(57)【要約】【課題】低い電圧で簡便にＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの誘導体の酸化電流を得ることのできる印加用電極、印加方法、電気化学的酸化反応測定方法、酵素サイクリング反応測定方法及びバイオセンシング方法を提供する。【解決手段】ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの誘導体の電気化学的酸化反応における印加用電極は、電極表面に、断面直径１０〜４０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極表面に、断面直径１０〜４０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造を備える、
ことを特徴とするＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの誘導体の電気化学的酸化反応における印加用電極。
【請求項２】
電極表面に、断面直径１０〜４０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造を備える電極を用いる、
ことを特徴とするＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの誘導体の電気化学的酸化反応における印加方法。
【請求項３】
電極表面に、断面直径１０〜４０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造を備える電極を用いる、
ことを特徴とするＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの誘導体の電気化学的酸化反応測定方法。
【請求項４】
電極表面に、断面直径１０〜４０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造を備える電極を用いる、
ことを特徴とするＮＡＤ依存型酵素又はＮＡＤＰ依存型酵素における酵素サイクリング反応測定方法。
【請求項５】
電極表面に、断面直径１０〜４０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造を備える電極を用いる、
ことを特徴とするＮＡＤ依存型酵素又はＮＡＤＰ依存型酵素における酵素サイクリング反応を活用したバイオセンシング方法。
【請求項６】
遊離可能な水素イオンの濃度に換算して０ｍＭを超えて５００ｍＭ未満の酸性溶液又は遊離可能な塩化物イオンの濃度に換算して０ｍＭを超えて５００ｍＭ未満の中性溶液に浸された電極に対して印加処理することで得られる、
ことを特徴とするＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの誘導体の電気化学的酸化反応における印加用電極。
【請求項７】
前記印加処理において、０．１〜１．５Ｖの電圧を１〜１８００秒間印加する、
ことを特徴とする請求項６に記載の印加用電極。
【請求項８】
前記酸性溶液は、塩酸溶液、シュウ酸溶液、クロム酸溶液、リン酸溶液及び硫酸溶液からなる群より少なくとも１つ選択される溶液である、
ことを特徴とする請求項６又は７に記載の印加用電極。
【請求項９】
前記中性溶液は、塩化ナトリウム溶液又は塩化カリウム溶液である、
ことを特徴とする請求項６又は７に記載の印加用電極。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、印加用電極、印加方法、電気化学的酸化反応測定方法、酵素サイクリング反応測定方法及びバイオセンシング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）及びその還元型であるジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）並びにニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）及びその還元型であるジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）は、多数の生化学的酸化還元反応に関与する重要な補酵素である。
【０００３】
補酵素としてＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋に作用する酵素によって、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋が還元されて各々ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨとなり、該酵素の基質は生成物に変換される。ここで、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを酸化検出する酵素サイクリング反応は、バイオセンシングにおいて幅広く利用されている。
【０００４】
ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの酸化検出において、電圧を印加することでＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの電気化学的酸化反応を引き起こすことができる。このような電気化学検出法は、短い応答時間、優れた再現性、簡便な操作、低コストといった利点を有するため、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ依存型酵素を用いるバイオセンシングにおいて大きな期待が寄せられている。
【０００５】
ところで、従来の電極表面での電気化学的酸化反応は、通常の（熱力学的には十分な）電圧では進行が非常に遅いため、過剰な電圧（過電圧）を印加する必要があった。しかしながら、このような過電圧によって、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ以外の物質も酸化されてしまう等の問題が生じるため、該過電圧を抑制する方法が種々検討されてきた。
【０００６】
非特許文献１には、金と銀との合金（５０：５０ｗｔ％）を濃硝酸に１．５時間浸漬して銀を溶解（除去）することで、４０ｎｍサイズの樹状突起を有する金ナノ孔構造ｌｅａｆを形成させ、これを基板電極（炭素素材）に貼り付けて、ナノ孔を有する電極を調製したことが記載されている。この非特許文献１に記載の電極をＮＡＤＨの電気化学的酸化反応に用いることで、過電圧を０．２Ｖ程度小さくすることができた。
【０００７】
非特許文献２には、基板となる電極上に高分子材料を用いた膜を構築し、そこに金ナノ微粒子を長時間（１８時間以上）かけて集積化させ、かつ、該微粒子を数倍程度に大きくすることで、微粒子集積体を電極表面に形成させた電極を調製したことが記載されている。この非特許文献２に記載の電極をＮＡＤＨの電気化学的酸化反応に用いることで、過電圧を０．７Ｖ程度小さくすることができた。
【０００８】
非特許文献３には、キノン、ビタミンＫ等の電子を媒介する分子（メディエーター）やＮＡＤＨを酸化する酵素を用いることで、ＮＡＤＨの酸電気化学的化反応に対する過電圧が、最も良い系で０．８Ｖ程度抑制されたことが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２４（２００９）３０１４−３０１８
【非特許文献２】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７８（２００６）６３３２−６３３９
【非特許文献３】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９８９，５（３），２６９−２７４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、非特許文献１に記載の電極をＮＡＤＨの電気化学的酸化反応に用いることで、過電圧は抑制されるものの、その抑制の度合いは０．２Ｖ程度と小さいものであった。また、非特許文献２に記載の電極は、過電圧を効果的に抑制するものの、微粒子集積体を電極表面に形成させたものであり、電極作製にコスト及び時間を要する点で課題を残していた。また、非特許文献３の方法では、過電圧を効果的に抑制するものの、メディエーターやＮＡＤＨを酸化する酵素を要するため、系が煩雑になることに加えコストが高くなるという問題を有していた。
【００１１】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、低い電圧で簡便にＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの誘導体の酸化電流を得ることのできる印加用電極、印加方法、電気化学的酸化反応測定方法、酵素サイクリング反応測定方法及びバイオセンシング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの誘導体の電気化学的酸化反応における印加用電極は、
電極表面に、断面直径１０〜４０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造を備える、
ことを特徴とする。
【００１３】
本発明の第２の観点に係るＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの誘導体の電気化学的酸化反応における印加方法は、
電極表面に、断面直径１０〜４０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造を備える電極を用いる、
ことを特徴とする。
【００１４】
本発明の第３の観点に係るＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの誘導体の電気化学的酸化反応測定方法は、
電極表面に、断面直径１０〜４０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造を備える電極を用いる、
ことを特徴とする。
【００１５】
本発明の第４の観点に係るＮＡＤ依存型酵素又はＮＡＤＰ依存型酵素における酵素サイクリング反応測定方法は、
電極表面に、断面直径１０〜４０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造を備える電極を用いる、
ことを特徴とする。
【００１６】
本発明の第５の観点に係るＮＡＤ依存型酵素又はＮＡＤＰ依存型酵素における酵素サイクリング反応を活用したバイオセンシング方法は、
電極表面に、断面直径１０〜４０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造を備える電極を用いる、
ことを特徴とする。
【００１７】
本発明の第６の観点に係るＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの誘導体の電気化学的酸化反応における印加用電極は、
遊離可能な水素イオンの濃度に換算して０ｍＭを超えて５００ｍＭ未満の酸性溶液又は遊離可能な塩化物イオンの濃度に換算して０ｍＭを超えて５００ｍＭ未満の中性溶液に浸された電極に対して印加処理することで得られる、
ことを特徴とする。
【００１８】
例えば、前記印加処理において、０．１〜１．５Ｖの電圧を１〜１８００秒間印加する。
【００１９】
例えば、前記酸性溶液は、塩酸溶液、シュウ酸溶液、クロム酸溶液、リン酸溶液及び硫酸溶液からなる群より少なくとも１つ選択される溶液である。
【００２０】
例えば、前記中性溶液は、塩化ナトリウム溶液又は塩化カリウム溶液である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、低い電圧で簡便にＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの誘導体の酸化電流を得ることのできる印加用電極、印加方法、電気化学的酸化反応測定方法、酵素サイクリング反応測定方法及びバイオセンシング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】（ａ）は表面に平滑構造を有する電極（ｎｏｒｍａｌ電極）を模式的に示した図及びその写真図であり、（ｂ）は表面にナノ孔構造を有する電極を模式的に示した図及びその写真図であり、（ｃ）は（ｂ）の一部を拡大した電子顕微鏡画像の図である。
【図２】本実施例のナノ孔構造電極を用いてＮＡＤＨの電気化学酸化反応を評価したグラフ図である。
【図３】本実施例のナノ孔構造電極を用いて様々な濃度のＮＡＤＨについて電気化学酸化反応を評価した場合の、得られた酸化電流とＮＡＤＨ濃度との相関を示すグラフ図である。
【図４】（ａ）は、ナノ孔構造電極によりＮＡＤＨがＮＡＤ＋へ変換され、ＮＡＤ依存型グルコース脱水素酵素を介したグルコース脱水素反応により、グルコースからグルコノラクトンが生成されることを模式的に示した図であり、（ｂ）は酵素反応（グルコース脱水素反応）回転による触媒応答を評価したグラフ図である。
【図５】ナノ孔構造電極及びＮＡＤ依存型グルコース脱水素酵素を用いて、様々な濃度のグルコースを添加した場合の、酸化電流とグルコース濃度との相関を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
まず、本実施形態による印加用電極について説明する。
【００２４】
本実施形態による印加用電極は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの誘導体の電気化学的酸化反応における印加用電極である。
【００２５】
従来、電極によるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの電気化学的酸化反応は、通常の（熱力学的には十分な）電圧では進行が非常に遅いため、過剰な電圧（過電圧）を印加しなければならなかった。本発明者らは、本実施形態による印加用電極によって、低い電圧で簡便にＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの酸化電流を得ることが可能であることを見出した。
【００２６】
本実施形態による印加用電極によって、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが電気化学的に酸化されると、補酵素としてＮＡＤ＋に作用する酵素（ＮＡＤ依存型酵素）又は補酵素としてＮＡＤＰ＋に作用する酵素（ＮＡＤＰ依存型酵素）によって、ＮＡＤＨ＋又はＮＡＤＰＨ＋が還元されて各々ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨとなり、該酵素の基質は生成物に変換される。このように、本実施形態による印加用電極を用いることで、ＮＡＤ依存型酵素又はＮＡＤＰ依存型酵素の酵素サイクリング反応を活用した効果的なバイオセンシングが可能となる。
【００２７】
本明細書において、ＮＡＤＨの誘導体又はＮＡＤＰＨの誘導体は、例えば、チオＮＡＤＨ又はチオＮＡＤＰＨ、特開２０１２−２２４６３８号公報で示されるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの誘導体などを含む。
【００２８】
本実施形態による印加用電極は、電極表面に、断面直径１０〜４０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造を備える。
【００２９】
印加用電極の素材は、例えば、金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）、ロジウム（Ｒｈ）、イリジウム（Ｉｒ）、銅（Ｃｕ）、銀（Ａｇ）及びタングステン（Ｗ）からなる群より少なくとも１つ選択される。
【００３０】
印加用電極の電極表面には、図１（ｂ）、（ｃ）で示されるような、断面直径１０〜４０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造が形成されている。この微細構造は、略円柱状突起物が、三次元的に枝状に分布する網状のナノ構造であり、略円柱状突起物の断面直径は、例えば１０〜３０ｎｍ、好ましくは１５〜２５ｎｍである。また、この微細構造は、例えば前述の非特許文献２に記載の手法で金属表面に形成される微粒子構造とは全く異なる形状を有し、微粒子又は微粒子の集積体ではない。
【００３１】
本明細書において、「ナノ孔構造電極」とは、電極表面に上記の微細構造が形成されている印加用電極をいう。印加用電極の電極表面に形成された微細構造については、例えば、電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡等を用いて電極表面を観察することで確認可能である。
【００３２】
本実施形態による印加用電極は、表面に平滑構造を有する通常の電極の電極表面に対して印加処理を施すことで、電極表面に三次元の網状構造からなる微細構造（前述）を形成させることで作製することができる。該作製方法は、極めて簡便な方法であり、酸性溶液又は中性溶液に浸された通常の電極に対して印加処理することで行われる。
【００３３】
酸性溶液は、例えば、塩酸溶液、シュウ酸溶液、クロム酸溶液、リン酸溶液又は硫酸溶液であってもよく、これらの混合溶液であってもよい。酸性溶液の濃度は、遊離可能な水素イオンの濃度に換算して０ｍＭを超えて５００ｍＭ未満であり、この濃度範囲では、電極表面に前述の三次元の網状構造からなる微細構造を形成させることができる。酸性溶液の濃度は、遊離可能な水素イオンの濃度に換算して、例えば、好ましくは５〜２００ｍＭ、より好ましくは１０〜１００ｍＭ、さらに好ましくは１５〜５５ｍＭである。なお、酸性溶液の濃度及び／又は下記の印加時間を調節することで、略円柱状突起物の断面直径及び／又は該突起物間の空間サイズを制御することができる。
【００３４】
中性溶液は、例えば、塩化ナトリウム溶液又は塩化カリウム溶液であってもよい。中性溶液の濃度は、遊離可能な塩化物イオンの濃度に換算して０ｍＭを超えて５００ｍＭ未満であり、この濃度範囲では、電極表面に前述の三次元の網状構造からなる微細構造を形成させることができる。中性溶液の濃度は、遊離可能な塩化物イオンの濃度に換算して、例えば、好ましくは５〜２００ｍＭ、より好ましくは１０〜１００ｍＭ、さらに好ましくは１５〜５５ｍＭである。なお、中性溶液の濃度及び／又は下記の印加時間を調節することで、略円柱状突起物の断面直径及び／又は該突起物間の空間サイズを制御することができる。
【００３５】
印加処理においては、例えば、０．１〜１．５Ｖの電圧を１〜１８００秒間印加するのが好ましい。印加については、当業者に公知の方法により適宜行うことができるが、例えば、電気化学装置として北斗電工株式会社製のＨＺ−５０００を使用した３極式による印加処理を行ってもよく、例えば、参照電極として銀・塩化銀電極（ＲＥ−１ＣＰ、ＢＡＳ社製）を使用してもよく、例えば、対極電極として白金電極を使用してもよい。
【００３６】
本実施形態による印加用電極の作製方法の一例を示す。市販の金電極（直径３ｍｍ）を塩酸（３５ｍＭ）に浸し、１．２Ｖの電圧を１０分間印加して、金を酸化溶解する。このようにして製造された印加用電極の電極表面には、前述の三次元の網状構造からなる微細構造が形成されている。
【００３７】
他の実施形態による印加用電極は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの電気化学的酸化反応における印加用電極であり、前述同様、遊離可能な水素イオンの濃度に換算して０ｍＭを超えて５００ｍＭ未満の酸性溶液又は遊離可能な塩化物イオンの濃度に換算して０ｍＭを超えて５００ｍＭ未満の中性溶液に浸された電極に対して印加処理することで得られる。印加処理においては、例えば、１．０〜１．５Ｖの電圧を１〜１８００秒間印加するのが好ましい。また、酸性溶液は、例えば、塩酸溶液、シュウ酸溶液、クロム酸溶液、リン酸溶液又は硫酸溶液であってもよく、これらの混合溶液であってもよい。中性溶液は、例えば、塩化ナトリウム溶液又は塩化カリウム溶液であってもよい。
【００３８】
次に、本実施形態による印加方法について説明する。
【００３９】
本実施形態による印加方法は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの電気化学的酸化反応における印加方法であり、電極表面に、断面直径１０〜４０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造を備える電極が用いられる。“電極表面に、断面直径１０〜４０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造を備える電極”については前述同様である。本実施形態による印加方法によって、低い電圧で効率的にＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの酸化電流を得ることが可能である。
【００４０】
次に、本実施形態によるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの電気化学的酸化反応測定方法について説明する。
【００４１】
本実施形態による電気化学的酸化反応測定方法は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの電気化学的酸化反応を測定するための方法であり、電極表面に、断面直径１０〜４０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造を備える電極が用いられる。“電極表面に、断面直径１０〜４０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造を備える電極”については前述同様である。本実施形態による電気化学的酸化反応測定方法によって、低い電圧でＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの酸化電流を得ることができ、酸化電流を測定することで、効率的かつ簡便にＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの電気化学的酸化反応を測定することができる。
【００４２】
次に、本実施形態によるＮＡＤ依存型酵素又はＮＡＤＰ依存型酵素における酵素サイクリング反応測定方法及び該酵素サイクリング反応を活用したバイオセンシング方法について説明する。
【００４３】
本実施形態による酵素サイクリング反応測定方法及びバイオセンシング方法は、ＮＡＤ依存型酵素又はＮＡＤＰ依存型酵素における酵素サイクリング反応を検出するための方法であり、電極表面に、断面直径１０〜４０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造を備える電極が用いられる。本明細書において、「ＮＡＤ依存型酵素」とは、補酵素としてＮＡＤ＋に作用する酵素であり、「ＮＡＤＰ依存型酵素」とは、補酵素としてＮＡＤＰ＋に作用する酵素である。“電極表面に、断面直径１０〜４０ｎｍの略円柱状突起物を有する微細構造を備える電極”については前述同様である。該電極によってＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが電気化学的に酸化されると、ＮＡＤ依存型酵素又はＮＡＤＰ依存型酵素によって、ＮＡＤＨ＋又はＮＡＤＰＨ＋が還元されて各々ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨとなり、該酵素の基質は生成物に変換される。この際に得られた酸化電流を計測することで酵素サイクリング反応の程度を測定することができる。このように、本実施形態による酵素サイクリング反応測定方法によって、ＮＡＤ依存型酵素又はＮＡＤＰ依存型酵素の酵素サイクリング反応を活用した効果的なバイオセンシングが可能となる。
【００４４】
本実施形態で用いられるＮＡＤ依存型酵素又はＮＡＤＰ依存型酵素としては、特に制限されずに選択され得、例えば、ＮＡＤ依存型グルコース脱水素酵素、Ｄ／Ｌ−乳酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、ホルムアルデヒド脱水素酵素、水素脱水素酵素、キサンチン脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ヒドロキシステロイド脱水素酵素（３α、３β、１１β、１７β）等が挙げられる。例えば、ＮＡＤ依存型グルコース脱水素酵素の場合、本実施形態の電極によって、ＮＡＤＨが電気化学的に酸化されてＮＡＤ＋となり、ＮＡＤ依存型グルコース脱水素酵素によって、ＮＡＤ＋が還元されてＮＡＤＨになるとともに、該酵素の基質であるグルコースからグルコノラクトンが生成される（図４（ａ））。
【００４５】
本実施形態による酵素サイクリング反応測定方法及びバイオセンシング方法の一例を示す。ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ依存型酵素又はＮＡＤＰ依存型酵素及び該酵素の基質を含む液体に前述のナノ孔構造電極を浸し、−０．２〜０Ｖの低い電圧を印加する。印加により得られた酸化電流を測定することで、酵素サイクリング反応の程度を測定する。つまり、得られた酸化電流が大きいほど、該液体中に基質が多く含まれていることになる。
【００４６】
以上説明したように、本実施形態による印加用電極は、電極表面に特定の微細構造を備えることで、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの電気化学的酸化反応における過電圧を大幅に抑制することができる。このように、本実施形態による印加用電極を用いることで、低い電圧で簡便にＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの酸化電流を得ることができる。そして、本実施形態による印加用電極によって、ＮＡＤ依存型酵素又はＮＡＤＰ依存型酵素の酵素サイクリング反応を活用した効果的なバイオセンシングが可能となる。
【００４７】
また、印加用電極は、酸性溶液又は中性溶液に浸された通常の電極に対して印加処理するという、極めて簡便かつ短時間で行うことが可能な方法で作製することができ、また、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの電気化学的酸化反応に用いる際にメディエーターやＮＡＤＨを酸化する酵素を必要としないため、低い電圧で低コストかつ簡便にＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの酸化電流を得ることができる。
【００４８】
また、バイオセンシングにおいて、血液や唾液などの生体サンプル中には、酸化され得る物質（例えば、血中のビタミンＣ等）が多く含まれるため、従来の方法により高い電圧を印加することで、生体サンプル中の該物質が酸化されてしまい、ＮＡＤ依存型酵素又はＮＡＤＰ依存型酵素の酵素サイクリング反応を正確に測定することができない場合があった。しかしながら、本実施形態による印加用電極を用いることで、低い電圧でＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの酸化電流を得ることができるため、より正確なバイオセンシングが可能となる。
【００４９】
本実施形態による印加方法、電気化学的酸化反応測定方法、酵素サイクリング反応測定方法及びバイオセンシング方法についても前述同様の効果を奏する。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５１】
（実施例１）
市販の金電極（直径３ｍｍ、バイオアナリティカル・システムズ社）（図１（ａ））を機械的に研磨し、−０．２〜１．６Ｖの電位を繰り返し印加することにより０．０５Ｍの硫酸中で電気化学的に洗浄した。次に、３５ｍＭの塩酸に浸し、１．２Ｖの電圧を１０分間印加して （電気化学アナライザー６００、ＣＨＩ社）、金を酸化溶解することで、電極表面にナノ孔構造を形成させた（図１（ｂ））。
【００５２】
図１（ｃ）に、印加処理後の電極表面の電子顕微鏡画像を示す（Ｓ−４３００ＦＥ−ＳＥＭ（日立製作所）を用いた走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による）。電極表面に、断面直径２０ｎｍサイズの樹状突起（略円柱状突起物）を有するナノ孔構造が形成されていることが確認された。
【００５３】
（実施例２）
実施例１で得られた印加処理後の電極（以下、“ナノ孔構造電極”という）を用いてＮＡＤＨの電気化学酸化反応を評価した。より具体的には、ナノ孔構造電極を緩衝溶液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する）中に浸し、ＮＡＤＨ（［ＮＡＤＨ］＝０．５ｍＭ）を添加して電気化学計測を行った。電気化学計測は、Ａｇ／ＡｇＣｌ／ｓａｔ．ＫＣｌ参照電極、Ｐｔ補助電極及びＮＰＧ作用電極を備える、通常の３電極構成を有する電気化学分析装置（ＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）を用いて室温で行った。
【００５４】
結果を図２に示す。図２において、実線はＮＡＤＨを添加した場合の応答を表し、破線はＮＡＤＨを含まない緩衝溶液中での応答を表す。ナノ孔構造電極では、−０．１Ｖ付近に酸化ピーク電流が観測され、−０．１Ｖ程度の低い電圧でＮＡＤＨの酸化電流を得ることができた。なお、ナノ孔構造を有しない通常の金電極（図２の挿入グラフ）では、０．６Ｖ付近に酸化ピーク電流が観測されたことから、ナノ孔構造電極を用いることで、０．７Ｖ過電圧が小さくなることが示された。
【００５５】
また、図３に、ナノ孔構造電極を用いて様々な濃度（３μＭ、６μＭ、１１μＭ、１６μＭ、２６μＭ、３６μＭ、８６μＭ、１３６μＭ、２３６μＭ、３３６μＭ）のＮＡＤＨについて電気化学酸化反応を評価した場合の、得られた酸化電流とＮＡＤＨ濃度との相関を示す。酸化電流とＮＡＤＨ濃度との間には良好な直線関係が得られ、電流の程度は、ＮＡＤＨ濃度に依存することが確認された。
【００５６】
以上より、本実施例のナノ孔構造電極は、ＮＡＤＨセンサ及びＮＡＤ再生系として機能し得ることがわかった。
【００５７】
（実施例３）
ナノ孔構造電極を用いて、ＮＡＤ依存型グルコース脱水素酵素反応を電気化学計測した。より具体的には、実施例１で得られたナノ孔構造電極を、１５０ｍＭ  グルコース、０．１ｍＭ  ＮＡＤＨ、０．５７μＭ  ＮＡＤ依存型グルコース脱水素酵素を含有する緩衝溶液（実施例２と同様）中に浸し、実施例２と同様に電気化学計測を行った。
【００５８】
ＮＡＤ依存型グルコース脱水素酵素は、補酵素としてＮＡＤ＋に作用する酵素である（図４（ａ））。ナノ孔構造電極によりＮＡＤＨがＮＡＤ＋へ変換され、酵素を介したグルコース脱水素反応により、グルコースからグルコノラクトンが生成される。
【００５９】
結果を図４（ｂ）に示す。図４（ｂ）において、破線はグルコース及びＮＡＤＨを含有する緩衝溶液での応答であり、実線はグルコース及びＮＡＤＨを含有する緩衝溶液にさらにＮＡＤ依存型グルコース脱水素酵素を加えた系の応答を表す。ナノ孔構造電極によりＮＡＤＨがＮＡＤ＋へ変換され、ＮＡＤ依存型グルコース脱水素酵素の存在下で、酵素反応（グルコース脱水素反応）回転による大きな触媒応答が得られることが確認された。
【００６０】
また、図５に、ナノ孔構造電極及びＮＡＤ依存型グルコース脱水素酵素を用いて、様々な濃度のグルコースを計測した場合の、得られた酸化電流とグルコース濃度との相関を示す。より具体的には、０．１ｍＭ  ＮＡＤＨ、０．５７μＭ  ＮＡＤ依存型グルコース脱水素酵素を含有する緩衝溶液（実施例２と同様）中に様々な濃度（１５μＭ、３５μＭ、１０５μＭ、２０５μＭ、４０５μＭ）のグルコースを添加し、実施例１で得られたナノ孔構造電極を浸して実施例２と同様に電気化学計測を行った。その結果、酸化電流とグルコース濃度との間には良好な直線関係が得られた。
【００６１】
以上より、本実施例のナノ孔構造電極によって、ＮＡＤ依存型グルコース脱水素酵素の酵素サイクリング反応を活用したグルコースのバイオセンシングが可能であることが実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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