(57)【要約】【課題】Ｌ−ＦＡＢＰのみの定量結果に基づき肝疾患早期の患者から末期肝硬変患者までを一貫して検査し得る肝疾患検査方法、その検査キット及びコンパニオン診断薬を提供すること。【解決手段】被験者から採取した血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含む肝疾患の検査方法であって、前記定量の結果に基づき、肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つを判定する検査方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取した血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含む肝疾患の検査方法であって、前記定量の結果に基づき、肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つを判定する検査方法。
【請求項２】
前記判定は、肝疾患による死亡リスクの予測を含む、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
被験者から採取した血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含む肝疾患の検査方法であって、
前記肝疾患が、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患である、検査方法。
【請求項４】
被験者から採取した血液中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値を定量する工程を含む肝疾患の検査方法。
【請求項５】
前記定量する工程が、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程である、請求項４に記載の検査方法。
【請求項６】
前記定量が、抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における定量である、請求項４又は５に記載の検査方法。
【請求項７】
前記条件が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理によって形成された条件である、請求項６に記載の検査方法。
【請求項８】
前記抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件よりも、酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質及び酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度差が小さい条件にて前記肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を更に含む、請求項６又は７に記載の検査方法。
【請求項９】
前記測定感度差が小さい条件が、前記血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を界面活性剤による変性処理により形成された条件である、請求項８に記載の検査方法。
【請求項１０】
前記測定感度差が小さい条件における前記肝型脂肪酸結合タンパク質の測定値と、前記抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における測定値とに基づき、血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含む、請求項８又は９に記載の検査方法。
【請求項１１】
前記肝疾患が、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患である、請求項１、２又は４に記載の検査方法。
【請求項１２】
前記検査が、肝疾患による死亡リスクの予測を含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項１３】
下記（１）及び（２）よりなる群から選択される少なくとも１つの工程を含む、被験者における肝型脂肪酸結合タンパク質の量又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値に基づく肝疾患の検査方法。
（１）肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の正常範囲、又は慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患における肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の範囲、又は肝疾患による死亡リスクを有する肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の範囲と、被験者における肝型脂肪酸結合タンパク質の量とを比較し、被験者における前記量が、前記範囲のいずれに該当するかを決定する工程
（２）酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の正常範囲、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の範囲、又は肝疾患による死亡リスクを有する酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の範囲と、被験者の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、被験者における前記量若しくはそれと相関するパラメータの値が、前記範囲のいずれに該当するかを決定する工程
【請求項１４】
肝型脂肪酸結合タンパク質のみの定量結果に基づく、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
脳症の程度及び腹水の程度の評価を含まない、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む肝疾患検査キット。
【請求項１７】
肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法に用いる肝疾患検査キット。
【請求項１８】
肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つを判定する請求項１６又は１７に記載の肝疾患検査キット。
【請求項１９】
さらに変性処理剤を含む請求項１６に記載の肝疾患検査キット。
【請求項２０】
前記肝型脂肪酸結合タンパク質又は前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質は抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体であり、前記変性処理剤は界面活性剤またはドデシル硫酸ナトリウムである請求項１６又は１７に記載の肝疾患検査キット。
【請求項２１】
肝型脂肪酸結合タンパク質の量又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む肝疾患コンパニオン診断薬。
【請求項２２】
肝型脂肪酸結合タンパク質の量又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法を用いる肝疾患コンパニオン診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝型脂肪酸結合タンパク質のみの測定値に基づき肝疾患早期の患者から末期肝硬変患者までを一貫して検査し得、従来の検査に用いられる血清アルブミンと比較しても検査能が高い肝疾患の検査方法、その検査キット及びコンパニオン診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性肝疾患は慢性肝炎、肝硬変と幅広い病態を呈し、進行した肝硬変では肝腎症候群、特発性細菌性腹膜炎といった合併症をも併発し得る。また、慢性肝疾患には高率に肝細胞癌が発症し得ることも周知である。肝硬変患者の重症度分類、肝予備能ないし予後予測の指標としては、世界的にＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類が頻用されている。
【０００３】
血清アルブミンは肝臓において合成される蛋白であり、血清中タンパク質の約５０〜７０％ほどを占める。肝硬変患者における有意な予後予測因子であることが複数の臨床研究から示され、上記Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類などのスコアリングシステムにおける検査項目に含まれる。
【０００４】
肝機能及び肝癌を含めたスコアリングシステムとしてはＢａｒｃｅｌｏｎａ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｌｉｖｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ（ＢＣＬＣ）病期分類が存在するが、血清アルブミンをその検査項目に含むＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類が含まれる。
【０００５】
肝臓における原発性肝癌のうち９０％以上を占める肝細胞癌の検査にはα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びＰＩＶＫＡ−ＩＩが腫瘍マーカーとして用いられる。ＡＦＰ−Ｌ３分画はＡＦＰよりも肝細胞癌に対する特異性が高いことが知られている。
【０００６】
肝型脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ｔｙｐｅ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；以下、単に「Ｌ−ＦＡＢＰ」ともいう。）は肝臓や、腎臓の近位尿細管の細胞質等に存在しており、特に健常人において肝細胞の細胞質内蛋白の７〜１１％を占めるとされる（例えば、非特許文献１）。Ｌ−ＦＡＢＰは逆平行βシートが２枚直行したβバレル構造に２本のαへリックスが蓋をするような形で安定化され、２分子の遊離脂肪酸と結合することが知られている（例えば、非特許文献２）。
【０００７】
Ｌ−ＦＡＢＰはメチオニン残基の酸化修飾により構造変化が生じ、Ｌ−ＦＡＢＰ分子の内部領域が露わとなる（例えば、非特許文献３）。その結果、Ｌ−ＦＡＢＰ分子の内部領域と結合する抗体を用いることでＥＬＩＳＡなどの抗原抗体反応を用いた測定において抗体結合能が変化し、測定値が大きく変化することが知られている。またこのＬ−ＦＡＢＰのメチオニン残基の酸化修飾は２，２’−アゾビズ２−アミジノプロパン（以下、「ＡＡＰＨ」と略記する。）処理、空気酸化等によって生じることが報告されている（特許文献１〜３）。
【０００８】
血液中Ｌ−ＦＡＢＰが非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ：Ｎｏｎ−Ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ＳｔｅａｔｏＨｅｐａｔｉｔｉｓ）及び慢性Ｃ型肝炎の検査に有用との報告がなされ（非特許文献４、５）、ＮＡＳＨにおいては血液中Ｌ−ＦＡＢＰがＡＳＴ、ＡＬＴなどといった肝機能マーカーないしＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｓｃｏｒｅ）と相関することが知られている（非特許文献６）。また肝細胞質内Ｌ−ＦＡＢＰが細胞傷害とともに血液中に放出されることを機序の１つとして、アセトアミノフェンなどによる薬剤性肝障害や肝移植後の急性拒絶反応に伴う肝障害において血液中濃度が上昇することが報告されている（非特許文献７、８）。
【０００９】
特許文献４には、尿試料に変性剤として、還元剤（グルタチオン、システイン、ペニシラミン等）、カオトロピック試薬（尿素、グアニジン等）及び界面活性剤（ｎ−ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等）からなる化合物の１種又は２種を添加し、尿試料をこれらの化合物を用いて前処理することで免疫測定の感度、すなわち測定対象物である尿中のタンパク質の測定感度を向上させる方法が開示されており、尿中のタンパク質の一例として、Ｌ−ＦＡＢＰが挙げられているが、Ｌ−ＦＡＢＰの検出についての具体的な記載はない。また特許文献５には、有機アミン化合物を用いることによって、担体粒子の自然凝集を起こさせずに特異反応に基づく凝集を促進する方法が開示され、特許文献６には、ベンズアミジン誘導体などの分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造と環状構造とを有する化合物を試料中のＬ−ＦＡＢＰと接触させることにより測定感度を向上させる方法が開示されている。
しかしながら、Ｌ−ＦＡＢＰ分子の内部領域と結合する抗体を用いたＬ−ＦＡＢＰの酸化状態を評価する方法としての記載はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第６１７４７７８号公報
【特許文献２】特許第６２１８９８３号公報
【特許文献３】特許第６０５９３８８号公報
【特許文献４】特開２０１４−８５２０８号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ２００７／０７４８６０号
【特許文献６】国際公開ＷＯ２０１６／１３６８６３号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｖｅｒｇａｎｉ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，９８（１−２），１９９０．
【非特許文献２】Ｃａｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ，１０２：２５８５−２５９４，２０１２．
【非特許文献３】Ｙａｎ，  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ，５０：２４４５−２４５４，２００９．
【非特許文献４】Ａｋｂａｌ，  Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｗｉｅｎ  Ｋｌｉｎ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ，１２８（１−２）：４８−５２，２０１６
【非特許文献５】Ａｋｂａｌ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．：Ａｒｃｈ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ，４４（１）：３４−３８，２０１３
【非特許文献６】Ｏｚｅｎｉｒｌｅｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，６０（１２５）：１０９５−１１００，２０１３
【非特許文献７】Ｋａｒｖｅｌｌａｓ，ＣＪ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，６５（３）：９３８−９４９，２０１７
【非特許文献８】Ｐｅｌｓｅｒｓ，ＭＭ．ｅｔ  ａｌ．：Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，４８（１）：２０５５−２０５７，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
肝疾患における肝予備能、予後予測等の指標としては、世界的にＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類が頻用されている。
しかしながらこのスコアリングシステムには脳症、腹水等の程度といった主観的な要素を含むことが指摘されており、また適用が肝硬変患者に限られることなどに問題がある。
【００１３】
Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類に用いられる検査項目である血清アルブミンは適用が肝硬変などの末期肝不全に限られる他、肝不全が進行し肝臓における血清アルブミン合成能が大幅に低下した後など、肝硬変から肝癌に移行する多くの患者には使用できない。また肝癌の有無で血清アルブミン値は変動しない。
【００１４】
肝癌合併例においてはＢＣＬＣ病期分類を用いた治療選択がなされているが、ＢＣＬＣには患者因子としてＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類が含まれている。近年、ａｌｂｕｍｉｎ−ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ（ＡＬＢＩ）ｇｒａｄｅの有用性が報告されているが、未だ十分検討されているとは言えない。また、腫瘍因子が加味されていないことから、進行肝癌の予後は予測し得ない。このような背景から肝癌を含む全ての慢性肝疾患の予後予測が可能となる検査項目が求められている。
【００１５】
肝臓における原発性肝癌のうち９０％以上を占める肝細胞癌の検査にはＡＦＰ及びＰＩＶＫＡ−ＩＩが腫瘍マーカーとして用いられるが、肝細胞癌においてＰＩＶＫＡ−ＩＩ陽性例は５７％程度とされ、全ての肝細胞癌を検出できるわけではない。またＡＦＰの疾患特異性を高める目的でＡＦＰ−Ｌ３分画が用いられることもあるが、保険診療上ＡＦＰ及びＰＩＶＫＡ−ＩＩとの同時測定は認められておらず、悪性腫瘍の可能性が強く疑われる場合のみ算定可能である。
【００１６】
慢性肝疾患の早期から肝癌を有する患者まで一貫して予後を評価できる疾患マーカー、病期分類等に用いられる臨床上の有用性が担保されたスコアリングシステムなどは存在しない。
【００１７】
血液中Ｌ−ＦＡＢＰに関して、アセトアミノフェンによる急性肝障害においては死亡群において血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度が有意に高値となるとされているものの、ＮＡＳＨ、Ｃ型肝炎などの肝疾患患者における予後予測因子としての血液中Ｌ−ＦＡＢＰの有用性についての報告はなく、また簡便かつ高精度で評価できる血液中Ｌ−ＦＡＢＰ測定系が求められている。さらにこれまでＬ−ＦＡＢＰの生体内における酸化状態を判別する方法はない。
【００１８】
肝細胞癌患者におけるＬ−ＦＡＢＰ発現量の評価は、病理組織による悪性診断、組織中の遺伝子発現、タンパク質発現量等に基づき評価されており、また組織中のＬ−ＦＡＢＰ発現量が高値であると予後不良であることが報告されている。しかしながらこれらの方法は煩雑な工程を含み実施可能な施設が限られる。また血液中Ｌ−ＦＡＢＰが肝癌患者で高値となるかどうかの報告はなく、煩雑な工程を要することなく、高精度で肝疾患を検査できる血液中Ｌ−ＦＡＢＰ測定手法が求められる。
【００１９】
本発明は、このような従来の慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌の検査における実情に鑑みてなされたものであり、Ｌ−ＦＡＢＰのみの定量結果に基づき肝疾患早期の患者から末期肝硬変患者までを一貫して検査し得る肝疾患の検査方法、その検査キット及びコンパニオン診断薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、（ｉ）血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度が肝細胞癌を有する慢性肝疾患患者において有意に高値となること、（ｉｉ）カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理後のＬ−ＦＡＢＰの測定値が肝細胞癌を有する慢性肝疾患患者において高値となること、（ｉｉｉ）血液中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度とＬ−ＦＡＢＰ酸化率との積が肝細胞癌を有する慢性肝疾患患者においてさらに高い診断性能を示すことを見出し、従来の血清アルブミンと比べて優れた検査能を示すことを見出した。
本発明は、上記知見に基づき完成されるに至ったものである。
すなわち本発明は以下の通りである。
【００２１】
＜１＞被験者から採取した血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含む肝疾患の検査方法であって、前記定量の結果に基づき、肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つを判定する検査方法。
＜２＞上記判定は、肝疾患による死亡リスクの予測を含む、＜１＞に記載の検査方法。
＜３＞被験者から採取した血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含む肝疾患の検査方法であって、
上記肝疾患が、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患である、検査方法。
＜４＞被験者から採取した血液中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値を定量する工程を含む肝疾患の検査方法。
＜５＞上記定量する工程が、上記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程である、＜４＞に記載の検査方法。
＜６＞上記定量が、抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して上記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における定量である、＜４＞又は＜５＞に記載の検査方法。
＜７＞上記条件が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理によって形成された条件である、＜６＞に記載の検査方法。
＜８＞上記抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件よりも、酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質及び酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度差が小さい条件にて上記肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を更に含む、＜６＞又は＜７＞に記載の検査方法。
＜９＞上記測定感度差が小さい条件が、上記血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を界面活性剤による変性処理により形成された条件である、＜８＞に記載の検査方法。
＜１０＞上記測定感度差が小さい条件における上記肝型脂肪酸結合タンパク質の測定値と、上記抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における測定値とに基づき、血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含む、＜８＞又は＜９＞に記載の検査方法。
＜１１＞上記肝疾患が、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患である、＜１＞、＜２＞又は＜４＞に記載の検査方法。
＜１２＞上記検査が、肝疾患による死亡リスクの予測を含む、＜３＞又は＜４＞に記載の方法。
＜１３＞下記（１）及び（２）よりなる群から選択される少なくとも１つの工程を含む、被験者における肝型脂肪酸結合タンパク質の量又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値に基づく肝疾患の検査方法。
（１）肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の正常範囲、又は慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患における肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の範囲、又は肝疾患による死亡リスクを有する肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の範囲と、被験者における肝型脂肪酸結合タンパク質の量とを比較し、被験者における上記量が、上記範囲のいずれに該当するかを決定する工程
（２）酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の正常範囲、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の範囲、又は肝疾患による死亡リスクを有する酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の範囲と、被験者の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、被験者における上記量若しくはそれと相関するパラメータの値が、上記範囲のいずれに該当するかを決定する工程
＜１４＞肝型脂肪酸結合タンパク質のみの定量結果に基づく、＜１３＞に記載の方法。
＜１５＞脳症の程度及び腹水の程度の評価を含まない、＜１３＞又は＜１４＞に記載の方法。
＜１６＞肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む検査キット。
＜１７＞肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、＜１＞〜＜１２＞のいずれか１項に記載の方法に用いる検査キット。
＜１８＞肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つを判定する＜１６＞又は＜１７＞に記載の肝疾患検査キット。
＜１９＞さらに変性処理剤を含む＜１６＞に記載の肝疾患検査キット。
＜２０＞前記肝型脂肪酸結合タンパク質又は、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質は抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体であり、前記変性処理剤は界面活性剤またはドデシル硫酸ナトリウムである＜１６＞又は＜１７＞に記載の肝疾患検査キット。
【００２２】
＜２１＞肝型脂肪酸結合タンパク質の量又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む肝疾患コンパニオン診断薬。
＜２２＞肝型脂肪酸結合タンパク質の量又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、＜１＞〜＜１２＞のいずれか１項に記載の方法を用いる肝疾患コンパニオン診断薬。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、単一のタンパク質Ｌ−ＦＡＢＰの測定値に基づき肝疾患早期の患者（例えば、Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類におけるステージＡの患者）から末期肝硬変患者（ないしは肝細胞癌を有する慢性肝疾患患者）までを一貫して評価することができ、またＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類における脳症、腹水等の程度といった主観的な要素を含むことなく検査することができる。
また、血液中Ｌ−ＦＡＢＰは血清アルブミンのように末期肝硬変患者において合成能が低下することがないことから、本発明によれば、Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類などにも用いられる肝疾患検査におけるゴールドスタンダードである血清アルブミンと比較しても検査能が高い。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】参考例１の結果を示す図である。
【図２】実施例１の結果を示す図である。
【図３】実施例２の結果を示す図である。
【図４】血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度と、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ＡＦＰ及びＡＦＰ−Ｌ３分画との相関分析結果を示す図である。
【図５】血液中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度、酸化率、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの血中濃度、及び血清アルブミン濃度各々についてのＲＯＣ解析結果を示す図である。
【図６】酸化率、血液中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの血中濃度及び血清アルブミン濃度の各々の基準値における生存曲線を示す図である。
【図７】ＧＵ処理後Ｌ−ＦＡＢＰの測定値についてのＲＯＣ解析結果及び生存曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明の実施態様について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施態様に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
【００２６】
（Ｌ−ＦＡＢＰ）
Ｌ−ＦＡＢＰのアミノ酸配列や遺伝子配列は既に報告されている（Ｖｅｅｒｋａｍｐ  ａｎｄ  Ｍａａｔｍａｎ，  Ｐｒｏｇ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，３４：１７−５２，１９９５）。配列番号１は、野生型ヒトＬ−ＦＡＢＰのアミノ酸配列を表す。
配列表の配列番号１に記載した野生型ヒト肝型脂肪酸結合タンパク質のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異タンパク質であっても、その変異が野生型ヒト肝型脂肪酸結合タンパク質の３次元構造において保存性が高い変異であれば、これらは全て肝型脂肪酸結合タンパク質の範囲内に属し得る。
タンパク質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的にタンパク質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）又はバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）又はＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等が挙げられる。
【００２７】
上記Ｌ−ＦＡＢＰの取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換えタンパク質でもよい。
【００２８】
≪肝疾患の検査方法≫
本発明の第１の態様は、被験者（例えば、患者）から採取した血液中のＬ−ＦＡＢＰを定量する工程を含む肝疾患の検査方法であって、上記定量の結果に基づき、肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つを判定する検査方法である。
第１の態様に係る肝疾患の検査方法において、上記肝疾患の種類としては、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患が挙げられ、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患が好ましく、肝細胞癌がより好ましい。
本明細書及び特許請求の範囲において、慢性肝疾患としては、ウイルス性肝疾患（例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎）、アルコール性肝疾患、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、原発性胆汁性胆管炎、薬物性肝障害、自己免疫性肝炎等が挙げられる。
上記肝疾患の進行度としては、早期、中期、末期等が挙げられる。
上記肝疾患の重篤度としては、軽度、中度、重度等が挙げられる。
上記判定は、肝疾患による死亡リスクの予測を含むことが好ましい。
後述の実施例に示すように、血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度は肝疾患マーカーとの相関が得られ、Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類及びＢＣＬＣ病期分類における重症度が上がるとともに高値となり得る。また血清アルブミンと比較して高い予後予測能を示し、肝細胞癌患者における血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度が有意に高値となるとともに肝細胞癌における腫瘍マーカーであるＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ＡＦＰ、ＡＦＰ−Ｌ３分画等との相関が得られる。
上記死亡リスクの予測し得る日数程度としては、肝疾患による死亡リスクを予測し得る限り特に制限はなく、上記定量から所定日以上先の死亡リスクの予測であってもなくてもよいが、例えば、上記定量から１００日以上先の死亡リスクを予測することができ、より先の将来を予測し得る観点から、上記定量から５００日以上先（より好ましくは１１００日以上先、更に好ましくは１５００日以上先、特に好ましくは２０００日以上先、とりわけ好ましくは２５００日以上先、最も好ましくは３０００日以上先）の死亡リスクを予測し得る点で好ましい。
上記予測の程度の上限としては特に制限はないが、例えば、６０００日以下、５０００日以下、４０００日以下である。
また、上記予測が、予後の予測であることが好ましい。
【００２９】
本発明の第２の態様は、被験者から採取した血液中のＬ−ＦＡＢＰを定量する工程を含む肝疾患の検査方法であって、
上記肝疾患が、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患である、検査方法であり、重篤度の観点から、上記肝疾患が、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患であることが好ましい。
【００３０】
第１及び第２の態様に係る肝疾患の検査方法において、Ｌ−ＦＡＢＰの検出ないし定量等の測定方法としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＬＥＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、電気化学発光測免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光抗体法（ＦＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット法（ＷＢ）、イムノブロット法などを採用したアッセイ法が挙げられ、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を用いた測定であることが好ましい。
【００３１】
用いる抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体としては、Ｌ−ＦＡＢＰを認識し得る限り特に制限はなく、公知の抗体であってもよく、今後開発される抗体であってもよい。例えば、下記変性処理により外部へ曝露される部位を認識する抗体が挙げられる。
【００３２】
抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体により定量を行なう場合、上記血液中のＬ−ＦＡＢＰを界面活性剤による変性処理により形成された条件にて定量を行なうことが好ましい。これにより、Ｌ−ＦＡＢＰの一次構造を維持した状態で水素結合、ジスルフィド結合等を切断することによりその立体構造を変性させることができ、抗体がＬ−ＦＡＢＰ分子の内部領域と結合する場合であってもＬ−ＦＡＢＰの酸化状態に影響されることなく、高感度かつ特異的にＬ−ＦＡＢＰを検出ないし定量することができる。
上記界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が好ましい。
上記変性処理としては、室温（例えば、２５℃）もしくは加温条件下（例えば、３７℃）にて適切な濃度（例えば、０．２質量／体積％（ｗ／ｖ％）〜１０質量／体積％、好ましくは０．４質量／体積％（ｗ／ｖ％）以上、０．５質量／体積％（ｗ／ｖ％）以上、又は０．７質量／体積％（ｗ／ｖ％）以上であってよい。）の界面活性剤により適切な時間（例えば、５〜６０分間）処理する方法が挙げられる。
典型的には、１ｗ／ｖ％のＳＤＳにて２５℃１０分間変性処理することが挙げられる。
【００３３】
上記測定方法として、より詳細には、抗原（Ｌ−ＦＡＢＰ）に対する認識部位が異なる２種類の抗体を組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法であることが好ましい。
認識部位が異なる２種類の抗体は、一方を、マイクロプレートのウェル中の表面に結合させた固相化抗体として用い、他方を、検出ないし定量のための標識抗体として用いることが好ましい。上記標識抗体における標識としては特に制限はなく、例えば、パーオキシダーゼ標識等の酵素標識、蛍光標識、紫外線標識、放射線標識等が挙げられる。
【００３４】
抗原（Ｌ−ＦＡＢＰ）に対する認識部位が異なる抗体としては、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローン１、クローン２、クローンＬ及びクローンＦよりなる群から選択される抗体を含む抗体が挙げられ（例えば、特許文献１〜３）、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローンＬを含む組み合わせ、又は抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローン２を含む組み合わせであることが好ましく、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローンＬを含む組み合わせであることがより好ましく、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローンＬを固相化抗体として用い、任意の抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を標識抗体として用いることが更に好ましく、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローンＬを固相化抗体として用い、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローン２を標識抗体として用いることが特に好ましい。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法を利用したＬ−ＦＡＢＰ測定キットの市販品としては、「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テストＴＭＢ」（シミックホールディングス社製）、「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テストＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス社製）等が挙げられる。
【００３５】
第１及び第２の態様に係る肝疾患の検査方法において、上記血液中のＬ−ＦＡＢＰは、酸化されたＬ−ＦＡＢＰ（以下、単に「酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ」ともいう。）であっても、酸化されていないＬ−ＦＡＢＰ（以下、単に「非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ」ともいう。）であっても、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの混合物であってもよいが、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの混合物又は酸化型Ｌ−ＦＡＢＰが好ましい。
【００３６】
Ｌ−ＦＡＢＰは、配列番号１における１９番目、７４番目及び１１３番目のメチオニンが酸化され得、上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰは、１９番目、７４番目及び１１３番目のメチオニンの少なくともいずれかが酸化されたＬ−ＦＡＢＰということができ、特に、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を用いた測定値の変化に関しては、１９番目及び１１３番目のメチオニンの酸化が支配的であると考えられることから、１９番目及び１１３番目のメチオニンの少なくともいずれかが酸化されたＬ−ＦＡＢＰが好ましい。
酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの検出ないし定量等の測定方法としては、「Ｌ−ＦＡＢＰの検出ないし定量等の測定方法」として上述した具体例及び好ましい例と同様のものが挙げられる。抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を用いる測定である場合、用いられる抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体も同様であるが、上記メチオニンの酸化により外部へ曝露される部位を認識する抗体が更に好ましい。
【００３７】
本発明の第３の態様は、被験者から採取した血液中の酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値を定量する工程を含む肝疾患の検査方法である。
上記定量する工程が、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値を、抗原抗体反応を促進する処理後に定量する工程であることが好ましい。
酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量と相関するパラメータとしては、測定値（例えば、標識強度）から換算して算出されるパラメータであって、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量そのものではないパラメータが挙げられ、具体的には、後述する非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が高い条件における測定値、後述する「血液中のＬ−ＦＡＢＰの酸化率」等が挙げられる。
第３の態様に係る肝疾患の検査方法において、上記定量する工程が、上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量を定量する工程であることが好ましい。
第２及び第３の態様に係る肝疾患の検査方法において、上記肝疾患の検査が、肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つの判定、肝疾患による死亡リスクの予測、肝疾患進行リスクの予測及び肝疾患進行のモニタリングよりなる群から選択される少なくとも１種の検査が挙げられ、肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つの判定、肝疾患による死亡リスクの予後予測、肝疾患進行リスクの予後予測及び肝疾患進行のモニタリングによる予後予測よりなる群から選択される少なくとも１種の検査がより好ましい。
また、上記肝疾患の検査が、疾患の進行状況の判断、治療方針の参考にされることはもちろんであるが、肝疾患による死亡リスクの予測にも用いることができ、肝疾患による死亡リスクの予後の予測に用いられることがより好ましい。
第３の態様に係る肝疾患の検査方法において、上記肝疾患は、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患が好ましく、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患がより好ましく、肝細胞癌が更に好ましい。
【００３８】
第３の態様に係る肝疾患の検査方法において、上記定量が、抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が高い条件における定量であることが好ましい。
具体的には、例えば、５０ｍＭのＡＡＰＨにて３７℃６０分間処理した酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰと、未処理の非酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰとを、それぞれ、
「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テスト  ＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス株式会社製）の抗体を使用してＥＬＩＳＡ測定し、標識抗体の発色強度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定した場合に、濃度２５ｎｇ／ｍｌにおいて、非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が１．４倍以上（好ましくは１．５倍以上、より好ましくは１．８倍以上、更に好ましくは２．０倍以上）高い条件における定量であることがより好ましい。
測定感度の倍率の上限値としては特に制限はないが、例えば、６倍以下又は４倍以下が挙げられる。
ここでいう「未処理の非酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰ」とは、１０００ｍＭのベンズアミジン塩酸塩又は１５００ｍＭの塩化グアニジニウムの少なくとも一方にて２５℃１０分間処理した後、「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テストＨＳ（高感度）」の抗体を使用してＥＬＩＳＡ測定し、標識抗体の発色強度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定した場合に、濃度２５ｎｇ／ｍｌにおいて、５０ｍＭのＡＡＰＨにて３７℃６０分間処理した酸化型Ｌ−ＦＡＢＰに対して発色強度が０．７倍以下となるＬ−ＦＡＢＰをいう。
【００３９】
例えば、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を用いる定量等である場合、上記抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が高い条件では、Ｌ−ＦＡＢＰの物理化学的特性が軽度に変更してＬ−ＦＡＢＰと抗体との反応が促進されつつ、Ｌ−ＦＡＢＰの立体構造が損なわれる程には変性していない。これにより、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度よりも高い特性を維持または亢進しつつ、絶対的な測定感度を増加することができる。
このような条件は、種々のタンパク質変性剤を適切な使用条件との組合せで使用することで形成可能であり、タンパク質変性作用の穏やかな物質を用いることは、使用条件の自由度が高くなる点で好ましい。ただし、タンパク質変性作用の強い物質（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））を用いても、使用条件の自由度が相応に低くはなる（低濃度、低温、短時間等の制約が加わる）が、上記条件形成が可能であり得る。
この観点で、いわゆる免疫凝集促進剤が好ましく、具体的にはカオトロピック試薬又は有機アミン化合物がより好ましい。
参考例１において後述するように、免疫凝集促進剤を適切な条件で使用する処理後の測定感度は、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰについて、絶対的に著しく増大しつつ、非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰに比べて相対的に高い。
したがって、免疫凝集促進剤による処理後の抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を用いる測定値と、上記処理無しの抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を用いる測定値（好ましくは、後述する酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件における測定値）との対比から、血液中の酸化型Ｌ−ＦＡＢＰを定量し得る。
【００４０】
免疫凝集促進剤としては、カオトロピック試薬、有機アミン化合物、還元剤（グルタチオン、システイン、ペニシラミン等）、界面活性剤（ｎ−ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等））、又は同様の効果を有する物質等が挙げられ、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物が好ましい。
第１の態様に係る肝疾患の検査方法において、上記定量が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理後のＬ−ＦＡＢＰの定量であることがより好ましい。
測定に用いられる抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体は上記と同様であるが、上記メチオニンの酸化により外部へ曝露される部位を認識する抗体が更に好ましい。
【００４１】
上記カオトロピック試薬ないし有機アミン化合物の具体例としては、尿素、２−アミノ−２−チアゾリン塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、グアニジン塩酸塩、アミノピリン、アンチピリン、４−アミノアンチピリン、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩、ｐ−アニシジン塩酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、２，４−ジアミノアニソール二塩酸塩、ピリジン塩酸塩、塩酸１，４−フェニレンジアミン、アミノグアニジン塩酸塩、ベタイン塩酸塩から選ばれる少なくとも１種が好ましく用いられる。この中でも、ベンズアミジン塩酸塩、ベンジルアミン塩酸塩、２−アミノ−２−チアゾリン塩酸塩がさらに好ましい。
また、下記式（Ａ）で表される化合物もしくはその塩又はエステル、下記式（Ａ）で表される化合物又はその塩も好ましく用い得る。
【化１】
2020056626.tif 000003
（式（Ａ）中、Ｘａ１は、水素原子、水酸基又はアルキル基であり、Ｘａ２〜Ｘａ６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、水酸基、カルボキシ基、アミノ基又は−ＳＸａ７（Ｘａ７は、水素原子、水酸基又はアルキル基を表す。Ｘａ７が複数存在するときは、それぞれ同一であっても異なる基であってもよい。）を表す。）
上記アルキル基としては、直鎖状又は分岐状のアルキル基が挙げられ、炭素原子数１〜３のアルキル基が好ましい。
【化２】
2020056626.tif 000004
（式（Ｂ）中、Ｘｂ１〜Ｘｂ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アミノ基、ハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基又は−ＳＸｂ６（Ｘｂ６は、水素原子、水酸基又はアルキル基を表す。Ｘｂ６が複数存在するときは、それぞれ同一であっても異なる基であってもよい。）であり、ここで、Ｘｂ１とＸｂ２の両方が存在する場合はそれぞれ一緒になってカルボニル基を形成していてもよく、Ｘｂ３とＸｂ４の両方が存在する場合はそれぞれ一緒になってカルボニル基を形成していてもよく、Ｘｂ５は、水素原子、ハロゲン原子又はアルキル基であり、
Ｅｂ１は、窒素原子又は硫黄原子であり、
Ｅｂ２及びＥｂ３は、それぞれ独立して、炭素原子又は窒素原子であり、
ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕは、それぞれ独立して、０又は１であり、
Ｅｂ１とＥｂ３との間の二重破線及びＥｂ２とＥｂ３との間の二重破線は、それぞれ独立して、単結合又は二重結合であり、上記ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕの値並びにＥｂ１とＥｂ３との間の二重破線及びＥｂ２とＥｂ３との間の二重破線の結合は、Ｅｂ１〜Ｅｂ３の原子価に応じて適宜定まる値及び結合を示す。）
上記アルキル基としては、直鎖状又は分岐状のアルキル基が挙げられ、炭素原子数１〜３のアルキル基が好ましい。
【００４２】
なお、各有機アミン化合物の塩としては、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素塩、ふっ化水素酸塩、ほうふっ化水素酸塩、しゅう酸塩、乳酸塩、アジピン酸塩、酒石酸塩、よう化水素酸塩、トルエンスルホン酸塩、マロン酸塩、重炭酸塩など特に制限は無いが、本発明の効果以外に試薬としての取扱い易さや入手のしやすさ等を勘案して適宜選ぶことができる。
【００４３】
上記カオトロピック試薬、有機アミン化合物等の免疫凝集促進剤による処理としては、室温（例えば、２５℃）もしくは加温条件下（例えば、３７℃）にて適切な濃度（例えば、１０ｍＭ〜３０００ｍＭ）の免疫凝集促進剤により適切な時間（例えば、５〜６０分間）処理する方法が挙げられ、室温（例えば、２５℃）にて任意の濃度の免疫凝集促進剤により処理する方法が好ましい。典型的には、１０００ｍＭのベンズアミジン塩酸塩又は１５００ｍＭの塩化グアニジニウムにて２５℃１０分間処理することが挙げられる。
上記カオトロピック試薬、有機アミン化合物等の免疫凝集促進剤は１種単独で用いても、複数種を混合して用いてもよい。
【００４４】
ＳＤＳ等の界面活性剤による処理としては、低温（例えば、２５℃以下）にて適切な低濃度（例えば、０．１２質量／体積％未満）の界面活性剤により適切な短時間（例えば、４分未満）処理する方法が挙げられる。
【００４５】
第３の態様に係る肝疾患の検査方法は、上記非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が高い条件よりも、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件にて上記Ｌ−ＦＡＢＰを定量する工程を更に含むことが好ましい。
酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件として、例えば、例えば、５０ｍＭのＡＡＰＨにて３７℃６０分間処理した酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰと、未処理の非酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰとを、「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テスト  ＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス株式会社製）の抗体を使用してＥＬＩＳＡ測定し、標識抗体の発色強度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定した場合に、濃度２５ｎｇ／ｍｌにおいて、濃度において、非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が０．８倍以上１．４倍未満（好ましくは０．９倍以上１．２５倍以下）の条件が挙げられる。
ここでいう「未処理の非酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰ」については前述の通りである。
このような測定感度差が小さい条件は、種々のタンパク質変性剤を適切な使用条件との組合せで使用することで形成可能であり、タンパク質変性作用の強い物質を用いることは、使用条件の自由度が高くなる点で好ましい。ただし、タンパク質変性作用の穏やかな物質（例えば、上記の免疫凝集促進剤）を用いても、使用条件の自由度が相応に低くはなる（高濃度、高温、長時間等の制約が加わる）が、上記条件形成が可能であり得る。
この観点で、界面活性剤が好ましく、具体的にはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が好ましい。
上記変性処理としては、室温（例えば、２５℃）もしくは加温条件下（例えば、３７℃）にて適切な濃度（例えば、０．２質量／体積％（ｗ／ｖ％）〜１０質量／体積％、好ましくは０．４質量／体積％（ｗ／ｖ％）以上、０．５質量／体積％（ｗ／ｖ％）以上、又は０．７質量／体積％（ｗ／ｖ％）以上であってよい。）の界面活性剤により適切な時間（例えば、５〜６０分間）処理する方法が挙げられる。
典型的には、１ｗ／ｖ％のＳＤＳにて２５℃１０分間変性処理することが挙げられる。
【００４６】
免疫凝集促進剤による処理としては、加温条件下（例えば、３７℃以上）にて適切な高濃度（例えば、３５００ｍＭ）の免疫凝集促進剤により適切な長時間（例えば、８０分間）処理する方法が挙げられる。
【００４７】
本明細書及び特許請求の範囲において、血液中Ｌ−ＦＡＢＰの全濃度（酸化型Ｌ−ＦＡＢＰと、非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰとの総和）に対する血液中の酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの比率を「血液中のＬ−ＦＡＢＰの酸化率」と定義することができる。
実施例の項において後述するように検査能の観点から、第３の態様に係る肝疾患の検査方法は、上記測定感度差が小さい条件における上記Ｌ−ＦＡＢＰの測定値と、上記非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が高い条件における測定値とに基づき、血液中のＬ−ＦＡＢＰ中の酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含むことが好ましい。
「血液中のＬ−ＦＡＢＰの酸化率」は、上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件におけるＬ−ＦＡＢＰの測定値（例えば、標識強度）に対する上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が高い条件における測定値の比（例えば、下記式で表される吸光度比（ＯＤ比））に略対応し得る。
上記非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度に対して酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度が高い条件におけるＯＤ値／上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件におけるＬ−ＦＡＢＰのＯＤ値
【００４８】
また、「血液中のＬ−ＦＡＢＰの酸化率」は、例えば、下記式のように表すこともできる。
（ａＸ+ｂＹ）（ＯＤ値）／血液中Ｌ−ＦＡＢＰの全濃度（ＯＤ値）
（上記式中、ａ、ｂは係数を表し、Ｘは酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの濃度を表し、Ｙは非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの濃度を表す。）
係数ａは酸化型Ｌ−ＦＡＢＰに対する抗体の反応性を表す係数であることが好ましく、係数ｂは非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰに対する抗体の反応性を表す係数であることが好ましい。
【００４９】
上述のように、第３の態様に係る肝疾患の検査方法は、被験者の血液中の酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値を定量する工程を含み、上記定量する工程が、上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰを定量する工程であることが好ましい。
実施例の項において後述するように、「酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量」の方が、「血液中のＬ−ＦＡＢＰの酸化率」及び「血液中Ｌ−ＦＡＢＰの全濃度」のそれぞれ単独の定量結果よりも高精度に検査し得るからである。
上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの濃度は、上記酸化率と、上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ及び非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの測定感度差が小さい条件におけるＬ−ＦＡＢＰの測定値（血液中Ｌ−ＦＡＢＰの全濃度）との積から定量し得る。
また、非酸化型Ｌ−ＦＡＢＰは認識しないが、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰを特異的に認識し得る抗酸化型Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を用いて上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰを定量することもできる。
【００５０】
第１〜３の態様に係る肝疾患の検査方法において、上記定量は、測定される標識の強度（例えば、吸光度、酵素標識強度、蛍光強度、紫外線強度、放射線強度等）と、Ｌ−ＦＡＢＰの量（例えば、濃度）との関係に基づき検量線を作成し、上記検量線に基づき（例えば、対比して）定量してもしなくてもよい。
【００５１】
本発明の第４の態様は、下記（１）及び（２）よりなる群から選択される少なくとも１つの工程を含む、被験者におけるＬ−ＦＡＢＰの量又は酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値に基づく肝疾患の検査方法である。
（１）Ｌ−ＦＡＢＰの量の既知の正常範囲、又は慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患におけるＬ−ＦＡＢＰの量の既知の範囲、又は肝疾患による死亡リスクを有するＬ−ＦＡＢＰの量の既知の範囲と、被験者におけるＬ−ＦＡＢＰの量とを比較し、被験者における上記量が、上記範囲のいずれに該当するかを決定する工程
（２）酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の正常範囲、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患における酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の範囲、又は肝疾患による死亡リスクを有する酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量の既知の範囲と、被験者の酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、被験者における上記量若しくはそれと相関するパラメータの値が、上記範囲のいずれに該当するかを決定する工程
【００５２】
第１〜４の態様に係る肝疾患の検査方法は、ＲＯＣ（受信者動作特性）解析結果として、曲線下面積（ＡＵＣ）が０．６５０以上で検査し得ることが好ましく、０．７００以上で検査し得ることがより好ましく、０．７１０以上で検査し得ることが更に好ましい。
【００５３】
第１〜４の態様に係る肝疾患の検査方法は、Ｌ−ＦＡＢＰのみの定量結果に基づくことができるが、他の検査方法（例えば、Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類、ＢＣＬＣ病期分類、ＭＥＬＤ（Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｅｎｄ−Ｓｔａｇｅ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ）等に基づく検査方法）と併用して用いても用いなくてもよい。
また、第１〜４の態様に係る肝疾患の検査方法は、肝疾患早期の患者（例えば、Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類におけるステージＡの患者）から末期肝硬変患者（ないしは肝細胞癌を有する慢性肝疾患患者）までを一貫して評価することができるが、肝疾患早期の患者から末期肝硬変患者までを一貫して評価しなくてもよい。
第１〜４の態様に係る肝疾患の検査方法は、Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類における脳症の程度及び腹水の程度の評価を含まず、主観的な要素を含むことなく検査することができる。
【００５４】
≪検査キット、コンパニオン診断薬≫
本発明の第５の態様は、Ｌ−ＦＡＢＰ又は酸化型Ｌ−ＦＡＢＰを定量し得る物質を含む肝疾患検査キットであり、第１〜３の態様に係る肝疾患の検査方法に用いる検査キットであることが好ましい。
本発明の第６の態様は、肝型脂肪酸結合タンパク質の量又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む肝疾患コンパニオン診断薬であり、第１〜３の態様に係る肝疾患の検査方法を用いるコンパニオン診断薬であることが好ましい。
本明細書及び特許請求の範囲において、「コンパニオン診断薬」は、個々の肝疾患患者に対する医薬品の効果、副作用のリスク、適切な投薬量を予測するために、実際に投薬を開始する前に行う検査で使用される診断薬をいう。
第５の態様に係る肝疾患検査キットにおいて、上記肝疾患の検査が、肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つの判定、肝疾患による死亡リスクの予測、肝疾患進行リスクの予測及び肝疾患進行のモニタリングよりなる群から選択される少なくとも１種の検査が挙げられ、肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つの判定、肝疾患による死亡リスクの予後予測、肝疾患進行リスクの予後予測及び肝疾患進行のモニタリングによる予後予測よりなる群から選択される少なくとも１種の検査がより好ましい。
第６の態様に係るコンパニオン診断薬において、肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つの判定、肝疾患による死亡リスクの予測、肝疾患発症リスクの予測及び肝疾患進行のモニタリングよりなる群から選択される少なくとも１種のコンパニオン診断薬が好ましく、肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つの判定、肝疾患による死亡リスクの予後予測、肝疾患進行リスクとその予後予測及び肝疾患進行のモニタリングによる予後予測よりなる群から選択される少なくとも１種のコンパニオン診断薬がより好ましい。
また、上記肝疾患のコンパニオン診断薬が、肝疾患による死亡リスクの予測が好ましく、肝疾患による死亡リスクの予後の予測がより好ましい。
第６の態様に係るコンパニオン診断薬において、肝疾患の種類としては、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患が好ましく、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患がより好ましく、肝細胞癌が更に好ましい。
第５の態様に係る検査キット及び第６の態様に係るコンパニオン診断薬において、Ｌ−ＦＡＢＰ又は酸化型Ｌ−ＦＡＢＰを定量し得る物質としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＬＥＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、電気化学発光測免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光抗体法（ＦＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット法（ＷＢ）、イムノブロット法などに基づいてＬ−ＦＡＢＰ又は酸化型Ｌ−ＦＡＢＰを定量する物質が挙げられ、具体的には、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体が好ましい。
【００５５】
用いる抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体としては、Ｌ−ＦＡＢＰを認識し得る限り特に制限はなく、公知の抗体であってもよく、今後開発される抗体であってもよい。例えば、上記変性処理、上記メチオニンの酸化等により外部へ曝露される部位を認識する抗体が挙げられる。
【００５６】
上記定量手段として、より詳細には、抗原（Ｌ−ＦＡＢＰ）に対する認識部位が異なる２種類の抗体を組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法を採用したアッセイ系が好ましい。
認識部位が異なる２種類の抗体については≪肝疾患の検査方法≫において上述した通りである。
【００５７】
上記定量手段としては、試薬として上記抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を含むことが好ましく、標識抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を更に含むことがより好ましく、必要に応じて吸着防止剤（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、スキムミルク、ポリエチレングリコール等）、前処理液（任意の界面活性剤、任意の緩衝液等）、反応緩衝液（任意の緩衝液等）、発色基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、過酸化水素水等）等を含んでいてもよい。
上記定量手段における吸着防止剤の含有量としては本発明の効果を損なわない限りにおいて特に制限はないが、０．０５〜１０質量％であることが好ましい。
【００５８】
上記定量手段として、抗原に対する認識部位が異なる２種類の抗体を組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いたキットであることが好ましく、固相に抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローンＬ、標識抗体に抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体クローン２を使用しているキットであることがより好ましい。
【００５９】
第５の態様に係る検査キット及び第６の態様に係るコンパニオン診断薬は、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体により定量を行なう場合、定量に先だって、界面活性剤によりＬ−ＦＡＢＰを変性する手段を備えることが好ましい。
第５の態様に係る肝疾患検査用キットは、上記血液中のＬ−ＦＡＢＰを界面活性剤により変性処理する手段、及び
上記変性処理後のＬ−ＦＡＢＰを定量する手段を更に備えることがより好ましい。
上記界面活性剤としては、上述の通りである。
上記変性手段としては、室温（例えば、２５℃）もしくは加温条件下（例えば、３７℃）にて任意の濃度（例えば、０．２質量／体積％〜１０質量／体積％）の界面活性剤により処理する手段（例えば、上記界面活性剤、任意の緩衝液等を含む変性処理液）が挙げられる。
【００６０】
第５の態様に係る検査キット及び第６の態様に係るコンパニオン診断薬は、血液中のＬ−ＦＡＢＰを免疫凝集促進剤（好ましくはカオトロピック試薬又は有機アミン化合物）により処理する手段を更に備え、かつ上記定量する手段が上記処理後のＬ−ＦＡＢＰを定量する手段であることが好ましい。
【００６１】
第５の態様に係る検査キット及び第６の態様に係るコンパニオン診断薬が、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いたキットである場合の具体的態様としては、例えば、下記（１）〜（１０）を含むキットが挙げられる。
（１）Ｌ−ＦＡＢＰ抗体固相化マイクロプレート……抗ヒトＬ−ＦＡＢＰマウスモノクローナル抗体結合ウェル例えば、クローンＬ産生細胞株由来）
（２）変性処理液（例えば、任意の界面活性剤）
（３）免疫凝集促進剤処理液（例えば、カオトロピック試薬、有機アミン化合物）
（４）反応緩衝液
（５）酵素標識抗体……パーオキシダーゼ標識抗ヒトＬ−ＦＡＢＰマウスモノクローナル抗体（例えば、クローン２産生細胞株由来）
（６）酵素基質液
（７）洗浄剤（任意の緩衝液、界面活性剤等）
（８）反応停止液（１Ｎ硫酸等）
（９）標準緩衝液（任意の緩衝液等）
（１０）肝型脂肪酸結合タンパク質標品
（１０）肝型脂肪酸結合タンパク質標品の濃度としては特に制限はなく、例えば、１０〜１００００ｎｇ／ｍＬが挙げられ、５０〜５０００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１００〜１０００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、２００〜８００ｎｇ／ｍＬが更に好ましく、３００〜６００ｎｇ／ｍＬが特に好ましい。
【００６２】
第５の態様に係る検査キット及び第６の態様に係るコンパニオン診断薬は、タンパク吸着防止を目的としてＢＳＡを含有するタンパク質保存緩衝液を含むことが好ましい。例えば、下記タンパク質保存緩衝液が挙げられる。
（タンパク質保存緩衝液）
１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３
【実施例】
【００６３】
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
【００６４】
＜参考例１＞
５０ｍＭのＡＡＰＨにて３７℃６０分間処理した様々な濃度の酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰと、未処理の様々な濃度の非酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰとを、それぞれ、１ｗ／ｖ％のＳＤＳにて２５℃１０分間変性処理した後、「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テスト  ＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス株式会社製）の抗体を使用してＥＬＩＳＡ測定を実施し、標識抗体の発色強度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定した。上記検査用キットの使用方法は通常添付されている添付文書に従った測定方法に準じて行った。
結果を図１（ａ）に示す。
【００６５】
一方、ＳＤＳによる変性処理の代わりに１０００ｍＭのベンズアミジン塩酸塩にて２５℃１０分間処理（以下、「ＢＡ処理」ともいう。）すること以外は同様にしてＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果を図１（ｂ）に示す。
また、ＳＤＳによる変性処理の代わりに１５００ｍＭの塩化グアニジニウムにて２５℃１０分間処理（以下、「ＧＵ処理」ともいう。）すること以外は同様にしてＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果を図１（ｃ）に示す。
【００６６】
図１ａ）に示した結果から明らかなように、リコンビナントＬ−ＦＡＢＰの各濃度において、酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰのＯＤ測定値（強度）と、非酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰのＯＤ測定値とはほぼ同一になることが分かる。
【００６７】
一方、図１（ｂ）及び（ｃ）に示した結果から明らかなように、ＳＤＳによる変性処理の代わりにＢＡ処理又はＧＵ処理した場合は、リコンビナントＬ−ＦＡＢＰの任意の１つの濃度において、非酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰのＯＤ測定感度に対する酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰのＯＤ測定感度が大きいことが分かる。
この測定感度の増大は、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰは抗体が認識するＬ−ＦＡＢＰ内部領域が外部へ曝露される構造変化を起こすことに起因するものと考えられる。
一方、非酸化型リコンビナントＬ−ＦＡＢＰでは、Ｌ−ＦＡＢＰ内部領域を認識する抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を測定に用いても上記抗体が認識するＬ−ＦＡＢＰ内部領域が外部へ曝露される構造変化を起こしていないことから測定強度が増大していないものと考えられる。
【００６８】
＜実施例１＞
慢性肝炎（ＣＨ）患者、肝硬変（ＬＣ）患者、Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類におけるステージＡ（以下、単に「ＣＰ  Ａ」ともいう。）の患者、ステージＢ（以下、単に「ＣＰ  Ｂ」ともいう。）の患者及びステージＣ（以下、単に「ＣＰ  Ｃ」ともいう。）の患者の各々の血液検体を用いて、１ｗ／ｖ％のＳＤＳにて２５℃１０分間変性処理した後、「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テスト  ＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス株式会社製）の抗体を使用して血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を測定した。結果を図２（ａ）及び（ｂ）に示す。図中＊＊は有意水準ｐ＜０．０１を、＊＊＊はｐ＜０．００１をそれぞれ示す。
【００６９】
図２（ａ）に示した結果から明らかなように、ＣＨ患者よりもＬＣ患者の血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度が有意に高いことが分かる。
また、図２（ｂ）に示した結果から明らかなように、Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類におけるステージＡの患者からステージＢ、ステージＣというように病態ステージが進むごとに血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度が有意に高値となり、血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度を測定することにより、慢性肝炎患者から末期肝硬変患者までを検査し得ることが分かる。
【００７０】
また、世界的に頻用されるＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類の病態ステージごとにＬ−ＦＡＢＰ値が高くなることはこれまで報告されておらず、またＨＣＶ、ＮＡＳＨといった限定された肝疾患ではなく様々な肝疾患背景をもつ患者群からなる検体においてＬ−ＦＡＢＰの高い検査能が得られた。
【００７１】
＜実施例２＞
肝細胞癌（ＨＣＣ）を有する慢性肝疾患患者（ＨＣＣ（＋））、及びＨＣＣを有さない慢性肝疾患患者（ＨＣＣ（−））の各々の血液検体を用いて、１ｗ／ｖ％のＳＤＳにて２５℃１０分間変性処理した後、「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テスト  ＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス株式会社製）の抗体を使用して血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を測定した。結果を図３（ａ）に示す。図中＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
図３（ａ）に示した結果から明らかなように、ＨＣＣを有さない慢性肝疾患患者に比べて、ＨＣＣを有する慢性肝疾患患者において血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度が有意に高値となることが分かり、血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度を測定することにより、慢性肝疾患患者において、更に、ＨＣＣの有無をも検査し得ることが分かる。
【００７２】
慢性肝疾患よりも病態が更に進行した肝硬変（ＬＣ）患者について、肝細胞癌（ＨＣＣ）を有するＬＣ患者（ＨＣＣ（＋））、及びＨＣＣを有さないＬＣ患者（ＨＣＣ（−））の各々の血液検体を用いて、同様に変性処理後、血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を測定した。結果を図３（ｂ）に示す。図中＊＊はｐ＜０．０１を示す。
図３（ｂ）に示した結果から明らかなように、ＨＣＣを有さないＬＣ患者に比べて、ＨＣＣを有するＬＣ患者において血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度が有意に高値となることが分かり、血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度を測定することにより、ＬＣ患者において、更に、ＨＣＣの有無をも検査し得ることが分かる。
【００７３】
ＢＣＬＣ分類のステージＡ〜Ｄの患者についても同様に変性処理後、血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を測定した。結果を図３（ｄ）に示す。
また、図３（ｄ）に示した結果から明らかなように、ＢＣＬＣ分類のステージＡの患者よりもステージＢ〜Ｄの患者において高値となる傾向が認められることが分かる。
【００７４】
（比較例１）
比較例１として、ＨＣＣを有するＬＣ患者（ＨＣＣ（＋））、及びＨＣＣを有さないＬＣ患者（ＨＣＣ（−））の各々の血液検体を用いて、血液中アルブミン（Ａｌｂ）濃度（Ｕ／Ｌ）を測定した。結果を図３（ｃ）に示す。
図３（ｃ）に示した結果から明らかなように、ＨＣＣ（＋）とＨＣＣ（−）との間に血液中Ａｌｂ濃度の有意差がないことが分かる。
慢性肝疾患よりも病態が更に進行したＬＣ患者においては、Ａｌｂ合成能が低下しており、ＨＣＣの有無を検査し得ないことが分かる。
【００７５】
血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度と、肝細胞癌の検査マーカーであるＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ＡＦＰ及びＡＦＰ−Ｌ３分画との相関分析を行なった。なお、ＡＦＰ−Ｌ３分画はＡＦＰよりも肝細胞癌に対する特異性が高いことが知られている。結果を図４（ａ）〜（ｃ）に示す。
図４（ａ）〜（ｃ）に示した結果から明らかなように、血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩと有意（ｐ＜０．０００１）に相関係数ｒ＝０．５１８の高い相関が見られ、ＡＦＰと有意（ｐ＝０．００２）に相関係数ｒ＝０．２７１の低い相関が見られ、ＡＦＰ−Ｌ３分画と有意（ｐ＝０．００４）に相関係数ｒ＝０．４１５の高い相関が見られた。
【００７６】
以上、実施例２に示した結果から、血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度を測定することにより、Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類におけるステージＡの患者から末期肝硬変患者、また肝細胞癌を有する慢性肝疾患患者までを一貫して評価することができ、かつＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類における脳症や腹水の程度といった主観的な要素を含むことなく肝疾患進行リスクの予測ないし肝疾患進行のモニタリングを検査することができるといえる。
【００７７】
＜実施例３＞
ＨＣＣを有する慢性肝疾患患者（ＨＣＣ（＋））、及びＨＣＣを有さない慢性肝疾患患者（ＨＣＣ（−））の各々の血液検体を用いて、１ｗ／ｖ％のＳＤＳにて２５℃１０分間変性処理した後、「レナプロ  Ｌ−ＦＡＢＰ  テスト  ＨＳ（高感度）」（シミックホールディングス株式会社製）の抗体を使用して血液中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度（ｎｇ／ｍｌ）を測定した。
また、ＨＣＣ（＋）、及びＨＣＣ（−）の各々の血液検体を、ＳＤＳによる変性処理の代わりにＧＵ処理すること以外は同様にしてＥＬＩＳＡ測定を実施し、ＧＵ処理後ＯＤ値／ＳＤＳによる変性処理後ＯＤ値からＬ−ＦＡＢＰの酸化率を算出した。
また、上記得られた酸化率と、上記血液中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度（ｎｇ／ｍｌ）との積から酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの血中濃度（ｎｇ／ｍｌ）を算出した。結果を下記表１に示す。
【００７８】
また、肝疾患により死亡した群（死亡群）と、肝疾患により死亡しなかった群（生存群）との慢性肝疾患患者の各々の血液検体を用いて血液中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度、また、ＧＵ処理後強度を同様に測定し、Ｌ−ＦＡＢＰの酸化率、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの血中濃度を各々算出した。結果を下記表２に示す。
（比較例２）
また、比較例２として、ＨＣＣ（＋）、ＨＣＣ（−）、死亡群、及び生存群の各々の血液検体において血清アルブミン濃度（Ｕ／Ｌ）も測定した。結果を下記表１及び２に示す。
【表１】
2020056626.tif 000005
【表２】
2020056626.tif 000006
【００７９】
上記表１及び２に示した結果から明らかなように、ＨＣＣ（−）と比べＨＣＣ（＋）においてＬ−ＦＡＢＰ全濃度が有意に高値となること、生存群と比べ死亡群においてＬ−ＦＡＢＰ全濃度が有意に高値となることが分かる。
また、ＨＣＣ（−）と比べＨＣＣ（＋）においてＬ−ＦＡＢＰの酸化率が高値となる傾向があること、生存群と比べ死亡群においてＬ−ＦＡＢＰの酸化率が有意に高値となることが分かる。
また、酸化率と血液中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度との積から得られた酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの血中濃度が、ＨＣＣ（−）と比べＨＣＣ（＋）において有意に高値となること、生存群と比べ死亡群において有意に高値となることが分かる。
【００８０】
Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度、酸化率よりも、酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの血中濃度の方が、ＨＣＣ（−）と比べたＨＣＣ（＋）及び生存群と比べた死亡群のいずれにおいても小さなｐ値で有意に高値となることが示されていることから、最も高精度に肝疾患を検査し得るといえる。
一方、比較例２の血清アルブミン濃度はＨＣＣ（−）及びＨＣＣ（＋）間において有意差がなく、生存群及び死亡群間において有意差がなく肝疾患の検査能に劣っていることが分かる。
【００８１】
肝疾患の検査能の精度をより詳細に評価する観点から、上記血液中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度、Ｌ−ＦＡＢＰの上記酸化率、並びに上記酸化率と上記血液中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度との積から得られる酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの血中濃度各々についてＲＯＣ解析を行なった。また、比較例２の血清アルブミン濃度についてもＲＯＣ解析を行なった。結果を図５に示す。
【００８２】
図５に示した結果から明らかなように、Ｌ−ＦＡＢＰの酸化率のＡＵＣが０．６５８、ｐが０．００９であり、血液中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度のＡＵＣが０．７０１、ｐが０．０００８であり、及び上記酸化率と上記血液中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度との積から得られる酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの血中濃度のＡＵＣが０．７２９、ｐが０．０００１であり、上記酸化率、上記血液中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度及び上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの血中濃度の順に、肝疾患の検査能の精度が向上していることが分かり、いずれも高精度に肝疾患を検査し得ることが分かり、特に、上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの血中濃度は肝疾患の検査能の精度に最も優れることが分かる。
一方、比較例２の血清アルブミン濃度についてはＡＵＣが０．５６８と小さく、ｐ値も０．２９と大きく有意性がなく、肝疾患の検査能に劣っていることが分かる。
【００８３】
上記ＲＯＣ解析結果から、血液中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度の基準値（カットオフ値）７．７、上記血液中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度との積から得られる酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの血中濃度の基準値１．９、血清アルブミン濃度の基準値３．１が得られた。
上記血液中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度の上記基準値で分けた生存曲線及び上記酸化率と上記血液中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度との積から得られる酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの血中濃度の上記基準値で分けた生存曲線、及び血清アルブミン濃度の上記基準値で分けた生存曲線を図６（ａ）〜（ｂ）に示す。
【００８４】
図６（ａ）に示した結果から明らかなように、上記血液中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度が基準値７．７より大きい場合と基準値７．７以下の場合との生存曲線のｐ値は＜０．００３であり有意差があり、肝疾患による死亡リスク（好ましくは、定量から１１００日以上先の死亡リスク）を予測し得ることが分かる。
図６（ｂ）に示した結果から明らかなように、更に、上記酸化率と上記血液中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度との積から得られる酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの血中濃度が基準値１．９より大きい場合と基準値１．９以下の場合との生存曲線のｐ値は＜０．０００１であり有意差が大きく、特に肝疾患の検査能に優れ、肝疾患による死亡リスクを予測し得ることが分かる。
一方、図６（ｃ）に示した結果から明らかなように、血清アルブミン強度３．１より大きい場合と血清アルブミン濃度３．１以下の場合との生存曲線のｐ値は＜０．０２であり有意性が小さく、肝疾患の検査能に劣っていることが分かる。
【００８５】
ＧＵ処理後のＬ−ＦＡＢＰの測定値についてもＲＯＣ解析を行なった。結果を図７（ａ）に示す。
また、比較のため、上記血液中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度、上記酸化率と上記血液中Ｌ−ＦＡＢＰ全濃度との積から得られる酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの血中濃度、及び比較例２の血清アルブミン濃度各々についてのＲＯＣ解析結果を図５から転記する。
【００８６】
図７（ａ）に示した結果から明らかなように、ＧＵ処理後Ｌ−ＦＡＢＰの測定値のＡＵＣは０．７１７、ｐ値が０．０００９であり、上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの血中濃度のＡＵＣ及びｐ値に近い値が得られ、上記酸化型Ｌ−ＦＡＢＰの血中濃度に準じる程度に高精度に肝疾患を検査し得ることが分かる。
【００８７】
上記ＲＯＣ解析結果から、ＧＵ処理後のＬ−ＦＡＢＰの測定値の基準値４．５が得られた。
ＧＵ処理後Ｌ−ＦＡＢＰの測定値の基準値４．５で分けた生存曲線を図７（ｂ）に示す。
図７（ｂ）に示した結果から明らかなように、ＧＵ処理後Ｌ−ＦＡＢＰの測定値が基準値４．５より大きい場合と基準値４．５以下の場合との生存曲線のｐ値は＜０．０００２であり有意差が大きく肝疾患の検査能に優れ、肝疾患による死亡リスク（好ましくは、定量から１１００日以上先の死亡リスク）を予測し得ることが分かる。
【図１】
2020056626.tif 000007
【図２】
2020056626.tif 000008
【図３】
2020056626.tif 000009
【図４】
2020056626.tif 000010
【図５】
2020056626.tif 000011
【図６】
2020056626.tif 000012
【図７】
2020056626.tif 000013
【配列表】
2020056626000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月26日(2019.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取した血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含み、
前記定量の結果に基づき、血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質の量と相関する肝疾患の進行度又は重篤度を検査する方法。
【請求項２】
前記検査は、肝疾患による死亡リスクの予測を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記予測が、日数を含めた死亡リスク発生の予測である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
被験者から採取した血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含み、
肝硬変を含む慢性肝疾患である肝疾患の検査方法。
【請求項５】
前記肝疾患が、肝硬変を含む慢性肝疾患及び肝細胞癌の併発である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
被験者から採取した血液中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値を定量する工程を含み、
前記定量する工程が、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程であるか、又は
前記定量が、抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における定量である、
血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質の量と相関する肝疾患の検査方法。
【請求項７】
血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質の定量値に対する前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の定量値の比率を酸化率として求める工程を含み、
前記測定感度が高い条件が、前記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が１．４倍以上の条件である、請求項６に記載の検査方法。
【請求項８】
前記条件において、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質が、２，２’−アゾビズ２−アミジノプロパンにより酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質であり、前記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質が、２，２’−アゾビズ２−アミジノプロパンにより酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質である、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記条件が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理によって形成された条件である、請求項６に記載の検査方法。
【請求項１０】
前記抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件よりも、酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質及び酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度差が小さい条件にて前記肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を更に含む、請求項６〜９のいずれか１項に記載の検査方法。
【請求項１１】
前記測定感度差が小さい条件が、前記血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を界面活性剤による変性処理により形成された条件である、請求項１０に記載の検査方法。
【請求項１２】
前記測定感度差が小さい条件における前記肝型脂肪酸結合タンパク質の測定値と、前記抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における測定値とに基づき、血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含む、請求項１０又は１１に記載の検査方法。
【請求項１３】
前記肝疾患が、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患である、請求項１、２、３又は６に記載の検査方法。
【請求項１４】
前記検査が、肝疾患による死亡リスクの予測を含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記予測が、日数を含めた死亡リスク発生の予測である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
下記（１）及び（２）よりなる群から選択される少なくとも１つの工程を含む、被験者における肝型脂肪酸結合タンパク質の量又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値に基づく肝疾患の検査方法。
（１）肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の正常範囲、又は慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患における肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の範囲、又は肝疾患による死亡リスクを有する肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の範囲と、被験者における肝型脂肪酸結合タンパク質の量とを比較し、被験者における前記量が、前記範囲のいずれに該当するかを決定する工程
（２）酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の正常範囲、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の範囲、又は肝疾患による死亡リスクを有する酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の範囲と、被験者の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、被験者における前記量若しくはそれと相関するパラメータの値が、前記範囲のいずれに該当するかを決定する工程
【請求項１７】
肝型脂肪酸結合タンパク質のみの定量結果に基づく、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
脳症の程度及び腹水の程度の評価を含まない、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法に用いる肝疾患検査キット。
【請求項２０】
肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つを検査する請求項１９に記載の肝疾患検査キット。
【請求項２１】
さらに変性処理剤を含む請求項１９に記載の肝疾患検査キット。
【請求項２２】
前記肝型脂肪酸結合タンパク質又は前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質は抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体であり、前記変性処理剤は界面活性剤またはドデシル硫酸ナトリウムである請求項１９に記載の肝疾患検査キット。
【請求項２３】
肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法に用いる肝疾患コンパニオン診断薬。
【請求項２４】
肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質からなり、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法における定量対象として用いられる肝疾患マーカー。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
慢性肝疾患のなかでも、病態が更に進行した肝硬変（ＬＣ）患者について、肝細胞癌（ＨＣＣ）を有するＬＣ患者（ＨＣＣ（＋））、及びＨＣＣを有さないＬＣ患者（ＨＣＣ（−））の各々の血液検体を用いて、同様に変性処理後、血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を測定した。結果を図３（ｂ）に示す。図中＊＊はｐ＜０．０１を示す。
図３（ｂ）に示した結果から明らかなように、ＨＣＣを有さないＬＣ患者に比べて、ＨＣＣを有するＬＣ患者において血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度が有意に高値となることが分かり、血液中Ｌ−ＦＡＢＰ濃度を測定することにより、ＬＣ患者において、更に、ＨＣＣの有無をも検査し得ることが分かる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
（比較例１）
比較例１として、ＨＣＣを有するＬＣ患者（ＨＣＣ（＋））、及びＨＣＣを有さないＬＣ患者（ＨＣＣ（−））の各々の血液検体を用いて、血液中アルブミン（Ａｌｂ）濃度（Ｕ／Ｌ）を測定した。結果を図３（ｃ）に示す。
図３（ｃ）に示した結果から明らかなように、ＨＣＣ（＋）とＨＣＣ（−）との間に血液中Ａｌｂ濃度の有意差がないことが分かる。
慢性肝疾患のなかでも、病態が更に進行したＬＣ患者においては、Ａｌｂ合成能が低下しており、ＨＣＣの有無を検査し得ないことが分かる。
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月25日(2019.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取した血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含み、
前記定量の結果に基づき、血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質の量と相関する肝疾患の進行度又は重篤度を検査する方法。
【請求項２】
前記検査は、肝疾患による死亡リスクの予測を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記予測が、日数を含めた死亡リスク発生の予測である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
被験者から採取した血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を含み、
肝硬変を含む慢性肝疾患である肝疾患の検査方法。
【請求項５】
前記肝疾患が、肝硬変を含む慢性肝疾患及び肝細胞癌の併発である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
被験者から採取した血液中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値を定量する工程を含み、
前記定量する工程が、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程であるか、又は
前記定量が、抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における定量である、
血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質の量と相関する肝疾患の検査方法。
【請求項７】
血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質の定量値に対する前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の定量値の比率を酸化率として求める工程を含み、
前記測定感度が高い条件が、前記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が１．４倍以上の条件である、請求項６に記載の検査方法。
【請求項８】
前記条件において、前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質が、２，２’−アゾビズ２−アミジノプロパンにより酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質であり、前記酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質が、２，２’−アゾビズ２−アミジノプロパンにより酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質である、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記条件が、カオトロピック試薬又は有機アミン化合物による処理によって形成された条件である、請求項６に記載の検査方法。
【請求項１０】
前記抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件よりも、酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質及び酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度差が小さい条件にて前記肝型脂肪酸結合タンパク質を定量する工程を更に含む、請求項６〜９のいずれか１項に記載の検査方法。
【請求項１１】
前記測定感度差が小さい条件が、前記血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質を界面活性剤による変性処理により形成された条件である、請求項１０に記載の検査方法。
【請求項１２】
前記測定感度差が小さい条件における前記肝型脂肪酸結合タンパク質の測定値と、前記抗原抗体反応を促進する処理を行い、かつ、酸化されていない肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度に対して酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の測定感度が高い条件における測定値とに基づき、血液中の肝型脂肪酸結合タンパク質中の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の比率に略対応する酸化率を算出する工程を更に含む、請求項１０又は１１に記載の検査方法。
【請求項１３】
前記肝疾患が、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患である、請求項１、２、３又は６に記載の検査方法。
【請求項１４】
前記検査が、肝疾患による死亡リスクの予測を含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記予測が、日数を含めた死亡リスク発生の予測である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
下記（１）及び（２）よりなる群から選択される少なくとも１つの工程を含む、被験者における肝型脂肪酸結合タンパク質の量又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値に基づく肝疾患の検査方法。
（１）肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の正常範囲、又は慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患における肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の範囲、又は肝疾患による死亡リスクを有する肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の範囲と、被験者における肝型脂肪酸結合タンパク質の量とを比較し、被験者における前記量が、前記範囲のいずれに該当するかを決定する工程
（２）酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の正常範囲、慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患における酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値の既知の範囲、又は肝疾患による死亡リスクを有する酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量の既知の範囲と、被験者の酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質の量若しくはそれと相関するパラメータの値とを比較し、被験者における前記量若しくはそれと相関するパラメータの値が、前記範囲のいずれに該当するかを決定する工程
【請求項１７】
肝型脂肪酸結合タンパク質のみの定量結果に基づく、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
脳症の程度及び腹水の程度の評価を含まない、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法に用いる肝疾患検査キット。
【請求項２０】
肝疾患の種類、進行度及び重篤度よりなる群から選択される少なくとも１つを検査する請求項１９に記載の肝疾患検査キット。
【請求項２１】
さらに変性処理剤を含む請求項１９に記載の肝疾患検査キット。
【請求項２２】
前記肝型脂肪酸結合タンパク質又は前記酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質は抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体であり、前記変性処理剤は界面活性剤またはドデシル硫酸ナトリウムである請求項２１に記載の肝疾患検査キット。
【請求項２３】
肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質を定量し得る物質を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法に用いる肝疾患コンパニオン診断薬。
【請求項２４】
肝型脂肪酸結合タンパク質又は酸化された肝型脂肪酸結合タンパク質からなり、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法における定量対象として用いられる肝疾患マーカー。