(57)【要約】【課題】新規な特徴を有するラムナンの提供。【解決手段】構成糖としてラムノース、ガラクトース、グルコース、キシロース、及びウロン酸を含む、直鎖型ラムナン。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成糖としてラムノース、ガラクトース、グルコース、キシロース、及びウロン酸を含む、直鎖型ラムナン。
【請求項２】
ウロン酸としてガラクツロン酸を含む、請求項１に記載のラムナン。
【請求項３】
硫酸化されていない、請求項１又は２に記載のラムナン。
【請求項４】
糖組成におけるラムノースの割合が４０〜６０モル％であり、ガラクトースの割合が１０〜２５モル％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のラムナン。
【請求項５】
糖組成におけるガラクツロン酸の割合が５〜１５モル％である、請求項２に記載のラムナン。
【請求項６】
受託番号FERM P-22318を有するパラクロレラ・エスピー（Parachlorella sp.）BX1.5株により細胞外へと産生される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のラムナン。
【請求項７】
２．０〜２．２×１０６ダルトンの重量平均分子量を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のラムナン。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラムナンを含む、食品添加剤。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラムナンを含む、化粧品添加剤。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラムナンを含む、医薬品添加剤。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラムナンを含む、飼料添加剤。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラムナンを含む、環境ストレス耐性増強剤。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラムナン、又は請求項８に記載の食品添加剤を含む、食品。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラムナン、又は請求項９に記載の化粧品添加剤を含む、化粧品。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラムナン、又は請求項１０に記載の医薬品添加剤を含む、医薬品。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラムナン、又は請求項１１に記載の飼料添加剤を含む、飼料。
【請求項１７】
受託番号FERM P-22318を有するパラクロレラ・エスピー（Parachlorella sp.）BX1.5株を培養し、細胞外多糖を回収することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のラムナンの製造方法。
【請求項１８】
前記BX1.5株を、窒素源欠乏培地又は人工海水で培養する、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緑藻由来多糖及びその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑藻や藍藻などの微細藻類は、優れた炭酸固定能を持ち、光合成能は高等植物のそれと比較して数十倍と言われている。微細藻類は従来より食品としても利用されており、その代表例としてクロレラが挙げられる。
【０００３】
クロレラは、栄養素として蛋白質45％、脂質20％、糖質20％、灰分10％を含み、その他微量成分としてビタミン類やミネラル類を含む。蛋白質含量が高いため、クロレラは食料資源の一つとして研究が行われている。最近の研究ではクロレラに抗ウイルス感染、抗がん（転移）作用、免疫賦活作用、糖尿病予防作用などの健康機能が発見されている。
【０００４】
一方、地球環境に配慮した物質生産の手法として、微細藻類によるモノつくり「バイオリファイナリー」が国内外で活発に行われている。微細藻類由来の有用物質は、上記の食品栄養成分に加え、燃料油、機能性多糖、光合成色素など多岐にわたる。
【０００５】
微細藻類由来の多糖類は、主に細胞外多糖（extracellular polysaccharides; EPS）として知られ、近年、その構造や機能に関する報告が多くなされている。微細藻類のうちシアノバクテリア（藍藻）がEPSを産生することが報告されている。スイゼンジノリ（Aphanothece sacrum）が産生するEPSは、アラビノース、フコース、ラムノース、キシロース、マンノース、ガラクトース、ガラクツロン酸、グルクロン酸、グルコース、及びガラクトサミンを構成糖とする、分岐構造を有する分子量200万ダルトン以上の硫酸化多糖である。特許文献１は、この多糖に脂肪酸や有機酸を導入した配糖体にすることにより、食品の増粘剤や抗ウイルス剤として用いることを開示している。スピルリナ属Spirulina （Arthrospira）sp.が産生するEPSは、ラムノース、リボース、マンノース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、グルコース、グルクロン酸、及びガラクツロン酸を構成糖とする分岐構造を有する分子量26万ダルトンの酸性多糖である。特許文献２は、スピルリナ属Spirulina（Arthrospira）sp.が産生するEPSが、腫瘍転移抑制作用を有すると報告している。
【０００６】
緑藻由来のEPSについても報告がなされている。セネデスムス属Scenedesmus sp.が産生するEPSは、ガラクトース、グルコース、マンノース、フコース、グルコサミン、及びキシロースを構成糖とする分岐構造を有する分子量4万ダルトンの多糖であり、蛋白質と結合した糖蛋白質である。この糖蛋白質は抗腫瘍作用を示すことが報告されている（特許文献３）。また、アオサノリ（Monostroma nitidum）が産生するEPSは、構成糖としてラムノース79％、ガラクトース5％、グルコース10％、及びキシロース5％を含み、ウロン酸を8％含む分岐構造を有する分子量87万ダルトンの多糖である。このEPSは硫酸エステル含量が28％と高いことを特徴とする（非特許文献１〜３）。
【０００７】
パラクロレラ・ケスレリ（Parachlorella kessleri）が産生するEPSは、ガラクトース、マンノース、アラビノース、ラムノース、及びキシロースを構成糖とする分岐構造を有する分子量5〜8万ダルトンの多糖である（特許文献４）。このEPSは、ガラクトース含量が全糖含量の50〜79％と極めて高い。
【０００８】
一方、非光合成微生物であるアルカリゲネス属Alcaligenes sp.が産生するEPSであるカードランも知られており、これは食品の食感や食品加工時の加工適性を向上する増粘剤やゲル化剤として広く利用されている。カードランは、一般的に、アルカリゲネス属菌の培養液を水などで希釈し、加熱殺菌した後、多糖をイソプロパノールなどの親水性極性溶媒で沈澱せしめ、沈澱した多糖を遠心分離機又は脱水機で回収し、乾燥及び粉砕して製造される。カードランの構成糖はグルコースのみであり、直鎖構造を有している（特許文献５）。
【０００９】
このように、藍藻や緑藻由来の多糖類の多くは、主鎖と側鎖から構成される分岐構造を有している。食品の増粘安定剤やゲル化剤、化粧品の保湿剤や乳化分散剤として用いられる多糖類は、植物の種子、果実、樹液、又は海藻などから分離精製されており、代表的なものとしては、グアーガム、ローカストビーンガム、ペクチン、アラビアガム、寒天、カラギーナンなどがあるが、これらも分岐構造を持つものがほとんどである。多糖類の増粘やゲル化などの機能には分岐度が大きく影響するが、直鎖構造を有する多糖類は限られている。
【００１０】
ところで本発明者らは、緑藻BX1.5株を用いた脂質の製造方法を開発している（特許文献６；未公開）。この方法では、緑藻細胞内に効率良く脂質を蓄積させることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００８／０６２５７４号
【特許文献２】特開平９−１７６０２２号公報
【特許文献３】特開平６−２５３８８１号公報
【特許文献４】特開２０１４−２５０３５号公報
【特許文献５】特開２００６−９６９８７号公報
【特許文献６】特願２０１７−１４０２８１号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Whe-Jun et al., Carbohydrate Polymers (2008) 74巻, 834-839頁
【非特許文献２】Lee et al., Carbohydrate Polymers (2010) 81巻, 572-577頁
【非特許文献３】Supatra et al., International Journal of Biological Macromolecules (2011) 48巻, 311-318頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、新規な特徴を有する多糖を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、緑藻BX1.5株の細胞外多糖（EPS）として高分子量の直鎖型ラムナンを得られること、それが食品添加剤等として有用な特性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は以下を包含する。
[1] 構成糖としてラムノース、ガラクトース、グルコース、キシロース、及びウロン酸を含む、直鎖型ラムナン。
[2] ウロン酸としてガラクツロン酸を含む、上記[1]に記載のラムナン。
[3] 硫酸化されていない、上記[1]又は[2]に記載のラムナン。
[4] 糖組成におけるラムノースの割合が４０〜６０モル％であり、ガラクトースの割合が１０〜２５モル％である、上記[1]〜[3]のいずれかに記載のラムナン。
[5] 糖組成におけるガラクツロン酸の割合が５〜１５モル％である、上記[2]に記載のラムナン。
[6] 受託番号FERM P-22318を有するパラクロレラ・エスピー（Parachlorella sp.）BX1.5株により細胞外へと産生される、上記[1]〜[5]のいずれかに記載のラムナン。
[7] ２．０〜２．２×１０６ダルトンの重量平均分子量を有する、上記[1]〜[6]のいずれかに記載のラムナン。
[8] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載のラムナンを含む、食品添加剤。
[9] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載のラムナンを含む、化粧品添加剤。
[10] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載のラムナンを含む、医薬品添加剤。
[11] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載のラムナンを含む、飼料添加剤。
[12] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載のラムナンを含む、環境ストレス耐性増強剤。
[13] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載のラムナン、又は上記[8]に記載の食品添加剤を含む、食品。
[14] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載のラムナン、又は上記[9]に記載の化粧品添加剤を含む、化粧品。
[15] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載のラムナン、又は上記[10]に記載の医薬品添加剤を含む、医薬品。
[16] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載のラムナン、又は上記[11]に記載の飼料添加剤を含む、飼料。
[17] 受託番号FERM P-22318を有するパラクロレラ・エスピー（Parachlorella sp.）BX1.5株を培養し、細胞外多糖を回収することを含む、上記[1]〜[7]のいずれかに記載のラムナンの製造方法。
[18] 前記BX1.5株を、窒素源欠乏培地又は人工海水で培養する、上記[17]に記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、食品添加剤等として有用な特性を有するラムナンを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、墨汁液を用いて可視化した、BX1.5株細胞並びにその細胞内に蓄積した油（中性脂肪）と細胞の外側の多糖（EPS）層を示す写真である。
【図２】図２は、異なる培地を用いたBX1.5株培養物に含まれるEPSのおよその割合（EPSの相対生産量）を示す、エタノール抽出後の試料の写真である。左から順に、BG11培地、BG11-N培地、液体人工海水をそれぞれ用いた培養物の結果である。
【図３】図３は、本発明の多糖のゲル濾過HPLCクロマトグラフィーの分析データを示す。図３中、「a」はRI検出器の測定データを示し、「b」はマルチアングルレーザーライトスキャッタリングのデータを示す。
【図４】図４は、本発明の多糖の赤外分光分析の結果を示すIRスペクトルを示す。Ａ：BX1.5EPS、Ｂ：プルラン、Ｃ：κ−カラギーナン。Ｃのκ−カラギーナンのIRスペクトル中、ピーク７がS=O、ピーク10がC-O-Sの存在を示す。
【図５】図５は、本発明の多糖の分子構造を示す、原子間力顕微鏡像の写真である。
【図６】図６は、多糖の粘度の温度依存性を示す。上から、BX1.5由来ラムナン、ι−カラギーナン、κ−カラギーナンの結果を示す。
【図７】図７は、環境ストレス負荷下での細胞生育能に及ぼすBX1.5由来ラムナンの効果を示す写真である。上段、中断、下段の写真はそれぞれ、培養５日目、８日目、１０日目の結果を示す。また最も左の列から順に、凍結乾燥、凍結融解、熱乾燥、UV処理した試料を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
１）本発明の多糖
本発明は、構成糖としてラムノース、ガラクトース、グルコース、キシロース、及びウロン酸を含む、直鎖型ラムナンに関する。
【００２０】
本発明において「ラムナン」とは、ラムノースを主成分とする糖鎖（糖残基の重合体）を有する多糖類をいう。「ラムノースを主成分とする糖鎖」とは、多糖類を構成する糖鎖であって、構成糖（単糖残基単位）のうちラムノースを最も多い割合で含む糖鎖を指す。本発明において「直鎖型ラムナン」とは、その糖鎖が直鎖状であって分岐（側鎖）を全く含まないか又は実質的に含まない、ラムナンを指す。「分岐を実質的に含まない」とは、多糖１分子当たり平均で１個未満の分岐しか有しないことを意味する。本発明において「多糖」及び「多糖類」とは、糖残基の平均重合度が10以上のものを指す。本発明における「多糖」、「多糖類」は、文脈上明らかに異なる場合を除き、特に記載しない限り、糖鎖のみからなるものだけでなく、非糖鎖物質（蛋白質、脂質、又は核酸など）との複合体化等により糖鎖に加えて非糖鎖物質（蛋白質、脂質、又は核酸など）を含むもの、糖鎖に他の修飾を有するもの、EPS（細胞外多糖又は菌体外多糖）なども包含する。すなわち本発明のラムナンは、糖の他に、例えば蛋白質等の非糖鎖物質を含んでもよい。ローリー法で測定した場合の本発明のラムナンの蛋白質含量は、乾燥重量で、総重量に対して好ましくは10重量％未満である。本発明のラムナンの糖鎖の平均重合度は、典型的には100以上、好ましくは100〜30,000、より好ましくは500〜20,000、さらに好ましくは1,000〜15,000、例えば5,000〜15,000であり得るが、これらの範囲に限定されるものではない。
【００２１】
本発明のラムナンは、構成糖としてラムノース、ガラクトース、グルコース、キシロース、及びウロン酸を含む糖鎖を有するヘテロ多糖である。ラムノース、ガラクトース、グルコース、及びキシロースは中性糖である。ウロン酸は酸性糖である。ウロン酸とは、単糖の酸化誘導体のうち主鎖末端のヒドロキシメチル基がカルボキシル基に酸化された糖であり、例えば、ガラクツロン酸、グルクロン酸などが挙げられる。本発明のラムナンは、構成糖であるウロン酸としてガラクツロン酸を含むことが好ましい。一実施形態では、本発明のラムナンは、ウロン酸としてガラクツロン酸のみを含んで他の種類のウロン酸（グルクロン酸など）を含まなくてもよい。
【００２２】
本発明のラムナンは、ラムノース、ガラクトース、グルコース、キシロース、及びウロン酸に加えて、かつ、他の構成糖をさらに含んでもよいが、含まなくてもよい。本発明のラムナンは、構成糖としてのラムノース、ガラクトース、グルコース、キシロース、及びウロン酸（例えば、ガラクツロン酸）の合計が90モル％以上、例えば95モル％以上、98モル％以上又は99モル％以上となる糖組成を有することが好ましい。本発明のラムナンは、他の構成糖を検出限界未満の量でしか含まないものであってもよい。他の構成糖としては、ラムノース、ガラクトース、グルコース、キシロース、及びウロン酸以外の糖であればよく、特に限定されないが、例えば、アラビノース、フコース、マンノース、ガラクトサミン、リボース、フルクトース、グルコサミンなどが挙げられる。一実施形態において、本発明のラムナンは、ウロン酸としてガラクツロン酸を含み、かつ他の種類のウロン酸（グルクロン酸など）を検出限界未満の量でしか含まないものであってもよく、その場合はガラクツロン酸以外のウロン酸は「他の構成糖」に含めることとする。
【００２３】
なお本発明における構成糖や糖組成に関して、ウロン酸、デオキシ糖、アミノ糖などの糖誘導体は、対応する単糖とは区別される。例えば、ガラクトースが酸化されたウロン酸であるガラクツロン酸は、ガラクトースとは別の種類の構成糖とする。なおウロン酸及びアミノ糖は酸性糖に属する。
【００２４】
本発明のラムナンの糖組成は、一般的な細胞外多糖と同様に、製造時の培養条件や精製条件等により多少変動し得るが、その糖組成におけるラムノースの割合は40〜70モル％（例えば、40〜60モル％、45〜70モル％、又は45〜55モル％）であることが好ましい。本発明のラムナンの糖組成において、ガラクトースの割合は5〜30モル％（例えば、5〜25モル％、10〜25モル％、又は13〜23モル％）であることが好ましい。本発明のラムナンの糖組成において、グルコースの割合は2〜30モル％（例えば、2〜25モル％、7〜30モル％、又は7〜20モル％）であることが好ましい。本発明のラムナンの糖組成において、キシロースの割合は2〜30モル％（例えば、2〜25モル％、7〜30モル％、又は7〜20モル％）であることが好ましい。本発明のラムナンの糖組成において、中性糖の割合は50〜95モル％（例えば、70〜95モル％、85〜95モル％、又は88〜92モル％）であることが好ましい。本発明のラムナンの糖組成において、ウロン酸（例えば、ガラクツロン酸）の割合は3〜20モル％（例えば、5〜20モル％、5〜15モル％、又は8〜12モル％）であることが好ましい。一実施形態では、本発明のラムナンは、i)ラムノースの割合が40〜70モル％、ガラクトースの割合が5〜30モル％である糖組成を有するか、又はii)ラムノースの割合が40〜60モル％、ガラクトースの割合が10〜25モル％である糖組成を有する。一実施形態では、本発明のラムナンは、i)ラムノースの割合が40〜70モル％、ガラクトースの割合が5〜30モル％、ウロン酸（例えば、ガラクツロン酸）の割合が3〜20モル％である糖組成を有するか、又はii)ラムノースの割合が40〜60モル％、ガラクトースの割合が10〜25モル％、ウロン酸（例えば、ガラクツロン酸）の割合が5〜15モル％である糖組成を有する。
【００２５】
本発明のラムナンの糖組成における構成比（モル比）の好ましい例として、ラムノース、ガラクトース：グルコース：キシロース：ウロン酸＝40〜60：10〜25：7〜20：7〜20：5〜15が挙げられる。本発明のラムナンの糖組成における構成比（モル比）の典型例は、ラムノース：ガラクトース：グルコース：キシロース：ウロン酸＝49：16：13：13：9であるが、これに限定されない。
【００２６】
本発明において「糖組成における糖"Ｘ"の割合が"Ｙ"モル％である」又は「糖"Ｘ"の割合が"Ｙ"モル％である糖組成を有する」という記載は、多糖の全構成単糖の合計分子数（残基数）に対する構成単糖"Ｘ"の分子数（残基数）の割合が"Ｙ"％となる糖組成を当該多糖が有していることを意味する。
【００２７】
なお本発明に関して用いる「重量％」は、質量％と同義であり、wt/wt％を意味する。
【００２８】
本発明のラムナンの全糖含量は、フェノール硫酸法により測定することができる。本発明のラムナンのウロン酸含量は、常法により、例えばBlumenkrantz法により測定することができる。
【００２９】
本発明のラムナンの中性糖の組成も、常法により決定することができる。具体的には、例えば、ラムナンを硫酸にて単糖まで加水分解し、炭酸バリウムにて中和した後、電気化学検出器を用いたイオンクロマトグラフィー法（HPAE-PAD法）を用いて測定すればよい。
HPAE-PAD法による分析条件の例は、後述の実施例に記載されているとおりである。
【００３０】
本発明のラムナンは、硫酸化されていないものであってよい。本発明において「硫酸化されていない」とは、糖鎖に硫酸基を有しないか又は実質的に有しないことを意味する。「糖鎖に硫酸基を実質的に有しない」とは、多糖１分子当たり平均で１個未満の硫酸基しか有しないことを意味する。
【００３１】
本発明のラムナンは、典型的には、受託番号FERM P-22318を有する緑藻パラクロレラ・エスピー（Parachlorella sp.）BX1.5株に由来する細胞外多糖である。好ましい実施形態では、本発明のラムナンは、BX1.5株により産生・分泌され、細胞外に蓄積される。本発明のラムナンは、BX1.5株により細胞外へと産生されるものであってよい。本発明のラムナンはまた、BX1.5株により細胞外へと産生された細胞外多糖を抽出・精製したものであってもよいし、あるいは／又はそれに加えて、その細胞外多糖から一部の画分の多糖分子を分離したものであってもよい。
【００３２】
本発明のラムナンは、以下に限定するものではないが、好ましくは1×105〜3×106ダルトン（Da）の重量平均分子量（モル質量）を有し、より好ましくは2×105〜3×106ダルトン（Da）、1.0×106〜2.5×106ダルトン（Da）、又は1.5×106〜2.5×106ダルトン（Da）、さらに好ましくは2.0×106〜2.2×106ダルトン（Da）、例えば、約2.11×106ダルトン（Da）の重量平均分子量（モル質量）を有する。BX1.5株により細胞外へと産生される細胞外多糖（BX1.5EPS）である本発明のラムナンは、典型的には、1.5×106〜2.5×106ダルトン（Da）、特に2.0×106〜2.2×106ダルトン（Da）、例えば、約2.11×106ダルトン（Da）の重量平均分子量（モル質量）を有する。なおBX1.5EPSの分子量分布は、以下に限定するものではないが、10万から300万が好ましく、20万から250万がより好ましい。なお本発明において「約」とは、±5％の範囲を指す。また本発明において重量平均分子量は、好ましくは絶対分子量である。
【００３３】
分子量（モル質量）の測定は、常法により行うことができるが、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて実施することができる。具体的には、例えば、HPLCカラム（TSK-gel G-6000PWXL：東ソー；φ7.8mm×300mm）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーを実施し、絶対分子量（MM）と粒子の回転分子半径（Rw）を、カラム通液後にトルエンでキャリブレーションしたマルチアングルレーザーライトスキャッタリング（MALLS; Wyatte社）により求め、溶離液：50mM 酢酸ナトリウム水溶液（pH 5.0）、流速：1.0mL/分の分析条件で、RI検出器及びMALLS検出器にて重量平均分子量を絶対分子量として測定することができる。
【００３４】
本発明のラムナンは、分岐のない直鎖構造を有する。原子間力顕微鏡で本発明のラムナンの分子構造を解析することができる。具体的には、例えば、ラムナンの0.1重量％水溶液を調製し、0.5μLをマイカ上に滴下して自然乾燥し、20N/mのカンチレバーを使用して原子間力顕微鏡（SII社：SPI3800N, SPA300HV）のDFMモードにて分子構造を観察することができる。原子間力顕微鏡で測定される本発明のラムナンの１分子の鎖長は、例えば、平均0.5μm〜1.2μmであり得るが、これに限定されるものではない。
【００３５】
２）本発明の多糖の製造方法
本発明のラムナンは、合成法により製造してもよいが、緑藻の培養を通じて好適に製造することができる。より具体的には、本発明のラムナンは、緑藻パラクロレラ・エスピー（Parachlorella sp.）BX1.5株の培養を通じて有利に製造することができる。
【００３６】
パラクロレラ・エスピー（Parachlorella sp.）BX1.5株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（NITE-IPOD）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に2016年12月13日（受託日）付けで寄託されており、その受託番号は、FERM P-22318である。本明細書において、パラクロレラ・エスピーBX1.5株は「BX1.5株」と略記することがある。
【００３７】
パラクロレラ・エスピーBX1.5株の菌学的性質は次のとおりである。
（a）培養的性質
BX1.5株は、静置培養又は培地を連続的に撹拌しながら行う培養により増殖可能である。培地を連続的に撹拌しながら行う培養は、空気若しくは炭酸ガス（例えば約0.04〜10％（v/v）二酸化炭素濃度）を培地に吹き込む（通気）か、又は約30〜100rpmの速度で振とうすることによって行うことができる。BX1.5株は、典型的には、BG11培地（例えばBG11液体培地）で培養することができる。
【００３８】
炭酸ガスを供給する場合は約0.04〜15％（v/v）の範囲内が望ましい。
【００３９】
約1％（v/v）接種による植継ぎを2〜3ヶ月毎に行うことが好ましい。典型的には、培養液は植継直後には薄い緑色を示し、1週間程度で緑色になる。静置培養の場合は、植継直前には細胞が沈殿する傾向がある。
【００４０】
BX1.5株を保存する場合は、典型的には、BG11液体培地で充分育った培養液約1mLをマイクロチューブに移し、-80℃で保存する。保護剤又は緩衝剤は必要としない。培養の再開は、保存後のマイクロチューブを氷上に置き、培養液を解凍させた後、培養液をBG11液体培地に直接接種し行うことができる。
【００４１】
（b）形態的性質
約3〜10μmの直径の球形の単細胞である（図１）。
【００４２】
（c）生理学的性質
（1）最適生育条件：温度25℃〜35℃、pH6〜10、光強度（光量子束密度）30〜200μmolフォトン m-2s-1、炭酸ガス濃度0.04〜5％（v/v） 
（2）生育の範囲：温度約5〜65℃、pH約2〜12、光強度（光量子束密度）1〜2,000μmolフォトン m-2s-1、炭酸ガス濃度約0.04〜15％（v/v）
（3）酸素に対する性質：好気性
【００４３】
（d）化学分類的性質
18SリボゾームDNA（18SリボゾームRNAコード配列）、ITS1、5.8SリボゾームDNA及びITS2に及ぶ領域における塩基配列相同性：
BX1.5株の上記領域の塩基配列は、パラクロレラ・ケスレリ（Parachlorella kessleri）の塩基配列（18SリボゾームDNA領域のGenBankデータベース登録番号FR865655）と約99.9％の相同性を有している。
【００４４】
（e）その他の特徴
BX1.5株は、脂質を生産し、細胞内に蓄積することができる。BX1.5株は、栄養源欠乏培地（窒素源欠乏培地又はリン源欠乏培地）で培養すると脂質生産が促進され、栄養源非欠乏培地での培養と比較して細胞内の脂質量が増加する（特許文献６）。
【００４５】
本発明では、BX1.5株を培養し、その細胞外多糖を回収することにより、本発明のラムナンを製造することができる。本発明は、BX1.5株を培養し、細胞外多糖を回収することを含む、本発明のラムナンの製造方法も提供する。
【００４６】
ラムナン製造時の培養は、培地を連続的に撹拌しながら行うことが好ましい。本明細書において、「培地を連続的に撹拌する」とは、撹拌翼などの撹拌機を用いて培地を連続的にかき混ぜることだけでなく、他の様々な方法によって培地を連続的に流動させることも指す。本明細書において、「培地を連続的に撹拌しながら行う」培養は、限定されないが、振とう培養（レシプロ式（往復運動による）又はロータリー式（旋回運動による））、撹拌機による撹拌培養、通気培養若しくは灌流培養又はこれらの組み合わせ、例えば、撹拌培養と通気培養を組み合わせた通気撹拌培養を含み得る。培地を連続的に撹拌しながら行う培養は、例えば、撹拌機構若しくは水流を起こす機構を備えた培養池（例えば、円型、四角型若しくはレースウェイ型）、あるいは円柱型、球型、袋（チューブ）型、若しくは薄層型などの支持体を備え、支持体の表面若しくは内部に培地を流し循環させる培養装置（例えば、特開2013-153744号公報を参照）で行ってもよい。あるいはラムナン製造時の培養は、BX1.5株と非光合成生物との混合培養として行ってもよい（例えば、国際公開第WO2016/140374号公報を参照）。振とう培養は、限定するものではないが、通常は10〜300 rpm程度、好ましくは10〜100 rpm程度、例えば、約40 rpmで行うことができる。
【００４７】
本明細書において、「通気培養」とは、二酸化炭素及び酸素を含む気体、例えば、空気、又は空気と二酸化炭素ガスの混合気体（二酸化炭素ガス濃度0.04〜15％(v/v)など）を培地に送り込み、気泡を発生させながら行う培養をいう。
【００４８】
ラムナン製造時の培養に用いる培地は、緑藻の培養に用いることができる任意の培地であってよい。培地は、通常、炭素源、窒素源、無機栄養素（例えば、リン、硫黄、カリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、ナトリウム）などの栄養源を含み得るが、窒素源（窒素の供給源）などの少なくとも一部の栄養源を欠乏した培地（栄養源欠乏培地；例えば、窒素源欠乏培地や、天然又は人工海水など）を用いることも好ましい。培地は、微量栄養素（例えば、ホウ素、マンガン、亜鉛、モリブデン、銅、コバルトなど）を含んでもよい。培地の例としては、限定されないが、BG11培地（例えば、BG11液体培地）、窒素源欠乏BG11培地、人工海水などが挙げられる。BG11培地の組成は次のとおりである：0.003mM Na2-Mg EDTA、0.029mM クエン酸、0.18mM K2HPO4、0.30mM MgSO4・7H2O、0.25mM CaCl2・2H2O、0.19mM Na2CO3（無水）、0.03mM クエン酸鉄アンモニウム、1ml/L 微量栄養素（微量栄養素の組成：2.86g/L ホウ酸、1.81g/L MnCl2・4H2O、0.22g/L ZnSO4・7H2O、0.39g/L Na2MoO4・2H2O、0.08g/L CuSO4・5H2O、0.049g/L Co（NO3）2・6H2O）、1.5g/L NaNO3。BG11液体培地は、クエン酸鉄アンモニウム以外の上記成分を水に溶解し、121℃で20分間オートクレーブ滅菌し、別途フィルター滅菌したクエン酸鉄アンモニウムを添加することによって調製できる。BG11寒天培地は、高純度寒天粉末（TaKaRa_LO3など）を0.6％（w/v）添加して作製できる。本発明のラムナン製造方法で用いる培地は典型的には液体培地である。培地のpHは、例えば、2〜12、6〜11、又は7〜10であってよい。
【００４９】
本明細書において、窒素源欠乏培地は、窒素源を含まないか、又は通常の培地（例えば、BG11液体培地）中の窒素源に対して窒素源が乏しい（例えば、通常の培地中の窒素源に対して50％（w/w）以下、例えば、1〜20％（w/w）又は2〜10％（w/w）の窒素源を含む）培地である。欠乏させる窒素源としては、例えば、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸カルシウム、アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム等が挙げられる。例えば、窒素源欠乏培地は、上記のBG11液体培地において硝酸ナトリウム（NaNO3）を添加しない培地又は50％（w/w）以下の硝酸ナトリウムを添加した培地であってもよい。なおBX1.5株を窒素源欠乏培地で培養すると、脂質生産が促進され、対応する栄養源非欠乏培地での培養と比較して細胞内の脂質量が増加する（特許文献６）。
【００５０】
培地へのBX1.5株の接種量は適宜設定することができる。例えば、前培養（例えば14〜20日間通気撹拌培養）した培養物を、培地量に対して典型的には0.1〜30％（v/v）、例えば10〜20％（v/v）の量で、培地に接種することができるが、接種量はこの範囲に限定されない。前培養物は、市販のエバポレーター、遠心分離機又は凝集剤等を用いてBX1.5株の濃度を高めることによって濃縮し、濃縮物を培地に接種してもよい。
【００５１】
培養温度は、例えば0〜65℃、好ましくは5〜40℃、10〜40℃、20〜35℃又は25〜35℃であってもよい。温度は、例えば、恒温培養器（インキュベーター）内で培養を行う場合は恒温培養器内の温度、室内で培養を行う場合は室温を指し、屋外で培養を行う場合は培養槽付近の外気温を指す。
【００５２】
ラムナン製造時の培養における二酸化炭素濃度は、例えば、0.01％（v/v）〜15％（v/v）、好ましくは0.02〜4％（v/v）であってよい。ラムナン製造時の培養は炭酸ガス供給下で行うことが好ましく、1〜3％又は1.5〜2.5％（v/v）炭酸ガス供給下、例えば2％（v/v）炭酸ガス供給下で行うことができる。
【００５３】
培養は、人工光源による光照射下又は太陽光などの自然光下で行うことができる。人工光源としては、限定するものではないが、例えば、白熱電球、蛍光灯、LED、有機EL、半導体レーザー、高圧ナトリウムランプ、低圧ナトリウムランプ、メタルハライドランプ、キセノンランプ、水銀ランプなどが挙げられる。光の強度（光量子束密度）は、0〜3,000μmolフォトン m-2s-1であってよい。光照射下の光強度は5μmolフォトンm-2s-1以上であることが好ましく、例えば10〜2,000μmolフォトン m-2s-1、20〜1,000μmolフォトン m-2s-1又は30〜200μmolフォトン m-2s-1、例えば約100フォトン m-2s-1であってよい。光照射は、連続的であってもよいし、暗所期間を設けて（典型的には明暗サイクルを用いて）もよい。「暗所」とは、光の非照射状態をいう。太陽光を用いる場合、暗所期間は日没から日の出までの期間をいう。暗所は、光を完全に遮蔽した暗黒状態に限られず、漏れ光、作業を行うために必要な薄明かり、又は恒温培養器内の表示部の光などがあってもよい。暗所の光の強度は、例えば、0〜3μmolフォトン m-2s-1、好ましくは0〜1μmolフォトン m-2s-1であり得る。培養に用いる光は、特定波長又は波長域の光であってもよい。培養に用いる光は、白色光であってもよい。
【００５４】
培養期間は、1時間〜50日、好ましくは3〜40日、4〜30日、5〜20日、又は3〜15日、例えば約6日であってよい。
【００５５】
一実施形態では、ラムナン製造のための培養として、BX1.5株（受託番号FERM P-22318）を、2％（v/v）炭酸ガス供給下、窒素源欠乏BG11培地又は人工海水で培養してもよい。より具体的な実施形態では、BX1.5株をBG11液体培地で無菌的に前培養後、この前培養物を新しい培地、例えば、窒素源欠乏BG11培地（例えば、硝酸ナトリウム抜きのBG11培地）又は人工海水に、培養量総体積の７分の１容となる量で接種し、引き続き2％（v/v）炭酸ガス供給下のインキュベーター（CF-415、TOMY、Japan）を使用し、30℃、白色光光量レベル1（100μmolフォトン m-2s-1）、レシプロ振とう40 rpmの条件下で、6日間培養を行ってもよい。このような培養においては、多糖を効率良く、細胞外に産生させ、蓄積させることができる。
【００５６】
以上のようにしてBX1.5株を培養すると、細胞の外側に、細胞外多糖が分泌・蓄積され、典型的には細胞外多糖の層が形成される。本発明の方法では、この細胞外多糖を回収することが好ましい。本発明では、この細胞外多糖を本発明のラムナンとして使用することができるし、あるいは、この細胞外多糖からさらなる処理を通じて本発明のラムナンを調製することもできる。
【００５７】
本発明の方法におけるラムナンの分離のためには、BX1.5株の培養物をプレート式又は蒸気吹きこみ式の殺菌装置等の装置にて加熱殺菌した後、著しい増粘やゲルを形成しない条件下で珪藻土、スクリーンフィルター、フィルタープレス、遠心分離などにより培養物からBX1.5株細胞を分離除去することが好ましい。BX1.5株細胞からのラムナンの分離は、細胞を超音波分散機、高速攪拌機、高圧ホモジナイザー、ビーズミルなどの破砕装置を用いて破壊した後、珪藻土、スクリーンフィルター、フィルタープレス、遠心分離などの装置で細胞成分を分離除去することにより好適に行うことができる。但し、BX1.5株が死滅する条件で加熱処理した場合などには、BX1.5株とラムナンを分離しなくてもよい。細胞から分離したラムナン含有液は培養液由来の窒素成分やミネラル等を含み得るため、必要に応じてイオン交換、活性炭、電気透析などを用いて除窒素と脱塩の工程を追加してもよい。本発明のラムナンは、液状のままであってもよいが、乾燥処理してもよい。本発明のラムナンは、種々の手法によって乾燥、及び必要に応じて粉末化することができる。具体的には、乾燥技術としては、熱風乾燥、ドラム乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥等を挙げることができる。また、親水性有機溶媒（好ましくはエタノールやイソプロパノールなど）によりラムナンを不溶化し、遠心分離やコンベア式脱水装置等で脱溶剤した後、乾燥し、粉末化することもできる。
【００５８】
得られるラムナンの色調を改善するために、培養後の培養液に対し、一般的に用いられている各種漂白剤、好ましくは次亜塩素酸ナトリウムや過酸化水素、さらし粉による漂白を行ってもよい。
【００５９】
本発明のラムナンは、酸、酵素、熱水等を用いた加水分解処理により部分分解してもよい。そのような加水分解処理により、平均重合度のより低いラムナンを製造することができる。
【００６０】
３）本発明の多糖の特性及び用途
本発明のラムナンは、独特の粘度特性を有する。多糖類の粘性は一般的に温度依存性を示すが、本発明のラムナンは広い温度帯、例えば10℃〜40℃の温度帯で安定した粘度を示す（粘度が変化しにくい）という有利な特徴を有する。好ましい実施形態では、本発明のラムナンは、より高濃度（例えば、5重量％以上）の水溶液においてゲルを形成せず、粘稠性に優れたゾルを形成する。
【００６１】
水溶液の粘度特性は、常法により調べることができるが、例えば、温度調整機能を有するコーンプレート型粘度測定器（ブルックフィールド社; LV-DV2T、コーンプレートCPA-52Z）を用いて測定することができる。例えば、本発明のラムナンを1重量％になるようにイオン交換水に懸濁し、70℃で20分加熱溶解したのち、0.5mLを測定試料として用いて絶対粘度を測定すればよい。
【００６２】
本発明のラムナンは、水易溶性の特性を有する。好ましい実施形態では、本発明のラムナンは、20％程度の高濃度まで溶解させることができる。本発明のラムナンはまた、保水性が高く、水に分散・溶解させることで固体的なゾル状からゲル状の性状を示す。
【００６３】
また本発明のラムナンは、高い乳化安定化作用を示す。好ましくは、本発明のラムナンは、油分などの他の成分と混合した場合、保存期間中のオイルオフや凝集・沈殿などを防止又は低減することができる。本発明のラムナンによるこのような安定化効果は、加熱処理しても得ることができる。
【００６４】
以上のように、本発明のラムナンは、増粘剤などの添加剤として優れた特性を有する。本発明のラムナンは、例えば、食品添加剤、化粧品添加剤、医薬品添加剤、飼料添加剤等として有用である。本発明は、本発明のラムナンを含む、食品添加剤、化粧品添加剤、医薬品添加剤、及び飼料添加剤を提供する。これらの添加剤は、増粘安定剤等であってもよいし、化粧品基材や医薬品基材などの基材であってもよい。これらの添加剤は本発明のラムナンを有効量で含む。本発明のラムナンを食品、化粧品、医薬品、飼料などの組成物において添加剤として配合すると、キサンタンガム等と比べて保水性、安定性等においてより優れた効果をもたらす。
【００６５】
本発明は、本発明のラムナン、又は、本発明のラムナンを含む食品添加剤、化粧品添加剤、医薬品添加剤、若しくは飼料添加物を含む、それぞれ食品、化粧品、医薬品、若しくは飼料などの組成物も提供する。
【００６６】
本発明のラムナンの、食品、化粧品、医薬品、若しくは飼料などの組成物への添加量は、対象となる組成物にもよるが、多糖類の一般的な添加量に従えばよく、例えば、組成物総重量に対して0.001〜10重量％、例えば0.05〜5重量％であるがこれらの範囲に限定されない。組成物へのラムナンの添加方法は、常法に従えばよく、特に限定されない。
【００６７】
本発明の食品の例として、例えば、アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス、シャーべット、及び氷菓等の冷菓類、牛乳、乳飲料、乳酸菌飲料、果汁入り清涼飲料、炭酸飲料、果汁飲料、菜汁飲料、茶飲料、スポーツ飲料、ビタミン補給飲料、栄養補給バランス飲料、ゼリー飲料及び粉末飲料等の飲料類、プリン、及び果汁入りプリン等のプリン類、ゼリー、ババロア、及びヨーグルト等のデザート類、チューインガム等のガム類、マーブルチョコレート等のチョコレート類、キャラメル、ヌガー、グミキャンディー、マシュマロ等を含むソフトキャンディーやタフィ等のキャラメル類、ソフトビスケット、ハードビスケット、ソフトクッキー等の焼き菓子類、乳化タイプドレッシング、セパレートドレッシング、及びノンオイルドレッシング等のドレッシング類、ケチャップ、たれ、及びソース等のソース類、ストロべリージャム、ブルーべリージャム、マーマレード、リンゴジャム、及びプレザーブ等のジャム類、シロップ漬のチェリー、アンズ、リンゴ、及びイチゴ等の加工用果実、ハム、及びソーセージ等の畜肉加工品、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、魚肉すり身、蒲鉾、竹輪、はんぺん、及び薩摩揚げ等の水産練り製品、うどん、冷麦、そうめん、そば、中華そば、スパゲッティ、マカロニ、ビーフン、及び春雨等の麺類、食パン、菓子パン、及び惣菜パン等のパン類、コーヒークリーム、生クリーム、カスタードクリーム、ホイップクリーム、及びサワークリーム等のクリーム類、コンソメスープ、ポタージュスープ、クリームスープ、中華スープ、味噌汁、シチュー、及びカレー等のスープ類などの加工食品を挙げることができる。また、これら一般食品に加えて、カルシウム・鉄・ビタミン強化食品、低アレルギー食品、及び濃厚流動食等の医療食品のトロミ調整剤も例示できる。食品はまた、特定保健用食品、機能性表示食品、栄養機能食品、サプリメントなどを含む機能性食品であってもよい。機能性食品はまた、コーデックス（FAO/WHO合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Health claim）が適用される健康食品などの健康食品全般を包含する。機能性食品は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤などの固形製剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤、又はジェル剤やペースト剤などであってもよいし、通常の飲食品の形状（例えば、飲料、菓子など）であってもよい。
【００６８】
化粧品は、乳液、化粧水、美容パック、化粧下地、日焼け止めなどの基礎化粧品、ファンデーション、チーク、マスカラ、口紅などのメイクアップ化粧品などであってよいが、これらに限定されない。
【００６９】
医薬品は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤などの固形製剤、ジェル剤、又は液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤等の任意の剤形のものであってよい。医薬品は経口製剤であっても非経口製剤であってもよい。
【００７０】
飼料は、固形、半固形、液状などの任意の形状であってよい。飼料は任意の非ヒト動物への給餌のためのものであってよい。
【００７１】
本発明の食品、化粧品、医薬品、及び飼料は、本発明のラムナンに加えて、食品、化粧品、医薬品、及び飼料においてそれぞれ許容される添加剤を含んでもよい。添加剤としては、例えば担体、結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、着色剤などが挙げられる。添加剤は、適宜又は組み合わせて選択することができる。
【００７２】
本発明の食品、化粧品、医薬品、及び飼料などの組成物に本発明のラムナンを添加することにより、増粘効果、乳化安定化効果（脂肪などの油性成分のクリーミングとエマルションの分離防止）、分散安定化効果（凝集した蛋白質やカカオパウダーなどの不溶性固形分の沈降の防止）、保水性の改良効果（経時的な離水抑制）、グアーガムなどのガラクトマンナン多糖類やグルコマンナン類との反応性の向上によるゲル化性の付与効果などが得られる。したがって本発明の食品、化粧品、医薬品、及び飼料は、油脂などの油性成分及び／又は水を含むことが好ましい。また例えば、食品の食感改良効果として、保水性の上昇に伴うしっとり感やジューシー感の向上なども得ることができる。
【００７３】
本発明のラムナンはまた、生細胞に対し、熱、乾燥、凍結、紫外線（UV）などの環境ストレスに対する耐性を増強することによる保護効果をもたらすこともできる。したがって本発明のラムナンは、環境ストレス耐性増強剤として有用である。本発明は、本発明のラムナンを含む環境ストレス耐性増強剤も提供する。本発明の環境ストレス耐性増強剤は、担体、結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、着色剤などの添加剤を含んでもよい。本発明の環境ストレス耐性増強剤は、添加剤として、例えば、培養系添加剤として細胞又は組織培養系に添加したり、化粧品添加剤として使用したりすることによって、細胞に環境ストレスへの保護をもたらすことができる。
【００７４】
本発明によれば、優れた粘性を持ちながら、分散性に優れた食品用の増粘安定剤や、保湿性と紫外線耐性に優れた化粧品などを提供することができる。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７６】
［実施例１］
緑藻パラクロレラ・エスピー（Parachlorella sp.）BX1.5株（受託番号FERM P-22318）を、BG11液体培地で無菌的に前培養し、その培養物を、窒素源欠乏BG11培地（BG11培地から硝酸ナトリウムを除いた培地; BG11-N培地）に総体積の７分の１容となる量で接種し、引き続き2％（v/v）炭酸ガス供給下のインキュベーター（CF-415、TOMY、Japan）中、30℃、白色光光量レベル1（100μmolフォトン m-2s-1）、レシプロ振とう40 rpmの条件下で、6日間培養を行った。
【００７７】
得られた培養物の一部を採取し、等量の墨汁液（書道液、ダイソー社製）を添加して混合した後、微分干渉顕微鏡（BX53、オリンパス社製）を用いて観察し、シャッタースピード484.1 msで撮影した。結果を図１に示す。
【００７８】
図１にも見られるように、細胞内には特願２０１７−１４０２８１で開示されているように、中性脂肪（主な脂質成分として、C18:2のリノール酸やC18:3のαリノレン酸を含むトリアシルグリセロール）の高蓄積が観察され、一方で細胞外（細胞の外側周辺）には、墨汁で染まらない、分厚い多糖（EPS）層が観察された。このことから、BX1.5株培養物においては、油脂と多糖の蓄積がそれぞれ異なる場所で同時並行的に生じることが明らかとなった。BX1.5株を用いれば、油脂と多糖の生産が拮抗せず、それぞれの生産を効率良く行えるという特長が示された。
【００７９】
上記で得られたBX1.5株培養物1kgを、90℃で30分間加熱した後、遠心分離機を用いて5,000G、20分間遠心分離した。沈殿した細胞を回収し、300gの水を加えて懸濁した後、ホモミキサー（TK-ホモミクサー; プライミクス）を用いて8,000rpmで30分間撹拌して細胞を破壊した。これを100rpmの低速で撹拌しながら、700gの99.5％エタノールを加え、多糖を不溶化した（エタノール抽出）。遠心分離機にて3,000Gで20分間遠心分離して不溶化した多糖（EPS; 本発明ではBX1.5EPSとも称する）を回収した。
【００８０】
［実施例２］
BX1.5株を、BG11培地で前培養した後、BG11培地、窒素源欠乏BG11培地（BG11-N培地）、又は人工海水粉末を蒸留水に対し3.6％（w/v）溶解させた液体人工海水に総体積の７分の１容となる量で接種し、引き続き2％炭酸ガス供給下のインキュベーター（CF-415、TOMY、Japan）中、30℃、白色光光量レベル1 （100μmolフォトン m-2s-1）、レシプロ振とう40 rpmの条件下で、6日間培養を行った。
【００８１】
それぞれの培養物を、90℃で30分間加熱した後、遠心分離機を用いて5,000G、20分間遠心分離した。沈殿した細胞を回収し、水を加えて懸濁した後、ホモミキサー（TK-ホモミクサー; プライミクス）を用いて8,000rpmで30分間撹拌して細胞を破壊した。これを100rpmの低速で撹拌しながら、99.5％エタノールを加え、多糖を不溶化した（エタノール抽出）。エタノール抽出後の試料2mLを2.5mL容シリンジに移した（図２）。以下の式に従って、多糖（EPS）の相対生産量を算出した。
多糖の相対生産量（％）＝白色層（多糖を含む）の体積／サンプルの体積ｘ100
【００８２】
BG11培地、BG11-N培地、及び液体人工海水を培養に用いた場合の多糖の相対生産量は、それぞれ、29％、62％、51％であった。
【００８３】
BG11培地を用いた場合と比較して、窒素源欠乏BG11培地（BG11-N培地）又は人工海水を培養に使用した場合の方が、効率良く多糖BX1.5EPSが生産されることが示された。多糖の製造において培地として人工海水などの海水も使用できると考えられる。
【００８４】
［実施例３］
実施例１で回収した多糖について、全糖含量をフェノール硫酸法で測定し、また蛋白質含量をローリー法で測定した。さらにガラクツロン酸含量をブルーメンクランツ（Blumenkrantz）法で測定した。中性糖の組成は、多糖を硫酸にて単糖まで加水分解し、炭酸バリウムにて中和した後、電気化学検出器を用いたイオンクロマトグラフィー法（HPAE-PAD法）を用いて測定した。
【００８５】
（HPAE-PAD法の分析条件）
・システム：ICS-3000（DIONEX社製）
・カラム：CarboPack PA1（DIONEX社製）
・溶媒：20mM 水酸化ナトリウム（0〜20分）、20mM 水酸化ナトリウム＋20mM 酢酸ナトリウム（20〜35分）
・流速：1.0 ml/分
・検出器：電気化学検出器（PAD）
・カラムオーブン：30℃
多糖の絶対分子量（MM）と分子回転半径（Rw）は、多糖試料をゲル濾過HPLCクロマトグラフィーに供し、カラム通液後にトルエンでキャリブレーションしたマルチアングルレーザーライトスキャッタリング（MALLS）により算出した。分析条件としては、溶離液：50mM 酢酸ナトリウム水溶液（pH 5.0）、流速：1.0mL/分、分析サンプル量: 1.0％水溶液 20μLを用い、カラム: TSK-gel G-6000PWXL（東ソー；φ7.8mm×300mm）、示差屈折率（RI）検出器（Shodex RI-101）、及びMALLS検出器（Wyatte社）を使用した。
【００８６】
多糖の成分分析値、絶対分子量、水溶液中（水中で分散している状態）の分子回転半径の測定値を表１及び表２に示す。表１に示す絶対分子量は重量平均分子量（Mw）である。
【００８７】
【表１】
2020117624.tif 000002
【００８８】
【表２】
2020117624.tif 000003
【００８９】
表２に示すように、得られた本発明の多糖は、ラムノース（ゲル濾過HPLCクロマトグラフィーで保持時間6分から9分に検出）を主成分とすることからラムナンであり、さらに、ガラクツロン酸（ウロン酸の一種）を含むことから酸性ラムナンであることが明らかとなった。得られた多糖の絶対分子量は211万ダルトンと算出され、極めて高分子量の多糖類であることが示された。この多糖のゲル濾過HPLCクロマトグラフィーの結果（分子量分布）を図３に示す。
【００９０】
さらに、硫酸基の有無を調べるため、実施例１で回収した多糖を臭化カリウム（KBr）と混合して調製した薄膜試料をJASCO FT/IR-4200スペクトロメータ−を用いた赤外分光分析（FT-IR）に供してIRスペクトルを取得した。比較のため、硫酸基を有しないプルランと、硫酸基を有するκ-カラギーナンについても、同様にしてIRスペクトルを取得した。結果を図４に示す。OH; 3400cm-1、 CH; 2900cm-1、 COO; 1640cm-1、 S=O; 1240cm-1、グリコシド結合; 1050cm-1、C-O-S; 847cm-1、α(1,4); 757cm-1。図４に示されるように、本発明の多糖について硫酸基は検出されなかった。
【００９１】
続いて、多糖の分子構造を、原子間力顕微鏡で解析した。得られた多糖の0.1重量％水溶液を調製し、0.5μLをマイカ上に滴下して自然乾燥し、原子間力顕微鏡（SII社：SPI3800N, SPA300HV）のDFMモードにて、20N/mのカンチレバーを使用し、分子構造を観察した。得られた原子間力顕微鏡像を図５に示す。観察の結果、多糖の構造には分岐が認められず、この多糖が直鎖構造を持つことが示された。原子間力顕微鏡で測定した１分子の鎖長は平均0.5μm〜1.2μmと算出された。
【００９２】
［実施例４］
実施例１で回収した多糖及び他の多糖について、以下のとおり、水溶液（水分散液）の粘度特性とゲル形成性を調べ、比較した。
【００９３】
１）本発明のBX1.5由来のラムナン
実施例１で回収した多糖1gを10mL容の耐熱ガラス管に測りとり、最終濃度が10％になるようにイオン交換水を加えて懸濁した。耐熱キャップをした後、90℃で20分間加熱して多糖を溶解させ、流水中で冷却して試料を調製した。同様に、10mL容の耐熱ガラス管中、実施例１で回収した多糖を、最終濃度が0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、又は5％になるようにイオン交換水で希釈して、最終濃度10％の試料と同様の方法に従って、多糖濃度が異なる試料を調製した。各試料の0.5mLを用い、温度調節機能を有するコーンプレート型粘度測定器（ブルックフィールド社; LV-DV2T、コーンプレートCPA-52Z）で、20℃における絶対粘度を測定した。また多糖の水溶液を4℃で24時間冷蔵保存し、ゲル形成の有無を評価した。なお多糖の濃度は重量％（w/w％）で表しており、以下の実施例でも同様である。
【００９４】
２）パラクロレラ・ケスレリ（P. kessleri）由来のラムナン
パラクロレラ・ケスレリ（P. kessleri）由来ラムナンは、パラクロレラ・ケスレリ（Parachlorella kessleri）が産生する、分岐構造を有し、分子量5〜8万のラムナンである。実施例１で回収した多糖の代わりにパラクロレラ・ケスレリ由来ラムナンを用いる点以外は上記１）と同じ手順により、パラクロレラ・ケスレリ由来ラムナンの水溶液の粘度を測定し、またゲル形成について調べた。
【００９５】
３）グアーガム
実施例１で回収した多糖の代わりにグアーガム（GRINDSTED(R)GUAR 175; 三晶）を用いる点以外は上記１）と同じ手順により、グアーガムの水溶液の粘度を測定し、またゲル形成について調べた。
【００９６】
４）ペクチン
実施例１で回収した多糖の代わりにペクチン（GENU-Pectin YM-150-LJ; 三晶）を用いる点以外は上記１）と同じ手順により、ペクチンの水溶液の粘度を測定し、またゲル形成について調べた。
【００９７】
５）大豆多糖類
実施例１で回収した多糖の代わりに大豆多糖類（ソヤファイブ-S DA100; 不二製油）を用いる点以外は上記１）と同じ手順により、大豆多糖類の水溶液の粘度を測定し、またゲル形成について調べた。
【００９８】
６）アラビアガム
実施例１で回収した多糖の代わりにアラビアガム（和光純薬）を用いる点以外は上記１）と同じ手順により、アラビアガムの水溶液の粘度を測定し、またゲル形成について調べた。
【００９９】
７）κ-カラギーナン
実施例１で回収した多糖の代わりにκ-カラギーナン（SWG-J; 三晶）を用いる点以外は上記１）と同じ手順により、κ-カラギーナンの水溶液の粘度を測定し、またゲル形成について調べた。
【０１００】
８）カードラン
実施例１で回収した多糖の代わりにカードラン（MCフードスペシャリティーズ）を用いる点以外は上記１）と同じ手順により、カードランの水溶液の粘度を測定し、またゲル形成について調べた。
【０１０１】
結果を表３に示す。表３中の「ゲル形成」は、多糖の10％水溶液を4℃で24時間冷蔵保存した場合のゲル形成の有（＋）及び無（−）を示す。
【０１０２】
【表３】
2020117624.tif 000004
【０１０３】
直鎖構造を有する多糖類は一般的に粘度が高い傾向にあるが、本発明のラムナンは、今回調べた直鎖構造を有する多糖類の中では最も水溶液の粘度が低く、また0.5〜10％の水溶液においてゲルを形成しなかった。本発明のラムナンは高濃度（5〜10％）においてゲルを形成しないものの、粘稠性に優れたゾルを形成した（高粘度及び粘稠性により粘度の測定不可）。一方、多分岐構造を有する多糖類は粘度が低く、10％水溶液でも11.5 mPa・sec（アラビアガム）や110 mPa・sec（大豆多糖類）に留まった。一方、パラクロレラが産生する分岐型ラムナンは10％水溶液で27,000 mPa・secと高粘度であるのに対し、本発明の直鎖型ラムナンは1％水溶液で同程度の25,000 mPa・secという高粘度を示し、本発明のラムナンが、低濃度で高い粘性を示し、かつゲルを形成しない独特な性質を有する多糖類であることが明らかとなった。
【０１０４】
なお予備的実験として、本発明のラムナンは少なくとも20％程度までは水に溶解させることができることが示された。
【０１０５】
［実施例５］
本発明のラムナンの水溶液の粘度の温度依存性を調べるため、実施例１で回収した多糖を濃度1％になるようにイオン交換水に懸濁後、70℃で20分加熱溶解した。得られた水溶液の0.5mLを用い、温度調整機能を有するコーンプレート型粘度測定器（ブルックフィールド社; LV-DV2T、コーンプレートCPA-52Z）によって絶対粘度を測定した。粘度の測定は、10℃、20℃、及び40℃で行った。比較のため、実施例１で回収した多糖の代わりに、ι−カラギーナン又はκ−カラギーナンを使用する点以外は同じ手順で、カラギーナンの粘度測定を行った（対照区）。一般に、ι−カラギーナンはゲル状添加剤、κ−カラギーナンはゾル状添加剤として使用されている。結果を図６に示す。
【０１０６】
図６に示すように、本発明のラムナンは、少なくとも10℃から40℃の温度帯で粘度がほとんど変化せず、広い温度範囲で安定した粘度をもたらすことが示された。なお0.5％水溶液の粘度は、せん断応力で9〜10Paであった。多糖類の粘性は一般的に温度依存性を示し、食品添加剤として一般的に用いられているι−カラギーナン及びκ−カラギーナンも温度に依存して粘度の大きな変化を示した（図６）が、本発明のラムナンの粘度特性はそれとは対照的であった。このように、本発明の多糖BX1.5由来ラムナンの粘度が、一般的な温度帯（特に10℃〜40℃）で変化しにくいことは、食品添加剤や化粧品添加剤としての優れた特性を示す。
【０１０７】
［実施例６］
１）マヨネーズ様食品（試験品１  −油分40％、ラムナン0.3％配合）の製造
乳化油滴の分散安定化と流動性改善を目的に、本発明のラムナンを配合した、乳化タイプのマヨネーズ様食品を調製した。
アラビアガム（乳化剤）10％、キャノーラ油40％、米酢3.5％、食塩1.0％、砂糖0.5％、実施例１で回収した多糖（安定剤）0.3％、水44.7％の組成（いずれもw/w％）を有するマヨネーズ様食品を調製するため、キャノーラ油を除く材料を水に分散溶解した後、キャノーラ油を加えてホモジナイザー（TK-ホモミクサー; プライミクス）を用いて15,000rpmで３分間ホモジナイズし、マヨネーズ様食品200gを得た。
【０１０８】
２）マヨネーズ様食品（試験品２  −油分50％、ラムナン0.3％配合）の製造
キャノーラ油50％、水34.7％を用いる点以外は実施例６の１）と同様にしてマヨネーズ様食品を調製した。
【０１０９】
３）マヨネーズ様食品（比較品１  −油分40％、安定剤なし）の製造
安定剤（実施例１で回収した多糖など）を使用せず、また水45％を用いる点以外は実施例６の１）と同様にしてマヨネーズ様食品を調製した。
【０１１０】
４）マヨネーズ様食品（比較品２  −油分50％、安定剤なし）の製造
安定剤（実施例１で回収した多糖など）を使用せず、またキャノーラ油50％、水35％を用いる点以外は実施例６の１）と同様にしてマヨネーズ様食品を調製した。
【０１１１】
５）マヨネーズ様食品（比較品３  −油分40％、安定剤なし）の製造
実施例１で回収した多糖の代わりにキサンタンガムを安定剤として使用する点以外は実施例６の１）と同様にしてマヨネーズ様食品を調製した。
【０１１２】
６）マヨネーズ様食品（比較品４  −油分50％、安定剤なし）の製造
実施例１で回収した多糖の代わりにキサンタンガムを安定剤として使用する点以外は実施例６の２）と同様にしてマヨネーズ様食品を調製した。
【０１１３】
調製したマヨネーズ様食品を冷蔵庫で12日間保存し、6日目と12日目にオイルオフ（油分離）、凝集の有無を目視で確認した。また、乳化油滴のメディアン粒径をレーザー回折式粒度分布計（SALD-2200; 島津製作所）で測定し、20℃における粘度を音叉式粘度測定装置（SV-10A; A&D社）で測定した。
【０１１４】
オイルオフや沈殿が少ないほど安定性が高く、また凝集が認められないか又は少ないほど安定性が高いことを示す。粒度分布は12日間の保存期間中の変化が少ないほど安定性が優れることを示す。
【０１１５】
調製したマヨネーズ様食品の評価結果を以下の表４に示す。
【０１１６】
【表４】
2020117624.tif 000005
本発明のラムナンを含むマヨネーズ様食品では、油分40％及び50％の条件下で油の分離と油滴の凝集が認められなかった。油滴粒子のメディアン粒径の経時変化が少なく、経時的な粘度増加も少ないことから、本発明のラムナンを含むマヨネーズ様食品は安定性に優れていることが示された。
【０１１７】
一方、キサンタンガムを含むマヨネーズ様食品では、油分40％及び50％の条件下で油滴粒子の凝集、油滴のメディアン粒径の粗大化、並びに粘度の大幅な経時的増加が認められた。本評価系においてキサンタンガムは配合量0.3％では十分な保存安定性をもたらさなかった。
【０１１８】
以上の結果から、本発明のラムナンは、食品安定剤として使用されているキサンタンガムに勝る乳化安定化機能を有することが示された。
【０１１９】
［実施例７］
マヨネーズをピザトースト等の製造のために調味料として利用する場合、加熱した場合に油の分離が認められないこと、すなわち乳化状態が維持されることが、望まれる。そこで、実施例６で製造したマヨネーズ様食品を用いて、加熱焼成時の安定性（焼成耐性）について検討した。
【０１２０】
試験品１、比較品２及び比較品４のマヨネーズ様食品各1mLを、No.1濾紙（ADVANTEC社）に垂らし、オーブン（MRO-TS8; HITACHI）で210℃で3分間加熱した。加熱後、オーブンから取り出した直後に濾紙上の油染みの外縁をマーキングし、デジタルマイクロスコープ（VHX-200; キーエンス社）で画像を読み取って油染みの面積を計算した。試験は3回実施して面積の平均値を算出した。安定剤を含まない比較品２の油染みの平均面積を100とし、それに対する、安定剤を含む試験品１及び比較品４のそれぞれの油染みの平均面積の相対サイズ（オイルオフ面積）を算出し、各マヨネーズ様食品の焼成耐性を評価した。結果を表５に示す。
【０１２１】
【表５】
2020117624.tif 000006
【０１２２】
本発明のラムナンを含むマヨネーズ様食品は、加熱により生じたオイルオフ（油分の染み出し）が少ないことから、加熱しても乳化状態を保持する機能が高いことが示された。すなわち、本発明のラムナンは油脂と馴染みやすく、熱処理にも安定であり、その点でも食品添加剤として好ましい特性を有している。
【０１２３】
［実施例８］
BG11液体培地を用いておよそ2日間、2％CO2ガスを供給しながらBX1.5株を振とう培養した。得られた培養物の100μLを、1.5mL容マイクロチューブに採集し、これを高速遠心機にかけ、培養上清を捨てて菌体を回収した。得られた菌体塊に、0.5％(w/v)EPS水溶液を100μL添加する（試験区）か、又は何も添加しない（菌体のみ: 対照区）ことにより、試料を調製した。なお使用したEPS水溶液は、実施例１で回収した多糖BX1.5EPSに0.5％（w/v）濃度となるように水を添加し、90℃で数分間加熱融解後、室温に戻したものである。
【０１２４】
各試料を、熱乾燥（42℃で一晩）又は凍結乾燥（-80℃で凍結後、0.002mBar設定条件下で真空乾燥を210秒）に供した。乾燥後の各試料に100μLのBG11液体培地を添加し、その混合液のうち5μLを採取してBG11寒天培地にスポットした。
【０１２５】
比較のため、凍結乾燥前のそれぞれの試料であって-80℃で凍結しておいた試料（凍結融解試料）に、100μLのBG11液体培地を添加し、その混合液のうち5μLを採取してBG11寒天培地にスポットした。
【０１２６】
また、上記と同様にして調製した菌体塊に、0.5％ EPS水溶液（試験区）、又は滅菌水（対照区）を100μL添加して混合し、試料毎に混合液全量を96穴プレートの1穴に移した。この試料に紫外線（UV光源から4cmの距離で100μmolフォトン m-2s-1）を10分間照射後、5μLを採取し、BG11寒天培地にスポットした。
【０１２７】
このようにして各試料をスポットしたBG11寒天培地を、白色蛍光灯（30μmolフォトン m-2s-1）下、30℃で5〜10日間連続して培養した。この培養中、5日目、8日目、及び10日目の寒天培地を観察し、撮影を行った。結果を図７に示す。
【０１２８】
まずBX1.5株の生育は、凍結融解を経ても可能であることが明らかとなり、これは本株の長期保存が可能である特長を示している。また、多糖を添加した試料でも、凍結融解を経た再培養で生育が可能であることが明らかとなった。
【０１２９】
さらに、凍結（真空）乾燥、熱乾燥、又は紫外線（UV）処理のいずれのストレス下でも、多糖を添加した試験区の方が、無添加の対照区と比較して、より良好な生育を示した。この結果は、BX1.5EPSが、熱、減圧（真空）、乾燥、及び紫外線などの環境ストレスに対する抵抗性（環境ストレス耐性）の増加を生存細胞にもたらすことを示す。このような環境ストレス耐性増強作用は、例えば、化粧品添加剤、培養系添加剤、又は医薬品添加剤としてのBX1.5EPSの有用性を示している。
【図１】
2020117624.tif 000007
【図２】
2020117624.tif 000008
【図３】
2020117624.tif 000009
【図４】
2020117624.tif 000010
【図５】
2020117624.tif 000011
【図６】
2020117624.tif 000012
【図７】
2020117624.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月4日(2019.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号FERM P-22318を有するパラクロレラ・エスピー（Parachlorella sp.）BX1.5株により細胞外へと産生される、構成糖としてラムノース、ガラクトース、グルコース、キシロース、及びウロン酸を含む、直鎖型ラムナン。
【請求項２】
ウロン酸としてガラクツロン酸を含む、請求項１に記載のラムナン。
【請求項３】
硫酸化されていない、請求項１又は２に記載のラムナン。
【請求項４】
糖組成におけるラムノースの割合が４０〜６０モル％であり、ガラクトースの割合が１０〜２５モル％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のラムナン。
【請求項５】
糖組成におけるガラクツロン酸の割合が５〜１５モル％である、請求項２に記載のラムナン。
【請求項６】
構成糖としてラムノース、ガラクトース、グルコース、キシロース、及びウロン酸を含み、糖組成におけるラムノースの割合が４０〜６０モル％であり、ガラクトースの割合が１０〜２５モル％であり、ラムノース：ガラクトース：グルコース：キシロース：ウロン酸＝４０〜６０：１０〜２５：７〜２０：７〜２０：５〜１５のモル比で表される糖組成を有する、直鎖型ラムナン。
【請求項７】
ウロン酸としてガラクツロン酸を含み、糖組成におけるガラクツロン酸の割合が５〜１５モル％である、請求項６に記載のラムナン。
【請求項８】
硫酸化されていない、請求項６又は７に記載のラムナン。
【請求項９】
２．０〜２．２×１０６ダルトンの重量平均分子量を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のラムナン。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のラムナンを含む、食品添加剤。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のラムナンを含む、化粧品添加剤。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のラムナンを含む、医薬品添加剤。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のラムナンを含む、飼料添加剤。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のラムナンを含む、環境ストレス耐性増強剤。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のラムナン、又は請求項１０に記載の食品添加剤を含む、食品。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のラムナン、又は請求項１１に記載の化粧品添加剤を含む、化粧品。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のラムナン、又は請求項１２に記載の医薬品添加剤を含む、医薬品。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のラムナン、又は請求項１３に記載の飼料添加剤を含む、飼料。
【請求項１９】
受託番号FERM P-22318を有するパラクロレラ・エスピー（Parachlorella sp.）BX1.5株を培養し、細胞外多糖を回収することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のラムナンの製造方法。
【請求項２０】
前記BX1.5株を、窒素源欠乏培地又は人工海水で培養する、請求項１９に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月23日(2020.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号FERM BP-22318を有するパラクロレラ・エスピー（Parachlorella sp.）BX1.5株により細胞外へと産生される、構成糖としてラムノース、ガラクトース、グルコース、キシロース、及びウロン酸を含む、直鎖型ラムナン。
【請求項２】
ウロン酸としてガラクツロン酸を含む、請求項１に記載のラムナン。
【請求項３】
硫酸化されていない、請求項１又は２に記載のラムナン。
【請求項４】
糖組成におけるラムノースの割合が４０〜６０モル％であり、ガラクトースの割合が１０〜２５モル％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のラムナン。
【請求項５】
糖組成におけるガラクツロン酸の割合が５〜１５モル％である、請求項２に記載のラムナン。
【請求項６】
構成糖としてラムノース、ガラクトース、グルコース、キシロース、及びウロン酸を含み、糖組成におけるラムノースの割合が４０〜６０モル％であり、ガラクトースの割合が１０〜２５モル％であり、ラムノース：ガラクトース：グルコース：キシロース：ウロン酸＝４０〜６０：１０〜２５：７〜２０：７〜２０：５〜１５のモル比で表される糖組成を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のラムナン。
【請求項７】
２．０〜２．２×１０６ダルトンの重量平均分子量を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のラムナン。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラムナンを含む、食品添加剤。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラムナンを含む、化粧品添加剤。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラムナンを含む、医薬品添加剤。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラムナンを含む、飼料添加剤。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラムナンを含む、環境ストレス耐性増強剤。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラムナン、又は請求項８に記載の食品添加剤を含む、食品。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラムナン、又は請求項９に記載の化粧品添加剤を含む、化粧品。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラムナン、又は請求項１０に記載の医薬品添加剤を含む、医薬品。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラムナン、又は請求項１１に記載の飼料添加剤を含む、飼料。
【請求項１７】
受託番号FERM BP-22318を有するパラクロレラ・エスピー（Parachlorella sp.）BX1.5株を培養し、細胞外多糖を回収することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のラムナンの製造方法。
【請求項１８】
前記BX1.5株を、窒素源欠乏培地又は人工海水で培養する、請求項１７に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
すなわち、本発明は以下を包含する。
[1] 構成糖としてラムノース、ガラクトース、グルコース、キシロース、及びウロン酸を含む、直鎖型ラムナン。
[2] ウロン酸としてガラクツロン酸を含む、上記[1]に記載のラムナン。
[3] 硫酸化されていない、上記[1]又は[2]に記載のラムナン。
[4] 糖組成におけるラムノースの割合が４０〜６０モル％であり、ガラクトースの割合が１０〜２５モル％である、上記[1]〜[3]のいずれかに記載のラムナン。
[5] 糖組成におけるガラクツロン酸の割合が５〜１５モル％である、上記[2]に記載のラムナン。
[6] 受託番号FERM BP-22318を有するパラクロレラ・エスピー（Parachlorella sp.）BX1.5株により細胞外へと産生される、上記[1]〜[5]のいずれかに記載のラムナン。
[7] ２．０〜２．２×１０６ダルトンの重量平均分子量を有する、上記[1]〜[6]のいずれかに記載のラムナン。
[8] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載のラムナンを含む、食品添加剤。
[9] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載のラムナンを含む、化粧品添加剤。
[10] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載のラムナンを含む、医薬品添加剤。
[11] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載のラムナンを含む、飼料添加剤。
[12] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載のラムナンを含む、環境ストレス耐性増強剤。
[13] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載のラムナン、又は上記[8]に記載の食品添加剤を含む、食品。
[14] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載のラムナン、又は上記[9]に記載の化粧品添加剤を含む、化粧品。
[15] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載のラムナン、又は上記[10]に記載の医薬品添加剤を含む、医薬品。
[16] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載のラムナン、又は上記[11]に記載の飼料添加剤を含む、飼料。
[17] 受託番号FERM BP-22318を有するパラクロレラ・エスピー（Parachlorella sp.）BX1.5株を培養し、細胞外多糖を回収することを含む、上記[1]〜[7]のいずれかに記載のラムナンの製造方法。
[18] 前記BX1.5株を、窒素源欠乏培地又は人工海水で培養する、上記[17]に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
本発明のラムナンは、典型的には、受託番号FERM BP-22318を有する緑藻パラクロレラ・エスピー（Parachlorella sp.）BX1.5株に由来する細胞外多糖である。好ましい実施形態では、本発明のラムナンは、BX1.5株により産生・分泌され、細胞外に蓄積される。本発明のラムナンは、BX1.5株により細胞外へと産生されるものであってよい。本発明のラムナンはまた、BX1.5株により細胞外へと産生された細胞外多糖を抽出・精製したものであってもよいし、あるいは／又はそれに加えて、その細胞外多糖から一部の画分の多糖分子を分離したものであってもよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
パラクロレラ・エスピー（Parachlorella sp.）BX1.5株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（NITE-IPOD）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に2016年12月13日（受託日）付けで寄託されており、その受託番号は、FERM BP-22318である。本明細書において、パラクロレラ・エスピーBX1.5株は「BX1.5株」と略記することがある。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
一実施形態では、ラムナン製造のための培養として、BX1.5株（受託番号FERM BP-22318）を、2％（v/v）炭酸ガス供給下、窒素源欠乏BG11培地又は人工海水で培養してもよい。より具体的な実施形態では、BX1.5株をBG11液体培地で無菌的に前培養後、この前培養物を新しい培地、例えば、窒素源欠乏BG11培地（例えば、硝酸ナトリウム抜きのBG11培地）又は人工海水に、培養量総体積の７分の１容となる量で接種し、引き続き2％（v/v）炭酸ガス供給下のインキュベーター（CF-415、TOMY、Japan）を使用し、30℃、白色光光量レベル1（100μmolフォトン m-2s-1）、レシプロ振とう40 rpmの条件下で、6日間培養を行ってもよい。このような培養においては、多糖を効率良く、細胞外に産生させ、蓄積させることができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
［実施例１］
緑藻パラクロレラ・エスピー（Parachlorella sp.）BX1.5株（受託番号FERM BP-22318）を、BG11液体培地で無菌的に前培養し、その培養物を、窒素源欠乏BG11培地（BG11培地から硝酸ナトリウムを除いた培地; BG11-N培地）に総体積の７分の１容となる量で接種し、引き続き2％（v/v）炭酸ガス供給下のインキュベーター（CF-415、TOMY、Japan）中、30℃、白色光光量レベル1（100μmolフォトン m-2s-1）、レシプロ振とう40 rpmの条件下で、6日間培養を行った。