(57)【要約】【課題】任意の検体中のＬ−ＦＡＢＰないし酸化されたＬ−ＦＡＢＰを定量する方法、その定量用キット、被験者の尿中のＬ−ＦＡＢＰ又は酸化されたＬ−ＦＡＢＰの定量結果に基づく腎疾患の検査方法、その検査キット及びコンパニオン診断薬を提供すること。【解決手段】抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件において、肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含む肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件において、肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含む肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する方法。
【請求項２】
前記条件が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理によって形成された条件である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件よりも、酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質及び酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度差が小さい条件にて前記肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記測定感度差が小さい条件が、前記検体中の肝型脂肪酸結合タンパク質を界面活性剤による変性処理により形成された条件である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記測定感度差が小さい条件における前記肝型脂肪酸結合タンパク質の測定値と、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における測定値とに基づき、検体中の肝型脂肪酸結合タンパク質中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法に用いる定量用キット。
【請求項７】
抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件において、被験者の尿中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含む腎疾患の検査方法。
【請求項８】
被験者の尿中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値を、抗原抗体反応を促進する処理後に定量する工程を含む、腎疾患の検査方法。
【請求項９】
前記定量が、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における定量である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記条件が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理によって形成された条件である、請求項７又は９に記載の検査方法。
【請求項１１】
前記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件よりも、酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質及び酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度差が小さい条件にて前記肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を更に含む、請求項７、９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記測定感度差が小さい条件が、前記尿中の肝型脂肪酸結合タンパク質を界面活性剤による変性処理により形成された条件である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記測定感度差が小さい条件における前記肝型脂肪酸結合タンパク質の測定値と、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における測定値とに基づき、尿中の肝型脂肪酸結合タンパク質中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の正常範囲、又は腎疾患における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の範囲と、被験者の尿中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、被験者における前記量若しくはそれと相関するパラメータの値が、前記範囲のいずれに該当するかを決定する工程を含む、被験者における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値に基づく腎疾患の検査方法。
【請求項１５】
肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法に用いる検査キット。
【請求項１６】
肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法を用いるコンパニオン診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する方法、その定量用キット、腎疾患の検査方法、その検査キット及びコンパニオン診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝型脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ｔｙｐｅ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；以下、単に「Ｌ−ＦＡＢＰ」ともいう。）は肝臓、腎臓の近位尿細管細胞などの細胞質に存在しており、腎臓では尿細管障害による虚血ないし酸化ストレスに応答して尿中への排泄量が増加する（例えば、非特許文献１）。そのため尿中の腎臓組織由来Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質の総量の検出に基づく腎疾患の検査が可能である（例えば、特許文献１）。Ｌ−ＦＡＢＰは逆平行βシートが２枚直行したβバレル構造に２本のαへリックスが蓋をするような形で安定化され、２分子の遊離脂肪酸と結合することが知られている（例えば、非特許文献２）。
【０００３】
Ｌ−ＦＡＢＰはメチオニン残基の酸化修飾により構造変化が生じ、Ｌ−ＦＡＢＰ分子の内部領域が露わとなる（例えば、非特許文献３）。その結果、Ｌ−ＦＡＢＰ分子の内部領域と結合する抗体を用いることでＥＬＩＳＡなどの抗原抗体反応を用いた測定において抗体結合能が変化し、測定値が大きく変化することが知られている。またこのＬ−ＦＡＢＰのメチオニン残基の酸化修飾は２，２’−アゾビズ２−アミジノプロパン（以下、「ＡＡＰＨ」と略記する。）処理、空気酸化等によって生じることが報告されている（特許文献２〜４）。
【０００４】
特許文献５には、尿試料に変性剤として、還元剤（グルタチオン、システイン、ペニシラミン等）、カオトロピック試薬（尿素、グアニジン等）及び界面活性剤（ｎ−ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等）からなる化合物の１種又は２種を添加し、尿試料をこれらの化合物を用いて前処理することで免疫測定の感度、すなわち測定対象物である尿中のタンパク質の測定感度を向上させる方法が開示されており、尿中のタンパク質の一例として、Ｌ−ＦＡＢＰが挙げられているがＬ−ＦＡＢＰの検出についての具体的な記載はない。また特許文献６には、有機アミン化合物を用いることによって、担体粒子の自然凝集を起こさせずに特異反応に基づく凝集を促進する方法が開示され、特許文献７には、ベンズアミジン誘導体などの分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造と環状構造とを有する化合物を試料中のＬ−ＦＡＢＰと接触させることにより測定感度を向上させる方法が開示されている。
しかしながら、Ｌ−ＦＡＢＰ分子の内部領域と結合する抗体を用いたＬ−ＦＡＢＰの酸化状態を評価する方法としての記載はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１１−２４２０２６号公報
【特許文献２】特許第６１７４７７８号公報
【特許文献３】特許第６２１８９８３号公報
【特許文献４】特許第６０５９３８８号公報
【特許文献５】特開２０１４−８５２０８号公報
【特許文献６】国際公開ＷＯ２００７／０７４８６０号
【特許文献７】国際公開ＷＯ２０１６／１３６８６３号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋａｍｉｊｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ，１４３：２３−３０，２００４
【非特許文献２】Ｃａｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ，１０２：２５８５−２５９４，２０１２．
【非特許文献３】Ｙａｎ，  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ，５０：２４４５−２４５４，２００９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、このような従来技術の実情に鑑みてなされたものであり、任意の検体中のＬ−ＦＡＢＰないし酸化されたＬ−ＦＡＢＰを定量する方法、その定量用キット、被験者の尿中のＬ−ＦＡＢＰ又は酸化されたＬ−ＦＡＢＰの定量結果に基づく腎疾患の検査方法、その検査キット及びコンパニオン診断薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、抗原抗体反応を促進する処理を適切に行うことで、酸化されていないＬ−ＦＡＢＰに対して酸化されたＬ−ＦＡＢＰの測定感度が相対的に高く、かつ酸化されたＬ−ＦＡＢＰの測定感度が絶対的にも高い条件の実現が可能であることを見出した。また、本発明者らは、慢性腎疾患（ＣＫＤ）患者及び急性腎疾患（ＡＫＩ）患者とで尿中におけるＬ−ＦＡＢＰの酸化率が相違することを見出した。
本発明は、上記知見に基づき完成されるに至ったものである。
すなわち本発明は以下の通りである。
【０００９】
＜１＞抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件において、肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含む肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する方法。
＜２＞前記条件が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理によって形成された条件である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞前記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件よりも、酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質及び酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度差が小さい条件にて前記肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を更に含む、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞前記測定感度差が小さい条件が、前記検体中の肝型脂肪酸結合タンパク質を界面活性剤による変性処理により形成された条件である、＜３＞に記載の方法。
＜５＞前記測定感度差が小さい条件における前記肝型脂肪酸結合タンパク質の測定値と、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における測定値とに基づき、検体中の肝型脂肪酸結合タンパク質中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含む、＜３＞又は＜４＞に記載の方法。
＜６＞肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載の方法に用いる定量用キット。
【００１０】
＜７＞抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件において、被験者の尿中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含む腎疾患の検査方法。
＜８＞被験者の尿中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値を、抗原抗体反応を促進する処理後に定量する工程を含む、腎疾患の検査方法。
＜９＞前記定量が、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における定量である、＜８＞に記載の方法。
＜１０＞前記条件が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理によって形成された条件である、＜７＞又は＜９＞に記載の検査方法。
＜１１＞前記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件よりも、酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質及び酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度差が小さい条件にて前記肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を更に含む、＜７＞、＜９＞又は＜１０＞に記載の方法。
＜１２＞前記測定感度差が小さい条件が、前記尿中の肝型脂肪酸結合タンパク質を界面活性剤による変性処理により形成された条件である、＜１１＞に記載の方法。
＜１３＞前記測定感度差が小さい条件における前記肝型脂肪酸結合タンパク質の測定値と、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における測定値とに基づき、尿中の肝型脂肪酸結合タンパク質中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含む、＜１１＞又は＜１２＞に記載の方法。
＜１４＞酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の正常範囲、又は腎疾患における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の範囲と、被験者の尿中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、被験者における前記量若しくはそれと相関するパラメータの値が、前記範囲のいずれに該当するかを決定する工程を含む、被験者における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値に基づく腎疾患の検査方法。
【００１１】
＜１５＞肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、＜７＞〜＜１４＞のいずれか１項に記載の方法に用いる検査キット。
＜１６＞肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、＜７＞〜＜１４＞のいずれか１項に記載の方法を用いるコンパニオン診断薬。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、任意の検体中のＬ−ＦＡＢＰ又は酸化されたＬ−ＦＡＢＰを定量する方法、その定量用キットを提供し得る。
また、本発明によれば、被験者の尿中のＬ−ＦＡＢＰ又は酸化されたＬ−ＦＡＢＰの定量結果に基づき、慢性腎疾患、急性腎疾患等の腎疾患を検査し得る検査方法、その検査キット及びコンパニオン診断薬を提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】参考例１の結果を示す図である。
【図２】実施例１の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施態様について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施態様に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
【００１５】
（Ｌ−ＦＡＢＰ）
Ｌ−ＦＡＢＰのアミノ酸配列や遺伝子配列は既に報告されている（Ｖｅｅｒｋａｍｐ  ａｎｄ  Ｍａａｔｍａｎ，  Ｐｒｏｇ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，３４：１７−５２，１９９５）。配列番号１は、野生型ヒトＬ−ＦＡＢＰのアミノ酸配列を表す。
配列表の配列番号１に記載した野生型ヒト肝型脂肪酸結合タンパク質のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異タンパク質であっても、その変異が野生型ヒト肝型脂肪酸結合タンパク質の３次元構造において保存性が高い変異であれば、これらは全て肝型脂肪酸結合タンパク質の範囲内に属し得る。
タンパク質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的にタンパク質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）又はバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）又はＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等が挙げられる。
【００１６】
上記Ｌ−ＦＡＢＰの取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換えタンパク質でもよい。
【００１７】
≪Ｌ−ＦＡＢＰを定量する方法≫
本発明の第１の態様は、抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質（以下、単に「非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ」ともいう。）の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質（以下、単に「酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ」ともいう。）の測定感度が高い条件において、Ｌ−ＦＡＢＰを定量する工程を含むＬ−ＦＡＢＰを定量する方法である。
Ｌ−ＦＡＢＰを含有する検体としては任意の検体でよく、例えば、尿、血液、汗等が挙げられ、尿が好ましい。
【００１８】
第１の態様に係るＬ−ＦＡＢＰを定量する方法において、検体は非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰを含んでいてもいなくてもよく、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの混合物であってもよいが、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの混合物又は酸化型Ｌ−ＦＡＢＰが好ましい。
【００１９】
Ｌ−ＦＡＢＰは、配列番号１における１９番目、７４番目及び１１３番目のメチオニンが酸化され得、上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰは、１９番目、７４番目及び１１３番目のメチオニンの少なくともいずれかが酸化されたＬ−ＦＡＢＰということができ、特に、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を用いた測定値の変化に関しては、１９番目及び１１３番目のメチオニンの酸化が支配的であると考えられることから、１９番目及び１１３番目のメチオニンの少なくともいずれかが酸化されたＬ−ＦＡＢＰが好ましい。
Ｌ−ＦＡＢＰの検出ないし定量等の測定方法としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＬＥＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、電気化学発光測免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光抗体法（ＦＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット法（ＷＢ）、イムノブロット法などを採用したアッセイ法が挙げられ、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を用いた測定であることが好ましい。
【００２０】
用いる抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体としては、Ｌ−ＦＡＢＰを認識し得る限り特に制限はなく、公知の抗体であってもよく、今後開発される抗体であってもよい。抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を用いる測定である場合、上記メチオニンの酸化により外部へ曝露される部位を認識する抗体が更に好ましい。
また、非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰは認識しないが、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰを特異的に認識し得る抗酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を用いることもできるが、第１の態様に係るＬ−ＦＡＢＰを定量する方法における上記条件は、そのような抗体依存的な条件を含むものではない。
【００２１】
具体的には、例えば、５０ｍＭのＡＡＰＨにて３７℃６０分間処理した酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰと、未処理の非酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰとを、「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テストＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス株式会社製）の抗体を使用してＥＬＩＳＡ測定し、標識抗体の発色強度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定した場合に、濃度２５ｎｇ／ｍｌにおいて、非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰに対して酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が１．４倍以上（好ましくは１．５倍以上、より好ましくは１．８倍以上、更に好ましくは２．０倍以上）高い条件における定量であることがより好ましい。
測定感度の倍率の上限値としては特に制限はないが、例えば、６倍以下又は４倍以下が挙げられる。
ここでいう「未処理の非酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰ」とは、１０００ｍＭのベンズアミジン塩酸塩又は１５００ｍＭの塩化グアニジニウムの少なくとも一方にて２５℃１０分間処理した後、「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テストＨＳ（高感度）」の抗体を使用してＥＬＩＳＡ測定し、標識抗体の発色強度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定した場合に、濃度２５ｎｇ／ｍｌにおいて、５０ｍＭのＡＡＰＨにて３７℃６０分間処理した酸化型Ｌ−ＦＡＢＰに対して発色強度が０．７倍以下となるＬ−ＦＡＢＰをいう。
【００２２】
上記測定方法として、より詳細には、抗原（Ｌ−ＦＡＢＰ）に対する認識部位が異なる２種類の抗体を組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法であることが好ましい。
認識部位が異なる２種類の抗体は、一方を、マイクロプレートのウェル中の表面に結合させた固相化抗体として用い、他方を、検出ないし定量のための標識抗体として用いることが好ましい。上記標識抗体における標識としては特に制限はなく、例えば、パーオキシダーゼ標識等の酵素標識、蛍光標識、紫外線標識、放射線標識等が挙げられる。
【００２３】
抗原（Ｌ−ＦＡＢＰ）に対する認識部位が異なる抗体としては、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローン１、クローン２、クローンＬ及びクローンＦよりなる群から選択される抗体を含む抗体が挙げられ（例えば、特許文献２〜４）、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローンＬを含む組み合わせ、又は抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローン２を含む組み合わせであることが好ましく、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローンＬを含む組み合わせであることがより好ましく、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローンＬを固相化抗体として用い、任意の抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を標識抗体として用いることが更に好ましく、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローンＬを固相化抗体として用い、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローン２を標識抗体として用いることが特に好ましい。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法を利用したＬ−ＦＡＢＰ測定キットの市販品としては、「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テストＴＭＢ」（シミックホールディングス社製）、「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テストＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス社製）等が挙げられる。
【００２４】
例えば、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を用いる定量等である場合、抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が高い条件では、Ｌ−ＦＡＢＰの物理化学的特性が軽度に変更してＬ−ＦＡＢＰと抗体との反応が促進されつつ、Ｌ−ＦＡＢＰの立体構造が損なわれる程には変性していない。これにより、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度よりも高い特性を維持または亢進しつつ、絶対的な測定感度を増加することができる。
このような条件は、種々のタンパク質変性剤を適切な使用条件との組合せで使用することで形成可能であり、タンパク質変性作用の穏やかな物質を用いることは、使用条件の自由度が高くなる点で好ましい。ただし、タンパク質変性作用の強い物質（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））を用いても、使用条件の自由度が相応に低くはなる（低濃度、低温、短時間等の制約が加わる）が、上記条件形成が可能であり得る。
この観点で、いわゆる免疫凝集促進剤が好ましく、具体的にはカオトロピック試薬又は有機アミン化合物がより好ましい。
参考例１において後述するように、免疫凝集促進剤を適切な条件で使用する処理後の測定感度は、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰについて、絶対的に著しく増大しつつ、非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰに比べて相対的に高い。
したがって、免疫凝集促進剤による処理後の抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を用いる測定値と、上記処理無しの抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を用いる測定値（好ましくは、後述する酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件における測定値）との対比から、検体中の酸化型Ｌ−ＦＡＢＰを定量し得る。
【００２５】
免疫凝集促進剤としては、カオトロピック試薬、有機アミン化合物、還元剤（グルタチオン、システイン、ペニシラミン等）、界面活性剤（ｎ−ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等）、又は同様の効果を有する物質等が挙げられ、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物が好ましい。
第１の態様に係る酸化型Ｌ−ＦＡＢＰを定量する方法において、上記定量が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理後のＬ−ＦＡＢＰの定量であることがより好ましい。
測定に用いられる抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体は上記と同様である。
【００２６】
上記カオトロピック試薬ないし有機アミン化合物の具体例としては、尿素、２−アミノ−２−チアゾリン塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、グアニジン塩酸塩、アミノピリン、アンチピリン、４−アミノアンチピリン、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩、ｐ−アニシジン塩酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、２，４−ジアミノアニソール二塩酸塩、ピリジン塩酸塩、塩酸１，４−フェニレンジアミン、アミノグアニジン塩酸塩、ベタイン塩酸塩から選ばれる少なくとも１種が好ましく用いられる。この中でも、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、２−アミノ−２−チアゾリン塩酸塩がさらに好ましい。
また、下記式（Ａ）で表される化合物もしくはその塩又はエステル、下記式（Ｂ）で表される化合物又はその塩も好ましく用い得る。
【化１】
2020056621.tif 000003
（式（Ａ）中、Ｘａ１は、水素原子、水酸基又はアルキル基であり、Ｘａ２〜Ｘａ６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、水酸基、カルボキシ基、アミノ基又は−ＳＸａ７（Ｘａ７は、水素原子、水酸基又はアルキル基を表す。Ｘａ７が複数存在するときは、それぞれ同一であっても異なる基であってもよい。）を表す。）
上記アルキル基としては、直鎖状又は分岐状のアルキル基が挙げられ、炭素原子数１〜３のアルキル基が好ましい。
【化２】
2020056621.tif 000004
（式（Ｂ）中、Ｘｂ１〜Ｘｂ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アミノ基、ハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基又は−ＳＸｂ６（Ｘｂ６は、水素原子、水酸基又はアルキル基を表す。Ｘｂ６が複数存在するときは、それぞれ同一であっても異なる基であってもよい。）であり、ここで、Ｘｂ１とＸｂ２の両方が存在する場合はそれぞれ一緒になってカルボニル基を形成していてもよく、Ｘｂ３とＸｂ４の両方が存在する場合はそれぞれ一緒になってカルボニル基を形成していてもよく、Ｘｂ５は、水素原子、ハロゲン原子又はアルキル基であり、
Ｅｂ１は、窒素原子又は硫黄原子であり、
Ｅｂ２及びＥｂ３は、それぞれ独立して、炭素原子又は窒素原子であり、
ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕは、それぞれ独立して、０又は１であり、
Ｅｂ１とＥｂ３との間の二重破線及びＥｂ２とＥｂ３との間の二重破線は、それぞれ独立して、単結合又は二重結合であり、上記ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕの値並びにＥｂ１とＥｂ３との間の二重破線及びＥｂ２とＥｂ３との間の二重破線の結合は、Ｅｂ１〜Ｅｂ３の原子価に応じて適宜定まる値及び結合を示す。）
上記アルキル基としては、直鎖状又は分岐状のアルキル基が挙げられ、炭素原子数１〜３のアルキル基が好ましい。
【００２７】
なお、各有機アミン化合物の塩としては、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素塩、ふっ化水素酸塩、ほうふっ化水素酸塩、しゅう酸塩、乳酸塩、アジピン酸塩、酒石酸塩、よう化水素酸塩、トルエンスルホン酸塩、マロン酸塩、重炭酸塩など特に制限は無いが、本発明の効果以外に試薬としての取扱い易さや入手のしやすさ等を勘案して適宜選ぶことができる。
【００２８】
上記カオトロピック試薬、有機アミン化合物等の免疫凝集促進剤による処理としては、室温（例えば、２５℃）もしくは加温条件下（例えば、３５℃以下）にて適切な濃度（例えば、１０ｍＭ〜３０００ｍＭ）の免疫凝集促進剤により適切な時間（例えば、５〜６０分間）処理する方法が挙げられ、非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰに対して酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が高い条件を達成する観点、及び３５℃以下の範囲では、測定感度の差異が小さい観点から、室温もしくは３５℃以下の加温条件下にて任意の濃度の免疫凝集促進剤により処理する方法が好ましく、室温もしくは３３℃以下の加温条件下にて任意の濃度の免疫凝集促進剤により処理する方法がより好ましく、室温もしくは３０℃以下の加温条件下にて任意の濃度の免疫凝集促進剤により処理する方法が更に好ましく、室温もしくは２８℃以下の加温条件下にて任意の濃度の免疫凝集促進剤により処理する方法が特に好ましく、室温（例えば、２５℃）にて任意の濃度の免疫凝集促進剤により処理する方法が最も好ましい。典型的には、１０００ｍＭのベンズアミジン塩酸塩又は１５００ｍＭの塩化グアニジニウムにて２５℃１０分間処理することが挙げられる。
上記カオトロピック試薬、有機アミン化合物等の免疫凝集促進剤は１種単独で用いても、複数種を混合して用いてもよい。
【００２９】
ＳＤＳ等の界面活性剤による処理としては、低温（例えば、２５℃以下）にて適切な低濃度（例えば、０．１２質量／体積％以下）の界面活性剤により適切な短時間（例えば、４分未満）処理する方法が挙げられる。
【００３０】
第１の態様に係るＬ−ＦＡＢＰを定量する方法は、上記非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰに対して酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が高い条件よりも、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件にて上記Ｌ−ＦＡＢＰを定量する工程を更に含むことが好ましい。
酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件として、例えば、５０ｍＭのＡＡＰＨにて３７℃６０分間処理した酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰと、未処理の非酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰとを、「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テストＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス株式会社製）の抗体を使用してＥＬＩＳＡ測定し、標識抗体の発色強度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定した場合に、濃度２５ｎｇ／ｍｌにおいて、非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰに対して酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が０．８倍以上１．４倍未満（好ましくは０．９倍以上１．２５倍以下）の条件が挙げられる。
【００３１】
上記測定感度差が小さい条件では、Ｌ−ＦＡＢＰの一次構造を維持した状態で水素結合、ジスルフィド結合等を切断することによりその立体構造が変性している。これにより、抗体がＬ−ＦＡＢＰ分子の内部領域と結合する場合であってもＬ−ＦＡＢＰの酸化状態に影響されることなく、高感度かつ特異的にＬ−ＦＡＢＰを検出ないし定量することができる。
このような条件は、種々のタンパク質変性剤を適切な使用条件との組合せで使用することで形成可能であり、タンパク質変性作用の強い物質を用いることは、使用条件の自由度が高くなる点で好ましい。ただし、タンパク質変性作用の穏やかな物質（例えば、上記の免疫凝集促進剤）を用いても、使用条件の自由度が相応に低くはなる（高濃度、高温、長時間等の制約が加わる）が、上記条件形成が可能であり得る。
この観点で、界面活性剤が好ましく、具体的にはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が好ましい。
ここでいう「未処理の非酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰ」については前述の通りである。
上記変性処理としては、室温（例えば、２５℃）もしくは加温条件下（例えば、３７℃）にて適切な濃度（例えば、０．２質量／体積％（ｗ／ｖ％）〜１０質量／体積％、好ましくは０．４質量／体積％（ｗ／ｖ％）以上、０．５質量／体積％（ｗ／ｖ％）以上、又は０．７質量／体積％（ｗ／ｖ％）以上であってよい。）の界面活性剤により適切な時間（例えば、５〜６０分間）処理する方法が挙げられる。典型的には、１ｗ／ｖ％のＳＤＳにて２５℃１０分間変性処理することが挙げられる。
【００３２】
免疫凝集促進剤による処理としては、加温条件下（例えば、３７℃以上）にて適切な高濃度（例えば、３５００ｍＭ）の免疫凝集促進剤により適切な長時間（例えば、８０分間）処理する方法が挙げられる。
【００３３】
本明細書及び特許請求の範囲において、検体中Ｌ−ＦＡＢＰの全濃度（酸化型Ｌ−ＦＡＢＰと、非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰとの総和）に対する検体中の酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの比率を「Ｌ−ＦＡＢＰの酸化率」と定義することができる。
精度の観点から、第１の態様に係るＬ−ＦＡＢＰを定量する方法は、上記測定感度差が小さい条件における上記Ｌ−ＦＡＢＰの測定値と、上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が高い条件における測定値とに基づき、検体中のＬ−ＦＡＢＰ中の酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含むことが好ましい。
「Ｌ−ＦＡＢＰの酸化率」は、上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件におけるＬ−ＦＡＢＰの測定値（例えば、標識強度）に対する上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が高い条件における測定値の比（例えば、下記式で表される吸光度比（ＯＤ比））に略対応し得る。
上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が高い条件におけるＯＤ値／上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件におけるＬ−ＦＡＢＰのＯＤ値
【００３４】
また、「Ｌ−ＦＡＢＰの酸化率」は、例えば、下記式のように表すこともできる。
（ａＸ+ｂＹ）（ＯＤ値）／Ｌ−ＦＡＢＰの全濃度（ＯＤ値）
（上記式中、ａ、ｂは係数を表し、Ｘは酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの濃度を表し、Ｙは非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの濃度を表す。）
係数ａは酸化型Ｌ−ＦＡＢＰに対する抗体の反応性を表す係数であることが好ましく、係数ｂは非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰに対する抗体の反応性を表す係数であることが好ましい。
【００３５】
第１の態様に係るＬ−ＦＡＢＰを定量する方法は、検体中の酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値を定量する工程を含み、上記定量する工程が、上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰを定量する工程であることが好ましい。
酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量と相関するパラメータとしては、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量そのものではなく、測定値（例えば、標識強度）から換算して算出されるパラメータが挙げられ、具体的には、非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が高い条件における測定値、「Ｌ−ＦＡＢＰの酸化率」等が挙げられる。
「酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量」の方が、「Ｌ−ＦＡＢＰの酸化率」及び「検体中Ｌ−ＦＡＢＰの全濃度」のそれぞれ単独の定量結果よりも精度が高いからである。
上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの濃度は、上記酸化率と、上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件におけるＬ−ＦＡＢＰの測定値（検体中Ｌ−ＦＡＢＰの全濃度）との積から定量し得る。
【００３６】
第１の態様に係るＬ−ＦＡＢＰを定量する方法において、上記定量は、測定される標識の強度（例えば、吸光度、酵素標識強度、蛍光強度、紫外線強度、放射線強度等）と、Ｌ−ＦＡＢＰの量（例えば、濃度）との関係に基づき検量線を作成し、上記検量線に基づき（例えば、対比して）定量してもしなくてもよい。
【００３７】
≪定量用キット≫
本発明の第２の態様は、Ｌ−ＦＡＢＰを定量し得る物質を含む、第１の態様に係るＬ−ＦＡＢＰを定量する方法に用いる定量用キットである。
第２の態様に係る定量用キットにおいて、Ｌ−ＦＡＢＰを定量し得る物質としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＬＥＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、電気化学発光測免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光抗体法（ＦＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット法（ＷＢ）、イムノブロット法などに基づいてＬ−ＦＡＢＰを定量する物質が挙げられ、具体的には、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体が好ましい。
【００３８】
用いる抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体としては、Ｌ−ＦＡＢＰを認識し得る限り特に制限はなく、公知の抗体であってもよく、今後開発される抗体であってもよい。例えば、上記変性処理、上記メチオニンの酸化等により外部へ曝露される部位を認識する抗体が挙げられる。
【００３９】
上記定量手段として、より詳細には、抗原（Ｌ−ＦＡＢＰ）に対する認識部位が異なる２種類の抗体を組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法を採用したアッセイ系が好ましい。
認識部位が異なる２種類の抗体については上述した通りである。
【００４０】
上記定量手段としては、試薬として上記抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を含むことが好ましく、標識抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を更に含むことがより好ましく、必要に応じて吸着防止剤（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、スキムミルク、ポリエチレングリコール等）、前処理液（任意の界面活性剤、任意の緩衝液等）、反応緩衝液（任意の緩衝液等）、発色基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、過酸化水素水等）等を含んでいてもよい。
上記定量手段における吸着防止剤の含有量としては本発明の効果を損なわない限りにおいて特に制限はないが、０．０５〜１０質量％であることが好ましい。
【００４１】
上記定量手段として、抗原に対する認識部位が異なる２種類の抗体を組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いたキットであることが好ましく、固相に抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローンＬ、標識抗体に抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローン２を使用しているキットであることがより好ましい。
【００４２】
第２の態様に係る定量用キットは、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体により定量を行なう場合、定量に先だって、界面活性剤によりＬ−ＦＡＢＰを変性する手段を備えることが好ましい。
第２の態様に係る定量用キットは、上記検体中のＬ−ＦＡＢＰを界面活性剤により変性処理する手段、及び
上記変性処理後のＬ−ＦＡＢＰを定量する手段を更に備えることがより好ましい。
上記界面活性剤としては、上述の通りである。
【００４３】
第２の態様に係る定量用キットは、検体中のＬ−ＦＡＢＰないし酸化型Ｌ−ＦＡＢＰを免疫凝集促進剤（好ましくはカオトロピック試薬又は有機アミン化合物）により処理する手段を更に備え、かつ上記定量する手段が上記処理後のＬ−ＦＡＢＰを定量する手段であることが好ましい。
【００４４】
第２の態様に係る定量用キットが、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いたキットである場合の具体的態様としては、例えば、下記（１）〜（１０）を含むキットが挙げられる。
（１）Ｌ−ＦＡＢＰ抗体固相化マイクロプレート……抗ヒトＬ−ＦＡＢＰマウスモノクローナル抗体結合ウェル（例えば、クローンＬ産生細胞株由来）
（２）変性処理液（例えば、任意の界面活性剤）
（３）免疫凝集促進剤処理液（例えば、カオトロピック試薬、有機アミン化合物）
（４）反応緩衝液
（５）酵素標識抗体……パーオキシダーゼ標識抗ヒトＬ−ＦＡＢＰマウスモノクローナル抗体（例えば、クローン２産生細胞株由来）
（６）酵素基質液
（７）洗浄剤（任意の緩衝液、界面活性剤等）
（８）反応停止液（１Ｎ硫酸等）
（９）標準緩衝液（任意の緩衝液等）
（１０）肝型脂肪酸結合タンパク質標品
（１０）肝型脂肪酸結合タンパク質標品の濃度としては特に制限はなく、例えば、１０〜１００００ｎｇ／ｍＬが挙げられ、５０〜５０００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１００〜１０００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、２００〜８００ｎｇ／ｍＬが更に好ましく、３００〜６００ｎｇ／ｍＬが特に好ましい。
【００４５】
第２の態様に係る定量用キットは、タンパク吸着防止を目的としてＢＳＡを含有するタンパク質保存緩衝液を含むことが好ましい。例えば、下記タンパク質保存緩衝液が挙げられる。
（タンパク質保存緩衝液）
１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３
【００４６】
≪腎疾患の検査方法≫
本発明の第３の態様は、抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰに対して酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が高い条件において、被験者（例えば、患者）から採取した尿中のＬ−ＦＡＢＰを定量する工程を含む腎疾患の検査方法である。
また、本発明の第４の態様は、被験者から採取した尿中の酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値を、抗原抗体反応を促進する処理後に定量する工程を含む腎疾患の検査方法であり、上記定量する工程が、上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量を定量する工程であることが好ましい。
酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量と相関するパラメータとしては、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量そのものではなく、測定値（例えば、標識強度）から換算して算出されるパラメータが挙げられ、具体的には、上述した非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が高い条件における測定値、上述した「Ｌ−ＦＡＢＰの酸化率」等が挙げられる。
【００４７】
第３及び４の態様に係る腎疾患の検査方法において、非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰを含んでいてもいなくてもよく、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの混合物であってもよいが、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの混合物又は酸化型Ｌ−ＦＡＢＰが好ましい。
第３及び４の態様に係る腎疾患の検査方法において、上記腎疾患は、ＣＫＤ及びＡＫＩよりなる群から選択される少なくとも１種の腎疾患が好ましく、ＡＫＩがより好ましい。
Ｌ−ＦＡＢＰないし酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの検出ないし定量等の測定方法としては、≪Ｌ−ＦＡＢＰを定量する方法≫について上述した具体例及び好ましい例と同様のものが挙げられる。
第３及び４の態様に係る腎疾患の検査方法において、上記腎疾患の検査が、疾患の進行状況の判断、治療方針の参考にされることはもちろんであるが、腎疾患の重篤度の判定、腎疾患発症リスクの予測及び腎疾患進行のモニタリングよりなる群から選択される少なくとも１種の検査が好ましく、腎疾患の予後の重篤度の判定、腎疾患発症リスクの予後予測及び腎疾患進行のモニタリングによる予後予測よりなる群から選択される少なくとも１種の検査がより好ましい。
【００４８】
第４の態様に係る腎疾患の検査方法において、上記定量が、非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が高い条件における定量であることが好ましい。
非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が高い条件の具体例及び好ましい例としては、≪Ｌ−ＦＡＢＰを定量する方法≫について上述した具体例及び好ましい例と同様のものが挙げられる。
【００４９】
第３及び４の態様に係る腎疾患の検査方法は、上記非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が高い条件よりも、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件にて上記Ｌ−ＦＡＢＰを定量する工程を更に含むことが好ましい。
酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件の具体例及び好ましい例としては、≪Ｌ−ＦＡＢＰを定量する方法≫について上述した具体例及び好ましい例と同様のものが挙げられる。
【００５０】
第３及び４の態様に係る腎疾患の検査方法において、上記定量は、測定される標識の強度（例えば、吸光度、酵素標識強度、蛍光強度、紫外線強度、放射線強度等）と、Ｌ−ＦＡＢＰの量（例えば、濃度）との関係に基づき検量線を作成し、上記検量線に基づき（例えば、対比して）定量してもしなくてもよい。
【００５１】
本発明の第５の態様は、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の正常範囲、又は腎疾患における酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の範囲と、被験者の尿中の酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、被験者における上記量若しくはそれと相関するパラメータの値が、上記範囲のいずれに該当するかを決定する工程を含む、被験者における酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値に基づく腎疾患の検査方法である。
【００５２】
第３〜５の態様に係る腎疾患の検査方法は、ＲＯＣ（受信者動作特性）解析結果として、曲線下面積（ＡＵＣ）が０．６５０以上で検査し得ることが好ましく、０．７００以上で検査し得ることがより好ましく、０．７１０以上で検査し得ることが更に好ましい。
【００５３】
第３〜５の態様に係る腎疾患の検査方法は、Ｌ−ＦＡＢＰのみの定量結果に基づくことができ、ＣＫＤ又はＡＫＩを評価することができ、ＣＫＤ及びＡＫＩを一貫して評価することもできる。
【００５４】
≪検査キット、コンパニオン診断薬≫
本発明の第６の態様は、Ｌ−ＦＡＢＰないし酸化型Ｌ−ＦＡＢＰを定量し得る物質を含む、第３又は４の態様に係る腎疾患の検査方法に用いる検査キットである。
本発明の第７の態様は、Ｌ−ＦＡＢＰないし酸化型Ｌ−ＦＡＢＰを定量し得る物質を含む、第３又は４の態様に係る腎疾患の検査方法を用いるコンパニオン診断薬である。
本明細書及び特許請求の範囲において、「コンパニオン診断薬」は、個々の腎疾患（例えば、ＣＫＤ、ＡＫＩ）患者に対する医薬品の効果、副作用のリスク、適切な投薬量を予測するために、実際に投薬を開始する前に行う検査で使用される診断薬をいう。
第７の態様に係るコンパニオン診断薬において、腎疾患は、ＣＫＤ及びＡＫＩよりなる群から選択される少なくとも１種の疾患が好ましい。
第６の態様に係る検査キット及び第７の態様に係るコンパニオン診断薬において、Ｌ−ＦＡＢＰ又は酸化型Ｌ−ＦＡＢＰを定量し得る物質の具体例及び好ましい例としては、≪定量用キット≫について上述したものと同様のものが挙げられる。
【００５５】
上記定量手段としては、試薬として上記抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を含むことが好ましく、標識抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を更に含むことがより好ましく、必要に応じて吸着防止剤（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、スキムミルク、ポリエチレングリコール等）、前処理液（任意の界面活性剤、任意の緩衝液等）、反応緩衝液（任意の緩衝液等）、発色基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、過酸化水素水等）等を含んでいてもよい。
上記定量手段における吸着防止剤の含有量としては本発明の効果を損なわない限りにおいて特に制限はないが、０．０５〜１０質量％であることが好ましい。
【００５６】
第６の態様に係る検査キット及び第７の態様に係るコンパニオン診断薬は、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体により定量を行なう場合、定量に先だって、界面活性剤によりＬ−ＦＡＢＰを変性する手段を備えることが好ましい。
界面活性剤によりＬ−ＦＡＢＰを変性する手段の具体例及び好ましい例としては、≪定量用キット≫について上述したものと同様のものが挙げられる。
【００５７】
第６の態様に係る検査キット及び第７の態様に係るコンパニオン診断薬は、尿中のＬ−ＦＡＢＰを免疫凝集促進剤（好ましくはカオトロピック試薬又は有機アミン化合物）により処理する手段を更に備え、かつ上記定量する手段が上記処理後のＬ−ＦＡＢＰを定量する手段であることが好ましい。
【００５８】
第６の態様に係る検査キット及び第７の態様に係るコンパニオン診断薬が、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いたキットである場合の具体的態様としては、例えば、≪定量用キット≫について上記（１）〜（１０）を含むキットが挙げられる。
【００５９】
第６の態様に係る検査キット及び第７の態様に係るコンパニオン診断薬は、タンパク吸着防止を目的としてＢＳＡを含有するタンパク質保存緩衝液を含むことが好ましい。
【実施例】
【００６０】
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
【００６１】
＜参考例１＞
５０ｍＭのＡＡＰＨにて３７℃６０分間処理した様々な濃度の酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰと、未処理の様々な濃度の非酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰとを、それぞれ、１ｗ／ｖ％のＳＤＳにて２５℃１０分間変性処理した後、「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テストＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス株式会社製）の抗体を使用してＥＬＩＳＡ測定を実施し、標識抗体の発色強度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定した。上記検査用キットの使用方法は通常添付されている添付文書に従った測定方法に準じて行った。
結果を図１（ａ）に示す。
【００６２】
一方、ＳＤＳによる変性処理の代わりに１０００ｍＭのベンズアミジン塩酸塩にて２５℃１０分間処理（以下、「ＢＡ処理」ともいう。）すること以外は同様にしてＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果を図１（ｂ）に示す。
また、ＳＤＳによる変性処理の代わりに１５００ｍＭの塩化グアニジニウムにて２５℃１０分間処理（以下、「ＧＵ処理」ともいう。）すること以外は同様にしてＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果を図１（ｃ）に示す。
【００６３】
図１ａ）に示した結果から明らかなように、リコンビナントＬ−ＦＡＢＰの各濃度において、酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰのＯＤ値と、非酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰのＯＤ値とはほぼ同一になることが分かる。
【００６４】
一方、図１（ｂ）及び（ｃ）に示した結果から明らかなように、ＳＤＳによる変性処理の代わりにＢＡ処理又はＧＵ処理した場合は、リコンビナントＬ−ＦＡＢＰの任意の１つの濃度において、非酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰのＯＤ測定感度に対する酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰのＯＤ測定感度が大きいことが分かる。
この測定感度の増大は、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰは抗体が認識するＬ−ＦＡＢＰ内部領域が外部へ曝露される構造変化を起こすことに起因するものと考えられる。
一方、非酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰでは、Ｌ−ＦＡＢＰ内部領域を認識する抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を測定に用いても上記抗体が認識するＬ−ＦＡＢＰ内部領域が外部へ曝露される構造変化を起こしていないことから測定強度が増大していないものと考えられる。
【００６５】
＜実施例１＞
慢性腎疾患（ＣＫＤ）患者及び急性腎疾患（ＡＫＩ）患者の各々の尿検体を用いて、１ｗ／ｖ％のＳＤＳにて２５℃１０分間変性処理した後、「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テストＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス株式会社製）の抗体を使用して尿中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度（ｎｇ／ｍｌ）を測定した。結果を図２（ａ）に示す。
また、ＣＫＤ患者（ｎ＝６）及びＡＫＩ患者（ｎ＝１６）の各々の尿検体を、ＳＤＳによる変性処理の代わりにＢＡ処理すること以外は同様にしてＥＬＩＳＡ測定を実施した。
ＢＡ処理後ＯＤ値／ＳＤＳによる変性処理後ＯＤ値から尿中Ｌ−ＦＡＢＰの酸化率を算出した。結果を図２（ｂ）に示す。
【００６６】
図２（ａ）に示した結果から明らかなように、ＣＫＤ患者及びＡＫＩ患者の尿中Ｌ−ＦＡＢＰの全濃度（ｎｇ／ｍｌ）（酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰを含む。）はほぼ同一であることが分かる。
一方、図２（ｂ）に示した結果から明らかなように、Ｌ−ＦＡＢＰの酸化率は、ＣＫＤ患者に対してＡＫＩ患者では著しく低いことが分かる。この結果は、また、急性腎障害（ＡＫＩ）により細胞内Ｌ−ＦＡＢＰが生理的な条件によらずに尿中に出てきた場合には非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの割合が高く、逆に生理的条件下で尿中に排泄されたＬ−ＦＡＢＰは酸化率が高いことを示しているといえる。
【００６７】
また、図２（ｂ）に示したＣＫＤ患者、ＡＫＩ患者におけるＬ−ＦＡＢＰの酸化率と、図２（ａ）に示したＣＫＤ患者、ＡＫＩ患者における尿中Ｌ−ＦＡＢＰの全濃度との積から、それぞれ、ＣＫＤ患者、ＡＫＩ患者における尿中酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの濃度を定量することができる。
【図１】
2020056621.tif 000005
【図２】
2020056621.tif 000006
【配列表】
2020056621000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月26日(2019.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件において、肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含む肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する方法。
【請求項２】
前記条件において、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質が、２，２’−アゾビズ２−アミジノプロパンにより酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質であり、前記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質が、２，２’−アゾビズ２−アミジノプロパンにより酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記条件が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理によって形成された条件である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件よりも、酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質及び酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度差が小さい条件にて前記肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記測定感度差が小さい条件が、前記検体中の肝型脂肪酸結合タンパク質を界面活性剤による変性処理により形成された条件である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記測定感度差が小さい条件における前記肝型脂肪酸結合タンパク質の測定値と、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における測定値とに基づき、検体中の肝型脂肪酸結合タンパク質中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含む、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法に用いる定量用キット。
【請求項８】
抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件において、被験者の尿中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含む腎疾患の検査方法。
【請求項９】
被験者の尿中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値を、抗原抗体反応を促進する処理後に定量する工程を含む、腎疾患の検査方法。
【請求項１０】
前記定量が、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における定量である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記条件が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理によって形成された条件である、請求項８又は１０に記載の検査方法。
【請求項１２】
前記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件よりも、酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質及び酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度差が小さい条件にて前記肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を更に含む、請求項８、１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記測定感度差が小さい条件が、前記尿中の肝型脂肪酸結合タンパク質を界面活性剤による変性処理により形成された条件である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記測定感度差が小さい条件における前記肝型脂肪酸結合タンパク質の測定値と、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における測定値とに基づき、尿中の肝型脂肪酸結合タンパク質中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の正常範囲、又は腎疾患における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の範囲と、被験者の尿中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、被験者における前記量若しくはそれと相関するパラメータの値が、前記範囲のいずれに該当するかを決定する工程を含む、被験者における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値に基づく腎疾患の検査方法。
【請求項１６】
肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の方法に用いる検査キット。
【請求項１７】
肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の方法に用いるコンパニオン診断薬。
【請求項１８】
肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質からなり、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の方法における定量対象として用いられる腎疾患マーカー。
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月25日(2019.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件において、肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含む肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する方法。
【請求項２】
前記条件において、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質が、２，２’−アゾビズ２−アミジノプロパンにより酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質であり、前記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質が、２，２’−アゾビズ２−アミジノプロパンにより酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記条件が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理によって形成された条件である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件よりも、酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質及び酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度差が小さい条件にて前記肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記測定感度差が小さい条件が、検体中の肝型脂肪酸結合タンパク質を界面活性剤による変性処理により形成された条件である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記測定感度差が小さい条件における前記肝型脂肪酸結合タンパク質の測定値と、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における測定値とに基づき、検体中の肝型脂肪酸結合タンパク質中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含む、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法に用いる定量用キット。
【請求項８】
抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件において、被験者の尿中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含む腎疾患の検査方法。
【請求項９】
被験者の尿中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値を、抗原抗体反応を促進する処理後に定量する工程を含む、腎疾患の検査方法。
【請求項１０】
前記定量が、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における定量である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記条件が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理によって形成された条件である、請求項８又は１０に記載の検査方法。
【請求項１２】
前記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件よりも、酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質及び酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度差が小さい条件にて前記肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を更に含む、請求項８、１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記測定感度差が小さい条件が、前記尿中の肝型脂肪酸結合タンパク質を界面活性剤による変性処理により形成された条件である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記測定感度差が小さい条件における前記肝型脂肪酸結合タンパク質の測定値と、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における測定値とに基づき、尿中の肝型脂肪酸結合タンパク質中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の正常範囲、又は腎疾患における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の範囲と、被験者の尿中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、被験者における前記量若しくはそれと相関するパラメータの値が、前記範囲のいずれに該当するかを決定する工程を含む、被験者における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値に基づく腎疾患の検査方法。
【請求項１６】
肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の方法に用いる検査キット。
【請求項１７】
肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の方法に用いるコンパニオン診断薬。
【請求項１８】
肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質からなり、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の方法における定量対象として用いられる腎疾患マーカー。