(57)【要約】【課題】アフィニティ精製法によって簡便に精製できる融合タンパク質、融合タンパク質の製造方法、及びそれを利用した目的タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】タンパク質、又は立体構造を形成するポリペプチドからなるタグが目的タンパク質に連結された融合タンパク質であって、前記タグにおいて、一次構造上で任意の連続する９個のアミノ酸残基中においてヒスチジン残基が４個以上含ませず、かつ、立体構造上で表面に出ているヒスチジン残基のうち、表面に出ている別のヒスチジン残基との距離が１．６ｎｍ以下であるヒスチジン残基の数ＮＡを４個以上とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質、又は立体構造を形成するポリペプチドからなるタグが目的タンパク質に連結された融合タンパク質であって、
前記タグは、一次構造上で任意の連続する９個のアミノ酸残基中においてヒスチジン残基が４個以上含まれず、かつ、立体構造上で表面に出ているヒスチジン残基のうち、表面に出ている別のヒスチジン残基との距離が１．６ｎｍ以下であるヒスチジン残基の数ＮＡが４個以上である、融合タンパク質。
【請求項２】
前記タグの立体構造上で表面に出ているヒスチジン残基のうち、互いの距離が１．６ｎｍ以下であるヒスチジン残基同士のペアの数ＮＢが４個以上である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記タグが、配列番号１で表されるアミノ酸配列とのホモロジーが８０％以上であるアミノ酸配列を有する改変ＳＵＭＯタグである、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記タグが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する改変ＳＵＭＯタグである、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を製造する融合タンパク質の製造方法であって、
無細胞タンパク質合成系で前記融合タンパク質を合成し、アフィニティ精製法により前記融合タンパク質を精製する、融合タンパク質の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の融合タンパク質の製造方法により、融合タンパク質を製造した後、タグを認識して切り離すプロテアーゼで処理し、前記タグが切り離された目的タンパク質を得る、目的タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合タンパク質及びその製造方法、目的タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
創薬、医療、酵素、生化学研究等の様々な分野において、目的タンパク質にタグが連結された融合タンパク質を利用する技術が広く用いられている。タグを有する融合タンパク質としては、例えば、ＳＵＭＯ（small ubiquitin related modifier）タンパク質をＮ末端タグとして有する融合タンパク質が提案されている（特許文献１）。ＳＵＭＯタグを有する融合タンパク質は、ＳＵＭＯタグが必要なくなったときに、プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）で処理することで目的タンパク質からＳＵＭＯタグを切り離すことができる。
【０００３】
タンパク質は、一般に、生きた細胞、無細胞タンパク質合成系等によってタンパク質を合成し、精製することで製造される。タンパク質の精製方法としては、アフィニティ精製法が広く普及している。アフィニティ精製法によれば、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋等の金属イオンにキレート配位するアフィニティ精製用レジンを用いて、前記金属イオンに対するアフィニティを有するタンパク質を簡便に精製できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００５−５１４０２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、ＳＵＭＯタグは前記金属イオンに対するアフィニティを有しないため、特許文献１のようなＳＵＭＯタグを有する融合タンパク質はアフィニティ精製法では精製できない。
【０００６】
本発明は、アフィニティ精製法によって簡便に精製できる融合タンパク質、融合タンパク質の製造方法、及びそれを利用した目的タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の態様を有する。
［１］タンパク質、又は立体構造を形成するポリペプチドからなるタグが目的タンパク質に連結された融合タンパク質であって、前記タグは、一次構造上で任意の連続する９個のアミノ酸残基中においてヒスチジン残基が４個以上含まれず、かつ、立体構造上で表面に出ているヒスチジン残基のうち、表面に出ている別のヒスチジン残基との距離が１．６ｎｍ以下であるヒスチジン残基の数ＮＡが４個以上である、融合タンパク質。
［２］前記タグの立体構造上で表面に出ているヒスチジン残基のうち、互いの距離が１．６ｎｍ以下であるヒスチジン残基同士のペアの数ＮＢが４個以上である、［１］に記載の融合タンパク質。
［３］前記タグが、配列番号１で表されるアミノ酸配列とのホモロジーが８０％以上であるアミノ酸配列を有する改変ＳＵＭＯタグである、［１］又は［２］に記載の融合タンパク質。
［４］前記タグが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する改変ＳＵＭＯタグである、［３］に記載の融合タンパク質。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の融合タンパク質を製造する融合タンパク質の製造方法であって、無細胞タンパク質合成系で前記融合タンパク質を合成し、アフィニティ精製法により前記融合タンパク質を精製する、融合タンパク質の製造方法。
［６］［５］に記載の融合タンパク質の製造方法により、融合タンパク質を製造した後、タグを認識して切り離すプロテアーゼで処理し、前記タグが切り離された目的タンパク質を得る、目的タンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、アフィニティ精製法によって簡便に精製できる融合タンパク質、融合タンパク質の製造方法、及びそれを利用した目的タンパク質の製造方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】数ＮＡ及び数ＮＢのカウント方法を説明する模式図である。
【図２】数ＮＡ及び数ＮＢのカウント方法を説明する模式図である。
【図３】分子動力学シミュレーション（ＭＤ）により算出した改変ＳＵＭＯタンパク質の構造を示した図である。
【図４】実施例１における融合タンパク質のアフィニティ精製前後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した図である。
【図５】実施例１における精製した融合タンパク質のタグの切断処理前後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［融合タンパク質］
本発明の融合タンパク質は、タンパク質、又は立体構造を形成するポリペプチドからなるタグが目的タンパク質に連結された融合タンパク質である。
なお、本発明において、「タンパク質」とは、２５個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した化合物を意味する。「ポリペプチド」とは、２個以上２５個未満のアミノ酸がペプチド結合により結合した化合物を意味する。
【００１１】
本発明の融合タンパク質においては、目的タンパク質のＮ末端側にタグが連結されていてもよく、目的タンパク質のＣ末端側にタグが連結されていてもよい。
【００１２】
本発明の融合タンパク質が有するタグは、複数のヒスチジン残基を有し、立体構造上で複数のヒスチジン残基が表面に露出したタグであり、以下の条件（１）及び条件（２）を満たしている。
（１）タグの一次構造上で任意の連続する９個のアミノ酸残基中において、ヒスチジン残基が４個以上含まれない。
（２）タグの立体構造上で表面に出ているヒスチジン残基のうち、表面に出ている別のヒスチジン残基との距離ｄが１．６ｎｍ以下であるヒスチジン残基の数ＮＡが４個以上である。
【００１３】
タグの一次構造上の任意の連続する９個のアミノ酸残基中においてヒスチジン残基が４個以上含まれると、目的タンパク質の立体構造や、機能、性質が変化しやすく、また合成時に融合タンパク質の発現量が低下しやすい。例えば、アフィニティ精製タグとして知られている、６個程度のヒスチジン残基が連続したＨｉｓタグを用いると、目的タンパク質の立体構造や、機能、性質が変化したり、合成時に充分な発現量が得られなかったりすることがある。
【００１４】
これに対し、本発明の融合タンパク質においては、タグが条件（１）を満たすことで、目的タンパク質の立体構造や、機能、性質に悪影響を与えにくく、生きた細胞や無細胞タンパク質合成系等を用いたタンパク質合成において融合タンパク質が充分に発現する。なお、本発明の融合タンパク質が有するタグは、一次構造上の任意の連続する９個のアミノ酸残基中において３個のヒスチジン残基が含まれていてもよい。
【００１５】
条件（２）の距離ｄは、立体構造を形成したタグの表面に露出している２個のヒスチジン残基の側鎖のＮε窒素原子同士の立体構造上における距離である。距離ｄが０．４ｎｍ以下である２個のヒスチジン残基は、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋等の金属イオンにキレート配位できる。距離ｄが１．６ｎｍ以下である２個のヒスチジン残基も、タンパク質の構造の揺らぎにより距離ｄが０．４ｎｍ以下になりえて、金属イオンにキレート配位できる。距離ｄが１．６ｎｍ以下である数ＮＡが４個以上あれば、融合タンパク質に金属イオンへの充分なキレート能が付与されるため、アフィニティ精製が可能となる。
なお、露出とは、ヒスチジン残基の少なくとも一部が表面に出ていることを意味する。
【００１６】
ヒスチジン残基間の距離ｄが１．６ｎｍ以下であるヒスチジン残基の数ＮＡは、４個以上、かつタグのアミノ酸残基数に対して２０％以下となる数が好ましく、６個以上、かつタグのアミノ酸残基数に対して１５％以下となる数がより好ましく、８個以上、かつタグのアミノ酸残基数に対して１０％以下となる数がさらに好ましい。数ＮＡが前記範囲の下限値以上であれば、融合タンパク質に金属イオンへの充分なキレート能が付与されるため、アフィニティ精製法によって融合タンパク質を簡便に精製できる。数ＮＡが前記範囲の上限値以下であれば、タグの機能及び性質を毀損しにくい。
【００１７】
本発明の融合タンパク質が有するタグは、条件（１）及び条件（２）に加えて、さらに以下の条件（３）を満たすことが好ましい。
（３）タグの立体構造上で表面に出ているヒスチジン残基のうち、互いの距離ｄが１．６ｎｍ以下であるヒスチジン残基同士のペアの数ＮＢが４個以上である。
【００１８】
タグが条件（１）及び条件（２）に加えて条件（３）をさらに満たすことで、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋等の金属イオンへのアフィニティが向上し、アフィニティ精製法による融合タンパク質の精製効率がより高くなる。
数ＮＢは、４個以上が好ましく、６個以上がより好ましく、８個以上がさらに好ましい。数ＮＢが前記範囲の下限値以上であれば、アフィニティ精製法による融合タンパク質の精製効率が向上する。数ＮＢが大きいほどタンパク質の精製効率は向上する。
【００１９】
タグにおける数ＮＡ及び数ＮＢのカウント方法について、図１及び図２を参照して具体的に説明する。
例えば図１（Ａ）に示すように、立体構造を形成したタグの表面において、任意のヒスチジン残基からの距離ｄは１．６ｎｍ以下であるが、互いのヒスチジン残基同士の距離ｄは１．６ｎｍを超えるヒスチジン残基が２個ある場合、数ＮＡは３個であり、数ＮＢは２個である。
図１（Ｂ）に示すように、立体構造を形成したタグの表面において、どの組み合わせでもヒスチジン残基同士の距離ｄが１．６ｎｍ以下である３個のヒスチジン残基がある場合、数ＮＡは３個であり、数ＮＢは３個である。
【００２０】
図２（Ａ）に示すように、立体構造を形成したタグの表面において、ヒスチジン残基同士の距離ｄが１．６ｎｍ以下である２組のヒスチジン残基のペアがあり、それらのペアの片方のヒスチジン残基同士の距離ｄだけが１．６ｎｍ以下である場合、数ＮＡは４個であり、数ＮＢは３個である。
図２（Ｂ）に示すように、立体構造を形成したタグの表面において、どの組み合わせでもヒスチジン残基同士の距離ｄが１．６ｎｍ以下であるヒスチジン残基が３個あり、そのうちの１個のヒスチジン残基からの距離ｄのみが１．６ｎｍ以下であるヒスチジン残基がさらにもう１個ある場合、数ＮＡは４個であり、数ＮＢは４個である。
図２（Ｃ）に示すように、立体構造を形成したタグの表面において、正方形の各頂点に位置し、各辺のどの組み合わせでもヒスチジン残基同士の距離ｄが１．０ｎｍ以下であり、かつ対角線上のヒスチジン残基同士の距離ｄが１．６ｎｍ以下である４個のヒスチジン残基がある場合、距離ｄが１．６ｎｍ以下の数ＮＡは４個であり、数ＮＢは６個である。
【００２１】
このように、数ＮＡが同数の場合、数ＮＢが大きいほど、立体構造を形成したタグの表面において、別のヒスチジン残基との距離ｄが１．６ｎｍ以下であるヒスチジン残基が密集していることを示している。立体構造を形成したタグの表面においてヒスチジン残基が密集するほど、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋等の金属イオンへのアフィニティが高くなるため、アフィニティ精製法による融合タンパク質の精製効率が高くなる。
【００２２】
本発明の融合タンパク質が有するタグの態様は、条件（１）及び（２）を満たし、必要に応じてさらに条件（３）を満たす以外は、特に限定されない。
タンパク質からなるタグとしては、例えば、任意の野生型タンパク質に対し、条件（１）及び（２）、又は条件（１）〜（３）を満たすようにアミノ酸配列を変異させた変異型タンパク質からなるタグが挙げられる。
ポリペプチドからなるタグとしては、例えば、任意の野生型タンパク質の一部のアミノ酸配列を有し、かつ立体構造を形成する部分構造体に対し、条件（１）及び（２）、又は条件（１）〜（３）を満たすようにアミノ酸配列を変異させたポリペプチドからなるタグが挙げられる。
【００２３】
タグの設計においては、野生型タンパク質やその部分構造体等の表面に存在し、その構造や機能に大きく影響しないと予想されるアミノ酸残基を変異させることが好ましい。具体的には、例えば、野生型タンパク質やその部分構造体等の表面において、同様の電荷を持つアミノ酸残基が密集している部分のアミノ酸残基や、他のアミノ酸残基と水素結合等の強い相互作用をしているアミノ酸残基を避けて変異を導入することが好ましい。
【００２４】
野生型タンパク質又はその部分構造体の変異による構造や機能への影響は、例えば、Ｘ線結晶解析法、ＮＭＲ、分子動力学シミュレーション等による野生型タンパク質の構造解析結果や、タンパク質構造データバンク（ＰＤＢ）の野生型タンパク質や複合体の構造情報等から推測することができる。
【００２５】
また、タグの設計においては、１個のアミノ酸残基を１個の別のアミノ酸残基に置換してもよく、１個のアミノ酸残基を２個以上の別のアミノ酸残基に置換してもよく、任意の２個のアミノ酸残基の間に１個以上のアミノ酸残基を追加してもよく、任意のアミノ酸残基を取り除いてもよい。
【００２６】
タグとしては、条件（１）及び（２）、又は条件（１）〜（３）を満たすように野生型ＳＵＭＯタンパク質を変異させた改変ＳＵＭＯタグを用いることが好ましい。改変ＳＵＭＯタグは、Ｈｉｓタグに比べて目的タンパク質の構造や機能への影響が小さく、生きた細胞や無細胞タンパク質合成系での合成時に充分な発現量が得られやすい。また、改変ＳＵＭＯタグをＮ末端タグとして有する融合タンパク質は、アフィニティ精製法による精製後に、プロテアーゼで処理して改変ＳＵＭＯタグを目的タンパク質から切り離すことできる。
【００２７】
改変ＳＵＭＯタグの設計に用いる野生型ＳＵＭＯタンパク質は、特に限定されず、例えば、セントリン、ＳＭＴ３、ＰＩＣ１、ＧＭＰ１、ＵＢＬ１等が挙げられる。
改変ＳＵＭＯタグとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列とのホモロジーが８０％以上であるアミノ酸配列を有する改変ＳＵＭＯタグが好ましく、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する改変ＳＵＭＯタグがより好ましい。
【００２８】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する改変ＳＵＭＯタグでは、野生型ＳＵＭＯタンパク質（ＳＭＴ３、配列番号３）におけるＵｌｐ１プロテアーゼとの結合部位と反対側の表面に露出した複数のアミノ酸残基を変異させている。Ｕｌｐ１プロテアーゼは、ＳＵＭＯタンパク質のＣ末端を特異的に切断するタンパク質分解酵素である（Lee C.D. et al., Protein Science(2008), 17(7):1241-1248）。
【００２９】
具体的には、野生型ＳＵＭＯタンパク質（ＳＭＴ３、配列番号３）のＮ末端側から２番目のセリン残基がリシン残基に置換されている。２番目のアミノ酸残基をリシン残基（コドンＡＡＡ）にすることで、融合タンパク質の発現量が増加する。
また、野生型ＳＵＭＯタンパク質の１４番目と１８番目のバリン残基、２２番目と４２番目のトレオニン残基、５１番目のアラニン残基、及び５４番目のリシン残基がそれぞれヒスチジン残基に置換されている。さらに、１０番目のアラニン残基がヒスチジン残基、アラニン残基、ヒスチジン残基の順の３個のアミノ酸残基に置換されている。これにより、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する改変ＳＵＭＯタグは、距離ｄが１．６ｎｍ以下の数ＮＡが９個、数ＮＢが８個となり、条件（１）〜（３）を満たしている。また、前記改変ＳＵＭＯタグにおいては、一次構造上で連続するどの９個のアミノ酸残基を選択しても、その中にヒスチジン残基が４個以上含まれる部分がない。
【００３０】
改変ＳＵＭＯタグの配列番号１で表されるアミノ酸配列とのホモロジーは、８０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、１００％が特に好ましい。ホモロジーが前記下限値以上であれば、目的タンパク質の構造や機能への影響が小さく、合成時に充分な発現量が得られやすく、また野生型ＳＵＭＯタンパク質を認識してそのＣ末端で切断するプロテアーゼ（ＳＵＭＯプロテアーゼ）で処理して改変ＳＵＭＯタグを目的タンパク質から切り離すことできる。
【００３１】
なお、配列番号１で表されるアミノ酸配列とのホモロジーは、以下のように算出される。
アミノ酸配列のホモロジーは、ホモロジー計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool, https://blast.ncbi.nlm.govのProteinBLAST）を用い、以下の条件（Expected threshold=10; Gap costs=Existence:11, Extension:1; Matrix=BLOSUM62; Filter=off）にて計算することができる。アミノ酸配列のホモロジーを決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLAST及びXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997)）］、Needleman et al., J. Mol. Biol., 48: 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
【００３２】
タグとしては、改変ＳＵＭＯタグには限定されず、例えば、ＳＵＭＯタンパク質以外のタンパク質を、条件（１）及び条件（２）、又は条件（１）〜（３）を満たすように変異させた変異型タンパク質や、その部分構造体からなるポリペプチドであってもよい。
ＳＵＭＯタンパク質以外のタンパク質としては、例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質（ＧＳＴ）等が挙げられる。
【００３３】
タグを連結する目的タンパク質は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択できる。例えば、リンゴ酸合成酵素Ｇ（ＭＳＧ）、ウシ脾臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）等が挙げられる。
【００３４】
［融合タンパク質の製造方法］
本発明の融合タンパク質は、大腸菌、酵母、真核細胞、カイコ等の生きた細胞を用いたタンパク質合成方法や、無細胞タンパク質合成系等の公知の方法で合成できる。なかでも、簡便に短時間で融合タンパク質が得られることから、無細胞タンパク質合成系で合成することが好ましい。
【００３５】
「無細胞タンパク質合成系」とは、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系と、ｍＲＮＡの情報を読み取ってリボソーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系とを含む無細胞転写翻訳系、及び、無細胞翻訳系の両方を包含する。
【００３６】
無細胞タンパク質合成系には、無細胞タンパク質合成系に必要な成分を含む細胞から抽出した無細胞タンパク質合成用細胞抽出液（以下、単に「細胞抽出液」という。）、あるいはタンパク質合成に必要な因子を個別に精製し混合した再構成型無細胞タンパク質合成法に用いられる溶液を用いることができる。
【００３７】
細胞抽出液としては、リボソーム、ｔＲＮＡ等のタンパク質合成に関与する翻訳系に必要な成分、又は、転写系及び翻訳系に必要な成分を含む植物細胞、動物細胞、真菌細胞、細菌細胞から抽出した細胞抽出液等が挙げられる。例えば、大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、出芽酵母等からの細胞抽出液などが挙げられる。
【００３８】
例えば、細胞抽出液に、アミノ酸、ＡＴＰ等のエネルギー源、融合タンパク質のアミノ酸配列を逆翻訳した塩基配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡ等を添加して、無細胞タンパク質合成系である無細胞転写翻訳系又は無細胞翻訳系で融合タンパク質を合成できる。
【００３９】
無細胞タンパク質合成系は、特に限定はなく、市販品を用いることができ、市販品としては、例えば、無細胞タンパク質合成キット（商品名：無細胞くん、大陽日酸社製）等が挙げられる。
【００４０】
融合タンパク質の合成条件は、適宜設定でき、例えば、反応温度は１６〜３７℃、反応時間は１５分〜４８時間とすることができる。
【００４１】
合成した融合タンパク質は、条件（１）及び（２）、又は条件（１）〜（３）を満たすタグを有するため、アフィニティ精製法により精製することができる。例えば、アフィニティ精製用レジンが充填されたカラムに合成後の反応液を通し、融合タンパク質をアフィニティ精製用レジンに吸着させた後、融合タンパク質を溶出させるアフィニティカラムクロマトグラフィーによって精製することができる。
【００４２】
アフィニティ精製法に用いるアフィニティ精製用レジンとしては、特に限定されず、例えば、Ni-Sepharose HP affinity resin（GE Healthcare社製）、TALON superflow Metal Affinity Resin（Clonetech社製）、HisLink Protein Purification Resin（Promega社製）等が挙げられる。
【００４３】
［目的タンパク質の製造方法］
前記した改変ＳＵＭＯタグを有する融合タンパク質の場合、精製後に改変ＳＵＭＯタグを認識して切り離すプロテアーゼで処理することで、改変ＳＵＭＯタグが切り離されたタンパク質を得ることができる。
プロテアーゼとしては、ＳＵＭＯプロテアーゼであるＵｌｐ１、Ｕｌｐ２等を用いることができる。
【００４４】
プロテアーゼによるタグ切断に必要な条件は、融合相手のタンパク質、濃度、使用するプロテアーゼ濃度、反応バッファー組成等に依存する。プロテアーゼによる処理条件は、プロテアーゼに適した条件であればよく、例えば、反応温度は４〜３７℃、反応時間は１０分〜２４時間とすることができる。
【００４５】
以上説明したように、本発明においては、条件（１）及び（２）を満たすタグを有する融合タンパク質とするため、アフィニティ精製法によって簡便に精製することができる。また、条件（１）及び（２）を満たす改変ＳＵＭＯタグを用いれば、精製後の融合タンパク質から改変ＳＵＭＯタグを切り離してタグのない目的タンパク質を得ることができる。さらに無細胞タンパク質合成系による合成を組み合わせれば、高純度な目的タンパク質を迅速かつ簡便に製造することができる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記載によっては限定されない。
［実施例１］
S. Cerevisiae由来の野生型ＳＵＭＯタンパク質（配列番号３、９８残基、ＳＭＴ３、GeneBank accession no.: G12306）とＵｌｐ１プロテアーゼの複合体の構造情報（Mossesova E. and Lima C.D., PDB accession no.: 1EUV）を基に、ＳＵＭＯタンパク質におけるＵｌｐ１プロテアーゼとの結合部位と反対側の表面に露出している複数のアミノ酸残基を変異させた改変ＳＵＭＯタンパク質（配列番号１、１００残基、１２ｋＤａ）を設計した。改変ＳＵＭＯタンパク質の設計では、野生型ＳＵＭＯタンパク質において立体構造形成への寄与が低い、すなわち他のアミノ酸残基と水素結合を形成しないと思われる、電荷の少ない小型のアミノ酸残基を主たる変異の対象とした。具体的には、野生型ＳＵＭＯタンパク質のＮ末端側から２番目のセリン残基をリシン残基に置換した。また、１４番目と１８番目のバリン残基、２２番目と４２番目のトレオニン残基、５１番目のアラニン残基、及び５４番目のリシン残基をそれぞれヒスチジン残基に置換した。また、１０番目のアラニン残基をヒスチジン残基、アラニン残基、ヒスチジン残基の順の３個のアミノ酸残基に置換した。
【００４７】
公共データーベースに公開されている野生型ＳＭＴ３タンパク質のＸ線結晶構造解析による構造情報（ＰＤＢ  ＩＤ：  １ＥＵＶ）を鋳型として、前記改変ＳＵＭＯタンパク質の構造を分子動力学シミュレーション（ＭＤ）により算出した。ＭＤ計算には、ソフトウェアパッケージVMD 1.9.3（Humphrey, W., Dalke, A. and Schulten, K., “VMD - Visual Molecular Dynamics”, J. Molec. Graphics, 1996, vol. 14, pp. 33-38., http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/）, NAMD 2.13（James C. Phillips, Rosemary Braun, Wei Wang, James Gumbart, Emad Tajkhorshid, Elizabeth Villa, Christophe Chipot, Robert D. Skeel, Laxmikant Kale, and Klaus Schulten. Scalable molecular dynamics with NAMD. Journal of Computational Chemistry, 26:1781-1802, 2005., http://www.ks.uiuc.edu/Research/namd/）のQwikMDプロトコルのデフォルト設定（Simulation time=3 ns）を用いた。構造の表示と距離測定は、ソフトウェアパッケージPyMol（The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.0 Schrodinger, LLC.）を用いた。結果を図３に示す。
【００４８】
図３に示すように、１０番目のヒスチジン残基（Ｈ１０）と１２番目のヒスチジン残基（Ｈ１２）の距離ｄは１．１５ｎｍである。１２番目のヒスチジン残基（Ｈ１２）と１６番目のヒスチジン残基（Ｈ１６）の距離ｄは０．７８ｎｍである。２０番目のヒスチジン残基（Ｈ２０）と２４番目のヒスチジン残基（Ｈ２４）の距離ｄは１．２５ｎｍである。２４番目のヒスチジン残基（Ｈ２４）と２５番目のヒスチジン残基（Ｈ２５）の距離ｄは０．８８ｎｍである。２４番目のヒスチジン残基（Ｈ２４）と４４番目のヒスチジン残基（Ｈ４４）の距離ｄは１．５３ｎｍである。２５番目のヒスチジン残基（Ｈ２５）と４４番目のヒスチジン残基（Ｈ４４）の距離ｄは１．３８ｎｍである。２５番目のヒスチジン残基（Ｈ２５）と５３番目のヒスチジン残基（Ｈ５３）の距離ｄは１．３８ｎｍである。５３番目のヒスチジン残基（Ｈ５３）と５６番目のヒスチジン残基（Ｈ５６）の距離ｄは０．８１ｎｍである。このように、距離ｄが１．６ｎｍ以下の数ＮＡは９個であり、数ＮＢは８個であった。
【００４９】
改変ＳＵＭＯタンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列を逆翻訳した塩基配列（配列番号２）を含むＤＮＡ断片と、ｐＵＣプラスミドベクターにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を組み込んだｐＵＣ−ＣＡＴ遺伝子とを、Two-step PCRの鋳型として用意した。E. coli由来のリンゴ酸合成酵素Ｇ（Malate Synthase G; ＭＳＧ、８０ｋＤａ）に改変ＳＵＭＯタグ（配列番号１のアミノ酸）がＮ末端タグとして連結された融合タンパク質（改変ＳＵＭＯタグ−ＭＳＧ）を無細胞タンパク質合成系にて合成するためのリニア鋳型ＤＮＡを、前記ＤＮＡ断片とｐＵＣ−ＣＡＴ遺伝子を用いたTwo-step PCRによって調製した。前記リニア鋳型ＤＮＡと無細胞タンパク質合成キット（商品名：無細胞くん、大陽日酸社製）を用い、無細胞タンパク質合成系にて３０℃、１６時間の条件で改変ＳＵＭＯタグ−ＭＳＧ（９２ｋＤａ）を合成した。
【００５０】
次いで、反応液を回収し、遠心分離して上清画分を採取し、５倍量のバッファーＡ（２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．０、３００ｍＭＮａＣｌ）で希釈してアフィニティ精製に用いた。Ni-Sepharose HP affinity resin（GE Healthcare社製）が充填されたカラムに希釈液を通し、改変ＳＵＭＯタグ−ＭＳＧをアフィニティレジンに吸着させた。次いで、各種濃度のイミダゾールを含むバッファーＢ（２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．０、３００ｍＭＮａＣｌ、イミダゾール濃度：２０〜５００ｍＭ）を用い、イミダゾール濃度を段階的に増加させながら改変ＳＵＭＯタグ−ＭＳＧの溶出を７回行った。
【００５１】
各溶出画分をＳＤＳ（Sodium dodecyl sulfate）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図４に示す。
なお、図４における各記号は以下の意味を示す。
Ｌ：合成反応液の上清画分、
ＦＴ：精製カラムを素通りした画分、
Ｅ１〜Ｅ７：カラム溶出画分（イミダゾール濃度：２０ｍＭ、３０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、５００ｍＭ、５００ｍＭ）、
Ｒ：溶出後のアフィニティレジンの残留画分、
Ｍ：分子量マーカー（LMW Calibration kit, GE, cat. 17-0446-01）。
【００５２】
また、イミダゾール濃度が１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭの溶出液を混合した混合液にＵｌｐ１プロテアーゼを加え、４℃で１晩インキュベートした。切断反応前の混合液と切断反応後の反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色した。結果を図５に示す。
なお、図５における各記号は以下の意味を示す。
Ｅ：切断反応前の混合液、
Ｃ：切断反応後の反応液。
【００５３】
図４に示すように、カラム溶出画分のレーンＥ１〜Ｅ７では、合成反応液の上清画分のレーンＬに比べ、改変ＳＵＭＯタグ−ＭＳＧ（分子量：約９７ｋＤａ）のバンド以外のバンドが薄く、アフィニティ精製によって改変ＳＵＭＯタグ−ＭＳＧが高純度に精製されていた。
また、図５に示すように、切断反応後の反応液のレーンＣでは、切断反応前の混合液のレーンＥのバンドＢ１（改変ＳＵＭＯタグ−ＭＳＧ）が消え、バンドＢ１よりも分子量が小さいバンドＢ２（ＭＳＧ）及びバンドＢ３（改変ＳＵＭＯタグ）が確認された。すなわち、アフィニティ精製後にＵｌｐ１プロテアーゼで処理することによって、改変ＳＵＭＯタグ−ＭＳＧから改変ＳＵＭＯタグが切り離され、精製されたＭＳＧが得られることが確認できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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