(57)【要約】      （修正有）【課題】疼痛、および他の神経栄養因子が関連する病理、例えば乾癬、湿疹、関節リウマチ、膀胱炎、子宮内膜症および変形性関節症の治療に使用可能な融合タンパク質及びその使用方法の提供。【解決手段】ｐ７５ＮＴＲニューロトロフィン結合タンパク質（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質であって：（ａ）ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）部分；および（ｂ）免疫グロブリンＦｃ部分、を含む、ｐ７５ＮＴＲニューロトロフィン結合タンパク質（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ７５ＮＴＲニューロトロフィン結合タンパク質（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質であって：
（ａ）ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）部分；および
（ｂ）免疫グロブリンＦｃ部分、
含む、
ｐ７５ＮＴＲニューロトロフィン結合タンパク質（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質であって、
前記のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）部分およびＦｃ部分は、リンカーを介して連結される、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項３】
請求項２に記載のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質であって、
前記リンカーは、式Ｇｘ（ここでｘは、１、２、３、４、５または６である）のペプチドを含む、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質であって、
前記ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）はヒトｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）である、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質であって、
前記ＦｃはヒトＦｃである、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質であって、
配列番号３に示すアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか一項に記載のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質であって、
配列番号１５に示すアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質であって、
前記ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３またはＮＴ４／５のいずれかに、２０℃での表面プラズモン共鳴により測定すると、約０．０１ｎＭ〜約５０ｎＭの結合親和性（Ｋｄ）で結合する、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質であって、
疼痛または疼痛の症状の治療での使用のための、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれかに記載のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸分子であって、
場合により、シグナル配列をコードするものをさらに含む、
核酸分子。
【請求項１１】
細胞（場合により哺乳類の細胞）をトランスフェクトするための複製可能な発現ベクターであって、
前記ベクターは請求項１０の核酸分子を含む、
複製可能な発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１の複製可能な発現ベクターであって、
前記ベクターはウイルスベクターである、
複製可能な発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１０の核酸分子を保有する、
宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１０に記載の核酸分子、または、請求項１１または１２のいずれかに記載のベクターであって、
疼痛または疼痛の症状の治療での使用のための、
核酸分子またはベクター。
【請求項１５】
請求項１から８または請求項９のいずれか一項に記載のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、または、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の核酸またはベクターであって、
前記のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、または、核酸分子またはベクターは、第二の薬理学的に活性の化合物と組み合わせて、別々に、連続して、または同時に併用するためのものである、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、または、核酸またはベクター。
【請求項１６】
医薬組成物であって、
請求項１から８または請求項９のいずれか一項に記載のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質または請求項１１から１４に記載の核酸分子またはベクター、および、薬学的に許容できる担体および／または賦形剤を含む、
医薬組成物。
【請求項１７】
（ａ）請求項１から８または請求項９のいずれか一項に記載のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、または、請求項１０から１４に記載の核酸分子またはベクター、；および
（ｂ）疼痛および／または疼痛の症状の予防または治療の任意の１または複数のための、または、疼痛および／または疼痛の症状の発達または進行を改善する、制御する、発生を低減させる、または、遅らせるための、有効量の前記ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、核酸分子、ベクターまたは医薬組成物の、個体への投与に関する説明書
を含む、
キット。
【請求項１８】
個体での疼痛およびまたは疼痛の症状を治療およびまたは予防する方法であって、
前記個体に、治療的に有効量の、請求項１から８または請求項９のいずれか一項に記載のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、または、請求項１０から１４に記載の核酸分子またはベクター（場合により、薬学的に許容できる担体をさらに含む）を投与するステップを含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ニューロトロフィンである神経栄養成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、およびニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）は、４つの受容体：低親和性ｐ７５神経栄養受容体（ｐ７５ＮＴＲ）および高親和性チロシンキナーゼ受容体；ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、およびＴｒｋＣを介して作用する。低親和性受容体ｐ７５ＮＴＲは、４つのニューロトロフィンの全てに結合して活性化され、他の受容体から独立して機能することが報告されている。しかしながら、Ｔｒｋ受容体はより選択的に活性化され、すなわちＮＧＦはＴｒｋＡに対する選択的なリガンドであり、ＢＤＮＦはＴｒｋＢに対するリガンドであり、そして、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５はＴｒｋＣに対するリガンドである。加えて、ｐ７５ＮＴＲとＴｒｋタンパク質が共発現されると、それらは複合体を形成し、両方の受容体のシグナリングを変えることが報告されている（ＨｕａｎｇおよびＲｅｉｃｈａｒｄｔ，２００３，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：６０９−４２）。実際に、ｐ７５ＮＴＲは、各ニューロトロフィン（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｎ）のそれぞれのＴｒｋ受容体に対する選択性を促進することが示唆されている。
【０００２】
ｐ７５ＮＴＲは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲ−ＳＦ）のメンバーであり、このスーパーファミリーの完全に特徴付けられた最初のメンバーであった。スーパーファミリー（ヒトでは約３０の遺伝子によりコードされる）は、ｐ７５ＮＴＲにおいて初めて同定された、４０アミノ酸のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）の１つまたは複数の（典型的に４つ）の繰り返しからなるリガンド結合ドメインにより定義づけられる（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８６  Ｃｅｌｌ  ４７：５４５−５５４；Ｒａｄｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ，１９８７  Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：５９３−５９７）。対照的に、全てのＴＮＦＲ−ＳＦファミリーメンバーの細胞内ドメインで共通する配列モチーフはない。その結果として、ＴＮＦＲ−ＳＦタンパク質のシグナリングメカニズムは非常に多様性がある。
【０００３】
ｐ７５ＮＴＲの構造の独特な特徴は、膜貫通ドメイン内のシステイニル残基を介して形成された、ジスルフィド結合のｐ７５ＮＴＲ二量体の存在である。このジスルフィド結合は、ｐ７５ＮＴＲによる効果的なニューロトロフィン依存性シグナリングに必要であり、細胞内および細胞外ドメインの形成において重要な役割を果たす（Ｖｉｌａｒ  ｅｔ  ａｌ，２００９  Ｎｅｕｒｏｎ  ６２：７２−８３）。ニューロトロフィンは、生理学的に、非共有結合的に関連する二量体として（Ｂｏｔｈｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｏｏｔｅｒ，１９７７  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２５２（２３）：８５３２−６．）、およそ５分の分布相半減期で（Ｔｒｉａ  ｅｔ  ａｌ，１９９４  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．１２７（２）：１７８−８３）、存在する。ニューロトロフィン依存性のｐ７５ＮＴＲの活性化は、ｐ７５ＮＴＲ二量体の２つの細胞外ドメインのＣＲＤ２〜４とニューロトロフィン二量体の関連性に関与する（Ｈｅ  ａｎｄ  Ｇａｒｃｉａ，２００４  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：８７０−８７５）。最近の研究は、ニューロトロフィン結合が、ｐ７５ＮＴＲ二量体の２つの細胞外ドメインを共により近くに動かし、ジスルフィド結合を中心としたスネイルトング様の動きの中で細胞内ドメインを広げて離れさせて、シグナリングアダプタータンパク質ＮＲＩＦおよびＴＲＡＦ６と細胞内ドメインとを関連させるモデルを支持する（Ｖｉｌａｒ  ｅｔ  ａｌ，２００９  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １２２：３３５１−３３５７，Ｖｉｌａｒ  ｅｔ  ａｌ，２００９  Ｎｅｕｒｏｎ  ６２：７２−８３）。ｐ７５ＮＴＲに存在するような内部膜貫通ドメインのジスルフィド結合は、他のＴＮＦＲ−ＳＦファミリーメンバーまたは任意の他の膜タンパク質では、これまで開示されていない。
【０００４】
ｐ７５ＮＴＲは、α−セクレターゼとγ−セクレターゼの活性およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）により連続的にタンパク質分解的に切断され、Ｎｏｔｃｈとβ−アミロイド前駆体タンパク質の切断依存的シグナリングパスウェイに似た様式で、その細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を細胞質内に放出する（Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：４２１６１−４２１６９；Ｋａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００３  Ｊ  Ｎｅｕｒｏ−  ｓｃｉ  ２３：５４２５−５４３６）。このパスウェイによるｐ７５ＮＴＲ  ＩＣＤの細胞質放出は、関連するＮＲＩＦによるシグナリングを促進する（Ｋｅｎｃｈａｐｐａ  ｅｔ  ａｌ，２００６  Ｎｅｕｒｏｎ  ５０：２１９−２３２）。α−セクレターゼとγ−セクレターゼの活性およびＭＭＰによるタンパク質分解的な切断の後の、ｐ７５ＮＴＲの細胞外ドメインの役割は、完全には理解されていない。
【０００５】
ＮＧＦおよび他のニューロトロフィン（ＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４／５）が、変形性関節症、膵炎、関節リウマチ、乾癬、掻痒症および多発性硬化症に起因する疼痛などの病変において、重大な役割を果たすことが示されている（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．８６（１６）：３５６６−７４；Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．６３（１１）：３２４３−５２；Ｂａｒｔｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．１１（３）：Ｒ８２；Ｔｒｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．１８：９４８−５８；ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．１８：２３４−４４；Ｙａｍａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｃｉ．４６（１）：４１−５１）。ＮＧＦまたはＢＤＮＦのいずれか、ＮＴ−３、およびＮＴ−４／５の、任意のニューロトロフィン（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｎ）に対する選択的抗体が、著しく疼痛を軽減させることが示されている。さらに、ニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  Ｔｒｋ  Ａ、Ｔｒｋ  ＢまたはＴｒｋ  Ｃに対する抗体もまた、疼痛モデルに有効であることが示されている（Ｏｒｉｔａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ．２８：１６１４−２０；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｐａｉｎ．１４８：４７３−８０；Ｉｗａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｊ  Ｈａｎｄ  Ｓｕｒｇ  Ａｍ．３５：２６７−７３；Ｃｉｒｉｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３０：５１−６２；Ｐｅｚｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｐａｉｎ．９０：１１３−２５；Ｈａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｊ  Ｐａｉｎ．１２：１０５９−６８；Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｐａｉｎ．１５２：１８３２−７；Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．；１１２：４３８−４３；Ｇｈｉｌａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｂｏｎｅ．４８：３８９−９８；Ｆｕｋｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ．２０１０；２８：２７９−８３）。疼痛モデルでのＦｕｋｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）（坐骨神経挫滅に続く機械的アロディニア）は、抗ｐ７５ＮＴＲ抗体での治療の後の、疼痛に関連するエンドポイントに対する有意な有効性を示した。この研究から、ｐ７５ＮＴＲ阻害抗体での治療は、ＣＧＲＰおよびｐ７５ＮＴＲ発現を減少させて、疼痛の有意な低減をもたらすことが結論付けられた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ｐ７５ＮＴＲニューロトロフィン結合タンパク質（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質に関する。我々は、そのような分子の親和性およびインビボのカイネティクス、および、動物モデルにおける疼痛の治療での有効性を示す。ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、疼痛、および他の神経栄養因子が関連する病理、例えば乾癬、湿疹、関節リウマチ、膀胱炎、子宮内膜症および変形性関節症の治療における用途を見いだす。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第一の態様によれば、以下を含む、ｐ７５ＮＴＲニューロトロフィン結合タンパク質（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質が提供される：
（ａ）ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）部分；および
（ｂ）免疫グロブリンＦｃ部分。
【０００８】
好ましくは、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）部分およびＦｃ部分は、リンカーを介して連結される。より好ましくは、リンカーは、式Ｇｘ（ここでｘは、１、２、３、４、５または６である）のペプチドを含む。
【０００９】
本発明に係るｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質の特に好ましい実施態様では、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、ヒトｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）である。本発明に係るｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質の別の特に好ましい実施態様では、ＦｃはヒトＦｃである。
【００１０】
さらに別の好ましい実施態様では、本発明のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３に示すアミノ酸配列を含むか、または、それからなる。別の好ましい実施態様では、本発明のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１５に示すアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００１１】
好ましい実施態様では、本発明に係るｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３またはＮＴ４／５のいずれかに、２０℃での表面プラズモン共鳴により測定すると、約０．０１ｎＭ〜約５０ｎＭの結合親和性（Ｋｄ）で結合する。
【００１２】
本発明の第二の態様では、本発明の任意の他の態様に係るｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、疼痛または疼痛の症状の治療での使用のために提供される。
【００１３】
本発明の第三の態様では、本発明の第一または第二の態様に係るｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸分子が提供され、場合により、シグナル配列をコードするものをさらに含む。
【００１４】
本発明の第四の態様では、細胞（場合により哺乳類の細胞）をトランスフェクトするための複製可能な発現ベクターが提供され、ベクターは、本発明の第三の態様に係る核酸分子を含む。
【００１５】
好ましくは、複製可能な発現ベクターは、ウイルスベクターである。
【００１６】
本発明の第五の態様では、本発明の第三の態様の核酸分子を保有する宿主細胞が提供される。
【００１７】
本発明の第六の態様では、本発明の第三の態様に係る核酸分子または本発明の第四の態様に係るベクターは、疼痛または疼痛の症状の治療での使用のためのものである。
【００１８】
疼痛または疼痛の症状は、限定されないが：急性疼痛；慢性疼痛；炎症性疼痛；侵害受容性疼痛；神経因性疼痛；痛覚過敏；アロディニア；中枢痛；癌性疼痛；術後疼痛；内臓痛；筋骨格痛；心臓または血管性疼痛；片頭痛を含む頭痛；歯痛を含む口腔顔面痛；および背痛を含む。疼痛の治療は、制限されないが、疼痛および／または疼痛の症状の発達または進行を、予防する、改善する、制御する、発生を低減させる、または遅らせることを含む。
【００１９】
第七の態様では、第一または第二の態様に係るｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、または、第三または第四の態様に係る核酸またはベクターが提供され、ここで、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、または、核酸分子またはベクターは、第二の薬理学的に活性の化合物と組み合わせて、別々に、連続して、または同時に併用するためのものである。
【００２０】
第八の態様では、本発明は、本発明の任意の態様に係るｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質または本発明の任意の態様に係る核酸分子またはベクター、および、薬学的に許容できる担体および／または賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
【００２１】
好ましくは、医薬組成物は、疼痛および／または疼痛の症状の発達または進行を、予防する、改善する、制御する、発生を低減させる、または、遅らせる、任意の１または複数での使用のためのものである。
【００２２】
本発明のさらなる態様では、以下を含むキットが提供される：
【００２３】
（ａ）本発明の任意の態様に係るｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、または、本発明の任意の態様に係る核酸分子またはベクター、または、第八の態様に係る医薬組成物；および
（ｂ）疼痛および／または疼痛の症状の予防または治療の任意の１または複数のための、または、疼痛および／または疼痛の症状の発達または進行を改善する、制御する、発生を低減させる、または、遅らせるための、有効量の前記ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、核酸分子、ベクターまたは医薬組成物の、個体への投与に関する説明書。
【００２４】
本発明のさらに別の態様では、個体での疼痛およびまたは疼痛の症状を治療およびまたは予防する方法が提供され、本発明の任意の態様に係る治療的に有効量のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、または、本発明の任意の態様に係る核酸分子またはベクター、（場合により、薬学的に許容できる担体をさらに含む）、または、本発明の第八の態様に係る医薬組成物を、前記個体へ投与するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明に係るｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列である（配列番号１）。αおよびγセクレターゼ切断部位をボールド体で示す。ＩｇＧ１のＦｃ部分をイタリック体で示す。
【図２】図４に示す核酸配列（配列番号４）の、スタートコドンからストップコドンまでの翻訳物（配列番号２）である。
【図３】本発明に係る好ましいｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列である（配列番号３）。ＩｇＧ１のＦｃ部分をイタリック体で示す。ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）部分とＦｃ部分との間のリンカー配列を下線で示す。
【図４】５’クローニングサイトから３’クローニングサイトまでの、産物遺伝子全体の核酸配列である（配列番号４）。
【図５】ｐ７５−ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質の変異：１：ｐ７５＿ＮＴＲ−ｐ７５−ＮＴＲ配列（配列番号６）；２：市販のｐ７５−ＮＴＲ−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号７）；３：ｐ７５＿Ｆｃ（Ｆｃ配列をＩｇＧ１ｚａのＬｏｎｚａ定常領域のものに改変した市販のｐ７５−ＮＴＲ−Ｆｃ融合タンパク質）（配列番号８）；４：ｐ７５＿Ｆｃ＿Ｃ２２２Ｓ（Ｆｃ配列をＩｇＧ１ｚａのＬｏｎｚａ定常領域のものに改変し、２２２位に追加のシステインからセリンへの変異を有する市販のｐ７５−ＮＴＲ−Ｆｃ融合タンパク質）（配列番号９）；５：ｐ７５＿Ｆｃ＿Ｇ４ｘ１−変異１（４残基グリシンリンカーを有するｐ７５−ＮＴＲ−Ｆｃ融合タンパク質案）（配列番号１０）；６：ｐ７５＿Ｆｃ＿Ｇ４Ｓｘ１−変異２（単一のテトラ−グリシンセリンリンカーを有するｐ７５−ＮＴＲ−Ｆｃ融合タンパク質案）（配列番号１１）；７：ｐ７５＿Ｆｃ＿Ｇ４Ｓｘ２−変異３（２つのテトラ−グリシンセリンリンカーを有するｐ７５−ＮＴＲ−Ｆｃ融合タンパク質案）（配列番号１２）；８：ＩｇＧ１ｚａのＬｏｎｚａ定常領域（配列番号１３）。  このアライメントでは、フォーマットスキームを用いて、推定受容体、Ｆｃ−融合タンパク質およびＦｃ定常領域の間の類似領域を強調する：囲み型（Ｂｏｘｅｄ  ｔｙｐｅ）を用いて、変異タンパク質とｐ７５−ＮＴＲとの間の同一配列領域を示す；一重下線を用いて、全てのＦｃ−融合タンパク質とＬｏｎｚａ  ＩｇＧ１ｚａ  Ｆｃとの間の同一配列領域を示す；イタリック体を用いて、ｐ７５−ＮＴＲとＦｃ定常領域との接合部でのリンカー領域を示す；二重下線およびボールド体を用いて、リンカー領域の外側の非同一配列の位置（親のｐ７５−ＮＴＲ  Ｆｃ−融合タンパク質における２２２と同等の位置）を示す。
【図６】ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃは、ＭＩＡにより誘導されるＯＡの齧歯類モデルにおいて疼痛を有意に低減する。＊Ｐ＜０．１および＊＊Ｐ＜０．０５
【図７】本発明に係る好ましいｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列である（配列番号１５）。ＩｇＧ１のＦｃ部分をイタリック体で示す。ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）部分とＦｃ部分との間のリンカー配列を下線で示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の第一の態様によれば、以下を含むｐ７５ＮＴＲニューロトロフィン結合タンパク質（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質が提供される：
（ａ）ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）部分；および
（ｂ）免疫グロブリンＦｃ部分。
【００２７】
好ましくは、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）部分およびＦｃ部分は、リンカーを介して連結される。より好ましくは、リンカーは、式Ｇｘ（ここでｘは、１、２、３、４、５または６である）のペプチドを含む。
【００２８】
本発明に係るｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質の特に好ましい実施態様では、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）はヒトｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）である。本発明に係るｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質の別の特に好ましい実施態様では、ＦｃはヒトＦｃである。
【００２９】
さらに別の好ましい実施態様では、本発明のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３に示すアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。別の好ましい実施態様では、本発明のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１５に示すアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００３０】
好ましくは、ｐ７５ＮＴＲニューロトロフィン結合タンパク質（ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ））はペグ化され、さらに好ましくはグリコシル化される。
【００３１】
本発明のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、好ましくは、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３またはＮＴ４／５のうちの任意の１または複数と、約０．０１ｎＭ〜約５０ｎＭの間の結合親和性（Ｋｄ）で結合する。一部の好ましい実施態様では、結合親和性（Ｋｄ）は、本明細書に記載のＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３またはＮＴ４／５に関するインビトロ結合アッセイにより測定すると、好ましくは２０℃での表面プラズモン共鳴により測定すると、約０．０１ｎＭと、約０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、１．５ｎＭ、２ｎＭ、２．５ｎＭ、３ｎＭ、３．５ｎＭ、４ｎＭ、４．５ｎＭ、５ｎＭ、５．５ｎＭ、６ｎＭ、６．５ｎＭ、７ｎＭ、７．５ｎＭ、８ｎＭ、８．５ｎＭ、９ｎＭ、９．５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭまたは５０ｎＭのいずれかとの間である。一部のさらに好ましい実施態様では、結合親和性（Ｋｄ）は、本明細書に記載のニューロトロフィンとのｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質に関するインビトロ結合アッセイで測定すると、好ましくは２０℃での表面プラズモン共鳴により測定すると、約２５０ｐＭ、３００ｐＭ、３５０ｐＭ、４００ｐＭ、４５０ｐＭ、５００ｐＭ、５５０ｐＭ、６００ｐＭ、６５０ｐＭ、７００ｐＭ、７５０ｐＭ、８００ｐＭ、８５０ｐＭ、９５０ｐＭまたは１ｎＭのいずれか、またはそれ未満である。さらにより好ましい実施態様では、結合親和性（Ｋｄ）は、本明細書に記載のニューロトロフィンとｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質に関するインビトロ結合アッセイで測定すると、好ましくは２０℃での表面プラズモン共鳴により測定すると、約０．３ｎＭまたは約１ｎＭである。
【００３２】
好ましくは、本発明のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、疼痛または疼痛の症状の治療での使用のためのものである。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まずに、本発明者らは、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、前述のニューロトロフィンＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３またはＮＴ４／５の機能性活性（例えば、それらのそれぞれの受容体とのそれらの相互作用により生じる前述のニューロトロフィンの機能性活性）をもたらすことにより（ニューロトロフィンの機能性活性を調節する、または上方または下方制御するものとして定義される）、疼痛または疼痛の症状の治療における有効性を達成すると考える。
【００３３】
好ましくは、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、神経細胞およびシナプスの増殖および分化、神経細胞培養での生存および分化、Ｔｒｋシグナリング、軸索伸長の刺激（インビトロまたはインビボ）のいずれかの機能性アッセイにより評価されるような、ＢＤＮＦの機能性活性をもたらす。
【００３４】
好ましくは、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、古典的な神経細胞生存アッセイ（例えば、Ｃｏｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００１；２４：５５１−６００に記載される）に示されるように、ＮＧＦのＴｒｋＡに対する結合および活性化を測定することにより評価されるような、ＮＧＦの機能性活性をもたらす。
【００３５】
好ましくは、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｔｒｋ受容体リン酸化、分裂促進因子により活性化されるタンパク質キナーゼリン酸化レポーターアッセイ、または、細胞生存および軸索伸長のアッセイに示されるように、ＮＴ３の内因性Ｔｒｋ受容体に対する結合および内因性Ｔｒｋ受容体活性の活性化を測定することにより評価されるような、ＮＴ３の機能性活性をもたらす。
【００３６】
好ましくは、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、例えばミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）リン酸化アッセイにおいて、または代わりに、インビボの血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）／塩基性線維芽細胞増殖因子により誘導される血管新生のマトリゲル血管新生アッセイにおいて、ＮＴ４／５のインビトロまたはインビボのリン酸化および活性化アッセイを測定することにより評価されるような、ＮＴ４／５の機能性活性をもたらす。
【００３７】
好ましくは、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｈｅ  ａｎｄ  Ｇａｒｃｉａ（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１，８７０〜８０５頁に示される、ニューロトロフィンＮＧＦ、ＮＴ３、ＢＤＮＦおよびＮＴ４／５のうちの１つまたは複数の接触残基に結合する。
【００３８】
好ましくは、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は可溶性であり、好ましくは水性溶液に可溶性であり、好ましくは生物学的流体、例えば血清、血漿、血液に可溶性である。
【００３９】
本明細書において用いられる用語、「Ｆｃ」または「免疫グロブリンＦｃ」または「Ｉｇ  Ｆｃ」は、免疫グロブリン鎖定常領域のカルボキシル末端部分、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域、またはその部分を意味すると理解される。好ましくは、免疫グロブリンＦｃは、１）場合により免疫グロブリンヒンジ領域を伴う、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、および、ＣＨ３ドメイン、２）場合により免疫グロブリンヒンジ領域を伴う、ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）場合により免疫グロブリンヒンジ領域を伴う、ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）場合により免疫グロブリンヒンジ領域を伴う、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または、５）場合により免疫グロブリンヒンジ領域と組み合わされた、制限されないがＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から選択される、２またはそれ以上のドメインの組み合わせを含む。好ましくは、免疫グロブリンＦｃは、少なくとも、免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、および場合によりＣＨ１ドメインを含む。好ましくは、免疫グロブリンＦｃは、制限されないが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、さらに好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ｓＩｇＡ、さらに好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４、最も好ましくはＩｇＧ１を含む、アイソタイプの免疫グロブリンのＦｃまたはＦｃ部分を含むか、またはそれからなる。場合により、免疫グロブリンＦｃはまた、補体結合または抗体依存性の細胞の細胞毒性を最小限化する働きをする、またはＦｃ受容体に対する結合の親和性を改善する、アミノ酸変異、欠失、置換または化学修飾も含む。
【００４０】
さらに好ましくは、免疫グロブリンＦｃは、（ａ）ＣＨ２ドメインまたはその部分、および、ＣＨ３ドメインまたはその部分、（ｂ）ＣＨ２ドメインまたはその部分、または、（ｃ）ＣＨ３ドメインまたはその部分のいずれかを含むか、またはこれらからなり、ここで、免疫グロブリンＦｃまたはその部分は、制限されないが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、さらに好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ｓＩｇＡ、さらに好ましくはＩｇＧ、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４、最も好ましくはＩｇＧ１を含む、アイソタイプである。
【００４１】
好ましくは、免疫グロブリンＦｃは、免疫グロブリン重鎖のカルボキシ末端領域を含むか、またはそれからなり、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＤ抗体アイソタイプ由来のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインまたはそれらの部分、または、ＩｇＭまたはＩｇＥ由来のＣＨ２および／またはＣＨ３および／またはＣＨ４ドメインまたはそれらの部分を含んでよい。好ましくは、免疫グロブリンＦｃは、主としてＣＨ３を含みＣＨ２をごく一部含むＦｃのフラグメントを含むか、またはそれからなり、免疫グロブリンのペプシン消化により生じさせることができる。好ましくは、免疫グロブリンＦｃは、Ｆｃ全領域を含むか、またはそれからなり、ＣＨ２およびＣＨ３を含み、さらに無傷の免疫グロブリンにおいてＣＨ１およびＣＨ２領域を連結する重鎖の短いセグメントであるヒンジ領域に結合され、免疫グロブリンのパパイン消化により生産され得る。好ましくは、免疫グロブリンヒンジ領域は、ＩｇＧ、好ましくはヒトＩｇＧ、さらに好ましくは、制限されないがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から選択される、最も好ましくはＩｇＧ１に由来する、ヒンジ領域またはヒンジ領域部分を含むか、またはそれからなるか、または代わりに、前述のヒンジ領域の具体例の種または対立遺伝子多型である。ヒンジ領域または免疫グロブリンのヒンジ領域部分は、Ｆｃ領域のＣ末端またはＮ末端、好ましくはＮ末端に存在してよい。
【００４２】
本発明の好ましい実施態様によれば、免疫グロブリンＦｃは、好ましくは、Ｆｃのエフェクター機能を減少させる、ＣＨ２領域に野生型配列の１つまたは複数のアミノ酸変異を含む免疫グロブリンのＦｃまたは免疫グロブリンのＦｃの一部分を、含むか、またはそれからなる。好ましくは、これらの変異は、Ａ３３０、Ｐ３３１〜Ｓ３３０、Ｓ３３１である（野生型ＩｇＧ１配列に関するアミノ酸のナンバリングであり、ＣＨ２領域はヒト重鎖ＩｇＧ１定常領域に存在する：［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４］。好ましくは、免疫グロブリンＦｃはグリコシル化されて生理学的ｐＨで高電荷であり、それ故に、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）を可溶化するのを助ける。また、Ｆｃ領域は、例えば診断目的での、抗−ＦｃのＥＬＩＳＡによるｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）の検出を可能にする。本発明のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、好ましくは通常のグリコシル化部位でＩｇ  Ｆｃをグリコシル化する細胞内で、好ましくは合成される。
【００４３】
好ましくは、免疫グロブリンＦｃは、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域を含むか、またはそれからなる。
【００４４】
本発明によれば、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、好ましくは、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）の溶解性および／またはｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）の安定性の改善、および／または、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）の血清半減期の改善の、有利な生物学的特性を示す。溶解性の改善は、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）の生物学的利用性が投与の際に最大化されて、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）の正確な用量を決定および実行することができるため、望ましい。溶解性の改善は、インビボの送達において望ましくない疼痛を引き起こしかつ潜在的炎症につながる凝集体の問題を、克服するのに有利である。血清半減期の改善は、送達されるｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）の同等または維持された治療効果を達成するために、治療のための使用の間、必要投与量のレベルの低減または頻度の低減を容易にする、利点を有する。延長された半減期および血液中または血清中でのより高い安定性は、より低い頻度の投与および／またはより少ない投与レベルの用量計画を可能にする利点を有し、それ故に、インビボでの潜在的な毒性または副作用を減少させる。この場合、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、その治療効果においてより強力であり、および／または、循環においてより安定である。結果として生じる、より低い、または、より少ない頻度の投与量は、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）投与と関連する可能性のある任意の潜在的な毒性作用または副作用を最小限化する点で有利である。ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質の分子量は、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）単独よりも増加しており、このこともまた、静脈内投与されたときに分子が血液循環中に良く維持されて、中枢神経系などの望ましくない部位への透過性の危険を減らし、分子が標的組織中に維持または集中されるのを適切にするという利点を有する。
【００４５】
好ましくは、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）単独と比較して、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）の溶解性の改善、および／または、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）の安定性の改善、および／または、血清半減期の改善を示す。好ましくは、溶解性の改善は、好ましくはバッファーなどの賦形剤および／または好ましくは生理学的ｐＨ、好ましくはｐＨ５〜ｐＨ８の間、好ましくは約ｐＨ７の塩を有する、水などの水性溶液中での溶解性であり、または、血清または血液などの生物学的流体中での溶解性である。好ましくは、安定性の改善は、保管期間またはその後の凍結融解の間の、長年にわたる変性、酸化、フラグメント化、または凝集の効果に起因する、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）タンパク質の活性または構造的一体性の安定性である。構造的安定性は、変性、酸化、凝集または凝集の標準的な測定により判定することができ、活性の安定性は、本明細書に記載の結合または機能性アッセイにより測定することができ、タンパク質の血清半減期を測定する方法は公知である。
【００４６】
好ましくは、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、様々な哺乳類の宿主細胞から高レベルで発現させて単一種を生産することができ、アフィニティクロマトグラフィーにより、例えば黄色ブドウ球菌プロテインＡに対する結合により、効率的に精製することができる。好ましくは、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、二量体化することができ、好ましくは、その二量体は、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）単独と比較して、ニューロトロフィンＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３またはＮＴ４／５に対する親和性が増加する。よりタイトな結合は、例えば本明細書に記載のニューロトロフィン機能性アッセイにより判定されるｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）の効果により判断されるように、より高い効能およびより高い治療有効性の利点を有する。より高い効能は、より低い用量でｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質を使用して同一の治療有効性を達成することができ、それ故に、インビボでの潜在的な毒性または副作用を減少させるという利益を有する。
【００４７】
好ましくは、本発明のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、インビボで、約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８または２１０時間＋／−１時間のいずれか、またはこれを超える半減期を有し、さらに好ましくは、本発明のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、インビボで、約２４時間またはこれを超える半減期を有する。
【００４８】
さらに好ましくは、本発明のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、インビトロで、約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８または２１０日＋／−１日のいずれか、またはこれを超える半減期を有し、さらに好ましくは、本発明のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、インビトロで、約６日またはこれを超える半減期を有する。好ましくは、安定性は、だいたい生理学的なｐＨで、緩衝水溶液中で、好ましくは２０℃または３７℃で測定される。
【００４９】
前述の好ましい実施態様によれば、好ましくは、インビボの半減期は、ラットでの半減期またはヒトでの半減期、さらに好ましくはヒトでの半減期である。好ましくは、半減期は、例えば静脈内または皮下注入によるインビボでの投与の後に、本発明のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質のレベルの血清測定より決定される。
【００５０】
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）部分および免疫グロブリンＦｃ部分は、リンカーを介して連結されてよい。リンカーは、好ましくは、１または複数のアミノ酸を含むか、またはそれからなる、または、アミノ酸、好ましくは約１〜約２５アミノ酸、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、または９アミノ酸のいずれか、さらに好ましくは約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１  ２２、２３または２４アミノ酸のいずれか、最も好ましくは１３アミノ酸の、ポリペプチド配列を含むか、またはそれからなる。
【００５１】
好ましくは、リンカーは、αへリックス、β鎖、３１０へリックスおよびｐｉへリックス、ポリプロリンヘリックス、αシートなどの任意の安定な二次構造が欠損した、アミノ酸のポリペプチド配列を含むか、またはそれからなる。好ましくは、リンカー領域は、可動性または動的または不定形のポリペプチド、例えばフレキシブルループ、ランダムコイルまたはフレキシブルターンなどを定義するアミノ酸のポリペプチド配列を含むか、またはそれからなり、そのような不定形のポリペプチドは、大きなタンパク質分子における二次構造の結合領域にしばしば見られる。
【００５２】
好ましくは、リンカーは、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）中の約５０％またはそれより多いグリシンおよび／またはアラニンおよび／またはセリン、さらに好ましくは、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）中の約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％またはそれより多いグリシンおよび／またはアラニンおよび／またはセリンを含む、アミノ酸のポリペプチド配列である。好ましくは、リンカー領域は、グリシンおよびセリンの両方を、好ましくはセリンよりもグリシンが多い比率で含む、アミノ酸のポリペプチド配列を含むか、またはそれからなり、好ましくは、リンカー領域は、可動性リンカーを含むか、またはそれからなる。
【００５３】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望まずに、本発明者らは、可動性リンカーは、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）単独と比較すると、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合の、前述のニューロトロフィン結合能力または生物学的活性を妨げ得る立体障害を、克服または防ぐと考える。それ故に、リンカー領域は、例えば本明細書に記載の結合アッセイを用いたニューロトロフィンに対する結合により判定されるように、フリーまたは天然のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）単独と比較して、好ましくはｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）部分と免疫グロブリンＦｃ部分との間に可動性を与え、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質の前述の生物学的活性を維持または改善させる。
【００５４】
さらに好ましくは、リンカーは免疫学的に不活性であり、したがって、補体媒介性の溶解を引き起こさず、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を刺激せず、ミクログリアまたはＴ細胞を活性化しない。好ましくは、リンカー領域は、これらの活性の１つまたは複数が低下している。
【００５５】
さらに好ましくは、リンカーは、構造分析または構造予測から、可動性または動的または不定形のポリペプチドであるか、または安定な二次構造を欠くと知られ、または予測されるポリペプチドを含むか、またはそれからなる。
【００５６】
最も好ましくは、リンカーは、式Ｇｘ（ここでｘは、１、２、３、４、５または６である）のペプチドを含むか、またはそれからなる。
【００５７】
また、本発明のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、場合によりｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）部分と免疫グロブリンＦｃ部分との間に入れられた、タンパク質分解的な切断部位を含んでもよい。タンパク質分解的な切断部位は、リンカー内、またはｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）部分または／および免疫グロブリンＦｃ部分のいずれかとリンカーの接合部に位置してよい。ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、場合により、治療目的のための投与およびまたは製剤化の前に、免疫グロブリンＦｃ部分から切断されてよい。
【００５８】
あるいは、本発明のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質を改変して、タンパク質分解的な切断部位を取り除いてよい。好ましい実施態様では、αおよびγセクレターゼの切断部位を取り除くことができる。特に好ましい実施態様では、配列ＧＳＳＱＰＶＶＴＲＧＴＴＤＮＤＩＥＧＲＭＤ（配列番号５）が取り除かれる。
【００５９】
さらに好ましい実施態様では、収率または溶解度などの特性を改善するために、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質における特定のアミノ酸を変更してよい。１つの特に好ましい実施態様は、２２２位のシステイン残基の、セリン残基への変更であり、それは、タンパク質製造中にＣＨＯ細胞から発現されるときにタンパク質の凝集を低減させることが見いだされた。
【００６０】
好ましくは、リンカーおよび／または免疫グロブリンＦｃ部分は、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）部分を害さず、または著しく害さない：
【００６１】
（ａ）ニューロトロフィンＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３またはＮＴ４／５の機能性活性に対する効果（ニューロトロフィンの機能性活性の調節または上方または下方制御として定義される）、
（ｂ）約０．１ｎＭ〜約５０ｎＭの間の結合親和性での、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３またはＮＴ４／５のいずれかに対する結合親和性、
（ｃ）ニューロトロフィンＮＧＦ、ＮＴ３、ＢＤＮＦおよびＮＴ４／５、好ましくはヒトＮＧＦ、ＮＴ３、ＢＤＮＦおよびＮＴ４／５のそれぞれに対する結合能力。
【００６２】
本発明の別の態様によれば、第一または第二の態様に係るｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸分子が提供される。好ましくは、核酸分子は、疼痛の治療での使用のためのものである。
【００６３】
本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子は、シグナル配列、好ましくはｐ７５ＮＴＲシグナル配列をコードする領域、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ配列をさらに含んでよい。
【００６４】
本発明の別の態様によれば、細胞をトランスフェクトするための複製可能な発現ベクターが提供され、ベクターは、第三の態様の核酸分子を含み、好ましくは、ベクターはウイルスベクターである。好ましくは、ベクターは、疼痛の治療で用いるためのものである。
【００６５】
さらに本発明の上記態様によれば、本発明の核酸分子またはベクターを発現させて、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質を生産または分泌する方法が提供される。好ましくは、前記方法は、核酸分子またはベクターを細胞内に導入すること、および、その中で核酸を発現させて、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質を、生産または分泌させることを含む。好ましくは、核酸分子またはベクターは、インビトロあるいはインビボで細胞内に導入される。好ましくは、発現されるｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、インビトロで発現されて、場合によりさらに分離および精製され、あるいは好ましくは、発現されるｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質は、インビボで発現され、好ましくは、インビボでの発現は、遺伝子治療を構成する。好ましくは、ベクターは、複製可能な発現ベクターであり、場合により哺乳類の細胞をトランスフェクトするためのものであり、好ましくは、ベクターはウイルスベクターである。
【００６６】
本発明の別の態様によれば、第三または第四の態様のいずれかの核酸分子またはベクターを保有する宿主細胞が提供され、好ましくは、細胞は哺乳類の細胞である。
【００６７】
本発明の別の態様によれば、疼痛または疼痛の症状の治療での使用のためのｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、または、疼痛または疼痛の症状の治療での使用のための核酸またはベクターが提供される。疼痛または疼痛の症状は、制限されないが以下を含んでよい：
（ａ）急性疼痛および／または自発痛、
（ｂ）慢性疼痛およびまたは進行中の疼痛、
（ｃ）関節痛、変形性関節症または関節リウマチから生じる疼痛、炎症性腸疾患、乾癬および湿疹から生じる疼痛のいずれかを含む炎症性疼痛、
（ｄ）侵害受容性疼痛、
（ｅ）有痛性糖尿病性神経障害または帯状疱疹後神経痛と関連する疼痛を含む、神経障害性疼痛
（ｆ）痛覚過敏、
（ｇ）アロディニア、
（ｈ）中枢痛、中枢性卒中後痛、多発性硬化症から生じる疼痛、脊髄損傷から生じる疼痛、またはパーキンソン病またはてんかんから生じる疼痛、
（ｉ）癌性疼痛、
（ｊ）術後疼痛、
（ｋ）消化性内臓痛および非消化性内臓痛を含む内臓痛、胃腸（ＧＩ）障害に起因する疼痛、機能性腸疾患（ＦＢＤ）から生じる疼痛、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）から生じる疼痛、月経困難、骨盤痛、膀胱炎、間質性膀胱炎または膵炎から生じる疼痛、
（ｌ）筋骨格痛、筋肉痛、線維筋痛、脊椎炎、血清陰性（非リウマチ性）関節障害、関節外リウマチ、ジストロフィン異常症、グリコーゲン分解、多発性筋炎、化膿性筋炎、
（ｍ）心臓または血管性疼痛、狭心症、心筋梗塞、僧帽弁狭窄、心膜炎、レイノー現象、浮腫性硬化症（ｓｃｌｅｒｅｄｏｍａ）、浮腫性硬化症または骨格筋虚血に起因する疼痛、
（ｎ）片頭痛、前兆を伴う片頭痛、前兆を伴わない片頭痛、群発頭痛、緊張型頭痛を含む、頭痛、
（ｏ）歯痛、顎関節筋膜痛または耳鳴りを含む、口腔顔面痛、または、
（ｐ）背痛、滑液包炎、月経痛、片頭痛、関連痛、三叉神経痛、超増感、脊椎の外傷および／または変性または脳卒中から生じる疼痛
【００６８】
疼痛の治療は、制限されないが、疼痛および／または疼痛の症状の発達または進行を、予防する、改善する、制御する、発生を低減させる、または遅らせることを含む。
【００６９】
本発明の別の態様によれば、第一または第二の態様またはそれらの好ましい実施態様に係るｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、または、第三および第四の態様に係る核酸分子またはベクターが提供され、ここで、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質または核酸分子またはベクターは、第二の薬理学的に活性の化合物と組み合わせて、別々に、連続して、または同時に併用するためのものである。好ましくは、組み合わせる第二の薬理学的に活性の化合物は、制限されないが、以下を含んでよい；
・オピオイド鎮痛薬、例えばモルヒネ、ヘロイン、ヒドロモルフォン、オキシモルフォン、レボルファノール、レバロルファン、メタドン、メペリジン、フェンタニル、コカイン、コデイン、ジヒドロコデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、プロポキシフェン、ナルメフェン、ナロルフィン、ナロキソン、ナルトレキソン、ブプレノルフィン、ブトルファノール、ナルブフィンまたはペンタゾシン；
・非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えばアスピリン、ジクロフェナク、ジフルシナル（ｄｉｆｌｕｓｉｎａｌ）、エトドラク、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルフェニサル、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラック、メクロフェナム酸、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、ニメスリド、ニトロフルルビプロフェン、オルサラジン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スルファサラジン、スリンダク、トルメチンまたはゾメピラック；
・バルビツレート鎮静剤、例えばアモバルビタール、アプロバルビタール、ブタバルビタール、ブタルビタール（ｂｕｔａｂｉｔａｌ）、メホバルビタール、メタルビタール、メトヘキシタール、ペントバルビタール、フェノバルビタール（ｐｈｅｎｏｂａｒｔｉｔａｌ）、セコバルビタール、タルブタール、チアミラール（ｔｈｅａｍｙｌａｌ）またはチオペンタール；
・鎮静作用を有するベンゾジアゼピン、例えばクロルジアゼポキシド、クロラゼペート、ジアゼパム、フルラゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、テマゼパムまたはトリアゾラム；
・鎮静作用を有するＨ１拮抗薬、例えばジフェンヒドラミン、ピリラミン、プロメタジン、クロルフェニラミンまたはクロルシクリジン；
・鎮静剤、例えばグルテチミド、メプロバメート、メタカロンまたはジクロラルフェナゾン；
・骨格筋弛緩薬、例えばバクロフェン、カリソプロドール、クロルゾキサゾン、シクロベンザプリン、メトカルバモールまたはオルフレナジン；
・ＮＭＤＡ受容体拮抗薬、例えばデキストロメトルファン（（＋）−３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルモルフィナン）またはその代謝物デキストロルファン（（＋）−３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルモルフィナン）、ケタミン、メマンチン、ピロロキノリンキニン、シス−４−（ホスホノメチル）−２−ピペリジンカルボン酸、ブジピン、ＥＮ−３２３１（ＭｏｒｐｈｉＤｅｘ（登録商標）、モルヒネおよびデキストロメトルファンの組み合わせ製剤）、トピラマート、ネラメキサン、または、ＮＲ２Ｂ拮抗薬を含むペルジンホテル、例えばイフェンプロジル、トラキソプロジルまたは（−）−（Ｒ）−６−｛２−［４−（３−フルオロフェニル）−４−ヒドロキシ−１−ピペリジニル］−１−ヒドロキシエチル−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−キノリノン；
・α−アドレナリン作用薬、例えばドキサゾシン、タムスロシン、クロニジン、グアンファシン、デキスメタトミジン（ｄｅｘｍｅｔａｔｏｍｉｄｉｎｅ）、モダフィニル、または４−アミノ−６，７−ジメトキシ−２−（５−メタン−スルホンアミド−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノール−２−イル）−５−（２−ピリジル）キナゾリン；
・三環系抗うつ薬、例えばデシプラミン、イミプラミン、アミトリプチリンまたはノルトリプチリン；
・抗痙攣薬、例えばカルバマゼピン、ラモトリジン、トピラマート（ｔｏｐｉｒａｔｍａｔｅ）またはバルプロエート；
・タキキニン（ＮＫ）拮抗薬、特にＮＫ−３、ＮＫ−２またはＮＫ−１拮抗薬、例えば（αＲ，９Ｒ）−７−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）ベンジル］−８，９，１０，１１−テトラヒドロ−９−メチル−５−（４−メチルフェニル）−７Ｈ−［１，４］ジアゾシノ［２，１−ｇ］［１，７］−ナフチリジン−６−１３−ジオン（ＴＡＫ−６３７）、５−［［（２Ｒ，３Ｓ）−２−［（１Ｒ）−１−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］エトキシ−３−（４−フルオロフェニル）−４−モルホリニル］−メチル］−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−１，２，４−トリアゾル−３−オン（ＭＫ−８６９）、アプレピタント、ラネピタント、ダピタントまたは３−［［２−メトキシ−５−（トリフルオロメトキシ）フェニル］−メチルアミノ］−２−フェニルピペリジン（２Ｓ，３Ｓ）；
・ムスカリン拮抗薬、例えばオキシブチニン、トルテロジン、プロピベリン、塩化トロスピウム（ｔｒｏｐｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ダリフェナシン、ソリフェナシン、テミベリンおよびイプラトロピウム；
・ＣＯＸ−２選択的阻害剤、例えばセレコキシブ、ロフェコキシブ、パレコキシブ、バルデコキシブ、デラコキシブ、エトリコキシブ、またはルミラコキシブ；
・コールタール鎮痛剤、特にパラセタモール；
・神経遮断薬、例えばドロペリドール、クロルプロマジン、ハロペリドール、ペルフェナジン、チオリダジン、メソリダジン、トリフルオペラジン、フルフェナジン、クロザピン、オランザピン、リスペリドン、ジプラシドン、クエチアピン、セルチンドール、アリピプラゾール、ソネピプラゾール、ブロナンセリン、イロペリドン、ペロスピロン、ラクロプリド、ゾテピン、ビフェプルノックス、アセナピン、ルラシドン、アミスルプリド、バラペリドン、パリンドール、エプリバンセリン、オサネタント、リモナバン、メクリネルタント、Ｍｉｒａｘｉｏｎ（登録商標）またはサリゾタン；
・バニロイド受容体アゴニスト（例えばレシニフェラトキシン）または拮抗薬（例えばカプサゼピン）；
・β−アドレナリン作用薬、例えばプロプラノロール；
・局部麻酔薬、例えばメキシレチン；
・コルチコステロイド、例えばデキサメタゾン；
・５−ＨＴ受容体アゴニストまたは拮抗薬、特に５−ＨＴ１Ｂ／１Ｄアゴニスト、例えばエレトリプタン、スマトリプタン、ナラトリプタン、ゾルミトリプタンまたはリザトリプタン；
・５−ＨＴ２Ａ受容体拮抗薬、例えばＲ（＋）−α−（２，３−ジメトキシ−フェニル）−１−［２−（４−フルオロフェニルエチル）］−４−ピペリジンメタノール（ＭＤＬ−１００９０７）；
・コリン作用性（ニコチン性）鎮痛剤、例えばイスプロニクリン（ＴＣ−１７３４）、（Ｅ）−Ｎ−メチル−４−（３−ピリジニル）−３−ブテン−１−アミン（ＲＪＲ−２４０３）、（Ｒ）−５−（２−アゼチジニルメトキシ）−２−クロロピリジン（ＡＢＴ−５９４）またはニコチン；
・トラマドール（登録商標）；
・ＰＤＥＶ阻害剤、例えば５−［２−エトキシ−５−（４−メチル−１−ピペラジニル−スルホニル）フェニル］−１−メチル−３−ｎ−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（シルデナフィル）、（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチル−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−ピラジノ［２’，１’：６，１］−ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン（ＩＣ−３５１またはタダラフィル）、２−［２−エトキシ−５−（４−エチル−ピペラジン−１−イル−１−スルホニル）−フェニル］−５−メチル−７−プロピル−３Ｈ−イミダゾ［５，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−４−オン（バルデナフィル）、５−（５−アセチル−２−ブトキシ−３−ピリジニル）−３−エチル−２−（１−エチル−３−アゼチジニル）−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン、５−（５−アセチル−２−プロポキシ−３−ピリジニル）−３−エチル−２−（１−イソプロピル−３−アゼチジニル）−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン、５−［２−エトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）ピリジン−３−イル］−３−エチル−２−［２−メトキシエチル］−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン、４−［（３−クロロ−４−メトキシベンジル）アミノ］−２−［（２Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−イル］−Ｎ−（ピリミジン−２−イルメチル）ピリミジン−５−カルボキサミド、３−（１−メチル−７−オキソ−３−プロピル−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−Ｎ−［２−（１−メチルピロリジン−２−イル）エチル］−４−プロポキシベンゼンスルホンアミド；
・カンナビノイド；
・代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ１（ｍＧｌｕＲ１）拮抗薬；
・セロトニン再取り込み阻害剤、例えばセルトラリン、セルトラリン代謝物デメチルセルトラリン、フルオキセチン、ノルフルオキセチン（フルオキセチンデスメチル代謝物）、フルボキサミン、パロキセチン、シタロプラム、シタロプラム代謝物デスメチルシタロプラム、エスシタロプラム、ｄ，ｌ−フェンフルラミン、フェモキセチン、イフォキセチン、シアノドチエピン、リトキセチン、ダポキセチン、ネファゾドン、セリクラミンおよびトラゾドン；
・ノルアドレナリン（ノルエピネフリン）再取り込み阻害剤、例えばマプロチリン、ロフェプラミン、ミルタザピン（ｍｉｒｔａｚｅｐｉｎｅ）、オキサプロチリン、フェゾラミン、トモキセチン、ミアンセリン、ブプロプリオン、ブプロプリオン代謝物ヒドロキシブプロプリオン、ノミフェンシンおよびビロキサジン（Ｖｉｖａｌａｎ（登録商標））、特に選択的ノルアドレナリン再取り込み阻害剤、例えばレボキセチン、特に（Ｓ，Ｓ）−レボキセチン；
・二重セロトニン−ノルアドレナリン再取り込み阻害剤、例えばベンラファキシン、ベンラファキシン代謝物Ｏ−デスメチルベンラファキシン、クロミプラミン、クロミプラミン代謝物デスメチルクロミプラミン、デュロキセチン、ミルナシプランおよびイミプラミン；
・誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）阻害剤、例えばＳ−［２−［（１−イミノエチル）アミノ］エチル］−Ｌ−ホモシステイン、Ｓ−［２−［（１−イミノエチル）−アミノ］エチル］−４，４−ジオキソ−Ｌ−システイン、Ｓ−［２−［（１−イミノエチル）アミノ］エチル］−２−メチル−Ｌ−システイン、（２Ｓ，５Ｚ）−２−アミノ−２−メチル−７−［（１−イミノエチル）アミノ］−５−ヘプテン酸、２−［［（１Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−（５−チアゾリル）−ブチル］チオ］−５−クロロ−３−ピリジンカルボニトリル；２−［［（１Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−（５−チアゾリル）ブチル］チオ］−４−クロロベンゾニトリル、（２Ｓ，４Ｒ）−２−アミノ−４−［［２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］チオ］−５−チアゾールブタノール、２−［［（１Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−（５−チアゾリル）ブチル］チオ］−６−（トリフルオロメチル）−３ピリジンカルボニトリル、２−［［（１Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−（５−チアゾリル）ブチル］チオ］−５−クロロベンゾニトリル、Ｎ−［４−［２−（３−クロロベンジルアミノ）エチル］フェニル］チオフェン−２−カルボキサミジン、またはグアニジノエチルジスルフィド；
・アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、例えばドネペジル；
・プロスタグランジンＥ２サブタイプ４（ＥＰ４）拮抗薬、例えばＮ−［（｛２−［４−（２−エチル−４，６−ジメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）フェニル］エチル｝アミノ）−カルボニル］−４−メチルベンゼンスルホンアミドまたは４−［（１Ｓ）−１−（｛［５−クロロ−２−（３−フルオロフェノキシ）ピリジン−３−イル］カルボニル｝アミノ）エチル］安息香酸；
・ロイコトリエンＢ４拮抗薬；例えば１−（３−ビフェニル−４−イルメチル−４−ヒドロキシ−クロマン−７−イル）−シクロペンタンカルボン酸（ＣＰ−１０５６９６）、５−［２−（２−カルボキシエチル）−３−［６−（４−メトキシフェニル）−５Ｅ−ヘキセニル］オキシフェノキシ］−吉草酸（ＯＮＯ−４０５７）またはＤＰＣ−１１８７０、
・５−リポキシゲナーゼ阻害剤、例えばジレウトン、６−［（３−フルオロ−５−［４−メトキシ−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル］）フェノキシ−メチル］−１−メチル−２−キノロン（ＺＤ−２１３８）、または２，３，５−トリメチル−６−（３−ピリジルメチル）、１，４−ベンゾキノン（ＣＶ−６５０４）；
・ナトリウムチャンネルブロッカー、例えばリドカイン；または
・５−ＨＴ３拮抗薬、例えばオンダンセトロン；
および、それらの薬学的に許容できる塩および溶媒和物。
【００７０】
本発明のさらなる態様によれば、個体における疼痛または任意の前述の疼痛および／または疼痛の症状の発達または進行を治療する、予防する、改善する、制御する、発生を低減させる、または遅らせる方法が提供され、第一または第二の態様またはそれらの好ましい実施態様に係る有効量のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、または、第三および第四の態様に係る核酸分子またはベクターの、個体への投与を含む。
【００７１】
本発明は、ヒト医療および獣医分野の両方に適用可能である。好ましくは、個体は、哺乳類、例えばウマ、ネコまたはイヌなどのコンパニオン動物、または、ヒツジ、ウシまたはブタなどの家畜である。最も好ましくは、個体はヒトである。
【００７２】
本発明の第八の態様によれば、疼痛または任意の前述の疼痛／または症状の発達または進行を治療する、予防する、改善する、制御する、発生を低減させる、または遅らせる、任意の１または複数のための医薬組成物が提供され、第一または第二の態様またはそれらの好ましい実施態様によるｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、または、第三および第四の態様による核酸分子またはベクターおよび薬学的に許容できる担体および／または賦形剤を含む。
【００７３】
好ましくは、第一または第二の態様またはそれらの好ましい実施態様によるｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、または、第三および第四の態様による核酸分子またはベクター、または、第八の態様の医薬組成物は、経口、舌下、口腔内、局所、直腸内、吸入、経皮、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、骨内、皮内、腹腔内、経粘膜、膣内、硝子体内、関節内、関節周囲、局所または皮膚上の投与のために調製され、またはそれらの投与に適切である。
【００７４】
好ましくは、第一または第二の態様またはそれらの好ましい実施態様に係るｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、または、第三および第四の態様による核酸分子またはベクター、または、第八の態様の医薬組成物は、疼痛発症前および／または疼痛発症中および／または疼痛発症後の投与のために、または、そのような使用のために、調製され、または適切である。
【００７５】
好ましくは、第一または第二の態様またはそれらの好ましい実施態様に係るｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）Ｆｃ、または第三および第四の態様に係る核酸分子またはベクターまたは第八の態様の医薬組成物は、１週間あたり１回〜７回、さらに好ましくは１ヶ月あたり１回〜４回、さらに好ましくは６ヶ月の期間で１回〜６回、さらに好ましくは１年あたり１回〜１２回の投与のためであり、またはそのような投与のために調製される。好ましくは、薬剤は、制限されないが、１日に１回、２日、３日、４日、５日または６日ごとに１回、毎週、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、毎月、２ヶ月ごとに１回、３ヶ月ごとに１回、４ヶ月ごとに１回、５ヶ月ごとに１回、６ヶ月ごとに１回、７ヶ月ごとに１回、８ヶ月ごとに１回、９ヶ月ごとに１回、１０ヶ月ごとに１回、１１ヶ月ごとに１回または毎年を含む期間で、末梢に投与されるものであり、または、そのように投与されるために調製される。
【００７６】
さらに好ましくは、第一または第二の態様またはそれらの好ましい実施態様に係るｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、または第三および第四の態様に係る核酸分子またはベクター、または第八の態様の医薬組成物は、制限されないが、経口で、舌下に、口腔に、局所的に、直腸に、吸入を介して、経皮的に、皮下で、静脈内に、動脈内に、または筋肉内に、心臓内投与を介して、骨内に、皮内に、腹腔内に、経粘膜的に、経膣的に、硝子体内に、皮膚上に、関節内に、関節周囲に、または局所的に、１つまたは複数を含む経路を介して末梢に投与されるものであり、またはそのように投与されるために調製される。
【００７７】
好ましくは、第一または第二の態様またはそれらの好ましい実施態様に係るｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、または第三および第四の態様に係る核酸分子またはベクター、または第八の態様の医薬組成物は、約０．０５〜約２００ｍｇ／ｍｌの間；好ましくは約０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００ｍｇ／ｍｌ＋／−約１０％誤差のいずれか、最も好ましくは約３ｍｇ／ｍｌ（獣医学的適用）、および０．１（ヒト）の濃度での投与のためであり、または、そのような投与のために調製される。
【００７８】
好ましくは、第一または第二の態様またはそれらの好ましい実施態様に係るｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、または第三および第四の態様に係る核酸分子またはベクター、または第八の態様の医薬組成物は、約０．１〜約２００ｍｇ／ｋｇ体重の間；好ましくは約０．５、１、５、１０、１５  ２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または約２００ｍｇ／ｋｇ体重＋／−約１０％誤差のいずれか、最も好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇ（獣医学的適用）、および０．３（ヒト）の濃度での投与のためであり、または、そのような投与のために調製される。
【００７９】
本発明の第九の態様によれば、以下を含むキットが提供される：
（ａ）第一または第二の態様またはそれらの好ましい実施態様に係るｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、または、第三および第四の態様に係る核酸分子またはベクター、または第八の態様の医薬組成物；および
（ｂ）疼痛および／または疼痛の症状の予防または治療の任意の１または複数のための、または、疼痛および／または疼痛の症状の発達または進行を改善する、制御する、発生を低減させる、または、遅らせるための、有効量の前記ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、核酸分子、ベクターまたは医薬組成物の、個体への投与に関する説明書。
【００８０】
キットは、本明細書に記載のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、核酸、ベクターまたは医薬組成物を含んだ１つまたは複数の容器、および、本発明の任意の方法および用途に係る使用に関する指示書を含んでよい。キットは、個体が疼痛または疼痛の症状を有するか、または、そのようなものを有するリスクがあるかどうかの同定に基づいて、治療に適切な個体を選択する説明書をさらに含んでよい。医薬組成物の投与に関する指示書は、用量、投与スケジュール、および、意図する治療のための投与経路に関する情報を含んでよい。
【００８１】
本発明のさらに別の態様によれば、予防または治療の任意の１または複数での使用のための、または、ニューロトロフィンＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５の任意の１または複数と関連する状態または状態の症状の発達または進行を、改善する、制御する、発生を低減させる、または遅らせるための、第一または第二の態様またはそれらの好ましい実施態様に係るｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質、または、第三および第四の態様に係る核酸分子またはベクター、または、第八の態様の医薬組成物が提供される。
【００８２】
−ＮＧＦ（神経成長因子）は、少なくとも２つのクラスの受容体：ｐ７５ＮＴＲおよびＴｒｋＡ、膜貫通チロシンキナーゼと結合し、軸索の成長、分岐および伸長に関与する。ＮＧＦと関連する状態および症状は公知である。ＮＧＦは、炎症性疾患および疼痛において発現されて、炎症性疾患および疼痛と関連する［タンパク質配列ＮＰ＿００２４９７．２、ＮＰ＿０３８６３７］。また、ＮＧＦは、数々の心血管系の疾患、例えば冠動脈アテローム性動脈硬化、肥満、２型糖尿病、およびメタボリック症候群において、および多発性硬化症において、役割を果たすことが示されている。ＮＧＦの血漿レベルの減少は（およびＢＤＮＦの血漿レベルの減少もまた）、急性冠動脈症候群およびメタボリック症候群と関連している。ＮＧＦはまた、様々な神経障害、例えば認知症、うつ病、神経分裂症、自閉症、レット症候群、神経性食欲不振、および神経性過食症とも関連し、そして、アルツハイマー病および神経変性疾患の発達にも関与している。ＮＧＦはまた、創傷治癒を促進することも示されており、皮膚の潰瘍および角膜の潰瘍の治療に役立ち得ることができる証拠が存在し、ラットにおいて、神経変性を減らし、末梢神経の再生を促進することが示されている。
【００８３】
−ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）はニューロトロフィンであり、神経系の発達中の神経の生存および伸長をサポートする［タンパク質配列ＮＰ＿００１１３７２７７．１、ＮＰ＿００１０４１６０４］。ＢＤＮＦは、細胞表面受容体ＴｒｋＢおよびｐ７５ＮＴＲに結合し、また、α−７ニコチン性受容体の活性を調節する。ＢＤＮＦと関連する状態および症状は公知である。ＢＤＮＦは、生理学的および病理学的疼痛の伝達において、特に、ＢＤＮＦの合成が非常に増加することが認められている急性疼痛、炎症性疼痛および神経障害性疼痛のモデルにおいて、重大な役割を果たすことが示されていて；また、ＢＤＮＦは、慢性疼痛の症状において、およびさらに湿疹および乾癬などの症状において、上方制御されることが示されている。ＢＤＮＦの下方制御は、うつ病、神経分裂症、強迫性障害、アルツハイマー病、ハンチントン病、レット症候群、および認知症、ならびに、神経性食欲不振および神経性過食症でみられる。
【００８４】
−ニューロトロフィン−５（ＮＴ−５）としても知られるニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）は、主にｐ７５ＮＴＲおよびＴｒｋＢ受容体を介してシグナル伝達して、末梢知覚交感神経細胞の生存を促進する神経栄養因子である。このタンパク質の成熟ペプチドは、ヒト、ブタ、ラットおよびマウスを含む調べられた全ての哺乳類において同一である［タンパク質配列ＮＰ＿００６１７０、ＮＰ＿９３７８３３］。ＮＴ−４は、後根神経節（ＤＲＧ）の主な神経細胞、および、傍脊椎および椎前の交感神経節、背側および腹角の脊椎の神経細胞により生成され、前立腺、胸腺、胎盤および骨格筋を含む多くの組織において発現が見られる。ＮＴ−４／５と関連する状態および症状は公知である。ＮＴ４／５における異常は、原発性開放隅角緑内障に対する感受性と関連する。また、ニューロトロフィン４は、乳癌細胞の生存に寄与することも示されており、腫瘍増殖を阻害する標的である。ＮＴ−４／５は、疼痛−シグナリングシステム、例えば侵害受容性疼痛に関与することが知られており、また、ＮＴ−４／５の上方制御は、皮膚の慢性炎症性疾患、例えば皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎の痒疹病変にも見られる。ＮＴ−４／５の下方制御は、アルツハイマー病、ハンチントン病に見られる。
【００８５】
−ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）は、構造的に、β−ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、およびＮＴ−４に関連し、哺乳類の神経細胞の生存と分化および成人の神経系の維持を調節するニューロトロフィンであり、ヒト胎盤で発現されると、胚での神経細胞の発達に影響し得る。ＮＴ３と関連する状態および症状は公知である。遺伝子ターゲッティングにより生産されたＮＴＦ３−欠損マウスは、四肢の重度な運動障害を示す。ＮＴ−３は、Ｔｒｋ受容体を介してシグナル伝達し、神経およびグリア細胞の増殖および生存を促進する［タンパク質配列ＮＰ＿００１０９６１２４．１およびＮＰ＿０３２７６８］。ヒト、マウスおよびラットのＮＴ−３のアミノ酸配列は同一である。ＮＴ３およびその同起源受容体、チロシンキナーゼＣ（ＴｒｋＣ）は、神経障害性疼痛と侵害受容性疼痛、および、侵害受容と自己受容性感覚（ｐｒｏｐｏｒｉｏｃｅｐｔｉｏｎ）のメカニズムを調節することが知られており、例えば、ＮＴ３発現は、神経障害性動物の小型ＤＲＧ細胞内で増加している。また、ＮＴ３発現は、神経障害、例えば糖尿病性多発性神経障害およびＨＩＶ関連の神経障害、萎縮を含む大径繊維神経障害（ｌａｒｇｅ  ｆｉｂｅｒ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）とも関連し、さらに、痛覚過敏の進行（通常の侵害性刺激の閾値が減少する）、アロディニア（非侵害性刺激が侵害性になる）、および自発痛（明らかに刺激が不存在下での疼痛）に関与し、公知の筋肉痛のモジュレーターである。
【００８６】
ここで、本発明は、以下の実施例を参照することにより説明され、それらは本発明を説明するために提供されるが、制限はしない。
【実施例】
【００８７】
ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ配列に関するインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）免疫原性テスト
【００８８】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＦｃ（結晶化可能断片）に基づく新規クラスの多機能性の治療的融合タンパク質を含む幅広いバイオ医薬品を生産するために、組み換えＤＮＡ技術が現在のところ利用されている（Ｈｕａｎｇ  ２００９  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０（６），６９２−９）。Ｆｃドメインへの治療的タンパク質の融合は、２つの独特な方法で分子の血清半減期を延長させることにより、バイオ医薬品の全体的な治療効果を高める。第一に、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのｐＨ依存的な結合によるＦｃ−融合の再生は、エンドソーム内の治療的タンパク質の分解を減らす。第二に、Ｆｃ−ドメインの追加および治療的タンパク質に対するＦｃが仲介する二量体化の両方による分子サイズの増大は、治療的分子と比較して腎クリアランスを制限するのを助ける。
【００８９】
融合タンパク質は、２以上のドメインを一緒に直接接合することにより作ることができる。しかしながら、これは、生じる融合タンパク質において好ましくない分子特性、例えば低下した生物活性（Ｂａｉ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０２  ７２９２−７２９６）、タンパク質ミスフォールディング（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６１，７３−７７）または低収率（Ａｍｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２６，５２３−５２８）をもたらし得る。リンカー配列をドメイン間に挿入してこれらの潜在的論点を対処することができるが、様々な因子を考慮して適切なリンカーを選択しなければならない。第一に、リンカーは、融合タンパク質内のドメインの対象とする機能全てを反映しなければならない。一部の状況では、ドメインは独立に作動しなければならず、したがって、リンカーの可動性が望ましい。反対に、剛性リンカーは、ドメインを繋留する場合に必要であり得る。第二に、リンカーは、翻訳後修飾（ＰＴＭ）を介して融合タンパク質内にいかなる不要な機能も導入してはならない。最後に、リンカーはヒトの体内で天然に生じないデノボ設計の配列であり得るので、リンカーおよびリンカーに隣接する領域の潜在的免疫原性を考慮しなければならない。
【００９０】
ほとんどの治療的タンパク質は、程度は異なるが免疫原性であり（Ｖａｎ  Ｗａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．７（３）：４０５−１８，Ｓｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、そしてさらに、いわゆる完全−ヒト抗体治療は、免疫原性領域を含み得る（Ｈａｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  ＭＡｂｓ．２，２５６−２６５）。免疫原性は、Ｔｈ（Ｔ−ヘルパー）応答を誘導する能力であり、それは、独特のＴ細胞受容体が、抗原提示細胞上に提示されたＨＬＡクラスＩＩ分子に結合したペプチドを認識するときに引き起こされる。ペプチドは、抗原提示細胞により内在化されたタンパク質から生産され、それからエンドソーム切断経路を通して処理される。ＨＬＡクラスＩＩ分子に関して十分な親和性を有するペプチドのみが、細胞表面上に提示され、場合によりＴｈ応答を引き起こし得る。
【００９１】
その結果として、Ｔｈエピトープを取り除くこと（脱免疫化として知られる処理）により、免疫原性の潜在性を低くすることが可能である（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  ２００２  Ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  ５，４−９，Ｂａｋｅｒ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ  ２００７  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．１０，２１９−２２７）。これは、治療的タンパク質内のどのペプチドがＨＬＡクラスＩＩ分子に結合することができるかを予測し、続いてＨＬＡクラスＩＩ分子に関するペプチド結合親和性を排除または低減する置換を導入することにより達成される。
【００９２】
様々なＨＬＡクラスＩＩ遺伝子が存在し、ほとんど全てが非常に多型性である。さらに、ＨＬＡクラスＩＩ分子はαおよびβ鎖からなり、生来の多型を有する異なる遺伝子からそれぞれ得られ、さらに多様性を増大させる。具体的には、全ての個体が遺伝子：ＤＲＡ／ＤＲＢ、ＤＱＡ／ＤＱＢおよびＤＰＡ／ＤＰＢを発現する。これらのうちＤＲＡのみが非多型性である。加えて、「第二の」ＤＲＢ遺伝子（ＤＲＢ３、ＤＲＢ４またはＤＲＢ５）が存在し得て、その産物もまたＤＲＡ鎖と関連する。
【００９３】
脱免疫化中の焦点は、ＤＱおよびＤＰよりも高いレベルで発現することが知られるＤＲアロタイプに当てられる（Ｌａｕｐｅｚｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６０，５９１−５９７，Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｚｉｅｒ  １９８８  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７，２２−３４，Ｂｅｒｄｏｚ  ｅｔ  ａｌ．１９８７  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９，１３３６−１３４１，Ｓｔｕｎｚ  ｅｔ  ａｌ．１９８９  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３，３０８１−３０８６）。ＤＲアロタイプは通常、ＤＲＡ遺伝子は一定のままなのでＤＲＢ遺伝子により参照され、例えば、ＤＲＢ１＊０１：０１であり、数字は対立遺伝子特有である。
【００９４】
個々のエピトープに関する重度評価は、雑多さの基準、すなわち、特異的なエピトープが結合するＨＬＡアロタイプの数、および、集団中のアロタイプの重要性（頻度）およびＨＬＡの定性的評価：ペプチド複合体の結合の長さに基づく。個体のＴ−細胞集団は「自己−ペプチド」を認識しないように選択されているので、通常はＴｈ応答を誘導しない（公知の）自己−ペプチドに対応するペプチドに関して脱免疫化されているタンパク質をスクリーニングすることが可能である。Ｔ細胞成熟中にどの内因性タンパク質が内在化されて、それとして自己−ペプチドを生じさせるのか詳細には知られていないが、抗体はその中にある（Ｋｉｒｓｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５，５６５５−５６６２，Ｖｅｒｒｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４３，３９２−３９７，Ｈａｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  ＭＡｂｓ．２，２５６−２６５）。
【００９５】
ｐ７５−ＮＴＲ  Ｆｃ−融合タンパク質の設計
ｐ７５−ＮＴＲ  Ｆｃ−融合タンパク質のＦｃ部分の特異的なアロタイプは、ＩｇＧ  ｐＣｏｎベクターＩｇＧｚａであった（上記参照）。
【００９６】
ｐ７５−ＮＴＲ  Ｆｃ−融合タンパク質の設計は、様々な段階で進めた：
【００９７】
・Ｆｃ−融合タンパク質に用いるべきｐ７５−ＮＴＲ配列の正確な構築物を定義した。以下を含む様々な因子を考慮した：
【００９８】
ｐ７５−ＮＴＲ  Ｆｃ−融合は、少なくともＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４を含む様々なニューロトロフィンと結合することが可能でなければならない；可動性がｐ７５−ＮＴＲ  Ｆｃ−融合タンパク質内に維持されていなければならない。
【００９９】
不要なα−セクレターゼ切断部位がｐ７５−ＮＴＲ−Ｆｃ（配列番号１）上の細胞外ドメイン内に存在し、それらは切断を受けて、その結果として生物学的活性およびインビボのｐ７５−Ｆｃ産物のＰＫプロファイルを低減させるので、これらはその配列から取り除かれなければならない。元のｐ７５−Ｆｃ産物（配列番号１参照）はα−セクレターゼ切断部位を含み、その結果として、半減期および生物学的活性（ＰＫ／ＰＤ）が配列番号３と比較して有意に低下した（以下参照）。
【０１００】
ｐ７５−ＮＴＲ  Ｆｃ−融合タンパク質内の細胞外ｐ７５−ＮＴＲドメインおよびＦｃを接合するための使用に適した、適切な経験的リンカーを同定した。翻訳後修飾（ＰＴＭ）に潜在的に参加することのできる部位を含むリンカー配列は除いた。
【０１０１】
異なる潜在的リンカー配列を用いた適切なＦｃ領域部分を有する所定のｐ７５−ＮＴＲ構築物を用いて、ｐ７５−ＮＴＲ  Ｆｃ−融合タンパク質の様々な変異をインシリコで構築した。構造モデリング、および、ｐ７５−ＮＴＲ細胞外ドメイン、Ｆｃヒンジ領域および潜在的リンカーのＣ末端の分析を試みた（表１参照）。
【０１０２】
異なるリンカー配列を有する変異を、潜在的なＴｈエピトープに関して、Ｅｐｉｂａｓｅ（商標）を用いてスクリーニングした。
【０１０３】
発現した配列３  ｐ７５−ＮＴＲ  Ｆｃ−融合タンパク質（配列番号３）を、予測の免疫原性リスクに基づき提案した。
【０１０４】
Ｆｃ−融合タンパク質配列分析
現在のところ利用可能な治療的Ｆｃ−融合タンパク質１３個に関するタンパク質配列を、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ａｄｏｐｔｅｄ  Ｎａｍｅｓ（ＵＳＡＮ）ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍａ−ａｓｓｎ．ｏｒｇ／ａｍａ／ｐｕｂ／ｐｈｙｓｉｃｉａｎ−ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｍｅｄｉｃａｌ−ｓｃｉｅｎｃｅ／）から取得した。可能な場合は、タンパク質配列を相互参照し、オンラインの特許情報ウェブサイトのような他のオンラインリソースに対して確認した。研究グレードのＦｃ−融合タンパク質に関するタンパク質配列を、オンラインリソースを用いて他の市販の供給元から得た。
【０１０５】
様々なＦｃ−融合タンパク質が得られた推定の親配列を同定するために、Ｆｃ−融合タンパク質配列を、ＭＡＦＦＴを用いて社内のＬｏｎｚａ  ＩｇＧ  ｐＣｏｎ  ベクターの翻訳タンパク質産物に対して並べた（Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０，３０５９−３０６６）。それから、並べたＦｃ−融合タンパク質配列を、Ｆｃ−融合がＩｇＧ配列と一致し始める位置でトランケートした。どこでＩｇＧ配列が始まるのか決定するために、３つの連続したＩｇＧ残基の基準を用いた。
【０１０６】
Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（Ｔｈｅ  ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，ＵｎｉＰｒｏｔ  ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１２−０９−Ｏｃｔ３，２０１２）の社内コピーのＢｌａｓｔ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５  ３３８９−３４０２）を、トランケートされたＦｃ−融合タンパク質配列をそれらのＩｇＧ配列を伴わずに用いて行ない、最も近いマッチングのタンパク質配列を同定した。それから、各Ｆｃ−融合タンパク質配列を、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース内に見られる最も近いマッチングの配列および最も近いマッチングのＬｏｎｚａ  ＩｇＧ  ｐＣｏｎ配列の両方に対して手作業で再度並べた。それから、融合パートナーとＦｃ領域との間の接合部を抽出して、１３の治療的Ｆｃ−融合タンパク質に関するもの１つと市販のＦｃ−融合タンパク質に関するもの１つの、２つのセットを作成した。それから、これらの２つのセットから、リンカー領域を定義した。
【０１０７】
それから、市販のＦｃ−融合タンパク質配列のセットを、最も近いマッチングのＬｏｎｚａ  ＩｇＧ  ｐＣｏｎ配列に対する配列同一性が見いだされたＮ末端の位置でトランケートした。それから、トランケートされた配列を分類し、配列の非重複（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）セットを生産した。
【０１０８】
Ｅｐｉｂａｓｅ（商標）免疫プロファイリング
Ｅｐｉｂａｓｅ（商標）免疫プロファイリングを、Ｇｌｏｂａｌセット中の８５のＨＬＡクラスＩＩアロタイプを用いて、Ｆｃ−融合タンパク質変異に関して行なった。
【０１０９】
ＨＬＡ結合の予測のみを用いた、Ｆｃ−融合タンパク質変異のそれらの免疫原性リスクに関する比較は、非常に困難である。これは、様々の重要な因子が考慮されていないからである：
【０１１０】
・結合ペプチドは加工機械により生産され得ず、したがって、抗原提示細胞によりペプチド−ＨＬＡ複合体としてＴｈ細胞に露出されることは決してない。
【０１１１】
・ペプチド−ＨＬＡ複合体は、Ｔｈ細胞により認識され得ない。
【０１１２】
これらを考慮すれば、変異配列間でＥｐｉｂａｓｅ（商標）免疫プロファイリングを用いて、３つのタイプの定量的な比較を行なうことができる。第一に、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３／４／５、ＤＱおよびＤＰのアロタイプのセットのそれぞれに関する重要なエピトープの数は、１つとしてカウントされる同一のグループの多数のアロタイプに結合するペプチドと比較することができる。そのようなエピトープの数は各セット内の独特のエピトープの数を示し、変異間の違いは潜在的なＴｈエピトープの完全な除去または付加を明らかにする。
【０１１３】
多くのエピトープ（特に雑多なエピトープ）が多数のアロタイプに結合するのと同様に、独特のＴｈエピトープの数の変化は、変異間の免疫原性の潜在性の実際の減少または増加を目立たなくさせ得る。したがって、第二の定量的比較は、全てのＴｈエピトープにわたる各ＨＬＡアロタイプのレベルにおいてであり、変異に関するアロタイプあたりの結合ペプチドの数は、血清型および集団頻度とともに考慮すれば、血清型またはアロタイプレベルのいずれかでの比較を可能にする。第三に、最悪の場合の免疫原性リスクを表わす概算のスコアは以下のように計算することができる：
【０１１４】
スコア＝Σ（エピトープ数×アロタイプ頻度）
【０１１５】
影響を受けたアロタイプそれぞれに関する乗法結果は、所定のアロタイプに結合することが予測されるエピトープの数、および影響を受けたアロタイプの対立遺伝子の頻度から計算される。結果は、試験に用いた全ての影響を受けたＤＲＢ１、ＤＲＢ３／４／５、ＤＱおよびＤＰアロタイプに関して合計される。全ての選択されたＨＬＡアロタイプ（ＤＲＢ１、ＤＲＢ３／４／５、ＤＱおよびＤＰ）を考慮しなければならないので、個々のアロタイプスコアは免疫原性リスクを測定する絶対的測定基準でないことに注意すべきである。
【０１１６】
Ｌｏｎｚａ  ｐＣｏｎ  ＩｇＧ  Ｆｃから得られるもののようなヒト抗体生殖細胞系配列は、それらはヒト免疫系に対して提示される循環抗体のプール中に見られ、自己−ペプチドであると考えることができるので、免疫原性であるとは考えなかった。同様に、ｐ７５−ＮＴＲは、ヒト体内に天然に発現されるので、本質的に免疫原性とは考えない。結果として、ｐ７５−ＮＴＲまたはヒト抗体生殖細胞系配列のいずれかから完全に得られるペプチドから生じる重要なエピトープは、示される免疫原性スコアおよびカウントから除外される。
【０１１７】
構造モデリング
提案されるｐ７５−ＮＴＲ  Ｆｃ−融合タンパク質の構造モデルは、Ｌｏｎｚａのモデリングプラットフォームを用いて生産した。ｐ７５−ＮＴＲおよびＦｃ部分に関する候補の構造テンプレート断片は、社内の抗体データベースの塩基およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）の両方から、それらの配列同一性、および、分解能（Ａｎｇｓｔｒｏｍ（Ａ））のようなテンプレート構造の定性的結晶学的方法に関して、スコアを付け、ランクを付け、選択した。
【０１１８】
ｐ７５−ＮＴＲ  Ｆｃ−融合タンパク質に対する構造テンプレート断片の配列アライメントを作成した。テンプレート断片を、配列アライメントとともにＭＯＤＥＬＬＥＲ（Ｓａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ２３４，７７９−８１５）により処理した。このプロトコルは、並べられた構造テンプレートのセットに由来する立体構造制限を作り出す。制限を満たす構造の集合体は、共役勾配およびシミュレートされたアニーリング最適化手順により作り出される。１つまたは複数のモデル構造は、タンパク質構造のスコアおよび立体構造制限の充足から得られるエネルギースコアに基づき、この集合体から選択される。モデルを調べて、ターゲットとテンプレートとの間で異なる位置の側鎖を、側鎖最適化アルゴリズムおよび最小限化されたエネルギーを用いて最適化した。一連の可視化および計算ツールを用いて、構造の立体構造可変性、および、ドメインのスコアおよびローカルパッキング（ｌｏｃａｌ  ｐａｃｋｉｎｇ）を評価して、１つまたは複数の好ましいモデルを選択した。
【０１１９】
ｐ７５−ＮＴＲ  Ｆｃ−融合タンパク質の設計
ｐ７５−ＮＴＲ  Ｆｃ−融合タンパク質の３つのリンカー変異を設計した。最終のＦｃ−融合タンパク質内のｐ７５−ＮＴＲ領域における可動性を維持する試み、および、αおよびγセクレターゼに関する不要な切断部位を避ける望みの、設計制約を考慮して、細胞外ｐ７５−ＮＴＲ配列をＧ２３７位でトランケートした。元のｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ配列１（配列番号１）を、Ａ２５０位でトランケートした。αセクレターゼ切断部位は、２４１−２４２位と２４４−２４５位との間のｐ７５−ＮＴＲの細胞外部分に同定されていて（Ｚａｍｐｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８０，１４５６３−７１）、推定のγセクレターゼ切断部位は、２８２位の領域内の配列ホモロジーにより推測されている。配列１のＰＫ／ＰＤから、配列１（配列番号１）のＰＫおよび生物学的活性は、配列３（配列番号３）と比較して有意に低下していることが明らかである。これらの実験から、αおよびγセクレターゼの位置（ｓｔｉｅｓ）は、インビボ活性の低下に寄与することが結論付けられた。
【０１２０】
変異に関して選択されるリンカーの重要な要件は、ＰＴＭを生じることができるいかなる残基の導入も避けて低い免疫原性リスクを維持するために、Ｆｃ−融合タンパク質における融合パートナーの可動性を可能にすることである。
【０１２１】
Ｆｃ定常領域、経験的リンカーおよび天然のタンパク質から得られるリンカーにｐ７５−ＮＴＲを接合するために、２つのクラスのリンカーを利用することができる。天然のタンパク質から得られるリンカーは、不要なＰＴＭが可能な部位を導入し得て、それらの特質に起因して、潜在的に、免疫原性を導入するリスクがより高い。経験的リンカーは、これらの理由に関してさらなる調査が進められた。可動性または剛性のいずれかに幅広く分類することができる。繰り返しユニットの経験的リンカーの配列を、それらの可動性の分類とともに以下に記載する：
【０１２２】
・（Ｇ４Ｓ）ｘ−可動性
・Ｇｘ−可動性
・Ａ（ＥＡＡＡＫ）ＸＡ−剛性（配列番号１４）
・（ＰＡ）ｘ−剛性
【０１２３】
最終のＦｃ−融合タンパク質における、少なくともＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３およびＮＴ４を含む多数の神経栄養性リガンドに対する結合を確実にするための、可動性に関する必要性を考慮して、可動性リンカーのみ考えた。
【０１２４】
これらの考察に基づき、ポリ−グリシンリンカーを用いた１つの変異、および、テトラ−グリシンセリンリンカーを用いた２つの変異の、３つの変異を構築した。変異は全て、リンカー配列の一部として、元のｐ７５−ＮＴＲ配列におけるＧ２０９（発現タンパク質、配列３（配列番号３）参照）を考慮する。加えて、変異は、元のｐ７５−ＮＴＲ  Ｆｃ−融合タンパク質配列１（配列番号１）における２２２位と同等の位置での、システインからセリンへの変異を含む。変異のリンカー領域を図５に示す。
【０１２５】
各変異および図１に示す他の配列に関する免疫原性の潜在性の分析を、Ｅｐｉｂａｓｅ（商標）を用いて行なった。Ｇｌｏｂａｌセット中の８５のＨＬＡクラスＩＩアロタイプに影響を及ぼす重要なエピトープに関する予測の免疫原性スコアを、以下の表１に示す。加えて、重要でないエピトープにより影響を受けたアロタイプの数についての情報も表１に示す。
【０１２６】
【表１】
2020062011.tif 000002
【０１２７】
予測の免疫原性およびＰＴＭが可能な任意の部位の不在に基づき、変異１（ｐ７５＿Ｆｃ＿Ｇ４ｘ１）は、３つの変異の最高の特性を有する。そしてインビボ試験のために生産された。
【０１２８】
ＮＧＦに関する、配列１（配列番号１）および配列３（配列番号３）ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃの親和性
実験ではＢｉａｃｏｒｅチップを調製し、フローセル１および２にプロテインＡをアミン結合した。捕捉されたｐ７５−Ｆｃに結合するＮＧＦの１サイクルのカイネティクスを測定した。
【０１２９】
チップ表面の結合能（ＲｍａＸ）は、リガンド（融合タンパク質）の固定化レベルに依存する。カイネティクス試験のために、５０〜１００ＲＵのＲｍａＸがアドバイスされる。ｐ７５−ＦｃおよびＮＧＦの分子量を用いることにより、融合タンパク質に関する所望の固定化レベルを計算することができる。
【０１３０】
ＲｍａＸ＝（ＮＧＦ分子量／融合タンパク質分子量）×固定化レベル×化学量論比：５０＝（１３，５００／１０２，０００）×固定化レベル×１。
【０１３１】
したがって、必要な固定化レベル＝（１０２，０００／１３，５００）×５０＝３７８ＲＵの配列１（配列番号１）および配列３（配列番号３）ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃであり、１サイクルのカイネティクスの前にプロテインＡチップ上にＮＴＲ−Ｆｃを固定化した。
【０１３２】
手動操作により、所望のレベルの約３８０ＲＵが達成されるまで、プロテインＡチップのフローセル２上に、配列３  ｐ７５−Ｆｃ（配列番号３）を捕捉させた。これは、１０μｌ／分の流速および配列３  ｐ７５−Ｆｃ（配列番号３）濃度１０μｇ／ｍｌでの２２秒の注入で行ない、プロテインＡ表面上に捕捉された４１８ＲＵの融合タンパク質をもたらした。
【０１３３】
まず、１０、５  ２．５、１．２５および０．６２５ｎＭのＮＧＦ濃度を試験した。融合タンパク質に関するＫＤがこの範囲のＮＧＦ濃度内であると概算されるので、これらの濃度を試験した。
【０１３４】
１サイクルのカイネティクス方法は以下を含んだ：
【０１３５】
−０．６２５ｎＭのＮＧＦを、捕捉されたｐ７５−Ｆｃ上に、３０μｌ／分で１２０秒間注入する。
【０１３６】
−それから、このプロセスを１．２５ｎＭでのＮＧＦの注入で繰り返し、２．５、５および１０ｎＭを続けた。
【０１３７】
−最終濃度のＮＧＦが注入された後、ランニングバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ）をチップ上に流すことにより、６００秒の解離フェーズを行なった。
【０１３８】
一旦完了したら、１０ｍＭのグリシンＨＣｌ（ｐＨ２）を３０μｌ／分で６０秒間を注入することにより、チップをそのプロテインＡ表面へ元に再生した。
【０１３９】
それから、１０μｇ／ｍｌの濃度で１０μｌ／分の流速で３８秒の注入を行なうことにより、配列１（配列番号１）ｐ７５−Ｆｃをチップ上に捕捉した。これは、所望のレベルの４３０ＲＵを達成した。それから、上述の１サイクルのカイネティクス手順を繰り返した。
【０１４０】
データ分析
融合タンパク質−ＮＧＦ結合データを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアｖ１を用いて以下の方法で分析した：
【０１４１】
−フローセル２（Ｆｃ＝２）上の融合タンパク質に対するＮＧＦの結合に関して、および、コントロールフローセル１（Ｆｃ＝１；プロテインＡのみ）上を流れるＮＧＦに関して、データを記録する。
【０１４２】
−それから、Ｆｃ＝１によるデータをＦｃ＝２から差し引き、「２−１」結合データを得る。
【０１４３】
−それから、０ｎＭ（ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファーのみ）の注入に関する２−１結合データを全ての２−１結合データから差し引き、実験全体のベースラインにおける任意のドリフトに関して調節する。
【０１４４】
−それから最後に、このデータを１：１結合モデルに合わせて、会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）および親和性（ＫＤ）を含む、結合特性を計算する。
【０１４５】
捕捉された配列１（配列番号１）および３（配列番号３）ｐ７５−Ｆｃ融合タンパク質に結合するＮＧＦの１サイクルのカイネティクスデータ
両方の融合タンパク質に関する、ＮＧＦへの結合プロファイルは、４００ｐＭ（配列番号１）および３６０ｐＭ（配列番号３）であった。これらの試験から、配列３（配列番号３）は、配列１（配列番号１）よりも、ＮＧＦに関して高い親和性を有することが明らかであった。
【０１４６】
配列１（配列番号１）および３（配列番号３）ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃのインビボ薬物動態
体重１２０〜１５０ｇ（到着時）の雄Ｗｉｓｔａｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＵＫ）を、この試験に用いた。各動物は、到着時に検査し、外見上健康であるようであった。それらを２つのケージに無作為に割り当て、各ラットは、尾に押した入れ墨により固有の識別番号が割り当てられた。０日目の試験開始前に少なくとも１０日間、動物を動物ユニットに慣れさせた。
【０１４７】
ラットがそれらの環境に慣れた時点で、それらを保管／手順室へ移し、そこで全てのインビボ手順を行なった。Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ  １９８６で推奨される１２時間の明暗サイクル（オン７時オフ１９時）を与えるように設定された蛍光灯により、動物を照らし続けた。部屋は空調管理し、空気温度（２１℃＋／−２℃）および相対的湿度を日常的に測定した。
【０１４８】
ラットには照射食物（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｕｇｙ，Ｆｒａｎｃｅ）を与え、オートクレーブした水が試験を通じて適宜利用可能であった。食物の各バッチを検査し、組成および汚染物質に関して日常的にスクリーニングした。巣およびケージをオートクレーブし、各ケージは個別に換気した（ＩＶＣシステム）。
【０１４９】
試験設計は、表２に概説する５つの処置群があるようにした。
【０１５０】
【表２】
2020062011.tif 000003
【０１５１】
２、４、６、８、１２および１５日目のほぼ同じ時間（午前１０時〜午前１１時３０分）にラットの尾静脈から血液サンプルを採取し、血漿を調製した。
【０１５２】
尾静脈からの血液サンプリング
ラットを３８℃に設定された加温ボックス内に、最低５分間だが１０分よりも長くない時間置いて、尾静脈の血管拡張を誘導して出血を促進させた。ラットを適切なサイズの保定器（ｒｅｓｔｒａｉｎｅｒ）内に監禁し、滅菌２３Ｇニードルを用いて尾静脈を刺し、ＣＢ３００マイクロベットチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ  １６．４４４）へ血液を流し入れた。最低１００μｌおよび最高３００μｌの血液を、全ての時点において各ラットから回収した。繰り返しのサンプリングのために異なる部位を選択し、ラットは手順全体を通じて落ち着いていた。ラットは、繰り返しの血液サンプリングに良好に耐容し、傷の所見はなかった。回収した血液を用いて血漿を調製した。
【０１５３】
心臓由来の末端血液サンプル
末端血液サンプルを、テルモ１ｍｌシリンジおよび２３Ｇニードルを用いたイソフルラン麻酔薬の下で、心臓穿刺により採取した。それから動物を頚椎脱臼により殺した。回収した血液を用いて血清を調製した。
【０１５４】
血漿調製
尾静脈由来の血液を含むマイクロベットを穏やかに数回反転させて、抗凝固剤（カリウム−ＥＤＴＡ）との良好な混合を確実にした。それから、２７００×ｇで１０分間遠心分離する前にチューブを氷上に置き、血漿をポリプロピレンチューブ中に等分した（１アリコートのみ調製された２日目を除き、各時点について動物あたり２アリコート）。全ての血漿サンプルを直ちに凍らせて、必要になるまで−８０℃で保管した。
【０１５５】
血清調製
１５日目に心臓穿刺により回収した血液を、ポリプロピレンチューブ内で室温にて２〜３時間（最大３時間）凝固させた。それから、凝固血液を４０００×ｇで５分間遠心分離し、血清をポリプロピレンチューブ中に等分した（動物あたり２アリコート）。血清サンプルを直ちに凍らせて、−８０℃で保管した。
【０１５６】
血漿ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃの決定
無傷のｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃの全血漿濃度を決定する手段として、ｐ７５ＮＴＲ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＩｇＧ１  Ｆｃ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）に関して改変ＥＬＩＳＡを用いて、血漿ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃを測定した。
【０１５７】
ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃの配列１（配列番号１）および配列３（配列番号３）の薬物動態を判定した。
【０１５８】
【表３】
2020062011.tif 000004
【０１５９】
結果
配列１（配列番号１）ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃのαおよびγセクレターゼ切断部位を取り除くことにより、配列３（配列番号３）と比較して、これはｐ７５ＮＴＲ−ＦｃのＰＫを有意に改善し、続いて、慢性の治療後の疼痛スコアにより評価される有効性を改善した。配列１（配列番号１）ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃのαおよびγセクレターゼ切断部位は、この化合物を、疼痛およびニューロトロフィン生物学に関連する他の病理（例えば呼吸器疾患）の治療のためのインビボ薬として不適切にさせた。
【０１６０】
配列３（配列番号３）は安定していて、配列１（配列番号１）と比較して改善されたＰＫ／ＰＤプロファイル、および、ニューロトロフィンに対するより高い親和性を有する。
【０１６１】
Ｐ７５ＮＴＲ−ＦＣ（配列番号３）は鎮痛剤である
この試験の目的は、ラットでの、ヨード酢酸一ナトリウム（ＭＩＡ）で誘導される変形性関節症（ＯＡ）における、ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ（配列番号３）の慢性暴露の、疼痛有効性に対する効果を調べることであった。
【０１６２】
以前に我々は、自発痛の評価は、無能力試験器（ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ  ｔｅｓｔｅｒ）を用いた静的荷重負荷の測定により行なうことができること、および、これは膝の組織病理学と関連していることも示している。疼痛のための新規の治療法を用いた事前の臨床試験は、データに偏見を生じさせる可能性に関して批判を受けている。これを対処するために、ＯＡの誘導のために左右両膝を無作為に選択し、毎日のインビボの任務の全ての操作者は各膝の状態が見えないようにされた。典型的に文献からは、ＯＡの誘導は右膝のみで行われているが、以前の試験で我々は、時点または用いたＭＩＡの投与量にかかわらず、右膝に対して、左膝でのＯＡの誘導の間に一貫した違いは見いださなかった。
【０１６３】
ＭＩＡの調製
ＭＩＡを０．３ｍｇ／５０μｌのＥＴＦ−ＰＢＳ（それぞれの関節内注入に用いられる容量）で調製した（６ｍｇ／ｍｌストック溶液と同等である）。３０２ｍｇのＭＩＡを量り取り、５０．３ｍｌのＥＴＦ−ＰＢＳ中に溶解させた。ＭＩＡを１日前もって調製し、必要になるまで暗所にて４℃で保管した。
【０１６４】
動物
体重１１０〜１３０ｇ（到着時）の４４匹の雄Ｗｉｓｔａｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＵＫ）を、この試験に用いた。各動物は、到着時に検査し、外見上健康であるようであった。それらを２つのケージに無作為に割り当て、各ラットは、尾に押した入れ墨により固有の識別番号が割り当てられた。
【０１６５】
０日目の試験開始前に少なくとも１０日間、動物を動物ユニットに慣れさせた。ラットがそれらの環境に慣れた時点で、それらを保管／手順室へ移し、そこで全てのインビボ手順を行なった。Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ  １９８６で推奨される１２時間の明暗サイクル（オン０７．００オフ１９．００）を与えるように設定された蛍光灯により、動物を照らし続けた。部屋は空調管理し、空気温度（２１℃＋／−２℃）および相対的湿度を日常的に測定した。
【０１６６】
ラットには照射食物（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｕｇｙ，Ｆｒａｎｃｅ）を与え、オートクレーブした水が適宜利用可能であった。食物の各バッチを検査し、組成および汚染物質に関して日常的にスクリーニングした。巣およびケージをオートクレーブし、各ケージは個別に換気した（ＩＶＣシステム）。
【０１６７】
実験設計
試験設計は、５グループの動物が存在するようにした：コントロールヒト抗体（ｎ＝６）、０．３ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ（配列番号３）、１ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ（配列番号３）、３ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ（配列番号３）および３ｍｇ／ｋｇのＰＧ−００７（ファイザーのタネズマブのバイオシミラー抗−ＮＧＦ抗体）。
【０１６８】
抗体およびｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ（配列番号３）を、５日ごとに２５日間、皮下注入により投与した。
【０１６９】
体重を測定し、ベースラインの血液サンプルを−２日の朝に尾静脈から採取した。−１日のほぼ同じ時間に、ベースラインの静的荷重負荷を測定した。０日に、再びその日のほぼ同じ時間に、全てのラットをそれらのそれぞれの抗体またはｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ融合タンパク質で処置した。３時間後、全ての動物は、片方の膝に０．３ｍｇのＭＩＡを関節内注入された（ＥＴＦ−ＰＢＳを逆側の膝に注入した）。
【０１７０】
処置の無作為化
試験の開始前にラットを計量し、各群内の動物の平均体重がほぼ等しくなるように、２つの各ケージのラットを無作為に処置群に割り当てた。特定の処置群に割り当てられた各ラットに加え、各ラットの左右いずれかの膝にＭＩＡを注入するように（各ラットの逆側の膝はＥＴＦＰＢＳを注入した）、さらなる無作為化も行なった。処置群の割り当ておよび各ラットに関してどちらの膝が治療を受けるかは、ＭａｃのＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １４．１．１）の乱数発生器を用いて出した。動物と接触のない職員が、無作為化手順および割り当てを行なった。
【０１７１】
２本の７ｍｌポリプロピレンバイアルを各動物に関してラベルして左または右膝を表示した（合計８８バイアル）。２人（１人がマスター無作為化シートをスコア付けおよび確認し、もう１人が関節内注入のために溶液を等分する）が、８８バイアルを調製した。等分は、ＭＩＡバイアルが最初に充填されて、その後に残りのバイアルがＥＴＦ−ＰＢＳで充填されるように（これは各動物に関して反対側の膝のバイアルである）、順々に行なった。インビボ試験全体を通じて、科学者は、全ての動物の処置状態が見えなかった。
【０１７２】
動物手順
膝の関節内注入
全てのラットを、Ｂｏｙｌｅｓ  Ａｐｐａｒａｔｕｓを用いたイソフルランの吸入により麻酔した。各動物の両膝上の毛をクリップで留めて、両膝をエタノールで拭いた。２７Ｇニードルを付けた０．５ｍｌ滅菌Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｍｉｃｒｏ−Ｆｉｎｅインスリンシリンジを用いて、ＥＴＦ−ＰＢＳ中０．３ｍｇのＭＩＡまたはＥＴＦ−ＰＢＳのみのいずれかを５０μｌ、膝蓋下靭帯を通して各膝に注入した。
【０１７３】
自発痛の評価
各動物に関して、無能力試験器（Ｌｉｎｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｕ．Ｋ．）を用いて左右後肢の荷重負荷を測定することにより自発痛を判定した。ラットを、それらの後脚が別々のセンサー上に座るように、無能力試験器上の適切なサイズのパースペックス動物ボックス中に置いた。ボックスのサイズは、ラットが押し潰されずに快適に座ることを可能にしたが、同様に、方向転換する十分な空間を与えなかった。ラットが安定して落ち着いた時点で、各肢の荷重負荷を５秒にわたり記録し、両後肢によってもたらされる力（グラム）の平均を記録した。後足の荷重配分を各時点で各ラットに関して５回判定し（その妥当性を以前に我々は示している）、５回の測定値の平均を計算した。右肢の荷重を両後肢に関する合計荷重で割ることにより、個々の荷重負荷データを荷重配分に変換した。
【０１７４】
ＭＩＡにより誘導されるＯＡに続く、自発痛の測定
無能力試験器を用いて自発痛を評価して、後肢を通じた荷重の配分を測定した。評価はベースラインで、ＭＩＡでの処置の３週後に行なった。
【０１７５】
図６に示すデータは、後肢にわたる合計荷重の比率として示される。
【０１７６】
処置を受けていない動物（ｎａｉｖｅ  ａｎｉｍａｌ）に関しては、後肢上の荷重の比率と理論的予測の０．５との間に、統計的に有意な違いはなかった。
【０１７７】
コントロール抗体で処置した動物に関しては、処置されていない肢よりも、処置された肢上に統計的に有意に少ない荷重がかけられた（３９％対６１％）。抗−ＮＧＦ抗体（ＰＧ−００７タネズマブバイオシミラー３ｍｇ／ｋｇ）で処置した動物およびｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ（配列番号３）を０．３および１ｍｇ／ｋｇで処置した動物では、測定した任意の時点において、処置された後肢上の荷重の比率と理論的予測の０．５との間に（両後肢にわたる分配でさえ）、統計的に（Ｐ＜０１）有意差はなかった。３ｍｇ／ｋｇでのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ（配列番号３）の鎮痛効果は、対応するコントロールと比較して、さらにより統計的に有意（Ｐ＜０．０５）であった。
【０１７８】
これらの試験から、ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ（配列番号３）は、ＯＡのＭＩＡラットモデルにおける鎮痛剤であることが明らかである。ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ（配列番号３）の鎮痛効果は、同様の投与量：３ｍｇ／ｋｇ皮下で、抗−ＮＧＦ抗体（ＰＧ−００７：ファイザー抗−ＮＧＦ抗体タネズマブのバイオシミラー）に関して観察されるよりも高かった。
【０１７９】
個々のニューロトロフィンに対する、ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ分子（配列３および配列１５）の親和性における、予期しない改善
文献および従来技術から、低親和性ｐ７５ニューロトロフィン受容体は、約１ｎＭの全てのニューロトロフィンに関して同様の親和性を有することが一般に認められている（Ｉｃｈｉｍ  ｅｔａｌ．，２０１２  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ３１８（１１）：１２２１−８）。さらに、Ａｐｏｌｌｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ  ＵＳ  ２００９０２３２８０８  Ａ１）の従来技術は、個々のニューロトロフィンに関するｐ７５ニューロトロフィン受容体の親和性の類似性をさらに挙げている。「ＮＧＦＲは、２８アミノ酸のシグナルペプチドからなる４２７アミノ酸の糖タンパク質として合成されるＩ型膜タンパク質である。ＮＧＦＲは、全てのニューロトロフィンに同等の親和性で結合する。」
【０１８０】
Ｂｉａｃｏｒｅプラズマ共鳴試験から、我々は、ＧＧＧリンカースペーサーを用いてヒトＩｇＧ１  Ｆｃに結合した配列３および１５の結合親和性における有意な変化を示した。
【０１８１】
【表４】
2020062011.tif 000005
【０１８２】
等電点（ｐＩ）の低下：
【０１８３】
配列３の等電点およびＡｐｏｌｌｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅの従来技術に開示される等電点は、理論的に４．１１のｐＩを有するが、これらの分子の両方とも有意にグリコシル化され、実際は３〜４の範囲のｐＩをもたらす。
【０１８４】
配列１５は、理論的に４．２３のｐＩを有し、他のｐ７５ＮＴＲよりも低くグリコシル化される。その結果、ｐＩは４〜５の範囲である。これは、配列３およびＡｐｏｌｌｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅの従来技術において以前に開示された配列よりも、重大な利点（改善された製剤化およびグリコシル化の部位およびグリコシル化の量における変動に起因する分子構造の低い可変性）を提供する。
【０１８５】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施態様により範囲が制限されるものではない。実際に、本明細書に記載のものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の説明および添付図面から、当業者に明らかになるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。さらに、本明細書に記載の全ての実施態様は、幅広く適用可能であり、必要に応じて、任意および全ての他の一貫した実施態様と組み合わせることができると考えられる。
【０１８６】
様々な刊行物が本明細書中に挙げられ、その開示はそれらの全体で参照により援用される。
【図１】
2020062011.tif 000006
【図２】
2020062011.tif 000007
【図３】
2020062011.tif 000008
【図４】
2020062011.tif 000009
【図５】
2020062011.tif 000010
【図６】
2020062011.tif 000011
【図７】
2020062011.tif 000012
【配列表】
2020062011000001.app
【外国語明細書】
2020062011000001.pdf
2020062011000002.pdf
2020062011000003.pdf
2020062011000004.pdf