(57)【要約】【課題】本発明は、培養角膜内皮細胞の純化、作製方法、特に形質転換細胞を含まない角膜内皮細胞のために使用するための細胞表面マーカーを提供する。【解決手段】本発明は、正常細胞と形質転換細胞と、特に角膜内皮細胞の正常細胞と形質転換細胞とを識別するための細胞マーカーを提供する。この細胞マーカーは、特定の細胞表面マーカーであり、例えば、ＣＤ１６６などの正常角膜内皮表面マーカーおよびＣＤ７３などの形質転換細胞表面マーカーに関する。ＣＤ７３などの形質転換細胞表面マーカーを用いて形質転換細胞をソーティングにより除去することで、正常培養角膜内皮の純度を向上させることが可能となる。ＣＤ１６６などの正常角膜内皮表面マーカーも使用または形質転換細胞表面マーカーと併用することにより、調製した角膜内皮の純度を確認する手段も提供することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞、特に眼科領域の分化状態のマーカー、特に角膜内皮細胞マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
視覚情報は、眼球の最前面の透明な組織である角膜から取り入れられた光が、網膜に達して網膜の神経細胞を興奮させ、発生した電気信号が視神経を経由して大脳の視覚野に伝達することで認識される。良好な視力を得るためには、角膜が透明であることが必要である。角膜の透明性は、角膜内皮細胞のポンプ機能およびバリア機能により、含水率が一定に保たれることにより保持される。
【０００３】
角膜は眼球の前方に位置し、主に角膜上皮細胞層、角膜実質層、角膜内皮細胞層の３層構造を持った透明な組織である。角膜内皮細胞層は角膜深層部に存在する単層の細胞層であり、バリア機能とポンプ機能を持ち、角膜の水分量を一定に保つことで角膜の透明性を維持する役割を果たしている。また、障害を受けても生体内で増殖しないことが知られており、角膜内皮細胞が外傷や疾患等によって障害されて細胞数が減少することで、重篤な視覚障害が生じることが知られている。
【０００４】
ヒトの角膜内皮細胞は、出生時には１平方ミリメートル当たり約３０００個の密度で存在しているが、一度障害を受けると再生する能力を持たない。角膜内皮変性症や種々の原因による角膜内皮の機能不全によって生じる水疱性角膜症では、角膜が浮腫と混濁を生じ、著しい視力低下をきたす。現在、水疱性角膜症に対しては、角膜の上皮、実質および内皮の３層構造のすべてを移植する全層角膜移植術が行われている。しかし、日本での角膜提供は不足しており、角膜移植の待機患者約２６００人に対し、年間に国内ドナー角膜を用いて行われている角膜移植件数は１７００件程度である。
【０００５】
近年、拒絶反応や術後合併症のリスクを軽減し、よりよい視機能を得る目的から、障害を受けた組織のみを移植する「パーツ移植」の考えが注目されている。角膜移植の中でも、実質組織の移植である深層表層角膜移植術、角膜内皮組織の移植であるデスメ膜角膜内皮移植術（Descemet's  Stripping  Automated  Endothelial  Keratoplasty）などが行われるようになっている。また、生体外で培養した角膜上皮や口腔粘膜を角膜上皮の代わりに移植する培養粘膜上皮移植術は既に臨床応用されており、同様に生体外で培養した角膜内皮を移植する方法も検討されている。
【０００６】
角膜内皮細胞を再生して利用する手法が検討されているが、再生した角膜内皮細胞を識別するマーカーはあまり存在しない。
【０００７】
特許文献１は、角膜内皮細胞マーカーの記載はあるが、本発明のものとは異なる。特許文献２は、角膜内皮細胞マーカーを開示するがいずれも表面抗原ではない。特許文献３は、角膜内皮細胞を識別することを開示するが、使用しているマーカーは神経堤マーカーである。
【０００８】
非特許文献１では、角膜内皮細胞特異的細胞表面マーカーの同定の記載はあるが、具体的な開示はなされていない。非特許文献２は、角膜内皮細胞マーカーを開示するが表面抗原ではない。非特許文献３は、上皮細胞または内皮細胞マーカーの記載はあるが、角膜内皮細胞に関する具体的な記載はなされていない。非特許文献４は角膜実質細胞に関するマーカーを記載する文献であり角膜内皮細胞に関する記載はない。非特許文献５は、角膜内皮細胞マーカーを開示するがいずれも表面抗原ではない。非特許文献６は角膜内皮細胞マーカーを開示するがいずれも表面抗原ではない。非特許文献７は角膜内皮細胞マーカーを開示するがいずれも表面抗原ではない。非特許文献８は角膜内皮細胞マーカーを開示するが具体的な開示はなされていない。非特許文献９は角膜内皮細胞マーカーを開示するがいずれも表面抗原ではない。
【０００９】
このように、角膜内皮の形質転換について正常かどうかを判断するための表面分子の実態は明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第2013/086236号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2013/051722号パンフレット
【特許文献３】国際公開第2013/012087号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】再生医療：Vol.9,  増刊号,Page.283  (2010.02.05)
【非特許文献２】日本角膜学会総会・日本角膜移植学会プログラム・抄録集：Vol.35th-27th,Page.75  (2011)
【非特許文献３】Am  J  Pathol.  2011  Feb;178(2)572-9.
【非特許文献４】Cytotherapy.2007;9(3):252-8
【非特許文献５】日本眼科学会雑誌  Vol.117,  臨時増刊号,  Page.378  (2013.03.04)
【非特許文献６】Kunzevitzky,  NJ,  et  al.  ARVO  E-Abstract1698,  Poster  Board  Number:  D0333,  2013
【非特許文献７】Mehta  JS,  et  al.  ARVO  E-Abstract  2198,2013
【非特許文献８】再生医療  Vol.10,  増刊号,  Page.201  (2011.02.01)
【非特許文献９】日本眼科学会雑誌  Vol.105,  臨時増刊号,  Page.195  (2001.03.15)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、角膜細胞、特に角膜内皮細胞の正常細胞と形質転換細胞とを識別するマーカーを提供する。したがって、本発明は、以下をも提供する。
（１）  ＣＤ１６６、ＨＬＡ−Ａ２、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ９８、ＣＤ５９、ＣＤ５４、ＣＤ３４０、ＣＤ４７、ＥＧＦ−Ｒ、ＣＤ２９、ＣＤ７４、ＣＤ１６５、ＣＤ２２１、ＣＤ４９ａ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ１３０およびＣＤ４９ｆからなる群より選択される遺伝子の核酸および／または該核酸によってコードされるタンパク質を含む正常角膜内皮細胞マーカー：ならびに
ＣＤ２６、ＣＤ９、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ１３、ＣＤ９９、ＣＤ１０５、ＣＤ６３、ＣＤ５８、ＣＤ２０１、ＣＤ５６、ＣＤ４４、ＣＤ５５、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９１、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ１６４、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ４６、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ８１、ＣＤ１５１、ＣＤ２００およびＣＤ１０なる群より選択される遺伝子の核酸および／または該核酸によってコードされるタンパク質を含む形質転換角膜内皮細胞マーカー
から選択される少なくとも１つを含む、角膜内皮細胞の正常細胞・形質転換細胞を識別するためのマーカー。
（２）前記マーカーは、細胞表面マーカーである、項目１に記載のマーカー。
（３）前記マーカーは、少なくとも１つの形質転換角膜内皮細胞マーカーと少なくとも１つの正常角膜内皮細胞マーカーとを含む、項目１または２に記載のマーカー。
（４）前記マーカーは正常角膜内皮細胞マーカーとしてＣＤ９８、ＣＤ１６６、およびＣＤ３４０からなる群より選択される少なくとも１つの分子を含む、項目１〜３のいずれか１項に記載のマーカー。
（５）前記マーカーは形質転換角膜内皮細胞マーカーとしてＣＤ９、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４４、およびＣＤ７３からなる群より選択される少なくとも１つの分子を含む、項目１〜４のいずれか１項に記載のマーカー。
（６）前記マーカーは正常角膜内皮細胞マーカーとしてＣＤ９８、ＣＤ１６６、およびＣＤ３４０からなる群より選択される少なくとも１つの分子を含み、形質転換角膜内皮細胞マーカーとしてＣＤ９、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４４、およびＣＤ７３からなる群より選択される少なくとも１つの分子を含む、項目１〜５のいずれか１項に記載のマーカー。
（７）前記マーカーは、ＣＤ１６６およびＣＤ７３からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーを含む、項目１〜６のいずれか１項に記載のマーカー。
（８）項目１〜７のいずれか１項に記載のマーカーに結合する物質を含む、正常角膜内皮細胞と形質転換角膜内皮細胞とを識別するための検出剤。
（９）項目１〜７のいずれか１項に記載のマーカーを、正常角膜内皮細胞と形質転換角膜内皮細胞とを識別する指標とする方法。
（１０）  ａ）角膜内皮細胞を含む試料を提供する工程；および
ｂ）該サンプルにおいて、項目１〜７のいずれか１項に記載のマーカーを指標として、正常角膜内皮細胞の割合を上昇させる工程
を含む、正常角膜内皮細胞の割合が上昇した角膜内皮細胞試料を調製するための方法。
（１１）項目１〜７のいずれか１項に記載のマーカーまたは該マーカーに結合する物質を含む、角膜内皮細胞を含む試料を作製する際の純度検定剤。
（１２）項目１〜７のいずれか１項に記載のマーカーを、角膜内皮細胞を含む試料を作製する際の純度検定の指標とする方法。
（１３）純化された角膜内皮細胞を調製するための方法であって、該方法は：
未分化細胞から角膜内皮細胞を誘導する工程：および
項目１〜７のいずれか１項に記載のマーカーを指標として、該角膜内皮細胞の割合を上昇させる工程を包含する、方法。
（１４）前記未分化細胞は、誘導性多能性幹（ｉＰＳ）細胞または胚性幹（ＥＳ）細胞である、項目１３に記載の方法。
（１５）項目１０または１３に記載の方法で調製された細胞を含む組成物。
（１６）角膜治療のための、項目１５に記載の組成物。
（１７）前記角膜治療の対象は角膜内皮疾患を含む、項目１６に記載の組成物。
【００１３】
あるいは、本発明は以下を提供し得る。
（Ａ１）  ＣＤ１６６、ＨＬＡ−Ａ２、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ９８、ＣＤ５９、ＣＤ５４、ＣＤ３４０、ＣＤ４７、ＥＧＦ−Ｒ、ＣＤ２９、ＣＤ７４、ＣＤ１６５、ＣＤ２２１、ＣＤ４９ａ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ１３０およびＣＤ４９ｆからなる群より選択される遺伝子の核酸および／または該核酸によってコードされるタンパク質を含む正常角膜内皮細胞マーカー：ならびに
ＣＤ２６、ＣＤ９、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ１３、ＣＤ９９、ＣＤ１０５、ＣＤ６３、ＣＤ５８、ＣＤ２０１、ＣＤ５６、ＣＤ４４、ＣＤ５５、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９１、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ１６４、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ４６、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ８１、ＣＤ１５１、ＣＤ２００およびＣＤ１０なる群より選択される遺伝子の核酸および／または該核酸によってコードされるタンパク質を含む形質転換角膜内皮細胞マーカー
から選択される少なくとも１つを含む、角膜内皮細胞の正常細胞・形質転換細胞を識別するためのマーカー。
（Ａ２）前記マーカーは、細胞表面マーカーである、項目Ａ１に記載のマーカー。
（Ａ３）前記マーカーは、少なくとも１つの形質転換角膜内皮細胞マーカーと少なくとも１つの正常角膜内皮細胞マーカーとを含む、項目Ａ１またはＡ２に記載のマーカー。
（Ａ４）前記マーカーは正常角膜内皮細胞マーカーとしてＣＤ９８、ＣＤ１６６、およびＣＤ３４０からなる群より選択される少なくとも１つの分子を含む、項目Ａ１〜Ａ３のいずれか１項に記載のマーカー。
（Ａ５）前記マーカーは形質転換角膜内皮細胞マーカーとしてＣＤ９、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４４、およびＣＤ７３からなる群より選択される少なくとも１つの分子を含む、項目Ａ１〜Ａ４のいずれか１項に記載のマーカー。
（Ａ６）前記マーカーは正常角膜内皮細胞マーカーとしてＣＤ９８、ＣＤ１６６、およびＣＤ３４０からなる群より選択される少なくとも１つの分子を含み、形質転換角膜内皮細胞マーカーとしてＣＤ９、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４４、およびＣＤ７３からなる群より選択される少なくとも１つの分子を含む、項目Ａ１〜Ａ５のいずれか１項に記載のマーカー。
（Ａ７）前記マーカーは、ＣＤ１６６およびＣＤ７３からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーを含む、項目Ａ１〜Ａ６のいずれか１項に記載のマーカー。
（Ａ８）項目Ａ１〜Ａ７のいずれか１項に記載のマーカーに結合する物質を含む、正常角膜内皮細胞と形質転換角膜内皮細胞とを識別するための検出剤。
（Ａ９）項目Ａ１〜Ａ７のいずれか１項に記載のマーカーに結合する物質を含む、正常角膜内皮細胞と形質転換角膜内皮細胞とを識別するための診断剤。
（Ａ１０）前記角膜内皮細胞は、生体内に存在する細胞である、項目Ａ９に記載の診断剤。
（Ａ１１）前記診断は、角膜内皮疾患の診断を含む、項目Ａ９またはＡ１０に記載の診断剤。
（Ａ１２）前記角膜内皮疾患は、線維芽細胞に関連する疾患である、項目Ａ１１に記載の診断剤。
（Ａ１３）前記角膜内皮疾患は、水疱性角膜症、外傷または内眼手術に起因する角膜内皮障害、ならびにFuchs角膜内皮ジストロフィおよび後部多形性角膜内皮ジストロフィを含
む角膜ジストロフィからなる群より選択される、項目Ａ１１またはＡ１２に記載の診断剤。
（Ａ１４）前記形質転換角膜内皮細胞マーカーが少なくとも１つ発現した場合、形質転換角膜内皮細胞が含まれると判断される、項目Ａ９〜Ａ１３のいずれか１項に記載の診断剤。
（Ａ１５）項目Ａ１〜Ａ７のいずれか１項に記載のマーカーに結合する物質を含む、角膜内皮細胞の診断剤であって、前記形質転換角膜内皮細胞マーカーが少なくとも１つ発現した場合、該角膜内皮細胞に不可逆性の変性を来していると診断される、診断剤。
（Ａ１６）前記結合する物質を染色するための薬剤をさらに含む、項目Ａ９〜Ａ１５のいずれか１項に記載の診断剤。
（Ａ１７）項目Ａ１〜Ａ７のいずれか１項に記載のマーカーを、正常角膜内皮細胞と形質転換角膜内皮細胞とを識別する指標とする方法。
（Ａ１８）  ａ）角膜内皮細胞を含む試料を提供する工程；および
ｂ）該サンプルにおいて、項目Ａ１〜Ａ７のいずれか１項に記載のマーカーを指標として、正常角膜内皮細胞の割合を上昇させる工程
を含む、正常角膜内皮細胞の割合が上昇した角膜内皮細胞試料を調製するための方法。
（Ａ１９）項目Ａ１〜Ａ７のいずれか１項に記載のマーカーまたは該マーカーに結合する物質を含む、角膜内皮細胞を含む試料を作製する際の純度検定剤。
（Ａ２０）項目Ａ１〜Ａ７のいずれか１項に記載のマーカーを、角膜内皮細胞を含む試料を作製する際の純度検定の指標とする方法。
（Ａ２１）純化された角膜内皮細胞を調製するための方法であって、該方法は：
未分化細胞から角膜内皮細胞を誘導する工程：および
項目Ａ１〜Ａ７のいずれか１項に記載のマーカーを指標として、該角膜内皮細胞の割合を上昇させる工程を包含する、方法。
（Ａ２２）前記未分化細胞は、誘導性多能性幹（ｉＰＳ）細胞または胚性幹（ＥＳ）細胞である、項目Ａ２１に記載の方法。
（Ａ２３）項目Ａ１８〜Ａ２２のいずれか１項に記載の方法で調製された細胞を含む組成物。
（Ａ２４）角膜治療のための、項目Ａ２３に記載の組成物。
（Ａ２５）前記角膜治療の対象は角膜内皮疾患を含む、項目Ａ２４に記載の組成物。
（Ｂ８）項目Ａ１〜Ａ７のいずれか１項に記載のマーカーに結合する物質を、角膜内皮細胞を含むサンプルに適用する工程、および該物質と該角膜内皮細胞との結合を検出する工程を含む、正常角膜内皮細胞と形質転換角膜内皮細胞とを識別するための検出方法。
（Ｂ９）項目Ａ１〜Ａ７のいずれか１項に記載のマーカーに結合する物質を、角膜内皮細胞を含むサンプルに適用する工程、および該物質と該細胞との結合を検出する工程を含む、該角膜内皮細胞の診断方法であって、該結合の有無を判断することによって正常角膜内皮細胞と形質転換角膜内皮細胞とが識別される、方法。
（Ｂ１０）前記角膜内皮細胞は、生体内に存在する細胞である、項目Ｂ９に記載の方法。（Ｂ１１）前記診断は、角膜内皮疾患の診断を含む、項目Ｂ９またはＢ１０に記載の方法。
（Ｂ１２）前記角膜内皮疾患は、線維芽細胞に関連する疾患である、項目Ｂ１１に記載の方法。
（Ｂ１３）前記角膜内皮疾患は、水疱性角膜症、外傷または内眼手術に起因する角膜内皮障害、ならびにFuchs角膜内皮ジストロフィおよび後部多形性角膜内皮ジストロフィを含
む角膜ジストロフィからなる群より選択される、項目Ｂ１１またはＢ１２に記載の方法。（Ｂ１４）前記形質転換角膜内皮細胞マーカーが少なくとも１つ発現した場合、形質転換角膜内皮細胞が含まれると判断される、項目Ｂ９〜Ｂ１３のいずれか１項に記載の診断剤。
（Ｂ１５）項目Ａ１〜Ａ７のいずれか１項に記載のマーカーに結合する物質を、角膜内皮細胞を含むサンプルに適用する工程、および該物質と該細胞との結合を検出する工程を含む、角膜内皮細胞の診断方法であって、前記形質転換角膜内皮細胞マーカーが少なくとも１つ発現した場合、該角膜内皮細胞に不可逆性の変性を来していると診断される、方法。（Ｂ１６）前記マーカーに結合する物質は前記結合する物質を染色するための薬剤をさらに含む、項目Ｂ９〜Ｂ１５のいずれか１項に記載の方法。
（Ｂ１９）項目Ａ１〜Ａ７のいずれか１項に記載のマーカーに結合する物質を、角膜内皮細胞を含むサンプルに適用する工程、および該物質と該細胞との結合を検出する工程を含む、角膜内皮細胞を含む試料を作製する際の純度を検定する方法であって、該結合の有無を判断することによって正常角膜内皮細胞と形質転換角膜内皮細胞とが識別される、方法。
（Ｂ２３）項目Ａ１８〜Ａ２２のいずれか１項に記載の方法で調製された細胞を用いる、治療または予防方法。
（Ｂ２４）前記治療または予防は角膜のためのものである、項目Ｂ２３に記載の方法。
（Ｂ２５）前記治療または予防の対象は角膜内皮疾患を含む、項目Ｂ２４に記載の組成物。
【００１４】
さらに別の局面において、本発明は、本発明の検出剤、マーカー等を用いた診断剤、検出キット、診断キット、検出システム、診断システム等を提供する。
【００１５】
さらに別の局面において、本発明は、本発明の医薬組成物、治療剤または進行予防剤を用いた治療方法、予防方法、使用等を提供する。
【００１６】
本発明において、上述の特徴は、１または複数をさらに組み合わせて用いることができることが理解される。
【００１７】
本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、角膜内皮細胞に存在する細胞の分化能を識別することができ、機能が高い細胞を識別することができ、その結果従来不可能または困難であった、角膜内皮の疾患や障害を治療または予防することができる。また、細胞を含む試料を作製する際の純度検定の方法、角膜内皮細胞の純化方法、純化された角膜内皮細胞を調製するための方法もまた提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、培養角膜内皮細胞生産への解決課題に関する図である。角膜内皮不全の新たな治療を樹立することを目的として、サルおよびウサギモデルにおいて、培養角膜内皮細胞の移植のための新たな外科手順を樹立した。従来は、タイプIコラーゲンシート上でサル内皮細胞を培養し、これを角膜内皮不全サルモデルに培養した角膜内皮シートを移植するあるいは細胞懸濁液として前房内に注入して移植するといったことがなされている。図中、上段では、左からドナー角膜からヒト角膜内皮細胞の分離、および培養を行い、これを移植するというフロー模式図が記載されている。左下の写真は正常の形態に培養した角膜内皮を示し、右下は培養により形質転換を生じた細胞を示す。
【図２】図２は、培養サル角膜内皮細胞における位相差顕微鏡像を示す。左側に示す正常角膜内皮細胞は、六角形を主とする多角形細胞から成る様子が示されている。それに対し、右側に示す、線維芽細胞様に形質転換を起こしている細胞では細胞は多角形ではなく、細長い線維芽細胞様の形状をしている。
【図３】図３は培養サル角膜内皮細胞における候補マーカーのフローサイトメトリー解析結果を示す。左は正常細胞、右は形質転換細胞を示す。また、上段はＣＤ１６６、下段はＣＤ７３を示す。この結果から、ＣＤ１６６は正常細胞で高発現、ＣＤ７３は形質転換細胞で高発現となっていることが明確に確認される。
【図４】図４は、培養サル角膜内皮細胞における候補マーカーのＰＣＲ解析結果を示す。上からＣＤ１６６、ＣＤ７３、およびコントロールとしてのＧＡＰＤＨであり、左の列が正常細胞、右の列が形質転換細胞である。この結果から、特に、ＣＤ１６６は正常細胞で高発現、ＣＤ７３は形質転換細胞で高発現となっていることが明確に確認される。これはフローサイトメトリーによる解析結果と一致している。
【図５】図５は、培養サル角膜内皮細胞における候補マーカーの免疫染色像を示す。左からＣＤ１６６、ＣＤ７３を用いて染色したものである。上段が正常角膜内皮細胞、下段が形質転換細胞である。この結果から、ＣＤ１６６は正常角膜内皮細胞において高発現であり、ＣＤ７３は形質転換細胞において高発現であるということがわかる．この結果はフローサイトメトリーによる解析結果と一致するものである。バーは１００μｍを示す。
【図６】図６は、培養サル角膜内皮細胞における位相差顕微鏡像の結果を示す。左上は正常角膜内皮細胞を示し、右上は形質転換細胞を示す。これらの正常細胞と、形質転換細胞を混合した後に、ＣＤ７３の発現の程度によってソーティングして培養したものを下段に示す。ＣＤ７３低発現の細胞は多角形の正常の細胞形態を示す。一方、ＣＤ７３高発現の細胞は形質転換した線維芽細胞様の形態を示す。
【図７】図７は、不死化ヒト角膜内皮細胞における位相差顕微鏡像の結果を示す。左は正常角膜内皮細胞を示し、中は形質転換細胞を示す。これらの正常細胞と、形質転換細胞を混合して培養したものを左に示す。バーは１００μｍである。
【図８】図８は図７に示した不死化ヒト角膜内皮細胞における正常細胞と、形質転換細胞を混合したものをフローサイトメトリーによってＣＤ７３発現を検討したものである。ＣＤ７３の高発現のピークと低発現のピークに分かれることを示す。
【図９】図９は図７に示した不死化ヒト角膜内皮細胞における正常細胞と、形質転換細胞を混合したものをフローサイトメトリーによってＣＤ７３発現によりソーティングして培養したものである。ＣＤ７３低発現の細胞は多角形の正常の細胞形態を示す。一方、ＣＤ７３高発現の細胞は形質転換した線維芽細胞様の形態を示す。ＣＤ７３高発現および低発現のものをソーティングせず培養したものは一部に正常細胞と一部に形質転換細胞を含む。
【図１０】図１０は、ＣＤ７３によりソーティングした後の候補マーカーの発現解析を行った結果を示す。上段がＣＤ７３が低発現であった細胞のソーティング後であり、下段がＣＤ７３が高発現であった細胞のソーティング後である。左はＣＤ７３による染色、右はＣＤ１６６による染色を示す。ＣＤ７３低発現の細胞は免疫染色においてＣＤ１６６高発現である一方、ＣＤ７３高発現の細胞は免疫染色においてＣＤ１６６低発現であった。
【図１１】図１１は、ＣＤ７３によりソーティングした後の角膜内皮細胞の機能関連マーカーの発現解析を行った結果を示す。上段がＣＤ７３が低発現であった細胞のソーティング後であり、下段がＣＤ７３が高発現であった細胞のソーティング後である。左側は、ＺＯ−１の発現を示し、右側は、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅの発現を示す。ＣＤ７３低発現の細胞は免疫染色においてＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅの発現を認めた。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。従って、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００２１】
本明細書において、「ＣＤ９８」は、ＣＤタンパク質の一種であり、大中性アミノ酸トランスポーター（large  neutral  amino  acid  transporter  １；ＬＡＴ１）を形成するＳＬＣ３Ａ２（溶質キャリアファミリー３（二塩基性および中性のアミノ酸輸送の活性化剤）メンバー２、４Ｆ２ｈｃ／ＣＤ９８；ＣＤ９８の重サブユニットタンパク質；ＭＤＵ１、４Ｔ２ＨＣ、４Ｆ２、ＮＡＣＡＥとも呼ばれる。このトランスポーターは、細胞内カルシウムレベルの調節およびＬ型アミノ酸の輸送に役割を果たす。Gene  ID（Entrez）:  6520；NM_001013251（NM_001012661）およびNP_001012680）とＳＬＣ７Ａ５（ＣＤ９８の軽サブユニットタンパク質；ＬＡＴ１、Ｅ１６、Ｄ１６Ｓ４６９Ｅ、ＭＰＥ１６等とも呼ばれる。Gene  ID（Entrez）:8140  NM_003486；NP_003477）とから構成されるヘテロダイマーである糖タンパク質である。配列番号１−４が代表的な配列（ＳＬＣ３Ａ２＝配列番号１−２；ＳＬＣ７Ａ５＝配列番号３−４；それぞれ核酸配列、アミノ酸配列）である。
【００２２】
本明細書において「ＣＤ１６６」は、Activated  leukocyte  cell  adhesion  molecule（ALCAM）として知られているＩ型膜貫通タンパクである。１０箇所のＮ結合型糖鎖附加部位を含む、免疫グロブリンスーパーファミリー分子である。分子量１００−１０５ｋＤａで、５個の細胞外Ｉｇ様ドメインと３２アミノ酸の細胞内末端、短い膜貫通領域で構成されている。ＣＤ１６６は接着分子の一つで、ＣＤ６分子との結合、またはＡＬＣＡＭ−ＡＬＣＡＭの同種結合を形成する。ＡＬＣＡＭ；ＣＤ１６６；ＭＥＭＤとも呼ばれる。文献PMID:23056608およびPMID:18334960も参照。各種アクセッション番号については、Gene  ID（Entrez）:214（human）、NM_001243280（mRNA）、NP_001230209（タンパク質）である。配列番号５−６が代表的な配列（それぞれ核酸配列、アミノ酸配列）である。
【００２３】
本明細書において「ＣＤ３４０」はＨＥＲ２またはｎｅｕオンコジーンとして知られるＣＤの一種であり、細胞表面に存在する約１８５ｋＤａの糖タンパクで、受容体型チロシンキナーゼである。ＮＥＵ；ＮＧＬ；ＨＥＲ２；ＴＫＲ１；ＣＤ３４０；ＨＥＲ−２；ＭＬＮ  １９；ＨＥＲ−２／ｎｅｕとも呼ばれる。ＥＲＢＢ２：ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽細胞白血病ウイルス由来オンコジーンホモログ（鳥類）である。この遺伝子は、受容体型チロシンキナーゼの上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプターファミリーのメンバーをコードする。このタンパク質は、それ自体のリガンド結合ドメインを有しないため、増殖因子に結合することができないとされているが、他のリガンド結合ＥＧＦレセプターファミリーのメンバーに結合してヘテロダイマーを形成し、リガンド結合を安定化して、下流のシグナル伝達経路（例えば、有糸活性化タンパク質キナーゼおよびホスファチジルイノシトールー３キナーゼ等）のキナーゼ媒介活性化を増強するとされている。文献PMID:  15557433を参照。Entrez  Gene  ID:  (Hu)  2064  であり、NM＿0010005862.1である。配列番号７−８が代表的な配列（それぞれ核酸配列、アミノ酸配列）である。
【００２４】
本明細書において「ＣＤ９」は、４回膜貫通４スーパーファミリーのメンバーであり、テトラスパニンとも呼ばれる。ＣＤ９；ＢＴＣＣ−１；ＤＲＡＰ−２７；ＭＩＣ３；ＭＲＰ−１；ＴＳＰＡＮ−２９；ＴＳＰＡＮ２９とも呼ばれる。テトラスパニンは、４回膜貫通ドメインを伴う細胞表面糖タンパク質であり、他の細胞表面タンパク質とマルチマー複合体を形成する。ヒト羊膜上皮細胞（ｈＨＥＡＣ）は、ＣＤ９、ＣＤ４４、ＣＤ７３およびＣＤ９０を発現し、無視できる程度でＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ１１７を発現する。文献PMID:  21166885を参照。ＣＤ９遺伝子は、１．４ｋｂのｍＲＮＡをコードし、角膜において検出可能に優勢に発現し毛様体上皮、網膜、虹彩、および水晶体において低レベルで発現する。文献PMID:1339429を参照。Entrez  Gene  ID:928であり、RefSeq(mRNA)：NM_001769（Hu）、RefSeq(protein)：NP_001760（Hu）である。配列番号９−１０が代表的な配列（それぞれ核酸配列、アミノ酸配列）である。
【００２５】
本明細書において「ＣＤ４９ｅ」は、通常インテグリンα５と呼ばれるタンパク質であり、ＩＴＧＡ５；ＣＤ４９ｅ；ＦＮＲＡ；ＶＬＡ５Ａとも呼ばれる。ファイブロネクチンレセプターαポリペプチドとも呼ばれている。α鎖５は翻訳後修飾により細胞外ドメインにおいて切断され、ジスルフィド結合の軽鎖および重鎖を生じ、β１と結合してフィブロネクチンレセプターを形成する。この分子の発現のプロモーターは、角膜上皮細胞では細胞外マトリクス成分のフィブロネクチンによって転写因子Ｓｐ１と通じて正に調節されている。文献PMID:10995740を参照。Entrez  Gene  ID:3678であり、RefSeq(mRNA)：NM_002205（Ｈｕ）であり、RefSeq(protein)：NP_002196（Hu）である。配列番号１１−１２が代表的な配列（それぞれ核酸配列、アミノ酸配列）である。
【００２６】
本明細書において「ＣＤ４４」は、細胞−細胞、細胞−細胞間基質（ＥＣＭ；extra  cellular  matrix）を接着させる細胞表面糖タンパク質である。ＣＤ４４分子にはＮ結合糖鎖部位、Ｏ結合糖鎖部位、それにコンドロイチン硫酸結合部位が複数あり糖鎖に富む構造を示す。膜貫通部に続く細胞内部分にはリン酸化されるセリンがあり、またアンキリンを介してアクチンと結合、細胞の運動（癌細胞の転移）に関与しているヒアルロン酸（ＨＡ）のレセプターであり、他のリガンド（例えば、オステオポンチン、コラーゲンおよびマトリクスメタロプオテイナーゼ（ＭＭＰ））とも相互作用することができるとされている。ヒト羊膜上皮細胞（ｈＨＥＡＣ）は、ＣＤ９、ＣＤ４４、ＣＤ７３およびＣＤ９０を発現し、無視できる程度でＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ１１７を発現する。文献PMID:21166885を参照。ＣＤＷ４４；ＣＳＰＧ８；ＥＣＭＲ−ＩＩＩ；ＨＣＥＬＬ；  ＨＵＴＣＨ−Ｉ；ＩＮ；ＬＨＲ；ＭＣ５６；ＭＤＵ２；ＭＤＵ３；ＭＩＣ４；Ｐｇｐ１とも呼ばれる。Entrez  Gene  ID:960であり、RefSeq(mRNA)：NM_000610であり、RefSeq(protein)：NP_000601である。配列番号１３−１４が代表的な配列（それぞれ核酸配列、アミノ酸配列）である。
【００２７】
本明細書において「ＣＤ７３」は、エクト−５’−ヌクレオチダーゼとも呼ばれる酵素であり、ＡＭＰをアデノシンに変換する。ＮＴ５Ｅ；ＣＤ７３；Ｅ５ＮＴ；ＮＴ；ＮＴ５；ＮＴＥ；ｅＮ；ｅＮＴとも呼ばれる。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞外ヌクレオチドを膜透過性ヌクレオシドへと変換する反応を触媒する血漿膜タンパク質である。ヒト羊膜上皮細胞（ｈＡＥＣ）は、ＣＤ９、ＣＤ４４、ＣＤ７３およびＣＤ９０を発現し、無視できる程度でＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ１１７を発現する。単離された角膜ケラトサイトは、線維芽細胞様の形状を示し、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１３３を発現するが、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３４、ＣＤ１１７およびＣＤ４５について陰性である。これらの特性は、ＢＭ−ＭＳＣ（骨髄間葉系幹細胞）に類似する。辺縁骨髄間葉系幹細胞（Ｌ−ＭＳＣ）は、ＣＤ３４−、ＣＤ３４−、ＣＤ９０＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋であるとされている。文献PMID:21166885、PMID:17464757およびPMID:22587591を参照。Entrez  Gene  ID:4907であり、RefSeq(mRNA)：NM_001204813であり、RefSeq(protein)：NP_001191742である。配列番号１５−１６が代表的な配列（それぞれ核酸配列、アミノ酸配列）である。
【００２８】
このほかのＣＤについては、例えば、http://hcdm.org/index.php/component/molecule/?Itemid=132の情報を参照することができ、また、以下のようであることが知られており、本発明の実施においてこれらの情報を利用することができ、必要に応じてこれらの情報の内容は、本明細書において参考として援用する。
【００２９】
【表１−１】
2020078333.tif 000002
【００３０】
【表１−２】
2020078333.tif 000003
【００３１】
【表１−３】
2020078333.tif 000004
【００３２】
【表１−４】
2020078333.tif 000005
【００３３】
各ＣＤ名については、特定のアクセッション番号（および本明細書に具体的に記載する場合の配列番号）に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００３４】
なお、本発明で挙げる他のタンパク質すべてにも同じことがあてはまる。従って、既定のタンパク質または核酸の名称は、配列表に示すようなタンパク質または核酸を指すだけでなく、機能的に活性な誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシー条件下で、好ましくは上述のような条件下で、前記タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、指す。本明細書で使用される「誘導体」または「構成要素タンパク質の類似体」または「変異体」は、好ましくは、限定を意図するものではないが、構成要素タンパク質に実質的に相同な領域を含む分子を含み、このような分子は、種々の実施形態において、同一サイズのアミノ酸配列にわたり、または当該分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによってアラインメントを行ってアラインされる配列と比較した際、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％同一であるか、あるいはこのような分子をコードする核酸は、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、またはストリンジェントでない条件下で、構成要素タンパク質をコードする配列にハイブリダイズ可能である。これは、それぞれ、アミノ酸置換、欠失および付加によって、天然存在タンパク質を修飾した所産であり、その誘導体がなお天然存在タンパク質の生物学的機能を、必ずしも同じ度合いでなくてもよいが示すタンパク質を意味する。例えば、本明細書において記載されあるいは当該分野で公知の適切で利用可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって、このようなタンパク質の生物学的機能を調べることも可能である。本発明では、ヒトについて主に論じられるが、他の種例えば霊長類内の他の種あるいはこのほかの属の動物の種のものにも当てはまることが理解され、これらの哺乳動物についても、本発明の範囲内に入ることが理解される。
【００３５】
本明細書で使用される「機能的に活性な」は、本明細書において、本発明のポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体が関連する態様に従って、生物学的活性などの、タンパク質の構造的機能、制御機能、または生化学的機能を有する、ポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体を指す。
【００３６】
本発明において、ＣＤ９８等の分子の「フラグメント」とは、ＣＤ９８等の分子の任意の領域を含むポリペプチドであり、本発明の目的（例えば、検出、診断等）に用いることができる限り、天然の分子の生物学的機能を有していなくてもよい。フラグメントの例として、ＣＤ９８等の分子の細胞外領域を含むフラグメントが挙げられるがそれに限定されない。
【００３７】
ＣＤ９８等の分子の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号Ｘに記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号Ｘ＋１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号Ｘ＋１に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号Ｘに記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号Ｘ＋１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＣＤ９８等の分子の有する活性をいう。
【００３８】
ＣＤ９８等の分子のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号Ｘ＋１に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号Ｘ＋１に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号Ｘ＋１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号Ｘ＋１に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、配列番号Ｘ（Ｘは、１〜１５）までの奇数）は、ＣＤ９８等の分子（サブユニットを含む）の核酸配列を示し、Ｘ＝１はＣＤ９８の重サブユニットタンパク質、Ｘ＝３はＣＤ９８の軽サブユニットタンパク質、Ｘ＝５はＣＤ１６６、Ｘ＝７はＣＤ３４０、Ｘ＝９はＣＤ９、Ｘ＝１１はＣＤ４９ｅ、Ｘ＝１３はＣＤ４４、Ｘ＝１５はＣＤ７３である。生物学的活性とは、代表的に、ＣＤ９８等の分子の有する活性をいう。また、配列番号１−１５の核酸配列は、ＣＤＲ（コード領域）以外の配列を含みうる。これらの領域もプライマーまたはプローブとして使用することができるが、別の実施形態ではＣＤＲのみを核酸領域として利用してもよい。
【００３９】
ここで、本明細書において「ＣＤ９８等」とは、本発明の任意のマーカーをいう。より詳細には、正常細胞において形質転換細胞より有意に多く発現するマーカーとして、ＣＤ１６６、ＨＬＡ−Ａ２、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ９８、ＣＤ５９、ＣＤ５４、ＣＤ３４０、ＣＤ４７、ＥＧＦ−Ｒ、ＣＤ２９、ＣＤ７４、ＣＤ１６５、ＣＤ２２１、ＣＤ４９ａ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ１３０、ＣＤ４９ｆが含まれ、形質転換細胞において正常細胞より有意に多く発現するマーカーとして、ＣＤ２６、ＣＤ９、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ１３、ＣＤ９９、ＣＤ１０５、ＣＤ６３、ＣＤ５８、ＣＤ２０１、ＣＤ５６、ＣＤ４４、ＣＤ５５、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９１、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ１６４、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ４６、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ８１、ＣＤ１５１、ＣＤ２００、ＣＤ１０が含まれるがこれらに限定されない。
【００４０】
本発明の関連において、「ＣＤ９８等の分子に結合する物質」または「ＣＤ９８等の分子相互作用分子」は、少なくとも一時的にＣＤ９８等の分子に結合し、そして好ましくは、結合したことを表示しうる（例えば標識されるか標識可能な状態である）、分子または物質である。ＣＤ９８等の分子に結合する物質はＣＤ９８等の分子の阻害剤であってもよく、その例としては、抗体、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、低分子量分子（ＬＭＷ）、結合性ペプチド、アプタマー、リボザイムおよびペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）等を挙げることができ、例えばＣＤ９８等の分子に対して向けられる、特にＣＤ９８等の分子の活性部位に対して向けられる、結合性タンパク質または結合性ペプチド、並びにＣＤ９８等の分子の遺伝子に対して向けられる核酸も含まれる。ＣＤ９８等の分子に対する核酸は、例えばＣＤ９８等の分子の遺伝子の発現またはＣＤ９８等の分子の活性を阻害する、二本鎖または一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはその修飾物または誘導体を指し、そして限定なしに、アンチセンス核酸、アプタマー、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）およびリボザイムを含む。本明細書において、ＣＤ９８等の分子について「結合性タンパク質」または「結合性ペプチド」とは、ＣＤ９８等の分子に結合する種類のタンパク質またはペプチドを指し、そしてＣＤ９８等の分子に対して指向されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、抗体フラグメントおよびタンパク質骨格を含むがこれらに限定されない。
【００４１】
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が包含される。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
【００４２】
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
【００４３】
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine-modified  cytosine）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzer  et  al.,  Nucleic  Acid  Res.19:5081(1991);Ohtsuka  et  al.,  J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);  Rossolini  et  al.,  Mol.  Cell.  Probes  8:91-98(1994)）。本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。
【００４４】
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する遺伝子を調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。「遺伝子産物」とは、遺伝子に基づいて産生された物質でありタンパク質、ｍＲＮＡなどをさす。
【００４５】
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。従って本明細書において「相同体」または「相同遺伝子産物」は、本明細書にさらに記載する複合体のタンパク質構成要素と同じ生物学的機能を発揮する、別の種、好ましくは哺乳動物におけるタンパク質を意味する。こうような相同体はまた、「オルソログ遺伝子産物」とも称されることもある。ヒトおよび哺乳動物または他の種からオルソログ遺伝子対を検出するためのアルゴリズムは、これらの生物の全ゲノムを用いる。まず、予測されるタンパク質の完全Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ並列を用いて、対合ベストヒットを回収する。信頼性をさらに改善するため、キイロショウジョウバエ（Drosophila  melanogaster）および線虫（C．elegans）タンパク質を含む対合ベストヒットを用いて、これらの対のクラスターを形成してもよい。このような分析は、例えば、Nature，2001,409：860−921に提供される。他の種の遺伝子に対する、本明細書に提供するタンパク質をコードする遺伝子の配列相同性に基づいて、慣用的技術を適用してそれぞれの遺伝子をクローニングし、そしてこのような遺伝子からタンパク質を発現させることによって、あるいは本明細書に提供する方法に従って、または当該分野で周知の他の適切な方法に従って、類似の複合体を単離することにより、他の種のタンパク質を単離することによって、本明細書に記載のタンパク質の相同体を単離することも可能である。
【００４６】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはIUPAC−IUB  Biochemical  Nomenclature  Commissionにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのBLAST  2．2.9（2004．5.12発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記BLASTを用い、デフォルトの条件でア
ラインした際の値をいう。ただし、パラメータの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。類似性は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。
【００４７】
本明細書において「ストリンジェント（な）条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（saline−sodium  citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Molecular  Cloning  2nd  ed.,Current  Protocols  in  Molecular  Biology,Supplement  1〜38、DNA  Cloning  1:Core  Techniques,  A  Prac1tical  Approach,  Second  Edition,  Oxford  University  Press(1995)などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。従って、本発明において使用されるポリペプチド（例えば、トランスサイレチンなど）には、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。これらの低ストリンジェンシー条件は、３５％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、５０ｍＭ  Tris−HCl（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  EDTA、０．０２％  ポリビニルピロリドン（PVP）、０．０２％ＢＳＡ、100μｇ／ｍｌ変性サケ精子DNA、および１０％（重量／体積）デキストラン硫酸を含む緩衝液中、４０℃で１８〜２０時間ハイブリダイゼーションし、２ｘＳＳＣ、２５ｍＭ  Tris−HCl（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  EDTA、および０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中、５５℃で１〜５時間洗浄し、そして２ｘSSC、２５ｍＭ  Tris−HCl（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  EDTA、および０．１％SDSからなる緩衝液中、６０℃で１．５時間
洗浄することを含む。
【００４８】
本明細書において「精製された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。従って、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質は、好ましくは「精製された」物質である。
【００４９】
本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドと同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。対応するアミノ酸は、例えば、システイン化、グルタチオン化、Ｓ−Ｓ結合形成、酸化（例えば、メチオニン側鎖の酸化）、ホルミル化、アセチル化、リン酸化、糖鎖付加、ミリスチル化などがされる特定のアミノ酸であり得る。あるいは、対応するアミノ酸は、二量体化を担うアミノ酸であり得る。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。
【００５０】
本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。従って、マウス、ラットのＣＤ９８等の分子は、それぞれ、ヒトにおいて、対応するＣＤ９８等の分子を見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。従って、例えば、ある動物（例えば、マウス、ラット）における対応する遺伝子は、対応する遺伝子（例えば、ヒトのもの）の基準となる遺伝子として配列番号１等の配列をクエリ配列として用いてその動物の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【００５１】
本明細書において「フラグメント（断片）」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなフラグメントは、例えば、全長のものがマーカーとして機能する場合、そのフラグメント自体もまたマーカーとしての機能を有する限り、本発明の範囲内に入ることが理解される。
【００５２】
本発明に従って、用語「活性」は、本明細書において、最も広い意味での分子の機能を指す。活性は、限定を意図するものではないが、概して、分子の生物学的機能、生化学的機能、物理的機能または化学的機能を含む。活性は、例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力、および他の分子の機能を活性化するか、促進するか、安定化するか、阻害するか、抑制するか、または不安定化する能力、安定性、特定の細胞内位置に局在する能力を含む。適用可能な場合、この用語はまた、最も広い意味でのタンパク質複合体の機能にも関する。
【００５３】
本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本発明においては、例えば、ＣＤ９８等がそのリガンドを認識する機能などを挙げることができるがそれらに限定されない。このような生物学的活性は、上述した表の中で言及されるアクセッション番号、Entrez番号等において引用される文献等を参照することができ、本明細書においてそのような文献等もまた参考として援用する。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。２つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。従って、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。従って、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が挙げられる。
【００５４】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたもの（本明細書にいう誘導体）であり得る。例えば、ＣＤ９８等の分子の発現レベルは、任意の方法によって決定することができる。具体的には、ＣＤ９８等の分子のｍＲＮＡの量、ＣＤ９８等の分子タンパク質の量、そしてＣＤ９８等の分子タンパク質の生物学的な活性を評価することによって、ＣＤ９８等の分子の発現レベルを知ることができる。ＣＤ９８等の分子のｍＲＮＡやタンパク質の量は、本明細書に記載したような方法によって決定することができる。
【００５５】
本明細書において、「ＣＤ９８等の分子またはその機能的等価物」または「ＣＤ９８等の分子およびその機能的等価物からなる群」という場合は、ＣＤ９８等の分子自体のほか、ＣＤ９８等の分子の変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、眼細胞等の分化制御および／または増殖促進作用を有するもの、または本明細書に記載されるマーカーとしての機能を有するもの、ならびに、作用する時点において、ＣＤ９８等の分子自体またはこのＣＤ９８等の分子の変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、ＣＤ９８等の分子自体またはＣＤ９８等の分子の変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含されることが理解される。本発明において、ＣＤ９８等の分子の機能的等価物は、格別に言及していなくても、ＣＤ９８等の分子と同様に用いられうることが理解される。
【００５６】
本発明で用いられるＣＤ９８等の分子の機能的等価物は、データベース等を検索することによって、見出すことができる。本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、BLAST（Altschul  et  al.,  J.Mol.Biol.215:403-410(1990))、FASTA(Pearson  &  Lipman,  Proc.Natl.Acad.Sci.,USA  85:2444-2448(1988)）、Smith  and  Waterman法（Smith  and  Waterman,J.Mol.Biol.147:195-197(1981)）、およびNeedleman  and  Wunsch法（Needleman
and  Wunsch,  J.Mol.Biol.48:443-453(1970)）などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、PCRおよびin  situハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
【００５７】
本発明の機能的等価物としては、アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加されたものを用いることができる。本明細書において、「アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、あるいは天然の変異により、天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされていることを意味する。
【００５８】
ＣＤ９８等の分子の改変アミノ酸配列は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、ＣＤ９８等の分子のアミノ酸配列において１または複数個（好ましくは１もしくは数個または１、２、３、もしくは４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。ここで「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００５９】
本明細書において「マーカー（物質、タンパク質または遺伝子（核酸））」とは、ある状態（例えば、正常細胞状態、形質転換状態、疾患状態、障害状態、あるいは増殖能、分化状態のレベル、有無等）にあるかまたはその危険性があるかどうかを追跡する示標となる物質をいう。このようなマーカーとしては、遺伝子（核酸＝ＤＮＡレベル）、遺伝子産物（ｍＲＮＡ、タンパク質など）、代謝物質、酵素などを挙げることができる。本発明において、ある状態（例えば、分化障害などの疾患）についての検出、診断、予備的検出、予測または事前診断は、その状態に関連するマーカーに特異的な薬剤、剤、因子または手段、あるいはそれらを含む組成物、キットまたはシステム等を用いて実現することができる。本明細書において、「遺伝子産物」とは、遺伝子によってコードされるタンパク質またはｍＲＮＡをいう。本明細書では、眼細胞、特に角膜内皮細胞への関連が示されていない遺伝子産物（すなわち、ＣＤ９８等の分子など）が眼細胞、特に角膜内皮細胞の正常かどうか（形質転換したかどうか）の指標として使用可能であることが見出された。
【００６０】
本明細書において「神経細胞」とは、広義に用いられ、神経系の器官に含まれる任意の細胞を意味し、特に、神経堤細胞由来の細胞（例えば、角膜内皮細胞等）も包含されることが理解される。
【００６１】
本明細書において「眼細胞」とは、広義に用いられ、眼に存在する任意の細胞を意味し、眼瞼、強膜、角膜、ぶどう膜、水晶体、硝子体、網膜、視神経に存在する任意の細胞が包含される。
【００６２】
本明細書において「角膜内皮細胞」は、当該分野で用いられる通常の意味で用いられる。角膜とは、眼を構成する層状の組織の一つであり透明であり、最も外界に近い部分に位置する。角膜は、ヒトでは外側（体表面）から順に５層でできているとされ、外側から角膜上皮、ボーマン膜（外境界線）、固有層、デスメ膜（内境界線）、および角膜内皮で構成される。特に、特定しない限り、上皮および内皮以外の部分は「角膜実質」とまとめて称することがあり、本明細書でもそのように称する。
【００６３】
本明細書において「角膜組織」とは、通常の意味で使用され、角膜を構成する組織自体をいう。角膜組織というときは、角膜を構成する角膜上皮、ボーマン膜（外境界線）、固有層、デスメ膜（内境界線）、および角膜内皮の全部（ヒトの場合。それ以外の動物の場合は、それに対応する区分に応じてその全部）を含んでいてもよく一部欠損していてもよく、あるいは、角膜のほか他の組織（強膜）を含んでいてもよく、その場合は特に強角膜ということがある。したがって、強角膜または強角膜片は角膜組織の一実施形態であるといえる。
【００６４】
本明細書において「正常角膜内皮細胞マーカー」とは、正常な角膜内皮細胞において発現し、形質転換を受けると、発現量が有意に減少するマーカーをいう。閾値としては、正常細胞における発現が、形質転換細胞における値よりも、約１．０１倍以上、約１．０２倍以上、約１．０３倍以上、約１．０４倍以上、約１．０５倍以上、約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２倍以上、約２．５倍以上、約３倍以上、約３．５倍以上、約４倍以上、約４．５倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、約１０倍以上などを挙げることができるがそれに限定されない。
【００６５】
本明細書において「形質転換角膜内皮細胞マーカー」とは、形質転換を起こした角膜内皮細胞において発現し、正常細胞では有意に発現が低いマーカーをいう。閾値としては、形質転換細胞における発現が、正常細胞における値よりも、約１．０１倍以上、約１．０２倍以上、約１．０３倍以上、約１．０４倍以上、約１．０５倍以上、約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２倍以上、約２．５倍以上、約３倍以上、約３．５倍以上、約４倍以上、約４．５倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、約１０倍以上などを挙げることができるがそれに限定されない。
【００６６】
本明細書において「形質転換」とは、細胞の形質が正常ではない状態に変化することをいい、正常な動物細胞が無制限に分裂を行うようになる、つまりがん化の意味、または化生の中で特にダイナミックなもの（幹細胞まで脱分化したり組織の基本形の壁を越えて変化したりするもの）の意味を含む。
【００６７】
本明細書において、角膜内皮細胞が正常に培養されているかどうかは、角膜内皮細胞が本来有している機能（本明細書では「正常（な）機能」ともいい、そのような細胞を「正常細胞」ともいう。）等の特徴を少なくとも１つは維持しているかを確認することによって判定することができる。そのような機能としては、ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、角膜移植への適応能（Matsubara  M,  Tanishima  T:  Wound-healing  of  the  corneal  endotheliumin  the  monkey:  a  morphometric  study,  Jpn  J  Ophthalmol  1982,  26:264-273；Matsubara  M,  Tanishima  T:  Wound-healing  of  corneal  endothelium  in  monkey:  an  autoradiographic  study,  Jpn  J  Ophthalmol  1983,  27:444-450；Van  Horn  DL,  Hyndiuk  RA:  Endothelial  wound  repair  in  primate  cornea,  Exp  Eye  Res  1975,21:113-124およびVan  Horn  DL,  Sendele  DD,  Seideman  S,  Buco  PJ:  Regenerative  capacity  of  the  corneal  endothelium  in  rabbit  and  cat,  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci  1977,16:597-613）等が挙げられるがそれらに限定されない。すなわち、「正常な機能」は、角膜移植を実現するのに必要な機能または十分であることを示す指標でありうることが理解される。例えば、正常化の判断方法としては、ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅのような角膜内皮細胞における機能タンパク質を指標としてその発現の変化を観察したり、あるいはサル等への移植によって生着し、機能するかどうかを調べることによって実行することができる。移植による判断方法は以下のとおりに行なうことができる。すなわち、Ｉ型コラーゲンまたは羊膜または角膜実質などのキャリア上に角膜内皮培養して培養角膜内皮シートを作製する。全身麻酔下でカニクイザルの角膜輪部を1.5mm切開してシリコン製の手術器具を前房内に挿入して角膜内皮細胞を機械的に掻爬して水疱性角膜症モデルを作製する。続いて角膜輪部を５−６ｍｍ切開して培養角膜内皮シートを前房内に挿入し、前房を空気で置換することでシートを角膜内皮面に接着させる。培養角膜内皮シートの移植による水疱性角膜症の治療効果は細隙灯顕微鏡による角膜透明性の評価にて行うことができる。またキャリアを用いずに、Rhoキナーゼ阻害剤などの細胞接着促進剤とともに細胞を懸濁液として前房内に注入することでも同様に水疱性角膜症の治療効果は細隙灯顕微鏡による角膜透明性の評価にて行うことができる。したがって、正常でない、すなわち、形質転換を生じた細胞は、この評価において正常細胞の評価を受けない。形質転換を生じた細胞は角膜内皮細胞としての機能であるポンプ機能、バリア機能が減弱あるいは喪失しているために、角膜が透明化しない、角膜厚が厚い、角膜内皮細胞密度が低いなどの項目で評価される。
【００６８】
本発明において、「Ｒｈｏキナーゼ」とは、Ｒｈｏの活性化に伴い活性化されるセリン／スレオニンキナーゼを意味する。例えば、ＲＯＫα（ＲＯＣＫ−ＩＩ：Leung,  T.  et  al.,  J.Biol.Chem.,  270,  29051-29054,  1995）、ｐ１６０ＲＯＣＫ（ＲＯＫβ、ＲＯＣＫ−Ｉ：Ishizaki,  T.  et  al.,  The  EMBO  J.,  15(8),  1885-1893,  1996）およびその他のセリン／スレオニンキナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００６９】
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤としては、下記文献：米国特許４６７８７８３号、特許第３４２１２１７号、国際公開第９５／２８３８７、国際公開９９／２０６２０、国際公開９９／６１４０３、国際公開０２／０７６９７６、国際公開０２／０７６９７７、国際公開第２００２／０８３１７５、国際公開０２／１００８３３、国際公開０３／０５９９１３、国際公開０３／０６２２２７、国際公開２００４／００９５５５、国際公開２００４／０２２５４１、国際公開２００４／１０８７２４、国際公開２００５／００３１０１、国際公開２００５／０３９５６４、国際公開２００５／０３４８６６、国際公開２００５／０３７１９７、国際公開２００５／０３７１９８、国際公開２００５／０３５５０１、国際公開２００５／０３５５０３、国際公開２００５／０３５５０６、国際公開２００５／０８０３９４、国際公開２００５／１０３０５０、国際公開２００６／０５７２７０、国際公開２００７／０２６６６４などに開示された化合物があげられる。かかる化合物は、それぞれ開示された文献に記載の方法により製造することができる。具体例として、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジンまたはその塩（たとえば、ファスジル（１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン））、（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（４−ピリジルカルバモイル）シクロヘキサン（（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド）またはその塩（たとえば、Ｙ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）など）などがあげられ、これらの化合物は、市販品（和光純薬株式会社、旭化成ファーマ等）を好適に用いることもできる。
【００７０】
（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（４−ピリジルカルバモイル）シクロヘキサン、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジンおよびそれらの薬学的に許容される塩等は、角膜内皮細胞の接着促進に特に優れているため、好ましく用いられる。該化合物の塩としては、薬学的に許容される酸付加塩が好ましく、それらの酸とは塩酸、臭化水素酸、硫酸等の無機酸、メタンスルホン酸、フマル酸、マレイン酸、マンデル酸、クエン酸、酒石酸、サリチル酸等の有機酸があげられる。（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（４−ピリジルカルバモイル）シクロヘキサン（（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド）・２塩酸塩（一水和物であってもよい）、および１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン塩酸塩がより好ましい。
【００７１】
本明細書において「被験体」とは、本発明の診断または検出等の対象となる対象（例えば、ヒト等の生物または生物から取り出した器官（眼）あるいは細胞等）をいう。
【００７２】
本明細書において「試料」とは、被験体等から得られた任意の物質をいい、例えば、眼の細胞等が含まれる。当業者は本明細書の記載をもとに適宜好ましい試料を選択することができる。
【００７３】
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではagentに相当す
る）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００７４】
本明細書において「検出剤」とは、広義には、目的の対象（例えば、正常細胞（例えば、正常角膜内皮細胞）または形質転換細胞（例えば、形質転換角膜内皮細胞））を検出することができるあらゆる薬剤をいう。
【００７５】
本明細書において「診断剤」とは、広義には、目的の状態（例えば、疾患など）を診断することができるあらゆる薬剤をいう。
【００７６】
本発明の検出剤は、検出可能とする部分（例えば、抗体等）に他の物質（例えば、標識等）を結合させた複合体または複合分子であってもよい。本明細書において使用される場合、「複合体」または「複合分子」とは、２以上の部分を含む任意の構成体を意味する。例えば、一方の部分がポリペプチドである場合は、他方の部分は、ポリペプチドであってもよく、それ以外の物質（例えば、糖、脂質、核酸、他の炭化水素等）であってもよい。本明細書において複合体を構成する２以上の部分は、共有結合で結合されていてもよくそれ以外の結合（例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等）で結合されていてもよい。２以上の部分がポリペプチドの場合は、キメラポリペプチドとも称しうる。従って、本明細書において「複合体」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子を含む。
【００７７】
本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。
【００７８】
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つの物質の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。結合または相互作用を測定することによって、本発明のマーカーの発現の度合い等を測定することができる。
【００７９】
従って、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に」相互作用する（または結合する）「因子」（または、薬剤、検出剤等）とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。
【００８０】
本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含む試料中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用する（または結合する）ことをいう。物質または因子について特異的な相互作用（または結合）としては、例えば、リガンド−レセプター反応、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用（または結合）が包含される。
【００８１】
本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、マーカー検出剤への結合または相互作用を含む、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、免疫沈降法（ＩＰ）、免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Nat  Genet．2002  Dec；32  Suppl：526-32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、RT−PCR、RACE法、SSCP法、免疫沈降法、two−hybridシステム、in  vitro翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【００８２】
本明細書において「発現量」とは、目的の細胞、組織などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡ等が発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。あるマーカーの発現量を測定することによって、マーカーに基づく種々の検出または診断を行うことができる。
【００８３】
本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「減少」または「抑制」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における減少、または減少させる活性をいう。
【００８４】
本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「増加」または「活性化」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または増加させる活性をいう。
【００８５】
従って、本発明のマーカーの減少、抑制、増加または活性化等の調節能力を指標に、眼の細胞の分化調節を行う薬剤を検出、スクリーニングすることができることが理解される。
【００８６】
本明細書において「抗体」は、広義にはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらのフラグメント、例えばＦｖフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂフラグメント、ならびにその他の組換えにより生産された結合体または機能的等価物（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、多機能抗体、二重特異性またはオリゴ特異性（oligospecific）抗体、単鎖抗体、ｓｃＦＶ、ダイアボディー、ｓｃ（Ｆｖ）２（single  chain  （Fv）2）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ）を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホス
ファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。本発明で用いられるＣＤ９８等に対する抗体は、それぞれ、ＣＤ９８等のタンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状などは問われない。具体的には、非ヒト動物の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体が使用できる。本発明においては、モノクローナル、あるいはポリクローナルを抗体として利用することができるが好ましくはモノクローナル抗体である。抗体のＣＤ９８等のそれぞれのタンパク質への結合は特異的な結合であることが好ましい。
【００８７】
本明細書において「抗原」（antigen）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（immunogen）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。本明細書において「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体またはリンパ球レセプターが結合する抗原分子中の部位をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
【００８８】
本明細書において「手段」とは、ある目的（例えば、検出、診断、治療）を達成する任意の道具となり得るものをいい、特に、本明細書では、「選択的に認識（検出）する手段」とは、ある対象を他のものとは異なって認識（検出）することができる手段をいう。
【００８９】
本明細書において使用される抗体は、擬陽性が減じられるかぎり、どのような特異性の抗体を用いても良いことが理解される。従って、本発明において用いられる抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。本明細書において「リガンド」とは、あるタンパク質に特異的に結合する物質をいう。例えば、細胞膜上に存在する種々のレセプタータンパク質分子と特異的に結合するレクチン、抗原、抗体、ホルモン、神経伝達物質などがリガンドとして挙げられる。
【００９０】
本発明の検出剤または診断剤あるいはその他医薬は、プローブおよびプライマーの形態を採ることができる。本発明のプローブおよびプライマーは、ＣＤ９８等の分子と特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書に記載されるように、ＣＤ９８等の分子の発現は角膜内皮細胞における正常細胞または形質転換細胞であるかどうかの指標であり、また、形質転換の度合いの指標として有用である。従って、本発明によるプローブおよびプライマーは、角膜内皮細胞のうち正常細胞または形質転換細胞および／または形質転換の度合いを識別するために用いることができる。本発明のプローブおよびプライマーは、１つの実施形態では、ＣＤ９８等の分子の発現を検出することができればよく、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等の塩基または塩基対からなる重合体を指す。二本鎖ｃＤＮＡも組織in  situハイブリダイゼーションにおいて利用可能であることが知られており、本発明のプローブおよびプライマーにはそのような二本鎖ｃＤＮＡも含まれる。組織中のＲＮＡの検出において特に好ましいプローブおよびプライマーとしては、ＲＮＡプローブ（リボプローブ）を挙げることができる。
【００９１】
本明細書において「（核酸）プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。本明細書においてプライマーはマーカー検出手段として使用され得る。
【００９２】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子（例えば、本発明のマーカー）の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、LASERGENE，PrimerSelect，DNAStar）を用いて行ってもよい。
【００９３】
本発明によるプライマーは、二種以上の該プライマーからなる、プライマーセットとしても使用することができる。
【００９４】
本発明によるプライマーおよびプライマーセットは、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅法を利用して目的遺伝子を検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーおよびプライマーセットとして利用することができる。
【００９５】
本発明によるプライマーセットはＣＤ９８等の分子等の目的のタンパク質のヌクレオチド配列をＰＣＲ法等の核酸増幅法により増幅できるように選択することができる。核酸増幅法は周知であり、核酸増幅法におけるプライマーペアの選択は当業者に自明である。例えば、ＰＣＲ法においては、二つのプライマー（プライマー対）の一方がＣＤ９８等の分子目的のタンパク質の二本鎖ＤＮＡのプラス鎖に対合し、他方のプライマーが二本鎖ＤＮＡのマイナス鎖に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、ＬＡＭＰ法（ＷＯ００／２８０８２号公報）においては、標的遺伝子に対して３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという３つの領域を、５’末端側からＢ１、Ｂ２、Ｂ３という３つの領域を、それぞれ規定し、この６つの領域を用いて４種類のプライマーを設計することができる。本発明のプライマーは、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づき、化学合成できる。プライマーの調製は周知であり、例えば、『Molecular  Cloning，  A  Laboratory  Manual  2nd  ed．』（Cold  Spring  Harbor  Press（1989））、『Current  Protocols  in  Molecular  Biology』（John  Wiley  ＆  Sons（1987−1997））に従って実施することができる。
【００９６】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の手段となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチド、特異的抗体またはそのフラグメントなどが挙げられるがそれに限定されない。本明細書においてプローブは、マーカー検出手段としてもちいられる。
【００９７】
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも約７０％相同な、より好ましくは、少なくとも約８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも約９０％相同な、少なくとも約９５％相同な核酸配列が含まれる。
【００９８】
１つの実施形態において、本発明の検出剤は、標識されたものでありうる。あるいは、本発明の検出剤は、タグを結合させたものであってもよい。
【００９９】
本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（例えば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。本発明のマーカーまたはそれを捕捉する因子または手段を複数、蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上であることが好ましい。リガンドを標識する場合、機能に影響を与えないものならば何れも用いることができるが、蛍光物質としては、ＡｌｅｘａＴＭＦｌｕｏｒが望ましい。ＡｌｅｘａＴＭＦｌｕｏｒは、クマリン、ローダミン、フルオレセイン、シアニンなどを修飾して得られた水溶性の蛍光色素であり、広範囲の蛍光波長に対応したシリーズであり、他の該当波長の蛍光色素に比べ、非常に安定で、明るく、またｐＨ感受性が低い。蛍光極大波長が１０ｎｍ以上ある蛍光色素の組み合わせとしては、ＡｌｅｘａＴＭ５５５とＡｌｅｘａＴＭ６３３の組み合わせ、ＡｌｅｘａＴＭ４８８とＡｌｅｘａＴＭ５５５との組み合わせ等を挙げることができる。核酸を標識する場合は、その塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、AAIF（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等を使用することが好ましい。蛍光発光極大波長の差が１０ｎｍ以上である蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ５とローダミン６Ｇ試薬との組み合わせ、Ｃｙ３とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン６Ｇ試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。
【０１００】
本明細書において使用される場合、「タグ」とは、受容体−リガンドのような特異的認識機構により分子を選別するための物質、より具体的には、特定の物質を結合するための結合パートナーの役割を果たす物質（例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジンのような関係を有する）をいい、「標識」の範疇に含まれうる。よって、例えば、タグが結合した特定の物質は、タグ配列の結合パートナーを結合させた基材を接触させることで、この特定の物質を選別することができる。このようなタグまたは標識は、当該分野で周知である。代表的なタグ配列としては、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡ、Ａｖｉタグなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のマーカーまたはマーカー検出剤にはこのようなタグを結合させてもよい。
【０１０１】
１つの局面において、本発明は、ＣＤ９８等の分子を、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を識別する指標とするための方法、あるいは角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を検出または診断する方法を提供する。
【０１０２】
本発明の方法では、ＣＤ９８等の分子を、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を識別する指標とするために、例えば、ＣＤ９８等の分子またはこれらの分子の遺伝子を生体内で検出する工程を行って実施することができる。例えば、その際に、ＣＤ９８等の分子またはこれらの分子の遺伝子に結合する物質を含む検出剤を用いることができる。そのような検出剤は、本明細書において記載されており、その記載を元に、当業者が本発明の方法を実施することができることが理解される。
【０１０３】
本発明の方法は、本発明の検出剤または診断剤を目的とする試料に接触させ、その試料中に目的とする対象であるＣＤ９８等の分子またはこれらの分子の遺伝子があるかどうか、あるいはそのレベルまたは量を測定する。
【０１０４】
本明細書中で使用される「接触（させる）」とは、物質を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のマーカー、検出剤、診断剤、リガンド等として機能しうるポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在させることができる。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。
【０１０５】
１つの実施形態では、本発明の方法において対象とされる増殖能の高い細胞は未分化細胞である。
【０１０６】
別の実施形態では、本発明の方法において対象とされる増殖能の高い細胞は幹細胞である。
【０１０７】
別の実施形態では、本発明の方法において対象とされる角膜内皮細胞はヒト細胞である。
【０１０８】
さらに別の実施形態では、本発明の方法において対象とされる角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。
【０１０９】
本発明の１つの実施形態では、本発明の指標とする方法に基づいて、分化の状態に関する診断を行うこともできる。
【０１１０】
具体的なＣＤ９８等の分子またはこれらの分子の遺伝子の発現を検出する方法については、被験試料（例えば、細胞等）におけるＣＤ９８等の分子またはこれらの分子の遺伝子の発現を検出できる方法であれば特に限定されず、例えば、ハイブリダイゼーション法、核酸増幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。
【０１１１】
ここで、「被験試料」とは、角膜内皮細胞または目的とする細胞またはそれに由来する物質であって遺伝子発現を可能にするものを含むと考えられる試料であればよく、例えば、角膜内皮から直接単離した細胞を用いることができる。角膜内皮の細胞は公知の方法により取得することができる（Koizumi  N,  Okumura  N,  Kinoshita  S.,  Experimental  Eye  Research.  2012;95:60-7.）。好ましくは、角膜内皮のドナーから得られた細胞、角膜内皮細胞等を被験細胞試料として用いることができる。また、インビトロで分化誘導された角膜内皮細胞を含む培養細胞を試料として用いることができる。インビトロにおける角膜内皮細胞への分化誘導は、公知のＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、骨髄間質細胞等の細胞を出発材料として、公知の方法、例えば、AMED法等による分化させる＜Ueno  M,  Matsumura  M,  Watanabe  K,  Nakamura  T,  Osakada  F,  Takahashi  M,  Kawasaki  H,  Kinoshita  S,  Sasai  Y:,  Proc  Natl  Acad  Sci  USA.  103(25):  9554-9559,  2006．＞処理を行うことにより実施することができる。
【０１１２】
本発明による検出の１つの実施形態によれば、本発明によるプローブを核酸試料（ｍＲＮＡまたはその転写産物）とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体、すなわちヌクレオチド二本鎖、を直接または間接的に検出することにより細胞試料におけるＣＤ９８等の分子またはその分子の遺伝子の発現を検出することができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular  Cloning,  A  Laboratory  Manual  2nd  ed.』(Cold  Spring  Harbor  Press(1989)、特にSection  9.47-9.58)、”Current  Protocols  in  Molecular  Biology”(John  Wiley  &  Sons(1987-1997)、特にSection  6.3-6.4)、”DNA  Cloning  1:Core  Techniques,  A  Practical  Approach  2nd  ed.”(Oxford  University(1995)、条件については特にSection  2.10）を参照しうる。
【０１１３】
ハイブリダイゼーション法を利用したＣＤ９８等の分子またはこれらの分子の遺伝子の発現の検出は、例えば、：（ａ）被験試料由来のポリヌクレオチドと、本発明によるプローブとを接触させる工程；および（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程により実施することができる。工程（ａ）において、目的の被験試料から調製されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、被験細胞試料由来のポリヌクレオチドとして、プローブと接触させることができる。プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては例えば、放射能活性（例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、および３５Ｓ）、蛍光（例えば、ＦＩＴＣ、ユーロピウム）、化学発色のような酵素反応（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）等を利用した標識が挙げられる。ハイブリダイゼーション産生物の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニー・ハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。ハイブリダイゼーション複合体が検出された細胞は、ＣＤ９８等の分子を発現している細胞であるので、該細胞について、増殖能が高い（未分化細胞、前駆細胞または幹細胞等）および／または分化能が高いと判定することができる。
【０１１４】
本発明による検出の別の実施形態によれば、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法により核酸試料（ｍＲＮＡまたはその転写産物）を増幅させ、増幅産物を検出することにより、試料におけるＣＤ９８等の分子またはこれらの分子の遺伝子の発現を検出することができる。
【０１１５】
核酸増幅法を利用したＣＤ９８等の分子またはこれらの分子の遺伝子の発現の検出は、例えば、（ｉ）被験試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法を実施する工程；および（ｉｉ）形成された増幅産物を検出する工程により実施することができる。
【０１１６】
工程（ｉ）において、目的の被験試料から調製されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を鋳型として用いることができる。増幅産物の検出は、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅法を用いて実施できる。増幅産物が検出される細胞は、正常角膜内皮細胞マーカーについては、正常角膜内皮細胞の傾向が高いものであり、形質転換角膜内皮細胞マーカーについては、形質転換角膜内皮細胞の傾向が高いものであるので、該細胞について、正常または形質転換された細胞であるかどうかを判定することができる。
【０１１７】
本発明による検出の別の実施形態によれば、本発明による抗体と試料とを接触させ、抗原抗体反応を検出することにより試料において、含まれる細胞が正常または形質転換された細胞であるかどうか、および／またはその割合を判定することができる。
【０１１８】
抗原抗体反応を利用したＣＤ９８等の分子の発現の検出は、例えば、下記工程：（Ｉ）被験細胞試料由来のタンパク質と、本発明による抗体とを接触させる工程；および（ＩＩ）抗原抗体複合体を測定する工程により実施することができる。抗原抗体反応の検出方法は当業者に周知であり、例えば、免疫学的方法により、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含むと考えられる被験細胞試料中のＣＤ９８等の分子を検出することができる。免疫学的方法としては、細胞試料を必要に応じて適切な処理、例えば、細胞の分離、抽出操作などをした試料について、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、ウェスタンブロット法、凝集法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法を適用することができる。免疫組織染色法は、例えば標識化抗体を用いる直接法、該抗体に対する抗体の標識化されたものを用いる間接法などにより行うことができる。標識化剤としては蛍光物質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質を使用することができる。
【０１１９】
抗原抗体複合体が検出される細胞は、ＣＤ９８等の分子を発現している細胞であるので、該細胞について、増殖能が高い（未分化細胞、前駆細胞または幹細胞等）および／または分化能が高いと判定することができる。角膜内皮の移植が必要な疾患、例えば水疱性角膜症、角膜浮腫、角膜白斑、特に、角膜ジストロフィ、外傷または内眼手術に起因する角膜内皮障害などの、あるいは他の特定の角膜内皮疾患（Fuchs角膜内皮ジストロフィ、後部多形性角膜内皮ジストロフィ等）の治療に用いるためには、増殖能が高い細胞（未分化細胞、前駆細胞または幹細胞等）は純度が高いことが望ましい。
【０１２０】
前記の各検出工程は１回のみならず、同工程を繰り返しあるいは組み合わせて行うことにより、細胞の正常・形質転換のレベルの検出または選択の精度を高めていくことができる。従って、このような実施形態を採用した場合、本発明による検出方法によれば、前記の工程を２回以上行うことにより、細胞の正常・形質転換のレベルをより高精度に検出または選択することができる。
【０１２１】
また、他のマーカー遺伝子、好ましくは例えば増殖マーカー遺伝子（例えば、Ｋｉ−６７およびＢｒｄＵ等）あるいはこれらの検出剤を併用することにより、細胞の正常・形質転換のレベルの検出または選択の精度を高めていくことができる。
【０１２２】
本明細書において「診断」とは、被験体（例えば、生体、細胞等）における疾患、障害、状態などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状または未来を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、細胞または体内等の状態を調べることができ、そのような情報を用いて、被験体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、広義には「早期診断」、「予測診断」、「事前診断」等を含む。本発明の診断方法は、原則として、身体から出たもの（例えば、細胞）を利用することができ、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。例えば、本発明のマーカーに結合する物質を用いて正常角膜内皮細胞と形質転換角膜内皮細胞とを識別して、細胞を診断することができる。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「予測診断、事前診断もしくは診断」を「支援」すると称することがある。
【０１２３】
本発明の診断薬等の医薬等としての処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、使用すべき量を決定することができる。
【０１２４】
本発明で使用される抗体は、以下のようにして生産することができる。
【０１２５】
本発明で使用される抗体（例えば、抗ＣＤ９８抗体等）は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として取得できる。本発明で使用される抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるもの等を含む。
【０１２６】
一例として、モノクローナル抗体の調製方法を以下に記載する。モノクローナル抗体は、抗原で免疫した動物から得られる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを調製し、得られるハイブリドーマからＣＤ９８等の分子等の活性を特異的に阻害する抗体を産生するクローンを選択することにより調製することができる。
【０１２７】
動物の免疫に抗原として用いるＣＤ９８等の分子等の成熟型等のタンパク質のアミノ酸配列の全体または免疫原性を有するフラグメントを免疫原として使用することができる。また、細胞表面に存在するタンパク質を特異的に検出するためのモノクローナル抗体としては、本発明のマーカーのタンパク質のアミノ酸配列における任意の１０以上からなるペプチドを抗原として使用することが好ましい。他の本発明の任意の因子（例えば、ＣＤ９８等の分子ならびにこれらに対応するタンパク質など）についても同様に抗原を設計することができる。
【０１２８】
得られた抗原用のＣＤ９８等の分子に結合させた後、アジュバントを添加する。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。
【０１２９】
上記のようにして得られた抗原を哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウマ、サル、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に投与する。免疫は、既存の方法であれば何れの方法をも用いることができるが、主として静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射などにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは４〜２１日間隔で免疫する。
【０１３０】
最終の免疫日から２〜３日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞が挙げられるが、一般に脾臓細胞が用いられる。抗原の免疫量は１回にマウス１匹当たり、例えば１００μｇ用いられる。
【０１３１】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。まず、目的となるタンパク質（例えば、ＣＤ９８等の分子等のタンパク質）を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免疫する。免疫動物から得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させてハイブリドーマを得る。更にこのハイブリドーマから、通常のスクリーニング法により、目的とする抗体を産生する細胞をスクリーニングすることによって目的の抗体を産生するハイブリドーマが選択できる。
【０１３２】
具体的には、モノクローナル抗体の作製は例えば以下に示すように行われる。まず、目的となる遺伝子（ＣＤ９８等の分子等）を発現させることによって、抗体取得の感作抗原として使用される目的のタンパク質が取得できる。目的の遺伝子の塩基配列およびタンパク質のアミノ酸配列は、本明細書の他の場所に記載されている（例えば、配列番号１−１６などに開示されている。すなわち、目的の遺伝子をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から、目的のタンパク質が公知の方法で精製できる。また、精製した天然のタンパク質もまた同様に使用できる。また、本発明で用いられるように、目的のタンパク質の所望の部分ポリペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質を免疫原として利用することもできる。免疫原とする融合タンパク質を製造するために、例えば、抗体のFcフラグメントやペプチドタグなどを利用することができる。融合タンパク質を発現するベクターは、所望の二種類またはそれ以上のポリペプチドフラグメントをコードする遺伝子をインフレームで融合させ、当該融合遺伝子を発現ベクターに挿入することにより作製することができる。融合タンパク質の作製方法はMolecular  Cloning  2nd  ed.(Sambrook,J  et  al.,  Molecular  Cloning  2nd  ed.,  9.47-9.58,  Cold  Spring  Harbor  Lab.  press,  1989）に記載されている。
【０１３３】
このようにして精製された目的のタンパク質（例えば、ＣＤ９８等の分子のタンパク質）を、哺乳動物に対する免疫に使用する感作抗原として使用できる。目的のタンパク質の部分ペプチドもまた感作抗原として使用できる。例えば、次のようなペプチド：目的のタンパク質（ＣＤ９８等の分子）のアミノ酸配列に基づいて化学合成によって取得されたペプチド；目的の遺伝子（ＣＤ９８等の分子等）の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによって取得されたペプチド；目的のタンパク質（ＣＤ９８等の分子）をタンパク質分解酵素により分解することによって取得されたペプチドを感作抗原とすることができる。
【０１３４】
部分ペプチドとして用いるタンパク質の領域および大きさは限定されない。例示的な領域としては、ＣＤ９８等の分子の細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列から選択することができる。感作抗原とするペプチドを構成するアミノ酸の数は、少なくとも３以上、例えば、５以上、あるいは６以上であることが好ましい。より具体的には、８〜５０、好ましくは１０〜３０残基のペプチドを感作抗原とすることができる。
【０１３５】
１つの実施形態では、本発明による検出キットとしては、本発明による実施形態の検出を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、ＣＤ９８等の分子の発現を検出するためのキットであって、本発明によるプローブを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。このプローブは、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法によりＣＤ９８等の分子の発現を検出する。従って第一の態様の検出方法は、所望により、ハイブリッド形成法を実施するための種々の試薬、例えば標識の検出に用いられる基質化合物、ハイブリダイゼーション緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
【０１３６】
本発明によるこの実施形態の検出キットは、精度の高い検出を行うために、ＣＤ９８等の分子以外の分化マーカー遺伝子（例えば、Ｋｉ−６７、ＢｒｄＵ等）の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、ＣＤ９８等の分子以外の分化マーカー遺伝子の発現を更に検出する。
【０１３７】
別の実施形態において、本発明による検出用キットとしては、本発明による別の実施形態の検出を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、ＣＤ９８等の分子の発現を検出するためのキットであって、本発明によるプライマーまたは本発明によるプライマーセットを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この検出用キットは核酸増幅法によりＣＤ９８等の分子の発現を検出する。従って第二の態様の検出方法は、所望により、核酸増幅法を実施するための種々の試薬、例えば緩衝液、ＰＣＲが正常に進行し得ることを示す内部標準、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
【０１３８】
本発明によるこの実施形態の検出キットは、精度の高い検出を行うために、ＣＤ９８等の分子以外の分化マーカー遺伝子の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、ＣＤ９８等の分子以外の分化マーカーの発現を更に検出する。
【０１３９】
さらなる実施形態において、本発明による検出キットとしては、本発明によるさらなる実施形態の検出を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、ＣＤ９８等の分子のタンパク質を検出するためのキットであって、本発明による抗体を少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットは抗原抗体反応を検出することによりＣＤ９８等の分子の発現を検出する。この実施形態の検出方法は、所望により、抗原抗体反応を実施するための種々の試薬、例えばＥＬＩＳＡ法等に用いる２次抗体、発色試薬、緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
【０１４０】
この実施形態では、本発明による検出キットは、精度の高い検出を行うために、ＣＤ９８等の分子以外の分化マーカーの発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、ＣＤ９８等の分子以外の分化マーカーの発現を更に検出する。
【０１４１】
これらのキット、組成物またはシステムは、本発明のマーカー（例えば、ＣＤ９８等の分子を同定することができる限り、任意の被験体由来の試料中のマーカー、該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段を用いることができることが理解され得る。従って、本明細書において具体的に記載された因子または手段のみならず、当該分野において公知の任意の等価の因子または手段を用いることができることが理解される。
【０１４２】
１つの実施形態では、本発明において使用される因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択され、好ましくは、因子は、タンパク質または複合分子（例えば、糖タンパク質、脂質タンパク質など）である。好ましくは、因子は、抗体（例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）である。このような因子は、標識されるか、または標識可能であることが好ましい。なぜなら、診断することが容易となるからである。
【０１４３】
本発明の好ましい実施形態において、使用される手段は、質量分析装置、核磁気共鳴測定装置、Ｘ線解析装置、ＳＰＲ、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー）、免疫学的手段（例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノソルベントアッセイ））、生化学的手段（例えば、ｐＩ電気泳動、サザンブロッティング、二次元電気泳動）、電気泳動機器、化学的分析機器、蛍光二次元ディファレンシャル電気泳動法（２ＤＥ−ＤＩＧＥ）、同位体標識法（ＩＣＡＴ）、タンデムアフィニティ精製法（ＴＡＰ法）、物理学的手段、レーザーマイクロダイセクションおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０１４４】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のシステムまたはキットは、さらに、マーカーの標準を含む。このような標準は、マーカーの検出手段（該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段など）が正常に機能しているかどうかを確認するために用いることが好ましい。
【０１４５】
好ましい実施形態では、本発明では、対象となる試料を精製する手段をさらに備え得る。このような精製手段としては、例えば、クロマトグラフィーなどを挙げることができる。精製することによって、診断の精度を上げることができることから、好ましい実施形態において使用され得るが、これは必須ではない。
【０１４６】
（好ましい実施形態）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【０１４７】
（正常細胞・形質転換細胞マーカー）
１つの局面において、本発明は、新規正常角膜内皮細胞マーカーおよび／または形質転換角膜内皮細胞マーカーから選択される少なくとも１つを含む、角膜内皮の正常細胞・形質転換細胞を識別するためのマーカーを提供する。
【０１４８】
本発明において提供される正常角膜内皮細胞マーカーはＣＤ１６６、ＨＬＡ−Ａ２、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ９８、ＣＤ５９、ＣＤ５４、ＣＤ３４０、ＣＤ４７、ＥＧＦ−Ｒ、ＣＤ２９、ＣＤ７４、ＣＤ１６５、ＣＤ２２１、ＣＤ４９ａ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ１３０およびＣＤ４９ｆ等がある。
【０１４９】
また、本発明において提供される形質転換角膜内皮細胞マーカーはＣＤ２６、ＣＤ９、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ１３、ＣＤ９９、ＣＤ１０５、ＣＤ６３、ＣＤ５８、ＣＤ２０１、ＣＤ５６、ＣＤ４４、ＣＤ５５、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９１、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ１６４、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ４６、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ８１、ＣＤ１５１、ＣＤ２００およびＣＤ１０等がある。
【０１５０】
これらのマーカーのほとんどが細胞表面マーカーである。細胞表面マーカーであることから、ＦＡＣＳ等での利用が容易であり、細胞の分析が容易に行えることが理解される。
【０１５１】
本発明のマーカーは、少なくとも１つの形質転換角膜内皮細胞マーカーと少なくとも１つの正常角膜内皮細胞マーカーとを含んでいてもよい。２種類の傾向を示す（複数の）マーカーを提供することによって正常細胞および形質転換細胞の両方をマーカーの発現という正の反応で判断することができるため分析がより容易になる。
【０１５２】
マーカーとして用いるためには、そのマーカーの発現の程度が強ければ強いほど有利である。正常と形質転換との区別が容易になるからである。ヒトについていえば、マーカーとして適切な強発現の程度としては、約１倍を超えるもの、例えば、少なくとも約１．１倍以上、少なくとも約１．２倍以上、少なくとも約１．３倍以上、少なくとも約１．４倍以上、少なくとも約１．５倍以上、少なくとも約１．６倍以上、少なくとも約１．７倍以上、少なくとも約１．８倍以上、少なくとも約１．９倍以上、少なくとも約２．０倍以上、少なくとも約２．５倍以上、少なくとも約３．０倍以上、少なくとも約４．０倍以上、少なくとも約５．０倍以上等を挙げることができるがこれに限定されない。また、マーカーは１つ用いてもよく複数用いてもよい。なお、発現の程度については、表２−３を参照のこと。表４においては、好ましいマーカーが示されている（正常細胞ではＣＤ９８、ＣＤ１６６、ＣＤ３４０を、形質転換細胞ではＣＤ９、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４４、ＣＤ７３である）が、これに限定されるものではない。また、表４に記載されるマーカーは１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つ全部を任意に組み合わせてもよいことが理解される。
【０１５３】
１つの好ましい実施形態では、正常角膜内皮細胞マーカーとしてＣＤ９８、ＣＤ１６６、およびＣＤ３４０が有利である。これらのマーカーは１つ、２つまたは３つ使用することができる。理論に束縛されることを望まないが、これらのマーカーは角膜内皮細胞の正常細胞と形質転換細胞との間できわめて顕著に発現レベルの相違が見られたため、そのマーカーとしての利用が期待されるからである。
【０１５４】
別の好ましい実施形態では、形質転換角膜内皮細胞マーカーとしてＣＤ９、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４４、およびＣＤ７３が有利である。これらのマーカーは１つ、２つ、３つまたは４つ使用することができる。理論に束縛されることを望まないが、これらのマーカーは角膜内皮細胞の正常細胞と形質転換細胞との間できわめて顕著に発現レベルの相違が見られたため、そのマーカーとしての利用が期待されるからである。
【０１５５】
さらに好ましい実施形態では、本発明のマーカーは、正常角膜内皮細胞マーカーとしてＣＤ９８、ＣＤ１６６、およびＣＤ３４０からなる群より選択される少なくとも１つの分子を含み、形質転換角膜内皮細胞マーカーとしてＣＤ９、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４４、およびＣＤ７３からなる群より選択される少なくとも１つの分子を含む。
【０１５６】
さらに好ましい実施形態では、本発明のマーカーは、ＣＤ１６６およびＣＤ７３からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーを含む。これらのマーカーは、角膜内皮細胞の正常細胞と形質転換細胞との間でなおいっそうきわめて顕著に発現レベルの相違が見られたため、そのマーカーとしての利用がなおいっそう期待されるからである。
【０１５７】
別の局面において、本発明は、本発明のマーカーとして使用しうる遺伝子の核酸および／または該核酸によってコードされるタンパク質をマーカーとして提供する。このような場合、本発明は、本発明のマーカーに結合する物質を含む、正常角膜内皮細胞と形質転換角膜内皮細胞とを識別するための検出剤を提供する。本発明のマーカーとしては、本明細書において記載される任意の形態が利用されうることが理解される。あるいは、本発明は、本発明のマーカーに結合する物質を含む、正常角膜内皮細胞と形質転換角膜内皮細胞とを識別するための診断剤を提供する。また、本発明は、本発明のマーカーに結合する物質を用いた、正常角膜内皮細胞と形質転換角膜内皮細胞とを識別するための診断する方法を提供する。本発明の検出剤または診断剤は、対象となる細胞が提供されたときに、本発明のマーカーに結合する物質を用いて、その物質の細胞への結合状態に関する情報（例えば、この物質を標識して用いて、その標識に関する信号等を検出するか、あるいは、結合する物質ことができる）に基づいて、その対象となる細胞が正常であるか、形質転換されているかを検出ないし診断することができる。
【０１５８】
１つの特定の局面では、本発明は、本発明のマーカーに結合する物質を、角膜内皮細胞を含むサンプルに適用する工程、および該物質と該角膜内皮細胞との結合を検出する工程を含む、正常角膜内皮細胞と形質転換角膜内皮細胞とを識別するための検出方法を提供する。あるいは、本発明は、本発明のマーカーに結合する物質を、角膜内皮細胞を含むサンプルに適用する工程、および該物質と該細胞との結合を検出する工程を含む、該角膜内皮細胞の診断方法であって、該結合の有無を判断することによって正常角膜内皮細胞と形質転換角膜内皮細胞とが識別される、方法を提供する。
【０１５９】
１つの実施形態では、この物質は、抗体またはその抗原結合断片、核酸プライマー、プローブ等でありうる。
【０１６０】
ある実施形態では、本発明の診断剤または検出剤が対象とする細胞は、生体内に存在するまたは存在していた細胞である。あるいは、本発明の診断剤または検出剤が対象とする細胞は、継代培養した細胞等、生体内に存在していないまたは存在していなかった細胞であり得る。
【０１６１】
ある実施形態では、本発明の診断剤または診断方法を用いて、角膜内皮疾患の診断を行うことができる。例えば、本発明の診断剤または診断方法を用いて生体内に存在するまたは存在していた細胞の状態を調べ、形質転換細胞が見出されたとき、ある実施形態では本発明の形質転換角膜内皮細胞マーカーの発現が一定のレベル以上で見出されたとき、その形質転換細胞あるいは線維芽細胞に関連する角膜内皮疾患が発生しているまたはその予兆があると診断することができる。生体内で調べる場合は、例えば、手術前あるいは手術中等にその場で細胞状態を診断することができる。このような一定のレベルは、当業者は本明細書の情報をもとに統計学等の当該分野の技術常識を用いて適宜設定することができる。本発明の検出または診断が対象としうる角膜内皮障害としては、原発性のもの（内皮細胞を標的とする疾患として、角膜内皮変性（滴状角膜、Fuchs角膜内皮ジストロフィ、後部多形性角膜ジストロフィ、虹彩角膜内皮症候群、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ等）、ウイルス性疾患（サイトメガロウイルス角膜内皮炎、単純ヘルペスウイルス角膜内皮炎等）、落屑症候群、角膜移植後拒否反応等）、続発性のもの（外的要因に伴う炎症あるいは物理的損傷として、例えば、角膜ぶどう膜炎、角膜実質炎、白内障手術後、角膜移植後、網膜・硝子体手術後、緑内障手術後（濾過手術、周辺虹彩切開）、緑内障発作、コンタクトレンズ長期装着、角膜外傷、分娩時外傷等）、その最終的な症状としての水疱性角膜症が挙げられるがこれらに限定されない。特に重要な角膜内皮疾患としては、水疱性角膜症、外傷または内眼手術に起因する角膜内皮障害、Fuchs角膜内皮ジストロフィおよび後部多形性角膜内皮ジストロフィなどの角膜ジストロフィを含む角膜内皮細胞の線維性変化が関与するものを挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１６２】
１つの実施形態では、本発明の診断剤または診断方法では、形質転換角膜内皮細胞マーカーが少なくとも１つ発現した場合、形質転換角膜内皮細胞が含まれると判断される。あるいは、本発明の別の実施形態では、形質転換角膜内皮細胞マーカーが少なくとも１つ発現した場合、該角膜内皮細胞に不可逆性の変性を来していると診断される。
【０１６３】
１つの実施形態では、本発明は、本発明において用いられる上記結合する物質を染色するための薬剤をさらに含んでいてもよい。このような結合する物質の染色によって、結合状態をより可視化することができる。このような染色に使用される薬剤は、染色し得るかぎりどのような薬剤であってもよく当該分野において公知の任意の薬剤を用いることができる。
【０１６４】
染色技術も当該分野において公知であり任意の手法を用いることができる。例えば、特定のタンパク質の存在または過剰発現を検出するために抗体を使用することは当該分野において公知である。本発明では、形質転換した角膜内皮細胞は形質転換角膜内皮細胞マーカーが発現またはその発現が有意に増加するため、本発明の形質転換角膜内皮細胞マーカーあるいは正常角膜内皮細胞マーカーに対する特異的な抗体を、この発現の検出に使用し、そして、それにより形質転換の状態を検出しうる。上述の技術は、これだけに制限されることなく、ウェスタンブロット、ドットブロット、沈殿、凝集、ＥＬＩＳＡアッセイ、免疫組織化学、in  situハイブリダイゼーション、さまざまな組織または体液におけるフローサイトメトリー、および他の種々のサンドイッチアッセイを含む。これらの技術は、当該分野において周知である。例えば米国特許第５，８７６，９４９号（本明細書においてその全体を援用する）を参照のこと。本発明の形質転換角膜内皮細胞マーカーあるいは正常角膜内皮細胞マーカーの細胞内エピトープに特異的な抗体を使用したとき、細胞を溶解し、そしてその抗体と一緒にインキュベートする必要がある。上述の技術は全細胞溶解物または例えば免疫沈殿により試験するために分離される形質転換角膜内皮細胞あるいは正常角膜内皮細胞において行われうる。あるいは別の技術として、例えば免疫組織学的染色は、細胞全体を必要とし、そして特定の細胞密度の細胞層をさらに必要とする。上述の試験は、本発明の形質転換角膜内皮細胞マーカーあるいは正常角膜内皮細胞マーカーの細胞外エピトープに特異的な抗体を必要とする。形質転換角膜内皮細胞マーカーあるいは正常角膜内皮細胞マーカーは、表面抗原であるため、通常は、細胞を溶解する必要はないと考えられる。
【０１６５】
また、本発明の形質転換角膜内皮細胞マーカーあるいは正常角膜内皮細胞マーカーに対する特異的な抗体は、角膜内皮細胞の状態を検出または診断するために利用されうる。そのための処理方法、例えば免疫組織学的染色または免疫蛍光顕微鏡検査は、当該分野で周知であり、そして形質転換角膜細胞または正常角膜内皮細胞を視覚化するために使用されうる。例えば米国特許第５，５１４，５５４号（本明細書においてその全体が参考として援用される。）を参照のこと。例えば、本発明の形質転換角膜内皮細胞マーカーあるいは正常角膜内皮細胞マーカーの発現は、本発明の形質転換角膜内皮細胞マーカーあるいは正常角膜内皮細胞マーカーのタンパク質全体またはそのタンパク質の断片を検出しうる抗体を使用することにより検出され得る。あるいは、本発明の形質転換角膜内皮細胞マーカーあるいは正常角膜内皮細胞マーカーの発現の他の検出方法は、本発明の形質転換角膜内皮細胞マーカーあるいは正常角膜内皮細胞マーカーをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出を含む。このようなＤＮＡまたはＲＮＡの配列の検出技術は当該分野において周知であり任意の手法を用いることができる。
【０１６６】
この場合、本発明の形質転換角膜内皮細胞マーカーあるいは正常角膜内皮細胞マーカーの発現または分布変更を検出するために、本発明の形質転換角膜内皮細胞マーカーあるいは正常角膜内皮細胞マーカーに特異的な抗体は、多数の公知の検出可能な標識、例えば、蛍光、放射性または酵素物質等により、共有結合的または非共有結合的に標識され得る。あるいは、本発明の形質転換角膜内皮細胞マーカーあるいは正常角膜内皮細胞マーカーに特異的な抗体に特異的な２次抗体が、当該分野において公知の任意の適切な検出可能な標識により標識され、本発明の形質転換角膜内皮細胞マーカーあるいは正常角膜内皮細胞マーカーに特異的な抗体を検出するために使用される。
【０１６７】
１つの実施形態では、生体内での診断は以下のようにして実施することができる。１つの例としては、蛍光標識した形質転換角膜内皮細胞マーカーあるいは正常角膜内皮細胞マーカーに特異的な抗体を前房内（または血管内）に投与し、蛍光顕微鏡などにより生体内で観察することができるが生体内での診断の手法はこれに限定されず任意の他の形態を用いることができる。
【０１６８】
別の局面において、本発明は、本発明のマーカーを、正常角膜内皮細胞と形質転換角膜内皮細胞とを識別する指標とする方法を提供する。本発明のマーカーとしては、本明細書において記載される任意の形態が利用されうることが理解される。
【０１６９】
（正常角膜内皮細胞の割合が上昇した角膜内皮細胞試料を調製するための方法・純化された角膜内皮細胞を調製するための方法）
別の局面において、本発明は、ａ）角膜内皮細胞を含む試料を提供する工程；およびｂ）該サンプルにおいて、本発明のマーカーを指標として、正常角膜内皮細胞の割合を上昇させる工程を含む、正常角膜内皮細胞の割合が上昇した角膜内皮細胞試料を調製するための方法を提供する。本発明のマーカーとしては、（正常細胞・形質転換細胞マーカー）をはじめとして、本明細書において記載される任意の形態が利用されうることが理解される。
【０１７０】
別の局面において、本発明は、純化された角膜内皮細胞を調製するための方法であって、該方法は：未分化細胞から角膜内皮細胞を誘導する工程：および本発明のマーカーを指標として、該角膜内皮細胞の割合を上昇させる工程を包含する、方法を提供する。本発明のマーカーとしては、（正常細胞・形質転換細胞マーカー）をはじめとして、本明細書において記載される任意の形態が利用されうることが理解される。
【０１７１】
純化の方法としては、例えば、蛍光細胞ソーター（FACS）において、目的とするマーカーを発現する細胞を分取する手法、磁気細胞分離法(MACS)等を列挙することができるが、これに限定されない。
【０１７２】
１つの具体的な手法としては、以下を挙げることができるがこれに限定されない：培養した角膜内皮細胞を正常細胞あるいは形質転換細胞マーカーに対する抗体と反応させたのちに、蛍光細胞ソーターにより目的の正常細胞あるいは形質転換細胞マーカーの発現強度の程度により正常細胞あるいは形質転換細胞をそれぞれ分離して回収する。
【０１７３】
１つの実施形態では、未分化細胞は、誘導性多能性幹（ｉＰＳ）細胞または胚性幹（ＥＳ）細胞である。
【０１７４】
別の局面において、本発明は、本発明の方法で調製された細胞を含む組成物を提供する。
【０１７５】
さらに別の局面では、本発明は、本発明の組成物を角膜治療のために使用することを提供する。ここで角膜治療の対象は角膜内皮疾患を含みうるが、それに限定されない。
【０１７６】
（純度検定）
別の局面において、本発明は、本発明のマーカーに結合する物質を含む、角膜内皮細胞を含む試料を作製する際の純度検定剤を提供する。あるいは本発明は、本発明のマーカーに結合する物質を、角膜内皮細胞を含むサンプルに適用する工程、および該物質と該細胞との結合を検出する工程を含む、角膜内皮細胞を含む試料を作製する際の純度を検定する方法であって、該結合の有無を判断することによって正常角膜内皮細胞と形質転換角膜内皮細胞とが識別される、方法を提供する。本発明はまた、本発明の純度を検定する方法で調製された細胞を用いる、治療または予防方法を提供する。１つの実施形態では、この治療または予防は角膜のためのものである。１つの実施形態では、前記治療または予防の対象は角膜内皮疾患を含む。疾患、治療および予防は、本明細書において記載される任意の技術および実施形態が適用され得ることが理解される。
【０１７７】
また、他の局面において、本発明は、本発明のマーカーを、角膜内皮細胞を含む試料を作製する際の純度検定の指標とする方法を提供する。
【０１７８】
純度の検定の方法としては、フローサイトメトリー等で発現抗原を測定し、これを全体の割合で除することによって純度を検定すること、磁気細胞分離法(MACS)、免疫染色を行い蛍光顕微鏡で観察すること、ウエスタンブロッティング法、PCR法などがあるが、これに限定されない。
【０１７９】
１つの具体的な手法としては、以下を挙げることができるがこれに限定されない：培養した角膜内皮細胞を正常細胞あるいは形質転換細胞マーカーに対する抗体と反応させたのちに、フローサイトメトリーにより目的の正常細胞あるいは形質転換細胞マーカーの発現強度の程度により細胞集団における正常細胞あるいは形質転換細胞の割合を検定することができる。
【０１８０】
純度検定の技術において使用される本発明のマーカーとしては、（正常細胞・形質転換細胞マーカー）をはじめとして、本明細書において記載される任意の形態が利用されうることが理解される。
【０１８１】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook  J.  et  al.(1989).  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harborおよびその3rd  Ed.(2001);  Ausubel,  F.M.(1987).  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience;  Ausubel,  F.M.(1989).  Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience;  Innis,  M.A.(1990).PCR  Protocols:  A  Guide  to  Methods  and  Applications,  Academic  Press;  Ausubel,  F.  M.(1992).  Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates;  Ausubel,  F.M.(1995).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates;  Innis,  M.A.  et  al.(1995).  PCR  Strategies,  Academic  Press;  Ausubel,  F.M.(1999).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Wiley,  and  annual  updates;  Sninsky,J.J.et  al.(1999).  PCR  Applications:  Protocols  for  Functional  Genomics,  Academic  Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得  る）が参考として援用される。
【０１８２】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Gait,  M.J.(1985).  Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Gait,  M.J.(1990).  Oligonucleotide  Synthesis:A  Practical  Approach,IRL  Press;  Eckstein,  F.  (1991).  Oligonucleotides  and  Analogues:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Adams,  R.L.  et  al.(1992).The  Biochemistry  of  the  Nucleic  Acids,  Chapman  &  Hall;  Shabarova,  Z.  et  al.(1994).  Advanced  Organic  Chemistry  of  Nucleic  Acids,  Weinheim;  Blackburn,  G.M.  et  al.(1996).  Nucleic  Acids  in  Chemistry  and  Biology,  Oxford  University  Press;  Hermanson,  G.T.(1996).  Bioconjugate  Techniques,  Academic  Pressなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１８３】
例えば、本明細書において、当該分野に知られる標準法によって、例えば自動化ＤＮＡ合成装置（Biosearch,  Applied  Biosystems等から商業的に入手可能なものなど）の使用によって、本発明のオリゴヌクレオチドを合成することも可能である。例えば、Stein  et  al.（1988,  Nucl.  Acids  Res.  16:  3209）の方法によって、ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを合成することも可能であるし、調節孔ガラスポリマー支持体（Sarin  et  al.,  1988,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  85:7448-7451）等の使用によって、メチルホスホネート・オリゴヌクレオチドを調製することも可能である。
【０１８４】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１８５】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１８６】
必要な場合、以下の実施例で用いる動物の取り扱いは、京都府立医科大学または同志社大学において規定される基準を遵守し、ヘルシンキ宣言に基づいて行った。また、視覚および眼科研究における動物の使用についてのＡＲＶＯ宣言（the  ARVO  Statement  for  the  Use  of  Animals  in  Ophthalmic  and  Vision  Research）に従って動物の飼育および取り扱いを行った。また、試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Ｓｉｇｍａ、和光純薬、ナカライ、abcam、Santa  Cruz  Biotechnology、R  &  D  Systems、Abnova、AssayPro、Origene、Biobyt、Biorad、Cell  Signaling  Technology、GE  Healthcare、IBL等）の同等品でも代用可能である。
【０１８７】
（実験材料と方法）
（材料）
（角膜組織）
本実験で使用した全てのヒト角膜組織はアメリカシアトルアイバンクのSightLifeTM（Northwest  Lions  Foundation）より輸入されたものを使用した。また、全てのサル角膜組織は、他の研究目的により安楽死したカニクイザル（日精バイリス株式会社滋賀研究所（Nissei  Bilis  Co．，  Ltd．）Ohtsu，  Japan、株式会社ケアリー（Keari  Co．，  Ltd．）Wakayama，  Japan）の角膜を使用した。全ての角膜を、保存培地（Optisol；Chiron  Vision  Corporation，Irvine，CA）中、４℃で保存した。
【０１８８】
（細胞培養）
ヒト角膜内皮細胞初代培養では、角膜組織から内皮細胞層を含むデスメ膜を剥離し、OPTIMEM-Iに溶解した２ｍｇ／ｍｌ  Collagenase  Ａ（カタログ番号：70164923；Roche  Applied  Science，Penzberg，  Germany）に入れて３７℃でインキュベートした。12時間後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去後、沈殿している角膜内皮細胞塊に培養培地を加えて混和し、FNC  Coating  Mix（カタログ番号：０４０７；Athena  Enzyme  Systems，  Baltimore，MD，USA）をコートした１２ウェルプレートへ全量を播種した。培養培地はOPTIMEM-I（カタログ番号：51985；Gibco-Invitrogen，  Carlsbad，  CA）に8％ウシ胎仔血清（カタログ番号：10437-028；fetal  bovine  serum；FBS；BioWest，France）、５０μｇ／ｍｌ  Gentamicin（Invtirogen）、１０μＭ  Y-27632（Calbiochem，  La  Jolla，CA）を加えたものを使用した。
【０１８９】
サル角膜内皮細胞初代培養では、角膜組織から内皮細胞層を含むデスメ膜を剥離し、ＤＭＥＭ（Gibco-Invitrogen）に溶解した２ｍｇ／ｍｌ  Collagenase  A（カタログ番号：70164923；Roche  Applied  Science，  Penzberg，  Germany）に入れて３７℃でインキュベートした。12時間後、1000rpmで５分間遠心分離して上清を除去後、沈殿している角膜内皮細胞塊に培養培地を加えて混和し、FNC  Coating  Mix（カタログ番号：０４０７；Athena  Enzyme  Systems，  Baltimore，MD，USA）をコートした１２ウェルプレートへ全量を播種した。培養培地はＤＭＥＭ(カタログ番号：１２３２０；Gibco-Invitrogen)に１０％  ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン（カタログ番号：１５７１０−０６４；Invitrogen）、２ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（basic  fibroblast  growth  factor；カタログ番号：１３２５６−０２９；bFGF；  Invitrogen）を加えたものを使用した。
【０１９０】
ヒト角膜は、初代培養までの期間が１４日未満のものを用いた。ヒトおよびサルの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の培養には、以前に報告した系［Koizumi  N  et  al.、Exp  Eye  Res.,2012;95:60-67；Koizumi  N  et  al.、Invest  Ophthalmol  Vis  Sci..2007;48:4519-4526；Okumura  N  et  al.、Am  J  Pathol.  2012;181:268-277］を使用した。
【０１９１】
培地交換は２日ごとに行った。継代は５０〜８０％コンフルエントになった時点で行った。継代方法は、Ｃａ２＋Ｍｇ２＋非含有（free）ＰＢＳ（ＰＢＳ−；Nissui  Pharmaceutical  Co．，  Ltd．，  Tokyo．  Japan）で細胞を洗浄し、TrypLETM  Select（カタログ番号：12563；Invitrogen）を加え、３７℃で５分間インキュベートした。プレートから細胞を剥離して回収し、１０００ｒｐｍ  ５分間遠心分離後、培養培地を加えて細胞懸濁液とした。FNC  Coating  Mixをコートしたプレートへ１：２〜３の密度で細胞を播種した。
【０１９２】
（免疫染色）
培養した細胞を固定した後にCD73、CD166または、機能関連マーカーとしてＺＯ−１、Ｎａ＋／Ｋ＋−ATPaseを用いて免疫染色を行い蛍光顕微鏡にて観察を行った。培養サルまたはヒト角膜内皮細胞を24ウェルプレート(Sigma-Aldrich  Co.、St.  Louis、MO)にて培養し、４％ホルムアルデヒドで１０分間室温（ＲＴ）で固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに３０分間インキュベートした。次に、Anti-HumanCD73(カタログ番号:550256；BD  Pharmingen)あるいはAnti-Human  CD166(カタログ番号:559260；BD  Pharmingen)あるいはバリア機能に関連するタンパク質であるＺＯ−１（Zymed  Laboratories，Inc．，South  San  Francisco，CA）あるいはポンプ機能に関連するタンパク質であるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ（Upstate  Biotec，Inc．，Lake  Placid，NY）の免疫組織染色を行った。それぞれの抗体の１：3００希釈を用いて実施した。二次抗体には、Alexa  Fluor（登録商標）４８８標識Alexa  Fluor（登録商標）の１：1000希釈を使用した。次いで、細胞の核をＤＡＰＩ（Vector  Laboratories，Inc．，Burlingame，CA）で染色した。次いで、スライドを蛍光顕微鏡（BZ-9000,  KEYENCE、Osaka、Japan）で観察した。
【０１９３】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
RT-PCR（半定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）により、ＣＤ１６６、ＣＤ７３、ＧＡＰＤＨに対するＰＣＲ法を行った。プライマーは、オリゴヌクレオチド合成会社であるINVITROGENから購入し、脱塩処理したものを用いた。細胞からの総ＲＮＡの抽出にはRNEasy  Mini  Kit（QIAGEN社、カタログ番号：74106）を用いた。抽出したＲＮＡはReverTra  Ace（TOYOBO社（カタログ番号：TRT−101））により逆転写反応（４２℃、６０分間）を行い、TAKARA  Taq  Hot  Start  Version（タカラバイオ社、カタログ番号：RR001A）によりＧＡＰＤＨを内部標準としてCD166、CD73を増幅した。同量のｃＤＮＡを、ＰＣＲ機（GeneAmp  9700；Applied  Biosystems）と、下記のプライマーペアによって増幅した。ＰＣＲ反応には下記に示すプライマーを用いた。
・ＣＤ１６６−Ｆ:CCCCAGAGGAATTTTTGTTTTAC（配列番号１７）
・ＣＤ１６６−Ｒ：AGCCTGATGTTATCTTTCATCCA（配列番号１８）
・ＣＤ７３−Ｆ：GTTCCTGTAGTCCAGGCCTATG（配列番号１９）
・ＣＤ７３−Ｒ：ACATTTCATCCGTGTGTCTCAG（配列番号２０）
・ＧＡＰＤＨ-Ｆ：GAGTCAACGGATTTGGTCGT（配列番号２１）
・ＧＡＰＤＨ-Ｒ：TTGATTTTGGAGGGATCTCG（配列番号２２）
増幅されたＤＮＡ断片は１．５％アガロースゲル（ナカライテスク、カタログ番号：01149−76）で電気泳動し、エチジウムブロマイド（ナカライテスク、カタログ番号：14603−51）での染色により検出した。
【０１９４】
（フローサイトメトリー）
培養ヒト角膜内皮あるいは培養サル角膜内皮細胞をFNC  Coating  Mixをコートした培養皿へ播種し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下にてコンフルエントに到達するまで約１４日間培養した。TrypLETM  Selectにて細胞を剥離して回収した。Human  Cell  Surface  Marker  Screening  Panel(BD  LyoplateTM、BD  Bio-sciences，  Franklin  Lakes，  NJ)を用いて、説明書に準じてフローサイトメーター（BD  FACSCantoTMII(BD  Biosciences、Franklin  Lakes、NJ)）を使用してハイスループットの表面抗原解析を行った。また、培養サル角膜内皮を（BD  AccuriTM  C6  (BD  Biosciences、Franklin  Lakes、NJ)）を用いて表面抗原の解析を行った。TrypLETM  Selectにて細胞を剥離して回収した細胞に７０％エタノールを加えて−２０℃で２時間インキュベートし、細胞を固定した。ＰＢＳ−にて２回洗浄後、１％  ＢＳＡを加え、室温で１５分間インキュベートしてブロッキングした。APCMouse  anti-Human  CD73  (カタログ番号:560847；BD  Pharmingen)あるいはPEMouse  anti-HumanCD166  (カタログ番号:560903；BD  Pharmingen)を使用し、室温で３０分間インキュベートした。培養サル角膜内皮および不死化ヒト角膜内皮細胞のソーティングは、FACS  Aria  II（BD  Bio−sciences，  Franklin  Lakes，  NJ）を使用した。回収した細胞を1次抗体としてPurified  Mouse  anti-HumanCD73  (カタログ番号:550256；BD  Pharmingen)にて室温で１５分間インキュベートし、二次抗体はAlexa  Fluor  488-conjugated  goat  anti-rabbit  IgG（1：1500）を使用し、室温で２０分間インキュベートした。ＣＤ７３の発現の程度に応じてソーティングして、２４ウェルプレート(Sigma−AldrichCo.、St.  Louis、MO)にて培養した。
【０１９５】
（参考例１）
図１に示すように、従来の培養角膜内皮細胞生産における問題点をみるために、ドナー角膜からヒト角膜内皮細胞の分離、および培養を行った場合の、細胞の様子を観察した。実験観察条件は、上記（実験材料と方法）の欄で記載したとおりである。
【０１９６】
図１に示すように、左は正常の多角形の細胞形態を保って培養できた角膜内皮を示すが、通常の方法で分離し、培養すると容易に右下に示すように、形質転換を生じて線維芽細胞様に形態変化して細胞機能を消失する。
【０１９７】
培養角膜内皮細胞移植の臨床応用には、形質転換細胞を含まない角膜内皮細胞の作製が不可欠であるが、従来の技術では達成できないというのが現在の眼科学における状況である。そこで、培養した細胞の純度検定、純度をソーティングで高める、iPS細胞およびES細胞から角膜内皮細胞を誘導した際に正常な角膜内皮細胞をソーティングで選別するなどの目的に用いることが可能な、正常または形質転換角膜内皮細胞のマーカーの選定を行った。
【０１９８】
（調製例：正常角膜内皮細胞および形質転換角膜内皮細胞の不死化株の作製）
本例では、正常角膜内皮細胞および形質転換角膜内皮細胞の不死化株を作製した。
【０１９９】
（培養方法）
シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼを用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。ヒト細胞用の培地はOpti−MEM  I  Reduced−Serum  Medium,    Liquid（INVITROGEN  カタログ番号：３１９８５−０７０）に、８％FBS（BIOWEST、カタログ番号：S1820−500）、２００mg／ml  CaCl２・２H２O（SIGMA  カタログ番号：C7902−500G）、０．０８％  コンドロイチン硫酸（SIGMA  カタログ番号：C9819−5Ｇ）、２０μg／mlアスコルビン酸（SIGMA  カタログ番号：A4544−25G）、50μg／mlゲンタマイシン（INVITROGEN  カタログ番号：15710−064）および５ng／ml  EGF（INVITROGEN  カタログ番号：PHG0311）を加えた3Ｔ3フィーダー細胞用の馴化させたものを基本培地として用いた。また、基本培地にSB431542（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）（１μmol／l）およびSB203580（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルホニルフェニル）−５（４−ピリジル）イミダゾール＜４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）（１μmol／l）を添加したもの（「SB203580＋SB431542＋３T３馴化培地」という）で培養した。SB431542は、TOCRIS社から得た（カタログ番号：1614）。SＢ203580はCALBIOCHEMから得た（カタログ番号：559389）。
【０２００】
（取得方法）
図１で示したヒトドナー角膜由来の培養角膜内皮細胞のうち、形態が正常の細胞、形質転換した細胞それぞれをSV４０ラージT抗原およびhTERT遺伝子を導入して不死化細胞株を作成した。具体的には、SV４０ラージT抗原およびhTERT遺伝子をPCRにより増幅して、レンチウイルスベクター（pLenti6.3_V5-TOPO;  Life  Technologies  Inc）に導入した。その後、レンチウイスルベクターを３種類のヘルパープラスミド(pLP1、pLP2、pLP/VSVG;  Life  Technologies  Inc.)とともにトランスフェクション試薬(Fugene  HD;  Promega  Corp.,  Madison,  WI)を用いて293T細胞(RCB2202;  Riken  Bioresource  Center,  Ibaraki,  Japan)に感染させた。48時間の感染後にウイスルを含む培養上清を回収して、5μg/mlのポリブレンを用いて、培養した正常形態の角膜内皮細胞、形質転換した角膜内皮細胞それぞれの培養液に添加して、SV４０ラージT抗原およびhTERT遺伝子を導入し不死化した。
【０２０１】
（実施例１：形質転換角膜内皮細胞および正常角膜内皮細胞におけるフローサイトメトリー）
本発明者らは、フローサイトメトリーを用いたハイスループット解析により、正常ヒト角膜内皮細胞および形質転換した細胞の表面マーカーのスクリーニングを行い、候補マーカーの選定を進めた。
【０２０２】
ヒト角膜内皮細胞を上述の（実験材料と方法）に記載の方法で培養して、細胞形態が正常の細胞と形質転換した細胞をHuman  Cell  Surface  Marker  Screening  Panel  (BD  LyoplateTM、BD  Bioscience)を用いてフローサイトメトリーを用いたハイスループット解析を行った。そこで、正常細胞および形質転細胞におけるそれぞれの表面抗原の発現を比較して、正常細胞において増強しているものを正常細胞のマーカー候補とした（表２）。一方、同様に形質転換細胞で発現が増強しているものを形質転換細胞のマーカーとした（表３）。
【０２０３】
（表２  正常転換ヒト角膜内皮細胞において強発現である表面抗原）
【０２０４】
【表２】
2020078333.tif 000006
【０２０５】
（表３  形質転換ヒト角膜内皮細胞において強発現である表面抗原）
【０２０６】
【表３】
2020078333.tif 000007
【０２０７】
また、ヒト角膜内皮細胞と同様にカニクイザルの角膜組織から分離した正常および形質転換した角膜内皮細胞においても同様の解析を行った。ヒト角膜内皮細胞における候補マーカーについてサル角膜内皮細胞において同様の傾向を示したマーカーを特に確度の高い候補マーカーとして表４に示す。使用したプロトコールは、上記（実験材料と方法）に記載の方法に準じた。
【０２０８】
（表４  角膜内皮細胞の代表的表面抗原マーカー）
【０２０９】
【表４】
2020078333.tif 000008
【０２１０】
その結果、以下の正常角膜内皮細胞マーカーおよび形質転換角膜内皮細胞マーカーを同定した。以下にそのマーカーを示す。
【０２１１】
ヒト角膜内皮細胞の正常細胞におけるマーカーはＣＤ１６６、ＨＬＡ−Ａ２、ＣＤ６６（ａ，ｃ，ｄ，ｅ）、ＣＤ９８、ＣＤ５９、ＣＤ５４、ＣＤ３４０、ＣＤ４７、ＥＧＦ−Ｒ、ＣＤ２９、ＣＤ７４、ＣＤ１６５、ＣＤ２２１、ＣＤ４９ａ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ１３０、ＣＤ４９ｆである。
【０２１２】
また、形質転換細胞におけるマーカーはＣＤ２６、ＣＤ９、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ１３、ＣＤ９９、ＣＤ１０５、ＣＤ６３、ＣＤ５８、ＣＤ２０１、ＣＤ５６、ＣＤ４４、ＣＤ５５、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９１、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ１６４、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ４６、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ８１、ＣＤ１５１、ＣＤ２００、ＣＤ１０である。
【０２１３】
特に確度の高いマーカーは、正常細胞ではＣＤ９８、ＣＤ１６６、ＣＤ３４０を、形質転換細胞ではＣＤ９、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４４、ＣＤ７３である。
【０２１４】
本発明者らは、上記のうち、ＣＤ１６６およびＣＤ７３を選択して更なる解析を進めた。なお、正常細胞ではＣＤ１６６が高発現であり、ＣＤ７３が低発現、一方で、形質転換細胞ではＣＤ１６６が低発現であり、ＣＤ７３が高発現であることが示されている。
【０２１５】
これらの表面抗原のマーカーについて説明すると、ＣＤ１６６は増殖や遊走に関与する細胞集団に広く分布するＩ型膜貫通タンパク質であり、造血細胞や内皮細胞、骨髄間葉系幹細胞、線維芽細胞など、様々な細胞に発現している。ＣＤ７３は中性条件下でＡＭＰをアデノシンへと変換する作用を有する膜結合型酵素であり、ＴおよびＢリンパ球のサブセットや濾胞樹状細胞、内皮細胞、骨髄ストローマ細胞などに発現している。
【０２１６】
（実施例２：培養サル角膜内皮細胞における解析）
本実施例では、培養サル角膜内皮細胞を用いて、形質転換細胞および正常細胞におけるこれらの細胞表面マーカーの解析を行った。
【０２１７】
サル角膜内皮細胞の培養を行った。具体的には、サル角膜組織から内皮細胞層を含むデスメ膜を剥離し、ＤＭＥＭ（Gibco−Invitrogen）に溶解した２mg／ml  Collagenase  A（カタログ番号：70164923；Roche  Applied  Science，Penzberg，  Germany）に入れて３７℃でインキュベートした。12時間後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去後、沈殿している角膜内皮細胞塊に培養培地を加えて混和し、FNC  Coating  Mix（カタログ番号：0407；Athena  Enzyme  Systems，  Baltimore，MD，USA）をコートした１２ウェルプレートへ全量を播種した。培養培地はＤＭＥＭ(カタログ番号：12320；Gibco−Invitrogen)に１０％  ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン（カタログ番号：15710−064；Invitrogen）、２ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（basic  fibroblast  growth  factor；カタログ番号：13256−029；bFGF；  Invitrogen）を加えたものを使用した。同様の方法で培養した際に、正常の形態に培養できた角膜内皮細胞を正常角膜内皮細胞として、線維芽細胞様に形質転換を生じた細胞を形質転換細胞として以下の検討に用いた。図２の位相差顕微鏡像において左側に示す正常角膜内皮細胞は、１つ１つの細胞が小さく、六角形を主とする多角形細胞から成る様子が示されている。それに対し、右側に示す、線維芽細胞様に形質転換を起こしている細胞では、1つ1つの細胞が大きく、細長い形状をしている。
【０２１８】
次に、これらの２種類の状態（正常角膜内皮細胞、形質転換細胞）の培養サル角膜内皮細胞におけるＣＤ１６６、ＣＤ７３のフローサイトメトリーを行った。免疫染色のプロトコールは、（実験材料および方法）に記載したものに準じた。
【０２１９】
結果を図３に示す。左側が正常角膜内皮細胞、右側が形質転換細胞である。上段はＣＤ１６６、下段はＣＤ７３を用いてフローサイトメトリーを行ったものである。この結果から、コントロールと比べると、ＣＤ１６６は正常角膜内皮細胞では高発現であるのに対して、形質転換細胞ではコントロールと同程度の発現量であった。また、ＣＤ７３においてはコントールと比較して、正常細胞におけるより形質転換細胞においては発現の強い増強を認めた。このことは、ＣＤ１６６は正常角膜内皮細胞において高発現であり、ＣＤ７３は形質転換細胞において高発現であるということがわかる。この結果はフローサイトメトリーによるスクリーニング解析結果と一致するものである。
【０２２０】
次に、これらの２種類の状態（正常角膜内皮細胞、線維芽細胞様に形質転換を起こしている細胞）の培養サル角膜内皮細胞におけるＣＤ１６６、ＣＤ７３のＲＴ−ＰＣＲを行った。プロトコールは、（実験材料および方法）に記載したものに準じた。
【０２２１】
結果を図４に示す。上からＣＤ１６６、ＣＤ７３、およびコントロールとしてのＧＡＰＤＨのバンドであり、左の列が正常細胞、右の列が形質転換細胞である。この結果から、遺伝子レベルにおいてもＣＤ１６６は正常細胞で高発現、ＣＤ７３は形質転換細胞で高発現となっていることが明確に確認された。これはフローサイトメトリーによるスクリーニング解析結果と一致している。
【０２２２】
次に、これらの２種類の状態（正常角膜内皮細胞、形質転換細胞）の培養サル角膜内皮細胞におけるＣＤ１６６、ＣＤ７３の発現を免疫染色においても確認した。プロトコールは、（実験材料および方法）に記載したものに準じた。
【０２２３】
結果を図５に示す。左からＣＤ１６６およびＣＤ７３を示し、上段は正常細胞、下段は形質転換細胞のものを示す。これらの結果から、正常細胞ではＣＤ１６６が高発現、ＣＤ７３が低発現であり、一方形質転換細胞ではＣＤ１６６が低発現、ＣＤ７３が高発現であることが示され、フローサイトメトリーによるスクリーニング解析結果と一致することを確認できた。以上の結果より正常細胞マーカーとしてＣＤ１６６、形質転換細胞マーカーとしてＣＤ７３を代表例として詳細な検討を行ったが、フローサイトメトリー、ＰＣＲ、免疫染色においてマーカーとして利用可能であることが実証された。
【０２２４】
（実施例３：培養サル角膜内皮細胞における解析）
本実施例では、サル正常および形質転換細胞をＣＤ７３を代表としてソーティングして、細胞の純化に応用可能であることを示した。図６左上に正常サル角膜内皮細胞、右上に形質転換細胞の位相差顕微鏡像を示す。これらの２種類の状態（正常角膜内皮細胞、形質転換細胞）のサル角膜内皮細胞を１：１の比率で混合した後に、ＣＤ７３によりフローサイトメトリー解析を行った。ＣＤ７３の高発現の細胞群と低発現の細胞群の２群に分けてソーティングして培養した。左下はＣＤ７３低発現の細胞（ＣＤ７３(−)）、右下はＣＤ７３高発現の細胞（ＣＤ７３(＋)）のソーティング後の位相差顕微鏡写真である。ＣＤ７３（−）では、正常細胞の形態である多角形形態の細胞であるのに対してＣＤ７３（＋）では、形質転換した線維芽細胞様形態となった細胞である。このことから、ＣＤ７３をマーカーとして用いることで、正常細胞と形質転換して線維芽状となった細胞とをソーティングに用いることが可能であることが示された。
【０２２５】
（実施例４：不死化ヒト角膜内皮細胞における解析）
本実施例では、調製例にて調製した不死化ヒト角膜内皮細胞を用いて、形質転換細胞および正常細胞におけるこれらの細胞表面マーカーの解析を行った。ヒト角膜組織から内皮細胞層を含むデスメ膜を剥離し、OPTIMEM−Iに溶解した２ｍｇ／ｍｌ  Collagenase  A（カタログ番号：70164923；Roche  Applied  Science，Penzberg，  Germany）に入れて３７℃でインキュベートした。12時間後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去後、沈殿している角膜内皮細胞塊に培養培地を加えて混和し、FNC  Coating  Mix（カタログ番号：0407；Athena  Enzyme  Systems，  Baltimore，MD，USA）をコートした１２ウェルプレートへ全量を播種した。培養したヒト角膜内皮細胞にＳＶ４０およびｈＴＥＲＴ遺伝子の導入を行い不死化細胞を作製した。作製したヒト角膜内皮不死化細胞から、正常の細胞形態または線維芽細胞様に形質転換した細胞をそれぞれクローニングして、正常細胞、形質転換細胞として以下の検討に用いた。
【０２２６】
そのヒト角膜内皮不死化細胞の位相差顕微鏡像を図７に示す。左は正常角膜内皮細胞を示し、右は形質転換細胞を示す。培養サル細胞と同様に、左側に示す正常角膜内皮細胞は、１つ１つの細胞が小さく、六角形を主とする多角形細胞から成る様子が示されている。それに対し、右側に示す、線維芽細胞様に形質転換を起こしている細胞では、１つ１つの細胞が大きく、細長い形状をしている。
【０２２７】
次に、ＣＤ７３を例として、本特許におけるマーカーを用いることで、正常細胞をソーティングして純化できるか否かの試験を行った。正常形態および形質転換不死化ヒト角膜内皮細胞の混合培養細胞をＣＤ７３によりフローサイトメトリー解析を行った。
【０２２８】
結果を図８に示す。ＣＤ７３によるフローサイトメトリーにより、ＣＤ７３の高発現の細胞群と低発現の細胞群の２群からなることが分かる。次に、図８のＰ４で示されるＣＤ７３低発現の細胞と、Ｐ５で示されるＣＤ７３高発現の細胞をソーティングして細胞培養を行った。
【０２２９】
結果を図９に示す。左はＣＤ７３低発現の細胞（ＣＤ７３(-)）、中はＣＤ７３高発現の細胞（CD73(+)）のソーティング後の位相差顕微鏡写真である。ＣＤ７３（−）では、正常細胞の形態である多角形形態の細胞であるのに対してＣＤ７３（＋）では、形質転換した線維芽細胞様形態となった細胞である。右はコントロールとしてソーティングを行わずに培養した位相差顕微鏡像であるが、正常の形態での細胞と、形質転換した細胞が混在する。これらのことから、ＣＤ７３をマーカーとして用いることで、正常細胞と形質転換して線維芽状となった細胞とをソーティングに用いることが可能であることが示された。
【０２３０】
次に、ＣＤ７３によりソーティングした後の候補マーカーの発現解析を行った。ここでは、ＣＤ７３、ＣＤ１６６の発現解析を行った。プロトコールは、（実験材料および方法）に記載したものに準じた。
【０２３１】
結果を図１０に示す。上段がＣＤ７３（−）としてソーティングした細胞を示し、下段がＣＤ７３（＋）としてソーティングした細胞を示す。左側はＣＤ７３による染色、右側はＣＤ１６６による染色を示す。ＣＤ７３（−）では、CD73が染色されないが、ＣＤ１６６が強く染色された。また、ＣＤ７３（＋）ではCD73が染色される一方で、CD166の発現がＣＤ７３（−）と比べて減弱を認めた。
【０２３２】
次に、ＣＤ７３によりソーティング下後の機能関連マーカーの発現解析を行った。ここでは、ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅの発現を解析した。プロトコールは、（実験材料および方法）に記載したものに準じた。
【０２３３】
結果を図11に示す。上段がＣＤ７３（−）を示し、下段がＣＤ７３（＋）を示す。左側は、ＺＯ−１の発現を示し、右側は、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅの発現を示す。ＣＤ７３（−）では、正常機能を示すＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅがいずれも有意に多く発現していることが示される。したがって、ＣＤ７３（−）は、機能的な面でも、正常細胞を形質転換した細胞から区別することができるマーカーであることが示される。
【０２３４】
（実施例５：本発明のマーカーを用いた正常細胞が濃縮された試料の調製方法）
培養した角膜内皮細胞を本発明の形質転換細胞のマーカーを用いてソーティングして形質転換細胞を除去することで、正常形態および正常機能を有する角膜内皮細胞を純化することが可能となる。また、本発明の正常細胞のマーカーを用いてソーティングすること正常形態および正常機能を有する角膜内皮細胞を選択的に培養することが可能となる。また、角膜組織から角膜内皮細胞を培養する際に、角膜上皮細胞、角膜実質細胞、結膜上皮細胞、結膜実質細胞などの角膜内皮細胞以外の細胞がコンタミネーションした際には本発明のマーカーを用いてソーティングすることで角膜内皮細胞を純化することが可能である。また、本技術を用いることで、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞から誘導した細胞群から、本発明のマーカーを用いてソーティングすることで角膜内皮細胞を純化することが可能である。
【０２３５】
（実施例６：本発明のマーカーを用いた正常細胞が濃縮された試料を用いた治療）
実施例５で作製した、純度を高めた培養角膜内皮細胞またはｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞から誘導した角膜内皮細胞をキャリアを用いるあるいは用いない角膜内皮細胞シートとして角膜内皮機能不全患者に移植することで治療可能である。また、細胞の懸濁液として前房内などの眼内に注入、注射することで治療可能である。
【０２３６】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本願は日本国特許出願特願2013-157597に対する優先権を主張しその内容は参考としてその全体が援用される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０２３７】
眼細胞の線維芽様に形質転換した細胞と正常細胞とを区別するマーカーが提供され、角膜移植に関連する技術に関与する産業（細胞培養産業、製薬等）において利用可能な技術が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【０２３８】
配列番号１：ＣＤ９８の重サブユニットタンパク質（Gene  ID（Entrez）:6520；NM_001013251（NM_001012661）およびNP_001012680）の核酸配列
配列番号２：ＣＤ９８の重サブユニットタンパク質（Gene  ID（Entrez）:6520；NM_001013251（NM_001012661）およびNP_001012680）のアミノ酸配列
配列番号３：ＣＤ９８の軽サブユニットタンパク質（Gene  ID（Entrez）:8140  NM_003486；NP_003477）の核酸配列
配列番号４：ＣＤ９８の軽サブユニットタンパク質（Gene  ID（Entrez）:8140  NM_003486；NP_003477）のアミノ酸配列
配列番号５：ＣＤ１６６（Gene  ID（Entrez）:214（ｈｕｍａｎ）、NM_001243280（mRNA）、NP_001230209（タンパク質））の核酸配列
配列番号６：ＣＤ１６６（Gene  ID（Entrez）:214（ｈｕｍａｎ）、NM_001243280（mRNA）、NP_001230209（タンパク質））のアミノ酸配列
配列番号７：ＣＤ３４０（Entrez  Gene  ID:  (Hu)  2064  であり、NM＿0010005862.1
）の核酸配列
配列番号８：ＣＤ３４０（Entrez  Gene  ID:  (Hu)  2064  、NM＿0010005862.1）のア
ミノ酸配列
配列番号９：ＣＤ９（Entrez  Gene  ID:928、NM_001769（Hu）、NP_001760（Hu））の核酸配列
配列番号１０：ＣＤ９（Entrez  Gene  ID:928、NM_001769（Hu）、NP_001760（Hu））のアミノ酸配列
配列番号１１：ＣＤ４９ｅ（Entrez  Gene  ID:3678、NM_002205（Ｈｕ）、NP_002196（Ｈｕ））の核酸配列
配列番号１２：ＣＤ４９ｅ（Entrez  Gene  ID:3678、NM_002205（Ｈｕ）、NP_002196（Ｈｕ））のアミノ酸配列
配列番号１３：ＣＤ４４（Entrez  Gene  ID:960、NM_000610、NP_000601）の核酸配列
配列番号１４：ＣＤ４４（Entrez  Gene  ID:960、NM_000610、NP_000601）のアミノ酸配列
配列番号１５：ＣＤ７３（Entrez  Gene  ID:4907、NM_001204813、NP_001191742）の核酸配列
配列番号１６：ＣＤ７３（Entrez  Gene  ID:4907、NM_001204813、NP_001191742）のアミノ酸配列
配列番号１７：プライマーＣＤ１６６−Ｆ  CCCCAGAGGAATTTTTGTTTTAC
配列番号１８：プライマーＣＤ１６６−Ｒ  AGCCTGATGTTATCTTTCATCCA
配列番号１９：プライマーＣＤ７３−Ｆ  GTTCCTGTAGTCCAGGCCTATG
配列番号２０：プライマーＣＤ７３−Ｒ  ACATTTCATCCGTGTGTCTCAG
配列番号２１：プライマーＧＡＰＤＨ-Ｆ  GAGTCAACGGATTTGGTCGT
配列番号２２：プライマーＧＡＰＤＨ-Ｒ  TTGATTTTGGAGGGATCTCG
【図１】
2020078333.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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