(57)【要約】      （修正有）【課題】一態様において、ポリアクリルアミドゲルの処理方法であって、透明性が維持され、保存可能で、かつ、再度ゲル状態に戻すことが可能な乾燥ゲルを得ることができる処理方法を提供する。【解決手段】一態様において、ポリアクリルアミドゲルの処理方法であって、（１）ポリアクリルアミドゲルを３０％―５０％アルコール水溶液に浸漬する工程、（２）前記工程（１）後のゲルを乾燥させ、変形し硬化した乾燥ゲルを得る工程、及び（３）前記工程（２）後の変形した乾燥ゲルを加熱して軟化させ、該変形を修正する工程に関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアクリルアミドゲルの処理方法であって、
（１）ポリアクリルアミドゲルを３０％―５０％アルコール水溶液に浸漬する工程、
（２）前記工程（１）後のゲルを乾燥させ、変形し硬化した乾燥ゲルを得る工程、及び
（３）前記工程（２）後の変形した乾燥ゲルを加熱して軟化させ、該変形を修正する工程、を含む、方法。
【請求項２】
処理対象のポリアクリルアミドゲルは、電気泳動、染色、及び脱色の後のポリアクリルアミドゲルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アルコール水溶液は、実質的に、糖類、糖アルコール、及び水溶性高分子を含有しない、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記加熱の温度は８０℃―１００℃である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の処理方法を施された乾燥ポリアクリルアミドゲル。
【請求項６】
電気泳動及び染色後のポリアクリルアミドゲルの保存方法であって、前記ゲルを請求項１から４のいずれかに記載の処理方法により乾燥ゲルとすることを含む、保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ポリアクリルアミドゲルの処理の方法、及び該処理を施された乾燥ポリアクリルアミドゲルに関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲルを用いた電気泳動(gel sieving electrophoresis)は、タンパク質や核酸の分離・分析に汎用されている技術である。タンパク質に対しては、ポリアクリルアミドゲルの架橋度を、例えば、４〜２０％としたポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)が最も多用されている。
電気泳動後のゲル状態のポリアクリルアミドゲルスラブは脆く、そのまま長期間保存することが困難であるため、ゲルスラブを乾燥させて保存する方法が検討されてきた。
【０００３】
特許文献１は、電気泳動後のポリアクリルアミドゲルを８０％エタノールに浸漬した後に乾燥させる乾燥処理方法を開示する。この方法によると、ゲルは不透明白色になる。
特許文献２は、電気泳動後のポリアクリルアミドゲルを半透膜フィルムで押さえて乾燥させる方法において、半透膜フィルムで押させる前に、糖類、C4以上の糖アルコール及び水溶性ポリマーから選ばれる１種又は２種以上を含む水溶液でゲル中の溶液成分を置換する方法を開示する。該方法によれば、ゲルをひび割れなく透明性を維持しつつゲルを乾燥できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１−１４７３５６号公報
【特許文献２】特開平９−５４０６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示は、一態様において、ポリアクリルアミドゲルの処理方法であって、透明性が維持され、保存可能で、かつ、再度ゲル状態に戻すことが可能な乾燥ゲルを得ることができる処理方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、一態様において、ポリアクリルアミドゲルの処理方法であって、
（１）ポリアクリルアミドゲルを３０％―５０％アルコール水溶液に浸漬する工程、
（２）前記工程（１）後のゲルを乾燥させ、変形し硬化した乾燥ゲルを得る工程、及び
（３）前記工程（２）後の変形した乾燥ゲルを加熱して軟化させ、該変形を修正する工程、を含む、方法に関する。
また、本開示は、その他の一態様において、本開示に係るポリアクリルアミドゲルの処理方法を施された乾燥ポリアクリルアミドゲルに関する。
【発明の効果】
【０００７】
本開示に係る処理方法によれば、一又は複数の実施形態において、ポリアクリルアミドゲルを、透明性が維持され、保存可能で、かつ、再度ゲル状態に戻すことが可能な乾燥ゲルとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、乾燥中に変形した乾燥ポリアクリルアミドゲル（透明性を維持している）の一例の写真である。
【図２】図２は、変形した乾燥ゲルを板状に成形した後の乾燥ポリアクリルアミドゲル（透明性を維持している）の一例の写真である。
【図３】図３は、従来の方法（特許文献１の方法）により得られた、不透明白色を呈した乾燥ポリアクリルアミドゲルの一例の写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［処理対象のポリアクリルアミドゲル］
本開示に係る処理方法の処理対象であるポリアクリルアミドゲルは、一又は複数の実施形態において、タンパク質を含む試料の電気泳動法（ＰＡＧＥ）に用いられるゲルが挙げられ、その他の一又は複数の実施形態において、電気泳動後のポリアクリルアミドゲル、電気泳動後に染色されたポリアクリルアミドゲル、又は、電気泳動後に染色されさらに脱色されたポリアクリルアミドゲルが挙げられる。
処理対象であるポリアクリルアミドゲルの形状は、一又は複数の実施形態において、一般的なタンパク質の電気泳動法に用いられる板状（スラブ型）のほか、ディスク型、スティック型などが挙げられる。
ポリアクリルアミドゲルのアクリルアミドの濃度は特に制限されず、例えば、４〜２０質量％が挙げられる。
スラブ型のゲルの場合、厚みとしては、例えば、０．５−３ｍｍが挙げられる。
【００１０】
電気泳動法の種類としては、例えば、従来公知の電気泳動、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)、ドデシル硫酸ナトリウムを添加したポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)、オファーレルの二次元電気泳動法、ＲＦＨＲ二次元電気泳動法（特公平６−４１９３３）等が挙げられる。
【００１１】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のタンパク質の染色には、代表的には、色素染色法、銀染色法、蛍光染色法の３つが利用されるが、処理対象のポリアクリルアミドゲルもこれらの染色方法で染色されたものであってもよい。これらの中でも、最も一般的な染色方法は、色素染色法であって、その中でも、クーマシー（商標名）ブリリアントブルー（Coomassie(R) Brilliant Blue：以下、ＣＢＢともいう）という色素を用いた方法が最も主流である。
なお、本開示において、特に言及しない場合、電気泳動後の染色の工程には、通常行われる脱色の工程も含まれうる。
【００１２】
したがって、本開示に係る処理方法の処理対象であるポリアクリルアミドゲルは、一又は複数の実施形態において、タンパク質の電気泳動法に用いられ、タンパク質の染色、及び、ゲルの脱色が行われたゲルである。
【００１３】
［アルコール水溶液］
処理対象のポリアクリルアミドゲルは、３０％―５０％アルコール水溶液に浸漬される。
前記アルコールとしては、特に制限されないが、エタノール、メタノール、プロパノールなどが挙げられるが、取り扱いの点等から、エタノールが好ましい。
アルコール水溶液におけるアルコール濃度としては、ポリアクリルアミドゲルの透明性を維持する点から、３０％−５０％であって、３５％−４５％が好ましく、３７％−４３％がより好ましく、３９％−４１％がさらに好ましい。
アルコール水溶液は、一又は複数の実施形態において、実質的に、糖類、糖アルコール、及び水溶性高分子を含有しない。本開示において「実質的に含有しない」とは、一又は複数の実施形態において、本開示に係る処理方法の効果に影響を及ぼさない範囲をいい、あるいは、１質量％未満、０．１質量％未満、０．０１質量％未満、検出限界以下、若しくは０質量％の含有量をいう。
浸漬に使用するアルコール水溶液の量としては、特に制限されないが、乾燥ポリアクリルアミドゲルの透明性維持と保存安定性の点から、一又は複数の実施形態において、16x13.5x0.2 cm3のゲル当たり３００ｍL以上が好ましく、４００ｍL以上がより好ましく、４５０ｍL以上がさらに好ましい。上限は特に制限されないが、例えば、１０００ｍL以下が挙げられる。
浸漬時間は、乾燥ポリアクリルアミドゲルの透明性維持と保存安定性の点から、一又は複数の実施形態において、少なくともゲルの大きさが浸漬前よりも縮小するまで行うことが好ましい。浸漬時間は、一又は複数の実施形態において、３時間以上、４時間以上、５時間以上、又は６時間以上である。上限は特に制限されないが、例えば、１２時間以下又は１０時間以下が挙げられる。
したがって、本開示に係るポリアクリルアミドゲルの処理方法は、「（１）ポリアクリルアミドゲルを３０％―５０％アルコール水溶液に、少なくともゲルのサイズが縮小する変化が生じるまで、浸漬する工程」を含む。
この（１）の工程では、ポリアクリルアミドゲルは、一又は複数の実施形態において、ゲルの透明性を維持できる。
【００１４】
［乾燥］
上記（１）の工程の後、アルコール水溶液から取り出されたポリアクリルアミドゲルを乾燥させる。
乾燥は、一又は複数の実施形態において、そのまま室温で風乾することが挙げられる。その他の一又は複数の実施形態において、乾燥装置を使用してもよい。
この乾燥において、反り、うねり、ゆがみ、亀裂、又はこれらの組み合わせなどの変形がゲルに生じうる。
乾燥は硬化するまで続ける。乾燥時間は、硬化するまで続ければよく、限定されないが、一又は複数の実施形態において、２ｍｍ厚のゲルの室温風乾の場合、２〜３日が挙げられる。
乾燥後、透明性が維持され、硬化した、乾燥ポリアクリルアミドゲルを得ることができる。
したがって、本開示に係るポリアクリルアミドゲルの処理方法は、上記（１）の工程加え、「（２）前記工程（１）後のゲルを乾燥させ、変形し硬化した乾燥ゲルを得る工程」を含む。
【００１５】
［成形］
上記（２）の工程で得られた乾燥ゲルの変形は、該乾燥ゲルを加熱して軟化させ、温度が下がり再び硬化するまでの間に修正できる。
例えば、もともとスラブ型のポリアクリルアミドゲルの場合に、反り、うねり、歪み、亀裂などが起こった場合、加熱軟化をさせたのち、元のスラブ型（板状、シート状）に成形することができる。
乾燥ポリアクリルアミドゲルを軟化させる温度としては、一又は複数の実施形態において、８０℃―１００℃が挙げられる。
このような加熱軟化では、ゲルの透明性は維持され、例えば、不透明な白色を呈することはない。
加熱方法は特に制限されないが、一又は複数の実施形態において、８０℃―１００℃の水の水槽を用いて、乾燥ゲルが濡れないように防水の袋（例えば、ポリ袋など）を使用するなどして間接的に加熱すること（湯煎）が挙げられる。
したがって、本開示に係るポリアクリルアミドゲルの処理方法は、上記（１）及び（２）の工程加え、「（３）前記工程（２）後の変形した乾燥ゲルを加熱して軟化させ、該変形を修正する工程」を含みうる。
【００１６】
前記（３）の工程の成形（変形の修正）の作業により、例えば、乾燥ポリアクリルアミドゲルの表面に防水袋に起因するシワ模様が残る場合がある。その場合、該乾燥ゲルを固めの樹脂シート（例えば、PETシート）で挟みこみ、再度、加熱して軟化し、PETシートの両面から加圧しながら冷却硬化させることでシワを取ることができる。
【００１７】
本開示に係るポリアクリルアミドゲルの処理方法によれば、透明性が維持された乾燥ポリアクリルアミドゲルを得ることができる。
したがって、本開示は、一態様において、本開示に係るポリアクリルアミドゲルの処理方法で得られた乾燥ポリアクリルアミドゲルに関する。
このように得られた乾燥ポリアクリルアミドゲルは、一又は複数の実施形態において、乾燥前のゲルの各辺がほぼ１／２に縮小したサイズである。
本開示に係る乾燥ポリアクリルアミドゲルは、透明性が維持されたまま、例えば、２０年以上、安定に保存できる。
したがって、本開示は、一態様において、電気泳動及び染色後のポリアクリルアミドゲルの保存方法であって、前記ゲルを本開示に係る処理方法によって乾燥ゲルとすることを含む、保存方法に関する。
本開示に係る乾燥ポリアクリルアミドゲルは、乾燥に起因する反り、うねり、歪み、亀裂などの変形も修正でき、また、透明性が維持されるので、例えば、乾燥後にデンシトメーターなどによる解析が可能である。
【００１８】
［再ゲル化］
本開示に係る乾燥ポリアクリルアミドゲルは、ゲル状態に戻すことができる。
再ゲル化の方法としては、工程（１）で用いたアルコール水溶液に浸漬することが挙げられる。
ゲル状態に戻すことで、例えば、電気泳動されたタンパク質スポットからタンパク質の回収が容易になる。
乾燥ゲルからゲル状態としたゲルは、再度、上述の方法で乾燥ゲルとすることができる。
【実施例】
【００１９】
以下、本開示を実施例により詳細に説明するが、本開示はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２０】
［保存処理対象のポリアクリルアミドゲル］
大腸菌から調製したリボソーマルタンパク質を含む試料をRadical-Free Highly Reducing Two-Dimensional PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (RFHR 2-D PAGE) で電気泳動し、染色及び脱色したものを、保存処理対象のポリアクリルアミドゲルとした。
ゲルの大きさは、１６ｘ１３．５ｘ０．２ｃｍ３であった。
［試料］
試料として大腸菌のクルードリボソーム分画（CRフラクション）を使用した。CRフラクションは、Noll et al., J. Mol. Biol. 75, 281-294 (1973) の方法に少しの改変を加えたHorie et al., J. Biochem. 90, 449-461 (1981)の方法に従って調製した。
培養、回収した大腸菌の細胞をほぼ同量のクォーツサンド及び大豆トリプシンインヒビター（0.42 mg/g cells）とともにグラインドし、バッファーＩ［20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM 酢酸マグネシウム, 100 mM 酢酸アンモニウム, 6 mM 2-メルカプトエタノール］で抽出した。そのホモジェネートを9000 g, 15 min, 4℃で遠心分離し、上清を回収した。ペレットは、バッファーＩで再懸濁したあと、上記と同様に遠心分離を行い、上清を回収した。これらの上清をあわせたもの（細胞エクストラクト）を、バッファーＩの３０％スクロースクッション上に重層し、55.2Ti ローター（Beckman社製）を用いて206000 g, 3h, 4℃で遠心分離した。そのペレットをバッファーＩで再懸濁し、このサスペンションをCRフラクションとした。
試料としては、このCRフラクションを密度勾配遠心法で分離した、30S＋50Sサブユニットフラクション、70Sリボソームフラクション、100Sリボソームフラクションも使用した。
調製した試料を2%酢酸で3回24時間透析し、凍結乾燥してー80℃で保存した。
【００２１】
［RFHR 2-D PAGE］
凍結乾燥試料からタンパク質溶液サンプル（0.5 - 1 mg protein in 100 μL 10 mM urea 含有0.2 M 2-メルカプトエタノール）を調製し、RFHR 2-D PAGEで電気泳動した。
RFHR 2-D PAGEは、Wada, A., J. Biochem 100, 1583-1594 (1986) 及びWada, A., J. Biochem 100, 1585-1605 (1986) の方法に少しの改変を加えたUeta et al., J. Biochem. 143, 425-433 (2010)の方法に従って行った。
サンプルチャージング電気泳動は、100 定電圧（CV）、15分、室温で行い、一次元目の電気泳動は、170 CV、８時間、室温で行い、二次元目の電気泳動は、100 CV、15時間、室温で行った。
電気泳動後のポリアクリルアミドゲルをCBB G-250染色及び脱色（２％酢酸を数回交換した）を行って、保存処理対象のポリアクリルアミドゲルを得た。
【００２２】
［保存処理］
電気泳動及び染色・脱色後のポリアクリルアミドゲルに対して、以下の処理を行った。
１．ゲルを40％エタノール（wt/wt）に漬ける。
２．16x13.5x0.2 cm3のゲル当たり500 mlの40%エタノールを用いる。
３．適当な大きさの蓋つきケースに40%エタノールを入れ、サランの網を敷き、その上にゲルを横たえる。ゲル上面が乾かないようにゲルの上にもサランの網を載せておく。５時間放置。
４．40%エタノールから取り出したゲルを、サランの網を敷いた上に横たえる。ゲルは乾燥するにつれて、通常、ゲルに反り、うねり、及び／又はゆがみが発生する。完全に硬化するまで放置する。２mmのゲルで２〜３日。乾燥してもゲルの透明性は維持される（図１）。
５．硬化したゲルを適当なポリ袋にいれ、ポリ袋をゆがんだゲルの形に添わせながら沸騰水または80℃以上の湯に漬ける。ゲルは過熱されると柔らかくなっていく。ゲルの透明性は維持される。
６．柔らかくなったゲルを、フラットな板上でポリ袋をほぐしながらほぼフラットになるように手で矯正する。
７．ゲルの面にはポリ袋の皺がある場合には、ゲルをPETフィルムに挟み、それをフラットな板で挟んで、さらに、ゲルをぬらさぬようポリ袋に入れて再び80℃以上の湯で軟化させる。
８．軟化したら取り出し、ポリ袋ごと平面上で加圧し、ゲルをPETフィルムになじませる。これでゲル表面の皺がなくなる。
９．冷えるのを待って、ゲルを取り出し、ポリ袋などに密封保存する。ゲルの透明性は維持される（図２）。
【００２３】
このような処理をした乾燥ポリアクリルアミドゲルは、透明性を維持して長期に（例えば２０年以上）安定保存できる。
また、当該乾燥ポリアクリルアミドゲルは、40%エタノールに漬けると、元のゲル状態に戻すことができ、さらに、乾燥状態、ゲル状態を繰り返すことができる。
【００２４】
［比較保存処理］
電気泳動及び染色・脱色後のポリアクリルアミドゲルに対して、比較保存処理の一例として、特許文献１にならい、以下の処理を行った。
１．ゲルを４０％エタノール（wt/wt）に漬ける。
２．16x13.5x0.2 cm3のゲル当たり500 mlの40%エタノールを用いる。
３．適当な大きさの蓋つきケースに40%エタノールを入れ、サランの網を敷き、その上にゲルを横たえる。ゲル上面が乾かないようにゲルの上にもサランの網を載せておく。５時間放置。
４．ゲルを８０％エタノール５００ｍｌに移す。ゲルは短時間で不透明になる。
５．ゲルは柔らかいラバーの状態になり、伸縮できるようになる。2時間放置。
６．ゲルをキムワイプに挟んで真空デシケーターで吸引乾燥させる。ゲルは、不透明白色である（図３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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