(57)【要約】      （修正有）【課題】線維輪を修復する方法の提供。【解決手段】コラーゲンゲル、及び架橋剤を含むコラーゲンゲル組成物を提供する段階、及び、線維輪を修復するための条件下で、線維輪の修復部位の中、周り、または付近へ該組成物を注入する段階を含む線維輪の修復方法であって、コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物が注入される場所付近の生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量で、架橋剤が、コラーゲンゲルと共に含まれるかまたはコラーゲンゲルへ加えられる方法。【選択図】図２
2020114403.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンゲル、及び
架橋剤
を含むコラーゲンゲル組成物を提供する段階、及び、
線維輪を修復するための条件下で、線維輪の修復部位の中、周り、または付近へ該組成物を注入する段階
を含む線維輪の修復方法であって、
コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物が注入される場所付近の生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量で、架橋剤が、コラーゲンゲルと共に含まれるかまたはコラーゲンゲルへ加えられる、方法。
【請求項２】
コラーゲンがＩ型コラーゲンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生細胞をコラーゲンゲル組成物へ加える段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
生細胞が、軟骨細胞、線維芽細胞、幹細胞、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
コラーゲンが、約１〜２００ｍｇ／ｍｌの濃度で組成物中に含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
架橋剤が、約７．５ｍＭまでの濃度で組成物中に含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
架橋剤が、リボフラビン、ローズベンガル、リボース、デコリン、カルボジイミド、アルデヒド、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
架橋剤がリボフラビンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
注入する段階が、周囲の生物組織に損傷を引き起こさない、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
融合が、線維輪の天然組織を伴う、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
コラーゲンゲル、及び
架橋剤
を含むコラーゲンゲル組成物であって、
コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物と接触する生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量で、架橋剤が該組成物に含まれる、組成物。
【請求項１２】
コラーゲンがＩ型コラーゲンである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
生細胞をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
生細胞が、軟骨細胞、線維芽細胞、幹細胞、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
コラーゲンが、約１〜２００ｍｇ／ｍｌの濃度で組成物中に含まれる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
架橋剤が、約７．５ｍＭまでの濃度で組成物中に含まれる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
架橋剤が、リボフラビン、ローズベンガル、リボース、デコリン、カルボジイミド、アルデヒド、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１８】
架橋剤がリボフラビンである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
注入可能である、請求項１１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１３年１２月３日に出願された米国特許仮出願第６１／９１１，３２５号の優先権を主張するものであり、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、米国立衛生研究所により与えられた認可番号１Ｆ３１ＡＲＯ６４６９５−０１で、政府支援を受けてなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、線維輪を修復する方法及びコラーゲンゲル組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
腰痛は、しばしば、椎間板の膨隆または椎間板ヘルニア（「ＩＶＤ」）によってもたらされる。部分的な椎間板切除は、損傷したＩＶＤの痛みを緩和するが、結果として得られる線維輪の欠損は、しばしば治療せずに放置される。これにより、開放性欠損を経て、再発性椎間板ヘルニアの可能性が増大する。線維輪の修復方法が、損傷したＡＦ生物組織における欠損領域に対処するために発明されている。これらの治療は、脱出を防ぎ、かつあるいは変性を遅くしたり抑制したりするために、ＡＦ中の損傷を力学的に閉じることを目標とする。
【０００５】
線維輪の閉鎖治療のタイプは、成功の程度は種々だが、完全に力学的な方法から、生物組織が導く方法にまでわたって開発されている。多くの力学的方法は、すでに商業的に実施されている（すなわち、縫合、バリヤー、栓子である）。線維輪を閉鎖するための巾着縫合（「ＭＰＳＳ」）法では、残った生物組織を一緒に引っ張るために、縫合糸及びアンカーによる手順を使用する。このＭＰＳＳは、Ｘｃｌｏｓｅという製品へ発展されている。Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ社のＢａｒｒｉｃａｉｄ、及びＮｅｗ-Ｖｅｒｔ社のＯＳＡシステムなどの物理的に欠損を埋めるような、移植可能なバリヤーも存在する。研究グループは、線維輪の欠損へ挿入することが可能な、かかりのついた栓子も開発している。これらの方法は、商業的に利用されているが、多数の欠点及び制約を有している。縫合法では、アンカーの導入を介して、初期欠損の周辺に小さな穿刺が導入される。縫合という性質により、この小さい穿刺は張力下に置かれる。また、初期欠損が大きい場合は、縫合は線維輪中の裂け目を完全に閉鎖するのには十分ではないかもしれない。バリヤーで欠損を覆うためには、作製物が力学的に周囲の生物組織へ固定されることが必要で、隣接した脊椎へ通常挿入されるので骨へ損傷を与え、そしておそらく損傷した椎間板における負荷を変化させる。バリヤー及び栓子などの修復方法では、破局的な失敗の危険性が常に伴う、金属及びプラスティックを用いて作製されている。かかりのついた栓子は、ヒツジのモデルで試験をしたときには、粉々に砕けた。その結果生じた破片は、周囲の椎間板隙と同様に、残った椎間板にもさらなる損傷を与え得る。これらの力学的方法は欠損部分に喪失した生物組織をもたらすこともなければ、生物組織の増殖用の基質をもたらしたりすることもない。
【０００６】
生物組織を加工したフィブリンハイドロゲルは、線維輪の修復向けに開発されている。これらのゲルは付着することが可能であるが、生物学的治療に関するその可能性は、未知である。さらに、天然の線維輪はＩ型コラーゲンからなっており、そのためフィブリン（血液凝固及び瘢痕組織に共通して関連する因子）の導入が、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験したときに、望まない副作用を誘導した。
【０００７】
輪の欠損の修復が、変性脊髄疾患に対する治療を顕著に改善することを可能にした（Ｂｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｒｅｐａｉｒ，  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｎｕｌｕｓ  Ｆｉｂｒｏｓｕｓ:  Ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，"  Ｅｕｒ．  Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．  １８:３０１−１３  （２００９）（非特許文献１））。開放性欠損は、椎間板隙の核組織を含むため、ＡＦの能力を損ない、それによって椎間板切除後、ヘルニアの再発及び進行性変性のおそれが増大する（Ｌｅｂｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  Ｓａｍｅ-Ｓｉｔｅ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｓｃ  Ｈｅｒｎｉａｔｉｏｎ  Ａｆｔｅｒ  Ｌｕｍｂａｒ  Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ:  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  Ｓｔｕｄｙ  ｗｉｔｈ  ２-Ｙｅａｒ  Ｓｅｒｉａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ，"  Ｓｐｉｎｅ  ３６:２１４７-５１  （２０１１）（非特許文献２）;  Ａｍｂｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｌｕｍｂａｒ  Ｄｉｓｃ  Ｈｅｒｎｉａｔｉｏｎ  Ａｆｔｅｒ  Ｓｉｎｇｌｅ-Ｌｅｖｅｌ  Ｌｕｍｂａｒ  Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ:  Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｓｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，"  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ６５:５７４-８  （２００９）（非特許文献３）;  ＭｃＧｉｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ａ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｃｏｈｏｒｔ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｅ  Ｉｎｔｅｒｖａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｆｔｅｒ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｌｕｍｂａｒ  Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ:  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｓｃ  Ｈｅｒｎｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｓｃ  Ｈｅｉｇｈｔ  Ｌｏｓｓ，"  Ｓｐｉｎｅ  ３４:２０４４-５１  （２００９）（非特許文献４）;  Ｃａｒｒａｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ａ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  Ｖｅｒｓｕｓ  Ｓｕｂｔｏｔａｌ  Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ:  Ｓｈｏｒｔ-Ｔｅｒｍ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｅｒｎｉａｔｅｄ  Ｌｕｍｂａｒ  Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｄｉｓｃｓ  ａｎｄ  Ｌａｒｇｅ  Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  Ａｎｕｌａｒ  Ｄｅｆｅｃｔ，"  Ｓｐｉｎｅ  ３１:６５３-７  （２００６）（非特許文献５）;  Ｃａｒｒａｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ａｆｔｅｒ  Ｌｕｍｂａｒ  Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ  ｆｏｒ  Ｓｃｉａｔｉｃａ:  Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｔｙｐｅ  ａｎｄ  Ａｎｕｌａｒ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ，"  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．  Ａｍ．  ８５-Ａ:１０２-８  （２００３）（非特許文献６））。さらに、治療工程、または診断工程における線維輪への穿刺が、変性椎間板疾患の進行を加速したり、核組織の突出を促進したりすることが、懸念されてきた（Ｃａｒｒａｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  "２００９  ＩＳＳＬＳ  Ｐｒｉｚｅ  Ｗｉｎｎｅｒ:  Ｄｏｅｓ  Ｄｉｓｃｏｇｒａｐｈｙ  Ｃａｕｓｅ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  Ｐ���ｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｌｕｍｂａｒ  Ｄｉｓｃ:  Ａ  Ｔｅｎ-Ｙｅａｒ  Ｍａｔｃｈｅｄ  Ｃｏｈｏｒｔ  Ｓｔｕｄｙ，"  Ｓｐｉｎｅ  ３４:２３３８-４５  （２００９）（非特許文献７））。穿刺欠損の治療の成功が、それらの変性変化を抑制することを可能にした。
【０００８】
ＡＦの本来備わっている極めて限定された治癒力のために、線維輪の欠損が持続され、単純な力学的な閉鎖では顕著に改善しない（Ｂｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｒｅｐａｉｒ，  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｎｕｌｕｓ  Ｆｉｂｒｏｓｕｓ:  Ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，"  Ｅｕｒ．  Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．  １８:３０１-１３  （２００９）（非特許文献１）;  Ｍｅｌｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｎｎｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｖｉｄｅ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｒｉｍ-Ｌｅｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｄｉｓｃ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｎｅｗ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ａｎｎｕｌａｒ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，"  Ｅｕｒ．  Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．  １７:１１３１-４８  （２００８）（非特許文献８）;  Ｂｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｌｏｓｕｒｅ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｎｕｌｕｓ  Ｆｉｂｒｏｓｕｓ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  ａ  Ｇｏａｔ  Ｎｕｃｌｅｕｓ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ，"  Ｅｕｒ．  Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．  １９:１３４７-５５  （２０１０）（非特許文献９）;  Ｆａｚｚａｌａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ  Ａｎｕｌａｒ  Ｔｅａｒｓ  ｉｎ  ａｎ  Ｏｖｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌ，"  Ｓｐｉｎｅ  ２６:２５７５-８１  （２００１）（非特許文献１０）;  Ｈａｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｈｅａｌｉｎｇ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｕｌｕｓ  Ｆｉｂｒｏｓｕｓ，"  Ｓｐｉｎｅ  １４:３９８-４０１  （１９８９）（非特許文献１１））。この結果、多くの研究グループが、線維輪の修復に生物材料を用いることを研究してきた。
【０００９】
あるグループによって（Ｖａｄａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  Ａｎｎｕｌｕｓ  Ｆｉｂｒｏｓｕｓ  Ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，"  Ｅｕｒ．  Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．  ２１（ｓｕｐｐｌ  １）:Ｓ２０-６  （２０１２）（非特許文献１２））、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生物組織を加工したＡＦ作製物を用いた剛性インプラントが研究されており、別のグループによって（Ｌｅｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｓｕｂｍｕｃｏｓａ  ｆｏｒ  Ａｎｕｌａｒ  Ｄｅｆｅｃｔ  Ｃｌｏｓｕｒｅ:  Ｌｏｎｇ-Ｔｅｒｍ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ａｎ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｓｈｅｅｐ  Ｍｏｄｅｌ，"  Ｓｐｉｎｅ  ３４:１４５７-６３  （２００９）（非特許文献１３））、ｉｎ  ｖｉｖｏで小さい腸粘膜下組織を用いた、剛性インプラントの研究がされている。移植された粘膜下組織が、ヒツジの脊椎のアニュロトミー（ａｎｎｕｌｏｔｏｍｙ）後の変性変化を低減させた。Ｓｃｈｅｋらによる、"Ｇｅｎｉｐｉｎ-Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  Ｆｉｂｒｉｎ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ａｓ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｔｏ  Ａｕｇｍｅｎｔ  Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｄｉｓｃ  Ａｎｎｕｌｕｓ  Ｒｅｐａｉｒ，"  Ｅｕｒ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍａｔｅｒ．  ２１:３７３-８３  （２０１１）（非特許文献１４）は、ゲニピンが架橋したフィブリンハイドロゲルを伴う、注入可能な生体材料について研究した。フィブリンはヒトＡＦ組織の切片と融合させると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、有望な生体力学的かつ細胞播種の特性を示した。注入可能な高密度コラーゲン（"ＨＤＣ"）ゲルが試験され、ＨＤＣがｉｎ  ｖｉｔｒｏで針穿刺をしたラットの尾のＡＦに力学的機能を部分的に復活させることが可能であることが見いだされた（Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ;  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ  （２０１２）で報告された論文、Ｂｏｒｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｔａｉｌ  Ａｎｎｕｌｕｓ  Ｆｉｂｒｏｓｕｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｈｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｇｅｌｓ"（非特許文献１５））。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏで輪の欠損を治療するための、注入可能な生体材料の利用を報告した研究は存在しない。
【００１０】
針穿刺により導入された輪の欠損は、ラットの尾の脊椎中にある椎間板の変性における予測可能なパターンを導く（Ｋｅｏｒｏｃｈａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｎｅｅｄｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｃａｕｄａｌ  Ｄｉｓｃ:  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｏｇｒａｐｈ，  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，"  Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．  １０:１０１４-２３  （２０１０）（非特許文献１６）;  Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ａ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｄｉｓｃ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｎｅｅｄｌｅ  Ｐｕｎｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｔａｉｌ，"  Ｓｐｉｎｅ  ３３:１９２５-３４  （２００８）（非特許文献１７））。そうしたモデルにおいては、穿刺による欠損を介した、髄核の生物組織の突出により変性が始まる。針穿刺のモデルは、椎間板再生のための生物材料を検査するために頻繁に用いられているが（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｄｉｓｃａｌ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｄｉｓｃ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，"  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  Ｒｅｐ．  ８:１１８-２２  （２０１３）（非特許文献１８）;  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｉｎｔｒａｄｉｓｃａｌ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ  Ｒｅｔａｒｄｓ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｄｉｓｃ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｓｔａｂ  Ｉｎｊｕｒｙ，"  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  Ｔｈｅｒ．  １１:Ｒ１７２  （２００９）（非特許文献１９）;  Ｇｕｌｌｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｐｌａｔｅｌｅｔ-Ｒｉｃｈ  Ｐｌａｓｍａ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ:  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌ，"  Ｅｖｉｄ．  Ｂａｓｅｄ  Ｓｐｉｎｅ  Ｃａｒｅ  Ｊ．  ２:１３-８  （２０１１）（非特許文献２０）;  Ｓｈｅｉｋｈ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｄｉｓｃ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ-Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｈｏｎｄｒｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ，"  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  Ｓｐｉｎｅ  １０:２６５-７２  （２００９）（非特許文献２１））、椎間板の変性を防ぐために、導入された欠損の修復について検討するような、このモデルを用いた研究は、今のところ存在しない。
【００１１】
本発明は、当技術分野において、これら及びその他の欠陥を克服することを対象にする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｂｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｒｅｐａｉｒ，  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｎｕｌｕｓ  Ｆｉｂｒｏｓｕｓ:  Ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，"  Ｅｕｒ．  Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．  １８:３０１−１３  （２００９）
【非特許文献２】Ｌｅｂｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  Ｓａｍｅ-Ｓｉｔｅ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｓｃ  Ｈｅｒｎｉａｔｉｏｎ  Ａｆｔｅｒ  Ｌｕｍｂａｒ  Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ:  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  Ｓｔｕｄｙ  ｗｉｔｈ  ２-Ｙｅａｒ  Ｓｅｒｉａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ，"  Ｓｐｉｎｅ  ３６:２１４７-５１  （２０１１）
【非特許文献３】Ａｍｂｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｌｕｍｂａｒ  Ｄｉｓｃ  Ｈｅｒｎｉａｔｉｏｎ  Ａｆｔｅｒ  Ｓｉｎｇｌｅ-Ｌｅｖｅｌ  Ｌｕｍｂａｒ  Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ:  Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｓｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，"  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ６５:５７４-８  （２００９）
【非特許文献４】ＭｃＧｉｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ａ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｃｏｈｏｒｔ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｅ  Ｉｎｔｅｒｖａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｆｔｅｒ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｌｕｍｂａｒ  Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ:  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｓｃ  Ｈｅｒｎｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｓｃ  Ｈｅｉｇｈｔ  Ｌｏｓｓ，"  Ｓｐｉｎｅ  ３４:２０４４-５１  （２００９）
【非特許文献５】Ｃａｒｒａｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ａ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  Ｖｅｒｓｕｓ  Ｓｕｂｔｏｔａｌ  Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ:  Ｓｈｏｒｔ-Ｔｅｒｍ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｅｒｎｉａｔｅｄ  Ｌｕｍｂａｒ  Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｄｉｓｃｓ  ａｎｄ  Ｌａｒｇｅ  Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  Ａｎｕｌａｒ  Ｄｅｆｅｃｔ，"  Ｓｐｉｎｅ  ３１:６５３-７  （２００６）
【非特許文献６】Ｃａｒｒａｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ａｆｔｅｒ  Ｌｕｍｂａｒ  Ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ  ｆｏｒ  Ｓｃｉａｔｉｃａ:  Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｔｙｐｅ  ａｎｄ  Ａｎｕｌａｒ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ，"  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．  Ａｍ．  ８５-Ａ:１０２-８  （２００３）
【非特許文献７】Ｃａｒｒａｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  "２００９  ＩＳＳＬＳ  Ｐｒｉｚｅ  Ｗｉｎｎｅｒ:  Ｄｏｅｓ  Ｄｉｓｃｏｇｒａｐｈｙ  Ｃａｕｓｅ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｌｕｍｂａｒ  Ｄｉｓｃ:  Ａ  Ｔｅｎ-Ｙｅａｒ  Ｍａｔｃｈｅｄ  Ｃｏｈｏｒｔ  Ｓｔｕｄｙ，"  Ｓｐｉｎｅ  ３４:２３３８-４５  （２００９）
【非特許文献８】Ｍｅｌｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｎｎｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｖｉｄｅ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｒｉｍ-Ｌｅｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｄｉｓｃ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｎｅｗ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ａｎｎｕｌａｒ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，"  Ｅｕｒ．  Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．  １７:１１３１-４８  （２００８）
【非特許文献９】Ｂｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｌｏｓｕｒｅ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｎｕｌｕｓ  Ｆｉｂｒｏｓｕｓ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  ａ  Ｇｏａｔ  Ｎｕｃｌｅｕｓ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ，"  Ｅｕｒ．  Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．  １９:１３４７-５５  （２０１０）
【非特許文献１０】Ｆａｚｚａｌａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ  Ａｎｕｌａｒ  Ｔｅａｒｓ  ｉｎ  ａｎ  Ｏｖｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌ，"  Ｓｐｉｎｅ  ２６:２５７５-８１  （２００１）
【非特許文献１１】Ｈａｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｈｅａｌｉｎｇ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｕｌｕｓ  Ｆｉｂｒｏｓｕｓ，"  Ｓｐｉｎｅ  １４:３９８-４０１  （１９８９）
【非特許文献１２】Ｖａｄａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  Ａｎｎｕｌｕｓ  Ｆｉｂｒｏｓｕｓ  Ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，"  Ｅｕｒ．  Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．  ２１（ｓｕｐｐｌ  １）:Ｓ２０-６  （２０１２）
【非特許文献１３】Ｌｅｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｓｕｂｍｕｃｏｓａ  ｆｏｒ  Ａｎｕｌａｒ  Ｄｅｆｅｃｔ  Ｃｌｏｓｕｒｅ:  Ｌｏｎｇ-Ｔｅｒｍ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ａｎ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｓｈｅｅｐ  Ｍｏｄｅｌ，"  Ｓｐｉｎｅ  ３４:１４５７-６３  （２００９）
【非特許文献１４】Ｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｇｅｎｉｐｉｎ-Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  Ｆｉｂｒｉｎ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ａｓ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｔｏ  Ａｕｇｍｅｎｔ  Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｄｉｓｃ  Ａｎｎｕｌｕｓ  Ｒｅｐａｉｒ，"  Ｅｕｒ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍａｔｅｒ．  ２１:３７３-８３  （２０１１）
【非特許文献１５】Ｂｏｒｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｔａｉｌ  Ａｎｎｕｌｕｓ  Ｆｉｂｒｏｓｕｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｈｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｇｅｌｓ"
【非特許文献１６】Ｋｅｏｒｏｃｈａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｎｅｅｄｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｃａｕｄａｌ  Ｄｉｓｃ:  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｏｇｒａｐｈ，  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，"  Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．  １０:１０１４-２３  （２０１０）
【非特許文献１７】Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ａ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｄｉｓｃ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｎｅｅｄｌｅ  Ｐｕｎｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｔａｉｌ，"  Ｓｐｉｎｅ  ３３:１９２５-３４  （２００８）
【非特許文献１８】Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｄｉｓｃａｌ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｄｉｓｃ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，"  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  Ｒｅｐ．  ８:１１８-２２  （２０１３）
【非特許文献１９】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｉｎｔｒａｄｉｓｃａｌ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ  Ｒｅｔａｒｄｓ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｄｉｓｃ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｓｔａｂ  Ｉｎｊｕｒｙ，"  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  Ｔｈｅｒ．  １１:Ｒ１７２  （２００９）
【非特許文献２０】Ｇｕｌｌｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｐｌａｔｅｌｅｔ-Ｒｉｃｈ  Ｐｌａｓｍａ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ:  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌ，"  Ｅｖｉｄ．  Ｂａｓｅｄ  Ｓｐｉｎｅ  Ｃａｒｅ  Ｊ．  ２:１３-８  （２０１１）
【非特許文献２１】Ｓｈｅｉｋｈ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｄｉｓｃ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ-Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｈｏｎｄｒｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ，"  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  Ｓｐｉｎｅ  １０:２６５-７２  （２００９）
【発明の概要】
【００１３】
本発明の第１の態様は、線維輪を修復する方法に関する。この方法は、コラーゲンゲル及び架橋剤を含有するようなコラーゲンゲル組成物を提供することを含む。このコラーゲンゲル組成物は、線維輪を修復するための条件下で、線維輪の修復部位の中へ、周りへ、または近くに注入される。コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物が注入される場所付近の生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量で、この架橋剤は、コラーゲンゲルと共に含まれたり、または加えられたりする。
【００１４】
本発明の第２の態様は、コラーゲンゲル及び架橋剤を含有するようなコラーゲンゲル組成物を提供することに関する。コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物と接触する生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量で、この架橋剤は、組成物に含まれる、及び／または加えられる。
【００１５】
本発明のコラーゲンゲル組成物を注入する方法は、他の方法及び組成物がなし得なかった場所で成功することが可能である。このゲル組成物は、注入可能であり、そして送達時に粘度が低い。このため、部分的に、または完全に線維輪の欠損を密閉するために、種々の形状や大きさで送達し得る。ゲル組成物の送達は、任意の周辺の生物組織へ損傷を与えず、隣接する天然の椎間板組織と融合することを示した。さらに、この方法は生物材料のゲル組成物を注入することを含むので、周辺の椎間板隙中に破壊性破片を残すような、破局的な失敗の可能性がない。上に示したように、本来の線維輪は、概してＩ型コラーゲンからなり、それゆえに、その領域を修復するための架橋Ｉ型コラーゲンゲルの送達は、長期にわたる生物組織の増殖及び欠損の生物学的な修復のための基質を提供する。
【００１６】
以下で説明される実施例において、高密度のＩ型コラーゲンが、ラットの尾にある脊椎のＡＦにおける針穿刺欠損の導入後、５週に至るまで線維輪の欠損を修復するために示されている。この性能は、ＲＦによる架橋と明らかに相関する。針穿刺を行ったラットの尾が、線維輪の修復向けの生体材料を研究するために好適なｉｎ  ｖｉｖｏモデルであると示されてきた。以下の実施例において説明される、この実験の目的は、ラットの尾の脊椎における、針穿刺によるＡＦ欠損を修復するためのＨＤＣの能力を評価することであった。具体的にいうと、この目的は、組織学的結果及び放射性学的結果によって決められるように、注入されたＨＤＣゲルが、核組織の突出及び／または、結果として生じるＩＶＤの変性を防ぐことが可能であるかどうかを試験することであった。さらに、注入されたコラーゲンの架橋が、修復の工程に影響するかどうかが評価された。この目的のために、コラーゲン架橋の光活性開始剤であるリボフラビン（「ＲＦ」）が、異なる濃度で加えられた。ラットの尾のモデルが、コラーゲンゲルの種々の組成物をスクリーニングするために用いられた。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、Ｔ２−ＲＴによって、髄核の大きさを決定するために用いた方法の写真である。図１Ａは、針穿刺をした椎間板（白い矢印）を有する、ラットの尾のＴ２強調磁気共鳴画像を示す。図１Ｂは、カラーマップで表示した、Ｔ２−ＲＴ測定による符合する画像を示す。近接した健常な椎間板のＮＰ中に、ＲＯＩを描いた。差分閾値を、ＲＯＩのＴ２−ＲＴの平均値より低い、２標準偏差に設定した。図１Ｃの画像は、その閾値未満の全てのボクセルが削除されていることを示している。この後、椎間板隙中に残されたボクセルを算出した。ＲＯＩは、対象部位を示す。
【図２】穿刺された全ての群について、５週間後の結果の例を示す、画像の一覧である。ＮＰボクセル数及び組織学的断面の測定によると、健常な椎間板と比較した場合、０．５ｍＭのＲＦ群で表示される検体は、ＮＰの大きさにおいてほんのわずかな縮小のみを示している。０．２５ｍＭのＲＦ群のＩＶＤは、核の大きさの縮小を示している。ＮＰは依然として均質、かつ高信号で見えるが、卵形は消滅している。低減した椎間板の高さは、放射線写真でも見られるが、フィルマン・グレード（Ｐｆｉｒｒｍａｎｎ  ｇｒａｄｅ）がＩＩＩであった。非架橋コラーゲンを注入したＩＶＤは、ＮＰの大きさにおいて、より大幅な縮小を示す。このＮＰは、依然として高信号であるが、より不均質性が見られる。未処理の椎間板では、崩壊した椎間板隙と合わせて、磁気共鳴画像上で黒い椎間板として、端部の変性変化が見られる。ＮＰ組織は、結合組織と完全に入れ替わっている。終板の損傷が明らかである。ＮＰは髄核を示す。
【図３】図３Ａ〜Ｂは、核の大きさ、及び椎間板の高さの測定値を示すグラフである。図３Ａのグラフは、ＮＰボクセル数測定値による核の大きさを示す。０．５ｍＭのＲＦ群は、健常な椎間板が示すよりも、５週にわたりわずかに少数のＮＰボクセルを示した。２つの架橋群のボクセル数は、第２週と第５週の間、一定の値を保った。非架橋コラーゲンゲルを注入した動物では、５週にわたって、ＮＰボクセルの連続的な低下を示した。未処理群では、全ての時点において最小のボクセル数を示した。図３Ｂでは、椎間板の高さの測定値が、ＮＰボクセル数の結果と相関があることを示している。０．５ｍＭのＲＦ群は、その初期における椎間板の高さの８８％を保持していたが、未処置群は５５％に減少した。群内における差異が、磁気共鳴画像法の日程計画の制限から生じた。ＮＰは髄核を示し、ＤＨＩは、椎間板の高さの指数である。
【図４】図４Ａ〜Ｆは、５週間後の、穿刺されたＩＶＤの異なる組織学的結果の写真である。図４Ａは、０．２５ｍＭのＲＦ群のサフラニンＯによる染色を示す。椎間板が、標準的な大きさの卵形のＮＰを示している。針穿刺欠損及び線維性被膜が、四角形で囲まれている。図４Ｂは、偏光下でさらに拡大した図を示す。針穿刺欠損が、明確に見える（白い矢印）。ＡＦラメラの内部の３分の２は分離した状態であり、細胞組織が修復された形跡はない。欠損周辺の３分の１が、線維性被膜（「ＦＣ」）で覆われている。複屈折していないＦＣマトリックスが、鮮やかかつ複屈折のＡＦ線維組織に侵入しているようである。図４Ｃは、０．２５ｍＭのＲＦ群のアルシアンブルーによる染色を示している。薄い線維性の線（黒い矢印）は、線維輪の欠損（白い矢印）を覆っているだけである。図４Ｄは非架橋群のアルシアンブルーによる染色を示す。いずれの線維性生物組織も、欠損（白い矢印）を修復しているようには見えない。遠位輪状線維（「ＤＡＦ」）及び、近位輪状線維（「ＰＡＦ」）が、周囲の瘢痕組織（「ＳＴ」）を分離させ、かつ侵入した状態である。黒い矢印は、隔離されたＮＰ物質を示している。図４Ｅは、非架橋群のアルシアンブルーによる染色を示す。ＮＰ組織（黒い矢印）が、輪の欠損を通って脊椎傍隙へ突出している。ＡＦが複数の亀裂を示している（白い矢印）。図４Ｆは未処理の対照ＩＶＤを示す。針穿刺欠損（矢印）が、重大な変性変化を誘発した。組織化された目に見えるＡＦ組織はなく、ＮＰが結合組織と入れ替わっている。略語：Ｂは終板骨であり、ＣＴはコンピューター断層撮影である。
【図５】図５Ａ〜Ｆは、５週間後の０．５ｍＭのＲＦ群について、穿刺されたＩＶＤのサフラニンＯによる染色の写真である。図５Ａは、倍率の低い拡大図を示す。ＮＰは、標準的な大きさで卵の形を示している。明白な端部が、ＡＦ及び終板骨ＢからＮＰを分離している。四角形は、針穿刺欠損を示している。図５Ｂは、針穿刺欠損がＡＦの全ての層を貫通していることを示している、倍率の高い拡大図である。四角形で印をつけた線維性被膜が、ＡＦの周辺部分で線維輪の欠損を覆っている。この線維性組織のマトリックスが、周囲のＳＴよりもさらに強くサフラニンＯで染色されている。図５Ｃ及び５Ｄは、線維性被膜がＡＦ線維組織に侵入していると思われる、倍率の高い拡大図を示す。図５Ｅ及び５Ｆは、偏光下で見える、Ａ〜Ｃと同様の検体を示している。鮮やかな複屈折のＡＦ線維組織が、線維性被膜の複屈折していない生物組織と共に網目を作っている。略語：ＡＦは線維輪を示し、ＮＰは髄核を、ＳＴは瘢痕組織を、ＦＣは線維性被膜をそれぞれ示す。
【図６】図６Ａ〜Ｂは、コラーゲンゲルの運命を示す写真である。図６Ａは、コラーゲンゲル（「ＣＧ」）注入直後に偏光させた、サフラニンＯによる染色を示す。高密度コラーゲン（ＨＤＣ）が、脊椎傍隙に分散し、ＡＦ欠損を覆っている。ＡＦと対照的に、ＨＤＣは偏光下で非複屈折であり、より小さい組織が構成されていることを示している。図６Ｂは、倍率の高い拡大図を示す。穿刺欠損が明確に見える（矢印）。ＣＧは、サフラニンＯでわずかに陽性染色された、非結晶の均質組織のように見える。これはＡＦの欠損部へ移動していない。略語：ＮＰは髄核を示し、ＡＦは線維輪を示し、ＣＧはコラーゲンゲルを示す。
【図７】コラーゲン注入５週後、脊椎傍隙において、アルシアンブルー染色を用いた、コラーゲンの運命を示す写真である。非結晶の均質コラーゲンである３つの分離した組織塊が、瘢痕組織に包囲されている。分離した組織塊Ａには細胞侵入は見られず、分離した組織塊Ｂでは、極めて限定された侵入が見られる。分離した組織塊Ｃは、線維芽細胞の高程度の侵入を示す。コラーゲン組織内の吸収帯（黒い矢印）で示されているように、この細胞は、生物組織を再構成しているように見える。炎症性反応の形跡はない。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、線維輪を修復する方法に関する。この方法は、コラーゲンゲル及び架橋剤を含有するようなコラーゲンゲル組成物を提供することを含む。このコラーゲンゲル組成物は、線維輪を修復するための条件下で、線維輪の修復部位の中へ、周りへ、または近くに注入される。コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物が注入される場所付近の生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量で、この架橋剤は、コラーゲンゲルと共に含まれるか、または加えられる。
【００１９】
本発明は、コラーゲンゲル及び架橋剤を含有するようなコラーゲンゲル組成物にも関する。コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物と接触する生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量の組成物に、この架橋剤は、含まれる、及び／または加えられる。
【００２０】
椎間板は、脊髄の椎骨を１つずつ分け、衝撃を和らげたり、脊柱に伝わった応力及びひずみを吸収したりすることで、天然の緩衝材の役割を努めている。椎間板組織は、主に３つの部位である、終板、線維輪（「ＡＦ」）、及び髄核（「ＮＰ」）からなる。線維輪は、低密度である線維軟骨、及び移行領域を包囲しているＩ型コラーゲン線維の外輪を有する、強靱なコラーゲン線維の複合体である。それらのコラーゲン線維は、円筒の層を形成している。各層において、線維は互いに平行であるが、層と層の間にある線維の配向は、３０度〜６０度の間で変化する。この組織は、脊椎における、ねじれ、曲げ、及び圧縮応力がかかっている際に支援をする。終板は、椎間板における上部及び下部の表面に見られ、線維輪と協働して、椎間板の中の髄核のゲル状マトリックスを含んでいる。髄核は、プロテオグリカンと、水中で無作為に配向したＩＩ型コラーゲン線維の柔和なマトリックスでできている。プロテオグリカン及び水の含量は、椎間板の中央で最も多く、椎間板の外縁に向かって減少する。
【００２１】
本発明の方法は、例えばＩＶＤの線維輪構造を修復するために実行される。本明細書で使用される、「修復する」という用語は、機能及び／または構造を、復元したり、保持したり、及び／または、増大させたりするような、任意の補正、補強、再生、改善、補給、健全、回復、修繕、補修などを示す。従って、「修復する」という用語は、修正すること、補強すること、再調整すること、改善すること、補給すること、健全にすること、補充すること、修繕すること、補修すること、保持すること（すなわち、さらなる損傷、または分解などからである）、ないしは別の方法で、機能及び／または構造を復元することも意味し得る。「修復する」は、椎間板線維輪の欠損の完全な修復及び、部分的な修復を含む。さらに、「修復する」という用語は、椎間板線維輪の欠損に関連する、または椎間板線維輪の欠損によって起こる、少なくとも１つの症状の、治療、予防、または回復も含む。「治療」、「予防」、または「回復」は、発症を遅らせたりまたは予防したり、椎間板線維輪の欠損または損傷に関連する症状の、進行、悪化、または変質、または進行または重症度を逆転させたり、軽減したり、改良したり、抑制したり、進行する速度を落としたり、または止めたりすることを意味する。
【００２２】
一実施形態において本発明の方法は、椎間板のＡＦを「修復」するために、及びその後の、線維輪を修復する治療のために実行され、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、またはそれ以上の椎間板の高さが、数日間、数週間、数カ月、または数年間の後にも維持される。
【００２３】
本発明の方法を実行するにあたり、コラーゲンゲル組成物（以下に述べる）は、線維輪を有効に修復するための条件下で、線維輪の修復部位の中へ、周りへ、または近くに注入される。組成物の注入は、例えば、病気に冒されている椎間板の線維輪へ挿入されたガイド針を用いて（しかし、ガイド針が必要ということではない）、実施され得る。その後、注入針がガイド針を介して挿入され得る。注入針で線維輪を貫通することが必要な場合もあり、必要でない場合もある。ガイド針の先端の位置、または注入針の先端の位置は、例えば蛍光透視法、磁気共鳴画像法、コンピューター断層切断法、または当技術分野において既知で任意である他の同様の技術などの画像診断を用いて、確認することが可能である。
【００２４】
一実施形態では、注入は周辺の生物組織に損傷を与えない。
【００２５】
別の実施形態において、注入は、線維輪の天然の組織と融合した、注入されたゲル組成物をもたらす。
【００２６】
本発明の方法は、ヒトを含む任意の哺乳動物で実行されてもよい。
【００２７】
本発明のコラーゲンゲル組成物は、脊椎硬膜の閉鎖と同様に、硬膜半月板、関節唇、及び靱帯／腱用の挿入物などの、線維軟骨用構造物における欠損を修復するためにも用いられ得る。
【００２８】
示してきたように、本発明の方法は、コラーゲンゲル組成物を提供すること、及び注入することを含む。こうした組成物を、これから記載する。複数のコラーゲンの型が存在する。主に、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型コラーゲンが、生体材料の原料として用いられている。Ｉ型コラーゲンはほとんど結合組織内で見ることができ、生体内に最も多量に存在するコラーゲンの型である。そして、腱、真皮及び骨に存在する。工業的には、コラーゲンは、生物のそれらの部位から抽出される場合が多い。ＩＩ型は軟骨を形成するコラーゲンである。ＩＩＩ型コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンと同様の生物組織中に少量見られる。ＩＶ型コラーゲンは基底膜を形成する。Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型は、生体内にコラーゲン線維として存在し、生物組織または器官の強度を維持する主な機能を有している。ＩＶ型は線維形成能力を有していないが、４つの分子で構成される網目状の集合体を形成し、基底膜における細胞分化に関与し得る。本明細書で使用する場合、「コラーゲン」という用語は、当技術分野で既知である、または発見されるような、１種または複数種の任意のコラーゲン型を示す。
【００２９】
一実施形態では、コラーゲンゲル組成物中のコラーゲンは、Ｉ型コラーゲンである。これは、天然のＡＦと同様のコラーゲン型である。Ｉ型コラーゲンが、Ｉ型コラーゲンをすでに含んでいる生物組織へ送達されるとき、ゲル組成物に対する免疫応答（注入に続く）、及び周辺の生物組織への何らかの否定的な作用の可能性が取り除かれる。
【００３０】
このコラーゲンは、可溶性であっても、または不溶性であってもよく、任意の動物における、任意の生物組織に由来し得る。例えば、コラーゲンゲルは、ラットの尾腱、子牛の皮膚コラーゲン、及び／または子牛の伸筋腱を含む、皮膚及び腱由来のコラーゲンを用いて作製され得る。
【００３１】
一実施形態では、コラーゲンゲルは、約１〜２００ｍｇ／ｍｌ、約１０〜１８０ｍｇ／ｍｌ、約２０〜１６０ｍｇ／ｍｌ、約３０〜１４０ｍｇ／ｍｌ、約４０〜１２０ｍｇ／ｍｌ、約５０〜１００ｍｇ／ｍｌ、約６０〜８０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌより高い、約１００ｍｇ／ｍｌより高い、約１５０ｍｇ／ｍｌより高い、約２００ｍｇ／ｍｌより低い、約１５０ｍｇ／ｍｌより低い、約１００ｍｇ／ｍｌより低い、または約５０ｍｇ／ｍｌより低い濃度で、本発明の組成物中に含まれる。
【００３２】
本発明の組成物には架橋剤が含まれ、この架橋剤は、コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために十分な量で含有される。この架橋剤は、周辺のコラーゲン線維といくらかの架橋を引き起こす場合もある。例えば、これは、欠損部を包囲する生物組織と、注入されたゲルの良好な接着があるということを意味している。言い換えれば、本発明の組成物は、注入時に周囲の細胞組織へ安定して融合する。一実施形態によると、これは、本発明の組成物が線維輪の修復部位への注入で、修復部位でその位置に留まることが可能であることを意味する。これは、周辺の生物組織と融合するためである。
【００３３】
一実施形態では、コラーゲン系物質の架橋剤は、超急性拒絶反応を防ぐために、物質の抗原性を抑制するよう用いられる。
【００３４】
架橋は、力学的特性を改善するため、及び分解に対する抵抗性を向上させるためにも用いられる。
【００３５】
種々の架橋に関する方法論が、本発明におけるコラーゲンゲル組成物を架橋するために用いられ得る。この架橋は、ＵＶ処理または可視光処理を用いた、光誘起性のものであってもよい。露光における種々の態様では、光の露出時間（０〜６００秒、またはそれ以上の秒数）、及び光の照度（２，０００ｍｗ／ｃｍ２まで）などを変えることができる。ＵＶ照射（例えば、２００〜３００ｎｍで）は、コラーゲン原線維の力学的強度を増大する、迅速かつ容易に制御される手法であり、後に生体材料を洗って除去することが必要な任意の有毒な副生成物を生成しない。コラーゲンゲルは、ＵＶ及び／または可視光による架橋処理を最適化し得るような、多糖、またはＧＡＧなどの構成成分を含有するヒドロキシ基を含む場合がある。コラーゲンは、メチレンブルー及びローズベンガルによる染色などの光増感剤の染色剤存在下で、可視光を用いて架橋され得る。
【００３６】
架橋は、電子線及び／またはガンマ線を用いた放射線処理によっても実行される場合がある。放射線誘発架橋は、細胞毒性架橋剤の使用を必要とせず、そしてその後の処理工程を必要としない。放射線誘発架橋剤の別の利点は、ガンマ線が可視光またはＵＶの光誘発架橋のような、別の手順を用いては達成し得ないような深さへ生体材料を貫通することができる点である。
【００３７】
１種または複数種の架橋剤を、本発明におけるコラーゲンゲル組成物を架橋するために用いることができる。架橋剤は、タンパク質の特定の官能基（第１級アミン、スルフヒドリル、など）に化学的に結合することが可能な、２つ以上の反応性末端を含む分子である。好ましくは、この架橋剤は不揮発性の副生物を生成するべきではない。架橋剤は、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、またはヘキサメチルジイソシアネートを含み得るが、限定されない。この架橋剤は、カルボジイミド、ポリアルデヒド、ポリスルホン、活性化ＰＥＧ、エポキシド、イミダゾールまたはジイソシアネートであってもよい。架橋はグルタルアルデヒド、またはホルムアルデヒド（リジン残基を架橋することができる）などのアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（アミノ基及びカルボキシル基を架橋することができる）、またはグリセロールポリ（グリシジルエーテル）、及びポリ（エチレングリコールジグリシジルエーテル）などのポリエポキシ化合物との処理を含み得る。この架橋剤は、アミノ基を架橋することができる、ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＭＤＩ）であってもよい。
【００３８】
一実施形態において、架橋剤は、リボフラビン、ローズベンガル、リボース、デコリン、カルボジイミド、アルデヒド、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。特定の一実施形態によると、架橋剤は、リボフラビンである。ゲルに混合する架橋剤（例えば、リボフラビン）は、コラーゲンゲル中だけでなく、周囲の天然コラーゲン線維との架橋も促進する助けをする。本発明のコラーゲンゲル組成物は欠損部位で重合して、組成物中のコラーゲンと周囲の天然コラーゲンとの自然な相互作用を利用することを可能にし、欠損部位での結合及び力学的治癒を促進する。欠損部位での重合反応によって、異なる欠損の形状及び大きさへゲルが広がったり、適合したりすることも可能になる。
【００３９】
架橋剤は、約１．５ｍＭ、約２．０ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３．０ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４．０ｍＭ、約４．５ｍＭ、約５．０ｍＭ、約５．５ｍＭ、約６．０ｍＭ、約６．５ｍＭ、約７．０ｍＭ、もしくは約７．５ｍＭまでの濃度、または約７．５ｍＭより高い濃度で、組成物に含まれ得る。
【００４０】
本発明のコラーゲンゲル組成物は、高度に力学的、化学的、及び生物学的に調節可能である。コラーゲンは、コラーゲンの密度、及び架橋剤の濃度を変えることが可能な方法で調整され、それらの両方が力学的特性に影響を与える。混合する工程の間、前、及び／または後に、細胞を加えることもでき、組成物の多用途性が増大する。治療薬を含む、種々の成長因子及び剤を、細胞及びその周囲の生物組織から特定の応答を誘発するために、組成物に加えることができる。
【００４１】
本発明のコラーゲンゲル組成物は、さらに生細胞も含み得る。この細胞は、幹細胞、始原細胞、分化した細胞、最終分化した細胞、またはそれらの混合物であり得る。この細胞は、分化全能性、多能性、もしくは単能性の幹細胞、または、人工多能性幹細胞であり得る。この細胞は、例えば、樹立されている細胞株を介したような、ヒトの胚細胞の破壊を必要としない技術によって誘導された、ヒト胚性幹細胞であってもよい。間葉系幹細胞（骨髄間質細胞、多機能性間質細胞、またはＭＳＣともいう）は、骨芽細胞、腱細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞を含む種々の細胞型に分化することができる、多能性幹細胞である。これらの細胞型は、骨、腱、靱帯、軟骨、筋肉、及び脂肪を作製する能力を有している。この細胞は、ＭＳＣまたはＭＳＣ系列中の任意の細胞であってもよい。始原細胞は、成熟細胞へ末端で分化する前に、複数回の細胞分裂を経ることができ、そして、その細胞は、それらの中間の細胞であってもよい。この細胞は、ＭＳＣ（骨髄間質細胞、間葉系幹細胞、多機能性間質細胞）、軟骨細胞、線維軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、滑膜細胞、脂肪細胞、骨髄細胞、間葉細胞、間質細胞、遺伝的に形質転換された細胞、またはそれらの混合物から選択され得る。この細胞は、自己の、または異種性のものであってよい。
【００４２】
この細胞は、以下の、胚性幹細胞、脂肪組織及び／または骨髄由来の前駆細胞、末梢血始原細胞、成体組織及び／または若年性組織から単離された幹細胞及び／または非幹細胞、遺伝的に形質転換した細胞、軟骨細胞及び他の細胞の組み合わせ、骨細胞と他の細胞の組み合わせ、滑膜細胞及び他の細胞の組み合わせ、骨髄細胞と他の細胞の組み合わせ、間葉細胞と他の細胞の組み合わせ、間質細胞と他の細胞の組み合わせ、幹細胞及び他の細胞の組み合わせ、胚性幹細胞及び他の細胞の組み合わせ、成体組織及び他の細胞から単離された前駆細胞の組み合わせ、末梢血始原細胞と他の細胞の組み合わせ、成体組織及び他の細胞から単離された幹細胞の組み合わせ、及び遺伝的に形質転換した細胞と他の細胞の組み合わせの、１種または複数種を含み得る。
【００４３】
ヒト細胞は本発明の組成物及び方法での利用において好ましいが、この細胞は、ヒト原料由来の細胞に限定されない。ウマ、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ヤギ、及びヒツジの原料を含むがそれらに限定されない、他の哺乳類由来の細胞が用いられ得る。げっ歯動物原料由来の細胞である、ラットの細胞も含み得る。細胞のドナーは、発育及び年齢の点で変動してもよい。細胞は、胚、新生児、または成体を含む高齢個体の移植用提供組織由来であってもよい。
【００４４】
一実施形態では、生細胞が、軟骨細胞、線維芽細胞、幹細胞、及びそれらの組み合わせから選択される。
【００４５】
一実施形態によると、本発明のコラーゲンゲル組成物に含まれる細胞は、例えば、特定のタンパク質を発現させるために操作されてもよい。例えば、特定のタンパク質をコードする核酸分子は、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて宿主細胞に取り込まれ得る。一般に、これは、ＤＮＡ分子をそのＤＮＡ分子が異種性である（すなわち、通常存在しない）発現系へ挿入することを含む。異種性ＤＮＡ分子は、センス配向及び正確な読み枠で発現系またはベクターへ挿入される。ベクターは、挿入されたタンパク質コード配列の転写、及び翻訳のために必要な要素（プロモーター、サプレッサー、オペレーター、転写終結配列など）を含む。組換え遺伝子またはＤＮＡコンストラクトを、発現ベクターへの挿入の前に調製することができる。例えば、従来の組換えＤＮＡ技術を用いた、プロモーターが有効なＤＮＡ分子を、タンパク質をコードするＤＮＡ分子の５'側に機能的に結合することができ、転写終結部（すなわち、ポリアデニル化配列）をそれらの３'側に機能的に結合することができる。
【００４６】
所望のタンパク質をコードしたポリヌクレオチドは、その分子が異種性であるような発現系またはベクターへ挿入され得る。異種性である核酸分子は、プロモーター及び他の任意の５'調節分子に対して本来のセンス（５'→３'）の配向及び正確な読み枠で、発現系またはベクターへ挿入される。核酸コンストラクトの調製は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  &  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ:  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）に記載されている通り、当技術分野でよく知られている標準的なクローニング方法を用いて実施することができ、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。コーヘン及びボイヤーによる米国特許第４，２３７，２２４号においても、制限酵素での切断及びＤＮＡリガーゼによるライゲーションを用いた、組換えプラスミドの形態の発現系の生成が記載されており、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
【００４７】
好適な発現ベクターは、宿主細胞に適合可能な種由来である、レプリコン及び制御配列を含有するベクターを含む。例えば、大腸菌が宿主細胞として用いられる場合は、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、またはｐＢＲ３２２などのプラスミドが用いられ得る。昆虫の宿主細胞を用いる場合に、昆虫の宿主細胞に適合可能である適切なトランスファーベクターは、所望のタンパク質に結合した分泌シグナルが取り込まれている、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＡｃＧＰ６７、及びｐＡｃＳｅｃＧ２Ｔ、ならびに、ＧＳＴ及び６ｘＨｉｓタグ（ＢＤ  バイオサイエンス、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）を含有する、ｐＡｃＧＨＬＴ及びｐＡｃＨＬＴを含む。好適なウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ノダウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターを含む。他の好適な発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ:  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）に記載されており、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。核酸操作に関する多くの技術及びプロトコルが知られており、例えば核酸コンストラクトの調製においては、突然変異生成、シークエンシング、細胞へのＤＮＡの導入、及び遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析について、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｆｒｅｄ  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  ２００３）の中で詳細に記載されており、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
【００４８】
異なる遺伝子シグナル及びプロセシング事象は多くのレベルの遺伝子発現（例えば、ＤＮＡ転写、及びメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）翻訳）を制御し、そしてその後、所望のタンパク質量が生成されて、宿主細胞によって発現される。ＤＮＡの転写はプロモーターの存在に依存し、このプロモーターはＲＮＡポリメラーゼの結合を導くＤＮＡ配列であって、それによってｍＲＮＡの合成を促進する。プロモーターは、その"強さ"（すなわち、転写を促進する能力）の点で変動する。クローニングした遺伝子を発現させることを目的として、高レベルの転写、従って発現を得るための強いプロモーターを用いることが望ましい。利用した宿主系に依って、多数の好適なプロモーターのうちいずれか１つを用いてよい。哺乳類の細胞において、発現を指示するために好適な一般的なプロモーターは、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、メタロチオネイン−１、アデノウイルスＥｌａ、ＣＭＶ、即時性免疫グロブリン重鎖プロモーター及びエンハンサー、ならびにＲＳＶ−ＬＴＲを含むが、限定されない。プロモーターは、常時発現性のもの、または代わりに、生物組織特異的なものまたは誘導可能なものであり得る。
【００４９】
本発明の組成物は、一実施形態によると注入可能である。本発明のコラーゲンゲル組成物が注入可能であるため、この組成物を最小限の侵襲的外科的手法及び標準的な医療機器で、異なる欠損部位へ送達することができる。他のＡＦ修復組成物及び技術は、周囲の生物組織への固着を可能にするためにより大きな手術部位を必要とする。また本発明の組成物とは異なり、他に存在するＡＦ修復技術は、異なる欠損の形状及び大きさに適合することができず、外科医に、均一の欠損を作るために天然の生物組織をさらに除去させる。
【００５０】
本発明のコラーゲンゲル組成物の一実施形態において、コラーゲンゲル組成物は送達時に低粘度を有し、欠損の大きさ及び形の影響を受けずに任意の欠損部において重合する。さらに、ｉｎ  ｓｉｔｕで架橋するための、例えばリボフラビンの利用は、ゲル／ＡＦの境界面を感染の危険にさらすことなく、より力学的に安定なゲルを形成することのできる、新規かつ独特のものである。
【実施例】
【００５１】
以下の例は、本発明の実施を例証することを意図したものであるが、それらの範囲を限定することを決して意図しない。
【００５２】
材料と方法
研究群
４２体のオス、１０〜１２週齢、純系、ヌード、無胸腺のラットを、本研究に用いた。動物を４つのグループに分けた。第１のグループの１４体には針穿刺をして、１５ｍｇ／ｍｌの濃度のＨＤＣを注入した。第２のグループの１５体には穿刺をして、ＲＦ架橋をしたＨＤＣ（１５ｍｇ／ｍｌ）を注入した。そのうち、９体には０．２５ｍＭのＲＦを、そして６体には０．５ｍＭのＲＦを注入した。第３のグループの６体には、穿刺をし、対照標準として未処理で放置した。これらの３つのグループの全ての動物を、５週間後に屠殺した。尾部を回収して組織学的分析に用いた。第４のグループの６体の動物は屠殺し、尾部を回収し、その後針穿刺をして、ＨＤＣを注入した。このグループは、注入直後のコラーゲンについて、形態及び分布を調査するために用いた。
【００５３】
動物は全て、米国獣医学会の標準プロトコルに基づき、二酸化炭素で屠殺した。
【００５４】
本研究は、特別手術施設病院動物管理使用委員会（Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）及びニューヨーク州によって概説されるガイドラインにより承認され、着手された。
【００５５】
コラーゲンゲルの調製
コラーゲンは、前述の通り（Ｃｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｄｅｎｓｅ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  Ｔｈａｔ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，"  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３１:８５９６-６０７  （２０１０）;  Ｂｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｓｅｌｆ-Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ａｌｉｇｎｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ-Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ａｎｎｕｌｕｓ  Ｆｉｂｒｏｓｕｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｄｉｓｃ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｖｉａ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ，"  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ  １６:１３３９-４８  （２０１０）、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）、ラットの尾腱から採取され、再構成された。線維は、０．１％酢酸で温浸し、４８時間凍結させ、凍結乾燥させて、２０ｍｇ／ｍＬの０．１％酢酸で再構成した。送達直前に酸性コラーゲン溶液を、１０×ダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（「ＤＰＢＳ」）、１Ｎ  ＮａＯＨ、及び１×ＤＰＢＳを含む使用液と混合し、１５ｍｇ／ｍＬで最終のコラーゲンゲルの重合反応を開始した。ＲＦ群に関しては、ＲＦは所望の濃度で１×ＤＰＢＳに加えた。ＲＦを加えたゲルには、架橋を開始する注入後に、４０秒間、４８０ｎｍの波長の青色光を露光した。
【００５６】
開放性針穿刺及びコラーゲン注入
尾部の第３脊椎と第４脊椎の間の標的レベルは、Ｘ線写真の対照下で特定した。動物に麻酔をかけて、うつぶせにして置いた。２ｃｍの縦の皮膚切開を、印のついたレベルまで行った。次いで、ＡＦに露光し、これを損傷しないようにするために細心の注意を払った。その後、コラーゲンゲルが入ったシリンジに装着した１８ゲージの針を用いてＡＦを穿刺した。穿刺直後に、欠損部の周りに約０．５ｍｌのゲルを注入した。ＲＦをコラーゲンに加えると、ゲルは、ｉｎ  ｓｉｔｕで硬化した。対照群は穿刺し、未処理で放置した。穿刺技術を標準化するために、針を常に、同じ方向（針のベベルが上向きの状態）、及び同じ深度（ベベルが、完全にＡＦを貫通するまで）で挿入した。
【００５７】
定量的磁気共鳴画像法
定量的画像法は、それを構成する磁気共鳴画像法（「ＭＲＩ」）のボクセルの数によって、ＮＰの大きさを評価するために用いた。このボクセルの数を、ここではＮＰボクセル値と呼ぶ。磁気共鳴画像は、穿刺１週、２週、及び５週後の時点で、７Ｔ  ＭＲＩ（Ｂｒｕｋｅｒ社  ７Ｔ  ＵＳＲ前臨床ＭＲＩシステム）で得た（図１Ａ）。
【００５８】
矢状断面マルチスライスマルチエコー・パルスシーケンス（ＴＲ＝２０００ｍｓ、ＴＥ＝１２ｍｓ、ＮＥＸ＝２、エコー数＝１２、エコースペーシング＝１２ｍｓ、スライス厚＝１ｍｍ、及びマトリックスサイズ＝３２０×３２０、分解能：１２５μｍ×１２５μｍ×１ｍｍ）を、１２の取得されたエコーに対して、Ｔ２信号強度対緩和時間の適合する片対数プロットに基づきＴ２マップを作成するために用いた。Ｂｒｕｋｅｒ社（Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ビレリカ、マサチューセッツ州）の所有するプログラムであるＴｏｐＳｐｉｎを、適合工程に用いた。得られたＴ２マップにカラーマップを割り当てた（図１Ｂ）。次に、約１ｍｍ２の大きさである、対象となる標準部位（「ＲＯＩ」）を、穿刺されるＩＶＤに近くて健常な椎間板のＮＰの中心に描いた。ＲＯＩが測定された、標準的なＴ２緩和時間（Ｔ２−ＲＴ）、そして、この値−２標準偏差を、スライス時の全てのボクセルにおける差分閾値を設定するために用いた。（図１Ｂ）。続いて、閾値より低いＴ２値をもつボクセルを減算した（図１Ｃ）。その結果、ＮＰ組織を示す、Ｔ２値をもつボクセルのみが椎間板隙に残り、その後ボクセルを算出した。各時点において、穿刺された椎間板の平均ボクセル値を、近接した健常なＩＶＤの平均ボクセル値と比較した。
【００５９】
定性的ＭＲＩ分析
矢状断面ＴｕｒｂｏＲａｒｅシーケンス（ＴＲ＝２０１７ｍｓ、ＴＥ＝６０ｍｓ、ＮＥＸ＝６、エコートレインレングス＝１２、スライス厚＝１ｍｍ、及びマトリックスサイズ＝３２０×３２０、及び分解能：１２５μｍ×１２５μｍ×１ｍｍ）を、定性的評価のために用いた。改変したフィルマン・スケール（Ｐｆｉｒｒｍａｎｎ  ｓｃａｌｅ）（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  "ＭＲＩ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｌｕｍｂａｒ  Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｄｉｓｃ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｌｕｍｂａｒ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｆｉｒｒｍａｎｎ  Ｇｒａｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，"  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７:ｅ４８０７４  （２０１２）、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）を、ＮＰ信号強度、均一性、椎間板の高さの減少によって明らかにされる、変性の４つの段階をはっきりさせるために用いた（表１）。
【００６０】
（表１）改変した磁気共鳴画像法フィルマンによる類別
2020114403.tif 000003
ＮＰは、髄核を示す
【００６１】
椎間板の高さの測定
椎間板の高さを、デジタル放射線写真のキャビネ版で得た。指標部分の正確な側面の放射線写真を得るために、細心の注意を払った。ＩＶＤの高さは椎間板の高さの指数として表され、Ｌｕらによる、"Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎａｓｅ  ＡＢＣ  ａｎｄ  Ｃｈｙｍｏｐａｐａｉｎ  ｏｎ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｍｏｔｉｏｎ  Ｓｅｇｍｅｎｔ  Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓの改変した方法に基づき、隣接する椎体の高さで椎間板の高さを割ることで計算される。Ａｎ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ，  Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃ，  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｓｔｕｄｙ，"  Ｓｐｉｎｅ  ２２:１８２８-３４  （１９９７）は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。椎間板の高さは、１週、２週、５週時点において、術前かつ術後に測定した。
【００６２】
組織学
適切な固定の後に尾部を脱灰し、正中矢状面で切断し、７５％のエタノールに移した。切片をパラフィンに包埋し、次いで５μｍの厚さに切断し、アルシアンブルー及びサフラニンＯで染色した。ＮＰの大きさは、あるＲＯＩを核の周囲に描くことで測定し、その後、そのＲＯＩの断面部分をＢｉｏｑｕａｎｔの画像システムを用いて測定した（図２）。穿刺した椎間板において、断面部分の平均測定値を近接した健常なＩＶＤの値と比較した。Ｈａｎの分類システムを、穿刺したＩＶＤの変性段階について記載するために用いた。このシステムは、ＡＦ／ＮＰの細胞充実性、形態、及び境界に基づくものである（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ａ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｄｉｓｃ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｎｅｅｄｌｅ  Ｐｕｎｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｔａｉｌ，"  Ｓｐｉｎｅ  ３３:１９２５-３４  （２００８）、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）。この分類システムは、５（健常な椎間板）から１５（末期まで変性した椎間板）にまで及ぶ。
【００６３】
統計データ
ＮＰボクセル数及び椎間板の高さのデータは、穿刺した健常な隣接したレベル、未処理の穿刺対コラーゲン注入、及びＲＦ濃度でネストし、分散モデリングのネストされたマルチレベル分析を用いて評価した。分析は、ＪＭＰ  ９．０（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，ＳＡＳキャンパスドライブケーリー、ノースカロライナ州）で行った。ｐ≦０．０５の場合、変数と測定結果の間の統計的に有意な相関関係を示した。
【００６４】
実施例１−定性的なＭＲＩ
０．５ｍＭのＲＦ群について、６体中５体の動物では、５週のＭＲ画像において変性が変化しているような明白な形跡は見られなかった（図２）。この群の改変したフィルマングレードは、ＩからＩＩＩに及んだ（平均：１．３）。同じ時点において、０．２５ｍＭのＲＦ群の動物は全て、ＮＰの大きさの減少を示し、核酸はまだ均質かつ高信号の状態であった（図２）。フィルマングレードは、ＩＩからＩＩＩに及んだ（平均：２．６）。非架橋コラーゲン群では、より不均質性で、顕著に増大したＡＦ／ＮＰ比を有する、より小さいＮＰを示した（図２）。ＡＦは核の方へ膨れ出ており、砂時計のような形を示した。動物は、全てフィルマングレードＩＩＩを有した。未処理群について、６体の検体中５体は黒いＩＶＤを示し、末期である椎間板の変性を示していた（図２）。フィルマングレードは、ＩＩＩからＩＶに及んだ（平均：３．８）。
【００６５】
実施例２−ＮＰボクセル数
対照のＩＶＤでは、１週、２週、及び５週で１４０から１５３ボクセルに及ぶ平均的なＮＰボクセル数を有していた。そして、０．５ｍＭのＲＦ群のボクセル数は、１２９（ＳＤ＋／−１６．３）〜１４０（ＳＤ＋／−２２．５）の間であった。０．２５ｍＭのＲＦ群は、低い値：１週で７１ボクセル（ＳＤ＋／−５９．１４）、そして第２週及び第５週で５７ボクセル（ＳＤ＋／−５６．４０）を示した。２つのＲＦ群のＮＰボクセル数は、２週〜５週の間、一定であった。
【００６６】
非架橋コラーゲン群では、１週で４６（ＳＤ＋／−２５）ボクセルを示し、この値は５週で１４（ＳＤ＋／−１５．６）へ連続的に低下した。未処理群では、各時点において、最も低いボクセル数の値を示し、５週間後には、５（ＳＤ＋／−４．１７）へ減少している（図３Ａ）。全体として、ＨＤＣゲル注入は、未処理の椎間板と比較して、ボクセル数の値（Ｐ＜０．０００１）が顕著に増大した。増大したＲＦ濃度（０ｍＭ、０．２５ｍＭ、及び０．５ｍＭ）が、ＮＰボクセル数の値が顕著に増大していることを示している（Ｐ＜０．０００１）。
【００６７】
実施例３−椎間板の高さの測定
針穿刺した全てのＩＶＤは、針穿刺後に椎間板の高さが急降下したが、２週〜５週の間では一定の状態であった（図３Ｂ）。０．５ｍＭのＲＦ群では、初期の椎間板の高さの平均８４％（ＳＤ＋／−８．７７）を維持し、０．２５ｍＭのＲＦ群では、平均７７％（ＳＤ＋／−８．７２）を維持していた。
【００６８】
非架橋コラーゲン群では、６７％（ＳＤ＋／−１６．８６）を維持し、未処理群では椎間板の高さの５３％（ＳＤ＋／−１３．８２）を維持していた。全体として、ＨＤＣ処理ゲルは、椎間板の高さ指数を顕著に改善した（Ｐ＝０．０２６４）。
【００６９】
実施例４−輪の欠損
針穿刺による欠損は、ＡＦラメラ層を全て貫通しており（図４Ａ、４Ｂ、及び５Ａ−５Ｃ）、そして動物全てで、５週間後であっても見られた。対照及び非架橋群では、ＡＦ線維が周辺の瘢痕組織を分離させ、かつ侵入した状態であった。（図４Ｄ）。線維輪の修復の進行を示す、細胞充実性または血管分布が増大した肉芽組織は見られなかった。０．５ｍＭのＲＦ群は、両末端をつなぐ輪状線維が崩壊している、外側の第３のＡＦで線維性被膜の形成を示した（図５Ａ−５Ｆ）。この線維性被膜は、周囲のＡＦ及び瘢痕組織よりも、サフラニンＯ及びアルシアンブルーでより強く染色されている密なコラーゲンマトリックスで包埋された線維芽細胞で構成されていた。０．２５ｍＭのＲＦ群では、同様の被膜（図４Ａ及び４Ｂ）か、ＡＦの外側の部分を修復している厚い線維性の線か、のいずれかの形成を示した（図４Ｃ）。２つの架橋された群において、ＡＦの内側の３分の２では、生物組織の修復の形跡は見られなかった。
【００７０】
実施例５−椎間板の変性
０．５ｍＭのＲＦ群では、変性の明白な形跡は見られなかった。ＩＶＤは、平均してＨａｎ変性グレード６．８を示した。０．２５ｍＭのＲＦ群におけるＩＶＤは、クラスター形成を伴うＮＰ細胞で減少を示し、平均してＨａｎグレード９．３に到達した。
【００７１】
非架橋コラーゲン群の全てのＩＶＤでは、椎間板隙で見られた残存したＮＰ組織でのみ、変性変化が進行している形成が見られた（図２）。穿刺欠損は、ＡＦへ分岐し、複数の亀裂が形成された。ＮＰ組織は、開放性欠損を通過して、ヘルニアを起こしていた（図４Ｅ）。椎間板は、Ｈａｎグレード１２．８を示した。
【００７２】
未処理群の全ての動物では、重大な変性の形跡が見られ、つまりＮＰが結合組織と完全に入れ替わっていた。ＡＦは破裂し、かつ組織が崩壊しているように見えた（図４Ｆ）。複数の検体では、顕著な終板の損傷が見られた（図２）。平均してＨａｎグレードは、１４．３であった。
【００７３】
実施例６−組織学的断面の領域
５週後、穿刺したＩＶＤに近位の健常なＮＰでは、平均して１．５９ｍｍ２のＮＰの断面部分を有していた。０．５ｍＭのＲＦ、０．２５ｍＭのＲＦ、及び非架橋コラーゲン群の平均値は、それぞれ１．２９ｍｍ２、０．７８ｍｍ２、及び０．７８ｍｍ２であった。未処理のＩＶＤの椎間板隙には測定できるＮＰ組織が残っていなかった。
【００７４】
実施例７−注入されたコラーゲンの運命
注入直後、コラーゲンは輪の欠損の外側部分を覆っている脊椎傍隙に分散したが、欠損部へは移動しなかった（図６Ａ−６Ｂ）。ＨＤＣはアルシアンブルーまたはサフラニンＯで薄く染色された、均質の非結晶組織として見えた。５週後、残ったコラーゲンは、依然として均質かつ非結晶に見え、また、宿主の線維芽細胞が様々な度合いで侵入していた。吸収帯を確認でき、注入された物質の宿主細胞による再構成を示していた。（図７）。炎症性または異物反応の形跡は、見られなかった。
【００７５】
実施例１−７についての考察
本研究の第１の目的は、針穿刺したネズミの尾のモデルにおける線維輪の欠損を修復するＨＤＣの能力を試験することであった。コラーゲンは、椎間板隙の核組織を維持するＡＦの能力を保持することができ、それによってＩＶＤへの変性変化を防ぐことが可能であることを見いだした。輪の完全性を部分的に回復させるような線維性組織の形成を誘発するコラーゲンゲルの可能性も認められた。第２の目的は、ＲＦの追加がＡＦ修復の特質に影響を及ぼすかどうかを評価することであった。ＲＦは、針穿刺後最長５週まで、またはそれ以上、ＮＰの大きさ及び椎間板の高さの保持を改善することを見いだした。
【００７６】
ＲＦの有利な効果は、投与量に依存した。ＲＦが存在しない場合、コラーゲンゲルは未処理のＩＶＤと比較して、ＮＰの大きさ及び椎間板の高さにほんのわずかな増大を生じたのみであった。ＮＰボクセル値及び組織学的断面の測定によると、０．５ｍＭのＲＦ群は、その核組織の大部分を保持していた。椎間板の高さの平均８４％を維持していた。ＭＲＩ分析も組織学的評価のどちらでも顕著な変性変化を示さなかった。
【００７７】
複数の可能性のある仕組みが存在し、それによって、架橋はＡＦ修復に確かに影響を及ぼし得る。化学的架橋により堅さが増大し、コラーゲンゲルの水力学的透過率が減少することが知られている（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｇｅｎｉｐｉｎ-Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ-Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍａｔｒｉｘ  ａｓ  ａ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ａｄｉｐｏｓｅ-Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ，"  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．  Ｐａｒｔ  Ａ  １９:４８４-９６  （２０１３）;  Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｒｏｓｓ-Ｌｉｎｋｓ  Ｒｅｄｕｃｅ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，"  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．  ５０:１６０６-１２  （２００９）;  Ｔｉｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ:  Ｎｅｗ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  Ｔａｉｌｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ，"  Ｍａｔｅｒ．  Ｌｅｔｔ．  ７４:５８-６１  （２０１２）、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）。堅さの増大により、欠損部を塞ぐためのより頑強なバリヤーの形成を助け得る。水力学的透過率の減少は、高度に水和したＮＰ物質が欠損部を通って失われることを制限する（Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、サンフランシスコ、カリフォルニア州、（２０１２）で発表された論文である、Ｂｏｒｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｔａｉｌ  Ａｎｎｕｌｕｓ  Ｆｉｂｒｏｓｕｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｈｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｇｅｌｓ"は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）。さらに、架橋は、他の生体高分子ゲルに見られるような、ＡＦ組織へのコラーゲンの接着を補強し得る。（Ｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｇｅｎｉｐｉｎ-Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  Ｆｉｂｒｉｎ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ａｓ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｔｏ  Ａｕｇｍｅｎｔ  Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｄｉｓｃ  Ａｎｎｕｌｕｓ  Ｒｅｐａｉｒ，"  Ｅｕｒ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍａｔｅｒ．  ２１:３７３-８３  （２０１１）、これらは、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）。これは、線維輪からの移植された物質の脱離、及びＮＰ組織のその後の損失を防ぐ。
【００７８】
注目すべき組織学的知見は、２つの架橋群両方での線維輪の欠損部の外側部分を覆う線維性被膜の形成である。コラーゲンゲルが、生物組織の再構成の形跡を伴う、宿主線維芽細胞の侵入のレベルを変えることを示し、これにより、その線維性組織が形成されていることを説明することができた。コラーゲンゲルのその後の組織修復を伴う、宿主細胞の侵入の仕組みは、すでにこの文献に記載されている（Ｇｕｉｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｈｙｄｒａｔｅｄ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｋｉｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，"  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｓｃｉ．  ７９:６７-８１  （１９８５）;  Ｓｔａｓｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｔｈｅ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  Ｆａｔｅ  ｏｆ  Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉｎｊｅｃｔｅｄ  Ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｖｏｃａｌ  Ｆｏｌｄ，"  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ．  １１８:１８７-９０  （１９９８）、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）。スタコフスキーらは、イヌのモデルにＩ型コラーゲンを注入し、これに続く線維芽細胞の侵入が、ゲル中で新しい宿主コラーゲンの付着を引き起こすことを記載している。この研究によると、細胞の侵入は、架橋コラーゲンの調製物においてより迅速に進行しており、これによって、線維性被膜の形成が架橋群でのみ起こったのはなぜなのかを説明することができた。さらに、架橋は分解を遅らせ、コラーゲンの骨格を持続する時間が増加することが知られており、これは、細胞の移動及び組織修復も補助するであろう（Ｈａｒｒｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｋｉｎ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ  Ｇｒａｆｔｅｄ  ｔｏ  Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｍｉｃｅ，"  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  ３５:１３７-４５  （１９９７）;  Ｊａｒｍａｎ-Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ，  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，"  Ｊ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｓｃｉ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｍｅｄ．  １５:９２５-３２  （２００４）、これらは、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）。
【００７９】
ＲＦは、円錐角膜の治療において、角膜のコラーゲン線維を架橋するために、臨床的にすでに用いられている（Ｈａｓｈｅｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｒｏｓｓ-Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ  ａｎｄ  Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ:  Ｌｏｎｇ-Ｔｅｒｍ  Ｒｅｓｕｌｔｓ，"  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  １２０:１５１５-２０  （２０１３）、これらは、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）、しかし、それはＩＶＤ組織の修復には適用されていない。ＲＦは、酸素ラジカルの生成を誘発する光増感剤として役立ち、次いでコラーゲンの原線維の間の化学結合を誘導し、それによってそれらを架橋する（Ｔｉｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ:  Ｎｅｗ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  Ｔａｉｌｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ，"  Ｍａｔｅｒ．  Ｌｅｔｔ．  ７４:５８-６１  （２０１２）、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）。複数の異なる物質が、生体高分子ゲルを架橋するために用いられている（Ｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｇｅｎｉｐｉｎ-Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  Ｆｉｂｒｉｎ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ａｓ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｔｏ  Ａｕｇｍｅｎｔ  Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｄｉｓｃ  Ａｎｎｕｌｕｓ  Ｒｅｐａｉｒ，"  Ｅｕｒ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍａｔｅｒ．  ２１:３７３-８３  （２０１１）;  Ｈａｒｒｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｋｉｎ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ  Ｇｒａｆｔｅｄ  ｔｏ  Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｍｉｃｅ，"  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  ３５:１３７-４５  （１９９７）;  Ｊａｒｍａｎ-Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ，  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，"  Ｊ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｓｃｉ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｍｅｄ．  １５:９２５-３２  （２００４）、これらは、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）。ＲＦを用いることは、ＲＦがｉｎ  ｓｉｔｕで青色光によって活性化した後にのみ線維を架橋し、注入前にはコラーゲンゲルが液体の状態のままであることを可能にするため有利である。注入可能な生体材料は、強固である生体埋め込み物よりも、脊髄での手順における利用において、技術的により実現可能であるということも立証し得る。これは、それらの生体材料がＡＦまたは椎体への固着が必要でないためである。また、注入可能な物質のみを経皮的に適用することができる。
【００８０】
ラットの尾のモデルが、コラーゲンゲルの種々の組成物を検査するために好適であることが立証された。１８ゲージの針は、ラットの尾の椎間板のＡＦの後壁のほぼ全体を含む大きな欠損を形成する。この欠損は、椎間板造影法のために椎間板が除去または穿刺される際、アニュロトミーによって引き起こされた欠損より、比例してさらに大きいものである。未処理で放置された場合は、ＮＰの液体粘稠度と相まって、高い椎間板内圧が核組織の迅速な突出を引き起こす。
【００８１】
未処理のＩＶＤは、経皮的な手法で同様のモデルを用いている他の研究で記載されている場合よりも、より迅速に変質した（Ｋｅｏｒｏｃｈａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｎｅｅｄｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｃａｕｄａｌ  Ｄｉｓｃ:  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｏｇｒａｐｈ，  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，"  Ｓｐｉｎｅ  Ｊ  １０:１０１４-２３  （２０１０）、これらは、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）。これは、その研究で用いられた公にされた手法によるものであってよく、その手法において傍脊柱筋がＡＦを解離させ、大きな生物組織の欠損が生じる。
【００８２】
好ましい実施形態を本明細書に詳細に描写及び記載してきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく、種々の改良、追加、置き換えなどが行えることは、関連技術分野の当業者には明白であろう。そしてそれゆえに、それらは下記の請求項に規定する本発明の範囲内であると考えられる。 
【図１】
2020114403.tif 000004
【図２】
2020114403.tif 000005
【図３】
2020114403.tif 000006
【図４】
2020114403.tif 000007
【図５】
2020114403.tif 000008
【図６】
2020114403.tif 000009
【図７】
2020114403.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月21日(2020.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
以下で説明される実施例において、高密度のＩ型コラーゲンが、ラットの尾にある脊椎のＡＦにおける針穿刺欠損の導入後、５週に至るまで線維輪の欠損を修復するために示されている。この性能は、ＲＦによる架橋と明らかに相関する。針穿刺を行ったラットの尾が、線維輪の修復向けの生体材料を研究するために好適なｉｎ  ｖｉｖｏモデルであると示されてきた。以下の実施例において説明される、この実験の目的は、ラットの尾の脊椎における、針穿刺によるＡＦ欠損を修復するためのＨＤＣの能力を評価することであった。具体的にいうと、この目的は、組織学的結果及び放射性学的結果によって決められるように、注入されたＨＤＣゲルが、核組織の突出及び／または、結果として生じるＩＶＤの変性を防ぐことが可能であるかどうかを試験することであった。さらに、注入されたコラーゲンの架橋が、修復の工程に影響するかどうかが評価された。この目的のために、コラーゲン架橋の光活性開始剤であるリボフラビン（「ＲＦ」）が、異なる濃度で加えられた。ラットの尾のモデルが、コラーゲンゲルの種々の組成物をスクリーニングするために用いられた。
[本発明1001]
コラーゲンゲル、及び
架橋剤
を含むコラーゲンゲル組成物を提供する段階、及び、
線維輪を修復するための条件下で、線維輪の修復部位の中、周り、または付近へ該組成物を注入する段階
を含む線維輪の修復方法であって、
コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物が注入される場所付近の生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量で、架橋剤が、コラーゲンゲルと共に含まれるかまたはコラーゲンゲルへ加えられる、方法。
[本発明1002]
コラーゲンがＩ型コラーゲンである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
生細胞をコラーゲンゲル組成物へ加える段階をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
生細胞が、軟骨細胞、線維芽細胞、幹細胞、及びそれらの組み合わせから選択される、本発明1003の方法。
[本発明1005]
コラーゲンが、約1〜200ｍｇ／ｍｌの濃度で組成物中に含まれる、本発明1001の方法。
[本発明1006]
架橋剤が、約7．5ｍＭまでの濃度で組成物中に含まれる、本発明1001の方法。
[本発明1007]
架橋剤が、リボフラビン、ローズベンガル、リボース、デコリン、カルボジイミド、アルデヒド、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1008]
架橋剤がリボフラビンである、本発明1007の方法。
[本発明1009]
注入する段階が、周囲の生物組織に損傷を引き起こさない、本発明1001の方法。
[本発明1010]
融合が、線維輪の天然組織を伴う、本発明1009の方法。
[本発明1011]
コラーゲンゲル、及び
架橋剤
を含むコラーゲンゲル組成物であって、
コラーゲンゲルの架橋を引き起こすために、かつコラーゲンゲル組成物と接触する生物組織と該コラーゲンゲル組成物の融合を可能にするために十分な量で、架橋剤が該組成物に含まれる、組成物。
[本発明1012]
コラーゲンがＩ型コラーゲンである、本発明1011の組成物。
[本発明1013]
生細胞をさらに含む、本発明1011の組成物。
[本発明1014]
生細胞が、軟骨細胞、線維芽細胞、幹細胞、及びそれらの組み合わせから選択される、本発明1013の組成物。
[本発明1015]
コラーゲンが、約1〜200ｍｇ／ｍｌの濃度で組成物中に含まれる、本発明1011の組成物。
[本発明1016]
架橋剤が、約7．5ｍＭまでの濃度で組成物中に含まれる、本発明1011の組成物。
[本発明1017]
架橋剤が、リボフラビン、ローズベンガル、リボース、デコリン、カルボジイミド、アルデヒド、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、本発明1011の組成物。
[本発明1018]
架橋剤がリボフラビンである、本発明1017の組成物。
[本発明1019]
注入可能である、本発明1011の組成物。