(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳動物に提供された場合に、百日咳毒素特異的なTh1/Th17細胞応答を誘発し、かつワクチン接種者における百日咳菌(B.pertussis)の鼻咽頭定着及び保菌を低減させる、ワクチン組成物の提供。【解決手段】(i)遺伝学的に解毒された百日咳毒素(PT)、(ii)SEQ ID NO 1の一次アミノ酸を有する、遺伝学的に解毒された百日咳アデニル酸シクラーゼ毒素(ACT)、(iii)B.ブロンセプチカ(B.bronseptica)LOSの十二糖コアの構造、又は百日咳菌株186のLOSの脱アミノ化により得られた五糖ハプテンの構造、或いはスペーサーと末端アルデヒドとを備えた合成百日咳菌エピトープのLOS末端三糖の構造を有するオリゴ糖のうちの一つ又は複数、(iv)百日咳菌に対する防御細胞性応答を誘導するTLR-2アゴニストを含む、免疫原性百日咳菌ワクチン組成物。【選択図】図２
2020114838.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)  遺伝学的に解毒された百日咳毒素(PT)；
(ii)  SEQ ID NO 1の一次アミノ酸を有する、遺伝学的に解毒された百日咳アデニル酸シクラーゼ毒素(ACT)；
(iii)  以下の式1、式2、または式3のオリゴ糖のうちの一つまたは複数
2020114838.tif 000008
；および
(iv)  百日咳菌に対する防御細胞性応答を誘導するTLR-2アゴニスト
を含む、免疫原性百日咳菌ワクチン組成物であって、
哺乳動物に提供された場合に、
百日咳毒素特異的なTh1/Th17細胞応答を誘発し；かつ
ワクチン接種者における百日咳菌(B. pertussis)の鼻咽頭定着および保菌を低減させる、ワクチン組成物。
【請求項２】
前記遺伝学的に解毒された百日咳毒素(PT)が大腸菌(E. coli)において産生される、請求項1に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
遺伝学的に解毒された百日咳毒素(PT)が百日咳菌において産生される、請求項1に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
(i)  遺伝学的に解毒された百日咳毒素(PT)；
(ii)  SEQ ID NO 1の一次アミノ酸を有する、遺伝学的に解毒された百日咳アデニル酸シクラーゼ毒素(ACT)；
(iii)  以下の式1、式2、または式3のオリゴ糖のうちの一つまたは複数
2020114838.tif 000009
；および
(iv)  百日咳菌に対する防御細胞性応答を誘導するTLR-2アゴニスト
を含む、オリゴ糖結合体。
【請求項５】
式3の五糖が、合成されたものであるかまたは百日咳菌LOSの脱アミノ化産物である、請求項4に記載の結合体。
【請求項６】
百日咳菌によって引き起こされる疾患を予防するために哺乳動物を免疫化する百日咳ワクチン製剤を調製するための、請求項1〜3のいずれか一項に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項７】
百日咳菌の鼻咽頭定着および保菌を低減させるために哺乳動物を免疫化する百日咳ワクチン製剤を調製するための、請求項1〜3のいずれか一項に記載のワクチン組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への参照
本出願は、2015年4月16日に出願された米国仮特許出願番号第62/148,529号の優先権を主張し、これは具体的にかつ全体として参照により組み入れられる。
【０００２】
1.発明の分野
本発明は、百日咳菌(Bordetella pertussis)の治療および予防における組成物、ワクチン、ツール、および方法に向けられている。とりわけ、本発明は、必須ではないワクチン成分の除去、未変性の遺伝学的に解毒された変異体の使用、および病原性因子の添加を含む三方向からのアプローチに向けられている。
【背景技術】
【０００３】
2.発明の背景
1940年代後半の全細胞百日咳(wP)ワクチンの導入により百日咳の発生率およびその感染症により引き起こされる死亡例の両方が迅速に低減した。しかしながら、これらのワクチンによる成功は安全性の問題への懸念から徐々に失われた。こうして、多くの先進国では1990年代後半に、無細胞百日咳(aP)ワクチンに取って代わられた(1)。それ以来、百日咳症例は増加し、劇的な流行周期が再開した。2012年には、48,277例の百日咳症例および18例の死亡例が疾病対策センター(CDC)に報告された。これは米国における百日咳の60年間で最大の負荷であり、かつ他の国でも同様の大流行が起こっている(2〜4)。しかしながら、現代の百日咳の疫学はワクチン以前の時代の再現ではない。疾患は今や幼児および年長の小児(9〜19歳)においてより多く起こり、かつ驚くべきことに、このような年長の小児は多くの場合、現行の勧告に従ってきちんとワクチン接種を受けていてなお百日咳を発症している(5、6)。不吉なことに、aPワクチンへの移行中に生まれかつワクチン接種を受けた小児における百日咳発生率を解析した研究により、感染率が、wPワクチンで一回でもワクチン接種を受けた小児と比較して、aPワクチンのみでワクチン接種を受けた小児で有意に高いことが発見された(7)。この群での感染の増大と闘うために、規制機関は追加免疫を早めに受けるよう呼びかけた(8)。百日咳の再出現が単に、免疫の減弱に由来するのか、またはwPワクチンもしくは自然感染と比べてaPワクチンによって誘導される免疫応答の性質が根本的に違うことに由来するのか不明なため、aPワクチンによる追加免疫の恩恵は、どうひいき目にみても不明確である。
【０００４】
年長の小児また成人での疾患の発生率の増加は、非免疫化幼児または不完全免疫化幼児への伝染の危険性に相当するため、とりわけ厄介である(9)。この問題を悪化させることに、大抵の診断がなされる頃までには抗生物質治療は最小限の効能しか有さず、かつ重症例は人工呼吸などの呼吸困難に対する標準的な療法に対して無応答性であることもある(10)。このような世界規模の公衆衛生問題としての百日咳の再出現により数多くの課題が提示される。例えば、許容可能な安全性プロファイルを有し、持続性の免疫を提供し、感染負荷を低減し、かつ伝染を予防するワクチンが必要である。脆弱集団における疾病率および死亡率を低減させる治療剤および治療戦略も必要である(11)。明らかに、改良された百日咳ワクチンへの強い必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、現行の戦略およびデザインに関連する問題と短所を克服し、百日咳菌および関連生物による感染症の治療および予防のための新たなツール、組成物、および方法を提供する。
【０００６】
本発明の一つの態様は、遺伝学的に解毒された百日咳毒素(PT)；遺伝学的に解毒された百日咳アデニル酸シクラーゼ毒素(ACT)；担体タンパク質または担体ペプチドに付けられた内毒素の抗原決定基の一つまたは複数を有する、百日咳菌(B pertussis)のリポオリゴ糖に由来する免疫原性オリゴ糖またはその断片；百日咳菌に対する防御細胞性応答を誘導するTLRアゴニストを含む、免疫原性百日咳菌ワクチン組成物であって、哺乳動物に提供された場合に、百日咳菌に対する抗毒素中和抗体を産生し；百日咳菌に対する直接殺菌性抗体を産生し；百日咳毒素特異的なTh1/Th17細胞応答を誘発し；好中球の動員を可能にするIFN-δおよびIL-17サイトカインを生成し；かつワクチン接種者における百日咳菌(B. pertussis)の鼻咽頭定着および保菌を低減させる、ワクチン組成物に向けられている。好ましくは、前記遺伝学的に解毒された百日咳毒素は大腸菌(E. coli)において産生される。さらに好ましくは、遺伝学的に解毒された百日咳毒素変異体が百日咳菌において産生される。好ましくは、前記遺伝学的に解毒されたAC毒素はSEQ ID NO 1の一次アミノ酸を有する。好ましくは、本発明のワクチンは、百日咳菌に対する抗PTおよび抗ACT中和抗体ならびに殺菌性抗体の産生を誘導する。
【０００７】
本発明の別の態様は、遺伝学的に解毒された百日咳毒素(PT)；遺伝学的に解毒された百日咳アデニル酸シクラーゼ毒素(ACT)；担体タンパク質または担体ペプチドに付けられた内毒素の抗原決定基の一つまたは複数を有する、百日咳菌のリポオリゴ糖に由来する免疫原性オリゴ糖またはその断片；百日咳菌に対する防御細胞性応答を誘導するTLRアゴニストを含む、オリゴ糖結合体に向けられている。好ましくは、前記オリゴ糖は、図2の式1、式2、または式3のオリゴ糖のうちの一つまたは複数を含む。さらに好ましくは、式3の五糖は合成されたものであるかまたは百日咳菌LOSの脱アミノ化産物である。好ましくは、前記オリゴ糖は、百日咳菌のLOSに由来するオリゴ糖(OS)またはその断片および百日咳菌に由来する解毒された毒素(dPT)を含み、かつ前記オリゴ糖は、百日咳菌のLOSに由来するオリゴ糖(OS)またはその断片および百日咳に由来する解毒された毒素(dACT)を含む。好ましくは、前記TLRアゴニストはTLR-2、TLR-4、またはTLR-8である。
【０００８】
本発明の別の態様は、百日咳菌によって引き起こされる疾患を予防するために請求項1に記載のワクチンで哺乳動物を免疫化する方法に向けられている。
【０００９】
本発明の別の態様は、百日咳菌の鼻咽頭定着および保菌を低減させるために請求項1に記載のワクチンで哺乳動物を免疫化する方法に向けられている。
【００１０】
[本発明1001]
遺伝学的に解毒された百日咳毒素(PT)；遺伝学的に解毒された百日咳アデニル酸シクラーゼ毒素(ACT)；担体タンパク質または担体ペプチドに付けられた内毒素の抗原決定基の一つまたは複数を有する、百日咳菌(B pertussis)のリポオリゴ糖に由来する免疫原性オリゴ糖またはその断片；百日咳菌に対する防御細胞性応答を誘導するTLRアゴニスト
を含む、免疫原性百日咳菌ワクチン組成物であって、
哺乳動物に提供された場合に、
百日咳菌に対する抗毒素中和抗体を産生し；
百日咳菌に対する直接殺菌性抗体を産生し；
百日咳毒素特異的なTh1/Th17細胞応答を誘発し；
好中球の動員を可能にするIFN-δおよびIL-17サイトカインを生成し；かつ
ワクチン接種者における百日咳菌(B. pertussis)の鼻咽頭定着および保菌を低減させる、ワクチン組成物。
[本発明1002]
前記遺伝学的に解毒された百日咳毒素が大腸菌(E. coli)において産生される、本発明1001のワクチン。
[本発明1003]
遺伝学的に解毒された百日咳毒素変異体が百日咳菌において産生される、本発明1001のワクチン。
[本発明1004]
前記遺伝学的に解毒されたAC毒素がSEQ ID NO 1の一次アミノ酸を有する、本発明1001のワクチン。
[本発明1005]
百日咳菌に対する抗PTおよび抗ACT中和抗体ならびに殺菌性抗体の産生を誘導する、本発明1001のワクチン。
[本発明1006]
遺伝学的に解毒された百日咳毒素(PT)；遺伝学的に解毒された百日咳アデニル酸シクラーゼ毒素(ACT)；担体タンパク質または担体ペプチドに付けられた内毒素の抗原決定基の一つまたは複数を有する、百日咳菌のリポオリゴ糖に由来する免疫原性オリゴ糖またはその断片；百日咳菌に対する防御細胞性応答を誘導するTLRアゴニスト
を含む、オリゴ糖結合体。
[本発明1007]
前記オリゴ糖が、図2の式1、式2、または式3のオリゴ糖のうちの一つまたは複数を含む、本発明1006の結合体。
[本発明1008]
式3の五糖が、合成されたものであるかまたは百日咳菌LOSの脱アミノ化産物である、本発明1007の結合体。
[本発明1009]
前記オリゴ糖が、百日咳菌のLOSに由来するオリゴ糖(OS)またはその断片および百日咳菌に由来する解毒された毒素(dPT)を含む、本発明1006の結合体。
[本発明1010]
前記オリゴ糖が、百日咳菌のLOSに由来するオリゴ糖(OS)またはその断片および百日咳に由来する解毒された毒素(dACT)を含む、本発明1006の結合体。
[本発明1011]
前記TLRアゴニストがTLR-2、TLR-4、またはTLR-8である、本発明1006の結合体。
[本発明1012]
百日咳菌によって引き起こされる疾患を予防するために本発明1001のワクチンで哺乳動物を免疫化する方法。
[本発明1013]
百日咳菌の鼻咽頭定着および保菌を低減させるために本発明1001のワクチンで哺乳動物を免疫化する方法。
本発明の他の態様および長所の一部は、以下の説明に記載されており、かつ一部は以下の説明から明らかであり得るかまたは本発明の実践から習得され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】百日咳菌の解毒されたアデニル酸シクラーゼ毒素の配列ID No 1のアミノ酸配列を示している。
【図２】B. ブロンセプチカ(B. bronseptica) LOSの十二糖コアの構造(式1)；百日咳菌株186のLOSの脱アミノ化により得られた五糖ハプテンの構造(式2)；および、スペーサーと末端アルデヒドとを備えた合成百日咳菌エピトープのLOS末端三糖の構造(式3)を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の説明
年長の小児での、および成人でも疾患の発生率の増加は警戒すべきことである。この問題を悪化させることに、大抵の診断がなされる頃までには抗生物質治療は最小限の効能しか有さず、かつ重症例は呼吸困難に対する標準的な療法に対して無応答性であることもある。このような世界規模の公衆衛生問題としての百日咳の再出現により数多くの課題が提示される。許容可能な安全性プロファイルを有し、持続性の免疫を提供し、感染負荷を低減し、かつ伝染を予防するワクチンが必要である。
【００１３】
三方向からのアプローチによって百日咳ワクチン治療が新しく作り出せることは驚くべき発見であった。段階1は、必須ではないワクチン成分の除去を含む。段階2は、未変性の遺伝学的に解毒された変異体を使用して必須の成分PTxを改良することを含み、その一つは、低(1/5)用量で、化学的に修飾されたPTxよりも良い免疫原であることが示されている(12、13)。段階3は、免疫応答を広幅化するためにアデニル酸シクラーゼ毒素およびリポオリゴ糖結合体などの病原性因子を添加することを含む(21、22)。この3つ目の段階は以下を提供する：(i)抗タンパク質抗体。ワクチンおよび疾患誘導IgG抗タンパク質は、最大レベルが2〜5年間で約10分の1に低下するようにその持続期間が終わりに近づく(14〜17)；(ii)年長の小児および成人は、その有害反応のために全細胞性百日咳ワクチンで免疫化されなかったため、多数の免疫のない個体が残された(18)；(iii) Alison Weissによると「無細胞百日咳ワクチンによる成人の追加免疫は予備免疫レベルより殺菌活性を増加させないことが見出された。殺菌性免疫応答を促進することにより百日咳ワクチンの効能を改善できる」(19)；ならびに(iv)百日咳ワクチンの一次作用は貪食細胞上のPTの不活性化作用を妨げる血清IgG抗毒素免疫であり、それにより、百日咳菌をオプソニン化することが可能になる、すなわち、無細胞ワクチンまたは全細胞ワクチンにより誘発された抗体が直接病原体を殺すわけではない。咳を減らし、よって易感染性集団への百日咳菌の伝染を減少させる、百日咳ワクチンの「群集」免疫効果も存在する。広く行き渡っているジフテリアトキソイドによる免疫化により誘導される効果と同様に、抗毒素のこのような間接的な効果が、両方のワクチンについて個体ベースでの不完全な免疫(およそ71%)の原因である。グラム陰性病原体の表面多糖に対するワクチン誘導IgG抗体が殺菌効果と免疫を誘導することから、百日咳菌のリポオリゴ糖(LOS)はワクチンの成分となる可能性がある(20)。これは、滅菌的免疫応答を産生するのにより効果的であり得、かつ保菌を低減させ、よって疾患の発生率を低減させる。百日咳菌の内毒素は典型的なO抗原を欠いており、よってリポオリゴ糖を構成する。百日咳菌LOSはリピドA、コアオリゴ糖、および単一のオリゴ糖ユニットである末端三糖により構成されている(52、53)。百日咳菌株の中には末端三糖を持たないLOSを有する株もあるが、それらはより低い病原性を示す。
【００１４】
百日咳菌はいくつかの毒素を分泌するが、そのうちの一つのアデニル酸シクラーゼ毒素(ACT)は感染後にしか現れない。百日咳(whooping cough)菌が気管支の細胞に付着すると菌内の遺伝子のスイッチが入り、その結果、免疫系に対する力場のように作用するACT毒素が産生される。ACTは免疫系が百日咳菌を認識するのを妨げ、約2週間、免疫系が騙されたという事実に気付くまで百日咳菌に有利な立場を与える。自然な状態での百日咳免疫の場合、ACTすなわちアデニル酸シクラーゼ毒素が初期の免疫応答の基盤を形成する。最前線の免疫応答は、初回の百日咳菌を排除するのに決定的に重要なだけではなく、その後の感染の際に百日咳菌を除去するのにも極めて重要である。ワクチン接種を受けているかどうかに関わらず、菌が循環している時には感染した個体で定着が見られる。ワクチン接種を受けた個体でより長く定着が保たれ、かつある程度の咳が出ることが多いという違いにより百日咳の蔓延がもたらされる。自然な状態での免疫では、体はACTに対して非常に強く反応するが、ワクチン接種を受けた個体は、抗原原罪(33)およびワクチン中にACTが存在しないために、ACTに対して反応するように全くプログラムされていない。今のところまだその抗原がワクチンに入っていないため、ワクチンはこの毒素に対する抗体を増加させない。自然な状態での回復期血清は、百日咳感染後に測定してDTaP接種者が有する量に比べて17倍超のACTに対する抗体を有し、DTPワクチン接種者が有する量に比べて9倍超のACTに対する抗体を有する(23)。百日咳菌アデニル酸シクラーゼ溶血素(AC-Hly)は標的細胞に直接侵入し細胞内cAMPを上昇させることでその正常機能を低下させる。精製した百日咳菌AC-HlyまたはAC(アデニル酸シクラーゼ活性だけは保持するがインビトロで毒素活性を保持しないAC-Hly分子の断片)による能動免疫化は、マウスを百日咳菌の鼻内感染から防御する(50)。AC-HlyまたはACによる免疫化は、マウス気道の菌の定着期間を有意に短縮する。さらに、パラ百日咳菌(B. parapertussis)のAC-HlyまたはACも、パラ百日咳菌の定着に対する防御抗原であり；その防御活性は全細胞ワクチンのそれと同等である(50)。マウスモデルでは、AC-Hlyがボルデテラ属の病原性において重要な役割を果たしている可能性がある。この因子がヒトの疾患においても同様な役割を果たしているならば、防御抗原としてのその使用は疾患の発生率を低減させ得るだけではなく、保菌を制限することで無症候性ヒト宿主も低減し得る。したがって、本発明の課題は、より有効な百日咳菌ワクチン製剤にACTを添加することである。
【００１５】
ワクチンのアジュバントは開発されているが、安全性についての根本的な懸念から、幼児での使用が想定されている第三世代百日咳ワクチンへのその導入は困難になっている。それでも、若者および成人を対象としたアジュバント、抗原送達系、および百日咳ワクチンの投与経路は、研究を正当化する。
【００１６】
本発明は、Th1/th17細胞応答へ免疫応答を偏向させるアジュバントを含有するワクチンで若者および成人を免疫化するための方法も含む。無細胞百日咳ワクチン(aP)はミョウバンに吸収された個々の百日咳菌抗原により構成され、かつ強い抗体、Th2およびTh17応答を促進するが、Th1細胞により媒介される細胞性免疫を誘導する効果は弱い。対照的に、全細胞百日咳ワクチン(wP)は内在性のToll様受容体(TLR)アゴニストを含み、Th17応答だけではなくTh1応答も誘導する。百日咳菌に由来する新規TLR2活性化リポタンパク質が同定および特徴づけられた(24)。このようなタンパク質はグラム陰性菌に特有の特徴的なN末端シグナルペプチドを含有し、かつ我々はこのようなリポタンパク質のうちの一つ、BP1569がTLR2を介してマウスの樹状細胞およびマクロファージならびにヒトの単核細胞を活性化することを実証する。強力な免疫賦活性およびアジュバント特性を伴う、相当する合成リポペプチドLP1569は、実験的Paによってマウスに誘導されるTh1、Th17、およびIgG2a抗体応答を亢進させることができ、百日咳菌感染に対して、ミョウバンとともに製剤化された同等のワクチンより優れた防御を付与した(24)。
【００１７】
小児でのT細胞応答の解析から、PwがTh1細胞を優先的に誘導するのに対し、PaがTh2型応答を促進することが実証された(25、26)。マウスでwPにより誘導された優れた長期的防御は、抗体応答が有意に減弱した時、強力なTh1応答の誘導と関連していたことも報告されていた(27)。さらに最近には、自然感染またはwPによる免疫化により誘導された防御において、Th17細胞も役割を果たしていることが報告されていた(28〜31)。
【００１８】
遺伝学的に解毒された百日咳毒素(dPT)は入手可能であり、かつワクチン開発に適した百日咳毒素の変異体は入手可能である(43、44a、44b)。dPTにより誘導されるTh17増殖は、PI3K経路により逆調節されている。その特性および百日咳でワクチンAgとしてヒトで既に使われていることから、dPTは、Th1/Th17が宿主免疫を媒介している感染性疾患に対するワクチンにおいて防御免疫応答を助長するための妥当な候補アジュバントであり得る(45)。例えば、百日咳毒素変異体、そのような変異体を産生できるボルデテラ株、および抗百日咳ワクチンの開発におけるそれらの使用が米国特許第7,666,436号に記載されている。百日咳毒素(PT)変異体は免疫学的に活性でありかつ毒性が低減しているかまたは毒性がないと記載されており、サブユニットS1のアミノ酸配列のアミノ酸残基Glu129、Asp11、Trp26、Arg9、Phe50、Asp1、Arg13、Tyr130、Gly86、Ile88、Tyr89、Tyr8、Gly44、Thr53、およびGly80の少なくとも一つが欠失して天然アミノ酸群内で選択された異なるアミノ酸残基により置換されていることで特徴づけられる。
【００１９】
前記PT変異体を提供および分泌可能なボルデテラ株ならびにそれらを入手するための手段および方法も記載されている。前記ボルデテラ株および該ボルデテラ株により産生されるPT変異体は有効な全細胞性および無細胞抗百日咳ワクチンの調製に特に適している。
【００２０】
アデニル酸シクラーゼ毒素は百日咳菌によって(および他の近縁のボルデテラ種によっても)分泌されるもう一つの重要な病原性因子である。この毒素は免疫原性タンパク質でありかつ防御免疫応答を誘発できるが、無細胞百日咳ワクチンの成分としては含まれていなかった。ACTは、アミノ末端のおよそ400アミノ酸のアデニル酸シクラーゼ(AC)ドメインおよび大腸菌の溶血素と有意な相同性を有するおよそ1300アミノ酸の膜孔形成毒素中反復配列(repeat in toxin)(RTX)溶血素ドメインからなる。ACTは、CyaBDEタンパク質により形成されるI型分泌「チャネル・トンネル」機構により百日咳菌から分泌され、そしてその後、CyaCアシル基転移酵素により媒介される、溶血素ドメイン中の2つの特定のリジン残基の脂肪酸アシル化により修飾される(35)。マウスモデルでの研究からACTが百日咳菌感染症に対する重要な病原性因子であることが確立された(36〜38)。AC触媒活性がない百日咳菌の点変異体は、マウス新生仔に対して野生型の菌に比べて病原性が1000分の1よりも低かったことにより、百日咳の病原性におけるAC毒素の重要性が直接実証された。同様に、HLYを欠く百日咳菌のインフレーム欠失変異体は同じく非病原性であり、HLYドメインがAC毒素の細胞への進入において決定的に重要な役割を果たすという観察を支持する。さらに、点変異体により産生される遺伝学的に解毒されたAC毒素は、天然の毒素と抗原性について類似している。この株は百日咳成分ワクチンの開発において有用であり得る(37)。PTおよびACTを欠損した変異体を用いた結果、感染部位に存在していたら、PTが早期に作用して好中球流入を阻害し、かつACTは後期に作用して好中球(および他の動員細胞)を中毒させるということが提唱されている(39)。アデニル酸シクラーゼ毒素に対する中和抗体は、ヒト好中球による百日咳菌の貪食を促進する(40)。AC-HlyまたはACによる免疫化は、百日咳菌だけではなく他のヒト病原体ボルデテラ属についてもその肺定着を予防できかつ無症候性保菌を低減できると考えられる。百日咳菌のアデニル酸シクラーゼ(AC)毒素は、触媒ドメイン、疎水性ドメイン、グリシン／アスパラギン酸に富む反復配列ドメイン、および分泌シグナルドメインという4つの主なドメインからなる、177kDaの毒素中反復配列(repeats-in-toxin)(RTX)ファミリーのタンパク質である(41)。百日咳菌のAC毒素は、大腸菌において、遺伝学的に解毒された組換え型として産生できる。このような組換え毒素は、pTRACGプラスミドから派生した発現ベクターを用いて、とりわけ大腸菌BL株(Novagen, Madison, WI)において産生できる(42)。
【００２１】
好ましい態様において、百日咳ワクチン製剤は遺伝学的に解毒された組換え百日咳毒素(rPT)を含む。全てのaPワクチンに存在する主要な病原性因子であるPTの予備刺激は、表面エピトープの最大80%が除去される産生の間に用いられる化学的(特にホルムアルデヒド)解毒プロセスのために誤った方法に向けられ得る。化学的解毒は、PTの免疫原性を低減し、かつ抗原原罪すなわちPTワクチンエピトープに対して免疫記憶が利用されて、その後の投与／曝露に応じて野生型株に対して無効な抗体を産生することにつながる可能性がある(32〜34)。
【００２２】
別の好ましい態様は、dPTに加え解毒されたアデニル酸シクラーゼ毒素(dACT)を含むワクチンに向けられている。PTは、植菌後最初の24〜48時間の間感染部位への好中球の流入を遅らせることにより、百日咳菌感染の初期の重要な役割を果たし、その後ACTが、菌と動員好中球との相互作用後、動員好中球を中毒させることに重要な役割を果たす。ACTは好中球上に存在するCD11b/CD18インテグリン受容体との結合後効率的に細胞に進入し、かつ好中球の活性に有害な作用を有することが公知であり、近縁の病原体である気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica)についての研究の結果、ACTが感染を促進するにあたっての主要な標的細胞として好中球が同定された。したがってこれらの毒素は、好中球の動員および活性に対して、百日咳菌による最適な感染および気道定着に必須であるダブルパンチを提供すると考えられる。
【００２３】
別の態様において、本発明は、滅菌的免疫応答を産生するのに効果的である殺菌性抗体を生成するための、および保菌を低減させてその結果疾患の発生率を低減させるためのリポオリゴ糖結合体を含む。別の好ましい態様において、ワクチンは、担体タンパク質または担体ペプチドに結合している内毒素の抗原決定基の一つまたは複数を有する、百日咳菌のリポオリゴ糖内毒素に由来するコアオリゴ糖を含む。
【００２４】
別の態様において、本発明は、免疫応答をTh1/Th17細胞応答に向き変えて百日咳菌に対する防御細胞免疫を媒介するために、Toll様受容体(TLR)、好ましくはTLR4またはTLR2アゴニストをアジュバントとして含む、百日咳ワクチン製剤を提供する。遺伝学的に解毒された百日咳毒素(dPT)により誘導されるTh17増殖がPI3K経路により逆調節されていることは証拠から示されている。その特性および百日咳でワクチンAgとしてヒトで既に使われていることから、dPTは、Th1/Th17が宿主免疫を媒介している感染性疾患に対するワクチンにおいて防御免疫応答を助長するための妥当な候補アジュバントであり得る(45)。
【００２５】
以下の実施例により本発明の態様を説明するが、本発明の範囲を限定すると見なされるべきではない。
【実施例】
【００２６】
実施例1  cyaA変異体の構築
cyaAの2.7キロベース(kb)のBamHI-EcoRI断片をpUC19にサブクローニングしてcyaA変異体を構築し、大腸菌で発現させた(47)。cyaAのBcl I部位にpUC4-KIXX (Pharmacia)に由来する1.6kbのBamHIカナマイシン耐性カセットを挿入することにより、具体的に変異を導入されるcyaAの2つの領域からおよそ等距離に選択可能マーカーを保持する変異cyaA断片を作成した。記載されているように(47)、cyaAの58位のリジンをメチオニンに置換するオリゴヌクレオチド指定突然変異を行って、AC点変異株A2-6の作成に用いる変異cyaA断片を産生した。cyaAの1047塩基対のpflMI断片を切り出しかつ再連結することにより、cyaA毒素のアミノ酸469〜817を欠くHLY欠失変異株32-5の作成に用いる変異cyaA断片を産生した。次いで変異cyaA断片の全てをpUC19から切り出し、かつそれをcyaAの直接上流に由来する追加的な2kbのBamHI断片を保持する組換えpSS1129ベクターに適切な向きで連結した。百日咳菌の変異株は、Stibitz et al. (48)の方法に従って、このような組換えpSS1129ベクターの接合伝達および遺伝的組換えのセレクションにより作成した。AC変異cyaA遺伝子またはHLY変異cyaA遺伝子の対立遺伝子交換を2段階法で成し遂げ、遺伝的組換えがcyaA遺伝子の外側で起こらなかったことを確実にした。最初に、染色体性cyaAに、百日咳菌へのカナマイシン耐性挿入変異の相同組換えにより選択可能な表現型で目印をつけ、AC株およびHLY株を作成した(S7c2)。2回目のサイクルで、目印をつけた染色体性遺伝子をAC点変異またはHLY欠失変異のいずれかで置き換えた。適切な部位での組換えであることは、表現型解析およびサザンブロット解析(49)または免疫ブロット解析のいずれかにより確認した。百日咳菌の解毒されたCyaA変種配列のアミノ酸配列を図1に示す。
【００２７】
実施例2  オリゴ糖結合体の構築
百日咳菌内毒素および気管支敗血症菌(B. bronchiseptica)のオリゴ糖結合体は殺菌性抗体を誘導し、百日咳ワクチンの添加物であり、そのような結合体は容易に調製および標準化される。組換え百日咳トキソイドに添加されると、それらは抗菌免疫および抗毒素免疫を誘導し得る(20、46)。内毒素コアオリゴ糖は、百日咳菌Tohama IおよびTax 113のそれと類似している気管支敗血症菌RB50 LPSコアOS構造から、O-SPという付加的成分とともに入手可能である。そのO-SP(一般的に「バンドA」と呼ばれる)を欠いた気管支敗血症菌RB50の十二糖コア(図2A)は、Bio-Gel P-4カラムでの分離、活性化、および担体タンパク質への結合を容易に行うことができる。気管支敗血症菌は百日咳菌より生育が容易であることから、内毒素コアオリゴ糖を入手するにあたって合理的な産生株でもある。
【００２８】
実施例3  五糖の構築
結合体の五糖部分は百日咳菌186のLOSから単離された断片であり、かつ末端三糖、七炭糖、およびアンヒドロマンノースを含む。五糖TTd結合体は、免疫蛍光測定法(FACS)で百日咳菌に結合できた抗体を誘導できる。百日咳菌株186由来のリポオリゴ糖の末端五糖は、熱フェノール水法による菌細胞の抽出の結果生成でき、超遠心分離法により精製できる(51)。前記五糖は、亜硝酸での処理によりLOSから選択的に切断できる。簡潔には、リポオリゴ糖(50mg)を、水、5%亜硝酸ナトリウム、および30%酢酸(1:1:1、容量/容量/容量)を含有する新たに調整された溶液(180ml)中に懸濁し、25℃で4時間放置して、その後、超遠心分離法を行った(200,000g、2時間)。上清を凍結乾燥し、かつ産物をBio-Gel P-2 (Bio-Rad)のカラムで精製して、10mgの五糖(その構造は図2(式2)に示されている)を得、MALDI-TOF MSおよびNMR分光法により解析した。
【００２９】
実施例4  免疫原性のオリゴ糖−タンパク質結合体の形成
末端アルデヒドまたは他の適切な官能基を伴うスペーサーリンカーを備えた図2(式3)に示された構造の合成三糖(末端三糖残基A、D、E)を、百日咳菌LOSとインビボで相互作用して、凝集、貪食、および殺菌、ならびにLOSの内毒素活性の中和を促進すると考えられる、そのような三糖に対する抗体を産生させるために、結合体免疫原とともに調製した。
【００３０】
十二糖(図2)または五糖または末端三糖(図2)のいずれかまたは全ての免疫原性のオリゴ糖−タンパク質結合体の形成では、還元末端KDO残基または五糖の2,5アンヒドロマンノースの還元的アミノ化(リンカー有りまたは無し)による直接結合および担体タンパク質の第一アミノ基との縮合により担体タンパク質に結合される。あるいは、本発明の免疫原性結合体は、担体タンパク質の第一アミノ基と容易に縮合するカルボキシレート中間体を形成するカルボジイミド処理によるオリゴ糖の直接結合により調製されてもよい。好ましい担体タンパク質としては、CRM、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、コレラ毒素サブユニットB、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)外膜タンパク質、ニューモリソイド(pneumolysoid)、B群連鎖球菌(group B Streptococcus)由来のC-βタンパク質、B群連鎖球菌由来の非IgA結合C-βタンパク質、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)トキソイド、百日咳トキソイド、リジンまたはシステイン残基を含有する合成タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。担体タンパク質は天然タンパク質であっても、化学的に修飾されたタンパク質であっても、解毒されたタンパク質であっても、または組換えタンパク質であってもよい。本発明に従って調製された結合体分子は、タンパク質成分に関して、単量体であっても、二量体であっても、三量体であっても、およびより高度に架橋結合した分子であってもよい。
【００３１】
本発明の他の態様および使用は、本明細書および本明細書に記載される本発明の実践の検討に基づき当業者には明らかであると考えられる。全ての刊行物ならびに全ての米国および外国の特許および特許出願を含む本明細書に引用される全ての参考文献は、具体的にかつ全体として参照により組み入れられる。含む(comprising)という用語は、使われる場合常に、からなる(consisting of)、および、から本質的になる(consisting essentially of)という用語を含むことを意図する。さらに、含む(comprising)、含む(including)、および、含有する(containing)という用語は、限定することを意図しない。本明細書および実施例は、添付の特許請求の範囲によって示される本発明の真の範囲および精神とともに、単なる例として見なされることが意図される。
【００３２】
参考文献
2020114838.tif 000003
2020114838.tif 000004
2020114838.tif 000005
2020114838.tif 000006
2020114838.tif 000007
【図１】
2020114838.tif 000010
【図２】
2020114838.tif 000011
【配列表】
2020114838000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月22日(2020.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝学的に解毒された百日咳毒素(PT)；SEQ ID NO 1に記載のアミノ酸配列を有する遺伝学的に解毒された百日咳アデニル酸シクラーゼ毒素(ACT)；担体タンパク質または担体ペプチドに結合した一つまたは複数の抗原決定基を有する、百日咳菌(B pertussis)のリポオリゴ糖に由来する免疫原性オリゴ糖またはその断片；および百日咳菌に対する防御細胞性応答を誘導するTLRアゴニスト
を含む、免疫原性百日咳菌ワクチン組成物であって、
哺乳動物に提供された場合に、
百日咳菌に対する抗毒素中和抗体を産生し；
百日咳菌に対する直接殺菌性抗体を産生し；
百日咳毒素特異的なTh1/Th17細胞応答を誘発し；
好中球の動員を可能にするIFN-δおよびIL-17サイトカインを生成し；かつ
ワクチン接種者における百日咳菌(B. pertussis)の鼻咽頭定着および保菌を低減させる、ワクチン組成物。
【請求項２】
前記遺伝学的に解毒された百日咳毒素が大腸菌(E. coli)、百日咳菌または気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica)において産生される、請求項1に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
遺伝学的に解毒された百日咳毒素が百日咳菌、気管支敗血症菌または大腸菌において産生される百日咳毒素の変異体を含む、請求項1に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記遺伝学的に解毒されたAC毒素が大腸菌、百日咳菌または気管支敗血症菌において産生される、請求項1に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
百日咳菌に対する抗PTおよび抗ACT中和抗体ならびに殺菌性抗体の産生を誘導する、請求項1に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
遺伝学的に解毒された百日咳毒素(PT)；SEQ ID NO 1に記載のアミノ酸配列を有する遺伝学的に解毒された百日咳アデニル酸シクラーゼ毒素(ACT)；担体タンパク質または担体ペプチドに結合した一つまたは複数の抗原決定基を有する、百日咳菌のリポオリゴ糖に由来する免疫原性オリゴ糖またはその断片；および百日咳菌に対する防御細胞性応答を誘導するTLRアゴニスト
を含む、オリゴ糖結合体。
【請求項７】
前記オリゴ糖が、B. ブロンセプチカ(B. bronseptica) LOSの十二糖コアの構造、百日咳菌株186のLOSの脱アミノ化により得られた五糖ハプテンの構造、および、スペーサーと末端アルデヒドとを備えた合成百日咳菌エピトープのLOS末端三糖の構造からなる群より選択される、請求項6に記載の結合体。
【請求項８】
前記スペーサーと末端アルデヒドとを備えた合成百日咳菌エピトープのLOS末端三糖の構造が、合成されたものであるかまたは百日咳菌LOSの脱アミノ化産物である、請求項7に記載の結合体。
【請求項９】
前記オリゴ糖が、百日咳菌のLOSに由来するオリゴ糖(OS)またはその断片および百日咳菌に由来する解毒された毒素(dPT)を含む、請求項6に記載の結合体。
【請求項１０】
前記オリゴ糖が、百日咳菌のLOSに由来するオリゴ糖(OS)またはその断片および百日咳に由来する解毒された毒素(dACT)を含む、請求項6に記載の結合体。
【請求項１１】
前記TLRアゴニストがTLR-2、TLR-4、またはTLR-8である、請求項6に記載の結合体。
【請求項１２】
遺伝学的に解毒された百日咳毒素(PT)；遺伝学的に解毒された百日咳アデニル酸シクラーゼ毒素(ACT)；担体タンパク質または担体ペプチドに結合した一つまたは複数の抗原決定基を有する、百日咳菌のリポオリゴ糖に由来する免疫原性オリゴ糖またはその断片；および百日咳菌に対する防御細胞性応答を誘導するTLRアゴニスト
を含む、オリゴ糖結合体であって、前記オリゴ糖が、B. ブロンセプチカ(B. bronseptica) LOSの十二糖コアの構造、百日咳菌株186のLOSの脱アミノ化により得られた五糖ハプテンの構造、および、スペーサーと末端アルデヒドとを備えた合成百日咳菌エピトープのLOS末端三糖の構造からなる群より選択される、オリゴ糖結合体。
【請求項１３】
前記遺伝学的に解毒されたAC毒素(ACT)がSEQ ID NO 1のアミノ酸配列を含む、請求項12に記載の結合体。
【請求項１４】
前記合成百日咳菌エピトープのLOS末端三糖がスペーサーと末端アルデヒドとを備える、請求項12に記載の結合体。
【請求項１５】
前記合成百日咳菌エピトープのLOS末端三糖が百日咳菌LOSの脱アミノ化産物である、請求項14に記載の結合体。
【請求項１６】
前記オリゴ糖が、百日咳菌のLOSに由来するオリゴ糖(OS)またはその断片および百日咳菌に由来する解毒された毒素(dPT)を含む、請求項12に記載の結合体。
【請求項１７】
前記オリゴ糖が、百日咳菌のLOSに由来するオリゴ糖(OS)またはその断片および百日咳に由来する解毒された毒素(dACT)を含む、請求項12に記載の結合体。
【請求項１８】
前記TLRアゴニストがTLR-2、TLR-4、またはTLR-8である、請求項12に記載の結合体。
【請求項１９】
前記遺伝学的に解毒された百日咳毒素が大腸菌、百日咳菌または気管支敗血症菌において産生される、請求項12に記載の結合体。
【請求項２０】
遺伝学的に解毒された百日咳毒素が百日咳菌、気管支敗血症菌または大腸菌において産生される百日咳毒素の変異体を含む、請求項12に記載の結合体。
【請求項２１】
前記遺伝学的に解毒されたAC毒素が大腸菌、百日咳菌または気管支敗血症菌において産生される、請求項12に記載の結合体。
【請求項２２】
請求項6に記載のオリゴ糖結合体を含むワクチン。
【請求項２３】
請求項12に記載のオリゴ糖結合体を含むワクチン。