(57)【要約】【課題】効率的にインビトロでＢ細胞を遺伝子改変する方法および試薬を改善すること。【解決手段】本開示は、Ｂ細胞が予防と治療用途に効果的に使用可能なように、Ｂ細胞を改変および分化／活性化するベクターと方法を提供する。本開示は、メモリーＢ細胞をプラズマ芽球およびプラズマ細胞へと分化させるために、インビトロの複数条件下でＢ細胞を培養することに一般的に関する。本発明はさらに、Ｂ細胞を遺伝学的に改変して目的遺伝子を発現させること、そして、その目的遺伝子にコードされるタンパク質を発現させるために、その改変Ｂ細胞を活性化および培養することに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１４日に出願した米国仮特許出願番号第６１／７８５，４９０号への優先権を主張し、その出願は参照により完全に本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本開示は、メモリーＢ細胞をプラズマ芽球およびプラズマ細胞へとインビトロで分化させること並びにこれらの細胞を遺伝学的に改変して目的タンパク質（例、特異的抗体または他のタンパク質治療剤）を発現させることに関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
骨髄を離れた後、Ｂ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として振る舞い、抗原を内部に取り込む。抗原は、受容体を媒介するエンドサイトーシスによりＢ細胞に取り込まれ、プロセスされる。抗原は、抗原性ペプチドにプロセスされ、ＭＨＣＩＩ分子にロードされ、そして、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞へとＢ細胞の細胞外表面上で提示される。このＴ細胞は、ＭＨＣＩＩ／抗原分子に結合し、Ｂ細胞の活性化を引き起こす。Ｔ細胞により刺激されると、活性化Ｂ細胞は、より特異的な細胞へと分化する。胚中心のＢ細胞は、メモリーＢ細胞またはプラズマ細胞へと分化する場合がある。これらＢ細胞のほとんどは、プラズマ芽球、最終的にはプラズマ細胞になり、多量の抗体を産生開始する（例えば、Ｔｒｅｎｄｓ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００９年６月、３０（６）：２７７−２８５；Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００５年、５：２３１−２４２を参照されたい）。Ｂ細胞ではなくプラズマ細胞と考えられるほとんどの未成熟血液細胞は、プラズマ芽球である。プラズマ芽球は、Ｂ細胞よりも抗体を分泌するが、プラズマ細胞よりは少ない。プラズマ芽球は、迅速に分裂し、まだ抗原を内部に取り込むことができて、抗原をＴ細胞へと提示することができる。細胞はこの状態に数日間留まる場合があり、その後、死滅するか、または、成熟した完全に分化したプラズマ細胞へと不可逆的に分化する。
【０００４】
最終的に分化したプラズマ細胞は、比較的少数の表面抗原を発現し、共通する一般的（ｐａｎ）Ｂ細胞マーカー（例、ＣＤ１９およびＣＤ２０）を発現しない。その代わりに、プラズマ細胞は、ＣＤ３８、ＣＤ７８、インターロイキン６受容体の追加的発現とＣＤ４５の発現の欠如によりフローサイトメトリーを介して同定される。ヒトにおいては、ＣＤ２７がプラズマ細胞の良いマーカーであり、ナイーブＢ細胞はＣＤ２７−、メモリーＢ細胞はＣＤ２７＋、そしてプラズマ細胞は、ＣＤ２７＋＋である。ＣＤ３８およびＣＤ１３８がプラズマ細胞上でハイレベルに発現される（Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ、自由に利用できる百科事典、「Ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌ（プラズマ細胞）」、ページバージョンＩＤ：４０４９６９４４１、最終更新日：２０１０年１２月３０日、０９：５４  ＵＴＣ、２０１１年１月４日に検索、を参照されたい；また、Ｊｏｕｒｄａｎら、Ｂｌｏｏｄ．、２００９年１２月１０日；１１４（２５）：５１７３−８１；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９年６月、３０（６）：２７７−２８５；Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００５年、５：２３１−２４２；Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、２０１０年、１６：１２３−１２９；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．、Ｈｏｎｊｏ，Ｔ．、Ａｌｔ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｗ．、（２００４年）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ」、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ｐｐ．１８９−１９１；Ｂｅｒｔｉｌ  Ｇｌａｄｅｒ、Ｇｒｅｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｇ．、Ｊｏｈｎ  Ｆｏｅｒｓｔｅｒ、Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ｇｅｏｒｇｅ  Ｇ．、Ｐａｒａｓｋｅｖａｓ，Ｆｒｉｘｏｓ、（２００８年）、「Ｗｉｎｔｒｏｂｅ’ｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ」、第二版、Ｓｅｔ．Ｈａｇｅｒｓｔｗｏｎ，ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ．、ｐｐ．３４７；Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍａｒｋ、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ、Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ、Ｔｒａｖｅｒｓ，ＰａｕｌＪ．、（２００８年）、「Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｐｐ．３８７−３８８；Ｒａｗｓｔｒｏｎ  ＡＣ（２００６年５月）、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌｓ」、Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｃｙｔｏｍも参照されたい）。
【０００５】
従来の偽型レトロウイルスは、様々な組織および細胞への感染効率が十分ではなかった。例えば、各種幹細胞（造血幹細胞ならびに休止Ｂ細胞およびＴ細胞を含むもの）は、遺伝子治療等において重要な標的細胞である（Ｙ．Ｈａｎａｚｏｎｏ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌ．３６、Ｎｏ．７、１９９９年）が、これらの細胞型のほとんどは非分裂状態で見出される（Ａｂｋｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、２（２）、１９０−７、１９９６年）。一般的に、そのような非分裂細胞に対して感染効率が低いレトロウイルスベクターを使用して遺伝子導入するのは困難である。
【０００６】
休止ＴおよびＢ細胞は、麻疹ウイルスの糖タンパク質ＨおよびＦをその表面に偽型したレトロウイルスベクターで効率的に形質導入可能である（例えば、Ｂｌｏｏｄ、２００９年１０月８日、１１４（１５）：３１７３−８０；Ｂｌｏｏｄ、２００８年、１１２：４８４３−４８５２を参照されたい）。しかしながら、ＶＳＶ−Ｇ偽型ウイルスベクターがＢ細胞に形質導入する能力に関しては、文献には相容れない報告がある（Ｂｏｖｉａら、２００３年、１０１：１７２７−１７３３；Ｓｅｒａｆｉｎｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３２５（２００４年）、４１３-４２４を参照されたい）。
非分裂細胞を改変することは、遺伝子治療および免疫療法にとって、特に重要である。しかしながら、Ｂ細胞をインビトロで分化および活性化する能力は、被験体に注入するために改変Ｂ細胞を調製する重要な工程となる。活性化および分裂Ｂ細胞はまた、簡単には遺伝的に改変されない。従って、効率的にインビトロでＢ細胞を遺伝子改変する方法および試薬を改善することの必要性が、当該技術分野ではまだある。本開示は、Ｂ細胞が予防と治療用途に効果的に使用可能なように、Ｂ細胞を改変および分化／活性化するベクターと方法を提供する。本開示は、詳細な説明に記載される本利点および他の利点を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００９年６月、３０（６）：２７７−２８５
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００５年、５：２３１−２４２
【非特許文献３】Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ、自由に利用できる百科事典、「Ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌ（プラズマ細胞）」、ページバージョンＩＤ：４０４９６９４４１、最終更新日：２０１０年１２月３０日、０９：５４  ＵＴＣ、２０１１年１月４日に検索
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｄａｎら、Ｂｌｏｏｄ．、２００９年１２月１０日；１１４（２５）：５１７３−８１
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、２０１０年、１６：１２３−１２９
【非特許文献６】Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．、Ｈｏｎｊｏ，Ｔ．、Ａｌｔ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｗ．、（２００４年）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ」、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ｐｐ．１８９−１９１
【非特許文献７】Ｂｅｒｔｉｌ  Ｇｌａｄｅｒ、Ｇｒｅｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｇ．、Ｊｏｈｎ  Ｆｏｅｒｓｔｅｒ、Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ｇｅｏｒｇｅ  Ｇ．、Ｐａｒａｓｋｅｖａｓ，Ｆｒｉｘｏｓ、（２００８年）、「Ｗｉｎｔｒｏｂｅ’ｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ」、第二版、Ｓｅｔ．Ｈａｇｅｒｓｔｗｏｎ，ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ．、ｐｐ．３４７
【非特許文献８】Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍａｒｋ、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ、Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ、Ｔｒａｖｅｒｓ，ＰａｕｌＪ．、（２００８年）、「Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｐｐ．３８７−３８８
【非特許文献９】Ｒａｗｓｔｒｏｎ  ＡＣ（２００６年５月）、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌｓ」、Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｃｙｔｏｍ
【非特許文献１０】Ｙ．Ｈａｎａｚｏｎｏ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌ．３６、Ｎｏ．７、１９９９年
【非特許文献１１】Ａｂｋｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、２（２）、１９０−７、１９９６年
【非特許文献１２】Ｂｌｏｏｄ、２００９年１０月８日、１１４（１５）：３１７３−８０
【非特許文献１３】Ｂｌｏｏｄ、２００８年、１１２：４８４３−４８５２
【非特許文献１４】Ｂｏｖｉａら、２００３年、１０１：１７２７−１７３３
【非特許文献１５】Ｓｅｒａｆｉｎｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３２５（２００４年）、４１３-４２４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一観点が提供するのは、Ｂ細胞に目的核酸を発現させる方法であって、（ａ）ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、およびｐ−ＯＤＮからなる群より選択される一又は複数の因子を含むＢ細胞活性化因子をＣＤ４０Ｌと組み合わせて含む組成物とメモリーＢ細胞を接触させる工程と、（ｂ）ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、およびＩＬ−１５からなる群より選択される一又は複数の因子を含むＢ細胞活性化因子と工程（ａ）の前記Ｂ細胞を接触させる工程であって、工程（ｂ）の前記Ｂ細胞がＣＤ３８を発現するような条件下にある工程と、（ｃ）ＶＳＶ−Ｇ偽型レトロウイルスベクターを用いて工程（ｂ）の前記Ｂ細胞に形質導入する工程であって、前記レトロウイルスベクターがプロモーターに機能的に連結された前記目的核酸を含む工程と、（ｄ）ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−δ、ＩＬ−６、およびＩＬ−１５からなる群より選択される一又は複数の因子を含むＢ細胞活性化因子と工程（ｃ）の前記形質導入Ｂ細胞を接触させて、従って、前記Ｂ細胞に前記目的核酸を発現させる工程と、を含む方法である。一つの実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、ｓＣＤ４０Ｌ−ｈｉｓである。別の実施形態では、形質導入効率は約２０％であり、いくつかの実施形態では、形質導入効率は２０％より高い。他の実施形態では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一つの実施形態（ｅｍｏｂｄｉｍｅｎｔ）では、目的核酸は、少なくとも免疫グロブリンＶＬおよびＶＨ領域をコードする核酸を含む。さらに別の実施形態では、目的核酸は、抗体タンパク質、その抗原結合断片、融合タンパク質、またはＤＮＡによりコードされる小分子をコードする。ある実施形態では、抗体は、抗ＨＩＶ抗体、抗ＲＮＡ抗体、または免疫制御に関わるタンパク質に結合する抗体である。本明細書中の方法の別の実施形態では、メモリーＢ細胞は、末梢血から単離される。本方法のいくつかの実施形態では、本方法の工程（ｂ）のＢ細胞は、ＣＤ２０−ＣＤ３８＋ＣＤ１３８−である。さらに別の実施形態では、本方法の工程（ｃ）のＢ細胞は、ＣＤ２０−ＣＤ３８＋ＣＤ１３８＋である。
特定の態様では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
Ｂ細胞に目的核酸を発現させる方法であって、
（ａ）ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、およびｐ−ＯＤＮからなる群より選択される一又は複数の因子を含むＢ細胞活性化因子をＣＤ４０Ｌと組み合わせて含む組成物とメモリーＢ細胞を接触させる工程と、
（ｂ）ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、およびＩＬ−１５からなる群より選択される一又は複数の因子を含むＢ細胞活性化因子と工程（ａ）の前記Ｂ細胞を接触させる工程であって、
工程（ｂ）の前記Ｂ細胞がＣＤ３８を発現するような条件下にある工程と、
（ｃ）ＶＳＶ−Ｇ偽型レトロウイルスベクターを用いて工程（ｂ）の前記Ｂ細胞に形質導入する工程であって、前記レトロウイルスベクターがプロモーターに機能的に連結された前記目的核酸を含む工程と、
（ｄ）ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−δ、ＩＬ−６、およびＩＬ−１５からなる群より選択される一又は複数の因子を含むＢ細胞活性化因子と工程（ｃ）の前記形質導入Ｂ細胞を接触させて、従って、前記Ｂ細胞に前記目的核酸を発現させる工程と、を含む方法。
（項目２）
前記ＣＤ４０ＬがｓＣＤ４０Ｌ−ｈｉｓである、請求項１に記載の方法。
（項目３）
前記形質導入効率が約２０％である、請求項１に記載の方法。
（項目４）
前記形質導入効率が２０％より高い、請求項１に記載の方法。
（項目５）
前記レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
（項目６）
前記目的核酸が、少なくとも免疫グロブリンＶＬおよびＶＨ領域をコードする核酸を含む、請求項１に記載の方法。
（項目７）
前記目的核酸が、抗体タンパク質、その抗原結合断片、融合タンパク質、またはＤＮＡによりコードされる小分子をコードする、請求項１に記載の方法。
（項目８）
前記抗体が、抗ＨＩＶ抗体、抗ＲＮＡ抗体、または免疫制御に関わるタンパク質に結合する抗体である、請求項７に記載の方法。
（項目９）
前記メモリーＢ細胞が末梢血から単離される、請求項１に記載の方法。
（項目１０）
工程（ｂ）の前記Ｂ細胞がＣＤ２０−、ＣＤ３８＋およびＣＤ１３８−である、請求項１に記載の方法。
（項目１１）
工程（ｃ）の前記Ｂ細胞がＣＤ２０−、ＣＤ３８＋およびＣＤ１３８＋である、請求項１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−１】図１は、一連のフローサイトメトリーのドットプロットであって、インビトロ培養のＤａｙ０（Ｄ０）、Ｄａｙ４（Ｄ４）、Ｄａｙ５（Ｄ５）、Ｄａｙ６（Ｄ６）、およびＤａｙ７（Ｄ７）での緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ウイルスを用いたＢ細胞への形質導入を示すものである。
【図１−２】図１は、一連のフローサイトメトリーのドットプロットであって、インビトロ培養のＤａｙ０（Ｄ０）、Ｄａｙ４（Ｄ４）、Ｄａｙ５（Ｄ５）、Ｄａｙ６（Ｄ６）、およびＤａｙ７（Ｄ７）での緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ウイルスを用いたＢ細胞への形質導入を示すものである。
【図１−３】図１は、一連のフローサイトメトリーのドットプロットであって、インビトロ培養のＤａｙ０（Ｄ０）、Ｄａｙ４（Ｄ４）、Ｄａｙ５（Ｄ５）、Ｄａｙ６（Ｄ６）、およびＤａｙ７（Ｄ７）での緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ウイルスを用いたＢ細胞への形質導入を示すものである。
【図２】図２は、９日間に渡るインビトロ培養でのメモリーＢ細胞分化を示す一連のフローサイトメトリーのドットプロットである。ＣＤ２０をｙ軸に示し、ＣＤ３８をｘ軸に示す。
【図３】図３は、９日間のインビトロ培養期間中の細胞増殖を示すドットプロットである。Ｄａｙ０に存在する細胞数に相対的な細胞数の変化倍数をｙ軸に提供し、培養日数をｘ軸に沿って提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示は、メモリーＢ細胞をプラズマ芽球およびプラズマ細胞へと分化させるために、インビトロの複数条件下でＢ細胞を培養することに一般的に関する。本発明はさらに、Ｂ細胞を遺伝学的に改変して目的遺伝子を発現させること、そして、その目的遺伝子にコードされるタンパク質を発現させるために、その改変Ｂ細胞を活性化および培養することに関する。これらの活性化改変Ｂ細胞を、その後、被験体に投与する。本明細書中に記載される組成物と方法は、例えば、簡単な採血由来のＢ細胞をインビトロで分化させ、その後、目的核酸によりコードされるタンパク質を大量に分泌するようにその分化したＢ細胞に前記目的核酸を形質導入する能力を提供する。このシステムの一つの特定の利点は、このシステムが休止メモリーＢ細胞をプラズマ芽球またはプラズマ細胞（これらは、その後、形質導入および目的タンパク質の生産のために使用される場合がある）へと分化させるために約１０日間しか必要としないことである。当該技術分野で既知のシステムは、１０週間ほどかかる場合がある。従って、本開示は、培養に、より少ない時間を必要とする方法であって、先行方法に比べて商業上の利点および安全性の利点を提供するものを提供する。本発明の別の利点は、このインビトロ培養方法により、形質導入効率が、約２０％の形質導入効率へと増加することである。このことは、当該技術分野で既知の方法の形質導入効率が低いことへの改善となる。本方法は、また、ＧＭＰグレードの生産にとってやっかいなものとなっているフィーダー細胞を必要としない。
【００１１】
Ｂ細胞の培養および形質導入方法
本開示の形質導入方法を用いる、使用のための細胞のプロトタイプの例は、Ｂ細胞である。ある実施形態では、本開示の方法に使用されるＢ細胞は、休止Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、プライムされるか若しくは活性化されたＢ細胞、ミエローマ細胞、リンパ球性白血病Ｂ細胞、またはＢリンパ腫細胞である場合がある。しかしながら、当業者は、本開示のベクターおよび方法が他の細胞型にも適用可能であることを容易に理解する。例示すると、培養、分化、改変、および活性化可能な細胞型には、任意の一般的に非分裂または静止状態の細胞（例、神経芽細胞、造血幹細胞および造血前駆細胞（ＣＤ３４＋細胞）、間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、神経と肝臓の前駆および幹細胞、樹状細胞、Ｔ細胞（ＣＤ８＋もしくはＣＤ４＋Ｔ細胞）、他の白血球集団、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）、多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉ−ｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）等）が含まれる。従って、本開示のある実施形態は、この本方法の結果生じる細胞集団を提供する。ある実施形態では、本明細書中に記載される方法およびベクターを使用して、任意の他の所望細胞型（例、肝細胞、表皮細胞、骨芽細胞、筋肉細胞、繊維芽細胞、脂肪細胞等）に形質導入する場合がある。
【００１２】
本明細書中で使用される「静止状態」は、細胞が活発に増殖していない細胞状態を指す。
【００１３】
分化および形質導入前に、被験体からＢ細胞の供給源を得る。用語「被験体」は、後天免疫応答が誘発可能な生きている生物（例、哺乳動物）を含むことを意図している。被験体の例には、ヒト、イヌ、ネコ、ネズミ、ラット、およびその遺伝子組み換え種が含まれる。Ｂ細胞は、多数の供給源（例、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、感染部位由来組織、脾臓組織、および腫瘍を含むもの）から得ることができる。本開示のある実施形態では、当該技術分野で利用可能な任意の数のＢ細胞株を使用してもよい。本明細書中に記載される方法のある実施形態では、当業者に既知の任意の数の技術（例、ＦＩＣＯＬＬ（商標）（高密度溶液を調製するのに使用可能な、ショ糖とエピクロルヒドリンとのコポリマー）分離）を使用して、被験体から回収される血液のユニットから、Ｂ細胞を得ることができる。一つの好ましい実施形態では、個人の循環血液由来の細胞を、アフェレーシスまたは白血球分離により得る。アフェレーシス産物は、典型的には、リンパ球（Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むもの）を含む。一つの実施形態では、アフェレーシスにより回収された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、そして、その細胞を次の処理工程用の適切な緩衝液または培地中に置く場合がある。本明細書中に記載される方法の一つの実施形態では、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。他の実施形態では、洗浄溶液はカルシウムを欠き、および、マグネシウムも欠く場合があるか又は全ての二価陽イオンではないかもしれないがその多くを欠く場合がある。当業者が容易に理解するであろうことには、当業者に公知の方法（例、半自動化「フロースルー」遠心分離機（例、Ｃｏｂｅ  ２９９１細胞処理装置）を、製造元の説明書に従って使用すること）により、洗浄工程を達成する場合がある。洗浄後、細胞を、各種生体適合性緩衝液（例、ＰＢＳ）中に再懸濁してもよい。または、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去し、そして細胞を、直接、培養培地中に再懸濁してもよい。
【００１４】
Ｂ細胞を、当該技術分野で既知の手法を使用して、末梢血から又は白血球分離により単離する場合がある。例えば、ＰＢＭＣをＦＩＣＯＬＬ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して単離する場合があり、そして、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を、当該技術分野で既知の任意の各種抗体を使用するネガティブまたはポジティブ選択（例、ロゼット型四量体（Ｒｏｓｅｔｔｅ  ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ）複合システム（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、カナダ））により精製する場合もある。ある実施形態では、メモリーＢ細胞を、Ｊｏｕｒｄａｎらにより記載されるように単離する（Ｂｌｏｏｄ、２００９年１２月１０日、１１４（２５）：５１７３−８１）。例えば、抗ＣＤ２磁性ビーズを使用して、ＣＤ２＋細胞を除去した後、ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋メモリーＢ細胞をＦＡＣＳによりソーティングする場合がある。骨髄プラズマ細胞（ＢＭＰＣ）を、抗ＣＤ１３８磁性マイクロビーズによるソーティングまたは他の同様な方法と試薬を使用して、精製することができる。
【００１５】
他の単離キット（例、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）製ＭａｇＣｅｌｌｅｃｔヒトＢ細胞単離キット）が、市販されている。ある実施形態では、休止Ｂ細胞を、文献（Ｄｅｆｒａｎｃｏら、（１９８２年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５５：１５２３）に記載されるように、不連続Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配上に沈降させることにより調製する場合がある。
【００１６】
本開示は、Ｂ細胞が、目的タンパク質をコードするウイルスベクターを用いて効率的に形質導入され、導入遺伝子によりコードされるタンパク質を活発に生産するように分化および活性化を促進するための、Ｂ細胞（例、メモリーＢ細胞）を培養する方法を提供する。この点に関しては、Ｂ細胞は活性化され、プラズマ細胞もしくはプラズマ芽球またはその両者へと分化する。当業者に認識されるのは、プラズマ細胞は、標準的フローサイトメトリー法を使用して、細胞表面タンパク質発現パターンにより同定可能であることである。例えば、最終的に分化したプラズマ細胞は、比較的少数の表面抗原を発現し、共通する一般的（ｐａｎ）Ｂ細胞マーカー（例、ＣＤ１９およびＣＤ２０）を発現しない。その代わりに、プラズマ細胞は、ＣＤ３８、ＣＤ７８、ＣＤ１３８、インターロイキン６受容体の追加的発現とＣＤ４５の発現の欠如によりフローサイトメトリーを介して同定される。ヒトにおいては、ＣＤ２７がプラズマ細胞の良いマーカーであり、ナイーブＢ細胞はＣＤ２７−、メモリーＢ細胞はＣＤ２７＋、そしてプラズマ細胞は、ＣＤ２７＋＋である。ＣＤ３８およびＣＤ１３８は、プラズマ細胞でハイレベルに発現される。従って、ある実施形態では、本明細書中に記載されるインビトロ培養方法の開始時に使用されるＢ細胞は、ＣＤ２０＋ＣＤ３８−ＣＤ１３８−であり、形質導入効率は良くない。しかしながら、一つの実施形態では、本明細書中に記載される培養方法のある工程の後においては、細胞は、ほとんどＣＤ２０−ＣＤ３８＋ＣＤ１３８−である。そして、本明細書中に記載されるインビトロ培養方法のさらなる工程の後、細胞はＣＤ２０−ＣＤ３８＋ＣＤ１３８＋となる。そのような細胞を、その後、本明細書中に記載されるように、効率的な形質導入のために使用する場合がある。ある実施形態では、形質導入前に、Ｂ細胞を分化および活性化するのが望ましい。一つの実施形態では、Ｄａｙ６での細胞の表現型は、「活性化型」として最適に記載可能である。というのも、それらの細胞の細胞表面表現型は、ＣＤ２０−ＣＤ３８−ＣＤ１３８−ＣＤ２７＋となるからだ。
【００１７】
一つの実施形態では、Ｂ細胞活性化因子（例、Ｂ細胞を活性化および／または分化させることが知られる、任意の各種サイトカイン、成長因子、または細胞株）とＢ細胞を接触させる場合がある（例えば、Ｆｌｕｃｋｉｇｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、１９９８年、９２：４５０９−４５２０；Ｌｕｏら、Ｂｌｏｏｄ、２００９年、１１３：１４２２−１４３１を参照されたい）。そのような因子は、限定はされないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、およびＩＬ−３５、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−δ、Ｃ型ケモカインＸＣＬ１およびＸＣＬ２、Ｃ−Ｃ型ケモカイン（現在までに、ＣＣＬ１〜ＣＣＬ２８を含む）、ＣＸＣ型ケモカイン（現在までに、ＣＸＣＬ１〜ＣＸＣＬ１７を含む）、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例、ＴＮＦ−α、４−１  ＢＢリガンド、Ｂ細胞活性化因子（ＢＬｙＳ））、ＦＡＳリガンド、ｓＣＤ４０Ｌ（多量体バージョンのｓＣＤ４０Ｌを含む；例、ヒスチジンのタグを付けた可溶性組換えＣＤ４０Ｌを抗ポリヒスチジンｍＡｂと組み合わせて、複数のｓＣＤ４０Ｌ分子を共に一つの群とするもの）、リンホトキシン、ＯＸ４０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、ＴＲＡＩＬ、ＣｐＧ、ならびに、他のトール様受容体作動薬（例、ＣｐＧ）からなる群より選択される場合がある。一つの実施形態では、特に、Ｂ細胞（形質導入されたＢ細胞を含むもの）を、フィーダー細胞に接触させるか、または、その上で培養する。他の実施形態では、本明細書中に記載される培養システムを、フィーダー細胞の非存在下で実施し、フィーダー細胞を必要とする当該技術分野で既知の他のシステムより大きい利点を提供する。フィーダー細胞が使用可能な場合、フィーダー細胞は、ストローマ細胞株（例、マウスストローマ細胞株Ｓ１７またはＭＳ５）である。さらなる実施形態では、精製ＣＤ１９＋細胞を、Ｂ細胞活性化因子であるサイトカイン（例、ＩＬ−１０およびＩＬ−４）の存在下、およびＣＤ４０リガンドを発現する繊維芽細胞の存在下で培養してもよい。ＣＤ４０Ｌを、表面（例、組織培養プレートまたはビーズ）に結合させて提供する場合もある。別の実施形態では、精製Ｂ細胞を、フィーダー細胞の存在下または非存在下であって、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ｐ−ＯＤＮ、ＣｐＧ  ＤＮＡ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、およびＩＦＮ−δから選択される一若しくは複数のサイトカインまたは因子の存在下で、ＣＤ４０Ｌと共に培養する場合がある。
【００１８】
別の実施形態では、Ｂ細胞活性化因子を、Ｂ細胞または他のフィーダー細胞にトランスフェクションすることにより提供する場合がある。この文脈では、抗体分泌細胞へのＢ細胞の分化を促進する一又は複数の因子および／または抗体生産細胞の寿命を伸ばす一又は複数の因子を使用してもよい。そのような因子には、例えば、Ｂｌｉｍｐ−１、ＴＲＦ４、Ｂｃｌ−ｘｌもしくはＢｃｌ５のような抗アポトーシス因子、またはＣＤ４０受容体の恒常活性化型変異体が含まれる。さらに、下流に働くシグナル分子（例、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）の発現を促進する因子も、また、Ｂ細胞の活性化／分化に使用可能である。この点では、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの細胞活性化機能、細胞維持機能、および抗アポトーシス機能は、ほとんどＴＲＡＦ１〜６により媒介される（例えば、Ｒ．Ｈ．Ａｒｃｈら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１２（１９９８年）、ｐｐ．２８２１−２８３０を参照されたい）。ＴＲＡＦ情報伝達の下流エフェクターには、各種観点の細胞機能および免疫機能に関わる遺伝子をオン状態にすることができる、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１ファミリーの転写因子が含まれる。さらに、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１の活性化は、抗アポトーシス遺伝子の転写を介して、細胞にアポトーシスからの防御を提供することが示されている。
【００１９】
他の実施形態では、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来のタンパク質が、Ｂ細胞の活性化／分化に有用である場合があり、または、抗体生産細胞の寿命を伸ばすのに有用である場合がある。ＥＢＶ由来のタンパク質には、限定はされないが、ＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、ＥＢＥＲ、ｍｉＲＮＡ（複数）、ＥＢＶ−ＥＡ、ＥＢＶ−ＭＡ、ＥＢＶ−ＶＣＡ、およびＥＢＶ−ＡＮが含まれる。
【００２０】
ある実施形態では、本明細書中に提供される方法を使用して、Ｂ細胞をＢ細胞活性化因子と接触させることは、他の事象の中では、細胞増殖、活性化型成熟Ｂ細胞と矛盾しない表面表現型へとＩｇＭ＋細胞表面表現型を調節すること、Ｉｇの分泌、およびアイソタイプ・スイッチングを導く。ＣＤ１９＋Ｂ細胞を、既知で市販されている細胞分離キット（例、ＭｉｎｉＭａｃｓ細胞分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ））を使用して、単離してもよい。ある実施形態では、ＣＤ４０Ｌを発現する繊維芽細胞を、本明細書中に記載される方法に使用する前に放射線照射する。さらなる実施形態では、前駆細胞またはＢ細胞を、ＩＬ−３、ＩＬ−７、Ｆｌｔ３リガンド、トロンボポエチン、ＳＣＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、Ｇ−ＣＳＦ、およびＣｐＧの中の一又は複数のものの存在下で培養する場合がある。ある実施形態では、本方法は、低レベルのアンカー型ＣＤ４０Ｌを提供する形質転換したストローマ細胞（例、ＭＳ５）と、またはプレートもしくはビーズに結合したＣＤ４０Ｌと組み合わせて、一又は複数の前記因子の存在下で、Ｂ細胞または前駆細胞を培養する工程を含む。
【００２１】
任意の各種培養培地が本方法に使用可能であり、それらは当業者には知られている（例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」、２０００〜２００９年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．によるものを参照されたい）。一つの実施形態では、本明細書中に記載される方法に使用される培地には、限定はされないが、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（牛胎児血清または他の適切な血清を有してもまたは有さなくてもよいもの）が含まれる。例示的な培地には、また、限定はされないが、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５、およびＸ−Ｖｉｖｏ２０が含まれる。さらなる実施形態では、培地は、界面活性剤、抗体、プラスマネートもしくは還元剤（例、Ｎ−アセチル−システイン、２−メルカプトエタノール）、または一若しくは複数の抗生物質を含む場合がある。いくつかの実施形態では、ＩＬ−６、可溶性ＣＤ４０Ｌ、および架橋増強剤を使用する場合もある。
【００２２】
Ｂ細胞または前駆細胞を、所望の分化および活性化を実現するのに十分な時間と条件下で培養する場合がある。ある実施形態では、Ｂ細胞または前駆細胞を、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％さえものＢ細胞が望ましくは分化および／または活性化するような十分な時間と条件下で培養する。一つの実施形態では、Ｂ細胞は活性化され、プラズマ細胞へと分化する。当業者に認識されるのは、本明細書中のどこかに記載される標準的フローサイトメトリー法を使用して、細胞表面タンパク質発現パターンにより、プラズマ芽球およびプラズマ細胞を同定する場合があることである。例えば、ＣＤ３８、ＣＤ７８、インターロイキン６受容体、ＣＤ２７ｈｉｇｈ、ＣＤ１３８の発現と、共通する一般的（ｐａｎ）Ｂ細胞マーカー（例、ＣＤ１９およびＣＤ２０）の発現欠如と、ＣＤ４５の発現欠如とにより同定可能である。当業者に理解されるのは、メモリーＢ細胞が、一般的に、ＣＤ２０＋ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＣＤ３８−である一方で、初期のプラズマ芽球は、ＣＤ２０−ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋＋ＣＤ３８＋＋であることである。ある実施形態では、本明細書中に記載される方法における開始集団は、ＣＤ２０＋ＣＤ３８−ＣＤ１３８−（これらの細胞は一般的に形質導入効率が悪い）である。一つの実施形態では、本明細書中に記載される方法を使用して培養される細胞は、ＣＤ２０−ＣＤ３８＋ＣＤ１３８−である。別の実施形態では、細胞が検討される培養日と因子が培地中に使用される培養日に依存して、細胞は、ＣＤ２０−ＣＤ３８＋ＣＤ１３８＋の表現型を有する場合がある。ある実施形態では、細胞を１〜７日間培養する。さらなる実施形態では、細胞を、７、１４、２１日間以上培養する。従って、細胞を、適切な条件下で培養する期間は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９日以上である。細胞をまき直し、当該技術分野で既知の手法を使用して、必要ならば、培地および添加物を加えるか又は交換する場合がある。
【００２３】
ある実施形態では、Ｂ細胞または前駆細胞（形質導入の前または後のいずれかのもの）を、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の前記細胞が分化および活性化してＩｇを生産および／または目的トランスジーンを発現するのに十分な時間と条件下で培養する場合がある。
【００２４】
Ｂ細胞の活性化の誘導を測定する技術は、例えば、ＲＮＡへの３Ｈ−ウリジン取り込み（Ｂ細胞が分化するにつれ、ＲＮＡ合成は増加する）または３Ｈ−チミジン取り込み（細胞増殖と関連するＤＮＡ合成を測定するもの）によるものである場合がある。Ｂ細胞増殖の最適な測定のために、インターロイキン４（ＩＬ−４）を、適切な濃度（例、約１０ｎｇ／ｍｌ）で培養培地に加えてもよい。
【００２５】
または、Ｂ細胞活性化を、免疫グロブリン分泌の関数として測定してもよい。例えば、ＣＤ４０Ｌを、ＩＬ−４（例、１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−５（例、５ｎｇ／ｍｌ）またはＢ細胞の活性化に適する他のサイトカインと一緒に、休止Ｂ細胞に加える場合がある。活性化Ｂ細胞に典型的な細胞表面マーカーを測定するために、フローサイトメトリーが、また、使用可能である。例えば、Ｃｉｖｉｎ  ＣＩ、Ｌｏｋｅｎ  ＭＲ、Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、９８７、５：１−１６；Ｌｏｋｅｎ，ＭＲら、「Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ，Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｉｎｅａｇｅｓ  ｉｎ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ，ｉｎ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ」、Ｌａｅｒｕｍ  ＯＤ、Ｂｊｅｒｋｓｎｅｓ  Ｒ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年、ｐｐ．３１−４２；ならびにＬｅＢｅｉｎ  ＴＷら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１９９０年、４：３５４−３５８を参照されたい。
【００２６】
適切な期間（例、２、３、４、５、６、７、８、または９日以上）の培養後、一般的には、約３日後に、追加的容量の培養培地を加える場合がある。個々の培養物の上清を、培養期間の様々な時間で回収して、Ｎｏｅｌｌｅら、（１９９１年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４６：１１１８−１１２４に記載されているようにＩｇＭとＩｇＧ１に関して定量する場合がある。さらなる実施形態では、培養物を回収して、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、または当該技術分野で既知の他のアッセイを使用して、目的トランスジーンの発現を測定する場合がある。
【００２７】
さらなる実施形態では、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ＩｇＭまたは他の抗体アイソタイプの生産あるいは目的トランスジーンの生産を測定してもよい。ある実施形態では、捕獲抗体として市販の抗体（例、ヤギ抗ヒトＩｇＧ）を使用し、その後、任意の各種適切な検出試薬（例、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ストレプトアビジン・アルカリホスファターゼ、および基質）を使用して検出することにより、ＩｇＧ決定を行う場合がある。
【００２８】
Ｂ細胞または他の目的細胞は、当該技術分野で既知の任意の各種手法を使用し、本明細書中に記載されるレトロウイルスベクターを用いて形質導入可能である（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９６年４月１２日、２７２：２６３−２６７；Ｂｌｏｏｄ、２００７年、９９：２３４２−２３５０；Ｂｌｏｏｄ、２００９年、１１３：１４２２−１４３１；Ｂｌｏｏｄ、２００９年１０月８日、１１４（１５）：３１７３−８０；Ｂｌｏｏｄ、２００３年、１０１（６）：２１６７−２１７４；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」または「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（２００９年）を参照されたい）。例えば、ドナー由来のＰＢＭＣ、Ｂリンパ球、またはＴリンパ球および他のＢ細胞のがん細胞（例、Ｂ−ＣＬＬ）は、ＩＭＤＭ培地もしくはＲＰＭＩ１６４０（ＧｉｂｃｏＢＲＬ・Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｕｃｋｌａｎｄ、ニュージーランド）または本明細書中に記載される他の適切な培地（血清不含有もしくは１０％のＦＣＳを添加したものであって、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび／または他の適切な添加剤（例、トランスフェリンおよび／またはインスリン）を有するもの）中で、単離および培養可能である。ある実施形態では、細胞を、１×１０５細胞で、４８穴プレートに播種し、濃縮ベクターを各種用量（日常的に行われる方法を使用して、当業者によりルーチンに最適化される場合があるもの）で加える。ある実施形態では、Ｂ細胞を、１０％のＡＢ血清、５％のＦＣＳ、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−１５、および５ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を添加したＲＰＭＩ中で、ＭＳ５細胞単層上へ移し、そして、培地を、必要ならば定期的に新しいものにする。当業者に認識されるのは、他の適切な培地と添加剤とが、所望ならば、使用可能であることである。
【００２９】
一つの実施形態では、分化させるために本明細書中に記載されるように培養されるＢ細胞を、そのＢ細胞の少なくとも一部に形質導入するのに十分な条件下で、プロモーターに機能的に連結された目的核酸を含む本明細書中に記載されるレトロウイルスベクターと接触させる。一つの実施形態では、Ｂ細胞を、そのＢ細胞の少なくとも２０％に形質導入するのに十分な条件下で、プロモーターに機能的に連結された目的核酸を含む本明細書中に記載されるレトロウイルスベクターと接触させる。さらなる実施形態では、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％さえもの休止Ｂ細胞に形質導入するのに十分な条件下で、本明細中に記載されるベクターと、Ｂ細胞を接触させる。一つの特定の実施形態では、分化および活性化されたＢ細胞（本明細書中に記載されるようにインビトロで培養されたもの）に形質導入する。そのようなケースでは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％さえもの分化および活性化されたＢ細胞に形質導入するのに十分な条件下で、本明細中に記載されるベクターと、培養されて分化および活性化されたＢ細胞を接触させる。
【００３０】
ある実施形態では、形質導入前に、細胞を黄色ブドウ球菌コーワン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｕｒｅｕｓ  Ｃｏｗａｎ）（ＳＡＣ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で前刺激する。当業者に既知であって、ルーチンに最適化された適切な濃度で、Ｂ細胞に対してはＩＬ−２、Ｔ細胞に対しては抗ｈＣＤ３／抗ｈＣＤ２８／ＩＬ−２を用いて前刺激する。他のＢ細胞活性化因子（例、ＰＭＡ）（当業者に既知であって、本明細書中に記載されたもの）が使用可能である。
【００３１】
ウイルスベクター
ある実施形態は、本明細書中に記載される発現システムを用いて、プラズマ細胞（例、Ｂ細胞）に形質導入するためのウイルスベクターを採用する。ウイルスベクターの例には、限定はされないが、アデノウイルス系ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）系ベクター、レトロウイルスベクター、レトロウイルス・アデノウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（アンプリコンベクター、複製欠損型ＨＳＶ、および弱毒化ＨＳＶを含むもの）由来ベクターが含まれる（例えば、Ｋｒｉｓｋｙ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、５：１５１７−３０、１９９８年；Ｐｆｅｉｆｅｒ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、２：１７７−２１１、２００１年を参照されたい；各々は参照により完全に組込まれる）。
【００３２】
ある実施形態は、レトロウイルスベクターまたはレトロウイルス由来のベクターの使用に関する。「レトロウイルス」は、エンベロープに包まれたＲＮＡウイルスであって、動物細胞に感染することができ、感染の初期段階で酵素である逆転写酵素を利用して、そのＲＮＡゲノムからＤＮＡコピーを生成し、その後、宿主ゲノムに典型的に組み込まれるようなウイルスである。レトロウイルスベクターの例には、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクター、マウス幹細胞ウイルス（標的細胞（例、造血前駆細胞およびその分化した子孫細胞）中で長期安定発現を提供するもの（例えば、Ｈａｗｌｅｙら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９３：１０２９７−１０３０２、１９９６年；Ｋｅｌｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、９２：８７７−８８７、１９９８年を参照されたい））に基づくレトロウイルスベクター、ハイブリッドベクター（例えば、Ｃｈｏｉら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、１９：２３６−２４６、２００１年を参照されたい）、および複雑なレトロウイルス由来のベクター（例、レンチウイルスベクター）が含まれる。
【００３３】
上記したように、ある実施形態では、レンチウイルスベクターを用いる。用語「レンチウイルス」は、分裂および非分裂細胞の両者に感染することができる複雑なレトロウイルスの属を指す。レンチウイルスの例には、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ  １型、ＨＩＶ  ２型を含む）、ビスナ・マエディウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる。レンチウイルスベクターは、任意の一又は複数のこれらのレンチウイルスより派生可能である（例えば、Ｅｖａｎｓら、Ｈｕｍ  ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、１０：１４７９−１４８９、１９９９年；Ｃａｓｅら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９６：２９８８−２９９３、１９９９年；Ｕｃｈｉｄａら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９５：１１９３９−１１９４４、１９９８年；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８３：６８２−６８６、１９９９年；Ｓｕｔｔｏｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７２：５７８１−５７８８、１９９８年；およびＦｒｅｃｈａら、Ｂｌｏｏｄ、１１２：４８４３−５２、２００８年を参照されたい；各々は参照により完全に組み込まれる）。
【００３４】
休止ＴおよびＢ細胞が、ＨＩＶのアクセサリータンパク質（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、およびｎｅｆ）のほとんどを保持するＶＳＶＧ被覆ＬＶにより形質導入可能であることは詳細に記述されている（例えば、Ｆｒｅｃｈａら、２０１０年、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ、１８：１７４８を参照されたい）。ある実施形態では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスゲノム（例、ＨＩＶゲノムまたはＳＩＶゲノム）由来のいくつかの最小配列を含んでいる。レンチウイルスのゲノムは、典型的には、５’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）領域、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、アクセサリー遺伝子（例、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ）、および３’ＬＴＲ領域に構成される。ウイルスのＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ（リピート）、およびＵ５と呼ばれる３つの領域に分割される。Ｕ３領域は、エンハンサーとプロモーターエレメントを含む。Ｕ５領域は、ポリアデニル化シグナルを含む。そして、Ｒ領域は、Ｕ３領域とＵ５領域を分離させる。Ｒ領域の転写配列は、ウイルスＲＮＡの５’および３’末端の両方に見られる（例えば、「ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ａｌａｎ  Ｊ．Ｃａｎｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００年）；Ｏ
Ｎａｒａｙａｎ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．、７０：１６１７−１６３９、１９８９年；Ｆｉｅｌｄｓら、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、Ｒａｖｅｎ
Ｐｒｅｓｓ．、１９９０年；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．、７２：８１５０−７、１９９８年；および米国特許番号第６，０１３，５１６号を参照されたい；各々は参照により完全に組み込まれる）。レンチウイルスベクターは、所望のようにベクターの活性を制御するために、レンチウイルスゲノムのこれらエレメントの任意の一又は複数を含む場合がある。または、レンチウイルスベクターは、レンチウイルス複製の病理学的効果を減らすため、または、レンチウイルスベクターを一回の感染に限定するために、これらエレメントの一又は複数に欠失、挿入、置換、または変異を含む場合がある。
【００３５】
典型的には、最小なレトロウイルスベクターは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ配列、一又は複数の目的遺伝子（標的細胞で発現されるもの）、一又は複数のプロモーター、およびＲＮＡのパッケージングのためにシスに作用する配列を含む。本明細書中に記載され且つ当該技術分野で既知の他の制御配列も含まれる場合がある。ウイルスベクターは、典型的には、パッケージング細胞株（例、真核細胞（例、２９３−ＨＥＫ））へとトランスフェクション可能なプラスミドにクローニングされる。ウイルスベクターはまた、典型的には、細菌中でのプラスミド複製に有用な配列も含む。
【００３６】
ある実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス（例、レンチウイルス）の５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲ由来の配列を含む。ＬＴＲ配列は、任意の種からの任意のレンチウイルス由来のＬＴＲ配列である場合がある。例えば、それらは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、またはＢＩＶ由来ＬＴＲ配列であってもよい。好ましくは、ＬＴＲ配列は、ＨＩＶのＬＴＲ配列である。
【００３７】
ある実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスの５’ＬＴＲ由来のＲおよびＵ５配列と、レンチウイルス由来の不活性化された又は「自己不活化する」３’ＬＴＲとを含む。「自己不活化する３’ＬＴＲ」は、ＬＴＲ配列が下流遺伝子の発現を促進するのを阻害する変異、置換、または欠失を含む３’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）である。その３’ＬＴＲ由来のＵ３領域のコピーは、組み込まれたプロウイルス中の両方のＬＴＲの生成のための鋳型として働く。従って、不活性化欠失または変異を有する前記３’ＬＴＲが、プロウイルスの５’ＬＴＲとして組み込まれる場合は、その５’ＬＴＲからの転写は不可能である。このことが、ウイルスのエンハンサー／プロモーターと任意の内部エンハンサー／プロモーターとの間の競合を排除する。自己不活化する３’ＬＴＲは、例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．、７２：９８７３−９８８０、１９９８年；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．、７２：８１５０−８１５７、１９９８年；およびＩｗａｋｕｍａら、Ｖｉｌｏｌｏｇｙ、２６１：１２０−１３２、１９９９年（各々は参照により完全に組み込まれる）に記載される。自己不活化する３’ＬＴＲは、当技術分野において公知の任意の方法により作製可能である。ある実施形態では、３’ＬＴＲのＵ３エレメントは、そのエンハンサー配列、好ましくは、ＴＡＴＡボックス、Ｓｐ１および／またはＮＦκＢサイトの欠失を含んでいる。自己不活化する３’ＬＴＲの結果、宿主細胞ゲノムに組み込まれるプロウイルスは、不活化した５’ＬＴＲを含む。
【００３８】
本明細書中に提供されるウイルスベクターは、典型的には、一又は複数の標的細胞に望ましくは発現されるタンパク質（または他の分子（例、ｓｉＲＮＡ））をコードする遺伝子を含む。好ましくは、目的遺伝子は、５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間に位置している。さらに、目的遺伝子は、好ましくは、その目的遺伝子が一旦標的細胞に組み込まれたら、特定の様式でその目的遺伝子の発現を制御するために、他の遺伝的要素（例、転写制御配列（例、プロモーターおよび／またはエンハンサー））と機能的に関係する。ある実施形態では、有用な転写制御配列は、時空間的に活性が高度に制御されるものである。
【００３９】
ある実施形態では、多様な集団内（例、ヒト患者内）で、感染した標的細胞を選択的に死滅させることを主として可能にするために、一又は複数の追加的遺伝子を、安全策として取り込ませる場合がある。一つの例示的実施形態では、選択遺伝子は、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）であり、その発現は、標的細胞を薬剤ガンシクロビルの作用に感受性とする。さらなる実施形態では、自殺遺伝子は、カスパーゼ９自殺遺伝子である。
【００４０】
ある実施形態では、マーカータンパク質をコードする遺伝子を、所望タンパク質を発現している細胞の同定を可能にするために、その主要遺伝子の前または後に配置する場合がある。ある実施形態は、蛍光マーカータンパク質（例、緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ））をコードする遺伝子を目的主要遺伝子とともに取り込む。もし、一又は複数の追加的レポーター遺伝子を含めるならば、ＩＲＥＳ配列または２Ａエレメントもまた含める場合がある。それらは、目的主要遺伝子をレポーター遺伝子および／または他の目的遺伝子から分離する。
【００４１】
ある実施形態は、一又は複数の選択マーカーをコードする遺伝子を用いる場合がある。例には、真核細胞または原核細胞中で効果的な選択マーカー（例、選択培養培地中で増殖する形質転換した宿主細胞の生存または増殖に必要な因子をコードする薬剤耐性遺伝子）が含まれる。例示的選択遺伝子は、抗生物質または他の毒素に耐性を付与するタンパク質（例、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、ピュロマイシン、ゼオシン、ウアバイン、ブラストサイジン、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリン）、栄養要求性欠如を補充するタンパク質、または供給するタンパク質をコードし、別々のプラスミドに存在する場合があり、そして、ウイルスベクターとコトランスフェクションすることにより導入される場合もある。ある他の実施形態は、トランフェクションされた細胞にタグを付けたり、検出したり、または精製するために使用可能な細胞表面受容体（複数可）（例、低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）または形質導入タグシステムとして有用な他のそのような受容体；例えば、Ｌａｕｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．、２０００年３月、７（３）：４３０−７を参照されたい）をコードする遺伝子を用いる場合がある。
【００４２】
あるウイルスベクター（例、レトロウイルスベクター）は、一又は複数の異種プロモーター、エンハンサー、またはその両者を採用する。ある実施形態では、レトロウイルス又はレンチウイルスの５’ＬＴＲ由来のＵ３配列は、ウイルスコンストラクト中のプロモーター又はエンハンサー配列で置換可能である。ある実施形態は、ウイルスベクターの５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に位置し、目的遺伝子に機能的に連結される「内部」プロモーター／エンハンサーを用いる。「機能的関係」および「機能的に連結」は、限定はされないが、プロモーターおよび／またはエンハンサーが適切な制御分子と接触した場合に、遺伝子発現が影響を受けるように、そのプロモーターおよび／またはエンハンサーに対して適切な位置と方向に遺伝子があることを意味する。パッケージング細胞株中でウイルスＲＮＡゲノムの発現を制御（例、増加、減少）するか、感染標的細胞中で目的選択遺伝子の発現を制御するか、またはその両者である任意のエンハンサー／プロモーターの組み合わせが使用可能である。
【００４３】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写が起こるのを可能にするＤＮＡ配列により形成される発現制御エレメントである。プロモーターは、目的選択遺伝子の開始コドンの上流（５’）（典型的には、約１００〜１０００ｂｐの範囲内）に位置し、プロモーターが機能的に連結されるポリヌクレオチドコード配列の転写と翻訳を制御する非翻訳配列である。プロモーターは、誘導性または恒常活性化型であってもよい。誘導性プロモーターは、培養条件の何らかの変化（例、温度変化）に対応して、その制御下でＤＮＡからの転写のレベルを増加開始させる。
【００４４】
各種プロモーターが当該技術分野で公知であり、そのプロモーターをポリヌクレオチドコード配列に機能的に連結する方法も公知である。自然なプロモーター配列と多くの異種プロモーターの両者を使用して、目的選択遺伝子の発現を指揮する。ある実施形態が異種プロモーターを用いるのは、それらプロモーターが、一般的に、自然なプロモーターと比べて転写を増加させて、所望タンパク質の収量を高くできるからだ。
【００４５】
ある実施形態は、異種ウイルスプロモーターを採用する場合がある。そのようなプロモーターの例には、ウイルス（例、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０））のゲノムから得られるものが含まれる。ある実施形態は、異種哺乳類プロモーター（例、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーター、または目的遺伝子の自然な配列と結合するプロモーター）を用いる場合がある。典型的には、プロモーターは、標的細胞（例、静止状態のＢリンパ球、活性化Ｂリンパ球、プラズマＢ細胞、メモリーＢ細胞、または他のリンパ球標的細胞）と適合する。
【００４６】
ある実施形態は、一又は複数のＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩプロモーターを用いる場合がある。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩを適切に選択することが、例えば、ＰａｕｌｅとＷｈｉｔｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．２８、ｐｐ１２８３−１２９８、２０００年（参照により完全に組み込まれるもの）に見出すことができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩプロモーターはまた、それぞれＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩを指揮して、その下流のＲＮＡコード配列を転写可能にする任意の合成または設計ＤＮＡ断片を含む。さらに、ウイルスベクターの一部として使用されるＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩ（ＰＯＬＩＩ又はＩＩＩ）プロモーター（複数可）は、誘導性である場合がある。任意の適切な誘導性ＰｏｌＩＩまたはＩＩＩプロモーターは、本明細書中に記載される方法と共に使用可能である。例示的ＰｏｌＩＩまたはＩＩＩプロモーターには、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＯｈｋａｗａとＴａｉｒａ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｖｏｌ．１１、ｐｐ５７７−５８５、２０００年；およびＭｅｉｓｓｎｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．２９、ｐｐ１６７２−１６８２、２００１年で提供されるもの；各々は参照により完全に組み込まれる）が含まれる。
【００４７】
使用可能な恒常活性化型プロモーターの非限定的な例には、ユビキチンプロモーター、ＣＭＶプロモーター（例えば、Ｋａｒａｓｕｙａｍａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６９：１３、１９８９年を参照されたい）、β−アクチンプロモーター（例えば、Ｇｕｎｎｉｎｇら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８４：４８３１−４８３５、１９８７年を参照されたい）、およびｐｇｋプロモーター（例えば、Ａｄｒａら、Ｇｅｎｅ、６０：６５−７４、１９８７年を参照されたい）が含まれる（Ｓｉｎｇｅｒ−Ｓａｍら、Ｇｅｎｅ、３２：４０９−４１７、１９８４年；およびＤｏｂｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１０：２６３５−２６３７、１９８２年；各々は参照により組み込まれる）。組織特異的プロモーターの非限定的な例には、ｌｃｋプロモーター（例えば、Ｇａｒｖｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、８：３０５８−３０６４、１９８８年；およびＴａｋａｄｅｒａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、９：２１７３−２１８０、１９８９年を参照されたい）、ミオゲニンプロモーター（Ｙｅｅら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、７：１２７７−１２８９、１９９３年）、ｔｈｙｌプロモーター（例えば、Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎら、Ｇｅｎｅ、１１３：２０７−２１４、１９９２年を参照されたい）が含まれる。
【００４８】
プロモーターの別の例には、ユビキチンＣプロモーター、（Ｂリンパ球で機能的である）ヒトμ重鎖プロモーターまたはＩｇ重鎖プロモーター（例、ＭＨ）、およびヒトκ軽鎖プロモーターまたはＩｇ軽鎖プロモーター（例、ＥＥＫ）が含まれる。ＭＨプロモーターは、ヒトμ重鎖プロモーターであって、その前にはι、ε、μエンハンサーがマトリクス関連領域（ｍａｔｒｉｘ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）が側に付いて配置されるものを含む。そして、ＥＥＫプロモーターは、κ軽鎖プロモーターであって、その前に、イントロン性エンハンサー（ι、ε、κ）、マトリクス関連領域、および３’エンハンサー（３’ε、κ）が配置されるものを含む（例えば、Ｌｕｏら、Ｂｌｏｏｄ、１１３：１４２２−１４３１，２００９年および米国特許出願公開番号第２０１００２０３６３０号を参照されたい）。従って、ある実施形態は、一又は複数のこれらのプロモーターまたはエンハンサーエレメントを採用する場合がある。
【００４９】
上記した様に、ある実施形態は、エンハンサーエレメント（例、内部エンハンサー）を使用して、目的遺伝子の発現を増加させることができる。エンハンサーは、シスに作用するＤＮＡエレメントで、通常、長さは約１０〜３００ｂｐであり、プロモーターに作用して、プロモーターからの転写を増加させる。あるエンハンサー配列（例、ι、ε、μエンハンサー、ι、ε、κイントロン性エンハンサー、および３’ε、κエンハンサー）は、哺乳類遺伝子（例、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、インスリン）に由来する。また、真核生物ウイルス由来のエンハンサー（例、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含むもの）が含まれる。エンハンサーは、抗原特異的ポリヌクレオチド配列の５’または３’の位置にベクター中へ挿入されるが、好ましくは、プロモーターの５’サイトに位置する。当業者は、所望の発現パターンに基づいて適切なエンハンサーを選択する。
【００５０】
ある実施形態では、プロモーターを、遺伝子の誘導性発現を可能にするために選択する場合がある。多数の誘導性発現システムが当該技術分野で公知となっていて、そのシステムには、テトラサイクリン応答システムおよびｌａｃオペレーター・リプレッサーシステムが含まれる。また、目的遺伝子の所望の発現を得るために、プロモーターの組み合わせが使用可能であることも考慮される。当業者は、目的生物および／または目的標的細胞での遺伝子の所望の発現パターンに基づいて、プロモーターを選択することができる。
【００５１】
あるウイルスベクターは、ウイルスＲＮＡゲノムをウイルス粒子に取り込むことを促進する、シスに作用するパッケージング配列を含む。例には、ｐｓｉ配列が含まれる。そのようなシスに作用する配列は、当該技術分野で公知である。ある実施形態では、本明細書中に記載されるウイルスべクターは、二以上の遺伝子を発現する場合があり、それは、例えば、第一遺伝子を超えて各個別の遺伝子に機能的に連結される内部プロモーターを組み込んだり、共発現を促進するエレメント（例、内部リボソーム結合配列（ＩＲＥＳ）エレメント）（米国特許番号第４，９３７，１９０号；参照により組み込まれる）、または、２Ａエレメント、あるいは、その両者を組み込むことにより実現される。ただ例示するやり方としてではあるが、単一のベクターが、所望の特異性を有する免疫グロブリン分子の各鎖をコードする配列を含む場合、ＩＲＥＳまたは２Ａエレメントが使用可能である。例えば、第一コード領域（重鎖または軽鎖のいずれかをコードするもの）を、プロモーターの下流直下に配置してもよく、第二コード領域（他の鎖をコードするもの）を、第一コード領域の下流に位置するものであって、第一コード領域と第二コード領域との間にＩＲＥＳまたは２Ａエレメントを（好ましくは、第二コード領域の直前に）配置するようにしてもよい。他の実施形態では、ＩＲＥＳまたは２Ａエレメントを使用して、非関連遺伝子（例、レポーター遺伝子、選択マーカー、または免疫機能を向上させる遺伝子）を共発現する。使用可能なＩＲＥＳ配列の例には、限定はされないが、脳せき髄炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のＩＲＥＳエレメント、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のＩＲＥＳエレメント、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ）のＩＲＥＳエレメント、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）のＩＲＥＳエレメント、コクサッキーウイルス（ＣＳＶ）のＩＲＥＳエレメント、ポリオウイルス（ＰＯＬＩＯ）のＩＲＥＳエレメント、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）のＩＲＥＳエレメント、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＩＲＥＳエレメント、およびペスチウイルス類（例、ブタコレラウイルス（ＨＯＣＶ）およびウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ））のＩＲＥＳエレメントが含まれる（例えば、Ｌｅら、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ、１２：１３５−１４７、１９９６年；およびＬｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３６２−３６９、１９９７年を参照されたい；各々は参照により完全に組み込まれる）。２Ａエレメントの一つの例には、口蹄疫ウイルス由来のＦ２Ａ配列が含まれる。
【００５２】
ある実施形態では、本明細書中に提供されるウイルスベクターは、また、所望の結果を得るために、追加的な遺伝学的要素を含む場合がある。例えば、あるウイルスベクターは、標的細胞中でウイルスゲノムが核に侵入するのを促進するシグナル（例、ＨＩＶ−１のフラップシグナル）を含む場合がある。さらなる例として、あるウイルスベクターは、標的細胞中でのプロウイルスの組み込み位置の特徴解析を容易にする要素（例、ｔＲＮＡアンバーサプレッサー配列）を含む場合がある。あるウイルスベクターは、目的遺伝子の発現を向上させるように設計された一又は複数の遺伝学的要素を含む場合がある。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス応答エレメント（ＷＲＥ）を、コンストラクト中に配置してもよい（例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７４：３６６８−３６８１、１９９９年；およびＤｅｇｌｏｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１１：１７９−１９０、２０００年を参照されたい；各々は参照により完全に組み込まれる）。別の例として、トリβ−グロビンインスレーターが、ウイルスコンストラクト中に含まれる場合もある。このエレメントは、メチル化とヘテロクロマチン化効果により、標的細胞中に組み込まれたプロウイルスをサイレンシングする確率を低下させることが示されている。また、インスレーターは、内部エンハンサー、プロモーター、および外部遺伝子を、染色体上の組み込み位置の周囲のＤＮＡに由来する正または負の位置効果から守ることができる。ある実施形態は、これら遺伝学的要素の各々を採用する。別の実施形態では、本明細書中に提供されるウイルスベクターは、また、発現を増加させるために、遍在性クロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）を含む場合がある（例えば、Ｚｈａｎｇ  Ｆら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１０年９月、１８（９）：１６４０-９を参照されたい）。
【００５３】
ある実施形態では、本明細書中に提供されるウイルスベクター（例、レトロウイルス、レンチウイルスのもの）は、選択細胞型を主として標的とするために、一又は複数の選択ウイルス糖タンパク質またはエンベロープタンパク質で「偽型」される。「偽型」とは、一般的に、一又は複数の異種ウイルス糖タンパク質を細胞表面のウイルス粒子上に取り込むことを指し、しばしば、ウイルス粒子がその通常の標的細胞と異なる選択細胞に感染することを可能にする。「異種」エレメントは、ウイルスベクターのＲＮＡゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来する。典型的には、ウイルスベクターの糖タンパク質コード領域は、例えば、欠失により遺伝学的に改変されて、その自身の糖タンパク質の発現を妨げる。単に例示のやり方としてではあるが、ＨＩＶに由来するレンチウイルスベクターのエンベロープ糖タンパク質であるｇｐ４１および／またはｇｐ１２０は、典型的には、異種ウイルス糖タンパク質で偽型される前に欠失される。
【００５４】
ある実施形態では、ウイルスベクターは、Ｂリンパ球を標的とする異種ウイルス糖タンパク質で偽型される。ある実施形態では、ウイルス糖タンパク質は、休止または静止状態のＢリンパ球に選択的に感染するか、または、それに形質導入することを可能にする。ある実施形態では、ウイルス糖タンパク質は、Ｂリンパ球プラズマ細胞、プラズマ芽球、および活性化Ｂ細胞に選択的に感染することを可能にする。ある実施形態では、ウイルス糖タンパク質は、静止状態のＢリンパ球、プラズマ芽球、プラズマ細胞、および活性化Ｂ細胞への感染または形質導入を可能にする。ある実施形態では、ウイルス糖タンパク質は、Ｂ細胞である慢性リンパ性白血病細胞への感染を可能にする。一つの実施形態では、ウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇで偽型される。別の実施形態では、異種ウイルス糖タンパク質は、麻疹ウイルス（例、エドモントン麻疹ウイルス）の糖タンパク質に由来する。ある実施形態は、麻疹ウイルス糖タンパク質である、ヘマグルチニン（Ｈ）、融合タンパク質（Ｆ）、またはその両者で偽型する（Ｆｒｅｃｈａら、Ｂｌｏｏｄ、１１２：４８４３−５２、２００８年；およびＦｒｅｃｈａら、Ｂｌｏｏｄ、１１４：３１７３−８０、２００９年を参照されたい；各々は参照により完全に組み込まれる）。一つの実施形態では、ウイルスベクターは、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）で偽型される。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、ベクターを特定の細胞型へと標的化する機能を持つ抗体結合ドメイン（例、一又は複数の可変領域（例、重鎖および軽鎖可変領域））をコードするものが埋め込まれている。
【００５５】
ウイルスベクターの作製は、当該技術分野で既知の任意の適切な遺伝工学技術を使用して実現可能である。その技術には、限定はされないが、標準的技術のエンドヌクレアーゼ制限酵素分解、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、ＰＣＲ増幅、およびＤＮＡ配列決定法が含まれる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらのもの（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））、Ｃｏｆｆｉｎらのもの（「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９７年））、および「ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ａｌａｎ  Ｊ．Ｃａｎｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、（２０００年））に記載される）。
【００５６】
当該技術分野で既知の任意の各種方法を使用して、ゲノムがウイルスベクターのＲＮＡコピーを含むような、適切なレトロウイルス粒子を生産することができる。一つの方法として、ウイルスベクターに基づくウイルスゲノムＲＮＡを、所望の標的細胞特異性を有するウイルス粒子中にパッケージするパッケージング細胞株へと、そのウイルスベクターを導入する場合がある。パッケージング細胞株は、典型的には、ウイルスゲノムＲＮＡをウイルス粒子にパッケージングし、標的細胞に感染させるために必要とされるウイルスタンパク質（構造タンパク質ｇａｇ、酵素タンパク質ｐｏｌ、およびエンベロープ糖タンパク質を含むもの）をトランスに提供する。
【００５７】
ある実施形態では、パッケージング細胞株は、必須または所望のウイルスタンパク質（例、ｇａｇ、ｐｏｌ）のあるものを安定的に発現する場合がある（例えば、米国特許番号第６，２１８，１８１号を参照されたい；参照により本明細書中に組み込まれる）。ある実施形態では、パッケージング細胞株は、必須または所望のウイルスタンパク質（例、ｇａｇ、ｐｏｌ、糖タンパク質）（本明細書中に記載される麻疹ウイルス糖タンパク配列を含むもの）のあるものをコードするプラスミドで一過性にトランスフェクションされる場合がある。一つの例示的実施形態では、パッケージング細胞株は、ｇａｇおよびｐｏｌ配列を安定的に発現する。その後、その細胞株に、ウイルスベクターをコードするプラスミドと糖タンパク質をコードするプラスミドとをトランスフェクションする。所望プラスミドの導入後、例えば、超遠心分離法によりウイルス粒子を回収および順次処理し、ウイルス粒子の濃縮ストックを得る。例示的パッケージング細胞株には、２９３細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  Ｘ）、ＨｅＬａ細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｄ１７細胞株（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ  １８３）、ＭＤＣＫ細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、ＢＨＫ細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）、およびＣｆ２Ｔｈ細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４３０）が含まれる。
【００５８】
目的遺伝子／核酸
本明細書中で使用される「目的遺伝子」、「遺伝子」、または「目的核酸」は、標的形質導入細胞中で発現される目的タンパク質をコードする目的核酸を指す。用語「遺伝子」を使用する場合があるが、この用語は、ゲノムＤＮＡに見られる遺伝子であることを意味せず、用語「核酸」と相互に交換して使用される。一般的に、目的核酸は、目的タンパク質をコードする適した核酸を提供し、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを含む場合があり、そして、イントロンを含んでもよいし、含まなくてもよいが、一般的には、イントロンを含まない。どこかで記載されるように、目的核酸は、発現制御配列に機能的に連結されて、効果的に、標的細胞で目的タンパク質を発現する。ある実施形態では、本明細書中に記載されるベクターは、二以上の目的遺伝子を含む場合があり、２個、３個、または４個の目的遺伝子（例、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖）であって、本明細書中に記載される内部プロモーターを使用して編成される場合があるものを含んでもよい。
【００５９】
本明細書中で使用される記載「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＤＮＡを示す。その用語は、典型的には、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドまたはヌクレオチドのいずれかの型の改変された形のものであって、少なくとも１０塩基長のヌクレオチドの重合体フォームを指す。その用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの一本鎖および二本鎖の形を含む。目的核酸または目的遺伝子は、目的タンパク質をコードする任意の核酸であってもよい。本明細書中に記載される使用のための目的タンパク質は、所望の活性を提供する任意のタンパク質を含む。この点では、目的タンパク質には、限定はされないが、抗体もしくはその抗原結合断片、細胞表面受容体、サイトカインの様な分泌タンパク質（例、リンホカイン、インターロイキン、インターフェロン、またはケモカイン）、ＤＮＡによりコードされる小分子（例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、５、６４７−６５４（２００９年）を参照されたい）、または接着分子が含まれる。一つの実施形態では、核酸は、抗体またはその抗原結合断片をコードする。例示的抗原結合断片には、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖが含まれる。一つの実施形態では、核酸によりコードされる抗体は、ＨＩＶ中和抗体ｂ１２の少なくとも抗原結合ドメインを含む（例えば、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、２００３年、７７：５８６３−５８７６；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９４年８月、６８（８）：４８２１−８；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、１９９２年、８９：９３３９−９３４３を参照されたい；例示的配列が、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号（ＡＡＢ２６３０６．１  Ｇｌ  ２９９７３７）（ｂ１２の軽鎖）および（ＡＡＢ２６３１５．１  Ｇｌ  ２９９７４６）（重鎖）で提供される）。さらなる実施形態では、目的核酸によりコードされる抗体は、フゼオン（商標）（Ｔ−２０／エンフビルチド／ペンタフシド（ｐｅｎｔａｆｕｓｉｄｅ）／ＤＰ−１７８）を含む。ＤＰ−１７８は、ＨＩＶのｇｐ４１由来のアミノ酸配列であり、ＨＩＶがその標的細胞と融合する能力と干渉する。フゼオンは、当業者に既知の方法を使用して合成的に作製可能である（例えば、２００１年のＪ．Ｖｉｒｏｌ．、７５：３０３８−３０４２を参照されたい；この論文中に記載された方法が、ＤＰ−１７８ペプチドの治療的用量の分泌を生じることはありそうではないことに注意されたい）。
【００６０】
一つの特定の実施形態では、目的核酸は、免疫学的に活性のあるタンパク質をコードする。ある実施形態では、目的核酸は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、または他の免疫細胞の表面上にタンパク質を提示することを介して免疫ワクチン様反応を誘導するタンパク質または生物学的に活性のあるその断片をコードする。ある実施形態では、目的タンパク質は、Ｂ細胞の制御（例、限定はされないが、細胞分裂の促進、様々なＢ細胞系列への分化促進、細胞の不活性化もしくは細胞を死滅させること）に影響を与えるか、または、他の導入ＤＮＡエレメントの生産もしくは活性を制御する。インターロイキンは当業者に知られていて、現在までに、その例には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２７の分泌型ｐ２８サブユニット、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、およびＩＬ−３５が含まれる。インターフェロンには、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−ωが含まれる。本明細書中の使用に考慮されるケモカインには、Ｃ型ケモカイン（ＸＣＬ１およびＸＣＬ２）、Ｃ−Ｃ型ケモカイン（現在までに、ＣＣＬ１〜ＣＣＬ２８を含む）、およびＣＸＣ型ケモカイン（現在までに、ＣＸＣＬ１〜ＣＸＣＬ１７を含む）が含まれる。目的遺伝子として考慮されるものには、また、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例、ＴＮＦ−α、４−１  ＢＢリガンド、Ｂ細胞活性化因子、ＦＡＳリガンド、リンホトキシン、ＯＸ４０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、およびＴＲＡＩＬ）がある。
【００６１】
ある実施形態では、目的タンパク質は、免疫寛容を誘導する。この点では、目的タンパク質は、ＩｇＧ−抗原融合タンパク質（例えば、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２３５（１）、２００５年、１２−２０を参照されたい）を含む場合がある。
【００６２】
さらなる実施形態では、目的遺伝子（複数可）は、抗体分泌細胞へのＢ細胞の分化を促進する一又は複数の因子および／または抗体生産細胞の寿命を伸ばす一又は複数の因子をコードする。そのような因子には、例えば、Ｂｌｉｍｐ−１、ＴＲＦ４、Ｂｃｌ−ｘｌもしくはＢｃｌ５のような抗アポトーシス因子、ＣＤ４０受容体の恒常活性化型変異体が含まれる。さらに、目的遺伝子は、下流のシグナル分子（例、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ））の発現を促進する因子をコードする。この点では、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの細胞活性化機能、細胞維持機能、および抗アポトーシス機能は、ほとんどＴＲＡＦ１〜６により媒介される（例えば、Ｒ．Ｈ．Ａｒｃｈら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１２（１９９８）、ｐｐ．２８２１−２８３０を参照されたい）。ＴＲＡＦ情報伝達の下流エフェクターには、各種観点の細胞機能および免疫機能に関わる遺伝子をオン状態にすることができる、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１ファミリーの転写因子が含まれる。さらに、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１の活性化は、抗アポトーシス遺伝子の転写を介して、細胞にアポトーシスからの防御を提供することが示されている。
【００６３】
別の実施形態では、目的核酸（複数可）は、一又は複数のエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来タンパク質をコードする。ＥＢＶ由来のタンパク質には、限定はされないが、ＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、ＥＢＥＲ、ＥＢＶ−ＥＡ、ＥＢＶ−ＭＡ、ＥＢＶ−ＶＣＡ、およびＥＢＶ−ＡＮが含まれる。一つの特定の実施形態では、目的核酸は、抗体またはその抗原結合断片をコードする。この点では、抗体は、自然な抗体またはカスタム化された組換え工学による抗体である場合がある。融合タンパク質は、抗体またはその部分を含み、本明細書中に記載されるベクターによりコードされることが具体的に考慮される。
【００６４】
一つの実施形態では、本開示に係る抗体またはその断片は、抗ＨＩＶ抗体（例、ｍ３６抗ＨＩＶ抗体）（例えば、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、２００８年１１月４日、１０５（４４）：１７１２１−６を参照されたい）のアミノ酸配列または抗ＨＩＶ抗体（例、ｍ３６）のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸分子を有する。特に、ｍ３６を含む融合タンパク質またはその誘導体（例、ｍ３６Ｌ２ＣＤ４Ｆｃ）が、具体的に考慮される（例えば、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌｕｍｅ  ８８、Ｉｓｓｕｅ  １、２０１０年１０月、１０７−１１５ページを参照されたい）。
【００６５】
さらなる実施形態では、本開示のトランスジーンによりコードされる抗体は、自己抗原に結合する。ある実施形態では、この点に関する自己抗原は、多発性硬化症またはＩ型糖尿病の発生と関連し、その例には、限定はされないが、ＭＢＰ、αＢ−クリスタリン、Ｓ１００β、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ＨＳＰ１０５、水疱性類天疱瘡（ＢＰ）抗原１の表皮型アイソフォーム（ＢＰＡＧ１−ｅ）、脂質、ならびにミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）−αおよびＭＯＧ−βアイソフォーム、あるいは、任意の各種膵島細胞自己抗原（例、シアロ糖脂質、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、インスリン、インスリン受容体、３８ｋＤタンパク質、ウシ血清アルブミン、グルコース輸送体、ｈｓｐ６５、カルボキシペプチダーゼＨ、５２ｋＤタンパク質、ＩＣＡ１２／ＩＣＡ５１２、１５０ｋＤタンパク質、およびＲＩＮポーラー（ｐｏｌａｒ））が含まれる。これらの自己抗原に対する抗体は、当該技術分野で公知であり、配列決定されている場合があり、普段使われる技術を使用して組換え的に作製可能である（例えば、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０７（５）：５５５−５６４（２００１年）を参照されたい）。
【００６６】
さらなる実施形態では、抗体は、がん関連抗原に結合する。がん関連抗原は、各種腫瘍タンパク質に由来する場合がある。本開示に有用な例示的な腫瘍タンパク質には、限定はされないが、ｐ５３、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、−１０、ＧＡＧＥ−１、−２、−８、ＧＡＧＥ−３、−４、−５、−６、−７Ｂ、ＮＡ８８−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ＭＣ１  Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ−Ｂ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（例、抗体はＨｅｒ２特異的ｍＡｂであるハーセプチン（Ｒ）由来である場合がある）、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ＷＴ１、ＡＦＰ、β−カテニン／ｍ、カスパーゼ−８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ−４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン／ｍ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、７０７−ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ−ａｂｌ、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ、およびＴＥＬ／ＡＭＬ１の任意の一又は複数のものが含まれる。これら及び他の腫瘍タンパク質は、当業者に公知である。
【００６７】
さらなる実施形態では、目的核酸は、特定の機能的属性（例、限定はされないが、阻害活性、がん細胞に細胞死を誘導する能力、またはがん細胞増殖を減速もしくは阻害する能力）を有するペプチドまたは他の結合ドメインをコードする。この点について、一つの実施形態では、目的核酸によりコードされるペプチドまたは結合ドメインは、本明細書中に記載される任意の標的タンパク質（例、上記がん関連抗原、ＣＤ４、ＨＩＶのｇｐ１２０もしくは他のウイルスタンパク質、ＩＣＡＭ−３、ＤＣ−ＳＩＧＮ（例えば、米国特許番号第７，３０１，０１０号を参照されたい））に結合する場合がある。ある実施形態では、ペプチドは、病原性および非病原性細菌と緑色植物に由来する場合がある。例示的ペプチドが、米国特許番号第７０８４１０５号、７３０１０１０号、７３３８７６６号、７３８１７０１号、７４９１３９４号、７５１１１１７号、７５５６８１０号に開示されている。一つの実施形態では、目的核酸は、アズリン−ｐ２８（ＮＳＣ７４５１０４）（ｐ５３ユビキチン化のペプチド阻害剤）をコードする（例えば、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、２０１０年、ＤＯＩ  １０．１００７／Ｓ００２８０−０１０−１５１８−３；米国特許番号第７，０８４，１０５号を参照されたい）。さらなる実施形態では、目的核酸は、食欲を惹起し、がん患者の治療に使用可能なグレリンとして知られる因子をコードする（例えば、Ｏｂｅｓ  Ｆａｃｔｓ．、２０１０年、３：２８５−９２；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、１８（３）：４３９−５６を参照されたい）。別の実施形態では、目的核酸は、アンジオポエチン１および２に結合および阻害する結合ペプチド（例、ＡＭＧ３８６（がん治療に使用される抗体のＦｃ断片（ペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）））をコードする。ある実施形態では、腫瘍抗原は、がんを有する個人から直接同定可能である。この点については、スクリーニングを、各種既存技術を使用して実施する場合がある。例えば、一つの実施形態では、腫瘍生検サンプルを患者から取得し、ＲＮＡを腫瘍細胞から単離し、および、ジーンチップ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ製、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用してスクリーニングし、そして、腫瘍抗原を同定する。一旦、腫瘍標的抗原が同定されると、その後、クローニングされ、そして、当該技術分野で既知の手法を使用して精製される。
【００６８】
一つの実施形態では、目的核酸は、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉまたはハーラー症候群）の治療または予防用のイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードする。別の実施形態では、目的核酸は、血友病の治療または予防用の第ＶＩＩ因子をコードする。一つの実施形態では、目的核酸は、例えば、レシチンコレステロールアシル転移酵素（ＬＣＡＴ）欠損症およびアテローム性動脈硬化の治療と予防に有用なレシチンコレステロールアシル転移酵素（ＬＣＡＴ）をコードする。別の実施形態では、目的核酸は、心血管疾患および障害（例、アテローム性動脈硬化）の治療または予防用のアポリポプロテインＡ−１ミラノ（ＡｐｏＡ−１  Ｍｉｌａｎｏ）をコードする。一つの実施形態では、目的核酸は、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）欠損症の治療または予防用のリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）をコードする。別の実施形態では、目的核酸は、広い範囲の中和抗体（ｂＮＡｂ）または複数のＨＩＶ−１株に結合し中和するその融合タンパク質（例、ｂ１２）をコードする。さらに別の実施形態では、目的核酸は、フェニルケトン尿症（ｐｈｅｎｙｋｅｔｏｎｕｒｉａ）（ＰＫＵ）の治療または予防用のフェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードする。
【００６９】
本明細書中で使用される「抗体」は、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両者を含み；霊長類化抗体（例、ヒト化抗体）、マウス抗体、マウス−ヒト抗体、マウス−霊長類抗体、およびキメラ抗体を含み；インタクトな分子、その断片（例、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’および、Ｆ（ａｂ）’２断片）、あるいは、インタクトな分子や断片の多量体または集合体である場合があり；自然に存在するか、または、例えば、免疫、合成、遺伝子工学により製造される場合もある。本明細書中で使用される「抗体断片」は、抗体由来または抗体に関連する断片であって、抗原に結合し、そして、いくつかの実施形態では、誘導体化されて、例えば、ガラクトース残基を取り込むことによってクリアランスと取り込みを促進する構造的特徴を示す場合がある。抗体断片には、例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）’２、ｓｃＦｖ、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、およびその組み合わせが含まれる。供給源には、様々な種に由来する抗体（抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、またはＦａｂ（例、ファージライブラリー中のもの）の形式をとる場合もある）遺伝子配列が含まれている。その中には、ヒト、ラクダ類（ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ；Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、（１９９３年）、Ｎａｔｕｒｅ、３６３：４４６およびＮｇｕｙｅｎら、（１９９８年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７５：４１３）、サメ（Ｒｏｕｘら、（１９９８年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：１１８０４）、魚（Ｎｇｕｙｅｎら、（２００２年）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、５４：３９）、齧歯類、鳥類、ヒツジの配列、ランダムペプチドライブラリーをコードする配列、あるいは、代替的非抗体スキャフォールド（例、フィブリノーゲンドメイン（例えば、Ｗｅｉｓｅｌら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：１３８８を参照されたい）、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメイン（例えば、米国特許番号第６，４２３，４９８号を参照されたい）、リポカリンドメイン（例えば、ＷＯ２００６／０９５１６４を参照されたい）、Ｖ様ドメイン（例えば、米国特許出願公開番号第２００７／００６５４３１号を参照されたい）、Ｃ型レクチンドメイン（ＺｅｌｅｎｓｋｙとＧｒｅａｄｙ（２００５年）ＦＥＢＳ  Ｊ．２７２：６１７９）、ｍＡｂ＜２＞またはＦｃａｂ（ＴＭ）（例えば、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２００７／０９８９３４；ＷＯ２００６／０７２６２０を参照されたい）等）のループ領域中で工学的に多様化されたアミノ酸をコードする配列が含まれる。
【００７０】
抗体技術を指して当業者に理解される用語は、本明細書中に明らかに定義されていない場合は、各々、当該技術分野で得られる意味を持つ。例えば、用語「ＶＬ」および「ＶＨ」は、それぞれ、抗体軽鎖および重鎖由来の可変結合領域を指す。可変結合領域は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）および「フレームワーク領域」（ＦＲ）として知られる別個の詳細に定義されたサブ領域から構成される。用語「Ｏ．」および「ＣＨ」は、「免疫グロブリン定常領域」、すなわち、それぞれ抗体軽鎖または重鎖由来の定常領域を指す。後者の領域は、さらに、その領域が由来する抗体アイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）に依存して、Ｃｍ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４定常領域ドメインに分類可能であることが理解される。定常領域ドメインの一部は、Ｆｃ領域（「断片結晶化可能」領域）をなす。Ｆｃ領域は、免疫グロブリンのエフェクター機能（例、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害活性）、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害作用）、ならびに補体結合反応、Ｆｃ受容体への結合、Ｆｃ領域を欠くポリペプチドに比べてより長いインビボ半減期、プロテインＡ結合、および、おそらく経胎盤伝達さえも含むもの）を担当するドメインを含む（Ｃａｐｏｎら、（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、３３７：５２５を参照されたい）。さらに、Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、そのポリペプチドの二量体化または多量体化が可能である。
【００７１】
免疫グロブリンのドメイン構造は、設計改変することができて、抗原結合ドメインおよびエフェクター機能を付与するドメインを、免疫グロブリンのクラス間およびサブクラス間で交換することが可能である。免疫グロブリンの構造と機能は、例えば、Ｈａｒｌｏｗら編、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第１４章（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８８年）に概説されている。組換え抗体技術のあらゆる観点に関する広範囲にわたる導入部とともに詳細な情報が、教科書「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９９９年）に見出すことができる。詳細な抗体工学ラボプロトコルの包括的コレクションが、Ｒ．ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎとＳ．Ｄｕｂｅｌ編、「Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２０００年）に見出すことができる。さらに関連するプロトコルが、また、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（２００９年８月）（出版はＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から入手可能である。酵素（例、ＩＤＵＡ）およびタンパク質生産工学方法は、当該技術分野で公知であり、本明細書中での使用に考慮される。
【００７２】
従って、本開示は、遺伝学的にＢ細胞を改変するために、本開示の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド（単離ポリヌクレオチド、精製ポリヌクレオチド、または純粋なポリヌクレオチド）、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター（クローニングベクターおよび発現ベクターを含むもの）、および本開示に係るポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換またはトランスフェクションした細胞（例、宿主細胞）を提供する。ある実施形態では、本開示の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が考慮される。目的タンパク質をコードする発現カセットも、また、本明細書中で考慮される。
【００７３】
本開示はまた、本開示のポリヌクレオチドを含むベクターに関し、特に、組換え発現コンストラクトに関する。一つの実施形態では、本開示は、本開示のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、そのようなタンパク質をコードする配列の転写、翻訳、およびプロセシングを引き起こすか又は助長する他のポリヌクレオチド配列とともに含むベクターを考慮する。原核生物および真核生物宿主と共に使用する適切なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、（１９８９年）に記載されている。例示的なクローニング／発現ベクターには、中に含まれるポリヌクレオチドの増幅、移行、および／または発現に適する、当該技術分野で公知のプラスミド、ファジミド、ファスミド、コスミド、ウイルス、人工染色体、または任意の核酸ビヒクルに基づく場合があるクローニングベクター、シャトルベクター、および発現コンストラクトが含まれる。
【００７４】
ウイルスベクターについてそうでないと記載されない限り、本明細書中で使用する「ベクター」は、それが連結される別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。例示的ベクターには、プラスミド、酵母人工染色体、およびウイルスゲノムが含まれる。あるベクターは宿主細胞で自律的に複製することができるが、他のベクターは宿主細胞ゲノムに組み込まれて、従って、宿主ゲノムと共に複製される場合がある。また、あるベクターは、本明細書中では、「組換え発現ベクター」（または、単に、「発現ベクター」）として呼ばれるものであって、発現制御配列に機能的に連結される核酸配列を含み、従って、それらの配列発現を指揮することができるものを指す。ある実施形態では、発現コンストラクトは、プラスミドベクターに由来する。例示的コンストラクトには、改変ｐＮＡＳＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）（アンピシリン耐性遺伝子、ポリアデニル化シグナル、およびＴ７プロモーター部位をコードする核酸配列を有するもの）；ｐＤＥＦ３８およびｐＮＥＦ３８（ＣＭＣ  ＩＣＯＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（ＣＨＥＦ１プロモーターを有するもの）；およびｐＤ１８（Ｌｏｎｚａ）（ＣＭＶプロモーターを有するもの）が含まれる。他の適切な哺乳類発現ベクターが周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９５年；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい；また、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｎｏｖａｇｅｎカタログ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ；Ｐｈａｒｍａｃｉａカタログ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪを参照されたい）。融合タンパク質の生産レベルの上昇（そのレベルは、適切な選択剤（例、メトトレキサート）の添加後に起こる遺伝子増幅の結果生じる）を促進するための、適切な規制的制御下にあるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）コード配列を含む有用なコンストラクトが作製可能である。
【００７５】
一般的に、組換え発現ベクターは、上記した様に、複製開始点、宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー、および、下流の構造配列の転写を指揮するための高発現遺伝子由来プロモーターを含んでいる。本開示に係るポリヌクレオチドが機能的に連結されているベクターから、クローニングまたは発現コンストラクトが作製される。例示的なクローニング／発現コンストラクトは、本開示のポリヌクレオチドに機能的に連結される少なくとも一つの発現制御エレメント（例、プロモーター）を含む。別の発現制御エレメント（例、エンハンサー、因子特異的結合部位、ターミネーター、およびリボソーム結合部位）は、本開示に係るベクターおよびクローニング／発現コンストラクトの中でも考慮される。本開示に係るポリヌクレオチドの異種構造配列を、翻訳開始および停止配列を用いて適切な相中で組み立てる。従って、例えば、本明細書中に提供されるコード核酸は、宿主細胞でそのようなタンパク質を発現する組換え発現コンストラクトとして、任意の一つの各種発現ベクターコンストラクト中に含有可能である。
【００７６】
適切なＤＮＡ配列（複数可）を、例えば、各種方法により、ベクターに挿入する場合がある。一般的に、ＤＮＡ配列を、当該技術分野で既知の方法により、適切な制限酵素切断部位（複数可）に挿入する。クローニング、ＤＮＡ単離、増幅および精製用の標準的技術、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、および制限酵素等用の標準的技術、ならびに様々な分離技術が考慮される。多数の標準的技術の記載が、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ，１９９３年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ」、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ、１９８９年）；Ｍａｎｉａｔｉｓら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ、１９８２年）；Ｇｌｏｖｅｒ（編）（「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｖｏｌ．ＩおよびＩＩ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ、１９８５年）；ＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ（編）（「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ、１９８５年）；等にある。
【００７７】
発現ベクター中のＤＮＡ配列を、少なくとも一つの適切な発現制御配列（例、恒常活性化型プロモーターまたは制御プロモーター）に機能的に連結して、ｍＲＮＡ合成を指揮する。そのような発現制御配列の例示的な例には、上記した、真核細胞またはそのウイルスのプロモーターが含まれる。プロモーター領域を、ＣＡＴ（クロラムフェニコール転移酵素）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択してもよい。真核生物プロモーターには、ＣＭＶ即時初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−１プロモーターが含まれる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、当該技術分野の通常の技術水準範囲内に十分ある。そして、本開示に係るタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結される少なくとも一つのプロモーターまたは制御プロモーターを含む特に好ましい組換え発現コンストラクトの調製は、本明細書中に記載されている。
【００７８】
本開示のポリヌクレオチドの変異体も考慮する。変異体ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される定義配列のポリヌクレオチドの一つ、または、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム（約６５〜６８℃）または０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウムおよび５０％のホルムアミド（約４２℃））下で、定義配列のポリヌクレオチドの一つとハイブリダイズするポリヌクレオチドの一つと、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、そして、好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％同一である。ポリヌクレオチド変異体は、本明細書中に記載される機能性を有する結合ドメインまたはその融合タンパク質をコードする能力を保持している。
【００７９】
用語「ストリンジェント」は、ストリンジェントだと当該技術分野で共通に理解される条件を指して使用される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、および変性剤（例、ホルムアミド）の濃度により、原理的に決定される。ハイブリダイゼーションと洗浄のストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム（約６５〜６８℃）または０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および５０％のホルムアミド（約４２℃）である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年を参照されたい）。よりストリンジェントな条件（例、より高温、より低イオン強度、より高濃度のホルムアミド、または他の変性剤）も使用可能である。しかしながら、ハイブリダイゼーションの効率が影響を受けることになる。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関する例では、さらに別の例示的ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、６×ＳＳＣ、０．０５％のピロリン酸ナトリウム中の洗浄（１４ベースのオリゴヌクレオチド用には３７℃、１７ベースのオリゴヌクレオチド用には４８℃、２０ベースのオリゴヌクレオチド用には５５℃、および２３ベースのオリゴヌクレオチド用には６０℃）が含まれる。
【００８０】
本開示のさらなる観点は、本開示の任意のポリヌクレオチドまたはベクター／発現コンストラクトで形質転換またはトランスフェクションした、或いはそうでなければそれを含む宿主細胞を提供する。本開示のポリヌクレオチドまたはクローニング／発現コンストラクトを、当該技術分野で既知の任意の方法（形質転換、トランスフェクション、および形質導入を含むもの）を使用して、適切な細胞へ導入する。宿主細胞には、体外細胞療法（例、体外遺伝子治療を含むもの）を受ける被験体の細胞が含まれる。真核生物宿主細胞が本開示に係るポリヌクレオチド、ベクター、またはタンパク質を保持している場合に、本開示の観点として考慮される真核生物宿主細胞には、被験体自身の細胞（例、ヒト患者自身の細胞）に加えて、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（発現される多価結合分子の糖鎖付加パターンを改変することのできる改変型ＣＨＯ細胞を含む；米国特許出願公開番号第２００３／０１１５６１４号を参照されたい）、ＣＯＳ細胞（例、ＣＯＳ−７）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｎ細胞、３Ｔ３細胞、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞（例、Ｓｆ９細胞）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞、ならびに、本開示に係るタンパク質またはペプチドを発現および、任意ではあるが、単離するのに有用な、当該技術分野で既知の任意の他の真核細胞が含まれる。原核細胞（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ストレプトミセス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ）、または、本開示に係るタンパク質またはペプチドを発現および、任意ではあるが、単離するのに適切な、当該技術分野で既知の任意の原核細胞を含むもの）も、また、考慮される。原核細胞からタンパク質またはペプチドを単離する場合、特に、封入体からタンパク質を抽出するための、当該技術分野で既知の技術を使用する場合があることも考慮される。適切な宿主の選択は、本明細書中の教義から、当業者の実施範囲内にある。本開示の融合タンパク質に糖鎖付加する宿主細胞も考慮する。
【００８１】
用語「組換え宿主細胞」（または、単に、「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターを含む細胞を指す。そのような用語が、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫を指すように意図されることは、理解されるべきである。突然変異かまたは環境的影響のせいで後世にある特定の改変が生じる可能性があるため、そのような子孫は、実際に、親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書に用いられる場合の「宿主細胞」という用語の範囲内になお含まれる。組換え宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、または、特定遺伝子を増幅するのに適するように改変された従来の栄養培地中で培養可能である。発現に関して選抜された特定の宿主細胞のための培養条件（例、温度、ｐＨ等）は、当業者には明白である。各種哺乳類細胞培養システムを用いて、組換えタンパク質を発現することもできる。哺乳類発現システムの例には、サル腎臓繊維芽細胞であるＣＯＳ−７株（Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１年）、Ｃｅｌｌ、２３：１７５に記載されるもの）および適合するベクターを発現可能な他の細胞株（Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株）が含まれる。哺乳類発現ベクターは、複製開始点、適切なプロモーター、ならびに任意ではあるが、エンハンサー、また、任意の必須リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライシングドナーとアクセプター部位、転写終結配列、および、例えば、多価結合タンパク質発現コンストラクトの調製に関して本明細書中に記載される、５’側に隣接する非転写配列を含む。ＳＶ４０のスプライシング部位およびポリアデニル化部位由来のＤＮＡ配列を使用して、必要な非転写遺伝子エレメントを提供することができる。宿主細胞へのコンストラクトの導入は、当業者が使い慣れた各種方法（リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーション（Ｄａｖｉｓら（１９８６年）「Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」）を含むもの）により、実効化可能である。
【００８２】
組成物および使用方法
一つの実施形態では、本開示の細胞組成物は、インビトロで活性化／分化したＢ細胞であって、本明細書中に記載されるように目的タンパク質を発現するために形質導入されたものを含む。一つの実施形態では、組成物は、プラズマＢ細胞に分化し、一又は複数の目的タンパク質を形質導入されて発現するＢ細胞を含む。標的細胞集団（例、形質導入されて活性化した本開示のＢ細胞集団）を、単独で投与する場合があり、または、希釈剤と組み合わせるか若しくは他の成分（例、サイトカインまたは細胞集団）と組み合わせる医薬組成物として投与する場合がある。簡単に言うと、本開示の細胞組成物は、本明細書中に記載される目的タンパク質を形質導入されて発現している分化および活性化したＢ細胞集団を、一若しくは複数の医薬的または生理学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含む場合がある。そのような組成物は、緩衝液（例、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等）；炭水化物（例、グルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、マンニトール）；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（例、グリシン）；酸化防止剤；キレート剤（例、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）；アジュバント（例、水酸化アルミニウム）；および防腐剤を含んでもよい。本開示の組成物は、好ましくは、静脈投与用に処方される。
【００８３】
本開示の細胞組成物は、治療（予防）される疾患に適切なやり方で投与可能である。投与の量と回数を、患者の状態、および患者の疾患のタイプと重症度のような因子により決定する。しかしながら、適切な投与量は、臨床試験により決定する場合がある。
【００８４】
「有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療有効量」を指す場合、投与される本開示の組成物の正確な量を、患者（被験体）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染と転移の程度、および症状の個人差を考慮して医師が決定する場合がある。Ｂ細胞組成物を、また、適切な投与量で複数回投与してもよい。細胞は、免疫療法で一般的に知られる点滴技術を使用して投与可能である（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｍｅｄ．、３１９：１６７６、１９８８年を参照されたい）。特定の患者に対する最適な投与量と治療計画は、疾患の兆候に関して患者を監視し、治療をそれに従って調整することで、医学の当業者により容易に決定可能である。典型的には、関連する養子免疫療法の試験では、抗原特異的Ｔ細胞を、約２×１０９〜２×１０１１細胞で、患者に投与する（例えば、米国特許番号第５，０５７，４２３号を参照されたい）。本開示のいくつかの観点では、本開示のより少ない数の形質導入Ｂ細胞（１０６細胞／キログラム（患者当たり１０６〜１０１１細胞）の範囲のもの）を投与する場合がある。ある実施形態では、被験体に、Ｂ細胞を、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、２×１０８、２×１０９、１×１０１０、２×１０１０、１×１０１１、５×１０１１、または１×１０１２細胞で投与する。Ｂ細胞組成物を、これらの範囲内の投与量で、複数回投与してもよい。細胞は、治療を受ける患者の自己のものであっても、異種のものであってもよい。所望ならば、治療は、免疫応答の誘導を向上させるために、本明細書中に記載するように、分裂促進因子（例、ＰＨＡ）もしくはリンホカイン、サイトカイン、および／またはケモカイン（例、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１ａ等）の投与工程を含めてもよい。
【００８５】
対象の組成物の投与を、任意の簡便な様式（エアゾール吸入、注射、経口摂取、点滴、インプラント、または移植）で実施する場合がある。本明細書中に記載される組成物は、患者に対して、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄質内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により、または腹腔内に投与可能である。一つの実施形態では、本開示のＢ細胞組成物を、患者に、皮内または皮下注射により投与する。別の実施形態では、本明細書中に記載のＢ細胞組成物を、好ましくは、ｉ．ｖ．注射により投与する。Ｂ細胞の組成物は、直接に、腫瘍、リンパ節、骨髄、または感染部位に注射可能である。
【００８６】
さらに別の実施形態では、医薬組成物を、放出制御システムで送達する場合がある。一つの実施形態では、ポンプを使用する場合がある（Ｌａｎｇｅｒ、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５２７−１５３３；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７年、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．
Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．、１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０年、Ｓｕｒｇｅｒｙ、８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９年、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２１：５７４を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料が使用可能である（「Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ」、１９７４年、ＬａｎｇｅｒとＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．；「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ」、１９８４年、ＳｍｏｌｅｎとＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＲａｎｇｅｒとＰｅｐｐａｓ、１９８３年、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２３：６１を参照されたい；また、Ｌｅｖｙら、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９年、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、７１：１０５も参照されたい）。さらに別の実施形態では、放出制御システムを、治療標的の近くに設置して、従って、全身投薬量のほんの少ししか必要としない場合もある（例えば、「Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ」、１９８４年、ＬａｎｇｅｒとＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．、ｖｏｌ．２、ｐｐ．１１５−１３８を参照されたい）。
【００８７】
本開示のＢ細胞組成物は、任意の数のマトリクスを使用して投与可能でもある。マトリクスは、組織工学の内容の範囲内で多年に渡って利用されてきた（例えば、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」（Ｌａｎｚａ、ＬａｎｇｅｒとＣｈｉｃｋ（編）、１９９７年））。本開示は、Ｂ細胞の支持と維持のために人工リンパ性器官として働くという新規な内容の範囲内で、そのようなマトリクスを利用する。従って、本開示は、組織工学において有用性を実証されたこれらのマトリクス組成物および処方を利用することができる。従って、本開示の組成物、デバイス、および方法に使用可能なマトリクスのタイプは、実際制限がなく、生物学的マトリクスと合成マトリクスの両者を含む場合がある。一つの特定の例では、米国特許番号第５，９８０，８８９号；第５，９１３，９９８号；第５，９０２，７４５号；第５，８４３，０６９号；第５，７８７，９００号；または第５，６２６，５６１号に記載される組成物とデバイスを利用する。マトリクスは、哺乳類宿主に投与される場合、生体適合性であることと一般的に関連する特徴を有する。マトリクスは、自然または合成材料の両者から成形可能である。マトリクスは、動物の体内に永続的な構造物または除去可能な構造物（例、インプラント）を残すことが望ましい例では、非生分解性である場合があるし、あるいは生分解性であってもよい。マトリクスの取り得る形態は、スポンジ、インプラント、チューブ、テルファ・パッド、線維、中空繊維、凍結乾燥構成要素、ゲル、粉、多孔性組成物、またはナノ粒子である。また、マトリクスは、徐放性の種細胞、生産済みサイトカイン、または他の活性剤を実現可能なように設計される場合がある。ある実施形態では、本開示のマトリクスは、フレキシブル且つ弾力性であり、物質（例、無機塩、水性流動体、ガス（酸素を含む）が溶解した剤）を透過する半固形基材として記載される場合がある。
【００８８】
マトリクスは、生体適合性物質の例として、本明細書中で使用される。しかしながら、本開示は、マトリクスに限定されない。従って、用語「マトリクス（複数可）」が出てきた場合はいつでも、これらの用語は、細胞保持または細胞横断を実現し、生体適合性であって、そして、物質自体が半透過性膜であるようにその物質を直接通過するか、または、特定の半透過性物質と共に使用するかのいずれかで高分子の横断を実現可能にするデバイスおよび他の物質を含むように読まれることが望ましい。
【００８９】
本開示のある実施形態では、本明細書中に記載の方法または当該技術分野で既知の他の方法を使用して形質導入および活性化されたＢ細胞を、患者に、任意の数の妥当な治療様式（限定はされないが、薬剤（抗ウイルス剤）を用いる治療、化学療法、放射線、免疫抑制剤（例、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびＦＫ５０６）、抗体もしくは他の免疫除去（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ）剤（例、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、他の抗体療法）、サイトキシン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒｉｂｉｎｅ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および放射線照射）の、例えば、前、同時、または後に組み合わせて投与する。これらの薬剤は、カルシウム依存性ホスファターゼであるカルシニューリンを阻害する（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）または成長因子誘導性シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）のいずれかである（Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ、６６：８０７−８１５、１９９１年；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｍｍｕｎ．、７３：３１６−３２１、１９９１年；Ｂｉｅｒｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．、５：７６３−７７３、１９９３年；Ｉｓｏｎｉｅｍｉ（上記））。さらなる実施形態では、本開示の細胞組成物を、患者に、骨髄移植、化学療法剤（例、フルダラビン）を使用するＴ細胞除去療法、外部ビーム照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、または抗体（例、ＯＫＴ３またはＣＡＭＰＡＴＨ）の、例えば、前、同時、後に組み合わせて投与する。一つの実施形態では、本開示の細胞組成物を、Ｂ細胞除去療法（例、ＣＤ２０と反応する薬剤（例、Ｒｉｔｕｘａｎ（Ｒ）））の後に投与する。例えば、一つの実施形態では、被験体は、高用量化学療法での標準的な治療の後に、末梢血幹細胞移植を行う場合がある。ある実施形態では、移植の後に、被験体に、本開示の増殖拡張後の免疫細胞を注入する。別の実施形態では、増殖拡張した細胞を、外科手術の前または後に投与する。
【００９０】
患者に投与される上記治療剤の投与量は、治療される症状の正確な性質と治療を受ける被験体にしたがって異なる。ヒトへ投与量は、当該分野の慣習に従って、決定可能である。
【００９１】
本開示の形質導入Ｂ細胞組成物、特に、特定目的抗体を発現するために形質導入されたＢ細胞は、各種感染症、がん、変性疾患、および免疫障害の治療または予防に使用可能である。
【００９２】
本明細書中に記載される形質導入Ｂ細胞を含む組成物は、感染性生物（例、ウイルス、細菌、寄生虫、および真菌）が原因の任意の各種感染症の治療に使用可能である。感染性生物には、ウイルス（例、ＲＮＡウイルス、ＤＮＡウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型、Ｂ型、およびＣ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、寄生虫（例、原生動物および後生動物病原体（例、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉａ）種、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）種、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）種）、細菌（例、マイコバクテリア、特に、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、サルモネラ菌、ストレプトコッカス菌、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌）、真菌（例、カンジダ菌（Ｃａｎｄｉｄａ）種、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種）、ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、ならびにプリオン（既知のプリオンは、動物に感染し、スクレーピー（ｓｃｒａｐｉｅ）（ヒツジとヤギの神経系の伝達性変性疾患）、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）（または「狂牛病」）、およびネコの猫海綿状脳症）を引き起こすもの）が含まれる場合がある。ヒトに罹患することが知られる四種類のプリオン病は、（１）クールー病、（２）クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、（３）ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、および（４）致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）である。本明細書中で使用される「プリオン」は、任意の使用動物（特に、ヒトおよびペット家畜）においてこれらの疾患または他の疾患の全てまたは任意のものを引き起こす全ての形態のプリオンを含む。例示的感性症には、限定はされないが、トキソプラズマ病、ヒストプラスマ症、ＣＭＶ、ＥＢＶ、コクシジウム症、結核、およびＨＩＶ等が含まれる。
【００９３】
ある実施形態では、本明細書中に記載される形質導入Ｂ細胞組成物は、また、各種がんの予防または治療に使用可能でもある。この点について、ある実施形態では、形質導入Ｂ細胞を含む組成物は、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、白血病、プラズマ細胞腫、肉腫、グリオーマ、胸腺腫、乳がん、前立腺がん、大腸・直腸がん、腎臓がん、腎細胞がん、子宮がん、膵臓がん、食道がん、脳がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、胃がん、食道がん、多発性骨髄腫、肝がん、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）あるいは他のがんの予防または治療に有用である。
【００９４】
一つの実施形態では、形質導入Ｂ細胞は、また、免疫疾患（例、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、他の免疫不全、免疫抑制、および重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ））の治療に使用可能である。
【００９５】
一つの実施形態では、本明細書中に記載される形質導入Ｂ細胞は、また、自己免疫疾患（例、限定はされないが、関節リウマチ、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、アディソン病、セリアック病、慢性疲労症候群、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、線維筋痛症、全身性エリテマトーデス、乾癬、シェーグレン症候群、甲状腺機能亢進症／グレーブス病、甲状腺機能低下症／橋本病、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）、重症筋無力症、子宮内膜症、強皮症、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、ヴェーグナー病、糸球体腎炎、再生不良性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、骨髄異形成症候群、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血、エバンス症候群、第ＶＩＩＩ因子阻害剤症候群、全身性血管炎、皮膚筋炎、多発性筋炎、およびリウマチ熱）の治療に使用可能でもある。従って、一つの実施形態では、本明細書中の方法は、疾患を治療する方法であって、治療を必要とする被験体または患者に、本明細書中に記載される形質導入Ｂ細胞を含む組成物の治療有効量を投与して、従って、前記疾患を治療する工程を含む方法を、含む。
【実施例】
【００９６】
実施例１：
インビトロでのメモリーＢ細胞分化およびＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスを用いた形質導入
この実施例は、プラズマ芽球およびプラズマ細胞のインビトロ分化とＶＳＶ−Ｇウイルスを用いた同芽球・細胞への形質導入を記載する。本方法が実証するのは、培養システムの第二相後に、当該技術分野で既知の方法を使用してはたった５％であるのに比較して、約２０％の形質導入が観察されることである。
（形質導入に関して：回転させながらイノキュレーションする必要（ｓｐｉｎｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）はない。単に、硫酸プロタミンと共にウイルス上清を加えて、一晩インキュベートする。そして、培地交換する。）
【００９７】
メモリーＢ細胞を、以下に記載のメモリーＢ細胞単離法を使用して単離した。
１．Ｄ１：精製メモリーＢ細胞を、１．５×１０５細胞／ｍｌで、サイトカインの混合剤を添加した培地＃１に再懸濁し、３日間インキュベートする。
２．Ｄ４：細胞を回収し、基本培地で洗浄し、８分間３００ｇでスピンダウンし、細胞を、サイトカインの混合剤を添加した培地＃２中に再懸濁した。
３．Ｄ６：細胞を回収および計数し、培地＃２中に１．５×１０６細胞／ｍｌで、細胞を再懸濁し、硫酸プロタミン（１００×）１０μｌ＋濃縮ＧＦＰウイルス１００μｌ（ＭＯＩ約５０）を加え、一晩インキュベートする。
４．Ｄ７：細胞を回収し、基本培地で洗浄し、８分間３００ｇでスピンダウンし、サイトカインの混合剤を添加した培地＃３中に再懸濁し、３日間インキュベートした。
５．Ｄ１０：８分間３００ｇでスピンダウンすることにより、細胞を回収し、４℃で１５分間、固定バッファー中で細胞を固定する。細胞を二度洗浄し、そして細胞をフローバッファー中に保存する。細胞は、形質導入効率を測定するためのフローサイトメトリー解析に準備が整っている。
【００９８】
第二工程後の細胞は、ほとんど、ＣＤ２０−ＣＤ３８＋ＣＤ１３８−であり、第三工程後の細胞はＣＤ２０−ＣＤ３８＋ＣＤ１３８＋である。
【００９９】
【表１】
2020062058.tif 000002
【０１００】
ストック試薬調製：
１．インスリン５０ｍｇ（シグマ）を、０．００５ＮのＨＣＬに溶解し、濾過（０．２２μｍ）し、１ｍｌ／チューブで分注し、−２０℃で保存した。ストック濃度は、５ｍｇ／ｍｌ（１０００×）である。
２．トランスフェリン１００ｍｇ（シグマ）を、２ｍｌのＰＢＳに溶解し、濾過（０．２２μｍ）し、０．５ｍｌ／チューブで分注し、−２０℃で保存した。ストック濃度は、５０ｍｇ／ｍｌ（１０００×）である。
３．ｐ−ＯＤＮ４７．９５ｍｇ（ＩＤＴで合成）を、４．７９５ｍｌの滅菌ｄｄＨ２Ｏに溶解し、１ｍｌ／チューブで分注し、−２０℃で保存した。ストック濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ（１０００×）である。
４．ｓＣＤ４０Ｌ−ｈｉｓ（２０μｇ／４０μｌ）（Ｐｒｏｓｐｅｃ）を、滅菌した０．４ｍｌのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ中に希釈し、１３０μｌ／チューブで分注し、−２０℃で保存した。ストック濃度は、５０μｇ／ｍｌ（１０００×）である。
５．ＩＬ−１５の５μｇ（Ｒ＆Ｄ）を、０．５ｍｌの滅菌したＰＢＳ／０．５％ＢＳＡに溶解し、１００μｌ／チューブで分注し、−２０℃で保存した。ストック濃度は、１０μｇ／ｍｌ（１０００×）である。
６．ＩＬ−６の１０μｇ（Ｒ＆Ｄ）を、０．２ｍｌの滅菌したＰＢＳ／０．５％ＢＳＡに溶解し、５０μｌ／チューブで分注し、−２０℃で保存した。ストック濃度は、５０μｇ／ｍｌ（１０００×）である。
７．ＩＬ−２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は、１００μｇ／ｍｌ、つまり５．６×１０６Ｕ／ｍｇであった。従って、ストックは５．７×１０５Ｕ／ｍｌ（２８５０×）である。
８．ＩＬ−１０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は、１００μｇ／ｍｌ（２０００×）であった。
９．ＩＦＮは、１０００００Ｕに対して総量０．１ｍｌである。ストック濃度は、１×１０６Ｕ／ｍｌ（２０００×）である。
１０．抗ポリｈｉｓ抗体
【０１０１】
上記方法における開始集団の大半は、ＣＤ２０＋ＣＤ３８−ＣＤ１３８−であり、それらの形質導入効率は悪い。第二工程後の細胞は、ほとんど、ＣＤ２０−ＣＤ３８＋ＣＤ１３８−であり、第三工程後の細胞はＣＤ２０−ＣＤ３８＋ＣＤ１３８＋である。インビトロのプラズマ芽球およびプラズマ細胞の分化を利用し、ＶＳＶ−Ｇによる形質導入を組み合わせた方法は、当該技術分野では記載がない。このインビトロ方法を使用する場合、形質導入効率は、約２０％に大幅に増加した。
【０１０２】
特に、本明細書中で実証された培養条件は、初めて、Ｂ細胞が形質導入可能になった時間枠を設定した（図１）。ＶＳＶ−Ｇ偽型ウイルスを用いたＢ細胞への効率的形質導入は、Ｂ細胞増殖と特異的Ｂ細胞表現型の取得との両者を刺激する条件を必要とした。９日間の培養過程に渡って、ＣＤ２０＋；ＣＤ３８−ＣＤ２０−；ＣＤ３８−ＣＤ２０−；およびＣＤ３８＋表現型の変化を、図２に示す。
【０１０３】
図１に示されるように、Ｂ細胞分化を促進するように設計された培養の５日後に、細胞は、形質導入可能性が最大になった。また、Ｂ細胞の表現型移行タイミングは、最も増殖している状態にある細胞と相関していた（図３）。培養条件は、細胞増殖と表現型移行を誘導し、それらは、他の方法を使用することで観察されたものよりも有意に大きな形質導入効率を生じさせた。従って、本方法を使用して、効率的にＢ細胞に形質導入して目的タンパク質（例、特異的抗体または他の治療用タンパク質）を発現させることができる。
【０１０４】
上記各種実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書で参照および／または出願データシートにリストアップした米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許文献の全ては、参照により完全に本明細書中に組み込まれる。必要ならば、各種特許、出願、および刊行物の概念を採用してまださらなる実施形態を提供するために、実施形態の観点は改変可能である。
【０１０５】
これらのおよび他の変更を、上記記載の観点から、実施形態に施すことができる。一般的に、引き続く特許請求の範囲では、使用する用語は、本明細書や請求項に開示される具体的実施形態に特許請求の範囲を限定するとは解釈されるべきではないが、そのような請求項が表わす等価なものの範囲全体に沿って全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。従って、特許請求の範囲は、本開示により限定されない。
【図１−１】
2020062058.tif 000003
【図１−２】
2020062058.tif 000004
【図１−３】
2020062058.tif 000005
【図２】
2020062058.tif 000006
【図３】
2020062058.tif 000007
【外国語明細書】
2020062058000001.pdf