(57)【要約】【課題】  スフェアなどの培養対象物を収容するための複数の凹部が形成された培養部を有する培養容器において、培地を１ｍＬ／分以上の流速で送液しても、凹部間におけるスフェアなどの移動を防止することを可能とする。【解決手段】  スフェアを収容するための複数の凹部が形成された培養部を有する培養容器であって、少なくとも一つのポートが備えられ、凹部の深さが５０〜５００μｍであり、凹部の側壁の少なくとも一部が略垂直であり、側壁の略垂直部分の垂直方向の長さが、スフェアの最大径の半分より長い培養容器とする。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフェアを収容するための複数の凹部が形成された培養部を有する培養容器であって、少なくとも一つのポートが備えられ、前記凹部の深さが５０〜５００μｍであり、前記凹部の側壁の少なくとも一部が略垂直であり、前記側壁の略垂直部分の垂直方向の長さが、スフェアの最大径の半分より長いことを特徴とする培養容器。
【請求項２】
単一細胞を収容するための複数の凹部が形成された培養部を有する培養容器であって、少なくとも一つのポートが備えられ、前記凹部の深さが５〜５０μｍであり、前記凹部の側壁の少なくとも一部が略垂直であり、前記側壁の略垂直部分の垂直方向の長さが、単一細胞の最大径の半分より長いことを特徴とする培養容器。
【請求項３】
軟包材からなることを特徴とする請求項１又は２記載の培養容器。
【請求項４】
バッグ形状であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の培養容器。
【請求項５】
前記側壁の略垂直部分に対して垂直方向に、培養容器の両端において対向して２つのポートが備えられたことを特徴とする請求項４記載の培養容器。
【請求項６】
前記凹部の底部が、錐体状、半球状、又はアール状であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の培養容器。
【請求項７】
請求項５記載の培養容器を用いて、一方のポートから培地を注入し、他方のポートから培地を排出して、培地の流速を制御することを特徴とする培養方法。
【請求項８】
前記培地の流速を１ｍＬ／分以上に制御することを特徴とする請求項７記載の培養方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載の培養容器の上面に接して押圧板が備えられ、前記培養容器が前記押圧板により押圧され、前記押圧板が、前記培養容器への培地の注入又は排出に伴って垂直方向に移動可能であることを特徴とする培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養技術に関し、特にスフェアの作成などを効率化する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの幹細胞等の接着細胞を大量に培養する場合には、細胞を培養容器に接着させて増殖させるだけではなく、細胞に対して接着性の低い材料を塗工したマイクロウェルプレートなどを備えた培養容器を使用して、スフェア（スフェロイド，凝集塊）やオルガノイドを形成させることによって、細胞をより生体内に近い三次元的な状態で培養する方法が用いられている。
【０００３】
このような培養容器を使用したスフェアの培養においては、スフェアがウェル（凹部）から飛び出して他のウェルに移動してしまい、所望の大きさや形状のスフェアを得ることが難しいという問題があった。
すなわち、培地交換を行うために、多数のウェルを培養部に備えた培養バッグ（袋状の培養容器）内に培地を送液すると、スフェアは簡単にウェルから飛び出して他のウェルに移動する（以下、これをスフェアの移動と称する）ため、培地の流速を極めて遅くする必要があり、迅速な培地交換が非常に困難であった。このため、このような培養容器は、頻繁に培地交換が必要な長期間培養には不向きであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第２７１６６４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
スフェアの移動は、浅いウェルを備えた培養バッグを用いる場合に頻繁に生じるが、培地交換を適切に行うためには、浅いウェルを備えた培養バッグを用いることが好ましい。
すなわち、ウェルの深さが５００μｍより小さい、浅いウェルを備えた培養バッグを用いる場合、一般的に、培地を送液する速度（流速）を０．１ｍＬ／分以下にしなければスフェアの移動が生じ得るため、培養バッグから培地を全て排出するのに長時間を要するという問題があった。例えば、培養バッグ内の培地量が１０ｍＬの場合、０．１ｍＬ／分の流速で排出すると１００分を要することになり、細胞にダメージを与えることが懸念された。
【０００６】
スフェアの移動を防止するために、深いウェルを備えた培養バッグを用いることも考えられる。しかしながら、このような培養バッグでは、培地の交換が十分に行えないという問題があった。
例えば、開口部の幅が２ｍｍ、深さが７００μｍの１０００個のウェルを備えた培養バッグを用いて、乳酸を溶かした培地２ｍＬを充填した後、乳酸を含まない培地１０ｍＬを１ｍＬ／分の流速で培養バッグ内に送液した。その後、ウェル内の培地の乳酸濃度を測定することによって、ウェルに残留した培地量を計算した。その結果、ウェル内には、元の培地が約２０％残留していることが分かった。この場合、２００μｍのスフェアであれば、残留している元の培地にその全体が埋まり、培養に支障が出ることが予想された。
【０００７】
これに対して、ウェルからスフェアが飛び出さないように所定の処置を施した状態で培養バッグを反転させて、ウェルから培地を排出することも考えられる。しかし、この方法でも、約７％の培地が表面張力によってウェル内に残留していた。また、培養バッグを反転させると、スフェアが培養バッグ内の上面に貼り付くなど、ダメージを受けることがあるため、培養バッグに培地を送液することによって、培地を交換することが望ましい。
一方、培地の全交換を行わず、例えば半量のみを交換することによって培養を行うことも考えられなくはない。しかし、実際に行ってみると、この方法ではｉＰＳ細胞のスフェアを適切に作成することはできなかった。
【０００８】
現在、リジッドなマイクロウェルプレートなどの培養容器を用いることにより、研究用のスフェアの作成が行われている。しかしながら、このような従来の方法では、広い培養面積を得ることは難しく、スフェアの大量作成に適するものではなかった。
スフェアを大量に作成するためには、例えばＡ４程度のサイズ（約６００ｃｍ２）で浅いウェルを備えた培養バッグを使用することが好ましい。このような培養バッグを用いて培地の液厚を２ｍｍ〜１０ｍｍとして培養を行う場合には、培養バッグ内には１２０ｍｌ〜６００ｍｌの培地が充填される。この場合には、培地の流速を１ｍＬ／分〜１０ｍＬ／分としてもスフェアの移動を生じることなく培地を排出することは可能である。しかしながら、培地の液厚を１ｍｍ以下として培養を行う場合には、培地の流速を０．１ｍＬ／分以下にしなければ、スフェアの移動が生じるため、例えば培地量が６０ｍＬである場合には、培地の排出に１０時間かかることになり、実用化することが困難であった。
【０００９】
そこで、本発明者らは鋭意研究して、深さが５０〜５００μｍ程度の浅いウェルを備えた培養容器であっても、ウェルの側壁の少なくとも一部を略垂直とし、略垂直部分の垂直方向の長さをスフェアの最大径の半分より長くすることによって、培地交換において培地を１ｍＬ／分以上の流速で送液してもスフェアの移動を防止できることを見いだして、本発明を完成させた。
【００１０】
ここで、側壁の少なくとも一部が略垂直であるウェルを備えた培養容器について記載のある先行文献として、特許文献１を挙げることができる。
特許文献１には、底面が角度１２０度以下のロート状、曲率半径が１０ｍｍ以下の半球状、またはそれらの底面の中心部を平面にした形状をなす培養容器が開示されている。しかし、これらの培養容器は、リジッドな培養容器でスフェアを形成することを想定したものであり、培養バッグに培地を送液する場合における上記の問題を解消可能なものではなかった。
【００１１】
すなわち、例えば軟包材からなる培養バッグを用いる場合には、その上面部と下面部の間の厚みに従って、培地の流速を大きく変更する必要があるため、スフェアの移動の防止及び培地の流速の制御は、重要な問題となっていた。
例えば、上述したように、培地の液厚が２ｍｍ以上であれば、培地の流速を１ｍＬ／分としてもスフェアの移動を生じることなく培地を排出することが可能であるが、培地の液厚が１ｍｍ以下であれば、培地の流速を０．１ｍＬ／分程度に遅くしなければ、スフェアの移動が生じてしまう。また、培地の液厚が０．５ｍｍ以下の場合には、培地の流速を０．０５ｍＬ／分以下にしなければならなかった。
【００１２】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、スフェアなどの培養対象物を収容するための複数の凹部が形成された培養部を有する培養容器において、培地を１ｍＬ／分以上の流速で送液しても、凹部間におけるスフェアなどの移動を防止することが可能な培養容器、培養方法、及び培養装置の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するため、本発明の培養容器は、スフェアを収容するための複数の凹部が形成された培養部を有する培養容器であって、少なくとも一つのポートが備えられ、前記凹部の深さが５０〜５００μｍであり、前記凹部の側壁の少なくとも一部が略垂直であり、前記側壁の略垂直部分の垂直方向の長さが、スフェアの最大径の半分より長い構成としてある。
【００１４】
また、本発明の培養方法は、上記の培養容器を用いて、一方のポートから培地を注入し、他方のポートから培地を排出して、培地の流速を制御する方法としてある。
【００１５】
また、本発明の培養装置は、上記の培養容器の上面に接して押圧板が備えられ、前記培養容器が前記押圧板により押圧され、前記押圧板が、前記培養容器への培地の注入又は排出に伴って垂直方向に移動可能である構成としてある。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、スフェアなどの培養対象物を収容するための複数の凹部が形成された培養部を有する培養容器において、培地を１ｍＬ／分以上の流速で送液しても、凹部間におけるスフェアなどの移動を防止することが可能な培養容器、培養方法、及び培養装置の提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の実施形態に係る培養容器の構成を示す模式図である。
【図２】本発明の実施形態に係る培養容器の変形例の構成を示す模式図である。
【図３】本発明の実施形態に係る培養容器における培養部を示す模式図である。
【図４】本発明の実施形態に係る培養容器の写真を示す図である。
【図５】本発明の実施形態に係る培養装置の構成を示す模式図である。
【図６】本発明の実施形態に係る培養装置に培養容器の変形例を配置した状態を示す模式図である。
【図７】実施例１で作成した培養容器の培養部の顕微鏡写真を示す図である。
【図８】実施例１で作成した培養容器に樹脂ビーズを入れて培地を送液している状態の顕微鏡写真を示す図である。
【図９】実施例１で作成した培養容器にｉＰＳ細胞のスフェアを収容した状態の顕微鏡写真を示す図である。
【図１０】実施例２で作成した培養容器にＴ細胞を収容した状態の顕微鏡写真を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の培養容器、培養方法、及び培養装置の実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態及び実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
【００１９】
図１に示すように、本実施形態の培養容器１０は、スフェアなどの培養対象物を収容するための複数の凹部（ウェル）が形成された培養部１１を有する培養容器であって、少なくとも一つのポート１３が備えられている。このポート１３にはチューブ１４が接続され、図示しないがチューブ１４に配設されたポンプなどにより、培養容器１０への培地１の注入、及び培養容器１０からの培地１の排出が行われるようになっている。
【００２０】
また、図１において、培養容器１０は、軟包材からなり、バッグ状に形成されており、天板部１２を有している。培養容器１０に注入される培地１の量に応じて、培養部１１と天板部１２との間隔（液厚Ｌ）が変化するようになっている。
さらに、本実施形態の培養容器１０の変形例を図２に示す。この変形例では、培養容器１０ａ内における培地１の液厚をより均一化することができると共に、全ての凹部を設置面と並行に接触させることができる。これにより、培養対象物の増殖性の差異や細胞播種時の細胞数のバラツキを低減することが可能になっている。その他の構成は、図１に示す培養容器１０と同様である。
【００２１】
培養部１１における複数の凹部は、図３に示すように、側壁の少なくとも一部が略垂直状に形成されている。また、これらの凹部には、培養対象物２が収容され、側壁の略垂直部分の垂直方向の長さ（ｂ）が、培養対象物２の最大径の半分（ｃ）より長くなっている。
凹部における側壁が略垂直である領域の形状は、例えば、円柱状、四角柱状等とすることができる。また、培養部１１における複数の凹部の配置は、例えば、千鳥状や格子状等とすることができる。
培養容器１０における凹部をこのような構成とすることによって、ポート１３から培養容器１０に培地１を送液した場合に、その流速を１ｍＬ／分以上にしても、凹部から培養対象物２が飛び出して、他の凹部へ移動することを防止することが可能になっている。
【００２２】
培養対象物２がスフェアである場合、凹部の深さ（ａ）としては、５０〜５００μｍとすることが好ましい。凹部の深さ（ａ）を５００μｍより大きくすると、培養容器１０に培地１を送液しても、凹部内の培地を十分に置換することが困難になる場合があるためである。また、５００μｍより深い凹部を備えた培養容器は、加工難易度が高くなるためである。
【００２３】
ここで、１個のスフェアは、約２００個から数千個程度のシングルセル（単一細胞）を凝集させることによって形成させることができる。このようにして形成されたスフェアの大きさは、小さいもので、５０μｍ〜１００μｍ程度であり、大きいものでは、２００μｍ〜３００μｍ程度である。
したがって、凹部の深さ（ａ）としては、７５〜５００μｍとすることも好ましく、１００〜５００μｍとすることも好ましい。また、凹部の深さ（ａ）を、１００〜４００μｍとすることも好ましく、１００〜２５０μｍとすることも好ましい。
【００２４】
凹部内の底部の形状は、特に限定されないが、培養対象物２がスフェアの場合には、シングルセルを凝集し易くしてスフェアの形成を好適に行えるようにするため、錐体状、半球状、又はアール状とすることが好ましい。
【００２５】
培養対象物２がシングルセルである場合、凹部の深さ（ａ）としては、５〜５０μｍとすることが好ましい。シングルセルの大きさは、６μｍ〜１５μｍ程度であり、１０μｍ程度のものが多いためである。したがって、この場合、凹部の深さ（ａ）としては、６〜５０μｍとすることも好ましく、１０〜５０μｍとすることも好ましい。また、凹部の深さ（ａ）を、１０〜４０μｍとすることも好ましく、１０〜２５μｍとすることも好ましい。
【００２６】
凹部の開口部の形状は、特に限定されず、円形、又は正方形などの矩形状とすることができる。また、凹部の開口部の幅は、培養対象物２のサイズに合わせて、適宜設定することができる。
例えば、培養対象物２をスフェアとする場合、凹部の開口部の円又は内接円の直径の下限を、６０μｍ以上，７０μｍ以上，８０μｍ以上，９０μｍ以上，１００μｍ以上，１１０μｍ以上，１２０μｍ以上，１５０μｍ以上等としてもよい。また、凹部の開口部の円又は内接円の直径の上限を、１ｍｍ以下，９００μｍ以下，８００μｍ以下，７００μｍ以下，５００μｍ以下等としてもよい。
また、培養対象物２をシングルセルとする場合、凹部の開口部の円又は内接円の直径の下限を、５μｍ以上，６μｍ以上，８μｍ以上等としてもよい。また、凹部の開口部の円又は内接円の直径の上限を、５０μｍ以下，４０μｍ以下，３０μｍ以下等としてもよい。
【００２７】
また、本実施形態の培養容器１０において、２つのポート１３を備えることが好ましく、これらのポート１３を凹部の側壁の略垂直部分に対して垂直方向に（底面に平行に）、培養容器の両端において対向して備えることが好ましい。
また、このような培養容器１０を用いて、一方のポート１３から培地１を注入し、他方のポート１３から培地１を排出して、培地の流速を制御することが好ましい。
このとき、培地１の流速としては、１ｍＬ／分以上に制御することが好ましく、３ｍＬ／分以上に制御することがより好ましく、５ｍＬ／分以上に制御することがさらに好ましく、１０ｍＬ／分以上に制御することがさらにまた好ましい。
【００２８】
このような本実施形態の培養容器の写真を図４に示す。また、培養容器の培養部の一部の顕微鏡写真を図７に示す。この培養容器は、培養部に約５００００個の凹部を備えており、凹部の深さが２５０μｍであり、凹部の側壁の略垂直部分の垂直方向の長さが１７０μｍであり、凹部の開口部の形状が正方形であり、その内接円の直径が２６０μｍであり、凹部の底部が錐状であり、凹部の開口部の間隔が４０μｍである。
【００２９】
また、２つのポートが、凹部の側壁の略垂直部分に対して垂直方向に、培養容器の両端において対向して備えられている。
後述するように、この培養容器の凹部に直径２００μｍのスフェア等を入れて、培養容器の一方のポートから培地を注入し、他方のポートから培地を排出して、培地の流速を３ｍＬ／分等に制御した。その結果、樹脂ビーズが凹部から飛び出して他の凹部へ移動することは、観察されなかった。
【００３０】
ここで、本実施形態における培地の流速は、注入及び排出する培地量から計算され得るが、培養容器１０内における培地の実際の流速は、培養容器１０内の場所、及び液厚の変化によって異なる。すなわち、培養容器１０内ではポート１３付近の流速が最も早いため、この領域の凹部から培養対象物２が移動しないことが重要である。
また、天板部１２を押圧することによって液厚を小さくすればするほど、流速は早くなる。このため、このような場合でも、凹部から培養対象物２が移動しないことが重要である。
【００３１】
本実施形態の培養容器１０の材料としては、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン系樹脂などを好適に用いることができる。例えば、ポリエチレン、エチレンとα−オレフィンの共重合体、エチレンと酢酸ビニルの共重合体、エチレンとアクリル酸やメタクリル酸共重合体と金属イオンを用いたアイオノマー等を挙げることができる。また、ポリオレフィン、スチレン系エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、シリコーン樹脂等を用いることもできる。さらに、シリコーンゴム、軟質塩化ビニル樹脂、ポリブタジエン樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、塩素化ポリエチレン樹脂、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、スチレン系エラストマー、例えば、ＳＢＳ（スチレン・ブタジエン・スチレン）、ＳＩＳ（スチレン・イソプレン・スチレン）、ＳＥＢＳ（スチレン・エチレン・ブチレン・スチレン）、ＳＥＰＳ（スチレン・エチレン・プロピレン・スチレン）、ポリオレフィン樹脂、フッ素系樹脂等を用いてもよい。
【００３２】
また、培養対象物２をスフェアとする場合、本実施形態の培養容器１０内において、培養部１１には、スフェアやシングルセルが接着しないように、低接着性表面処理塗工を行うことが好ましい。具体的には、細胞接着抑制剤（細胞低接着処理剤）を塗布しておくことが好ましい。
細胞接着抑制剤としては、リン脂質ポリマー、ポリビニルアルコール誘導体、リン脂質・高分子複合体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、アルブミン等を用いることができる。また、これらを組み合わせて用いてもよい。
【００３３】
培養対象物２をスフェアとする場合、本実施形態の培養容器１０は、スフェアを形成する工程、スフェア状態を維持したまま培養して増殖させる工程、及びスフェア状態で分化誘導する工程等に用いることができる。
また、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞、その他幹細胞から既に分化誘導工程を経て得られた分化細胞を使用してスフェアを形成させる方法や、分化誘導した細胞を一度凍結保存し、再度解凍後にスフェアを形成する方法等において用いることもできる。
【００３４】
なお、天板部１２において、培養容器１０の内側に天板突起部を備えて、天板突起部の幅を凹部の開口部の幅よりも小さくし、かつ、天板突起部の高さを培養対象物２の最小径より小さくして、天板突起部が培養部１１の上端面１１１の一部に接触した場合に、上端面１１１と天板部１２に間隙が形成される構成とすることも好ましい。
【００３５】
本実施形態の培養容器１０をこのような構成にすれば、培養部１１の凹部に形状により、培地を１ｍＬ／分以上の流速で送液しても凹部間におけるスフェアの移動を防止可能であることに加え、例えばより迅速に培地交換を行う必要が生じた場合に、天板突起部を上端面１１１の一部に接触させて、培養対象物２のサイズよりも小さい間隙を上端面１１１と天板部１２に形成させた状態にすることができる。これにより、培地などの液状物を間隙から通液可能としつつ、スフェアなどの培養対象物の移動を防止することが可能となる。
【００３６】
また、本実施形態の培養装置は、図５に示すように、培養容器１０、積載台２０、ガイドピン２１、及び押圧板３０を備えている。また、この培養装置に、図２に示す培養容器１０ａを配置した例を図６に示す。
培養容器１０は積載台２０に配置され、その上面に接して押圧板３０が配置されている。積載台２０の四隅にはガイドピン２１が立設され、押圧板３０はこれらのガイドピン２１により垂直方向に移動可能に支持されている。
【００３７】
すなわち、押圧板３０の自重によって、培養容器１０を一定の圧力で押圧するように固定することができる。また、ガイドピン２１にバネ材を設置して、押圧板２０を培養容器１０に適宜押し付けることができる。これにより、培養容器１０への培地の注入又は排出に伴って、押圧板３０を垂直方向に移動可能とすることができる。
本実施形態の培養装置によれば、このような構成によって、培養容器１０における培地の流速をより適切に制御することが可能になっている。
【００３８】
以上説明したように、本実施形態の培養容器、培養方法、及び培養装置によれば、スフェアなどの培養対象物を収容するための複数の凹部が形成された培養部を有する培養容器において、培地を１ｍＬ／分以上の流速で送液しても、凹部間におけるスフェアなどの移動を防止することが可能になっている。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明の実施形態に係る培養容器の効果を確認するために行った試験について説明する。
【００４０】
（実施例１）
実施例１の培養容器として、凹部の深さが２５０μｍであり、凹部の側壁の略垂直部分の垂直方向の長さが１７０μｍであり、凹部の開口部の形状が正方形であり、その内接円の直径が２６０μｍであり、凹部の底部が錐状であり、凹部の開口部の間隔が４０μｍであり、凹部を５００００個備えた培養部を有するものを作成した。作成した培養容器の顕微鏡写真を図７に示す。同図の左の写真は培養容器の一部を示しており、右の写真はその一部を拡大したものである。
また、培養対象物として、擬似のスフェアと、実物のスフェアを準備した。擬似のスフェアは、直径が２００μｍに揃った樹脂ビーズであり、実物のスフェアは、ｉＰＳのスフェアで直径が約８０μｍのものである。
【００４１】
培地としてStemFit AK02N（品番RCAK02N，味の素株式会社）を使用して、培養容器内に充填した後、擬似のスフェアと実物のスフェアをそれぞれ別個に培養容器内に注入して全体に分散させ、凹部内に収容した。図８に、樹脂ビーズを入れて培地を送液している状態の顕微鏡写真を示す。また、図９に、ｉＰＳ細胞のスフェアを収容した状態の培養容器の顕微鏡写真を示す。
【００４２】
そして、ポートに取り付けたポンプを駆動させて、培地を０．２ｍＬ／分、１ｍＬ／分、３ｍＬ／分の３種類の流速で送液し、スフェアの移動が生じたか否かについて、顕微鏡を用いた目視観察によって確認した。
その結果、実施例１の培養容器では、擬似のスフェアと実物のスフェアの両方について、３種類の全ての流速において、スフェアの移動は生じなかった。
【００４３】
（参考例１）
参考例１の培養容器として、凹部の深さが５００μｍであり、凹部の側壁がアール状であり、凹部の開口部の形状が円形であり、その直径が１ｍｍであり、凹部の開口部の間隔が５０μｍであり、凹部を４０００個備えた培養部を有するものを準備した。
また、培養対象物として、実施例１と同様に、擬似のスフェアと、実物のスフェアを準備した。
【００４４】
実施例１と同様の培地を培養容器内に充填した後、擬似のスフェアと実物のスフェアをそれぞれ別個に培養容器内に注入して全体に分散させ、凹部内に収容した。
そして、ポートに取り付けたポンプを駆動させて、培地を０．２ｍＬ／分、１ｍＬ／分、３ｍＬ／分の３種類の流速で送液し、スフェアの移動が生じたか否かについて、顕微鏡を用いた目視観察によって確認した。
その結果、参考例１の培養容器では、擬似のスフェアと実物のスフェアの両方について、３種類の全ての流速において、スフェアの移動は生じなかった。
【００４５】
（比較例１）
比較例１の培養容器として、凹部の深さが２５０μｍであり、凹部の側壁がアール状であり、凹部の開口部の形状が円形であり、その直径が１ｍｍであり、凹部の開口部の間隔が５０μｍであり、凹部を４０００個備えた培養部を有するものを準備した。
また、培養対象物として、実施例１と同様に、擬似のスフェアと、実物のスフェアを準備した。
【００４６】
実施例１と同様の培地を培養容器内に充填した後、擬似のスフェアと実物のスフェアをそれぞれ別個に培養容器内に注入して全体に分散させ、凹部内に収容した。
そして、ポートに取り付けたポンプを駆動させて、培地を０．２ｍＬ／分、１ｍＬ／分、３ｍＬ／分の３種類の流速で送液し、スフェアの移動が生じたか否かについて、顕微鏡を用いた目視観察によって確認した。
その結果、比較例１の培養容器では、擬似のスフェアと実物のスフェアの両方について、３種類の全ての流速において、スフェアの移動が生じた。
【００４７】
（実施例２）
実施例２の培養容器として、凹部の深さが３０μｍであり、凹部の側壁の略垂直部分の垂直方向の長さが２０μｍであり、凹部の開口部の形状が正方形であり、その内接円の直径が２０μｍであり、凹部の底部が錐状であり、凹部の開口部の間隔が１０μｍであり、凹部を１０００００個備えた培養部を有するものを作成した。
また、培養対象物として、シングルセル（ヒトＴ細胞）を準備した。
【００４８】
実施例１と同様の培地を培養容器内に充填した後、Ｔ細胞を培養容器内に注入して全体に分散させ、凹部内に収容した。図１０に、Ｔ細胞を収容した培養容器の顕微鏡写真を示す。
そして、ポートに取り付けたポンプを駆動させて、培地を０．２ｍＬ／分、１ｍＬ／分、３ｍＬ／分の３種類の流速で送液し、シングルセルの移動が生じたか否かについて、顕微鏡を用いた目視観察によって確認した。
その結果、実施例２の培養容器では、３種類の全ての流速において、シングルセルの移動は生じなかった。
【００４９】
本発明は、以上の実施形態及び実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。例えば、細胞種や培養容器の大きさは実施例に示したものに限定されず、例えば５０万個〜１００万個のスフェアを形成可能な大きさのものにしたり、数１０００万個のシングルセルが培養可能な大きさにするなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、等間隔に配列された均一なサイズのスフェアを効率的に大量に作成する場合などに、好適に利用することが可能である。
【符号の説明】
【００５１】
１０  培養容器
１１  培養部
１２  天板部
１３  ポート
１４  チューブ
２０  積載台
２１  ガイドピン
３０  押圧板
【図１】
2020114191.tif 000003
【図２】
2020114191.tif 000004
【図３】
2020114191.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月10日(2020.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフェアを収容するための複数の凹部が形成された培養部を有する培養容器であって、少なくとも一つのポートが備えられ、前記凹部の深さが５０〜５００μｍであり、前記凹部の側壁の少なくとも一部が略垂直であり、前記側壁の略垂直部分の垂直方向の長さが、２５μｍより長いことを特徴とする培養容器。
【請求項２】
前記側壁の略垂直部分の垂直方向の長さが、スフェアの最大径の半分より長いことを特徴とする請求項１記載の培養容器。
【請求項３】
単一細胞を収容するための複数の凹部が形成された培養部を有する培養容器であって、少なくとも一つのポートが備えられ、前記凹部の深さが５〜５０μｍであり、前記凹部の側壁の少なくとも一部が略垂直であり、前記側壁の略垂直部分の垂直方向の長さが、３μｍより長いことを特徴とする培養容器。
【請求項４】
前記側壁の略垂直部分の垂直方向の長さが、単一細胞の最大径の半分より長いことを特徴とする請求項３記載の培養容器。
【請求項５】
軟包材からなることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の培養容器。
【請求項６】
バッグ形状であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の培養容器。
【請求項７】
前記側壁の略垂直部分に対して垂直方向に、培養容器の両端において対向して２つのポートが備えられたことを特徴とする請求項６記載の培養容器。
【請求項８】
前記凹部の底部が、錐体状、半球状、又はアール状であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の培養容器。
【請求項９】
請求項７記載の培養容器を用いて、一方のポートから培地を注入し、他方のポートから培地を排出して、培地の流速を制御することを特徴とする培養方法。
【請求項１０】
前記培地の流速を１ｍＬ／分以上に制御することを特徴とする請求項９記載の培養方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載の培養容器の上面に接して押圧板が備えられ、前記培養容器が前記押圧板により押圧され、前記押圧板が、前記培養容器への培地の注入又は排出に伴って垂直方向に移動可能であることを特徴とする培養装置。