(57)【要約】【課題】改良特性のある新しいダクリズマブ分子を提供すること。【解決手段】本開示は、皮下投与に適したダクリズマブの組成物およびその製造方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
無血清および無コレステロール培地において増殖するよう適応されており、組換えタンパク質を発現するよう操作されている改変されたＮＳ０細胞であって、無血清および無コレステロール培地において増殖される場合、１０日間のフェドバッチ法において１００Ｌの培養物中１００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる改変されたＮＳ０細胞。
【請求項２】
コレステロールおよび動物由来成分のない培地において増殖される場合、１０日間のフェドバッチ法において１，０００Ｌの培養物中１００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる、請求項１に記載の改変されたＮＳ０細胞。
【請求項３】
コレステロールおよび動物由来成分のない培地において増殖される場合、１０日間のフェドバッチ法において１６，０００Ｌの培養物中１００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる、請求項１に記載の改変されたＮＳ０細胞。
【請求項４】
フェドバッチ法が、追加される容積が最初の細胞培養物容積の割合を表す、次のスケジュール：
【表１】
2020078348.tif 000055
に従って追加される流加培地を添加することを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の改変されたＮＳ０細胞。
【請求項５】
１３日間のフェドバッチ法において少なくとも１００Ｌの培養物中２００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる、請求項１に記載の改変されたＮＳ０細胞。
【請求項６】
無コレステロール培地において増殖される場合、１３日間のフェドバッチ法において１，０００Ｌの培養物中２００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる、請求項５に記載の改変されたＮＳ０細胞。
【請求項７】
無血清および無コレステロール培地において増殖される場合、１０日間のフェドバッチ法において１６，０００Ｌの培養物中１００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる、請求項５に記載の改変されたＮＳ０細胞。
【請求項８】
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体を発現するのに有用な核酸で安定的にトランスフェクトされる、請求項１に記載の改変されたＮＳ０細胞。
【請求項９】
抗ＣＤ２５モノクローナル抗体が、配列番号２の２１位から２３３位に配列が一致するＶＬ鎖および配列番号４の２０位から４６５位に配列が一致するＶＨ鎖を含む、請求項８に記載の改変されたＮＳ０細胞。
【請求項１０】
ベクターｐＡｂＸ．ｇｐｔを用いて形質転換される、請求項１に記載の改変されたＮＳ０細胞。
【請求項１１】
ベクターｐＨＡＴ．ＩｇＧ１．ｒｇ．ｄＥを用いて形質転換される、請求項１に記載の改変されたＮＳ０細胞。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の改変されたＮＳ０細胞を培養することを含む、組換えタンパク質を生産する方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、１０日間のフェドバッチ法において１００Ｌ、１，０００Ｌもしくは１６，０００Ｌの培養物中少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を、または１３日間のフェドバッチ法において１００Ｌ、１，０００Ｌもしくは１６，０００Ｌの培養物中少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を生産する条件下で、改変されたＮＳ０細胞が培養される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
改変されたＮＳ０細胞が、血清およびコレステロールの非存在下で培養される、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
改変されたＮＳ０細胞が、トロポロンおよびヒドロコルチゾンの非存在下で培養される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
改変されたＮＳ０細胞が、１０−３５ｇ／Ｌグルコースを含有する基本および／または流加培地において培養される、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
改変されたＮＳ０細胞が、１５ｇ／Ｌグルコースを含有する基本培地および／または２８ｇ／Ｌグルコースを含有する流加培地において培養される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
基本培地が、ＰＦＢＭ２±１０％成分で構成されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
流加培地が、ＰＦＦＭ３±１０％成分で構成されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
細胞が基本培地において１−３日間、次に流加培地において１０−１３日間培養される、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
流加培地が、表７において概要が述べられているスケジュール±１０％に従って追加される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物細胞において作動可能である選択可能なマーカーの発現を推進する弱いプロモーターおよび対象のタンパク質の発現を推進する強いプロモーターを含む、対象のタンパク質を組換え的に発現するのに有用なベクター。
【請求項２３】
対象のタンパク質が治療抗体である、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
治療抗体が抗ＣＤ２５抗体である、請求項２３に記載のベクター。
【請求項２５】
ＣＤ２５抗体がダクリズマブのＣＤＲを含む、請求項２４に記載のベクター。
【請求項２６】
ＣＤ２５抗体がダクリズマブである、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
対象のタンパク質の高い容積生産性を有する哺乳動物宿主細胞を得るための方法であって、細胞に請求項２２から２６のいずれか一項に記載のベクターをトランスフェクトし、１０日間のフェドバッチ法において１００Ｌ、１，０００Ｌもしくは１６，０００Ｌの培養物中少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／日対象のタンパク質を、または１３日間のフェドバッチ法において１００Ｌ、１，０００Ｌもしくは１６，０００Ｌの培養物中少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を生産することができる細胞を選択することを含む、対象のタンパク質の高い容積生産性を有する哺乳動物宿主細胞を得るための方法。
【請求項２８】
ダクリズマブがｐＥ／Ｑ重鎖Ｎ連結アイソフォームおよび／またはＱ／ＶＨＳ重鎖Ｎ末端アイソフォームの存在により特徴付けられる、ダクリズマブを含む組成物。
【請求項２９】
ｐＥ／Ｑ重鎖Ｎ末端アイソフォームがダクリズマブのおよそ３−１７％または６−１５％を構成する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
ｐＥ／Ｑ重鎖Ｎ末端アイソフォームがダクリズマブのおよそ５−１２％または７−１２％を構成する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
Ｑ／ＶＨＳ重鎖Ｎ末端アイソフォームがダクリズマブのおよそ１−１５％を構成する、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
Ｑ／ＶＨＳ重鎖Ｎ末端アイソフォームがダクリズマブのおよそ３−１２％を構成する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
ダクリズマブの重鎖が次のＮ末端アイソフォーム：
【表２】
2020078348.tif 000056
に存在する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３４】
ダクリズマブの重鎖が次のＮ末端アイソフォーム：
【表３】
2020078348.tif 000057
に存在する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３５】
ダクリズマブが、図１８のアイソフォームプロファイルと実質的に類似する陽イオン交換クロマトグラフィーアイソフォームプロファイルにより特徴付けられる、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３６】
ダクリズマブがＤＡＣ  ＨＹＰである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３７】
ダクリズマブを含む組成物であって、１つがオリゴ糖Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃに一致し１つがオリゴ糖Ｇ０に一致する２つの主要ピークを含有するＮ連結グリコシル化ＨＰＬＣプロファイルによりダクリズマブが特徴付けられ、これら２つのピークの合わせたＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約７５−１００％、約８０−１００％、約８５−１００％または約８８−９９．５％を構成する、ダクリズマブを含む組成物。
【請求項３８】
Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約５−２０％、約５−１８％を構成し、Ｇ０ピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約７０−９９％、約７５−９２％または約７５−９０％を構成する、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約６−１６％または約７−１５％を構成し、Ｇ０ピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約７８−９０％または約８１−８８％を構成する、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
Ｎ連結グリコシル化プロファイルが約３％未満のＭａｎ５を有する、請求項３７から３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
Ｎ連結グリコシル化プロファイルが約０．５％未満のＧ２、Ｍａｎ６および／またはＭａｎ７を有する、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
Ｎ連結グリコシル化プロファイルがシアル酸付加オリゴ糖に一致する第三のピークを含有し、シアル酸付加オリゴ糖ピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの１％以下を構成する、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４３】
Ｎ連結グリコシル化プロファイルがオリゴ糖Ｇ１に一致する第三のピークを含有し、Ｇ１ピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満または約１−５％、約１−４％もしくは約１−３％を構成する、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４４】
Ｇ１ピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約１−２％を構成する、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
ダクリズマブが、図１９のプロファイルにまたは図２１の下のパネルのプロファイルに実質的に類似しているＮ連結グリコシル化ＨＰＬＣプロファイルを有する、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４６】
ダクリズマブがＤＡＣ  ＨＹＰである、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４７】
ダクリズマブを含む組成物であって、１μｇ／ｍＬのダクリズマブ濃度および約２５対１のエフェクター細胞対標的細胞比で、少なくとも３体の健康なドナー由来のエフェクター細胞および標的細胞としてＫｉｔ２２５  Ｋ６細胞を使用して、インビトロ細胞アッセイにおいて測定される場合、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満のＡＤＣＣ平均細胞傷害性を示すダクリズマブを含む組成物。
【請求項４８】
ダクリズマブが、前記アッセイにおいて５％から３０％、５％から２５％、１０％から３０％、１０％から２５％または１５％から２５％のＡＤＣＣ平均細胞傷害性を示す、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記アッセイが少なくとも６体の健康なドナー由来のエフェクター細胞を使用する、請求項４７または請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記アッセイが少なくとも１０体の健康なドナー由来のエフェクター細胞を使用する、請求項４７または請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】
ダクリズマブがＤＡＣ  ＨＹＰである、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
ダクリズマブ製剤を作製するのに有用な組成物であって、約１５０−１９０ｍｇ／ｍＬのダクリズマブ、ならびに希釈緩衝液を用いた組成物の希釈により約８５−１６５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含有し、約２６７−３２７ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の浸透圧および２５℃で約ｐＨ５．８−６．２の範囲のｐＨを有し、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定される場合、ダクリズマブの少なくとも約９５％が単量体形態である希釈組成物を生じるような量の賦形剤を含む、ダクリズマブ製剤を作製するのに有用な組成物。
【請求項５３】
希釈緩衝液で希釈される場合、希釈組成物が約８５−１１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含有するような量の賦形剤を含有する、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
希釈緩衝液で希釈される場合、希釈組成物が約１５０±１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含有するような量の賦形剤を含有する、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５５】
ダクリズマブの０．１％以下がアグリゲート形態である、約４から１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含む組成物。
【請求項５６】
ダクリズマブの最大２．５％がアグリゲート形態である、約４から１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含むダクリズマブ組成物を、弱陽イオン交換樹脂上のカラムクロマトグラフィーにより精製することによって得られる、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
弱陽イオン交換樹脂がＣＭ−６５０Ｍである、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
ＣＭ−６５０Ｍ樹脂が約２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有する平衡化緩衝液、ｐＨ４．４−４．６と平衡化しており、ダクリズマブが約２０ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび約７５ｍＭの硫酸ナトリウムを含有する溶出緩衝液、ｐＨ４．４−４．６を用いて溶出される、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
クロマトグラフィーが、約１０−３０ｃｍまたは約１７−１９ｃｍの高さを有する樹脂床を使用して円筒形カラムにおいて実施され、ダクリズマブが約４−２２℃または約１８−２２℃の範囲の温度で、約５０−２００ｃｍ／時または９０−１１０ｃｍ／時の範囲の流速で溶出される、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
ヒト投与に適した組成物であって、約８５−１６５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブおよび約０．０２−０．０４％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含み、約２６７−３２７ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の浸透圧および２５℃で約ｐＨ５．８−６．２の範囲のｐＨを有し、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定される場合、ダクリズマブの少なくとも約９５％が単量体形態である、ヒト投与に適した組成物。
【請求項６１】
サイズ排除クロマトグラフィーにより測定される場合、ダクリズマブの少なくとも約９９％が単量体形態である、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
約８５−１１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６３】
約１００ｍｇ／ｍＬのダクリズマブ、約４０ｍＭのコハク酸ナトリウム、約１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび約０．０３％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０から本質的になり、２５℃で約６．０のｐＨを有する、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
約１３５−１６５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６５】
約１５０ｍｇ／ｍＬのダクリズマブ、約４０ｍＭのコハク酸ナトリウム、約１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび約０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０から本質的になり、２５℃で約６．０のｐＨを有する、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
請求項６４に記載の組成物であって、約４から１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含むダクリズマブ組成物を適切な緩衝液中での限外濾過により濃縮して、約８５−１８０ｍｇ／ｍＬの範囲のダクリズマブ濃度を達成するステップ、および、場合によって、濃縮された組成物を希釈緩衝液で希釈するステップを含む方法により得られる、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６７】
約８５−１６５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含み、約２−８℃の範囲の温度での約１２ヶ月の期間の貯蔵後にアグリゲート形態中のダクリズマブの百分率が約３％を超えない、皮下投与に適した医薬組成物。
【請求項６８】
約８５−１１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含む、請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
約１３５−１６５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含む、請求項６８に記載の医薬組成物。
【請求項７０】
約２−８℃の範囲の温度での約１２ヶ月の期間の貯蔵後にアグリゲート形態中のダクリズマブの百分率が約２％を超えない、請求項６８または請求項６９に記載の医薬組成物。
【請求項７１】
約２−８℃の範囲の温度での約１８ヶ月の期間の貯蔵後にアグリゲート形態中のダクリズマブの百分率が約３％を超えない、請求項６８または請求項６９に記載の医薬組成物。
【請求項７２】
細胞培養物から組換えタンパク質を収穫するための方法であって、
（ｉ）組換えタンパク質を発現し分泌する細胞培養物のｐＨを、約ｐＨ４．５−５．５の範囲のｐＨに調整するステップ、
（ｉｉ）ｐＨ調整された細胞培養物を約４から１５℃の範囲の温度で約３０−９０分間インキュベートするステップ、および
（ｉｉｉ）インキュベートされたｐＨ調整細胞培養物を遠心分離して細胞残渣を除去するステップ
を含む、細胞培養物から組換えタンパク質を収穫するための方法。
【請求項７３】
精製されたダクリズマブ組成物を生産するための方法であって、
（ｉ）未精製ダクリズマブ調製物から親和性クロマトグラフィー樹脂上にダクリズマブを吸着させるステップ、
（ｉｉ）親和性クロマトグラフィー樹脂を洗浄緩衝液で洗浄して混入物を除去するステップ、
（ｉｉｉ）吸着したダクリズマブを溶出緩衝液で溶出させるステップ、
（ｉｖ）ｐＨを約３−４の範囲のｐＨに調整することにより溶出液中のウイルスを不活化し、ｐＨ調整された溶出液を規定温度でウイルスを不活化するのに十分な期間インキュベートするステップ、
（ｖ）ウイルス不活化溶出液を約ｐＨ７．７−７．９（２５℃で測定される）の範囲のｐＨまで中和するステップ、
（ｖｉ）中和された溶出液を強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通して流すステップ、
（ｖｉｉ）ステップ（ｖｉ）の溶出液のダクリズマブを弱陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂上に吸着させるステップ、および
（ｖｉｉｉ）吸着したダクリズマブを弱陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶出させるステップ
を含む、精製されたダクリズマブ組成物を生産するための方法。
【請求項７４】
未精製ダクリズマブ調製物が細胞培養物から収穫される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
ダクリズマブが請求項７２に記載の方法を使用して収穫される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
請求項７３に記載の方法であって、
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）の溶出されたダクリズマブ組成物を濾過して、ウイルスを除去するステップ、および
（ｘ）濾過された溶液を限外濾過により濃縮して、約８５−１８０ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含む精製されたダクリズマブ組成物を産出するステップ
をさらに含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
請求項７６に記載の方法であって、約８５−１６５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブおよび約０．０２−０．０４％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、約２６７−３２７ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の浸透圧および２５℃で約ｐＨ５．８−６．２の範囲のｐＨを有し、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定される場合、ダクリズマブの少なくとも約９５％が単量体形態である組成物が得られるように、精製されたダクリズマブ組成物を希釈緩衝液で希釈するステップをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
得られる組成物が、ダクリズマブの組換え供給源由来の５０ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質を有し、１０ｐｐｍ未満のプロテインＡを有し、および組成物中のダクリズマブの３％以下がアグリゲート形態である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
基本培地ＰＦＢＭ２。
【請求項８０】
流加培地ＰＦＦＭ３。
【請求項８１】
ダクリズマブが培養培地中に分泌される条件下で、請求項１から１１のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法により得られる、ダクリズマブ組成物。
【請求項８２】
請求項８１に記載のダクリズマブ組成物であって、方法が、分泌されたダクリズマブを細胞培養培地から単離するステップをさらに含む、請求項８１に記載のダクリズマブ組成物。
【請求項８３】
約１００−５００ｍＭのクエン酸ナトリウム、約１０−３０ｍＭのＮａＯＨおよび約０．５−３％（ｖ／ｖ）ベンジルアルコールを含む、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂を衛生化するのに有用な緩衝液。
【請求項８４】
カラムを衛生化するのに十分な流速でおよび期間、請求項８３に記載の衛生化緩衝液を用いてカラムを洗浄することを含む、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラムを衛生化する方法。
【請求項８５】
カラムを、約１５０ｃｍ／時の流速でおよそ１．８カラム容積の衛生化緩衝液を用いて洗浄し、洗浄されたカラムが約３０−４５分の期間流動なしでインキュベートされ、次に平衡化緩衝液を用いて平衡化される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
平衡化緩衝液が、約２０ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、約ｐＨ７（２５℃で）のｐＨを有する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
治療効果を与えるのに十分な量のＤＡＣ  ＨＹＰ組成物を患者に投与することを含む、多発性硬化症に罹っている患者を治療する方法。
【請求項８８】
ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が静脈内投与される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、約０．８−０．９ｍｇ／ｋｇのＤＡＣ  ＨＹＰに一致する量で投与される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、約１ｍｇ／ｋｇのＤＡＣ  ＨＹＰに一致する量で投与される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
ＤＡＣ  ＨＹＰが、少なくとも６週間、少なくとも１２週間、少なくとも２４週間の期間、週あたり１回投与される、請求項８７から９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
ＤＡＣ  ＨＹＰが単独療法として投与される、請求項８７から９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
請求項９２に記載の方法であって、患者がインターフェロンベータを用いた前治療に無効果であったかまたはインターフェロンベータを用いた前治療を中止している、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
ＤＡＣ  ＨＹＰがインターフェロンベータに対して補助的に投与される、請求項８７から９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が皮下投与される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９６】
ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、約１ｍｇ／ｋｇのＤＡＣ  ＨＹＰに一致する量で投与される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が２週間に１回投与される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が計約２４週間投与される、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、約２ｍｇ／ｋｇのＤＡＣ  ＨＹＰに一致する量で投与される、請求項９５に記載の方法。
【請求項１００】
ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、４週間に１回投与される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、計約２４週間投与される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、７５ｍｇから３００ｍｇのＤＡＣ  ＨＹＰに一致する量で投与される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、１５０ｍｇに一致する量で投与される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、３００ｍｇに一致する量で投与される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、４週間に１回投与される、請求項１０１から１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、計少なくとも４８週間投与される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
ＤＡＣ  ＨＹＰが単独療法として投与される、請求項１０１から１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
請求項１０７に記載の方法であって、患者がインターフェロンベータを用いた前治療に無効果であったかまたはインターフェロンベータを用いた前治療を中止している、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
ＤＡＣ  ＨＹＰがインターフェロンベータに対して補助的に投与される、請求項１０１から１０６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ダクリズマブ（ＤＡＣ）は、活性化されているが休止していないＴリンパ球およびＢリンパ球の表面で発現されるヒト高親和性インターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体のアルファサブユニット（ＣＤ２５またはＴａｃ）に結合するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。活性化された細胞上のＣＤ２５が結合すると、ＤＡＣは高親和性ＩＬ−２受容体複合体の形成を阻止し、それによって活性化された細胞のＩＬ−２誘導増殖を阻止する。
【０００２】
ＰＨＡ芽細胞上での直接結合アッセイにおいて測定された場合、ＤＡＣは０．３ｎＭの近似の結合親和性（ＫＤ）でＣＤ２５に結合し、用量依存の形でＰＨＡ芽細胞の増殖を抑制する（Ｈａｋｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１（２）：１０７５−８５頁）。最適以下の用量のＩＬ−２（２．５ｎｇ／ｍＬ）では、１５ｎＭのＤＡＣはＩＬ−２依存性細胞系統Ｋｉｔ２２５／Ｋ６の増殖を５０％抑制する（Ｐｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９（３）：１５４３−５６頁）。ＩＬ−２依存性抗原誘導Ｔ細胞増殖アッセイでは、０．５−１μｇ／ｍＬ（３−７ｎＭ）の範囲のＤＡＣを用いると増殖の５０％抑制が観察された（Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０（５）：１４９５−５０２頁）。
【０００３】
ＤＡＣの１バージョンは、腎臓移植患者における急性同種移植片拒絶反応の治療のために、シクロスポリンおよびコルチコステロイドを含む免疫抑制療法の補助剤としてＺＥＮＡＰＡＸ（商標）の商品名でＨｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ社から以前市販されていた。ＺＥＮＡＰＡＸは、さらなる希釈および静脈内投与のために濃縮製剤として供給されていた。濃縮製剤のバイアルごとに、５ｍｇ／ｍＬのＤＡＣ、３．６ｍｇ／ｍＬのリン酸ナトリウム一塩基一水和物、１１ｍｇ／ｍＬのリン酸ナトリウム二塩基七水和物、４．６ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０ならびにｐＨをｐＨ６．９に調整するのに十分なＨＣｌおよび／またはＮａＯＨを含有する溶液を５ｍＬ含有していた。成人患者にも小児患者にも推奨される用量は１．０ｍｇ／ｋｇであり、２５ｍｇ／５ｍＬのＺＥＮＡＰＡＸ濃縮製剤の計算された容積を５０ｍＬの無菌０．９％塩化ナトリウム溶液で希釈することにより調製され、１５分間かけて末梢静脈または中心静脈を介して静脈内投与された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第７，２５８，８５９号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｈａｋｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１（２）：１０７５−８５頁
【非特許文献２】Ｐｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９（３）：１５４３−５６頁
【非特許文献３】Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０（５）：１４９５−５０２頁
【非特許文献４】Ｎｕｓｓｅｎｂｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００４年、ＦＯＣＩＳ  ２００４  ｍｅｅｔｉｎｇ；７月１８日−２３日、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、ＱＣ．Ａｂｓｔｒａｃｔ  ４６８８
【非特許文献５】Ｎｕｓｓｅｎｂｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００３年、Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２１：２８３−９３頁
【非特許文献６】Ｂｉｅｌｅｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．、２００４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１（２３）：８７０５−８７０８頁
【非特許文献７】Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００７年、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６９：７８５−７８９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＤＡＣは、ブドウ膜（Ｎｕｓｓｅｎｂｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００４年、ＦＯＣＩＳ  ２００４  ｍｅｅｔｉｎｇ；７月１８日−２３日、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、ＱＣ．Ａｂｓｔｒａｃｔ  ４６８８；Ｎｕｓｓｅｎｂｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００３年、Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２１：２８３−９３頁）および多発性硬化症（たとえば、Ｂｉｅｌｅｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．、２００４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（２３）：８７０５−８７０８頁；Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００７年、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６９：７８５−７８９頁；米国特許第７，２５８，８５９号参照）の治療にも有効性を示しており、現在、多発性硬化症の治療のために進行中の臨床試験の主題となっている。ＤＡＣは安全で効果的であることが判明しているが、長い有効期限を有し、さらに処方するまたは操作することなく都合よく投与することが可能な高濃度液状製剤の他にも、ＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣと比べて増強された安全性などの改良特性のある新しいダクリズマブ分子があれば望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
背景技術のセクションで述べられたように、ダクリズマブは、リンパ球活性化の重要な媒介物であるヒトインターロイキン−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）のアルファサブユニット（ＣＤ２５またはＴａｃとも呼ばれる）に特異的に結合するヒト化ＩｇＧ１抗体である。ＺＥＮＡＰＡＸ（商標）の商品名でＨｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ社から以前市販されていたダクリズマブの一バージョンは、シクロスポリンおよびコルチコステロイドを含む免疫抑制療法の補助剤として使用される場合、腎同種移植片拒絶反応の治療において安全性および有効性を実証しており（たとえば、ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ａｇｅｎｃｙ（“ＥＭＥＡ”）ｍａｒｋｅｔ  ａｕｔｈｏｒｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＺＥＮＡＰＡＸ参照）、多発性硬化症においても有効性を実証している（たとえば、Ｂｉｅｌｅｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．、２００４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（２３）：８７０５−８７０８頁；Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００７年、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６９：７８５−７８９頁；米国特許第７，２５８，８５９号参照）。ＥＭＥＡによれば、ＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣはＧＳ−ＮＳ０（マウス骨髄腫）細胞において発現され、Ｑ−セファロースクロマトグラフィー、Ｓ−セファロースクロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、Ｑ−セファロースＩＩクロマトグラフィー、限外濾過、Ｓ−３００ゲル濾過クロマトグラフィーおよび限外濾過を含む方法を使用して精製される。無血清、無コレステロールおよび他の無動物産物培養物で増殖するように適応されており、異なる方法により単離されるＮＳ０細胞系統において発現されるダクリズマブは、ＺＥＮＡＰＡＸダクリズマブ（「ＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣ」）とは異なり、いくつかの例ではＺＥＮＡＰＡＸダクリズマブより優れている特徴および特性を有することが現在では見出されている。この新しいダクリズマブは、本明細書ではＤＡＣ  ＨＹＰと呼ばれるが、ＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣとは異なるアイソフォームプロファイル（陽イオン交換クロマトグラフィーにより決定される場合）；両方の形態のダクリズマブはＮＳ０細胞において発現されるが、ＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣとは異なるＮ連結グリコシル化プロファイル；および生物学的アッセイにおいてＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣよりも少ないＡＤＣＣ細胞傷害性を有する。
【０００８】
たとえば、重鎖Ｎ末端およびＣ末端での不均一性のために、ダクリズマブのアイソフォームが可能になる。ダクリズマブの成熟ＶＨ鎖のアミノ酸配列は、図２に示されるアミノ酸配列の２０位で始まる（配列番号４）。成熟ＶＨ鎖のＮ末端グルタミン（Ｑ）（図２では太字で下線付きのテキストで）は環化され、ピログルタミン酸（ｐＥ）を形成することができる。いくつかの例では、シグナルペプチド配列はトランケートし、バリン−ヒスチジン−セリン（ＶＨＳ）配列を成熟ＶＨ鎖のＮ末端グルタミン残基に結合したままにしておくことがある。各ダクリズマブ分子は２つのＶＨ鎖を含有するために、ダクリズマブの様々なＮ末端アイソフォームは、（１）２つのグルタミン残基（Ｑ／Ｑ）、（２）１つのグルタミン残基と１つのＶＨＳ配列（Ｑ／ＶＨＳまたはＶＨＳ／Ｑ）、（３）２つのＶＨＳ配列（ＶＨＳ／ＶＨＳ）、（４）１つのグルタミン残基と１つのピログルタミン酸残基（Ｑ／ｐＥまたはｐＥ／Ｑ）、（５）１つのピログルタミン酸残基と１つのＶＨＳ配列（ｐＥ／ＶＨＳまたはＶＨＳ／ｐＥ）および（６）２つのピログルタミン酸残基（ｐＥ／ｐＥ）を含有する形態を含むことができる。異なるＣ末端アイソフォームも可能であり、アイソフォームは０、１つまたは２つのＣ末端リジン（Ｋ）残基（０Ｋ、１Ｋまたは２Ｋ）のいずれかを含有し、複雑なアイソフォームプロファイルを生じる。
【０００９】
非常に驚くべきことに、ＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣのＶＨ鎖のＮ末端グルタミンは完全に環化されてピログルタミン酸になるが、完全な環化はＤＡＣ  ＨＹＰでは実現されない。その結果、ＤＡＣ  ＨＹＰの陽イオン交換クロマトグラムは、ｐＥ／ＱアイソフォームピークおよびＱ／ＶＨＳアイソフォームピークにより特徴付けられる。いかなる理論にも縛られるつもりはないが、これら独特のｐＥ／ＱおよびＱ／ＶＨＳアイソフォームは、ＤＡＣ  ＨＹＰを発現するのに使用されるリーダー配列に影響される可能性があると考えられている。したがって、一態様では、本開示は、陽イオン交換クロマトグラフィーにより決定される場合、ｐＥ／ＱアイソフォームがＮ末端アイソフォームのうちの３％−１７％、３％−１５％、５％−１５％、さらに好ましくは、５％−１２％もしくは７％−１２％に及ぶ、および／またはＱ／ＶＨＳアイソフォームがＮ末端アイソフォームのうちの１％−１５％、さらに好ましくは３％−１２％に及ぶダクリズマブ組成物を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ダクリズマブ組成物は、図１８または図２３のＤＡＣ  ＨＹＰプロファイルに実質的に類似する陽イオン交換クロマトグラフィープロファイルにより特徴付けられる。
【００１１】
ダクリズマブはＮ連結オリゴ糖が重鎖残基Ａｓｎ２９６に結合している。これらＮ連結オリゴ糖が、アミダーゼＰＮＧアーゼＦを使用して放出され、ＨＰＬＣによって分析されると、ＤＡＣ  ＨＹＰは、両方ともＮＳ０細胞系統において組換え的に産生されるという事実にもかかわらず、ＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣとは異なるグリコシル化プロファイルを示す。実際、ＤＡＣ  ＨＹＰのグリコシル化プロファイルは著しく均質である。図２１の上パネルを参照すると、ＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣのグリコシル化プロファイルは、オリゴ糖Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃ、Ｇ０、Ｇ１、Ｍａｎ５、Ｇ２、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７およびシアル酸付加オリゴ糖を表すピークにより特徴付けられる。図２１の下パネルは、ＤＡＣ  ＨＹＰのグリコシル化プロファイルが、Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃグリコフォームおよびＧ０グリコフォームに一致する２つの主要ピークならびにＧ１グリコフォームに一致する小さいほうのピークにより特徴付けられることを示している。Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃグリコフォームは、ＡＵＣの約５％から約２０％、さらに典型的にはＡＵＣの約７．２％から１４．６％に及ぶことが可能である。Ｇ０グリコフォームは、ＡＵＣの７０％から９９．２％、さらに典型的にはＡＵＣの８０．９％から９９．２％に及ぶことが可能である。Ｇ１グリコフォームは、ＡＵＣの１％から９％、さらに典型的にはＡＵＣの１．４％から３．８％に及ぶことが可能である。シアル酸付加オリゴ糖は総ＡＵＣの１．０％以下である。
【００１２】
免疫原性および高レベルのエフェクター機能は、長期的に投与される薬物には問題となることがある。さらに、急速なクリアランス速度は薬物有効性を低下させ得る。当業者には周知であるように、治療抗体のグリコシル化パターンの違いは免疫原性の違いを生じ得る。ＤＡＣ  ＨＹＰのように高度に均質なグリコシル化パターンを有する抗体は、有益な免疫原性プロファイル、ＡＤＣＣレベルおよびクリアランス速度を提供し得る。さらに、より均質なグリコシル化パターンを有する生物製剤であれば、バッチによる変動を減少させ、一貫性および安定性を改善することが可能である。
【００１３】
したがって、別の態様では、本開示は、均質なＮ連結グリコシル化プロファイルにより特徴付けられるダクリズマブ組成物を提供する。一実施形態では、ダクリズマブ組成物は、ＨＰＬＣにより測定された場合、Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃグリコフォームの総ＡＵＣのおよそ５−２０％、いくつかの実施形態では、Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃグリコフォームの総ＡＵＣのおよそ５％−１８％またはおよそ７−１５％（たとえば、７．２％−１４．６％もしくは６．９％から１４．７％）（いくつかの特定の実施形態では、Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃグリコフォームの総ＡＵＣの７．３％）、ならびにＧ０グリコフォームの総ＡＵＣのおよそ７０％−９９．２％、およびいくつかの実施形態では、Ｇ０グリコフォームの総ＡＵＣのおよそ７５％−９０％、およそ７５−９２％またはおよそ８１−８８％（いくつかの特定の実施形態では、Ｇ０グリコフォームの総ＡＵＣの８６％）を含むＮ連結グリコシル化プロファイルにより特徴付けられる。場合によって、Ｇ１ピークは、総ＡＵＣの約１０％未満、総ＡＵＣの約５％未満、約４％未満または約３％未満であり、ある種の実施形態では、約１％から約４％（たとえば、１．４％から３．８％）または約１％から約３％に及ぶ。Ｍａｎ５グリコフォームは好ましくは、総ＡＵＣの約３％以下である。他の実施形態では、ダクリズマブ組成物は、図１９に示されるプロファイルに実質的に類似するＨＰＬＣ  Ｎ連結グリコフォームプロファイルにより特徴付けられる。
【００１４】
ある種の態様では、本開示のダクリズマブ組成物は、２つまたはこれよりも多いグリコフォームピークの総数により特徴付けられる。ある種の実施形態では、本開示のダクリズマブ組成物は、（ａ）合わせると総ＡＵＣの約７５％から約１００％、約８０％から約１００％、もしくは約８５％から約１００％に及ぶＧ０−ＧｌｃＮＡｃグリコフォームおよびＧ０グリコフォームに一致する２つの主要なピーク、ならびに／または（ｂ）合わせると総ＡＵＣの約６％以下であるＭａｎ５、Ｍａｎ６およびＭａｎ７グリコフォームに一致するピーク、ならびに／または（ｃ）合わせると総ＡＵＣの約２％以下であるＭａｎ６およびＭａｎ７グリコフォームに一致するピークにより特徴付けられる。そのような実施形態では、Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃ  Ｇ０、Ｇ１および／またはＭａｎ５の百分率は、前の段落に記載されている量で存在し得る。
【００１５】
ＤＡＣ  ＨＹＰの結合および抑制特性の他にＴ細胞のＩＬ−２誘導増殖の抑制を測定するアッセイにおいて評価されるＤＡＣ  ＨＹＰの機能的効力は、ＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣの特性および効力に類似している。しかし、非常に驚くべきことに、ＤＡＣ  ＨＹＰが示すＡＤＣＣ細胞傷害性はＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣよりも著しく小さいが、これはおそらく、少なくとも一部は、その非フコシル化マンノースグリコシル化レベルの違いによる（図２１参照）。図２２Ａおよび図２２Ｂにおいて示されるように、細胞アッセイにおいて測定される場合、ＤＡＣ  ＨＹＰが示すＡＤＣＣ細胞傷害性は、ＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣよりも少なくとも２５％小さい。当業者であれば認識されることになるように、ＤＡＣ  ＨＹＰの減少したＡＤＣＣ細胞傷害性は、たとえば、多発性硬化症またはブドウ膜炎の治療のためには細胞死が望ましくない長期投与に関連する兆候には有益である可能性がある。たとえば、多発性硬化症および他の非腫瘍学兆候の治療においてなどの治療が慢性的に適用されるこれらの状況では、ＤＡＣ  ＨＹＰ治療はＺＥＮＡＰＡＸ（商標）を用いる治療よりも安全でありうる。
【００１６】
したがって、別の態様では、本開示は、たとえば、標的細胞としてＫｉｔ２２５／Ｋ６を使用する場合および／または３体以上、６体以上、１０体以上または５０体以上の健康なドナー由来のＰＢＭＣエフェクター細胞を使用する場合、エフェクター対標的細胞比２５対１、４０対１、５０対１または６０対１を使用するインビトロアッセイにおいて測定される場合、濃度１μｇ／ｍＬで約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％未満またはこれよりもずっと低いＡＤＣＣ細胞傷害性を示すことにより特徴付けられるダクリズマブ組成物を提供する。特定の実施形態では、本開示は、たとえば、標的細胞としてＫｉｔ２２５／Ｋ６を使用する場合および／または３体以上、６体以上、１０体以上または５０体以上の健康なドナー由来のＰＢＭＣエフェクター細胞を使用する場合、エフェクター対標的細胞比２５対１、４０対１、５０対１または６０対１を使用するインビトロアッセイにおいて測定される場合、濃度１μｇ／ｍＬで、５−３０％、１０−３０％、１５−３０％、１５−３０％、５−２５％、１０−２５％、２０−３０％、１５−２５％、１５−３５％または２０−３５％に及ぶＡＤＣＣ細胞傷害性を示すことにより特徴付けられるダクリズマブ組成物を提供する。ＤＡＣ  ＨＹＰはＩｇＧ１免疫グロブリンであり、ＡＤＣＣ細胞傷害性を低下させることが知られているフレームワーク変異を含有しないことを考えると、ＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣと比べた場合ＤＡＣ  ＨＹＰを用いて観察されるさらに低いレベルのＡＤＣＣ細胞傷害性は驚きである。
【００１７】
ＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣと比べた場合のＤＡＣ  ＨＹＰの安全性プロファイルは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のない高度に純粋な生産物の生産を可能にする高収率無血清方法の使用によりさらに改善され得る。したがって、本開示は、ＢＳＡがないおよび／またはＢＳＡが存在しない細胞培養方法の生産物であるダクリズマブ組成物を提供する。
【００１８】
上で考察された特性のうちの１つまたは複数により特徴付けられるダクリズマブ組成物（ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物）は、哺乳動物細胞における組換え発現により都合よく入手することが可能である。いかなる特定の動作原理にも縛られるつもりはないが、上で考察された独特の特徴および／または特性のうちの１つまたは複数は、少なくとも一部は、高生産性組換え発現系の使用による可能性があると考えられている。これは、ＤＨＦＲを使用する、または好ましくは、対象のタンパク質（好ましくは、分泌されたタンパク質）の発現を推進する強いプロモーターと組み合わせて、弱いプロモーターの制御下にある選択可能なマーカー遺伝子を使用する遺伝子増幅によるなどのいかなる方法によっても達成することが可能である。理論に縛られずに、弱いプロモーターの制御下にあるマーカーの選択は、発現ベクターが転写的に活性である染色体領域に組み込まれ、高発現レベルの対象のタンパク質を産生する、安定なトランスフェクタントの同定を促進すると考えられている。一実施形態では、選択可能なマーカーの発現を促進する弱いプロモーターは、１つまたは両方のエンハンサー領域の活性が、部分的なまたは完全な欠失によるなどで減少しているまたは除去されているＳＶ４０プロモーター（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９７８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００：４９４−５０２頁）であり、場合によって、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９８５年、Ｃｅｌｌ  ４１（２）：５２１−３０頁）などの強いプロモーターと組み合わせて、対象のタンパク質の発現を推進する。
【００１９】
したがって、別の態様では、本開示は、ＤＡＣ  ＨＹＰなどの高レベルのダクリズマブを安定的に発現し、選択マーカーの発現が１つまたは両方のエンハンサー配列の部分的欠失によるなどでエンハンサー機能が減少されているＳＶ４０プロモーター（ｄＥ−ＳＶ４０と命名されている）の制御下にある組換え細胞系統を作製するのに有用なベクターを提供する。安定した発現細胞系統を生産するのに使用することが可能な特定のｄＥ−ＳＶ４０プロモーター配列は、図３Ａ−図３Ｄに、および図３Ｅに示されているベクターｐＨＡＴ．ＩｇＧ１．ｒｇ．ｄＥ（配列番号５）の６５３６位−６７３５位にある（配列番号１２）。安定した発現細胞系統を生産するのに使用することが可能な特定のベクターの様々な実施形態は、２０１１年１１月３０日提出の米国特許出願第６１／５６５，４１９号および２０１１年１１月３０日提出の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／６２７２０号に記載されており、これら特許文献は参照により本明細書に組み込む。
【００２０】
一般に、ＤＡＣ  ＨＹＰなどのダクリズマブを発現するのに有用なベクターは、ｐＨＡＴ．ＩｇＧ１．ｒｇ．ｄＥにより例証される、プロモーターなどの特徴（下のセクション５．１に記載されている。）のうちの１つまたは複数を含むことになる。ダクリズマブの２つの鎖は別々の転写制御下に置くことが可能であるが、好ましくは同一ベクター上にあり、そのコード領域はｃＤＮＡまたはイントロンとエキソンを含有するゲノムＤＮＡであることが可能である。別々の転写制御の代案として、２つの鎖は、単一転写物または単一オープンリーディングフレームとして発現されることが可能であり、そのコード領域は配列内リボソーム進入部位または自己切断インテイン配列により分離されており、その場合には重鎖および軽鎖コード配列は単一プロモーターの制御下にある。例となるプロモーターはＣＭＶ  ＩＥプロモーターおよびエンハンサーである（ｐＨＡＴ．ＩｇＧ１．ｒｇ．ｄＥ（配列番号５）の０００１位−０６２３位および３９８２位−４６０４位）。追加の特徴には、転写開始部位（選ばれるプロモーターに不在であれば）、転写終結部位および複製の起点が含まれる。そのような特徴の例は表１に例示されており、この表はｐＨＡＴ．ＩｇＧ１．ｒｇ．ｄＥの成分を概説している。
【００２１】
ＮＳ０細胞において、単一の外来性核酸からＤＡＣ  ＨＹＰなどのダクリズマブの重鎖と軽鎖の両方を発現するのに有用な特定の実施形態は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（Ｈｐｈ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）などの、哺乳動物細胞において作動可能な選択マーカーを利用する。好ましい実施形態では、本開示のベクターにおける選択可能マーカーは、そのコード配列が図３Ａ−図３Ｄに示されるｐＨＡＴ．ＩｇＧ１．ｒｇ．ｄＥ（配列番号５）の６９３５位−７７９３位に見出すことが可能なエンハンサーレスＳＶ４０プロモーターの制御下の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ選択可能マーカーである。
【００２２】
別の態様では、本開示は、たとえば、ＤＡＣ  ＨＹＰなどのダクリズマブを組換え的に生産するのに有用なベクターをトランスフェクトされている宿主細胞を提供する。宿主細胞は、たとえば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ベロ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＣＯＳ７細胞、ＷＩ３８細胞、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞、Ｌ細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＭＤＣＫ細胞および２９３細胞を含むいかなる哺乳動物細胞でもよい。ベクターは、トランスフェクトされると、ゲノムに組み込まれて安定した産生細胞系統を生じ得る。当業者であれば、ヒトへの投与のために指定された組成物中に動物産物を含むのは望ましくないことを認識する。したがって、増殖のために血清または他の動物産物（たとえば、コレステロールなど）を必要としない宿主細胞が好まれる。そのような動物産物を必要とする宿主細胞は、無血清および他の無動物産物培地を利用するように適応させることが可能である。無血清および無コレステロール培地で増殖するようにマウス骨髄腫ＮＳ０細胞を適応させるための方法は、Ｈａｒｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００７年、Ｂｉｏｔｅｃｈ．＆Ｂｉｏｅｎｇ．９６（２）：２９４−３０６頁およびＢｕｒｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００７年、Ｂｉｏｔｅｃｈ．＆Ｂｉｏｅｎｇ．９６（２）：２８１−２９３頁に記載されている。無血清および無コレステロール培地で増殖するように適応されたＮＳ０細胞の特定の系統は、ＤＡＣ  ＨＹＰを生産するのに使用することが可能な上記のベクターを安定的にトランスフェクトされてきた（クローン７Ａ１１−５Ｈ７−１４−４３）。
【００２３】
当業者であれば認識することになるように、組換えタンパク質産生のために細胞を培養するのに使用される基本培地および流加培地の他に、フィーディング計画、増殖速度、温度および酸素レベルなどの他の変数は発現されるタンパク質の収率および質に影響を及ぼすことが可能である。これらの条件を最適化する方法は当業者の範囲内であり、例となる条件は本開示の例となる実施形態に記載されている。好ましくは、細胞は、コレステロール由来、血清由来および他の動物由来の成分のない培地で増殖するように適応され、そのような場合には、基本培地および流加培地は、好ましくはそのような成分の代わりとなる定義された化学物質を含む。高レベルのグルコース、たとえば、１０−３５ｇ／Ｌのグルコースを含有する培地は、細胞培養生産性を有利に増加することも見出されている。特定の実施形態では、基本培地は約１０−２０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは、約１５ｇ／Ｌのグルコースを有し、および／または流加培地は２２−３５ｇ／Ｌ、さらに好ましくは、約２８ｇ／Ｌのグルコースを有している。当技術分野では公知のように、流加培地を、８−１５日間、９−１３日間または、もっとも好ましくは１０−１３日間の期間にわたり、加速するフィーディング計画に従って細胞に追加することが可能である。
【００２４】
ＮＳ０産生系統７Ａ１１−５Ｈ７−１４−４３において発現されるＤＡＣ  ＨＹＰでは、増殖および流加培地の成分ならびに発現と産生に影響を及ぼす他の変数は最適化されている。したがって、本開示は、最適化された基本培地、流加培地、フィーディング計画および他の培養法ならびにダクリズマブを高収率および純度で生産するのに有用な条件も提供する。これらの培地ならびに培養パラメータおよび方法は、セクション５．３にさらに詳細に記載されている。
【００２５】
ある種のクロマトグラフィーステップの組合せを利用して細胞培養物からダクリズマブを精製すると、精製されたダクリズマブおよびＤＡＣ  ＨＹＰ原薬組成物ならびに高濃度で、典型的には少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬ±１０−１５％の、およびいくつかの実施形態では１５０ｍｇ／ｍＬ±１０−１５％の名目上のダクリズマブまたはＤＡＣ  ＨＹＰ濃度（紫外分光または屈折率により測定した場合）で液状の貯蔵安定である液体ダクリズマブおよびＤＡＣ  ＨＹＰ薬物製剤を生じることも見出されている。
【００２６】
安定した高濃度ダクリズマブ薬物製剤は、一般に、濃縮されたダクリズマブ製剤を約２６７−３２７ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の（たとえば、２７０−３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の浸透圧および２５℃で約ｐＨ５．８−６．２の範囲の（たとえば、２５℃で５．９−６．１）のｐＨを有する交換緩衝液を用いて交換して、中間製剤を生じ、次に中間製剤をポリソルベート希釈緩衝液で希釈して、紫外分光または屈折率により測定した場合、約１００ｍｇ／ｍＬ±１０％のダクリズマブ（たとえば、ＤＡＣ  ＨＹＰ）、いくつかの実施形態では少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬのダクリズマブ（たとえば、ＤＡＣ  ＨＹＰ）を含む安定な高濃度液体製剤を生じることにより調製される。希釈緩衝液は交換緩衝液と同じであるが、約０−１０％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、最終の安定な高濃度ダクリズマブ製剤が０．０２−０．０４％の範囲で、いくつかの実施形態では約０．０３％（ｗ／ｖ）で計算されたポリソルベート８０濃度（名目濃度）を有するような量で使用される。様々な異なる緩衝剤および賦形剤は、定義された範囲内の浸透圧およびｐＨを達成するよう交換および希釈緩衝液中に含まれることが可能である。安定で高濃度液体ダクリズマブおよびＤＡＣ  ＨＹＰ薬物製剤を処方するのに適した交換緩衝液の特定の非限定的例は、約４０ｍＭのコハク酸および約１００ｍＭのＮａＣｌを含有し２５℃で約６．０のｐＨを有する。この交換緩衝液を用いて使用するのに適した希釈緩衝液の特定の非限定的例は、約４０ｍＭのコハク酸、約１００ｍＭのＮａＣｌおよび約１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含有し２５℃で約６．０のｐＨを有する。最終製剤のｐＨは酸または塩基を用いて調整して２５℃で約６．０の実際のｐＨを生じることが可能である。
【００２７】
安定で高濃度液体ダクリズマブ製剤は、低レベルのアグリゲーション、典型的には、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定される場合、少なくとも９５％の単量体および３％未満のアグリゲート、ときには１．５％未満のアグリゲート、より一般的には、９９％を超える単量体および０．８％未満のアグリゲートを含有することにより特徴付けられる。高濃度液体ダクリズマブ薬物製剤の他の純度の特徴はセクション５．６にさらに詳細に記載されている。
【００２８】
高濃度ダクリズマブ薬物製剤は、長い貯蔵期間、すなわち、２−８℃で貯蔵される場合、最長５４ヶ月以上、たとえば、少なくとも５年間の期間、促進的条件（２３−２７℃／６０±５％の相対湿度）下で貯蔵される場合、最長９ヶ月の期間およびストレス条件（３８−４２℃／７５±５％の相対湿度）下で貯蔵される場合、最長３ヶ月の期間、５％を超える分解および３％を超えるアグリゲートの形成（それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより測定される場合）に対して安定であることにも特徴付けられる。
【００２９】
上記のように、安定な高濃度液体ダクリズマブ製剤は、中間製剤をポリソルベート希釈緩衝液で希釈し、完成したダクリズマブ薬物製剤を生じることにより調製することが可能である。したがって、別の態様では、本開示は、ポリソルベート希釈緩衝液で希釈して本明細書に記載される安定な高濃度ダクリズマブ液体薬物製剤を生じることが可能な、少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬのダクリズマブ、いくつかの実施形態では約１７０−１９０ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含有する無ポリソルベート精製されたダクリズマブ（好ましくはＤＡＣ  ＨＹＰ）中間製剤を提供する。特定の実施形態では、濃縮された無ポリソルベート中間製剤は、約１５５ｍｇ／ｍＬまたは約１８０ｍｇ／ｍＬのダクリズマブ（好ましくはＤＡＣ  ＨＹＰ）、約４０ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび約１００ｍＭのＮａＣｌ、２５℃でｐＨ６．０を名目上含有する。特定の実施形態では、濃縮された無ポリソルベート中間製剤は、約１５５ｍｇ／ｍＬまたは約１８０ｍｇ／ｍＬのダクリズマブ（好ましくはＤＡＣ  ＨＹＰ）、約４０ｍＭのコハク酸ナトリウムおよび約１００ｍＭのＮａＣｌ、２５℃でｐＨ６．０を名目上含有する。ダクリズマブ組成物は、下でさらに記載される低レベルのアグリゲートにより特徴付けられる。
【００３０】
ダクリズマブを限外濾過により濃縮すると、アグリゲートが誘導されて形成され、容認できない（たとえば、＞３％）レベルのアグリゲートを含有する高濃度ダクリズマブ薬物製剤が生じ得ることが見出されている。したがって、アグリゲートを取り除くためにダクリズマブ原薬を濃縮することに先立って「研磨」ステップを利用するのが好ましい。濃縮に先立って容認できるアグリゲートのレベルは、濃縮されるダクリズマブ原薬の濃度、最終ダクリズマブ薬物製剤中の望ましい濃度および最終ダクリズマブ薬物製剤中の容認できるレベルのアグリゲートに依存することになる。たとえば、３％未満のアグリゲートを含有する１５０ｍｇ／ｍＬのダクリズマブ製剤が望ましく、この完成したダクリズマブ製剤を達成するためにはダクリズマブ原薬を１０倍から３０倍（たとえば、２０倍）濃縮しなければならない場合は、濃縮されるダクリズマブ組成物は、＜０．３％のアグリゲート、好ましくは＜０．２％のアグリゲート、好ましくはさらに低いレベル、たとえば、約０．１％のアグリゲートを含有するほうがよい。
【００３１】
たとえば、強陽イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む、様々な公知の技法を使用して、本明細書に記載される濃縮されたダクリズマブ中間物および最終製剤に濃縮するための容認できるレベルのアグリゲートを含有する出発ダクリズマブ原薬組成物を得ることが可能である。しかし、驚くべきことに、弱陽イオン交換クロマトグラフィーは、４−１２ｍｇ／ｍＬのダクリズマブおよび最大２．５％のアグリゲートから極度に低いレベル、典型的には、約０．１％のアグリゲートの範囲で含有するダクリズマブ組成物のアグリゲートのレベルを低下させることが見出されている。アグリゲートを取り除くために弱陽イオン交換を使用するのは、窒素含有溶液（たとえば、硫酸アンモニウム溶液）を利用する疎水性相互作用クロマトグラフィーよりも環境にやさしい。
【００３２】
したがって、別の態様では、本開示は、得られる研磨された組成物が、一般に、約４から１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含有し、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定される場合、０．３％以下（たとえば、０．２％以下または０．１％以下）がアグリゲート形態であるように、ダクリズマブ組成物を研磨しアグリゲートを取り除く方法を提供する。方法は、一般に、約４−１０ｍｇ／ｍＬ、典型的には約８−９ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約８．５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブおよび＞０．５％のアグリゲートを含有するダクリズマブ組成物を、適切な緩衝液中の弱陽イオン交換樹脂上に通過させてダクリズマブを吸着させ、吸着されたダクリズマブを溶出緩衝液で溶出することを含む。有用な弱陽イオン交換樹脂には、ＣＭ−６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＭ−セファロース、ＣＭ−ＨｙｐｅｒＤが含まれるが、これらに限定されない。平衡化、洗浄および溶出緩衝液の成分は、使用される弱陽イオン交換樹脂に依存することになり、当業者には明らかとなる。ＣＭ−６５０Ｍ樹脂（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、品番１０１３９２）では、約２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．５を含有する平衡化と洗浄緩衝液および２０ｍＭのクエン酸ナトリウムと７５ｍＭの硫酸ナトリウム、ｐＨ４．５を含有する溶出緩衝液がうまく機能する。使用される流速は樹脂とカラムのサイズの選択に依存することになる。約１０−３０ｃｍの範囲（たとえば、１７−１９ｃｍ）の床高を有するＣＭ−６５０Ｍ樹脂の円筒形カラムおよび約５０−２００ｃｍ／時の範囲（たとえば、９０−１１０ｃｍ／時、好ましくは約１００ｃｍ／時）の流速では、クロマトグラフィーを十分用いた作業は、室温で、またはもっと低い温度、たとえば、４℃から、１０℃、１５℃、２０℃もしくは２５℃の範囲の温度で、実施することが可能である。典型的で有用な温度範囲は１８−２５℃（たとえば、１８−２２℃）である。
【００３３】
ＺＥＮＡＰＡＸ  ＥＭＥＡに従えば、ＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣのための精製方法は、以下の１２のステップ：
（ｉ）培養液濃度；
（ｉｉ）Ｑ−セファロースクロマトグラフィー；
（ｉｉｉ）Ｓ−セファロースクロマトグラフィー；
（ｉｖ）ウイルス不活化のための低ｐＨ処置；
（ｖ）濃縮／限外濾過；
（ｖｉ）ウイルス除去のためのＤＶ５０濾過；
（ｖｉｉ）Ｑ−セファロースＩＩクロマトグラフィー；
（ｖｉｉｉ）ウイルス除去のためのバイアソルブ（ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ）クロマトグラフィー；
（ｉｘ）限外濾過による濃縮；
（ｘ）Ｓ−３００ゲル濾過クロマトグラフィー；
（ｘｉ）限外濾過による濃縮；
（Ｘｉｉ）バイアルの無菌充填
を含む。
【００３４】
この方法は非効率的であり、提供する精製収率は低い。ステップはもっと少ないが、同時にもっと高い純度を生じる方法を用いてもっと高い収率を達成することが可能であることが見出されており、これを使えば、得られるダクリズマブ原薬を上記の高濃度薬物製剤に処方することが可能になる。したがって、本開示は、ダクリズマブ原薬と高濃度薬物製剤の両方を単離するおよび／または精製するための改良された方法も提供する。該方法は、強い陰イオン交換（Ｑ−セファロース）クロマトグラフィーおよび弱陽イオン交換（ＣＭ−６５０Ｍ）クロマトグラフィーと併せてプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを利用し、それにより方法中間物を希釈しない連続フロー処理が可能になる。精製されたダクリズマブ原薬を得るための改良された方法は、以下のステップ：
（ｉ）ダクリズマブを他の細胞培養成分から単離するためのプロテインＡ親和性クロマトグラフィー；
（ｉｉ）低ｐＨウイルス不活化；
（ｉｉｉ）ＤＮＡを取り除くための強い陰イオン交換（Ｑ−セファロース）クロマトグラフィー；
（ｉｖ）アグリゲートを減らすための弱陽イオン交換（ＣＭ−６５０Ｍ）クロマトグラフィー；および
（ｖ）ウイルスを取り除くための濾過
を含む。
【００３５】
当技術分野で周知のように、正確な容積、カラムサイズおよび操作用パラメータは、一部、精製の規模に依存することになる。大規模精製に有用な比容積、カラムサイズおよび操作用パラメータはセクション５．４に記載されている。
【００３６】
精製され、場合によって上記の方法により処方される未精製ダクリズマブは、様々な従来の方法、たとえば、マイクロフィルター法、遠心分離および直接バイオリアクターからのデプス濾過を使用して細胞培養物から収穫することが可能である。しかし、未精製ダクリズマブは、１５℃未満の温度で細胞培養物のｐＨをおよそｐＨ５まで下げて、細胞を凝結させ、この細胞を遠心分離により取り除くことができることにより都合よく収穫することが可能であることはすでに見出されている。特定の実施形態では、未精製ダクリズマブは、細胞培養物のｐＨをおよそｐＨ５まで下げ、培養物を３０−９０分間１５℃未満、たとえば、４℃まで冷却し、得られた懸濁物を遠心分離にかけて細胞を取り除くことにより収穫される。この方法は、一般に、組換えタンパク質を培養培地中に分泌するいかなる細胞培養物にも適用可能であり、ダクリズマブまたは治療抗体を産生する培養物に限定されてはいない。培養物のｐＨは、弱い有機酸もしくは強い有機酸、または弱い無機酸もしくは強い無機酸を含む様々な異なる酸を使用して調整することが可能である。ダクリズマブ培養物では、クエン酸がうまく機能することが見出されている。濃縮されたクエン酸溶液、たとえば、０．５Ｍ−２Ｍ溶液を、収穫に先立って培養物のｐＨを調整するために使用することが可能である。
【００３７】
ＤＡＣ  ＨＹＰの精製は、３つのクロマトグラフィーステップ、すなわち、ウイルス不活化、ウイルス濾過および最終の限外濾過の使用により実現される。プロテインＡ親和性クロマトグラフィーは、精製方法の最初のステップであり、大部分のプロセス関連不純物を取り除く。プロテインＡ親和性カラムの再利用を可能にするためには、カラムを再生し衛生化しなければならない。ＮａＯＨ水溶液はカラム再生と衛生化の両方を実現するのに効果的であることが見出されている。しかし、ＮａＯＨ溶液を使用するとプロテインＡ樹脂を分解することがあり、全体的な生産コストを増やしてしまう。プロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂をＮａＯＨおよびベンジルアルコールを含有する溶液で衛生化すると良好な結果を生じ、精製サイクルの回数を著しく増やすことも見出されている。したがって、本開示は、プロテインＡ親和性カラムおよび樹脂を再生し衛生化するための衛生化溶液および方法も提供する。該緩衝液は、一般に約１００から５００ｍＭのクエン酸ナトリウム、約１０から３０ｍＭのＮａＯＨおよび約０．５から３％（ｖ／ｖ）のベンジルアルコールを含み、約ｐＨ１０から１３の範囲のｐＨを有する。該緩衝液は、場合によって、たとえば、塩および／または洗剤などの他の成分も含み得る。クエン酸ナトリウムとベンジルアルコールの両方はプロテインＡ樹脂をＮａＯＨにより破壊されることから保護し、殺菌作用を増強するために重要である。特定の実施形態では、プロテインＡ衛生化緩衝液は、約２００ｍＭのクエン酸ナトリウム、約２０ｍＭのＮａＯＨおよび約１％（ｖ／ｖ）のベンジルアルコールを含有する。セクション５．４．２において記載されるように、ベンジルアルコールおよび水酸化ナトリウムを含有する衛生化溶液は有益な抗菌効果を有し、これを使用して、いかなる抗体についても精製方法におけるプロテインＡカラムを衛生化することができる。
【００３８】
衛生化緩衝液を使用して、バッチ式方法においてプロテインＡクロマトグラフィー樹脂を衛生化することができ、樹脂は過剰な（たとえば、１．５−２×容積）衛生化緩衝液で洗浄され、続いて過剰な（たとえば、１．５−２×容積）衛生化緩衝液中で約３０−４５分間インキュベートし、続いて平衡化緩衝液または貯蔵緩衝液で平衡化される。衛生化緩衝液を使用して、カラムを適切な流速（たとえば、約１１０−１９０ｃｍ／時または１３５−１６５ｃｍ／時の幅がある）で過剰な（たとえば、１．５−２×カラム容積）衛生化緩衝液で洗浄し、カラムを約３０−４０分間、流速０の条件下に保持し、次にカラムを平衡化緩衝液または貯蔵緩衝液で洗浄することにより、調製されたプロテインＡクロマトグラフィーカラムを衛生化することが可能である。適切な平衡化緩衝液および貯蔵緩衝液はセクション５．５に記載されている。
【００３９】
本明細書に記載される衛生化緩衝液を用いてプロテインＡカラムを衛生化すると、単一バッチの樹脂を使用することができる精製の回数を著しく増加させる。たとえば、単一バッチのプロテインＡ樹脂は、従来のＮａＯＨ緩衝液（たとえば、５０ｍＭのＮａＯＨ、０．５ＭのＮａＣｌ）で衛生化される場合、典型的には約３０精製サイクルしかもちこたえないが、本明細書に記載される衛生化緩衝液で衛生化されたプロテインＡカラムは、１００回を超える精製サイクルに使用することが可能である。いかなる動作原理にも縛られるつもりはないが、本明細書に記載される衛生化緩衝液は、固定化されたプロテインＡをＮａＯＨ誘導分解から一部保護し、それによって樹脂の耐用期間を増加すると考えられている。したがって、ＮａＯＨ分解に耐性であるよう設計されたプロテインＡの変異系統を利用する樹脂（たとえば、ＭａｂＳｕＲｅ樹脂）を含むあらゆるプロテインＡ樹脂には改良が予想されるが、非改変の固定化されたプロテインＡまたはＮａＯＨ安定であるように操作されていないプロテインＡを利用してプロテインＡ樹脂およびカラムを衛生化するのに使用される場合、本明細書に記載される衛生化緩衝液は特に有益である。本開示は、精製実行を行い、樹脂を本明細書に開示される衛生化溶液で洗浄することを含む、３０回を超える、３５回を超えるまたは４０回を超える抗体精製実行、いくつかの例では最大５０または最大１００のタンパク質精製サイクルにプロテインＡ親和性樹脂を使用することを含む方法をさらに提供する。
【００４０】
上記のように、ダクリズマブは、活性化されており休止していないＴリンパ球およびＢリンパ球上で発現されるＣＤ２５に特異的に結合し、ＣＤ２５へのＩＬ−２の結合をブロックして、それによって高親和性ＩＬ−２受容体複合体の形成を阻害し、活性化されたＴ細胞およびＢ細胞の増殖を抑制する。本明細書に記載されるＤＡＣ組成物および製剤ならびに特にＤＡＣ  ＨＹＰ組成物および製剤は、同様にＣＤ２５に特異的に結合し、類似の生物学的特性を示す。したがって、本明細書に記載されるＤＡＣ組成物および製剤ならびに特にＤＡＣ  ＨＹＰは、ダクリズマブ全般、具体的にはＺＥＮＡＰＡＸについて記載されているアッセイおよび治療法のいずれにおいても有用である。したがって、本開示は、同種移植片拒絶の治療および予防、ブドウ膜炎の治療ならびに多発性硬化症の治療などの、活性化されたＴ細胞および／またはＢ細胞増殖が関与している疾患の治療に向けた治療手段として、インビトロ適用でもインビボ適用でも活性化されたＴ細胞およびＢ細胞の増殖を抑制するために、本明細書に記載されるＤＡＣ組成物および製剤ならびに特にＤＡＣ  ＨＹＰ組成物および高濃度安定液体製剤を使用する方法もさらに提供する。
【００４１】
該方法は、一般的には、活性化されたＴ細胞および／またはＢ細胞を、その増殖を抑制するのに十分な量の本明細書に記載されるダクリズマブ組成物または製剤に接触させることを含む。
【００４２】
治療法では、該方法は、一般的には、治療効果を与える量のダクリズマブ組成物、たとえば、本明細書に記載されるＤＡＣ  ＨＹＰ組成物または高濃度ＤＡＣ製剤を対象に投与することを含む。特定の実施形態では、ダクリズマブ組成物および製剤を使用して、単独でまたはインターフェロンベータなどの他の薬物と組み合わせて、多発性硬化症を治療することができる。本明細書に記載されるＤＡＣ組成物は、７５ｍｇから３００ｍｇ（たとえば、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇもしくは３００ｍｇ）の範囲のまたは１ｍｇ／ｋｇから４ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、患者に毎週から毎月（たとえば、毎週、２週間ごとに、月２回、４週ごとにもしくは毎月）皮下投与することが可能である。該組成物は、好ましくは、１００ｍｇ／ｍＬ±１０−１５％または１５０ｍｇ／ｍＬ±１０−１５％の名目上のダクリズマブ濃度で、皮下使用に便利な充填済みのシリンジで提供することが可能である。濃縮されたＤＡＣ組成物は、静脈内投与のために希釈することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＤＡＣ−ＨＹＰ軽鎖ｃＤＮＡ（配列番号１）および翻訳アミノ酸（配列番号２）配列を提供する図である。太字の下線を引いたアスパラギン酸（Ｄ）残基は、適切にプロセッシングされた成熟タンパク質における第１のアミノ酸であり、この残基の上流のアミノ酸配列はシグナル配列に対応する。
【図２】ＤＡＣ−ＨＹＰ重鎖ｃＤＮＡ（配列番号３）および翻訳アミノ酸配列（配列番号４）を提供する図である。太字の下線を引いたグルタミン（Ｑ）残基は、適切にプロセッシングされた成熟タンパク質における第１のアミノ酸であり、この残基の上流のアミノ酸配列はシグナル配列に対応する。
【図３Ａ】ベクターｐＨＡＴ．ＩｇＧ１．ｒｇ．ｄＥ（配列番号５）に関する完全ヌクレオチド配列を提供する図である。
【図３Ｂ】ベクターｐＨＡＴ．ＩｇＧ１．ｒｇ．ｄＥ（配列番号５）に関する完全ヌクレオチド配列を提供する図である。
【図３Ｃ】ベクターｐＨＡＴ．ＩｇＧ１．ｒｇ．ｄＥ（配列番号５）に関する完全ヌクレオチド配列を提供する図である。
【図３Ｄ】ベクターｐＨＡＴ．ＩｇＧ１．ｒｇ．ｄＥ（配列番号５）に関する完全ヌクレオチド配列を提供する図である。
【図３Ｅ】高収量の生産株の選択に使用できる、ｄＥＳＶ４０プロモーター（配列番号１２）の具体的実施形態を提供する図である。
【図４Ａ】ベクターｐＨＡＴ．ＩｇＧ１．ｒｇ．ｄＥの略図であり、これはｐＡＢＸ．ｇｐｔに由来する。
【図４Ｂ】任意の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子またはさらに非抗体ポリペプチドを発現するように適合させ得るベクターである、ｐＡＢＸ．ｇｐｔの略図である。
【図５】ＤＡＣ  ＨＹＰの例示的生産方法を提供する図である。
【図６】プロテインＡの親和性クロマトグラフィーの間の生産物分画をモニターする、ＵＶ（２８０ｎｍ）、ｐＨおよび導電率を明示する図である。
【図７】Ｑ−セファロースクロマトグラフィーの間の生産物分画をモニターする、ＵＶ（２８０ｎｍ）、ｐＨおよび導電率を明示する図である。
【図８】ＣＭ陽イオン交換クロマトグラフィーの間の生産物分画をモニターする、ＵＶ（２８０ｎｍ）、ｐＨおよび導電率を明示する図である。
【図９】ＤＡＣ  ＨＹＰ限外濾過系の略図である。
【図１０】０−６０分のＤＡＣ  ＨＹＰのペプチドマップクロマトグラムを提供する図である。参照プロファイルは、１００ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物であり、バッチ１およびバッチ２は１５０ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物に対応する。
【図１１】５５−１１５分のＤＡＣ  ＨＹＰのペプチドマップクロマトグラムを提供する図である。参照プロファイルは、１００ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物であり、バッチ１およびバッチ２は１５０ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物に対応する。
【図１２】１１０−１７０分のＤＡＣ  ＨＹＰのペプチドマップクロマトグラムを提供する図である。参照プロファイルは、１００ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物であり、バッチ１およびバッチ２は１５０ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物に対応する。
【図１３】ＤＡＣ  ＨＹＰの１５０ｍｇ／ｍｌのロットのバッチ１およびバッチ２の円偏光二色性スペクトルを重ね合わせた図である。参照は、１００ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物である。
【図１４Ａ】重ね合わせたゼロ次紫外スペクトルを提供する図である。参照プロファイルは、１００ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物であり、バッチ１およびバッチ２は１５０ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製品物に対応する。３種すべてのスペクトルが存在するが、互いに重ね合わせたところ単一のスペクトルのように見える。
【図１４Ｂ】重ね合わせた二次微分紫外スペクトルを提供する図である。参照プロファイルは、１００ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物であり、バッチ１およびバッチ２は１５０ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物に対応する。３種すべてのスペクトルが存在するが、互いに重ね合わせたところ単一のスペクトルのように見える。
【図１５Ａ】フルスケールのサイズ排除クロマトグラムを提供する図である。参照プロファイルは、１００ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物であり、バッチ１およびバッチ２は１５０ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物に対応する。
【図１５Ｂ】拡大スケールのサイズ排除クロマトグラムを提供する図である。参照プロファイルは、１００ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物であり、バッチ１およびバッチ２は１５０ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物に対応する。
【図１６】時間の関数としてのＤＡＣ  ＨＹＰの凝集のプロットである。
【図１７】還元型および非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（それぞれ、左および右のパネル）を示す図である。参照プロファイルは、１００ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物であり、バッチ１およびバッチ２は１５０ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物に対応する。
【図１８】ＤＡＣ  ＨＹＰの陽イオン交換クロマトグラムを示す図である。参照プロファイルは、１００ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物であり、バッチ１およびバッチ２は１５０ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物に対応する。ピークラベルは、さまざまなＮ末端およびＣ末端のアイソフォームに対応する。
【図１９】ＤＡＣ  ＨＹＰから酵素的に切断された、Ｎ連結オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。参照プロファイルは、１００ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物であり、バッチ１およびバッチ２は１５０ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物に対応する。
【図２０】ＤＡＣ  ＨＹＰのＡＤＣＣ反応曲線を示す図である。参照プロファイルは、１００ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物であり、バッチ１およびバッチ２は１５０ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  ＨＹＰ調製物に対応する。
【図２１】それらのさまざまなグリコシル化プロファイルを例示する、ＤＡＣ  ＨＹＰから放出されたＮ連結オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラム（下のパネル）およびＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣから放出されたＮ連結オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラム（上のパネル）を示す図である。
【図２２Ａ】エフェクター対標的細胞比を可変としたＡＤＣＣアッセイフォーマットを使用した、２種のＤＡＣ  ＨＹＰ調製物（ＤＡＣ  ＨＹＰ  バッチ３およびＤＡＣ  ＨＹＰ  バッチ４と称される）、ＤＡＣ  ＰｅｎｚｂｕｒｇおよびＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣのＡＤＣＣ活性間の比較を提供する図である。
【図２２Ｂ】抗体濃度を可変としたＡＤＣＣアッセイフォーマットを使用した、２種のＤＡＣ  ＨＹＰ調製物（ＤＡＣ  ＨＹＰ  バッチ３およびＤＡＣ  ＨＹＰ  バッチ４と称される）、ＤＡＣ  ＰｅｎｚｂｕｒｇおよびＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣのＡＤＣＣ活性間の比較を提供する図である。
【図２３】ＤＡＣ  ＨＹＰ、ＤＡＣ  ＰｅｎｚｂｅｒｇおよびＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣの電荷アイソフォームの比較を提供する図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
４．詳細な説明
本開示は、たとえば、活性化されたＴ細胞および／またはＢ細胞の増殖を抑制し、たとえば、多発性硬化症などの活性化されたＴ細胞および／またはＢ細胞媒介疾患を治療するおよび／または予防するために、とりわけ、特定の特性を有するＤＡＣ組成物、ある種の投与様式に特に有用であり異なる温度で貯蔵安定である高濃度ＤＡＣ製剤、ＤＡＣ組成物を生産するのに有用なベクターおよび宿主細胞、ＤＡＣ組成物を生産するのに有用な最適化された培養液および培養条件、ＤＡＣ組成物および高濃度製剤を精製するための方法ならびにＤＡＣ組成物および高濃度製剤を使用する方法を提供する。
【００４５】
本明細書において使用されるダクリズマブ（ＤＡＣ）とは、図１に例示される軽（ＶＬ）鎖配列（配列番号２の２１位−２３３位）および図２に例示される重（ＶＨ）鎖配列（配列番号４の２０位から４６５位）を有するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体のことである。ＤＡＣのＣＤＲ配列は以下の通りである。
【００４６】
【化１】
2020078348.tif 000002
【００４７】
ある種のダクリズマブ分子は文献中に報告されており、ＤＡＣの特定のバージョンは、シクロスポリンおよびコルチコステロイドを含む免疫治療の補助剤として腎臓移植患者における同種移植片拒絶の予防のためにＨｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  ＲｏｃｈｅによりＺＥＮＡＰＡＸの商品名ですでに市販されている。ＺＥＮＡＰＡＸの商品名で販売されているバージョンのＤＡＣは本明細書においては「ＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣ」と呼ばれる。
【００４８】
ＤＡＣの別のバージョンは、ドイツのペンツベルグの施設で製造されており、一度も市販されたことはないが、ある種の臨床試験で使用されたことがある。ＤＡＣのこのバージョンは本明細書では「ＤＡＣペンツベルグ」と呼ばれる。
【００４９】
本明細書に記載されるように、本開示は、一部には、ＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣおよびＤＡＣペンツベルグの特徴および特性とは異なる、いくつかの例では、これらより優れている特徴および特性を有する新しいバージョンのＤＡＣに関する。したがって、本開示は、一部には、新しいＤＡＣ組成物に関する。新しいＤＡＣ組成物は、発明の概要においてより完全に記載されている以下の特色：
（１）特徴的なｐＥ／Ｑおよび／またはＱ／ＶＨＳ  Ｎ末端アイソフォーム；
（２）２つの主要なピークおよび小ピークにより特徴付けられる均質なＮ連結オリゴ糖プロファイル；
（３）ＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣおよびＤＡＣペンツベルグと比べて減少したＡＤＣＣ細胞傷害性；ならびに
（４）１５０±１０−１５％もの名目上の濃度で処方される場合の低レベルのアグリゲート形態（＜３％）
のうちの１つまたは複数により特徴付けられる。
【００５０】
これらの特徴および／または特性のうちの１つまたは複数を有するＤＡＣ組成物は、本明細書において「ＤＡＣ  ＨＹＰ」組成物と呼ばれる。本明細書に記載される発明の様々な態様および特色を例証する目的で、上記４つの特性すべてを有する特定のＤＡＣ  ＨＹＰが、この生産および精製のための特定の組成物および方法と同じように、記載される。しかし、ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物は、本開示の範囲に収まる上記４つの特徴をすべて有する必要はないことは理解されるべきである。特定の実施形態では、ＤＡＣ  ＨＹＰは、上記（１）から（４）までの特徴うち少なくとも２つ（たとえば、少なくとも（１）および（２）；（１）および（３）；（１）および（４）；（２）および（３）；（２）および（４）、もしくは（３）および（４）の組合せ）または上記（１）から（４）までの特徴うち少なくとも３つ（たとえば、少なくとも（１）、（２）および（３）；（１）、（２）および（４）；（１）、（３）および（４）、ならびに（２）、（３）、（４）の組合せ）を有する。そのようなＤＡＣ  ＨＹＰ組成物は、１００ｍｇ±１０−１５％またはさらに１５０±１０−１５％の濃度で処方される場合、＜３％のアグリゲート、＜２％のアグリゲートおよびこれよりはるかに低いレベル、たとえば、＜１％のアグリゲートも有し得る。
【００５１】
さらに、本明細書に記載される発明のある種の態様および実施形態はＤＡＣ  ＨＹＰを用いて例示され例証されるが、本発明はＤＡＣ  ＨＹＰに限定されておらず、ダクリズマブ組成物全般に有用であり、ＤＡＣに類似する特定のＣＤ２５結合特性を有するＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗ＣＤ２５抗体、ならびにヒトに投与するのに適しておりまだヒト化されていない抗ＣＤ２５抗体にも限定されていないことは当業者であれば認識することになる。これら様々な異なる抗ＣＤ２５抗体は本明細書において「ＤＡＣ類似体」と呼ばれる。そのようなＤＡＣ類似体は、通常上記の６つのＤＡＣ  ＣＤＲを含み得るが、他のＣＤＲ配列を含み得る。
【００５２】
ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物の特徴および特性は、標準アッセイ及び方法を使用して確認することが可能である。たとえば、Ｎ末端およびＣ末端アイソフォームプロファイルは、２２０ｎｍで検出する陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して評価することができる。特定の方法では、１００μＬの試験試料（緩衝液Ａに溶解した１ｍｇ／ｍＬの抗体）は、以下の分離勾配（カラムは緩衝液Ａを用いて平衡化されている。）：
【００５３】
【表１】
2020078348.tif 000003
を使用してＰｒｏＰａｃ  ＷＣＸ−１０Ｇガードカラム（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を備えたＰｒｏＰａｃ  ＷＣＸ−１０カラム（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｐｏｒａｔｉｏｎ）上、室温で分離される。
【００５４】
Ｎ連結グルコシル化プロファイルは、アミダーゼＰＮＧアーゼＦを用いてＮ連結オリゴ糖を切断し、オリゴ糖を蛍光標識を用いて誘導体化し、得られた混合物を蛍光検出付きの順相ＨＰＬＣにより分析することにより評価することが可能である。特定の方法では、アントラニル酸誘導体化切断Ｎ連結グリカンは、以下の溶出勾配（１００μＬの試料注入量を使用して；カラムは、８５％緩衝液Ａ／１５％緩衝液Ｂで平衡化されている。）：
【００５５】
【表２】
2020078348.tif 000004
を使用して、２５０×４．６ｍｍ重合体アミン結合Ａｓａｈｉｐａｋ  Ａｍｉｎｏ  ＮＨ２Ｐ−５０４Ｅカラム（５μｍ粒子サイズ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カタログ番号ＣＨＯ−２６２８）上、５０℃で分離される。
【００５６】
純度は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（プレキャスト１４％Ｔｒｉｓグリシン勾配ミニゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  品番６０１６３２）およびコロイドブルー染色、ならびに／または２８０ｎｍでの検出付きサイズ排除クロマトグラフィーを使用して確認することが可能である。特に、１５μＬの試験試料（溶出緩衝液中２０ｍｇ／ｍＬ抗体）は、流速１ｍＬ／分で、均一濃度勾配の溶出緩衝液（２００ｍＭのＫＰＯ４、１５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ６．９）を使用する０．５μｍのプレカラムフィルター（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ、品番Ａ−１０２Ｘ）を備えた７．８ｍｍ×３０ｃｍＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、品番６０１３４２）上、室温で分離することが可能である。
【００５７】
本明細書に記載される安定な高濃度液体ＤＡＣ製剤などの、本明細書に記載されるＤＡＣ  ＨＹＰ組成物および他のＤＡＣ製剤は、少なくとも一部は、たとえば、同種移植の拒絶および多発性硬化症を含む、活性化されたＴ細胞および／またはＢ細胞により媒介されると考えられる様々な障害および状態を治療するのに有用である。特定の患者集団、製剤、投与様式ならびに同種移植片拒絶を治療するまたは予防するのに有用な投与量および投与計画は、米国特許第６，０１３，２５６号に記載されており、参照により本明細書に組み込む。特定の患者集団、製剤、投与様式ならびに多発性硬化症に罹った患者を治療するのに有用な投与量および投与計画は、米国特許第７，２５８，８５９号に記載されており、参照により本明細書に組み込む。これらの製剤、投与様式、投与量および投与計画すべて、の他に開示された特定の患者集団および組合せ療法は、本明細書に記載されるＤＡＣ  ＨＹＰ組成物および、適用可能な場合には、高濃度ＤＡＣ製剤に等しく適している。
【００５８】
本明細書に記載されるＤＡＣ  ＨＹＰ組成物および製剤は、治療効果を与える量で投与される。治療効果には、根底にある障害の治療が含まれるが、これに限定されない。治療効果には、標準診断検査および他の検査を使用して評価される特定の疾患の症状または副作用を改善するまたは寛解させることも含まれ得る。多発性硬化症では、たとえば、脳病変を評価する磁気共鳴画像法の使用を含む治療効果を評価するおよび／または能力障害への進行を評価する様々な手段は米国特許第７，２５８，８５９号に記載されており、参照により本明細書に組み込む。これらの様々な検査法すべてを使用して、多発性硬化症に罹っている患者という状況で治療効果を評価することが可能である。
【００５９】
安定な高濃度ＤＡＣ製剤は、ＤＡＣ  ＨＹＰで作製されるものでも、ＤＡＣ全般で作製されるものでも、ＤＡＣ類似体で作製されるものでも、多発性硬化症などの慢性疾患の治療における皮下投与に特に有用である。該製剤は、単回ボーラス皮下注射として都合よく投与されるまたは静脈投与のために希釈されることが可能である。該製剤は、７５ｍｇから３００ｍｇ（たとえば、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇもしくは３００ｍｇ）の範囲のまたは１ｍｇ／ｋｇから４ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、患者に毎週から毎月（たとえば、毎週、２週間ごとに、月２回、４週ごとにもしくは毎月）皮下投与することが可能である。該組成物は、皮下使用に便利な充填済みのシリンジで提供することが可能である。希釈された製剤は、皮下投与と同じ回数、適切な投与量で静脈内投与することが可能である。
【００６０】
５．例示的実施形態
本明細書に記載の発明のさまざまな態様および特徴は、以下の例示的実施形態を用いてさらに記載される。例示的実施形態が、特定の細胞培養培地、細胞培養条件、カラムクロマトグラフィー樹脂および平衡化緩衝液、洗浄緩衝液および溶出緩衝液を利用する限り、日常の変更は実施可能であると認められる。さらに、さまざまな細胞培養方法が特定の生産株（クローン７Ａ１１−５Ｈ７−１４−４３）により例示される限り、日常の最適化を用いて、または用いずに、他のＤＡＣまたはＤＡＣ類似体生産株が良好に使用され得ることが期待される。さらに、（上記の要約または以下の例示的実施形態のいずれにおいても）特定の実施形態を伴って記載される特徴は、本開示の方法および組成物の望ましい特性に実質的に影響を与えずに逸脱可能であり、さらにその異なる実施形態は、これらが明確に互いに排他的でない限り、さまざまな方法で一緒に組み合わせ、使用することができる。したがって、以下に提供される例示的実施形態は例示を意図し、限定することを意図するものではないと理解されるべきであり、これらの実施形態に従った特許請求の範囲を限定すると解釈するべきではない。
【００６１】
以下に例示された製造方法は、ＤＡＣ  ＨＹＰ製剤原料を１５０ｍｇ／ｍＬで生産するために使用された。ＤＡＣ  ＨＹＰ製剤原料を１００ｍｇ／ｍＬで作るために、小さなプロセス変更が導入される：
ＤＡＣ  ＨＹＰ（セクション５．３を参照されたい）を１００ｍｇ／ｍＬで生産するために使用される細胞培養は、消泡剤エマルジョンを含まず、一方、ＤＡＣ  ＨＹＰが１５０ｍｇ／ｍＬの細胞培養は、発泡を最小に抑えるために、１０，０００Ｌバイオリアクターにおいて低濃度のＤｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｃを使用する。最終抗体濃度１００ｍｇ／ｍＬを有するＤＡＣ  ＨＹＰ製剤を生産する場合、ＣＭ−６５０Ｍカラム（セクション５．４．５を参照されたい）は、０．５ＭのＮａＯＨ、０．５Ｍの硫酸ナトリウムの緩衝液を用いて衛生化され、最終抗体濃度１５０ｍｇ／ｍＬを有するＤＡＣ  ＨＹＰ製剤を生産する場合、硫酸ナトリウムは衛生化緩衝液から省かれる。ＤＡＣ  ＨＹＰを１００ｍｇ／ｍＬで作るために、ワンステップの限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）が、ポリソルベート８０の添加および製剤原料の最終容積への希釈の直前の、下流プロセスの終わりに使用され（セクション５．４．７を参照されたい）、一方、製剤原料を濃度１５０ｍｇ／ｍＬに作るためには、ツーステップのＵＦ／ＤＦが使用される。以下の実施例は、さまざまなロットの、１００ｍｇ／ｍＬおよび１５０ｍｇ／ｍＬのＤＡＣ  ＨＹＰの比較分析を示す。いくつかの研究において、１５０ｍｇ／ｍＬのＤＡＣ  ＨＹＰのバッチが、以下に参照標準ロットＲＳ０８０１と称される、１０，０００Ｌ規模で製造された、１種のロットのＤＡＣ  ＨＹＰ１００ｍｇ／ｍＬと比較された。
【００６２】
５．１．ＤＡＣ  ＨＹＰ発現構築体
抗Ｔａｃ、マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、マウス骨髄腫細胞系ＮＳ−１と、Ｔ細胞白血病患者から生じたヒトＴ細胞系を用いて免疫化されたマウス由来の脾臓細胞とを融合することによって発生させた（Ｕｃｈｉｙａｍａら、１９８１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６（４）：１３９３−７頁）。抗Ｔａｃは、活性化Ｔ細胞とのその反応性に関して選択されたが、静止Ｔ細胞または静止Ｂ細胞とは反応性がない。抗Ｔａｃは、後に、ヒトＩＬ−２受容体のアルファサブユニットと反応することが示された（Ｌｅｏｎａｒｄら、１９８２年、Ｎａｔｕｒｅ  ３００（５８８９）：２６７−９頁）。
【００６３】
マウス抗Ｔａｃの軽鎖および重鎖の可変領域に関するアミノ酸配列は、それぞれのｃＤＮＡから決定された（Ｑｕｅｅｎら、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６（２４）：１００２９−３３頁）。マウス抗Ｔａｃの結合親和性は、Ｑｕｅｅｎらが記載したヒト化形態中に保有された。マウス抗Ｔａｃの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、まず、ヒト抗体Ｅｕのアクセプターフレームワークにグラフトされた。三次元モデルの助けを借りて、ＣＤＲの立体構造に重要な、カギとなるマウスフレームワーク残基、したがって結合親和性が特定され、アクセプターフレームワーク中のヒトカウンターパートに置換された。さらに、アクセプターフレームワーク中の非定型アミノ酸が、対応する位置のヒトコンセンサス残基と置き換えられ、潜在的免疫原性が排除された。
【００６４】
ＤＡＣ  ＨＹＰのＶＬおよびＶＨ遺伝子は、Ｑｕｅｅｎ（１９８９）らにより記載されたように、重複オリゴヌクレオチドのアニーリングおよび伸長によってミニエクソンとして構築された。ＩｇＧ１形態におけるＤＡＣ  ＨＹＰの発現のために、結果として得られたＶＬおよびＶＨ遺伝子が、Ｃｏｌｅら、（１９９７年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９（７）：３６１３−２１頁）およびＫｏｓｔｅｌｎｙら（２００１年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９３（４）：５５６−６５頁）に概説されたように、単一発現ベクター中にクローニングされ、ｐＨＡＴ．ＩｇＧ１．ｒｇ．ｄＥが構築された（図３および図４Ａを参照されたい）。プラスミドｐＨＡＴ．ＩｇＧ１．ｒｇ．ｄＥは、ダクリズマブのＩｇＧ１重鎖およびカッパ軽鎖の両方に関する遺伝子を含有し、各々がヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの調節下にある。このプラスミドは、選択可能なマーカーとして、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のグアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子を含有する。ｐＨＡＴ．ＩｇＧ１．ｒｇ．ｄＥ中のこの遺伝成分を、以下の表１に記載する。
【００６５】
【表３】
2020078348.tif 000005
【００６６】
ｄＥＳＶ４０プロモーターは、ｐＨＡＴ．ＩｇＧ１．ｒｇ．ｄＥの６５３６−６７３５位に及ぶ（６５３６−６５６２は７２ｂｐのエンハンサーＡの２７残基であり、６５６６−６６２９は３つの２１−ｂｐの反復である。６５３６−６７３５はＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ０２４００．１（シミアンウイルス（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ）４０完全ゲノム））中の５１７２−１および１−１３３の逆相補配列（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）である。発現ベクター中のＤＡＣ  ＨＹＰ軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列決定により確認された。
【００６７】
５．２．ＤＡＣ  ＨＹＰ安定細胞系
マウス骨髄腫細胞系ＮＳ０は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣカタログ番号８５１１０５０３、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から得られた。これらのＮＳ０細胞のバイアルを、１０％ＦＢＳを添加されたＤＭＥＭ中で解凍した。細胞は、加湿インキュベーターにおいて３７℃および７．５％ＣＯ２において維持された。細胞は、次いで、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを添加された基本培地ＳＦＭ−３において培養された。ＳＦＭ−３は、１０ｍｇ／ｍＬインスリンおよび１０μｇ／ｍＬトランスフェリンを添加された、ＤＭＥＭおよびＨａｍ’ｓＦ−１２の１：１混合物である。およそ３ヶ月にわたって、ＮＳ０細胞を、それが排除されるまで培養培地中のＦＢＳの量を徐々に減少させることによって、添加なしのＳＦＭ−３に適応させ、その後、単一ステップにおいてＢＳＡを最終的に除去する。得られた宿主細胞系は、ＳＦＭ−３において１５−２０回継代され、凍結バンクが調製された。
【００６８】
ＳＦＭ−３適応細胞に、（ＦｓｐＩ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｒ０１３５Ｌ、ロット４３）により線形化された）ｐＨＡＴ．ＩｇＧ１．ｒｇ．ｄＥを、エレクトロポレーションにより形質移入した。簡潔に言うと、３０−４０μｇのｐＨＡＴ．ＩｇＧ１．ｒｇ．ｄＥを、１×１０７の対数的に増殖する適応ＮＳ０細胞に加え、１．５ｋＶ、２５μＦで、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を使用して２回パルスをかけた。エレクトロポレーション後、細胞を５つの９６−ウェルプレート中のＤＭＥＭ±１０％ＦＢＳに、ミコフェノール酸（「ＭＰＡ」）選択後に単一コロニー／ウェルを支持する密度である２０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。Ｈａｒｔｍａｎら、２００７年、Ｂｉｏｔｅｃｈ．＆Ｂｉｏｅｎｇ９６（２）：２９４−３０６頁に記載のように、ベクターに安定に統合された形質移入体を、ミコフェノール酸の存在下で選択した。高レベルのＤＡＣ  ＨＹＰを産生するＮＳ０安定形質移入体から出発し、連続３ラウンドのサブクローニングを、限界希釈クローニングまたは蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によって、２．５％または５％いずれかのウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を含有するＰＦＢＭ−１中に実施した。サブクローニングの各ラウンドにおいて、最も優れた生産株の１種を次のラウンドのサブクローニングに使用した。第３ラウンドのサブクローニング後、最終生産細胞系（７Ａ１１−５Ｈ７−１４−４３）を選択した。その後、最終生産細胞系のシードバンクを、１ｍＬの９０％ＦＢＳ／１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中１×１０７細胞／バイアルを凍結することによって調製した。
【００６９】
５．３．ＤＡＣ  ＨＹＰ組換体の生産
５．３．１．細胞の培養および回収
単一細胞バンクバイアルから細胞を解凍し、Ｔ−フラスコ、ローラーボトル、スピナーフラスコおよびバイオリアクター内に、生産規模が達成されるまで、徐々により大きな容積に拡大する。生産培養が完了次第、細胞培養液を遠心分離および深層濾過により浄化し、収穫保持タンクに移送した。生産培養期間はおよそ１０日である。
【００７０】
細胞の培養および回収を、さまざまな異なる細胞培養設備において標準的な機器を使用して、当技術分野において公知のように実施することができる。別の実施例において、細胞を、単一細胞バンクバイアルから解凍し、振とうフラスコおよびバイオリアクター内に、生産規模が達成されるまで、徐々により大きな容積に拡大する。生産培養が完了次第、細胞培養液を遠心分離および深層濾過により浄化し、収穫保持タンクに移送する。生産培養期間はおよそ１０日である。
【００７１】
５．３．１．１．接種材料の調製
単一細胞バンクバイアルを解凍することによって生産バッチを開始する。細胞を、既知組成培地である無タンパク質基本培地−２（ＰＦＢＭ−２）を含有するＴフラスコに移す。ＮａＣｌ、フェノールレッド、トランスフェリンおよびインスリンを含まず、再構成した場合に、５ｍｇ／Ｌの濃度を得る量のＥＤＴＡ鉄（ＩＩＩ）ナトリウム塩を含み、再構成した場合に、それらの濃度が再構成されたＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭと同じであるように調整された残りの成分量を有するＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地粉末を要求することにより、ＰＦＢＭ−２を作るためのカスタム粉末をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから注文することができる。調製されたＰＦＢＭ−２培地は、以下の成分を含有する：８ｇ／Ｌのカスタム粉末、２．４５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、３．１５ｇ／ＬのＮａＣｌおよび１６．５ｇ／ＬのＤ−グルコース一水和物（１５ｇ／Ｌグルコース）。
【００７２】
細胞を、その後２日ごとに、ローラーボトルまたはスピナーフラスコ内で連続継代することによって拡大する。Ｔ−フラスコ、ローラーボトルおよびスピナーフラスコは設定温度３７℃において、Ｔ−フラスコおよびローラーボトルに関しては７．５％ＣＯ２およびスピナーフラスコに関しては５％ＣＯ２の雰囲気下で動作するインキュベーターに配置する。
【００７３】
スピナーフラスコに、細胞培養液の容積に依存して、ヘッドスペースに重ねること、または培養液内への散布のいずれかによって、５％ＣＯ２を添加し、インペラ速度は、一定の回転数／分（ＲＰＭ）に調節される。全ての接種材料の拡大継代における標的シーディング密度は、およそ２．５×ｌ０５生存細胞／ｍＬである。
【００７４】
さらに、接種材料の調製を、当技術分野において公知の方法に従って、さまざまな標準的培養槽、容積および条件を使用して、実施することができる。例えば、生産バッチは、単一細胞バンクバイアルを解凍することによって開始できる。細胞は、既知組成培地である無タンパク質基本培地２（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｒｅｅ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ−２）（ＰＦＢＭ−２）を含有する振とうフラスコに移すことができる。ＮａＣｌ、フェノールレッド、トランスフェリンおよびインスリンを含まず、再構成した場合に、５ｍｇ／Ｌの濃度を得る量のＥＤＴＡ鉄（ＩＩＩ）ナトリウム塩を含み、再構成した場合に、それらの濃度が再構成されたＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭと同じであるように調整された残りの成分量を有するＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地粉末を要求することにより、ＰＦＢＭ−２を作るためのカスタム粉末をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから注文することができる。調製されたＰＦＢＭ−２培地は以下の成分を含有する：８ｇ／Ｌのカスタム粉末、２．４５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、３．１５ｇ／ＬのＮａＣｌおよび１６．５ｇ／ＬのＤ−グルコース一水和物（１５ｇ／Ｌグルコース）。場合により、バイオリアクター段階において、例えば、０．０４ｍｇ／Ｌの濃度で硫酸銅七水和物を加えてもよい。
【００７５】
細胞を、その後２日ごとに、振とうフラスコ内で連続継代することによって拡大する。振とうフラスコは、設定温度３７℃において、７．５％ＣＯ２の雰囲気下で動作するインキュベーターに配置する。
【００７６】
振とうフラスコは、インキュベーター内の振とうプラットホームにおいて、一定の回転数／分（ＲＰＭ）でかき混ぜられる。全ての接種材料の拡大継代における標的シーディング密度は、およそ２．２−２．５×ｌ０５生存細胞／ｍＬである。
【００７７】
細胞バンクの解凍後およそ１４日、十分な数の生存細胞が生産された時、最初のいくつか、通常３または４のステンレス製撹拌タンクのシードバイオリアクターに接種する。使用前に、これらのシードバイオリアクターは、定置洗浄され、定置蒸気滅菌され、適切な容積のＰＦＢＭ−２培養培地をロードされる。ｐＨプローブおよび溶存酸素プローブは、バイオリアクターが定置蒸気滅菌される前に較正する。最初のシードバイオリアクターに、２．０−２．５×１０５の生存細胞／ｍＬの初期細胞密度を標的とするための十分な数の細胞を接種する。より大きな容積（通常、１００Ｌから３００Ｌおよびその後１，０００Ｌのシードバイオリアクターまたは６０Ｌから２３５Ｌ、９５０Ｌおよび３７５０Ｌのシードバイオリアクター）への連続移送を、各リアクターにおける増殖のおよそ２日後および標的初期細胞密度２．０−２．５×１０５生存細胞／ｍＬに実施する。培養のｐＨは、自動制御を介してＣＯ２ガスまたは１Ｍの炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）の添加により維持される。シードバイオリアクターおよび生産バイオリアクターの標的動作条件は、設定温度３７℃、ｐＨ７．０および（空気飽和の百分率として）３０％の溶存酸素を含む。１００Ｌ、３００Ｌおよび１，０００Ｌのバイオリアクターは、それぞれ１００ｒｐｍ、８０ｒｐｍおよび７０ｒｐｍでかき混ぜられる。いくつかの場合、シードバイオリアクターおよび生産バイオリアクターの標的動作条件は、設定温度３７℃、ＣＯ２散布および塩基の添加による調節を用いた７．０のｐＨおよび（空気飽和の百分率として）３０％の溶存酸素を含む。より大きな容積のバイオリアクターは、１００ｒｐｍ、８０ｒｐｍ、７０ｒｐｍまたは４０ｒｐｍの速度でかき混ぜることができる。
【００７８】
５．３．２．細胞培養液生産バイオリアクター
１，０００Ｌのシードバイオリアクターにおいておよそ２日後、接種材料をステンレス製撹拌タンクの生産バイオリアクターに移送する。生産バイオリアクターは、およそ１０，０００Ｌの作業容積を有する。使用前に、バイオリアクターは、定置洗浄され、定置蒸気滅菌され、およそ４，０００ＬのＰＦＢＭ−２培地をロードされる。ｐＨプローブおよび溶存酸素プローブは、バイオリアクターが定置蒸気滅菌される前に較正する。
【００７９】
別の実施例において、接種材料は、３７５０Ｌのシードバイオリアクターにおいて増殖され、その後、およそ１５，０００Ｌの作業容積を有するステンレス製撹拌タンクの生産バイオリアクターへ移送され、このステンレス製撹拌タンク生産バイオリアクターは、使用前に、定置洗浄され、定置蒸気滅菌され、およそ４，０００−７，０００ＬのＰＦＢＭ−２培地をロードされる。
【００８０】
生産バイオリアクターの標的シーディング密度は、２．０−２．５×１０５生存細胞／ｍＬの範囲である。既知組成の無タンパク質流加培地濃度（ＰＦＦＭ−３）（ＰＦＦＭ３小成分１および２、Ｌ−グルタミン、Ｄ−グルコース、リン酸ナトリウム二塩基性七水和物、Ｌ−チロシン、葉酸、塩酸および水酸化ナトリウムを再構成することによって作られた、既知組成濃縮流加培地）を、培養の間に加える。ＰＦＦＭ３は、表４に示す成分を含有する。
【００８１】
【表４】
2020078348.tif 000006
【００８２】
ＰＦＦＭ３  小成分１は、以下の表５に示す成分を含有する。
【００８３】
【表５】
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【００８４】
ＰＦＦＭ３小成分２は以下の表６に示す成分を含有する。
【００８５】
【表６】
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【００８６】
培養液へのＰＦＦＭ−３の添加のタイミングおよび量は、以下の表７に示すように行う。
【００８７】
【表７】
2020078348.tif 000009
【００８８】
培養のｐＨは、ＣＯ２ガスおよび１Ｍの炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）の添加の自動制御により、およそｐＨ７．０、好ましくはｐＨ７．０およびｐＨ７．１の間に維持される。溶存酸素含有量は、空気飽和のおよそ３０％まで下がってもよい。酸素／空気混合物を、培養液中に散布し、一定の合計ガスの流速を達成し、溶存酸素は、必要に応じて空気対酸素ガスの比率を調整することによって、および最大の酸素対空気の比率に達した後のかき混ぜ速度を増加することによって調節される。別の実施例において、かき混ぜは、力／容積の一定比率を維持するように調整される。シメチコン系消泡剤エマルジョンを、発泡レベルに基づき、必要に応じてバイオリアクターに加える。試料を定期的に採取し、細胞密度、細胞の生存能力、生産物濃度、グルコースおよび乳酸塩濃度、溶存Ｏ２、溶存ＣＯ２、ｐＨおよび浸透圧に関して試験する。バイオリアクター培養液は、接種後およそ１０日で収穫される。収穫前に、バイオリアクターの内容物を未処理バルクとしてサンプリングする。
【００８９】
５．３．３．収穫および細胞除去
収穫の直前に、生産バイオリアクターをまず＜１５℃に冷やし、ｐＨを、０．５Ｍまたは１Ｍまたは２Ｍのクエン酸を使用して５．０±０．１に調整し、およそ３０−９０または４５−６０分の期間そのまま保持し、収穫槽に移送する前に細胞および細胞残渣を凝集させる。ｐＨを調整した収穫は、その後、バッチ記録書類に定義のボウル速度および流速に関する所定のパラメーターの下で動作された連続遠心分離によって浄化される。
【００９０】
遠心分離液を、デプスフィルターを介してろ過し、その後０．２２μｍのメンブレンフィルターを介してろ過し、あらかじめ滅菌されたタンクに回収する。無細胞収穫を、１−２ＭのＴｒｉｓ溶液を使用しておよそ６．４のｐＨに調整し、さらなる処理のために２−８℃で貯蔵する。いくつかの場合、このｐＨ調整は、ｐＨ５．０への元のバイオリアクターのｐＨ調整の１２時間以内に行う。
【００９１】
５．４．ＤＡＣ  ＨＹＰの精製
５．４．１．概説
ＤＡＣ  ＨＹＰの精製および製剤化方法は、ＺＥＮＡＰＡＸ生産方法と比較して有効性を改良し、生産物関連不純物およびプロセス関連不純物の一貫したクリアランスを確実にするように設計された。以下のサブセクションは精製方法を記載する。精製は、低ｐＨウイルス不活性化、ウイルスのろ過、限外濾過／ダイアフィルトレーションおよび製剤化ステップと組み合わせた、３種のクロマトグラフィー技術に基づく（プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、Ｑセファロース陰イオン交換クロマトグラフィーおよびＣＭ−６５０（Ｍ）陽イオン交換クロマトグラフィー）。すべてのステップは、閉鎖型装置において行われる。ＤＡＣ  ＨＹＰのための精製方法の概要を、図５に提示し、以下に記載する。
【００９２】
５．４．２．プロテインＡクロマトグラフィー
プロテインＡ親和性クロマトグラフィーステップは、一連の下流動作において第１の精製ステップである。このステップは、カラムのサイズに依存して１回または複数回のサイクル、通常、表８Ａに記載のカラムに関して２回または３回のサイクルで行われる（すなわち、無細胞の収穫を２つのアリコートに分割し、その後各アリコートをプロテインＡカラムに別々にロードし、溶出する）。組換えタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー樹脂はＩｇＧに特異的に結合し、細胞培養液の収穫の他の成分から抗体を分離する。
【００９３】
平衡化緩衝液を用いたプロテインＡカラムの平衡化の後、カラム樹脂に抗体を結合させるために、中和された、無細胞の収穫をカラムに通過させる。平衡化緩衝液は２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０である。カラムに、３５グラムの抗体（タンパク質）／充填された樹脂のリットルを超えない容量をロードする。ロード後、平衡化緩衝液を用いてカラムを洗浄し、未結合および緩く結合した不純物を樹脂から除去し、クエン酸塩緩衝液を用いて溶出前の洗浄を行い、カラムのクエン酸塩濃度および塩化ナトリウム濃度を調整する。クエン酸塩緩衝液は、１０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ７．０である。次いで、結合した抗体を、ｐＨ３．５の１０ｍＭのクエン酸ナトリウムの溶出緩衝液を使用するｐＨの変更ステップにより、カラムから溶出する。プロテインＡクロマトグラフィーの条件の要約を、表８Ａに述べる。
【００９４】
【表８】
2020078348.tif 000010
【００９５】
生産物溶出液がカラムから離れたら、流出物の吸光度を波長２８０ｎｍにおいてモニターし、生産物分画の回収のガイドに使用した（図６を参照されたい）。
【００９６】
水酸化ナトリウムおよびベンジルアルコールを含有する衛生化緩衝液の使用は、広範囲の微生物を有利に殺すが、プロテインＡ樹脂の品質に与える影響が最小である。このことを例示するために、さまざまな衛生化溶液をさまざまな微生物にスパイクし、一定期間にわたってインキュベートした。インキュベーション時間の異なる間隔において、スパイクされた衛生化溶液の一部は中和され、微生物の力価を測定し、対照と比較した。殺菌作用は、一定期間にわたる微生物のｌｏｇ減少として表す。表８Ｂは、衛生化緩衝液２０ｍＭの水酸化ナトリウム、２００ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび１％のベンジルアルコールとの接触時間の関数としての、微生物力価の減少を示す。
【００９７】
【表９】
2020078348.tif 000011
【００９８】
表８Ｃは、異なる衛生化溶液による微生物の減少を示す。
【００９９】
【表１０】
2020078348.tif 000012
【０１００】
前述のデータは、ベンジルアルコールおよび水酸化ナトリウムを含有する衛生化溶液が、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌、芽胞形成細菌、酵母ならびに真菌を含む、広範囲の微生物を殺すために非常に有効であることを示す。通常の衛生化の３０分後、Ｅ．コリ、スタフィロコッカス・アウレウス、シュードモナス・アルギノーザおよびカンジダ・アルビカンスに関して５ｌｏｇ１０を超える減少が観察された。真菌（Ａ．ニガー）を殺すためにはさらに時間がかかるが、細胞培養液において真菌の感染は稀である。バイオテクノロジー設備において単離される最も一般的な微生物は、バチルス、シュードモナスおよびスタフィロコッカスである。これらは、衛生化溶液によって、接触時間の３０分後に有効に殺される。比較すると、水酸化ナトリウムまたはベンジルアルコール単独では、すべての微生物を殺すためには有効ではない。さらに、水酸化ナトリウム衛生化溶液は、芽胞形成バチルスは殺さない。
【０１０１】
５．４．３．ウイルス不活性化のための低ｐＨの保持
このステップは、低ｐＨ感受性の内因性ウイルス様粒子およびウイルスを不活性化するように設計されている。各プロテインＡサイクルからのプロテインＡ溶出液は、回収タンク内に溶出され、ここに、０．５ＭのＨＣｌをｐＨ３．５±０．１に達するまで加える。生産物は保持タンクに移送され、ここで別のｐＨメーターによってｐＨが確認される。低ｐＨ保持ステップは、ｐＨ３．５±０．１または±０．２（例えば、ｐＨ３．３５−３．６４）に、３０−１２０分または３０−２４０分の間厳密に制御される。３０−１２０分の保持後、ウイルス不活性化溶出液を、１ＭのＴｒｉｓ塩基を使用して、ｐＨ７．８±０．１または±０．３（例えば、ｐＨ８．０５−８．３４）に中和し、その後、０．２２μｍのフィルターを介して生産物プールタンクに移送する。低ｐＨウイルス不活性化条件の要約を、表９に述べる。
【０１０２】
【表１１】
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【０１０３】
５．４．４．Ｑセファロース陰イオン交換フロースルークロマトグラフィー
Ｑセファロース陰イオン交換クロマトグラフィーステップを使用し、生産物関連不純物およびプロセス関連不純物（例えば、核酸、宿主細胞タンパク質、生産物アグリゲート、浸出されたプロテインＡリガンドなど）を減少させ、さらなるウイルスクリアランス能力を精製方法に提供する。ロードの電導率およびｐＨを、抗体がカラムをフロースルーし宿主細胞タンパク質および細胞ＤＮＡなどの負に帯電した不純物が正に帯電した樹脂と結合するような様式で選択する。
【０１０４】
陰イオン交換カラムを、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．８の平衡化緩衝液を用いて平衡化する。低ｐＨ保持ステップによるｐＨが調製された生産物をカラムに、抗体（タンパク質）の６０グラムを超えない容量、または抗体（タンパク質）の３０−６０グラム／充填された樹脂のリットルを超えない容量までロードする。ローディングの完了後、未結合の抗体および不純物を、平衡化緩衝液を用いてカラムから除去する。
【０１０５】
生産物の回収を、波長２８０ｎｍにおいて流出液の吸光度をモニターすることによってガイドする（図７を参照されたい）。
【０１０６】
衛生化流速は、１００ｃｍ／時であり保持時間は６０分である。
【０１０７】
Ｑ−セファロースクロマトグラフィーの条件の要約を表１０に述べる。
【０１０８】
【表１２】
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【０１０９】
いくつかの使用に関して、貯蔵緩衝液容積は３に設定し、カラム貯蔵温度は５℃−２５℃に設定する。
【０１１０】
５．４．５．ＣＭ−６５０（Ｍ）陽イオン交換クロマトグラフィー
このクロマトグラフィーステップは、微量レベルのプロセス関連不純物および生産物関連不純物を減少させるために、方法において使用する最終ステップである。抗体のアグリゲートおよび切断断片に加えて、このステップは、宿主細胞の核酸およびタンパク質などのプロセス関連不純物ならびに浸出したプロテインＡもまた減少させる。
【０１１１】
カラムは、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．５の平衡化緩衝液を用いて平衡化される。陰イオン交換溶出液のプールを、０．５Ｍのクエン酸を使用して４．５±０．１または±０．２（例えば、４．３５−４．６４）のｐＨに調整し、２５または３０グラムの抗体（タンパク質）／充填樹脂のリットルを超えない標的ローディング容量までカラムにロードする。結合ステップ後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、任意の未結合または緩く結合した不純物を樹脂から除去する。その後、結合した抗体を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、７５ｍＭ硫酸ナトリウム、ｐＨ４．５の溶出緩衝液を用いて溶出様式のステップにおいてカラムから溶出する。ピークの回収を、波長２８０ｎｍにおいて流出液の吸光度をモニターすることによってガイドする（図８を参照されたい）。
【０１１２】
ＣＭ−６５０（Ｍ）クロマトグラフィーの条件の要約を表１１に述べる。
【０１１３】
【表１３】
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【０１１４】
５．４．６．ナノ濾過
ナノ濾過ステップの目的は、精製方法に追加のウイルスクリアランス能力を提供することである。このステップにおけるウイルスおよびウイルス様粒子の除去は、サイズ排除機序を介して行われる。フィルターの細孔は、抗体が細孔を通過するが、ウイルス様粒子およびウイルスはフィルターの上流側に保有されるように設計される。
【０１１５】
０．２２μｍまたは０．１μｍのフィルターを介して濾過された陽イオン交換溶出液は、小型のウイルス保有ナノフィルターを通過し、その後ポリソルベート８０を含まないＤＡＣ  ＨＹＰ製剤化緩衝液（４０ｍＭのコハク酸塩、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０）を用いたフィルターフラッシュが続く。緩衝液フラッシュステップを適用し、ラインおよびフィルターのハウジングに残存する抗体を回収する。
【０１１６】
ナノ濾過のパラメーターの要約を、表１２に述べる。
【０１１７】
【表１４】
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【０１１８】
５．４．７．限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）
この方法ステップは、生産物を濃縮し、生産物中の緩衝液を、ポリソル
ベート８０を含まないＤＡＣ  ＨＹＰ製剤化緩衝液と交換するように設計されている。この方法ステップは、３０ｋＤａの名目分画分子量のメンブレンを使用するタンジェンシャルフロー様式で動作する。最終濃度の期待生産物容量および各ＵＦ系の相対的保持容積のため、２つの限外濾過／ダイアフィルトレーション段階を使用し、１５０ｍｇ／ｍＬの製剤を生産する。
【０１１９】
第１の段階は、大型のＵＦ系を使用して処理される（図９を参照されたい）。ナノ濾過のろ液を、まずおよそ３０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、その後、交換緩衝液（ポリソルベート８０を含まない製剤化緩衝液）にダイアフィルトレーションする。ダイアフィルトレーションされた抗体溶液を、およそ１００ｍｇ／ｍＬまでさらに濃縮し、その後、ＵＦ／ＤＦ系からおよそ５５ｍｇ／ｍＬの濃度で回収し、０．２２μｍのフィルターを介して移送する。ダイアフィルトレーションされた抗体溶液は、およそ２０−６０ｍｇ／ｍＬの濃度で回収することもできる。第１段階のパラメーターの要約を、表１３に述べる。
【０１２０】
【表１５】
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【０１２１】
第２段階は、より小さいＵＦ系であるが、同じ３０ｋＤａのカットオフのメンブレンを使用して処理される。ＤＡＣ  ＨＹＰ（通常５５ｍｇ／ｍＬ）溶液を、およそ１８０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、ＵＦ系から回収し、その後０．２２μｍのフィルターを介して移送する。ＵＦ系を、ポリソルベート８０を含まない製剤化緩衝液を用いてすすぎ、０．２２μｍのフィルターを介して移送し、およそ１７０ｍｇ／ｍＬまたはおよそ１５０−１７０ｍｇ／ｍＬの精製された製剤原料を得る。第２段階のパラメーターの要約を、表１４に述べる。
【０１２２】
【表１６】
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【０１２３】
５．５．ＤＡＣ  ＨＹＰの製剤化
最終方法ステップは、精製された製剤原料の１５０または１００ｍｇ／Ｌ±１０％の最終標的濃度、すなわち、適切な濃度のポリソルベート８０を含有する緩衝液中、１５０±１５ｍｇ／ｍＬ（１５０ｍｇ／ｍＬの製剤化の場合）または１００±１０ｍｇ／ｍＬ（１００ｍｇ／ｍＬの製剤化の場合）の最終標的濃度への希釈である。製剤化は、段階的に実施される。
【０１２４】
例えば、まず、ポリソルベート８０を含まない製剤化緩衝液（４０ｍＭのコハク酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０）を、製剤化された製剤原料の９０％標的容積に達するように、精製された製剤原料に加える。その後、計算された量のポリソルベート８０希釈緩衝液（４０ｍＭのコハク酸塩、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１％ポリソルベート８０、ｐＨ６．０）を、最終製剤中０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０の標的濃度に達するように加える。最終的に、ポリソルベート８０を含まない製剤化緩衝液（１５０ｍｇ／ｍＬの製剤のためにコハク酸塩およびコハク酸ならびに１００ｍｇ／ｍＬの製剤のためにコハク酸塩およびＨＣｌで作られる）を使用して生産物容積を調整し、１５０±１５ｍｇ／ｍＬ（好ましくは１５０±８ｍｇ／ｍＬ）の最終抗体濃度を達成する。１００ｍｇ／ｍＬの薬剤生産物は、同様の様式で、最終濃度１００±１０ｍｇ／ｍＬ（好ましくは１００±５ｍｇ／ｍＬ）に製剤化される。
【０１２５】
製剤化された製剤原料を、０．２２μｍのフィルターを介して、半剛性の円筒状の支持体内部に配置されたＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ  ＴＭ（ＢＰＣ（登録商標））のバッグ（または同等物）内に濾過する。支持体は、ＢＰＣと蓋とを包囲し、柔軟性のバッグおよび外部環境の間の防護壁を提供する。製剤化された製剤原料は、薬剤生産物の充填／仕上げ操作のために、アクセス制御クーラー中で２−８℃において貯蔵される。
【０１２６】
製剤化条件の要約を表１５に述べる。
【０１２７】
【表１７】
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【０１２８】
１ｍＬの薬剤生産物を、バイアルまたは注射器に充填する。仕上がった１５０ｍｇ／ｍＬおよび１００ｍｇ／ｍＬ生産物の成分の要約を、表１６に示す（すべての量は名目値である。）。
【０１２９】
【表１８】
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【０１３０】
５．６．ＤＡＣ  ＨＹＰ製剤原料の特徴付け
ＤＡＣ  ＨＹＰを、両方の重鎖サブユニットのアミノ酸２９６においてグリコシル化し、主要なオリゴ糖形態は、末端のガラクトースを欠いた、コアがフコシル化された二分岐構造として存在する。
【０１３１】
ＤＡＣ  ＨＹＰ重鎖のＮ末端は、３つの主要な形態：１）（ＤＮＡ配列から予測される）Ｎ−末端グルタミン、２）Ｎ−末端ピログルタミン酸（Ｎ−末端グルタミンの環化による）および３）（シグナルペプチドの不完全な切断によりもたらされる）予測されるＮ末端グルタミン残基に加えてＮ−末端バリン、ヒスチジンおよびセリン残基として存在する。
【０１３２】
ＤＡＣ  ＨＹＰ重鎖のＣ末端は、Ｃ末端リジン残基を含んで、または含まずに存在する。主要形態はＣ末端リジン残基を欠き、Ｃ末端グリシンをもたらす。
【０１３３】
ＤＡＣ  ＨＹＰは、ヌクレオチド配列により定義された一次アミノ酸組成に基づき、分子量１４４ｋＤａと計算された。縮小された重鎖の対応する分子量は４８．９ｋＤａであり、縮小された軽鎖は２３．２ｋＤａであり、これらの重量は、炭水化物含有量または翻訳後修飾を占めない。
【０１３４】
ＤＡＣ  ＨＹＰの結合はＣＤ２５に高度に特異的であり、ＣＤ２５は活性化されたＴリンパ球およびＢリンパ球に発現されるが、静止Ｔリンパ球および静止Ｂリンパ球には発現されない。これらの活性化細胞におけるＤＡＣ  ＨＹＰとＣＤ２５との結合は、ＩＬ−２とＣＤ２５との結合およびその後の高親和性ＩＬ−２受容体複合体の形成を遮断する。その結果として、活性化細胞のＩＬ−２誘導性増殖が遮断される。ＤＡＣ  ＨＹＰの観察された治療有効性および潜在的治療有効性は、活性化された自己反応性Ｔ細胞の増殖についてのその阻害効果の大部分を静止すると考えられる。しかし、ＤＡＣ  ＨＹＰはまた、好酸球などの他のＣＤ２５産生細胞型に関してその遮断効果を介して治療効果を発揮すると思われる。
【０１３５】
高濃度の１５０ｍｇ／ｍｌ  ＤＡＣ  ＨＹＰ製剤が臨床試験に適していることを確認するために、包括的な物理化学的および生物学的評価を特徴付けのために実施し、本明細書においてバッチ１およびバッチ２（またはそれぞれ、バッチ１５０−１もしくはバッチ１５０−２）と称される、ＤＡＣ  ＨＹＰ  １５０ｍｇ／ｍＬ製剤原料の２種のバッチを、１０，０００Ｌ規模で製造されたＤＡＣ  ＨＹＰ  １００ｍｇ／ｍＬの１種のロットである参照標準ロットＲＳ０８０１と比較した。
【０１３６】
結果は、ＤＡＣ  ＨＹＰ薬剤生産物の１５０ｍｇ／ｍＬロットは純度が高く、１００ｍｇ／ｍＬロットに匹敵し、臨床研究における使用に適していることを実証している。これらの特徴の要約を表１７に示す。
【０１３７】
【表１９】
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【０１３８】
５．６．１．色、外観および透明度
ＤＡＣ  ＨＹＰ製剤原料の外観は、色の視覚的検査ならびに拡大なしの黒色背景および白色背景に対する直射光における溶液の透明度によって査定する。溶液は、目に見える粒子の存在に関してもまた評価する。さまざまなロットのＤＡＣ  ＨＹＰ薬剤生産物の通常の外観を表１７に記載する。
【０１３９】
５．６．２．ｐＨ決定
ＤＡＣ  ＨＹＰのｐＨは、Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｎｏ．（７９１）に従って決定する。ＤＡＣ  ＨＹＰ薬剤生産物のさまざまなロットのｐＨ範囲を、表１７に要約する。
【０１４０】
５．６．３．ＵＶ分光器による生産物濃度
ＤＡＣ  ＨＹＰの濃度は、ＵＶ分光器により決定する。ＤＡＣ  ＨＹＰ試料を、緩衝液を用いて重量測定法で希釈する。各希釈試料溶液のＵＶ吸光度を、緩衝液ブランクに対して２７８ｎｍにおいて測定する。試料のタンパク質濃度を、ＤＡＣ  ＨＹＰに関する吸光係数を使用して計算する。ＤＡＣ  ＨＹＰ薬剤生産物のさまざまなロットのタンパク質濃度を、表１７に要約する。
【０１４１】
５．６．４．Ｎ末端配列決定
ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬロットを、Ｎ末端配列決定によって評価した。試料を、自動Ｅｄｍａｎ分解配列決定器を使用して分析した。
【０１４２】
最初の１５残基ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶ（配列番号１３）を介して、軽鎖の予想アミノ酸配列を、すべての試料に関して確認した。
【０１４３】
ＤＡＣ  ＨＹＰ中の重鎖の大部分は、Ｎ末端重鎖配列を生じないピログルタミン酸（ｐＥ）残基によって遮断される。ＤＡＣ  ＨＹＰ中で次に最も高頻度で見られるＮ末端重鎖配列は、バリン、ヒスチジン、セリン（ＶＨＳ）配列で始まり、重鎖シグナルペプチドの３個の末端残基のプロセッシングを欠いたことによりもたらされる。最初の１５個のＮ末端残基のうちの１４個は、すべての試料において、ＶＨＳ重鎖配列（ＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫ（配列番号１４））が確認された。先行する配列決定サイクルにおいてＬＣから検出された大量のグルタミンのため、４番目の残基であるグルタミンは確認できなかった。Ｎ末端グルタミンを有する重鎖の証拠もまた、すべての試料中に存在した。この配列は、天然のＮ末端重鎖グルタミン残基が、ピログルタミン酸形態への環化を受けなかった結果である。１５０ｍｇ／ｍＬロットに関するＮ末端配列決定の結果は、重鎖および軽鎖のコーディング配列から予測された配列と一致する。同様の結果を、１００ｍｇ／ｍＬロットに関して得た。
【０１４４】
５．６．５．重鎖および軽鎖の質量分析
ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬロットの重鎖および軽鎖ならびに参照標準ＲＳ０８０１の分子量を液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって評価した。すべてのロットを、アミダーゼＰＮＧａｓｅＦを用いて脱グリコシル化させ、ジチオスレイトールを用いて還元し、ヨード酢酸を用いてアルキル化し、逆相クロマトグラフィーにより分離した。理論的な重鎖および軽鎖の質量を、タンパク質配列から計算した。試料の観察された質量は、以下の表１８に示すように計算質量の１Ｄａ以内であった。
【０１４５】
【表２０】
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【０１４６】
先行するサブセクションに記載のように、ＤＡＣ  ＨＹＰ重鎖の２種の最も高頻度で見られる形態は、Ｎ末端ピログルタミン酸（ｐＥ）残基またはバリン、ヒスチジン、セリン（ＶＨＳ）配列を含有し、Ｃ末端リジンを欠くことが公知である。１５０ｍｇ／ｍＬロット中の２種の優勢な重鎖変異体および軽鎖に関して得られた分子量は、参照標準ＲＳ０８０１の分子量と同様であり、タンパク質配列から予測された質量と一致した。
【０１４７】
以下のサブセクションに提示したペプチドマッピングの結果と一緒に、重鎖および軽鎖の質量結果により、ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬロット中の予想される軽鎖および重鎖の一次構造の存在を確認する。
【０１４８】
５．６．６．ペプチドマッピング
ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬロットおよび参照標準ＲＳ０８０１（１０，０００Ｌ規模で製造された１００ｍｇ／ｍＬの製剤原料のロットから生産されたＤＡＣ  ＨＹＰ）を、逆相ＨＰＬＣペプチドマッピングを使用して評価した。すべてのロットを、ジチオスレイトールを用いて還元し、ヨード酢酸を用いてアルキル化し、トリプシンを用いて酵素的に消化した。得られたペプチドを、逆相クロマトグラフィーにより分離し、２１５ｎｍの紫外線吸光度によって検出し、ペプチドマップを作製した。
【０１４９】
一次アミノ酸配列を検証するために、１５０ｍｇ／ｍＬロットのペプチドマップを、参照標準ＲＳ０８０１のペプチドマップと比較した。予想される重鎖および軽鎖の残基と９８％対応するペプチドが、参照標準ＲＳ０８０１のペプチドマップにおける質量分析によってすでに特定されている。ペプチドマップに計上されない残基は、単一のアミノ酸である、または非常に極性のジペプチド中に存在し、逆相カラムに保有されることが予想されない。ピログルタミン酸、グルタミンおよび重鎖Ｎ末端ペプチドのＮ末端におけるＶＨＳ配列に一致する質量が、参照標準中に特定された。ＤＡＣ  ＨＹＰは、Ａｓｎ２９６における重鎖のＦｃ部分中のＮ連結グリコシル化に関するコンセンサス部位を含有し、連結複合体のコアが二分岐のオリゴ糖構造と一致する質量が、Ａｓｎ２９６残基を含有するペプチドに関して特定された。
【０１５０】
ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬロットと参照標準ＲＳ０８０１とを比較するペプチドマップを、図１０（０から６０分）、図１１（５５から１１５分）および図１２（１１０から１７０分）に示す。ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬロットのペプチドマップは、参照標準のペプチドマップと同様であり、１５０ｍｇ／ｍＬロットにおける予想一次構造の存在が確認される。
【０１５１】
５．６．７．円偏光二色性分光法
ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬロットおよび参照標準ＲＳ０８０１を、遠紫外円偏光二色性分光法（遠−ＵＶ  ＣＤ）により分析し、二次構造を評価した。分析前に、試料を、最終タンパク質濃度０．２ｍｇ／ｍＬに水を用いて希釈した。スペクトルを、０．１ｃｍのセルを使用して１９５−２６０ｎｍから入手し、得られたシグナルを、緩衝液を差し引いた後でモル楕円率に変換した。
【０１５２】
ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬロットのバッチ１およびバッチ２ならびに参照標準ＲＳ０８０１の重ね合わせた遠−ＵＶ  ＣＤスペクトルを、図１３に示す。すべてのロットのスペクトルは、およそ２０２ｎｍにおいて正のバンドを示し、およそ２１７ｎｍにおいて負のバンドを示す。２１７ｎｍにおける負のバンドは、βシート立体構造の特徴であり、ＩｇＧ分子の優勢な立体構造である。ロットの遠−ＵＶ  ＣＤスペクトルは同様であり、ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬロットおよび参照標準ＲＳ０８０１の中の均一な二次構造を支持した。
【０１５３】
５．６．８．紫外分光法
ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬロットおよび参照標準ＲＳ０８０１を、紫外（ＵＶ）分光法により分析し、三次構造を評価した。分析前に、試料を製剤化緩衝液（４０ｍＭのコハク酸塩、１００ｍＭの塩化ナトリウム、０．０３％のポリソルベート８０、ｐＨ６．０）で最終タンパク質濃度０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。スペクトルを、１ｃｍの路長の石英キュベットを使用して２５０から３５０ｎｍから入手し、２８０ｎｍにおける吸光度を１．０とし正規化した。
【０１５４】
重ね合わせたゼロ次および二次微分のＵＶスペクトル（平滑化したゼロ次のデータから計算）を、それぞれ図１４Ａおよび１４Ｂに示す。評価したすべてのロットのゼロ次および二次微分スペクトルは、重ねることができ、ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬロットのバッチ１およびバッチ２ならびに参照標準ＲＳ０８０１の中の均一な三次構造を支持した。
【０１５５】
５．６．９．サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、水系移動相を有する多孔質シリカカラムおよび２８０ｎｍの紫外吸光度を検出を用いて実施した。具体的には、１５μＬの試験試料（溶出緩衝液中２０ｍｇ／ｍＬの抗体）を、室温において、０．５μｍプレカラムフィルター（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ、ｐａｒｔ  ｎｏ．Ａ−１０２Ｘ）を装備した７．８ｍｍ×３０ｃｍのＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｐａｒｔ  ｎｏ．６０１３４２）において、溶出緩衝液（２００ｍＭのＫＰＯ４、１５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ６．９）の均一濃度の勾配を使用して、１ｍＬ／分の流速で分析した。
【０１５６】
図１５Ａ（フルスケール）および図１５Ｂ（拡大スケール）に示すように、ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬロットのクロマトグラフィープロファイルは、参照標準ＲＳ０８０１のクロマトグラフィープロファイルと同様であった。すべてのロットは、ダクリズマブ単量体に一致する同じ主要なピークおよび小さなアグリゲートピークを示した。ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬロットに関するアグリゲート結果は、以下の表１９に示すように、ＤＡＣ  ＨＹＰ１００ｍｇ／ｍＬロットのアグリゲート結果と同様であった。
【０１５７】
【表２１】
2020078348.tif 000023
【０１５８】
１５０ｍｇ／ｍＬロットおよび参照標準ＲＳ０８０１を、多角度光散乱検出（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）を有するＳＥＣを使用して分析し、アグリゲートピークの分子量を決定した。すべてのロットに関して、アグリゲートピークに関して得られた分子量はおよそ３００ｋＤａであり、これは抗体二量体に一致する。
【０１５９】
ＤＡＣ  ＨＹＰ中のアグリゲートの形成を、１８か月の間にわたってモニターした。製剤中のアグリゲートのレベルは上昇したが、アグリゲートの百分率は横這いであり、５℃において１８か月貯蔵した場合、およそ１．５％を超えなかった（図６を参照されたい）。新しいバッチの新しいデータは、５℃において貯蔵した場合、６週間でおよそ１．８−１．９％のアグリゲートが出現し得るが、試験したすべての試料に関しては、５℃において貯蔵した場合、５年間にわたって形成されたアグリゲートは３％未満であったことを示す。
【０１６０】
５．６．１０．沈降速度超遠心分析法
ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬおよび１００ｍｇ／ｍＬのロット中の単量体およびアグリゲートを、沈降速度超遠心分析法（ＳＶ−ＡＵＣ）を使用して特徴付けた。単量体および個々のアグリゲートに関する沈降係数値および相対的存在度を、以下の表２０および２１に提示する。
【０１６１】
【表２２】
2020078348.tif 000024
【０１６２】
【表２３】
2020078348.tif 000025
【０１６３】
単量体は、個々のロットにおいて観察される主要な成分であった。単量体ピークの沈降係数は、単量体の立体構造が、１５０ｍｇ／ｍＬおよび１００ｍｇ／ｍＬのロットの間で同様であることを示すロットと高度に一致した。１５０ｍｇ／ｍＬロットの単量体の含有量は、１００ｍｇ／ｍＬのロットの単量体の含有量と同様であった。
【０１６４】
個々のロット中の優勢なアグリゲート種は、抗体の二量体と一致する沈降係数を有した。これはＳＥＣ−ＭＡＬＳの結果と一致し、ＳＥＣアグリゲートピークが、主に抗体二量体から構成されることを示す（先行するサブセクションを参照されたい）。三量体および四量体と一致する沈降係数を有する、低レベルの２種のより大きなアグリゲートもまた、ＡＵＣにより個々のロットにおいて観察された。１５０ｍｇ／ｍＬロットの二量体、三量体および四量体の含有量は、１００ｍｇ／ｍＬロットの二量体、三量体および四量体の含有量と同様であった。
【０１６５】
５．６．１１．定量的還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
純度を、４−２０％（通常１４％）のｔｒｉｓ−グリシンゲルおよびコロイダルブルー染色を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。試料を、還元条件下で１０μｇの試料ロードを用いて分析した。純度を、密度測定によって測定された、重鎖および軽鎖のバンド面積の合計を全バンド面積で割ることによって計算した。
【０１６６】
以下の表２２に示すように、１５０ｍｇ／ｍＬロットは高純度であり、１００ｍｇ／ｍＬロットと同様である。
【０１６７】
【表２４】
2020078348.tif 000026
【０１６８】
５．６．１２．定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＤＡＣ  ＨＹＰの純度を、還元型および非還元型のゲル電気泳動の両方によって査定した。プレキャストの１４％または８−１６％のＴｒｉｓ−グリシンゲルを分析に使用した。１５０ｍｇ／ｍＬ  ＤＡＣ  ＨＹＰ製剤の２種のバッチ由来のアリコートを、前述のように参照バッチと比較した。ＤＡＣ  ＨＹＰの純度を分析する還元型および非還元型ゲルを、図１７に示す。１５０ｍｇ／ｍＬロットのバンドパターンは、参照標準ＲＳ０８０１のバンドパターンと同様であり、１５０ｍｇ／ｍＬロットに新しいバンドは検出されなかった。
【０１６９】
５．６．１３．陽イオン交換クロマトグラフィー
ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬロットおよび１００ｍｇ／ｍＬロットの荷電アイソフォームの分布を、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を使用して評価した。ＣＥＸを、非多孔質のカルボン酸塩官能化の、弱陽イオン交換カラムを使用して実施し、２２０ｎｍにおいて検出した。１００μＬの試験試料（緩衝液Ａに溶解した１ｍｇ／ｍＬの抗体）を、室温で、ＰｒｏＰａｃ  ＷＣＸ−１０Ｇガードカラム（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を装備したＰｒｏＰａｃ  ＷＣＸ−１０カラム（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｐｏｒａｔｉｏｎ）において以下の分離勾配を使用して（カラムは緩衝液Ａを用いて平衡化される）分離した。
【０１７０】
【表２５】
2020078348.tif 000027
【０１７１】
図１８に示すように、１５０ｍｇ／ｍＬロットのＣＥＸクロマトグラムは、参照標準ＲＳ０８０１のＣＥＸクロマトグラムと一致し、１５０ｍｇ／ｍＬロットにおいて新しい荷電アイソフォームは検出されなかった。ＣＥＸクロマトグラム中に存在する５種の主要なアイソフォームは、重鎖Ｎ末端における不均一のためであり、１）２つのピログルタミン酸残基（ｐＥ／ｐＥ）；２）１つのピログルタミン酸残基および１つのグルタミン残基（ｐＥ／Ｑ）；３）１つのピログルタミン酸残基および１つのＶＨＳ配列（成熟重鎖のＮ末端グルタミン残基に先行するトランケート型ＶＨＳシグナルペプチド）（ｐＥ／ＶＨＳ）；４）１つのグルタミン残基および１つのＶＨＳ配列（Ｑ／ＶＨＳ）；５）２つのＶＨＳ配列（ＶＨＳ／ＶＨＳ）を含む。Ｃ末端リジン（Ｋ）のアイソフォームも分離され、図１８において特定される。上記の個々のＮ末端アイソフォームは、異なるＣ末端アイソフォーム（０、１または２つのＫ）として存在してもよい。混合物の複雑性のため、Ｃ末端リジンアイソフォームは、記載の方法を使用してのみ、明瞭に分離され、主要なｐＥ／ｐＥおよびｐＥ／ＶＨＳのアイソフォームに関して測定可能である。
【０１７２】
Ｎ末端およびＣ末端アイソフォームの定量結果を、１５０ｍｇ／ｍＬおよび１００ｍｇ／ｍＬのロットに関して、それぞれ表２３および２４に提供し、報告される百分率は、すべてのピークの全曲線下面積（ＡＵＣ）と比較した特定のピークの曲線下面積の百分率に基づく。
【０１７３】
【表２６】
2020078348.tif 000028
【０１７４】
【表２７】
2020078348.tif 000029
【０１７５】
５．６．１４．オリゴ糖マッピング
ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬロットおよび１００ｍｇ／ｍＬロットのオリゴ糖の分布を、オリゴ糖マッピングにより評価した。Ｎ連結オリゴ糖は、重鎖Ａｓｎ２９６からアミダーゼＰＮＧａｓｅＦを使用して酵素的に放出された。オリゴ糖を、続いて蛍光標識（この場合、アンスラニル酸）を用いて誘導体化し、ナイロンメンブレンを介して抗体から分離した。誘導体化され、切断されたＮ連結グリカンを、５０℃で、２５０×４．６ｍｍの高分子アミン結合Ａｓａｈｉｐａｋ  Ａｍｉｎｏ  ＮＨ２Ｐ−５０４Ｅカラム（粒径５μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カタログ番号ＣＨＯ−２６２８）において蛍光検出を用いて、以下の溶出勾配（試料注入容積１００μＬ；カラムは８５％の緩衝液Ａ／１５％の緩衝液Ｂを用いて平衡化する）を使用して分離した。
【０１７６】
【表２８】
2020078348.tif 000030
【０１７７】
１５０ｍｇ／ｍＬロットと参照標準ＲＳ０８０１とを比較するクロマトグラムを、図１９に示す。全ピーク面積の少なくとも１．０％を構成するオリゴ糖ピークを標識し、以下の表２５に報告する。
【０１７８】
【表２９】
2020078348.tif 000031
【０１７９】
すべてのロットは、主にＧ０およびＧ０−ＧｌｃＮＡｃ（二分岐構造の１つのアームにＧｌｃＮＡｃを欠いたＧ０）からなり、これはＤＡＣ  ＨＹＰ方法を代表する。シアル化オリゴ糖は、およそ６８分で溶出し、すべての被験ロットにおいて１．０％より低い。ピーク３と称される特徴付けされていないオリゴ糖は、すべての被験ロットにおいて同様の存在度で存在した。
【０１８０】
５．６．１５．酸化
ＤＡＣ  ＨＹＰ  ロットを、ペプチドマップ中に存在する、酸化および非酸化トリプシンペプチドをモニターすることによって、潜在的なメチオニンの酸化を評価した。ペプチドを含有する個々のメチオニンの非酸化型および酸化型のピーク面積を、質量スペクトルにより抽出されたイオンクロマトグラムを使用して決定した。個々のメチオニン残基に関して、酸化メチオニンのパーセントを、酸化ペプチドの質量スペクトルピーク面積を、酸化および非酸化ペプチドのピーク面積の合計で割ることによって計算した。
【０１８１】
以下の表２６に示すように、１５０ｍｇ／ｍＬロットおよび５種の１００ｍｇ／ｍＬロットに関するメチオニン酸化の結果は同様であった。
【０１８２】
【表３０】
2020078348.tif 000032
【０１８３】
重鎖のＭｅｔ２５１およびＭｅｔ４２７は最も不安定であり、最も高い酸化程度を示す。比較可能性を評価するために同時に試験されたロットの中で、Ｍｅｔ２５１およびＭｅｔ４２７に関する酸化レベルは、それぞれ４．８％および１．８％を超えなかった。
【０１８４】
５．６．１６．結合効力（ＣＤ２５の結合）
ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬおよび１００ｍｇ／ｍＬのロットを、放出試験の一部の効力の測定として、ＥＬＩＳＡを介してＩＬ−２受容体のアルファサブユニット（ＣＤ２５）との結合に関して評価した。マイクロタイタープレートに可溶性ＣＤ２５を固定し、さまざまな量のＤＡＣ  ＨＹＰと一緒にインキュベートした。結合したＤＡＣ  ＨＹＰを、ホースラッディシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体と、３，３’，５，５’−テトラ−メチルベンジジン基質とを並行して使用して検出した。得られた吸光度値を、４−パラメーターフィットを使用してｌｏｇ１０のＤＡＣ  ＨＹＰ濃度に対してプロットし、相対効力値のパーセントを、平行線分析を使用して作製した。
【０１８５】
製剤原料の結果を以下の表に要約する。
【０１８６】
【表３１】
2020078348.tif 000033
【０１８７】
１５０ｍｇ／ｍＬロットの結合効力の結果は、１００ｍｇ／ｍＬロットの結合効力の結果と同様であった。
【０１８８】
５．６．１７．表面プラズモン共鳴（ＣＤ２５の結合）
表面プラズモン共鳴分析を実施し、ＤＡＣ  ＨＹＰとＩＬ−２受容体のアルファサブユニット（ＣＤ２５）との結合相互作用に関する親和定数（ＫＤ）を決定した。
【０１８９】
ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体をチップの表面に固定してＤＡＣ  ＨＹＰ試料を捕捉し、その後、可溶性ＣＤ２５をさまざまな濃度で、捕捉されたＤＡＣ  ＨＹＰの上に自動化法を使用して２連に注入した。結合データを回収し、参照フローセルおよび緩衝液ブランクを使用して修正し、平衡定数を得るために１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルを使用してＢＩＡ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いてフィットさせた。
【０１９０】
ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬロットおよび参照標準ＲＳ０８０１に関する結果を、表２８に要約する。
【０１９１】
【表３２】
2020078348.tif 000034
【０１９２】
１５０ｍｇ／ｍＬロットの会合定数（ｋａ）、解離定数（ｋｄ）および親和定数（ＫＤ）の値は、参照標準ＲＳ０８０１のものと同様であった。
【０１９３】
５．６．１８．機能的効力
ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬおよび１００ｍｇ／ｍＬのロットを、放出試験の一部として機能的効力を評価した。機能的効力のアッセイは、ＤＡＣ  ＨＹＰがＩＬ−２受容体のアルファサブユニット（ＣＤ２５）と結合することによる、ＩＬ−２誘導性Ｔ細胞増殖の阻害を測定する。ＩＬ−２の存在下で、さまざまな量のＤＡＣ  ＨＹＰをＩＬ−２受容体を発現するＫＩＴ−２２５Ｋ６細胞（Ｈｏｒｉら、１９８７年、Ｂｌｏｏｄ７０：１０６９−１０７２頁）と一緒にインキュベートした。ＤＡＣ  ＨＹＰによるＴ細胞増殖の阻害を、アラマーブルーを使用して続けて検出した。得られた蛍光値を、４−パラメーターフィットを使用してｌｏｇ１０のＤＡＣ  ＨＹＰ濃度に対してプロットし、相対効力値のパーセントを、平行線分析を使用して作製した。
【０１９４】
機能的効力の結果を表２９に要約する。
【０１９５】
【表３３】
2020078348.tif 000035
【０１９６】
１５０ｍｇ／ｍＬロットの機能的効力の結果は１００ｍｇ／ｍＬロットの機能的効力と同様であった。
【０１９７】
５．６．１９．抗体依存性細胞傷害性
ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬ製剤の２種のロットを、参照標準ＲＳ０８０１の１００ｍｇ／ｍＬ  ＤＡＣ  ＨＹＰのロットと比較して評価した。
【０１９８】
ＩＬ−２受容体発現ＫＩＴ−２２５Ｋ６細胞を、５１Ｃｒを用いて標識し、続けてＤＡＣ  ＨＹＰと一緒にインキュベートした。ヒトエフェクター細胞（ＰＢＭＣ）をさまざまな量で加え、エフェクター対標的細胞（ＫＩＴ−２２５Ｋ６）の異なる比率を達成した。Ｆｃ受容体産生単球は、ＤＡＣ  ＨＹＰ  Ｆｃドメインと相互作用し、続いて標的細胞の溶解を起こす。細胞傷害性の程度は、標的細胞由来の５１Ｃｒの放出を測定することにより決定し、最大細胞溶解の百分率として表した。
【０１９９】
多数のドナー由来のＰＢＭＣを、各試料に利用した。各ドナーに関して、試料のＡＤＣＣ活性のパーセントを、細胞傷害性のパーセントに基づき、参照標準ＲＳ０８０１のＡＤＣＣ活性に対して計算した。ＡＤＣＣの結果を、以下の表３０に要約する。
【０２００】
【表３４】
2020078348.tif 000036
【０２０１】
１５０ｍｇ／ｍＬロット、参照標準ＲＳ０８０１、陽性および陰性の対照抗体ならびに抗体を含まない対照（抗体独立性細胞傷害性またはＡＩＣＣのため）に関する反応曲線を、図２０に示す。
【０２０２】
１５０ｍｇ／ｍＬロットのＡＤＣＣ活性は、参照標準ＲＳ０８０１のＡＤＣＣ活性と同様であった。
【０２０３】
５．６．２０．残存プロテインＡ
残存プロテインＡはＥＬＩＳＡ法によって決定でき、標準、試料対照、プレートブランクおよび試験試料を、変性緩衝液を用いて希釈し、プロテインＡを解離させるために沸騰水のバスに配置し、変性させ、ダクリズマブを沈降させた。沸騰後、標準、対照および試料を冷却し、遠心分離にかけ、ポリクローナル抗プロテインＡ捕捉抗体をコーティングしたマイクロタイタープレートに加えた。試料中に存在する残存プロテインＡを、その後、ビオチン化抗プロテインＡ抗体と並行してストレプトアビジンアルカリホスファターゼおよびＰ−ニトロフェニルリン酸塩（ＰＮＰＰ）基質を使用して検出する。プレートを、分光光度プレートリーダーにおいて分析し、ｌｏｇ−ｌｏｇ標準曲線を作製し、これに対してプロテインＡの濃度を決定する。試験試料の結果を、百万分率（ｐｐｍ）単位で報告する。百万分率の結果はｎｇ／ｍＬのプロテインＡの結果を、ｍｇ／ｍＬの試験試料の抗体濃度で割ることによって計算する。
【０２０４】
５．６．２１．ＤＮＡ含有量
マウスＤＮＡの検出を、契約研究所において定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）試験法を使用して決定する。この方法において、試料をＤＮＡ抽出に供する。その後、試料抽出液を、マウスＤＮＡの反復成分の特異的断片を増幅するためにマウス特異的プライマーおよびプローブを使用して、Ｑ−ＰＣＲによって分析する。ＤＮＡの増幅は検出される蛍光シグナルをもたらす。試料中のＤＮＡを、既知の量のマウスＤＮＡを使用して作製した標準曲線と比較することによって測定する。結果は、ＤＮＡのピコグラム／抗体のミリグラムで表す。さまざまなロットのＤＡＣ  ＨＹＰ薬剤生産物中の平均ＤＮＡ含有量を、表１７に要約する。
【０２０５】
５．６．２２．宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）
生産物中の残存宿主細胞タンパク質を、市販のキットを使用して定量する。ＮＳ０細胞溶解物に対する、アフィニティ精製したヤギポリクローナル抗体を、ＮＳ０  ＨＣＰの捕捉および検出の両方に使用する。ＨＣＰ標準を、疑似的生産工程から無細胞収穫材料を回収することによって生産する。ＨＣＰ作業標準を使用して標準曲線を作製し、ＨＣＰを含有する試料を、標準曲線の範囲を標的として段階的に希釈する。標準、試料対照および試験試料を、抗ＮＳ０  ＨＣＰポリクローナル抗体コーティングプレートに加える。その後、宿主細胞タンパク質を、ホースラッディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートした抗ＮＳ０  ＨＣＰポリクローナル抗体と並行して３，３’，５，５’−テトラ−メチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を用いて検出する。次いで、プレートを、分光光度プレートリーダーにおいて分析し４つのパラメーターカーブフィットを作製し、試料中のＨＣＰの量を定量する。
【０２０６】
ＮＳ０  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡアッセイに関する結果を、百万分率（ｐｐｍ）単位で報告する。百万分率の結果はｎｇ／ｍＬのＨＣＰの結果を、ｍｇ／ｍＬの抗体濃度で割ることによって計算する。ＤＡＣ  ＨＹＰ薬剤生産物のさまざまなロットの平均ＨＣＰを表１７に要約する。
【０２０７】
５．６．２３．ポリソルベート８０濃度
ポリソルベート８０は、有色のチオシアン酸コバルトとポリソルベート８０の複合体の形成に基づく分光光度方法を使用して定量する。標準曲線を、一連のポリソルベート８０標準を使用して構築する。試料中のポリソルベート８０濃度を、標準曲線から決定する。ＤＡＣ  ＨＹＰ薬剤生産物のさまざまなロットのポリソルベート濃度範囲を、表１７に要約する。
【０２０８】
５．６．２４．浸透圧
浸透圧は、蒸気圧降下浸透圧計を使用して測定する。試料分析の前に、浸透圧計を、試料の予想浸透圧を一括する浸透圧標準を使用して較正する。ＤＡＣ  ＨＹＰ薬剤生産物のさまざまなロットの浸透圧範囲を表１７に要約する。
【０２０９】
５．６．２５．結論
実施された物理化学的および生物学的分析は、ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ／ｍＬおよびＤＡＣ  ＨＹＰ１００ｍｇ／ｍＬ製剤の総合評価を提供する。今までのところ、すべての被験ロットの物理化学的および生物学的特徴は同様である。
【０２１０】
全てのＤＡＣ  ＨＹＰロットに関して、Ｎ末端配列決定により決定された重鎖および軽鎖の最初の１５アミノ酸、ペプチドマップおよび分子量分析は、ダクリズマブの遺伝子配列と一致した。
【０２１１】
ＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＳＶ−ＡＵＣにより決定した、すべての被験１５０ｍｇ／ｍＬおよび１００ｍｇ／ｍＬのロット中のアグリゲートのレベルおよびアグリゲート種のサイズ分布は同様であり、ゲル電気泳動により試験したそれらの純度も同様であった。
【０２１２】
１５０ｍｇ／ｍＬロットの電荷アイソフォーム分布は１００ｍｇ／ｍＬロットの電荷アイソフォーム分布と同様であり、ｐＥ／ＶＨＳ（１５０ｍｇ／ｍＬロット＝３１％ｐＥ／ＶＨＳ；１００ｍｇ／ｍＬロット＝３４から４２％ｐＥ／ＶＨＳ）およびＱ／ＶＨＳ（１５０ｍｇ／ｍＬロット＝１１から１２％Ｑ／ＶＨＳ；１００ｍｇ／ｍＬロット＝４から９％Ｑ／ＶＨＳ）Ｎ末端アイソフォームの相対量にわずかに差があっただけである。ＤＡＣ  ＨＹＰの特徴は以下のとおりである。
【０２１３】
ＣＥＸによるＮ末端アイソフォーム：
ｐＥ／ｐＥ：３１−４６％
ｐＥ／Ｑ：７−１２％
ｐＥ／ＶＨＳ：３１−４２％
Ｑ／ＶＨＳ：３−１２％
ＶＨＳ／ＶＨＳ：１−１７％
ＣＥＸによるＣ末端アイソフォーム：
０Ｋ：５３−８０％
１Ｋ：１４−２８％
２Ｋ：５−１９％
ＤＡＣ  ＨＹＰのＮ連結グリカンの分布は以下の通りである。
Ｇ０−Ｇ１ｃＮＡｃ：７．２−１４．６％
Ｇ０：８０．９−８８．２％
ピーク３：１．３−１．７％
Ｇ１：１．４−３．８
ＤＡＣ  ＨＹＰに関して測定された酸化レベルは低かった。
【０２１４】
ＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴のＣＤ２５結合実験において確認されたように、ＤＡＣ  ＨＹＰは生物学的に活性であり、ＩＬ−２誘導性Ｔ細胞増殖の阻害に対して機能性である。ＤＡＣ  ＨＹＰはまた、貯蔵における低レベルのアグリゲーションを特徴とする。
【０２１５】
５．７．ＤＡＣ  ＨＹＰの安定性
高濃度のＤＡＣ  ＨＹＰ製剤は貯蔵において安定である。以下の表は、１５０ｍｇ／ｍＬ  ＤＡＣ  ＨＹＰ製剤原料ロットに関する安定性データを提供する。
【０２１６】
以下の表３１は、推奨条件（２−８℃）における、５０ｍＬバッグ中での貯蔵後の安定性データを提供する。以下の表３２は、２３−２７℃における５０ｍＬバッグ中での貯蔵の加速安定性データを提供する。以下の表３３は、ストレス安定性データを提供する。
【０２１７】
【表３５】
2020078348.tif 000037
【０２１８】
【表３６】
2020078348.tif 000038
【０２１９】
【表３７】
2020078348.tif 000039
【０２２０】
５．８．ダクリズマブのさまざまな形態間の比較
Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．（「Ｒｏｃｈｅ」）は、ＺＥＮＡＰＡＸ（商標）という商品名で販売される、製造中止となっている同種移植の拒絶反応治療用ダクリズマブの静注製剤を製造した。ＤＡＣ  Ｐｅｎｚｂｅｒｇは、ＰＤＬ  ＢｉｏＰｈａｒｍａによる臨床試験に使用されるダクリズマブの１００ｍｇ／ｍｌの皮下製剤である（以下のセクション５．９．１に記載のＣＨＯＩＣＥ研究を参照されたい）。
【０２２１】
ＤＡＣ  ＨＹＰ、ＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣおよびＤＡＣ  Ｐｅｎｚｂｅｒｇの製剤の間の比較を、表３４に示す。表において、製剤化緩衝液はＤＡＣがダイアフィルトレーションされ、最終製剤を得た緩衝液である。したがって、記された濃度は名目濃度である。
【０２２２】
【表３８】
2020078348.tif 000040
【０２２３】
ＤＡＣ  ＨＹＰのさまざまな特徴をＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣおよびＤＡＣ  Ｐｅｎｚｂｅｒｇのさまざまな特徴と比較した。
【０２２４】
ＤＡＣ  ＨＹＰ対ＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣのグリコシル化間の比較を図２１に示す。ダクリズマブの３種の形態の例示的ロットの分析を表３５に述べる。
【０２２５】
【表３９】
2020078348.tif 000041
【０２２６】
ＤＡＣ  ＨＹＰはまた、ＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣより有意に低レベルのマンノースグリコシル（例えば、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７）および低レベルのシアル化グリコシルも有する（例えば図２１を参照されたい）。
【０２２７】
抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ依存性活性および抗体−標的結合の潜在的細胞傷害作用を査定するために使用できる、インビトロアッセイである。エフェクター細胞として６例の健康なドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および標的細胞としてＣＤ２５発現ＫＩＴ２２５／Ｋ６細胞系を使用して、可変のエフェクター細胞対標的細胞比のフォーマットまたは可変抗体濃度フォーマットの両方において、さまざまなダクリズマブ調製物のＡＤＣＣ活性をアッセイした。
【０２２８】
可変のエフェクター細胞対標的細胞比のフォーマットに関して、５１Ｃｒ標識ＫＩＴ２２５／Ｋ６細胞（１２，５００細胞／ウェル）を、１μｇ／ｍＬの抗体（最終濃度）と一緒に、３０分間４℃において、Ｖ底９６−ウェルプレート中で１００μＬの容積のＡＤＣＣアッセイ培地（４３５ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０、５．０ｍＬのＬ−グルタミン、５０ｍＬの熱不活性化ウシ胎児血清、５００μｌの１０００×２−メルカプトエタノール、５．０ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシン（１００×）、および５．０ｍＬのＨＥＰＥＳ（１Ｍストック）／５００ｍＬを含有する）と一緒にプレインキュベートし、対照細胞は、その後の抗体独立性５１Ｃｒ放出の決定のために、抗体の不在下でＡＤＣＣアッセイ培地においてインキュベートした。
【０２２９】
ＰＢＭＣ（エフェクター）を、ＡＤＣＣアッセイ培地において別々の９６ウェルポリプロピレンプレート中に段階的に希釈し、６．２５×１０５細胞、３．１３×１０５細胞、１．５６×１０５細胞、７．８１×ｌ０４細胞または３．９１×１０４細胞の細胞濃度／１００μＬを得た。１００μＬ／ウェルの容積のＰＢＭＣ懸濁液を、５１Ｃｒ標識ＫＩＴ２２５／Ｋ６および抗体を含有するプレートに加え、５０：１、２５：１、１２．５：１、６．２５：１および３．１３：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比を得た。さらに、１００μＬ／ウェルの容積のＡＤＣＣアッセイ培地単独（エフェクターなし）を、５１Ｃｒ標識ＫＩＴ２２５／Ｋ６＋ｍＡｂに加え、５１Ｃｒの自然放出を決定した。アッセイプレートを、５０ＲＣＦにおいて２分間回転させ、３７℃で７．５％ＣＯ２インキュベーターにおいて４時間インキュベートした。
【０２３０】
４時間のインキュベーション終了の３０分前、８％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の２５μＬの容積を、適切な対照ウェルに加え、標的細胞由来の５１Ｃｒの最大放出を決定した。４時間のインキュベーションの完了において、プレートを３５０ＲＣＦにおいて５分間回転させ、各ウェル由来の上清の１００μＬの容積を、ミニチューブに移した。各ミニチューブを、シンチレーションバイアルに挿入し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇａｍｍａ５５００Ｂカウンターまたは同等物において１分間カウントした。
【０２３１】
可変抗体濃度のフォーマットに関して、５１Ｃｒ標識ＫＩＴ２２５／Ｋ６細胞（１２，５００細胞／ウェル；標的）を、ｍＡｂ（最終濃度）のさまざまな用量の抗体（５、１、０．２、０．０４、０．００８および０．００１６μｇ／ｍＬ）と一緒に、３０分間４℃においてＶ底９６−ウェルプレート中で１００μＬの容積のＡＤＣＣアッセイ培地においてプレインキュベートした。対照細胞は、その後の抗体独立性５１Ｃｒ放出の決定のために、ＡＤＣＣアッセイ培地単独（ｍＡｂなし）と一緒にインキュベートした。
【０２３２】
ＰＢＭＣ（エフェクター）を、別々の９６ウェルポリプロピレンプレートにおいて、３．１３×１０５細胞／１００μＬの濃度にＡＤＣＣアッセイ培地で段階的に希釈した。ＰＢＭＣ懸濁液の１００μＬ／ウェルの容積を、５１Ｃｒ標識ＫＩＴ２２５／Ｋ６＋ｍＡｂを含有するプレートに加え、２５：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比を得た。さらに、１００μＬ／ウェルの容積のＡＤＣＣアッセイ培地単独（エフェクターなし）を、５１Ｃｒ標識ＫＩＴ２２５／Ｋ６＋ｍＡｂに加え、５１Ｃｒの自然放出を決定した。アッセイプレートを、５０ＲＣＦにおいて２分間回転させ、３７℃で７．５％ＣＯ２インキュベーターにおいて４時間インキュベートした。
【０２３３】
４時間のインキュベーション終了の３０分前、８％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の２５μＬの容積を、適切な対照ウェルに加え、標的細胞由来の５１Ｃｒの最大放出を決定した。４時間のインキュベーションの完了において、プレートを３５０ＲＣＦにおいて５分間回転させ、各ウェル由来の上清の１００μＬの容積を、ミニチューブに移した。各ミニチューブを、シンチレーションバイアルに挿入し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇａｍｍａ５５００Ｂカウンターまたは同等物において１分間カウントした。
【０２３４】
ＡＤＣＣの結果を図２２Ａ（可変のエフェクター細胞対標的細胞比のフォーマット）および図２２Ｂ（可変抗体濃度フォーマット）に示す。これらのデータは、段階的濃度において試験されたＤＡＣ  ＨＹＰにより達成された最大ＡＤＣＣ活性が、同じ濃度のＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣおよびＤＡＣ  Ｐｅｎｚｂｅｒｇにより発揮される活性よりおよそ３０−４０％低かったことを示す。
【０２３５】
ＤＡＣ  ＨＹＰ対ＺＥＮＡＰＡＸ  ＤＡＣ対ＤＡＣ  Ｐｅｎｚｂｅｒｇの電荷アイソフォームプロファイル（Ｎ末端変異体と一致する）の比較を、図２３に示す。
【０２３６】
５．９．ＤＡＣ  ＨＹＰ臨床試験
５．９．１．ＣＨＯＩＣＥ研究
ＣＨＯＩＣＥ試験は、２３０例の再発性ＭＳ患者においてインターフェロンベータ療法に加えた、ダクリズマブの第２相、ランダム化、二重盲検、プラセボ対照試験であった。この試験は、皮下注射として投与した１００ｍｇ／ｍｌのＤＡＣ  Ｐｅｎｚｂｅｒｇ（生産品の説明に関する上記のセクション５．８を参照されたい）の２種の投与計画：１ｍｇ／ｋｇのダクリズマブを４週間ごとに投与、および２ｍｇ／ｋｇダクリズマブを２週間ごとに投与、を試験した。この研究の結果は、インターフェロンベータ療法に２ｍｇ／ｋｇで２週間ごとに投与するダクリズマブを加えることによって、インターフェロンベータ療法単独と比較して、新しい、または拡大したガドリニウム増強病巣が２４週目に有意に縮小されることを示した。
【０２３７】
ＣＨＯＩＣＥ研究の結果は、Ｗｙｎｎら、２０１０年、Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．９（４）：３８１−９０頁に記載されている。ダクリズマブ治療は、一般的に忍容性良好であった。一般的な有害事象は、すべての治療群において類似であった。グレード３の有害事象は、２４パーセントのＤＡＣ／ＩＦＮβ治療患者および１４％のプラセボ／ＩＦＮβ治療患者に観察された。最も頻度の高いグレード３有害事象は、感染症であり、７％のＤＡＣ／ＩＦＮβ治療患者および３パーセントのプラセボ／ＩＦＮβ治療患者に起こった。日和見感染または死亡は無く、すべての感染症は、標準的な療法で解消された。
【０２３８】
ＣＨＯＩＣＥ試験は、ＩＦＮβ−ａｌ療法の経歴のあるＭＳ患者において、ダクリズマブが忍容性良好であり、ＩＦＮβ−ａｌ単独と比較して、新しい／拡大したガドリニウム増強（Ｇｄ＋）病巣において７２％の用量依存性縮小を起こしたことを実証した。臨床的有効性は、免疫調節性ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ  ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の著しい拡大を伴った。
【０２３９】
５．９．２．ＳＥＬＥＣＴ研究
ランダム化二重盲検プラセボ対照用量範囲探索試験（ＳＥＬＥＣＴ）を実施し、ＤＡＣ  ＨＹＰの２種の異なる投薬量レベルの安全性および有効性を決定した。
【０２４０】
概説。本研究は、チェコ共和国、ドイツ、ハンガリー、インド、ポーランド、ロシア、ウクライナおよび英国における７６の施設で実施された。個々の患者のケアは、治療を行う神経科医、治療を行う看護師（または研究コーディネーター）、検査を行う神経科医、ＭＲＩの検査技師および薬剤師（または承認された被指名人）が関与する。集中型双方向音声応答システム（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｖｏｉｃｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）を、すべての部位にわたるランダム化に使用した。プロトコルで規定された暫定無益分析を、１５０例の患者が２４週の通院を完了した後に実施した。
【０２４１】
患者。臨床的に明確な再発寛解型多発性硬化症（２００５年  ＭｃＤｏｎａｌｄ基準１−４に従って；Ｐｏｌｍａｎら、２００５年Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ５８：８４０−８４６頁を参照されたい）であり、ベースラインの総合障害度評価尺度（Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｔａｔｕｓ  Ｓｃａｌｅ）（ＥＤＳＳ）が０−０．５０（Ｋｕｒｔｚｋｅ、１９８３年、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ３３（１１）：１４４４−５２頁）およびランダム化の前１２か月に少なくとも１回ＭＳが再発した、またはランダム化の前６週間以内に実施された脳ＭＲＩにおいて１つの新しいＧｄ＋病巣があった、適格基準に含まれる１８−５５歳の患者をランダム化し、ＤＡＣ  ＨＹＰ（１５０ｍｇまたは３００ｍｇ）またはプラセボのいずれかを、４週ごとに１回の５２週間の皮下注射として与えた。妊娠の可能性がある患者は、有効な避妊の実践を必要とした。
【０２４２】
患者が、原発性進行性、二次進行性もしくは進行性再発性のＭＳ、悪性腫瘍の病歴、重症のアレルギー反応もしくはアナフィラキシー反応もしくは既知の薬剤過敏症または治験責任医師の立場から考えて、ＤＡＣ  ＨＹＰの投与を妨げる他の深刻な医学的条件を有する場合、その患者は排除した。さらなる排除基準は、ＤＡＣ  ＨＹＰまたはＺＥＮＡＰＡＸ（商標）、全身リンパ節照射法、クラドリビン、ミトキサントロン、Ｔ−細胞もしくはＴ−細胞受容体のワクチン接種またはナタリズマブもしくはリツキシマブを除く任意の治療用ｍＡｂを用いた以前の治療を含む。ランダム化の時点において、患者は、前年にシクロホスファミドもしくはリツキシマブを用いた治療、６か月以内にナタリズマブ、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、静注用免疫グロブリン、血漿交換療法または細胞吸着除去療法を用いた治療、またはランダム化前の３か月以内に生ウイルスワクチン、酢酸グラチマー、ＩＦＮβ、インターフェロンアルファを用いた治療、または３０日以内にコルチコステロイド、４−アミノピリジンまたは関連製品を用いた治療を受けることはできなかった。
【０２４３】
この群の特徴は以下の通りであった。
【０２４４】
【表４０】
2020078348.tif 000042
【０２４５】
エンドポイント。この研究の第１の目的は、ＤＡＣ  ＨＹＰ単独療法が、５２週において年換算再発率（ＡＲＲ）で定義されたＭＳの再発を減少させるかどうかを決定することであった。再発は、検査を行う神経科医による査定において、新しい神経学的発見を伴う、２４時間を超えて続く新しいまたは繰り返し起こる神経症状（熱または感染症を伴わない）として定義された。３人の盲検のＭＳ神経科医からなる独立した神経学評価委員会（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＮＥＣ）は、すべての疑わしい再発を評価し、ＭＳ再発のプロトコル定義を満たすかどうかを判定した。ＩＮＥＣが承認した再発だけがは、一次分析に含まれた。
【０２４６】
第２の目的は、患者のサブセットにおいて、８、１２、１６、２０および２４週に実施された脳ＭＲＩスキャンにおいて累積する新しいＧｄ＋病巣の数の減少、；５２週における新しい、または新たに拡大したＴ２高強度病巣の数の減少；ベースラインと５２週の間に再発する患者集団の減少；および２９項目の多発性硬化症インパクトスケール（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｉｍｐａｃｔ  Ｓｃａｌｅ）（ＭＳＩＳ−２９）（Ｈｏｂａｒｔら、２００１年、Ｂｒａｉｎ  １２４（Ｐｔ５）：９６２−７３頁）の５２週における身体的影響スコアのベースラインからの変化により測定される生活の質の改良（ＱｏＬ）にＤＡＣ  ＨＹＰが有効であるかどうかを決定することであった。確認された障害の進行を、ベースラインおよび５２週の間のＥＤＳＳスコアの変化によって査定した（ベースラインＥＤＳＳ≧１．０に関してＥＤＳＳは１．０ポイント上昇、または１２週間持続したベースラインＥＤＳＳ＝０に関して１．５ポイント上昇）。ＥＤＳＳの評価は、１２週ごとならびに２０、５２、６０および７２週に実施した。
【０２４７】
追加のＱｏＬエンドポイントは、ＥＱ−視覚的アナログ尺度（Ｖｉｓｕａｌ  Ａｎａｌｏｇｕｅ  Ｓｃａｌｅ）（ＥＱ−ＶＡＳ）（ＥｕｒｏＱｏｌ−生活健康関連の質の測定のための新しい機関、２０１１年、１７．１１．１１アクセス、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｏｑｏｌ．ｏｒｇ／）により査定された対象の幸福の全体的査定であり、ＥＱ−５Ｄ健康調査（ＥｕｒｏＱｏｌ−生活健康関連の質の測定のための新しい機関、２０１１年、１７．１１．１１アクセス、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｏｑｏｌ．ｏｒｇ／）；１２項目の略式健康調査ＳＦ−１２（Ｗａｒｅら、１９９６年、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ３４（３）：２２０−３３頁）および５２週におけるＭＳＩＳ−２９の精神的スケール（Ｈｏｂａｒｔら、２００１年、Ｂｒａｉｎ  １２４（Ｐｔ５）：９６２−７３頁）における変化であった。
【０２４８】
追加のＭＲＩエンドポイントは、５２週におけるＧｄ＋病巣の数、２４および５２週における全体および新しい、または新たに拡大したＴ２高強度病巣の容積、２４および５２週における全体および新しいＴ１低強度病巣「ブラックホール」（灰白質に対して等強度／低強度であり、ガドリニウム投与後に増強されなかった病巣として定義される）の容積ならびにＳＩＥＮＡ法（Ｓｍｉｔｈら、２００１年、Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｓｓｉｓｔ  Ｔｏｍｏｇｒ２５（３）：４６６−７５頁）により査定された脳全体の容積における百分率の変化であった。
【０２４９】
リンパ球のサブセットは、検証されたＦＡＣＳアッセイを使用して複数の時点で測定した。ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞は、ＣＤ３−／ＣＤ１６＋／ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔリンパ球として定義された。ＤＡＣ  ＨＹＰに対する免疫原性を、抗薬剤抗体をスクリーニングするための標準的ＥＬＩＳＡを使用して査定し、その後、細胞アッセイを使用して、すべての陽性試料における中和抗体に関して試験した。
【０２５０】
統計分析。サンプルサイズおよそ６００例の患者を、ＤＡＣ  ＨＹＰ治療群およびプラセボ群の間のＡＲＲにおいて５０％の減少を検出するための９０％の検出力を有するように選択し、１０％の脱落率、５％の第１種過誤率および両側検定の負の２項分布と仮定するシミュレーションから推定した。プラセボ群におけるＡＲＲは、ＲＲＭＳ対象において最近完了した試験に基づき、０．４７６であると仮定された。報告されたすべてのｐ値は、両側である。
【０２５１】
一次分析により、各ＤＡＣ  ＨＹＰ群対プラセボ間のＡＲＲの差が評価された。別のＭＳ薬物を用いた救命治療後に起こった再発は打ち切りであった。差は、研究登録前の年の再発数に関して補正される負の二項回帰モデル、ベースラインＥＤＳＳ（ＥＤＳＳ≦２．５対ＥＤＳＳ＞２．５）およびベースライン年齢（≦３５対＞３５歳）を使用して評価した。二次分析は、負の二項回帰（８および２４週の間の新しいＧｄ＋病巣の数；新しい、または新たに拡大したＴ２高強度病巣の数）、Ｃｏｘ比例ハザードモデル（最初の再発までの時間、疾患の進行までの時間）および分散モデルの分析（ＥＤＳＳにおける変化、新しい、または新たに拡大したＴ２病巣の容積、新しいＴ１低強度病巣の容積、ＱｏＬ）ならびに比例オッズモデル（５２週における新しいＧｄ＋病巣の数）を使用して治療差に関して試験した。再発なしの患者の割合は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの生存率曲線分布から推定した。
【０２５２】
８および２４週の間の新しいＧｄ＋病巣の累積数に関して、患者が１または２回の連続スキャンまたはすべてのスキャンを逃した場合、最後のベースラインではない観察をそれより先に実施するか、または各治療群内の病巣の平均数をそれぞれ使用した。他のＭＲＩエンドポイントに関して、欠測データは、治療群内の平均を使用して転嫁した。ＭＳＩＳ−２９に関して、患者が＜１０項目を逃した場合、非欠測項目の平均を使用してスコアに転嫁した。≧１０項目および他のＱｏＬ測定を逃した患者に関して、ランダムスロープおよび切片モデルを使用して欠測データを推定した。
【０２５３】
有効性エンドポイントに関する統計的試験は、ＤＡＣ  ＨＹＰ３００ｍｇ群対プラセボおよびＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ群対プラセボの別々の比較を使用した。逐次的閉検定手順を使用して、多重比較による全体の第１種過誤率を調節した。
【０２５４】
有効性分析を、ランダム化を受けたすべての患者が含まれる治療意図（ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ）（ＩＴＴ）集団において評価した。しかし、１つの研究施設からの２１例の患者は、研究完了前に特定された、該施設における不正確な投薬の証拠ため（該施設の全ての患者は、積極的治療を受けていた）、研究完了前にＩＴＴ集団からあらかじめ除外した。感度分析において、すべての一次および二次有効性分析を、すべてのランダム化した患者を使用して繰り返した。すべての安全性分析は、研究薬剤の少なくとも１回の投与を受け、少なくとも１回のランダム化後の査定を受けたすべての患者として定義される安全性集団に基づいた。
【０２５５】
あらかじめ計画された無益性分析を、１５０例の対象が２４週の通院を完了した後に実施し、ＤＡＣ  ＨＹＰの仮定された効果が明白でなかった場合、停止する機会を提供した。有効性は、研究期間にわたって変化し得るので、無益性分析の時に、優位性の証拠のために研究を早期に停止する計画は無かった。無益性は、各投薬群に関する８および２４週の間の新しいＧｄ＋病巣の累積数ならびにＡＲＲエンドポイントの両方に関する条件付き検出力を別々に推定することによって査定した。安全性モニタリング委員会（Ｓａｆｅｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）は、分析時のデータを検討し、データの全体的一貫性およびリスク便益の査定に基づき、研究を続けることを推奨した。
【０２５６】
結果の要約。
【０２５７】
適格な参加者を、２／１５／２００８から５／１４／２０１０までランダム化した。ベースラインの特徴は、３種の治療群にわたって類似であるが、ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ群の患者がＤＡＣ  ＨＹＰ３００ｍｇ群の患者より多くのＴ２およびＧｄ＋Ｔ１病巣を有する傾向があった。すべてのランダム化された患者にわたって、合計５７７例（９３％）が、研究を完了したＤＡＣ  ＨＹＰおよびプラセボ治療患者と類似の割合で治療期間を完了した。
【０２５８】
詳細な結果。臨床的有効性。５２週におけるＡＲＲ（一次エンドポイント）は、プラセボ（０．４６；表３６）と比較して、ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ（０．２１）または３００ｍｇ（０．２３）にランダム化された患者に関してより低く、ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ（９５％ＣＩ、３１％から６９％、ｐ＜０．０００１）によりプラセボに対して５４％の減少、およびＤＡＣ  ＨＹＰ３００ｍｇ（９５％ＣＩ、２６％から６６％、ｐ＝０．０００２；表３６）に関してプラセボに対して５０％の減少を示した。５２週にわたって、再発患者の割合は、プラセボ群において再発した３６％に対してＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ（１９％）および３００ｍｇ（２０％）の群において減少した（両方の比較に関してｐ≦０．００１）（表３６）。プラセボと比較して、５２週における３か月持続する障害進行の危険性は、ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇにおいて５７％（ハザード比＝０．４３；９５％ＣＩ、０．２１から０．８８；ｐ＝０．０２１）およびＤＡＣ  ＨＹＰ３００ｍｇ群において４３％（ハザード比＝０．５７；９５％ＣＩ、０．３０から１．０９；ｐ＝０．０９１）減少した。
【０２５９】
５２週におけるＭＳＩＳ−２９身体的スコアで相対的に４．０の改良が、プラセボに対してＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇに観察され、ＤＡＣ  ＨＹＰ３００ｍｇ患者において著しい変化は低かった（ｐ＜０．０００８およびｐ＝０．１２８４対プラセボ、それぞれ；表３６）。身体的および精神的機能両方ならびに全体の健康の測定を含む、生活の健康関連の質の他の測定についてもまた、類似の改良が観察された（表３６）。
【０２６０】
【表４１】
2020078348.tif 000043
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【０２６１】
ＭＲＩ。ＤＡＣ  ＨＹＰは、ＭＲＩにより定義されたように、新しいＭＳ病巣の活性を、全研究集団および８から２４週の間に実施される月１回のＭＲＩによるサブセットの両方において減少させた（表３６）。臨床的エンドポイントと対照的に、有効性のこのポイントの推定値は、潜在的ベースラインの不均衡を調整後でも、１５０ｍｇ用量群と比較して３００ｍｇ用量群においてわずかに強かった。縦モード解析は、Ｇｄ＋病巣の活性が、治療の最初の２、３か月は３００ｍｇ用量群と比較して１５０ｍｇ用量群において高かったが、５２週には類似であったことを実証した（表３６）。１つの排除研究現場由来の２１例の患者を含んだ感度分析は、すべての有効性分析に関して類似の結果を得た。
【０２６２】
安全性。有害事象（ＡＥ）は、ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ（７３％）、ＤＡＣ  ＨＹＰ３００ｍｇ（７６％）およびプラセボ（７９％）の群中の患者に類似の割合で起こった（表３７）。重篤なＡＥは、プラセボ群の２６％、ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍ群において１５％およびＤＡＣ  ＨＹＰ３００ｍｇ群において１７％で起こった。ＭＳの再発を除いて、ＳＡＥは各群の患者の６％、７％および９％で起こった（表３７）。＞５％のＤＡＣ  ＨＹＰ患者において起こったＡＥを、表３７に示す。重篤な感染症の発生率は、ＤＡＣ  ＨＹＰ治療患者中における２％対プラセボにおける０％であった。投薬が続いていた間に重篤な感染症になった７例の患者のうち、１例は重篤な感染症のため治療を中止し、６例は、感染症が解消後治療を再開した。皮膚事象の発生率は、ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ群において１８％、ＤＡＣ  ＨＹＰ３００ｍｇ群において２２％およびプラセボ群において１３％であった（表３７）。重篤な皮膚事象は、ＤＡＣ  ＨＹＰ治療患者の１％において起こった。重篤な発疹から回復していた１例のＤＡＣ  ＨＹＰ治療患者は、腰筋膿瘍の合併症のため死亡した。剖検において、以前に診断未確定であった腰筋膿瘍は、腸間膜動脈に関与することが見いだされ、局所血栓症および急性虚血性大腸炎をもたらした。５例の悪性腫瘍が試験中に起こり、２例の子宮頸がん（プラセボ群およびＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇ群において各１例）；ＤＡＣ  ＨＹＰ１５０ｍｇにおける１例の甲状腺新生物は、重篤ではない甲状腺結節ではなく、ＤＡＣ  ＨＹＰ３００ｍｇ群における２例のメラノーマであった。メラノーマの症例は、局所切除により治療され、再発の報告はなかった。
【０２６３】
【表４２】
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【０２６４】
実験結果。ＤＡＣ  ＨＹＰを用いて治療された患者は、５２週においてプラセボと比較して合計ＮＫ細胞カウント（細胞／ｍｍ３）が増加した（中央値：４２．０（１５０ｍｇＤＡＣ  ＨＹＰ）；４６．５（３００ｍｇＤＡＣ  ＨＹＰ）；対−４．５プラセボ；ｐ＝＜０．００１）。合計ＮＫ細胞数の増加は、ベースラインにおける中央値７．７７から治療終了時の４４．８４である、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞の選択的増加に関連していた。対照的に、ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞はわずかに変化しただけであった（中央値の変化は１２２．６８から１２３．７０）。ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞の拡大は、ＤＡＣ  ＨＹＰ治療群対プラセボの両方において最初のベースライン後の時点（４週）で明らかであった（ｐ＜０．０００１）。ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞は、ベースラインのリンパ球の０．６％の中央値から５２週の２．８％に拡大した。対照的に、ＤＡＣ  ＨＹＰを用いて治療された患者は、Ｂ細胞および合計リンパ球カウントがわずかに減少した（表３８）。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞両方のカウントは、ＤＡＣ  ＨＹＰ治療患者で５２週においておよそ７−１０％減少し、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋比は、治療期間中一定を維持した。
【０２６５】
【表４３】
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【０２６６】
肝機能検査（ＬＦＴ）の異常は５Ｘ  ＵＬＮを上回り、４％のＤＡＣ治療患者および＜１％のプラセボ治療患者において起こった。これらの異常は、通常、治療期間の後期（中央値  発症＋３０８日）に起こり、中央値にして６２日で解消した。＞５Ｘ  ＵＬＮに上昇した１７例のＤＡＣ  ＨＹＰ治療患者のうち、６例が、解消後少なくとも６か月間、ＤＡＣ  ＨＹＰを用いて治療を続け、または再開し、この期間中全員に再発はなかった。２例の患者において、ＬＦＴの上昇は感染症を伴った（１例がＢ型肝炎および１例がサイトメガロウイルス感染症）。
【０２６７】
免疫原性。２４週において、ＤＡＣ  ＨＹＰに対する中和抗体を、６例（２％）のＤＡＣ  ＨＹＰ治療患者（１５０ｍｇ用量群中５例の患者および３００ｍｇ用量群中１例の対象）において検出した。一部の患者において、これらの抗体は一時的であり、５２週において、ＤＡＣ  ＨＹＰに対する中和抗体は、各ＤＡＣ  ＨＹＰ用量群から１対象存在しただけであった。
【０２６８】
結論。毎月の、皮下ＤＡＣ  ＨＹＰ単独療法によるＣＤ２５の拮抗作用は、例えば、再発率の減少、ＭＲＩにより定義された新しい病巣およびＭＳ患者の優勢に治療された天然集団における障害の進行により測定して、ＭＳ疾患活性について１年にわたって強固で臨床的に意味のある効果を実証した。
【０２６９】
６．具体的な実施形態、参照による組み込み
本開示の様々な態様は、以下の番号付きパラグラフに述べられる実施形態に記載されている。
１．無血清および無コレステロール培地において増殖するよう適応されており、組換えタンパク質を発現するよう操作されている、無血清および無コレステロール培地において増殖される場合、１０日間のフェドバッチ法において１００Ｌの培養物中１００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる改変されたＮＳ０細胞。
２．コレステロールおよび動物由来成分のない培地において増殖される場合、１０日間のフェドバッチ法において１，０００Ｌの培養物中１００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる、実施形態１に記載の改変されたＮＳ０細胞。
３．コレステロールおよび動物由来成分のない培地において増殖される場合、１０日間のフェドバッチ法において１６，０００Ｌの培養物中１００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる、実施形態１に記載の改変されたＮＳ０細胞。
４．流加培地が、追加される容積が最初の細胞培養物容積の割合を表す、次のスケジュール：
【０２７０】
【表４４】
2020078348.tif 000052
に従って追加される、実施形態１−３のいずれか１つに記載の改変されたＮＳ０細胞。
５．１３日間のフェドバッチ法において少なくとも１００Ｌの培養物中２００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる、実施形態１に記載の改変されたＮＳ０細胞。
６．無コレステロール培地において増殖される場合、１３日間のフェドバッチ法において１，０００Ｌの培養物中２００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる、実施形態５に記載の改変されたＮＳ０細胞。
７．無血清および無コレステロール培地において増殖される場合、１０日間のフェドバッチ法において１６，０００Ｌの培養物中１００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる、実施形態５に記載の改変されたＮＳ０細胞。
８．抗ＣＤ２５モノクローナル抗体を発現するのに有用な核酸で安定的にトランスフェクトされる、実施形態１に記載の改変されたＮＳ０細胞。
９．抗ＣＤ２５モノクローナル抗体が、配列番号２の２１位から２３３位に配列が一致するＶＬ鎖および配列番号４の２０位から４６５位に配列が一致するＶＨ鎖を含む、実施形態８に記載の改変されたＮＳ０細胞。
１０．ベクターｐＡｂＸ．ｇｐｔを用いて形質転換された、実施形態１に記載の改変されたＮＳ０細胞。
１１．ベクターｐＨＡＴ．ＩｇＧ１．ｒｇ．ｄＥを用いて形質転換された、実施形態１に記載の改変されたＮＳ０細胞。
１２．クローン７Ａ１１−５Ｈ７−１４−４３で表される実施形態１に記載の改変されたＮＳ０細胞。
１３．実施形態１−１２のいずれか１つに記載の改変されたＮＳ０細胞を培養することを含む、組換えタンパク質を生産する方法。
１４．１０日間のフェドバッチ法において１００Ｌ、１，０００Ｌもしくは１６，０００Ｌの培養物中少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を、または１３日間のフェドバッチ法において１００Ｌ、１，０００Ｌもしくは１６，０００Ｌの培養物中少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を生産する条件下で、改変されたＮＳ０細胞が培養される、実施形態１３に記載の方法。
１５．改変されたＮＳ０細胞が、血清およびコレステロールの非存在下で培養される、実施形態１３または実施形態１４に記載の方法。
１６．改変されたＮＳ０細胞が、トロポロンおよびヒドロコルチゾンの非存在下で培養される、実施形態１５に記載の方法。
１７．改変されたＮＳ０細胞が、１０−３５ｇ／Ｌグルコースを含有する基本および／または流加培地において培養される、実施形態１３または実施形態１４に記載の方法。
１８．改変されたＮＳ０細胞が、１５ｇ／Ｌグルコースを含有する基本培地および／または２８ｇ／Ｌグルコースを含有する流加培地において培養される、実施形態１７に記載の方法。
１９．基本培地が、ＰＦＢＭ２±１０％成分で構成されている、実施形態１８に記載の方法。
２０．流加培地が、ＰＦＦＭ３±１０％成分で構成されている、実施形態１８に記載の方法。
２１．細胞が基本培地において１−３日間、次に流加培地において１０−１３日間培養される実施形態１９または実施形態２０に記載の方法。
２２．流加培地が、表７において概要が述べられているスケジュール±１０％に従って追加される、実施形態１８に記載の方法。
２３．哺乳動物細胞において作動可能である選択可能なマーカーの発現を推進する弱いプロモーターおよび対象のタンパク質の発現を推進する強いプロモーターを含む、対象のタンパク質を組換え的に発現するのに有用なベクター。
２４．対象のタンパク質が治療抗体である、実施形態２３に記載のベクター。
２５．治療抗体が抗ＣＤ２５抗体である、実施形態２４に記載のベクター。
２６．ＣＤ２５抗体がダクリズマブのＣＤＲを含む、実施形態２５に記載のベクター。
２７．ＣＤ２５抗体がダクリズマブである、実施形態２６に記載のベクター。
２８．細胞に実施形態２３−２７のいずれか１つに記載のベクターをトランスフェクトし、１０日間のフェドバッチ法において１００Ｌ、１，０００Ｌもしくは１６，０００Ｌの培養物中少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／日対象のタンパク質を、または１３日間のフェドバッチ法において１００Ｌ、１，０００Ｌもしくは１６，０００Ｌの培養物中少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を生産することができる細胞を選択することを含む、対象のタンパク質の高い容積生産性を有する哺乳動物宿主細胞を得るための方法。
２９．ダクリズマブがｐＥ／Ｑ重鎖Ｎ連結アイソフォームおよび／またはＱ／ＶＨＳ重鎖Ｎ末端アイソフォームの存在により特徴付けられる、ダクリズマブを含む組成物。
３０．ｐＥ／Ｑ重鎖Ｎ末端アイソフォームがダクリズマブのおよそ６−１５％を構成する、実施形態２９に記載の組成物。
３１．ｐＥ／Ｑ重鎖Ｎ末端アイソフォームがダクリズマブのおよそ７−１２％を構成する、実施形態２９に記載の組成物。
３２．Ｑ／ＶＨＳ重鎖Ｎ末端アイソフォームがダクリズマブのおよそ１−１５％を構成する、実施形態２９−３１のいずれか１つに記載の組成物。
３３．Ｑ／ＶＨＳ重鎖Ｎ末端アイソフォームがダクリズマブのおよそ３−１２％を構成する、実施形態３２に記載の組成物。
３４．ダクリズマブの重鎖が次のＮ末端アイソフォーム：
【０２７１】
【表４５】
2020078348.tif 000053
に存在する、実施形態２９に記載の組成物。
３５．ダクリズマブの重鎖が次のＮ末端アイソフォーム：
【０２７２】
【表４６】
2020078348.tif 000054
に存在する、実施形態２９に記載の組成物。
３６．ダクリズマブが、図１８のアイソフォームプロファイルと実質的に類似する陽イオン交換クロマトグラフィーアイソフォームプロファイルにより特徴付けられる、実施形態２９に記載の組成物。
３７．ダクリズマブがＤＡＣ  ＨＹＰである、実施形態２９に記載の組成物。
３８．１つがオリゴ糖Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃに一致し１つがオリゴ糖Ｇ０に一致する２つの主要ピークを含有するＮ連結グリコシル化ＨＰＬＣプロファイルによりダクリズマブが特徴付けられ、これら２つのピークの合わせたＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約８８−９９．５％を構成する、ダクリズマブを含む組成物。
３９．Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約５−１８％を構成し、Ｇ０ピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約７５−９２％を構成する、実施形態３８に記載の組成物。
４０．Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約６−１６％を構成し、Ｇ０ピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約７８−９０％を構成する、実施形態３９に記載の組成物。
４１．Ｎ連結グリコシル化プロファイルが約３％未満のＭａｎ５を有する、実施形態３８−４０のいずれか１つに記載の組成物。
４２．Ｎ連結グリコシル化プロファイルが約０．５％未満のＧ２、Ｍａｎ６および／またはＭａｎ７を有する、実施形態４１に記載の組成物。
４３．Ｎ連結グリコシル化プロファイルがシアル酸付加オリゴ糖に一致する第三のピークを含有し、シアル酸付加オリゴ糖ピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの１％以下を構成する、実施形態３８に記載の組成物。
４４．Ｎ連結グリコシル化プロファイルがオリゴ糖Ｇ１に一致する第三のピークを含有し、Ｇ１ピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約１−５％を構成する、実施形態３８に記載の組成物。
４５．Ｇ１ピークのＡＵＣが全ピークの総ＡＵＣのうちの約１−２％を構成する、実施形態４４に記載の組成物。
４６．ダクリズマブが、図１９のプロファイルにまたは図２１の下のパネルのプロファイルに実質的に類似しているＮ連結グリコシル化ＨＰＬＣプロファイルを有する、実施形態３８に記載の組成物。
４７．ダクリズマブがＤＡＣ  ＨＹＰである、実施形態３８に記載の組成物。
４８．１μｇ／ｍＬのダクリズマブ濃度および約２５対１のエフェクター細胞対標的細胞比で、少なくとも３体の健康なドナー由来のエフェクター細胞および標的細胞としてＫｉｔ２２５  Ｋ６細胞を使用して、インビトロ細胞アッセイにおいて測定される場合、３５％未満のＡＤＣＣ平均細胞傷害性を示すダクリズマブを含む組成物。
４９．ダクリズマブが、前記アッセイにおいて１０％から３０％のＡＤＣＣ平均細胞傷害性を示す、実施形態４８に記載の組成物。
５０．前記アッセイが少なくとも６体の健康なドナー由来のエフェクター細胞を使用する、実施形態４８または実施形態４９に記載の組成物。
５１．前記アッセイが少なくとも１０体の健康なドナー由来のエフェクター細胞を使用する、実施形態４８または実施形態４９に記載の組成物。
５２．ダクリズマブがＤＡＣ  ＨＹＰである、実施形態４８−５１のいずれか１つに記載の組成物。
５３．約１５０−１９０ｍｇ／ｍＬのダクリズマブ、ならびに希釈緩衝液を用いた組成物の希釈により約８５−１６５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含有し、約２６７−３２７ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の浸透圧および２５℃で約ｐＨ５．８−６．２の範囲のｐＨを有し、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定される場合、ダクリズマブの少なくとも約９５％が単量体形態である希釈組成物を生じるような量の賦形剤を含む、ダクリズマブ製剤を作製するのに有用な組成物。
５４．希釈緩衝液で希釈される場合、希釈組成物が約８５−１１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含有するような量の賦形剤を含有する、実施形態５３に記載の組成物。
５５．希釈緩衝液で希釈される場合、希釈組成物が約１５０±１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含有するような量の賦形剤を含有する、実施形態５３に記載の組成物。
５６．ダクリズマブの０．１％以下がアグリゲート形態である、約４から１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含む組成物。
５７．ダクリズマブの最大２．５％がアグリゲート形態である、約４から１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含むダクリズマブ組成物を、弱陽イオン交換樹脂上のカラムクロマトグラフィーにより精製することによって得られる、実施形態５６に記載の組成物。
５８．弱陽イオン交換樹脂がＣＭ−６５０Ｍである、実施形態５７に記載の組成物。
５９．ＣＭ−６５０Ｍ樹脂が約２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有する平衡化緩衝液、ｐＨ４．４−４．６と平衡化しており、ダクリズマブが約２０ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび約７５ｍＭの硫酸ナトリウムを含有する溶出緩衝液、ｐＨ４．４−４．６を用いて溶出される、実施形態５８に記載の組成物。
６０．クロマトグラフィーが、約１０−３０ｃｍまたは約１７−１９ｃｍの高さを有する樹脂床を使用して円筒形カラムにおいて実施され、ダクリズマブが約４−２２℃または約１８−２２℃の範囲の温度で、約５０−２００ｃｍ／時または９０−１１０ｃｍ／時の範囲の流速で溶出される、実施形態５９に記載の組成物。
６１．約８５−１６５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブおよび約０．０２−０．０４％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含み、約２６７−３２７ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の浸透圧および２５℃で約ｐＨ５．８−６．２の範囲のｐＨを有し、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定される場合、ダクリズマブの少なくとも約９５％が単量体形態である、ヒトに投与するのに適している組成物。
６２．サイズ排除クロマトグラフィーにより測定される場合、ダクリズマブの少なくとも約９９％が単量体形態である、実施形態６１に記載の組成物。
６３．約８５−１１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含む、実施形態６１に記載の組成物。
６４．約１００ｍｇ／ｍＬのダクリズマブ、約４０ｍＭのコハク酸ナトリウム、約１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび約０．０３％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０から本質的になり、２５℃で約６．０のｐＨを有する、実施形態６３に記載の組成物。
６５．約１３５−１６５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含む、実施形態６１に記載の組成物。
６６．約１５０ｍｇ／ｍＬのダクリズマブ、約４０ｍＭのコハク酸ナトリウム、約１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび約０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０から本質的になり、２５℃で約６．０のｐＨを有する、実施形態６５に記載の組成物。
６７．約４から１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含むダクリズマブ組成物を適切な緩衝液中での限外濾過により濃縮して、約８５−１８０ｍｇ／ｍＬの範囲のダクリズマブ濃度を達成するステップ、および、場合によって、濃縮された組成物を希釈緩衝液で希釈するステップを含む方法により得られる、実施形態６５に記載の組成物。
６８．約８５−１６５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含み、約２−８℃の範囲の温度での約１２ヶ月の期間の貯蔵後にアグリゲート形態中のダクリズマブの百分率が約３％を超えない、皮下投与に適している医薬組成物。
６９．約８５−１１５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含む、実施形態６８に記載の医薬組成物。
７０．約１３５−１６５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含む、実施形態６８に記載の医薬組成物。
７１．約２−８℃の範囲の温度での約１２ヶ月の期間の貯蔵後にアグリゲート形態中のダクリズマブの百分率が約２％を超えない、実施形態６９または実施形態７０に記載の医薬組成物。
７２．約２−８℃の範囲の温度での約１８ヶ月の期間の貯蔵後にアグリゲート形態中のダクリズマブの百分率が約３％を超えない、実施形態６９または実施形態７０に記載の医薬組成物。
７３．（ｉ）組換えタンパク質を発現し分泌する細胞培養物のｐＨを、約ｐＨ４．５−５．５の範囲のｐＨに調整するステップ、
（ｉｉ）ｐＨ調整された細胞培養物を約４から１５℃の範囲の温度で約３０−９０分間インキュベートするステップ、および
（ｉｉｉ）インキュベートされたｐＨ調整細胞培養物を遠心分離して細胞残渣を除去するステップ
を含む、細胞培養物から組換えタンパク質を収穫するための方法。
７４．（ｉ）未精製ダクリズマブ調製物から親和性クロマトグラフィー樹脂上にダクリズマブを吸着させるステップ、
（ｉｉ）親和性クロマトグラフィー樹脂を洗浄緩衝液で洗浄して混入物を除去するステップ、
（ｉｉｉ）吸着したダクリズマブを溶出緩衝液で溶出させるステップ、
（ｉｖ）ｐＨを約３−４の範囲のｐＨに調整することにより溶出液中のウイルスを不活化し、ｐＨ調整された溶出液を規定温度でウイルスを不活化するのに十分な期間インキュベートするステップ、
（ｖ）ウイルス不活化溶出液を約ｐＨ７．７−７．９（２５℃で測定される）の範囲のｐＨまで中和するステップ、
（ｖｉ）中和された溶出液を強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通して流すステップ、
（ｖｉｉ）ステップ（ｖｉ）の溶出液のダクリズマブを弱陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂上に吸着させるステップ、および
（ｖｉｉｉ）吸着したダクリズマブを弱陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶出させるステップ
を含む、精製されたダクリズマブ組成物を生産するための方法。
７５．未精製ダクリズマブ調製物が細胞培養物から収穫される、実施形態７４に記載の方法。
７６．未精製ダクリズマブ調製物は、ダクリズマブが培養培地中に分泌される条件下で宿主細胞７Ａ１１−５H７−１４−４３を培養することと、分泌されたダクリズマブを収穫することにより得られる、実施形態７４に記載の方法。
７７．ダクリズマブが実施形態７３に記載の方法を使用して収穫される、実施形態７６に記載の方法。
７８．（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）の溶出されたダクリズマブ組成物を濾過して、ウイルスを除去するステップ、および
（ｘ）濾過された溶液を限外濾過により濃縮して、約８５−１８０ｍｇ／ｍＬのダクリズマブを含む精製されたダクリズマブ組成物を産出するステップ
をさらに含む、実施形態７４に記載の方法。
７９．約８５−１６５ｍｇ／ｍＬのダクリズマブおよび約０．０２−０．０４％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、約２６７−３２７ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の浸透圧および２５℃で約ｐＨ５．８−６．２の範囲のｐＨを有し、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定される場合、ダクリズマブの少なくとも約９５％が単量体形態である組成物が得られるように、精製されたダクリズマブ組成物を希釈緩衝液で希釈するステップをさらに含む、実施形態７８に記載の方法。
８０．得られる組成物が、ダクリズマブの組換え供給源由来の５０ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質、１０ｐｐｍ未満のプロテインＡを有し、組成物中のダクリズマブの３％以下がアグリゲート形態である、実施形態７９に記載の方法。
８１．基本培地ＰＦＢＭ２。
８２．流加培地ＰＦＦＭ３。
８３．ダクリズマブが培養培地中に分泌される条件下で、実施形態１−１１のいずれか１つに記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法により得られる、ダクリズマブ組成物。
８４．方法が、分泌されたダクリズマブを細胞培養培地から単離するステップをさらに含む、実施形態８３に記載のダクリズマブ組成物。
８５．約１００−５００ｍＭのクエン酸ナトリウム、約１０−３０ｍＭのＮａＯＨおよび約０．５−３％（ｖ／ｖ）ベンジルアルコールを含む、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂を衛生化するのに有用な緩衝液。
８６．カラムを衛生化するのに十分な流速でおよび期間、実施形態８５に記載の衛生化緩衝液を用いてカラムを洗浄することを含む、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラムを衛生化する方法。
８７．カラムを、約１５０ｃｍ／時の流速でおよそ１．８カラム容積の衛生化緩衝液を用いて洗浄し、洗浄されたカラムが約３０−４５分の期間流動なしでインキュベートされ、次に平衡化緩衝液を用いて平衡化される、実施形態８６に記載の方法。
８８．平衡化緩衝液が、約２０ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、約ｐＨ７（２５℃で）のｐＨを有する、実施形態８７に記載の方法。
８９．治療効果を与えるのに十分な量のＤＡＣ  ＨＹＰ組成物を患者に投与することを含む、多発性硬化症に罹っている患者を治療する方法。
９０．ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が静脈内投与される、実施形態８９に記載の方法。
９１．ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、約０．８−０．９ｍｇ／ｋｇのＤＡＣ  ＨＹＰに一致する量で投与される、実施形態９０に記載の方法。
９２．ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、約１ｍｇ／ｋｇのＤＡＣ  ＨＹＰに一致する量で投与される、実施形態９１に記載の方法。
９３．ＤＡＣ  ＨＹＰが、少なくとも６週間、少なくとも１２週間、少なくとも２４週間の期間、週あたり１回投与される、実施形態８９−９２のいずれか１つに記載の方法。
９４．ＤＡＣ  ＨＹＰが単独療法として投与される、実施形態８９−９３のいずれか１つに記載の方法。
９５．患者がインターフェロンベータを用いた前治療に無効果であったかまたはインターフェロンベータを用いた前治療を中止している、実施形態９４に記載の方法。
９６．ＤＡＣ  ＨＹＰがインターフェロンベータに対して補助的に投与される、実施形態８９から９３のいずれか１つに記載の方法。
９７．前記ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が皮下投与される、実施形態８９に記載の方法。
９８．ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、約１ｍｇ／ｋｇのＤＡＣ  ＨＹＰに一致する量で投与される、実施形態９７に記載の方法。
９９．ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が２週間に１回投与される、実施形態９８に記載の方法。
１００．ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が計約２４週間投与される、実施形態９９に記載の方法。
１０１．ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、約２ｍｇ／ｋｇのＤＡＣ  ＨＹＰに一致する量で投与される、実施形態９７に記載の方法。
１０２．ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、４週間に１回投与される、実施形態１０１に記載の方法。
１０３．ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、計約２４週間投与される、実施形態１０２に記載の方法。
１０４．ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、７５ｍｇから３００ｍｇのＤＡＣ  ＨＹＰに一致する量で投与される、実施形態１０３に記載の方法。
１０５．ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、１５０ｍｇに一致する量で投与される、実施形態１０４に記載の方法。
１０６．ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、３００ｍｇに一致する量で投与される、実施形態１０４に記載の方法。
１０７．ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、４週間に１回投与される、実施形態１０３−１０６のいずれか１つに記載の方法。
１０８．ＤＡＣ  ＨＹＰ組成物が、計少なくとも４８週間投与される、実施形態１０７に記載の方法。
１０９．ＤＡＣ  ＨＹＰが単独療法として投与される、実施形態１０３−１０８のいずれか１つに記載の方法。
１１０．患者がインターフェロンベータを用いた前治療に無効果であったかまたはインターフェロンベータを用いた前治療を中止している、実施形態１０９に記載の方法。
１１１．ＤＡＣ  ＨＹＰがインターフェロンベータに対して補助的に投与される、実施形態１０３−１０８のいずれか１つに記載の方法。
１１２．（ｉ）組換えタンパク質を発現し分泌する細胞培養物のｐＨを、約ｐＨ４．５−５．５の範囲のｐＨに調整するステップ、
（ｉｉ）ｐＨ調整された細胞培養物を約４から１５℃の範囲の温度で約３０−９０分間インキュベートするステップ、および
（ｉｉｉ）インキュベートされたｐＨ調整細胞培養物を遠心分離して細胞残渣を除去するステップ
を含む方法により細胞培養物から得られるまたは得られることが可能な、組換えタンパク質。
１１３．（ｉ）未精製ダクリズマブ調製物から親和性クロマトグラフィー樹脂上にダクリズマブを吸着させるステップ、
（ｉｉ）親和性クロマトグラフィー樹脂を洗浄緩衝液で洗浄して混入物を除去するステップ、
（ｉｉｉ）吸着したダクリズマブを溶出緩衝液で溶出させるステップ、
（ｉｖ）ｐＨを約３−４の範囲のｐＨに調整することにより溶出液中のウイルスを不活化し、ｐＨ調整された溶出液を規定温度でウイルスを不活化するのに十分な期間インキュベートするステップ、
（ｖ）ウイルス不活化溶出液を約ｐＨ７．７−７．９（２５℃で測定される）の範囲のｐＨまで中和するステップ、
（ｖｉ）中和された溶出液を強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通して流すステップ、
（ｖｉｉ）ステップ（ｖｉ）の溶出液のダクリズマブを弱陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂上に吸着させるステップ、および
（ｖｉｉｉ）吸着したダクリズマブを弱陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶出させるステップ
を含む方法により得られるまたは得られることが可能な、精製されたダグリズマブ組成物。
１１４．実施形態７４−８０のいずれか１つに記載の方法により得られるまたは得られることが可能な、精製されたダグリズマブ組成物。
【０２７３】
本出願に引用されるすべての出版物、特許、特許出願および他の文書は、あたかも各個々の出版物、特許、特許出願または他の文書が、あらゆる目的のために参照により組み込むことを個別に指示されている場合と同じ程度に、これによってあらゆる目的のために参照によりその全体を組み込む。
【０２７４】
様々な具体的実施形態が例示され説明されたが、本発明（複数可）の精神と範囲から逸脱することなく様々な変化を加えることが可能であることは認識される。
【図１】
2020078348.tif 000058
【図２】
2020078348.tif 000059
【図３Ａ】
2020078348.tif 000060
【図３Ｂ】
2020078348.tif 000061
【図３Ｃ】
2020078348.tif 000062
【図３Ｄ】
2020078348.tif 000063
【図３Ｅ】
2020078348.tif 000064
【図４Ａ】
2020078348.tif 000065
【図４Ｂ】
2020078348.tif 000066
【図５】
2020078348.tif 000067
【図６】
2020078348.tif 000068
【図７】
2020078348.tif 000069
【図８】
2020078348.tif 000070
【図９】
2020078348.tif 000071
【図１０】
2020078348.tif 000072
【図１１】
2020078348.tif 000073
【図１２】
2020078348.tif 000074
【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
2020078348.tif 000078
【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月31日(2020.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無血清および無コレステロール培地において増殖するよう適応されており、組換えタンパク質を発現するよう操作されている改変されたＮＳ０細胞であって、無血清および無コレステロール培地において増殖される場合、１０日間のフェドバッチ法において１００Ｌの培養物中１００ｍｇ／Ｌ／日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる改変されたＮＳ０細胞。