(57)【要約】【課題】前立腺癌の検出に使用することができる生体試料中のバイオマーカーを特定すること。【解決手段】本発明は、患者の体液または組織に前立腺癌を検出する組成物および方法を提供する。体液試料中のグリピカン−１のレベルを測定することにより前立腺癌を検出する。一実施形態では、体液試料とＭＩＬ−３８などの抗グリピカン−１抗体とを接触させることにより前立腺癌を検出する。本発明は、抗グリピカン−１抗体とグリピカン−１標準品とを含む、体液試料に前立腺癌を検出するためのキットを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の前立腺癌を検出する方法であって、患者の体液試料中のグリピカン−１のレベルを測定することと、前記体液試料中のグリピカン−１のレベルに基づき、前記患者に前立腺癌があるか、前立腺癌が発生する可能性が高いことを確定することとを含む、方法。
【請求項２】
（ａ）患者から体液試料を採取する段階と、
（ｂ）前記体液試料と抗グリピカン−１抗体とを接触させる段階と、
（ｃ）前記抗グリピカン−１抗体と前記体液試料との結合に基づき、前記患者に前立腺癌があるか、前立腺癌が発生する可能性が高いことを判定する段階と
を含む、請求項１に記載の患者の前立腺癌を検出する方法。
【請求項３】
前記抗グリピカン−１抗体がＭＩＬ−３８である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記体液試料と抗体の集団とを接触させ、
前記集団の抗体が、
（ａ）重鎖可変領域であって、
配列番号１０の位置５０〜５４によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、
配列番号１０の位置６９〜８５によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、
配列番号１０の位置１１８〜１２６によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と
を含む、重鎖可変領域および
（ｂ）軽鎖可変領域であって、
配列番号１１の位置４４〜５４によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、
配列番号１１の位置７０〜７６によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、
配列番号１１の位置１０９〜１１７によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と
を含む、軽鎖可変領域
を含み、
前記集団の抗体が、
配列番号１２の位置４８〜５８によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、
配列番号１２の位置７４〜８０によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、
配列番号１２の位置１１３〜１２１によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と
を含む軽鎖可変領域を含まない、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体集団が、２０１４年８月２２日、ＣｅｌｌＢａｎｋ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ（ＣＢＡ）にアクセッション番号ＣＢＡ２０１４００２６の下で寄託されたハイブリドーマ細胞によって産生されるものであるか、同細胞によって生成される抗体集団と同一のものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗グリピカン−１抗体がＭＩＬ−３８ではない、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記抗グリピカン−１抗体が、グリピカン−１と結合することが可能な抗体フラグメントまたは組換え抗体である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗グリピカン−１抗体を標識する、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記標識が、放射標識、蛍光標識、ビオチン−アビジン増幅系、化学発光系、マイクロスフェアおよびコロイド金からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
免疫蛍光法、放射標識、イムノブロッティング、ウエスタンブロット法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、免疫沈降、免疫組織化学法、生物膜試験、ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｉｎｇ  ｔｅｓｔ、抗体アレイ吸光度試験および化学発光からなる群より選択される技術により抗グリピカン−１抗体結合を検出する、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者の体液試料中のグリピカン−１のレベルと、対照試料中のグリピカン−１のレベルとを比較し、前記体液試料の抗グリピカン−１抗体結合が前記対照試料よりも増大していれば、前立腺癌が存在するものとする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記体液試料のグリピカン−１のレベルが前記対照試料中のグリピカン−１のレベルよりも５０％以上増大していれば、前立腺癌があることを示す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗グリピカン−１抗体と前記体液試料との結合を、対照試料の抗グリピカン−１抗体結合と比較し、前記体液試料の抗グリピカン−１抗体結合が前記対照試料よりも増大していれば、前立腺癌が存在するものとする、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗グリピカン−１抗体と前記体液試料との結合が前記対照試料の抗グリピカン−１抗体結合のレベルよりも５０％以上増大していれば、前立腺癌があることを示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗グリピカン−１抗体と前記体液試料との結合を、抗グリピカン−１抗体と１つまたは複数のグリピカン−１標準品との結合と比較し、前記標準品の抗グリピカン−１抗体結合を用いて前記体液試料中のグリピカン−１の量を定量化する、請求項２〜１０、１３または１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記体液試料中のグリピカン−１含有量が約１０ｎｇ／ｍｌを上回れば、前立腺癌があることを示す、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者の体液試料中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のレベルを測定することと、
（ｉ）前記体液試料で測定したＰＳＡのレベルおよび（ｉｉ）前記抗グリピカン−１抗体と前記体液試料との結合に基づき、前記患者に前立腺癌があるか、前立腺癌が発生する可能性が高いことを確定することと
をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のレベルを前記患者の血液試料で測定する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
測定した前記体液試料中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のレベルと、対照試料で測定したＰＳＡのレベルとを比較し、前記体液試料中のＰＳＡレベルが前記対照試料よりも増大していれば、前立腺癌が存在するものとする、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記体液が、血液、血清、血漿および尿からなる群より選択される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前立腺癌を検出するキットであって、第一の抗グリピカン−１抗体と、薬学的に許容される担体と、グリピカン−１標準品とを含み、患者の体液中のグリピカン−１を検出することが可能である、キット。
【請求項２２】
前記抗グリピカン−１抗体がＭＩＬ−３８ではない、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記抗グリピカン−１抗体がＭＩＬ−３８である、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
前記抗グリピカン−１抗体が、請求項４、５または７のいずれか１項で言及されている抗体である、請求項２１に記載のキット。
【請求項２５】
二次リガンドをさらに含む、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２６】
前記二次リガンドが、第二の抗グリピカン−１抗体またはグリピカン−１と結合することが可能なアプタマーであり、前記第二の抗グリピカン−１抗体が、前記第一の抗グリピカン−１抗体と同じものであり得る、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記二次リガンドを迅速に検出するため、前記リガンドが標識とコンジュゲートされている、請求項２５または請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記標識が、免疫蛍光法、放射標識、イムノブロッティング、ウエスタンブロット法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、免疫沈降、免疫組織化学法、生物膜試験、ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｉｎｇ  ｔｅｓｔ、抗体アレイ吸光度試験および化学発光からなる群より選択される検出方法に使用するためのものである、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
ＥＬＩＳＡを実施するための構成要素を含む、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、全般的には前立腺癌診断の分野に関する。具体的には、本発明は、前立腺癌の検出に使用することができる生体試料中のバイオマーカーを特定することに関する。特定されたマーカーはほかにも、前立腺癌患者の予後の判定および治療に対する応答のモニタリングに使用し得る。
【背景技術】
【０００２】
相互参照による組込み
本願は、２０１４年１月１７日に出願された米国特許仮出願第６１／９２８，７７６号の優先権を主張するものであり、上記出願の内容全体が相互参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
発明の背景
前立腺癌は、米国の男性に最も高頻度に診断が下される内臓癌であり、その死因の第２位を占めている。米国癌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）の推定では、２０１３年に新たに診断される前立腺癌の症例数は約２３８，５９０例にのぼり、２９，７２０人の男性が前立腺癌で死亡するとみられている。全体でみると、男性の６人に１人が生涯の間に前立腺癌の診断が下されることになる。
【０００４】
現在、前立腺癌は直腸指診（ＤＲＥ）または患者の血中前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の測定のいずれかによって検出することが可能である。しかし、いずれの検査も完全に決定的なものになるわけではなく、偽陰性（実際には存在する癌が検出されずにいる）および偽陽性（癌が存在しなくても癌のシグナルが発生する）となることもある。例えば、推奨される４．０ｎｇ／ｍｌのカットオフレベルで実施される標準的なＰＳＡ検査は、癌患者に対する感度は８６％であるが、特異性は３３％であり、非癌患者のおよそ６７％が偽陽性となる（Ｈｏｆｆｍａｎら，２００２）。偽陽性であれば通常、続いて侵襲性で痛みを伴う生検が実施される。
【０００５】
精度および／または感度が改善された前立腺癌の診断検査法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
本発明は、前立腺癌患者の体液または組織にグリピカン−１ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＧＰＣ−１）レベルの上昇がみられるという発見に一部基づくものである。本発明者らは、グリピカン−１が新たな前立腺癌のマーカーになることを発見した。したがって、本発明は、グリピカン−１を検出して患者に前立腺癌が存在することを確定する方法を提供する。
【０００７】
一実施形態では、本発明は、患者の前立腺癌を検出する方法であって、患者から体液試料または組織試料を採取することと、前記試料と抗グリピカン−１抗体とを接触させることと、前記抗グリピカン−１抗体と前記体液試料または組織試料との結合に基づき、前記患者に前立腺癌があるか、前立腺癌が発生する可能性が高いことを確定することとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、体液試料または組織試料中の１つまたは複数の追加の前立腺マーカーのレベルを測定し、患者に癌があること確定は、患者の体液試料または組織試料中のグリピカン−１のレベルおよび１つまたは複数の追加のマーカーのレベルに基づくものである。いくつかの実施形態では、癌は前立腺癌であり、追加のマーカーはＰＳＡである。いくつかの実施形態では、抗グリピカン−１抗体はＭＩＬ−３８である。他の実施形態では、抗グリピカン−１抗体はＭＩＬ−３８ではない。いくつかの実施形態では、抗グリピカン−１抗体は、グリピカン−１と結合することが可能な抗体フラグメントまたは組換え抗体である。いくつかの実施形態では、検出を容易にするために抗グリピカン−１抗体を標識する。いくつかの実施形態では、抗体の標識は、特に蛍光標識、ビオチン−アビジン増幅系、化学発光系、マイクロスフェアまたはコロイド金であり得る。
【０００８】
いくつかの実施形態では、患者から採取する体液試料は、血液試料、血清試料、血漿試料または尿試料である。
【０００９】
一実施形態では、抗グリピカン−１抗体と患者の体液試料または組織試料との結合を、対照試料の抗グリピカン−１抗体結合のレベルと比較し；体液試料または組織試料の抗グリピカン−１抗体結合が対照試料よりも増大していれば、前立腺癌が存在するものとする。いくつかの実施形態では、前記対照試料は、年齢が一致し前立腺癌がない患者の体液を含む。
【００１０】
他の実施形態では、抗グリピカン−１抗体と患者の体液または組織との結合のレベルを、抗グリピカン−１抗体と比較標準品との結合のレベルと比較し、体液試料または組織試料の抗グリピカン−１抗体結合が比較標準品試料よりも増大していれば、前立腺癌が存在するものとする。いくつかの実施形態では、前記比較標準品は、グリピカン−１含有量が既知の試料を含む。いくつかの実施形態では、抗グリピカン−１と体液または組織との結合の比較を、抗グリピカン−１とグリピカン−１標準品との結合と比較して、前記体液中のグリピカン−１の量を定量化する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、体液試料中のグリピカン−１含有量が約０．１ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌまたは２０ｎｇ／ｍｌを上回れば、前立腺癌があることを示す。
【００１２】
本発明の診断方法は、患者に１つまたは複数の前立腺癌治療を実施することと、患者の回復または前立腺癌治療に対する応答をモニターする機序として体液または組織中のグリピカン−１レベルの変化を追跡することとをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、免疫蛍光法、放射標識、イムノブロッティング、酵素結合免疫測定法、フローサイトメトリー、吸光度および化学発光などの技術により抗グリピカン−１抗体結合を検出する。
【００１３】
本発明はこのほか、患者の体液または組織中のグリピカン−１を検出するキットを含む。一実施形態では、前立腺癌を検出するキットは、第一の抗グリピカン−１抗体と、薬学的に許容される担体と、グリピカン−１標準品とを含み；前記キットは、患者の体液または組織中のグリピカン−１を検出することが可能なものである。いくつかの実施形態では、キットは二次リガンドをさらに含む。いくつかの実施形態では、二次リガンドは第二の抗グリピカン−１抗体である。一実施形態では、第二の抗グリピカン−１抗体は第一の抗グリピカン−１抗体と同じものである。
【００１４】
いくつかの実施形態では、前記リガンドを迅速に検出するため、二次リガンドが標識とコンジュゲートされている。
【００１５】
したがって、本発明は、少なくとも以下の番号を付した一連の実施形態に関する：
実施形態１：患者の前立腺癌を検出する方法であって、患者の体液試料中のグリピカン−１のレベルを測定することと、体液試料中のグリピカン−１のレベルに基づき、前記患者に前立腺癌があるか、前立腺癌が発生する可能性が高いことを確定することとを含む、方法。
【００１６】
実施形態２：
（ａ）患者から体液試料を採取する段階と、
（ｂ）前記体液試料と抗グリピカン−１抗体とを接触させる段階と、
（ｃ）前記抗グリピカン−１抗体と前記体液試料との結合に基づき、前記患者に前立腺癌があるか、前立腺癌が発生する可能性が高いことを判定する段階と
を含む、実施形態１に記載の患者の前立腺癌を検出する方法。
【００１７】
実施形態３：前記抗グリピカン−１抗体がＭＩＬ−３８である、実施形態２に記載の方法。
【００１８】
実施形態４：前記体液試料と抗体の集団とを接触させ、
集団の抗体が、
（ａ）重鎖可変領域であって、
配列番号１０の位置５０〜５４によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、
配列番号１０の位置６９〜８５によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、
配列番号１０の位置１１８〜１２６によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と
を含む、重鎖可変領域および
（ｂ）軽鎖可変領域であって、
配列番号１１の位置４４〜５４によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、
配列番号１１の位置７０〜７６によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、
配列番号１１の位置１０９〜１１７によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と
を含む、軽鎖可変領域
を含み、
集団の抗体が、
配列番号１２の位置４８〜５８によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、
配列番号１２の位置７４〜８０によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、
配列番号１２の位置１１３〜１２１によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と
を含む軽鎖可変領域を含まない、実施形態２に記載の方法。
【００１９】
実施形態５：抗体集団が、２０１４年８月２２日、ＣｅｌｌＢａｎｋ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ（ＣＢＡ）にアクセッション番号ＣＢＡ２０１４００２６の下で寄託されたハイブリドーマ細胞によって産生されるものであるか、同細胞によって生成される抗体集団と同一のものである、実施形態４に記載の方法。
【００２０】
実施形態６：前記抗グリピカン−１抗体がＭＩＬ−３８ではない、実施形態２に記載の方法。
【００２１】
実施形態７：前記抗グリピカン−１抗体が、グリピカン−１と結合することが可能な抗体フラグメントまたは組換え抗体である、実施形態２〜４のいずれか１つに記載の方法。
【００２２】
実施形態８：前記抗グリピカン−１抗体を標識する、実施形態２〜７のいずれか１つに記載の方法。
【００２３】
実施形態９：前記標識が、放射標識、蛍光標識、ビオチン−アビジン増幅系、化学発光系、マイクロスフェアおよびコロイド金からなる群より選択される、実施形態８に記載の方法。
【００２４】
実施形態１０：免疫蛍光法、放射標識、イムノブロッティング、ウエスタンブロット法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、免疫沈降、免疫組織化学法、生物膜試験、ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｉｎｇ  ｔｅｓｔ、抗体アレイ吸光度試験および化学発光からなる群より選択される技術により抗グリピカン−１抗体結合を検出する、実施形態２〜９のいずれか１つに記載の方法。
【００２５】
実施形態１１：前記患者の体液試料中のグリピカン−１のレベルと、対照試料中のグリピカン−１のレベルとを比較し、体液試料の抗グリピカン−１抗体結合が対照試料よりも増大していれば、前立腺癌が存在するものとする、実施形態１に記載の方法。
【００２６】
実施形態１２：前記体液試料のグリピカン−１のレベルが対照試料中のグリピカン−１のレベルよりも５０％以上増大していれば、前立腺癌があることを示す、実施形態１１に記載の方法。
【００２７】
実施形態１３：抗グリピカン−１抗体と前記体液試料との結合を、対照試料の抗グリピカン−１抗体結合と比較し、体液試料の抗グリピカン−１抗体結合が対照試料よりも増大していれば、前立腺癌が存在するものとする、実施形態２〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【００２８】
実施形態１４：抗グリピカン−１抗体と前記体液試料との結合が対照試料の抗グリピカン−１抗体結合のレベルよりも５０％以上増大していれば、前立腺癌があることを示す、実施形態１３に記載の方法。
【００２９】
実施形態１５：抗グリピカン−１抗体と前記体液試料との結合を、抗グリピカン−１抗体と１つまたは複数のグリピカン−１標準品との結合と比較し、標準品の抗グリピカン−１抗体結合を用いて前記体液試料中のグリピカン−１の量を定量化する、実施形態２〜１０、１３または１４のいずれか１つに記載の方法。
【００３０】
実施形態１６：体液試料中のグリピカン−１含有量が約１０ｎｇ／ｍｌを上回れば、前立腺癌があることを示す、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【００３１】
実施形態１７：
患者の体液試料中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のレベルを測定することと、
（ｉ）体液試料で測定したＰＳＡのレベルおよび（ｉｉ）前記抗グリピカン−１抗体と前記体液試料との結合に基づき、前記患者に前立腺癌があるか、前立腺癌が発生する可能性が高いことを確定することと
をさらに含む、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【００３２】
実施形態１８：前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のレベルを患者の血液試料で測定する、実施形態１７に記載の方法。
【００３３】
実施形態１９：測定した体液試料中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のレベルと、対照試料で測定したＰＳＡのレベルとを比較し、体液試料中のＰＳＡレベルが対照試料よりも増大していれば、前立腺癌が存在するものとする、実施形態１７または実施形態１８に記載の方法。
【００３４】
実施形態２０：前記体液が、血液、血清、血漿および尿からなる群より選択される、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【００３５】
実施形態２１：前立腺癌を検出するキットであって、第一の抗グリピカン−１抗体と、薬学的に許容される担体と、グリピカン−１標準品とを含み、患者の体液中のグリピカン−１を検出することが可能である、キット。
【００３６】
実施形態２２：抗グリピカン−１抗体がＭＩＬ−３８ではない、実施形態２１に記載のキット。
【００３７】
実施形態２３：抗グリピカン−１抗体がＭＩＬ−３８である、実施形態２１に記載のキット。
【００３８】
実施形態２４：抗グリピカン−１抗体が、実施形態４、５または７のいずれか１つで言及されている抗体である、実施形態２１に記載のキット。
【００３９】
実施形態２５：二次リガンドをさらに含む、実施形態２１〜２４のいずれか１つに記載のキット。
【００４０】
実施形態２６：前記二次リガンドが、第二の抗グリピカン−１抗体またはグリピカン−１と結合することが可能なアプタマーであり、前記第二の抗グリピカン−１抗体が、第一の抗グリピカン−１抗体と同じものであり得る、実施形態２５に記載のキット。
【００４１】
実施形態２７：前記二次リガンドを迅速に検出するため、前記リガンドが標識とコンジュゲートされている、実施形態２５または実施形態２６に記載のキット。
【００４２】
実施形態２８：前記標識が、免疫蛍光法、放射標識、イムノブロッティング、ウエスタンブロット法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、免疫沈降、免疫組織化学法、生物膜試験、ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｉｎｇ  ｔｅｓｔ、抗体アレイ吸光度試験および化学発光からなる群より選択される検出方法に使用するためのものである、実施形態２７に記載のキット。
【００４３】
実施形態２９：ＥＬＩＳＡを実施するための構成要素を含む、実施形態２２〜２８のいずれか１つに記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】細胞結合ＭＩＬ−３８グリピカン−１抗原の特徴付けを示す図である。ＤＵ−１４５前立腺癌細胞を膜タンパク質抽出キット（ＭＰＥＫ、Ｍｅｒｃｋ社）で処理し、磁気ビーズと結合させたＭＩＬ−３８抗体とインキュベートした。次いで、抗原を免疫沈降させ、磁気ビーズ上で洗浄した後、抗原を溶出させ、前記抗原を質量分析に供した。グリピカン−１がＭＩＬ−３８抗原であると同定されたマススペック解析の結果を示す。グリピカン−１タンパク質の範囲にわたる１８個の固有のペプチド配列には下線が施されている。
【図２】ＭＩＬ−３８の免疫沈降およびサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。ＭＩＬ−３８を用いてＤＵ−１４５前立腺癌細胞の膜抽出物を免疫沈降させ、サイズ排除クロマトグラフィーカラムに通した。図は、ＭＩＬ−３８抗体または二次抗体対照のいずれかを用いた偶数のクロマトグラフィー画分のウエスタンブロット分析を示している。画分Ａ２８およびＡ３０の６０Ｋｄの位置にＭＩＬ−３８抗原が見られる。
【図３】サイズ排除クロマトグラフィーで精製したＭＩＬ−３８抗原の質量分析を示す図である。  図２のサイズ排除クロマトグラフィーによる分離で得られた画分番号Ａ２９を質量分析により分析した。グリピカン−１がＭＩＬ−３８抗原であると同定されたマススペック解析の結果が、グリピカン−１タンパク質の範囲にわたる８個の固有のペプチド配列に下線を施して示されている。
【図４】ＭＩＬ−３８抗体と抗ＧＰＣ−１抗体が二次元ゲルウエスタンブロット上で反応性の重複を示すことを示す図である。ＤＵ−１４５前立腺癌細胞の膜タンパク質抽出物を二次元ゲルで分離した（ｐＩ勾配が横方向、分子質量が縦方向である）。ＭＩＬ−３８抗体および市販のｒＧＰＣ−１ウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットに６０Ｋｄタンパク質を示す反応性の重複が見られる（図の丸で囲った部分）。レーンＤは、対照であるＤＵ−１４５抽出物の一次元分離である。レーンＭは、対照である分子量サイズのマーカーの一次元分離レーンである。
【図５】ＭＩＬ−３８がＧＰＣ−１抗体の免疫沈降物を検出することができ、逆も同様であることを示す図である。ＭＩＬ−３８抗体およびウサギ抗ＧＰＣ−１抗体をそれぞれ用いて、ＤＵ−１４５前立腺癌細胞またはＣ３（ＭＩＬ−３８陰性）細胞の膜タンパク質抽出物からその抗原を免疫沈降させた。ＭＩＬ−３８抗体または抗ＧＰＣ−１抗体のいずれかで検出された免疫沈降のウエスタンブロットが示されている。図５Ａは、ＭＩＬ−３８免疫沈降物のＧＰＣ−１による検出（左）およびＧＰＣ−１免疫沈降物のＭＩＬ−３８による検出（右）を示す。図５Ｂは、対照であるＭＩＬ−３８免疫沈降物のＭＩＬ−３８による検出を示す。各レーンは、Ｍａｇｉｃ  Ｍａｒｋ−対照である市販のタンパク質マーカー；ＤＵ１４５ＭＰＥＫ−前立腺癌膜タンパク質抽出物（免疫沈降させていない）；ＤＵ１４５  ＦＴ−免疫沈降で得られた前立腺癌のフロースルー；ＤＵ１４５  ＩＰ−抗体を用いた免疫沈降物；Ｃ３  ＭＰＥＫ−（ＭＩＬ−３８陰性）対照膜タンパク質抽出物（免疫沈降させていない）；Ｃ３  ＦＴ−免疫沈降で得られた（ＭＩＬ−３８陰性）細胞のフロースルー；Ｃ３  ＩＰ溶出物−抗体を用いた（ＭＩＬ−３８陰性）細胞の免疫沈降物である。ＭＩＬ−３８はｒＧＰＣ−１抗体の免疫沈降物を検出することができ、逆も同様である。ＭＩＬ−３８はほかにも、ＤＵ１４５  ＭＰＥＫを含めた全対照およびＭＩＬ−３８により実施したＩＰと結合することができる。
【図６】ＭＩＬ−３８が組換えグリピカン−１を検出することを示す図である。ＮＳ０細胞で産生された組換えグリピカン−１のＭＩＬ−３８抗体および抗ＧＰＣ−１抗体との反応性を試験した。ウエスタンブロットは、ＭＩＬ−３８抗体およびウサギポリクローナル抗ＧＰＣ−１抗体がともに組換えグリピカン−１との反応を有することを示している。各レーンは、Ｍａｇｉｃ  Ｍａｒｋ−対照である市販のタンパク質マーカー；ＧＰＣ−１−組換えグリピカン−１タンパク質；ＧＰＣ−１  ｒｅｄ−還元剤を用いた組換えグリピカン−１タンパク質である。
【図７】ＭＩＬ−３８が細胞培養上清中に分泌された抗原を検出することができることを示す図である。ＤＵ−１４５前立腺癌細胞を無血清培地で３６時間インキュベートして無細胞馴化培地を得た。ＭＩＬ−３８抗体を用いて細胞を全く含まない馴化培地を免疫沈降させ、ＤＵ−１４５  ＭＰＥＫ膜タンパク質抽出物を用いた標準ＩＰと比較した。ＭＩＬ−３８抗体を用いた免疫沈降物のウエスタンブロットが示されている。ＭＩＬ−３８抗体は、馴化液体培地中の４０ｋＤおよび５５ｋＤの抗原を検出することができる。
【図８Ａ】細胞培養上清中に検出されたＭＩＬ−３８抗原がグリピカン−１であることを示す図である。ＤＵ−１４５前立腺癌細胞を無血清培地で３６時間インキュベートして無細胞馴化培地を得た。ＭＩＬ−３８抗体を用いて馴化培地を免疫沈降させ、免疫沈降物を質量分析法による分析に供した。図８Ａ．４０ｋＤおよび５５ｋＤのＭＩＬ−３８反応性抗原をともに含有する試料をマススペック解析に供した。グリピカン−１が馴化液体培地のＭＩＬ−３８抗原であると同定されたマススペック解析の結果が、グリピカン−１タンパク質のＮ末端の範囲にわたる９個の固有のペプチド配列に下線を施して示されている。図８Ｂ．４０  ｋＤａのＭＩＬ−３８反応性抗原を含有する試料をマススペック解析に供した。グリピカン−１が馴化液体培地のＭＩＬ−３８抗原であると同定されたマススペック解析の結果が、グリピカン−１タンパク質のＮ末端の範囲にわたる１０個の固有のペプチド配列に下線を施して示されている。図８Ｃ．５５ｋＤａのＭＩＬ−３８反応性抗原を含有する試料をマススペック解析に供した。グリピカン−１が馴化液体培地のＭＩＬ−３８抗原であると同定されたマススペック解析の結果が、グリピカン−１タンパク質のＮ末端の範囲にわたる９個の固有のペプチド配列に下線を施して示されている。
【図８Ｂ】細胞培養上清中に検出されたＭＩＬ−３８抗原がグリピカン−１であることを示す図である。ＤＵ−１４５前立腺癌細胞を無血清培地で３６時間インキュベートして無細胞馴化培地を得た。ＭＩＬ−３８抗体を用いて馴化培地を免疫沈降させ、免疫沈降物を質量分析法による分析に供した。図８Ａ．４０ｋＤおよび５５ｋＤのＭＩＬ−３８反応性抗原をともに含有する試料をマススペック解析に供した。グリピカン−１が馴化液体培地のＭＩＬ−３８抗原であると同定されたマススペック解析の結果が、グリピカン−１タンパク質のＮ末端の範囲にわたる９個の固有のペプチド配列に下線を施して示されている。図８Ｂ．４０  ｋＤａのＭＩＬ−３８反応性抗原を含有する試料をマススペック解析に供した。グリピカン−１が馴化液体培地のＭＩＬ−３８抗原であると同定されたマススペック解析の結果が、グリピカン−１タンパク質のＮ末端の範囲にわたる１０個の固有のペプチド配列に下線を施して示されている。図８Ｃ．５５ｋＤａのＭＩＬ−３８反応性抗原を含有する試料をマススペック解析に供した。グリピカン−１が馴化液体培地のＭＩＬ−３８抗原であると同定されたマススペック解析の結果が、グリピカン−１タンパク質のＮ末端の範囲にわたる９個の固有のペプチド配列に下線を施して示されている。
【図８Ｃ】細胞培養上清中に検出されたＭＩＬ−３８抗原がグリピカン−１であることを示す図である。ＤＵ−１４５前立腺癌細胞を無血清培地で３６時間インキュベートして無細胞馴化培地を得た。ＭＩＬ−３８抗体を用いて馴化培地を免疫沈降させ、免疫沈降物を質量分析法による分析に供した。図８Ａ．４０ｋＤおよび５５ｋＤのＭＩＬ−３８反応性抗原をともに含有する試料をマススペック解析に供した。グリピカン−１が馴化液体培地のＭＩＬ−３８抗原であると同定されたマススペック解析の結果が、グリピカン−１タンパク質のＮ末端の範囲にわたる９個の固有のペプチド配列に下線を施して示されている。図８Ｂ．４０  ｋＤａのＭＩＬ−３８反応性抗原を含有する試料をマススペック解析に供した。グリピカン−１が馴化液体培地のＭＩＬ−３８抗原であると同定されたマススペック解析の結果が、グリピカン−１タンパク質のＮ末端の範囲にわたる１０個の固有のペプチド配列に下線を施して示されている。図８Ｃ．５５ｋＤａのＭＩＬ−３８反応性抗原を含有する試料をマススペック解析に供した。グリピカン−１が馴化液体培地のＭＩＬ−３８抗原であると同定されたマススペック解析の結果が、グリピカン−１タンパク質のＮ末端の範囲にわたる９個の固有のペプチド配列に下線を施して示されている。
【図９】ＭＩＬ−３８抗体が前立腺癌患者の血漿および前立腺癌の膜抽出物中のグリピカン−１を検出することができることを示す図である。図９Ａ．正常対照患者１例および前立腺癌患者１例の血漿試料をＭＩＬ−３８抗体で免疫沈降させた。ＭＩＬ−３８抗体およびｒＧＰＣ１抗体によるウエスタンブロットの両方が示されている。ＭＩＬ−３８では、対照患者の血漿よりも前立腺癌患者の血漿の方が免疫沈降したグリピカン−１タンパク質のレベルが高かった。各レーンは、０４６  ＩＰ  ＮＴ−前立腺癌血漿のＩＰ；０４６  ＩＰ  ＨｅｐＩ−ヘパリナーゼで処理した前立腺癌血漿のＩＰ；０４２  ＩＰ  ＮＴ−正常対照血漿のＩＰ；０４２  ＩＰ  ＨｅｐＩ−ヘパリナーゼで処理した正常対照血漿のＩＰ；Ｍａｇｉｃ  Ｍａｒｋ−対照である市販のタンパク質マーカーである。図９Ｂ．正常前立腺１例および前立腺癌１例の膜タンパク質抽出物をＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏ社から入手した。ＭＩＬ−３８抗体を用いて等量のタンパク質にウエスタンブロットを実施した。前立腺癌抽出物の方がＭＩＬ−３８抗原の発現が高かった。
【図１０】ＭＩＬ−３８が前立腺癌患者の尿に癌を検出することができることを示す図である。年齢が一致した患者１２５例から尿試料を採取し、間接免疫蛍光アッセイにＭＩＬ−３８抗体を用いて前立腺癌の存在を試験した。生検による確認（ＢＰＨ、ＣａＰ）または危険因子の分析（健常対照）のいずれかに基づき、患者を健常対照、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）または前立腺癌（ＣａＰ）に分類した。図には、ＣａＰ実験試料；ＤＵ１４５陽性対照試料；およびＣ３陰性対照試料の例示的な画像が示されている。
【図１１】ＭＩＬ−３８が様々なＥＬＩＳＡフォーマットで組換えグリピカン−１を検出することができることを示す図である。組換えヒトＮＳ０産生グリピカン−１タンパク質（ｒｈＧＰＣ１）０ｎｇ、０．１ｎｇ、１ｎｇまたは１０ｎｇを分析物として用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ法を実施した。図１１Ａ．ＭＩＬ−３８抗体による捕捉、ウサギポリクローナル抗ＧＰＣ１（ａ−ＧＰＣ１）による検出。図１１Ｂ．抗グリピカン−１抗体による捕捉、ＭＩＬ−３８による検出。図１１Ｃ．ＭＩＬ−３８による捕捉、ビオチン化ＭＩＬ−３８による検出。
【図１２Ａ】様々なＭＩＬ−３８抗体調製物を捕捉抗体として用いて実施したサンドイッチＥＬＩＳＡ法による比較を示す図である。図１２Ａ．ＡＭ３およびＡＭ４を捕捉抗体として用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による比較を示している。図１２Ｂ．混合調製物（３４Ａ）またはクローン集団（ＡＭ４  １Ｆ５）のいずれかを捕捉抗体として用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による比較を示している。
【図１２Ｂ】様々なＭＩＬ−３８抗体調製物を捕捉抗体として用いて実施したサンドイッチＥＬＩＳＡ法による比較を示す図である。図１２Ａ．ＡＭ３およびＡＭ４を捕捉抗体として用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による比較を示している。図１２Ｂ．混合調製物（３４Ａ）またはクローン集団（ＡＭ４  １Ｆ５）のいずれかを捕捉抗体として用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による比較を示している。
【図１３】抗体スクリーニングの未処理データの箱ひげ図グラフである。ＡＭ４  ＭＩＬ−３８抗体と各合成ペプチドとの結合をＰＥＰＳＣＡＮベースのＥＬＩＳＡで試験した。箱の下端および上端はデータの２５番目および７５番目の百分位数である。箱中央付近の帯は５０番目の百分位数（中央値）である。ひげは四分位範囲の１．５倍にあたり、データセット内の統計的外れ値を示している（Ｍｃｇｉｌｌら，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｉａｎ，３２：１２−１６，１９７８）。
【図１４】セット３の置換分析（実施例１３）で探索したＭＩＬ３８−ＡＭ４を文字プロットで表した図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
詳細な説明
本発明は、前立腺癌患者の体液または細胞にグリピカン−１ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＧＰＣ−１）レベルの上昇がみられるという発見に一部基づくものである。本発明者らは、グリピカン−１が新たな前立腺癌のマーカーになることを発見した。したがって、本発明は、患者に前立腺癌の存在を検出する方法を提供する。
【００４６】
正常なヒト細胞がテロメア短縮により生存不能になるまでに可能な細胞分裂の回数はわずか４０〜６０回である。しかし、前立腺癌細胞は分裂のヘイフリック限界による制限を受けずにいつまでも分裂し続け、異常な増殖をもたらす。
【００４７】
癌の発生で最もよくみられるのは、患者体内での腫瘍の形成である。本発明のいくつかの実施形態では、前立腺癌腫瘍は無痛性および無症候性であり得る。他の実施形態では、腫瘍は身体的不快感をはじめ、体液流の閉塞または出血などの局所的症状を引き起こし得る。いくつかの実施形態では、本発明の前立腺癌は、全身症状、例えば正常な身体機能の破壊によって引き起こされる全身症状などを引き起こし得る。他の実施形態では、本発明の前立腺癌の症状は、排便習慣または膀胱機能の変化を含み得る。
【００４８】
良性前立腺腫瘍（非癌性）と悪性前立腺腫瘍（癌性）とを区別する因子のひとつに、転移する能力がある。転移とは、癌が他の身体部分に拡散する（転移する）能力のことである。患者の前立腺癌はさらに、疾患の進行に応じていくつかのステージに分類される。最もよく用いられるステージング法がＴＮＭ法であり、この方法では、原発性腫瘍の大きさおよび程度（Ｔ）、周辺リンパ節への癌の拡散（Ｎ）ならびに原発性腫瘍が他の身体部分に転移することにより形成された続発性腫瘍の存在（Ｍ）に基づいて癌を分類する（米国癌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ））。表１に癌の各ステージの定義の例を示す。
【００４９】
【表１】
2020060585.tif 000002
【００５０】
いくつかの実施形態では、本発明により任意の１つまたは複数のステージの癌を検出することができる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本発明のグリピカン−１は配列番号１によってコードされる。いくつかの実施形態では、グリピカン−１タンパク質は配列番号２の完全アミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、グリピカン−１タンパク質は配列番号３のシグナルペプチドを含まない。いくつかの実施形態では、グリピカン−１タンパク質は配列番号４のプロペプチドを含まない。いくつかの実施形態では、本発明のグリピカン−１タンパク質は配列番号５である。いくつかの実施形態では、本発明のグリピカン−１は、グリピカン−１変異体、例えばアイソフォーム、スプライスバリアントおよびアロタイプなどを含む。本発明はこのほか、前立腺癌の患者の予後を判定する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、患者から体液被験試料または組織被験試料を採取することと、前記体液または組織中のグリピカン−１のレベルを測定することと、前記レベルと固定された範囲の数値とを比較することとを含み、グリピカン−１レベルの方が高いほど、予後不良であるか、患者転帰が好ましくないものとする。
【００５２】
本発明を用いて検出され得る前立腺癌の非限定的な例としては、前立腺上皮内新生物、腺癌、平滑筋肉腫および横紋筋肉腫が挙げられる。
【００５３】
癌に対する最も強力なツールのひとつが早期検出である。癌のステージが早期であるほど治療が容易になる傾向があり、ほとんどの癌は、未だ局在化していれば予後が良好になるのが一般的である。癌の診断に役立ち得る検査は多数存在する。いくつかの実施形態では、本発明は、グリピカン−１を単独で用いて前立腺癌を検出するものである。他の実施形態では、ＧＰＣ−１を別の抗原とともに使用し、両方の抗原が検出されることによって前立腺癌の存在が確定される。一実施形態では、別の抗原はＰＳＡである。
【００５４】
本発明は、前立腺癌を検出する方法を提供する。前立腺癌は、米国の男性に最も高頻度に診断が下される内臓癌であり、その死因の第２位を占めている。米国癌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）の推定では、２０１３年に新たに診断される前立腺癌の症例数は約２３８，５９０例にのぼり、２９，７２０人の男性が前立腺癌で死亡するとみられている。全体でみると、男性の６人に１人が生涯の間に前立腺癌の診断が下されることになる。前立腺癌には、排尿困難、勃起不全および疼痛を含めた多数の症状がみられとされている。前立腺癌のほとんどは増殖速度が遅いが、転移して最終的に死に至る可能性のある進行性の前立腺癌の症例もある。
【００５５】
現在、医療専門家によって用いられている主要な前立腺癌検出検査は、直腸指診（ＤＲＥ）および患者血液中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の測定の２つである。だが、いずれの検査も完全に決定的なものになるわけではなく、偽陰性（実際には存在する癌が検出されずにいる）および偽陽性（癌が存在しなくても癌のシグナルが発生する）となることもある。例えば、推奨される４．０ｎｇ／ｍｌのカットオフレベルで実施される標準的なＰＳＡ検査は、癌患者に対する感度は８６％であるが、特異性は３３％であり、非癌患者のおよそ６７％が偽陽性となる（Ｈｏｆｆｍａｎら，２００２）。本発明では、グリピカン−１測定とまた別の前立腺癌抗原、ＰＳＡとを組み合わせ、患者の体液または組織中のグリピカン−１のレベルおよびＰＳＡ検査の結果に基づき、前立腺癌の存在を確定する方法について記載する。
【００５６】
ＢＬＣＡ−３８（ＭＩＬ−３８としても知られる）は、ヒト膀胱癌細胞系ＵＣＲＵ−ＢＬ−１７ＣＬに対してマウスに生じさせたＩｇＧ１マウス抗体である（Ｗａｌｋｅｒら，１９８９）。得られた抗体は、ほとんどのヒト膀胱癌系と結合することが明らかにされている（Ｒｕｓｓｅｌｌら，２００４）。この抗体は、３０Ｋｄの細胞表面タンパク質と結合し、特定の種類の膀胱癌の検出に有用であるものとして記載されている（米国特許第５，６２２，８３６号）。
【００５７】
本発明は、ＭＩＬ−３８抗原のアイデンティティについて初めて記載するものである。本発明者らは、のちの実施例１〜８に記載する一連の免疫沈降、ウエスタンブロット分析、質量分析および二次元ゲルにより、この抗原を発見した。本発明に従えば、当業者に公知の任意の適切な薬剤および／または任意の適切な技術を用いて、所与の試料（例えば、体液試料）中のグリピカン−１のレベルを測定し、その測定値を用いて、試料を得た患者の前立腺癌の診断および／または予後予測を実施することができる。いくつかの実施形態では、薬剤は抗グリピカン−１抗体である。本発明のいくつかの実施形態では、ＭＩＬ−３８抗体を用いて、６０ｋＤグリピカン−１プロテオグリカンと結合させて検出する。いくつかの実施形態では、ＭＩＬ−３８抗体を用いて前立腺癌細胞表面のグリピカン−１抗原を検出する。他の実施形態では、ＭＩＬ−３８抗体を用いて前立腺癌患者の体液または組織中の可溶性グリピカン−１を検出する。いくつかの実施形態では、ＭＩＬ−３８抗体は、第一のセグメントＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥ（配列番号６）またはＫＶＮＰＱＧＰＧＰ（配列番号７）を含むグリピカン−１エピトープに対する結合特異性を有する。エピトープは、第二のセグメントＴＱＮＡＲＡ（配列番号８）またはＴＱＮＡＲＡＦＲＤ（配列番号９）をさらに含み得る。本発明は、ＭＩＬ−３８が前立腺癌組織と結合する能力がグリピカン−１抗原の存在に基づくものであることを明らかにし、さらに、これ以外の抗グリピカン−１抗体を用いて癌性前立腺細胞が検出されることを示す。したがって、いくつかの実施形態では、抗グリピカン−１抗体はＭＩＬ−３８ではない。本発明はさらに、患者の体液または組織中のグリピカン−１レベルを検出することによって前立腺癌を検出することが可能であることを示す。このようにして、本発明者らは、グリピカン−１が前立腺癌のマーカーであることを発見した。
【００５８】
本発明に従えば、任意の適切な技術（例えば、任意のプロテオミクス技術）を用いて、体液または組織中のグリピカン−１レベルを検出することができる。いくつかの実施形態では、抗グリピカン−１抗体を用いてグリピカン−１レベルを検出することができる。例えば、配列番号１０の位置５０〜５４によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；配列番号１０の位置６９〜８５によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；配列番号１０の位置１１８〜１２６によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む、重鎖可変領域を含み；配列番号１１の位置４４〜５４によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；配列番号１１の位置７０〜７６によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；配列番号１１の位置１０９〜１１７によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む、抗グリピカン−１抗体を用いて、グリピカン−１レベルを検出することができる。グリピカン−１レベルの検出に用いる抗グリピカン−１抗体は、配列番号１２の位置４８〜５８によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；配列番号１２の位置７４〜８０によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および配列番号１２の位置１１３〜１２１によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含まないものであり得る。抗グリピカン−１抗体は、２０１４年８月２２日、ＣｅｌｌＢａｎｋ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ（ＣＢＡ）にアクセッション番号ＣＢＡ２０１４００２６の下で寄託されたハイブリドーマ細胞によって産生されるものであるか、同細胞によって生成される抗体と同一のものであり得る。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態では、１つまたは複数の他の抗グリピカン−１抗体を用いて、患者の体液または組織中のグリピカン−１を検出し得る。いくつかの実施形態では、前記他の抗グリピカン−１抗体は、本願（表２）に挙げる抗体のいずれであってもよい。さらに別の実施形態では、患者の体液または組織中のグリピカン−１の検出に用いる抗体は、グリピカン−１と結合することが可能な任意の抗体であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は抗体フラグメントまたは組換え抗体を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗体はコンジュゲート抗体である。本発明の抗体フラグメントの非限定的なリストとしては、抗原結合フラグメントであるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、ＳｃＦｖ、Ｄｉ−ｓｃＦｖ  ｓｄＡｂ、化学結合Ｆ（ａｂ’）2、二重特異性抗体、三重特異性抗体Ｆａｂ３、ビス−ｓｃＦｖ、二価抗体のミニボディ、三価抗体のトリアボディ、二重特異性抗体のダイアボディ、四価抗体のテトラボディが挙げられる。ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ  ２００５ならびに米国特許出願公開第２００３／００７７２８２号には、抗体フラグメントおよびドメインの組合せの概説が記載されている。
【００６０】
【表２−１】
2020060585.tif 000003
【００６１】
【表２−２】
2020060585.tif 000004
【００６２】
本発明のいくつかの態様では、グリピカン−１タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体から新たな抗グリピカン−１抗体を作製することができる。単なる非限定的な例を挙げれば、第一のセグメントＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥ（配列番号６）またはＫＶＮＰＱＧＰＧＰ（配列番号７）を含むグリピカン−１エピトープに対して抗グリピカン−１抗体を生じさせることができる。エピトープは、第二のセグメントＴＱＮＡＲＡ（配列番号８）またはＴＱＮＡＲＡＦＲＤ（配列番号９）をさらに含み得る。当業者には、例えばＨａｒｌｏｗら，１９８８に記載されている方法など、抗体の作製に利用可能な方法を多数認識されよう。いくつかの実施形態では、抗グリピカン−１抗体の作製に用いるグリピカン−１免疫原は、天然のタンパク質の翻訳後修飾（例えば、フォールディング）を含む。いくつかの実施形態では、グリピカン−１免疫原は、シグナルペプチド（配列番号３）配列もＣ末端プロペプチド（配列番号４）配列も含まない。いくつかの実施形態では、グリピカン−１免疫原は、ヒト細胞をはじめとする哺乳動物細胞、例えば形質転換マウスＮＳ０細胞系、野生型ＤＵ−１４５細胞系をはじめとするグリピカン−１発現細胞系などから得られるものである。いくつかの実施形態では、グリピカン−１抗原はグリピカン−１を発現する細胞であり得る。いくつかの実施形態では、グリピカン−１免疫原は、表面にグリピカン−１タンパク質を有する細胞全体または細胞部分であり得る。当業者にはこのほか、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋら，１９９５；および米国特許第７，９６０，５１７号に記載されている方法などの様々な周知の方法によって、遺伝情報から結合フラグメントまたはＦａｂフラグメントを調製し得ることが理解されよう。
【００６３】
本発明の別の実施形態では、前立腺癌を検出するために、グリピカン−１を標的とするポリクローナル抗体を作製し得る。同じく単なる非限定的な例を挙げれば、第一のセグメントＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥ（配列番号６）またはＫＶＮＰＱＧＰＧＰ（配列番号７）を含むグリピカン−１エピトープを含めた一連のグリピカン−１エピトープに対して、グリピカン−１を標的とするポリクローナル抗体を生じさせることができる。エピトープは、第二のセグメントＴＱＮＡＲＡ（配列番号８）またはＴＱＮＡＲＡＦＲＤ（配列番号９）をさらに含み得る。グリピカン−１またはグリピカン−１のフラグメントに対するポリクローナル抗体の作製には、当該技術分野で公知の様々な方法を用い得る。本発明の一実施形態では、グリピカン−１タンパク質またはそのフラグメントを宿主動物に注射し得る。いくつかの実施形態では、宿主動物としては、特に限定されないが、ウサギ、マウス、ラットなどを挙げ得る。いくつかの実施形態では、得られた血清を精製し、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光スクリーニング、フローサイトメトリー、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）などの当該技術分野で周知の技術によって、それがグリピカン−１と反応することができるかどうかを試験する。
【００６４】
別の実施形態では、前立腺癌を検出するために、グリピカン−１に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製し得る。同じく単なる非限定的な例を挙げれば、第一のセグメントＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥ（配列番号６）またはＫＶＮＰＱＧＰＧＰ（配列番号７）を含むグリピカン−１エピトープに対して、グリピカンを標的とするモノクローナル抗体を生じさせることができる。エピトープは、第二のセグメントＴＱＮＡＲＡ（配列番号８）またはＴＱＮＡＲＡＦＲＤ（配列番号９）をさらに含み得る。一実施形態では、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５）をはじめとする技術（Ｃｏｌｅら，１９８５；または米国特許第６，１１６，０１３号）により抗グリピカン−１抗体を作製する。抗体作製に関するさらなる詳細および例については、米国特許第７，９８５，５６０号を参照されたい。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態では、抗グリピカン−１抗体により患者の体液または組織中のグリピカン−１を検出する。いくつかの実施形態では、患者から採取する体液試料は、血液試料、血清試料、血漿試料または尿試料である。他の実施形態では、患者の組織試料中のグリピカン−１を検出する。いくつかの実施形態では、組織試料には、腫瘍生検をはじめとする患者の組織が含まれる。本発明のいくつかの態様では、抗体は、ウエスタンブロット分析、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光細胞分取もしくはＦＡＣＳ、免疫蛍光法、放射標識、免疫沈降、免疫組織化学法、イムノブロッティング、化学発光および／または抗体もしくはその他のリガンド、例えばグリピカン−１と結合することが可能タンパク質などを用いてタンパク質を検出するその他の既知の技術によりグリピカン−１を検出する。いくつかの実施形態では、生物膜試験または米国特許出願公開第２０１３／０１６，７３６号に記載されているａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｉｎｇ  ｔｅｓｔによりグリピカン−１を検出する。いくつかの実施形態では、透明な表面（例えば、ポリカルボナート製スライド）にコートしたグリピカン−１結合剤によりグリピカン−１を検出する。グリピカン−１またはグリピカン−１を有する細胞の結合は、吸光度の変化によって検出することができる。いくつかの実施形態では、抗グリピカン−１抗体と前記体液試料または組織試料との結合を、抗グリピカン−１抗体と１つまたは複数のグリピカン−１較正標準品との結合と比較し、較正標準品の抗グリピカン−１抗体を用いて前記体液試料中のグリピカン−１の量を定量化する。一実施形態では、較正標準品は、グリピカン−１濃度が既知である１つまたは複数の試料を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、前記体液試料または組織試料とグリピカン−１リガンドとを接触させることによりグリピカン−１の測定を実施する。いくつかの実施形態では、リガンドは、グリピカン−１プロテオグリカンと結合することが可能な抗グリピカン−１抗体であり得る。
【００６７】
いくつかの実施形態では、患者の組織または体液は、抗グリピカン−１リガンドによる検出の前に前処理を必要とし得る。いくつかの実施形態では、前記前処理は、特にヘパリナーゼＰＮＧａｓｅＦ、Ｎ−グリコシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはヘパリチナーゼなどの薬剤による処理を含み得る。他の実施形態では、前記前処理は、特に組織溶解、膜精製、血漿もしくは血清分画、細胞精製またはタンパク質精製を含み得る。
【００６８】
いくつかの実施形態では、患者の体液または組織で測定したグリピカン−１のレベルを、癌を有さない患者の体液または組織の対照試料と比較する。他の実施形態では、患者の体液または組織で測定したグリピカン−１のレベルを、所定の参照値または参照値の範囲と比較する。他の実施形態では、患者の体液または組織中のグリピカン−１のレベルが前立腺腫瘍の大きさまたは進行度の指標となる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、体液試料または組織試料からのグリピカン−１の検出を酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により実施する。ＥＬＩＳＡは、比色分析、化学発光および蛍光分析に基づくものを含む。ＥＬＩＳＡは、体組織または血液試料、血清試料および血漿試料などの体液中に少量含まれる薬物はじめとする抗原成分の測定への応用に成功を収めており、当該技術分野で周知のものである。本発明に有用なＥＬＩＳＡは、抗体およびその誘導体、タンパク質リガンドなどを含めた任意の適切な捕捉試薬および検出可能試薬を用い得る。ある特定の実施形態では、ＥＬＩＳＡは細胞ベースのものである。他の実施形態では、ＥＬＩＳＡは無細胞抗原を検出するものである。いくつかの実施形態では、グリピカン−１を含有することが疑われる生体試料を捕捉（またはコート）抗体と接触させてインキュベートし、捕捉抗体はグリピカン−１を捕捉し、またはこれと結合する。検出段階では、前記グリピカン−１と結合し、その標識の検出に基づいてグリピカン−１の存在または量を検出するのに用いることができる、検出可能な抗体または検出可能なタンパク質リガンドを使用する。
【００７０】
いくつかの実施形態では、生体試料を、グリピカン−１抗体であり得る固定化した捕捉（またはコート）試薬と接触させてインキュベートする。この抗体は任意の種のものであり得るが、いくつかの実施形態では、抗体はマウス抗体またはラット抗体である。他の実施形態では、抗体はマウス抗体である。他の実施形態では、抗体はハイブリドーマに由来する。いくつかの実施形態では、グリピカン−１抗体は組換え抗体または抗体フラグメントである。固定化は、アッセイ法の前に水不溶性のマトリックスまたは表面に吸着させる（米国特許第３，７２０，７６０号）か、非共有結合または共有結合（例えば、米国特許第３，６４５，８５２号またはＲｏｔｍａｎｓら，１９８３に記載されているように、事前に支持体を例えば硝酸および還元剤で活性化させるかどうかを問わず、グルタルアルデヒド架橋もしくはカルボジイミド架橋を用いて）させることによって、あるいは、アッセイ法の後に例えば免疫沈降によって、捕捉試薬を不溶化することにより従来通りに実施する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、固定化に用いる固相は、例えば表面、粒子、多孔性マトリックスなどの形態の支持体を含め、実質的に不水溶性であり免疫測定アッセイに有用な任意の不活性な支持体または担体であり得る。よく用いられる支持体の例としては、小型のシート、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ポリ塩化ビニル、プラスチック製ビーズのほか、９６ウェルマイクロタイタープレートを含めたポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなどから製造されたアッセイ用のプレートまたは試験管ならびにフィルター紙、アガロース、架橋デキストランをはじめとする多糖類などの粒子性材料が挙げられる。あるいは、米国特許第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同第４，１９５，１２８号；同第４，２４７，６４２号；同第４，２２９，５３７号；および同第４，３３０，４４０号に記載されている臭化シアン活性化炭水化物などの反応性不水溶性マトリックスおよび反応性基質が捕捉試薬の固定化に用いるのに適している。一実施形態では、固定化した捕捉試薬をマイクロタイタープレートにコートし、特に、用いる固相は、１回で複数の試料を分析するのに用いることができるマルチウェルマイクロタイタープレート、例えば、Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉｓｏｒｂまたはＩｍｍｕｌｏｎなどとして販売されているマイクロテスト９６ウェルＥＬＩＳＡプレートである。ある特定の実施形態では、プレートは、ＮＵＮＣ  ＭＡＸＩＳＯＲＢ（商標）またはＩＭＭＵＬＯＮ（商標）などとして販売されているＭＩＣＲＯＴＥＳＴ（商標）またはＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）９６ウェルＥＬＩＳＡプレートである。
【００７２】
いくつかの実施形態では、所望の非共有結合的もしくは共有結合的相互作用または物理結合によって結合され得る上記の捕捉試薬で固相をコートする。結合させる技術としては、米国特許第４，３７６，１１０号およびそこに引用されている参考文献に記載されているものが挙げられる。共有結合的相互作用の場合、プレートをはじめとする固相を捕捉試薬とともに、室温で１時間などの当該技術分野で周知の条件下で架橋剤とインキュベートする。
【００７３】
他の実施形態では、捕捉試薬を固相基質に結合させるのによく用いられる架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル、例えば４−アジド−サリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス−（スクシンイミジル−プロピオナート）などのジスクシンイミジルエステルを含めたホモ二官能性イミドエステルおよびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）−ジチオ］プロピオイミダートなどの誘導体化剤により、光の存在下で架橋を形成することが可能な光活性化中間体が得られる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、９６ウェルプレートを用いる。いくつかの実施形態では、９６ウェルプレートを捕捉試薬でコートする（通常、約８〜１２、約９〜１０または約９．６のｐＨ、約４〜２０℃または約４〜８℃の温度で少なくとも約１０時間、より好ましくは一晩インキュベートすることにより、０．０５Ｍ炭酸ナトリウムなどの緩衝液で希釈する）。さらに短時間のコーティングが望まれる場合、いくつかの実施形態では、プレートをコートする時間をさらに短く、例えば室温で２時間以下にすることができる。いくつかの実施形態では、アッセイそのものにかなり先立ってプレートを積み上げコートしてもよく、次いで、手動、半手動または自動で、例えばロボットの使用などにより、複数の試料で同時にアッセイを実施することができる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、コートしたプレートを結合部位と非特異的に結合し飽和するブロッキング剤で処理して、遊離リガンドがプレートのウェル上の過剰な部位と不必要に結合するのを防ぐことができる。この目的に適したブロッキング剤の非限定的な例としては、例えば、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、卵アルブミン、カゼインおよび脱脂乳が挙げられる。いくつかの実施形態では、ブロッキング処理を周囲温度、約１〜４時間の条件下で実施することができる。他の実施形態では、ブロッキングを１〜３時間以下の時間にわたって実施することができる。他の実施形態では、ブロッキングを０〜４℃で一晩実施することができる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、分析するグリピカン−１標準品（例えば、精製グリピカン−１タンパク質）または生体試料を適宜希釈して固定化相に加える。いくつかの実施形態では、希釈率は約１〜１５体積％である。いくつかの実施形態では、グリピカン−１タンパク質標準品は、天然のタンパク質の翻訳後修飾を含む。いくつかの実施形態では、グリピカン−１タンパク質標準品は、ヒト細胞をはじめとする哺乳動物細胞、例えば形質転換ＮＳ０細胞系、野生型ＤＵ−１４５細胞系をはじめとするグリピカン−１発現細胞系などから得られるものである。他の実施形態では、グリピカン−１タンパク質は、体液または組織から精製されるものであり得る。いくつかの実施形態では、グリピカン−１標準品は、グリピカン−１検出抗体またはリガンドによって検出される部分的グリピカン−１ペプチドをはじめとするエピトープである。いくつかの実施形態では、標準品はグリピカン−１を発現する細胞であり得る。いくつかの実施形態では、希釈率は約１０体積％である。この目的で希釈に使用し得る緩衝液の非限定的なグループとしては、（ａ）０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０（商標）界面活性剤（Ｐ２０）、０．０５％ＰＲＯＣＬＩＮ（商標）３００抗生物質、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％ＣＨＡＰＳ界面活性剤、０．２％ウシγ−グロブリンおよび０．３５Ｍ  ＮａＣｌを含有するｐＨ７．４のＰＢＳ；（ｂ）０．５％ウシ血清アルブミン、０．０５％ポリソルベート２０、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％ＣＨＡＰＳ、０．２％ウシγ−グロブリンおよび０．３５Ｍ  ＮａＣｌを含有するｐＨ７．４のＰＢＳ（ｃ）０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０（Ｐ２０）および０．０５％ＰＲＯＣＬＩＮ（商標）３００を含有するｐＨ７のＰＢＳ；（ｄ）０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｐ２０、０．０５％ＰＲＯＣＬＩＮ（商標）３００、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．３５Ｍ  ＮａＣｌを含有するｐＨ６．３５のＰＢＳ；（ｅ）０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｐ２０、０．０５％ＰＲＯＣＬＩＮ（商標）３００、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％ウシγ−グロブリンおよび０．３５Ｍ  ＮａＣｌを含有するｐＨ７．４のＰＢＳ；ならびに（ｆ）０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｐ２０、０．０５％ＰＲＯＣＬＩＮ（商標）３００、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％ＣＨＡＰＳおよび０．３５Ｍ  ＮａＣｌを含有するｐＨ７．４のＰＢＳが挙げられる。ＰＲＯＣＬＩＮ（商標）３００は保存剤として作用し、ＴＷＥＥＮ２０（商標）は非特異的結合を排除する界面活性剤として作用する。
【００７７】
捕捉試薬の濃度は一般に、生体試料を希釈する必要があればそれを考慮に入れたうえで、目的とするグリピカン−１の濃度範囲によって決定されるが、捕捉試薬の最終濃度は通常、目的とする範囲にわたってアッセイの感度が最大になるよう実験的に決定される。
【００７８】
試料と、固定化した捕捉試薬とのインキュベーションの条件は、アッセイの感度が最大になり、解離が最小限に抑えられるよう選択する。いくつかの実施形態では、約０℃〜約４０℃の範囲のかなり一定した温度でインキュベーションを実施する。他の実施形態では、約２０〜２５℃でインキュベーションを実施する。インキュベーションの時間は主として温度によって決まり、一般には、感度の低いアッセイになるのを避けるため、約１０時間以内である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は約０．５〜３時間である。他の実施形態では、インキュベーションは、遊離グリピカン−１と捕捉試薬との結合を最大にするため、室温で約１．５〜３時間以内である。生体液中のプロテアーゼがグリピカン−１を分解するのを防ぐためにプロテアーゼ阻害剤を加える場合、インキュベーションの持続時間は長くなり得る。
【００７９】
いくつかの実施形態では、検出方法は競合ＥＬＩＳＡ法である。いくつかの実施形態では、インキュベーション段階は、未結合で未標識の抗体の添加を含む。いくつかの実施形態では、既知の濃度の未標識抗体が遊離グリピカン−１抗原と結合し、同抗原がプレート上に固定化されるのを妨げる。いくつかの実施形態では、インキュベーション段階は、濃度既知の標識グリピカン−１タンパク質の添加を含む。いくつかの実施形態では、体液試料または組織試料中のグリピカン−１の量を、混合した標識グリピカン−１タンパク質の結合の減少として検出する。他の実施形態では、ＥＬＩＳＡはサンドイッチＥＬＩＳＡ法である。
【００８０】
この段階では、インキュベーション混合物のｐＨは通常、約４〜９．５の範囲内にある。他の実施形態では、ｐＨの範囲は約６〜９である。さらに別の実施形態では、ｐＨの範囲は約７〜８である。別の実施形態では、アッセイ（ＥＬＩＳＡ）希釈液のｐＨはｐＨ７．４である。インキュベーション緩衝液のｐＨは、捕捉試薬と、捕捉されるグリピカン−１との特異的結合が相当レベルに維持されるよう選択する。この段階で所望のｐＨを達成し維持するのに、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス−ＨＣｌまたはトリスリン酸塩、酢酸塩、バルビタールなどを含めた様々な緩衝液を用い得る。特定の緩衝液を用いることが本発明に極めて重要であるというわけではないが、個々のアッセイで、ある緩衝液が別の緩衝液よりも好ましいものであり得る。
【００８１】
いくつかの実施形態では、固定化した捕捉試薬から生体試料を（好ましくは洗浄によって）分離して、未捕捉分子を除去する。洗浄に使用する溶液は一般に、インキュベーション段階について上に記載した考慮事項および緩衝液を用いてｐＨを決定した緩衝液（「洗浄緩衝液」）である。一実施形態では、洗浄緩衝液のｐＨの範囲は約６〜９である。洗浄は１回実施しても複数回実施してもよい。洗浄温度は一般に、冷蔵庫の温度から中程度の温度、通常約０〜４０℃であり、アッセイを実施する間は一定温度を維持する。他の実施形態では、洗浄温度は約４〜３０℃である。例えば、洗浄前に洗浄緩衝液を貯蔵所に４℃で氷中に置くことができ、この段階にプレート洗浄機を用いることができる。ほかにも、捕捉されたグリピカン−１が次の段階である程度解離し得ることが懸念される場合、この段階で架橋剤をはじめとする適切な薬剤を添加して、新たに結合したグリピカン−１と捕捉試薬とを共有結合させ得る。
【００８２】
いくつかの実施形態では、固定化した捕捉試薬と検出可能な抗体とを接触させる。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体は抗グリピカン−１抗体である。いくつかの実施形態では、抗グリピカン−１抗体はＭＩＬ−３８である。他の実施形態では、抗体は表２に記載されているものである。他の実施形態では、検出可能な抗体は、グリピカン−１を検出することが可能な任意の抗体である。検出可能な抗体は、固定化したグリピカン−１と約２０〜４０℃の温度で接触させる。他の実施形態では、検出可能な抗体を約２０〜２５℃で接触させ、接触させる正確な温度および時間はともに主として、用いる検出手段によって決まる。例えば、ストレパタビジン（ｓｔｒｅｐａｔａｖｉｄｉｎ）−ペルオキシダーゼおよび３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを検出手段として用いる場合、例えば、一実施形態では、シグナルを最大限が増幅されるよう接触を（例えば、約１時間以上）実施する。いくつかの実施形態では、プレート洗浄後、予想される遊離グリピカン−１の最大濃度に対してモル過剰の抗体またはリガンドをプレートに添加する。この抗体は直接的または間接的に検出可能なものである。検出可能な抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、例えば、ある特定の実施形態では、それはモノクローナル抗体であり、一実施形態ではマウス抗体であり、一実施形態ではＭＩＬ−３８である。ほかにも、検出可能な抗体は直接的に検出可能なものであり得、一実施形態では比色分析標識を有し、別の実施形態では蛍光分析標識を有する。他の実施形態では、検出可能な抗体をビオチン化し、検出手段はアビジンまたはストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよび３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体をビオチン−アビジン増幅系、化学発光系、マイクロスフェアまたはコロイド金で標識し得る。検出手段の読取りは、特に蛍光分析または比色分析であり得る。抗体の親和性は、少量の遊離グリピカン−１でも検出されるのに十分なものでなければならない。
【００８３】
いくつかの実施形態では、検出可能な抗体を検出する手段を用いて、捕捉試薬と結合したグリピカン−１を測定する。体液試料または組織試料が患者由来のものであれば、測定段階は、上記段階の結果として起こる反応と標準曲線とを比較して、前記体液試料または組織試料中のグリピカン−１のレベルを求めることを含む。他の実施形態では、上記段階の結果として起こる反応と、年齢が一致し癌がない個体の体液または組織などの対照体液試料または組織試料を用いた同様の反応とを比較する。
【００８４】
他のグリピカン−１検出の実施形態では、患者の体液中のグリピカン−１をウエスタンブロット分析により検出する。いくつかの実施形態では、このアッセイは、電気泳動を用いて複雑な試料中のタンパク質を分離するものである。他の実施形態では、電気泳動をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥとしてよく知られる）などのサイズ排除ゲルで実施する。一実施形態では、次いで、分離されたタンパク質を膜に転写する。当業者には、ウエスタンブロットに使用することができる材料には様々なものがあることが認識されよう。いくつかの実施形態では、膜はニトロセルロース製またはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）製である。いくつかの実施形態では、膜でもゲルと同じタンパク質の分離パターンが保持されるように、タンパク質転写ボックス内で転写を実施する。いくつかの実施形態では、次いで、希釈したタンパク質溶液中、例えば脱脂粉乳またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液中で膜をインキュベートして、非特異的結合部位をブロックする。次いで、ブロックした膜をグリピカン−１標的タンパク質に特異的な一次抗体とインキュベートすることができる。いくつかの実施形態では、次いで膜を洗浄し、第一の抗体を標的とする二次抗体とインキュベートする。いくつかの実施形態では、第一または第二の抗体が容易に検出されるように、これを検出可能な標識とコンジュゲートする。いくつかの実施形態では、標識としては、蛍光標識、化学発光標識、放射標識または当該技術分野で周知の別の標識が挙げられる。いくつかの実施形態では、二次リガンドとコンジュゲートする前記標識は、放射標識、蛍光標識、ビオチン−アビジン増幅系、化学発光系、マイクロスフェアおよびコロイド金からなる群より選択される。
【００８５】
任意選択で、本発明のいくつかの態様は、使用者が試料中に標的タンパク質が存在するかどうかを判定した後、膜から一次抗体および（任意選択の）二次抗体を取り除くことができ、その膜を同じタンパク質または別のタンパク質に特異的な別の一次抗体とインキュベートすることができることを教示する。いくつかの実施形態では、第二のタンパク質を負荷対照として使用し得る。他の実施形態では、第二のタンパク質は、患者の健康状態の別のマーカーである。
【００８６】
一実施形態では、グリピカン−１をフローサイトメトリーにより検出する。いくつかの実施形態では、患者の体液または組織中の細胞の表面にあるグリピカン−１を検出する。本発明のある特定の態様では、フローサイトメトリーによるグリピカン−１の検出を以下に概説する通りに実施し得る。いくつかの実施形態では、体液または組織由来の細胞を精製する。細胞の精製は中和段階を含み得る。いくつかの実施形態では、中和段階は、細胞を中和緩衝液中で保管することを含む。中和緩衝液は、０．２Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4 ３９ｍｌと０．２Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4 ６１ｍｌとを混合し、水を加えて２００ｍｌにすることにより作製することができる。いくつかの実施形態では、細胞を遠心分離し、異なる溶液中で再懸濁させる。他の実施形態では、細胞を精製せずに保管する。いくつかの実施形態では、細胞をＣｙｔｏＬｙｔ溶液中で再懸濁または洗浄する。他の実施形態では、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で再懸濁または洗浄する。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液を塩化アンモニウムで処理して赤血球を溶解させる。いくつかの実施形態では、細胞をスライド上に固定する。他の実施形態では、細胞は遊離したままである。いくつかの実施形態では、細胞と、一次抗グリピカン−１抗体をはじめとするリガンドとを接触させる。いくつかの実施形態では、一次抗体はＭＩＬ−３８である。いくつかの実施形態では、一次抗体はＭＩＬ−３８ではない。他の実施形態では、一次抗体は他の任意の抗グリピカン−１抗体（表２）である。ある特定の実施形態では、さらに細胞と、検出標識とコンジュゲートした二次検出抗体とを接触させる。別の実施形態では、一次抗体が検出標識とコンジュゲートされている場合、抗原は一次抗体によって直接検出され得る。特定の場合には、グリピカン−１抗体で標識することに加えて、細胞が識別可能なように、特に限定されないが、ある細胞型と別の細胞型とを識別する細胞表面マーカーに対する抗体を含めた他のプローブで標識し得る。いくつかの態様では、他のプローブを用いて、シグナルまたは総細胞計数値を正規化し得る。いくつかの実施形態では、他のプローブは細胞内抗原を標識するものである。他の実施形態では、他のプローブは細胞外抗原を標識するものである。標識した後、標識細胞をＦＡＣＳフローサイトメトリーにより単離し得る。いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳ機器により標識細胞を１個ずつ（すなわち、単一細胞として）単離し得る。他の実施形態では、標識細胞を混合集団として単離し、次いでＦＡＣＳ後に単一細胞に希釈し得る。いくつかの実施形態では、二次標識は色素であり得る。いくつかの実施形態では、色素標識はＤＡＰＩである。いくつかの実施形態では、ＤＡＰＩ標識を用いて試料中の細胞数を定量化する。
【００８７】
細胞を複数の異なる標識で標識する実施形態では、複数の異なる特性を用いて細胞を選択し得る。例えば、細胞を最初にあるプローブによって選別し、次いで別のプローブによって選別し得る。いくつかの実施形態では、細胞を最初に細胞型によって選別し、のちにグリピカン−１濃度によって選別することができる。これと同じようにして、プローブおよびＦＡＣＳ機器による検出とともに計画した任意の順序で細胞を選別し得る。蛍光標識細胞分取の一般的原理については、単細胞懸濁液を作製することができる方法、例えば蛍光標識プローブを用いて細胞を標識することができる方法、細胞を互いに分離することができる方法のほか、フローセル、試薬およびコンピュータ制御システムを含めたフローサイトメトリーに用いることができるハードウェアを含め、公知であり、特に限定されないが：Ｏｒｆａｏら，１９９６；Ｊｏｈｎｓｏｎら，２００７；Ｔｕｎｇら，２００７；およびＤａｉｎｉａｋら，２００７を含めた様々な刊行物で概説されている。
【００８８】
本発明はほかにも、患者の体液または組織中のグリピカン−１を検出するキットを含む。一実施形態では、癌を検出するキットは、本願に記載される検出アッセイのいずれかを実施するのに必要な材料を含む。いくつかの実施形態では、癌を検出するキットは、第一の抗グリピカン−１抗体をはじめとするリガンドと、薬学的に許容される担体と、グリピカン−１標準品とを含み；前記キットは患者の体液または組織中のグリピカン−１を検出することが可能である。第一の抗グリピカン−１抗体は、ＭＩＬ−３８であってもＭＩＬ−３８でなくてもよい。第一の抗グリピカン−１抗体は、配列番号１０の位置５０〜５４によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；配列番号１０の位置６９〜８５によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；配列番号１０の位置１１８〜１２６によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む、重鎖可変領域を含み；配列番号１１の位置４４〜５４によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；配列番号１１の位置７０〜７６によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；配列番号１１の位置１０９〜１１７によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含むものであり得る。グリピカン−１レベルの検出に用いる抗グリピカン−１抗体は、配列番号１２の位置４８〜５８によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；配列番号１２の位置７４〜８０によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および配列番号１２の位置１１３〜１２１によって定められるアミノ酸配列を含むか、これよりなる相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含まないものであり得る。第一の抗グリピカン−１抗体は、２０１４年８月２２日、ＣｅｌｌＢａｎｋ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ（ＣＢＡ）にアクセッション番号ＣＢＡ２０１４００２６の下で寄託されたハイブリドーマ細胞によって産生されるものであるか、同細胞によって生成される抗体と同一のものであり得る。
【００８９】
いくつかの実施形態では、キットは、ほかにも標準的な実験用のツールまたは機械の使用を必要とする。いくつかの実施形態では、必要なツールとしては、当業者に公知のピペット、細胞選別機、プレートリーダー、遠心分離機などが挙げられる。いくつかの実施形態では、キットの使用には、ほかにも当業者に周知のピペットチップ、膜、緩衝液または化学薬品物質などの標準的な実験試薬が必要とされ得る。いくつかの実施形態では、キットは二次リガンドをさらに含む。いくつかの実施形態では、二次リガンドは第二の抗グリピカン−１抗体である。一実施形態では、第二の抗グリピカン抗体は第一の抗グリピカン−１抗体と同じものである。いくつかの実施形態では、二次リガンドを迅速に検出するため、二次リガンドが標識とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、キットの抗体は、本願に記載される抗体フラグメントまたは抗体の組合せであり得る。
【００９０】
いくつかの実施形態では、患者の体液または組織中のグリピカン−１の検出が前立腺癌の存在を示す。いくつかの実施形態では、患者の体液中にグリピカン−１が１ｐｇ／ｍｌ、２ｐｇ／ｍｌ、３ｐｇ／ｍｌ、４ｐｇ／ｍｌ、５ｐｇ／ｍｌ、６ｐｇ／ｍｌ、７ｐｇ／ｍｌ、８ｐｇ／ｍｌ、９ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、１１ｐｇ／ｍｌ、１２ｐｇ／ｍｌ、１３ｐｇ／ｍｌ、１４ｐｇ／ｍｌ、１５ｐｇ／ｍｌ、１６ｐｇ／ｍｌ、１７ｐｇ／ｍｌ、１８ｐｇ／ｍｌ、１９ｐｇ／ｍｌ、２０ｐｇ／ｍｌ、２１ｐｇ／ｍｌ、２２ｐｇ／ｍｌ、２３ｐｇ／ｍｌ、２４ｐｇ／ｍｌ、２５ｐｇ／ｍｌ、２６ｐｇ／ｍｌ、２７ｐｇ／ｍｌ、２８ｐｇ／ｍｌ、２９ｐｇ／ｍｌ、３０ｐｇ／ｍｌ、３１ｐｇ／ｍｌ、３２ｐｇ／ｍｌ、３３ｐｇ／ｍｌ、３４ｐｇ／ｍｌ、３５ｐｇ／ｍｌ、３６ｐｇ／ｍｌ、３７ｐｇ／ｍｌ、３８ｐｇ／ｍｌ、３９ｐｇ／ｍｌ、４０ｐｇ／ｍｌ、４１ｐｇ／ｍｌ、４２ｐｇ／ｍｌ、４３ｐｇ／ｍｌ、４４ｐｇ／ｍｌ、４５ｐｇ／ｍｌ、４６ｐｇ／ｍｌ、４７ｐｇ／ｍｌ、４８ｐｇ／ｍｌ、４９ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｍｌ、５１ｐｇ／ｍｌ、５３ｐｇ／ｍｌ、５４ｐｇ／ｍｌ、５５ｐｇ／ｍｌ、５６ｐｇ／ｍｌ、５７ｐｇ／ｍｌ、５８ｐｇ／ｍｌ、５９ｐｇ／ｍｌ、６０ｐｇ／ｍｌ、６１ｐｇ／ｍｌ、６２ｐｇ／ｍｌ、６３ｐｇ／ｍｌ、６４ｐｇ／ｍｌ、６５ｐｇ／ｍｌ、６６ｐｇ／ｍｌ、６７ｐｇ／ｍｌ、６８ｐｇ／ｍｌ、６９ｐｇ／ｍｌ、７０ｐｇ／ｍｌ、７１ｐｇ／ｍｌ、７２ｐｇ／ｍｌ、７３ｐｇ／ｍｌ、７４ｐｇ／ｍｌ、７５ｐｇ／ｍｌ、７６ｐｇ／ｍｌ、７７ｐｇ／ｍｌ、７８ｐｇ／ｍｌ、７９ｐｇ／ｍｌ、８０ｐｇ／ｍｌ、８１ｐｇ／ｍｌ、８２ｐｇ／ｍｌ、８３ｐｇ／ｍｌ、８４ｐｇ／ｍｌ、８５ｐｇ／ｍｌ、８６ｐｇ／ｍｌ、８７ｐｇ／ｍｌ、８８ｐｇ／ｍｌ、８９ｐｇ／ｍｌ、９０ｐｇ／ｍｌ、９１ｐｇ／ｍｌ、９２ｐｇ／ｍｌ、９３ｐｇ／ｍｌ、９４ｐｇ／ｍｌ、９５ｐｇ／ｍｌ、９６ｐｇ／ｍｌ、９７ｐｇ／ｍｌ、９８ｐｇ／ｍｌ、９９ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌ、１１０ｐｇ／ｍｌ、１２０ｐｇ／ｍｌ、１３０ｐｇ／ｍｌ、１４０ｐｇ／ｍｌ、１５０ｐｇ／ｍｌ、１６０ｐｇ／ｍｌ、１７０ｐｇ／ｍｌ、１８０ｐｇ／ｍｌ、１９０ｐｇ／ｍｌ、２００ｐｇ／ｍｌ、２１０ｐｇ／ｍｌ、２２０ｐｇ／ｍｌ、２３０ｐｇ／ｍｌ、２４０ｐｇ／ｍｌ、２５０ｐｇ／ｍｌ、２６０ｐｇ／ｍｌ、２７０ｐｇ／ｍｌ、２８０ｐｇ／ｍｌ、２９０ｐｇ／ｍｌ、３００ｐｇ／ｍｌ、３１０ｐｇ／ｍｌ、３２０ｐｇ／ｍｌ、３３０ｐｇ／ｍｌ、３４０ｐｇ／ｍｌ、３５０ｐｇ／ｍｌ、３６０ｐｇ／ｍｌ、３７０ｐｇ／ｍｌ、３８０ｐｇ／ｍｌ、３９０ｐｇ／ｍｌ、４００ｐｇ／ｍｌ、４１０ｐｇ／ｍｌ、４２０ｐｇ／ｍｌ、４３０ｐｇ／ｍｌ、４４０ｐｇ／ｍｌ、４５０ｐｇ／ｍｌ、４６０ｐｇ／ｍｌ、４７０ｐｇ／ｍｌ、４８０ｐｇ／ｍｌ、４９０ｐｇ／ｍｌ、５００ｐｇ／ｍｌ、６００ｐｇ／ｍｌ、７００ｐｇ／ｍｌ、８００ｐｇ／ｍｌ、９００ｐｇ／ｍｌ、１０００ｐｇ／ｍｌ存在すれば、前立腺癌があることを示す。
【００９１】
いくつかの実施形態では、患者の体液または組織中のグリピカン−１の検出が前立腺癌の存在を示す。いくつかの実施形態では、患者の体液中にグリピカン−１が１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、１７ｎｇ／ｍｌ、１８ｎｇ／ｍｌ、１９ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２１ｎｇ／ｍｌ、２２ｎｇ／ｍｌ、２３ｎｇ／ｍｌ、２４ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、２６ｎｇ／ｍｌ、２７ｎｇ／ｍｌ、２８ｎｇ／ｍｌ、２９ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３１ｎｇ／ｍｌ、３２ｎｇ／ｍｌ、３３ｎｇ／ｍｌ、３４ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、３６ｎｇ／ｍｌ、３７ｎｇ／ｍｌ、３８ｎｇ／ｍｌ、３９ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４１ｎｇ／ｍｌ、４２ｎｇ／ｍｌ、４３ｎｇ／ｍｌ、４４ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、４６ｎｇ／ｍｌ、４７ｎｇ／ｍｌ、４８ｎｇ／ｍｌ、４９ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、５１ｎｇ／ｍｌ、５３ｎｇ／ｍｌ、５４ｎｇ／ｍｌ、５５ｎｇ／ｍｌ、５６ｎｇ／ｍｌ、５７ｎｇ／ｍｌ、５８ｎｇ／ｍｌ、５９ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、６１ｎｇ／ｍｌ、６２ｎｇ／ｍｌ、６３ｎｇ／ｍｌ、６４ｎｇ／ｍｌ、６５ｎｇ／ｍｌ、６６ｎｇ／ｍｌ、６７ｎｇ／ｍｌ、６８ｎｇ／ｍｌ、６９ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、７１ｎｇ／ｍｌ、７２ｎｇ／ｍｌ、７３ｎｇ／ｍｌ、７４ｎｇ／ｍｌ、７５ｎｇ／ｍｌ、７６ｎｇ／ｍｌ、７７ｎｇ／ｍｌ、７８ｎｇ／ｍｌ、７９ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、８１ｎｇ／ｍｌ、８２ｎｇ／ｍｌ、８３ｎｇ／ｍｌ、８４ｎｇ／ｍｌ、８５ｎｇ／ｍｌ、８６ｎｇ／ｍｌ、８７ｎｇ／ｍｌ、８８ｎｇ／ｍｌ、８９ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、９１ｎｇ／ｍｌ、９２ｎｇ／ｍｌ、９３ｎｇ／ｍｌ、９４ｎｇ／ｍｌ、９５ｎｇ／ｍｌ、９６ｎｇ／ｍｌ、９７ｎｇ／ｍｌ、９８ｎｇ／ｍｌ、９９ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１１０ｎｇ／ｍｌ、１２０ｎｇ／ｍｌ、１３０ｎｇ／ｍｌ、１４０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、１６０ｎｇ／ｍｌ、１７０ｎｇ／ｍｌ、１８０ｎｇ／ｍｌ、１９０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２１０ｎｇ／ｍｌ、２２０ｎｇ／ｍｌ、２３０ｎｇ／ｍｌ、２４０ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、２６０ｎｇ／ｍｌ、２７０ｎｇ／ｍｌ、２８０ｎｇ／ｍｌ、２９０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、３１０ｎｇ／ｍｌ、３２０ｎｇ／ｍｌ、３３０ｎｇ／ｍｌ、３４０ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、３６０ｎｇ／ｍｌ、３７０ｎｇ／ｍｌ、３８０ｎｇ／ｍｌ、３９０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、４１０ｎｇ／ｍｌ、４２０ｎｇ／ｍｌ、４３０ｎｇ／ｍｌ、４４０ｎｇ／ｍｌ、４５０ｎｇ／ｍｌ、４６０ｎｇ／ｍｌ、４７０ｎｇ／ｍｌ、４８０ｎｇ／ｍｌ、４９０ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ存在すれば、前立腺癌があることを示す。
【００９２】
いくつかの実施形態では、患者の体液または組織中のグリピカン−１の検出が前立腺癌の存在を示す。いくつかの実施形態では、患者の体液または組織中にグリピカン−１が１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１１μｇ／ｍｌ、１２μｇ／ｍｌ、１３μｇ／ｍｌ、１４μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、１７μｇ／ｍｌ、１８μｇ／ｍｌ、１９μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２１μｇ／ｍｌ、２２μｇ／ｍｌ、２３μｇ／ｍｌ、２４μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、２６μｇ／ｍｌ、２７μｇ／ｍｌ、２８μｇ／ｍｌ、２９μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、３１μｇ／ｍｌ、３２μｇ／ｍｌ、３３μｇ／ｍｌ、３４μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌ、３６μｇ／ｍｌ、３７μｇ／ｍｌ、３８μｇ／ｍｌ、３９μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、４１μｇ／ｍｌ、４２μｇ／ｍｌ、４３μｇ／ｍｌ、４４μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌ、４６μｇ／ｍｌ、４７μｇ／ｍｌ、４８μｇ／ｍｌ、４９μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ存在すれば、前立腺癌があることを示す。
【００９３】
いくつかの実施形態では、患者の体液または組織中のグリピカン−１のレベルまたはグリピカン−１検出シグナルが上昇していれば、前立腺癌があることを示す。いくつかの場合には、癌患者のグリピカン−１レベルは、対照非癌性体液または組織のグリピカン−１レベルまたはグリピカン−１検出シグナルよりも１％、２％、３％、４、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、５００、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、５，０００％、１０，０００％、１５，０００％超高い。いくつかの実施形態では、対照非癌性体液または組織は患者と年齢が一致するものである。
【００９４】
実施例
実施例１．細胞と結合したＭＩＬ−３８抗原の特徴付け。
ＭＩＬ−３８抗原は最初、３０ｋＤタンパク質として報告された（Ｒｕｓｓｅｌｌら，２００４）が、本発明者らの研究では、ＭＩＬ−３８抗体が、様々な細胞抽出物中の主として６０ｋＤａ抗原を検出することが示された。ウエスタンブロットでは、ゲル電気泳動の前に試料を還元剤とインキュベートすると、ＭＩＬ−３８の抗原との反応性が失われる。
【００９５】
ＭＩＬ−３８抗体を免疫沈降実験に用いて、様々な細胞抽出物から６０ｋＤａタンパク質を特異的に単離することができた。生細胞の免疫沈降を用いて、細胞表面上の６０ｋＤａ抗原の存在を検討した。この実験では、生細胞をＭＩＬ−３８抗体を含有する無血清培地と氷上でインキュベートした。次いで細胞を洗浄し、可溶化液を調製し、タンパク質Ｇビーズとインキュベートして、細胞と結合したあらゆる抗体を単離した。免疫沈降物には６０ｋＤａバンドが認められ、培地中のＭＩＬ−３８によって抗原が細胞表面上に認識されることが示された。
【００９６】
実施例２．ＭＩＬ−３８抗原の免疫沈降および質量分析。
ＤＵ−１４５前立腺癌細胞を膜タンパク質抽出キット（ＭＰＥＫ）で処理した。磁気ビーズと架橋したＭＩＬ−３８により膜抽出物を免疫沈降させた。免疫沈降物をゲルで泳動して切り取り、質量分析に供するか、ビーズから直接溶離させてから質量分析に供した。次いで、質量／電荷のデータに基づいてペプチドを同定することができる質量分析により、ＭＩＬ−３８抗体と結合した抗原を分析した。
【００９７】
質量分析計により、ペプチドスコア４２７８および１８の異なる配列を含む配列カバレッジ４６％でグリピカン−１が同定された（図１）。
【００９８】
実施例３．ＭＩＬ−３８抗原の免疫沈降、サイズ排除クロマトグラフィーおよび質量分析。  ＤＵ−１４５前立腺癌細胞を膜タンパク質抽出キット（ＭＰＥＫ）で処理した。磁気ビーズと架橋したＭＩＬ−３８により膜抽出物を免疫沈降させた。十分に洗浄した後、免疫沈降物を２％ＳＤＳ含有ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）中に溶出させた。溶出物をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供し、１つ置きの画分にアセトン沈殿を実施し、試料負荷緩衝液に再懸濁させ、ＭＩＬ−３８のウエスタンブロットに用いた。画分２８および３０に大量のＭＩＬ−３８抗原が含まれている（図２）ことから、画分２９にもＭＩＬ−３８抗原が高濃度で含まれていることが示唆された。画分２９をマススペック解析に供し、配列カバレッジ１４％でグリピカン−１が同定された（図３）。これにより、ＭＩＬ−３８抗体の抗原がグリピカン−１であることが重ねて確認された。
【００９９】
実施例４．ＭＩＬ−３８抗体と抗グリピカン−１（抗ＧＰＣ−１）抗体は二次元ウエスタンブロットで反応性の重複を示す。
ウサギ抗ＧＰＣ−１抗体を購入し、ＭＩＬ−３８により検出される分子量と同じ約６０ｋＤａの分子量のグリピカン−１コアタンパク質と反応することが明らかになった。ＭＩＬ−３８がグリピカン−１を認識したことを確認するため、前立腺癌ＤＵ−１４５のＭＰＥＫ抽出物を二次元電気泳動およびウエスタンブロット法に供した。
【０１００】
図４に示されるように、ＭＩＬ−３８抗体と抗ＧＰＣ−１抗体は反応性の重複を示し、分子量が６０ｋＤａ、等電点の範囲が５〜７のタンパク質を検出した。
【０１０１】
実施例５．ＭＩＬ−３８は抗ＧＰＣ−１免疫沈降物中に検出され、逆も同様である。
ＭＩＬ−３８抗体またはウサギ抗ＧＰＣ−１抗体を用いて、その反応性抗原をＤＵ−１４５またはＣ３（ＭＩＬ−３８陰性）のＭＰＥＫ抽出物から免疫沈降させた。免疫沈降物（ＩＰ）にＭＩＬ−３８抗体または抗ＧＰＣ−１抗体のいずれかを用いてウエスタンブロットを実施した（図５）。
【０１０２】
抗ＧＰＣ−１とブロットしたＭＩＬ−３８のＩＰには６０ｋＤａのＧＰＣ−１反応性のバンドが検出されたのに対し、ＭＩＬ−３８とブロットした抗ＧＰＣ−１のＩＰには６０ｋＤａのＭＩＬ−３８反応性のバンドが検出された。二次抗体単独の対照では反応性は検出されなかった。さらに、ＭＩＬ−３８抗体で免疫沈降させたところ、ＭＩＬ−３８抗原および抗ＧＰＣ−１抗原はともにほぼ完全に枯渇し、ＭＩＬ−３８抗原がグリピカン−１であることが強く示唆された。
【０１０３】
実施例６．ＭＩＬ−３８は組換えＧＰＣ−１を検出する。
精製組換えグリピカン−１の２つの入手源について、ＭＩＬ−３８抗体および抗ＧＰＣ−１抗体との反応性を試験した。第一の入手源はコムギ胚芽抽出物から作製された短縮型のものである（これにはしかるべき哺乳動物の翻訳後修飾が含まれていなかったことに留意されたい）。第二の入手源はマウスＮＳ０細胞により産生された完全長グリピカン−１である。コムギ胚芽発現グリピカン−１はＭＩＬ−３８との反応性が全く認められなかったが、ウサギ抗ＧＰＣ−１抗体により検出することができた（データ不掲載）。これに対し、ＮＳ０細胞で産生されたグリピカン−１にはＭＩＬ−３８抗体および抗ＧＰＣ−１抗体との極めて強い反応性が認められた（図６）。
【０１０４】
実施例７．ＭＩＬ−３８は細胞培養上清中に分泌された抗原を検出することができる。
これまで、ＭＩＬ−３８抗原の分泌を示す実験的証拠は得られていない。このことを検討するため、ＤＵ−１４５細胞を無血清培地で洗浄した後、無血清培地で３６時間インキュベートした。得られた馴化培地をＭＩＬ−３８で免疫沈降させ、得られた試料をＤＵ−１４５のＭＰＥＫ抽出物の標準ＩＰと比較した。訓化培地ＩＰには、ＤＵ−１４５抽出物から単離された６０ｋＤａバンドに対して、約４０ｋＤａバンドおよび５５ｋＤａバンドが認められた（図７）。
【０１０５】
４０ｋＤバンドおよび５５ｋＤバンドを含有する訓化培地ＩＰ試料をマススペック解析に供した。グリピカン−１（配列番号２）が１６％のペプチドカバレッジで同定された（図８ａ）。４０ｋＤバンドのみ（図８ｂ）または５５ｋＤバンドのみ（図８ｃ）を別々に分析したところ、ともにグリピカン−１ペプチド（配列番号２）であると同定された。
【０１０６】
以上の結果は、ＤＵ−１４５前立腺癌細胞系からＭＩＬ−３８反応型のグリピカン−１が細胞培養上清中に放出され得ることを示唆している。
【０１０７】
実施例８．ＭＩＬ−３８により前立腺癌患者の前立腺癌血漿試料中および膜抽出物中にＧＰＣ−１を検出することができる。
これまで、正常患者でも前立腺癌患者でも血漿試料中にＭＩＬ−３８抗原の分泌を示す実験的証拠は得られていない。このことを検討するため、正常患者１例（０４２）および前立腺癌患者１例（０４６）の血漿試料をＭＩＬ−３８抗体で免疫沈降させ、ＩＰ試料にＭＩＬ−３８抗体および抗ＧＰＣ−１抗体を用いてウエスタンブロットを実施した（図９ａ）。
【０１０８】
両抗体とも、２種類の血漿試料に約７０ｋＤａの特異的バンドが検出された。ＭＩＬ−３８抗体および抗ＧＰＣ−１抗体ともに、前立腺癌患者の血漿の方が正常患者の血漿よりもシグナルが著明に強く（バンドの色が濃く）、この可溶型のグリピカン−１は前立腺癌患者で上昇し得ることが示唆された。
【０１０９】
正常前立腺および前立腺癌の膜タンパク質抽出物にＭＩＬ−３８抗原が検出されるかどうかを明らかにするため、それぞれの試料を１例ずつＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏ社から入手した。等量のタンパク質にＭＩＬ−３８抗体を用いてウエスタンブロットを実施した（図９ｂ）。前立腺癌抽出物の方が正常前立腺試料よりもＭＩＬ−３８抗原の発現量がはるかに多いことが示された。
【０１１０】
実施例９．患者尿中のＭＩＬ−３８抗原の検出。
ＭＩＬ−３８は前立腺癌患者の尿中の細胞を検出することができる。この検出方法の感度および特異性を試験するため、年齢が一致した尿試料１２５例を入手した。尿から細胞を遠心沈殿させ、ＭＩＬ−３８間接免疫蛍光アッセイにより分析した。合計で健常対照４７例、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）３７例および生検で確認された前立腺癌４１例を分析した。陽性前立腺癌細胞、ＤＵ−１４５陽性対照およびＣ３陰性細胞の例を示す（図１０）。
【０１１１】
ＭＩＬ−３８免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）検査では、コホート内での前立腺癌の識別は感度が７１％、特異性が７３％であることが示された。この試験から、前立腺癌の識別はＢＰＨ患者に比して感度が７１％、特異性が７６％であることが明らかになった（表３）。
【０１１２】
【表３】
2020060585.tif 000005
【０１１３】
実施例１０．ＭＩＬ−３８抗原の検出とＰＳＡレベルとの併用より前立腺癌の検出能が増大する。
ＭＩＬ−３８免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）検査とＰＳＡ検査とを併用すると、感度および特異性が増大する。このような増大は、ＰＳＡ検査に適用するカットオフ値に応じて異なる。陽性診断のカットオフが２ｎｇ／ｍＬより大きい場合、特異性はＩＦＡ単独検査時の７３％から２つの検査併用時の８３％まで増大する。陽性診断のカットオフが４ｎｇ／ｍＬより大きい場合、特異性はＩＦＡ単独検査時の７３％から２つの検査併用時の８９％まで増大する。
【０１１４】
このことは、２つの検査を併用した場合にＯＲおよび９５％ＣＩの増大を示すロジスティック回帰分析によってさらに説明される。
【０１１５】
【表４】
2020060585.tif 000006
【０１１６】
実施例１１．ＭＩＬ−３８は様々なＥＬＩＳＡフォーマットで組換えグリピカン−１を検出することができる。
図１１に示されるように、３種類のＥＬＩＳＡアッセイフォーマットを実施した。捕捉抗体としてＭＩＬ−３８、検出抗体としてウサギ抗ＧＰＣ−１を用いて、組換えグリピカン−１を０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌの濃度で試験した。同様の実験を、捕捉抗体としてウサギ抗ＧＰＣ−１、検出抗体としてＭＩＬ−３８を用いて実施した。ほかにも、捕捉抗体としてＭＩＬ−３８抗体、検出抗体としてビオチン化ＭＩＬ−３８抗体を用いて、単一抗体ＥＬＩＳＡを試験した。結果から、抗ＧＰＣ抗体を様々なＥＬＩＳＡフォーマットで用いることが可能であり、また、ＮＳ０  ＧＰＣ−１が適切な陽性対照になり得ることがわかる。
【０１１７】
実施例１２．ＡＭ４  ＭＩＬ−３８抗体を用いたグリピカン−１抗原の検出
本発明者らが実施した実験から、当時「ＢＬＣＡ−３８ハイブリドーマ」と称された原寄託のＭＩＬ−３８抗体のハイブリドーマ（ＡＴＣＣアクセション番号ＨＢ１１７８５：マウスハイブリドーマＢＬＣＡ−３８）は、ここで「ＡＭ３」および「ＡＭ４」と称される２つの異なる抗体集団を産生するハイブリドーマ細胞の混合集団であることが明らかになった。異なる抗体集団をそれぞれ産生するハイブリドーマ細胞を分離し、２０１４年８月２２日、「ＡＭ４」ハイブリドーマ細胞をＣｅｌｌＢａｎｋ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ（ＣＢＡ）にアクセッション番号ＣＢＡ２０１４００２６の下で寄託した。
【０１１８】
９６ウェルプレートを、ＭＩＬ−３８を炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で調製したＡＭ３またはＡＭ４（１μｇ／ウェル）で一晩コートした。５％脱脂乳を含有するＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）でプレートを３７℃にてブロックし、洗浄した。１５０ｍＭ  ＮａＣｌを加えた緩衝液ＩＩ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で抗原（ＧＰＣ−１  ＮＳ０）を希釈し、３７℃で一晩インキュベートした。ビオチン化ＡＭ４抗体による検出を実施し、次いでアビジンＨＲＰ（１μｇ／ｍＬ）による検出を実施した。ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｔ０４４０）を加え、ＴＭＢ停止液（Ｓｉｇｍａ社、Ｓ５８１４）で停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。結果を図１２Ａに示す。
【０１１９】
２つ目の実験では、９６ウェルプレートを、ＭＩＬ−３８をＰＢＳ（ｐＨ７．２）で調製した３４Ａ（ＡＭ３抗体とＡＭ４抗体の混合物）またはＡＭ４（２．５μｇ／ウェル）で１時間、室温でコートした。プレートを３７℃で１時間、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）に溶かしたＢｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ社）でブロックした。洗浄後、５０ｍＭトリシンおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するＴＢＳ（ｐＨ７．２）で抗原（ＧＰＣ−１  ＮＳ０）を希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。ビオチン化ＡＭ４クローン１Ｆ５による検出を実施し、次いでアビジンＨＲＰ（１μｇ／ｍＬ）による検出を実施した。ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｔ０４４０）を加え、ＴＭＢ停止液（Ｓｉｇｍａ社、Ｓ５８１４）で停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。結果を図１２Ｂに示す。
【０１２０】
ＭＩＬ−３８を用いて上記の１つ目のＥＬＩＳＡを実施して、ＮＳ０が産生したＧＰＣ−１（すなわち、ＭＩＬ−３８抗原）を捕捉した。この実験では、モノクローナルＡＭ３  ＭＩＬ−３８とモノクローナルＡＭ４  ＭＩＬ−３８の捕捉を比較した。サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイでは、ＡＭ３は捕捉剤として機能しなかったのに対し、ＡＭ４は捕捉剤として機能することが明らかになった（図１２Ａ）。
【０１２１】
上記の２つ目のＥＬＩＳＡでは、ＭＩＬ−３８の混合集団（ＡＭ３およびＡＭ４）と、モノクローナルＡＭ４  １Ｆ５クローンから得られた混合集団とを比較した場合に得られたＥＬＩＳＡシグナルを比較した。ＡＭ４  １Ｆ５を捕捉剤として用いた場合の方が、混合３４Ａ抗体集団を用いた場合よりも強いＥＬＩＳＡシグナルが得られた（図１２Ｂ）。
【０１２２】
サンドイッチＥＬＩＳＡの結果は、捕捉試薬としてグリピカン−１抗原の検出に有用なのはＡＭ４様形態のモノクローナルＭＩＬ−３８抗体のみであり、モノクローナル集団を含む捕捉剤の方が混合集団からなる捕捉剤よりも優れたＥＬＩＳＡシグナルが得られることを示している。
【０１２３】
実施例１３．ＡＭ４およびＡＭ３  ＭＩＬ−３８抗体集団の配列解析
材料および方法
−重鎖および軽鎖のシーケンシング（ＤＮＡ）
別個のシーケンシングのランを３回実行した。１回目のラン（コード２２４９４５）には、１−Ｏと称する混合（ＡＭ４およびＡＭ３）調製物の二クローン性ハイブリドーマ細胞を用いた。２回目のラン（コード４４９２９５−１）には、ＡＭ４の生成に用いたハイブリドーマストックであるＡｌｆｉｏの細胞を用いた。３回目のラン（コード４４９２９５−５）には、ＡＭ３の生成に用いたハイブリドーマストックであるＡｌｆｉｏ  ＩＩの細胞を用いた。
【０１２４】
シーケンシングのラン２２４９４５（１−Ｏ）および４４９２９５−１（Ａｌｆｉｏ  Ｉ）では、凍結ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出し、そのＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。次いで、ＲＴ−ＰＣＲを実施して抗体の可変領域（重鎖および軽鎖）および定常領域を増幅し、次いでこれを標準的なクローニングベクターに別個にクローニングし配列を決定した。
【０１２５】
ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍの技術マニュアルに従って、ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡをアガロースゲル電気泳動により分析した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍの技術マニュアルに従い、アイソタイプ特異的アンチセンスプライマーまたはユニバーサルプライマーを用いて全ＲＮをｃＤＮＡに逆転写させた。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社のＲＡＣＥの標準操作手順書に従って、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨおよびＣＬの抗体フラグメントを増幅した。
【０１２６】
標準的な分子クローニング法を用いて、増幅した抗体フラグメントを標準的なクローニングベクターにクローニングした。
【０１２７】
コロニーＰＣＲスクリーニングを実施して、正確な大きさのインサートを有するクローンを特定した。各抗体フラグメントについて、正確な大きさのインサートを有する単一コロニーを５つ以上、シーケンシングに供した。
【０１２８】
ＶHプラスミドおよびＶLプラスミドには、抗体の完全長可変領域およびＣH１とＣLの一部分がコードされていた。ＣHプラスミドには、ＣH１の一部分および完全長のＣH２とＣH３がコードされていた。ＣLプラスミドにはＣLの一部分がコードされていた。完全長の定常領域または重鎖／軽鎖を得るため、ＶHプラスミドおよびＶLプラスミドによってコードされる定常領域の部分ならびにＣHプラスミドおよびＣLプラスミドによってコードされる定常領域の部分を別個にＰＣＲで増幅し、次いで、オーバーラップ・エクステンションＰＣＲを用いて完全長のＤＮＡを得た。ＶH、ＶL、ＣHおよびＣLのインサートの大きさが正確な５つの単一コロニーをシーケンシングに供した。
【０１２９】
シーケンシングラン４４９２９５−５（Ａｌｆｉｏ  ＩＩ）では、予測されたＩｇＧ１重鎖配列に対応する配列を得るうえで困難に直面した。ＲＮＡの調製を２回実施した。１つ目のバッチの細胞では、オリゴ−ｄＴプライマーおよびＣＤＳ  ＩＩＩプライマーを逆転写（ＲＴ）に用いた。ＩｇＧ１およびＩｇΚに特異的なプライマーを用いたＰＣＲによりＶＨ／ＣＨおよびＶΚ／ＣΚを増幅し、陽性対照として部分的マウスβ−アクチン遺伝子を増幅した。ゲルには、通常の軽鎖バンドが容易に得られたのに対し、ＶＨはわずかに観察されるにとどまった。ＶΚおよびＣΚのインサートの大きさが正確な５つの個々のコロニーをシーケンシングに供した。５つの異なるコロニーのＶΚ遺伝子およびＣΚ遺伝子はほぼ同一であることがわかった。Ａｌｆｉｏ  ＩＩハイブリドーマから得られたコンセンサス軽鎖配列を以下に挙げる。下に示されるように、無作為にシーケンシングに供した８個のＶＨ陽性クローンから非生産的な重鎖配列が１つ得られた。無作為にシーケンシングに供した１０個のＣＨ陽性クローンから３種類の重鎖定常領域配列が得られた（ＩｇＧ1ＣＨが１つ、ＩｇＧ2aＣHが１つ、ＩｇＧ2bＣHが８つ）。クラススイッチングの影響を受ける可能性を回避するため、ＩｇＭ特異的プライマーを用いたＣHの増幅を実施したが、目的ＰＣＲ産物は得られなかった。また、重鎖ＦＲ１縮重プライマーを用いて完全長重鎖（ＶH−ＣH）を増幅しても、目的ＰＣＲ産物は得られなかった。
【０１３０】
数回試みても生産的な重鎖は得られなかったため、２つ目のバイアルのＡｌｆｉｏ  ＩＩ細胞から重鎖配列を単離することを試みた。２つ目のバイアルの細胞では、最初にオリゴ−ｄＴプライマーを逆転写に用いた。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＭ、ＩｇＡに特異的なプライマーおよびＩｇＧ縮重プライマーをそれぞれ用いてＶHを増幅し、ＩｇΚ特異的プライマーを用いてＶΚを増幅した。前回の結果と同じく、生産的な軽鎖および非生産的な重鎖が得られた。ほかにもランダム６量体プライマーを用いた逆転写を試みたが、成功しなかった。
【０１３１】
以上をまとめると、軽鎖配列および重鎖配列の単離を何度も試みた。２種類のバッチの細胞で別々に試みても一貫して、再配列された軽鎖配列が１つ得られた。しかし、ＶＨの目的ＰＣＲ産物がわずかに観察されるにとどまり、シーケンシングを実施しても一貫した重鎖配列は全く得られなかった。
【０１３２】
結果
−配列のまとめの表
下の表５に、検討した抗体の重鎖および軽鎖の核酸配列およびタンパク質配列の概要を記載するとともに、様々な内部領域を示す。
【０１３３】
【表５】
2020060585.tif 000007
【０１３４】
−シーケンシング（ＤＮＡ）
試料から単離した全ＲＮＡを１．５％アガロース／ＧｅｌＲｅｄ（商標）ゲル上でＤＮＡマーカー（Ｍａｒｋｅｒ  ＩＩＩ−ＴＩＡＮＧＥＮ社、カタログ番号ＭＤ１０３）と並べて泳動した。
【０１３５】
各試料のＰＣＲ産物４マイクロリットルを１．５％アガロース／ＧｅｌＲｅｄ（商標）ゲル上でＤＮＡマーカー（Ｍａｒｋｅｒ  ＩＩＩ）と並べて泳動した。ＰＣＲ産物を精製し、のちに使用するまで−２０℃で保管した。
【０１３６】
５つの異なるクローンのＶH、ＶL、ＣHおよびＣL遺伝子はほぼ同一であった。以下に挙げるコンセンサス配列は、モノクローナルハイブリドーマ集団（ＡＭ−４）によって産生された抗体の配列であることが明らかになった。
【０１３７】
【表６】
2020060585.tif 000008
【０１３８】
【表７】
2020060585.tif 000009
【０１３９】
上記の重鎖および軽鎖のＡＭ４  ＭＩＬ−３８コンセンサスＤＮＡ配列は以下の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列に翻訳される：
【表８】
2020060585.tif 000010
【０１４０】
【表９】
2020060585.tif 000011
【０１４１】
ＡＭ３コンセンサス配列
ＡＭ３様Ａｌｆｉｏ  ＩＩ細胞からは一貫した重鎖配列は得られなかった。シーケンシングラン４４９２９５−５（Ａｌｆｉｏ  ＩＩ）から得られた軽鎖配列は一貫して得られたものであり、他の２回のシーケンシングランの配列と比較して、フレームワーク領域および相補性決定領域の両方に明らかな差がみられた。
【０１４２】
【表１０】
2020060585.tif 000012
【０１４３】
【表１１】
2020060585.tif 000013
【０１４４】
実施例１４．ＡＭ４抗グリピカン−１抗体が結合するグリピカン−１エピトープの同定および特徴付け
材料および方法
本研究に使用したＡＭ４抗グリピカン−１抗体に関する情報を下の表６に記載する。
【０１４５】
【表１２】
2020060585.tif 000014
【０１４６】
−ペプチド
本研究の土台となったヒトグリピカン−１（ＧＰＣ−１）配列は配列番号１６で定められる。以下の残基配列を用いた：
ＧＰＣ１＿残基  番号３４３〜３６６  ＧＮＰＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫＲＲＲＧＫＬＡＰ（配列番号１７）
ＧＰＣ１＿残基  番号１４０〜１４９  ＧＥＬＹＴＱＮＡＲＡＦＲＤＬＹＳＥＬＲ（配列番号１８）
【０１４７】
−ペプチド合成
実施例１で言及した方法を用いてペプチド合成を実施した。以下に示す設計に従って、化学合成線状ペプチドおよびＣＬＩＰＳペプチドを合成した：
【０１４８】
−Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ（ＣＬＩＰＳ）技術
用いたＣＬＩＰＳ技術の一般的原理の説明について以下で説明する。
【０１４９】
ＣＬＩＰＳ技術は、ペプチドの構造を定められた三次元構造に固定化するものである。これにより、最も複雑な結合部位の機能さえ模倣される。ＣＬＩＰＳ技術は現在、ペプチドライブラリーを単一ループ構造、二重ループ構造または三重ループ構造のほか、シート様およびへリックス様の折畳み構造に形づくるために日常的に用いられている。
【０１５０】
ＣＬＩＰＳ足場のブロモ基とシステインのチオール側鎖との間でＣＬＩＰＳ反応が起こる。この反応は、穏やかな条件下では迅速で特異的なものである。この化学反応を用いると、天然のタンパク質配列が単一Ｔ２ループ、Ｔ３二重ループ、コンジュゲートＴ２＋Ｔ３ループ、安定化ベータシートおよび安定化アルファへリックスを含めた様々な構造を有するＣＬＩＰＳ構築物に変換される（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２００７；２０：２８３−２９）。
【０１５１】
ＣＬＩＰＳライブラリースクリーニングではまず、コンビナトリアル基質設計を用いて、標的タンパク質を最大１０，０００個の重複するペプチド構築物からなるライブラリーに変換する。固体担体上で線状ペプチドの基質を合成し、次いで、これを空間的に定められたＣＬＩＰＳ構築物に形づくる。正しい立体構造内の不連続エピトープの部分をともに示す構築物が抗体と高い親和性で結合し、これを検出し定量化する。不完全なエピトープを提示する構築物はこれよりも低い親和性で抗体と結合するのに対し、エピトープを含まない構築物は全く結合しない。親和性に関する情報を反復スクリーニングに用いて、エピトープの配列および立体構造の詳細を明らかにする。
【０１５２】
不連続な立体構造エピトープを含む標的タンパク質を基質ライブラリーに変換する。商標登録されているミニカード上でコンビナトリアルペプチドを合成し、空間的に定められたＣＬＩＰＳ構築物に化学的に変換する。抗体の結合を定量化する。
【０１５３】
−ペプチド合成
標的分子の不連続エピトープを再構築するため、構造化されたペプチドのライブラリーを合成した。この合成はＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ（ＣＬＩＰＳ）技術を用いて実施した。ＣＬＩＰＳ技術により、単一ループ、二重ループ、三重ループ、シート様の折畳み、へリックス様の折畳みおよびその組合せに構造化されたペプチドを作製することができた。ＣＬＩＰＳ鋳型とシステイン残基とを結合させた。ペプチド内の多数のシステインの側鎖を１つまたは２つのＣＬＩＰＳ鋳型と結合させた。例えば、Ｔ２  ＣＬＩＰＳ鋳型である１，３−ビス（ブロモメチル）ベンゼンの０．５ｍＭ溶液を炭酸水素アンモニウム（２０ｍＭ、ｐＨ７．９）／アセトニトリル（１：１（ｖ／ｖ））に溶かした。この溶液をペプチドアレイ上に加えた。固相中に存在する２つのシステインの側鎖と結合したＣＬＩＰＳ鋳型がペプチドアレイ（３μｌウェルを備えた４５５ウェルプレート）のペプチドと結合した。ペプチドアレイを溶液中、溶液で完全に覆われた状態で３０〜６０分間、穏やかに振盪した。最後に、ペプチドアレイを過剰のＨ2Ｏで十分に洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に１％ＳＤＳ／０．１％ベータ−メルカプトエタノールを含有する破壊緩衝液中、７０℃で３０分間、超音波処理した後、Ｈ2Ｏ中でさらに４５分間、超音波処理した。システインが３つであること以外は同じ方法で、Ｔ３  ＣＬＩＰＳを有するペプチドを作製した。
【０１５４】
以下の設計に従って線状ペプチドおよびＣＬＩＰＳペプチドを化学的に合成した：
セット１
模倣体の種類  不連続エピトープ模倣体
標識  ＭＡＴ．Ａ、ＭＡＴ．Ｂ
説明  様々な長さの制約型ペプチド模倣体。２つの出発配列（配列番号１７および配列番号１８）からステップサイズ４の１０〜２２量体ペプチドおよび１０〜１８量体ペプチドをすべて作製し、これらを対にしたもの。末端および２つのペプチドの中間にシステインが位置している。これらはＴ３  ＣＬＩＰＳによって連結されている。
【０１５５】
セット２
模倣体の種類  線状ペプチド
標識  ＲＮ．ＰＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫＲＲ（配列番号１９）
説明  置換分析、ベース配列ＰＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫＲＲ（配列番号２０）から出発して、システインを除く個々のアミノ酸がすべて、天然に存在するアミノ酸に置き換わっている。
【０１５６】
セット３
模倣の種類  制約型ペプチド
標識  ＲＮ．ＰＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫＲＲ＿ＬＯＯＰ（配列番号１９）
ＲＮ．ＥＬＣＴＱＮＣＲＡＦＲＤＬＹＳ＿ｈｅｌｉ３（配列番号２１）
ＲＮ．ＥＬＣＴＱＮＣＲＡＦＲＤＬＹＳ＿ＬＯＯＰ（配列番号２１）
説明  置換分析、標識名に示されるベース配列から出発して、システインを除く個々のアミノ酸がすべて、天然に存在するアミノ酸に置き換わっている。
【０１５７】
−ＥＬＩＳＡスクリーニング
抗体と各合成ペプチドとの結合をＰＥＰＳＣＡＮベースのＥＬＩＳＡで試験した。ペプチドアレイを一次抗体溶液とインキュベートした（４℃で一晩）。洗浄後、ペプチドアレイを１／１０００希釈の抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート（ＳＢＡ社、カタログ番号２０１０−０５）と２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質の２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンゾチアゾリンスルホナート（ＡＢＴＳ）および３％Ｈ2Ｏ2  ２μｌ／ｍｌを加えた。１時間後、発色を測定した。電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラおよび画像処理システムで発色を定量化した。
【０１５８】
−データ処理
ＣＣＤカメラで得られた値は０〜３０００ｍＡＵの範囲内にあり、標準的な９６ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダーとほぼ同じである。結果を定量化し、Ｐｅｐｌａｂデータベースに保存した。ウェルに気泡が含まれているために偽陽性の値が出ることがあり、カードを手作業で検査し、気泡によって生じた値はいずれもスコアを０とする。
【０１５９】
−合成の品質管理
合成ペプチドの品質を確認するため、別個のセットの陽性対照ペプチドおよび陰性対照ペプチドを同時に合成した。これらを抗体５７．９でスクリーニングした（Ｐｏｓｔｈｕｍｕｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０，６４：３３０４−３３０９を参照されたい）。
【０１６０】
−スクリーニングの詳細
表７に抗体結合条件をまとめる。Ｐｅｐｓｃａｎ緩衝液および前準備（ＳＱ）について、数値は競合タンパク質（ウマ血清とオボアルブミンの組合せ）の相対量を示している。
【０１６１】
【表１３】
2020060585.tif 000015
【０１６２】
結果
−主要な実験結果およびシグナル／ノイズ比の決定
スクリーニングによって得られた未処理のＥＬＩＳＡの結果の全データセットの概要を図１３にグラフで示す。図中、箱ひげ図は各データセットを表し、各データセット内でのＥＬＩＳＡシグナルの平均値、分布および外れ値を示している。実験条件（抗体量、ブロッキング強度など）に応じて様々なＥＬＩＳＡデータの分布が得られる。
【０１６３】
−抗体ＭＩＬ３８−ＡＭ４
本発明者らが以前実施した分析では、ＭＩＬ３８−ＡＭ４が伸長348ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ358（配列番号２２）上のグリピカンと結合するほか、伸長135ＴＱＮＡＲＡ140（配列番号８）／135ＴＱＮＡＲＡＦＲＤ143（配列番号９）とも結合することが確認され、このことは不連続エピトープであることを示すと考えられた。
【０１６４】
主要な伸長を含むループ型の構築物から、結合に最も重要な残基が正確に特定される。本研究の結果から、残基のうちＶ３４８、Ｑ３５１、Ｇ３５２およびＰ３５３は置換が許容されず、Ｋ３４７、Ｎ３４９およびＰ３５０は、Ｇ３５４、Ｐ３５５およびＥ３５６よりは程度が低いにせよ、必要度が相当高いことが示された（図１４）。
【０１６５】
−結論
抗体ＭＩＬ３８−ＡＭ４の立体構造エピトープの特徴を明らかにした。ＭＩＬ３８−ＡＭ４に対する不連続エピトープを示唆する以前の分析で得られたリードを用いて、ループの長さが異なるマトリックスアレイを作製した。さらに、個々のリード配列の完全置換分析を実施した。いずれのアレイもＭＩＬ３８−ＡＭ４抗体で探索した。
【０１６６】
グリピカン−１の認識については、本研究で検討したＭＩＬ３８−ＡＭ４抗体は、残基３４７と３５８との間の柔軟なループのみからなるか、主としてこれよりなるエピトープと結合する。
【０１６７】
モノクローナル抗体ＭＩＬ３８−ＡＭ４は主として残基３４７〜３５５の間のループ上のグリピカン−１と結合するが、この抗体には、ペプチドに１３５〜１４０または１３５〜１４３の範囲の残基を付加することが有益である。
【０１６８】
【表１４】
2020060585.tif 000016
【０１６９】
別途定義されない限り、本明細書の技術用語および科学用語はいずれも、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本発明の実施または検証には、本明細書に記載されるものと類似するか、これと同等の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法および材料は本明細書に記載されるものである。引用されるあらゆる刊行物、特許および特許公開は、あらゆる目的においてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７０】
本明細書に記載される刊行物は、単に本願の出願日に先立って開示されたことを理由に記載されるものである。本明細書に記載されることはいずれも、本発明が、先行発明であるという理由でこのような先行刊行物に対する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。
【０１７１】
ここまで本発明をその特定の実施形態に関連させて説明してきたが、本発明にはさらなる改変を施すことが可能であり、本願は、本開示からの逸脱で、本発明が属する技術分野において既知のまたは慣例的な実施の範囲内に収まるもの、本明細書でここまでに記載した必須の特徴に当てはまり得るものおよび添付の「特許請求の範囲」の範囲内で導かれるものを含め、本発明の原理に全般的に従った本発明のあらゆる変形形態、用途または改変形態を包含することを意図するものであることが理解されよう。
【０１７２】
参考文献
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Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ，ｅｄ．），１９９５，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９，３９１４−３９２０（１９９２）
Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６
Ｄａｉｎａｋ  Ｍ，Ｋｕｍａｒ  Ａ，Ｇａｌａｅｖ  ＩＹ，Ｍａｔｔｉａｓｓｏｎ  Ｂ．２００７“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ”Ｖｏｌ  １０６：１−１８
Ｄａｖｉｄ  Ｇ，Ｌｏｒｉｅｓ  Ｖ，Ｄｅｃｏｃｋ  Ｂ，Ｍａｒｙｎｅｎ  Ｐ，Ｃａｓｓｉｍａｎ  ＪＪ，Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅ  Ｈ．１９９０．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｈｅｐａｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｕｎｇ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  １１１：６−２  ３１６５−３１７６
Ｆｉｌｍｕｓ  Ｊ，Ｃａｐｕｒｒｏ  Ｍ，Ｒａｓｔ  Ｊ．“Ｇｌｙｐｉｃａｎｓ”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００８，９：２２４
Ｆｉｌｍｕｓ  Ｊ，Ｓｅｌｌｅｃｋ  ＳＢ：Ｇｌｙｐｉｃａｎｓ：ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｕｒｐｒｉｓｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００１，１０８：４９７−５０１．
Ｆｕｊｉｓｅ  Ｍ，Ｔａｋｅｏ  Ｓ，Ｋａｍｉｍｕｒａ  Ｋ，Ｍａｔｓｕｏ  Ｔ，Ａｉｇａｋｉ  Ｔ，Ｉｚｕｍｉ  Ｓ，Ｎａｋａｔｏ  Ｈ．Ｄａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＤＰＰ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｗｉｎｇ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００３，１３０：１５１５−１５２２．
Ｈａｎ  Ｃ，Ｂｅｌｅｎｋａｙａ  ＴＹ，Ｗａｎｇ  Ｂ，Ｌｉｎ  Ｘ．“Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｇｌｙｐｉｃａｎｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｂｙ  ａ  ｄｙｎａｍｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｓｓ”．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００４，１３１：６０１−６１１．
Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ  １９８８．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．
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【図１】
2020060585.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
2020060585.tif 000030
【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月8日(2020.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の前立腺癌を検出する方法であって、患者の体液試料中のグリピカン−１のレベルを測定することと、前記体液試料中のグリピカン−１のレベルに基づき、前記患者に前立腺癌があるか、前立腺癌が発生する可能性が高いことを確定することとを含む、方法。
【外国語明細書】
2020060585000001.pdf