(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞外基質（細胞外マトリクス）（ＥＣＭ）組成物及びＥＣＭ組成物の製造方法の提供。【解決手段】ヒト胎盤組織を用いて調製された細胞外基質（ＥＣＭ）組成物。ＥＣＭ組成物は３０％から６０％のコラーゲン及び１０％から３５％のエラスチンを含む。さらに、そのようなＥＣＭ組成物は、（i）エライザ法（ＥＬＩＳＡ）によって測定される、極めて少量のフィブロネクチン（０．１％未満のフィブロネクチン）；（ii）エライザ法による測定で、検出されないか又は検出不能な量のラミニン；及び／又は例えばエライザ法による測定で、検出されないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
約３５−５５％のコラーゲン及び約１０−３０％のエラスチンを含むことを特徴とする細胞外基質（ＥＣＭ）組成物。
【請求項２】
０．１％未満のフィブロネクチンを含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
検出不能な量のラミニンを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
検出不能な量のグリコサミノグリカンを含むことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
０．１％未満のフィブロネクチン、検出不能な量のラミニン、及び検出不能な量のグリコサミノグリカンを含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
約４０−７０％のコラーゲン及び約１５−２５％のエラスチンを含むことを特徴とするＥＣＭ組成物。
【請求項７】
約０．１％未満のフィブロネクチンを含むことを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
約０．１％未満のラミニンを含むことを特徴とする請求項６又は７に記載の組成物。
【請求項９】
約０．１％未満のグリコサミノグリカンを含むことを特徴とする請求項６乃至８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
検出不能な量のサイトカイン、成長因子、又はデオキシコール酸を含むことを特徴とする請求項６乃至９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
約０．１％未満のフィブロネクチンと、約０．１％未満のラミニンと、約０．１％未満のグリコサミノグリカンと、検出不能な量のサイトカイン、成長因子、又はデオキシコール酸と、を含むことを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
約０．１％未満のフィブロネクチンと、約０．１％未満のラミニンと、約０．１％未満のグリコサミノグリカンと、検出不能な量のサイトカイン、成長因子、及びデオキシコール酸と、を含むことを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＥＣＭは胎盤ＥＣＭであることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記胎盤ＥＣＭは、ヒト胎盤ＥＣＭであることを特徴とする請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物はシートとして調製されることを特徴とする請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記シートは約１．５から２．５ｍｍの厚さであることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物は粒子として調製されることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物は流動性基質として調製されることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
約３５−５５％のコラーゲン及び約１０−３０％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物であって、（i）羊膜、絨毛膜、及び臍帯を胎盤から除去するステップと；（ii）残っている胎盤組織を、１Ｍ ＮａＣｌを含む溶液内に入れるステップと；（iii）胎盤組織を均質化するステップと；（iv）２％デオキシコール酸ナトリウムを含む溶液に胎盤組織を接触させるステップと；（v）水で胎盤組織を洗浄するステップと；（vi）１Ｍ 水酸化ナトリウムを含む溶液に胎盤組織を接触させるステップと；（vii）胎盤組織を含む溶液を中性のｐＨとするステップと；（viii）胎盤組織を回収するステップと、を含む方法によって調製されるＥＣＭ組成物。
【請求項２０】
０．１％未満のフィブロネクチンを含むことを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
検出不能な量のラミニンを含むことを特徴とする請求項１９又は２０に記載の組成物。
【請求項２２】
検出不能な量のグリコサミノグリカンを含むことを特徴とする請求項１９乃至２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
０．１％未満のフィブロネクチン、検出不能な量のラミニン、及び検出不能な量のグリコサミノグリカンを含むことを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
約４０−７０％のコラーゲン及び約１５−２５％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物であって、（i）胎盤から絨毛膜を取得するステップと；（ii）絨毛膜を擦り清浄にするステップと；（iii）絨毛膜組織を、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む溶液内に入れるステップと；（iv）２％デオキシコール酸又はデオキシコール酸ナトリウムを含む溶液に絨毛膜を接触させるステップと；（v）絨毛膜を水でリンスするステップと、（vi）すり潰し、凍結乾燥するステップと、を含む方法によって調製されるＥＣＭ組成物。
【請求項２５】
約０．１％未満のフィブロネクチンを含むことを特徴とする請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
約０．１％未満のラミニンを含むことを特徴とする請求項２４又は２５に記載の組成物。
【請求項２７】
約０．１％未満のグリコサミノグリカンを含むことを特徴とする請求項２４乃至２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
検出不能な量のサイトカイン、成長因子、又はデオキシコール酸を含むことを特徴とする請求項２４乃至２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
約０．１％未満のフィブロネクチンと、約０．１％未満のラミニンと、約０．１％未満のグリコサミノグリカンと、検出不能な量のサイトカイン、成長因子、又はデオキシコール酸と、を含むことを特徴とする請求項２４に記載の組成物。
【請求項３０】
約０．１％未満のフィブロネクチンと、約０．１％未満のラミニンと、約０．１％未満のグリコサミノグリカンと、検出不能な量のサイトカイン、成長因子、及びデオキシコール酸と、を含むことを特徴とする請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
約４０−７０％のコラーゲン及び約１５−２５％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物であって、（i）胎盤から絨毛膜を取得するステップと；（ii）絨毛膜を擦り清浄にするステップと；（iii）絨毛膜を、１．０Ｍ ＮａＣｌを含む溶液内に入れるステップと；（iv）０．０５％−０．１％のデオキシコール酸又はデオキシコール酸ナトリウム及び３ｍＭ−５ｍＭのＥＤＴＡを含む第１の洗浄剤溶液に絨毛膜を接触させ、その後水でリンスするステップと；（iv）０．０５％−０．１％のデオキシコール酸又はデオキシコール酸ナトリウムを含む第２の洗浄剤溶液に絨毛膜を接触させ、その後水でリンスするステップと；（v）凍結乾燥するステップと、を含む方法によって調製されるＥＣＭ組成物。
【請求項３２】
約０．１％未満のフィブロネクチンを含むことを特徴とする請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
約０．１％未満のラミニンを含むことを特徴とする請求項３１又は３２に記載の組成物。
【請求項３４】
約０．１％未満のグリコサミノグリカンを含むことを特徴とする請求項３１乃至３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
検出不能な量のサイトカイン、成長因子、又はデオキシコール酸を含むことを特徴とする請求項３１乃至３４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】
約０．１％未満のフィブロネクチンと、約０．１％未満のラミニンと、約０．１％未満のグリコサミノグリカンと、検出不能な量のサイトカイン、成長因子、又はデオキシコール酸と、を含むことを特徴とする請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
約０．１％未満のフィブロネクチンと、約０．１％未満のラミニンと、約０．１％未満のグリコサミノグリカンと、検出不能な量のサイトカイン、成長因子、及びデオキシコール酸と、を含むことを特徴とする請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ＥＣＭは胎盤ＥＣＭであることを特徴とする請求項１９乃至３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記胎盤ＥＣＭは、ヒト胎盤ＥＣＭであることを特徴とする請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記組成物はシートとして調製されることを特徴とする請求項１９乃至３９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記シートは約１．５から２．５ｍｍの厚さであることを特徴とする請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記組成物は粒子として調製されることを特徴とする請求項１９乃至３９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記組成物は流動性基質として調製されることを特徴とする請求項１９乃至３９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
細胞外基質（ＥＣＭ）を必要とする被検体における治療の方法であって、被検体に投与するステップ、又は被検体を請求項１乃至４３のいずれか１項に記載の組成物に接触させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
前記被検体が口腔病変を有することを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記被検体が尿失禁を有することを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記被検体が膀胱尿管逆流症を有することを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記被検体が胃食道逆流症を有することを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記被検体が１つ又は両側の声帯及び／又は喉頭に影響する疾患、障害又は異常状態を有することを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記被検体が声門の機能不全を有することを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＥＣＭは、神経ガイドとして用いられることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＥＣＭは、腱ラップとして用いられることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＥＣＭは、硬膜の代用として用いられることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項５４】
前記被検体が美容上の欠陥を有することを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項５５】
前記美容上の欠陥は、リンクル、陥没、クリース、妊娠線、瘢痕、窪んだ目、又は結果として目の周りのクマとなる可視血管であることを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１４年８月２５日に出願された米国特許出願第６２/０４１４６８号に基づく優先権の利益を主張する。当該出願の内容は、その全体が参照されることで本願明細書に包含されている。
【０００２】
１．技術分野
本明細書において、細胞外基質（細胞外マトリクス）（ＥＣＭ）組成物及びＥＣＭ組成物の製造方法が開示される。また、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物の使用について、本明細書に開示される。
【背景技術】
【０００３】
２．背景技術
細胞外基質（ＥＣＭ）は、腱、靱帯、及び皮膚や内臓器官を支えるシート（sheets）を含む体の様々な構造を形成するタンパク質を含む。当該技術分野において、今なお新たな改良されたＥＣＭ組成物及びそのようなＥＣＭ組成物を作る方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
３．概要
１つの態様において、本明細書が開示するものは、例えばヒトの胎盤組織などの胎盤組織を用いて調製された細胞外基質（ＥＣＭ）の組成物である。
【０００５】
いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるＥＣＭ組成物は、約３０％から約６０％のコラーゲン及び約１０％から３５％のエラスチンを含む。加えて、そのようなＥＣＭ組成物は、（i）例えばエライザ法（ＥＬＩＳＡ）によって測定される、極めて少量のフィブロネクチン（例えば、０．１％未満のフィブロネクチン）、（ii）例えばエライザ法による測定で、検出されないか又は検出不能な量のラミニン、及び／又は例えばエライザ法による測定で、検出されないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。
【０００６】
いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるＥＣＭ組成物は、約３０％から約７２％のコラーゲン及び約１０％から３５％のエラスチンを含む。加えて、そのようなＥＣＭ組成物は、（i）例えばエライザ法によって測定される、極めて少量のフィブロネクチン（例えば、０．１％未満のフィブロネクチン）、（ii）例えばエライザ法によって測定されるラミニン（例えば、０．１％未満のラミニン）、例えばエライザ法によって測定されるグリコサミノグリカン（例えば、０．１％未満のグリコサミノグリカン）、（iii）検出されないか又は検出不能な量のサイトカイン、（iv）検出されないか又は検出不能な量の成長因子、及び／又は（v）検出されないか又は検出不能な量のデオキシコール酸を含み得る。
【０００７】
本明細書において開示されるＥＣＭ組成物は、治療学的／医学的利用に適した特性を有する。特に、本明細書において開示されるＥＣＭ組成物は、無菌（sterile）で、無細胞（例えば、≧９９％無細胞（細胞フリー））であり、かつ／又は細胞残屑を含まない（free of cellular debris）(例えば、≧９９％細胞残屑を含まない（細胞残屑フリー）)。特定の実施形態において、本明細書において開示されるＥＣＭ組成物は、サイトカインを含まないか又は例えばエライザ法による測定で検出不能な量のサイトカインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書においてさらに開示されるＥＣＭ組成物は、試薬の残渣を欠いている。すなわち、最終的なＥＣＭ組成物は、当該組成物の製造において用いられる検出不能な量の試薬を含む。さらに、特定の実施形態において、本明細書において開示されるＥＣＭ組成物は、極少量の核酸（例えば乾燥品で、〜４１−１７１ｎｇ／ｍｇ）及びエンドトキシン（例えば、＜０．２５ＥＵ）を含む。
【０００８】
本明細書において開示されるＥＣＭ組成物の他の有利な特性は、その吸水性である。いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるＥＣＭ組成物は、自重の１５０％−２２５％の水を吸収する。そのような特性は、例えば、本明細書において開示されるＥＣＭ組成物の創傷治療への適用において有利である。
【０００９】
本明細書において開示される特定の実施形態は、約３５−５５％のコラーゲン及び約１０−３０％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。特定の実施形態において、前記組成物は約３４−５３％のコラーゲン及び約１３−２９％のエラスチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、例えばヒトの胎盤組織などの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、例えばヒト胎盤（human placenta）由来の絨毛膜などの胎盤の絨毛膜から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。
【００１０】
本明細書において開示される特定の実施形態は、約３５−７２％のコラーゲン及び約１５−２５％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。本明細書において開示される他の特定の実施形態は、約４０−７０％のコラーゲン及び約１５−２５％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。他の特定の実施形態において、前記組成物は、４０−７０％のコラーゲン及び１５−２２％のエラスチンを含む。他の特定の実施形態において、前記組成物は、４３−６８％のコラーゲン及び１８−２１％のエラスチンを含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０５％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、０．００１％未満のフィブロネクチン、０．００１から０．１％のフィブロネクチン、０．００１から０．０５％のフィブロネクチン、０．００１から０．０１％のフィブロネクチン、０．０１から０．１％のフィブロネクチン、又は０．０１から０．０５％のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はラミニンを含み、例えば、０．１％未満のラミニン、０．０５％未満のラミニン、０．０１％未満のラミニン、０．００１％未満のラミニン、０．００１から０．１％のラミニン、０．００１から０．０５％のラミニン、０．００１から０．０１％のラミニン、０．０１から０．１％のラミニン、又は０．０１から０．０５％のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含み、例えば、０．１％未満のグリコサミノグリカン、０．０５％未満のグリコサミノグリカン、０．０１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１から０．１％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０５％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０１％のグリコサミノグリカン、０．０１から０．１％のグリコサミノグリカン、又は０．０１から０．０５％のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、サイトカイン、成長因子及び／又はデオキシコール酸を含まないか又は検出不能な量のサイトカイン、成長因子及び／又はデオキシコール酸を含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、フィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０５％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、０．００１％未満のフィブロネクチン、０．００１から０．１％のフィブロネクチン、０．００１から０．０５％のフィブロネクチン、０．００１から０．０１％のフィブロネクチン、０．０１から０．１％のフィブロネクチン、又は０．０１から０．０５％のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含み、例えば、０．１％未満のラミニン、０．０５％未満のラミニン、０．０１％未満のラミニン、０．００１％未満のラミニン、０．００１から０．１％のラミニン、０．００１から０．０５％のラミニン、０．００１から０．０１％のラミニン、０．０１から０．１％のラミニン、又は０．０１から０．０５％のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含み、例えば、０．１％未満のグリコサミノグリカン、０．０５％未満のグリコサミノグリカン、０．０１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１から０．１％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０５％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０１％のグリコサミノグリカン、０．０１から０．１％のグリコサミノグリカン、又は０．０１から０．０５％のグリコサミノグリカンを含み、加えて、サイトカイン、成長因子及び／又はデオキシコール酸を含まないか又は検出不能な量のサイトカイン、成長因子及び／又はデオキシコール酸を含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、例えばヒトの胎盤組織などの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤の絨毛膜、例えば胎盤の絨毛膜板から得られる。当該絨毛膜は、例えばヒト胎盤由来の絨毛膜板等である。
【００１１】
本明細書において開示される他の特定の実施形態は、約５０−６０％のコラーゲン及び約１０−２０％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤組織、例えば、ヒトの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤の絨毛膜、例えば、ヒト胎盤由来の絨毛膜から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。
【００１２】
本明細書において開示される他の特定の実施形態は、約４５−５５％のコラーゲン及び約１５−２５％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤組織、例えば、ヒトの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤の絨毛膜、例えば、ヒト胎盤由来の絨毛膜から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。
【００１３】
本明細書において開示される他の特定の実施形態は、約４０−５０％のコラーゲン及び約２０−３０％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤組織、例えば、ヒトの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤の絨毛膜、例えば、ヒト胎盤由来の絨毛膜から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。
【００１４】
本明細書において開示される他の特定の実施形態は、約３０−４０％のコラーゲン及び約２５−３５％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤組織、例えば、ヒトの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤の絨毛膜、例えば、ヒト胎盤由来の絨毛膜から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。
【００１５】
本明細書において開示される他の特定の実施形態は、約３４−４３％のコラーゲン及び約１６−２４％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤組織、例えば、ヒトの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤の絨毛膜、例えば、ヒト胎盤由来の絨毛膜から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。
【００１６】
本明細書において開示される他の特定の実施形態は、約３７−４２％のコラーゲン及び約１６−２４％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤組織、例えば、ヒトの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤の絨毛膜、例えば、ヒト胎盤由来の絨毛膜から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。
【００１７】
本明細書において開示される他の特定の実施形態は、約３０−７０％、３０−６０％、３０−５０％、３０−４０％、３０−３５％、３４−４３％、３５−７２％、３５−４０％、３７−４２％、４０−７０％、４０−６０％、４０−５０％、４０−４５％、４０−６５％、４３−６８％、４５−５０％、５０−５５％、又は５５−６０％のコラーゲン及び約１０−３０％、１０−２０％、１０−１５％、１５−２５％、１５−２２％、１５−２０％、１６−２４％、１７−２４％、１８−２１％、１８−２０％、２０−２４％、２０−３０％、２０−２５％、２５−３０％、又は３０−３５％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤組織、例えば、ヒトの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤の絨毛膜、例えば胎盤の絨毛膜板から得られる。当該絨毛膜は、例えばヒト胎盤由来の絨毛膜板等である。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０５％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、０．００１から０．１％のフィブロネクチン、０．００１から０．０５％のフィブロネクチン、０．００１から０．０１％のフィブロネクチン、０．０１から０．１％のフィブロネクチン、又は０．０１から０．０５％のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のラミニンを含み、例えば、０．１％未満のラミニン、０．０５％未満のラミニン、０．０１％未満のラミニン、又は０．００１％未満のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はラミニンを含み、例えば、０．００１から０．１％のラミニン、０．００１から０．０５％のラミニン、０．００１から０．０１％のラミニン、０．０１から０．１％のラミニン、又は０．０１から０．０５％のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のグリコサミノグリカンを含み、例えば、０．１％未満のグリコサミノグリカン、０．０５％未満のグリコサミノグリカン、０．０１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１％未満のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はグリコサミノグリカンを含み、例えば、０．００１から０．１％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０５％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０１％のグリコサミノグリカン、０．０１から０．１％のグリコサミノグリカン、又は０．０１から０．０５％のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０５％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、０．００１％未満のフィブロネクチン、０．００１から０．１％のフィブロネクチン、０．００１から０．０５％のフィブロネクチン、０．００１から０．０１％のフィブロネクチン、０．０１から０．１％のフィブロネクチン、又は０．０１から０．０５％のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含み、例えば、０．１％未満のラミニン、０．０５％未満のラミニン、０．０１％未満のラミニン、０．００１％未満のラミニン、０．００１から０．１％のラミニン、０．００１から０．０５％のラミニン、０．００１から０．０１％のラミニン、０．０１から０．１％のラミニン、又は０．０１から０．０５％のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含み、例えば、０．１％未満のグリコサミノグリカン、０．０５％未満のグリコサミノグリカン、０．０１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１から０．１％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０５％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０１％のグリコサミノグリカン、０．０１から０．１％のグリコサミノグリカン、又は０．０１から０．０５％のグリコサミノグリカンを含み、加えて、サイトカイン、成長因子及び／又はデオキシコール酸を含まないか又は検出不能な量のサイトカイン、成長因子及び／又はデオキシコール酸を含む。
【００１８】
本明細書において開示される他の特定の実施形態は、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％又は約７２％のコラーゲン、及び約１０％、約１５％、約１８％、約２０％、約２５％、約３０％又は約３５％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤組織、例えば、ヒトの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤の絨毛膜、例えば胎盤の絨毛膜板から得られる。当該絨毛膜は、例えばヒト胎盤由来の絨毛膜板等である。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０５％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、０．００１から０．１％のフィブロネクチン、０．００１から０．０５％のフィブロネクチン、０．００１から０．０１％のフィブロネクチン、０．０１から０．１％のフィブロネクチン、又は０．０１から０．０５％のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のラミニンを含み、例えば、０．１％未満のラミニン、０．０５％未満のラミニン、０．０１％未満のラミニン、又は０．００１％未満のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はラミニンを含み、例えば、０．００１から０．１％のラミニン、０．００１から０．０５％のラミニン、０．００１から０．０１％のラミニン、０．０１から０．１％のラミニン、又は０．０１から０．０５％のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のグリコサミノグリカンを含み、例えば、０．１％未満のグリコサミノグリカン、０．０５％未満のグリコサミノグリカン、０．０１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１％未満のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はグリコサミノグリカンを含み、例えば、０．００１から０．１％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０５％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０１％のグリコサミノグリカン、０．０１から０．１％のグリコサミノグリカン、又は０．０１から０．０５％のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０５％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、０．００１％未満のフィブロネクチン、０．００１から０．１％のフィブロネクチン、０．００１から０．０５％のフィブロネクチン、０．００１から０．０１％のフィブロネクチン、０．０１から０．１％のフィブロネクチン、又は０．０１から０．０５％のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含み、例えば、０．１％未満のラミニン、０．０５％未満のラミニン、０．０１％未満のラミニン、０．００１％未満のラミニン、０．００１から０．１％のラミニン、０．００１から０．０５％のラミニン、０．００１から０．０１％のラミニン、０．０１から０．１％のラミニン、又は０．０１から０．０５％のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含み、例えば、０．１％未満のグリコサミノグリカン、０．０５％未満のグリコサミノグリカン、０．０１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１から０．１％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０５％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０１％のグリコサミノグリカン、０．０１から０．１％のグリコサミノグリカン、又は０．０１から０．０５％のグリコサミノグリカンを含み、加えて、サイトカイン、成長因子及び／又はデオキシコール酸を含まないか又は検出不能な量のサイトカイン、成長因子及び／又はデオキシコール酸を含む。
【００１９】
本明細書において開示される他の特定の実施形態は、コラーゲンを約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、又は７２％含み、エラスチンを約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、又は３５％含むＥＣＭ組成物である。特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤組織、例えば、ヒトの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤の絨毛膜、例えば胎盤の絨毛膜板から得られる。当該絨毛膜は、例えばヒト胎盤由来の絨毛膜板等である。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０５％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、０．００１から０．１％のフィブロネクチン、０．００１から０．０５％のフィブロネクチン、０．００１から０．０１％のフィブロネクチン、０．０１から０．１％のフィブロネクチン、又は０．０１から０．０５％のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のラミニンを含み、例えば、０．１％未満のラミニン、０．０５％未満のラミニン、０．０１％未満のラミニン、又は０．００１％未満のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はラミニンを含み、例えば、０．００１から０．１％のラミニン、０．００１から０．０５％のラミニン、０．００１から０．０１％のラミニン、０．０１から０．１％のラミニン、又は０．０１から０．０５％のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のグリコサミノグリカンを含み、例えば、０．１％未満のグリコサミノグリカン、０．０５％未満のグリコサミノグリカン、０．０１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１％未満のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はグリコサミノグリカンを含み、例えば、０．００１から０．１％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０５％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０１％のグリコサミノグリカン、０．０１から０．１％のグリコサミノグリカン、又は０．０１から０．０５％のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０５％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、０．００１％未満のフィブロネクチン、０．００１から０．１％のフィブロネクチン、０．００１から０．０５％のフィブロネクチン、０．００１から０．０１％のフィブロネクチン、０．０１から０．１％のフィブロネクチン、又は０．０１から０．０５％のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含み、例えば、０．１％未満のラミニン、０．０５％未満のラミニン、０．０１％未満のラミニン、０．００１％未満のラミニン、０．００１から０．１％のラミニン、０．００１から０．０５％のラミニン、０．００１から０．０１％のラミニン、０．０１から０．１％のラミニン、又は０．０１から０．０５％のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含み、例えば、０．１％未満のグリコサミノグリカン、０．０５％未満のグリコサミノグリカン、０．０１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１から０．１％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０５％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０１％のグリコサミノグリカン、０．０１から０．１％のグリコサミノグリカン、又は０．０１から０．０５％のグリコサミノグリカンを含み、加えて、サイトカイン、成長因子及び／又はデオキシコール酸を含まないか又は検出不能な量のサイトカイン、成長因子及び／又はデオキシコール酸を含む。
【００２０】
本明細書において開示されるＥＣＭ組成物は、多様な方法によって調製され得る。調製物の種類は、例えば目的とされるＥＣＭ組成物の用途に基づいて選択され得る。本明細書において開示されるＥＣＭ組成物の調製物の具体例は、４.１.１節に詳述されている。特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、流動性を有する基質として調製される。例えば、当該ＥＣＭ組成物は、シリンジを用いて投与され得る形態で調製される。他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、粒子として調製される。例えば、当該ＥＣＭ組成物は、粉末の形態で調製される。他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、シートとして調製される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、ＥＣＭ組成物ではない１つ以上の成分を含んで調製される。４.１.１.１節を参照されたい。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるものは、本明細書に開示される少なくとも１つのＥＣＭシートを含むラミネート（laminates）である。特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、２つのＥＣＭシートを含むラミネートである。特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、少なくとも１つの本明細書に開示されるＥＣＭシート及び少なくとも１つの他の平面状の脱細胞された組織（例えば、脱細胞された／脱水された羊膜、又は完全に脱細胞され若しくは線維芽細胞層を維持するように脱細胞された組織）を含む、又は代わりに平面状の人工組織を有するラミネートである。いくつかの実施形態において、ラミネートは、複数のＥＣＭシート、又は１つ以上のＥＣＭシート及び他の平面状の脱細胞された組織を、例えばニカワ（glue）（例えば天然のニカワ、例えばフィブロネクチン、フィブリン、又は合成ニカワ）などの接着材の存在下で互いに接触させて配置することによって生成され得る。いくつかの実施形態において、ラミネートは、２つ以上のＥＣＭシートを共に、又は１つ以上のＥＣＭシート及び１つ以上の平面状の脱細胞された組織を共に加熱乾燥することによって生成され得る。
【００２２】
本明細書において開示されるＥＣＭ組成物には、１つ以上の種類の細胞が播種され、かつ／又は含まれ得る。すなわち、細胞は、本明細書に記載されたＥＣＭ組成物を培地として培養されて当該ＥＣＭ組成物上で成長し得、又は本明細書に記載されたＥＣＭ組成物の中に分散され得る（例えば、ＥＣＭの流動性のある基質組成物に加えられる）。当業者は、当該技術分野において周知の、幹細胞及び非幹細胞の両方を含むあらゆる種類の細胞が、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物に播種され、かつ／又は培養され得ることを十分に理解するであろう。本明細書に開示されるＥＣＭ組成物上に播種され得る細胞の種類の限定的ではない列挙が、４.１.２節に開示されている。
【００２３】
他の態様において、本明細書に開示されるものは、本明細書に記載されたＥＣＭ組成物を作る方法である。４.２節を参照されたい。いくつかの実施形態において、ＥＣＭ組成物を本明細書に開示される胎盤（例えば、ヒト胎盤）から作る方法は、次のようなステップを順に含む：（i）羊膜、絨毛膜、及び臍帯を胎盤から（例えば、出産直後の母体から得られた胎盤から、又は保存された胎盤から）除去するステップと、（ii）胎盤組織に結合された細胞の浸透圧崩壊（osmotic disruption）を引き起こす溶液に、胎盤組織をさらすステップと、（iii）洗浄剤を含む溶液に胎盤を接触させるステップと、（iv）塩基を含む溶液に胎盤を接触させるステップ。いくつかの実施形態において、ＥＣＭ組成物を胎盤から作る方法であって、胎盤（例えば、ヒト胎盤）の絨毛膜を用いる方法は、次のようなステップを順に含む：（i）胎盤から（例えば、出産直後の母体から得られた胎盤から、又は保存された胎盤から）絨毛膜を取得するステップと、（ii）絨毛膜に結合された細胞の浸透圧崩壊を引き起こす溶液に、絨毛膜をさらすステップと、（iii）洗浄剤を含む溶液に絨毛膜を接触させるステップと、（iv）塩基を含む溶液に絨毛膜を接触させるステップ。いくつかの実施形態において、ＥＣＭ組成物を胎盤から作る方法であって、胎盤（例えば、ヒト胎盤）の絨毛膜を用いる方法は、次のようなステップを順に含む：（i）胎盤から（例えば、出産直後の母体から得られた胎盤から、又は保存された胎盤から）絨毛膜を取得するステップと、（ii）絨毛膜を擦り（scraping）、清浄にするステップと、（iii）絨毛膜に結合された細胞の浸透圧崩壊を引き起こす溶液に、絨毛膜をさらすステップと、（iv）洗浄剤を含む溶液に絨毛膜を接触させるステップと、（v）すり潰し（grinding）、凍結乾燥するステップ。いくつかの実施形態において、ＥＣＭ組成物を胎盤から作る方法であって、胎盤（例えば、ヒト胎盤）の絨毛膜を用いる方法は、次のようなステップを順に含む：（i）胎盤から（例えば、出産直後の母体から得られた胎盤から、又は保存された胎盤から）絨毛膜を取得するステップと、（ii）絨毛膜を擦り、清浄にするステップと、（iii）絨毛膜に結合された細胞の浸透圧崩壊を引き起こす溶液に、絨毛膜をさらすステップと、（iv）第１の洗浄剤溶液を含む溶液、次に第２の洗浄剤溶液を含む溶液に絨毛膜を接触させるステップであって、前記溶液は洗浄剤及び例えばＥＤＴＡなどのキレート剤を含むステップと、（v）凍結乾燥するステップ。本明細書に開示されたＥＣＭ組成物を作る方法は、例えば塩基、洗浄剤、キレート剤などの成分を、本明細書に開示された特別な特徴を有するＥＣＭ組成物を生成する結果となる量で用いる。
【００２４】
本明細書に開示されたＥＣＭ組成物を作る方法は、例えば塩基、洗浄剤などの成分を、本明細書に開示された特別な特徴を有するＥＣＭ組成物を生成する結果となる量で用いる。
【００２５】
本明細書に開示される特定の実施形態において、ＥＣＭ組成物を作る方法は、（i）羊膜、絨毛膜、及び臍帯を胎盤から（例えば、出産直後の母体から得られた胎盤から、又は保存された胎盤から）除去するステップと、（ii）残っている胎盤組織を、例えば塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、例えば、１Ｍ ＮａＣｌ）などの、当該胎盤組織に結合された細胞の浸透圧崩壊を引き起こす溶液内に入れ（placing）て、均質化する（ホモジナイズする）（homogenizing）ステップと、（iii）例えばデオキシコール酸ナトリウム（例えば、２％デオキシコール酸ナトリウム）などの洗浄剤を含む溶液に胎盤組織を接触させるステップと、（iv）例えば水などで胎盤組織を洗浄するステップと、（v）例えば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ、例えば、１Ｍ ＮａＯＨ）などの塩基を含む溶液に胎盤組織を接触させるステップと、（vi）例えば塩酸（ＨＣｌ）などの酸性溶液を、胎盤組織を含む溶液に加えて中性のｐＨ又は中性に近いｐＨ（例えば、ｐＨ６．０−８．０）とするステップと、（vii）胎盤組織を当該溶液の液体部分から分離し（例えば、遠心分離によって）、当該胎盤組織を回収するステップと、を含み、これによってＥＣＭ組成物を作る。当該方法によって生成するＥＣＭ組成物は、通常、ペースト状（ＥＣＭペースト）であり、後で使用するために回収後に冷凍されて、保管され得るか、又は回収後直ちに本明細書に記載されたＥＣＭ調製物（formulation）、例えば、ＥＣＭシートの調製物、ＥＣＭ粒子の調製物、又はＥＣＭ流動性基質などの製造に使用され得る。
【００２６】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、ＥＣＭ組成物を作る方法であって、前記方法は、（i）胎盤から（例えば、出産直後の母体から得られた胎盤から、又は保存された胎盤から）絨毛膜を取得するステップと、（ii）絨毛膜組織を、例えば塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、例えば、１Ｍ ＮａＣｌ）などの、当該絨毛膜組織に結合された細胞の浸透圧崩壊を引き起こす溶液内に入れて、当該絨毛膜組織を均質化するステップと、（iii）例えばデオキシコール酸ナトリウム（例えば、２％デオキシコール酸ナトリウム）などの洗浄剤を含む溶液に絨毛膜組織を接触させるステップと、（iv）例えば水などで絨毛膜組織を洗浄するステップと、（v）例えば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ、例えば、１Ｍ ＮａＯＨ）などの塩基を含む溶液に絨毛膜組織を接触させるステップと、（vi）例えば塩酸（ＨＣｌ）などの酸性溶液を、絨毛膜組織を含む溶液に加えて中性のｐＨ又は中性に近いｐＨ（例えば、ｐＨ６．０−８．０）とするステップと、（vii）絨毛膜組織を当該溶液の液体部分から分離し（例えば、遠心分離によって）、当該絨毛膜組織を回収するステップと、を含み、これによってＥＣＭ組成物を作る。当該方法によって生成するＥＣＭ組成物は、通常、ペースト状（ＥＣＭペースト）であり、後で使用するために回収後に冷凍され、保管され得るか、又は回収後直ちに本明細書に記載されたＥＣＭ調製物、例えば、ＥＣＭシートの調製物、ＥＣＭ粒子の調製物、又はＥＣＭ流動性基質などの製造に使用され得る。
【００２７】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、ＥＣＭ組成物を作る方法であって、前記方法は、（i）絨毛膜、例えば絨毛膜板を胎盤から（例えば、出産直後の母体から得られた胎盤から、又は保存された胎盤から）取得するステップと、（ii）絨毛膜を擦り、清浄にするステップと、（iii）絨毛膜組織を、例えば塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、例えば、０．５Ｍ ＮａＣｌ）などの、当該絨毛膜組織に結合された細胞の浸透圧崩壊を引き起こす溶液内に入れるステップと、（iv）例えばデオキシコール酸又はデオキシコール酸ナトリウム（例えば、２％デオキシコール酸又はデオキシコール酸ナトリウム）などの洗浄剤を含む溶液に絨毛膜組織を接触させ、そして例えば水によってすすぐ（リンスする）（rinsing）などのリンスするステップと、（v）すり潰し、凍結乾燥するステップと、を含む。当該ＥＣＭ組成物は、通常、ペースト（ＥＣＭペースト）であり、例えば、粉砕されて調製され、様々な形状又は形態で調製され得る。例えば、当該ＥＣＭ組成物は、ＥＣＭシート、ＥＣＭ粒子の調製物、又はＥＣＭ流動性基質などに調製され得る。
【００２８】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、ＥＣＭ組成物を作る方法であって、前記方法は、（i）絨毛膜、例えば絨毛膜板を胎盤から（例えば、出産直後の母体から得られた胎盤から、又は保存された胎盤から）取得するステップと、（ii）絨毛膜を擦り、清浄にするステップと、（iii）絨毛膜組織を、例えば塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、例えば、１．０Ｍ ＮａＣｌ）などの、当該絨毛膜組織に結合された細胞の浸透圧崩壊を引き起こす溶液内に入れるステップと、（iv）例えばデオキシコール酸又はデオキシコール酸ナトリウム（例えば、０．０５％−０．２％又は０．３％−０．６％のデオキシコール酸又はデオキシコール酸ナトリウム）などの洗浄剤及びＥＤＴＡ（例えば、１−５ｍＭ ＥＤＴＡ又は５−１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を含む第１の洗浄剤溶液に絨毛膜組織を接触させるステップと、（v）例えばデオキシコール酸又はデオキシコール酸ナトリウム（例えば、０．０５％−０．２％又は０．３％−０．６％のデオキシコール酸又はデオキシコール酸ナトリウム）などの洗浄剤及びＥＤＴＡ（例えば、１−５ｍＭ ＥＤＴＡ又は５−１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を含む第２の洗浄剤溶液に絨毛膜組織を接触させ、そして例えば水などによってリンスするステップと、（vi）凍結乾燥し、脱細胞され凍結乾燥された、全絨毛膜を得るステップと、を含む。当該全絨毛膜は、例えば、粉砕されて溶液（例えば、水又はリン酸緩衝生理食塩水）中に再懸濁されて調製され得、脱細胞されたＥＣＭペーストを形成し得る。そして、例えばＥＣＭシート、ＥＣＭ粒子の調製物、又はＥＣＭ流動性基質などの様々な形状又は形態に調製され得る。
【００２９】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、ＥＣＭシートを生成する方法であって、前記方法は、（i）本明細書に開示される方法に従ってＥＣＭペーストを準備するステップと、（ii）ＥＣＭペーストを例えば水中に懸濁し、例えばＥＣＭを型に入れるなど、シートを形成するために適した基板に当該懸濁されたＥＣＭ溶液を入れるステップと、（iii）ＥＣＭを凍結させるステップと、（iv）凍結したＥＣＭを凍結乾燥させるステップと、（v）凍結乾燥されたＥＣＭを基板から取り外して水に浸すステップと、（vi）例えば真空乾燥機を用いて、ＥＣＭを乾燥させるステップと、を含む。
【００３０】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、ＥＣＭ粒子を生成する方法であって、前記方法は、（i）本明細書に開示される方法に従ってＥＣＭペーストを準備するステップと、（ii）ＥＣＭペーストを例えば水中に、懸濁するステップと、（iii）ＥＣＭを凍結させるステップと、（iv）凍結したＥＣＭを凍結乾燥させるステップと、（v）凍結乾燥されたＥＣＭを粉砕するステップと、を含む。
【００３１】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、ＥＣＭ流動性基質を生成する方法であって、前記方法は、（i）本明細書に開示される方法に従ってＥＣＭペーストを準備するステップと、（ii）ＥＣＭペーストを例えば水中に、懸濁するステップと、（iii）ＥＣＭを凍結させるステップと、（iv）凍結したＥＣＭを凍結乾燥させるステップと、（v）冷凍乾燥されたＥＣＭを微粉末化するステップと、を含む。微粉末化されたＥＣＭを例えば生理食塩水などに再懸濁することで、ＥＣＭ流動性基質が生成される。
【００３２】
他の態様において、本明細書に開示されるものは、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物の用途である。４.３章を参照されたい。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、治療学的／医学的な目的で利用される。４.３.１節を参照されたい。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、美容の目的で利用される。４.３.２節を参照されたい。
【００３３】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、創傷の治療及び／又は管理において使用される。４.３.１節を参照されたい。特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、傷を埋めるために、すなわち、創傷充填剤（wound filler）として使用される。他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、例えば火傷による傷などの傷を手当てする（dress）（例えば、被覆する（cover））ために使用される。
【００３４】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、例えば歯の欠陥を修復するなど、歯の状態の治療及び／又は管理において使用される。４.３.２節を参照されたい。
【００３５】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、口腔病変（oral lesions）の治療及び／又は管理において使用される。４．３．３節を参照されたい。
【００３６】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、被検体の体の空隙（void）をシール（seal）するため、充填するため、及び／又は他の処置をするために使用される。４．３．４節を参照されたい。
【００３７】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、被検体における組織バルキング（tissue bulking）に使用される。４．３．５節を参照されたい。
【００３８】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、被検体における尿失禁の治療に使用される。４．３．６節を参照されたい。
【００３９】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、被検体における膀胱尿管逆流症の治療に使用される。４．３．７節を参照されたい。
【００４０】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、被検体における胃食道逆流症の治療に使用される。４．３．８節を参照されたい。
【００４１】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、被検体における１つ又は両側の声帯及び／又は喉頭に影響する疾患、障害又は他の異常状態の治療に使用される。４．３．９節を参照されたい。
【００４２】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、被検体における声門の機能不全（glottic incompetence）の管理又は治療に使用される。４．３．１０節を参照されたい。
【００４３】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、組織又は器官のバイオエンジニアリング（bioengineering）に使用される。４．３．１１節を参照されたい。
【００４４】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、美容の目的、例えば、美容目的での被検体の皮膚の増強（augment）、（例えば、被検体がより若々しく見えるようにすること）に使用される。４．３．１２節を参照されたい。
【００４５】
他の態様において、本明細書に開示されるものは、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を含むキット（kit）である。本明細書に開示されるキットは、通常、当業者である施術者への配布に便利な容器に入れられた、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を含む。５章を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
３．１図面の簡単な説明
【図１】図１Ａから図１Ｆ：アルビノのニュージーランドホワイトラビットに移植された後の、ブタ膀胱基質（porcine urinary bladder matrix）に対する組織の反応性と比較した際の本明細書に記載された方法に従って調製されたＥＣＭシートに対する組織の反応性を示している。移植後第１週では、膀胱組織（urinary bladder matrix）（ UBM）シートに近接する組織は粒状化及び炎症反応の明瞭な兆候を示しているのに対して（図１Ａ）、ＥＣＭシート近傍の組織は、顆粒球の僅かな浸透に伴って散在した筋組織を示している（図１Ｂ）。第２週及び第４週では、ＵＢＭシート近傍で粒状化がさらに顕著であるのに対して（図１Ｃ及び図１Ｅ）、ＥＣＭシート近傍の組織は、実質的に粒状化が無く、正常に見える（図１Ｄ及び図１Ｆ）。
【図２】図２Ａから図２Ｆ：アルビノのニュージーランドホワイトラビットに移植された後の、ＭＡＴＲＩＳＴＥＭ ＭＩＣＲＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）に対する組織の反応性と比較した際の本明細書に記載された方法に従って調製されたＥＣＭ粒子に対する組織の反応性を示している。移植後第１週では、ＥＣＭ粒子は、炎症を示すいくらかの粒状化を示しているが（図２Ｂ）、その程度はＵＢＭ粒子よりも著しく小さい（図２Ａ）。第２週及び第４週では、ＥＣＭ粒子は粒状化の著しい減少を示しており（図２Ｄ及び図２Ｆ）、これと比較してＵＢＭ粒子は、第２週及び第４週で実質的な炎症を示している（図２Ｃ及び図２Ｅ）。
【図３】図３Ａから図３Ｆ：アルビノのニュージーランドホワイトラビットに移植された後の、ウシ由来の（bovine derived）創傷基質製品（wound matrix product）（ＩＮＴＥＧＲＡ(商標)Ｆｌｏｗａｂｌｅ）に対する組織の反応性と比較した際の本明細書に記載された方法に従って調製されたＥＣＭ流動性基質に対する組織の反応性を示している。ウシ由来の創傷基質製品（ＩＮＴＥＧＲＡ(商標)Ｆｌｏｗａｂｌｅ）は、第１週で粒状化を示し（図３Ａ）、続いて第２週及び第４週で瘢痕化している（図３Ｃ及び図３Ｅの明るい領域）。一方で、ＥＣＭ流動性基質は、実質的に最初の週にのみ炎症反応を示し（図３Ｂ）、続いて、第２週及び第４週では殆ど完全に回復している（図３Ｄ及び図３Ｆ）。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
４．発明の詳細な説明
本明細書において、細胞外基質（ＥＣＭ）組成物（４．１参照）及び細胞外基質（ＥＣＭ）組成物を製造する方法（４．２参照）が開示される。また、本明細書において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物の用途（４．３参照）及び本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を含むキット（kit）が開示される（５章参照）。
【００４８】
４．１．細胞外基質組成物
１つの態様において、本明細書に開示されるものは、胎盤組織（例えば、ヒト胎盤組織）を用いて調製される細胞外基質（ＥＣＭ）組成物である。本明細書に記載されたＥＣＭ組成物は、例えばコラーゲン及びエラスチンなどのＥＣＭ成分を、当該技術分野において周知のＥＣＭ組成物中の量とは異なる量で含む。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、約３０％から６０％のコラーゲン及び約１０％から約３５％のエラスチンを含む。本明細書において使用される「約」の用語は、特定の数字について１０％多いか又は少ない量を示す。加えて、そのような本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、（i）例えばエライザ法（ＥＬＩＳＡ）によって測定される、極めて少量のフィブロネクチン（例えば、０．１％未満のフィブロネクチン）、（ii）例えばエライザ法による測定で、検出されないか又は検出不能な量のラミニン、及び／又は例えばエライザ法による測定で、検出されないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。
【００５０】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、約３０％から７２％のコラーゲン及び約１０％から約３５％のエラスチンを含む。加えて、そのようなＥＣＭ組成物は、（i）例えばＥＬＩＳＡ（エライザ法）によって測定される、極めて少量のフィブロネクチン（例えば、０．１％未満のフィブロネクチン）、（ii）例えばエライザ法によって測定されるラミニン（例えば、０．１％未満のラミニン）、例えばエライザ法によって測定されるグリコサミノグリカン（例えば、０．１％未満のグリコサミノグリカン）、（iii）検出されないか又は検出不能な量のサイトカイン、（iv）検出されないか又は検出不能な量の成長因子、及び／又は（v）検出されないか又は検出不能な量のデオキシコール酸を含み得る。
【００５１】
本明細書において開示されるＥＣＭ組成物は、治療学的／医学的利用に適した特性を有する。特に、本明細書において開示されるＥＣＭ組成物は、無菌で、無細胞（例えば、≧９９％無細胞）であり、及び／又は細胞残屑を含まない（free of cellular debris）(例えば、≧９９％細胞残屑を含まない)。特定の実施形態において、本明細書において開示されるＥＣＭ組成物は、サイトカインを含まないか又は例えばエライザ法による測定で検出不能な量のサイトカインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書においてさらに開示されるＥＣＭ組成物は、試薬の残渣を欠いている。すなわち、最終的なＥＣＭ組成物は、検出不能な量の、当該組成物の製造において用いられる試薬を含む。さらに、特定の実施形態において、本明細書において開示されるＥＣＭ組成物は、極少量の核酸（例えば乾燥品で、〜４１−１７１ｎｇ／ｍｇ）及びエンドトキシン（例えば、＜０．２５ＥＵ）を含む。
【００５２】
本明細書において開示されるＥＣＭ組成物の他の有利な特性は、その吸水性である。いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるＥＣＭ組成物は、自重の１５０％−２２５％の水を吸収する。
【００５３】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は約３４−５３％のコラーゲン及び約１３−２９％のエラスチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、例えばヒトの胎盤組織などの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、例えばヒト胎盤由来の絨毛膜などの胎盤の絨毛膜から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。
【００５４】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は約３５−５５％のコラーゲン及び約１０−３０％のエラスチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、例えばヒトの胎盤組織などの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、例えばヒト胎盤由来の絨毛膜などの胎盤の絨毛膜から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。
【００５５】
本明細書において開示される特定の実施形態は、約３５−７２％のコラーゲン及び約１５−２５％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。本明細書において開示される他の特定の実施形態は、約４０−７０％のコラーゲン及び約１５−２５％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。他の特定の実施形態において、前記組成物は、４０−７０％のコラーゲン及び１５−２２％のエラスチンを含む。他の特定の実施形態において、前記組成物は、４３−６８％のコラーゲン及び１８−２１％のエラスチンを含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０５％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、０．００１％未満のフィブロネクチン、０．００１から０．１％のフィブロネクチン、０．００１から０．０５％のフィブロネクチン、０．００１から０．０１％のフィブロネクチン、０．０１から０．１％のフィブロネクチン、又は０．０１から０．０５％のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はラミニンを含み、例えば、０．１％未満のラミニン、０．０５％未満のラミニン、０．０１％未満のラミニン、０．００１％未満のラミニン、０．００１から０．１％のラミニン、０．００１から０．０５％のラミニン、０．００１から０．０１％のラミニン、０．０１から０．１％のラミニン、又は０．０１から０．０５％のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含み、例えば、０．１％未満のグリコサミノグリカン、０．０５％未満のグリコサミノグリカン、０．０１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１から０．１％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０５％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０１％のグリコサミノグリカン、０．０１から０．１％のグリコサミノグリカン、又は０．０１から０．０５％のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、サイトカイン、成長因子及び／又はデオキシコール酸を含まないか又は検出不能な量のサイトカイン、成長因子及び／又はデオキシコール酸を含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、フィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０５％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、０．００１％未満のフィブロネクチン、０．００１から０．１％のフィブロネクチン、０．００１から０．０５％のフィブロネクチン、０．００１から０．０１％のフィブロネクチン、０．０１から０．１％のフィブロネクチン、又は０．０１から０．０５％のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含み、例えば、０．１％未満のラミニン、０．０５％未満のラミニン、０．０１％未満のラミニン、０．００１％未満のラミニン、０．００１から０．１％のラミニン、０．００１から０．０５％のラミニン、０．００１から０．０１％のラミニン、０．０１から０．１％のラミニン、又は０．０１から０．０５％のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含み、例えば、０．１％未満のグリコサミノグリカン、０．０５％未満のグリコサミノグリカン、０．０１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１から０．１％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０５％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０１％のグリコサミノグリカン、０．０１から０．１％のグリコサミノグリカン、又は０．０１から０．０５％のグリコサミノグリカンを含み、加えて、サイトカイン、成長因子及び／又はデオキシコール酸を含まないか又は検出不能な量のサイトカイン、成長因子及び／又はデオキシコール酸を含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、例えばヒトの胎盤組織などの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤の絨毛膜、例えば胎盤の絨毛膜板から得られる。当該絨毛膜は、例えばヒト胎盤由来の絨毛膜板等である。
【００５６】
本明細書において開示される他の特定の実施形態は、約５０−６０％のコラーゲン及び約１０−２０％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤組織、例えば、ヒトの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤の絨毛膜、例えば、ヒト胎盤由来の絨毛膜から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。
【００５７】
本明細書において開示される他の特定の実施形態は、約４５−５５％のコラーゲン及び約１５−２５％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤組織、例えば、ヒトの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤の絨毛膜、例えば、ヒト胎盤由来の絨毛膜から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。
【００５８】
本明細書において開示される他の特定の実施形態は、約４０−５０％のコラーゲン及び約２０−３０％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤組織、例えば、ヒトの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤の絨毛膜、例えば、ヒト胎盤由来の絨毛膜から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。
【００５９】
本明細書において開示される他の特定の実施形態は、約３０−４０％のコラーゲン及び約２５−３５％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤組織、例えば、ヒトの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤の絨毛膜、例えば、ヒト胎盤由来の絨毛膜から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。
【００６０】
本明細書において開示される他の特定の実施形態は、約３４−４３％のコラーゲン及び約１６−２４％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤組織、例えば、ヒトの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤の絨毛膜、例えば、ヒト胎盤由来の絨毛膜から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。
【００６１】
本明細書において開示される他の特定の実施形態は、約３７−４２％のコラーゲン及び約１６−２４％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤組織、例えば、ヒトの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤の絨毛膜、例えば、ヒト胎盤由来の絨毛膜から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。
【００６２】
本明細書において開示される他の特定の実施形態は、約３０−７０％、３０−６０％、３０−５０％、３０−４０％、３０−３５％、３４−４３％、３５−７２％、３５−４０％、３７−４２％、４０−７０％、４０−６０％、４０−５０％、４０−４５％、４０−６５％、４３−６８％、４５−５０％、５０−５５％、又は５５−６０％のコラーゲン及び約１０−３０％、１０−２０％、１０−１５％、１５−２５％、１５−２２％、１５−２０％、１６−２４％、１７−２４％、１８−２１％、１８−２０％、２０−２４％、２０−３０％、２０−２５％、２５−３０％、又は３０−３５％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤組織、例えば、ヒトの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤の絨毛膜、例えば胎盤の絨毛膜板から得られる。当該絨毛膜は、例えばヒト胎盤由来の絨毛膜板等である。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０５％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、０．００１から０．１％のフィブロネクチン、０．００１から０．０５％のフィブロネクチン、０．００１から０．０１％のフィブロネクチン、０．０１から０．１％のフィブロネクチン、又は０．０１から０．０５％のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のラミニンを含み、例えば、０．１％未満のラミニン、０．０５％未満のラミニン、０．０１％未満のラミニン、又は０．００１％未満のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はラミニンを含み、例えば、０．００１から０．１％のラミニン、０．００１から０．０５％のラミニン、０．００１から０．０１％のラミニン、０．０１から０．１％のラミニン、又は０．０１から０．０５％のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のグリコサミノグリカンを含み、例えば、０．１％未満のグリコサミノグリカン、０．０５％未満のグリコサミノグリカン、０．０１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１％未満のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はグリコサミノグリカンを含み、例えば、０．００１から０．１％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０５％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０１％のグリコサミノグリカン、０．０１から０．１％のグリコサミノグリカン、又は０．０１から０．０５％のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０５％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、０．００１％未満のフィブロネクチン、０．００１から０．１％のフィブロネクチン、０．００１から０．０５％のフィブロネクチン、０．００１から０．０１％のフィブロネクチン、０．０１から０．１％のフィブロネクチン、又は０．０１から０．０５％のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含み、例えば、０．１％未満のラミニン、０．０５％未満のラミニン、０．０１％未満のラミニン、０．００１％未満のラミニン、０．００１から０．１％のラミニン、０．００１から０．０５％のラミニン、０．００１から０．０１％のラミニン、０．０１から０．１％のラミニン、又は０．０１から０．０５％のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含み、例えば、０．１％未満のグリコサミノグリカン、０．０５％未満のグリコサミノグリカン、０．０１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１から０．１％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０５％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０１％のグリコサミノグリカン、０．０１から０．１％のグリコサミノグリカン、又は０．０１から０．０５％のグリコサミノグリカンを含み、加えて、サイトカイン、成長因子及び／又はデオキシコール酸を含まないか又は検出不能な量のサイトカイン、成長因子及び／又はデオキシコール酸を含む。
【００６３】
本明細書において開示される他の特定の実施形態は、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％又は約７２％のコラーゲン、及び約１０％、約１５％、約１８％、約２０％、約２５％、約３０％又は約３５％のエラスチンを含むＥＣＭ組成物である。特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤組織、例えば、ヒトの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤の絨毛膜、例えば胎盤の絨毛膜板から得られる。当該絨毛膜は、例えばヒト胎盤由来の絨毛膜板等である。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０５％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、０．００１から０．１％のフィブロネクチン、０．００１から０．０５％のフィブロネクチン、０．００１から０．０１％のフィブロネクチン、０．０１から０．１％のフィブロネクチン、又は０．０１から０．０５％のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のラミニンを含み、例えば、０．１％未満のラミニン、０．０５％未満のラミニン、０．０１％未満のラミニン、又は０．００１％未満のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はラミニンを含み、例えば、０．００１から０．１％のラミニン、０．００１から０．０５％のラミニン、０．００１から０．０１％のラミニン、０．０１から０．１％のラミニン、又は０．０１から０．０５％のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のグリコサミノグリカンを含み、例えば、０．１％未満のグリコサミノグリカン、０．０５％未満のグリコサミノグリカン、０．０１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１％未満のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はグリコサミノグリカンを含み、例えば、０．００１から０．１％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０５％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０１％のグリコサミノグリカン、０．０１から０．１％のグリコサミノグリカン、又は０．０１から０．０５％のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０５％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、０．００１％未満のフィブロネクチン、０．００１から０．１％のフィブロネクチン、０．００１から０．０５％のフィブロネクチン、０．００１から０．０１％のフィブロネクチン、０．０１から０．１％のフィブロネクチン、又は０．０１から０．０５％のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含み、例えば、０．１％未満のラミニン、０．０５％未満のラミニン、０．０１％未満のラミニン、０．００１％未満のラミニン、０．００１から０．１％のラミニン、０．００１から０．０５％のラミニン、０．００１から０．０１％のラミニン、０．０１から０．１％のラミニン、又は０．０１から０．０５％のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含み、例えば、０．１％未満のグリコサミノグリカン、０．０５％未満のグリコサミノグリカン、０．０１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１から０．１％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０５％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０１％のグリコサミノグリカン、０．０１から０．１％のグリコサミノグリカン、又は０．０１から０．０５％のグリコサミノグリカンを含み、加えて、サイトカイン、成長因子及び／又はデオキシコール酸を含まないか又は検出不能な量のサイトカイン、成長因子及び／又はデオキシコール酸を含む。
【００６４】
本明細書において開示される他の特定の実施形態は、コラーゲンを約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、又は７２％含み、エラスチンを約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、又は３５％含むＥＣＭ組成物である。特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤組織、例えば、ヒトの胎盤組織から得られる。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、胎盤の絨毛膜、例えば胎盤の絨毛膜板から得られる。当該絨毛膜は、例えばヒト胎盤由来の絨毛膜板等である。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０５％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、０．００１％未満のフィブロネクチンを含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、０．００１から０．１％のフィブロネクチン、０．００１から０．０５％のフィブロネクチン、０．００１から０．０１％のフィブロネクチン、０．０１から０．１％のフィブロネクチン、又は０．０１から０．０５％のフィブロネクチンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のラミニンを含み、例えば、０．１％未満のラミニン、０．０５％未満のラミニン、０．０１％未満のラミニン、又は０．００１％未満のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はラミニンを含み、例えば、０．００１から０．１％のラミニン、０．００１から０．０５％のラミニン、０．００１から０．０１％のラミニン、０．０１から０．１％のラミニン、又は０．０１から０．０５％のラミニンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のグリコサミノグリカンを含み、例えば、０．１％未満のグリコサミノグリカン、０．０５％未満のグリコサミノグリカン、０．０１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１％未満のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はグリコサミノグリカンを含み、例えば、０．００１から０．１％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０５％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０１％のグリコサミノグリカン、０．０１から０．１％のグリコサミノグリカン、又は０．０１から０．０５％のグリコサミノグリカンを含む。他の特定の実施形態において、前記ＥＣＭ組成物は、極めて少量のフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、又は０．００１％未満のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含まないか又は検出不能な量のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含まないか又は検出不能な量のグリコサミノグリカンを含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＣＭ組成物はフィブロネクチンを含み、例えば、０．１％未満のフィブロネクチン、０．０５％未満のフィブロネクチン、０．０１％未満のフィブロネクチン、０．００１％未満のフィブロネクチン、０．００１から０．１％のフィブロネクチン、０．００１から０．０５％のフィブロネクチン、０．００１から０．０１％のフィブロネクチン、０．０１から０．１％のフィブロネクチン、又は０．０１から０．０５％のフィブロネクチンを含み、ラミニンを含み、例えば、０．１％未満のラミニン、０．０５％未満のラミニン、０．０１％未満のラミニン、０．００１％未満のラミニン、０．００１から０．１％のラミニン、０．００１から０．０５％のラミニン、０．００１から０．０１％のラミニン、０．０１から０．１％のラミニン、又は０．０１から０．０５％のラミニンを含み、グリコサミノグリカンを含み、例えば、０．１％未満のグリコサミノグリカン、０．０５％未満のグリコサミノグリカン、０．０１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１％未満のグリコサミノグリカン、０．００１から０．１％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０５％のグリコサミノグリカン、０．００１から０．０１％のグリコサミノグリカン、０．０１から０．１％のグリコサミノグリカン、又は０．０１から０．０５％のグリコサミノグリカンを含み、加えて、サイトカイン、成長因子及び／又はデオキシコール酸を含まないか又は検出不能な量のサイトカイン、成長因子及び／又はデオキシコール酸を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたＥＣＭ組成物中のコラーゲンは、テロペプチドコラーゲン（telopeptide collagen）を含む、すなわち構成要素とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたＥＣＭ組成物中のコラーゲンは、アテロペプチドコラーゲン（atelopeptide collagen）を含む、すなわち構成要素とする。いくつかの場合、テロペプチドコラーゲン及びアテロペプチドコラーゲンを構成要素とする。
【００６６】
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物中のコラーゲンの第１の種類は、Ｉ型コラーゲン（type I collagen）である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物中のコラーゲンは、乾燥重量で少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は８０％以上のＩ型コラーゲンを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物中のコラーゲンは、乾燥重量で、５０％から７０％のＩ型コラーゲン、６０％から８０％のＩ型コラーゲン、又は７０％から９０％のＩ型コラーゲンを含む。特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物中のコラーゲンは、６０％から８０％のＩ型コラーゲンを含む。
【００６７】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物中のコラーゲンは、例えばＩ型コラーゲンを含み同様にIII型コラーゲン及び／又はIＶ型コラーゲンも含むといったように、複数種のコラーゲンの混合物を含む。
【００６８】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物中のコラーゲンは、相当量のＩ型コラーゲン（例えば、６０％−８０％のＩ型コラーゲン）を含み、さらにIII型コラーゲンも含む。例えば、Ｉ型コラーゲンに加えて、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物中のコラーゲンは、乾燥重量で、１％から５％のIII型コラーゲン、５％から１０％のIII型コラーゲン、若しくは１％から１０％のIII型コラーゲンを含み得、又は、当該本明細書に開示されるＥＣＭ組成物中のコラーゲンは、乾燥重量で、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、若しくは約１０％のIII型コラーゲンを含み得る。
【００６９】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物中のコラーゲンは、相当量のＩ型コラーゲン（例えば、６０％−８０％のＩ型コラーゲン）を含み、さらにIＶ型コラーゲンも含む。例えば、Ｉ型コラーゲンに加えて、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物中のコラーゲンは、乾燥重量で、１％から５％のIＶ型コラーゲン、５％から１０％のIＶ型コラーゲン、若しくは１％から１０％のIＶ型コラーゲンを含み得、又は、当該本明細書に開示されるＥＣＭ組成物中のコラーゲンは、乾燥重量で、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、若しくは約１０％のIＶ型コラーゲンを含み得る。
【００７０】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物中のコラーゲンは、相当量のＩ型コラーゲン（例えば、６０％−８０％のＩ型コラーゲン）を含み、さらにIII型コラーゲン及びIＶ型コラーゲンも含む。例えば、Ｉ型コラーゲンに加えて、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物中のコラーゲンは、（i）乾燥重量で、１％から５％のIII型コラーゲン、５％から１０％のIII型コラーゲン、若しくは１％から１０％のIII型コラーゲンを含み得、又は、当該本明細書に開示されるＥＣＭ組成物中のコラーゲンは、乾燥重量で、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、若しくは約１０％のIII型コラーゲンを含み得、そして、（ii）乾燥重量で、１％から５％のIＶ型コラーゲン、５％から１０％のIＶ型コラーゲン、若しくは１％から１０％のIＶ型コラーゲンを含み得、又は、当該本明細書に開示されるＥＣＭ組成物中のコラーゲンは、乾燥重量で、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、若しくは約１０％のIＶ型コラーゲンを含み得る。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物中のコラーゲンは、例えば架橋剤によって、架橋されている。架橋剤の具体例は、グルタルアルデヒド（例えば、米国特許第4,852,640号, 第5,428,022号, 第5,660,692号 及び 第5,008,116号参照。これらの特許の内容は、その全体が参照されることで本願明細書に包含されている。））、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル、及びゲニピン（genipin）(例えば、米国特許出願第2003/0049301号参照。当該出願の内容は、その全体が参照されることで本願明細書に包含されている。)を含む。さらに架橋剤及びコラーゲンの架橋方法の具体例は、米国特許第 5,880,242 号及び 第6,117,979号、 ゼーマンらの文献（Zeeman et al., 2000, J Biomed Mater Res. 51(4):541-8）、 ワケムらの文献（van Wachem et al., 2000, J Biomed Mater Res. 53(1):18-27）、ワケムらの文献（van Wachem et al., 1999, J Biomed Mater Res. 47(2):270-7）、ゼーマンらの文献（Zeeman et al., 1999, J Biomed Mater Res. 46(3):424-33）、及びゼーマンらの文献（Zeeman et al., 1999, Biomaterials 20(10):921-31）に記載されており、当該特許及び文献の内容は、その全体が参照されることで本願明細書に包含されている。
【００７２】
４．１．１調製物
本明細書において開示されるＥＣＭ組成物は、多様な方法によって調製され得る。調製物の種類は、例えば目的とされるＥＣＭ組成物の用途に基づいて選択され得る。
【００７３】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、流動性基質として調製され、例えばシリンジを用いて投与され得る形態で調製される。従って、本明細書に提示されるものは、本明細書に記載されたようなＥＣＭ組成物を含むシリンジである。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される流動性基質のＥＣＭ組成物は、水中又はリン酸緩衝生理食塩水中に、例えば溶液又は懸濁液、例えば洗口液として調製され得る。溶液中で（例えば、流動性基質として）、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、当業者にとって有用な任意の濃度で存在し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される流動性基質ＥＣＭ組成物は、２００−３００ｍｇ／ｍｌ、１００−２００ｍｇ／ｍｌ、１５０−２５０ｍｇ／ｍｌ、０．１−１００ｍｇ／ｍｌ、１−１００ｍｇ／ｍｌ、１−７５ｍｇ／ｍｌ、１−５０ｍｇ／ｍｌ、１−４０ｍｇ／ｍｌ、１０−４０ｍｇ／ｍｌ、又は２０−４０ｍｇ／ｍｌのＥＣＭを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される流動性基質ＥＣＭ組成物は、約５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌのＥＣＭ、７５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、１７５ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、２２５ｍｇ／ｍｌ、２５０ｍｇ／ｍｌ、２７５ｍｇ／ｍｌ、又は３００ｍｇ／ｍｌのＥＣＭを含む。特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、２００ｍｇ／ｍｌのＥＣＭを含む流動性基質ＥＣＭ組成物である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される流動性基質ＥＣＭ組成物は、本明細書に記載された方法を用いて調製された、凍結乾燥され、粉末化されたＥＣＭを用いて、当業者によって調製される。例えば、前記凍結乾燥され、粉末化されたＥＣＭはキット（kit）の形態で提供され、例えば生理食塩水等の適切な懸濁溶液を伴う。そして、当業者は、当該凍結乾燥され、粉末化されたＥＣＭを当該懸濁溶液に懸濁させることによって、流動性基質ＥＣＭ組成物を容易に生成することができる。
【００７４】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、例えば粉末の形態など、粒子として調製される。粒子である場合、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、バイアル（例えば、ガラスバイアル（glass vial））等の、粒子の保存に適した任意の容器内に準備され得る。粒子として提供される場合、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、当業者にとって有用な任意の濃度で容器内に準備され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粒子ＥＣＭ組成物は、２００−３００ｍｇ、１００−２００ｍｇ、１５０−２５０ｍｇ、５０−１００ｍｇ、２５−５０ｍｇ、１０−２５ｍｇ、５−１０ｍｇ、又は１−５ｍｇのＥＣＭを含む。いくつかの実施形態において、いくつかの実施形態において、本明細書に開示される流動性基質ＥＣＭ組成物は、約５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇのＥＣＭ、約７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、又は３００ｍｇのＥＣＭを含み得る。特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、２００ｍｇのＥＣＭを含む粒子ＥＣＭ組成物である。他の特定の実施形態において、１００ｍｇのＥＣＭを含む粒子ＥＣＭ組成物である。
【００７５】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、例えば平面状の固形のＥＣＭ層のような、シートとして調製される。シートである場合、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、意図される用途に適した任意の厚さ及び寸法のシートに成形され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭシートは、例えば５×５ｃｍ又は８×８ｃｍのサイズといった標準のサイズで提供され、当業者によって使用前に操作（例えば、切断）がなされ得る。当該切断は、例えば、意図される用途に適したサイズであり、当該用途は例えば、創傷ドレッシング（wound dressing）としての使用である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、０．１−０．１５ｍｍ、０．１５−０．２ｍｍ、０．１−０．２ｍｍ、０．２−０．２５ｍｍ、０．２５−０．３ｍｍ、又は０．２−０．３ｍｍの厚さを有するシートとして調製される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、約０．１ｍｍ、０．１５ｍｍ、０．２ｍｍ、０．２５ｍｍ、又は０．３ｍｍの厚さを有するシートとして調製される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、２×２ｃｍのシート、３×３ｃｍのシート、４×４ｃｍのシート、５×５ｃｍのシート、６×６ｃｍのシート、７×７ｃｍのシート、８×８ｃｍのシート、又は９×９ｃｍのシートとして調製され、前記シートは約０．１−０．１５ｍｍ、０．１５−０．２ｍｍ、０．１−０．２ｍｍ、０．２−０．２５ｍｍ、０．２５−０．３ｍｍ、又は０．２−０．３ｍｍの厚さを有する。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるものは、本明細書に開示される少なくとも１つのＥＣＭシートを含むラミネート（laminates）である。特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、２つのＥＣＭシートを含むラミネートである。特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、少なくとも１つの本明細書に開示されるＥＣＭシート及び少なくとも１つの他の平面状の脱細胞された組織（例えば、脱細胞された／脱水された羊膜、又は完全に脱細胞され若しくは線維芽細胞層を維持するように脱細胞された組織）を含む、又は代わりに平面状の人工組織を有するラミネートである。いくつかの実施形態において、ラミネートは、複数のＥＣＭシート、又は１つ以上のＥＣＭシート及び他の平面状の脱細胞された組織を、例えばニカワ（例えば天然のニカワ、例えばフィブロネクチン、フィブリン、又は合成ニカワ）などの接着材の存在下で互いに接触させて配置することによって生成され得る。いくつかの実施形態において、ラミネートは、２つ以上のＥＣＭシートを共に、又は１つ以上のＥＣＭシート及び１つ以上の平面状の脱細胞された組織を共に加熱乾燥することによって生成され得る。
【００７７】
４．１．１．１ 非ＥＣＭ組成物
特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、通常はＥＣＭに付随しない1つ以上の成分を含むように調製される。
【００７８】
１つの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、当該ＥＣＭ組成物が被検体への投与に適するように、薬学上又は美容上許容され得るキャリアと結合される。当該被検体は例えば、そのような投与を必要とする人間の被検者である。投与の形態は、限定するものではないが、注射、溶液、クリーム、ゲル、インプラント（implant）、ポンプ、軟膏、乳液、懸濁液、微小球（microsphere）、粒子(particle)、微小粒子（microparticle）、ナノ粒子（nanoparticle）、リポソーム、ペースト、パッチ（patch）、錠剤、経皮デリバリーデバイス（transdermal delivery device）、スプレー、エアロゾル及びその他の、当該技術分野において当業者に知られている手段を含む。そのような薬学上又は美容上許容され得るキャリア（pharmaceutically or cosmetically acceptable carrier）は、当該技術分野において当業者に周知である。「薬学上又は美容上許容され得るキャリア」又は「薬学上又は美容上許容され得る賦形剤（pharmaceutically or cosmetically acceptable vehicle）」の用語は、本明細書において、限定するものではないが、あらゆる液体、固体、又は準固体を意味するように使用され、限定するものではないが、水又は生理食塩水、ゲル、クリーム、軟膏、溶媒、希釈剤、液体軟膏基材（fluid ointment base）、軟膏ペースト、インプラント（implant）、リポソーム、ミセル、巨大ミセルなど、生きている動物又は人間の組織に接触した使用に適しており、不都合な生理的反応又は美容上の反応を引き起こさず、組成物の他の成分、例えばＥＣＭ等と、有害な態様での相互作用をしないものを含む。
【００７９】
１つの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、有効成分を放出可能に構成されている。例えば当該有効成分は、ＥＣＭ組成物に加えられた有効成分である。例えば、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物には、製造中又は製造後に、生体分子が含浸されても良い。生体分子の具体例は、限定するものではないが、抗生物質（例えばクリンダマイシン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシンなど）、ホルモン、成長因子、抗がん剤、抗真菌薬、抗ウイルス剤、鎮痛剤、抗ヒスタミン剤、抗炎症剤、抗感染薬、銀元素（elemental silver）、抗生物質、殺菌酵素（例えばリソゾーム（lysozome）など）、創傷治癒剤（例えば、サイトカインであり、限定するものではないが、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ、チモシンを含む）、ヒアルロン酸、創傷シーラント（例えば、トロンビンを含むか又は含まないフィブリン）、細胞誘引物質及び足場試薬を含む。特定の例において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、少なくとも１つの成長因子が含浸される。例えば、当該成長因子は、線維芽細胞成長因子又は上皮成長因子である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、例えば個別の生化学過程に関する特定の阻害物質といった有機小分子が含浸される。当該特定の阻害物質は、例えば、膜受容体阻害薬、キナーゼ阻害薬、成長阻害物質、及び抗がん剤等である。
【００８０】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、ヒドロゲルと混合される。当業者に知られているあらゆるヒドロゲルが用いられ得る。例えば、当該あらゆるヒドロゲルは、以下の論文、グラハム氏（Graham）, 1998, Med. Device Technol. 9(1): 18-22ページ、 ペッパス氏ら（Peppas et al.）, 2000, Eur. J. Pharm. Biopharm. 50(1): 27-46ページ、グエン氏ら（Nguyen et al.）, 2002, Biomaterials, 23(22): 4307-4314ページ、ヘニンクル氏ら（Henincl et al.）, 2002, Adv. Drug Deliv. Rev 54(1): 13-36ページ、スケルホーン氏ら（Skelhorne et al.）, 2002, Med. Device. Technol. 13(9): 19-23ページ、 or シュメドレン氏ら（Schmedlen et al）, 2002, Biomaterials 23: 4325-4332ページに開示されるようなあらゆるヒドロゲル組成物等である。特定の実施形態において、ヒドロゲルはＥＣＭ組成物の上に塗布される、すなわち、ＥＣＭ組成物の表面上に吐出される。例えば、ヒドロゲルは、ＥＣＭ組成物上に噴霧され、ＥＣＭ組成物の表面に染み込ませられ、ＥＣＭ組成物に浸漬され、ＥＣＭ組成物に浸され、又はＥＣＭ組成物の表面に塗布されても良い。本明細書に開示される方法及び組成物に有用なヒドロゲルは、当該技術分野において知られる、水と相互作用する（water-interactive）又は水溶性のあらゆるポリマーから作られ得る。当該あらゆるポリマーは、限定するものではないが、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ヒアルロン酸、デキストラン（dextran）並びにこれらの誘導体及び類似体を含む。
【００８１】
４．１．２ 細胞
本明細書において開示されるＥＣＭ組成物には、１つ以上の種類の細胞が播種され又は培養されることで含まれ得る。例えば、細胞は、本明細書に記載されたＥＣＭ組成物を培地として培養されて成長し得、又は本明細書に記載されたＥＣＭ組成物上に若しくは当該ＥＣＭ組成物中に分散され得る（例えば、ＥＣＭの流動性基質組成物に加えられる）。当業者は、当該技術分野において周知の、幹細胞及び非幹細胞の両方を含むあらゆる種類の細胞が、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物に播種され、かつ／又は培養され得ることを十分に理解するであろう。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物には、幹細胞が播種され、かつ／又は含まれる。当該幹細胞は、所定の目的に適した如何なる幹細胞であっても良く、全能性若しくは多能性の幹細胞でも良く、又は前駆細胞でも良い。特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物には、胎盤幹細胞が播種され、かつ／又は含まれる。当該胎盤幹細胞は、例えば、米国特許第7,045,148号, 第7,468,276号, 第8,057,788号 及び 第8,202,703号に記載され、これらの特許の開示は、その全体が参照されることで本願明細書に包含されている。他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物には、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、間葉幹細胞、骨髄由来幹細胞、造血前駆細胞（例えば、末梢血、胎児血、胎盤血、臍帯血、胎盤かん流液（placental perfusate）等に由来する造血幹細胞など）、体性幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、膵臓幹細胞、内皮幹細胞、心臓幹細胞、筋幹細胞、脂肪幹細胞等が播種され、かつ／又は含まれる。特定の実施形態において、当該幹細胞は、ヒト幹細胞である。
【００８３】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物には、１つ以上の種類の非幹細胞が播種され、かつ／又は含まれる。本明細書において、最終分化細胞について「非幹細胞」と称する。例えば、１つの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、複数の線維芽細胞を含む。本明細書に開示されるＥＣＭ組成物と混合され得る非幹細胞は、限定するものではないが、線維芽細胞又は線維芽細胞様細胞、真皮細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋細胞、心臓細胞、及び膵臓細胞を含む。他のいくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物には、２種類の非幹細胞が播種され、かつ／又は含まれる。
【００８４】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は細胞と共に培養され、当該培養は、複数の細胞がＥＣＭ組成物に付着するために十分な時間なされる。そのような実施形態によれば、ＥＣＭ組成物は実用的な形状に成形され得る。例えば、ＥＣＭ組成物は、シート、プラグ(plug)、チューブ、又は他の形状に、ＥＣＭ組成物が細胞と接触される前に、成形され得る。
【００８５】
当該ＥＣＭ組成物は、少なくとも１×１０６, ３×１０６, １×１０７, ３×１０７, １×１０８, ３×１０８, １×１０９, ３×１０９, １×１０１０, ３×１０１０, １×１０１１, ３×１０１１, 若しくは １×１０１２の細胞か又は１×１０６, ３×１０６, １×１０７, ３×１０７, １×１０８, ３×１０８, １×１０９, ３×１０９, １×１０１０, ３×１０１０, １×１０１１, ３×１０１１, 若しくは １×１０１２未満の細胞と共に培養され得る。
【００８６】
４．１．１．キャラクタリゼーション
当該技術分野において公知の生化学に基づく定量法が、本明細書に開示される方法を用いて作製されたＥＣＭ組成物の生化学的組成を確認するために用いられ得る。タンパク質の含有量は、例えば、吸光度定量法（absorbance assay）を用いて決定される。当該吸光度定量は、例えば、レイン氏（Layne, E）, Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins, Methods in Enzymology 3: 447-455ページ, (1957); ストシェック氏（Stoscheck, C M,） Quantitation of Protein, Methods in Enzymology 182: 50-69ページ, (1990)), スコープス氏（Scopes, R K）, Analytical Biochemistry 59: 277ページ, (1974); 及びストシェック氏（Stoscheck, C M.） Quantitation of Protein, Methods in Enzymology 182: 50-69ページ, (1990))に記載されている。あるいは、特定のタンパク質の含有量を測定するために、修正ローリー法定量（modified Lowry assay）、ビウレット定量（biuret assay）、ブラッドフォード定量（Bradford assay）、ビシンコニニック酸（スミス）定量法（Bicinchoninic Acid (Smith) assay）（ストシェック氏（Stoscheck, C M.） Quantitation of Protein, Methods in Enzymology 182: 50-69ページ, (1990)参照）を含む比色分析に基づく定量法が用いられ得る。
【００８７】
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物のコラーゲンの総含有量は、例えば、ヒドロキシプロリン又は定量的な染料ベースの定量キット、例えば、バイオカラー社製（Biocolor Ltd, UK.）のＳＩＲＣＯＬ（商標）キット等を用いて決定され得る。本明細書に開示されるＥＣＭ組成物中のコラーゲンの種類は、例えばエライザ定量法（ELISA assay）等の当該技術分野において公知の標準的な方法を用いて決定され得る。
【００８８】
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物のエラスチンの総含有量は、例えば、定量的な染料ベースの定量キット、例えば、バイオカラー社製（Biocolor Ltd, UK.）の染料ベースの定量キット（ＦＡＳＴＩＮ）等を用いて決定され得る。
【００８９】
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の総含有量は、例えば、バイオカラー社製（Biocolor Ltd, UK.）の定量的な染料ベースの定量キット（ＢＬＹＳＣＡＮ）等を用いて決定され得る。また、ＧＡＧの含有量は、エライザ法によって、技術分野において公知の方法を用いて測定され得る。
【００９０】
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物のラミニン及びフィブロネクチンの総含有量は、例えば、エライザ定量法を用いて決定され得る。例えば、当該エライザ定量法は、サンドウィッチエライザ定量法等であり、例えば、タカラバイオ社製（Takara Bio Inc.,Shiga, Japan）のキットとして提供されるラミニン及びフィブロネクチンに特化したエライザ定量法等である。
【００９１】
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、非免疫原性であり、例えばヒトの被検体等の被検体の組織への生体適合性がある。本明細書において、「生体適合性」は、生体組織内で有毒なもの、有害なもの、又は免疫反応若しくは免疫学的拒絶反応を生じさせず、生物学的に適合する性質をいう。本明細書に開示されるＥＣＭ組成物の生体適合性を確認するために、生体適合性の評価が行われ得る。そのような評価は、当業者に公知であり、限定するものではないが、細胞毒性分析（例えば、ＩＳＯ ＭＥＭ 溶出試験）、ウサギ眼刺激性試験（rabbit eye irritation tests）、溶血性試験、及び発熱試験を含む。
【００９２】
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、殺菌されて調製され得、これによって生物学的汚染物質を含まない。微生物の存在は、例えば、適切な細菌増殖培地の中／上でのＥＣＭ組成物の直接植菌等の公知の方法を用いて判定され得る。当該培地は、例えば、大豆カゼイン培地又はチオグリコール酸培地等である。
【００９３】
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、少量のエンドトキシンを含むか、エンドトキシンを含まないか、又は検出不能なレベルのエンドトキシンを含むように調製され得る。本明細書に開示されるＥＣＭ組成物中のエンドトキシンの存在は、例えばリムルス試験（Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test）（細菌のエンドトキシン試験）等の、技術分野において周知のインビトロ（in vitro）での検査によって判定することができる。特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、調製物当たり２０エンドトキシンユニット（ＥＵ）未満を含む（例えば、本明細書に開示されるＥＣＭの１つのシートが２０ＥＵ未満を含む）。
【００９４】
４．２．細胞外基質組成物を作る方法
１つの態様において、本明細書において開示されるものは、胎盤の細胞外基質（ＥＣＭ）組成物を生成する方法である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される胎盤（例えば、ヒト胎盤）からＥＣＭ組成物を作る方法は、次のようなステップを順に含む：（i）羊膜、絨毛膜、及び臍帯を胎盤から（例えば、出産直後の母体から得られた胎盤から、又は保存された胎盤から）除去するステップと、（ii）胎盤組織に結合された細胞の浸透圧崩壊を引き起こす溶液に、胎盤組織をさらすステップと、（iii）洗浄剤を含む溶液に胎盤を接触させるステップと、（iv）塩基を含む溶液に胎盤を接触させるステップ。いくつかの実施形態において、ＥＣＭ組成物を胎盤から作る方法であって、胎盤（例えば、ヒト胎盤）の絨毛膜を用いる方法は、次のようなステップを順に含む：（i）胎盤から（例えば、出産直後の母体から得られた胎盤から、又は保存された胎盤から）絨毛膜を取得するステップと、（ii）絨毛膜に結合された細胞の浸透圧崩壊を引き起こす溶液に、絨毛膜をさらすステップと、（iii）洗浄剤を含む溶液に絨毛膜を接触させるステップと、（iv）塩基を含む溶液に絨毛膜を接触させるステップ。いくつかの実施形態において、ＥＣＭ組成物を胎盤から作る方法であって、胎盤（例えば、ヒト胎盤）の絨毛膜を用いる方法は、次のようなステップを順に含む：（i）胎盤から（例えば、出産直後の母体から得られた胎盤から、又は保存された胎盤から）絨毛膜を取得するステップと、（ii）絨毛膜を擦り、清浄にするステップと、（iii）絨毛膜に結合された細胞の浸透圧崩壊を引き起こす溶液に、絨毛膜をさらすステップと、（iv）洗浄剤を含む溶液に絨毛膜を接触させるステップと、（v）すり潰し、凍結乾燥するステップ。いくつかの実施形態において、ＥＣＭ組成物を胎盤から作る方法であって、胎盤（例えば、ヒト胎盤）の絨毛膜を用いる方法は、次のようなステップを順に含む：（i）胎盤から（例えば、出産直後の母体から得られた胎盤から、又は保存された胎盤から）絨毛膜を取得するステップと、（ii）絨毛膜を擦り、清浄にするステップと、（iii）絨毛膜に結合された細胞の浸透圧崩壊を引き起こす溶液に、絨毛膜をさらすステップと、（iv）第１の洗浄剤溶液を含む溶液、次に第２の洗浄剤溶液を含む溶液に絨毛膜を接触させるステップであって、前記溶液は洗浄剤及び例えばＥＤＴＡなどのキレート剤を含むステップと、（v）凍結乾燥するステップ。重要なことには、本明細書に開示されたＥＣＭ組成物を作る方法は、例えば塩基、洗浄剤、キレート剤などの成分を、本明細書に開示された特別な特徴を有するＥＣＭ組成物を生成する結果となる量で用いる。
【００９５】
本明細書に開示されるＥＣＭを生成する方法において用いられる胎盤は、通常、満期産の後に得られ、新鮮分離され又は前もって分離されて冷凍保存され得る。通常、本明細書に開示される方法によって、冷凍の胎盤を使用してＥＣＭ組成物を作製する際に、当該胎盤は、例えば使用する前に室温で、解凍される。例えば、当該胎盤は〜22-23℃で解凍され、２４時間又は当該胎盤が使用できる状態になるまで解凍される。
【００９６】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法によって胎盤からＥＣＭ組成物を作製する前に、当該胎盤は放血される、すなわち、出産後に残っている臍帯血が排出される。いくつかの実施形態において、当該胎盤は、本明細書に開示される方法において使用される前に、７０％放血され、８０％放血され、９０％放血され、９５％放血され、又は９９％放血される。
【００９７】
本明細書に開示される方法において実行される、胎盤組織に結合された細胞の浸透圧崩壊を引き起こす溶液に、胎盤組織（例えば、羊膜、絨毛膜、及び除去された臍帯由来の、又は胎盤の絨毛膜由来の胎盤組織）をさらすステップは、結果として、通常は胎盤組織に結合されている細胞及び細胞残屑だけでなく血液及び血液成分を除去する。従って、当業者は、細胞の浸透圧崩壊を引き起こすあらゆる溶液が、本明細書に開示される方法において用いられ得ることを理解するであろう。例えば、ＮａＣｌ、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸アンモニウム、単糖、二糖（例えば、２０％スクロース）、親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）、グリセロールが、その浸透ポテンシャル（osmotic potential）によって細胞を崩壊させるために用いられ得る。
【００９８】
特定の実施形態において、本明細書に開示される方法において使用される胎盤組織（例えば、羊膜、絨毛膜、及び除去された臍帯由来の、又は胎盤の絨毛膜由来の胎盤組織）に結合された細胞の浸透圧崩壊を引き起こすためにＮａＣｌが用いられる。特定の実施形態において、約０．２５Ｍ, ０．５Ｍ, ０．７５Ｍ, １．０Ｍ, １．２５Ｍ, １．５Ｍ, １．７５Ｍ, ２Ｍ, ２．２５Ｍ,又は２．５ＭのＮａＣｌを含む溶液が、本明細書に開示される方法において使用される胎盤組織に結合された細胞の浸透圧崩壊を引き起こすために用いられる。特定の実施形態において、約０．２５Ｍから５Ｍ, 約０．５Ｍから４Ｍ, 約０．７５Ｍから３Ｍ,又は約１．０Ｍから２．０ＭのＮａＣｌを含む溶液が、本明細書に開示される方法において使用される胎盤組織に結合された細胞の浸透圧崩壊を引き起こすために用いられる。
【００９９】
胎盤組織（例えば、羊膜、絨毛膜、及び除去された臍帯由来の、又は胎盤の絨毛膜由来の胎盤組織）を、浸透圧崩壊を引き起こす溶液に接触させるステップは、当業者の判断によるあらゆる温度で実行され得る。いくつかの実施形態において、当該ステップは、約０℃から３０℃、約５℃から２５℃、約５℃から２０℃、又は約５℃から１５℃で実行される。いくつかの実施形態において、当該ステップは、約０℃、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、又は約３０℃で実行される。特定の実施形態において、当該ステップは室温で実行される。他の特定の実施形態において、当該ステップは３７℃±５℃で実行される。
【０１００】
胎盤組織（例えば、羊膜、絨毛膜、及び除去された臍帯由来の、又は胎盤の絨毛膜由来の胎盤組織）を、浸透圧崩壊を引き起こす溶液に接触させるステップは、当業者の判断による適切な時間にわたって実行され得る。いくつかの実施形態において、当該ステップは、約１−２４時間、約２−２０時間、約５−１５時間、約８−１２時間、又は約２−５時間実行される。特定の実施形態において、当該ステップは、室温で約１８−２６時間実行される。他の特定の実施形態において、当該ステップは、３７℃±５℃で約１８−２６時間実行される。
【０１０１】
胎盤組織（例えば、羊膜、絨毛膜、及び除去された臍帯由来の、又は胎盤の絨毛膜由来の胎盤組織）を、洗浄剤に接触させるステップは、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物からの核酸の除去と同様に、細胞及び細胞残屑（例えば、細胞膜）の除去をもたらす。従って、本明細書に開示される方法において用いられる洗浄剤は、細胞又はオルガネラ膜（subcellular membranes）を崩壊させることができるものとして当業者に公知のあらゆる洗浄剤であり得る。いくつかの実施形態において、当該洗浄剤はイオン性である。例えば、いくつかの実施形態において、当該洗浄剤は、デオキシコール酸ナトリウム、デオキシコール酸、又はドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecylsulfate）である。いくつかの実施形態において、当該洗浄剤は両性イオン性である。いくつかの実施形態において、当該洗浄剤は非イオン性である。例えば、いくつかの実施形態において、当該洗浄剤は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）‐２０等のＴＷＥＥＮ（登録商標）洗浄剤又はＴｒｉｏｎＸ １００等のＴｒｉｏｎＸ洗浄剤であっても良い。コラーゲン組成物は、不必要な成分を当該組成物から取り除くために適するように当業者によって判断される条件下で洗浄剤に接触され得る。
【０１０２】
特定の実施形態において、本明細書に開示される方法において用いられる洗浄剤は、デオキシコール酸ナトリウム又はデオキシコール酸である。前記デオキシコール酸ナトリウム又はデオキシコール酸は、本明細書に開示される方法において、細胞、細胞残屑、及び核酸を取り除くために適した濃度で用いられ得る。本明細書に開示される方法の特定の実施形態において、デオキシコール酸ナトリウム又はデオキシコール酸は、例えば、最終濃度約１．５％、約２％、又は約２．５％で用いられ得る。特定の実施形態において、前記デオキシコール酸ナトリウム又はデオキシコール酸は、本明細書に開示される方法において、最終濃度約２％で用いられ得る。
【０１０３】
本明細書に開示される方法の他の特定の実施形態において、例えば、デオキシコール酸ナトリウム又はデオキシコール酸等の洗浄剤を例えばエチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminetetraacetic acid）（ＥＤＴＡ）のようなキレート剤と共に利用する方法には、第１の洗浄剤溶液において、そのようなデオキシコール酸ナトリウム又はデオキシコール酸が例えば最終濃度約０．０５％から約０．１％、約０．０５％から約０．２％、約０．２％から約０．３％、約０．３％から約０．４％、若しくは約０．４％から約０．５％、又は最終濃度約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、若しくは約０．５％で用いられ得る。特定のそのような実施形態において、デオキシコール酸ナトリウム又はデオキシコール酸は最終濃度約０．０６７％で用いられ得る。そのような第１の洗浄剤溶液中に存在するキレート剤に関して、キレート剤がＥＤＴＡである場合、そのようなＥＤＴＡは、例えば、最終濃度約１から約５ｍＭ、約２から約５ｍＭ、約２から約４ｍＭ、約３から約４ｍＭ、約３ｍＭから約５ｍＭ、約５から約１０ｍＭ、約６から約１０ｍＭ、約７から約９ｍＭ、若しくは約８から約１０ｍＭ、又は約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、又は１０ｍＭで用いられ得る。第１の洗浄剤溶液の特定の実施形態において、当該溶液は、デオキシコール酸ナトリウム又はデオキシコール酸を最終濃度で約０．０６７％含み得、ＥＤＴＡを最終濃度で約４ｍＭ含み得る。
【０１０４】
本明細書に開示される方法の実施形態において、例えば、デオキシコール酸ナトリウム又はデオキシコール酸等の洗浄剤をＥＤＴＡ等のキレート剤と共に利用する方法には、第２の洗浄剤溶液において、そのようなデオキシコール酸ナトリウム又はデオキシコール酸が例えば最終濃度約０．０５％から約０．１％、約０．０５％から約０．２％、約０．２％から約０．３％、約０．３％から約０．４％、若しくは約０．４％から約０．５％、又は最終濃度約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、若しくは約０．５％で用いられ得る。特定のそのような実施形態において、約０．２％から約０．６％のデオキシコール酸ナトリウム又はデオキシコール酸が最終濃度約０．３９％で用いられ得る。そのような第２の洗浄剤溶液中に存在するキレート剤に関して、キレート剤がＥＤＴＡである場合、そのようなＥＤＴＡは、例えば、最終濃度約１から約５ｍＭ、約２から約５ｍＭ、約２から約４ｍＭ、約３から約４ｍＭ、約３ｍＭから約５ｍＭ、約５から約１０ｍＭ、約６から約１０ｍＭ、約７から約９ｍＭ、若しくは約８から約１０ｍＭ、又は約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、又は１０ｍＭで用いられ得る。第１の洗浄剤溶液の特定の実施形態において、当該溶液は、デオキシコール酸ナトリウム又はデオキシコール酸を最終で濃度約０．３９％、ＥＤＴＡを最終濃度で約８ｍＭ含み得る。
【０１０５】
胎盤組織（例えば、羊膜、絨毛膜、及び除去された臍帯由来の、又は胎盤の絨毛膜由来の胎盤組織）を、洗浄剤に接触させるステップは、当業者の判断によるあらゆる温度で実行され得る。いくつかの実施形態において、当該洗浄剤処理は、約０℃から３０℃、約５℃から２５℃、約５℃から２０℃、又は約５℃から１５℃で実行される。いくつかの実施形態において、当該洗浄剤処理ステップは、約０℃、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、又は約３０℃で実行される。特定の実施形態において、洗浄剤処理ステップは室温で実行される。他の特定の実施形態において、当該洗浄剤処理ステップは３７℃±５℃で実行される。
【０１０６】
当該洗浄剤処理（キレート剤を用いるか又は用いない）は、当業者の判断による適切な時間にわたって実行され得る。いくつかの実施形態において、当該洗浄剤処理は、約１−２４時間、終夜、約２４−４８時間、又は約４８−７２時間実行される。特定の実施形態において、当該洗浄剤処理ステップは、約７２時間実行される。他の特定の実施形態において、当該洗浄剤処理ステップは、室温で約７２時間実行される。他の特定の実施形態において、当該洗浄剤処理ステップは、３７℃±５℃で約７２時間実行される。
【０１０７】
胎盤組織（例えば、羊膜、絨毛膜、及び除去された臍帯由来の、又は胎盤の絨毛膜由来の胎盤組織）を、塩基に接触させるステップは、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物からのいくつかのＥＣＭ成分の除去をもたらす。例えば、そのようなＥＣＭ組成物を変性させることによって、フィブロネクチン及びラミニンが除去される。当該塩基処理のための塩基の具体例は、生体適合性の塩基、揮発性塩基又は容易で安全にＥＣＭから除去されることが当業者に公知の塩基を含む。当該塩基は、例えば０．２Ｍから１．０Ｍの濃度の、当業者にとって公知のあらゆる有機又は無機の塩基であり得る。いくつかの実施形態において、当該塩基は、水酸化アンモニウム（ammonium hydroxide）、水酸化カリウム又は水酸化ナトリウムである。例えば、当該塩基は、水酸化アンモニウム溶液、水酸化カリウム溶液又は水酸化ナトリウム溶液である。
【０１０８】
特定の実施形態において、本明細書に開示される方法の塩基処理ステップにおいて用いられる塩基は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）である。ＮａＯＨは本明細書に開示される方法において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物から例えばラミニン及びフィブロネクチンを除去するために適したあらゆる濃度で用いられ得る。例えば、ＮａＯＨは本明細書に開示される方法において、約０．１Ｍ ＮａＯＨ、０．２５Ｍ ＮａＯＨ、０．５Ｍ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＯＨ、又は２Ｍ ＮａＯＨの濃度で用いられ得る。特定の実施形態では、ＮａＯＨは本明細書に開示される方法において、１Ｍ ＮａＯＨの濃度で用いられ得る。
【０１０９】
当該塩基処理ステップは、当業者の判断によるあらゆる温度で実行され得る。いくつかの実施形態において、当該塩基処理は、約０℃から３０℃、約５℃から２５℃、約５℃から２０℃、又は約５℃から１５℃で実行される。いくつかの実施形態において、当該塩基処理は、約０℃、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、又は約３０℃で実行される。特定の実施形態において、塩基処理ステップは室温で実行される。他の特定の実施形態において、当該塩基処理ステップは３７℃±５℃で実行される。
【０１１０】
当該塩基処理ステップは、当業者の判断による適切な時間にわたって実行され得る。いくつかの実施形態において、当該塩基処理は、約１５分−３０分、３０分−１時間、１−２時間、２−４時間、４−８時間、８−１２時間又は約１２−２４時間実行される。特定の実施形態において、当該塩基処理ステップは、約３０分間実行される。他の特定の実施形態において、当該塩基処理ステップは、室温で約３０分間実行される。他の特定の実施形態において、当該塩基処理ステップは、３７℃±５℃で約３０分間実行される。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法のステップのうちいくつかのステップ又は全てのステップは、滅菌状態下で実行される。さらなる実施形態において、本明細書に開示される方法によって調製されるＥＣＭ組成物は、当業者にとって明白な以下に記載する技術によって、さらに滅菌される。
【０１１２】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、ＥＣＭ組成物を作る方法であり、前記方法は、（i）羊膜、絨毛膜、及び臍帯を胎盤から（例えば、出産直後の母体から得られた胎盤から、又は保存された胎盤から）除去するステップと、（ii）例えば塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、例えば、１Ｍ ＮａＣｌ）などの、当該胎盤組織に結合された細胞の浸透圧崩壊を引き起こす溶液内に、残っている胎盤組織を入れて、当該胎盤組織を均質化するステップと、（iii）例えばデオキシコール酸ナトリウム（例えば、２％デオキシコール酸ナトリウム）などの洗浄剤を含む溶液に胎盤組織を接触させるステップと、（iv）例えば水などで胎盤組織を洗うステップと、（v）例えば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ、例えば、１Ｍ ＮａＯＨ）などの塩基を含む溶液に胎盤組織を接触させるステップと、（vi）例えば塩酸（ＨＣｌ）などの酸性溶液を、胎盤組織を含む溶液に加えて中性のｐＨ又は中性に近いｐＨ（例えば、ｐＨ６．０−８．０）とするステップと、（vii）胎盤組織を当該溶液の液体部分から分離し（例えば、遠心分離によって）、当該胎盤組織を回収するステップと、を含み、これによってＥＣＭ組成物を作る。当該方法によって生成するＥＣＭ組成物は、通常、ペースト状（ＥＣＭペースト）であり、後で使用するために回収後に冷凍され、保管され得るか、又は回収後直ちに本明細書に記載されたＥＣＭ調製物、例えば、ＥＣＭシートの調製物、ＥＣＭ粒子の調製物、又はＥＣＭ流動性基質などの製造に使用され得る。
【０１１３】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、ＥＣＭ組成物を作る方法であり、前記方法は、（i）羊膜、絨毛膜、及び臍帯を胎盤から（例えば、出産直後の母体から得られた胎盤から、又は保存された胎盤から）除去するステップと、（ii）胎盤を細片に切る、例えば、２×２センチメートルの細片に切るステップと、（iii）胎盤組織を１．５リットルの１Ｍ ＮａＣｌ溶液に入れ、（例えば、オムニインターナショナル社製（Omni International, Kennesaw, GA）のオムニミクサーホモジナイザー（Omni Mixer Homogenizer）を用いて）当該胎盤組織を均質化するステップと、(iv)均質化された胎盤組織を処理容器（例えば、バッグ）に入れ、１Ｍ ＮａＣｌを９．２リットルとなるように加えるステップと、（v）均質化された胎盤組織を1Ｍ ＮａＣｌで３回洗浄するステップであって、当該洗浄は、（a）当該処理容器を攪拌器上で１０分間攪拌するステップ、（b）、胎盤組織を処理容器内で１０分間沈殿させるステップ、及び（c）６．２リットルの上澄みを重力排水（gravity drainage）によって除去するステップを含むステップと、（vi）洗浄された胎盤組織を残りの１Ｍ ＮａＣｌ溶液内で、室温で〜１８−２６時間、攪拌器上で混合させるステップと、（vii）上述したように、胎盤組織を水で４回洗浄するステップと、（viii）洗浄された胎盤組織を水の中で、室温で〜１８−２６時間、攪拌器上で混合させるステップと、（ix）一晩水の中で混合させた後、最後にもう１回、上述したように水で洗浄し、その後、３％のデオキシコール酸ナトリウムを６．２Ｌ、当該混合物に加え、デオキシコール酸ナトリウムの濃度を２％とするステップと、（x）胎盤組織を２％のデオキシコール酸ナトリウム溶液中、室温で〜７２時間、攪拌器上で混合させるステップと、（xi）胎盤組織を水中で５回、上記した態様で洗浄するステップと、（xii）最後に水を加えた後、１Ｍ ＮａＯＨを加えることによって当該溶液のｐＨを約１０−１２に調整し、塩基性溶液とするステップと、（xiii）胎盤組織を当該塩基性溶液中、室温で〜３０分間、攪拌器上で混合させるステップと、（xiv）０．１Ｎ ＨＣｌを用いて当該溶液のｐＨを約７．０−７．５に調節するステップと、（xv）処理容器から、(例えば、遠心分離によって)上澄みを除去し、胎盤組織を回収するステップと、を含み、これによってＥＣＭ組成物を作る。
【０１１４】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、ＥＣＭ組成物を作る方法であり、前記方法は、（i）胎盤から（例えば、出産直後の母体から得られた胎盤から、又は保存された胎盤から）絨毛膜を取得するステップと、（ii）胎盤絨毛膜（placental chorion）を、例えば塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、例えば、１Ｍ ＮａＣｌ）などの、当該胎盤絨毛膜に結合された細胞の浸透圧崩壊を引き起こす溶液内に入れて、当該胎盤絨毛膜を均質化するステップと、（iii）例えばデオキシコール酸ナトリウム（例えば、２％デオキシコール酸ナトリウム）などの洗浄剤を含む溶液に胎盤絨毛膜組織を接触させるステップと、（iv）例えば水などで胎盤絨毛膜組織を洗浄するステップと、（v）例えば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ、例えば、１Ｍ ＮａＯＨ）などの塩基を含む溶液に胎盤絨毛膜組織を接触させるステップと、（vi）例えば塩酸（ＨＣｌ）などの酸性溶液を、胎盤絨毛膜組織を含む溶液に加えて中性のｐＨ又は中性に近いｐＨ（例えば、ｐＨ６．０−８．０）とするステップと、（vii）胎盤絨毛膜組織を当該溶液の液体部分から分離し（例えば、遠心分離によって）、当該胎盤絨毛膜組織を回収するステップと、を含み、これによってＥＣＭ組成物を作る。当該方法によって生成するＥＣＭ組成物は、通常、ペースト状（ＥＣＭペースト）であり、後で使用するために回収後に冷凍され、保管され得るか、又は回収後直ちに本明細書に記載されたＥＣＭ調製物、例えば、ＥＣＭシートの調製物、ＥＣＭ粒子の調製物、又はＥＣＭ流動性基質などの製造に使用され得る。いくつかの実施形態において、当該方法の様々なステップ（例えば、浸透圧崩壊、洗浄剤処理、洗浄、塩基処理）は、室温で実行される。いくつかの実施形態において、当該方法の様々なステップ（例えば、浸透圧崩壊、洗浄剤処理、洗浄、塩基処理）は、３７℃±５℃で実行される。いくつかの実施形態において、洗浄ステップは、１／２から２リットルの体積の液体を用いて１−３回実行される。
【０１１５】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、ＥＣＭ組成物を作る方法であり、前記方法は、（i）胎盤から（例えば、出産直後の母体から得られた胎盤から、又は保存された胎盤から）絨毛膜を取得するステップと、（ii）絨毛膜を細片に切る、例えば、２×２センチメートルの細片に切るステップと、（iii）胎盤絨毛膜組織を１．５リットルの１Ｍ ＮａＣｌ溶液に入れ、（例えば、オムニインターナショナル社製（Omni International, Kennesaw, GA）のオムニミクサーホモジナイザー（Omni Mixer Homogenizer）を用いて）当該胎盤組織を均質化する（ホモジナイズする）（homogenizing）ステップと、(iv)均質化された胎盤絨毛膜組織を処理容器（例えば、バッグ）に入れ、１Ｍ ＮａＣｌを９．２リットルとなるように加えるステップと、（v）均質化された胎盤絨毛膜組織を1Ｍ ＮａＣｌで３回洗浄するステップであって、当該洗浄は、（a）当該処理容器を攪拌器上で１０分間攪拌するステップ、（b）、胎盤絨毛膜組織を処理容器内で１０分間沈殿させるステップ、及び（c）６．２リットルの上澄みを重力排水によって除去するステップを含むステップと、（vi）洗浄された胎盤絨毛膜組織を残りの１Ｍ ＮａＣｌ溶液内で、室温で〜１８−２６時間、攪拌器上で混合させるステップと、（vii）上述したように、胎盤絨毛膜組織を水で４回洗浄するステップと、（viii）洗浄された胎盤絨毛膜組織を水の中で、室温で〜１８−２６時間、攪拌器上で混合させるステップと、（ix）一晩水の中で混合させた後、最後にもう１回、上述したように水で洗浄し、その後、３％のデオキシコール酸ナトリウムを６．２Ｌ、当該混合物に加え、デオキシコール酸ナトリウムの濃度を２％とするステップと、（x）胎盤絨毛膜組織を２％のデオキシコール酸ナトリウム溶液中、室温で〜７２時間、攪拌器上で混合させるステップと、（xi）胎盤絨毛膜組織を水中で５回、上記した態様で洗浄するステップと、（xii）最後に水を加えた後、１Ｍ ＮａＯＨを加えることによって当該溶液のｐＨを約１０−１２に調整し、塩基性溶液とするステップと、（xiii）胎盤絨毛膜組織を当該塩基性溶液中、室温で〜３０分間攪拌器上で混合させるステップと、（xiv）０．１Ｎ ＨＣｌを用いて当該溶液のｐＨを約７．０−７．５に調節するステップと、（xv）処理容器から、(例えば、遠心分離によって)上澄みを除去し、胎盤絨毛膜組織を回収するステップと、を含み、これによってＥＣＭ組成物を作る。いくつかの実施形態において、洗浄ステップは、１／２から２リットルの体積の液体を用いて実行される。
【０１１６】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、ＥＣＭ組成物を作る方法であり、前記方法は、（i）絨毛膜、例えば絨毛膜板を胎盤から（例えば、出産直後の母体から得られた胎盤から、又は保存された胎盤から）取得するステップと、（ii）絨毛膜を擦り、清浄にするステップと、（iii）絨毛膜組織を、例えば塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、例えば、０．５Ｍ ＮａＣｌ）などの、当該絨毛膜組織に結合された細胞の浸透圧崩壊を引き起こす溶液内に入れるステップと、（iv）例えばデオキシコール酸又はデオキシコール酸ナトリウム（例えば、２％デオキシコール酸又はデオキシコール酸ナトリウム）などの洗浄剤を含む溶液に絨毛膜組織を接触させ、そして例えば水によってリンスするなどのリンスするステップと、（v）すり潰し、凍結乾燥するステップと、を含む。当該ＥＣＭ組成物は、通常、ペースト（ＥＣＭペースト）であり、例えば、粉砕されて調製され、様々な形状又は形態で調製され得る。例えば、当該ＥＣＭ組成物は、ＥＣＭシート、ＥＣＭ粒子の調製物、又はＥＣＭ流動性基質などに調製され得る。いくつかの実施形態において、当該方法の様々なステップ（例えば、浸透圧崩壊、洗浄剤処理、リンス）は、室温で実行される。いくつかの実施形態において、当該方法の様々なステップ（例えば、浸透圧崩壊、洗浄剤処理、リンス）は、３７℃±５℃で実行される。いくつかの実施形態において、洗い流しステップは、１／２から２リットルの体積の液体を用いて１−３回実行される。
【０１１７】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、ＥＣＭ組成物を作る方法であり、前記方法は、次のようなステップを順に含む：（i）満期産直後の母体からヒト胎盤（human placenta）を取得するか又は前もって分離された冷凍のヒト胎盤であって解凍されているもの、例えば、室温で約２４時間解凍されたものを取得するステップと、（ii）胎盤を０．５Ｍ ＮａＣｌ中で洗浄するステップと、（iii）羊膜、臍帯及び壁側脱落膜を胎盤から除去し、胎盤の絨毛膜板を保持するステップと、（iv）絨毛膜を擦り、清浄にするステップと、（v）０．５Ｍ ＮａＣｌ中及び水中で絨毛膜をリンスするステップと、（vi）絨毛膜を２％デオキシコール酸内で一晩リンスし、続いて水リンスを数回、例えば、３、４、５、６、７回又はそれ以上の水リンスを行うステップと、（vii）当該処理された絨毛膜を粉砕し、凍結乾燥するステップ。当該ＥＣＭ組成物は、通常、ペースト（ＥＣＭペースト）であり、例えば、粉砕されて調製され、様々な形状又は形態で調製され得る。例えば、当該ＥＣＭ組成物は、ＥＣＭシート、ＥＣＭ粒子の調製物、又はＥＣＭ流動性基質などに調製され得る。いくつかの実施形態において、当該方法の様々なステップ（例えば、ＮａＣｌ処理、デオキシコール酸処理、リンス）は、室温で実行される。いくつかの実施形態において、当該方法の様々なステップ（例えば、ＮａＣｌ処理、デオキシコール酸処理、リンス）は、３７℃±５℃で実行される。いくつかの実施形態において、当該リンスステップは、１／２から２リットルの体積の液体を用いて１−３回実行される。
【０１１８】
他の特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、ＥＣＭ組成物を作る方法であり、前記方法は、（i）絨毛膜、例えば絨毛膜板を胎盤から（例えば、出産直後の母体から得られた胎盤から、又は保存された胎盤から）取得するステップと、（ii）絨毛膜を擦り、清浄にするステップと、（iii）絨毛膜組織を、例えば塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、例えば、１．０Ｍ ＮａＣｌ）などの、当該絨毛膜組織に結合された細胞の浸透圧崩壊を引き起こす溶液内に入れるステップと、（iv）例えばデオキシコール酸又はデオキシコール酸ナトリウム（例えば、０．０５％−０．２％又は０．３％−０．６％のデオキシコール酸又はデオキシコール酸ナトリウム）などの洗浄剤及びＥＤＴＡ（例えば、１−５ｍＭ ＥＤＴＡ又は５−１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を含む第１の洗浄剤溶液に絨毛膜組織を接触させるステップと、（v）例えばデオキシコール酸又はデオキシコール酸ナトリウム（例えば、０．０５％−０．２％又は０．３％−０．６％のデオキシコール酸又はデオキシコール酸ナトリウム）などの洗浄剤及びＥＤＴＡ（例えば、１−５ｍＭ ＥＤＴＡ又は５−１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を含む第２の洗浄剤溶液に絨毛膜組織を接触させ、そして例えば水などによって洗い流すステップと、（vi）凍結乾燥し、脱細胞され凍結乾燥された、全絨毛膜を得るステップと、を含む。当該全絨毛膜は、例えば、粉砕されて溶液（例えば、水又はリン酸緩衝生理食塩水）中に再懸濁されて、調製され得、脱細胞されたＥＣＭペーストを形成し得る。そして、例えばＥＣＭシート、ＥＣＭ粒子の調製物、又はＥＣＭ流動性基質などの様々な形状又は形態に調製され得る。いくつかの実施形態において、当該方法の様々なステップ（例えば、浸透圧崩壊、洗浄剤／ＥＤＴＡ処理、リンス）は、室温で実行される。いくつかの実施形態において、当該方法の様々なステップ（例えば、浸透圧崩壊、洗浄剤／ＥＤＴＡ処理、リンス）は、３７℃±５℃で実行される。いくつかの実施形態において、当該リンスステップは、１／２から２リットルの体積の液体を用いて１−３回実行される。
【０１１９】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、ＥＣＭ組成物を作る方法であり、前記方法は、次のようなステップを順に含む：（i）満期産直後の母体からヒト胎盤を取得するか又は前もって分離された冷凍のヒト胎盤であって解凍されているもの、例えば、室温で約２４時間解凍されたものを取得するステップと、（ii）羊膜、臍帯及び壁側脱落膜を胎盤から除去し、胎盤の絨毛膜板を保持するステップと、（iii）絨毛膜を擦り、清浄にするステップと、（iv）１．０Ｍ ＮａＣｌ中及び水中で絨毛膜をリンスするステップと、（v）０．０６７％のデオキシコール酸及び４ｍＭ ＥＤＴＡを含む第１の洗浄剤溶液中で絨毛膜を一晩リンスし、続いて水リンスを数回、例えば、３、４、５、６、７回又はそれ以上の水リンスを行うステップと、（vi）０．３９％のデオキシコール酸及び８ｍＭ ＥＤＴＡを含む第２の洗浄剤溶液中で絨毛膜を一晩リンスし、続いて水リンスを数回、例えば、３、４、５、６、７回又はそれ以上の水リンスを行うステップと、（vii）処理された絨毛膜を凍結乾燥するステップ。生成した組成物は、脱細胞されたＥＣＭペーストであり、さらなる調製に適している。例えば、当該組成物は、粉砕されて調製される。いくつかの実施形態において、当該方法の様々なステップ（例えば、ＮａＣｌ処理、デオキシコール酸／ＥＤＴＡ処理、リンス）は、室温で実行される。いくつかの実施形態において、当該方法の様々なステップ（例えば、ＮａＣｌ処理、デオキシコール酸／ＥＤＴＡ処理、リンス）は、３７℃±５℃で実行される。いくつかの実施形態において、当該リンスステップは、１／２から２リットルの体積の液体を用いて１−３回実行される。
【０１２０】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、ＥＣＭシートを生成する方法であり、前記方法は、（i）本明細書に開示される方法に従ってＥＣＭペーストを準備するステップと、（ii）ＥＣＭペーストを例えば水中に懸濁し、例えばＥＣＭを型に入れるなど、シートを形成するために適した基板に当該懸濁されたＥＣＭ溶液を入れるステップと、（iii）ＥＣＭを凍結させるステップと、（iv）凍結したＥＣＭを凍結乾燥させるステップと、（v）凍結乾燥されたＥＣＭを基板から取り外して水に浸すステップと、（vi）例えば真空乾燥機を用いて、ＥＣＭを乾燥させるステップと、を含む。脱水後、乾燥前に、本明細書に開示されるＥＣＭシートは、例えばブロック、チューブ、又は他の形状などのあらゆる有用な形状に成形され得る。
【０１２１】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、ＥＣＭ粒子を生成する方法であり、前記方法は、（i）本明細書に開示される方法に従ってＥＣＭペーストを準備するステップと、（ii）ＥＣＭペーストを例えば水中に、懸濁するステップと、（iii）
ＥＣＭを凍結させるステップと、（iv）凍結したＥＣＭを凍結乾燥させるステップと、（v）凍結乾燥されたＥＣＭを粉砕するステップと、を含む。
【０１２２】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるものは、ＥＣＭ流動性基質を生成する方法であって、前記方法は、（i）本明細書に開示される方法に従ってＥＣＭペーストを準備するステップと、（ii）ＥＣＭペーストを例えば水中に、懸濁するステップと、（iii）ＥＣＭを凍結させるステップと、（iv）凍結したＥＣＭを凍結乾燥させるステップと、（v）凍結乾燥されたＥＣＭを微粉末化するステップと、を含む。微粉末化されたＥＣＭを例えば生理食塩水などに再懸濁することで、ＥＣＭ流動性基質が生成される。
【０１２３】
本明細書に開示される方法によって生成されたＥＣＭ組成物の凍結乾燥は、技術分野において公知のあらゆる手段によって達成され得、加えて、一般にＥＣＭ組成物が実質的に乾燥するまで、例えば、水が重量で約３０％、２５％、２０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満となるまで進行する。
【０１２４】
４．２．１任意の追加的な処理
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、付加的なステップを包含する。例えば、当該付加的なステップは、細胞の浸透圧崩壊を起こすことができる溶液、洗浄剤、又は塩基以外の他の薬剤を伴って調製されるＥＣＭ組成物の処理をもたらすステップである。
【０１２５】
特定の実施形態において、本明細書に開示される方法は、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）を伴って本明細書に開示される方法によって調製されるＥＣＭ組成物の処理を含む。ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）は、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）由来の遺伝子操作されたエンドヌクレアーゼであり、全ての型のＤＮＡ及びＲＮＡを攻撃して分解する。従って、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）は、本明細書に開示される方法によって、生成するＥＣＭ組成物が核酸を含まない（又は実質的に含まない）ことを確実にするために用いられ得る。ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）による処理後、ＥＣＭ組成物は高いｐＨとなるように処理され得、その後、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）を不活性化させるために適した条件である低いｐＨとなるように処理され得る。
【０１２６】
特定の実施形態において、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される方法によって、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて調製されるＥＣＭ組成物の処理を含む。ＥＤＴＡは、当業者に周知の金属キレート剤であり、本明細書に開示される方法によって、二価金属イオンを本明細書に開示されるＥＣＭ組成物から除去するために用いられ得る。ＥＤＴＡは、当業者に公知の方法を用いてＥＣＭ組成物から洗い流され得る。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物中のコラーゲンは、架橋され得る。当該架橋は、例えば上述した架橋剤等の、当業者に公知のあらゆる架橋剤によってなされ得る。いくつかの実施形態において、架橋剤はグルタルアルデヒドであり、当該架橋は、当業者に公知の、コラーゲンをグルタルアルデヒドで架橋する方法によって実行される。他の実施形態において、架橋剤は1,4−ブタンジオールジグリシジルエーテル又はゲニピンである。
【０１２８】
４．２．２保存
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、室温で保存される（例えば、〜２２−２５℃）。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、低温で保存され、例えば、約０℃、約４℃、又は約８℃の温度で冷蔵される。いくつかの実施形態において、ＥＣＭは、冷蔵されない。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、例えば０℃よりも低い温度で冷凍保存される。当該温度は、例えば、−１０℃，−１５℃，−２０℃，−２５℃，−３０℃，−３５℃，−４０℃，−４５℃，−５０℃，−５５℃，−６０℃，−６５℃，−７０℃，−７５℃，−８０℃，若しくは−８５℃又はより低い温度である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物の前記凍結及び保管は、０℃から−１０℃,−１０℃から−２０℃, −２０℃から−３０℃, −３０℃から−４０℃, −４０℃から−５０℃, −５０℃から−６０℃, −６０℃から−７０℃,又は−７０℃から−８０℃の間の温度で行われる。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、無菌の状態下で、かつ、酸化しない状態下で保管される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、上記で特定した温度のいずれかの温度で、１２か月間か又はそれ以上の間保管される。
【０１３０】
４．２．３．滅菌
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、そのような組成物を滅菌するための当業者に公知の技術によって滅菌される。特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、例えばガンマ線照射等、放射線によって滅菌される。
【０１３１】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物の滅菌は、当業者に公知の方法を用いた電子ビーム照射によって実行される。例えば、当該方法について、バイロム（Gorham, D. Byrom (ed.)）, 1991, Biomaterials, Stockton Press, New York, 55-122ページを参照されたい。バクテリア又は他の潜在的な汚染微生物の少なくとも９９．９％を殺すために十分なあらゆる放射線量は、本明細書に開示される方法の範囲内である。特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物の最終的な滅菌を達成するために少なくとも１８−２５ｋＧｙの線量が用いられる。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、エンドトキシンを通過させ、かつ、ＥＣＭ組成物を保持するフィルターを通してろ過される。例えば３０ｋＤａなど、エンドトキシンをろ過するための当業者に公知のあらゆるサイズのフィルターが用いられ得る。いくつかの実施形態において、当該フィルターは５ｋＤａと１００ｋＤａとの間であり、例えば、当該フィルターは、約５ｋＤａ，約１０ｋＤａ，約１５ｋＤａ，約２０ｋＤａ，約３０ｋＤａ，約４０ｋＤａ，約５０ｋＤａ，約６０ｋＤａ，約７０ｋＤａ，約８０ｋＤａ，約９０ｋＤａ，又は約１００ｋＤａである。当該フィルターは、例えばセルロース又はポリエーテルスルホンなどの本明細書に開示されるＥＣＭ組成物に適合することが当業者に知られているあらゆる材料からなるものであり得る。当該ろ過は、当業者に所望される回数繰り返され得る。標準的な技術によってエンドトキシンが検出され得、浄化値（クリアランス）（clearance）がモニタされ得る。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、ろ過されてウイルス粒子を含まないか又は低減されたＥＣＭ組成物を生成する。ウイルスの除去に有効であることが当業者に公知であるあらゆるフィルターが用いられ得る。例えば、１０００ｋＤａのフィルターは、パルボウイルス、Ａ型肝炎ウィルス、及びＨＩＶを除去又は低減するために用いられ得る。７５０ｋＤａのフィルターは、パルボウイルス及びＡ型肝炎ウィルスを除去又は低減するために用いられ得る。５００ｋＤａのフィルターは、パルボウイルスを除去又は低減するために用いられ得る。当該フィルターは、例えばセルロース又はポリエーテルスルホンなどの本明細書に開示されるＥＣＭ組成物に適合することが当業者に知られているあらゆる材料からなるものであり得る。当該ろ過は、当業者に所望される回数繰り返され得る。標準的な技術によってウィルスの存在が検出され得、クリアランスがモニタされ得る。
【０１３４】
４．３．使用
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物（４．１参照）は、非常に多くの方法及び多くの目的で使用され得、限定するものではないが、パッチ又は組織のプラグ又は基質材料、人工装具、及び他のインプラント等の構造物を含む培養組織及び器官の製造におけるＥＣＭ組成物の使用；組織の足場としてのＥＣＭ組成物の使用；創傷の修復又は被覆におけるＥＣＭ組成物の使用；止血デバイスとしてのＥＣＭ組成物の使用；例えば縫合、手術用及び整形外科用のスクリュー、手術用及び整形外科用のプレート、人工のインプラント、美容的インプラント（cosmetic implants）及びサポートのための天然の被覆材又は天然の部品等の、組織の修復及び支持において使用するためのデバイスとしてのＥＣＭ組成物の使用；器官又は組織の修復又は構造的支持におけるＥＣＭ組成物の使用；物質輸送のためのＥＣＭ組成物の使用；生物工学プラットフォーム（bioengineering platforms）としてのＥＣＭ組成物の使用；細胞に対する物質の効果を試験するためのプラットフォームとしてのＥＣＭ組成物の使用；及び細胞培養におけるＥＣＭ組成物の使用を含む。さらに、ＥＣＭ組成物は、美容の目的で使用され得る。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物の使用は、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を被検体に投与することを必要とする。本明細書において使用される「被検体（subject）」の用語は、限定するものではないが、霊長類（例えば、ヒト）、牛、羊、ヤギ、馬、犬、猫、ウサギ、ラット、マウス等を含む哺乳類などの動物を称する。特定の実施形態において、当該被検体はヒトである。
【０１３６】
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物をインビボ（in vivo）で被検体に投与する方法は、限定するものではないが、経口投与（例えば、口腔投与又は舌下投与）、局所適用、エアロゾル適用、経皮投与、皮内投与、皮下投与、筋内投与、及び外科的投与を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される用途の一部として、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、クリーム、ゲル、溶液、懸濁液、リポソーム又は他の治療用及び美容用成分の調製及び輸送（delivery）の手段として当業者に公知の形態で適用され得る。皮下投与のための適切な調製物のいくつかの例は、限定するものではないが、インプラント、デポー、針（ニードル）、カプセル及び浸透圧ポンプを含む。経口投与のための適切な調製物のいくつかの実施例は、限定するものではないが：ペースト、パッチ、シート、液体、シロップ、懸濁液、エアロゾル及びミストを含む。経皮投与のための適切な調製物のいくつかの実施例は、限定するものではないが、クリーム、ペースト、パッチ、スプレー及びゲルを含む。皮下投与のための適切な輸送機構のいくつかの例は、限定するものではないが、インプラント、デポー、ニードル、カプセル、及び浸透圧ポンプを含む。
【０１３８】
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、所望の生理学的又は薬理学的な結果を生じるであろう任意の形態及び／又は濃度で被検体に投与され得る。ＥＣＭ組成物の形態及び濃度は、所望の治療終点（therapeutic endpoint）、作用部位又は体液中での所望有効濃度、及び投与のタイプに依存するであろう。被検体への物質の投与に関する情報は、当業者に公知であり、例えば、グッドマン（L. S. Goodman）及び ギルマン（A. Gilman）, eds, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Macmillan Publishing, New York, 及びカッツァング（Katzung）, Basic & Clinical Pharmacology, Appleton & Lang, Norwalk, Conn., (6th Ed. 1995)などの参照において見出されるであろう。所望の療法の技術分野に熟練した施術者（practitioner）が、状況及び投与されるべき物質による要求に応じて、特定の形態及び濃度、並びに投与の頻度を選択してもよい。
【０１３９】
４．３．１．創傷治療における使用
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、創傷の治療において使用される。
【０１４０】
１つの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、当該ＥＣＭ組成物を被検体の皮膚を覆って、創傷の部位に直接置くことによって創傷の治療に使用され、従って創傷は被覆される。他の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、当該ＥＣＭ組成物を、例えば皮下埋め込み等のインプラントとして用いることによって、創傷の治療に使用される。当業者は、ＥＣＭ組成物のいくつかの調製物がそのような仕様に適することを明確に理解するであろう。例えば、シートとして調製されたＥＣＭ組成物は、当該ＥＣＭシートを被検体の皮膚上の創傷を覆って直接置くことによって、創傷治療に使用され得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、創傷の治療に使用される際に、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は１つ以上の薬理活性物質を含むように調製され得る。当該薬理活性物質は、限定するものではないが、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、上皮成長因子、トランスフォーミング成長因子ベータ、血管新生因子、抗生物質、抗真菌薬、殺精子剤、ホルモン、酵素、及び酵素阻害薬を含む。
【０１４２】
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物によって治療され得る創傷は、限定するものではないが、上皮創傷、皮膚創傷、慢性創傷、急性創傷、外部創傷、内部創傷（例えば、ＥＣＭ組成物は、縫合線からの血液の漏出を防ぐために、加えて、体が縫合材料に対して癒着を形成することを防ぐために、外科手術の間に吻合部位に巻き付けられても良い）、先天性創傷（例えば、ジストロフィー性表皮水泡症）、褥瘡（例えば、褥瘡性潰瘍）、一部の層及び全層の創傷（partial and full-thickness wounds）、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、慢性血管潰瘍、トンネル状／穿掘性創傷（tunneled/undermined wounds）、手術創傷（例えば、ドナー部位／移植片、モース手術後、レーザー手術後、足治療（podiatric）、創傷裂開）、外傷創傷（例えば、剥離、裂傷、第２度熱傷及び皮膚裂傷）、及び排液性創傷を含む。
【０１４３】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、限定されないが、第１度熱傷、第２度熱傷（一部の層の熱傷（partial thickness burns））、第３度熱傷（全層熱傷（full thickness burns））、熱傷創の感染、切除された熱傷創及び切除されていない熱傷創の感染、以前に移植されたか若しくは治癒された熱傷創からの上皮の喪失、及び熱傷創の膿痂疹を含む火傷及び／又は火傷に関連する状態の治療に使用される。
【０１４４】
４．３．２．歯科用
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、歯の疾病及び歯牙障害の治療に使用される。
【０１４５】
１つの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、歯根膜手術、歯周組織を再生するための組織再生誘導法、誘導骨再生、及び／又は根面被覆において使用される。そのような方法は、限定するものではないが、整合（matched）両側歯周欠損（bilateral periodontol defects）、歯間骨内欠損（interdental intrabony defects）、深部３壁性骨内欠損（deep 3-wall intrabony defects）、２壁性骨内欠損（2-wall intrabony defects）及び骨内欠損２及び３（intrabony defects 2 and 3）を含む歯周部の骨内欠損の再生を促進するためのＥＣＭ組成物の用途を包含する。
【０１４６】
他の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、限定するものではないが、両側欠損、対の頬側クラスII下顎軟骨大臼歯分岐部欠損（paired buccal Class II mandibular molar furcation defects）、及び両側の下顎分岐部欠損（bilateral mandibular furcation defect）を含むクラスII分岐部欠損（class II furcation defects）の治療に使用される。
【０１４７】
他の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、限定するものではないが、歯周炎及び歯肉炎を含む歯周病の治療に使用される。１つの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、例えば、グルコン酸クロルヘキシジン等の抗生物質が含浸されたＥＣＭ組成物を被検体の１つ以上の、例えば、５ｍｍより大きいか又は５ｍｍ程度の歯周ポケットに挿入することによって、歯周病を有する被検体を治療するために使用され得る。
【０１４８】
４．３．３口腔病変
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、口腔病変の治療において使用される。前記病変は歯科手術又は口腔手術によって引き起こされるものではない。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるものは、口腔病変を有する被検体を治療する方法である。当該方法は、例えば、治療効果のある量の本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を口腔病変へ投与すること等の被検体への投与を含む。この文脈において「治療効果のある量」は、口腔病変の少なくとも１つの症状又は態様を低減又は除去する、ＥＣＭ組成物の量を意味する。例えば、当該ＥＣＭ組成物は病変を修復するために投与され得るか、又は、例えば、口腔病変に起因するか若しくは付随する痛み若しくは炎症を低減させる等のための苦痛緩和剤として投与され得る。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、治療の手段として、口腔病変に直接投与される。他の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、口腔病変の少なくとも一部分の、近傍に又は周辺に投与される。そのような投与は、例えば、口腔病変の少なくとも一部分又は全体を覆ってＥＣＭ組成物のシートを配置することによってなされ得る。いくつかの実施形態において、ＥＣＭ組成物はペーストとして口腔病変に投与される。いくつかの実施形態において、ＥＣＭ組成物はスプレー又はエアロゾルの形態で口腔病変に投与される。いくつかの実施形態において、ＥＣＭ組成物は、例えば洗口液等の溶液の形態で口腔病変に投与される。
【０１５０】
本明細書に開示される方法によって治療される口腔病変は、口腔病変を引き起こすことが技術分野において公知の様々な条件又は治療によって引き起こされ得る。１つの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を用いて治療される口腔病変は、例えば落屑性口腔疾患（desquamating oral disorder）等の、落屑（desquamation）に起因するか又は付随する。他の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を用いて治療される口腔病変は、例えばベーチェット病（Behcet’s disease）に起因するか又はベーチェット病の一部であるアフタ性潰瘍等の、アフタ性潰瘍である。他の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を用いて治療される口腔病変は、被検体の顎骨壊死に起因するか又は付随する。
【０１５１】
他の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を用いて治療される口腔病変は、移植片対宿主疾患（graft-versus-host disease）に起因するか又は付随する。他の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を用いて治療される口腔病変は、口腔病変を有する被検体によるメルファランの使用に起因するか又は付随する。
【０１５２】
他の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を用いて治療される口腔病変は、化学療法に起因するか又は付随する。当該化学療法は、例えば、腫瘍、血液癌、又は他のタイプの癌を治療するために被検体に施されている化学療法等の化学療法である。特定の実施形態において、口腔病変は、化学療法後の口腔粘膜炎又は化学療法による口腔粘膜炎（chemotherapy-induced oral mucositis）に起因する。他の実施形態において、当該口腔病変は、例えば特発性の（idiopathic）アフタ性口内炎等の、アフタ性口内炎であるか又はアフタ性口内炎と診断される。他の特定の実施形態において、口腔病変は、口腔病変を有する被検体によるｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳類標的；mammalian target of rapamycin）阻害剤の使用に起因するか又は付随する。他の特定の実施形態において、口腔病変は、口腔病変を有する被検体による５−フルオロウラシルの使用に起因するか又は付随する。特定の実施形態において、口腔病変が化学療法に起因するか又は付随する場合、当該口腔病変は、例えば化学療法剤に起因するか又は付随し、当該化学療法剤は、例えば、アルキル化剤（例えば、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロフォスファミド、ダカルバジン、イホスファミド、メクロレタミン又はメルファラン）；代謝拮抗物質（例えば、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン又はフルダラビン）；抗がん効果を有する抗生物質（例えば、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン又はイダルビシン）又は分裂抑制因子（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン又はビノレルビン（vinorelbine））である。他の特定の実施形態において、前記被検体が例えば化学療法等の一連の治療を受けているか又は受けたことがある場合、前記被検体における前記口腔病変の進行は、前記治療の早期終了（premature termination）をもたらすか又はもたらすことが予期される。この文脈において、「早期終了」は、部分的に又は全体的に前記口腔病変の結果として、一連の治療が、前記被検体に規定されていたよりも前に終了することを意味する。
【０１５３】
他の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を用いて治療される口腔病変は、治療を必要とする被検体への抗体の投与に起因するか又は付随する。いくつかの実施形態において、当該抗体は、アンチＣＤ２０抗体（anti-CD20 antibody）である。特定の実施形態において、当該抗体は、リツキシマブ（rituximab）（例えば、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、オファツムマブ（ofatumumab）（例えば、ＡＲＺＥＲＲＡ（登録商標））、ベルツズマブ（veltuzumab）又はオクレリズマブ（ocrelizumab）である。他の実施形態において、当該抗体は、抗腫瘍壊死因子抗体（anti-tumor necrosis factor antibody）である。さらに特定の実施形態において、当該抗体は、アダリムマブ（adalimumab）（例えば、ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、エタネルセプト（etanercept）（例えば、ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、インフリキシマブ（infliximab）（例えば、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、セルトリズマブペゴル（certolizumab pegol）（ＣＩＭＺＩＡ（登録商標））、ナタリズマブ（natalizumab）（例えば、ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標））、又はゴリムマブ（golimumab）（例えば、ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標））である。他の実施形態において、前記被検体が抗体治療を受けているか又は受けたことがある場合、前記被検体における前記口腔病変の進行は、前記抗体治療の早期終了（premature termination）をもたらす。この文脈において、「早期終了」は、部分的に又は全体的に前記口腔病変の結果として、抗体治療が、前記被検体に規定されていたよりも前に終了することを意味する。
【０１５４】
４．３．４．空隙充填
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、被検体の体内の空隙（void）をシール（seal）、充填、及び／又は他の処置をするために使用される。本明細書において使用される「空隙」の語は、被検体における好ましくない如何なる空洞をも包含することを意図している。当該好ましくない空洞は、例えば、加齢、疾患、手術、先天性異常、又はこれらの組み合わせによって形成される。例えば、空隙は、腫瘍又は他の塊（mass）を被検体から外科的に除去した後に形成され得る。本明細書に開示されるＥＣＭ組成物によって充填され得る空隙の限定的ではない具体例は、亀裂、瘻孔（fistula）、憩室、動脈瘤、嚢胞（cyst）、損傷、又は他の、被検体の体の様々な器官又は組織におけるあらゆる好ましくない空洞を含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、組織、器官又は他の体の構造体（例えば、血管）、又は近接する組織間、器官間又は構造体間の接合部、の中の裂け目、亀裂、又は瘻孔の全体又は部分を、充填、シール及び／又は治療するために使用され得、例えば血液、尿又は他の体液等の体液が漏出することを防止する。例えば、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、注射され、インプラントされ、挿入され（threaded into）、又は内臓間の瘻孔に若しくは被検体の体の内臓から外側までの開口部(opening)若しくは穴(orifice)に塗布され得る。本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、これらの病理状態によって形成される空隙又は他の欠陥を充填し、加えて、線維芽細胞浸透、治癒、及び組織の内方成長（ingrowth of tissue）を促すために使用され得る。
【０１５６】
１つの実施形態において、本明細書に開示されるものは、被検体の瘻孔を充填する、シールする、及び／又は他の治療をする方法であって、前記方法は、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を被検体に注入又は他の方法で投与するステップを含む。当該ＥＣＭ組成物は、ニードルを通して瘻孔オリフィス（fistular orifices）の１つに注入され、当該オリフィスの殆ど又は全ての分岐を充填することによって被検体に投与され得る。或いは、ＥＣＭ組成物の糸（strings）又は棒(rods)が、オリフィスを通して瘻孔損傷に挿入されても良く、又はコラーゲンがカテーテルによって被検体に導入されても良い。本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を用いて、例えば、肛門の、動静脈の、膀胱の、頸動脈−海綿静脈洞の（carotid-cavernous）、外面の、胃の、腸の、体腔壁の（parietal）、唾液腺の、膣の、及び肛門直腸の瘻孔又はこれらの組み合わせ等の多様なタイプの瘻孔が、充填され、シールされ、及び／又は他の治療を施され得る。
【０１５７】
１つの実施形態において、本明細書に開示されるものは、被検体の憩室を充填する、シールする、及び／又は他の治療をする方法であって、前記方法は、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を被検体に注入又は他の方法で投与するステップを含む。憩室は、正常ではない生理学的構造であり、例えば腸、膀胱等の管状又は嚢状の器官からの袋状又は嚢状の開口部であって、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を用いて充填され又は増強され（augmented）得る。
【０１５８】
他の実施形態において、本明細書に開示されるものは、被検体の嚢胞を充填する、シールする、及び／又は他の治療を施す方法であって、前記方法は、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を被検体に注入又は他の方法で投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、当該嚢胞は偽性嚢胞であり、例えば液体等の蓄積を有するが、上皮又は他の膜形成性の内張り（membranous lining）を含まない。充填され、シールされ、及び／又は他の治療を施され得る嚢胞の、追加の限定的ではない例は、皮脂嚢胞（sebaceous cyst）、皮様嚢腫（dermoid cyst）、骨嚢胞若しくは漿液性嚢胞（serous cysts）又はこれらの組み合わせを含む。
【０１５９】
他の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、注入又は他の方法で投与され得、不必要な又は好ましくない腫瘍、液体、細胞、又は組織を被検体から外科的、化学的又は生物学的に除去した結果として形成されるあらゆる空隙を全体的に又は部分的に充填することができる。ＥＣＭ組成物は、局所的な注入又は他の方法で空隙の部位に投与され得、残りの又は周囲の組織を増強し、治癒の過程を促進し、感染のリスクを最小限にする。この増強は、例えば、乳がん手術後、腫瘍に結合した組織、骨組織、又は軟骨組織等の除去手術後といった、腫瘍切除の後に形成される空隙部位に特に有効である。
【０１６０】
４．３．５組織バルキング
他の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、組織バルキング（tissue bulking）に使用され得る。本明細書において使用される「組織バルキング」の用語は、自然状態の被検体の（例えば、ヒトの）皮膚ではない柔らかい組織の、外部の動作又は作用によるあらゆる変化を意味する。本明細書に包含される組織は、限定するものではないが、筋組織、結合組織、脂肪、及び神経組織を含む。当該組織は、多くの器官の部分又は体の部分であり得、限定するものではないが、括約筋、膀胱括約筋及び尿道を含む。
【０１６１】
４．３．６尿失禁
他の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、尿失禁（腹圧性尿失禁（stress urinary incontinence））の治療に使用され得る。当該尿失禁は、例えば、咳、くしゃみ、笑い又は運動等の腹腔内圧の増大をもたらす行動に伴って起こる急な尿の漏出である。そのような実施形態によれば、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、例えば被検体に注入されて、被検体の括約筋組織を増強し、これによって被検体内で改善又は復元する。ＥＣＭ組成物は、注入又は他の方法で尿道周囲に投与され得、尿失禁の管理及び／又は治療のために尿道周辺の組織バルクを増大する。腹圧性失禁の改善は、組織バルクを増大させ、これによって尿の流出に対する耐性を増大させることによって達成され得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、ＥＣＭ組成物は注入又は他の方法で、被検体の尿道の周辺の領域に投与される。例えば、当該ＥＣＭ組成物は、尿が漏出する際に通る尿道内の穴を閉じるか又は尿道の壁の厚みを増大させ、尿が保持されている際に、堅く封止する。
【０１６３】
他の実施形態において、ＥＣＭ組成物は注入又は他の方法で、被検体の尿道の周辺の、膀胱の出口にある尿道の筋肉のすぐ外側に投与される。バルキング材料の注入は、皮膚を通して、尿道を通して、又は女性の場合は膣を通してなされ得る。
【０１６４】
４．３．７膀胱尿管逆流症
他の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、膀胱から腎臓への逆行する尿の流れに特徴づけられる膀胱尿管逆流症（Vesicoureteral Reflux（ＶＵＲ））（又は尿の逆流（urinary reflux））の治療に使用され得る。そのような実施形態によれば、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、注入又は他の方法でそれを必要とする被検体に投与され得、当該被検体の尿管壁が増強され得、ＶＵＲの症状は低減又は除去され得る。当該組成物は、例えば内視鏡の誘導下で、注入（例えば、サブトリゴナル注射（subtrigonal injection））又は他の方法で、尿管口の下の排尿筋の裏側（backing）に、当業者に公知の様々な方法を用いて投与され得る。
【０１６５】
４．３．８胃食道逆流症
他の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、下部食道括約筋（lower esophageal sphincter（ＬＥＳ））--食道が胃に合流する箇所の筋肉の弁--が適切に閉じない、弛緩する又は弱くなることによって頻繁に起こり、胃の内容物が食道にリークバック（leak back）又は逆流する障害である胃食道逆流症（Gastroesophageal Reflux Disease（ＧＥＲＤ））の治療に使用され得る。そのような実施形態によれば、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、注入又は他の方法でそれを必要とする被検体に投与され得、当該被検体のＬＥＳが増強され得、ＧＥＲＤの症状は低減又は除去され得る。いくつかの実施形態において、ＥＣＭ組成物は内視鏡の誘導下で、食道壁の胃食道接合部の位置に投与される。逆流を妨げることを目的とするバルキングの効果は、保持された材料とその結果生じる組織反応との組み合わせに起因する。ＥＣＭ組成物は、標準の又は太い（例えば、大きいゲージの）注射針を通して注入され得る。
【０１６６】
４．３．９声帯及び喉頭
他の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、１つ又は両側の声帯（vocal cords (folds)）及び／又は喉頭（larynx (voice box)）に影響する疾患、障害（例えば神経障害のような）又は他の異常状態の管理又は治療に使用され得る。喉頭及び声帯のそのような疾患、障害又は他の異常状態の限定的ではない例は、声門の機能不全（glottic incompetence）、片側性声帯麻痺（unilateral vocal cord paralysis）、両側性声帯麻痺（bilateral vocal cord paralysis）、麻痺性発声障害（paralytic dysphonia）、非麻痺性発声障害（nonparalytic dysphonia）、痙性発声障害（spasmodic dysphonia）又はこれらの組み合わせを含む。他の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、例えば、高齢であることによって（老人性声門痙攣（“presbylaryngis”））、及び／又は声帯の傷によって（例えば、過去の手術又は放射線治療によるもの）、例えば、一般に弱った声帯である声帯の不完全な麻痺（「不全麻痺」（“paresis”））など声帯の不適切な閉鎖をもたらす疾患、障害又は他の異常状態の管理又は治療に使用され得る。
【０１６７】
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、被検体の、かつて有していた容積が欠落している声帯（例えば声帯の湾曲（bowing）又は委縮など）又は可動性が欠如している（例えば麻痺など）声帯に支持(support)又は容積(bulk)を提供するために使用され得る。いくつかの実施形態において、声帯及び／又は他の喉頭の柔軟な組織は、単独で又は他の治療若しくは投薬と組み合わせて、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物によって増強され得る。１つの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、１つ（又は両側の）声帯を増強し又は体積を追加して、当該声帯は、他の声帯と接触することができる。
【０１６８】
当業者に周知の多くの手順のうちの任意の手順が、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を被検体の声帯又は喉頭に投与するために使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を被検体の口を通して注射するために湾曲した針が使用される。他の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を被検体の皮膚及び喉仏を通して直接投与するために、針（例えばより高いゲージの、短い針）が用いられても良い。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、声帯麻痺の管理又は治療において使用され得る。１つの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、当該ＥＣＭ組成物が注入又は他の方法で被検体に投与されることによって、片側性の又は両側性の声帯麻痺又はこれらに関連する被検体の症状を管理するか又は治療するために使用され、被検体における声帯の閉鎖が改善する。１つの実施形態において、ＥＣＭ組成物は１つ（又は両側の）麻痺した声帯を増強し又は当該声帯に体積を追加して、当該声帯は他の声帯と接触することができる。被検体へのＥＣＭ組成物の注入は、被検体の口を通して、又は皮膚及び喉仏を通して直接投与され得る。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、声に関する様々な機能障害又は発話困難（difficulty speaking）である発声障害の治療に用いられ得る。
【０１７１】
４．３．１０声門の機能不全
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、声門の機能不全の管理又は治療において使用され得る。経皮的な喉頭部のコラーゲン増強（collagen augmentation）は、ＥＣＭ組成物を被検体の声帯に当業者に公知の方法を用いて注入されることによって起こり得る。いくつかの場合において、被検体は、発声不全及び／又は喉頭の発生機能に影響する声門の機能不全、筋硬直の増大、及び甲状披裂筋の運動能力の低下を有する。他の実施形態において、発声不全はパーキンソン病に起因する。１つの実施形態において、当該ＥＣＭ組成物は、ＥＣＭ組成物を被検体の声帯に注入又は他の方法で投与することによって、必要とする被検体の声門の機能不全の管理又は治療のために用いられ得る。当該注入は、声帯を増強し、声門の閉鎖を改善して、被検体における声門の機能不全が低減されるか又は解消される。
【０１７２】
４．３．１１バイオエンジニアリング
他の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、組織又は器官のバイオエンジニアリング（bioengineering）に使用され得、例えば、組織置換剤に使用され得る。本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を用いて生成され得るバイオエンジニアリングされた（bioengineered）コンポーネント（component）の例は、限定するものではないが、骨、歯の構造、関節、軟骨、骨格筋、平滑筋、心筋、腱、半月板、靱帯、血管、ステント（stent）、心臓弁、角膜、鼓膜、神経ガイド（nerve guide）、組織又は器官のパッチ又はシーラント、欠落した組織用のフィラー（filler）、美容修復用のシート、皮膚（皮膚と同等のものを作るために細胞が加えられたシート）、気管、喉頭蓋及び声帯などの喉の柔軟な組織構造、鼻の軟骨、瞼板、気管リング（tracheal ring）、甲状軟骨、披裂軟骨等の他の軟骨構造、結合組織、血管移植片（vascular graft）、及びそれらの成分、局所的な適用及び肝臓、腎臓、膵臓などの器官の修復又は置換のためのシート、を含む。
【０１７３】
４．３．１２美容用途
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、さらに美容用途においても有用である。一般に、そのような美容用途は、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、被検体の皮膚内又は皮膚上のライン（line）、しわ（クリース）（crease）その他のしわ（リンクル）（wrinkle）を充填するために用いられることに基づき、より滑らかで、若く見える外観を復元する。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物は、被検体の皮膚増強（スキンオーグメンテーション）（skin augmentation）に使用され得る。１つの実施形態において、被検体の皮膚増強の方法は、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を、増強を必要とする被検体の顔又は体の領域に注入又は他の方法で投与することを含む。当該被検体の顔又は体の領域は、コラーゲンの投与前の当該領域と比較して増強される。本明細書において使用される「皮膚増強（skin augmentation）」の用語は、自然状態の被検体の（例えば、人間の）皮膚又は関連する領域の、外部の動作又は作用によるあらゆる変化を意味する。皮膚増強によって変化され得る限定的ではない皮膚の領域は、表皮、真皮、皮下層、脂肪、立毛筋（arrector pill muscle）、毛幹、汗孔、皮脂腺、又はこれらの組み合わせを含む。
【０１７５】
本明細書に開示されるＥＣＭ組成物の美容用途の例は、顔のしわになった又はくぼんだ領域を増強するための、加えて、被検体の顔又は体の領域に膨らみを追加するか又は当該領域の膨らみを増大させるためのＥＣＭ組成物の使用；限定するものではないが、しわ（wrinkles）、陥没、又は他のしわ（creases）（例えば、眉間のしわ（frown lines）、額のしわ（worry lines）、目尻のしわ（crow's feet）、マリオネットライン（marionette lines））、妊娠線（stretch marks）、内側の又は外側の瘢痕（例えば、けが、創傷、事故、咬傷（bites）又は手術による瘢痕）を含む皮膚の欠陥を治療するためのＥＣＭ組成物の使用；結果として目の周りのクマとなる「窪んだ」目（“hollow” eyes）及び可視血管（visible vessels）を補正するためのＥＣＭ組成物の使用；下側の眼瞼形成（lower blepharoplasty）によって眼の下の脂肪体を積極的に除去した後の目の下の補正、頬の脂肪の積極的な抜き取りの後の頬の下側の補正、及び鼻形成術、植皮、又は脂肪吸引によるへこみ（indentation）等の他の外科的に誘発された不整（irregularities）の結果の補正を含む、整形術を補正又は追加するためのＥＣＭ組成物の使用；顔又は体の瘢痕（例えば、創傷、水疱瘡、又はニキビのあと）を補正するためのＥＣＭ組成物の使用；及び顔の再形成のためのＥＣＭ組成物の使用を含む。
【０１７６】
５．キット
他の態様では、本明細書に開示されるものは、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を含むキット（kit）である。
【０１７７】
１つの実施形態において、本明細書に開示されるものは、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を含むキット（kit）であり、前記ＥＣＭ組成物はシートとして調製される。当該ＥＣＭシートは、滅菌された形態で提供され、パウチ（pouch）にパッケージ（package）される。そのようなキットにおいて提供されるＥＣＭのシートは、様々な大きさ（例えば、５×５ cm 又は ９×９ cm）及び厚み（例えば、1.5-2.5 mm）であり得、施術者による使用、例えば創傷ドレッシング（wound dressing）としての使用ができる状態である。
【０１７８】
他の実施形態において、本明細書に開示されるものは、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を含むキットであり、前記ＥＣＭ組成物は流動性基質として調製され得る。そのようなキットでは、ＥＣＭ組成物は滅菌された形態で提供され、ガラスバイアル内に微粉末化されたＥＣＭとしてパッケージされる。そのようなバイアルは、様々な量の微粉末化されたＥＣＭを含み得、例えば、２００ｍｇの微粉末化されたＥＣＭを含み得る。流動性基質として調製されるべきＥＣＭ組成物を含むキットは、微粉末化されたＥＣＭを懸濁する際の使用に適したコンポーネント、例えば、懸濁溶液（例えば、生理食塩水）と、針及び柔軟なアプリケータを含むシリンジと、をさらに含み得る。
【０１７９】
他の実施形態において、本明細書に開示されるＥＣＭ組成物を含むキットであり、前記ＥＣＭ組成物は粒子として調製される。そのようなキットでは、ＥＣＭ組成物は滅菌された形態で提供され、ガラスバイアル内に粉砕されたＥＣＭとしてパッケージされる。そのようなバイアルは、様々な量の粉砕されたＥＣＭを含み得、例えば、１００ｍｇ又は２００ｍｇの粉砕されたＥＣＭを含み得る。
【０１８０】
本明細書に開示されるキットは、当該キットにおいて提供されるＥＣＭ組成物の使用に関する使用説明（instruction）を示すラベル又は表示を含み得る。いくつかの実施形態において、当該キットは、ＥＣＭ組成物が有効であるための方法を実行するために有用なコンポーネントを含み得る。例えば、当該コンポーネントは、当該キット内のＥＣＭ組成物を投与するための手段であり、例えば、１つ以上のスプレーボトル、ピンセット、スパチュラ（ペースト又は粒子を適用するための）、カニューレ（cannula）、カテーテル等である。
【０１８１】
６．実施例
６．１．実施例１：胎盤ＥＣＭ（Placental ECM）を製造する方法
この実施例は、最初にペーストとして調製される、胎盤ＥＣＭを製造する方法を開示する。
【０１８２】
方法１：前もって分離された、冷凍のヒト胎盤が取得され、室温で〜２４時間解凍された。胎盤が解凍された後、羊膜、絨毛膜、及び臍帯が当該胎盤から除去されて廃棄された。次に、当該胎盤は、処理のために２×２センチメートルの細片に切断された。
【０１８３】
当該胎盤の組織は、１．５リットルの１Ｍ ＮａＣｌ溶液が入った容器に入れられ、オムニインターナショナル社製（Omni International, Kennesaw, GA）のオムニミクサーホモジナイザー（Omni Mixer Homogenizer）を用いて均質化された。次に、均質化された胎盤組織はプロセスバッグ（processing bag）に入れられ、当該バッグは１Ｍ ＮａＣｌで満たされて総体積が９．２リットルとなった。均質化された胎盤組織は1Ｍ ＮａＣｌ溶液で３回、次のように洗浄された：（i）プロセスバッグはオービタルシェーカー（orbital shaker）上で１０分間攪拌され、（ii）胎盤組織はプロセスバッグ内で１０分間沈殿させられ、（iii）６．２リットルの上澄みは重力排水によってプロセスバッグから除去された。このステップは、混合物から血液及び残屑を取り除くステップである。
【０１８４】
３回目の洗浄ステップの後、洗浄された胎盤組織は、室温で〜１８−２６時間、オービタルシェーカー上で、１Ｍ ＮａＣｌ溶液内（合計３リットルの混合物）に混合された。次に、上述したＮａＣｌ洗浄と同様に、胎盤組織は滅菌水で４回洗浄された。４回目の水での洗浄の後、胎盤組織は、室温で〜１８−２６時間、オービタルシェーカー上で、水の中に混合（合計３リットルの混合物）された。水の中での〜１８−２６時間の混合の後、胎盤組織は、水で最後に１回、上述した態様と同様に洗浄され、その後、６．２Ｌの３％デオキシコール酸ナトリウムが当該混合物に加えられ、当該混合物中のデオキシコール酸ナトリウムの最終濃度は２％とされた。
【０１８５】
当該胎盤組織は、室温で〜７２時間、オービタルシェーカー上で、２％のデオキシコール酸ナトリウム溶液中で混合された。当該胎盤組織は、〜７２時間の混合の後、上述した態様で、滅菌水で５回洗浄された。最後に水を加えられた後、１Ｍ ＮａＯＨの滴下（dropwise addition）によって当該溶液のｐＨは約１０−１２とされ、塩基性溶液とされた。胎盤組織は、当該塩基性溶液中、室温で〜３０分間オービタルシェーカー上で混合された。〜３０分の混合の後、当該溶液のｐＨは、０．１Ｎ ＨＣｌの滴下によって、約７．０−７．５に調節された。
【０１８６】
プロセスバッグから上澄みが除去され、残った胎盤組織が回収されて遠心分離された。遠心分離の後、上澄みは除去され、回収された胎盤組織は最後の洗浄ステップとして滅菌水（sterile water）中に再懸濁され、再度遠心分離され、その後上澄みが廃棄された。得られた組成物は、コラーゲン及びエラスチンを含む胎盤ＥＣＭ組成物であり、白いペーストの形態であった。
【０１８７】
方法２：処理が開始されると、冷凍のヒト胎盤は２−８℃で解凍され、生物学的安全キャビネット（biological safety cabinet）（ＢＳＣ）に移され、方法１と同様の処理が施された。当該胎盤は、保存容器からはずされて滅菌された使い捨てのトレーに置かれた。当該胎盤は、清掃されて余分な血液及び血餅が取り除かれ、小片に刻まれた。当該刻まれた胎盤材料は、滅菌水に懸濁され、機械的ホモジナイザー（mechanical homogenizer）を用いて均質化された。当該生成された微小な組織粒子は、増大した表面積を有し、胎盤ＥＣＭからのより効果的な細胞及び細胞残屑の分離及び除去を可能とする。均質化された胎盤由来の組織は、滅菌された１Ｍ塩化ナトリウム溶液の入った滅菌されたプロセスバッグに移された。当該組織は、滅菌された１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）で数回、オービタルシェーカー上での攪拌によって洗浄された；ＮａＣｌ溶液は、胎盤組織を沈殿させ、その後排液して追加の滅菌された１Ｍ ＮａＣｌ溶液を補給することによって交換された。胎盤組織は、滅菌された１Ｍ ＮａＣｌ溶液中で攪拌されている状態で１８−２４時間保持され、その後滅菌水による洗浄が繰り返された。全ての処理ステップは室温で実行された。胎盤組織を高濃度の塩化ナトリウムにさらし、その後水にさらすことは、組織への「浸透圧衝撃（osmotic shock）」を構成する。当該「浸透圧衝撃」は、組織の血液、血液成分、細胞及び細胞残屑を掃除することに役立つ。当該胎盤組織は次のステップである洗浄剤洗浄の前に、２回目の「浸透圧衝撃」を受ける。
【０１８８】
リンスされた胎盤組織は、滅菌された０．１−０．３％デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）溶液及び４−８ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液と共に、バイオプロセスバッグ（bio-processing bag）内で攪拌されている状態で、室温で４８−７２時間保持された。続いて滅菌水でのリンスの後、当該組織は、２回目のＤＯＣ／ＥＤＴＡによる１８−２４時間の洗浄が行われた。当該組織をリンスしてＤＯＣ及びＥＤＴＡを除去するために、滅菌水が用いられた。
【０１８９】
水による洗浄が終了すると、上澄みはバイオプロセスバッグから除去されて、２ｍＭ塩化マグネシウム溶液及びｐＨ８−９の１０Ｕ／ｍＬのＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）に置き換えられ、室温で１８−２４時間混合された。ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）は、全ての型の核酸（ＲＮＡ及びＤＮＡ）を分解するエンドヌクレアーゼである；得られる短いポリヌクレオチドの断片は、胎盤組織の一連のリンスによって洗い流される。
【０１９０】
核酸の残渣を除去するための胎盤組織のリンスの後、当該材料は、ウイルス不活性化のステップとして低いｐＨ及び高いｐＨで処理された。第１のステップにおいて、胎盤組織は、滅菌された０．６７Ｍ ＮａＣｌ溶液の存在下でｐＨ３．３か又はそれ以下とされ、２２±１℃で２４時間、オービタルシェーカー上で攪拌された。第２のステップにおいて、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて当該溶液のｐＨは≧１３に調整され、２２±１℃で最低４時間、オービタルシェーカー上、バイオプロセスバッグ内で混合された。当該ＮａＯＨ曝露（ＮａＯＨ exposure）の終わりに、溶液のｐＨは５．５−９．０の範囲に調整された。
【０１９１】
酸及び塩基処理が終了すると、当該組織は１Ｍ ＮａＣｌを伴ってインキュベート（incubate）され、オービタルシェーカー上で４８−７２時間混合された。ＮａＣｌ処理の後、当該胎盤ＥＣＭは滅菌水で１８−２４時間洗浄されて残屑及び残留した汚染物質を除去された。当該懸濁液を遠心分離することによって、ＥＣＭペーストが生成された。ＥＣＭペーストは、当該生成物が調製及び滅菌されるまで、−２０℃の冷凍庫で保存された。
【０１９２】
シートとしての調製：ＥＣＭシートを生成するために、ＥＣＭペーストは、２℃から２２℃で２４−４８時間解凍され、生物学的安全キャビネットにおいて、滅菌されたリン酸緩衝液に再懸濁された。当該組織は均質化されて均質なＥＣＭ懸濁液が準備され、当該懸濁液は滅菌されたプラスチックの型に分配されて凍結された。ＥＣＭの凍結された成型品は、凍結乾燥を使って脱水された。得られた脱水されたＥＣＭウェハ（ＥＣＭ wafer）は、滅菌水で再水和され、その後室温で１８−３６時間、真空補助乾燥機（vacuum-assisted dryer）で凝縮された。シートは二重のパウチに入れられ、医療グレードのシーラーで密封され、ラベルを付けられ、ガンマ線を用いて滅菌された。
【０１９３】
粒子としての調製：ＥＣＭ粒子を生成するために、ＥＣＭペーストは滅菌水中に再懸濁され、型に移され、サーモ・サイエンティフィック社 (Thermo Scientific, Marietta, OH) 製のコントロールレートフリーザー（Controlled Rate Freezer）を用いて凍結され、ラブコンコ社（LabConco, Kansas City, MO）製の凍結乾燥器（freeze-dryer）を用いて４８時間、凍結乾燥される。凍結乾燥されたＥＣＭは、フルイドエナジー社（Fluid Energy, Telford, PA）製のジェットミル（jet mill）を用いて粉砕され、ＥＣＭ粒子が生成される。粉砕されたＥＣＭ粉末は、琥珀色のガラスバイアルに充填されて密封され得る。
【０１９４】
流動性基質としての調製：ＥＣＭ流動性基質は、ＥＣＭ粒子を用いて調製され得る。通常、ＥＣＭ流動性基質は、凍結乾燥されて粉砕されたＥＣＭ（ＥＣＭ粒子）を例えば滅菌水中又は生理食塩水中に懸濁することによって調製され得る。
【０１９５】
６．２．実施例２：ＥＣＭ組成物のコラーゲン含有量の決定
この実施例は、ＥＣＭ組成物のコラーゲン含有量の分析について説明する。
【０１９６】
実施例１に記載されたように、粒子、シート、又は流動性基質の形態で調製されたＥＣＭ組成物は、比色分析のヒドロキシプロリン定量法を用いて全コラーゲン含有量（total collagen content）に関して分析された。コラーゲンは、非常に高いプロリン濃度を有するという点で独特のタンパク質である。さらに、コラーゲンは、変換後にヒドロキシプロリンに変わる。そのようなものとして、熱塩酸中で加水分解されたコラーゲンから得ることができるヒドロキシプロリンの定量化は、コラーゲンの定量化の代用物として用いられ得る。
【０１９７】
ＥＣＭ試料（ＥＣＭ sample）は、６Ｎ ＨＣｌを用いて１１０℃で加水分解され、その後、クロラミン−Ｔ（Chloramine-T）（Ｎ−クロロ−４−メチルベンゼンスルホンアミド（N-chloro 4-methylbenzenesulfonamide））を用いてヒドロキシプロリンが酸化されてピロール−２−カルボン酸（pyrrole-2-carboxylic acid）（ピロール（pyrrole））となった。色は４−ジメチルアミノベンズアルデヒド（4-Dimethylaminobenzaldehyde（ＤＭＡＢ））を用いて発現され、ヒドロキシプロリンの含有量は５５０ｎｍの吸光度を測定することによって決定された。試料の吸光度は、既知の量のヒドロキシプロリンを用いたヒドロキシプロリン標準曲線（standard curve）に対照して補間された。
【０１９８】
ＥＣＭ組成物は、ＥＣＭ組成物の重量で３１％から５３％の範囲の全コラーゲン（total collagen）を含むと判定された（表１）。１６試料中１４試料は、ＥＣＭ組成物の重量で全コラーゲンは３４％から４３％の範囲内であった。また、１６試料中１２試料は、ＥＣＭ組成物の重量で全コラーゲンは３７％から４２％の範囲内であった。これに対して、比較試料の（comparator）基質製品であるブタ膀胱基質（porcine urinary bladder matrix）（ＭＡＴＲＩＳＴＥＭ（登録商標） 創傷基質シート（Wound Matrix sheets） 又は ＭＡＴＲＩＳＴＥＭ ＭＩＣＲＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）粒子（particulates））及びウシ胎児真皮基質（fetal bovine dermis matrix）（ＰＲＩＭＡＴＲＩＸ（商標） 真皮修復基質（Dermal Repair Matrix））は、重量でそれぞれ６７％、６７％、６９％の全コラーゲンを含むことが見出された。
【０１９９】
【表１】
2020142114.tif 000002
【０２００】
６．３．実施例３：ＥＣＭ組成物のエラスチン含有量の決定
この実施例は、ＥＣＭ組成物のエラスチン含有量の分析について説明する。
【０２０１】
実施例１に記載されたように粒子又はシートとして調製されたＥＣＭ組成物は、バイオカラー社（BioColor, Ltd. (UK)）製のファスティンエラスチン定量キット（Fastin Elastin Assay kit）を用いてエラスチン含有量に関して分析された。当該キットは、テスト試料から抽出されて可溶化されたアルファ・エラスチン（α-elastin）を着色するために、5, 10, 15, 20-テトラフェニル-21, 23-ポルフィン テトラスルホン酸塩（5, 10, 15, 20-tetraphenyl-21, 23-porphine tetra-sulfonate (TPPS)）を染料として使用する。エラスチンは、０．２５Ｍ シュウ酸中１００℃で、ＥＣＭ組成物試料から抽出された。エラスチンは、トリクロロ酢酸（trichloroacetic acid）及び塩酸（ＴＣＡ／ＨＣｌ）によって沈殿され、その後ＴＰＰＳで着色された。その後、ＴＰＰＳはエラスチンから分離され、放出されたＴＰＰＳのレベルが分光光度法（spectrophotometry）によって定量された。ＥＣＭ組成物試料中のエラスチンレベルは、エラスチン標準曲線に対照して補間することによって決定された。
【０２０２】
ＥＣＭ組成物は、ＥＣＭ組成物の重量で１３％から２９％の範囲のエラスチンを有すると判定された（表２）。１６試料中１４試料は、ＥＣＭ組成物の重量でエラスチンは１６％から２４％の範囲内であり、１６試料中１３試料は、ＥＣＭ組成物の重量でエラスチンは１７％から２４％の範囲内であり、１６試料中１０試料は、ＥＣＭ組成物の重量でエラスチンは２０％から２４％の範囲内であった。これに対して、比較試料の基質製品であるブタ膀胱基質（マトリステム（ＭＡＴＲＩＳＴＥＭ（登録商標）） 創傷基質シート又は マトリステムマイクロマトリクス（ＭＡＴＲＩＳＴＥＭ ＭＩＣＲＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標））粒子）は、４％のエラスチンを含むことが見出された。ウシ胎児真皮基質（プリマトリクス（ＰＲＩＭＡＴＲＩＸ（商標）） 真皮修復基質）では、エラスチンは検出されなかった。
【０２０３】
表２及び表３において、試料８は表１における試料８と同じＥＣＭ組成物を示す。しかしながら、分析されたＥＣＭ組成物の種類は異なる（すなわち、表１では流動性基質の形態のＥＣＭ組成物が分析されたが、表２及び表３では粒子の形態のＥＣＭ組成物が分析された）。
【０２０４】
【表２】
2020142114.tif 000003
【０２０５】
６．４．実施例４：ＥＣＭ組成物のフィブロネクチン含有量の決定
この実施例は、ＥＣＭ組成物のフィブロネクチン含有量の分析について説明する。
【０２０６】
実施例１に記載されたように粒子又はシートとして調製されたＥＣＭ組成物は、マウンテンビュー社（Mountain View, CA）のタカラフィブロネクチンＥＩＡキット（TaKaRa Fibronectin EIA kit）を用いてフィブロネクチン含有量に関して分析された。当該キットは、サンドウィッチエライザ法（sandwich ELISA method）に基づき、２段階の工程によって、２つのマウスモノクローナル抗ヒトフィブロネクチン抗体（mouse monoclonal anti-human fibronectin antibodies）を利用してフィブロネクチンを検出する。加えて、２Ｍの尿素緩衝液（urea buffer）を用いたフィブロネクチンの特殊な抽出方法が開発された。
【０２０７】
１５ｍｇのＥＣＭ組成物が３ｍＬの抽出緩衝液（２Ｍの尿素、０．０５ＭのＰＯ４、２ｍＭのＰＭＳＦ、ｐＨ７．１）に混合され、攪拌プレート（stir plate）上で４時間混合された。当該試料は、その後10,000Ｘｇで遠心分離された。上澄みは、分析時まで−２０℃で保存されるか又は直ちに使用された。タカラフィブロネクチンＥＩＡキットを用いた１６のＥＣＭ組成物試料の分析は、製造元の使用説明書に従って行われた。フィブロネクチン濃度の標準曲線は、市販の凍結乾燥されたフィブロネクチンを用いて作成された。そして、試料のフィブロネクチン濃度は当該曲線から補間された。
【０２０８】
ＥＣＭ組成物のフィブロネクチン含有量は低く、平均でＥＣＭ組成物のｍｇあたり１９７ｎｇのフィブロネクチンを含み（ＥＣＭ組成物の重量で0.0197％）、21.3ng/mgから361.3ng/mgの範囲である。ブタ膀胱基質の試料（マトリステム（ＭＡＴＲＩＳＴＥＭ（登録商標）） 創傷基質シート又は マトリステムマイクロマトリクス（ＭＡＴＲＩＳＴＥＭ ＭＩＣＲＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標））粒子）及びウシ胎児真皮基質（プリマトリクス（ＰＲＩＭＡＴＲＩＸ（商標）） 真皮修復基質）はテストされたが、当該定量法においてフィブロネクチンの含有量は判明しなかった。これは、当該定量法において使用された抗体がウシ由来の又はブタ由来の基質と交差反応しなかったからである可能性がある。
【０２０９】
【表３】
2020142114.tif 000004
【０２１０】
６．５．実施例５：ＥＣＭ組成物のラミニン組成の決定
実施例１に記載されたように準備されて粒子又はシートとして調製された１６のＥＣＭ組成物は、マウンテンビュー社（Mountain View, CA）のタカラフィブロネクチンＥＩＡキットを用いて、製造元の使用説明書に従って、ラミニン含有量に関して分析された。当該キットは、サンドウィッチエライザ法に基づき、２段階の工程によって、２つのマウスモノクローナル抗ヒトフィブロネクチン抗体を利用してラミニンを検出する。加えて、２Ｍの尿素緩衝液を用いたラミニンの特殊な抽出方法が開発された。ラミニン濃度の標準曲線は、市販の凍結乾燥されたラミニンを用いて作成された。そして、試料のラミニン濃度は当該曲線から補間された。
【０２１１】
結果：ラミニンは、１６のＥＣＭ試料のいずれからも検出されなかった。また、比較のために分析されたブタ膀胱基質（シート若しくは粒子）又はウシ胎児真皮基質のいずれからも、ラミニンは検出されなかった。
【０２１２】
６．６．実施例６：ＥＣＭ組成物の生体適合性
実施例１に記載されたように準備されてシート、粒子又は流動性基質として調製されたＥＣＭ組成物は、調査開始時の年齢が４．７−６．３か月であり、体重が２．４−２．９kgのアルビノのニュージーランドホワイトラビットにおける生体適合性がテストされた。対照（control）のため、ＥＣＭシートはマトリステム（MATRISTEM（登録商標））創傷基質（ブタ膀胱基質）と比較され；ＥＣＭ粒子はマトリステムマイクロマトリクス（MATRISTEM MICROMATRIX（登録商標））と比較され、ＥＣＭ流動性基質はインテグラ流動性創傷基質（ＩＮＴＥＧＲＡ（商標）Flowable Wound Matrix）（コラーゲン及びグリコサミノグリカン）と比較された。
被験物質（test article）    使用量／サイトあたり（Site）
ＥＣＭ粒子                  ５．０−５．４ｍｇ
ＥＣＭ流動性基質            ５０μＬ
ＥＣＭシート                １×３×１０ｍｍ片
マトリステム（登録商標）粒子       ５．０−５．４ｍｇ
インテグラ流動性            ５０μＬ
マトリステムシート          １×３×１０ｍｍ片
【０２１３】
流動性基質の調製：ＥＣＭ流動物（ECM Flowable）及びＩＮＴＥＧＲＡ（商標）流動物は、２ｍＬ以上の注射可能な水を３ｍＬのバイアルアクセスシリンジ（Vial Access syringe）で吸引し、気泡を排除し、体積を２ｍＬに調節することによって調製された。その後、当該バイアルアクセスシリンジからカニューレが取り除かれた。次に、このシリンジは、２ｍＬの水が入ったＥＣＭシリンジと先端同士を（tip-to-tip）接続された。水はバイアルアクセスシリンジからバイアルアクセスシリンジにゆっくりと注入され、粉末が均一に水和されるまで、１０から１５の前後の動きによって注意深く混合された。再構成され全部のペーストは、シリンジの１つに押し込まれた。当該空のシリンジは廃棄され、１ｍＬの空のシリンジが残ったＥＣＭペーストシリンジに接続され、１ｍＬのＥＣＭ流動物又はＩＮＴＥＧＲＡ（商標）流動物のペーストは１ｍＬのシリンジに移された。この最後のステップは、２番目の１ｍＬシリンジに繰り返された。当該ペーストは、各々投与のために１ｍＬシリンジに装填される前に再混合された。ＩＮＴＥＧＲＡ（商標）流動物は、注射のために３．０ｍＬの生理食塩水と混合された。被験物質及び対照物質は、充填された１ｍＬを用いて直接適用された。
【０２１４】
移植（implantation）：各々の動物に、背中の中線上に両側の傍脊椎筋の筋膜を通って伸びる２−４ｃｍの皮膚切開が施された。各々の移植部位に、５ｍｍの切開が傍脊椎筋に施され、移植のため、止血鉗子によって、当該中線からおよそ２ｃｍで、かつ筋肉の繊維軸に平行である小さいポケットが生成されて、移植部位間に少なくとも２．５ｃｍの間隔がもたらされた。傍脊椎筋の一方の側に４つの被験物質又は４つの対照物質（control articles）が移植された。被験物質は右側に、対照物質は左側に、グループ毎に移植された。その後全ての移植部位は、非吸収性縫合糸で閉じられ、当該皮膚切開は縫合糸及び／又は皮膚ステープラー（skin staple）で閉じられた。５０μＬの流動性調製物、５ｍｇの粒子調製物及び１片（１×３×１０ｍｍ）のシート調製物が生成された筋肉のポケットに移植された。対照物質は、５０μＬのウシ由来の創傷基質製品（INTEGRA（商標） Flowable）、５ｍｇのブタの膀胱由来の細胞外基質の粒子調製物（MATRISTEM MICROMATRIX（登録商標））、及びブタの膀胱由来の細胞外基質のシート（１×３×１０ｍｍ）調製物（MATRISTEM WOUND MATRIX（登録商標））であった。動物は、移植後１、２又は４週間後に殺され、組織学的検査が行われた。
【０２１５】
結果：ＥＣＭシートは、ブタ膀胱基質よりも明らかに少ない組織反応性を示した。移植後第１週では、膀胱基質（ＵＢＭ）近傍の組織は、粒状化及び炎症反応の明瞭な兆候を示しているのに対して（図１Ａ）、ＥＣＭシートは、顆粒球の僅かな浸透に伴って散在した筋組織を示した。第２週及び第４週では、ＵＢＭシート近傍で粒状化がさらに顕著であるのに対して（図１Ｃ及び図１Ｅ）、ＥＣＭシート近傍の組織は、実質的に粒状化が無く、正常に見えた（図１Ｄ及び図１Ｆ）。ＥＣＭシートは、第１，２，４週において刺激性がないと思われた。
【０２１６】
ＥＣＭ粒子及び流動性基質は、対照の粒子及び流動性基質よりも少ない組織反応性を生じた（図２及び図３）。例えば、移植後第１週では、ＥＣＭ粒子は、炎症を示すいくらかの粒状化を示したが（図２Ｂ）、その程度はＵＢＭ粒子よりも著しく小さい（図２Ａ）。第２週及び第４週では、ＥＣＭ粒子は粒状化の著しい減少を示し、（図２Ｄ及び図２Ｆ）、これと比較してＵＢＭ粒子は、第２週及び第４週で実質的な炎症を示した（図２Ｃ及び図２Ｅ）。同様に、牛由来の創傷基質製品（INTEGRA(商標) Flowable）は、第１週で粒状化を示し（図３Ａ）、続いて第２週及び第４週で瘢痕化した（図３Ｃ及び図３Ｅの明るい領域）。一方で、ＥＣＭ流動性基質は、実質的に最初の週にのみ炎症反応を示し（図３Ｂ）、続いて、第２週及び第４週では殆ど完全に回復した（図３Ｄ及び図３Ｆ）。
【０２１７】
６．７．実施例７：胎盤絨毛膜から胎盤ＥＣＭを製造する方法
この実施例は、最初にペーストとして調製される胎盤ＥＣＭを胎盤絨毛膜から製造する方法を開示する。
【０２１８】
方法１：前もって分離され、凍結されたヒト胎盤を取得し、室温で〜２４時間程度解凍させる。当該胎盤が解凍された後、当該胎盤から絨毛膜が取得される。次に、当該胎盤は、処理のため２×２センチメートルの細片に切断される。
【０２１９】
その後、胎盤絨毛膜組織は、１．５リットルの１Ｍ ＮａＣｌ溶液が入った容器に入れられ、オムニインターナショナル社製のオムニミクサーホモジナイザーを用いて均質化される。次に、均質化された胎盤絨毛膜組織はプロセスバッグに入れられ、当該バッグは総体積が９．２リットルとなるように１Ｍ ＮａＣｌ溶液で満たされる。均質化された胎盤絨毛膜組織は1Ｍ ＮａＣｌ溶液で３回、次のように洗浄される：（i）プロセスバッグはオービタルシェーカー上で１０分間攪拌され、（ii）胎盤絨毛膜組織はプロセスバッグ内で１０分間沈殿させられ、（iii）６．２リットルの上澄みは重力排水によってプロセスバッグから除去された。このステップは、混合物から血液及び残屑を取り除くステップである。
【０２２０】
３回目の洗浄ステップの後、洗浄された胎盤絨毛膜組織は、室温で〜１８−２６時間、オービタルシェーカー上で、１Ｍ ＮａＣｌ溶液内（合計３リットルの混合物）に混合される。次に、上述したＮａＣｌ洗浄と同様に、胎盤組織は滅菌水で４回洗浄される。４回目の水での洗浄の後、胎盤絨毛膜組織は、室温で〜１８−２６時間、オービタルシェーカー上で、水の中に混合（合計３リットルの混合物）される。水の中での〜１８−２６時間の混合の後、胎盤絨毛膜組織は、水で最後に１回、上述した態様と同様に洗浄され、その後、６．２Ｌの３％デオキシコール酸ナトリウムが当該混合物に加えられ、当該混合物中のデオキシコール酸ナトリウムの最終濃度は２％とされる。
【０２２１】
当該胎盤絨毛膜組織は、室温で〜７２時間、オービタルシェーカー上で、２％のデオキシコール酸ナトリウム溶液中で混合される。当該胎盤絨毛膜組織は、〜７２時間の混合の後、上述した態様で、滅菌水で５回洗浄される。最後に水を加えられた後、１Ｍ ＮａＯＨの滴下によって当該溶液のｐＨは約１０−１２とされ、塩基性溶液とされる。胎盤絨毛膜組織は、当該塩基性溶液中、室温で〜３０分間オービタルシェーカー上で混合される。〜３０分の混合の後、当該溶液のｐＨは、０．１Ｎ ＨＣｌの滴下によって、約７．０−７．５に調節される。
【０２２２】
プロセスバッグから上澄みが除去され、残った胎盤絨毛膜組織が回収されて遠心分離される。遠心分離の後、上澄みは除去され、回収された胎盤絨毛膜組織は最後の洗浄ステップとして滅菌水中に再懸濁され、再度遠心分離され、その後上澄みが廃棄される。得られる組成物は、コラーゲン及びエラスチンを含む胎盤ＥＣＭ組成物であり、白いペーストの形態であろう。
【０２２３】
方法２：処理が開始されると、冷凍のヒト胎盤は２−８℃で解凍され、生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）に移される。当該胎盤は、保存容器からはずされて滅菌された使い捨てのトレーに置かれる。当該胎盤は、清掃されて余分な血液及び血餅が取り除かれる。当該胎盤の絨毛膜が取得され、小片に刻まれる。当該刻まれた胎盤材料は、滅菌水に懸濁され、機械的ホモジナイザーを用いて均質化される。当該ホモジナイザーは、増大した表面積を有する微小な組織粒子を生成し、胎盤ＥＣＭからのより効果的な細胞及び細胞残屑の分離及び除去を可能とする。均質化された胎盤絨毛膜由来の組織は、滅菌された１Ｍ塩化ナトリウム溶液の入った滅菌されたプロセスバッグに移される。当該組織は、滅菌された１Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）で数回、オービタルシェーカー上での攪拌によって洗浄される；胎盤組織を沈殿させ、その後排液して追加の滅菌された１Ｍ ＮａＣｌ溶液を補給することによって、ＮａＣｌ溶液は交換される。胎盤組織は、滅菌された１Ｍ ＮａＣｌ溶液中で攪拌されている状態で１８−２４時間保持され、その後滅菌水による洗浄が繰り返される。全ての処理ステップは室温で実行される。
胎盤絨毛膜組織を高濃度の塩化ナトリウムにさらし、その後水にさらすことは、組織への「浸透圧衝撃」を構成する。当該「浸透圧衝撃」は、組織の血液、血液成分、細胞及び細胞残屑を掃除することに役立つ。当該胎盤組織は次のステップである洗浄剤洗浄の前に、２回目の「浸透圧衝撃」を受けさせられる。
【０２２４】
リンスされた胎盤絨毛膜組織は、滅菌された０．１−０．３％デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）溶液及び４−８ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液と共に、バイオプロセスバッグ内で攪拌されている状態で、室温で４８−７２時間保持される。続いて滅菌水でのリンスの後、当該組織は、２回目のＤＯＣ／ＥＤＴＡによる１８−２４時間の洗浄が行われる。その後、当該組織をリンスしてＤＯＣ及びＥＤＴＡを除去するために、滅菌水が用いられる。
【０２２５】
水による洗浄が終了すると、上澄みはバイオプロセスバッグから除去されて、２ｍＭ塩化マグネシウム溶液及びｐＨ８−９の１０Ｕ／ｍＬのＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）に置き換えられ、室温で１８−２４時間混合される。ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）は、全ての型の核酸（ＲＮＡ及びＤＮＡ）を分解するエンドヌクレアーゼである；得られる短いポリヌクレオチドの断片は、胎盤組織の一連のリンスによって洗い流される。
【０２２６】
核酸の残渣を除去するための胎盤絨毛膜組織のリンスの後、当該材料は、ウイルス不活性化のステップとして低いｐＨ及び高いｐＨで処理される。第１のステップにおいて、胎盤絨毛膜組織は、滅菌された０．６７Ｍ ＮａＣｌ溶液の存在下でｐＨ３．３か又はそれ以下とされ、２２±１℃で２４時間、オービタルシェーカー上で攪拌される。第２のステップにおいて、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて当該溶液のｐＨは≧１３に調整され、２２±１℃で最低４時間、オービタルシェーカー上、バイオプロセスバッグ内で混合される。当該ＮａＯＨ曝露（ＮａＯＨ exposure）の終わりに、溶液のｐＨは５．５−９．０の範囲に調整される。
【０２２７】
酸及び塩基処理が終了すると、当該組織は１Ｍ ＮａＣｌを伴ってインキュベートされ、オービタルシェーカー上で４８−７２時間混合される。ＮａＣｌ処理の後、当該胎盤絨毛膜ＥＣＭは滅菌水で１８−２４時間洗浄されて残屑及び残留した汚染物質を除去される。当該懸濁液を遠心分離することによって、ＥＣＭペーストが生成される。ＥＣＭペーストは、当該生成物が調製及び滅菌されるまで、−２０℃の冷凍庫で保存され得る。
【０２２８】
シートとしての調製：ＥＣＭシートを生成するために、ＥＣＭペーストは、２℃から２２℃で２４−４８時間解凍され、生物学的安全キャビネットにおいて、滅菌されたリン酸緩衝液に再懸濁される。当該組織は均質化されて均質なＥＣＭ懸濁液が準備され、当該懸濁液は滅菌されたプラスチックの型に分配されて凍結される。ＥＣＭの凍結された成型品は、凍結乾燥を使って脱水される。得られた脱水されたＥＣＭウェハは、滅菌水で再水和され、その後室温で１８−３６時間、真空補助乾燥機で凝縮される。シートは二重のパウチに入れられ、医療グレードのシーラーで密封され、ラベルを付けられ、ガンマ線を用いて滅菌される。
【０２２９】
粒子としての調製：ＥＣＭ粒子を生成するために、ＥＣＭペーストは滅菌水中に再懸濁され、型に移され、サーモ・サイエンティフィック社 (Thermo Scientific, Marietta, OH) のコントロールレートフリーザー（Controlled Rate Freezer）を用いて凍結され、ラブコンコ社（LabConco, Kansas City, MO）の凍結乾燥器を用いて４８時間、凍結乾燥される。凍結乾燥されたＥＣＭは、フルイドエナジー社（Fluid Energy, Telford, PA）のジェットミルを用いて粉砕され、ＥＣＭ粒子が生成される。粉砕されたＥＣＭ粉末は、琥珀色のガラスバイアルに充填されて密封され得る。
【０２３０】
流動性基質としての調製：ＥＣＭ流動性基質は、ＥＣＭ粒子を用いて調製され得る。通常、ＥＣＭ流動性基質は、凍結乾燥されて粉砕されたＥＣＭ（ＥＣＭ粒子）を例えば滅菌水中又は生理食塩水中に懸濁することによって調製され得る。
【０２３１】
ＥＣＭのコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、及び／又はラミニンの含有量は、実施例２、３、４及び５においてそれぞれ開示された態様で分析され得る。さらに、ＥＣＭの生体適合性は、実施例６において開示された態様で評価され得る。
【０２３２】
６．８．実施例８：胎盤絨毛膜から胎盤ＥＣＭを製造する方法（２）
この実施例は、最初にペーストとして調製される胎盤ＥＣＭ組成物を胎盤絨毛膜から製造する方法を開示する。
【０２３３】
満期産直後の母体から取得されたヒト胎盤か又は前もって分離された冷凍のヒト胎盤であって解凍されているものが使用される。当該胎盤は、０．５Ｍ ＮａＣｌ中で洗浄される。羊膜、臍帯及び壁側脱落膜は胎盤から除去され、絨毛膜板は保持されて、擦って清浄にされる。当該擦って清浄にされた絨毛膜は、０．５Ｍ ＮａＣｌ中及び水中ですすがれ（リンスされ）、２％デオキシコール酸内で一晩リンスされ、続いて数回水リンスされる。その後、処理された絨毛膜は粉砕され、凍結乾燥される。得られる組成物は、脱細胞されたＥＣＭペーストであり、粉砕して調製するなど、さらなる調製に適する。
【０２３４】
シートとしての調製：ＥＣＭシートを生成するために、ＥＣＭペーストは、２℃から２２℃で２４−４８時間解凍され、生物学的安全キャビネットにおいて、滅菌されたリン酸緩衝液に再懸濁される。当該組織は均質化されて均質なＥＣＭ懸濁液が準備され、当該懸濁液は滅菌されたプラスチックの型に分配されて凍結される。ＥＣＭの凍結された成型品は、凍結乾燥を使って脱水される。その結果脱水されたＥＣＭウェハは、滅菌水で再水和され、その後室温で１８−３６時間、真空補助乾燥機で凝縮される。シートは二重のパウチに入れられ、医療グレードのシーラーで密封され、ラベルを付けられ、ガンマ線を用いて滅菌される。
【０２３５】
粒子としての調製：ＥＣＭ粒子を生成するために、ＥＣＭペーストは滅菌水中に再懸濁され、型に移され、サーモ・サイエンティフィック社 (Marietta, OH) のコントロールレートフリーザーを用いて凍結され、ラブコンコ社（Kansas City, MO）の凍結乾燥器を用いて４８時間、凍結乾燥される。凍結乾燥されたＥＣＭは、フルイドエナジー社（Telford, PA）のジェットミルを用いて粉砕され、ＥＣＭ粒子が生成される。粉砕されたＥＣＭ粉末は、琥珀色のガラスバイアルに充填されて密封され得る。
【０２３６】
流動性基質としての調製：ＥＣＭ流動性基質は、ＥＣＭ粒子を用いて調製され得る。通常、ＥＣＭ流動性基質は、凍結乾燥されて粉砕されたＥＣＭ（ＥＣＭ粒子）を例えば滅菌水中又は生理食塩水中に懸濁することによって調製され得る。
【０２３７】
ＥＣＭのコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、及び／又はラミニンの含有量は、実施例２、３、４及び５においてそれぞれ開示された態様で分析され得る。さらに、ＥＣＭの生体適合性は、実施例６において開示された態様で評価され得る。
【０２３８】
６．９．実施例９：胎盤絨毛膜から胎盤ＥＣＭを製造する方法（３）
この実施例は、胎盤ＥＣＭ組成物を胎盤絨毛膜から製造する方法を開示する。
【０２３９】
満期産直後の母体から取得されたヒト胎盤が使用される。羊膜、臍帯及び壁側脱落膜は胎盤から除去され、絨毛膜板は保持されて、擦って清浄にされる。当該擦って清浄にされた絨毛膜は、０．１Ｍ ＮａＣｌ中及び水中でリンスされ、０．０６７％デオキシコール酸及び４ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶液内で一晩リンスされ、続いて数回水リンスされる。その後当該絨毛膜は、０．３９％デオキシコール酸及び８ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶液内で一晩リンスされ、続いて数回水リンスされる。その後、処理された全絨毛膜は凍結乾燥される。
【０２４０】
シートとしての調製：ＥＣＭシートを生成するために、ＥＣＭは、２℃から２２℃で２４−４８時間解凍され、生物学的安全キャビネットにおいて、滅菌されたリン酸緩衝液に再懸濁されて、ＥＣＭペーストを形成する。当該組織は均質化されて均質なＥＣＭ懸濁液が準備され、当該懸濁液は滅菌されたプラスチックの型に分配されて凍結される。ＥＣＭの凍結された成型品は、凍結乾燥を使って脱水される。その結果脱水されたＥＣＭウェハは、滅菌水で再水和され、その後室温で１８−３６時間、真空補助乾燥機で凝縮される。シートは二重のパウチに入れられ、医療グレードのシーラーで密封され、ラベルを付けられ、ガンマ線を用いて滅菌される。
【０２４１】
粒子としての調製：ＥＣＭ粒子を生成するために、ＥＣＭは滅菌水中に再懸濁されてＥＣＭペーストを形成し、型に移され、サーモ・サイエンティフィック社 (Marietta, OH) のコントロールレートフリーザーを用いて凍結され、ラブコンコ社（Kansas City, MO）の凍結乾燥器を用いて４８時間、凍結乾燥される。凍結乾燥されたＥＣＭは、フルイドエナジー社（Telford, PA）のジェットミルを用いて粉砕され、ＥＣＭ粒子が生成される。粉砕されたＥＣＭ粉末は、琥珀色のガラスバイアルに充填されて密封され得る。
【０２４２】
流動性基質としての調製：ＥＣＭ流動性基質は、ＥＣＭ粒子を用いて調製され得る。通常、ＥＣＭ流動性基質は、凍結乾燥されて粉砕されたＥＣＭ（ＥＣＭ粒子）を例えば滅菌水中又は生理食塩水中に懸濁することによって調製され得る。
【０２４３】
ＥＣＭのコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、及び／又はラミニンの含有量は、実施例２、３、４及び５においてそれぞれ開示された態様で分析され得る。さらに、ＥＣＭの生体適合性は、実施例６において開示された態様で評価され得る。
【０２４４】
そのような方法で調製された滅菌前のＥＣＭ組成物のキャラクタリゼーションは、表４にまとめられているように、乾燥重量での特性を示している：
【０２４５】
【表４】
2020142114.tif 000005
【０２４６】
本明細書に引用される全ての出版物及び特許出願は、個々の出版物が、参照されることで包含されるように具体的に、かつ、個別的に、示されていることと同程度に、参照されることで本願明細書に包含される。明確な理解の目的で、本発明のいくつかの詳細が説明及び実施例によって示されているが、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく様々な変更がなされ得ることは、本明細書に開示される内容に照らして、当業者にとって明白であろう。
【図１】
2020142114.tif 000006
【図２】
2020142114.tif 000007
【図３】
2020142114.tif 000008
【外国語明細書】
2020142114000001.pdf