(57)【要約】      （修正有）【課題】表面増強蛍光法を用いた検出対象物の検出感度の向上を実現できる計測装置等を提供する。【解決手段】計測装置は、検出対象物（計測対象分子１）と特異的に結合する第１物質であって蛍光体４が固定された第１物質（蛍光標識抗体５）及び検出対象物と特異的に結合する第２物質であって金属ナノ微粒子２が固定された第２物質（金属ナノ微粒子標識抗体３）と、検出対象物とを結合させた複合体を含む試料を収容する試料収容部と、試料収容部に収容された複合体に、蛍光体４が蛍光を生じる波長を有する励起光を照射する光源と、蛍光体４が生じた蛍光であって、励起光の照射により金属ナノ微粒子が発生する局在化表面プラズモン共鳴によって増強された蛍光を検出する検出器と、を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象物と特異的に結合する第１物質であって蛍光体が固定された第１物質及び前記検出対象物と特異的に結合する第２物質であって金属微粒子が固定された第２物質と、前記検出対象物とを結合させた複合体を含む試料を収容する試料収容部と、
前記試料収容部に収容された前記複合体に、前記蛍光体が蛍光を発生する波長を有する励起光を照射する光源と、
前記蛍光体が発生する蛍光であって、前記励起光の照射により前記金属微粒子が発生する局在化表面プラズモン共鳴によって増強された蛍光を検出する検出器と、を備える、
計測装置。
【請求項２】
前記蛍光体は蛍光微粒子内に含まれ、
前記蛍光微粒子は、内部に磁性粒子を含有し、
前記計測装置はさらに、前記複合体を移動させる磁場を印加する磁場印加部を備え、
前記検出器は、前記磁場により前記複合体を移動させた際に前記増強された蛍光の位置変化を検出する、
請求項１に記載の計測装置。
【請求項３】
前記試料収容部は、さらに、前記励起光の照射により近接場を形成可能な基板を備え、
前記蛍光は、前記局在化表面プラズモン共鳴に加え、前記近接場によってさらに増強される、
請求項１、または２に記載の計測装置。
【請求項４】
前記試料収容部は、前記複合体を含む試料が通流する流路を備え、
前記光源は、前記流路内の前記複合体に前記励起光を照射する、
請求項１に記載の計測装置。
【請求項５】
検出対象物と特異的に結合する第１物質であって蛍光体が固定された第１物質及び前記検出対象物と特異的に結合する第２物質であって金属微粒子が固定された第２物質と、前記検出対象物とを結合することにより複合体を形成し、
前記複合体に、前記蛍光体が蛍光を発生する波長を有する励起光を照射し、
前記蛍光体が発生する蛍光であって、前記励起光の照射により前記金属微粒子が発生する局在化表面プラズモン共鳴によって増強された蛍光を検出する、
計測方法。
【請求項６】
前記蛍光体は、磁性粒子を含有する蛍光微粒子に含まれ、
前記計測方法はさらに、前記複合体を移動させる磁場を印加し、
前記蛍光の検出では、前記磁場により前記複合体を移動させた際の前記増強された蛍光の位置変化を検出する、
請求項５に記載の計測方法。
【請求項７】
前記励起光の照射では、前記複合体を含む試料が通流する流路内の前記複合体に前記励起光を照射する、
請求項５に記載の計測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、液体中に存在する計測対象分子の濃度または濃度域を光学的に計測する計測装置及び計測方法に関する。特に、金属ナノ微粒子の局在化表面プラズモン共鳴の作用によって蛍光を増強する表面増強蛍光法（Surface  Enhanced  Fluorescence  Spectroscopy）を利用した濃度計測方法及び濃度域計測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、病原体による感染症の拡大や新規病原体の出現等の問題から、これらの病原体を検出できる装置の開発が急がれている。検出対象物（言い換えると計測対象分子）としては、病原性タンパク質等の分子、ウイルス（外殻タンパク質等）、細菌（多糖等）などが知られており、これらの検出対象物に対する、表面増強蛍光法を利用した高感度なセンサも開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
特許文献１では、金属微粒子と蛍光体とが一体化された検出抗体が用いられる。これにより、蛍光体から発せられた蛍光は金属微粒子によるプラズモン共鳴で増強されるため、微量の検出対象物であっても増強蛍光によって検出することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２１６０４６号公報
【特許文献２】特開昭６２−３８３６３号公報
【特許文献３】特開２００１−１３３４５５号公報
【特許文献４】特開２０１０−１９７６５号公報
【特許文献５】国際公開第２０１７−１８７７４４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Michael E. Jolley et al. Clinical Chemistry, vol.27, No7(1981)
【非特許文献２】Kathryn L. Kellar et al. Experimental Hematology 30 1227-1237(2002)
【非特許文献３】AimPlex_Multiplex_Immunoassay_User_Manual Rev 1.3.24
【非特許文献４】Yasuura, M. and Fujimaki, M. Sci. Rep. 6, 39241; doi: 10.1038/srep39241 (2016).
【非特許文献５】Anger, P.; Bharadwaj, P.; Novotny, L. PhysRevLett.96.113002 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のセンサにおいては、検出抗体が検出対象物に結合していない遊離状態にあってもプラズモン共鳴によって増強された蛍光を発してしまう。つまり、背景光が上昇するため、検出の感度が低下してしまう。遊離状態の検出抗体を除去する方法も考えられ得るが、操作が複雑になり、検出に要する時間も増加する。
【０００７】
そこで本開示は、表面増強蛍光法を用いた検出対象物の検出感度の向上を実現できる計測装置等を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本開示に係る計測装置の一態様においては、検出対象物と特異的に結合する第１物質であって蛍光体が固定された第１物質及び前記検出対象物と特異的に結合する第２物質であって金属微粒子が固定された第２物質と、前記検出対象物とを結合させた複合体を含む試料を収容する試料収容部と、前記試料収容部に収容された前記複合体に、前記蛍光体が蛍光を発生する波長を有する励起光を照射する光源と、前記蛍光体が発生する蛍光であって、前記励起光の照射により前記金属微粒子が発生する局在化表面プラズモン共鳴によって増強された蛍光を検出する検出器と、を備える。
【０００９】
なお、これらの包括的または具体的な態様は、システム、方法、集積回路、コンピュータープログラムまたはコンピューター読み取り可能なＣＤ−ＲＯＭなどの記録媒体で実現されてもよく、システム、方法、集積回路、コンピュータープログラム及び記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。
【発明の効果】
【００１０】
本開示に係る検出装置及び検出方法により表面増強蛍光法を用いた検出対象物の検出感度の向上を実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本開示に係る原理を説明する第１図
【図２】本開示に係る原理を説明する第２図
【図３】本開示に係る計測方法を実施するための計測装置の第１構成図
【図４】本開示に係る計測方法を実施するための計測装置で得られる出力信号を表す第１グラフ
【図５】本開示に係る計測方法を実施するための計測装置の操作を示す第１フローチャート
【図６】本開示に係る原理を説明する第３図
【図７】本開示に係る原理を説明する第４図
【図８】本開示に係る計測方法を実施するための計測装置の第２構成図
【図９】本開示に係る計測方法を実施するための計測装置で得られる出力信号を表す第２グラフ
【図１０】本開示に係る計測方法を実施するための計測装置の操作を示す第２フローチャート
【図１１】本開示に係る原理を説明する第５図
【図１２】本開示に係る計測方法を実施するための計測装置の第３構成図
【図１３】本開示に係る計測方法を実施するための計測装置で得られる２次元画像
【図１４】本開示に係る計測方法を実施するための計測装置の操作を示す第３フローチャート
【図１５】本開示に係る計測方法を実施するための計測装置の第４構成図
【図１６】本開示に係る原理を説明する第６図
【図１７】本開示に係る金属ナノ微粒子付近の電場強度の波長依存性を示す第１図
【図１８】本開示に係る電場強度をシミュレーションする際の配置図
【図１９】本開示に係る蛍光体の消光スペクトルと蛍光スペクトル
【図２０】本開示に係る金属ナノ微粒子付近の電場強度の距離依存性を示す第１図
【図２１】本開示に係る金属ナノ微粒子付近の電場強度の距離依存性を示す第２図
【図２２】本開示に係る原理を説明する第７図
【図２３】本開示に係る金属ナノ微粒子付近の電場強度の波長依存性を示す第２図
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（本開示の基礎となった知見）
液体中に存在するタンパク質等の分子、ウイルス、細菌を特定して濃度を計測する技術としては、蛍光を利用した方法が広く用いられている。蛍光法とは、計測対象分子と、蛍光分子で標識した抗体とを抗原抗体反応させ、蛍光分子を励起できる光を照射し発生する蛍光を検出して、計測対象分子の濃度を計測する方法である。
【００１３】
［蛍光偏光免疫測定法］
例えば、蛍光偏光免疫測定法（Fluorescence  Polarization  Immunoassay）がある。この方法では、蛍光分子で標識された抗体（蛍光標識抗体）を含む溶液に、計測対象分子である抗原を含む被検溶液を混合させて、抗原抗体反応によって抗原抗体複合体を形成させ、抗原抗体複合体の形成前後の蛍光の偏光度の差より計測対象分子の濃度を計測する。これは、蛍光標識抗体が単体で存在している時は小さいので活発に回転運動しているが、抗原抗体複合体になると大きくなり、回転運動が抑制され、偏光度が増加する現象を利用している（特許文献２、非特許文献１参照）。
【００１４】
［免疫クロマトグラフ法］
他には、免疫クロマトグラフ法がある。これは、ニトロセルロース膜などを基材とした平板状の基板を用いた技術である。基板には計測対象分子と結合する抗体が固定化されている。この基板に、計測対象分子と蛍光標識された抗体（蛍光標識抗体）を含むサンプル溶液を滴下すると、蛍光標識抗体と結合した計測対象分子が固定化された抗体（固定化抗体）に捕捉される。ここに、光を照射すると、当該計測対象分子の濃度に応じた強度の蛍光が発生する。この蛍光を検出することで計測対象分子の濃度を計測することができる（特許文献３参照）。
【００１５】
［免疫クロマトグラフ法×表面増強蛍光］
免疫クロマトグラフ法を高感度化するために、表面増強蛍光を利用する技術もある。これは溶液を流す流路内に金属ナノ構造を形成した領域を設け、この金属ナノ構造上に計測対象分子と結合する抗体を固定化する。この流路に、計測対象分子と蛍光標識された抗体（蛍光標識抗体）を含むサンプル溶液を滴下すると、蛍光標識抗体と結合した計測対象分子が固定化された抗体（固定化抗体）に捕捉される。ここに、金属ナノ構造が局在化表面プラズモン共鳴を起こす波長の光を照射すると、蛍光標識抗体で発生した蛍光が増強され表面増強蛍光となる。この増強の程度を増強度と呼ぶ。表面増強蛍光の強度も、当該計測対象分子の濃度に応じて増加する。増強度は１〜３桁程度なので、表面増強蛍光は、通常の蛍光よりも１〜３桁程度高い強度を示す。従って、通常の蛍光としては、計測できないような低濃度の計測対象分子も計測できる（特許文献４参照）。
【００１６】
［エバネセント波を利用］
また、透明な基板の裏側から照射光を照射する裏面照射系を利用した方法がある。この方法は、基板の裏面から照射光を照射してエバネセント波を誘起して、基板の表面にある固定化抗体に補足された蛍光標識抗体にエバネセント波を照射して蛍光を発生させている。この方法の場合、エバネセント波は、抗体を固定化した基板表面から数百ｎｍの領域のみを照射するので、表面から照射する場合と比べて、照射される計測対象分子と結合していない蛍光標識抗体（Free成分）の量を低減することができる。計測対象分子と結合していない蛍光標識抗体が放射する蛍光は、計測対象分子の濃度を反映しない、即ち単なるノイズ成分であり、計測対象分子と結合している蛍光標識抗体（Bind成分）が放射する蛍光の計測を妨害して計測精度を低下させる。従って、エバネセント波を利用して照射領域を制限することは有効である（特許文献１参照）。
【００１７】
［フローサイトメトリー］
被検溶液を透明な細管（フローセル）中に流し、１個毎に流れている細胞等の粒子にレーザ光などを照射して、発生した散乱光、蛍光を検出して、粒子を特定して計数するフローサイトメトリーがある。細胞を検出する際は、細胞の表面のタンパク質と特異的に結合する抗体を蛍光体で標識した蛍光標識抗体を用いる。
【００１８】
また、計測対象分子がタンパク質の場合は次の様にする。計測対象分子を挟んで特異結合（サンドイッチ結合）して抗原抗体複合体を形成する２種類の抗体を準備する。一方の抗体は捕捉用ビーズに固定化し、もう一方の抗体は蛍光体で標識して蛍光標識抗体とする。これらを、計測対象分子と抗原抗体反応させて、捕捉用ビーズ−計測対象分子−蛍光標識抗体の複合体を形成させる。そして、捕捉用ビーズ−計測対象分子−蛍光標識抗体の複合体を含む溶液から未結合の蛍光標識抗体を取り除いた後に、フローセルに流し、捕捉用ビーズ−計測対象分子−蛍光標識抗体の複合体で発生した蛍光を検出して、計測対象分子を特定して計数する（非特許文献２、３参照）。
【００１９】
［EFA-NI（External  force-assisted  near-field  illumination）バイオセンサ］
更に、ウイルス等の粒子や、タンパク質等の計測対象分子を１個単位で計数できる方法もある。外力支援型近接場照明（EFA-NI）バイオセンサと呼ばれるこの方法では、まず粒子や計測対象分子を挟んで特異結合（サンドイッチ結合）して抗原抗体複合体を形成する２種類の抗体を準備する。一方の抗体は強磁性を有する磁性粒子に固定化し、もう一方の抗体は蛍光体または蛍光微粒子で標識して蛍光標識抗体とする。これらを、粒子や計測対象分子を含む被検溶液と混合して混合溶液を調製する。この混合溶液中で抗原抗体反応が進行して、抗原抗体複合体が形成される。裏面から光を照射すると近接場を発生する検出板の表面上に混合溶液を保持する。検出板の垂直方向に磁場勾配を印加して検出板の表面付近に混合溶液中の抗原抗体複合体を誘引する。ここで、抗原抗体複合体を近接場で照射し、表面側から混合溶液の２次元画像を取得すると、抗原抗体複合体は蛍光を放射する光点として２次元画像上に現れる。そして、検出板の表面と平行に磁場勾配を発生させると、２次元画像上の光点は磁場勾配方向に動く。この動く光点（動光点）を計数することで粒子や計測対象分子の数を１個単位で計測できる（特許文献５、非特許文献４参照）。
【００２０】
しかしながら、上述した蛍光偏光免疫測定法では、偏光度の違いを計測するために、偏光子の回転機構が必要になり装置が複雑になる。また偏光度の違いは抗原抗体複合体の形成前後の大きさの違いを反映しているので、蛍光標識抗体と比べて小さい分子を計測する場合は、偏光度の違いが小さいので、計測精度が低下する。さらに、被検溶液中に散乱性の物質が存在すると、偏光解消により、偏光度の違いを検出できない等の課題がある。
【００２１】
免疫クロマトグラフ法や、これに表面増強蛍光、エバネセント波を利用した方法では、計測対象分子は、基板上の固定化抗体と蛍光標識抗体とで抗原抗体複合体を形成している。
【００２２】
そして、この基板へ励起光を照射して蛍光の強度を計測している。この基板には、計測対象分子とは結合していない蛍光標識抗体が非特異吸着している。更に、被検溶液の蛍光を放射する共存物質も非特異吸着しているので、計測された蛍光の強度には、計測対象分子の濃度を反映している成分だけでなく、上記の非特異吸着の成分も含んでいる。従って、この非特異成分が精度を制限するという課題がある。
【００２３】
また、従来のフローサイトメトリーでは、未結合の蛍光標識抗体を除去する工程が必要になり、計測時間がかかる。
【００２４】
さらに、２次元画像の抗原抗体複合体からなる動光点を計数する方法は、次の理由から定量範囲（ダイナミックレンジ）に課題がある。抗原抗体複合体だけでなく未結合の蛍光標識抗体も近接場に照射される。このため、未結合の蛍光標識抗体も蛍光を放射して、背景画像の輝度（バックグラウンド）を上昇させている。バックグラウンドが上昇すると光点として認識が困難になるので、未結合の蛍光標識抗体の数を抑制する必要がある。このためには、被検溶液と混ぜる蛍光標識抗体の数を制限しなければならない。
【００２５】
定量可能な計測対象分子の数は蛍光標識抗体の数よりも小さくなるので、被検溶液と混ぜる蛍光標識抗体の数を抑制することで、定量範囲が制限される。上記の様に、光点として認識可能にするためには、蛍光標識抗体の数を抑制せざるを得ず、結果として計測対象分子の定量範囲が制限される。
【００２６】
（本開示の概要）
本開示における計測装置は、検出対象物と特異的に結合する第１物質であって蛍光体が固定された第１物質及び検出対象物と特異的に結合する第２物質であって金属微粒子が固定された第２物質と、検出対象物とを結合させた複合体を含む試料を収容する試料収容部と、試料収容部に収容された複合体に、蛍光体が蛍光を発生する波長を有する励起光を照射する光源と、蛍光体が発生する蛍光であって、励起光の照射により金属微粒子が発生する局在化表面プラズモン共鳴によって増強された蛍光を検出する検出器と、を備える。
【００２７】
これにより、検出対象物と複合体を形成した第１物質に固定された蛍光体から放射される蛍光は、同様に検出対象物と結合し、空間的に接近した第２物質に固定された金属微粒子によって増強され、輝度の高い蛍光として検出される。一方で複合体を形成していない第１物質（即ち遊離状態の第１物質）は第２物質が空間的に接近していないため、第１物質に固定された蛍光体が放射する蛍光は増強されず、複合体における増強された蛍光に比べて無視できる輝度である。よって遊離状態の第１物質を除去する必要がなく、高速かつ簡便な表面増強蛍光法を用いた測定により、検出対象物の検出感度の向上を実現できる。
【００２８】
また、本開示における計測装置は偏光を利用しなくてもよいため装置構成が簡単であり、また複合体の形成前後の分子の大きさの違いによる影響を低減することができ、計測対象分子の適用範囲が広い。
【００２９】
また例えば、蛍光体は蛍光微粒子に含まれ、蛍光微粒子は、内部に磁性粒子を含有し、計測装置はさらに、複合体を移動させる磁場を印加する磁場印加部を備え、検出器は、磁場により複合体を移動させた際に増強された蛍光の位置変化を検出する構成としてもよい。
【００３０】
これにより、第１物質及び複合体をそれぞれの光点の移動として計測でき夾雑物の影響を低減できる。また第１物質及び複合体を輝度の違いにより識別でき、計測対象分子のみを計数することができる。従って、遊離状態の第１物質が多く存在するような計測条件でも計測できるため、第１物質を増加させることが可能になる。つまり第１物質を高濃度に含む計測条件によって、定量可能な検出対象物の濃度範囲を拡大できる。
【００３１】
また、複合体が放射する蛍光は増強されているので、高輝度な光点が得られ、より鮮明な２次元画像が得られ、画像認識により動く光点を自動計数する際に有利である。さらに、複合体が放射する蛍光は増強されているので、より小粒径の蛍光微粒子が固定された第１物質も利用でき、複合体形成における反応速度を向上させることが可能になる。即ち計測を高速化できる。
【００３２】
また例えば、試料収容部は、さらに、励起光によって近接場を形成可能な基板を備え、蛍光は、局在化表面プラズモン共鳴に加え、近接場によってさらに増強される構成であってもよい。
【００３３】
これにより、励起される蛍光体を近接場の照射される範囲に存在するもののみに限定することができ、当該範囲内に位置する成分のみが蛍光を発することができる。従って近接場の照射されない領域に位置する成分による計測への影響を排除することができる。
【００３４】
また例えば、試料収容部は、複合体を含む試料が通流する流路を備え、光源は、流路内の複合体に励起光を照射する構成としてもよい。
【００３５】
これにより、流路を通流する整列された粒子に励起光を照射でき、未結合の第１物質及び第２物質と複合体とを出力信号の強度で識別できるので、未結合の粒子と複合体とを分離する分離工程（ＢＦ分離）が不要である。また複合体が放射する蛍光は増強されているので、高SNの出力信号が得られ、高速での計数が可能になる。つまり、混合溶液の流速を上げても正確に計数できるので、計測時間を短縮できる。
【００３６】
また、本開示における計測方法は、検出対象物と特異的に結合する第１物質であって蛍光体が固定された第１物質及び検出対象物と特異的に結合する第２物質であって金属微粒子が固定された第２物質と、検出対象物とを結合することにより複合体を形成し、複合体に、蛍光体が蛍光を発生する波長を有する励起光を照射し、蛍光体が発生する蛍光であって、励起光の照射により金属微粒子が発生する局在化表面プラズモン共鳴によって増強された蛍光を検出する。
【００３７】
これにより、検出対象物と複合体を形成した第１物質に固定された蛍光体から放射される蛍光は、同様に検出対象物と結合し、空間的に接近した第２物質に固定された金属微粒子によって増強され、輝度の高い蛍光として検出される。一方で複合体を形成していない第１物質（即ち遊離状態の第１物質）は第２物質が空間的に接近していないため、第１物質に固定された蛍光体が放射する蛍光は増強されず、複合体における増強された蛍光に比べて無視できる輝度である。よって遊離状態の第１物質を除去する必要がなく、高速かつ簡便な表面増強蛍光法を用いた測定により、検出対象物の検出感度の向上を実現できる。
【００３８】
また、本開示における計測方法は偏光を利用しないため計測が簡単であり、また複合体の形成前後の分子の大きさの違いには影響を受けず、計測対象分子の適用範囲が広い。
【００３９】
また例えば、蛍光体は、磁性粒子を含有する蛍光微粒子に含まれ、計測方法はさらに、複合体を移動させる磁場を印加し、蛍光の検出では、磁場により複合体を移動させた際の増強された蛍光の位置変化を検出してもよい。
【００４０】
これにより、第１物質及び複合体をそれぞれの光点の移動として計測でき夾雑物の影響を低減できる。また第１物質及び複合体を輝度の違いにより識別でき、計測対象分子のみを計数することができる。従って、遊離状態の第１物質が多く存在するような計測条件も実現できるため、第１物質を増加させることが可能になる。つまり第１物質を高濃度に含む計測条件によって、定量可能な検出対象物の濃度範囲を拡大できる。
【００４１】
また、複合体が放射する蛍光は増強されているので、高輝度な光点が得られ、より鮮明な２次元画像が有られ、画像認識により動く光点を自動計数する際に有利である。さらに、複合体が放射する蛍光は増強されているので、より小粒径の蛍光微粒子が固定された第１物質も利用でき、複合体形成における反応速度を向上させることが可能になる。即ち計測を高速化できる。
【００４２】
また例えば、励起光の照射では、複合体を含む試料が通流する流路内の複合体に励起光を照射してもよい。
【００４３】
これにより、流路を通流する整列された粒子に励起光を照射でき、未結合の第１物質及び第２物質と複合体とを出力信号の強度で識別できるので、未結合の粒子と複合体とを分離する分離工程（ＢＦ分離）が不要である。また複合体が放射する蛍光は増強されているので、高SNの出力信号が得られ、高速での計数が可能になる。つまり、混合溶液の流速を上げても正確に計数できるので、計測時間を短縮できる。
【００４４】
（実施の形態）
以下、本開示の実施の形態に関して図１〜１５を用いて説明する。
【００４５】
［均一系の濃度定量に応用］
図１は、本実施の形態における原理を示す原理図で、タンパク質等の計測対象分子１が示されている。また、金属ナノ微粒子２（つまり金属微粒子）は金、銀等の金属からなり、金属ナノ微粒子標識抗体３は計測対象分子１と特異的に結合する抗体（つまり第２物質）で金属ナノ微粒子２が固定されている。蛍光体４は、有機分子、量子ドット等からなり、直径は１０ｎｍ以下である。蛍光標識抗体５は計測対象分子１と特異的に結合する抗体（つまり第１物質）で、蛍光体４で標識されている。
【００４６】
またここでは、上記の第１物質と第２物質とは異なっている。第１物質と第２物質とが異なるとは、蛍光体４が固定された第１物質と、金属微粒子が固定された第２物質とに共有化される箇所がなく、それぞれが別個の物質として存在することを意味する。一方で、第１物質と第２物質とは、分子に限定はなく、第１物質と第２物質とは計測対象分子１と特異的に結合する性質を有した異種分子であってもよく、同種分子であってもよい。
【００４７】
また、蛍光標識抗体５は、複数の蛍光体４で標識されている場合もある。また、蛍光標識抗体５と金属ナノ微粒子標識抗体３とは、計測対象分子１の異なる部位と結合する。従って、図１に示すように、２つの抗体が計測対象分子１を挟んで結合（サンドイッチ結合）して抗原抗体複合体６を形成する。
【００４８】
金属ナノ微粒子２は直径が数ｎｍ〜数百ｎｍ程度で、特定の波長の光が照射されると局在化表面プラズモン共鳴が発生する。この局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長域と、蛍光体４を励起する波長域または／及び蛍光体４が放射する蛍光の波長域が重なっていると、金属ナノ微粒子２の近傍にある蛍光体４が放射する蛍光の強度は、局在化表面プラズモン共鳴の作用により増強される。この増強された蛍光を表面増強蛍光と称する。
【００４９】
本開示は、この増強現象を利用しており、この概要を図２〜４に示す。図２は、計測対象分子１、蛍光標識抗体５、金属ナノ微粒子標識抗体３が存在する混合溶液（即ち試料）中を示している。この混合溶液に、金属ナノ微粒子２で局在化表面プラズモン共鳴を発生させ、かつ蛍光体４を励起できる波長の励起光７を照射すると、抗原抗体複合体６を形成している蛍光標識抗体５の蛍光体４が、金属ナノ微粒子２で発生した局在化表面プラズモン共鳴の作用で増強された表面増強蛍光８を放射する。一方、抗原抗体複合体６を形成していない遊離の蛍光標識抗体５の蛍光体４は、金属ナノ微粒子２から離れているので、局在化表面プラズモン共鳴の作用を受けることができず増強されず、通常の蛍光９を放射する。
【００５０】
図３は、計測対象分子１の濃度を計測する場合の装置の例である。光学セル１０は計測対象分子１、蛍光標識抗体５、金属ナノ微粒子標識抗体３を含む混合溶液１１を保持する試料収容部の一例である。光学セル１０は、すくなくとも２面が透明になっており、混合溶液１１に励起光７を照射でき、混合溶液１１中で発生した光を外部へ取り出せる。光源１２は励起光７を発生させる。発生光１３は混合溶液１１中で発生した光の一部でレンズ１４により略平行光にされ、ロングパスフィルター１６に入射する。ロングパスフィルター１６は、励起光７の波長は透過させないが、蛍光体４より放射された蛍光の波長は、透過させる。
【００５１】
従って、発生光１３の内、散乱光はロングパスフィルター１６によって遮断されるが、蛍光９及び表面増強蛍光８は透過してレンズ１５に入射する。そして、レンズ１５により集光されて光検出器１７に入射する。光検出器１７は、混合溶液１１中で発生した蛍光９及び表面増強蛍光８の強度に相当する信号を出力する検出器の一例である。コンピューター１８は、光検出器１７の出力信号である蛍光９及び表面増強蛍光８の強度を解析して、計測対象分子１の濃度を算出する。さらに、コンピューター１８は光源１２の設定、制御機能を有している。
【００５２】
図４は、計測対象分子１の濃度が異なる被検溶液（言い換えると混合溶液１１）を計測する際の光検出器１７の出力信号の時間変化の様子を示す図である。光学セル１０に被検溶液を保持させ、ここに蛍光標識抗体５と金属ナノ微粒子標識抗体３を含む溶液を添加し、混合して混合溶液１１を調製する。図４で横軸は、添加混合した時点からの経過時間であり、縦軸は光検出器１７の出力信号である。経過時間が０の時は、未結合の蛍光標識抗体５（つまり、蛍光標識抗体５が備える蛍光体４）が放射する蛍光による出力信号を反映している。図４においては、破線は被検溶液中の計測対象分子１の濃度が濃度ゼロ、一点鎖線は低濃度、実線が高濃度の場合の光検出器１７の出力信号の変化を示す。
【００５３】
計測対象分子１が存在しない場合は、図１に示した抗原抗体複合体６が形成されないので、蛍光体４が放射する蛍光は増強されず破線の様に光検出器１７の出力信号は変化しない。
【００５４】
一方、計測対象分子１が存在すると、図１に示した抗原抗体複合体６が形成され、金属ナノ微粒子２の作用で蛍光体４が放射する蛍光が増強される。抗原抗体複合体６の形成は抗原抗体反応により時間の経過と供に進む、即ち抗原抗体複合体６の数は、時間の経過と供に増加する。そして、抗原抗体反応が平衡に到達した時点で飽和する。このような抗原抗体反応の進行に応じて、光検出器１７の出力信号が、一点鎖線と実線のように経過時間に対して変化する。
【００５５】
また、抗原抗体複合体６の数は計測対象分子１の数に依存するので、計測対象分子１の濃度が高い程、抗原抗体複合体６の数も増加して、光検出器１７の出力信号も高くなる。計測対象分子１の濃度の違いが、一点鎖線と実線の違いに相当する。従って、標準溶液として計測対象分子１の濃度が既知の溶液を準備し、これらの標準溶液を計測して計測対象分子１の濃度に対する出力信号の高さの検量線を事前に作成しておく。この検量線を用いて、被検溶液に対する光検出器１７の出力信号から計測対象分子１の濃度を算出することができる。
【００５６】
ここで、本装置の動作について一例として図５を用いて説明する。図５は本実施の形態に係る装置の動作を説明するためのフローチャートである。
【００５７】
例えば、あらかじめ調製された混合溶液１１は、光学セル１０に収容される（Ｓ１０１）。なお、混合溶液１１の調製は、計測対象分子１を含む溶液、蛍光標識抗体５を含む溶液、及び金属ナノ微粒子標識抗体３を含む溶液の順不同な混合により行われる。
【００５８】
光源１２は光学セル１０に収容された混合溶液１１に対し、励起光７を照射することで、混合溶液１１に含まれる抗原抗体複合体６に対して励起光７を照射する（Ｓ１０２）。なお励起光７の照射は混合溶液１１が収容されてから開始してもよく、収容される以前から連続的に照射してもよい。
【００５９】
装置は光検出器１７によりロングパスフィルター１６を通過した蛍光を検出し（Ｓ１０３）、蛍光強度に基づく信号を出力する。コンピューター１８は、実装されたプログラム等により、出力された、蛍光強度に基づく信号を解析し、計測対象分子１の定性または定量的な検出結果を出力する。
【００６０】
以上の様に本実施の形態では、表面増強蛍光法を用いた測定により、検出対象物の検出感度の向上を実現できる。さらに偏光子の回転機構が不要で構成が簡単である。また抗原抗体複合体６の形成前後の大きさの違いには影響をうけず、計測対象分子１の選択範囲が広い。さらに、被検溶液中に散乱性の物質が存在しても検量線を作成することで影響を低減できる。
【００６１】
［フローサイトメトリーに応用］
また、本実施の形態の第１別例としては図６、７に示すような蛍光微粒子１９を用いる例がある。蛍光微粒子１９は、有機蛍光分子、無機蛍光体、量子ドット等を組込んだポリスチレン、アクリル等の樹脂またはガラスからなる、直径が数十ｎｍから数百ｎｍの微粒子である。これらの蛍光微粒子１９は、樹脂やガラスに蛍光の失活防止剤を含ませることで光退色を低減できる、アミノ基、カルボキシル基をはじめ多様な表面修飾ができる、水中での分散性を上げることができる等、蛍光体４単体では実現が難しい特性を付与できる。さらに、蛍光体４よりもサイズが大きいので、蛍光微粒子１９単体でも比較的容易に観測できる。
【００６２】
蛍光微粒子標識抗体２０は計測対象分子１と結合する抗体であり、蛍光微粒子１９が固定されている。図１の場合と同様に、蛍光微粒子標識抗体２０と金属ナノ微粒子標識抗体３とは、計測対象分子１の異なる部位と結合するので、図７に示すように、２つの抗体が計測対象分子１を挟んで結合（サンドイッチ結合）して抗原抗体複合体６ａを形成する。金属ナノ微粒子２で局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長域と、蛍光微粒子１９を励起する波長域または／及び蛍光微粒子１９が放射する蛍光の波長域が重なっていると、金属ナノ微粒子２の近傍にある蛍光微粒子１９が放射する蛍光の強度は、局在化表面プラズモン共鳴の作用により増強される。
【００６３】
この増強現象の概要を図７に示す。図７は、計測対象分子１、蛍光微粒子標識抗体２０、金属ナノ微粒子標識抗体３が存在する混合溶液中を示している。この混合溶液に、金属ナノ微粒子２で局在化表面プラズモン共鳴を発生させ、かつ蛍光微粒子１９を励起できる波長の励起光７を照射すると、抗原抗体複合体６ａを形成している蛍光微粒子標識抗体２０の蛍光微粒子１９が、金属ナノ微粒子２で発生した局在化表面プラズモン共鳴の作用で増強された表面増強蛍光８を放射する。一方、抗原抗体複合体６ａを形成していない遊離の蛍光微粒子標識抗体２０の蛍光微粒子１９は、金属ナノ微粒子２から離れているので、局在化表面プラズモン共鳴の作用を受けることができず増強されず、通常の蛍光９を放射する。
【００６４】
図８は、本開示を蛍光フローサイトメーターへ利用した例である。計測対象分子１、蛍光微粒子標識抗体２０、金属ナノ微粒子標識抗体３が存在する混合溶液２２がフローセル２１に注入される（つまり収容される）。なお、フローセル２１は流路を備える試料収容部の一例である。この際、混合溶液２２を包む鞘液（シース液）の流れ（言い換えるとシース流ＳＦ）が抗原抗体複合体６ａ、蛍光微粒子標識抗体２０、金属ナノ微粒子標識抗体３等の微粒子を流体力学的に集中させるため、図８のように略一列に整列させる。
【００６５】
光源２３は、略一列に整列した抗原抗体複合体６ａ及び６ｂ、蛍光微粒子標識抗体２０、金属ナノ微粒子標識抗体３等が通過する位置で集光する励起光７を照射する。なお、抗原抗体複合体６ａ及び抗原抗体複合体６ｂは実質的に同一であるが、ここでは抗原抗体複合体６ｂは励起光７が照射されている時点の複合体を示している。上記の励起光７が集光している位置で発生した発生光２４は、レンズ２５で略平行光になり、ロングパスフィルター２６に入射する。ロングパスフィルター２６は、励起光７の波長は透過させないが、蛍光微粒子１９より放射された蛍光の波長は、透過させる。従って、発生光２４の内、散乱光はロングパスフィルター２６によって遮断されるが、蛍光９及び表面増強蛍光８は透過してレンズ２７に入射する。
【００６６】
そして、レンズ２７により集光されて光検出器２８に入射する。光検出器２８は、この励起光７が集光している位置で発生した蛍光９及び表面増強蛍光８の強度に相当する信号を出力する。コンピューター２９は、光検出器２８の出力信号を分析して、計測対象分子１の数を計数する。計数する場合の光検出器２８の出力信号を図９に示す。図９で、抗原抗体複合体６ａ及び６ｂ、蛍光微粒子標識抗体２０、金属ナノ微粒子標識抗体３が励起光７を横切った際の光検出器２８の出力信号をそれぞれ信号Ｓ６ａ及びＳ６ｂ並びに信号Ｓ２０及び信号Ｓ３により示す。
【００６７】
抗原抗体複合体６ａが、励起光７を横切った際は金属ナノ微粒子２の作用で増強された表面増強蛍光８が発生したので、蛍光微粒子標識抗体２０や金属ナノ微粒子標識抗体３が横切った際よりも出力信号が高い。なお、金属ナノ微粒子標識抗体３が横切る際は、蛍光は発生しないが、局在化表面プラズモン共鳴により強い散乱光が発生するので、ロングパスフィルター２６で遮断しきれない成分により、わずかながら信号が観測される。ここで、適切な閾値を設定する。例えば、図９において出力信号が５以上の際に、抗原抗体複合体６ａまたは６ｂが横切ったと判定すると、出力信号が５未満である蛍光微粒子標識抗体２０及び金属ナノ微粒子標識抗体３が除外され、計測対象分子１のみを計数することができる。
【００６８】
ここで、本装置の動作について一例として図１０を用いて説明する。図１０は本実施の形態の第１別例に係る装置の動作を説明するためのフローチャートである。
【００６９】
例えば、あらかじめ調製された混合溶液２２は、フローセル２１に収容される（Ｓ２０１）。なお、混合溶液２２の調製は、計測対象分子１を含む溶液、蛍光微粒子標識抗体２０を含む溶液、及び金属ナノ微粒子標識抗体３を含む溶液の順不同な混合により行われる。
【００７０】
装置は、フローセル２１に備えられた流路において混合溶液２２を通流させる（Ｓ２０２）。
【００７１】
続いて光源２３は、流路を通流する混合溶液２２に対し、励起光７を照射することで、混合溶液２２に含まれる抗原抗体複合体６ａ及び６ｂに対して励起光７を照射する（Ｓ２０３）。
【００７２】
装置は光検出器２８によりロングパスフィルター２６を通過した蛍光を検出し（Ｓ２０４）、蛍光強度に基づく信号を出力する。さらにコンピューター２９に実装されたプログラム等は、出力された、蛍光強度に基づく信号を解析し、計測対象分子１の定性または定量的な検出結果を出力する。
【００７３】
なお、励起光７の照射は連続的に行うため、混合溶液２２に含まれる抗原抗体複合体６ａ及び６ｂが流路を通過するたびに増強された蛍光が検出される。
【００７４】
上記の様に、抗原抗体複合体６ａ及び６ｂが横切った際の出力信号と、蛍光微粒子標識抗体２０や金属ナノ微粒子標識抗体３単体が横切った際の出力信号とを区別することができるので、計測対象分子１のみを計数することができる。抗原抗体複合体６ａ及び６ｂが放射する蛍光は増強されているので、高SNの出力信号が得られるので、通常より高速で計数することが可能になる。これにより、混合溶液２２の流速を上げても正確に計数できるので、より高速に混合溶液２２を計測できる。
【００７５】
さらに、未結合の蛍光微粒子標識抗体２０と抗原抗体複合体６ａまたは６ｂとを出力信号の強度で識別できるので、未結合の蛍光微粒子標識抗体２０を分離（ＢＦ分離）する工程が不要である。
【００７６】
［EFA-NIバイオセンサ（特許文献５、非特許文献４)に応用］
また、本実施の形態の第２別例を図１１、１２、１３に示す。図１１において、蛍光磁性微粒子３０は、蛍光微粒子１９と同様な蛍光微粒子の中にフェライト等の磁性体３１（磁性粒子）を保持したもので、蛍光を放射すると供に強磁性も有する。言い換えると、蛍光磁性微粒子３０は、その内部に磁性粒子を含有することによって強磁性を有した蛍光微粒子である。蛍光磁性微粒子標識抗体３２は計測対象分子１と特異的に結合する抗体で、蛍光磁性微粒子３０で標識されている。図６の場合と同様に、蛍光磁性微粒子標識抗体３２と金属ナノ微粒子標識抗体３とは、計測対象分子１の異なる部位と結合するので、図１１に示すように、２つの抗体が計測対象分子１を挟んで結合（サンドイッチ結合）して抗原抗体複合体６ｃを形成する。金属ナノ微粒子２で局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長域と、蛍光磁性微粒子３０を励起する波長域または／及び蛍光磁性微粒子３０が放射する蛍光の波長域が重なっていると、金属ナノ微粒子２の近傍にある蛍光磁性微粒子３０が放射する蛍光の強度は、局在化表面プラズモン共鳴の作用により増強される。本例は、本開示を特許文献５、または非特許文献４に応用した例であり、図１２を用いて説明する。
【００７７】
図１２は、装置の全体を示す図である。プリズム３４の表面上に検出板３５を配置する。検出板３５はつまり、プリズム３４と併せて、近接場を形成可能な基板となる。さらに、検出板３５の表面上に計測対象分子１、蛍光磁性微粒子標識抗体３２と金属ナノ微粒子標識抗体３を含む混合溶液３６を配置して、混合溶液３６の表面上にカバーガラス３７を配置する。即ち、混合溶液３６を検出板３５と透明なカバーガラス３７で挟んで保持する（つまり収容する）。したがって、検出板３５と、カバーガラス３７とによって形成される間隙の空間を、本装置における試料収容部とみなすことができる。
【００７８】
光源３８は、波長は光源１２、２３と同じで、検出板３５の裏面に光学的に貼り合せたプリズム３４を介して、混合溶液３６と検出板３５との界面における全反射条件で検出板３５の裏面側から励起光３９を照射するように配置する。検出板３５は、裏面側から励起光３９が照射されると、混合溶液３６側の表面付近に、エバネセント場や増強電場等の近接場を形成する。近接場は、表面近傍のみに形成され、検出板３５の表面から遠ざかるにつれて急激に減衰する性質を有するので、検出板３５の表面近傍の混合溶液３６にのみ照射される。
【００７９】
なお、検出板３５の構成としては、特に制限はなく目的に応じて適宜選択することができ、単層で構成されてもよく、電場増強を目的とした積層体で構成されてもよい。
【００８０】
２次元画像検出部４０は、検出板３５の表面側に配され、励起光３９の照射により混合溶液３６中の検出板３５の表面近傍で発生した光を結像させて２次元画像として検出する。つまり言い換えると、２次元画像検出部４０は本例における検出器である。ここで、ロングパスフィルター（図示せず）が、２次元画像検出部４０が備えるイメージセンサの受光面の直前に配置されており、蛍光だけがイメージセンサに受光されるので、検出板３５の表面近傍で発生した蛍光のみが検出され２次元画像となる。この２次元画像では、検出板３５の表面近傍に存在し蛍光を放射する微粒子が光点として現れる。抗原抗体複合体６ｃは、金属ナノ微粒子２の作用で蛍光磁性微粒子３０の蛍光が増強されるので、明るい（高輝度な）光点として現れる。一方、蛍光磁性微粒子３０単体では、金属ナノ微粒子２の作用による増強を受けないので、抗原抗体複合体６ｃの光点よりも暗い（低輝度な）光点としてしか現れない。もしくは背景（バックグラウンド）に隠れて、光点として識別できない。
【００８１】
引き寄せ磁場印加部４１は、混合溶液３６中に、図示したように下向き（検出板３５の垂直方向）に磁場勾配（つまり下向きのベクトルをもつ第１磁場５１）を発生させる。この第１磁場５１により、混合溶液３６中の蛍光磁性微粒子標識抗体３２、抗原抗体複合体６ｃが検出板３５の表面に引き寄せられる。この結果、混合溶液３６中に存在する全ての抗原抗体複合体６ｃ、蛍光磁性微粒子標識抗体３２が、励起光３９の近接場に照射される。同時に、２次元画像検出部４０によって得られた２次元画像上に抗原抗体複合体６ｃが光点として現れる。
【００８２】
次に、掃引磁場印加部４２によって、図示したように横方向（検出板３５の水平方向）に磁場勾配（つまり横方向のベクトルをもつ第２磁場５２）を発生させる。この第２磁場５２により、混合溶液３６中の蛍光磁性微粒子標識抗体３２、抗原抗体複合体６ｃが横方向に移動する。つまり第２磁場５２を印加する掃引磁場印加部４２は、磁場印加部の一例である。ここで、抗原抗体複合体６ｃの移動は２次元画像検出部４０によって得られた２次元画像上での光点Ｐ６ｃの移動として現れる。図１３に２次元画像上での光点の移動の様子を示す。動く光点Ｐ６ｃを計数することで、計測対象分子１の数を計数できる。なお、蛍光磁性微粒子標識抗体３２単体でも光点Ｐ３２として現れる場合があるが、低輝度なため、抗原抗体複合体６ｃの光点Ｐ６ｃとは区別できる。
【００８３】
ここで、本装置の動作について一例として図１４を用いて説明する。図１４は本実施の形態の第２別例に係る装置の動作を説明するためのフローチャートである。
【００８４】
例えば、あらかじめ調製された混合溶液３６は、前述の検出板３５と、カバーガラス３７とによって形成された間隙の空間に収容される（Ｓ３０１）。なお、混合溶液３６の調製は、計測対象分子１を含む溶液、蛍光磁性微粒子標識抗体３２を含む溶液、及び金属ナノ微粒子標識抗体３を含む溶液の順不同な混合により行われる。
【００８５】
引き寄せ磁場印加部４１は、間隙の空間に配された混合溶液３６に対して第１磁場５１を印加する（Ｓ３０２）。なお、第１磁場５１の印加は所定の期間行われる。所定の期間とは混合溶液３６中に分散した抗原抗体複合体６ｃが検出板３５の表面まで移動するための十分な時間であり、粒子の分散性や強磁性の度合いに応じて変化する。
【００８６】
続いて掃引磁場印加部４２は、間隙の空間に配された混合溶液３６に対して第２磁場５２を印加する（Ｓ３０３）。
【００８７】
さらに光源３８は励起光３９を照射することで、検出板３５の表面に近接場を形成する。形成された近接場は混合溶液３６に含まれる抗原抗体複合体６ｃを照射する（Ｓ３０４）。
【００８８】
装置は２次元画像検出部４０によりロングパスフィルター２６を通過した蛍光を検出し（Ｓ３０５）、蛍光強度に基づく信号を出力する。このとき出力される信号は、検出板３５の表面を平面視した蛍光強度の２次元画像である。装置はあらかじめ設定された時間間隔ごとに上記の２次元画像を出力するため、２次元画像上の蛍光強度の時間変化を示す動画像が得られる。つまり第２磁場５２によって移動する、増強された蛍光の位置変化を検出できる。
【００８９】
なお、光照射は磁場印加前に開始してもよい。また、図示しないが、本装置はコンピューター等に接続されていてもよく、必要に応じて当該コンピューターに実装されたプログラム等により、出力された動画像を解析し、計測対象分子１の定性または定量的な検出結果を出力する。
【００９０】
上記の様に、抗原抗体複合体６ｃの光点Ｐ６ｃと、蛍光磁性微粒子標識抗体３２単体の光点Ｐ３２を、輝度の違いにより識別できるので、計測対象分子１のみを計数することができる。従って、蛍光磁性微粒子標識抗体３２の数を増加させることが可能になり、定量範囲を拡大できる。
【００９１】
また、抗原抗体複合体６ｃが放射する蛍光は増強されているので高輝度な光点Ｐ６ｃが得られる。その結果、より鮮明な２次元画像が有られるので、光点Ｐ６ｃ及びＰ３２を自動的に画像認識することが容易になり、動く光点Ｐ６ｃを自動的に計数する際に有利である。さらに、抗原抗体複合体６ｃが放射する蛍光は増強されているので、より小粒径の蛍光磁性微粒子でも高輝度な光点Ｐ６ｃとして現れるので、より小粒径の蛍光磁性微粒子も利用できる。従って反応速度を向上させることが可能になり、計測を高速化できる。
【００９２】
［近接場に限定しない外力支援バイオセンサに応用］
図１５は、本実施の形態の第３別例の装置の全体を示す図である。図１５の混合溶液３６は、図１２の混合溶液３６と同様に計測対象分子１、蛍光磁性微粒子標識抗体３２と金属ナノ微粒子標識抗体３を含む。混合溶液３６は、基板４３と透明なカバーガラス４４で挟んで保持する（つまり収容する）。したがって、基板４３とカバーガラス４４とによって形成される間隙の空間を、本装置における試料収容部とみなすことができる。光源４５は、波長は光源１２、２３、３８と同じで、基板４３と透明なカバーガラス４４に挟まれた混合溶液３６に、励起光４６を基板４３の平面方向に向けて照射する。このように配置することで、混合溶液３６全体を照射することができ、かつ励起光４６が直接２次元画像検出部４７に混入することを抑えられる。２次元画像検出部４７は、励起光４６の照射により混合溶液３６中で発生した光を２次元画像として検出する。ここで、ロングパスフィルター（図示せず）が、２次元画像検出部４７が備えるイメージセンサの受光面の直前に配置されており、蛍光だけがイメージセンサに受光されるので、蛍光のみが２次元画像となる。２次元画像検出部４７の焦点深度は、混合溶液３６の厚さ（基板４３とカバーガラス４４の間の長さ）より深く設定する。従って、２次元画像では、混合溶液３６全体に存在する蛍光を放射する微粒子が光点として現れる。抗原抗体複合体６ｃは、金属ナノ微粒子２の作用で蛍光磁性微粒子３０の蛍光が増強されるので、明るい（高輝度な）光点として現れる。一方、蛍光磁性微粒子標識抗体３２単体では、金属ナノ微粒子２の作用による増強を受けないので、抗原抗体複合体６ｃの光点よりも暗い（低輝度な）光点としてしか現れない。もしくは背景（バックグラウンド）に隠れて、光点として識別できない。
【００９３】
ここで、掃引磁場印加部４２によって、図示したように横方向（基板４３の表面方向）に磁場勾配（つまり横方向のベクトルをもつ第３磁場５３）を発生させる。この第３磁場５３により、混合溶液３６中の蛍光磁性微粒子標識抗体３２、抗原抗体複合体６ｃが横方向に移動する。ここで、抗原抗体複合体６ｃの移動は２次元画像検出部４７によって得られた２次元画像上での光点の移動として現れる。この動く光点を計数することで、計測対象分子１の数を計数できる。なお、蛍光磁性微粒子標識抗体３２単体でも光点として現れる場合があるが、低輝度なため、抗原抗体複合体６ｃの光点とは区別でき、図１３と同様な２次元画像が得られる。
【００９４】
ここで、本装置の動作について説明する。なお、本装置の基本的な動作については上述の第２別例における動作と同様であるため、ここでは第２別例と異なる点について述べ、重複する点については説明を省略する。
【００９５】
本装置は引き寄せ磁場印加部４１を有しないため、図１４のステップＳ３０２は不要である。つまり本装置は、図１４のステップＳ３０１の後、図１４のステップＳ３０３の動作を実行し、掃引磁場印加部４２によって第３磁場５３を印加する。続いて本装置は、図１４のＳ３０４の動作を実行する。ここで、本装置において図１４のＳ３０４にあたる動作では近接場の形成が行われない。本装置においては励起光４６が混合溶液３６に直接照射される。
【００９６】
その後、装置は図１４のＳ３０５の動作を実行し、発生した蛍光を２次元画像検出部４７によって検出する。
【００９７】
以上のようにして本装置は、計測対象分子１の定性または定量的な検出結果を出力する。
【００９８】
上記の様に、抗原抗体複合体６ｃの光点と、蛍光磁性微粒子標識抗体３２単体の光点を、輝度の違いにより識別できるので、計測対象分子１のみを計数することができる。抗原抗体複合体６ｃが放射する蛍光は増強されているので高輝度な光点が得られる。その結果、より鮮明な２次元画像が有られるので、光点を自動的に画像認識することが容易になり、動く光点を自動的に計数する際に有利である。また、抗原抗体複合体６ｃが放射する蛍光は増強されているので、より小粒径の蛍光磁性微粒子でも光点として現れるので、より小粒径の蛍光磁性微粒子も利用できる。さらに、図１２のように、引き寄せ磁場印加部４１による引き寄せ工程が不要なため、高速化に有利である。
【００９９】
（実施例１）
本実施の形態における第１の実施例を以下に説明する。
【０１００】
以下、本実施例に関して図１６〜２１を用いて説明する。
【０１０１】
本実施例は、図１６における、計測対象分子１としては１０ｎｍ程度の血清アルブミン、金属ナノ微粒子２としては直径が６０ｎｍの金コロイド、蛍光体４としては、１ｎｍ以下の有機シアニン系蛍光分子であるCyanine  3（Ｃｙ３、分子量：714、量子収率QY：0.15）、金属ナノ微粒子標識抗体３と蛍光標識抗体５は、１５ｎｍ程度のモノクローナルＩｇＧ抗体に上述の金コロイド及びＣｙ３をそれぞれ固定したものを用いた場合である。
【０１０２】
これらが抗原抗体複合体６を形成した場合の、金属ナノ微粒子２の表面と蛍光体４との距離は、各抗体が計測対象分子１と結合する位置（結合部位）によって異なり、最大値（図１６の（ａ）の位置関係）は３５ｎｍ程度であり、最小値（図１６の（ｂ）の位置関係）は１０ｎｍ程度になる。
【０１０３】
金属ナノ微粒子２の局在化表面プラズモン共鳴による増強作用を示すため、金属ナノ微粒子２の周辺の電場強度をＦＤＴＤ法（Finite-difference  time-domain  method）にて、シミュレーションした。このシミュレーションの条件は、図１８に示した様に、水中に存在する直径が６０ｎｍの金コロイド６０に−ｚ方向に伝搬する平面波を照射する。この平面波の偏光方向がｘ方向の直線偏光で、電場強度は、１（Ｖ／ｍ）であり、金コロイド６０の表面からΔｘだけ離間した計測位置６１における電場強度を取得した。このシミュレーションの結果を図１７の四角形、円形に示す。図１７において、横軸は励起光の波長、縦軸は電場強度の２乗（（Ｖ／ｍ）２）を示す。四角形は、図１８のΔｘ＝１０ｎｍ、即ち金コロイドの表面より１０ｎｍ離れた位置の電場強度の２乗、円形は、図１８のΔｘ＝３５ｎｍ、即ち金コロイドの表面より３５ｎｍ離れた位置の電場強度の２乗である。この電場強度の２乗が増強度に相当する。図１７から明らかな様に、５００〜６００ｎｍ付近に局在化表面プラズモン共鳴が見られる。
【０１０４】
次に、蛍光体であるＣｙ３の消光スペクトル、蛍光スペクトルを図１９に示す。図１９において、横軸は波長、縦軸は消光度、蛍光強度のピークを１とした際の相対値を示し、白抜き四角形のプロットは消光スペクトルを、白抜き円形のプロットは蛍光スペクトルを示す。
【０１０５】
図１７、１９から、直径が６０ｎｍの金コロイドで発生する局在化表面プラズモン共鳴の波長域と、Ｃｙ３を励起する波長域、及びＣｙ３が蛍光を放射する波長域が重なっていることがわかる。従って、Ｃｙ３が放射する蛍光の強度は、局在化表面プラズモン共鳴の作用により増強される。
【０１０６】
次に、励起光の波長が５３２ｎｍの場合の増強度を算出する。波長がλで、位置がΔｘの増強度（電場強度の２乗）をＥＦ（λ、Δｘ）として表記すると、図１７より、以下となる。
【０１０７】
ＥＦ（５３２、１０）＝１１
ＥＦ（５３２、３５）＝２
【０１０８】
上記は励起光に対する増強度で、金属ナノ微粒子２が存在しない場合よりも、励起光の強度がそれぞれ、１１倍、２倍になることを意味する。この励起増強は、局在化表面プラズモン共鳴により励起光を金属ナノ微粒子２が周辺に集めることで発生する。
【０１０９】
波長が５３２ｎｍの励起光で励起されたＣｙ３は、図１９の白抜き円形のプロットの様な５７０ｎｍをピークとするスペクトルを有する蛍光を放射するので、波長が５７０ｎｍの蛍光に対する増強度は図１７より以下となる。
【０１１０】
ＥＦ（５７０、１０）＝１７
ＥＦ（５７０、３５）＝４
【０１１１】
上記はＣｙ３の蛍光に対する増強度で、金属ナノ微粒子２が存在しない場合よりも、蛍光の強度がそれぞれ、１７倍、４倍になることを意味する。この放射増強は、局在化表面プラズモン共鳴により、金属ナノ微粒子２が周辺の蛍光体４の量子収率を増加させることで発生する。Ｃｙ３の量子収率は、通常（周辺に金属ナノ微粒子２が存在しない場合）は、０．１５である。
【０１１２】
量子収率の最大値は１であるので、Ｃｙ３に対する放射増強の最大値は、１／０．１５≒７．７になる。従って、５７０ｎｍ、Δｘ＝１０ｎｍに対する増強度は、７におさえられるので実際は以下になる。
【０１１３】
ＥＦ（５７０、１０）＝７
【０１１４】
表面増強蛍光は励起増強と放射増強により発生するので、表面増強蛍光の増強度は、励起増強の増強度と放射増強の増強度との積になる。従って、Ｃｙ３の表面増強蛍光の増強度は以下になる。
【０１１５】
Δｘ＝１０ｎｍでは、
ＥＦ（５３２、１０）×ＥＦ（５７０、１０）＝１１×７＝７７
Δｘ＝３５ｎｍでは、
ＥＦ（５３２、３５）×ＥＦ（５７０、３５）＝２×４＝８
【０１１６】
以上の様に、抗原抗体複合体６を形成すると、Ｃｙ３が放射する蛍光は、抗原抗体複合体６を形成していないＣｙ３の放射する蛍光と比べて、８〜７７倍になる。
【０１１７】
上記の効果は、直径＝６０ｎｍの金コロイドだけでなく、異なる直径の金コロイドでも得られる。図２０、２１に直径＝２０、３０、４０、５０、６０、７０ｎｍの金コロイドが、波長＝５３２ｎｍ、５７０ｎｍで発生する増強度（電場強度の２乗（（Ｖ／ｍ）２）を示す。
【０１１８】
図２０、２１は図１８で示した条件でＦＤＴＤシミュレーションした結果で、横軸はΔｘで、縦軸は増強度を示す。四角形、円形、上向き三角形、下向き三角形、菱形、横向き三角形はそれぞれ直径＝２０、３０、４０、５０、７０ｎｍの金コロイドが発生する増強度を示している。図２０、２１から明らかなように、直径が６０ｎｍ以外の直径＝２０、３０、４０、５０、７０ｎｍの金コロイドでも増強効果を示し、Δｘが小さい方が、増強度が大きい。図１６の（ａ）と図１６の（ｂ）で示したΔｘの違いは、計測対象分子１と抗体との結合部位の違いによって生じる。図２０、２１で示した様にΔｘが小さい方が、増強度が大きいので、Δｘが小さくなる結合部位と結合する抗体を選択することで、より大きな効果を発揮できる。ただし、蛍光体４と金属ナノ微粒子２がΔｘ＝５ｎｍよりも接近すると、蛍光体４から金属ナノ微粒子２へ直接エネルギーが移動することによる蛍光消光（クエンチ）現象が発生するので、Δｘを５ｎｍ未満になるまで接近させることは好ましくない（非特許文献５参照）。
【０１１９】
さらに、本実施例は、光源としては実用性が高い広く普及している半導体励起固体（DPSS：Diode  Pumped  Solid  State）レーザが用いることができ、実用的である。
【０１２０】
（実施例２）
本実施の形態における第２の実施例を以下に説明する。
【０１２１】
以下、本実施例に関して図２２〜２３を用いて説明する。本実施例では、実施例１で示したＩｇＧ抗体よりも小型の抗体であるF（ab'）2を用いた例である。これは、ＩｇＧ抗体を断片化した抗体で、ＩｇＧ抗体をタンパク質分解酵素であるペプシンで分解した、N末端側のヒンジ部位を含んだ部分である。２個の抗体結合部がヒンジ部位で結合している断片で、ＩｇＧ抗体よりも小型ではあるが、蛍光体４で標識可能である。F（ab'）2の大きさは、ＩｇＧ抗体の半分程度で、約７ｎｍ程度である。
【０１２２】
この断片化抗体F（ab'）２を用いて抗原抗体複合体６ｄを形成した状態を図２２に示す。図２２において、蛍光標識断片化抗体４８は、蛍光体４（Ｃｙ３）で標識された断片化抗体F（ab'）２である。また、金属ナノ微粒子標識断片化抗体４９は、金属ナノ微粒子２（直径が６０ｎｍの金コロイド）で標識された断片化抗体F（ab'）２である。蛍光標識断片化抗体４８と金属ナノ微粒子標識断片化抗体４９が計測対象分子１を挟んで結合して抗原抗体複合体６ｄを形成する。これらが抗原抗体複合体６ｄを形成した場合の、金属ナノ微粒子２の表面と蛍光体４との距離は、各断片化抗体が計測対象分子１と結合する位置（結合部位）によって異なり、最大値（図２０の（ａ）の位置関係）は２５ｎｍ程度であり、最小値（図２０の（ｂ）の位置関係）は７ｎｍ程度になる。
【０１２３】
金属ナノ微粒子２の局在化表面プラズモン共鳴による増強作用を示すため、金属ナノ微粒子２の周辺の電場強度を実施例１と同様にＦＤＴＤ法にて、シミュレーションした。このシミュレーションの条件は、実施例１と同様である。
【０１２４】
このシミュレーションの結果を図２３の白抜き四角形、白抜き円形に示す。図２３において、横軸は励起光の波長、縦軸は電場強度の２乗（（Ｖ／ｍ）２）を示す。図２３の白抜き四角形は、図１８のΔｘ＝７ｎｍ、即ち金コロイドの表面より７ｎｍ離れた位置の電場強度の２乗を示す。また、図２３の白抜き円形は、図１８のΔｘ＝２５ｎｍ、即ち金コロイドの表面より２５ｎｍ離れた位置の電場強度の２乗である。この電場強度の２乗が増強度に相当する。実施例１と同様に、直径が６０ｎｍの金コロイドで発生する局在化表面プラズモン共鳴の波長域と、Ｃｙ３を励起する波長域、及び蛍光を放射する波長域が重なっているので、Ｃｙ３が放射する蛍光の強度は、局在化表面プラズモン共鳴の作用により増強される。
【０１２５】
次に、励起光の波長が５３２ｎｍの場合の増強度を算出する。実施例１と同様に波長がλで、位置がΔｘの増強度（電場強度の２乗）をＥＦ（λ、Δｘ）として表記すると、図２３より、以下となる。
【０１２６】
ＥＦ（５３２、７）＝１８
ＥＦ（５３２、２５）＝３
【０１２７】
上記は励起光に対する増強度で、金属ナノ微粒子２が存在しない場合よりも、励起光の強度がそれぞれ、１８倍、３倍になることを意味する。この励起増強は、局在化表面プラズモン共鳴により励起光を金属ナノ微粒子２が周辺に集めることで発生する。
【０１２８】
波長が５３２ｎｍの励起光で励起されたＣｙ３は、図１９の白抜き円形のプロットの様な５７０ｎｍをピークとするスペクトルを有する蛍光を放射するので、波長が５７０ｎｍの蛍光に対する増強度は図２３より以下となる。
【０１２９】
ＥＦ（５７０、７）＝２６
ＥＦ（５７０、２５）＝５
【０１３０】
上記はＣｙ３の蛍光に対する増強度で、金属ナノ微粒子２が存在しない場合よりも、蛍光の強度がそれぞれ、２６倍、５倍になることを意味する。この放射増強は、局在化表面プラズモン共鳴により、金属ナノ微粒子２が周辺の蛍光体４の量子収率を増加させことで発生する。実施例１と同様にＣｙ３の量子収率の最大値（＝１）制限により、Ｃｙ３に対する放射増強の最大値は、１／０．１５≒７．７になる。従って、５７０ｎｍ、Δｘ＝１０ｎｍに対する増強度は、７におさえられるので実際は実施例１と同様に以下になる。
【０１３１】
ＥＦ（５７０、１０）＝７
【０１３２】
表面増強蛍光は励起増強と放射増強により発生するので、表面増強蛍光の増強度は、励起増強の増強度と放射増強の増強度との積になる。従って、Ｃｙ３の表面増強蛍光の増強度は以下になる。
【０１３３】
Δｘ＝７ｎｍでは
ＥＦ（５３２、７）×ＥＦ（５７０、７）＝１８×７＝１２６
Δｘ＝２５ｎｍでは、
ＥＦ（５３２、２５）×ＥＦ（５７０、２５）＝３×５＝１５
【０１３４】
上記の様に抗原抗体複合体６ｄを形成すると、Ｃｙ３が放射する蛍光は、抗原抗体複合体６ｄを形成していないＣｙ３の放射する蛍光と比べて、１５〜１２６倍になる。
【０１３５】
本実施例では、実施例１よりも小型の抗体を利用することで、実施例１よりも更に大きな効果を発揮できる。
【０１３６】
小型抗体としては、本実施例で示したF（ab'）2だけでなく、結合部が１個だけのFab'、Fab、Fv、scFv等の断片化抗体でも良い。また、ラクダ科動物（ラマ、アルパカ等）から得られる重鎖のみで構成される抗体（重鎖抗体）の可変領域の断片であるVHH（variable  domain  of  heavy  chain  of  heavy  chain  antibody）抗体（ナノボディ）を用いても良い。さらに、計測対象分子と結合する物質でれば抗体に限定されず、核酸分子やペプチドであるアプタマーでも良い。
【０１３７】
なお、本実施例も実施例１も、上述した全ての実施の形態において効果を有する。ただし、直径が蛍光体４と比較して大きい蛍光微粒子１９や、蛍光磁性微粒子３０の場合は、金属ナノ微粒子２の表面からの距離がΔｘよりも、離れている部分があるので、効果は本実施例や実施例１において示した効果よりも、限定的である。
【産業上の利用可能性】
【０１３８】
本開示は、簡単、高速、高精度に計測対象分子１の濃度を計測するセンサデバイスに用いられる。    
【符号の説明】
【０１３９】
１    計測対象分子
２    金属ナノ微粒子
３    金属ナノ微粒子標識抗体
４    蛍光体
５    蛍光標識抗体
６、６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｄ    抗原抗体複合体
７、３９、４６    励起光
８    表面増強蛍光
９    蛍光
１０    光学セル
１１、２２、３６    混合溶液
１２、２３、３８、４５    光源
１３、２４    発生光
１４、１５、２５、２７    レンズ
１６、２６    ロングパスフィルター
１７、２８    光検出器
１８、２９    コンピューター
１９    蛍光微粒子
２０    蛍光微粒子標識抗体
２１    フローセル
３０    蛍光磁性微粒子
３１    磁性体
３２    蛍光磁性微粒子標識抗体
３４    プリズム
３５    検出板
３７、４４    カバーガラス
４０、４７    ２次元画像検出部
４１    引き寄せ磁場印加部
４２    掃引磁場印加部
４３    基板
４８    蛍光標識断片化抗体
４９    金属ナノ微粒子標識断片化抗体
５１    第１磁場
５２    第２磁場
５３    第３磁場
６０    金コロイド
６１    計測位置
Ｐ６ｃ、Ｐ３２    光点
Ｓ３、Ｓ６ａ、Ｓ６ｂ、Ｓ２０    信号
ＳＦ    シース流
【図１】
2020071136.tif 000003
【図２】
2020071136.tif 000004
【図３】
2020071136.tif 000005
【図４】
2020071136.tif 000006
【図５】
2020071136.tif 000007
【図６】
2020071136.tif 000008
【図７】
2020071136.tif 000009
【図８】
2020071136.tif 000010
【図９】
2020071136.tif 000011
【図１０】
2020071136.tif 000012
【図１１】
2020071136.tif 000013
【図１２】
2020071136.tif 000014
【図１３】
2020071136.tif 000015
【図１４】
2020071136.tif 000016
【図１５】
2020071136.tif 000017
【図１６】
2020071136.tif 000018
【図１７】
2020071136.tif 000019
【図１８】
2020071136.tif 000020
【図１９】
2020071136.tif 000021
【図２０】
2020071136.tif 000022
【図２１】
2020071136.tif 000023
【図２２】
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【図２３】
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