(57)【要約】【課題】本発明では、優れた医薬を得ることを目的とする。【解決手段】膜貫通タンパク質を担持する脂質二重膜有する抗体担持リポソームを含む医薬であって、該膜貫通タンパク質には抗体結合ドメインが設けられ、該抗体結合ドメインを介して、抗体が該脂質二重膜の外側の表面に配置され、該抗体の機能が当モル量の該抗体分子に比べて増強することを特徴とする、医薬の提供。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体担持リポソームを含有する医薬であって、該抗体担持リポソームは
（１）１個の脂質二重膜
（２）１個以上の膜貫通タンパク質、及び
（３）１個以上の抗体
を含有し、
前記膜貫通タンパク質は前記脂質二重膜を貫通し、及び１個以上の抗体結合ドメインを有し、
前記１個以上の抗体結合ドメインの一部又は全部は、前記リポソームの外側に配置され、及び
前記抗体は前記リポソームの外側に配置された抗体結合ドメインに結合し、前記抗体の機能が、当モル量の前記抗体分子に比べて増強されている、医薬。
【請求項２】
前記抗体が、前記リポソームの外側表面に整列配置されることを特徴とする、請求項１に記載する医薬。
【請求項３】
前記の増強される抗体の機能が、抗原結合活性、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、及びＡＤＣＰ活性からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１又は２に記載する医薬。
【請求項４】
前記膜貫通タンパク質が、エンベロープ型ウイルス外皮タンパク質である、請求項１〜３の何れか１項に記載する医薬。
【請求項５】
前記ウイルス外皮タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス外皮タンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス外皮タンパク質、センダイウイルス外皮タンパク質、ヒト免疫不全ウイルス外皮タンパク質、単純ヘルペスウイルス外皮タンパク質、水痘・帯状疱疹ウイルス外皮タンパク質、及びインフルエンザウイルス外皮タンパク質からなる群より選択される少なくとも一種のウイルス外皮タンパク質である、請求項４に記載の医薬。
【請求項６】
前記膜貫通タンパク質がＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である、請求項１〜５の何れか１項に記載の医薬。
【請求項７】
前記抗体結合ドメインが、イムノグロブリンのＦｃ、Ｆｖ、糖鎖、及びＪ鎖からなる群より選択される少なくとも一種に選択的に結合する、請求項１〜６の何れか１項に記載の医薬。
【請求項８】
前記糖鎖が、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、フコース及びシアル酸からなる群より選択される少なくとも一種の炭糖が、少なくとも５個以上グリコシド結合した糖鎖である、請求項１〜７の何れかに１項に記載する医薬。
【請求項９】
前記抗体が、イムノグロブリン、その断片、及びこれらの再構築物からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１〜８の何れか１項に記載する医薬。
【請求項１０】
前記イムノグロブリンの断片が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆｖ、糖鎖、及びＪ鎖から選択される少なくとも一種である、請求項９に記載する医薬。
【請求項１１】
前記イムノグロリン又はその断片の再構築物が、ｓｃＦｖ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ＶＨＨ、及び多価化抗体より選択される少なくとも一種である、請求項９に記載する医薬。
【請求項１２】
前記抗体が、イムノトキシン、アフィボディ（登録商標）、ナノボディ（登録商標）、及びユニボディからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１〜１１の何れか１項に記載する医薬。
【請求項１３】
（１）１個のリポソーム
（２）１個以上の膜貫通タンパク質、及び
（３）１個以上の抗体
を含有し、
前記膜貫通タンパク質は前記リポソームの脂質二重膜を貫通し、及び１個以上の抗体結合ドメインを有し、
前記１個以上の抗体結合ドメインの一部又は全部は、前記リポソームの外側に配置され、及び
前記抗体は前記リポソームの外側に配置された抗体結合ドメインに結合する抗体担持リポソームを使用する工程を含む、前記抗体の機能を増強させる方法。
【請求項１４】
その機能が増強された抗体を有効成分とする医薬の製造方法であって、
一個以上の抗体結合ドメインを設けた膜貫通タンパク質を担持する脂質二重膜を含有する１個のリポソームと、１個以上の該抗体とを結合させる工程を含み、
前記抗体結合ドメインは前記脂質二重膜の外側表面に配置される、
製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の抗体医薬に関する競争の激化に伴い、高品質な抗体医薬を開発する目的で、様々な手段を講じた研究開発がされている。
【０００３】
例えば、抗体医薬の有効成分となるモノモノクローナル抗体を入手するために必要なスクリーニング技術が進歩し、特定の抗原に対する親和性の高い抗体が得られるようになっている。また、抗体医薬による薬理効果を発揮する上で重要なＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を増強させるために、イムノグロブリンの定常領域に存在するＦｃ領域に対して、特定の変異を施す技術も開発されている。
【０００４】
具体的に、Ｓ２９８Ａ-Ｅ３３３Ａ-Ｋ３３４Ａ変異体は、ＦｃγＲＩＩＢ（抑制型Ｆｃγ）への結合力が弱く、且つ、ＦｃγＲＩＩＩへの結合力が強くなることが、非特許文献１に開示されている。
【０００５】
また、非特許文献２には、Ｓ２３９Ｄ-Ｉ３３２Ｅ変異体及びＳ２３９Ｄ-Ｉ３３２Ｅ-Ａ３３０Ｌ変異体は、共に変異導入前と比較してＦｃγＲＩＩＢへの結合力が上昇し、これらの変異体のＦｃγＲＩＩＩへの結合力がとても強いため、結果としてＡＤＣＣ活性化能が、上昇する事実が示されている。また、Ｓ２３９Ｄ-Ｉ３３２Ｅ-Ａ３３０Ｌ変異体は、変異導入前と比べて、ＣＤＣ活性化能が消失す傾向となる事実も示されている。
【０００６】
そして、Ｆ２４３Ｌ-Ｒ２９２Ｐ-Ｙ３００Ｌ-Ｖ３０５Ｉ-Ｐ３９６Ｌ変異体が、ＦｃγＲＩＩＢへの結合力が変異導入前と比較して上昇し、ＦｃγＲＩＩＩへの結合力がとても強いため、結果としてＡＤＣＣ活性化能が上昇する事実が非特許文献３に示されている。
【０００７】
他方、Ｋ３２６Ｗ及びＫ３２６Ｗ-Ｅ３３３Ｓ変異体が、変異導入前と比較して補体Ｃ１ｑの結合量が増大することにより、結果としてＣＤＣ活性化能が増強されることも知られている（非特許文献４）。
【０００８】
また、Ｓ２６７Ｅ-Ｈ２６８Ｆ-Ｓ３２４Ｔ変異体のＣＤＣ活性化能は、変異導入前と比較して約６．９倍程度上昇し、ＡＤＣＣ活性化能は約０．０４５倍程度にまで激減すること、及び、Ｓ２６７Ｅ-Ｈ２６８Ｆ-Ｓ３２４Ｔ-Ｇ２３６Ａ-Ｉ３３２Ｅ変異体のＣＤＣＣ活性化能は、変異導入前と比較して約２３倍程度に上昇し、ＡＤＣＣは約１．２倍程度の微増であることが非特許文献５に開示されている。
【０００９】
特許文献１には、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を改変して、これに抗体を担持させた複合体をＤＤＳ製剤として用いることができる旨の発明が開示されている。ＤＤＳ製剤とは、体内の必要な部位に、必要な量を、必要な時間だけ到達させることを目的に開発された医薬組成物の剤形の一つである。また、特許文献２には、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を改変して抗体を担持させた複合体を用いることによって、これが感度の良いイムノセンサーとして用いることができる旨の発明が開示されている。
【００１０】
また、特許文献３には上記する特許文献１に記載のＤＤＳ用途を利用して、ワクチンを開発した旨の発明が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００４−００２３２３
【特許文献２】特開２０１５−１８４２６９
【特許文献３】国際公開番号２０１３／１４７２３２
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌ．Ｓｈｉｅｌｄｓら，．Ｊ．Ｂ．Ｃ，Ｖｏｌ．２７６，Ｎｏ．９，Ｍａｒｃｈ  ２（２００１），ｐ６５９１-６６０４
【非特許文献２】Ｇｒｅｇ  Ａ．Ｌａｚａｒら，．ＰＮＡＳ  Ｍａｒｃｈ  １４（２００６）ｖｏｌ．１０３，ｎｏ．１１，４００５-４０１０
【非特許文献３】Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｂ．Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎら，．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００７；６７（１８）．８８８２−８８９０
【非特許文献４】Ｅｓｏｈｅ  Ｅ．Ｉｄｕｓｏｇｉｅら，．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（２００１）；１６６，２５７１-２５７５．
【非特許文献５】Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｌ．Ｍｏｏｒｅら，．ｍＡｂｓ２：２，１８１−１８９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記するように、抗体の入手手段の改良又は抗体自体に変異に施すことは、優れた抗体医薬を開発する手段として採用することは難しい。
【００１４】
というのも、既に抗体医薬の有効成分とするために開発された抗体よりも高い親和性を有する抗体を取得することは、まったく新しい抗体を得ることと大差は無く、それまでの開発にかかった時間的及び金銭的な事情を考慮すると、たとえ優れた抗体医薬を得るためといえども、現実的な対応とはいえない。
【００１５】
また、既に抗体医薬の有効成分とするために開発がなされた抗体に対して、上記の様な特定の変異を施して抗体の機能を増強させることは、斯かる変異導入によって抗体医薬の有効成分となる抗体そのものが発揮すべき機能が、意図しないように変更又は減衰してしまう恐れがあるために好ましくない。
【００１６】
斯かる事情を考慮したうえで、本発明では、優れた抗体医薬を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記課題を解決すべく、発明者らは鋭意検討を重ねた結果、既に開発された抗体医薬に用いられる有効成分である抗体をそのまま用いて、斯かる抗体の機能を増強する技術を開発することに着目した。
【００１８】
そこで、抗体結合ドメインが設けられた膜貫通タンパク質を担持する脂質二重膜を有するリポソーム用いることによって、斯かる抗体結合ドメインに結合する抗体の機能を増強させることを明らかにした。
【００１９】
本発明は斯かる知見に基づいて完成されたものであり、後記する態様の発明を広く包含する。
【００２０】
［項１］抗体担持リポソームを含有する医薬であって、該抗体担持リポソームは
（１）１個のリポソーム
（２）１個以上の膜貫通タンパク質、及び
（３）１個以上の抗体
を含有し、
前記膜貫通タンパク質は前記リポソームの脂質二重膜を貫通し、及び１個以上の抗体結合ドメインを有し、
前記１個以上の抗体結合ドメインの一部又は全部は、前記リポソームの外側に配置され、及び
前記抗体は前記リポソームの外側に配置された抗体結合ドメインに結合し、前記抗体の機能が、当モル量の前記抗体分子に比べて増強されている、医薬。
【００２１】
［項２］  前記抗体が、前記リポソームの外側表面に整列配置されることを特徴とする、項１に記載する抗体医薬。
【００２２】
［項３］  前記の増強される抗体の機能が、抗原結合活性、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、及びＡＤＣＰ活性からなる群より選択される少なくとも一種である、項１又は２に記載する抗体医薬。
【００２３】
［項４］  前記膜貫通タンパク質が、エンベロープ型ウイルス外皮タンパク質である、項１〜３の何れか１項に記載する抗体医薬。
【００２４】
［項５］  前記ウイルス外皮タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス外皮タンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス外皮タンパク質、センダイウイルス外皮タンパク質、ヒト免疫不全ウイルス外皮タンパク質、単純ヘルペスウイルス外皮タンパク質、水痘・帯状疱疹ウイルス外皮タンパク質、及びインフルエンザウイルス外皮タンパク質からなる群より選択される少なくとも一種のウイルス外皮タンパク質である、項４に記載の抗体医薬。
【００２５】
［項６］  前記膜貫通タンパク質がＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である、項１〜５の何れか１項に記載の抗体医薬。
【００２６】
［項７］  前記抗体結合ドメインが、イムノグロブリンのＦｃ、Ｆｖ、糖鎖、及びＪ鎖からなる群より選択される少なくとも一種に選択的に結合する、項１〜６の何れか１項に記載の医薬。
【００２７】
［項８］  前記糖鎖が、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、フコース及びシアル酸からなる群より選択される少なくとも一種の炭糖が、少なくとも５個以上グリコシド結合した糖鎖である、項１〜７の何れかに１項に記載する医薬。
【００２８】
［項９］  前記抗体が、イムノグロブリン、その断片、及びこれらの再構築物からなる群より選択される少なくとも一種である、項１〜８の何れか１項に記載する医薬。
【００２９】
［項１０］  前記イムノグロブリンの断片が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆｖ、糖鎖、及びＪ鎖から選択される少なくとも一種である、項９に記載する医薬。
【００３０】
［項１１］  前記イムノグロリン又はその断片の再構築物が、ｓｃＦｖ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ＶＨＨ、及び多価化抗体より選択される少なくとも一種である、項９に記載する医薬。
【００３１】
［項１２］  前記抗体が、イムノトキシン、アフィボディ（登録商標）、ナノボディ（登録商標）、及びユニボディ（登録商標）からなる群より選択される少なくとも一種である、項１〜１１の何れか１項に記載する医薬。
【００３２】
［項１３］
（１）１個のリポソーム
（２）１個以上の膜貫通タンパク質、及び
（３）１個以上の抗体を含有し、
前記膜貫通タンパク質は前記リポソームの脂質二重膜を貫通し、及び１個以上の抗体結合ドメインを有し、
前記１個以上の抗体結合ドメインの一部又は全部は、前記リポソームの外側に配置され、及び
前記抗体は前記リポソームの外側に配置された抗体結合ドメインに結合する抗体担持リポソームを使用する工程を含む、
前記抗体の機能を増強させる方法。
【００３３】
［項１４］
その機能が増強された抗体を有効成分とする医薬の製造方法であって、
一個以上の抗体結合ドメインを設けた膜貫通タンパク質を担持する脂質二重膜を含有する１個のリポソームと、１個以上の該抗体とを結合させる工程を含み、
前記抗体結合ドメインは前記脂質二重膜の外側表面に配置される、
製造方法。
【発明の効果】
【００３４】
本発明にかかる医薬は、その有効成分である抗体が有する機能を増強させる効果を発揮する。本発明にかかる医薬は、少ない投与量にて所望する治療効果を発揮することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】実施例１に示す本発明の医薬による効果を確認するｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験結果を示すグラフ。グラフ中の四角マークはＺＺ−ＢＮＣを、菱形マークはハーセプチンを、三角マークはＺＺ−ＢＮＣ−ハーセプチンを、クロスマークはカドサイラを、そしてサークルマークはＺＺ−ＢＮＣ−カドサイラを使用した時の結果を示している。グラフ中の縦軸は細胞生存率（％）を示す。また、グラフ中の横軸は、使用したサンプルの抗体部分で算出した濃度（ｎＭ）を示す。
【図２】実施例２に示す本発明の医薬による効果を確認するｉｎ  ｖｉｖｏ実験結果を示すグラフ。グラフ中の四角マークはＺＺ−ＢＮＣを、菱形マークはハーセプチンを、三角マークはＺＺ−ＢＮＣ−ハーセプチンを、クロスマークはカドサイラを、そしてサークルマークはＺＺ−ＢＮＣ−カドサイラを使用した時の結果を示している。
【図３】本発明の医薬を説明するための模式図。図中の（Ａ）は、ＺＺ−ＢＮＣ（抗体結合前の本発明の抗体担持リポソームに相当する）に基づく本発明の医薬を説明する図である。図中の（Ｂ）は、ＬＬ−ＢＮＣ（抗体結合前の本発明の抗体担持リポソームに相当する）に基づく本発明の医薬を説明する図である。図中の（Ｃ）は、ＧＬ−ＢＮＣ又はＬＧ−ＢＮＣ（抗体結合前の本発明の抗体担持リポソームに相当する）に基づく本発明の医薬を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明の医薬は、抗体担持リポソームを含有し、該抗体担持リポソームは
（１）１個のリポソーム
（２）１個以上の膜貫通タンパク質、及び
（３）１個以上の抗体
を含有し、
前記膜貫通タンパク質は前記リポソームの脂質二重膜を貫通し、及び１個以上の抗体結合ドメインを有し、
前記１個以上の抗体結合ドメインの一部、又は全部は、前記リポソームの外側に配置され、及び
前記抗体は前記リポソームの外側に配置された抗体結合ドメインに結合し、前記抗体の機能が、当モル量の前記抗体分子に比べて増強されている医薬である。
【００３７】
前記膜貫通タンパク質は前記抗体担持リポソームに含有されるリポソームの脂質二重膜を貫通する。すなわち、本発明の医薬において、前記膜貫通タンパク質は前記抗体担持リポソームに含有されるリポソームの脂質二重膜中に存在すると言える。ここで、「貫通」とは必ずしも該膜貫通タンパク質が該リポソームの脂質二重膜を突き抜ける態様には限定されず、該膜貫通タンパク質が該リポソームの外側に突出されている態様であってもよい。
【００３８】
本発明の医薬にて増強される抗体の機能とは、抗体が原始的に有する機能であって、所望の薬理効果を発揮する範囲内の機能であれば、特に限定されない。具体的には、抗原結合活性、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、又はＡＤＣＰ活性等を挙げることができる。
【００３９】
上記する抗体結合活性とは、抗体と抗原との結合力（親和性ともいう）であると例示される。このような結合力の増強の度合いは、抗体と抗原との結合定数等を指標として確認することができる。結合定数の測定方法は、特に限定されない。本発明に係る抗体医薬が有する上記の抗原結合活性は、本発明の抗体医薬が複数の抗体を有しているため、抗原と抗体との一対一対応の結合能を示すアフィニティとして測定することは好ましくなく、アビディティとして測定することが好ましい。
【００４０】
具体的には、Ｉｉｊｉｍａ  Ｍら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３２（２０１１）；１４５５−１４６４、Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｐ．Ａｄａｍｓら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ２００６；１２：１５９９−１６０５等の公知の文献に記載の方法を適宜改変して求めることができる。また、通常用いられる公知のイライザキット等を用いて測定することも可能である。
【００４１】
上記するＡＤＣＣ活性とは、抗体依存性細胞傷害活性とも呼ばれる。この活性は、抗体がマクロファージ、ＮＫ細胞、好中球、又は好酸球等のエフェクター細胞を、その近傍にリクルートし、その抗体近傍に存在する細胞又は生体内分子等に対し、リクルートされたエフェクター細胞を介して障害を与える活性と例示される。
【００４２】
このようなＡＤＣＣ活性化の程度を測定する方法は、特に限定されない。具体的には、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ｜Ａｕｇｕｓｔ  ２００７｜ｖｏｌ．９８｜ｎｏ．８｜１２７５-１２８０等の公知の文献に記載の方法を適宜改変して測定することができる。また、ＡＤＣＣ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｂｉｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてこれを測定することも可能である。その他の測定方法として、例えば、血液の白血球画分等を標的細胞と混合させることによる細胞障害を、ＬＤＨ漏れ出し量の測定、ＷＳＴ−８等を用いた細胞の生存活性等を数値化することによっても測定することができる。
【００４３】
上記のＣＤＣ活性とは、補体依存性細胞傷害活性とも呼ばれる。この活性は、抗体が補体を、その近傍にリクルートし、その抗体近傍に存在する細胞又は生体内分子等に対し、リクルートされた補体を介して障害を与える活性と例示される。このようなＣＤＣ活性の程度を測定する方法は、特に限定されない。具体的には、ＡＤＣＣの測定にて上記した文献等に記載する公知の方法を適宜改変して測定することができる。具体的には、血清を細胞に添加し、血清中の補体による細胞障害の程度を測定することにより測定可能である。
【００４４】
上記のＡＤＣＰ活性とは、抗体依存性細胞貪食活性とも呼ばれる。この活性は、抗体がマクロファージ等を、その近傍にリクルートし、その抗体近傍に存在する細胞又は生体内分子等に対し、リクルートされたマクロファージ等の貪食作用発揮させる活性と例示される。このようなＡＤＣＰ活性の程度を測定する方法は、特に限定されない。具体的には、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ＶＯＬ．１１１  Ｎｏ．４，３９１-３９６，２０１１等の公知の文献に記載の方法を適宜改変して測定することができる。この文献には、蛍光色素ＰＥで標識された貪食細胞（ＴＨＰ−１）と蛍光色素カルセインで標識された標的細胞（Ｒａｍｏｓ）を混合培養後にＦＡＣＳ解析することによって、貪食された標的細胞がＰＥとカルセインのダブル・ポジティブになることを指標として、貪食された標的細胞数の割合によりＡＣＤＰ活性を評価することを開示している。
【００４５】
また、ＦｃγＲＩＩａ−Ｈ  ＡＤＣＰ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｂｉｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）等のＦｃγＲＩＩａを発現する細胞を用いたアッセイで、ＡＤＣＰ活性を定量することも可能である。より詳細に説明すると、エフェクター細胞としてＦｃγＲＩＩａ−Ｈを安定発現し、なおかつＦｃ結合型ＦｃγＲＩＩａにより活性化を受ける転写因子ＮＦＡＴの結合配列、及びその下流にルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を結合した塩基配列を有するポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれている細胞を用いる。標的細胞に結合した抗体を上記のエフェクター細胞のＦｃγＲＩＩａが認識するとルシフェラーゼが発現する。このルシフェラーゼの活性を測定することにより、ＡＤＣＰ活性を定量化することができる。
【００４６】
上記する抗体の各種機能の増強を確認する方法は、特に限定されない。具体的には、本発明の医薬と、本発明の医薬を構成する抗体と同一の抗体とを、それぞれ同モル量の使用量で上記の各種測定方法等に供して、両者の抗体の機能の比較をすればよい。
【００４７】
なお、上記する抗体そのものが有する各種機能は、例えば、ある抗体の抗原をその表面に発現する細胞に対する生存活性の低下の程度、又はこのような細胞を含む組織の体積の減少の程度等を基に確認することもできる。具体的に後記する実施例では、本発明の医薬に含まれる抗体そのものが有する各種機能が増大（上記する細胞の生存活性の低下及び組織体積の減少）することの典型例を示している。
【００４８】
本発明の医薬の構成成分である抗体担持リポソームに含有されるリポソームの脂質二重膜中の膜貫通タンパク質とは、特に限定されない。
【００４９】
具体的には、エンベロープ型ウイルス外皮タンパク質等を挙げることができる。エンベロープ型ウイルス外皮タンパク質とは、ウイルス外皮タンパク質の中でも、エンベロープを構成するタンパク質であることを意味する。これらのエンベロープ型ウイルス外皮タンパク質は、一種又は複数を組み合わせて採用することもできる。
【００５０】
上記するエンベロープ型ウイルス外皮タンパク質とは、特に限定されない。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス外皮タンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス外皮タンパク質、センダイウイルス外皮タンパク質、ヒト免疫不全ウイルス外皮タンパク質、単純ヘルペスウイルス外皮タンパク質、水痘・帯状疱疹ウイルス外皮タンパク質、又はインフルエンザウイルス外皮タンパク質等を挙げることができる。
【００５１】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）外皮タンパク質に由来するエンベロープ型ウイルス外皮タンパク質として、具体的には、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）等を挙げることができる。なお、これらのタンパク質は、一種又は複数を組みわせて、上記する本発明の医薬の膜貫通タンパク質として採用することができる。
【００５２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）外皮タンパク質に由来するエンベロープ型ウイルス外皮タンパク質として、具体的には、グリコタンパク質であるＥ１タンパク質又はＥ２タンパク質等を挙げることができる。なお、これらのタンパク質は、一種又は複数を組みわせて、上記する本発明の医薬の膜貫通タンパク質として採用することができる。
【００５３】
センダイウイルス（ＳｅＶ）外皮タンパク質に由来するエンベローブ型ウイルス外皮タンパク質として、具体的には、グリコタンパク質であるＦタンパク質又はＨＮタンパク質等を挙げることができる。なお、これらのタンパク質は、一種又は複数を組みわせて、上記する本発明の医薬の膜貫通タンパク質として採用することができる。
【００５４】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）外皮タンパク質に由来するエンベローブ型ウイルス外皮タンパク質として、具体的には、グリコタンパク質であるＧＰ１６０タンパク質、ＧＰ１２０タンパク質、又はＧＰ４１タンパク質等を挙げることができる。なお、これらのタンパク質は、一種又は複数を組みわせて、上記する本発明の医薬の膜貫通タンパク質として採用することができる。
【００５５】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）外皮タンパク質に由来するエンベローブ型ウイルス外皮タンパク質として、具体的には、グリコタンパク質であるｇＢタンパク質、ｇＣタンパク質、ｇＤタンパク質、ｇＨタンパク質、又はｇＬタンパク質等を挙げることができる。なお、これらのタンパク質は、一種又は複数を組みわせて、上記する本発明の医薬の膜貫通タンパク質として採用することができる。
【００５６】
水痘・帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）外皮タンパク質外皮タンパク質に由来するエンベローブ型ウイルス外皮タンパク質として、具体的には、グリコタンパク質であるｇＢタンパク質、ｇＣタンパク質、ｇＥタンパク質、ｇＨタンパク質、ｇＩタンパク質、ｇＫタンパク質、又はｇＬタンパク質等を挙げることができる。なお、これらのタンパク質は、一種又は複数を組みわせて、上記する本発明の医薬の膜貫通タンパク質として採用することができる。
【００５７】
インフルエンザウイルス外皮タンパク質に由来するエンベローブ型ウイルス外皮タンパク質として、具体的には、グリコタンパク質であるＭ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ヘマグルチニン、又はノイラミニダーゼ等を挙げることができる。なお、これらのタンパク質は、一種又は複数を組みわせて、上記する本発明の医薬の膜貫通タンパク質として採用することができる。
【００５８】
上記する膜貫通タンパク質の中で、最も好ましい膜貫通タンパク質は、Ｂ型肝炎表面抗原ウイルス（ＨＢｓＡｇ）である。
【００５９】
なお、上記する膜貫通タンパク質は、本発明の医薬における抗体の機能を増強させる効果を減衰させない範囲において、置換、挿入、及び／又は欠失等に代表される各種の変異を施すことができる。また、膜貫通能を発揮しないような変異が好ましくないことはいうまでも無い。
【００６０】
このような変異とは、変異前後のアミノ酸配列の相同性が８０％以上であることが好ましく、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、最も好ましくは９９．５％以上である。
【００６１】
上記する本発明の医薬の構成成分である抗体担持リポソームに含有されるリポソームの脂質二重膜中の膜貫通タンパク質に配置される抗体結合ドメインは、特に限定されない。例えば、イムノグロブリンのＦｃ、Ｆｖ、糖鎖、又はＪ鎖等に結合するドメインを挙げることができる。これらの抗体結合ドメインに対する後記する抗体の結合は、特異的な結合であることが好ましい。
【００６２】
上記する抗体結合ドメインは、本発明の医薬の構成成分である抗体担持リポソームに含有される脂質二重膜中の膜貫通タンパク質において、１個以上配置される。好ましい態様として、上記する脂質二重膜の外側に、１個以上（１個又は複数個）配置される。
【００６３】
イムノグロブリンのＦｃとは、抗体間でも比較的変化の少ない定常領域に含まれ、例えば、ＩｇＧであれば、その構造からＦ（ａｂ）’領域を除いたＣＨ２−ＣＨ３領域がＦｃに相当する。
【００６４】
このようなＦｃに結合するタンパク質の典型例として、黄色ブドウ球菌等に由来するプロテインＡを挙げることができる。プロテインＡとは、ヒト由来（以後、「ｈ」と称することがある）のＩｇＤには結合しない傾向であるものの、各種動物に由来するアイソタイプのＩｇＧに結合することが認められるタンパク質である。
【００６５】
例えば、ＩｇＧであれば、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ４、マウス由来（以後、「ｍ」と称することがある）ＩｇＧ２ａ、ｍＩｇＧ２ｂ、又はｍＩｇＧ３等に高い特異性で結合することが分かっている。
【００６６】
このようなプロテインＡが有するＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、及びＣドメインを含むＺドメインを、上記する抗体のＦｃに結合する抗体結合ドメインとして挙げることができる。具体的なＺドメインのアミノ酸配列は特に限定されない。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列を挙げることができる。
【００６７】
上記する抗体結合ドメインとして、Ｚドメインを採用した本発明の医薬は、例えば、配列番号４に記載するアミノ酸配列を含むペプチドが配置された膜貫通タンパク質を含有する脂質二重膜有するリポソームを作製することによって得ることができる。このような膜貫通タンパク質には、上記するＺドメインがタンデムに２個並べられた態様にて配置されている。
【００６８】
具体的に、上記するＺドメインを有する医薬は、配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを用いて宿主細胞を形質転換し、これを培養する生合成によって容易に得ることができる。このような製造方法は、具体的には特許文献１〜３の記載に準じて行うことができ、得られる本発明の医薬の構成要素である抗体を担持する前のリポソームを、本明細書において「ＺＺ−ＢＮＣ」と呼ぶことがある。
【００６９】
上記の配列番号４に記載のアミノ酸配列は、本発明の医薬における、抗体の機能を増強させる効果を減衰させない範囲において、置換、挿入、及び／又は欠失等に代表される変異を施すことができる。また、膜貫通能を減衰するような変異も、抗体結合能を減衰するような変異も好ましくない。
【００７０】
このような変異とは、変異前後のアミノ酸配列の相同性が８０％以上であることが好ましく、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、最も好ましくは９９．５％以上である。
【００７１】
上記する抗体のＦｃに結合するタンパク質のもう一つの典型例として、連鎖球菌等に由来するプロテインＧを挙げることができる。このプロテインＧとは、上記したプロテインＡと同様に、ＩｇＤには結合しない傾向であるものの、各種動物に由来するアイソタイプのＩｇＧに結合することが認められるタンパク質である。
【００７２】
例えば、ＩｇＧであれば、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４、ｍＩｇＧ２ａ、ｍＩｇＧ２ｂ、又はｍＩｇＧ３等に高い特異性で結合することが分かっている。
【００７３】
このプロテインＧが有するＣ１、Ｄ１，Ｃ２、Ｄ２、又はＣ３ドメインを、上記する抗体のＦｃに結合する抗体結合ドメインとして挙げることができる。プロテインＧに由来するドメインの中でもＣ２ドメインが好ましい。具体的なＣ２ドメインのアミノ酸配列は特に限定されない。例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列を挙げることができる。
【００７４】
イムノグロブリンのＦｖとは抗体の可変領域に包含され、抗原決定に際して重要な働きを担う部分に相当する。
【００７５】
このようなＦｖに結合するタンパク質として、ペプトストレプトコッカス属マグナスに由来するプロテインＬを挙げることができる。このプロテインＬとは、抗体のＦｖに結合する、より詳細には、κ軽鎖に結合することから、ほぼすべてのアイソタイプのイムノグロブリンに結合することが認められる。
【００７６】
プロテインＬが有するＢ１、Ｂ２，Ｂ３、Ｂ４、又はＢ５ドメインを、上記する抗体のＦｖに結合する抗体結合ドメインとして挙げることができる。プロテインＬに由来するドメインの中でもＢ１ドメインが好ましい。具体的なＢ１ドメインのアミノ酸配列は特に限定されない。例えば、配列番号３に示すアミノ酸配列を挙げることができる。
【００７７】
なお、上記する抗体結合ドメインとしてＬドメインを採用した本発明の医薬は、例えば、配列番号５に記載するアミノ酸配列を含むペプチドが配置された膜貫通タンパク質を含有する脂質二重膜を有するリポソームを作製することによって得ることができる。このような膜貫通タンパク質には、上記するＬドメインがタンデムに２個並べられた態様にて配置されている。
【００７８】
具体的に、上記するＬドメインを有する医薬は、配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを用いて宿主細胞を形質転換し、これを培養する生合成によって容易に得ることができる。このような製造方法は、具体的には特許文献１〜３の記載に準じて行うことができ、得られる本発明の医薬の構成要素である抗体を担持する前のリポソームを、本明細書において「ＬＬ−ＢＮＣ」と呼ぶことがある。
【００７９】
なお、上記の配列番号５に記載のアミノ酸配列も、上記するＺＺ−ＢＮＣと同様に、本発明の医薬における、抗体の機能を増強させる効果を減衰させない範囲において、置換、挿入、及び／又は欠失等に代表される各種の変異を施すことができる。また、膜貫通能を発揮しないような変異も、抗体結合能を減衰するような変異も好ましくない。
【００８０】
このような変異は、変異前後のアミノ酸配列の相同性が８０％以上であることが好ましく、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、最も好ましくは９９．５％以上である。
【００８１】
また、上記する抗体のＦｃに結合する抗体結合ドメインの典型例であるプロテインＧに含まれるＣ２ドメイン（例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列）と上記する抗体のＦｖに結合する抗体結合ドメインの典型例であるプロテインＬに含まれるＢ１ドメイン（例えば、配列番号３に示すアミノ酸配列）とが、タンデムにて配置された態様のアミノ酸配列を有するＬＧ−ＢＮＣ（配列番号６）及びＧＬ−ＢＮＣ（配列番号７）も、本発明の医薬の構成要素である抗体を担持する前のリポソームの典型例として挙げることができる。
【００８２】
このようなＬＧ−ＢＮＣもＧＬ−ＢＮＣも、共に上記するＺＺ−ＢＮＣと同様にして得ることができる。
【００８３】
なお、上記する配列番号６及び７に記載のアミノ酸配列も、本発明の医薬における、抗体の機能を増強させる効果を減衰させない範囲において、置換、挿入、及び／又は欠失等に代表される各種の変異を施すことができる。また、膜貫通能を発揮しないような変異も抗体結合能を減衰するような変異も好ましくない。
【００８４】
このような変異とは、変異前後のアミノ酸配列の相同性が８０％以上であることが好ましく、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、最も好ましくは９９．５％以上である。
【００８５】
上記する本発明の医薬における抗体結合ドメインに選択的に結合する対象として挙げる糖鎖とは、後記する上記抗体結合ドメインに結合する抗体が有する糖鎖であれば、特に限定はされない。このような糖鎖は抗体のアスパラギン酸（Ａｓｎ）に結合するＮ型糖鎖であることが好ましい。
【００８６】
このような糖鎖として、具体的には、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、フコース、及びシアル酸等に代表される単糖が、グリコシド結合した糖鎖を挙げることができる。
【００８７】
また、糖鎖における上記する単糖がグリコシド結合する個数は特に限定はされない。具体的には、５個以上とすることができる。斯かる個数の上限値も限定的ではなく、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、又は１５個を例示することができる。
【００８８】
上記するグリコシド結合の態様も特に限定されない。具体的には、１−２結合、１−３結合、１−４結合、１−５結合、又は１−６結合等を挙げることができる。また、α結合であってもβ結合であってもよい。
【００８９】
このような糖鎖の具体例として、下記の表にて示すようなＮ型糖鎖を例示することができる。
【００９０】
【表１】
2020093980.tif 000003
【００９１】
表１の糖鎖の中でも、２つのシアル酸（◇）を含まない、１６種類の何れかに示す糖鎖が、ヒトＩｇＧに存在する糖鎖として好ましく例示される。
【００９２】
この様な好ましい糖鎖の典型例（Ｇ０、Ｇ１、及びＧ２）を下記の表２に示す。
【００９３】
【表２】
2020093980.tif 000004
【００９４】
上記する本発明の医薬における抗体結合ドメインに選択的に結合する対象として挙げるＪ鎖とは、抗体が有するタンパク質であり、特に限定はされない。具体的には、ＩｇＡ又はＩｇＭが有するＪ鎖を例示することができる。このようなＪ鎖のアミノ酸配列は特に限定されない。例えば、アメリカ合衆国の国立衛生研究所（ＮＩＨ）の国立医学図書館に付属する国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）にて、ＮＰ＿６５３２４７．１で検索されるアミノ酸配列を挙げることができる。
【００９５】
上記する本発明の医薬の構成要素である抗体担持リポソームに含有される抗体は、医薬の有効成分として用いられる抗体であれば、特に限定されない。このような抗体として、具体的には、イムノグロブリン、その断片、又はこれらの再構築物を挙げることができる。
【００９６】
上記するイムノグロブリンのアイソタイプは、特に限定されない。具体的には、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＷ，ＩｇＸ、ＩｇＹ、又はＩｇＮＡＲ等のアイソタイプを挙げることができる。これらのイムノグロブリンのアイソタイプ中でも、哺乳類動物が原始的に有するイムノグロブリンであるＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＥが好ましく、中でもＩｇＧが、上記するイムノグロブリンのアイソタイプとして好ましい。
【００９７】
なお、上記するＩｇＧとはサブクラスにカテゴライズされ、具体的には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、又はＩｇＧ２ｃ等を挙げることができる。また、上記するＩｇＡもサブクラスにカテゴライズされ、具体的にはＩｇＡ１又はＩｇＡ２等を挙げることができる。
【００９８】
上記する本発明の医薬の構成要素である抗体担持リポソームに含有される抗体の典型例であるイムノグロブリンの断片とは、特に限定されない。具体的には、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆｖ、糖鎖、ＩｇＡに由来するＪ鎖、又はＩｇＭに由来するＪ鎖等を挙げることができる。
【００９９】
上記するＦａｂとは、具体的には、ＩｇＧの重鎖に由来するＶＨ−ＣＨ１領域と軽鎖に由来するＶＬ−ＣＬがジスルフィド結合した分子であり、ＩｇＧをパパインで消化することによって得ることができる分子であると例示される。
【０１００】
上記するＦ（ａｂ’）２とは、具体的には、上記する２分子のＦａｂが、ヒンジ領域とそれに含まれるシステイン残基によってジスルフィド結合した分子であり、ＩｇＧをペプシンで消化することによって得ることができる分子であると例示される。
【０１０１】
上記するＦｃ、Ｆｖ、糖鎖、及びＪ鎖とは、本発明の医薬の構成要素である抗体担持リポソームに含有される脂質二重膜中の膜貫通タンパク質に配置された抗体結合ドメインの結合対象として説明したものと同様にすることができる。
【０１０２】
上記する本発明の医薬の構成要素である抗体担持リポソームに含有される抗体の典型例であるイムノグロブリン又はイムノグロブリンの断片の再構築物とは、特に限定されない。具体的には、ｓｃＦｖ、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ミニボディ（Ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖーＦｃ、ＶＨＨ、又は多価化抗体等を挙げることができる。
【０１０３】
上記するｓｃＦｖとは、具体的には、ＩｇＧの重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とがリンカーを介して結合してなる構造を有する分子であると例示される。このようなｓｃＦｖは、上記のＶＨとＶＬとのリンカーを介する結合として、後記する４つの態様を挙げることができるが、これらの何れかの態様に限定されないのはいうまでも無い。
・（N末端）ＶＨ（Ｃ末端）−（リンカー）−（Ｎ末端）ＶＬ（Ｃ末端）
・（N末端）ＶＬ（Ｃ末端）−（リンカー）−（Ｎ末端）ＶＨ（Ｃ末端）
・（N末端）ＶＨ（Ｃ末端）−（リンカー）−（Ｃ末端）ＶＬ（Ｎ末端）
・（N末端）ＶＬ（Ｃ末端）−（リンカー）−（Ｃ末端）ＶＨ（Ｎ末端）
【０１０４】
上記するディアボディとは、具体的には、上記の２分子のｓｃＦｖが、これらに含まれるＶＨとＶＬとを介して、互いに非共有結合的に会合してなる構造を有する分子であると例示される。
【０１０５】
上記するトリアボディとは、具体的には、上記の３分子のｓｃＦｖが、これらに含まれるＶＨとＶＬとを介して、互いに非共有結合的に会合してなる構造を有する分子であると例示される。
【０１０６】
上記するテトラボディとは、具体的には、上記の４分子のｓｃＦｖが、これらに含まれるＶＨとＶＬとを介して、互いに非共有結合的に、且つ、平面的に会合してなる構造を有する分子であると例示される。
【０１０７】
上記するミニボディとは、具体的には、上記のｓｃＦｖの末端にＩｇＧのＦｃドメインに含まれるＣＨ３ドメインが結合してなる２つの分子が、互いにそのＣＨ３ドメイン同士を介した非共有結合的に会合してなる構造を有する分子であると例示される。
【０１０８】
上記するｓｃＦｖーＦｃとは、具体的には、上記のｓｃＦｖの末端にヒンジ部、及びＩｇＧのＦｃドメインに含まれるＣＨ２ドメイン並びにＣＨ３ドメインが結合した２つの分子が、互いに上記のミニボディの構造にて説明したＣＨ３ドメイン同士を介した非共有結合的な会合及び該ヒンジ部を介したジスルフィド結合によって得られる構造を有する分子であると例示される。
【０１０９】
上記するＶＨＨとは、具体的には、ラクダ科動物の血中に存在する低解離定数で標的抗原に結合する能力を有する分子であり、ＩｇＧと比較すると重鎖のみからなる構造を有する、分子量約１３ｋＤａ程度のタンパク質として例示される。
【０１１０】
上記する多価化抗体とは、一個以上の抗原結合部位を有する抗体である限り、特に限定されない。例えば、上記するトリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、又はＩｇＧ、ＩｇＡ並びにＩｇＭ等のイムノグロブリンのほかに、四価ＩｇＧ等を挙げることができる。また、二重特異性抗体も本発明のイムノグロブリン又はイムノグロブリンの断片の再構築物の典型例として挙げる多価化抗体に包含される。
【０１１１】
本発明の医薬の構成要素である抗体担持リポソームに含有されるリポソームの脂質二重膜中の膜貫通タンパク質に配置された抗体結合ドメインに結合する抗体の他の典型例として、イムノトキシン、アフィボディ（登録商標）、ナノボディ（登録商標）、又はユニボディ等を挙げることもできる。
【０１１２】
イムノトキシンとは、抗体−薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｕｇａｔｅ：ＡＤＣ）とも呼ばれ、上記する抗体に細胞毒性作用を発揮する分子が担持されてなる分子のことを言う。
【０１１３】
細胞毒性作用を発揮する分子とは、特に限定されない。例えば、エムタンシン（ＤＭ１）、オゾガマイシン（カリケアミシン類）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、デュオカルマイシン類、アマニチン（ＡＡＭＴ）、アドゼルシン、ビゼルシン、カルゼルシン（Ｕ−８０２４４）、ＰＮＵ１５９６８２（ネモルビシン類）等を挙げることができる。これらの分子の中でも、かなり細胞に対する毒性が高いものが好ましい。このような分子として、例えば、エムタンシンを挙げることができる。
【０１１４】
アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）とは登録商標である。アフィボディとはプロテインＡの特定のドメインを足場にして、３つのへリックスドメインが結束した構造を有し、低解離定数で標的タンパク質（抗原）に結合する機能を有するタンパク質分子として例示される。より詳細に記載される米国特許第５，８３１，０１２号を参照することもできる。
【０１１５】
ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）とはＡｂｌｙｎｘ社の商標である。ナノボディとは、本発明の医薬の構成要素である脂質二重膜に担持される膜貫通タンパク質に設けられた抗体結合ドメインに結合する抗体の典型例として、上記に説明したＶＨＨを模倣した構造を有する抗原結合機能を有する分子である。より詳細に記載されるＷＯ２００４／０４１８６７を参照することもできる。
【０１１６】
ユニボディ（Ｕｎｉｂｏｄｙ）とは登録商標である。ユニボディとは、当技術分野で周知であり、これは、ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域を欠く抗体断片をいう。このようなヒンジ領域の欠失によって、従来のＩｇＧ４抗体の大きさの本質的に半分であり、且つＩｇＧ４抗体の二価の結合領域ではなく一価の結合領域を有する分子であると説明できる。より詳細には、ＷＯ２００７／０５９７８２の記載を参照することもできる。
【０１１７】
上記する本発明の医薬の構成要素である抗体担持リポソームに含有される抗体は、一種又は複数を組み合わせて用いることができる。
【０１１８】
本発明の医薬は、上記する抗体結合ドメインが配置された膜貫通タンパク質を有する脂質二重膜を有するリポソーム（典型例として上記にて挙げた、上記のＺＺ−ＢＮＣ、ＬＬ−ＢＮＣ、ＬＧ−ＢＮＣ、又はＧＬ−ＢＮＣ等）と、上記する抗体とを接触させることによって容易に作製することができる。
【０１１９】
このようにして得られる本発明の医薬の構成要素である抗体担持リポソームにおける上記する抗体の結合態様は、特に限定はされない。具体的には、前記抗体担持リポソームに含まれるリポソームの脂質二重膜の外側表面に、これが有する膜貫通タンパク質に設けられた抗体結合ドメインを介して、上記する抗体が整列配置された態様で結合されることが好ましい。整列配置とは、抗体の配向性が一様である状態を挙げることができる。
【０１２０】
例えば、本発明の医薬の構成要素である抗体担持リポソームに含有されるリポソームの脂質二重膜の外側に配置された抗体結合ドメインに結合する抗体が、Ｆｃ及びＦｖを有する抗体であるとき、該Ｆｃが該脂質二重膜中の膜貫通タンパク質に配置された抗体結合ドメインに固定され、Ｆｖが該脂質二重膜（リポソーム）の外側に一様に向いている状態を挙げることができる。このような状態は、Ｉｉｊｉｍａ  Ｍら、  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２（２０１２）７９０（５ｐａｇｅｓ）に記載の方法を採用することによって確認することができる。
【０１２１】
より具体的には、本発明の医薬の構成成分であるＺＺ−ＢＮＣは、図３（Ａ）の模式図に示すように、リポソームの外側に抗体のＦｖが一様に配向した構造であると例示することができる。
【０１２２】
また、本発明の医薬の構成成分であるＬＬ−ＢＮＣは、図３（Ｂ）の模式図に示すように、リポソームの外側に抗体のＦｃが一様に配向した構造であると例示することができる。
【０１２３】
そして、本発明の医薬の構成成分であるＬＧ−ＢＮＣ及びＧＬーＢＮＣは、図３（Ｃ）の模式図に示すように、リポソームの外側に抗体のＦｖが一様に配向した構造（ＺＺ−ＢＮＣの特徴）と、リポソームの外側に抗体のＦｃが一様に配向した構造（ＬＬ−ＢＮＣの特徴）を併せ持った構造であると例示することができる。
【０１２４】
上記する本発明の医薬の構成要素である抗体担持リポソームに含まれるリポソームの脂質二重膜中の膜貫通タンパク質に配置された抗体結合ドメインと、上記する抗体との結合は、架橋剤を用いた架橋処理によってより強固にされることもできる。
【０１２５】
このような架橋剤は、特に限定されない。例えば、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーションとして用いられる、ＤＡＢＣＯ（１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン）、３−（ジフェニルホスフィノ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル等；光反応性クロスリンカーとして用いられる、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸、ＢＡＳＥＤ（ビス［２−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド）、４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル］安息香酸、４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル］ベンジルアルコール、４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル］ベンジルアミン塩酸塩、４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル］ベンジルブロミド等；ヘテロ二官能性クロスリンカーとして用いられる、２−メルカプトエチルアミン、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド塩酸塩、カルボキシ−ＰＥＧ６−アミン、ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド、３−アジドプロピルアミン、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸、ＰＥＧ５−アジド、アミノ−ＰＥＧ３−アジド、アジド−ＰＥＧ３−カルボン酸、ＰＥＧ４−アジド、５−アジド吉草酸、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）プロパルギルアミン、３−ブチン酸、Ｎ−カルボベンゾキシ−６−アミノヘキサン酸、ジベンゾシクロオクチン−マレイミド（米国では使用不可）、ジエチレングリコールモノ（２−プロピン−１−イル）エーテル、８−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−３，６−ジオキサ−ｎ−オクタン酸、３−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−１−プロパノール、ゲニピン（（１Ｓ，２Ｒ，６Ｓ）−２−ヒドロキシ−９−（ヒドロキシメチル）−３−オキサビシクロ［４．３．０］ノナ−４，８−ジエン−５−カルボン酸メチル）、グリシジル２−プロピニルエーテル、５−ヘキシン酸、ＤＬ−α−リポ酸、（Ｒ）−α−リポ酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドヘキサン酸、１９−マレイミド−１７−オキソ−４，７，１０，１３−テトラオキサ−１６−アザノナデカン酸、３−マレイミドプロピオン酸、６−メルカプト−１−ヘキサノール、プロパルギル酢酸、プロパルギルアミン、Ｎ−プロパルギルマレイミド、プロパルギル−ＰＥＧ５−ＮＨＳ、２−［２−（プロパルギルオキシ）エトキシ］エチルアミン、２−（２−プロパルギルオキシ）エチルアミン、ＢＣＮ−アミン（Ｎ−（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチルオキシカルボニル−１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン）、ＳＡＴＰ（３−（アセチルチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル）、Ｎ−アクリルオキシスクシンイミド、ＡＮＢ−ＮＯＳ（Ｎ−（５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシ）スクシンイミド）、４−（アジドスルホニル）安息香酸Ｎ−スクシンイミジル、ＡＴＦＢ−ＳＥ（４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸Ｎ−スクシンイミジル）、４−ベンゾイル安息香酸Ｎ−スクシンイミジル、ブロモ酢酸Ｎ−スクシンイミジル、４−ホルミル安息香酸Ｎ−スクシンイミジル、ヨード酢酸Ｎ−スクシンイミジル、ＡＭＡＳ（Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミド）、ＧＭＢＳ（Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）Ｎ−（３−マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミド、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド、ＳＭＣＣ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸Ｎ−スクシンイミジル）、ＬＣ−ＳＭＣＣ（６−［［４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキシル］カルボキサミド］ヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジル）、ＳＭＰＢ（４−（４−マレイミドフェニル）酪酸Ｎ−スクシンイミジル）、ＢＭＰＳ（３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル）、ＫＭＵＳ（１１−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジル）、メタクリル酸Ｎ−スクシンイミジル、ＳＰＤＰ（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸３−スルホ−Ｎ−スクシンイミジルナトリウム、メルカプト酢酸、トリエチレングリコールモノプロパルギルエーテル、４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル］安息香酸、４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル］ベンジルアルコール、４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル］ベンジルアミン塩酸塩、４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル］ベンジルアミン塩酸塩、１０−ウンデシン酸；ヘテロ二官能性クロスリンカーとして用いられる、アジポジヒドラジド、１，２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン、ＤＦＤＮＰＳ（ビス（４−フルオロ−３−ニトロフェニル）スルホン）、ＢＭＢ（１，４−ビス（マレイミド）ブタン）、１，２−ビス（マレイミド）エタン、１，６−ビス（マレイミド）ヘキサン、ビス（ＮＨＳ）ＰＥＧ５、（ＮＨＳ）ＰＥＧ９、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２，２'−（エチレンジオキシ）ジエチルアミン、トリエチレングリコールビス（２−アミノエチル）エーテル、ビス［２−（２−アミノエトキシ）エチル］エーテル、ビス［２−（３−アミノプロポキシ）エチルエーテル、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩、アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩、ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩、スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩、ＤＳＣ（炭酸Ｎ，Ｎ'−ジスクシンイミジル）、ＤＴＳＰ（３，３'−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル））、スベリン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）、ＤＳＳ（セバシン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル））、３，３'−ジチオジプロピオン酸、１，２−ビス（２−プロピニルオキシ）エタン、１，２−ジグリシジルオキシエタン、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコールビス（３−アミノプロピル）エーテル、ジプロパルギルエーテル、ジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクタジエン−５，１１−ジイン、ＢＳ３（ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート）等を挙げることができる。
【０１２６】
これらの中でも、ＢＳ３を用いることが好ましい。
【０１２７】
上記する架橋処理は、使用する架橋剤に応じた公知の条件を採用することによって実施することができる。
【０１２８】
本発明の医薬は、薬学的に許容される担体等と組み合わせて用いることができる。このような担体等は公知のものを使用すればよく、特に限定されない。
【０１２９】
また、本発明の医薬は適当な剤形とすることもできる。なお、本発明の有効成分は抗体であるため経口投与は好ましくなく、例えば、経静脈投与などの非経口投与が可能となる剤形とすることが好ましい。
【０１３０】
本発明の医薬を用いることによって、これに含まれる抗体の機能を増強させることができる。
【０１３１】
具体的には、上記する本発明の医薬の構成成分となる抗体担持リポソームを作成する前のリポソーム（典型例として上記にて挙げた、ＺＺ−ＢＮＣ、ＬＬ−ＢＮＣ、ＬＧ−ＢＮＣ、及びＧＬ−ＢＮＣ等）に対して、上記する抗体を結合させることによって、結合させた抗体が結合させない同じ量の抗体と比較して、その機能を上昇させることができる。
【０１３２】
以下に、本発明をより詳細に説明する実施例を示す。本発明が以下に示す実施例に限定されないのはいうまでも無い。
【実施例】
【０１３３】
以下に示す実施例１及び２にて使用する、本発明の医薬の典型例であるＺＺ−ＢＮＣとハーセプチンの複合体（本明細書にて「ＺＺ−ＢＮＣ−ハーセプチン」と呼ぶことがある。）、及びＺＺ−ＢＮＣとカドサイラとの複合体（本明細書にて「ＺＺ−ＢＮＣ−カドサイラ」と呼ぶことがある。）を、後記する（１）〜（３）に示す手順にて作製した。
【０１３４】
（１）５０μＬのＰＢＳバッファー中で、タンパク質量として５μｇのＺＺ−ＢＮＣに、それぞれ抗体量（タンパク質量）として１μｇのハーセプチン（トラスツズマブ、中外製薬株式会社）、又はカドサイラ（トラスツズマブエムタンシン、中外製薬株式会社）を加えて混合した。
【０１３５】
上記するＺＺ−ＢＮＣとは、上記する特許文献１〜３の何れかに記載する方法に準じて作製した。
【０１３６】
なお、上記する条件はＺＺ−ＢＮＣ：ハーセプチン又はカドサイラ＝５：１（重量比）、モル比では１：８程度であり、結合可能と見つもられる条件は、ＺＺ−ＢＮＣ：ハーセプチン又はカドサイラ＝１：１（重量比）、モル比では１：４０程度である。
【０１３７】
（２）上記する（１）にて得られた混合物に対し、ＢＳ３（ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ）を、その最終濃度が５０μＭになるように追加し、これを室温にて３０分間インキュベートした。
【０１３８】
（３）上記する（２）のインキュベート後の混合物に対し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーを、その最終濃度が１００μＭになるように追加し、これを室温で１０分間インキュベートした。
【０１３９】
最後に、上記する（３）にて得られるインキュベート後の混合物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを用いてＰＢＳにバッファー交換し、これを後記する実験で使用するために４℃にて保存した。
【０１４０】
＜実施例１＞ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
本発明の医薬を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞毒性アッセイを行った。医薬によって特定の細胞を死滅させることは、抗体が有する機能が増強したと判断できる。本実施例では、この様な死滅の程度を、特定のサンプルの抗体としての使用量を基にＩＣ５０値にて確認する実験を行った。
【０１４１】
実験材料
本アッセイでは、以下に示す性質を有するヒト乳がん由来細胞を使用した。
【０１４２】
［細胞］
・ＳＫ−ＢＲ−３細胞：トラスツズマブ感受性（ＨＥＲ２陽性（３＋））
・ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞：トラスツズマブ非感受性（ＨＥＲ２陰性；ネガティブコントロール）
上記する本アッセイで使用する各種の細胞は、３７℃で５％のＣＯ２を含む環境下で、以下に示す培地を用いて馴化した。なお、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は５％のＣＯ２含まない環境下にて馴化した。馴化した各細胞を９６ウェルプレートに、それぞれ１０，０００細胞／ウェルで播種した。
【０１４３】
［培地］
・ＳＫ−ＢＲ−３細胞：ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａ培地＋１０％の非動化ＦＢＳ
・ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞：Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５培地＋１０％の非動化ＦＢＳ
【０１４４】
実験手段
上記する細胞等を用い、後記する（１）〜（３）に示す手順にて細胞毒性アッセイを行った。
【０１４５】
（１）上記する本発明の医薬の典型例（ＺＺ−ＢＮＣ−ハーセプチン及びＺＺ−ＢＮＣ−カドサイラ）をサンプルとして上記の適当な培地に加えて、抗体部分の最終濃度で１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．１ｎＭ、及び０ｎＭとなる１００μＬの培地を用意した。また、ネガティブコントロールとして、ＺＺ−ＢＮＣ、ハーセプチン、及びカドサイラをサンプルとして、それぞれ単独で含む１００μＬの培地も同様に用意した。
【０１４６】
（２）上記する（１）にて作製した１００μＬの培地を各細胞が播種された上記の９６穴プレートの各ウェルに加え、７２時間の３７℃で５％のＣＯ２を含む環境下での培養に供した。なお、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は５％のＣＯ２含まない環境下にて７２時間の培養を行った。
【０１４７】
（３）上記する培養の終了の後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ（ナカライテスク）を、各ウェルに１０μＬで添加し、その後室温で２０−１００分間程度インキュベート（発色度合いに従い反応時間を決定）し、プレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。この結果を図１に示す。
【０１４８】
結果と考察
図１に示す結果から、ＺＺ−ＢＮＣ単独では、ハーセプチン（トラスツズマブ）感受性細胞であるＳＫ−ＢＲ−３細胞に対して、何らの細胞毒性を与える結果は確認されなかった。
【０１４９】
また、ＳＫ−ＢＲ−３細胞に対する、ハーセプチンのＩＣ５０値は抗体部分濃度として、約１０ｎＭ以上程度と見積もられた。これに対して、ＺＺ−ＢＮＣ−ハーセプチンのＩＣ５０値は、抗体部分濃度で約１〜２ｎＭ程度と見積もられた。
【０１５０】
これらの結果から、本発明の医薬の典型例であるＺＺ−ＢＮＣ−ハーセプチンは従来品であるハーセプチンよりも、抗体の機能をより増強させることが明らかとなった。
【０１５１】
また、ＳＫ−ＢＲ−３細胞に対する、カドサイラのＩＣ５０値は抗体部分濃度として、約１ｎＭ程度と見積もられた。これに対して、ＺＺ−ＢＮＣ−カドサイラのＩＣ５０値は抗体部分濃度で約０．１ｎＭと見積もられた。
【０１５２】
これらの結果から、本発明の医薬の典型例であるＺＺ−ＢＮＣ−カドサイラは従来品であるカドサイラよりも、抗体の機能をより増強させることが明らかとなった。
【０１５３】
なお、ネガティブコントロールであるＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に対しては、約１０ｎＭ程度の抗体部分濃度まで、何れのサンプルも何ら細胞毒性を示す結果は得られなかった。
【０１５４】
＜実施例２＞ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
本発明の医薬を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞毒性アッセイを行った。上記する実施例１と同様に、医薬によって特定の細胞を含む組織を死滅させることは、抗体が有する機能が増強が増強したと判断できる。本実施例では、このような組織の死滅の程度を、担癌マウスの腫瘍サイズが本発明の医薬の投与による抑制効果を確認する実験にて評価した。
【０１５５】
実験材料
ヒト乳がん細胞（ＫＰＬ−４細胞：トラスツズマブに非感受性・ＨＥＲ２陽性（３＋））をＤＭＥＭ＋５％非動化ＦＢＳで培養した。６週令オスヌードマウス（日本ＳＬＣ）の背部皮下に上記する培養後のＫＰＬ−４細胞を１.０×１０７細胞（１００μＬ，５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ含有（ＢＤ））を接種した。
【０１５６】
サンプルとしては、上記する実施例１にて用いた本発明の医薬であるＺＺ−ＢＮＣ−ハーセプチン並びにＺＺ−ＢＮＣ−カドサイラ、及びネガティブコントロールとしてＺＺ−ＢＮＣ、ハーセプチン、並びにカドサイラを用いた。
【０１５７】
実験手段
上記するヌードマウスにＫＰＬ−４細胞を接種してから約１０日後、その腫瘍サイズが３００ｍｍ３に達した時（腫瘍サイズは、（長径ｘ（短径）２）／２で算出した）、１５０μＬの上記サンプル（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、３．４％（ｗ／ｗ）のＳｕｃｒｏｓｅで懸濁した状態にする）を投与した。
【０１５８】
ここで、ＺＺ−ＢＮＣ−ハーセプチンとハーセプチンは、抗体量３０ｍｇ／ｋｇを週１回で、計４回腹腔内投与した。初回以外は、１５ｍｇ／ｋｇの投与量で行った。
【０１５９】
また、カドサイラとＺＺ−ＢＮＣーカドサイラは抗体量１５ｍｇ／ｋｇで単回静注した。その後、１２６日間マウスの育種を続け、腫瘍サイズを測定した。この結果を図２に示す。
【０１６０】
結果と考察
図２に示すように、ＺＺ−ＢＮＣ単独投与群（当該抗体量の５倍量）については、全く腫瘍増殖に対して何ら抑制効果を示さなかった。
【０１６１】
ハーセプチン単独投与については投与期間中（０、７、１４、及び２１日目）で約１４０ｍｍ３程度の腫瘍サイズにまで限定的に増殖抑制効果を示したが、投与期間を超えると腫瘍増殖に対する抑制効果は速やかに消失した。これは、ハーセプチンがＫＰＬ−４細胞に対して元来限定的にしか作用しないためと考えられる。
【０１６２】
これに対して、ＺＺ−ＢＮＣ−ハーセプチンは投与期間（０、７、１４、及び２１日目）後も１２６日目までで約１００ｍｍ３程度の腫瘍サイズにまで腫瘍増殖を抑制したものの、この腫瘍増殖抑制の程度は、後記するカドサイラ及びＺＺ−ＢＮＣ−カドサイラを投与した時ほどの増殖抑制は観察されなかった。
【０１６３】
カドサイラ単独投与は強力な腫瘍増殖抑制を示し、これの投与後１２６日目でも約１５ｍｍ３程度の腫瘍サイズを示した。しかしながら、ＺＺ−ＢＮＣ−カドサイラの投与すると、カドサイラ単独投与を超える最も強力な腫瘍増殖抑制効果を発揮し、２１日目において腫瘍は視認できなくなり、この投与後１２６日目でも腫瘍の再増殖は認められなかった。
【０１６４】
以上より、本発明の医薬の典型例であるＺＺ−ＢＮＣ−ハーセプチン及びＺＺ−ＢＮＣ−カドサイラは、それぞれハーセプチン及びカドサイラよりも強い腫瘍増殖抑制効果を発揮することが確認された。よって、本発明の医薬は、抗体の機能を増強させることが明らかとなった。
【０１６５】
上記する本発明は様々な態様に修飾し得ることが明らかであると言える。このような修飾とは、本発明の趣旨から導き出される範囲から逸脱するものではなく、当業者にとって自明であろう全ての範囲の修飾を包含する。
【０１６６】
以下に、本明細書にて表示するアミノ酸配列を示す。
【符号の説明】
【０１６７】
１  Ｆｃ
２  Ｆｖ
３  脂質二重膜
４  膜貫通タンパク質
５  抗体結合ドメイン
【図１】
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【図２】
2020093980.tif 000006
【図３】
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【配列表】
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