｍ）とはいえ、放射線を放出する。したがって、正常細胞へ１０Ｂが取り込まれない、選択性が必要とされる。
【００１３】
通常この選択性は、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果を利用する。したがって、ホウ素含有化合物の粒度制御が重要となる。特許文献１ではＥＰＲ効果を発揮できる粒径を１００から２００ｎｍの大きさとして、該当する大きさの粒径のものが開示されているが、より安定に粒径を制御する要請がある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は上記の課題に鑑みて想到されたものであり、粒径の制御が容易であって、１０Ｂを多数含んだＢＳＨを細胞内に侵入させることができるホウ素含有化合物を提供する。
【００１５】
より具体的に本発明に係るホウ素含有化合物は、
担持粒子にホウ素の安定同位体と、細胞透過性ペプチド（細胞内運搬ペプチド）と、凝集阻害剤を担持させたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係るホウ素含有化合物は、担持粒子として金粒子を利用するため、ナノオーダーの粒径制御が極めて容易である。したがって、ＥＰＲ効果を奏する粒子径の大きさのそろったホウ素含有化合物を得ることができる。
【００１７】
また、ホウ素の安定同位体には、ＢＳＨ（ホウ素クラスター）を利用する。ＢＳＨは金粒子の表面に複数結合することが期待されるため、１つの粒子で多数のホウ素の安定同位体を細胞内に入れることができる。
【００１８】
また、担持粒子となる金粒子に細胞透過性ペプチドを担持させることで、ホウ素含有化合物は細胞侵入能を獲得することができる。
【００１９】
さらに、ホウ素含有化合物の外面には凝集阻害剤が担持されているので、ホウ素含有化合物は、凝集することなく、水に溶解させることができ、薬剤として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明に係るホウ素含有化合物の構成を示す模式図である。
【図２】ホウ素クラスター（ＢＳＨ）の構造を示す構造式である。
【図３】担持粒子としての金の走査電子顕微鏡写真である。
【図４】修飾細胞透過性ペプチドの適合性を調べるために行った実験結果を示す写真である。
【図５】ＨｅＬａ細胞にホウ素含有化合物を接触させた結果を示す写真である。図５（ａ）は接触前であり、図５（ｂ）は接触後である。
【図６】ホウ素含有化合物において、ホウ素クラスター（ＢＳＨ）と修飾細胞透過性ペプチド（サンプルＰ１）の比率を変えたホウ素含有化合物をＨｅＬａ細胞と接触させた結果を示す写真である。
【図７】修飾された金ナノ粒子の元素組成を調べたＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）のスペクトルを表すグラフである。
【図８】修飾された金ナノ粒子の元素組成を調べたエネルギー分散Ｘ線（ＥＤＸ）スペクトルの結果を表す写真である。
【図９】修飾された金ナノ粒子のＢＳＨおよび各サンプルペプチドの割合を変えたとき、および凝集阻害剤のＰＥＧの鎖長を変えたときの複合体の凝集状態を５２５ｎｍの吸光度で測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下に本発明に係るホウ素含有化合物およびそれを用いた薬剤について説明を行う。なお、以下の説明は本発明の一実施の形態および一実施例についての例示であって、本発明は以下の説明に限定されるものではない。本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて、以下の実施の形態は変更することができる。
【００２２】
本発明に係るホウ素含有化合物は、担持粒子と、ホウ素の安定同位体と、細胞透過性ペプチド（細胞内運搬ペプチド）と、凝集阻害剤で構成されている。
【００２３】
ホウ素の安定同位体は、担持粒子と結合する必要がある。例えば、ホウ素を含む骨格がチオール基（−ＳＨ）を有していれば、自己組織化単分子膜（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ：「ＳＡＭｓ」）を担持粒子上で構成するので、好適である。特に担持粒子を金とした場合は、金粒子上に安定にＳＡＭｓを構成する。
【００２４】
さらに、ホウ素の安定同位体がＢＳＨであればより好適である。ＢＳＨは、１２個のホウ素を含みさらにチオール基が結合したナトリウム塩である。
【００２５】
担持粒子は、ホウ素の安定同位体とＳＡＭｓを構成する金属であれば金以外の金属であってもよい。例えば、銀、白金、銅等が挙げられる。担持粒子の粒径はホウ素含有化合物となった時に、ＥＰＲ効果を奏するとされる２０〜２００ｎｍ、より好ましくは５０〜１５０ｎｍとなるような大きさが望ましい。
【００２６】
ホウ素の安定同位体は１０Ｂ元素が含まれる状態であればよい。特に担持粒子に対してＳＡＭｓを構成できるように、チオール基を有する化合物の形で存在するものが好適に利用できる。ＢＳＨは、１２個の１０Ｂと１個のチオール基を有しているので、好適に利用することができる。
【００２７】
細胞透過性ペプチドは、細胞侵入能を有していれば特に限定されない。Ｔａｔ、オリゴアルギニン、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ、ＴＰ−１０といったペプチドが好適に利用できる。中でも、Ｔａｔペプチド（「Ｔａｔタンパク質」といってもよい。）等は好適に利用できる。なお、細胞透過性ペプチドも、チオール基が結合していることが必要である。なお、これらのペプチドはＮ末端若しくはＣ末端を適宜改変して使用することができる。
【００２８】
凝集阻害剤は、本発明に係るホウ素含有化合物において担持粒子同士が凝集することを防止できることが必要である。また、生体適合性も必要とされる。そのような長鎖の炭化水素として、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリ乳酸等が挙げられる。特にポリエチレングリコールは好適に利用することができる。
【００２９】
なお、凝集阻害剤は、細胞透過性ペプチドに結合して存在するのが好ましい。ホウ素含有化合物の外周を包み、粒子同士の凝集を阻害するからである。凝集阻害剤と細胞透過性ペプチドが結合したもの、若しくはさらにチオール基が結合したものを修飾細胞透過性ペプチドと呼ぶ。
【００３０】
本発明に係るホウ素含有化合物は、薬剤として使用することができる。投与方法としては、非経口投与が望ましく、静脈注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射、経皮投与、経鼻投与、経肺投与、経腸投与、口腔内投与および経粘膜投与などの投与のための製剤であることができる。たとえば、注射剤、経皮吸収テープ、エアゾール剤および坐剤などであることができる。また、これらの製剤とする際には、従来公知の技術を用いて調製され、製剤分野において通常使用される無毒性かつ不活性な担体もしくは賦形剤を含有することができる。
【実施例】
【００３１】
以下に本発明に係るホウ素含有化合物の製造方法の概略について説明する。まず、担持粒子として金ナノ粒子を選択した。別に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と、チオール基（−ＳＨ基）を修飾したＣＰＰ（以下実施例ではＣＰＰの部分はＴａｔペプチド使用：全体で修飾細胞透過性ペプチド）とＢＳＨ（分子内に１個の−ＳＨ基をもつ）を用意した。これらを混合することによって、修飾細胞透過性ペプチドと、ＢＳＨがそれぞれＡｕ−Ｓ配位共有結合によって吸着した金ナノ粒子を調製した。これを以下「修飾された金ナノ粒子」と呼ぶ。修飾された金ナノ粒子は本発明に係るホウ素含有化合物である。
【００３２】
このホウ素含有化合物（修飾された金ナノ粒子）は、ＢＳＨを持ったまま、細胞に侵入することができる。つまり、本発明に係るホウ素含有化合物は、細胞内にＢＳＨを運搬することができる。
【００３３】
また、ホウ素含有化合物は表面をＰＥＧ（凝集防止剤）で保護しているので、凝集することなく水中で分散させることができる。
【００３４】
ホウ素含有化合物の構成を図１に示す。中心に担持粒子として金ナノ粒子がある。その周囲には、ＢＳＨとＣＰＰがＡｕ−Ｓ結合で結合している。ＣＰＰの末端には、ＰＥＧが連結している。
【００３５】
ＢＳＨは１分子中に１２個の１０Ｂと１個の−ＳＨ基を含んだホウ素クラスターである。図２にその化学構造式を示す。ＢＳＨはＫａｔｃｈｅｍ（プラハ、チェコ）より購入した。
【００３６】
金ナノ粒子は以下のように合成した。１ｍＭテトラクロリド金（ＩＩＩ）酸水溶液２５０ｍＬを、丸底フラスコ内で攪拌しながら沸騰させ、そこに３８．８ｍＭクエン酸三ナトリウム水溶液２５ｍＬを加えた。その溶液を１５分還流すると色に変化が起こり、淡い黄色から深い赤色へと変化した。その溶液を攪拌しながら、室温まで冷却した。
【００３７】
合成した金ナノ粒子は、走査電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，  ＳＥＭ）で観測し、直径は２０．５ｎｍと見積もった。図３はＳＥＭでの観測写真である。スケールバーは１００ｎｍである。粒形は、滑らかな球状にかなり近いといえる。
【００３８】
ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）鎖とＣｙｓ（システイン）を修飾したＴａｔペプチド（ＰＥＧ２８−Ｔａｔ−ＳＨ）はペプチド固相法により合成した。これが修飾細胞透過性ペプチドである。なお、ＰＥＧ２８の「２８」は、後述するがポリエチレングリコール中のエチレングリコール鎖の結合数を表す。「−ＳＨ」は、チオール基である。修飾細胞透過性ペプチドは、細胞透過性ペプチドと凝集阻害剤が結合し、さらにシステインを結合させることでチオール基が結合したものである。細胞透過性ペプチドをＴａｔとしたので、ここでは、以下修飾Ｔａｔペプチドと呼ぶ。なお、ここでＴａｔ部分のアミノ酸配列は、表１の配列番号１に示す。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
Ｆｍｏｃ基（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基）の脱保護は、２０％ピぺリジン／ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）溶液を加え、室温で７分間攪拌することにより行った。
【００４１】
ＤＭＦによる洗浄を行った後、ＨＢＴＵ／ＮＭＭ試薬を用いて、１回のカップリング当たり室温で４０分間攪拌することで、各アミノ酸をカップリングさせた。Ｎ末端のＦｍｏｃ基を脱保護後、キャッピングを行った。
【００４２】
樹脂をＤＣＭ（ジクロロメタン）で洗浄し、９４％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、２．５％蒸留水、２．５％ＴＩＰＳ（トリイソプロピルシラン）、１％ＥＤＴ（エタンジチオール）を用いて室温で１．５時間攪拌することにより、樹脂から切り出した。精製した修飾Ｔａｔペプチドは、ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ  ＭａｓｓおよびＲＰ−ＨＰＬＣにより同定および純度を確認した。
【００４３】
他にもコントロールの修飾ＴａｔペプチドとしてＴａｔ−ＰＥＧ２８−ＳＨやＴａｔ−ＳＨ、ＰＥＧ１２−Ｔａｔ−ＳＨ、ＰＥＧ６−Ｔａｔ−ＳＨ、ＰＥＧ６×２−Ｔａｔ−ＳＨ、ＰＥＧ１８−Ｔａｔ−ＳＨ、ＰＥＧ２４−Ｔａｔ−ＳＨ、も同様に合成した。これらをサンプルペプチドと呼び、それぞれサンプルＰ１、サンプルＰ２、サンプルＰ３、サンプルＰ４、サンプルＰ５、サンプルＰ６、サンプルＰ７、サンプルＰ８と呼ぶ。サンプルペプチドには、Ｔａｔペプチドのみで修飾したもの（サンプルＰ４）も含まれている。
【００４４】
作製したサンプルペプチドを表２に示す。表２で、右端からサンプルＮｏ．、サンプルペプチドの略称、サンプルペプチドの構造を表す。なお、ここで「Ａｃ」はアセチル基であり、「ＣＨ３ＣＯ−」であり、「Ｓｐ」はエチレングリコール鎖のことで、化学構造式は、「−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−」である。したがって、「Ｓｐ２」は「−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）２−」を表す。また、ポリエチレングリコール中のエチレングリコール鎖の結合数を数字で示し、ＰＥＧ６等とも表す。また、「Ｃ」はシステインを表す。また、Ｔａｔはアミノ酸配列を示す。このように、修飾Ｔａｔペプチド（サンプルペプチド）は、チオール基との結合およびＰＥＧとの結合において、間に他の構造が含まれてもよい。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
これら金ナノ粒子、ＢＳＨおよび各サンプルペプチドを水中で混合するときに形成される複合体の凝集状態を調べた。実験方法はまず、金ナノ粒子水溶液とＢＳＨ水溶液と各サンプルペプチド水溶液を混ぜ合わせ、最終濃度として、金ナノ粒子１．９ｎＭ、ＢＳＨ４０５μＭ、サンプルペプチド４５μＭの水溶液とした。
【００４７】
溶液の調製方法は、金ナノ粒子溶液、サンプルペプチド水溶液、ＢＳＨ水溶液を別々に用意し、先にサンプルペプチド水溶液とＢＳＨ水溶液を混ぜ合わせてから金ナノ粒子溶液に加えることで、上記のモル濃度とした。
【００４８】
攪拌時間は１晩、室温で行った。攪拌後の水溶液の画像を図４に示す。写真は左からａ：金ナノ粒子のみ、ｂ：サンプルＰ４（Ｔａｔ−ＳＨ）、ｃ：サンプルＰ１（Ｓｐ２８−Ｔａｔ−ＳＨ）、ｄ：サンプルＰ２（Ｓｐ１２−Ｔａｔ−ＳＨ）、ｅ：サンプルＰ３（Ｔａｔ−Ｓｐ２８−ＳＨ）、ｆ：ＢＳＨのみで表面を修飾した金ナノ粒子、ｇ：サンプルＰ４（Ｔａｔ−ＳＨ）のみで表面を修飾した金ナノ粒子を用いた結果である。
【００４９】
その結果、ＰＥＧ２８−Ｔａｔ−ＳＨを加えたサンプルＰ１（ｃ）のみ凝集が確認されなかった。画像ではサンプルＰ２（ＰＥＧ１２−Ｔａｔ−ＳＨ：（ｄ））、サンプルＰ３（Ｔａｔ−ＰＥＧ２８−ＳＨ：（ｅ））、サンプルＰ４（Ｔａｔ−ＳＨ：（ｂ））、サンプルＰ４のみ表面された金ナノ粒子（ｇ）は完全に凝集し、チューブの底に沈殿した。なお、金ナノ粒子のみ（ａ）やＢＳＨのみ表面修飾された金ナノ粒子（ｆ）では、凝集は確認されない。
【００５０】
細胞内に１０Ｂを搬送するには、水中に分散し溶液として扱えることが必要となる。すなわち、凝集を生じて沈殿してしまっては、細胞内に入ることはできない。したがって、ホウ素を細胞内に運搬させるためには、サンプルＰ１（ＰＥＧ−Ｔａｔ−ＳＨ）のように、粒子の最外殻に凝集阻害剤を配置するのがよいということがわかる。
【００５１】
次に、この修飾された金ナノ粒子が、細胞内に侵入できるかを確認するための試験を行った。培養したＨｅＬａ細胞に、サンプルＰ１の最終濃度が１μＭになるように修飾した金ナノ粒子を加えて２時間インキュベーションを行った。修飾された金ナノ粒子の調整方法は、まず、サンプルＰ１とＢＳＨの割合が１：９になるように混ぜ合わせた金ナノ粒子水溶液を調製し、この粒子を遠心分離によって沈殿させ、余剰の原料を取り除くため、上澄み液を除去した後、蒸留水で再分散させる操作を２回繰り返した。最後にもう一度遠心分離を行って沈殿させ、上澄み液を除去することで、修飾された金ナノ粒子の沈殿物を回収して、ＨｅＬａ細胞が培養されている培地に加えた。２時間、３７℃でインキュベーションした後、培地を洗浄して、細胞を暗視野顕微鏡で観察した。
【００５２】
その結果を図５に示す。図５（ａ）は、ＨｅＬａ細胞のみの画像であり、図５（ｂ）は、ＨｅＬａ細胞に調整したホウ素含有化合物を加えたものである。スケールバーは５０μｍである。金ナノ粒子は表面プラズモン共鳴により、波長５２０ｎｍ付近の光を吸収し、赤色に見える。図５（ｂ）に示すように、修飾した金ナノ粒子を担持粒子とするホウ素含有化合物を加えたＨｅＬａ細胞は、赤く色づいた。このことから修飾された金ナノ粒子は細胞内へ侵入したことがわかる。この高い細胞膜透過性は、ＣＰＰによって引き起こされ、同時に多量のＢＳＨを細胞内へ運搬することに成功した。
【００５３】
次に、この修飾された金ナノ粒子のＢＳＨおよび各サンプルペプチドの割合を変えたとき、細胞内に侵入できるかを確認するための試験を行った。培養したＨｅＬａ細胞に、金ナノ粒子が０．７６ｎＭになるように修飾した金ナノ粒子を加えて２時間インキュベーションを行った。修飾された金ナノ粒子の調整方法は、まず、サンプルＰ１とＢＳＨの割合が１０：０、９：１、７：３、５：５、３：７、１：９、０：１０になるように混ぜ合わせた金ナノ粒子水溶液を調製し、この粒子を遠心分離によって沈殿させ、余剰の原料を取り除くため、上澄み液を除去した後、蒸留水で再分散させる操作を２回繰り返した。最後にもう一度遠心分離を行って沈殿させ、上澄み液を除去することで、修飾された金ナノ粒子の沈殿物を回収して、ＨｅＬａ細胞が培養されている培地に加えた。
【００５４】
その結果を図６に示す。図６（ａ）から（ｈ）はそれぞれ各比率毎の明視野画像（左側）と暗視野画像（右側）を示す。また、明視野画像と暗視野画像はそれぞれ同一倍率である。明視野画像には、スケールバー（５０μｍ）を示した。図６（ａ）はＨｅＬａ細胞のみの画像であり、図６（ｂ）〜（ｈ）は、ＨｅＬａ細胞に、調整したサンプルＰ１とＢＳＨの割合が１０：０（ｂ）、９：１（ｃ）、７：３（ｄ）、５：５（ｅ）、３：７（ｆ）、１：９（ｇ）、０：１０（ｈ）のホウ素含有化合物（修飾された金ナノ粒子）を加えたものである。図５（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）のＨｅＬａ細胞は赤く色づいた。図（ｂ）、（ｃ）および図（ｇ）、（ｈ）のＨａＬａ細胞は赤く色づかなかった。
【００５５】
粒子の最外殻に凝集阻害剤が密集してしまうと、ＣＰＰの細胞表面への接触をも阻害されてしまい細胞膜透過性が失われてしまう。また、金ナノ粒子に表面修飾されたサンプルＰ１の割合が少なくなっても細胞膜透過性が失われてしまう。従って、ホウ素含有化合物（修飾された金ナノ粒子）の高い細胞膜透過性は、サンプルＰ１とＢＳＨの割合に依存することがわかる。
【００５６】
上記の実験では、サンプルＰ１のペプチドについては、ＢＳＨとの比が７：３〜３：７の時に、細胞膜透過性を有しているといえる。
【００５７】
次に、修飾された金ナノ粒子の元素組成を確認するための試験を行った。実験方法はまず、金ナノ粒子水溶液とＢＳＨ水溶液とサンプルＰ１水溶液を混ぜ合わせ、最終濃度として、金ナノ粒子１．９ｎＭ、ＢＳＨ４０５μＭ、サンプルＰ１が４５μＭの水溶液とした。水溶液中のこの粒子を遠心分離によって沈殿させ、余剰の原料を取り除くため、上澄み液を除去した後、蒸留水で再分散させる操作を２回繰り返した。最後にもう一度遠心分離を行って沈殿させ、上澄み液を除去することで、修飾された金ナノ粒子の沈殿物を回収して、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）スペクトルを測定した。
【００５８】
その結果を図７に示す。いずれのグラフも横軸は結合エネルギー（ｅＶ）であり、縦軸は強度（任意単位）である。また、図７（ａ）はＡｕ元素の４ｆ軌道の電子、（ｂ）はＣ元素の１ｓ軌道の電子、（ｃ）はＯ元素の１ｓ軌道の電子、（ｄ）はＮ元素の１ｓ軌道の電子、（ｅ）はＢ元素の１ｓ軌道の電子、（ｆ）はＳ元素の２ｐ軌道の電子、（ｇ）はＳｉ元素の２軌道の電子のＸＰＳスペクトルである。
【００５９】
図７（ｇ）より、測定基板として用いたＳｉ元素のピークが現われていないことから、基板に修飾された金ナノ粒子が存在することがわかる。図７（ａ）より、修飾された金ナノ粒子にＡｕ元素が含まれていることがわかり、金ナノ粒子の存在が確認される。図７（ｂ）より、修飾された金ナノ粒子に３種類のＣ元素が含まれていることがわかり、ペプチドのカルボニル炭素と通常の炭素、およびＰＥＧの−Ｏ−ＣＨ２−の炭素の存在が確認される。
【００６０】
図７（ｃ）より、修飾された金ナノ粒子に２種類のＯ元素が含まれていることがわかり、ペプチドのカルボニル酸素とＰＥＧの酸素元素の存在が確認される。図７（ｄ）より、修飾された金ナノ粒子にＮ元素が含まれていることがわかり、ペプチドのアミド結合の窒素の存在が確認される。図７（ｅ）より、修飾された金ナノ粒子にＢ元素が含まれていることがわかり、ＢＳＨの存在が確認される。図７（ｆ）より、修飾された金ナノ粒子にＳ元素が含まれていることがわかり、そのピーク位置より、Ａｕ−Ｓ結合の存在が確認される。
【００６１】
次に、修飾された金ナノ粒子の元素組成を確認するための試験を行った。実験方法はまず、金ナノ粒子水溶液とＢＳＨ水溶液とサンプルＰ１水溶液を混ぜ合わせ、最終濃度として、金ナノ粒子１．９ｎＭ、ＢＳＨ４０５μＭ、サンプルＰ１が４５μＭの水溶液とした。水溶液中のこの粒子を遠心分離によって沈殿させ、余剰の原料を取り除くため、上澄み液を除去した後、蒸留水で再分散させる操作を２回繰り返した。最後にもう一度遠心分離を行って沈殿させ、上澄み液を除去することで、修飾された金ナノ粒子の沈殿物を回収して、エネルギー分散Ｘ線（ＥＤＸ）スペクトルを測定した。
【００６２】
その結果を図８に示す。図８（ａ）は、明視野画像である。図８（ｂ）は、修飾された金ナノ粒子１個の明視野画像である。図８（ｃ）は、図８（ｂ）の金元素画像である。同様に、図８（ｄ）は、図８（ｂ）のホウ素元素画像であり、図８（ｅ）は酸素元素画像であり、図８（ｆ）は、硫黄元素画像であり、図８（ｇ）は、窒素元素画像であり、図８（ｈ）は、炭素元素画像である。図８（ｃ）から図８（ｈ）までの写真には、図８（ｂ）と同じ位置に、ぼんやりとした像が確認できる。
【００６３】
図８（ａ）の明視野画像では、複合体と複合体の間に隙間があることがわかり、サンプルＰ１が金ナノ粒子に表面修飾され、複合体間の接触が防がれていることがわかる。また、複合体の元素成分である金元素（図８（ｃ））、ホウ素元素（図８（ｄ））、酸素元素（図８（ｅ））、硫黄元素（図８（ｆ））、窒素元素（図８（ｇ））、炭素元素（図８（ｈ））がそれぞれ確認された。
【００６４】
次に、この修飾された金ナノ粒子のＢＳＨおよび各サンプルペプチドの割合を変えたとき、および凝集阻害剤のＰＥＧの鎖長を変えたときの複合体の凝集状態を調べた。金ナノ粒子の５２５ｎｍの吸光度を測定した。
【００６５】
その結果を図９に示す。図９は横軸がサンプルを表し、縦軸は吸光度（無単位）を示す。横軸では、金ナノ粒子単体（「ＡｕＮＰ」と記した。）、各サンプルペプチドとＢＳＨの比率が、９：１、７：３、５：５、３：７、１：９のグループが示されている。また、各グループにおいて、サンプル４から８、そして１の順でＰＥＧの鎖長が長くなる。なお、各グループ毎に各サンプルペプチドをＰ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ１を単に「４５６７８１」と矢印で示した。
【００６６】
各サンプルペプチドとＢＳＨの割合のいずれにおいても、凝集阻害剤であるＰＥＧの鎖長が長くなると、吸光度が高くなり、凝集が防がれることがわかった。また、各サンプルペプチドとＢＳＨの割合において、各サンプルペプチドの割合が増えると、凝集が防がれることもわかった。
【００６７】
ＰＥＧの鎖長は、１８以上（サンプルＰ７）で最も好ましく複合体の凝集を防ぐことがわかった。また、サンプルＰ１（Ｓｐ２８−Ｔａｔ−ＳＨ）では、サンプルペプチドＰ１：ＢＳＨ＝７：３以上で最も好ましく複合体の凝集を防ぐことがわかり、サンプルＰ７（Ｓｐ１８−Ｔａｔ−ＳＨ）では、サンプルペプチドＰ７：ＢＳＨ＝７：３以上で、サンプルＰ８（Ｓｐ２４−Ｔａｔ−ＳＨ）では、サンプルペプチドＰ１：ＢＳＨ＝５：５以上で最も好ましく複合体の凝集を防ぐことがわかる。なお、ここで「以上」とは、サンプルペプチドの割合が高いという意味である。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明に係るホウ素含有化合物は、ホウ素中性子捕捉療法の際に、１０Ｂを腫瘍細胞内に運搬する薬剤として好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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