(57)【要約】      （修正有）【課題】配列をアラインするための方法およびシステムを提供する。【解決手段】リード（例えば、核酸リード、アミノ酸リード）を基準配列構築物にアラインするための方法、基準配列構築物を構築するための方法、ならびにアライメント法および構築物を使用して、配列を作製するシステムを含む。方法は、拡張性があり、何百万ものリードを何千もの塩基長またはアミノ酸長の構築物にアラインするのに使用することができる。本発明は加えて、構築物内の場所への核酸リードのアライメントに基づき、疾患または遺伝子型を同定するための方法も含む。【選択図】図３
2020042813.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１３年９月３日に出願された米国特許出願第１４／０１６，８３３号および２０１３年８月２１日に出願された米国特許出願第６１／８６８，２４９号の優先権を主張し、当該出願の両方は、その全体が本明細書において参考として援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列）を互いにアラインして、試料（例えば、遺伝子試料、タンパク質試料）に対応する連続的な配列リードを作製するための方法およびシステムに関する。本発明は加えて、試料中の変異型を同定するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
遺伝学は、分析科学から、情報科学へと進化している。研究者はかつて、どのようにして核酸を抽出および同定するのかで奮闘したが、今や、このような技法は、些末なものとなっている。次世代シーケンシング（ＮＧＳ：ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（例えば、全トランスクリプトームショットガンシーケンシング、ピロシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、合成を介するシーケンシング）は、全ゲノムをカバーする何百万ものリードを、わずか数日間で作り出すことが可能である。このスループットを達成するために、ＮＧＳシーケンシングでは、小型の核酸配列に対する大規模な並列化であって、併せて、大きな遺伝情報体、例えば、染色体またはゲノムを構成する並列化を使用する。遺伝子試料から出発して、核酸（例えば、ＤＮＡ）を切断し、増幅し、超高速で読み取る。これらの能力を考慮して、研究者は現在、いかにして（廉価に）リードをアラインして、疾患または疾患の危険性を指し示す配列内の遺伝子座を同定するのかで奮闘している。
【０００４】
最新のアライメント法では、重複するリードを基準にアラインして、重要な遺伝情報または構造情報の探索を可能にする配列（例えば、疾患に関するバイオマーカー）を作製するのに、膨大な計算能力を使用する。最終的に、配列アライメントの目標は、シーケンサーにより作製される核酸リードのセットを組み合わせて、その対象に由来する遺伝子試料に基づき、長いリード（すなわち、コンティグ）、なおまたは対象の全ゲノムを達成することである。次世代シーケンサーからの配列データは、併せて標的配列の全体を表示する、何百万もの短い配列を含むことが多いため、リードのアラインは、複雑で計算が高価である。加えて、ランダムシーケンシングエラー（すなわち、不正確なシーケンシングマシン出力）により引き起こされる配列の歪みを最小化するためには、プローブされた配列の各部分を、複数回にわたり（例えば、２〜１００回またはこれを超える回数にわたり）シーケンシングして、任意のランダムシーケンシングエラーの、作り出される最終アライメントおよび出力配列に対する影響を最小化する。最後に、核酸リードの全てに対応するデータの全てを収集したら、対象の全ての配列（またはその一部）を決定するために、リードを、単一の基準配列、例えばＧＲＣｈ３７にアラインする。多くの場合、個々のリードを実際に表示するわけではなく、アラインされた配列を、配列へとアセンブルし、配列を、データファイルとして提示する。
【０００５】
典型的には、配列アライメントは、２つの線形的な配列情報のストリング間の対応のあるアライメントを集約することにより構築される。アライメントの例として述べると、２つのストリングである、Ｓ１（配列番号１２：ＡＧＣＴＡＣＧＴＡＣＡＣＴＡＣＣ）およびＳ２（配列番号１３：ＡＧＣＴＡＴＣＧＴＡＣＴＡＧＣ）は、互いにアラインすることができる。典型的には、Ｓ１はリードに対応し、Ｓ２は基準配列の部分に対応する。互いに対して、Ｓ１およびＳ２は、置換、欠失、および挿入からなっていてもよい。典型的には、条件は、ストリングＳ１からストリングＳ２への変換に関して定義される：置換は、Ｓ２内の文字または配列が、Ｓ１内の同じ長さの異なる文字または配列で置きかえられる場合に生じ、欠失は、Ｓ２内の文字または配列が、Ｓ１の対応する区画内で「スキップ」される場合に生じ、挿入は、文字または配列が、Ｓ１内の、Ｓ２内では隣接する２つの位置の間で生じる場合に生じる。例えば、２つの配列であるＳ１およびＳ２は、下記の通りにアラインすることができる。下記のアライメントは、１３箇所のマッチ、長さ１の欠失、長さ２の挿入、および１箇所の置換：
（Ｓ１）ＡＧＣＴＡ−ＣＧＴＡＣＡＣＴＡＣＣ（配列番号１２）
（Ｓ２）ＡＧＣＴＡＴＣＧＴＡＣ−−ＴＡＧＣ（配列番号１３）
を表示する。
【０００６】
当業者は、配列アライメントのための正確なアルゴリズムおよび近似的なアルゴリズムが存在することを察知すると予想される。正確なアルゴリズムは、最高スコアのアライメントを見出すと予想されるが、計算が高価でありうる。２つの最も周知の正確なアルゴリズムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、４８巻（３号）：４４３〜４５３頁、１９７０年）およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１４７巻（１号）：１９５〜１９７頁、１９８１年；Ａｄｖ．  ｉｎ  Ｍａｔｈ．、２０巻（３号）：３６７〜３８７頁、１９７６年）である。Ｇｏｔｏｈ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１６２巻（３号）：７０５〜７０８頁、１９８２年）による、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎに対するさらなる改善は、計算時間を、Ｏ（ｍ２ｎ）からＯ（ｍｎ）［式中、ｍおよびｎは、比較される配列サイズであり、並列処理により適する］へと短縮する。バイオインフォーマティクスの分野では、Ｇｏｔｏｈの改変アルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムと称されることが多い。並列計算リソースが、より広くかつ廉価に利用可能となりつつあるので、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ法は、より多くの配列セットをより多くの基準配列にアラインするのに使用されている。例えば、ｈｔｔｐ：／／ａｗｓ．ａｍａｚｏｎ．ｃｏｍで入手可能な、Ａｍａｚｏｎ．ｃｏｍのクラウドコンピューティングリソースを参照されたい。上記の雑誌論文の全ては、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
【０００７】
Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（ＳＷ）アルゴリズムでは、配列内の塩基間の重複に対して加点し、配列間のギャップに対して減点することにより、直鎖状の配列をアラインする。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎはまた、ＳＷは、短い配列が、長い配列を記載する文字のストリングにわたることを必要としないという点でも、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈと異なる。すなわち、ＳＷは、１つの配列が、他の配列の全体についてのリードであることを仮定しない。さらに、ＳＷは、ストリングの全長にわたり伸長するアライメントを見出さなくてもよいため、局所的アライメントは、２つの配列内のどこでも開始および終結させることが可能である。
【０００８】
下記の式（１）：
【数１】
2020042813.tif 000003
との関連で述べると、ＳＷアルゴリズムは、長さｎおよびｍの２つのストリングを表示する、ｎ×ｍ行列Ｈで容易に表示される。上記の式では、ｓ（ａｉ，ｂｊ）は、マッチボーナス（ａｉ＝ｂｊである場合）またはミスマッチペナルティー（ａｉ≠ｂｊである場合）を表し、挿入および欠失には、それぞれ、ペナルティーＷｉｎおよびＷｄｅｌが課される。大半の場合、結果として得られる行列は、ゼロである多くの成分を有する。この表示は、行列内の上行〜下行、右列〜左列のバックトレースを容易とし、これにより、アライメントの同定を容易とする。
【０００９】
行列にスコアを完全に投入したら、ＳＷアルゴリズムにより、バックトラックを実施して、アライメントを決定する。アルゴリズムは、行列内の最大値から始めて、各セルの最終的な最大値を計算するのに３つの値（Ｈｉ−１，ｊ−１、Ｈｉ−１，ｊ、またはＨｉ，ｊ−１）のうちのいずれを使用したのかに基づき、バックトラックすると予想される。バックトラッキングは、ゼロに到達すると停止される。例えば、先行技術を表すものではなく、バックトラックの概念と、バックトラックが読み取られた場合の、対応する局所的アライメントとを説明するものである、図３（Ｂ）を参照されたい。したがって、アルゴリズムにより決定された「最良のアライメント」は、可能な最小数を超える挿入および欠失を含有しうるが、可能な最大数をはるかに下回る置換を含有すると予想される。
【００１０】
ＳＷまたはＳＷ−Ｇｏｔｏｈとして適用する場合、技法では、動的計画法アルゴリズムを使用して、それぞれ、サイズをｍおよびｎとする、２つのストリングＳおよびＡの局所的配列アライメントを実施する。この動的計画法では、表または行列を採用して、マッチスコアを保存し、一連のセルについての再計算を回避する。ストリングの各成分は、配列の文字に関するインデックスが付されていてもよく、すなわち、ＳがストリングＡＴＣＧＡＡであれば、Ｓ［１］＝Ａ、Ｓ［４］＝Ｇなどである。最適のアライメントをＨｉ，ｊ（上記）と表す代わりに、最適のアライメントは、下記の式（２）：
【数２】
2020042813.tif 000004
のＢ［ｊ，ｋ］と表すことができる。最大値関数であるＢ［ｊ，ｋ］の引数を、下記の式（３）〜（５）［式中、ＭＩＳＭＡＴＣＨ＿ＰＥＮＡＬＴＹ、ＭＡＴＣＨ＿ＢＯＮＵＳ、ＩＮＳＥＲＴＩＯＮ＿ＰＥＮＡＬＴＹ、ＤＥＬＥＴＩＯＮ＿ＰＥＮＡＬＴＹ、およびＯＰＥＮＩＮＧ＿ＰＥＮＡＬＴＹは、全て定数であり、ＭＡＴＣＨ＿ＢＯＮＵＳを除き、全て負である］に概括する。マッチの引数であるｐ［ｊ，ｋ］は、下記の式（３）：
【数３】
2020042813.tif 000005
で与えられ、挿入の引数であるｉ［ｊ，ｋ］は、下記の式（４）：
【数４】
2020042813.tif 000006
で与えられ、欠失の引数であるｄ［ｊ，ｋ］は、下記の式（５）：
【数５】
2020042813.tif 000007
で与えられる。３つの引数全てについて、［０，０］成分は、ゼロと置いて、バックトラックの完了を確認する、すなわち、ｐ［０，０］＝ｉ［０，０］＝ｄ［０，０］＝０とする。
【００１１】
スコア付けパラメータは、ある程度任意のものであり、計算の挙動を達成するように調整することができる。ＤＮＡのためのスコア付けパラメータ設定の一例（Ｈｕａｎｇ、３章：Ｂｉｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｃｏｍｐ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌシリーズ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．：  Ｔｈｅ  ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ、２００２年）であれば、
ＭＡＴＣＨ＿ＢＯＮＵＳ：１０
ＭＩＳＭＡＴＣＨ＿ＰＥＮＡＬＴＹ：−２０
ＩＮＳＥＲＴＩＯＮ＿ＰＥＮＡＬＴＹ：−４０
ＯＰＥＮＩＮＧ＿ＰＥＮＡＬＴＹ：−１０
ＤＥＬＥＴＩＯＮ＿ＰＥＮＡＬＴＹ：−５
となる。上記のギャップペナルティー（ＩＮＳＥＲＴＩＯＮ＿ＰＥＮＡＬＴＹ、ＯＰＥＮＩＮＧ＿ＰＥＮＡＬＴＹ）の間の関係は、ギャップ挿入ペナルティーを、ギャップオープニングコストより大きく設定することにより、ギャップオープニングの数を制限する、すなわち、ギャップをまとめてグループ化することを支援する一助となる。当然ながら、ＭＩＳＭＡＴＣＨ＿ＰＥＮＡＬＴＹ、ＭＡＴＣＨ＿ＢＯＮＵＳ、ＩＮＳＥＲＴＩＯＮ＿ＰＥＮＡＬＴＹ、ＯＰＥＮＩＮＧ＿ＰＥＮＡＬＴＹ、およびＤＥＬＥＴＩＯＮ＿ＰＥＮＡＬＴＹの間の代替的な関係も可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、４８巻（３号）：４４３〜４５３頁、１９７０年
【非特許文献２】Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１４７巻（１号）：１９５〜１９７頁、１９８１年
【非特許文献３】Ａｄｖ．  ｉｎ  Ｍａｔｈ．、２０巻（３号）：３６７〜３８７頁、１９７６年
【非特許文献４】Ｇｏｔｏｈ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１６２巻（３号）：７０５〜７０８頁、１９８２年
【非特許文献５】Ｈｕａｎｇ、３章：Ｂｉｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｃｏｍｐ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌシリーズ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．：  Ｔｈｅ  ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ、２００２年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
アライメントが完了したら、アラインされた配列を、基準（すなわち、遺伝的標準）と比較して、変異型を同定しうる配列を作製するように、アセンブルすることができる。変異型は、疾患、病期、再発などに関する洞察をもたらしうる。アミノ酸アライメントの場合、アセンブルされたアミノ酸配列を、標準と比較して、タンパク質についての進化情報またはタンパク質についての機能情報を決定することができる。しかし、変異型の多くは、疾患と必ずしも相関しているわけではないため、疾患比較のこの標準法は時間がかかる。例えば、遺伝的標準が、試料と異なる先祖を有する人口集団に由来する場合、判定される変異型の多くは、毛髪の色、皮膚の色などのことがらの差違に起因する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、アルゴリズムおよびその実行のための方法であって、例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ−Ｇｏｔｏｈなど、線形的な局所的配列アライメント工程を、並列化の増大、速度の増大、精度の増大、および全ゲノムを通してリードをアラインする能力をもたらす、多次元的アライメントアルゴリズムへと変換するアルゴリズムおよび方法を提供する。本発明のアルゴリズムは、配列情報（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎにおけるのと同様な）についての「遡及」型の解析をもたらすが、公知の線形的方法とは対照的に、本発明の遡及は、全般的なミスマッチ率、欠失率、および挿入率の低下を達成しながら、錯綜として長大な配列リードについてのより精密なアライメントをもたらすために、複数の経路および複数のノードを含む多次元空間を介して実行される。
【００１５】
実際的には、本発明は、配列リードを、一連の有向非巡回配列であって、アライメント内の、可能な配列変異の全てまたはほぼ全てであり、挿入、欠失、および置換を含む配列変異を構成する分枝点間にわたる配列にアラインすることにより実行される。有向非巡回グラフ（ＤＡＧ：ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｃｙｃｌｉｃ  ｇｒａｐｈ）として表示されることが多い、このような構築物は、「受け入れられた」基準配列および変異型判定フォーマット（ＶＣＦ：ｖａｒｉａｎｔ  ｃａｌｌ  ｆｏｒｍａｔ）のエントリーを含む、利用可能な配列データベースから容易にアセンブルすることができる。したがって、ＤＡＧまたは他の有向構築物と組み合わされると、開示されるアルゴリズムは、配列アライメントへの多次元手法であって、アライメントの精度を大幅に改善し、従来のアルゴリズムでは不可能な配列分解能を可能とする多次元手法をもたらす。実際、技法は、任意の配列情報と共に使用しうるが、本明細書で論じられる通り、核酸配列およびアミノ酸配列をアラインするのに最も有用である。
【００１６】
本発明は、加えて、基準配列構築物、例えば、ゲノムの各遺伝子座において公知の変異型を表示するＤＡＧを使用して、特異的な遺伝子座において、特異的な塩基判定を下す方法も提供する。配列リードは、アライメント時にＤＡＧにアラインされるため、突然変異を、基準ゲノムと突き合わせて、公知の突然変異についての表と比較する後続のステップを廃することができる。開示される方法を使用すると、それは、核酸リードを、ＤＡＧ上に表示される公知の突然変異に位置するものとして同定し、その突然変異を判定することであるに過ぎない。代替的に、突然変異が公知でない（すなわち、基準配列構築物内で表示されない）場合も、アライメントは見出され、変異型は、新たな突然変異として同定される。方法はまた、特異的な疾患の危険性または疾患の進行などのさらなる情報を、基準配列構築物へと組み込まれた公知の突然変異と関連付けることも可能とする。さらに、全ての遺伝学的に関連する結果を、アライメント時に見出す潜在的可能性を有することに加えて、開示される方法は、複数の基準配列との同時比較を可能としながら、アライメントの作製に求められる計算資源も縮減する。
【００１７】
本発明は、生物の配列内の位置において、公知の変異型を表示する、有向非巡回グラフ（ＤＡＧ）データ構造を構築するための方法もさらに含む。ＤＡＧは、何千箇所もの位置において、複数の配列を含むことが可能であり、各位置において、欠失、挿入、翻訳、逆位、および一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、複数の変異型を含みうる。また、ＤＡＧ内の各変異型に、「乳がん」など、相関する診断情報をタグ付けし、これにより、試料を提供する患者に対する危険性を同定するのに必要とされるステップを縮減することも可能である。一部の実施形態では、変異型を、スコア付けするか、重み付けするか、または他の変異型と相関させ、疾患についてのマーカーとしてその変異型の発生率を反映させることになろう。
【００１８】
本発明は、本発明の方法を実行するためのシステムもさらに含む。一実施形態では、システムは、複数の配列（すなわち、核酸配列、アミノ酸配列）を、ゲノム内またはゲノムの領域内で観察される変異を表示する基準配列構築物（例えば、ＤＡＧ）と比較することが可能な、プロセッサーおよび記憶装置の分散型ネットワークを含む。システムは、加えて、効率的なアライメントアルゴリズムを使用して、連続的な配列を作製するように、核酸リードをアラインすることが可能である。基準配列構築物は、膨大な冗長情報を圧縮し、アライメントアルゴリズムは、極めて効率的であるため、市販のリソースを使用して、全ゲノム上でリードにタグ付けし、アセンブルすることができる。システムは、複数のリードと基準配列構築物との複数の比較を同時に実行する複数のプロセッサーを含む。比較データは、蓄積し、医療提供者へと提示することができる。比較は、計算により扱いやすいため、配列リードの解析はもはや、ＮＧＳシーケンシングと患者の遺伝的危険性についての有意義な議論との間のボトルネックを表さないと予想される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１は、基準配列内の遺伝子変異を表示する有向非巡回グラフ（ＤＡＧ）の構築について描示する図である。図１（Ａ）は、出発基準配列および欠失の付加を示す図である。図１（Ｂ）は、挿入およびＳＮＰの付加であり、これにより、アライメントに使用される最終的なＤＡＧに到達することを示す図である。
【図１Ｂ】図１は、基準配列内の遺伝子変異を表示する有向非巡回グラフ（ＤＡＧ）の構築について描示する図である。図１（Ａ）は、出発基準配列および欠失の付加を示す図である。図１（Ｂ）は、挿入およびＳＮＰの付加であり、これにより、アライメントに使用される最終的なＤＡＧに到達することを示す図である。
【００２０】
【図２】図２は、有向非巡回グラフとして表示される、３つの変異型判定フォーマット（ＶＣＦ）のエントリーについて描示する図である。
【００２１】
【図３】図３（Ａ）は、核酸配列リードを、挿入イベントならびに基準配列からなる構築物にアラインすることについての、図解による表示である。図３（Ｂ）は、核酸配列リード「ＡＴＣＧＡＡ」の適正な場所を同定するのに使用される、行列およびバックトラックを示す図である。
【００２２】
【図４】図４は、並列処理のための連想計算モデルについて描示する図である。
【００２３】
【図５】図５は、並列計算のためのアーキテクチャーについて描示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列）を、基準配列構築物にアラインするための方法、基準配列構築物を構築するための方法、ならびにアライメント法および構築物を使用して、アライメントおよびアセンブリーを作製するシステムを含む。基準配列構築物は、下記で記載される、有向非巡回グラフ（ＤＡＧ）でありうるが、基準配列は、構築物が、アライメントのためにフォーマットされていることを条件として、種内の異なる生物の配列内の遺伝的変異性を反映する任意の表示でありうる。遺伝的変異性はまた、生物における異なる組織間または異なる細胞間の遺伝的変異性でもある。一般に、基準配列構築物は、サンプリングされた配列の間で同一な部分と、サンプリングされた配列の間で変化する部分とを含むと予想される。したがって、構築物は、同じ配列を含む位置（すなわち、いくつかのカノニカルの秩序付けに従う）と、遺伝的変異性を反映する代替配列を含むいくつかの位置とを有すると考えることができる。本出願は、加えて、核酸リードの、構築物内の場所に対するアライメントに基づき、疾患または遺伝子型を同定するための方法も開示する。方法は、遺伝子シーケンシングおよび突然変異スクリーニングの分野に広く適用可能である。
【００２５】
基準配列構築物
核酸リードをアラインして遺伝子型解析するのに単一の基準配列を使用する先行技術による配列アライメント法と異なり、本発明では、種内、集団内、なおまたは単一の生物における異なる細胞間の遺伝子配列の変異性を構成しうる構築物を使用する。遺伝子変異についての表示は、有向非巡回グラフ（ＤＡＧ）（上記で論じた）の行−列によるアライメント行列、またはｄｅＢｒｕｉｊｎグラフとして提示することができ、これらの構築物は、アライメントアルゴリズムのパラメータを適正に設定する（下記で論じる）ことを条件として、本発明のアライメント法と共に使用することができる。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態では、構築物は、有向非巡回グラフ（ＤＡＧ）である、すなわち、方向を有するが、巡回経路を有さない構築物である（すなわち、配列経路は、基準構築物上のある位置を１回より多く通って巡回し得ない）。ＤＡＧでは、配列内の遺伝子変異を、代替的なノードとして表示する。ノードは、保存的配列の区画の場合もあり、遺伝子の場合もあり、単に核酸の場合もある。構築物を通る、異なる可能な経路は、公知の遺伝子変異を表示する。ＤＡＧは、生物の全ゲノムについて構築することもでき、ゲノムの部分、例えば、染色体、または遺伝情報の小セグメントだけについて構築することもできる。一部の実施形態では、ＤＡＧは、１０００を超える核酸、例えば、１０，０００を超える核酸、例えば、１００，０００を超える核酸、例えば、１，０００，０００を超える核酸を表示する。ＤＡＧは、種（例えば、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）を表示する場合もあり、選択された集団（例えば、乳がんを有する女性）を表示する場合もあり、または同じ個体における異なる腫瘍細胞間の遺伝子変異など、さらに小さな部分集団を表示する場合もある。
【００２７】
ＤＡＧ構築の簡単な例を、図１に示す。図１（Ａ）に示される通り、ＤＡＧは、図１（Ａ）に配列番号１：ＣＡＴＡＧＴＡＣＣＴＡＧＧＴＣＴＴＧＧＡＧＣＴＡＧＴＣとして示される基準配列で始まる。実際的には、基準配列は、はるかに長いことが多く、全ゲノムでありうる。配列は、ＦＡＳＴＡファイルまたはＦＡＳＴＱファイルとして保存される（ＦＡＳＴＱは、次世代シーケンサーから作製された配列データのためのデフォルトフォーマットとなっている）ことが典型的である。一部の実施形態では、基準配列は、ＧＲＣｈ３７などの標準的な基準でありうる。当業者により認識される通り、配列内の各文字（または記号）は、実際的には、ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）またはアミノ酸（例えば、ヒスチジン、ロイシン、リシンなど）に対応する。
【００２８】
次のステップでは、図１（Ａ）の下図に示される通り、変異型を、基準配列へと付加する。図１（Ａ）に示される変異型は、図中の直線間の基準からの、配列「ＡＧ」の欠失である（すなわち、配列番号２）。図上では、この欠失を、基準配列を、欠失の前後でノードへと切断し、２つのストリングを、ノードの間に挿入することにより表示する。ノードの間の１つの経路は、基準配列を表示するが、他の経路は、欠失を表示する。
【００２９】
実際的には、変異型は、１０００  Ｇｅｎｏｍｅｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔウェブサイトで見出されうるＶＣＦファイルなどの、変異型判定フォーマット（ＶＣＦ）ファイル内のエントリーを適用することにより、ＤＡＧに照らして判定する。各ＶＣＦファイルは、特異的な基準ゲノムに適合させてあるため、ストリングがどこに位置するのかを同定することは、困難ではない。実際、ＶＣＦファイル内の各エントリーは、図２に表示される通り、基準と組み合わせて、別個のグラフを創出するエントリーと考えることができる。図２中のＶＣＦエントリーは、図１のＶＣＦエントリーに対応しないことに注目されたい。
【００３０】
図１（Ｂ）に移ると、特異的な位置における挿入「ＧＧ」に対応する、第２のＶＣＦエントリーを付加して、伸長型ＤＡＧ、すなわち、配列番号３および配列番号４を含むＤＡＧを作製する。次に、第３のＶＣＦエントリーを、伸長型ＤＡＧへと付加して、基準配列内の初期のＳＮＰ、すなわち、配列番号５〜８を含むＳＮＰを構成することができる。こうして、３つのステップで、核酸リードをアラインさせることができるＤＡＧが創出された（下記で論じられる）。
【００３１】
実際的には、ＤＡＧは、コンピュータメモリ内（ハードディスク、フラッシュメモリ、クラウドメモリなどの中）に、ノードのセットＳとして表示され、各ノードは、ストリング、親ノードのセット、および位置により規定される。ストリングとは、ノードの「内容物」、すなわち、配列であり、親ノードは、ノードの位置を、グラフ内の他のノードに照らして規定し、ノードの位置は、システム内のいくつかのカノニカルの秩序付け、例えば、基準ゲノムに対する位置である。グラフを、基準配列に照らして規定することが厳密に必要なわけではないが、これにより、出力データの操作が簡略となる。当然ながら、Ｓに対するさらなる制約は、それがループを含み得ないことである。
【００３２】
このＤＡＧ法を、大型の構造へと外挿することにより、基準の所与の領域について、遺伝子配列内の公知の変異を表示する、何千ものＶＣＦエントリーを組み込むＤＡＧを構築することが可能である。しかしながら、ＤＡＧが嵩高くなると、計算も長くかかるので、多くの適用では、配列の部分、例えば、染色体だけを表示しうる、小型のＤＡＧを使用する。他の実施形態では、ＤＡＧにより包含される集団のサイズを縮減することにより、例えば、乳がんにおける変異を表示するＤＡＧから、トリプルネガティブ乳がんにおける変異を表示するＤＡＧへと移行することにより、ＤＡＧを小型とすることができる。代替的に、試料間で不変である、ＤＡＧの大部分を結果としてもたらすことが典型的な、容易に同定される遺伝子マーカーに基づきカスタマイズされた、長大なＤＡＧも使用することができる。例えば、アフリカ系女性に由来する核酸リードのセットを、アフリカ系女性に由来するＶＣＦエントリーにより創出されたＤＡＧにアラインすれば、同じ配列にわたりヒトにおいて公知の全ての変異を構成するＤＡＧと比較して速いと予想される。本発明のＤＡＧは、それらが、時間の経過に応じて、新たに同定された突然変異を組み込むように改変されうるという点で、動的構築物であることを認識されたい。加えて、また、アライメント結果をＤＡＧへと再帰的に付加するアルゴリズムも可能である。
【００３３】
ストリング対ＤＡＧアライメントの場合は、ギャップペナルティーを、ギャップ挿入のコストをなおより大きくし、これにより、全体的な配列内の新たなギャップのオープニングではなく、配列に対するアライメントを支援するように調整することができる。当然ながら、ＤＡＧ内の改善（上記で論じた）により、突然変異は、ＤＡＧ内で構成されるため、ギャップの発生は、なおさらに減少するはずである。
【００３４】
アライメントアルゴリズム
一実施形態では、アルゴリズムを使用して、配列リードを、有向非巡回グラフ（ＤＡＧ）にアラインする。「発明の背景」で表されたアルゴリズムと異なり、アライメントアルゴリズムでは、ＤＡＧ（例えば、基準配列構築物）上の位置において含有される各配列に対する最大スコアを同定することにより、Ｃｉｊの最大値を同定する。実際、先行する位置を「振り返って」見ることにより、複数の可能な経路にわたり最適のアライメントを同定することが可能である。
【００３５】
本発明のアルゴリズムは、上記で論じた通り、リード（また「ストリング」としても公知）および有向非巡回グラフ（ＤＡＧ）上で実行される。アルゴリズムを規定する目的で、Ｓを、アラインされるストリングとし、Ｄを、Ｓがアラインされる有向非巡回グラフとする。ストリングＳの成分において、１で始まるインデックスがカッコ内に示される。したがって、ＳがストリングＡＴＣＧＡＡであれば、Ｓ［１］＝Ａ、Ｓ［４］＝Ｇなどである。
【００３６】
ＤＡＧでは、ノードの配列の各文字は、別個の成分であるｄとして表示されることになる。ｄの先行成分は、以下のように定義される。
（ｉ）ｄが、そのノードの配列の第１の文字でなければ、そのノード内のｄに先行する文字が、その（唯一の）先行成分であり、
（ｉｉ）ｄが、そのノードの配列の第１の文字であれば、任意のノードの配列の最後の文字であって、ｄのノードの親である文字が、ｄの先行成分である。
【００３７】
全ての先行成分のセットは、Ｐ［ｄ］として表示する。
【００３８】
「最良の」アライメントを見出すために、アルゴリズムでは、Ｓの最初のｊ個の成分の、ｄに先行する（およびｄを含む）ＤＡＧの部分による最適のアライメントについてのスコアである、Ｍ［ｊ，ｄ］の値を求める。このステップは、「発明の背景」節中の式１内のＨｉｊを見出すステップと同様である。具体的に、Ｍ［ｊ，ｄ］を決定するステップは、下記：
Ｍ［ｊ，ｄ］＝ｍａｘ｛ａ，ｉ，ｅ，０｝  （６）
［式中、
Ｐ［ｄ］中のｐ＊について、ｅ＝ｍａｘ｛Ｍ［ｊ，ｐ＊］＋ＤＥＬＥＴＥ＿ＰＥＮＡＬＴＹ｝
ｉ＝Ｍ［ｊ−１，ｄ］＋ＩＮＳＥＲＴ＿ＰＥＮＡＬＴＹ
Ｓ［ｊ］＝ｄならば、Ｐ［ｄ］中のｐ＊について、ａ＝ｍａｘ｛Ｍ［ｊ−１，ｐ＊］＋ＭＡＴＣＨ＿ＳＣＯＲＥ｝；
Ｓ［ｊ］≠ｄならば、Ｐ［ｄ］中のｐ＊について、ａ＝ｍａｘ｛Ｍ［ｊ−１，ｐ＊］＋ＭＩＳＭＡＴＣＨ＿ＰＥＮＡＬＴＹ｝
で規定される通り、ａ、ｉ、ｅ、および０のうちの最大値を見出すことを伴う。
【００３９】
上記で記載した通り、ｅとは、Ｓの最初のｊ個の文字の、ＤＡＧの部分であって、ｄまでであるが、ｄを含まない部分によるアライメントのうちの最高のスコアに、追加のＤＥＬＥＴＥ＿ＰＥＮＡＬＴＹを加えた値である。したがって、ｄが、ノードの配列の第１の文字でなければ、唯一の先行成分ｐが存在し、Ｓの最初のｊ個の文字の、ＤＡＧ（ｐまでであり、ｐを含む）によるアライメントスコアは、Ｍ［ｊ，ｐ］＋ＤＥＬＥＴＥ＿ＰＥＮＡＬＴＹと等しい。ｄが、そのノードの配列の第１の文字である場合、複数の可能な先行成分が存在することが可能であり、ＤＥＬＥＴＥ＿ＰＥＮＡＬＴＹは定数であるため、［Ｍ［ｊ，ｐ＊］＋ＤＥＬＥＴＥ＿ＰＥＮＡＬＴＹ］を最大化することは、先行成分を、Ｓの最初のｊ個の文字による最高のアライメントスコアと共に選択することと同じである。
【００４０】
式（６）では、ｉとは、ストリングＳの最初のｊ−１個の文字の、ｄまでであり、ｄを含むＤＡＧによるアライメントに、ＳＷにおける挿入引数の定義（式１を参照されたい）と同様のＩＮＳＥＲＴ＿ＰＥＮＡＬＴＹを加えた値である。
【００４１】
加えて、ａとは、Ｓの最初のｊ個の文字の、ＤＡＧの部分であって、ｄまでであるが、ｄを含まない部分によるアライメントのうちの最高のアライメントに、ＭＡＴＣＨ＿ＳＣＯＲＥ（Ｓのｊ番目の文字が、文字ｄと同じである場合）またはＭＩＳＭＡＴＣＨ＿ＰＥＮＡＬＴＹ（Ｓのｊ番目の文字が、文字ｄと同じでない場合）を加えた値である。ｅと同様に、これは、ｄが、そのノードの配列の第１の文字でなければ、唯一の先行成分、すなわち、ｐが存在することを意味する。これは、ａが、Ｓの最初のｊ−１個の文字の、ＤＡＧ（ｐまでであり、ｐを含む）によるアライメントスコア、すなわち、ｄとＳのｊ番目の文字とがマッチするのかどうかに応じて、ＭＩＳＭＡＴＣＨ＿ＰＥＮＡＬＴＹまたはＭＡＴＣＨ＿ＳＣＯＲＥを付加したＭ［ｊ−１，ｐ］であることを意味する。ｄが、そのノードの配列の第１の文字である場合、複数の可能な先行成分が存在しうる。この場合、｛Ｍ［ｊ，ｐ＊］＋ＭＩＳＭＡＴＣＨ＿ＰＥＮＡＬＴＹまたはＭＡＴＣＨ＿ＳＣＯＲＥ｝を最大化することは、先行成分を、Ｓの最初のｊ−１個の文字による最高のアライメントスコア（すなわち、Ｍ［ｊ−１，ｐ＊］の候補引数の最高値）と共に選択し、ｄとＳのｊ番目の文字とがマッチするのかどうかに応じて、ＭＩＳＭＡＴＣＨ＿ＰＥＮＡＬＴＹまたはＭＡＴＣＨ＿ＳＣＯＲＥを付加することと同じである。
【００４２】
ここでもまた、「発明の背景」で論じられたＳＷアルゴリズムの場合と同様に、ペナルティー、例えば、ＤＥＬＥＴＥ＿ＰＥＮＡＬＴＹ、ＩＮＳＥＲＴ＿ＰＥＮＡＬＴＹ、ＭＡＴＣＨ＿ＳＣＯＲＥ、およびＭＩＳＭＡＴＣＨ＿ＰＥＮＡＬＴＹは、少数のギャップを伴うアライメントを促すなどのように調整することができる。
【００４３】
上記の式で記載されている通り、アルゴリズムでは、各リードについて、その成分についての挿入スコア、欠失スコア、およびマッチスコアを計算するだけでなく、ＤＡＧ上の任意の先行ノードを振り返って見て（ＤＡＧの方向と反対方向に）、最大のスコアを見出すことにより、最大値を見出す。こうして、アルゴリズムは、ＤＡＧを通る異なる経路であって、公知の突然変異を含有する経路を横断的に検討することが可能である。グラフは有向であるため、グラフの方向と反対方向に移動するバックトラックは、グラフの起点に向かって好ましい変異型配列を追跡し、最大値のアライメントスコアは、最も可能性の高いアライメントを、高い確実性で同定する。上記の式は、「最大」値として表示されるが、「最大」は、例えば、式の全てにおいて記号を切り替え、最小値について解くことを含む、最適化の任意の形態を包含することを意図する。
【００４４】
開示されるアルゴリズムの実行について、図３で例示するが、ここで配列「ＡＴＣＧＡＡ」を、基準配列である配列番号１０：ＴＴＧＧＡＴＡＴＧＧＧと、公知の挿入イベントである
【化１】
2020042813.tif 000008
［配列中、挿入には下線を付す］とを表示するＤＡＧにアラインする。図３（Ａ）が、ＤＡＧと比較されるリードについての図解による表示を示すのに対し、図３（Ｂ）は、比較に対応する実際の行列を示す。「発明の背景」で論じられたＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ法と同様に、本発明のアルゴリズムでは、最高のスコアを同定し、バックトラックを実施して、リードの適正な場所を同定する。図３（Ａ）およびＢまた、本発明が、ストリングについて、構築物に対する実際のマッチをもたらすのに対し、公知の方法（例えば、ＳＷ）であったら、ストリングを、基準の誤った部分にアラインする、またはストリングを、アライメント内に含まれるのに十分に高いアライメントスコアをもたらさないものとして棄却した可能性が高いことも強調する。配列リードが、ＤＡＧ内に含まれていなかった変異型を含む場合、アラインされた配列は、ギャップ、挿入などを伴うと報告されると予想される。
【００４５】
並列化の可能性
Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ−Ｇｏｔｏｈアルゴリズムの逐次形は、大規模な並列化に適応し、大幅に改変されている。例えば、超並列連想処理を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ法（ＳＷＡＭＰ）と呼ばれるＡＳＣモデルについては、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１２／０２３９７０６号において記載されている。ＳＷＡＭＰ（および他の並列処理システム）のための並列化の一部は、任意の反対角成分に沿った値が、互いから独立であるという事実から来る。こうして、所与の反対角成分に沿ったセルの全ては、計算資源を分散させるように、並列的に処理することができる。上記の再帰式で示されたデータの依存性により、達成可能な並列処理のレベルは制限されるが、ウェーブフロント法を使用することにより、この有用なアルゴリズムはさらに加速化されると予想される。Ｗｏｚｎｉａｋ（Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  ｉｎ
ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＢＩＯＳ）、１３巻（２号）：１４５〜１５０頁、１９９７年）により、Ｓｕｎ  Ｕｌｔｒａ  ＳＰＡＲＣ上で実行されるウェーブフロント法では、特化したＳＩＭＤ様のビデオ処理命令を使用する。Ｗｏｚｎｉａｋは、ＳＩＭＤレジスターを使用して、副対角成分に沿った値を保存したところ、同じマシン上の従来の実行に対して２倍の加速化を報告している。Ｗｏｚｎｉａｋの例に続く、コードを並列化する同様の様式は、ストリーミングＳＩＭＤ拡張（ＳＳＥ：Ｓｔｒｅａｍｉｎｇ  ＳＩＭＤ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）セットを、ｘ８６アーキテクチャーに使用することである。Ｉｎｔｅｌにより設計されたベクトル様演算では、少数の値（通例、４つ、８つ、または１６の値）に対する単一の演算／命令を、一度に完了させる。多くのＡＭＤ製チップおよびＩｎｔｅｌ製チップが、ＳＳＥの多様なバージョンを支援しており、Ｉｎｔｅｌでは、その最新チップセットのためのアドバンストベクトルエクステンション（ＡＶＸ）に関して、この技術の開発を継続している。
【００４６】
他の実行では、ＲｏｇｎｅｓおよびＳｅｅｂｅｒｇ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、１６巻（８号）：６９９〜７０６頁、２０００年）は、Ｉｎｔｅｌ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）プロセッサーを、ＳＳＥの先行成分に対して使用し、ＭＭＸ  ＳＩＭＤ命令を、それらの実行のために使用している。ＲｏｇｎｅｓおよびＳｅｅｂｅｒｇ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１６巻（８号）：６９９〜７０６頁、２０００年）による、ＰａｒＡｌｉｇｎのための作業から開発された手法では、ウェーブフロント法を使用しない（Ｒｏｇｎｅｓ、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２９巻（７号）：１６４７〜５２頁、２００１年；Ｓａｅｂｏら、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３３巻（増刊２号）：Ｗ５３５〜Ｗ５３９頁、２００５年）。代わりに、彼らは、クエリー配列と並行にＳＩＭＤレジスターをアラインさせ、あらかじめ計算されたクエリー特異的なスコア行列を使用して、８つの値を一度に計算する。この方法のさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．７，９１７，３０２において見出すことができる。ＲｏｇｎｅｓおよびＳｅｅｂｅｒｇが、ＳＩＭＤレジスターを位置特定する方式である、ノースネイバー依存方式によれば、ＳＳＥによる並列「ベクトル」計算から得られる潜在的加速化のうちの最大３分の１が失われうると予想される。これを克服するために、彼らは、ＳＷＡＴ様最適化を組み込んでいる。アフィンギャップペナルティーを大きくすると、ノーザンネイバーは、大半の場合にゼロとなろう。これが成り立つなら、プログラムは、ノースネイバーの値の計算をスキップすることが可能であり、これを、Ｆａｒｒａｒ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２３巻（２号）：１５６〜１６１頁、２００７年）は、「Ｆ遅延評価」と称している。ＲｏｇｎｅｓおよびＳｅｅｂｅｒｇの方法では、ノースネイバーの値がある特定の閾値を下回る場合には、それをスキップすることにより、式１の計算回数を縮減して、それらのアルゴリズムを加速化することが可能である。ＲｏｇｎｅｓおよびＳｅｅｂｅｒｇ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１６巻（８号）：６９９〜７０６頁、２０００年では、ＭＭＸ／ＳＳＥ命令およびＳＷＡＴ様拡張を介する８元ベクトルを使用して、６倍の加速化が報告されている。
【００４７】
Ｆａｒｒａｒ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２３巻（２号）：１５６〜１６１頁、２００７年）によりなされたＳＳＥ作業では、ストライプパターンまたはストライドパターンのアクセスを使用して、ＳＩＭＤレジスターを、クエリーレジスターに沿って直線状に並べる。このようにすることにより、いかなる依存性の重複も回避される。ここでもまた、ＳＷＡＴ様最適化（Ｆａｒｒａｒ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２３巻（２号）：１５６〜１６１頁、２００７年）を組み込むことにより、Ｗｏｚｎｉａｋ（ＣＡＢＩＯＳ、１３巻（２号）：１４５〜１５０頁、１９９７年）およびＲｏｇｎｅｓおよびＳｅｅｂｅｒｇ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、１６巻（８号）：６９９〜７０６頁、２０００年）によるＳＩＭＤ実装に対して、２〜８倍の加速化が達成されている。ブロック置換行列、および効率的で巧妙な内部ループであって、ノーザン（Ｆ）条件により、その内部ループの外部へと移動させた内部ループは、重要な最適化である。１６ビットエレメント、８ビットエレメントの処理のための、ストライドパターンによるメモリアクセスもまた、メモリアクセス時間を改善し、全体的な加速化に寄与する。
【００４８】
Ｆａｒｒａｒ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、２００８年）は、ソニー、東芝、およびＩＢＭにより製造されたＣｅｌｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒのために、自身の作業を拡張した。このＣｅｌｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒは、１つの主コアおよび８つの副コアを有する。Ｃｅｌｌ  Ｂｒｏａｄｂａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅは、複数のさらなるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ実装であって、いずれもＦａｒｒａｒのストライピング法を使用する、Ｓｚａｌｋｏｗｓｋｉら（ＢＭＣ  Ｒｅｓ  Ｎｏｔｅｓ、１巻（１０７号）、２００８年）によるＳＷＰＳ３、およびＷｉｒａｗａｎら（ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、９巻（３７７号）、２００８年）によるＣＢＥＳＷを含む実装のための、開発プラットフォームであった。Ｒｕｄｎｉｃｋｉら（Ｆｕｎｄ  Ｉｎｆｏｒｍ．、９６巻、１８１〜１９４頁、２００９年）は、ＰＳ３を使用して、複数のデータベース配列にわたる並列化を使用する方法を開発した。
【００４９】
Ｒｏｇｎｅｓ（ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１２巻（２２１号）、２０１１年）はまた、ＳＷＩＰＥと呼ばれるマルチスレッド法であって、複数のデータベース配列を、並列的に処理するマルチスレッド法も開発している。焦点は、ＳＩＭＤ法を、「通常のＣＰＵ」上で使用することであった。粗視化並列処理を使用するこの探索は、複数のデータベース配列を並列的に使用する作業を分割するものであり、これは、Ｌｉｕら（ＢＭＣ  Ｒｅｓ  Ｎｏｔｅｓ、２巻（７３号）、２００９年）ならびにＬｉｇｏｗｓｋｉおよびＲｕｄｎｉｃｋｉ（Ｅｉｇｈｔ  Ａｎｎｕａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｒｏｍｅ、２００９年）によるＣＵＤＡＳＷで説明されている画像処理装置（ＧＰＵ：ｇｒａｐｈｉｃｓ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  ｕｎｉｔ）ベースのツールと同様である。ＧＰＵ作業の他の実装は、Ｌｉｕら（ＢＭＣ  Ｒｅｓ  Ｎｏｔｅｓ、３巻（９３号）、２０１０年）およびＬｉｇｏｗｓｋｉら（ＧＰＵ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｅｍｓ，  Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍｏｒｇａｎ  Ｋａｕｆｍａｎｎ、１５５〜１５７頁、２０１１年）によるＣＵＤＡＳＷ＋＋２．０でなされている。
【００５０】
他の変化形では、小スケールのベクトルによる並列化（８、１６、または３２元の並列処理）を、複数の配列を並列的にアラインするＧＰＵ実装を介して、計算をアクセス可能とするのに使用することができる。計算の理論的なピーク加速化は、最適な加速化であるｍ倍である。９６の処理エレメントを使用する、ＣｌｅａｒＳｐｅｅｄ実装について、９６倍の加速化がなされることから、理論的な加速化が確認される。
【００５１】
並列計算モデル
Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ配列アライメントを開発および拡張するのに使用される、主要な並列モデルは、連想計算（ＡＳＣ：ＡＳｓｏｃｉａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）（Ｐｏｔｔｅｒら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ、２７巻（１１号）：１９〜２５頁、１９９４年）である。本明細書では、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムの効率的な並列バージョンが記載される。本節では、このモデルおよび他の１つのモデルが詳細に記載される。
【００５２】
ここでは、いくつかの関連する語彙が定義される。フリンによるコンピュータアーキテクチャーの分類法からの２つの目的の用語は、並列計算の２つの異なるモデルである、ＭＩＭＤおよびＳＩＭＤである。複数命令複数データ（ＭＩＭＤ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｄａｔａ）モデルと分類される、コンピュータクラスターを、超大スケールのアライメントにおけるメモリの限界を克服する概念実証として使用する。第８節では、ＭＩＭＤモデルの使用法について記載する。また、ＡＳＣとして公知の、拡張型データ並列単一命令複数データ（ＳＩＭＤ：ｓｉｎｇｌｅ−ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｄａｔａ）モデルについても記載される。
【００５３】
複数命令複数データ（ＭＩＭＤ）
複数命令複数データモデルまたはＭＩＭＤモデルは、現在利用可能な並列システムの大半について記載するものであり、最新の一般用コンピュータクラスターを含む。ＭＩＭＤプロセッサーは、各々がそれ固有のローカルメモリを伴う（Ｑｕｉｎｎ、Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、２版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、１９９４年）、本格的中央処理装置（ＣＰＵ：ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｕｎｉｔ）を有する。ＳＩＭＤモデルと異なり、ＭＩＭＤプロセッサーの各々は、それ固有のプログラムを、非同期的に保存および実行する。ＭＩＭＤプロセッサーは、それらが通信することを可能とするネットワークを介して接続されるが、使用されるネットワークは、マシン（クラスターノード）間のＥｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）接続、Ｍｙｒｉｎｅｔ接続、およびＩｎｆｉｎｉＢａｎｄ接続にわたり、広く変化しうる。通信は、ＳＩＭＤよりはるかに拘束の緩やかな通信構造を採用する傾向があり、単一のユニット内に収まらない。データは、ネットワークに沿って、個々のプロセッサーにより、それらが実行しつつある、それらの個々のプログラムの制御下で、非同期的に移送される。通信は、メッセージの送受信を支援する複数の異なる並列言語のうちの１つにより操作されることが典型的である。このための極めて一般的なライブラリーは、メッセージパッシングインターフェース（ＭＰＩ）として公知である。「ＳＩＭＤ様」方式の通信も可能であるが、データの移動は、非同期的となろう。ＭＩＭＤによる並列計算は通例、プロセッサーにより実行される多様なタスクが、高度に独立（すなわち、いわゆる「驚異的並列（ｅｍｂａｒｒａｓｓｉｎｇｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ）」問題または「完全並列（ｐｌｅａｓｉｎｇｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ）」問題）でない限りにおいて、広範な通信および頻繁な同期化を必要とする。第８節で提示される作業では、ＩｎｆｉｎｉＢａｎｄを介して接続された、ＡＭＤ  Ｏｐｔｅｒｏｎクラスターを使用する。
【００５４】
ＳＩＭＤと異なり、メッセージの送受信に必要とされる最悪の場合の時間は、予測するのが困難であるかまたは不可能である。ＭＩＭＤソフトウェアのためのメッセージの送受信の実行時間は、ＳＩＭＤに典型的な、最悪の場合の理論的な査定によってではなく、試行により決定されることが多い、平均的な場合の推定値を使用して決定することが典型的である。ＭＩＭＤソフトウェアの最悪の場合は、極めて悪いことが多く、生じるのはまれであるので、平均的な場合の推定値がはるかに有用である。結果として、特定の問題についてＭＩＭＤに必要とされる通信時間は、ＳＩＭＤの場合より顕著に長くなる可能性があり、通例、顕著に長い。これにより、ＭＩＭＤのプログラミング（とりわけ、メッセージの送受信を使用する場合）における重要な目標であって、必要とされるプロセッサー間通信の数を最小化し、プロセッサー通信間の時間の長さを最大化するという目標がもたらされる。これは、画像処理装置またはＧＰＵを使用する場合など、単一のカードによる加速化レベルでもなお成り立つ。
【００５５】
また、データ並列プログラミングも、ＭＩＭＤのプログラミングで重要な技法であるが、この場合、全てのタスクは、異なるデータに対して同じ演算を実施し、多様な臨界点に限り同期化される。ＭＩＭＤシステムのためのアルゴリズムの大半は、単一プログラム複数データ（ＳＰＭＤ：Ｓｉｎｇｌｅ−Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−Ｄａｔａ）プログラミングパラダイムで書き込まれる。各プロセッサーは、同じプログラムのそれ固有のコピーであって、そのプロセッサーまたはコアに特異的なコードセクションを、そのローカルデータに対して実行するコピーを有する。ＳＰＭＤパラダイムの一般性は、多数の異なるプログラムであって、異なるプロセッサーにわたり共時的に実行され、なおかつ、単一の問題を解くのに協同することが可能なプログラムを書き込むことは極めて困難であるという事実から来る。メモリ集約的ではあるが、計算集約的ではない問題に使用される別の手法は、第８節で提示される作業を使用して、ＪｕｍｂｏＭｅｍによりなされる通り、バーチャルメモリサーバーを創出することである。ここでは、その基礎となる実行においてＭＰＩが使用される。
【００５６】
単一命令複数データ（ＳＩＭＤ）
ＳＩＭＤモデルは、ＰＥと呼ばれる、複数の単純な演算処理エレメント（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）からなる。各ＰＥは、それ固有のローカルメモリであって、ＰＥがそこからフェッチおよび保存するメモリは有するが、プログラムをコンパイルまたは実行する能力は有さない。本明細書で使用される「並列メモリ」という用語は、計算システム内のローカルメモリを集合的に指す。例えば、並列メモリは、ＳＩＭＤコンピュータシステム内のローカルメモリの集合体（例えば、ＰＥのローカルメモリ）、ＭＩＭＤコンピュータシステム内のプロセッサーのローカルメモリの集合体（例えば、中央処理装置のローカルメモリ）などでありうる。プログラムのコンパイルおよび実行は、制御装置（またはフロントエンド）と呼ばれるプロセッサーにより操作される（Ｑｕｉｎｎ、Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、２版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、１９９４年）。制御装置は、通例はバスにより、全てのＰＥへと接続される。
【００５７】
全てのアクティブなＰＥは、制御装置から受信されたプログラムの命令を、ロックステップで、同期的に実行する。「いかなる時間単位においても、単一の演算は、複数の処理装置であって、各々が異なるデータを操作する処理装置上で、同じ実行状態にある」（Ｑｕｉｎｎ、Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、２版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、１９９４年、７９頁）。全てのアクティブなＰＥは、同じ命令を、同時に並列的に実行するが、いくつかのＰＥは、任意の特定の命令をスキップすることを許容されうる（Ｂａｋｅｒ、ＳＩＭＤ  ａｎｄ  ＭＡＳＣ：  Ｃｏｕｒｓｅ  ｎｏｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ＣＳ６／７３３０１：Ｐａｒａｌｌｅｌ  ａｎｄ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ−−ｐｏｗｅｒ  ｐｏｉｎｔ  ｓｌｉｄｅｓ、（２００４年）２００４年）。これは通例、ＰＥのうちの一部が、ｉｆ命令を実行し、残りのＰＥが、ｅｌｓｅ部分を実行する、「ｉｆ−ｅｌｓｅ」分枝構造を使用して達成される。このモデルは、「データ並列的」な性質の問題であって、たかだか少数のｉｆ−ｅｌｓｅ分枝構造であり、図像処理および行列演算など、同時に生じうる分枝構造を有する問題に理想的である。
【００５８】
制御装置は、データを、全てのアクティブなＰＥへと散布することができ、制御装置はまた、制御装置とＰＥとの接続（通例、バス）を使用して、データ値を、特定のＰＥから得ることもできる。加えて、ＰＥのセットは、直線状アレイ、２Ｄメッシュ、またはハイパーキューブなどの相互接続ネットワークであって、ＰＥ間の並列データの移動をもたらす相互接続ネットワークによっても接続される。データは、このネットワークを通して、同期的並列方式で、ＰＥにより移送され、ＰＥは、データの移動を含む命令を、ロックステップで実行する。命令を、ＰＥへと散布するのは、制御装置である。特に、ＳＩＭＤネットワークは、今日大半の並列コンピュータにより使用される、メッセージ送受信パラダイムを使用しない。このことの重要な利点は、ＳＩＭＤネットワークによる通信は、極めて効率的であり、通信に必要とされる最大の時間を、その特定の通信を制御するアルゴリズムの最悪の場合の時間により決定しうることである。
【００５９】
本節の残りは、拡張型ＳＩＭＤ  ＡＳＣモデルについて記載することに充てる。ＡＳＣは、本論のためのアルゴリズムの設計および開発の中心にある。
【００６０】
連想計算モデル
連想計算（ＡＳＣ）モデルとは、Ｇｏｏｄｙｅａｒ  ＡｅｒｏｓｐａｃｅのＫｅｎｎｅｔｈ  Ｂａｔｃｈｅｒ博士により設計されたＳＩＭＤ式連想コンピュータであるＳＴＡＲＡＮ、および米国海軍で大いに活用されているその後継モデルであるＡＳＰＲＯに基づく拡張型ＳＩＭＤである。
【００６１】
ケント州立大学コンピュータ科学科で開発された、ＡＳＣとは、連想計算のためのアルゴリズムモデルである（Ｐｏｔｔｅｒら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ、２７巻（１１号）：１９〜２５頁、１９９４年）（Ｐｏｔｔｅｒ、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  Ｐａｒａｄｉｇｍ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９９２年）。ＡＳＣモデルは、Ｇｏｏｄｙｅａｒ  Ａｅｒｏｓｐａｃｅにより組み立てられた連想プロセッサーであるＳＴＡＲＡＮ上およびＭＰＰ上の作業から生じた。現在ハードウェアではサポートされていないが、現在の研究努力は、このモデルを効率的にシミュレートし、かつ、このモデルのためにコンピュータを設計しようとしてなされている。
【００６２】
拡張型ＳＩＭＤモデルとして、ＡＳＣでは、マルチタスク処理および非同期的二点間通信経路決定の両方を回避する、同期的データ並列プログラミングを使用する。いかなる時点においても、１つのタスクだけが実行され、このタスクの複数のインスタンスは、全てのアクティブな処理エレメント（ＰＥ）上で、ロックステップで実行されるので、マルチタスク処理は、不要である。ＳＩＭＤプログラマーと同様、ＡＳＣも、ロードバランシング、同期化、および動的タスクスケジューリングを伴う課題、ＭＰＩパラダイムおよび他のＭＩＭＤクラスターパラダイムでは明示的に取り組まなくてはならない問題を回避する。
【００６３】
図４は、ＡＳＣコンピュータの概念モデルを示す。命令列（ＩＳ）としてもまた公知の、単一の制御装置と、各々がそれ固有のローカルメモリを伴う、複数の処理エレメント（ＰＥ）とが見られる。制御装置とＰＥアレイとは、散布／低減ネットワークを介して接続され、ＰＥは、ＰＥデータ相互接続ネットワークを介して一体に接続される。
【００６４】
図４で見られる通り、ＰＥは、それ固有のローカルメモリ内に位置特定されたデータへのアクセスを有する。データは、その場にとどまり、応答する（アクティブな）ＰＥが、それらのローカルデータを並列的に処理する。連想という語に対する言及は、データを、メモリアドレスではなく、内容により位置特定しようとする検索の使用に関する。ＡＳＣモデルでは、連想メモリを採用せず、その代わりに、ＡＳＣモデルとは、一般的なサイクルが、検索する〜処理する〜読み出すである、連想プロセッサーである。ＡＳＣモデルについての概観は、Ｐｏｔｔｅｒら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ、２７巻（１１号）：１９〜２５頁、１９９４年において入手可能である。
【００６５】
アルゴリズムの表解的性格は、それ自体、ＡＳＣデータ構造本来の表解的構造に起因して、ＡＳＣを使用する計算をもたらす。ＳＷＡＭＰでは、ロックステップによるノースネイバーおよびノースウェストネイバーのデータシフトのための、ＰＥ相互接続ネットワークにわたる、高度に効率的な通信、ならびに検索および並列計算にわたる最大値のための、小定数時間による連想機能を十分に活用する。
【００６６】
連想演算は、ＡＳＣモデルにより必要とされる、さらなるハードウェアに起因して、定数時間で実行される（Ｊｉｎら、１５ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  ａｎｄ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（ＩＰＤＰＳ’Ｏｌ）Ｗｏｒｋｓｈｏｐｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９３頁、２００１年）。これらの演算は、任意のＳＩＭＤ様マシンにより、効率的に（それほど速くはないが）実施することができ、複数のＳＩＭＤハードウェアプラットフォーム上で、効率的になされるように適応させることに成功している（Ｙｕａｎら、Ｐａｒａｌｌｅｌ  ａｎｄ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＰＤＣＳ）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、２００９年；Ｔｒａｈａｎら、Ｊ．  ｏｆ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  ａｎｄ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ（ＪＰＤＣ）、２００９年）。したがって、ＳＷＡＭＰアルゴリズムおよび他のＡＳＣアルゴリズムは、ＳＩＭＤと近縁の他のシステムであって、ベクトルマシンを含むシステム上でも効率的に実行することができ、このために、モデルは、パラダイムとして使用されている。
【００６７】
制御装置は、プログラムの命令を、フェッチおよび解読し、制御信号を、ＰＥへと散布する。ＰＥは、制御装置の指示下で、それらの固有のローカルデータを使用して、これらの命令を実行する。全てのＰＥは、命令を、命令間の暗黙の同期化を伴って、ロックステップ方式で実行する。ＡＳＣは、複数の関与性の高速大域処理：連想検索、最大値／最小値検索、およびレスポンダーの選択／検出を有する。これらについては、以下の節において記載される。
【００６８】
連想機能
ＳＷＡＭＰアルゴリズムに関与性の機能については、下記で論じる。
【００６９】
連想検索
ＡＳＣアルゴリズムにおける基礎的演算は、連想検索である。連想検索では、そのローカルデータが、所与の検索キーにマッチするＰＥを、同時に位置特定する。マッチするデータを有するＰＥは、レスポンダーと呼ばれ、非マッチしないデータを伴うＰＥは、非レスポンダーと呼ばれる。検索を実施した後、次いで、アルゴリズムは、非レスポンダーを無効化することにより、さらなる処理を、レスポンダーに影響を及ぼす処理だけに制限することができる（またはこの逆も成り立つ）。さらなる検索を実施することにより、レスポンダーのセットをさらに精緻化することができる。連想検索は、どのＰＥが、対角成分内の並列動作中でアクティブなのかを選択するときに、ＳＷＡＭＰ＋により大いに活用される。
【００７０】
最大値／最小値検索
各ＰＥが、標準的な比較演算子（等しい、未満など）を使用して、そのローカルデータを、検索キーに照らして比較する、単純検索に加えて、連想コンピュータはまた、全ＰＥアレイからのデータを一体に組み合わせて、レスポンダーのセットを決定する、大域検索も実施しうる。大域検索の最も一般的な種類は、レスポンダーを、それらのデータが、全ＰＥアレイにわたる最大値または最小値であるＰＥとする、最大値／最小値検索である。ＳＷＡＭＰ＋は、それが処理するあらゆる対角成分内で最大値を使用して、それまでに計算された最高値を追跡する。最大値検索の使用は、高頻度で、論理的並列動作において１回ずつ、アライメント１つ当たりｍ＋ｎ回生じる。
【００７１】
レスポンダーの選択／検出
連想検索は、複数のレスポンダーを結果としてもたらすことが可能であり、連想アルゴリズムは、３つの異なるモード：並列選択、逐次選択、または単独選択のうちの１つにおいて、これらのレスポンダーを処理しうる。並列レスポンダー処理では、同じ演算セットを、各レスポンダーに対して、同時に実施する。逐次レスポンダー処理では、各レスポンダーを、個別に選択し、各レスポンダーについて、異なる演算セットを許容する。単独レスポンダー選択（ｐｉｃｋＯｎｅとしてもまた公知の）では、１つの任意選択されたレスポンダーを選択して、処理にかける。複数のレスポンダーに加えてまた、連想検索は、レスポンダーを結果としてもたらさない可能性もある。この場合を取り扱うために、ＡＳＣモデルでは、その場合に、別個のアクションのセットを検索および実施するのに何らかのレスポンダー（ａｎｙＲｅｓｐｏｎｄｅｒｓとして公知の）が存在するのかどうかを検出することが可能である。ＳＷＡＭＰでは、アラインされた文字を含有する複数のレスポンダーを、上述の連想検索に基づき、並列的に選択および処理する。単独レスポンダー選択は、最大値／最小値検索を使用する場合に、正確な同じ最大値を有する複数の値が存在すれば、その時点で生じる。
【００７２】
ＰＥ相互接続ネットワーク
大半の連想プロセッサーは、アレイ内の並列データの移動を可能とする、いくつかの種類のＰＥ相互接続ネットワークを含む。ＡＳＣモデルそれ自体は、任意の特定の相互接続ネットワークを指定せず、実際、多くの有用な連想アルゴリズムは、相互接続ネットワークを必要としない。連想プロセッサーは、１Ｄ直線状アレイまたは２Ｄメッシュなど、単純なネットワークを実装することが典型的である。これらのネットワークは、実装が簡単であり、データを、迅速に、同期方式で転送することを可能とする。例えば、１Ｄ直線状アレイは、ＳＷＡＭＰアルゴリズムにおける、ＰＥ間の明示的通信に十分である。
【００７３】
並列計算システム
一般化された並列処理アーキテクチャーを、図５に示す。各コンポーネントは、直接的な接続を有するものとして示されるが、多様なエレメントは、地理的に隔てられうるが、ネットワーク、例えば、インターネットを介して、接続されうることを理解されたい。ハイブリッドコンフィギュレーションも可能であるが、並列コンピュータ内のメインメモリは、単一のアドレス空間内の全ての処理エレメント間で共有されているか、または分散されている、すなわち、各処理エレメントが、それ固有のローカルアドレス空間を有する（分散型メモリとは、メモリが論理的に分散されているという事実を指すがまた、それが、物理的に分散されていることもしばしば示唆する）ことが典型的である。処理エレメントが、それ固有のローカルメモリおよび非ローカルプロセッサー上のメモリへのアクセスを有する場合、分散型共有メモリおよびメモリの視覚化は、２つの手法を組み合わせる。ローカルメモリへのアクセスは、非ローカルメモリへのアクセスより速いことが典型的である。
【００７４】
メインメモリの各エレメントに、等しい待ち時間およびバンド幅でアクセスしうる、コンピュータアーキテクチャーは、ユニフォームメモリアクセス（ＵＭＡ：Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ａｃｃｅｓｓ）システムとして公知である。ＵＭＡは、メモリが物理的に分散されていない、共有メモリシステムだけにより達成しうることが典型的である。この特性を有さないシステムは、非ユニフォームメモリアクセス（ＮＵＭＡ：Ｎｏｎ−Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ａｃｃｅｓｓ）アーキテクチャーとして公知である。分散型メモリシステムは、非ユニフォームメモリアクセスを有する。
【００７５】
プロセッサー間通信およびプロセッサー−メモリ間通信は、共有（マルチポート型またはマルチプレックス型）メモリ、クロスバースイッチ、共有バス、またはスター、リング、ツリー、ハイパーキューブ、ファットハイパーキューブ（ノードにおいて複数のプロセッサーを伴うハイパーキューブ）、またはｎ次元メッシュを含む無数のトポロジーを有する相互接続ネットワークを介する方式を含む、複数の方式で、ハードウェア内に実装することができる。
【００７６】
相互接続されたネットワークに基づく並列コンピュータは、直接的に接続されていないノード間のメッセージの送受信を可能とする経路決定を組み込まなければならない。プロセッサー間の通信に使用される媒体は、大型のマルチプロセッサーマシン内で階層的である可能性が高い。このようなリソースは、専用で市販されているか、または「クラウド」、例えば、アマゾンクラウドコンピューティングを介して、これらのリソースにアクセスすることができる。
【００７７】
コンピュータは一般に、バスを介してメモリへと連結されたプロセッサーを含む。メモリは、ＲＡＭまたはＲＯＭを含むことが可能であり、少なくとも１つの有形の非一時的メディアであって、システムに、本明細書で記載される機能を果たさせるように実行可能な命令保存するメディアを含むことが好ましい。当業者であれば、本発明の方法の実施に必要であるかまたは最適であると認識する通り、本発明のシステムは、バスを介して互いに通信する、１または複数のプロセッサー（例えば、中央処理装置（ＣＰＵ）、画像処理装置（ＧＰＵ）など）、コンピュータ可読記憶装置（例えば、メインメモリ、スタティックメモリなど）、またはこれらの組合せを含む。
【００７８】
プロセッサーは、当技術分野で公知の、任意の適切なプロセッサーであって、Ｉｎｔｅｌ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）により、ＸＥＯＮ  Ｅ７という商標で販売されているプロセッサー、またはＡＭＤ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）により、ＯＰＴＥＲＯＮ  ６２００という商標で販売されているプロセッサーなどのプロセッサーでありうる。
【００７９】
メモリは、コンピュータ可読記憶装置を指す場合があり、命令（例えば、本明細書で見出される任意の方法または機能を統合するソフトウェア）、データ（例えば、を統合すること患者の染色体内で見出される遺伝子配列など、任意の有形の物理オブジェクト）、またはこれらの両方の１または複数のセットが保存された、任意のマシン可読メディアを含みうる。例示的な実施形態では、コンピュータ可読記憶装置は、単一のメディアでありうるが、「コンピュータ可読記憶装置」という用語は、命令またはデータの１または複数のセットを保存する、単一のメディアまたは複数のメディア（例えば、集中型データベースもしくは分散型データベース、ならびに／または関連するキャッシュおよびサーバー）を含むものと理解されたい。したがって、「コンピュータ可読記憶装置」という用語は、限定なしに述べると、ソリッドステートメモリ（例えば、加入者識別モジュール（ＳＩＭ）カード、セキュアディジタルカード（ＳＤカード）、マイクロＳＤカード、またはソリッドステートドライブ（ＳＳＤ））、光学メディアおよび磁気メディア、ならびに他の任意の有形記憶メディアを含むものと理解されたい。好ましくは、コンピュータ可読記憶装置は、有形の非一時的メディアを含む。このような非一時的メディアは、例えば、一過性の波動および信号を除外する。「非一時的メモリ」は、信号それ自体など、コンピュータ可読伝送媒体を除外すると解釈されたい。
【００８０】
本発明に従う入力／出力デバイスは、ビデオディスプレイ装置（例えば、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）またはブラウン管（ＣＲＴ）モニター）、英数字入力デバイス（例えば、キーボード）、カーソル制御デバイス（例えば、マウスまたはトラックバッド）、ディスクドライブ装置、信号発生器（例えば、スピーカー）、タッチスクリーン、加速度計、マイクロフォン、セルラー式ラジオ波アンテナ、および、例えば、ネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）、Ｗｉ−Ｆｉカード、またはセルラー式モデムでありうる、ネットワークインターフェースデバイスを含みうる。
【００８１】
試料の収集および調製
本発明は、生物学的試料から回収された核酸に対応する配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列）を作製するための方法を含む。一部の実施形態では、結果として得られる情報を使用して、対象から得られた核酸素材中に存在する突然変異を同定することができる。一部の実施形態では、試料、すなわち、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を対象から得、核酸を処理し（溶解させ、増幅し、かつ／または精製し）、下記に記載される方法を使用して、核酸をシーケンシングする。多くの実施形態では、シーケンシングの結果は、直鎖状の核酸配列ではなく、何千または何百万もの個々の短い核酸リードであって、対象についての配列へとリアセンブルしなければならない核酸リードのコレクションである。リードをアラインして配列を作製したら、アラインされた配列を、基準配列と比較して、例えば、疾患を指し示す突然変異を同定することができる。他の実施形態では、リードの、基準配列構築物、すなわち、上記で記載した、有向非巡回グラフ（「ＤＡＧ」）へのアライメントに基づき、特定の突然変異を伴う対象を同定することができる。
【００８２】
上記の目的のうちのいずれのためにも、方法を生物学的試料へと適用することができる。生物学的試料は、例えば、血液試料、全血液、血漿、涙液、乳首吸引物、血清、糞便、尿、唾液、循環細胞、組織、生検試料、毛包、または患者の生物学的素材を含有する他の試料を含みうる。このような試料に基づき検査を行うときの１つの問題は、大半の場合において、目的の突然変異を含有するＤＮＡまたはＲＮＡであって、試料中に存在しうるＤＮＡまたはＲＮＡは、ごく微量でありうることである。これは、とりわけ、口腔内スワブ試料または血液試料などの非侵襲的試料であって、突然変異型核酸が、極めて少量で存在する非侵襲的試料中で成り立つ。一部の実施形態では、核酸断片は、天然の短鎖でありうる、すなわち、試料中の関与性の核酸のランダムなせん断により、短い断片が作り出されうる。他の実施形態では、処理を容易とするため、またはシーケンシング法では、１０００塩基未満、例えば、５００塩基未満、例えば、２００塩基未満、例えば、１００塩基未満、例えば、５０塩基未満のリードだけをシーケンシングしうるため、核酸を意図的に断片化する。本明細書で記載される方法を使用して、様々な長さの配列をアラインしうるが、一部の実施形態では、複数の核酸リードの大部分は、シーケンシング法から得られ、１０００塩基未満、例えば、５００塩基未満、例えば、２００塩基未満、例えば、１００塩基未満、例えば、５０塩基未満を含む。
【００８３】
核酸は、当技術分野で公知の方法により得ることができる。一般に、核酸は、その内容が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２８０〜２８１頁（１９８２年）により記載されている技法など、様々な技法により生物学的試料から抽出することができる。
【００８４】
十分に純粋な核酸調製物を得るためには、まず、試料の抽出物を調製し、次いで、さらなるステップ（すなわち、示差的沈殿、カラムクロマトグラフィー、有機溶媒を伴う抽出など）を実施することが必要でありうる。抽出物は、当技術分野における標準的な技法を使用して、例えば、細胞の化学的溶解または機械的溶解により調製することができる。次いで、抽出物は、例えば、濾過および／もしくは遠心分離により、かつ／あるいはイソチオシアン酸グアニジニウムもしくは尿素などのカオトロピック塩、またはフェノールおよび／もしくはＨＣＣｌ３などの有機溶媒によりさらに処理して、任意の夾雑的タンパク質および潜在的に干渉的なタンパク質を変性させることができる。一部の実施形態では、試料は、対象試料、例えば、血液試料から収集されたＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを含みうる。当技術分野では、ＲＮＡ抽出のための一般的な方法が周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７年）を含む、分子生物学の標準的な教科書において開示されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出のための方法は、例えば、ＲｕｐｐおよびＬｏｃｋｅｒ、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．、５６巻：Ａ６７頁（１９８７年）、およびＤｅ  Ａｎｄｒｅｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１８巻：４２０４４頁（１９９５年）において開示されている。これらの参考文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。特に、ＲＮＡの単離は、Ｑｉａｇｅｎなど、市販品の製造元による精製キット、緩衝液セット、およびプロテアーゼを、製造元の指示書に従い使用して、実施することができる。例えば、培養物中の細胞に由来する全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉカラムを使用して単離することができる。他の市販のＲＮＡ単離キットは、ＭＡＳＴＥＲＰＵＲＥ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、およびＰａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．）を含む。組織試料に由来する全ＲＮＡは、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を使用して単離することができる。腫瘍から調製されたＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離により単離することができる。
【００８５】
解析的シーケンシング
シーケンシングは、当技術分野で公知の任意の方法を介しうる。ＤＮＡシーケンシング法は、標識されたターミネーターまたはプライマーおよびスラブ内またはキャピラリー内のゲル分離を使用する、古典的なジデオキシシーケンシング反応（サンガー法）、可逆的終結型標識ヌクレオチドを使用する、合成を介するシーケンシング、ピロシーケンシング、４５４シーケンシング、標識されたオリゴヌクレオチドプローブのライブラリーとの、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、標識されたクローンのライブラリーとの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションに続いてライゲーションを使用する、合成を介するシーケンシング、重合化ステップにおける、標識されたヌクレオチドの組込みについての、リアルタイムモニタリング、ポロニーシーケンシング、およびＳＯＬｉＤシーケンシングを含む。分離された分子のシーケンシングは、より近年になって、ポリメラーゼまたはリガーゼを使用する、逐次的伸長反応または単一の伸長反応によるほか、プローブのライブラリーとの単一の示差的ハイブリダイゼーションまたは逐次的な示差的ハイブリダイゼーションによっても裏付けられている。シーケンシングの前に、試料中の核酸の一部または全部を増幅することは、さらに有益でありうる。一部の実施形態では、核酸を、当技術分野で公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用して増幅する。
【００８６】
本発明の方法で使用されうるシーケンシング技術の一例は、ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅するのに活用されうる、合成を介するポリメラーゼベースの配列である、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング（例えば、ＭｉＳｅｑ（商標）プラットフォーム）である。ＤＮＡのためのＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングは、固体表面上のＤＮＡの増幅であって、フォールドバックＰＣＲおよびアンカリングされたプライマーを使用する増幅に基づく。ゲノムＤＮＡを、断片化し、アダプターを、断片の５’末端および３’末端へと付加する。フローセルチャネルの表面へと接合させたＤＮＡ断片を伸長させ、架橋増幅する。断片は二本鎖となり、二本鎖分子を変性させる。複数サイクルにわたる固相増幅に続く変性により、フローセルの各チャネル内に、同じ鋳型の約１，０００コピーの一本鎖ＤＮＡ分子による数百万のクラスターを創出することができる。プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および４つのフルオロフォアで標識された可逆的終結型ヌクレオチドを使用して、逐次シーケンシングを実施する。ヌクレオチド組込みの後、レーザーを使用して、フルオロフォアを励起し、画像を捕捉し、第１の塩基の識別を記録する。３’側ターミネーターおよび組み込まれた各塩基のフルオロフォアを除去し、組込みステップ、検出ステップ、および同定ステップを繰り返す。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングを使用して、ＲＮＡを検出する場合、試料のＲＮＡ発現を決定するために、ＲＮＡ断片を単離および増幅することを除き、同じ方法が適用される。配列は、シーケンサーで精査した後、生物学的配列および品質スコアを保存するための、テキストベースのフォーマットである、ＦＡＳＴＱファイルなどのデータファイルに出力することができる（上記の議論を参照されたい）。
【００８７】
本発明の方法で使用されうるＤＮＡシーケンシング法の別の例は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）シーケンシングである。それらの各々の内容が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００９／００２６０８２号、同第２００９／０１２７５８９号、同第２０１０／００３５２５２号、同第２０１０／０１３７１４３号、同第２０１０／０１８８０７３号、同第２０１０／０１９７５０７号、同第２０１０／０２８２６１７号、同第２０１０／０３００５５９号、同第２０１０／０３００８９５号、同第２０１０／０３０１３９８号、および同第２０１０／０３０４９８２号を参照されたい。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）シーケンシングでは、ＤＮＡを、約３００〜８００塩基対の断片へとせん断すると、断片は、平滑末端となる。次いで、オリゴヌクレオチドアダプターを、断片の末端へとライゲーションする。アダプターは、断片の増幅およびシーケンシングのためのプライマーとして用いられる。断片を、表面へと接合させ、断片が個別に分解可能となるような分解能で検出する。１または複数のヌクレオチドの付加により、プロトン（Ｈ＋）が放出され、このシグナルは、シーケンシング計器により検出および記録される。シグナル強度は、組み込まれたヌクレオチドの数に比例する。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔデータはまた、ＦＡＳＴＱファイルとしても出力される。
【００８８】
本発明の方法で使用されうるＤＮＡシーケンシング法およびＲＮＡシーケンシング法の別の例は、４５４（商標）シーケンシング（Ｒｏｃｈｅ）（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  Ｍら、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ、４３７巻、３７６〜３８０頁）である。４５４（商標）シーケンシングは、合成を介するシーケンシング技術であって、ピロシーケンシングもまた活用する技術である。ＤＮＡの４５４（商標）シーケンシングは、２つのステップを伴う。第１のステップでは、ＤＮＡを、約３００〜８００塩基対の断片へとせん断し、断片は、平滑末端となる。次いで、オリゴヌクレオチドアダプターを、断片の末端へとライゲーションする。アダプターは、断片の増幅およびシーケンシングのためのプライマーとして用いられる。断片は、例えば、５’−ビオチンタグを含有するＡｄａｐｔｏｒ  Ｂを使用して、ＤＮＡ捕捉ビーズ、例えば、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズへと接合させることができる。ビーズへと接合させた断片は、油−水エマルジョンの液滴内でＰＣＲ増幅する。結果は、各ビーズ上でクローン増幅されたＤＮＡ断片の複数のコピーである。第２のステップでは、ビーズを、ウェル（ピコリットルサイズの）内で捕捉する。ピロシーケンシングは、各ＤＮＡ断片に対して並行的に実施する。１または複数のヌクレオチドの付加により、光シグナルが発生し、これを、シーケンシング計器内のＣＣＤカメラで記録する。シグナル強度は、組み込まれたヌクレオチドの数に比例する。ピロシーケンシングでは、ヌクレオチドが付加されると放出される、ピロリン酸（ＰＰｉ）を使用する。ＰＰｉは、アデノシン５’ホスホ硫酸の存在下で、ＡＴＰスルフリラーゼにより、ＡＴＰへと転換される。ルシフェラーゼは、ＡＴＰを使用して、ルシフェリンを、オキシルシフェリンへと転換し、この反応が、光を発生させ、これが検出および解析される。別の実施形態では、ピロシーケンシングを使用して、遺伝子発現を測定する。ＲＮＡについてのピロシーケンシングも、ＤＮＡについてのピロシーケンシングと同様に適用され、部分ｒＲＮＡ遺伝子配列を微小ビーズへと接合させ、次いで、接合物を個々のウェルに入れることにより達成する。次いで、遺伝子発現プロファイルを決定するために、接合させた部分ｒＲＮＡ遺伝子配列を増幅する。Ｓｈａｒｏｎ  Ｍａｒｓｈ、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（登録商標）  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３７３巻、１５〜２３頁（２００７年）。
【００８９】
本発明の方法で使用されうるＤＮＡ検出法およびＲＮＡ検出法の別の例は、ＳＯＬｉＤ（商標）技術（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）である。ＳＯＬｉＤ（商標）技術システムとは、ライゲーションベースのシーケンシング技術であって、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれについての超並列次世代シーケンシングを行うのにも活用されうる技術である。ＤＮＡ  ＳＯＬｉＤ（商標）シーケンシングでは、ゲノムＤＮＡを、断片へとせん断し、アダプターを、断片の５’末端および３’末端へと接合させて、断片ライブラリーを作り出す。代替的に、内部アダプターは、アダプターを、断片の５’末端および３’末端へとライゲーションし、断片を環状化し、環状化させた断片を消化させて、内部アダプターを作り出し、アダプターを、結果として得られる断片の５’末端および３’末端へと接合させて、メートペア（ＭＰ：ｍａｔｅ−ｐａｉｒｅｄ）ライブラリーを作り出すことにより導入することができる。次に、クローンビーズ集団を、ビーズ、プライマー、鋳型、およびＰＣＲ成分を含有するマイクロリアクター内で調製する。ＰＣＲ後、鋳型を変性させ、ビーズを濃縮して、伸長した鋳型を伴うビーズを分離する。選択されたビーズ上の鋳型を、スライドガラスへの結合を可能とする３’修飾にかける。配列は、逐次ハイブリダイゼーションと、中央部の決定された塩基（または塩基対）であって、特異的なフルオロフォアにより同定される塩基を伴う、部分的にランダムなオリゴヌクレオチドのライゲーションとにより決定することができる。色を記録した後で、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドを切断および除去し、次いで、工程を繰り返す。
【００９０】
他の実施形態では、ＳＯＬｉＤ（商標）遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ：Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を使用して、遺伝子発現を測定する。遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）とは、各転写物についての個別のハイブリダイゼーションプローブを準備する必要なしに、多数の遺伝子転写物についての同時的で定量的な解析を可能とする方法である。まず、タグが、各転写物内の固有の位置から得られることを条件として、短い配列タグ（約１０〜１４ｂｐ）であって、転写物を固有に同定するのに十分な情報を含有するタグを作り出す。次いで、多くの転写物を併せて連結して、長い連鎖分子であって、シーケンシングすることが可能であり、複数のタグの識別を同時に明らかにする分子を形成する。転写物の任意の集団の発現パターンは、個々のタグの存在度を決定し、各タグに対応する遺伝子を同定することにより、定量的に査定することができる。さらなる詳細については、例えば、それらの各々の内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：４８４〜４８７頁（１９９５年）；およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｃｅｌｌ、８８巻：２４３〜５１頁（１９９７年）を参照されたい。
【００９１】
本発明の方法で使用されうる別のシーケンシング法は、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｓの真の１分子のシーケンシング（ｔＳＭＳ：Ｔｒｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｈａｒｒｉｓ  Ｔ．  Ｄ．ら（２００８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２０巻：１０６〜１０９頁）を含む。ｔＳＭＳ法では、ＤＮＡ試料を、約１００〜２００ヌクレオチドの鎖へと切断し、ｐｏｌｙＡ配列を、各ＤＮＡ鎖の３’末端へと付加する。各鎖を、蛍光標識されたアデノシンヌクレオチドの付加により標識する。次いで、ＤＮＡ鎖を、フローセル表面へと固定化された、何百万ものオリゴ−Ｔ捕捉部位を含有するフローセルとハイブリダイズさせる。鋳型は、１ｃｍ２当たりの鋳型約１億個の密度でありうる。次いで、フローセルを、計器、例えば、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）シーケンサーへとローディングし、レーザーでフローセルの表面を照射し、各鋳型の位置を明らかにする。ＣＣＤカメラにより、フローセル表面上の鋳型の位置をマッピングすることができる。次いで、鋳型の蛍光標識を、切断し、洗い落とす。ＤＮＡポリメラーゼと、蛍光標識されたヌクレオチドとを導入することにより、シーケンシング反応を開始する。オリゴ−Ｔ核酸は、プライマーとして用いられる。ポリメラーゼにより、標識されたヌクレオチドを、プライマーへと、鋳型指向的な様式で組み込む。ポリメラーゼおよび組み込まれなかったヌクレオチドは、除去する。蛍光標識されたヌクレオチドの組込みを方向付けた鋳型は、フローセル表面をイメージングすることにより検出する。イメージングの後、切断ステップにより、蛍光標識を除去し、所望のリード長が達成されるまで、他の蛍光標識されたヌクレオチドについても、工程を繰り返す。配列情報は、各ヌクレオチドの付加ステップにより収集する。ｔＳＭＳについてのさらなる記載は、例えば、Ｌａｐｉｄｕｓら（米国特許第７，１６９，５６０号）、Ｌａｐｉｄｕｓら（米国特許出願第２００９／０１９１５６５号）、Ｑｕａｋｅら（米国特許第６，８１８，３９５号）、Ｈａｒｒｉｓ（米国特許第７，２８２，３３７号）、Ｑｕａｋｅら（米国特許出願第２００２／０１６４６２９号）、およびＢｒａｓｌａｖｓｋｙら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、１００巻：３９６０〜３９６４頁（２００３年）において示されており、これらの参考文献の各々の内容は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれている。
【００９２】
本発明の方法で使用されうるシーケンシング技術の別の例は、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれもシーケンシングする、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによる単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ：ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）技術を含む。ＳＭＲＴでは、４つのＤＮＡ塩基の各々を、４つの異なる蛍光色素のうちの１つへと接合させる。これらの色素は、リン酸連結されている。単一のＤＮＡポリメラーゼを、鋳型である一本鎖ＤＮＡの単一の分子と共に、ゼロモード導波管（ＺＭＷ：ｚｅｒｏ−ｍｏｄｅ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅ）の底部に固定化する。ＺＭＷとは、単一のヌクレオチドの、ＤＮＡポリメラーゼによる組込みの、ＺＭＷの内外へと急速に（数マイクロ秒間で）拡散する蛍光ヌクレオチドのバックグラウンドに対する観察を可能とする閉じ込め構造である。ヌクレオチドを成長しつつある鎖へと組み込むには、数ミリ秒間かかる。この時間中に、蛍光標識が励起され、蛍光シグナルをもたらし、蛍光タグが切断される。色素の対応する蛍光の検出により、どの塩基が組み込まれたのかが指し示される。工程を繰り返す。ＲＮＡをシーケンシングするためには、ＺＭＷでは、ＤＮＡポリメラーゼを、逆転写酵素で置きかえ、相応の工程に従う。
【００９３】
本発明の方法で使用されうるシーケンシング法の別の例は、ナノ細孔シーケンシング（Ｓｏｎｉ  Ｇ  ＶおよびＭｅｌｌｅｒ，  Ａ、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、５３巻：１９９６〜２００１頁、２００７年）である。ナノ細孔とは、直径が１ナノメートルのオーダーの小孔である。ナノ細孔を、導電性流体中に浸漬し、ナノ細孔にわたり電位を印加する結果として、ナノ細孔を通るイオンの導通に起因する微弱な電流がもたらされる。流れる電流の量は、ナノ細孔のサイズに対して感受性である。ＤＮＡ分子が、ナノ細孔を通って通過するとき、ＤＮＡ分子上の各ヌクレオチドは、ナノ細孔を、異なる程度で閉塞させる。こうして、ＤＮＡ分子が、ナノ細孔を通って通過するときに、ナノ細孔を通って通過する電流の変化は、ＤＮＡ配列の読取りを表示する。
【００９４】
本発明の方法で使用されうるシーケンシング法の別の例は、化学感受性電界効果トランジスター（ｃｈｅｍＦＥＴ：ｃｈｅｍｉｃａｌ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｉｅｌｄ  ｅｆｆｅｃｔ  ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）アレイを使用して、ＤＮＡをシーケンシングするステップ（例えば、米国特許出願公開第２００９００２６０８２号において記載されている）を伴う。技法の一例では、ＤＮＡ分子を、反応チャンバー内に入れることができ、鋳型分子を、シーケンシングプライマーへと結合させたポリメラーゼとハイブリダイズさせることができる。シーケンシングプライマーの３’末端における、１または複数の三リン酸の、新たな核酸鎖への組込みは、電流の変化を介して、ｃｈｅｍＦＥＴにより検出することができる。アレイは、複数のｃｈｅｍＦＥＴセンサーを有しうる。別の例では、単一の核酸を、ビーズへと接合させることができ、核酸を、ビーズ上で増幅することができ、個々のビーズを、ｃｈｅｍＦＥＴアレイ上の個々の反応チャンバーであって、各チャンバーがｃｈｅｍＦＥＴセンサーを有するチャンバーへと移送することができ、核酸をシーケンシングすることができる。
【００９５】
本発明の方法で使用されうるシーケンシング法の別の例は、電子顕微鏡（Ｍｏｕｄｒｉａｎａｋｉｓ  Ｅ．  Ｎ．およびＢｅｅｒ  Ｍ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、１９６５年３月、５３巻：５６４〜７１頁）を使用するステップを伴う。技法の一例では、電子顕微鏡を使用して識別可能な金属標識を使用して、個々のＤＮＡ分子を標識する。次いで、これらの分子を、平面上で伸長させ、配列を測定するのに電子顕微鏡を使用してイメージングした。
【００９６】
さらなる検出法では、マイクロアレイへの結合を、後続の蛍光検出または非蛍光検出、質量分析的方法を使用する、バーコードによる質量検出、発せられたラジオ波の検出、アラインされたバーコードからの散乱光の検出、定量的ＰＣＲ法またはディジタルＰＣＲ法を使用する蛍光の検出のために活用することができる。比較核酸ハイブリダイゼーションアレイとは、患者の試料ＤＮＡ中のコピー数変異を検出するための技法である。試料ＤＮＡと、基準ＤＮＡとを、例えば、顕著に異なるフルオロフォアを使用して、異なる様式で標識し、次いで、多数のプローブとハイブリダイズさせる。次いで、試料および基準の蛍光強度を測定し、次いで、蛍光強度比を使用して、コピー数変異を計算する。比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイの方法については、Ｓｈｉｎａｗｉ  Ｍ、Ｃｈｅｕｎｇ  ＳＷ、Ｔｈｅ  ａｒｒａｙ  ＣＧＨ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ、１３巻（１７〜１８号）：７６０〜７０頁においてより詳細に論じられている。マイクロアレイによる検出から、ＦＡＳＴＱファイルを直接作製することはできないが、マイクロアレイシーケンサーにより作成されたデータを、ＦＡＳＴＱまたは同様のフォーマットへと転換するプログラムが利用可能である。
【００９７】
ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、およびコピー数を検出する別の方法は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｉａｎ  Ｄａｒｂｙ編、２０００年））である。ＦＩＳＨとは、ＤＮＡ配列内の突然変異およびコピー数変異など、特異的な染色体再配列を検出する、分子細胞遺伝学法である。ＤＮＡ分子を化学的に変性させ、２つの鎖へと分離する。次いで、一本鎖プローブを、変性させたＤＮＡ鎖と共にインキュベートする。一本鎖プローブは、標的配列部分に応じて選択され、相補的配列部分に対する高アフィニティーを有する。プローブは、反復配列プローブ、全染色体プローブ、および遺伝子座特異的プローブを含みうる。インキュベート中に、組み合わされたプローブとＤＮＡ鎖とをハイブリダイズさせる。次いで、任意の変動を評価するために、結果を、顕微鏡下で視覚化および定量化する。
【００９８】
別の実施形態では、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（商標）ベースの遺伝子発現プロファイリング法を使用して、遺伝子発現を測定する。Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）により開発されたＭａｓｓＡＲＲＡＹ（商標）ベースの遺伝子発現プロファイリング法では、ＲＮＡの単離および逆転写の後、得られたｃＤＮＡを、単一の塩基を除く全て位置において、ターゲティングされるｃＤＮＡ領域にマッチし、内部標準として用いられる、合成ＤＮＡ分子（コンペティター）とスパイクする。ｃＤＮＡ／コンペティター混合物を、ＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ後エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）酵素処理にかけ、その結果として、残りのヌクレオチドの脱リン酸化をもたらす。アルカリホスファターゼを不活化させた後、コンペティターおよびｃＤＮＡに由来するＰＣＲ産物を、プライマー伸長にかけ、これにより、コンペティターに由来するＰＣＲ産物およびｃＤＮＡに由来するＰＣＲ産物について、顕著に異なる質量シグナルを発生させる。精製後、これらの産物を、マトリックス支援レーザー脱着イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）による解析に必要とされる成分をあらかじめローディングされたチップアレイ上に分注する。次いで、反応物中に存在するｃＤＮＡを、作成された質量スペクトル内のピーク面積の比を解析することにより定量化する。さらなる詳細については、例えば、ＤｉｎｇおよびＣａｎｔｏｒ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１００巻：３０５９〜３０６４頁（２００３年）を参照されたい。
【００９９】
さらなるＰＣＲベースの技法は、例えば、それらの各々の内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、示差的ディスプレイ（ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７巻：９６７〜９７１頁（１９９２年））；増幅フラグメント長多型（ｉＡＦＬＰ）（Ｋａｗａｍｏｔｏら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１２巻：１３０５〜１３１２頁（１９９９年））；ＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標）技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．；Ｏｌｉｐｈａｎｔら、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓへの付録）、２００２年６月；Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７２巻：５６１８頁（２０００年））；市販のＬｕｍｉｎｅｘ１００ＬａｂＭＡＰシステムおよび複数色でコードされたマイクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）を、遺伝子発現のための迅速アッセイで使用される、遺伝子発現の検出のためのビーズアレイ（ＢＡＤＧＥ）（Ｙａｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１１巻：１８８８〜１８９８頁（２００１年））；ならびに高カバレッジ発現プロファイリング（ＨｉＣＥＰ）解析（Ｆｕｋｕｍｕｒａら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．、３１巻（１６号）ｅ９４頁（２００３年））を含む。
【０１００】
ある特定の実施形態ではまた、遺伝子発現の変動も、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）から市販されているアレイなど、ナイロン膜アレイ、マイクロチップアレイ、およびスライドガラスアレイを含む、マイクロアレイ法を使用して、同定または確認することができる。一般に、ＲＮＡ試料は、単離され、逆転写を介して、標識されたｃＤＮＡへと転換される。次いで、標識されたｃＤＮＡを、ナイロン膜、マイクロチップ、またはスライドガラス上で、目的の細胞または組織に由来する、特異的なＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。次いで、ハイブリダイズさせたｃＤＮＡを検出および定量化し、結果として得られる遺伝子発現データを、解析のために対照と比較することができる。標識化法、ハイブリダイゼーション法、および検出法は、マイクロアレイの支持体が、ナイロン膜であるのか、マイクロチップであるのか、スライドガラスであるのかに応じて変化する。ナイロン膜アレイは、Ｐ−ｄＮＴＰで標識されたプローブとハイブリダイズさせることが典型的である。水ライドガラスアレイは、２つの顕著に異なる、蛍光標識されたヌクレオチドによる標識化を伴うことが典型的である。マイクロアレイを作製し、遺伝子産物の発現（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質）を決定するための方法は、その内容が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｙｅａｔｍａｎら（米国特許出願第２００６／０１９５２６９号）に示されている。
【０１０１】
一部の実施形態では、質量分析（ＭＳ）による解析は、生物学的試料中の、本明細書で開示される、１または複数のバイオマーカーの存在および／または量を決定するのに、単独で使用することもでき、他の方法（例えば、イムノアッセイまたはＲＮＡ測定アッセイ）と組み合わせることもできる。一部の実施形態では、ＭＳ解析は、例えば、ダイレクトスポットＭＡＬＤＩ−ＴＯＦまたは液体クロマトグラフィーＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による解析など、マトリックス支援レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間（ＴＯＦ）ＭＳ解析を含む。一部の実施形態では、ＭＳ解析は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ＭＳ、など、例えば、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）ＥＳＩ−ＭＳを含む。質量分析は、市販の分光光度計を使用して達成することができる。当技術分野では、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳおよびＥＳＩ−ＭＳを含むＭＳ解析を活用して、生物学的試料中のバイオマーカーペプチドの存在および量を検出するための方法が公知である。さらなる指針については、例えば、それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９２５，３８９号；同第６，９８９，１００号；および同第６，８９０，７６３号を参照されたい。
【０１０２】
本発明の方法、配列構築物、およびシステムを伴う使用のためのタンパク質配列は、当業者に公知の多数の技法を使用して決定することができる。例えば、アミノ酸配列およびアミノ酸配列リードは、質量分析により、またはエドマン分解を使用して、タンパク質またはタンパク質の部分を解析することにより作製することができる。質量分析は、例えば、ダイレクトスポットＭＡＬＤＩ−ＴＯＦまたは液体クロマトグラフィーＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による解析などの、マトリックス支援レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間（ＴＯＦ）ＭＳ解析、例えば、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）ＥＳＩ−ＭＳなどのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ＭＳ、またはＭＳ−ＭＳなど、他の技法を含みうる。エドマン分解による解析は、Ｍｏｄｅｌ  ４９Ｘ  Ｐｒｏｃｉｓｅタンパク質／ペプチドシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）など、市販の計器を使用して実施することができる。シーケンシングされたアミノ酸配列、すなわち、ポリペプチド、すなわち、タンパク質は、少なくとも１０アミノ酸の長さ、例えば、少なくとも２０アミノ酸の長さ、例えば、少なくとも５０アミノ酸の長さでありうる。
【０１０３】
参照による組込み
本開示を通して特許、特許出願、特許公開、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなど、他の文献に対する言及および引用を行ってきた。全てのこのような文献は、参照によりそれらの全体において全て目的で本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
同等物
当業者には、本明細書で示され、記載される実施形態に加えて、本発明の多様な改変およびその多くのさらなる実施形態も、本明細書で引用される研究文献および特許文献への言及を含む、本明細書の全内容から明らかとなろう。本明細書における対象物は、その多様な実施形態における本発明およびその同等物の実施に適応させうる、重要な情報、例示、および指針を含有する。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
複数の配列リードをアラインするための、プロセッサーおよび非一時的メモリを含むシステムであって、前記メモリは、実行された際、前記プロセッサーに、
複数の配列リードを、記号のストリングとして得て；
配列リードに対応する記号の各ストリングを、基準配列構築物内の複数の位置と比較し、ここで前記構築物は、前記構築物内の複数の位置において、記号の少なくとも２つの異なるストリングを含み；
配列リードに対応する記号の各ストリングと、前記基準配列構築物内の前記複数の位置の各々との重複をスコア付けし、ここで高スコアは重複の量が大きいことに対応し；
各配列リードについて、最高のスコアに対応する前記重複を同定し；
各配列リードを、最高のスコアに対応する前記構築物上の場所へと割り当て；
アラインされた各配列リードの前記場所に対応するメモリにファイルを書き込む
ことをさせる命令を含む、システム。
（項目２）
前記配列リードが、核酸配列リードである、項目１に記載のシステム。
（項目３）
前記配列リードが、アミノ酸配列リードである、項目１に記載のシステム。
（項目４）
前記メモリが、実行された際、前記プロセッサーに、
各配列リードの前記割り当てられた場所に基づき、前記複数のアラインされた配列リードをアセンブルして、アセンブルされた配列を得て；
前記アセンブルされた配列に対応するメモリにファイルを書き込む
ことをさせる命令をさらに含む、項目１に記載のシステム。
（項目５）
前記アセンブルされた配列が、生物の遺伝子配列に対応する、項目４に記載のシステム。
（項目６）
前記遺伝子配列が、染色体またはゲノムを実質的に包含する、項目５に記載のシステム。
（項目７）
１または複数のアラインされた配列リードの前記場所に基づき、生物に遺伝子型を割り当てることをさらに含む、項目１に記載のシステム。
（項目８）
前記割り当てられた遺伝子型を、疾患の危険性と相関させることをさらに含む、項目７に記載のシステム。
（項目９）
前記疾患が、がんである、項目８に記載のシステム。
（項目１０）
前記基準配列構築物が、非一時的コンピュータ可読メディアに保存された位置および記号についてのデータベースを含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記システムが、複数のプロセッサーを含み、各プロセッサーが、前記複数の配列リードの部分を前記基準配列構築物と比較しスコア付けするように構成されている、項目１に記載のシステム。
（項目１２）
前記メモリが、第２のプロセッサーが、得て、比較し、スコア付けし、同定し、割り当て、次いで前記割り当てられた場所を第１のプロセッサーへと送信することを前記第１のプロセッサーに命令させる命令をさらに含む、項目１に記載のシステム。
（項目１３）
前記基準配列構築物上の各位置が、基準配列内の核酸に対応する、項目１に記載のシステム。
（項目１４）
前記構築物上の各位置が、基準配列内のアミノ酸に対応する、項目１に記載のシステム。
（項目１５）
前記構築物上の各位置が、基準配列内の遺伝子に対応する、項目１に記載のシステム。
（項目１６）
前記基準配列構築物が、方向を有する、項目１に記載のシステム。
（項目１７）
前記基準配列構築物を前記方向で通る経路が、生物のゲノムを表示する、項目１６に記載のシステム。
（項目１８）
前記基準配列構築物を前記方向で通る経路が、生物の染色体を表示する、項目１６に記載のシステム。
（項目１９）
前記基準配列構築物を前記方向で通る経路が、タンパク質を表示する、項目１６に記載のシステム。
（項目２０）
前記基準配列構築物を前記方向で通る経路が、非巡回経路である、項目１６に記載のシステム。
（項目２１）
前記構築物内の記号の前記少なくとも２つの異なるストリングが、前記位置における公知の配列変異を表示する、項目１に記載のシステム。
（項目２２）
記号の前記少なくとも２つの異なるストリングが、塩基の挿入または塩基の欠失により互いに異なる核酸配列に対応する、項目１に記載のシステム。
（項目２３）
記号の前記少なくとも２つの異なるストリングが、アミノ酸の挿入またはアミノ酸の欠失により互いに異なるポリペプチドに対応する、項目１に記載のシステム。
（項目２４）
前記基準配列構築物が、１，０００を超える記号を含む、項目１に記載のシステム。
（項目２５）
前記基準配列構築物が、１，０００，０００を超える記号を含む、項目２４に記載のシステム。
（項目２６）
前記複数の配列リードが、１０００を超える配列リードを含む、項目１に記載のシステム。
（項目２７）
前記複数の配列リードの大部分が、記号１００個を超える長さである、項目１に記載のシステム。
（項目２８）
前記複数の配列リードが、次世代シーケンシング法の出力ファイルである、項目１に記載のシステム。
（項目２９）
複数の配列リードをアラインする方法であって、
複数の配列リードを得るステップと；
基準配列構築物に対する各配列リードごとの配列の重複をスコア付けするステップであり、前記構築物は、前記構築物内の複数の位置において、位置１箇所当たり少なくとも２つの代替配列を含み、ここで重複が大きくなればより高いスコアがもたらされる、ステップと；
各配列リードごとの前記スコアが最大化されるように、各配列リードを前記構築物内の場所にアラインするステップと
を含む方法。
（項目３０）
前記構築物に対する前記配列のアライメントに基づき、前記配列リードを互いにアセンブルするステップをさらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記配列リードが、核酸配列リードである、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記配列リードが、アミノ酸配列リードである、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
前記構築物内の各位置が、基準配列内の塩基またはアミノ酸に対応する、項目２９に記載の方法。
（項目３４）
前記構築物内の各位置が、基準配列内の遺伝子に対応する、項目２９に記載の方法。
（項目３５）
前記基準配列構築物が、方向を有する、項目２９に記載の方法。
（項目３６）
前記基準配列構築物を前記方向で通る経路が、生物のゲノムを表示する、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記基準配列構築物を前記方向で通る経路が、生物の染色体を表示する、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
前記基準配列構築物を前記方向で通る経路が、タンパク質を表示する、項目３５に記載の方法。
（項目３９）
前記基準配列を通る経路が、非巡回経路である、項目３５に記載の方法。
（項目４０）
前記構築物内の前記少なくとも２つの代替配列が、前記位置における公知の遺伝子変異を表示する、項目２９に記載の方法。
（項目４１）
前記核酸リードの前記割り当てられた場所に基づき、生物に遺伝子型を割り当てるステップをさらに含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記構築物内の前記少なくとも２つの代替配列が、前記位置における公知の構造変異を表示する、項目２９に記載の方法。
（項目４３）
前記少なくとも２つの代替配列が、塩基の挿入または塩基の欠失により互いに異なる、項目２９に記載の方法。
（項目４４）
前記少なくとも２つの代替配列が、アミノ酸の挿入またはアミノ酸の欠失により互いに異なる、項目２９に記載の方法。
（項目４５）
各リードが、核酸塩基の測定された配列を表示する記号のストリングを含む、項目２９に記載の方法。
（項目４６）
核酸塩基の前記測定された配列が、サンガーシーケンシング、ピロシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、合成を介するシーケンシング、ライゲーションを介するシーケンシング、および単一分子リアルタイムシーケンシングから選択されるシーケンシング法により決定される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
各リードが、アミノ酸の測定された配列を表示する記号のストリングを含む、項目２９に記載の方法。
（項目４８）
アミノ酸の前記測定された配列が、質量分析により決定される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記基準配列構築物が、１，０００を超える塩基を含む、項目２９に記載の方法。
（項目５０）
前記基準配列構築物が、１，０００，０００を超える塩基を含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記複数のリードが、１０００を超えるリードを含む、項目２９に記載の方法。
（項目５２）
前記複数のリードの大部分が、１００塩基対を超える長さである、項目２９に記載の方法。
（項目５３）
前記複数のリードの大部分が、１０アミノ酸を超える長さである、項目２９に記載の方法。
（項目５４）
前記基準配列構築物が、コンピュータ可読メディアに保存された位置および配列のデータベースを含む、項目２９に記載の方法。
（項目５５）
前記リードが、コンピュータ可読メディアに保存された記号のストリングを含む、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
試料に由来する複数の核酸をシーケンシングするステップをさらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目５７）
前記試料を患者から得るステップをさらに含む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記試料が、血液、尿、唾液、痰、糞便、乳首吸引物、汗、毛包、口腔内スワブ、または組織から選択される、項目５６に記載の方法。
（項目５９）
複数の核酸を、前記試料から単離するステップをさらに含む、項目５８に記載の方法。（項目６０）
前記単離された複数の核酸の少なくとも一部を増幅するステップをさらに含む、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
複数の核酸リードをアラインする方法であって、
複数の核酸リードを得るステップと；
前記リード内の塩基と前記構築物内の塩基との重複をスコア付けするアルゴリズムを使用して、前記核酸リードを、基準配列構築物にアラインするステップであり、前記構築物は、前記構築物内の複数の位置において、位置１箇所当たり少なくとも２つの代替配列を含む、ステップと
を含む方法。
（項目６２）
前記アルゴリズムが、前記少なくとも２つの配列間の選択に応じた最大の重複スコアを計算する、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記基準配列構築物が、有向非巡回グラフである、項目６１に記載の方法。
（項目６４）
前記構築物が、少なくとも１，０００塩基を含む、項目６１に記載の方法。
（項目６５）
前記構築物が、少なくとも１，０００，０００塩基を含む、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
複数のアミノ酸リードをアラインする方法であって、
複数のアミノ酸リードを得るステップと；
前記リード内のアミノ酸と前記構築物内のアミノ酸との重複をスコア付けするアルゴリズムを使用して、前記アミノ酸リードを、基準配列構築物にアラインするステップであり、前記構築物は、前記構築物内の複数の位置において、位置１箇所当たり少なくとも２つの代替配列を含む、ステップと
を含む方法。
（項目６７）
前記アルゴリズムが、前記少なくとも２つの配列間の選択に応じた最大の重複スコアを計算する、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記基準配列構築物が、有向非巡回グラフである、項目６６に記載の方法。
（項目６９）
前記構築物が、少なくとも１００アミノ酸を含む、項目６６に記載の方法。
（項目７０）
前記構築物が、少なくとも１０，０００アミノ酸を含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
コンピュータで実行される複数のリードをアラインする方法であって、
複数のリードを、記号のストリングとして得るステップと；
コンピュータプロセッサーを使用して、リードに対応する記号の各ストリングを、基準配列構築物内の複数の位置と比較するステップであり、前記構築物は、前記構築物内の複数の位置において、記号の少なくとも２つの異なるストリングを含む、ステップと；
記号の前記ストリングと、前記基準配列構築物内の前記複数の位置の各々との重複を、プロセッサーによりスコア付けするステップであり、高スコアは重複の量が大きいことに対応する、ステップと；
各リードについて、最高のスコアに対応する前記重複を同定するステップと；
前記リードを、最高のスコアに対応する前記構築物上の場所にアラインするステップとを含む方法。
（項目７２）
前記構築物上の、前記アラインされた場所に基づき、前記リードを互いにアセンブルするステップをさらに含む、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記リードが、核酸リードである、項目７１に記載の方法。
（項目７４）
前記リードが、アミノ酸リードである、項目７１に記載の方法。
（項目７５）
前記構築物上の各位置が、基準配列内の塩基に対応する、項目７１に記載の方法。
（項目７６）
前記構築物上の各位置が、基準配列内のアミノ酸に対応する、項目７１に記載の方法。（項目７７）
前記構築物上の各位置が、基準配列内の遺伝子に対応する、項目７１に記載の方法。
（項目７８）
前記基準配列構築物が、方向を有する、項目７１に記載の方法。
（項目７９）
前記基準配列構築物を前記方向で通る経路が、生物のゲノムを表示する、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記基準配列構築物を前記方向で通る経路が、生物の染色体を表示する、項目７８に記載の方法。
（項目８１）
前記基準配列構築物を前記方向で通る経路が、タンパク質を表示する、項目７８に記載の方法。
（項目８２）
前記基準配列構築物を前記方向で通る経路が、非巡回経路である、項目７８に記載の方法。
（項目８３）
前記構築物内の前記少なくとも２つの代替配列が、前記位置における公知の遺伝子変異を表示する、項目７１に記載の方法。
（項目８４）
前記核酸リードの前記割り当てられた場所に基づき、生物に遺伝子型を割り当てるステップをさらに含む、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記少なくとも２つの代替配列が、塩基の挿入または塩基の欠失により互いに異なる、項目７１に記載の方法。
（項目８６）
各核酸リードが、核酸塩基の測定された配列を表示する記号のストリングを含む、項目７１に記載の方法。
（項目８７）
核酸塩基の前記測定された配列が、サンガーシーケンシング、ピロシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、合成を介するシーケンシング、ライゲーションを介するシーケンシング、および単一分子リアルタイムシーケンシングから選択されるシーケンシング法により決定される、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記基準配列構築物が、１，０００を超える塩基を含む、項目７１に記載の方法。
（項目８９）
前記基準配列構築物が、１，０００，０００を超える塩基を含む、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記複数の核酸リードが、１０００を超えるリードを含む、項目７１に記載の方法。
（項目９１）
前記複数の核酸リードの大部分が、１００塩基対を超える長さである、項目７１に記載の方法。
（項目９２）
コンピュータで実行される複数のリードをアラインする方法であって、
複数のリードを、記号のストリングとして得るステップと；
前記リードと前記構築物との重複をスコア付けするアルゴリズムを実行するプロセッサーを使用して、前記リードを、基準配列構築物にアラインするステップであり、前記構築物は、前記構築物内の複数の位置において、位置１箇所当たり少なくとも２つの代替配列を含む、ステップとを含む方法。
（項目９３）
前記アルゴリズムが、前記少なくとも２つの代替配列の選択に応じて最大の重複スコアを計算する、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記基準配列構築物が、有向非巡回グラフである、項目９２に記載の方法。
（項目９５）
前記複数の核酸リードが、コンピュータ可読メディアに保存される、項目９２に記載の方法。
（項目９６）
前記基準配列構築物が、コンピュータ可読メディアに保存されたデータベースを含む、項目９２に記載の方法。
（項目９７）
複数のリードをアラインするための、プロセッサーおよびメモリを含むシステムであって、前記メモリは、実行された際、前記プロセッサーに、
複数のリードを、記号のストリングとして得て；
前記リードと前記構築物との重複をスコア付けするアルゴリズムを使用して、前記リードを基準配列構築物にアラインし、ここで前記構築物は、前記構築物内の複数の位置において、位置１箇所当たり少なくとも２つの代替配列を含み；
前記アラインされた配列に対応するメモリにファイルを書き込む
ことをさせる命令を含む、システム。
（項目９８）
前記メモリが、実行された際、前記少なくとも２つの代替配列の選択に応じて最大の重複スコアを計算することを前記プロセッサーにさせる命令をさらに含む、項目９７に記載のシステム。
（項目９９）
前記基準配列構築物が、有向非巡回グラフである、項目９７に記載のシステム。
（項目１００）
前記複数のリードが、コンピュータ可読メディアに保存される、項目９７に記載のシステム。
（項目１０１）
前記基準配列構築物が、コンピュータ可読メディアに保存されたデータベースを含む、項目９７に記載のシステム。
（項目１０２）
複数の配列リードをアラインする方法であって、
複数の配列リードを得るステップと；
基準配列構築物に対する各配列リードごとの配列の重複をスコア付けするステップであり、前記構築物は、前記構築物内の複数の位置において、位置１箇所当たり少なくとも２つの代替配列を含み、ここで重複が大きくなればより低いスコアがもたらされる、ステップと；
各配列リードごとの前記スコアが最小化されるように、各配列リードを、前記構築物内の場所にアラインするステップと
を含む方法。
（項目１０３）
コンピュータで実行される複数のリードをアラインする方法であって、
複数のリードを、記号のストリングとして得るステップと；
コンピュータプロセッサーを使用して、リードに対応する記号の各ストリングを、基準配列構築物内の複数の位置と比較するステップであり、前記構築物は、前記構築物内の複数の位置において、記号の少なくとも２つの異なるストリングを含む、ステップと；
記号の前記ストリングと、前記基準配列構築物内の前記複数の位置の各々との重複を、プロセッサーによりスコア付けするステップであり、低スコアは重複の量が大きいことに対応する、ステップと；
各リードについて、最低のスコアに対応する前記重複を同定するステップと；
前記リードを、最低のスコアに対応する前記構築物上の場所にアラインするステップとを含む方法。
（項目１０４）
複数のリードをアラインするための、プロセッサーおよびメモリを含むシステムであって、前記メモリは、実行された際、前記プロセッサーに、
複数のリードを、記号のストリングとして得て；
リードに対応する記号の各ストリングを、基準配列構築物内の複数の位置と比較し、ここで前記構築物は、前記構築物内の複数の位置において、記号の少なくとも２つの異なるストリングを含み；
記号の前記ストリングと、前記基準配列構築物内の前記複数の位置の各々との重複をスコア付けし、ここで低スコアは重複の量が大きいことに対応し；
各核酸リードについて、最低のスコアに対応する前記重複を同定し；
前記核酸リードを、最低のスコアに対応する前記構築物上の場所へと割り当て；
前記アラインされた配列に対応するメモリにファイルを書き込む
ことをさせる命令を含む、システム。
【図１Ａ】
2020042813.tif 000009
【図１Ｂ】
2020042813.tif 000010
【図２】
2020042813.tif 000011
【図３】
2020042813.tif 000012
【図４】
2020042813.tif 000013
【図５】
2020042813.tif 000014
【配列表】
2020042813000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月19日(2019.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列リードをアラインするためのシステムであって、前記システムは、
少なくとも１つのプロセッサーと；
少なくとも１つの非一時的メモリであって、前記メモリは、実行された際、前記少なくとも１つのプロセッサーに、
配列リードを、記号のストリングとして得る工程と；
基準配列の少なくともいくつかを表示する基準有向非巡回グラフ（ＤＡＧ）であって、各配列を記号のストリングとして表示するノードと、前記ノードを接続するエッジとを含むＤＡＧにアクセスする工程であって、前記ノードの少なくともいくつかは、１または複数の親ノードを有し、前記ノードの少なくとも２つは、前記基準配列における１つまたは複数の位置の共通のセットについての異なる配列を表示する、工程と；
少なくとも部分的に、前記基準ＤＡＧの複数の位置の各々での前記配列リードの各々および前記基準ＤＡＧの間の重複をスコア付けすることにより、前記配列リードを前記基準ＤＡＧにアラインする工程であって、前記スコア付けは、あるノードのある記号ストリングにおける第１の記号の先行成分記号を、前記ノードの親ノードの記号ストリングの最後の記号として同定することを含む、工程と
アラインメントの結果をファイルに書き込む工程と
を含む方法を行わせる命令を保存する、非一時的メモリと
を含む、システム。
【請求項２】
前記配列リードが、核酸配列リードである、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記配列リードが、アミノ酸配列リードである、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記少なくとも１つの非一時的メモリが、実行された際、前記プロセッサーに、
前記配列リードの前記アラインメントの結果に基づき、前記アラインされた配列リードをアセンブルして、アセンブルされた配列を得る工程と；
前記アセンブルされた配列を、ファイルに書き込む工程と
を含む方法を行わせる命令をさらに保存する、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記アセンブルされた配列が、生物の遺伝子配列に対応する、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
前記遺伝子配列が、染色体またはゲノムを実質的に包含する、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
１または複数のアラインされた配列リードの前記アラインメントの結果に基づき、生物に遺伝子型を割り当てることをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記割り当てられた遺伝子型を、疾患の危険性と相関させることをさらに含む、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記疾患が、がんである、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記基準ＤＡＧが、非一時的コンピュータ可読メディアに保存された位置および記号についてのデータベースを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのプロセッサーが、複数のプロセッサーを含み、各プロセッサーが、前記配列リードの部分を前記基準ＤＡＧに対してアラインするように構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記基準ＤＡＧ上の前記複数の位置の各々が、前記基準配列内の核酸に対応する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記基準ＤＡＧ上の前記複数の位置の各々が、前記基準配列内のアミノ酸に対応する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記基準ＤＡＧ上の前記複数の位置の各々が、前記基準配列内の遺伝子に対応する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
前記基準ＤＡＧが、方向を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１６】
前記基準ＤＡＧを前記方向で通る経路が、生物のゲノムを表示する、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記基準ＤＡＧを前記方向で通る経路が、生物の染色体を表示する、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
前記基準ＤＡＧを前記方向で通る経路が、タンパク質を表示する、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１９】
前記基準配列における１つまたは複数の位置の共通のセットについての異なる配列を表示する前記少なくとも２つのノードが、塩基の挿入または塩基の欠失により互いに異なるヌクレオチド配列に対応する、請求項１に記載のシステム。
【請求項２０】
前記基準配列における１つまたは複数の位置の共通のセットについての異なる配列を表示する前記少なくとも２つのノードが、アミノ酸の挿入またはアミノ酸の欠失により互いに異なるポリペプチドに対応する、請求項１に記載のシステム。
【請求項２１】
前記基準ＤＡＧが、１，０００を超える記号を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２２】
前記基準ＤＡＧが、１，０００，０００を超える記号を含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２３】
前記配列リードが、１０００を超える配列リードを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２４】
前記配列リードの大部分が、記号１００個を超える長さである、請求項１に記載のシステム。
【請求項２５】
前記配列リードが、次世代シーケンシング法の出力ファイルである、請求項１に記載のシステム。