(57)【要約】【課題】本発明の目的は、大きなカーゴ（例えば、細胞小器官、染色体、細菌及び同種のもの）を細胞に送達するための方法及びデバイスを提供することである。【解決手段】本発明は、大きなカーゴを真核細胞に送達する方法であり、前記方法は、多孔質膜の片側に配置された前記細胞を準備することと、前記多孔質膜の反対側にあるリザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを準備することと、前記カーゴを、前記多孔質膜を構成する孔を通過させるのに十分な圧力を前記リザーバ室に印加することとを含み、前記カーゴは細胞膜を通って前記細胞に入る、前記方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大きなカーゴを真核細胞に送達する方法であり、前記方法は、
多孔質膜の片側に配置された前記細胞を準備することと、
前記多孔質膜の反対側にあるリザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを準備することと、
前記カーゴを前記多孔質膜を構成する孔を通過させるのに十分な圧力を前記リザーバ室に印加することとを含み、前記カーゴは細胞膜を通って前記細胞に入る、前記方法。
【請求項２】
前記リザーバ室の容積は、約１０μＬから約５００μＬまで、または約４０μＬから約５００μＬまで、または約５０μＬから約４００μＬまで、または約６０μＬから約３００μＬまで、または約７０μＬから約２００μＬまで、または約８０μＬから約１５０μＬまで、または約１０μＬから約１００μＬまでに及ぶ、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リザーバ室の容積は約１００μＬである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記多孔質膜の厚さは、約５μｍから約３０μｍ、または約５μｍから約２０μｍ、または約５μｍから約１５μｍに及ぶ、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記多孔質膜の厚さは約１０μｍである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記多孔質膜の孔サイズの平均または中央値は、約１００ｎｍから約２０μｍまでまたは約２０μｍまで、または約５００ｎｍから約８μｍまで、または約１μｍから約５μｍまでに及ぶ、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記多孔質膜の孔サイズの中央値または平均は約１μｍである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記多孔質膜の孔サイズの中央値または平均は約３μｍである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記多孔質膜の孔サイズの中央値または平均は約５μｍである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記多孔質膜は、約１×１０５孔／ｃｍ２から最大約１×１０７孔／ｃｍ２、または約５×１０５孔／ｃｍ２から最大約５×１０６、または約１×１０５孔／ｃｍ２から最大約１×１０７孔／ｃｍ２を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記多孔質膜は、約１．６×１０６孔／ｃｍ２で約１μｍ直径の平均孔サイズを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記多孔質膜は、約８×１０５孔／ｃｍ２で約３μｍ直径の平均孔サイズを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記膜はポリマー膜を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記膜は、ナイロン膜、ナイロンメッシュ、フィルター膜、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）膜、ポリエステル膜、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）膜、延伸ポリエーテルエーテルケトン（ｅＰＥＥＫ）膜、ポリエチレン（ＰＥ）膜、ポリプロピレン（ＰＰ）膜、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜、エチルビニルアセタート（ＥＶＡ）膜、熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）膜、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜、ポリカーボネート膜及びポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）膜からなる群から選択される材料を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記膜は、ポリエステル膜、ポリカーボネート膜またはポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）膜を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記圧力を印加することは、前記多孔質膜のゆがみを引き起こす、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ゆがみは、約２０μｍから、または約５０μｍから、または約１００μｍから、または約５００μｍから約１ｃｍまで、または約５００ｍｍまで、または約３００ｍｍまで、または約１００ｍｍまでに及ぶ、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記圧力を印加することは、一時的な圧力を印加することを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記圧力を印加することは、圧力を約１ミリ秒から最大約１分間印加することを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記圧力を印加することは、ポートを通して前記リザーバ室の中へ圧力を印加することを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記圧力を印加することは、前記リザーバ室が一杯で閉鎖されているときに前記リザーバ室の壁を撓ませることを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記圧力を印加することは、前記リザーバ室の壁を通して溶液を注入することを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
リザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを前記準備することは、ポートを通して前記リザーバ室に前記溶液を導入することを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
リザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを前記準備することは、前記カーゴ溶液を前記リザーバにピペットで入れることを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
リザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを前記準備することは、前記多孔質膜を前記リバーザ室上または内に置く前に前記リザーバ室に装填することを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
リザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを前記準備することは、前記溶液を前記リザーバ室の壁を貫通する針を通して注入することを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
リザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを前記準備することは、前記溶液を前記膜を通過させて前記リザーバ室に装填することを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記カーゴは、リポソーム内にパッケージングされた天然染色体もしくは染色体フラグメント、合成染色体、細菌、合成粒子、細胞内真菌、細胞内原生動物、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ（例えば、リポフェクタミン）ならびに細胞小器官からなる群から選択される１つあるいは部分を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記カーゴは細胞核を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記カーゴはミトコンドリアを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記カーゴは染色体または染色体フラグメントを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記カーゴは人工染色体を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記カーゴは細菌を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞は、脊椎動物細胞、真菌細胞及び酵母菌細胞からなる群から選択される、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞及び無脊椎動物細胞からなる群から選択される、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞は哺乳動物細胞を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞はヒト細胞を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞は非ヒト哺乳動物細胞を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞はリンパ球または幹細胞を含む、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞は分化した体細胞を含む、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞は細胞株からの細胞を含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞は表１に列挙される細胞株からの細胞を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞は、ＨｅＬａ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの６０種の癌細胞株（ＮＣＩ６０）、ＥＳＴＤＡＢデータベース、ＤＵ１４５（前立腺癌）、Ｌｎｃａｐ（前立腺癌）、ＭＣＦ−７（乳癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８（乳癌）、ＰＣ３（前立腺癌）、Ｔ４７Ｄ（乳癌）、ＴＨＰ−１（急性骨髄性白血病）、Ｕ８７（膠芽腫）、ＳＨＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞、骨髄腫からクローン化される及びＳａｏｓ−２細胞（骨癌）からなる群から選択される細胞株からの細胞を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞は、吸着、接着分子、遠心力及びゲルマトリックスの１つ以上によって前記多孔質膜に付着させられる、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞は、前記多孔質膜上で培養される、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞は、前記多孔質膜上で付着層として培養される、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞は、前記多孔質膜上でコンフルエンスになるまで培養される、請求項４６〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記多孔質膜は、金属薄膜または金属ナノ粒子を載せていない、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記方法は、前記膜の表面を加熱することを含まない、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記方法は、前記膜の表面をレーザーにより加熱することを含まない、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
多孔質膜と、
前記多孔質膜の片側にある容積が約５００μＬ未満のリザーバ室と
を備える大きなカーゴを真核細胞に送達するためのデバイス。
【請求項５３】
前記リザーバ室の容積は、約４０μＬから約５００μＬ、または約５０μＬから約４００μＬ、または約６０μＬから約３００μＬ、または約７０μＬから約２００μＬ、または約８０μＬから約１５０μＬ、または約１０μＬから約１００μＬまでに及ぶ、請求項５２に記載のデバイス。
【請求項５４】
前記リザーバ室の容積は約１００μＬである、請求項２に記載のデバイス。
【請求項５５】
前記多孔質膜の厚さは、約５μｍから約３０μｍ、または約５μｍから約２０μｍ、または約５μｍから約１５μｍに及ぶ、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５６】
前記多孔質膜の厚さは約１０μｍである、請求項５５に記載のデバイス。
【請求項５７】
前記多孔質膜の孔サイズの平均または中央値は、約１００ｎｍから約２０μｍまでまたは約２０μｍまで、または約５００ｎＭから約８μｍまで、または約１μｍから約５μｍまでに及ぶ、請求項５２〜５６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５８】
前記多孔質膜の孔サイズの中央値または平均は約１μｍである、請求項５７に記載のデバイス。
【請求項５９】
前記多孔質膜の孔サイズの中央値または平均は約３μｍである、請求項５７に記載のデバイス。
【請求項６０】
前記多孔質膜の孔サイズの中央値または平均は約５μｍである、請求項５７に記載のデバイス。
【請求項６１】
前記多孔質膜は、約１×１０５孔／ｃｍ２から最大約１×１０７孔／ｃｍ２、または約５×１０５孔／ｃｍ２から最大約５×１０６、または約１×１０５孔／ｃｍ２から最大約１×１０７孔／ｃｍ２を含む、請求項５２〜６０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６２】
前記多孔質膜は、約１．６×１０６孔／ｃｍ２で約１μｍ直径の平均孔サイズを含む、請求項６１に記載のデバイス。
【請求項６３】
前記多孔質膜は、約８×１０５孔／ｃｍ２で約３μｍ直径の平均孔サイズを含む、請求項６１に記載のデバイス。
【請求項６４】
前記膜はポリマー膜を含む、請求項５２〜６３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６５】
前記膜は、ナイロン膜、ナイロンメッシュ、フィルター膜、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）膜、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）膜、延伸ポリエーテルエーテルケトン（ｅＰＥＥＫ）膜、ポリエチレン（ＰＥ）膜、ポリプロピレン（ＰＰ）膜、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜、エチルビニルアセタート（ＥＶＡ）膜、熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）膜及びポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜からなる群から選択される材料を含む、請求項５２〜６３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６６】
前記膜は、ポリエステル膜、ポリカーボネート膜またはポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）膜を含む、請求項５２〜６３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６７】
前記リザーバ室は、溶液を前記リザーバ室に導入するよう構成されたポートまたはチャネルと流体連結している、請求項５２〜６６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６８】
前記リザーバ室は閉鎖及び／または密閉した（例えば、前記リザーバからの流れは前記多孔質膜を通してのみ生じることができる）、請求項５２〜６６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６９】
リザーバ室は、前記真核細胞に送達されるカーゴを含む溶液を含有する、請求項５２〜６６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項７０】
前記カーゴは、リポソーム内にパッケージングされた天然染色体もしくは染色体フラグメント、合成染色体、細菌、合成粒子、細胞内真菌、細胞内原生動物、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡあるいは脂質粒子ならびに細胞小器官からなる群から選択される１つあるいは部分を含む、請求項６９に記載のデバイス。
【請求項７１】
前記カーゴは細胞核を含む、請求項７０に記載のデバイス。
【請求項７２】
前記カーゴはミトコンドリアを含む、請求項７０に記載のデバイス。
【請求項７３】
前記カーゴは染色体または染色体フラグメントを含む、請求項７０に記載のデバイス。
【請求項７４】
前記カーゴは人工染色体を含む、請求項７０に記載のデバイス。
【請求項７５】
前記カーゴは細菌を含む、請求項７０に記載のデバイス。
【請求項７６】
真核細胞は、前記リザーバ室に近接する側と反対の前記多孔質膜の表面に配置される、請求項５２〜７５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項７７】
前記細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞及び無脊椎動物細胞からなる群から選択される、請求項７５に記載のデバイス。
【請求項７８】
前記細胞は哺乳動物細胞を含む、請求項７７に記載のデバイス。
【請求項７９】
前記細胞はヒト細胞を含む、請求項７７に記載のデバイス。
【請求項８０】
前記細胞は非ヒト哺乳動物細胞を含む、請求項７７に記載のデバイス。
【請求項８１】
前記細胞はリンパ球または幹細胞を含む、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８２】
前記細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞を含む、請求項８１に記載のデバイス。
【請求項８３】
前記細胞は分化した体細胞を含む、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８４】
前記細胞は細胞株からの細胞を含む、請求項５２〜７５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８５】
前記細胞は表１に列挙される細胞株からの細胞を含む、請求項８４に記載のデバイス。
【請求項８６】
前記細胞は、ＨｅＬａ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの６０種の癌細胞株（ＮＣＩ６０）、ＥＳＴＤＡＢデータベース、ＤＵ１４５（前立腺癌）、Ｌｎｃａｐ（前立腺癌）、ＭＣＦ−７（乳癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８（乳癌）、ＰＣ３（前立腺癌）、Ｔ４７Ｄ（乳癌）、ＴＨＰ−１（急性骨髄性白血病）、Ｕ８７（膠芽腫）、ＳＨＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞、骨髄腫からクローン化される及びＳａｏｓ−２細胞（骨癌）からなる群から選択される細胞株からの細胞を含む、請求項８４に記載のデバイス。
【請求項８７】
前記細胞は、前記多孔質膜上で培養される、請求項５２〜８６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８８】
前記細胞は、前記多孔質膜上で付着層として培養される、請求項５２〜８６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８９】
前記細胞は、前記多孔質膜上でコンフルエンスになるまで培養される、請求項８７〜８８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９０】
前記多孔質膜は、金属薄膜または金属ナノ粒子を載せていない、請求項５２〜８９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９１】
前記方法は、前記膜の表面を加熱することを含まない、請求項５２〜９０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９２】
請求項５２〜９１のいずれか一項に記載の第１のデバイスと、
請求項５２〜９１のいずれか一項に記載の第２のデバイスと
を含み、
前記第１のデバイス及び前記第２のデバイスが、前記第１のデバイス及び前記第２のデバイスを構成する前記リザーバ室と流体連結しているポート及び／またはチャンネルを備え、前記ポート及び／またはチャンネルは互いに流体連結しているか、あるいは前記第１のデバイス及び前記第２のデバイスが、前記第１のデバイス及び前記第２のデバイスを構成する前記リザーバ室と流体連結しているポート及び／またはチャンネルを備え、前記ポート及び／またはチャンネルは互いに流体連結していない、大きなカーゴを真核細胞に送達するためのシステム。
【請求項９３】
前記第１のデバイス及び前記第２のデバイスは、前記第１のデバイス及び前記第２のデバイスを構成する前記リザーバ室と流体連結しているポート及び／またはチャンネルを備え、前記ポート及び／またはチャンネルは互いに流体連結している、請求項９２に記載のシステム。
【請求項９４】
前記第１のデバイス及び前記第２のデバイスは、前記第１のデバイス及び前記第２のデバイスを構成する前記リザーバ室と流体連結しているポート及び／またはチャンネルを備え、前記ポート及び／またはチャンネルは互いに流体連結していない、請求項９２に記載のシステム。
【請求項９５】
前記第１のデバイスの前記リザーバ室に存在するカーゴは、前記第２のデバイスの前記リザーバ室に存在するカーゴとは異なる、請求項９４に記載のシステム。
【請求項９６】
前記第１のデバイスに存在する真核細胞は、前記第２のデバイスの真核細胞と同じ種類である、請求項９２〜９５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項９７】
前記第１のデバイスに存在する真核細胞は、前記第２のデバイスの真核細胞とは異なる、請求項９２〜９５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項９８】
前記システムは、請求項５２〜９１のいずれか一項に記載の第３のデバイスを備え、
前記第１のデバイス及び前記第３のデバイスが、前記第１のデバイス及び前記第３のデバイスを構成する前記リザーバ室と流体連結しているポート及び／またはチャンネルを備え、前記ポート及び／またはチャンネルは互いに流体連結しているか、あるいは前記第１のデバイス及び前記第３のデバイスが、前記第１のデバイス及び前記第３のデバイスを構成する前記リザーバ室と流体連結しているポート及び／またはチャンネルを備え、前記ポート及び／またはチャンネルは互いに流体連結していない、請求項９２〜９７のいずれか一項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年３月２８日に出願されたＵＳＳＮ６１／９７２，１４５の利益及び優先権を主張するものであり、この出願はあらゆる目的のために参照によってその全体を本明細書に組み込んだものとする。
政府支援の陳述
［適用なし］
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、染色体、核、ならびに量子ドット、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）粒子及びミクロビーズなどの無生物粒子を含むカーゴを１サイズの広い範囲にわたって哺乳動物細胞に運搬することは、生物学の多くの分野において極めて望ましい。エンドサイトーシスなどの送達方法はエンドソームにカーゴを封入することができ、この場合、ｐＨが低い微小環境及び溶菌酵素がカーゴ分解につながることが多い（Ｌｕｏ  ａｎｄ  Ｓａｌｔｚｍａｎ（２０００）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８：  ３３−３７）。ウイルス及び化学的送達方法は、ウイルス内にカーゴをパッケージングするか、または取り込みを向上させる化学的複合体を形成する（Ｎａｌｄｉｎｉら、（１９９６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７２：  ２６３−２６７；  Ｆｅｌｇｎｅｒら、（１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８４：  ７４１３−７４１７）。しかしながら、毒性、細胞種固有の取り込み、さらに重要なことに限られたカーゴ詰め込み容量がカーゴサイズ及び運搬可能な細胞種に著しい制約を課す（Ｌｕｏ  ａｎｄ  Ｓａｌｔｚｍａｎ、上記）。
【０００３】
物理的運搬方法としては、ランダムに分散したナノスケールの孔をもたらすエレクトロポレーション（Ｃｈｕら、（１９８７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：  １３１１−１３２６）及びソノポレーション（Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ（２００５）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，  ４：  ２５５−２６０）、ならびにレーザー焦点において細胞膜に孔を形成するオプトポレーション（Ｔｉｒｌａｐｕｒ  ａｎｄ  Ｋｏｎｉｇ（２００２）  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１８：  ２９０−２９１；  Ｖｏｇｅｌら、（２００５）  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｂ：  Ｌａｓｅｒ  Ｏｐｔ．，  ８１：  １０１５−１０４７；  Ｃｌａｒｋら、（２００６）  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｏｐｔ．，  １１：  ０１４０３４）が挙げられる。こうした孔を通って、小さなカーゴは熱拡散または電場によって細胞に送達される。こうした方法による大きなカーゴの送達は、遅いカーゴの拡散速度及び孔サイズの増加に伴う細胞生存率の低下のために効率が低い（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、（２００６）  Ｏｐｔ．  Ｅｘｐｒｅｓｓ，  １４：  ７１２５−７１３３）。マイクロキャピラリー注入（Ｋｉｎｇ（２００４）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４５：  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  １；  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．：  Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ）は、鋭いガラスの先端を使用して送達のために機械的に細胞膜を貫通させる。しかしながら、細胞生存率を維持するために、膜貫通による機械的外傷は典型的なピペットの先端の直径を０．５ｕｍに制限する（Ｈａｎら、（２９９８）  Ｊ．  Ｎａｎｏｍｅｄ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．，  ４：  ２１５−２２５）。
【０００４】
ピペットを詰まらせ、カーゴを切断するため、ピペットの先端よりも大きなカーゴを注入することはできない。エレクトロポレーションをマイクロキャピラリー注入と組み合わせる電気注入は、接触する細胞膜を電場により軟化させた後に穏やかに細胞へ機械的に貫通させることによってＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡなどの小分子の生細胞への送達（Ｂｏｕｄｅｓら、（２０８）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｍｅｔｈ．，  １７０：  ２０４−２１１；  Ｋｉｔａｍｕｒａら、（２００８）  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈ．，  ５：  ６１−６７）ならびに人工脂質ベシクルへの細菌送達（Ｈｕｒｔｉｇ  ａｎｄ  Ｏｒｗａｒ（２００８）  Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ，  ４：  １５１５−１５２０）を実証した。あるいは、単純脂質アシストマイクロインジェクション（ＳＬＡＭ）技術（Ｌａｆｆａｆｉａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌｅｔｔ（１９９８）  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．，  ７５：２５５８−２５６３）は、ガラスマイクロキャピラリーの先端において合成脂質分子を組み込む。ＳＬＡＭマイクロピペットの細胞膜との接触は、脂質分子を細胞膜と融合させて、カーゴ送達のための連続的及び一時的な経路を形成する。この方法は、細胞膜を貫くマイクロピペットの先端のジグザグに刺す動きを回避する。しかしながら、カーゴ及び細胞膜との親油性相互作用は、細胞ならびに送達カーゴに望ましくない生物学的影響を与える可能性があり、この方法を特定の細胞種及びカーゴ含量に限定する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
さまざまな態様において、本明細書において意図される本発明（複数可）は、以下の実施形態のいずれか１つ以上を含んでもよいが、これらに限定される必要はない。
【０００６】
実施形態１：大きなカーゴを真核細胞に送達する方法であり、前記方法は、多孔質膜の片側に配置された前記細胞を準備することと、前記多孔質膜の反対側にあるリザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを準備することと、前記カーゴを、前記多孔質膜を構成する孔を通過させるのに十分な圧力を前記リザーバ室に印加することとを含み、前記カーゴは細胞膜を通って前記細胞に入る、前記方法。
【０００７】
実施形態２：前記リザーバ室の容積は、約１０μＬから約５００μＬまで、または約４０μＬから約５００μＬまで、または約５０μＬから約４００μＬまで、または約６０μＬから約３００μＬまで、または約７０μＬから約２００μＬまで、または約８０μＬから約１５０μＬまで、または約１０μＬから約１ｍＬまで、または約１０μＬから約５００μＬまで、または約１０μＬから約１００μＬまでに及ぶ、実施形態１に記載の方法。
【０００８】
実施形態３：前記リザーバ室の容積は約１００μＬである、実施形態２に記載の方法。
【０００９】
実施形態４：前記多孔質膜の厚さは、約５μｍから約３０μｍ、または約５μｍから約２０μｍ、または約５μｍから約１５μｍに及ぶ、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【００１０】
実施形態５：前記多孔質膜の厚さは約１０μｍである、実施形態４に記載の方法。
【００１１】
実施形態６：前記多孔質膜の孔サイズの平均または中央値は、約１００ｎｍから約２０μｍまでまたは約２０μｍまで、または約５００ｎｍから約８μｍまで、または約１μｍから約５μｍまでに及ぶ、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【００１２】
実施形態７：前記多孔質膜の孔サイズの中央値または平均は約１μｍである、実施形態６に記載の方法。
【００１３】
実施形態８：前記多孔質膜の孔サイズの中央値または平均は約３μｍである、実施形態６に記載の方法。
【００１４】
実施形態９：前記多孔質膜の孔サイズの中央値または平均は約５μｍである、実施形態６に記載の方法。
【００１５】
実施形態１０：前記多孔質膜は、約１×１０５孔／ｃｍ２から最大約１×１０７孔／ｃｍ２、または約５×１０５孔／ｃｍ２から最大約５×１０６、または約１×１０５孔／ｃｍ２から最大約１×１０７孔／ｃｍ２を含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【００１６】
実施形態１１：前記多孔質膜は、約１．６×１０６孔／ｃｍ２で約１μｍ直径の平均孔サイズを含む、実施形態１０に記載の方法。
【００１７】
実施形態１２：前記多孔質膜は、約８×１０５孔／ｃｍ２で約３μｍ直径の平均孔サイズを含む、実施形態１０に記載の方法。
【００１８】
実施形態１３：前記膜はポリマー膜を含む、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【００１９】
実施形態１４：前記膜は、ナイロン膜、ナイロンメッシュ、フィルター膜、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）膜、ポリエステル膜、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）膜、延伸ポリエーテルエーテルケトン（ｅＰＥＥＫ）膜、ポリエチレン（ＰＥ）膜、ポリプロピレン（ＰＰ）膜、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜、エチルビニルアセタート（ＥＶＡ）膜、熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）膜、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜、ポリカーボネート膜及びポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）膜からなる群から選択される材料を含む、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【００２０】
実施形態１５：前記膜は、ポリエステル膜、ポリカーボネート膜またはポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）膜を含む、実施形態１４に記載の方法。
【００２１】
実施形態１６：前記圧力を印加することは、前記多孔質膜のゆがみを引き起こす、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【００２２】
実施形態１７：前記ゆがみは、約２０μｍから、または約５０μｍから、または約１００μｍから、または約５００μｍから約１ｃｍまで、または約５００ｍｍまで、または約３００ｍｍまで、または約１００ｍｍまでに及ぶ、実施形態１６に記載の方法。
【００２３】
実施形態１８：前記圧力を印加することは、一時的な圧力を印加することを含む、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【００２４】
実施形態１９：前記圧力を印加することは、圧力を約１ミリ秒から最大約１分間、または約１００ミリ秒から最大約１分間、または約１秒から最大約１分間印加することを含む、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【００２５】
実施形態２０：前記圧力を印加することは、ポートを通して前記リザーバ室の中へ圧力を印加することを含む、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【００２６】
実施形態２１：前記圧力を印加することは、前記リザーバ室が一杯で閉鎖されているときに前記リザーバ室の壁を撓ませることを含む、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【００２７】
実施形態２２：前記圧力を印加することは、前記リザーバ室の壁を通して溶液を注入することを含む、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【００２８】
実施形態２３：リザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを前記準備することは、ポートを通して前記リザーバ室に前記溶液を導入することを含む、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【００２９】
実施形態２４：リザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを前記準備することは、前記カーゴ溶液を前記リザーバにピペットで入れることを含む、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【００３０】
実施形態２５：リザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを前記準備することは、前記多孔質膜を前記リバーザ室上または内に置く前に前記リザーバ室に装填することを含む、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【００３１】
実施形態２６：リザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを前記準備することは、前記溶液を前記リザーバ室の壁を貫通する針を通して注入することを含む、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【００３２】
実施形態２７：リザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを前記準備することは、前記溶液を前記膜を通過させて前記リザーバ室に装填することを含む、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【００３３】
実施形態２８：前記カーゴは、リポソーム内にパッケージングされた天然染色体もしくは染色体フラグメント、合成染色体、細菌、合成粒子、細胞内真菌、細胞内原生動物、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ（例えば、リポフェクタミン）ならびに細胞小器官からなる群から選択される１つあるいは部分を含む、実施形態１〜２７のいずれか１つに記載の方法。
【００３４】
実施形態２９：前記カーゴは細胞核を含む、実施形態２８に記載の方法。
【００３５】
実施形態３０：前記カーゴはミトコンドリアを含む、実施形態２８に記載の方法。
【００３６】
実施形態３１：前記カーゴは染色体または染色体フラグメントを含む、実施形態２８に記載の方法。
【００３７】
実施形態３２：前記カーゴは人工染色体を含む、実施形態２８に記載の方法。
【００３８】
実施形態３３：前記カーゴは細菌を含む、実施形態２８に記載の方法。
【００３９】
実施形態３４：前記細胞は、脊椎動物細胞、真菌細胞及び酵母菌細胞からなる群から選択される、実施形態１〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【００４０】
実施形態３５：前記細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞及び無脊椎動物細胞からなる群から選択される、実施形態１〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【００４１】
実施形態３６：前記細胞は哺乳動物細胞を含む、実施形態３５に記載の方法。
【００４２】
実施形態３７：前記細胞はヒト細胞を含む、実施形態３５に記載の方法。
【００４３】
実施形態３８：前記細胞は非ヒト哺乳動物細胞を含む、実施形態３５に記載の方法。
【００４４】
実施形態３９：前記細胞はリンパ球または幹細胞を含む、実施形態３６〜３８のいずれか１つに記載の方法。
【００４５】
実施形態４０：前記細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞を含む、実施形態３９に記載の方法。
【００４６】
実施形態４１：前記細胞は分化した体細胞を含む、実施形態３６〜３８のいずれか１つに記載の方法。
【００４７】
実施形態４２：前記細胞は細胞株からの細胞を含む、実施形態１〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【００４８】
実施形態４３：前記細胞は表１に列挙される細胞株からの細胞を含む、実施形態４２に記載の方法。
【００４９】
実施形態４４：前記細胞は、ＨｅＬａ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの６０種の癌細胞株（ＮＣＩ６０）、ＥＳＴＤＡＢデータベース、ＤＵ１４５（前立腺癌）、Ｌｎｃａｐ（前立腺癌）、ＭＣＦ−７（乳癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８（乳癌）、ＰＣ３（前立腺癌）、Ｔ４７Ｄ（乳癌）、ＴＨＰ−１（急性骨髄性白血病）、Ｕ８７（膠芽腫）、ＳＨＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞、骨髄腫からクローン化される及びＳａｏｓ−２細胞（骨癌）からなる群から選択される細胞株からの細胞を含む、実施形態４２に記載の方法。
【００５０】
実施形態４５：前記細胞は、前記多孔質膜上で培養される、実施形態１〜４４のいずれか１つに記載の方法。
【００５１】
実施形態４６：前記細胞は、前記多孔質膜上で付着層として培養される、実施形態１〜４４のいずれか１つに記載の方法。
【００５２】
実施形態４７：前記細胞は、前記多孔質膜上でコンフルエンスになるまで培養される、実施形態４５〜４６のいずれか１つに記載の方法。
【００５３】
実施形態４８：前記多孔質膜は、金属薄膜または金属ナノ粒子を載せていない、実施形態１〜４７のいずれか１つに記載の方法。
【００５４】
実施形態４９：前記方法は、前記膜の表面を加熱することを含まない、実施形態１〜４８のいずれか１つに記載の方法。
【００５５】
実施形態５０：前記方法は、前記膜の表面をレーザーにより加熱することを含まない、実施形態１〜４８のいずれか１つに記載の方法。
【００５６】
実施形態５１：多孔質膜と、前記多孔質膜の片側にある容積が約５００μＬ未満のリザーバ室とを備える大きなカーゴを真核細胞に送達するためのデバイス。
【００５７】
実施形態５２：前記リザーバ室の容積は、約４０μＬから約５００μＬ、または約５０μＬから約４００μＬ、または約６０μＬから約３００μＬ、または約７０μＬから約２００μＬ、または約８０μＬから約１５０μＬ、または約１０μＬから約１００μＬまでに及ぶ、実施形態５１に記載のデバイス。
【００５８】
実施形態５３：前記リザーバ室の容積は約１００μＬである、実施形態２に記載のデバイス。
【００５９】
実施形態５４：前記多孔質膜の厚さは、約５μｍから約３０μｍ、または約５μｍから約２０μｍ、または約５μｍから約１５μｍに及ぶ、実施形態５１〜５３のいずれか１つに記載のデバイス。
【００６０】
実施形態５５：前記多孔質膜の厚さは約１０μｍである、実施形態５４に記載のデバイス。
【００６１】
実施形態５６：前記多孔質膜の孔サイズの平均または中央値は、約１００ｎｍから約２０μｍまでまたは約２０μｍまで、または約５００ｎｍから約８μｍまで、または約１μｍから約５μｍまでに及ぶ、実施形態５１〜５５のいずれか１つに記載のデバイス。
【００６２】
実施形態５７：前記多孔質膜の孔サイズの中央値または平均は約１μｍである、実施形態５６に記載のデバイス。
【００６３】
実施形態５８：前記多孔質膜の孔サイズの中央値または平均は約３μｍである、実施形態５６に記載のデバイス。
【００６４】
実施形態５９：前記多孔質膜の孔サイズの中央値または平均は約５μｍである、実施形態５６に記載のデバイス。
【００６５】
実施形態６０：前記多孔質膜は、約１×１０５孔／ｃｍ２から最大約１×１０７孔／ｃｍ２、または約５×１０５孔／ｃｍ２から最大約５×１０６、または約１×１０５孔／ｃｍ２から最大約１×１０７孔／ｃｍ２を含む、実施形態５１〜５９のいずれか１つに記載のデバイス。
【００６６】
実施形態６１：前記多孔質膜は、約１．６×１０６孔／ｃｍ２で約１μｍ直径の平均孔サイズを含む、実施形態６０に記載のデバイス。
【００６７】
実施形態６２：前記多孔質膜は、約８×１０５孔／ｃｍ２で約３μｍ直径の平均孔サイズを含む、実施形態６０に記載のデバイス。
【００６８】
実施形態６３：前記膜はポリマー膜を含む、実施形態５１〜６２のいずれか１つに記載のデバイス。
【００６９】
実施形態６４：前記膜は、ナイロン膜、ナイロンメッシュ、フィルター膜、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）膜、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）膜、延伸ポリエーテルエーテルケトン（ｅＰＥＥＫ）膜、ポリエチレン（ＰＥ）膜、ポリプロピレン（ＰＰ）膜、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜、エチルビニルアセタート（ＥＶＡ）膜、熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）膜及びポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜からなる群から選択される材料を含む、実施形態５１〜６２のいずれか１つに記載のデバイス。
【００７０】
実施形態６５：前記膜は、ポリエステル膜、ポリカーボネート膜またはポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）膜を含む、実施形態５１〜６２のいずれか１つに記載のデバイス。
【００７１】
実施形態６６：前記リザーバ室は、溶液を前記リザーバ室に導入するよう構成されたポートまたはチャネルと流体連結している、実施形態５１〜６５のいずれか１つに記載のデバイス。
【００７２】
実施形態６７：前記リザーバ室は閉鎖及び／または密閉した（例えば、リザーバからの流れは多孔質膜を通してのみ生じることができる）、実施形態５１〜６５のいずれか１つに記載のデバイス。
【００７３】
実施形態６８：リザーバ室は、前記真核細胞に送達されるカーゴを含む溶液を含有する、実施形態５１〜６５のいずれか１つに記載のデバイス。
【００７４】
実施形態６９：前記カーゴは、リポソーム内にパッケージングされた天然染色体もしくは染色体フラグメント、合成染色体、細菌、合成粒子、細胞内真菌、細胞内原生動物、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡあるいは脂質粒子ならびに細胞小器官からなる群から選択される１つあるいは部分を含む、実施形態６８に記載のデバイス。
【００７５】
実施形態７０：前記カーゴは細胞核を含む、実施形態６９に記載のデバイス。
【００７６】
実施形態７１：前記カーゴはミトコンドリアを含む、実施形態６９に記載のデバイス。
【００７７】
実施形態７２：前記カーゴは染色体または染色体フラグメントを含む、実施形態６９に記載のデバイス。
【００７８】
実施形態７３：前記カーゴは人工染色体を含む、実施形態６９に記載のデバイス。
【００７９】
実施形態７４：前記カーゴは細菌を含む、実施形態６９に記載のデバイス。
【００８０】
実施形態７５：真核細胞は、前記リザーバ室に近接する側と反対の前記多孔質膜の表面に配置される、実施形態５１〜７４のいずれか１つに記載のデバイス。
【００８１】
実施形態７６：前記細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞及び無脊椎動物細胞からなる群から選択される、実施形態７４に記載のデバイス。
【００８２】
実施形態７７：前記細胞は哺乳動物細胞を含む、実施形態７６に記載のデバイス。
【００８３】
実施形態７８：前記細胞はヒト細胞を含む、実施形態７６に記載のデバイス。
【００８４】
実施形態７９：前記細胞は非ヒト哺乳動物細胞を含む、実施形態７６に記載のデバイス。
【００８５】
実施形態８０：前記細胞はリンパ球または幹細胞を含む、実施形態７７〜７９のいずれか１つに記載のデバイス。
【００８６】
実施形態８１：前記細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞を含む、実施形態８０に記載のデバイス。
【００８７】
実施形態８２：前記細胞は分化した体細胞を含む、実施形態７７〜７９のいずれか１つに記載のデバイス。
【００８８】
実施形態８３：前記細胞は細胞株からの細胞を含む、実施形態５１〜７４のいずれか１つに記載のデバイス。
【００８９】
実施形態８４：前記細胞は表１に列挙される細胞株からの細胞を含む、実施形態８３に記載のデバイス。
【００９０】
実施形態８５：前記細胞は、ＨｅＬａ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの６０種の癌細胞株（ＮＣＩ６０）、ＥＳＴＤＡＢデータベース、ＤＵ１４５（前立腺癌）、Ｌｎｃａｐ（前立腺癌）、ＭＣＦ−７（乳癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８（乳癌）、ＰＣ３（前立腺癌）、Ｔ４７Ｄ（乳癌）、ＴＨＰ−１（急性骨髄性白血病）、Ｕ８７（膠芽腫）、ＳＨＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞、骨髄腫からクローン化される及びＳａｏｓ−２細胞（骨癌）からなる群から選択される細胞株からの細胞を含む、実施形態８３に記載のデバイス。
【００９１】
実施形態８６：前記細胞は、前記多孔質膜上で培養される、実施形態５１〜８５のいずれか１つに記載のデバイス。
【００９２】
実施形態８７：前記細胞は、前記多孔質膜上で付着層として培養される、実施形態５１〜８５のいずれか１つに記載のデバイス。
【００９３】
実施形態８８：前記細胞は、前記多孔質膜上でコンフルエンスになるまで培養される、実施形態８６〜８７のいずれか１つに記載のデバイス。
【００９４】
実施形態８９：前記多孔質膜は、金属薄膜または金属ナノ粒子を載せていない、実施形態５１〜８８のいずれか１つに記載のデバイス。
【００９５】
実施形態９０：前記方法は、前記膜の表面を加熱することを含まない、実施形態５１〜８９のいずれか１つに記載のデバイス。
【００９６】
実施形態９１：実施形態５１〜９０のいずれか１つに記載の第１のデバイスと、実施形態５１〜９０のいずれか１つに記載の第２のデバイスとを含み、前記第１のデバイス及び前記第２のデバイスが、前記第１のデバイス及び前記第２のデバイスを構成する前記リザーバ室と流体連結しているポート及び／またはチャンネルを備え、前記ポート及び／またはチャンネルは互いに流体連結しているか、あるいは前記第１のデバイス及び前記第２のデバイスが、前記第１のデバイス及び前記第２のデバイスを構成する前記リザーバ室と流体連結しているポート及び／またはチャンネルを備え、前記ポート及び／またはチャンネルは互いに流体連結していない、大きなカーゴを真核細胞に送達するためのシステム。
【００９７】
実施形態９２：前記第１のデバイス及び前記第２のデバイスは、前記第１のデバイス及び前記第２のデバイスを構成する前記リザーバ室と流体連結しているポート及び／またはチャンネルを備え、前記ポート及び／またはチャンネルは互いに流体連結している、実施形態９１に記載のシステム。
【００９８】
実施形態９３：前記第１のデバイス及び前記第２のデバイスは、前記第１のデバイス及び前記第２のデバイスを構成する前記リザーバ室と流体連結しているポート及び／またはチャンネルを備え、前記ポート及び／またはチャンネルは互いに流体連結していない、実施形態９１に記載のシステム。
【００９９】
実施形態９４：前記第１のデバイスのリザーバ室に存在するカーゴは、前記第２のデバイスのリザーバ室に存在するカーゴとは異なる、実施形態９３に記載のシステム。
【０１００】
実施形態９５：前記第１のデバイスに存在する真核細胞は、前記第２のデバイスの真核細胞と同じ種類である、実施形態９１〜９４のいずれか１つに記載のシステム。
【０１０１】
実施形態９６：前記第１のデバイスに存在する真核細胞は、前記第２のデバイスの真核細胞とは異なる、実施形態９１〜９４のいずれか１つに記載のシステム。
【０１０２】
実施形態９７：前記システムは、実施形態５１〜９０のいずれか１つに記載の第３のデバイスを備え、
前記第１のデバイス及び前記第３のデバイスが、前記第１のデバイス及び前記第３のデバイスを構成するリザーバ室と流体連結しているポート及び／またはチャンネルを備え、前記ポート及び／またはチャンネルは互いに流体連結しているか、あるいは前記第１のデバイス及び前記第３のデバイスが、前記第１のデバイス及び前記第３のデバイスを構成するリザーバ室と流体連結しているポート及び／またはチャンネルを備え、前記ポート及び／またはチャンネルは互いに流体連結していない、実施形態９１〜９６のいずれか１つに記載のシステム。
【０１０３】
定義
「カーゴ」という用語は、細胞への送達に対して本明細書中で使用される場合、細胞に送達するのが望ましい任意の部分を指す。実例となるカーゴとしては、細胞小器官、完全な染色体もしくは細菌、大きな核酸またはタンパク質コンストラクト、合成粒子及び同種のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０４】
「大きなカーゴ」という用語は、（長さ及び／もしくは幅でならびに／または直径で）約１００ｎｍから、または約５００ｎｍから、または約８００ｎｍから、または約１μｍから、または約３μｍから、または約５μｍから約２０μｍまで、または約１５μｍまで、または約１０μｍまでのサイズに及ぶカーゴを指す。特定の実施形態において、大きなカーゴは、約１００ｎｍ（例えば、脂質またはリポソーム複合体中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）から約１０μｍまで（例えば、染色体、核など）のサイズに及ぶ。
【０１０５】
「密閉された」または「閉鎖された」という用語は、密閉及び／または閉鎖されたリザーバ室に対して使用される場合、リザーバからの流出が多孔質膜を通してのみ起こり得る、またはそれが主として多孔質膜を通して起こることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】送達プロセスの一実施形態を示す概略図である。
【図２Ａ】図２Ａ及び２Ｂは、本明細書に記載されるトランスフェクションシステムのさまざまな非限定的な実施形態の略図を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ参照。
【図３】ミトコンドリア送達後の多孔質膜上のレシピエント１４３ＢＴＫ  ｒｈｏ（０）細胞を示す。送達されたＤｓＲｅｄ標識ミトコンドリアを、細胞内及び膜孔内に観察することができる。
【図４】制限培地における２週間の培養後、ｍｔＤＮＡを含まないｒｈｏ（０）細胞における大量の死滅（右）と比較して、送達されたｍｔＤＮＡを含有する首尾よくトランスフォームされた１４３ＢＴＫ  ｒｈｏ（０）は集簇を形成した（左）ことを示す。
【図５】首尾よくトランスフォームされたレシピエント１４３ＢＴＫ  ｒｈｏ（０）細胞が、ミトコンドリアドナー細胞株ＭＤＡＭＢ４５３とは同一であるが、その親細胞株１４３ＢＴＫとは異なるｍｔＤＮＡを含有することを裏づけたミトコンドリアＤＮＡ配列を示す。１４３ＢＴＫ（配列番号：１）、１４３ＢＴＫ  ｒｈｏ（０）（配列番号：２）、ＭＤＡＭＢ４５３（配列番号：３）。
【図６】本明細書に記載のアプローチを使用して８４％の細菌送達効率が得られたことを示す。送達の９時間後、ＨｅＬａ細胞は核（青）及び細胞膜（赤）が着色された。送達されたＧＦＰ細菌（緑）は、細胞質基質内で自己複製した。
【図７Ａ】図７Ａ及び７Ｂは、トランスフェクションシステムに組み込まれた複数のトランスフェクションデバイスを模式的に示す。特定の実施形態において、トランスフェクションデバイスは、システムを構成する異なるトランスフェクションデバイスのすべて、もしくは一部用の共通の装填ポート／チャンネル（図７Ａ）及び／またはシステムを構成する異なるトランスフェクションデバイスのすべて、もしくは一部用の共通のカーゴ装填チャネル／ポート（図７Ｂ）を備える。
【図７Ｂ】図７Ａ参照。
【発明を実施するための形態】
【０１０７】
さまざまな実施形態において、カーゴ、とりわけ「大きな」カーゴを細胞に送達するための改善された方法及びデバイスが本明細書中で提供される。本明細書に記載の方法及びデバイスは、以下に限定されるものではないが、単離ミトコンドリア及び細菌を含む大きなカーゴを哺乳動物細胞に前例のないスループット及び容易さで運搬する。１０５細胞への同時送達が数秒以内に達成されることが証明され、細胞生存率（＞９０％）が観察された。
【０１０８】
送達方法の実例となるが非限定的な一実施形態が図１に示される。そこに示されるとおり、レシピエント細胞（例えば、真核細胞）は、膜を貫通する孔を有する多孔質膜（例えば、１０μｍ厚のポリマー膜）上に置かれるか、またはそこで培養される。レシピエント細胞にトランスフェクションされるカーゴは溶液に入れられ、多孔質膜の反対側にあるリザーバ室に装填される。下部リザーバ室に圧力が印加されてカーゴ懸濁液を膜孔を通してレシピエント細胞の方へ送り込む。特定の実施形態において、ポリマー膜は、圧力により動かされる流れのためにわずかに変形する。加圧の直後にトランスフェクト細胞が確認できる。
【０１０９】
トランスフェクションデバイス
特定の実施形態において、本明細書に記載される方法に使用するためのトランスフェクションデバイスが提供される。特定の実例となるが非限定的な実施形態において、トランスフェクションデバイスは、リザーバ室上に配置された本明細書に記載されるとおりの多孔質膜を備える（例えば、図２Ａを参照）。
【０１１０】
図２Ａに示されるとおり、リザーバ室は、レシピエント細胞にトランスフェクションされるカーゴを含有するよう構成される。レシピエント細胞を支持するため、且つ特定の実施形態においては、それらの細胞を付着層として多孔質膜上で培養することを可能にするために多孔質膜も選択される。
【０１１１】
さまざまな実施形態において、細胞は、付着層として培養される必要はない。例えば、特定の実施形態において、細胞は、例えば、直接堆積及び／または遠心沈殿によって単に膜に吸着している。特定の実施形態において、細胞は、さまざまな付着分子を使用して膜に付着させられる（例えば、インテグリン、カドヘリン、セレクチン及びさまざまな合成リンカー（例えば、ヘテロ二官能性またはホモ二官能性ペプチドリンカー）。特定の実施形態において、細胞は、ゲルマトリックス（例えば、ゼラチン、ＨＹＤＲＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）、ＭＡＸＧＥＬ（登録商標）、コラーゲンゲル、ハイドロゲルなど）によって膜に「付着させられる」。
【０１１２】
特定の実施形態において、リザーバ室は、カーゴ溶液の導入及び／またはトランスフェクション中のリザーバ室の加圧のためのポート及び／またはチャネルを備えていてもよいが、下記で説明するとおり、そのようなポートまたはチャネルは必須ではない。
【０１１３】
実例となるが非限定的なさまざまな実施形態において、リザーバ室の容積は、約１０μＬから、または約２０μＬから、または約３０μＬから、または約４０μＬから、または約５０μＬから、または約６０μＬから、または約７０μＬから、または約８０μＬから約５００μＬまで、または約４００μＬまで、または約３００μＬまで、または約２００μＬまで、または約１００μＬまでに及ぶ。
【０１１４】
さまざまな実施形態において、多孔質膜及び／またはリザーバ室は、真核細胞及び細胞に送達されるカーゴと適合した本質的にあらゆる材料から作製される。適した材料としては、セラミック、ガラス及びプラスチックが挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態では、リザーバ室は硬質の／堅いプラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）から作製されるが、他の実施形態においては、リザーバ室は可撓性ポリマー（例えば、ＰＤＭＳまたはその他のポリマー）から作製される。
【０１１５】
上記のとおり、本トランスフェクション方法は、多孔質膜、特定の実施形態においては、可撓性多孔質膜を利用する。多種多様な材料（例えば、ナイロンまたはナイロンメッシュ、フィルター膜、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、延伸ポリエーテルエーテルケトン（ｅＰＥＥＫ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、エチルビニルアセタート（ＥＶＡ）、熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）及び同種のもの）の多孔質膜が利用可能である。特定の実施形態において、多孔質の硬質材料（例えば、多孔質セラミック、多孔質ガラスなど）も意図される。多孔質膜は、当業者に周知であり、さまざまな孔サイズで多くの製造業者（例えば、Ｐｏｒｅｘ  Ｃｏｒｐ．  フェアバーン、ジョージア州などを参照）から商業的に入手可能である。
【０１１６】
特定の実施形態において、多孔質膜の厚さは、約３μｍから、または約５μｍから、または約７μｍから約３０μｍまで、または約２５μｍまで、または約２０μｍまで、または約１５μｍまで、または約１０μｍまでに及ぶ。特定の実施形態において、多孔質膜の厚さは約１０μｍである。
【０１１７】
特定の実施形態において、多孔質膜の孔サイズの平均または中央値は、約５０ｎｍから、または約１００ｎｍから、または約２００ｎｍから、または約３００ｎｍから、または約４００ｎｍから、または約５００ｎｍから、または約６００ｎｍから、または約７００ｎｍから、または約８００ｎｍから、または約９００ｎｍから、または約１μｍから約３０μｍまで、または約２０μｍまで、または約１５μｍまで、または約１０μｍまで、または約８μｍまで、または約５μｍまでに及ぶ。特定の実施形態において、前記多孔質膜の孔サイズの中央値または平均は約１μｍまたは約３μｍまたは約５μｍである。
【０１１８】
典型的な実施形態において、膜の孔密度は、平均してその上の細胞の少なくとも半分が少なくとも１個の孔上、または少なくとも２個の孔上、または少なくとも３個の孔上、または少なくとも４個の孔上、または少なくとも５個の孔上、または少なくとも１０個の孔上に位置するよう十分に高い。特定の実施形態において、多孔質膜は、約１×１０５孔／ｃｍ２から最大約１×１０７孔／ｃｍ２、または約５×１０５孔／ｃｍ２から最大約５×１０６、または約１×１０５孔／ｃｍ２から最大約１×１０７孔／ｃｍ２を含む。特定の実施形態において、多孔質膜は、約１．６×１０６孔／ｃｍ２で約１μｍ直径の平均孔サイズまたは約８×１０５孔／ｃｍ２で約３μｍ直径の平均孔サイズを含む。
【０１１９】
本明細書に記載されるトランスフェクションデバイスの構築及びそれらを組み込むことができるマイクロ流体デバイスに使用されてもよい多くの形式、材料及びサイズスケールがある。一部の実施形態において、トランスフェクションデバイスならびに存在する場合、接続流体チャンネル及び／またはポートは、ＰＤＭＳ（またはその他のポリマー）から成り、ソフトリソグラフィを使用して作製されるが、多孔質膜は一般にそのような膜の供給業者から購入される。
【０１２０】
ＰＤＭＳは、以下に限定されるものではないが低コスト、光透過性、成形の容易さ及びエラストマーの特性を含むさまざまな理由のため本明細書に記載されるデバイスの作製に対して魅力的な材料である。ＰＤＭＳは、従来のシロキサンの化学的性質及び細胞培養の要件（例えば、低毒性、気体透過性）の両方との適合性を含む望ましい化学的特性も有する。実例となるソフトリソグラフィ法において、１つ以上のリザーバ室ならびに存在する場合、結合したポート及び／またはチャンネルを形成するために原型が作製される。この原型は、微細機械加工プロセス、フォトリソグラフィプロセスによって、または当業者に既知の任意の数の方法によって製作されてもよい。そのような方法としては、ウェットエッチング、電子ビーム真空蒸着、フォトリソグラフィ、プラズマ増強化学蒸着、分子線エピタキシー、反応性イオンエッチング及び／または化学的促進イオンビームミリングが挙げられるが、これらに限定されるものではない（Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ（１９９７）  Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，  Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，  Ｓｏｃ．  Ｐｈｏｔｏ−Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕ．  Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．；  Ｂａｒｄ  ＆  Ｆａｕｌｋｎｅｒ，  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）。
【０１２１】
作製されると、原型は前駆ポリマーに曝露され、それが、その後、硬化させられてＰＤＭＳのパターンが形成された複製品を形成する。複製品が原型から取り除かれ、形が整えられ、必要とされる場合、流体注入口が加えられる。ポリマー複製品は、任意にプラズマ（例えば、Ｏ２プラズマ）で処理され、ガラスなどの適した支持体と結合させられてもよい。Ｏ２プラズマによるＰＤＭＳの処理は、適した支持体とコンフォーマル接触させられた場合にしっかりと、不可逆的に密閉する表面を形成し、水溶液と併せて使用される場合にマイナスに帯電した流体チャネル壁を形成する利点を有する。こうした固定された電荷は、デバイスを通して流体を移動させるために使用することができる動電学的な送り込みを助ける。液滴形成デバイスの上記の作製はＰＤＭＳを使用するが、数々の他の材料がこのポリマーと置き換えられてもよく、またはこのポリマーと共に使用されてもよいことが認識されるべきである。例としては、ポリオレフィンプラストマー、ペルフルオロポリエチレン、ポリウレタン、ポリイミド及び架橋フェノール／ホルムアルデヒドポリマー樹脂が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１２２】
トランスフェクションデバイス操作
特定の実施形態において、本明細書に記載される方法は、多孔質膜の片側に配置された「レシピエント細胞」を準備することと、多孔質膜の反対側にあるリザーバ室に配置された溶液中のカーゴを準備することと、カーゴを多孔質膜を構成する孔を通過させるのに十分な圧力をリザーバ室に印加することとを含み、カーゴは細胞膜を通って前記細胞に入る。特定の実施形態において、リザーバ室の加圧には、多孔質膜の変形が伴う。
【０１２３】
カーゴ含有溶液は、いくつかの都合がよい任意の方法によってリザーバ室に導入することができる。例えば、実例となるが非限定的な一実施形態において、カーゴ含有溶液は、ポートまたはチャネルを通ってリザーバ室に導入される（例えば、図２Ａを参照）。
【０１２４】
実例となるが非限定的な別の実施形態において、リザーバ室は、連続するチャネルの一部として作製される。チャネルの流出部は、バルブを伴って構成されてもよい。カーゴ溶液は、リザーバ室へ入り、そこを通って流される。望ましい場合、バルブが閉められ、リザーバーチャネルを密封し、圧力水頭が維持されて高い圧力をもたらすことができ、またはリザーバ室はさらに加圧されてもよい。１種のカーゴを満たしたチャネルに沿って複数のリザーバーチャネルが構成される場合、バルブは特に有用である（例えば、図７Ｂを参照）。
【０１２５】
実例となるが非限定的な別の実施形態において、カーゴ含有溶液は、リザーバ室の上または中に（例えば、細胞を載せている）多孔質膜を置く前にリザーバ室に装填される。
【０１２６】
実例となるが非限定的な別の実施形態において、カーゴ含有溶液は、リザーバ室の壁を貫通する針によりリザーバ室へ注入される。そのような実施形態において、カーゴ溶液の導入のためのポートまたはチャネルは容易に省くことができる。
【０１２７】
実例となるが非限定的な別の実施形態において、カーゴ含有溶液を単に多孔質膜を通過させてリザーバ室に装填してもよい。
【０１２８】
リザーバ室はまた、いくつかの任意の方法によって加圧されてもよい。例えば、多孔質リザーバ室がチャネルまたはポートと流体連結している場合、ポンプまたは重力送りを使用してそのポートに流体または気体圧力が印加されてもよい。
【０１２９】
実例となる別の実施形態において、リザーバ室が密閉され、例えば、手動により、単にリザーバ室の１つ以上の壁を内側へ変形させること、マイクロマニピュレーターを使用すること、多孔質リザーバ室が配置されている容器内に圧力をかけること、電気機械アクチュエータ使用することなどによって圧力が印加されてもよい。
【０１３０】
実例となる別の実施形態において、リザーバ室が密閉され、カーゴ含有溶液または付加的な溶液のいずれかをリザーバーチャネルに例えば、シリンジ、シリンジポンプもしくはその他の注入デバイスを使用して注入することによって圧力が印加されてもよい。
【０１３１】
特定の実施形態において、圧力は一時的に印加される。そのような例のさまざまな実施形態において、約１ミリ秒から、または約１０ミリ秒から、または約２０ミリ秒から、または約５０ミリ秒から、または約８０ミリ秒から、または約１００ミリ秒から、または約５００ミリ秒から、または約１秒から、または約５秒から、または約１０秒から約２０秒まで、または約３０秒まで、または約４０秒まで、または約５０秒まで、または約１分まで、または約１．５分まで、または約２分まで、または約２．５分まで、または約５分まで、または約１０分までに及ぶ時間、圧力が印加される。特定の実施形態において、圧力は、約１００ミリ秒から約１分までに及ぶ時間印加される。
【０１３２】
細胞は標準的な方法を使用して多孔質マトリックスにつけられる。一般に、細胞は、多孔質マトリックス上で培養されてもよい。培養は、トランスフェクションデバイス中で行われてもよく、あるいは、別々に行われ、細胞を載せている多孔質マトリックスがその後、トランスフェクションデバイスに移されてもよい。特定の実施形態において、細胞は付着層として培養される。特定の実施形態において、細胞は、トランスフェクションの前または後のいずれかにコンフルエンスになるなで培養される。
【０１３３】
前述の操作の方法は、実例となる、非限定的なものである。本明細書において提供される教示を使用して当業者は、特定の細胞及び／またはカーゴの種類に適用させるためにトランスフェクション方法及びデバイスを慣行的に最適化することができる。
【０１３４】
トランスフェクションシステム
特定の実施形態において、複数のトランスフェクションデバイスは、トランスフェクションシステムに連結される。かかる実施形態において、各トランスフェクションデバイスは、異なるカーゴを各デバイスに存在する細胞に充填する／トランスフェクトするよう構成されてもよい。したがって、例えば、特定の実施形態において、単一のシステムは、そのシステムを構成する異なるトランスフェクションデバイス用の異なる装填ポート／チャンネルを備えてもよい（例えば、図７Ａを参照）。あるいは、システムを構成する各トランスフェクションデバイスは、その他の装填手段を使用して異なるカーゴが装填されてもよい（例えば、本明細書に記載されるとおり）。
【０１３５】
特定の実施形態において、単一のシステムは、そのシステムを構成する異なるトランスフェクションデバイス用の共通の装填ポート／チャンネルを備えてもよい（例えば、図７Ａを参照）。したがって、システムを構成するトランスフェクションデバイスのすべて、または一部が共通のカーゴ装填チャネル／ポートを共有してもよい（例えば、図７Ｂを参照）。異なる細胞が、共通のチャネル上の各デバイスを構成する多孔質膜上で培養されてもよく、それにより共通のカーゴによる異なる細胞種のトランスフェクションを容易にする。
【０１３６】
特定の実施形態において、こうした構成は、単一のシステムにおいて組み合わされてもよく、それにより、共通のカーゴ装填チャネル／ポートを共有するデバイスの部分及び別々のカーゴ装填チャンネル／ポートを有するデバイスの部分を提供する。
【０１３７】
当然のことながら、これらの構成は、実例となる、非限定的なものである。本明細書において提供される教示を使用して、多数の他の構成が当業者に利用可能であろう。
【０１３８】
モジュラーシステム
特定の実施形態において、本明細書に記載されるトランスフェクションプラットフォームは、容易に既存の設備と一体化させることができる「モジュール」として提供される。例えば、特定の実施形態において、トランスフェクション支持体は、既存の顕微鏡に付け加えることができるか、または顕微鏡のステージに取って代わることができる形式で提供される。特定の実施形態において、支持体は、倒立顕微鏡（例えば、Ｚｅｉｓ倒立顕微鏡）のｘ／ｙ／ｚステージに取って代わるよう構成される。
【０１３９】
特定の実施形態において、トランスフェクション支持体はマイクロ流体システム（例えば、ラブオンチップシステム）として及び／またはマイクロ流体システムと一体化させることができるモジュールとして提供される。
【０１４０】
送達可能な材料（カーゴ）
本明細書に記載の方法及びデバイスを使用して本質的にあらゆる所望の材料を細胞に送達することが可能であると考えられる。そのような材料としては、核酸、タンパク質、細胞小器官、薬物送達粒子、プローブ、標識などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。複数の実施形態において、カーゴは、天然染色体または染色体フラグメント、合成染色体、細菌、合成粒子、細胞内真菌（例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ，Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ，Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓなど）、細胞内原生動物（例えば、アピコンプレックス門（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属の種、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、トリパノソーマ科（例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属の種、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉなど）及び同種のもの）ならびに細胞小器官（例えば、核、核小体、ミトコンドリア、クロロプラスト、リボソーム、リソソーム及び同種のもの）からなる群から選択される１つ以上の部分を含む。
【０１４１】
特定の実施形態において、カーゴは、核及び／またはクロロプラスト及び／または核小体及び／またはミトコンドリアを含む。
【０１４２】
特定の実施形態において、カーゴは、完全な染色体または染色体フラグメントまたは合成染色体（例えば、ＢＡＣ（細菌人工染色体））を含む。本明細書に記載のデバイス及び方法は、完全なもしくは部分的な天然染色体または合成染色体を送達するために使用することができると考えられる。ＢＡＣと同様に、従前の方法では大半の細胞種に形質導入することができない大きな染色体または染色体フラグメントを、例えば、とりわけ、ヒトトリソミー障害（例えば、ダウン症候群及びクラインフェルター症候群）のモデルを確立するために本明細書に記載の方法によって細胞に運搬することができる。
【０１４３】
特定の実施形態において、カーゴは、以下に限定されるものではないが、さまざまな細菌、真菌及び原生動物を含む細胞内病原体を含む。さまざまな無生物粒子のトランスフェクションも考えられる。そのような粒子としては、量子ドット、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）粒子、ミクロビーズ及び同種のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１４４】
これらのカーゴは実例となる、非限定的なものであることが意図されることが認識される。本明細書において提供される教示を使用して、多数のその他のカーゴ、とりわけ大きなカーゴが細胞にトランスフェクションされてもよい。
【０１４５】
細胞種
本明細書に記載の方法及びデバイスは、細胞膜を有する本質的にあらゆる細胞と共に使用することができると考えられる。したがって、さまざまな実施形態において、本明細書に記載の方法及びデバイスを使用して本質的にあらゆる真核細胞をトランスフェクションすることができると考えられる。したがって、例えば、本明細書に記載される方法を使用してトランスフェクションすることができる適した細胞としては、脊椎動物細胞、真菌細胞及び酵母菌細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞または無脊椎動物細胞である。
【０１４６】
一般的に、本明細書に記載される方法は、ヒト哺乳動物細胞及び非ヒト哺乳動物細胞（例えば、非ヒト霊長類、イヌ科動物、ウマ科動物、ネコ科動物、ブタのような動物、ウシ科動物、有蹄動物、ウサギ目の動物及び同種のもの）の両方を含む哺乳動物細胞を用いて実施されることになる。
【０１４７】
特定の実施形態において、トランスフェクト細胞は、幹細胞または分化が方向付けられた前駆細胞を含む。特定の実施形態において、幹細胞としては、成体幹細胞、胎生幹細胞、臍帯血幹細胞、酸による先祖帰り幹細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が挙げられる。
【０１４８】
特定の実施形態において、細胞はリンパ球またはその他の分化した体細胞を含む。
【０１４９】
特定の実施形態において、細胞は、細胞株からの細胞を含む。適した細胞株としては、例えば、ＨｅＬａ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの６０種の癌細胞株（ＮＣＩ６０）、ＥＳＴＤＡＢデータベース、ＤＵ１４５（前立腺癌）、Ｌｎｃａｐ（前立腺癌）、ＭＣＦ−７（乳癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８（乳癌）、ＰＣ３（前立腺癌）、Ｔ４７Ｄ（乳癌）、ＴＨＰ−１（急性骨髄性白血病）、Ｕ８７（膠芽腫）、ＳＨＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞、骨髄腫からクローン化される、Ｓａｏｓ−２細胞（骨癌）、及び同種のものが挙げられる。
【０１５０】
特定の実施形態において、適した細胞株としては、表１に列挙される細胞株が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１５１】
さまざまな実施形態において、細胞は、多孔質膜上で培養される（例えば、１時間以上、または２時間以上または４時間以上、または６時間以上または１２時間以上、または１日以上、または２日以上、または３日以上、または４日以上、または５日以上、または６日以上、または１週間以上、または２週間以上。
【表１Ａ】
2020062049.tif 000002
【表１Ｂ】
2020062049.tif 000003
【表１Ｃ】
2020062049.tif 000004
【表１Ｄ】
2020062049.tif 000005
【表１Ｅ】
2020062049.tif 000006
【表１Ｆ】
2020062049.tif 000007
【表１Ｇ】
2020062049.tif 000008
【０１５２】
当然のことながら、前述の細胞種は、実例となる、非限定的なものであることが意図される。多数の他の真核細胞種が本明細書に記載の方法及びデバイスに容易に使用することができることが認識されるであろう。
キット。
【実施例】
【０１５３】
以下の実施例は、説明するために提供されるものであって、特許請求される発明を限定するために提供されるものではない。
【０１５４】
実施例１  多孔質支持体上の細胞への大きなカーゴの送達
本発明者らは、単離された機能するミトコンドリアのｍｔＤＮＡ枯渇ｒｈｏ（０）細胞への送達を実演し、ドナー細胞ミトコンドリアのゲノムを含有するトランスフォームされたｒｈｏ（０）細胞株を得た。安定してトランスフォームされたトランスミトコンドリア細胞株を得る発生頻度は約１０−４であり、これは各送達実験の多数のコロニーに対応する。実質的に、トランスミトコンドリア細胞株が毎回得られることになる。送達プロセスを図１に示す。レシピエント細胞を、膜を貫通する孔（１．６×１０６孔／ｃｍ２で１μｍ直径の孔または８×１０５孔／ｃｍ２で３μｍの孔）を有する１０μｍ厚のポリマー膜上で培養した。ドナー細胞からのミトコンドリアを単離し、ミトコンドリア懸濁液（タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍＬ）をポリマー膜の反対側にあるリザーバ室に装填した。特定の実施形態において、本方法をポリエステル、ポリカーボネート及びポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）膜を使用して試験した。リザーバ室の容量は１００μＬである。下部リザーバ室に一時的な圧力を印加して、ミトコンドリア懸濁液を膜孔を通してレシピエント細胞の方へ送り込む。圧力により動かされた流れのためポリマー膜はわずかに変形し、送達後にレシピエント細胞及び膜孔内でミトコンドリア及びミトコンドリア凝集体が観察された（図３）。
【０１５５】
送達の２４時間後に細胞を回収し、送達されたミトコンドリアを含有する成功した形質転換細胞を選択するために制限培地で培養した（図４）。Ｄ−ループ高頻度可変領域のミトコンドリアＤＮＡの直接配列決定は、形質転換細胞コロニーが、送達されたドナー細胞ミトコンドリアから生じたｍｔＤＮＡを含有していたことをさらに裏づけた（図５）。
【０１５６】
ミトコンドリア送達効率を比較するために、以下の実験も行った：
（Ａ）１００μＬのミトコンドリア懸濁液を多孔質膜上で培養されるレシピエント細胞に添加し、２４時間コインキュベートした；及び
（Ｂ）１００μＬのミトコンドリア懸濁液を多孔質膜上に回転させてつけた後、レシピエント細胞を接種し、２４時間インキュベートした。
【０１５７】
表２は、これらの実験からの形質転換細胞コロニーの数及び形質転換細胞発生頻度を列記する。方法（Ａ）及び（Ｂ）を使用して生存可能なコロニーは得られなかった。
【表２】
2020062049.tif 000009
【０１５８】
本発明の送達方法を使用して、本発明者らは、異なるミトコンドリアゲノムを用いて再現性よくいくつかのトランスミトコンドリア細胞株を形成した。この結果を表３に概要を示す。
【表３】
2020062049.tif 000010
【０１５９】
細菌の送達を実証するために、非食細胞で細菌を効率的に内部移行しないＨｅＬａ細胞を、３μｍの孔を有するポリマー膜上で培養した。１０１０細菌／ｍＬのＧＦＰ  Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ細菌懸濁液をリザーバ室に装填した。流体の送り込み及び細菌送達に続いて、細胞を高濃度の抗生物質（１０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン）で３０分間処理して細胞外細菌を死滅させた。インキュベーションの９時間後、細胞質基質内で自己複製しているＧＦＰ細菌によってわかるとおり８４％のＨｅＬａ細胞が細胞内細菌を含有する（図６）。
【０１６０】
当然のことながら、本明細書に記載される例及び実施形態は、説明の目的のためのものに過ぎず、それを鑑みさまざまな改変または変更が当業者に示されることになるが、それらは本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれるべきである。本明細書中で引用されたすべての刊行物、特許及び特許出願は、あらゆる目的のためにその全体を参照により本明細書に組み込んだものとする。
【図１】
2020062049.tif 000011
【図２Ａ】
2020062049.tif 000012
【図２Ｂ】
2020062049.tif 000013
【図３】
2020062049.tif 000014
【図４】
2020062049.tif 000015
【図５】
2020062049.tif 000016
【図６】
2020062049.tif 000017
【図７Ａ】
2020062049.tif 000018
【図７Ｂ】
2020062049.tif 000019
【配列表】
2020062049000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月14日(2020.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大きなカーゴを真核細胞に送達する方法であり、前記方法は、
多孔質膜の片側に配置された前記細胞を準備することと、
前記多孔質膜の反対側にあるリザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを準備することと、
前記カーゴを前記多孔質膜を構成する孔を通過させるのに十分な圧力を前記リザーバ室に印加することとを含み、前記カーゴは細胞膜を通って前記細胞に入る、前記方法。
【請求項２】
前記リザーバ室の容積は、約１０μＬから約５００μＬまで、または約４０μＬから約５００μＬまで、または約５０μＬから約４００μＬまで、または約６０μＬから約３００μＬまで、または約７０μＬから約２００μＬまで、または約８０μＬから約１５０μＬまで、または約１０μＬから約１００μＬまでに及ぶ、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多孔質膜の厚さは、約５μｍから約３０μｍ、もしくは約５μｍから約２０μｍ、もしくは約５μｍから約１５μｍに及び；及び／または
前記多孔質膜の孔サイズの平均もしくは中央値は、約１００ｎｍから約２０μｍまでもしくは約２０μｍまで、もしくは約５００ｎｍから約８μｍまで、もしくは約１μｍから約５μｍまでに及び：及び／または
前記多孔質膜は、約１×１０５孔／ｃｍ２から最大約１×１０７孔／ｃｍ２、もしくは約５×１０５孔／ｃｍ２から最大約５×１０６、もしくは約１×１０５孔／ｃｍ２から最大約１×１０７孔／ｃｍ２を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記膜はポリマー膜を含み；並びに／または
前記膜は、ナイロン膜、ナイロンメッシュ、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）膜、ポリエステル膜、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）膜、延伸ポリエーテルエーテルケトン（ｅＰＥＥＫ）膜、ポリエチレン（ＰＥ）膜、ポリプロピレン（ＰＰ）膜、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜、エチルビニルアセタート（ＥＶＡ）膜、熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）膜、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜、ポリカーボネート膜及びポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）膜からなる群から選択される材料を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記圧力を印加することは、前記多孔質膜のゆがみを引き起こす、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ゆがみは、約２０μｍから、または約５０μｍから、または約１００μｍから、または約５００μｍから約１ｃｍまで、または約５００ｍｍまで、または約３００ｍｍまで、または約１００ｍｍまでに及ぶ、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記圧力を印加することは、一時的な圧力を印加することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記圧力を印加することは、ポートを通して前記リザーバ室の中へ圧力を印加することを含み；または
前記圧力を印加することは、前記リザーバ室が一杯で閉鎖されているときに前記リザーバ室の壁を撓ませることを含み；または
前記圧力を印加することは、前記リザーバ室の壁を通して溶液を注入することを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
リザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを準備することは、ポートを通して前記リザーバ室に前記溶液を導入することを含み；または
リザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを準備することは、前記カーゴ溶液を前記リザーバにピペットで入れることを含み；または
リザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを準備することは、前記多孔質膜を前記リバーザ室上もしくは内に置く前に前記リザーバ室に装填することを含み；または
リザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを準備することは、前記溶液を前記リザーバ室の壁を貫通する針を通して注入することを含み；または
リザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを準備することは、前記溶液を前記膜を通過させて前記リザーバ室に装填することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記カーゴは、天然染色体もしくは染色体フラグメント、合成染色体、細菌、合成粒子、細胞内真菌、細胞内原生動物、リポソーム内にパッケージングされたＤＮＡ及び／またはＲＮＡ（例えば、リポフェクタミン）ならびに細胞小器官からなる群から選択される１つあるいは部分を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞は、脊椎動物細胞、真菌細胞及び酵母菌細胞からなる群から選択され；または
前記細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞及び無脊椎動物細胞からなる群から選択され；または
前記細胞はリンパ球もしくは幹細胞を含み；または
前記細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞は、吸着、接着分子、遠心力及びゲルマトリックスの１つ以上によって前記多孔質膜に付着させられ；または
前記細胞は、前記多孔質膜上で培養され；または
前記細胞は、前記多孔質膜上で付着層として培養される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
多孔質膜と、
前記多孔質膜の片側にある容積が約５００μＬ未満のリザーバ室と
を備える大きなカーゴを真核細胞に送達するためのデバイス。
【請求項１４】
前記多孔質膜の厚さは、約５μｍから約３０μｍ、もしくは約５μｍから約２０μｍ、もしくは約５μｍから約１５μｍに及び；並びに／または
前記多孔質膜の孔サイズの平均もしくは中央値は、約１００ｎｍから約２０μｍまでもしくは約２０μｍまで、もしくは約５００ｎｍから約８μｍまで、もしくは約１μｍから約５μｍまでに及び；並びに／または
前記多孔質膜は、約１×１０５孔／ｃｍ２から最大約１×１０７孔／ｃｍ２、もしくは約５×１０５孔／ｃｍ２から最大約５×１０６、もしくは約１×１０５孔／ｃｍ２から最大約１×１０７孔／ｃｍ２を含む、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記膜はポリマー膜を含み；または
前記膜は、ナイロン膜、ナイロンメッシュ、フィルター膜、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）膜、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）膜、延伸ポリエーテルエーテルケトン（ｅＰＥＥＫ）膜、ポリエチレン（ＰＥ）膜、ポリプロピレン（ＰＰ）膜、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜、エチルビニルアセタート（ＥＶＡ）膜、熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）膜及びポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜からなる群から選択される材料を含み；または
前記膜は、ポリエステル膜、ポリカーボネート膜もしくはポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）膜を含む、請求項１３または１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記リザーバ室は、溶液を前記リザーバ室に導入するよう構成されたポートもしくはチャネルと流体連結している；または
前記リザーバ室は閉鎖及び／もしくは密閉した（例えば、前記リザーバからの流れは前記多孔質膜を通してのみ生じることができる）、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１７】
リザーバ室は、前記真核細胞に送達されるカーゴを含む溶液を含有する、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８】
真核細胞は、前記リザーバ室に近接する側と反対の前記多孔質膜の表面に配置される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記細胞は、前記多孔質膜上で培養され；及び／または
前記細胞は、前記多孔質膜上で付着層として培養され；及び／または
前記細胞は、前記多孔質膜上でコンフルエンスになるまで培養される、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２０】
請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の第１のデバイスと、
請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の第２のデバイスと
を含み、
前記第１のデバイス及び前記第２のデバイスが、前記第１のデバイス及び前記第２のデバイスを構成する前記リザーバ室と流体連結しているポート及び／またはチャンネルを備え、前記ポート及び／またはチャンネルは互いに流体連結しているか、あるいは前記第１のデバイス及び前記第２のデバイスが、前記第１のデバイス及び前記第２のデバイスを構成する前記リザーバ室と流体連結しているポート及び／またはチャンネルを備え、前記ポート及び／またはチャンネルは互いに流体連結していない、大きなカーゴを真核細胞に送達するためのシステム。
【外国語明細書】
2020062049000001.pdf