(57)【要約】【課題】生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法ならびに装置を提供する。【解決手段】本発明は、生体組織及び生体液に含有される微量発現タンパク質及び／又はペプチドを、分解処理を施さずに特定の発蛍光化試薬（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌなど）を結合させた後、微量液体クロマトグラフィーにおける精密な検出・分離に続き、分離精製された蛍光化タンパク質及び／又はペプチドを、蛍光検出器を用いた連続的な定量計測により、生体組織及び生体液の状態を解析する方法ならびに装置に関するものである。【効果】蛍光検出器を有する微量送液液体クロマトグラフによって、生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドのプロファイルを得ることが可能である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのポンプの組み合わせにより任意な勾配送液が可能な送液システムと、シリカ基材を含む吸着層の厚みが１μｍ以下である吸着剤を含む内径３０〜３００μｍかつ長さ２５ｃｍ以上の分離カラムならびに蛍光検出器を備えた液体クロマトグラフフィーカラムにより、被験試料に蛍光マーカーを結合させたタンパク質及び／又はペプチドを用いて当該タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離を行い、続いて、分離された蛍光化タンパク質及び／又はペプチドを、蛍光検出器で連続的に定量計測することにより、生体中で発現したタンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づくプロファイルを得ることを特徴とする生体組織及び／又は生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項２】
前記ポンプの送液流量が、０．１〜１０μＬ／ｍｉｎである、請求項１に記載の生体組織及び／又は生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項３】
前記カラムが、モノリス状シリカゲルあるいはモノリス状ポリマーゲルを含むモノリスシリカキャピラリーカラムである、請求項１又は２に記載の生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項４】
前記カラムが、表層多孔性シリカゲル粒子あるいは合成ポリマー粒子を含むものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項５】
前記カラム表面へ結合された蛍光化タンパク質の吸着リガンドの炭素数が、１〜１８である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項６】
前記タンパク質が、ヒトや動物、植物、昆虫あるいは微生物から抽出されるタンパク質であり、タンパク質総重量が、５μｇ以下である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項７】
前記蛍光マーカーが、タンパク質及び／又はペプチド中のチオール基あるいはアミノ基に結合するものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項８】
分析目的とする複数のタンパク質プロファイルを選択し、少なくとも２つの送液ポンプを含む複数台の送液ユニットを並列稼働させる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項９】
前記指紋を用いた解析方法で使用する装置であって、少なくとも２つのポンプにより任意な勾配送液が可能な送液システムと、シリカ基材を含む吸着層の厚みが１μｍ以下である吸着剤を含む内径３０〜３００μｍかつ長さ２５ｃｍ以上の分離カラムならびに蛍光検出器を備えた液体クロマトグラフィーカラムとを構成要素として含み、被験試料として、発蛍光化試薬で標識化した生体組織及び／又は生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドを前記蛍光検出器を備えた液体クロマトグラフィーカラムに供給することにより当該微量発現タンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析を行うようにしたことを特徴とする装置。
【請求項１０】
少なくとも２つの送液ポンプを含む複数台の送液ユニットを並列に設置して並列稼働させるようにした、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記カラムが、モノリス状シリカゲルあるいはモノリス状ポリマーゲルを含むモノリスシリカキャピラリーカラムである、請求項９又は１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記吸着剤が、表層多孔性シリカゲル粒子あるいは合成ポリマー粒子を含むものである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
前記吸着剤が、シリカ基材へ炭素数１〜１８の吸着リガンド又はフェニル形シリル化剤による表面修飾処理を施したものである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法ならびに装置に関するものであり、さらに詳しくは、本発明は、生体組織及び生体液に含有される数千から数万種のタンパク質及び／又はペプチドを、分解処理を施さずに蛍光マーカーを結合させた後、微量液体クロマトグラフィーにおける精密な検出・分離に続き、分離精製された蛍光化タンパク質及び／又はペプチドを、蛍光検出器を用いた連続的な網羅的定量計測により、生体中で発現したタンパク質及び／又はペプチドの種類や発現量に基づく、いわゆる指紋プロファイル（フィンガープリント）を得ることで、生体組織及び生体液の状態を解析する方法ならびに装置に関するものである。
【０００２】
本発明は、プロテオミクスあるいはプロテオーム解析において、生体組織及び生体液の状態あるいは生体活動を理解あるいは制御するための指紋プロファイルを用いた新しい解析方法ならびに装置に関する新技術・新製品を提供するものとして有用である。
【背景技術】
【０００３】
生体組織及び生体液に含有されるタンパク質は、生体の有するＤＮＡあるいはＲＮＡの活動により発現し、生体機能あるいは生体活動の中心成分として作用している。
【０００４】
生体組織におけるタンパク質の発現は、同一ＤＮＡを有する１個体であっても、生体組織の置かれている環境などの影響を受けることは知られている。
【０００５】
これら、生体中に含有されるタンパク質の発現を定量的あるいは定性的に分析することが出来れば、生体個別的に活動したＤＮＡやＲＮＡの働きを理解することや、内的及び外的要因により変化するタンパク質活性の解析が可能となる。
【０００６】
例えば、いわゆる正常な状態の生体組織におけるタンパク質発現に対して、疾患などにより異常な状態となった生体組織におけるタンパク質発現を比較し、その差異を解析することによって、疾患起因による特徴的なタンパク質を見出すことが出来る。
【０００７】
また、生体中に含有されるタンパク質の発現を定量的あるいは定性的に分析することにより、例えば、ｉＰＳ細胞のようないわゆる初期状態の細胞が多様な組織へ分化する前後で変化する特徴的なタンパク質を知ることで、細胞の分化を任意に制御するなどの利用が考えられる
【０００８】
この様に、生体組織中で発現しているタンパク質を分析し、その発現によって生体の状態あるいは生体活動を理解あるいは制御する研究をプロテオミクスあるいはプロテオーム解析と呼び、例えば、医薬学分野では、ガンなどの疾患と関連のあるタンパク質を見出すことで、診断や治療に関わる疾患マーカーとして活用するために、生体組織及び生体液中のタンパク質やペプチドについての研究が進められている（非特許文献１）。
【０００９】
上記プロテオミクスあるいはプロテオーム解析の研究では、トップダウン法とボトムアップ法（ショットガン法とも呼ぶ）の２手法が広く知られている（非特許文献２）。
【００１０】
トップダウン法は、細胞から取り出した全タンパク質を、平面状のアガロースなどの不活性ゲル板の端面へ注入し、電気の加圧による電気泳動によって分子サイズなどによって分画した後、蛍光マーカーによって染色をした面を撮影し、タンパク質スポットの輝度により発現タンパク質を見出す手法であり、タンパク質を分解せずに分離し、その量の大小を計測する方法である。そして、定性分析を行うタンパク質については、スポットをゲルごと切り出した後、液体クロマトグラフ−質量分析計などにより分析を行う。
【００１１】
一方、上記トップダウン法の課題として、使用するタンパク質が数十μｇと多く必要なため、微量分析には適していないこと、また、生体からの試料取得に負荷が大きいこと、目的タンパク質とそれ以外のタンパク質のスポットが近接している場合や、目的タンパク質の輝度が相対的に低い場合は、画像解析にて見逃される場合があること、現在は作業の多くが作業者の手によりなされており、ゲルの切り出し面積の最適条件がタンパク質量毎に異なるため、１回の分析毎あるいは作業者毎で分析値が変動することなどが挙げられ、結果として、微量なタンパク質成分の定量的な分析が困難なことが課題として挙げられる。
【００１２】
これに対し、ボトムアップ法は、細胞から取り出した全タンパク質を、トリプシンなどの、タンパク質のアミノ酸配列中の切断部位が分かっている消化酵素を用いて、ペプチド断片への消化処理を施した後、液体クロマトグラフ−質量分析計により一斉に分離分析を行い、質量分析システムが保有するペプチドデータベースと照合することで、発現したタンパク質の情報を得る手法である。（非特許文献３、４）
【００１３】
上記ボトムアップ法では、タンパク質を消化したペプチド断片を質量分析計にて検出するので、検出感度は非常に高く、タンパク質数μｇ以下の微量分析に適している一方、検出している成分がタンパク質ではなくペプチドであるので、タンパク質内部のより微細な構造変化など、定性的な情報が高い確度で得られるものの、タンパク質自体の定量分析が困難なことが課題として挙げられ、結果として、生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質の定量分析では、主にトップダウン法が主流となっている。
【００１４】
これらの背景を踏まえ、本発明の共同発明者である今井は、これまでに、生体組織及び生体液試料中の微量発現タンパク質ならびにペプチドに蛍光誘導体化処理を施した後、蛍光検出を含むＨＰＬＣによって高感度に検出・分離した後、その画分を質量分析により解析することで、微量発現タンパク質の定量・同定を行う新手法を発明している（特許文献１、２）。
【００１５】
上記発明は、組織発現タンパク質を、多孔性微粒子充填型カラムを用いる液体クロマトグラフィーにて順次分離・溶出し、蛍光検出器による定量を行った後、タンパク質画分を質量分析で解析するため、定量・定性を高精度で行うことが出来る優れた技術である。その一方、試料の分析で使用検討した分離カラムのサイズを検証した結果、内径４．６〜６ｍｍのカラムが最適であることが研究成果として報告されている（非特許文献５）。
【００１６】
しかし、上記先行技術は、例えば、ＨＰＬＣポンプの送液流量０．５ｍＬ／分にて、約１０時間の分析を行う場合では、１測定につき、約３００ｍＬの溶離液を消費すること、また、試料タンパク質として８μｇ程度が使用されていることから、同一試料による繰り返し分析あるいは連続分析における検体数が限られること、さらには、高純度な溶離液を大量に使用するため分析コストがかかることなど、研究段階から社会実装への展開において幾つかの課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】今井一洋、特許第４５５８２９７号「発明の名称：発現微量タンパク質／ペプチドの検出・分離・同定法」
【特許文献２】今井一洋、特許第４６７９３６８号「発明の名称：発現微量タンパク質／ペプチドの検出・分離・同定法」
【特許文献３】Ｋａｚｕｈｉｒｏ  Ｉｍａｉ，ＵＳ２００８２８０３１６（Ａ１），Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｔｒａｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｅｐｔｉｄｅ
【特許文献４】Ｋａｚｕｈｉｒｏ  Ｉｍａｉ，ＥＰ１７０５４８２（Ａ２），Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｔｒａｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｅｐｔｉｄｅ
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】大規模プロテオーム解析とその臨床応用、山田哲司、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０（１）ｐ１〜５，２０１０
【非特許文献２】入門講座プロテオーム解析概論、平野  久、ぶんせき２００５年７月ｐ３４８〜３５３
【非特許文献３】ショットガンプロテオミクスの新潮流、石濱  泰、生化学第８３巻、第５号、ｐ４１３〜４１８、２０１１年５月
【非特許文献４】Ｏｎｌｉｎｅ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ−ｓｅｒｉａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ＰＡＳＥＦ）  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｒａｐｐｅｄ  ｉｏｎ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ，Ｆｌｏｒｉａｎ  Ｍｅｉｅｒ，Ａｎｄｒｅａｓ−Ｄａｖｉｄ  Ｂｒｕｎｎｅｒ１，Ｓｃａｒｌｅｔ  Ｋｏｃｈ，Ｈｅｉｎｅｒ  Ｋｏｃｈ，Ｍａｒｋｕｓ  Ｌｕｂｅｃｋ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｋｒａｕｓｅ，Ｎｉｅｌｓ  Ｇｏｅｄｅｃｋｅ，Ｊｅｎｓ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｋｏｓｉｎｓｋｉ，Ｍｅｌｖｉｎ  Ａ．Ｐａｒｋ，Ｎｉｃｏｌａｉ  Ｂａｃｈｅ，Ｏｌｅ  Ｈｏｅｒｎｉｎｇ，Ｊ▲ｕ▼ｒｇｅｎ  Ｃｏｘ，Ｏｌｉｖｅｒ  Ｒ▲ａ▼ｔｈｅｒ，Ｍａｔｔｈｉａｓ  Ｍａｎｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．（２０１８）Ｖｏｌ．１７，Ｉｓｓｕｅ  １２，２５３４−２５４５
【非特許文献５】Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔａｃｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｔｏｍｏｋｏ  Ｉｃｈｉｂａｎｇａｓｅ，Ｉｔａｒｕ  Ｙａｚａｗａ  ａｎｄ  Ｋａｚｕｈｉｒｏ  Ｉｍａｉ,Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．（２０１３）２７，１５２０−１５２３
【００１９】
上記先行技術を低コストで運用していくためには、タンパク質ならびにペプチドを分離するカラムを小径化し、分析に要する溶媒のポンプ送液流量を低減させることが考えられる。
【００２０】
一方、先行技術を開発するにあたり、内径４．０ｍｍ〜６．０ｍｍの多孔性微粒子充填型カラムを用いたタンパク質の高精度分離を検証した結果、カラムの内径が大きいほど高精度分離が達成されることが示されている。
【００２１】
このため、タンパク質を高精度で分離することと、分離カラムの小径化によってポンプ送液流量を低減させることは両立させることが難しく、生体組織及び生体液試料中のタンパク質ならびにペプチドを繰り返しかつ連続的に分析する装置の実現は困難な状況にあった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
このような状況の中で、本発明者らは、先行技術の課題である、生体組織及び生体液試料中のタンパク質ならびにペプチドの精密分離を保ちながら分離カラムの小径化を実現することを目標として研究開発を進める過程において、内径の細いキャピラリーカラムを鋭意検証した結果、本発明者らが開発したモノリス状シリカを利用したキャピラリーカラムが、図１及び図２に示した構成からなる液体クロマトグラフィーシステムにおいてタンパク質を高精度に検出・分離出来ることを見出し、本発明を完成するに至った（図３）。
【００２３】
本発明は、本発明者らが開発したモノリスシリカキャピラリーカラム（例えば、０．１ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ，７００ｍｍｌｅｎｇｔｈ）と、特定の発蛍光化試薬（例えば、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌなど）を利用することにより、タンパク質の高精度分離ならびに小径化による微量発現タンパク質の高感度検出を可能とする生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた新しい解析方法を提供することを目的とするものである。
【００２４】
また、本発明は、従来法では高精度分離ならびに高感度検出が難しかった、生体組織及び生体液に含まれる微量発現タンパク質及び／又はペプチドを、上記モノリスシリカキャピラリーカラムを利用することにより高精度に検出することならびに小径化による微量発現タンパク質及び／又はペプチドを高感度に検出することを可能とする生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた新しい解析装置を提供することを目的とするものである。
【００２５】
従来の多孔性微粒子充填型カラムを利用した結果に反して、細いキャピラリーカラムにてタンパク質の精密な分離が達成された理由としては、開発した多孔性シリカモノリスの吸着層が１μｍ以下であり、現在市販されている多孔性微粒子充填剤サイズが最小で１．５μｍであることから、多孔性微粒子充填型カラムでは成しえないタンパク質の高精度分離がモノリス状シリカを利用したキャピラリーカラムにて実現されたことが挙げられる。
【００２６】
上記の結果を踏まえ、本発明者らは、吸着層の厚みが１μｍ以下の充填剤を含むキャピラリーカラムを用いることで、先行技術の課題を解決し、従来では実現困難であった、本発明に係る生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法ならびに装置を発明した。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
本発明は、少なくとも２つのポンプの組み合わせにより任意な勾配送液が可能な送液システムと、シリカ基材を含む吸着層の厚みが１μｍ以下である吸着剤を含む内径３０〜３００μｍかつ長さ２５ｃｍ以上の分離カラムならびに蛍光検出器を備えた液体クロマトグラフィーにより、被験試料に蛍光マーカーを結合させたタンパク質及び／又はペプチドを用いて当該タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離を行い、続いて、分離された蛍光化タンパク質及び／又はペプチドを、蛍光検出器で連続的に定量計測することにより、生体中で発現したタンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づくプロファイルを得ることを特徴とする生体組織及び／又は生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドの指紋を用いた解析方法、に係るものである。
【００２８】
また、本発明は、前記指紋を用いた解析方法で使用する装置であって、少なくとも２つのポンプにより任意な勾配送液が可能な送液システムと、シリカ基材を含む吸着層の厚みが１μｍ以下である吸着剤を含む内径３０〜３００μｍかつ長さ２５ｃｍ以上の分離カラムならびに蛍光検出器を備えた液体クロマトグラフィーカラムとを構成要素として含み、被験試料として、発蛍光化試薬で標識化した生体組織及び／又は生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドを前記蛍光検出器を備えた液体クロマトグラフィーカラムに供給することにより当該微量発現タンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法による解析を行うようにしたことを特徴とする装置、に係るものである。
【００２９】
本発明に係る上記指紋を用いた解析方法ならびに装置にて使用されるポンプの送液流量は、好適には、０．１〜１０μＬ／ｍｉｎ、より好ましくは０．３〜３μＬ／ｍｉｎの範囲であり、これらの範囲で任意の値に適宜設定することが出来る。
【００３０】
本発明に係る上記指紋を用いた解析方法ならびに装置にて使用される分離カラムとしては、好適には、内径３０〜３００μｍ、より好ましくは５０〜２００μｍの範囲であり、カラム長さとして２５ｃｍ以上のサイズを有するもの、より好ましくは５０〜１００ｃｍのサイズを有するものを使用する。
【００３１】
また、本発明に係る上記指紋を用いた解析方法ならびに装置にて使用される分離カラム内部に充填されている吸着剤は、吸着層の厚さが１μｍ以下であるモノリス状シリカあるいはモノリス状ポリマー、さらには吸着層の厚みが１μｍ以下である表層多孔性シリカ粒子あるいはポリマー粒子を基材とし、その表面に炭素数１〜１８、さらに好ましくは炭素数２〜８の吸着リガンドを有することを特徴とする。
【００３２】
また、本発明に係る上記指紋を用いた解析方法ならびに装置にて使用される送液システムは、少なくとも２つのポンプの組み合わせにより、長時間にわたる任意な勾配送液が可能な送液システムであり、送液流量が、０．１〜１０μＬ／ｍｉｎ、好ましくは０．３〜３μＬ／ｍｉｎの範囲で稼動することを特徴とする。
【００３３】
さらに、本発明に係る上記指紋を使用した解析方法ならびに装置にて分析対象となる生体成分は、ヒトや動物、植物、昆虫あるいは微生物などから抽出されるタンパク質及び／又はペプチドであり、タンパク質及び／又はペプチドの総重量が５μｇ以下、好ましくは０．１〜１μｇであり、これらタンパク質及び／又はペプチド中のチオール基あるいはアミノ基に蛍光化試薬が結合されていることを特徴とする。
【００３４】
本発明は、細胞から抽出したタンパク質に蛍光マーカーを付け、蛍光検出器にて、タンパク質及び／又はペプチドプロファイルを定量的に分析することを特徴としている。本発明により、チオール基を有する化合物のみ検出することが出来るので、本発明は、タンパク質及び／又はペプチドの定量分析に適している。本発明は、細胞の異常に関連したタンパク質及び／又はペプチドの探索と検査を実現出来るので、診断や医薬品開発、細胞異常の兆候チェックなどに有用である。
【００３５】
本発明で使用するタンパク質及び／又はペプチド分析用発蛍光化試薬としては、図８に示す発蛍光化試薬（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ、ＳＢＤ−Ｆなど）が挙げられ、必要により、適宜加温する。この発蛍光化試薬（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ、ＳＢＤ−Ｆなど）の特性としては、例えば、３０〜１００℃で、望ましくは、４０〜７０℃で１０〜３００分間、より望ましくは、６０〜１８０分間加温することにより、タンパク質及び／又はペプチドを発蛍光標識化するが、反応条件：４０度１０分で反応、励起波長：３９５ｎｍ、蛍光波長（検出）：５０５ｎｍ、が好適なものとして例示される。
【００３６】
ここでは、発蛍光標識化反応液を蛍光検出器付き逆相分配ＨＰＬＣ、又はイオン交換カラムＨＰＬＣ、又はゲル濾過ＨＰＬＣに付し、クロマトグラムを得る。
【００３７】
これを基に細胞の種類により、プロファイルが異なれば（差異があれば）、簡単な比較で差異があることが分かる。例えば病態で異なる場合、本発明では、先行技術（特許文献１及び２）に記載されているように、発現タンパク質及び／又はペプチドを含むＨＰＬＣ／蛍光検出で分離し、蛍光ピークの強さを比較して標的発現タンパク質及び／又はペプチドの蛍光誘導体を分離し、得られた標的微量発現タンパク質及び／又はペプチドのピーク画分を、質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析、データベース照会、構造解析により、上記タンパク質及び／又はペプチドを同定する。
【００３８】
本発明においては、上述したように、例えば、３０〜１００℃で、望ましくは、４０〜７０℃で１０〜３００分間、より望ましくは、６０〜１８０分間加温することにより、タンパク質及び／又はペプチドを発蛍光標識化する。その後、反応液のほぼ全量、又は一部を蛍光検出器付き逆相分配ＨＰＬＣ、又はイオン交換ＨＰＬＣ、又はゲル濾過ＨＰＬＣに付し、蛍光をモニターしながらピーク分画を分取することが可能である。この場合、蛍光検出は、標識蛍光体の励起・蛍光波長に相当する波長に設定して行う。
【００３９】
次に、ＤＡＡＢＤ化タンパク質及び／又はペプチドの同定について説明すると、上記蛍光化試薬で誘導化した物質のうち、ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ，ｏｘｙｔｏｃｉｎ，ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ，ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ，ａｍｙｌｉｎについて、ＬＣ−ＭＳによる同定を試みた。それらの分子量を以下に示す。
ｍ／ｚ  ５４１．８（Ｍ＋３Ｈ）３＋［ＤＡＡＢＤ−ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ］
５１６．０（Ｍ＋３Ｈ）３＋［ＤＡＡＢＤ−ｏｘｙｔｏｃｉｎ］
７２６．６（Ｍ＋３Ｈ）３＋［ＤＡＡＢＤ−ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ］
９８９．９（Ｍ＋４Ｈ）４＋［ＤＡＡＢＤ−ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ］
８９２．８（Ｍ＋５Ｈ）５＋［ＤＡＡＢＤ−ａｍｙｌｉｎ］
【００４０】
これらの全ての分子量は、それぞれのペプチドの２つのシステイン残基にＤＡＡＢＤが付加したときの分子量であり、多価イオンピークの検出結果より、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌによる誘導体化において、これらのペプチドのシステイン残基間のＳ−Ｓ結合が還元され、２つのチオール基両方に試薬が反応したことがわかった。
また、タンパク質の場合は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ検出及びＭＡＳＣＯＴによるデータベース検索を行って同定を試みた結果、タンパク質を同定することが可能であった。
【００４１】
本発明では、被験試料として、生体から採取したあらゆる種類のタンパク質及び／又はペプチドを含む試料が対象とされる。本発明の方法では、被験試料中の微量発現タンパク質及び／又はペプチドを発蛍光化試薬で標識し、蛍光誘導体化する。この場合、タンパク質及び／又はペプチド水溶液に、官能基特異的蛍光化試薬を加え、場合により、界面活性剤及び／又はタンパク変性剤を加え、発現タンパク質及び／又はペプチドを定量的に誘導体化することが重要である。
【００４２】
即ち、本発明では、発現タンパク質及び／又はペプチド水溶液に、界面活性剤と、場合によっては還元剤を添加し、これに官能基特異的発蛍光化試薬を加え、必要により、加温することにより、発現タンパク質及び／又はペプチドを蛍光標識する。本発明では、上記界面活性剤として、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性又は両イオン性界面活性剤が用いられる。また、本発明では、上記還元剤として、好適には、Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ，ｔｒｉｂｕｔｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｉｎｅが用いられるが、これらに制限されるものではなく、同効のものであれば、同様に使用することができる。
【００４３】
本発明において、上記官能基特異的発蛍光化試薬として、好適には、例えば、以下の発蛍光化試薬（図８）が挙げられる。
（１）ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ］
【００４４】
本発明で使用する発蛍光化試薬としては、例えば、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ［４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ］が挙げられるが、これに制限されるものではなく、例えば、Ｃｙｓ−含有微量タンパク質を誘導化するためには、チオール基に特異的な発蛍光化試薬であるＳＢＤ−Ｆ［Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］を使用することができる。
【００４５】
本発明では、発現タンパク質／ペプチドの種類、分析目的等に応じて、例えば、以下の発蛍光化試薬を適宜使用することができる。尚、これらの発蛍光化試薬は、先行技術に係るＪＰ特許第４５５８２９７号の特許公報（Ｂ２）の実施例に具体的に記載した方法と同様にして合成することができる。
【００４６】
（１）ＴＡＡＢＤ−Ｃｌ（７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（２）ＤＡＡＢＤ−Ｆ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ］
（３）ＴＡＡＢＤ−Ｆ（７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（４）ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｃｌ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ］
（５）ＴＡＡＢＳｅＤ−Ｃｌ（７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（６）ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ］
（７）ＴＡＡＢＳｅＤ−Ｆ（７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（８）ＤＡＡＢＴｈＤ−Ｃｌ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ］
（９）ＴＡＡＢＴｈＤ−Ｃｌ（７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（１０）ＤＡＡＢＴｈＤ−Ｆ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ］
（１１）ＴＡＡＢＴｈＤ−Ｆ（７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
【００４７】
また、本発明に係る生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法は、先行技術である特許文献１〜４記載の手法同様、蛍光検出器による発現タンパク質及び／又はペプチドの検出後に、フラクションコレクターなどによる分画を行い、トリプシンなどの消化酵素を用いたタンパク質及び／又はペプチドの断片化処理を施した後、質量分析計を用いた発現タンパク質及び／又はペプチドの同定ならびに構造決定を行うことが可能である。
【００４８】
本操作による生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドの同定ならびに構造解析においては、分離カラム通過後の溶出液の一部あるいは全てを分画することで、発現タンパク質及び／又はペプチドの一部あるいは全ての同定ならびに構造決定を行うことが出来る。
【００４９】
さらに、本発明において使用する液体クロマトグラフィーシステムならびに分離カラムにおいては、試料の分離に要する溶媒の送液量が極端に微量化されることから、カラム溶出液を直接的に質量分析計へ導入することも可能であり、使用する質量分析計の種類あるいは解析ソフトウェアに対応して、カラム溶出液を分画した後、酵素消化を行い、質量分析計による溶出成分の同定ならびに構造解析を行う手法と、カラム溶出液を直接的に質量分析計へ導入し、溶出成分の同定ならびに構造解析を行う手法を利用することが可能である。
【発明の効果】
【００５０】
本発明は、上記特定の構成を採用することにより、明細書に記載の以下のような格別な作用効果を奏するものである。
１）本発明に係る生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法ならびに装置によれば、生体組織及び生体液に含有される多種多様でありかつ微量である発現タンパク質及び／又はペプチドに、システイン選択的発蛍光化試薬を導入することで、蛍光検出器を有する微量送液液体クロマトグラフによって、生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドのプロファイルを得ることが可能である。
【００５１】
２）また、測定時に使用するポンプ送液流量の範囲が、０．１〜１０μＬ／ｍｉｎであることから、例えば、２４時間連続の測定であったとしても、溶媒の使用量は、０．１４〜１４ｍＬと少量であるので、数日にわたる連続測定も可能である。
【００５２】
３）そのため、由来の異なる生体組織及び生体液の多検体を連続的に測定することや、培養漕などから継時的に取り出した生体液試料を測定し、得られたプロファイルを差異解析することによって、生体組織及び生体液の状態を解析すること、即ち、生体組織等の内的ならびに外的要因に基づく変化や特徴を知ること、が可能となる。
【００５３】
４）さらに、特に、生体活動に関連するタンパク質成分に焦点を当てたプロファイルを描くこと、ならびに複数のタンパク質成分に対しては、装置の並列稼働により、生体組織等の内的ならびに外的要因に基づく変化や特徴に関する分析時間を短縮させること、が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の一実施形態に係る装置構成の模式図（装置の概要）を示す。
【図２】本発明の一実施形態に係る並列化装置の模式図（並列化装置の概要）示す。
【図３】本発明の一実施形態に使用するモノリス形シリカキャピラリーカラムによるヒトタンパク質の一斉分離結果に係る高精度分離図を示す。
【図４】実施例１における酵母由来発蛍光化タンパク質の分離プロファイル結果を表す図を示す。（分析例）
【図５】実施例２における酵母由来発蛍光化タンパク質の分離プロファイル結果を表す図を示す。（長さの効果）
【図６】実施例３における酵母由来発蛍光化タンパク質の分離プロファイル結果を表す図を示す。（グラジエント時間の最適化）
【図７】実施例４における酵母由来発蛍光化タンパク質の分離プロファイル結果を表す図を示す。（システムの並列稼働）
【図８】タンパク質分析用発蛍光化試薬（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ）及びＳＤＢ−Ｆを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
以下、本発明の一実施形態（装置の構成例、試験例、実施例等）を、図面を用いて説明するが、本発明は、以下の構成例、試験例、実施例等によって何ら限定されるものではない。
【００５６】
装置の構成例１
本発明に係るタンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法で使用する装置の構成例を図１に基づいて具体的に説明する。
【００５７】
移動相Ａ及び移動相Ｂの少なくとも２つの液送ポンプＡと液送ポンプＢの組み合わせにより長時間にわたる任意の勾配送液が可能な送液ユニットと、シリカ基材を含む吸着層の厚みが１μｍ以下である吸着剤を含む内径３０〜３００μｍかつ長さ２５ｃｍ以上の分離カラムと、蛍光検出器を備えた微量送液液体クロマトグラフィーカラムとを連結して本解析方法で使用する解析装置を構築した。
【００５８】
上記送液ユニットに試料注入切り替えバルブを介して、上記蛍光検出器を備えた分離カラムを連結し、該分離カラムに温度制御可能な恒温槽を設けた。上記送液ユニット、試料注入切り替えバルブ、分離カラム及び蛍光検出器をシステム制御用のパソコンと連結して、データ取得、解析等を実行するための基本構成とした。
【００５９】
蛍光検出器を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＦＤ−ＬＣ）を含むそれぞれの構成要素は、以下の通りである。
ＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ；Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００ｎａｎｏ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ），Ｄｅｔｅｃｔｏｒ；ＦＰ−２０２０  ｐｌｕｓ  ｗｉｔｈ  ３０μｍ  Ｉ．Ｄ．ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｃｅｌｌ（ＪＡＳＣＯ，Ｅｘ；３９５ｎｍ，Ｅｍ；５０５ｎｍ），Ｃｏｌｕｍｎｓ（モノリスシリカキャピラリーカラム；０．１ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ、７００ｍｍ  ｌｅｎｇｔｈ；Ｕｌｔｒｏｎ  Ｃ４  ａｎｄ  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｓｈｉｎｗａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）
【００６０】
装置の構成例２
本発明に係るタンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法で使用する並列化装置の構成例を図２に基づいて具体的に説明する。
【００６１】
少なくとも２つの送液ポンプの組み合わせにより長時間にわたる任意の勾配送液が可能な４台の送液ユニットと、シリカ基材を含む吸着層の厚みが１μｍ以上である吸着剤を含む内径３０〜３００μｍかつ長さ２５ｃｍ以上の分離カラムと、蛍光検出器を備えた微量送液液体クロマトグラフィーカラムとを、試料注入切り替えバルブを介して連結した本解析方法で使用する解析装置を構築した。
【００６２】
上記送液ユニットに、上記試料注入切り替えバルブを介して、自動試料注入装置（オートサンプラ）を連結し、試料の移動相を自動的に注入できるようにした。上記各々の蛍光検出器とシステム制御用のパソコンを連結して、データ取得、解析等を実行するための並列化装置の基本構成とした。尚、蛍光検出器を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＦＤ−ＬＣ）を含むそれぞれの構成要素は、装置の構成例１と同様とした。
【００６３】
試験例１
本試験例では、発蛍光化試薬（蛍光誘導体化試薬）の合成を行った。
ＤＡＡＢＤ−Ｃｌの合成
４−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｙｌ−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏａｄｉａｚｏｌｅ（ＣＢＤ−Ｃｌ）（１２６．５３ｍｇ）をＣＨ３ＣＮに溶解し、Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅを滴下し、ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅを加えた。室温で約１０分間撹拌後、反応液を減圧乾固した後、シリカゲルカラム（ＣＨ２Ｃｌ２）で精製し、４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ）（２０．２ｍｇ，８７．４％）を得た。
【００６４】
得られた化合物の確認データを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：７．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５），（７．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５），３．０６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７），２．３０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７），２．０２（６Ｈ，ｓ）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３０５（Ｍ＋Ｈ）＋
【００６５】
試験例２
本試験例では、発蛍光化試薬（発蛍光誘導体化試薬）のＭＳでの感度を比較した。
上記合成例で作製したサンプルを、ＬＣ−ＭＳにより検出し、発蛍光誘導体試薬でラベルしていないもの及びＳＢＤ−Ｆ（図８）で誘導体化したものと、相対強度を比較した。
【００６６】
発蛍光誘導体化試薬でラベルしていないｃｙｓｔｅｉｎｅ，ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ，ＧＳＨの高さをそれぞれ１としたときの相対強度は下記の表１の通りであった。尚、ＳＢＤ−Ｆの場合、４０℃で誘導体化を行うと１２０分間の反応時間が必要であったが、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌの場合は、１０〜２０分間で反応が終了した。従って、反応時間は、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌの場合は２０分が好適であった。上記より、ＤＡＡＢＤ−ＣｌがＭＳでの感度が高いことがわかった。また、移動相が酸性であるので、ＤＡＡＢＤ化誘導体は、プラスに荷電され、水溶性であると考えられた。
【００６７】
【表１】
2020201075.tif 000003
【００６８】
ＤＡＡＢＤ化ペプチド・タンパク質の検出限界
下記の表２に示した１０種類のペプチド・タンパク質標品１０μＭ混合液、１７．５ｍＭ  ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＣＨＡＰＳそれぞれを５０μＬを混合し、ｐＨ９．０、４０℃で、３０分間反応させた。尚、各試薬は、６．０Ｍ塩酸グアニジンを含む０．１０Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。生成したＤＡＡＢＤ化ペプチド・タンパク質はＨＰＬＣを用いて測定し、蛍光検出の検出限界をＳＢＤ−Ｆと比較した。
【００６９】
【表２】
2020201075.tif 000004
【００７０】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明する。
【実施例１】
【００７１】
酵母抽出タンパク質を用いたプロファイルを作製するために、次の装置構成ならびに分析条件にてシステムを構築した。
【００７２】
「システム構成」
・送液ポンプ、オートサンプラー、カラムオーブン：Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ｎａｎｏ（サーモフィッシャー）
・蛍光検出器：ＦＰ−２０２０（日本分光）
・検出セル：キャピラリーセル（内径３０μｍ、セル長さ１ｃｍ）
・カラム：Ｃ４修飾モノリスキャピラリーカラム（内径１００μｍ、長さ７０ｃｍ）
【００７３】
「クロマトグラフィー分離条件」
・移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ−超純水
・移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ−アセトニトリル
・送液流量：０．５μＬ／分
【００７４】
・グラジエント条件：２０〜３５％Ｂ（３６０分）
・カラム温度：５０度
・蛍光波長：励起波長（Ｅｘ）３９５ｎｍ、検出波長（Ｅｍ）５０５ｎｍ、ゲイン１０００
・サンプル注入量：０．５μＬ
・サンプル重量：０．５μｇ
【００７５】
分析用試料は、特許文献に則り、次の条件にて調製した。
「分析試料の調製」
試料として、酵母（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）抽出タンパク質（商品名：ＭＳ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔ，  Ｉｎｔａｃｔ、プロメガ社）を用いた。本酵母は、１２百万塩基よりなる酵母であり、タンパク質発現に関わる遺伝子数は、約６，０００である。
【００７６】
本試料１ｍｇに対し、６Ｍグアニジン溶液（６００μＬ），１００ｍＭ  ＥＤＴＡ―６Ｍグアニジン溶液（２００μＬ）、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ−６Ｍグアニジン溶液（５０μＬ）、１４０ｍＭ  ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−アセトニトリル溶液（５０μＬ）を添加後、４０度で１０分間反応させた後、氷冷しながら１０％ＴＦＡ（３０μＬ）を加え、結果として、蛍光化タンパク質の１ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【００７７】
６時間にわたる分析の結果を図４に示す。図の縦軸は、蛍光発光による検出値（ｍＶ）を示す。結果として、タンパク質の種類によるピークが約３５０本得られたとともに、本試料の酵母が発現したタンパク質に由来するプロファイルが得られた（ゲノムサイズ：１２．１百万塩基、遺伝子数：６２７５）。本測定で使用された溶媒量は、約０．２ｍＬであった。
【実施例２】
【００７８】
分離カラムの長さによるプロファイルへの影響を確認するために、長さ２５ｃｍならびに７０ｃｍのカラムを使用し、それぞれの長さに適した分析時間での分析を実施した。分析条件は、グラジエント条件のみ変更し、長さ２５ｃｍカラムに対しては、１０〜５５％Ｂ（６０分）、長さ７０ｃｍカラムに対しては、２０〜５５％Ｂ（２４０分）を実施した。結果を図５に示す。図の縦軸は、蛍光発光による検出値（ｍＶ）を示す。
【００７９】
図５（ａ）は、２５ｃｍカラムで得られたプロファイルであり、図５（ｂ）は、７０ｃｍカラムで得られたプロファイルである。図５（ａ）の２５ｃｍカラムで得られたプロファイルは、図５（ｂ）の７０ｃｍカラムで得られたプロファイルに比して、良好な分離とは言い難い。一方、両プロファイルとも同様の形状は示していることが見て取れる。
【００８０】
生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法においては、必ずしも超高精度な分離は必要と限らない。また、遺伝子数の少ない生物種は、タンパク質の種類が少ないため、生物種に適したカラム長さの選択が可能である。実施例２の結果は、本発明は、生物種に適したカラム長を選択可能であることを示している。
【実施例３】
【００８１】
より高精度なタンパク質及び／又はペプチド情報を得る取り組みとして、分離時間とタンパク質及び／又はペプチドのピーク検出数の関係を検証した。その結果を図６に示す。図の縦軸は、蛍光発光による検出値（ｍＶ）を示す。分析条件は、２５〜４５％のグラジエントを２４０分、３６０分、６００分で実施した。結果として、それぞれ検出ピーク数が３０１、３９２、７０６であった。
【００８２】
グラジエント時間を長くするにつれて、より多くのタンパク質のピークが検出されたことから、より高精度にタンパク質のプロファイルを得るためには、長い緩やかなグラジエント条件が適していることが示された。従って、本発明は、例えば、よりタンパク質数の多いヒトを対象とした疾患マーカー探索などでは、より長時間、安定的に稼働出来る点で有用であることが実証された。
【実施例４】
【００８３】
実施例３より、ヒトなどより多くの遺伝子を有し、多くのタンパク質及び／又はペプチドの発現が予測される生物種の、より精密な指紋解析のためには、数十時間のグラジエント分析が必要であることが推測される。
【００８４】
一方、本発明に係る上記解析手法は、多検体のプロファイルを比較することにより、疾患特異的なプロファイルや、疾患関連タンパク質及び／又はペプチドなどを見出すことが期待されることから、一日に数検体の分析が求められる。本発明に係る上記指紋を用いた解析方法ならびに装置により、短時間での高精度の分析を実現するために、並列化装置の稼働について検証をした。
【００８５】
図７（ａ）は、分析時間６００分において、グラジエント条件として２０〜４５％Ｂを適用し得られたプロファイルである。これに対し、同分析時間にて、グラジエント条件２０〜３５％Ｂで得たプロファイルを図７（ｂ）に、グラジエント条件３０〜４５％Ｂを適用して得たプロファイルを図７（ｃ）に示す。
【００８６】
図７（ｂ）のグラジエント条件２０〜３５％Ｂは、図７（ａ）の０〜３６０分に対応し、同等のプロファイルを保ちながら、より高精度な分離がなされた。また、図７（ｃ）のグラジエント条件３０〜４５％Ｂは、図７（ａ）の２４０〜６００分に対応し、同等のプロファイルを保ちながら、より高精度な分離が達成された。
【００８７】
このように、液体クロマトグラフィーの原理に従い、タンパク質及び／又はペプチドは、溶離液の濃度に対応して溶出ならびに検出されることから、グラジエント条件が異なっていても、溶離液の濃度に対応したプロファイルが得られていることが分かる。また、より緩やかなグラジエント条件になっていることから、より高精度の分離が達成された。
【００８８】
従って、本システムを、図２のように、複数台並列化させ、例えば、１０台使用し、それぞれグラジエント条件をずらすことで、１００時間相当の分析にて得られる高精度なタンパク質及び／又はペプチドプロファイルを、１０時間の分析時間にて得ることが出来ること、あるいは、１０時間相当で得られる分析結果を１時間で得ることが可能となること、が検証された。
【００８９】
本発明は、タンパク質及び／又はペプチドを高精度に分離する微小カラムを使用し、分析にかかる溶媒量の消費を大きく低減していることから、このようなシステムの並列化は現実的であり、例えば、タンパク質及び／又はペプチドが関与する疾患の診断あるいは個別化治療の効果予測などに、広く活用されることが期待される。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
以上、詳述したように、本発明は、生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法ならびに装置に係るものであり、本発明は、生体組織及び生体液において発現した微量発現タンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた新規解析方法を提供するとともに、微量送液液体クロマトグラフ技術を利用することにより、連続的に多検体の生体組織及び生体液において発現した微量発現タンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法ならびに解析装置を提供するものである。本発明は、上記指紋を用いた解析方法及びその装置の利用により、医学や薬学だけでなく、微生物を利用した培養技術やその効率化へ向けた微生物の遺伝子改変技術の向上など、農学や食品学に至るまで多くの産業にて有用である。
【図１】
2020201075.tif 000005
【図２】
2020201075.tif 000006
【図３】
2020201075.tif 000007
【図４】
2020201075.tif 000008
【図５】
2020201075.tif 000009
【図６】
2020201075.tif 000010
【図７】
2020201075.tif 000011
【図８】
2020201075.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月10日(2019.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのポンプの組み合わせにより任意な勾配送液が可能な送液システムと、シリカ基材を含む吸着層の厚みが１μｍ以下である吸着剤を含む内径３０〜３００μｍかつ長さ２５ｃｍ以上の分離カラムならびに蛍光検出器を備えた液体クロマトグラフィーカラムにより、被験試料に蛍光マーカーを結合させたタンパク質及び／又はペプチドを用いて当該タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離を行い、続いて、分離された蛍光化タンパク質及び／又はペプチドを、蛍光検出器で連続的に定量計測することにより、生体中で発現したタンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づくプロファイルを得ることを特徴とする生体組織及び／又は生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項２】
前記ポンプの送液流量が、０．１〜１０μＬ／ｍｉｎである、請求項１に記載の生体組織及び／又は生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項３】
前記分離カラムが、モノリス状シリカゲルあるいはモノリス状ポリマーゲルを含むモノリスシリカキャピラリーカラムである、請求項１又は２に記載の生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項４】
前記分離カラムが、表層多孔性シリカゲル粒子あるいは合成ポリマー粒子を含むものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項５】
前記分離カラム表面へ結合された蛍光化タンパク質の吸着リガンドの炭素数が、１〜１８である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項６】
前記タンパク質が、ヒトや動物、植物、昆虫あるいは微生物から抽出されるタンパク質であり、タンパク質総重量が、５μｇ以下である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項７】
前記蛍光マーカーが、タンパク質及び／又はペプチド中のチオール基あるいはアミノ基に結合するものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項８】
分析目的とする複数のタンパク質プロファイルを選択し、少なくとも２つの送液ポンプを含む複数台の送液ユニットを並列稼働させる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項９】
前記指紋を用いた解析方法で使用する装置であって、少なくとも２つのポンプにより任意な勾配送液が可能な送液システムと、シリカ基材を含む吸着層の厚みが１μｍ以下である吸着剤を含む内径３０〜３００μｍかつ長さ２５ｃｍ以上の分離カラムならびに蛍光検出器を備えた液体クロマトグラフィーカラムとを構成要素として含み、被験試料として、発蛍光化試薬で標識化した生体組織及び／又は生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドを前記蛍光検出器を備えた液体クロマトグラフィーカラムに供給することにより当該微量発現タンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析を行うようにしたことを特徴とする装置。
【請求項１０】
少なくとも２つの送液ポンプを含む複数台の送液ユニットを並列に設置して並列稼働させるようにした、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記分離カラムが、モノリス状シリカゲルあるいはモノリス状ポリマーゲルを含むモノリスシリカキャピラリーカラムである、請求項９又は１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記吸着剤が、表層多孔性シリカゲル粒子あるいは合成ポリマー粒子を含むものである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
前記吸着剤が、シリカ基材へ炭素数１〜１８の吸着リガンド又はフェニル形シリル化剤による表面修飾処理を施したものである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の装置。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
従来の多孔性微粒子充填型カラムを利用した結果に反して、細いキャピラリーカラムにてタンパク質の精密な分離が達成された理由としては、開発した多孔性シリカモノリスの吸着層の厚みが１μｍ以下であり、現在市販されている多孔性微粒子充填剤サイズが最小で１．５μｍの厚みであることから、多孔性微粒子充填型カラムでは成しえないタンパク質の高精度分離がモノリス状シリカを利用したキャピラリーカラムにて実現されたことが挙げられる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
本発明は、少なくとも２つのポンプの組み合わせにより任意な勾配送液が可能な送液システムと、シリカ基材を含む吸着層の厚みが１μｍ以下である吸着剤を含む内径３０〜３００μｍかつ長さ２５ｃｍ以上の分離カラムならびに蛍光検出器を備えた液体クロマトグラフにより、被験試料に蛍光マーカーを結合させたタンパク質及び／又はペプチドを用いて当該タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離を行い、続いて、分離された蛍光化タンパク質及び／又はペプチドを、蛍光検出器で連続的に定量計測することにより、生体中で発現したタンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づくプロファイルを得ることを特徴とする生体組織及び／又は生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドの指紋を用いた解析方法、に係るものである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
（１）ＴＡＡＢＤ−Ｃｌ（７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（２）ＤＡＡＢＤ−Ｆ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ］
（３）ＴＡＡＢＤ−Ｆ（７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（４）ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｃｌ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ］
（５）ＴＡＡＢＳｅＤ−Ｃｌ（７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（６）ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ］
（７）ＴＡＡＢＳｅＤ−Ｆ（７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（８）ＤＡＡＢＴｈＤ−Ｃｌ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ］
（９）ＴＡＡＢＴｈＤ−Ｃｌ（７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（１０）ＤＡＡＢＴｈＤ−Ｆ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ］
（１１）ＴＡＡＢＴｈＤ−Ｆ（７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
「システム構成」
・送液ポンプ、オートサンプラー、カラムオーブン：Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ｎａｎｏ（サーモフィッシャー）
・蛍光検出器：ＦＰ−２０２０（日本分光）
・検出セル：キャピラリーセル（内径３０μｍ、セル長さ１ｃｍ）
・カラム：Ｃ４修飾モノリスシリカキャピラリーカラム（内径１００μｍ、長さ７０ｃｍ）
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
分析用試料は、特許文献に則り、次の条件にて調製した。
「分析試料の調製」
試料として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）抽出タンパク質（商品名：ＭＳ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔ，  Ｉｎｔａｃｔ、プロメガ社）を用いた。本酵母は、１２百万塩基よりなる酵母であり、タンパク質発現に関わる遺伝子数は、約６，０００である。
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月29日(2020.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのポンプの組み合わせにより任意な勾配送液が可能な送液システムと、シリカ基材を含む吸着層の厚みが１μｍ以下である吸着剤を含む内径３０〜３００μｍかつ長さ２５ｃｍ以上の分離カラムならびに蛍光検出器を備えた液体クロマトグラフィーカラムにより、被験試料に蛍光マーカーを結合させたタンパク質及び／又はペプチドを用いて当該タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離を行い、続いて、分離された蛍光化タンパク質及び／又はペプチドを、蛍光検出器で連続的に定量計測することにより、生体中で発現したタンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づくプロファイルを得ることを特徴とする生体組織及び／又は生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項２】
前記ポンプの送液流量が、０．１〜１０μＬ／ｍｉｎである、請求項１に記載の生体組織及び／又は生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項３】
前記分離カラムが、モノリス状シリカゲルあるいはモノリス状ポリマーゲルを含むモノリスシリカキャピラリーカラムである、請求項１又は２に記載の生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項４】
前記分離カラムが、表層多孔性シリカゲル粒子あるいは合成ポリマー粒子を含むものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項５】
前記分離カラム表面へ結合された蛍光化タンパク質の吸着リガンドの炭素数が、１〜１８である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項６】
前記タンパク質が、ヒトや動物、植物、昆虫あるいは微生物から抽出されるタンパク質であり、タンパク質総重量が、５μｇ以下である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項７】
前記蛍光マーカーが、タンパク質及び／又はペプチド中のチオール基あるいはアミノ基に結合するものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項８】
分析目的とする複数のタンパク質プロファイルを選択し、少なくとも２つの送液ポンプを含む複数台の送液ユニットを並列稼働させる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の生体組織及び生体液含有微量発現タンパク質及びペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の指紋を用いた解析方法で使用する装置であって、少なくとも２つのポンプにより任意な勾配送液が可能な送液システムと、シリカ基材を含む吸着層の厚みが１μｍ以下である吸着剤を含む内径３０〜３００μｍかつ長さ２５ｃｍ以上の分離カラムならびに蛍光検出器を備えた液体クロマトグラフィーカラムとを構成要素として含み、被験試料として、発蛍光化試薬で標識化した生体組織及び／又は生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドを前記蛍光検出器を備えた液体クロマトグラフィーカラムに供給することにより生体組織及び／又は生体液含有微量発現タンパク質及び／又はペプチドの種類及び発現量に基づく指紋を用いた解析を行うようにしたことを特徴とする装置。
【請求項１０】
少なくとも２つの送液ポンプを含む複数台の送液ユニットを並列に設置して並列稼働させるようにした、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記分離カラムが、モノリス状シリカゲルあるいはモノリス状ポリマーゲルを含むモノリスシリカキャピラリーカラムである、請求項９又は１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記吸着剤が、表層多孔性シリカゲル粒子あるいは合成ポリマー粒子を含むものである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
前記吸着剤が、シリカ基材へ炭素数１〜１８の吸着リガンド又はフェニル形シリル化剤による表面修飾処理を施したものである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の装置。