(57)【要約】【課題】容易な免疫染色を実現することができる。【解決手段】免疫染色方法は、電子供与体を含む標的分子と、前記標的分子に結合され、第１励起光により活性種を発生する発生剤を含む抗体と、色素化合物と、を含む試料に、前記第１励起光を照射し、前記第１励起光の照射により発生剤から発生した活性種によって前記色素化合物と前記電子供与体とを結合させる、照射工程、を含む。【選択図】図１Ｂ
2020071152.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電子供与体を含む標的分子と、前記標的分子に結合され第１励起光により活性種を発生する発生剤を含む抗体と、色素化合物と、を含む試料に、前記第１励起光を照射し前記第１励起光の照射によって前記発生剤から発生した活性種によって前記色素化合物と前記電子供与体とを結合させる照射工程、
を含む免疫染色方法。
【請求項２】
前記第１励起光は前記発生剤が活性種を発生し、且つ前記色素化合物が活性種を発生しない波長領域の光である、
請求項１に記載の免疫染色方法。
【請求項３】
前記色素化合物は第２励起光の照射により励起し、前記第１励起光と前記第２励起光とは波長領域が異なる、
請求項１に記載の免疫染色方法。
【請求項４】
前記第１励起光は前記第２励起光より長波長領域の光である、
請求項３に記載の免疫染色方法。
【請求項５】
前記色素化合物は色素で標識された芳香族化合物である、請求項１に記載の免疫染色方法。
【請求項６】
前記電子供与体は極性基を有する芳香族化合物である、請求項１に記載の免疫染色方法。
【請求項７】
前記電子供与体は活性種により前記色素化合物とラジカル架橋反応する化合物である、
請求項１に記載の免疫染色方法。
【請求項８】
前記発生剤はシアニン色素である、請求項１に記載の免疫染色方法。
【請求項９】
前記色素化合物はチラミド色素である、請求項１に記載の免疫染色方法。
【請求項１０】
前記標的分子は前記抗体に対して特異性を有する抗原または前記抗原に結合した一次抗体である、
請求項１に記載の免疫染色方法。
【請求項１１】
複数種類の前記標的分子を含む前記試料に前記第１励起光を照射する前記照射工程を、前記第１励起光の波長領域および前記色素化合物の種類を変更して繰り返す繰返工程、
を含む、請求項１に記載の免疫染色方法。
【請求項１２】
電子供与体を含む標的分子と、前記標的分子に結合され、第１励起光により活性種を発生する発生剤を含む抗体と、色素化合物と、を含む試料に、前記第１励起光を照射する照射部と、
前記電子供与体に結合された前記色素化合物を検出する検出部と、
を備える免疫染色システム。
【請求項１３】
電子供与体を含む標的分子に結合され、第１励起光により活性種を発生する発生剤を含む抗体と、
色素化合物と、を含み、
前記電子供与体は前記第１励起光の照射によって前記発生剤から発生した活性種によって前記色素化合物を結合させる免疫染色キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、免疫染色方法、免疫染色システム、および免疫染色キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体を用いてサンプル中の抗原を検出する方法として、免疫染色法が知られている。免疫染色法は検出感度や視認性をよくするために、例えば、ＣＡＲＤ（Ｃａｔａｌｙｃｅｄ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）法の原理に、ビオチン標識チラミドを適用した方法が知られている（例えば、特許文献１〜特許文献５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第５７３１１５８号明細書
【特許文献２】米国特許第５５８３００１号明細書
【特許文献３】米国特許第５１９６３０６号明細書
【特許文献４】特開平６−１０９７３４号公報
【特許文献５】国際公開第２００８／１２８３５２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来技術では、測定対象の抗原に一次抗体および二次抗体を順次反応させた後に、二次抗体に酵素を付加し、該酵素による酵素反応によってラジカルを生成している。このため、従来技術では、酵素の至適温度に応じた温度調整、酵素に応じた反応時間の調整、および、複数種類の反応溶液の調整、などが必要であり、容易な免疫染色を行う事が困難であった。
【０００５】
そこで、本開示では、容易な免疫染色を実現することができる、免疫染色方法、免疫染色システム、および免疫染色キットを提案する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の課題を解決するために、本開示に係る一形態の免疫染色方法は、電子供与体を含む標的分子と、前記標的分子に結合され、第１励起光により活性種を発生する発生剤を含む抗体と、色素化合物と、を含む試料に、前記第１励起光を照射し、前記第１励起光の照射により前記発生剤から発生した活性種によって前記色素化合物と前記電子供与体とを結合させる、照射工程、を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】本開示の第１の実施形態に係る、試料の一例を示す模式図である。
【図１Ｂ】本開示の第１の実施形態に係る、第１励起光の照射の説明図である。
【図１Ｃ】本開示の第１の実施形態に係る、色素化合物が標的分子に結合した状態を示す模式図である。
【図２】本開示の第１の実施形態に係る、免疫染色システムの一例を示す模式図である。
【図３】本開示の第１の実施形態に係る、データ処理部の機能を実現するコンピュータの一例を示すハードウェア構成図である。
【図４】本開示の第１の実施形態に係る、免疫染色システムが実行する情報処理の手順の一例を示すフローチャートである。
【図５】本開示の第２の実施形態に係る、試料の一例を示す模式図である。
【図６】本開示の第２の実施形態に係る、免疫染色方法の工程順を示す説明図である。
【図７Ａ】本開示の第２の実施形態に係る、試料の一例を示す模式図である。
【図７Ｂ】本開示の第２の実施形態に係る、第１励起光の照射の説明図である。
【図７Ｃ】本開示の第２の実施形態に係る、色素化合物が標的分子に結合した状態の説明図である。
【図８Ａ】本開示の第２の実施形態に係る、試料の一例を示す模式図である。
【図８Ｂ】本開示の第２の実施形態に係る、第１励起光の照射の説明図である。
【図８Ｃ】本開示の第２の実施形態に係る、色素化合物が標的分子に結合した状態の説明図である。
【図９Ａ】本開示の第２の実施形態に係る、試料の一例を示す模式図である。
【図９Ｂ】本開示の第２の実施形態に係る、第１励起光の照射の説明図である。
【図９Ｃ】本開示の第２の実施形態に係る、色素化合物が標的分子に結合した状態の説明図である。
【図１０】本開示の実施例１に係る、検知結果を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下に、本開示の実施形態について詳細に説明する。
【０００９】
（第１の実施形態）
本実施形態の免疫染色方法は、照射工程を含む。照射工程は、電子供与体を含む標的分子と、標的分子に結合され、第１励起光により活性種を発生する発生剤を含む抗体と、色素化合物と、を含む試料に、第１励起光を照射し、第１励起光の照射により発生剤から発生した活性種によって色素化合物と電子供与体とを結合させる工程である。
【００１０】
本実施形態では、第１励起光を照射することで、抗体に含まれる発生剤から活性種を発生させる。この活性種によって、色素化合物は、標的分子に含まれる電子供与体に結合する。このため、本実施形態では、第１励起光の照射によって、色素化合物を標的分子に結合させることができ、標的分子の近傍に、シグナルを増幅させることができる。すなわち、本実施形態の免疫染色方法では、第１励起光を照射する照射工程によって、容易な免疫染色を実現可能であることが明らかとなった。
【００１１】
なお、電子供与体を含む標的分子に結合され、第１励起光により活性種を発生する発生剤を含む抗体と、色素化合物と、を含む試料は、免疫染色キットとして提供することが可能である。免疫染色キットでは、電子供与体は、第１励起光の照射によって発生剤から発生した活性種によって色素化合物を結合させる。
【００１２】
以下、詳細に説明する。
【００１３】
図１Ａは、試料１０の一例を示す模式図である。
【００１４】
試料１０は、標的分子１４と、抗体２０と、色素化合物２４と、を含む。
【００１５】
［標的分子］
標的分子１４は、免疫染色対象である。標的分子１４は、例えば、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチドなど）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む）などである。また、標的分子１４は、タンパク質、アミノ酸、糖質、脂質、およびこれらの修飾分子の、１または複数の複合体であってもよい。また、標的分子１４は、病理診断の対象となる疾病に関連する抗原（腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモン、癌の増殖制御因子、転移制御因子、増殖制御因子、炎症性サイトカイン、ウィルス関連分子、など）であってもよい。また、標的分子１４は、代謝産物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ポリヌクレオチド、毒素、薬物、ビリオン、細胞、ヘモグロビン、などであってもよい。なお、標的分子１４の種類は、上記に限定されない。
【００１６】
試料１０中において、標的分子１４は、固相１２に固定化されていることが好ましい。固定化には、公知の物理吸着などの手法を用いればよい。固相１２の材質および形状は特に限定されない。例えば、固相１２には、マイクロプレートまたはガラス板などを用いる。なお、シグナル検出の観点から、固相１２には、透明な材質を用いる事が好ましい。
【００１７】
［電子供与体］
本実施形態では、標的分子１４は、電子供与体１６を含む。
【００１８】
電子供与体１６は、電子供与性を有する化合物や極性基である。例えば、電子供与体１６は、抗体２０に第１励起光が照射されることで発生した活性種により、色素化合物２４とラジカル架橋反応し得る化合物である。活性種は、ラジカルまたは遊離基を示す。
【００１９】
電子供与体１６は、例えば、極性基を有する芳香族化合物である。極性基は、例えば、水酸基、メトキシ基、アルコキシ基、アミノ基、メチルアミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアミノ基、メチル基などである。なお、電子供与体１６は、極性基を有さない芳香族化合物であってもよい。
【００２０】
電子供与体１６は、試料１０に用いる色素化合物２４に応じて選択すればよい。例えば、色素化合物２４がチラミド色素である場合、電子供与体１６は、フェノール基を有する芳香族化合物である事が好ましい。フェノール基を有する芳香族化合物は、例えば、チロシン残基を有するタンパク質またはペプチドである。
【００２１】
本実施形態では、電子供与体１６が、チロシン残基を有するタンパク質である場合を、一例として説明する。すなわち、本実施形態では、標的分子１４がタンパク質を含み、電子供与体１６を含んだ構成である場合を、一例として説明する。
【００２２】
なお、電子供与体１６は、固相１２に固定化されていてもよい。すなわち、電子供与体１６は、標的分子１４に含まれると共に、固相１２に固定化されていてもよい。
【００２３】
［抗体］
抗体２０は、標的分子１４に対して特異性を有する。抗体２０は、標的分子１４に応じて適宜選択すればよい。抗体２０は、例えば、疾病（悪性腫瘍など）に関連する抗原（例えば、ＨＥＲ２など）に対する抗体である。
【００２４】
抗体２０は、一次抗体および二次抗体の何れであってもよい。すなわち、抗体２０は、抗原である標的分子１４に結合する一次抗体であってもよい。また、抗体２０は、抗原に結合した一次抗体に結合する二次抗体であってもよい。特に、複数種類の抗体２０を利用する後述の多重染色においては、抗体宿主動物種の種間交叉を考慮しなくてよいため抗体２０は一次抗体であることが望ましい。なお、抗体２０が二次抗体である場合、標的分子１４を、抗体２０に対して特異性を有する抗原に結合した一次抗体とすればよい。本実施形態では、抗体２０が、一次抗体である場合を一例として説明する。
【００２５】
［発生剤］
抗体２０は、発生剤１８を含む。
【００２６】
発生剤１８は、第１励起光の照射により活性種を発生する物質である。言い換えると、発生剤１８は、特定の波長領域の光の照射によって励起し、活性種を発生する物質である。発生剤１８の励起スペクトルは、色素化合物からの活性種の発生を抑制するためと、多重染色性を獲得するため、後述する色素化合物２４の励起スペクトルより長波長であることが好ましい。
【００２７】
発生剤１８は、例えば、Ｃｙ３，Ｃｙ５，Ｃｙ７などのシアニン色素、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ；ＦＩＴＣ）などのフルオレセイン誘導体、クマリン色素、メチレンブルー、ローズベンガル、フェントン試薬、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）などの蛋白性蛍光物質、などである。これらの中でも、可視化能波長域で長波長であることと、活性種発生の実績がある理由から、発生剤１８には、Ｃｙ５を用いる事が好ましい。なお、発生剤１８は、第１励起光の照射により活性種を発生する物質であればよく、上述したシアニン色素などの色素に限定されない。
【００２８】
発生剤１８は、公知の方法により、抗体２０に結合されていればよい。
【００２９】
［第１励起光］
第１励起光は、発生剤１８から活性種を発生させる波長領域の光であればよい。第１励起光の波長領域は、照射対象の発生剤１８の種類に応じて、適宜調整すればよい。
【００３０】
なお、第１励起光は、発生剤１８のみから活性種を発生させるように、試料１０に含まれる該発生剤１８以外の物質が活性種を発生しない波長領域の光であることが好ましい。具体的には、第１励起光は、発生剤１８が活性種を発生し、色素化合物２４が活性種を発生しない波長領域の光であることが好ましい。
【００３１】
［色素化合物］
色素化合物２４は、色素で標識された物質である。例えば、色素化合物２４は、色素で標識された芳香族化合物である。
【００３２】
色素化合物２４に含まれる色素は、色素化合物２４を標識可能な物質であればよい。該色素は、例えば、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ４８８、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＹＯＹＯ１（ｄｉｍｅｒ  ｏｆ  ｏｘａｚｏｌｅ  ｙｅｌｌｏｗ）、ＴＡＭＲＡ（ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＴＭＲ（ｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＥＶＯｂｌｕｅＴＭ、Ａｌｅｘａ６４７、等である。但し、色素化合物２４に含まれる色素は、これらに限定されない。
【００３３】
色素化合物２４は、上記色素で標識した物質であればよい。標識には、公知の方法を用いればよい。なお、色素化合物２４は、特に、電子供与体と反応し架橋反応を起こすもの、電子供与体と反応し不溶性化合物を形成するものが望ましい。
【００３４】
色素化合物２４における、色素以外の化合物部分は、具体的には、チラミド色素（色素標識されたチラミド）、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩）、アリールアジド、グリチルシロシン、などである。これらの中でも、水溶性であり、活性酸素との反応性が高く、チロシンと架橋反応がおこることから、色素化合物２４は、チラミド色素であることが好ましい。
【００３５】
色素化合物２４は、市販品としても入手可能である。色素化合物２４の市販品の具体例としては、以下のものを挙げることができる。
【００３６】
モレキュラープローブ社：
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７
【００３７】
パーキンエルマー社：ＮＥＬ７４１  ＴＳＡ  Ｐｌｕｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＮＥＬ７４２  ＴＳＡ  Ｐｌｕｓ  ＴＭＲ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＮＥＬ７４４  ＴＳＡ  Ｐｌｕｓ  Ｃｙａｎｉｎｅ  ３  Ｓｙｓｔｅｍ，ＮＥＬ７４５  ＴＳＡ  Ｐｌｕｓ  Ｃｙａｎｉｎｅ  ５  Ｓｙｓｔｅｍ
【００３８】
なお、色素化合物２４は、標的分子１４に結合した色素化合物２４を容易に検出する観点から、第２励起光の照射によって励起し、蛍光等の光を発することが好ましい。色素化合物２４には、この条件を満たすものを、選択すればよい。
【００３９】
なお、第２励起光は、色素化合物２４を励起させる波長領域の光であればよい。但し、抗体２０の発生剤１８から活性種を発生させるために照射する第１励起光と、色素化合物２４を励起させる第２励起光とは、互いに波長領域が異なる事が好ましい。すなわち、第１励起光と第２励起光とは、波長領域が異なることが好ましい。
【００４０】
また、第２励起光は、第１励起光より短波長領域の光であることが好ましい。言い換えると、第１励起光は、第２励起光より長波長領域の光であることが好ましい。
【００４１】
［免疫染色方法］
次に、本実施形態の免疫染色方法について具体的に説明する。
【００４２】
本実施形態の免疫染色方法は、前処理工程と、抗原抗体反応工程と、照射工程と、洗浄工程と、検出工程と、を含む。本実施形態の免疫染色方法では、前処理工程、抗原抗体反応工程、照射工程、洗浄工程、検出工程を、この順に実行する。
【００４３】
以下、各工程について詳細に説明する。
【００４４】
［前処理工程］
まず、前処理工程を実行する。前処理工程は、固定工程と、賦活化工程と、ブロッキング工程と、を含む。
【００４５】
固定工程は、電子供与体１６を含む標的分子１４を、固相１２に固定化する工程である。固定化には、公知の方法を用いればよい。なお、標的分子１４が固定化された固相１２を準備してもよい。
【００４６】
賦活化工程は、標的分子１４を賦活化する工程である。賦活化の方法には、公知の方法を用いればよい。また、賦活化条件には、標的分子１４の種類に応じた、公知の方法を用いればよい。
【００４７】
ブロッキング工程は、固相１２をブロッキング剤によりブロッキングする工程である。ブロッキング剤には、公知の物質を用いればよい。例えば、ブロッキング剤は、ウシ血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、などのタンパク質が挙げられる。また、市販のブロッキング剤を用いてもよい。
【００４８】
［抗原抗体反応工程］
抗原抗体反応工程は、抗原抗体反応によって、発生剤１８を含む抗体２０を標的分子１４に結合させる。抗原抗体反応工程は、一次抗体法や二次抗体法などの一般的な免疫染色に用いられる抗原抗体反応を含む。この抗原抗体反応の反応条件は、標的分子１４と抗体２０の種類に応じて調整すればよい。
【００４９】
［照射工程］
照射工程では、まず、抗原抗体反能に関わらない発生剤１８を含む抗体２０を洗浄によって除去する。
【００５０】
次に、色素化合物２４を添加する。添加する色素化合物２４の種類は、標的分子１４に結合されている抗体２０に含まれる発生剤１８の種類に応じて、調整すればよい。
【００５１】
例えば、発生剤１８としてローズベンガルを用いる場合には、色素化合物２４としてチラミド色素（Ａｌｅｘａ  ６４７  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ  ｔｙｒａｍｉｎｅ）を用いる事が好ましい。
【００５２】
また、例えば、発生剤１８として、Ｃｙ５を用いる場合には、色素化合物２４として、チラミド色素（Ｃｙ３  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ  ｔｙｒａｍｉｎｅ）を用いる事が好ましい。
【００５３】
また、例えば、発生剤１８として、ＦＩＴＣを用いる場合には、色素化合物２４として、チラミド色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０  ｔｏ  ｔｙｒａｍｉｎｅ）を用いる事が好ましい。
【００５４】
また、例えば、発生剤１８として、ＧＦＰを用いる場合には、色素化合物２４として、チラミド色素（ａｍｉｎｏ  ｃｏｕｍａｒｉｎｅ  ａｃｉｄ）を用いる事が好ましい。
【００５５】
発生剤１８と色素化合物２４との組合せとして、上記組合せを用いることで、該組合せを用いない場合に比べて、多重染色を行いやすいという効果が得られる。
【００５６】
色素化合物２４は、試料１０に含まれる抗体２０を１分子に対して、色素化合物２４を５以上６以下の分子数、添加することが好ましい。なお、色素化合物２４の添加量は、色素化合物２４および抗体２０の種類に応じて適宜調整すればよく、この範囲に限定されない。
【００５７】
次に、上記工程によって作製された、標的分子１４と抗体２０と色素化合物２４とを含む試料１０に、第１励起光を照射する。
【００５８】
図１Ｂは、試料１０への第１励起光Ｌ１の照射の説明図である。
【００５９】
上述したように、第１励起光Ｌ１は、抗体２０に含まれる発生剤１８が活性種２６を発生する波長領域の光である。このため、第１励起光Ｌ１の照射によって、発生剤１８が活性種２６を発生する。
【００６０】
色素化合物２４は、活性種２６の作用によって、豊富な電子を有する電子供与体１６とラジカル架橋反応することで、該電子供与体１６を含む標的分子１４に結合、または、又は不溶性物質を形成する。
【００６１】
図１Ｃは、色素化合物２４が標的分子１４に結合した状態を示す模式図である。第１励起光Ｌ１の照射によって生じる活性種２６は、寿命（一重項酸素２μｓ，ヒドロキシルラジカル２００μｓ）が短く、拡散しないので、標的分子１４の近傍でのみ生じる。発生剤１８からの活性種２６の発生は第１励起光Ｌ１の照射中、繰り返し起こる。このため、標的分子１４の近傍のシグナルを増幅させることができる。また、照射中しか、活性種２６が生じないため、酵素反応と違い増幅率を制御しやすい。
【００６２】
［洗浄工程］
洗浄工程は、色素化合物２４が結合された標的分子１４を洗浄する工程である。洗浄工程によって、試料１０に含まれる、未反応の色素化合物２４が除去される。洗浄には、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）などの緩衝液を用いればよい。例えば、室温（１℃〜３０℃など）に調整されたＰＢＳに、色素化合物２４が結合された標的分子１４を浸漬させて、予め定めた時間放置するなどの方法が挙げられる。なお、浸漬中に、ＰＢＳを交換してもよい。
【００６３】
［検出工程］
試料１０における、標的分子１４に結合した色素化合物２４の色を測定または観察することで、標的分子１４を検出する。
【００６４】
標的分子１４に結合した色素化合物２４の色は、光学回折、吸光度、蛍光、ラマン散乱、燐光、発光、放射能、およびＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）などによって測定すればよい。
【００６５】
標的分子１４に結合した色素化合物２４の色の測定には、公知の機器を用いればよい。例えば、測定には、分光光度計、撮影画像を得る撮像素子、などを用いる。なお、光学顕微鏡や蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡などを用いて色素化合物２４の色を観察することで、標的分子１４を検出してもよい。
【００６６】
具体的には、上記照射工程および洗浄工程を経た試料１０に、第２励起光Ｌ２を照射する（図１Ｃ参照）。このとき、色素化合物２４の吸収極大波長および励起スペクトルに対応する励起光源および光学フィルタを用いて、第２励起光Ｌ２を照射すればよい。そして、第２励起光Ｌ２の照射によって色素化合物２４が励起することで発せられた光の検出結果を、撮像素子などを用いて取得すればよい。そして、検出結果に示される、輝点数または発光輝度を、公知の方法で計測することで、標的分子１４を検出（すなわち、定量）すればよい。
【００６７】
［免疫染色システム］
次に、上述した免疫染色方法を実現するための免疫染色システムの一例を説明する。
【００６８】
図２は、免疫染色システム１の一例を示す模式図である。免疫染色システム１は、顕微鏡３０と、データ処理部４０とを有する。
【００６９】
顕微鏡３０は、ステージ３１、照射部３３、および撮像素子３４を有する。ステージ３１は、試料１０であるサンプルＳＰＬを載置可能な載置面を有する。ステージ３１は、ステージ駆動部３５の制御によって、平行方向（ｘ−ｙ平面方向）および垂直方向（ｚ軸方向）へ移動可能とされている。
【００７０】
照射部３３は、試料１０に、第１励起光Ｌ１または第２励起光Ｌ２を照射する。照射部３３は、光学系３２と、光源駆動部３６と、光源３８と、を含む。
【００７１】
光学系３２は、ステージ３１の上方に配置されている。光学系３２は、対物レンズ３２Ａ、結像レンズ３２Ｂ、ダイクロイックミラー３２Ｃ、エミッションフィルタ３２Ｄ、および励起フィルタ３２Ｅを有する。光源３８は、例えば水銀ランプ等の電球やＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ）などである。
【００７２】
励起フィルタ３２Ｅは、光源３８から出射された光のうち、第１励起光Ｌ１または第２励起光Ｌ２の各々の波長領域の光を選択的に透過させるフィルタである。顕微鏡３０には、透過させる波長領域の異なる複数の励起フィルタ３２Ｅが搭載されている。具体的には、顕微鏡３０には、第１励起光Ｌ１の波長領域の光を選択的に透過させる励起フィルタ３２Ｅ１と、第２励起光Ｌ２の波長領域の光を選択的に透過させる励起フィルタ３２Ｅ２と、が搭載されている。
【００７３】
ダイクロイックミラー３２Ｃは、光源３８から出射し、励起フィルタ３２Ｅを透過した光を、対物レンズ３２Ａへ導く。対物レンズ３２Ａは、当該光をサンプルＳＰＬへ集光する。そして対物レンズ３２Ａおよび結像レンズ３２Ｂは、サンプルＳＰＬの像を所定の倍率に拡大した拡大像を、撮像素子３４の撮像面に結像させる。
【００７４】
光源駆動部３６は、光源３８の制御と、励起フィルタ３２Ｅ１と励起フィルタ３２Ｅとの切替えと、を制御する。
【００７５】
例えば、光源駆動部３６が、光源３８から出射した光が励起フィルタ３２Ｅ１を透過するように、励起フィルタ３２Ｅ１の位置を制御することで、第１励起光Ｌ１が試料１０であるサンプルＳＰＬに照射される。一方、光源駆動部３６が、光源３８から出射した光が励起フィルタ３２Ｅ２を透過するように、励起フィルタ３２Ｅ２の位置を制御することで、第２励起光Ｌ２が試料１０であるサンプルＳＰＬに照射される。
【００７６】
撮像素子３４は、試料１０の撮影画像を得る。撮像素子３４には、対物レンズ３２Ａおよび結像レンズ３２Ｂを介して、試料１０の拡大像が結像される。撮像素子３４は、この結像によって、試料１０を拡大した撮影画像を得る。
【００７７】
撮像素子３４は、光電変換素子を有し、入射光から画像を得るイメージャである。撮像素子３４は、例えばＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）イメージセンサ、などである。なお、結像レンズ３２Ｂおよびエミッションフィルタ３２Ｄを、分光素子に変更することも可能である。この場合、空間走査方式であるランスキャン方式の分光カメラか時間走査方式の２次元分光カメラを用いる。
【００７８】
撮像素子３４は、撮像制御部３７の制御によって試料１０を撮影した撮影画像を取得し、データ処理部４０へ出力する。
【００７９】
データ処理部４０は、照射制御部４０Ａと、取得部４０Ｂと、検出部４０Ｃと、を備える。照射制御部４０Ａ、取得部４０Ｂ、および検出部４０Ｃの一部またはすべては、例えば、ＣＰＵなどの処理装置にプログラムを実行させること、すなわち、ソフトウェアにより実現してもよいし、ＩＣ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｃｉｒｃｕｉｔ）などのハードウェアにより実現してもよいし、ソフトウェアおよびハードウェアを併用して実現してもよい。
【００８０】
照射制御部４０Ａは、照射部３３を制御する。
【００８１】
詳細には、照射制御部４０Ａは、上述した前処理工程が終了し且つ照射工程前の状態の試料１０のサンプルＳＰＬがステージ３１上に載置されたときに、第１励起光Ｌ１を試料１０に照射するように、光源駆動部３６を制御する。照射制御部４０Ａは、照射工程前の試料１０がステージ３１上に載置されたこと示す情報の入力を、ユーザによる操作指示の受付などによって判断すればよい。照射制御部４０Ａの制御によって、光源駆動部３６は、光源３８から出射した光が励起フィルタ３２Ｅ１を透過するように、励起フィルタ３２Ｅ１の位置を制御した後に、光源３８から光を照射させる。
【００８２】
このため、前処理工程が終了した試料１０に、第１励起光Ｌ１が照射される。第１励起光Ｌ１の照射によって、上述したように、発生剤１８から活性種２６が発生し、活性種２６によって色素化合物２４が標的分子１４へ結合する（図１Ｂ、図１Ｃ参照）。
【００８３】
次に、照射制御部４０Ａは、上記照射工程が終了した試料１０に対して、第２励起光Ｌ２を照射するように、光源駆動部３６を制御する。なお、照射制御部４０Ａは、第１励起光Ｌ１を照射する照射工程が終了し、且つ、上述した洗浄工程が終了した後の試料１０に対して、第２励起光Ｌ２を照射するように制御することが好ましい。例えば、照射制御部４０Ａは、照射工程が終了し且つ洗浄工程が終了したことを示す情報の入力を、ユーザによる操作指示の受付けなどにより判断すればよい。
【００８４】
この照射制御部４０Ａの制御によって、光源駆動部３６は、光源３８から出射した光が励起フィルタ３２Ｅ２を透過するように、励起フィルタ３２Ｅ２の位置を制御した後に、光源３８から光を照射させる。
【００８５】
このため、照射工程および洗浄工程が終了した試料１０に、第２励起光Ｌ２が照射される。第２励起光Ｌ２の照射によって、標的分子１４に結合した色素化合物２４が励起して発光する。
【００８６】
取得部４０Ｂは、撮像制御部３７から、試料１０の撮影画像を取得する。詳細には、取得部４０Ｂは、第２励起光Ｌ２が試料１０に照射されているときに、試料１０の撮影画像を取得するように撮像制御部３７を制御することで、試料１０の撮影画像を取得する。
【００８７】
検出部４０Ｃは、取得部４０Ｂで取得した撮影画像に基づいて、標的分子１４の電子供与体１６に結合された色素化合物２４を検出する。例えば、検出部４０Ｃは、撮影画像を公知の画像処理方法により解析し、輝点数または発光輝度を公知の方法で計測することで、標的分子１４を検出（すなわち、定量）する。
【００８８】
なお、検出部４０Ｃは、標的分子１４の検出結果を出力してもよい。例えば、データ処理部４０を、表示装置、通信装置、音声出力装置、などの出力部に電気的に接続した構成とする。そして、検出部４０Ｃは、標的分子１４の検出結果を、出力部に出力してもよい。
【００８９】
次に、データ処理部４０のハードウェア構成を説明する。
【００９０】
図３は、データ処理部４０の機能を実現するコンピュータ１０００の一例を示すハードウェア構成図である。
【００９１】
コンピュータ１０００は、ＣＰＵ１１００、ＲＡＭ１２００、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ  Ｏｎｌｙ  Ｍｅｍｏｒｙ）１３００、ＨＤＤ（Ｈａｒｄ  Ｄｉｓｋ  Ｄｒｉｖｅ）１４００、通信インターフェース１５００、および入出力インターフェース１６００を有する。コンピュータ１０００の各部は、バス１０５０によって接続される。
【００９２】
ＣＰＵ１１００は、ＲＯＭ１３００またはＨＤＤ１４００に格納されたプログラムに基づいて動作し、各部の制御を行う。例えば、ＣＰＵ１１００は、ＲＯＭ１３００またはＨＤＤ１４００に格納されたプログラムをＲＡＭ１２００に展開し、各種プログラムに対応した処理を実行する。
【００９３】
ＲＯＭ１３００は、コンピュータ１０００の起動時にＣＰＵ１１００によって実行されるＢＩＯＳ（Ｂａｓｉｃ  Ｉｎｐｕｔ  Ｏｕｔｐｕｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）等のブートプログラムや、コンピュータ１０００のハードウェアに依存するプログラム等を格納する。
【００９４】
ＨＤＤ１４００は、ＣＰＵ１１００によって実行されるプログラム、および、かかるプログラムによって使用されるデータ等を非一時的に記録する、コンピュータが読み取り可能な記録媒体である。具体的には、ＨＤＤ１４００は、プログラムデータ１４５０の一例である本開示に係るプログラムなどを記録する記録媒体である。
【００９５】
通信インターフェース１５００は、コンピュータ１０００が外部ネットワーク１５５０（例えばインターネット）と接続するためのインターフェースである。例えば、ＣＰＵ１１００は、通信インターフェース１５００を介して、他の機器からのデータ受信、または、ＣＰＵ１１００が生成したデータの他の機器への送信を実行する。
【００９６】
入出力インターフェース１６００は、入出力デバイス１６５０とコンピュータ１０００とを接続するためのインターフェースである。例えば、ＣＰＵ１１００は、入出力インターフェース１６００を介して、撮像制御部３７、光源駆動部３６、およびステージ駆動部３５などの入出力デバイス１６５０の各々と通信する。また、入出力インターフェース１６００は、所定の記録媒体（メディア）に記録されたプログラム等を読み取るメディアインターフェイスとして機能してもよい。メディアとは、例えばＤＶＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｄｉｓｃ）、ＰＤ（Ｐｈａｓｅ  ｃｈａｎｇｅ  ｒｅｗｒｉｔａｂｌｅ  Ｄｉｓｋ）等の光学記録媒体、ＭＯ（Ｍａｇｎｅｔｏ−Ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｉｓｋ）等の光磁気記録媒体、テープ媒体、磁気記録媒体、または半導体メモリ等である。
【００９７】
例えば、コンピュータ１０００がデータ処理部４０として機能する場合、コンピュータ１０００のＣＰＵ１１００は、ＲＡＭ１２００上にロードされた情報処理プログラムを実行することにより、照射制御部４０Ａ等の機能を実現する。また、ＨＤＤ１４００には、本開示に係る情報処理プログラムなどのデータが格納される。なお、ＣＰＵ１１００は、プログラムデータ１４５０をＨＤＤ１４００から読み取って実行するが、他の例として、外部ネットワーク１５５０を介して、他の装置からこれらのプログラムを取得してもよい。
【００９８】
次に、免疫染色システム１が実行する情報処理の手順の一例を説明する。
【００９９】
図４は、免疫染色システム１が実行する情報処理の手順の一例を示すフローチャートである。
【０１００】
まず、上述した前処理工程が終了し且つ照射工程前の状態の試料１０のサンプルＳＰＬがステージ３１上に載置されたときに、照射制御部４０Ａが、第１励起光Ｌ１を試料１０に照射するように、光源駆動部３６を制御する（ステップＳ１００）。
【０１０１】
ステップＳ１００の処理によって、試料１０に第１励起光Ｌ１が照射される。第１励起光Ｌ１の照射によって、試料１０に含まれる発生剤１８から活性種２６が発生し、活性種２６によって色素化合物２４が標的分子１４の電子供与体１６へ結合する（図１Ｂ、図１Ｃ参照）。
【０１０２】
次に、照射制御部４０Ａは、ステップＳ１００で第１励起光Ｌ１を照射された後の試料１０に対して、第２励起光Ｌ２を照射するように、光源駆動部３６を制御する（ステップＳ１０２）。なお、ユーザは、ステップ１００の処理が終了すると、試料１０を洗浄する上記洗浄工程を実行した後に、試料１０をステージ３１へ載置すればよい。
【０１０３】
ステップ１０２の処理によって、標的分子１４に結合した色素化合物２４が励起して発光する。
【０１０４】
次に、取得部４０Ｂが、撮像制御部３７を介して撮像素子３４から、試料１０の撮影画像を取得する（ステップＳ１０４）。
【０１０５】
次に、検出部４０Ｃが、ステップＳ１０４で取得した撮影画像に基づいて、標的分子１４の電子供与体１６に結合された色素化合物２４を検出する（ステップＳ１０６）。そして、本ルーチンを終了する。
【０１０６】
以上説明したように、本実施形態の免疫染色方法は、照射工程を備える。照射工程は、電子供与体１６を含む標的分子１４と、標的分子１４に結合され、第１励起光Ｌ１により活性種２６を発生する発生剤１８を含む抗体２０と、色素化合物２４と、を含む試料１０に、第１励起光Ｌ１を照射し、第１励起光Ｌ１の照射により発生剤１８から発生した活性種２６によって、色素化合物２４と標的分子１４の電子供与体１６とを結合させる工程である。
【０１０７】
このように、本実施形態の免疫染色方法では、標的分子１４に結合された抗体２０に含まれる発生剤１８に、第１励起光Ｌ１を照射することで発生した活性種２６によって、色素化合物２４を標的分子１４の電子供与体１６に結合させる。このため、標的分子１４の近傍を、色素化合物２４によって、容易にシグナル増幅させることができる。
【０１０８】
ここで、従来技術では、測定対象の抗原に一次抗体および二次抗体を順次反応させた後に、二次抗体に酵素を付加し、該酵素による酵素反応によってラジカルを生成していた。このため、従来技術では、酵素の至適温度に応じた温度調整、酵素に応じた反応時間の調整、および、複数種類の反応溶液の調整、などが必要であり、容易な免疫染色を行う事が困難であった。詳細には、従来技術では、主に、２つの課題があった。１つの課題は、多重染色を行う場合、２次抗体と使うことから、１次抗体と２次抗体の組み合わせが抗体を作成した動物種の組み合わせとなり、制限ができていた。もう１つの課題は、酵素反応とラジカル生成による増感反応は温度時間により反応生成物の量が異なるので、定量性を得にくい、という課題である。また、従来技術では、溶液調整などが容易ではなかった。
【０１０９】
一方、本実施形態の免疫染色方法では、第１励起光Ｌ１により活性種２６を発生させるため、酵素を用いる免疫染色方法に比べて、酵素の至適温度に応じた温度調整および反応時間の調整、または複数種類の反応溶液の調整などは不要である。
【０１１０】
従って、本実施形態の免疫染色方法は、容易な免疫染色を実現することができる。
【０１１１】
詳細には、本実施形態の免疫染色方法は、工程削減と定量性向上と多重染色性に優れた、免疫染色を実現することができる。
【０１１２】
また、本実施の形態の免疫染色方法では、光照射時間の制御による活性種２６の生成量の制御ができ、定量性が確保される。また、１次抗体と２次抗体の組合せは、免疫動物の種類によって制限されるので、組合せが限定される。本実施の形態の免疫染色方法では、１次抗体しか用いないため、同じ発生剤１８の種類の数に依存するため、多重染色が容易になる。
【０１１３】
また、本実施形態の免疫染色方法では、酵素を用いる必要が無いことから、上記効果に加えて、試料１０の保存性の向上を図ることができる。また、本実施形態の免疫染色方法では、第１励起光Ｌ１の照射によって免疫染色を行うため、酵素を用いた従来の方法に比べて、免疫染色に要する時間の短縮を図ることができる。
【０１１４】
また、本実施形態の免疫染色方法では、第１励起光Ｌ１の照射により活性種２６を発生させるため、試料１０における特定の領域に選択的に第１励起光Ｌ１を照射することができる。このため、試料１０における、特定の領域に位置する標的分子１４に対して、選択的に、免疫染色を行うことができる。
【０１１５】
また、本実施形態の免疫染色方法では、抗体２０として一次抗体のみを用いることができるため、シグナルの強度が小さくなることを抑制することができ、シグナルの増幅と高感度化を容易に図ることができる。
【０１１６】
また、本実施形態の免疫染色方法は、第１励起光Ｌ１を照射することで、標的分子１４を免疫染色する。このため、照射する第１励起光Ｌ１の光量（強度および照射時間の少なくとも一方）を調整することで、標的分子１４への色素化合物２４の結合量を容易に調整することが出来る。
【０１１７】
このため、本実施形態の免疫染色方法は、上記効果に加えて、標的分子１４の検出における定量性の向上を図ることができる。
【０１１８】
（第２の実施形態）
本実施形態では、上記第１の実施形態における照射工程を、第１励起光Ｌ１の波長を変更して繰り返すことで、多重染色を実現する形態を説明する。
【０１１９】
本実施形態の免疫染色方法では、固相１２に複数種類の標的分子１４を固定化し、更に、互いに異なる発生剤１８を含む複数種類の抗体２０を、各々に対応する種類の標的分子１４に結合させる。そして、照射工程ごとに、第１励起光Ｌ１の波長領域および色素化合物２４の種類を変更する。
【０１２０】
図５は、試料１１の一例を示す模式図である。本実施形態の免疫染色方法で用いる試料１１は、複数種類の標的分子１４を含む。図５には、一例として、３種類の標的分子１４Ａ、標的分子１４Ｂ、標的分子１４Ｃを示した。なお、試料１１に含まれる標的分子１４の種類は、２種類、または、４種類以上、であってもよい。
【０１２１】
また、これらの複数種類の標的分子１４（標的分子１４Ａ、標的分子１４Ｂ、標的分子１４Ｃ）は、各々異なる種類の抗体２０に対して特異性を有する。
【０１２２】
図５には、標的分子１４Ａに対して特異性を有する抗体２０Ａ、標的分子１４Ｂに対して特異性を有する抗体２０Ｂ、標的分子１４Ｃに対して特異性を有する抗体２０Ｃを示した。
【０１２３】
複数種類の抗体２０（抗体２０Ａ、抗体２０Ｂ、抗体２０Ｃ）は、互いに異なる種類の発生剤１８を含む。本実施形態では、抗体２０Ａが発生剤１８Ａを含み、抗体２０Ｂが発生剤１８Ｂを含み、抗体２０Ｃが発生剤１８Ｃを含む場合を、一例として説明する。
【０１２４】
これらの複数種類の発生剤１８（発生剤１８Ａ、発生剤１８Ｂ、発生剤１８Ｃ）は、互いに異なる波長領域の第１励起光Ｌ１により励起し、活性種２６を発生する。すなわち、これらの複数種類の発生剤１８は、互いに非重複の波長領域の第１励起光Ｌ１の照射によって励起し、活性種２６を発生する。
【０１２５】
本実施形態では、第１の実施形態における照射工程を、第１励起光Ｌ１の波長領域および色素化合物２４の種類を変更して繰り返す繰返工程を含む。
【０１２６】
色素化合物２４の種類を変更する、とは、吸収および発光スペクトルの少なくとも一方の異なる色素化合物２４を添加する事を意味する。具体的には、色、蛍光、およびりん光、の少なくとも１つの異なる色素化合物２４を添加することを意味する。すなわち、繰返工程では、照射工程ごとに、同一の試料１１に対して前の照射工程で添加した色素化合物２４とは異なる色の色素化合物２４を、添加する。
【０１２７】
すなわち、本実施形態の免疫染色方法では、固相１２に複数種類の標的分子１４（標的分子１４Ａ、標的分子１４Ｂ、標的分子１４Ｃ）を固定化し、更に、互いに異なる発生剤１８Ａを含む複数種類の抗体２０（抗体２０Ａ、抗体２０Ｂ、抗体２０Ｃ）を、各々に対応する種類の標的分子１４に結合させた後に、照射工程ごとに、第１励起光Ｌ１の波長領域および色素化合物２４の種類を変更する。
【０１２８】
なお、固相１２に複数種類の標的分子１４（標的分子１４Ａ、標的分子１４Ｂ、標的分子１４Ｃ）を固定化した後に、照射工程ごとに、抗体２０の種類、第１励起光Ｌ１の波長領域、および色素化合物２４の種類、の全てを変更してもよい。
【０１２９】
図６は、本実施形態の免疫染色方法の工程順を示す説明図である。図６に示すように、本実施形態の免疫染色方法では、まず、第１の実施形態と同様に、前処理工程を実行し（ステップＳ２００）、次に抗原抗体反応工程を実行し（ステップＳ２０２）、次に照射工程を実行し（ステップＳ２０４）、次に洗浄工程を実行し（ステップＳ２０６）、最後に検出工程を実行する（ステップＳ２０８）。但し、本実施形態の免疫染色方法では、ステップＳ２０４の照射工程、ステップＳ２０６の洗浄工程、およびステップＳ２０８の検出工程を、試料１１に含まれる標的分子１４の種類に応じた回数、第１励起光Ｌ１の波長領域および色素化合物２４の種類を、変更して繰り返し実行する。
【０１３０】
次に、本実施形態の繰返工程について、具体例を説明する。
【０１３１】
なお、以下の具体例では、照射工程ごとに、第１励起光Ｌ１の波長領域、および色素化合物２４の種類、を変更する形態を、一例として説明する。また、以下の具体例では、照射工程を、３回繰返し実行する場合を、一例として説明する。
【０１３２】
［前処理工程・抗原抗体反応工程］
図７Ａは、試料１１の一例を示す模式図である。第１の実施形態と同様に、まず、前処理工程を実行する。例えば、標的分子１４Ａ、標的分子１４Ｂ、および標的分子１４Ｂが固定化された固相１２を用意する。そして、第１の実施形態と同様に、標的分子１４を賦活化する賦活化工程を実行した後に、ブロッキング工程を実行する。
【０１３３】
次に、抗原抗体反応工程を実行する。すなわち、互いに異なる発生剤１８Ａを含む複数種類の抗体２０（抗体２０Ａ、抗体２０Ｂ、抗体２０Ｃ）を、各々に対応する種類の標的分子１４（標的分子１４Ａ、標的分子１４Ｂ、および標的分子１４Ｂ）に結合させる。詳細には、図７Ａに示すように、複数種類の標的分子１４の内、標的分子１４Ａに対して特異性を有する抗体２０Ａを、標的分子１４Ａに結合させる。抗体２０Ａには、発生剤１８Ａが結合されている。また、標的分子１４Ｂに対して特異性を有する抗体２０Ｂを、標的分子１４Ｂに結合させる。抗体２０Ｂには、発生剤１８Ｂが結合されている。また、標的分子１４Ｃに対して特異性を有する抗体２０Ｃを、標的分子１４Ｃに結合させる。抗体２０Ｃには、発生剤１８Ｃが結合されている。
【０１３４】
［照射工程（１回目）］
照射工程では、まず、色素化合物２４を添加する。図７Ａには、色素化合物２４として、色素化合物２４Ａを添加した場合を想定して示した。
【０１３５】
図７Ｂは、第１励起光Ｌ１ａの照射の説明図である。図７Ｂに示すように、試料１１に、第１励起光Ｌ１として、第１励起光Ｌ１ａを照射する。第１励起光Ｌ１ａは、抗体２０Ａに結合されている発生剤１８Ａが活性種２６を発生する波長領域の光である。このため、第１励起光Ｌ１ａの照射によって、発生剤１８Ａが活性種２６を発生する。
【０１３６】
図７Ｃは、色素化合物２４Ａが標的分子１４Ａに結合した状態の説明図である。図７Ｃに示すように、色素化合物２４Ａは、標的分子１４Ａに結合された抗体２０Ａにおける発生剤１８Ａの近傍で発生した活性種２６の作用によって、標的分子１４Ａの電子供与体１６に選択的に結合する。
【０１３７】
［洗浄工程］
次に、洗浄工程を実行する。洗浄工程は、上記第１の実施形態と同様である。洗浄工程によって、未反応の色素化合物２４Ａが試料１１から除去される。
【０１３８】
［検出工程（１回目）］
次に、色素化合物２４Ａの色を測定または観察することで、標的分子１４Ａを検出する。
【０１３９】
［照射工程（２回目）］
図８Ａは、試料１１の一例を示す模式図である。図８Ａに示すように、次に、色素化合物２４を添加する。図８Ａには、色素化合物２４として、色素化合物２４Ｂを添加した場合を想定して示した。色素化合物２４Ｂは、標的分子１４Ａに結合した色素化合物２４Ａとは異なる色の色素化合物２４であればよい。
【０１４０】
図８Ｂは、第１励起光Ｌ１ｂの照射の説明図である。図８Ｂに示すように、試料１１に、第１励起光Ｌ１として、第１励起光Ｌ１ｂを照射する。第１励起光Ｌ１ｂは、抗体２０Ｂに結合されている発生剤１８Ｂが活性種２６を発生する波長領域の光である。このため、第１励起光Ｌ１ｂの照射によって、発生剤１８Ｂが活性種２６を発生する。なお、第１励起光Ｌ１ｂは、前回の照射工程で照射した第１励起光Ｌ１ａより長波長領域の光であることが好ましい。
【０１４１】
図８Ｃは、色素化合物２４Ｂが標的分子１４Ｂに結合した状態の説明図である。図８Ｃに示すように、色素化合物２４Ｂは、標的分子１４Ｂに結合された抗体２０Ａにおける発生剤１８Ｂの近傍で発生した活性種２６の作用によって、標的分子１４Ｂの電子供与体１６に選択的に結合する。
【０１４２】
［洗浄工程］
次に、洗浄工程を実行する。洗浄工程は、上記第１の実施形態と同様である。洗浄工程によって、未反応の色素化合物２４Ｂが試料１１から除去される。
【０１４３】
［検出工程（２回目）］
次に、色素化合物２４Ｂの色を測定または観察することで、標的分子１４Ｂを検出する。
【０１４４】
［照射工程（３回目）］
図９Ａは、試料１１の一例を示す模式図である。図９Ａに示すように、次に、色素化合物２４を添加する。図９Ａには、色素化合物２４として、色素化合物２４Ｃを添加した場合を想定して示した。色素化合物２４Ｃは、標的分子１４Ａに結合した色素化合物２４Ａ、および、標的分子１４Ｂに結合した色素化合物２４Ｂ、とは異なる色の色素化合物２４であればよい。
【０１４５】
図９Ｂは、第１励起光Ｌ１ｃの照射の説明図である。図９Ｂに示すように、試料１１に、第１励起光Ｌ１として、第１励起光Ｌ１ｃを照射する。第１励起光Ｌ１ｃは、抗体２０Ｃに結合されている発生剤１８Ｃが活性種を発生する波長領域の光である。このため、第１励起光Ｌ１ｃの照射によって、発生剤１８Ｃが活性種２６を発生する。なお、第１励起光Ｌ１ｃは、前回の照射工程で照射した第１励起光Ｌ１ｂより長波長領域の光であることが好ましい。
【０１４６】
図９Ｃは、色素化合物２４Ｃが標的分子１４Ｃに結合した状態の説明図である。図９Ｃに示すように、色素化合物２４Ｃは、標的分子１４Ｃに結合された抗体２０Ｃにおける発生剤１８Ｃの近傍で発生した活性種２６の作用によって、標的分子１４Ｃの電子供与体１６に選択的に結合する。
【０１４７】
［洗浄工程］
次に、洗浄工程を実行する。洗浄工程は、上記第１の実施形態と同様である。洗浄工程によって、未反応の色素化合物２４Ｃが試料１１から除去される。
【０１４８】
［検出工程（３回目）］
次に、色素化合物２４Ｃの色を測定または観察することで、標的分子１４Ｃを検出する。
【０１４９】
なお、検出工程は、照射工程および洗浄工程を、標的分子１４の種類に応じた回数繰返し実行した後に、最後にまとめて実行してもよい。
【０１５０】
なお、照射工程を繰り返し実行する場合、より後の照射工程で照射する第１励起光Ｌ１ほど、より長波長の第１励起光Ｌ１となるように、照射工程で照射する第１励起光Ｌ１の波長領域を調整することが好ましい。
【０１５１】
以上説明したように、本実施形態の免疫染色方法では、試料１１に含まれる標的分子１４の種類に応じた回数、第１励起光Ｌ１の波長領域および色素化合物２４を変更して照射工程を繰り返すことによって、多重染色を実現する。
【０１５２】
従って、本実施形態の免疫染色方法では、上記実施形態の効果に加えて、容易に多重染色を実現することができる。
【０１５３】
また、上述したように、本実施形態の免疫染色方法では、試料１１に含まれる複数種類の標的分子１４（標的分子１４１、標的分子１４Ｂ、標的分子１４Ｃ）の各々に、対応する抗体２０（抗体２０Ａ、抗体２０Ｂ、抗体２０Ｃ）を結合させた状態で、第１励起光Ｌ１の波長領域および色素化合物２４を変更して照射工程を繰返すことができる。このため、試料１１に照射する第１励起光Ｌ１の波長領域と色素化合物２４の種類を変更するのみで、容易に、標的分子１４を種類に応じた色に染色することができる。
【実施例】
【０１５４】
以下に実施例を挙げて本開示を具体的に説明するが、本開示はこれらの実施例に制限されるものではない。
【０１５５】
（実施例１）
−前処理工程、抗原抗体反応工程、照射工程、洗浄工程−
固相１２としてスライドガラス用意した。また、複数種類の標的分子１４を含む標本として、パラフィン包埋された病理標本を用意した。そして、固相１２に、パラフィン包埋された病理標本を４ｕｍに薄切し、熱をかけて、スライドガラスに固定化したのち、脱パラフィンを行った。次に、マイクロウェーッブで９５℃に加熱しすることにより、標的分子１４を賦活化した。次に、ブロッキング液（ＴＢＳＴ／５％正常ヤギ血清：１×ＴＢＳＴ  ５ｍＬに正常ヤギ血清２５０μＬを添加したもの）１００−４００μＬ用いて、固相１２を室温で１時間ブロッキングした。
【０１５６】
次に、発生剤１８を含む抗体２０として、ＦＩＴＣ結合１次抗体（ＭＰ社）を用意した。そして、この抗体２０の溶液を、上記病理標本が固定化された固相１２に添加し、２時間室温で放置した。この処理により、抗体２０を標的分子１４に結合させた。
【０１５７】
次に、色素化合物２４として、Ｃｙ３結合チラミド化合物（ＰＥ社）について、ストック溶液を１ｘ  Ｐｌｕｓアンプリフィケーション希釈液で５０倍希釈した反応液を、上記固相１２上に添加した。
【０１５８】
次に、上記発生剤１８が活性種２６を発生する波長領域の第１励起光Ｌ１として、４８８ｎｍ±１０ｎｍの波長領域の第１励起光Ｌ１を、５分照射した。
【０１５９】
次に、試料１０をＴＮＴバッファー内で撹拌しながら、室温５分間の洗いを３回繰り返し、未反応の色素化合物２４を除去した。
【０１６０】
―検出工程―
洗浄後の該試料１０に、５５０ｎｍ±１０ｎｍの波長の第２励起光Ｌ２を照射した状態で、該試料１０を撮影することで、試料１０の撮影画像を得た。そして、該撮影画像について、輝点数を計測した。輝点数の計測は、ＩｍａｇｅＪ  ＦｉｎｄＭａｘｉｍａ法を用いて行った（照射時間２００ｍｓｅｃでＮｏｉｓｅＴｏｌｅｒａｎｃｅは６０）。また、撮影画像取得時の試料１０に照射される第２励起光Ｌ２のエネルギーは、１０００ｍＷ／ｃｍ２となるように設定した。
【０１６１】
その結果、図１０に示す画像が得られた。なお、実施例１では、輝点の色が緑色の画像が得られた。このため、工程削減と定量性向上に優れた免疫染色を実現することができ、容易な免疫染色を実現することができることが確認できた。
【０１６２】
（実施例２）
上記実施例１において、実施例１と同じ病理標本を用い、第１励起光Ｌ１として５８１＋−１０ｎｍの波長の第１励起光Ｌ１を用い、発生剤１８Ａの結合された抗体２０ＡとしてＣｙ３．５結合１次抗体を用い、色素化合物２４としてＣｙ５結合チラミド、第二励起波長は６４８＋−１０ｎｍを用いた点以外は、実施例１と同様にして、前処理工程、抗原抗体反応工程、照射工程、および検出工程を実行した。
【０１６３】
その結果、図１０と同様の画像が得られた。なお、実施例２では、輝点の色が紫色の画像が得られた。このため、工程削減と定量性向上に優れた免疫染色を実現することができ、容易な免疫染色を実現することができることが確認できた。
【０１６４】
（実施例３）
本実施例では、多重染色を行った。具体的には、複数種類の標的分子１４を含む標本として、実施例１と同じ、パラフィン包埋された病理標本を用意した。そして、実施例１と同様にして、前処理工程および抗原抗体反応工程を実行した後に、実施例１における照射工程、洗浄工程、および検出工程を実行した後に、実施例２における照射工程、洗浄工程、および検出工程を実行した。
【０１６５】
その結果、１回目の照射工程の後の検出工程で得られた画像の輝点は、緑色であり、２回目の照射工程の後の検出工程で得られた画像の輝点は、紫色であった。このため、工程削減と定量性向上と多重染色性に優れた免疫染色を実現することができ、容易に多重染色を実現することができることが確認できた。
【０１６６】
なお、本技術は以下のような構成も取ることができる。
（１）
電子供与体を含む標的分子と、前記標的分子に結合され第１励起光により活性種を発生する発生剤を含む抗体と、色素化合物と、を含む試料に、前記第１励起光を照射し前記第１励起光の照射によって前記発生剤から発生した活性種によって前記色素化合物と前記電子供与体とを結合させる照射工程、
を含む免疫染色方法。
（２）
前記第１励起光は前記発生剤が活性種を発生し、且つ前記色素化合物が活性種を発生しない波長領域の光である、
上記（１）に記載の免疫染色方法。
（３）
前記色素化合物は第２励起光の照射により励起し、前記第１励起光と前記第２励起光とは波長領域が異なる、
上記（１）または（２）に記載の免疫染色方法。
（４）
前記第１励起光は前記第２励起光より長波長領域の光である、
上記（３）に記載の免疫染色方法。
（５）
前記色素化合物は色素で標識された芳香族化合物である、上記（１）〜（４）の何れか１つに記載の免疫染色方法。
（６）
前記電子供与体は極性基を有する芳香族化合物である、上記（１）〜（５）の何れか１つに記載の免疫染色方法。
（７）
前記電子供与体は活性種により前記色素化合物とラジカル架橋反応する化合物である、
上記（１）〜（６）の何れか１つに記載の免疫染色方法。
（８）
前記発生剤はシアニン色素である、上記（１）〜（７）の何れか１つに記載の免疫染色方法。
（９）
前記色素化合物はチラミド色素である、上記（１）〜（８）の何れか１つに記載の免疫染色方法。
（１０）
前記標的分子は前記抗体に対して特異性を有する抗原または前記抗原に結合した一次抗体である、
上記（１）〜（９）の何れか１つに記載の免疫染色方法。
（１１）
複数種類の前記標的分子を含む前記試料に前記第１励起光を照射する前記照射工程を、前記第１励起光の波長領域および前記色素化合物の種類を変更して繰り返す繰返工程、
を含む、上記（１）〜（１０）の何れか１つに記載の免疫染色方法。
（１２）
電子供与体を含む標的分子と、前記標的分子に結合され、第１励起光により活性種を発生する発生剤を含む抗体と、色素化合物と、を含む試料に、前記第１励起光を照射する照射部と、
前記電子供与体に結合された前記色素化合物を検出する検出部と、
を備える免疫染色システム。
（１３）
電子供与体を含む標的分子に結合され、第１励起光により活性種を発生する発生剤を含む抗体と、
色素化合物と、を含み、
前記電子供与体は前記第１励起光の照射によって前記発生剤から発生した活性種によって前記色素化合物を結合させる免疫染色キット。
【符号の説明】
【０１６７】
１０、１１  試料
１４、１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ  標的分子
１６  電子供与体
１８  発生剤
２０、２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ  抗体
２４、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃ  色素化合物
２６  活性種
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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