(57)【要約】【課題】簡便且つ正確な被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの検出方法を提供する。【解決手段】被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの検出方法は、ヘリコバクター・ピロリ感染治療薬を投与された前記被検体から得られた生体試料中のエクソソームに含まれるタンパク質を分析する分析工程を備えることを特徴とする検出方法である。前記ヘリコバクター・ピロリ感染治療薬は、アモキシシリン、クラルスロマイシン、メトロニダゾール、ランソプラゾール、及びラベプラゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種であってもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの検出方法であって、
ヘリコバクター・ピロリ感染治療薬を投与された前記被検体から得られた生体試料中のエクソソームに含まれるタンパク質を分析する分析工程を備えることを特徴とする検出方法。
【請求項２】
前記分析工程において、Ｆｌａｇｅｌｌｕｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、Ｍａｎｎｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓe、Ｍｅｔｈｙｌ−ａｃｃｅｐｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴｌｐＡ）、Ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｆａｃｔｏｒ  ＢａｍＡ、Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）  ｄｉｃｉｔｒａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦｅｃＡ）、Ｐｅｎｔａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｇｕａｎｏｓｉｎｅ−３−ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＳｐｏＴ）、Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ、６−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ、Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、Ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  Ｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＤＮＡ  ｇｙｒａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａ、３０Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ６、Ｉｎｏｓｉｎｅ−５−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｌｐｈａ、ＵｖｒＡＢＣ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ、及びＦｌａｇｅｌｌａｒ  ｈｏｏｋ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２、ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＨＵ、Pｕｔａｔｉｖｅ  ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ＨｃｐＣ、Ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ−５５３、１０ｋＤａ  ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ、Ｐｒｏｂａｂｌｅ  ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ、Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ［Ｆｅ］、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｎｏｎ−ｈｅｍｅ  ｆｅｒｒｉｔｉｎ、５０Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２、Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｔｕ、Ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ＨＰ＿０１７５、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ、Ｕｒｅａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｂｅｔａ、Ｃａｔａｌａｓｅ、ＣＯＰ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ａｄｅｎｉｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｈｐａｉｍ）、及びＯｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （Ｏｍｐ１１）からなる群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質又はそのペプチド断片を検出する請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記ヘリコバクター・ピロリ感染治療薬は、アモキシシリン、クラルスロマイシン、メトロニダゾール、ランソプラゾール、及びラベプラゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１又は２に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸内細菌の菌叢分析方法及び被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸内細菌叢は、免疫バランスへの関与や疾患関連性等、様々な分野での重要性が明らかになっている。しかし、腸内細菌がいかに全身の免疫や臓器に関与するのか全く不明であった。さらに、従来、腸内細菌叢は便の解析でしか解析できないものと考えられていた。
【０００３】
また、ヒトの胃粘膜にはしばしば、ヘリコバクター属の細菌（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ（ヘリコバクター・ピロリ）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｈｅｉｌｍａｎｉｉ（ヘリコバクター・ハイルマニ）等）、又はカンピロバクター属の細菌が感染している。
【０００４】
中でも、ヘリコバクター・ピロリはヒト等の胃に生息する螺旋桿菌であり、世界人口の４０〜５０％が保菌者と考えられており、日本において４０歳以上の約７割が保菌者である。また、ヘリコバクター・ピロリは、胃粘膜に感染して胃炎を惹起する。さらに、ヘリコバクター・ピロリ感染は生涯に渡って持続することが多く、粘膜の慢性活動性炎症を背景として、慢性胃炎、胃潰瘍、胃癌、特発性血小板減少性紫斑病等を引き起こす。さらに、慢性ヘリコバクター・ピロリ胃炎（Ｂ型胃炎）は、胃腺癌及び胃リンパ腫の前兆と考えられている。ＷＨＯによれば、ヘリコバクター・ピロリは最も癌のリスクが高いクラスの発癌要因であり、最近では、胃癌患者由来の血液試料中のエクソソームにヘリコバクター・ピロリ由来のＣａｇＡタンパク質が含まれることが明らかとなった（例えば、非特許文献１、参照。）。
【０００５】
従来、ヘリコバクター・ピロリ感染は、ＨｐＳＡ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  Ｓｔｏｏｌ  Ａｎｔｉｇｅｎ）試験によって、行われていた（例えば、非特許文献１参照。）。しかしながら、ＨｐＳＡ試験では、便中に大量のヘリコバクター・ピロリ抗原が存在するときのみ機能するため、偽陰性の結果が得られることがあった。
これに対し、特許文献１には、便、唾液、及び分泌性の試料中の病原性生物を二抗体サンドイッチ結合アッセイによりヘリコバクター・ピロリ等の細菌感染を検出する方法が開示されている。
【０００６】
また、ヘリコバクター・ピロリの除菌治療としては、２種類の抗生物質（アモキシシリン及びクラルスロマイシン）と１種類のプロトポンプ阻害薬（ランソプラゾール）とを１週間内服するのが一般的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４１２２４１９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】S Shimoda A., et al., “Exosomes as nanocarriers for systemic delivery of the Helicobacter pylori virulence factor CagA”, Scientific Reports, 6:18346, DOI: 10.1038/srep18346, 2016.
【非特許文献２】田中昭文ら、「糞便中のＨ．ｐｙｌｏｒｉ抗原検査」、モダンメディア、第５０巻、第５号、ｐ１１７−１２１、２００４年。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、上記治療薬を用いたヘリコバクター・ピロリの除菌治療後の患者において、薬疹（薬剤が原因の発疹）以外の皮疹、すなわち、ヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーが起こることを初めて見出した。
しかしながら、特許文献１及び非特許文献２に記載の方法では、ヘリコバクター・ピロリの除菌治療後の皮疹が、薬疹か、ヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーかを判定することはできない。
また、便の解析以外の腸内細菌の菌叢分析方法の開発には未だ至っていなかった。
【００１０】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、便の解析を行わない簡便な腸内細菌の菌叢分析方法、及び簡便且つ正確な被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの検出方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ヘリコバクター・ピロリの除菌治療前後の患者由来の生体試料中のエクソソームにおいて、ヘリコバクター・ピロリ等の腸内細菌由来のタンパク質の種類及び量が変化することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの検出方法であって、
ヘリコバクター・ピロリ感染治療薬を投与された前記被検体から得られた生体試料中のエクソソームに含まれるタンパク質を分析する分析工程を備えることを特徴とする検出方法。
［２］前記分析工程において、Ｆｌａｇｅｌｌｕｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、Ｍａｎｎｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓe、Ｍｅｔｈｙｌ−ａｃｃｅｐｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴｌｐＡ）、Ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｆａｃｔｏｒ  ＢａｍＡ、Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）  ｄｉｃｉｔｒａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦｅｃＡ）、Ｐｅｎｔａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｇｕａｎｏｓｉｎｅ−３−ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＳｐｏＴ）、Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ、６−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ、Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、Ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  Ｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＤＮＡ  ｇｙｒａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａ、３０Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ６、Ｉｎｏｓｉｎｅ−５−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｌｐｈａ、ＵｖｒＡＢＣ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ、及びＦｌａｇｅｌｌａｒ  ｈｏｏｋ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２、ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＨＵ、Pｕｔａｔｉｖｅ  ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ＨｃｐＣ、Ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ−５５３、１０ｋＤａ  ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ、Ｐｒｏｂａｂｌｅ  ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ、Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ［Ｆｅ］、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｎｏｎ−ｈｅｍｅ  ｆｅｒｒｉｔｉｎ、５０Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２、Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｔｕ、Ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ＨＰ＿０１７５、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ、Ｕｒｅａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｂｅｔａ、Ｃａｔａｌａｓｅ、ＣＯＰ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ａｄｅｎｉｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｈｐａｉｍ）、及びＯｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （Ｏｍｐ１１）からなる群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質又はそのペプチド断片を検出する［１］に記載の検出方法。
［３］前記ヘリコバクター・ピロリ感染治療薬は、アモキシシリン、クラルスロマイシン、メトロニダゾール、ランソプラゾール、及びラベプラゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種である［１］又は［２］に記載の検出方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、便の解析を行わない簡便な腸内細菌の菌叢分析方法、及び簡便且つ正確な被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（Ａ）実施例１におけるＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈しないヘリコバクター・ピロリ感染患者、及びヘリコバクター・ピロリ非感染者由来のＰＢＭＣに、ヘリコバクター・ピロリの死菌、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の死菌、又はＰＢＳを添加した各試験群でのＩＬ−２量を測定した結果を示すグラフである。（Ｂ）実施例１におけるＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈しないヘリコバクター・ピロリ感染患者、及びヘリコバクター・ピロリ非感染者由来のＰＢＭＣに、ヘリコバクター・ピロリの死菌、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の死菌、又はＰＢＳを添加した各試験群でのＩＬ−４量を測定した結果を示すグラフである。（Ｃ）実施例１におけるＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈しないヘリコバクター・ピロリ感染患者、及びヘリコバクター・ピロリ非感染者由来のＰＢＭＣに、ヘリコバクター・ピロリの死菌、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の死菌、又はＰＢＳを添加した各試験群でのＩＬ−６量を測定した結果を示すグラフである。（Ｄ）実施例１におけるＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈しないヘリコバクター・ピロリ感染患者、及びヘリコバクター・ピロリ非感染者由来のＰＢＭＣに、ヘリコバクター・ピロリの死菌、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の死菌、又はＰＢＳを添加した各試験群でのＩＦＮ−γ量を測定した結果を示すグラフである。（Ｅ）実施例１におけるＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈しないヘリコバクター・ピロリ感染患者、及びヘリコバクター・ピロリ非感染者由来のＰＢＭＣに、ヘリコバクター・ピロリの死菌、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の死菌、又はＰＢＳを添加した各試験群でのＴＮＦ−α量を測定した結果を示すグラフである。
【図２】実施例２におけるＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者、及びＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈しないヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣに、ヘリコバクター・ピロリの死菌、アモキシシリン、クラルスロマイシン、又はランソプラゾールを添加した各試験群でのリンパ球刺激試験の結果を示すグラフである。
【図３】実施例３におけるＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者、及びＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈しないヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣに、ヘリコバクター・ピロリの死菌、アモキシシリン、クラルスロマイシン、ランソプラゾール、又はＰＢＳを添加した各試験群でのＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を示す画像である。
【図４】（Ａ）実施例４におけるＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣに、アモキシシリン、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の混合薬剤（各４μｇ／ｍＬ）を添加した試験群でのフローサイトメトリーによる解析結果を示すグラフである。（Ｂ）実施例４におけるＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣに、ヘリコバクター・ピロリの死菌を添加した試験群でのフローサイトメトリーによる解析結果を示すグラフである。
【図５】（Ａ）実施例５におけるＤＬＳＴ陰性でありアモキシシリン、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の混合薬剤の投与開始から１０日後に皮疹を呈したヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣに、ヘリコバクター・ピロリの死菌、アモキシシリン、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の混合薬剤（各４μｇ／ｍＬ）、ヘリコバクター・ピロリの死菌及び前記混合薬剤、又はＰＢＳを添加した各試験群でのフローサイトメトリーによるＣＤ４＋Ｔ細胞数に対するＣＤ１５４＋Ｔ細胞数の割合（％）を示すグラフである。（Ｂ）実施例５におけるＤＬＳＴ陰性であり前記混合薬剤の投与開始から１０日より以前（薬剤投与中止から３日より以前）に皮疹を呈したヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣに、ヘリコバクター・ピロリの死菌、アモキシシリン、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の混合薬剤（各４μｇ／ｍＬ）、ヘリコバクター・ピロリの死菌及び前記混合薬剤、又はＰＢＳを添加した各試験群でのフローサイトメトリーによるＣＤ４＋Ｔ細胞数に対するＣＤ１５４＋Ｔ細胞数の割合（％）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜腸内細菌の菌叢分析方法＞
一実施形態において、本発明は、被検体から得られた生体試料中のエクソソームに含まれるタンパク質を分析する分析工程を備える腸内細菌の菌叢分析方法を提供する。
【００１６】
本実施形態の腸内細菌の菌叢分析方法によれば、便の解析を行わず、簡便に腸内細菌の菌叢を分析することができる。
【００１７】
本発明者らは、ヘリコバクター・ピロリ感染治療薬による除菌治療後の患者において、薬疹（薬剤が原因の発疹）以外の皮疹、すなわち、ヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーが起こることを初めて見出した。このとき、ヘリコバクター・ピロリ感染治療薬による除菌治療前後で、患者由来の生体試料中のエクソソームに含まれるタンパク質が変化することを、質量分析を行うことで明らかにした。また、前記エクソソームには、ヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質を含む種々の腸内細菌由来のタンパク質が含まれていることを明らかにした。前記分析結果から、特に、腸内の表層の細胞内に感染している菌がエクソソームに入り、体内に吸収されているものと考えられる。
また、ヒト等の動物の個体ごとに保有する腸内細菌の種類及び量が異なることから、個体ごとにエクソソームに含まれる腸内細菌由来のタンパク質が異なることが推測される。このことから、前記エクソソームに含まれる腸内細菌由来のタンパク質の違いが、個体の生育過程において胸腺でのＴ細胞の教育（自己抗原と非自己抗原との認識等）に関連していると考えられる。よって、エクソソームに含まれる腸内細菌由来のタンパク質を解析することで、免疫系疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（花粉症）、アレルギー性結膜炎、 アレルギー性胃腸炎、気管支喘息、小児喘息、食物アレルギー、薬物アレルギー、蕁麻疹等のアレルギー疾患；ギラン・バレー症候群、クローン病、バセドウ病、橋本病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患）等の機序の解明等へ応用することができる。
【００１８】
一般的に、「エクソソーム」とは、様々な細胞が分泌する直径４０ｎｍ〜１５０ｎｍの膜小胞である。この膜小胞の中には、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ等の核酸、タンパク質、脂質が含まれている。さらに、エクソソームは、分泌細胞とその標的細胞の間でタンパク質や脂質を交換する重要なメッセンジャーであることが明らかとなりつつある。特に、エクソソームには生体内抗原や、抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体が含まれており、免疫細胞間での抗原情報の交換や、免疫細胞の活性化など様々な免疫応答を制御する可能性が示唆されている。よって、本実施形態の腸内細菌の菌叢分析方法においては、前記タンパク質のうち腸内細菌由来のタンパク質が腸内細菌の菌叢を反映しており、さらに免疫の獲得に関与していると考えられる。
また、エクソソームは血液等の生体試料中で数日〜数週間程度安定的に存在する。そのため、エクソソームを用いた分析は安定した結果を得ることができる。
本実施形態の腸内細菌の菌叢分析方法における工程について、以下に詳細を説明する。
【００１９】
［分析工程］
まず、被検体から生体試料を採取する。
前記被検体としては、例えば、特別な限定はなく、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等が挙げられ、これらに限定されない。また、被検体の種類は、目的等により任意に選択することができる。中でも、被検体はヒトであることが好ましい。被検体がヒトであることにより、ヒトにおける腸内細菌の菌叢を分析することができ、さらに免疫系疾患の機序の解明研究等へ応用することができる。
【００２０】
前記生体試料としては、エクソソームを含むものであればよいが、エクソソームはほとんどの細胞から分泌されており、多くの生体試料中にはエクソソームが含まれている。このため、前記生体試料としては、特別な限定はなく、例えば、被検体から採取された体液試料、被検体から採取された細胞の抽出液、被検体から採取された細胞の培養上清等が挙げられ、これらに限定されない。
中でも、前記生体試料としては、採取が容易であることから、被検体から採取された体液試料であることが好ましい。
【００２１】
前記体液試料としてより具体的には、例えば、血液、血清、血漿、尿、パフィーコート、唾液、涙液、痰、粘液、リンパ液、腹水、胸水、膀胱洗浄液等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、前記体液試料としては、採取が容易であり、その他検査における試料としても併用できることから、血液、血清、血漿、尿、パフィーコート、又は唾液であることが好ましい。
【００２２】
前記被検体由来の細胞としてより具体的には、例えば、生体を構成する体細胞のうち消化器系、循環器系、泌尿器系、内分泌系の器官を構成する組織由来の細胞、生体を構成する体細胞のうち消化器系、循環器系、泌尿器系、内分泌系の器官を構成する組織から分離されたがん細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
前記組織由来の細胞としては、例えば、腎臓、副腎、肝臓、膵臓、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、胸腺、血管組織、血液、心臓等の任意の組織から採取される細胞等が挙げられ、これらに限定されない。体細胞として、より具体的には、例えば、骨髄細胞、免疫細胞（例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、マクロファージ、単球、等）、赤血球、血小板、周皮細胞、樹状細胞、上皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、肝細胞、膵島細胞（例えば、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞等）、心筋細胞、食道細胞、単核細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２３】
前記がん細胞とは、体細胞のうち消化器系、循環器系、泌尿器系、内分泌系の器官を構成する組織由来の細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。がん細胞の由来となる癌としては、例えば、膵癌（例えば、膵管癌等）、胃癌（例えば、乳頭腺癌、粘液性腺癌、腺扁平上皮癌等）、結腸癌（例えば、消化管間質腫瘍等）、直腸癌（例えば、消化管間質腫瘍等）、大腸癌（例えば、家族性大腸癌、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、消化管間質腫瘍等）、小腸癌（例えば、非ホジキンリンパ腫、消化管間質腫瘍等）、食道癌、十二指腸癌、舌癌、咽頭癌（例えば、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌等）、唾液腺癌、肝臓癌（例えば、原発性肝癌、肝外胆管癌等）、腎臓癌（例えば、腎細胞癌、腎盂と尿管との移行上皮癌等）、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、膀胱癌、尿道癌、血管腫、悪性リンパ腫（例えば、細網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病等）、副甲状腺癌、血管線維腫、小児固形癌（例えば、小児腎腫瘍等）、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、慢性骨髄増殖性疾患、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病等）等が挙げられ、これらに限定されない。
なお、本明細書において、「癌」とは、診断名を表す際に用いられ、「がん」とは、悪性新生物の総称を表す際に用いられる。
【００２４】
分析工程において、生体試料中のエクソソームを単離及び精製して用いることが好ましい。単離及び精製方法としては、使用する生体試料の種類に応じて、適宜公知の方法に基づき行うことができる。
単離及び精製方法としては、例えば、遠心分離、超遠心分離、濾過、膜分離、吸着分離、免疫沈降、吸水処理等を用いて、精製することができる。また、これらの単離及び精製方法のうち、遠心分離、超遠心分離、及び濾過を組み合わせた分画遠心法（参考文献１：「Thery C. et al., “UNIT 3.22 Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids”, Current Protocols in Cell Biology, Chapter 3:Unit 3.22, doi: 10.1002/0471143030.cb0322s30, 2006.」、参考文献２：「Luga V. et al., “Exosomes Mediate Stromal Mobilization of Autocrine Wnt-PCP Signaling in Breast Cancer Cell Migration”, Cell, vol. 151, Issue 7, p1542-1556, 2012.」）を用いて、精製することができる。
前記分画遠心法としてはより具体的には、まず生体試料を８００ｇ及び２，０００ｇにて連続遠心分離を行い、次いで、得られた上清をフィルター濾過し、さらに、１００，０００ｇにて遠心分離を行うことで、分離及び精製されたエクソソーム画分を得ることができる。分離処理を行うにあたっては、市販の分離器等の機器を用いればよい。
【００２５】
また、分離処理時の温度は、試料の種類に応じて適宜設定することができ、例えば０℃以上１０℃以下であればよく、例えば０℃以上５℃以下であればよい。
【００２６】
得られた画分にエクソソームが含まれることについては、フローサイトメトリー法等により、エクソソームの膜に存在する抗原タンパク質（例えば、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＨＬＡ−ＡＢＣ）を検出することで確認することができる。
【００２７】
得られたエクソソーム画分は、ＰＢＳ等を用いて洗浄し、さらに溶解緩衝液（例えば、尿素／ＳＤＳ、ロイペプチン、ペプスタチン、及びフッ化フェニルメチルスルホニル含有緩衝液等）に再懸濁させて、エクソソームに含まれるタンパク質を抽出して用いればよい。
【００２８】
次いで、生体試料中のエクソソームに含まれるタンパク質を分析する。
分析方法としては、例えば、質量分析法、タンパク質マイクロアレイ等が挙げられ、これらに限定されない。
前記質量分析法としては、例えば、ＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法等が挙げられ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳなどにより分析することができる。
【００２９】
分析工程において、タンパク質の分析により得られた結果から、腸内細菌由来のタンパク質を選択し解析することで、被検体の腸内細菌の菌叢を推測することができる。
また、後述のヘリコバクター・ピロリ等の腸内細菌に対するアレルギーの有無を判定するための指標となり得る。
また、腸内細菌叢は、がん、心臓病、免疫系疾患、痴呆症等の各種疾患との関連性も指摘されているため、腸内細菌叢のバランスと前記疾患との関連性の解明研究に応用することができる。
【００３０】
＜被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの検出方法＞
一実施形態において、本発明は、被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの検出方法であって、ヘリコバクター・ピロリ感染治療薬を投与された前記被検体から得られた生体試料中のエクソソームに含まれるタンパク質を分析する分析工程を備える検出方法を提供する。
【００３１】
本実施形態の検出方法によれば、被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの有無を簡便且つ正確に判定することができる。また、被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの有無が明らかとなることで、ヘリコバクター・ピロリ感染の除菌治療に失敗した場合に、薬疹がなく被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーを有しない被検体においては、２次除菌を行うことができる。一方、薬疹がなく被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーを有する被検体においても、２次除菌を行いながら、ヘリコバクター・ピロリに対するアレルギー反応の抑制又は緩和治療も並行して行うことができる。
【００３２】
被検体において、腸内において死滅したヘリコバクター・ピロリ等の腸内細菌は腸内を通って便として排出、又は腸管から吸収され体内を循環し、尿として排出される。このとき、体内を循環するヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質の一部はマクロファージ又は樹状細胞に取り込まれ、プロセッシングされた後、前記マクロファージ又は樹状細胞からヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質を含むエクソソームとして放出される。この放出されたエクソソームは免疫細胞の活性化に関与すると考えられる。よって、除菌治療により被検体の生体試料中のエクソソームに含まれるヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質の量が増加することで、免疫反応が惹起されると考えられる。これにより、ヘリコバクター・ピロリに対するアレルギー反応が皮疹等の形で現れる。
本実施形態の検出方法における工程について、以下に詳細に説明する。
【００３３】
［分析工程］
まず、ヘリコバクター・ピロリ感染治療薬を投与された被検体から生体試料を採取する。
前記被検体としては、上述の＜腸内細菌の菌叢分析方法＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、被検体はヒトであることが好ましい。被検体がヒトであることにより、ヘリコバクター・ピロリ感染の２次除菌の実施可否を判断することができる。
【００３４】
前記ヘリコバクター・ピロリ感染治療薬としては、例えば、アモキシシリン、クラルスロマイシン、メトロニダゾール、ランソプラゾール、ラベプラゾール等が挙げられ、これらに限定されない。これらの治療薬は、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。中でも、治療薬は、アモキシシリン、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールを混合して用いることが好ましい。
服用方法及び服用量については、有効成分の種類、被検体の年齢、性別、体重、症状、投与方法、処理時間等を勘案して適宜調節される。例えば、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１回につき、アモキシシリン（形状：水和物）を７５０ｍｇ程度、クラルスロマイシンを２００ｍｇ程度、及びランソプラゾール（形状：ナトリウム塩）を１０ｍｇ程度同時に、１日２回、７日間続けて経口投与すればよい。
なお、クラルスロマイシンは、１回４００ｍｇ、１日２回を上限として、必要に応じて適宜増量することができる。
【００３５】
また、被検体において生体試料を採取するタイミングとしては、例えばヘリコバクター・ピロリ感染治療薬の投与期間の終了直後から１５日以内であればよく、例えば投与期間の終了から３日以上１０日以内であればよい。
【００３６】
前記生体試料としては、上述の＜腸内細菌の菌叢分析方法＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、前記生体試料としては、採取が容易であることから、被検体から採取された体液試料であることが好ましい。
【００３７】
前記体液試料としては、上述の＜腸内細菌の菌叢分析方法＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、前記体液試料としては、採取が容易であり、その他検査における試料としても併用できることから、血液、血清、血漿、尿、パフィーコート、又は唾液であることが好ましい。
【００３８】
分析工程において、生体試料中のエクソソームを単離及び精製して用いることが好ましい。単離及び精製方法としては、使用する生体試料の種類に応じて、適宜公知の方法に基づき行うことができる。
単離及び精製方法としては、上述の＜腸内細菌の菌叢分析方法＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００３９】
得られた画分にエクソソームが含まれることについては、フローサイトメトリー法等により、エクソソームの膜に存在する抗原タンパク質（例えば、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＨＬＡ−ＡＢＣ）を検出することで確認することができる。
【００４０】
得られたエクソソーム画分は、ＰＢＳ等を用いて洗浄し、エクソソームに含まれるタンパク質を抽出して用いればよい。
エクソソーム中のタンパク質の抽出方法としては、例えば、界面活性剤又はカオトロピック試薬を用いた抽出方法等が挙げられる。
前記界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウム等の陰イオン界面活性化剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、トリトン（登録商標）Ｘ−１００、ｎ−Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ等の非イオン界面活性剤等を挙げることができ、これらに限定されない。
界面活性剤は、タンパク質量に応じて、所定の割合で添加すればよく、例えば、エクソソームを含む溶液における界面活性剤の濃度は、例えば０．０００１（ｗ／ｖ）％以上１（ｗ／ｖ）％以下であればよく、例えば０．００２（ｗ／ｖ）％以上０．０５（ｗ／ｖ）％以下であればよく、例えば０．００５（ｗ／ｖ）％以上０．５（ｗ／ｖ）％以下であればよい。
界面活性剤が陰イオン界面活性化剤、特にＳＤＳである場合、エクソソームを含む溶液における界面活性化剤の濃度は、例えば０．００１（ｗ／ｖ）％以上０．０５（ｗ／ｖ）％以下であればよく、例えば０．００５（ｗ／ｖ）％以上０．００８（ｗ／ｖ）％以下であればよい。
このように比較的低い濃度の界面活性剤を用いることにより、効果的にタンパク質を抽出することができる。
【００４１】
また、前記カオトロピック試薬としては、カオトロピック効果を生じさせる物質であればよく、例えば、チオシアン酸イオン等のカオトロピック塩であってもよく、具体的には、尿素、グアニジン塩酸、グアニジンイソチオシアネート等が挙げられる。
前記界面活性剤と前記カオトロピック試薬とは混合して用いてもよい。
【００４２】
また、上記エクソソームの単離及び精製と、エクソソーム中のタンパク質の抽出方法について、市販のキット（例えば、ＤｉａｇＥｘｏ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ  Ｅｘｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（１０１  Ｂｉｏ社製）、Ｔｏｔａｌ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  ＲＮＡ  ＆  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等）を用いて行ってもよい。
【００４３】
次いで、生体試料中のエクソソームに含まれるタンパク質を分析する。
分析方法としては、上述の＜腸内細菌の菌叢分析方法＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００４４】
分析工程において、タンパク質の分析により得られた結果から、ヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質が検出された場合、被検体においてヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーを有すると判定することができる。
【００４５】
前記ヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質としては、例えば、Ｆｌａｇｅｌｌｕｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、Ｍａｎｎｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓe、Ｍｅｔｈｙｌ−ａｃｃｅｐｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴｌｐＡ）、Ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｆａｃｔｏｒ  ＢａｍＡ、Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）  ｄｉｃｉｔｒａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦｅｃＡ）、Ｐｅｎｔａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｇｕａｎｏｓｉｎｅ−３−ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＳｐｏＴ）、Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ、６−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ、Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、Ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  Ｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＤＮＡ  ｇｙｒａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａ、３０Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ６、Ｉｎｏｓｉｎｅ−５−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｌｐｈａ、ＵｖｒＡＢＣ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ、及びＦｌａｇｅｌｌａｒ  ｈｏｏｋ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２、ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＨＵ、Pｕｔａｔｉｖｅ  ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ＨｃｐＣ、Ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ−５５３、１０ｋＤａ  ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ、Ｐｒｏｂａｂｌｅ  ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ、Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ［Ｆｅ］、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｎｏｎ−ｈｅｍｅ  ｆｅｒｒｉｔｉｎ、５０Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２、Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｔｕ、Ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ＨＰ＿０１７５、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ、Ｕｒｅａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｂｅｔａ、Ｃａｔａｌａｓｅ、ＣＯＰ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ａｄｅｎｉｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｈｐａｉｍ）、Ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （Ｏｍｐ１１）等が挙げられ、これらに限定されない。また、これらのタンパク質のペプチド断片であってもよい。これらのタンパク質のうち、少なくとも１種が検出されることにより、被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの有無を判定することができる。
【００４６】
また、本実施形態の検出方法において、薬剤アレルギー検査を並行して実施してもよい。前記薬剤アレルギー検査としては、例えば、パッチテスト（スクラッチパッチテスト）、プリックテスト、内服テスト（誘発テスト）、薬剤によるリンパ球刺激試験（ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ；ＤＬＳＴ）等が挙げられ、これらに限定されない。
薬剤アレルギー検査を実施することにより、２次除菌の実施可否を判断することができる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４８】
［実施例１］
（１）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来の末梢血単核球の採取
まず、ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者（１５名、内皮疹を呈した患者１２名、及び皮疹を呈しない患者３名）から採血し、ヘパリン含有採血管に採取した。次いで、フィコール比重遠心法により、末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）を単離した。
なお、ヘリコバクター・ピロリ感染患者におけるヘリコバクター・ピロリ除菌は、１回につき、アモキシシリン（形状：水和物）７５０ｍｇ、クラルスロマイシン２００ｍｇ、及びランソプラゾール（形状：ナトリウム塩）１０ｍｇを同時に経口投与し、１日２回、７日間続けて経口投与することで行った。
【００４９】
得られたＰＢＭＣは、１０ｃｍディッシュに播種し、３７℃、５％二酸化濃度の環境下で培養し、培養開始９０分後に非接着細胞を取り除き、接着した細胞を７日間培養し、維持した。ＰＢＭＣの培養には、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、及び１００ｎｇ／ｍＬヒト組換え顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｃｏｌｏｎｙ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ：ＧＭ−ＣＳＦ）（ＲＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）含有ＲＰＭＩ培地を用いた。
【００５０】
（２）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣを用いたリンパ球刺激試験
次いで、得られたＰＢＭＣのうち皮疹を呈したヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣを用いて、薬剤によるリンパ球刺激試験（ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ；ＤＬＳＴ）を行った。具体的には、前記ＰＢＭＣを浮遊培養し、アモキシシリン、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の薬剤を各４μｇ／ｍＬで添加し、５日間培養した。次いで、トリチウムチミジン（３Ｈ−チミジン）（パーキンエルマー社製）を投与し、１２時間培養し、ＤＮＡ合成に使用されたチミジン量を液体シンチレーションカウンターで計測した。すなわち、前記治療薬の添加により、３Ｈ−チミジン取り込み量が増加した場合、薬剤特異的Ｔ細胞が存在すると判断することができる。
【００５１】
ＤＬＳＴにより、ヘリコバクター・ピロリ除菌後、皮疹を呈した患者１２名のうち、３名はＤＬＳＴ陽性であり、残りの９名はＤＬＳＴ陰性であった（図示せず）。
よって、上記９名については、薬剤以外の要因により皮疹が起きたことが示唆された。
【００５２】
（３）サイトカイン量の測定
次いで、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈しないヘリコバクター・ピロリ感染患者、及びヘリコバクター・ピロリ非感染者由来のＰＢＭＣに、ヘリコバクター・ピロリの死菌（１．０×１０７／ＣＦＵ）、対照群として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＡＴＣＣ２５９９２株）の死菌（１．０×１０７／ＣＦＵ）、又はコントロールとしてＰＢＳを添加し、２４時間培養した。次いで、各培養液を４℃で５分間２，５００ｒｐｍで遠心分離した。次いで、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２７−Ｐｌｅｘ  ｐａｎｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて、得られた上清に含まれるサイトカイン量を測定した。具体的には、ＥＬＩＳＡキット（ＲＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、サイトカインとして、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ（ＩＦＮ）−γ、及びｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）−αの量を測定した。結果を図１（Ａ）〜（Ｅ）に示す。図１（Ａ）〜（Ｅ）において、「ＨＰ（−）」とはヘリコバクター・ピロリ非感染者由来のＰＢＭＣを意味し、「ＨＰ（＋）」とはヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを意味し、「ＳＥ（＋）」とは皮疹を呈する患者由来のＰＢＭＣを意味する。すなわち、「ＨＰ（−）」とは、ヘリコバクター・ピロリ非感染者由来のＰＢＭＣを用いた試験群であり、「ＨＰ（＋）ＳＥ（−）」とは、皮疹を呈しないヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いた試験群であり、「ＨＰ（＋）ＳＥ（＋）」とは、皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いた試験群である。また、図１（Ａ）〜（Ｅ）において、「ＨＰ」はヘリコバクター・ピロリの死菌を添加した試験群であり、「Ｅ．ｃｏｌｉ」は大腸菌の死菌を添加した対照群であり、「ＰＢＳ」はＰＢＳを添加したコントロール群である。
【００５３】
図１（Ａ）〜（Ｅ）から、「ＨＰ（＋）ＳＥ（＋）」群のうち、ヘリコバクター・ピロリの死菌を添加した試験群において、各種サイトカインの有意な上昇が認められた。これに対し、「ＨＰ（−）」群、及び「ＨＰ（＋）ＳＥ（−）」群においては、各種サイトカインの上昇は認められなかった。
このことから、ＤＬＳＴ陰性であり、皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣでは、ヘリコバクター・ピロリの死菌の存在により、サイトカインの分泌が惹起されたと推察された。
【００５４】
［実施例２］
（１）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣの採取
実施例１で採取したＰＢＭＣを実施例２においても使用した。
【００５５】
（２）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣを用いたリンパ球刺激試験
次いで、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者、及びＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈しないヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いて、アモキシシリン、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の薬剤（各４μｇ／ｍＬ）の他に、ヘリコバクター・ピロリの死菌（１．０×１０７／ＣＦＵ）を添加した以外は、実施例１の（２）と同様の方法を用いて、リンパ球刺激試験を行った。結果を図２に示す。図２において、「Ｐａｔｉｅｎｔ  ５」とはＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈する特定のヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いた試験群であり、「Ｐａｔｉｅｎｔ  ６」とはＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈する特定のヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いた試験群であり、「ＨＰ（＋）ＳＥ（−）」とは、皮疹を呈しないヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いた試験群である。
【００５６】
図２から、「Ｐａｔｉｅｎｔ  ５」群おいて、ヘリコバクター・ピロリの死菌の存在により、ヘリコバクター・ピロリ特異的Ｔ細胞が存在することが確かめられた。
【００５７】
［実施例３］
（１）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣの採取
実施例１で採取したＰＢＭＣを実施例３においても使用した。
【００５８】
（２）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣを用いたＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
次いで、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者、及びＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈しないヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣに、ヘリコバクター・ピロリの死菌（１．０×１０７／ＣＦＵ、又は３．３×１０６／ＣＦＵ）、アモキシシリン、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の薬剤（各４μｇ／ｍＬ）、又はＰＢＳを添加し、２４時間培養した。次いで、各ＰＢＭＣを回収し、ヒトＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔＰＲＯ  キット（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ社製）を用いて、抗原特異的ＩＦＮ−γ産生細胞の存在を確かめた。データは、２×１０５細胞のＰＢＭＣ当たりのスポット形成単位（ＣＦＵ）として表示した。また、ポジティブコントロールとして、ポリクローナル活性化剤である抗ＣＤ３抗体を用いた。スポットの計測は、ＣＴＬ−ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  Ｓ５  ＵＶ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）及びＣＴＬ  ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０  ｒｅａｄｅｒ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて行った。結果を図３に示す。図３において、「ＨＰ」は、ヘリコバクター・ピロリの死菌を１．０×１０７／ＣＦＵ添加した試験群であり、「ＨＰ（ｏｎｅ ｔｈｉｒｄ ｏｆ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）」はヘリコバクター・ピロリの死菌を３．３×１０６／ＣＦＵ添加した試験群であり、「Ａｍｏｘｉｃｉｌｌｉｎ」はアモキシシリンを４μｇ／ｍＬ添加した試験群であり、「Ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ」はクラルスロマイシンを４μｇ／ｍＬ添加した試験群であり、「Ｌａｎｓｏｐｒａｚｏｌｅ」はランソプラゾールを４μｇ／ｍＬ添加した試験群であり、「ＰＢＳ」はＰＢＳを添加したコントロール群である。また、「Ｐａｔｉｅｎｔ  ５」とはＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈する特定のヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いた試験群であり、「Ｐａｔｉｅｎｔ  ６」とはＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈する特定のヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いた試験群であり、「ＨＰ（＋）ＳＥ（−）」とは、皮疹を呈しないヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いた試験群である。
【００５９】
図３から、「Ｐａｔｉｅｎｔ  ５」群おいて、ヘリコバクター・ピロリの死菌の濃度依存的に、ＰＢＭＣ中のＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞の数が上昇していた。一方、薬剤を添加した試験群ではＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞は認められなかった。
【００６０】
［実施例４］
（１）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣの採取
実施例１で採取したＰＢＭＣを実施例４においても使用した。
【００６１】
（２）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣを用いたフローサイトメトリー
次いで、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣに、ヘリコバクター・ピロリの死菌（１．０×１０７／ＣＦＵ）、又はアモキシシリン、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の混合薬剤（各４μｇ／ｍＬ）を添加し、２４時間培養した。次いで、各ＰＢＭＣを回収し、以下の抗体及び試薬を用いて染色した。
・ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）
・ＰＥ−Ｃｙ７結合抗ＣＤ３抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）
・ＰＥ結合抗ＣＤ１５４抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）
・ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ８１抗体 (ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製)
・ＰＥ結合抗ＣＤ９抗体(ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製)
・Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ結合抗ＣＤ６３抗体(ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製)
・ＰＥ−Ｃｙ７結合抗ＨＬＡ−ＡＢＣ抗体(ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製)
・ＰｅｒＣＰ  ｃｙ５．５結合抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体(ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製)
・Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ (Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製)
【００６２】
次いで、染色した細胞をＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ  ｏｒ  Ａｒｉａ  ＩＩＩ  ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ(ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製)を用いて、測定した。次いで、得られたデータをＦｌｏｗＪｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社製）を用いて、解析した。結果を図４（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図４（Ａ）において、「ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ」は、アモキシシリン、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の混合薬剤（各４μｇ／ｍＬ）を添加した試験群であり、図４（Ｂ）において、「ＨＰ」はヘリコバクター・ピロリの死菌を１．０×１０７／ＣＦＵ添加した試験群である。
【００６３】
図４（Ａ）及び（Ｂ）から、「ＨＰ」群では、ヘリコバクター・ピロリの添加により初期活性マーカーであるＣＤ１５４が高発現していることが確かめられた。このことから、「ＨＰ」群では、ヘリコバクター・ピロリ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が存在することが確かめられた。
【００６４】
［実施例５］
（１）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣの採取
実施例１で採取したＰＢＭＣを実施例５においても使用した。
【００６５】
（２）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣを用いたフローサイトメトリー
次いで、ＤＬＳＴ陰性でありアモキシシリン、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の混合薬剤の投与開始から１０日後（薬剤投与中止から３日後）に皮疹を呈したヘリコバクター・ピロリ感染患者、及びＤＬＳＴ陰性であり前記混合薬剤の投与開始から１０日より以前（薬剤投与中止から３日より以前）に皮疹を呈したヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣに、ヘリコバクター・ピロリの死菌（１．０×１０７／ＣＦＵ）、アモキシシリン、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の混合薬剤（各４μｇ／ｍＬ）、ヘリコバクター・ピロリの死菌（１．０×１０７／ＣＦＵ）及び前記混合薬剤、又はＰＢＳを添加し、２４時間培養した以外は、実施例４の（２）と同様の方法を用いて、フローサイトメトリーを行った。次いで、得られたデータから、ＣＤ４＋Ｔ細胞数に対するＣＤ１５４＋細胞数の割合（％）を計算した。結果を図５（Ａ）及び（Ｂ）に示す。
図５（Ａ）及び（Ｂ）において、「Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ  ＋  ｄｒｕｇ」はヘリコバクター・ピロリの死菌及び前記混合薬剤を添加した試験群であり、「Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ」はヘリコバクター・ピロリの死菌のみを添加した試験群であり、「ｄｒｕｇｓ」は前記混合薬剤のみを添加した試験群であり、「ＰＢＳ」はＰＢＳを添加したコントロール群である。
また、図５（Ａ）において、「≧１０ｄａｙｓ」はＤＬＳＴ陰性であり前記混合薬剤の投与開始から１０日後（薬剤投与中止から３日後）に皮疹を呈したヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いた試験群であり、「＜１０ｄａｙｓ」はＤＬＳＴ陰性であり前記混合薬剤の投与開始から１０日より以前（薬剤投与中止から３日より以前）に皮疹を呈したヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いた試験群である。
【００６６】
図５（Ａ）及び（Ｂ）から、「≧１０ｄａｙｓ」群では、ヘリコバクター・ピロリの添加により、ＣＤ１５４＋Ｔ細胞の割合が上昇していることが確かめられた。このことから、「≧１０ｄａｙｓ」群では、ヘリコバクター・ピロリ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が存在することが確かめられた。
【００６７】
［実施例６］
（１）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来の血液試料の採取
実施例１において採血した各血液試料のうちＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈したヘリコバクター・ピロリ感染患者の血液試料について、採血管を転倒講和して３０分間静置した。次いで、３，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行い、上清（血清）を得た。得られた血清は使用するまで、冷蔵保存した。
【００６８】
（２）血液試料からエクソソームの単離
次いで、（１）で得られた血清について、３００×ｇで遠心分離を行い、上清を得た。次いで、得られた上清を１００，０００×ｇで超遠心分離して、エクソソームのペレットを得た。得られたエクソソームのペレットをＰＢＳで洗浄した後、少量のＰＢＳに再懸濁した。
また、得られたエクソソームについて、エクソソームマーカー（ＣＤ９、ＣＤ８１、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＨＬＡ−ＡＢＣ）を各マーカーに対する抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた染色を行い、フローサイトメトリーにより解析し確認した。
【００６９】
（３）液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によるエクソソームに含まれるタンパク質の解析
次いで、（２）で得られたエクソソームのペレットについて、相関移動溶解法(ＰＴＳ（Ｐｈａｓｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）法)を用いて、タンパク質を抽出した。具体的には、前記（２）で得られたエクソソームのペレットに、陰イオン性界面活性剤であるデオキシコール酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ；ＳＤＣ）及びＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）を１２ｍＭとなるように添加し、膜タンパク質を溶解した。次いで、有機溶媒として酢酸エチル（ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）（最終濃度５０％）を添加し、さらにトリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ；ＴＦＡ）（最終濃度０．５％）を添加して酸性条件下とすることで有機相に界面活性剤を移動させて、水相を回収することで界面活性剤を除去した。次いで、水相に含まれるエクソソームに含まれていたタンパク質を１質量％のトリプシンを用いて、３７℃で一晩消化処理した。次いで、ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００  ｎａｎｏ−ｆｌｏｗ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｉｏｎｅｘ社製）及びＨＴＣ−ＰＡＬ  ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ（ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ社製）、並びにＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ(Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製)を用いた液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により、消化処理されたタンパク質を測定した。測定データはＭａｘＱｕａｎｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．５．１．２）を用いて解析した。また、ピークリストはＡｎｄｒｏｍｅｄａ  ｓｅａｒｃｈ  ｅｎｇｉｎｅを用いて、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＨＰ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅと照合して解析した。質量分析において、「ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｍａｓｓ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ」＝７ｐｐｍ、「ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ」＝０．０１Ｄａとなるように設定した。タンパク質の解析結果のうち、ヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質を以下の表１に示す。
【００７０】
【表１】
2020201281.tif 000002
【００７１】
表１から、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈したヘリコバクター・ピロリ感染患者の血液試料由来のエクソソームには、ヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質が存在することが確かめられた。
【００７２】
［実施例７］
（１）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣの採取
実施例１で採取したＰＢＭＣのうち、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈したヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを実施例７においても使用した。
【００７３】
（２）血液試料からエクソソームの単離
次いで、血清の代わりに前記ＰＢＭＣの培養上清を用いた以外は、実施例６の（２）と同様の方法を用いて、エクソソームを単離した。
【００７４】
（３）液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によるエクソソームに含まれるタンパク質の解析
次いで、実施例６の（３）と同様の方法を用いて、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によるエクソソームに含まれるタンパク質の解析を行った、タンパク質の解析結果のうち、ヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質を以下の表２に示す。
【００７５】
【表２】
2020201281.tif 000003
【００７６】
表２から、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈したヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣの培養上清に含まれるエクソソームには、ヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質が存在することが確かめられた。
【００７７】
［実施例８］
（１）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来の血液試料の採取
ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者において、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の混合薬剤の投与開始直後、３日後、７日後、及び１０日後に採血を行った。次いで、採血管を転倒講和して３０分間静置した。次いで、３，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行い、上清（血清）を得た。得られた血清は使用するまで、冷蔵保存した。
【００７８】
（２）血液試料からエクソソームの単離
次いで、採血日の異なる血清を複数用いた以外は、実施例６の（２）と同様の方法を用いて、エクソソームを単離した。
【００７９】
（３）安定同位体ラベル化法を用いたペプチドの標識及びイオン交換カラムを用いたタンパク質の分離
次いで、得られたエクソソームについて、実施例６の（３）と同様にＰＴＳ法を用いて、タンパク質を抽出した。次いで、抽出されたエクソソームに含まれていたタンパク質をアミン反応性ＴＭＴ１０ｐｌｅｘ（登録商標）  Ｉｓｏｂａｒｉｃ  Ｌａｂｅｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｅｔ (Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製)を用いた安定同位体ラベル化法により、タンパク質を標識した。次いで、標識されたタンパク質を含む溶液をイオン交換カラムを用いて、分画した。
【００８０】
（４）質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）によるエクソソームに含まれるタンパク質の解析
次いで、分画されたタンパク質について、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ(Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製)を用いたー質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）により、測定した。測定データはＭａｘＱｕａｎｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．５．１．２）を用いて解析した。また、ピークリストはＡｎｄｒｏｍｅｄａ  ｓｅａｒｃｈ  ｅｎｇｉｎｅを用いて、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＨＰ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅと照合して解析した。質量分析において、「ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｍａｓｓ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ」＝７ｐｐｍ、「ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ」＝０．０１Ｄａとなるように設定した。タンパク質の解析結果のうち、ヘリコバクター・ピロリ由来以外の腸内細菌由来のタンパク質を以下の表３に示す。
【００８１】
【表３】
2020201281.tif 000004
【００８２】
表３から、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の混合薬剤の投与より、ヘリコバクター・ピロリ以外の腸内細菌由来のタンパク質について、エクソソームにおける含有量が減ることが確かめられた。このことから、薬剤の投与より、ヘリコバクター・ピロリ以外の腸内細菌についても除菌されることが推察される。
また、薬剤の投与後に増加するヘリコバクター・ピロリ以外の腸内細菌由来のタンパク質も存在する。例えば、表３において、「Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｊｅｊｕｎｉ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ｏ：２３／３６」はギラン・バレー症候群の原因菌とされている。このことから、エクソソームに含まれる腸内細菌由来のタンパク質を解析することは、各種疾患と腸内細菌叢との関連性を解明するために有用であると考えられる。
【００８３】
以上のことから、ヘリコバクター・ピロリ感染患者の血液試料由来のエクソソームに含まれているタンパク質を分析することにより、前記患者におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの有無を判定することができる。また、被検体の血液試料由来のエクソソームに含まれているタンパク質を分析することにより、被検体の腸内細菌の菌叢を簡便に分析することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の腸内細菌の菌叢分析方法によれば、便の解析を行わず、簡便に腸内細菌の菌叢を分析することができる。さらに、腸内細菌叢は、がん、心臓病、免疫系疾患、痴呆症等の各種疾患との関連性も指摘されているため、腸内細菌叢のバランスと前記疾患との関連性の解明研究に応用することができる。
また、本発明の検出方法によれば、被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの有無を簡便且つ正確に判定することができる。さらに、被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの有無が明らかとなることで、ヘリコバクター・ピロリ感染の除菌治療に失敗した場合に、薬疹がなく被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーを有しない被検体においては、２次除菌を行うことができる。一方、薬疹がなく被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーを有する被検体においても、２次除菌を行いながら、ヘリコバクター・ピロリに対するアレルギー反応の抑制又は緩和治療も並行して行うことができる。
【図１】
2020201281.tif 000005
【図２】
2020201281.tif 000006
【図３】
2020201281.tif 000007
【図４】
2020201281.tif 000008
【図５】
2020201281.tif 000009
【配列表】
2020201281000001.app