(57)【要約】【課題】  簡易な操作でも行うことができる新たな癌の診断を補助する方法を提供する。【解決手段】  被験者から採取された体液中の揮発性有機化合物（ＶＯＣ）を検出するものであり、前記ＶＯＣとして、健常者では検出されるが癌患者では検出されないＶＯＣ群である消失群、健常者では検出されないが癌患者では検出されるＶＯＣ群である新生群、及び健常者と癌患者の両方で検出されるが癌患者で検出量が顕著に増減するＶＯＣ群である増減群からなる群から選択される１以上の癌診断ＶＯＣを検出するＶＯＣ検出工程と、  前記癌診断ＶＯＣの検出可否および／または検出量から、前記癌診断ＶＯＣの健常者群と癌患者群とを判定する判定基準を用いて、前記被験者の癌の可能性を判定する判定工程と、を有する癌の診断を補助する方法。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取された体液中の揮発性有機化合物（ＶＯＣ）を検出するものであり、前記ＶＯＣとして、健常者では検出されるが癌患者では検出されないＶＯＣ群である消失群、健常者では検出されないが癌患者では検出されるＶＯＣ群である新生群、及び健常者と癌患者の両方で検出されるが癌患者で検出量が顕著に増減するＶＯＣ群である増減群からなる群から選択される１以上の癌診断ＶＯＣを検出するＶＯＣ検出工程と、
前記癌診断ＶＯＣの検出可否および／または検出量から、前記癌診断ＶＯＣの健常者群と癌患者群とを判定する判定基準を用いて、前記被験者の癌の可能性を判定する判定工程と、を有する癌の診断を補助する方法。
【請求項２】
前記癌診断ＶＯＣとして、前記消失群、前記新生群、および前記増減群からなる群から選択される異なる２以上の群のＶＯＣを用いる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＶＯＣ検出工程で検出する前記癌診断ＶＯＣが、消失群から選択される１以上のＶＯＣの消失ＶＯＣであり、
前記判定工程が、前記消失ＶＯＣが検出されない場合癌と判定する、および／または、前記消失ＶＯＣが検出される場合癌ではないと判定する判定工程である請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ＶＯＣ検出工程で検出する前記ＶＯＣが、新生群から選択される１以上のＶＯＣの新生ＶＯＣであり、
前記判定工程が、前記新生ＶＯＣが検出される場合癌と判定する、および／または、前記新生ＶＯＣが検出されない場合癌ではないと判定する判定工程である請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ＶＯＣ検出工程が、前記消失群から選択される１以上の癌診断ＶＯＣと、前記新生群から選択される１以上の癌診断ＶＯＣとを検出するものであり、
前記判定工程が、前記消失群の癌診断ＶＯＣが検出され、かつ、前記新生ＶＯＣの癌診断ＶＯＣが検出されない場合、癌ではないと判定し、前記消失群の癌診断ＶＯＣが検出されず、かつ、前記新生ＶＯＣの癌診断ＶＯＣが検出される場合、癌であると判定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記ＶＯＣ検出手段が、前記消失群から選択される１以上の癌診断ＶＯＣ、および／または、前記新生群から選択される１以上の癌診断ＶＯＣを検出し、かつ、前記増減群から選択される１以上のＶＯＣを検出するものであり、
前記判定工程が、前記消失群のＶＯＣが検出されず、および／または、前記新生群のＶＯＣ検出される場合、増減群のＶＯＣの検出量により、癌の進行を判定することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記ＶＯＣ検出工程が、前記増減群から選択される１以上のＶＯＣの検出量を測定するものであり、
前記判定工程が、前記ＶＯＣの検出量について予め作成された健常者と癌患者とを判別する閾値と対比して判定するものである請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記ＶＯＣ検出工程が、前記消失群、前記新生群、及び前記増減群から選択される少なくとも３種以上のＶＯＣの検出量を測定するＶＯＣ検出量群を検出するものであり、
前記判定工程が、前記ＶＯＣ検出量群のＶＯＣ検出量を説明変数として、健常者と癌患者とを判別する多変量解析を行う判別式により判別する判別工程を有する請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記癌患者が、口腔癌の患者であり、
前記消失群が、ウンデカン、１−ヘプタノール、１−オクタノール、アセトアルデヒドベンゼン、（Ｅ，Ｅ）−２，４−デカジエナール、ブチロラクトン、およびベンジルアルコールからなる群から選択される１以上のＶＯＣであり、
前記新生群が、３−ヘプタノン、メトキシアセトアルデヒド、６−メチル−５−ヘプテン−２−オン、３−メチル−２−ブタノール、メトキシ−フェニル−オキシム、１，３−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、ブチルエステルブタン酸、１−ヘキサデカノール、および１−テトラデカノールからなる群から選択される１以上のＶＯＣであり、
前記増減群が、エタノール、２−ペンタノン、１−プロパノール、１−ヒドロキシ−２−プロパノン、１−オクテン−３−オール、フェニルエチルアルコール、フェノール、２−ピペリジノン、ヘキサデカン酸、およびインドールからなる群から選択される１以上のＶＯＣである請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記体液が、唾液、汗、および尿からなる群から選択されるいずれかである請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ＶＯＣ検出工程が、前記体液に含まれるＶＯＣを濃縮する濃縮工程を含み、前記濃縮工程で濃縮されたＶＯＣを検出するものである請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記濃縮工程が、ゼオライト及びシリコーンの複合膜に、前記体液を接触させ、前記複合膜に前記体液の前記ＶＯＣを吸着させる吸着工程と、前記複合膜に吸着した前記ＶＯＣを回収流体中に回収する回収工程とを含み、前記ＶＯＣ検出工程が、前記回収流体中のＶＯＣ検出量を測定するものである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記ＶＯＣ検出工程が、ガスクロマトグラフィーおよび／またはガスクロマトグラフ質量分析を用いてＶＯＣ検出量を測定するものである請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
被験者から採取された体液中の揮発性有機化合物（ＶＯＣ）を検出するものであり、前記ＶＯＣとして、健常者では検出されるが癌患者では検出されないＶＯＣ群である消失群、健常者では検出されないが癌患者では検出されるＶＯＣ群である新生群、及び健常者と癌患者の両方で検出されるが癌患者で検出量が顕著に増減するＶＯＣ群である増減群からなる群から選択される１以上の癌診断ＶＯＣを検出するＶＯＣ検出手段と、
前記癌診断ＶＯＣの検出可否および／または検出量から、前記癌診断ＶＯＣの健常者群とを癌患者群とを判定する判定基準を用いて、前記被験者の癌の可能性を判定する判定手段と、を有するシステム。
【請求項１５】
前記癌診断ＶＯＣとして、前記消失群、前記新生群、および前記増減群からなる群から選択される異なる２以上の群のＶＯＣを用いる請求項１４記載のシステム。
【請求項１６】
前記ＶＯＣ検出手段で検出する前記癌診断ＶＯＣが、消失群から選択される１以上のＶＯＣの消失ＶＯＣであり、
前記判定手段が、前記消失ＶＯＣが検出されない場合癌と判定する、および／または、前記消失ＶＯＣが検出される場合癌ではないと判定する判定手段である請求項１４記載のシステム。
【請求項１７】
前記ＶＯＣ検出手段で検出する前記ＶＯＣが、新生群から選択される１以上のＶＯＣの新生ＶＯＣであり、
前記判定手段が、前記新生ＶＯＣが検出される場合癌と判定する、および／または、前記新生ＶＯＣが検出されない場合癌ではないと判定する判定手段である請求項１４記載のシステム。
【請求項１８】
前記ＶＯＣ検出手段が、前記増減群から選択される１以上のＶＯＣの濃度を測定するＶＯＣ濃度群を検出するものであり、
前記判定手段が、前記ＶＯＣ濃度について予め作成された健常者と癌患者とを判別する閾値と対比して判定するものである請求項１４記載のシステム。
【請求項１９】
前記ＶＯＣ検出手段が、前記消失群、前記新生群、及び前記増減群から選択される少なくとも３種以上のＶＯＣの検出量を測定するＶＯＣ検出量群を検出するものであり、
前記判定手段が、前記ＶＯＣ検出量群のＶＯＣ検出量を説明変数として、健常者と癌患者とを判別する多変量解析を行う判別式により判別する判別手段を有する請求項１４または１５に記載のシステム。
【請求項２０】
前記癌患者が、口腔癌の患者であり、
前記消失群が、ウンデカン、１−ヘプタノール、１−オクタノール、アセトアルデヒドベンゼン、（Ｅ，Ｅ）−２，４−デカジエナール、ブチロラクトン、およびベンジルアルコールからなる群から選択される１以上のＶＯＣであり、
前記新生群が、３−ヘプタノン、メトキシアセトアルデヒド、６−メチル−５−ヘプテン−２−オン、３−メチル−２−ブタノール、メトキシ−フェニル−オキシム、１，３−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、ブチルエステルブタン酸、１−ヘキサデカノール、および１−テトラデカノールからなる群から選択される１以上のＶＯＣであり、
前記増減群が、エタノール、２−ペンタノン、１−プロパノール、１−ヒドロキシ−２−プロパノン、１−オクテン−３−オール、フェニルエチルアルコール、フェノール、２−ピペリジノン、ヘキサデカン酸、およびインドールからなる群から選択される１以上のＶＯＣである請求項１４〜１９のいずれかに記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌の診断を補助する方法、および癌を診断するシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
世界における新規癌患者数は約１７５０万人程度と言われており、死亡者数も約８８０万人と言われている。医療や保健衛生の進歩により日本は世界有数の長寿国になっているが、癌は３０年以上にわたり死因第一位である。また、日本での癌による死亡者数は年間３７万人を超え、その数は年々増加している傾向である。
【０００３】
このような癌の治療には早期発見は重要であるが、発見が困難な癌も多数存在する。例えば、口腔癌は、高い罹患率及びおよそ５０％の５年死亡率を有する、最も一般的なヒト悪性腫瘍の６位の疾患である。また、その９０％以上が扁平上皮癌（ＯＳＣＣ：oral squamous cell cancer）であり、毎年新たに３０万件の新規症例が報告され、そのうち１４万５０００人が死に至る。日本では、口腔癌による死亡者数は２０１６年に７３００人以上と報告されている。
【０００４】
口腔癌腫は、一連の分子突然変異を介して生じ、過形成から形成異常へ、そして上皮内癌への制御不能な細胞増殖をもたらし、続いて浸潤癌をもたらす。主な危険因子には、環境及び遺伝因子と共に煙草及びアルコール暴露が含まれる（Brinkman and Wong, 2006; Figuerido ら、2004; Hu ら、2007; Turhaniら、2006）。
【０００５】
これらの癌は、通常、病期の遅い段階になって発見され、この時期には、疾患が進行し、したがって不十分な予後及び低い生存率をもたらす。現在、外科手術及び放射線療法が一次治療であるが、頭部及び頸部に位置するため、これは、通常、患者に術後欠陥及び機能障害をもたらす（Thomson and Wylie, 2002）。
【０００６】
特に、ＯＳＣＣに関連する死亡率は特に高く、リンパ節又は頸部に広がった後でようやく発見されることが多いことに起因している。したがって、安価で感受性が高く正確な疾患スクリーニングの早期検出のための技術開発が非常に重要であり、早期検出により、この疾患に関連する罹患率及び死亡率を低下させることが可能である。
【０００７】
悪性新生物である癌の最も一般的な診断ツールとして、Ｘ線診断、ＣＴ、腫瘍マーカーを標的とした血液検査等が行われているが、実際に陽性反応が出た時点では病態が進行してしまっていることも少なくなく、必ずしも早期診断につながっていない。従って、疾患の早期検出は、より効果的な治療のための最も重要な医療目標である。
【０００８】
ヒトの体液である、唾液、血液及び尿は、多様な経路により系統的に影響を受け、全身性の疾患及び状態のスクリーニング及びモニタリングへの使用に適している。
【０００９】
例えば、唾液は、タンパク質、ペプチド、ホルモン等、多様な成分を含み、体内の健康状態を反映する生体液である。乳癌、卵巣癌、シェーグレン症候群、肝細胞癌、白斑症及び口腔癌のような多様な疾患のための潜在的な診断マーカーとして、主に唾液タンパク質が研究されている（Ryuら、2006; Streckfusら、2000; Rhodusら、2005; Brailoら、2006；Yioら、1992; Gorelikら、2005; Huら、2007）。
【００１０】
Xieらは、口腔癌患者の全唾液において１千個を超えるタンパク質を同定し、その大部分が上皮から剥離した細胞、並びに、幾つかが癌発症に寄与すると想定される、３０種を超える異なる細菌種を含有することを明らかにしている（非特許文献１）。
【００１１】
また、口腔癌患者の唾液においてカリウム及びアミラーゼの関係（非特許文献２）、アルファ−アミラーゼ及びアルブミンの関係（非特許文献３）、ｍＲＮＡプロフィールパターン分析に基づいて口腔癌検出のトランスクリプトーム診断（非特許文献４）、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用したショットガンプロテオミクス分析（非特許文献５）などが報告されている。
これらのタンパク質は、潜在的な唾液疾患マーカーとして疾患の初期検出のため、並びに治療の前・後及び間の疾患進行をモニタリングするための、簡単な臨床ツールの開発をもたらすことから注目を集めてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２０１３−５０５４２８号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】H. Xieら、Mol Cell Proteomics, 7(3),486-498 (2008)
【非特許文献２】Shpitzerら、J Cancer Res Clin Oncol, 133(9), 613-617 (2007)
【非特許文献３】Chenら、Rapid Commun Mass Spectrom, 16(5),364-369 (2002)
【非特許文献４】Liら、Clin Cancer Res 10(24), 8442-8450 (2004)
【非特許文献５】Huら、Cancer Genomics Proteomics, 4(2), 55-64 (2007)
【非特許文献６】Sogaら, J Biol Chem, 281(24), 16768-16776 (2006)
【非特許文献７】Haickら, Chem Soc Rev, 43(5), 1423-1449 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
代謝分析は、数百の代謝産物を定性的及び定量的な様式の両方で同時にモニタリングすることを可能にし、特定の環境変数に対する反応をもたらす細胞挙動の解明を可能にすることができる。
【００１５】
しかし、トランスクリプトーム及びプロテオームに基づくこれまでの口腔癌の研究は、臨床用途に潜在的な核酸及びタンパク質バイオマーカーを同定することができたが、口腔疾患を罹患している患者の唾液代謝産物のレベルの網羅的な変化は、代謝手法を介して調査されたことがない。
【００１６】
例えば、近年、Sogaらは、代謝産物の同定に毛細管電気泳動（ＣＥ）組み合わせた飛行時間質量分析（ＣＥ−ＴＯＦ−ＭＳ）に加え、タンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）による標準質量校正の正規化に基づいた代謝測定技術を報告し（非特許文献６、特許文献１）、唾液中に含まれるアラニン、ベータ−アラニン、アルパラギン酸、ベタニン、カダベリン、カルニチン、シトルリン、Ｄ−アルファ−アミノ酪酸、ガンマ−アミノ酪酸、グルタミン酸、グルタミン、グリ シン、ヒポキサンチン、イソロイシン、トリシン、リシン、オルニチン、ピペコリン酸、 ピペリジン、フェニルアラニン、プロリン、プトレッシン、セリン、トレオニン、チロシン、トリプトファン、及びバリンなど、アミノ酸や有機酸、アミン化合物からなる非揮発性の水溶性小分子代謝産物群に基づいた口腔癌及び歯周病診断を試みている。
【００１７】
しかし、非揮発性の水溶性小分子代謝産物の計測を行うことは難しい。これらを行うためのＣＥ−ＴＯＦ−ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ技術は、高価で分析に掛かる時間が長く、高度の専門性を要するなどの問題がある。また、同定に必要な質量精度を上げるために以下のような技術的問題が指摘されている。ｍ／ｚ範囲の標準偏差が大きい、ＭＳデータのみで未知のピークに代謝産物を割り当てることができない、唾液サンプルを分析する前に候補分子でスパイクするか又はＭＳ／ＭＳフラグメントスペクトルとの比較が必要、組成式を決定するためにアイソトープ分布パターン解析が必要、雑音除去、ベースライン修正、ピーク検出、及び切片電気泳動図のピーク面積の統合など解析に手間がかかる。
【００１８】
以上のように、従来技術の多くは核酸やタンパク質、アミノ酸、アミンなどの非揮発性の癌バイオマーカーに着目しており、それらの分子量決定等に当たり複数の分析手法を組み合わせる必要があるなど、分析時間が長く操作が煩雑であるという普及を妨げる課題が残されている。
【００１９】
一方、人体から排出される揮発性有機化合物（Volatile Organic Compounds, 以下「ＶＯＣ」）が体内の健康状態を反映し、癌をはじめとする様々な疾患との関係性が近年の研究されている（例えば、非特許文献７）。しかしながら、まだＶＯＣと様々な疾患との関係は明らかとなっていない点が多く、新しい癌の診断手法が求められている。
係る状況下、本発明は、簡便な操作で実施することができる新たな癌を診断する方法およびシステムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、下記の発明が上記目的に合致することを見出し、本発明に至った。すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
【００２１】
＜１＞  被験者から採取された体液中の揮発性有機化合物（ＶＯＣ）を検出するものであり、前記ＶＯＣとして、健常者では検出されるが癌患者では検出されないＶＯＣ群である消失群、健常者では検出されないが癌患者では検出されるＶＯＣ群である新生群、及び健常者と癌患者の両方で検出されるが癌患者で検出量が顕著に増減するＶＯＣ群である増減群からなる群から選択される１以上の癌診断ＶＯＣを検出するＶＯＣ検出工程と、
前記癌診断ＶＯＣの検出可否および／または検出量から、前記癌診断ＶＯＣの健常者群と癌患者群とを判定する判定基準を用いて、前記被験者の癌の可能性を判定する判定工程と、を有する癌の診断を補助する方法。
＜２＞  前記癌診断ＶＯＣとして、前記消失群、前記新生群、および前記増減群からなる群から選択される異なる２以上の群のＶＯＣを用いる前記＜１＞記載の方法。
＜３＞  前記ＶＯＣ検出工程で検出する前記癌診断ＶＯＣが、消失群から選択される１以上のＶＯＣの消失ＶＯＣであり、
前記判定工程が、前記消失ＶＯＣが検出されない場合癌と判定する、および／または、前記消失ＶＯＣが検出される場合癌ではないと判定する判定工程である前記＜１＞記載の方法。
＜４＞  前記ＶＯＣ検出工程で検出する前記ＶＯＣが、新生群から選択される１以上のＶＯＣの新生ＶＯＣであり、
前記判定工程が、前記新生ＶＯＣが検出される場合癌と判定する、および／または、前記新生ＶＯＣが検出されない場合癌ではないと判定する判定工程である前記＜１＞記載の方法。
＜５＞  前記ＶＯＣ検出工程が、前記消失群から選択される１以上の癌診断ＶＯＣと、前記新生群から選択される１以上の癌診断ＶＯＣとを検出するものであり、
前記判定工程が、前記消失群の癌診断ＶＯＣが検出され、かつ、前記新生ＶＯＣの癌診断ＶＯＣが検出されない場合、癌ではないと判定し、前記消失群の癌診断ＶＯＣが検出されず、かつ、前記新生ＶＯＣの癌診断ＶＯＣが検出される場合、癌であると判定する前記＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜６＞  前記ＶＯＣ検出手段が、前記消失群から選択される１以上の癌診断ＶＯＣ、および／または、前記新生群から選択される１以上の癌診断ＶＯＣを検出し、かつ、前記増減群から選択される１以上のＶＯＣを検出するものであり、
前記判定工程が、前記消失群のＶＯＣが検出されず、および／または、前記新生群のＶＯＣ検出される場合、増減群のＶＯＣの検出量により、癌の進行を判定することを特徴とする前記＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜７＞  前記ＶＯＣ検出工程が、前記増減群から選択される１以上のＶＯＣの検出量を測定するものであり、
前記判定工程が、前記ＶＯＣの検出量について予め作成された健常者と癌患者とを判別する閾値と対比して判定するものである前記＜１＞記載の方法。
＜８＞  前記ＶＯＣ検出工程が、前記消失群、前記新生群、及び前記増減群から選択される少なくとも３種以上のＶＯＣの検出量を測定するＶＯＣ検出量群を検出するものであり、
前記判定工程が、前記ＶＯＣ検出量群のＶＯＣ検出量を説明変数として、健常者と癌患者とを判別する多変量解析を行う判別式により判別する判別工程を有する前記＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜９＞  前記癌患者が、口腔癌の患者であり、
前記消失群が、ウンデカン、１−ヘプタノール、１−オクタノール、アセトアルデヒドベンゼン、（Ｅ，Ｅ）−２，４−デカジエナール、ブチロラクトン、およびベンジルアルコールからなる群から選択される１以上のＶＯＣであり、
前記新生群が、３−ヘプタノン、メトキシアセトアルデヒド、６−メチル−５−ヘプテン−２−オン、３−メチル−２−ブタノール、メトキシ−フェニル−オキシム、１，３−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、ブチルエステルブタン酸、１−ヘキサデカノール、および１−テトラデカノールからなる群から選択される１以上のＶＯＣであり、
前記増減群が、エタノール、２−ペンタノン、１−プロパノール、１−ヒドロキシ−２−プロパノン、１−オクテン−３−オール、フェニルエチルアルコール、フェノール、２−ピペリジノン、ヘキサデカン酸、およびインドールからなる群から選択される１以上のＶＯＣである前記＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の方法。
＜１０＞  前記体液が、唾液、汗、および尿からなる群から選択されるいずれかである前記＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の方法。
＜１１＞  前記ＶＯＣ検出工程が、前記体液に含まれるＶＯＣを濃縮する濃縮工程を含み、前記濃縮工程で濃縮されたＶＯＣを検出するものである前記＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の方法。
＜１２＞  前記濃縮工程が、ゼオライト及びシリコーンの複合膜に、前記体液を接触させ、前記複合膜に前記体液の前記ＶＯＣを吸着させる吸着工程と、前記複合膜に吸着した前記ＶＯＣを回収流体中に回収する回収工程とを含み、前記ＶＯＣ検出工程が、前記回収流体中のＶＯＣ検出量を測定するものである前記＜１１＞記載の方法。
＜１３＞  前記ＶＯＣ検出工程が、ガスクロマトグラフィーおよび／またはガスクロマトグラフ質量分析を用いてＶＯＣ検出量を測定するものである前記＜１＞〜＜１２＞のいずれかに記載の方法。
【００２２】
＜１４＞  被験者から採取された体液中の揮発性有機化合物（ＶＯＣ）を検出するものであり、前記ＶＯＣとして、健常者では検出されるが癌患者では検出されないＶＯＣ群である消失群、健常者では検出されないが癌患者では検出されるＶＯＣ群である新生群、及び健常者と癌患者の両方で検出されるが癌患者で検出量が顕著に増減するＶＯＣ群である増減群からなる群から選択される１以上の癌診断ＶＯＣを検出するＶＯＣ検出手段と、
前記癌診断ＶＯＣの検出可否および／または検出量から、前記癌診断ＶＯＣの健常者群とを癌患者群とを判定する判定基準を用いて、前記被験者の癌の可能性を判定する判定手段と、を有するシステム。
＜１５＞  前記癌診断ＶＯＣとして、前記消失群、前記新生群、および前記増減群からなる群から選択される異なる２以上の群のＶＯＣを用いる前記＜１４＞記載のシステム。
＜１６＞  前記ＶＯＣ検出手段で検出する前記癌診断ＶＯＣが、消失群から選択される１以上のＶＯＣの消失ＶＯＣであり、
前記判定手段が、前記消失ＶＯＣが検出されない場合癌と判定する、および／または、前記消失ＶＯＣが検出される場合癌ではないと判定する判定手段である前記＜１４＞記載のシステム。
＜１７＞  前記ＶＯＣ検出手段で検出する前記ＶＯＣが、新生群から選択される１以上のＶＯＣの新生ＶＯＣであり、
前記判定手段が、前記新生ＶＯＣが検出される場合癌と判定する、および／または、前記新生ＶＯＣが検出されない場合癌ではないと判定する判定手段である前記＜１４＞記載のシステム。
＜１８＞  前記ＶＯＣ検出手段が、前記増減群から選択される１以上のＶＯＣの濃度を測定するＶＯＣ濃度群を検出するものであり、
前記判定手段が、前記ＶＯＣ濃度について予め作成された健常者と癌患者とを判別する閾値と対比して判定するものである前記＜１４＞記載のシステム。
＜１９＞  前記ＶＯＣ検出手段が、前記消失群、前記新生群、及び前記増減群から選択される少なくとも３種以上のＶＯＣの検出量を測定するＶＯＣ検出量群を検出するものであり、
前記判定手段が、前記ＶＯＣ検出量群のＶＯＣ検出量を説明変数として、健常者と癌患者とを判別する多変量解析を行う判別式により判別する判別手段を有する前記＜１４＞または＜１５＞に記載のシステム。
＜２０＞  前記癌患者が、口腔癌の患者であり、
前記消失群が、ウンデカン、１−ヘプタノール、１−オクタノール、アセトアルデヒドベンゼン、（Ｅ，Ｅ）−２，４−デカジエナール、ブチロラクトン、およびベンジルアルコールからなる群から選択される１以上のＶＯＣであり、
前記新生群が、３−ヘプタノン、メトキシアセトアルデヒド、６−メチル−５−ヘプテン−２−オン、３−メチル−２−ブタノール、メトキシ−フェニル−オキシム、１，３−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、ブチルエステルブタン酸、１−ヘキサデカノール、および１−テトラデカノールからなる群から選択される１以上のＶＯＣであり、
前記増減群が、エタノール、２−ペンタノン、１−プロパノール、１−ヒドロキシ−２−プロパノン、１−オクテン−３−オール、フェニルエチルアルコール、フェノール、２−ピペリジノン、ヘキサデカン酸、およびインドールからなる群から選択される１以上のＶＯＣである前記＜１４＞〜＜１９＞のいずれかに記載のシステム。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の癌を診断するための方法およびシステムによれば、検出しやすい成分の検出による比較的簡便な操作で癌を診断に寄与することができる。この診断は、唾液などの被験者から簡易な作業で採取しやすい試料からの診断も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の方法を実施するフローチャートの一例を示す図である。
【図２】本発明においてＶＯＣを検出する操作の一例を示す図である。
【図３】本発明の癌を診断するシステムを実施するための構成の一例を示す図である。
【図４】本発明の癌を診断するシステムを実施するための構成の一例を示す図である。
【図５】ＺＳＭ−５／ＰＤＭＳ複合薄膜抽出による揮発性代謝産物のＧＣ−ＭＳ分析の概略図である。
【図６】腔癌患者群において著しく減少した１０個の唾液ＶＯＣピーク面積の健常者対照群との比較結果を示す図である。
【図７】２７成分のＶＯＣのＧＣピーク面積を説明変数として主成分分析（ＰＣＡ）スコアプロットした結果を示す図である。
【図８】図７に示す主成分分析に用いた各ＶＯＣの変数の寄与を示すチャートである。
【図９】健常者と口腔癌患者を区別する１２成分の潜在的なＶＯＣバイオマーカープロファイルの比較結果を示す図である。
【図１０】２７成分のＶＯＣのＧＣピーク面積を説明変数として主成分分析（ＰＣＡ）スコアプロットした結果を示す図である。
【図１１】２７成分のＶＯＣのＧＣピーク面積を説明変数として対象者数を追加して主成分分析（ＰＣＡ）スコアプロットした結果を示す図である。
【図１２】２−ペンタノン、ウンデカン、ヘキサデカン酸、１，３ブタンジオールの４成分を、癌診断ＶＯＣとして用いた癌判定の決定樹を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の一例（代表例）であり、本発明はその要旨を変更しない限り、以下の内容に限定されない。なお、本明細書において「〜」という表現を用いる場合、その前後の数値を含む表現として用いる。
【００２６】
［本発明の癌の診断を補助する方法］
本発明の癌の診断を補助する方法は、被験者から採取された体液中の揮発性有機化合物（ＶＯＣ）を検出するものであり、前記ＶＯＣとして、健常者では検出されるが癌患者では検出されないＶＯＣ群である消失群、健常者では検出されないが癌患者では検出されるＶＯＣ群である新生群、及び健常者と癌患者の両方で検出されるが癌患者で検出量が顕著に増減するＶＯＣ群である増減群からなる群から選択される１以上の癌診断ＶＯＣを検出するＶＯＣ検出工程と、
前記癌診断ＶＯＣの検出可否および／または検出量から、前記癌診断ＶＯＣの健常者群と癌患者群とを判定する判定基準を用いて、前記被験者の癌の可能性を判定する判定工程を有する。
以下、本発明の癌の診断を補助する方法を、「本発明の癌を診断する方法」と略記する場合がある。
【００２７】
本発明の癌を診断する方法によれば、特定のＶＯＣを測定することで、簡易な操作でも癌の診断を補助することができる。この検出対象となる成分はＶＯＣのため、比較的簡便な装置で検出することができる。また、特定のＶＯＣを対象とするため、そのＶＯＣを検出するものとして設定すればよいため、検出作業が行いやすい。
【００２８】
［本発明の癌を診断するシステム］
本発明の癌を診断するシステムは、被験者から採取された体液中の揮発性有機化合物（ＶＯＣ）を検出するものであり、前記ＶＯＣとして、健常者では検出されるが癌患者では検出されないＶＯＣ群である消失群、健常者では検出されないが癌患者では検出されるＶＯＣ群である新生群、及び健常者と癌患者の両方で検出されるが癌患者で検出量が顕著に増減するＶＯＣ群である増減群からなる群から選択される１以上の癌診断ＶＯＣを検出するＶＯＣ検出手段と、
前記癌診断ＶＯＣの検出可否および／または検出量から、前記癌診断ＶＯＣの健常者群とを癌患者群とを判定する判定基準を用いて、前記被験者の癌の可能性を判定する判定手段と、を有する。
本発明の癌を診断するシステムによれば、特定のＶＯＣを測定することで、簡易な操作でも癌を診断することができる。
なお、本願において本発明の癌を診断する方法は、本発明の癌を診断するシステムを用いて行うこともでき、本願においてそれぞれの発明に対応する構成は相互に利用することができる。
【００２９】
［本発明の知見］
本発明者等は、癌患者および健常者から採取した体液に含まれるＶＯＣを測定した結果、特定のＶＯＣに癌患者と健常者との間に差がみられることを見出した。その差として、消失群に分類するＶＯＣは、健常者の体液に含まれるものの、癌患者の体液には含まれず、癌となることで消失する傾向がみられることを見出した。また、新生群に分類するＶＯＣは、健常者の体液に含まれないものの、癌患者の体液には含まれ、癌となることで新生する傾向がみられることを見出した。また、増減群に分類するＶＯＣは、健常者の体液に含まれるものの、癌患者の体液では優位に増加または減少し、癌となることで明らかに増加または減少する傾向がみられることを見出した。このような知見に基づき、体液の消失群、新生群、増減群のＶＯＣの有無やその検出量や濃度等を検出することで癌を診断することができることを見出した。
【００３０】
［ＶＯＣ検出工程］
本発明の癌を診断する方法は、被験者から採取された体液中の揮発性有機化合物（ＶＯＣ）を検出するＶＯＣ検出工程を有する。このＶＯＣ検出工程は、ＶＯＣとして、消失群、新生群、及び増減群からなるいずれかの癌診断ＶＯＣを検出するものである。なお、本発明において、検出とは、対象とするＶＯＣが検出下限以上含まれるか否かの特定（検出可否）や、その検出量の特定も含む概念として、検出と呼ぶ。
【００３１】
［体液］
本発明は、体液に含まれるＶＯＣに基づいて癌を診断するものである。本発明において体液は、生体由来のＶＯＣを含む液体成分の総称であり、被験者から採取できるものをいう。例えば、血液；リンパ液；組織液（組織間液、細胞間液、間質液）；漿膜腔液、胸水、腹水、心嚢液などの体腔液；脳脊髄液（髄液）；関節液（滑液）；眼房水（房水）；唾液、胃液、胆汁、膵液、腸液などの消化液；汗；涙；鼻水；尿；精液；膣液；羊水；乳汁が挙げられる。また、呼気や痰を液体に溶解・分散させたものも含む。これらのうち、適宜癌の種類や、体液の採取しやすさ、ＶＯＣの含みやすさを考慮して、診断に適した体液を用いることができる。
これらの中でも、採取しやすさや被験者の症状によるＶＯＣの変化の生じやすさ等を考慮し、血液や、唾液、汗、尿などが好ましく用いられる。血液は侵襲的な採取によること、コストがかかること、感染の恐れがあることなどが懸念される場合がある。このため、特に、唾液や、汗、尿を用いることが好ましい。簡単な採取及び処理、最小限の侵襲性、並びに低い費用のために、唾液は本発明に係る診断に用いる検体に特に適している。
【００３２】
［被験者］
本発明における被験者とは、癌患者や健常者など、癌か否か診断する対象となるものをいう。ＶＯＣは食事や喫煙習慣等の影響も受ける可能性があるため、被験者からのサンプリング条件をある程度統一した状態とした方がよい。この状態は、判定工程で用いる健常者、癌患者の判定基準の作成時にも同様の状態とした方がよい。具体的には、食事、飲酒、服薬、喫煙の条件をある程度統一したほうがよい。例えば、起床後、朝食前の所定の時間に採取したり、食後１時間以上や、１．５時間以上、２時間以上空けてから、体液を採取したほうがよい。また、ばらつきや傾向を確認するために同日に時間を空けて複数回採取したり、別日に複数回採取してもよい。
【００３３】
［揮発性有機化合物（ＶＯＣ）］
本発明は、ＶＯＣの検出結果に基づいて癌を診断するものである。ＶＯＣは、揮発性有機化合物（Volatile Organic Compounds）の略称である。揮発性有機化合物は、揮発性を有する有機化合物であり、分子量が数百程度の低分子である。本発明では、このような低分子の代謝産物をモニターできる点が特徴である。
【００３４】
本発明では、消失群、新生群、減少群といったＶＯＣのいずれかを分析する。さらに、これらに含まれないＶＯＣや、各種マーカーと併用してもよい。
消失群、新生群、増減群のＶＯＣから選択され、判定の対象として用いるものを癌診断ＶＯＣと呼ぶ。この癌診断ＶＯＣは、消失群、新生群、増減群のいずれかから１種以上を用いる。この癌診断ＶＯＣは、複数種のＶＯＣを用いることが好ましく、癌診断ＶＯＣに用いるＶＯＣは、２種以上が好ましく、３種以上がより好ましく、４種以上がさらに好ましい。用いるＶＯＣが多いほど、より信頼性が高い判定ができる。このとき同一の群から複数用いてもよいし、複数の群から１種以上を用いてもよい。なお、用いるＶＯＣの数は特に上限を定めなくてもよいが、検出対象を限定してより高い精度で検出しやすいように、３０種以下や、２７種以下、２０種以下、１５種以下、１２種以下、１０種以下のような上限を設けてもよい。
【００３５】
この癌診断ＶＯＣは、消失群、新生群、および増減群からなる群から選択される２以上の群のＶＯＣを用いることが好ましい。また、癌診断ＶＯＣは、消失群、新生群、および増減群の３つの群からそれぞれ１種以上のＶＯＣを選択して用いることがより好ましい。異なる群から選択されるＶＯＣを用いることで、より体液の採取や測定による誤差の影響を抑えて、信頼性が高い判定が可能となる。また、２以上の群から選択される癌診断ＶＯＣは、合計で３種以上用いることがより好ましく、４種以上用いることがさらに好ましい。複数の群から選択し、用いるＶＯＣが多いほど、より信頼性が高い判定ができる。
【００３６】
本発明において、消失群、新生群、および増減群のＶＯＣは、予め、健常者と、癌患者との体液中のＶＯＣを測定し、ＶＯＣの種類ごとに健常者と、癌患者とでその検出の可否、検出量を対比する。この対比の結果、健常者と癌患者とに差があるとき、健常者では検出されるが癌患者では検出されないとき消失群、健常者では癌患者では検出されないとき新生群、健常者と癌患者音いずれでも検出されるがその検出量に顕著に差があるとき増減群とすることで具体的なＶＯＣを決定することができる。健常者と、癌患者とは、それぞれ複数の対象者の群とすることが好ましく、同一の対象者から複数回、時間帯等を変えて採取したものを用いてもよい。健常者と癌患者と、それぞれ３以上の対象者の群から。好ましくは５以上の対象者の群から採取したものを用いて、各ＶＯＣを決定することが好ましい。また、同一対象者から複数回サンプリングすることも含めて、健常者群と、癌患者群とから、それぞれ１０以上や、１５以上、２０以上とより多くのサンプルを採取して、各ＶＯＣを決定することが好ましい。また、癌患者は、より好ましくは、癌の種類に応じて変更することが好ましく、さらに好ましくはそのステージに応じて異なる群とすることが好ましい。
【００３７】
［消失群］
消失群は、健常者では検出されるが癌患者では検出されないＶＯＣ群である。消失群のＶＯＣは、健常者の群で検出量を測定したとき、その出現頻度が０．０８以上や、０．１以上のものとすることが好ましく、０．２以上や、０．３以上、０．４以上のものを用いることが好ましい。一方で、癌患者の群で出現頻度が、０．０８未満や、０．０５未満、０．０３未満のものとすることが好ましく、０であることが最も好ましい。
例えば、口腔癌の判定に適した消失群のＶＯＣは、次のものである。ウンデカン（undecane）、１−ヘプタノール（1-heptanol）、１−オクタノール（1-octanol）、アセトアルデヒドベンゼン（benzeneacetaldehyde）、ブチロラクトン（butyrolactone）、（Ｅ，Ｅ）−２，４−デカジエナール（E,E-2,4-decadienal）、ベンジルアルコール（benzyl alcohol）。
この消失群のＶＯＣは、健常者の体液に含まれるものの、口腔癌の癌患者の体液には含まれず、口腔癌となることで消失する傾向がみられる。
【００３８】
消失群のＶＯＣの中でも、ウンデカン（undecane）、１−オクタノール（1-octanol）、ブチロラクトン（butyrolactone）、およびベンジルアルコール（benzyl alcohol）からなる群から選択される１以上を癌診断ＶＯＣとして用いることが好ましい。これらの好適な消失群のＶＯＣの化学式を下記する。これらのＶＯＣは、癌患者、中でも口腔癌患者において、特異的に消失しやすい傾向があり、これらを指標とすることで判定の精度が向上する。
【００３９】
【化１】
2020071150.tif 000003
【００４０】
［新生群］
新生群は、健常者では検出されないが癌患者では検出されるＶＯＣ群である。新生群のＶＯＣは、癌患者の群で検出量を測定したとき、その出現頻度が０．１以上や、０．２以上のものとすることが好ましく、０．３以上や、０．４以上のものを用いることがより好ましい。一方で、健常者の群で出現頻度が、０．１未満や、０．０５未満、０．０３未満のものとすることが好ましく、０であるものとすることが最も好ましい。
【００４１】
例えば、口腔癌の判定に適した新生群のＶＯＣは次のものである。３−ヘプタノン（3-Heptanone）、メトキシアセトアルデヒド（Acetaldehyde, methoxy-）、６−メチル−５−ヘプテン−２−オン（5-Hepten-2-one, 6-methyl-）、３−メチル−２−ブタノール（2-Butanol, 3-methyl-）、メトキシ−フェニル−オキシム（Oxime, methoxy-phenyl-）、１，３−ブタンジオール（1,3-Butanediol）、１，２−ペンタンジオール（1,2-Pentanediol）、ブチルエステルブタン酸（ブチル酪酸）（Butanoic acid, butyl ester）、１−ヘキサデカノール（1-Hexadecanol）、１−テトラデカノール（1-Tetradecanol）。
この新生群のＶＯＣは、健常者の体液に含まれないものの、口腔癌の癌患者の体液には含まれ、口腔癌となることで新生する傾向がみられる。
【００４２】
新生群のＶＯＣの中でも、３−ヘプタノン（3-Heptanone）、１，３−ブタンジオール（1,3-Butanediol）、１，２−ペンタンジオール（1,2-Pentanediol）、および１−ヘキサデカノール（1-Hexadecanol）からなる群から選択される１以上を癌診断ＶＯＣとして用いることが好ましい。これらの好適な新生群のＶＯＣの化学式を下記する。これらのＶＯＣは、口腔癌患者において、特異的に新生しやすい傾向があり、これらを指標とすることで判定の精度が向上する。
【００４３】
【化２】
2020071150.tif 000004
【００４４】
［増減群］
増減群は、健常者と癌患者の両方で検出されるが癌患者で検出量が顕著に増減するＶＯＣ群である。増減群のＶＯＣは、健常者と、癌患者とでいずれも出現頻度が０．２５以上のものを用いることが好ましく、０．３以上、０．４以上、０．５以上と、より出現頻度が高いものを用いることが好ましい。一方で、その増減に顕著な差を確認できることが好ましい。癌患者で増加するものは増加群、癌患者で減少するものは減少群と呼んでもよい。また、検出量を踏まえて、健常者における検出量を基準として、その変化比の絶対値（１−「癌患者の検出量の平均値／健常者の検出量の平均値」×１００（％））が５％以上や、１０％以上、２０％以上のような増減群のいずれかのＶＯＣとする指標を設定してもよい。
【００４５】
例えば、口腔癌の判定に適した増減群のＶＯＣは次のものである。エタノール（ethanol）、２−ペンタノン（2-pentanone）、１−プロパノール（1-propanol）、１−ヒドロキシ−２−プロパノン（1-hydroxy-2-propanone）、１−オクテン−３−オール（1-octen-3-ol）、フェニルエチルアルコール（phenylethyl alcohol）、フェノール（phenol）、２−ピペリジノン（2-piperidinone）、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）（hexadecanoic acid）、インドール（indole）。
口腔癌の患者においてこれらの増減群のＶＯＣは減少群とよぶこともでき、健常者の体液に含まれるものの、口腔癌の癌患者の体液では優位に減少し、口腔癌となることで明らかに減少する傾向がみられる。
【００４６】
増減群のＶＯＣの中でも、エタノール（ethanol）、２−ペンタノン（2-pentanone）、フェノール（phenol）、およびヘキサデカン酸（パルミチン酸）（hexadecanoic acid）からなる群から選択される１以上を癌診断ＶＯＣとして用いることが好ましい。これらの好適な増減群のＶＯＣの化学式を下記する。これらのＶＯＣは、癌患者、中でも口腔癌患者において、特異的に減少しやすい傾向があり、これらを指標とすることで判定の精度が向上する。
【００４７】
【化３】
2020071150.tif 000005
【００４８】
消失群、新生群、増減群のＶＯＣとして、癌患者が口腔癌の場合、それぞれの群のＶＯＣは以下のものを用いることができる。
消失群は、ウンデカン、１−ヘプタノール、１−オクタノール、アセトアルデヒドベンゼン、（Ｅ，Ｅ）−２，４−デカジエナール、ブチロラクトン、およびベンジルアルコールからなる群から選択される１以上のＶＯＣであり、
新生群は、３−ヘプタノン、メトキシアセトアルデヒド、６−メチル−５−ヘプテン−２−オン、３−メチル−２−ブタノール、メトキシ−フェニル−オキシム、１，３−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、ブチルエステルブタン酸、１−ヘキサデカノール、および１−テトラデカノールからなる群から選択される１以上のＶＯＣであり、
増減群は、エタノール、２−ペンタノン、１−プロパノール、１−ヒドロキシ−２−プロパノン、１−オクテン−３−オール、フェニルエチルアルコール、フェノール、２−ピペリジノン、ヘキサデカン酸、およびインドールからなる群から選択される１以上のＶＯＣである。
【００４９】
［濃縮工程］
本発明の癌を診断する方法は、ＶＯＣ検出工程が、体液に含まれるＶＯＣを濃縮する濃縮工程を含み、濃縮工程で濃縮されたＶＯＣを検出するものであることが好ましい。濃縮には体液からその体液よりもＶＯＣ濃度が高いものとすることができる任意の手法を用いることができる。体液中のＶＯＣ以外の成分は、水やタンパク質等が含まれるため、これらの成分を選択的に回収したり蒸散、除去させることでＶＯＣ濃度を増大させたり、ＶＯＣ相当の成分等を選択的に回収することで濃縮してもよい。ＶＯＣ相当の成分を選択的に回収する手法としては、ＶＯＣに相当する成分を吸着する多孔質材等の吸着素材に吸着させて、その後、吸着素材に吸着しているＶＯＣを回収することで濃縮することもできる。
【００５０】
本発明で用いる体液の好適例として唾液などがあげられる。唾液はタンパク質、ペプチド、ホルモン等、多様な成分を含み、体内の健康状態を反映する体液であり、その中のＶＯＣは血液から受動拡散を介して移送される。更に、簡便で非侵襲的に採取可能であること、採取にあたり感染リスクが少ないこと、赤血球や白血球、血小板等細胞成分がほとんどなく凝固することもないため搬送や保存が容易であり、医療費の削減にもつながることなど、検体液として高い利用価値を有する。
【００５１】
一方で、唾液中のＶＯＣに関しての報告は少なく疾患診断への応用が停滞していた。その理由として、唾液中の成分濃度は血液の１／１０００に満たない程度少なく、その極微量の成分を高感度に検出する手法が確立されていないこと、常時３００種以上の口腔内細菌が存在するなかで、高病原性化した口腔細菌叢や炎症組織から生成されるＶＯＣを分別し詳細に検討した先行研究がないことなどが挙げられる。
濃縮工程を行うことで、この唾液のように、ＶＯＣの含有量が少ない体液から、ＶＯＣ以外の成分を排除して、ＶＯＣを検出しやすくなる。
【００５２】
濃縮工程は、ゼオライト及びシリコーンの複合膜に、体液を接触させ、複合膜に体液のＶＯＣを吸着させる吸着工程を有し、複合膜に吸着したＶＯＣを回収流体中に回収する回収工程を含むものであることが好ましい。そして、ＶＯＣ検出工程は、この回収流体中のＶＯＣの検出量を測定するものであることが好ましい。
【００５３】
［吸着工程］
吸着工程には、ゼオライト及びシリコーンの複合膜を用いることが好ましい。ゼオライトとシリコーンの複合膜は、ゼオライトが比較的分子量が小さいものを吸着しやすく、シリコーンが比較的分子量が大きいものを吸着しやすい。さらに粒状や粉状の場合が多いゼオライトをシリコーンと複合化することで、シートやフィルム等の膜状で一体化しているため取り扱いやすい。
【００５４】
ゼオライトは、アルミノケイ酸塩のうち、結晶構造中に比較的大きな空隙を持つものである。ゼオライトの中でも、典型的な構造であるＺＳＭ−５型のゼオライトなどを用いることができる。
【００５５】
シリコーンは、シロキサン結合による主骨格を持つ、合成高分子化合物である。シリコーンは、ポリジメチルシロキサンを用いた高分子膜であることが好ましい。このシリコーンは、シート状や膜状に加工され、ここにゼオライトを包埋させたり、表層に固着等させて、複合膜とする。
【００５６】
複合膜と体液とを接触させることで、複合膜内の孔などにＶＯＣが吸着される。この接触は、任意の接触とすることができ、体液を含む容器に複合膜を加えてもよいし、複合膜を配置した容器に体液を加えて行ってもよい。接触させることで複合膜にＶＯＣは吸着され、任意の時間、静置したり、振とうしたり、加圧して吸着させてもよい。接触させた後、吸着されない水分やタンパク質などを除去する。この除去は、体液と接触している複合膜を取り出すか、吸着されない水分等を洗い流すなどして排除する等して行うことができる。さらに、複合膜の表層などに余剰なタンパク質等の成分が付着する場合があるため、これらを除去するために、水等で洗浄してもよい。洗浄後も、複合膜内部にＶＯＣは吸着や担持された状態で保持される。
【００５７】
［回収工程］
吸着工程で複合膜に吸着したＶＯＣを回収してＶＯＣを検出する。ＶＯＣの検出は、回収流体に複合膜を接触させることで行うことができる。この回収流体は、液体でも気体でもよい。癌診断ＶＯＣとして選択していないもの、または、消失群、新生群、増減群のいずれにも属さない有機溶媒等を用いることが好ましい。例えば、メタノールなどを用いることができる。回収流体にＶＯＣを吸着した複合膜を接触させることで、吸着膜に吸着していたＶＯＣが回収流体側に移行し、この回収流体を分析することでＶＯＣを検出することができる。この吸着と、回収との液量の調整などにより、タンパク質等の余分な成分を除去して、ＶＯＣを選択的に含む濃縮ができる。
【００５８】
［検出手段］
本発明の癌を診断する方法において、ＶＯＣの検出は、癌診断ＶＯＣとして選択するＶＯＣを検出の可否、またはＶＯＣの検出量を測定することができる任意の手法を採用することができる。
例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、電気化学分析、毛細管電気泳動（ＣＥ）、質量分析（ＭＳ）、屈折率分光法（ＲＩ）、紫外分光法（ＵＶ）、蛍光分析、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、放射化学分析、近赤外分光法（近ＩＲ）、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、及び光散乱分析（ＬＳ）、を含む群から選択されるいずれかの分析手段を用いることができる。また、光導波路センサ及び水晶振動子センサを用いた検出手段（特許第５３８８３０９号公報、特許第５６５２８４７号公報参照）を用いた検出などを用いることができる。また、ＶＯＣを選択して検出するため、癌診断ＶＯＣとして選択するＶＯＣに適したセンサを組み合わせたものを検出手段としてもよい。また、これらの検出手段は、適宜組み合わせて用いてもよい。
【００５９】
本発明の癌を診断する方法は、前記ＶＯＣ検出工程が、ガスクロマトグラフィーおよび／またはガスクロマトグラフ質量分析を用いてＶＯＣの検出量を測定するものであることが好ましい。
ガスクロマトグラフィーやガスクロマトグラフ質量分析することで、複数のＶＯＣを短時間で効率的に、分子量及び分子構造を決定することができ、その量の程度も含めて分析することができる。例えば、まずＧＣ−ＭＳを用いて、ＲＴとＶＯＣを関係付けてＶＯＣを特定し、その後はガスクロマトグラフィー単独で検出してもよい。
検出手段は、癌診断ＶＯＣを消失群および／または新生群から選択する場合、検出されるか否かの検出可否の検出のみ行うものであってもよい。
【００６０】
［判定工程］
本発明の癌を診断する方法は、前記癌診断ＶＯＣの検出可否および／または検出量から、前記癌診断ＶＯＣの健常者群とを癌患者群とを判定する判定基準を用いて、前記被験者の癌の可能性を判定する判定工程を有する。この判定は、選択された癌診断ＶＯＣがいずれの群に属するかに応じて、各種判定をすることができる。また、判定基準は、健常者群と、癌患者群とを分類するものとして設定される基準である。例えば、癌診断ＶＯＣの検出の有無や増減に対する閾値に対する比較、複数の癌診断ＶＯＣによる決定樹、複数の癌診断ＶＯＣを用いた関数や、多変量解析による判別式などを用いて、設定された判断基準と対比して、癌の可能性の有無や、その程度などを判定する。
【００６１】
（消失群の判定）
消失群のＶＯＣについては、健常者では通常検出されて、癌患者において消失する傾向がある。このため健常者で検出され、癌患者で検出されないということを判断基準として用いて、消失群のＶＯＣが検出されるか否かで診断することができる。消失群のＶＯＣが検出されない場合、癌の可能性が高いと判定される。
すなわち、本発明の癌を診断する方法は、ＶＯＣ検出工程で検出するＶＯＣが、消失群から選択される１以上のＶＯＣの消失ＶＯＣであり、判定工程が、消失ＶＯＣが検出されない場合癌と判定する、および／または、ＶＯＣが検出される場合癌ではないと判定する判定工程を有することができる。
【００６２】
（新生群の判定）
新生群のＶＯＣについては、健常者では通常検出されず、癌患者において検出される傾向がある。このため健常者で検出されず、癌患者で検出されるということを判断基準として用いて、新生群のＶＯＣが検出されるか否かで診断することができる。新生群のＶＯＣが検出される場合、癌の可能性が高いと判定される。
すなわち、本発明の癌を診断する方法は、ＶＯＣ検出工程で検出するＶＯＣが、新生群から選択される１以上のＶＯＣの新生ＶＯＣであり、判定工程が、新生ＶＯＣが検出される場合癌と判定する、および／または、新生ＶＯＣが検出されない場合癌ではないと判定する判定工程を有することができる。
【００６３】
（増減群の判定）
ＶＯＣ検出工程が、増減群から選択される１以上のＶＯＣの検出量を検出するものであり、判定工程が、ＶＯＣ濃度について予め作成された健常者と癌患者とを判別する閾値と対比して判定するものとすることもできる。
増減群のＶＯＣについては、健常者では通常検出され、癌患者において増加または減少する傾向がある。このため健常者の群の上限量または下限量を判断基準として用いて、その上限以上か否かまたは下限量以下か否かを基準として、診断することができる。増減群のＶＯＣが所定の値より高い場合や低い場合、癌の可能性が高いと判定される。また、癌のステージによる検量線を設けて、そのステージを判断する指標としてもよい。
【００６４】
これらの消失ＶＯＣ、新生ＶＯＣ、減少ＶＯＣの指標を組み合わせて判定してもよい。この組み合わせは同一の群から複数のＶＯＣを選択して組み合わせてもよいし、複数の群からの組合わせであってもよい。組み合わせ方としては、例えば、複数の癌診断ＶＯＣの検出量を測定してその検出量にそれぞれ閾値を設けて、閾値に対する判定結果の傾向として分析することができる。または、決定樹のように、癌診断ＶＯＣの診断結果を特定の順序で閾値を超えるか否かを順に判定して求めることができる。または、ＶＯＣ検出量を説明変数とし、診断情報を目的変数として多変量解析を行って所定の写像（例えば、検索空間など）を構成する方法などがあげられる。
【００６５】
組み合わせて判定する場合、例えば、ＶＯＣ検出工程が、消失群から選択される１以上の癌診断ＶＯＣと、新生群から選択される１以上の癌診断ＶＯＣとを検出するものであり、判定工程が、消失群の癌診断ＶＯＣが検出され、かつ、新生ＶＯＣの癌診断ＶＯＣが検出されない場合、癌ではないと判定し、消失群の癌診断ＶＯＣが検出されず、かつ、新生ＶＯＣの癌診断ＶＯＣが検出される場合、癌であると判定するものとすることができる。
【００６６】
また、他の例として、消失群から選択される１以上の癌診断ＶＯＣ、および／または、新生群から選択される１以上の癌診断ＶＯＣを検出し、かつ、増減群から選択される１以上のＶＯＣを検出するＶＯＣ検出手段と、消失群のＶＯＣが検出されず、および／または、新生群のＶＯＣが検出される場合、増減ＶＯＣの検出量により、癌の進行を判定するものとすることができる。
【００６７】
［多変量解析による判定］
本発明の癌を診断する方法は、ＶＯＣ検出工程で検出するＶＯＣが、消失群、新生群、及び増減群から選択される少なくとも３以上のＶＯＣの検出量を測定するＶＯＣ検出量群であり、
判定工程が、ＶＯＣ検出量群のＶＯＣの検出量を説明変数として、健常者と癌患者とを判別する多変量解析を行う判別式により判別する判別工程を有することができる。多変量解析の説明変数として用いる癌診断ＶＯＣ検出量の数は、４以上が好ましく、６以上がより好ましい。
この３以上のＶＯＣは、消失群、新生群、または増減群のいずれか同じ１つの群に属するものを３種以上としてもよいし、異なる２以上の群のものを１種以上含むものとしてもよい。同じ１つの群に属するものを用いることで、多種のＶＯＣを用いる解析を行うことで、信頼性が高い判定ができる。異なる２以上の群のものを用いることで、それぞれ傾向が異なるものを含む判定となることから、より誤判定や判定不能となることが少なく信頼性が高い判定ができる。
【００６８】
［多変量解析］
【００６９】
多変量解析とは、互いに関係のある多変量（他種類の特性値）のデータが持つ特徴を要約し、かつ、目的に応じて総合するための手法のことである。
多変量解析には、
（１）予測式（関係式）の発見や量の推定などに用いる重回帰分析や正準相関分析、
（２）標本の分類や質の推定などに用いるクラスター分析や判別分析、
（３）多変量の統合整理（減らす）、変量の分類、および代表変量の発見などに用いる主成分分析や因子分析などが含まれる。本発明に用いる多変量解析は、これらの方法のいずれを採用してもよい。
【００７０】
多変量解析は、癌診断ＶＯＣを説明変数として、癌患者と健常者との分類を目的変数として判別式を作成して用いるものとすることができ、この判別式により癌患者か否か、またその可能性を判定することができる。
また、癌患者を、ステージや症状に応じてさらに分類したものを目的変数とした判別式とすることもでき、これにより癌のステージや、種類も判定することができる。
【００７１】
［表示］
このようにして判定された判定結果は、モニターに「癌である」や「癌ではない」のように表示したり、「癌の可能性Ｘ％」のように確率などで表示したり、音や表示灯で示す等、任意の手法で表示することができる。その内容を診断結果として採用したり、その結果に基づいてさらに詳細な精密検査などを行うことができる。
【００７２】
［癌］
本発明で診断する癌は、種々の癌を対象とすることができる。癌は、血液（および骨髄）−造血細胞悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫；脳腫瘍；乳がん；子宮体がん；子宮頚がん；卵巣がん；食道癌；胃癌；虫垂癌；大腸癌 ；肝癌、肝細胞癌；胆嚢癌；胆管癌；膵臓がん（膵がん）；副腎癌；消化管間質腫瘍；中皮腫（胸膜、腹膜、心膜など）；頭頚部癌（喉頭癌；口腔癌、口腔底癌、歯肉癌、舌癌、頬粘膜癌；唾液腺癌；副鼻腔癌、上顎洞癌、前頭洞癌、篩骨洞癌、蝶型骨洞癌、甲状腺癌）；腎臓がん；肺癌；骨肉腫；前立腺癌；精巣腫瘍（睾丸がん）；腎細胞癌；膀胱癌；横紋筋肉腫；皮膚癌；肛門癌などの各種癌を診断対象とすることができる。診断対象とする癌の種類に応じて、癌診断ＶＯＣとして用いるＶＯＣを変更し、その判定基準とする閾値等を設定して実施することができる。
特に、頭頚部癌（喉頭癌；口腔癌、口腔底癌、歯肉癌、舌癌、頬粘膜癌；唾液腺癌；副鼻腔癌、上顎洞癌、前頭洞癌、篩骨洞癌、蝶型骨洞癌、甲状腺癌）を診断対象とすることが好ましく、中でも、口腔癌、口腔底癌、歯肉癌、舌癌、頬粘膜癌を診断対象とすることが特に好ましい。
特に本発明の癌を診断する方法は、口腔癌を診断する方法として好適である。
【００７３】
［本発明の第一の実施形態］
図１は、本発明の方法を実施するフローチャートの一例を示すものである。被験者の体液が、ＶＯＣ検出のサンプルとして供給される（サンプル供給Ｓ１１）。次に、供給されたサンプルはＶＯＣを濃縮する処理が行われる（濃縮Ｓ２１）。次に、濃縮されたＶＯＣを回収する処理が行われる（回収Ｓ２２）。そして、回収されたＶＯＣの有無や検出量の検出が行われる（検出Ｓ２３）。検出結果は、適宜、読み取って判定手段に入力したり、電子データとして判定手段に入力されて、その結果に基づいて、癌の可能性が判定される（判定Ｓ３１）。その判定結果は、表示手段に表示される（表示Ｓ４１）。表示結果をもとに、癌の診断等が行われる。
【００７４】
図２は、本発明のＶＯＣを検出するまでの操作の一例をより詳しく説明するための図である。サンプリングピペットまたは吐き出しにより、５〜１０分にかけて唾液を採取する（ｉ）。次に、採取された唾液は、１０ｍＬ容量のガラス試料瓶に入れ、この瓶内で、２ｍＬの唾液を、３ｍＬのイオン交換水と混合され希釈される（ｉｉ）。その後、容量５０ｍＬのガラス抽出瓶に先ほどの抽出液は加える。このガラス抽出瓶の底部には、ＺＳＭ−５／ＰＤＭＳ複合膜（ゼオライトとシリコーンの複合膜）が配置されている。このガラス抽出瓶を、３時間ほど振とうすることで、唾液からＶＯＣを、ＺＳＭ−５／ＰＤＭＳの複合膜に抽出する（ｉｉｉ）。その後、イオン交換水による複合膜の洗浄と窒素ガスによる複合膜の乾燥が行われる（ｉｖ）。そして、抽出された検体（ＶＯＣ）は、この乾燥後の複合膜を含む瓶に注入されたメタノール抽出により回収される（ｖ）。このメタノール回収液を、ＧＣ−ＭＳ分析することで、ＶＯＣを検出する（ｖｉ）。
【００７５】
［本発明の癌を診断するシステム（第一の形態）］
本発明の癌を診断するシステムは、第一の形態として、被験者から採取された体液中に含まれる、前述の消失群から選択される１以上のＶＯＣの消失ＶＯＣを検出する消失ＶＯＣ検出手段を有する。また、前記消失ＶＯＣが検出されない場合癌と判定する、および／または、前記ＶＯＣが検出される場合癌ではないと判定する判定手段を有するものとすることができる。
消失ＶＯＣ検出手段は、消失群から選択されたいずれかの消失ＶＯＣの有無を検出するものでよい。そして、その検出結果に基づいて、検出されない場合癌と判定、および／または、検出される場合ＶＯＣと判定する判定手段を有する。
【００７６】
［本発明の癌を診断するシステム（第二の形態）］
本発明の癌を診断するシステムは、第二の形態として、被験者から採取された体液中に含まれる、前述の新生群から選択される１以上のＶＯＣの新生ＶＯＣを検出する新生ＶＯＣ検出手段を有する。また、前記新生ＶＯＣが検出されない場合癌と判定する、および／または、前記新生ＶＯＣが検出される場合癌ではないと判定する判定手段を有するものとすることができる。
新生ＶＯＣ検出手段は、新生群から選択されたいずれかの新生ＶＯＣの有無を検出するものでよい。そして、その検出結果に基づいて、検出される場合癌と判定、および／または、検出されない場合ＶＯＣと判定する判定手段を有する。
【００７７】
［本発明の第二の実施形態］
図３は、本発明の癌を診断するシステムの第一の形態や第二の形態の構成の一例を説明するための図である。癌の診断システム１１は、検出手段２１、判定手段３１を有しており、表示手段４１と、メモリ６１を有している。採取された唾液は、検出手段２１に供給され、検出対象のＶＯＣの有無や検出量などが検出される。この検出手段２１は、第一の癌を診断するシステムでは、消失ＶＯＣを検出する。また、第二の癌を診断するシステムでは、新生ＶＯＣを検出する。
【００７８】
次に、この検出手段２１による検出結果は、適宜メモリ６１に保存され、判定手段３１でその結果が判定される。検出対象が１種のＶＯＣの場合、その有無のみから判定を行ってもよいし、複数のＶＯＣを検出する場合、それらに基づく複合的な結果を可能性の程度として判定してもよい。このとき、ＶＯＣの種類によって重みづけを行うこともでき、その判定や重みづけの指標は適宜メモリ６１に保存しておいて判定することもできる。判定結果は、適宜メモリ６１に保存され、表示手段４１に表示される。これらの各手段は、適宜、装置内に組み込んで癌を診断する装置としてもよいし、その一部（例えば判定手段３１やメモリ６１）をサーバで実施したり、そのためのプログラムとしたり、これを保存した記録媒体としてもよい。
【００７９】
［本発明癌を診断するシステム（第三の形態）］
本発明の癌を診断するシステムの第三の形態は、被験者から採取された体液中の、前述の消失群、新生群、及び増減群からなる群から選択され、少なくとも３種以上の化合物を含む癌診断ＶＯＣ検出量群に基づいて判定するものとすることができる。また、前記癌診断ＶＯＣ検出量群の各ＶＯＣの検出量を説明変数として、健常者と癌患者とを判別する多変量解析を行った判別式により癌を判別する判定手段を有する。このような複数の癌診断ＶＯＣによる分析を行うことで、より、精度が高い判定をすることができる。この多変量解析は、複数の癌患者の癌診断ＶＯＣと、健常者の癌診断ＶＯＣとを予め取得して、それらを判別するために作成した判別式を用いる。
【００８０】
図４は、本発明の癌を診断するシステムの第三の形態の構成の一例を説明するための図である。癌の診断システム１２は、操作部５２、判定手段３２を有しており、表示手段４２と、メモリ６２を有している。このシステムは、予め取得された癌診断ＶＯＣの検出量を用いてその結果に基づく診断を行うことができる。ガスクロマトグラフィーなどを用いて取得された、被験者の体液に関する癌診断ＶＯＣ群の測定結果は、操作部５２から入力したり、データ転送手段（図示せず）等によりメモリ６２などに保存しておくことができ、この癌診断ＶＯＣ群を用いて判定が行われる。
判定手段３２では、操作部５２から入力したり、メモリ６２から読み込んだ、被験者の癌診断ＶＯＣ群の各ＶＯＣの検出量を説明変数として、健常者と癌患者とを判別する多変量解析を行った判別式により癌を判別する。この判別式は、予め、健常者と癌患者とを判別する判別式として作成されたものを用いて、その判別式はメモリ６２に保存されている。この判別式により、被験者の判定を行うことで、被験者が癌か否かや、その可能性を判定して、その結果は、表示手段４２に表示される。なお、ここでは、被験者の癌診断ＶＯＣ群を、既知の判別式で判別するものを例に説明したが、被験者の癌診断ＶＯＣ群を、既に取得していた他の健常者と癌患者との癌診断ＶＯＣ群とともに多変量解析することで判定するものとしてもよい。なお、これらの各手段は、適宜、装置内に組み込んで癌を診断する装置としてもよいし、その一部（例えば判定手段３２やメモリ６２）をサーバで実施したり、そのためのプログラムとしたり、これを保存した記録媒体としてもよい。
【００８１】
［本発明の効果等］
本発明は、癌の診断を行うことができる。本発明は、個体における口腔癌の早期診断又はその予後の提供に使用するための、口腔癌に特異性を示す新規の揮発性唾液メタボロームを提供するものとすることができる。また、個体の唾液中に見出される揮発性代謝産物を検出することによって、口腔癌を診断する又はその進行や予後を提供することができる。更に、病気の進行に伴って唾液中に見出される揮発性代謝産物が、増減・消滅・新生といった異なる匂い群に分かれ、その匂い群を形成する１種又は１種以上の揮発性代謝産物の代謝プロファイルから口腔癌を検出・診断する方法に関するものとすることができる。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を変更しない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【００８３】
［癌診断ＶＯＣの特定］
本実施例では、ＺＳＭ−５／ＰＤＭＳ複合薄膜を用いたＶＯＣの分析により、口腔癌患者及び健康者を特徴づける唾液ＶＯＣの代謝パターンの確立に有用な技術を検討した。アルコール、ケトン、炭化水素、アルデヒド、有機酸、エステル、フェノール類として分類された口腔癌群（ｎ＝２４）と対照群（ｎ＝５１）の試料の間で８０種類の揮発性代謝産物が検出され、そのうち口腔癌に特異性を示す２７種類の代謝産物（１０種類が減少し、７種類が消滅し、１０種類が新たに口腔癌群で産生された）発見することができた。以下、より具体的な操作とその結果を説明する。
【００８４】
（１）判定基準を作成するための健常者および癌患者情報
本実施例において口腔癌患者（１２名）は、病理組織検査、生検、外科的切除により扁平上皮癌と確定診断された者で、放射線療法や化学療法などの治療歴のない者とした。健常者（８名）は基礎疾患がなく、悪性腫瘍の病歴が無い者とした。
【００８５】
（２）唾液サンプルの採取
被験者からの唾液サンプルは、採取前に口を水ですすぎ、１０ｍＬのサンプル瓶に平均２ｍＬの安静時唾液を５〜１０分かけて採取した。唾液は、採取後直ちに−８０℃の環境下で保管した。唾液中のＶＯＣは、生体内代謝に起因する内因性成分と、食事や飲酒、服薬、喫煙など、生活歴や環境由来の外因性成分が混在し、成分が変動しやすい。従って、これらＶＯＣの日間変動や個体間変動を考慮し、一人当たり複数回唾液の採取を行った。健常者は、朝食をとらず午前７時から１０時の間に、最低５日間連続して唾液を採取した。口腔がん患者に関しては、食後少なくとも１．５時間以上経過し、入院後手術までの期間、可能な限り複数回採取した。全ての被験者に、唾液採取1時間前には歯磨剤や洗口液を含めた口腔清掃や喫煙を避けるよう、指示した。
表１に、唾液サンプル採取に関する対象者情報等を示す。
【００８６】
【表１】
2020071150.tif 000006
【００８７】
（３）ＶＯＣの検出
本発明では、従来から固相抽出に多く用いられているジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）吸着マトリックスにゼオライトの一種であるＺＳＭ−５を加えたＰＤＭＳ／ＺＳＭ−５複合膜に基づく薄膜抽出法（Ｔｈｉｎ  Ｆｉｌｍ  Ｍｉｃｒｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，  ＴＦＭＥ）を組み合わせたガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ−ＭＳ）に基づき、口腔癌の病態に特異的なＶＯＣ分子情報をもとに口腔癌と高い相関性をもつ新規バイオマーカーの発見を試みた。
【００８８】
「複合膜」
（原料）
・ゼオライト（ＺＳＭ−５）：ＪＧＣ  Ｃａｔａｌｙｓｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、ＺＳＭ−５（ＳｉＯ2／Ａｌ2Ｏ3モル比＝ ３０，Ｌｏｔ．１１０４２１）
・ジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）：Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ社製Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４  ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｅｌａｓｔｏｍｅｒ  ｋｉｔを用いて製造
（複合膜を作成するための操作）
ＰＤＭＳを凝固させる前に、ＰＤＭＳに対してＺＳＭ−５の重量比が２０％となるように混合して、その混合物１．０ｇをガラス瓶に滴下し、２５℃で７２時間放置することでＺＳＭ−５／ＰＤＭＳ複合膜を担持した抽出デバイス作成した。次いで１００℃で１時間加熱した後、続いて、ＺＳＭ−５／ＰＤＭＳフィルムを有する抽出デバイスを３日間メタノールで振とう洗浄を行うことで、未反応のＰＤＭＳモノマーを除去した。
【００８９】
「ＧＣ−ＭＳ」
・ガスクロマトグラフ質量分析：日本電子（ＪＥＯＬ）社製（ＪＭＳ−Ｑ１０００ＧＣ、Ａｇｉｌｅｎｔ社製ガスクロマトグラフ７８９０Ａ合体型）
・検出部：四曲歯質量分析計（電子イオン化モード電位７０ｅＶ）
・カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ社製、ＤＢ−ＷＡＸキャピラリカラム（長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．５μｍ）
（運転条件等）
超高純度のヘリウムガス（純度９９．９９９％）をキャリアガスとして１．０ｍＬ／ｍｉｎの流速で流した。ＧＣインジェクタの温度は２３０℃に保たれた。オーブンの温度は、４０℃で３分間保持し、１０℃／分で２３０℃まで昇温し、１０分間保持するようにプログラムした。保持時間データを５分２０秒から３２分まで記録した。データ収集は、ｍ／ｚ＝２５−３１０およびスキャン時間３００ｍｓのフルスキャンモードで行った。試料成分の同定は、米国標準技術研究所（ＮＩＳＴ）質量スペクトルライブラリ検索ソフトウェア（ＪＥＯＬバージョン１．５）を用いて行った。信頼できるＶＯＣ同定のために、７００を超える構造的類似性を有する化合物を候補バイオマーカーとして選択した。
【００９０】
唾液中ＶＯＣの定量分析には、ＧＣ−ＭＳを用いた。ＰＤＭＳ／ＺＳＭ−５複合膜を有する抽出デバイスに、解凍した唾液２．０ｍＬとイオン交換水３．０ｍＬを入れ、３時間の振とう後、唾液を捨て純水による洗浄及び窒素乾燥を行った。次に１００μＬのメタノールを入れ、抽出デバイスから３０分間ＶＯＣの再抽出を行い、その内１．０μＬをＧＣ−ＭＳを用いて分析を行った。
【００９１】
図５は、ＺＳＭ−５／ＰＤＭＳ複合薄膜抽出による揮発性代謝産物のＧＣ−ＭＳ分析の概略図である。図５は、（ａ）健常者と（ｂ）口腔癌患者のＧＣ−ＭＳトータルイオンクロマトグラム唾液ＶＯＣプロファイルの例である。
【００９２】
（４）ＶＯＣの分析
口腔癌患者１２名及び健常者８名からそれぞれ７３及び４２種のＶＯＣが検出され、両群に共通して検出された成分は３５成分であった。
図６は、腔癌患者群において著しく減少した１０個の唾液ＶＯＣピーク面積の健常者対照群との比較結果を示すものである。
【００９３】
健常者群と比較し、口腔癌患者群において有意な差を示した２７成分を抽出した。これらは、癌患者と、健常者とのそれぞれの傾向から、「消失群」、「新生群」、「増減群」のいずれかに分類することができた。さらに、これらの中でも１２成分のＶＯＣは、高い信頼性と再現性を示す。この結果より、これらの２７成分、なかでも１２成分を、潜在的な唾液口腔癌マーカーとして選定した。
【００９４】
検出結果の一例として、表２は消失群の７種、表３は新生群の１０種、表４は増減群の１０種について、ＧＣ−ＭＳ検出時の結果と、ＶＯＣの有機化合物としての分類、また、出現頻度（ＦＡ）を示すものである。
【００９５】
【表２】
2020071150.tif 000007
【００９６】
【表３】
2020071150.tif 000008
【００９７】
【表４】
2020071150.tif 000009
【００９８】
（５）ＶＯＣの主成分分析
（５−１）２７成分による分析例
図７は、２７成分のＶＯＣのＧＣピーク面積を説明変数として、主成分分析（ＰＣＡ）スコアプロットした結果を示すものである。主成分分析は、オリジン９ソフトウェア（Origin 9 software、Origin Lab Corporation, Northampton, MA, USA）を用いておこなった。図７に示すように多変量解析（主成分分析）の結果は、これらのＶＯＣが癌患者群と、健常者群の区別に寄与できることが確認された。この図７では、主成分分析のＰＣ１を用いて、ＰＣ１が約−１以上のものは健常者(Healthy)と判定され、約−１未満のものは、癌患者（Cancer）と判定される基準とできる。この基準に基づき、被験者のＶＯＣを測定して、この主成分分析による基準により分析することで、被験者が癌であるか否か、またその可能性を判定することができる。
【００９９】
さらに、図８は、図７に示す主成分分析に用いた各ＶＯＣの変数の寄与を示すチャートである。チャートに示したとき、消失群、増減群、新生群は、チャート上でも分類できていることが確認できる。
【０１００】
特に、口腔癌バイオマーカーとして抽出した１２種類の代謝産物のＶＯＣプロファイルは、その有意差に基づいた口腔癌のスクリーニングや異なる段階にある病態の識別に活用できる可能性が高い。
【０１０１】
図９は、健常者と口腔癌患者を区別する１２成分の潜在的なＶＯＣバイオマーカープロファイルの比較を示すグラフである。
【０１０２】
（５−２）２７成分による分析例
癌診断ＶＯＣとして、前記（５−１）と同様に２７成分のＧＣ−ＭＳ検出量を用いて、「健常者群８名（試料数５０）」、「癌患者群１１名（試料数２２）」について主成分分析を行った結果を図１０に示す。さらに、癌患者（舌癌ステージ４）１名（試料数２）を未知の試料として追加して主成分分析を行った結果を図１１に示す。追加した癌患者はいずれの試料（Ｃ１、Ｃ２）も「癌患者である」と判断されるＰＣ１であった。
【０１０３】
（６）癌診断ＶＯＣの決定樹による分類
図１２は、２−ペンタノン、ウンデカン、ヘキサデカン酸、１，３ブタンジオールを、癌診断ＶＯＣとして用いた、癌判定の決定樹である。それぞれのＶＯＣについて、ＧＣ−ＭＳによる検出量（ｐｅａｋ  ａｒｅａ）に基づいて基準を設けて、この基準と比較して判定していくことで、癌患者（Ｃ）と、健常者（Ｈ）が分類できることを確認した。
【０１０４】
（７）ＶＯＣのＰ値（p value）
表５は、健常者と、癌患者とで共通して検出された代表的な成分のｐ−ｖａｌｕｅと、検出量の増減（表中「↓」は減少、「↑」は増加）を示すものである。
【０１０５】
【表５】
2020071150.tif 000010
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明の診断するシステムは、癌を診断するための物であり、産業上利用可能性を有する。また、本発明の癌を診断する方法は、人体から収集された試料やデータを用いて基準と比較するなどの分析を行うものであり、癌の可能性を判定するものであり産業上利用可能性がある。  
【符号の説明】
【０１０７】
１１、１２  診断システム
２１  検出手段
３１、３２  判定手段
４１、４２  表示手段
５２  操作部
６１、６２  メモリ
【図１】
2020071150.tif 000011
【図２】
2020071150.tif 000012
【図３】
2020071150.tif 000013
【図４】
2020071150.tif 000014
【図５】
2020071150.tif 000015
【図６】
2020071150.tif 000016
【図７】
2020071150.tif 000017
【図８】
2020071150.tif 000018
【図９】
2020071150.tif 000019
【図１０】
2020071150.tif 000020
【図１１】
2020071150.tif 000021
【図１２】
2020071150.tif 000022