(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｓ１００Ａ９活性によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または状態の新規治療法の提供。【解決手段】有効量のＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９阻害剤を含む組成物を使用して、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）のような、Ｓ１００Ａ９活性によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または状態を治療するための組成物及び方法。【選択図】図１Ａ
2020011979.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ヒトＣＤ３３の細胞外ドメイン、ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）の細胞外ドメイン、及び終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）の細胞外ドメインから成る群より選択される少なくとも２つのＳ１００Ａ９結合部分、及び
（ｂ）免疫グロブリンＦｃ領域
を含む組換え融合タンパク質。
【請求項２】
以下の式：すなわち
ｅＣＤ３３−ｅＴＬＲ４−Ｆｃ、
ｅＣＤ３３−ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ、
ｅＴＬＲ４−ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ、
ｅＲＡＧＥ−ｅＴＬＲ４−Ｆｃ、
ｅＣＤ３３−ｅＴＬＲ４−ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ、
ｅＣＤ３３−ｅＲＡＧＥ−ｅＴＬＲ４−Ｆｃ、
ｅＴＬＲ４−ｅＣＤ３３−ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ、
ｅＲＡＧＥ−ｅＣＤ３３−ｅＴＬＲ４−Ｆｃ、
ｅＴＬＲ４−ｅＲＡＧＥ−ｅＣＤ３３−Ｆｃ、及び
ｅＲＡＧＥ−ｅＴＬＲ４−ｅＣＤ３３−Ｆｃ
から成る群より選択される式を含む請求項１記載の融合タンパク質であって、
式中「ｅＣＤ３３」はヒトＣＤ３３の細胞外ドメインを含み、
式中「ｅＴＬＲ４」はＴＬＲ４の細胞外ドメインを含み、
式中「ｅＲＡＧＥ」はＲＡＧＥの細胞外ドメインを含み、
式中「Ｆｃ」は免疫グロブリンＦｃ領域を含み、
そして式中「−」はペプチドリンカーまたはペプチド結合から成る、
前記融合タンパク質。
【請求項３】
ビオチン及びＡＴＰの存在下で、ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）によってビオチン化され得るビオチン受容体ペプチドを更に含む請求項１または２記載の融合タンパク質。
【請求項４】
（ａ）ヒトＣＤ３３の細胞外ドメイン、ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）の細胞外ドメイン、及び終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）の細胞外ドメインから成る群より選択されるＳ１００Ａ９結合部分、
（ｂ）ビオチン及びＡＴPの存在下で、ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）によってビオチン化され得るビオチン受容体ペプチド、及び
（ｃ）免疫グロブリンＦｃ領域
を含む組換え融合タンパク質。
【請求項５】
以下の式：すなわち
ｅＣＤ３３−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＴＬＲ４−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＣＤ３３−ｅＴＬＲ４−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＣＤ３３−ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＴＬＲ４−ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＲＡＧＥ−ｅＴＬＲ４−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＣＤ３３−ｅＴＬＲ４−ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＣＤ３３−ｅＲＡＧＥ−ｅＴＬＲ４−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＴＬＲ４−ｅＣＤ３３−ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＲＡＧＥ−ｅＣＤ３３−ｅＴＬＲ４−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＴＬＲ４−ｅＲＡＧＥ−ｅＣＤ３３−Ｆｃ−Ａｖｉ及び
ｅＲＡＧＥ−ｅＴＬＲ４−ｅＣＤ３３−Ｆｃ−Ａｖｉ
から成る群より選択される式を含む請求項４記載の融合タンパク質であって、
式中「ｅＣＤ３３」はヒトＣＤ３３の細胞外ドメインを含み、
式中「ｅＴＬＲ４」はＴＬＲ４の細胞外ドメインを含み、
式中「ｅＲＡＧＥ」はＲＡＧＥの細胞外ドメインを含み、
式中「Ｆｃ」は免疫グロブリンＦｃ領域を含み、
式中「Ａｖｉ」は、ビオチン及びＡＴPの存在下で、ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）によってビオチン化され得る任意のビオチン受容体ペプチドを含み、
そして式中「−」はペプチドリンカーまたはペプチド結合から成る、
前記融合タンパク質。
【請求項６】
前記ビオチン受容体ペプチドが、配列番号７のアミノ酸配列、または配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項３〜５のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ヒトＣＤ３３の細胞外ドメインが、前記可変領域のみを含む請求項１〜６のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
【請求項８】
（ａ）前記ヒトＣＤ３３の可変細胞外ドメイン、及び
（ｂ）免疫グロブリンＦｃ領域
から実質的に成る組換え融合タンパク質。
【請求項９】
前記ヒトＣＤ３３の細胞外ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１〜８のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ヒトＣＤ３３の細胞外ドメインが、前記配列番号２のアミノ酸配列を含む請求項９記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ヒトＣＤ３３の可変領域が、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項７〜８のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ヒトＣＤ３３の可変領域が、配列番号４のアミノ酸配列を含む請求項１１記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記ヒトＴＬＲ４の細胞外ドメインが、配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１〜１２のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記ＲＡＧＥの細胞外ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１〜１３のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
コア分子またはコア粒子にコンジュゲートされた請求項１〜１４のいずれか一つに記載の２つ以上の融合タンパク質を含む多量体複合体。
【請求項１６】
前記コア分子がストレプトアビジンであり、前記２つ以上の融合タンパク質がビオチン化される請求項１５記載の多量体複合体。
【請求項１７】
前記コア分子が、前記２つ以上の融合タンパク質と特異的に結合する抗体を含むリポソームである請求項１５記載の多量体複合体。
【請求項１８】
前記抗体が、前記ビオチン受容体ペプチドと特異的に結合する請求項１７記載の多量体複合体。
【請求項１９】
前記コア分子またはコア粒子にコンジュゲートされた２〜５つの融合タンパク質を含む請求項１５〜１８のいずれか一つに記載の多量体複合体。
【請求項２０】
Ｓ１００Ａ９活性によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または状態を治療する方法であって、請求項１〜１８のいずれか一つに記載の融合タンパク質または請求項１５〜１９のいずれか一つに記載の多量体複合体を含む組成物を、前記治療を必要としている対象に対して投与することを含む、前記方法。
【請求項２１】
前記方法が、前記患者における感染、敗血症、またはそれらの組み合わせを治療することを含む請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が、前記患者の自己免疫疾患を治療することを含む請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が、前記患者の関節リウマチを治療することを含む請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が、前記患者の癌を治療することを含む請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
前記方法が、前記対象の骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を治療することを含む請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
対象の骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を治療する方法であって、Ｓ１００Ａ９と結合して隔離する可溶性ＣＤ３３融合体タンパク質を含む組成物の治療有効量を前記対象に対して投与することを含む、前記方法。
【請求項２７】
Ｓ１００Ａ９がＣＤ３３に結合することを阻止する能力について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を治療するための薬剤を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年７月５日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６１／８４３，２７４、２０１４年１月２３日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６１／９３０，７９８、２０１４年１月２４日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６１／９３１，３６６、及び２０１４年４月１０日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６１／９７８，００９の優先権を主張し、それらは参照により完全に本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府資金による研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所によって付与された交付金番号ＣＡ１３１０７６及び交付金番号ＡＩ０５６２１３の下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
脊髄形成異常症候群（ＭＤＳ）は、造血幹細胞悪性腫瘍であり、米国の人口の高齢化によって有病率が増加している。ＭＤＳは、赤血球生成の障害、調節不全の骨髄分化、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）への移行のリスク増加と関連のある悪性血液疾患の群を含む。ＭＤＳの発病率は、米国では毎年１５，０００〜２０，０００人の新患が増加し、多数の患者が長期にわたる輸血を必要としている。依然として、無効造血が、骨髄（ＢＭ）微小環境内における、ＭＤＳクローンに固有の遺伝子異常と、老化依存性炎症シグナルとの間の複雑な相互作用によって駆動される、より多くの無痛性サブタイプ患者の主要な治療課題である。３種の薬剤が、米国（ＵＳ）ではＭＤＳの治療用に承認されているが、レナリドマイド（ＬＥＮ）が唯一の標的化治療である。ＬＥＮによる治療は、染色体５ｑ欠失（ｄｅｌ５ｑ）を有する患者の大部分において細胞遺伝学的異常の部分的または完全な寛解を伴って持続的な赤血球輸血からの独立をもたらすが、ほんの少数の非ｄｅｌ５ｑのＭＤＳ患者が、まれに細胞遺伝学的改善を含む意味のある応答を獲得する。ｄｅｌ５ｑ欠失ＭＤＳの患者における応答は、比較的永続的であり、中央値２．５年を持続するが、時が経つにつれて耐性が現れ、輸血依存が再開する。
【発明の概要】
【０００４】
ＣＤ３３＋骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）は、ＭＤＳ患者のＢＭ中に特異的に蓄積し、ＣＤ３３開始シグナル伝達のための内因性リガンドとしてＳ１００Ａ９を含むメカニズムによって造血を損なうことを本明細書で示す。したがって、ＭＤＳＣの活性化を阻害するためのＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９アンタゴニストの有効量を投与することを一般的に含むＭＤＳを治療するための組成物及び方法を開示する。例えば、本方法は、Ｓ１００Ａ９に結合して隔離する薬剤を含む組成物の治療的に有効な量を対象に投与することを含むことができる。
【０００５】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９アンタゴニストは、内因性Ｓ１００Ａ９と結合して隔離し、そしてＭＤＳＣ上のＣＤ３３受容体に対するその結合を阻害する。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９アンタゴニストは、Ｓ１００Ａ９結合ドメインを含有する分子である。例えば、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９アンタゴニストは、ＣＤ３３の外部ドメイン、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）の外部ドメイン、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）の外部ドメイン、またはその組み合わせを含むキメラ融合タンパク質であり得る。ＣＤ３３、ＴＬＲ４、及び／またはＲＡＧＥのこの外部ドメインは、Ｓ１００Ａ９と結合することができる、ＣＤ３３、ＴＬＲ４、及び／またはＲＡＧＥの任意のフラグメントであり得る。例えば、場合によっては、ＣＤ３３外部ドメインは、ＣＤ３３の可変領域のみを含有する。
【０００６】
したがって、免疫グロブリンＦｃ領域と；Ｓ１００Ａ９タンパク質と結合し、そして免疫グロブリンＦｃ領域のカルボキシ末端に対してペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって連結される、ヒトＣＤ３３の細胞外ドメイン、ＴＬＲ４の細胞外ドメイン、ＲＡＧＥの細胞外ドメイン、またはそれらの組み合わせの１つ、２つ、３つ、またはそれ以上とを含む組換え融合タンパク質を開示する。融合タンパク質は、ビオチン及びＡＴＰの存在下で、ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）によってビオチン化され得るビオチン受容体ペプチドを更に含むことができる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、その融合タンパク質は、
ｅＣＤ３３−ｅＴＬＲ４−Ｆｃ、
ｅＣＤ３３−ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ、
ｅＴＬＲ４−ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ、
ｅＲＡＧＥ−ｅＴＬＲ４−Ｆｃ、
ｅＣＤ３３−ｅＴＬＲ４−ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ、
ｅＣＤ３３−ｅＲＡＧＥ−ｅＴＬＲ４−Ｆｃ、
ｅＴＬＲ４−ｅＣＤ３３−ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ、
ｅＲＡＧＥ−ｅＣＤ３３−ｅＴＬＲ４−Ｆｃ、
ｅＴＬＲ４−ｅＲＡＧＥ−ｅＣＤ３３−Ｆｃ、及び
ｅＲＡＧＥ−ｅＴＬＲ４−ｅＣＤ３３−Ｆｃ
から成る群より選択される式を含み、
式中、「ｅＣＤ３３」はヒトＣＤ３３の細胞外ドメインであり、
式中、「ｅＴＬＲ４」はＴＬＲ４の細胞外ドメインであり、
式中、「ｅＲＡＧＥ」はＲＡＧＥの細胞外ドメインであり、
式中、「Ｆｃ」は免疫グロブリンＦｃ領域であり、そして、
式中、「−」はペプチドリンカーまたはペプチド結合である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、その融合タンパク質は、
ｅＣＤ３３−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＴＬＲ４−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＣＤ３３−ｅＴＬＲ４−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＣＤ３３−ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＴＬＲ４−ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＲＡＧＥ−ｅＴＬＲ４−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＣＤ３３−ｅＴＬＲ４−ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＣＤ３３−ｅＲＡＧＥ−ｅＴＬＲ４−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＴＬＲ４−ｅＣＤ３３−ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＲＡＧＥ−ｅＣＤ３３−ｅＴＬＲ４−Ｆｃ−Ａｖｉ、
ｅＴＬＲ４−ｅＲＡＧＥ−ｅＣＤ３３−Ｆｃ−Ａｖｉ、及び
ｅＲＡＧＥ−ｅＴＬＲ４−ｅＣＤ３３−Ｆｃ−Ａｖｉ
から成る群より選択される式を含み、
式中、「ｅＣＤ３３」はヒトＣＤ３３の細胞外ドメインであり、
式中、「ｅＴＬＲ４」はＴＬＲ４の細胞外ドメインであり、
式中、「ｅＲＡＧＥ」はＲＡＧＥの細胞外ドメインであり、
式中、「Ｆｃ」は免疫グロブリンＦｃ領域であり、そして、
式中、「Ａｖｉ」は、ビオチン及びＡＴＰの存在下で、ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）によってビオチン化され得る任意のビオチン受容体ペプチドであり、
式中、「−」はペプチドリンカーまたはペプチド結合である。
【０００９】
Ｓ１００Ａ９タンパク質は、モノマーまたはダイマーとして存在することができる。例えば、Ｓ１００Ａ９タンパク質は、ヘテロダイマーとしてＳ１００Ａ８タンパク質と会合することができる。これらの場合では、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９アンタゴニストは、Ｓ１００Ａ８／Ａ９ヘテロダイノマー複合体と結合して隔離する。
【００１０】
場合によっては、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９アンタゴニストは、多価抗体であり、例えば、それは、少なくとも２つ、３つ、またはそれ以上のＳ１００Ａ９結合ドメインを含む。例えば、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９アンタゴニストは、１つ以上のＣＤ３３外部ドメイン、１つ以上のＴＬＲ４外部ドメイン、及び／または１つ以上のＲＡＧＥ外部ドメインを含むキメラ融合タンパク質であり得る。その融合タンパク質は、例えばＩｇＧ４、ＩｇＧ２またはＩｇＧｌ由来の免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）を更に含むことができる。
【００１１】
その融合タンパク質の複数のコピーを組み合わせて多価複合体を形成することもできる。したがって、いくつかの実施形態では、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の融合タンパク質をコア分子または粒子に連結することができる。例えば、Ｆｃ部分はビオチン化することができる。次いで、そのビオチン化融合タンパク質は、多量体（例えば、テトラマー）ストレプトアビジンにコンジュゲートさせることができる。他の実施形態では、２つ以上の融合タンパク質を、リポソームまたは他の微粒子の表面にコンジュゲートさせる。その多価複合体は、均質であることができ、すなわち、１つの融合タンパク質の１つのタイプの複数のコピーを含有することができるか、または、不均質であり得る。例えば、多価複合体は、ＣＤ３３、ＴＬＲ４、及びＲＡＧＥ融合タンパク質の組み合わせを含有することができる。更に、その多価複合体は、多価融合タンパク質、すなわち、２つ以上のＳ１００Ａ９結合ドメインを含有する少なくとも２つ以上の融合タンパク質を含有することができる。
【００１２】
他の実施形態では、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９阻害剤は、ＭＤＳＣ上の内因性ＣＤ３３受容体と結合して阻害する。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９アンタゴニストは、ＣＤ３３結合ドメインを含有する分子である。例えば、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９阻害剤は、ＭＤＳＣを活性化することなくＣＤ３３と結合し、そして内因性Ｓ１００Ａ９の結合に関して競合する組換えタンパク質であり得る。例えば、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９阻害剤は、Ｓ１００Ａ９の突然変異体または切断型変異体、すなわちドミナントネガティブなＳ１００Ａ９であり得る。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９阻害剤は、ＣＤ３３またはＳ１００Ａ９に特異的に結合し、それによって内因性ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９の活性化を阻害する抗体またはアプタマーである。
【００１４】
また、本明細書で開示されるＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９アンタゴニストを含む組成物を対象に投与することを含む、Ｓ１００Ａ９活性によって引き起こされるかまたは悪化する疾患または状態を対象において治療するための方法も開示する。
【００１５】
また、ＭＤＳを治療する薬剤を特定する方法も開示する。いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＤ３３へのＳ１００Ａ９の結合を阻止する能力について候補薬剤をスクリーニングすることを含む。他の実施形態では、本方法は、Ｓ１００Ａ９によるＣＤ３３の活性化を阻止する能力について候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
【００１６】
本発明の１つ以上の実施形態に関する詳細を、添付の図面及び以下の説明で明らかにする。本発明の他の特長、目的、及び利益は、説明及び図面、そして特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ−１Ｎ】ＭＤＳ患者由来のＢＭ細胞におけるＭＤＳＣの蓄積の増加及び機能を示す図である。図１ＡはＭＤＳ（ｎ＝１２）、同一年齢層の健康者（ｎ＝８）、及び非ＭＤＳ癌検体（ｎ＝８、胸部４、リンパ腫４、Ｐ＜０．０００１）のＢＭ−ＭＮＣにおけるＭＤＳＣのパーセントを示している。図１ＢはＭＤＳ  ＢＭ−ＭＮＣ（ｎ＝５、ＣＥＰ７及び７ｑ３１）由来の分取されたＭＤＳＣまたは非ＭＤＳＣの７番染色体のＦＩＳＨを示している。図１Ｃ及び１Ｄは１：０．２５及び１：０．５の比率（Ｔ細胞：ＭＤＳＣ）で、分取されたＭＤＳ−ＭＤＳＣと共培養された刺激自己Ｔ細胞の３Ｈ−チミジン取り込み（図１Ｃ）及びＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ（図１Ｄ）を示している。エラーバーは、３回繰り返して検査された異なる３人の患者の検体に関する標準偏差を示している。図１Ｅは自己由来の分取されていないＢＭ−ＭＮＣ、ＭＤＳＣが枯渇しているＢＭ−ＭＮＣ（−ＭＤＳＣ）ＢＭ−ＭＮＣまたは再混合された（＋ＭＤＳＣ）ＢＭ−ＭＮＣと混合した後の刺激Ｔ細胞のＢｒＤｕ取り込みを示している。図１Ｆ〜１Ｉは２４時間の培養後にＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−１０（図１Ｆ）、ＴＧＦＰ（図１Ｇ）、アルギナーゼ（図１Ｈ）、及びＮＯ（図１Ｉ）生成に関して検査された、ＭＤＳまたは健康なドナーＢＭ由来の分取されたＭＤＳＣを示している。図１Ｊは０分及び３０分での顕微鏡検査による、１：３（ＭＤＳＣ：赤芽球前駆体）の比率で混合され分取されたＭＤＳ−ＭＤＳＣ及び自己由来赤芽球前駆体に関するＭＤＳＣ：赤芽球前駆体接触域を示している。細胞は、ＣＤ７１、グリコフォリンＡ、ＣＤ３３、及びグランザイムＢについて染色した。図１Ｋは精製された自己由来赤芽球前駆体と共培養されたＣＤ３３及びグランザイムＢで標識され、顕微鏡検査でモニターされたＭＤＳまたは健康なドナー由来の分取されたＭＤＳＣを示している（０または３０分）。図１ＬはＭＤＳＣ−ＨＰＣコンジュゲート動員顆粒のカウント。図１Ｍは分取された自己由来ＭＤＳ−ＢＭ  ＭＤＳＣと一緒にまたは無しで培養された赤芽球前駆体（ＣＤ７１＋ＣＤ２３５ａ＋）に関するアネキシンＶ曝露を示している。図１Ｎは分取されていない、−ＭＤＳＣ、または再混合された（＋ＭＤＳＣ）ＭＤＳ  ＢＭ−ＭＮＣ（１：３の比率、＊、Ｐ＜０．００５、＊＊、Ｐ＜０．００１）のコロニー形成能力を示している。
【図２Ａ−２Ｇ】ＭＤＳＣ抑制機能を強化するＣＤ３３シグナルを示す図である。図２ＡはＣＤ３３の平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して分析されたＭＤＳ患者（ｎ＝１２）、同一年齢層の健康なドナー（ｎ＝８）、及び非ＭＤＳ癌（ｎ＝８）由来のＢＭ−ＭＮＣを示しており、＊＝Ｐ＜０．０００５である。図２ＢはＣＤ３３（またはアイソタイプ）架橋Ｕ９３７細胞の上清由来のＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、及びＶＥＧＦの濃度を示している。棒は、３つの別の実験での３つのウェルの平均±標準誤差を表している。図２Ｃは健康なドナーから単離され、そして、成熟した骨髄マーカー、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、及びＣＣＲ７のフローサイトメトリー分析７２時間前に、ＧＦＰ（Ａｄ−ＧＦＰ）またはＣＤ３３（Ａｄ−ＣＤ３３）のいずれかを含有しているアデノウイルスベクターで感染させたＢＭ−ＭＮＣを示している。対照は非感染細胞である。図２Ｄはコロニー形成能アッセイの結果を示している。ここでは、ＭＤＳ患者のＢＭからＭＤＳＣを選別した後、残留しているＭＤＳＣ陰性の細胞を、１４日間、非標的のｓｈＲＮＡまたはＣＤ３３  ｓｈＲＮＡ（ｓｈＣＤ３３）を含有するレンチウイルスベクター（ＬＶ）でモック感染または感染させたＭＤＳＣと一緒に培養した。また、ＭＤＳＣは、ＭＤＳＣ陰性ＢＭ細胞と培養する前に、上記構造物を含有するＬＶで感染させた後、７２時間、培養もした。＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０００１（対照のｓｈＲＮＡで処理された細胞に対して）。図２Ｅ〜２ＧはＥＬＩＳＡによってアッセイされた上清中のＩＬ−１０（図２Ｅ）及びＴＧＦ−β（図２Ｆ）を示している。＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０００１（対照のｓｈＲＮＡで処理された細胞に対して）。図２ＧはｓｈＣＤ３３で処理された細胞におけるアルギナーゼ活性を示している。＊Ｐ＜０．０５（対照のｓｈＲＮＡで処理された細胞に対して）。
【図３Ａ−３Ｏ】ＣＤ３３のための天然リガンドとしてのＳ１００Ａ９の同定を示す図である。図３Ａは対照のＩｇＧまたはＣＤ３３融合体で沈殿されたＢＭ溶解物のクマシーブルー染色（Ｃｏｏｍａｓｉｅ  ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を示している。図３ＢはＣＤ３３融合体（ＡＰＣ）で染色された、トランスフェクトされたＳＪＣＲＨ３０細胞を示している（左上Ｓ１００Ａ８及び左下Ｓ１００Ａ９）。図３Ｃはトランスフェクトされていない細胞（陰性）由来またはＳ１００Ａ９がトランスフェクトされた細胞由来の溶解物に関するＳ１００Ａ９捕獲ＥＬＩＳＡを示している。二次抗体は、抗Ｓ１００Ａ９（陽性対照）またはＣＤ３３融合体であった。図３Ｄはトランスフェクトされていない、またはベクターまたはＳ１００Ａ９でトランスフェクトされたＡＤ２９３及びＳＪＣＲＨ３０細胞溶解物をＰＶＤＦ膜上へ系列希釈し、そしてＣＤ３３融合体でブロットしたことを示している。クマシーブルー染色は充填対照（ｌｏａｄｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として役立つ。図３ＥはＣＤ３３に対してブロットされた、ＳＪＣＲＨ３０  ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９でコトランスフェクトされた細胞溶解物のＳ１００Ａ９免疫沈降を示している。図３Ｆは健康人及びＭＤＳの検体由来のＰＢＭＣ及びＢＭ−ＭＮＣをＣＤ３３融合体で免疫沈降させ、そしてＳ１００Ａ９についてブロットしたことを示している。図３Ｇは示された時点における、ＣＤ３３トランスフェクトされた（上のパネル）またはベクタートランスフェクトされた（下のパネル）ＳＪＣＲＨ３０細胞と一緒に培養された組換えヒトＳ１００Ａ９−ＤＤＫの免疫蛍光染色を示している。ＤＡＰＩ＝核、ＡＰＣ−ＤＤＫ＝ｒｈＳ１００Ａ９。図３Ｈ〜３ＩはｒｈＳ１００Ａ９によるＳＪＣＲＨ３０−ＣＤ３３細胞の処理がＩＬ−１０発現（図３Ｈ）及びＴＧＦ−β発現（図３Ｉ）を誘導したことを示している。図３Ｊ〜３ＫはｒｈＳ１００Ａ９によるＳＪＣＲＨ３０−ＣＤ３３細胞の処理がＩＬ−１０発現（図３Ｊ）及びＴＧＦ−β発現（図３Ｋ）も誘導することを示している。図３ＬはＥＬＩＳＡで測定されたＭＤＳ患者（ｎ＝６）の血漿中のＳ１００Ａ９タンパク質濃度を示している。図３Ｍ〜３Ｎは１μｇのｒｈＳ１００Ａ９で処理されたＭＤＳ−ＭＤＣＳをＣＤ３３−ＦＩＴＣ及び抗ＤＤＫ−ＡＰＣについて染色し（図３Ｍ）、そして抗−ＣＤ３３抗体で免疫沈降させ、次いで抗ＳＨＰ−１でブロットした（図３Ｎ）ことを示している。図３Ｏは健康なドナー（ｎ＝３）またはＭＤＳ患者（ｎ＝３）由来のＢＭ血漿を用いてＳＨＰ−１動員をアッセイしたことを示している。すべての実験でエラーバーは３つの別の実験のＳＥＭを表している。
【図４Ａ−４Ｎ】ＭＤＳ  ＢＭにおけるＣＤ３３を介してのＳ１００Ａ９シグナル伝達がＭＤＳＣの活性化機能及び抑制機能と関連があることを示す図である。図４Ａ〜４ＨはＩＬ−１０（図４Ａ）、ＴＧＦ−β（図４Ｃ）、ＡＲＧ２（図４Ｅ）もしくはＮＯＳ２（図４Ｆ）の発現に関してＱ−ＰＣＲによって評価された、またはＩＬ−１０（図４Ｂ）及びＴＧＦ−β（図４Ｄ）に関してＥＬＩＳＡによって評価された、ＧＦＰまたはＣＤ３３発現ベクターを含有するアデノウイルスを感染させた健康なＢＭ細胞を示している。Ｑ−ＰＣＲ（図４Ｇ）及びＧＦＰ発現のフローサイトメトリー（図４Ｈ）によりトランスフェクション効率を測定した。図４Ｉ及び４Ｊは健康なＢＭ細胞のＲＡＧＥ、ＴＬＲ４、ＣＤ３３またはそれらの組み合わせを、細胞それら自体を培養する前にブロックするか、または、１μｇのＳ１００Ａ９で４８時間ブロックして、ＩＬ−１０遺伝子及びタンパク質発現（Ｑ−ＰＣＲ及びＥＬＩＳＡ、（図４Ｉ））もしくはＴＧＦ−β遺伝子及びタンパク質発現（図４Ｊ）を測定することを示している。図４Ｋは特異的なｓｈＲＮＡを使用して初代ＭＤＳ−ＢＭ細胞におけるＳ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９の発現をサイレンシングすることを示している（ウェスタンブロットによって示される）。図４Ｌ〜４ＮはサイレンシングがＩＬ−１０（図４Ｌ）及びＴＧＦ−β（図４Ｍ）の発現を阻害することを示している。＊：Ｐ＜０．０１：＊＊、Ｐ＜０．００１（対照ｓｈＲＮＡで処理された細胞に対して）。図４Ｎは特異的なｓｈＲＮＡによってＳ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９をブロックすると、ＭＤＳの患者から単離されたＢＭ細胞におけるコロニー形成が促進されることを示している。＊：Ｐ＜０．０５（対照ｓｈＲＮＡで処理された細胞に対して）。すべての実験で、エラーバーは、３つの別の一次検体に関する３回の測定の標準誤差を表している。
【図５Ａ−５Ｐ】Ｓ１００Ａ９トランスジェニック（Ｔｇ）マウスでは、ＭＤＳＣの蓄積及び活性化が増大し、ヒトＭＤＳの病理を再現する形成異常の特徴を示している図である。図５Ａは６、１８または２４週でＳ１００Ａ９Ｔｇマウスまたは６及び２４週でＳ１００Ａ９ＫＯまたは野生型（ＷＴ）マウスから単離されたＢＭ−ＭＮＣにおけるＧｒ１＋ＣＤ１１ｂ＋  ＭＤＳＣの蓄積を示している。図５Ｂはフローサイトメトリーによる６、１８及び２４週齢におけるＳ１００Ａ９ＴｇマウスのＢＭ、脾臓及びＰＢＭＣ由来のＭＤＳＣの％を示している。図５Ｃ〜５Ｄは成熟マーカーＦ４／８０＋Ｇｒ１−（図５Ｃ）及びＩ−Ａｄ＋（図５Ｄ）に対してアッセイされた脾臓細胞を示している。図５Ｅは図５Ａに記載したマウスのＢＭからＦＡＣＳで分取されたＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞（＋ＭＤＳＣ）を、コロニー形成を評価する１４日前に、１：１の比率で、自己由来１×１０５ＭＤＳＣ陰性集団（ＨＳＰＣを含有、−ＭＤＳＣ）と再混合したことを示している。ＭＤＳＣ陰性集団を対照として用いた。図５ＦはＷＴ、Ｓ１００Ａ９Ｔｇ及びＳ１００Ａ９  ＫＯマウス由来のＭＤＳＣを、ＦＡＣＳで分取し、そして９６穴プレートで２４時間培養し、その後で、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−１０及びＴＧＦ−βの生成を測定したことを示している。図５Ｇ〜５ＮはＷＴ（図５Ｇ〜５Ｊ）及びＳ１００Ａ９Ｔｇマウス（図５Ｋ〜５Ｎ）の血液病理学（ｈｅｍａｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ）分析の比較を示している。ＭＤＳ−ＢＭ一次検体を、ＣＤ３３陽性細胞（図５Ｏ）及びＣＤ３４陽性細胞（図５Ｐ）におけるＳ１００Ａ９の位置について検査した。流れ図は、３回繰り返した実験を代表している。
【図６Ａ−６Ｉ】Ｓ１００Ａ９に富むＨＳＣ及びＷＴ  ＨＳＣの混合移植が造血に関して効果を持続していることを示す図である。図６Ａは８週目（移植後）のＷＴ由来、Ｓ１００Ａ９Ｔｇ由来、またはその２つの１：１混合物由来の富化ＨＳＣを移植した、致命的に放射線にさらされたマウス（９００Ｇｙ）におけるＭＤＳＣの割合を示している。図は５回の移植実験を代表している。図６Ｂは図６ＡのＭＤＳＣのＧＦＰ発現を示している。図６ＣはＷＴ、Ｓ１００Ａ９Ｔｇ、または富化ＨＳＣの１：１混合物を移植した後に致命的な放射線にさらされたマウスにおけるＬｉｎｅａｇｅ−ｃＫｉｔ＋Ｓｃａ−１＋と定義されるＬＳＫ  ＨＳＣの％を示している。図６Ｄ〜６Ｆは移植後ＣＢＣによって毎週測定された、白血球（ＷＢＣ）（図６Ｄ）、ヘモグロビン（ＨＧＢ）（図６Ｅ）及びＲＢＣ（図６Ｆ）の割合及び濃度を示している。エラーバーはｎ＝５の標準誤差である。図６Ｇは４８時間、Ｓ１００Ａ９を用いてまたは用いずに処理されたＭＤＳＣ枯渇ＭＤＳ−ＢＭ検体におけるＣＤ３４陽性細胞の％を示している。図６Ｈは図６Ｇと同じ実験を示しており、Ｓ１００Ａ９による処理後にアネキシンＶ及びＰＩの表面発現を評価している。図６Ｉは健康なヒトＣＤ３４細胞（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｋｅｒｓｆｉｅｌｄ）を、図６Ｈのように処理し、４８時間培養し、次いでアネキシンＶ／ＰＩフローサイトメトリー分析を行ったことを示している。
【図７Ａ−７Ｉ】ＭＤＳＣ活性化及びシグナル伝達を標的にすると、抑制性ＢＭ微小環境を改善できることを示す図である。図７Ａ〜７ＢはＡＴＲＡは、Ｓ１００Ａ９ＴｇマウスのＢＭ中のＭＤＳＣを減少させ（図７Ａ）、骨髄成熟マーカーの発現を促進する（図７Ｂ）ことを示している。図７ＣはＡＴＲＡで処理された、ＷＴ及びＳ１００Ａ９ＴｇマウスＢＭ細胞のＢＦＵコロニー形成を示している。培養物のすべては２連であった。＊：Ｐ＜０．０５（ＡＴＲＡ処理Ｓ１００Ａ９Ｔｇマウスとビヒクル処理Ｓ１００Ａ９Ｔｇマウスとの間）。図７ＤはＡＴＲＡで処理されたマウス及び未処理のマウスに関するＣＢＣ分析から得られたＲＢＣ，ＷＢＣ及び血小板の数を示している。＊：Ｐ＜０．０５（ＡＴＲＡ処理Ｓ１００Ａ９Ｔｇマウスとビヒクル処理Ｓ１００Ａ９Ｔｇマウスとの間）。図７ＥはｑＰＣＲ（ｎ＝５）による、健康な検体またはＭＤＳ検体から単離されたＭＤＳＣ由来のＤＡＰ１２の相対的な発現レベルを示している。図７Ｆはベクター、ＷＴ−ＤＡＰ１２、ドミナントネガティブＤＡＰ１２（ＤＮ）または活性ＤＡＰ１２（Ｐ２３）でＡＤ２９３細胞を４８時間トランスフェクトし、そしてリン酸化されたまたはすべてのＳｙｋ及びＥＲＫの発現に関してウェスタンブロットによって分析したことを示している。これは、３つの独立した実験の代表である。ＭＤＳＣを、ＭＤＳ患者のＢＭから単離し、ＷＴまたは活性なＤＡＰ１２（Ｐ２３）を含有するアデノウイルスベクターで４８または７２時間感染させた。図７Ｇ及び７Ｈはフローサイトメトリーによって分析された、ＣＤ１４またはＣＤ１５（図７Ｇ）または成熟マーカーＣＤ８０、ＣＣＲ７及びＣＤ１１ｃ（図７Ｈ）の表面発現を示している。図７ＩはＦＡＣＳ分取によってＭＤＳ患者のＢＭ−ＭＮＣからＭＤＳＣを精製し、そして細胞をＬＶ−ＷＴ  ＤＡＰ１２またはＬＶ−Ｐ２３に感染させたことを示している。コロニー形成能アッセイを１４日間メチルセルロースで行った。結果は、７例の患者の平均±標準誤差として示す。＊：Ｐ＜０．００１，＊＊：Ｐ＜０．０００１（ＬＶ−ＷＴに感染させた細胞に対して）。
【図８】移植されたマウスにおける移植％を示す図である。野生型の雌のＦＶＢ／ＮＪマウスに、ＷＴ由来、Ｓ１００Ａ９Ｔｇ由来または比率１：１のＷＴ：Ｔｇ雄性細胞由来の富化ＨＳＣを移植した。移植されていない雄のマウスのＢＭ細胞に対して正規化されたｑＰＣＲによって、移植％を、ＳＲＹ遺伝子の発現を測定することによって評価した。ＧＡＰＤＨは内部標準として役立つ。
【図９】ＩＴＩＭまたはＩＴＡＭモチーフを介するＣＤ３３／Ｓｉｇｌｅｃ  ３−媒介シグナル伝達のモデルである。ＣＤ３３は２つの細胞質ゾルＩＴＩＭモチーフを有する。Ｓｒｃキナーゼリン酸化チロシン残基は、ＣＤ３３架橋後にまたはそのリガンド（単数または複数）との相互作用時に、ＩＴＩＭＳ中に存在する。リン酸化されたＩＴＩＭは、ホスファターゼ（ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、またはＳＨＩＰ−１）を動員または活性化し、その結果としてＭＡＰＫの下方調節をもたらし、最終的には、細胞阻害及び抑制性サイトカインの生成をもたらす。またＣＤ３３の活性化は、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９の発現も誘導し、そしてそれらは分泌され、ＣＤ３３またはＴＬＲ４のためのヘテロダイマーとして作用し、そして、したがって炎症及びＭＤＳＣの活性化を媒介する。ＩＴＩＭを欠くＳｉｇｌｅｃは、膜通過領域において荷電アミノ酸を有し、それにより、ＤＡＰ１２、ＩＴＡＭ含有活性化アダプターと会合することができる。ＩＴＩＭの場合と同様に、Ｓｒｃキナーゼも、ＤＡＰ１２のＩＴＡＭにおけるチロシン残基をリン酸化する。次いで、Ｓｙｋキナーゼ及びＺＡＰ７０を動員し、下流の細胞活性化、分化及び／または成熟を永続化させる。
【図１０】未発達のＤＣ成熟に関する活性ＤＡＰ１２のｔ効果を示す図である。初代ＤＣを、健康なドナーから調製し、示したようにＧＦＰ単独、ＷＴ−ＤＡＰ１２、ｄｎＤＡＰ１２及び活性ＤＡＰ１２（Ａｄ−Ｐ２３）を含有するアデノウイルスベクターに感染させた。その細胞を、示したように、成熟したＤＣ表面マーカーを使用するフローサイトメトリー分析の７２時間前に、培養した。モック感染したＤＣ及びアイソタイプＩｇＧを対照群に包含した。各実験構築物を、空ベクターの対照と比較し（塗りつぶされたヒストグラム）、分析前に感染細胞をＧＦＰでゲートした。
【図１１】ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９アンタゴニストの例示的実施形態を説明している図である。図１１Ａ〜１１Ｇは融合タンパク質が、ＩｇＧのＦｃ部分と、そしてＢｉｒＡまたは抗体認識によるビオチン化のためのビオチン受容体ペプチド（例えば、ＡｖｉＴａｇ（商標）配列）とを含有することを示している。図１１Ａ、１１Ｃ、及び１１Ｇの融合タンパク質はＣＤ３３の外部ドメインを含有する。１１Ｂ及び１１Ｄの融合タンパク質は、ＣＤ３３の外部ドメインの可変領域（「ｖＣＤ３３」）のみを含有する。図１１Ｃ及び１１ＤにおけるｖＣＤ３３領域は、図１１Ａ及び１１ＢにおけるｖＣＤ３３に比べて、一塩基多型（「ＳＮＰ」）を含有する。図１１Ｅ、１１Ｆ及び１１Ｇに描写されている融合タンパク質は、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）の外部ドメインを含有する。また、図１１Ｆ及び１１Ｇの融合タンパク質は、ＣＤ３３の外部ドメイン（図１１Ｇ）またはｖＣＤ３３領域のみ（図１１Ｆ）も含有する。図１１ＨはＡｖｉＴａｇ（商標）配列のビオチン化と、これらの融合タンパク質の四量体ストレプトアビジン（「ＳＡ」）へのコンジュゲートとによって形成された多量体複合体を示している。図１１ＩはＡｖｉＴａｇ（商標）と特異的に結合する抗体をリポソーム中に組み込むことよって形成される多量体複合体を示している。
【図１２Ａ−１２Ｂ】４つの細胞集団における血漿処理対照に正規化された活性なカスパーゼ−１及びＩＬ−１β生成の倍率変化を示す図である。活性なカスパーゼ−１及びＩＬ−１β生成を、ＣＤ３３−ＩｇＧによる処理後にフローサイトメトリーによって、４集団で、すなわち幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）、前駆細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋）、赤芽球（ＣＤ７１＋）、及び骨髄細胞（ＣＤ３３＋）で評価した。活性なカスパーゼ−１  ＭＦＩ（図１２Ａ）及びＩＬ−１β（図１２Ｂ）生成の倍率変化。
【図１３Ａ−１３Ｂ】４つの細胞集団における血漿処理対照に正規化された活性なカスパーゼ−１及びＩＬ−１β生成の倍率変化を示す図である。活性なカスパーゼ−１及びＩＬ−１β生成は、関連の経路阻害剤で処理した後にフローサイトメトリーによって４集団、すなわち幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）、前駆細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋）、赤芽球（ＣＤ７１＋）、及び骨髄細胞（ＣＤ３３＋）において評価した。活性なカスパーゼ−１  ＭＦＩ（図１３Ａ）及びＩＬ−１β（図１３Ｂ）生成の倍率変化。
【図１４Ａ−１４Ｃ】ＣＤ３３キメラトラップによる血漿Ｓ１００Ａ９の中和が、ＭＤＳ患者検体においてコロニー形成能を強化することを示す図である。図１４Ａ〜１４Ｃは、ＩｇＧ、血漿、または０．１、０．５もしくは１．０ｇのＣＤ３３−ＩｇＧキメラトラップで処理されたＭＤＳ患者検体における、赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）（図１４Ｂ）、多能性コロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）（図１４Ａ）、及び顆粒球／マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）（図１４Ｃ）を示す図である。
【図１５Ａ−１５Ｃ】ＣＤ３３キメラで処理された４つのＬＲ−ＭＤＳ検体におけるコロニー形成能の変化を示す図である。各患者由来のＢＭ−ＭＮＣを、自己由来ＢＭ血漿及び増加濃度のＣＤ３３−ＩｇＧと一緒に培養し、メチルセルロースにおける１つの処理条件あたり４回反復で平板培養した。コロニーは平板培養１４日後に計数し、各患者に関して平均した。ＣＦＣの増加は、ＧＥＭＭ（図１５Ａ）、赤芽球（図１５Ｂ）、及びＧＭ（図１５Ｃ）のコロニーそれぞれに関して、血漿培養対照に正規化された倍率変化として表される。
【図１６Ａ−１６Ｅ】ＣＤ３３−キメラトラップが、ＭＤＳ  ＢＭ−ＭＮＣにおけるピロトーシス関連の遺伝子発現を抑制することを示す図である。ＢＭ−ＭＮＣを５人の低リスクＭＤＳ患者から単離し、自己由来ＢＭ血漿及び増加濃度のＣＤ３３キメラと一緒に培養した。５人の正常なドナーから単離されたＢＭ−ＭＮＣを比較のために用いた。ＲＮＡを単離し、ピロトーシス関連遺伝子のカスパーゼ−１（図１６Ａ）、ＩＬ−１β（図１６Ｂ）、ＮＬＲＰ１（図１６Ｃ）、ＮＬＲＰ３（図１６Ｄ）、及びＩＬ−１８（図１６Ｅ）に関してｑＰＣＲを行った。遺伝子発現は、正常なドナーに正規化された倍率変化として表されている。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
担腫瘍マウス及び癌患者で蓄積することが知られている未成熟の骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）は、癌の進行の原因となる部位特異的炎症性のＴ細胞免疫抑制エフェクター細胞である（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，Ｄ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：１６２−１７４；Ｋｕｓｍａｒｔｓｅｖ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５５：２３７−２４５）。それらの抑制活性は、炎症関連のシグナル伝達分子によって、例えば危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）ヘテロダイマーＳ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９（それぞれ骨髄関連タンパク質（ＭＲＰ）−８及びＭＲＰ−１４としても知られている）によって、ＴＬＲ４のライゲーションを介して部分的に駆動される（Ｅｈｒｃｈｅｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ８６：５５７−５６６；Ｖｏｇｌ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １３：１０４２−１０４９）。しかしながら、ネズミＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋  ＭＤＳＣは、大多数のメカニズム研究の基礎を形成するが、それらのヒトでの対応物に関する報告はずっと少なかった。ヒトＭＤＳＣは、成熟免疫細胞のマーカーを殆ど欠いている（ＬＩＮ−、ＨＬＡ−ＤＲ−）が、ＣＤ３３、すなわちレクチン（Ｓｉｇｌｅｃ）のシアル酸結合免疫グロブリン様（Ｉｇ）スーパーファミリーのプロトタイプメンバーを有する（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，Ｄ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：１６２−１７４；Ｔａｌｍａｄｇｅ，Ｊ．Ｅ．２００７．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３：５２４３−５２４８；Ｔａｌｍａｄｇｅ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ  ２６：３７３−４００；Ｃｒｏｃｋｅｒ，Ｐ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：２５５−２６６）。重要なことには、ＣＤ３３は、その正確な作用は知られていないが、免疫抑制と関連がある免疫受容体チロシン系抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を有する（Ｃｒｏｃｋｅｒ，Ｐ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：２５５−２６６）。
【００１９】
ＬＩＮ−ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＤ３３＋ＭＤＳＣは、ＭＤＳ患者のＢＭに特異的に蓄積し（本明細書ではＭＤＳ−ＭＤＳＣと呼ぶ）、ＣＤ３３開始シグナル伝達のための内因性リガンドとしてＳ１００Ａ９を含むメカニズムを介して造血を阻害することを本明細書で示す。重要なことに、Ｓ１００Ａ９トランスジェニック（Ｓ１００Ａ９Ｔｇ）マウスを用いると、この炎症経路の持続活性化がＭＤＳの発症の原因となること、及びこの血液学的表現型が、ＣＤ３３  ＩＴＩＭ−シグナル伝達を抑制する戦略によって救われること、を示す。Ｓ１００Ａ９がＣＤ３３にライゲートしてＭＤＳＣの増殖を誘発するという開示所見は、この経路を標的にすると、ＭＤＳを治療するための治療的アプローチを提供できることを示している。最後に、このシグナル伝達経路の発見は、免疫抑制の重要な開始因子としてのＳ１００Ａ９の役割を示している。したがって、Ｓ１００Ａ９Ｔｇマウスは、ＭＤＳ病因論、治療、及び癌におけるＭＤＳＣの全役割を研究するための有用なモデルとして役立てることができる。
【００２０】
したがって、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の活性化を阻害するためのＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９阻害剤の使用を含むＭＤＳを治療するための組成物及び方法を開示する。
【００２１】
ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９阻害剤
いくつかの実施形態では、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９阻害剤は、内因性Ｓ１００Ａ９と結合して隔離し、そしてＭＤＳＣ上のＣＤ３３受容体に対するその結合を阻害する。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９アンタゴニストは、Ｓ１００Ａ９結合ドメインを含有する分子である。他の実施形態では、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９阻害剤は、ＭＤＳＣ上の内因性ＣＤ３３受容体と結合して阻害する。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９アンタゴニストは、ＣＤ３３結合ドメインを含有する分子である。
【００２２】
可溶性受容体
例えば、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９阻害剤は、可溶性ＣＤ３３受容体であり得る。「可溶性受容体」は、細胞膜に結合されない受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、最も一般的には、膜貫通型ドメイン及び細胞質ドメインを欠くリガンド結合性受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、追加のアミノ酸残基、例えば、ポリペプチドの精製を提供するか、またはポリペプチドの基質への結合のための部位を提供するアフィニティータグを含むことができる。多くの細胞表面受容体は、タンパク質分解によって生成される天然の可溶性対応物を有する。可溶性受容体ポリペプチドは、膜固定またはシグナル変換を提供するのに十分なこれらのセグメント部分を欠く場合、それぞれ、実質的に膜貫通型及び細胞内ポリペプチドセグメントを含有しないと言われる。
【００２３】
例えば、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９アンタゴニストは、ＣＤ３３の外部ドメイン、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）の外部ドメイン、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）の外部ドメイン、またはその組み合わせを含むキメラ融合タンパク質であり得る。ＣＤ３３、ＴＬＲ４、及び／またはＲＡＧＥのこの外部ドメインは、Ｓ１００Ａ９と結合することができるＣＤ３３、ＴＬＲ４、及び／またはＲＡＧＥの任意のフラグメントであり得る。
【００２４】
キメラタンパク質としても公知である融合タンパク質は、本来は別々のタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子を接合することにより作製されるタンパク質である。この融合遺伝子を翻訳すると、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドがもたらされる。組換え融合タンパク質は、生物学的研究または治療法で使用するために、組換えＤＮＡ技術によって人工的に作製することができる。大規模な突然変異が、典型的には染色体転座が、２つの異なる遺伝子由来のコード配列の部分を含有する新規なコード配列を創出するとき、キメラ突然変異タンパク質は自然に生じる。
【００２５】
融合タンパク質の機能性は、多くのタンパク質機能ドメインがモジュール性であるという事実によって可能となる。言い換えれば、所定のドメイン、例えばチロシンキナーゼドメインに対応するポリペプチドの線状部分を、その本来の酵素能力を破壊することなく、残りのタンパク質から除去することができる。したがって、本明細書で開示される機能ドメインのいずれをも使用して、融合タンパク質を設計することができる。
【００２６】
組換え融合タンパク質は、融合遺伝子の遺伝子操作によって作製されたタンパク質である。これは、典型的には、第１のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列から終止コドンを除去し、次いでライゲーションまたは重複伸長ＰＣＲによって第２のタンパク質のｃＤＮＡ配列をインフレームで付加することを含む。次いで、そのＤＮＡ配列は、単一のタンパク質として細胞によって発現される。タンパク質を、両方の元のタンパク質の全長またはいずれかの一部のみを包含するように操作することができる。
【００２７】
２つの要素がタンパク質である場合、しばしばリンカー（または「スペーサー」）ペプチドも追加し、それにより、タンパク質が独立して折り畳まれ、予想通りに挙動する可能性がより高くなる。特に、リンカーがタンパク質精製を可能にする場合、タンパク質またはペプチド融合体中のリンカーは、時に、２つの個別のタンパク質を遊離することができるプロテアーゼまたは化学物質のための切断部位によって、操作される。この技術は、しばしば、ニッケル樹脂またはコバルト樹脂（アフィニティクロマトグラフィー）を使用して単離することができるＧＳＴタンパク質、ＦＬＡＧペプチド、またはヘキサ−ｈｉｓペプチド（ａｋａ：６ｘｈｉｓ−タグ）を融合させることによって、タンパク質の同定及び精製のために使用される。
【００２８】
適当なＣＤ３３、ＴＬＲ４、及びＲＡＧＥ外部ドメインのためのアミノ酸配列は、公知であり、開示される組成物及び方法での使用に適合し得る。例えば、ヒト骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３の外部ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ２０１３８［ａａ．１８−２５９］）は、以下のアミノ酸配列：
１８−ＤＰＮ  ＦＷＬＱＶＱＥＳＶＴ  ＶＱＥＧＬＣＶＬＶＰ  ＣＴＦＦＨＰＩＰＹＹ  ＤＫＮＳＰＶＨＧＹＷ  ＦＲＥＧＡＩＩＳＲＤ  ＳＰＶＡＴＮＫＬＤＱ  ＥＶＱＥＥＴＱＧＲＦ  ＲＬＬＧＤＰＳＲＮＮ  ＣＳＬＳＩＶＤＡＲＲ  ＲＤＮＧＳＹＦＦＲＭ  ＥＲＧＳＴＫＹＳＹＫ  ＳＰＱＬＳＶＨＶＴＤ  ＬＴＨＲＰＫＩＬＩＰ  ＧＴＬＥＰＧＨＳＫＮ  ＬＴＣＳＶＳＷＡＣＥ  ＱＧＴＰＰＩＦＳＷＬ  ＳＡＡＰＴＳＬＧＰＲ  ＴＴＨＳＳＶＬＩＩＴ  ＰＲＰＱＤＨＧＴＮＬ  ＴＣＱＶＫＦＡＧＡＧ  ＶＴＴＥＲＴＩＱＬＮ  ＶＴＹＶＰＱＮＰＴＴ  ＧＩＦＰＧＤＧＳＧＫ  ＱＥＴＲＡＧＶＶＨ−２５９（配列番号１）、
またはそのフラグメントもしくは変異体を有することができ、例えば、配列番号１と少なくとも６５％，７０％，７１％，７２％，７３％，７４％，７５％，７６％，７７％，７８％，７９％，８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％の配列同一性を有することができ、ここで、そのフラグメントもしくは変異体はＳ１００Ａ９と結合することができる。
【００２９】
ＣＤ３３の外部ドメインには少なくとも３つの公知の一塩基多型（「ＳＮＰ」）（すなわちＷ２２Ｒ、Ｒ６９Ｇ、Ｓ１２８Ｎ）が存在する。
したがって、ヒトＣＤ３３の細胞外ドメインは、これらＳＮＰの任意の１つ以上と共に配列番号１のアミノ酸配列を有することができる。
例えば、ヒトＣＤ３３の細胞外ドメインは、以下のアミノ酸配列：
１８−ＤＰＮ  ＦＸ１ＬＱＶＱＥＳＶＴ  ＶＱＥＧＬＣＶＬＶＰ  ＣＴＦＦＨＰＩＰＹＹ  ＤＫＮＳＰＶＨＧＹＷ  ＦＲＥＧＡＩＩＳＸ２Ｄ  ＳＰＶＡＴＮＫＬＤＱ  ＥＶＱＥＥＴＱＧＲＦ  ＲＬＬＧＤＰＳＲＮＮ  ＣＳＬＳＩＶＤＡＲＲ  ＲＤＮＧＳＹＦＦＲＭ  ＥＲＧＳＴＫＹＸ３ＹＫ  ＳＰＱＬＳＶＨＶＴＤ  ＬＴＨＲＰＫＩＬＩＰ  ＧＴＬＥＰＧＨＳＫＮ  ＬＴＣＳＶＳＷＡＣＥ  ＱＧＴＰＰＩＦＳＷＬ  ＳＡＡＰＴＳＬＧＰＲ  ＴＴＨＳＳＶＬＩＩＴ  ＰＲＰＱＤＨＧＴＮＬ  ＴＣＱＶＫＦＡＧＡＧ  ＶＴＴＥＲＴＩＱＬＮ  ＶＴＹＶＰＱＮＰＴＴ  ＧＩＦＰＧＤＧＳＧＫ  ＱＥＴＲＡＧＶＶＨ−２５９
も有することができる、ここで、Ｘ１はＷまたはＲ；Ｘ２はＲまたはＧ；そしてＸ３はＳまたはＮである（配列番号２）。
【００３０】
場合によっては、ＣＤ３３外部ドメインは、ＣＤ３３の可変領域のみを含有する（「ｖＣＤ３３」）。例えば、いくつかの実施形態では、ｖＣＤ３３部分は、以下のアミノ酸配列：
１９−ＰＮ  ＦＷＬＱＶＱＥＳＶＴ  ＶＱＥＧＬＣＶＬＶＰ  ＣＴＦＦＨＰＩＰＹＹ  ＤＫＮＳＰＶＨＧＹＷ  ＦＲＥＧＡＩＩＳＲＤ  ＳＰＶＡＴＮＫＬＤＱ  ＥＶＱＥＥＴＱＧＲＦ  ＲＬＬＧＤＰＳＲＮＮ  ＣＳＬＳＩＶＤＡＲＲ  ＲＤＮＧＳＹＦＦＲＭ  ＥＲＧＳＴＫＹＳＹＫ  ＳＰＱＬＳＶＨＶＴＤ−１３５（配列番号３）、
またはそのフラグメントもしくは変異体を有し、例えば、配列番号３と少なくとも６５％，７０％，７１％，７２％，７３％，７４％，７５％，７６％，７７％，７８％，７９％，８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％の配列同一性を有し、ここで、そのフラグメントもしくは変異体はＳ１００Ａ９と結合することができる。ｖＣＤ３３は、開示されるＳＮＰ（すなわちＷ２２Ｒ、Ｒ６９Ｇ、Ｓ１２８Ｎ）の任意の１つ以上を有することもできる。したがって、いくつかの実施形態では、ｖＣＤ３３部分は、以下のアミノ酸配列：
１９−ＰＮ  ＦＸ１ＬＱＶＱＥＳＶＴ  ＶＱＥＧＬＣＶＬＶＰ  ＣＴＦＦＨＰＩＰＹＹ  ＤＫＮＳＰＶＨＧＹＷ  ＦＲＥＧＡＩＩＳＸ２Ｄ  ＳＰＶＡＴＮＫＬＤＱ  ＥＶＱＥＥＴＱＧＲＦ  ＲＬＬＧＤＰＳＲＮＮ  ＣＳＬＳＩＶＤＡＲＲ  ＲＤＮＧＳＹＦＦＲＭ  ＥＲＧＳＴＫＹＸ３ＹＫ  ＳＰＱＬＳＶＨＶＴＤ−１３５
を有し、ここでＸ１はＷまたはＲ；Ｘ２はＲまたはＧ；そしてＸ３はＳまたはＮである（配列番号４）。
【００３１】
ＣＤ３３の可変領域は、更に変異して、Ｓ１００Ａ９に対する結合を強化するために、より多くのグリコシル化部位を創出することができる。これらの突然変異は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでスクリーンすることができ、且つ／またはＳ１００Ａ９結合を評価するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで検査することができる。
【００３２】
Ｎ−結合炭水化物は、Ｎ−アセチルグルコサミン及びアスパラギンを介して結合される。Ｎ−結合コンセンサス配列はＡｓｎ−Ｘ１−Ｘ２であり、式中、Ｘ１はＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ２はＳｅｒまたはＴｈｒである。ほとんどのＯ−結合炭水化物共有結合は、単糖類Ｎ−アセチルガラクトサミンとアミノ酸のセリンまたはスレオニンとの間の結合を含む。
【００３３】
突然変異部位の非限定例としては、より多くのグリコシル化部位を創出するために突然変異し得るＣＤ３３残基に存在する部位、例えばＱ２６Ｎ、Ｐ４０Ｎ、Ｌ７８Ｔ及びＥ８４Ｎが挙げられるが、それらに限定されない。他の残基を、日常の方法を使用して、同定及び検査することができる。例えば、タンパク質−タンパク質反応は、結合親和性アッセイ、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｃｈａｒｅ）を用いてリアルタイムに未標識の反応体を検出するための表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）を利用するアッセイを使用して、評価分析することができる。
【００３４】
ヒトＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｏ００２０６［ａａ．２４−６３１］）の細胞外ドメインは、以下のアミノ酸配列：
２４−ＥＳＷＥＰＣＶ  ＥＶＶＰＮＩＴＹＱＣ  ＭＥＬＮＦＹＫＩＰＤ  ＮＬＰＦＳＴＫＮＬＤ  ＬＳＦＮＰＬＲＨＬＧ  ＳＹＳＦＦＳＦＰＥＬ  ＱＶＬＤＬＳＲＣＥＩ  ＱＴＩＥＤＧＡＹＱＳ  ＬＳＨＬＳＴＬＩＬＴ  ＧＮＰＩＱＳＬＡＬＧ  ＡＦＳＧＬＳＳＬＱＫ  ＬＶＡＶＥＴＮＬＡＳ  ＬＥＮＦＰＩＧＨＬＫ  ＴＬＫＥＬＮＶＡＨＮ  ＬＩＱＳＦＫＬＰＥＹ  ＦＳＮＬＴＮＬＥＨＬ  ＤＬＳＳＮＫＩＱＳＩ  ＹＣＴＤＬＲＶＬＨＱ  ＭＰＬＬＮＬＳＬＤＬ  ＳＬＮＰＭＮＦＩＱＰ  ＧＡＦＫＥＩＲＬＨＫ  ＬＴＬＲＮＮＦＤＳＬ  ＮＶＭＫＴＣＩＱＧＬ  ＡＧＬＥＶＨＲＬＶＬ  ＧＥＦＲＮＥＧＮＬＥ  ＫＦＤＫＳＡＬＥＧＬ  ＣＮＬＴＩＥＥＦＲＬ  ＡＹＬＤＹＹＬＤＤＩ  ＩＤＬＦＮＣＬＴＮＶ  ＳＳＦＳＬＶＳＶＴＩ  ＥＲＶＫＤＦＳＹＮＦ  ＧＷＱＨＬＥＬＶＮＣ  ＫＦＧＱＦＰＴＬＫＬ  ＫＳＬＫＲＬＴＦＴＳ  ＮＫＧＧＮＡＦＳＥＶ  ＤＬＰＳＬＥＦＬＤＬ  ＳＲＮＧＬＳＦＫＧＣ  ＣＳＱＳＤＦＧＴＴＳ  ＬＫＹＬＤＬＳＦＮＧ  ＶＩＴＭＳＳＮＦＬＧ  ＬＥＱＬＥＨＬＤＦＱ  ＨＳＮＬＫＱＭＳＥＦ  ＳＶＦＬＳＬＲＮＬＩ  ＹＬＤＩＳＨＴＨＴＲ  ＶＡＦＮＧＩＦＮＧＬ  ＳＳＬＥＶＬＫＭＡＧ  ＮＳＦＱＥＮＦＬＰＤ  ＩＦＴＥＬＲＮＬＴＦ  ＬＤＬＳＱＣＱＬＥＱ  ＬＳＰＴＡＦＮＳＬＳ  ＳＬＱＶＬＮＭＳＨＮ  ＮＦＦＳＬＤＴＦＰＹ  ＫＣＬＮＳＬＱＶＬＤ  ＹＳＬＮＨＩＭＴＳＫ  ＫＱＥＬＱＨＦＰＳＳ  ＬＡＦＬＮＬＴＱＮＤ  ＦＡＣＴＣＥＨＱＳＦ  ＬＱＷＩＫＤＱＲＱＬ  ＬＶＥＶＥＲＭＥＣＡ  ＴＰＳＤＫＱＧＭＰＶ  ＬＳＬＮＩＴＣＱＭＮ  Ｋ−６３１  （配列番号５）、
またはそのフラグメントもしくは変異体を有することができ、例えば、配列番号５と少なくとも６５％，７０％，７１％，７２％，７３％，７４％，７５％，７６％，７７％，７８％，７９％，８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することができ、ここでそのフラグメントもしくは変異体はＳ１００Ａ９と結合することができる。
【００３５】
ＴＬＲ４の外部ドメインは、従来から、リポ多糖類（ＬＰＳ）トラップとして機能する骨髄分化因子２（ＭＤ−２）との融合タンパク質で使用されている。ＭＤ−２は、ＴＬＲ４がＬＰＳと結合するのに必要である。しかしながら、ＴＬＲ４は、Ｓ１００Ａ９と結合してトラップする必要はない。したがって、いくつかの実施形態では、ＴＬＲ４を含有している融合タンパク質は、ＭＤ−２も含有していない。他の実施形態では、融合タンパク質はＴＬＲ４及びＣＤ３３外部ドメインの両方を含有している。
【００３６】
ヒト終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）の細胞外ドメイン（受入番号ＮＰ＿００１１２７［ａａ．２３−３４２］）は、以下のアミノ酸配列：
２３−ＡＱＮＩＴＡＲＩ  ＧＥＰＬＶＬＫＣＫＧ  ＡＰＫＫＰＰＱＲＬＥ  ＷＫＬＮＴＧＲＴＥＡ  ＷＫＶＬＳＰＱＧＧＧ  ＰＷＤＳＶＡＲＶＬＰ  ＮＧＳＬＦＬＰＡＶＧ  ＩＱＤＥＧＩＦＲＣＱ  ＡＭＮＲＮＧＫＥＴＫ  ＳＮＹＲＶＲＶＹＱＩ  ＰＧＫＰＥＩＶＤＳＡ  ＳＥＬＴＡＧＶＰＮＫ  ＶＧＴＣＶＳＥＧＳＹ  ＰＡＧＴＬＳＷＨＬＤ  ＧＫＰＬＶＰＮＥＫＧ  ＶＳＶＫＥＱＴＲＲＨ  ＰＥＴＧＬＦＴＬＱＳ  ＥＬＭＶＴＰＡＲＧＧ  ＤＰＲＰＴＦＳＣＳＦ  ＳＰＧＬＰＲＨＲＡＬ  ＲＴＡＰＩＱＰＲＶＷ  ＥＰＶＰＬＥＥＶＱＬ  ＶＶＥＰＥＧＧＡＶＡ  ＰＧＧＴＶＴＬＴＣＥ  ＶＰＡＱＰＳＰＱＩＨ  ＷＭＫＤＧＶＰＬＰＬ  ＰＰＳＰＶＬＩＬＰＥ  ＩＧＰＱＤＱＧＴＹＳ  ＣＶＡＴＨＳＳＨＧＰ  ＱＥＳＲＡＶＳＩＳＩ  ＩＥＰＧＥＥＧＰＴＡ  ＧＳＶＧＧＳＧＬＧＴ  ＬＡ−３４２  （配列番号６）、またはそのフラグメントもしくは変異体を有することができ、例えば、配列番号６と少なくとも６５％，７０％，７１％，７２％，７３％，７４％，７５％，７６％，７７％，７８％，７９％，８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することができ、ここで、そのフラグメントもしくは変異体はＳ１００Ａ９と結合することができる。
【００３７】
ＣＤ３３、ＴＬＲ４、及び／またはＲＡＧＥの受容体細胞外ドメインは、２つの定常領域ドメインを含有し且つ可変領域を欠いている免疫グロブリン重鎖定常領域、典型的にはＦｃフラグメントとの融合体して発現することができる。そのような融合体は、Ｆｃ部分が互いにジスルフィド結合されていて、そして２つの受容体ポリペプチドが互いに隣接して配列されている多量体分子として分泌され得る。このキメラ分子は、融合タンパク質として生成することができ、そしてそれは、構成ポリペプチドの化学カップリングによって形成され得るか、または１つの連続した融合タンパク質をコードする核酸配列から１つのポリペプチドとして発現され得る。一本鎖融合タンパク質は、１つの連続したポリペプチド骨格を有する融合タンパク質である。融合タンパク質は、２つの遺伝子をインフレームで連結して１つの核酸にし、次いで、その核酸を、適切な宿主細胞において、融合タンパク質が生成される条件下で発現させる分子生物学の従来の方法を使用して、調製することができる。特に、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９阻害剤は、ＣＤ３３、ＴＬＲ４、及び／またはＲＡＧＥの外部ドメインと、例えばＩｇＧ１由来の免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）とを含むキメラ融合タンパク質であり得る。
【００３８】
場合によっては、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９アンタゴニストは多価であり、例えば、それは、少なくとも２つ、３つ、またはそれ以上のＳ１００Ａ９結合ドメインを含有する。場合によっては、そのアンタゴニストは、少なくとも１つのＣＤ３３外部ドメインと、ＴＬＲ４外部ドメイン及びＲＡＧＥ外部ドメインから成る群から選択されるＳ１００Ａ９結合ドメインとを含有する。
【００３９】
その融合タンパク質の複数のコピーを組み合わせて多価複合体を形成することもできる。したがって、いくつかの実施形態では、２つ以上の融合タンパク質をコアの分子または粒子に連結することができる。その最も単純な形態では、多価複合体は、好ましくはリンカー分子を介して互いに会合された（例えば共有結合的にまたはそれ以外の方法で連結された）開示される融合タンパク質の２つまたは３つまたは４つまたはそれ以上の多量体を含む。適切なリンカー分子としては、多価結合分子、例えばアビジン、ストレプトアビジン及びエクストラビジンが挙げられ、そのそれぞれは、ビオチンのための４つの結合部位を有することができる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、その融合タンパク質はビオチン化され得る。ビオチン化したら、次いでそのビオチン化融合タンパク質は、多量体ストレプトアビジンにコンジュゲートさせることができる。タンパク質は、化学的にまたは酵素でビオチン化することができる。化学的ビオチン化は、アミン、カルボキシレート、スルフヒドリル及び炭水化物を非特異的にビオチン化するために、様々なコンジュゲーションケミストリーを利用する。酵素的ビオチン化は、細菌ビオチンリガーゼによって、ある配列内に存在する特定のリジンをビオチン化する。ほとんどの化学的ビオチン化試薬は、ビオチンの吉草酸側鎖にリンカーを介して結合している反応基から成る。このリンカーは、ビオチン化試薬に溶解性をもたらすこともでき；ポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）を組み込んでいるリンカーは、水不溶性試薬を可溶性にすることができるか、またはある程度まで既に可溶性であるビオチン化試薬の溶解度を増加させることができる。
【００４１】
酵素的ビオチン化は、最もしばしば、関心対象のタンパク質を、そのＮ末端、Ｃ末端においてまたは内部ループにおいて、末端ＡｖｉＴａｇ（商標）もしくは受容体ペプチド（ＡＰ）とも呼ばれる１５アミノ酸のビオチン受容体ペプチドに対して、遺伝子的に連結させることにより、行われる。次いで、そのタグを付したタンパク質を、ビオチン及びＡＴＰの存在下で、ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）と一緒に培養する。酵素的ビオチン化はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができるが、ＢｉｒＡは、哺乳動物細胞及び細菌細胞の内側及び細胞表面に存在するその標的ペプチドとも特異的に反応するが、他の細胞タンパク質は修飾されない。したがって、融合タンパク質は、ビオチン及びＡＴＰの存在下で、ＢｉｒＡによってビオチン化され得るビオチン受容体ペプチドを更に含むことができる。例えば、Ｆｃ部分は、ＡｖｉＴａｇ（商標）系（Ａｖｉｄｉｔｙ，ＬＬＣ、Ａｕｒｏｒａ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）を使用して酵素的にビオチン化することができ、その系は、１５アミノ酸のペプチド配列を、Ｅ．ｃｏｌｉのＢｉｒＡ酵素によってビオチン化され得るキメラ融合タンパク質中に組み込むことを含む。いくつかの実施形態では、このビオチン受容体ペプチドは、アミノ酸配列ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号７）を有する。
【００４２】
オリゴヌクレオチドは、ビオチンホスホラミダイトを使用するホスホラミダイト法によって、オリゴヌクレオチド合成の過程で容易にビオチン化される。標準的な脱保護時に、得られるコンジュゲートは、逆相または陰イオン交換ＨＰＬＣを使用して精製することができる。
【００４３】
他の実施形態では、２つ以上の融合タンパク質を、リポソームまたは他の微粒子の表面にコンジュゲートして、多価複合体を形成する。多くの報告が、リポソームへの抗体の結合を記載している。例えば、米国５，６２０，６８９号は、Ｂリンパ球またはＴリンパ球上の選択された抗原に対して結合するのに有効な抗体または抗体フラグメントが、ポリエチレングリコール鎖の表面被覆を有するリポソームにおける膜脂質の遠位端に結合される、いわゆる「免疫リポソーム」を開示している。いくつかの実施形態では、開示される多価複合体は、開示される融合タンパク質と特異的に結合する抗体を含有する免疫リポソームを含む。例えば、抗体は、融合タンパク質のＦｃ部分、または、ビオチン受容体ペプチドのようなタンパク質上のタグと結合することができる。
【００４４】
その多価複合体は、均質であることができ、すなわち、１つの融合タンパク質の１つのタイプの複数のコピーを含有することができるか、または、不均質であり得る。例えば、多価複合体はＣＤ３３とＴＬＲ４融合タンパク質との組み合わせを含有することができる。更に、その多価複合体は、多価融合タンパク質、すなわち、２つ以上のＳ１００Ａ９結合ドメインを含む少なくとも２つ以上の融合タンパク質を含有することができる。
【００４５】
開示されるキメラ融合タンパク質は、１つ以上のＣＤ３３及び／またはＴＬＲ４外部ドメインを互いに対して、Ｆｃ部分に対して、またはそのあらゆる組み合わせに対して接続するペプチドリンカー配列を含有することもできる。例えば、そのペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＤＩＥＧＲＭＤ（配列番号８）を有することができる。
【００４６】
他の実施形態では、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９阻害剤は、ＭＤＳＣ上の内因性ＣＤ３３受容体と結合して阻害する。例えば、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９阻害剤は、ＭＤＳＣを活性化することなくＣＤ３３と結合し、内因性Ｓ１００Ａ９（例えばＳ１００Ａ９の突然変異体または切断型変異体）の結合に関して競合する組換えタンパク質であり得る。
【００４７】
抗体
開示される組成物及び方法で使用できる抗体としては、任意のクラスの全免疫グロブリン（すなわち、完全な抗体）、そのフラグメント、及び少なくとも抗体の抗原結合可変ドメインを含有する合成タンパク質が挙げられる。可変ドメインは、抗体間で配列が異なり、その特定の抗原のためのそれぞれの特有な抗体の結合及び特異性で使用される。しかしながら、可変性は、通常は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布されない。可変性は、典型的には、軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方にある相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存される部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、３つのＣＤＲによって結合された主にβシート配置をとる４つのＦＲ領域を含み、これらのＣＤＲは、ループを形成して、βシート構造と結合し、場合によっては、その一部を形成する。各鎖中のＣＤＲは、他の鎖からのＣＤＲと共にＦＲ領域によって極めて接近して一体的に保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。
【００４８】
生物活性を有する抗体のフラグメントも開示される。フラグメントとしては、他の配列に結合されたか、結合されていないかに関わらず、修飾されていない抗体または抗体フラグメントと比較して、フラグメントの活性が有意に変更されることも損なわれることもないという条件で、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択された修飾が挙げられる。
【００４９】
技術は、本開示の抗原タンパク質に特異的な一本鎖抗体を製造するために適合させることもできる。一本鎖抗体を製造する方法は当業者には公知である。短いペプチドリンカーを用いて重鎖及び軽鎖の可変ドメインを一緒に融合し、それによって単一の分子上に抗原結合部位を再構築することによって、一本鎖抗体を作製することができる。１５から２５アミノ酸のペプチドまたはリンカーを介して、１つの可変ドメインのＣ末端が、他の可変ドメインのＮ末端につながっている一本鎖抗体可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、抗原結合またはその結合の特異性を有意に損なうことなく開発されている。重鎖及び軽鎖がそれらの適切なコンホメーションの方向で一緒に結合することを可能にするようにリンカーを選択する。
【００５０】
二価の一本鎖可変フラグメント（ｄｉ−ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖを連結することによって工学的に作製し得る。これは、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域を有する１本のペプチド鎖を製造し、タンデムｓｃＦｖを生じさせることによって、行うことができる。また、ｓｃＦｖは、２つの可変領域が一緒にフォールディングされるには短すぎるリンカーペプチド（約５アミノ酸）を用いて設計することもでき、ｓｃＦｖを二量体化させる。このタイプは、ダイアボディとして公知である。二重特異性抗体は、対応するｓｃＦｖに比べて４０倍まで低い解離定数を有することが示されており、このことは、それらがそれらの標的に対してはるかに高い親和性を有することを意味している。更により短いリンカー（１または２アミノ酸）は、トライマー（トリアボディまたはトリボディ）の形成をもたらす。テトラボディも製造されている。それらは、それらの標的に対して、ダイアボディより更に高い親和性を示す。
【００５１】
アプタマー
「アプタマー」という用語は、特定の標的分子に結合するオリゴ核酸またはペプチド分子を指す。これらの分子は、一般的に、ランダム配列プールから選択される。選択されたアプタマーは、固有の３次構造に適応し、そして高い親和性及び特異性で標的分子を認識することができる。「核酸アプタマー」は、そのコンホメーションを介して標的分子に結合し、それにより標的分子の機能を阻害または抑制するＤＮＡまたはＲＮＡオリゴ核酸である。核酸アプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその組み合わせによって構成され得る。「ペプチドアプタマー」は、足場タンパク質内に挿入された可変ペプチド配列を有するコンビナトリアルタンパク質分子である。ペプチドアプタマーの同定は、典型的には、厳密な酵母ジハイブリッド条件下で行われ、そしてそれは、選択されたペプチドアプタマーが安定的に発現され、そして正確に細胞内環境で折り畳まれる確率を高める。
【００５２】
核酸アプタマーは、典型的には、ステム−ループまたはＧカルテットなどの、定義された２次及び３次構造へとフォールディングする、長さ１５〜５０塩基のオリゴヌクレオチドである。核酸アプタマーは、好ましくは、標的分子と、１０−６未満、１０−８未満、１０−１０未満、または１０−１２未満のＫｄで結合する。核酸アプタマーはまた、非常に高い程度の特異性でも標的分子と結合する。核酸アプタマーは、他の非標的分子とのＫｄに比べて、少なくとも１０、１００、１０００、１０，０００、または１００，０００倍低い、標的分子とのＫｄを有することが好ましい。
【００５３】
核酸アプタマーは、典型的には、吸着、回収、及び再増幅の反復プロセスによって、合成オリゴヌクレオチドの複合体ライブラリーから単離される。例えば、核酸アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（指数的濃縮によるリガンドの系統的進化（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））法を用いて調製することができる。ＳＥＬＥＸ法は、両端にランダム配列領域及びプライマー結合領域を有するＲＮＡ分子から成るＲＮＡプールから、標的分子に結合されるＲＮＡ分子を選択すること、回収されたＲＮＡ分子をＲＴ−ＰＣＲによって増幅すること、得られたｃＤＮＡ分子を鋳型として使用して転写を行うこと、及び得られた生成物をその後の手順のためのＲＮＡプールとして使用することを含む。そのような手順を数回から数十回反復して、標的分子により強く結合する能力を有するＲＮＡを選択する。ランダム配列領域及びプライマー結合領域の塩基配列の長さは、特に制限されない。通常は、ランダム配列領域は、約２０〜８０塩基を含有し、プライマー結合領域は約１５〜４０塩基を含有する。予め、標的分子に類似の分子をＲＮＡプールと混合すること及び関心対象の分子に結合しなかったＲＮＡ分子を含有するプールを使用することによって、標的分子に対する特異性を増強することができる。そのような技術によって最終生成物として得られたＲＮＡ分子は、ＲＮＡアプタマーとして使用される。インビトロセレクション法によって生成されてきたアプタマー及び非天然リボザイムについての包括的な配列情報を含有するアプタマーデータベースは、ａｐｔａｍｅｒ．ｉｃｍｂ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕで入手可能である。
【００５４】
核酸アプタマーは、一般的に、抗体に比べて、標的分子に対してより高い特異性及び親和性を有する。したがって、核酸アプタマーは、標的分子に対して特異的に、直接的に、そして強固に結合することができる。結合に必要な標的アミノ酸残基の数は、抗体のそれに比べて少なくてもよいことから、核酸アプタマーは、例えば、相同性の高いタンパク質の中で所定のタンパク質の機能を選択的に抑制する際には、抗体よりも優れている。
【００５５】
非修飾核酸アプタマーは、アプタマーの本来の低い分子量の結果、主にヌクレアーゼ分解及び腎臓による身体からのクリアランスに起因して、数分から数時間の半減期で血流から急速に取り除かれる。この急速クリアランスは、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像診断のような用途で有利であり得る。しかしながら、いくつかの修飾、例えば２’−フッ素置換ピリミジン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合などは、アプタマーの血漿半減期を日または更に週の時間スケールまで延長するために利用可能である。
【００５６】
アプタマーのヌクレアーゼ抵抗性を増加させる別のアプローチは、Ｓｐｒｉｅｇｅｌｍｅｒを使用することである。Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒは、非天然Ｌ−リボヌクレオチドから作製されたリボ核酸（ＲＮＡ）様分子である。したがって、Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒは天然オリゴヌクレオチドの立体化学的鏡像（エナンチオマー）である。他のアプタマーのように、Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒはタンパク質のような標的分子と結合することができる。それらの標的分子に対するＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒの親和性は、しばしば、ピコモルからナノモル範囲であり、したがって抗体に匹敵する。他のアプタマーと対照的に、Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒは、酵素による加水分解で切断されにくいので、Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒは血清中で高度な安定性を有する。にもかかわらず、Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒは、それらは低いモル質量に起因して短時間で腎臓によって排出される。他のアプタマーとは異なり、ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒはＳＥＬＥＸ法によって直接製造できない。これは、Ｌ−核酸が、酵素的方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応に従わないからである。その代わりに、ＳＥＬＥＸ法によって同定された天然アプタマーの配列が確認され、次いで、天然アプタマーの鏡像の人工合成で使用される。
【００５７】
ペプチドアプタマーは、細胞内の他のタンパク質相互作用を妨げるように設計されるタンパク質である。それらは、足場の両端に結合された様々なペプチドループから成る。この二重構造の制約は、ペプチドアプタマーの結合親和性を、抗体に匹敵するレベルまで大きく増加させる。
【００５８】
可変ループ長は、典型的には、約１０〜２０のアミノ酸から構成され、足場は、良好な溶解性を有する任意のタンパク質であり得る。現在、細菌タンパク質のチオレドキシンＡは、最も頻繁に使用される足場タンパク質であり、可変ループは、還元された活性部位内に挿入され、２つのシステイン側鎖は、ジスルフィド架橋を形成することができる。
【００５９】
ペプチドアプタマーの選択は、異なる系を使用して行うことができるが、最も頻繁に使用されるシステムは、現在、酵母の２ハイブリッド系である。また、ペプチドアプタマーは、ファージディスプレイ、及び他の表面ディスプレイ技術、例えばｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイ及び酵母ディスプレイによって構築されたコンビナトリアルペプチドライブラリーから選択することもできる。これらの実験手順は、バイオパニングとしても公知である。バイオパニングから得られるペプチドのうち、ミモトープは、ペプチドアプタマーの一種と考えることができる。コンビナトリアルペプチドライブラリーからパニングされたすべてのペプチドは、ＭｉｍｏＤＢという名前の特別なデータベースに保存されている。
【００６０】
医薬組成物
開示される組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて治療に使用することができる。「薬学的に許容される」とは、物質が生物学的にまたはそれ以外においても不適切ではない、すなわち、その物質が、望ましくない生物学的効果を生じることなく、またはそれを含有する医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な相互作用を起こすことなく、核酸またはベクターと一緒に、対象に投与可能であることを意味している。担体は、当業者には公知であるように、当然に、活性成分の分解を最小化するとともに、対象における副作用を最小化するように選択される。
【００６１】
適切な担体及びそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５に記載されている。典型的には、製剤において適量の薬学的に許容される塩を使用して製剤を等張にする。薬学的に許容される担体の例としては、生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液が挙げられるが、それらに限定されない。その溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８であり、より好ましくは、約７〜約７．５である。更なる担体としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性基質などの徐放性製剤が挙げられ、その基質は、造形品の形態、例えば膜、リポソーム、または微粒子である。例えば、投与される組成物の投与経路及び濃度によっては、ある種の担体がより好ましい場合があることは当業者には明白である。
【００６２】
医薬担体は当業者に公知である。これらは、最も典型的には、生理的ｐＨの滅菌水、生理食塩水、及び緩衝液などの溶液を包含する、ヒトに対する薬物の投与のための標準的な担体である。その組成物は、筋肉内投与または皮下投与することができる。他の化合物は、当業者が使用する標準的な手順に従って投与される。
【００６３】
医薬組成物は、選択分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存料、界面活性剤などを包含していてもよい。医薬組成物はまた、１つ以上の活性成分、例えば抗菌薬、抗炎症薬、麻酔薬等も包含していてもよい。
【００６４】
非経口投与のための製剤は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、及びエマルジョンを包含する。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、エマルジョン、または懸濁液、例えば生理食塩水及び緩衝媒体が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体及び栄養補給剤、電解質補給剤（例えば、リンガーのデキストロースをベースにしたもの）などが挙げられる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、及び不活性ガスなどのような保存料及び他の添加剤を含有させてもよい。
【００６５】
経口投与のための組成物は、粉末もしくは顆粒、懸濁液もしくは水溶液、または非水性媒体中の溶液、カプセル、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）、または錠剤を包含する。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、または結合剤が望ましい場合がある。
【００６６】
上記組成物のいくつかは、可能性として、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、及びリン酸、及び有機酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、及びフマル酸との反応によって、または無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、及び有機塩基、例えばモノアルキル、ジアルキル、トリアルキル、及びアリールアミン、ならびに置換エタノールアミンとの反応によって形成される薬学的に許容される酸または塩基付加塩として投与可能である。
【００６７】
治療法
また、本明細書で開示されるＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９アンタゴニストを含む組成物を対象に投与することを含む、Ｓ１００Ａ９活性によって引き起こされるかまたは悪化する、対象における疾患または状態を治療する方法も開示する。
【００６８】
先天性の免疫系は、炎症反応の開始及び増幅にとって重要である。このプロセス中、食細胞が、ＰＲＲによって認識されるＰＡＭＰによって活性化される。また、食細胞は、部分的に特異的で部分的に共通のＰＲＲを介して、アラーミンまたはＤＡＭＰと呼ばれる内因性デンジャーシグナルによっても活性化される。Ｓ１００タンパク質ファミリーの２つのメンバーである、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９は、重要な内因性ＤＡＭＰとして最近同定されている。Ｓ１００ＡとＳ１００Ａ９との複合体（カルプロテクチンとも呼ばれる）は、食細胞のストレス応答中に活発に分泌される。これらの分子はＴＬＲ４の内因性活性化剤として同定されてきており、致死、内毒素誘発ショックを促進することが示されている。重要なことに、Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９は、感染症における炎症反応を促進することを含むのみならず、自己免疫ならびに癌の進行及び腫瘍の転移における炎症の強力な増幅物質としても同定された。Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９のこの炎症促進作用は、食細胞、内皮細胞、及び他の細胞においてオートクリン及びパラクリンのメカニズムを含む。正味の結果として、炎症を起こした組織への白血球の血管外遊出及びそれらのその後の活性化が増加する。而して、Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９は、炎症の増幅において重要な役割を果たす。
【００６９】
Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９活性と関連のある疾患としては、関節リウマチ、若年性ライテル症候群、乾癬性関節炎、敗血症、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈症候群／心筋梗塞、糖尿病、乾癬／炎症性皮膚疾患、炎症性腸疾患、脈管炎、移植拒絶、ＳＬＥ／糸球体腎炎、膵炎、癌、皮膚筋炎／多発性筋炎、及び高亜鉛血症／全身性炎症が挙げられるが、それらに限定されない。更に、再発性感染症を特徴とする疾患、肝脾腫、貧血、血管障害（ｖａｓｃｕｌｏｐａｔｈｉｅ）、随伴性皮膚潰瘍（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｕｌｃｅｒ）、及び全身性炎症は、細胞外液におけるＳ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９の異常に高いレベルによって定義される。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本方法は、感染を治療し、且つ／または敗血症を予防することをそれを必要とする患者において行うことを含む。敗血症は、血液、尿路、肺、皮膚、または他の組織における重篤な感染、最も一般的には細菌による感染であるが、また真菌、ウイルス、及び寄生虫による感染に対する免疫系の応答によって引き起こされる。典型的な敗血症性炎症カスケードを引き起こし得る多くの微生物因子が存在する。侵入している病原体は、その病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）によって認識される。ＰＡＭＰの例は、グラム陰性菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）、グラム陰性菌のフラゲリン、グラム陽性菌及びＣｐＧ細菌ＤＮＡのペプチドグリカン細胞壁中のムラミルジペプチドである。これらのＰＡＭＰは、先天性免疫系のパターン認識受容体（ＰＲＲ）によって認識される。ＰＲＲには４つのファミリーが存在する：すなわち、ｔｏｌｌ様受容体、Ｃ型レクチン受容体、ヌクレオチドオリゴマー化ドメイン様受容体、及びＲｉｇＩ−ヘリカーゼである。Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９は、ＴＮＦ−αの上流での食細胞に関するＬＰＳ効果の増幅に関わる内因性ＴＬＲ４リガンドとして作用する。ＴＮＦ−αはＬＰＳ毒性にとって重要であるが、ＴＮＦ−αの遮断は、ヒト敗血症における保護効果よりはむしろ有害であった。更に、小規模研究では、Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９レベルは、敗血症から回復中の生存患者では減少することが示され、そして非生存者では、Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９の血清レベルが高いことが特徴であった。敗血症は、通常は、静脈内補液及び抗生物質で治療される。開示されるＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９アンタゴニストは、静脈内への抗生物質の代わりに、またはそれに加えて、使用することができる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本方法は、炎症性疾患及び／または自己免疫疾患を治療することを、それを必要とする患者において行うことを含む。Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９は、様々なタイプの関節炎の病因に関与する。マクロファージ由来のＳ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９は、抗原によって誘発された関節炎の炎症応答を増幅し、また、感染または病原体の非存在下で、内因性ＤＡＭＰとしても作用する。自己免疫は、自己としてそれ自身の構成要素を認識する際の生物の障害であり、したがって、それ自身の細胞及び組織に対する免疫応答を導く。そのような異常免疫応答から生じるいかなる疾患も自己免疫疾患または自己炎症疾患と呼ぶ。自己免疫疾患及び自己炎症疾患は、両群の障害が、免疫系が身体の自分自身の組織を攻撃することから生じ、そしてまた炎症の増加ももたらす、という点で共通の特徴を共有する。よく知られている例としては、セリアック病、１型糖尿病（ＩＤＤＭ）、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、チャーグ−ストラウス症候群、橋本甲状腺炎、グレーヴズ病、特発性血小板減少性紫斑病、アジソン病、関節リウマチ（ＲＡ）、痛風性関節炎、多発性筋炎（ＰＭ）、皮膚筋炎（ＤＭ）、移植片対宿主病、悪性貧血、アジソン病、強皮症、グッドパスチャー症候群、炎症性腸疾患、例えばクローン病、大腸炎、異型大腸炎、化学性結腸炎；コラーゲン蓄積大腸炎、遠位大腸炎、空置大腸炎：劇症大腸炎、不確定大腸炎、感染性腸炎、虚血性大腸炎、リンパ球性大腸炎、顕微鏡的大腸炎、胃腸炎、ヒルシュスプルング病、炎症性消化器系疾患、クローン病、非慢性または慢性消化器系疾患、非慢性病患者または慢性炎症性消化器系疾患；限局性腸炎及び潰瘍性大腸炎、自己免疫性溶血性貧血、生殖不能、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドウ病、血小板減少症紫斑、インスリン依存性糖尿病、アレルギー；喘息、アトピー性疾患；動脈硬化；心筋炎；心筋症；糸球体腎炎；低形成貧血；器官移植後の拒絶反応及び肺、前立腺、肝臓、卵巣、結腸、頸部、リンパ及び胸部組織の多くの悪性腫瘍、乾癬、尋常性座瘡、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、骨盤腹膜炎、再灌流障害サルコイドーシス、脈管炎、間質性膀胱炎、Ｉ型過敏症、全身性硬化、皮膚筋炎、多発性筋炎、及び封入体筋炎、及びアレルギーが挙げられる。自己免疫疾患の治療は、伝統的に、免疫抑制、抗炎症（ステロイド）、または緩和療法であった。非免疫学的治療法、例えば橋本甲状腺炎及び１型糖尿病におけるホルモン補充は、自己免疫応答の結果を治療することであり、したがってこれらは緩和的療法である。食餌の操作により、セリアック病の重症度が限定される。ステロイドまたはＮＳＡＩＤ療法により、多くの疾患の炎症症状が限定される。ＩＶＩＧがＣＩＤＰ及びＧＢＳのために使用される。特定の免疫調節療法、例えばＴＮＦαアンタゴニスト（例えばエタナーセプト）、Ｂ細胞枯渇薬リツキシマブ、抗ＩＬ−６受容体トシリズマブ、及び同時刺激遮断薬アバタセプトは、ＲＡ治療に有用であることが証明されている。これらの免疫療法のいくつかは、感染感受性などの悪影響のリスク増加を伴う場合がある。開示されるＣＤ３３���Ｓ１００Ａ９アンタゴニストは、これら既存の治療の代わりに、またはそれに加えて、使用することができる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本方法は、神経変性疾患または障害を治療することを、それを必要とする患者において行うことを含む。本明細書で使用される場合、「神経変性疾患」としては、「タンパク質凝集障害」、「タンパク質高次構造障害」または「タンパク質症」とも呼ばれるタンパク質凝集と関連のある神経変性疾患が挙げられる。タンパク質凝集と関連のある神経変性疾患としては、有害な細胞内タンパク質凝集（例えば、細胞質ゾルまたは核中の封入体）または細胞外タンパク質凝集（例えば、プラーク）の形成を特徴とする疾患または障害が挙げられる。「有害なタンパク質凝集」は、２つ以上のヘテロマーまたはホモマーのタンパク質またはペプチドの望ましくなく且つ有害な蓄積、オリゴマー形成、フィブリン形成または凝集である。有害なタンパク質凝集体は、体、封入体またはプラーク内に沈着する可能性があり、その特性はしばしば疾患を示し、疾患特異的タンパク質を含有する。例えば、スーパーオキシドジスムターゼ−１凝集体はＡＬＳと関連があり、ポリＱ凝集体はハンチントン舞踏病と関連があり、そしてα−シヌクレイン含有レヴィー小体はパーキンソン病と関連がある。
【００７３】
また、神経系疾患は、病原性実体と間接的にまたは直接的に関係づけられる因子に起因して、含有する免疫系の能力を上回る病原性因子レベルの増加、または免疫機能が疾患の進行と同時に低下もしくは抑制される状態と関係づけられる免疫不全とも関連がある。ＭＤＳＣは、エフェクターＴ細胞活性を抑制することによってＴ細胞の欠乏を引き起こすことができ、したがって免疫不全と関連のある神経変性疾患を促進する。
【００７４】
タンパク質凝集障害またはプロテオパシーの代表的な例は、タンパク高次構造障害、α−シヌクレイノパシー、ポリグルタミン疾患、セルピノパシー、タウオパシーまたは他の関連障害が挙げられる。神経系疾患またはの他の例は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、びまん性レヴィー小体認知症（ＤＬＢＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、筋緊張性異栄養症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、フリードライヒ失調症、脆弱性Ｘ症候群、脆弱性ＸＥ精神遅滞、マシャド−ヨセフ病（ＭＪＤまたはＳＣＡ３）、脊髄延髄筋萎縮（別名ケネディ病）、脊髄小脳性運動失調１型（ＳＣＡｌ）遺伝子、脊髄小脳性運動失調２型（ＳＣＡ２）、脊髄小脳性運動失調６型（ＳＣＡ６）、脊髄小脳性運動失調７型（ＳＣＡ７）、脊髄小脳性運動失調１７型（ＳＣＡ１７）、慢性肝炎、ニューロセルピン封入体（ＦＥＮＩＢ）を伴う家族性エンセファロパシー、ピック病、皮質基底核変性（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソニズム認知症複合体、白内障、セルピノパシー、溶血性貧血、嚢胞性線維症、ウィルソン病、神経線維腫症２型、髄鞘脱落末梢神経障害、色素性網膜炎、マルファン症候群、気腫、特発性肺線維症、嗜銀顆粒性認知症（Ａｒｇｙｏｐｈｉｌｉｃ  ｇｒａｉｎ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、皮質基底核変性、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化、１７番染色体に関連する前頭側頭型認知症／パーキンソニズム、ハレルフォルデンスパッツ病、ニーマンピック病Ｃ型、亜急性硬化性汎脳炎、認知障害、例えば認知症（アルツハイマー病関連、虚血、心的外傷、脈管問題または脳卒中、ＨＩＶ疾患、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、ピック病、クロイツフェルト−ヤーコプ病、周産期低酸素、他の全身身体状態または物質乱用）；せん妄、健忘性疾患または加齢に関係する認識力低下；不安障害、例えば急性ストレス障害、広場恐怖症、全般性不安障害、強迫性障害、パニック発作、パニック障害、心的外傷後ストレス障害、分離不安障害、対人恐怖症、特定の恐怖症、物質誘発性不安障害及び全身の医学的状態に起因する不安；統合失調症または精神病、例えば統合失調症（妄想型、解体型、緊張型または未分化型）、統合失調症様障害、統合失調感情障害、妄想性障害、短期精神疾患性障害、共有精神病障害、全身の医学的状態に起因する精神病性障害及び物質誘発性精神病性障害；物質関連障害及び耽溺行為（例えば物質誘導性譫妄、持続性認知症、持続性健忘障害、精神病性障害または不安障害；アルコール、アンフェタミン、大麻、コカイン、幻覚薬、吸入薬、ニコチン、オピオイド、フェンシクリジン、鎮痛剤、睡眠薬または抗不安薬を含む物質由来の耐性、依存性、禁断症状；運動障害、例えば無動症及び無動性硬直症候群（例えばパーキンソン病、薬物誘発性パーキンソン症、脳炎後パーキンソン症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン症−ＡＬＳ認知症複合体及び大脳基底核石灰化症）、薬物誘発性パーキンソン症（例えば神経安定薬誘発性パーキンソン症、神経弛緩薬性悪性症候群、神経安定薬誘発性急性筋緊張異常、神経安定薬誘発性急性静座不能症、神経安定薬誘発性遅発性ジスキネジア及び薬物誘発性姿勢振戦）ジル・ド・ラ・トゥーレット症候群、癲癇、及びジスキネジア、［例えば震顫（例えば静止時震顫、姿勢震顫及び意図震顫等）、舞踏病（例えばシデナム舞踏病、ハンチントン病、良性遺伝性舞踏病、神経有棘赤血球症、症候性舞踏病、薬物誘発性舞踏病及び片側バリズム）ミオクローヌス（例えば全身性ミオクローヌス及び局所性ミオクローヌス）、チック（例えば単純チック、複雑チック及び症候性チックを含む）、及びジストニア（例えば全身性ジストニア、例えば特発性ジストニア、薬物誘発性ジストニア、症候性ジストニア及び発作性ジストニア、及び局所性ジストニア、例えば眼瞼痙攣、顎口腔ジストニア、突発性発声障害、痙性斜頚、軸性ジストニア、ジストニー書痙及び片麻痺性ジストニア）］；肥満、神経性大食症及び強迫性摂食障害；疼痛、例えば骨痛及び関節痛（変形性関節症）、反復動作による疼痛、歯痛、癌性疼痛、筋筋膜痛（筋肉損傷、線維筋痛症）、周術期疼痛（一般外科、婦人科）、慢性疼痛、神経因性疼痛、外傷後疼痛、三叉神経痛、及び片頭痛（ｍｉｇｒａｉｎｅ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｉｎｅ  ｈｅａｄａｃｈｅ）；過剰な食物摂取と関連のある肥満または摂食障害、及びそれと関連のある合併症；注意欠陥／多動障害；行為障害；気分障害、例えば抑鬱性障害、双極性障害、全身の医学的状態に起因する気分障害、及び物質誘発性気分障害；筋肉痙攣、及び筋痙縮または筋力低下と関連のある障害、例えば震顫；尿失禁；筋萎縮性側索硬化症；ニューロン損傷、例えば眼球損傷、目の網膜症または黄斑変性、難聴または耳鳴；嘔吐、脳水腫、及び睡眠障害、例えばナルコレプシー、及び運動ニューロン細胞のアポトーシスが挙げられるが、それらに限定されない。神経因性疼痛の実例としては、糖尿病性多発ニューロパシー、エントラップメントニューロパシー、幻痛、脳卒中後の視床痛、帯状疱疹後神経痛、抜歯などの後の異型顔面神経痛、脊髄外傷、三叉神経痛、及び麻薬性鎮痛薬、例えばモルヒネに対して耐性を示す癌性疼痛が挙げられる。神経因性疼痛としては、中枢または末梢の神経損傷に起因する疼痛が挙げられる。そして、それは、単発神経障害または多発神経障害によって引き起こされる疼痛を包含する。
【００７５】
場合によっては、本方法は、腫瘍免疫応答を高めることを、それを必要とする患者において行うことを含む。Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９の発現は、様々な腫瘍を有する患者で増加している。腫瘍細胞から分泌される可溶性因子は、Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９の過剰発現を誘発し、その結果としてＭＤＳＣの生成が増加すると考えられる。これらのＭＤＳＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞による抗腫瘍反応を阻害し、したがって腫瘍成長を促進し得る。開示される方法の癌は、無秩序な成長、浸潤、または転移を経験している対象におけるあらゆる細胞であり得る。いくつかの態様では、その癌は、放射線治療が現在用いられるあらゆる新生物または腫瘍であり得る。いくつかの態様では、その癌は、標準の治療療法に抵抗性のあらゆる腫瘍であり得る。したがって、また、本明細書で開示される化合物または組成物の有効量を対象に投与することを含む、標準治療療法に腫瘍を感作する方法も提供する。例えば、その癌は、標準法を用いる放射線治療に対して十分な感度がない新生物または腫瘍であり得る。而して、癌は肉腫、リンパ腫、白血病、癌、芽腫、または胚細胞性腫瘍であり得る。開示される組成物を用いて治療し得る癌の代表的ではあるが非限定的なリストとしては、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳癌、神経系癌、頭頸部癌、頭頸部の扁平上皮癌、腎癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）、肺癌、例えば小細胞肺癌及び非小細胞性肺癌、神経芽細胞腫／グリア芽細胞腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、皮膚癌、肝癌、黒色腫、口腔、咽喉、喉頭、及び肺の扁平上皮癌、結腸癌、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸カルシノーマ（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳癌、上皮癌、腎性癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、尿生殖器癌、肺性癌（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）、食道癌、頭頸部カルシノーマ、大腸癌、造血癌；精巣癌；結腸癌及び直腸癌、前立腺癌、及び膵臓癌が挙げられる。開示されるＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９アンタゴニストは、既存の抗腫瘍薬及び／または放射線治療の代わりに、またはそれに加えて、使用することができる。
【００７６】
本明細書で開示されるように、ＬＩＮ−ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＤ３３＋ＭＤＳＣは、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）患者のＢＭ中に特異的に蓄積し、ＣＤ３３開始シグナル伝達のための内因性リガンドとしてＳ１００Ａ９を含むメカニズムによって造血を阻害する。したがって、開示される方法は、ＭＤＳを治療することを、それを必要とする患者で行うことを含むことができる。骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、血球の骨髄クラスの無効な生成（または形成異常）を伴う血液学的（血液に関する）医学的状態である。場合によっては、ＭＤ患者は、染色体５ｑ欠失（ｄｅｌ（５ｑ））を有する。しかしながら、他の場合では、患者は非ｄｅｌ５ｑ  ＭＤＳである。３種の薬剤が米国（ＵＳ）ではＭＤＳ治療用に承認されているが、レナリドマイド（ＬＥＮ）が唯一の目標化された治療法である。したがって開示されるＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９アンタゴニストは、レナリドマイドの代わりに、またはそれに加えて、使用することができる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書で開示される組成物の有効量を対象に投与することを含む、患者において慢性疾患性貧血（癌関連の貧血を含む）を治療することを含む。
【００７８】
投与
開示されるＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９阻害剤は、Ｓ１００Ａ９活性によって引き起こされるかまたは悪化する疾患を治療するために対象に治療的に有効な量を投与することができる。開示される、医薬組成物を含む組成物は、局所または全身の治療が望ましいか否かによっていくつかの方法で、治療領域に投与することができる。例えば、開示される組成物は、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、腔内に、または経皮的に投与することができる。組成物は、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内に）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外的に、眼科的に、経膣的に、直腸に、鼻腔内に、局所的になどで投与することができ、例えば局所鼻腔内への投与または吸入剤によって投与してもよい。
【００７９】
使用する場合、組成物の非経口投与は、一般的には、注射を特徴とする。注射製剤は、溶液または懸濁液として、注射の前に液体中の溶液または懸濁液にするのに適した固体形態、またはエマルジョンとして、慣用の形態で調製することができる。非経口投与のための改良されたアプローチは、一定の投与量が維持されるように、徐放または持続的放出のシステムの使用を含む。例えば、本明細書に参照により組み込まれる米国特許第３，６１０，７９５号を参照されたい。
【００８０】
本明細書で開示される組成物は、ＭＤＳのリスクがある患者または対象に予防的に投与してもよい。このように、本方法は、本明細書開示の組成物を投与する前に、ＭＤＳのリスクがある対象を特定することを更に含むことができる。
【００８１】
必要とされる組成物の正確な量は、対象の種、年齢、及び全身状態、治療されるアレルギー性疾患の重症度、使用される特定の核酸またはベクター、その投与方式などによって、対象により異なる。而して、組成物ごとに正確な量を指定することはできない。しかしながら、適切な量は、本明細書の教示を考慮して、日常の実験法のみを用いて当業者が決定することができる。例えば、組成物を投与するための効果的な投与量及び計画は、経験的に決定することができ、そのような決定は当該分野の技術の範囲内である。組成物を投与するための投与量の範囲は、症状障害が影響される所望の効果を産み出す程に十分に大きい。その投与用量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などの有害な副作用を引き起こすほど高用量であるべきではない。一般的に、用量は、患者の年齢、状態、性別、疾患の程度、投与経路、またはレジメンに他の薬剤が含まれているかどうかによって変化し、当業者によって決定することができる。投与量は、あらゆる禁忌の事象がある場合、個々の医師よって調節可能である。投与量は変動し得、１日または数日間にわたって、毎日１回以上の投与で、投与することができる。所定のクラスの医薬品に関する適切な投与量については、文献中に指針を見出すことができる。例えば、抗体に関して適切な投与を選択する指針は、例えばＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｏｇｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，（１９８５）ｃｈ．２２  ａｎｄ  ｐｐ．３０３−３５７；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９７７）ｐｐ．３６５−３８９のような、抗体の治療用途に関する文献で見出すことができる。単独で用いられる抗体の典型的な１日当たりの投与量は、上記の要因に応じて、１日当たり体重１ｋｇ当たり約１μｇから１００ｍｇまでの範囲またはそれより多くできる。
【００８２】
スクリーニング法
対象のＭＤＳを治療するのに用いることができる薬剤を同定する方法も、本明細書で提供する。本方法は、ＣＤ３３とＳ１００Ａ９が結合する条件下でＣＤ３３及びＳ１００Ａ９を含む試料を提供すること、その試料を候補薬剤と接触させること、ＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９結合のレベルを検出すること、そしてその結合レベルを対照と比較することを含むことができ、ここで、対照と比較されたＣＤ３３／Ｓ１００Ａ９結合の減少によって、炎症性疾患を治療するために使用できる薬剤を同定する。
【００８３】
Ｓ１００Ａ９のＣＤ３３に対する結合は、タンパク質結合を妨害しない日常の方法、例えば免疫学的検出法を使用して検出することができる。本方法は、細胞ベースまたは無細胞ベースのアッセイであり得る。様々な有用な免疫学的検出法のステップは、科学文献、例えばＭａｇｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，（１９８７）ａｎｄ  Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７．１−２７．２０（１９８６）に記載されてきており、それらのそれぞれは、参照によって本明細書に完全に組み込まれ、詳しくは免疫学的検出法に関するその教示が組込まれる。最も単純で直接的な意味で、イムノアッセイは、抗体と抗原との結合が関わる結合アッセイである。多くの種類及び形式のイムノアッセイが知られており、すべてが、開示されるバイオマーカーを検出するのに適切である。イムノアッセイの例としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラジオイムノ沈殿アッセイ（ＲＩＰＡ）、イムノビーズ捕捉アッセイ、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、ゲル−シフトアッセイ、フローサイトメトリー、タンパク質アレイ、多重ビーズアレイ、磁気捕捉、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、及び光退色後の蛍光回復／局在化（ＦＲＡＰ／ＦＬＡＰ）がある。
【００８４】
一般的に、当該分野で公知の方法によって、天然産物または合成（または半合成）抽出物の大きなライブラリーまたは化学物質ライブラリーから候補薬剤を同定することができる。薬剤発見及び開発の当業者は、試験抽出物または化合物の正確な供給源は、本発明のスクリーニング手順（単数または複数）にとって重要ではないことを理解するだろう。
【００８５】
したがって、実質的に任意の数の化学的抽出物または化合物を、本明細書記載の代表的な方法を使用してスクリーニングすることができる。そのような抽出物または化合物の例としては、植物、真菌、原核生物または動物ベースの抽出物、発酵ブロス、及び合成化合物、ならびに存在する化合物の修飾が挙げられるが、それらに限定されない。糖類、脂質、ペプチド、ポリペプチド、及び核酸ベースの化合物を含むがこれらに限定されない任意の数の化学化合物のランダムまたは指向性合成（例えば半合成または全合成）を起こすための多くの方法も利用可能である。合成化合物ライブラリーは、例えばＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１６９８１  Ｖｉａ  Ｔａｚｏｎ，Ｓｕｉｔｅ  Ｇ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，９２１２７，ＵＳＡ，ｗｗｗ．ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ．ｃｏｍ）；ＣｈｅｍＤｉｖ（６６０５  Ｎａｎｃｙ  Ｒｉｄｇｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  ９２１２１，ＵＳＡ）；Ｌｉｆｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  （１１０３  Ｏｒａｎｇｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｒｏａｄ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＴ  ０６４７７）；Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔｔ，Ｔｉｎｔａｇｅｌ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ  ＰＬ３４  ０ＨＷ，ＵＫ）を包含するが、それらに限定されない化学物質ライブラリーの供給者から利用可能である。
【００８６】
あるいは、細菌、真菌、植物、及び動物の抽出物の形態である天然化合物のライブラリーは、Ｏ２Ｈ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、ＭｅｒＬｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ  ＩＩ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  １１７５２８）、及びＧａｌａｐａｇｏｓ  ＮＶ（Ｇｅｎｅｒａａｌ  Ｄｅ  Ｗｉｔｔｅｌａａｎ  Ｌ１１  Ａ３，Ｂ−２８００  Ｍｅｃｈｅｌｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含む多くの供給源から市販されている。
【００８７】
更に、天然に及び合成で製造されるライブラリーは、所望ならば、当該分野で公知の方法にしたがって、例えば、標準的な抽出及び分画法によって、または固相有機合成、マイクロ波合成及びスクリーニング目的のために多数の化合物を作るのに適用できる当該技術分野で公知の他の迅速スループット法と組み合わせた標準的な合成法によって、製造される。更に、所望ならば、試料形式及び溶解を包含するあらゆるライブラリーまたは化合物は、標準的な化学的、物理的、または生化学的方法を用いて、容易に改変される。更に、薬剤発見及び開発の当業者は、デレプリケーション（例えば分類学的デレプリケーション、生物学的デレプリケーション、及び化学的デレプリケーション、またはそれらの任意の組み合わせ）のための方法またはＭＤＳに関するそれらの効果について既知である材料の複製もしくは反復の排除のための方法を、可能な場合はいつでも採用するべきであることを容易に理解する。
【００８８】
候補薬剤は、多くの化学基を含むが、最も多くの場合、有機分子、例えば１００超で約２，５００ダルトン未満の分子量を有する小さな有機化合物である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用に必要な、特に水素結合に必要な官能基を包含することができ、そして典型的には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、例えばそれらの化学官能基のうちの少なくとも２つを含む。その候補薬剤は、しばしば、１つ以上の上記官能基で置換された、環状炭素もしくは複素環式構造及び／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、候補薬剤はタンパク質である。いくつかの態様では、候補薬剤は、天然に存在するタンパク質または天然に存在するタンパク質のフラグメントである。したがって、例えば、タンパク質を含有する細胞抽出物、またはタンパク質様細胞抽出物のランダムもしくは指向性の消化物を使用することができる。このようにして、原核生物及び真核生物タンパク質のライブラリーを、本明細書の方法を使用してスクリーニングのために作製することができる。そのライブラリーは、細菌、真菌、ウイルス、及び脊椎動物のタンパク質、及びヒトのタンパク質であり得る。
【００９０】
定義
「抗体」という用語は標的抗原と選択的に結合する天然または合成抗体を指す。この用語はポリクローナル及びモノクローナル抗体を包含する。完全な免疫グロブリン分子に加えて、「抗体」という用語には、それらの免疫グロブリン分子のフラグメントまたはポリマー、及び標的抗原と選択的に結合する免疫グロブリン分子のヒトまたはヒト化版も含まれる。
【００９１】
「キメラ分子」は、自然の状態では分離して存在する２種以上の分子を結合することによって作製される単一分子である。単一のキメラ分子は、その構成分子のすべての所望の機能性を有する。
【００９２】
「融合タンパク質」とは、１つのポリペプチドのアミノ末端と、もう１つのポリペプチドのカルボキシル末端との間に形成されるペプチド結合を介して２つ以上のポリペプチドを結合することによって形成されるポリペプチドを指す。融合タンパク質は、構成ポリペプチドの化学カップリングによって形成され得るか、または１つの連続した融合タンパク質をコードする核酸配列から１つのポリペプチドとして発現され得る。一本鎖融合タンパク質は、１つの連続したポリペプチド骨格を有する融合タンパク質である。融合タンパク質は、２つの遺伝子をインフレームで連結して１つの核酸にし、次いで、その核酸を、適切な宿主細胞において、融合タンパク質が産生される条件下で発現させる分子生物学の従来の方法を使用して、調製することができる。
【００９３】
「阻害する」という用語は、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメーターの低減を指す。これは、活性、応答、状態、または疾患の完全な消失を包含することができるが、それに限定されるものではない。これは、例えば、自然のレベルまたは対照のレベルと比較して、その間で、活性、応答、状態、または疾患が１０％低減することも包含し得る。したがって、低減は、自然または対照レベルと比較して、その間で、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％であり得るか、または任意の量での低減であり得る。
【００９４】
「リポソーム」は、薬剤（例えば、本明細書で開示されるアンタゴニスト、任意には化学療法剤）の哺乳動物への送達に有用である様々な種類の脂質、リン脂質及び／または界面活性剤から構成される小胞である。リポソームの成分は、通常は、生物膜の脂質配置に類似した２層構造に配置されている。
【００９５】
「ペプチド」、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、交換可能に使用され、もう一方のアルファアミノ基に対して１つのアミノ酸のカルボキシル基によって連結される２つ以上のアミノ酸を含む天然または合成分子を指す。
【００９６】
「パーセント（％）配列同一性」または「相同性」という用語は、最大のパーセント配列同一性を達成するために配列のアラインメントを行い、必要な場合はギャップを導入した後に、参照核酸配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸と同一である候補配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸の百分率と定義される。パーセント配列同一性を決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術範囲内にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを包含する、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを、公知の方法によって決定することができる。
【００９７】
「薬学的に許容される」という用語は、安全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題、または妥当な便益／リスク比で釣り合っている合併症無しでヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適している、化合物、物質、組成物、及び／または剤形を指す。
【００９８】
本明細書で使用する「特異的に結合する」という用語は、ポリペプチド（抗体を含む）または受容体について言及している場合、タンパク質の不均一集団及び他の生物製剤においてタンパク質またはポリペプチドまたは受容体が存在することが確かめられる結合反応を意味する。したがって、特定されたリガンドまたは抗体は、試料中に存在する他のタンパク質に対して、またはリガンドもしくは抗体が生物体内で接触する可能性のある他のタンパク質に対して有意な量で結合しないとき、指定された条件下で（例えば、抗体の場合、イムノアッセイ条件下で）、その特定の「標的」に「特異的に結合する」（例えば、抗体は内皮抗原に特異的に結合する）。一般的に、第２分子と「特異的に結合する」第１分子は、その第２分子に関して、約１０５Ｍ−１を超える（例えば、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、及び１０１２Ｍ−１またはそれより高い）親和定数（Ｋａ）を有する。
【００９９】
「対象」という用語は、投与または治療の標的であるあらゆる個体を指す。対象は、脊椎動物、例えば哺乳類であり得る。したがって、対象は、ヒトまたは獣医学の患者であり得る。用語「患者」は、臨床医、例えば医師の治療を受けている対象を指す。
【０１００】
「治療的に有効な」という用語とは、使用される組成物の量が疾患または障害の１つ以上の原因または症状を改善するのに十分な量を指す。そのような改善は、低減または変化を求めるのみであって、必ずしも除去を求めない。
【０１０１】
「治療」という用語は、疾患、病態、または障害の治癒、改善、安定化、または予防を目的とした患者の医学的管理を指す。この用語は、積極的処置、すなわち、特に疾患、病態、または障害の改善に関する処置を含むと共に、原因処置、すなわち、関連疾患、病態、または障害の原因の除去に関する処置も包含する。更に、この用語は、緩和的処置、すなわち、疾患、病態、または障害の治癒ではなく症状の緩和のために設計された処置；予防的処置、すなわち、関連疾患、病態、または障害の進行の最小化または部分的もしくは完全な阻害に関する処置；及び補助的処置、すなわち、関連疾患、病態、または障害の改善に関する他の特定の療法の補完に用いられる処置を含む。
【０１０２】
本発明のいくつかの実施形態を説明した。だがそれにもかかわらず、発明の趣旨と範囲から逸脱することなく、様々な変更を施すことが可能であることが理解されよう。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。
【実施例】
【０１０３】
実施例１：骨髄由来サプレッサー細胞によって媒介される微小環境誘発脊髄形成異常
方法
ＭＤＳ患者
ＭＤＳの患者の大多数は、特に明記しない限り低リスクであった。すべての患者を、中央精査によって確認し、世界保健機関基準または国際予後判定システム（ＩＰＳＳ）にしたがって分類した。患者は、Ｈ．Ｌｅｅ  Ｍｏｆｆｉｔｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＭａｌｉｇｎａｎｔ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ｃｌｉｎｉｃ及びオランダにあるＲａｄｂｏｕｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｎｉｊｍｅｇｅｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙから募集採用した。前記のように、フィコール・ハイパック比重遠心によって、骨髄単核球（ＢＭ−ＭＮＣ）を、ヘパリン化ＢＭ吸引液から単離した（Ｗｅｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６：１２９７４−１２９７９）。系統（Ｌｉｎ−）マーカー（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６）及びＨＬＡ−ＤＲの発現を欠くＣＤ３３＋細胞の蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によってＭＤＳＣを同定し精製した。
【０１０４】
マウス
すべてのマウスの作業は、南フロリダ大学の動物実験委員会の承認を得た。野生型（ＷＴ）ＦＶＢ／ＮＪマウスはジャクソン研究所から購入し、Ｓ１００Ａ９ノックアウトマウス（ＫＯ）及びＳ１００Ａ９トランスジェニックマウス（Ｔｇ）を既にされているように作製し、使用した（Ｃｈｅｎｇ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０５：２２３５−２２４９；Ｍａｎｉｔｚ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２３：１０３４−１０４３）。Ｓ１００Ａ９ＴｇマウスはＦＶＢ／ＮＪホモ接合マウスから作製し、１５世代を超えて飼育した。競合移植実験のために、１８週齢のＦＶＢ／ＮＪ野生型雌のマウスを、回転ガンマ線照射装置（ｒｏｔａｔｉｎｇ  ｇａｍｍａ  ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ）で総線量９００Ｇｙを１回で照射した。同時に、製造者のプロトコルに従って磁性細胞分取（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｌｉｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によってＨＳＣが富化された、同一年齢層の雄ＷＴまたはＳ１００Ａ９Ｔｇマウス脛骨及び大腿骨からＢＭ細胞を単離した。６時間照射後に１ｘ１０７富化ＨＳＣを、レシピエントマウスへ尾静脈注射によって投与した。次いで、マウスを、無菌箱下での体重測定のために一日おきにモニターした。ＣＢＣのための末梢血は、毎週センターで動物飼養場のスタッフによって前眼窩の静脈（ａｎｔｅｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ  ｖｅｉｎ）から採取した。８週までに（ＷＴレシピエントに移植した後、３ｘ１０３細胞／血液１ｍｌ超のＷＢＣ）マウスをＣＯ２呼吸によって安楽死させ、その時点で心臓穿刺し、続いて脛骨及び大腿骨（既に記載した）及び脾臓を切開することによって末梢血を採取した。
【０１０５】
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
ＦＩＳＨはＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｆｆｉｔｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒで行った。その詳細な方法は既に記載されている（Ｗｅｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６：１２９７４−１２９７９）。ＭＤＳＣ陽性（ＭＤＳ−ＭＤＳＣ）細胞由来及びＭＤＳＣ陰性細胞由来の標的ＤＮＡを、市販の検査（Ａｂｂｏｔｔ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用してｄｅｌ５ｑまたはｄｅｌ７ｑを有することが予め確認された同じ患者から精製した。
【０１０６】
免疫染色
ＢＭ−ＭＮＣをＭＤＳ患者から精製し、３ｘ１０５細胞／ｍｌの濃度に希釈し、顕微鏡スライド上にサイトスピンし、そしてメタノール／アセトン（割合３：１、−２０℃で３０分間）で固定した。血清との非特異的結合をブロックする前に、トリトンＸ−１００バッファーで５分間及び５０ｍＭのトリスバッファー（ｐＨ７．４）で１０分間洗浄を行った。そのスライドを、一次抗体：すなわちウサギ抗ＣＤ３３抗体（１：１００希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、マウス抗グランザイムＢ（１：１００希釈、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）及びマウス抗ヒトＣＤ７１（１：１００希釈、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、続いて、それらの各二次抗体、すなわちＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５９４ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＩＴＣヤギ抗マウス（Ｓｉｇｍａ）及びＡｌｅｘａ−３５０ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。試料（１：５０希釈、Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）に添加する前に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓのキットを用いて、ラット抗ヒトグリコフォリンＡを、Ａｌｅｘａ−６４７にプレコンジュゲートさせ、続いてそのスライドを水性培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＵＳ）と一緒にマウントした。免疫蛍光を、Ｚｅｉｓｓ製自動化直立型蛍光顕微鏡と、キャプチャープログラムＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎを有するＮｉｋｏｎ製カメラでキャプチャーされたイメージとを使用して、検出した。Ｓ１００Ａ９がトランスフェクトされたＳＪＣＲＨ３０細胞の免疫染色のための詳細な方法は、既に出版されている（Ｃｈｅｎ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｂｌｏｏｄ  １１３（１４）：３２２６−３４）。詳しくは、ＣＤ３３及びＳ１００Ａ９の検出可能な発現レベルを欠くＳＪＣＲＨ３０細胞を、４８〜７２時間、Ｓ１００Ａ９またはＳ１００Ａ８（陰性対照）でトランスフェクトした。ＣＤ３３融合体との培養後（２μｇ／ｍｌ）、１×１０４個の細胞を、スライドの上にサイトスピンし、次いで、二次抗ヒトＩｇＧ１−ＡＰＣで染色した後免疫蛍光顕微鏡検査によって分析した。同様に、ＣＤ３３で安定にトランスフェクトされたＳＪＣＲＨ３０細胞を、様々な時点間でＤＤＫでタグ付けされたｒｈＳ１００Ａ９と培養した。
【０１０７】
抑制アッセイ
ＭＤＳＣがＴ細胞抑制を媒介できるか否かを測定するために、ＦＡＣＳによって、ＣＤ４５＋  ＣＤ３３＋  ＣＤ１１ｂ＋  Ｌｉｎ−細胞を、ＭＤＳ患者の完全骨髄から分取した。次の抗原：すなわち、ＣＤ４５−ＰＥＣｙ７、ＣＤ３３−ＰＥＣｙ５、ＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣ、ＣＤ３−ＰＥ、ＣＤ１４−ＰＥ、ＣＤ２０−ＰＥ（すべてＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＣＤ１６−ＰＥ、ＣＤ１９−ＰＥ（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）及びＣＤ５６−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。Ｔ細胞は、自己末梢血から、ＣＤ３マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｅｒｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して磁性活性化細胞分取（ＭＡＣＳ）によって分離した。２０，０００個のＴ細胞を、１０％ヒト血清ＰＡＡ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｓｃｈｉｎｇ，Ａｕｓｔｒｉａ）を補ったＩｓｃｏｖｅの修飾ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を９６ウェル丸底プレートに３連で播種した。培養物を、３０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＴ細胞のビーズに対する割合が１：２の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーテッドビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で刺激した。ＭＤＳＣを１：２及び１：４の割合でＴ細胞培養物と混合し、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを補ってＭＤＳＣの生育力をサポートした。共培養３日後、培養上清を採取して、ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）によってＩＦＮ−γ濃度を測定した。その後、０．５μＣｉの３Ｈ−チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を各ウェルに加え、一晩培養した後、１２０５  Ｗａｌｌａｃ  Ｂｅｔａｐｌａｔｅカウンターを使用して３Ｈ−チミジンの取り込みを測定した。増殖とＩＦＮ−γ生成の違いが統計的に有意であったか否かを測定するために、一元配置分散分析を、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎの事後検定とともに使用した。統計的有意性をｐ値＜０．０５で認めた。
【０１０８】
コロニー形成アッセイ
ヒトＢＭから、またはＳ１００Ａ９Ｔｇ、Ｓ１００Ａ９ＫＯもしくはＷＴの脛骨と大腿骨から単離された細胞を、室温で５分間ＡＣＫ  （Ｓｉｇｍａ）に供して赤血球を溶解した。次いで、残留しているＢＭ細胞を、完全なメチルセルロース培地（メトカルト完全培地）中に必要なサイトカイン及び成長因子（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と一緒に播種し、その混合物を、グリッドされた３５ｍｍ培養皿（２×１０５細胞／皿）に２連で入れ、７〜１４日間、５％のＣＯ２中で３７℃に培養した。培養後、ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＭのコロニーを、手動で特定し、倒立光学顕微鏡を使用して計数した。ＡＴＲＡで処置したマウスを使用して行ったコロニー形成能アッセイでは、２５０μｇ（２００μｌ）のＡＴＲＡまたはビヒクル（オリーブ油）を５日連続経口投与してから２日間安静にさせた。
【０１０９】
リアルタイム定量によるｍＲＮＡ発現
ＲＴ−ＰＣＲ及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）反応を、ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ）によって行った。反応混合物（総量２５μｌ）は、１２．５μｌのｉＱ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ、０．２５μｌのフォワードプライマー（ｓ  ＧＡＰＤＨ）（２０μＭ）、１１μｌのＲＮａｓｅを含まない水、及び１．０μｌのｃＤＮＡを含有していた。次のサイクルを行った。すなわち、９５℃で３分を１回、４０の増幅サイクル（９５°Ｃで１５秒、５６°Ｃで６０秒）、９５℃で１分を１回、ｃＤＮＡテンプレートを用いない１つの陰性対照１回をアッセイ毎に実施した。ｄｓＤＮＡ  Ｉの最適融点及び最低５５℃及び融解曲線（８０ｘ１０秒  ５５℃、１０秒当たり０．５℃増加）。反応の効率は、前もって最適化した。各個体当たりの転写コピー数を、ＧＡＰＤＨ発現に正規化することによって計算した。各患者に関する遺伝子発現の相対レベルを、５つの対照で観察された平均発現レベルに正規化することによって計算した。ＣＤ３３をトランスフェクトしたＳＪＣＲＨ  ３０細胞及びトランスフェクトしていないＳＪＣＲＨ  ３０細胞を、１μｇのｒｈＳ１００Ａ９で２０分間処理し、そしてその発現を、全ＲＮＡ由来のＩＬ１０及びＴＧＦβの存在に関してＱ−ＰＣＲによって測定し、そしてΔΔＣｔ法で計算した。そこで、ｒｈＳ１００Ａ９未処理の細胞は実験上の対照であり、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨは内部標準であった。エラーバーは３つの別の実験の標準誤差を表している。
【０１１０】
ＣＤ３３／Ｓｉｇｌｅｃ  ３キメラ融合タンパク質の調製
ＣＤ３３／Ｓｉｇｌｅｃ  ３外部ドメインの組換え可溶性融合体を、既に記載のように構成した（Ｃａｎｎｏｎ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６４：３９−４７；Ｃａｎｎｏｎ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７４８：５１−６７；Ｃａｎｎｏｎ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２９：２２８−２３７）。具体的には、ＣＤ３３／Ｓｉｇｌｅｃ  ３外部ドメインをコードするｃＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって増幅し、ヒトＦｃγをコードし、続いてＥ．ｃｏｌｉビオチンリガーゼのためのｃ−末端認識部位をコードするベクター中に挿入した。このベクターは、細胞外Ｉｇ型ドメインをコードする遺伝子セグメントの、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域への融合を促進するために操作されている。その組換えタンパク質は、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、トランスフェクション後に２９３Ｔ細胞で発現され、２５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ  無血清培地を３連続回収した。回収物を、プールし、５００ｇで１０分間遠心分離して砕片を除去し、０．０２％のアジ化ナトリウム中に４℃で保管した。培養上清中のＣＤ３３融合体の濃度は、ブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって測定した。
【０１１１】
質量分析法
ゲル内トリプシン消化後、ペプチドを真空遠心下で抽出し濃縮した。エレクトロスプレーイオントラップ質量分析計（ＬＴＱ，Ｔｈｅｒｍｏ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に連結されたナノフロー液体クロマトグラフ（Ｅａｓｙ−ｎＬＣ，Ｐｒｏｘｅｏｎ，Ｏｄｅｎｓｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、タンデム型質量分析ペプチド塩基配列決定実験のために使用した。試料を、まず最初に、トラップカラム（ＢｉｏＳｐｈｅｒｅ  Ｃ１８逆相樹脂，５μｍ，１２０Å，１００μｍ  ＩＤ，ＮａｎｏＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｎｉｅｕｗｋｏｏｐ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に充填し、８ｍｌ／分で３分間洗浄した。そのトラップされたペプチドを、分析カラム（ＢｉｏＳｐｈｅｒｅ  Ｃ１８  逆相樹脂，１５０ｍｍ，５μｍ，１２０Å，１００μｍ  ＩＤ，ＮａｎｏＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｎｉｅｕｗｋｏｏｐ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）上へ溶離した。ペプチドを、３００ｎｌ／分の流速で、５％Ｂから４５％Ｂ（溶媒Ａ：２％のアセトニトリル＋０．１％のギ酸；溶媒Ｂ：９０％のアセトニトリル＋０．１％のギ酸）の勾配で６０分間溶離した。５つのタンデム質量スペクトルを各サーベイスキャン後にデータ依存的な方法で集めた。配列を、ヒトＩＰＩエントリーに対するＭａｓｃｏｔ（ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）検索を使用して割り当てた。システインのカルバミドメチル化、メチオニン酸化、及びアスパラギンとグルタミンのアミド分解を様々な修飾として選択し、２までのトリプシン消化切断ミス（ｍｉｓｓｅｄ  ｔｒｙｐｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ）が許容された。前駆体質量許容値（ｍａｓｓ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）は２．５に設定し、フラグメントイオン許容値は０．８に設定する。Ｍａｓｃｏｔの結果をＳｃａｆｆｏｌｄで編集し、それを、ペプチドの割り当て及びタンパク質同定の手動検査に使用した。
【０１１２】
Ｓ１００Ａ９のＣＤ３３／Ｓｉｇｌｅｃ  ３に対する特異的結合の特定
Ｓ１００Ａ９がトランスフェクトされたＳＪＣＲＨ  ３０細胞のＣＤ３３−融合結合細胞溶解物に関するＥＬＩＳＡアッセイ。製造者の提案に従って、９６ウェル平底ＥＬＩＳＡプレートを、１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗Ｓ１００Ａ９ｌで一晩コートした。ＰＢＳ−Ｔで１回洗浄した後、トランスフェクトされていない細胞（陰性）またはＳ１００Ａ９でトランスフェクトされた細胞由来の５０μｌの溶解物をウェルに加えた。４４０ｎｍでのＥＬＩＳＡ  ＨＲＰ反応分析にしたがって示されているように、二次抗体は、Ｓ１００Ａ９ポリクローナル抗体（陽性対照）またはＣＤ３３融合体であった。
【０１１３】
ＣＤ３３を発現するアデノウイルスベクターの調製
ＣＤ３３プラスミド（ＧｅｎｅＣｏｐｅｉａ）を、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−１ベクター（ＣＭＶプロモーター及びｈｒＧＦＰを含有）中にサブクローニングした。次いで、ＰｍｅＩで消化されたシャトルベクターを、ｐＡｄＥａｓｙ−１（ウイルスバックボーンを含有）を有するエレクトロコンピテントＢＪ５１８３細菌に形質転換し、カナマイシンＬＢプレート上で選択した。細菌中のプラスミドを、ｐｌａｓｍｉｄ  ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して増幅し精製した。完全なアデノウイルスベクターを、ＰａｃＩ消化によって線形化し、次いでリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＡＤ２９３細胞内にトランスフェクトした。すべての組換えアデノウイルスをＡＤ２９３細胞中で増幅した。ウイルスストックは、ＡＤ２９３細胞を増幅し、続いて、標準的な２ステップのＣｓＣｌ勾配超遠心分離、透析、そして−８０℃でグリセロールストック（１０％ｖ／ｖ）中に保管することによって、得た。各ウイルスストックの力価は、ＡＤ２９３細胞を使用してプラーク形成アッセイによってルーチン的に検査し１０１１〜１０１２ｐｆｕであった。
【０１１４】
ｓｈＲＮＡレンチウイルスベクターの調製
ヒトＳ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９及びＣＤ３３及び陰性対照（標的無し）のためのＳｕｒｅＳｉｌｅｎｃｉｎｇ（商標）ｓｈＲＮＡプラスミドをＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。２９３Ｔの細胞を、製造者の取扱い説明書にしたがい、トランスフェクション試薬（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、トランスフェクトした。６時間の培養後、トランスフェクション試薬を除去し、１０％のウシ胎児血清で補充された新鮮なＤＭＥＭで置換した。ウイルス含有培地を２４〜４８時間後に集めた。プラスミド、ｐｃＤＮＡ３野生型ＤＡＰ１２及びＰ２３−ＤＡＰ１２を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で切断し、そしてＤＮＡポリメラーゼＩ  Ｌａｒｇｅ（ＫｌｅｎｏｗＩ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）を使用して陥凹３′末端を満たした。ＧＦＰ発現カセット（Ａｄｄｇｅｎｅ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）を含有するｐＷＰＩを、ＰＭＥＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）を使用して消化した。ＤＮＡ及びベクターを切断した後、Ｓｔｒａｔａ  Ｐｒｅｐ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によってｐＷＰＩを精製し、ＤＮＡをベクターｐＷＰＩ中に結紮し（Ｔａｋａｒａ  ＤＮＡライゲーションキット，Ｆｉｓｈｅｒ）、そしてＳＴＢＬ２コンピテント細胞を形質転換させた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。２９３Ｔ細胞を、標準プロトコルにしたがって４：３：１の比率でＬｉｐｏｆｅｃｔｅｍｉｎｅ−２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｐＷＰＩレンチウイルスベクター、そのパッケージングプラスミド、ｐｓＰＡＸ２、及びエンベローププラスミド、ｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）で、トランスフェクトした。６時間の培養後、トランスフェクション試薬を除去し、１０％のウシ胎児血清で補充された新鮮なＤＭＥＭで置換した。ウイルス含有培地を２４〜４８時間後に集めた。細胞感染を上記のように実行した。第１感染の４日後に、形質導入された細胞を、９９％超の純度でＧＦＰ＋細胞を分取するＦＡＣＳによって単離した。
【０１１５】
ＭＤＳ患者由来のＭＤＳＣの感染
ＭＤＳ患者から単離されたＭＤＳＣを、８μｇ／ｍｌのポリブレン（ｐｏｌｙｂｅｒｅｎｅ）の存在下で、２４時間間隔でウイルス含有感染培地を用いて３回感染させた。各感染のために、１ウェル当たり１×１０６個の細胞を１２ウェル皿で平板培養した。第１感染の４日後に、細胞を回収し、リアルタイムＰＣＲ、ウェスタンブロット解析、フローサイトメトリー、またはコロニー形成能アッセイのために使用した。
【０１１６】
フローサイトメトリー
ＢＭ−ＭＮＣを、２％のＢＳＡバッファーを有するＰＢＳ中適切な特異的コンジュゲート化抗体で染色した。ＭＤＳＣ分取のために、陽性対照としてＦＩＴＣ抗ＣＤ３及びＦＩＴＣ抗ＨＬＡ−ＤＲと、陰性対照としてアイソタイプＩｇＧを使用して、非特異的染色を検出した。細胞を穏やかに混合し、暗所で４℃において３０分間培養した。試料をＰＢＳで洗浄し、５００ｇで５分間遠心分離した。表現型分析のみで使用した細胞に関しては、ＰＢＳ中０．５ｍｌの１％パラホルムアルデヒドを分析前に加えた。
【０１１７】
細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで、氷上で暗所で３０分間、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＣＲ７、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＬＲ２、またはＴＬＲ４及び関連のアイソタイプ対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に特異的なＰＥコンジュゲート化ｍＡｂで染色した。次いで、その細胞を０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄した。生細胞を７−ＡＡＤのための陰性染色法に基づいてゲーティングした。試料をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで獲得し、分析をＦｌｏｗｊｏ  ６．３．４ソフトウェアを使用して行った。
【０１１８】
アルギナーゼ活性
アルギナーゼ活性を、以前に記載された通り、細胞溶解物で測定した（Ｙｏｕｎ，Ｊ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８１：５７９１−５８０２）。簡潔に言えば、細胞を１００μｌの０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で３０分間溶解した。続いて、１００μｌの２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び１０μｌの１０ｍＭのＭｎＣｌ２を加え、そして酵素を５６℃で１０分間加熱することによって活性化させた。アルギニン加水分解を、１２０分間、３７℃で、１００μｌの０．５ＭのＬ−アルギニン（ｐＨ９．７）と一緒にその溶解物を培養することによって実行した。その反応は、９００μｌのＨ２ＳＯ４（９６％）／Ｈ３ＰＯ４（８５％）／Ｈ２Ｏ（１／３／７（ｖ／ｖ／ｖ））で停止させた。尿素濃度を、４０μｌのα−イソニトロソプロピオフェノン（１００％エタノール中に溶かした）を加え、続いて３０分間９５℃で加熱した後で、５４０ｎｍで測定した。
【０１１９】
ＮＯ生成
等しい体積の培養上清（１００μｌ）を、再蒸留水中のＧｒｅｉｓｓ試薬液（５％リン酸中１％スルファニルアミド及び０．１％Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩）と混合し、そして室温で１０分間培養した。その混合物の吸光度を、マイクロプレートプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して５５０ｎｍで測定した。亜硝酸塩濃度を、試験試料に関する吸光度値を０．２５ｍＭの亜硝酸ナトリウムの系列希釈によって作製された標準曲線と比較することによって、測定した。
【０１２０】
ウェスタンブロット解析
１％のＮＰ−４０、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭのヨードアセトアミド、５０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．４ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのペプサチン、及び１０μｇ／ｍｌのアプロチニン中に細胞ペレットを再懸濁し、そして３０分間氷上で溶解することによって、細胞溶解物を調製した。細胞溶解物を１２，０００ｇで１５分間遠心分離して核及び細胞片を除去した。可溶性抽出物のタンパク質濃度をＢｉｏＲａｄ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質アッセイを使用することによって測定した。５０μｇのタンパク質（１レーン当たり）を、電気泳動によって１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、次いでＰＶＤＦ膜へと移した。次に示す抗体：すなわち、抗Ｓ１００Ａ８または抗Ｓ１００Ａ９（それぞれＭＲＰ８またはカルグラヌリンＡ及び抗ＭＲＰ１４またはカルグラヌリンＢ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）；抗Ｓ１００Ａ８／Ａ９（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）；抗ホスホＥｒｋ、抗全Ｅｒｋ、抗ホスホＳｙｋ、及び抗全Ｓｙｋ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に関して膜をプローブした。タンパク質を、増強化学発光検出システム（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）で検出した。Ｓ１００Ａ９でトランスフェクトされていない、空のベクター及びＳ１００Ａ９でトランスフェクトされたＳＪＣＲＨ３０またはＡＤ２９３細胞由来の溶解物を、第１溶解物（５０μｇで開始）で連続的に希釈し（図に示したように）、続いてニトロセルロース膜上に充填し、そして５％のミルクで４０℃で一晩ブロックした。室温の２時間のＣＤ３３融合体と一緒に培養し、そして抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体で染色した後、その膜を、洗浄し、そしてＸ線写真分析に使用して、ＣＤ３３に対する特異的なＳ１００Ａ９の結合を証明した。その後で、その膜は、ニトロセルロース膜における各ドット上に比較的等しい充填量のタンパク質を示すためのクマシーブルー染色のために用いた。
【０１２１】
全血球算定（ＣＢＣ）
ＣＢＣを、Ｍｏｆｆｉｔｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒの動物飼養場においてａｎｉｍａｌ  ｃｏｒｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの病理学職員によって実行した。Ｈｅｓｋａ  Ｈｅｍａｔｒｕｅ血液分析装置で表１に記載したようにマウスの血液パラメーターを測定した。
【０１２２】
ｗｔマウス及びＳ１００Ａ９Ｔｇマウス由来の脾臓及びＢＭの生検病理検査
骨髄細胞を、以前に記載されているように（Ｘｕ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．  ２０１０．  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１０：１０５９４０）、６月齢のＳ１００Ａ９Ｔｇマウス及びｗｔ対照マウス由来の左右の脛骨と大腿骨から得た。ネズミ脾細胞のタッチプリント（ｔｏｕｃｈ  ｐｒｉｔ）を、記載されたように調製した（Ｉｏａｃｈｉｍ，Ｈ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｉｏｃｈｉｍ’ｓ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｃｈａｐｔｅｒ  ３．ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｗｏｌｔｅｒｓ  Ｋｌｕｗｅｒ／Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ．：ｐ２１−２２）。骨髄穿刺液及びタッチインプリント（ｔｏｕｃｈ−ｉｍｐｒｉｎｔ）をライトギムザ染色を使用して染色した。骨髄の部分及び脾臓の切片を、１０％リン酸緩衝の中性ホルマリン中に固定し、脱石灰し（骨髄に適用されるのみ）、そしてルーチンの手順によってパラフィン中に包埋した。切片を４μｍで切断し、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）及び過ヨウ素酸シッフ反応（ＰＡＳ）で染色した。ＭＤＳの骨髄異形成の特徴特性の存在を、経験豊かな血液病理学者が評価した。ＢＭコア生検は、成熟三血球系造血（ｍａｔｕｒｉｎｇ  ｔｒｉｌｉｎｅａｇｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ）で５０％の細胞充実性を示している（Ｈ＆Ｅ、２００ｘ）。図５Ｅは、正常な分葉を有し正常な外観を呈する巨核球を示すＢＭ生検の高倍率ビューを示す。混合された骨髄前駆体及び赤芽球前駆体は、Ｍ：Ｅ比が約２：１で正常に分布している（Ｈ＆Ｅ，６００ｘ）。ライトギムザ染色されたＢＭ穿刺液は、形成異常の特徴が無い全三血球系における完全な成熟を示す（ライトギムザ、１０００ｘ）。インレットには正常な分葉のある巨核球が示されている（図５Ｆ）。マウス脾臓のタッチインプリントは、所々で赤血球生成前駆体と混ざり合った小さく且つ成熟した外観のリンパ球の優勢を示す（ライトギムザ、１０００ｘ）（図５Ｇ）。ＢＭコア生検では、特に小さい形態の巨核球増加による約９５％の細胞過形成がみられる（Ｈ＆Ｅ，２００ｘ）（図５Ｈ）。高倍率により、単一もしくは低分葉の、またはばらばらの核及び数の著しい増加による形成異常巨核球が強調されている（Ｈ＆Ｅ，６００ｘ）（ｉｎｓｅｒｔ）（図５Ｉ）。インレットには、低分葉（ｈｙｐｏｌｏｂａｔｉｏｎ）の２つの著しい形成異常の小さな巨核球（ｍｉｃｒｏｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ）が含まれている。ＢＭ穿刺液は、少しさらなるブラストが骨髄前駆体及び赤芽球前駆体とが混ざり合った穏やかに増加した芽細胞を示している。後者は、わずかに不規則な核輪郭及び最小の巨赤芽球様の変化を示している（ライトギムザ、１０００ｘ）（図５Ｊ）。インレットには、デリケートまたは微細なクロマチン、顕著な核小体、高いＮ：Ｃ比、及び乏しい好塩基性細胞質を示している２つの芽球が含まれている。トランスジェニックマウス脾臓のタッチプリパレーション（ｔｏｕｃｈ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）は、赤芽球前駆体が増加していることを示しており；それらのいくつかは、異常な核性及び随時の核橋を有する拡大サイズを示している（ライトギムザ、１０００ｘ）（図５Ｋ）。
【０１２３】
統計
すべてのデータは平均±標準誤差として提示した。統計計算は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌまたはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ分析ツールで行った。個別群間の差は対応のあるｔ検定で分析した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意であるとみなした。
【０１２４】
結果
Ｌｉｎ−ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＤ３３＋  ＭＤＳＣはＭＤＳ一次ＢＭ検体及び自己由来赤芽球前駆体の直接抑制で増殖する。骨髄単核球（ＢＭ−ＭＮＣ）を、ＭＤＳ  ＢＭ穿刺液（ｎ＝１２）、同一年齢層の健康者のＢＭ（ｎ＝８）、または非ＭＤＳ癌患者（胸部４及びリンパ腫４）から単離し、フローサイトメトリーによってＬＩＮ−ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＤ３３＋ＭＤＳＣの存在について分析した。ＭＤＳ患者は、健康なドナーまたは非ＭＤＳ癌患者（５％未満、図１Ａ）と比較して、著しくより高いＭＤＳＣ数を示した（中央値３５．５％、Ｐ＜０．０００１）。ＭＤＳ−ＭＤＳＣが悪性ＭＤＳクローンから誘導されるか否かを測定するために、ＬＩＮ−ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＤ３３＋  ＭＤＳＣを、染色体５ｑ［ｄｅｌ（５ｑ）］または７ｑ［ｄｅｌ（７ｑ）］欠失を有するＭＤＳ検体から分取し、特定のプローブを使用して蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって分析した。
【０１２５】
ｄｅｌ（５ｑ）またはｄｅｌ（７ｑ）を有する細胞遺伝学的に異常な細胞は非ＭＤＳＣ集団に限られたが、ＬＩＮ−ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＤ３３＋  ＭＤＳＣは、対応する正常な染色体組を示した（図１Ｂ）。エキソーム塩基配列決定試験により、クローン体細胞遺伝子突然変異が、中期核型分析によって染色体異常を欠いているＭＤＳ検体の大多数において明白であることが示された。ＭＤＳＣとＭＤＳクローンの関係を更に評価するために、ＭＤＳで最も一般的な遺伝子突然変異のＱＰＣＲ配列（Ｑｉａｇｅｎ）を、一次骨髄ＭＤＳ検体由来の精製ＭＤＳＣ及び非ＭＤＳＣ集団で実施した。ＣＢＬ、ＥＺＨ２、ＩＤＨ１／２、Ｎ−ＲＡＳ、ＳＲＳＦ２、Ｕ２Ａ５３５及びＲＵＮＸ１遺伝子を含む突然変異が、ＭＤＳ検体で検出されたが、すべての突然変異は、ＭＤＳＣ枯渇分画に限定され（表１）、ＬＩＮ−ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＤ３３＋  ＭＤＳＣが悪性クローンとは異なることを示した。
【表１Ａ】
2020011979.tif 000003
【表１Ｂ】
2020011979.tif 000004
【表１Ｃ】
2020011979.tif 000005
【０１２６】
試料は、新鮮であり、ゲノムＤＮＡ抽出法の前に分取した。製造業者の分析説明によると：試験試料における所定の突然変異アッセイのための生のＣＴを、定義済みＣＴカットオフと比較する。差に基づいて、突然変異は、「存在」（＋）、「境界線上」（−／＋）、または「無し」（−）とみなすことができる。
【０１２７】
ＭＤＳＣの認められた機能特性としては、抗原刺激またはＣＤ３刺激Ｔ細胞分裂増殖及びインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）産生の抑制が挙げられる（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，Ｄ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：１６２−１７４；Ｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８２：４４９９−４５０６）。ＭＤＳ患者のＢＭから精製されたＴ細胞は、自己由来ＭＤＳ−ＭＤＳＣとの共培養の後に、Ｔ細胞分裂増殖（図１Ｃ）及びＩＦＮ−γ産生（図１Ｄ）の低減を示し、これらの細胞の予期される抑制的な活性を証明した。これらの所見を更に確認するために、ＭＤＳＣを、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激の前に、ＭＤＳ  ＢＭ検体から枯渇させ、同時にＭＤＳＣを対照群に戻し加えた。ＭＤＳＣの枯渇により、ＭＤＳＣを補充した群（図１Ｅ）と比較して、Ｔ細胞応答を有意に改善し、それにより、観察される障害されたＴ細胞反応が、ＢＭ由来ＭＤＳＣの活動に関連づけられた。更に、抑制性ＭＤＳ−ＭＤＳＣは、健康なドナーから単離されるＭＤＳＣ（図１Ｈ及び１Ｉ）と比較して、抑制性サイトカイン、例えばＩＬ−１０及びＴＧＦ−β（図１Ｆ及び１Ｇ）、ならびに一酸化窒素（ＮＯ）及びアルギナーゼを過剰生成した。まとめると、これらのデータから、ＬＩＮ−ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＤ３３＋ＭＤＳＣは、ＭＤＳ患者のＢＭにおける炎症誘発性微小環境及び免疫寛容を支持するユニーク且つ機能的な細胞サブセットであることを証明している。
【０１２８】
ＭＤＳＣによって媒介される抑制性及び細胞毒性エフェクター機能は、標的細胞との直接接触を必要とする。細胞毒性エフェクターによって利用される１つのメカニズムは、エフェクター：標的接触の部位に対する、孔形成顆粒の動員及び例えばグランザイムＢのようなカスパーゼ活性化エフェクタープロテアーゼの放出であり、それにより標的細胞のアポトーシスが誘導される（Ｃｈｅｎ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｂｌｏｏｄ  １１３（１４）：３２２６−３４）。ＭＤＳＣは、ＭＤＳにおいてアポトーシス率の増加を示す造血前駆細胞（ＨＰＣ）に近接して存在するので、ＭＤＳＣによって媒介される細胞分裂阻止活性はＨＰＣの死の一因となり得る。これに対処するために、ＭＤＳ−ＭＤＳＣ顆粒の動員及びグランザイムＢの放出を、４色の免疫蛍光染色を使用して調べた。ＭＤＳ−ＭＤＳＣは、ＣＤ２３５ａ＋（グリコフォリンＡ）／ＣＤ７１＋自己由来赤芽球前駆体との細胞接触の部位における強いグランザイムＢの偏りを示した（図１Ｊ）。３０分培養した後、ＭＤＳ患者検体におけるそのようなエフェクター−標的コンジュゲートの頻度は、健康なドナー由来の試料におけるそれに比べて、有意に高かった（３４％）（５％、Ｐ＜０．００１、図１Ｋ及び１Ｌ）。標的とされる赤芽球前駆体のアポトーシスをもたらすこれらの細胞間相互作用（図１Ｍ）は、公知のＭＤＳＣによって媒介される免疫抑制機能に加えて、認められていないＭＤＳＣによって媒介される造血抑制能力があることを証明している。この所見を補強するために、ＨＰＣの増殖能力に関するＭＤＳＣの効果を、メチルセルロースコロニー形成能アッセイでＭＤＳ−ＭＤＳＣ枯渇及びＨＳＰＣ富化のＢＭ患者検体を調べた。赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）及び顆粒球／マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）は、ＭＤＳＣを補充された試料及び分取されていない試料（図１Ｎ）と比較して、ＭＤＳＣ枯渇検体において有意により高く、ＭＤＳＣが、赤芽球及び骨髄の前駆細胞の発達に関して直接的な抑制的役割を有することを証明している。
【０１２９】
ＣＤ３３発現及びシグナル伝達の増加は、ＭＤＳＣ抑制機能及び造血障害の一因となる。ヒトにおけるＭＤＳＣは、このファミリーの他のメンバーと共に炎症において突出した役割を有する表面膜内外糖タンパク質ＣＤ３３、Ｓｉｇｌｅｃ  ３受容体を特徴的に発現させる（Ｃｒｏｃｋｅｒ，Ｐ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：２５５−２６６；Ｂｌａｓｉｕｓ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｂｌｏｏｄ  １０７：２４７４−２４７６；Ｂｌａｓｉｕｓ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：２５５−２６０；Ｌａｊａｕｎｉａｓ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５：２４３−２５１；Ｎｕｔｋｕ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｂｌｏｏｄ  １０１：５０１４−５０２０；ｖｏｎ  Ｇｕｎｔｅｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．２００８．Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １１４３：６１−８２；Ｐａｕｌ，Ｓ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｂｌｏｏｄ  ９６：４８３−４９０；Ｕｌｙａｎｏｖａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１４４５１−１４４５８；Ａｖｒｉｌ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３：６８４１−６８４９；Ｉｋｅｈａｒａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：４３１１７−４３１２５）しかしながら、骨髄造血におけるＣＤ３３の関与はまだ調べられていない。それ故に、ＭＤＳ−ＭＤＳＣ上におけるＣＤ３３膜発現密度と、ＭＤＳ  ＢＭにおけるそれらの活性化及び維持との関係を調べた。これらの細胞は、非ＭＤＳ関連の癌患者及び健康なドナーＢＭ細胞から単離されたＬＩＮ−ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＤ３３＋細胞に比べてより高いレベルでＣＤ３３を強力に発現することが見出された（図２Ａ）。ＣＤ３３結合の機能的影響を調査するために、ＣＤ３３をＵ９３７細胞（高度なＣＤ３３発現を有するヒト単球性細胞系）中で架橋させ、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β及びＶＥＧＦ分泌（図２Ｂ）を誘発させた。ＣＤ３３がＭＤＳＣの蓄積及び／または活性化を促進できるか否かを調べるために、健康なドナー由来のＢＭ−ＭＮＣにおいてアデノウイルスベクターでＣＤ３３を過剰発現させ、そしてそれは、成熟マーカーＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、及びＣＣＲ７（図２Ｃ）の発現が減少することによって明示されるように、骨髄細胞の発達を有意に抑制した。ＭＤＳＣ媒介ＢＭ抑制におけるＣＤ３３の役割を更に確立するために、ＣＤ３３に特異的なｓｈＲＮＡを含有するレンチウイルスベクター（ＬＶ）を使用してＭＤＳ−ＭＤＳＣにおいてＣＤ３３をノックダウンした。ＣＤ３３  ｓｈＲＮＡで処理されたＭＤＳ−ＭＤＳＣと一緒に自己由来ＨＰＣを共培養すると、スクランブルされたｓｈＲＮＡで処理され且つ形質導入されていないＭＤＳ−ＭＤＳＣ及び健康なドナーＢＭ  ＭＤＳＣ（図２Ｄ）と一緒に培養されたそれらと比較して、結果としてＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＭコロニーの回収は２〜３倍増加した。更に、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、及びアルギナーゼの生成は、対照細胞（図２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ）と比較して、ＣＤ３３  ｓｈＲＮＡで処理されたＭＤＳ−ＭＤＳＣで低減した。まとめると、これらのデータは、ＭＤＳ及び直接の造血障害におけるＭＤＳＣの活性化及び増殖におけるＣＤ３３の役割を詳細に表している。
【０１３０】
Ｓ１００Ａ９はＣＤ３３のための天然リガンドである。これらの調査は、ＣＤ３３／Ｓｉｇｌｅｃ  ３がＭＤＳＣの機能の活性化に関与する重要な受容体であることを示したが、その天然リガンドは知られていなかった。したがって、この受容体のための潜在的リガンド（単数または複数）を同定するために、ＣＤ３３の外部ドメインとヒトＩｇＧのＦｃ部分とを有するキメラ融合タンパク質（ここでは、ＣＤ３３融合体と呼ぶ）を製造した。ＭＤＳ患者由来のＢＭ細胞溶解物を、ＣＤ３３融合体と一緒に免疫沈降させ、続いて関連ペプチドに関して高スループット質量分析を行った。ＭＤＳＣを活性化させることが知られている炎症性シグナル伝達分子であるＳ１００Ａ９は、同定された最も突出したタンパク質バンドの１つだった（図３Ａ）。このＤＡＭＰのＣＤ３３に対する結合の特異性を確認するために、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９トランスフェクタントの両方を、内因性ＣＤ３３、Ｓ１００Ａ８またはＳ１００Ａ９の検出可能な発現の無い横紋筋肉腫細胞系ＳＪＣＲＨ３０で調製した。ＣＤ３３融合体（ＡＰＣ）はＳ１００Ａ９がトランスフェクトされた細胞のみを染色し、Ｓ１００Ａ８がトランスフェクトされた細胞は染色せず、これで結合特異性を確認した（図３Ｂ）。トランスフェクタントはＦＩＴＣで染色され、そしてＣＤ３３融合体による特異的結合はＡＰＣで染色された（核はＤＡＰＩで染色された）。Ｓ１００Ａ９のＣＤ３３に対する直接結合を、捕捉抗体が抗Ｓ１００Ａ９（図３Ｃ）であるサンドイッチＥＬＩＳＡによって、ならびにトランスフェクトされた細胞溶解物をＣＤ３３融合体でドットブロット分析（図３Ｄ）することによって、更に確認し、相互作用の特異性を証明した。このペアの結合を完全に裏付けるために、逆免疫沈降をＣＤ３３がトランスフェクトされた細胞に関して行い、Ｓ１００Ａ９が共トランスフェクトされた細胞においてＣＤ３３のみとＳ１００Ａ９が共沈殿することを示した（図３Ｅ）。ＭＤＳ患者におけるリガンド特異性を臨床的に確認するために、プルダウンを、健康なＰＢＭＣ及びＢＭならびにＭＤＳ患者由来のＣＤ３３融合体と比較した。予期したように、最高量のＳ１００Ａ９がＭＤＳ患者検体のＢＭから沈殿した（図３Ｆ）。次に、Ｓ１００Ａ９とＣＤ３３との相互作用の動力学を理解するために、ＳＪＣＲＨ３０細胞を、ベクターまたはＣＤ３３でトランスフェクトし、ＤＤＫ（ＤＹＫＤＤＤＤＫエピトープ、Ｆｌａｇと同じエピトープ）でタグ付けされた組換えヒト（ｒｈ）Ｓ１００Ａ９と一緒に培養した。結果としてｒｈＳ１００Ａ９と安定なＳＪＣＲＨ３０−ＣＤ３３細胞との結合は時間依存的に増加したが、ベクターをトランスフェクトした細胞には結合しなかった（図３Ｇ）。このライゲーションペアの機能性を示すために、ｒｈＳ１００Ａ９をＪＣＲＨ３０−ＣＤ３３細胞へ加え、ＩＬ１０及びＴＧＦβ発現のＣＤ３３媒介上方調節を誘発させた（図３Ｈ及び３Ｉ）。ｒｈＳ１００Ａ９が、ＣＤ３３を架橋した後にこれらのサイトカインを分泌することについてこれらの観察を再現できることを確認するために、ｒｈＳ１００Ａ９を用いてＵ９３７細胞で実験を繰り返し、両方のサイトカインの生成の増加を再び見出した（図３Ｊ及び３Ｋ��。重要なことには、Ｓ１００Ａ９のＢＭ血漿濃度は、健康なドナー由来のＢＭ血漿と比較して、ＭＤＳ患者で有意に増加した（図３Ｌ）。更に、患者ＢＭ由来のＭＤＳ−ＭＤＳＣにおけるＣＤ３３とｒｈＳ１００Ａ９との結合は、初代ＭＤＳ−ＢＭ細胞におけるこのリガンド／受容体ペアの時間依存性共存をもたらした（図３Ｍ）。ＣＤ３３は、ＳＨＰ−１（Ｓｒｃ相同領域２ドメイン含有ホスファターゼ−１）を動員するＩＴＩＭのリン酸化を介してシグナル伝達することがよく認められている。ｒｈＳ１００Ａ９ライゲーションは、ＳＨＰ−１の動員を相応に増加させ、ＭＤＳ−ＢＭにおけるＳ１００Ａ９ライゲーション後に、そのＩＴＩＭを介してＣＤ３３がシグナル伝達していることを確認した（図３Ｎ）。更に、ＭＤＳ患者のＢＭ血漿でＣＤ３３トランスフェクトＳＪＣＲＨ３０を直接処理すると、健康なドナーの血漿で処理された細胞と比較して、ＩＴＩＭへのＳＨＰ−１の動員を誘発し、局所的ＢＭ微小環境におけるＳ１００Ａ９の分泌の増加が、ＣＤ３３−ＩＴＩＭシグナル伝達の活性化に関与できることを示唆している（図３Ｏ）。
【０１３１】
ＣＤ３３のＳ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９結合はＭＤＳ−ＭＤＳＣ活性化を誘発する。Ｓ１００Ａ９及びＣＤ３３を機能的なリガンド／受容体ペアとして確立した後、受容体架橋で観察される機能的応答を繰り返す際のこの相互作用の役割を調べた。ＣＤ３３過剰発現を、アデノウイルストランスフェクションによって健康なＢＭ細胞で再び誘導し、ｒｈＳ１００Ａ９を添加または添加せずに、免疫抑制特性を試験した。ＣＤ３３の強制的発現により、抑制性サイトカイン、ＩＬ−１０及びＴＧＦβの遺伝子発現及び分泌の平行増加を誘発した（明灰色の棒、図４Ａ−Ｄ）。そしてそれはｒｈＳ１００Ａ９の添加によって大幅に増加した。抑制性サイトカインＴＧＦβの分泌は、ＣＤ３３トランスフェクト細胞をｒｈＳ１００Ａ９で処理した後に唯一観察され（図４Ｄ）、それはＮＯＳ２及びＡＲＧ２の発現の増加を伴い、抑制性サイトカインプロフィールと一致している（図４Ｅ及び４Ｆ）。図４Ｇ−Ｈは、それぞれ、フローサイトメトリーによりＱＰＣＲ及びＧＦＰで測定される遺伝子及びタンパク質の発現レベルの両方における、ＣＤ３３アデノウイルスのトランスフェクション効率を示している。
【０１３２】
その他のリガンドと比較して、ＣＤ３３とのＳ１００Ａ９のライゲーションの特定の役割を更に詳細に示すために、ＲＡＧＥ、ＴＬＲ４、ＣＤ３３ならびに各ペアを、ｒｈＳ１００Ａ９で健康なＢＭ細胞を処理する前に、抗体でブロックした。これらのデータからは、ＣＤ３３を遮断するとＩＬ−１０及びＴＧＦβ双方の産生が減少するが、抗ＲＡＧＥ及び抗ＴＬＲ４で処理すると、ＩＬ−１０生成に関しては有意な効果は無く、ＴＧＦβの分泌と発現に関しては適度な抑制を示した、ことが分かる（図４Ｉ及び４Ｊ）。これらの所見は、ＣＤ３３が両方のサイトカインの分泌で重要な役割を果たすが、局所的骨髄炎と関連のある他の受容体も寄与する可能性もあることを示唆している。Ｓ１００Ａ９発現がＢＭ微小環境で炎症の一因となることを確認するために、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９を、遺伝子特異的ｓｈＲＮＡを用いてＭＤＳ−ＭＤＳＣでノックダウンした（図４Ｋ）。Ｓ１００Ａ９が、通常はヘテロダイマーとしてＳ１００Ａ８とペアになり、双方が同時に制御されることを考慮すると、その交互タンパク質の発現での下方調節による遺伝子発現において相反性変化が存在することは意外ではなかった。重要なことに、Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９発現の減少は、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−β生成を著しく減弱し（図４Ｌ及び４Ｍ）、自己由来ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＭコロニー形成を助けた（図４Ｎ）。これらのデータは、炎症関連のＳ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９シグナル伝達が、ＭＤＳ−ＭＤＳＣの活性化で重要な役割を果たし、正常な造血を抑制する、ことを示している。
【０１３３】
Ｓ１００Ａ９トランスジェニックマウスは、ヒトＭＤＳの特徴を再現する。Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９は、ＣＤ３３／Ｓｉｇｌｅｃ  ３のシグナル伝達を誘発し、ＭＤＳＣ活性化に関与するという所見を考慮して（Ｅｈｒｃｈｅｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ８６：５５７−５６６；Ｖｏｇｌ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １３：１０４２−１０４９；Ｃｈｅｎｇ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０５：２２３５−２２４９）、Ｓ１００Ａ９トランスジェニックマウス（Ｓ１００Ａ９Ｔｇ）を作製してＭＤＳＣ関連の炎症を調べた（Ｃｈｅｎｇ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０５：２２３５−２２４９）。ＭＤＳは年齢関連の疾患であるので、年齢とＢＭ  ＭＤＳＣ（Ｇｒ１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞）の割合の変化を、６，８または２４週齢において、Ｓ１００Ａ９ノックアウト（Ｓ１００Ａ９ＫＯ）（Ｍａｎｉｔｚ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２３：１０３４−１０４３）マウスまたは野生型（ＷＴ）マウスと比較して、Ｓ１００Ａ９Ｔｇで分析した。この分析により、Ｓ１００Ａ９ＴｇマウスのＢＭにおいてＭＤＳＣの著明な年齢依存的な蓄積が結果として得られたが、Ｓ１００Ａ９ＫＯまたはＷＴマウスでは得られず、その蓄積は２４週までにその最大に達した（図５Ａ）。同様に、ＰＢＭＣ及び脾臓におけるＭＤＳＣの割合も年齢と共に増加した（図５Ｂ）。脾臓におけるＭＤＳＣの割合の変化はＢＭに比べて比較的少なかったが、それは、成熟細胞の割合の低下を伴い（図５Ｃ及び５Ｄ）、この造血臓器における未成熟細胞の成熟細胞に対する割合は事実上増加した。機能的に、Ｓ１００Ａ９ＫＯまたはＷＴマウスではなく２４週齢のＳ１００Ａ９Ｔｇマウス由来のＭＤＳＣだけが、ＢＦＵ−Ｅ（図５Ｅ）及びＣＦＵ−ＧＭの形成を有意に阻害し、Ｓ１００Ａ９Ｔｇ群（図５Ｅ）におけるＭＤＳＣの枯渇後に救出された。重要なことに、ＭＤＳＣ増殖及び抑制性活性を調節する必須の起炎因子としてのＳ１００Ａ９の役割の更なる証拠として、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−β分泌が、ＫＯまたは野生型動物と比較して、Ｓ１００Ａ９Ｔｇマウスで有意に増加した（図５Ｆ）。
【０１３４】
造血に関するＳ１００Ａ９過剰発現のｉｎ  ｖｉｖｏでの結果を評価するために、生後６、１８及び２４週齢のＷＴ及びＳ１００Ａ９Ｔｇマウスから得られた連続全血球算定（ＣＢＣ）を分析した。Ｓ１００Ａ９Ｔｇマウスは、生後６週間目という早い時期にはっきりとしたヘモグロビン（Ｈｇｂ）、赤血球（ＲＢＣ）数、好中球、及び血小板数の減少を特徴とする進行性多系列血球減少症を発症した。１８週齢までに、Ｓ１００Ａ９Ｔｇマウスは、重篤な貧血及び血小板減少を示し、ＲＢＣは２２．０％超減少、Ｈｇｂは２０．１％減少、そして血小板は７７．８％減少した（表２）。ＷＴマウス由来のＢＭ穿刺液及び生検切片の組織検査は、正常な形態学的特徴及び細胞学的特徴を示した（図５Ｇ−Ｊ）。対照的に、Ｓ１００Ａ９ＴｇマウスのＢＭは、三血球系細胞学的形成異常（ｔｒｉ−ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）（図５Ｋ−Ｎ）を伴う細胞過形成（９５％の細胞充実性）であった。巨核球形態は、単核または低分葉の形態が優位であるというヒトＭＤＳの形成異常特徴特性を再現した。赤芽球前駆体は、異常なヘモグロビン化及び時に二核化を有する巨赤芽球様の成熟を示した。核出芽及び奇異な有糸分裂の形態も明瞭であった（図５Ｋ−Ｎ）。血球減少症は齢と共に悪化し、２４週齢までに、Ｓ１００Ａ９Ｔｇマウスは、重篤な汎血球減少症は発症した（詳細な説明が図の脚注に要約される）。このモデルはヒトＭＤＳで観察される炎症性環境を厳密に再現しているが、Ｓ１００Ａ９Ｔｇマウス由来のＨＳＰＣもＳ１００Ａ９タンパク質を発現する。ヒトＭＤＳのこのタンパク質の由来が分からないことをふまえて、ＭＤＳ  ＢＭ−ＭＮＣにおけるＳ１００Ａ９の細胞発現はフローサイトメトリーによって調べた。Ｓ１００Ａ９細胞内染色はＣＤ３３＋細胞で検出されたが、ＣＤ３４＋  ＨＳＣでは明白なＳ１００Ａ９発現は無かった（図５Ｏ及び５Ｐ）。Ｓ１００Ａ９発現は、他の免疫細胞、例えばＣＤ３＋リンパ球、ＣＤ１９＋Ｂ細胞またはＣＤ５６＋ＮＫ細胞で検出されなかった。
【表２】
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【０１３５】
Ｓ１００Ａ９Ｔｇマウス由来の富化ＨＳＣを養子移入することによるＭＤＳＣの役割の分析
造血におけるＳ１００Ａ９Ｔｇマウス由来のＭＤＳＣの役割を正確に詳細に記載するために、同一年齢層のＷＴ  ＨＳＣ、Ｓ１００Ａ９Ｔｇ  ＨＳＣ、または雄のマウス由来の富化ＢＭ  ＨＳＣの混合物（１：１の比率）と一緒に、致命的に放射線にさらされた（９００ｃＧｙ）雌のＦＶＢ／ＮＪマウス中へ富化ＨＳＣを競合的養子移入（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）した。雄雌ＳＲＹ遺伝子発現ＰＣＲアプローチを使用して移植をモニターすると、すべてのマウスが８０％を超える移植を経験した（図８）。移植（８週で、ＷＴレシピエントにおいてＷＢＣが３ｘ１０３細胞／μＬ超と定義する）の後、ＷＴ  ＨＳＣのレシピエントは、移植されていないＷＴマウスにおけるレベルと同等な（図５Ａ）、ＢＭ由来のＧｒ１＋Ｃｄ１１ｂ＋とＨＳＣ（図６Ａ及び６Ｃ）の両方の割合を有していた。対照的に、Ｓ１００Ａ９Ｔｇ富化ＨＳＣによる養子移入は、ＨＳＣの割合の減少を伴うＧＦＰ発現Ｇｒ１＋Ｃｄ１１ｂ＋ＭＤＳＣ（図６Ｂ）を高い割合で生成させ、これらの結果は、我々の高齢のトランスジェニックマウスにおける観察と類似していた（図６Ｃ）。しかしながら、混合ＨＳＣ集団を受容したマウスは、ＷＴ養子移入マウスのそれに近いＭＤＳＣの割合（約３０％）を有していた。特に、約５０％に近いＭＤＳＣがＧＦＰ発現を欠いており、ＷＴ  ＨＳＰＣ（図６Ｂ）由来の起源（ｏｒｉｇｉｎａｔｉｏｎ）を示しているが、残りのＧＦＰ＋  ＭＤＳＣはＳ１００Ａ９Ｔｇドナー細胞由来であった。全ＭＤＳＣ集団はＳ１００Ａ９Ｔｇ養子移入マウスで観察されるレベルまで増加しなかったが、Ｓ１００Ａ９Ｔｇドナー細胞を移植されたマウスで見出されたレベルまでＨＳＣの割合は減少したことが観察された（図６Ｃ）。これらの所見は、Ｓ１００Ａ９Ｔｇドナー細胞由来の活性化ＭＤＳＣのより少ない集団は、造血の完全性の同等の障害をもたらすのに十分な抑制性活性を有していたことを示している。これらの所見は、混合供給源移植レシピエントが、Ｓ１００Ａ９ＴｇまたはＷＴドナー細胞（図６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ）を受容しているマウスに比べて重症度が中程度の血球減少症を有していた、末梢血球算定の逐次分析によって支持された。興味深いことに、混合ドナーレシピエントは移植後のＨＳＣの割合がＴｇ移植マウスと同じであったが、それらのＷＢＣ計数は、Ｓ１００Ａ９Ｔｇ  ＨＳＣを移植されたマウスに比べてより高く、ＷＴ  ＨＳＣレシピエントのレベルに比べてより低かった。同様に、貧血の発症は、Ｓ１００Ａ９Ｔｇドナー細胞に対して混合レシピエントでは遅れた。これらの所見は、ＷＴマウス由来の正常なＨＳＣは部分的に造血を救助することができるが、時間と共に、Ｓ１００Ａ９Ｔｇドナー細胞に由来するＭＤＳＣが蓄積することによって、造血は抑制される。
【０１３６】
Ｓ１００Ａ９のみがＨＳＣに関して直接効果を有するか否かを調べるために、ＭＤＳ患者検体由来のＢＭ  ＣＤ３４＋（ＭＤＳＣ枯渇、ＭＤＳＣ−）を、２４〜４８時間、ｒｈＳ１００Ａ９で処理し、フローサイトメトリーによってアポトーシスを評価した。ＣＤ３４＋  ＨＳＰＣ数の減少が、４８時間の暴露後に、生存細胞中のアポトーシス分画が対応して増加している対照と比較して、処理後に観察された（図６Ｇ及び６Ｈ）。これらの所見を補強するために、健康な骨髄由来のＣＤ３４＋細胞（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｋｅｒｆｉｅｌｄ）をｒｈＳ１００Ａ９と一緒に培養した。生細胞の減少は、処理後に再び観察された（対照細胞の生存率５０．７％対ｒｈＳ１００Ａ９処理細胞の生存率２４．７％、図６Ｉ）。これらの所見は、Ｓ１００Ａ９が、ヒトＨＳＣにおいて直接的なアポトーシス効果を有することを示唆している。
【０１３７】
ＭＤＳＣの強制成熟（ｆｏｒｃｅｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）は造血を回復させる。ＭＤＳＣのエフェクターの役割を確認し、ＭＤＳＣの標的抑制の潜在的有益性を調べるために、Ｓ１００Ａ９Ｔｇマウスを全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）で処置した。ＡＴＲＡは、成熟骨髄細胞へのＭＤＳＣの分化を誘導し、ＲＯＳ産生を中和し、それによって強制的な最終分化によってＭＤＳＣを消滅させる（Ｎｅｆｅｄｏｖａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７：１１０２１−１１０２８；Ｍｉｒｚａ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：９２９９−９３０７）。この目的のために、ＡＴＲＡがＳ１００Ａ９ＴｇマウスにおけるＭＤＳＣ分化を誘導し、造血を改善するか否かを調べた。Ｓ１００Ａ９Ｔｇ及びＷＴマウスを、５日間連続で、経口で、ＡＴＲＡ（２５０μｇ／２００μｌ）またはビヒクル対照で処置した。処置完了２日後に、ＡＴＲＡはＭＤＳＣの総数を減少させたが、ＷＴマウスにおける数は基底レベルのままであった（図７Ａ）。Ｓ１００Ａ９ＴｇマウスにおけるＭＤＳＣ数の減少は、ＡＴＲＡ処置後の成熟細胞の増加に連動していた（図７Ｂ）。ＡＴＲＡによる一次ＭＤＳ  ＢＭ検体の処理により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＤＳＣの蓄積も低下した。重要なことに、ＡＴＲＡで処理されたＳ１００Ａ９Ｔｇマウス由来のＢＭ前駆細胞培養物は、ビヒクル処理対照と比較して、有意に改善されたＢＦＵ−Ｅ回復を示した（図７Ｃ）。末梢血球算定における変化を分析すると、ビヒクル処理対照（図７Ｄ）と比較して、ＲＢＣ、ＷＢＣ及び血小板のカウントは有意に増加しており、それはＭＤＳＣの最終分化が有効な造血を回復させることができることを示した。
【０１３８】
研究により、ＭＤＳＣがＣＤ３３関連ＩＴＩＭを用いてそれ自体の細胞成熟を阻害することが分かった（図３Ｎ及びＯ）。しかしながら、ＩＴＩＭシグナルは、刺激性免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）によって媒介されるシグナルによって無効にされ得る（Ｌａｎｉｅｒ，Ｌ．Ｌ．２００５．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：２２５−２７４；Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：８４−８９）。いくつかのＣＤ３３関連受容体、例えばある種のＳｉｇｌｅｃは、ＩＴＩＭを欠き、代わりに活性化受容体として機能する。マウスＳｉｇｌｅｃ−Ｈ及びヒトＳｉｇｌｅｃ−１４は、ＤＡＰ１２（Ｂｌａｓｉｕｓ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｂｌｏｏｄ  １０７：２４７４−２４７６；Ｂｌａｓｉｕｓ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：２５５−２６０；Ａｎｇａｔａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｆａｓｅｂ  Ｊ  ２０：１９６４−１９７３；Ｌａｎｉｅｒ，Ｌ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：７０３−７０７）と、すなわち、骨髄細胞成熟を促進し（図９）、そしてＴＬＲ−４活性化を抑制できるＩＴＡＭ含有アダプター（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｉ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：１５５−１６１）と相互作用することが分かった。精製されたＭＤＳ−ＭＤＳＣ（ｎ＝５）のＤＡＰ１２遺伝子発現を、同一年齢層の健康なドナーのＭＤＳＣ（ｎ＝５）と比較した。ＤＡＰ１２  ｍＲＮＡは、検査したすべての検体におけるＭＤＳ−ＭＤＳＣで有意により低かった（図７Ｅ）。ＤＡＰ１２によるＣＤ３３−ＩＴＩＭシグナル伝達の無効化は、これらの未成熟な骨髄細胞の分化を誘導し、造血を改善すると推測された。これを試験するために、Ｐ２３と名付けられたＤＡＰ１２の構成的に活性な形態を作製し、そしてＡＤ２９３細胞にＧＦＰ、ＷＴ−ＤＡＰ１２、または活性なＤＡＰ１２  Ｐ２３ウイルスベクターをトランスフェクトした。その結果は、Ｐ２３が、Ｓｙｋキナーゼと結合し、外部の刺激無しに、形質導入されたＡＤ２９３細胞における下流のシグナル伝達を活性化させる、ことを示している（図７Ｆ）。更に、Ｐ２３は、ＣＤ８０、ＣＤ８３、及びＣＣＲ７抗原の上方調節によって示されるように、一次ヒトＤＣ成熟を促進する（図１０）（Ｂｌａｓｉｕｓ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｂｌｏｏｄ  １０７：２４７４−２４７６；Ｂｌａｓｉｕｓ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：２５５−２６０）。これらの所見に基づき、Ｐ２３はＭＤＳ−ＭＤＳＣの成熟を誘導することができ、それにより造血の抑制を防止することができた、可能性がある。これを試験するために、ヒト単球及び顆粒球の表面マーカーＣＤ１４及びＣＤ１５の発現を、トランスフェクション後に分析し（Ａｒａｋｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｂｌｏｏｄ  １０３：２９７３−２９８０）、その結果は、ＷＴ−ＤＡＰ１２トランスフェクション単独が、ＣＤ１４及びＣＤ１５の上方調節を誘導するのに十分であったが、Ｐ２３トランスフェクションは両方の成熟マーカーの更により多くの発現を誘導したことを示している（図���Ｇ）。更に、Ｐ２３は、ＣＤ８０、ＣＤ８３、及びＣＣＲ７成熟マーカーの上方調節によって示されるように、初代ＭＤＳ−ＭＤＳＣの成熟を促進した（図７Ｈ）。最後に、ＤＡＰ１２媒介ＭＤＳＣ成熟が赤血球生成の抑制を軽減したか否かを試験するために、ＭＤＳ−ＭＤＳＣを、７例のＭＤＳ患者から精製し、そして対照、ＷＴ−ＤＡＰ１２またはＰ２３レンチウイルス構築物に感染させた。造血に関する成熟ＭＤＳ−ＭＤＳＣの抑制機能を評価するために、自己由来ＭＤＳＣ枯渇ＢＭ細胞で感染させた細胞を培養した後に、コロニー形成能を評価した。Ｐ２３感染ＭＤＳ−ＭＤＳＣ共培養物は、対照ウイルスベクターまたはＷＴ−ＤＡＰ１２感染ＭＤＳ−ＭＤＳＣ共培養物に比べて、有意により高いコロニー数を生成させた（図７Ｉ）。これらの所見は、ＤＡＰ１２が、ＣＤ３３関連ＩＴＩＭシグナル伝達を無効にしてＭＤＳＣ成熟を刺激し、そしてＨＰＣコロニー形成能に関する抑制効果を逆転させる、ことを示している。
【０１３９】
考察
ＢＭ微小環境内の炎症性刺激は、ＭＤＳにおける前駆細胞の増殖及びアポトーシスを刺激する重要な生物学的シグナルと認識される。最近の集団研究は、慢性免疫刺激とＭＤＳ疾病素質との間の強い連関を示すことによって、更にこれを拡張した（Ｋｒｉｓｔｉｎｓｓｏｎ，Ｓ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２９：２８９７−２９０３）。ニッチ内因性異常それ自体のみによって細胞の非自律的な様式でのＭＤＳの発症を説明できる決定的な証拠は、乏しい。Ｒａａｉｊｍａｋｅｒｓと同僚は、ＢＭ微小環境の間葉成分におけるＤｉｃｅｒ１の欠失によって引き起こされる選択的な骨前駆細胞機能不全は、造血を混乱させ、そして骨髄形成異常の発症、続いて骨髄系に拘束された遺伝的異常の二次的生成へと導くのに十分である、ことを示した（Ｒａａｉｊｍａｋｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｎａｔｕｒｅ  ４６４：８５２−８５７）。
【０１４０】
開示された研究は、Ｌｉｎ−ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＤ３３＋  ＭＤＳＣが、ＭＤＳ患者のＢＭ中に蓄積し、腫瘍性クローンとは異なる集団に由来し、造血を抑制する細胞エフェクターとして機能し、Ｔ細胞免疫寛容を促進し、そしてＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＮＯ、及びアルギナーゼのような骨髄抑制性及び炎症性の分子の重要な供給源として機能することを示している。複数の生物学的及び生化学的アプローチを使用して、遊走阻止因子関連タンパク質１４（ＭＲＰ−１４）またはカルグラヌリン−Ｂとしても知られているＳ１００Ａ９は、ＣＤ３３／Ｓｉｇｌｅｃ  ３のための内因性天然リガンドとして機能し得ることを示した。更に、トランスジェニックマウスにおけるＳ１００Ａ９の過剰発現によるＭＤＳＣの強制的な増殖により、ヒトＭＤＳ、特に、進行性年齢依存的な無効及び形成異常の造血の表現型模写をする血液学的特徴の発症が開始される。これらの所見は、ＢＭ微小環境の一つの細胞構成要素の増殖が、ニッチ誘導腫瘍形成によって異種骨髄前駆細胞における腫瘍性変化を促進するのに十分である、ことを示している。トランスジェニックマウスモデルにおけるＭＤＳＣの時間依存的な蓄積は、ＭＤＳＣが炎症促進性のサイトカイン（例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１β）の血清レベルの上昇を伴って齢と共に増殖するという最近のヒトの所見に対応し、そしてＭＤＳＣの増殖を引き起こすそのような老化依存的な変化は、ＭＤＳの年齢依存的な病因において重要な役割を果たし得るという証拠を提供する（Ｖｅｒｓｃｈｏｏｒ  ＣＰ，ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ９３（４）：６３３−７）。重要なことに、同一年齢層の健康なドナー由来または非ＭＤＳ癌患者由来のＬｉｎ−ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＤ３３＋  ＭＤＳＣ抑制の欠如によって明示されるように、Ｌｉｎ−ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＤ３３＋表現型はサプレッサー細胞機能を単独では付与しなかった。開示された研究は、ＭＤＳ−ＭＤＳＣによって媒介される抑制機能の誘導のために、先天性の免疫シグナル伝達の活性化及び例えばＳ１００Ａ９のような炎症誘発性分子の生成が必要であることを示している。更に、初代ヒトＭＤＳ−ＭＤＳＣが悪性クローン固有の分子遺伝的異常を欠いているという開示所見は、ＭＤＳＣは非腫瘍性ＨＳＣに由来し、そしてＭＤＳＣの活性化及び増殖は、おそらく、遺伝的に異なったＭＤＳクローンの出現よりも先に起こることを示している。
【０１４１】
本明細書では、ＭＤＳＣを包含する多くの免疫細胞によって発現されるＣＤ３３、Ｓｉｇｌｅｃ受容体は、ＭＤＳ−ＭＤＳＣによって著しく過剰発現されることが示され、またこの受容体は、ＩＴＩＭ媒介シグナル伝達の分断を通してＭＤＳ−ＭＤＳＣの抑制機能を制御することが示される。更に、ｒｈＳ１００Ａ９がヒトＨＰＣでアポトーシスを直接的に誘発するという開示所見は、このリガンドが、細胞（ＭＤＳＣ）及び体液メカニズム（ＣＤ３３、ＴＬＲ４）の両方を含む無効な造血を促進する際に二重の役割を果たすことを示している。更に、ＣＤ３３リガンド結合に対する細胞の応答は、細胞型に特異的（すなわち、ＨＰＣにおけるアポトーシス対ＭＤＳＣにおける活性化及び増殖）と考えられる。脊髄区画（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）内における代償再生は、ＭＤＳにおいて観察される増殖指数の増加（Ｒａｚａ  ｅｔ．ａｌ．１９９５．Ｂｌｏｏｄ  ８６（１）：２６８−２７６）、及び齢と共に起こる選択的な骨髄の歪みを説明でき得る。したがって、ＣＤ３３の過剰発現は、未成熟ＭＤＳＣの増殖に重要であるＩＴＡＭ関連受容体からの成熟シグナルを損なう可能性がある（図７Ｇ及び７Ｈ）。これと一貫して、ＣＤ３３のｓｈＲＮＡサイレンシングは、骨髄抑制性サイトカイン生成を減らし、そして重要なことに、造血の前駆細胞コロニー形成能を回復させた。更に、構成的に活性なＤＡＰ１２シグナル伝達は、ＣＤ３３−ＩＴＩＭ阻害を無効にし、そしてＭＤＳＣの分化を誘導するのに十分であり、そしてそれによりＭＤＳ−ＭＤＳＣ中へ活性なＤＡＰ１２をトランスフェクトすると赤血球生成が回復した。更に重要なことに、ＤＡＰ１２の活性化は、炎症によって媒介されるＢＭ抑制において役割を果たす可能性もあるＴＬＲによって媒介されるシグナル伝達経路を阻害することができ得る（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｉ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：１５５−１６１；Ｈａｍｅｒｍａｎ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７７：２０５１−２０５５）。
【０１４２】
多くの証拠が、ヒトＭＤＳの病因及び生物学的機構において、先天性免疫シグナル伝達の活性化を示唆している（Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｗ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｂｌｏｏｄ  １００：３５５３−３５６０；Ｇｏｎｄｅｋ，Ｌ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｂｌｏｏｄ  １１１：１５３４−１５４２；Ｓｔａｒｃｚｙｎｏｗｓｋｉ，Ｄ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｂｌｏｏｄ  １１２：３４１２−３４２４）。ｄｅｌ（５ｑ）ＭＤＳにおいて、ｍｉＲ−１４５及びｍｉＲ−１４６ａの対立遺伝子の欠失は、結果としてそれぞれの標的、ＴＩＲＡＰ及びＴＲＡＦ６の抑制解除をもたらす。特に重要なことには、Ｓｔａｒｃｚｎｏｗｓｋｉと同僚は、ネズミＨＳＰＣにおいて、これらの特異的なｍｉＲのノックダウンまたはＴＲＡＦ６の過剰発現により、インターロイキン−６を含む細胞自律及び非細胞自律の両方のメカニズムを介して、移植モデルでｄｅｌ（５ｑ）ＭＤＳの血液学的特徴が再現されることを示した（Ｓｔａｒｃｚｙｎｏｗｓｋｉ，Ｄ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １６：４９−５８；Ｓｔａｒｃｚｙｎｏｗｓｋｉ，Ｄ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ２４：３４３−３５９）。開示される研究は、ＢＭ炎症部位で特異的に放出されるヘテロダイマー  ＤＡＭＰ  Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９が、ＭＤＳで異常に発現されるだけでなく、ＣＤ３３のための天然リガンドとしても機能する、ことを示している。この所見は、Ｓ１００タンパク質が、ＭＤＳＣを包含する微小環境に誘導された細胞非自律メカニズムを介して直接的にＭＤＳ病因に関与するという証拠を提供する（Ｅｈｒｃｈｅｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ８６：５５７−５６６；Ｖｉｅｍａｎｎ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｂｌｏｏｄ  １０９：２４５３−２４６０）。更に、ＴＬＲ活性化は、骨芽細胞分化を抑制し、その一方でＨＳＣに関する脊髄の決定を指令する（Ｂａｎｄｏｗ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４０２：７５５−７６１；Ｄｅ  Ｌｕｃａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２３：２０６３−２０７４）。したがって、年齢と共に、先天性免疫シグナル伝達の長期活性化は、造血幹細胞の維持を支援するＢＭ骨内膜ニッチを破壊する可能性があり、ＭＤＳに特有な脈管形成ニッチへの脊髄前駆細胞の移行を有利にする可能性がある（Ｂｅｌｌａｍｙ，Ｗ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｂｌｏｏｄ  ９７：１４２７−１４３４）。これは、Ｓ１００Ａ９Ｔｇマウスにおける形成異常の細胞学的特徴の出現という、血球減少症の年齢依存的な発症に関する開示所見によって支持される。より重要なことに、競合移植実験により、Ｓ１００Ａ９ＴｇとＷＴドナーＨＳＣとの混合物は、造血を遅延させるが、依然として造血を阻害する、ことが分かった。
【０１４３】
開示された所見は、ＢＭ微小環境における先天性の免疫シグナル伝達の持続的活性化は、脊髄形成異常の発症とって十分に寛容な炎症環境を生じさせるＭＤＳ病因モデルを支持している。細胞自律性腫瘍造血前駆細胞は、脊髄区画での二次遺伝的異常（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ）の獲得後に、出現し得る。Ｓ１００Ａ９Ｔｇマウスは、ヒトＭＤＳをシミュレートし、ＭＤＳ病因及び新規の治療法の開発を研究するためのｉｎ  ｖｉｖｏモデルとして役立てることができる。にもかかわらず、ＭＤＳＣの成熟を促進する治療的介入は、疾患経過の初期に適用すると、寛解可能性を有し得る。
【０１４４】
実施例２
活性なカスパーゼ−１（表３）及びＩＬ−１β生成（表４）を４つの集団：すなわち幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）、前駆細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋）、赤芽球（ＣＤ７１＋）、及び骨髄細胞（ＣＤ３３＋）で評価した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を表３に示す。
【表３】
2020011979.tif 000007
【表４】
2020011979.tif 000008
【０１４５】
図１２に示してあるように、活性なカスパーゼ−１及びＩＬ−１β生成の倍率変化を、４つの細胞集団において、血漿処理対照に正規化した。活性なカスパーゼ−１及びＩＬ−１βの生成を、ＣＤ３３−ＩｇＧによる処理後にフローサイトメトリーによって４集団で、すなわち幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）、前駆細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋）、赤芽球（ＣＤ７１＋）、及び骨髄細胞（ＣＤ３３＋）において評価した。活性なカスパーゼ−１  ＭＦＩ（図１２Ａ）及びＩＬ−１β（図１２Ｂ）生成の倍率変化。
【０１４６】
図１３に示してあるように、活性なカスパーゼ−１及びＩＬ−１β生成の倍率変化を、４つの細胞集団において、血漿処理対照に正規化した。活性なカスパーゼ−１及びＩＬ−１β生成を、関連の経路阻害剤で処理した後にフローサイトメトリーによって４集団、すなわち幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）、前駆細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋）、赤芽球（ＣＤ７１＋）、及び骨髄細胞（ＣＤ３３＋）において評価した。活性なカスパーゼ−１  ＭＦＩ（図１３Ａ）及びＩＬ−１β（図１３Ｂ）生成の倍率変化。
【０１４７】
活性なカスパーゼ−１及びＩＬ−１β生成を４つの集団：すなわち幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）、前駆細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋）、赤芽球（ＣＤ７１＋）、及び骨髄細胞（ＣＤ３３＋）で評価した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を表３及び表４に示す。
【０１４８】
図１４に示してあるように、ＣＤ３３キロラトラップによる血漿Ｓ１００Ａ９の中和は、ＭＤＳ患者検体のコロニー形成能を高める。図１４Ａ〜１４Ｃは、ＩｇＧ、血漿、または０．１、０．５もしくは１．０mｇのＣＤ３３−ＩｇＧキメラトラップで処理されたＭＤＳ患者検体における、赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）（図１４Ｂ）、多能性コロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）（図１４Ａ）、及び顆粒球／マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）（図１４Ｃ）を示している。
【０１４９】
別段定義されなければ、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、開示された本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で引用される刊行物及びそれらが列挙している資料は特定的にに参照によって組み込まれる。
【０１５０】
当業者であれば、ルーチンの実験法のみを使用して、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するだろう、または確認することができるであろう。そのような等価物は以下の特許請求の範囲に包含される。
【図１Ａ】
2020011979.tif 000009
【図１Ｂ】
2020011979.tif 000010
【図１Ｃ】
2020011979.tif 000011
【図１Ｄ】
2020011979.tif 000012
【図１Ｅ】
2020011979.tif 000013
【図１Ｆ−１Ｉ】
2020011979.tif 000014
【図１Ｊ】
2020011979.tif 000015
【図１Ｋ】
2020011979.tif 000016
【図１Ｌ】
2020011979.tif 000017
【図１Ｍ】
2020011979.tif 000018
【図１Ｎ】
2020011979.tif 000019
【図２Ａ】
2020011979.tif 000020
【図２Ｂ】
2020011979.tif 000021
【図２Ｃ】
2020011979.tif 000022
【図２Ｄ】
2020011979.tif 000023
【図２Ｅ】
2020011979.tif 000024
【図２Ｆ】
2020011979.tif 000025
【図２Ｇ】
2020011979.tif 000026
【図３Ａ】
2020011979.tif 000027
【図３Ｂ】
2020011979.tif 000028
【図３Ｃ】
2020011979.tif 000029
【図３Ｄ】
2020011979.tif 000030
【図３Ｅ−３Ｆ】
2020011979.tif 000031
【図３Ｇ】
2020011979.tif 000032
【図３Ｈ−３Ｉ】
2020011979.tif 000033
【図３Ｊ−３Ｌ】
2020011979.tif 000034
【図３Ｍ】
2020011979.tif 000035
【図３Ｎ−３Ｏ】
2020011979.tif 000036
【図４Ａ−４Ｂ】
2020011979.tif 000037
【図４Ｃ−４Ｄ】
2020011979.tif 000038
【図４Ｅ−４Ｆ】
2020011979.tif 000039
【図４Ｇ−４Ｈ】
2020011979.tif 000040
【図４Ｉ】
2020011979.tif 000041
【図４Ｊ】
2020011979.tif 000042
【図４Ｋ−４Ｌ】
2020011979.tif 000043
【図４Ｍ−４Ｎ】
2020011979.tif 000044
【図５Ａ】
2020011979.tif 000045
【図５Ｂ】
2020011979.tif 000046
【図５Ｃ−５Ｄ】
2020011979.tif 000047
【図５Ｅ−５Ｆ】
2020011979.tif 000048
【図５Ｇ−５Ｎ】
2020011979.tif 000049
【図５Ｏ−５Ｐ】
2020011979.tif 000050
【図６Ａ】
2020011979.tif 000051
【図６Ｂ】
2020011979.tif 000052
【図６Ｃ】
2020011979.tif 000053
【図６Ｄ】
2020011979.tif 000054
【図６Ｅ】
2020011979.tif 000055
【図６Ｆ】
2020011979.tif 000056
【図６Ｇ】
2020011979.tif 000057
【図６Ｈ】
2020011979.tif 000058
【図６Ｉ】
2020011979.tif 000059
【図７Ａ】
2020011979.tif 000060
【図７Ｂ】
2020011979.tif 000061
【図７Ｃ】
2020011979.tif 000062
【図７Ｄ】
2020011979.tif 000063
【図７Ｅ】
2020011979.tif 000064
【図７Ｆ】
2020011979.tif 000065
【図７Ｇ】
2020011979.tif 000066
【図７Ｈ】
2020011979.tif 000067
【図７Ｉ】
2020011979.tif 000068
【図８】
2020011979.tif 000069
【図９】
2020011979.tif 000070
【図１０】
2020011979.tif 000071
【図１１Ａ−１１Ｉ】
2020011979.tif 000072
【図１２Ａ】
2020011979.tif 000073
【図１２Ｂ】
2020011979.tif 000074
【図１３Ａ】
2020011979.tif 000075
【図１３Ｂ】
2020011979.tif 000076
【図１４Ａ】
2020011979.tif 000077
【図１４Ｂ】
2020011979.tif 000078
【図１４Ｃ】
2020011979.tif 000079
【図１５Ａ】
2020011979.tif 000080
【図１５Ｂ】
2020011979.tif 000081
【図１５Ｃ】
2020011979.tif 000082
【図１６Ａ】
2020011979.tif 000083
【図１６Ｂ】
2020011979.tif 000084
【図１６Ｃ】
2020011979.tif 000085
【図１６Ｄ】
2020011979.tif 000086
【図１６Ｅ】
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【配列表】
2020011979000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月24日(2019.9.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を治療するための医薬組成物であって、Ｓ１００Ａ９と結合して隔離する可溶性ＣＤ３３融合タンパク質を含む組成物の治療有効量が前記対象に対して投与されるものであり、
該融合タンパク質は、ヒトＣＤ３３の細胞外ドメイン及び免疫グロブリンＦｃ領域を含む医薬組成物。
【請求項２】
前記融合タンパク質は、以下の式：すなわち
ｅＣＤ３３−Ｆｃ、
ｅＣＤ３３−ｅＴＬＲ４−Ｆｃ、
ｅＣＤ３３−ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ、
ｅＣＤ３３−ｅＴＬＲ４−ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ、
ｅＣＤ３３−ｅＲＡＧＥ−ｅＴＬＲ４−Ｆｃ、
ｅＴＬＲ４−ｅＣＤ３３−ｅＲＡＧＥ−Ｆｃ、
ｅＲＡＧＥ−ｅＣＤ３３−ｅＴＬＲ４−Ｆｃ、
ｅＴＬＲ４−ｅＲＡＧＥ−ｅＣＤ３３−Ｆｃ、及び
ｅＲＡＧＥ−ｅＴＬＲ４−ｅＣＤ３３−Ｆｃ
から成る群より選択される式を含む請求項２２記載の医薬組成物であって、
式中「ｅＣＤ３３」はヒトＣＤ３３の細胞外ドメインを含み、
式中「ｅＴＬＲ４」はＴＬＲ４の細胞外ドメインを含み、
式中「ｅＲＡＧＥ」はＲＡＧＥの細胞外ドメインを含み、
式中「Ｆｃ」は免疫グロブリンＦｃ領域を含み、
そして式中「−」はペプチドリンカーまたはペプチド結合から成る、
前記医薬組成物。
【外国語明細書】
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