(57)【要約】【課題】異なるドナーに由来するＮＫ細胞を増幅しプールする。【解決手段】本発明は、細胞治療分野、特にＮＫ細胞を介した治療に関する。本発明は、エキソビボ細胞（好ましくはＮＫ細胞）の集団を、少なくとも２つの臍帯血ユニット（ＵＣＢユニット）又は上記細胞を含有するその分画から、上記少なくとも２つのＵＣＢユニットをプールして細胞の集団を作製することにより、作製する方法に関する。本発明は、治療用途のため（好ましくはがん及び慢性感染症の治療のため）の成分としての、本発明に係るプロセスにより入手可能又は入手された、上記細胞（好ましくはＮＫ細胞）の用途に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）少なくともｎ個のＵＣＢユニット、又はＮＫ細胞を含有する前記ＵＣＢユニットの分画からＮＫ細胞を含む細胞の集団を作製するステップであって、
（ｉ）ｎ≧２である、少なくともｎ個の臍帯血ユニット（ＵＣＢユニット）、又はＮＫ細胞を含有する前記ＵＣＢユニットの分画を提供することと、
（ｉｉ）前記少なくともｎ個のＵＣＢユニット、又は前記分画をプールして、細胞の集団を作製することとを含む、ステップと、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた前記細胞の集団に含まれるＮＫ細胞を適切な培地で増殖及び活性化して、増殖された活性化ＮＫ細胞の集団を作製するステップと、
（Ｃ）前記増殖された活性化ＮＫ細胞を回収するステップとを含む、
増殖された活性化ＮＫ細胞の集団を作製する方法であって、
前記方法は、ステップ（Ａ）において、（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）で得られた前記細胞の集団からＴ細胞を枯渇させること、又は、前記ＵＣＢユニットをプールする前記（ｉｉ）の前に、前記ｎ個のＵＣＢユニットのそれぞれに含有されるＴ細胞を枯渇させることを含み、
プールされた際の前記ｎ個のＵＣＢユニットが、主要ＨＬＡクラスＩ群遺伝子型について同一パターンを呈し、
前記主要ＨＬＡクラスＩ群が、ＫＩＲ３ＤＬ２によって認識されるＨＬＡ  Ａ３／Ａ１１；ＫＩＲ３ＤＬ１によって認識されるＨＬＡ  Ｂｗ４；ＫＩＲ２ＤＬ２／３によって認識されるＨＬＡ  Ｃ１群；及びＫＩＲ２ＤＬ１によって認識されるＨＬＡ  Ｃ２群からなる群から選択され、
前記ステップ（Ｂ）において前記ＮＫ細胞を増殖及び活性化するための前記適切な培地が、補助細胞を含む、方法。
【請求項２】
前記ステップ（Ａ）において、前記ｎ個のＵＣＢユニットの各々は、前記ＵＣＢユニットをプールする前記（ｉｉ）の前にＴ細胞が枯渇させられている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記補助細胞と増殖及び活性化されるＮＫ細胞は、ＨＬＡ−ＫＩＲ不一致である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記補助細胞は、照射された細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記補助細胞は不死化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｎ個のＵＣＢユニットの各々又は前記ＵＣＢユニットのプールは、赤血球が枯渇されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ（Ａ）において使用される前記ＵＣＢユニットは、凍結保存されたＵＣＢユニットから解凍されたＵＣＢユニットである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップ（Ａ）は、
ｉ）ｎ≧２である少なくともｎ個のＵＣＢユニット又はＮＫ細胞を含有する前記ＵＣＢユニットの分画を提供することであって、前記少なくともｎ個のＵＣＢユニットが、主要ＨＬＡクラスＩ群遺伝子型について同一パターンを呈する、提供することと、
ｉｉ）任意で、各ＵＣＢユニットの赤血球を枯渇させることと、
ｉｉｉ）任意で、ｉ）又はｉｉ）で得られた細胞の集団を、ステップｉｖ）の前に、凍結、液体窒素中で維持、及び解凍することと、
ｉｖ）各ＵＣＢユニットに含有されるＴ細胞を枯渇させることと、
ｖ）ステップｉ）〜ｉｖ）のＵＣＢユニット中で得られたｎ個のＵＣＢユニットの細胞、又はＮＫ細胞を含有する前記ＵＣＢユニットの分画をプールして、プールされたＮＫ細胞の集団を作製することと、を含み、
前記ステップ（Ｂ）は、
前記プールに含有されるＮＫ細胞を、補助細胞を含む適切な培地中に接触させることにより、ステップｉ）〜ｖ）で得られたプールされたＮＫ細胞を増殖及び活性化して、前記プールされ、増殖され、活性化されたＮＫ細胞の集団を作製することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ（Ａ）は、
ｉ）ｎ≧２である少なくともｎ個のＵＣＢユニット又はＮＫ細胞を含有する前記ＵＣＢユニットの分画を提供することであって、前記少なくともｎ個のＵＣＢユニットが、主要ＨＬＡクラスＩ群遺伝子型について同一パターンを呈する、提供することと、
ｉｉ）任意で、各ＵＣＢユニットの赤血球を枯渇させることと、
ｉｉｉ）任意で、ｉ）又はｉｉ）で得られた細胞の集団を、ステップｉｖ）の前に、凍結、液体窒素中で維持、及び解凍することと、
ｉｖ）前記ステップｉ）〜ｉｉｉ）のＵＣＢユニットで得られたｎ個のＵＣＢユニットの細胞、又はＮＫ細胞を含有する前記ＵＣＢユニットの分画をプールして、プールされたＮＫ細胞の集団を作製することと、
ｖ）ステップｉｖ）の後に得られたプールされたＮＫ細胞に含まれるＴ細胞を枯渇させることとを含み、
前記ステップ（Ｂ）は、
前記プール中に含有されるＮＫ細胞を、補助細胞を含む適切な培地中に接触させることにより、ステップｉ）〜ｖ）で得られた前記プールされたＮＫ細胞を増殖し、任意で活性化して、プールされ、増殖され、任意で活性化されたＮＫ細胞の集団を作製することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記適切な培地が、少なくとも１つの適切なＮＫ活性化因子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
プールされ増殖された活性化ＮＫ細胞の少なくとも２つの異なる製造ロットを、ＵＣＢユニットから作製する方法であって、増殖及び活性化された製造ロットの各集団は、阻害性ＫＩＲであるＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ３ＤＬ２からなる群より選択される主要阻害性ＫＩＲの１つについての異なる非発現を示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞治療分野、特にＮＫ細胞を介した治療に関する。本発明は、エキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）細胞の集団（好ましくはＮＫ細胞の集団）を、少なくとも２つの臍帯血ユニット（ＵＣＢユニット）又は上記細胞の集団を含有するその分画から、上記少なくとも２つのＵＣＢユニットをプールして上記細胞の集団を作製することにより、作製する方法に関する。本発明は、治療用途のための（好ましくはがん及び慢性感染症の治療のための）組成物としての、本発明に係るプロセスにより入手可能又は入手された上記細胞（好ましくはＮＫ細胞）の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は自然免疫系の基本成分である。ＮＫ細胞は、腫瘍細胞、及びウイルス又は細菌に感染した細胞を認識し破壊する能力がある（非特許文献１）。過去２０年に亘るＮＫ細胞レポーター及びそれらのリガンドの同定及び特徴付けによって、腫瘍細胞によるＮＫ細胞活性化の分子メカニズムが解明された。抑制性受容体の発見は、その先駆的な研究によってＮＫ細胞が主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子を欠損した腫瘍細胞を殺傷することを示したＫａｒｒｅによって提唱された「ミッシング・セルフ（ｍｉｓｓｉｎｇ  ｓｅｌｆ）」仮説を裏付けた。抑制性受容体はＭＨＣクラスＩ分子を認識する一方、活性化受容体は種々様々なリガンドを認識する（非特許文献２）。
【０００３】
ＮＫ細胞は、最小のＧｖＨ（移植片対宿主）効果及びＨｖＧ（宿主対移植片）効果を伴う移植片対白血病（ＧｖＬ）効果の原因であり、ＮＫ細胞が関与する免疫療法の開発に関心が向けられている。いくつかの研究室から得られたデータは、ＮＫ細胞のアロ反応性の利用が、ＮＫ細胞供給源とは無関係に、大きな利点となり得ることを示唆している。不適合移植はＮＫ細胞によって仲介されるアロ反応性のトリガーとなり、これは「非自己認識（ｍｉｓｓｉｎｇ  ｓｅｌｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）」に基づいている。ドナー対レシピエントのＮＫ細胞のアロ反応は、ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子群、ＨＬＡ−Ｂｗ４群及び／又はＨＬＡ−Ａ３／１１が不一致である個人間で発生する。移植片対宿主方向ＫＩＲリガンド不一致ではなかった２０組のドナー−レシピエントペアにおいて、ドナーアロ反応性ＮＫクローンが見出されなかったことから、ＫＩＲリガンド不一致はＮＫ細胞のアロ反応性に必須である。
【０００４】
ＮＫ細胞の別の興味深い点は、たとえＮＫ細胞が主にそれらの抑制性受容体で自己同一性分子（ｓｅｌｆ−ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（ＨＬＡ分子）も認識しても、ＮＫ細胞が、活性化シグナルと阻害性シグナルの複合的平衡を介して活性化され、感染細胞、異常細胞又は腫瘍性細胞によってのみ発現される活性化シグナルを、これらの細胞を殺傷するために必要とすることである。更に、ＮＫ細胞のみを用いた場合、ドナー及び患者は全く同じ主要ＨＬＡ対立遺伝子を発現する必要がない（例えば、全臍帯血（ＵＣＢ）移植において、ＨＬＡ一致が＞４／６）ため、ドナー選択がより容易となる。対照的に、レシピエントが一致したＨＬＡを発現していない場合（阻害性シグナルの欠如＝ｉＫＩＲ−ＨＬＡ不一致）、抑制性受容体を発現するＮＫは、ＧｖＨＤをもたらすことなく、より良好な腫瘍殺傷を達成する。
【０００５】
ＮＫ細胞が天然の細胞傷害能を有していたとしても、それらの細胞障害活性は、様々な活性化メカニズムによってインビトロで改善することができ、これらのメカニズムの大部分は、ＮＫ細胞を（可変の増幅率で）増幅し、より治療効果の高い細胞をより効率的にもたらすことも可能である。
【０００６】
ＮＫ細胞を増幅／活性化する良い方法を発見することは、これらの細胞の治療ポテンシャル（量及び作用強度）を向上させるために重要である。
【０００７】
インビトロにおける活性化プロトコルには、末梢血単核球、腫瘍性細胞又は腫瘍性細胞株等の補助細胞の有無にかかわらず、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ（．．．）等のサイトカイン及び増殖因子の使用が含まれる（Ｍ．Ｖｉｌｌａｌｂａ  Ｇｏｎｚａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．による特許文献１を参照）。特定のｉＫＩＲ−ＨＬＡ不一致（４つの主要ｉＫＩＲ−ＨＬＡ不一致：ＨＬＡ  Ａ３／Ａ１１；ＨＬＡ  Ｂｗ４；ＨＬＡ  Ｃ１；ＨＬＡ  Ｃ２及び関連ｉＫＩＲ受容体）を示す補助細胞の使用。
【０００８】
臍帯血（ＵＣＢ）は、ＮＫ細胞の良好な供給源であり、ＮＫ細胞の割合がより高く、インビボ発現／活性化が良好であることが示されている（Ｍ．Ｖｉｌｌａｌｂａ  Ｇｏｎｚａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．による特許文献２を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００９／１４１７２９号公報
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２０１２／１４６７０２号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｌａｎｉｅｒ  ＬＬ，２００８；Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４９５−５０２
【非特許文献２】Ｐ．Ａ．Ｍａｔｈｅｗ，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  Ｔｈｅｒ，Ｖｏｌｕｍｅ  ３，Ｉｓｓｕｅ  ７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、１ＵＣＢユニットに含有されるＮＫ細胞を良好な増幅率で増幅及び活性化することが可能ではあるものの、利用可能であり、純度が高く、高い発現率及び活性化状態を有し、ＮＫ細胞の細胞障害活性を示す臨床治療のための細胞産物（特にＮＫ細胞産物）が提供されることが望まれている。
【００１２】
更に、上記方法は、少なくとも１人より多い（好ましくは５０人、より好ましくは約１００人の）患者を治療することを見込んで、同一のバッチ（製造ロット）において、大量の細胞（特に活性化ＮＫ細胞）の生産を可能とすることが望ましく、治療薬は可能な限り可変性が少ないことが必要であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この目的を達成するために、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則（ｃＧＭＰ）、規制当局の商業規模の生産・化学、製造及び管理の基準に従った細胞生産プロセスで、同一の生産ロットで、大量の、特定の、濃縮された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）細胞集団を入手するための能力を与える方法を提供することが望ましいであろう。
【００１４】
これが本発明の目的である。
初めて、そして驚くべき方法で、本出願人は、異なるドナーに由来するＮＫ細胞を増幅しプールすることに成功した。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１（図１（Ａ）〜図１（Ｃ））は、本発明の製造プロセスの一例を示す模式図である。
【図２】図２は、ＣＤ３枯渇後又はＣＤ３枯渇無しで得られたＮＫ増殖を示す図である。
【図３】図３は、ＣＤ３枯渇後又はＣＤ３枯渇無しで得られたＮＫ増殖を示す図である。
【図４】図４は、プールされたＣＤ３枯渇ＵＣＢユニットから得られたＮＫ増殖を示す図である。
【図５】図５は、５つのプールされたＣＤ３枯渇ＵＣＢユニットから得られたＮＫ増殖を示す図である。
【図６】図６は、事前のＣＤ３枯渇無しでプールされたＵＣＢユニットから得られたＮＫ増殖を示す図である。
【図７】図７は、ＣＤ３非枯渇ＵＣＢを用いた９日間の培養の後に、プールされたＵＣＢユニットから得られたＮＫ増殖を示す図である。
【図８】図８は、ＰＬＨ補助細胞を用いて増幅され、２つのＫＩＲ−ＨＬＡ一致ＵＣＢを用いて得られたＮＫ増殖の増幅率を示す図である。
【図９】図９は、ＰＬＨ補助細胞を用いて増幅され、２つのＫＩＲ−ＨＬＡ不一致ＵＣＢを用いて得られたＮＫ増殖の増幅率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
第一の実施形態によれば、本発明は、下記工程を含む、細胞の集団を作製する方法に関する：
（ａ）少なくともｎ個（ここで、ｎ≧２、好ましくは２＜ｎ≦１００である）の、臍帯血ユニット（ＵＣＢユニット）又は上記細胞を含有するその分画、を準備する工程；及び
（ｂ）上記少なくともｎ個のＵＣＢユニット又は上記細胞を含有するその分画をプールして、細胞の集団を作製する工程。
より好ましい実施形態では３≦ｎ≦５０であり、３≦ｎ≦２５が最も好ましい。
【００１７】
本発明との関連で、「細胞を含有するＵＣＢユニットの分画」とは、作製されることが望まれる細胞の集団又は当該細胞の集団の一部を少なくとも含有するＵＣＢユニットの分画を示すことが意図される。
【００１８】
好ましい様式では、本発明は、
（ｃ）工程（ｂ）で得られたプールに含まれるＴ細胞を枯渇させる工程、
を更に含む、本発明に係る方法に関する。
【００１９】
別の好ましい実施形態によれば、本発明は、プール工程（ｂ）の前に、ｎ個のＵＣＢユニットのそれぞれに含有されるＴ細胞を枯渇させる工程を含む本発明に係る方法に関する。
【００２０】
本発明は更に、工程（ｂ）でプールされたｎ個のＵＣＢユニットが主要ＨＬＡクラスＩ群遺伝子型について同一パターンを示す本発明に係る方法を提供する。
【００２１】
本明細書において、「主要ＨＬＡクラスＩ群遺伝子型について同一パターンを示す」とは、そのＨＬＡ分子の群が同一の阻害性ＫＩＲによって認識される、又は、好ましくは、プールされたｎ個のＵＣＢに存在する各ＨＬＡ群がＮＫ細胞による同一の主要阻害性ＫＩＲによって認識される、ＵＣＢユニットを示すことが意図される。
【００２２】
別の好ましい実施形態において、本発明は、プールされたｎ個のＵＣＢ中に存在する各ＵＣＢが同一の阻害性ＫＩＲによって認識されるＨＬＡ群に属する、本発明に係る方法に関する。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「ＫＩＲ」又は「阻害性ＫＩＲ」という用語は、当該技術分野における一般的な意味を有し、限定はされないが、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ３ＤＬ２が挙げられる。
【００２４】
主要な（ｍａｉｎ／ｍａｊｏｒ）阻害性ＫＩＲは、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ３ＤＬ２である。
【００２５】
ＫＩＲ２ＤＬ１は、ＨＬＡ−Ｃ  ｗ４及び関連する「２群」対立遺伝子を認識する。ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３は、ＨＬＡ−Ｃｗ３及び関連する「１群」対立遺伝子を認識する。ＫＩＲ３ＤＬ１は、Ｂｗ４モチーフを有するＨＬＡ−Ｂアロタイプの受容体である。最後に、ＫＩＲ３ＤＬ２は、ＨＬＡ−Ａ３／１１の受容体である。
【００２６】
別の好ましい実施形態において、本発明は、主要ＨＬＡクラスＩ群が、ＫＩＲ３ＤＬ２によって認識されるＨＬＡ  Ａ３／Ａ１１、ＫＩＲ３ＤＬ１によって認識されるＨＬＡ  Ｂｗ４、ＫＩＲ２ＤＬ２／３によって認識されるＨＬＡ  Ｃ１群、及びＫＩＲ２ＤＬ１によって認識されるＨＬＡ  Ｃ２群からなる群から選択される、本発明に係る方法に関する。
【００２７】
ＵＣＢユニットの好ましい供給源はヒトＵＣＢユニットである。
【００２８】
特に好ましい実施形態では、上記供給源は、凍結ヒトＵＣＢの供給源である。
【００２９】
別の態様において、本発明は更に、ｎ個のＵＣＢユニット中に含有される細胞から、細胞の増殖された集団を作製する方法を提供し、当該方法は下記工程を含む：
（Ａ）本発明に係る細胞の集団を作製する方法によって、少なくともｎ個のＵＣＢユニット又は上記細胞を含有するその分画から、細胞の集団を作製する工程であって、所望により、工程（Ａ）の前に、各ＵＣＢユニットを上記細胞について予備的且つ別々に増殖させてもよい、上記工程；及び
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞の集団から得られた所望の細胞を適切な培地中で増殖させて、所望の細胞の増殖された集団を作製する工程。
【００３０】
本発明のｎ個のＵＣＢユニット中に含有される細胞から細胞の増殖された集団を作製する方法において、工程（Ａ）におけるプール工程（ｂ）の前に各ＵＣＢユニットが細胞について予備的且つ別々に増殖されている場合には、工程（Ｂ）は任意の工程とすることができる。
【００３１】
別の好ましい態様では、本発明は更に、ｎ個のＵＣＢユニット中に含有される所望の細胞から分化細胞の集団を作製する方法を提供し、当該方法は下記工程を含む：
（Ａ）本発明に係る細胞の集団を作製する方法によって、上記ｎ個のＵＣＢユニット又は上記所望の細胞を含有するその分画から、細胞の集団を作製する工程であって、所望により、工程（Ａ）の前に、各ＵＣＢユニットを細胞について予備的且つ別々に分化させてもよい、上記工程；及び
（Ｂ）上記工程で得られた所望の細胞を適切な培地中で分化させて、上記分化細胞の集団を作製する工程。
【００３２】
ｎ個のＵＣＢユニット中に含有される細胞から分化細胞の集団を作製する本発明の方法では、工程（Ａ）におけるプール工程（ｂ）の前に各ＵＣＢユニットが細胞について予備的且つ別々に増殖されている場合には、分化工程（Ｂ）は任意の工程とすることができる。
【００３３】
別の好ましい態様では、本発明は更に、活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む細胞の集団を作製する方法を提供し、当該方法は下記工程を含む：
（Ａ）本発明に係る細胞の集団を作製する方法によって、少なくともｎ個のＵＣＢユニット又はＮＫ細胞を含有するその分画から、活性化ＮＫ細胞を含む細胞の集団を作製する工程であって、所望により、工程（Ａ）の前に、各ＵＣＢユニットをＮＫ細胞について予備的且つ別々に増殖してもよい、上記工程；
（Ｂ）工程（Ａ）で得られたＮＫ細胞を適切な培地中で活性化して、活性化ＮＫ細胞を含む細胞の集団を作製する工程；
（Ｃ）所望により、活性化ＮＫ細胞を上記集団から回収する工程。
【００３４】
別の好ましい態様では、本発明は更に、増殖された活性化ＮＫ細胞の集団を作製する方法を提供し、当該方法は下記工程を含む：
（Ａ）本発明に係る細胞の集団を作製する方法によって、少なくともｎ個のＵＣＢユニット又はＮＫ細胞を含有するその分画から、ＮＫ細胞を含む細胞の集団を作製する工程であって、所望により、工程（Ａ）の前に、各ＵＣＢユニットをＮＫ細胞について予備的且つ別々に増殖及び活性化してもよい、上記工程；
（Ｂ）工程（Ａ）で得られたＮＫ細胞を適切な培地中で増殖及び活性化して、増殖された活性化ＮＫ細胞の集団を作製する工程；及び
（Ｃ）所望により、上記増殖された活性化ＮＫ細胞を回収する工程。
【００３５】
本発明は更に、ｎ個のＵＣＢユニットから増殖された（所望により活性化された）ＮＫ細胞の集団を作製する方法を含み、当該方法は下記工程を含む：
（ｉ）少なくともｎ個（ここで、ｎ≧２、好ましくは２＜ｎ≦１００又は３≦ｎ≦５０、より好ましくは３≦ｎ≦２５）のＵＣＢユニット又はＮＫ細胞を含有するその分画を準備する工程であって、上記少なくともｎ個のＵＣＢユニットが、主要ＨＬＡクラスＩ群遺伝子型について同一パターンを示す（好ましくは、プールされたｎ個のＵＣＢに存在する各ＨＬＡ群が同一の主要阻害性ＫＩＲによってＮＫ細胞により認識される）工程；
（ｉｉ）好ましくは密度勾配分離により、より好ましくはＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）密度勾配分離により、Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ（ヒドロキシエチルデンプン；ＨＥＳ）法により、ＰｒｅｐａＣｙｔｅ（登録商標）ＣＢ装置の使用により、又は凍結・解凍工程により、所望により各ＵＣＢユニットの赤血球（ｒｅｄ  ｃｅｌｌ／ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）を枯渇させる工程；
（ｉｉｉ）所望により、工程（ｉ）又は工程（ｉｉ）で得られた細胞の集団を、工程（ｉｖ）の前に、凍結、液体窒素中で維持、及び解凍する工程；
（ｉｖ）各ＵＣＢユニット中に含有されるＴ細胞を枯渇させる工程；
（ｖ）上記工程で得られたＵＣＢユニットのそれぞれについて、１ＵＣＢユニット又はＮＫ細胞を含有するその分画に含有されるＮＫ細胞を適切な培地中に、好ましくは３日間〜２８日間、接触させることにより、各ＵＣＢユニットに含有されるＮＫ細胞を別々に増殖（及び所望により活性化）して、各ＵＣＢユニット中の上記増殖された集団（及び所望により、活性化ＮＫ細胞）を作製する工程；
（ｖｉ）上記工程のＵＣＢユニット群中、又はＮＫ細胞を含有するその分画中に得られたｎ個のＵＣＢユニットからの細胞群をプールして、プールされ、増殖され、所望により活性化されたＮＫ細胞の集団を作製する工程。
【００３６】
本発明はまた、ｎ個のＵＣＢユニットから、増殖され、所望により活性化されたＮＫ細胞の集団を作製する方法を含み、当該方法は下記工程を含む：
（ｉ）少なくともｎ個（ここで、ｎ≧２、好ましくは２≦ｎ≦１００又は３≦ｎ≦５０、より好ましくは３≦ｎ≦２５）のＵＣＢユニット又はＮＫ細胞を含有するその分画を準備する工程であって、上記少なくともｎ個のＵＣＢユニットが、主要ＨＬＡクラスＩ群遺伝子型について同一パターンを示す（好ましくは、プールされたｎ個のＵＣＢ中に存在する各ＨＬＡ群が同一の主要阻害性ＫＩＲによってＮＫ細胞により認識される）工程；
（ｉｉ）好ましくは密度勾配分離により、より好ましくはＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）密度勾配分離（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ型（登録商標））により、Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ（ヒドロキシエチルデンプン；ＨＥＳ）法により、ＰｒｅｐａＣｙｔｅ（登録商標）ＣＢ装置の使用により、又は凍結・解凍工程により、所望により各ＵＣＢユニットの赤血球を枯渇させる工程；
（ｉｉｉ）所望により、工程（ｉ）又は工程（ｉｉ）で得られた細胞の集団を、工程（ｉｖ）の前に、凍結、液体窒素中で維持、及び解凍する工程；
（ｉｖ）上記工程で得られたＵＣＢユニット群のそれぞれについて、１ＵＣＢユニット又はＮＫ細胞を含有するその分画に含有されるＮＫ細胞を適切な培地中に、好ましくは３日間〜２８日間、接触させることにより、各ＵＣＢユニットに含有されるＮＫ細胞を別々に増殖（及び所望により活性化）して、各ＵＣＢユニットについて、上記増殖された集団（及び所望により、活性化ＮＫ細胞）を作製する工程；
（ｖ）上記工程のＵＣＢユニット群中、又はＮＫ細胞を含有するその分画中に得られたｎ個のＵＣＢユニットからの細胞群をプールして、プールされ、増殖され、所望により活性化されたＮＫ細胞の集団を作製する工程；及び
（ｖｉ）所望により、工程（ｖ）の後に、得られたプールされたＮＫ細胞に含まれるＴ細胞を枯渇させる工程。
【００３７】
好ましい実施形態において、工程（ｖ）後に得られたプールされたＮＫ細胞に含まれるＴ細胞を枯渇させる工程（ｖｉ）は、所望により実施される工程ではなく、特許請求された方法の一部である。
【００３８】
別の好ましい実施形態において、工程（ｖ）後に得られたプールされたＮＫ細胞に含まれるＴ細胞を枯渇させる工程（ｖｉ）の後には、当該プロセスの最後に残っている非活性化ＮＫ細胞を除去することがなお望ましいかどうかにかかわらず、ＣＤ５６＋バイオマーカーを発現するＮＫ細胞を選択する工程が続く。
【００３９】
本発明はまた、ｎ個のＵＣＢユニットから、増殖（所望により活性化）されたＮＫ細胞の集団を作製する方法を含み、当該方法は下記工程を含む：
（ｉ）少なくともｎ個（ここで、ｎ≧２、好ましくは２＜ｎ≦１００又は３≦ｎ≦５０、より好ましくは３≦ｎ≦２５）のＵＣＢユニット又はＮＫ細胞を含有するその分画を準備する工程であって、上記少なくともｎ個のＵＣＢユニットが、主要ＨＬＡクラスＩ群遺伝子型について同一パターンを示す（好ましくは、プールされたｎ個のＵＣＢ中に存在する各ＨＬＡ群が同一の主要阻害性ＫＩＲによってＮＫ細胞により認識される）工程；
（ｉｉ）好ましくは密度勾配分離により、より好ましくはＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）密度勾配分離により、Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ（ヒドロキシエチルデンプン；ＨＥＳ）法により、ＰｒｅｐａＣｙｔｅ（登録商標）ＣＢ装置の使用により、又は凍結・解凍工程により、所望により各ＵＣＢユニットの赤血球を枯渇させる工程；
（ｉｉｉ）所望により、工程（ｉ）又は工程（ｉｉ）で得られた細胞の集団を、工程（ｉｖ）の前に、凍結、液体窒素中で維持、及び解凍する工程；
（ｉｖ）所望により又は好ましくは、各ＵＣＢユニットに含有されるＴ細胞を枯渇させる工程；
（ｖ）上記工程のＵＣＢユニット群中、又はＮＫ細胞を含有するその分画中に得られたｎ個のＵＣＢユニットからの細胞群をプールして、プールされたＮＫ細胞の集団を作製する工程；及び
（ｖｉ）プール又はＮＫ細胞を含有するその分画に含有されるＮＫ細胞を適切な培地中に、好ましくは１〜５週間、接触させることにより、上記工程で得られたプールされたＮＫ細胞を増殖（所望により活性化）して、上記プールされ、増殖され、所望により活性化されたＮＫ細胞の集団を作製する工程であって、好ましくは、当該増殖／活性化工程の全期間が９〜２８日間である場合、当該増殖工程後のＮＫ細胞の増幅率が少なくとも１００、好ましくは２００、３００又は５００である、上記工程。
【００４０】
本発明はまた、ｎ個のＵＣＢユニットから、増殖され、所望により活性化されたＮＫ細胞の集団を作製する方法を含み、当該方法は下記工程を含む：
（ｉ）少なくともｎ個（ここで、ｎ≧２、好ましくは２＜ｎ≦１００又は３≦ｎ≦５０、より好ましくは３≦ｎ≦２５）のＵＣＢユニット又はＮＫ細胞を含有するその分画を準備する工程であって、上記少なくともｎ個のＵＣＢユニットが、主要ＨＬＡクラスＩ群遺伝子型について同一パターンを示す（好ましくは、プールされたｎ個のＵＣＢ中に存在する各ＨＬＡ群が同一の主要阻害性ＫＩＲによってＮＫ細胞により認識される）工程；
（ｉｉ）好ましくは密度勾配分離により、より好ましくはＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）密度勾配分離により、Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ（ヒドロキシエチルデンプン；ＨＥＳ）法により、ＰｒｅｐａＣｙｔｅ（登録商標）ＣＢ装置の使用により、又は凍結・解凍工程により、所望により各ＵＣＢユニットの赤血球を枯渇させる工程；
（ｉｉｉ）所望により、工程（ｉ）又は工程（ｉｉ）で得られた細胞の集団を、工程（ｉｖ）の前に、凍結、液体窒素中で維持、及び解凍する工程；
（ｉｖ）上記工程のＵＣＢユニット群中、又はＮＫ細胞を含有するその分画中に得られたｎ個のＵＣＢユニットからの細胞群をプールして、プールされたＮＫ細胞の集団を作製する工程；
（ｖ）所望により又は好ましくは、工程（ｉｖ）の後に得られたプールされたＮＫ細胞に含まれるＴ細胞を枯渇させる工程；及び
（ｖｉ）プール又はＮＫ細胞を含有するその分画に含有されるＮＫ細胞を適切な培地中に、好ましくは１〜５週間、接触させることにより、上記工程で得られたプールされたＮＫ細胞を増殖し、所望により活性化して、上記プールされ、増殖され、所望により活性化されたＮＫ細胞の集団を作製する工程であって、好ましくは、当該増殖／活性化工程の全期間が９〜２８日間である場合、当該増殖工程後のＮＫ細胞の増幅率が少なくとも１００、２００、３００又は５００である、上記工程。
【００４１】
活性化／増殖されたＮＫ細胞の作製に関連する本発明に係る全ての方法は、以下のＫＩＲのうちの１つの発現欠損を有する、プールされたＵＣＢユニット由来の活性化ＮＫ細胞の作製に特に適している：ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ３ＤＬ２。従って、この場合、本発明に従って作製された上記のような、活性化／増殖されたプールされたＮＫ細胞は、対応するＫＩＲリガンドを欠損した他者に由来する細胞に対しアロ反応性となり、逆に、同一のＫＩＲリガンドを有する別の個体由来の細胞には寛容性となる。
【００４２】
従って、本発明の方法によって、本発明のＮＫ細胞を作製する方法によって得られる、プールされた活性化／増殖ＮＫ細胞の少なくとも２つ（好ましくは３つ、より好ましくは４つ）の異なる製造ロット群の集合体若しくは治療用細胞バンク；又は、上記製造ロット群の少なくとも２つ、３つ若しくは４つの分画の集合体を作製することができ、ここで、各製造ロットは主要阻害性ＫＩＲのうちの１つ（ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ３ＤＬ２阻害性ＫＩＲから成る群から選択されることが好ましい）の異なる発現欠損を示す。
【００４３】
このような、本発明のプールされた活性化／増殖されたＮＫ細胞を作製する方法によって得られる、プールされた活性化／増殖されたＮＫ細胞の、少なくとも２つ（好ましくは３つ、より好ましくは４つ）の異なる製造ロット群の集合体は、本発明に含まれる。
【００４４】
好ましい実施形態において、上記集合体は、複数の貯蔵容器の集合体であり、主要阻害性ＫＩＲのうちの１つの特定の発現欠損を示す、本発明のＮＫ細胞を作製する方法によって得られる、プールされた活性化／増殖されたＮＫ細胞、又はその分画をそれぞれ含有する、少なくとも２つ、３つ又は４つの容器を含む。
【００４５】
本発明によれば、１人の患者を治療するために多量に必要とされる、特許請求された集合体の１製造ロット又はその分画は、治療を必要とする患者（好ましくは、移植されるプールされた活性化／増幅されたＮＫ細胞の製造ロットによって認識される、特定の主要ＫＩＲリガンドを発現しない標的細胞を示す患者）における移植に使用することができる。
【００４６】
ＵＣＢ／ＮＫ細胞又は患者標的細胞のＨＬＡ／ＫＩＲ遺伝子型同定／表現型検査は、あらゆる周知の標準法によって行われ得る。
【００４７】
好ましい実施形態において、ＮＫ細胞を増殖及び活性化するのに適した培地は、補助細胞及び／又は少なくとも１つの適切なＮＫ活性化因子を含む。
【００４８】
好ましい実施形態において、補助細胞は、以下の群から選択される：
・哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞、より好ましくはＨＬＡ型（ＨＬＡ−ｔｙｐｅｄ）細胞集団由来、及び、所望により、照射細胞、特にγ線照射、Ｘ線照射又はＵＶ照射細胞、好ましくはγ線照射細胞；
・形質転換哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞であって、上記細胞において、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）リガンドをコードする１つの遺伝子の発現が阻害されている細胞。
【００４９】
好ましい実施形態において、ＨＬＡ型細胞集団由来の上記細胞は、ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８８０５２０４７、ＩＨＷ番号９０４７及びＨＯＭ−２、ＩＤ  Ｎｏ．ＨＣ１０７５０５、ＩＨＷ番号９００５の群から選択されることが好ましい、ＰＬＨ細胞株由来である。
【００５０】
好ましい実施形態において、上記補助細胞は、ＫＩＲリガンドをコードする１つの遺伝子の発現が阻害されており、ＭＨＣ−Ｉ発現の阻害若しくは減少、及び／又はＥＲＫ５遺伝子の発現の阻害を更に含む、形質転換された哺乳類細胞である。このような補助細胞を作製するための方法は、当業者に周知である（参照によって本明細書に援用される、２０１２年１１月１日に公開されたＷＯ２０１２／１４６７０２を参照）。
【００５１】
ＭＨＣ−Ｉ発現の阻害又は減少は、上記補助細胞であり、当該技術分野において周知のあらゆる方法で実行され得る。例えば、上記方法は、国際特許出願公開公報ＷＯ２００９／１４１７２９Ａ２に例示されている。典型的には、上記ＭＨＣ−Ｉ発現の阻害又は減少は、β−２−ミクログロブリン遺伝子発現の阻害剤を使用することにより実行される。
【００５２】
上記に示されるように、上記補助細胞は、陰性のＥＲＫ５表現型を示している。「陰性ＥＲＫ５表現型を示す細胞」という用語は、その発現レベルと比較して、細胞内、具体的にはミトコンドリア画分内、に存在するＥＲ５タンパク質の発現レベル又は量において、少なくとも１０％、好ましくは２５％〜９０％、例えば２５％〜５０％又は５０％〜７５％の減少を有する、細胞を意味する。
【００５３】
ＥＲＫ５遺伝子発現の阻害又は減少は、上記補助細胞であり、当該技術分野において周知のあらゆる方法で実行され得る。例えば、上記方法は、国際特許出願公開公報ＷＯ２００９／１４１７２９Ａ２に例示されている。典型的には、上記ＥＲ５発現の阻害又は減少は、ＥＲ５遺伝子発現の阻害剤を使用することにより実行される。
【００５４】
好ましい実施形態において、上記補助細胞は、好ましくはエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換によって、不死化されている。
【００５５】
その結果、上記補助細胞は、培養下で無制限に増殖する細胞株を構成する。細胞を不死化させる方法は、当該技術分野において周知であり、特に、ヒトリンパ球を不死化させるための「エプスタイン・バーウイルス」（「ＥＢＶ」）法が使用される。
【００５６】
好ましい実施形態において、適切な培地は、適切なＮＫ活性化因子として、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−７、及び／若しくはＩＬ−１２及び／若しくはＩＬ−１５、又はα−若しくはβ−インターフェロン、好ましくはヒト組換え活性化因子を含む。
【００５７】
ＮＫ細胞を活性化するために補助細胞を使用しない場合、活性化は、ＮＫ細胞活性化因子を含有する以下の可能な培地を用いて行うことができる：
１．ＩＬ−２  ５ｎｇ／ｍｌ＋／−抗ＣＤ３  ５０ｎｇ／ｍｌ＋ＩＬ−７  １０ｎｇ／ｍｌ＋ＩＬ−１２  １０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは７日後；
２．ｈＩＬ−１５  ３０ｎｇ／ｍｌ＋ｈＩＬ−２１  ３０ｎｇ／ｍｌ（ペプロテック社（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ））＋ヒドロコルチゾン１０−６Ｍ＞ＣＤ３４＋２１日間の培養、例えば、ＮＫ細胞の成熟／活性化のための２１日間の培養；
３．ＩＬ−２  ５００Ｕ／ｍｌ＋ビーズＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）及びＣＤ２；
４．ＣＤ３４＋増幅からの、バイオリアクター内での、１４日目〜４２日目のＮＫ細胞の増殖のための、サイトカインＩＬ−７、ＳＣＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５（強濃度）及びＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６（低濃度）の混合物；０日目〜９日目＝低分子ヘパリン＋サイトカイン類（強濃度）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ−７及び（低濃度）ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６（ＣＤ３４＋増幅）の混合物；Ｊ９〜１４＝低分子ヘパリン＋サイトカイン類（強濃度）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−１５、ＩＬ−７及びＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６（低濃度、ＮＫ分化）の混合物。（ＩＬ−１８及びＩＦＮαも使用できる）。
【００５８】
補助細胞存在下での活性化及び増殖：
１．ＩＬ−２  ５００Ｕ／ｍｌ＋自家／同種間の被照射支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌｓ）ＰＢＭＣ（２５Ｇｙ）  ｏｕ  ＥＢＶ−ＬＣＬ（１００Ｇｙ）、支持細胞：ＮＫの比率２０：１（又は、ＵＣＢユニットのスケールアップのために１０：１）（０日目）
２．ＩＬ−２  ２００Ｕ／ｍｌ＋マイトマイシン（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ）処理された支持細胞（ＰＢＭＣ＋Ｋ５６２  比率１：１）  支持細胞：ＮＫの比率８：１
３．ＩＬ−２  ５００Ｕ／ｍｌ＋同種間被照射支持細胞ＰＢＭＣ（５０００ｒａｄ）（０日目ａｂｄ７日目）  支持細胞：全体の比率１０：１＋ＯＫＴ３（抗ＣＤ３）３０ｎｇ／ｍｌ（培地中、又は支持細胞とプレインキュベート）
４．ＩＬ−２  ５００Ｕ／ｍｌ＋被照射支持細胞Ｊｕｒｋａｔ−ＫＬｌ（３００Ｇｙ）（０日目）
５．ＩＬ−２  ５００Ｕ／ｍｌ＋自家被照射支持細胞ＰＢＭＣ（２０００ｒａｄ、支持細胞細胞のＴリンパ球の刺激開始において、＋ＯＫＴ３  １０ｎｇ／ｍｌ（枯渇  ｄｉｎ  非被照射画分））  支持細胞：ＮＫの比率５：１（Ｊ０）
６．ＩＬ−２＋ＩＬ−１５＋支持細胞  被照射支持細胞Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ（１００Ｇｙ）
【００５９】
別の好ましい実施形態では、本発明の方法において、Ｔ細胞を枯渇させる工程は、以下の工程を含む方法によって実行される：
細胞を除去抗体と接触させる工程；及び
上記除去抗体によって検出された細胞を除去する工程。
【００６０】
除去抗体は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１４、及び抗ＣＤ２０抗体からなる群から選択される少なくとも１つの抗体であることが好ましく、好ましくは、抗ＣＤ３抗体である。
【００６１】
得られた枯渇処理された細胞の集団において、０．５％未満又は更には０．１％未満又は更には０．００１％未満が、ＣＤ３陽性細胞である。
【００６２】
別の好ましい実施形態では、本発明の方法において、各ＵＣＢユニット又はプールされたｎ個のＵＣＢユニットは、好ましくは密度勾配分離により、より好ましくはＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）密度勾配分離により、Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ（ヒドロキシエチルデンプン；ＨＥＳ）法により、ＰｒｅｐａＣｙｔｅ（登録商標）ＣＢ装置の使用により、又は凍結・解凍工程により、赤血球（ｒｅｄ  ｃｅｌｌ／ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）を枯渇される。
【００６３】
別の好ましい実施形態では、本発明の方法において、各ＵＣＢユニット又はプールされたｎ個のＵＣＢユニットは、赤血球の溶解を含む方法によって、特に、ＵＣＢユニットのそれぞれ、又はｎ個のＵＣＢユニットのプール細胞に含有される細胞を凍結及び解凍する工程を含む方法によって、赤血球を枯渇される。
【００６４】
別の好ましい実施形態では、本発明の方法において、工程（ｂ）又は工程（ｉ）で使用されるＵＣＢユニットは、凍結保存されたＵＣＢユニットから解凍されたＵＣＢユニットである。
【００６５】
別の好ましい実施形態では、本発明の方法において、工程（ｂ）又は工程（ｉ）で使用されるＵＣＢユニットは、凍結保存されたＵＣＢユニットから解凍されたＵＣＢユニットである。
【００６６】
上記方法の最後に得られる、上記プールされたＵＣＢユニット又は細胞を含有するその分画は、−７０℃以下の温度、好ましくは−８０℃以下の温度、より好ましくは液体窒素中に保存されることが好ましい。
【００６７】
別の好ましい実施形態において、本発明は、
各ＵＣＢユニットが予め、使用前に適切な培地（好ましくはＲＰＭＩ培地）中で希釈され；及び／又は
各ＵＣＢユニット若しくはプールされたｎ個のＵＣＢユニットの赤血球（ｒｅｄ−ｃｅｌｌ／  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）枯渇の後、収集した細胞を、所望によりウシ胎児血清ＡＢ型マイナス（ＦＢＳ）を含有する、適切な培地（好ましくはＲＭＰＩ培地）中、又はＸ−ＶＩＶＯ（商標）型培地（ロンザ社）、ＡＩＭ−Ｖ（商標）培地（インビトロジェン社）若しくはＣｅｌｌＧｒｏ（商標）（セル・ジェニックス社（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ））中に再懸濁し；及び／又は
赤血球枯渇ＵＣＢユニット又はプールされた赤血球枯渇ＵＣＢユニットそれぞれに由来する収集細胞が凍結保存される場合、収集細胞を白血球凍結保護物質を含む適切な培養液中で再懸濁する、
本発明の方法に関する。
【００６８】
より好ましくは、ＮＫ細胞の増殖／活性化に適した培地中に存在するＮＫ細胞と補助細胞との比率は、０．０１〜２、好ましくは０．０５〜１．０、より好ましくは０．１〜０．５である。
【００６９】
より好ましくは、ＮＫ細胞の増殖／活性化に適した培地中に存在する補助細胞、及び増殖／活性化されるＮＫ細胞は、ＨＬＡ−ＫＩＲ不一致である。
【００７０】
別の好ましい実施形態によれば、本発明は、
ＣＤ５６＋ＮＫ細胞濃縮の工程を更に含む、本発明に係るプールされ、活性化及び／又は増殖されたＮＫ細胞を作製するための方法に関する。
【００７１】
別の好ましい実施形態によれば、本発明は、増殖され、所望により活性化されたＮＫ細胞の集団の少なくとも２つの別々のプールをＵＣＢユニットから作製する方法に関し、ここで、プールされたｎ個のＵＣＢのＮＫ細胞によって認識される主要ＨＬＡクラスＩ群はプール毎に異なっており、ｎ個のＵＣＢユニット由来の、増殖され、所望により、活性化されたＮＫ細胞の集団の各プールは、本発明に係るプールされ、活性化及び／又は増殖されたＮＫ細胞を作製するための方法によって作製される。
【００７２】
より具体的には、本発明は、本発明に係るＵＣＢユニットから増殖され、所望により活性化されたＮＫ細胞の集団の少なくとも２つ、３つ、好ましくは４つの異なるプールを作製するための方法に関し、ここで、プールされたｎ個のＵＣＢのＮＫ細胞によって認識される主要ＨＬＡクラスＩ群はプール毎に異なっており、それぞれ、ＫＩＲ３ＤＬ２によって認識されるＨＬＡ  Ａ３／Ａ１１、ＫＩＲ３ＤＬ１によって認識されるＨＬＡ  Ｂｗ４、ＫＩＲ２ＤＬ２／３によって認識されるＨＬＡ  Ｃ１群及びＫＩＲ２ＤＬ２によって認識されるＨＬＡ  Ｃ２群からなる群から選択される。
【００７３】
別の実施形態によれば、本特許出願の発明は、
本発明に係る方法によって得られる細胞の集団；又は
本発明の方法によって得られる細胞の集団であって、上記「得られる」細胞の集団が少なくともｎ個（ここで、ｎ≧２、好ましくは２＜ｎ≦１００又は３≦ｎ≦５０、より好ましくは３≦ｎ≦２５）のＵＣＢユニット又はＮＫ細胞を含有するその分画に由来する細胞（好ましくはＮＫ細胞）を含み、上記ｎ個のＵＣＢユニットが主要ＨＬＡクラスＩ群遺伝子型について同一パターンを更に示すことが好ましい（好ましくは、プールされたｎ個のＵＣＢのＮＫ細胞によって認識される主要ＨＬＡクラスＩ群がプール毎に異なり、それぞれ、ＫＩＲ３ＤＬ２によって認識されるＨＬＡ  Ａ３／Ａ１１、ＫＩＲ３ＤＬ１によって認識されるＨＬＡ  Ｂｗ４、ＫＩＲ２ＤＬ２／３によって認識されるＨＬＡ  Ｃ１群及びＫＩＲ２ＤＬ２によって認識されるＨＬＡ  Ｃ２群からなる群から選択される）上記細胞の集団、に関する。
【００７４】
より好ましくは、本発明に係る方法によって得られる上記細胞の集団は、各々プールされたｎ個のＵＣＢにおいて、ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ１、及びＫＩＲ３ＤＬ２から成る群から選択されるＫＩＲのうちの１つの発現欠損を更に示す。
【００７５】
別の態様では本発明は、本発明に係る方法によって得られる又は入手可能な、プールされ、活性化及び／又は増殖された細胞（特にＮＫ細胞）の集団を含む組成物に関する。
【００７６】
また本発明は、薬剤として使用するための、本発明に係る方法によって得られる又は入手可能な、プールされ、活性化及び／又は増殖された細胞（特にＮＫ細胞）の集団を含む医薬組成物に関する。
【００７７】
また本発明は、薬剤的に許容できる担体を更に含む、本発明に係る医薬組成物に関する。
【００７８】
本明細書において、「薬剤的に許容できる担体」とは、副反応を引き起こさず、例えば、活性化合物の投与を促進する、それらの寿命及び／若しくは身体における有効性を増加させる、溶液中のそれらの溶解性を増加させる、又はそれらの保存性を向上させる、医薬組成物の一部となる、化合物又は化合物の組合せを指す。このような薬剤的に許容できる担体は周知であり、選択される活性化合物の性質及び投与様式に従って当業者によって適合される。
【００７９】
別の態様によれば、本発明は、上記貯蔵容器のそれぞれが、本発明に係る方法によって入手可能な又は得られる、ある製造ロットの細胞の集団の分画を含有する、哺乳類細胞用（好ましくはヒト細胞用）の貯蔵容器の集合体に関する。
【００８０】
本発明に係る哺乳類細胞用の上記貯蔵容器の集合体は、増殖及び／又は活性化されたＮＫ細胞を含有することが好ましい。
【００８１】
本発明に係る哺乳類細胞用の上記貯蔵容器の集合体又は本発明に係る上記組成物は、治療される患者の体重に応じて、少なくとも１０７個、好ましくは２〜１０×１０７個又は１０〜１００×１０７個、の活性化及び／又は増殖されたＮＫ細胞を含有することが好ましい。
【００８２】
本発明に係る上記貯蔵容器の集合体のそれぞれ、又は本発明に係る上記組成物は、ＮＫ細胞を含有し、ＣＤ３＋Ｔ細胞を本質的に含有しない（好ましくは０．１％未満又は０．０１％未満）ことが好ましい。
【００８３】
本発明に係る哺乳類細胞用の上記貯蔵容器の集合体又は本発明に係る上記組成物は、以下を含有することが好ましい：
マーカーＣＤ５６＋を示す、少なくとも７５％、好ましくは８５％超若しくは９０％超のＮＫ細胞；及び／又は
ＣＤ４５ＲＡｄｉｍを示す、少なくとも７５％、好ましくは８０％超のＮＫ細胞。
【００８４】
別の態様によれば、本発明は、その用途が、腫瘍細胞の増殖を抑制するための、好ましくは、がんの予防及び／若しくは治療のための、又は感染治療のための、本発明に係る貯蔵容器の集合体又は本発明に係る上記組成物の貯蔵容器に関する。
【００８５】
好ましい実施形態において、治療される上記腫瘍細胞又はがんは、造血器腫瘍の腫瘍細胞、固形腫瘍細胞又は癌腫細胞、好ましくは、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫（ＣＭＬ）細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫細胞、又は肺、結腸、前立腺、神経膠芽腫（ｇｌｙｏｂｌａｓｔｏｍａ）のがんから成る群から選択される。
【００８６】
本発明によれば、本発明に従って作製されたプールされ、活性化及び／若しくは増殖されたＮＫ細胞、又は本発明に係る上記組成物は、感染症又は免疫不全／自己免疫疾患の治療にも有用であり得る。
【００８７】
好ましい実施形態において、本発明に係る貯蔵容器又は組成物に含有される細胞は、治療される疾患／病態に応じて、全身又は局所経路によって、対象に投与される。好ましくは、上記化合物は、筋肉内、皮内、腹腔内若しくは皮下経路によって、又は経口経路によって、全身投与され得る。本発明に係る抗体を含む組成物は、長期に亘る、何回かの投与で、投与され得る。
【００８８】
これらの最適な投与様式、用量スケジュール及びガレヌス形態（ｇａｌｅｎｉｃ  ｆｏｒｍ）は、例えば、患者の年齢又は体重、患者の全体的な健康の重症度、注意される治療及び副作用に対する耐性等の、患者に適合される治療の確立において一般的に考慮される判断基準に従って、決定され得る。
【００８９】
本発明は更に、以下の図面及び実施例によって説明される。しかし、これらの実施例及び図面は、決して、本発明の範囲を限定していると解釈されるべきでなない。
【実施例】
【００９０】
実施例１：材料及び方法
Ａ）細胞：
ＰＬＨ（実施例４）：ＨＬＡ−Ｃ１無し、ＥＣＡＣＣバンクＮｏ．８８０５２０４７、ＩＨＷ番号９０４７
この細胞株は、スカンジナビア人女性由来のＢリンパ球のＥＢＶ不死化によって得られた。この細胞は、完全にＨＬＡ遺伝子型同定されており、Ｃ１群からではなく、Ｃ２群、Ａ３／Ａ１１型及びＢｗ４型からのＨＬＡクラスＩ対立遺伝子を発現する特性を有する（完全な情報についてはＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベースを参照）。
【００９１】
この細胞株は、補助細胞とＵＣＢとの間に特定のＨＬＡ不一致を選択することを可能にすることから（ＨＬＡ  Ｃ１群、及び可能性として関連抑制性受容体ＫＩＲ２ＤＬ２／３を発現する）、ＮＫ増幅／活性化プロトコルのための補助細胞として使用される。ＥＢＶ感染により形質転換することにより、ウイルスにより誘導されたいくつかのＮＫ活性化受容体リガンドが膜発現するため、そのＮＫ活性化能が増加する。
【００９２】
ＨＯＭ−２（実施例４）：ＨＬＡ−Ｃ２無し、ＩＤ  Ｎｏ．ＨＣ１０７５０５、ＩＨＷ番号９００５
この細胞株は、カナダ人／北アメリカ人女性由来のＢリンパ球のＥＢＶ不死化によって得られた。この細胞は、完全にＨＬＡ遺伝子型同定されており、Ｃ２群からではなく、Ｃ１群、Ａ３／Ａ１１型及びＢｗ４型からの、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子を発現する特性を有する（完全な情報についてはＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベースを参照）。
【００９３】
この細胞株は、補助細胞とＵＣＢとの間に特定のＨＬＡ不一致を選択することを可能にすることから（ＨＬＡ  Ｃ２群、及び可能性として関連抑制性受容体ＫＩＲ２ＤＬ１を発現する）、ＮＫ増幅／活性化プロトコルのための補助細胞として使用される。ＥＢＶ感染により形質転換することにより、ウイルスにより誘導されたいくつかのＮＫ活性化受容体リガンドが膜発現するため、そのＮＫ活性化能が増加する。
【００９４】
Ｂ）培地、緩衝液及びサイトカイン：
１．リンパ球の分離に使用されるフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）及びジアトリゾエートナトリウムの密度勾配細胞分離培地：Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７、シグマ・アルドリッチ社（米国ミズーリ州セントルイス）製
２．細胞を７ＡＡＤ及び蛍光性ＤＮＡプローブで標識する、Ｍｕｓｅ装置（Ｍｕｓｅ  ｍａｃｈｉｎｅ）を用いる、細胞を計数し、それらの生存率を調べるためのキット：計数及び生存率キット、ミリポア社（ダルムシュタット、ドイツ）製
３．細胞培地：ＲＰＭＩ１６４０  Ｇｌｕｔａｍａｘ、インビトロジェン社（米国カリフォルニア州カールズバッド）製、フランスの卸売業者サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社から購入
４．細胞培地中の栄養源：胎児ウシ血清、インビトロジェン社（米国カリフォルニア州カールズバッド）製、フランスの卸売業者サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社から購入
５．細胞凍結用の有機溶剤：ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｙｄｅ）、ＤＭＳＯ、ビー・ブラウン社（Ｂ．  Ｂｒａｕｎ）（メルズンゲン、ドイツ）製
６．フローサイトメトリー標識用の緩衝液：ＰＢＳ、インビトロジェン社（米国カリフォルニア州カールズバッド）製、フランスの卸売業者サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社から購入
７．ＮＫ増幅／活性化用のサイトカイン：組換えヒトｒｈＩＬ−２、イーバイオサイエンス社（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（米国カリフォルニア州サンディエゴ）製
８．  ＮＫ増幅／活性化用のサイトカイン：組換えヒトｒｈ−ＩＬ１５、ミルテニー社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）（ベルギッシュグラートバハ、ドイツ）製
【００９５】
実施例２：製造プロセスの例
プロセスの詳細：図１−１〜図１−３を参照されたい。
・最初の凍結の前にＵＣＢをフィコールＵＣＢ単核細胞単離で処理した。
・手動の磁気枯渇キットを用いてＣＤ３枯渇を行った。
・プールＵＣＢは、主要ＨＬＡクラスＩ群遺伝子型について同一パターンを示す（各ＨＬＡ群は主要阻害性ＫＩＲによってＮＫ細胞により認識される）：ＫＩＲ３ＤＬ２によって認識されるＨＬＡ  Ａ３／Ａ１１；ＫＩＲ３ＤＬ１によって認識されるＨＬＡ  Ｂｗ４；ＫＩＲ２ＤＬ２／３によって認識されるＨＬＡ  Ｃ１群；ＫＩＲ２ＤＬ１によって認識されるＨＬＡ  Ｃ２群。
・プールされたＵＣＢを、発現されたプールＵＣＢのｉＫＩＲによって認識されるＨＬＡのうちの１つを欠損した補助細胞を用いて活性化する。
・ＮＫ細胞を２０〜２４日間増幅した。
・使用されるサイトカインはＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍｌ）及びＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍｌ）である。同様の結果を得るために、これらの濃度は変更可能である。
補助細胞は、特定のＨＬＡ遺伝子型（１つの主要ＨＬＡクラスＩ群欠損）を有するＥＢＶ不死化細胞株（ウイルス誘導性活性化リガンドを発現する細胞）である。
・補助細胞を、様々な方法によって、様々な照射線量で照射することができる（ここでは、主に２０秒のＵＶ照射が使用されたが、最後の実験には１０５Ｇｙのγ線照射も使用され、これはより良好な増幅結果を示した）。
・被照射補助細胞は、事前の凍結保存有り又は無しで使用され得る：新たに照射した細胞、又は被照射凍結保存細胞（凍結直前の照射）として。
・最後の３つの実験では、被照射補助細胞を、３〜４日毎に（０日目；４日目；８日目；１２日目；＋／−１５日目；＋／−１８日目）、ＮＫ：補助細胞比率１：４で、ＵＣＢ細胞に加えた。３日間〜７日間の添加頻度で、比率１：２、又は１：１〜１：３の全細胞  補助細胞の比率を用いて、いくつかの結果（以前の結果及び他の示されていない結果）を得た。このパラメータは、同様の増幅／活性化結果を得ながら、変更することが可能である。
・示された実験では、プールされたＣＤ３枯渇ＵＣＢ由来のＮＫ細胞がプロセスの最後に既に９０％超の生細胞を示していたため、プロセスの最後にＣＤ５６＋選択を行わなかった。ＣＤ５６選択工程は必須ではなく、ＮＫ純度を向上させ得るものであり、医薬品のために好ましい（及び、完全に必要とされ得る）。
【００９６】
上記プロセスのいくつかの工程は変更可能である：
・ＵＣＢは、Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ（商標）又はＰｒｅｐａＣｙｔｅ  ＣＢ（商標）装置（又は他の既存の方法及び臨床的に承認された方法）等のＧＭＰに準拠した方法を用いて、最初の凍結の前に別様に処理される。
・現在の前臨床及び臨床の知見によって、ｉＫＩＲ−ＨＬＡ不一致がｉＫＩＲ−ＨＬＡ一致よりも良好な結果を与えることが示されているとしても、我々の場合では、ｉＫＩＲ−ＨＬＡが臨床成績において異なる影響を有する可能性がまだある。そのため、差し当たっては、文献の知見に基づく開発は、ＮＫ／補助細胞不一致及びＮＫ／患者同一不一致を用いる工程を伴うべきである。更に、前臨床及び臨床のデータによって、このパラメータは不要であれば変更可能である。
・ＮＫ増幅の培養期間は最適化可能である：１４日間〜２８日間。
・ＩＬ−２及びＩＬ−１５の濃度は最適化可能である。
・ＣＤ３枯渇は、ｃｌｉｎｉＭＡＣＳ等の自動の臨床的に承認された装置を用いて行われる。
・ＣＤ３枯渇は、赤血球除去及び体積削減の直後にも行うことが可能である（恐らく、ＮＫ回収に関してはより良好な結果）。
・結果の１つは、いくつかの不明確な場合において、ＣＤ３枯渇がＵＣＢのプールされたＮＫ細胞の良好な増幅／活性化に必要でないことを示している。
・唯一の薬剤的に定義されたロットで特徴付けられる、活性化された複数のドナーに由来するＮＫ細胞の重要な量を得るために、選択的にＣＤ３枯渇されたＵＣＢユニットが工程の様々な時期にプールされ得る：増幅培養前、増幅培養中、又は増幅培養の最後。
【００９７】
実施例３：目的
１．第一の実験
異なるドナー由来のＴリンパ球はＨＬＡの差異の認識によって互いに殺傷し合うことが知られているため、及びＮＫ細胞は細胞傷害性となるのに活性化シグナルを必要とするため、同一の主要ＨＬＡ群（阻害性ＫＩＲによるそれらの認識に依存）を発現するが、同一のＨＬＡ対立遺伝子を発現しない、ＣＤ３枯渇ＵＣＢをプールすることが可能であるかどうかを問うた。３つのＵＣＢからの全単核細胞及びＣＤ３枯渇単核細胞をプールして、ＣＤ３枯渇が必須であるかどうかを検証した。
【００９８】
２．第二の実験
それぞれの主要ｉＫＩＲ／ＨＬＡ対についてｉＫＩＲ−ＨＬＡ不一致を示す４つのＮＫ細胞クラスを作製したいことから、ＵＣＢのプールが成功した理由が、以前に使用された最初の特定のＨＬＡ遺伝子型同定のみによるものであったかどうか、又は、ＵＣＢの別のＨＬＡ遺伝子型同定で再現可能かどうか、を調べる必要があった：別のｉＫＩＲ−ＨＬＡ不一致を利用する別の補助細胞株が、同一ＨＬＡ群を発現する３つのＣＤ３枯渇ＵＣＢのプールからのＮＫの増幅／活性化を可能にするかどうかを問うた。
【００９９】
３．第三の実験
約１００人の患者を治療するには、１０個のＵＣＢをプールする必要があることから、同一ＨＬＡ群を発現する５つのＵＣＢ（半分）のプールが同一のＮＫ増幅／活性化を可能にするかどうかを問うた。
【０１００】
実施例４：実施例
１．第一の実験
フィコール分離によって得られたＵＣＢ単核細胞を凍結保存し、その後解凍し、一部に対して幹細胞キットを用いてＣＤ３枯渇した。同一の主要ＨＬＡクラス１群Ａ３／Ａ１１＋、Ｂｗ４＋、Ｃｌ＋、Ｃ２＋遺伝子型を有する３つのＣＤ３枯渇ＵＣＢ又は全ＵＣＢをプールし、４日毎に加えられられるＩＬ−２、ＩＬ−１５及び被照射補助細胞ＰＬＨ（Ａ３／Ａ１１＋、Ｂｗ４＋、Ｃｌ−、Ｃ２＋遺伝子型）と一緒に、２１〜２５日間培養した。
【０１０１】
２．第二の実験
フィコール分離によって得られたＵＣＢ単核細胞を凍結保存し、その後解凍し、幹細胞キットを用いてＣＤ３枯渇した。同一の主要ＨＬＡクラス１群Ａ３／Ａ１１−、Ｂｗ４＋、Ｃｌ−、Ｃ２＋遺伝子型を有する３つのＣＤ３枯渇ＵＣＢをプールし、４日毎に加えられるＩＬ−２、ＩＬ−１５及び被照射補助細胞ＨＯＭ−２（Ａ３／Ａ１１＋、Ｂｗ４＋、Ｃｌ＋、Ｃ２−遺伝子型）と一緒に、２１〜２５日間培養した。
【０１０２】
３．第三の実験
フィコール分離によって得られたＵＣＢ単核細胞を凍結保存し、その後解凍し、幹細胞キットを用いてＣＤ３枯渇した。同一の主要ＨＬＡクラス１群Ａ３／Ａ１１−、Ｂｗ４＋、Ｃｌ＋、Ｃ２−遺伝子型を有する５つのＣＤ３枯渇ＵＣＢをプールし、４日毎に加えられるＩＬ−２、ＩＬ−１５及び被照射補助細胞ＰＬＨ（Ａ３／Ａ１１＋、Ｂｗ４＋、Ｃｌ−、Ｃ２＋遺伝子型）と一緒に、２１日間培養した。
【０１０３】
４．評価したパラメータ
ＭＵＳＥミリポア社製システム及びフローサイトメトリーによる培養液中の細胞構成の特徴付けを用いて、生ＮＫ細胞を定期的に計数した。
フローサイトメトリーによって、ＮＫ細胞の活性化マーカーの発現を定期的に評価した（モノクローナル抗体治療との強力な相乗効果のためのＣＤ１６；共通の活性化受容体としてのＣＤ６９）。
培養２０日目に、実験２及び実験３のために、周知のＫ５６２標的細胞、及び腫瘍性細胞に対して、細胞毒性を評価した（ＮＫ：Ｋ５６２（比率３：１）、ＮＫ：精製Ｂリンパ腫細胞（比率３：１）、ＮＫ：ＡＭＬ細胞（患者の全ＰＢＭＣ試料中）（比率１０：１）と一緒に２時間インキュベーション）。
【０１０４】
実施例５：結果
１．第一の実験（図２及び図３を参照）
ＵＣＢ１：ＨＬＡ  Ａ１１：０１／Ａ２９：０２、Ｂ３５：０１／Ｂ４４：０２、Ｃ０４：０１／Ｃ１６／０１＞ＨＬＡ  Ａ３／Ａ１１＋、Ｂｗ４＋、Ｃ１＋、Ｃ２＋
ＵＣＢ２：ＨＬＡ  Ａ１１：０１／Ａ２３：０１、Ｂ３５：０２／Ｂ４９：０１、Ｃ０４：０１／０７：０１＞ＨＬＡ  Ａ３／Ａ１１＋、Ｂｗ４＋、Ｃ１＋、Ｃ２＋
ＵＣＢ３：ＨＬＡ  Ａ２／Ａ３、Ｂ１８／Ｂ５１、Ｃ５／Ｃ１４＞ＨＬＡ  Ａ３／Ａ１１＋、Ｂｗ４＋、Ｃ１＋、Ｃ２＋
【０１０５】
Ｔリンパ球はサイトカインが使用される増殖においてＮＫ細胞と競合することから（及び、ＥＢＶ抗原を対象とするＣＤ８−Ｔリンパ球も補助細胞によって刺激されることから）、単離されたＵＣＢからのＮＫ増殖は、ＣＤ３枯渇後により良好な結果を示した。
プールされたＣＤ３枯渇ＵＣＢ由来のＮＫは、単離されたＵＣＢ由来のＮＫと同様に増殖するが、ＵＣＢがＣＤ３枯渇されていない場合、異なるドナー由来のＴリンパ球はその他のＴリンパ球に対して細胞傷害性であり、ＮＫ細胞は増殖することができない。
【０１０６】
【表１】
2020114248.tif 000002
【０１０７】
ＮＫ増幅率は技術的な問題からこの実験では比較的低い。
活性化受容体は良好に発現しており、培養ＮＫ細胞の共通標的Ｋ５６２に対する細胞毒性は非活性化ＮＫ細胞を用いるよりも大いに良好である。
この実験によって、ＮＫ増幅のために、同一の主要ＨＬＡ群の遺伝子型を有するＵＣＢをプールすることは適しているが、事前のＣＤ３枯渇が必要であることが示された。増幅されたＮＫ細胞は充分に活性化されている。
【０１０８】
２．第二の実験（図４参照）
ＵＣＢ１：ＨＬＡ  Ａ０１／０２、Ｂ２７：０５／Ｂ４０：０２／Ｃ０２：０２／Ｃ１５：０２＞ＨＬＡ  Ａ３／Ａ１１−、Ｂｗ４＋、Ｃ１−、Ｃ２＋
ＵＣＢ２：ＨＬＡ  Ａ２／Ａ３１、Ｂ５０／Ｂ５１、Ｃ０６：０２／１５：０２＞ＨＬＡＡ３／Ａ１１−、Ｂｗ４＋、Ｃ１−、Ｃ２＋
ＵＣＢ３：ＨＬＡ  Ａ２３／Ａ２４、Ｂ４４／Ｂ４４、Ｃ４／Ｃ５＞ＨＬＡ  Ａ３／Ａ１１−、Ｂｗ４＋、Ｃ１−、Ｃ２＋
【０１０９】
この新たな遺伝子型を有するプールＣＤ３枯渇ＵＣＢからのＮＫ増殖は、単離ＣＤ３枯渇ＵＣＢを用いたＮＫ増殖と同様である。
【０１１０】
【表２】
2020114248.tif 000003
【０１１１】
ＮＫ増幅率は、この実験ではより高い（技術的な問題無し）が、具体的には新規の補助細胞株についてプロトコル最適化によりまだ向上させることが可能である。
活性化受容体は非常に良く発現されている。培養ＮＫ細胞の共通標的Ｋ５６２に対する細胞毒性は非活性化ＮＫ細胞を用いるよりも大いに良好であり、２時間のインキュベーションによりＢリンパ腫腫瘍性細胞に対する有意な細胞毒性が観察される。
別の主要ＨＬＡ群遺伝子型を有するＣＤ３枯渇ＵＣＢをプールすること、並びに別のｉＫＩＲ−ＨＬＡ不一致及び別の補助細胞株を用いるＮＫ細胞を増幅することは、実行可能である。増幅されたＮＫ細胞は充分に活性化されている。
【０１１２】
３．第三の実験（図５参照）
ＵＣＢ：ＨＬＡ  Ａ３／Ａ１１−、Ｂｗ４＋、Ｃ１＋、Ｃ２−
【０１１３】
【表３】
2020114248.tif 000004
【０１１４】
５つのプールＣＤ３枯渇ＵＣＢからのＮＫ増殖は良好である。
ＮＫ増幅率はこの実験ではより高い。
活性化受容体は非常に良く発現されている。培養ＮＫ細胞の共通標的Ｋ５６２に対する細胞毒性は非活性化ＮＫ細胞を用いるよりも大いに良好であり、２時間のインキュベーションによりＡＭＬ腫瘍性細胞に対する低い特異的細胞毒性が観察される（しかし、２０時間後には細胞毒性は観察できなかったが、これは、この時点において、患者細胞が解凍によって死滅するためである）。
５つのＣＤ３枯渇ＵＣＢをプールし、重要な増幅率でＮＫ細胞を増幅することは、我々の製造工程を用いて実行可能である。増幅されたＮＫ細胞は充分に活性化されている。
【０１１５】
４．補完的な結果
・事前のＣＤ３枯渇無しでプールＵＣＢからのＮＫ細胞の良好な増幅を示す実験（再現性の無いアッセイ）：（図６参照）
ＰＬＨを用いて増幅された３つのｉＫＩＲ−ＨＬＡ不一致ＵＣＢ：
ＵＣＢ１：ＨＬＡ  Ａ２：０１／Ａ６８：０１；Ｂ３８：０１／Ｂ５７：０１；Ｃ６：０２／Ｃ１２：０３＞Ｃ１＋、Ｃ２＋、Ａ３／Ａ１１−、Ｂｗ４＋
ＵＣＢ２：ＨＬＡ  Ａ１：０１／Ａ２：０１；Ｂ５２：０１／Ｂ５７：０１；Ｃ６：０２／Ｃ１２：０２＞Ｃ１＋、Ｃ２＋、Ａ３／Ａ１１−、Ｂｗ４＋
ＵＣＢ３：ＨＬＡ  Ａ０２／０２；Ｂ１５：０９／Ｂ５０：０２；Ｃ０６／Ｃ０７＞Ｃ１＋、Ｃ２＋、Ａ３／Ａ１１−、Ｂｗ４−
【０１１６】
ＮＫ増幅は、事前のＣＤ３枯渇無しで単離又はプールされたＵＣＢにおいて同様であり得る。
・９日間の培養後にプールの可能性を示す実験（ＣＤ３非枯渇ＵＣＢを使用）：
１．先と同じ実験（図７参照）
【０１１７】
【表４】
2020114248.tif 000005
【０１１８】
有意であるがより低いＮＫ増幅を維持しながら、９日目の活性化ＮＫ細胞（ここでは事前のＣＤ３枯渇無し）をプールすることが可能である。
【０１１９】
２．ＰＬＨを用いて増幅された２つのｉＫＩＲ−ＨＬＡ一致ＵＣＢを用いた実験：（図８参照）
ＵＣＢ１：ＨＬＡ  Ａ１１：０１／Ａ２９：０２、Ｂ３５：０１／Ｂ４４：０２、Ｃ０４：０１／Ｃ１６／０１＞ＨＬＡ  Ａ３／Ａ１１＋、Ｂｗ４＋、Ｃ１＋、Ｃ２＋
ＵＣＢ２：ＨＬＡ  Ａ１１：０１／Ａ２３：０１、Ｂ３５：０２／Ｂ４９：０１、Ｃ０４：０１／０７：０１＞ＨＬＡ  Ａ３／Ａ１１＋、Ｂｗ４＋、Ｃ１＋、Ｃ２＋
ＮＫがＣＤ３非枯渇において適切に増幅しない場合、９日間の増幅後のＵＣＢのプール（ＮＫ％及びＮＫ活性化状態を増加させるが、未だ高いＴリンパ球％を有する）が問題を解決すると思われる。それらは、Ｂリンパ腫腫瘍性細胞に対してインビトロにおける同様の良好な細胞毒性を示した（一晩、Ｅ：Ｔ比率１：１）。
【０１２０】
３．ＰＬＨを用いて増幅された２つのｉＫＩＲ−ＨＬＡ不一致ＵＣＢを用いた実験：（図９参照）
ＵＣＢ１：ＨＬＡ  Ａ０２：０２／３０：０１、Ｂ４２：０１／Ｂ５３：０１、Ｃ０４：０１／１７：０１＞ＨＬＡ  Ａ３／Ａ１１−、Ｂｗ４＋、Ｃ１−、Ｃ２＋
ＵＣＢ２：ＨＬＡ  Ａ１１：０１／Ａ２３：０１、Ｂ３５：０２／Ｂ４９：０１、Ｃ０４：０１／０７：０１＞ＨＬＡ  Ａ３／Ａ１１＋、Ｂｗ４＋、Ｃ１＋、Ｃ２＋
【０１２１】
【表５】
2020114248.tif 000006
【０１２２】
ＣＤ３非枯渇・ｉＫＩＲ−ＨＬＡ不一致のプールＵＣＢ由来のＮＫ細胞は、より低い増幅率を示し、９日間の増幅後にこれらのＵＣＢをプールすることは、より良好なＮＫ増幅をもたらした。それらは、Ｂリンパ腫腫瘍性細胞に対してインビトロにおける同様の良好な細胞毒性を示した（一晩、Ｅ：Ｔ比率１：１）。
【０１２３】
実施例６：展望
１．プロセスの最適化
本発明に係るプールされた活性化／増殖されたＮＫ細胞の製造プロセスが医薬品規制義務に適合され、プロセスの全ての工程が最高品質保証のために適合されることが好ましい。
第一に、例えば、７％（３〜１５％のＮＫがＵＣＢの全有核細胞で一般的に観察される）等のＮＫ割合の最小閾値を伴って、１．４又は１．６×１０６個超の全有核細胞（現在、我々のローカルなＵＣＢバンクにおいては１．８５×１０６個の全有核細胞）等の、ＵＣＢユニットの判定基準が設定されなければならない。
ＵＣＢ単核細胞（ＵＣＢＭＣ）単離のために上記実施例で使用された「フィコール」法は、ＨＥＳ６％及び遠心分離赤血球除去及び体積削減、又はＰｒｅｐａｃｙｔｅ  ＣＢ単離系等の適合された手順を用いる、充分に適合された標準的且つ周知の臨床応用のための方法、及び、例えば、密閉された、無菌の、使い捨ての、バッグを備えた系を用いる製薬条件に容易に置き換えることができる。これらの系は、第一工程における全有核細胞（ｎｕｃｌｅｔｅｄ  ｃｅｌｌ）の回収を確実に向上させる。
ＵＣＢＭＣのＣＤ３枯渇は、最良の細胞回収及び最良のＣＤ３枯渇品質のために、最初の凍結保存工程の前後に、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）等の適合した臨床的にアップグレード可能な物質を用いて、及び、要否を問わず、ＣＤ３枯渇のための最良の工程時間を決定することにより、製薬学的用途のために規制コンプライアンス及び／又はＧＭＰ手順により良好に適合可能であることが好ましい。
ＵＣＢＭＣに対する凍結、凍結保存及び解凍の手順は、製造プロセスの確認の後に、臨床応用のために自動化された手順を用いて改善可能であることが好ましい。バッグ密閉系用の適合された物質が使用可能であり、凍結保存条件（培地、細胞濃度）は本発明の方法の当業者により容易に最適化可能である。これらの最適化工程が、唯一、解凍後の全細胞回収を確実に向上させるべきである。同時に、製薬ガイドラインに従う製造工程に進むべき各々の解凍されたＵＣＢＭＣの判定基準が設定されるべきである。
好ましくは、ＨＬＡ遺伝子型同定及び阻害性ＫＩＲ発現評価の手順は、増幅／活性化工程のためにプールされる異なるＵＣＢユニットを選択することを確認されるべきである：選択基準は各ロットに設定されるべきである。
好ましくは、ＮＫ増幅に対する最終的なスクリーニングを伴う、本発明の方法に含まれるかどうかにかかわらない、ＧＭＰ順守のアップグレード可能な補助細胞：クローン選択のための活性化。最終的な補助細胞は、治療薬製造手順での使用のために、充分に特徴付けされなければならない。この最適化工程も、ＮＫ増幅／活性化の結果を向上させ得る。
照射手順は、臨床に適合した品質パラメータを伴う最良の増幅／活性化結果のために、最適化及び確認されることが好ましく、非増殖評価、細胞生存率、ＥＢＶ不活性化等を含む、凍結保存した被照射補助細胞ロットの判定基準が設定されることが好ましい。
被照射補助細胞の正確な追加手順は、補助細胞を含むプロセスで使用される最終的なクローンに対して最適化される。
少なくとも５つ、好ましくは１０個のプールされたＵＣＢユニットを用いた増幅／活性化工程のために、ＮＫ培養について試験済みのＷａｖｅシステム（商標）（ＧＥヘルスケア社）等の、バイオリアクター内の動的培養密閉系が使用されることが好ましい。
ロンザ社（Ｌｏｎｚａ）製Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）培地、セルジェニックス社（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）製ＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ（商標）又はインビトロジェン社製ＡＩＭ  Ｖ（商標）（ＮＫ培養について試験済み）等の動物血清非含有培地を用いる、増幅／活性化工程に使用される培地が、使用され得ることが好ましい。
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）等の適合された臨床的にアップグレード可能な物質を用いる、増幅／活性化されたＮＫ細胞のＣＤ５６陽性選択が使用されることが好ましい。
【０１２４】
２．医薬品開発：最終産物の特徴付け及び判定基準
好ましくは、生成物同定工程（遺伝的安定性、キメラ現像、表現型）及び標準的な作用強度評価手順を含む、最終的な増幅／活性化産物の判定基準の工程が、プロセスに含まれなければならない。
好ましくは、本発明のプロセスの前及び後のＮＫ細胞の遺伝的安定性が確認され、それらの核型が調べられ（例えば、当業者に周知のＧバンド核型分析又はｃｙｔｏｓｃａｎＨＤマイクロアレイ法によって）、異なるドナー由来の最終的なプールされたＮＫ細胞のキメラ現象が定義されるべきである（例えば、標準的な複合ＰＣＲ  ＳＴＲ法によって）。
好ましくは、並びに最終産物をより良好に同定及び特徴付けするために、並びに判定基準を規定するために、より多くのＮＫ表現型マーカー（ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ９４、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１５８．．．）の発現が評価される（例えば、フローサイトメトリーによって）。
各々の産物ロットは、一般的に使用される周知の標的細胞に対する有効な細胞毒性アッセイを用いて試験されることが好ましい。
好ましくは、細菌、真菌、マイコプラズマ及びウイルス（特にＥＢＶ）等の混入物の非存在は、製造工程の間に使用されるエンドトキシン及びサイトカインの非存在として、プロセスの最終工程の間又は後に確認されなければならない。
【図１】
2020114248.tif 000007
【図２】
2020114248.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月3日(2020.6.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
２．医薬品開発：最終産物の特徴付け及び判定基準
好ましくは、生成物同定工程（遺伝的安定性、キメラ現像、表現型）及び標準的な作用強度評価手順を含む、最終的な増幅／活性化産物の判定基準の工程が、プロセスに含まれなければならない。
好ましくは、本発明のプロセスの前及び後のＮＫ細胞の遺伝的安定性が確認され、それらの核型が調べられ（例えば、当業者に周知のＧバンド核型分析又はｃｙｔｏｓｃａｎＨＤマイクロアレイ法によって）、異なるドナー由来の最終的なプールされたＮＫ細胞のキメラ現象が定義されるべきである（例えば、標準的な複合ＰＣＲ  ＳＴＲ法によって）。
好ましくは、並びに最終産物をより良好に同定及び特徴付けするために、並びに判定基準を規定するために、より多くのＮＫ表現型マーカー（ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ９４、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１５８．．．）の発現が評価される（例えば、フローサイトメトリーによって）。
各々の産物ロットは、一般的に使用される周知の標的細胞に対する有効な細胞毒性アッセイを用いて試験されることが好ましい。
好ましくは、細菌、真菌、マイコプラズマ及びウイルス（特にＥＢＶ）等の混入物の非存在は、製造工程の間に使用されるエンドトキシン及びサイトカインの非存在として、プロセスの最終工程の間又は後に確認されなければならない。
本発明の態様には以下が含まれる。
＜１＞  （Ａ）少なくともｎ個のＵＣＢユニット、又はＮＫ細胞を含有する前記ＵＣＢユニットの分画からＮＫ細胞を含む細胞の集団を作製するステップであって、
（ｉ）ｎ≧２である、少なくともｎ個の臍帯血ユニット（ＵＣＢユニット）、又はＮＫ細胞を含有する前記ＵＣＢユニットの分画を提供することと、
（ｉｉ）前記少なくともｎ個のＵＣＢユニット、又は前記分画をプールして、細胞の集団を作製することとを含む、ステップと、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた前記細胞の集団に含まれるＮＫ細胞を適切な培地で増殖及び活性化して、増殖された活性化ＮＫ細胞の集団を作製するステップと、
（Ｃ）前記増殖された活性化ＮＫ細胞を回収するステップとを含む、
増殖された活性化ＮＫ細胞の集団を作製する方法であって、
前記方法は、ステップ（Ａ）において、（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）で得られた前記細胞の集団からＴ細胞を枯渇させること、又は、前記ＵＣＢユニットをプールする前記（ｉｉ）の前に、前記ｎ個のＵＣＢユニットのそれぞれに含有されるＴ細胞を枯渇させることを含み、
プールされた際の前記ｎ個のＵＣＢユニットが、主要ＨＬＡクラスＩ群遺伝子型について同一パターンを呈し、
前記主要ＨＬＡクラスＩ群が、ＫＩＲ３ＤＬ２によって認識されるＨＬＡ  Ａ３／Ａ１１；ＫＩＲ３ＤＬ１によって認識されるＨＬＡ  Ｂｗ４；ＫＩＲ２ＤＬ２／３によって認識されるＨＬＡ  Ｃ１群；及びＫＩＲ２ＤＬ１によって認識されるＨＬＡ  Ｃ２群からなる群から選択され、
前記ステップ（Ｂ）において前記ＮＫ細胞を増殖及び活性化するための前記適切な培地が、補助細胞を含む、方法。
＜２＞  前記ステップ（Ａ）において、前記ｎ個のＵＣＢユニットの各々は、前記ＵＣＢユニットをプールする前記（ｉｉ）の前にＴ細胞が枯渇させられている、＜１＞に記載の方法。
＜３＞  前記補助細胞と増殖及び活性化されるＮＫ細胞は、ＨＬＡ−ＫＩＲ不一致である、＜１＞に記載の方法。
＜４＞  前記補助細胞は、照射された細胞である、＜１＞に記載の方法。
＜５＞  前記補助細胞は不死化されている、＜１＞に記載の方法。
＜６＞  前記ｎ個のＵＣＢユニットの各々又は前記ＵＣＢユニットのプールは、赤血球が枯渇されている、＜１＞に記載の方法。
＜７＞  前記ステップ（Ａ）において使用される前記ＵＣＢユニットは、凍結保存されたＵＣＢユニットから解凍されたＵＣＢユニットである、＜１＞に記載の方法。
＜８＞  前記ステップ（Ａ）は、
ｉ）ｎ≧２である少なくともｎ個のＵＣＢユニット又はＮＫ細胞を含有する前記ＵＣＢユニットの分画を提供することであって、前記少なくともｎ個のＵＣＢユニットが、主要ＨＬＡクラスＩ群遺伝子型について同一パターンを呈する、提供することと、
ｉｉ）任意で、各ＵＣＢユニットの赤血球を枯渇させることと、
ｉｉｉ）任意で、ｉ）又はｉｉ）で得られた細胞の集団を、ステップｉｖ）の前に、凍結、液体窒素中で維持、及び解凍することと、
ｉｖ）各ＵＣＢユニットに含有されるＴ細胞を枯渇させることと、
ｖ）ステップｉ）〜ｉｖ）のＵＣＢユニット中で得られたｎ個のＵＣＢユニットの細胞、又はＮＫ細胞を含有する前記ＵＣＢユニットの分画をプールして、プールされたＮＫ細胞の集団を作製することと、を含み、
前記ステップ（Ｂ）は、
前記プールに含有されるＮＫ細胞を、補助細胞を含む適切な培地中に接触させることにより、ステップｉ）〜ｖ）で得られたプールされたＮＫ細胞を増殖及び活性化して、前記プールされ、増殖され、活性化されたＮＫ細胞の集団を作製することを含む、＜１＞に記載の方法。
＜９＞  前記ステップ（Ａ）は、
ｉ）ｎ≧２である少なくともｎ個のＵＣＢユニット又はＮＫ細胞を含有する前記ＵＣＢユニットの分画を提供することであって、前記少なくともｎ個のＵＣＢユニットが、主要ＨＬＡクラスＩ群遺伝子型について同一パターンを呈する、提供することと、
ｉｉ）任意で、各ＵＣＢユニットの赤血球を枯渇させることと、
ｉｉｉ）任意で、ｉ）又はｉｉ）で得られた細胞の集団を、ステップｉｖ）の前に、凍結、液体窒素中で維持、及び解凍することと、
ｉｖ）前記ステップｉ）〜ｉｉｉ）のＵＣＢユニットで得られたｎ個のＵＣＢユニットの細胞、又はＮＫ細胞を含有する前記ＵＣＢユニットの分画をプールして、プールされたＮＫ細胞の集団を作製することと、
ｖ）ステップｉｖ）の後に得られたプールされたＮＫ細胞に含まれるＴ細胞を枯渇させることとを含み、
前記ステップ（Ｂ）は、
前記プール中に含有されるＮＫ細胞を、補助細胞を含む適切な培地中に接触させることにより、ステップｉ）〜ｖ）で得られた前記プールされたＮＫ細胞を増殖し、任意で活性化して、プールされ、増殖され、任意で活性化されたＮＫ細胞の集団を作製することを含む、＜１＞に記載の方法。
＜１０＞  前記適切な培地が、少なくとも１つの適切なＮＫ活性化因子をさらに含む、＜１＞に記載の方法。
＜１１＞  プールされ増殖された活性化ＮＫ細胞の少なくとも２つの異なる製造ロットを、ＵＣＢユニットから作製する方法であって、増殖及び活性化された製造ロットの各集団は、阻害性ＫＩＲであるＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ３ＤＬ２からなる群より選択される主要阻害性ＫＩＲの１つについての異なる非発現を示す、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）少なくともｎ個のＵＣＢユニット、又はＮＫ細胞を含有する前記ＵＣＢユニットの分画からＮＫ細胞を含む細胞の集団を作製するステップであって、
（ｉ）ｎ≧２である、少なくともｎ個の臍帯血ユニット（ＵＣＢユニット）、又はＮＫ細胞を含有する前記ＵＣＢユニットの分画を提供することと、
（ｉｉ）前記少なくともｎ個のＵＣＢユニット、又は前記分画をプールして、細胞の集団を作製することとを含む、ステップと、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた前記細胞の集団に含まれるＮＫ細胞を適切な培地で増殖及び活性化して、増殖された活性化ＮＫ細胞の集団を作製するステップと、
（Ｃ）前記増殖された活性化ＮＫ細胞を回収するステップとを含む、
増殖された活性化ＮＫ細胞の集団を作製する方法であって、
前記方法は、ステップ（Ａ）において、（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）で得られた前記細胞の集団からＴ細胞を枯渇させること、又は、前記ＵＣＢユニットをプールする前記（ｉｉ）の前に、前記ｎ個のＵＣＢユニットのそれぞれに含有されるＴ細胞を枯渇させることを含み、
プールされた際の前記ｎ個のＵＣＢユニットが、主要ＨＬＡクラスＩ群遺伝子型について同一パターンを呈し、
前記主要ＨＬＡクラスＩ群が、ＫＩＲ３ＤＬ２によって認識されるＨＬＡ  Ａ３／Ａ１１；ＫＩＲ３ＤＬ１によって認識されるＨＬＡ  Ｂｗ４；ＫＩＲ２ＤＬ２／３によって認識されるＨＬＡ  Ｃ１群；及びＫＩＲ２ＤＬ１によって認識されるＨＬＡ  Ｃ２群からなる群から選択され、
前記ステップ（Ｂ）において前記ＮＫ細胞を増殖及び活性化するための前記適切な培地が、補助細胞を含む、方法。
【請求項２】
前記ステップ（Ａ）において、前記ｎ個のＵＣＢユニットの各々は、前記ＵＣＢユニットをプールする前記（ｉｉ）の前にＴ細胞が枯渇させられている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記補助細胞と増殖及び活性化されるＮＫ細胞は、ＨＬＡ−ＫＩＲ不一致である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記補助細胞は、γ線照射、Ｘ線照射、又はＵＶ照射細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記補助細胞は不死化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｎ個のＵＣＢユニットの各々又は前記ＵＣＢユニットのプールは、赤血球が枯渇されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ（Ａ）において使用される前記ＵＣＢユニットは、凍結保存されたＵＣＢユニットから解凍されたＵＣＢユニットである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記適切な培地が、少なくとも１つの適切なＮＫ活性化因子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
プールされ増殖された活性化ＮＫ細胞の少なくとも２つの異なる製造ロットを、ＵＣＢユニットから作製する方法であって、増殖及び活性化された製造ロットの各集団は、請求項１に記載の方法により製造され、阻害性ＫＩＲであるＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ３ＤＬ２からなる群より選択される主要阻害性ＫＩＲの１つについての異なる非発現を示す、方法。
【外国語明細書】
2020114248000001.pdf