(57)【要約】【課題】金属原子の数や組成の自由度が高い、ナノクラスター等の金属含有クラスターを合成する新規な方法を提供する。【解決手段】本発明の金属含有クラスターの製造方法は、複数の同一または別異のアミノ酸残基に同一または別異の金属原子が結合した、前記複数の金属原子を含むメタル化ペプチドを、還元もしくは加水分解するか、またはこれらに準じて化学的に変換することにより、前記複数の金属原子および／またはこれに由来する金属酸化物からなる金属含有クラスターを形成することを特徴としている。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の同一または別異のアミノ酸残基に同一または別異の金属原子が結合した、前記複数の金属原子を含むメタル化ペプチドを、還元もしくは加水分解するか、またはこれらに準じて化学的に変換することにより、前記複数の金属原子および／またはこれに由来する金属酸化物からなる金属含有クラスターを形成する、金属含有クラスターの製造方法。
【請求項２】
前記メタル化ペプチドを担体表面に担持し、次いで還元もしくは加水分解するか、またはこれらに準じて化学的に変換することにより、前記担体表面に前記金属含有クラスターを形成する、請求項１に記載の金属含有クラスターの製造方法。
【請求項３】
前記アミノ酸残基に金属原子が結合した構造は、金属塩化合物（Ａ）と、アミノ酸残基（Ｂ）とのアミド化反応によりこれらが結合したものである、請求項１または２に記載の金属含有クラスターの製造方法。
【請求項４】
前記メタル化ペプチドを固相合成法により合成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の金属含有クラスターの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属含有クラスター、特に金属含有ナノクラスター、および金属含有サブナノクラスターの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
触媒としても使用し得るナノスケールの微粒子の製造方法として、本発明者らによる独自の方法であるフェニルアゾメチンデンドリマーを鋳型として用いる方法が精力的に探索、開発されてきている（特許文献１）。本発明者らにより開発され、その検討が続けられているフェニルアゾメチンデンドリマーは、骨格に高い配位性を示すイミン部位を多数有していることからルイス酸と錯形成が可能である。フェニルアゾメチンデンドリマーは、イミンからの電子供与が末端から中心に向けて連続的に加算されることで、末端のイミンから中心に向かってイミンの電子密度が増加するという電子密度勾配を有している。この電子密度勾配によって、フェニルアゾメチンデンドリマーに金属塩が錯形成する際、最内層イミンから優先的に金属塩と錯形成していく段階的錯形成が起こる。フェニルアゾメチンデンドリマーの段階的錯形成能を利用することで、白金塩等の１種単独の一元系をはじめとして、各層にそれぞれ異なる金属種を集積する、２種金属塩を用いた二元系や、更には３種、４種、５種等の多元系の精密へテロ金属集積も可能となり、金属塩の個数および組成を規定したデンドリマー錯体を調製できる。この金属塩が配位したデンドリマー錯体を還元することで、粒径分布が極めて小さい精密に制御された金属含有サブナノクラスターの形成が可能となる（特許文献２〜５）。
【０００３】
金属原子数が十数個程度の金属含有サブナノクラスターは、本発明者らの研究によって、その物理的性質、化学的性質が、構成原子数や種類に大きく依存することが明らかにされている（非特許文献１、２）。このような観点より、構成原子数とその種類を規定した合成法が望まれている。しかし、フェニルアゾメチンデンドリマーを鋳型として用いる方法は、金属の錯形成定数に依存して集積するため、金属の数や組成をより細かく設計してサブナノクラスターを形成することには限界があった。
【０００４】
非特許文献３は、複数のアミノ酸残基に金属が結合したメタル化ペプチドの合成を報告している。しかしながら、ナノクラスターのような金属含有クラスターを合成する観点においては、メタル化ペプチドに着目した例は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４５１１１２５号公報
【特許文献２】特開２０１０−１８６１０号公報
【特許文献３】特開２０１３−１５９５８８号公報
【特許文献４】特開２００７−２３１６６号公報
【特許文献５】特開２０１８−１４５１７２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】K. Yamamoto et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 9810-9815.
【非特許文献２】K. Yamamoto et al. Sci. Adv. 2017, 3, e1700101.
【非特許文献３】Chem. Lett. 2014, 43, 1167-1169.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
更に、金属含有ナノクラスター／ナノ粒子触媒の元素を自由自在に制御できる全自動合成法が望まれている。ペプチドはメリーフィールド固相合成法などを基盤とした自動合成法が確立されており、装置も市販されている。ペプチドを鋳型として活用することで金属含有ナノクラスター／ナノ粒子触媒の自動合成が可能になると考えられる。
【０００８】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、金属原子の数や組成の自由度が高い、ナノクラスター等の金属含有クラスターを合成する新規な方法を提供することを課題としている。
また自動合成を可能とすることで触媒探索の高速化に資する方法も提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意検討した結果、ペプチドをテンプレートとして、複数の同一または別異の金属原子を含むメタル化ペプチドを形成することにより、金属原子の数や組成の自由度が高く、特に単分散なクラスターを合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の金属含有クラスターの製造方法は、複数の同一または別異のアミノ酸残基に同一または別異の金属原子が結合した、前記複数の金属原子を含むメタル化ペプチドを、還元もしくは加水分解するか、またはこれらに準じて化学的に変換することにより、前記複数の金属原子および／またはこれに由来する金属酸化物からなる金属含有クラスターを形成することを特徴としている。
また本発明の金属含有クラスターの製造方法は、前記メタル化ペプチドを固相合成法により合成することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、金属原子の数や組成の自由度が高い、ナノクラスターやサブナノクラスター等の金属含有クラスターを合成する新規な方法が提供される。
またメタル化ペプチドを固相合成法により自動合成の方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】（ａ）は実施例において合成したＰｔＬ−ＮＨ2のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトル、（ｂ）はその1Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図２】実施例において合成したＦｍｏｃ−ＧｌｕＰｔＬ−ＯＡｌｌのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。
【図３】実施例において合成したＦｍｏｃ−（Ｇｌｕ−ＰｔＬ）4−ＯＡｌｌのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである（（ａ）は精製前、（ｂ）は精製後）。
【図４】Ｆｍｏｃ−（Ｇｌｕ−ＰｔＬ）4−ＯＡｌｌ／ＫＢ（０．０５ｗｔ％）の錯体モデル（ａ）とＨＡＤＤＦ−ＳＴＥＭ像（ｂ）である。ペプチドは溶媒にＴＨＦを用いてＫＢに担持した。
【図５】Ｐｔ4クラスター／ＫＢのＨＡＤＤＦ−ＳＴＥＭ像である。
【図６】Ｆｍｏｃ−（Ｇｌｕ−ＰｔＬ）4−ＯＡｌｌ／ＫＢ（０．０５ｗｔ％）のＨＡＤＤＦ−ＳＴＥＭ像である。ペプチドは溶媒にＤＭＦを用いてＫＢに担持した。
【図７】Ｆｍｏｃ−（Ｇｌｕ−ＰｔＬ）4−ＯＡｌｌ／ＫＢ（０．０５ｗｔ％）のＨＡＤＤＦ−ＳＴＥＭ像である。ペプチドは溶媒にＣＨ3Ｃｌを用いてＫＢに担持した。
【図８】Ｆｍｏｃ−（Ｇｌｕ−ＰｔＬ）4−ＯＡｌｌの焼成前後のＸＰＳスペクトルである（（ａ）は焼成前、（ｂ）は焼成後）。
【図９】焼成時間を変更して測定したＦｍｏｃ−（Ｇｌｕ−ＰｔＬ）4−ＯＡｌｌの焼成後のＸＰＳスペクトルである。焼成前の結果も併せて示している。
【図１０】焼成温度を変更して測定したＦｍｏｃ−（Ｇｌｕ−ＰｔＬ）4−ＯＡｌｌの焼成後のＸＰＳスペクトルである。焼成前の結果も併せて示している。
【図１１】（ａ）は実施例において合成したＦｍｏｃ−（Ｅ−ＮＨ−Ｐｔ）−ＣＯＯＨのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトル（マトリックス：４−ニトロアニリン）、（ｂ）はＨＰＬＣ分析結果（検出器：２１４ｎｍ）である。
【図１２】実施例において合成したＮＨ2−（Ｅ−ＮＨ−Ｐｔ）−ＣＯＯＨのＨＰＬＣ分析結果（検出器：２１４ｎｍ）である。
【図１３】（ａ）は実施例において合成したＮＨ2−（Ｅ−ＮＨ−Ｐｔ）2−ＣＯＮＨ2のＨＰＬＣ分析結果（検出器：２１４ｎｍ）、（ｂ）は粗生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトル（マトリックス：ＣＨＣＡ）である。
【図１４】実施例において合成したＮＨ2−（Ｅ−ＮＨ−Ｐｔ）4−ＣＯＯＨのＨＰＬＣ分析結果（検出器：２１４ｎｍ）である。
【図１５】実施例において合成したＮＨ2−（Ｅ−ＮＨ−Ｐｔ）n−ＣＯＯＨ（ｎ＝１−４,６）を同じ分析ＨＰＬＣ条件（検出器：２１４ ｎｍ）で比較した結果である。
【図１６】実施例において合成したＮＨ2−（Ｅ−ＮＨ−Ｐｔ）12−ＣＯＯＨのＨＰＬＣ分析結果（検出器：２１４ｎｍ）である。
【図１７】（ａ）はＰＲＥＰ ＨＰＬＣで精製したＮＨ2−（Ｅ−ＮＨ−Ｐｔ）3−ＣＯＮＨ2のＨＰＬＣ分析結果（検出器：２１４ ｎｍ）、（ｂ）は各マトリックスを使用した精製ＮＨ2−（Ｅ−ＮＨ−Ｐｔ）12−ＣＯＯＨのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトル（マトリックス：ＤＣＴＢ、ＣＨＣＡ、４−ニトロアニリン、ジトラノール）である。
【図１８】Ｐｔ12ペプチド／ＫＢ（ケッチェンブラック） ５ｗｔ％の原子分解能ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭ像である。
【図１９】（ａ）はＰｔ12ペプチド／ＫＢ ５ｗｔ％の拡大視野で観察された画像（ｂ）はＧａｕｓｓｉａｎ Ｖｉｅｗで描かれたＰｔ12ペプチドの分子モデル、（ｃ）はＧａｕｓｓｉａｎ Ｖｉｅｗで描かれたＰｔ12ペプチドの白金の位置である。
【図２０】（ａ）はＰｔ12 サブナノ粒子／ＫＢ ２ｗｔ％の原子分解能ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭ像、（ｂ）は原子数が正確にカウントされるＰｔ12 サブナノ粒子、（ｃ）は観測されたサブナノ粒子サイズ分布である。
【図２１】（ａ）は実施例において合成したＮＨ2−（Ｅ−ＮＨ−Ｐｔ）19−ＮＨ2のＨＰＬＣ分析結果（検出器：２１４ ｎｍ）、（ｂ）は粗生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトル（マトリックス：ＤＣＴＢ）である。
【図２２】Ｐｔ19 サブナノ粒子／ＫＢ ０．４７ｗｔ％＠Ｐｔの原子分解能ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭ像であり、（ａ）は全体的な視野［１］スケールバー：５ｎｍ（ｂ）別の全体的な視野［２］スケールバー：１０ｎｍである。
【図２３】実施例におけるトルエン酸化の触媒反応において、各生成物の収率合計から計算された総収率である。０．４７ｗｔ％の推定金属担持量に基づいて、すべての収率を評価した。
【図２４】（ａ）は実施例において合成したＦｍｏｃ−（Ｅ−ＮＨ−ｐｙＬ）−ＯＡｌｌの1Ｈ ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ, ＤＭＳＯ−ｄ6）、（ｂ）はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトル（マトリックス：ＤＣＴＢ）である。
【図２５】実施例において合成したＮＨ2−（Ｅ−ＮＨ−（ｐｙＬ−Ｉｒ））−ＣＯＯＨのＨＰＬＣ分析結果（検出器：２１４ｎｍ）である。
【図２６】樹脂から切断後のＮＨ2−（Ｅ−ＮＨ−（ｐｙＬ−Ｉｒ））−ＣＯＮＨ2のＨＰＬＣ分析結果（検出器：２１４ｎｍ）である。
【図２７】実施例において合成したＮＨ2−（Ｅ−ＮＨ−Ｐｔ）3−（Ｅ−ＮＨ−（ｐｙＬ−Ｉｒ））3−ＣＯＮＨ2のＨＰＬＣ分析結果（検出器：２１４ｎｍ）である。
【図２８】ＮＨ2−（Ｅ−ＮＨ−Ｐｔ）3−（Ｅ−ＮＨ−（ｐｙＬ−Ｉｒ））3−ＣＯＮＨ2の焼成前および焼成後のＸＰＳスペクトルである。
【図２９】Ｐｔ3Ｉｒ3 サブナノ粒子／ＫＢ ２ｗｔ％の原子分解能ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭ像であり、（ａ）は広視野像、（ｂ）は約０．６ｎｍのＰｔ3Ｉｒ3 サブナノ粒子である。
【図３０】（ａ）はＰｔ3Ｉｒ3サブナノ粒子のＥＤＳマッピング、（ｂ）は視野内の元素のＥＤＳスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本発明を詳細に説明する。
（メタル化ペプチド）
本発明に使用されるメタル化ペプチド（メタロペプチドという場合もある。）は、複数の同一または別異のアミノ酸残基に金属原子が結合した、前記複数の同一または別異の金属原子を含む。
【００１４】
複数のアミノ酸残基に複数の金属原子が結合した形態は、金属原子が錯形成、イオン結合、共有結合した形態を含む。典型的な例において、金属原子が錯形成により複数のアミノ酸残基に結合する。
【００１５】
金属原子としては、特に限定されず、例えば、チタン、バナジウム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ガリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、インジウム、錫、アンチモン、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、金、水銀、ビスマス等が挙げられる。これらは１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。２種以上を組み合わせて使用した場合には、合金クラスターを形成し得る。
【００１６】
メタル化ペプチドは、例えば、次式（Ｉ）の構造を含む。
【００１７】
【化１】
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（式中、Ｒ1はアミノ酸残基を示し、ｎは２以上の整数を示す。ｎ個のＲ1は各々同一でも異なっていてもよく、ｎ個のＲ1のうち少なくとも２個以上はアミノ酸残基に金属原子が結合している。）
【００１８】
メタル化ペプチドの構成単位は、アミノ酸および／またはアミノ酸誘導体である。メタル化ペプチドは、そのような構成単位のオリゴマーまたはポリマーであってよい。ここでオリゴマーとは、概ね１０個以下のアミノ酸残基がペプチド結合により結合したオリゴペプチドをいう。ポリマーとは、概ね１１個以上のアミノ酸残基がペプチド結合により結合したポリペプチドをいう。
【００１９】
本発明において「アミノ酸」とは、分子内にアミノ基（−ＮＨ2）とカルボキシ基とを持つ化合物をいい、一般的なアミノ酸の定義のとおり、アミノ基の水素が分子内の他の部分と置換して二級アミンとなった環状化合物であるイミノ酸も包含する。
【００２０】
本発明において「アミノ酸誘導体」とは、上記アミノ酸において、いずれかの基が修飾または置換された構造を有する化合物をいう。例えば、生体を構築する成分である天然に存在するアミノ酸誘導体等が挙げられる。
【００２１】
メタル化ペプチドにおけるアミノ酸残基の数は、２以上であれば特に限定されず、例えば１００以下である。ナノクラスターを合成する観点では、金属原子と結合するアミノ酸残基の数は３以上が好ましく、４以上がより好ましい。また、６０以下が好ましく、５０以下がより好ましい。典型的な例において、メタル化ペプチドにおけるアミノ酸残基の全てが、金属原子と結合するアミノ酸残基である。
【００２２】
本発明においてメタル化ペプチドは、アミノ酸および／またはアミノ酸誘導体の構成単位を有するものであれば、他の構造部位は特に限定されない。例えば、末端は本発明の効果を損なわない限りにおいて任意の有機基等であってよく、合成経路の便宜等に応じて適宜のものであってよい。
【００２３】
メタル化ペプチドの由来であるアミノ酸としては、特に限定されず、例えば、天然のタンパク質を構成する２０種のα−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸およびδ−アミノ酸等が挙げられる。
【００２４】
金属原子と結合するアミノ酸残基を有する観点において、メタル化ペプチドの由来であるアミノ酸およびアミノ酸誘導体は、反応性の官能基を残基に有することが好ましい。この反応性の官能基は、金属塩化合物の反応性の官能基と反応させることにより、金属原子と結合するアミノ酸残基を形成する。反応性の官能基としては、例えば、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、チオール基、ホスホン酸基等が挙げられる。このような反応性の官能基を残基に有するアミノ酸としては、例えば、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン等が挙げられる。また反応性の官能基を残基に有するアミノ酸誘導体としては、例えば、クレアチン、オルニチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、ホスホセリン、テアニン、カイニン酸、トリコロミン酸等が挙げられる。
【００２５】
メタル化ペプチドにおけるアミノ酸残基に金属原子が結合した構造は、例えば、金属塩化合物（Ａ）と、アミノ酸残基（Ｂ）との反応によりこれらが結合したものである。当該反応としては、例えば、上記の反応性の官能基による縮合反応、特に、アミド化反応、エステル化反応等が挙げられる。
【００２６】
これらの中でも、塩基による脱保護を行う際に加水分解により結合が分解してしまうことを抑制する観点より、アミノ酸残基に金属原子が結合した構造は、金属塩化合物（Ａ）と、アミノ酸残基（Ｂ）とのアミド化反応によりこれらが結合したものであることが好ましい。主鎖のペプチドと同じ結合である当該結合は安定性が向上する。この場合、例えば、金属塩化合物（Ａ）とアミノ酸残基（Ｂ）のうちいずれか一方がアミノ基を有し、他方がカルボキシル基を有する。
【００２７】
金属塩化合物（Ａ）は、例えば、Ｍ−Ｒ2で表される。ここでＭは金属、Ｒ2は金属原子Ｍの残余の化学構造を示す。Ｒ2は、Ｍの価数に応じて単数もしくは複数の結合形態であってよい。Ｒ2全体の質量は、特に限定されないが、例えば、原子量換算で４００以下、３００以下、あるいは２００以下であってよい。
【００２８】
金属塩化合物（Ａ）は、金属とアニオンとの塩、配位子との錯体等を含む広義のものである。金属塩化合物におけるカウンターアニオンもしくは配位子としては、特に限定されないが、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲンイオンや、トリフルオロメタンスルホン酸、酢酸、アセチルアセトン、サレン、シクロペンタジエニル等が挙げられる。これらの他、アミノ酸残基（Ｂ）における上記の反応性の官能基と反応する官能基を持つ有機基を好ましく含む。
【００２９】
金属塩化合物（Ａ）のうち好ましい例としては、次式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）で表されるものが挙げられる。
【００３０】
【化２】
2020151706.tif 000004
（式中、Ｒa〜Ｒeは水素原子または置換基を示し、Ｘは金属原子Ｍの残余の化学構造を示し、ＲAは、アミド結合またはエステル結合を形成し得る官能基を含む基を示す。）
【００３１】
【化３】
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（式中、Ｒf〜Ｒlは水素原子または置換基を示し、Ｘは金属原子Ｍの残余の化学構造を示し、ＲAは、アミド結合またはエステル結合を形成し得る官能基を含む基を示す。）
【００３２】
Ｒa〜Ｒlが置換基である場合、置換基としては、特に限定されないが、例えば、塩素原子、臭素原子、フッ素原子等のハロゲン原子、メチル基、エチル基等のアルキル基（例えば炭素数１〜６）、結合部位がヘテロ元素で炭素を含まないヘテロ元素含有基（ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、チオール基等）や、ハロゲン原子、酸素含有基（ヒドロキシ基、オキソ基、エーテル基、カルボキシル基、アルデヒド基等）、窒素含有基（シアノ基、１級〜３級アミノ基、ニトロ基等）、硫黄含有基、リン含有基等のヘテロ元素含有基で炭素原子が置換もしくは基端やＣ−Ｃ結合が中断されたアルキル基（例えば炭素数１〜６）等が挙げられる。これらの置換基は、１個または複数個有していてよい。その中でも、Ｒa〜Ｒlの置換基は１個以下が好ましく、置換基を有しないことがより好ましい。
【００３３】
Ｘとしては、例えば、カウンターアニオンもしくは配位子等が挙げられる。
【００３４】
ＲAは、特に限定されないが、例えば、アミド結合またはエステル結合を形成し得る官能基を置換基として含む炭化水素基（例えば炭素数１〜２０）、例えば脂肪族炭化水素基、芳香族炭化水素基、脂環式炭化水素基等が挙げられる。
【００３５】
ＲAの官能基は、上記したように、塩基による脱保護を行う際に加水分解により結合が分解してしまうことを抑制する観点より、アミド結合を形成する基が好ましい。アミノ酸残基（Ｂ）における反応性の官能基がカルボキシル基である場合にはアミノ基が好ましい。
【００３６】
上記式（ＩＩ）においては、フェニルアゾメチン構造におけるアゾメチン結合を形成するイミン窒素原子と炭素原子および該炭素原子に結合するフェニル環と、金属塩化合物の金属原子Ｍとの間で、環状構造を形成している。この環状構造は、金属原子が強固な結合を形成し、金属原子の結合安定性に優れる。上記式（ＩＩＩ）においては、ピリジンを含む構造で同様に環状構造を形成している。この環状構造は、イミン部位の分解がなく水系でも使用可能で、強酸への耐性にも優れる。
【００３７】
本発明においてメタル化ペプチドは、ペプチドを合成した後、金属塩化合物（Ａ）と、アミノ酸残基（Ｂ）とを反応させる液相合成や、金属塩化合物（Ａ）とアミノ酸またはその誘導体におけるアミノ酸残基（Ｂ）との反応によりこれらを結合し、予めメタル化アミノ酸またはその誘導体を合成した後、逐次合成する固相合成法によって製造される。
【００３８】
液相合成法（Liquid-Phase Peptide Synthesis）は、一度に反応点を修飾可能で、簡易に合成できる利点がある。
【００３９】
固相合成法（Solid-Phase Peptide Synthesis）は、逐次合成が可能であることから、金属クラスターの組成に自由度がある。高収率、短時間での合成が可能で、長鎖であっても、ラセミ化や反応点が現れにくいといった反応性の低下を抑制できる。固相合成法によれば、多元素多核錯体シーケンスを合成し、それをテンプレートとして還元することによって、サイズ選択性を持ち、かつ自由な組成の多元素クラスターを合成することができる。すなわち、ステップバイステップで行うことで、種々の金属と配列をプログラミングしたペプチドを合成し、自由な組成で、その鎖の長さを伸ばしたペプチドテンプレートを設計することができる点で大きな利点を持つ。ペプチド固相合成法は、コンビナトリアルケミストリーや自動合成、バーチャルライブラリ等に応用されており、テンプレートの自由組成という点において実績のある方法である。
【００４０】
固相合成法の一例では、表面をアミノ基で修飾したポリスチレン高分子ゲルのビーズ等を固相として用い、ここから脱水反応によって１個ずつメタル化アミノ酸鎖を伸長していく。目的とするペプチドの配列が出来上がったら固相表面から切り出し、目的の物質を得る。固相合成法ではＣ末端側からＮ末端側へ向かって合成が進められる。従って、Ｃ末端アミノ酸を担体に固定して合成が開始される。アミノ酸が自己縮合してジケトピペラジン体になったり、オリゴマーが生成してからペプチドと反応したりすることを防止するために、アミノ基の保護としてＦｍｏｃ基、Ｂｏｃ基等が使用される。またアミド結合形成反応には、縮合剤としてＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ等のウロニウム系縮合剤、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールとＮ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミドの組み合わせや、ジイソプロピルカルボジイミド等のカルボジイミド系縮合剤等を用いることができる。固相表面とメタル化アミノ酸との反応が終了したら、固相を溶媒で洗浄して残存するアミノ酸等を除去する。その後、固相に結合しているメタル化アミノ酸の保護基を除去（脱保護）すると、次の反応点となるアミノ基が再び固相表面に出現する。使用するメタル化アミノ酸を適宜に変更しながらこの手順を繰り返すことで、目的とする配列をもつメタル化ペプチドを精度よく合成することができる。この手順を自動化した、自動合成機も使用可能となっている。
【００４１】
固相合成の流れについて、１２残基の白金ペプチドを例として説明する。この例において、メタル化ペプチドを合成するためのＰｔユニット(白金錯体結合アミノ酸)は、式（ＩＩ）で表される構造を有し、金属塩化合物（Ａ）と、アミノ酸残基（Ｂ）との反応によりこれらが結合したものである。固相合成から１２原子のＰｔサブナノ粒子の合成まで流れは大きく以下の３つようになっている。
(1)ペプチドの側鎖につなげる金属錯体を合成、そしてこれをグルタミン酸に結合させた人工のアミノ酸を合成する。
(2)続いて、合成したアミノ酸を固相合成法にて縮合し樹脂から切り出し１２残基の白金ペプチドを得る。
(3)最終的に還元処理により対応する数の白金サブナノ粒子を合成する。
尚、デンドリマーを用いたサブナノ粒子の合成方法と同様、１２残基の白金ペプチドを固相合成し、担体に担持後還元処理により白金サブナノ粒子を合成してもよいし、１２残基の白金ペプチドを固相合成し、還元処理により白金サブナノ粒子を合成後、担体に担持してもよい。デンドリマーでのサブナノ粒子の合成では、錯形成後に還元させ、その後ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）溶液に含侵させることで凝集が抑えられることが確認されているが、例えばメタル化ペプチドを合成後に還元させ、その後ＰＶＰ溶液に含侵させ凝集を防ぎ、その後担体に担持することが考慮される。
【００４２】
(1)における側鎖修飾Ｐｔ錯体の合成スキームでは、ベンズアルデヒドと片側のアミンが保護されたエチルアミンを出発原料として、イミン結合を持つ配位子を定量的に合成する。さらに合成した配位子に、白金塩とトリフェニルホスフィンを加え白金シクロメタレート錯体を合成し、末端を強酸で脱保護することでペプチド側鎖修飾用のアミン白金錯体を合成する。Ｐｔユニット(白金錯体結合アミノ酸)の合成スキームでは、Ｎ末端とＣ末端が保護基で保護されたグルタミン酸を用いて、上記合成したアミン白金錯体を側鎖に修飾する。その後、一方の保護基を、テトラキスパラジウムを用いて外すことで固相合成へ適用できる白金錯体結合アミノ酸を合成する。
【００４３】
(2)では下記のように、ＳＴＥＰ１として、固相とＰｔユニットの縮合を行い固相に白金のペプチドを化学結合させる。その後、ＳＴＥＰ２としてピペリジンを用いてペプチド先端の保護基を外し、末端アミンにし、ＳＴＥＰ３として白金ユニットを加えて縮合することで１ユニット伸長した白金のペプチドを合成する。ＳＴＥＰ２、ＳＴＥＰ３を繰り返して任意の数まで白金のペプチドを伸長させた後、ＳＴＥＰ４で酸を用いて処理することで所望の白金数のペプチドを合成する。
【００４４】
【化４】
2020151706.tif 000006
【００４５】
以上のようなメタル化ペプチド固相合成において、最後の切り出しの条件は、錯体の分解を抑制する点では強酸よりも弱酸が好ましい。弱酸を使用する場合、固相は弱酸で切り出し可能なリンカーを有するものを使用する。また、各縮合の際に未反応の反応点が残ってしまうと、１２回縮合を繰り返しても１１や１０残基が混入してしまう。縮合効率を高める点では、ウロニウム系縮合剤が好ましく、カルボジイミド系縮合剤よりも合成純度を高めることができる。
【００４６】
下記の例では、合金の固相合成サイクルを示している。上記Ｐｔユニットと共に、側鎖の錯体を式（ＩＩＩ）で表されるピリジン型の構造を有するＩｒ錯体を用いた金属塩化合物（Ａ）と、アミノ酸残基（Ｂ）との反応によりこれらが結合したＩｒユニットを用いる。Ｐｔユニットを３回伸長した後、Ｉｒユニットを３回伸長することでＰｔ3Ｉｒ3メタロペプチドを合成する。
【００４７】
【化５】
2020151706.tif 000007
【００４８】
本発明の金属含有クラスターの製造方法では、複数の同一または別異のアミノ酸残基に同一または別異の金属原子が結合した、前記複数の金属原子を含むメタル化ペプチドを、還元もしくは加水分解するか、またはこれらに準じて化学的に変換することにより、前記複数の金属原子および／またはこれに由来する金属酸化物からなる金属含有クラスターを形成する。
本発明においては、前記メタル化ペプチドを担体表面に担持し、次いで還元もしくは加水分解するか、またはこれらに準じて化学的に変換することにより、前記担体表面に前記金属含有クラスターを形成することができる。
あるいは、メタル化ペプチドを担体に担持せずに、還元もしくは加水分解するか、またはこれらに準じて化学的に変換することにより、前記複数の同一または別異の金属原子および／またはこれに由来する金属酸化物からなる金属含有クラスターを形成することもできる。例えば、デンドリマーでのサブナノ粒子の合成では、錯形成後に還元させ、その後ＰＶＰ溶液に含侵させることで凝集が抑えられることが確認されているが、例えばメタル化ペプチドを合成後に還元させ、その後ＰＶＰ溶液に含侵させ凝集を防ぎ、その後担体に担持することが考慮される。
【００４９】
（担体への担持と還元）
アミノ酸残基に金属が結合した、複数の同一または別異の金属を含むメタル化ペプチドを担体表面に担持し、次いで還元または加水分解することにより、前記担体表面に前記複数の金属原子および／またはこれに由来する金属酸化物からなる金属含有クラスターを形成することができる。還元後、酸化、または大気開放することにより金属は金属酸化物となり、担体表面に前記複数の金属酸化物からなる金属含有クラスターを形成することができる。
【００５０】
メタル化ペプチドを担体に担持することによって、金属粒子の凝集等を抑制できる。担体の形状は、特に限定されるものではなく、粒状、繊維状、顆粒状、膜状、板状等、各種のものであってよい。単位重量当たりの表面積が大きい点を考慮すると、粒状（粉末状）が好ましい。
【００５１】
担体としては、炭素材料、例えば、カーボンブラック（ケッチェンブラック、オイルファーネスブラック、ガスブラック、アセチレンブラック、ランプブラック、サーマルブラック、チャンネルブラック等）、活性炭、カーボンファイバー等の非晶質（微結晶）カーボン、フラーレン、ナノチューブ、グラフェン、酸化グラフェン等のナノカーボン、グラファイト等の３次元結晶、グラファイト化メソポーラスカーボン等が挙げられる。これらの炭素材料は多孔質物質であってもよく、細孔表面に単一元素クラスターを担持できる。
【００５２】
この他、担体として無機材料を用いることができる。無機材料としては、例えば、シリカゲル、アルミナ、チタニア、マグネシア、ジルコニア、酸化鉄、酸化銅、ガラス、珪砂、タルク、マイカ、クレイ、ウォラスナイト等が挙げられる。
【００５３】
担体の内部面積、親和性、汎用性、安定性、耐久性の点から好ましい担体として、ケッチェンブラック（ＫＢ）、グラファイト化メソポーラスカーボン（ＧＭＣ）、酸化グラフェン（ＧＯ）、酸化アルミニウム（Ａｌ2Ｏ3）等が挙げられる。
【００５４】
担体への担持は、例えば、有機溶媒等の適宜の溶媒に溶解した溶液を用いて、担体分散液との混合、含浸、塗布、滴下等によって担体に接触させた後、乾燥することによって行うことができる。必要に応じて粉砕処理を行ってもよい。
【００５５】
担体への担持量としては、原子数の制御された金属クラスター合成を達成するためには、錯体が凝集しない適切な担持量を選択することが考慮される。焼成前のメタル化ペプチドが低密度で担持されていると焼成による凝集が起こりにくい。また金属クラスターの原子数が少なくなる程、面積あたりの粒子数が多くなり、粒子の平均間隔が狭くなることから凝集が起こりやすいため、凝集を抑制する点では担持量はより少ないことが望ましい。触媒活性等の使用目的のために担持量が多いことや、当該使用目的の性能等として凝集が起こりにくいことが要求されることのバランスとしては、メタル化ペプチドが凝集しない程度での多い担持量を選択することが考慮される。
【００５６】
還元は、メタル化ペプチドの金属に対して還元作用を有し、これを０価の状態まで還元することができる還元剤を用いて気相もしくは溶液中で行うことができる。
【００５７】
気相で還元する場合、担体に担持した後、この担体を水素ガス、あるいは水素を含む窒素やアルゴンとの混合ガス雰囲気下で焼成する。メタル化ペプチドを担体に担持することによって、凝集せずにクラスターを生成できる。
【００５８】
焼成温度は、メタル化ペプチドの種類等に応じて特に限定されないが、焼成による還元が進行することや、進行焼成時間が長くなり過ぎないこと、クラスター凝集の抑制等を考慮すると、例えば、２００〜３００℃が考慮される。焼成時間は、特に限定されないが、例えば、１〜２４時間が考慮される。
【００５９】
溶液中で還元する場合、還元剤としては、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、水素化シアノホウ素ナトリウム、水素、ヒドラジン類、水素化アルミニウムリチウム、水素化ジイソブチルアルミニウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素テトラｎ−ブチルアンモニウム、水素化ホウ素メチルアンモニウム、水素化トリエチルホウ素リチウム、ボラン錯体類、トリアセトキシホウ素ナトリウム、水素化ホウ素亜鉛、水素化トリブチルホウ素リチウム、水素化トリブチルホウ素カリウム、Ｓｃｈｗａｒｔｚ試薬、Ｓｔｒｙｋｅｒ試薬、水素化トリブチルスズ、水素化ナトリウム、水素化リチウム、水素化カルシウム、ベンゾフェノンケチルラジカル類、金属ナフタレニド類、過酸化水素等が挙げられる。
【００６０】
このようにしてメタル化ペプチドを還元することで、メタル化ペプチドの金属原子の数に相当する大きさの金属クラスターを合成することができる。
【００６１】
加水分解は、例えば酸化チタンの場合、加水分解することにより水酸化チタンとなり、焼成することで金属クラスターが形成される。
【００６２】
本発明の方法は、金属含有クラスターのうち、金属ナノ粒子の合成に好適である。いくつかの原子が集まり、それらの一部もしくは全体が直接結合することによって作られる多面体型の原子集団は一般にクラスターと称されているが、その意味において金属ナノ粒子はクラスターである。
【００６３】
本発明の方法によって得られる金属ナノ粒子等の金属含有ナノクラスターは、触媒をはじめとして各種の分野、例えば、医薬品、電子機能材料、環境適合材料、発光材料等のための素材としての応用が期待される。
【実施例】
【００６４】
以下に、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
PtL-NH2の合成
下記に示す経路で、原料錯体として末端にアミンを導入した白金錯体の合成を行った。
【００６５】
【化６】
2020151706.tif 000008
具体的には、aminoethane-Boc(2.00g)と蒸留したbenzaldehyde(1.34g)をトルエン溶媒中で115℃、24時間で撹拌し溶媒を留去することで配位子(Ligand-Boc)を収率92%で合成した。
【００６６】
その後、Ligand-Boc 1.21g、K2[PtCl4] 2.01gをMeOH溶媒中にて、70℃で24時間還流し、室温下に戻してPPh3を1.26g添加し3時間撹拌した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて酢酸エチル:ヘキサン＝1:1の展開溶媒で展開して精製することで、白金錯体(PtL-Boc)を収量0.40g、収率11.2%で得た。PtL-BocをCH2Cl2/TFA50%溶液中にて室温下で10分撹拌することでBoc基を脱保護し、酢酸エチル：メタノール溶媒でグラジエントをかけながらシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することで98％の収率で目的物であるPtL-NH2を得た。同定は1H NMRとMALDI-TOF-MSにて行った(図１（ａ）、（ｂ）)。
【００６７】
Fmoc-GluPtL-NH-OAllの合成
下記に示すようにFmoc-Glu-OAllと合成したPtL-NH2を原料として縮合剤を添加し、室温で撹拌することで縮合反応を行った。
【００６８】
【化７】
2020151706.tif 000009
反応開始後MALDI-TOF-MSで原料のピークを追跡したところ、反応開始後3時間でPtL-NH2のピークの消失か確認した。その後、分液処理を行い縮合剤を除去した後、酢酸エチル：ヘキサン=1:1を展開溶媒としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行った (収率55%)。得られた黄色オイルをMALDI-TOF-MSにて同定を行った(図２)。
【００６９】
Fmoc-(Glu-PtL)4-OAllの合成
下記に示す経路でペプチドのカルボン酸側鎖にアミン錯体を導入し、4核メタロペプチドの合成を行った。
【００７０】
【化８】
2020151706.tif 000010
具体的には、Ar雰囲気下でFmoc-Glu4-OAll(5.0mg)とPtL-NH2 (19.4mg)をDMF溶媒中に溶解させ、縮合剤を添加し、室温で4日間撹拌し合成した。その後、分液処理で縮合剤を除去し、シリカゲルに担持させ、フラッシュカラムクロマトグラフィーを用いてCHCl3:MeOHでグラジエントをかけながら精製することで目的物(m/z=3253)を収率18%で得た。同定はMALDI-TOF-MSで行った(図３)。
【００７１】
次に、得られたメタロペプチド・クラスターのSTEM観察を行った。
KB/Fmoc-(Glu-PtL)4-OAll 0.05%wtの直接観察
Fmoc-(Glu-PtL)4-OAll 1mgをTHF 100 mlに溶解させ、3μMの溶液を調製し、ナスフラスコ内で撹拌しながら、酸処理したKB（ケッチェンブラック）を20mg入れ担持させた。担持KBをメンブレンフィルターろ過し、取り出して乾燥させた後、MeOHに分散させCuグリットに3μl×3回ドロップキャストすることでTEMサンプルを準備した。HAADF-STEMを用いて錯体を直接観察したところ図４（ｂ）に見られるように4核メタロペプチド由来と思われる4つの白金の存在を確認することができた。図４（ａ）の錯体モデル構築から4核錯体のサイズはおおよそ2〜3nmと予測されるため、サイズに合致した白金錯体が合成されているのではないかと示唆される。
【００７２】
KB/Pt4クラスターの直接観察
上記において調製したKB/Fmoc-(Glu-PtL)4-OAll 0.05%wtを用いて、水素還元炉にてH2/N2 3%の混合ガス下で250℃ 18時間の条件で焼成した。焼成したKBを上記と同様にMeOHに分散させ、Cuグリットに3μl×3回ドロップキャストし、TEMサンプルを調整し、HADDF-STEMで直接観察を行った。図５のようにPt4クラスターと思われる物質を確認することにも成功した。
【００７３】
Fmoc-(Glu-PtL)4-OAllの担持溶媒検討
担持溶媒をDMFとCHCl3に変更した担持KBを観察したところ図６、図７のような分散状態が観察された。２つを比較してもわかるように同量のFmoc-(Glu-PtL)4-OAllを入れてもKBに担持される量は大きく異なることがわかる。（１）のTHFの結果も含めて比較すると、溶媒によるKBの担持量はDMF>THF>CH3Clとなった。この結果から、極性が大きい溶媒の方がKBと相互作用が強く、担体を担持しやすい溶媒であることがわかった。メタロペプチドを孤立分散して担持する点においては、分散性を考慮すると0.05wt%条件ではCH3Clの条件が最適である。
【００７４】
メタロペプチド焼成前後のXPS測定
Fmoc-(Glu-PtL)4-OAll 3.8μM溶液をHOPG基板上に3ml×3回ドロップキャストした後、Fmoc-(Glu-PtL)4-OAllの電荷状態を測定するため、XPS測定を行った。また測定したサンプルを更にH2/N2 3%雰囲気下のもと250℃で18時間焼成した後、再度同じサンプルをXPSにて測定した。結果は図８のようになった。焼成前のPt 4f軌道の4f7/2・4f5/2におけるBinding energyはそれぞれ72.8eV、75.8eVでありPt2+特有の軌道を測定することができた。対して焼成後のPt 4f軌道の4f7/2・4f5/2におけるBinding energyはそれぞれ71.7eV、74.9eVであり焼成前とくらべてBinding energyがおよそ1eVほど還元側にピークがシフトしたため焼成することでPt2+からPt0へと還元することを確認した。
【００７５】
焼成時間、焼成温度
上記の条件から焼成時間を変更し、サンプルをXPSにて測定した。結果は図９のようになった。焼成前との比較より、Pt 4f軌道の4f7/2・4f5/2におけるBinding energyの還元側へのピークシフトから、3時間から18時間では焼成による還元を確認した。
【００７６】
また上記の条件から焼成温度を変更し、サンプルをXPSにて測定した。なお焼成時間は3時間とした。結果は図１０のようになった。焼成前との比較より、Pt 4f軌道の4f7/2・4f5/2におけるBinding energyの還元側へのピークシフトから、225℃から250℃では焼成による還元を確認した。
【００７７】
次に、ペプチドの固相合成について検討を行った。ペプチドの固相合成には手動による合成と自動合成装置を用いる方法があるが、以下においてはペプチド自動合成装置(Biotage社製)、HPLC(島津製作所社製)、遠心分離機(エッペンドルフ社製)を用いた。
【００７８】
固相利用前駆体 Fmoc-(E-NH-Pt)-COOHの合成
【００７９】
【化９】
2020151706.tif 000011
【００８０】
２口ナスフラスコ(100ml)にFmoc-(E-NH-Pt)-OAll(2.18g, 2.12mmol)とPd(PPh3)(0.24mg, 0.21mmol)、dimedone(0.68mg, 4.84mmol)を加え系内をAr置換する。片方にはセプタムラバー、他方には三方コック取り付けた。脱水CH2Cl2を20mlシリンジで加え、再度系内をAr置換した。三方コック先に風船を取り付けAr下に保ったまま、室温で3時間撹拌した。撹拌後、大気開放してMALDI-TOF-MSを測定したところ原料のピークであるm/z=996のピークが消失したことから反応の完了を確認した。反応溶液を減圧去留して溶液を濃縮した後、フラッシュカラムクロマトグラフィーにてシリカゲルカラム上部に直接チャージした後、CHCl3で10CV流した後、CHCl3:MeOH=90:10のまで10CVでグラジエントをかけながら展開溶媒を流すことで目的物を分離した。分離したフラクションの溶媒を減圧去留し、真空下で１日乾燥させて黄色粉末を得た。収量は1.50g、収率71.8%であり、同定はMALDI-TOF-MSとanalysis HPLCを用いて行った（図１１（ａ）、（ｂ））。
【００８１】
自動合成装置によるFmoc-(E-NH-Pt)3-CONH2の合成
このように高純度で合成された単核Ptメタロペプチドを前駆体として合成を行った。ペプチド合成の流れは下記のように、固相に対してN末端が保護されたペプチドを縮合し、N末端を脱保護したものに対して再度次のペプチド加え縮合することを繰り返して固相に結合させたままペプチド鎖伸長していき目的の配列が得られた時点で、酸などのクリベージ溶液を用いて固相から切断して目的物を得るという簡易的なフローで行われる。そのため、自動合成装置を用いることで、決まったペプチド残基をプログラミングして自動で配列を行うことが可能である。
【００８２】
弱酸切り出し条件でのメタロペプチド固相合成
これまで、強酸を用いた固相からの切り出しによって白金メタロペプチドが部分的に分解してしまう挙動が見受けられた。そのため、使用していた強酸条件でクリベージを行うRink Amid ChemMatrix resinから保護ペプチドを合成する際に用いられるTrityl-OH ChemMatrix resinへと使用するレジンを変更した。このTrityl-OH ChemMatrix resinは末端がヒドロキシ基であるためレジン使用前に、末端をクロライドへと変換して活性化する必要がある。具体的には、0.01mmolスケールで利用する場合使用前にCH2Cl2 2mlでレジン(25mg)を3時間振盪することによって膨潤し溶液を吐出した後、SOCl2/CH2Cl2 2%溶液を2ml加え、１晩振盪する。その後、レジンをCH2Cl2 1mlで5回洗浄し、DIPEA/ CH2Cl2 2%溶液 1mlで３回洗浄することで末端を塩素化した。更にそのままペプチドを伸長する場合は、CH2Cl2 1mlに対して、Fmoc-(E-NH-Pt)-COOH(29.7 mg, 0.03 mmol)とDIPEA(5.17 mg, 0.04 mmol)を加えて一晩振盪し固相にペプチドを１残基伸長した配列を合成し、N末端をpiperidine/DMF 20%(v/v)で15min反応させることで末端を脱保護した。その後、CH2Cl2:TFA:TIPS =96.5:1:2.5(v/v)の切り出しカクテルを用いて固相からクリベージを行い溶液を回収し、tert-butyl methyl etherを13ml加えることで再沈殿した。沈殿した物質をデカンテーションした後、diethyl ether を13ml加え洗浄した後、再度遠心分離機にて沈殿させる操作を２回繰り返し、黄色粉末を得た。
【００８３】
【化１０】
2020151706.tif 000012
【００８４】
得られた粉末をCH3CN/H2O 30%(0.1% TFA)溶液で溶解させ、Analysis HPLCにてCH3CN/H2O30%(0.1% TFA)からCH3CN/H2O 95%(0.1% TFA)までグラジエントをかけながら分析を行ったところ単一のメインピークが観測された（図１２）。この結果から、全体のUVピーク面積に対してのメインピーク面積比を算出すると、96.7%となったことから、Trityl-OH ChemMatrix resinを用いて単核のPtメタロペプチドを着脱することに成功した。
【００８５】
NH2-(E-NH-Pt)2-CONH2の合成
前記と同様の手順を踏み、末端が脱保護された１残基Ptメタロペプチドを用意した。その後、更に１残基伸長するために、DMF 1mlにFmoc-(E-NH-Pt)-COOH(29.7mg, 0.03mmol)とCOMU(17.1mg, 0.04mmol)、DIPEA(5.17mg, 0.04mmol)を加えて１時間振盪した後、DMFにて洗浄した。その後、N末端をpiperidine/DMF 20%(v/v)で15 min反応させることで末端を脱保護した。前記と同様の方法で固相の切り出しと再沈殿を行い黄色粉末を得た。粉末をCH3CN/H2O 30%(0.1% TFA)溶液で溶解させ、Analysis HPLCにてCH3CN/H2O 30%(0.1% TFA)からCH3CN/H2O 95%(0.1% TFA)までグラジエントをかけながら同様に分析を行ったところ、NH2-(E-NH-Pt)1-CONH2の時に比べてRTが長い時間(24.4 min)にメインピークを観測できたことから、残基を伸ばすと分子の極性としては低極性へと変化することが示唆された(図１３（ａ）)。またピークの総面積比に対するメインピークの面積比は81.8%となった。crude粉末をMALDI-TOF-MSにて測定したところ、NH2-(E-NH-Pt)2-CONH2と思われる(m/z = 1485)のピークが観察されたことから初めて目的とするPtメタロペプチドの固相合成が成功した（図１３（ｂ））。
【００８６】
弱酸切り出し条件の樹脂を用いた自動合成
前記と同様に、末端が脱保護された１残基Ptメタロペプチドを用意し、自動合成装置を用いて２残基目以降を合成した。
【００８７】
伸長には縮合剤としてHBTU/DMF 0.2M、縮合補助剤としてHOBt/DMF 0.2M、補助塩基としてN-ethyl-diisopropylamine/NMP 0.2M、縮合ペプチドとしてFmoc-(E-NH-Pt)-COOH/DMF 0.5Mを加え、microwave 75℃、5minの条件で行った。また末端Fmoc基の脱保護はpiperidine/DMF 20%(v/v)溶液で反応させた。脱保護→伸長のプロセスを３回行った後に、最後脱保護のプロセスを入れて末端をアミンにして自動合成装置から5mlバイアルを取り出して、CH2Cl2:TFA:TIPS=96.5:1:2.5(v/v)の切り出しカクテルを用いて固相からクリベージを行い溶液を回収し、再沈殿操作を行うことでNH2-(E-NH-Pt)4-CONH2の黄色粉末を得た。
【００８８】
得られた粉末をCH3CN/H2O 30%(0.1% TFA)溶液で溶解させ、Analysis HPLCにてCH3CN/H2O30%(0.1% TFA)からCH3CN/H2O 95%(0.1% TFA)までグラジエントをかけながら分析を行ったところRT=31.5 minの位置にメインピークが観測された（図１４）。総ピーク面積に対するメインピークの面積比は88%となり、自動合成装置にて純度高くPt4メタロペプチド合成に成功した。
【００８９】
同様にしてPt3メタロペプチド合成やPt6メタロペプチド合成をして同じHPLC条件で保持時間を比較すると残基数が増加するにつれて、段階的にRetention timeは大きくなる、すなわち極性が小さくなることがわかり、Pt6メタロペプチド程度であればcrude状態でも高い純度で目的の配列を持ったメタロペプチド合成条件の探索ができた（図１５）。
【００９０】
Pt12メタロペプチドの合成
前記と同様に、末端が脱保護された１残基Ptメタロペプチドを用意し、伸長条件も同様にして11回脱保護→伸長を繰り返した後に最後N末端を脱保護することで末端がアミンの状態で合成を終了した。自動合成装置から5mlバイアルを取り出して、CH2Cl2:TFA:TIPS =96.5:1:2.5(v/v)の切り出しカクテルを用いて固相からクリベージを行い溶液を回収し、再沈殿操作を行うことでNH2-(E-NH-Pt)12-CONH2の黄色粉末を得た。6残基までの時とは異なり、得られた粉末がCH3CN/H2O 30%(0.1% TFA)溶液で溶解することができなかったため、CH3CN/H2O 50%(0.1% TFA)溶液で溶解させ、Analysis HPLCにてCH3CN/H2O 50%(0.1% TFA)からCH3CN/H2O 95%(0.1% TFA)までグラジエントをかけながら分析を行ったところ多数のピークが見られた(図１６)。
【００９１】
このピークが上手く伸長が行われなかったことによるピークであると仮定すると図１２でも表されていたように最も反応が伸長したものが 最も保持時間が長くなると考えられるので、Retention time=25.2minのピーク部分をNH2-(E-NH-Pt)12-COOHのピークとして分取カラムを用いて同条件でグラジエントをかけながら回収した。回収した溶液を再度、Analysis HPLCで評価したところシングルピークとまでは行かないが余分なピークを除去して回収を行うことができた(図１７（ａ）)。回収溶液を凍結乾燥機で溶媒を取り除くことでNH2-(E-NH-Pt)12-COOHと思われるペプチドを450μg回収した。
MALDI-TOF-MSを用いて、回収メタロペプチドを異なるマトリックスで比較したのが図１７（ｂ）であり、MSスペクトルからm/z=7000から9000の付近にて一定間隔(約m/z=260)でピークが現れていることからメタロペプチドの錯体部にあるPPh3(Mw =262)がMALDI-TOF-MSのレーザーにて外れて見られているものだと考えられる。このことから、回収してきたメタロペプチドは分析HPLCの結果とMALDI-TOF-MSから考えてPt12メタロペプチドが合成できている。
【００９２】
Pt12メタロペプチド/KB 2 wt%のSTEM観察
このように合成したNH2-(E-NH-Pt)12-COOHを20μg精密天秤にて量りとり10mバイアルに加えた後、2mlのCHCl3を加え溶解させた。また、別の10mlバイアルに1mgのKBを加えた後、2mlのCHCl3を加え15分超音波をかけ、分散させる。超音波による分散が終了した後、バイアルを振盪させながら、Pt12ペプチド溶液を滴下する。その後、バイアルのまま溶媒をエバポレーターで減圧去留し、40℃で１日真空乾燥を行う。得られたPt12メタロペプチド担持KBをMeOHで再分散させ、Cuマイクログリッド上に1μl×3回ドロップキャストすることにより、Pt12メタロペプチド/KB 2 wt%の STEMサンプルを作成した。
【００９３】
原子分解能HADDF-STEMにてSTEMサンプルを観察したところKB上に白金の輝点が観察された。図１８の枠で囲ったところのようにメタロペプチド鎖として広がりを持って白金の輝点が12個見られる場所と、別の枠で囲ったところのようにサブナノ粒子ほど小さくはないが白金の輝点が12個集まって存在している場所の２つの担持状態が白金の輝点の位置から情報であるが観察された。
【００９４】
また、広がって担持されている場所を拡大すると白金-白金間の直径は5.0nmとなり、分子モデルにて考えられるPt12ペプチドの白金-白金間の直径は4.8nmほどであり、このサンプルにて観察された白金の輝点はPt12ペプチドによるものであるとHADDF-STEMの結果から確かめることができた(図１９)。
【００９５】
Pt12サブナノ粒子のSTEM観察
Pt12ペプチド/KB 2wt%の原子分解能HADDF-STEMにより、Pt12ペプチドが担体であるKBに担持されていることが確認できたので、同様のサンプルを電気焼成炉に入れ水素雰囲気下(H2/N2 3%)、250℃、3時間の条件でPt12ペプチドの還元を行った。その後、焼成した担持KBを10 mlバイアルに入れ、MeOHに超音波をかけながら再分散し、Cuマイクログリッドに1μl×3回ドロップキャストし、Pt12サブナノ粒子/KB 2 wt%のSTEMサンプルを作成した。サンプルを観察したところ、マクロな視野ではPtサブナノ粒子と見られる輝点の集まりが見られ、黄枠で囲った部分に関して視野を拡大すると0.9nmほどの白金原子が12個集まったPtサブナノ粒子が見られたことから合成に成功した。今回Pt12サブナノ粒子を合成したことにより、金属原子数が多いほうがクラスターとしての安定性は大きく、かつHAADF-STEMにて担体上のサブナノ粒子を探しやすいため、多くのサブナノ粒子を観察でき、粒径分布が0.91 ± 0.20 nmとなった。TPMG4デンドリマーを用いて、Pt12サブナノ粒子を合成した際は0.9±0.1 nm 6であったことから、TPMG4のデンドリマーと同様にメタロペプチドがサブナノ粒子合成の鋳型となることを実証することができた。(図２０)
【００９６】
Pt19メタロペプチドとPt19サブナノ粒子の合成
Pt19サブナノ粒子は他の原子数のサブナノ粒子に比べてORR活性や触媒活性が高いため、メタロペプチドテンプレート法を用いてもPt19サブナノ粒子を合成することができないか検討することとした。新規にNoveNovaSynRTGR resinを用いることでTrityl OH resin の時とは異なり、1残基目を手動合成で伸長させてから自動合成を行う必要がなくなり、完全自動合成が可能となった。合成経路として始めに、piperidine/DMF 20%(v/v)溶液を用いて、NoveNovaSynRTGR resinの末端Fmoc基を脱保護した。その後、伸長→脱保護を19回繰り返して目的の配列であるNH2-(E-NH-Pt)19-CONH2の配列を合成した。(伸長条件:縮合剤としてHATU/DMF 0.2M、縮合補助剤としてHOBt/DMF 0.2M、補助塩基として N-ethyl-diisopropylamine/NMP 0.2M、縮合ペプチドとしてFmoc-(E-NH-Pt)-COOH/DMF 0.5M、反応条件: microwave 75℃、5min脱保護条件:piperidine/DMF 20%(v/v)溶液)終了後、自動合成装置から5mlバイアルを取り出して、CH2Cl2:TFA:TIPS =96.5:1:2.5(v/v)の切り出しカクテルを用いて固相からクリベージを行い溶液を回収し、再沈殿操作を行うことでクルードであるNH2-(E-NH-Pt)19-CONH2の黄色粉末を得た。
【００９７】
CH3CN/H2O 50%(0.1% TFA)溶液で溶解させ、Analysis HPLCにてCH3CN/H2O 50%(0.1% TFA)からCH3CN/H2O 95%(0.1% TFA)までグラジエントをかけながら分析を行ったところ多数のピークが見られた（図２１（ａ））。12残基伸長させた時と同様に、最も反応が伸長したものが 最も保持時間が長くなると考えられるので、図２１（ａ）のメインピークをNH2-(E-NH-Pt)19-CONH2のピークと仮定して分取カラムを用いて同条件でグラジエントをかけながら分取した。回収溶液を凍結乾燥機で溶媒を取り除くことでNH2-(E-NH-Pt)19-COOHと思われるペプチド黄色粉末にて得た。
【００９８】
得られたクルードをMALDI-TOF-MSで分析したところ、ピークの立ち上がり位置はm/z=10500ほどの位置であったため、PPh3が外れた分子量から考えると15〜17残基ほどものであるのではないかと予想される(図２１（ｂ）)。
【００９９】
分離し、凍結乾燥させたサンプルについて、NH2-(E-NH-Pt)19-CONH2と仮定して182μg精密天秤にて量りとり50mlバイアルに加えた後、10mlのCHCl3を加え溶解させた。また、別の50mlバイアルに10mgのKBを加えた後、20mlのCHCl3を加え15分超音波をかけ、分散させる。超音波による分散が終了した後、バイアルを振盪させながら、Pt19ペプチド溶液を滴下する。その後、バイアルのまま溶媒をエバポレーターで減圧去留し、Pt19メタロペプチド/KB 0.47wt%＠Ptを作成した。
【０１００】
その後、電気焼成炉に入れ水素雰囲気下(H2/N2 3%)、250℃、3時間の条件でPt19ペプチドの還元を行った。焼成した担持KBを10mlバイアルに入れ、MeOHに超音波をかけながら再分散し、Cuマイクログリッドに1μl×3回ドロップキャストし、Pt19 SNP/KB 0.47wt%＠PtのSTEMサンプルを作成した。サンプルを観察するとサブナノ粒子と思われる、白金原子が集まった微粒子と白金の単原子が観察された。Pt12サブナノ粒子の時と比べ、原子数が少なかったり多かったりするサブナノ粒子が多く散見された(図２２（ａ）、（ｂ）)。この理由としては、ペプチドの主鎖が長くなり、還元する際のPt-Ptの原子間の距離が大きくなったことで還元する際に隣のサブナノ粒子と凝集することで、白金の数が少ないものや多いものができてしまったと考えられる。
【０１０１】
メタロペプチドテンプレート法で合成したPtサブナノ粒子の活性評価
このように合成したサブナノ粒子サイズの白金を以下に示すトルエンの酸化の触媒反応に利用した。
【０１０２】
【化１１】
2020151706.tif 000013
【０１０３】
トルエン2mlに対して担持されたPt19/KB0.47 wt%@Ptを触媒量(5mg)加え、オートクレーブで1Mpa、160℃の条件で5時間反応させた。反応後、溶液をNMRで測定することによってトルエン酸化の反応物を定量した。得られた生成物はBenzaldehyd、Benzyl Alcohol、Benzoic Acid、Benzyl Benzoateの4種類であり、市販のPt/C 10wt%を用いて実験を行ったところ収率は0.23%であったが、Pt19/KB0.47 wt%@Ptでは収率は3.26%となり、14.2倍の活性を示した(図２３)。TOFにて換算すると671倍という結果となった。このことから、ペプチドテンプレート法を用いて合成したPtサブナノ粒子は実際に触媒として利用できることがわかった。
【０１０４】
Fmoc-(E-NH-(PyL-Ir))-OAllの合成
白金の単核メタロペプチドは合成できているが、合金のためにはその他の金属原子を錯体としてもつメタロペプチドを合成ことが必要であった。白金-炭素結合はとても強く、TFAなどの強酸でも耐えうることができるが、一般的な錯体であると、TFAの酸によりC-Mまたは、N-Mの結合部が分解してしまう可能性があったため強酸を使用しないスキームを考えた。その際、今後の金属原子ライブラリーを展開することを考えて、錯体としての報告例が多いピリジン型を骨格として採用することとした。グルタミン酸誘導体の側鎖に末端がアミンのフェニルピリジンを縮合することで錯体化の時に強酸を使用しないペプチド配位子を合成する。
【０１０５】
【化１２】
2020151706.tif 000014
【０１０６】
ナスフラスコ(500ml)にFmoc-Glu-OAl(1.91g, 4.66mmol)とEDCl(1.61g, 8.42mmol)にCH2Cl2を72mlを加えて室温で10分撹拌する。その後、4-(pyridine-2-yl)aniline(0.72g, 4.22mmol)、DMAP(0.09g, 0.74mmol)を加えさらに室温で撹拌した。１時間ほど撹拌すると白い沈殿ができ始めた。6時間撹拌した後、MALDI-TOF-MSで4-(pyridine-2-yl)anilineのピークの消失を確認したので撹拌を停止した。反応溶液をエバポレーターで３分の１ほどまでとばした後、冷凍庫に入れることによって再結晶させた。溶液中の白い綿のような物質をメンブレンフィルターで濾過し、冷やしたCH2Cl2で洗うことで精製した。目的物であるFmoc-(E-NH-pyL)-OAlを1.71g収率72%で得た。同定はNMRを用いて行った。
1H NMR(CDCl3, 400 MHz): δ8.60(d,1H) δ8.09(s,1H)δ7.89(d,2H) δ7.69-7.59(m,6H) 
δ7.53-7.50(t, 2H) δ7.32(t, 2H) δ7.22(t, 2H) δ7.12(t, 1H)δ5.89-5.77 (m, 1H) δ5.57(d, 1H)δ5.27(d. 2H) δ5.20(d. 2H)δ4.58(d. 2H) δ4.43-4.33(m. 3H) δ2.40-2.25(m. 3H) δ2.20-1.87(m.1H) 
【０１０７】
ペプチド配位子が合成できたので側鎖のフェニルピリジンに対して、Ir塩を用いて、Irメタロペプチドの合成を検討した。
【０１０８】
【化１３】
2020151706.tif 000015
【０１０９】
ナスフラスコ(100ml)にFmoc-(E-NH-pyL)-OAl(81.8mg, 146μmol)、(Cp*IrCl2)2 (38.6mg, 48.5μmol)、酢酸ナトリウム(101mg, 388μmol)に溶媒としてCH2Cl2を39mlを加え、室温で１日撹拌する。MALDI-TOF-MSにてFmoc-(E-NH-pyL)-OAlのピークが消失したことを確認し、撹拌を停止した。その後、溶け残っていた酢酸ナトリウムをメンブレンフィルター濾過によって取り除き、シリカゲルに溶液を塗した。フラッシュカラムクロマトグラフィーを用いて、CHCl3を展開溶媒として流したあと、展開溶媒をアセトンに変更して、黄色溶液を得た。エバポレーターで溶媒を去留したのち、１日真空乾燥することで目的物であるFmoc-(E-NH-(pyL-Ir))-OAlを41.4mg 収率30.1%で得た。同定はNMRとMALDI-TOF-MS(図２４（ａ）、（ｂ）)で行った。
【０１１０】
Fmoc-(E-NH-(PyL-Ir))-COOHの合成
【化１４】
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【０１１１】
２口ナスフラスコ(100ml)に前記と同様にして合成したFmoc-(E-NH-Pt)-OAll(1.09g,.1.18mmol)とPd(PPh3)(0.12mg, 0.10mmol)、dimedone(0.34mg, 2.42mmol)を加え系内をAr置換する。片方にはセプタムラバー,他方には三方コック取り付けた。脱水CH2Cl2を20ml シリンジで加え、再度系内をAr置換した。三方コック先に風船を取り付けAr下に保ったまま、室温で3時間撹拌した。フラッシュカラムクロマトグラフィーにてシリカゲルカラム上部に直接チャージした後、CHCl3で10CV流した後、CHCl3:MeOH=90:10のまで10 CVでグラジエントをかけながら展開溶媒を流すことで目的物を分離した。分離したフラクションの溶媒を減圧去留し、真空下で１日乾燥させて黄色粉末を得た。分析HPLCで純度を計測したところ77%であった(図２５)。
【０１１２】
Fmoc-(E-NH-(PyL-Ir))-COOHの固相着脱試験
合成したFmoc-(E-NH-(PyL-Ir))-COOHが弱酸条件で適用出来るか調べた。
【０１１３】
【化１５】
2020151706.tif 000017
【０１１４】
まず始めに、piperidine/DMF 20%(v/v)溶液を用いて、NoveNovaSynRTGR resinの末端Fmoc基を脱保護した。その後、伸長→脱保護をおこないNH2-(E-NH-(pyL-Ir))-CONH2の配列を合成した。伸長には縮合剤としてHATU/DMF 0.2M、縮合補助剤としてHOAt/DMF 0.2M、補助塩基としてN-ethyl-diisopropylamine/NMP 0.2M、縮合ペプチドとしてFmoc-(E-NH-Pt)-COOH/DMF 0.03M加え、microwave 75℃,5 minの条件で行った。また末端Fmoc基の脱保護はpiperidine/DMF 20%(v/v)溶液で反応させた。終了後、自動合成装置から5mlバイアルを取り出して、CH2Cl2:TFA:TIPS =96.5:1:2.5(v/v)の切り出しカクテルを用いて固相からクリベージを行い溶液を回収し、再沈殿操作を行うことでクルードであるNH2-(E-NH-(pyL-Ir))-CONH2の黄色粉末を得た。
【０１１５】
CH3CN/H2O 30%(0.1% TFA)溶液で溶解させ、Analysis HPLCにてCH3CN/H2O 30%(0.1% TFA)からCH3CN/H2O 95%(0.1% TFA)までグラジエントをかけながら分析を行ったところ原料と同様の位置にすべてピークが見られたことから、弱酸条件の切り出しではIrメタロペプチドが耐えうることがわかった(図２６)。
【０１１６】
次に、合金メタロペプチドの合成とサブナノ粒子化について検討を行った。
Pt3Ir3メタロペプチドの合成
合成スキームとして始めに、piperidine/DMF 20%(v/v)溶液を用いて、NoveNovaSynRTGR resinの末端Fmoc基を脱保護した。その後、Fmoc-(E-NH-Pt)-COOHの伸長→脱保護を3回繰り返したあと、Fmoc-(E-NH-(pyL-Ir))-COOHの伸長→脱保護を3回繰り返し目的の配列であるNH2-(E-NH-Pt)3--(E-NH-(pyL-Ir))3-CONH2の配列を合成した(伸長条件:縮合剤としてHATU/DMF 0.2M、縮合補助剤としてHOBt/DMF 0.2M、補助塩基としてN-ethyl-diisopropylamine/NMP 0.2M、縮合ペプチドとしてFmoc-(E-NH-Pt)-COOH/DMF 0.04M、Fmoc-(E-NH-(pyL-Ir))-COOH/DMF 0.04M、反応条件: microwave 75℃、5min脱保護条件:piperidine/DMF 20%(v/v)溶液)。終了後、自動合成装置から5mlバイアルを取り出して、CH2Cl2:TFA:TIPS=96.5:1:2.5(v/v)の切り出しカクテルを用いて固相からクリベージを行い溶液を回収し、再沈殿操作を行うことでクルードであるNH2-(E-NH-Pt)3--(E-NH-(pyL-Ir))3-CONH2の黄橙色粉末を得た。CH3CN/H2O 30%(0.1% TFA)溶液で溶解させ、Analysis HPLCにてCH3CN/H2O 30%(0.1% TFA)からCH3CN/H2O 95%(0.1% TFA)までグラジエントをかけながら分析を行ったところ多数のピークが見られた(図２７)。そのため、HPLC分取(7ml/min)を1ml毎に区画細かくしてフラクションを回収した。各フラクションをMALDI-TOF-MSで分析するとRetention time=27.4の位置のフラクションから目的物のピークを観測することができたため、その溶液を凍結乾燥して回収した。
【０１１７】
Pt3Ir3サブナノ粒子の合成と還元前後の電子状態
合成したNH2-(E-NH-Pt)3-(E-NH-(pyL-Ir))3-CONH2(52μg, 12 nmol)をクロロホルム 52μlに溶解することで230μMのPt3Ir3ペプチド溶液を調整し、HOPG基盤上に溶液を1μL×3回ドロップキャストしてXPSを測定し、測定が終了した基盤を電気管状炉に入れ、H2/N2 3% 条件でガスをフローしながら250℃で焼成を行った。
【０１１８】
焼成前と焼成後のXPSで比較したところ、Pt 4f7/2ピークとPt 4f5/2ピークの結合エネルギーが焼成前はそれぞれ73.0eV、76.3eVであったが、焼成後はPt 4f7/2ピークとPt 4f5/2ピークの結合エネルギーが71.3eV、74.5eVとなりPt4ペプチドを焼成した時と同様に約1.5eV結合エネルギーがシフトしたことから水素雰囲気下で焼成を行うことによりPtが2価の状態から0価の状態へと還元できると示された。また、Ir 4f7/2ピークとIr 4f5/2ピークの結合エネルギーが焼成前はそれぞれ63.4eV、66.7eVであったが、焼成後はIr 4f7/2ピークとIr 4f5/2ピークの結合エネルギーが62.3eV、65.1eVとなり白金と同様に約1.3eV結合エネルギーがシフトしたことから水素雰囲気下で焼成を行うことによりIrが3価の状態から0価の状態へと還元できることが示された(図２８)。測定値はHOPG基盤のC 1s の284.5eVを基準としてチャージアップ補正を行っている。
【０１１９】
Pt3Ir3サブナノ粒子のTEM観察とEDSスペクトル測定
NH2-(E-NH-Pt)3-(E-NH-(pyL-Ir))3-CONH2 20μgを精密天秤にて量りとり10mlバイアルに加えた後、2mlのCHCl3を加え溶解させた。また、別の10mlバイアルに1mgのKBを加えた後、2mlのCHCl3を加え15分超音波をかけ、分散させる。超音波による分散が終了した後、バイアルを振盪させながら、Pt3Ir3ペプチド溶液を滴下する。その後、バイアルのまま溶媒をエバポレーターで減圧去留し、Pt3Irメタロペプチド/KB 2wt%を作成した。
【０１２０】
その後、電気焼成炉に入れ水素雰囲気下(H2/N2 3%)、250℃、3時間の条件でPt3Ir3メタロペプチド還元を行った。焼成した担持KBを10mlバイアルに入れ、MeOHに超音波をかけながら再分散し、Cuマイクログリッドに1μl×3回ドロップキャストし、Pt3Ir3サブナノ粒子/KB 2wt%のSTEMサンプルを作成した。HAADF-STEMにてサンプルを観察するとKB上にサブナノ粒子と思われる輝点が見られ、拡大していくとPt3Ir3サブナノ粒子と思われる６つの輝点をおよそ0.6nmのサイズで観察することに成功した(図２９（ａ）、（ｂ）)。
【０１２１】
また、別視野においてEDSマッピングをとったところ、１つのサブナノ粒子からIrとPtの元素をマッピングとして得ることができ、またEDSスペクトルではSTEMサンプル基盤由来のCuとPtとIrが部分的にスペクトルが重なってしまっていたが、Ir LaとPt La線で２種類の元素を別々に分離してみられた(図３０（ａ）、（ｂ）)。
【０１２２】
XPSの結果から還元前と還元後にてPtとIrの元素が存在し、還元前後にて結合エネルギーが約1.5eVシフトすることからPt、Irともに錯体の電子状態から金属への還元が行われたことを確認した。また、STEMの結果からKB上にPt3Ir3サブナノ粒子と思われる6つの輝点の集まりを確認し、EDSからPt、Irの特性X線スペクトルを得たことから、ペプチドテンプレート法を用いて合金サブナノ粒子を合成に成功した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020151706.tif 000024
【図８】
2020151706.tif 000025
【図９】
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【図１０】
2020151706.tif 000027
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2020151706.tif 000030
【図１４】
2020151706.tif 000031
【図１５】
2020151706.tif 000032
【図１６】
2020151706.tif 000033
【図１７】
2020151706.tif 000034
【図１８】
2020151706.tif 000035
【図１９】
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【図２０】
2020151706.tif 000037
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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