(57)【要約】【課題】より強度の高いタンパク質繊維を製造することができるタンパク質繊維の製造方法、紡糸ノズル、およびタンパク質繊維の製造装置を提供する。【解決手段】紡糸ノズルを用いてタンパク質を含む紡糸原液を吐出しタンパク質繊維を製造するタンパク質繊維の製造方法であって、紡糸ノズルが管状の吐出部を備え、吐出部の内径（Ｄ）に対する吐出部の長さ（Ｌ）の比（Ｌ／Ｄ）が３０超であり、紡糸ノズルの吐出部から、紡糸原液を吐出させて凝固させる工程を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
紡糸ノズルを用いてタンパク質を含む紡糸原液を吐出しタンパク質繊維を製造するタンパク質繊維の製造方法であって、
前記紡糸ノズルが管状の吐出部を備え、前記吐出部の内径（Ｄ）に対する前記吐出部の長さ（Ｌ）の比（Ｌ／Ｄ）が３０超であり、
前記紡糸ノズルの前記吐出部から、前記紡糸原液を吐出させて凝固させる工程を含む、タンパク質繊維の製造方法。
【請求項２】
前記紡糸ノズルの前記吐出部の前記比（Ｌ／Ｄ）が２００以下である、請求項１に記載のタンパク質繊維の製造方法。
【請求項３】
前記紡糸原液を加圧して前記紡糸原液の体積を減少させた圧縮状態で、前記紡糸ノズル内に前記紡糸原液を導入する加圧導入工程を含む、請求項１または２に記載のタンパク質繊維の製造方法。
【請求項４】
前記圧縮状態での前記紡糸原液の前記ノズル内への導入が、該紡糸原液を加圧して前記紡糸ノズルに送り込む圧送手段によって実現されている、請求項３に記載のタンパク質繊維の製造方法。
【請求項５】
前記圧送手段がシリンジポンプまたは窒素ポンプである、請求項４に記載のタンパク質繊維の製造方法。
【請求項６】
タンパク質を含む紡糸原液を吐出するための紡糸ノズルであって、
前記紡糸原液を導入するように構成された導入部と、
前記導入部に接続されて、前記紡糸原液を吐出するように構成された管状の吐出部と、を備え、
前記吐出部の内径（Ｄ）に対する前記吐出部の長さ（Ｌ）の比（Ｌ／Ｄ）が３０超である、紡糸ノズル。
【請求項７】
紡糸ノズルを用いてタンパク質を含む紡糸原液を吐出しタンパク質繊維を製造するタンパク質繊維の製造装置であって、
前記紡糸ノズルが管状の吐出部を備え、前記吐出部の内径（Ｄ）に対する前記吐出部の長さ（Ｌ）の比（Ｌ／Ｄ）が３０超である、タンパク質繊維の製造装置。
【請求項８】
前記紡糸原液を加圧して前記紡糸原液の体積を減少させた状態で、前記紡糸ノズル内に前記紡糸原液を導入するように構成された圧送手段を備える、請求項７に記載のタンパク質繊維の製造装置。
【請求項９】
前記圧送手段がシリンジポンプまたは窒素ポンプである、請求項８に記載のタンパク質繊維の製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質繊維の製造方法、紡糸ノズル、およびタンパク質繊維の製造装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、各種の繊維を製造するための紡糸口金（紡糸ノズル）が検討されている。特許文献１には、合成繊維であるポリビニルアルコール（ＰＶＡ）系繊維の製造方法が記載されている。この紡糸口金は、孔の長さＬと孔径Ｄとの比（Ｌ／Ｄ）が、３以上の吐出孔を有する。その他にも、特許文献２にはセルロース繊維の製造方法が記載されており、紡糸ノズルにおける比（Ｌ／Ｄ）が１０以上である旨が記載されている。特許文献３にはセルロースアセテート繊維の製造方法が記載されており、乾式紡糸を行うに際して、紡糸口金における比（Ｌ／Ｄ）が１以上である旨が記載されている。特許文献４には、合成繊維の製造方法が記載されており、溶融紡糸を行うに際して、紡糸口金のキャピラリーにおける比（Ｌ／Ｄ）が５以上である旨が記載されている。
【０００３】
一方、タンパク質繊維を製造するための紡糸ノズルも検討されている。タンパク質繊維は、合成繊維とは異なって、生分解性を有し、生産や加工のエネルギーが小さい等の利点を有する。近年の環境保全意識の高まりに応じて、タンパク質繊維に関しては、様々な分野への需要の増大が見込まれている。また、そのようなタンパク質繊は、様々な用途への適用が検討されており、その中には、より高い強度を要求されるものもある。
【０００４】
タンパク質繊維の中でも、シルク等の天然のタンパク質繊維は、全長のコントロールが不能であり、また、天然であるが故に一定の品質のものを安定的に得ることは困難であった。そこで、たとえば特許文献５に記載されるように、天然由来のタンパク質を含む紡糸原液を紡糸ノズルから吐出させて凝固させることにより、高物性のタンパク質繊維を人工的に製造する方法等が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平７−３０５２２２号公報
【特許文献２】特開平７−２２９０１６号公報
【特許文献３】特開平７−３３１５２７号公報
【特許文献４】特開２０００−９６３３６号公報
【特許文献５】特許第５５４０１５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年、上記したような人工的なタンパク質繊維の製造分野において、引張強度等の物性を更に高められ得る技術の確立が求められている。本発明は、より強度の高いタンパク質繊維を製造することができるタンパク質繊維の製造方法、それに用いられる紡糸ノズル、およびタンパク質繊維の製造装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様は、紡糸ノズルを用いてタンパク質を含む紡糸原液を吐出しタンパク質繊維を製造するタンパク質繊維の製造方法であって、紡糸ノズルが管状の吐出部を備え、吐出部の内径（Ｄ）に対する吐出部の長さ（Ｌ）の比（Ｌ／Ｄ）が３０超であり、紡糸ノズルの吐出部から、紡糸原液を吐出させて凝固させる工程を含む。
【０００８】
このタンパク質繊維の製造方法によれば、タンパク質を含む紡糸原液を吐出させ、凝固させることで、タンパク質繊維が製造される。紡糸原液を吐出するための紡糸ノズルは、３０超の比（Ｌ／Ｄ）を有する吐出部を備える。この特有の比（Ｌ／Ｄ）を持つ紡糸ノズルを用いることによって、より強度の高いタンパク質繊維を製造することができる。
【０００９】
タンパク質繊維の製造方法において、紡糸ノズルの吐出部の比（Ｌ／Ｄ）が２００以下であってもよい。
【００１０】
タンパク質繊維の製造方法が、紡糸原液を加圧して紡糸原液の体積を減少させた圧縮状態で、紡糸ノズル内に紡糸原液を導入する加圧導入工程を含んでもよい。
【００１１】
タンパク質繊維の製造方法において、圧縮状態での紡糸原液のノズル内への導入が、該紡糸原液を加圧して紡糸ノズルに送り込む圧送手段によって実現されていてもよい。
【００１２】
タンパク質繊維の製造方法において、圧送手段がシリンジポンプまたは窒素ポンプであってもよい。
【００１３】
本発明の別の態様は、タンパク質を含む紡糸原液を吐出するための紡糸ノズルであって、紡糸原液を導入するように構成された導入部と、導入部に接続されて、紡糸原液を吐出するように構成された管状の吐出部と、を備え、吐出部の内径（Ｄ）に対する吐出部の長さ（Ｌ）の比（Ｌ／Ｄ）が３０超である。
【００１４】
この紡糸ノズルによれば、タンパク質を含む紡糸原液を吐出し、凝固させることで、タンパク質繊維が製造される。この紡糸ノズルは、３０超の比（Ｌ／Ｄ）を有する吐出部を備える。この特有の比（Ｌ／Ｄ）を持つ紡糸ノズルによって、より強度の高いタンパク質繊維を製造することができる。
【００１５】
本発明のさらに別の態様は、紡糸ノズルを用いてタンパク質を含む紡糸原液を吐出しタンパク質繊維を製造するタンパク質繊維の製造装置であって、紡糸ノズルが管状の吐出部を備え、吐出部の内径（Ｄ）に対する吐出部の長さ（Ｌ）の比（Ｌ／Ｄ）が３０超である。
【００１６】
このタンパク質繊維の製造装置によれば、タンパク質を含む紡糸原液を吐出させ、凝固させることで、タンパク質繊維が製造される。紡糸原液を吐出するための紡糸ノズルは、３０超の比（Ｌ／Ｄ）を有する吐出部を備える。この特有の比（Ｌ／Ｄ）を持つ紡糸ノズルを備えた構成によって、より強度の高いタンパク質繊維を製造することができる。
【００１７】
タンパク質繊維の製造装置が、紡糸原液を加圧して紡糸原液の体積を減少させた状態で、紡糸ノズル内に紡糸原液を導入するように構成された圧送手段を備えてもよい。
【００１８】
タンパク質繊維の製造装置において、圧送手段がシリンジポンプまたは窒素ポンプであってもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のいくつかの態様によれば、より強度の高いタンパク質繊維を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本開示の一実施形態に係るタンパク質繊維の製造装置を概略的に示す図である。
【図２】図１中の紡糸ノズルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照しながら説明する。なお、図面の説明において同一要素には同一符号を付し、重複する説明は省略する。
【００２２】
本実施形態に係るタンパク質繊維の製造装置および製造方法では、紡糸ノズルを用いて、タンパク質を含むドープ液（紡糸原液）を吐出し、凝固させ、高強度を有するタンパク質繊維を製造する。対象とされるたんぱく質は、たとえば構造タンパク質である。本実施形態では、特に、分子量５００ｋＤａ以下のタンパク質を含む人造タンパク質繊維の高強度化を可能とする。高強度化の観点において、タンパク質の分子量は、好ましくは４００ｋＤａ以下であり、より好ましくは３００ｋＤａ以下であり、さらにより好ましくは２００ｋＤａ以下である。
【００２３】
［構造タンパク質］
構造タンパク質とは、生体構造を構築する役割を有するタンパク質であり、酵素、ホルモン、抗体等の機能タンパク質とは異なる。構造タンパク質としては、クモ糸タンパク質やカイコシルクタンパク質等を含むフィブロイン、ケラチン、コラ−ゲン、エラスチン及びレシリン等の天然構造タンパク質、並びにそれらのタンパク質由来の構造タンパク質等が挙げられる。本実施形態に係るモールド成形体を構成する構造タンパク質としては、天然クモ糸タンパク質に由来する、いわゆる組換えクモ糸タンパク質が好適に用いられる。すなわち、構造タンパク質は、天然クモ糸タンパク質および天然クモ糸タンパク質に由来するタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１種を含有する。
【００２４】
クモ糸タンパク質は、例えば、牽引糸タンパク質や横糸タンパク質であってもよい。
【００２５】
クモ糸タンパク質であって牽引糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質として、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ１］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ１］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。組換えクモ糸タンパク質は、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、クモ糸タンパク質に特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。
【００２６】
ここで、本明細書において「組換えクモ糸タンパク質」とは、人為的に製造されたクモ糸タンパク質（人造クモ糸タンパク質）を意味する。組換えクモ糸タンパク質は、そのドメイン配列が、天然由来のクモ糸タンパク質のアミノ酸配列とは異なるクモ糸タンパク質であってもよく、天然由来のクモ糸タンパク質のアミノ酸配列と同一であるクモ糸タンパク質であってもよい。本明細書でいう「天然由来のクモ糸タンパク質１」もまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ１］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ１］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。
【００２７】
「組換えクモ糸タンパク質」は、天然由来のクモ糸タンパク質のアミノ酸配列をそのまま利用したものであってもよく、天然由来のクモ糸タンパク質のアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のクモ糸タンパク質の遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のクモ糸タンパク質に依らず人工的に設計及び合成したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。
【００２８】
本明細書において「ドメイン配列」とは、クモ糸タンパク質特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ１］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ１］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、アミノ酸残基数は２〜２７である。（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、２〜２０、４〜２７、４〜２０、８〜２０、１０〜２０、４〜１６、８〜１６、又は１０〜１６の整数であってよい。また、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されてもよい。ＲＥＰは２〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。ｍは２〜３００の整数を示し、１０〜３００の整数であってもよい。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。具体的には配列番号１および配列番号９で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をあげることができる。
【００２９】
クモ糸タンパク質であって横糸タンパク質に由来の組換えクモ糸タンパク質としては、例えば、式３：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式３中、ＲＥＰ２はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘはアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選ばれる一つのアミノ酸を示す。ｏは８〜３００の整数を示す。）をあげることができる。
【００３０】
具体的には配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をあげることができる。配列番号２で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）のリピート部分及びモチーフに該当するＮ末端から１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列（ＰＲ１配列と記す。）と、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３８８４７、ＧＩ：２８３３６４９）のＣ末端から８１６残基目から９０７残基目までのＣ末端アミノ酸配列を結合し、結合した配列のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００３１】
コラーゲン由来のタンパク質として、例えば、式４：［ＲＥＰ３］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式４中、ｐは５〜３００の整数を示す。ＲＥＰ３は、Ｇｌｙ一Ｘ一Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号３で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００３２】
レシリン由来のタンパク質として、例えば、式５：［ＲＥＰ４］ｑで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式５中、ｑは４〜３００の整数を示す。ＲＥＰ４はＳｅｒ一Ｊ一Ｊ一Ｔｙｒ一Ｇｌｙ一Ｕ−Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ４は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＰ  ６１１１５７、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに置換し、かつ９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号８で示されるアミノ酸配列（タグ配列）が付加されたものである。
【００３３】
エラスチン由来のタンパク質として、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。具体的には、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号５で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００３４】
ケラチン由来のタンパク質として、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ  ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。具体的には、配列番号６で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＣＹ３０４６６のアミノ酸配列）を含むタンパク質を挙げることができる。
【００３５】
＜組換えタンパク質の製造方法＞
組換えタンパク質は、例えば、当該組換えタンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
【００３６】
組換えタンパク質をコードする遺伝子の製造方法は特に制限されない。例えば、天然の構造タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的な合成によって、遺伝子を製造することができる。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した構造タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質、をコードする遺伝子を合成してもよい。
【００３７】
調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、組換えタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いても良い。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
【００３８】
発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、組換えタンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
【００３９】
宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
【００４０】
原核生物の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ等を挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ等を挙げることができる。セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス等を挙げることができる。バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス等を挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等を挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム等を挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等を挙げることができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ等を挙げることができる。
【００４１】
原核生物を宿主とする場合、組換えタンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
【００４２】
真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
【００４３】
真核生物を宿主とする場合、組換えタンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９，２１１０  （１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。
【００４４】
発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
【００４５】
組換えタンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に組換えタンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
【００４６】
宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００４７】
炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
【００４８】
無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
【００４９】
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
【００５０】
また、培養中必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００５１】
発現させた組換えタンパク質の単離、精製は通常用いられている方法で行うことができる。例えば、当該組換えタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
【００５２】
また、組換えタンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として組換えタンパク質の不溶体を回収する。回収した組換えタンパク質の不溶体は蛋白質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法により組換えタンパク質の精製標品を得ることができる。当該組換えタンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該組換えタンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００５３】
［ドープ液（紡糸原液）］
ドープ液（紡糸原液）は、上述した方法に準じて製造したクモ糸フィブロイン等の構造タンパク質を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、又はヘキサフルオロイソプロノール（ＨＦＩＰ）、ギ酸等の溶媒にて溶解させることにより作成される。この際、必要に応じて無機塩を添加してもよい。
【００５４】
［タンパク質繊維の製造装置］
図１を参照して、タンパク質繊維の製造装置について説明する。図１は、本実施形態に係るタンパク質繊維の製造装置を概略的に示す図である。図１に示される製造装置１０は、タンパク質原料繊維を紡糸し、更にタンパク質原料繊維に所定の処理を施すことにより、高引張強度および高伸度を有するタンパク質繊維を簡便に製造することができる装置である。この製造装置１０は、タンパク質原料繊維３６を紡糸する紡糸装置２５と、紡糸装置２５によって紡糸されたタンパク質原料繊維３６を高温で加熱して収縮させる高温加熱弛緩装置４０とを備えている。製造装置１０では、紡糸工程と、延伸工程と、加熱状態での弛緩収縮による防縮工程とが連続して行われる。このような連続工程の実現により、高い生産性をもって高引張強度および高伸度を有するタンパク質繊維５０を製造することができる。
【００５５】
本実施形態では、一例として、乾湿式紡糸による紡糸装置２５が適用される場合について説明する。紡糸装置２５は、例えば乾湿式紡糸用の紡糸装置であり、貯留タンク６０と、ポンプ（圧送手段）７０と、紡糸ノズル１と、凝固装置２と、洗浄装置３と、乾燥装置４とを、上流側から順に備えている。貯留タンク６０には、ドープ液が貯留される。凝固装置２は凝固浴槽２０を有しており、この凝固浴槽２０に凝固液１１（例えば、メタノール）が貯留される。ドープ液は、圧送ポンプ７０によって圧送され、凝固液１１との間にエアギャップ１９を開けて設けられた紡糸ノズル１から吐出される。吐出されたドープ液は、エアギャップ１９を経て凝固液１１内に供給される。凝固液１１内でドープ液から溶媒が除去されてタンパク質が凝固する。
【００５６】
凝固液１１としては、脱溶媒できる溶液であればよく、例えば、メタノール、エタノール及び２−プロパノール等の炭素数１〜５の低級アルコール、並びにアセトン等を挙げることができる。凝固液１１は、適宜水を含んでいてもよい。凝固液１１の温度は、０〜３０℃であることが好ましい。凝固したタンパク質が凝固液１１中を通過する距離（実質的には、糸ガイド１８ａから糸ガイド１８ｂまでの距離）は、凝固液１１中でのタンパク質原料繊維３６の滞在時間を確保可能な長さがあればよい。凝固液１１中での滞留時間は、例えば、０．０１〜３分であってよく、０．５〜１分であってもよい。また、凝固液１１中で延伸（前延伸）をしてもよい。
【００５７】
洗浄装置３は、洗浄浴槽２１を有しており、この洗浄浴槽２１に洗浄液１２（例えば、水）が貯留される。凝固浴槽２０内で凝固したタンパク質は、洗浄浴槽２１に導かれ、洗浄液１２により洗浄される。このタンパク質は、洗浄浴槽２１内に設置された第１ニップローラ１３と第２ニップローラ１４により、乾燥装置４へと送られる。
【００５８】
洗浄装置３は、第１ニップローラ１３と第２ニップローラ１４を有することにより、タンパク質原料繊維３６を延伸する延伸装置の機能を兼ね備えている。すなわち、第１ニップローラ１３および第２ニップローラ１４は、タンパク質原料繊維３６を延伸する延伸手段２６を構成している。例えば、第２ニップローラ１４の回転速度が第１ニップローラ１３の回転速度よりも速く設定されることで、回転速度比に応じた倍率で延伸されたタンパク質原料繊維３６が得られる。なお、１８ａ〜１８ｅは糸ガイドである。
【００５９】
第１ニップローラ１３および第２ニップローラ１４には、これらの回転速度を調節することにより、タンパク質原料繊維３６の延伸倍率を調節する延伸倍率調節手段が設けられてもよい。この場合、延伸手段２６は、第１ニップローラ１３および第２ニップローラ１４を回転駆動する駆動部に対して制御信号を送信するコントローラを有してもよい。
【００６０】
タンパク質原料繊維を得る際に洗浄浴槽２１内で実施される延伸は、温水中、温水に有機溶剤等を加えた溶液中等で行う、いわゆる湿熱延伸であってもよい。この湿熱延伸の温度としては、例えば、０〜９０℃であってよく、２０〜７０℃が好ましく、３０〜６０℃がより好ましい。湿熱延伸での未延伸糸（又は前延伸糸）の延伸倍率は、例えば、１〜１０倍であってもよく、２〜８倍であってもよい。
【００６１】
最終的な延伸倍率は、その下限値が、未延伸糸（又は前延伸糸）に対して、好ましくは、１倍超、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上のうちのいずれかであり、上限値が、好ましくは１００倍以下、８０倍以下、６０倍以下、４０倍以下、３０倍以下、２０倍以下、１５倍以下、１４倍以下、１３倍以下、１２倍以下、１１倍以下、１０倍以下である。
【００６２】
なお、洗浄装置３が延伸装置を兼ねる場合に限られず、洗浄装置３と延伸装置（延伸手段）とがそれぞれ別個に設けられてもよい。その場合、タンパク質原料繊維３６の走行方向において、洗浄装置３の下流側に延伸装置が設けられてもよい。延伸装置は、洗浄装置３と乾燥装置４との間に設けられてもよい。また、洗浄装置３の上流側に延伸装置が設けられてもよい。延伸装置は、例えば、凝固浴槽２０と洗浄装置３との間に設けられてもよい。
【００６３】
洗浄液１２中で延伸されたタンパク質原料繊維３６は、洗浄浴槽２１内を離脱してから、乾燥装置４内を通過する際に乾燥される。乾燥装置４は、例えば乾熱式の乾燥炉１７を有している。乾燥炉１７内には、送出しローラ３１と巻取りローラ３２とが設けられている。タンパク質原料繊維３６は、これらの送出しローラ３１および巻取りローラ３２により、乾燥炉１７内を所定の滞在時間で滞在し、その後に高温加熱弛緩装置４０に送られる。乾燥炉１７では、例えば、巻取りローラ３２の回転速度が送出しローラ３１の回転速度よりも速く設定されることで、回転速度比に応じた倍率で、タンパク質原料繊維３６が延伸されてもよい。乾燥炉１７内には、図示しないヒータが設けられる。乾燥炉１７内の温度すなわちタンパク質原料繊維３６の乾燥温度は、例えば８０℃である。なお、洗浄装置３と乾燥装置４との間に、オイリング装置３０が設けられてもよい。
【００６４】
高温加熱弛緩装置４０は、タンパク質原料繊維３６の走行方向における紡糸装置２５の下流側に設けられている。乾式防縮装置である高温加熱弛緩装置４０は、例えば乾熱式の高温加熱炉４３を有している。高温加熱炉４３内には、送出しローラ（送出し手段）４１と巻取りローラ（巻取り手段）４２とが設けられている。送出しローラ４１および巻取りローラ４２はいずれも円筒状であり、これらの周面に、タンパク質原料繊維３６が巻き掛けられる。タンパク質原料繊維３６は、これらの送出しローラ４１および巻取りローラ４２により、高温加熱炉４３内を所定の滞在時間で滞在し、その後、ワインダーにて巻き取られる。
【００６５】
高温加熱炉４３では、例えば、巻取りローラ４２の回転速度が送出しローラ４１の回転速度よりも遅く設定されることで、回転速度比に応じた倍率で、タンパク質原料繊維３６が弛緩される。すなわち、送出しローラ４１は、タンパク質原料繊維３６を所定の送出し速度で連続的に送り出すように構成されている。巻取りローラ４２は、送出しローラ４１によって送り出されたタンパク質原料繊維３６を、送出しローラ４１の送出し速度よりも遅い巻取り速度で、連絡的に巻き取るように構成されている。このように構成された送出しローラ４１および巻取りローラ４２によれば、タンパク質原料繊維３６はオーバーフィードされることになり、送出しローラ４１と巻取りローラ４２の間で、タンパク質原料繊維３６の弛緩状態（緊張させない乃至は引張させない状態）が発生する。
【００６６】
続いて、図１および図２を参照して、本実施形態の紡糸ノズル１について詳細に説明する。紡糸ノズル１は、貯留タンク６０に接続された導入ラインＬ１に、接続されている。紡糸ノズル１には、導入ラインＬ１に設けられた圧送ポンプ７０によって、加圧されたドープ液が送り込まれる。導入ラインＬ１は、たとえば配管である。導入ラインＬ１の構成は、ドープ液を所定の圧力（圧送ポンプ７０の吐出圧力）で送液できる構成であれば何でもよく、特に限定されない。導入ラインＬ１は、所定の圧力に耐え得るチューブ等であってもよく、配管およびチューブの組み合わせ等であってもよい。
【００６７】
図２に示されるように、紡糸ノズル１は、たとえばニードル式の吐出ノズルである。紡糸ノズル１は、ドープ液が導入される導入部６と、導入部６に接続されて、ドープ液を吐出するように構成された管状の吐出部７とを備える。導入部６は、たとえば樹脂製であるが、金属製であってもよい。導入部６の基端部６ａに、上記導入ラインＬ１が接続される。吐出部７は、たとえば金属製のニードル等であり、ストレートな形状をなす。吐出部７の基端部７ａが、導入部６の先端部６ｂに取り付けられ、固定されている。吐出部７の基端部７ａが、導入部６の先端部６ｂに挿入されて、中心軸線Ｘ方向の所定の長さだけ埋没していてもよい。紡糸ノズル１では、たとえば円筒状の導入部６と、吐出部７とは、共通の中心軸線Ｘを有する。導入部６の内部には、ドープ液が導入される空間である導入流路６ｅが形成されている。導入流路６ｅの形状および大きさは、紡糸ノズル１に求められる性能に応じて、適宜に設定される。吐出部７は、内部に、基端部７ａから先端部７ｂまでを貫通する吐出流路７ｅを有している。このような構成を有する紡糸ノズル１では、吐出部７の吐出流路７ｅは、導入部６の導入流路６ｅに連通している。吐出部７の先端部７ｂが、紡糸ノズル１の吐出口を含む。
【００６８】
紡糸ノズル１は、高強度のタンパク質繊維を製造するため、従来の紡糸ノズルに比して特殊な構造を持っている。紡糸ノズル１では、吐出部７の内径Ｄ（吐出流路７ｅの直径）に対する吐出部７（吐出流路７ｅ）の長さＬの比（Ｌ／Ｄ）が、３０超である。吐出部７の内径は、たとえば、０．１ｍｍ以上であってもよく、０．２ｍｍ以上であってもよく、０．３ｍｍ以上であってもよく、０．４ｍｍ以上であってもよく、０．５ｍｍ以上であってもよい。吐出部７の内径は、１ｍｍ以上２ｍｍ未満であってもよい。吐出部７の長さＬは、たとえば、３ｍｍ以上であってもよく、６ｍｍ以上であってもよく、９ｍｍ以上であってもよく、１２ｍｍ以上であってもよい。吐出部７の長さＬは、２５ｍｍ以上であってもよく、３０ｍｍ以上であってもよい。吐出部７の長さＬは、５０ｍｍ未満であってもよく、６０ｍｍ未満であってもよい。
【００６９】
紡糸ノズル１において、上記した比（Ｌ／Ｄ）が、１００以下であってもよく、２００以下であってもよく、３００以下であってもよく、３７０以下であってもよい。あるいは、上記した比（Ｌ／Ｄ）が、３００以上であってもよく、４００以上であってもよい。より詳細には、上記した比（Ｌ／Ｄ）が、３７５以上であってもよい。
【００７０】
紡糸装置２５の圧送ポンプ７０は、たとえば、ドープ液を加圧してドープ液の体積を減少させた状態で、言い換えればドープ液を圧縮した状態（圧縮状態）で、紡糸ノズル１にドープ液を導入するように構成されている。圧送ポンプ７０は、その圧縮状態でのドープ液の紡糸ノズル１への導入を実現させる圧送手段である。圧縮状態におけるドープ液の圧力は、５ＭＰａ以上であってもよく、１０ＭＰａ以上であってもよく、２０ＭＰａ以上であってもよく、３０ＭＰａ以上であってもよく、４０ＭＰａ以上であってもよく、５０ＭＰａ以上であってもよい。圧縮状態におけるドープ液の圧力は、２０ＭＰａ未満であってもよく、３０ＭＰａ未満であってもよく、４０ＭＰａ未満であってもよく、５０ＭＰａ未満であってもよく、６０ＭＰａ未満であってもよく、７０ＭＰａ未満であってもよい。
【００７１】
圧送ポンプ７０および導入ラインＬ１は、圧送ポンプ７０の前後において、ドープ液の体積が０．５％以上減少するように構成されてもよく、１％以上減少するように構成されてもよく、３％以上減少するように構成されてもよく、５％以上減少するように構成されてもよい。
【００７２】
上記したドープ液の加圧および送込みを可能とする装置として、圧送ポンプ７０として、たとえば、シリンジポンプまたは窒素ポンプが用いられてもよい。シリンジポンプまたは窒素ポンプが用いられた場合、上記したドープ液の体積の減少（圧縮）が可能となる。圧送ポンプ７０として、一軸ねじポンプ（一例として、モーノポンプ（登録商標））が用いられてもよい。
【００７３】
紡糸装置２５を用いたタンパク質原料繊維３６の製造（製造装置１０を用いたタンパク質繊維５０の製造）では、貯留タンク６０に貯留されたドープ液が、圧送ポンプ７０によって加圧されて、紡糸ノズル１に送り込まれる。すなわち、タンパク質繊維５０の製造方法は、ドープ液を加圧してドープ液の体積を減少させた圧縮状態で、紡糸ノズル１の導入部６内にドープ液を導入する加圧導入工程を含む。そして、紡糸ノズル１の吐出部７から、ドープ液を吐出させて凝固浴槽２０においてタンパク質を凝固させる。
【００７４】
本実施形態の紡糸ノズル１、圧送ポンプ７０および紡糸ノズル１を備える製造装置１０、および、製造装置１０を用いたタンパク質繊維５０の製造方法によれば、より強度の高いタンパク質繊維を製造することができる。
【００７５】
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限られない。たとえば、本発明の紡糸ノズルは、乾湿式紡糸装置の他、湿式紡糸装置や乾式紡糸装置に適用されてもよい。その他、本発明の紡糸ノズルは、溶融紡糸装置等、各種の公知の紡糸装置に適用されてもよい。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７７】
＜（１）クモ糸タンパク質（クモ糸フィブロイン：ＰＲＴ７９９）の製造＞
（クモ糸タンパク質をコードする遺伝子の合成、及び発現ベクターの構築）
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ７９９」ともいう。）を設計した。
【００７８】
配列番号９で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列を有し、さらにＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されている。
【００７９】
次に、ＰＲＴ７９９をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
【００８０】
ＰＲＴ７９９をコードする核酸を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表１）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。
【００８１】
【表１】
2020056120.tif 000003
【００８２】
当該シード培養液を５００ｍｌの生産培地（下記表２）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。
【００８３】
【表２】
2020056120.tif 000004
【００８４】
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、ＰＲＴ７９９を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存したＰＲＴ７９９に相当するサイズのバンドの出現により、ＰＲＴ７９９の発現を確認した。
【００８５】
（ＰＲＴ７９９の精製）
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ  グアニジン緩衝液（８Ｍ  グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ  リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質（ＰＲＴ７９９）を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。
【００８６】
得られた凍結乾燥粉末におけるＰＲＴ７９９の精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｌｔｄ．）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、ＰＲＴ７９９の精製度は約８５％であった。
【００８７】
（ドープ液の調製）
ギ酸に、上述のクモ糸フィブロイン（ＰＲＴ７９９）を濃度２４質量％となるよう添加した後、室温環境下にて、シェーカーを使用して溶解させた。その後、ゴミと泡を取り除き、ドープ液とした。
【００８８】
（紡糸）
上記のようにして得られたドープ液と図１に示される紡糸装置２５および乾燥装置を用いて公知の乾湿式紡糸を行い、タンパク質繊維を得た。市販品の紡糸ノズルを用いた。なお、２つの凝固浴槽２０を設けた。第１凝固浴槽には、５℃のメタノールを用いた。第２凝固浴槽には、室温のメタノールを用いた。洗浄装置３には、水を用いた。洗浄浴槽内において、表３に示す倍率で延伸を行った。タンパク質繊維の乾燥は、６０℃のホットローラを用いて行った。各実施例における、圧送ポンプ７０の型式、延伸倍率、ノズル長（Ｌ）、ノズル径（Ｄ）、比（Ｌ／Ｄ）を表３に示す。また、各実施例において得られたタンパク質繊維の応力を、併せて表３に示す。各比較例における上記条件および結果を表４に示す。
【００８９】
【表３】
2020056120.tif 000005
【００９０】
【表４】
2020056120.tif 000006
【００９１】
表３および表４に示されるように、比（Ｌ／Ｄ）を大きくした実施例では、比（Ｌ／Ｄ）を小さくした比較例よりも、応力が向上した。実施例８および実施例１１と、実施例１とを比較すると、実施例１が、比（Ｌ／Ｄ）が比較的小さかったにもかかわらず、高応力が実現された。実施例７〜１１と実施例４〜６とを比較すると、特に比（Ｌ／Ｄ）が大きい場合において窒素ポンプを使用する方が、ギヤポンプや一軸ねじポンプを使用する場合よりも、高応力が実現された。また、ドープ液を加圧して体積を減少させ得るポンプを使用すると、ドープ液の体積減少により、ドープ液中のタンパク質における分子間距離が減少し、それによって分子配向が促進されることが推察される。
【符号の説明】
【００９２】
１…紡糸ノズル、６…導入部、７…吐出部、７ｅ…吐出流路、１０…製造装置、２５…紡糸装置、５０…タンパク質繊維、７０…圧送ポンプ（圧送手段）、Ｌ…（吐出部の）長さ。
【図１】
2020056120.tif 000007
【図２】
2020056120.tif 000008
【配列表】
2020056120000001.app