(57)【要約】【課題】  薬物の開発の分野には、細胞の膜電位測定法に代わって、薬物が薬物誘発性ＱＴ延長症候群を引き起こすか否かを判定する新規な方法についての要求が存在する。【解決手段】  被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する方法であって、被験物質を、ＡＴＰ結合部分と、蛍光共鳴エネルギー移動のためのドナーとしての蛍光タンパク質と、アクセプターとしての蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質を発現する非ヒトトランスジェニック動物に投与する工程；前記非ヒトトランスジェニック動物の心臓からの蛍光シグナルを測定する工程；及び測定された蛍光シグナルに基づいて、前記被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する工程を含む、判定方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する方法であって、
被験物質を、ＡＴＰ結合部分と、蛍光共鳴エネルギー移動のためのドナーとしての蛍光タンパク質と、アクセプターとしての蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質を発現する非ヒトトランスジェニック動物に投与する工程；
前記非ヒトトランスジェニック動物の心臓からの蛍光シグナルを測定する工程；及び
測定された蛍光シグナルに基づいて、前記被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する工程を含む、判定方法。
【請求項２】
被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する方法であって、
被験物質を、ＡＴＰ結合部分と、蛍光共鳴エネルギー移動のためのドナーとしての蛍光タンパク質と、アクセプターとしての蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質を含む融合タンパク質を発現する心筋細胞と接触させる工程；
前記心筋細胞からの蛍光シグナルを測定する工程；及び
測定された蛍光シグナルに基づいて、前記被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する工程を含む、判定方法。
【請求項３】
前記ＡＴＰ結合部分が、イノシンモノホスフェート脱水素酵素２（ＩＭＰＤＨ２）のＣＢＳドメイン又はその断片若しくはその改変体、ＧｌｎＫ１又はその断片若しくはその改変体、或いはＡＴＰ合成酵素のεサブユニット又はその断片若しくはその改変体である、請求項１又は２に記載の判定方法。
【請求項４】
前記ＡＴＰ結合部分が、ＡＴＰ合成酵素のεサブユニット又はその断片若しくはその改変体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項５】
前記融合タンパク質において、前記ドナーとしての蛍光タンパク質及び前記アクセプターとしての蛍光タンパク質のいずれか一方が前記ＡＴＰ結合部分のアミノ末端側に連結されており、その他方が前記ＡＴＰ結合部分のカルボキシ末端側に連結されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項６】
前記心筋細胞が、前記融合タンパク質を発現する非ヒトトランスジェニック動物由来の心筋細胞、又は前記融合タンパク質を発現する幹細胞から作製された心筋細胞である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項７】
被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する方法であって、
被験物質を心筋細胞と接触させる工程、及び前記心筋細胞におけるＡＴＰ濃度を測定する工程；又は
被験物質を非ヒト動物に投与する工程、及び前記非ヒト動物の心臓におけるＡＴＰ濃度を測定する工程を含み、
測定されたＡＴＰ濃度に基づいて、前記被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する工程をさらに含む、判定方法。
【請求項８】
薬物の候補物質ライブラリーを製造する方法であって、
２種以上の被験物質の各々について、心毒性を生じるか否かを判定する請求項１〜７のいずれか一項に記載の判定方法を実施する工程；及び
前記工程において、心毒性を生じないと判定された被験物質を選抜し、薬物の候補物質ライブラリーを製造する工程を含む、製造方法。
【請求項９】
被験物質が心毒性を生じるか否かの判定用の、ＡＴＰ結合部分と、蛍光共鳴エネルギー移動のためのドナーとしての蛍光タンパク質と、アクセプターとしての蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質を発現する心筋細胞又は非ヒトトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する方法に関する。本発明はまた、薬物の候補物質ライブラリーを製造する方法、及び被験物質が心毒性を生じるか否かの判定用の心筋細胞又は非ヒトトランスジェニック動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物の開発において、その効能及び毒性について適切に評価することは重要である。薬物の毒性として、患者に重篤な不整脈を引き起こす薬物誘発性ＱＴ延長症候群が知られている。薬物誘発性ＱＴ延長症候群は、薬物の投与後に心電図上のＱＴ間隔の延長が生じ、非持続性多形性心室頻拍（トルサード・ド・ポアンツ；ＴｄＰ）から、しばしば心室細動が起こり、失神又は突然死をきたす重篤な状態である。
【０００３】
薬物誘発性ＱＴ延長症候群におけるＱＴ間隔の延長は、調和のとれた心臓の拍動を投与された薬物が心筋細胞のイオンチャネルに作用し、その調和を乱すことによって生じると考えられている。薬物が、薬物誘発性ＱＴ延長症候群を引き起こすか否かを判定する方法として、細胞の膜電位測定法が知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】薬理雑誌（２００５）１２６、ｐ３２１〜３２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ベラパミル（Ｖｅｒａｐａｍｉｌ）、Ｖａｎｏｘｅｒｉｎｅなどの薬物は、イオンチャネルであるｈＥＲＧチャネルに作用するが、ＱＴ間隔の延長を引き起こさないことが知られている。従って、薬物の開発の分野には、薬物が薬物誘発性ＱＴ延長症候群を引き起こすか否かを判定するにあたって、細胞の膜電位測定法に代わる新規な方法についての要求が存在する。
【０００６】
医薬品の開発においては、その開発過程で副作用として不整脈が認められた候補物質は、開発過程から排除され、上市されるとはない。他方、開発過程では副作用として不整脈が認められずに上市された医薬品の中には、投与した患者に不整脈を生じさせてしまうものが複数存在した。副作用としての不整脈が上市後に認められた場合、及び上市前であっても開発の後期に副作用としての不整脈が認められた場合、それまでの医薬品の開発コストを浪費させてしまうという問題があった。従って、医薬品の開発の分野には、医薬品の候補物質が不整脈を生じさせるのか否かを、より早期に判定可能な方法に対する要求が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、心電図上のＱＴ延長などの兆候が見られないような低濃度の薬物の存在下であっても、心臓のＡＴＰ濃度に変化が生じることを見出した。これにより、本発明者は、心臓におけるＡＴＰ濃度を測定することで、被験物質がＱＴ延長症候群などの心毒性をきたすか否かを判定することができることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下に関する。
【０００８】
［項１］  被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する方法であって、被験物質を、ＡＴＰ結合部分と、蛍光共鳴エネルギー移動のためのドナーとしての蛍光タンパク質と、アクセプターとしての蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質を含む融合タンパク質を発現する非ヒトトランスジェニック動物に投与する工程；前記非ヒトトランスジェニック動物の心臓からの蛍光シグナルを測定する工程；及び測定された蛍光シグナルに基づいて、前記被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する工程を含む、判定方法。
【０００９】
［項２］  前記非ヒトトランスジェニック動物が、その染色体上のＲＯＳＡ２６遺伝子座に挿入された前記融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、及び、前記ＤＮＡがＣＡＧプロモーター配列と作動可能に連結されている、項１に記載の判定方法。
［項３］  被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する方法であって、被験物質を、ＡＴＰ結合部分と、蛍光共鳴エネルギー移動のためのドナーとしての蛍光タンパク質と、アクセプターとしての蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質を含む融合タンパク質を発現する心筋細胞と接触させる工程；前記心筋細胞からの蛍光シグナルを測定する工程；及び測定された蛍光シグナルに基づいて、前記被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する工程を含む、判定方法。
［項４］  前記心筋細胞が、その染色体上のＲＯＳＡ２６遺伝子座に挿入された前記融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、及び、前記ＤＮＡがＣＡＧプロモーター配列と作動可能に連結されている、項３に記載の判定方法。
【００１０】
［項５］  前記判定工程が、前記蛍光シグナルと第１の閾値とを比較する工程を含む、項１〜項４のいずれか一項に記載の判定方法。
［項６］  前記ＡＴＰ結合部分が、イノシンモノホスフェート脱水素酵素２（ＩＭＰＤＨ２）のＣＢＳドメイン又はその断片若しくはその改変体、ＧｌｎＫ１又はその断片若しくはその改変体、或いはＡＴＰ合成酵素のεサブユニット又はその断片若しくはその改変体である、項１〜項５のいずれか一項に記載の判定方法。
［項７］  前記ＡＴＰ結合部分が、ＡＴＰ合成酵素のεサブユニット又はその断片若しくはその改変体である、項１〜項６のいずれか一項に記載の判定方法。
［項８］  前記融合タンパク質において、前記ドナーとしての蛍光タンパク質及び前記アクセプターとしての蛍光タンパク質のいずれか一方が前記ＡＴＰ結合部分のアミノ末端側に連結されており、その他方が前記ＡＴＰ結合部分のカルボキシ末端側に連結されている、項１〜項７のいずれか一項に記載の判定方法。
【００１１】
［項９］  前記蛍光シグナルが、ドナーとしての蛍光タンパク質に由来する蛍光強度（以下「ドナー側の蛍光強度」という）、アクセプターとしての蛍光タンパク質に由来する蛍光強度（以下「アクセプター側の蛍光強度」という）、ドナー側の蛍光強度に対するアクセプター側の蛍光強度の比（＝［アクセプター側の蛍光強度］／［ドナー側の蛍光強度］）、又はドナーとしての蛍光タンパク質の蛍光寿命である、項１〜項８のいずれか一項に記載の判定方法。
［項１０］  前記非ヒトトランスジェニック動物がトランスジェニックマウスである、項１〜項９のいずれか一項に記載の判定方法。
［項１１］  前記心筋細胞が、前記融合タンパク質を発現する非ヒトトランスジェニック動物由来の心筋細胞、又は前記融合タンパク質を発現する幹細胞から作製された心筋細胞である、項３〜項９のいずれか一項に記載の判定方法。
【００１２】
［項１２］  薬物の候補物質ライブラリーを製造する方法であって、２種以上の被験物質の各々について、心毒性を生じるか否かを判定する項１〜項１１のいずれか一項に記載の判定方法を実施する工程；及び前記工程において、心毒性を生じないと判定された被験物質を選抜し、薬物の候補物質ライブラリーを製造する工程を含む、製造方法。
［項１３］  被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する用の、ＡＴＰ結合部分と、蛍光共鳴エネルギー移動のためのドナーとしての蛍光タンパク質と、アクセプターとしての蛍光タンパク質とを含む心筋細胞又は融合タンパク質を含む融合タンパク質を発現する非ヒトトランスジェニック動物。
［項１４］  被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する方法であって、被験物質を心筋細胞と接触させる工程、及び前記心筋細胞におけるＡＴＰ濃度を測定する工程；又は被験物質を非ヒト動物に投与する工程、及び前記非ヒト動物の心臓におけるＡＴＰ濃度を測定する工程を含み、測定されたＡＴＰ濃度に基づいて、前記被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する工程をさらに含む、判定方法。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】心臓におけるＡＴＰの需要と供給のバランスが取れている場合の概念図（図１ａ）、ＡＴＰの需要に対してＡＴＰの供給が小さい場合の概念図（図１ｂ）、及びＡＴＰの需要に対してＡＴＰの供給が大きい場合の概念図（図１ｃ）。
【図２】生理食塩水を投与したトランスジェニックマウスの心臓の蛍光画像（図２ａ：投与開始０ｍｉｎ、図２ｂ：投与開始後６０ｍｉｎ）。生食塩水投与開始０ｍｉｎの心電図（図２ｃ）、投与開始後６０ｍｉｎの心電図（図２ｄ）。前記トランスジェニックマウスの心臓におけるＡＴＰ濃度変化を示すグラフ（図２ｅ）。
【図３】ジソピラミド投与開始前後のトランスジェニックマウスの心電図（投与開始前：図３ａ上、投与開始後：図３ａ下）。前記トランスジェニックマウスの心臓の蛍光画像（投与開始０ｍｉｎ：図３ｂ左、投与開始後６０ｍｉｎ：図３ｂ右）、及び心臓におけるＡＴＰ濃度変化を示すグラフ（図３ｃ）。
【図４】Ｎｉｆｅｋａｌａｎｔ（図４ａ）、Ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ（図４ｂ）、Ａｌｆｕｚｏｓｉｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（図４ｃ）、Ｐｒｏｃａｉｎａｍｉｄｅ（図４ｄ）、Ｄｒｏｐｅｒｉｄｏｌ（図４ｅ）、及びＥｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ（図４ｆ）を投与したトランスジェニックマウスの心臓の蛍光画像（投与開始後０ｍｉｎ：左上図、投与開始後６０ｍｉｎ：右上図）及びＡＴＰ濃度変化を示すグラフ（下図）。
【図５】Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ（図５ａ）、Ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ（図５ｂ）、Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ（図５ｃ）、及びＭｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ（図５ｄ）を投与したトランスジェニックマウスの心臓の蛍光画像（投与開始後０ｍｉｎ：左上図、投与開始後６０ｍｉｎ：右上図）及びＡＴＰ濃度変化を示すグラフ（下図）。
【図６】Ｖａｎｏｘｅｒｉｎｅ（図６ａ）、Ｖｅｒａｐａｍｉｌ（図６ｂ）及びＦｕｒｏｓｅｍｉｄｅ（図６ｃ）を投与したトランスジェニックマウスの心臓の蛍光画像（投与開始後０ｍｉｎ：左上図、投与開始後６０ｍｉｎ：右上図）及び心臓におけるＡＴＰ濃度変化を示すグラフ（下図）。
【図７】５−ＦＵ（図７ａ）、Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ（図７ｂ）、及びＩｆｏｓｆａｍｉｄｅ（図７ｃ）を投与したトランスジェニックマウスの心臓の蛍光画像（投与開始後０ｍｉｎ：左上図、投与開始後６０ｍｉｎ：右上図）及び心臓におけるＡＴＰ濃度変化を示すグラフ（下図）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において「心毒性」は、心臓に悪影響を及ぼす薬物誘発性の毒性を意味する。心毒性は、限定するものではないが、不整脈、心不全、及びＱＴ延長症候群が挙げられる。
【００１５】
本明細書において「不整脈」は、心機能のうち調律機能が異常を呈する状態を意味する。不整脈は、限定するものでないが、催不整脈、上室性頻拍、「心室性期外収縮」、「心房（上室）期外収縮」、「持続性心室頻拍」、「心房細動」、「心房頻拍」、「心房粗動」、「房室ブロック」及び「洞不全症候群」が挙げられる。本明細書において「催不整脈」は、物質の投与により既存の不整脈が増悪すること、又は新たな不整脈が発生することを意味する。本明細書において「上室性頻拍」は、刺激の源が洞結節、心房筋又は心室接合部にある頻拍を意味する。
【００１６】
本明細書において「期外収縮」は、洞結節のつくる規則的な拍動とは別に、他の部位から興奮が始まり、心臓が洞結節よりの刺激より早く収縮する状態を意味する。本明細書において「心室性期外収縮」は、刺激の発生部位が房室結節の下の心室で生じる期外収縮を意味する。心室性期外収縮は、限定するものではないが、交感神経を緊張させる薬物、例えばカテコラミン又はカフェインによって誘発されうる。
【００１７】
本明細書において「心房（上室）期外収縮」は、刺激の発生部位が心房から心室結節までの期外収縮を意味する。心房（上室）期外収縮は、例えばテオフィリン、抗コリン薬又はβ２刺激薬などの気管支拡張薬によって誘発されうる。上室性期外収縮の状態が悪化すると「心房細動」、「心房頻拍」又は「心房粗動」を発症しうる。本明細書において「心房細動」は、心房の拍数が全く不規則で且つ高頻度になる状態を意味する。本明細書において「心房頻拍」は、心房起源の発作性頻拍症を意味する。本明細書において「心房粗動」は、心房が洞結節からの刺激に応じて興奮収縮をするのではなく、心房自体で発生した規則正しい頻回の興奮を連続する状態を意味する。
【００１８】
本明細書において「房室ブロック」は、心房・心室間の興奮伝導障害を意味する。本明細書において「洞不全症候群」は、洞房結節又は洞結節下流の伝導系が原因で除脈をきたす状態を意味する。
【００１９】
本明細書において「心不全」は、心臓（主として左心）の機能障害による体内各臓器及び四肢末梢の灌流障害に起因する息切れを主徴とし、動悸、倦怠感、運動耐容能の低下などをきたす症候群を意味する。心不全は、限定するものではないが、左心不全、右心不全及び両心不全が挙げられる。一例において、心不全は左心不全又は両心不全である。
【００２０】
本明細書において「ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）」は、薬物誘発性ＱＴ延長症候群を意味し、重症心室性不整脈（例えば「心室頻拍」及び「心室細動」）を生じ、眩暈、脳虚血症状（例えば失神）又は突然死をきたしうる症候群を意味する。本明細書において「心室頻拍（ＶＴ）」は、心室の異所性始点で起こる発作性頻拍を意味する。本明細書において「心室細動（ＶＦ）」は、心室が上位中枢からの興奮によらず、個々の心室固有筋が無秩序に興奮する状態を意味する。本明細書において「トルサード・ド・ポワント（ＴｄＰ）」は一過性の心室細動又は多形成心室頻拍を意味する。
【００２１】
本明細書において「被験物質」は、限定するものではないが、薬物としての利用に興味がある物質、薬物の候補物質として開発された物質、又は薬物として利用されている物質が挙げられる。被験物質は、例えば、有機分子、核酸、タンパク質、又は脂質、若しくはそれらの組合せである。被験物質は、公知の方法により調製することができ、又は商業的に入手可能である。
【００２２】
一例において、被験物質は、公知の方法に従って、動物に投与される。被験物質の動物への投与は、限定するものではないが、経口投与又は非経口投与される。他の例において、被験物質は、公知の方法に従って、細胞と接触される。被験物質の細胞への接触は、例えば、前記細胞を培養している場合、限定するものではないが、被験物質を細胞培養液に添加することが挙げられる。被験物質は、例えば、１種又は２種以上の被験物質の組合せであってもよい。
【００２３】
本明細書において、薬物の候補物質のライブラリーの製造において用いられる「２種以上の被験物質」は、限定するものではないが、１０種以上、１００種以上、又は１０００種以上の被験物質を含む。薬物の候補物質のライブラリーの製造において用いられる２種以上の被験物質は、例えば、理化学研究所が提供する化合物ライブラリー（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｒｇ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｎｐｄ／ｊａ／ａｎｎｏｕｎｃｅ．ｈｔｍｌ）、東京大学  創薬機構が管理又は提供する各種化合物ライブラリー（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｄｉ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／ｃｈｅｍｉｃａｌ＿ｌｉｂｒａｒｙ／）、フナコシ株式会社から商業的に入手可能な化合物ライブラリー（ＴＯＣＲＩＳＣＲＥＥＮ（登録商標））、及びシグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社から商業的に入手可能な各種化合物ライブラリー（例えばＳＡＬＯＲ）が挙げられる。
【００２４】
本明細書において「融合タンパク質」は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のためのドナーとしての蛍光タンパク質と、アクセプターとしての蛍光タンパク質と、ＡＴＰ結合部分とを含むタンパク質を意味する。前記融合タンパク質は、限定するものではないが、公知のＡＴＰ結合部分の遺伝子をコードするＤＮＡと、ＦＲＥＴのドナーとしての蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、アクセプターとしての蛍光タンパク質をコードするＤＮＡとを用いて遺伝子工学技術により調製することができる。一例において、前記融合タンパク質は、Ｎａｋａｎｏ，Ｍ，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，２０１１；６，７０９−７１５に記載の方法に従って、調製することができる。
【００２５】
前記融合タンパク質は、限定するものではないが、ＦＲＥＴのためのドナーとしての蛍光タンパク質及びアクセプターとしての蛍光タンパク質のいずれか一方の蛍光タンパク質が前記ＡＴＰ結合部分のアミノ末端（Ａ末端）側に連結されており、その他方の蛍光タンパク質が前記ＡＴＰ結合部分のカルボキシ末端（Ｃ末端）側に連結されている。一例において、ＦＲＥＴのための２種類の蛍光タンパク質の一方が前記ＡＴＰ結合部分のＡ末端側に連結されており、前記２種類の蛍光タンパク質の他方が前記ＡＴＰ結合部分のＣ末端側に連結されている。前記２種類の蛍光タンパク質は、前記ＡＴＰ結合部分とリンカー配列を介して連結されていてもよい。
【００２６】
前記２種類の蛍光タンパク質は、限定するものではないが、前記融合タンパク質のＡＴＰ結合部分にＡＴＰが結合した場合にＦＲＥＴを生じるように配置されている。他の例において、２種類の蛍光タンパク質は、前記融合タンパク質のＡＴＰ結合部分にＡＴＰが結合した場合にＦＲＥＴが解消するように配置されている。
【００２７】
本明細書において「蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）」は、ドナーとしての蛍光タンパク質とアクセプターとしての蛍光タンパク質が一定の距離以内に近づいた時に、ドナーとしての蛍光タンパク質が吸収した光エネルギーがアクセプターとしての蛍光タンパク質に移動する現象を意味する。ＦＲＥＴの検出は、通常、ドナーとしての蛍光タンパク質に励起波長を照射し、ドナーとしての又はアクセプターとしての蛍光タンパク質由来の蛍光シグナルを測定することにより行われる。
【００２８】
一例において、ドナーとしての蛍光タンパク質由来の蛍光強度を測定する場合、２種類の蛍光タンパク質が一定の距離より近い位置にあると、アクセプターとしての蛍光タンパク質に光エネルギーが吸収されるためにドナーとしての蛍光タンパク質由来の蛍光強度は小さくなり、距離が一定の距離より離れると蛍光強度が大きくなる。アクセプターとしての蛍光タンパク質由来の蛍光強度を測定する場合はその逆で、距離が一定の距離より近い位置にあるとアクセプターとしての蛍光タンパク質由来の蛍光強度が大きくなり、距離が一定の距離より離れると蛍光強度は強度が小さくなる。
【００２９】
他の例において、ドナーとしての蛍光タンパク質由来の蛍光寿命を測定する場合、ドナーとしての蛍光タンパク質とアクセプターとしての蛍光タンパク質とが一定の距離より遠い位置にあると、そのドナーとしての蛍光タンパク質はその固有の蛍光寿命を示し、それらの距離が一定の距離より近い位置にあると、ドナーとしての蛍光タンパク質の蛍光寿命は短くなる。
【００３０】
本明細書において「蛍光タンパク質」は、限定するものではないが、シアンフルオレセントプロテイン（ＣＦＰ）、イエローフルオレセントプロテイン（ＹＦＰ）、ブルーフルオレセントプロテイン（ＢＦＰ）、グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、レッドフルオレセントプロテイン（ＲＦＰ）及びオレンジフルオレセントプロテイン（ＯＦＰ）が挙げられる。他の例において、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１０，１００５−１０１２（２０１２）のＴａｂｌｅ１に記載の蛍光タンパク質も利用できる。蛍光タンパク質は、公知の方法により調製することができる、又は商業的に入手可能である。例えば、ＣＦＰとしてはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社からＣＦＰを、ＹＦＰとしてはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社からＹＦＰを又はＥｖｒｏｇｅｎ社からＰｈｉ−Ｙｅｌｌｏｗを、ＧＦＰとしてはＣｌｏｎｔｅｃｈ社からＥＧＦＰを又はＥｖｒｏｇｅｎ社からＴａｇ−ＧＦＰを、ＲＦＰとしてはＣｌｏｎｔｅｃｈ社からＤｓＲｅｄ２−ｍｏｎｏｍｅｒを又はＥｖｒｏｇｅｎ社からＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍを商業的に入手可能である。
【００３１】
前記融合タンパク質における、ＦＲＥＴのための２種類の蛍光タンパク質は、限定するものではないが、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ、ＧＦＰ、ＲＦＰ及びＯＦＰからなる群より選択される、ＦＲＥＴを生じる２種類の蛍光タンパク質の組合せである。一例において、ＦＲＥＴを生じる２種類の蛍光タンパク質の組合せは、ＣＦＰ、ＹＦＴ、ＢＦＰ及びＧＦＰからなる群より選択される１種のドナーとしての蛍光タンパク質と、ＦＲＰ及びＯＦＰからなる群より選択される１種のアクセプターとしての蛍光タンパク質との組合せである。一例において、ＦＲＥＴを生じる２種類の蛍光タンパク質の組合せは、ＣＦＰとＹＦＰとの組合せ、ＢＦＰとＧＦＰとの組合せ、又はＧＦＰとＲＦＰとの組合せが挙げられる。ドナーとしての蛍光タンパク質及びアクセプターとしての蛍光タンパク質のうちいずれがＡＴＰ結合部分のＡ末端側、Ｃ末端側に連結されていてもよい。
【００３２】
本明細書において「ＡＴＰ結合部分」は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）との結合又は解離によりその立体構造に構造変化が生じるペプチドを意味する。前記ＡＴＰ結合部分は、限定するものではないが、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、又はアデノシン酸との結合が、ＡＴＰとの結合と比べて、１０倍以上、１００倍以上、又は１０００倍以上小さい。一例において、ＡＴＰ結合部分はイノシンモノホスフェート脱水素酵素２（ＩＭＰＤＨ２）のＣＢＳドメインである。この例において、前記ＣＢＳドメインとＦＲＥＴのためのドナー及びアクセプターとしてのＣＦＰ及びＹＦＰとを含む融合タンパク質が知られている（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７；２５（２）：１７０−１７２．）。
【００３３】
他の例において、ＡＴＰ結合部分は、ＧｌｎＫ１又はその断片若しくはその改変体が挙げられる。前記ＧｌｎＫ１は、細菌におけるアンモニウム同化及び窒素固定の調節に関与することが知られている三量体ＰＩＩ様シグナル伝達タンパク質である。この例において、前記Ｇｌｎｋ１とＦＲＥＴのためのドナー及びアクセプターとしてのＣＦＰ及びＹＦＰ（ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ  ｐｅｒｍｕｔｅｄ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｖｅｎｕｓ）とを含む融合タンパク質が知られている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ２６３３４３６／）。
【００３４】
他の例において、ＡＴＰ結合部分は、ＡＴＰ合成酵素Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰａｓｅのεサブユニット、又はそれらの断片若しくは改変体が挙げられる。前記εサブユニットは、いずれの生物種由来のものであってもよい。ＡＴＰ結合部分は、限定するものではないが、微生物由来のεサブユニットである。ＡＴＰ結合部分は、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＰＳ３由来（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０４４９４２）又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｚ２８５９２）のεサブユニットである。
【００３５】
前記εサブユニットは、Ｎ末端ドメインとＣ末端ドメインの２つのドメインを含む。Ｎ末端ドメインは、εサブユニットのＮ末端側から８５番目くらいまでのアミノ酸で構成され、１０本程度のβストランドからなる。Ｃ末端ドメインは、εサブユニットのＣ末端側から４５番目くらいまでのアミノ酸で構成され、２本のαへリックスからなる。Ｃ末端ドメインは、εサブユニット単独の場合は折り畳まれた結晶構造を示す。前記εサブユニットは、ＡＴＰ合成酵素の他のサブユニットであるγサブユニットと複合体を構成する場合は、伸びた構造を示す。また生化学的な実験結果から、γサブユニット等との複合体中では、εサブユニットのＣ末端ドメインはＡＴＰの有無により構造変化を起こし、ＡＴＰがなければ伸びた状態であり、ＡＴＰが存在すると折り畳まれた構造になることが示される。これらにより、εサブユニットはＡＴＰが存在しない場合ではＣ末端ドメインが伸びた、又は動きやすい状態にあり、ＡＴＰが結合すると折り畳まれたコンパクトな状態になるものと考えられる。
【００３６】
前記εサブユニットは、例えば、全長、その断片又は改変体であってよい。前記断片は、εタンパク質において少なくともＡＴＰ特異的に構造変化を生じうる部位を担う構造を提供するペプチドであればよい。一例において、前記断片は、Ｎ末端ドメインとＣ末端ドメインの２つのドメインを含み、それらがＡＴＰの存在により構造変化を生じうるペプチドである。他の例において、前記改変体は、天然型のεサブユニット又はその断片のアミノ酸配列に、限定するものではないが、１または数個（例えば２〜５個）のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されている。一例において、εサブユニットとＡＴＰとの反応によるεタンパク質の構造変化を阻害しうる物質がεサブユニットに結合するのを防ぐために、前記εサブユニットの全長又はその断片のアミノ酸配列を一部置換してもよい。他の例において、前記εサブユニット又はその断片において、他のサブユニットであるγサブユニットとの相互作用に必要な疎水性のアミノ酸残基を、親水性のアミノ酸残基に置換することができる。
【００３７】
ＡＴＰ結合部分として、上記した菌種以外の菌種から得られたεサブユニットも用いることができる。εサブユニットは、生物種が異なればＡＴＰへのアフィニティーが異なることが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００３；２７８，３６０１３−３６０１６、及びＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００５；５７９，６８７５−６８７８）。前記融合タンパク質は、ＡＴＰ結合部分によって、低濃度のＡＴＰ濃度でＦＲＥＴによる蛍光シグナルが変化するものから、高濃度のＡＴＰ濃度でＦＲＥＴによる蛍光シグナルが変化するものまで種々の融合タンパク質を調製することができる。
【００３８】
融合タンパク質のＡＴＰ濃度に対する反応性は、ＡＴＰ結合部分の生物種以外に、ＡＴＰ結合部分に対する変異導入によっても改変することができる。ＡＴＰ結合部分をコードするＤＮＡは、公知の方法により調製することができる。ＡＴＰ結合部分をコードするＤＮＡに対する変異導入は、公知の方法に従って、実施することができる。所望の特性を有する改変ＡＴＰ結合部分は、限定するものではないが、変異導入したＤＮＡから改変ＡＴＰ結合部分を生成し、該改変体をＥＬＩＳＡ又はファージディスプレイ法を利用したスクリーニング方法に従ってスクリーニングすることによって、得ることができる。得られた改変ＡＴＰ結合部分は、限定するものではないが、表面プラズモン共鳴を利用してその結合定数又は解離定数を測定することができる。測定した結合定数又は解離定数に基づいて、所望の範囲のＡＴＰ濃度でＦＲＥＴによる蛍光シグナルが変化する融合タンパク質を調製することができる。
【００３９】
本明細書において「蛍光シグナル」は、限定するものではないが、蛍光強度、蛍光強度比、蛍光寿命が挙げられる。蛍光シグナルは、公知の方法により測定することができる。蛍光シグナルは、限定するものではないが、分光光度計、蛍光寿命測定装置などの商業的に入手可能な装置を用いて測定することができる。
【００４０】
一例において、蛍光シグナルは、前記融合タンパク質を発現する非ヒトトランスジェニック動物の心臓からの蛍光シグナルである。この例において、蛍光シグナルは、限定するものではないが、前記非ヒトトランスジェニック動物の胸部を開胸して露出された心臓表面全体からの蛍光シグナル、又は前記心臓の一部（例えば心房部分又は心室部分）からの蛍光シグナルである。心臓の一部からの蛍光シグナルは、例えば、心臓表面全体からの蛍光シグナルを所定時間測定した後に、測定時間内で蛍光シグナルの変化が大きかった領域部分からの蛍光シグナルである。このような蛍光シグナル変化が大きかった領域部分の抽出は、プログラムなどを用いて自動的に又は半自動的に行われてもよく、或いは解析者により行われてもよい。
【００４１】
他の例において、蛍光シグナルは、前記融合タンパク質を発現する心筋細胞からの蛍光シグナルである。
本明細書において、前記融合タンパク質を発現する「心筋細胞」は、限定するものではないが、前記融合タンパク質を発現する非ヒトトランスジェニック動物由来の心筋細胞、前記融合タンパク質を発現する幹細胞由来の心筋細胞が挙げられる。この例において、前記幹細胞由来の心筋細胞は、限定するものではないが、前記融合タンパク質を発現する胚性幹細胞から作製された心筋細胞、又は前記融合タンパク質を発現する人工多能性幹細胞から作製された心筋細胞である。一例において、前記融合タンパク質を発現する人工多能性幹細胞は、ヒト体細胞から公知の方法に従って誘導された人工多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞）である。
【００４２】
蛍光シグナルを測定する条件は、限定するものではないが、心臓又は心筋細胞の生理的機能を妨げないよう当業者により適宜設定される。一例において、蛍光シグナルは、１秒間の励起光の照射及び露光による撮影を、１０秒間隔で６０分間行われる。
【００４３】
一例において、前記融合タンパク質に由来する蛍光シグナルは、ＦＲＥＴが生じている場合、ドナーとしての蛍光タンパク質に対して励起光を照射することによって、ドナーとしての蛍光タンパク質及びアクセプターとしての蛍光タンパク質からそれぞれ得ることができる。一例において、２種類の蛍光タンパク質由来の蛍光シグナルは、公知の方法に従って、各蛍光タンパク質由来の蛍光シグナルに分光し、測定することができる。測定された各蛍光タンパク質由来の蛍光シグナルから、ＦＲＥＴ効率を算出することができる。
【００４４】
本明細書において「ＦＲＥＴ効率」は、ドナーとしての蛍光タンパク質に吸収されたエネルギーのうち、アクセプターとしての蛍光タンパク質に移動する割合を意味する。一例において、ＦＲＥＴ効率は、ドナーとしての蛍光タンパク質に由来する蛍光強度（「ドナー側の蛍光強度」）に対するアクセプターとしての蛍光タンパク質に由来する蛍光強度（アクセプター側の蛍光強度」）の比（＝［アクセプター側の蛍光強度］／［ドナー側の蛍光強度］）であってよい。
【００４５】
他の例において、ＦＲＥＴ効率は、ドナーとしての蛍光タンパク質の蛍光寿命である。他の例において、アクセプター側の蛍光強度又はドナー側の蛍光強度は、ＦＲＥＴ効率を反映して変動し得る。このため、アクセプター側の蛍光強度又はドナー側の蛍光強度をみかけのＦＲＥＴ効率として利用することができる。
【００４６】
本明細書において「非ヒトトランスジェニック動物」は、前記融合タンパク質を発現するように作製された、ヒトを除く動物を意味する。非ヒトトランスジェニック動物は、限定するものではないが、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡを非ヒト動物の染色体上に組み込んで、前記融合タンパク質を発現させることで得ることができる。
【００４７】
前記融合タンパク質をコードするＤＮＡは、限定するものではないが、非ヒトトランスジェニック動物の細胞で機能するよう、プロモーターの制御下で発現される。前記プロモーターとしては、限定するものではないが、β−アクチンプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧ（ＣＡＧＧＳ）プロモーターが挙げられる。一例において、前記プロモーターは、発現効率の観点から、例えば、ＣＡＧ（ＣＡＧＧＳ）プロモーターである。他の例において、前記プロモーターは、時期特異的プロモーター又は組織特異的プロモーターである。
【００４８】
融合タンパク質をコードするＤＮＡを相同組換えによって染色体上の内因性遺伝子と置き換える場合、前記ＤＮＡは、限定するものではないが、染色体上の目的部位と相同な配列を含む。一例において、染色体上の目的部位は、Ｒｏｓａ２６遺伝子座である。Ｒｏｓａ２６遺伝子座は、限定するものではないが、ヒトＲｏｓａ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  ２５，  ｐａｇｅｓ  １４７７-１４８２  （２００７））、マウスＲｏｓａ２６遺伝子座、その他の動物における対応する遺伝子座が挙げられる。マウスＲＯＳＡ２６遺伝子座は、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ及びＳｏｒｉａｎｏにより１９９１年に、レトロウイルスを感染させた胚性幹（ＥＳ）細胞を用いるジーントラップ実験により発見された（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，Ｇ．及びＰ．Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９１，５，１５１３〜１５２３）。
【００４９】
融合タンパク質をコードするＤＮＡは、限定するものではないが、Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ又はＦｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅなどの遺伝子組換えタンパク質によって認識されるｌｏｘ系配列を代表とする認識配列を含んでもよい。一例において、プロモーターと融合タンパク質をコードするＤＮＡの間にストップコドン及び／又は薬剤耐性遺伝子を配置し、Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが発現したときに、該プロモーターと融合タンパク質をコードするＤＮＡが直接連結し、該プロモーターによる転写が開始するようにすることができる。ｌｏｘ系配列としては、例えば、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ７１、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、Ｖｌｏｘ（ＶＣｒｅ）、Ｓｌｏｘ（ＳＣｒｅ）が挙げられる。他の例において、ＦＬＰにより認識されるＦＲＴ配列を、認識配列として使用してもよい。
【００５０】
一例において、融合タンパク質をコードするＤＮＡは、選択マーカーを含む。「選択マーカー」は、選択マーカーが導入された細胞に選択可能な表現型を提供する遺伝エレメントを意味する。選択マーカーは、限定するものではないが、細胞の増殖を阻害するか又は細胞を殺傷する薬剤に対して、耐性を与えるタンパク質をコードした遺伝子である。選択マーカーは、公知のものを特に制限なく用いることができる。選択マーカーは、例えば、Ｎｅｏ遺伝子、Ｈｙｇ遺伝子、ｈｉｓＤ遺伝子、Ｇｐｔ遺伝子、及びＢｌｅ遺伝子が挙げられる。選択マーカーの存在を選択するために有用な薬物としては、限定するものではないが、Ｎｅｏ遺伝子に対してはＧ４１８、Ｈｙｇ遺伝子に対してはハイグロマイシン、ｈｉｓＤ遺伝子に対してはヒスチジノール、Ｇｐｔ遺伝子に対しては６−チオキサンチン、そしてＢｌｅ遺伝子に対してはブレオマイシンが挙げられる。
【００５１】
前記非ヒトトランスジェニック動物は、例えば、国際公開公報ＷＯ２０１５／１０８１０２号、Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８６）、米国特許第５，６１６，４９１号および５，７５０，８２６号に記載の方法に従って作製することができる。具体的には、前記非ヒトトランスジェニック動物は、以下の（ａ）〜（ｇ）の工程を含む方法により得ることができる：
（ａ）融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むターゲッティングベクターを非ヒト動物の胚性幹（ＥＳ）細胞に導入する工程；（ｂ）前記融合タンパク質をコードするＤＮＡが挿入された染色体を有するＥＳ細胞を選択する工程；（ｃ）選択したＥＳ細胞を受精卵に導入する工程；（ｄ）前記受精卵を偽妊娠雌性非ヒト動物の卵管あるいは子宮に移植する工程；（ｅ）前記非ヒト動物を飼育し、産まれた仔から、生殖系列キメラを選択する工程；（ｆ）前記生殖系列キメラを交配させ、産まれた仔から、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡが挿入された染色体を有する個体を選択する工程；（ｇ）工程（ｆ）で得られた個体同士を交配させ、産まれた仔から、両方の相同染色体において、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡが挿入されたホモ接合体を選択する工程。
【００５２】
一例において、非ヒトトランスジェニック動物は、遺伝子工学的手法により、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡがその染色体上のＲＯＳＡ２６遺伝子座に挿入されている。他の例において、非ヒトトランスジェニック動物は、遺伝子工学的手法により、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡはＣＡＧプロモーター配列と作動可能に連結されている。他の例において、非ヒトトランスジェニック動物は、遺伝子工学的手法により、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡがその染色体上のＲＯＳＡ２６遺伝子座に挿入され、かつ、前記ＤＮＡはＣＡＧプロモーター配列と作動可能に連結されている。
【００５３】
前記非ヒトトランスジェニック動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ウシ、マーモセットのトランスジェニック動物である。一例において、前記非ヒトトランスジェニック動物は、トランスジェニックマウス、トランスジェニックラット又はトランスジェニックウサギである。他の例において、前記非ヒトトランスジェニック動物はトランスジェニックマウスである。
【００５４】
前記非ヒトトランスジェニック動物は、公知の方法に従って作製された疾患モデル非ヒトトランスジェニック動物であってよい。疾患モデル非ヒトトランスジェニック動物は、限定するものではないが、糖尿病モデル動物、癌疾患モデル動物、及び感染症モデル動物が挙げられる。
【００５５】
本明細書において前記融合タンパク質を発現する「幹細胞」は、限定するものではないが、前記融合タンパク質を発現するように作製された胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞が挙げられる。前記幹細胞は、限定するものではないが、遺伝子工学的手法により、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡがその染色体上に挿入されている。一例において、前記幹細胞は、その染色体上のＲＯＳＡ２６遺伝子座に挿入されており、前記ＤＮＡはＣＡＧプロモーター配列と作動可能に連結されている。前記幹細胞は、例えば、国際公開公報ＷＯ２０１５／１０８１０２号に記載の方法に従って作製することができる。前記人工多能性幹細胞は、限定するものではないが、前記融合タンパク質を発現する体細胞にリプログラミング因子を導入することによって調製することができる。
【００５６】
前記幹細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ウシ、マーモセット由来の細胞が挙げられる。一例において、前記幹細胞は、ヒト由来の細胞である。一例において、前記幹細胞は、ヒト体細胞由来の人工多能性幹細胞である。幹細胞から心筋細胞を作製する方法としては、限定するものではないが、胚様体形成法でサイトカインを用いて心筋細胞を分化誘導する方法（例えば、Ｎａｔｕｒｅ．２００８Ｍａｙ２２；４５３（７１９４）：５２４−８）、接着培養でサイトカインを使わずに心筋細胞を分化誘導する方法（例えば、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，２０１２Ｊｕｌｙ３；１０９（２７）：Ｅ１８４８−５７）、接着培養と、浮遊培養とを併用し、サイトカインを使わずに心筋細胞を分化誘導する方法（例えばＣｅｌｌ  Ｒｅｐ．，２０１２Ｎｏｖ２９；２（５）：１４４８−６０）などが知られている。一例において、心筋細胞は、前記幹細胞を心筋細胞への分化を誘導する因子と共に培養することによって調製される。
【００５７】
投与された被験物質が心毒性を生じるか否かの「判定」は、心臓におけるＡＴＰの供給と需要（消費）のバランスが乱されるか否かにより決定される。理論に拘泥するものではないが、心臓は、血液を大動脈に駆動するポンプ作用を有する。心臓のポンプ作用は心筋によって担われている。心筋はそのエネルギー源として大量のＡＴＰの供給を必要とし、ポンプ作用によりそのＡＴＰを大量に消費する。正常な心臓では、ＡＴＰの需要と供給のバランスが保たれていると考えられ（図１ａ）、心臓におけるＡＴＰ濃度は安定していると考えられる。
【００５８】
これに対して、例えば心虚血などにより、ＡＴＰの供給が滞るとＡＴＰ供給に対してＡＴＰ消費が大きくなり、ＡＴＰの需要と供給のバランスが乱れる（図１ｂ）。また、除脈や心収縮低下などにより、ＡＴＰが消費されにくくなるとＡＴＰ供給に対してＡＴＰ消費が小さくなり、ＡＴＰの需要と供給のバランスが乱れる（図１ｃ）。このようなＡＴＰの需要と供給のバランスの乱れが生じると、心臓におけるＡＴＰ濃度は変動すると考えられる。以上から、投与された被験物質が心毒性を生じるか否かの判定は、心臓におけるＡＴＰ濃度の変化に基づいて決定される。
【００５９】
ＡＴＰの需要と供給のバランスは、拍動する心筋細胞でも保たれていると推測される。従って、他の例において、投与された被験物質が心毒性を生じるか否かの判定は、心筋細胞におけるＡＴＰの供給と需要（消費）のバランスが乱されるか否かにより、即ち、心筋細胞におけるＡＴＰ濃度の変化に基づいて決定される。
【００６０】
１つの実施形態において、ＡＴＰ濃度は蛍光シグナルから算出することができる。一例において、ＡＴＰ濃度は、前記融合タンパク質を発現する細胞の細胞質に所定濃度となるようにＡＴＰを導入し、前記細胞からの蛍光シグナルとＡＴＰ濃度との関係を示す検量線を得て、前記融合タンパク質を発現する濃度未知のＡＴＰを含む心筋細胞又は心臓からの蛍光シグナルと前記検量線とから得ることができる。この例において、細胞の細胞質に所定濃度のＡＴＰを導入する方法としては、限定するものではないが、細胞の細胞膜に孔を設け、その培養液にＡＴＰを所定濃度となるように添加することによって実施することができる。
【００６１】
他の例において、ＡＴＰ濃度は、前記融合タンパク質を発現する細胞から前記細胞からの蛍光シグナルを測定し、及び測定後に細胞中のＡＴＰ濃度を測定し、それぞれ測定した蛍光シグナル及び細胞中のＡＴＰ濃度との関係を示す検量線を得て、前記融合タンパク質を発現する濃度未知のＡＴＰを含む心筋細胞又は心臓からの蛍光シグナルと前記検量線とから得ることができる。前記例において、細胞のＡＴＰ濃度を測定する方法としては、公知の方法、例えばルシフェラーゼ法を用いることができる。
【００６２】
前記のようにして得られた検量線からＡＴＰ濃度を得るには、上記した検量線の利用に代えて、前記検量線にモデル式をフィッティングして得られた関数を用いてもよい。前記モデル式は、例えば、Ｈｉｌｌの式である。この例において、フィッティングにより得られた関数に対して、濃度未知の心筋細胞又は心臓から得られた蛍光シグナルを前記関数に適用することで、前記サンプルのＡＴＰ濃度を算出することができる。
【００６３】
１つの実施形態において、投与された被験物質が心毒性を生じるか否かの判定は、測定された蛍光シグナルと、第１の閾値とを比較することにより行われる。この実施形態において、融合タンパク質はＡＴＰが結合することによってＦＲＥＴが生じる。
一例として、測定された蛍光シグナルはＦＲＥＴ効率であり、第１の閾値は、被験物質を投与していない場合に測定されたＦＲＥＴ効率の最大値より大きい数値（例えば、前記最大値の３倍）である。測定されたＦＲＥＴ効率が、第１の閾値以上の場合、投与された被験物質は心毒性を生じると判定される。この例において、測定された蛍光シグナルが、第１の閾値未満の場合、投与された被験物質は心毒性を生じないと判定される。
【００６４】
上記実施形態の他の例において、投与された被験物質が心毒性を生じるか否かの判定は、測定された蛍光シグナルと、第１の閾値より小さい第２の閾値と比較することをさらに含む。一例として、第２の閾値は、被験物質を投与していない場合に測定されたＦＲＥＴ効率の最小値よりも小さい数値である。測定されたＦＲＥＴ効率が、第１の閾値未満であり、第２の閾値以上の場合、投与された被検物資は心毒性を生じないと判定される。この例において、測定された蛍光シグナルが、第１の閾値以上または第２の閾値未満の場合、投与された被験物質は心毒性を生じと判定される。
【００６５】
上記実施形態では、測定された蛍光シグナルはＦＲＥＴ効率であったが、本態様はこれに限定されない。例えば、測定された蛍光シグナルは、測定時間に対するＦＲＥＴ効率を表す関数（ｆ（ｘ））の所定時間区間［ａ，ｂ］におけるＦＲＥＴ効率の積分値であってよい。
【００６６】
上記実施形態では、第１の閾値と第２の閾値とは共にＦＲＥＴ効率であったが、本態様はこれに限定されない。例えば、第１の閾値がＦＲＥＴ効率に関するものであり、第２の閾値がＦＲＥＴ効率の積分値であってよい。上記実施形態では、１つの閾値、または２つの閾値と比較することを含んだが、本態様はこれに限定されない。他の実施形態では、３つの閾値と比較してもよい。上記実施形態では、融合タンパク質はＡＴＰが結合することによってＦＲＥＴが生じるものであったが、本態様はこれに限定されない。例えば、融合タンパク質はＡＴＰが結合することによってＦＲＥＴが解消されるものであってよい。
【００６７】
１つの態様において、被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する方法が提供される。前記判定方法は、被験物質を、ＡＴＰ結合部分と、蛍光共鳴エネルギー移動のためのドナーとしての蛍光タンパク質と、アクセプターとしての蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質を発現する非ヒトトランスジェニック動物に投与する工程；前記非ヒトトランスジェニック動物の心臓からの蛍光シグナルを測定する工程；及び測定された蛍光シグナルに基づいて、前記被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する工程を含む。本件明細書に記載した、被験物質に関する特徴、融合タンパク質に関する特徴、非ヒトトランスジェニック動物に投与する工程に関する特徴、及び非ヒトトランスジェニック動物の心臓からの蛍光シグナルを測定する工程に関する特徴などは、この態様に適用される。
【００６８】
上記態様において、前記融合タンパク質を発現する非ヒトトランスジェニック動物は、前記融合タンパク質を発現する心筋細胞を含む心臓を有する非ヒトキメラ動物に置き換えることができる。この態様において、被験物質を、前記融合タンパク質を発現する非ヒトキメラ動物に投与する工程；前記非ヒトキメラ動物の心臓からの蛍光シグナルを測定する工程；及び測定された蛍光シグナルに基づいて、前記被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する工程を含む、判定方法が提供される。本件明細書に記載した、被験物質を非ヒトトランスジェニック動物に投与する工程に関する特徴、及び非ヒトトランスジェニック動物の心臓からの蛍光シグナルを測定する工程に関する特徴などは、非ヒトトランスジェニック動物を非ヒトキメラ動物に読み替えたうえで、この態様にも適用される。
【００６９】
本明細書において「非ヒトキメラ動物」は、前記融合タンパク質を発現する細胞と、前記細胞と異種の非ヒト細胞とが混在する動物であって、前記融合タンパク質を発現する細胞由来の心筋細胞を含む心臓を有する動物を意味する。非ヒトキメラ動物は、公知の発生工学的手法により（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｃｅｌｌ，１６８，４７３−４８６）、作製することができる。一例において、非ヒトキメラ動物は、前記融合タンパク質を発現する幹細胞を、遺伝子工学により心臓を形成しないように改変された、前記細胞と異なる種の非ヒト幹細胞で構成される胚に注入することにより作製することができる。この例において、前記融合タンパク質を発現する幹細胞は、例えば、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞（例えばヒト体細胞から公知の方法に従って誘導された人工多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞））であってよい。
【００７０】
１つの態様において、被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する方法が提供される。１つの実施形態において、前記判定方法は、被験物質を心筋細胞と接触させる工程；前記心筋細胞におけるＡＴＰ濃度を測定する工程；及び測定されたＡＴＰ濃度に基づいて、前記被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する工程を含む。他の実施形態において、前記判定方法は、被験物質を非ヒト動物に投与する工程、及び前記非ヒト動物の心臓におけるＡＴＰ濃度を測定する工程；及び測定されたＡＴＰ濃度に基づいて、前記被験物質が心毒性を生じるか否かを判定する工程を含む。この態様において、心筋細胞又は心臓におけるＡＴＰ濃度の測定は、限定するものではないが、公知の測定方法（例えば、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ））を利用することができる。本件明細書に記載した、被検物質に関する特徴、被験物質を心筋細胞と接触させる方法、心筋細胞に関する特徴、及びＡＴＰ濃度に基づいて被検物質が心毒性を生じるか否かの判定に関する特徴等は、この態様にも適用される。
【００７１】
本明細書において「非ヒト動物」は、ヒト以外の動物を意味する。非ヒト動物は、限定するものではないが、脊椎動物、特に哺乳動物である。非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ウシ又はマーモセットである。
【００７２】
本明細書において「薬物の候補物質」は、上記態様のいずれかの判定方法において心毒性を生じないと判定された被験物質を意味する。判定方法を実施する工程の判定結果の表現は、「心毒性を生じる」又は「心毒性を生じない」に限定されず、例えば、「心毒性を生じるおそれがある／そのおそれが小さい又はそのおそれがない」、「心毒性が懸念される／懸念されない」、「薬物の候補物質である／ない」であってよい。本明細書において「薬物の候補物質ライブラリー」は、２種以上の薬物の候補物質（例えば、１０種以上、１００種以上、又は１０００種以上の薬物の候補物質）を含む。
【００７３】
１つの態様において、薬物の候補物質ライブラリーを製造する方法が提供される。前記製造方法は、薬物の候補物質のライブラリーの製造において用いられる２種以上の被験物質の各々について、心毒性を生じるか否かを判定する上記判定方法を実施する工程；及び前記工程において、心毒性を生じないと判定された被験物質を選抜し、薬物の候補物質ライブラリーを製造する工程を含む。本件明細書において判定方法等に関して上記した特徴は、本態様の判定方法等にも適用される。
【００７４】
１つの態様において、被験物質が心毒性を生じるか否かの判定用の、ＡＴＰ結合部分と、蛍光共鳴エネルギー移動のためのドナーとしての蛍光タンパク質と、アクセプターとしての蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質を発現する心筋細胞、非ヒトキメラ動物又は非ヒトトランスジェニック動物が提供される。判定方法及び非ヒトトランスジェニック動物等に関して上記した特徴は、本態様の心筋細胞、非ヒトキメラ動物及び非ヒトトランスジェニック動物にも適用される。
【００７５】
以下、具体的な実施例を記載するが、それらは本発明の好ましい実施形態を示すものであり、添付する特許請求の範囲に記載の発明をいかようにも限定するものではない。
【００７６】
［比較例１］
（１）融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウス
国際公開公報ＷＯ２０１５／１０８１０２号に記載の方法に従って創出された、ＡＴＰ濃度に依存して異なる色の蛍光を発するトランスジェニックマウスを用いた。
【００７７】
前記トランスジェニックマウスは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＡＴＰ合成酵素のεサブユニット（Ｒ１２２Ｋ／Ｒ１２６Ｋ）と、そのＮ末端に緑色蛍光タンパク質（ｃｐ１７３−ｍＥＧＦＰ）及び前記εサブユニットのＣ末端に赤色蛍光タンパク質（ｍＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ）とが融合された融合タンパク質（ＧＯ−ＡＴｅａｍ２（Ｎａｋａｎｏ，Ｍ，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，２０１１；６，７０９−７１５）を発現している。前記融合タンパク質をコードするＤＮＡは、前記トランスジェニックマウスにおいて、染色体上のＲＯＳＡ２６遺伝子座に挿入されており、ＣＡＧプロモーター配列と作動可能に連結されている。
【００７８】
前記トランスジェニックマウスでは、ＡＴＰが前記融合タンパク質中のεサブユニット部分と結合すると、融合タンパク質において融合された２つの蛍光タンパク質の間でＦＲＥＴが生じる。このＦＲＥＴによって、ＡＴＰが結合する前と後とで、前記融合タンパク質から異なる色の蛍光シグナルが発せられる。具体的には、前記融合タンパク質は、ＡＴＰが結合する前には主として緑色（ピーク波長：５０９ｎｍ）の蛍光シグナルを発し、ＡＴＰ結合後には主として赤色（ピーク波長：５５９ｎｍ）の蛍光シグナルを発する。ＡＴＰとεサブユニットとは、ＡＴＰ濃度依存的に結合する。前記トランスジェニックマウスの心臓全体又はその一部から発せられる蛍光シグナル又は蛍光シグナルの変化を測定することによって、前記マウスの心臓又はその一部のＡＴＰ濃度又はＡＴＰ濃度の変化を調べることができる。
【００７９】
（２）蛍光画像測定
前記トランスジェニックマウスをイソフルランにて麻酔した後に、気管挿管した。頚静脈から毎分１５μＬの流速で生理食塩水（０．９％  ＮａＣｌ水溶液）を投与した。麻酔した前記トランスジェニックマウスに開胸手術を施し、心臓を露出させた。露出された心臓に、光源  Ｘｃｉｔｅ  ＬＥＤ１１０から励起フィルター４７０／４０ｎｍを通じた励起光を照射し、心臓からの蛍光シグナルを、Ｄｕａｌ−Ｖｉｅｗ（日本ローパー社製、ＢＰ５１５／３０、ＤＭ５４０、ＢＰ５７５／４０）にて前記融合タンパク質の緑色蛍光タンパク質由来の蛍光シグナル（Ｇ）と赤色蛍光タンパク質由来の蛍光シグナル（Ｒ）とに分光した。心臓の各蛍光画像をＯＲＣＡ−Ｆｌａｓｈ４．０（浜松ホトニックス社）にて撮影した。
【００８０】
撮影開始時（０ｍｉｎ）に得られた各蛍光画像を重ね合わせた（図２ａ）。励起光は、撮影時のみ照射した。撮影は、露光時間１秒にて１０秒間隔で６０分間行った（図２ｂ）。
【００８１】
（３）心電図及び直腸温測定
心臓の撮影と並行して心電図及び直腸の温度を計測した。心電図には生理食塩水の投与前（図２ｃ）と投与後（図２ｄ）との間に有意な変化は見られなかった。また、直腸温にも有意な変化はなかった。
【００８２】
（４）ＡＴＰ濃度算出
（４．１）蛍光強度比と繊維芽細胞内のＡＴＰ濃度
前記融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウスから、繊維芽細胞を樹立した。樹立した繊維芽細胞の細胞膜に孔を設けるために、前記繊維芽細胞の培養液にα−ｔｏｘｉｎを添加した。次いで、種々の濃度となるようＡＴＰを前記培養液に添加して約１０分間培養した後、前記繊維芽細胞の蛍光画像を取得した。各ＡＴＰ濃度での、緑色蛍光タンパク質由来の蛍光強度（Ｇ）に対する赤色蛍光タンパク質由来の蛍光強度（Ｒ）の蛍光強度比（＝［蛍光強度（Ｒ）］／［蛍光強度（Ｇ）］）を算出した。算出した蛍光強度比を、ＡＴＰ濃度に対してプロットした散布図を作成した。
【００８３】
（４．２）蛍光強度比と受精卵のＡＴＰ濃度
前記融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウスから受精卵を採取した。採取した受精卵を含む培養液をスライドグラス上におき、前記培養液に解糖系の阻害剤（２−デオキシ−Ｄ−グルコース；２ＤＧ）及び電子伝達系の阻害剤（Ａｎｔｉｍｙｃｉｎ  Ａ）を添加した。前記阻害剤の添加後に、前記受精卵から得られる蛍光強度の比が変化したときに撮影し、その直後に受精卵をそれぞれ物理的に破砕した。破砕前に受精卵の体積を見積もった。受精卵の破砕液中のＡＴＰ濃度をＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ法にて定量した。定量した破砕液のＡＴＰ濃度と破砕液から受精卵のＡＴＰ含有量を算出し、算出したＡＴＰ含有量及び受精卵の体積から受精卵のＡＴＰ濃度を算出した。各受精卵の蛍光強度比を、前記受精卵のＡＴＰ濃度に対してプロットした散布図を作成した。
【００８４】
（４．３）蛍光強度比とＡＴＰ濃度
上記（４．１）で作成した散布図に示された蛍光強度比とＡＴＰ濃度との曲線と、上記（４．２）で作成した散布図に示された蛍光強度比とＡＴＰ濃度との曲線とがほぼ一致した。そこで、（４．１）で得られた蛍光強度比とＡＴＰ濃度のデータ及び（４．２）で得られた蛍光強度比とＡＴＰ濃度のデータから、各ＡＴＰ濃度と蛍光強度比との散布図を作成した。
【００８５】
作成した散布図に示された蛍光強度比とＡＴＰ濃度との曲線に対して、Ｈｉｌｌの式［Ｒ＝（Ｒｍａｘ−Ｒｍｉｎ）×［ＡＴＰ］ｎ／［ＡＴＰ］ｎ＋Ｋｄｎ）＋Ｒｍｉｎ］をフィッティングした［式中、Ｒは蛍光強度比であり、Ｒｍａｘは最大の蛍光強度比であり、Ｒｍｉｎは最小の蛍光強度比であり、Ｋｄは前記融合タンパク質のεサブユニットとＡＴＰとの解離定数（１．６［ｎＭ］）であり、［ＡＴＰ］はＡＴＰ濃度である。］。フィッティングにより、
【数１】
2020071206.tif 000002
が得られた。
【００８６】
重ね合わせた蛍光画像の色は、緑色蛍光タンパク質由来の蛍光強度（Ｇ）に対する赤色蛍光タンパク質由来の蛍光強度（Ｒ）の蛍光強度比を反映している。（式１）を用いることで、各画像の興味ある領域（ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ；ＲＯＩ）の蛍光強度比からＡＴＰ濃度が算出される。図２ａ及び図２ｂの重ね合わせ画像の右横には、色変化とＡＴＰ濃度との関係を示す棒が示されている。
【００８７】
（５）ＡＴＰ濃度変化
生理食塩水の投与直後の測定開始時（０分）から６０分間の持続投与の間のＡＴＰ濃度の変化（ΔＡＴＰ（ｍＭ）＝［測定時（分）のＡＴＰ濃度（ｍＭ）］−［測定開始時（０分）のＡＴＰ濃度（ｍＭ）］）を示す（図２ｅ）。図２ｅは、比較例１の測定系ではＡＴＰ濃度は０．０５ｍＭ程度の変動の範囲内で安定していることを示す。
【００８８】
［実施例１］
頚静脈からジソピラミド（Ｄｉｓｏｐｙｒａｍｉｄｅ）を投与したことを除いて、比較例１と実質的に同じ方法で、心電図の測定（図３ａ）、蛍光画像の取得（図３ｂ）、及びＡＴＰ濃度を測定した（図３ｃ）。
【００８９】
図３ａは、０．２［ｍｇ／ｍｌ］のジソピラミドが心電図に有意な変化を示さないことを示す。図３ｂ及び図３ｃは、ジソピラミドの投与により、心臓におけるＡＴＰ濃度が経時的に増加したことを示す。
【００９０】
ジソピラミドは、Ｎａチャネルを遮断し、心筋収縮力を減少させることによって、心室頻脈を治療するために用いられる抗不整脈薬（クラス１ａ不整脈剤）である。ジソピラミドは、心電図にＴ波の形態異常を伴う再分極異常（ＱＴ延長）を呈し、トルサード・ド・ポワント（ＴｄＰ）などの重症心室性不整脈を生じて、突然死をきたしうることが知られている。
【００９１】
実施例１では、心電図からＱＴ延長が認められなかった濃度でのジソピラミドであっても（図３ａ）、心臓におけるＡＴＰ濃度に有意な変化が検出された（図３ｂ及びｃ）。この結果は、本実施形態に係る発明によれば、心電図でＱＴ延長が認められないような被験物質の投与条件であっても、ＱＴ延長症候群を来しうる物質を見つけ出すことが可能であることを示す。
【００９２】
［実施例２〜１４］
下記表の被験物質を投与したことを除いて、実施例１と実質的に同じ方法で、心臓でのＡＴＰ濃度の時間変化を測定した。
【表１】
2020071206.tif 000003
【００９３】
【表２】
2020071206.tif 000004
【００９４】
【表３】
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【００９５】
実施例２〜１４では、６０分間のＡＴＰ濃度変化の測定において、生理食塩水を用いた場合のＡＴＰ濃度変化の最大値（約０．０５ｍＭ、比較例１）の３倍のＡＴＰ濃度変化の値（０．１５ｍＭ）を第１の閾値とし、ＡＴＰ濃度変化の最大値が、第１の閾値未満であった被験物質を、心毒性を生じないと判定し、第１の閾値以上であった被験物質を、心毒性を生じると判定する。本実施形態において、心毒性を生じないと判定された物質は、薬物の候補物質と特定される。
【００９６】
実施例２〜１１の被験物質はいずれも、ＡＴＰ濃度変化の最大値が第１の閾値（０．１５ｍＭ）以上であり（図４及び図５）、心毒性を生じるおそれがあると判定された。
実施例１２〜１４の被験物質はいずれも、ＡＴＰ濃度変化の最大値が第１の閾値未満であり（図６）、心毒性を生じないと判定された。
【００９７】
実施例１の被験物質は、ＡＴＰ濃度変化の最大値が第１の閾値（０．１５ｍＭ）以上であり（図３）、心毒性を生じるおそれがあると判定された。したがって、本実施形態において、実施例１〜１４の被験物質のうち実施例１〜１１の被験物質が心毒性を生じるおそれがあると判定された。
【００９８】
実施例１〜１１の候補物質は、アメリカ食品衛生局（ＦＤＡ）にＴｄＰを生じうる化合物として登録されている。実施例１〜１１の候補物質は、本実施形態においても心毒性を生じるおそれがあると判定された。これらの結果は、本実施形態によれば、心毒性を生じるおそれがあると判定された被験物質を、被験物質のライブラリーから除くことによって薬物の候補物質ライブラリーを製造することができることを示す。
【００９９】
本実施形態において、実施例１〜１４の被験物質のうち実施例１２〜１４の被験物質が心毒性を生じないと判定された。
実施例１２及び１３の被験物質は、実験的に心臓の再分極に影響を及ぼさないこと、又はＱＴ間隔延長をきたさないことが知られている。本実施形態においても、実施例１２及び１３の化合はいずれも心毒性を生じないと判定された。これらの結果は、本実施形態によれば、心毒性を生じない物質を集めることで、薬物の候補物質ライブラリーを製造することができることを示す。
【０１００】
［実施例１５〜１７］
下記表の被験物質を投与したことを除いて、実施例１と実質的に同じ方法で、心臓でのＡＴＰ濃度の時間変化を測定した。
【表４】
2020071206.tif 000006
【０１０１】
実施例１５〜１７では、ＡＴＰ濃度の変化を示す関数（ｆ（ｘ））の区間[０、６０］での積分値について０（ゼロ）を第２の閾値とした。本実施形態において、第２の閾値未満であった被験物質は心毒性を生じるおそれがあると判定される。
【０１０２】
図７ａ〜ｃから理解されるように、実施例１５〜１７でのＡＴＰ濃度の変化を示す関数の区間［０、６０］での積分値は負（＜０）の値であった。したがって、本実施形態において、実施例１５〜１７の被験物質はいずれも、心毒性を生じるおそれがあると判定された。
【０１０３】
実施例１５〜１７の被験物質はいずれも、心電図異常や心室機能障害を呈しうることが知られている。本実施形態においても、実施例１５〜１７はいずれも心毒性を生じるおそれがあると判定された。これらの結果は、本実施形態によれば、被験物質ライブラリーから心毒性を生じるおそれがある物質を特定するのに有用であることを示している。
【０１０４】
［実施例１８］
実施例１〜１７では、前記トランスジェニックマウスの心臓全体でのＡＴＰ濃度の変化を測定した。実施例１８では、被験物質イホスファミドについて、心室部分のＡＴＰ濃度の変化を測定した（図７ｃ、左心室部分）。被験物質イホスファミドについて、心臓全体のＡＴＰ濃度の変化を測定した場合と比べて（図７ｃ、心臓全体）、心室部分のＡＴＰ濃度の変化の方が（図７ｃ、左心室部分）、より大きいダイナミックレンジで測定できた。この結果は、心臓の特定部分のＡＴＰ濃度変化を測定することで、より感度よく被験物質が心毒性を生じるおそれがあるか否かを判定できることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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