(57)【要約】【課題】延長リピート病を処置するためのオリゴヌクレオチドを提供すること。【解決手段】本発明は、細胞を、延長されたヌクレオチドリピートに対して十分な長さおよび相補性のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含む、野生型ｍＲＮＡと比較して延長されたヌクレオチドリピートを有している突然変異体ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現を選択的に低下させるための方法を提供する。より具体的には、本発明は、ハンチントン病と関係がある突然変異体ハンチントンタンパク質の発現を選択的に低下させることに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対応する野生型転写物またはタンパク質と比較して、延長リピート病と関係がある対立遺伝子を含有している突然変異体である延長されたヌクレオチドリピートから産生される突然変異体転写物またはタンパク質の発現を選択的に低下させるためのアンチセンス化合物の使用に関する。１つの実施形態では、本発明は、ハンチントン病における突然変異体ハンチントンの発現の対立遺伝子特異的阻害に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの３０近い遺伝性障害が、ゲノムＤＮＡ中の簡単なリピートのコピー数の増加により起こる。これらのＤＮＡリピートは、これらが細胞の複製、修復、および組み換え機構を混乱させる通常ではない構造的特徴を有するとの理由から、そのような発現の素因があると考えられる。延長されたＤＮＡリピートの存在はヒト細胞中で遺伝子発現を変化させ、疾患につながる。
【０００３】
１つのそのような遺伝性障害がハンチントン病（ＨＤ）である。ＨＤは、認知機能低下、認知症、および運動協調性の喪失に関連する、治療法がない生死にかかわる神経変性疾患である。これは、ハンチントン（ＨＴＴ）遺伝子のコード領域中のポリグルタミン鎖をコードするＣＡＧトリヌクレオチドリピートの長さの進行性かつ遺伝性の増大を特徴とする。これらのリピートは、代々、数が増加し得る。ＨＴＴ遺伝子の正常な対立遺伝子は３６未満のＣＡＧリピートを含むが、突然変異体対立遺伝子は３６を上回るリピートを含む。ほとんどのＨＤ患者は、１つの正常な対立遺伝子と１つの突然変異体である病因対立遺伝子とを保有する。機能的には、ＣＡＧリピートの異常な蓄積が、突然変異体ＨＤタンパク質に毒性機能獲得をもたらし、これが突然変異体ＨＤタンパク質の凝集を引き起こし、タンパク質の堆積（すなわち、封入体）を形成して、細胞死を誘導すると考えられている。疾患の重篤度は一般的に、突然変異体ＨＴＴタンパク質中の延長されたリピートの程度を反映する。
【０００４】
ＨＤについての治療法の選択肢には、この疾患の表現形の発現をコントロールするために設計されたハロペリドール、テトラベナジン、クロナゼパム、フルオキセチン（ｆｌｕｏｘｉｔｉｎｅ）、およびセルトラリンのような小分子薬物が含まれる。これらの薬物はＨＤ患者の生活の質を改善することができるが、これらは疾患の進行を有意に逆戻りさせる、もしくは変える、または平均余命を伸ばすことが期待できないだけではなく、疾患の根底にある分子機構に対処することもできない。
【０００５】
ゲノムＤＮＡ中の延長されたヌクレオチドリピートを特徴とする別の疾患は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。ＡＬＳは、典型的には、症候の発症から２〜３年以内に呼吸不全により死に至る、進行性の麻痺を臨床的特徴とする生死にかかわる神経変性疾患である。ＡＬＳは西欧諸国においては３番目に一般的な神経変性疾患であり、現在は有効な治療法が存在しない。ＡＬＳ患者の一部は、例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子中の、大きなヘキサヌクレオチド（ＧＧＧＧＣＣ）リピートの延長を特徴とする（例えば、Ｒｅｎｔｏｎら、Ｎｅｕｒｏｎ  ２０１１；７２：２５７−６８およびＤｅＪｅｓｕｓ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｎｅｕｒｏｎ  ２０１１；７２：２４５−５６を参照のこと）。
【０００６】
１型筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１）および２型筋強直性ジストロフィー（ＤＭ２）は、それぞれ、転写物である筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）およびジンクフィンガータンパク質９（ＺＮＦ９）の、３’−ＵＴＲならびにイントロン１領域中の長いｐｏｌｙＣＵＧおよびｐｏｌｙＣＣＵＧリピートと関係がある。正常な個体は３０程度のＣＴＧリピートを有するが、ＤＭＩ患者は５０〜１０００までの範囲のより多数のリピートを保有する。この疾患の重篤度および発症の年齢は、このリピートの数と相関関係がある。成人で発症した患者はより軽度の症候を示し、１００未満のリピートを有し、若年で発症したＤＭ１患者は５００程度のリピートを保有し、そして先天性の症例は、通常、およそ１０００のＣＴＧリピートを有する。ＣＵＧリピートを含有している延長された転写物は二次構造を形成し、核内フォーカスの形態で核の中に蓄積し、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＮＡ−ＢＰ）を隔離する。
延長リピート病を処置するための新規のおよび／または改良された治療アプローチが必要である。ＨＤおよびＡＬＳのような延長リピート病を処置するための１つの可能性のある経路は、延長されたリピートを含有する突然変異体である病因対立遺伝子の遺伝子産物の選択的な減少または排除であろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｅｎｔｏｎら、Ｎｅｕｒｏｎ  ２０１１；７２：２５７−６８
【非特許文献２】ＤｅＪｅｓｕｓ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｎｅｕｒｏｎ  ２０１１；７２：２４５−５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
１つの態様において、本発明は、野生型対立遺伝子と比較して、対立遺伝子を含有している突然変異体である延長されたヌクレオチドリピートから産生されるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を選択的に低下させるための方法を含む。この方法は、細胞を、突然変異体ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするように延長されたヌクレオチドリピートに対する十分な長さおよび相補性のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはＡＰＮ結合を有する。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｅｔｐｉｐ結合のような異なるタイプの陽イオン性結合を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１つの実施形態では、本発明は、ヒトの疾患と関係がある延長されたＤＮＡリピートに対して配列相補性を有している、１０〜４０ヌクレオチドの長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。ここでは、上記アンチセンスは、式：
【化１】
2020078347.tif 000002
［式中、Ｎｕはヌクレオ塩基であり；
Ｒ１は式：
【化２】
2020078347.tif 000003
（ｑは、０、１、２、３、または４であり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、およびホルムアミジニル部分からなる群より選択され、そして
Ｒ３は、水素およびＣ１〜Ｃ５アルキルからなる群より選択されるか、または、
Ｒ２とＲ３とが一緒になって、随意に１つの酸素ヘテロ原子を含有している５〜７員複素環を形成し、ここでは、上記環は、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、フェニル、ハロゲン、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で随意に置換され得；
Ｒ４は、不在、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびアラルキルからなる群より選択される）
の部分であり；
Ｒｘは、ＨＯ−、ヌクレオチド、細胞透過性ペプチド部分、およびピペラジニルからなる群より選択され；
Ｒｙは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ヌクレオチド、ペプチド部分、アミノ酸、ホルムアミジニル部分、およびアシルからなる群より選択され；そして
Ｒｚは、不在、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびアシルからなる群より選択される］およびその薬学的に許容され得る塩を有しているヌクレオチドを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、Ｎｕは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、およびヒポキサンチンからなる群より選択される。１つの実施形態では、Ｎｕはチミンまたはウラシルである。
【００１１】
１つの実施形態では、Ｒ１は、以下からなる群より選択される：
【化３】
2020078347.tif 000004
【００１２】
なお別の実施形態では、ヌクレオチドは以下の式を有する：
【化４】
2020078347.tif 000005
（式中、Ｒｘ、Ｒｙ、Ｒｚ、およびＮｕは上記に記載されたとおりである）。
【００１３】
他の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、（ＣＣＧ）ｎ、（ＣＴＧ）ｎ、（ＴＴＣ）ｎ、（ＮＧＣ）ｎ、（ＧＮＣ）ｎ、（ＣＡＧＧ）ｎ、（ＡＧＡＡＴ）ｎ、および（ＣＧＣＧ４ＣＧ４）ｎからなる群より選択される配列を含有し、式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは３から１０までである。１つの実施形態では、配列は（ＧＣＴ）７であり、Ｒｙは随意にＧヌクレオチドである。
【００１４】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ならびに１型および２型筋強直性ジストロフィーのような、延長されたリピートと関係があるヒトの疾患の処置に有用である。
【００１５】
なお他の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、式：
【化５】
2020078347.tif 000006
［Ｎｕ１、Ｎｕ２、およびＮｕ３は、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、およびヒポキサンチンからなる群より選択されるヌクレオ塩基であり；
ｎは、約３から約１０までであり、ヌクレオチド配列（Ｎｕ１、Ｎｕ２、Ｎｕ３）のリピートの数を表しており；
Ｒ１は式：
【化６】
2020078347.tif 000007
（ｑは、０、１、２、３、または４であり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、およびホルムアミジニル部分からなる群より選択され、そして
Ｒ３は、水素およびＣ１〜Ｃ５アルキルからなる群より選択されるか、または、
Ｒ２とＲ３とが一緒になって、酸素ヘテロ原子を随意に含有している５〜７員複素環を形成し、ここでは、上記環は、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、フェニル、ハロゲン、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で随意に置換され得；
Ｒ４は、不在、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびアラルキルからなる群より選択される）
の部分であり；
Ｒｘは、ＨＯ−、ヌクレオチド、細胞透過性ペプチド部分、およびピペラジニルからなる群より選択され；
Ｒｙは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ヌクレオチド、ペプチド部分、アミノ酸、ホルムアミジニル部分、およびアシルからなる群より選択され；そして
Ｒｚは、不在、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびアシルからなる群より選択される］およびその薬学的に許容され得る塩を有している繰り返される３ヌクレオチドの配列を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、３ヌクレオチドの配列は、（ＣＣＧ）、（ＣＴＧ）、（ＴＴＣ）、（ＮＧＣ）、および（ＧＮＣ）からなる群より選択され、式中、Ｎは任意のヌクレオチドである。１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは配列（ＧＣＴ）ｎを含み、式中、ｎは約３から約１０までであり、生理学的ｐＨで正電荷を持つ少なくとも１つのヌクレオシド間結合を含む。他の実施形態では、繰り返される３ヌクレオチドの配列は（ＧＣＴ）７であり、Ｒｙは随意にＧヌクレオチドである。
【００１７】
他の実施形態は、繰り返される４、５、または６ヌクレオチドの配列を含むオリゴヌクレオチドに関する。代表的な４ヌクレオチドの配列は、式：
【化７】
2020078347.tif 000008
［Ｎｕ１、Ｎｕ２、Ｎｕ３、およびＮｕ４（またはＮｕ５、Ｎｕ６など）は、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、およびヒポキサンチンからなる群より選択されるヌクレオ塩基であり；
ｎは約３から約１０までの整数であり、ヌクレオチド配列（Ｎｕ１、Ｎｕ２、Ｎｕ３、Ｎｕ４、随意に、Ｎｕ５、Ｎｕ６など）のリピートの数を表しており；
Ｒ１は式：
【化８】
2020078347.tif 000009
（ｑは、０、１、２、３、または４であり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、およびホルムアミジニル部分からなる群より選択され、そして
Ｒ３は、水素およびＣ１〜Ｃ５アルキルからなる群より選択されるか、または
Ｒ２とＲ３とが一緒になって、酸素ヘテロ原子を随意に含有している５〜７員複素環を形成し、ここでは、上記環は、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、フェニル、ハロゲン、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で随意に置換され得；
Ｒ４は、不在、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびアラルキルからなる群より選択される）
の部分であり；
Ｒｘは、ＨＯ−、ヌクレオチド、細胞透過性ペプチド部分、およびピペラジニルからなる群より選択され；
Ｒｙは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ヌクレオチド、ペプチド部分、アミノ酸、ホルムアミジニル部分、およびアシルからなる群より選択され；そして
Ｒｚは、不在、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびアシルからなる群より選択される］およびその薬学的に許容され得る塩を有する。
【００１８】
１つの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは非電荷である。さらなる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは電荷を有している。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの中の１つ以上のヌクレオチド間結合が、ＡＰＮ修飾のような陽イオン性結合を有し得る。修飾されたオリゴヌクレオチドは、ヌクレオ塩基Ｔ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはこれらのアナログを含有する。好ましくは、修飾されたヌクレオチド間結合はＴ、Ｃ、またはＡサブユニットに由来する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞透過性ペプチド輸送体、例えば、アルギンリッチペプチド（例えば、（Ａｒｇ）６Ｇｌｙ）のようなペプチド部分にコンジュゲートされる。
【００２０】
１つの実施形態では、繰り返される４ヌクレオチドの配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは（ＣＡＧＧ）ｎであり、式中、ｎは３〜１０である。このようなオリゴヌクレオチドは、１型筋強直性ジストロフィーの処置に有用である。別の実施形態では、繰り返される５ヌクレオチドの配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは（ＡＧＡＡＴ）ｎであり、式中、ｎは３〜１０である。このようなオリゴヌクレオチドは、１０型脊髄小脳失調の処置に有用である。なお別の実施形態では、繰り返される６ヌクレオチドの配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは（ＧＧＣＣＣＣ）ｎであり、式中、ｎは３〜１０である。このようなオリゴヌクレオチドは筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置に有用である。
【００２１】
本発明のなお他の実施形態は、表Ｉ（および配列表）に示される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表Ｉに示されるように、疾患の処置に有用である。
【００２２】
本発明の他の態様は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと薬学的に許容され得る担体を含む薬学的組成物、ならびに延長されたＤＮＡリピートに関係がある疾患の処置のための医薬品の製造におけるそのようなオリゴヌクレオチドの使用に関する。そのような組成物は、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ならびに１型および２型筋強直性ジストロフィーのような、延長されたＤＮＡリピートと関係がある疾患を処置するために被検体に投与され得る。
【００２３】
本発明のなお他の態様は、以下の工程を含む、ノーザンブロッティングによる、延長されたＤＮＡリピートが関係している遺伝性障害の診断方法に関する：
ａ．ホモジナイズされた組織試料または細胞からの全ＲＮＡの抽出；
ｂ．ｍＲＮＡを単離する工程；
ｃ．ゲル電気泳動を使用して大きさによりｍＲＮＡを分離する工程；
ｄ．ｍＲＮＡをメンブレンにトランスファーする工程；
ｅ．ｍＲＮＡをメンブレンに固定する工程；および
ｆ．延長されたリピートを検出するためにプローブを使用する工程であって、ここでは、プローブは本発明のオリゴヌクレオチドである、工程。
【００２４】
別の態様は、以下の工程を含む、オリゴヌクレオチド療法での処置に対するポリヌクレオチドリピート障害の被検体の応答性を決定するための方法に関する：
ｉ．被検体から細胞を単離する工程；
ｉｉ．細胞を培養する工程；
ｉｉｉ．オリゴヌクレオチドを細胞に導入する工程；
ｉｖ．細胞からｍＲＮＡまたはタンパク質を単離する工程；
ｖ．ポリヌクレオチドリピート病の病因転写物に対する遺伝子特異的プライマーを使用してｍＲＮＡを逆転写し、増幅する工程であって、ここでは、上記遺伝子特異的プライマーが上記ポリヌクレオチドリピートの両方の末端に隣接している、工程；
ｖｉ．突然変異体であるポリヌクレオチドリピート病の病因ｍＲＮＡまたはタンパク質と、基準である野生型ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを定量化する工程；ならびに
ｖｉｉ．突然変異体であるポリヌクレオチドリピート病の病因ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを、基準である野生型ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルと比較する工程；ならびに
ｖｉｉｉ．突然変異体であるポリヌクレオチドリピート病の病因ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルが基準である野生型ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルより低い場合に、被検体がオリゴヌクレオチド療法に対して応答性であることを決定する工程。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
ヒトの疾患と関係がある延長されたＤＮＡリピートに対して配列相補性を有している１０〜４０ヌクレオチドの長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ここでは、前記アンチセンスが式：
【化１】
2020078347.tif 000010
［式中、Ｎｕはヌクレオ塩基であり；
Ｒ１は、式：
【化２】
2020078347.tif 000011
（ｑは、０、１、２、３、または４であり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、およびホルムアミジニル部分からなる群より選択され、そして
Ｒ３は、水素およびＣ１〜Ｃ５アルキルからなる群より選択されるか、または
Ｒ２とＲ３とが一緒になって酸素ヘテロ原子を随意に含有している５〜７員複素環を形成し、ここでは、前記環は、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、フェニル、ハロゲン、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で随意に置換され得；
Ｒ４は、不在、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびアラルキルからなる群より選択される）
の部分であり；
Ｒｘは、ＨＯ−、ヌクレオチド、細胞透過性ペプチド部分、およびピペラジニルからなる群より選択され；
Ｒｙは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ヌクレオチド、ペプチド部分、アミノ酸、ホルムアミジニル部分、およびアシルからなる群より選択され；そして
Ｒｚは、不在、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびアシルからなる群より選択される］を有しているヌクレオチドおよびその薬学的に許容され得る塩を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
（項目２）
Ｎｕが、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、およびヒポキサンチンからなる群より選択される、項目１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（項目３）
Ｎｕが、チミンまたはウラシルである、項目２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（項目４）
Ｒ１が以下からなる群より選択される、項目１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド：
【化３】
2020078347.tif 000012
（項目５）
前記ヌクレオチドが式：
【化４】
2020078347.tif 000013
を有し、式中、Ｒｘ、Ｒｙ、Ｒｚ、およびＮｕは項目１に記載されたとおりである、項目１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（項目６）
Ｎｕがチミンである、項目５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（項目７）
（ＣＣＧ）ｎ、（ＣＴＧ）ｎ、（ＴＴＣ）ｎ、（ＮＧＣ）ｎ、（ＧＮＣ）ｎ、（ＣＡＧＧ）ｎ、（ＡＧＡＡＴ）ｎ、および（ＣＧＣＧ４ＣＧ４）ｎからなる群より選択される配列を含み、式中、Ｎが任意のヌクレオチドであり、ｎが３から１０までである、項目１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（項目８）
前記ヒトの疾患が、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ならびに１型および２型筋強直性ジストロフィーからなる群より選択される、項目１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（項目９）
配列（ＧＣＴ）７を含む、項目８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（項目１０）
ＲｙがＧヌクレオチドである、項目９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（項目１１）
項目１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと薬学的に許容され得る担体を含む、薬学的組成物。
（項目１２）
項目１１に記載の組成物を投与する工程を含む、被検体のハンチントン病の処置方法。
（項目１３）
式：
【化５】
2020078347.tif 000014
［Ｎｕ１、Ｎｕ２、およびＮｕ３は、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、およびヒポキサンチンからなる群より選択されるヌクレオ塩基であり；
ｎは、約３から約１０までであり、ヌクレオチド配列（Ｎｕ１、Ｎｕ２、Ｎｕ３）のリピートの数を表しており；
Ｒ１は、式：
【化６】
2020078347.tif 000015
（ｑは、０、１、２、３、または４であり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、ホルムアミジニル部分からなる群より選択され、そして
Ｒ３は、水素およびＣ１〜Ｃ５アルキルからなる群より選択されるか、または
Ｒ２とＲ３とが一緒になって酸素ヘテロ原子を随意に含有している５〜７員複素環を形成し、ここでは、前記環は、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、フェニル、ハロゲン、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で随意に置換され得；
Ｒ４は、不在、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびアラルキルからなる群より選択される）
の部分であり；
Ｒｘは、ＨＯ−、ヌクレオチド、細胞透過性ペプチド部分、およびピペラジニルからなる群より選択され；
Ｒｙは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ヌクレオチド、ペプチド部分、アミノ酸、ホルムアミジニル部分、およびアシルからなる群より選択され；そして
Ｒｚは、不在、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびアシルからなる群より選択される］を有している繰り返される３ヌクレオチドの配列およびその薬学的に許容され得る塩を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
（項目１４）
Ｎｕがチミンである、項目１３に記載のアンチセンスヌクレオチド。
（項目１５）
前記３ヌクレオチドの配列が、（ＣＣＧ）、（ＣＴＧ）、（ＴＴＣ）、（ＮＧＣ）、および（ＧＮＣ）からなる群より選択され、式中、Ｎは任意のヌクレオチドである、項目１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（項目１６）
繰り返される３ヌクレオチドの配列が（ＧＣＴ）７である、項目１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（項目１７）
ＲｙがＧヌクレオチドである、項目１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（項目１８）
項目１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと薬学的に許容され得る担体を含む、薬学的組成物。
（項目１９）
項目１８に記載の組成物を投与する工程を含む、被検体のハンチントン病の処置方法。
（項目２０）
ｇ．ホモジナイズされた組織試料または細胞からの全ＲＮＡの抽出；
ｈ．ｍＲＮＡを単離する工程；
ｉ．ゲル電気泳動を使用して大きさによりｍＲＮＡを分離する工程；
ｊ．ｍＲＮＡをメンブレンにトランスファーする工程；
ｋ．ｍＲＮＡをメンブレンに固定する工程；および
ｌ．延長されたリピートを検出するためにプローブを使用する工程であって、ここでは、プローブが項目１に記載のオリゴヌクレオチドである工程を含む、ノーザンブロッティングによる延長されたＤＮＡリピートと関係がある遺伝性障害の診断方法。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】モルホリノオリゴマーの合成のための固体支持体の調製。
【図２】モルホリノオリゴマーの合成のための固体支持体の調製。
【図３】モルホリノオリゴマーの固相合成。
【図４】モルホリノオリゴマーの固相合成。
【図５】ＨＴＴ対立遺伝子由来のアンプリコンの略図。この図表は、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ｒｅｃｏｒｄ（アクセス番号ＮＭ＿００２１１１．６）に基づき、ＮＣＢＩ  ＣＡＧトリプレットリピート延長の長さがＧＭ０４２８１繊維芽細胞株中の突然変異体対立遺伝子の延長に交換されている。
【図６】オリゴヌクレオチドで処置されたハンチントン病患者の繊維芽細胞による用量応答曲線。ＬＮＡオリゴヌクレオチド、ＰＭＯオリゴヌクレオチド、およびＡＰＮオリゴヌクレオチドは同じ配列：５’ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  Ｇ  ３’（配列番号２１）を含む。ＬＮＡオリゴヌクレオチド（Ｅｘｉｑｏｎからの注文品）は、各チミン（Ｔ）塩基にＬＮＡ修飾を持つＤＮＡ骨格を含む（合計７個の修飾）。ＡＰＮオリゴヌクレオチドは、各Ｔ塩基にａｐｎ修飾を持つＰＭＯ骨格を含む（合計７個の修飾）。ＰＭＯオリゴヌクレオチドは、Ｔ塩基またはいずれのサブユニット間結合にもさらなる修飾を持たないＰＭＯ骨格を含む。パネルＡ、Ｂ、およびＣの細胞はそれぞれ、ＬＮＡオリゴヌクレオチド、ＰＭＯオリゴヌクレオチド、またはＡＰＮオリゴヌクレオチドでヌクレオフェクト（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔ）された。  ＧＭ０４２８１繊維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ）由来の野生型または突然変異体ＨＴＴ対立遺伝子を示しているゲルバンドの強度が、最も低い処理された試料のそれぞれの野生型または突然変異体バンドの強度に対して正規化された。各点はそれぞれの濃度での２つのレプリカによる正規化された発現レベルの平均を表し、２回の独立した実験が、上記データセットを得るために合わせられた。ゲル強度の定量化はＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ）を用いて行われた。強度の正規化、ＥＣ５０の計算、および選択性はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ａｎｄ  Ｒを用いて分析された。データ点および曲線がＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍにプロットされた。
【図７】ＬＮＡオリゴヌクレオチド、ＰＭＯオリゴヌクレオチド、およびＡＰＮオリゴヌクレオチドのＥＣ５０ならびに選択性。化合物は図６に記載されたものと同じである。ロックト核酸（ＬＮＡ）、ＰＭＯ、またはＡＰＮオリゴヌクレオチドがヌクレオフェクトされたＧＭ０４２８１繊維芽細胞由来の突然変異体および野生型ＨＴＴ対立遺伝子のｍＲＮＡ発現の分析が、図６に記載されるように行われた。各対立遺伝子についての平均ＥＣ５０値は図６に示されるデータセットから計算され、さらに、突然変異体対立遺伝子についての選択性が、同じオリゴヌクレオチドがヌクレオフェクトされた繊維芽細胞由来の野生型および突然変異体対立遺伝子のＥＣ５０から、Ｒ  ａｎｄ  Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して計算された。  データは、ＰＭＯオリゴヌクレオチドおよびＡＰＮオリゴヌクレオチドが、ＬＮＡよりも、突然変異体対立遺伝子に対して高い選択性を示すことを示している。さらに、ＥＣ５０値に基づくＡＰＮオリゴヌクレオチドの効力は、ＰＭＯオリゴヌクレオチドを上回って改善されている。
【図８】オリゴヌクレオチドで処置されたハンチントン病患者の繊維芽細胞による用量応答曲線。化合物は、図６に記載されるものと同じである。このデータは図６と同じ様式で分析されたが、３回の独立した実験が合わせられた。全てのオリゴヌクレオチドによるデータが同じグラフ上にプロットされる。
【図９】ＰＭＯ化合物およびＡＰＮ化合物は突然変異ＨＴＴ  ｍＲＮＡに対して選択性を示す。このデータは、図７中の表と同じ様式で分析されたが、３回の独立した実験が組み合わせられた。
【図１０】突然変異体ＨＴＴ対立遺伝子および野生型ＨＴＴ対立遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ。示される濃度のａｐｎ（ＧＣＴ）７Ｇ（配列番号２１）オリゴヌクレオチドがヌクレオフェクトされたＧＭ０４２８１繊維芽細胞由来のＲＮＡが、方法に記載されるようにＲＴ−ＰＣＲ増幅された。得られる反応物を含有しているゲルが、方法の中、および図６中に記載されるように分析された。
【図１１】ＬＮＡ化合物ではなく、ＰＭＯ化合物およびＡＰＮ化合物は、野生型ＨＴＴタンパク質と比較して、突然変異体ＨＴＴタンパク質の発現を選択的に低下させる。化合物は、図６に記載されるものと同じである。ＰＭＯオリゴヌクレオチド（左のパネル）、ＡＰＮオリゴヌクレオチド（中央のパネル）、またはＬＮＡオリゴヌクレオチド（右のパネル）がヌクレオフェクトされたＧＭ０４２８１繊維芽細胞由来の突然変異体ＨＴＴタンパク質および野生型ＨＴＴタンパク質のタンパク質発現分析が、実施例２４に記載されるように行われた。ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）後３日で、タンパク質溶解物が調製された。それぞれの処理された試料由来の等量の全タンパク質が２連のトリス酢酸ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に泳動され、ニトロセルロースにトランスファーされた。ブロットが抗ＨＴＴ一次抗体（ＭＡＢ２１６６，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）または抗β−アクチン一次抗体（Ａ１９７８，Ｓｉｇｍａ）で、続いてｃｙ５がコンジュゲートされた二次抗体でプローブされた。得られるブロットがＴｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ（ＧＥ）上でスキャンされ、突然変異体ＨＴＴタンパク質および正常なＨＴＴタンパク質のシグナル強度が、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ）ソフトウェアで別々に定量化された（下のパネル）。正常なＨＴＴのバンド（下）および突然変異体ＨＴＴのバンド（上）のシグナル強度が、それぞれのレーン中のβ−アクチンシグナルに対して正規化され、次に、それぞれのＨＴＴのバンドが、別のブロット上の未処理の対照試料由来の対応する正常なＨＴＴまたは突然変異体ＨＴＴのバンドの強度に対して正規化された。タンパク質発現の結果は、ＨＴＴタンパク質発現の平均百分率、＋／−１ＳＤとして、それぞれの対立遺伝子（正常、実線；突然変異体、点線）についてプロットされる。
【図１２】ＡＰＮで修飾されたＰＭＯは、野生型ＨＴＴタンパク質と比較して突然変異体ＨＴＴタンパク質の発現を選択的に低下させる。図１１によるデータが、ＰＭＯで修飾されたオリゴヌクレオチド、ＡＰＮで修飾されたオリゴヌクレオチド、およびＬＮＡで修飾されたオリゴヌクレオチドのそれぞれについて、突然変異体ＨＴＴタンパク質の発現に対する野生型ＨＴＴタンパク質の発現の比を決定し、プロットするために使用された。
【図１３】ＡＰＮ関連陽イオン性修飾およびｐｌｕｓ関連陽イオン性修飾の例示的な構造。ＡＰＮ関連陽イオン性修飾およびｐｌｕｓ関連陽イオン性修飾の例示的な種が示される。ＡＰＮ関連修飾としては、ＡＰＮおよびｍａｐが挙げられ、ｐｌｕｓ関連修飾としては、ｐｌｕｓ、ｍｅｄａ、およびｅｔｐｉｐが挙げられる。例示される修飾はチミンに関するが、任意の塩基（例えば、チミン、シトシン、グアニン、アデニン）が、ＡＰＮ関連陽イオン性修飾およびｐｌｕｓ関連陽イオン性修飾で修飾され得る。
【図１４】ＡＰＮ関連骨格修飾およびｐｌｕｓ関連骨格修飾を持つオリゴヌクレオチドは、野生型ＨＴＴタンパク質と比較して突然変異体ＨＴＴタンパク質の発現を選択的に低下させる。ＧＭ０４２８１繊維芽細胞が、様々な濃度（０．１６μＭ、０．８μＭ、１０μＭ、および２０μＭ）の示される修飾されたオリゴヌクレオチドで図１１に記載されるようにヌクレオフェクトされ、突然変異体ＨＴＴタンパク質の発現に対する野生型ＨＴＴタンパク質の発現の比が図１１および１２に記載されるように決定された。ＡＰＮで修飾されたオリゴヌクレオチドおよびｍａｐＴで修飾されたオリゴヌクレオチド（左のパネル）、ならびにｅｔｐｉｐＴで修飾されたオリゴヌクレオチド、ｍｅｄａＴで修飾されたオリゴヌクレオチド、およびｐｌｕｓＴで修飾されたオリゴヌクレオチド（右のパネル）は、野生型ＨＴＴタンパク質と比較して突然変異体ＨＴＴタンパク質の発現を選択的に低下させた。
【図１５】ＡＰＮで修飾されたオリゴヌクレオチドおよびｅｔｐｉｐで修飾されたオリゴヌクレオチドは、野生型ＨＴＴタンパク質と比較して突然変異体ＨＴＴタンパク質に対して高い選択性を示す。比較のために、図１４によるＡＰＮ、ｅｔｐｉｐＴ、ＰＭＯ、および対照についてのデータが同じグラフ上にプロットされた。ＡＰＮで修飾されたオリゴヌクレオチドおよびｅｔｐｉｐＴで修飾されたオリゴヌクレオチドはいずれも、野生型ＨＴＴと比較して突然変異体ＨＴＴの発現の低下について高い選択性を示したが、ＡＰＮは、突然変異体ＨＴＴについてより低い用量で高い選択性を示した。
【図１６】ＡＰＮ修飾はＰＭＯと比較して、ＩＣＶ注射後にＥＧＦＰ活性を増強する。ｅＧＦＰ−６５４トランスジーンが体中で一様に発現されるトランスジェニックｅＧＦＰマウスモデルがこれまでに記載されている（Ｓａｚａｎｉ，Ｇｅｍｉｇｎａｎｉら、２００２）。このモデルは、本発明の修飾されたオリゴマーが、修飾され増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）ｐｒｅ−ｍＲＮＡの異常なスプライシングをブロックし、正確なスプライシングを回復させる活性についてのスプライシングアッセイを使用する。翻訳されたｅＧＦＰのレベルは、アンチセンスオリゴマーの効力と、作用部位でのそれらの濃度とに比例する。この動物モデルは、機能レポーターの獲得により、アンチセンスオリゴヌクレオチドに誘導されるスプライシングの修正についてのインビボアッセイを提供する。  この実施例に記載される化合物の特異的ＰＭＯ−Ｘ修飾は、０−１−０−７３０（ＰＭＯ）：ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＡＣＣ  ＴＴＡ  ＡＣＣ  ＣＡＧ（配列番号２２）およびＮＧ−１０−０２４５（ＡＰＮ）：ＧＣａｐｎＴ  ＡａｐｎＴａｐｎＴ  ＡＣＣ  ＴａｐｎＴＡ  ＡＣＣ  ＣＡＧ（配列番号２２）であった。ｅＧＦＰトランスジーンを標的化する、中性電荷を持つＰＭＯまたは陽イオン性骨格電荷（ＡＰＮ）で修飾されたＰＭＯが、脳定位固定装置を使用した１回の脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｂｒｅｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）（ＩＣＶ）注射によりＥＧＦＰ−６５４マウスの左側脳室に投与された。用量は、全てのマウスについていずれかの５ｍｇ／ｋｇからなるか（左のパネル、ＰＭＯまたはＡＰＮ）、あるいは、一定の用量範囲に及ぶ（右のパネル、２．５から４０ｍｇ／ｋｇまで、ＡＰＮのみ）。注射の２週間後、マウスが麻酔され、脳が取り出され、左半球と右半球になるように中線で矢状に半分にカットされた。それぞれの半球が、平たい圧盤の上にカット面を下に向けて配置されることにより、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ（ＧＥ）上で画像化された。ｅＧＦＰの蛍光を励起させるための４８８ｎｍのレーザーを使用してスキャンが収集された。得られた画像が、それぞれの半球の蛍光強度を定量化するためにＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（ＧＥ）で分析された。それぞれの半球の中で検出された蛍光強度の合計が、脳のそれぞれの半分についての領域に依存しない平均蛍光値を得るために、その半球中に存在するピクセルの数により割り算された。処置群のそれぞれの生存している動物についての活性の結果が散布図上の点として表される。群の平均蛍光は、横線、＋／−１ＳＤにより示される（左のパネル）。同じ実験が、様々な用量のＡＰＮ化合物を用いて行われた（右のパネル）。ＥＧＦＰシグナルの位置を示している生理食塩水で処置されたｅＧＦＰ−６５４マウス、ＰＭＯで処置されたｅＧＦＰ−６５４マウス、およびＡＰＮで処置されたｅＧＦＰ−６５４マウス由来の代表的なｔｙｐｈｏｏｎ画像は、ＩＣＶ注射されたオリゴマーの活性が脳の特定の領域内で優先的に発現されることを示している（下のパネル）。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義
本明細書中で使用される場合は、「ヌクレオ塩基」（Ｎｕ）、「塩基対合部分」、または「塩基」は、天然のままのＤＮＡまたはＲＮＡ中に見られるプリンあるいはピリミジン塩基（ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、およびグアニン）、ならびに、オリゴヌクレオチドの結合親和性のような改良された特性をもたらす、自然界に存在するプリンおよびピリミジンのアナログを意味するように互換的に使用される。例示的なアナログとして、ヒポキサンチン（ヌクレオシドイノシンの塩基構成要素）；５−メチルシトシン；Ｃ５−プロピニルで修飾されたピリミジン、９−（アミノエトキシ）フェノキサジン（Ｇ−クランプ（Ｇ−ｃｌａｍｐ））などが挙げられる。
【００２７】
塩基対合部分のさらなる例として、アシル保護基、２−フルオロウラシル、２−フルオロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、２，６−ジアミノプリン、アザシトシン、ピリミジンアナログ（例えば、シュードイソシトシンおよびシュードウラシル）、ならびに他の修飾されたヌクレオ塩基（例えば、８置換プリン、キサンチン、またはヒポキサンチン（後者の２つは天然の分解産物である））により保護されたそれらのそれぞれのアミノ基を有している、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、およびグアニンが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。Ｃｈｉｕ  ａｎｄ  Ｒａｎａ，ＲＮＡ，２００３，９，１０３４−１０４８，Ｌｉｍｂａｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２，２１８３−２１９６、およびＲｅｖａｎｋａｒ
ａｎｄ  Ｒａｏ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第７巻，３１３の中で開示されている修飾されたヌクレオ塩基もまた考えられる。
【００２８】
塩基対合部分のさらなる例として、１つ以上のベンゼン環が付加されている、サイズが拡大されたヌクレオ塩基が挙げられるがこれに限定されるわけではない。Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈのカタログ（ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）；Ｋｒｕｅｇｅｒ  ＡＴら、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００７，４０，１４１−１５０；Ｋｏｏｌ，ＥＴ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００２，３５，９３６−９４３；Ｂｅｎｎｅｒ
Ｓ．Ａ．ら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２００５，６，５５３−５４３；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００３，７，７２３−７３３；Ｈｉｒａｏ，Ｉ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００６，１０，６２２−６２７に記載されている核塩基置換が、本明細書中に記載されるオリゴマーの合成に有用であると考えられる。これらのサイズが拡大されたヌクレオ塩基のいくつかの例が以下に示される：
【化９】
2020078347.tif 000016
【００２９】
リボース、糖アナログ、またはモルホリノに共有結合されたヌクレオ塩基はヌクレオシドを含む。「ヌクレオチド」は、１つのリン酸基と一緒になったヌクレオシドからなる。リン酸基は隣接するヌクレオチドを互いに共有結合して、オリゴヌクレオチドを形成する。本明細書中で使用される場合は、「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオ塩基がワトソン・クリック塩基対合によりＲＮＡ中の標的配列にハイブリダイズして、標的配列内にオリゴヌクレオチド：ＲＮＡヘテロ二本鎖を形成することを可能にするヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの直鎖状配列である。用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「アンチセンスオリゴマー」、「オリゴマー」、および「化合物」は、オリゴヌクレオチドを意味するように互換的に使用され得る。
【００３０】
「モルホリノオリゴマー」または「ＰＭＯ」は、典型的なポリヌクレオチドに対して水素結合することができるヌクレオ塩基を支える骨格を有しているオリゴヌクレオチドを意味する。ここでは、ポリマーは五単糖の骨格部分を欠くが、代わりにモルホリノ環を含む。このように、ＰＭＯ中では、モルホリノ環構造が塩基対合部分を支えて、典型的には処理される細胞中または処置される被検体中の選択されたアンチセンス標的にハイブリダイズするように設計される塩基対合部分の配列を形成する。例示的な「モルホリノ」オリゴマーは、隣接するサブユニット（各サブユニットはポリヌクレオチド中の塩基に対して塩基特異的水素結合により結合するために有効なプリンまたはピリミジンヌクレオ塩基を含む）の４’環外炭素に対して１つのサブユニットのモルホリノ窒素を結合するホスホルアミデートまたはホスホロジアミデート結合により互いに連結されたモルホリノサブユニット構造を含む。モルホリノオリゴマー（アンチセンスオリゴマーを含む）は、例えば、米国特許第５，６９８，６８５号；同第５，２１７，８６６号；同第５，１４２，０４７号；同第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，５２１，０６３号；同第５，５０６，３３７号、および係属中の米国特許出願１２／２７１，０３６；同１２／２７１，０４０；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００９／０６４４７１に詳細に記載されており、これらは全て言及されたことによりそれらの全体が本明細書中に組み入れられたこととなる。
【００３１】
オリゴヌクレオチド構造内では、リン酸基は一般に、オリゴヌクレオチドの「ヌクレオシド間結合」の形成と呼ばれる。ＲＮＡおよびＤＮＡの自然界に存在するヌクレオシド間結合は３’から５’のホスホジエステル結合である。「ホスホルアミデート」基は、３個の酸素原子が結合しており、１個の窒素原子が結合しているリンを含み、一方、「ホスホロジアミデート」基は、２個の酸素原子が結合しており、２個の窒素原子が結合しているリンを含む。本明細書中に記載されるＰＭＯおよび／またはＰＭＯＸオリゴマーの非電荷または陽イオン性のサブユニット間結合においては、１つの窒素は常に骨格鎖に吊り下がっている。２つ目の窒素は、ホスホロジアミデート結合においては、典型的にはモルホリノ環構造中の環窒素である。
【００３２】
「ＰＭＯＸ」は、（ｉ）モルホリノ環の窒素原子に対する共有結合と（ｉｉ）４−アミノピペルジン−１−イル（すなわち、ＡＰＮ）または４−アミノピペルジン−１−イルの誘導体の環窒素に対する第２の共有結合とを持つリン原子を有しているホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーを意味する。ＰＭＯＸオリゴマーは、その全体が言及されたことにより本明細書中に組み込まれたこととなる、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／３８４５９に開示されている。「ＰＭＯａｐｎ」または「ＡＰＮ」は、リン原子がモルホリノ基と４−アミノピペルジン−１−イル（すなわち、ＡＰＮ）の環窒素に連結されているＰＭＯＸオリゴマーを意味する。
【００３３】
本明細書中で使用される場合は、ＬＮＡはロックト核酸オリゴヌクレオチドを意味する。「ＬＮＡ」は、架橋化核酸（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ＢＮＡ）と呼ばれる改変体の１つのクラスのメンバーである。ＢＮＡは、Ｃ３０−エンド（ノーザン）シュガーパッカー（Ｃ３０−ｅｎｄｏ（ｎｏｒｔｈｅｒｎ）ｓｕｇａｒ  ｐｕｃｋｅｒ）中のリボース環の立体構造をロックする共有結合を特徴とする。ＬＮＡについては、架橋は２’−Ｏ位と４’−Ｃ位との間のメチレンからなる。ＬＮＡは、ハイブリダイゼーションを増大させ、熱安定性を高めるために、骨格の事前の構成および塩基の積み重ねを増強する。
【００３４】
オリゴヌクレオチドは、オリゴマーが生理学的条件下で、実質的には４５℃より高いＴｍで、好ましくは少なくとも５０℃、そして典型的には６０℃〜８０℃またはそれより高いＴｍで標的にハイブリダイズする場合に、標的ポリヌクレオチドに対して「特異的にハイブリダイズする」。そのようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に対応する。所定のイオン強度およびｐＨで、Ｔｍは、標的配列のうちの５０％が相補性ポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。そのようなハイブリダイゼーションは、標的配列に対するアンチセンスオリゴマーの「近い」または「実質的な」相補性によって、ならびに正確な相補性によって起こり得る。
【００３５】
標的化配列は、標的配列に対して「近い」または「実質的な」相補性を有し得、そして本発明の目的のためになおも機能する、すなわち、依然「相補的」である。好ましくは、本発明において使用されるオリゴヌクレオチドアナログ化合物は、１０ヌクレオチドのうち、最大で１つの標的配列との不一致を、好ましくは、２０ヌクレオチドのうち最大で１つの不一致を有する。あるいは、使用されるアンチセンスオリゴマーは、本明細書中に示される例示的な標的化配列と少なくとも９０％の配列相同性、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を有する。
【００３６】
「延長されたヌクレオチドリピート」または「リピート延長」または「延長されたポリヌクレオチドリピート」は、野生型遺伝子中の通常は多形のヌクレオチドリピートが、リピートが単純なヌクレオチドリピートの挿入により長さが延長される突然変異による変化を受ける突然変異を意味する。この機能的突然変異（ｄｙｎａｍｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）は、延長されたリピートが続く各世代毎にさらなる変化（通常は継続した延長）を受け得るとの理由から、従来の突然変異とは異なる。
【００３７】
本明細書中で使用される場合は、用語「突然変異体ｍＲＮＡ」は「突然変異体であるポリヌクレオチドリピート病の病因ｍＲＮＡ」と互換的に使用され、ポリヌクレオチドリピート病の病因である突然変異を有するｍＲＮＡを意味する。
【００３８】
本明細書中で使用される場合は、用語「野生型ｍＲＮＡ」または「基準である正常なｍＲＮＡ」は、ポリヌクレオチドリピート病の病因である突然変異を含まないｍＲＮＡを意味する。ハンチントン病の状況では、ハンチントン遺伝子の正常な対立遺伝子は３６未満のＣＡＧリピートを含む。したがって、基準である正常なｍＲＮＡは、３６未満のＣＡＧリピートを含有しているＨＴＴ  ｍＲＮＡを意味する。ポリヌクレオチドリピートの数は、同じポリヌクレオチドリピート病の個体間で同じである必要はない。なぜなら、個体間でリピートの数にばらつきがあるからである。例えば、ハンチントン病の１被検体は、例えば、正常なＨＴＴ対立遺伝子については２８のＣＡＧリピートを、そして突然変異体ＨＴＴ対立遺伝子については８０のＣＡＧリピートを有し得るが、別の被検体は、正常なＨＴＴ対立遺伝子については１３のＣＡＧリピートを、そして突然変異体ＨＴＴ対立遺伝子については６０のリピートを有し得る。
【００３９】
本明細書中で使用される場合は、用語「突然変異体対立遺伝子」は、疾患を引き起こす可能性がある遺伝子の対立遺伝子を意味する。用語「正常な対立遺伝子」は、疾患を引き起こすことができない遺伝子の対立遺伝子を意味する。ハンチントン病の状況では、ＨＴＴ遺伝子の正常な対立遺伝子は３６未満のＣＡＧリピートを含み、一方、「突然変異体対立遺伝子」は３６を上回るＣＡＧリピートを含む。
【００４０】
「電子対」は、他の原子と結合していないまたは他の原子と共有されていない価電子対を意味する。
【００４１】
用語「細胞透過性ペプチド」（ＣＰＰ）または「細胞内取り込みを増強するペプチド部分」は互換的に使用され、「輸送ペプチド」、「担体ペプチド」、または「ペプチド導入ドメイン」とも呼ばれる陽イオン性細胞透過性ペプチドを意味する。ペプチドは、所定の細胞培養物集団の細胞の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内の細胞の透過を誘導する能力を有し、全身投与された場合には、インビボで多数の組織内でのマクロ分子局在化を可能にする。１つの実施形態では、細胞透過性ペプチドはアルギニンリッチペプチド輸送体である。別の実施形態では、細胞透過性ペプチドはペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）またはＴａｔペプチドである。これらのペプチドは当該分野で周知であり、例えば、その全体が言及されたことにより組み込まれたこととなる米国特許公開番号２０１０−００１６２１５  Ａ１の中で開示されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドに対するペプチドのコンジュゲーションに特に好ましい手法は、その全体が言及されたことにより組み込まれたこととなるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／１５０９６０の中に見ることができる。ペプチドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの好ましい実施形態は、ＣＰＰとアンチセンスオリゴヌクレオチドとの間のリンカーとしてグリシンを利用する。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、（Ａｒｇ）６Ｇｌｙのようなアルギニンリッチペプチドに対して結合され得る（オリゴヌクレオチドに対して６個のアルギニンと１個のグリシンが連結されている）。一例として、このペプチドはＰＭＯにコンジュゲートさせることができ、「Ｒ６−Ｇ−ＰＭＯ」としても知られている。
【００４２】
「単離された」により、その天然のままの状態においてそれに通常付随する構成要素を実質的または原則的に含まない材料が意味される。例えば、「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたオリゴヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合は、自然界に存在する状態においてそれに隣接している配列から精製されているか、または隣接している配列から取り除かれているポリヌクレオチド、例えば、ゲノム中でその断片に隣接している配列から取り除かれたＤＮＡ断片を意味し得る。用語「単離する（ｉｓｏｌａｔｉｎｇ）」は、これが細胞に関する場合には、供給源である被検体（例えば、ポリヌクレオチドリピート病の被検体）からの細胞（例えば、繊維芽細胞、リンパ芽球）の精製を意味する。ｍＲＮＡまたはタンパク質の状況では、「単離する（ｉｓｏｌａｔｉｎｇ）」は、供給源、例えば、細胞からのｍＲＮＡまたはタンパク質の回収を意味する。
【００４３】
本明細書中で使用される場合は、「十分な長さ」は、突然変異体ＲＮＡの延長されたリピートの中の少なくとも８、より典型的には８〜３０の連続するヌクレオ塩基に対して相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。十分な長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、突然変異体ＲＮＡ中の延長されたリピートに特異的にハイブリダイズできる少なくとも最小数のヌクレオチドを有する。好ましくは、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、および４０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む、１０から４０までのヌクレオチドの長さである。１つの実施形態では、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、１０から約３０ヌクレオチドまでの長さである。別の実施形態では、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、１５から約２５ヌクレオチドまでの長さである。なお別の実施形態では、十分な長さのオリゴヌクレオチドは２０から約３０ヌクレオチドまでの長さである。１つの実施形態では、ＨＤの処置用のアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは２２ヌクレオチドである。
【００４４】
本明細書中で使用される場合は、用語「細胞を接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ  ａ
ｃｅｌｌ）」、「導入する（ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ）」または「送達する（ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ）」は、当該分野で日常的に行われる方法、例えば、トランスフェクション（例えば、リポソーム、リン酸カルシウム、ポリエチレンイミン）、エレクトロポレーション（例えば、ヌクレオフェクション）、マイクロインジェクションによる、本発明のオリゴヌクレオチドの細胞への送達を意味する。
【００４５】
本明細書中で使用される場合は、用語「定量化する（ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ）」、「定量化」、または他の関連する語句は、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の単位容量中の量、質量、あるいは濃度を決定することを意味する。
【００４６】
本明細書中で使用される場合は、被検体（例えば、ヒトのような哺乳動物）の「処置」または細胞の「処理」は、個体または細胞の天然の経過を変化させるための試みにおいて使用される任意のタイプの介入である。処置／処理として、薬学的組成物の投与が挙げられるがこれに限定されるわけではなく、予防的に、あるいは、病理学的事象の開始または病原体との接触後のいずれかに行われ得る。
【００４７】
オリゴヌクレオチドの構造的特徴
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは非電荷である。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは電荷を持つ。
【００４８】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、「モルホリノオリゴマー」、「ＰＭＯ」、「ＰＭＯＸ」、「ＰＰＭＯ」、または「ＰＭＯ＋」であり得る。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、ＰＭＯは、当該分野で公知の任意の様式で修飾され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオチド間結合が修飾され得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオチド間結合は、陽イオン性修飾を有し得る。陽イオン性修飾はＡＰＮ修飾であり得る。好ましくは、修飾されたヌクレオチド間結合は、Ｔ、Ｃ、またはＡサブユニットに由来する。例えば、１つの実施形態では、ＰＭＯは陽イオン性修飾を含み得る。ＰＭＯはＡＰＮ修飾されたＰＭＯであり得、これは、「ＰＭＯａｐｎ」または「ＡＰＮ」と呼ばれ得る。
【００４９】
実質的に非電荷のオリゴヌクレオチドは、本発明の態様にしたがって、例えば、各１０の非電荷結合当たり約４〜５のような、各２〜５毎の非電荷結合あたり約１までの電荷を持つ結合を含むように修飾され得る。特定の実施形態では、骨格結合のうちの約２５％が陽イオン性である場合に、アンチセンス活性の最適な改善が見られ得る。特定の実施形態では、少数の、例えば、１０〜２０％の陽イオン性結合を持つ場合、または、陽イオン性結合の数が、約６０％のように５０〜８０％の範囲にある場合に、増強が見られ得る。
【００５０】
特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、段階的な固相合成により、混合物または非電荷の骨格結合および陽イオン性骨格結合を有しているオリゴヌクレオチドの合成に関して上記および下記に記載される参考文献の中で詳細に記載されている方法を使用して調製され得る。いくつかの場合には、例えば、薬物動態を増強するため、または化合物の捕捉もしくは検出を容易にするために、アンチセンス化合物に対してさらなる化学的部分を付加することが所望され得る。そのような部分は、標準的な合成方法にしたがって共有結合により付着され得る。例えば、ポリエチレングリコール部分または他の親水性ポリマー（例えば、１〜１００個の単量体サブユニットを有しているもの）の付加が、溶解度の増大に有用であり得る。
【００５１】
フルオレセインまたは放射標識された基のようなレポーター部分が検出の目的のために付着され得る。あるいは、オリゴマーに付着されたレポーター標識は、標識された抗体またはストレプトアビジンに結合することができる、抗原またはビオチンのようなリガンドであり得る。アンチセンス化合物の付着または修飾のための部分の選択においては、生体適合性であり、そして望ましくない副作用を伴わずに被検体によりおそらくは寛容化され得る群の化学化合物を選択することが、一般的には当然望ましい。
【００５２】
いくつかの実施形態では、アンチセンス化合物は、上記のタイプの非電荷結合が散りばめられて組み込まれた選択された数の陽イオン性結合を含むように構築され得る。非電荷かつ陽イオン性の両方であるサブユニット間結合は、好ましくは、以下の構造を有しているリンを含有している結合であり：
【化１０】
2020078347.tif 000017
（式中、
Ｗは、ＳまたはＯであり、好ましくはＯであり、
Ｘ＝Ｒ１、ＮＲ１１Ｒ１２、またはＯＲ１６であり、
Ｙ＝ＯまたはＮＲ１７である）、
そして、オリゴマー中の上記結合はそれぞれ以下から選択される：
（ａ）非電荷結合（ａ）（式中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１６、およびＲ１７はそれぞれが独立して、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択される）；または
（ｂ１）陽イオン性結合（ｂ１）［式中、Ｒ１は以下の式の部分である：
【化１１】
2020078347.tif 000018
（ｑは、０、１、２、３、または４であり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、およびホルムアミジニル部分からなる群より選択され、そして
Ｒ３は、水素およびＣ１〜Ｃ５アルキルからなる群より選択されるか、あるいは
Ｒ２とＲ３とが一緒になって、随意に酸素ヘテロ原子を含有している５〜７員複素環を形成し、ここでは、上記環は、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、フェニル、ハロゲン、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で随意に置換され得；
Ｒ４は、不在、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびアラルキルからなる群より選択される）］；
（ｂ２）陽イオン性結合（ｂ２）［式中、Ｘ＝ＮＲ１１Ｒ１２であり、Ｙ＝Ｏであり、そしてＮＲ１１Ｒ１２は以下の式の随意に置換されたピペラジノ基を表す：
【化１２】
2020078347.tif 000019
（式中、
Ｒはそれぞれ独立して、ＨまたはＣＨ３であり、
Ｒ１４は、Ｈ、ＣＨ３、または不在であり、そして
Ｒ１３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、５〜７員の置換されたもしくは非置換アリール、ヘテロアリール、またはＮおよびＯからなる群より選択される最大２個のヘテロ原子を含有している複素環式環、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｚ−Ｌ−ＮＲＲ、Ｚ−Ｌ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｚ−Ｌ−ＣＯＯＨ、Ｚ−Ｌ−ＳＨ、Ｚ−Ｌ−ＰＰｈ３、Ｚ−Ｌ−Ｒ２１−Ｒ２２、コール酸塩、ならびに［Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ’ＮＨ］ｍＨより選択され、式中、ＺはＣ（Ｏ）または直接結合であり、Ｌは、アルキル、アルコキシ、およびアルキルアミノより選択される結合を有している、１８原子までの長さ、好ましくは１２原子まで、より好ましくは８原子までの長さの随意のリンカーであり、Ｒ’は、自然界に存在するアミノ酸の側鎖またはその１炭素もしくは２炭素ホモログであり、ｍは１〜６、好ましくは１〜４であり；Ｒ２１は５〜７員のアリール環であり、そしてＲ２２は、ＮおよびＯからなる群より選択される４個までのヘテロ原子を含有している５〜７員のヘテロアリール環である）］；
（ｂ３）陽イオン性結合（ｂ３）［式中、Ｘ＝ＮＲ１１Ｒ１２であり、Ｙ＝Ｏであり、Ｒ１１＝ＨまたはＣＨ３であり、そしてＲ１２＝ＬＮＲ１３Ｒ１４Ｒ１５であり、式中、Ｌ、Ｒ１３、およびＲ１４は上記で定義されたとおりであり、そしてＲ１５は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ１〜Ｃ６（アルコキシ）アルキルである］；ならびに
（ｂ４）陽イオン性結合（ｂ４）［式中、Ｙ＝ＮＲ１７であり、Ｘ＝ＯＲ１６であり、そしてＲ１７＝ＬＮＲ１３Ｒ１４Ｒ１５であり、式中、Ｌ、Ｒ１３、Ｒ１４、およびＲ１５は上記で定義されたとおりであり、そしてＲ１６は、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである］；
そして少なくとも１つの上記結合が陽イオン性結合（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、および（ｂ４）より選択される。
【００５３】
特定の実施形態では、オリゴマーは、少なくとも２つの連続するタイプ（ａ）の結合（すなわち、非電荷結合）を含み得る。さらなる実施形態では、オリゴマー中の結合のうちの少なくとも５％が陽イオン性結合（すなわち、タイプ（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、または（ｂ４））であり、例えば、１０％〜６０％、好ましくは２０〜５０％の結合が陽イオン性結合であり得る。
【００５４】
１つの実施形態では、少なくとも１つの結合がタイプ（ｂ１）の結合であり、ここでは、ｑは１であり、Ｒ２およびＲ３は水素であり、そしてＲ４は不在である。
【００５５】
１つの実施形態では、少なくとも１つの結合がタイプ（ｂ２）の結合であり、ここでは、好ましくは、ＲはそれぞれＨであり、Ｒ１４はＨ、ＣＨ３、または不在であり、そしてＲ１３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、およびＣ（Ｏ）−Ｌ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２より選択される。Ｒ１３の後者の２つの実施形態は、それぞれ、ピペラジン環に直接付着したか、またはリンカー基Ｌに吊り下がっているかのいずれかであるグアニジニル部分を提供する。合成を容易にするためには、Ｒ１３中の可変のＺは、好ましくは、示されるようなＣ（Ｏ）（カルボニル）である。
【００５６】
リンカー基Ｌは、上記のように、Ｌ中の末端原子（例えば、カルボニルまたは窒素に隣接するもの）が炭素原子であるという条件で、その骨格の中に、アルキル（例えば、−ＣＨ２−ＣＨ２−）、アルコキシ（−Ｃ−Ｏ−）、およびアルキルアミノ（例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−）より選択される結合を含む。分岐した結合（例えば、−ＣＨ２−ＣＨＣＨ３−）が可能であるが、リンカーは好ましくは非分岐である。１つの実施形態では、リンカーは炭化水素リンカーである。そのようなリンカーは構造−（ＣＨ２）ｎ−を有し得、式中、ｎは１〜１２、好ましくは２〜８、より好ましくは２〜６である。
【００５７】
いくつかの実施形態では、モルホリノサブユニット（ヌクレオチド）は以下の構造を有する：
【化１３】
2020078347.tif 000020
式中、Ｐｉは塩基対合部分であり、上記で示される結合は、（ｉ）の窒素原子を隣接するサブユニットの５’炭素に対して連結する。塩基対合部分Ｐｉは同じであっても異なっていてもよく、一般的には、標的核酸に結合する配列を提供するように設計される。
【００５８】
モルホリノサブユニットを連結するための上記結合タイプ（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、および（ｂ４）の実施形態の使用は以下のようにグラフで説明され得る：
【化１４】
2020078347.tif 000021
【００５９】
必ずしもそうではないが、好ましくは、オリゴマー中の全ての陽イオン性結合が同じタイプの結合、すなわち、全てがタイプ（ｂ１）、全てがタイプ（ｂ２）、全てがタイプ（ｂ３）、または全てがタイプ（ｂ４）である。
【００６０】
さらなる実施形態では、陽イオン性結合は、以下に示されるように、結合（ｂ２’）および（ｂ２”）より選択される。ここでは、（ｂ２’）は本明細書中では「Ｐｉｐ」結合と呼ばれ、（ｂ２”）は本明細書中では「ＧｕＸ」結合と呼ばれる：
【化１５】
2020078347.tif 000022
【００６１】
上記構造中では、ＷはＳまたはＯであり、好ましくはＯである。Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ別々に、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルより選択され、好ましくは、メチルまたはエチルである。そしてＡは、（ｂ２’）および（ｂ２”）中の１つ以上の炭素原子上の水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルを示す。好ましくは、ピペラジン環中の環炭素は非置換である。しかし、これらはメチルのような非干渉置換基を含み得る。好ましくは、最大で１個または２個の炭素原子がそのように置換される。さらなる実施形態では、結合のうちの少なくとも１０％がタイプ（ｂ２’）または（ｂ２”）の結合であり、例えば、１０％〜６０％、好ましくは２０％〜５０％の結合がタイプ（ｂ２’）または（ｂ２”）の結合であり得る。
【００６２】
特定の実施形態では、オリゴマーは上記タイプ（ｂ２’）の結合を含まない。あるいは、オリゴマーはタイプ（ｂ２）の結合を含まず、式中、ＲはそれぞれＨであり、Ｒ１３はＨまたはＣＨ３であり、そしてＲ１４は、Ｈ、ＣＨ３、または不在である。
【００６３】
モルホリノサブユニットはまた、以下にさらに記載されるように、非リン系サブユニット間結合によっても連結され得、この場合、少なくとも１つの結合が上記のような吊り下がった陽イオン性基で修飾される。
【００６４】
それらの非修飾の状態では非電荷であるが、吊り下がったアミン置換基もまた持つことができる他のオリゴヌクレオチドアナログ結合が使用され得る。例えば、モルホリノ環上の５’窒素原子が、スルファミド結合または尿素結合（ここでは、リンがそれぞれ炭素または硫黄で置き換えられる）において利用され得、上記構造（ｂ４）中の５’窒素原子と同様の様式で修飾され得る。
【００６５】
全てが陽イオン性で連結されたオリゴマーを含む、任意の数の陽イオン性結合を有しているオリゴマーが提供される。しかし、好ましくは、オリゴマーは部分的に、例えば、１０％〜８０％の電荷を持つ。好ましい実施形態では、約１０％〜６０％、好ましくは２０％〜５０％の結合が陽イオン性である。
【００６６】
１つの実施形態では、陽イオン性結合が骨格に沿って散りばめられて組み込まれる。部分的に電荷を持つオリゴマーは好ましくは、少なくとも２つの連続する非電荷結合を含む。すなわち、オリゴマーは好ましくは、その全長にわたり厳密に交互のパターンを有さない。
【００６７】
陽イオン性結合のブロックと非電荷結合のブロックとを有しているオリゴマーもまた考えられる。例えば、非電荷結合の中央のブロックに陽イオン性結合のブロックが隣接し得、またその逆でもあり得る。１つの実施形態では、オリゴマーは、ほぼ等しい長さの５’領域、３’領域、および中央領域を有し、中央の領域の中の陽イオン性結合の百分率は、約５０％を上回り、好ましくは約７０％を上回る。
【００６８】
アンチセンスの用途において使用されるオリゴマーは、一般に、約１０から約４０サブユニットまでの長さの範囲であり、より好ましくは約１０から３０サブユニット、典型的には１５〜２５塩基の範囲である。例えば、アンチセンス化合物について有用な長さである１９〜２０のサブユニットを有している本発明のオリゴマーは、理想的には、２〜１０個、例えば、４〜８個の陽イオン性結合と、残りの非電荷結合とを有し得る。１４〜１５のサブユニットを有しているオリゴマーは、理想的には、２〜７個、例えば、３個、４個、または５個の陽イオン性結合と、残りの非電荷結合とを有し得る。
【００６９】
モルホリノ環構造はそれぞれが塩基対合部分を支えて、典型的には処理される細胞中または処置される被検体中の選択されたアンチセンス標的にハイブリダイズするように設計される塩基対合部分の配列を形成する。塩基対合部分は、天然のままのＤＮＡもしくはＲＮＡ（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ）、またはヒポキサンチン（ヌクレオシドイノシンの塩基構成要素）もしくは５−メチルシトシンのようなアナログ中に見られるプリンあるいはピリミジンであり得る。
【００７０】
上記のように、特定の実施形態は、ＰＭＯ−Ｘオリゴマーおよび修飾された末端基を有しているものを含む、新規のサブユニット間結合を含有しているオリゴマーに関する。いくつかの実施形態では、これらのオリゴマーは、対応する非修飾オリゴマーよりもＤＮＡおよびＲＮＡに対して高い親和性を有し、他のサブユニット間結合を有しているオリゴマーと比較して、改善された細胞送達、効力、および／または組織分布特性を示す。１つの実施形態では、オリゴマーは、少なくとも１つの本明細書中で定義されるタイプ（Ｂ）のサブユニット間結合を含む。オリゴマーはまた、１つ以上の本明細書中で定義されるタイプ（Ａ）のサブユニット間結合を含み得る。様々なタイプの結合およびオリゴマーの構造的特徴および特性が、以下の考察においてさらに詳細に記載される。これらのオリゴマーおよび関連するオリゴマーの合成は、その全体が言及されたことにより組み込まれたこととなる、共有に係る米国特許出願番号１３／１１８，２９８に記載されている。
【００７１】
特定の実施形態では、本発明は、ヒトの疾患と関係がある標的配列に対して配列相補性を有しており、式：
【化１６】
2020078347.tif 000023
［式中、Ｎｕはヌクレオ塩基であり；
Ｒ１は選択される、式：
【化１７】
2020078347.tif 000024
（ｑは、０、１、２、３、または４であり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、およびホルムアミジニル部分からなる群より選択され、そして
Ｒ３は、水素およびＣ１〜Ｃ５アルキルからなる群より選択されるか、または
Ｒ２とＲ３とが一緒になって酸素ヘテロ原子を随意に含有している５〜７員複素環を形成し、ここでは、上記環は、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、フェニル、ハロゲン、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で随意に置換され得；
Ｒ４は、不在、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびアラルキルからなる群より選択される）の部分であり；
Ｒｘは、ＨＯ−、ヌクレオチド、細胞透過性ペプチド部分、およびピペラジニルからなる群より選択され；
Ｒｙは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ヌクレオチド、ペプチド部分、アミノ酸、ホルムアミジニル部分、およびアシルからなる群より選択され；そして
Ｒｚは、不在、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびアシルからなる群より選択される］を有しているヌクレオチドおよびその薬学的に許容され得る塩の配列を含むオリゴヌクレオチドが提供される。
【００７２】
Ｎｕは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、およびヒポキサンチンからなる群より選択され得る。より好ましくは、Ｎｕはチミンまたはウラシルである。
【００７３】
いくつかの実施形態では、Ｒ１基のうちの約５０〜９０％がジメチルアミノ（すなわち、Ｒ１’）である。好ましくは、Ｒ１基のうちの約６６％（３分の２）がジメチルアミノである。
【００７４】
Ｒ１は以下からなる群より選択され得る：
【化１８】
2020078347.tif 000025
【００７５】
好ましくは、オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドが以下の式を有する：
【化１９】
2020078347.tif 000026
（式中、Ｒｘ、Ｒｙ、Ｒｚ、およびＮｕは上記に記載されたとおりである。好ましくは、Ｎｕはチミンまたはウラシルである）。
【００７６】
チミン（Ｔ）が、上記化学的修飾を含有している好ましい塩基対合部分（ＮｕまたはＰｉ）であるが、当業者に公知の任意の塩基サブユニットが、塩基対合部分として使用され得る。
【００７７】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明は、（ＣＣＧ）ｎ、（ＣＴＧ）ｎ、（ＴＴＣ）ｎ、（ＮＧＣ）ｎ、（ＧＮＣ）ｎ、（ＣＡＧＧ）ｎ、（ＡＧＡＡＴ）ｎ、および（ＣＧＣＧ４ＣＧ４）ｎ（配列番号２３）からなる群より選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供し、ここでは、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｎは約３から約１０までである。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、（ＧＣＴ）ｎおよび（Ｇ２Ｃ４）ｎからなる群より選択される配列を含む。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは（ＧＣＴ）ｎである。この最後の態様では、ｎは約７であり得る。１つの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列（ＧＣＴ）７Ｇ（配列番号２１）を含む。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは（Ｇ２Ｃ４）ｎであり、ｎについての好ましい範囲は３〜１０であり、より好ましくは４である。
【００７８】
様々な延長リピート障害の処置に適している本発明の例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列が表１に示される。
【００７９】
ハンチントン病
ＨＤは、認知機能低下、認知症、および運動協調性の喪失に関連する、治療法がない生死にかかわる神経変性疾患である。これは、ハンチントン（ＨＴＴ）遺伝子のコード領域中のポリグルタミン鎖をコードするＣＡＧトリヌクレオチドリピートの長さの進行性かつ遺伝性の増大を特徴とする。これらのリピートは、代々、数が増加し得る。ＨＴＴ遺伝子の正常な対立遺伝子は３６未満のＣＡＧリピートを含むが、突然変異体対立遺伝子は３６を上回るリピートを含む。ほとんどのＨＤ患者は、１つの正常な対立遺伝子と１つの突然変異体である病因対立遺伝子とを保有する。機能的には、ＣＡＧリピートの異常な蓄積が、突然変異体ＨＤタンパク質に毒性機能獲得をもたらし、これが突然変異体ＨＤタンパク質の凝集を引き起こし、タンパク質の堆積（すなわち、封入体）を形成して、細胞死を誘導すると考えられている。疾患の重篤度は一般的に、突然変異体ＨＴＴタンパク質中の延長されたリピートの程度を反映する。
【００８０】
好ましい実施形態では、ＨＤを処置するためのＰＭＯａｐｎのオリゴマーの構造は、  
５’ＧＣａｐｎＴ  ＧＣａｐｎＴ  ＧＣａｐｎＴ  ＧＣａｐｎＴ  ＧＣａｐｎＴ  ＧＣａｐｎＴ  ＧＣａｐｎＴ  Ｇ  ３’（配列番号２１）である。
【００８１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの任意の塩基（すなわち、チミン、アデニン、シトシン、およびグアニン）は、陽イオン性結合（例えば、ａｐｎ結合）で修飾され得る。上記に示されるＰＭＯａｐｎにおいては、チミン（Ｔ）がシトシンとの間に、上付きのａｐｎにより示されるａｐｎ結合を有する。他の結合は、好ましくは、リン原子に連結されたジメチルアミノを有する。上記配列は、ハンチントンの突然変異体ＲＮＡ中の延長されたリピートに相補的である。ＨＤの処置のための他の例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列が以下に示される：
ＡＯＮ＃１：５’−ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ−３’（配列番号３）
ＡＯＮ＃２：５’−ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ−３’（配列番号４）。
【００８２】
これらのアンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、本明細書中に開示される任意の陽イオン性サブユニット間結合により修飾され得る。
【００８３】
ＤＭ１／ＤＭ２
１型筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１）および２型筋強直性ジストロフィー（ＤＭ２）は、それぞれ、転写物である筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）およびジンクフィンガータンパク質９（ＺＮＦ９）の３’−ＵＴＲならびにイントロン１領域中の長いｐｏｌｙＣＵＧおよびｐｏｌｙＣＣＵＧリピートと関係がある。正常な個体は３０程度のＣＴＧリピートを有するが、ＤＭＩ患者は５０〜１０００までの範囲のより多数のリピートを保有する。この疾患の重篤度および発症の年齢は、このリピートの数と相関関係がある。成人で発症した患者はより軽度の症候を示し、１００未満のリピートを有し、若年で発症したＤＭ１患者は５００程度のリピートを保有し、そして先天性の症例は、通常、およそ１０００のＣＴＧリピートを有する。ＣＵＧリピートを含有している延長された転写物は二次構造を形成し、核内フォーカスの形態で核の中に蓄積し、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＮＡ−ＢＰ）を隔離する。
【００８４】
ＤＭ１の処置のための他の例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが以下に示される：
ＡＯＮ＃１：５’−ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ−３’（配列番号９）
ＡＯＮ＃２：５’−ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ−３’（配列番号１０）。
【００８５】
ＤＭ２の処置のための他の例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが以下に示される：
ＡＯＮ＃１：５’−ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＧＧ−３’（配列番号５）
ＡＯＮ＃２：５’−ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＣＡＧ−３’（配列番号６）。
【００８６】
これらのアンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、本明細書中に開示される任意の陽イオン性サブユニット間結合により修飾され得る。
【００８７】
ＡＬＳ
ゲノムＤＮＡ中の延長されたヌクレオチドリピートを特徴とする別の疾患は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。ＡＬＳは、典型的には、症候の発症から２〜３年以内に呼吸不全により死に至る、進行性の麻痺を臨床的特徴とする生死にかかわる神経変性疾患である。ＡＬＳは西欧諸国においては３番目に一般的な神経変性疾患であり、現在は有効な治療法が存在しない。ＡＬＳ患者の一部は、例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子中の、大きなヘキサヌクレオチド（ＧＧＧＧＣＣ）リピートの延長を特徴とする（例えば、Ｒｅｎｔｏｎら（前出）およびＤｅＪｅｓｕｓ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら（前出）を参照のこと）。
【００８８】
【表１】
2020078347.tif 000027
【００８９】
１つの実施形態では、（Ｇ４Ｃ２）ｎリピートと関係があるＡＬＳの処置のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列（Ｇ２Ｃ４）１０（配列番号２４）を含む。ＡＬＳの処置のための他の例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが以下に示される：
ＡＯＮ＃１：５’−ＧＧＣ  ＣＣＣ  ＧＧＣ  ＣＣＣ  ＧＧＣ  ＣＣＣ  ＧＧＣ  ＣＣＣ−３’（配列番号１５）
ＡＯＮ＃２：５’−ＧＧＣ  ＣＣＣ  ＧＧＣ  ＣＣＣ  ＧＧＣ  ＣＣＣ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＣＣＣ  ＧＧＣ−３’（配列番号１６）。
【００９０】
これらのアンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、本明細書中に開示される任意の陽イオン性サブユニット間結合により修飾され得る。
【００９１】
本発明の方法
１つの態様において、本発明は、細胞を、突然変異体ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするように延長されたヌクレオチドリピートに対して十分な長さおよび相補性のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含む、対応する野生型ｍＲＮＡまたはタンパク質と比較して、ヌクレオチドリピート病と関係がある対立遺伝子を含有している突然変異体ヌクレオチドリピートにより産生される突然変異体ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を選択的に低下させるための方法を提供する。１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは配列（ＧＣＴ）ｎを含み（ここでは、ｎは約３から約１０までである）、生理学的ｐＨで正電荷を持つ少なくとも１つのヌクレオシド間結合を含む。好ましくは、ｎは７である。より好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列（ＧＣＴ）７Ｇ（配列番号２１）を含む。
【００９２】
随意に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩基性窒素と、アルキル、アリール、またはアラルキル基の両方を持つヌクレオシド間結合を有し得る。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドはモルホリノを含む。
【００９３】
さらに、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが生理学的ｐＨで正電荷を持つ少なくとも１つのヌクレオシド間結合を有することを提供する。本発明はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、５．５から１２の間のｐＫａを示す少なくとも１つのヌクレオシド間結合を有することも提供する。
【００９４】
理論に束縛されるわけではないが、ＰＭＯＸオリゴマー中の正電荷を持つＡＰＮ基またはＡＰＮ誘導体は、突然変異体ｍＲＮＡの延長されたリピート中の負電荷を持つリン酸への結合を促進すると考えられる。したがって、突然変異体ＲＮＡとＰＭＯＸオリゴマーとの間でのヘテロ二本鎖の形成は、イオン性引力により、ならびにワトソン・クリック塩基対合により、互いにくっついた状態で維持され得る。
【００９５】
本発明はまた、以下の工程を含む、オリゴヌクレオチド療法での処置に対するポリヌクレオチドリピート病の被検体の応答性を決定するための方法に関する：
ｉ．被検体から細胞を単離する工程；
ｉｉ．細胞を培養する工程；
ｉｉｉ．オリゴヌクレオチドを細胞に導入する工程；
ｉｖ．細胞からｍＲＮＡまたはタンパク質を単離する工程；
ｖ．ポリヌクレオチドリピート病の病因転写物に対する遺伝子特異的プライマーを使用してｍＲＮＡを随意に逆転写し、増幅する工程であって、ここでは、上記遺伝子特異的プライマーが上記ポリヌクレオチドリピートの両方の末端に隣接している、工程；
ｖｉ．突然変異体であるポリヌクレオチドリピート病の病因ｍＲＮＡまたはタンパク質と、基準である野生型ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを定量する工程；ならびに
ｖｉｉ．突然変異体であるポリヌクレオチドリピート病の病因ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを、基準である野生型ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルと比較する工程；ならびに
ｖｉｉｉ．突然変異体であるポリヌクレオチドリピート病の病因ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルが基準である野生型ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルより低い場合に、被検体がオリゴヌクレオチド療法に対して応答性であることを決定する工程。
【００９６】
細胞は好ましくは、繊維芽細胞、リンパ芽球、および白血球細胞からなる群より選択される。
【００９７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明のオリゴヌクレオチド療法に対する任意の所定のポリヌクレオチドリピート病の被検体の応答性を決定するためのアッセイに応用され得る。したがって、本発明のアッセイは、ポリヌクレオチドリピート病の被検体がオリゴヌクレオチド療法の候補であるかどうかを決定するために有用である。
【００９８】
本発明のオリゴヌクレオチド療法がポリヌクレオチドリピート病の被検体にとっての実行可能な選択肢であるかどうか、すなわち、被検体がオリゴヌクレオチド療法に対して応答性であるかどうかを決定するために、細胞が被検体から単離され、続いて、標的であるポリヌクレオチドリピート病の病因転写物またはタンパク質のｍＲＮＡあるいはタンパク質の発現を低下させる本発明のオリゴヌクレオチドの能力がアッセイされる。
【００９９】
ポリヌクレオチドリピート病の患者から単離される細胞は限定されず、例えば、リンパ芽球、白血球細胞（ＷＢＣ）、または繊維芽細胞であり得る。これらの細胞を培養する、確立する、不死化する、および継代する方法は当該分野で日常的に行われており、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０００；第２８章に記載されている。好ましくは、細胞は繊維芽細胞である。ＷＢＣおよびリンパ芽球は、例えば、ＵＳ２０１１／０１３６１５１（これは、その全体が言及されたことにより本明細書中に組み込まれたこととなる）に開示されている当該分野で承認されている技術を使用して患者の血液試料から容易に得ることができる。さらに、当該分野で日常的に行われているように、細胞株は、エプスタイン・バーウイルスまたはＳＶ４０  Ｔ抗原のようなウイルスでの不死化により、これらの単離された細胞から確立され得る（例えば、Ｍａｌｉら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００８；２６：１９９８−２００５；Ａｌｓｏ−Ｒａｌｌｏら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０１０；１９：１０５９−６５）。好ましくは、不死化剤はＳＶ４０
Ｔ抗原である。単離された細胞および確立された細胞株の培養ならびに継代は、例えば、ＵＳ２０１１／０１３６１５１およびＶｉｌｌｅｇａｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２００５；２８．３．１−２８．３．９に開示されている方法のような、標準的な細胞培養方法を使用して行われる。
【０１００】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標準的なトランスフェクション方法（例えば、リポソームによる方法、リン酸カルシウム）、エレクトロポレーション（例えば、ヌクレオフェクション）、およびマイクロインジェクションを含むがこれらに限定されるわけではない当該分野で承認されている方法を使用して、単離された細胞または確立された細胞株に導入され得る。トランスフェクション剤、例えば、リポソームをベースとする薬剤がキットとして市販されており（例えば、ＱｉａｇｅｎによるＳｕｐｅｒｆｅｃｔ；ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００；ＲｏｃｈｅによるＦｕｇｅｎｅ）、これらのトランスフェクション剤を使用するための方法は、製造業者が推奨する説明書に従う。ヌクレオフェクションを実施するためのキット（例えば、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ｋｉｔ）は、例えば、Ｌｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から市販されている。ヌクレオフェクションは、製造業者が推奨するプロトコールにしたがって行われる。
【０１０１】
細胞もしくは確立された細胞株からｍＲＮＡおよび／またはタンパク質を単離するための方法は当該分野で日常的に行われており、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１；第４章および第１０章に記載されている。ｍＲＮＡおよびタンパク質を単離するためのキットもまた市販されている（例えば、ＱｉａｇｅｎによるＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；ＧＥによるＩｌｌｕｓｔｒａ  ＲＮＡｓｐｉｎ  ９６  ｋｉｔ；ＭｉｌｌｉｐｏｒｅによるＴｏｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）。
【０１０２】
ｃＤＮＡを作製するための方法は当該分野で日常的に行われており、単離されたｍＲＮＡの逆転写酵素を用いる逆転写を含む。逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成のキットは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）およびＥｐｉｃｅｎｔｒｅ社（ＭＭＬＶ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｃＤＮＡ  １ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ）から入手可能である。一本鎖ｃＤＮＡの合成を、続いて行われる遺伝子特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と組み合わせるキットもまた、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）およびＱｉａｇｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ）から市販されている。
【０１０３】
ｍＲＮＡを定量化する方法は当該分野で日常的に行われている。いくつかの限定ではない例として、ノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション、およびｃＤＮＡ合成とＰＣＲまたは定量的ＰＣＲとの組み合わせが挙げられる。好ましい実施形態では、ｍＲＮＡがｃＤＮＡ合成により定量化され、続いて、ポリヌクレオチドリピート病の病因であるリピート配列（例えば、ハンチントン病についてはＨＴＴ中のＣＡＧ）の両方の末端に隣接する遺伝子特異的プライマーを用いるＰＣＲが行われる。タンパク質を定量化する方法もまた当該分野で日常的に行われており、これには例えば、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。これらの方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１；第４章、第１０章、第１５章）に記載されている。
【０１０４】
ｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡから増幅された突然変異体対立遺伝子および正常な対立遺伝子のｍＲＮＡまたはＰＣＲ産物のレベルは、様々な当該分野で承認されている方法を使用して比較され得る。１つの実施形態では、ＰＣＲ産物（「アンプリコン」）は、例えば、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を使用するデンシトメトリーによりアガロースゲル上で定量化され得る。別の実施形態では、定量化は、定量的ＰＣＲを使用して行われる（例えば、Ｆｒａｇａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２００８，００：１０．３．１−１０．３．３４を参照のこと）。
【０１０５】
本開示はまた、開示されるオリゴマーの製剤および送達も提供する。したがって、１つの実施形態においては、本開示は、本明細書中で開示されるオリゴマーおよび薬学的に許容され得るビヒクルを含有している組成物に関する。標的核酸に対するアンチセンスオリゴマーの効率的な送達は、処置の重要な局面である。アンチセンスオリゴマーの送達経路として、経口経路および非経口経路を含む様々な全身経路、例えば、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、および筋肉内、ならびに吸入、経皮、および局所送達が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。適切な経路は、処置される被検体の症状に応じて適切に、当業者により決定され得る。血管循環または血管外循環、血液またはリンパ系、および脳脊髄液が、ＲＮＡが導入され得るいくつかの非限定的な部位である。
【０１０６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意の当該分野で承認されている方法により被検体の神経系に送達され得る。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの末梢血への注射が、拡散性の手段および／または積極的な手段により末梢神経に上記試薬を送達するために使用され得る。あるいは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞に対する上記試薬の送達を達成するための血液／脳関門（ＢＢＢ）の横断を促進するように修飾され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチド技術および送達ストラテジーにおける具体的な最近の進歩は、ニューロン障害にアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する範囲を広げた（Ｆｏｒｔｅ，Ａ．ら、２００５．Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ６：２１−２９；Ｊａｅｇｅｒ，Ｌ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｗ．Ａ．Ｂａｎｋｓ．２００５．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０６：２３７−２５１；Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ，Ｓ．Ｖ．ら、２００４．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：５０−６０；上記は、言及されたことによりそれらの全体が本明細書中に組み入れられたこととなる）。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）化合物として作製され得る。ＰＮＡ試薬はそれぞれ、ＢＢＢを横断することが同定されている（Ｊａｅｇｅｒ，Ｌ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｗ．Ａ．Ｂａｎｋｓ．２００５．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０６：２３７−２５１）。被検体の、例えば、血管作用薬での処置もまた、ＢＢＢを横断する輸送を促進することが記載されている（Ｉｄ）。ＢＢＢを横切って積極的に輸送される薬剤に対して本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドをつなぐこと（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）もまた、送達機構として使用され得る。１つの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、脳室内に（ｉｃｖ）送達される。
【０１０７】
特定の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、経皮的方法により（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、例えば、エマルジョンへの組み込みにより、随意にリポソームにパッケージされたそのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて）送達され得る。そのような経皮的であり、そしてエマルジョン／リポソームに媒介される送達方法は、当該分野において、例えば、米国特許第６，９６５，０２５号（その内容は言及されたことにより本明細書中に組み入れられたこととなる）中でアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達について記載されている。
【０１０８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、体内埋め込み用装置を介しても送達され得る。そのような装置の設計は当該分野で承認されているプロセスであり、例えば、合成のインプラントの設計が、例えば、米国特許第６，９６９，４００号（その内容は言及されたことによりその全体が本明細書中に組み入れられたこととなる）に記載されている。
【０１０９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該分野で承認されている技術（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、融合、リポソーム、コロイド状ポリマー粒子、ならびにウイルスベクターおよび非ウイルスベクター、さらには当該分野で公知の他の手段）を使用して細胞に導入され得る。選択される送達方法は、少なくとも、処理される細胞および細胞の位置によって異なり、当業者に明らかであろう。例えば、位置は、リポソームを向かわせるための特異的マーカーを表面上に持つリポソーム、標的細胞を含有している組織への直接の注入、特異的受容体が媒介する取り込み、ウイルスベクターなどにより達成され得る。
【０１１０】
当該分野で公知であるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、リポソームに媒介される取り込み、脂質複合体、ポリリジンに媒介される取り込み、ナノ粒子に媒介される取り込み、および受容体に媒介されるエンドサイトーシス、ならびに、マイクロインジェクション、透過化処理（例えば、ストレプトリジン−Ｏでの透過化処理、陰イオン性ペプチドでの透過化処理）、エレクトロポレーション、および当該分野で公知の様々な非侵襲性の非エンドサイトーシス性の送達方法（言及されたことによりその全体が本明細書中に組み込まれたこととなるＤｏｋｋａ  ａｎｄ  Ｒｏｊａｎａｓａｋｕｌ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ４４，３５−４９を参照のこと）のようなさらなる非エンドサイトーシス性の送達様式を含む方法を使用して送達され得る。
【０１１１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理学的および／または薬学的に許容され得る任意の従来のビヒクルあるいは担体中で投与され得る。そのような組成物には、当業者により使用される任意の様々な標準的な薬学的に許容され得る担体が含まれ得る。例として、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、水、水性エタノール、油／水エマルジョンまたはトリグリセリドエマルジョンのようなエマルジョン、錠剤およびカプセル剤が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。適切な生理学的に許容され得る担体の選択は、選択される投与様式に応じて変わるであろう。「薬学的に許容され得る担体」は、薬学的投与と適合する、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むように意図される。薬学的活性物質についてのそのような媒体および薬剤の使用は当該分野で周知である。いずれかの従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除き、組成物中でのその使用が想定される。補助的な活性化合物もまた組成物中に組み込まれ得る。
【０１１２】
本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、一般に、遊離酸または遊離塩基として利用され得る。あるいは、本発明の化合物は、酸付加塩または塩基付加塩の形態で使用され得る。本発明の遊離のアミノ化合物の酸付加塩は当該分野で周知の方法により調製され得、有機酸および無機酸から形成され得る。適切な有機酸として、マレイン酸、フマル酸、安息香酸、アスコルビン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、プロピオン酸、酒石酸、サリチル酸、クエン酸、グルコン酸、乳酸、マンデル酸、ケイ皮酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、グリコール酸、グルタミン酸、およびベンゼンスルホン酸が挙げられる。
【０１１３】
適切な無機酸として、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、および硝酸が挙げられる。塩基付加塩として、カルボキシレートアニオンとともに形成する塩基付加塩が挙げられ、また、アルカリ金属およびアルカリ土類金属（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、バリウムおよびカルシウム）ならびにアンモニウムイオンおよびその置換誘導体（例えば、ジベンジルアンモニウム、ベンジルアンモニウム、２−ヒドロキシエチルアンモニウムなど）より選択されるもののような有機陽イオンおよび無機陽イオンとともに形成される塩が挙げられる。したがって、用語「薬学的に許容され得る塩」は、任意かつ全ての許容され得る塩の形態を含むように意図される。
【０１１４】
加えて、プロドラッグがまた、本発明の文脈内に含まれる。プロドラッグは、そのようなプロドラッグが患者に投与された場合に、インビボで化合物を放出する任意の共有結合で結合した担体である。プロドラッグは、一般に、修飾が、日常的に行われる操作によるかまたはインビボにおいてかのいずれかで切断されて親化合物が得られるような方法で官能基を修飾することにより調製される。プロドラッグとしては、例えば、ヒドロキシ基、アミン基、またはスルフヒドリル基が、患者に投与されると切断されてヒドロキシ基、アミン基、またはスルフヒドリル基を形成する任意の基に結合された本発明の化合物が挙げられる。したがって、プロドラッグの代表的な例としては、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのアルコール官能基およびアミン官能基の酢酸誘導体、ギ酸誘導体および安息香酸誘導体が挙げられる（しかし、これらに限定されるわけではない）。さらに、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）の場合には、メチルエステル、エチルエステルなどのようなエステルが用いられ得る。
【０１１５】
場合によっては、リポソームは、細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの取り込みを容易にするために使用され得る（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ａ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １０（１２）：１９８０−１９８９，１９９６；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．２３：１１９，１９９４；Ｕｈｌｍａｎｎら、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕａｌｅｏｔｉｄｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，第９０巻，Ｎｏ．４，２５  ５４４−５８４頁，１９９０；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．，第１４章，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２８７−３４１頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９７９を参照のこと）。ヒドロゲルもまた、例えば、ＷＯ９３／０１２８６に記載されているように、アンチセンスオリゴマーの投与のためのビヒクルとして使用され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドはマイクロスフェアまたは微粒子中で投与され得る（例えば、Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．ａｎｄ  Ｗｕ，Ｃ．Ｈ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２，３０  １９８７を参照のこと）。あるいは、アンチセンスオリゴマーと混合されたガスが充填された微小泡の使用は、米国特許第６，２４５，７４７号に記載されているように、標的組織への送達を増強し得る。徐放性組成物もまた使用され得る。これらは、フィルムまたはマイクロカプセルのような成形品の形態の中に半透性ポリマーマトリックスを含み得る。
【０１１６】
１つの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドリピート障害の症候を示している哺乳動物被検体、例えば、ヒトまたは家畜に、適切な薬学的に許容され得る担体中で投与される。アンチセンスオリゴヌクレオチドが被検体において突然変異体タンパク質の発現を選択的に低下させることが考えられる。
【０１１７】
方法の１つの態様では、被検体はヒト被検体、例えば、ポリヌクレオチドリピート病を有していると診断された患者である。患者の状態はまた、例えば、（１）免疫無防備状態にある；（２）火傷の被害者である；（３）留置カテーテルを有している；または（４）外科手術を受ける予定であるかもしくは最近外科手術を受けた患者の場合においては、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの予防的投与を決定づけ得る。１つの好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは薬学的に許容され得る担体中に含まれ、経口送達される。別の好ましい実施形態では、オリゴマーは薬学的に許容され得る担体中に含まれ、静脈内（ｉ．ｖ．）送達される。
【０１１８】
１つの実施形態では、アンチセンス化合物は、少なくとも２００〜４００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドのピーク血中濃度を得るために効果的な量および様式で投与される。典型的には、アンチセンスオリゴマーの単回用量または複数回用量が、一般的には、約１〜２週間の期間にわたり一定の間隔で投与される。
【０１１９】
経口投与について好ましい用量は、７０ｋｇあたり約１〜１０００ｍｇまでのオリゴヌクレオチドである。場合によっては、１０００ｍｇのオリゴヌクレオチド／患者を上回る用量が必要であり得る。ｉ．ｖ．投与については、好ましい用量は、７０ｋｇあたり約０．５ｍｇから１０００ｍｇまでのオリゴマーである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、短い期間にわたり一定の間隔で、例えば、２週間未満の間毎日；２日毎に１回；３日毎に１回；３〜７日毎に１回；３〜１０日毎に１回；７〜１０日毎に１回；２週間毎に１回；１カ月、２カ月毎、３カ月毎、４カ月毎、５カ月毎、または６カ月毎に１回投与され得る。しかし場合によっては、オリゴヌクレオチドは、より長い期間にわたり、例えば、数週間、数ヶ月間、または数年間にわたり間欠的に投与される。投与に続いて、または投与と同時に、抗生物質の投与あるいは他の治療処置が行われ得る。処置レジュメは、処置される被検体の免疫学的測定、他の生化学的試験および生理学的検査の結果に基づいて、示されるように調整され得る（用量、頻度、経路など）。
【０１２０】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するインビボでの処置レジュメの有効性は、投与の期間、用量、頻度、および経路、ならびに処置される被検体の状態（すなわち、予防的投与か限局性感染もしくは全身感染に応じる投与か）により様々であり得る。したがって、そのようなインビボでの治療には多くの場合、最適な治療結果を達成するためには、処置される特定のタイプの障害に適した試験によるモニタリングと、それに応じた用量または処置レジュメの調整が必要である。
【０１２１】
処置は、例えば、当該分野で公知の疾患の一般的な指標によりモニターされ得る。インビボで投与された本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与前、投与中、および投与後に被検体から採取された生物学的試料（組織、血液、尿など）から決定され得る。そのような試料のアッセイには、（１）当業者に公知の手順、例えば、電気泳動によるゲル移動度のアッセイを使用する、標的配列と非標的配列を含むヘテロ二本鎖の形成の有無のモニタリング；（２）ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、もしくはウェスタンブロッティングのような標準的な技術により決定されるような、基準である野生型ｍＲＮＡまたはタンパク質と比較した突然変異体ｍＲＮＡまたはタンパク質の量のモニタリングが含まれる。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、哺乳動物細胞により積極的に取り込まれる。さらなる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのような取り込みを容易にするために、本明細書中に記載されるように輸送部分（例えば、輸送ペプチド）にコンジュゲートされ得る。
【０１２３】
処置方法
本発明はまた、治療目的（例えば、ポリヌクレオチドリピート障害の被検体の処置）のために本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してｍＲＮＡの発現またはタンパク質の発現を低下させる方法に関する。したがって、１つの実施形態では、本発明は、疾患に関係するポリヌクレオチドリピートを含有している突然変異体ｍＲＮＡまたはタンパク質の異常な発現を特徴とするポリヌクレオチドリピート障害に罹患した個体の処置方法を提供する。
【０１２４】
１つの実施形態では、例えば、ＨＤを有している被検体由来の細胞が、突然変異体ＨＴＴ対立遺伝子から産生されるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を低下させるために、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させられる。他の実施形態では、突然変異体であるポリヌクレオチドリピートを含有している対立遺伝子から産生されるタンパク質の発現の低下が有効である、異なるポリヌクレオチドリピート障害（例えば、表１に列挙されたもののうちの１つ）を有している被検体由来の細胞が、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的配列と例示的な配列もまた表１に開示される。
【０１２５】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、突然変異体であるポリヌクレオチドリピートを含有している対立遺伝子により産生されるｍＲＮＡまたはタンパク質の異常な発現と関係がある障害を（予防的または治療的に）処置するために被検体に投与され得る。そのような処置と組み合わせて、薬理ゲノミクス（すなわち、個体の遺伝子型と、外来化合物または薬物に対するその個体の応答との間の関係性の研究）が考慮され得る。治療薬の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との間の関係を変化させることにより深刻な毒性または治療の失敗につながる可能性がある。したがって、医師または臨床医は、治療薬を投与するかどうかを決定する際、ならびに、その治療薬の投与量および／またはその治療薬での処置の治療レジュメを目的に合わせる際に、関連する薬理ゲノミクスの研究において得られた知見の適用を検討し得る。
【０１２６】
ＰＭＯａｐｎオリゴヌクレオチド、ＰＭＯオリゴヌクレオチド、およびＬＮＡオリゴヌクレオチドでの処置に応答した突然変異体ＨＴＴ転写物の発現の比較
本発明のプロセスを実行する際には、ｍＲＮＡの発現の並べての比較が、ＰＭＯａｐｎオリゴヌクレオチド、ＰＭＯオリゴヌクレオチド、およびＬＮＡオリゴヌクレオチドの間で行われた。結果は図６〜１０に示される。ＬＮＡオリゴマー、ＰＭＯオリゴマー、およびＡＰＮオリゴマーは同じ配列：５’ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＴ
ＧＣＴ  Ｇ  ３’（配列番号２１）を含む。ＬＮＡオリゴマー（Ｅｘｉｑｏｎからの注文品）は、全てのＴ塩基にＬＮＡ修飾を持つＤＮＡ骨格を含む（全部で７個の修飾）。ＡＰＮオリゴマーは、全てのＴ塩基にａｐｎ修飾を持つＰＭＯ骨格を含む（全部で７個の修飾）。ＰＭＯオリゴマーは、いずれのサブユニット間結合にもさらなる修飾を持たないＰＭＯ骨格を含む。
【０１２７】
細胞はそれぞれ、ＬＮＡオリゴ、ＰＭＯオリゴ、またはＡＰＮオリゴでヌクレオフェクトされた。実施例２３を参照のこと。ヌクレオトランスフェクションプロセスの４８時間後に残っているＲＮＡが逆転写酵素ＰＣＲを使用して定量化され、そしてＰＣＲ産物がアクリルアミドゲル上で泳動された。ＧＭ０４２８１繊維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ）由来の野生型ＨＴＴ対立遺伝子または突然変異体ＨＴＴ対立遺伝子を表しているゲルバンドの強度が、最も低い処理された試料のそれぞれの野生型または突然変異体のバンドの強度に対して正規化された。結果は図６に示される。グラフ上のそれぞれの点は、それぞれの濃度での２つのレプリカによる正規化された発現レベルの平均を表しており、２回の独立した実験が、図６のデータセットを得るために合わせられた。ゲル強度の定量化はＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ）を用いて行われた。強度の正規化、ＥＣ５０の計算、および選択性は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ａｎｄ  Ｒを用いて分析された。
【０１２８】
それぞれの対立遺伝子についての平均ＥＣ５０値が、図６に示されるデータセットから計算され、さらに、突然変異体対立遺伝子についての選択性が、同じオリゴがヌクレオフェクトされた繊維芽細胞由来の野生型対立遺伝子および突然変異体対立遺伝子のＥＣ５０から、Ｒ  ａｎｄ  Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して計算された。結果の定量的比較が図７および図９Ａに示される。ＥＣ５０の比較は、ＰＭＯおよびＡＰＮオリゴで処理された細胞が、ＬＮＡと比較して、野生型対立遺伝子と比較した突然変異体対立遺伝子のｍＲＮＡ発現を低下させたことを示す。さらに、ＡＰＮオリゴの効力は、ＥＣ５０値に基づくと、ＰＭＯオリゴを上回って改善される。
【０１２９】
結果は、ＰＭＯ、ＡＰＮ、およびＬＮＡオリゴマーにより、ハンチントン病の原因であると考えられる突然変異体ｍＲＮＡのレベルの予期しない低下と、ＰＭＯオリゴマーまたはＬＮＡオリゴマーのいずれよりも、ＡＰＮオリゴが突然変異体ｍＲＮＡの発現の低下に関してより選択的であることを示す。当業者は、リピート病ｍＲＮＡの発現を低下させるためのこの方法が、ＡＬＳ、および延長されたＣＡＧトリヌクレオチドリピートを有しているリピート病を引き起こすもののような、他のリピート病ｍＲＮＡに応用され得ることを理解するであろう。アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、ｎは好ましくは約３〜約１０である。
【０１３０】
ＰＭＯａｐｎオリゴヌクレオチド、ＰＭＯオリゴヌクレオチド、およびＬＮＡオリゴヌクレオチドでの処置に応答した突然変異体ＨＴＴタンパク質の発現の比較
上記結果は、ハンチントン病および多くの他の延長リピート病が、突然変異体であるポリヌクレオチドリピートを含有している対立遺伝子により産生されるタンパク質の発現と関係がある毒性機能獲得が原因で最終的に顕在化することを前提として、突然変異体ＨＴＴタンパク質の発現の分析に拡大された。
【０１３１】
図１１は、図６〜１０に記載されるように、同じ配列および修飾を有しているＰＭＯａｐｎ、ＰＭＯ、およびＬＮＡオリゴヌクレオチドの選択性の並べての比較を示す。ＧＭ−０４２８１細胞が、図６〜１０に記載されるようにヌクレオフェクトされた。実施例２４を参照のこと。タンパク質溶解物が調製され、抗ＨＴＴまたは抗β−アクチン一次抗体を使用してウェスタンブロット分析が行われた。得られたブロットがＴｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ（ＧＥ）上でスキャンされ、突然変異体ＨＴＴタンパク質および正常なＨＴＴタンパク質のシグナル強度がＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ）ソフトウェアで別々に定量化された。正常なＨＴＴのバンド（下）および突然変異体ＨＴＴのバンド（上）のシグナル強度が、それぞれのレーンの中のβ−アクチンシグナルに対して正規化され、次に、それぞれのＨＴＴバンドが、別のブロット上の未処理の対照試料由来の対応する正常なＨＴＴバンドまたは突然変異体ＨＴＴバンドの強度に対して正規化された。タンパク質発現の結果は、それぞれの対立遺伝子（正常、実線；突然変異体、点線）について、ＨＴＴタンパク質の発現の平均百分率、＋／−１ＳＤとしてプロットされる。図１２は、突然変異体ＨＴＴタンパク質の発現に対する野生型ＨＴＴタンパク質の発現の比としてプロットされた同じデータを示す。図１１および１２に示されるように、ＰＭＯで修飾されたオリゴヌクレオチドおよびＬＮＡで修飾されたオリゴヌクレオチドと比較して、ＡＰＮで修飾されたオリゴヌクレオチドは、野生型ＨＴＴタンパク質と比較した突然変異体ＨＴＴタンパク質の発現の低下について高い選択性を示した。
【０１３２】
結果は、ＡＰＮで修飾されたオリゴヌクレオチドによる突然変異体ＨＴＴタンパク質のレベルの予期しない低下と、ＰＭＯで修飾されたオリゴヌクレオチドによる突然変異体ＨＴＴタンパク質レベルのより少ない程度の低下を示し、しかし、ＬＮＡで修飾されたオリゴヌクレオチドによっては突然変異体ＨＴＴタンパク質レベルの低下がなかったことを示す。当業者は、リピート病タンパク質の発現を低下させるためのこの方法が、ＡＬＳおよび延長されたＣＡＧトリヌクレオチドリピートを有しているヌクレオチドリピート病を引き起こすもののような、他のリピート病ｍＲＮＡにも応用され得ることを理解するであろう。表１は、この技術が応用され得る他のリピート病を、それぞれの疾患についての例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに列挙する。
【０１３３】
ＡＰＮ関連修飾およびｐｌｕｓ関連修飾を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理に応答した突然変異体ＨＴＴタンパク質の発現の比較
ＡＰＮ関連サブユニット間結合（すなわち、ＡＰＮおよびｍａｐ）ならびにｐｌｕｓ関連サブユニット間結合（すなわち、ｐｌｕｓ、ｍｅｄａ、およびｅｔｐｉｐ）を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドの、野生型ＨＴＴタンパク質と比較して突然変異体ＨＴＴタンパク質を低下させることについての選択性が試験された。
ＰＭＯ−ａｐｎＴ：ＧＣａｐｎＴ  ＧＣａｐｎＴ  ＧＣａｐｎＴ  ＧＣａｐｎＴ  ＧＣａｐｎＴ  ＧＣａｐｎＴ  ＧＣａｐｎＴ  Ｇ（配列番号２１）
ＰＭＯ−ｍａｐＴ：ＧＣｍａｐＴＧＣｍａｐＴＧＣｍａｐＴＧＣｍａｐＴＧＣｍａｐＴＧＣｍａｐＴＧＣｍａｐＴＧ（配列番号２１）
ＰＭＯｐｌｕｓ：ＧＣ＋ＴＧＣ＋ＴＧＣ＋ＴＧＣ＋ＴＧＣ＋ＴＧＣ＋ＴＧＣ＋ＴＧ（配列番号２１）
ＰＭＯ−ｍｅｄａＴ：ＧＣｍｅｄａＴＧＣｍｅｄａＴＧＣｍｅｄａＴＧＣｍｅｄａＴＧＣｍｅｄａＴＧＣｍｅｄａＴＧＣｍｅｄａＴＧ（配列番号２１）
ＰＭＯ−ＥｔｐｉｐＴ：ＧＣＥｔｐｉｐＴＧＣＥｔｐｉｐＴＧＣＥｔｐｉｐＴＧＣＥｔｐｉｐＴＧＣＥｔｐｉｐＴＧＣＥｔｐｉｐＴＧＣＥｔｐｉｐＴＧ（配列番号２１）
【０１３４】
ＡＰＮ関連陽イオン性修飾およびｐｌｕｓ関連陽イオン性修飾についての例示的な構造が図１３に示される。ＧＭ−０４２８１細胞が図６〜１０に記載されるようにヌクレオフェクトされ、タンパク質試料が図１１および１２に記載されるように分析された。実施例２５を参照のこと。
【０１３５】
結果は、ＡＰＮ関連サブユニット間結合またはｐｌｕｓ関連サブユニット間結合を有しているオリゴヌクレオチドが、野生型ＨＴＴタンパク質と比較した突然変異体ＨＴＴタンパク質の発現の低下において予期しない高い選択性を示したことを示す。特に、試験された化合物のうち、ＡＰＮで修飾されたオリゴヌクレオチドおよびｅｔｐｉｐＴで修飾されたオリゴヌクレオチドは、突然変異体ＨＴＴタンパク質について最も高い選択性を示した（図１４および１５）。当業者は、代替えの陽イオン性修飾（例えば、ｐｌｕｓ関連サブユニット間結合）が、ＡＬＳおよび延長されたＣＡＧトリヌクレオチドリピートを有しているリピート病のようなヌクレオチドリピート病と関係がある突然変異体タンパク質の発現を低下させるために、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの中に組み込まれ得ることを理解するであろう。表１は、この技術が適用され得る他のリピート病を、それぞれの疾患についての例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに列挙する。
【０１３６】
塩基性窒素ヌクレオシド間リンカーを持つＰＭＯ−Ｘの調製
モルホリノサブユニット、修飾されたサブユニット間結合、およびそれを含有しているオリゴマーは、実施例中に、ならびに米国特許第５，１８５，４４４号および同第７，９４３，７６２号（これらは言及されたことによりそれらの全体が本明細書中に組み込まれたこととなる）に記載されているように調製され得る。モルホリノサブユニットは、以下の一般的な反応スキームＩにしたがって調製され得る。
【０１３７】
反応スキームＩ．モルホリノサブユニットの調製
【化２０】
2020078347.tif 000028
【０１３８】
反応スキーム１（式中、Ｂは塩基対合部分を表し、ＰＧは保護基を表す）に関して、モルホリノサブユニットは、示されるように、対応するリボヌクレオシド（１）から調製され得る。モルホリノサブユニット（２）は、適切な保護基前駆体、例えば、トリチルクロライドとの反応により、随意に保護され得る。３’保護基は、一般的には、以下にさらに詳細に記載されるように、固体の状態のオリゴマーの合成の間に除去される。塩基対合部分は、固相オリゴマー合成のために適切に保護され得る。適切な保護基として、アデニンおよびシトシンについてはベンゾイル、グアニンについてはフェニルアセチル、そしてヒポキサンチン（Ｉ）についてはピバロイルオキシメチルが挙げられる。ピバロイルオキシメチル基は、ヒポキサンチン複素環塩基のＮ１位に導入され得る。保護されていないヒポキサンチンサブユニットが使用され得るが、活性化反応における収率は、塩基が保護されている場合にはるかに優れている。他の適切な保護基として、同時係属中の米国特許出願番号１２／２７１，０４０（これは言及されたことによりその全体が本明細書中に組み込まれたこととなる）の中で開示されている保護基が挙げられる。
【０１３９】
活性化されたリン化合物４を用いる３の反応は、所望される結合部分５を有しているモルホリノサブユニットを生じる。構造４の化合物は、当業者に公知の任意の数の方法を使用して調製され得る。例えば、そのような化合物は、対応するアミンとオキシ塩化リンとの反応により調製され得る。これに関して、アミン出発材料は、当該分野で公知の任意の方法、例えば、実施例中および米国特許第７，９４３，７６２号に記載されているそのような方法を使用して調製され得る。
【０１４０】
構造５の化合物は、サブユニット間結合を含有しているオリゴマーの調製のための固相自動オリゴマー合成において使用され得る。そのような方法は当該分野で周知である。簡単に説明すると、構造５の化合物は、固体支持体に対するリンカーを含むように５’末端で修飾され得る。例えば、化合物５は、Ｌ１１およびＬ１５を含有しているリンカーにより固体支持体に連結され得る。例示的な方法が、図１および２に示される。一旦、支持されると、保護基（例えば、トリチル）が取り除かれ、遊離のアミンが構造５の第２の化合物の活性化されたリン部分と反応させられる。この順序が、所望される長さのオリゴが得られるまで繰り返される。末端の５’末端中の保護基は、除去され得るか、または５’修飾が所望される場合はそのままにされるかのいずれかであり得る。オリゴは、任意の数の方法、例えば、図３および４に示されるような、ＤＴＴ、それに続く水酸化アンモニウムでの処理を使用して、固体支持体から除去され得る。
【０１４１】
修飾されたモルホリノサブユニットおよびモルホリノオリゴマーの調製は、実施例にさらに詳細に記載される。任意の数の修飾された結合を含有しているモルホリノオリゴマーが、本明細書中に記載される方法、当該分野で公知のおよび／または本明細書中の参考文献に記載されている方法を使用して、調製され得る。これまでに記載されている（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８０３６１２７を参照のこと）ように調製されたモルホリノオリゴマーのグローバルな（ｇｌｏｂａｌ）修飾もまた、実施例に記載される。
【０１４２】
用語「保護基」は、化合物のいくつかの反応性部分または全ての反応性部分をブロックし、保護基が除去されるまで、そのような部分が化学反応に関与することを妨げる化学的部分、例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９９）の中で列挙され、記載されているそのような部分を意味する。様々な保護基が使用される場合は、それぞれの（異なる）保護基が異なる手段により除去可能であることが有利であり得る。完全に共通点のない反応条件下で切断される保護基は、そのような保護基のディファレンシャルな除去を可能にする。例えば、保護基は、酸、塩基、および加水分解により除去され得る。トリチル、ジメトキシトリチル、アセタール、およびｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルのような基は酸不安定性であり、加水分解により除去可能なＣｂｚ基と塩基不安定性であるＦｍｏｃ基とで保護されたアミノ基の存在下で、カルボキシ反応性成分およびヒドロキシ反応性部分を保護するために使用され得る。カルボン酸部分は、塩基不安定性の基（例えば、メチル、またはエチルであるがこれらに限定されるわけではない）でブロックされ得、そしてヒドロキシ反応性部分は、ｔｅｒｔ−ブチルカルバメートのような酸不安定性の基で、または酸安定性かつ塩基安定性であるが、加水分解的に除去可能であるカルバメートでブロックされたアミンの存在下で、アセチルのような塩基不安定性の基でブロックされ得る。
【０１４３】
カルボン酸反応性部分およびヒドロキシル反応性部分はまた、ベンジル基のような加水分解的に除去可能な保護基でもブロックされ得、一方、アミン基はＦｍｏｃのような塩基不安定性の基でブロックされ得る。式（Ｉ）の化合物の合成に特に有用なアミン保護基は、トリフルオロアセトアミドである。カルボン酸反応性部分は、２，４−ジメトキシベンジルのような酸化的に除去可能な保護基でブロックされ得、一方、同時に存在しているアミノ基は、フッ化物に不安定であるシリルカルバメートでブロックされ得る。
【０１４４】
アリルブロッキング基は、酸保護基および塩基保護基の存在下で有用である。なぜなら、前者は安定であり、金属触媒またはπ酸触媒によりその後に除去することができるからである。例えば、アリルでブロックされたカルボン酸は、酸不安定性ｔ−ブチルカルバメート保護基または塩基不安定性酢酸アミン保護基の存在下でパラジウム（０）に触媒される反応で脱保護され得る。保護基のなお別の形態は、それに対して化合物または中間体が付着させられ得る樹脂である。残基が樹脂に付着している限りは、官能基はブロックされており、反応できない。一旦、樹脂から離れると、官能基は反応に利用され得る。
【０１４５】
典型的なブロッキング基／保護基は当該分野で公知であり、典型的なブロッキング基／保護基として以下の部分が挙げられるが、これらに限定されるわけではない：
【化２１】
2020078347.tif 000029
【０１４６】
他に断りのない限りは、全ての化合物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｆｌｕｋａから入手された。ベンゾイルアデノシン、ベンゾイルシチジン、およびフェニルアセチルグアノシンは、Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，ＵＫから入手された。
【０１４７】
本明細書中に記載されるようなさらなる結合修飾を含有しているＰＭＯ、ＰＭＯ＋、ＰＰＭＯおよびＰＭＯ−Ｘの合成は、当該分野で公知であり、係属中の米国特許出願番号１２／２７１，０３６および同１２／２７１，０４０、ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００９／０６４４７１（これらは言及されたことによりそれらの全体が本明細書中に組み入れられたこととなる）に記載されている方法を使用して行われた。
【０１４８】
３’トリチル修飾を持つＰＭＯは、脱トリチル化工程が省略されることを除き、原則的にＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００９／０６４４７１に記載されているとおりに合成される。
【実施例】
【０１４９】
活性化されたサブユニットの調製のための手順Ａ：
【化２２】
2020078347.tif 000030
【０１５０】
ジクロロメタン中の６（１等量）の撹拌溶液に対して、ＰＯＣｌ３（１．１等量）を、続いてジイソプロピルエチルアミン（３等量）を０℃で添加し、氷浴により冷却した。１５分後、氷浴を取り除き、溶液を１時間かけて室温に温めた。反応が完了したら、反応溶液をジクロロメタンで希釈し、１０％のクエン酸水溶液で３回洗浄した。ＭｇＳＯ４上での乾燥後、有機層をシリカゲルのプラグに通過させ、真空中で濃縮した。得られたホスホロアミドジクロライド（４）を、さらに洗浄することなく次の工程に直接使用した。
【０１５１】
ジクロロメタン中のホスホロアミドジクロライド（４）（１等量）、２，６−ルチジン（１等量）の溶液に対して、Ｍｏ（Ｔｒ）Ｔ（７）（０．５等量）／ジクロロメタン溶液、続いてＮ−メチルイミダゾール（０．２等量）を添加した。この反応物を室温で一晩撹拌した。反応が完了したら、反応溶液をジクロロメタンで希釈し、１０％のクエン酸水溶液で３回洗浄した。ＭｇＳＯ４上での乾燥後、有機層を濾過し、その後、濃縮した。生成物（８）をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し（酢酸エチル／ヘキサンの勾配で溶離させた）、次いで−２０℃で保存した。構造をＬＣＭＳ分析により確認した。
【０１５２】
活性化されたサブユニットの調製のための手順Ｂ：
【化２３】
2020078347.tif 000031
【０１５３】
ジクロロメタン中のＰＯＣｌ３（１．１等量）の溶液に対して、２，６−ルチジン（２等量）を添加し、続いてＭｏ（Ｔｒ）Ｔ（７）（１等量）／ジクロロメタン溶液を０℃で１滴ずつ添加した。１時間後、反応溶液をジクロロメタンで希釈し、直ちに１０％のクエン酸水溶液で３回洗浄した。所望されるホスホジクロリデート（９）が、ＭｇＳＯ４上での乾燥および溶媒の蒸発後に得られた。
【０１５４】
ジクロロメタン中のホスホジクロリデート（１等量）の溶液に対して、アミン（１等量）／ジクロロメタンを０℃の溶液に対して１滴ずつ添加した。１５分後、反応混合物を約１時間かけて室温に温めた。反応が完了したら、白色固体としての生成物（８）をヘキサンの添加による沈殿によって回収し、続いて濾過した。この生成物を、減圧下での乾燥後に−２０℃で保存した。構造をＬＣＭＳ分析により確認した。
【０１５５】
実施例１：（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチルホスホロジクロリデート
【化２４】
2020078347.tif 000032
【０１５６】
オキシ塩化リン（２．１２ｍＬ、２２．７ｍｍｏｌ）の冷却した（氷／水浴）ＤＣＭ溶液（２０ｍＬ）に対して、２，６−ルチジン（４．８２ｍＬ、４１．４ｍｍｏｌ）を１滴ずつ添加し、次いで、ＤＣＭ溶液（２０ｍＬ）Ｍｏ（Ｔｒ）Ｔ（２）（１０．０ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）を１５分かけて１滴ずつ添加し（内部温度（ｉｎｔ．ｔｅｍｐ．）０〜１０℃）、その後、浴を取り除き、環境温度で２０分間撹拌を継続した。反応物をクエン酸溶液（４０ｍＬ×３、１０％ｗ／ｖ  ａｑ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、そして濃縮して白色の発泡体（９．７９ｇ）とし、次に以下の手順に直接使用した。
【０１５７】
実施例２：（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（ジメチルアミノ）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化２５】
2020078347.tif 000033
【０１５８】
実施例１によるジクロロホスフェート（５．００ｇ、５．００ｍｍｏｌ）の冷却した（氷／水浴）ＤＣＭ溶液（５ｍＬ）に対して、ピペリジン（０．６１ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（５ｍＬ）を１滴ずつ添加し、次に浴を取り除き、そして環境温度で３０分間撹拌を継続した。この反応物を直接カラムにロードした。クロマトグラフィー［ＳｉＯ２カラム（４０ｇ）、ＤＣＭ／ＥｔＯＨ溶離液（勾配は１：０から１：１）］により、表題化合物（２．５ｇ）を白色の発泡体とした。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４６Ｈ５５Ｎ８Ｏ７Ｐ  ８６２．４について計算したＥＳＩ／ＭＳにより、ｍ／ｚ＝８６３．６（Ｍ＋１）であることが明らかになった。
【０１５９】
実施例３：１−（１−（クロロ（（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）ホスホリル）ピペリジン−４−イル）−１−メチルピロリジン−１−イウムクロライド
【化２６】
2020078347.tif 000034
【０１６０】
表題化合物を、実施例２に記載した様式と同様の様式で合成して、表題化合物（０．６ｇ）を白色固体とした。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４９Ｈ６０Ｎ８Ｏ７Ｐ  ９０３．４について計算したＥＳＩ／ＭＳにより、ｍ／ｚ＝９０３．７（Ｍ＋）であることが明らかになった。
【０１６１】
実施例４：（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−メチルピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化２７】
2020078347.tif 000035
【０１６２】
オキシ塩化リン（１．０２ｍＬ、１１．０ｍｍｏｌ）の冷却した（氷／水浴）ＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）に対して、２，６−ルチジン（３．４９ｍＬ、２９．９ｍｍｏｌ）を１滴ずつ添加し、次いで、メチルピペラジン（１．００ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）を１滴ずつ添加し、１時間撹拌を継続した。Ｍｏ（Ｔｒ）Ｔ（２）（４．８２、１０．０ｍｍｏｌ）およびＮＭＩ（７９μＬ、１．０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）を添加し、４時間撹拌し、その後、カラム上に直接ロードした。クロマトグラフィー［ＳｉＯ２カラム（８０ｇ）、２％のＴＥＡ溶離液を含むＤＣＭ／アセトン（勾配１：０から０：１）］により、表題化合物（０．８ｇ）を白色の発泡体とした。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４３Ｈ４８Ｎ７Ｏ８Ｐ  ８３４．４について計算したＥＳＩ／ＭＳにより、ｍ／ｚ＝８３５．５（Ｍ＋１）であることが明らかになった。
【０１６３】
実施例５：（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−エチルピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化２８】
2020078347.tif 000036
【０１６４】
表題化合物を実施例４に記載した様式と同様の様式で合成して、表題化合物（１１．５ｇ）を白色の発泡体とした。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４５Ｈ５３Ｎ８Ｏ７Ｐ  ８４８．４について計算したＥＳＩ／ＭＳにより、ｍ／ｚ＝８４９．７（Ｍ＋１）であることが明らかになった。
【０１６５】
実施例６：（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−エチルピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化２９】
2020078347.tif 000037
【０１６６】
表題化合物を実施例４に記載した様式と同様の様式で合成して、表題化合物（４．５ｇ）を白色の発泡体とした。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ５２Ｈ５６Ｎ１１Ｏ６Ｐ  ９６１．４について計算したＥＳＩ／ＭＳにより、ｍ／ｚ＝９６２．８（Ｍ＋１）であることが明らかになった。
【０１６７】
実施例７：（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−イソプロピルピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化３０】
2020078347.tif 000038
【０１６８】
表題化合物を実施例４に記載した様式と同様の様式で合成して、表題化合物（３．５ｇ）を白色の発泡体とした。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４６Ｈ５５Ｎ８Ｏ７Ｐ  ８６２．４について計算したＥＳＩ／ＭＳにより、ｍ／ｚ＝８６３．７（Ｍ＋１）であることが明らかになった。
【０１６９】
実施例８：（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチルメチル（２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチル）ホスホルアミドクロリデート
【化３１】
2020078347.tif 000039
【０１７０】
表題化合物を実施例４に記載した様式と同様の様式で合成して、表題化合物（１．０ｇ）を白色の発泡体とした。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４４Ｈ４８Ｆ３Ｎ８Ｏ８Ｐ  ９０４．３について計算したＥＳＩ／ＭＳにより、ｍ／ｚ＝９０３．７（Ｍ−１）であることが明らかになった。
【０１７１】
実施例９：（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチルメチル（２−（２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−メチルアセトアミド）エチル）ホスホルアミドクロリデート
【化３２】
2020078347.tif 000040
【０１７２】
表題化合物を実施例４に記載した様式と同様の様式で合成して、表題化合物（１．８ｇ）を白色の発泡体とした。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４５Ｈ５０Ｆ３Ｎ８Ｏ８Ｐ  ９１８．３について計算したＥＳＩ／ＭＳにより、ｍ／ｚ＝１８３６．６（２Ｍ＋）であることが明らかになった。
【０１７３】
実施例１０：（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化３３】
2020078347.tif 000041
【０１７４】
ＤＣＭ（１９０ｍＬ）中のオキシ塩化リン（１７．７ｍＬ、１９０ｍｍｏｌ）の冷却した溶液（氷／水浴）に対して、２，６−ルチジン（１０１ｍＬ、８６４ｍｍｏｌ）を１滴ずつ添加し、次いで、Ｍｏ（Ｔｒ）Ｔ（２）（８３．５ｇ、１７３ｍｍｏｌ）を１５分かけて少量ずつ添加し（内部温度０〜１０℃）、そして撹拌した。３０分後、４−アミノピペリジンモノトリフルオロアセトアミド（４８．９ｇ、約１９０ｍｍｏｌ）を１５分かけて１滴ずつ添加し（内部温度０〜８℃）、そして撹拌した。１時間後、ＤＩＰＥＡ（５０ｍＬ）を１滴ずつ添加し（内部温度０〜１０℃）、そして１時間撹拌した。反応物をクエン酸溶液で洗浄し（５００ｍＬ×３、１０％ｗ／ｖ  ａｑ）、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、そして濃縮すると粘性のある油となり、これをカラム上に直接ロードした。クロマトグラフィー［ＳｉＯ２カラム（３３０ｇ）、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ溶離液（勾配１：０から０：１）］によって、表題化合物（９１．３ｇ、７０％の収率）を白色の発泡体とした。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４３Ｈ４８Ｎ７Ｏ８Ｐ  ９３０．９について計算したＥＳＩ／ＭＳにより、ｍ／ｚ＝９５４．４（Ｍ＋Ｎａ）であることが明らかになった。
【０１７５】
実施例１３〜３７は、上記に記載した手順Ａにより調製した。
【０１７６】
実施例１１：（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（１−（２，２，２−トリフルオロアセチル）ピペリジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化３４】
2020078347.tif 000042
【０１７７】
実施例１２：（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−モルホリノピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化３５】
2020078347.tif 000043
【０１７８】
実施例１３：（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチルビス（３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）プロピル）ホスホルアミドクロリデート
【化３６】
2020078347.tif 000044
【０１７９】
実施例１４：（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル［１，４’−ビピペラジン］−１’−イルホスホノクロリデート
【化３７】
2020078347.tif 000045
【０１８０】
以下の実施例１５〜２０は上記に記載した手順Ｂにより調製した。
【０１８１】
実施例１５：（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化３８】
2020078347.tif 000046
【０１８２】
実施例１６：（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化３９】
2020078347.tif 000047
【０１８３】
実施例１７：（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−フェニルピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化４０】
2020078347.tif 000048
【０１８４】
実施例１８：（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−メチルアセトアミド）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化４１】
2020078347.tif 000049
【０１８５】
実施例１９：（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチルメチル（３−（２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−メチルアセトアミド）プロピル）ホスホルアミドクロリデート
【化４２】
2020078347.tif 000050
【０１８６】
実施例２０：（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化４３】
2020078347.tif 000051
【０１８７】
実施例２１：（４−（ピロリジン−１−イル）ピペリジン−１−イル）ホスホン酸ジクロライドヒドロクロライド
【化４４】
2020078347.tif 000052
【０１８８】
ＤＣＭ（３０ｍＬ）中のオキシ塩化リン（５．７０ｍＬ、５５．６ｍｍｏｌ）の冷却した（氷／水浴）溶液に対して、２，６−ルチジン（１９．４ｍＬ、１６７ｍｍｏｌ）および４−（１−ピロリジニル）−ピペリジン（８．５８ｇ、５５．６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（３０ｍＬ）を添加し、１時間撹拌した。この懸濁液を濾過し、固形物を過剰量のジエチルエーテルで洗浄して、表題ピロリジン（１７．７ｇ、９１％の収率）を白色固体とした。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ１９Ｈ３０Ｎ５Ｏ４Ｐ  ４２３．２について計算したＥＳＩ／ＭＳにより、ｍ／ｚ＝４２２．２（Ｍ−１）であることが明らかになった。
【０１８９】
実施例２２：（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（ピロリジン−１−イル）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデートヒドロクロライド
【化４５】
2020078347.tif 000053
【０１９０】
ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の実施例２１によるジクロロホスホルアミデート（１７．７ｇ、５０．６ｍｍｏｌ）の撹拌した冷却した（氷／水浴）溶液に対して、Ｍｏ（Ｔｒ）Ｔ（２）（２４．５ｇ、５０．６ｍｍｏｌ）、２，６−ルチジン（１７．７ｍＬ、１５２ｍｍｏｌ）および１−メチルイミダゾール（０．４０１ｍＬ、５．０６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１００ｍＬ）を、１０分かけて１滴ずつ添加した。浴を、懸濁液を撹拌しながら環境温度に温めた。６時間後、この懸濁液をジエチルエーテル（１Ｌ）上に注ぎ、１５分間撹拌し、濾過し、そして固体をさらなるエーテルで洗浄して、白色固体（４５．４ｇ）とした。この粗生成物をクロマトグラフィー［ＳｉＯ２カラム（１２０グラム）、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ溶離液（勾配１：０から６：４）］により精製し、合わせた画分をジエチルエーテル（２．５Ｌ）上に注ぎ、１５分間撹拌し、濾過し、そして得られた固体をさらなるエーテルで洗浄して、表題化合物（２３．１ｇ、６０％の収率）を白色固体とした。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４８Ｈ５７Ｎ８Ｏ７Ｐ  ８８８．４について計算したＥＳＩ／ＭＳにより、ｍ／ｚ＝８８７．６（Ｍ−１）であることが明らかになった。
【０１９１】
モルホリノオリゴマーの調製
トリチルピペラジンフェニルカルバメート１ｂの調製（図１を参照のこと）：ジクロロメタン（６ｍＬ／ｇ  １１）中の化合物１ａの冷却した懸濁液に対して、水中の炭酸カリウム（３．２等量）の溶液（４ｍＬ／ｇの炭酸カリウム）を添加した。この二相混合物に対して、ジクロロメタン中のクロロギ酸フェニル（１．０３等量）の溶液（２ｇ／ｇのクロロギ酸フェニル）をゆっくりと添加した。この反応混合物を２０℃に温めた。反応が完了したら（１〜２時間）、層を分離させた。有機層を水で洗浄し、無水炭酸カリウム上で乾燥させた。生成物１ｂをアセトニトリルからの結晶化により単離した。収率＝８０％。
【０１９２】
カルバメートアルコール１ｃの調製：水酸化ナトリウム（１．２等量）を１−メチル−２−ピロリジノン（３２ｍＬ／ｇの水酸化ナトリウム）中に懸濁した。この懸濁液に対して、トリエチレングリコール（１０．０等量）および化合物１ｂ（１．０等量）を添加した。得られたスラリーを９５℃に加熱した。反応が完了したら（１〜２時間）、混合物を２０℃に冷却した。この混合物に対して、３０％のジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ｖ：ｖ）および水を添加した。生成物を含有している有機層を、ＮａＯＨ水溶液、コハク酸水溶液、および飽和塩化ナトリウム溶液で連続して洗浄した。生成物１ｃを、ジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／ヘプタンによる結晶化によって単離した。収率＝９０％。
【０１９３】
Ｔａｉｌ酸１ｄの調製：テロラヒドロフラン中の化合物１ｃの溶液（７ｍＬ／ｇ  ３６）に対して、無水コハク酸（２．０等量）およびＤＭＡＰ（０．５等量）を添加した。混合物を５０℃に加熱した。反応が完了したら（５時間）、混合物を２０℃に冷却し、そしてＮａＨＣＯ３水溶液でｐＨ８．５に調整した。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを添加し、生成物を水相の中に抽出した。ジクロロメタンを添加し、混合物をクエン酸水溶液でｐＨ３に調整した。生成物を含有している有機層を、ｐＨ＝３のクエン酸緩衝液および飽和塩化ナトリウム水溶液の混合物で洗浄した。１ｄのこのジクロロメタン溶液を、化合物１ｅの調製において単離することなく使用した。
【０１９４】
１ｅの調製：化合物１ｄの溶液に対して、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）（１．０２等量）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．３４等量）、次いで、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）（１．１等量）を添加した。混合物を５５℃に加熱した。反応が完了したら（４〜５時間）、混合物を２０℃に冷却し、１：１の０．２Ｍのクエン酸／塩水と塩水とで連続して洗浄した。ジクロロメタン溶液をアセトンに、次いでＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶媒交換し、生成物を、アセトン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドから飽和塩化ナトリウム水溶液中への沈殿により単離した。粗生成物を水中に数回、再びスラリー化して、残留しているＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよび塩を取り除いた。化合物１ｃからの１ｅの収率＝７０％。活性化された「Ｔａｉｌ」のジスルフィドアンカー樹脂（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ａｎｃｈｏｒ−ｒｅｓｉｎ）上への導入を、固相合成の間にサブユニットを取り込むために使用した手順により、ＮＭＰ中で行った。
【０１９５】
モルホリノオリゴマーの合成のための固体支持体の調製（図２を参照のこと）：この手順を、フリットまたは減圧抽出機（ｖａｃｕｕｍ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）を通じてＮ２が気泡となって上昇できるように、空孔率が高い（ｃｏａｒｓｅ  ｐｏｒｏｓｉｔｙ）（４０〜６０μｍ）ガラスフリット、オーバーヘッドスターラ−、および３方向のテフロン（登録商標）ストップ栓（Ｔｅｆｌｏｎ  ｓｔｏｐｃｏｃｋ）を持つ、シラン化されたジャケット付きのペプチド容器（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ，ＮＪ，ＵＳＡに特別注文した）の中で行った。温度管理は、水浴を循環させることにより反応容器の中で達成した。
【０１９６】
以下の手順での樹脂の処理／洗浄工程は、２つの基本操作：樹脂の流動化および溶媒／溶液抽出からなる。樹脂の流動化のために、ストップ栓を、フリットを通じてＮ２が上向きに流れるように配置し、特別な樹脂の処理／洗浄を反応器に対して加え、樹脂に浸透し、樹脂が完全に湿った状態にした。次に、混合を開始し、樹脂のスラリーを指定された時間の間混合した。溶媒／溶液抽出のために、混合とＮ２フローを停止し、真空ポンプを始動させ、次に、ストップ栓を、廃棄のために樹脂の処理／洗浄を撤収できるように配置した。全ての樹脂の処理／洗浄の容量は、特に明記しない限りは、１５ｍＬ／ｇ樹脂とした。
【０１９７】
シラン化されたジャケット付きのペプチド容器中のアミノメチルポリスチレン樹脂（１００〜２００メッシュ；約１．０ｍｍｏｌ／ｇ  Ｎ２置換；７５ｇ、１等量、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ，ＵＫ，ｐａｒｔ  ＃１４６４−Ｘ７９９）に対して、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ；２０ｍｌ／ｇ樹脂）を添加し、樹脂を混合しながら１〜２時間膨張させた。膨潤溶剤（ｓｗｅｌｌ  ｓｏｌｖｅｎｔ）の排出後、樹脂を、ジクロロメタン（２×１〜２分）、２５％のイソプロパノール／ジクロロメタン（２×３〜４分）中の５％のジイソプロピルエチルアミン、およびジクロロメタン（２×１〜２分）で洗浄した。最後の洗浄液の排出後、樹脂を、１−メチル−２−ピロリジノン中のジスルフィドアンカー２ａの溶液（０．１７Ｍ；１５ｍＬ／ｇ樹脂、約２．５等量）で流動化し、樹脂／試薬混合物を、４５℃で６０時間加熱した。反応が完了した時点で、加熱を中断し、アンカー溶液を排出し、樹脂を１−メチル−２−ピロリジノン（４×３〜４分）およびジクロロメタン（６×１〜２分）で洗浄した。樹脂を、ジクロロメタン中の１０％（ｖ／ｖ）のジエチルジカルボネートの溶液（１６ｍＬ／ｇ；２×５〜６分）で処理し、次いで、ジクロロメタン（６×１〜２分）で洗浄した。樹脂２ｂをＮ２流下で１〜３時間、その後、真空下で恒量（±２％）になるまで乾燥させた。収率：もとの樹脂の重量の１１０〜１５０％。
【０１９８】
アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂のローディングの決定：樹脂のローディング（利用できる可能性がある反応部位の数）を、樹脂１グラムあたりのトリフェニルメチル（トリチル）基の数について分光測定法により決定する。
【０１９９】
既知の重量の乾燥樹脂（２５±３ｍｇ）をシラン化された２５ｍｌのメスフラスコに移し、ジクロロメタン中の約５ｍＬの２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を添加する。内容物を静かに旋回させることによって混合し、次いで、３０分間置いておく。さらなるジクロロメタン中の２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で容量を２５ｍＬにし、内容物を十分に混合する。容積流量ピペットを使用して、トリチル含有溶液のアリコート（５００μＬ）を１０ｍＬのメスフラスコに移し、メタンスルホン酸で容量を１０ｍＬにする。
【０２００】
最終的な溶液中のトリチル陽イオン含有量を４３１．７ｎｍでのＵＶ吸光度により測定し、樹脂のローディングを、適切な容量、希釈度、減衰係数（ε：４１μｍｏｌ−１ｃｍ−１）および樹脂の重量を使用して、樹脂１グラムあたりのトリチル基（μｍｏｌ／ｇ）で計算する。アッセイは、３連で、そして計算した平均のローディングで行う。
【０２０１】
本実施例での樹脂のローディング手順は、およそ５００μｍｏｌ／ｇがローディングされた樹脂を提供するであろう。ジスルフィドアンカーの取り込み工程を室温で２４時間行った場合は、３００〜４００μｍｏｌ／ｇのローディングが得られた。
【０２０２】
Ｔａｉｌローディング：アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂の調製と同じ設定および容量を使用して、Ｔａｉｌを分子に導入することができる。カップリング工程については、４−エチルモルホリンを含有しているＮＭＰ（ＮＥＭ、０．４Ｍ）中の１ｅの溶液（０．２Ｍ）をジスルフィドアンカー溶液の代わりに使用した。４５℃で２時間の後、樹脂２ｂを２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％のジイソプロピルエチルアミンで２回、そしてＤＣＭで１回洗浄した。樹脂に対して、安息香酸無水物（０．４Ｍ）およびＮＥＭ（０．４Ｍ）の溶液を添加した。２５分後、反応器のジャケットを室温に冷却し、樹脂を、２５％のイソプロパノール／ジクロロメタン中の５％のジイソプロピルエチルアミンで２回、そしてＤＣＭで８回洗浄した。樹脂２ｃを濾過し、高真空下で乾燥させた。樹脂２ｃについてのローディングは、Ｔａｉｌローディングに使用したもとのアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂２ｂのローディングと定義する。
【０２０３】
固相合成：モルホリノオリゴマーを、２ｍＬのＧｉｌｓｏｎポリプロピレン反応カラム（Ｐａｒｔ  ＃３９８０２７０）中でＧｉｌｓｏｎ  ＡＭＳ−４２２  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで調製した。水流のためのチャンネルを持つアルミニウムブロックを、これらが合成装置上に設置されるように、カラムの周囲に置いた。ＡＭＳ−４２２は試薬／洗浄溶液を交互に添加し、指定された時間の間保ち、そして真空を使用してカラムを排出するであろう。
【０２０４】
約２５サブユニットの長さまでの範囲のオリゴマーについては、およそ５００μｍｏｌ／ｇの樹脂がローディングされたアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂が好ましい。より大きなオリゴマーについては、３００〜４００μｍｏｌ／ｇの樹脂がローディングされたアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂が好ましい。５’−Ｔａｉｌを持つ分子が所望される場合は、Ｔａｉｌがロードされている樹脂が同じローディング指針により選択される。
【０２０５】
以下の試薬溶液を調製した：
脱トリチル溶液：４：１のジクロロメタン／アセトニトリル中の１０％のシアノ酢酸（ｗ／ｖ）；中和溶液：３：１のジクロロメタン／イソプロパノール中の５％のジイソプロピルエチルアミン；カップリング溶液：１，３−ジメチルイミダゾリジノン中の０．１８Ｍ（または２０より長い成長させたサブユニットを有しているオリゴマーについては０．２４Ｍ）の所望される塩基および結合のタイプの活性化されたモルホリノサブユニットならびに０．４ＭのＮ−エチルモルホリン。ジクロロメタン（ＤＣＭ）を、様々な試薬溶液洗浄剤を分離する従来の洗浄剤として使用した。
【０２０６】
ブロックを４２℃に設定した合成装置上で、３０ｍｇのアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂（またはＴａｉｌ樹脂）を含有しているそれぞれのカラムに対して、２ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノンを添加し、室温で３０分間置いておいた。２ｍＬのジクロロメタンでの２回の洗浄後、以下の合成サイクルを使用した：
【０２０７】
【表２】
2020078347.tif 000054
【０２０８】
個々のオリゴマーの配列を、それぞれのカラムが適切な順序で適切なカップリング溶液（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｉ）を受け取るように、合成装置にプログラムした。カラム中のオリゴマーがその最終的なサブユニットの取り込みを完了したら、カラムをブロックから取り出し、最終サイクルを、０．８９Ｍの４−エチルモルホリンを含有している４−メトキシトリフェニルメチルクロライド（ＤＭＩ中の０．３２Ｍ）からなるカップリング溶液を用いて、手作業で行った。
【０２０９】
樹脂からの切断、ならびに塩基および骨格保護基の除去：メトキシトリチル化後、樹脂を２ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノンで８回洗浄した。１−メチル−２−ピロリジノン中の０．１Ｍの１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および０．７３Ｍのトリエチルアミンからなる１ｍＬの切断溶液を添加し、カラムに蓋をし、室温で３０分間置いておいた。その時間の後、溶液を１２ｍＬのホイートンバイアル（Ｗｈｅａｔｏｎ  ｖｉａｌ）に排水した。大幅に収縮した樹脂を３００μＬの切断溶液で２回洗浄した。この溶液に対して４．０ｍＬの濃アンモニア水溶液（−２０℃で保存した）を添加し、バイアルに（Ｔｅｆｌｏｎが裏打ちされたスクリューキャップで）きっちりと蓋をし、溶液を混合するために混合物を旋回させた。バイアルを４５℃のオーブンの中に１６〜２４時間置いて、塩基および骨格保護基の切断を行った。
【０２１０】
最初のオリゴマーの単離：バイアルに入れた加アンモニア分解溶液をオーブンから取り出し、室温に冷却した。溶液を２０ｍＬの０．２８％アンモニア水溶液で希釈し、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ＨＱ樹脂を含有している２．５×１０ｃｍのカラム（ＢｉｏＲａｄ）を通過させた。塩勾配（Ａ：０．２８％のアンモニアをＢ：０．２８％のアンモニア中の１Ｍの塩化ナトリウムとともに；６０分間に０〜１００％のＢ）を使用して、メトキシトリチルを含有しているピークを溶離させた。合わせた画分をプールし、所望される生成物に応じてさらに処理した。
【０２１１】
モルホリノオリゴマーの脱メトキシトリチル化：Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ精製からプールした画分を１ＭのＨ３ＰＯ４で処理して、ｐＨを２．５に下げた。最初の混合の後、試料を室温で４分間置き、この時点で、これらを２．８％のアンモニア／水でｐＨ１０〜１１に中和する。生成物を固相抽出（ＳＰＥ）により精製した。
【０２１２】
Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＣＧ−３００Ｍ（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）（３ｍＬ）を２０ｍＬのフリットカラム（ＢｉｏＲａｄ  Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（７３２−１０１１））に充填し、樹脂を３ｍＬの以下のものでリンスした：０．２８％のＮＨ４ＯＨ／８０％のアセトニトリル；０．５ＭのＮａＯＨ／２０％のエタノール；水；５０ｍＭのＨ３ＰＯ４／８０％のアセトニトリル；水；０．５のＮａＯＨ／２０％のエタノール；水；０．２８％のＮＨ４ＯＨ。
【０２１３】
脱メトキシトリチル化による溶液をカラムにロードし、樹脂を３〜６ｍＬの０．２８％のアンモニア水溶液で３回リンスした。ホイートンバイアル（１２ｍＬ）をカラムの下に置き、生成物を２ｍＬの、０．２８％のアンモニア水溶液中の４５％のアセトニトリルでの２回の洗浄により溶離させた。溶液をドライアイス中で凍結させ、バイアルを凍結乾燥器の中に置くと毛羽立った白色粉末が得られた。試料を水中に溶解させ、注射器を使用して０．２２ミクロンのフィルター（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，０．２ミクロンのＨＴ  Ｔｕｆｆｒｙｎメンブレンを持つＡｃｒｏｄｉｓｃ  ２５ｍｍシリンジフィルター）を通して濾過し、そして光学密度（ＯＤ）をＵＶ分光光度計で測定して存在するオリゴマーのＯＤ単位を決定し、さらに分析のために試料を分配した。次に、溶液を、凍結乾燥のためにホイートンバイアルの中に戻した。
【０２１４】
モルホリノオリゴマーの分析：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用して、精製における画分の組成を決定し、さらに、オリゴマーの実態（分子量）についての証拠を得た。試料を、マトリックスとして３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸（シナピン酸）、３，４，５−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）、またはα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＨＣＣＡ）の溶液を用いて希釈した。
【０２１５】
陽イオン交換（ＳＣＸ）ＨＰＬＣを、Ｄｉｏｎｅｘ  ＰｒｏＰａｃ  ＳＣＸ−１０、４×２５０ｍｍカラム（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用し、２５ｍＭのｐＨ＝５の酢酸ナトリウム２５％アセトニトリル（緩衝液Ａ）と２５ｍＭのｐＨ＝５の酢酸ナトリウム２５％アセトニトリル１．５Ｍ塩化カリウム（緩衝液Ｂ）（１５分間で１０〜１００％のＢの勾配）、または２５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４  ２５％のアセトニトリル（ｐＨ＝３．５）（緩衝液Ａ）と１．５Ｍの塩化カリウムを含む２５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４  ２５％のアセトニトリル（ｐＨ＝３．５）（緩衝液Ｂ）（１５分間で０〜３５％のＢの勾配）を使用して行った。前者のシステムは、ペプチドが付着していない正電荷を持つオリゴマーに使用し、後者はペプチドコンジュゲートに使用した。
【０２１６】
陽イオン交換クロマトグラフィーによるモルホリノオリゴマーの精製：試料を２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ＝４．５）（緩衝液Ａ）に溶解させ、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０陽イオン交換樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカラムにアプライし、２０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび４０％のアセトニトリル中の０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ＝４．５）（緩衝液Ｂ）の勾配で溶離させる。プールした生成物を含有している画分を濃アンモニア水溶液で中和し、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＳＰＥカラムにアプライする。生成物を、上記のように溶離させ、凍結し、そして凍結乾燥させる。
【０２１７】
実施例２３：ＰＭＯ修飾オリゴヌクレオチド、ＡＰＮ修飾オリゴヌクレオチド、およびＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを使用した、野生型ＨＴＴ  ｍＲＮＡと比較した突然変異体ＨＴＴ  ｍＲＮＡの選択的低下
ハンチントン病の個体由来の患者由来の繊維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ細胞株ＧＭ０４２８１；６９のＣＡＧリピート）を、１０％のＦＢＳを含むＥａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ中で標準的なプロトコールにしたがって培養した。細胞を実験前に３〜５日間継代し、ヌクレオフェクション時は、およそ８０％のコンフルエントであった。オリゴヌクレオチドを、ヌクレアーゼ非含有水（ＤＥＰＣで処理されていないもの）中の１〜２ｍＭのストック溶液として調製した。このストック溶液から、ヌクレオフェクションのために適切な希釈物を作製した。繊維芽細胞をトリプシン処理し、計数し、９０ｇで１０分間遠心分離し、そしてウェルあたり１〜５×１０ｅ５個の細胞をヌクレオフェクション溶液Ｐ２（Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁した。次に、オリゴヌクレオチド溶液および細胞を、Ｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ  １６ウェルストリップの各ウェルに添加し、プログラムＥＮ−１５０でパルスした。細胞を室温で１０分間インキュベートし、１２ウェルプレートに２連で移した。全ＲＮＡを、製造業者が推奨するプロトコールにしたがってＧＥ  Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ９６  Ｓｐｉｎキットを使用して、４８時間後に処理した細胞から単離した。回収したＲＮＡを分析前に−８０℃で保存した。
【０２１８】
逆転写酵素ＰＣＲを、野生型ＨＴＴ対立遺伝子および突然変異体ＨＴＴ対立遺伝子を増幅するために、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。ヌクレオフェクトした細胞から単離した１００ｎｇの全ＲＮＡを逆転写し、以下の遺伝子特異的プライマーおよび条件で増幅した：ＨＴＴ−Ｆｗｄ  ５’−−ａｔｇｇｃｇａｃｃｃｔｇｇａａａａｇｃｔｇａｔ  ３’（配列番号２５）；ＨＴＴ−Ｒｅｖ  ５’ＴＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＴＧ  ３’（配列番号２６）；ＰＣＲプログラム：６０℃で３０分間、ＲＴでのインキュベーション；９５℃での変性、６０℃でのアニーリング、７２℃での伸長を３５サイクル。Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐキットにおいて提供される増幅溶液には、蛍光によるバンドの可視化ができるように、Ｃｙ５で標識されたｄＣＴＰ（ＧＥ）が加えられている。増幅後、ＰＣＲ産物をプレキャスト１０％アクリルアミド／ＴＢＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で泳動し、圧盤表面に焦点面を持つ、６３３ｎｍの励起レーザーと６７０ｎｍのＢＰ３０発光フィルターを使用するＴｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ（ＧＥ）上で可視化した（例えば、図１０を参照のこと）。ゲルをＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ）で分析して、突然変異体対立遺伝子および野生型対立遺伝子由来のバンドの強度を決定した。
【０２１９】
突然変異体ＨＴＴ  ｍＲＮＡの並べての比較を、ＰＭＯａｐｎオリゴヌクレオチド、ＰＭＯオリゴヌクレオチド、およびＬＮＡオリゴヌクレオチドの間で行った。結果を図６〜１０に示す。ＬＮＡオリゴヌクレオチド、ＰＭＯオリゴヌクレオチド、およびＡＰＮオリゴヌクレオチドは同じ配列を含む：５’ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  Ｇ  ３’（配列番号２１）。ＬＮＡオリゴヌクレオチド（Ｅｘｉｑｏｎからの注文品）は、全てのＴ塩基にＬＮＡ修飾を持つＤＮＡ骨格を含む（全部で７個の修飾）。ＡＰＮオリゴヌクレオチドは、全てのＴ塩基にａｐｎ修飾を持つＰＭＯ骨格を含む（全部で７個の修飾）。ＰＭＯオリゴヌクレオチドは、いずれのサブユニット間結合にもさらなる修飾を持たないＰＭＯ骨格を含む。
【０２２０】
細胞を、上記のようにＬＮＡオリゴヌクレオチド、ＰＭＯオリゴヌクレオチド、またはＡＰＮオリゴヌクレオチドでヌクレオフェクトした。ヌクレオトランスフェクションプロセスの４８時間後に残っているＲＮＡを逆転写酵素ＰＣＲを使用して定量化し、ＰＣＲ産物をアクリルアミドゲル上で泳動した。ＧＭ０４２８１繊維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ）由来の野生型ＨＴＴ対立遺伝子または突然変異体ＨＴＴ対立遺伝子を表しているゲルバンドの強度を、最も低い処理した試料のそれぞれの野生型または突然変異体バンドの強度に対して正規化した。結果を図６に示す。グラフ上の各点はそれぞれの濃度での２つのレプリカにより正規化した発現レベルの平均を表しており、２回の独立した実験を、図６のデータセットを得るために合わせた。ゲル強度の定量化はＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ）を用いて行った。強度の正規化、ＥＣ５０の計算、および選択性を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ａｎｄ  Ｒを用いて分析した。
【０２２１】
各対立遺伝子についての平均ＥＣ５０値を、図６に示したデータセットから計算し、さらに、突然変異体対立遺伝子についての選択性を、同じオリゴヌクレオチドをヌクレオフェクトした繊維芽細胞由来の野生型および突然変異体対立遺伝子のＥＣ５０から、Ｒ  ａｎｄ  Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して計算した。結果の定量的比較を図７および図９に示す。ＥＣ５０の比較は、ＰＭＯオリゴヌクレオチドおよびＡＰＮオリゴヌクレオチドで処理した細胞が、ＬＮＡと比較して、野生型対立遺伝子を上回って突然変異体対立遺伝子のｍＲＮＡ発現を低下させたことを示す。さらに、ＥＣ５０値に基づくＡＰＮオリゴヌクレオチドの効力は、ＰＭＯオリゴヌクレオチドよりも改善されている。
【０２２２】
結果は、ＰＭＯオリゴヌクレオチド、ＡＰＮオリゴヌクレオチド、およびＬＮＡオリゴヌクレオチドにより、突然変異体ｍＲＮＡのレベルの予期しない低下がハンチントン病の原因であるとか考えられること、ならびにＡＰＮオリゴが、ＰＭＯまたはＬＮＡオリゴヌクレオチドのいずれよりも突然変異体ｍＲＮＡの発現を低下させることについて選択性が高いことを示している。
【０２２３】
実施例２４：ＰＭＯ修飾オリゴヌクレオチドおよびＡＰＮ修飾オリゴヌクレオチドによる、野生型ＨＴＴタンパク質と比較した突然変異体ＨＴＴタンパク質の選択的低下
ＰＭＯ修飾オリゴヌクレオチド、ＡＰＮ修飾オリゴヌクレオチド、およびＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドが、野生型ＨＴＴ  ｍＲＮＡよりも突然変異体ＨＴＴ  ｍＲＮＡの発現をより大きい程度に低下させたという知見（実施例２３）、ならびにハンチントン病が、突然変異体ＨＴＴタンパク質の発現と関係がある毒性機能獲得の結果として最終的に発現するという事実を前提とすると、突然変異体ＨＴＴタンパク質および野生型ＨＴＴタンパク質の発現に対するＰＭＯ修飾オリゴヌクレオチド、ＡＰＮ修飾オリゴヌクレオチド、およびＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドでの処理の効果を評価した。オリゴヌクレオチドの配列および修飾は実施例２３に記載したとおりである
【０２２４】
実験を、ヒトＨＴＴ  ＲＮＡのトリヌクレオチドリピート領域を標的化するＡＰＮ修飾オリゴヌクレオチド、ＰＭＯ修飾オリゴヌクレオチド、およびＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドで処理した細胞中での突然変異体ＨＴＴタンパク質ならびに野生型ＨＴＴタンパク質の発現を決定するために行った。細胞を、ハンチントン病のヒト患者由来のＧＭ０４２８１繊維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ）を使用して、２連のウェルにおいて一定範囲の用量を使用してヌクレオフェクトした（Ｌｏｎｚａ）。３日後、タンパク質溶解物を標準的な溶解技術を使用して調製し、ＢＣＡアッセイを使用して、製造業者が推奨するプロトコールにしたがって得られた試料のタンパク質濃度を決定した。処理した試料のそれぞれに由来する等量の全タンパク質を、２連でトリス酢酸ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、ニトロセルロースに移した。ブロットを、抗ＨＴＴ一次抗体（ＭＡＢ２１６６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）または抗β−アクチン一次抗体（Ａ１９７８、Ｓｉｇｍａ）、続いてｃｙ５がコンジュゲートされた二次抗体でプローブした。得られたブロットをＴｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ（ＧＥ）でスキャンし、突然変異体ＨＴＴタンパク質および正常なＨＴＴタンパク質のシグナル強度をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ）ソフトウェアで別々に定量化した。正常なＨＴＴバンド（下）および突然変異体ＨＴＴバンド（上）のシグナル強度を、各レーン内のβ−アクチンシグナルに対して正規化し、その後、各ＨＴＴバンドを別のブロット上の未処理の対照試料由来の対応する正常なＨＴＴまたは突然変異体ＨＴＴのバンドの強度に対して正規化した。タンパク質発現の結果を、ＨＴＴタンパク質発現の平均百分率、＋／−１ＳＤとして、それぞれの対立遺伝子（正常、実線；突然変異体、点線）についてプロットする。
【０２２５】
図１１のグラフを、ウェスタンブロットによるＨＴＴタンパク質バンドのデンシトメトリー分析に基づいてプロットした（図１１、下のパネル）。ＰＭＯ（図１１、左のパネル）およびＡＰＮ（図１１、中央のパネル）は、野生型ＨＴＴタンパク質と比較して突然変異体ＨＴＴタンパク質の発現を選択的に低下させ、ＡＰＮを用いた場合には、突然変異体ＨＴＴについてのより大きな選択性が観察された。対照的に、ＬＮＡは、野生型ＨＴＴタンパク質と比較して、突然変異体ＨＴＴタンパク質の発現を選択的に低下させなかった（図１１、右のパネル）。ＰＭＯ修飾オリゴヌクレオチドまたはＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドと比較した、野生型ＨＴＴタンパク質と比較して突然変異体ＨＴＴタンパク質に対するＡＰＮ修飾オリゴヌクレオチドの高い選択性はまた、ＨＴＴの発現を突然変異体ＨＴＴに対する野生型ＨＴＴの比としてプロットした場合にも明らかである（図１２）。実際、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドでの処理は、４μＭの濃度で約５まで、ＷＴ／突然変異体ＨＴＴ比を増大させたが、一方、ＰＭＯ修飾オリゴヌクレオチドでの処理が０．１６μＭから２０μＭまでで、ＷＴ／突然変異体ＨＴＴ比の増大の中程度の傾向を示したにもかかわらず、ＰＭＯ修飾オリゴヌクレオチドおよびＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドはいずれも、同じ濃度で約２の、類似するＷＴ／突然変異体ＨＴＴ比を有していた。これらの結果はまとめると、ＡＰＮ修飾オリゴヌクレオチドが、ＰＭＯ修飾オリゴヌクレオチドまたはＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドよりも、野生型ＨＴＴタンパク質と比較した突然変異体ＨＴＴタンパク質の発現の選択的低下により効果的であること、およびＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドが、野生型ＨＴＴタンパク質と比較した突然変異体ＨＴＴタンパク質の発現を選択的には低下させないことを示唆している。
【０２２６】
実施例２５：ＡＰＮ関連陽イオン性サブユニット間結合およびｐｌｕｓ関連陽イオン性サブユニット間結合を持つオリゴヌクレオチドを使用した、野生型ＨＴＴタンパク質と比較した突然変異体ＨＴＴタンパク質の選択的低下
野生型ＨＴＴタンパク質と比較した突然変異体ＨＴＴタンパク質の発現の低下についての他のタイプの陽イオン性サブユニット間結合を持つオリゴヌクレオチドの選択性を評価するために、ＡＰＮ関連サブユニット間結合（すなわち、ＡＰＮおよびｍａｐ）を持つオリゴヌクレオチド、ならびにｐｌｕｓ関連サブユニット間結合（すなわち、ｐｌｕｓ、ｍｅｄａ、およびｅｔｐｉｐ）を持つオリゴヌクレオチドを試験した。
【０２２７】
ＰＭＯ−ａｐｎＴ：ＧＣａｐｎＴ  ＧＣａｐｎＴ  ＧＣａｐｎＴ  ＧＣａｐｎＴ  ＧＣａｐｎＴ  ＧＣａｐｎＴ  ＧＣａｐｎＴＧ（配列番号２１）
ＰＭＯ−ｍａｐＴ：ＧＣｍａｐＴＧＣｍａｐＴＧＣｍａｐＴＧＣｍａｐＴＧＣｍａｐＴＧＣｍａｐＴＧＣｍａｐＴＧ（配列番号２１）
ＰＭＯｐｌｕｓ：ＧＣ＋ＴＧＣ＋ＴＧＣ＋ＴＧＣ＋ＴＧＣ＋ＴＧＣ＋ＴＧＣ＋ＴＧ（配列番号２１）
ＰＭＯ−ｍｅｄａＴ：ＧＣｍｅｄａＴＧＣｍｅｄａＴＧＣｍｅｄａＴＧＣｍｅｄａＴＧＣｍｅｄａＴＧＣｍｅｄａＴＧＣｍｅｄａＴＧ（配列番号２１）
ＰＭＯ−ＥｔｐｉｐＴ：ＧＣＥｔｐｉｐＴＧＣＥｔｐｉｐＴＧＣＥｔｐｉｐＴＧＣＥｔｐｉｐＴＧＣＥｔｐｉｐＴＧＣＥｔｐｉｐＴＧＣＥｔｐｉｐＴＧ（配列番号２１）
【０２２８】
ＡＰＮ関連陽イオン性修飾およびｐｌｕｓ関連陽イオン性修飾についての例示的な構造を図１３に示す。実験は実施例２４に記載したとおりに行った。
【０２２９】
図１４に示すように、ＡＰＮ関連結合（すなわち、ＡＰＮおよびｍａｐＴ）で修飾されたオリゴヌクレオチドは、ＷＴ／突然変異体ＨＴＴ比により評価すると、ＰＭＯ修飾オリゴヌクレオチドよりも、突然変異体ＨＴＴについて野生型ＨＴＴを上回るより大きな選択性を示した（図１４、左のパネル）。ｐｌｕｓ関連結合（すなわち、ｐｌｕｓＴ、ｍｅｄａＴ、およびｅｔｐｉｐＴ）で修飾された全てのオリゴヌクレオチドもまた、ＰＭＯ修飾オリゴヌクレオチドと比較して、突然変異体ＨＴＴについて野生型ＨＴＴを上回る選択性を示し、ｅｔｐｉｐＴ修飾オリゴヌクレオチドが最も高い選択性を示している（図１４、右のパネル）。ＡＰＮ修飾オリゴヌクレオチドおよびｅｔｐｉｐＴ修飾オリゴヌクレオチドの選択性を同じアッセイにおいて試験した場合は、両方が、ＰＭＯと比較して、突然変異体ＨＴＴについて野生型ＨＴＴと比較して実質的により大きな選択性を有していた。さらに、ＡＰＮ修飾オリゴヌクレオチドおよびｅｔｐｉｐＴ修飾オリゴヌクレオチドは類似する程度の選択性を示したが、ＡＰＮ修飾オリゴヌクレオチドは、より低い濃度でより高い選択性を示した。これらの結果は、ＡＰＮ修飾オリゴヌクレオチドおよびｅｔｐｉｐＴ修飾オリゴヌクレオチドが、試験したオリゴヌクレオチドの中でも、野生型ＨＴＴタンパク質と比較した突然変異体ＨＴＴタンパク質の低下について最も高い選択性を有していることを示唆している。
【０２３０】
実施例２６：ＥＧＦＰ−６５４マウスにおけるＰＭＯおよびＡＰＮのインビボでのＩＣＶ投与
本発明を裏付ける実験では、本発明の修飾されたサブユニット間結合を含有しているオリゴマーを評価するために、インビボでのアンチセンス活性についてのｅＧＦＰによるアッセイを使用した。ｅＧＦＰ−６５４トランスジーンが体中で一様に発現されるトランスジェニックｅＧＦＰマウスモデルはこれまでに記載されている（Ｓａｚａｎｉ，Ｇｅｍｉｇｎａｎｉら、２００２）。このモデルは、本発明の修飾されたオリゴマーが、修飾され増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）ｐｒｅ−ｍＲＮＡの異常なスプライシングをブロックし、正確なスプライシングを回復させる活性についてのスプライシングアッセイを使用する。この手法では、それぞれのオリゴマーのアンチセンス活性は、ｅＧＦＰレポーターのアップレギュレーションに正比例する。結果として、同じオリゴマーの機能効果を、ほぼ全ての組織においてモニターすることができる。これは、その発現が特定の組織だけに限定されるか、または表現形的に関係する遺伝子に対して標的化されたオリゴマーとは対照的である。ｅＧＦＰ−６５４マウスにおいては、ｐｒｅ−ｍＲＮＡは全ての組織中で容易に検出可能であったが、骨髄、皮膚、および脳中ではより少量しか見られなかった。翻訳されたｅＧＦＰのレベルはアンチセンスオリゴマーの効力と、作用部位でのそれらの濃度とに比例する。様々な組織から単離された全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲは、計測した全ての組織中でのｅＧＦＰ−６５４転写物の発現を示した。
【０２３１】
本実施例に記載する化合物の特異的なＰＭＯ−Ｘ修飾を以下に示す：
０−１−０−７３０（ＰＭＯ）：ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＡＣＣ  ＴＴＡ  ＡＣＣ  ＣＡＧ（配列番号２２）
ＮＧ−１０−０２４５（ＡＰＮ）：ＧＣａｐｎＴ  ＡａｐｎＴａｐｎＴ  ＡＣＣ  ＴａｐｎＴＡ  ＡＣＣ  ＣＡＧ（配列番号２２）。
【０２３２】
中性電荷を持つＰＭＯ、またはｅＧＦＰトランスジーンを標的化する陽イオン性骨格電荷（ＡＰＮ）で修飾されたＰＭＯを、脳定位固定装置を使用した１回の脳室内（ＩＣＶ）注射によりＥＧＦＰ−６５４マウスの左側脳室に投与した。用量は、全てのマウスについていずれかの５ｍｇ／ｋｇからなるか（左のパネル、ＰＭＯまたはＡＰＮ）、あるいは、１つの用量範囲に及んだ（右のパネル、２．５から４０ｍｇ／ｋｇまで、ＡＰＮのみ）。注射の２週間後、マウスを麻酔し、脳を取り出し、左半球と右半球になるように中線で矢状に半分にカットした。それぞれの半球を、平たい圧盤の上にカット面を下に向けて配置することにより、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ（ＧＥ）上で画像化した。ｅＧＦＰの蛍光を励起させるために４８８ｎｍのレーザーを使用してスキャンを収集した。得られた画像をＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（ＧＥ）で分析して、それぞれの半球の蛍光強度を定量化した。それぞれの半球の中で検出された蛍光強度の合計を、脳のそれぞれの半分についての領域に依存しない平均蛍光値を得るために、その半球中に存在するピクセルの数により割り算した。処置群のそれぞれの生存している動物についての活性の結果を、散布図上の点として表す。群の平均蛍光を横線、＋／−１ＳＤにより示す。
【０２３３】
図１６（左のパネル）に示すように、生理食塩水は脳においてはＥＧＦＰの発現を誘導しなかったが、ＰＭＯでの処置およびＡＰＮでの処置は、ＡＰＮ修飾オリゴヌクレオチドの注射を用いた場合に、ＰＭＯ修飾オリゴヌクレオチドの注射よりも大きな程度に、ＥＧＦＰの発現を誘導した。ＡＰＮ修飾オリゴヌクレオチドの注射もまた、用量依存性の様式でＥＧＦＰの発現を増大させた（図１６、右のパネル）。ＥＧＦＰシグナルの局在化を示している生理食塩水で処置した、ＰＭＯで処置した、およびＡＰＮで処置したｅＧＦＰ−６５４マウスによる代表的なｔｙｐｈｏｏｎ画像は、ＩＣＶ注射したオリゴマーの活性が脳の特定の領域で優先的に発現されることを明らかにしている（図１６、下のパネル）。まとめると、これらの結果は、脳中のオリゴマー活性がＰＭＯ骨格の陽イオン性修飾により増強されることを示している。
【０２３４】
実施例２７：インビボでのアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療的使用
本明細書中に記載する任意の陽イオン性結合、好ましくは、ＡＰＮ結合を持つ任意のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知のヌクレオチドリピート病の動物モデルにおいて使用することができる。このような動物モデルとして、ハンチントン病については、ＢＡＣＨＤ、ＹＡＣ１２８、およびＲ６／２マウス（例えば、Ｋｏｒｄａｓｉｅｗｉｃｚら、Ｎｅｕｒｏｎ  ２０１２；７４：１０３１−４４に開示されている）、ならびに、ＤＭ１についてはＨＳＡＬＲ（例えば、Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０１２；４８８：１１１−５に開示されている）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。延長されたヌクレオチドリピートを持つＡＬＳの動物モデルは現在は存在しないが、そのようなモデルは、当該分野で承認されている方法を使用して、例えば、延長されたＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピートを有している突然変異体Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子でマウスの野生型Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座を置き換えることにより容易に作製することができる（例えば、ＤｅＪｅｓｕｓ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら、前出；Ｒｅｎｔｏｎら、前出を参照のこと）（すなわち、突然変異体Ｃ９ＯＲＦ７２ノックインマウス）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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