(57)【要約】【課題】ジスルフィラムは、概念的実証としては、コカイン依存の治療に、ＤＢＨ阻害剤が有望な化合物であることが示されたが、コカイン依存の治療への有用性としては、アルコール及びコカインとの相互作用のために厳しく限定されている。【解決手段】本発明は、少なくとも一つの物質と化合物Ａの乱用、依存、又は離脱症状の少なくとも一つの症状に罹り又は罹る可能性のある患者の治療方法を提供する。また、少なくとも一つの依存物質の少なくとも一つの依存症の相の及びコカイン依存症の少なくとも一つの相の確かな治療方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願のクロスレファレンス
本出願は、２００７年８月６日に出願された６０／９３５，３２３「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ Ｕｓｉｎｇ Ｎｅｐｉｃａｓｔａｔ」、２００７年８月１７日に出願された６０／９５６，５５５「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ Ｕｓｉｎｇ Ｎｅｐｉｃａｓｔａｔ」及び２００７年１０月４日に出願された６０／９６０，５９１「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ Ｕｓｉｎｇ Ｎｅｐｉｃａｓｔａｔ」の米国仮特許出願について、３５ＵＳＣ第１１９条（e）による利益を主張し、その全体が本明細書で引用される。
【０００２】
本発明は、少なくとも一つの物質の少なくとも一つの乱用、依存または離脱の症状に罹り又は罹る可能性のある患者の、化合物Ａによる治療方法を提供する。また、少なくとも一つの物質の物質依存の少なくとも一つの相の確実な治療方法、及び、患者のコカイン依存の少なくとも一つの相の確実な治療方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
物質の乱用及び依存は、物質の渇望、探求、及び、物質の摂取制限の制御を喪失した使用によって特徴づけられる。これらの行動は、関連する問題の主要な物質の使用の問題として、及び他の行動を犠牲にして行われる。２００４年、１２歳以上のアメリカ人のうち約２２５０万人が、物質乱用による治療を必要としていた（アルコール又は違法薬物）。違法薬物乱用のみに関する費用の最新の見積りは、＄１８１０億である（２００２年）。
【０００４】
コカイン乱用及び依存の問題は、医療、社会及び法律上の大きな問題である。２００５年の薬物使用と健康に関する全国調査によると、１２歳以上のアメリカ人の約１３．９％は生涯のうちに一度はコカインを試したことがあり、３．３％はクラックコカインを試したことがあるとしている。より問題なのは、２００４年は２００万人だったのに対し、２００５年には２４０万人が今でもコカイン使用者であり、増加していることである。現在のクラックコカイン使用者は、６８２，０００人（２００５年）であり、４６７，０００人だった２００４年に比べて増加している。２００４年、薬物乱用警告ネットワークは、全国の薬物関連救急で救急治療室に入った人は、９４０，９５３人と見積もり、その中でもコカインが大多数を占めていた。
【０００５】
明らかに、広く効果のある治療のアプローチが必要であり、その中の一つとしては、単独の認知行動療法又は随伴性マネジメントといった現在の行動療法よりも効果的な医療構成とすることが含まれる。様々な処置法が臨床試験において試され、注目すべき成功なく終わっている。特に、デシプラミン、フルオキセチン、ブプロピオン、及びイミプラミンを含む多くの抗うつ剤の様々な無作為化対照試験が行われた。フェニトインの試験として、カルバマゼピン及びリチウムを含む気分安定剤の臨床試験も、ブロモクリプチン、ペルゴリド、アマンタジン、マジンドール、及びメチルフェニデートを含む直接又は間接ドパミン受容体アゴニストも行われた。他の薬剤には、リタンセリン、ゲピロン、ニモジピン、及びナルトレキソンを含み、よく研究されている。これらの化合物はいずれも、確実な有効性は示さなかった。ＧＡＢＡ系に作用するいくつかの治療薬、例えば、チアガピン、バクロフェン、及びビバガトリンは、コカイン依存の治療として評価されてきた。チアガピンの結果は同等であり、バクロフェンはわずかにより有望であったが、強力ではなかった。ビバガトリンの試験結果は、主として非盲検試験であるが同等に有望であった。これらの開発結果は、全般に思わしくなかった。
【０００６】
ドパミンβ−ヒドロキシラーゼ（ＤＢＨ）阻害剤であるジスルフィラムが、現存する最も薬理効果の高いコカイン依存症治療薬である。残念ながら、ジスルフィラムは、アルデヒド脱水素酵素、及び血漿エステラーゼを含むいくつかの酵素を非特異的に阻害する。ジスルフィラム及び関連する化合物キレート化銅は、アルデヒド脱水素酵素、血漿エステラーゼ及びＤＢＨといった様々な酵素に必須の補助因子となっている。アルデヒド脱水素酵素を阻害することで、ジスルフィラムはアルコールの代謝（エタノール）を変化させ、ジスルフィラム−エタノール反応を起こす。この反応は、紅潮、吐き気及び、及び血圧低下を招く。
【０００７】
血漿エステラーゼの阻害はコカインの消失を遅くし、血漿中コカイン濃度を上昇させる。実験室での研究では、鼻腔内コカイン処置に対しジスルフィラムで治療した場合、ジスルフィラムは顕著に血漿中コカイン濃度を上昇させた。しかし、増加したコカイン濃度は、身体的、主観的な効果にはコカインは関係ない。一連の制御下の試験で、６倍の血漿コカイン濃度の顕著な上昇が見られ、制御されていない違法使用においては、より上昇することが考えられる。続く静注を用いたコカイン投与では、ジスルフィラムは、おそらく血漿エステラーゼを阻害することにより、コカインの排出を遅らせた。初期には、鼻腔内投与による遅い吸収によって説明される血漿中濃度の上昇が見られた。
【０００８】
いくつかの研究により、コカイン依存の治療に対するジスルフィラムの予備的な効果が示された。実験室での研究ではヒトに対しては、ジスルフィラムによる治療はコカインによる主観的な効果を軽減した。アルコール及びコカイン依存を併発している患者は、５００ｍｇまでのジスルフィラムで治療することにより、症状が改善された。同様にジスルフィラムで治療することにより、ブプレノルフィン投与を継続しているオピオイド−及びコカイン−依存患者のコカイン使用を減少した。近年、大型の臨床試験の結果、アルコールの服用パターンや心理療法の使用の型に関わらず、２５０ｍｇ／日のジスルフィラム投与により、プラセボに対してコカイン使用を減少させることがわかった。この研究では、１１２人のコカイン依存のボランティアをランダムにプラセボ又はジスルフィラム投与し、２種のうちの１つの心理療法を施した。ジスルフィラム治療がコカイン使用量の減少につながったことは、プラセボに対してコカイン陽性の尿サンプルがほとんどなかったことから証明された。効果は大きくなく、この結果が再現されなければならないという問題が残る。
【０００９】
ジスルフィラムは、ノルエピネフリン（ＮＥ）合成を触媒する単一の酵素であるＤＢＨを阻害する。ＤＢＨは、ノルアドレナリン作動性神経において発現し、シナプス小胞に局在し、ＮＥに応じて分泌される。ＤＢＨは血漿中で測定され、ＤＢＨ濃度は、高度に遺伝性で、活性の多様性はＤＢＨの遺伝子座の多様性によって主に説明される。Ｔ変異体（−１０２１Ｃ→Ｔ）は、ＤＢＨ遺伝子転写を減少させ、ＤＢＨ活性を落とす。この対立遺伝子はよく見られる。アフリカ系アメリカ人のうち２０％、北欧系アメリカ人のうち２２％、日本人のうち１６％と報告されている。対応するハプロタイプの頻度は、それぞれこれらの人口の０．３２、０．３４、及び０．０９である。
【００１０】
ジスルフィラムは、低ＤＢＨ活性の患者に、より効果的であるとのいくつかの報告がある。低ＤＢＨ活性の患者において、コカイン陽性の尿の者は、２５０ｍｇ／日の繰り返しのジスルフィラム治療で、プラセボに対して減っていったが、６２．５ｍｇ及び１２５ｍｇの／日の繰り返しのジスルフィラム治療では有意に増加した（ｐ＜０．０４）。高ＤＢＨ活性の患者においては、６２．５ｍｇ／日の繰り返しのジスルフィラム治療では、コカイン陽性尿の患者はプラセボに対して増えた（ｐ＝０．００１）。このことから、２５０ｍｇ／日ジスルフィラム治療の効果は、低ＤＢＨ活性の患者（Ｃ→Ｔ遺伝子型）に限定されると考えられる。血漿中エステラーゼの阻害によるコカインクリアランスの減少により、コカインの多幸感に関連する乱用によるコカイン使用の増加が起こり、２５０ｍｇ／日よりも低いジスルフィラム投与は、コカイン使用を増加させると考えられる。
【００１１】
ジスルフィラムは、低ＤＢＨ活性と関連のあるＤＢＨ  Ｃ→Ｔ遺伝子型の患者によるコカイン使用を、より効果的に減少させる。おそらく、ジスルフィラムは、低ＤＢＨ活性の患者においてより完全にＤＢＨを阻害し、ジスルフィラムはＤＢＨが低活性Ｃ→Ｔ遺伝子型の患者において、より効果的である。ジスルフィラムが低活性ＤＢＨ  Ｃ→Ｔ遺伝子型の患者においてより効果的であることは、ＤＢＨの阻害が、コカイン依存の治療におけるジスルフィラムの鍵となる作用機序であることを示すものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ジスルフィラムは、概念的実証としては、コカイン依存の治療に、ＤＢＨ阻害剤が有望な化合物であることが示されたが、コカイン依存の治療への有用性としては、アルコール及びコカインとの相互作用のために厳しく限定されている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、少なくとも一つの物質によって乱用、依存又は離脱の少なくとも一つの症状に罹り又は罹る可能性のある患者を治療する方法を提供する。方法は、患者に治療上の有効量の化合物Ａを投与することを含む。
【００１４】
本発明は、また、少なくとも一つの物質による、少なくとも一つの物質依存相にある患者を治療する方法をも提供する。ここで少なくとも一つの物質依存相とは、獲得、維持、消滅、及び再発から選択されるものである。方法は、患者に治療上の有効量の化合物Ａを投与することを含む。
【００１５】
また、コカイン依存の少なくとも一つの相にある患者の治療方法をも提供する。ここで、少なくとも一つの相とは獲得、維持、消滅、及び再発から選択されるものである。方法は、患者に治療上の有効量の化合物Ａを投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、標本数を５ないし１５に変化した場合の効果量を示す。
【図２】図２は、個別の酵素アッセイの詳細を示す。
【図３】図３は、ＤＢＨ及びある種の選択された酵素及び受容体（ＩＣ５０又はＰＫｉ）に対する、ネピカスタットの親和性の表を示す。
【図４】図４は、ネピカスタットによる酵素活性の阻害％を示す。
【図５】図５は、健常志願者におけるネピカスタット投与２４時間後の尿中ドパミンレベルを示す。
【図６】図６は、担体投与又は様々な濃度のネピカスタット投与後のＳＨＲの皮質におけるノルエピネフリンレベルを示す。
【図７】図７は、担体投与又は様々な濃度のネピカスタット投与後のＳＨＲの皮質におけるドパミンレベルを示す。
【図８】図８は、担体投与又は様々な濃度のネピカスタット投与後のＳＨＲの皮質におけるドパミン／ノルエピネフリン比を示す。
【図９】図９は、担体投与又は様々な濃度のネピカスタット投与後のＳＨＲの腸間膜動脈におけるノルエピネフリンレベルを示す。
【図１０】図１０は、担体投与又は様々な濃度のネピカスタット投与後のＳＨＲの腸間膜動脈におけるドパミンレベルを示す。
【図１１】図１１は、担体投与又は様々な濃度のネピカスタット投与後のＳＨＲの腸間膜動脈におけるドパミン／ノルエピネフリン比を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書中、以下の語句は、文脈において異なることを示さない限り、以下に示すことを示す。
【００１８】
本明細書中「化合物Ａ」は、（Ｓ）−５−アミノメチル−１−（５，７−ジフルオロ−１，２，３，４−テトラヒドロナフト−２−イル）−２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−１Ｈ−イミダゾール、（Ｒ）−５−アミノメチル−１−（５，７−ジフルオロ−１，２，３，４−テトラヒドロナフト−２−イル）−２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−１Ｈ−イミダゾール、及びそれらの混合物、それらの薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩を含む。ある態様では、ネピカスタット（（Ｓ）−５−アミノメチル−１−（５，７−ジフルオロ−１，２，３，４−テトラヒドロナフト−２−イル）−２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−１Ｈ−イミダゾール塩酸塩）が用いられる。
【００１９】
本明細書中「化合物Ｂ」は、（Ｒ）−５−アミノメチル−l−（５，７−ジフルオロ−１，２，３，４−テトラヒドロナフト−２−イル）−２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−１Ｈ−イミダゾール、それらの薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩を意味する。
【００２０】
「薬学的に許容される塩」は、無機酸塩、例えば塩酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、スルフィン酸塩、硝酸塩、及び同様の塩；有機酸塩、例えばリンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、２−ヒドロキシエチルスルホン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、及びアルカン酸塩、例えば酢酸塩、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（ｎ＝０−４）、及び同様の塩を含む。
【００２１】
加えて、化合物が酸付加塩として得られた場合には、遊離の塩基は、酸性塩の溶液をアルカリ性にすることにより容易に得られる。逆に、生成物が遊離の塩基の場合、付加塩、特に薬学的に許容される塩は、適切な有機溶媒及び溶液を酸性にすることにより、塩基性の化合物から、従来の手順と同様の手順で酸付加塩が得られる。当該技術分野において通常の知識を有する者は、非毒性の薬学的に許容される付加塩を合成するのに用いられる様々な合成方法を理解できるであろう。
【００２２】
本明細書中、用語「患者」とは、ホ乳類を示す。ある実施態様中では、用語「患者」は、ヒトを示す
【００２３】
用語「投与する（administer）」「投与すること（administering）」又は「投与（administration）」とは、本明細書中、患者に化合物Ａを直接投与すること又はその医薬組成物を投与することを示す。
【００２４】
用語「治療する（treat）」又は「治療すること（treating）」とは、本明細書中、病態又は少なくとも一つの症状を、部分的に又は完全に和らげる、阻害する、妨げる、改善する、及び／又は、緩和することをいう。
【００２５】
用語「罹っている（suffer）」又は「罹っていること（suffering）」とは、本明細書中、患者の一つ以上の診断された又は疑われている病態をいう。
【００２６】
用語「罹る可能性がある（susceptible）」とは、本明細書中、少なくとも一つの病態の症状を示す可能性があることをいう。
【００２７】
当該分野における通常の技術を有する者であれば、理解できることであるが、「物質乱用」は、しばしば、身体的及び／又は精神的に「依存」症状が関わる。また、物質乱用の場合に、依存症の個体からやめさせると、その個体はしばしば、睡眠及び気分障害及び乱用していた薬物への激しい渇望を含む特定の症状を示し、これは「離脱」として知られている。本明細書中に記載する方法は、薬物乱用それ自体、依存、及び離脱の治療を含む。
【００２８】
用語「物質乱用」とは本明細書中、精神疾患の診断・統計マニュアル第４版（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ， ４ｔｈ Ｅｄ. Ｔｅｘｔ ｒｅｖｉｓｉｏｎ（２０００））（「ＤＳＭ−ＩＶ ＴＲ」）に記載された基準を参照し定義することができ、これは米国精神医学会、ＤＳＭ−ＩＶ作成委員会が作成した。物質乱用の特徴は、物質の繰り返し使用に関連する再発及び顕著な有害作用から生じる不適切な物質の使用パターンである。ＤＳＭ−ＩＶ ＴＲに引用されているように、物質乱用とは、以下の少なくとも一つの症状を１２ヶ月以内に引き起こす、臨床的に著しい障害又は苦痛につながる物質乱用と定義できる。その症状とは、（１）職場、学校、又は家庭において義務の重要な役割を履行することができないことによる物質の使用の再発；（２）身体的に有害な状況における物質の使用の再発；（３）物質に関連した法的な問題による再発；及び（４）乱用物質の影響により社会的又は対人的な問題が継続又は再発しているにもかかわらず継続的な物質の使用を継続すること、である。加えて、ＤＳＭ−ＩＶ ＴＲでは、物質乱用は、物質依存の基準にはなかった症状を必要としている。ある態様では、物質乱用の患者にネピカスタットを投与することにより、患者の乱用物質の使用量又は頻度が減少する。ある態様では、化合物Ａを患者に投与することにより、少なくとも一つの物質乱用の症状を軽減する。例えば、これに限られるものではないが、多幸感、無気力、興奮、無謀さ、判断力の低下、衝動強迫、攻撃性、怒り、乱用してきた物質の渇望、及び気分障害がある。ある態様では、化合物Ａを投与することにより、患者にとってストレスのたまる出来事による乱用物質の渇望を減少させることができる。
【００２９】
本明細書中、用語「症状を軽減する」とは、少なくとも一つの患者の病態の症状の頻度及び大きさを減少することを示す。特定の具体例では、患者は回復に向かい、もはや症状がなくなる。
【００３０】
本明細書中、用語「症状を増加させる」とは、少なくとも一つの患者の病態の頻度及び重篤性を増加させることを示す。
【００３１】
用語「物質依存」とは、本明細書中、ＤＳＭ−ＩＶ ＴＲに記載された基準を参照し定義することができる。ＤＳＭ−ＩＶ ＴＲに記載された物質依存の症状とは、以下の群から選択される少なくとも三つの症状を同じ１２ヶ月の期間以内に同時に引き起こす、臨床的に著しい障害及び苦痛へとつながる物質の使用パターンと定義できる。その症状とは、（１）（ａ）望ましい効果を得るために実質的に物質の量が増加したことによる；又は（ｂ）同一量の物質の継続的使用により実質的に効果が減少したことによる；耐性（２）（ａ）特定の物質による特徴的な離脱症状；又は（ｂ）離脱症状を和らげ又は避けるために摂取された同一又は密接な関連性のある物質による離脱症状；（３）乱用物質は、しばしば想定されていたよりも大用量又は長期間にわたって摂取されること；（４）乱用物質の制御への継続的な望み又は成功しない努力があること；（５）乱用物質の取得活動、物質の使用、又はその影響からの回復に多大な時間が費やされること；（６）乱用物質の使用のために、重要な社会的、職業的又は娯楽の活動を諦め、又は減らすこと；及び（７）乱用物質の使用は、身体的又は精神的問題が発生又は悪化させることを継続的に又は再発するらしいことを知っていながら、続けてしまうことである。物質依存とは、耐性又は離脱が起こる身体的依存であってもよく、耐性又は離脱が起こらない非身体的依存性であってもよい。ある態様では、物質依存に対する化合物Ａによる治療により、患者による使用量又は頻度を減少させる。ある態様では、化合物Ａによる治療により患者において少なくとも一つのＤＳＭ−ＩＶ ＴＲ記載の物質依存の症状を減少させる。ある態様では、物質依存に対する化合物Ａによる治療により、例えば、これに限定されるものではないが、多幸感、無気力、興奮、無謀さ、判断力の低下、衝動強迫、攻撃性、怒り、使用してきた依存物質の渇望、及び気分障害がある。ある態様では、化合物Ａによる治療により、患者にとってストレスのたまる出来事による乱用物質の渇望を減少させる。
【００３２】
本明細書中「回復」とは、少なくとも一つの物質乱用の症状又は依存性が減少することを示す。ある態様では、回復という用語は、患者がアゴニストによる治療を受けている場合や、関連する物質を入手することが制御された状況にある場合には、適さない。ある態様では、回復とは、患者における物質乱用又は依存による少なくとも一つの症状が起こらない状態を示す。ある態様では、回復とは、患者における物質乱用又は依存による全ての症状が軽減された状態を示す。ある態様では、回復とは、患者における物質乱用又は依存による症状が起こらない状態を示す。ある態様では、回復とは、物質の使用が起こらない状態を示す。
【００３３】
ある態様では、回復は、少なくとも一つの短期間の完全回復、短期間の部分的回復、持続的な完全回復、及び持続的な部分的回復によって特徴づけられ、乱用及び物質依存の症状が一つも起こらない状態が１ヶ月以上続く場合にのみ適用する。これらの４つのタイプの回復の定義は、依存が消失してからの時間の間隔（短期間又は持続的回復）の違いによって、少なくとも一つの物質依存性又は乱用の継続性があるかどうかに基づいている（部分的又は完全回復）。
【００３４】
用語「短期間の完全回復」とは、少なくとも１ヶ月、しかし１２ヶ月よりも短い期間、物質依存又は物質乱用の症状がないことを示す。
【００３５】
用語「短期間の部分的回復」とは少なくとも１ヶ月、しかし１２ヶ月よりも短い期間、物質依存又は乱用物質の症状の少なくとも一つがあったが、物質依存又は乱用物質の基準には達しないことを示す。
【００３６】
用語「持続的な完全回復」とは、少なくとも１２ヵ月以上にわたり、物質依存又は物質乱用の症状を生じていないことを示す。
【００３７】
用語「持続的な部分的回復」とは、少なくとも１２ヶ月にわたり、物質依存又は物質乱用の症状の少なくとも一つがあったが、物質依存又は物質乱用の基準には達しないことを示す。
【００３８】
ある態様では、化合物Ａによる治療は患者の回復を促進する。ある態様では、化合物Ａによる治療が患者の回復している期間を引き延ばす。
【００３９】
用語「回復している期間を引き延ばす（prolong a period of remission）」とは、回復している患者の再発までの時間が増加することを示す。ある態様では、ストレスのたまる出来事が生じると、回復が途切れることがある。ある態様では、再発は、回復が途切れたときに起こる。ある態様では、化合物Ａによる治療は、ストレスのたまる出来事による回復の途切れが生じうる可能性を減少させる。ある態様では、化合物Ａによる治療は、短期間の部分的回復、短期間の完全回復、持続的な完全回復、持続的な部分的回復の少なくとも一つを促進する。
【００４０】
「離脱」とは、関連物質の投与を軽減、遅延、又は中止したときに起こる症状の集合を言う。離脱の物質特異的症状は、例えば、社会的、職業的、及び他の重要な機能領域における臨床的に著しい障害又は苦痛につながる。これらの症状は、一般的な医学的な病態ではないため、他の精神障害によって説明することができない。必ず出はないが、離脱は通常、物質依存に関連していない。ある態様では、化合物Ａによる治療により、患者の離脱の少なくとも一つの症状を軽減できる。ある態様では、離脱症状は、これらに限られるものではないが、例えば、無気力、興奮、無謀さ、判断力の低下、衝動強迫、攻撃性、怒り、乱用してきた物質の渇望、気分障害、及び睡眠障害がある。ある態様では、化合物Ａによる治療により、患者にとってストレスのたまる出来事による乱用物質の渇望を減少させる。
【００４１】
用語「物質依存」とは、ＤＳＭ−ＩＶ ＴＲに言及されている以下の少なくとも一つの病態があることによって特徴づけられる:アルコール乱用；アルコール依存症；アルコール中毒；アルコール中毒による錯乱；アルコール離脱；アルコール離脱による錯乱；アルコール誘導性不安障害；アルコール誘導性気分障害；アルコール依存性継続的健忘障害；アルコール誘導性痴呆障害；錯覚を伴うアルコール誘発性精神障害；幻覚を伴うアルコール誘導性精神障害；アルコール誘導性性機能障害；アルコール誘導性睡眠障害；アルコール関連障害でここに明示されていないもの（ＮＯＳ）；アンフェタミン乱用；アンフェタミン依存；アンフェタミン中毒；アンフェタミン中毒性錯乱；アンフェタミン離脱；アンフェタミン誘導性不安障害；アンフェタミン誘導性気分障害；妄想を伴うアンフェタミン誘導性精神障害、；幻覚を伴うアンフェタミン誘導性精神障害；アンフェタミン誘導性性機能障害；アンフェタミン誘導性睡眠障害；アンフェタミン関連障害ＮＯＳ；カンナビス乱用；カンナビス依存；カンナビス中毒；カンナビス中毒性錯乱；カンナビス誘導性不安障害；妄想を伴うカンナビス誘導性精神障害；幻覚を伴うカンナビス誘導性精神障害；カンナビス関連障害ＮＯＳ；コカイン乱用；コカイン依存；コカイン中毒；コカイン中毒性錯乱；コカイン離脱；コカイン誘導性不安障害；コカイン誘導性気分障害；妄想を伴うコカイン誘導性精神障害；幻覚を伴うコカイン誘導性精神障害；コカイン誘導性性機能障害；コカイン誘導性睡眠障害；コカイン関連障害ＮＯＳ；吸入剤乱用；吸入剤依存；吸入剤中毒；吸入剤中毒性錯乱；吸入剤誘導性不安障害；吸入剤誘導性気分障害；吸入剤誘導性持続性痴呆；妄想を伴う吸入剤誘導性精神障害；幻覚を伴う吸入剤誘導性精神障害；吸入剤関連障害ＮＯＳ；オピオイド乱用；オピオイド依存；オピオイド中毒；オピオイド中毒性錯乱；オピオイド離脱；オピオイド誘導性気分障害；妄想を伴うオピオイド誘導性精神障害；幻覚を伴うオピオイド誘導性精神障害；オピオイド誘導性性機能障害；オピオイド誘導性睡眠障害；オピオイド関連障害ＮＯＳ；フェンシクリジン乱用；フェンシクリジン依存；フェンシクリジン中毒；フェンシクリジン中毒性錯乱；フェンシクリジン誘導性不安障害；フェンシクリジン誘導性気分障害；妄想を伴うフェンシクリジン誘導性精神障害；幻覚を伴うフェンシクリジン誘導性精神障害；及びフェンシクリジン関連障害ＮＯＳがある。
【００４２】
用語「中止（cessation）」及び「離脱（remission）」は、ＤＳＭ−ＩＶ ＴＲに言及されている病態の特徴に従う必要はなく：ニコチン離脱；ニコチン関連障害でここに明示されていないもの；身体的依存を伴うニコチン依存；身体的依存を伴わないニコチン依存；短期間の完全回復したニコチン依存；短期間の部分回復したニコチン依存；持続的に完全回復したニコチン依存；持続的に部分的回復したニコチン依存；アゴニスト治療によるニコチン依存；オピオイド離脱；オピオイド関連障害で明示されていないもの；身体的依存を伴うオピオイド依存；身体的依存を伴わないオピオイド依存；短期間の完全回復したオピオイド依存；短期間の部分回復したオピオイド依存；持続的に完全回復したオピオイド依存；持続的に部分的回復したオピオイド依存；アゴニスト治療によるオピオイド依存；及び、制御された環境下でのオピオイド依存；エタノール離脱；身体的依存を伴うエタノール依存；身体的依存を伴わないエタノール離脱；短期間の完全回復をするエタノール離脱；短期間の部分的回復するエタノール離脱；持続的に完全回復したエタノール離脱；持続的に部分的回復したエタノール離脱；アゴニスト治療によるエタノール離脱；制御された環境下でのエタノール離脱；アンフェタミン離脱；及びコカイン離脱がある。
【００４３】
本明細書中「アゴニスト治療による（on agonist therapy）」とは、アゴニストを物質乱用、依存、又は離脱の治療に用いることを示す。用語「アゴニスト」とは、患者が乱用、依存、又は離脱していた物質の反応の少なくとも一つ又は部分的な反応を誘発する化合物に限られず、例えば、小分子又は複合有機化合物又はタンパク質を含む因子をいう。例えば、「アゴニスト治療によるオピオイド依存」とはメタドン治療によるオピオイド依存を示す。
【００４４】
あらゆる種類の物質の使用の減少によって離脱症状を引き起こしうる。例えば、いずれもニコチンを含むが、タバコ製品の使用を中止すると、ニコチン離脱症状が通常起こる。ヒトは、葉巻タバコ（cigarette）、葉巻（cigar）、又はパイプタバコの喫煙に限られず、タバコの経口又は鼻腔内摂取、又は噛みタバコも含む、あらゆる形態のタバコの使用を中止した結果、しばしば、ニコチンの離脱症状に苦しむ。そのような経口又は鼻腔内摂取するタバコは、嗅ぎタバコ及び噛みタバコに限られない。ニコチンの使用中止又はニコチンの使用量の減少後、しばしば２４時間以内に、不機嫌、憂鬱な気分；意識朦朧； 不眠；興奮性、フラストレーション又は怒り；不安；神経性振戦； 集中力の欠如；落ち着きのなさ；心拍の低下；食欲増進又は体重増加；及びタバコ又はニコチンの渇望の症状が現れる。それらの症状は、しばしば社会的、職業上の、又は他の重要な機能を有する領域において臨床的に著しい苦痛又は障害を引き起こす。本明細書中に示す方法は、そのような症状が一般的な医学的病態でない場合にも、及び他の医学的障害としてうまく説明されない場合にも、ニコチン離脱症状に起因する一つ又はそれ以上の症状を緩和するのに用いることができる。本発明の方法は、ニコチン置換療法においてタバコから置換又は部分的置換した患者にも用いられる。こうして、そのような患者のあらゆる形態のニコチン依存を軽減し及び完全に消滅させるのを助ける。
【００４５】
典型的には自己投与において、注射又は経口、喫煙又は鼻腔内投与による、オピオイドの投与を中断又は減少させることは、しばしば、オピオイド離脱の特徴を示す状態を引き起こす。この離脱症状は、オピオイドアンタゴニスト、例えばナロキソン又はナルトレキソンをオピオイド使用の後に投与することによっても引き起こされる。オピオイドの離脱症状は、一般的にオピオイドアゴニスト効果と反対の症状によって特徴づけられる。そのような離脱症状には、不安；落ち着きのなさ；筋肉痛、しばしば背中及び脚に起こるもの；オピオイドの渇望；興奮及び痛みへの過敏性；不機嫌；吐き気又は嘔吐；流涙；鼻漏；乳頭膨張；立毛；発汗；下痢；あくび；発熱；及び不眠を含む。例えばヘロインといった、短時間効果型のオピオイドの依存の場合、離脱症状は通常、最後の投与後６−２４時間以内に起こるのに対し、例えばメタドンといった、長時間効果型のオピオイドでは症状が出るまでに２−４日かかる。これらの症状は、しばしば、社会的、職業的、及び他の重要な機能領域における臨床的に著しい障害又は苦痛につながる。本明細書中に示す方法は、そのような症状が一般的な医学的病態でない場合にも、及び他の医学的障害としてうまく説明されない場合にも、オピオイド離脱症状に起因する一つ又はそれ以上の症状を緩和するのに用いることができる。
【００４６】
エタノール（例えば、エタノール含有飲料）をやめ又は減少することにより、エタノール離脱症状が起こる。エタノール離脱症状は、エタノール摂取をやめ又は減少させた４ないし１２時間以内に血中エタノール濃度が急速に落ちることにより特徴づけられる。このようなエタノール離脱症状は、エタノールの渇望；自律神経系の活動高進（例えば、発汗又は心拍１００以上）；手の震え；不眠；吐き気；嘔吐；一過性の幻覚、幻触または幻聴；精神運動性激越；不安；及びてんかんの大発作を含む。これらの症状は、しばしば、社会的、職業的、及び他の重要な機能領域における臨床的に著しい障害又は苦痛につながる。本明細書中に示す方法は、そのような症状が一般的な医学的病態でない場合にも、及び他の医学的障害としてうまく説明されない場合にも、エタノール離脱症状に起因する一つ又はそれ以上の症状を緩和するのに用いることができる。
【００４７】
コカイン乱用及び依存は、認知、行動上、及び身体的症状を生じうる。コカイン乱用及び依存の症状には、様々な程度の注意欠陥・多動性障害及び多幸感；活力、興奮、及び社会性の増加；空腹感及び疲労の減少；身体的及び精神的な感受性の顕著な増加；情動不安；痛みの減少；及びコカインの渇望が含まれる。呼吸器への影響には、例えば、気管支炎、息切れ、及び胸痛があり、及び心血管系への影響には、例えば、動悸、不整脈、心筋症、及び心臓発作が含まれる。症状には、瞳孔散大、吐き気、嘔吐、頭痛、回転揺性目眩、不安、動揺性目眩、精神障害、及び錯乱が含まれる。鼻からの吸引（snorting）又は吸入（sniffing）によるコカインの投与では、耳、鼻及び喉への影響、例えば、鼻粘膜炎症，鼻粘膜痂皮、反復性鼻血、鼻づまり、及び顔面痛を含む症状を生じる。ある態様では、化合物Ａによる治療は、患者において少なくとも一つのコカイン乱用及び依存の症状を軽減する。ある態様では、ネピカスタット治療により、コカイン乱用及び依存による少なくとも一つの陰性自覚症状を増加させる。
【００４８】
コカインの離脱症状には、疲労、喜びの欠如、抑鬱、興奮、睡眠障害、食欲増加、精神運動遅延、動揺、過剰な疑い深さ、及びコカインの渇望がある。化合物Ａによる治療により、少なくとも一つのコカインの離脱症状を軽減することができる。
【００４９】
物質依存は相によって特徴づけられる：獲得、維持、消滅、及び再発がある。本明細書中、用語「獲得」とは、患者の物質に対する依存が開始し及び得られる物質依存相を示す。ある態様では、化合物Ａによる治療は、患者における獲得の進展を阻害する。ある態様では、化合物Ａによる治療は、患者における物質の使用量及び頻度の少なくとも一つを減少させる。ある態様では、獲得相における化合物Ａによる治療により、患者における少なくとも一つの物質乱用及び依存によるＤＳＭ−ＩＶ記載の症状を軽減させる。ある態様では、獲得相における化合物Ａによる治療により、実施例に示したような、及びこれに限定されることなく、多幸感，無気力，興奮 無謀さ， 判断力の低下、衝動強迫、攻撃性、怒り、乱用及び依存してきた物質の渇望、及び気分障害の少なくとも一つの物質乱用及び依存の症状を軽減する。ある態様では、ある態様では、化合物Ａによる治療により、患者にとってストレスのたまる出来事による乱用物質の渇望を減少させることができる。
【００５０】
「維持」とは、患者による安定した投与又は使用による物質依存相を示す。ある態様では、物質の使用量及び頻度の少なくとも一つにおいて現れる１０％の変動は、安定な行動であると考えられている。ある態様では、維持相における化合物Ａによる治療は、患者における少なくとも一つの物質乱用及び依存によるＤＳＭ−ＩＶ記載の症状を軽減する。ある態様では、維持相における化合物Ａによる治療は、乱用物質及び依存の症状の少なくとも一つを減少させる。ある態様では、実施例に示したような、及びこれに限定されることなく、維持相における化合物Ａによる治療は、多幸感、無気力，興奮、無謀さ，判断力の低下、衝動強迫、攻撃性、怒り、乱用及び依存してきた物質の渇望、及び気分障害の少なくとも一つの物質乱用及び依存の症状を軽減する。ある態様では、化合物Ａを投与することにより、維持相にある患者にとってストレスのたまる出来事による乱用物質の渇望を減少させることができる。
【００５１】
「消滅」とは、物質が患者に提供されない又は患者が物質の使用を控える物質依存相を示す。ある態様では、消滅相における物質依存が消滅又は減少することを示す。ある態様では、消滅相において少なくとも一つの離脱症状が生じることを示す。ある態様では、患者において化合物Ａによる治療は消滅相を促進する。ある態様では、消滅相にある化合物Ａによる治療は、患者における少なくとも一つの乱用及び依存物質によるＤＳＭ−ＩＶ記載の症状を減少させる。ある態様では、実施例に示したような、及びこれに限定されることなく、消滅相における化合物Ａによる治療は、多幸感，無気力，興奮 無謀さ，判断力の低下、衝動強迫、攻撃性、怒り、乱用及び依存してきた物質の渇望、及び気分障害の少なくとも一つの物質乱用及び依存の症状を軽減する。ある態様では、化合物Ａによる治療により、患者の消滅相における離脱症状を軽減する。ある態様では、化合物Ａを投与することにより、消滅相にある患者にとってストレスのたまる出来事による乱用物質の渇望を減少させることができる。
【００５２】
「再発」とは、患者がある期間物質を使用しなかった後に物質乱用又は依存症状の再発を示す。ある態様では、回復後に再発する。ある態様では、再発の前に症状を消滅させるためのトレーニングを受けている。ある態様では、再発は、呼び水、ストレス、又は物質の使用において以前関わった関連するきっかけ又は刺激の環境に曝されることにより起こる。ある態様では、化合物Ａによる治療は、患者における再発の頻度を減少させる。ある態様では、再発相にある化合物Ａによる治療は、患者における少なくとも一つの乱用及び依存物質によるＤＳＭ−ＩＶ記載の症状を減少させる。ある態様では、実施例に示したような、及びこれに限定されることなく、再発相における化合物Ａによる治療は、多幸感，無気力，興奮 無謀さ，判断力の低下、衝動強迫、攻撃性、怒り、乱用及び依存してきた物質の渇望、及び気分障害の少なくとも一つの物質乱用及び依存の症状を軽減する。ある態様では、化合物Ａによる患者において、再発相における治療により離脱症状を軽減する。ある態様では、化合物Ａを投与することにより、再発相にある患者にとってストレスのたまる出来事による乱用物質の渇望を減少させることができる。
【００５３】
物質乱用、依存、離脱の治療は、相に従い行われる。ある態様では、患者が物質を使用しない最初の期間は、化合物Ａによる治療の開始前が好ましい。ある態様では、最初は、化合物Ａを低容量で投与する。ある態様では、望ましい治療効果が見られるまでは、投与量を上げていく。ある態様では、患者の症状、副作用及び物質の渇望を最小限にするという病態の治療に最適な投与量を決定するために化合物Ａの投与量を上げていく。
【００５４】
ある態様では、化合物Ａによる治療が回復を促進する。ある態様では、化合物Ａの投与量は、患者に回復が見られた後は、変わらない又は徐々に減らす。
【００５５】
本発明は、少なくとも一つの物質からの、乱用、依存又は離脱の少なくとも一つの症状に罹り又は罹る可能性のある患者の治療方法を提供する。方法には、患者に治療上の有効量の化合物Ａを投与することを含む。ある態様では、依存薬物及び治療薬から選択される少なくとも一つの物質がある。ある態様では、依存薬物は、神経刺激剤、オピオイド、幻覚剤、吸入剤、鎮静剤、精神安定剤、睡眠剤、抗不安剤、及び違法薬物から選択される。ある態様では、神経刺激剤は、β−フェニルイソプロピルアミン誘導体である。ある態様では、β−フェニルイソプロピルアミン誘導体は、アンフェタミン、デキストロアンフェタミン、及びメタンフェタミンから選択される。ある態様では、神経刺激剤は、エクスタシー、フェンメトラジン、メチルフェニデート、ジエチルプロピオン、ペモリン、マジンドール、（−）カチノン、及びフェンフルラミンから選択される。ある態様では、オピオイドは、ロータブ、トラマドール、ヘロイン、メタドン、ヒドロコドン、及びオキシコドンから選択される。ある態様では、幻覚剤は、シロシビン、幻覚キノコ、リゼルギン酸ジエチルアミド（ＬＳＤ）、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、及びケタミンから選択される。ある態様では、吸入剤は、ベンゼン、トルエン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、フルオロベンゼン、ｏ−ジフルオロベンゼン、１、３、５−トリフルオロベンゼン、１、２、４−トリフルオロベンゼン、ペンタフルオロトルエン、ペンタフルオロベンゼン、及びペルフルオロベンゼンから選択される。ある態様では、治療薬は、麻酔剤、鎮痛剤、抗コリン剤、抗ヒスタミン剤、筋弛緩剤、非ステロイド性抗炎症薬、ＯＴＣ薬、及び抗うつ薬から選択される。ある態様では、依存薬物は、コカイン、アルコール、カフェイン、アヘン、カンナビノイド、カンナビス、ベンゾジアゼピン、カリソプロドール、タバコ、ニコチン、バイコジン、ローセット、ペルコセット、ペルコダン、及びタイロックスがある。ある態様では、依存薬物はコカインであり、化合物Ａが患者のコカイン乱用及び依存の症状である、注意欠陥・多動性障害；多幸感；活力、興奮、及び社会性の増加；空腹感及び疲労の減少；身体的及び精神的な感受性の顕著な増加； 痛みの減少； 気管支炎； 息切れ； 胸痛； 動悸； 不整脈； 心筋症；心臓発作； 瞳孔散大； 吐き気； 嘔吐； 頭痛； 回転揺性目眩； 動揺性目眩；不安；精神病； 錯乱； 鼻粘膜炎症； 鼻粘膜痂皮； 反復性鼻血； 鼻づまり； 顔面痛； 情動不安；及びコカインの渇望の少なくとも一つを減少させる。ある態様では、依存薬物はコカインであり、化合物Ａがコカイン乱用及び依存の陰性自覚症状を増加させる。ある態様では、依存薬物はコカインであり、化合物Ａは、疲労、喜びの欠如、抑鬱、興奮、睡眠障害、食欲増加、精神運動遅延、動揺、過剰な疑い深さ、及びコカインの渇望から選択されるコカイン離脱症状を減少させる。ある態様では、化合物Ａによる治療により、患者の、注意欠陥・多動性障害ＩＶ評価尺度（ＡＤＨＤ−ＩＶ）、ハミルトン鬱病評価尺度（ＨＡＭ−Ｄ）、ハミルトン不安評価尺度（ＨＡＭ−Ａ）、ベック抑鬱評価尺度（ＢＤＩ）、神経精神科検査によるやる気スコア、及び認知機能検査スケールの値の少なくとも一つを改善する。ある態様では、認知機能評価尺度は、ウェクスラー成人知能検査−改訂版（ＷＡＩＳ−Ｒ）、ウェクスラー記憶検査−改訂版（ＷＭＳ−Ｒ）、レイの聴覚性言語性記憶の検査（ＲＡＶＬＴ、試行Ｉ−ＶＩＩ）、レイの視覚認知能力検査（ＲＣＦＴ）、及びトレイルメイキングテスト（ＴＭＴ、Ａ及びＢ部）から選択される。ある態様では、化合物Ａは、患者による物質の使用量及び頻度の少なくとも一つを減少させる。ある態様では、化合物Ａは、患者による少なくとも一つの物質による乱用、依存又は離脱症状の少なくとも一つを減少させる。ある態様では、化合物Ａは、職場、学校、又は家庭において義務の重要な役割を履行することができないことによる物質の使用の再発；身体的に有害な状況における物質の使用の再発；物質に関連する法的な問題による再発；及び、乱用物質の影響により社会的又は対人的な問題が継続又は再発するにもかかわらず行うコカインの継続的な使用から選択される、患者において再発した物質乱用の少なくとも一つの症状を減少させる。ある態様では、化合物Ａは、耐性；離脱；乱用物質は、しばしば想定されていたよりも大用量又は長期間にわたって摂取されること；乱用物質の制御への継続的な望み及び／又は成功しない努力があること；乱用物質の取得活動、物質の使用、又はその影響からの回復に多大な時間が費やされること；乱用物質の使用のために、重要な社会的、職業的又は娯楽の活動を諦め、及び／又は減らすこと；及び、物質により発生又は悪化させると考えられている継続的に及び／又は再発する身体的及び／又は精神的問題であることを知っていながら、物質の使用を続けてしまうことから選択される少なくとも一つの物質依存による症状を減少させる。ある態様では、化合物Ａは、患者の回復を促進する。ある態様では、回復は、短期間の完全回復、短期間の部分的回復、持続的な完全回復、及び持続的な部分的回復により特徴づけられる。ある態様では、化合物Ａは、患者において再発までの期間を引き延ばす。ある態様では、方法は、随伴性マネジメント及び認知行動療法の少なくとも一つの治療をさらに含む。ある態様では、方法はさらに、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）、ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＮＲＩ）、ノルエピネフリン−ドパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）、セロトニン５−ヒドロキシトリプタミン１Ａ（５ＨＴ１Ａ）受容体アンタゴニスト、ドパミンβ−ヒドロキシラーゼ阻害剤、アデノシン受容体アンタゴニスト、アデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニスト、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤、ナトリウムチャネルブロッカー、カルシウムチャンネルブロッカー、中枢及び末梢αアドレナリン受容体アンタゴニスト、中枢αアドレナリン受容体アゴニスト、中枢又は末梢βアドレナリン受容体アンタゴニスト、ＮＫ−１受容体アンタゴニスト、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）アンタゴニスト、非典型的抗うつ剤／抗精神病薬、三環系抗うつ剤、抗けいれん剤、グルタミン酸アンタゴニスト，γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）アゴニスト、ＧＡＢＡ代謝酵素��害剤、ＧＡＢＡ合成活性化剤、部分ドパミンＤ２アゴニスト、ドパミン代謝酵素阻害剤、カテコール−Ｏ−メチル−トランスフェラーゼ阻害剤、オピオイド受容体アンタゴニスト、気分安定剤、直接的又は間接的ドパミン受容体アゴニスト、５ＨＴ１受容体部分アゴニスト、セロトニン５ＨＴ２受容体アンタゴニスト、オピオイド、カルボキシラーゼ阻害剤、オピオイド受容体部分アゴニスト、ニコチン受容体部分アゴニスト、及び吸入剤から選択される少なくとも一つの他の薬剤の治療上の有効量を同時投与（co-administering）することを含む。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、パロキセチン、セルトラリン、シタロプラム、エスシタロプラム、及びフルオキセチンから選択されるＳＳＲＩである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、デュロキセチン、ミルタザピン、及びベンラファキシンから選択されるＳＮＲＩである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ブプロピオン及びアトモキセチンから選択されるＮＲＩである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ＮＤＲＩであるブプロピオンである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ドパミンβ−ヒドロキシラーゼ阻害剤はジスルフィラムである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、アデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニストであるイストラデフィリンである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ラモトリジン、カルバマゼピン、オキサカルバゼピン、及びバルプロ酸から選択されるナトリウムチャネルブロッカーである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ニモジピン、ラモトリジン、及びカルバマゼピンから選択されるカルシウムチャンネルブロッカーである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、中枢及び末梢αアドレナリン受容体アンタゴニストであるプラゾシンである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、中枢αアドレナリン受容体アゴニストであるクロニジンである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、中枢又は末梢βアドレナリン受容体アンタゴニストであるプロプラノロールである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ブプロピオン、オランゼピン、リスペリドン、及びクエチアピンから選択される非典型的抗うつ剤／抗精神病薬である。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、アミトリプチリン、アモキサピン、デシプラミン、ドキセピン、イミプラミン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、及びトリミプラミントリミプラミンから選択される三環性抗うつ薬である。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、フェニトイン、ラモトリジン、カルバマゼピン、オキサカルバゼピン、バルプロ酸、トピラメート、チアガピン、ビバガトリン、及びレベチラセタムから選択される抗けいれん剤である。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、グルタミン酸アンタゴニストであるトピラメートである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、バクロフェン、バルプロ酸、及びトピラメートから選択されるＧＡＢＡアゴニストである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ドパミン代謝酵素阻害剤であるカルビドパである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ドパミンＤ２受容体部分アゴニストで��るアリピプラゾールである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ナルトレキソン及びナロキソンから選択されるオピオイド受容体アンタゴニストである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、カルバマゼピン及びリチウムから選択される気分安定剤である。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ドパミン、ブロモクリプチン、ペルゴリド、アマンタジン、マジンドール、及びメチルフェニデートから選択される直接的又は間接的ドパミン受容体アゴニストである。ある態様では、少なくとも他の薬剤は、５ＨＴ１受容体部分アゴニストであるゲピロンである。ある態様では、少なくとも他の薬剤は、セロトニン５ＨＴ２受容体アンタゴニストであるリタンセリンである。ある態様では、少なくとも他の薬剤は、オピオイドであるメタドンである。ある態様では、少なくとも他の薬剤は、オピオイド受容体部分アゴニストであるブプレノルフィンである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ニコチン受容体部分アゴニストであるチャンピックスである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ベンゼン、トルエン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、フルオロベンゼン、ｏ−ジフルオロベンゼン、１、３、５−トリフルオロベンゼン、１、２、４−トリフルオロベンゼン、ペンタフルオロトルエン、ペンタフルオロベンゼン、及びペルフルオロベンゼンから選択される吸入剤である。ある態様では、方法は、ベンゾジアゼピン、レボドパ、カリソプロドール、モダフィニル、アカンプロセート，γ−ブチロラクトン，γ−ヒドロキシ酪酸、アヘン、シロシビン、幻覚キノコ、タバコ、及びニコチンから選択される少なくとも一つの他の薬剤を、治療上の有効量を同時投与することを含む。ある態様では、化合物Ａは、物質を禁断中の期間経過後に患者に投与される。ある態様では、化合物Ａを治療上の有効量を、治療効果が見られるまで増量して患者に投与する。ある態様では、化合物Ａの用量は、回復してから減少させる。ある態様では、化合物Ａの用量は、回復してからも変化がない。
【００５６】
本発明は、患者における少なくとも一つの物質における少なくとも一つの物質依存相を治療するための方法も提供する。ある態様では、少なくとも一つの物質依存相は、獲得、維持、消滅、及び再発から選択される。方法は、患者に化合物Ａの治療上の有効量を投与することを含む。ある態様では、化合物Ａは、患者における獲得相の進行を阻害する。ある態様では、化合物Ａは、患者における消滅相の進展を促進する。ある態様では、化合物Ａは、患者における再発の回数を減少する。ある態様では、少なくとも一つの物質から依存薬物及び治療薬から選択される物質である。ある態様では、依存薬物は、神経刺激剤、オピオイド、幻覚剤、吸入剤、鎮静剤、精神安定剤、睡眠剤、抗不安剤、及び違法薬物から選択されるものである。ある態様では、神経刺激剤は、β−フェニルイソプロピルアミン誘導体である。ある態様では、β−フェニルイソプロピルアミン誘導体は、アンフェタミン、デキストロアンフェタミン、及びメタンフェタミンから選択されるものである。ある態様では、神経刺激剤は、エクスタシー、フェンメトラジン、メチルフェニデート、ジエチルプロピオン、ペモリン、マジンドール、（−）カチノン、及びフェンフルラミンから選択されるものである。ある態様では、オピオイドは、ロータブ、トラマドール、ヘロイン、メタドン、ヒドロコドン、及びオキシコドンから選択されるものである。ある態様では、幻覚剤は、シロシビン、幻覚キノコ、リゼルギン酸ジエチルアミド（ＬＳＤ）、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、及びケタミンから選択されるものである。ある態様では、吸入剤は、ベンゼン、トルエン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、フルオロベンゼン、ｏ−ジフルオロベンゼン、１、３、５−トリフルオロベンゼン、１、２、４−トリフルオロベンゼン、ペンタフルオロトルエン、ペンタフルオロベンゼン、及びペルフルオロベンゼンから選択されるものである。ある態様では、治療薬は、麻酔剤、鎮痛剤、抗コリン剤、抗ヒスタミン剤、筋弛緩剤、非ステロイド性抗炎症薬、ＯＴＣ薬、及び抗うつ薬から選択されるものである。ある態様では、依存薬物は、アルコール、カフェイン、アヘン、カンナビノイド、カンナビス、ベンゾジアゼピン、カリソプロドール、タバコ、ニコチン、バイコジン、ローセット、ペルコセット、ペルコダン、及びタイロックスから選択されるものである。ある態様では、化合物Ａの処方により、患者の、ＡＤＨＤ−ＩＶ、ＨＡＭ−Ｄ、ＨＡＭ−Ａ、ＢＤＩ、神経精神病による無気力評価尺度、及び認知機能評価尺度のスコアの少なくとも一つを改善する。ある態様では、認知機能評価尺は、ＷＡＩＳ−Ｒ、ＷＭＳ−Ｒ、ＲＡＶＬＴ、試行Ｉ−ＶＩＩ、ＲＣＦＴ、及びＴＭＴ、Ａ及びＢ部から選択される。ある態様では、化合物Ａは、患者において少なくとも一つの物質の使用量及び頻度の少なくとも一つを減少させる。ある態様では、化合物Ａは、患者における少なくとも一つの物質による乱用、依存又は離脱症状の少なくとも一つを減少させる。ある態様では、化合物Ａは、職場、学校、又は家庭において重要な役割を履行することができないことによる物質の使用の再発；身体的に有害な状況における物質の使用の再発；物��に関連した法的な問題による再発；及び、乱用物質の影響により起き又は悪化した社会的又は対人的な問題が継続又は再発するにもかかわらず行う物質の継続的な使用の再発から選択される、患者による物質乱用の少なくとも一つの症状を減少させる。ある態様では、化合物Ａは、耐性；離脱；乱用物質は、しばしば想定されていたよりも大用量又は長期間にわたって摂取されること；乱用物質の使用を減少し又は制御することへの継続的な望み及び／又は成功しない努力すること；乱用物質の取得活動、物質の使用、及びその影響からの回復の少なくとも一つの活動に多大な時間が費やされること；乱用物質の使用のために、重要な社会的、職業的又は娯楽の活動を諦め、及び／又は減らすこと；及び、物質により発生又は悪化させると考えられている継続的に及び／又は再発する身体的及び／又は精神的問題であることを知っていながら、物質の使用を続けてしまうことから選択される少なくとも一つの物質依存による症状を減少させる。ある態様では、化合物Ａは、患者の回復を促進する。ある態様では、回復は、短期間の完全回復、短期間の部分的回復、持続的な完全回復、及び持続的な部分的回復の少なくとも一つにより特徴づけられる。ある態様では、化合物Ａは、患者において再発までの期間を引き延ばす。ある態様では、方法は更に、予備的マネジメント及び認知行動療法の少なくとも一つにより治療することを含む。ある態様では、方法はさらに、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）、ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＮＲＩ）、ノルエピネフリン−ドパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）、セロトニン５−ヒドロキシトリプタミン１Ａ（５ＨＴ１Ａ）受容体アンタゴニスト、ドパミンβ−ヒドロキシラーゼ阻害剤、アデノシン受容体アンタゴニスト、アデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニスト、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤、ナトリウムチャネルブロッカー、カルシウムチャンネルブロッカー、中枢及び末梢αアドレナリン受容体アンタゴニスト、中枢αアドレナリン受容体アゴニスト、中枢又は末梢βアドレナリン受容体アンタゴニスト、ＮＫ−１受容体アンタゴニスト、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）アンタゴニスト、非典型的抗うつ剤／抗精神病薬、三環系抗うつ剤、抗けいれん剤、グルタミン酸アンタゴニスト，γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）アゴニスト、ＧＡＢＡ代謝酵素阻害剤、ＧＡＢＡ合成活性化剤、部分ドパミンＤ２アゴニスト、ドパミン代謝酵素阻害剤、カテコール−Ｏ−メチル−トランスフェラーゼ阻害剤、オピオイド受容体アンタゴニスト、気分安定剤、直接的又は間接的ドパミン受容体アゴニスト、５ＨＴ１受容体部分アゴニスト、セロトニン５ＨＴ２受容体アンタゴニスト、オピオイド、カルボキシラーゼ阻害剤、オピオイド受容体部分アゴニスト、ニコチン受容体部分アゴニスト、及び吸入剤から選択される少なくとも一つの他の薬剤の治療上の有効量を同時投与することを含む。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、パロキセチン、セルトラリン、シタロプラム、エスシタロプラム、及びフルオキセチンから選択されるＳＳＲＩである。���る態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、デュロキセチン、ミルタザピン、及びベンラファキシンから選択されるＳＮＲＩである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ブプロピオン及びアトモキセチンから選択されるＮＲＩである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ＮＤＲＩであるブプロピオンである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ドパミンβ−ヒドロキシラーゼ阻害剤はジスルフィラムである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、アデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニストであるイストラデフィリンである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ラモトリジン、カルバマゼピン、オキサカルバゼピン、及びバルプロ酸から選択されるナトリウムチャネルブロッカーである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ニモジピン、ラモトリジン、及びカルバマゼピンから選択されるカルシウムチャンネルブロッカーである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、中枢及び末梢αアドレナリン受容体アンタゴニストであるプラゾシンである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、中枢αアドレナリン受容体アゴニストであるクロニジンである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、中枢又は末梢βアドレナリン受容体アンタゴニストであるプロプラノロールである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ブプロピオン、オランゼピン、リスペリドン、及びクエチアピンである非典型的抗うつ剤／抗精神病薬である。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、アミトリプチリン、アモキサピン、デシプラミン、ドキセピン、イミプラミン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、及びトリミプラミントリミプラミンから選択される三環性抗うつ薬である。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、フェニトイン、ラモトリジン、カルバマゼピン、オキサカルバゼピン、バルプロ酸、トピラメート、チアガピン、ビバガトリン、及びレベチラセタムから選択される抗けいれん剤である。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、グルタミン酸アンタゴニストであるトピラメートである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、バクロフェン、バルプロ酸、及びトピラメートから選択されるＧＡＢＡアゴニストである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ドパミン代謝酵素阻害剤であるカルビドパである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ドパミンＤ２受容体部分アゴニストであるアリピプラゾールである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ナルトレキソン及びナロキソンから選択されるオピオイド受容体アンタゴニストである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、カルバマゼピン及びリチウムから選択される気分安定剤である。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ドパミン、ブロモクリプチン、ペルゴリド、アマンタジン、マジンドール、及びメチルフェニデートから選択される直接的又は間接的ドパミン受容体アゴニストである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、５ＨＴ１受容体部分アゴニストであるゲピロンである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、セロトニン５ＨＴ２受容体アンタゴニストであるリタンセリンである。ある態��では、少なくとも一つの他の薬剤は、オピオイドであるメタドンである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、オピオイド受容体部分アゴニストであるブプレノルフィンである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ニコチン受容体部分アゴニストであるチャンピックスである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ベンゼン、トルエン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、フルオロベンゼン、ｏ−ジフルオロベンゼン、１、３、５−トリフルオロベンゼン、１、２、４−トリフルオロベンゼン、ペンタフルオロトルエン、ペンタフルオロベンゼン、及びペルフルオロベンゼンから選択される吸入剤である。ある態様では、方法はさらに、ベンゾジアゼピン、レボドパ、カリソプロドール、モダフィニル、アカンプロセート，γ−ブチロラクトン，γ−ヒドロキシ酪酸、アヘン、シロシビン、幻覚キノコ、タバコ、及びニコチンから選択される少なくとも一つの他の薬剤を、治療上の有効量を同時投与することを含む。ある態様では、化合物Ａは、物質の禁断中の期間経過後に患者に投与される。ある態様では、化合物Ａを治療上の有効量を、治療効果が見られるまで増量して患者に投与する。ある態様では、化合物Ａの用量は、回復してから減少させる。ある態様では、化合物Ａの用量は、回復してからも変化がない。
【００５７】
本発明は、患者におけるコカイン依存の少なくとも一つの相を治療するための方法も提供する。ある態様では、少なくとも一つの物質依存相は、獲得、維持、消滅、及び再発から選択される。ある態様では、方法は、化合物Ａの治療上の有効量を投与することを含む。ある態様では、化合物Ａは、患者における獲得相の進行を阻害する。ある態様では、化合物Ａは、患者における消滅相の進展を促進する。ある態様では、化合物Ａは、患者における再発の回数を減少させる。ある態様では、化合物Ａは、患者においてコカインの乱用、依存、又は離脱の症状の少なくとも一つを減少させる。ある態様では、化合物Ａは、職場、学校、又は家庭において重要な役割を履行することができないことによるコカインの使用の再発；身体的に有害な状況におけるコカインの使用の再発；コカインに関連した法的な問題による再発；及び、コカインの影響により起き又は悪化した社会的又は対人的な問題が継続又は再発するにもかかわらず行うコカインの継続的な使用の再発から選択される、患者によるコカイン乱用の少なくとも一つの症状を減少させる。ある態様では、化合物Ａは、耐性；離脱；乱用物質は、しばしば想定されていたよりも大用量又は長期間にわたって摂取されること；コカインの使用を減少し又は制御することへの継続的な望み及び／又は成功しない努力をすること；コカインの取得活動、コカインの使用、及びその影響からの回復の少なくとも一つの活動に多大な時間が費やされること；コカインの使用のために、重要な社会的、職業的又は娯楽の活動を諦め、及び／又は減らすこと；及び、コカインの使用により継続的に又は再発すると考えられている身体的又は精神的問題が発生又は悪化するらしいことを知っていながらコカインの使用を続けてしまうこと、から選択される少なくとも一つのコカイン依存による症状を減少させる。ある態様では、化合物Ａは、注意欠陥・多動性障害；多幸感；活力、興奮、及び社会性の増加；空腹感及び疲労の減少；身体的及び精神的な感受性の顕著な増加；痛みの減少；気管支炎；息切れ；胸痛；動悸；不整脈；心筋症；心臓発作；瞳孔散大；吐き気；嘔吐；頭痛；回転揺性目眩；動揺性目眩；不安；精神障害； 錯乱； 鼻粘膜炎症； 鼻粘膜痂皮； 反復性鼻血； 鼻づまり； 顔面痛； 情動不安；及びコカインの渇望から選択されるコカイン乱用及び依存の少なくとも一つの症状を減少させる。ある態様では、化合物Ａは、コカイン乱用及び依存の陰性自覚症状の少なくとも一つを増加させる。ある態様では、化合物Ａは、患者の回復を促進する。ある態様では、回復は、短期間の完全回復、短期間の部分的回復、持続的な完全回復、及び持続的な部分的回復により特徴づけられる。ある態様では、化合物Ａは、患者において再発までの期間を引き延ばす。ある態様では、方法は、随伴性マネジメント及び認知行動療法の少なくとも一つの治療をさらに含む。ある態様では、方法はさらに、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）、ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＮＲＩ）、ノルエピネフリン−ドパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）、セロトニン５−ヒドロキシトリプタミン１Ａ（５ＨＴ１Ａ）受��体アンタゴニスト、ドパミンβ−ヒドロキシラーゼ阻害剤、アデノシン受容体アンタゴニスト、アデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニスト、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤、ナトリウムチャネルブロッカー、カルシウムチャンネルブロッカー、中枢及び末梢αアドレナリン受容体アンタゴニスト、中枢αアドレナリン受容体アゴニスト、中枢又は末梢βアドレナリン受容体アンタゴニスト、ＮＫ−１受容体アンタゴニスト、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）アンタゴニスト、非典型的抗うつ剤／抗精神病薬、三環系抗うつ剤、抗けいれん剤、グルタミン酸アンタゴニスト，γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）アゴニスト、ＧＡＢＡ代謝酵素阻害剤、ＧＡＢＡ合成活性化剤、部分ドパミンＤ２アゴニスト、ドパミン代謝酵素阻害剤、カテコール−Ｏ−メチル−トランスフェラーゼ阻害剤、オピオイド受容体アンタゴニスト、気分安定剤、直接的又は間接的ドパミン受容体アゴニスト、５ＨＴ１受容体部分アゴニスト、セロトニン５ＨＴ２受容体アンタゴニスト、オピオイド、カルボキシラーゼ阻害剤、オピオイド受容体部分アゴニスト、ニコチン受容体部分アゴニスト、及び吸入剤から選択される少なくとも一つの他の薬剤の治療上の有効量を同時投与することを含む。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、パロキセチン、セルトラリン、シタロプラム、エスシタロプラム、及びフルオキセチンから選択されるＳＳＲＩである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、デュロキセチン、ミルタザピン、及びベンラファキシンから選択されるＳＮＲＩである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ブプロピオン及びアトモキセチンから選択されるＮＲＩである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ＮＤＲＩであるブプロピオンである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ドパミンβ−ヒドロキシラーゼ阻害剤はジスルフィラムである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、アデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニストであるイストラデフィリンである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ラモトリジン、カルバマゼピン、オキサカルバゼピン、及びバルプロ酸から選択されるナトリウムチャネルブロッカーである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ニモジピン、ラモトリジン、及びカルバマゼピンから選択されるカルシウムチャンネルブロッカーである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、中枢及び末梢αアドレナリン受容体アンタゴニストであるプラゾシンである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、中枢αアドレナリン受容体アゴニストであるクロニジンである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、中枢又は末梢βアドレナリン受容体アンタゴニストであるプロプラノロールである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、非典型的抗うつ剤／抗精神病薬ブプロピオン、オランゼピン、リスペリドン、及びクエチアピン。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、アミトリプチリン、アモキサピン、デシプラミン、ドキセピン、イミプラミン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、及びトリミプラミンから選択される三環性抗うつ薬である。ある態様では、少なくとも一つ��他の薬剤は、フェニトイン、ラモトリジン、カルバマゼピン、オキサカルバゼピン、バルプロ酸、トピラメート、チアガピン、ビバガトリン、及びレベチラセタムから選択される抗けいれん剤である。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、グルタミン酸アンタゴニストであるトピラメートである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、バクロフェン、バルプロ酸、及びトピラメートから選択されるＧＡＢＡアゴニストである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ドパミン代謝酵素阻害剤であるカルビドパである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ドパミンＤ２受容体部分アゴニストであるアリピプラゾールである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ナルトレキソン及びナロキソンから選択されるオピオイド受容体アンタゴニストである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、カルバマゼピン及びリチウムから選択される気分安定剤である。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ドパミン、ブロモクリプチン、ペルゴリド、アマンタジン、マジンドール、及びメチルフェニデートから選択される直接的又は間接的ドパミン受容体アゴニストである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、５ＨＴ１受容体部分アゴニストであるゲピロンである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、セロトニン５ＨＴ２受容体アンタゴニストであるリタンセリンである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、オピオイドであるメタドンである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、オピオイド受容体部分アゴニストであるブプレノルフィンである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ニコチン受容体部分アゴニストであるチャンピックスである。ある態様では、少なくとも一つの他の薬剤は、ベンゼン、トルエン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、フルオロベンゼン、ｏ−ジフルオロベンゼン、１、３、５−トリフルオロベンゼン、１、２、４−トリフルオロベンゼン、ペンタフルオロトルエン、ペンタフルオロベンゼン、及びペルフルオロベンゼンから選択される吸入剤である。ある態様では、方法は、ベンゾジアゼピン、レボドパ、カリソプロドール、モダフィニル、アカンプロセート，γ−ブチロラクトン，γ−ヒドロキシ酪酸、アヘン、シロシビン、幻覚キノコ、タバコ、及びニコチンから選択される少なくとも一つの他の薬剤を、治療上の有効量を同時投与することを含む。ある態様では、化合物Ａは、物質の禁断中の期間経過後に患者に投与される。ある態様では、化合物Ａを治療上の有効量を、治療効果が見られるまで増量して患者に投与する。ある態様では、化合物Ａの用量は、回復してから減少させる。ある態様では、化合物Ａの用量は、コカイン依存から回復してからも変化がない。ある態様では、化合物Ａは、患者の二次的物質による乱用、依存、又は離脱症状の少なくとも一つを治療する。ある態様では、少なくとも一つの二次的物質は、乱用薬物及び治療薬から選択されるものである。ある態様では、依存薬物が、神経刺激剤、オピオイド、幻覚剤、吸入剤、鎮静剤、精神安定剤、睡眠剤、抗不安剤、及び違法薬物から選択されるものである。ある態様では、神経刺激剤は、β��フェニルイソプロピルアミン誘導体である。ある態様では、β−フェニルイソプロピルアミン誘導体は、アンフェタミン、デキストロアンフェタミン、及びメタンフェタミンから選択されるものである。ある態様では、神経刺激剤は、エクスタシー、フェンメトラジン、メチルフェニデート、ジエチルプロピオン、ペモリン、マジンドール、（−）カチノン、及びフェンフルラミンから選択されるものである。ある態様では、オピオイドは、ロータブ、トラマドール、ヘロイン、メタドン、ヒドロコドン、及びオキシコドンから選択されるものである。ある態様では、幻覚剤は、シロシビン、幻覚キノコ、リゼルギン酸ジエチルアミド（ＬＳＤ）、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、及びケタミンから選択されるものである。ある態様では、吸入剤は、ベンゼン、トルエン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、フルオロベンゼン、ｏ−ジフルオロベンゼン、１、３、５−トリフルオロベンゼン、１、２、４−トリフルオロベンゼン、ペンタフルオロトルエン、ペンタフルオロベンゼン、及びペルフルオロベンゼンから選択されるものである。ある態様では、治療薬は、麻酔剤、鎮痛剤、抗コリン剤、抗ヒスタミン剤、筋弛緩剤、非ステロイド性抗炎症薬、ＯＴＣ薬、及び抗うつ薬から選択されるである。ある態様では、乱用薬物は、アルコール、カフェイン、アヘン、カンナビノイド、カンナビス、ベンゾジアゼピン、カリソプロドール、タバコ、ニコチン、バイコジン、ローセット、ペルコセット、ペルコダン、及びタイロックスである。
【００５８】
薬学的に許容される誘導体は、酸、塩基、エノールエーテル、及びエステル、エステル、水和物、溶媒和物、及びプロドラッグの形態が含まれる。誘導体は、例えば、対応する中性薬剤の少なくとも一つの性質において薬物動態学的性質が優れたものが選択される。化合物Ａは、製剤化の前に誘導体化されていてもよい。
【００５９】
化合物Ａ又は薬学的に許容される誘導体の治療上の有効量は、中毒又は依存の重症度、依存、年齢及び患者の健康度合い、使用されてきた化合物の効力、及びその他の因子に依存して様々である。ある特定の態様では、治療上の有効量は、約０．１ミリグラム／（体重）ｋｇ（ｍｇ／ｋｇ）／日ないし約５０ｍｇ／（体重）ｋｇ／日である。他の態様では、用量は、約１．０ないし約１０ｍｇ／ｋｇ／日である。それゆえ、ある態様では、７０ｋｇのヒトにおける治療上の有効量は、約７．０ないし約３５００ｍｇ／日であり、他のある態様では、約７０ないし約７００ｍｇ／日である。
【００６０】
そのような疾患を治療の当該技術分野における通常の熟練者は、必要以上の試験を行うことなく、及び自分の知識や適用説明書に基づいて、中毒又は依存の治療又は予防のための化合物Ａの治療上の有効量を確定することができる。一般には、一例として、これに限定されることなく、化合物Ａは、医薬組成物として以下の経路によって投与される。経口、全身性（例えば、経皮、鼻腔内又は坐剤によって）又は非経口（例えば、筋肉内、静脈内又は皮下）である。医薬組成物は、一例として、これに限定されることなく、錠剤、丸薬、カプセル剤、半固体、散剤、持続性放出製剤、溶液、懸濁液、エリキシル剤、エアロゾル、又は、他のあらゆる適切な組成物の形態をとることができ、及びこれらは、一般に、化合物Ａと少なくとも一つの薬学的に許容される賦形剤と併用される。許容される賦形剤は、一例として、これに限定されることなく、非毒性、投与補助剤、及び化合物の治療効果に悪影響を与えるようなものでない化合物である。そのような賦形剤は、例えば、あらゆる、固体、液体、半固体、又は、エアロゾルの場合には、当該技術分野における熟練者が一般に入手できるガス状の賦形剤であってもよい。
【００６１】
固体の医薬賦形剤は、一例として、これに限定されることなく、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白墨、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、脱脂粉乳等がある。液体及び半固体の賦形剤は、水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール及び石油、動物性、植物性、又は合成油脂（例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等）を含む様々な油脂から選択されるものを含む。好ましい液体の担体は、特に注射用溶液としては、一例として、これに限定されることなく、水、生理食塩水、デキストロース水溶液及びグリコール類がある。圧縮ガスをエアロゾル形態の化合物の分散に用いてもよい。不活性ガスが適切であり、その目的に用いられる一例として、これに限定されることなく、窒素、一酸化炭素、亜酸化窒素等がある。
【００６２】
医薬製剤は、一例として、これに限定されることなく、さらに保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、香料、浸透圧を調節する塩、緩衝剤、マスキング剤又は抗酸化剤を含んでいてもよい。ある特定の態様では、更に他の治療に有効な物質を含んでいてもよい。他の適切な医薬担体及びその剤形は、Ａ． Ｒ． Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９８５、１７ｔｈ ｅｄ． Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。
【００６３】
組成物中の化合物Ａの用量は、例えば、剤形、投与単位の用量、賦形剤の種類、及び医薬品科学における当該技術分野における者に知られている他の因子により、様々である。一般に、最終組成物は、１０％（重量）ないし９０％（重量）が化合物であり、好ましくは２５％（重量）ないし７５％（重量）であり、残部に賦形剤を含む。好ましくは、医薬組成物は、継続的な治療においては単一の投与ユニットの形態によって投与され、又は、症状の緩和が特に必要な場合に投与する際に、単一の投与ユニットの形態で投与される。
【実施例１】
【００６４】
［１４Ｃ］−ネピカスタットの経口投与後、血漿中において、放射性同位体の大部分はネピカスタットのＮ−結合グルクロニド（代謝物２、Ｍ２）に付随したが、同定できない極性断片（Ｍｌ）が存在した。複数回投与においてもネピカスタットの顕著な凝集は見られずＴ１／２は、単回及び複数回投与において同様であった。Ｔ１／２は１０−１４時間であった。速いアセチレーター表現型及び遅いアセチレーター表現型の間でＣｍａｘ又はＡＵＣの有意差は見られなかったが、Ｎ−アセチル代謝物のＣｍａｘ又はＡＵＣは予想通り、速いアセチレーターに比べ、遅いアセチレーターではずっと低い値となった。絶食及び食後の４０ｍｇ錠剤の服用による薬物動態を比較すると、血漿中濃度の有意差は見られなかった。Ｔａｘは絶食では１．４時間だったのに対し、食後の服用では３．５時間に増加した。
【００６５】
男性及び女性において４０ｍｇを単回投与した場合のネピカスタットの薬物動態を比較した。ＡＵＣは約４３％女性の方が男性よりも大きく、Ｃｍａｘは約２３％女性の方が男性よりも大きかった。Ｔ１／２は、女性の方が男性よりも長かった。ネピカスタット４０ｍｇ投与後１０日の薬物動態は、Ｔ１／２には違いはなかったが、ＡＵＣは健常者の方がＣＨＥＦの患者よりも高かった。いずれの集団においても、複数回投与による顕著な蓄積はなかった。
【００６６】
ヒトにおいて、化合物に関連する放射能は、速やかに消失した。８７．４％の投与された放射性標識体は、最初の７２時間で８２．４％が尿中に、及び５．０１％が糞便中に回収された。１０日間で、合計平均９３．８％の放射性標識体が排泄された。血漿中、放射性同位体のＴａｘはｌ−２時間（ネピカスタットと同様である）であった。速い及び遅いアセチレーターのいずれにおいても、ネピカスタットのＮ−結合グルクロニドは、０ないし４８時間以上にわたり、血漿（２６．８％）及び尿中（５７．９％）に合計の放射性同位体は、もっとも大きな率で存在していた。血漿中の合計の放射性同位体の末端Ｔ１／２は非常に長く（〜１００時間）、遅く消失する低濃度の極性断片の存在によるものと考えられる。
【実施例２】
【００６７】
ネピカスタットの認知機能への影響を調べるため、被験者に５又は４０ｍｇのネピカスタットを投与したが、気分、睡眠、又は認知において顕著な障害はなかった。甲状腺における１２３Ｉの取り込みを調べるため、５、４０、及び１００ｍｇのネピカスタットを投与したが、プラセボに対して有意差はなかった。単回で２００ｍｇのネピカスタットの投与後、取り込みの減少は、プラセボに対して有意となったが、１０ｍｇのメチマゾール投与後におけるものよりは顕著に低かった。第Ｉ相臨床試験における単回投与試験において、５ないし８００ｍｇ（塩酸塩として計算）のネピカスタットの投与は、全般に健常者の男性において、耐性の値は良好であった。
【実施例３】
【００６８】
第Ｉ相臨床試験における複数回投与において、５及び４０ｍｇのネピカスタットの投与は、健常者の男性において、耐性の値は良好であった。
【００６９】
８日間以上２００ｍｇを投与した者６人中５人は、自然に湿疹が現れた。
【００７０】
６日間２００ｍｇのネピカスタット投与後に、１人は心房不整脈及び断続的な右脚ブロックを形成した。
【実施例４】
【００７１】
１６人の治療を希望しないコカイン依存の入院患者のボランティアを、二重盲検、対象者内のプラセボコントロールと対比し、試験した。インフォームドコンセントを行った後、参加の可能性のあるボランティアは、外来患者用の精神医学上の及び医学上のスクリーニングを行った。適格性を有するボランティアを選び、身体検査、ＥＫＧ、妊娠試験及び精神医学上の試験を完了した。参加者（ｎ＝１２）は、毎日、投与量を増加させてコカイン投与を受け（０ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、及び４０ｍｇ）、ネピカスタットを増量する増量法を用いて行った（０ｍｇ、８０ｍｇ、１６０ｍｇ）。並行群の参加者（ｎ＝４）は、試験中盲検試験を保つため、毎日、プラセボを処置された。それぞれの用量を処置する段階において、毎日４日間に渡り、又はネピカスタットの半減期の４倍以上の１０ないし１４時間間隔で投与した。それぞれの用量において４日目には、参加者は、コカインを０ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、及び４０ｍｇの順に投与を受けた。コカインは、心血管及び主観的な効果の両方がベースラインに戻るのに十分な１時間間隔で投与した。心血管の指標は、継続的なＥＧＫを用いて注意深くモニターし、コカインの投与を含む全ての過程を通じて頻繁に血圧を測定し、及び、停止パラメータを適切に設定し、あらかじめセットされた心血管の指標の限界を超える場合には、コカインを投与しないようにした。以前の試験において、コカイン３２ｍｇを６回の投与し、１４分の間隔で投与することが安全であり、投与間隔が１時間であれば、更に安全性が高いことが示されている。１０ｍｇのコカイン投与の薬物動態の分析のため、投与から３日目に０ｍｇネピカスタット及び、３日目に８０ｍｇ及び１６０ｍｇのネピカスタットを投与したものの血液サンプルを集めた。得られた情報からは、相互作用は考えられない。
【００７２】
それぞれの参加者は、試験が完了するまでに、約１２日間かかる。１６人の参加者は、試験を１年以内に完了する。
【００７３】
試験に参加するには、参加者は：
１．試験の時点で治療を必要としていない、英語を話すボランティアであること；
２．１８−５５歳であること；
３．コカイン依存のＤＳＭ−ＩＶ ＴＲ基準を満たすこと；
４．自己申告書において静注によるコカイン使用及び少なくとも一つのコカイン使用による陽性尿があったこと；
５．生体情報として、安静時の脈拍が５０及び９５ｂｐｍの間にあること、血圧が８５−１５０ｍｍＨｇ（最高血圧）及び４５−９６ｍｍＨｇ（最低血圧）であること；この基準は、承認の２日前に満たさなければならない；
６．血液及び化学物質検査において正常値の範囲内にあること（＋／−１０％）制限には以下の例外がある:ａ）肝臓機能検査値（総ビリルビン、ＡＬＴ、ＡＳＴ、及びアルカリホスファターゼ）＜正常値の３倍まで、及びｂ）腎機能検査値（クレアチニン及びＢＵＮ）＜正常値の２倍まで；
７．臨床的に正常な洞律動を示すＥＫＧベースラインを有すること、及び臨床的に顕著な不整脈を有しないこと；
８．治療履歴を持ち、簡単な医師の試験により、許可した医師及び治験責任医師の判断において、試験の参加に臨床的に顕著な禁忌がないこと。
【００７４】
参加予定者は、以下のいずれかに該当すると、参加できない:
１．てんかん発作の病歴又は疑いのある事実又は脳障害；
２．以前に、意識消失、胸痛、又はてんかん発作を含みコカインに対する医学的副作用があったこと；
３．神経又は精神障害、例えば；
・精神障害、双極性疾患又はＳＣＩＤにより大うつと診断されたこと；
・臨床面接において器質性脳疾患又は痴呆と判断されたこと；
・現在治療が必要又は試験のコンプライアンスが困難になるであろう何らかの精神疾患の病歴があること；
・自殺を試みた経歴があること、及び／又は、ＳＣＩＤにより現在自殺願望／計画を持っていると評価されたこと；
４．参加予定者が降圧薬を服用しているにもかかわらず、臨床的に重篤な心臓病又は高血圧であるとＰＩにより判断されたこと；
５．一親等以内の親族に早期の心血管疾患の有病又は死亡の家族歴があるとＰＩにより判断されたこと；
６．神経内分泌系、自己免疫系、腎臓系、肝臓系、又は活動性感染症を含む未治療または不安定な疾患の事実があること；
７．ＨＩＶ感染者であり現在症状があること、ＡＩＤＳと診断されたこと、又は高レトロウイルス薬の投与を受けていること；
８．妊娠又は授乳中であること。それ以外の女性は妊娠できない（例えば、外科的に不妊とした，不妊症、又は閉経後であること）、又は信頼できる形態の避妊を行っていること（例えば、禁欲していること，経口避妊薬，子宮内避妊器具、コンドーム、又は殺精子剤）。全ての女性は、病院の許可の前及び試験参加の終わりにおいて、尿による妊娠検査で、陰性でなければならない。
９．喘息であること、又は現在α又はβアゴニスト、テオフィリン、又は他の交感神経様作用薬を使用していること；
１０．ＰＩ及び／又は許可する医師が安全に及び／又はうまく試験を完了させるには除外した方がよいと判断した他の疾患、病態を持つ、又は向精神薬を使用している者。
兆候が見え始めた時点で中止する基準
１１．薬物のスクリーンで、コカインの違法使用を示す場合、コカイン、アルコール、オピオイド、又は他の乱用薬物で本プロトコールの一環として得られたものでないものについて尿が陽性、又は呼気検査で検出されたこと；
１２．試験の手続に従えない者；
１３．コカインに過剰に反応することにより以下の中止の基準に該当する場合。
中止の基準
【００７５】
参加者は、プロトコールに残るには、継続的に基準に適合していなければならない。顕著な不整脈又は生体情報が以下の許容範囲外にある場合には、コカイン投与を開始してはならない。安静時脈拍は、＜１３０ｂｐｍ、及び血圧が１６５ｍｍＨｇ（最高血圧）及び１００ｍｍＨｇ（最低血圧）以下であること。コカイン投与を受けて、生体情報が一過性の増加をすることはありうるため、これらの値は、治験に含むか／含まないかの基準値よりも高い。加えて、コカインの繰り返し投与は、コカイン毒性の兆候（動揺、精神障害、、試験の手続に協力できないこと）がある場合には行わない（及び、治験医がコカインの投与を中止する）。
以後の参加を中止する基準
【００７６】
以下のいずれかの兆候が現れた場合には、中止する。
１．最高血圧 ＢＰ＞１８０ｍｍＨｇが５分間以上続いたこと；
２．最低血圧 ＢＰ＞１２０ｍｍＨｇが５分間以上続いたこと；
３．心拍＞（２２０−年齢×０．８５）ｂｐｍが５分間以上続いたこと。
患者選別基準の論理的根拠
【００７７】
参加者は、より強力な内受容効果を受けることを避けるため、静注によるコカイン投与を受ける必要がある。判断未確定の心血管系疾患の患者の参加を避けるため、年齢の基準はあらかじめ定めていた。潜在的な基礎疾患の悪化を防ぐため活動性ＨＩＶ疾患の参加者は除いた；コカイン依存により高いリスクを負う無症候性ＨＩＶ疾患の患者もこの中に含めた。喘息患者（又は喘息治療薬服用者）は、βアゴニスト薬及びコカインの有害な相互作用の可能性のために除いた。
治験薬
【００７８】
コカインは、ＤＡ／ＮＥ、及びセロトニンのシナプス前小胞への取り込みを阻害することによる典型的な神経作動効果を有する。コカインは約９０分という短い排泄半減期を持つ。コカインの主な臨床効果は、精神運動の活発化及び交感神経系の緊張の増加であり、心拍及び血圧が上昇する事象として現れる。
【００７９】
コカインは単回投与で上限４０ｍｇまでの用量で投与され、上限は１３分間隔で２０ｍｇの用量を１０回投与することからなる自己投与で２００ｍｇまで投与できる。これらの用量は、本試験の参加者が毎日使用していたと報告した用量に比べて、少量である；典型的には、毎日平均２５０ｍｇないし５００ｍｇ以上の投与パターンであった。
【００８０】
提案した投与量よりもずっと多い用量となると、てんかん発作に関わり、重篤な心血管毒性及び死亡につながる。これらの毒性の可能性は、比較的低用量を用いること、そのおそれのあるボランティアへの注意深いスクリーニングを行うこと、コカイン投与後、参加者への注意深いモニタリングを行うこと、及び有害作用を生じた場合にはすみやかに医学的な介入を行えることにより、改善される。
【００８１】
コカインは静注により投与されるため、バイオアベイラビリティは完全である。コカインは、まず血漿中エステラーゼによりベンゾイルエクゴニンに代謝され、これはネピカスタットにより影響を受けるとの報告はない。ベンゾイルエクゴニン、及び他の少量の代謝物は腎排泄される。
【００８２】
ヒトへの静注用のコカインは、ＮＩＤＡとの契約で得、コカインに関するＮＩＤＡのＩＮＤ承認書はＦＤＡから得て提出した。
【００８３】
午前７時に、用量を増加させてネピカスタット投与する（０ｍｇ、８０ｍｇ、及び１６０ｍｇ）。それぞれの投与レベルで４日間投与を続ける。
【００８４】
低い用量から始め、最初の試験手続を完了した後に用量を増加させることにより、ネピカスタット及びコカインの併用のリスクを最小限にする。このアプローチは、これまで７％ないし２０％のボランティアに起こっていた発疹の可能性も減らすことができる。発疹は、用量及び治療期間に関連する。用量が１６０ｍｇを超えると、発疹のリスクが大きくなる。
【００８５】
ネピカスタットは、酵素阻害剤でないため薬物動態学的相互作用は想定していないが、１０ｍｇのコカイン投与において行った薬物動態学的評価により、ネピカスタットのそれぞれの用量レベルにおける投与で３日目に確認できた。ネピカスタットは、ＮＥの合成を減らすため、ネピカスタットでの治療中、コカインの効果は小さくなると考えられる。ネピカスタットは血漿中及び脳内のＤＡ濃度を高めるため、ＤＡ介在性の副作用、例えば、被害妄想が起こることが考えられる。これらの症状は、ＣＨＦでの試験中には見られなかったが、これらの試験において刺激薬は投与されなかった。
【００８６】
同意に従い、参加者は、薬物使用を行っている証拠としてコカイン陽性尿サンプルを提出する必要がある。（使用可能な装置の数に限定があるため）ある参加者には、スクリーニング中及び試験中テレメトリーを装着するように指示し、心拍及び動きを記録した。この装置からのデータから、これらのパラメータの変化により薬物使用を特定できる。
【００８７】
ニコチンに曝されるのを制限するため、試験前２時間以内は、コカイン摂取又は暴露に関わる喫煙は禁止される。参加者は、試験期間中、違法な及び処方による薬物の使用は控えるように指示され、これは毎日の尿及び呼気中のアルコールレベルによって確認される。
【００８８】
参加者は、検査期間中、その日のだいたい同じ時間に服用するように指示されている。コカインは検査室で投与される。２分以上かけて、コカイン又は生理食塩水のプラセボを、シリンジポンプを用いて投与する。薬物投与の１時間後、心拍及び血圧をモニターした。
【００８９】
参加者は目的の治療を受け、身体検査を受ける。血液は、ＣＢＣ、電解質、ＬＦＴ、及びクレアチニンを含む標準的検査のために、採取される。ＨＩＶスクリーニングは、参加者にサービスとして行われ、陽性の者はカウンセリングし、治療について言及した。
【００９０】
（使用可能な装置の数に限定があるため）アクチハートミニミッター（Ａｃｔｉｈｅａｒｔ Ｍｉｎｉ Ｍｉｔｔｅｒ）を用いて、ある参加者は参加許可の前に心拍及び動きを測定した。ミニミッターは、参加者の皮膚にペーストを用いて付着し、２週間までの期間で、侵襲なしにＥＧＫ及び動きを記録した。データは後の分析のためにＰＣにダウンロードできる。
【００９１】
参加者は、精神疾患簡易構造化面接法（ＭＩＮＩ）による、参加／排除の基準により決定されるコカイン及びニコチン依存のＤＳＭ−ＩＶ ＴＲ基準を満たさなければならない。ＭＩＮＩは、１９９０年に米国及び欧州で精神科医及び臨床医によってＤＳＭ−ＩＶ ＴＲ及びＩＣＤ−１０精神疾患のために開発された短い、構造的な診断用面接である。ＭＩＮＩは、臨床精神薬理学試験及び免疫学研究における評価及び結果の追跡に用いられている、精神評価及び構造化された精神科の面接の一つであり、世界でもっとも広く用いられている精神科の構造化診断の面接方法である。この装置は、被験者が薬物依存症の基準に適合しているか、及び何らかの大きな精神疾患を有しているかの判断において用いられる（例えば、情動障害、統合失調症）。
【００９２】
嗜癖重症度指標−ライト  臨床学的因子（ＡＳＩ−Ｌｉｔｅ ＣＦ）バージョンは、検査の間、訓練を受けた研究員により投与される。嗜癖重症度指標−ライトは、参加者の状態による、参加者の７つの分野における面接者による重症度の指標である（医療、雇用、薬物使用、アルコール使用、法的、家族／社会、及び精神）。ライトバージョンは、ＡＳＩ構成スコアの計算に、全ての質問を維持したままのＡＳＩの短いバージョンである。ＡＳＩの家族歴部分でも、ＡＳＩ−ライトバージョンでは、最小限の家族歴の情報を集め、維持されている。
【００９３】
１９９６年に改訂されたベック鬱評価尺度（ＢＤＩ）の第３世代がある。この尺度は、オリジナルの、約１０分で終了する２１項目の質問形式である。ＢＤＩ−ＩＩは、ＢＤＩ−ＩＡに対して改訂され、鬱／苦痛のよい指標として存在する。この指標は、参加者のうち、試験期間中に臨床的に鬱になった者に対して用いられ、参加者の安全を計るにも有用である。
【００９４】
現在、注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）の症状を、ＡＤＨＤ−ＩＶ評価スケールを用いて毎週評価している。
【００９５】
神経精神科検査（Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ）により得られたやる気スコアをベースラインで補正した。
【００９６】
頬の中を綿棒でこすってワットマンＦＴＡカードに適用し、ＤＮＡを得た。これらのカードは、ＤＮＡ抽出のための生体サンプルを安全に安定して保存することができる。予想されたゲノムＤＮＡは５０−１００μｇであり、現在入手可能な方法で５００以上の遺伝子型のアッセイに十分用いられる量である。
【００９７】
表現型は、５’エクソヌクレアーゼベース（タクマン社）の表現型アッセイを用いて行った。アッセイは、アプライドバイオシステム社（ＡＢＩ；アッセイバイデザイン）によって行われた。対立遺伝子の分離は、ＡＢＩ３７３０リアルタイムＰＣＲサイクラーによって行った。
【００９８】
コカインの薬物動態の分析のための血液サンプルは、０ｍｇのネピカスタット投与期間中（検査第１日）及び８０ｍｇ及び１６０ｍｇのネピカスタット投与期間中（検査第４及び８日）に採取した。血液サンプルは、それぞれの用量レベルのネピカスタット投与３日目に、コカイン１０ｍｇ投与後、１５、２０、３０、４０、５０、６０、９０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０、４２０及び４８０分後に採取した。それぞれの用量レベルのネピカスタット投与に合わせて、他の用量のコカイン（０−４０ｍｇ）も投与し、薬物動態評価が他の評価に影響しないようにした。血液を採取し、血漿を分離して、分析まで-７０℃で凍結させた。コカイン及びＢＥは液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いてアッセイした。これらのアッセイにおいては、参照試験機は、２．５ｎｇ／ｍｌの定量限界がある。薬物動態分析により、ネピカスタットはコカインの薬物動態に影響を与えることが明確になった。
【００９９】
ＤＢＨは、ＮＥ貯蔵顆粒に貯蔵されＮＥとともに分泌される。それゆえ、血漿中ＤＢＨは、中枢神経系における酵素活性のよい指標となる。血液は、毎日午前１０時に採取し（コカイン／プラセボ投与前）、次の分析のために保存した。ＤＢＨ活性は、チラミン−オクトパミン法を用い、上述した高速液体クロマトグラフィー−蛍光分析法を用いて測定した。これにより、ＤＢＨの経時変化の測定が可能となり、ネピカスタットによるＤＢＨ阻害の薬力学に関する考察を提供することができる。ＤＢＩは、気分の変化をモニターするために、プロトコールを通じて繰り返し投与された。
【０１００】
０ないし１００にスコア化するために、デジタル化された連続する１０ｃｍの直線からなるコンピュータ化された視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）を用いて主観的効果を測定した。参加者は、カーソルを左端から、ラインに沿って左又は右に動かして鬱の度合いを左又は右のマウスボタンによって表すよう指示されている。ＶＡＳはコカインによる多幸感、情動不安及び渇望を迅速に反映するようデザインされている。これらは、「何らかの薬物の効果」「高い」「よい効果」「興奮している」及び「悪影響」「被害妄想」「疑い深い」及び「入手できればコカインを使用する」「コカインを渇望する」「今はコカインを拒否できる」及び「コカインを欲する」。ＶＡＳ測定は、コカイン投与前、及び、投与後５、１０、１５、２０、３０、及び４５分に行われた。
【０１０１】
コカイン投与後５分後、（違法薬物提供者から現在購入するとしたら）＄５０／ｍｇを基準に、その用量の薬物にいくら支払うかを参加者に質問した。コカインの価格は時間と場所により変化し、応答を標準化するため、基準値を提供した。
【０１０２】
治験薬による治療最終日の第１３日、「試験期間」の全ての参加患者は、お金、又は、一連の二重盲検用のプラセボの投与又は２０ｍｇコカイン投与を選択した。ある期間ではプラセボ（生理食塩水）のみが選択可能であった。他の期間では２０ｍｇコカインのみが選択可能であった。参加者は自己投与のプラセボ又はお金、又は、２０ｍｇコカイン又はお金を選択した。これは、朝（午前）及び昼（午後）に行い、順序はランダムに、プラセボ又はネピカスタットが被験者の数に釣り合うように投与した。
実験（選択）項：
【０１０３】
それぞれの試験期間中、それぞれ患者は、注射（青又は、緑）又はお金の一連の選択をするように求められる。色は、サンプル期間中の投与量に対応する（コカイン０ｍｇ又は２０ｍｇ）。選択した２つの期間のそれぞれについて、点滴（一つの期間にはコカイン０ｍｇ静注、及び他の期間にはコカイン２０ｍｇ）又はお金に関して参加者は１０の選択をする。参加者は、お金を増額するオプション（＄０．０５、＄０．０５、＄０．０５、＄０．０５、＄１、＄４、＄７、＄１０、＄１３、及び＄１６）又は患者管理鎮痛（ＰＣＡ）ポンプを用いたコカイン（０ｍｇ又は２０ｍｇ／静注／点滴）の一連の選択をすることができる。
【０１０４】
コカイン点滴を選択した患者は、ＰＣＡボタンを用い、それに対してお金を選択した者は、治験監督者に口頭で申告させた。点滴は、２分以上に渡って行われ、３分の休止時間をおく。そのような場合、５分間隔の選択がなされることになる。
【０１０５】
参加者はコカイン投与を選択したことを申告した直後にコカインを受け取る。あらかじめセットされた最大２００ｍｇまでの投与における生体情報が残る（１０×２０ｍｇ）。お金の選択者は、選択の直後に受け取るが、このお金は退院までに使わなければならない。
表は、合計１６人の参加者の実験における選択期間である。
【表１】
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【０１０６】
ネピカスタットの１２の標本数は、最初の評価に適切な、治療されたグループが中程度から大きな大きさのものであれば、検出される。プロット（図１）は、有効なサイズが５ないし１５に変化する様子を表す。サイズ１２より大きいと、違いを検知する分析能力が上がっていくが、コストが増加する。プラセボ投与群は、盲検試験を保つためのものであり、比較群としては扱うことは意図していない。
【０１０７】
ネピカスタット治療群においては、分析は、主としてネピカスタットの効果に向けられている。プラセボ治療群は、主として盲検を保つためにある。副作用及び有害作用（ＡＥｓ）は表にし、ＡＮＯＶＡ又はカイ二乗検定を用いて、治療条件で比較した。コカイン静注及びプラセボ投与における、ネピカスタット治療の主作用及び心血管への作用と、プラセボを用いた治療における効果とを、反復測定分散分析（時間が繰り返し単位）（ＡＮＯＶＡ）、ピーク効果一元配置分散分析及び、及び必要なら曲線下面積ＡＮＯＶＡを用いて比較した。
【実施例５】
【０１０８】
チラミンからオクトパミンへの変換を測定することにより、ウシ及びヒトのドパミンβ−ヒドロキシラーゼ活性を測定した。ウシ副腎のドパミンβ−ヒドロキシラーゼはシグマ化学（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から得たのに対し、ヒトのドパミンβ−ヒドロキシラーゼは神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨの培地から精製した。アッセイは、ｐＨ５．２及び３２℃で、０．１２５Ｍ ＮａＡｃ、１０ｍＭフマル酸、０．５−２μＭＣｕＳＯ４、０．１ｍｇ．ｍｌ−１、０．１ｍＭチラミン及び４ｍＭアスコルビン酸を含んでいる培地中で行った。典型的なアッセイでは、反応混合物に０．５−１ミリ単位の酵素を加え、続いて、カタラーゼ、チラミン及びアスコルビン酸を含んだ基質混合物を加えて反応が開始した（最終容積２００μｌ）。サンプルは、適切な濃度のネピカスタット又は化合物Ｂを含み又は含まず、３７℃で３０ないし４０分培養された。２５ｍＭ ＥＤＴＡ、２４０μＭ ３−ヒドロキシチラミン（内部標準）を含む停止液でクエンチした。サンプルはオクトパミンを、逆相カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、２８０ｎＭの紫外線を検出）で分析した。ＨＰＬＣは、流速１ｍｌ．分−１であり、リクロカート１２５−４ ＲＰ−１８カラムを用い、及び均一溶出、１０ｍＭ塩酸、１０ｍＭ １−ヘプタンスルホン酸、１２ｍＭ テトラブチルアンモニウムホスファート及び１０％メタノールで行った。活性％は、内部標準を用いて作成した非線形４次元係数濃度反応曲線で適合させして、コントロールに基づいて計算した。
【０１０９】
ネピカスタット（Ｓ−エナンチオマー）及び化合物Ｂ（Ｒ−エナンチオマー）は、ウシ及びヒトドパミンβ−ヒドロキシラーゼの濃度依存的阻害活性を有する。算出したＩＣ５０値は、それぞれ８．５±０．８ｎＭ及び９．０±０．８ｎＭであった。化合物Ｂ（ＩＣ５０値は、ウシ及びヒト酵素それぞれに対し、２５．１±０．６ｎＭ及び１８．３±０．６ｎＭであった）は、ネピカスタットよりもわずかに活性が弱かった。ネピカスタットは、強力な阻害剤であることが示された。Ｓ−エナンチオマー（ネピカスタット）の阻害活性は、下限ぎりぎりではあったがＲ−エナンチオマー（化合物Ｂ）よりも有意に阻害効果があり、その阻害活性は立体特異的であることがわかった。
【０１１０】
選択された１２の酵素及び受容体に対するネピカスタットの効果は、受容体は、確立されたアッセイを通じて決定した。それぞれの酵素アッセイの根底にある理念の簡単な説明は、図２にある。結合データは、用量反応曲線により、４係数ロジスティック方程式に組み込んで分析した。Ｋｉ値は、チェン・プルソフの等式を用いて計算した。酵素活性は、ＩＣ５０値（酵素活性の５０％阻害に必要な濃度）で表した。
【０１１１】
ネピカスタットは、他の酵素（チロシンヒドロキシラーゼ、アセチルＣｏＡ合成酵素、アシルＣｏＡ−コレステロールアシルトランスフェラーゼ、Ｃａ２＋／カルモジュリンタンパク質キナーゼＩＩ、シクロオキシゲナーゼ−Ｉ、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、中性エンドペプチダーゼ、一酸化窒素合成酵素、ホスホジエステラーゼＩＩＩ、ホスホリパーゼＡ２、及びタンパク質キナーゼＣ）及び神経伝達物質受容体（α１Ａ、α１Ｂ、α２Ａ、α２Ｂ、β１及びβ２アドレノセプター、Ｍ１ムスカリン受容体、Ｄ１及びＤ２ドパミン受容体、μオピオイド受容体、５−ＨＴ１Ａ、５ＨＴ２Ａ、及び５ＨＴ２Ｃセロトニン受容体）に対する親和性（ＩＣ５０又はＫｉ＞１０μＭ）は無視できる程度である。ネピカスタットは、他の１２の受容体及び１３の神経伝達物質受容体に対する親和性は無視できる程度であるため、ドパミンβ−ヒドロキシラーゼに対する高い選択性を示すといえる。
【０１１２】
ＳＨＲに関連する試験においては、薬物、ネピカスタット（（Ｓ）−５−アミノメチル−１−（５、７−ジフルオロ−１、２、３、４−テトラヒドロナフト−２−イル）−１、３−ジヒドロイミダゾール−２−チオン塩酸塩）及び対応するＲ−エナンチオマー（化合物Ｂ）投与チューブを用いて経口投与した。イヌの試験では、薬物はカプセルに充填し、経口的に投与した。全ての投与は、遊離塩基等価体として示す。
【０１１３】
雄のＳＨＲ（１５−１６週齢、チャールスリバー社、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）をインビボ試験に用いた。試験の日には、動物は体重を計り、ランダムに媒体（コントロール）又は適切な用量のネピカスタット（３、１０、３０又は１００ｍｇ．ｋｇ−１、経口）又は化合物Ｂ（３０ｍｇ．ｋｇ−１、経口）を１２時間ごとに、３回連続して投与するために振り分けた。３回目の投与の６時間後、ラットはハロタン麻酔をし、頭部を切除し、組織を迅速に摘出し、計量し、氷冷した過塩素酸に浸け、液体窒素で凍結させて、−７０℃で続く分析まで保存した。ノルアドレナリン及びドパミン濃度を定量するため、組織を短時間超音波処理し、１３，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃で遠心分離した。上清に、３、４−ジヒドロキシベンジルアミン（内部標準）を混合し、ノルアドレナリン及びドパミンを電気化学的に検出した。
【０１１４】
コントロール動物の基部組織カテコールアミン含有量（μｇ．ｇ−１湿重量）は、以下の通りであった。腸間膜動脈（ノルアドレナリン、１０．４０±１．０３；ドパミン、０．２５±０．０２）、左心室（ノルアドレナリン、１．３０±０．０６；ドパミン、０．０２±０．００）及び大脳皮質（ノルアドレナリン、０．７６±０．０３；ドパミン、０．１４±０．０１）。ネピカスタットは、試験した３つの組織において、用量依存的にノルアドレナリン含有量を減少させ及びドパミン含有量及び、ドパミン／ノルアドレナリン比を増加させた。
【０１１５】
これらの変化は、≧３ｍｇ．ｋｇ−１投与の場合において、腸間膜動脈及び左心室において統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）が、大脳皮質においては、３０及び１００ｍｇ．ｋｇ−１においてのみであった。最高投与量（１００ｍｇ．ｋｇ−１、経口）では、ノルアドレナリンは、腸間膜動脈、左心室及び大脳皮質においてそれぞれ、４７％、３５％、４２％減少し、及びドパミンは、それぞれ８２０％、８００％及び８６％増加した。ネピカスタットを３０ｍｇ．ｋｇ−１、経口で投与した場合、Ｒ−エナンチオマー（化合物Ｂ）と比べて、腸間膜動脈及び左心室において大きく変化した。
【０１１６】
雄のビーグル犬もインビボ試験に使用した（１０−１６ｋｇ、Ｍａｒｓｈａｌｌ ｆａｒｍｓ ＵＳＡ Ｉｎｃ、Ｎｏｒｔｈ Ｒｏｓｅ、ＮＹ、ＵＳＡ）。試験の日に、イヌを計量し、５日間、空のカプセル（コントロール）又は、適切な用量のネピカスタット（０．０５、０．５、１．５又は５ｍｇ／ｋｇ−１；経口、ｂｉｄ）を投与するためにランダムに振り分けた。第５日における最初の投与の６時間後に、ペントバルビタールで安楽死させ、組織（大脳皮質、腎動脈、左心室）を速やかに摘出した。組織は、続いて処置して及びノルアドレナリン及びドパミンの分析に用いた。
【０１１７】
データは、平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）で表される。組織及び血漿カテコールアミンのデータは、それぞれノンパラメトリック一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）又は二元配置ＡＮＯＶＡを用いて分析し、フィッシャーの最小有意差法を用いて対比較した。Ｐ＜０．０５であれば、統計的に有意である。
【０１１８】
コントロール動物の基部組織におけるカテコールアミン含有量（μｇ．ｇ−１ 湿重量）配下の通りであった。腎動脈（ノルアドレナリン、１０．７±１．０５；ドパミン、０．２２±０．０１）、左心室（ノルアドレナリン、２．１１±０．１８；ドパミン、０．０７±０．０３）及び大脳皮質（ノルアドレナリン、０．２６±０．０２；ドパミン、０．０３±０．００）であった。コントロール動物と比較すると、ネピカスタットは、試験した３つの組織において、用量依存的にノルアドレナリン含有量を減少させ及びドパミン含有量及び、ドパミン／ノルアドレナリン比を増加させた。
【０１１９】
これらの変化は、３つの組織において≧０．１ｍｇ．ｋｇ−１．日−１の投与量において統計的に有意（ｐ＜０．０５）であった。最高投与量（５ｍｇ．ｋｇ−１、ｂｉｄ、経口）では、腎動脈、左心室及び大脳皮質において、それぞれノルアドレナリンは８８％、９１％及び９６％、及びドパミンは６２７％、７００％及び１６６％増加した。
【０１２０】
雄のビーグル犬を、１５日間、空のカプセル（コントロール）又はネピカスタット（２ｍｇ／ｋｇ−１、経口、ｂｉｄ）を経口投与するためにランダムに振り分けた。毎日、最初の投与の６時間後に、ドパミン及びノルアドレナリンの血漿中濃度を測定するために静脈血サンプルを採取した。サンプルを、ヘパリン及びグルタチオンを含むをチューブに収集し、−４℃で遠心分離し、分離した血漿を、−７０℃で分析まで保存した。カテコールアミンのベースラインの濃度は、二群の動物において互いに有意には異ならなかった。ネピカスタットで処理した群の、血漿中ノルアドレナリン及びドパミン濃度はそれぞれ、４６０．３±５９．６及び３４．４±１１．９ｐｇ．ｍｌ−１、コントロール群はそれぞれ、４０１．９±２５．５±及び４１．１±８．８ ｐｇ．ｍｌ−１であった。コントロール群と比較すると、ネピカスタット（２ｍｇ．ｋｇ−１、ｂｉｄ、経口）は、有意にノルアドレナリンの血漿中濃度を有意に低下させ、ドパミンの血漿中濃度及びドパミン／ノルアドレナリン比を増加させた。
【０１２１】
この経路における活性の上昇が疾患の悪化につながるため、薬理学的方法による交感神経機能の阻害による調節は、治療戦略としてうっ血性心不全の管理に魅力的である。この試験の目的は、ネピカスタットの効果の薬理学的特徴づけであり、ここでネピカスタットは、酵素であるドパミンβ−ヒドロキシラーゼの阻害による交感神経におけるノルアドレナリン合成の調節を行う化合物である。
【０１２２】
インビボでのドパミンβ−ヒドロキシラーゼの阻害は、ノルアドレナリン受容体神経支配を受ける組織における、基質（ドパミン）レベルの上昇及び生成物（ノルアドレナリン）のレベルの低下につながると予測された。この予測は、インビボでの、中枢及び末梢組織におけるネピカスタットのカテコールアミンレベルへの影響を見る実験で証明された。ＳＨＲ及びビーグル犬ともに、ネピカスタットは、用量依存的に末梢（腸間膜又は腎動脈、左心室）及び中枢（大脳皮質）組織におけるノルアドレナリン含有量の低下及びドパミン含有量の上昇を引き起こした。この観点からすると、化合物Ｂは、ＩＣ５０値が酵素の前者のエナンチオマーであるネピカスタットよりも弱い作用である。ドパミン／ノルアドレナリン比も上昇したが、ドパミンのノルアドレナリンへの置換は、化学量論量的に起こったように見えなかった。これは、神経内の代謝による、組織のドパミンレベルの過小評価により説明できると考えられる。
【０１２３】
ネピカスタットに大脳皮質におけるカテコールアミンレベルの調節能があることは、血液脳関門を薬物が浸透することを示唆している。イヌの大脳皮質におけるカテコールアミン量の変化の程度は、末梢組織におけるものに匹敵するものであった。しかし、ＳＨＲにおいてはネピカスタットが低容量（≦１０ｍｇ．ｋｇ−１）の場合、大脳皮質におけるカテコールアミン量に影響を与えることなく、末梢組織において有意にノルアドレナリン及びドパミン含有量に変化を与えた。このことは、少なくともＳＨＲにおいては、薬物は適度に末梢選択性を有するという。
【０１２４】
血漿中ノルアドレナリン濃度は、このパラメータは、神経系への取り込み及びカテコールアミンの代謝によるクリアランスによる影響を受けることはあるが、全般的な交感神経の活性のよい基準となる。イヌにおいて、血漿中のノルアドレナリン濃度のベースラインは、初期に驚くほど上昇したが、これはおそらく静脈切開術による血液サンプリングの方法によるストレスを反映していると考えられる。それにもかかわらず、コントロール群と比較すると、ネピカスタット処置によって、神経への取り込み又は代謝排泄に対して間接的ではあるが、神経伝達物質合成の減少及び放出に対応する、血漿中ノルアドレナリン濃度の有意な減少が見られた。ノルアドレナリン放出は、神経性ノルアドレナリンの総貯蔵の小分画であるので、ノルアドレナリン生合成の阻害剤が、ノルアドレナリン放出に影響を与えるのは、存在するカテコールアミンの貯蔵分が十分に使い果たされた後のこととなる。従って、血漿中ノルアドレナリン濃度の減少は、ネピカスタット投与第４日まで統計的に顕著な変化がなかったのは、交感神経系の緩やかな調節のためと考えられる。
【０１２５】
事実の蓄積から、うっ血性心不全における慢性の交感神経系の活性の高進は、不適応応答によることが示唆されている。この主張は、うっ血性心不全の患者へのカルベジロールの影響による長期の有病率及び死亡率に対して有利な効果を示した臨床試験によって裏付けられている。しかし、ほとんどの患者が、心血管系ホメオスタシスをサポートするのに、何らかのレベルの交感神経駆動を必要としていることは注目すべきである。事実、カルベジロールを含むβブロッカーによる治療評価は、特に治療開始による血流力学的低下の傾向により制限されている。交感神経系の高進による突然の離脱から生じる望ましくない効果には、注意深い用量滴定が必要である。ネピカスタットといったドパミンβ−ヒドロキシラーゼ阻害剤は、以下の理由によりこのような望ましくない作用を有しない。まず、このクラスの薬物は、アドレナリン放出を停止させるのではなく減弱させる、次に、徐々に系を変化させるため、用量滴定を必要としないためである。β−ブロッカーに対する他のネピカスタットの利点は、ドパミン受容体への作動活性によりドパミンレベルを上昇させ、腎血管拡張、利尿及びナトリウム利尿といった腎機能に有益な効果をもたらす。
【０１２６】
ネピカスタットは強力で、交感神経系の高進に関連のある心血管障害として評価される疾患の治療に有効である選択的で経口活性のあるドパミンβ−ヒドロキシラーゼ阻害剤である。
【実施例６】
【０１２７】
ネピカスタットは、テトラロン３（ＣＨ２Ｃｌ２中−６５℃で３、５−ジフルオロフェニルアセチルクロライドとエチレンをＡｌＣｌ３−触媒によるフリーデルクラフツ反応させることにより得られる。)を、寺島により見出された条件（ＬＡＨ、（−）−１Ｒ、２Ｓ−Ｎ−メチルエフェドリン、２−エチルアミノピリジン）で、キラル還元することによりＲ−（＋）−テトラロール４ａ（９２−９５％ｅｅ）を得、これをＲ−（＋）−メシレートに変換し、続いてアジ化ナトリウムと反応させることによりアジド及びジヒドロナフタレン７（９：１）の混合物が得られる。アジドを水素化し、生成物を無水塩酸で処理し、得られたＳ−（−）−アミン塩酸塩をストレッカー反応（ホルムアルデヒド重亜硫酸塩付加体及びＫＣＮ）によりＳ−（−）−アミノニトリルに変換した。ヘテロ環の形成は、アミノニトリルの一連のジホルミル化反応、続くチオシアン酸による処置により行われる。競合するニトリル加水分解によって、一級アミドが相当量生成する。ニトリルのアミンへの還元は、ＴＨＦ中ＬＡＨを用いて行った（９３−９６％ｅｅ）。エナンチオマーは、寺島・ケトン還元の同様の経路で（＋）−１Ｓ、２Ｒ−Ｎ−メチルエフェドリンを不斉補助基として用いて行った（９１．６％ｅｅ）。不斉中心の絶対配置は、Ｓ−（−）−２−テトラロールに関する先行文献をもとに決定した。
【０１２８】
融点は、ユニメルト・トーマス・フーバー・キャピラリー融点測定装置又はメトラーＦＢ８１ＨＴ細胞を有するメトラーＦＰ９０プロセッサーで測定し、補正しなかった。質量は、フィニガンＭＡＴ８２３０（電子衝撃法又は化学イオン化法）又はフィニガンＭＡＴ ＴＳＱ７０（ＬＳＩＭＳ）分光計によって行った。１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、ブルカーＡＣＦ３００、ＡＭ３００、ＡＭＸ３００又はＥＭ３９０分光計及びケミカルシフトは、ｐｐｍ（δ）で、テトラメチルシランを内部標準として用いて得られた。ＩＲスペクトルは、ニコレットＳＰＣ ＦＴ−ＩＲ分光計により行った。ＵＶスペクトル解析は、バリアン・キャリー３ ＵＶ−可視分光計により行った(リーマンラボ社)。旋光度は、パーキン・エルマーモデル１４１で測定した。キラルＨＰＬＣ測定は、レジスキラルＡＧＰカラム（４．６×１００ｍｍ）で行った。溶出は、２０℃で、２％アセトニトリル−９８％ ２０ｍＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ４．７）、流量１ｍＬ／分で行った。
【０１２９】
５、７−ジフルオロ−２−テトラロン。ＳＯＣｌ２（１００ｍＬ）を１度に加え、３、５−ジフルオロフェニル酢酸（１００g、０．５８ｍｏｌ）に加え、１５時間攪拌後、揮発性物質を減圧下留去した。生成した油性の酸クロライドをＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）に溶解し、メカニカルスターラーで攪拌下ＡｌＣｌ３（１５４ｇ、１．１６ｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１．０Ｌ）懸濁液に滴下した。懸濁液は、−６５℃ドライアイス／アセトン浴で冷やし、及び反応液の温度が＜−６０℃となるよう酸クロライド溶液を加えた。添加の後、エチレンガスを１０分間−６５℃で急速に反応混合物に吹き込んだ。反応混合物を、攪拌下、２時間以上かけて０℃まで戻し、その後−１０℃に冷却し、水（５００ｍＬ）を最初は滴下し、その後急速に加えた。有機層を分離し、食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、及びＭｇＳＯ４で乾燥した。有機層を減圧留去し、クーゲルロール収集装置により真空蒸留し、９０−１１０℃で沸騰した物質を集め（１．０ないし０．７ｍｍＨｇ））、暗色の油性残渣を得た。蒸留物は、１００−１０５℃で再蒸留し（０．３ｍｍＨｇ）、白色固体として得られた（７３．６ｇ、０．４０ ｍｏｌ； ７０％）。融点４６℃； ＩＲ（ＫＢｒ） １７０５ ｃｍ−１； １Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．５５（ｔ、Ｊ＝７．５ Ｈｚ、２Ｈ）、３．１０（ｔ、Ｊ＝ ７．５ Ｈｚ、２Ｈ）、３．５８（s、２Ｈ）、６．７０（ｍ、２Ｈ）； ＭＳ ｍ／ｚ １８２（Ｍ＋）。Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１０Ｈ８Ｆ２Ｏ：Ｃ、６５．９３； Ｈ、４．４２。Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、６５．５４； Ｈ、４．４２。
【０１３０】
（Ｒ）−（＋）−２−ヒドロキシ−５、７−ジフルオロ−１、２、３、４−テトラヒドロナフタレン。（−）１Ｒ、２Ｓ−Ｎ−メチルエフェドリン（８１．３ｇ、０．４５４ ｍｏｌ）の無水Ｅｔ２Ｏ溶液（１．１Ｌ）に、１．０Ｍ水素化アルミニウムリチウムのＥｔ２Ｏ溶液（４１６ｍＬ、０．４１６ ｍｏｌ）を４５分かけて滴下し、穏やかに還流が続くようにした。添加終了後、反応混合物を還流温度で１時間加熱した後、室温に戻した。２−エチルアミノピリジン（１１１ｇ、０．９８ｍｏｌ）溶液の無水Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ）溶液を加え、穏やかに還流が続くような温度で加熱した。反応混合物はさらに１時間還流し、その間に薄い黄緑色の懸濁液となった。反応混合物を、ドライアイス／アセトン浴を用いて−６５℃に冷却し、５、７−ジフルオロ−２−テトラロン（２３．０ｇ、１２６ ｍｍｏｌ） のＥｔ２Ｏ（１２５ｍＬ）溶液を、内部温度を−６０℃以下に保つように滴下した。滴下終了後、反応混合物は、−６５℃ないし−６８℃３時間攪拌し、ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）を、内部温度が−６０℃以下を保つようにクエンチした。反応は更に−６５ ℃で１０分攪拌し、その後、約−２０℃まで戻した。３Ｎ ＨＣｌ（２Ｌ）溶液を＜３５ ℃となるように添加の速度を制限した。完全に溶解させるため、攪拌速度を増加させた後、層を分離し、エーテル層を食塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥した（ＭｇＳＯ４）。エーテル溶液を減圧留去し、残渣を温かいＥｔ２Ｏ（２０ｍＬ）に溶解し、続いてヘキサン（２００ｍＬ）を加えた。シード溶液は、０℃で１時間、氷浴で冷却したところ、結晶を析出したので、結晶を収集し、真空で乾燥し、アルコールを得た（１０．９ｇ、４７ ％）。融点８５ ℃；［α］２５Ｄ＋３８．１°（ｃ＝１．８３、ＣＨＣｌ３）； キラルＨＰＬＣ９３．４％ ｅｅ：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．７０（ｂｒ s、１Ｈ）、１．７６−１．８８（ｍ、２Ｈ）、１．９９−２．０６（ｍ、２Ｈ）、２．６３−３．０８（ｍ、３Ｈ）、４．１５（ｍ、１Ｈ）、６．６０（ｍ、２Ｈ）。 Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１０Ｈ１０Ｆ２Ｏ：Ｃ、６５．２１； Ｈ、５．４７．  Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、６５．３８：Ｈ、５．４２。（Ｓ）−エナンチオマー ４ｂのスペクトルは同一である：融点８４−８５ ℃； ［α］２５Ｄ−３７．８°（ｃ＝１、２、４、ＣＨＣｌ３）； ９２．４％ ｅｅ キラルＨＰＬＣ．Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１０Ｈ１０Ｆ２Ｏ：Ｃ、６５．２１； Ｈ、５．４７。 Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、６５．４７； Ｈ、５．３９。
【０１３１】
（Ｒ）−（＋）−２−メタンスルホニルオキシ−５、７−ジフルオロ−１、２、３、４−テトラヒドロナフタレン。溶液Ｒ−（＋）−５、７−ジフルオロ−２−テトラロール（５９．０ｇ、３２０ ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（７４．２ｍＬ、５３．９ ｇ、５３０ ｍｍｏｌ）の無水Ｅｔ２Ｏ溶液（１．７８ Ｌ）を、氷−ＭｅＯＨ浴を用いて冷却し（−１５ ℃）、及びアルゴン雰囲気下、攪拌しながらＭｓＣｌ（３７．２ｍＬ、５５．３ｇ、４８０ ｍｍｏｌ）を５−１０分以上かけて滴下した。５時間後、反応が終了し（ＴＬＣにより確認）、固体を溶解するために水を加えた。少量の酢酸エチルを加え、固体を完全に溶解させた。有機層を分離し、１Ｎ ＨＣｌ、ＮａＨＣＯ３水溶液、食塩水で、この順に洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を留去すると、オフホワイトの固体が得られ（８７．１ｇ、３３２ ｍｍｏｌ）、そのまま次の反応に用いた。ｉ−Ｐｒ２Ｏによる少量サンプルの滴定により、分析用のサンプルを得た：融点７８．８−８０．５ ℃； ［α］２５Ｄ＋１６．８°（ｃ＝１．８６、ＣＨＣｌ３）； １Ｈ ＮＭＲδ２．１３−２．２８（ｍ、２Ｈ）、２．７８−２．９６（ｍ、２Ｈ）、３．０７（ｓ、３Ｈ）、３．０９（ｄｄ、Ｊ＝ １７．１ Ｈｚ、４．７、１Ｈ）、３．２０（ｄｄ、Ｊ＝ １７．２、４．７ Ｈｚ、１Ｈ）、５．２０（ｍ、１Ｈ）、６．６７（ｍ、２Ｈ）。Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１１Ｈ１２Ｆ２Ｏ３Ｓ：Ｃ、５０．３７； Ｈ、４．６１。Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、５０．４１； Ｈ、４．６４。（Ｓ）−エナンチオマー５ｂのスペクトルは同一である。融点７９．９−８０．９ ℃； ［α］２５Ｄ−１６．６°（ｃ＝２．２３、ＣＨＣｌ３）。Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１１Ｈ１２Ｆ２Ｏ３Ｓ：Ｃ、５０．３７； Ｈ、４．６１． Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、５０．４１； Ｈ、４．６５。
【０１３２】
（Ｓ）−（−）−２−アミノ−５、７−ジフルオロ−１、２、３、４−テトラヒドロナフタレン塩酸塩。アジ化ナトリウム（４０．０ｇ、０．６２ ｍｏｌ）にＤＭＳＯ（１ Ｌ）を加えた。メシレート（１３８ｇ、０．５３ ｍｏｌ）を１度に加え、加え、反応混合物を５０℃１６時間Ｎ２雰囲気下で加熱した。反応混合物をＨ２Ｏ（１．８ Ｌ）で希釈し、ペンタンで抽出し（４ｘ２５０ｍＬ）、続いて、合わせたペンタン抽出液を、Ｈ２Ｏ（２ｘ１００ｍＬ）、食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧留去したところ、油状の揮発性物質を得たので、すぐにペンタンでシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、ジヒドロナフタレンを揮発性の油状物として得た（８．５０ｇ、５１．２ ｍｍｏｌ）。さらに、ペンタン／ＣＨ２Ｃｌ２（９:１）で溶出すると、アジド（１０１ｇ、４８３ ｍｍｏｌ）を無色の油状物として得た。ＩＲ（ＣＨＣｌ３） ２１０３ｃｍ−１； ｍ／ｚ １７１（Ｍ＋）。アジド６ａを酢酸エチル（１２００ｍＬ）に溶かし、２．５ Ｌ パール加圧反応容器（６０ ｐｓｉ）中で、１０％ Ｐｄ／Ｃ（６ｇ）を用い６時間かけて水素化した。各時間ごとに、反応容器を真空に排気し、混入したＮ２を除くために水素を充填した。生じた混合物をセライト濾過し、ＨＣｌのエーテル溶液（１Ｎ、５００ｍＬ）中で攪拌し、細かい沈殿を酢酸エチルで濾過し、及び無水エーテルで洗浄した（濾過に約４時間要した）。湿潤固体を丸底フラスコに移し、残溶媒を真空下で除去し、白色固体を得た（９０．４ｇ、４１２ ｍｍｏｌ； ７７．９％）。融点＞２８０ ℃； ［α］２５Ｄ−６０．２°（ｃ＝２．６８、ＭｅＯＨ）； １Ｈ ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ１．７９（ｍ、１Ｈ）、２．３３（ｍ、１Ｈ）、２．６３（ｍ、１Ｈ）、２．８３−２．９２（ｍ、２Ｈ）、３．１４（ｄｄ、Ｊ＝ １６．７、５．０ Ｈｚ、１Ｈ）、３．４６（ｍ、１Ｈ）、６．９３（ｄ、Ｊ＝ ９．４ Ｈｚ、１Ｈ）、７．００（ｄｔ、Ｊ＝ ９．４、２．５ Ｈｚ、１Ｈ）. Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１０Ｈ１２ＣｌＦ２Ｎ：Ｃ、５４．６８； Ｈ、５．５１； Ｎ、６．３７。  Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、５４．３１； Ｈ、５．５２； Ｎ、６．４４。（Ｒ）−エナンチオマー８ｂのスペクトルは同じである。融点＞２８０ ℃； ［α］２５Ｄ＋５８．５°（ｃ＝１．６３、ＭｅＯＨ）。Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１０Ｈ１２ＣｌＦ２Ｎ：Ｃ、５４．６８； Ｈ、５．５１； Ｎ、６．３７． Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、５４．６４； Ｈ、５．５１； Ｎ、６．４０。
【０１３３】
（Ｓ）−（−）−（５、７−ジフルオロ−１、２、３、４−テトラヒドロナフト−２−イル）（シアノメチル）アミン。アミン塩酸塩８ａ（５０．２７ｇ、２２９ ｍｍｏｌ）をＮａＯＨ（１０．０ｇ. ２５０ ｍｍｏｌ）の水（１５０ｍＬ）溶液で処理し、溶液を得るためにＮａＯＨの粒を数個加えた。更に水（３００ｍＬ）を加え、混合物を５０ ℃浴に浸け、ホルムアルデヒド重亜硫酸ナトリウム付加体（３０．８ｇ、２３０ ｍｍｏｌ）で処理した。３０分攪拌後、ＫＣＮ（１５．０ｇ、２３０ ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物は、更に１時間、８０ ℃で攪拌し、室温に冷却し、酢酸エチルで抽出し、結晶化する油状物を得た（５１．３ｇ）。ＴＬＣ（５％ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）では、出発物質のアミンが約１０−１５％残った。シリカゲルクロマトグラフィーでは、ニトリル体（３９．４ｇ）及び、空気中で速やかに炭酸塩を形成する出発物質の遊離アミン（７．１２ｇ）を得た。アミンの再利用により、５．３５ｇの生成物を得た。合わせた収率（４４．８ ｇ、２０２ ｍｍｏｌ； ８７．５％）：融点７３．１−７６．５ ℃； ［α］２５Ｄ−５８．０°（ｃ＝１．６３、ＣＨＣｌ３）； １Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．５０（ｂｒ s、１Ｈ）、１．７０（ｍ、１Ｈ）、２．０５（ｍ、１Ｈ）、２．５５−３．０４（ｍ、４Ｈ）、３．２２（ｍ、１Ｈ）、３．７０（ｓ、２Ｈ）、６．６２（ｍ、２Ｈ）； ＭＳ ｍ／ｚ ２２２（Ｍ＋）。 Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１２Ｈ１２Ｆ２Ｎ２：Ｃ、６４．８５； Ｈ、５．４４； Ｎ、１２．６０． Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、６５．０７； Ｈ、５．４７； Ｎ、１、２、４４。（Ｒ）−エナンチオマー９ｂのスペクトルは、同一であった。融点６４．４−７３．６ ℃；［α］２５Ｄ＋５２．３°（ｃ＝２．１２、ＣＨＣｌ３）。Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１２Ｈ１２Ｆ２Ｎ２：Ｃ、６４．８５； Ｈ、５．４４； Ｎ、１２．６０． Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、６５．１４； Ｈ、５．５４； Ｎ、１２．５３。
【０１３４】
（Ｓ）−（−）−１−（５、７−ジフルオロ−１、２、３、４−テトラヒドロナフト−２−イル）−５−シアノ−２、３−ジヒドロ−２−チオキソ−１Ｈ−イミダゾール。ニトリル（４４．７ｇ、２０１ ｍｍｏｌ）のブチルホルメート（２４０ｍＬ）溶液を、Ｎ２下１９時間、加熱還流し（１２０ ℃ 浴）、溶媒を減圧下留去した。溶媒の残部を除くためにトルエンを加え、留去し、残渣を高真空下乾燥し、油状物を得た（５３．２ｇ）。ホルムアミド及びエチルホルメート（４８．７ｍＬ、４４．７ｇ、６０４ ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（９３５ｍＬ）溶液を氷／ＭｅＯＨ（−１５ ℃）下で冷却し、攪拌下、ｔ−ＢｕＯＫ（１Ｍ ＴＨＦ中、３０２ｍＬ、３０２ ｍｍｏｌ）を２０分以上かけて加えた。１８時間攪拌後、溶媒を留去し、残渣を１Ｎ ＨＣｌ（９９０ｍＬ）及びエタノール（４９７ｍＬ）に溶かし、ＫＳＣＮ（７８．１ｇ、８０４ ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を８５ ℃で１、３、５ 分攪拌後、氷浴につけると沈殿を生じた。濾過し、固体をスラリーとして１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２のヘキサンで詰めたシリカゲル（１ｋｇ）にアプライした。１０％ アセトン／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出し、生成物（１８．０５ｇ、６２．１ ｍｍｏｌ； ３０．８％）を得た。融点：２４０．７−２４９．２ ℃； ［α］２５Ｄ−６９．１°（ｃ＝１．１８、ＤＭＳＯ）； １Ｈ ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ２．１８（br ｍ、１Ｈ）、２．４７（ｍ、１Ｈ）、２．７５（ｍ、１Ｈ）、３．０３−３．３５（ｍ、３Ｈ）、５．１９（ｍ、１Ｈ）、６．９４（ｄ、Ｊ＝ ９．３ Ｈｚ、１Ｈ）、７．０３（ｄｔ、Ｊ＝ ９．３、２．４ Ｈｚ、１Ｈ）、８．２９（ｓ、１Ｈ）、１３．３（ｂｒ s、１Ｈ）； ＭＳ ｍ／ｚ ２９１（Ｍ＋）。Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１４Ｈ１１Ｆ２Ｎ３Ｓ： Ｃ、５７．７２； Ｈ、３．８０； Ｎ、１４．４２． Ｆｏｕｎｄ： Ｃ、５７．８２； Ｈ、３．９２； Ｎ、１４．３７。（１:１ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２の溶媒で、カラムを更に溶出すると、１級アミド１１ａが得られる：融点２６１．９−２６２．７ ℃； ［α］２５Ｄ−９０．５°（ｃ＝０．３９８）； ＩＲ（ＫＢｒ） １５９３、１６３０ ｃｍ−１； １Ｈ ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ２．１４（ｍ、１Ｈ）、２．１５−２．２８（ｍ、１Ｈ）、２．７４−３．０５（ｍ、４Ｈ）、５．６４（ｍ、１Ｈ）、６．９０（d、Ｊ＝ ９．２ Ｈｚ、１Ｈ）、７．０５（ｄｔ、Ｊ＝ ９．５、２．４ Ｈｚ、１Ｈ）、８．７３（ｓ、３Ｈ）、９．７０（ｂｒ s、１Ｈ）、１３．７（ｂｒ s、１Ｈ）； ＭＳ ｍ／ｚ ３０９（Ｍ＋）。Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１４Ｈ１３Ｆ２Ｎ３ＯＳ・０．２５Ｈ２Ｏ：Ｃ、５３．５７； Ｈ、４．３３； Ｎ、１３．３９。  Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、５３．３２； Ｈ、３．９６：Ｎ、１３．２４。（Ｒ）−エナンチオマーのスペクトルは同一である。融点２４３．１、２、４４．７ ℃；［α］２５Ｄ＋７４．９°（ｃ＝２．１４、ＤＭＳＯ）。Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１４Ｈ１１Ｆ２Ｎ３Ｓ:Ｃ、５７．７２；Ｈ、３．８０；Ｎ、１４．４２。Ｆｏｕｎｄ:Ｃ、５７．８５；Ｈ、３．８５；Ｎ、１４．４５。
【０１３５】
（Ｓ）−１−（５、７−ジフルオロ−１、２、３、４−テトラヒドロナフト−２−イル）−５−アミノメチル−２、３−ジヒドロ−２−チオキソ−１Ｈ−イミダゾール。上述のニトリル（５．００ｇ、１７．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（７５ｍＬ）溶液を氷浴中、アルゴン下攪拌し、均一な溶液を得た。ＬＡＨのＴＨＦ（１Ｍ ３４．３ｍＬ、３４．３ｍｍｏｌ）溶液を１０分以上かけて加え、溶液を３０分間、０℃で攪拌し、１．５時間室温に戻した。再び０ ℃に冷却し、飽和酒石酸ナトリウムカリウム溶液で、処理し混合物が自由に攪拌できるまで加えた。更に酒石酸溶液（３０ｍＬ）を加え、有機層を分離し、水層を１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）で抽出し、混合物を１５分攪拌し、水（１００−１５０ｍＬ）を加えた。有機層を分離し、水層を１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（２ｘ１２５ｍＬ）で抽出した。抽出物を合わせ、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、留去した。残渣を５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２の溶出液で、シリカゲルクロマトグラフィー（５．２ｇ）にかけ、遊離のアミン（２．９２g、９．８９ｍｍｏｌ；５８％）を得た。融点１７０℃；［α］２５Ｄ−１１．０°（ｃ＝１．５９、ＤＭＳＯ）。Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１４Ｈ１５Ｆ２Ｎ３Ｓ・０．２５Ｈ２Ｏ:Ｃ、５６．０７；Ｈ、５．２１；Ｎ、１４．０１。Ｆｏｕｎｄ:Ｃ、５６．１１；Ｈ、５．１０；Ｎ、１４．１４。
【０１３６】
（Ｓ）−１−（５、７−ジフルオロ−１、２、３、４−テトラヒドロナフト−２−イル）−５−アミノメチル−２、３−ジヒドロ−２−チオキソ−１Ｈ−イミダゾール塩酸塩（ネピカスタット）。塩酸塩は、メタノール（２５０ｍＬ）に溶かした遊離アミン２ａ（３．１２ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）に加熱しながら塩酸のエーテル溶液（１Ｍ、２０ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を加えることにより合成した。溶媒を乾燥するまで留去することなく、部分的に減圧留去し、酢酸エチルで数回共蒸着することにより置換した。生じた沈殿を酢酸エチル（１５０ｍＬ）及びエーテル（１５０ｍＬ）で濾過し、エーテルで洗浄し、窒素下で乾燥し、続いて高真空下、７８℃で２０時間乾燥して塩酸塩（３．８７ｇ）を得た。融点２４５℃（ｄｅｃ）；［α］２５Ｄ＋９．６５°（ｃ＝１．７０、ＤＭＳＯ）；（９３％ｅｅキラルＨＰＬＣ）；１Ｈ ＮＭＲ（Ｔ＝３２０°Ｋ、ＤＭＳＯ）δ２．０７（ｍ、１Ｈ）、２．６８−３．０８（ｍ、４Ｈ）、４．０９（ｍ、３Ｈ）、４．７７（ｍ、１Ｈ）、６．８４（ｍ、２Ｈ）、７．０５（ｓ、１Ｈ）、８．５７（ｂｒ s、３Ｈ）、１、２、４（ｂｒ ｓ、１Ｈ）。Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１４Ｈ１６ＣｌＦ２Ｎ３Ｓ・０．５Ｈ２Ｏ:Ｃ、４９．３３；Ｈ、５．０３；Ｎ、１２．３３。Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、４９．４４；Ｈ、４．９６；Ｎ、１２．１８。（Ｒ）−エナンチオマー（Ｒ）−１−（５、７−ジフルオロ−１、２、３、４−テトラヒドロナフト−２−イル）−５−アミノメチル−２、３−ジヒドロ−のスペクトルは、同一であった。融点２６１−２６３℃； ［α］２５Ｄ−１０．８°（ｃ＝１．４３、ＤＭＳＯ）、９１．６％ ｅｅ キラルＨＰＬＣ。Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１４Ｈ１６ＣｌＦ２Ｎ３Ｓ・０．３５Ｈ２Ｏ:Ｃ、４９．７３； Ｈ、４．９８； Ｎ、１、２、４２。Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、４９．８０； Ｈ、４．９３； Ｎ、１２．３９。
【０１３７】
ネピカスタットは、ウシ（ＩＣ５０＝８．５±０．８ｎＭ）及びヒト（ＩＣ５０＝９．０±０．８ｎＭ）のＤＢＨの競合阻害剤であることが示された。Ｒ−エナンチオマー（Ｒ）−１−（５、７−ジフルオロ−１、２、３、４−テトラヒドロナフト−２−イル）−５−アミノメチル−２、３−ジヒドロ−２−チオキソ−１Ｈ−イミダゾール（ＩＣ５０＝２５．１±０．６ｎＭ； １８．３±０．６ｎＭ）であり、ＳＫＦ１０２６９８（ＩＣ５０＝６７．０±４．２ｎＭ； ８５．０±３．７ｎＭ）は、それぞれウシ及びヒトの酵素に対してより低い阻害剤であった。ＤＢＨ活性は、チラミンからオクトパミンへの変換アッセイにより測定した。ウシの副腎から得られるＤＢＨは、シグマアルドリッチ社（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）より得た。ヒトから分泌されるＤＢＨは、神経芽細胞腫細胞ＳＫ−Ｎ−ＳＨ株の培地から精製した。アッセイは、ｐＨ５．２、３２℃下、０．１２５Ｍ酢酸エチル、１０ｍＭフマル酸、０．５−２μＭＣｕＳＯ４、０．１ｍｇ／ｍＬカタラーゼ、０．１ｍＭチラミン及び４ｍＭアスコルビン酸存在下で行った。典型的なアッセイでは、０．５−１ミリユニット(ｍｉｌｌｉｕｎｉｔ)の酵素を反応混合物に加え、続いてカタラーゼ、チラミン、及びアスコルビン酸を含む基質混合物を加えて反応を開始した（最終の容積は、２００μＬ）。試料は、３７℃３０−４０分間、適切な濃度の阻害剤を含み又は含まずに培養した。反応を、２５ｍＭ ＥＤＴＡ及び２４０μＭ３−ヒドロキシチラミン（内部標準）を含む反応停止液でクエンチした。試料は、逆相ＨＰＬＣによって２８０ｎＭのＵＶを検出するＵＶ検出計を用いて、オクトパミンを分析した。残存％活性は、コントロール（阻害剤なし）に基づいて、内部標準及び非線形４係数用量反応曲線から得られたＩＣ５０値で補正し、計算した。
【０１３８】
確立したアッセイによって１１の異なる酵素によるネピカスタットの活性を測定した。選択した１３の受容体に対するネピカスタットの親和性は、標準的な濾過技術及び膜調製法を用いて放射性リガンド結合アッセイによって決定した。結合データは、４係数ロジスティクス方程式に反復曲線を適用して決定した。Ｋｉ値は、チェン−プルソフ式を用いて計算した。図３は、ＤＢＨ及び選択された系列の酵素及び受容体の範囲をネピカスタットの相互作用の表を表す。ネピカスタットは、他の系列の酵素及び神経伝達物質の受容体のに対して弱い親和性しか持たなかった。これらのデータは、ネピカスタットは、ＤＢＨのインビトロにおける強力で高選択的阻害活性を有することを示唆した。さらに、Ｓ−エナンチオマーであるネピカスタットはＲ−エナンチオマーよりも約２−３倍強力であり、このことは、立体選択的であることを示している。
【０１３９】
ネピカスタットの経口投与を自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）及び通常のイヌに投与したところ、用量依存的に末梢動脈（腎臓の又は腸間膜）、左心室及び大脳皮質における組織ドパミン（ＤＡ）／ノルエピネフリン（ＮＥ）比が増加した。通常のイヌに対し、慢性的なネピカスタットの経口投与によっても、血漿ＤＡ／ＮＥ比を持続的に増加させた。無麻酔ラットに急速にネピカスタットの経口投与を行うと、用量依存的及び長期間の（＞４時間）降圧効果、及び節前交感神経刺激に対する降圧薬の反応の減弱が起こった。血清Ｔ３及びＴ４レベルは、腸間膜動脈においてドパミン／ノルエピネフリン比が上昇したが、用量（６．２ｍｇ／ｋｇ、経口、ｂｉｄ、１０日間）にる影響はなかった。心血管組織に対する交感神経駆動による強い調節能に基づき、ネピカスタットは、うっ血性心不全の治療において臨床的な評価を得ている。
【０１４０】
うっ血性心不全（ＣＨＦ）は、アメリカ合衆国において主要な死因である。ＣＨＦは、自律神経系及びレニン−アンジオテンシン系（ＲＡＳ）の顕著な活性化を特徴とする。これらの２つの神経ホルモン系の同時の活性化は、ＣＨＦの永続化及び進展に関係するとされる。神経ホルモン系のこれらの効果を阻害する治療は、ＣＨＦの病歴をよい方向に変更すると考えられる。事実、アンジオテンシンIIの生成を阻害するアンジオテンシン−変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤は、ＣＨＦ患者の疾病率及び死亡率を減少させる。しかし、ＡＣＥ阻害剤は、ＳＮＳを減弱させる限定的な間接的能力しかない。現在臨床評価を受けているβ−アドレナリン受容体アンタゴニストによるＳＮＳ阻害は、確実なアプローチである。直接ＳＮＳを調節する別の方法には、ＮＥをドパミン（ＤＡ）に変換する酵素であるドパミンβ−ヒドロキシラーゼ（ＤＢＨ）の阻害を介したノルエピネフリン（ＮＥ）生合成の阻害がある。ＤＢＨの阻害は、組織レベルのＮＥを減少させ、組織レベルのＤＡを上昇させ、それにより組織内ＤＡ／ＮＥ比を高める。このアプローチは、β−アドレナリン受容体アンタゴニストに対して大きな利点を有する。例えば、α−アドレナリン受容体刺激を減少させ、ＤＡレベルを上昇させる。腎臓の血管拡張、ナトリウム利尿を促進し、アルドステロン放出を減少させる。以前のＤＢＨ阻害剤、フザリン酸及びＳＫＦ−１０２６９８は、小さい効果及び特異性という欠点のため心疾患の臨床開発から除外された。
【０１４１】
ネピカスタットは、自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）及び正常ビーグル犬におけるインビボの生化学試験に用いる。試験日には、動物の体重を測定し、ランダムにプラセボ（担体）又は適切な用量のネピカスタットを投与するために分類する。朝に開始して、それぞれのラットに、１２時間ごとに３回経口投与した。３回目の投与６時間後、ラットにハロタン麻酔をかけ、断頭し、及び組織（大脳皮質、腸間膜動脈及び左心室）を迅速に摘出し、計量し、氷冷した０．４Ｍ過酸化水素酸に浸け、液体窒素で凍結させ、分析まで−７０℃で保存した。組織ＮＥ及びＤＡ濃度は、ＨＰＬＣにより電気化学的検出を用いて濃度を分析した。雄のビーグル犬（１０−１６ｋｇ、Ｍａｒｓｈａｌｌ ｆａｒｍｓ ＵＳＡ Ｉｎｃ、Ｎｏｒｔｈ Ｒｏｓｅ、ＮＹ）を試験に用いた。試験日には、イヌは、ランダムにプラセボ（空のカプセル）又は適切な用量のネピカスタットを投与した。それぞれのイヌは、４．５日にわたり１日２回投与された。第５日、最初の投与から６時間後、イヌをペントバルビタールで安楽死させ、及び組織（大脳皮質、腎動脈、左心室）を摘出し、計測し、氷冷した０．４Ｍ過酸化水素酸に浸け、液体窒素で凍結させ、分析まで−７０℃で保存した。組織ＮＥ及びＤＡ濃度は、ＨＰＬＣにより電気化学的検出を用いて濃度を分析した。
【０１４２】
ネピカスタットの経口投与により、ＳＨＲ及びイヌの（腸間膜又は腎）動脈、左心室及び大脳皮質において用量依存的にＤＡ／ＮＥ比を上昇させた。
【０１４３】
最高投与量（ＳＨＲには１００ｍｇ／ｋｇ、及びイヌには５ｍｇ／ｋｇ）では、ＤＡ／ＮＥ比が、それぞれ動脈、左心室及び大脳皮質において、１４、１１及び３．２倍（ＳＨＲ）及び９５、１５１及び８０倍（イヌ）であった。ＳＨＲにおいて３０ｍｇ／ｋｇを投与した場合、ＳＫＦ−１０２６９８（１）は、ＤＡ／ＮＥ比は、５．５倍、３．５倍及び２．７倍となり、同じ投与量でネピカスタットでは、腸間膜動脈、左心室及び大脳皮質において、それぞれ８．３、７．５及び１．５倍となった。ＳＨＲにおいて３０ｍｇ／ｋｇでは、化合物Ｂは、ＤＡ／ＮＥ比は腸間膜動脈、左心室及び大脳皮質においてそれぞれ２．６、３．５及び１．１倍増加したのみだった。これらのデータから、ネピカスタットはＳＨＲ及びイヌにおいて期待した生化学的効果を有するが、後者においてより強力であることを示唆している。更に、ネピカスタットはＳＨＲにおいて、化合物Ｂ及びＳＫＦ−１０２６９８（１）よりも強力であった。
【０１４４】
正常なイヌに対して、ネピカスタット（１４．５日間処理）による血漿ＤＡ／ＮＥ比への慢性的な効果を調べた。動物は、１４．５日間、ランダムに、経口又はプラセボ（空のカプセル）又はネピカスタット（２ｍｇ／ｋｇ、ｂｉｄ）を投与した。毎日、血漿中のＤＡ及びＮＥ濃度の測定のために最初の投与の６時間後、血漿サンプルを採取した。サンプルは、ヘパリン及びグルタチオンを含むチューブに採取し、−４℃で遠心分離し、分析まで−７０℃で保存した。
【０１４５】
ネピカスタットの経口投与（２ｍｇ／ｋｇ；ｂｉｄ）によって効果のピークが約６−７日後に、その後新たな安定状態に達するのが７−１４日後であるようなＤＡ／ＮＥ比の増加が見られた。
【０１４６】
心血管組織に高交感神経駆動するモデルである、意識下拘束したＳＨＲで、インビボでの血流力学的活性をさらに評価した。ＳＨＲにおける血流力学試験では、雄ＳＨＲ（１５−１６週齢）を試験に用いた。動物は、エーテルにより軽度に麻酔し、血圧測定及び薬物投与のために左大腿動脈及び静脈にそれぞれカテーテルを通した。動物を、拘束装置に入れ、３０−４０分間回復させた。ベースライン測定の後、動物に経口で担体又は適切な用量のネピカスタットを投与し、４時間血流力学係数を連続的に記録した。動物をペントバルビタールで麻酔し、温熱パッド（３７℃）にのせ、ハーバード・ローデント・ベンチレーターで通気した。アトロピン及びツボクラリン（１ｍｇ／ｋｇ、静注）投与後、ステンレススチールロッド（１．５ｍｍ厚、１５０ｍｍ長）を動物の眼窩から挿入した。ロッドに８０Ｖの１ｍｓパルス電気刺激を与え、異なる周波数（０．１５、０．４５、１．５、５、１５Ｈｚ）による周波数−昇圧反応曲線を得た。
【０１４７】
ネピカスタットの経口投与は、用量依存的降圧効果をもたらした。拘束装置に置き、３０−４０分間回復させた。ベースライン測定後、動物は担体又はネピカスタットの最適な投与量のネピカスタットを投与し、血流力学係数を続けて４時間記録した。ネピカスタットは、０．３ｍｇ／ｋｇ（１８０、２１０及び２４０分）及び１ｍｇ／ｋｇ（３０、２１０及び２４０分）全ての投与量及び時点で、有意な平均動脈性血圧の低下を起こした。
【０１４８】
平均血圧の最大の低下は、１０ｍｇ／ｋｇ投与した場合に、５３±４ｍｍＨｇ（コントロール担体に比較して３３％減少）であった。反応は遅く、安定状態に達するのに、３−４時間かかる。現在のところ、最高投与量（３０ｍｇ／ｋｇ）における抗高血圧効果の消失の正確な理由は、明確でない。心拍数は、１０及び３０ｍｇ／ｋｇ（それぞれ９．８及び１０．５％）でわずかに有意な下降があったことを除いては、有意に影響されなかった。この試験に従い、ラットは穿刺を行い、ネピカスタット投与による脊髄の節前神経刺激（ＰＮＳ）反応を投与後５時間後に測定した。周波数−昇圧反応曲線は有意に右にシフトした（ｐ＜０．０５）。心拍数はＰＮＳでは有意には影響を受けなかった。これらのデータは、ネピカスタットは交感神経駆動による血管系への阻害し、及びＳＨＲでの抗高血圧効果のメカニズムであると考えられる。
【０１４９】
ネピカスタットのヘテロ環部分は、ホ乳類の甲状腺機能の強力な抑制剤であるメチマゾールに構造的に似ているので、ネピカスタットの甲状腺機能の影響を２．０及び６．２ｍｇ／ｋｇ、経口、ｂｉｄ、１０日にわたりヨウ素欠乏性スプラーグドーリー（ＳＤ）系ラット（ｎ＝９−１２）で評価した。メチマゾール（１ｍｇ／ｋｇ、経口、ｂｉｄ）は、ポジティブコントロールとして用い、投与４時間後のホ乳類の血清中でのＴ３（第３日、３１％、ｐ＜０．０５；第７日及び９日、４２％及び４４％、ｐ＜０．０１）及びＴ４（第３日及び第７日、４６％及び５８％、ｐ＜０．０１）を有意に減少させたのに対し、ネピカスタットは試験中、有意な効果を示さなかった（第３、７及び９日）。両投与量において、ネピカスタット投与により腸間膜動脈における有意にＤＡ／ＮＥ比（担体コントロールと比較してｐ＜０．０１）が上昇したが、第１０日の最終投与４時間後の皮質においては上昇しなかった。
【０１５０】
この試験は、ネピカスタットが、ＤＢＨの強力な選択的及び経口での阻害剤であることを示唆している。この化合物は、動物モデルの有意な行動学上の影響を欠き、これらの発見は将来の研究の主題となるだろう。化合物ネピカスタットは、心血管組織の交感神経駆動を効果的に調節するため、ＣＨＦの治療に試されてきた。
【実施例７】
【０１５１】
ドパミン及びノルエピネフリン濃度は、９４２のうっ血性心不全（ＣＨＦ）患者の血漿サンプルから決定した。試験の目的は：
【０１５２】
１．投与後４週間後における様々な用量のネピカスタットの、経心筋の（動脈性−冠状動脈洞）及び冠状静脈洞のカテコールアミンレベル、及び、１２週を超える投与によるネピカスタットの安全性及び耐性を評価するためである。
【０１５３】
２．以下の評価項目のベースラインからの変化によるネピカスタットの効果を評価するためである：
【０１５４】
ａ）４及び１２週後の血漿中（静脈）カテコールアミンレベル
【０１５５】
ｂ）４及び１２週後のクオリティオブライフ（ＱｏＬ）、ＣＨＦ症状、包括的な評価、及びＮＹＨＡ分類
【０１５６】
ｃ）４週間後の、心拍出量、全身血管抵抗、ＭＶＯ２、肺動脈圧、及び肺動脈楔入圧を含む血流力学係数
【０１５７】
ｄ）ＣＨＦの１２週を超える治療による入院率及び治療薬の投与量の変化
【０１５８】
ｅ）４及び１２週後の血圧及び心拍
【０１５９】
ｆ）４及び１２週後の６分間歩行試験
【０１６０】
ｇ）１２週後の左心室駆出分画率、左心室収縮末期容積、及び左心室拡張末期容積
【０１６１】
血液サンプルは、第４及び１２週の投与２時間後、仰臥位の患者の末梢血管から採取された。さらなるサンプルは、第０日（例えば、投与を開始する前の日）の投与２時間後に対応する時間に、仰臥位の患者から採取した。加えて、患者群は、第４週の投与２時間後及び第０日（例えば、投与開始の前の日）の投与２時間後に、右心及び冠状静脈洞カテーテルを行った。患者のグループから、これらの患者の動脈性静脈及び冠状動脈洞から３回分のサンプルを採取した。
【０１６２】
放射酵素測定法で、ドパミン及びノルエピネフリンの遊離塩基の濃度を決定した。この方法は、血漿サンプルをカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ及びトリチウムＳ−アデノシルメチオニンと培養することを含む。培養が完了すると、液体／液体抽出により血漿からＯ−メチルカテコールアミンを抽出し、薄相クロマトグラフィーによって、分離した。それぞれのカテコールアミンに関連するバンドにマークをつけ、計数のため、シンチレーションバイアルに削る入れた。定量限界は、ドパミン又はノルエピネフリン１ｐｇ／血漿ｍＬである。直線的変化は、０．０４５ｍＬないし１ｍＬの血漿を用いて、１ないし３３３０００ｐｇ／血漿ｍＬの範囲である。
【０１６３】
採取したヒト血漿サンプルは、品質コントロール（ＱＣ）サンプルとして用い、１日１回、常用される方法の動作のモニターのために分析した。
【実施例８】
【０１６４】
前臨床のインビトロ及びインビボ薬理学試験をネピカスタットで行った。化合物のＤＢＨ阻害能をインビトロ試験で評価した。インビトロでの試験は、化合物によるＤＢＨの阻害活性、及び選択的受容体の結合親和性の評価のためにある。インビボ試験は、４つのカテゴリーに分類した：１）生化学的効果（例えば、組織中ノルエピネフリンレベルの減少能及びドパミンレベルの増加能）、２）甲状腺機能への効果、３）心血管効果、及び４）行動学的効果。
【０１６５】
ネピカスタットは、ウシ及びヒトＤＢＨの強力な阻害剤である。ヒトＤＢＨに対するネピカスタットのＩＣ５０は９ｎＭ（ＣＬ６９６０）であり、ＤＢＨ阻害剤ＳＫＦ−１０２６９８（８５ｎＭ）よりも有意に低かった。ネピカスタットのＳエナンチオマーは、化合物Ｂ（１８ｎＭ）として示されるＲエナンチオマーよりも強力であった。
【０１６６】
選択した受容体に対するネピカスタットの結合親和性を測定した。ネピカスタットは、Ｍ１、Ｄ１及びＤ２、及び５ＨＴ１Ａ、２Ａ及び２Ｃに対しては５．０よりも小さい親和性であった。同様に、ラット及びサルにおいて、ネピカスタットのＮ−アセチル代謝物は、これらの受容体に対して親和性を有しなかった。ネピカスタット及びその一次代謝産物は、上述した受容体の強力な阻害剤ではなかった。
【０１６７】
自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）におけるフェニレフリンに対するインビトロでの大動脈収縮反応は、正常血圧ウイスター−京都ラットと比較して、減弱された。毎日、ＳＨＲにネピカスタット（１０ｍｇ／ｋｇ、経口）を２１日間投与することによってフェニレフリン応答性は、ウイスター−京都ラットに匹敵するものとなった。
【０１６８】
結局、ネピカスタットは、ラット及びイヌに対して効果的なＤＢＨ阻害剤であることがわかった。経口又は静脈内投与によって、両方の種においても心臓、腸間膜又は腎動脈、及び大脳皮質での有意な（ｐ＜０．０５）組織内ノルエピネフリンの減少、ドパミンの増加、及びドパミン／ノルエピネフリンレベルの増加につながった。
【０１６９】
自然発症高血圧雄ラット（ＳＨＲ）による試験で、ネピカスタットは、経口投与又は６．２ｍｇ／ｋｇでの腸間膜動脈への静注０．５ないし４時間後にノルエピネフリンを減少させ、及びドパミン及びドパミン／ノルエピネフリン比を増加させた。これらのパラメータの有意な変化は、１２時間間隔で行った二つの静注（１５ｍｇ／ｋｇ）の２回目の投与後６時間におけるＳＤ系雄ラットの左心室でも見られた。雄のＳＨＲに対する１０又は３０ｍｇ／ｋｇの経口投与後、組織内カテコールアミンの２４時間経過を試験した。１時間後のドパミン／ノルエピネフリン比の増加は有意であり、それは持続した（１０ｍｇ／ｋｇの腸間膜動脈投与で１２時間、３０ｍｇ／ｋｇの左心室投与で２４時間）。有意な変化は、雄のＳＤ系ラットにおいて腸間膜動脈への２．０及び６．２ｍｇ／ｋｇ、経口、ｂｉｄ投与では、１０日後、ドパミン及びノルエピネフリンレベルの有意な変化が見られたが、大脳皮質においては有意な効果は見られなかった。ＳＨＲに１又は１０ｍｇ／ｋｇ／日、経口で７又は２５日間投与した場合、ドパミン増加及びドパミン／ノルエピネフリン比の増加が腸間膜動脈及び大脳皮質において見られた。これらを考え合わせると、ラットにおいて、ネピカスタットの腸間膜動脈への急性又は慢性投与（２５日間まで）では、ノルエピネフリンの減少及びドパミン及びドパミン／ノルエピネフリン比の増加が見られることがわかった。
【０１７０】
雄のＳＨＲ及びＳＤ系ラットにおいて、０．３、１、３、１０、３０、及び１００ｍｇ／ｋｇの経口投与６時間後に測定すると、ネピカスタットの効果は、用量依存的であることがわかった。ＳＨＲにおいては、ドパミン／ノルエピネフリン比の有意な変化が、０．３ｍｇ／ｋｇ投与で腸間膜動脈において、３．０ｍｇ／ｋｇ投与で左心室において、及び１０ｍｇ／ｋｇ投与で大脳皮質において見られた。ＳＤ系ラットにおいては、ドパミン／ノルエピネフリン比の増加が、３．０ｍｇ／ｋｇ投与で腸間膜動脈において、１．０ｍｇ／ｋｇ投与で左心室において、及び１００ｍｇ／ｋｇ投与でのみ大脳皮質においても見られた。第２回目の投与−反応試験では、ＳＨＲにおいては、１２時間間隔で３．０、１０、３０、又は１００ｍｇ／ｋｇのいずれかを３回投与し、３回目の投与６時間後に組織を摘出した。ネピカスタットは、左心室及び腸間膜動脈において有意な用量依存的ノルエピネフリン（１０ｍｇ／ｋｇ）の減少及びドパミン（３．０ｍｇ／ｋｇ）、及びドパミン／ノルエピネフリン比（３．０ｍｇ／ｋｇ）の増加をもたらした。ネピカスタットのドパミン及びノルエピネフリン濃度、及びドパミン／ノルエピネフリン比への影響は、大脳皮質では３０及び１００ｍｇ／ｋｇにおいてのみであった。同様の有意な用量−反応効果が、ウイスター系雌ラットの左心室において、ネピカスタットを７日間、飲料水（０．３、０．６、及び１．０ｍｇ／ｍｌ）に混ぜて投与した場合に見られた。結論としては、ネピカスタットは、ラットの大脳皮質（６０−１００ｍｇ／ｋｇ／日）においては、左心室及び腸間膜動脈（１−６ｍｇ／ｋｇ／日）よりもＤＢＨ阻害能は小さいことがわかった。
【０１７１】
ネピカスタット（Ｓエナンチオマー）は、１２時間間隔で３回投与（３０ｍｇ／ｋｇ、経口）した後、ＳＨＲの左心室及び腸間膜動脈において、Ｒエナンチオマーよりも有意な効果が見られた。ネピカスタットは、１回投与後または３回投与後（３０ｍｇ／ｋｇ）のＳＨＲの左心室及び腸間膜動脈において、ＤＢＨ阻害剤ＳＫＦ−１０２６９８よりもノルエピネフリンの減少及びドパミン及びドパミン／ノルエピネフリン比の増加において、有意に効果が見られた。インビボ研究の結果から左心室及び腸間膜動脈における効果は、精製したＤＢＨ（上述参照）を用いたインビトロ研究によく対応していた。しかし、ネピカスタットは大脳皮質においては、ノルエピネフリンレベルの減少及びドパミンレベルの増加において、ＳＫＦ−１０２６９８よりも有意に効果が小さかった。ノルエピネフリンは、レニンの放出を促進し、血漿中レニン活性を増加させることが示されている。それゆえ、ネピカスタット投与に伴うノルエピネフリンレベルの現象が、血漿中レニン活性の現象につながるか、関心のあるところである。しかし、雄ＳＨＲにおいてネピカスタット（３０及び１００ｍｇ／ｋｇ／日、経口、５日間）は、血漿中レニン活性を変化させなかった。それゆえ、ＳＨＲに対して組織内ノルエピネフリンレベルを低下させる濃度のネピカスタットを投与しても、血漿中レニン活性は変化しないことがわかった。
【０１７２】
ネピカスタットは、十二指腸内に３０ｍｇ／ｋｇを投与５時間後雄ビーグル犬の腸間膜動脈においては、有意にノルエピネフリンレベルの減少及びドパミン／ノルエピネフリン比を増加させたが、ドパミンレベルは変化させなかった。ネピカスタットを雄ビーグル犬に４．５日（５、１５、及び３０ｍｇ／ｋｇ、ｂｉｄ、又は１０、３０、及び６０ｍｇ／ｋｇ／日）を投与した場合、１０ｍｇ／ｋｇ／日及び６０ｍｇ／ｋｇ／日まで安定状態を経て、有意なノルエピネフリンの減少、及び有意なドパミン及び腎動脈、腎皮質、及び腎髄質におけるドパミン／ノルエピネフリン比の増加が見られた。同様の結果が、左心室においても見られたが、ドパミンには有意な変化はなかった。大脳皮質においては、ノルエピネフリンは、３０及び６０ｍｇ／ｋｇ／日の場合には有意に減少し、及びドパミン及びドパミン／ノルエピネフリン比は、全ての用量において有意に増加した。結論としては、ネピカスタットは、イヌにおいて１０ｍｇ／ｋｇ／日において強力な経口阻害活性のあるＤＢＨ阻害剤である。
【０１７３】
ネピカスタットは、インビボでの甲状腺ペルオキシダーゼの強力な阻害剤であるメチマゾールと構造的類似性がある。低ヨウ素食を与えられたＳＤ系雄ラットに、ネピカスタットを１０日間４又は１２．４ｍｇ／ｋｇ／日、経口投与したところ、トリヨードチラミン又はチロキシンの血清レベルには、影響を与えなかった。それに対し、メチマゾール（２ｍｇ／ｋｇ／日）は、血清中トリヨードチラミン又はチロキシンを有意に減少させた。それゆえ、ネピカスタットは、メチマゾールとは異なり、トリヨードチラミン又はチロキシンに影響を与えないことがわかった。
【０１７４】
意識下、拘束ストレスを与えたＳＨＲ（１．０−３０ｍｇ／ｋｇ、経口）においては、ネピカスタット誘導性の有意な４時間までの降圧効果が見られ、心拍を有意に減少させた（１０及び３０ｍｇ／ｋｇ）。意識下、拘束ストレスを与えたＳＨＲ（１０ｍｇ／ｋｇ、経口）によるネピカスタットの降圧効果は、ドパミン受容体（ＤＡ−１）アンタゴニストであるＳＣＨ−２３３９０による前処理によっては減少しなかった。また、ネピカスタット（１０ｍｇ／ｋｇ）は、血圧を意識下、拘束ストレスを与えた正常血圧ウイスター−京都ラットにおいて４時間後血圧を降下させたが、減少度（−１３ｍｍＨｇ）は、ＳＨＲ（−４６ｍｍＨｇ）よりも小さかった。まとめると、ネピカスタットは、ＳＨＲの方が大きな効果があったが、ＳＨＲ及び正常血圧ラットの両方において、血圧の低下を起こした。ＳＨＲにおける降圧効果は、ＤＡ−１受容体を介していないと考えられる。
【０１７５】
また、脊髄穿刺したＳＨＲに対する節前神経刺激に対し、ネピカスタットの投与（３ｍｇ／ｋｇ、経口）５時間後、有意に高血圧性及び頻脈性の反応を減少させた。それゆえ、ネピカスタットは、交感神経刺激に対する血圧上昇を減少させる。
【０１７６】
麻酔したＳＨＲにネピカスタット（３．０ｍｇ／ｋｇ、静注）を急速静注すると、３時間以上にわたり、平均動脈圧が低下するが、腎血流は低下させず、又は尿生産、又はナトリウム又はカリウムの尿排泄は変化させなかった。腎における血管抵抗の計算値は、投与に従い低下するした。ネピカスタットによる腎性血管拡張効果がＤＡ−１受容体を介しているかを確かめるために、ＤＡ−１アンタゴニストＳＣＨ−２３３９０を用いた。しかし、この化合物は、単独投与した場合には血圧を低下させたが、これにより結果の説明がつかなくなった。結局、ネピカスタットは、麻酔したＳＨＲにおいて腎機能を損なうことはなく、動脈圧が低下するにもかかわらず、腎血流は減少しなかった。
【０１７７】
ＳＨＲに２１日間毎日のネピカスタット（１及び１０ｍｇ／ｋｇ、経口）を投与し、心拍又は最高血圧をテール・カフ法（ｔａｉｌ ｃｕｆｆ ｍｅｔｈｏｄ）により測定した。しかし、ネピカスタット（１０ｍｇ／ｋｇ、経口）拘束ストレスを与え、動脈カニュレを用いて血圧を測定した場合には有意な降圧効果が見られた。
【０１７８】
ネピカスタットは、血圧無線遠隔変換器（ｒａｄｉｏ−ｔｅｌｅｍｅｔｒｙ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）を装着したＳＨＲを用いた場合には、３０日間３０及び１００ｍｇ／ｋｇ／日を投与した場合、有意に血圧が低下したが、３及び１０ｍｇ／ｋｇ／日においては有意な効果は見られなかった。２４時間以上かけて３０及び１００ｍｇ／ｋｇ／日を投与した場合、３０日以上にわたり効果の減少は見られなかった。心拍は増加せず、自発運動量に影響はなかった。血圧低下を起こさなかったアンジオテンシン変換酵素阻害剤エナラプリル（１ｍｇ／ｋｇ、経口）とネピカスタット（３０ｍｇ／ｋｇ）の３０日以上の併用によっては、降圧効果の相乗効果が見られ、有意な左心室重量の減少が見られた。左心室重量の減少は、エナラプリル単独では見られない。それゆえ、ネピカスタットを、３０日間、ＳＨＲに３０及び１００ｍｇ／ｋｇ／日投与すると、血圧降下が見られ、エナラプリルと併用すると、左心室重量の減少を伴う付加的な血圧降下作用が見られた。
【０１７９】
血圧無線遠隔変換器を装着した正常血圧ウイスターラットにおけるネピカスタットによる血圧降下の影響は、３０及び１００ｍｇ／ｋｇ／日を７日間投与した場合、ＳＨＲよりも小さかった。３０ｍｇ／ｋｇ／日において血圧降下の減少値のピークは−１０ ｍｍＨｇであり、ＳＨＲでは−２０であった。１００ｍｇ／ｋｇ／日において血圧降下の減少値のピークは−１７ ｍｍＨｇであり、ＳＨＲ−４２であった。それゆえ、正常血圧ラットでは、ＳＨＲにおいてより大きな血圧降下作用を有することがわかった。
【０１８０】
麻酔した正常犬おいて、ネピカスタットの急速静注（１−１０ｍｇ／ｋｇ、静注）５時間後、動脈圧、左心圧（ｄｐ／ｄｔピークを含む）、心拍、心拍出量又は腎血流といった心血管効果は生じなかった。意識下、常に血圧無線遠隔変換器を装着したイヌにおいても、単回投与（３−３０ｍｇ／ｋｇ、静注）の１２時間後、同様に効果は欠如していた。
【０１８１】
頸動脈を動脈閉塞させた麻酔した雄ビーグル犬に対し、ネピカスタット（３０ｍｇ／ｋｇ、十二指腸内投与）を投与した場合、直接の腎神経刺激、又は動脈圧の上昇による腎血流の減少といった有意な阻害効果を示さなかった。しかし、麻酔した雄のビーグル犬において、ネピカスタット投与５時間後、ノルエピネフリンレベルの減少及びドパミン／ノルエピネフリン比の有意な増加を引き起こしたが、ドパミンレベルの増加は見られなかった。それゆえ、組織内ノルエピネフリンレベルは有意に減少したが、有意な交感神経系の機能的な応答の阻害は見られなかった。
【０１８２】
頸動脈を動脈閉塞させた麻酔した雄ビーグル犬に対し、ネピカスタット４．５日間、１０ｍｇ／ｋｇ／日を投与した場合、統計的に有意な血圧低下及び心拍の増加は見られなかった。ネピカスタット処置により、静注のチラミン刺激に対し有意に心拍増加反応を減少させたが、血圧上昇の阻害においては、有意にではなくわずかに反応したのみだった。それゆえ、組織内ノルエピネフリンレベルの低下が最大値の場合における投与量でのネピカスタットの慢性投与は、主として交感神経系の機能的な応答に対する阻害効果を持たない。
【０１８３】
ネピカスタットでは、１．０−３０ｍｇ／ｋｇ、経口の急性投与後においても、マウスにおいて有意な総運動行動への影響は見られず、自発運動への影響は見られなかった（１０−１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）。ラットへの急性投与（３−１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）では、自発運動又は音への驚愕反応への影響はなかった。
【０１８４】
行動学的影響は、１０日間１０、３０、及び１００ｍｇ／ｋｇ／日、経口投与によっては、見られなかった。直腸温も影響を受けなかった。運動行動及び音への驚愕反応は、ＤＢＨ阻害剤ＳＫＦ−１０２６９８（１００ｍｇ／ｋｇ／日、経口）及び中枢性α−アドレナリン受容体アゴニストクロニジン（２０ｍｇ／ｋｇ、ｂｉｄ、経口）によって有意に減少した。ＳＨＲに３０日を超える投与（３−１００ｍｇ／ｋｇ／日、経口）をしても運動行動には影響を与えなかった。それゆえ、ネピカスタットは、ラットにおいて、中枢神経系を介した行動学的効果は検出されなかった。
【０１８５】
ネピカスタットは、ヒトにおいてはインビトロで、ラット及びイヌにおいてはインビボで、ＤＢＨ強力な競合阻害剤である。ラットにおいては、ネピカスタット６ｍｇ／ｋｇ／日の経口投与は、心臓及び腸間膜動脈においてＤＢＨ阻害を起こした。他のＤＢＨ阻害剤ＳＫＦ−１０２６９８と異なり、ネピカスタットでは大脳皮質でなく、左心室及び腸間膜動脈への選択性を示した。ネピカスタットでは、行動学的な影響はラットでは見られなかった。イヌにおいては、ＤＢＨ阻害効果の安定状態が心臓、腎動脈及び腎臓において１０ｍｇ／ｋｇ／日投与の場合に見られた。ネピカスタットは、ＳＨＲにおいて交感神経刺激（３ｍｇ／ｋｇ、経口）によるによると昇圧反応を有意に減少させ、３０日間、毎日１回の投与（３０ｍｇ／ｋｇ／日、経口）において血圧を有意に低下させた。結論としては、ネピカスタットは、強力な交感神経系作用を左右するＤＢＨ阻害剤であるといえる。
【実施例９】
【０１８６】
ネピカスタットの高用量投与による以下の薬物動態を評価するために試験をデザインした。雄及び雌のラットの薬物動態を比較するため、及び脳におけるネピカスタットのレベルを定量することにより、ネピカスタットの中枢神経系への浸透性を決定するためのデザインである。
【０１８７】
体重１８０−２２０ｇの雄ラット（Ｃｒｌ：ＣＤ ＢＲ Ｖａｆ＋）を、投与前終夜及び投与後４時間、絶食させた。２％１−ヒドロキシプロピルメチルセルロース（粘度５０センチポワズ）、１％ベンジルアルコール、及び０．６％トゥイーン８０（全てシグマ化学社）を含む水で製剤化して投与した。投与溶液の薬物濃度は、１０、３０、及び１００ｍｇ／ｋｇ投与についてはそれぞれ５、１５、及び５０ｍｇ／ｍｌであり、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）で確認した。５ｍｇ／ｍｌ投与用は、透明な溶液であり、それよりも高い濃度のものは半透明な懸濁液であった。投与体積は、２．０ｍｌ／ｋｇとした。投与後の様々な時間において、血液サンプルはヘパリンコーティングシリンジによる心穿刺によって採取し、血漿を遠心分離により得た。ラットの脳は外科的に摘出し、全てのサンプルは分析まで−２０℃で凍結しておいた。
【０１８８】
血漿（０．０５又は０．５ｍｌ）に、内部標準（５μｇ／ｍｌのネピカスタットモノフルオロ類似体及び５ｍｇ／ｍｌジチオスレイトールを含む５０μｌメタノール）を混合した。サンプルは、２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、（０．５ｍｌ）と混合し、３ｍＬの酢酸エチル／ヘキサンで抽出し（１／１、重量／重量）。分析体を含む有機層を２５０ｍＭ ２５０μｌを酢酸で逆抽出し、１００μｌの水層をＬＣで測定した。ＬＣは、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳ １５ｃｍ Ｃ８カラムを用いて室温で行った。移動相Ａは、５ｍＭドデカンスルホン酸でｐＨ３．０にした１２．５ｍＭリン酸カリウム、移動相Ｂアセトニトリルである。溶媒組成は、溶媒の構成が、４０％のＢで１ｍｌ／ｍｉｎの流量であった。２６１ｎｍでのＵＶ吸収を検出した。分析体の濃度は、未処置のラットに既知の濃度の血漿の分析体を投与して作成した標準曲線から決定した。血漿中濃度データは、μｇ／ｍｌ（遊離塩基）で示す。
【０１８９】
脳は、簡単に生理食塩水で洗浄し、ペーパータオルで拭き、重量を測定した（１．５−２．０ｇ）。内部標準（２０μｇ／ｍｌのネピカスタットのモノフルオロ類似体を含むメタノール溶液５０μｌ）を加え、０．５ｍｇ／ｍｌジチオスレイトールを含むｐＨ７．０、２００ｍＭリン酸ナトリウム５ｍＬ溶液で脳をホモジナイズした。ホモジネート（２ｍｌ）を１０ｍＬの酢酸エチル／ヘキサン（１／１、重量／重量）で抽出した。有機層を穏やかに２５０ｍＭ酢酸の１５０μｌで逆抽出した。
【０１９０】
水層に１００μｌのメタノール（あらゆる乳濁液を分散する）を加え、血漿を表す１００μｌをＬＣで分析した。脳組織中のレベルは、ｇ（遊離塩基）／ｇ脳組織で表される。
【０１９１】
薬物動態のパラメータを、平均血漿中濃度から計算した。血漿中半減期（Ｔ１／２）は、０．６９３／β、ここでβは、排泄速度は排泄速度定数によって、直線的回帰がある場合には、ｌｏｇ血漿中濃度 対  時間のデータを末端の直線的部分で決定する。血漿中濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）は、時間ゼロから最後の定量可能な血漿中濃度を示した時間までを、台形ルールで計算した。ＡＵＣのゼロから無限大（総ＡＵＣ）は、以下の通り計算した：
【０１９２】
総ＡＵＣ＝ＡＵＣ（０−Ｃｌａｓｔ）＋Ｃｌａｓｔ／β、ここでＣｌａｓｔは最後の定量可能な血漿中濃度である。
【０１９３】
雄ラットに対しネピカスタット１０、３０、又は１００ｍｇ／ｋｇを単回経口投与した場合の血漿中濃度が得られた。ネピカスタットの血漿中濃度は用量の増加に伴い上昇し、総ＡＵＣ及び用量の間の関係は、直線的であった。排泄半減期は、高用量において、わずかに増加しているように見えた（雄ラットにおける１０、３０、及び１００ｍｇ／ｋｇの経口投与の場合、それぞれ１．７０、２．０９、及び３．８８時間であった）。ネピカスタットを３０ｍｇ／ｋｇを雌ラットに経口投与した場合、ネピカスタットの血漿中総ＡＵＣは、同用量を雄ラットに投与した場合よりも雌ラットにおいて７７％高かった。脳内ネピカスタットレベル（μｇ／gで表す）は、初期には血漿中濃度（μｇ／ｍｌで表す）よりも低かった。しかし、投与２時間後、ネピカスタットの濃度は血漿中よりも高くなった。
【０１９４】
血漿中ネピカスタットレベルは、雄ラットに対する１０ないし１００ｍｇ／ｋｇ投与の場合、総ＡＵＣに基づき直線的に増加した。
【０１９５】
血漿中ネピカスタットレベルは、３０ｍｇ／ｋｇの投与量の場合、雌ラットにおける方が雄ラットよりも高かった。
【０１９６】
雄ラットに対しネピカスタット１０ｍｇ／ｋｇを投与した場合、脳内濃度は、初期には血漿中よりも低かったが、投与２時間後には脳内におけるネピカスタットの濃度は、血漿中よりも高くなった。
【実施例１０】
【０１９７】
この試験の目的は、自然発症高血圧ラットに対する単回経口投与による腸間膜動脈でのドパミン及びノルエピネフリンレベルへのネピカスタット（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果を、２４時間の時間経過で調べることにある。カテコールアミンレベルは、ネピカスタット（１０ｍｇ／ｋｇ）又は担体（ｄＨ２Ｏ；１０ｍｌ／ｋｇ）の単回経口投与の１、２、４、６、８、１２、１６、又は２４時間後において測定した。
【０１９８】
１６−１７週齢、３００−４００ｇの自然発症高血圧雄ラット（ＳＨＲ）は食餌及び水を自由に与えられた。動物は午後試験の前に、計量し、ランダムに以下の処理群（各群ｎ＝９）：ネピカスタット１０ｍｇ／ｋｇの単回経口投与、又は１、２、４、６、８、１２、１６、又は２４時間後に解剖する担体（１０ｍｌ／ｋｇ）の単回経口投与の群、のいずれかに振り分けた。
【０１９９】
ネピカスタットは、塩酸塩として合成され、ネピカスタットは担体（ｄＨ２Ｏ）に溶解し、１０ｍｌ／ｋｇの経口の繰り返し投与が可能なように調製した。全ての用量のネピカスタットは、遊離塩基等価体として投与し、投与の朝に調製した。
【０２００】
動物に解剖の朝、毎分投与した。投与１、２、４、６、８、１２、１６及び２４時間後、９匹の処置した動物及び９匹の担体を投与した動物をハロタン麻酔し、断頭し、迅速に左心室及び腸間膜動脈を摘出して計量した。腸間膜動脈は０．４Ｍ過酸化水素酸０．５ｍＬの入った遠心管に入れ、左心室は空のクリオチューブに入れた。両組織は、液体窒素で急速凍結し、−７０℃で保存した。腸間膜動脈カテコールアミンレベルは、電気化学的検出方法を用いてＨＰＬＣにより分析した。断頭の際に体内からの血液を、ヘパリンを含んだチューブに採取し、４℃で遠心し、血漿サンプルとした。
【０２０１】
それぞれの処理群は各時点で担体群と比較した。ＴＲＴ、ＨＡＲＶＥＳＴ効果をもつ二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により分析し、それらの相互作用を調べた。ＴＲＴ因子による一元配置ＡＮＯＶＡを、各摘出時に行った。処置群及び担体群における比較分析を、フィッシャーの最小有意差法を用いて、実験あたりの同過誤率を制御するために行った。ノルエピネフリン値は、４時間後の時点においてのみ担体よりも有意（ｐ＜０．０５）に低かった。６時間後の時点では、下限ぎりぎりではあったが有意に低かった（０．０５＜ｐ＜０．１）。ドパミンレベルは、２及び６時間後の摘出の際は担体よりも有意に高かった。ドパミン／ノルエピネフリン比は、１、２、４、６及び１２時間後の時点において、担体よりも有意（ｐ＜０．０５）に高かった。
【０２０２】
一般に、自然発症高血圧ラットに対するネピカスタット１０ｍｇ／ｋｇの投与１、２、４、６、８、１２、１６又は２４時間後において、腸間膜動脈におけるノルエピネフリン又はドパミンレベルに統計的に有意な効果を与えなかった。しかし、処置後最初の１２時間においては、持続的なドパミン／ノルエピネフリン比の増加が見られた。１６及び２４時間後の摘出における分析おいては、３つのパラメータには変化はなかった。
【実施例１１】
【０２０３】
この試験の目的は、ＳＤ系ラットに対する静脈内投与によるネピカスタット（以下、ネピカスタットと呼ぶ）の左心室での、ドパミン及びノルエピネフリンレベルへの影響を調べることにある。動物は、１２時間ごとに、担体（７５％プロピレングリコール＋２５％ＤＭＳＯ；１．０ｍｌ／ｋｇ）又は１５ｍｇ／ｋｇのネピカスタット２回の静脈内投与（ｉｖ）を受ける。組織内ノルエピネフリン及びドパミンレベルを最後の化合物投与６時間後に測定した。
【０２０４】
３００−４００ｇの１６ないし１７週齢のＳＤ系雄ラットに、食餌及び水を自由に与えた。午後試験の前に、動物を計量し、ランダムに以下の処理群（各群ｎ＝１０）：担体（１．０ｍｌ／ｋｇ）又はネピカスタット１５ｍｇ／ｋｇ、のいずれかに振り分けた。
【０２０５】
ネピカスタットを合成し、適切な容量の担体（７５％プロピレングリコール＋２５％ＤＭＳＯ）に溶解し、１．０ｍｌ／ｋｇとして投与できるように調製した。ネピカスタットは、遊離塩基等価体として投与し、初回投与の前日の午後に調製した。
【０２０６】
それぞれのラットに、摘出前日の午後に尾静脈に静注した。投与は、１２時間後、翌朝にも行われた。最終投与の６時間後、ラットにハロタン麻酔をかけ、断頭し、左心室を迅速に摘出して計量した。左心室は、氷冷した０．４Ｍ過酸化水素酸１．０ｍＬ中に加え、組織は、組織内ドパミン及びノルエピネフリンレベルを、電気化学的検出方法により液体クロマトグラフィーにより測定した。
【０２０７】
ノルエピネフリンを処置の主作用として一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った。クラスカル・ワリス検定をドパミンについて行い、処置群間に不均一な分散があるため、まずそれらの比を計算した。続いて、フィッシャーの最小有意差法を用いて、ネピカスタット処置ラット及び担体処置ラットを比較した。タイプ１の実験あたりの同過誤率５％以下となるようにボンフェローニ補正をすべてのｐ値を出す際に行った。
【０２０８】
ネピカスタット１５ｍｇ／ｋｇ投与の場合、担体投与動物と比較して、ノルエピネフリンレベルを５１％有意に（ｐ＜０．０１）減少させ、ドパミンレベルは４７２％有意に（ｐ＜０．０１）増加し、ドパミン／ノルエピネフリン比は１１１７％有意に（ｐ＜０．０１）増加した。
【０２０９】
結論としては、ＳＤ系ラットへのネピカスタットの静脈内投与により、左心室においてＤＢＨを有意に阻害したことがわかった。
【実施例１２】
【０２１０】
この試験では、自然発症高血圧雄ラット（ＳＨＲ）における皮質、左心室、及び腸間膜動脈における、ドパミン及びノルエピネフリンレベルを変化させる、ネピカスタットの効果を評価した。動物には、１２時間間隔で３、１０、３０又は１００ｍｇ／ｋｇを経口で、３回投与した。
【０２１１】
この試験では、Ｓエナンチオマー（ネピカスタット）をＲエナンチオマー（化合物Ｂ）との効果の比較も、３回投与（３０ｍｇ／ｋｇ）して行った。またこの試験では、ネピカスタットを、以前ラットにおいて経口活性があることが示されていたＤＢＨ阻害剤である、ＳＫＦ−１０２６９８、とも比較した。
【０２１２】
化合物は、遊離塩基等価体として調製し投与した。ネピカスタットを適切な容量の担体に溶解した（ネピカスタットはｄＨ２Ｏ、及びＳＫＦ−１０２６９８はＰＥＧ４００:ｄＨ２Ｏ＝５０:５０（容積:容積））。用量３、１０、３０、及び１００ｍｇ／ｋｇのネピカスタット、及び３０ｍｇ／ｋｇのＳＫＦ−１０２６９８を１０．０ｍｌ／ｋｇとなるように調製した。
【０２１３】
１５ないし１６週齢自然発症高血圧雄ラット（ＳＨＲ）（チャールス・リバー社）に食餌及び水を自由に与えた。動物は計量し、ランダムに以下の処置群：１）担体としての蒸留水（ｄＨ２Ｏ）、又は３、１０、３０、及び１００ｍｇ／ｋｇのネピカスタット、２）化合物Ｂ３０ｍｇ／ｋｇの蒸留水溶液、又は、３）担体としてのＰＥＧ４００：ｄＨ２Ｏ又はＳＫＦ−１０２６９８を３０ｍｇ／ｋｇ、に振り分けた。それぞれのラットに朝から開始して、３回、１２時間間隔で経口投与した（投与チューブを用いた経口投与）。３回目の投与の６時間後、ラットをハロタン麻酔し、断頭し、皮質、腸間膜動脈、及び左心室を速やかに摘出し、計量し、氷冷した０．４Ｍ過酸化水素酸中に加え、液体窒素で凍結し、−７０℃で保存した。組織内ドパミン及びノルエピネフリンレベルを高速液体クロマトグラフィー及び電気化学的検出方法により分析した。
【０２１４】
４種の統計分析を行った。最初のシリーズは、様々な投与量のネピカスタット、及び３０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｂを担体コントロール動物と比較した。因子を用量及びブロッキング因子を日とするノンパラメトリック一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を、それぞれの組織及び種について別々に行った。全ての結果を報告する。処置群及びコントロール群の比較分析を、実験あたりの同過誤率を制御するためにダネット検定を用いて行った。２つめの統計的試験では、ＳＫＦ−１０２６９８と、ＰＥＧ−ｄＨ２Ｏ担体処置群とを、ノンパラメトリックｔ−検定を用いて比較した。３つめの統計的試験では、３０ｍｇ／ｋｇにおける化合物Ｂと、ネピカスタットとをノンパラメトリックｔ−検定を用いて比較した。４つめの統計的試験では、３０ｍｇ／ｋｇにおけるネピカスタットと、ＳＫＦ−１０２６９８とを、２つの異なる担体を用いたため、差異の違いを計算する直線的対比を以下の式に従い行った：
【０２１５】
変化＝（３０ｍｇ／ｋｇ−担体）ＮＥＰＩＣＡＳＴＡＴ−（３０ｍｇ／ｋｇ−担体）ＳＫＦ−１０２６９８
【０２１６】
この新しい変数にＳＡＳプロシージャーの一般的線形モデルによってゼロを代入しテストした。
【０２１７】
大脳皮質におけるドパミンレベルは、３０及び１００ｍｇ／ｋｇのネピカスタット投与において、担体よりも有意に大きく（ｐ＜０．０５）、ノルエピネフリンレベルは有意に低く（ｐ＜０．０５）、及びドパミン／ノルエピネフリン比は有意に大きかった（ｐ＜０．０５）。
【０２１８】
左心室におけるドパミンレベルは、３、１０、３０及び１００ｍｇ／ｋｇ投与において、担体よりも有意に大きかった（ｐ＜０．０５）。ノルエピネフリンレベルは、１０、３０及び１００ｍｇ／ｋｇ投与において有意に低かった（ｐ＜０．０５）。左心室におけるドパミン／ノルエピネフリン比は、ネピカスタット３、１０、３０、及び１００ｍｇ／ｋｇ投与において、担体よりも有意に大きかった（ｐ＜０．０５）。
【０２１９】
ＳＨＲの腸間膜動脈におけるドパミンレベルは、３、１０、３０及び１００ｍｇ／ｋｇ投与において担体よりも有意に大きかった（ｐ＜０．０５）。ノルエピネフリンレベルは、１０、３０、及び１００ｍｇ／ｋｇ投与において担体よりも有意に低いとはいえなかった（ｐ＞０．０５）。腸間膜動脈におけるドパミン／ノルエピネフリン比は、ネピカスタットいずれのレベルにおいても担体よりも有意に大きかった（ｐ＜０．０５）。
【０２２０】
化合物Ｂによる処置により、大脳皮質においてドパミン及びノルエピネフリンは両方とも、担体と比較して有意に増加し（ｐ＜０．０１）、ドパミン／ノルエピネフリン比には影響を及ぼさなかった。ノルエピネフリンレベルは、ネピカスタットにおいて化合物Ｂと比較して有意に低下した（ｐ＜０．０１）。
【０２２１】
化合物Ｂによる処置により担体と比較して、左心室において、ドパミン及びドパミン／ノルエピネフリン比が有意に増加したが（ｐ＜０．０１）、ノルエピネフリンレベルは有意に低下しなかった。ネピカスタットは化合物Ｂよりも、ノルエピネフリンレベルをより有意に低下させ、ドパミン及びドパミン／ノルエピネフリン比を増加させた（ｐ＜０．０１）。
【０２２２】
化合物Ｂによる処置により担体と比較して、腸間膜動脈において、ドパミン及びドパミン／ノルエピネフリン比が有意に増加したが（ｐ＜０．０l）、ノルエピネフリンレベルを有意に低下させなかった。ネピカスタットは化合物Ｂよりも有意に、ノルエピネフリンレベル低下させ、ドパミン及びドパミン／ノルエピネフリン比を増加させた（ｐ＜０．０１）。
【０２２３】
大脳皮質におけるネピカスタットをＳＫＦ−１０２６９８と比較すると、３０ｍｇ／ｋｇ投与において、ドパミンレベルは皮質において、ＳＫＦ−１０２６９８の３０ｍｇ／ｋｇ投与の担体に対する場合よりも有意に増加した（ｐ＜０．０１）。担体に対する増加は、ＳＫＦ−１０２６９８における方がネピカスタットよりも有意であった（ｐ＜０．０１）。ノルエピネフリンレベルは、担体に対する減少は、ネピカスタットよりもＳＫＦ−１０２６９８の方が有意に低下させた（ｐ＜０．０１）。皮質におけるドパミン／ノルエピネフリン比は、ＳＫＦ−１０２６９８の担体に対するよりも有意に増加させ（ｐ＜０．０１）、ＳＫＦ−１０２６９８の方がネピカスタットにおけるよりも担体に対する増加は大きかった（ｐ＜０．０１）。
【０２２４】
左心室におけるドパミンレベルは、ＳＫＦ−１０２６９８では担体に対するよりも有意に増加し（ｐ＜０．０１）、担体に対する増加はネピカスタットの方がＳＫＦ−１０２６９８よりも大きかった（ｐ＜０．０１）。ＳＫＦ−１０２６９８処置によっては、ノルエピネフリンレベルは、担体に対して増加しなかったが、ネピカスタット処置では、ＳＫＦ−１０２６９８よりも、担体と比較して有意にノルエピネフリンを低下させた（ｐ＜０．０１）。左心室においてはドパミン／ノルエピネフリン比は、ＳＫＦ−１０２６９８の担体に対するよりも有意に増加し（ｐ＜０．０５）、ネピカスタットの方が、ＳＫＦ−１０２６９８の担体に対するよりも増加が大きかった（ｐ＜０．０５）。
【０２２５】
腸間膜動脈におけるドパミンレベルは、ＳＫＦ−１０２６９８では担体に対するよりも有意に大きく、担体に対する増加はネピカスタットの方がＳＫＦ−１０２６９８よりも大きかった。ノルエピネフリンレベルは、ＳＫＦ−１０２６９８の担体に対するよりも有意に低下し、ネピカスタットは担体に対して、ＳＫＦ−１０２６９８の担体に対してよりも、より有意に低下させた。左心室におけるドパミン／ノルエピネフリン比は、ＳＫＦ−１０２６９８の担体に対するよりも有意に大きく、ネピカスタットの担体に対する増加の方がＳＫＦ−１０２６９８の担体に対するよりも大きかった。
【０２２６】
結論としては、ＳＨＲに対し、１２時間間隔で投与した場合、３回目の経口投与６時間後において、腸間膜動脈、左心室、及び大脳皮質において、ネピカスタットはインビボでの強力なＤＢＨ阻害剤であることがわかった。３０ｍｇ／ｋｇの場合、Ｓエナンチオマーであるネピカスタットが、Ｒエナンチオマー（化合物Ｂ）よりも３つのすべての組織において、より強力であった。さらに、ネピカスタットは、３回の３０ｍｇ／ｋｇ投与した場合、腸間膜動脈及び左心室においては、２４時間以上に渡りＳＫＦ−１０２６９８よりも有効であったが、大脳皮質においては有効でなかった。
【実施例１３】
【０２２７】
ネピカスタットは、遊離塩基等価体として合成及び投与した。ネピカスタット及びメチマゾールは担体に溶解させて（６６．７％プロピレングリコール:３３．３％ｄＨ２Ｏ）適切な濃度の投与用溶液を得、全ての投与が１．０ｍｌ／ｋｇで行われるようにした。
【０２２８】
重量１８０−２００ｇのＳＤ系雄ラットに、投与１４日前にヨウ素欠乏食を自由に与えた（ピュリナ社、５８９１Ｃ、Ｌｏｔ１４７８、０．０６６±０．０４２ｍｇヨウ素／試料ｋｇ）。動物を計量し、ランダムに以下の処置群（各群ｎ＝１２）：ネピカスタット２．０ｍｇ／ｋｇ、ネピカスタット６．２ｍｇ／ｋｇ、メチマゾール１ｍｇ／ｋｇ、又は担体１ｍｌ／ｋｇに振り分けた。。各群のラットは、夜及び次の朝に約１２時間間隔で、１０日連続で行った。
【０２２９】
１０日目の２回目の投与の４時間後、ハロタン麻酔し、断頭し、及び皮質、線条体、及び腸間膜動脈を摘出し、計量した。甲状腺機能の決定のためのコントロールとして用いただけであるため、組織サンプルはメチマゾール群からは摘出しなかった。腸間膜動脈、皮質、及び線条体を速やかに氷冷した０．４Ｍ過酸化水素酸に浸け、その日、ＨＰＬＣによりノルエピネフリン及びドパミンレベルの測定に用いられるまで保存した。
【０２３０】
眼窩血サンプルは第−３、０、３、７、及び９日（第０日が、最初の投与日である）に採血した。血清サンプルは、放射性免疫アッセイを用いてＴ３及びＴ４レベルを分析した。
【０２３１】
Ｔ３及びＴ４レベルの変化を統計的評価するために、ベースラインからの変化を第−３日から計算した。ノンパラメトリック二元配置被験者内分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った。また一元配置ＡＮＯＶＡも、コントロールからの有意差を検出するために行った。実験あたりの同過誤率を制御するためフィッシャーの最小有意差法により、コントロール及びそれぞれの処置群を合わせて行った。
【０２３２】
動物へのネピカスタット２．０及び６．２ｍｇ／ｋｇ投与によるノルエピネフリンレベルは、皮質においては、担体コントロールに対して有意に変化しなかった（ｐ＞０．０５）。２．０及び６．２ｍｇ／ｋｇ投与群における腸間膜動脈におけるノルエピネフリンレベルは有意に低下し（ｐ＜０．０５）、２．０及び６．２ｍｇ／ｋｇにおいて両投与群とも線条体におけるノルエピネフリンレベルは、担体コントロールに比べ、下限ぎりぎりではあったが有意に低下した（ｐ＜０．１０）。
【０２３３】
ネピカスタット２．０又は６．２ｍｇ／ｋｇ投与群のドパミンレベルは、３つのすべての組織においていずれの投与量においても、担体コントロールに対して有意に変化しなかった（ｐ＞０．０５）。
【０２３４】
ネピカスタット２．０及び６．２ｍｇ／ｋｇ投与による皮質及び線条体におけるドパミン／ノルエピネフリン比は、担体コントロールに対して有意に変化しなかったが（ｐ＞０．０５）、ネピカスタット２．０及び６．２ｍｇ／ｋｇ投与による腸間膜動脈における比は、担体コントロールよりも有意に高くなった（ｐ＜０．０５）。
【０２３５】
ネピカスタット２．０又は６．２ｍｇ／ｋｇ投与では、ラット血清中の遊離Ｔ３又は総Ｔ４レベルを変化させることによる甲状腺機能には影響を与えなかった。陽性コントロールであるメチマゾール１．０ｍｇ／ｋｇ投与では、Ｔ３レベルを全ての処置日及びＴ４レベルを第３及び７日において、担体コントロールよりも有意に低下させた（ｐ＜０．０５）。メチマゾール処置動物のＴ４レベルは、第９日において下限ぎりぎりではあったが有意に低下した（ｐ＜０．１５）。
【０２３６】
ネピカスタット（２．０又は６．２ｍｇ／ｋｇ）では、ドパミン又はノルエピネフリンレベル、又はドパミン／ノルエピネフリン比に担体と比べて有意な変化は見られなかった（ｐ＞０．０５）。線条体においては、６．２ｍｇ／ｋｇ投与群においてノルエピネフリンレベルに下限ぎりぎりではあったが有意な減少が見られたが（ｐ＜０．１０）、他の有意な変化は見られなかった。ネピカスタット２．０及び６．２ｍｇ／ｋｇ投与では、腸間膜動脈において有意にノルエピネフリンレベルを低下させ（ｐ＜０．０５）、有意にドパミン／ノルエピネフリン比を増加させたが（ｐ＜０．０５）、ドパミンレベルに有意差はなかった。それゆえ、１０日間の投与により、ネピカスタットは、ＳＤ系ラットのインビボにおいて、大脳皮質又は線条体よりも腸間膜動脈に大きな効果を持つ、有効なドパミンβ−ヒドロキシラーゼ阻害剤であることがわかった。
【実施例１４】
【０２３７】
この試験は、ネピカスタットをイヌに投与することにより、腎髄質及び腎皮質におけるドパミン及びノルエピネフリンレベルを決定する目的がある。雄ビーグル成犬を、ランダムに４群に、各群８匹を振り分け、ネピカスタットを経口投与した。ネピカスタットは、５、１５及び３０ｍｇ／ｋｇを単カプセル剤として投与した。担体は空のカプセルとした。それぞれのイヌに朝と午後に２用量を投与した（８−１０時間間隔）。第５日朝に１用量を投与し、その６時間後にイヌを安楽死させた。腎髄質及び腎皮質サンプルを迅速に摘出し、計量し、氷冷した０．４Ｍ過酸化水素酸に浸け、液体窒素で凍結し、−７０℃で保存した。
【０２３８】
ノルエピネフリン（ＮＥ）及びドパミン（Ｄ）レベルの定量のため、それぞれの組織を０．４Ｍ過酸化水素酸中、簡易な超音波処理をした。超音波後、ホモジネートを３０分間４℃において１３，０００ｒｐｍで遠沈した。それぞれの上清を除去し、３、４−ジヒドロキシベンジルアミン（ＤＨＢＡ）を加えた。それぞれのサンプルからの抽出物は、電気化学的検出方法によりＨＰＬＣ分離した。この方法は、それぞれの検体において定量限界２．０ｎｇ／ｍＬであり、直線範囲は２．０ｎｇ／ｍＬないし４００ｎｇ／ｍＬである。
【０２３９】
それぞれの検体において、組織の重量において計算し、組織のグラム数に対し、μグラムで表した。ドパミン、ノルエピネフリン及びドパミンレベルのノルエピネフリンレベルの比（Ｄ／ＮＥ）をそれぞれのイヌについて計算した。加えて、計算上の平均値及びＤ／ＮＥ比をそれぞれの処置群においてそれぞれの検体について計算した。
【実施例１５】
【０２４０】
体重９−１６ｋｇの雄ビーグル犬（マーシャルファーム、Ｎｏｒｔｈ Ｒｏｓｅ、ＮＹ）を用いた。動物は水を自由に飲め、毎日１回午前１０時までに食餌を与えられる。動物は、ランダムに以下の処置群（ｎ＝８／群）：プラセボ（空のカプセル）、又はネピカスタット２ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄ（４ｍｇ／ｋｇ／日）、の一つに振り分けた。それぞれの動物は、毎日２用量、朝及び午後（８−１０時間間隔）に投与される。血液サンプル（１０ｍｌ）は、毎日、血漿中ネピカスタット及びカテコールアミンレベルの測定のために採血した。血液は、１時間以内にヘパリン及びグルタチオンを含むチューブに集め、−４℃で遠心した。血漿は、一つは血漿中カテコールアミンの測定のため、及びもう一つはネピカスタットの分析のために、２つのサンプルに分けた。
【０２４１】
組織サンプルも、後の時点で組織内カテコールアミンの分析に必要と思われたときのために、イヌから採取した。第１５日、午前の投与６時間後、最終血液サンプルを採血した（１０ｍｌ）。イヌは、ペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ、静注）で麻酔し、解剖台にのせ、２回目のペントバルビタール（８０ｍｇ／ｋｇ、静注）で安楽死させた。速やかに正中開胸手術を行い、腹部切開を行った。腎動脈及び左心室を切り取った。開頭して前頭葉の大脳皮質を露出させ、生体組織を採取した。組織サンプルを計量し、氷冷した０．４Ｍ過酸化水素酸に浸け、液体窒素で凍結し、分析まで−７０℃で保存した。
【０２４２】
血漿中のノルエピネフリン（ＮＥ）、ドパミン（ＤＡ）及びエピネフリン（ＥＰＩ）は、電気化学的検出方法を用いてＨＰＬＣにより分析した。ネピカスタットの血漿中濃度は電気化学的検出方法を用いてＨＰＬＣにより分析した。
【０２４３】
Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換は、対数が適切な変動安定化変換であることを示した；それゆえすべての分析は対数値で行われる。イヌ１の第１０日のＤＡ濃度ＢＱＬ（定量下限未満）を０とした；ｌｎ(０)は、欠損とした。分析は混合モデル（ＰＲＯＣ ＭＩＸＥＤを用いた）を用いて行った。分析の日及び処置のカテゴリー変数が固定されており、イヌの処置が変量効果である。固定効果は、薬剤及びプラセボ群が日々変わることによる、日及び処置の相互作用が含まれる。間違った項目を特定のコントラストに訂正するＣＯＮＴＲＡＳＴによってコントラストが計算される。特に、比較する処置群のコントラストで平均２乗誤差を含む。
【０２４４】
ヘルマート変換を用いて安定状態の期間を計算した（ＳＡＳ ＰＲＯＣ ＧＬＭマニュアルを参照）。これらの変換は、それぞれの処置の平均を、それ以降の時点の処置の平均と比較する。安定状態の時間は、ヘルマートコントラストが統計的に有意であるとした最初の時点からの最大時間である。しかし、この方法は、本件に現れる場合のような、なだらかな変化のプロセスを検出することができないため、安定状態にある間の検体濃度の勾配も計算した。それぞれのイヌの安定状態にある間の勾配が計算され、動物ごとの勾配が得られる。そこから、勾配の単変量統計が計算され、平均勾配からの通常理論（Normal theory）の信頼区間、及び勾配ゼロの場合の仮説が試みられ、通常理論のｐ値が計算される。この勾配分析は、安定状態は濃度変化の期間であったかどうかの決定の基礎として用いられる。
【０２４５】
プラセボ群と比較し、ネピカスタット（２ｍｇ／ｋｇ、ｂｉｄ）は、有意に血漿中ＮＥ（２．１倍）及びＥＰＩ（１．９１倍）を減少させ、有意に血漿中ＤＡ（７．５倍）及びＤＡ／ＮＥ比（１３．６倍）を増加させた。
【０２４６】
血漿中ＮＥ及びＥＰＩのピーク値の減少が第６日及び第８日にそれぞれ見られたが、血漿中ＤＡ及びＤＡ／ＮＥ比の増加が第７日及び第６日にそれぞれ見られた。血漿中ＮＥ、ＤＡ及びＥＰＩの安定状態は、それぞれおよそ第４、８及び６日であったと見られる。血漿中ＤＡ及びＤＡ／ＮＥ比の変化は、全ての日の投与後において、プラセボと比較して有意に異なっていた。血漿中ＮＥは、第４−９日及び第１１−１３日の投与後において、プラセボと比較して有意に異なっていた。血漿中ＥＰＩは、第７−９日及び第１２日の投与後において、プラセボと比較して有意に異なっていた。
【０２４７】
ネピカスタットの投与（２ｍｇ／ｋｇ、ｂｉｄ）により、全ての薬物投与の日のネピカスタットは血漿中濃度において有意に現れた。ピーク濃度は、投与２日後に現れた。有意なネピカスタットのＮ−アセチル代謝物はいずれの日においても有意に現れることはなかった。
【０２４８】
ネピカスタット（２ｍｇ／ｋｇ、ｂｉｄ、経口）の慢性投与（１４．５日間）により、血漿ＮＥ及びＥＰＩの有意な低下、及び血漿中ＤＡ及びＤＡ／ＮＥ比の有意な増加が見られた。これらの変化は、ドパミンβ−ヒドロキシラーゼ酵素を阻害することを介して交感神経副腎系を阻害することを反映している。
【実施例１６】
【０２４９】
ネピカスタットを計量し、カプセルごとに５、１５、及び３０ｍｇ／ｋｇ投与量となるようにカプセル剤を調製した（サイズ１３−トーパック社；Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）最初のイヌの体重を用いてそれぞれの動物の投与量を決定した。０ｍｇ／ｋｇ／日とは、イヌに空のカプセル（プラセボ）を投与する。全ての用量のネピカスタットは、遊離塩基等価体として投与した。
【０２５０】
重量１０−１２ｋｇの３２の雄ビーグル犬を、ランダムに以下の４つの処置群（各群ｎ＝８）：ネピカスタット０ｍｇ／ｋｇ／日（プラセボ）、１０ｍｇ／ｋｇ／日（５ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄ）、３０ｍｇ／ｋｇ／日（１５ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄ）、又は６０ｍｇ／ｋｇ／日（３０ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄ）、に振り分けた。イヌの番号は、用量群Ａには１−１６をつけ、用量群Ｂには１７−３２をつけた。組織摘出のための最終の手術は、１日１６動物行い、２日以上がかかった。最初の化合物を投与する２又は３日前に、それぞれのイヌの重量を測定し、頭部、伏在静脈、及び頸静脈を覆う皮膚の部分の毛を剃った。投与は、１カプセルを経口投与、２回目は８−１０時間後に投与することから構成される。第１−３日はスケジュール通り投与した。血漿中化合物濃度のベースラインを決定するために、第４日には、午前の投与前に頸静脈から３ｍＬの血液を採取した。次に、午前の投与を行い、投与１、２、４及び８時間後、血漿中化合物濃度を決定するために、３ｍＬの血液サンプルを採取した。血液サンプルは、ヘパリンを含むチューブに入れ、４℃で遠沈し、−２０℃で分析まで保存した。次に午後の投与をスケジュール通り行った。スケジュール通り午前の投与を行った。午前の投与約６時間後、血漿中化合物濃度の決定のために、最終の頸静脈から３ｍＬ血液サンプルを採取した。イヌにペントバルビタールナトリウムを、頭部又は伏在静脈に投与して麻酔し（〜４０ｍｇ／ｋｇ）、解剖室に運び、さらにペントバルビタールナトリウムを投与した（〜８０ｍｇ／ｋｇ、静注）。左心室、腎動脈、腎臓、腎髄質、腎皮質及び大脳皮質を速やかに摘出し、計量し、２ｍＬの０．４Ｍ過酸化水素酸に加え、液体窒素で凍結させて−７０℃で分析まで保存した。その後、カテコールアミン類をＨＰＬＣにより電気化学的検出方法を用いて分析した。すべての組織サンプルは２つの部分に分け、第２の部分は即時に液体窒素により凍結し、組織内化合物濃度の決定まで−７０℃で保存した。第３に、貫壁サンプルは左心室から切り出し、即時に液体窒素で凍結させ、−７０℃で分析まで保存し、受容体結合実験において用いた。
【０２５１】
貫壁のサンプルを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．４、４℃）で、ポリトロンＰ−１０組織破砕装置を用いて（セッティング１０、２ｘ１５秒間破砕）ホモジナイズした。ホモジネートは、５００×ｇで１０分間遠沈し、上清を氷浴で保存した。沈殿物は、再度懸濁して洗浄し、５００×ｇで遠沈し、上清を合わせた。合わせた上清を４８，０００×ｇで２０分間遠沈した。沈殿物は、再度懸濁して洗浄し、ホモジナイズ用の緩衝液で１回及び５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．５ｍＭＥＤＴＡ緩衝液で２回洗浄した（ｐＨ７．４、４℃）。沈殿した膜は−７０℃で、必要となるまで保存した。飽和試験は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４、３２℃）を含む［３Ｈ］ ＣＧＰ−１２１７７で行った。非特異的結合を１０μＭイソプロテレノールによって特定した。総結合、非特異的結合、及び総カウントチューブを、０．０１６ｎＭないし２ｎＭの８つの濃度の［３Ｈ］ ＣＧＰ−１２１７７のためにセットした。サンプルは、３２℃６０分間で培養した。サンプルはブランデルセルハーベスターを用いて０．１％ＰＥＩ前処理ＧＦ／Ｂガラス繊維フィルターマットで濾過した。サンプルは、３回３秒間、室温の水で洗浄した。アクアゾルシンチレーション試薬をそれぞれのバイアルに加え、液体シンチレーションカウンターで放射性同位体を特定した。飽和結合等温を、最初の総リガンド濃度から遊離リガンド濃度への変換の後に分析した（総−結合＝遊離）。個々の飽和等温をそれぞれの組織において計算した。細胞膜はタンパクとして、バイオ−ラッドタンパク質結合法を用いてγグロブリンを標準物質として細胞膜のアッセイをした。受容体の密度は、タンパク質に対するｍｇで表され、それぞれの処置群の平均をとった。組織内カテコールアミン濃度は、ネピカスタット処置群をプラセボ（コントロール）群と比較して分析した。ノンパラメトリック一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により、投与量を因子として、それぞれの組織及びそれぞれのカテコールアミン類を別々に測定した。それぞれの投与量における処置群とコントロールの対比分析を、実験あたりの同過誤率を制御するためダネット検定を用いて行った。Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ及びフィッシャーの最小有意差法を検証のために行った。組織及び血漿中の化合物濃度の分析は、２つの方法で行った。１つ目は、それぞれのパラメータを、それぞれの対応する用量を対応する用量の因子のパラメータとして比較するために個別のｔ−検定を行った。例えば、１０ｍｇ／ｋｇ投与を３回行った場合、特定の組織又は血漿においては、３０ｍｇ／ｋｇ投与群と匹敵する化合物濃度が見られるはずである。加えて、一元配置ＡＮＯＶＡにおいて、直線的直交コントラストを３つのすべての用量について計算した。対比ｔ−検定は、担体群とネピカスタット１０ｍｇ／ｋｇ／日投与群とにおいて結合の差異があるかを決定するために行った。
【０２５２】
イヌに０、５、１５、又は３０ｍｇ／ｋｇのネピカスタットのカプセル剤 ｂｉｄを１０、３０、及び６０ｍｇ／ｋｇ／日となるよう４．５日間投与し、最後の投与の６時間後に組織を摘出した。腎動脈においては、１０、３０及び６０ｍｇ／ｋｇ／日のネピカスタット投与の場合には、それぞれ８６％、８１％及び８５％、有意にノルエピネフリンレベルを低下させた（ｐ＜０．０１）。ドパミンレベルは１０、３０及び６０ｍｇ／ｋｇ／日投与の場合には、それぞれ１８０％、２７３％及び２６８％、有意に増加させた（ｐ＜０．０１）。１０、３０及び６０ｍｇ／ｋｇ／日のネピカスタット投与の場合には、ドパミン／ノルエピネフリン比を、それぞれ１７１１％、１７６７％及び１９４４％、プラセボに比べて有意に増加させた（ｐ＜０．０１）。１０及び６０ｍｇ／ｋｇ／日のネピカスタット投与の場合、大脳皮質ドパミンレベルは、それぞれ６３２％及び４１１％、有意に増加した（ｐ＜０．０１）。ドパミン／ノルエピネフリン比は、１０ｍｇ／ｋｇ／日のネピカスタット投与の場合には、５３１％増加し、及び６０ｍｇ／ｋｇ／日のネピカスタット投与後においては、有意に（ｐ＜０．０１）６１２％増加した。ノルエピネフリンレベルは、２つの投与量においては有意に変化をしなかった（ｐ＞０．０１）。３０ｍｇ／ｋｇ／日投与では、ノルエピネフリンは６３％、有意に減少し（ｐ＜０．０１）、比は８６％、有意に増加したが（ｐ＜０．０１）、ドパミンレベルはプラセボに対して１７４％、かろうじて増加した（０．０５＜ｐ＜０．１０）。１０、３０及び６０ｍｇ／ｋｇ／日のネピカスタット投与の場合、ノルエピネフリンレベルは左心室においては、それぞれ８５％、５８％及び７９％、有意に減少した（ｐ＜０．０１）。ドパミン／ノルエピネフリン比はプラセボ動物に対して、それぞれ８５２％、２７９％及び６０７％有意に（ｐ＜０．０１）。１０、３０、及び６０ｍｇ／ｋｇ／日のネピカスタット投与の場合には、ドパミンレベルの有意な変化は見られなかった。
【０２５３】
１０、３０及び６０ｍｇ／ｋｇ／日のネピカスタット投与の場合、腎皮質において、プラセボと比較してノルエピネフリンレベルは、それぞれ８６％、６６％及び８５％、有意に減少した（ｐ＜０．０１）。これらの濃度において、ドパミンレベルは、それぞれ１５６％、５０２％及び２０８％、有意に増加した（ｐ＜０．０１）。１０、３０、及び６０ｍｇ／ｋｇ／日投与の場合、ドパミン／ノルエピネフリン比は、それぞれ１６５３％、１４４０％及び１６９３％、有意に増加した（ｐ＜０．０１）。１０、３０及び６０ｍｇ／ｋｇ／日ネピカスタット投与の場合、腎髄質、ドパミン／ノルエピネフリン比は、プラセボに対してそれぞれ５５５％、６３６％及び６７７％、有意に増加した（ｐ＜０．０１）。１０及び６０ｍｇ／ｋｇ／日投与の場合、ドパミンレベルは５２２％、有意に増加し（ｐ＜０．０１）、３０ｍｇ／ｋｇ／日では、それぞれ１５０％及び１５６％、下限ぎりぎりではあったが有意に増加した（０．０５＜ｐ＜０．１０）。１０ｍｇ／ｋｇ／日のネピカスタット投与の場合、ノルエピネフリンレベルは７２％、プラセボに対して有意に減少した（ｐ＜０．０１）。６０ｍｇ／ｋｇ／日投与の場合、６９％、下限ぎりぎりではあったが有意に減少した（０．０５＜ｐ＜０．１０）。
【０２５４】
第４日のネピカスタットの血漿中濃度及び、第５日の組織及び血漿中濃度は、それぞれの投与レベルと、対応濃度の因子レベルは、用量に依存していた。それゆえ、投与点は以下の例外を除いて直線的であることがわかった（有意な結果からは、このデータは直線的でないことを示唆している）。
【０２５５】
腎髄質：３×１０＜３０（ｐ＜０．０５）
腎髄質：６×１０＜６０（ｐ＝０．０７７）
血漿（第４日）：２×３０＞６０（ｐ＝０．０７６）
【０２５６】
第５日においては、全ての組織内ネピカスタットレベルは、血漿中よりも高かった。
【０２５７】
１０ｍｇ／ｋｇ／日のネピカスタット投与群における左心室サンプルでは、担体処置群と差がなかった。
【実施例１７】
【０２５８】
ネピカスタットについて、チロシンヒドロキシラーゼ、ＮＯ合成酵素、ホスホジエステラーゼＩＩＩ、ホスホリパーゼＡ２、中性エンドペプチダーゼ、Ｃａ２＋／カルモジュリンタンパク質キナーゼＩＩ、アセチルＣｏＡ合成酵素、アシルＣｏＡ−コレステロールアシルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、タンパク質キナーゼ（非選択的）及びシクロオキシゲナーゼ−Ｉに対する酵素活性を調べた。図４に示されるように、ネピカスタットは、調べた１２すべての酵素についてＩＣ５０＞１０μＭであり、ドパミン−β−ヒドロキシラーゼ阻害剤として抗選択的であるといえる。（＞１０００倍）。
【実施例１８】
【０２５９】
ウシＤＢＨはシグマ化学社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。ヒト分泌性ＤＢＨは、神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨの培養細胞から精製され、阻害活性のデータを得るために用いた。２５ｍＬゲルを含むレンチルレクチンセファロースカラムを充填し、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．５、０．５Ｍ ＮａＣｌで並行化した。カラムは、５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ中１０％ メチルα、Ｄ−マンノピラノシド３５ｍＬを含む溶液を０．５ｍｌ／分で溶出した。最も多く酵素活性を有する分画を集め、ＹＭ３０膜を用いてアミコン攪拌細胞で濃縮した。メチルα、Ｄ−マンノピラノシドを５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＣｌによるバッファー交換で除いた。濃縮した酵素溶液、−２５℃で保存した。
【０２６０】
基質としてチラミン及びアスコルビン酸を用いてＤＢＨ活性を測定するのにＨＰＬＣアッセイを用いた。この方法は、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーによるチラミン及びオクトパミンの分離及び定量に基づく（Ｆｅｉｌｃｈｅｎｆｅｌｄ， Ｎ．Ｂ．， Ｒｉｃｈｔｅｒ， Ｈ． ＆ Ｗａｄｄｅｌｌ， Ｗ．Ｈ． (１９８２)．  Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ： Ａ ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ ａｓｓａｙ ｏｆ ｄｏｐａｍｉｎｅ β−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｎｇ ｈｉｇｈ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．  １２２： １２４−１２８）。アッセイは、ｐＨ５．２、３７℃で、０．１２５Ｍ ＮａＡｃ、１０ｍＭフマル酸、０．５〜２．０μＭＣｕＳＯ４、０．１ｍｇ／ｍｌカタラーゼ（６，５００ ｕ、べーリンガーマンハイム社、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、０．１ｍＭ チラミン、及び４ｍＭ アスコルビン酸を用いて行った。典型的なアッセイとしては、０．５−１．０ミリユニットの酵素を反応混合物に加え、カタラーゼ、チラミン及びアスコルビン酸を含む基質混合物を加えて反応を開始した（最終容積２００μｌ）。試料は３７℃で３０〜４０分間培養した。反応は、２５ｍＭ ＥＤＴＡ及び２４０μＭ ３−ヒドロキシチラミン（内部標準）を含む停止溶液でクエンチした。試料（１５０μｌ）をギルソンオートサンプラーにアプライし、２８０ｎｍＵＶ検出のＨＰＬＣで分析した。ＰＣ−１０００ソフトウエア（サーモセパレーション（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）社製、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）をデータの統合及び分析に用いた。ＨＰＬＣは、流速１ｍｌ／分、リクロカート１２５−４ＲＰ−１８カラムを用いて１０ｍＭ 酸、１０ｍＭ １−ヘプタンスルホン酸、１２ｍＭテトラブチルアンモニウムホスファート、及び１０％メタノールを含む均一濃度溶出で行った。残物質の活性％は、阻害剤を含まないコントロールから計算し、内部標準及び非線形４係数用量反応曲線から得られたＩＣ５０値で補正した。
【０２６１】
［１４Ｃ］−チラミンの精製。［１４Ｃ］チラミン塩酸塩はＣ１８ライトロードカラム（２つのカラムを１つに結合したもの）で精製し、２ｍＬのＭｅＯＨで洗浄し、２ｍＬの５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ２．３、３０％アセトニトリル、及び続いてｐＨ２．３、４ｍＬの５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４で洗浄した。真空マニホールド（Ｓｐｅｅｄ Ｍａｔｅ ３０、アプライドセパレーション（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）社）を用いて、真空でカラムを洗浄し、溶出した。［１４Ｃ］チラミンをアプライし、カラムを５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ２．３  ６ｍＬで洗浄し、３０％ アセトニトリルを含む５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４  ２ｍＬで溶出した。溶出液は、アセトニトリルを除くために凍結乾燥し、Ｈ２Ｏに再懸濁させ、−２０℃で保存した。
【０２６２】
酵素アッセイは放射活性法によって行った。酵素活性は、［１４Ｃ］チラミンを基質として用い、Ｃ１８カラムを用いて生成物を分離する。アッセイは、２００ｍＬ容器に、１００ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．２、１０ｍＭ フマル酸、０．５μＭＣｕＳＯ４、４ｍＭ アスコルビン酸、０．１ｍｇ／ｍｌカタラーゼ及び様々な濃度のチラミンを加えて行った。それぞれの反応における総カウント数は〜１５０，０００ｃｐｍであった。ウシＤＢＨ（各反応につき０．１８ｎｇ）を３７℃中、反応緩衝液中、チラミン及び阻害剤と混合した。反応は、アスコルビン酸／カタラーゼ混合物を加えることにより開始し、３７℃で３０分間培養した。反応は、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ２．３の１００ｍＬで停止させた。ＭｅＯＨであらかじめ洗浄し、５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ２．３で平衡化したＣ１８ライトロードカラム（２つのカラムを１つに結合したもの）に全混合物をアプライした。シンチレーションバイアルへの溶出液は、ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ２．３緩衝液で２回、続いて２ｍＬの同じ緩衝液で洗い込んだ。レディセーフシンチレーション液（１６ｍｌ）をシンチレーションバイアルに加え、１４Ｃ放射性同位体の計測のために試料を加えた。
【０２６３】
チラミン濃度:０．５、１、２、３、４ｍＭの場合における阻害の速度を調べるため、０、１、２、４、８ｎＭのネピカスタット濃度で試験した。１４Ｃカウントは、上述で行ったのと同一であった。酵素を含まないブランクコントロールは、バックグラウンドを得るために行った。データは、バックグラウンドの計算のために集められ、ｎｍｏｌ／分  活性に変換し、プロットした（１／Ｖ対１／Ｓ軸）。Ｋｍ’は、傾斜及びＹ切片から計算され、Ｋｉ値を得るために、線形回帰により計算した。
【０２６４】
基質濃度が３７℃でｐＨ５．２、０．１ｍＭチラミン、４ｍＭアスコルビン酸の場合におけるヒト及びウシＤＢＨに対するＳＫＦ−１０２６９８、ネピカスタット及び化合物ＢのＩＣ５０値をＨＰＬＣアッセイにより求めた。３つのすべての化合物とも、用量依存的にウシ及びヒトのいずれの酵素についてＤＢＨ阻害活性を有していた。
【０２６５】
ネピカスタット、化合物Ｂ及びＳＫＦ−１０２６９８のＩＣ５０値から、Ｓエナンチオマー（ネピカスタット）はヒトの酵素についてＲエナンチオマーよりも強力であることがわかった（化合物Ｂよりも３倍、ウシＤＢＨに対して２倍）。ネピカスタットは、ＳＫＦ−１０２６９８よりも８倍ウシＤＢＨに対して、及び９倍ヒトＤＢＨに対して活性を有することがわかった。
【０２６６】
０．６ｍＭにおけるＫｍは、ラインウィーバー−バークプロットで求めた。ネピカスタット（１−８ｎＭ）は競合阻害剤において見られるＫｍに大きなシフトが見られた。ネピカスタットによるウシＤＢＨ阻害は、チラミンと競合していると考えられる。線形回帰によりＫｉは、４．７±０．４ｎＭと算出した。
【０２６７】
ネピカスタットは強力なヒト及びウシＤＢＨ阻害剤である。ＳＫＦ−１０２６９８の８−９倍強力な阻害効果を有する。ネピカスタット（Ｓエナンチオマー）は、化合物Ｂ（Ｒエナンチオマー）よりも２−３倍強力である。ネピカスタットによるウシＤＢＨ阻害は、Ｋｉが４．７±０．４ｎＭとなり、チラミンと競合していると考えられる。
【実施例１９】
【０２６８】
ネピカスタットの親和性は、標準的放射性リガンド結合アッセイ法によって測定した。
【０２６９】
競合結合データは、４パラメータロジスティック法により逐次曲線にフィッティングさせて、分析した。ヒル係数及びＩＣ５０値は直接得られた。競合するリガンドのｐＫｉ（−ｌｏｇ Ｋｉ）は、チェンプルソフの等式によりＩＣ５０値から計算した。
【０２７０】
ネピカスタットは、α１受容体に対して中程度の親和性を有した（ｐＫｉは６．９−６．７）。他の全ての受容体に対する親和性は比較的低かった（ｐＫｉ＜６．２）。
【実施例２０】
【０２７１】
投与に際しては、担体とネピカスタット粉末を混合し、振とうすることにより、ネピカスタット製剤６０−ｍｇ／ｍｌを調製しておいた。６−及び２０−ｍｇ／ｍｌのネピカスタット製剤は、６０−ｍｇ／ｍｌ製剤を担体で希釈することにより得た。再構成したネピカスタット製剤は使用期間中、活性を保っていた。水溶性の担体及びネピカスタット製剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ベンジルアルコール、及びポリソルベート８０を含んでいる。
【０２７２】
用量選択は、マウスにネピカスタット２５０、１０００、又は２５００ｍｇ／ｋｇを単回経口投与する急性毒性試験に基づいて行った。１０００及び２５００ｍｇ／ｋｇの場合に毒性の臨床的なサインが現れ死亡した。
【０２７３】
担体又はネピカスタット製剤の単回経口投与は、げっ歯類用挿管器を用いて強制投与により行った。経口ルートが選択されたのは、臨床的に投与される経路と考えられるからである。投与用量は、投与前に記録した個々の体重に基づいて計算した（本明細書において体重は表にしていない）。食餌及び水は、プロトコールに１．５時間と特定して記載しなかった場合には、２．５ないし３．５時間前にやめさせた。この違いは試験の整合性に影響を与えるものではなかった。
【０２７４】
臨床所見を投与前に記録した。投与後、最初の６０分、それぞれの処置群のマウスは、３匹までの群として、約１０分間隔で臨床所見を評価し、プロトコール仕様の行動テストを行った。３０−ｍｇ／ｋｇ投与群の１匹、及び１００−ｍｇ／ｋｇ投与群の１匹は投与後に死亡したので、試験から除いた。残ったマウスは、観察／試験期間の終了後に安楽死させ、試験から除いた。
【０２７５】
各群６匹の雄マウスに、それぞれ投与チューブを用いて０（担体）、３０、１００、又は３００ｍｇ／ｋｇのネピカスタットを単回経口投与した。臨床所見は、試験製剤の投与６０分後に開始した。観察終了後、残ったすべてのマウスは安楽死させ、試験から除いた。
【０２７６】
担体コントロール群と比較して、３０−、１００−、及び３００−ｍｇ／ｋｇ群において体温低下が見られた。処置に関連した臨床的挙動又は相対的な行動の変化は見られなかった。直腸温度データ及び観察及び行動試験データが得られた。処置に関連した臨床的挙動又は相対的な行動の変化は見られなかった。異常な群衆性（その他の反応としてリストに挙げた）は、１００−ｍｇ／ｋｇ投与群に見られたが、３００−ｍｇ／ｋｇ投与群には見られなかった；これは偶然に起こったことと考えられる。１００−ｍｇ／ｋｇ投与群に１匹見られた臨床学的／行動学的変化とは、不活発化、異常な歩き方及び姿勢、誘発行動の減少、異常な無抵抗性、及び穏やかな／継続した発声であった；これらの変化は、ネピカスタットによるものではない。３０−及び１００−ｍｇ／ｋｇ投与群において、投与後１匹ずつ死亡したことは、偶然であると考えられ、試験から除いた。
【実施例２１】
【０２７７】
この試験の目的は、ＤＢＨ阻害剤であるＳＫＦ−１０２６９８及びネピカスタット投与により、自発運動又は音への驚愕反応に変化を及ぼすかを調べることにある。それゆえ、これらの行動の変化は、これらの化合物の中枢神経系での働きを反映していると考えられる。
【０２７８】
成熟ＳＤ系雄ラット（試験日の体重２５０−３５０ｇ）は、チャールスリバー社から入手した。ラットは、９時から２１時に電気をつける通常の明／暗サイクルで飼育した。動物は、つがいで通常の金属ワイヤーケージで、食餌及び水は自由に摂らせた。
【０２７９】
自発運動箱は、１８”×１８”、高さ１２”のプレキシガラス（登録商標）の箱からなる。プレキシガラス（登録商標）の箱は、１インチ幅フォトビームの及び箱ごとに３２まで番号を付けらたフォトセンサーからなるオムニテックデジスキャン動物行動モニター（モデル番号ＲＸＸＣＭ−１６）によって囲まれている。オムニテックデジスキャン分析装置によって、フォトビームの遮断の数を分析した（モデル番号ＤＣＭ−８）。動物は、外部音を遮断するため、ホワイトノイズ装置の稼働している部屋の中で試験をした。
【０２８０】
音への驚愕反応試験は、８つのＳＲ−Ｌａｂ小動物用驚愕反応測定装置（サンディエゴインスツルメンツ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）による自動試験台において行った。ラットは、それぞれ、防音装置を組み込んだプレキシガラス（登録商標）シリンダー（直径１０ｃｍ）に入れた。騒音（上昇及び下降時間が１秒の広帯域雑音）を、動物の３０ｃｍの上のスピーカから発せられる。電圧加速度計により被検体の動きを０ないし４０９５の任意の電圧に変換する。
【０２８１】
薬物投与前に、７２のラットそれぞれを驚愕装置に入れ、５分の順応時間の後、ラットに騒音を１５分にわたり２０秒間ずつ（計４５回の驚愕）騒音に曝した。驚愕１１ないし４５の平均の驚愕をそれぞれのラットについて計算した（最初の１０回の驚愕は除く。）。これらのラットのうち、それぞれの群において同様の平均驚愕値を示した、６４を８処置群のいずれかに振り分けた。８つの処置群とは：ＳＫＦ−１０２６９８（１００ｍｇ／ｋｇ）及びその担体（５０％水／５０％ポリエチレングリコール）、クロニジン（４０μｇ／ｋｇ）、ネピカスタット（３、１０、３０及び１００ｍｇ／ｋｇ）、及びそれらの担体であるｄＨ２Ｏ、である。以前の試験から、ラット間において驚愕反応には顕著な多様性があるが、その日及びその次の日に測定することにより、ラット内において高度の一貫性があることが示されている。
【０２８２】
この試験方法により、その次の日に、８匹のラットにそれぞれの薬物処置をし、即時に運動行動箱に入れ、ラットの運動行動を４時間観察した（各処置群１匹のラット）。次にラットを移動ケージに１５分おいた。１５分の開始時に、クロニジン投与を受けたラットは次の４０μｇ／ｋｇの注射を受けた。次にラットを驚愕装置に入れ、５分の順応期間の後、９０ｄＢの騒音に１分間隔で４時間曝した。
【０２８３】
運動行動を評価するために、水平行動（光線を遮断した回数）、動きの回数、及び休息時間を測定した。それぞれのパラメータを別々に分析した。それぞれの時間間隔（又はサンプルという）について、その日の処置による効果を試験するために、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を順位化したデータ（ノンパラメトリック法）を用いて行った。処置群と担体コントロール群の対比試験を、ダネットｔ−検定によっても行った。
【０２８４】
驚愕反応を評価するため、それぞれの驚愕の直前に、２００ミリ秒間に発揮される平均の力、及び最大の力を測定した。平均最大、及び平均電圧（ＭＡＸＭＥＡＮ及びＡＶＧＭＥＡＮ）を、それぞれの試験（ＴＲＩＡＬＮ）のそれぞれの処置（ＴＲＥＡＴ）ごとに計算し、これらの値をプロットした。プロットは本明細書に添付した。試験１−６０を時間＝１、試験６１−１２０を時間＝２、試験１２１−１８０を時間＝３及び試験１８１−２４０を時間＝４とした。平均最大及び平均驚愕反応を、それぞれの処置についてそれぞれの時間で計算した。平均値を、共分散を用いて分析した。研究者の関心となっているのは、ある時間における処置間の比較であって、時間による処置内の影響ではない。それゆえ、驚愕反応を時間で分析した。モデルは、試験された日、驚愕反応のベースライン、及び処置の項目を含む。日は阻害要因であり、驚愕反応のベースラインは共変数である。上述のそれぞれの目的物には、３つの異なるモデルがあった。多重比較の可能なダネット検定の手法で、様々な用量のネピカスタットを担体と比較した。
【０２８５】
４つのネピカスタット処置群を担体処置したコントロール群と比較したが、全体としては、試験中３つの項目について、いずれの時間においても、有意な差はなかった。
【０２８６】
担体処置したコントロール群と比較し、クロニジン処置群は、２及び２．５時間における水平方向の運動が有意に活発となり、２時間では運動量が有意に増加し、２時間では休息時間が有意に減少した（すべてｐ＜０．０５）。１時間後では、クロニジン処置群が、担体処置したコントロール群よりも休息時間は有意に多かったことは注目すべきである（ｐ＜０．０５）。
【０２８７】
担体処置したコントロール群と比較して、ＳＫＦ−１０２６９８処置群は、有意に水平方向の活動が減少し、２．５時間において運動量が有意に減少した（両方ともｐ＜０．０５）。ＳＫＦ−１０２６９８処置群は、担体処置したコントロール群よりも１．５及び４時間後では運動量が有意に増加していたことは注目すべきである（いずれもｐ＜０．０５）。ＳＫＦ−１０２６９８及び担体処置群において、休息時間に有意な差はなかった。
【０２８８】
一般に、水平運動及び運動量は、最初の２時間で減少し、最後の２時間に低くとどまった。同様に、休息時間は、最初の２時間で増加し、最後の２時間は多かった。
【０２８９】
ネピカスタットは、ラットの自発運動に有意に影響を与えなかった。動物にネピカスタット３、１０、３０又は１００ｍｇ／ｋｇを投与した場合、担体処置したコントロール群と比較して、水平方向の運動、運動量及び休息時間に有意差はなかった。
【０２９０】
驚愕反応において、全体としていずれの反応についてもいずれの時間においても、ネピカスタット及び担体処置による有意差は見られなかった（ｐ＞０．０５）。全体として、時間２における平均驚愕反応は、下限ぎりぎりではあったが有意であり、（ｐ＝０．０７０３）、ダネット検定では、ネピカスタット３０ｍｇ／ｋｇ投与群において、担体群よりも有意に平均驚愕反応が見られた（ｐ＜０．０５）。ベースラインは、平均驚愕反応において、統計的には、時間３及び４の両方において平均驚愕反応は有意であり（ｐ≦０．０５）、時間１及び２における、最大驚愕反応、及び時間２における平均驚愕反応は下限ぎりぎりではあったが有意であった（ｐ≦０．１０）。
【０２９１】
ＳＫＦ−１０２６９８（１００ｍｇ／ｋｇ）では、いずれの時間において驚愕反応を測定した場合でも、担体との有意差はなかった。
【０２９２】
クロニジンは、担体に比べ、最大及び平均驚愕反応を時間１において（ｐ＜０．０１）、及び時間２においては平均驚愕反応についてのみ（ｐ＝０．０３５２）、統計的に有意に低下した。クロニジン処置において、時間２における最大驚愕反応、及び時間３における平均驚愕反応は、水投与群よりも下限ぎりぎりではあったが有意であった。
【０２９３】
ネピカスタット３、１０、３０、又は１００ｍｇ／ｋｇ投与では、いずれの時間においても担体と比較して、最大または平均驚愕反応に効果を及ぼさなかった。ＳＫＦ−１０２６９８投与では、担体（ＰＥＧ）の場合と同様の挙動を示した。クロニジンは、有効に早期の段階からの最大及び平均驚愕反応を低下させ、後半では担体投与の場合と同じように挙動した。
【実施例２２】
【０２９４】
ラットに対するネピカスタット投与の慢性の投与効果を見た。最初の投与前３ないし１３日目の間に、ラットを驚愕装置に入れ、５分の順化の時間の後、ラットに２０分に渡り、１分間に平均１回の１１８ｄＢの騒音を与えた（試験間の間隔の変数は、３０から９０秒とした。）。驚愕反応を測定し、最後の２０の驚愕反応をそれぞれのラットについて計算した。ラットは、ランダムに８つの処置群：ネピカスタット、５、１５又は５０ｍｇ／ｋｇ、ｂｉｄ；ＳＫＦ−１０２６９８、５０ｍｇ／ｋｇ、ｂｉｄ；クロニジン、２０μｇ／ｋｇ、ｂｉｄ:ｄ−アンフェタミン、２ｍｇ／ｋｇ、ｂｉｄ；ｄＨ２Ｏ又はシクロデキストリン（ＳＫＦ−１０２６９８の担体）に分類した。ラットに１０ｍｌ／ｋｇ投与の経口強制投与を行った。ラットには、午前及び夕方に１０日間投与した。午前及び夕方の投与時間間隔は、６及び１０時間である。以前の研究により、驚愕反応への多様性には有意差はあるが、その日および次の日において高い一貫性を示し、この手順が音への驚愕反応に最も適切であることが示されている。
【０２９５】
９６全てのラットを同日に試験することは不可能であったため（８処置群、ｎ＝１２）、投与計画をずらし、毎日８ラットについて実施した。これら１２グループの８ラットは、それぞれ８つの処置群から１匹ずつ選ぶことからなることで、日の違いのバランスをとることができる。さらに、すべての処置群は８つの運動行動装置によってもバランスをとったが、驚愕反応装置に関しては、処置群間のバランスとれなかった。
【０２９６】
投与中及び慢性投与の後に以下の行動試験；中核体温、運動行動、音への驚愕反応、及び聴覚驚愕に対するプレパルスインヒビション、を行った。
【０２９７】
動物は、ホワイトノイズ発生装置の稼働している部屋の中で行った。運動行動試験は、第１０日の中核体温を測定した直後に行った（第１０日のネピカスタット及びＳＫＦ−１０２６９８の第１０日の朝の投与を行った約３時間３５分後で、クロニジン及びｄ−アンフェタミンの毎日の投与の２０分前）。運動行動試験は、１時間行った。診断用プログラムは、光線及び光センサーが適切に働くかを確認するために、運動行動装置はそれぞれの試験の前に作動させた。運動行動は、行動テストとなる中枢ドパミンレベルの変化に敏感に応答し（Ｄｉｅｔｚｅ ａｎｄ Ｋｕｓｃｈｉｎｓｋｙ， １９９４）、この行動試験はＤＢＨ阻害剤のインビボ試験として可能性のある敏感な試験であることがわかった。Ｄ−アンフェタミンは、このアッセイにおいて陽性コントロールとして用いた。
【０２９８】
ラットの中核体温の測定は、直腸プローブを２ｃｍそれぞれのラットの直腸に挿入して行った。それぞれのラットの中核体温は３回測定し、平均を計算した。中核温度は、第１０日の慢性投与の直前に行い（ベースラインを決定するため）、第１日、５、及び１０日のネピカスタット及びＳＫＦ−１０２６９８の朝の投与の３．５時間後、及びクロニジン及びｄ−アンフェタミン投与の１５分前に行った。中核体温は、ドパミン及びノルエピネフリンレベルに敏感に反応し、この行動試験が、ＤＢＨ阻害剤のインビボ試験として可能性のある敏感なアッセイであることがわかった。クロニジン（α２アゴニスト）、及びｄ−アンフェタミン（ドパミン分泌剤）をこのアッセイのポジティブコントロールとして行った。
【０２９９】
音への驚愕反応（速い筋収縮が強い音のノイズのバースト音に合わせて、起こること）、及びプレパルスインヒビション（驚愕しない刺激の直後に驚愕刺激を与えた場合における、驚愕反応のあらゆる減少を分析することにより測定した感覚運動ゲーティング）を８つのＳＲ−Ｌａｂ（サンディエゴインスツルメンツ社， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）による試験台において行った。ラットは、それぞれ防音装置を組み込んだプレキシガラスシリンダー（直径１０ｃｍ）に入れた。聴覚騒音（上昇及び下降時間が１秒の広帯域雑音）を、動物の３０ｃｍの上のスピーカーから発せられる。また、これらのスピーカーは、試験期間中６８ｄＢのバックグラウンドのノイズを出していた。プレキシガラスシリンダーの下に電圧加速度計を備えた電圧加速度計により、被検体の動きを電圧に変換し、続いてＳＲ−Ｌａｂソフトウエアおよびインターフェース集合体を有するＰＣで修正してデジタル化（目盛り０ないし４０９５）する。デシベル計は、スピーカーの８つの試験台の平均値の±１％の修正を行うために用いた。加えて、ＳＲ−Ｌａｂ修正装置は、８つの驚愕検出装置をそれぞれ平均値の±２％の修正をするために用いた。驚愕反応及びプレパルスインヒビションテストは、運動行動試験の直後（朝のネピカスタット及びＳＫＦ−１０２６９８注射の約４時間４０分後、及び第１０日の追加のクロニジン及びｄ−アンフェタミンの投与１０分後）。驚愕反応及びプレパルスインヒビションテストは、それぞれのラットをＳＲ−Ｌａｂ試験台に置き、５分間の順応時間を経て、異なる３つのうちの１つのバースト音を、１分間に平均１回で（３０から９０秒の様々な試行間隔）、１時間にわたり行った（合計６０のバースト音及び驚愕反応）。これらの異なる３つのタイプのバースト音は、大きなバースト音（１１８ｄＢ）、及び比較的静かなバースト音（７７ｄＢ）で構成され、比較的静かなバースト音は大きなバースト音よりも１００ｍ秒前に発生させた（プレパルスインヒビションテスト）。試験のバースト音は、擬似乱数に従い発生させた。プレパルスインヒビションは、中脳辺縁系ドパミンレベルの変化に敏感である。さらに、音への驚愕反応は、ドパミン及びノルエピネフリンレベルの変化にも敏感であり、このことからこれらの行動試験は、インビボでのＤＢＨ阻害剤の効果測定の試験として可能性のある敏感なアッセイである。クロニジン及びｄ−アンフェタミンは、音への驚愕反応及びプレパルスインヒビションの陽性コントロールとして用いた。
【０３００】
毎日の行動試験は以下のようにスケジュールされている。ｔ＝０で、ＤＢＨ阻害剤を注射する。３．５時間後、中核体温を測定する。３時間３５分後、運動行動を測定する。４時間４０分、驚愕反応及びプレパルスインヒビションを測定する。
【０３０１】
３回の体温測定を試験時間ごとに個々に行う。３つの記録値の平均を計算した。
【０３０２】
それぞれのラットの自発運動を、試験中に光線を遮った合計として計算した。
【０３０３】
被検体の反応を、刺激の後４０ｍ秒後に記録した。驚愕反応をそれぞれのバースト音の直後から、４０回の平均をとって計算した（１／ミリ秒）。音への驚愕反応は、１１８ｄＢの聴覚刺激によって得られた被検体の驚愕の平均反応を計算した。プレパルスインヒビション値は、１１８ｄＢパルス単独の平均値から、７７ｄＢ−１１８ｄＢパルスの対比較による平均値（上述したプレパルスインヒビションテスト）を引いたものを、１１８ｄＢパルス単独の平均値で割ったものである（［１１８ｄＢパルス単独−プレパルスインヒビション］÷１１８ｄＢ単独）。
【０３０４】
全体の一元配置ＡＮＯＶＡを、それぞれの動物のベースラインが変化する都度行った。続くｔ−検定を、興味があったので比較のため行った。
【０３０５】
自発運動行動を１５分ごとに１時間測定した。それぞれの時間帯（１５分ごと）に分析した。処置群間における差を見るためクラスカル・ワリス検定（ノンパラメトリック検定）を行った。全体として有意な差が見られなかったら、多重比較のためのボンフェローニの補正を行った。
【０３０６】
各処置（ＴＲＥＡＴ）及び各試験（ＴＲＩＡＬＮ）について、トライアルタイプＴ（ＴＲＩＡＬＴ）について平均電圧（ＡＶＧＭＥＡＮ）及び平均プレパルスインヒビション率（ＲＡＴＩＯ）を計算した。プレパルスインヒビション値は、１１８ｄＢパルス単独の平均値から、７７ｄＢ−１１８ｄＢパルスの対比較による平均値（プレパルスインヒビション試験の仕方は、上述）を引いたものを、１１８ｄＢパルス単独の平均値で割ったものである（［１１８ｄＢパルス単独−プレパルスインヒビション］÷１１８ｄＢ単独）。
【０３０７】
これらの値は、それぞれの処置の試験番号及び試験のタイプに対してプロットし、これらのプロットは本明細書に添付した。ｙ軸は変化することに注意すべきである。試験１−１５は時間１、試験１６−３０は時間２、試験３１−４５は時間３、及び試験４６−６０は時間４に対応する。時間に対し、平均プレパルスインヒビション率及び動物の驚愕の平均を示したプロットも添付した。
【０３０８】
平均驚愕反応及びプレパルスインヒビション率を、分散分析を用いて分析した。このモデルは、治療薬、治療薬を投与された動物、時間及び治療の相互作用の項目を含む。治療薬を投与された誤差項を用いて治療効果を調べた。時間による全体としての治療効果を調べた。フィッシャーの最小有意差法を用いて、多重比較を行った。全体としての処置又は時間による処置の効果が有意でなかった場合には（ｐ値＞０．０５）、ボンフェローニ補正を行った。全体としての治療効果が有意でなかった場合には、特定の対比較を行った。さらに、特定の対治療の効果が有意でなかった場合には（ｐ値＞０．０５）、時間に対する治療効果の修正を行った。全体としての治療効果及び時間に対する処置がともに有意でなかった場合には（ｐ値＞０．０５）、個別の比較についての時間及び平均時間について、ボンフェローニ補正を行った。
【０３０９】
分析に際しては、体重の投与前からの変化をそれぞれの動物について計算した。反復測定二元配置ＡＮＯＶＡを用いて、治療効果全体、時間、及び時間経過による治療の相互作用を評価した。一元配置ＡＮＯＶＡは、その日の治療効果を評価するために用いた。
【０３１０】
第１日目の陽性コントロール（ｄ−アンフェタミン及びクロニジン）は、慢性投与によって有意に中核体温を上昇させたが、他の化合物はいずれもどの時点においても中核体温に有意差はなかった。
【０３１１】
ｄ−アンフェタミン群は、担体コントロール群よりも全ての時点において有意に自発運動を増加させた。しかし、クロニジン群は、担体コントロール群と比べ有意差はなかった。ＳＫＦ−１０２６９８ ５０ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄ群は、最初の４５分では担体コントロール群よりも有意に自発運動を低下させたが（例えば、サンプル１−３）、４５分以降では有意差はなかった。
【０３１２】
どの時点においても、全体としてネピカスタットは有意な治療効果を示さなかった。対比較によってもネピカスタット治療群は、担体コントロール群と比較して、有意差はなかった。また、２つの担体コントロール群（ｄＨ２Ｏ及びＳＫＦの担体）は、有意差はなかった。
【０３１３】
プレパルスインヒビションにおいてはいずれの治療群も、有意な差を示さなかった。全体として統計的に、ＳＫＦ−１０２６９８群及びシクロデキストリン群において、時間による有意な差はなかった（ｐ＝０．０００１）。時間経過による治療効果の相互作用は、統計的にはシクロデキストリン対ｄＨ２Ｏ（ｐ＝０．０２８３）では有意差があったが、他ではなかった。治療効果は、関心のある比較においてはいずれも有意差はなかった。しかし、ＳＫＦ投与群は、シクロデキストリン投与群よりも下限ぎりぎりではあったが高い割合で、プレパルスインヒビション効果があった（ｐ＝０．０７８２）。
【０３１４】
時間１及び２において、クロニジン投与群はプレパルスインヒビションにおいて担体コントロール投与群よりも、ちょうど有意な効果を示したが、時間３及び４においては、担体投与群よりも有意な差は示さなかった。ｄ−アンフェタミンもＳＫＦ−１０２６９８も、それらの担体からいずれの時間においても有意差はなかった。ネピカスタット投与群は、ｄＨ２Ｏと比較していずれの時間においても有意差はなかった。
【０３１５】
ＳＫＦ−１０２６９８投与群だけは、音への驚愕反応に有意差があった。関心のあった全ての比較対象において、時間経過による治療効果は統計的に有意差があった（全てｐ＝０．０００１）。時間経過による治療効果の相互作用は、統計的にはアンフェタミン対ｄＨ２Ｏ、クロニジン対ｄＨ２Ｏ、及びシクロデキストリン対ｄＨ２Ｏ（全てｐ＜０．０５）において有意差があったが、他は有意差はなかった。治療効果は、ＳＫＦ−１０２６９８ ５０ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄ対シクロデキストリン（ｐ＝０．０００７）、及びネピカスタット ５０ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄ対ＳＫＦ−１０２６９８ ５０ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄ（ｐ＝０．００４７）において有意差があったが、他はなかった。ＳＫＦ−１０２６９８ ５０ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄ投与群は、シクロデキストリン投与群よりも有意に低い驚愕反応を示し、ネピカスタット５０ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄ投与群と比較しても有意に低い驚愕反応を示した。
【０３１６】
ＳＫＦ−１０２６９８（５０ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄ）投与群は、シクロデキストリン投与群よりもいずれの時間においても有意に低い驚愕反応を示した。時間１及び３、ネピカスタット（５０ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄ）投与群は、ＳＫＦ−１０２６９８（５０ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄ）投与群に比べ、有意に高い驚愕反応を示した。その他の有意差は見られなかった。
【０３１７】
全体として又は対比較において、投与前からの体重の変化による有意差は見られなかった。
【０３１８】
ｄ−アンフェタミン投与群は、担体コントロール投与群よりも投与前からの体重変化が、有意に小さかった（ｐ＜０．０１）。毎日分析した結果、担体コントロール投与群は、アンフェタミン投与群よりも処置日４−１０において、投与前からの体重増加が有意であった。しかし、クロニジン投与群では、担体コントロール投与群に比べ、いずれの時点においても、有意差はなかった。ＳＫＦ−１０２６９８（５０ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄ）投与群では、担体コントロール投与群（ＳＫＦ担体）と比べて、処置前から有意に小さい増加であった。毎日分析した結果、第３及び６日を除く第２−１０日において、投与前に比べ、ＳＫＦ−担体コントロール投与群は、ＳＫＦ−１０２６９８投与群よりも有意に大きな体重増加が見られた。重要なことは、ＳＫＦ−担体及び担体コントロール投与群では、いずれの日においても体重の変化はなかった。
【０３１９】
全体として、いずれの時点においてもいずれの用量においても、ネピカスタットによる体重による治療効果に有意な変化はなかった。対比較では、いずれの時点でもネピカスタット−処置群は、担体コントロール投与群に比べて有意差はなかった。興味深いことに、体重変化においてＳＫＦ−１０２６９８（５０ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄ）投与群及びネピカスタット（５０ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄ）投与群においては、全体として有意差があった。毎日分析した結果、ＳＫＦ−１０２６９８（５０ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄ）投与群はネピカスタット（５０ｍｇ／ｋｇ ｂｉｄ）投与群よりも第７−９日において体重は有意に低かった。
【実施例２３】
【０３２０】
１−メチル−４−フェニル−１，２、３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）はＲＢＩ社（Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ）より購入した。ＭＰＴＰは、投与において２ｍｇ／ｍＬ濃度（遊離塩基）で水に懸濁させ、各動物に、体重（ｋｇ）と同じ体積（ｍｌ）を皮下注射した。９５０ｇ動物は、２ｍｇ／ｍＬのＭＰＴＰを０．９５ｍＬ、結果として２．０ｍｇ／ｋｇの投与を受ける。
【０３２１】
サルは、１３ｈ／１１ｈの明暗サイクル下、食餌及び水を自由に摂取できるようにした。すべての手順はＮＩＨのガイドラインに従い、動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）の承認を得ている。動物は、それぞれ飼育され、少なくとも行動試験の１ヶ月前から、集団に慣れるようにした。
【０３２２】
６匹のリスザルのうち、３匹は障害を与えず、３匹は障害を与え（２ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰを３ヶ月前に投与した）ネピカスタットの最適な投与経路の研究のために用いた。（i）食餌に混入させ、（ii）経口シリンジ、及び（iii）経口投与チューブを含む３経路を試みた。ネピカスタット溶液（５ｍｇ／ｍｌ）をマシュマロに混入させたものを、障害を与えなかった３匹のサルに試みたところ、まずい味によるためと考えられるが摂取せず、よい投与経路とはいえなかった。経口シリンジによるネピカスタット（０．５、２、及び５ｍｇ／ｋｇ）投与を、障害を与えなかった３匹のサル及び障害を与えた３匹のサルに試みたところ、最高濃度において吐き出す経口にあったため、許容できる投与経路ではなかった。経口投与チューブによる投与では、３匹のＭＰＴＰ障害を与えたサルに最高濃度の薬物（５ｍｇ／ｋｇ）を投与したところ、うまく投与できた。
【０３２３】
ネピカスタットの安全性及び耐容性を調べるために３匹は障害を与えず、３匹は障害を与えた（２ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰを３ヶ月前に投与した）６匹のリスザルを用いた。動物に、０．５、２．０、又は５．０ｍｇ／ｋｇの濃度のネピカスタットを毎日２回、５日間（異なる投与レベルの場合には２日間のウォッシュアウト期間を設けた）投与した（午前１０時及び午後２時）。ネピカスタットは、０．５、２．０及び５．０ｍｇ／ｋｇ投与の場合には経口シリンジで、及び５．０ｍｇ／ｋｇ投与の場合には投与チューブで行った。薬物は、低濃度の２投与群では、十分な耐容性があった。５．０ｍｇ／ｋｇを投与した障害を与えなかった１匹のサルは、投与期間の最後の２日にうすいベージュ色の軟便となり、１日は薬物による離脱であるとわかった。
【０３２４】
２４匹のリスザルのうち、１４の雌及び１０の雄をパーキンソン病モデルとして用いた。２４の動物をランダムに各群６匹ずつ４つの処置群のいずれか振り分けた。投与群は、以下のように構成される：プラセボ（水）処置を受けるグループＡ（６匹）；ネピカスタット１ｍｇ／ｋｇ／日（０．５ｍｇ／ｋｇを１日２回）投与を受けるグループＢ（５匹）；４ｍｇ／ｋｇ／日（２ｍｇ／ｋｇ１日２回）投与を受けるグループＣ（６匹）；及び１０ｍｇ／ｋｇ／日（５ｍｇ／ｋｇ１日２回）投与を受けるグループＤ（６匹）。グループＢは、ＭＰＴＰ障害の直後に１匹死亡したが、補充しなかった。
【０３２５】
障害を与える前に各動物は、赤外線行動モニター（ＩＲＡＭ）ケージを用いて自発運動行動の定量的な評価を行った。全ての記録は６０分間ずつ１０回行われ、２週間を超えて記録した。動物の行動は、１ないし３人の臨床評価者によって、パーキンソン病臨床評価尺度（ＣＲＳ）を１日１回（正午ないし午後１時）、３ないし５日連続して評価した。正常動物では、通常ＣＲＳで３よりも大きな評価は現れない。活動モニタリング（ＩＲＡＭ）及び臨床評価により、それぞれの動物の平均ベースライン行動値が作成できた。
【０３２６】
動物には、２．０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基）のＭＰＴＰを皮下注射によってパーキンソン様症状を発生させた。ＭＰＴＰ障害の２ないし４週間後に行動評価を行った。自発運動をＩＲＡＭで６０分、３ないし５日観察した。１ないし３人の臨床評価者が３ないし５日間、動物の臨床行動（ＣＡＳ）を評価した。
【０３２７】
いくつかの場合には、臨床評価尺度の総合平均スコアが３よりも大きいことと定義されるパーキンソン病症状を示すには、追加のＭＰＴＰ（２ｍｇ／ｋｇ）投与が必要となった。有効性評価の試験開始後３週間以内に、すべての動物は、ＭＰＴＰ後の行動評価（ＩＲＡＭ及びＣＲＳ）を受けた。この最終ＭＰＴＰ後評価に基づき、臨床パーキンソン様症状のベースラインを作成し、統計分析の前処理値とした。
【０３２８】
Ｌ−ドパに対する反応性、及びネピカスタットの有効性を動物で確かめた。試験は、最後のＭＰＴＰ投与の後、４ないし１２週間に行った。２．５、５、又は７．５ｍｇ／ｋｇの濃度のＬ−ドパを、１日２回（午前１０時及び午後２時）７日続けて強制経口投与した。ＩＲＡＭ及びＣＲＳによって行動を評価した。臨床評価は、最後の４日間、午前１０時の投与後６０ないし９０分後に行った。評価者（１ないし３人）は、どの処置群かを知らされずに行った。ＩＲＡＭ評価は、期間中最後の２ないし５日間、午後２時の投与後すぐから行った。それぞれの用量の間には少なくとも２日のウォッシュアウト期間を設けた。
【０３２９】
ネピカスタット又は水（プラセボ）を１２日間の投与後、Ｌ−ドパ投与後少なくとも２日のウォッシュアウト期間を設けた。薬物は、１日２回午前１０時及び午後２時に強制経口投与によって投与された。行動はＩＲＡＭ及びＣＲＳによって評価した。ＣＲＳは、ネピカスタット投与の最後の５日間、午前１０時の投与後、６０ないし９０分後に行った。評価者（１ないし３人）は、どの処置群かを知らされずに行った。ＩＲＡＭは、薬物処置の最後の５日間に、午後２時の投与直後から９０分かけて行った。
【０３３０】
統計分析のために、自発運動及び臨床評価値をモニターした。各動物について、平均の自発運動を、ＭＰＴＰ障害を与える前後で測定した。ＭＰＴＰ障害前のベースラインは、１時間のモニター時間で１０回行い平均をとった。ＭＰＴＰ（前処理）障害後の行動評価は、有効性評価の試験開始後３週間以内に行った。ＭＰＴＰ障害後の自発運動は、１時間のモニター時間で３ないし５回行い平均をとった（ＩＲＡＭＳ）。活動のモニタリングは、「動きの回数／１０分」として記録した。より高いスコアであるほど、素早く動いていることになる。ウィルコクソン符号順位検定を用いてＭＰＴＰ障害前後の活動をそれぞれの投与群の動物について比較した（グループＡないしＤ）。
【０３３１】
それぞれの薬物レベルによる投与後、少なくとも９０分にわたり、１０分間隔でＩＲＡＭにより自発運動をモニターした。率が高いと、動きが速い動物であるといえる（パーキンソン病症状を示していない）。
【０３３２】
統計分析は、プラセボ及び１、４、及び１０ｍｇ／ｋｇの試験薬物を投与した場合における記述統計、及び１０分間ごとのデータの平均をグラフ化することからなる。次にグラフから傾向を見出した。グラフによる分析と違いがなかったため、さらなる統計分析は行わなかった。
【０３３３】
ＩＲＡＭデータが十分集まらなかったので、ＭＰＴＰ（前処置）障害後と２．５、５．０、及び７．５ｍｇ／ｋｇ Ｌ−ドパ及びネピカスタット（１、４、１０ｍｇ／ｋｇ／日又はプラセボ）処置との、統計分析の比較は行わなかった。ネピカスタット投与では９０分間のデータが集まったが、ＭＰＴＰ障害後６０分後のデータのみが収集された。
【０３３４】
ＣＲＳでは、ＭＰＴＰ障害前の動物で臨床評価尺度のスコアが３よりも大きいものはいなかった。ＭＰＴＰ障害後の臨床評価尺度のスコアは、有効性評価の試験開始後３週間以内に１ないし３の臨床評価者が３ないし５日連続で測定を行い、平均をとった（ＣＲＳ）。
【０３３５】
８つのパーキンソン病の特徴をそれぞれの動物について評価し、これら８つの特徴のスコアを足し合計スコアを得た。それぞれの動物について、それぞれの投与量での単一の臨床評価スコアは、複数の投与日について（投与量ごとに）全ての臨床評価者（１ないし３人）の得たスコアの平均をとることにより得た。この平均ＣＲＳを統計分析に用いた。より低いスコアの方が、パーキンソン病でないと評価される。
【０３３６】
統計分析は以下により構成される：（１）プラセボとネピカスタット１、４、及び１０ｍｇ／ｋｇ／日投与の場合の平均ＣＲＳを、クラスカル・ワリス検定（ノンパラメトリック分散分析）を用いて比較した。この比較を、それぞれの動物について、ＭＰＴＰ後の最終評価によって修正されたそれぞれの薬物濃度において、繰り返した。修正された臨床評価スコアとは、各濃度におけるＭＰＴＰ後の臨床評価スコアの比である。（２）対比較
（前処理としての）ＭＰＴＰ障害後の２．５、５．０、及び７．５ｍｇ／ｋｇ Ｌ−ドパ及びプラセボ処置の平均ＣＲＳを、フリードマン検定（ノンパラメトリック分散分析、反復測定）を用いて比較した。同じ分析を１、４、及び１０ｍｇ／ｋｇ濃度のネピカスタットでも行った。ノンパラメトリックデータを分析するときは、ダネットポストホック分析を必要であれば、行った。
【０３３７】
ＩＲＡＭ（行動モニタリング）及びＣＲＳ（臨床評価尺度）は、それぞれのリスザルのＭＰＴＰ障害の程度を評価するために用いた。
【０３３８】
グループＡ：プラセボ処置群の場合、動きの多様性／１０分／動物の程度が高かったため、ＩＲＡＭ群における障害前及び障害後において有意差はなかった。ウィルコクソン符号順位検定：Ｗ＝１９、Ｎ＝６、Ｐ＜０．０６であり、帰無仮説は採択された。グループＡの平均ＣＲＳは、８．９、幅４．８ないし１５．４だった。全ての動物においてＭＰＴＰ障害の後、臨床評価スコアが有意に増加した。（障害を与えなかった）正常動物は、通常スコアは３より小さい。
【０３３９】
グループＢ：１ｍｇ／ｋｇ／日処置群の場合、動きの多様性／１０分／動物の程度が高かったため、ＩＲＡＭ群における障害前及び障害後において有意差はなかった。ウィルコクソン符号順位検定：Ｗ＝９、Ｎ＝５、ｐ＜０．０６であり、臨床評価スコア（ＣＲＳ）の帰無仮説は採択された。グループＢの平均ＣＲＳは、１０．３２、幅４．３ないし１６．１だった。全ての動物においてＭＰＴＰ障害の後、臨床評価スコアが有意に増加した。（障害を与えなかった）正常動物は、通常スコアは３より小さい。
【０３４０】
グループＣ：４ｍｇ／ｋｇ／日処置群の場合、動きの多様性／１０分／動物の程度が高かったため、ＩＲＡＭ群における障害前及び障害後において有意差はなかった。ウィルコクソン符号順位検定：Ｗ＝１７、Ｎ＝６、Ｐ＞０．０６であり、臨床評価スコア（ＣＲＳ）の帰無仮説は採択された。グループＣの平均ＣＲＳは、８．９７、幅６．５ないし１７．３だった。全ての動物においてＭＰＴＰ障害の後、臨床評価スコアが有意に増加した。（障害を与えなかった）正常動物は、通常スコアは３より小さい。
【０３４１】
グループＤ：１０ｍｇ／ｋｇ／日処置群の場合、動きの多様性／１０分／動物の程度が高かったため、ＩＲＡＭ群における障害前及び障害後において有意差はなかった。ウィルコクソン符号順位検定：Ｗ＝２１、Ｎ＝６、Ｐ＞０．０６であり、臨床評価スコア（ＣＲＳ）の帰無仮説は採択された。グループＤの平均ＣＲＳは、８．０２、幅４．０ないし１５．６だった。全ての動物においてＭＰＴＰ障害の後、臨床評価スコアが有意に増加した。（障害を与えなかった）正常動物は、通常スコアは３より小さい。
【０３４２】
ＩＲＡＭ測定による投与群内における、ベースライン（ＭＰＴＰ障害前）及びＭＰＴＰ障害後の自発運動は、各動物におけるＩＲＡＭの高い多様性から全体として有意差はなかった。ＣＲＳ結果は、ＭＰＴＰ障害前及びＭＰＴＰ障害後における違いを表している。ＭＰＴＰ障害前の動物ではスコアは３よりも大きくはなかった。ＭＰＴＰ障害後におけるスコアは３よりも大きかった。すべての投与群（ＡからＤ）において、平均ＣＲＳは、可能な合計スコア２４のうち８ないし１０を占めていた。
【０３４３】
プラセボ処置群及び３つの濃度のネピカスタット（１、４、１０ｍｇ／ｋｇ／日）を、ＭＰＴＰ障害を与えたリスザルに投与したことによって検出しうる違いはなかった。ネピカスタット４及び１０ｍｇ／ｋｇ／日投与のいずれにおいても、及びプラセボは（前処理としての）ＭＰＴＰ障害後の状態に有意な改善が見られた。全ての投与群において、Ｌ−ドパ５ｍｇ／ｋｇ及び７．６ｍｇ／ｋｇ投与のいずれにおいても、グループＣの７．５ｍｇ／ｋｇ投与及びグループＢの５ｍｇ／ｋｇ／投与における例外を除いて、（前処理としての）ＭＰＴＰ障害後の状態に、有意な改善が見られた。ＭＰＴＰ障害後と比較して、Ｌ−ドパ２．５ｍｇ／ｋｇ投与の場合には、有意な差は見られなかった。
【０３４４】
フリードマン検定、記述統計及び、及びダネットポストホック検定を行い、プラセボ処置との行動モニターを全てのネピカスタット濃度で投与後１０−９０分において処置群及びＬ−ドパ投与群を比較した。それぞれの投与量で１０分間隔のプロットを行った。プラセボと比較した場合、薬物の違いによる（ネピカスタット）４及び１０ｍｇ／ｋｇ／日投与における違いはなかった。１ｍｇ／ｋｇ／日投与においては、動物はプラセボ処置群よりも遅かった。４つの異なる処置群（ネピカスタット１、４、及び１０ｍｇ／ｋｇ、及びプラセボ）についての非−対比較分析により、ネピカスタットは、ＭＰＴＰ障害の非ヒトＰＤモデルであるプラセボ（水）と比較して、パーキンソン病の症状を有意に示さなかった。動物（同一群について処置の前後で試験した）の対比較分析により、ネピカスタット４及び１０ｍｇ／ｋｇ／日投与においては、（前処理としての）ＭＰＴＰ障害後と比較して有意にパーキンソン様症状を示した。プラセボは、有意な効果といえるかの境界にあった。同じ対比較を用いて、Ｌ−ドパ５及び７．５ｍｇ／ｋｇを試みたところ、全ての群においてＭＰＴＰ障害後の状態と比較して、グループＢ（Ｌ−ドパ５ｍｇ／ｋｇで効果なし）及びグループＣ（Ｌ−ドパ７．５ｍｇ／ｋｇで効果なし。）以外では、有意な効果が得られた。しかし、Ｌ−ドパ２．５ｍｇ／ｋｇでは、有意な効果は見られなかった。
【０３４５】
薬物動態研究は、リスザルにおけるネピカスタットの血漿中濃度を測定することによって行った。この研究では、安全性及び耐容性試験と同時に行った。３つのＭＰＴＰ障害を起こさせたリスザル（＃３５３、３５８及び３７４）を用いた。分析のために１ｍＬの血液を採取した（各動物の大腿静脈から採血した）。異なる薬物濃度の間には２日間のウォッシュアウト期間を設けて、濃度１、４、及び１０ｍｇ／ｋｇのネピカスタットを５日間投与した。血液は、最初の薬物投与の１時間前にベースラインを作成するために、及びそれぞれの濃度において最初の投与の６時間後に採取した。
【０３４６】
第２に、薬物動態研究は、安定状態のネピカスタットの血漿濃度を決定するために行った。この研究は、３つの異なる濃度をそれぞれ１２日間投与した場合における薬効研究と同時に行った。１ｍＬの血液を大腿静脈から第１日の最初の投与後６時間後、第７日の最初の投与後６時間後、及び第１２日の最初の投与の６時間後に採取した。ベースラインにおける血漿濃度は、投与１週間前に採血したサンプルから決定した。
【０３４７】
また、この研究は対比較分析を表すが、ここでこの分析は、動物間の多様性を減らすため、同一動物の処置前後を比較し、少数の動物を使用する非−対比較研究よりも有意な薬効の検出においてより適切である。
【実施例２４】
【０３４８】
自然発症高血圧雄ラット（２８０−３４５ｇ；チャールスリバー社， Ｋｉｎｇｓｔｏｎ， ＮＹ）を終夜絶食させ、エーテル麻酔した。血圧の記録及び化合物投与のために、それぞれ大腿動脈及び大腿静脈にＰＥ５０チューブを挿入した。動物をＭＡＹＯ拘束器に入れて、脚を緩く拘束器にテープで留めた。実験中を通して、実験中それぞれのチューブの開存性を保つためヘパリンナトリウム生理食塩水（５０単位のヘパリンナトリウム／ｍｌ）を使用した。ＩＢＭパソコンを用いて、ＭＩ２ ＢｉｏＲｅｐｏｒｔ（登録商標）ソフトウエアモジュールを用いて以下のパラメータ：平均動脈圧（ＭＡＰ）、心拍（ＨＲ）、及び試験中の特定の時間におけるそれぞれのパラメータのベースラインからの変化を記録した。
【０３４９】
全ての化合物は、使用の日に溶解させた。ネピカスタットは、遊離塩基濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように脱イオン化水（担体）に溶解させた。経口投与容積は、ネピカスタット又は担体は１０ｍｌ／ｋｇとした。遊離塩基濃度が０．２ｍｇ／ｍｌとなるようにＳＣＨ−２３３９０を生理食塩水（担体）に溶かした。ネピカスタット又は生理食塩水は、１．０ｍｌ／ｋｇを、続いて０．２ｍＬの等張生理食塩水を静脈内にボーラス投与した。
【０３５０】
外科的手術の後、各動物は、少なくとも１時間の回復期間を与えられた。動物は、ランダムに４つの処置群に割り振られた。すなわち、担体（静注）／担体（経口）；担体（静注）／ネピカスタット（経口）；ＳＣＨ−２３３９０（静注）／担体（経口）；又はＳＣＨ−２３３９０（静注）／ネピカスタット（経口）である。一旦動物が安定（少なくとも１時間）したら、血圧及び心拍のベースラインを、１５分以上の平均をとることにより決定した。一旦血圧及び心拍のベースラインが確定されると、動物にＳＣＨ−２３３９０（２００μg／ｋｇ）又は担体（生理食塩水、１ｍｌ／ｋｇ）を、静脈内投与した。１５分後、ネピカスタット（１０ｍｇ／ｋｇ）又は担体（脱イオン化水、１０ｍｌ／ｋｇ）を投与した。
【０３５１】
血圧及び心拍のベースラインを決定するために静脈内投与の１５分前にパラメータを測定した。続いて、ＳＣＨ−２３３９０又は担体投与の５、１０、及び１５分後にパラメータを測定した。続くネピカスタットの経口投与又は担体は、パラメータは１５、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、及び２４０分後に記録した。
【０３５２】
実験の終わりには、各動物はハロタン麻酔し、断頭して安楽死させた。皮質、左心室（尖）、及び腸間膜動脈を解剖し、計量し、０．４Ｍ過酸化水素酸で固定した。次に組織は液体窒素で凍結させ、−７０℃で保存した。後日、生化学的分析をこれらの組織について行い、ドパミン及びノルエピネフリンレベルを含むカテコールアミンレベルを測定した。血圧及び心拍は別々に分析した。血圧及び心拍のベースラインからの変化は、処置、時間及びそれらの相互作用を用いて分散分析（ＡＮＯＶＡ）により分析した。分析は、静注後及び経口投与後ともに行った。さらなる分析は、それぞれ効果の主要素を時間として、ＡＮＯＶＡによって時間ごとに分析した。全体として有意な治療効果がなかった場合には、ボンフェローニ補正を用いてフィッシャーの最小有意差法により分析を行った。
【０３５３】
追加の分析を、それぞれの処置群によるベースラインの比較を行うために主要な処置の効果及び以下の対比較を行うためにＡＮＯＶＡを行った。ＳＣＨ−２３３９０（静注）／担体（経口）対  担体（静注）／担体（経口）、担体（静注）／ネピカスタット（経口）対  担体（静注）／担体（経口）、及びＳＣＨ−２３３９０（静注）／ネピカスタット（経口）対  担体（静注）／ネピカスタット（経口）を比較した。
【０３５４】
処置群間において、心拍のベースライン又は平均動脈圧に有意差はなかった。
【０３５５】
ＳＣＨ−２３３９０投与を静脈内処置により行うと、経口投与後１２０分から２４０分にかけて、担体コントロール投与群と比較して心拍の有意な減少が見られた（ｐ＜０．０５）。ネピカスタットは、担体処置動物において見られたほど、心拍を減少させなかった。投与後１５０及び１８０分においては統計的には有意であった（ｐ＜０．０５）。試験を通して、心拍は大きな多様性が見られたことは注目すべきである。
【０３５６】
ＳＣＨ−２３３９０の静脈内投与では、静注後１５分間において、わずかだが（５±１ｍｍＨｇ）、担体投与群よりも平均動脈圧に有意な減少が見られた（ｐ＜０．０５）。ネピカスタットの経口投与においては、投与３０分以降試験時間中において平均動脈圧が有意に減少した（ｐ＜０．０５）。ＳＣＨ−２３３９０による前処理では、ネピカスタット単独の時に見られたように有意な降圧効果は見られなかった。
【実施例２５】
【０３５７】
１５週齢の雄Ｃｒｌ：ＣＯＢＳ（ＷＩ）ＢＲラットを用いた。常に血圧無線遠隔変換器（ＴＡ１１ＰＡ−Ｃ４０、データサイエンス社， Ｓｔ. Ｐａｕｌ， ＭＮ）を装着した２４のラットを動脈圧、心拍、及び運動行動の測定に用いた。ラットは、ペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ、静注）で麻酔し、腹部の毛を剃った。無菌下、解剖は正中線に従って行った。腹部の大動脈にカテーテルのついた無線遠隔電送器のユニットを、カニュレを通して装着した。電送器を腹筋に縫いつけた後、皮膚を閉じた。それぞれのラットは、薬物投与の前に少なくとも２週間回復させた。試験開始の３日前、ラットをランダムに４処置群：担体（経口）、ヒドララジン（１０ｍｇ／ｋｇ、経口）、ネピカスタット（３０ｍｇ／ｋｇ、経口）、ネピカスタット（１００ｍｇ／ｋｇ、経口）、に振り分けた。
【０３５８】
最高血圧（ＳＢＰ）、最低血圧（ＤＢＰ）、平均血圧（ＭＢＰ）、心拍（ＨＲ）、及び運動行動（ＭＡ）をモニターした。ネピカスタット及びヒドララジンを微量のトゥイーン８０を含む水溶液として調製した。すべての投与において、ラットに遊離塩基等価体が１０ｍｌ／ｋｇとなるように投与した。
【０３５９】
ＳＢＰ、ＤＢＰ、ＭＢＰ、ＨＲ、及びＭＡのデータを継続的に収集するためにコンピュータ化されたデータ収集システムを用い、各ラットにつき、５分ごとに１０秒ずつ行った。これらは１時間ごとに平均値を取り、標準誤差（ＳＥＭ）を計算した。全ての値は、平均値±標準誤差で表した。統計的に有意差があるとは、ｐ値が０．０５よりも小さいことと定義する。ＭＢＰ、ＨＲ及びＭＡのデータは別々に分析した。それぞれの分析は、毎日２６時点で行われた。主効果を、治療及び時間及びそれらの相互作用として二元配置ＡＮＯＶＡを用いて分析した。全体としての治療効果又は有意な相互作用を検出した場合には、その時点において一連の一元配置ＡＮＯＶＡを行った。各時点での対比較はダネットの手法を用いて行った。全体としての治療効果が見られなかった場合には、コントロールとの対比較はボンフェローニ補正を用いて臨界値を補正して行った。
【０３６０】
これらのパラメータの前処置の数値を計算した後、それぞれのラットのグループに、７日間毎日、担体、ネピカスタット又はヒドララジンの投与を行った。
【０３６１】
ネピカスタットの経口投与３０ｍｇ／ｋｇ（以後全て経口投与である）は、血圧をゆっくりと下げる傾向にあったが、第１日においては、血圧低下効果は確実ではなかった。効果が進み、最大の低下効果は、−１０ｍｍＨｇが第２日の１３時間に見られた。同様の降圧効果が試験を通して見られた。１００ｍｇ／ｋｇ、最大−１１ｍｍＨｇ降圧反応を第１日目の投与から２２時間後に生じた（ｐ＜０．０１）。ＭＢＰは、減少し続け、第３日目に最低値は約−１７ｍｍＨｇとなった（ｐ＜０．０１）。ＭＢＰは試験中ずっと低いままだった。
【０３６２】
ヒドララジン１０ｍｇ／ｋｇを投与すると１０時間以内に急速な血圧低下を生じた。ＭＢＰは、第１日の１時間以内に最大の−２４ｍｍＨｇ（ｐ＜０．０１）の低下が見られた。同様の一過性の降圧効果が試験を通じて見られた。
【０３６３】
ネピカスタット３０及び１００ｍｇ／ｋｇ投与では、第１日目にはＨＲに確実な影響を与えなかった。しかし、第２日目、ネピカスタット１００ｍｇ／ｋｇ投与においては、投与３時間後には−１００ｂ／ｍｍの徐脈反応が現れた。有意であるが、様々な程度の、はっきりしない徐脈効果が、第３−７日において見られた。比較として、ヒドララジンは１０ｍｇ／ｋｇ投与で、様々な程度の頻脈が試験を通じて見られた。
【０３６４】
試験を通じて、いずれの薬物による治療もＭＡには確実な影響を与えなかった。
【０３６５】
体重は毎日記録した。体重の投与前からの変化に関しては、全体としての治療効果、日、日と治療効果相互作用を要素として用いて二元配置ＡＮＯＶＡにより分析した。次に、一元配置ＡＮＯＶＡを毎日行い、薬物治療群と担体コントロール投与群との対比較を、ダネットの手法、及び複数の比較対象がある場合に適合させるためにフィッシャーの最小有意差法を用いて行った。担体処置の対象と比較して、いずれの薬物も体重には効果はなかった（ｐ＜０．０５）。ネピカスタット１００ｍｇ／ｋｇ投与では、第３日において体重が減少する傾向にあったが、統計的には有意ではなかった。
【実施例２６】
【０３６６】
ネピカスタットは、ドパミンからノルエピネフリンへの変換を減少させる。基本的なネピカスタット活性の測定は、血漿又は尿中ドパミンのノルエピネフリンに対する比の増加率で計算する。ネピカスタット処置は、血漿又は尿中レベルのドパミン又はドパミン／ノルエピネフリン比を上昇させることがわかった。
【０３６７】
図５では、健常志願者にネピカスタットを投与した場合における２４時間後の尿中ドパミンレベルを示す。
【０３６８】
反復測定分散分析モデルを用いて分析したところ、プラセボ投与に対し、２００ｍｇのネピカスタット投与群は平均臥位血漿ドパミン／ノルエピネフリン比の有意な増加が見られた（ｐ＜０．０５）。尿中ドパミンレベルは、ネピカスタット４０ｍｇ及び２００ｍｇの投与後１０日間増加した。
【実施例２７】
【０３６９】
慢性心疾患（ＣＨＦ）の患者に、毎日ネピカスタット４０、８０、及び１２０ｍｇを投与し、一般に１０日は耐容性があった。有意な副作用が見られたのは、１６０ｍｇにおいてだった。
【０３７０】
１６０ｍｇで８日間以上治療した場合、８患者の中の４人に湿疹が生じた。発疹した中の２人は掻痒を伴った。１人の患者は発疹に息切れを伴った。
【０３７１】
８０ｍｇを投与された中の１人の患者は、症候性起立性低血圧のため試験から離脱した。同時投与の治療薬は、ヒドララジン及び３つの利尿剤を含む。プラセボを含み全ての投与量において、起立性低血圧が偶発的に起こった。１６０ｍｇ投与を受けた８患者の中の６人は、症候性起立性低血圧を生じた。
【０３７２】
ＣＨＦ患者における試験中２人が死亡した。１人はＣＨＦ（患者は８０ｍｇ １日１回投与を受けていた）の悪化によるものであり、もう１人はプラセボ投与を受けていた患者の突然死だった。
【０３７３】
薬物と関連すると思われる深刻な副作用は、クレアチニンレベルであり、これは入院が必要である。医学的に有意な症状で、試験薬物と関係のないと思われるものは、２患者におけるＣＨＦの悪化（１人は続いて急性のＭＩ及び心停止を起こした）、１患者における不安定狭心症、１患者における非典型的胸痛、及びの乳房癌の病歴のある１患者における副腎腫瘤である。
【０３７４】
うっ血性心不全患者における試験では、ネピカスタット投与後１０日間の、血漿ドパミンレベル、ノルエピネフリンレベル、及びドパミン／ノルエピネフリン比の変化を調べた。
【０３７５】
うっ血性心不全患者における試験では、ネピカスタット投与後３０日間の、血漿ドパミンレベル、ノルエピネフリンレベル、及びドパミン／ノルエピネフリン比、及び、レベル及び比の変化を調べた。３０日間のネピカスタット処置により、ドパミン／ノルエピネフリンレベルが上がった。
【実施例２８】
【０３７６】
げっ歯類にネピカスタットを投与した場合における脳内のドパミン／ノルエピネフリン比を測定した。げっ歯類にネピカスタット又はジスルフィラムを投与した場合、ドパミン／ノルエピネフリン比は、増加した。
【０３７７】
関連する分野における通常の技術を有する者にとっては明らかなことであるが、ここに記載した他の適切な方法及び適用の変更及び改変は、適切であり、発明の範囲及びそのいかなる態様からも外れることはない。発明は特定の態様と関連して記載されているが、それは、以下の請求項によって定義される発明の精神及び範囲に含まれている代替案、変更、及び等価体を網羅するために記載している。
【実施例２９】
【０３７８】
ラットにおける薬物の短期記憶又はワーキングメモリに対する効果を調べるために遅延場所あわせ課題（delayed-matching-to-position (ＤＭＴＰ) test）を行った。
【０３７９】
ネピカスタットのＤＭＴＰ課題の開始前に、最高用量のネピカスタット（１００ｍｇ／ｋｇ経口）急性及び繰り返し投与による、行動学的／生理学的効果を評価するため、及び、フィゾスチグミンを繰り返し投与し最大耐容経口用量を調べるために、予備試験を行った。
【０３８０】
予備試験において、ネピカスタット（３０及び１００ｍｇ／ｋｇ経口）又は担体を、同一の重量範囲に調節された（４００−４８０ｇ）ＳＤ系雄ラット（ｎ＝８）に急性投与した。薬物又は担体投与１、３及び２４時間後に、各動物がどのような処置を受けたか知らされていない観察者によって観察された。同様に別の試験において、フィゾスチグミン（１、３、１０又は３０ｍｇ／ｋｇ経口）又は担体を各グループ８匹のラットに投与した。薬物又は担体投与１、３及び２４時間後に観察した。
【０３８１】
繰り返し試験の予備試験は、ネピカスタット（１００ｍｇ／ｋｇ経口）又は担体を１日２回（０６:００及び１８:００）、１０日間（第１１日は１回）各グループ８匹のラットに投与した。動物の重量は試験を通じてモニターされ、第５日には、盲検試験による独立した観察者によって、行動学的／生理学的効果を評価するために、以下の繰り返し投与を行った。別々の試験として、各グループ８匹のラットに、担体又はフィゾスチグミン（０．３、１、３又は１０ｍｇ／ｋｇ経口）を同じ投与スケジュールで投与した。動物の体重は、試験期間中を通してモニターした。
【０３８２】
ネピカスタット（３０又は１００ｍｇ／ｋｇ急性経口投与）によっては、明らかな行動学的／生理学的変化はもたらさなかった。同様に、ネピカスタット１００ｍｇ／ｋｇの繰り返し経口投与による明らかな効果はなかった。しかし、後者の投与によって、動物の体重は１１日後に平均２８ｇ減少したが、コントロールでは平均１ｇ増加した。薬物処置を受けた１１日間の動物は、コントロール群に比べて、取り扱いにおいて怒りっぽくなっていた。
【０３８３】
フィゾスチグミンの急性投与は、３ｍｇ／ｋｇ以上の投与量においては、明らかな行動学的効果が見られた（そしゃく運動及び唾液）。毒性のサインが３０ｍｇ／ｋｇ経口（チアノーゼ、震え、頭を持ち上げる、運動失調）から見られた。フィゾスチグミン３及び１０ｍｇ／ｋｇの繰り返しの経口投与では、毒性が見られた（１０ｍｇ／ｋｇ投与群の８匹のうち３匹は第２日に死亡し、３ｍｇ／ｋｇ投与群においては８匹のうち２匹は第５日に震えを起こしていた。）。フィゾスチグミン０．３又は１ｍｇ／ｋｇ投与では影響はなかった。
【０３８４】
これらの研究結果から、ＤＭＴＰ課題のためのネピカスタット投与の最高用量は３０ｍｇ／ｋｇ（経口）とし、フィゾスチグミンの繰り返し投与には１ｍｇ／ｋｇ（経口）に減らして用いることとした。
【０３８５】
ＤＭＴＰ課題において、間隔を０、８、１６又は３２秒遅らせていき、ラットはレバーの場所を覚えるように訓練され、食餌を報酬として得る。以下の訓練では、ＤＭＰＴ試験で行いながら、ネピカスタット（１、３、１０及び３０ｍｇ／ｋｇ、経口 ｂｉｄ）又はフィゾスチグミン（１．０ｍｇ／ｋｇ、経口、ｂｉｄ）の１０日間に渡る繰り返し投与の効果を見た。試験の第１１日目には、ネピカスタット及びフィゾスチグミン処理された動物に、スコポラミン臭素酸塩（０．１ｍｇ／ｋｇ、皮下投与、３０ ｍｍの前処理時間）を同時投与した。ＤＭＴＰのパイロット試験は、スコポラミン０．１ｍｇ／ｋｇの選択精度によっては著しい障害を与えることがわかったため、スコポラミンの用量は、ＤＭＴＰのパイロット試験のデータに基づいて選択した。ネピカスタット又はフィゾスチグミンを投与する群に加え、以前担体を投与した群にスコポラミンを投与した。他の群のラットは、実験中担体のみを投与した。最終のスコポラミンの試験は、慢性投与がＤＭＴＰ課題においてスコポラミンに起因する障害の選択精度を小さくできるかを決定する目的がある。
【０３８６】
この試験において依存する項目は、訂正の選択、選択をするまでの待ち時間、及び７０分試験時間中に完成できた回数である。最初の項目の変化は、記憶及び／又は注意機能の変化を示唆しているのに対し、後の２つの項目の変化は、薬物による非認識下の効果の指標となる。
【０３８７】
試験開始時に体重２００−２９０ｇだった５６匹のＳＤ系雄ラットを用いた。ケージによって４つのグループに分け、ラット１匹につき約１２−１５ｇの食餌を与えた。これは、ラットに食餌を自由に与えた場合の約８５％の重さに当たる。体重が減り始めた動物には追加の食餌を与えた。水は自由に摂取できるようにした。動物は、午前６時に点灯し１２:１２時間ごとの明／暗サイクルで飼育した。
【０３８８】
キャムデン社の、２つの伸縮自在のレバー及び食餌ケースが中央に位置するオペラント箱１２個を用いて行動試験を行った。食餌ケースの前には、ラットがそれを後ろへ押して食餌を得られるフラップがついている。箱は修正して、仕切を食餌ケースのいずれの側でも適合するようにした。仕切は、透明なパースペックスであり、箱の床から天井までの大きさであり、中心付近では１０５ｍｍとなっている。オペラント箱は、音及び光が減弱される構造体に包まれている。装置の制御には、ポールフレイコントロールシステムインターレース（Ｐａｕｌ Ｆｒａｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｔｅｒｌａｃｅｓ）及びアラクニッドソフトを内蔵したアコーンＡ５０００（Ａｃｏｒｎ Ａ５０００）コンピュータプログラムが用いられている。
【０３８９】
試験中ケージは点灯しておき、まずラットを製剤「Ａ」としてノイス（Ｎｏｙｅｓ）４５ｍｇの食餌ペレットを、食餌ケースのフラップの後ろから取り出すように訓練した。次にラットを左と右の両方のレバーを押して報酬として食餌を得るように訓練した。左又は右のいずれかのレバーは３０ｍｍ中、ランダムに現れている。レバーを押すとレバーが戻り、食餌ペレットが出てきて、ケースの電灯が光る。電灯は、食餌ペレットを取るまでついたままである。
【０３９０】
次に、ＤＭＴＰ課題を開始した。これ以降の全ての訓練は、仕切のある実験ケージで行った。試験はまず５０分行われた。ラットを実験ケージに入れ、ケージの電灯を点灯させて実験を開始した。試験は３０秒間隔（ＩＴＩ）で行われ、２つのうちの１つのレバー（サンプルレバー）が装置の中に挿入されている。レバー押し行動が行われるまでは、レバーは入ったままである。レバー押し行動によりレバーが戻り、ケースの電灯が光る（食餌は出てこない）。ケースのフラップを押すと、ケースの電灯が消滅し、両方のレバーが入る。サンプルレバーを押して（例えば、以前紹介した）両方のレバーが戻ると、食事ペレットが出てきて、ケースの電灯が光る。ケースの電灯はフラップを押すまではついている。間違ったレバー（サンプルレバーと反対のレバー）押しでは、食餌ペレットは出ず、１０秒でタイムアウト（ＴＯ）となり、ケージのライトが消される。次の試験は、３０秒のＩＴＩで開始される。挿入されたレバーは、挿入されたレバーは、半ランダムに決定されている。１６回の試験ブロックのうち右及び左のレバーは８回ずつサンプルレバーとなっている。
【０３９１】
訂正の手順をこれ以降の訓練において用いた。サンプルレバー（左又は右）として設定されるかどうかは、訂正なしの試行においては、コンピュータによって決めた（例えば、最初の試行及び続く試行で正しい選択が行われる）。不正確な選択の都度、選ばれなかったレバー（例えば「正しい」レバー）を続く試行においては、「訂正」試行ではサンプルレバーとして設定した。これらの訂正の試行は、固定化した行動を防ぐために行った（例えば、いつも左又は右のいずれかを押し、５０％の正解率となること）。訂正の試行が行われた回数を記録したが、正解率の評価には、訂正試行以外のデータのみを用いた。
【０３９２】
以下の２４の試行のうち、動物は位置の適合試験において高い正確性を有していた。２５回目の試行では、サンプルレバー押しから、次の選択レバーが現れるまでの間に、遅延時間を設けた。サンプルレバーを押し、最初にフラップを押した後、０（即時）、４、８又は１６秒間、選択レバーは入ったままである。４タイプの指令（０、４、８又は１６秒遅延）が、１６試行ブロックに対して各４回ずつ２回は左に、及び２回は右になるように半ランダムにセットした。ラットが、遅延時間後３０秒の予定時間内に選択行動をとらなかった場合、試行は終了し、次の試行が始まるという時間制限を設けた。そのような試行は、不完全として数え、データ分析には含めなかった。ＩＴＩの終了後、同じ試行を開始した。試行２５以降は、不正確な選択によるタイムアウトはなくし、試行時間を７０秒とした。
【０３９３】
０−１６秒の遅延を設けた以下の２６試行（試行２５−５０）のうち、試行間の間隔は１０秒とし、その後の８試行（試行５１−５８）は、遅延を６４秒まで伸ばした。しかし、６４秒の遅延は効率が悪かったため、その後の試行には用いなかった。試行５９では、０、８、１６及び３２秒の遅延を設けた。これらの遅延は、以下の全ての試行において用いた。５９の試行を行い、２４以上を完了したのは、５６のラットのうち５１のみだった（正しい選択及び正しくない選択の和）。これらのラットは、行動の評価（正解率、反応までの時間、及び正解した回数）によって、半ランダムに以下の７群：担体／担体（ｎ＝７）、担体／スコポラミン（ｎ＝）、ネピカスタット１．０ｍｇ／ｋｇ／スコポラミン（ｎ＝７）、ネピカスタット３．０ｍｇ／ｋｇ／スコポラミン（ｎ＝７）、ネピカスタット１０．０ｍｇ／ｋｇ／スコポラミン（ｎ＝７）、ネピカスタット３０ｍｇ／ｋｇ／スコポラミン、及びフィゾスチグミン／スコポラミン（ｎ＝８）、に振り分けた。
【０３９４】
６０−６９試行を行うため、１日のうち午前６時及び午後６時に、ラットに担体、フィゾスチグミン（Ｐｈｙｓ）又はネピカスタット（１、３、１０又は３０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。試行６８及び６９の担体処置の動物が高い選択精度を示したため、０、８、１６及び３２秒の遅延を最終試行（試行７０）でも行い、担体／担体処置群以外に、試験前３０分前にスコポラミン臭素酸塩０．１ｍｇ／ｋｇを投与しておいた（皮下投与）。担体／担体群の動物には、最終試行の３０分前に生理食塩水を投与した（皮下投与）。それゆえ、１１日間における７群への薬物投与は以下の通りである：
【表２】
2020114883.tif 000003
【０３９５】
データを収集し、１）正解率、２）選択からサンプルレバーを選ぶまでの反応時間、及び３）正解及び不正解の選択が完了した合計数を含む項目をＤＭＰＴ研究において分析した。先の２つの依存項目は、不正解の試行の回数の計算のためにのみ収集した。
【０３９６】
統計分析の検出力及び検出感度を増加させるため、最初の１０の薬物処置期間（試行６０−６９）において、第１日から第１０日までの試験のデータの図が含まれているが、データは２つのブロックに分けた（ブロック１−５）。また、担体／担体及び担体／スコポラミン投与群は最初の１０日間の試験で同じ処置を受けるため、統計分析のために、まとめてブロック１−５に設定した。
【０３９７】
薬物処置の被検体間の因子及び被検体内の遅延時間（０、８、１６又は３２秒）の二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を、正しい選択の確率及び反応時間の分析のために用いた。これらの分析は、別々に行われ、それぞれのブロックのデータごとに行った。一元配置ＡＮＯＶＡをそれぞれの遅延について行った結果、有意な相互作用が見られた。両側ダネットｔ−検定に続く一元配置ＡＮＯＶＡにより有意な主効果が得られた。適切な場合には、完了した試行の平均回数を分析するためにダネットポストホック検定に続く一元配置ＡＮＯＶＡを行った。
【０３９８】
全ての統計分析は、スーパーアノーバソフトウエアを用いて、マッキントッシュコンピュータで行った。アルファは、試験中０．０５にセットした。４つの遅延時間の試行において選択を完了することができなかった動物は、分析の正解率及び遅延に対する応答試験の分析からは除外した。正解率及び反応の遅延の分析には、５ブロックに分けた薬物投与群及びスコポラミン投与群の動物の数を、分析に含め記録した。遅延時間を設けた試行における、薬物の全体としての効果の評価は、試行を完了した全ての動物の数が含まれている。
【０３９９】
フィゾスチグミン硫酸塩（１．０ｍｇ／ｋｇ、ＲＢＩ社）及びネピカスタット（１、３、１０及び３０ｍｇ／ｋｇ、ロシュ社）は、１日２回、午前６時及び午後６時に経口投与した。スコポラミン臭素酸塩（０．１ｍｇ／ｋｇ、シグマ社）は、前の試行の３０分前に投与した。フィゾスチグミン及びネピカスタットは、蒸留水に溶解又は懸濁させ、２．５ｍｌ／ｋｇとして投与した。スコポラミン臭素酸塩は、生理食塩水に溶解させ、１．０ｍｌ／ｋｇとして投与した。全ての投与用量は、体重を基準に表示した。
【０４００】
最初の試験ブロックでは、ＤＭＴＰ課題において正解率及び遅延に対する選択反応において、薬物処置群において有意な効果は示さなかった。薬物処置は、完了した試行の数に影響を与えなかった（Ｆ（５，４５）＝０．３１９、ｐ＝０．８９９）。
【０４０１】
ブロック２において、ネピカスタット及びフィゾスチグミンは、試行中、いずれの項目においても有意な効果を示さなかった。効果は統計的には有意差はなかったが（Ｆ（５，４５）＝１．７１７、ｐ＝０．１５０）、試行を完了できた動物が減っていったという傾向があった。これはネピカスタット３又は３０ｍｇ／ｋｇ及びフィゾスチグミン投与群において、わずかであるがより顕著に見られた効果であった。４種の遅延においては、ネピカスタット３０．０ｍｇ／ｋｇ投与群の動物は７動物のうち４動物しか試行を完了できなかった。
【０４０２】
ブロック３においては、フィゾスチグミン処置群は、遅延とは独立した選択の不正確性があった。正解率のＡＮＯＶＡによる分析では、薬物処置の有意な主効果が見られたが、薬物処置×遅延時間の相互作用においては、有意差は見られなかった。薬物処置の主効果をダネットポストホック検定で分析したところ、フィゾスチグミン処置群のみが担体処置群に比べて有意差を示した。薬物処置群は、このブロックにおいて、反応の遅延又は試行を完了した数において、有意差を示さなかった（Ｆ（５，４５）＝０．７０１、ｐ＝０．６２５）。
【０４０３】
ブロック４では、薬物処置による正解率への効果はあったが、統計的有意差までは示さなかった（ｐ＝０．０５６）。しかし、薬物処置群のＡＮＯＶＡ分析により、薬物処置×遅延に対する応答の相互作用において、有意に遅延に対する応答に障害を与え、有意差を示した。続く一元配置ＡＮＯＶＡにより、統計的には０、８、１６及び３２秒遅延による処置は、３２秒遅延のみ有意であった；０、８、１６及び３２秒遅延による場合、それぞれ、Ｆ（５，４０）＝２．１１５、ｐ＝０．０８４；Ｆ（５，４０）＝１．４０３、ｐ＝０．２４４；Ｆ（５，４０）＝２．２５９、ｐ＝０．０６７；Ｆ（５，４０）＝３．３２５、ｐ＝０．０１３であった。ダネットポストホック検定において、３２秒遅延におけるネピカスタット１０．０ｍｇ／ｋｇ投与群のみ担体処置群よりも長い遅延時間が可能であった。薬物治療は、ブロック４において試験を完了した回数は、有意ではなかった（Ｆ（５，４５）＝１.５３３、ｐ＝０．１９９）。
【０４０４】
ブロック５では、ネピカスタットを試みたところ、用量及び遅延時間依存性の選択の正確性に障害が生じ、二元配置ＡＮＯＶＡにより処置×遅延に対する応答の相互作用における有意差が見られ、続く一元配置ＡＮＯＶＡでは、０、８、１６及び３２秒遅延では、有意な差（３２秒遅延、Ｆ（５，３９）＝０．３２７、ｐ＝０．８９４；Ｆ（５，３９）＝０．８２５、ｐ＝０．５３９；Ｆ（５，３９）＝１．１８８、ｐ＝０．３３３；Ｆ（５，３９）＝３．０１８、ｐ＝０．０２１、０、８、１６及び３２）が見られた。ダネットポストホック検定では、３２秒遅延における、ネピカスタット１０及び３０ｍｇ／ｋｇ処置群は、担体処理の動物よりは効果は大きかった。
【０４０５】
ブロック５において、ネピカスタット及びフィゾスチグミンは、試行を完了した数は有意ではなかった（Ｆ（５，４５）＝１．６９２、ｐ＝０．１５６）。
【０４０６】
スコポラミン臭素酸塩を投与しても、多くの動物は、試行において遅延による効果を示さなかった。１０．０ｍｇ／ｋｇのネピカスタット＋スコポラミン投与群においては、１匹のラット、３０．０ｍｇ／ｋｇのネピカスタット＋スコポラミン投与群においては２匹のラットのみが４つの遅延時間において、試行を完了できた。事実、担体／担体及び担体／スコポラミンにおいてそれぞれ７匹及び４匹のラットが試行を完了し、それ以外の全ての群において、４つの遅延による試行を完了できたのはｎ＜４であった。
【０４０７】
全てのスコポラミン処置群において、試行を完了することができた数は減少した（Ｆ（６、１６）＝８．８０１、ｐ＝０．００１）。
【０４０８】
スコポラミン処置群のうちの少数のために、選択の正確性及び反応遅延データによってＡＮＯＶＡを行わなかった。加えて、４つの遅延において正解率の平均を求められなかった。担体／スコポラミン群の正確性を担体／担体群と比較したｔ−検定からは、スコポラミンは有意に背ｔんたくの正確性を減少させることがわかった（t（９）＝４．１５、ｐ＝０．００３）。被検体が４匹よりも小さい場合には、それ以上の分析は行わなかった。しかし、興味深いことに、ネピカスタット＋スコポラミン３０．０ｍｇ／ｋｇ処置群の中の２匹は、スコポラミン単独よりも正確な選択をした。この３０．０ｍｇ／ｋｇ処置動物は、担体／スコポラミン処置群又は他のスコポラミン処置群のいずれの動物よりも、正確な選択をした。
【０４０９】
ネピカスタット単独で投与した場合、ＤＭＴＰ課題においては、ネピカスタットの記憶向上効果にはつながらないと考えられる。遅延に伴う記憶障害は、担体処置した５つのブロックでは、消失したと考えられることは、注目すべきである。しかし、第５ブロックは遅延性の記憶障害が起こり、０秒遅延では１００％の正確性、３２秒遅延では８０％の正確性であった。このように担体処置動物では、天井効果は見られなかった。
【０４１０】
とりわけ、第５ブロックにおいてネピカスタットは選択的な記憶混乱効果があった。フィゾスチグミンは、いずれの処置日の効果も改善せず、第３ブロックにおいては正確性に関して遅延非依存性の障害が現れた（第５及び６日）。第１１日、スコポラミン臭素酸塩（０．１ｍｇ／ｋｇ）及びネピカスタット又はフィゾスチグミンを同時投与した、スコポラミン負荷試験は、ＤＭＴＰ課題を完了した被検体が少なかったために、分析できなかった。しかし、ネピカスタット及びスコポラミン３０．０ｍｇ／ｋｇ投与を受けた中の２匹のラットはＤＭＴＰ課題を行え、選択の正確性は、他のいずれのスコポラミン処置動物よりも正確であった。これよりネピカスタットは、「非認識性」の他のマスクされていた効果のため、スコポラミンによって引き起こされた記憶の破壊をいくらか弱めることが可能であるといえる。
【０４１１】
ネピカスタットは、有意に用量及び遅延時間依存性の選択の正確性への障害を引き起こす。ネピカスタット１０．０ｍｇ／ｋｇ処置された動物は、０、８及び１６秒遅延では、正確性において何ら障害を受けなかった。対照的に、３２秒の遅延では、ネピカスタット１０．０ｍｇ／ｋｇ投与群においては、担体処置群に比べて、障害を受けた。最高用量３０．０ｍｇ／ｋｇ投与を行った場合、０秒遅延では正確性に障害はなく、８及び１６秒遅延においては正確性に障害が出る傾向にあり、担体と比較して、３２秒遅延の場合には有意な障害が生じた。これらの薬物による遅延時間依存性の選択の正確性への障害は、化合物は直接短期記憶又はワーキングメモリに作用していることが考えられる。動物は十分に動くことができ、ＤＭＴＰ課題を正確に行うことができる。短い遅延の場合及び、保持間隔が長い場合にだけ、障害を起こす。試験した化合物で、このモデルの試験化合物で、ようなプロフィールを示したものはほとんどなかった。記憶障害を誘発するとされる多くの化合物は、全ての遅延で選択の正確性の障害が見られた（例えば、ＭＫ−８０１、スコポラミン）。ネピカスタットの１０．０ｍｇ／ｋｇ投与では、第４ブロックの試行において、３２秒遅延の場合に、担体処置動物よりも完了するのに時間がかかり、効果は小さかった。効果は用量非依存的であり、３０．０ｍｇ／ｋｇを投与した場合には効果は見られなかった。ネピカスタット投与動物は、担体投与動物よりも完了しにくい傾向にある：この傾向は、最後の２ブロックの試行で見られた。しかし、様々なデータがあるため、これらの傾向は、統計的有意性には届かなかった。この多様なデータは予想外だった。これは、慢性の経口投与管理による最初のストレスが、これらの食餌摂取動物において、特に最初の数ブロックの試行において効果を落とさせたものと考えられる。すべての群において、最初と２番目のブロックにおいて試行を完了した数が減少した。最初の減少から回復した動物は、より一貫した行動を次の３ブロックにおける試行では示した。
【０４１２】
我々は、動物の体重はある場合には５％を超えて総体重が減少し始めたことを発見した。体重減少を示した動物は別にして、毎日の試行の後に追加の食餌を与えた。この追加によって試行が完了したかどうかに多様性が出たのかもしれない。しかし、体系的な記録はなされていないが、大まかな観察から３０ｍｇ／ｋｇ投与群には、他の群よりも追加の食餌を与えるべきだった。この観察は、ネピカスタット１００ｍｇ／ｋｇの経口投与による予備試験に顕著な体重減少を引き起こした結果と一致している。
【０４１３】
フィゾスチグミンは、ＤＭＴＰ課題においてラットの行動を改善しなかった。フィゾスチグミンを投与された動物は、ブロック３においては正解率に有意に障害が出た。対照的に、フィゾスチグミンによって障害された正解率へのネピカスタット投与の効果は、遅延時間とは関係ないものであった：相互作用に関する分散分析は、統計的有意差を有しなかった。それゆえ、正確な反応へのフィゾスチグミンの効果は、この用量を投与した場合に見られる行動学上の毒性効果の二次的なものであると考えられる。フィゾスチグミンによる、統計的な有意差はなく、選択の正確性の障害により、試行の最後の２ブロックにおいて動物は、耐性を獲得していると考えられる。
【０４１４】
最後に、フィゾスチグミンはスコポラミンによる試験中、スコポラミンの効果を弱めることはなかった。異なる用量のフィゾスチグミンによりスコポラミンに対して効果がある可能性がある。我々は、本件の投与管理によってフィゾスチグミンによりスコポラミンの効果を弱めるかを試みたことがなかったので、本件の結果を比較すべきデータの履歴がない。フィゾスチグミンの効果がなかったのは、急性投与に比べて、低容量の場合、フィゾスチグミンの慢性投与を行わなければならなかったのであると考えられる。動物は、スコポラミンの効果を減弱するのに必要な高用量のフィゾスチグミンの繰り返し投与による耐容性がなかったと考えられる（予備試験の結果を参照）。加えて、ネピカスタットはスコポラミンの効果を弱めるようではなかったが、３０．０ｍｇ／ｋｇのネピカスタットを投与した２匹は、スコポラミン試験中、他のスコポラミン処置群よりも選択の正確性が上昇したことは興味深い。さらなる研究が必要である。ネピカスタットによる急性又は慢性投与により、スコポラミンの効果を弱めるか明確にする必要がある。
【０４１５】
ネピカスタットは、８日間の投与により、特定の記憶破壊効果を生じたと見られる。フィゾスチグミンは改善せず、３ブロックの試験期間において遅延時間非依存的な選択正解率への障害を引き起こした（第５及び６日）。スコポラミン負荷試験において、第１１日に動物に、スコポラミン臭素酸塩（０．１ｍｇ／ｋｇ）及びネピカスタット又はフィゾスチグミンを同時投与したが、ＤＭＴＰ課題を完了できたネピカスタット及びフィゾスチグミン処置群が少なかったために、分析できなかった。しかし、３０．０ｍｇ／ｋｇのネピカスタット及びスコポラミン投与を受けたラットのうちＤＭＴＰ課題を完了できた２匹のラットは、他のスコポラミン処置を受けたどのラットよりも高い選択正解率を示した。これよりネピカスタットは、「非認識性」の他のマスクされていた効果のため、スコポラミンによって引き起こされた認識破壊をいくらか弱めることが可能であるといえる。最終ブロックの試験において、ネピカスタット誘導性投与量及び遅延時間依存性の障害による選択正解率の減少を試験した。これは他の記憶障害薬からは予測できない発見であった。スコポラミン及びＭＫ−８０１、といった注意及び／又は運動／やる気の因子の障害による選択正解率への遅延時間非依存的障害によると考えられる。対照的に、変化及び注意又は変化／注意行動を説明できない。この結果は、受容体又は薬理作用において新しい受容体に選択的又は、ワーキングメモリの重要な基質である。
【実施例３０】
【０４１６】
近年、我々はネピカスタットが、選択的ドパミンβ−ヒドロキシラーゼ阻害剤であることを示し、ＳＨＲにおいて急性の降圧効果の効果の研究を行った。ネピカスタット降圧効果は、慢性的に同系統のラットで行った。さらに、我々は、ネピカスタット及びアンジオテンシン変換酵素阻害剤エナラプリルとの同時投与の相乗効果の可能性を調べた。この処置によるＳＨＲにおける心肥大効果も調べた。
【０４１７】
雄ＳＨＲ／ＮＣＲ１ ＢＲ ラット（食餌を与える時に２２−２８週齢）で、／ＮＣｒＩ ＢＲ ラットと体重の合うラットを用いた。４種の実験を順に行った。
シリーズＩ
担体
エナラプリル            １０ｍｇ／ｋｇ
ネピカスタット            ３ｍｇ／ｋｇ
ネピカスタット          １０ｍｇ／ｋｇ
シリーズＩＩ
担体
エナラプリル            １０ｍｇ／ｋｇ
ネピカスタット          ３０ｍｇ／ｋｇ
ネピカスタット        １００ｍｇ／ｋｇ
シリーズＩＩＩ
担体
エナラプリル              １ｍｇ／ｋｇ
ネピカスタット          ３０ｍｇ／ｋｇ
ネピカスタット          ３０ｍｇ／ｋｇ＋エナラプリル１ｍｇ／ｋｇ
シリーズＩＶ
エナラプリル              １ｍｇ／ｋｇ（Ｅ１）
ネピカスタット          １５ｍｇ／ｋｇ＋Ｅ１
ネピカスタット          ３０ｍｇ／ｋｇ＋Ｅ１
ネピカスタット          ６０ｍｇ／ｋｇ＋Ｅ１
【０４１８】
それぞれの動物の処置において、動脈性血圧、心拍、及び運動行動を観察するために２４匹のＳＨＲに常に血圧無線遠隔変換器を装着した。ラットをペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）で麻酔し、腹部の毛を剃った。麻酔下、正中線に従い解剖した。腹部の大動脈にカテーテルのついた無線遠隔電送器のユニットを、カニュレを通して装着した。電送器を腹筋に縫いつけた後、皮膚を閉じた。それぞれのラットは、薬物投与の前に少なくとも２週間回復させた。ラットは、８時から２０時に電気をつける通常の明／暗サイクルで個別に飼育した。
【０４１９】
実験開始の３日前、ラットをランダムに４処置群に振り分け、最高血圧（ＳＢＰ）、最低血圧（ＤＢＰ）、平均血圧（ＭＢＰ）、心拍（ＨＲ）、及び運動行動（ＭＡ）をモニターした。投与前のパラメータを測定した後、それぞれの群のラットに３０日間毎日ネピカスタット及び／又はエナラプリルを投与した（後述参照）。
【０４２０】
最後の処置の２４時間後、ラットは安楽死させ、左心室を摘出し、重量を測定し（湿重量）、乾燥重量を得るため少なくとも２４時間、凍結乾燥した。投与前のこれらのパラメータを測定した後、それぞれの群のラットは３０日のネピカスタット及び／又はエナラプリルを３０日間投与した。
【０４２１】
各試験の開始において、無線遠隔装置を装着した各群のラットの数は常に６とした。シリーズＩでは、ウイスター−京都ラット（ＷＫＹ）は７匹を同様に飼育し、担体（水）を投与したのに対し、シリーズＩＩＩ及びＩＶでは２匹のラットを各群に追加し、同様に処置した（ＳＨＲの肥大化への影響の統計分析を行うためにそれぞれの群の動物の数を２匹ずつ増やした）。これらのラットは無線遠隔装置の装着又はモニタリングは行わなかった。
【０４２２】
ネピカスタット及びエナラプリルはいずれも水溶液として調製した。すべての投与において、ラットに遊離塩基等価体が１０ｍｌ／ｋｇとなるように投与した。エナラプリル（バソテック（登録商標））は、市販されているものを地域の薬局から入手した。
【０４２３】
ＳＢＰ、ＤＢＰ、ＭＢＰ、ＨＲ、及びＭＡのデータを継続的に収集するためにコンピュータ化されたデータ収集システムを用いた。収集は各ラットにつき、５分ごとに１０秒ずつ行った。これらは１時間ごとに平均値を取り、標準誤差（ＳＥＭ）を計算した。処置終了後には、左心室重量（乾燥及び湿重量）を測定した。体重は毎日記録した。
【０４２４】
全ての値は、平均値±標準誤差で表した。統計的に有意差があるとは、ｐ値が０．０５よりも小さいことと定義する。
【０４２５】
ＭＢＰ、ＨＲ及びＭＡのデータは別々に分析した。それぞれの分析は、毎日２６時点で行われた。二元配置ＡＮＯＶＡには、主効果として、治療及び時間及びそれらの相互作用を用いた。全体としての治療効果又は有意な相互作用を検出した場合には、その時点における一元配置ＡＮＯＶＡを行った。各時点での対比較はダネットの手法を用いて行った。全体としての治療効果が見られなかった場合には、コントロールとの対比較はボンフェローニ補正を用いて臨界値を補正して行った。
【０４２６】
左心室重量については、組織の湿重量及び乾燥重量は最終体重を共変量として共分散による分析を行ったのに対し、組織の湿重量／体重及び組織の乾燥重量／体重の比を分析する際にはクラスカル・ワリス検定を用いた。全体としての処置の効果を全グループについて検出できなかった場合には、ボンフェローニ補正を行ってから多重比較を行った。
【０４２７】
体重については、投与前からの変化に関する二元配置ＡＮＯＶＡを処置、日、及び日ごとの処置との相互作用による全体の効果を分析するために行った。一元配置ＡＮＯＶＡを日ごとに行い、薬物処置群と担体コントロール投与群との対比較を、ダネットの手法及びフィッシャーの最小有意差法によって多重比較に適合させて行った。
【０４２８】
シリーズＩ及びＩＩについては、ネピカスタット３及び１０ｍｇ／ｋｇの経口投与（これ以降は全て経口投与である）では、３０日間のいずれの時点においても血圧に有意な効果を与えなかった（データは掲示してない）。ネピカスタット３０ｍｇ／ｋｇでは、第１日においてＭＢＰを緩やかに下げ、第３日目は最大−２０ｍｍＨｇとなり（ｐ＜０．０１）、２４時間ではほとんど回復しなかった。同様の降圧薬の効果が試験中見られた。１００ｍｇ／ｋｇでは、第１日の投与後２１時間後に−２９ｍｍＨｇの降圧反応が見られた。ＭＢＰは続けて減少し、第３日の最低値は約−４２ｍｍＨｇ（ｐ＜０．０１）であり、ＭＢＰは、ずっと低いままだった。
【０４２９】
エナラプリル１０ｍｇ／ｋｇは継続してＭＢＰを低下させた。最大下降比は、第５日の投与後１時間以内に現れた。ＭＢＰは−２９ｍｍＨｇ（ｐ＜０．０１）は、第５日に投与後１時間後に現れた。
【０４３０】
シリーズＩＩＩにおいて、エナラプリル１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６）又はネピカスタット３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６）の単独投与では、降圧効果は小さかったが、２つの化合物（ｎ＝６）の同時投与は大きな降圧反応を起こした（第１日、１６時間後に−２１ｍｍＨｇ、ｐ＜０．０１）。反応開始及び進行は、ゆっくりで緩やかだった。第２日に２回目の同時投与を行った場合、ほぼ１日に渡り、より大きな効果が見られた（−２５ｍｍＨｇ、１３時間後にｐ＜０．０１）。相乗効果は試験中を通じて見られた。
【０４３１】
シリーズＩＶにおいては、エナラプリルにより降圧しない用量でのネピカスタットの相乗効果を調べた。エナラプリル（１ｍｇ／ｋｇ）存在下では、ネピカスタット６０ｍｇ／ｋｇは最初、１５又は３０ｍｇ／ｋｇ投与の場合より大きく長いエナラプリルの効果が見られたが、第８日ないし第３０日においては、大きな効果は見られなかった。それゆえ、試したネピカスタットの投与量（１５、３０及び６０ｍｇ／ｋｇ）には関係がなかったといえる。ネピカスタット１５ｍｇ／ｋｇ及びＥ１群は、低い平均血圧を示し、より大きな標準誤差となった（２匹のラットは他よりも大きい降圧効果を示した）。
【０４３２】
ネピカスタット３及び１０ｍｇ／ｋｇ投与群は、３０日間の試験においては、継続して心拍（ＨＲ）に影響を与えたわけではなかった。しかし、ネピカスタット１００ｍｇ／ｋｇ投与群では、投与後最初の数時間においては、担体コントロール投与群よりも低いＨＲを示す傾向にあった。エナラプリル１ｍｇ／ｋｇ投与群ではＨＲに影響を与えなかったのに対し、ネピカスタット１０ｍｇ／ｋｇ投与群は、投与２時間以内に一過性のわずかな頻脈を起こす傾向があった。シリーズＩＩＩにおいては、例えば、エナラプリル（１ｍｇ／ｋｇ）、ネピカスタット（３０ｍｇ／ｋｇ）又はそれらの併用では、いずれも継続的にはＨＲに影響を与えなかった。シリーズＩＶにおいて、ネピカスタット（１５、３０及び６０ｍｇ／ｋｇ）及びエナラプリル（１ｍｇ／ｋｇ）処置群は、エナラプリル（１ｍｇ／ｋｇ）単独処置群よりも、より低いＨＲを示す傾向にあった。
【０４３３】
試験を通じて、運動行動（ＭＡ）についてはいずれの薬物処置群も有意な効果を示さなかった。
【０４３４】
ＳＨＲにおいて、ネピカスタット３−１００ｍｇ／ｋｇ投与群は、心臓の肥大化を示さなかった（ｐ＞０．０５）。エナラプリル（１０ｍｇ／ｋｇ）は、シリーズＩＩにおいて、左心室重量を有意に減少させたが、シリーズＩでは見られなかった。シリーズＩＩＩにおいては、エナラプリル１ｍｇ／ｋｇ投与群では肥大化は見られなかったが、エナラプリル（１ｍｇ／ｋｇ）及びネピカスタット（３０ｍｇ／ｋｇ）の同時投与群では左心室重量がＳＨＲにおいて有意に減少した（ｐ＜０．０１）。しかし、シリーズＩＶ、エナラプリル（１ｍｇ／ｋｇ）及びネピカスタット１５、３０及び６０ｍｇ／ｋｇの同時投与群では、エナラプリル単独と比べて左心室重量に差はなかった（ｐ＞０．０５）。
【０４３５】
担体処置群と比較して、ＳＨＲへのネピカスタット３及び１０ｍｇ／ｋｇ投与群は、ＳＨＲの体重に影響を与えなかった（ｐ＞０．０５）。しかし、ネピカスタット３０及び１００ｍｇ／ｋｇ投与群においては、体重が大きく増加した（ｐ＜０．０５）。
【０４３６】
比較として、エナラプリル１０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ラットの体重を有意に減少するか、影響はなかった（ｐ＜０．０５）。エナラプリル１ｍｇ／ｋｇ投与群では、わずかに体重を減少したが、エナラプリル（１ｍｇ／ｋｇ）及びネピカスタット（３０及び６０ｍｇ／ｋｇ）の同時投与群では、ラットの体重はわずかに増加した。
【０４３７】
担体、エナラプリル、及びネピカスタット３及び１０ｍｇ／ｋｇ処置群のラットの投与前の体重は、それぞれ３８７±１１、４１５±１、２、４０７±４、及び４１５±１２ｇであった。
【０４３８】
担体、エナラプリル、及びネピカスタット３０及び１００ｍｇ／ｋｇ処置群のラットの投与前の体重は、それぞれ３９９±１０、３８９±６、３８９±９、及び４０１±１０ｇであった。
【０４３９】
担体、エナラプリル、及びエナラプリルを含みまは含まないネピカスタット３０ｍｇ／ｋｇ処置群のラットの投与前の体重は、それぞれ３６５±９、３７１±８、３６１±７、及び３６９±７ｇであった。
【０４４０】
エナラプリル単独及びネピカスタット１５、３０、及び６０ｍｇ／ｋｇとの同時投与を行ったラットの投与前の体重は、それぞれ３５７±６、３６３±６、３４７±８、及び３４６±８ｇであった。
【０４４１】
３０日間の処置を４シリーズ行い観察したところ４匹が死亡した。死亡の原因は特定されていないが、ネピカスタット処置に関連するものではないように見えた。
【０４４２】
３０日間の慢性のネピカスタットの経口投与による血圧、心拍、運動行動及び左心室重量への影響を、４シリーズで行い、血圧無線遠隔変換器を装着した自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）で評価した。ネピカスタット３及び１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６）投与群では血圧に影響はなかった。ネピカスタット３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６）投与群では、降圧効果のピークは−２０ｍｍＨｇで、第３日に生じた（ｐ＜０．０１）。降圧効果は、緩やかであったが、試験中を通じて検出された。ネピカスタット１００ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）投与群では、より大きな降圧効果を示した。効果は緩やかで、第３日に−４２ｍｍＨｇでピークが生じた（ｐ＜０．０１）。降圧効果は、残りの試験期間中も比較的生じた。比較のため、アンジオテンシン変換酵素阻害剤エナラプリル（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝６）投与したところ、−２０ないし−３０ｍｍＨｇの降圧効果が試験期間中を通して見られた。エナラプリル（１ｍｇ／ｋｇ）の単独投与では、有意な降圧効果を示さなかったが、ネピカスタット（３０ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝６）との同時投与では、大きく長期間の降圧効果が見られた（ｐ＜０．０１）。相乗効果を３０日間見られた。エナラプリル（１ｍｇ／ｋｇ）によるネピカスタットの相乗的な降圧効果は、１５、３０、及び６０ｍｇ／ｋｇで見られたが、これらの効果は用量依存的ではなかった。
【０４４３】
ネピカスタット３−１０ｍｇ／ｋｇ又はエナラプリル１ｍｇ／ｋｇ投与群においては、有意な心拍への効果は見られなかった。しかし、ネピカスタット３０又は１００ｍｇ／ｋｇ投与群は、ラットの起床時間にわずかに徐脈が見られた。対照的に、エナラプリル１０ｍｇ／ｋｇ投与においては一過性の頻脈が見られた。ネピカスタット（１５、３０、及び６０ｍｇ／ｋｇ）及びエナラプリル（１ｍｇ／ｋｇ）の同時投与では、エナラプリル（１ｍｇ／ｋｇ）単独投与の場合よりも心拍が遅くなった。いずれの処置群においても運動行動への影響は見られなかった。
【０４４４】
ネピカスタット３０（ｎ＝６）及び１００（ｎ＝５）ｍｇ／ｋｇ処置群においては、ＳＨＲの左心室肥大化に関し、有意な効果は見られなかった。エナラプリル（１ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝８）又はネピカスタット（３０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝７）単独でも、肥大化を防がなかったが、両化合物の同時投与では（ｎ＝８）、有意にＳＨＲの左心室重量を減少させた。しかし、同時投与の左心室重量への効果はネピカスタット（１５、３０及び６０ｍｇ／ｋｇ）の用量依存的ではなく、統計的にはエナラプリル（１ｍｇ／ｋｇ）単独と差がなかった。
【０４４５】
４シリーズの試験において、４匹が３０日間の投与経過において死亡した。３匹はネピカスタット投与群で、１匹は担体投与群においてであった。死亡の原因は特定されていないが、ネピカスタット処置に関連するものではないように見えた。
【０４４６】
ネピカスタット３０及び１００ｍｇ／ｋｇ投与において、ＳＨＲ３０日間の投与において、反射的な頻脈を生ずることなくＳＨＲの血圧を有意に低下させた。降圧効果を生じない用量のエナラプリル（１ｍｇ／ｋｇ）とネピカスタット（３０ｍｇ／ｋｇ）の同時投与では、ＳＨＲにおいて、抗高血圧及び心室肥大を防止した。しかし、これらの効果は、ネピカスタット（１５、３０及び６０ｍｇ／ｋｇ）に用量依存的ではなかった。
【実施例３１】
【０４４７】
試験は、麻酔した、装置を搭載したイヌにおいて、自律神経作用薬の応答に対するネピカスタットの効果を評価するために行われた。
【０４４８】
ビーグルは、朝晩に食餌を与え、０（担体）又はネピカスタット６０ｍｇ／ｋｇを、十二指腸カニュレを通じて単回の十二指腸内投与をした。担体−コントロール投与群は雄１匹及び雌１匹、及びネピカスタット−処置群は雄２匹及び雌２匹ずつからなる。それぞれの動物は、イソフルレンガスで麻酔下、外科的手術により装置を装着した。試験製剤を投与する前、自律神経作用薬である、ノルエピネフリン（３μｇ／ｋｇ）、イソプロテレノール（０．３μｇ／ｋｇ）、及びアセチルコリン（１０μｇ／ｋｇ）を静脈内投与し、平均血圧を測定した。各動物に試験製剤を単回ボーラス投与し、自律神経作用薬による血圧変化を投与後約１、２、及び３時間後に測定した。実験終了後、それぞれのイヌは安楽死させ、試験から除いた。
【０４４９】
イヌは、試験化合物の血流力学係数を求める場合によく使われるので、用いた。ビーグル犬は、マーシャルファーム社（Ｎｏｒｔｈ Ｒｏｓｅ、ＮＹ）から購入した。それぞれのイヌは、供給業者の施した耳の入れ墨によって各個体を特定した。動物は実験室の条件下に少なくとも投与の少なくとも３週間、慣らせた。順応期間中、各動物についての一般的な条件を検討し、健康的であると考えられる条件を用いた。イヌはランダムに処置群に振り分けた；雄は偶数、雌は奇数の番号に振り分けた。
【０４５０】
各群に振り分けた後、イヌは個別にステンレススチールのケージに飼育し、試験番号、及び入れ墨で特定した。飼育の部屋の環境はコントロールできるようになっている。ケージは毎日洗浄し、動物は消毒したケージに１週間おきに移し替えられた。ピュリナ認定ケーナインチャウ(Purina Certified Canine Chow)（登録商標）を１日１回及び水は自由に与えた。
【０４５１】
処置の日、イヌは約１４ないし１６ヶ月である。雄は体重１０．３ないし１２．９ｋｇで、雌は８．５１ないし１．２ｋｇだった。
【０４５２】
投与においては、ネピカスタット粉末を担体と混合して６０−ｍｇ／ｍｌの懸濁液とした。使用の間６０−ｍｇ／ｍｌのネピカスタット製剤は、有効性を保っていた。各投与の日に、ノルエピネフリン（６０μｇ／ｍｌ）、イソプロテレノール（６μｇ／ｍｌ）、及びアセチルコリン（２００μｇ／ｍｌ）の水溶液を、滅菌水で調製した。
【０４５３】
雄１匹及び雌１匹の担体−コントロール投与群に１ｍｌ／ｋｇの担体、及び雄２匹及び雌２匹のネピカスタット−処置群に１ｍｌ／ｋｇの６０ｍｇ／ｍｌのネピカスタット溶液を投与した。総投与量は、各動物とも６０ｍｇ／ｋｇである。
【０４５４】
投与量は、ネピカスタットの２つの試験に基づいて選択した。イヌにおける急性毒性研究において、４００ｍｇ／ｋｇの経口投与により一過性の臨床兆候が現れた。１ヶ月の研究では、１日１回、５、２０、又は８０ｍｇ／ｋｇの経口投与を行った。８０ｍｇ／ｋｇ／日では、毒性の臨床兆候が現れた。
【０４５５】
担体又はネピカスタット製剤の単回の十二指腸内投与は、十二指腸カニュレを通して、直接十二指腸に投与した。十二指腸ルートを選択したのは、ネピカスタットの投与経路として経口ルートが提案されている経路だからである。投与容積は、投与前に記録した個々の体重に基づいて計算した（本明細書においてデータは表にしていない）。それぞれの試験の後、イヌを測定し、過量のペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ、静注）で安楽死させ、試験から除いた。
【０４５６】
プロトコールに記載された手順に従い、イヌに外科的に装置を装着した。イヌは外科的手術の前には、終夜、絶食させた。試験を行う各動物は、まず、ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）及びジアゼパム（０．５ｍｇ／ｋｇ）の混合物を静注で注入して麻酔した。各動物は試験中、体温を保つために温水が循環しているパッドの敷いてある手術用テーブルに乗せ、機械的に換気した。麻酔用の手術台をイソフルランガスで充満させた（酸素中１．５％ないし２％の１回換気量、流量約１．５Ｌ／分）。直腸温度は、血中のガス濃度を測定するためだけにモニターし、データは本明細書には記載していない。外部針電極を皮下に埋込み、麻酔を標準肢導出ＩＩ心電図（ＥＣＧ）でモニターした。
【０４５７】
左大腿静脈にカニュレを通し、自律神経作用薬の投与のためポリエチレンチューブの先を大静脈に通した。左大動脈にポリエチレンチューブのカニュレを５０Ｕ／ｍｌのヘパリン−生理食塩水溶液で満たしたポリエチレンチューブのカニュレを通した。動脈カニュレの先は胸大動脈に通し、外部圧力トランスデューサーに接続し、最高血圧及び最低血圧を記録した。動脈血サンプルは、血中ｐＨ、ＰＣＯ２、及びＰＯ２の分析のために動脈カニュレから採取した。
【０４５８】
正中線に沿った開腹手術を行い、幽門括約筋の尾方にある十二指腸を摘出した。十二指腸に針を挿入し、生理食塩水を満たしたカニュレの先は、試験製剤の投与のために針を通して細胞内腔まで達した。針は切開部位から抜き取り、カニュレはそこに固定し、カニュレの栓は腹部から外に出し、及び切開した腹部の皮膚を再び閉じた。
【０４５９】
外科的な測定の際は、必要ならば排気設備をつけ、動脈血ｐＨ、ＰＣＯ２濃度がほぼ通常値になるようにした(ｐＨ＝７．４３ないし７．５０及びＰＣＯ２＝２２ないし２７ｍｍＨｇ)。
【０４６０】
自律神経作用薬である、ノルエピネフリン（３μｇ／ｋｇ）、イソプロテレノール（０．３μｇ／ｋｇ）、及びアセチルコリン（１０μｇ／ｋｇ）を静脈内にボーラス投与（約１５秒）し、大腿静脈カニュレを用いて、各投与間は約１０分をかけて行った。それぞれの薬剤の投与後、カニュレは３ｍＬの水で洗浄した。薬剤の投与は、最初のアセチルコリン投与の約２０分後に行った。
【０４６１】
２回目のアセチルコリン投与の約３０分後、担体又はネピカスタットを１ｍｌ／ｋｇで、各動物に投与した。十二指腸に、十二指腸カニュレを通じてボーラス投与した。投与直後に十二指腸カニュレは担体溶液３ｍＬで洗浄した。投与約５０、１１０、及び１７０分後、１０分間隔で自律神経作用薬を繰り返し投与した。
【０４６２】
大動脈血圧、心拍、及びＥＣＧは、継続的に直接ポリグラフレコーダに記録した。血中ｐＨ、ＰＣＯ２、及びＰＯ２の値は、血液サンプルを採取したおよその時間で、血中ガス分析器から手動でポリグラフチャートに記録した。心拍、ＥＣＧ、及び血中ガス係数は、麻酔のレベル及び動物の調製の安定性を測定することのみに用いた；これらのデータは、本明細書には掲載していない。
【０４６３】
最高血圧、最低血圧、及び平均大動脈血圧は、投与前（ベースライン）及びそれぞれ薬剤のピーク反応（ベースラインからの最大変化）の時点で測定した。最高血圧、最低血圧、及び平均大動脈血圧、及び血中ｐＨ、ＰＣＯ２、及びＰＯ２は、試験製剤投与の約５０、１１０、及び１７０分後に測定した。
【０４６４】
ノルエピネフリンに対する反応は、それぞれのノルエピネフリン投与において、平均大動脈血圧、及びピーク血圧の時点での増加によって特徴づけられる。イソプロテレノール及びアセチルコリンに対する反応は、それぞれのイソプロテレノール及びアセチルコリン投与において、平均大動脈血圧、及びピーク血圧の時点での増加によって特徴づけられる。
【０４６５】
試験の最後に、それぞれのイヌは過量のペントバルビタールナトリウム（約３００ｍｇ／ｋｇ、静注）で安楽死させ、試験から除いた。
【０４６６】
本件処置に関連する投与前後におけるノルエピネフリンの応答の違いはなかった。イヌにおける担体コントロール群では、投与後のノルエピネフリン応答は、投与前よりも小さいものだった；これは偶然と考えられる。イソプロテレノールの投与前後における応答の違いはなかった。本件処置に関し、アセチルコリンの投与前後の応答の違いはなかった。
【０４６７】
外科的に装置を装着したビーグル犬の十二指腸に６０ｍｇ／ｋｇのネピカスタットを投与した。自律神経作用薬（ノルエピネフリン、イソプロテレノール、及びアセチルコリン）の静脈内投与に対する血圧の反応を投与前及び投与の約１、２、及び３時間後に測定した。処置に関する自律神経作用薬の応答の違いは見られなかった。
【実施例３２】
【０４６８】
ＤＢＨ阻害剤（ＤＢＨＩ）であるネピカスタット急性腹腔内投与によるマウスの自発運動への効果を調べた。このクラスの化合物は自発運動に影響があるとされている。
【０４６９】
成熟雄ＣＤ−１（ＩＣＲ）マウス（試験日の体重３０−４０ｇ）を、８匹を１群として、午前９時から午後９時までの通常の明／暗サイクルで飼育した。食餌及び水は自由に摂取させた。いずれの動物も投薬を受けたことがない。いずれの動物も１回しか使われない。
【０４７０】
自発運動を、自動化された１４ステーション活性モニタリングシステムでモニターした（サンディエゴ社）。各ステーションは、壁に等間隔で設置された３つの光線放出器及び３つの光線検出器を含む透明なパースペックスケージからなる（２５ｃｍ×４５ｃｍ×２０ｃｍ；ｗ×１×ｈ）。
【０４７１】
マウスは少なくとも１時間前に試験室に入れた。マウスを個別にいずれかのケージに入れ、３０分間探索させた。この馴化期間の後、マウスの腹腔内にネピカスタット（１０、３０及び１００ｍｇ／ｋｇ）、ＳＫＦ−１０２６９８（３０及び１００ｍｇ／ｋｇ）、コカイン（３０ｍｇ／ｋｇ）又は担体を投与し、即時に同じケージに戻した。６０分の前処理時間の後、運動行動を１８０分観察した。各動物について３０分ごとに活動数及び移動数（２回連続の光線の遮りと定義される）を記録した。
【０４７２】
処置、時間間隔、及び時間に対する処置の効果の相互作用の、全体としての効果を評価するために、総合順位データ（ノンパラメトリック技術）を用いて、反復測定二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により行った。一元配置ＡＮＯＶＡは、あるならば、いずれの時間間隔において処置の効果があるかを調べるために、それぞれの時間間隔において行った。ダネットの手法及びフィッシャーの最小有意差法を用いて、複数比較の問題を修正して対比較を各時間間隔について行った。
【０４７３】
ネピカスタットの投与量は３−１００ｍｇ／ｋｇであり、これを水に溶解させ、超音波をかけた。ＳＫＦ−１０２６９８の投与量は、３０−１００ｍｇ／ｋｇとした。コカイン塩酸塩は、３０ｍｇ／ｋｇとした。化合物の投与体積は、１ｍｌ／１００ｇとなるようにした。報告した全ての投与は遊離塩基の形態で存在し、コカインのみ塩を用いた。
【０４７４】
全体評価の分析モデルでは、処置及び時間において有意な効果が見られたが（ｐ＜０．０１）、時間に対する処置の効果の相互作用に関しては、有意な効果は見られなかった。分析の各時点は、時間間隔１−４の総合的な効果であるが（例えば、最初の１２０分は、全てｐ＜０．０１だった）、全体として有意な処置の効果は、時間間隔５及び６においては見られなかった（例えば、最後の６０分）。
【０４７５】
活動数及び移動数の両方についてコカインを担体投与群と比較した場合、処置及び時間において、いずれも有意な効果があったのに対し（両方ともｐ＜０．０１）、時間に対する処置の効果の相互作用に関しては、有意な効果は見られなかった。各時間間隔においてコカイン投与群は、総活動度及び移動度において、時間間隔１−４においては、有意差を示したが、５及び６群においては示さなかった（全てｐ＜０．０５）。
【０４７６】
対照的に、担体コントロール投与群と比較して、ネピカスタット−処置群又はＳＫＦ−１０２６９８−処置群において、いずれの時間間隔においても、総活動数又は移動数に有意差はなかった。
【０４７７】
コカインは、投与量３０ｍｇ／ｋｇにおいて、運動促進剤としての効果を示した。対照的に、ネピカスタット３、１０、３０又は１００ｍｇ／ｋｇの急性投与では、いずれの時間間隔においても、担体コントロール投与群と比較して、総活動数又は移動数に有意差はなかった。同様に、ＳＫＦ−１０２６９８３０の３０及び１００ｍｇ／ｋｇの投与では、いずれの時間間隔においても、担体コントロール投与群と比較して、総活動数又は移動数に有意差はなかった。これらのデータから、ＤＢＨＩは、マウスの運動行動に影響を与えないことが示唆される。
【実施例３３】
【０４７８】
ネピカスタット及びドパミン−β−ヒドロキシラーゼ阻害剤の急性投与は、自然発症高血圧ラットの左心室において、腸間膜動脈における酵素を阻害することが示された。７日及び２５日間におけるネピカスタット１ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇを経口投与した場合、ＳＨＲの大脳皮質及び腸間膜動脈におけるノルエピネフリン及びドパミンレベルの変化を調べた。
【０４７９】
ネピカスタット１及び１０ｍｇ／ｋｇを遊離塩基の形態で調製した。薬物は担体（ｄＨ２Ｏ）に溶解し、１０．０ｍｌ／ｋｇとなるように調製した。
【０４８０】
試験の開始時に１６−１７週齢である自然発症高血圧雄ラット（ＳＨＲ）を用いた。動物は、食餌及び水を自由に摂取できるようにした。動物はランダムに以下のいずれかの処置群：ネピカスタットの経口投与１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、又は脱イオン水で調製した担体、をそれぞれに１０ｍｌ／ｋｇとなるように投与する群に振り分けた。ラットは、７又は２５日間、担体、１ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇネピカスタット（ｎ＝８）を、第２５日だけｎ＝９で経口投与した。第７日には、化合物を投与した４時間後、動物はハロタン麻酔して断頭し、皮質及び腸間膜動脈は摘出し、計量し、及び２４匹のラットで分析した（ｎ＝８／処置群）。残りの３１匹のラットは、以下の１８日間、３つの処置のうちのどれかについて経口投与を受けた。最後の処置から４時間後、この投与群から腸間膜動脈及び皮質を摘出し、計量し、カテコールアミンレベルの分析に用いた。
【０４８１】
第２５日に安楽死させた動物は、血圧を測るためにも用いられた。最後の血圧は、第２２日に測定した。
【０４８２】
統計的には、３つの処置を、各時期において（第７又は第２５日間）、３つの分析をノンパラメトリック一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により行った。対比較分析をコントロール群と比較して、実験あたりの同過誤率を制御するためにサンプルサイズの違いを適合させて、フィッシャーの最小有意差法を用いて行った。それぞれの変数は、別々に分析した。図６−１１において、＊はｐ＜０．０５、及び、＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【０４８３】
７日間の処置した場合、１０ｍｇ／ｋｇ投与群は、担体投与群と比べて大脳皮質におけるノルエピネフリンレベルは、有意に低く（ｐ＜０．１）、ドパミン／ノルエピネフリン比（ｐ＜０．０５）は有意に高かった。７日間の処置の場合、担体と比較しても、いずれの二つの処置群（１又は１０ｍｇ／ｋｇネピカスタット）においても、ドパミンレベルに有意な差はなく（ｐ＞０．０５）、又は、１ｍｇ／ｋｇネピカスタット投与群においてもノルエピネフリンレベル又はドパミン／ノルエピネフリン比に有意差はなかった（図６−８）。１０ｍｇ／ｋｇネピカスタット投与群において、第７日におけるドパミン／ノルエピネフリン比は、わずかに有意差があった（ｐ＜０．０５）。
【０４８４】
２５日間の１ｍｇ／ｋｇネピカスタット投与群においては、担体投与群と比べて皮質におけるドパミンレベルが有意に高かった（ｐ＜０．０５）。この投与群においては、担体投与群と比べて皮質中のドパミン／ノルエピネフリン比も有意に高かった（ｐ＜０．０１）。１０ｍｇ／ｋｇネピカスタット投与群においてもこの比は、担体に比べて有意に大きかった（ｐ＜０．０５）。いずれの投与群においても、コントロールと比較して、ノルエピネフリンレベルに有意差はなく（ｐ＞０．０５）、１０ｍｇ／ｋｇ投与群におけるドパミンレベルにも有意差はなかった（図６−８）。
【０４８５】
腸間膜動脈において、第７日（ｐ＜０．０５）及び２５日（ｐ＜０．０１）の投与において、１０ｍｇ／ｋｇ投与群は、担体投与群に比べて、ドパミン及びドパミン／ノルエピネフリン比が有意に高かった。担体投与群は、ノルエピネフリンレベルに有意な差はなかった。有意に（ｐ＜０．０５）コントロールネピカスタット１ｍｇ／ｋｇ投与群（図９−１１）と比べても、有意に差はなかった。
【０４８６】
ネピカスタットは、７及び２５日に投与した場合、ドパミン−β−ヒドロキシラーゼを有意に阻害した。自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）皮質及び腸間膜用いられた。１０ｍｇ／ｋｇでは、１ｍｇ／ｋｇのネピカスタット投与群に比べ、より大きな阻害が見られたので、測定した効果は用量依存的であったといえる。
【０４８７】
当該関連技術分野の通常の知識を有するものには明白であるが、ここに記載した、方法や適用における他の適切な変更及び適用は適切であり、本発明の範囲から離れることなく又はあらゆる態様に用いることができる。発明は、特定の態様に関連して記載されているが、本発明を限定するために記載したのではなく、反対に、本発明の範囲及び発明の変更及び等価体が、以下の発明の範囲で定義される及び発明の範囲及び精神そのような代替、変更及び等価体もカバーするものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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