(57)【要約】【課題】多分散液滴を使用するデジタルアッセイを行うための方法及び装置の提供。【解決手段】デジタルアッセイを行うための方法、デバイス、及びシステムが提供される。ある特定の態様では、該方法、デバイス、及びシステムは、核酸の増幅及び検出に使用され得る。ある特定の態様では、該方法、デバイス、及びシステムは、ある体積における液滴の認識、検出、及びサイズ分けに使用され得る。本開示の方法及びデバイスと共に使用するのに好適な組成物及びキットも提供される。様々な態様において、本方法、システム、組成物、及びキットを使用して、ヌクレオチド試料の増幅に関与するデジタルＰＣＲアッセイを行うことができる。【選択図】図２Ｂ
2020060579.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デジタルアッセイを行うための方法であって、
複数の多分散液滴であって、前記複数の多分散液滴の少なくともいくつかの液滴が試料を含む、複数の多分散液滴を産出することと、
前記複数の多分散液滴の液滴の最大径を決定することと、
前記液滴の最大径から、前記液滴の体積を決定することと、
前記複数の多分散液滴中の前記試料の有無を決定することと、
前記複数の多分散液滴における前記試料の有無と、前記液滴の前記体積とに基づいて、前記複数の多分散液滴における前記試料の濃度を決定することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記液滴の前記最大径を決定することが、
前記液滴の円径に曲線を適合させることと、
前記曲線から前記最大径を補間することと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記液滴の前記最大径を決定することが、前記液滴の境界を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記液滴の画像を取得することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記液滴の画像スタックを取得することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記画像スタックが、前記液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記液滴の前記直径を決定することが、
前記液滴を前記画像スタックの複数の画像の間で相関させることと、
前記複数の画像における前記液滴の前記最大径を測定することと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が目的分子を含み、前記方法は、前記試料を、前記目的分子に関連するように構成された検出可能な薬剤で標識することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の多分散液滴中の前記試料の有無を決定することが、前記液滴中の前記目的分子に関連した前記検出可能な薬剤の有無を決定することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記目的分子が、核酸分子、ペプチド、タンパク質および脂質からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
増幅ステップをさらに含み、増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、環状ヘリカーゼ依存性増幅、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自立配列複製（３ＳＲ）及びシングルプライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、ＲＮＡ技術のシグナル媒介増幅（ＳＭＡＲＴ）、分岐ローリングサークル増幅（ＨＲＣＡ）、指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ）、スマート増幅（ＳｍａｒｔＡｍｐ）、核酸の等温及びキメラプライマー始動性増幅（ＩＣＡＮＳ）、及び多置換増幅（ＭＤＡ）、等温多置換増幅またはこれらの組み合わせを実施することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
増幅ステップをさらに含み、増幅が、抗体系増幅を実施することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
増幅ステップをさらに含み、増幅が、デジタルＥＬＩＳＡを実施することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の多分散液滴中の前記試料の濃度を決定することが、１つ以上の目的分子を有する前記複数の液滴中の液滴の数に基づいて、前記目的分子の濃度を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数の多分散液滴が、以下の特徴：
液滴中央径の１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を有する液滴径の分布；
液滴平均径の１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を有する液滴径の分布；および
約２倍超で、約１０倍超で、または約１００倍超で変動する体積
のうちの１つ以上を有する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
相互参照
本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年４月８日出願の米国仮出願第６１／９７６，９１８号、及び２０１４年９月８日出願の米国仮出願第６２／０４７，５７０号の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府支援の研究に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）認可番号Ｒ２１  ＧＭ１０３４５９の下で、米国政府の支援と共に成された。
【０００３】
ｙｅｓまたはｎｏの２値応答の計数に基づいて測定が行われるデジタルアッセイは、そのロバスト性、感度、及び正確性のために、生物学において重要性を増している。アナログ測定が多くの場合に実行標準の較正を必要とする一方で、デジタル測定は、較正を必要とせず、アナログ法よりも早く、実装が容易であり、正確であり、かつロバスト性である可能性を有する。
【０００４】
デジタルアッセイの重要な用途は、試料におけるＤＮＡまたはＲＮＡの正確な検出及び測定である。試料中のＤＮＡを検出するために最も一般的に使用される方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、ここでは、ＤＮＡは、ＤＮＡ重合酵素によって触媒される温度感受性反応において増幅される。ＰＣＲでは、試料は、典型的には、熱循環デバイスによって約６０℃〜約９５℃の範囲の２つまたは３つの温度の間を循環する。ＤＮＡを増幅するためのＰＣＲの使用は、基礎生物学から臨床診断及び法医学まで、幅広い分野を大きく前進させた。診断及び生物医学研究において使用されることが多いＰＣＲの１つの特定の形態は定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）であり、これは、試料中のＤＮＡの存在を検出するだけでなく、その濃度の正確な測定も提供する。
【０００５】
ｑＰＣＲを実施するために最も一般的に使用される方法は実時間ＰＣＲであり、ここでは、試料の絶対濃度が増幅プロセスの時間発展から推測され、これは、増幅産出物を特異的に認識する分子指標またはＴａｑｍａｎプローブなどの蛍光プローブを用いて熱循環プロセス中に繰り返しモニタリングされる。
【０００６】
実時間ＰＣＲは、プライマー分子がそれらの相補的な配列範囲に起因して互いに結合する不要なプライマーダイマーの形成を含む、様々な誤差の影響を受けやすい。結果として、利用可能なＰＣＲ試薬のための標的要素と競合する故に、標的配列の増幅を阻害し、正確な定量に干渉する可能性がある副生成物が生成される。標的の定量はまた、各サイクルに対する増幅効率の的確な知識を必要とし、成長が指数関数的であることから、増幅効率におけるごくわずかな（例えば、閾値検出レベルを下回る）不確実性は、標的のコピー数の決定における非常に大きな誤差をもたらすことになる。この誤差は、初期の核酸濃度が低いとき、または蛍光検出の感受性が十分でないときに、非常に大きくなり得る。故に、標的のＤＮＡを複雑な試料から特定し定量するその能力にも関わらず、実時間ＰＣＲは、例えば、病原体の検出または臨床診断において必要とされる、低試料濃度を確実かつ正確に定量することができない。
【０００７】
低コピー数ＤＮＡを正確に定量することに対する実時間ＰＣＲの限界は、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）を使用して克服できる可能性がある。ｄＰＣＲでは、試料を含む体積がより小さい体積へと分割されることで、ポアソン統計に基づいて、それらの体積の少なくともいくつかは標的ＤＮＡを含まないが、残りは１つ以上の標的分子を含み得るようにする。その後、ＤＮＡ増幅がより小さい体積のアレイにおいて同時に実行され、増幅前に１つ以上の標的分子を含む体積においてのみ蛍光（または他のシグナル）の増加をもたらす。ＤＮＡコピー数は、ウェルの総数と比較した増加したシグナル（即ち、増幅されたＤＮＡを含むもの）を持つウェルの体積及び数を知ることによって、容易かつ正確に決定され得る。
【０００８】
大部分の既存のデジタルアッセイは、単分散液滴エマルションなどの不変サイズの体積から取得された２値応答の計数に依存する。マイクロ流体システムの発展により単分散液滴エマルションの生成が可能にはなったが、これらのシステムは技術的に困難であり、従来のアナログ法と比較して、エンドユーザに時間及び費用の増加をもたらした。
【０００９】
実時間ＰＣＲなどのアナログアッセイに内在する限界、及び既存のデジタルアッセイの技術的困難を考慮すると、デジタルアッセイを行うための改善された方法及び装置を提供する必要があることは明らかである。本明細書に記載の本発明は、この必要性及びその他に対処する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、デジタルアッセイを行うための方法、システム、組成物、及びキットを提供する。本開示は、一部には、デジタルアッセイが不適切な実験誤差をもたらすことなく多分散液滴を含むシステムにおいて行われ得るという意外な発見に関する。
【００１１】
様々な態様において、本方法、システム、組成物、及びキットを使用して、ヌクレオチド試料の増幅に関与するデジタルＰＣＲアッセイを行うことができる。
【００１２】
様々な態様において、本開示は、デジタルアッセイを行うための方法を提供し、該方法は、液滴の少なくともいくつかが試料を含む、複数の多分散液滴を産出することと、試料を増幅することと、試料を検出可能な薬剤で標識することと、液滴のための画像スタックを取得することと、液滴の体積を画像スタックから決定することと、液滴中の検出可能な薬剤の有無を画像スタックから決定することと、複数の液滴中の試料の濃度を、複数の液滴中の検出可能な薬剤の有無に基づいて決定することと、を含む。
【００１３】
いくつかの態様において、本開示は、デジタルアッセイを行うための方法を提供し、該方法は、液滴の少なくともいくつかが試料を含む、複数の多分散液滴を産出することと、試料を増幅することと、試料を検出可能な薬剤で標識することと、複数の多分散液滴を、フローサイトメトリーチャネルを通して流すことと、液滴の体積を、それがフローサイトメトリーチャネルを通して流れるときに決定することと、液滴中の検出可能な薬剤の有無を決定することと、複数の液滴中の試料の濃度を、複数の液滴中の検出可能な薬剤の有無に基づいて決定することと、を含む。
【００１４】
様々な態様において、本開示は、デジタルアッセイを行うための組成物及びキットを提供し、これらは、第１の流体と、第２の流体であって、第１の流体及び第２の流体が互いに非混和性であり、物理的に撹拌されるとエマルションを形成することができる、第２の流体と、界面活性剤と、増幅試薬と、を含む。
【００１５】
様々な態様において、本開示は、二重エマルションを使用する、デジタルアッセイを行うための方法、組成物、及びキットを提供する。いくつかの態様において、二重エマルションは、２つの水相及び１つの油相を含む。
【００１６】
様々な態様において、本開示は、デジタルアッセイを行うための方法を提供する。複数の多分散液滴が産出され得る。液滴の少なくともいくつかは、試料を含んでもよい。試料は増幅されてもよい。試料は、検出可能な薬剤で標識されてもよい。液滴のための画像スタックが取得され得る。液滴の体積が画像スタックから決定され得る。液滴中の検出可能な薬剤の有無は、画像スタックから決定されてもよい。複数の液滴中の試料の濃度は、複数の液滴中の検出可能な薬剤の有無に基づいて決定されてもよい。
【００１７】
様々な態様において、本開示は、デジタルアッセイを行うための方法を提供する。複数の多分散液滴が産出され得る。液滴の少なくともいくつかは、試料を含んでもよい。試料は増幅されてもよい。試料は、検出可能な薬剤で標識されてもよい。複数の多分散液滴は、フローサイトメトリーチャネルを通して流され得る。液滴の体積は、それがフローサイトメトリーチャネルを通して流れるときに決定され得る。液滴中の検出可能な薬剤の有無が決定されてもよい。複数の液滴中の試料の濃度が、複数の多分散液滴中の検出可能な薬剤の有無に基づいて決定され得る。いくつかの態様においては、液滴のサイズが、液滴からの散乱光を検出することによって決定されてもよい。複数の多分散液滴中の試料の濃度は、液滴のサイズまたはサイズ分布に基づいて決定され得る。
【００１８】
様々な態様において、本開示は、デジタルアッセイを行うための組成物を提供する。組成物は、第１の流体、第２の流体、界面活性剤、及び増幅試薬を含み得る。第１の流体及び第２の流体は、互いに非混和性であってもよく、撹拌時にエマルションを形成することができてもよい。いくつかの態様において、本組成物は、ヌクレオチドなどの試料、及び／または試料を標識することができる検出可能な薬剤を更に含んでもよい。
【００１９】
様々な態様において、本開示は、少なくとも１つの液滴の体積を決定するためのシステムを提供する。本システムは、容器、撮像ソース、及びコンピューティングデバイスを含んでもよい。容器は、液滴（複数可）を保持するように構成され得る。撮像ソースは、容器中の液滴（複数可）の画像を取得するように構成され得る。コンピューティングデバイスは、プロセッサ及びメモリ（例えば、ＲＯＭ、ＲＡＭ、フラッシュメモリ、または同様のものなどの、非一時的有形コンピュータ可読記憶媒体）を含んでもよい。メモリは、プロセッサによって実行されるときに、（ｉ）撮像ソースに、液滴（複数可）の画像スタックを取得させ、（ｉｉ）プロセッサに、試料中の液滴（複数可）の体積を取得された画像スタックに基づいて決定させる、１組の命令を記憶し得る。
【００２０】
様々な態様において、本開示は、液滴の体積を決定するための方法を提供する。液滴の画像スタックが取得され得る。画像スタックの個々の画像中の画素セット（複数可）が特定され得る。画素セット（複数可）は、少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定されてもよい。個々の液滴（複数可）は、その対応に基づいて画素セット（複数可）から特定され得る。特定された個々の液滴（複数可）の体積は、少なくとも１つの画素セットに基づいて決定されてもよい。少なくとも１つの液滴の一部は、単一の液滴、複数の液滴の部分、全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。
【００２１】
様々な態様において、本開示は、デジタルアッセイを行うためのシステムを提供する。本システムは、容器、撮像ソース、及びコンピューティングデバイスを含んでもよい。容器は、複数の多分散液滴を保持するように構成され得る。液滴の少なくともいくつかは、検出可能な薬剤で標識された試料を含み得る。撮像ソースは、容器中に保持された複数の多分散液滴の画像スタックを取得するように構成され得る。コンピューティングデバイスは、撮像ソースを操作するように構成され得る。コンピューティングデバイスは、プロセッサ及びメモリ（例えば、ＲＯＭ、ＲＡＭ、フラッシュメモリ、または同様のものなどの、非一時的有形コンピュータ可読記憶媒体）を含んでもよい。メモリは、プロセッサによって実行されるときに、（ｉ）撮像ソースに、容器中に保持された複数の多分散液滴の画像スタックを取得させ、（ｉｉ）プロセッサに、複数の多分散液滴の体積を取得した画像スタックに基づいて決定させ、（ｉｉｉ）プロセッサに、複数の多分散液滴中の検出可能な薬剤の有無を決定させ、（ｉｖ）プロセッサに、複数の液滴中の試料の濃度を、複数の多分散液滴中の検出可能な薬剤の有無、及び複数の多分散液滴の体積に基づいて決定させる、１組の命令を記憶し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本開示の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において特殊性と共に示される。本開示の特徴及び利点のより良い理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の発明を実施するための形態、及び添付の図面を参照して得られるであろう。
【００２３】
【図１】共焦点蛍光顕微鏡法を使用して取得される、例示的な多分散液滴エマルションシステムのグレースケール画像である。
【図２Ａ】複数の液滴中の試料の有無を分析するように構成された例示的な検出システムを概略的に示す。
【図２Ｂ】複数の液滴中の試料の有無を分析するための例示的な検出方法を概略的に示す。
【図２Ｃ】複数の液滴中の試料の有無を分析するための別の例示的な検出方法を概略的に示す。
【図２Ｄ】図２Ｂ及び２Ａの方法を実装するために図２Ａのシステムと共に使用され得る、ある体積における液滴を特定するための例示的なスキャン検出方法を概略的に示す。
【図２Ｅ】図２Ｂ及び２Ａの方法を実装するために図２Ａのシステムと共に使用され得る、ある体積における液滴を特定するための例示的なシンプルバウンダリ法を概略的に示す。
【図２Ｆ】図２Ｂ及び２Ａの方法を実装するために図２Ａのシステムと共に使用され得る、ある体積における液滴を特定するための例示的なリバースウォーターシェッド法を概略的に示す。
【図２Ｇ】図２Ｂ及び２Ａの方法を実装するために図２Ａのシステムと共に使用され得る、ある体積における液滴を特定するための例示的な円検出法を概略的に示す。
【図２Ｈ】図２Ｂ及び２Ａの方法を実装するために図２Ａのシステムと共に使用され得る、ある体積における液滴を特定するための例示的なリバースウォーターシェッド及び円検出複合法を概略的に示す。
【図３】本開示の一態様に従うデジタルアッセイを行うための例示的な方法を示す。この態様に従い、ヌクレオチド試料を含む多分散液滴はボルテックスによって産出され得（ステップ３Ａ）、ヌクレオチドはＰＣＲによって増幅され得（ステップ３Ｂ）、ヌクレオチド試料はマルチウェルプレート形式で分析され得る（ステップ３Ｃ）。
【図４】本開示の一態様に従うデジタルアッセイを行うための例示的な方法を示す。この態様に従い、エマルションＰＣＲは、試料の移動の必要が最低限で済む、最適化された高スループットシステムの一部として行われ得る。この態様に従い、油性または水性ＰＣＲ構成要素をマルチウェルプレート上に載せ、マルチウェルプレート全体をボルテックスして乳化をもたらし、ヌクレオチド構成要素をサーマルサイクラー中でＰＣＲ増幅にかけ、結果として得られた産出物を蛍光顕微鏡で撮像する。
【図５】図５Ａに示される目的領域（ＲＯＩ）の特定、ならびに液滴サイズ及び標的分子の存在についての情報がそこから決定される図５Ｂに示される最適化した円領域を持つ最終の処理画像を含む、図１の画像に適用されたリバースウォーターシェッド法の初期ステップの結果を示す。
【図６】図１の画像に適用された円検出法の初期ステップを行った後に産出された処理画像を示す。図６Ｂは、図６Ａ中の円を分類して液滴を特定し位置決定した後に取得された最終結果を示す。
【図７】図１の画像に適用されたリバースウォーターシェッド及び円検出複合法の初期ステップを行った後に産出された処理画像を示す。図７Ｂは、図７Ａ中の円を分類して液滴を特定し位置決定した後に取得された最終結果を示す。
【図８Ａ】赤色蛍光（図８Ａ）及び緑色蛍光（図８Ｂ）検出システムに対する走査型共焦点顕微鏡によって獲得された多分散液滴エマルションの蛍光画像を示す。図８Ａ及び８Ｂ中の円は、特定された液滴を示す。図８Ａ及び８Ｂの右側のグラフは、左側の画像に示される直線に沿った蛍光強度を示す。図８Ｃは、ＲＯＸ蛍光シグナルを使用した乳化の後に測定した４８９個の液滴の液滴径の分布を示す。
【図８Ｂ】赤色蛍光（図８Ａ）及び緑色蛍光（図８Ｂ）検出システムに対する走査型共焦点顕微鏡によって獲得された多分散液滴エマルションの蛍光画像を示す。図８Ａ及び８Ｂ中の円は、特定された液滴を示す。図８Ａ及び８Ｂの右側のグラフは、左側の画像に示される直線に沿った蛍光強度を示す。図８Ｃは、ＲＯＸ蛍光シグナルを使用した乳化の後に測定した４８９個の液滴の液滴径の分布を示す。
【図８Ｃ】赤色蛍光（図８Ａ）及び緑色蛍光（図８Ｂ）検出システムに対する走査型共焦点顕微鏡によって獲得された多分散液滴エマルションの蛍光画像を示す。図８Ａ及び８Ｂ中の円は、特定された液滴を示す。図８Ａ及び８Ｂの右側のグラフは、左側の画像に示される直線に沿った蛍光強度を示す。図８Ｃは、ＲＯＸ蛍光シグナルを使用した乳化の後に測定した４８９個の液滴の液滴径の分布を示す。
【図９】３つの異なる開始濃度のｄｓＤＮＡ（ヒストグラム９Ａ中約２×１０３ｄｓＤＮＡコピー／μＬ、ヒストグラム９Ｂ中約２×１０６ｄｓＤＮＡコピー／μＬ、及び図ヒストグラム９Ｃ中約２×１０７ｄｓＤＮＡコピー／μＬ）で載せた多分散液滴の集団についての緑色対赤色の蛍光強度の比率の度数分布を示す。
【図１０】デジタルアッセイを行うための方法を検証するためにコンピュータシミュレーションで使用される液滴径のコンピュータで生成した短縮対数正規分布を示す。分布は、図８Ｃ中で示される実験分布の理想近似である。
【図１１】試料サイズ（即ち、横軸に示される液滴の数）、液滴径測定における誤差、及び試料濃度の測定における誤差（縦軸に示される測定変動）の間の関係を示す。データは、４．４×１０−５分子／ｆＬに設定した試料濃度で行われるデジタルアッセイのコンピュータシミュレーションを使用して生成された。
【図１２】試料濃度と統計的検出力との間の関係を示し、これを用いて、所与の濃度の試料が、５０％高い濃度を有する第２の試料からデジタルアッセイを使用して区別され得る。
【図１３】液滴径の測定誤差なしで多分散液滴（灰色の円）または単分散液滴（黒色の三角形）に行われるときの、デジタルアッセイの試料サイズ（横軸に示される液滴の数）とダイナミックレンジ（縦軸に示される）との間の関係を示す。
【図１４】多分散液滴エマルションにおける自発的にまたは熱循環の結果として発生する液滴融合事象の度数を示す。ＲＯＸを含むが緑色蛍光プローブを含まない乳化液滴を、緑色蛍光プローブを含むがＲＯＸを含まない液滴と組み合わせた。画像１４Ａ（赤色蛍光）及び画像１４Ｂ（緑色蛍光）に示される組み合わせた混合物を、その後、室温で放置して対照（加熱なし）とするか、または温態始動及び１〜５０の熱循環のうちの１つに供した。液滴融合事象の度数は、ＲＯＸ及び緑色蛍光プローブの両方を含む液滴のパーセントに反映される（チャート１４Ｃ）。
【図１５】加熱に供しない（白色の棒）、１の熱循環（灰色の棒）、または５０の熱循環（黒色の棒）に供した多分散液滴径の度数を示す。
【図１６】多分散液滴エマルションを構成する流体の屈折率整合によって達成されたデータデータ取得性能の改善を示す。蛍光画像は、共焦点顕微鏡を用いて、２つの異なるエマルションシステム（それぞれ、図１６、Ａ１〜Ａ５、及び図１６、Ｂ１〜Ｂ５に示される）から次第に深くなる（左から右へ）焦平面にて獲得した。水性試料（図１６、Ａ１〜Ａ５）においては、２つの非混和性流体構成要素の屈折率は全く異なり、液滴境界は、図１６、Ａ５のように、より深い焦平面にて取得された画像中で次第に明確でなくなる。水とグリセロールとの混合試料（図１６、Ｂ１〜Ｂ５）においては、２つの非混和性流体構成要素の屈折率は同様であり、液滴境界は、図１６、Ｂ５のように、より深い焦平面にて取得された画像中であっても明確なままである。
【図１７】水／油／水二重エマルションの蛍光画像を示す。
【図１８】４桁（２×１０３、２×１０４、２×１０５、及び２×１０６ｄｓＤＮＡコピー／μＬの精製ｄｓＤＮＡ）に渡るｄｓＤＮＡの濃度で載せた試料についての、最良適合法によって決定される試料濃度値（縦軸に示される）と、２６０ｎｍでの吸収測定によって決定される試料濃度値（横軸に示される）との間の関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本開示は、多分散液滴を使用するデジタルアッセイを行うための方法及びシステムに関する。特に、本開示は、多分散液滴システムにおける試料の増幅及び分析のための方法に関する。本方法及びシステムを使用して、多分散液滴システムにおいて液滴を特定し、その液滴が目的試料を含むか否か、及び例えばデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）などのアッセイステップの性能を決定することができる。
【００２５】
本開示の方法及びシステムは、有利にも、多分散液滴の使用を通して、試料の高スループット増幅及び分析を可能にする。本開示は、可変サイズの体積を生成することによって、デジタルアッセイの性能における大幅に改善されたダイナミックレンジを呈する。所与の試料濃度について、体積のサイズは、１つ以上の目的分子（例えば、鋳型分子）によって占有される確率を規定し得る。増幅関連技法の例においては、体積サイズの変動を使用して、この占有確率、故に、増幅を示すウェルまたは試料体積（例えば、液滴）の数を改変することができる。とりわけ、本開示は、ダイナミックレンジを増加させるように一定サイズで体積の数を単純に増加させる既存の技法を改善する。既存の方法とは異なり、可変体積試料の使用は、例えば、いくつかのデジタル化された体積が適切に形成されないかまたは他の欠陥を有するチップ上に欠陥の可能性を増加させる、ダイナミックレンジを拡大するために必要な体積を受け入れる大きなエリアを不要にする。加えて、体積の数を増加させることで、デジタル化された体積全てを分析するのに必要とされる時間も増加する。
【００２６】
本開示は、多分散液滴試料の生成、操作、分析、及びモデリングにおいて使用され得るデバイス、システム、及び装置を提供する。関係する方法も提供される。本開示はまた、デジタル定量プラットフォームの分析のための方法を含む。本開示は、多分散プラットフォームを使用するデジタルアッセイを可能にするように設計されるが、単分散エマルションプラットフォームを使用するデジタルアッセイにも適用され得る。本開示はまた、エマルション分配モデリング、データ取得、及びエマルション生成のための方法を含む。
【００２７】
本開示のいくつかの態様は、化学物質、生化学物質、遺伝物質（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、遺伝子物質の発現産物、タンパク質、代謝産物、ペプチド、ポリペプチド、結晶化分子、あるいは希少細胞、細胞分画、オルガネラ、エキソソーム、ミトコンドリア、薬物、末梢血若しくはリンパ系中を循環する生物学的粒子、または粒子を含む、生体細胞を含むがこれらに限定されない種の操作及び分析のための方法及び装置を含む。
【００２８】
いくつかの態様において、本開示の装置、デバイス、方法、及びシステムを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、逆転写ループ媒介増幅（ＲＴ−ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、逆転写ヘリカーゼ依存性増幅（ＲＴ−ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、逆転写リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＴ−ＲＰＡ）、触媒ヘアピン集合反応（ＣＨＡ）、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）、エントロピー駆動触媒、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、及び／または逆転写鎖置換増幅（ＲＴ−ＳＤＡ）などと共に、ポリヌクレオチド試料を増幅することができる。ある特定の態様において、本開示の装置、デバイス、方法、及びシステムは、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自立配列複製（３ＳＲ）、及びシングルプライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）に使用することができる。使用できる他の技法としては、例えば、ＲＮＡ技術のシグナル媒介増幅（ＳＭＡＲＴ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、超分岐ローリングサークル増幅（ＨＲＣＡ）、指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ）、スマート増幅（ＳｍａｒｔＡｍｐ）、核酸の等温及びキメラプライマー始動性増幅（ＩＣＡＮＳ）、及び多置換増幅（ＭＤＡ）が挙げられる。他の態様は、タンパク質及び小分子の結晶化、細胞（例えば、希少細胞または単一細胞）の操作及び／若しくは分析、他の生物学的粒子（例えば、単離されたミトコンドリア、細菌、ウイルス粒子）の操作及び／若しくは分析、または他の生物学的若しくは化学的構成要素を含み得る。
【００２９】
デジタルアッセイのための多分散液滴エマルション
本開示は、ダイナミックレンジの増加を伴う、デジタルアッセイを行うための方法、システム、及びデバイスを提供し、ここでは、多数の異なるサイズの体積が生成される。既存のプラットフォームとは異なり、本開示の方法及びシステムは、離散的ではなく連続的であるサイズ（例えば、体積）の分布の使用を含み得る。いくつかの態様において、可変サイズの液滴は、ランダムに、またはマイクロ流体の制御された適用によって、様々な方法で創出され得る。例えば、Ｔ字路またはフローフォーカスデバイスを使用することによる一定体積の液滴のマイクロ流体生成が、当該技術分野で周知である。これらのシステムでは、液滴のサイズは、剪断速度及びチャネル寸法によって制御され得る。所与のＴ字路形状に対しての場合、剪断速度は連続的に変化し、異なる体積の液滴が生成され得る。これらの方法は、例えば、水相及び油性分散媒の相対的流速を調整する、コンピュータ制御された注射器ポンプまたは調節された空気圧によって実現され得る。
【００３０】
本開示の様々な態様において、多分散液滴のエマルションは、２つ以上の非混和性流体間で産出され得る。本明細書で使用される場合、「非混和性流体」という用語は、実験条件の所与のセットの下で、互いに物理的に接触するときであっても相当程度の混合またはブレンドを受けて均一混合物を形成しない、２つ以上の流体を意味する。
【００３１】
本明細書で更に記載されるように、デジタル測定に使用される体積は、様々な方法によって生成及び分析され得る。本開示は、体積を保持して、その体積が更に処理及び／または分析され得るようにするために使用され得る試料ホルダを含む。本開示の試料ホルダは、試験管、微小遠心管、標準マルチウェルプレート中のウェルのアレイ、マイクロアレイ上またはマイクロ流体チップ中のウェルのアレイ、液滴を生成するように構成されたマイクロ流体チップ、ならびに試料の別々の体積（例えば、ウェルまたは液滴）を保持することができる他の市販のまたは一般に既知のデバイスを含み得る。
【００３２】
いくつかの態様においては、様々なサイズの液滴を、試料ホルダ（例えば、試験管）中での乳化によってランダムに生成することができる。液滴のランダムネスは、例えば、液滴のサイズを制御するための努力を必要としないため、実験を簡素化し得る。乳化中、異なる体積の液滴は、任意の好適な界面活性剤の使用により安定化させることができる。乳化アプローチは次のいくつかの理由から特に有用である。（１）本方法は、あらゆる生化学研究所で見られる基本的な設備と互換性がある、（２）液滴生成は単純であり、フロー制御用の複雑なチップ設計または精巧な機器を必要としない、（３）液滴は個々のウェル中に制限されず、このことは、多数の液滴を収容するのに求められるスペースを最小化する、（４）アッセイは、液滴生成及び増幅中の液滴貯蔵のために同じ容器を使用することができるため、単純である。有利にも、この方法を使用することで、液滴生成と増幅反応との間の試料移動が不要となる。
【００３３】
本開示のいくつかの態様は、非混和性流体中で液滴を産出することを含む。当該技術分野で周知のように、多様な非混和性流体を組み合わせて、異なる体積の液滴を産出することができる。本明細書で更に記載されるように、流体は、乳化などの様々な方法によって組み合わせることができる。例えば、水溶液（例えば、水）を非水性流体（例えば、油）と組み合わせて、試料ホルダ中またはマイクロ流体チップ上で液滴を産出し得る。本開示における使用に好適な水溶液は水性溶液を含み得、この水性溶液は、緩衝液、塩、及びＰＣＲなどの検出アッセイにおける使用が概して知られている他の構成要素を更に含み得る。故に、本明細書に記載の水溶液は、例えば、プライマー、ヌクレオチド、及びプローブを含み得る。好適な非水性流体としては、鉱油（例えば、軽油）などの有機相流体、シリコーン油、フッ化油若しくは流体（例えば、フッ化アルコールまたはフロリナート）、他の市販の物質（例えば、Ｔｅｇｏｓｏｆｔ）、またはこれらの組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３４】
エマルションは、様々な方法で生成することができる。本開示のある特定の態様に従うと、エマルションは、典型的には物理的撹拌である撹拌によって生成することができる。エマルション生成のための物理的撹拌のいくつかの方法としては、他の方法のなかでも、振とう、ボルテックス（個々の試験管若しくは全ウェルプレートまたは他のデバイスをボルテックスすることを含み得る）、超音波処理、磁石による混合、急速ピペッティング若しくは何らかの他の押出、またはマイクロ流体デバイス内でのフローフォーカスによるものが挙げられるが、これらに限定されない。本開示に従って使用される撹拌は、エマルションをもたらすのに十分である任意の好適な撹拌手段であり得る。例えば、ボルテックス、超音波処理、ピペッティング、押出、または他の撹拌方法に使用される速度、程度、及び時間は、本開示のエマルションシステムをもたらすのに十分であるように容易に調整することができる。エマルションの特定の特徴は、本システムにおける化学的構成要素、及び本システムが供される撹拌条件を調整することによって、チューニングし得る。
【００３５】
様々な流体（単数または複数）を使用して、本開示に従うエマルションを調製することができる。いくつかの態様において、本システムは、適切な条件下で混合した場合に分散液滴相と連続担体相とに分離する２つ以上の非混和性流体を含む。例えば、分散液滴相となる第１の流体は、試料を含み得る。いくつかの態様において、この第１の流体は水溶液である。いくつかの態様において、この第１の流体は液体のままであり、他の態様においては、ゲルまたは固体であり得るか、またはそうなり得る。いくつかの態様において、この第１の流体は、異なるシェルを有し得るか、またはそれを形成し得る。
【００３６】
液滴エマルションの１つの相として使用することができる可能性のある水性流体としては、とりわけ、様々なＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ溶液、ＬＡＭＰまたはＮＡＳＢＡ用の溶液などの等温増幅溶液、血液試料、血漿試料、血清試料、細胞溶解物若しくは分泌物または細菌溶解物若しくは分泌物を含む溶液、ならびにタンパク質、細菌、ウイルス粒子及び／または細胞（真核細胞、原核細胞、またはこれらの粒子）を含む他の生体試料が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の態様において、水性流体はまた、界面活性剤または他の薬剤を含むことで、それらが接触することになり得る非混和性流体及び／または他の物質若しくは界面との所望の相互作用及び／または互換性を促進することができる。ある特定の態様において、デバイスに載せられた水溶液は、悪性表現型を発現している細胞、胎児細胞、循環内皮細胞、腫瘍細胞、ウイルスに感染している細胞、目的遺伝子でトランスフェクトした細胞、あるいは自己免疫性若しくは自己反応性障害に罹患している対象の末梢血中に存在するＴ細胞若しくはＢ細胞、または免疫細胞の他のサブタイプ、あるいは末梢血中、またはリンパ系若しくは髄液若しくは他の体液中を循環する希少細胞若しくは生体粒子（例えば、エキソソーム、ミトコンドリア）を有し得る。細胞または生体粒子は、状況によっては試料中で希少であり得、離散化を使用して、例えば、細胞を空間的に孤立させることによって、希少細胞または生体粒子の検出を可能にし得る。
【００３７】
いくつかの態様において、連続相となり得る第２の流体は、第１の流体と非混和性である流体となる。第２の流体は油と称されるが、油である必要はない。第２の流体として働き得る可能性のある流体としては、フッ化炭素系油、ケイ素化合物系油、鉱油及びヘキサデカンなどの炭化水素系油、植物性油、イオン液体、第１の水相と非混和性であるかまたは第１の相と物理的バリアを形成する水層、超臨界流体、空気または他の気体相が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
本開示のある特定の態様において、多分散液滴は、流体界面修飾を含み得る。流体界面修飾要素としては、界面活性剤、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子などであるがこれらに限定されない、界面安定化若しくは修飾分子、または他の構成要素を含む。いくつかの態様において、１つ以上の流体界面修飾要素は、分散液滴相流体に含まれることになる流体中に存在し得る。他の態様において、１つ以上の流体界面修飾要素は、連続担体相流体に含まれることになる流体中に存在し得る。また他の態様において、１つ以上の流体界面修飾要素は、分散液滴相流体と連続担体相流体との両方の中に存在し得る。エマルションの一方の相の中に含まれることになる流体中に存在する流体界面修飾要素は、エマルションの別の相に含まれることになる流体中に存在する流体界面修飾要素と同じであり得るか、または異なり得る。
【００３９】
本開示のいくつかの態様においては、流体界面修飾要素を使用して隣接するエマルション滴の癒着を防止することで、長期のエマルション安定性がもたらされ得る。いくつかの態様において、流体界面修飾要素は、エマルション安定性にも寄与する場合もそうでない場合もある液滴内での生体適合性表面の提供など、何らかの他の、または更なる重要な役割を有し得る。いくつかの態様において、この構成要素は、流体間または液滴間の構成要素の輸送の制御に関与し得る。流体界面修飾要素のいくつかの非限定的な例としては、とりわけ、ＡＢＩＬ  ＷＥ  ０９、ＡＢＩＬ  ＥＭ９０、ＴＥＧＯＳＯＦＴ  ＤＥＣ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ソルビタン（例えば、Ｓｐａｎ  ８０）、ポリソルベート（例えば、ＴＷＥＥＮ  ２０及びＴＷＥＥＮ  ８０などのＰＥＧ化ソルビタン）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロオクタノール（ＰＦＯ）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００、モノオレイン、オレイン酸、リン脂質、及びＰｉｃｏ−Ｓｕｒｆ、ならびに様々なフッ化界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
いくつかの態様において、エマルションシステムは、目的試料を含み、連続油相によって取り囲まれる、分散した水相から成ることになる。他の態様はこのシステムの変形または改変であり得るか、あるいは、これらは全く異なる組成または構築のエマルションであり得る。代替的なエマルションシステムは、水中油中水（水／油／水、またはｗ／ｏ／ｗ）エマルション、または油中水中油（油／水／油、またはｏ／ｗ／ｏ）エマルションなどの、多重エマルションを含み得る。これらの多重エマルションシステムは、こうして、内部相、中間相、及び外部相を有し得る。いくつかの態様において、内部相及び外部相は、同じ組成を有し得る。他の態様において、内部相及び外部相は、同様（例えば、共に水性、または共に同じ油性）であり得るが、異なる従属構成要素を持ち得る。他の態様において、３つ全てのエマルション相は、異なる組成、場合によっては非常に個なる組成を有し得る。
【００４１】
ある特定の態様において、エマルションシステムは、共に水性または共に非水性である、２つの非混和性流体を含み得る。更なる態様において、両エマルション流体は油系であり得、ここでは、油は互いに非混和性である。例えば、油のうちの一方は炭化水素系油であり得、もう一方はフッ化炭素系油であり得る。他のエマルションシステムにおいて、両流体は、主に水性であるが、それでも互いに非混和性であり得る。いくつかの態様において、これは、水溶液が互いから相分離する構成要素を含むときに発生する。使用し得る溶質のいくつかの例としては、デキストラン、フィコール、メチルセルロース、異なる長さのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、Ｒｅｐｐａｌ  ＰＥＳ、Ｋ３ＰＯ４、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、Ｎａ２ＨＰＯ４、及びＫ３ＰＯ４を含むシステムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
水溶液及び非水性流体に加えて、例えば、液滴の安定性を改善するため、及び／または液滴形成を促進するために、界面活性剤を含めることもできる。好適な界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、シリコーン系界面活性剤、フッ化界面活性剤、またはこれらの組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤としては、例えば、ソルビタンモノステアレート（Ｓｐａｎ  ６０）、オクチルフェノキシエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、及びソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ  ８０）を挙げることができる。シリコーン系界面活性剤としては、例えば、ＡＢＩＬ  ＷＥ  ０９界面活性剤を挙げることができる。他の種類の界面活性剤は当該技術分野で概して周知であり、同様に使用することができる。いくつかの態様において、界面活性剤は、約０．０１％、０．１％、０．２５％、０．５％、１％、５％、または１０重量％など、様々な濃度または濃度範囲で存在し得る。
【００４３】
ある特定の態様において、本開示の多分散液滴は、連続体積分布を有する。本明細書で提供される場合、「連続体積分布」という用語は、体積分布に渡って、事前に定義された別々の段階によってではなく連続的に変化する体積の配分を説明するように意図される。例えば、チップに基づくプラットフォームは、チップの一部として製造された事前に定義された別々の段階によって定義される体積分布を網羅する、ウェルまたは液滴体積を含み得る。つまり、チップは、１００ｎＬ、１０ｎＬ、及び１ｎＬで存在する体積を有し、他の体積がこれらの別々の段階の間に存在しないように作製され得る。対照的に、連続体積分布は事前に定義されない（即ち、体積分布は、液滴体積の産出または形成の前に定義されない）。連続体積分布は、本明細書で更に記載されるように、例えば、乳化を介して産出され得る。エマルション中では、体積（例えば、液滴体積）は、別々の体積を有するが、配分における液滴体積は、液滴の産出の前に規定されず（即ち、製造技法によって事前に規定されない）、体積は、連続体積分布に従ってランダムに配分される。本開示に従い、乳化システムは、例えば、試料のボルテックスまたは振とうなどの物理的撹拌によって産出することができる。液滴体積についての上方境界及び下方境界は、エマルションに対して付与される力によって（例えば、ボルテックスの速度または振とうの強度によって）改変され得る。しかしながら、かかる技法によって生成された液滴体積は、産出された体積分布に従って連続的に異なる。
【００４４】
本開示の様々な態様に従い、多分散液滴は、２つ以上の非混和性流体の乳化を通して形成される。これらの態様に従い、多分散液滴のうちの少なくともいくつかは、試料を含み、この試料は、続いて、本明細書に記載の方法によって増幅及び分析される。本明細書で使用される場合、「多分散」という用語は、連続体積分布を有する液滴システム中の複数の液滴を指す。所与の多分散液滴システムについての、液滴の最小径、最大径、平均径、及び中央径、ならびにそれらの対応する標準偏差は、エマルションの物理的特性（例えば、化学的構成要素及び温度）、ならびに多分散液滴が形成された様式（例えば、多分散液滴システムをもたらした物理的撹拌の種類及び期間）に依存する。液滴の配分及びそれらの対応する確率は、所与のシステムについてのこれらのパラメータを調整することによってチューニングし得る。
【００４５】
いくつかの態様において、連続体積分布はまた、任意のセット（または複数）の液滴体積について、その分布関数がｆ（ｘ）で示され得、ここで、ｆ（ｘ）ｄｘは、セット中の所与の液滴がｘ〜ｘ＋ｄｘの体積を有することになる確率であるように、特性化され得る。（ｄｘは無限小の数である。）ある特定の態様において、連続分布は、液滴セット中の液滴の体積が、（１）事前に指定されておらず、かつ（２）一部の範囲ｘ＿ｌｏｗｅｒ＜ｘ＜ｘ＿ｕｐｐｅｒについて、ｆ（ｘ）が常にゼロ超である（ｘ＿ｌｏｗｅｒは、ｘ＿ｕｐｐｅｒと等しくなり得ず、ｆ（ｘ）についてそれ以上のことを知る必要はない）ものである。故に、本開示は、いくつかの態様においては、連続分布から導いた液滴セットを使用すること、セット中の各液滴の体積を測定すること、及び分析において測定された液滴体積を使用することを含み得る。
【００４６】
図８Ｃは、本明細書に記載の方法及びシステムに従って生成された、実験的に測定した液滴径の分布及びそれらの対応する確率を示す。実験的に決定した液滴径及び確率の配分は、図１０に示されるように、論理的に決定された値と一致し、両図面は、液滴についての連続体積分布を示す。
【００４７】
本明細書に記載のように、体積は、様々な異なる方法を使用して分析され得る様々な体積分布を有するように産出され得る。いくつかの態様において、試料は、分析され得る目的分子（単数または複数）を含み得る。試料の別々の体積は、デジタル測定による分析に対して生成され得る。例えば、本明細書の方法は、ある体積分布を有する複数の液滴を産出することを含み得る。いくつかの態様において、試料の複数の液滴は、本明細書で更に記載されるように、非混和性流体を組み合わせることを含むエマルション中で産出され得る。一例では、試料は、目的分子（例えば、核酸分子）を含む水溶液を含み得る。試料は、油と混合して、油中に懸濁させた試料の液滴を形成し得る。使用する方法に応じて、エマルション中の複数の液滴の体積は、連続的体積分布に沿ってランダムに分布し得る。更に、体積の範囲は、エマルションを形成するために使用される方法によって制御することができる。例えば、ボルテックス、振とう、超音波処理、及び／または押出の強度を制御して、あるいは界面活性剤及び／または油の組成を変化させることによって、所望の体積分布を産出し得る。
【００４８】
当業者には明らかとなるように、体積分布の範囲及びその内の体積は、所与の分析についての様々な因子に依存することになる。いくつかの態様において、複数の液滴の体積分布は、約１００ナノリットル（ｎＬ）〜約１フェムトリットル（ｆＬ）、約１０ｎＬ〜約１０ｆＬ、約１ｎＬ〜約１００ｆＬ、約１００ｎＬ〜約１ピコリットル（ｐＬ）、約１０ｎＬ〜約１０ｐＬ、約１ｎＬ〜約１ｐＬ、約５００ｐＬ〜約５０ｆＬ、約１００ｐＬ〜約１００ｆＬの体積範囲を含み得る。液滴を産出するために選択される因子に応じて、例えば、試料及び油の界面活性剤との混合の強度を変化させることによって、体積分布の上限及び下限を規定するのが慣例である。体積分布中の体積の範囲が存在し得る。例えば、分布中の体積は、２倍超で、１０倍超で、１００倍超で、１０００倍超で、１００００倍超で、１０００００倍超で、１００００００倍超で、約２倍超で、約１０倍超で、約１００倍超で、約１０００倍超で、約１００００倍超で、約１０００００倍超で、または１００００００倍超で、変動し得る。２倍で変動するということは、体積分布の下限は例えば１０ｎＬであり、上限は２０ｎＬであり得る。同様に、１０倍で変動するということは、体積分布の下限は例えば１０ｎＬであり、上限は１００ｎＬであり得る。
【００４９】
本開示のいくつかの態様において、多分散液滴は、液滴中央径の１０００％超、５００％超、１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を持つ液滴径の分布を有する。
【００５０】
本開示のいくつかの態様において、多分散液滴は、液滴平均径の１０００％超、５００％超、１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を持つ液滴径の分布を有する。
【００５１】
本開示のいくつかの態様において、体積は、バルブ、ウェル、または液滴を使用して創出され得る。ここでは、異なる体積（直径）の液滴は、幅広い方法を使用して生成され得る。１つの方法においては、規定体積の液滴は、マイクロ流体を使用して（例えば、当該技術分野で周知のＴチャネルまたはフローフォーカスを用いて）生成され、剪断速度またはチャネル寸法を変化させることによって、異なるサイズの液滴が形成され得る。別の方法では、異なる体積の液滴は、異なる界面活性剤を用いた乳化によって生成され、ここでは、異なる体積の液滴は、安定化され、異なる界面活性剤の使用によって制御される。いずれの方法でも、分析物の増幅（例えば、デジタルＰＣＲ）は、異なる体積（サイズ）の液滴全てにおいて同時に実行することができる。ある特定の態様において、液滴は、その後、１列形式でフローサイトメーターまたは他の同様のデバイスを通して流れ得、ここで、液滴のサイズが決定され得、液滴からの蛍光が調べられ得る。フローサイトメトリーまたは他の流入法を使用する場合、各液滴における増幅産物の存在は蛍光に基づいて決定され、各液滴のサイズ（体積）は、液滴からの散乱シグナルに基づいて決定される。あるいは、サイズは、画像に基づくフローサイトメトリーと同様の様式で液滴が装置を通る際に画像を撮影することによって、決定され得る。この方法では、各液滴のサイズと所与のサイズの各液滴における増幅産物の有無との両方に注目することによって、十分な数の異なるサイズの液滴を調べた後に、試料中に存在する分析物の元の濃度を逆算することが可能となる。これらの液滴はサイズが異なるため、所与のダイナミックレンジについて、分析は、既に考察した理由から、液滴が全て同様のサイズである場合よりもずっと迅速である。
【００５２】
ある特定の態様において、本方法及びシステムを使用して、デジタル化した体積における試料を分析することができる。「デジタル化した体積」という用語は、初期試料を取得し、それをアッセイに備えて物理的に異なったより小さい体積に分離した後で産出される体積を指す。
【００５３】
本開示のある特定の態様に従うと、液滴は、チップ中で形成されアッセイされ得る。更なる態様に従うと、増幅及びデジタル測定は、デジタル化チップ中で起こり得る。
【００５４】
一態様において、本開示は、デジタル測定及び読み出しと一体化する濃度勾配を創出するための方法を提供する。例えば、マイクロ流体勾配生成を試料デジタル化チップと一体化することができる。ダイナミックレンジを増加させるためには対数または指数関数濃度勾配が好ましいが、検出力関数、指数関数、誤差関数、ガウス関数、及び立方根関数を含むある数の方法が、様々な種類及び形状の濃度勾配をチップ状に形成するために現在利用可能である。
【００５５】
本開示のある特定の態様に従うと、２つの流入貯留部またはチャネルしかないマイクロ流体デバイスにおける濃度勾配が使用され得るが、それ以上も本開示の使用に好適である。この態様に従うと、１つの流入口を試料に使用し、もう１つを緩衝液（またはデジタルＰＣＲの場合はＰＣＲ試薬）に使用する。２つの溶液がネットワークを通して流れるとき、試料溶液は、流出チャネルの各々にて異なる濃度の試料が存在するように、事前に規定された様式で、緩衝（水またはＰＣＲ試薬）溶液によって希釈される。６桁に渡る線形、多項式、及び対数勾配は全て、この設計の変形を使用して生成されている。
【００５６】
別の態様においては、濃度における６桁に渡る対数または指数関数勾配が使用される。試料及びＰＣＲ溶液が２つの流入貯留部にピペッティングされ、その後、これらはウェルのアレイを通過することになる。ウェルが濃度勾配で満たされた後、軽油または何らかの他の非混和性流体がウェル上に流されて、ウェル内で個々のデジタル化された体積を創出する。この例におけるウェルは同じ体積である。本開示の別の態様においては、異なる体積のウェルを使用することができる。
【００５７】
別の態様においては、試料及びＰＣＲ溶液が２つの流入貯留部にピペッティングされ、その後、これらは親水性パッチ及び疎水性パッチのアレイを通過することになる。試料が親水性パッチの上を流れると、それらは異なるサイズの試料体積の湿潤した液滴の形成を引き起こす。あるいは、試料はデジタル化され得る。
【００５８】
本開示の別の態様において、勾配は、バルブ、ウェル、または液滴を使用して創出されたデジタル化された体積と共に使用される。液滴を用いる態様においては、液滴は、共に当該技術分野で周知であるＴチャネル形状またはフローフォーカス形状のいずれかである連続流様式で形成され得る。
【００５９】
希釈された試料をデジタル化するために、デジタル化スキームを使用することができる。ここでは、異なる濃度の標的分子を含む試料溶液は、地形的にパターン化された表面上を流れて、後続のデジタル測定及び読み出しのためにデジタル化された別々の体積を形成する。あるいは、パターン化された表面を使用して試料をデジタル化することも可能である。
【００６０】
別の態様において、試料は、マイクロ流体チャネル及び非混和性流体相を使用してデジタル化され得る。この態様においては、試料相、その後非混和性相がチャネルに導入され、これが、側空洞の幾何寸法によって規定される別々の試料体積を形成する（Ｄ．Ｅ．Ｃｏｈｅｎ，Ｔ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｍ．Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｔ．Ｃｈｉｕ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８２，５７０７−５７１７）。
【００６１】
１つの例示的な態様に従い、本開示は、異なるサイズのデジタル化された体積のアレイを提供し、パターン化された表面を使用して異なるサイズの体積のアレイを創出する。この態様に従うと、７セットのアレイが創出され、各アレイは、９００個のデジタル化された体積（３０×３０）を含む。アレイは、疎水性表面の背景に親水性円形パッチを創出することによって形成される。その結果、表面が水溶液及び油に露出するとき、親水性パッチは、油によって取り囲まれた水滴によって覆われることになる。この液滴は半球形であり得るが、使用する正確な表面及び使用する油及び水溶液に応じて、形状は変化し得る（よりパンケーキ形かより円形か）。一態様においては、重油が使用され、滴は、油が滴を押すため、よりパンケーキ形である。
【００６２】
９００個の親水性パッチの各セットを規定する円は、直径１μｍ〜直径５μｍ、１０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、５００μｍ、及び最終的に１ｍｍの範囲の異なるサイズを有する。滴の体積は滴の直径のおよそ３乗として量るため、パッチの直径を１０倍増加させることによって、体積は約１，０００倍増加する。その結果、異なるサイズのデジタル化された体積を使用することは、単純に同じサイズのより大きいデジタル化された体積を使用するよりも、スペース及び読み出しの点で効率的である。一態様において、アレイの各セットについての９００個のデジタル化された体積は、この数が統計的にロバスト性のデジタル読み出しに帰着するために好適であることに起因して、使用される。しかしながら、特定の用途及び必要とされる読み出しのロバスト性に応じて、アレイの各セット内のより大きいデジタル化された体積またはより小さいデジタル化された体積が設計され得る。この態様に従い、デジタル化された体積の大型のアレイは、異なるサイズの表面パターン化親水性パッチの容易性に起因して、異なるサイズで産出され得る。この態様は、広ダイナミックレンジが所望される場合が多いデジタルＰＣＲなどの用途に有用であり得、これは、パターン化された表面を使用して創出される滴においてＰＣＲを行うために極めて有益である。
【００６３】
ある特定の態様において、分散した液滴システムは、分散した液滴システムの少なくとも一部について液体から固相への変化を受け得る。いくつかの態様において、分散液滴システムの液体は、ゲル化プロセスを通して固体に変換され得る。例えば、アガロースの溶液は、温度が下降してその融解温度を下回るときに固化し得る。更なる態様において、液体から固体への変換は、溶液構成要素の光重合、重合を誘導する架橋剤の使用によって、可溶性前駆体からのアルギン酸カルシウムの形成を通して発生し得る。いくつかの態様においては、全液滴が固化し、一方で他の態様においては、界面の層のみが固化する。
【００６４】
いくつかの態様において、本開示のエマルションシステムは、液滴と周囲媒体との間の分散の程度が目的用途に応じて強化または最小化され得るように、構成され得る。ある特定の態様において、多分散液滴エマルションシステムは、液滴と周囲媒体との間の試薬の分散を強化するように設計され得る。ある特定の態様において、多分散液滴エマルションシステムは、液滴と周囲相との間の試薬の分散を低減または排除するように設計され得る。例えば、アガロース融解温度を上回る温度にて形成されたアガロース液滴は、室温に冷却されるときに固化し、溶液中のアガロースの濃度に応じて、滴境界内の分散または滴境界に渡る分散が発生し得る。ある特定の態様において、液滴及び周囲媒体の組成は、液滴のカプセル化の後に分散を最大化するようにチューニングされ得る。液滴の特性も、不要な分散、例えば、標的分子の分散を防止するように調整され得る。ある特定の態様において、標的分子は、架橋され得るか、または定位置で固定され得る。例えば、プライマーなどの主要な分子は、マトリックスに固定され得る。標的分子を定位置に固定することで、非油系プラットフォームにおけるエマルションの使用が可能となり得、これは、とりわけ下流処理または試料回収をより良好に促進するという利点を有し得る。
【００６５】
いくつかの態様においては、物理的バリアを分散液滴システムにおける相間に創出することができる。ある特定の態様において、液滴を取り囲む物理的バリアは、重合された固体シェル、脂質二重層、沈殿界面、または界面でのタンパク質、ナノ粒子、ベシクル、沈殿剤、極微小粒子、若しくは他の物質などの物質の凝集であり得る。
【００６６】
エマルションの操作、処理、または分析の利益となり得るエマルションシステムに対する他の改変を行って、ある特定の特性を変更することができる。分析の方法に応じて、エマルションシステムの異なる物理特性及び光学特性は非常に重要な役割を果たし得る。これらとしては、エマルション液滴のサイズ分布、流体の相対密度、流体の粘度、流体の屈折率、ならびに連続流体内の液滴の総合及び局所密度が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
屈折率整合は、光学分析に対して撮像深度を改善する（例えば、液滴境界の歪みを低減する）ために有益であり得る。水相の屈折率は、典型的には、水の屈折率に近く、これは即ち、およそｎ＝１．３３である。水相の屈折率は、典型的には、炭化水素系油のものよりも低いが、フッ化油のものよりわずかに高い。本開示の一態様において、屈折率整合は、とりわけ、グリセロール、スクロース、Ｃａｒｇｉｌｌ光学液、エチレングリコール、プロピレングリコール、ＣＳ２、サリチル酸メチル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などであるがこれらに限定されない、高屈折率（即ち、ｎ＞１．４５）の構成要素を、エマルションの水相に添加して、水相の屈折率を油の屈折率により近く整合させることによって、達成され得る。他の態様において、屈折率整合は、典型的には、水相よりも高い屈折率の構成要素と、水相よりも低い屈折率の構成要素との混合物から成る非水相の屈折率を調整することによって達成され得る。任意の好適な添加剤を使用して、屈折率が高い（即ち、ｎ＝１．３６〜１．４）、とりわけ、フッ化炭素系油（例えば、ペルフルオロデカリン；例えば、ＦＣ−４０、ＦＣ−７０などのフロリナート油；Ｋｒｙｔｏｘ油などであるがこれらに限定されない、低屈折率流体；とりわけ、オクタフルオロトルエン、ヘキサフルオロベンゼン、ペタフルオロベンゼン、１，２，４，５−テトラフルオロベンゼンデカフルオロ−ｐ−キシロールなどであるがこれらに限定されない、フッ化炭素溶媒の屈折率を上昇させることができる。以下の表１は、非水相の屈折率を調整することによって、それが水相の屈折率（即ち、水、ｎ＝１．３３）とより近く整合するようにし得る添加剤の非包含的リストを提供する。
【表１】
2020060579.tif 000003
【００６８】
液滴の適切な離間は、１つの液滴からの情報が別の液滴によって干渉されることなく分析され得る液滴の数を最大化するために重要である。いくつかの態様において、液滴間のスペースは、油システムの密度を改変することによって増加させることができる。例えば、部分的にフッ素化した炭化水素化合物を使用して、フッ化炭素油の密度を低下させることができる。別の態様では、水溶液の密度は、ＣｓＣｌまたは他の好適な密度増加構成要素を添加することによって改変し得る。例えば、ＣｓＣｌを５６重量％で含む溶液は１．７ｇ／ｍＬに近い密度を有し、６５％で含む溶液は約１．９ｇ／ｍＬの密度を有し、これらは多くのフッ化炭素の密度に厳密に整合する。また、油の粘度を改変して、液滴がよりゆっくりと移動するようにする、かつ／または液滴間の湿潤層を増加させることができる。別の態様において、第２の流体は、より固形の性質へと相転移を受けて、不連続相がある特定の位置で捕捉されるようにし得る。別の態様において、二重エマルション（例えば、ｗ／ｏ／ｗ）を使用して、液滴を密集してまとめながらも、直接的接触／重複を防ぐことができる。
【００６９】
いくつかの態様において、液滴径の分布は、液滴中央径の１０００％超、５００％超、１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を有する。いくつかの態様において、液滴径の分布は、液滴中央径の約１０００％超、約５００％超、約１００％超、約５０％超、約３０％超、約２０％超、約１５％超、約１０％超、約９％超、約８％超、約７％超、約６％超、または約５％超の標準偏差を有する。
【００７０】
他の態様において、液滴径の分布は、液滴平均径の１０００％超、５００％超、１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を有する。いくつかの態様において、液滴径の分布は、液滴平均径の約１０００％超、約５００％超、約１００％超、約５０％超、約３０％超、約２０％超、約１５％超、約１０％超、約９％超、約８％超、約７％超、約６％超、または約５％超の標準偏差を有する。
【００７１】
更なる態様において、多分散液滴における体積は、２倍超で、１０倍超で、１００倍超で、１０００倍超で、１００００倍超で、１０００００倍超で、１００００００倍超で、２倍超で、１０倍超で、１００倍超で、変化する。また更なる態様において、多分散液滴における体積は、約２倍超で、約１０倍超で、または約１００倍超で、約１０００倍超で、約１００００倍超で、約１０００００倍超で、または約１００００００倍超で、変化する。
【００７２】
いくつかの態様において、多分散液滴は、１００ナノリットル（ｎＬ）〜１フェムトリットル（ｆＬ）、１０ｎＬ〜１０ｆＬ、１ｎＬ〜１００ｆＬ、１００ｎＬ〜１ｐＬ、１０ｎＬ〜１０ｐＬ、または１ｎＬ〜１ｐＬ、５００ｐＬ〜５０ｆＬ、１００ｐＬ〜１００ｆＬの体積分布を有する。更なる態様において、多分散液滴は、約１００ナノリットル（ｎＬ）〜約１フェムトリットル（ｆＬ）、約１０ｎＬ〜約１０ｆＬ、約１ｎＬ〜約１００ｆＬ、約１００ｎＬ〜約１ｐＬ、約１０ｎＬ〜約１０ｐＬ、または約１ｎＬ〜約１ｐＬ、約５００ｐＬ〜約５０ｆＬ、約１００ｐＬ〜約１００ｆＬの体積分布を有する。
【００７３】
ある特定の態様において、多分散液滴の平均体積は、試料の増幅中に、５０％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満変化する。他の態様において、多分散液滴の中央体積は、試料の増幅中に、約５０％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満変化する。
【００７４】
いくつかの態様において、試料の増幅は、第１の増幅サイクルを含み、多分散液滴の５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、第１の増幅サイクル後に融合する。更なる態様において、試料の増幅は、第１の増幅サイクルを含み、多分散液滴の約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満が、第１の増幅サイクル後に融合する。
【００７５】
いくつかの態様において、第１の流体の屈折率は、第２の流体の屈折率と、２００％未満、１００％未満、６０％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満異なる。更なる態様において、第１の流体の屈折率は、第２の流体の屈折率と、２００％未満、約１００％未満、約６０％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満異なる。
【００７６】
二重エマルション中などいくつかの態様において、第１の流体の屈折率は、バルク媒体の屈折率と、２００％未満、１００％未満、６０％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満異なる。
【００７７】
いくつかの態様において、多分散液滴は、複数のエマルションを含む。ある特定の態様において、複数のエマルションは、３つ以上の非混和性流体を組み合わせることによって調製される。
【００７８】
デジタル測定を行うためのデバイス及び方法
本開示の別の態様は、本開示の方法を実行するためのデバイスを含む。この態様に従うと、本開示は、体積分布を有する複数の多分散液滴を産出するための手段、複数の多分散液滴中の所与の液滴の体積を測定するための手段、液滴中の試料の有無及び複数の多分散液滴中の試料の濃度を決定するための手段を提供する。本方法は、大きいダイナミックレンジに渡るデジタル測定の性能、ならびにダイナミックレンジを増加させるための方法及びシステムを可能にする。具体的には、本デバイスは、とりわけ、異なるサイズの試料体積を創出することによって、試料のデジタル測定のダイナミックレンジを増加させる。
【００７９】
様々な態様において、本開示は、デジタルアッセイを行うための方法を提供し、該方法は、液滴の少なくともいくつかが試料を含む、複数の多分散液滴を産出することと、試料を増幅することと、試料を検出可能な薬剤で標識することと、液滴のための画像スタックを取得することと、液滴の体積を画像スタックから決定することと、液滴中の検出可能な薬剤の有無を画像スタックから決定することと、複数の液滴中の試料の濃度を、複数の液滴中の検出可能な薬剤の有無に基づいて決定することと、を含む。
【００８０】
いくつかの態様において、画像スタックを取得することは光学撮像を含む。いくつかの態様において、検出可能な薬剤を検出することは光学撮像を含む。
【００８１】
更なる態様において、光学撮像は、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせによって行われる。
【００８２】
ある特定の態様において、画像スタックは、単一の液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含む。
【００８３】
更なる態様において、画像スタックは、液滴について別々の焦点深度から撮られた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００枚の画像を含む。他の態様において、画像スタックは、液滴について別々の焦点深度から撮られた、２超、３超、４超、５超、６超、７超、８超、９超、１０超、１５超、２０超、２５超、３０超、３５超、４０超、４５超、５０超、５５超、６０超、６５超、７０超、７５超、８０超、８５超、９０超、９５超、または１００超の画像を含む。更に他の態様において、画像スタックは、液滴について別々の焦点深度から撮られた、約２超、約３超、約４超、約５超、約６超、約７超、約８超、約９超、約１０超、約１５超、約２０超、約２５超、約３０超、約３５超、約４０超、約４５超、約５０超、約５５超、約６０超、約６５超、約７０超、約７５超、約８０超、約８５超、約９０超、約９５超、または約１００超の画像を含む。
【００８４】
更なる態様において、画像スタックは、液滴について別々の焦点深度または撮像デバイスの対物面から撮られた、１００〜５０、１００〜７５、１００〜２５、１００〜２０、１００〜１０、１００〜５、５０〜２０、５０〜１０、５０〜５、２０〜１０、２０〜５、１０〜５、１０〜２、約１００〜約５０、約１００〜約７５、約１００〜約２５、約１００〜約２０、約１００〜約１０、約１００〜約５、約５０〜約２０、約５０〜約１０、約５０〜約５、約２０〜約１０、約２０〜約５、約１０〜約５、または約１０〜約２の画像を含む。
【００８５】
いくつかの態様において、本方法は、複数の液滴に対して同時に行われる。更なる態様において、複数の多分散液滴は、１群列の多分散液滴を含む。また更なる態様において、群列の多分散液滴は、マルチウェルプレート中に配置される。
【００８６】
いくつかの態様において、液滴の体積は、ラインスキャン法、シンプルバウンダリ法、リバースウォーターシェッド法、円検出法、リバースウォーターシェッド及び円検出複合法、またはこれらの組み合わせによって、画像スタックから決定される。
【００８７】
いくつかの態様において、検出可能な薬剤の濃度は、少なくとも３桁のダイナミックレンジに渡って、または少なくとも６桁のダイナミックレンジに渡って決定される。
【００８８】
いくつかの態様において、複数の多分散液滴は第１の流体及び第２の流体を含み、第１の流体は第２の流体と非混和である。ある特定の態様において、多分散液滴のエマルションは、第１の流体及び第２の流体を含む溶液を撹拌することによって形成され、第１の流体は、第２の流体中で非混泡性である。更なる態様において、撹拌はボルテックスを含む。
【００８９】
様々な態様において、本開示は、第２の流体と非混和である第１の流体及び第２の流体を含む溶液を撹拌することによって多分散液滴のエマルションを形成することと、エマルションを第２の流体と非混和である第３の流体中で撹拌し、それにより二重エマルションを形成することと、を含む方法を提供する。
【００９０】
いくつかの態様において、本開示は、流体の撹拌を含む方法を提供し、撹拌は、振とう、ボルテックス、超音波処理、磁石による混合、押出、フローフォーカスにより、またはこれらの組み合わせであり得る。更なる態様において、撹拌することは、エマルションを形成するのに十分である。更なる態様において、押出は、流体のピペッティングを含み、このピペッティングは、エマルションを産出するのに十分である。ある特定の態様において、撹拌することは、マイクロ流体デバイス中で起きる。
【００９１】
様々な態様において、第１の流体は水を含み、第２の流体は油を含み、第３の流体は水を含む。
【００９２】
様々な態様において、多分散液滴は、複数のエマルションを含む。更なる態様において、複数のエマルションは、３つ以上の非混和性流体を組み合わせることによって調製される。
【００９３】
いくつかの態様において、第１の流体は水性である。ある特定の態様において、第１の流体は試料を含む。更なる態様において、第２の流体は油である。ある特定の態様において、第２の流体は油であり、第２の流体は第１の流体及び第３の流体と非混和性である。いくつかの態様において、第１の流体は第３の流体とは異なる。ある特定の態様において、第３の流体は油であり、第３の流体は第１の流体及び第２の流体と非混和性である。
【００９４】
いくつかの態様において、エマルションは、水相及び非水相を含む。更なる態様において、第１の流体は水を含み、第２の流体は油を含む。
【００９５】
ある特定の態様において、複数の多分散液滴は、流体界面修飾要素を更に含む。更なる態様において、流体界面修飾要素は界面活性剤である。また更なる態様において、流体界面修飾要素は、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせから選択される。
【００９６】
いくつかの態様において、本方法は、非混和性流体のうちの１つ以上をゲルまたは固体に変換することを更に含む。ある特定の態様において、非混和性流体は、試料を増幅する前、試料を増幅する間、または試料を増幅した後に、ゲルまたは固体に変換される。
【００９７】
様々な態様において、本方法において使用される検出可能な薬剤は、蛍光性または発光性である。ある特定の態様において、検出可能な薬剤は、フルオレセイン、フルオレセインの誘導体、ローダミン、ローダミンの誘導体、または半導体ポリマーである。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「ダイナミックレンジ」という用語は、可変量の最大値と最小値との間の比率として定義される。
【００９９】
「デジタルアッセイ」という用語は、測定がより小さい測定の計数に基づいて行われるアッセイを意味し、より小さい測定値の各々は、２値であり、それに割り当てられ得るちょうど２つの可能性のある値のうちの１つである値を有する。本明細書に記載のデジタルアッセイは、個々の流体の体積から取得される２値測定の計数に基づく、流体中に存在する試料の測定を含む。
【０１００】
反応（例えば、増幅）を、異なるサイズの体積中で、体積の分析前または最中に実行して、どの体積が反応を受けた（例えば、増幅された産物を有する）かを決定することができる。ある特定の例においては、体積（例えば、液滴）を寸定し、占有された液滴の数（例えば、検出可能な薬剤を含む液滴）を計数し得る。液滴の全てまたは一部のみを分析することができる。分析は、例えば、液滴を１列形式でフローサイトメーターまたは同様のデバイスを通して流すことによって達成され得、ここでは、液滴のサイズが決定され得、増幅の存在が検出され得る。液滴のサイズは、例えば、液滴からの散乱シグナルに基づいて決定され得、増幅の存在は、液滴からの蛍光シグナルによって示され得る。あるいは、液滴の直径は、顕微鏡法によって決定することができる。液滴は、試料ホルダから抽出し（反応、例えば、増幅の前、最中、または後に）、ＣＣＤカメラを用いて広視野で撮像し得る。液滴は、例えば、表面上に広げるか、または２枚のガラススライドの間に埋め込んで、広視野顕微鏡下に配置し得る。適当な励起及びエミッションフィルタを使用して、液滴内の蛍光を定量し、増幅の有無を明らかにすることができる。液滴のサイズと各液滴における増幅産物の有無との両方に注目することによって、十分な数の異なるサイズの液滴を調べた後に、試料中に存在する分析物の元の濃度を逆算することが可能となる。これらの液滴はサイズが異なるため、所与のダイナミックレンジについて、分析は、液滴が全て同様のサイズである場合よりもずっと迅速である。いくつかの態様において、本明細書の方法は、ある数の液滴を複数で、また液滴の個々の体積を複数で使用して、デジタル測定を実施することを更に含む。例えば、目的分子の試料濃度は、ある数の液滴を複数で、１つ以上の目的分子を持つある数の液滴を複数で使用して、及び液滴の一部または全ての体積を複数で測定することによって、決定され得る。試料濃度を決定するための例示的な方法は、実施例の節に見出すことができる。
【０１０１】
いくつかの態様において、本開示は、デジタルアッセイを行うための方法を提供し、該方法は、液滴の少なくともいくつかが試料を含む、複数の多分散液滴を産出することと、試料を増幅することと、試料を検出可能な薬剤で標識することと、複数の多分散液滴を、フローサイトメトリーチャネルを通して流すことと、液滴の体積を、それがフローサイトメトリーチャネルを通して流れるときに決定することと、液滴中の検出可能な薬剤の有無を決定することと、複数の液滴中の試料の濃度を、複数の液滴中の検出可能な薬剤の有無に基づいて決定することと、を含む。
【０１０２】
ある特定の態様において、試料の濃度を決定することは、液滴からの散乱光を検出することを含む。
【０１０３】
本開示は、デジタル測定が試料についての有用な情報を提供するいずれの技法にも使用され得る。そのため、本明細書で提供される方法、システム、及びデバイスは、検出可能な薬剤を含む体積を含み得る。ある特定の態様において、体積は、検出可能な薬剤を含むマイクロ流体チップ中のウェル若しくはチャンバ、または液滴（例えば、エマルション中またはチップの表面上に形成される水滴）であり得る。検出可能な薬剤が単一の検出可能な分子または複数の検出可能な分子を含み得ることが概して理解されるであろう。例えば、ビーズ、量子ドット、ナノ粒子などの他の種類の検出可能な薬剤を使用することができる。更に、検出可能な薬剤は、例えば、分析される試料中に存在する目的分子（例えば、血液、血清、唾液、または他の溶液中の核酸分子）であり得る。あるいは、検出可能な薬剤は、試料中の目的分子（例えば、核酸分子）に関係する分子であり得、それにより分子の検出を可能にし得る。いくつかの態様において、本開示の方法及びシステムは、デジタル測定を伴う増幅関連技法（例えば、デジタルＰＣＲ）に使用され得る。増幅測定については、体積（例えば、液滴）は、例えば単一のＤＮＡ分子を含み得るが、体積は、増幅及び検出に使用されることが概して周知である必要な構成要素も含むことになる。いくつかの態様において、検出可能な薬剤は蛍光性であり、故に、当該技術分野で既知の蛍光系検出方法によって検出され得る。しかしながら、他の検出方法（例えば、吸光度、化学発光、濁度、及び／または散乱）を使用して、体積の内容物を分析することができる。本開示に好適な様々な検出可能な薬剤が当該技術分野で概して周知であり、例えば、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１１ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１０）において見出すことができる。
【０１０４】
ある特定の態様において、検出可能な薬剤は、検出のための目的分子に関連し得る。例えば、検出可能な薬剤は、試料中に存在する核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ペプチド、タンパク質、脂質、または他の分子（例えば、生体分子）に関連し得る。本明細書で定義される場合、検出可能な薬剤の文脈における「関連する」は、共有結合性及び／または非共有結合性相互作用を介した分子との相互作用を含む。例えば、検出可能な薬剤は、目的分子と共有結合し得る。あるいは、検出可能な薬剤は、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ分子）を検出するために使用され得る挿入剤またはＴａｑｍａｎプローブであり得る。目的体積中の分子に関連しない場合がある参照染料などの他の検出可能な薬剤を使用することができる。本開示は、試料の濃度を決定することを更に含む。例えば、本方法及びシステムを使用して、（１）液滴の体積、及び（２）検出可能な薬剤を含む液滴の数を決定することができ、これを使用して、試料の濃度を決定することができる（即ち、所与の液滴中の試料の有無を決定することによって）。この情報を様々な方法で使用して、試料濃度を決定することができる。例えば、標的の分子は、分子／体積の単位の濃度で試料中に存在する。試料は、分析することができる可変体積の液滴に分配され得る。液滴の個々の体積（全てまたは一部のみ）は、本明細書で提供される方法によって決定することができる。加えて、本明細書に記載の検出方法を使用して、液滴が検出可能な薬剤を含むか否かを分析し得る。所与の試料濃度に対して、可変体積液滴のうちのいくつかは検出可能な薬剤を含み得、いくつかは含まない場合がある。より高い試料濃度については、概して複数のうちのより多い液滴が検出可能な薬剤を含むことになり、逆もまた同様であり、低い試料濃度については、複数のうちのより少ない液滴が、検出可能な薬剤によって占有され得る。本明細書で更に記載されるように、特定の体積分布における検出可能な薬剤による占有の確率は幅広い試料濃度に対して規定され得、その後これを実データと比較して、未知の試料の濃度を決定し得る。試料濃度を決定することについての更なる開示は、以下の実施例８に見出すことができる。実施例８に示される方法は、試料濃度の初期予測を行うこと、及びその後に１つ以上の検出可能な薬剤を含むことが予期される液滴（占有された液滴）の数を計算することを伴う。試料濃度についての予測は、その後、周知の数値法を使用して、所望の精度内に、占有された液滴の予期した数が複数における占有された液滴の実際の数と等しくなるまで調整される。
【０１０５】
いくつかの態様において、本開示の方法は、液滴の体積を、液滴が試料を含む場合にのみ測定することを含む。更なる態様において、本方法は、試料を含まないと決定されたあらゆる液滴を測定から除外することを含む。いくつかの態様において、試料濃度は、試料を含むと決定される液滴のみを特定、寸定、または計数することによって、本明細書に開示の方法に従って決定される。いくつかの態様において、試料濃度は、試料の全体積を測定することまたは知ることによって、及び試料を含むと決定される液滴のみを特定、寸定、または計数することによって、決定される。更なる態様において、試料中の分析物の濃度は、試料の全体積を測定することまたは知ることによって、及び陽性の液滴全てを計数し、陽性の液滴各々の体積を決定することによって、決定される。この方法の利点としては、スキャンする液滴の数が減少し、それにより試料濃度の決定にかかる分析時間が減少することが挙げられる。
【０１０６】
本明細書で更に記載されるように、本開示は、既存の方法及びシステムでは達成することができないデジタル測定のための様々な態様を提供する。例えば、本開示は、広ダイナミックレンジに渡って試料濃度を測定する能力を提供し得る。いくつかの態様において、ダイナミックレンジは、少なくとも３桁、少なくとも４桁、少なくとも５桁、または少なくとも６桁であり得る。いくつかの態様において、ダイナミックレンジは、約１０〜１０１０分子／ｍＬ、約１０２〜１０７分子／ｍＬ、約１０４〜１０１０分子／ｍＬ、約１０５〜１０９分子／ｍＬであり得る。ある特定の態様において、ダイナミックレンジ内の試料濃度を決定することは、試料中の目的分子に関連する検出可能な薬剤を検出することによって行うことができる。ダイナミックレンジは、エマルション中で産出される体積の範囲ならびに／または分析及び検出される体積の範囲など、様々な因子に依存し得る。ある特定の態様において、体積分布は、液滴体積を継続的に変化させることを含む。
【０１０７】
いくつかの態様において、本方法は、濃度勾配を使用してチップに対して行われる。ｄＰＣＲをオンチップ勾配生成と一体化させることによって、または異なるサイズのデジタル化した体積を使用することによって、またはこれらの方法の両方の組み合わせによって、本開示は、ｄＰＣＲチップのダイナミックレンジを、１桁から６桁に効果的に増加させ、これは、ＲＴ−ＰＣＲによって提供されるダイナミックレンジに匹敵する。より大きい範囲の濃度勾配、またはサイズの差異がより大きいデジタル化した体積のアレイを使用することによって、所望の場合には、ダイナミックレンジをまた更に増加させることができる。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実行するためのこの方法は、既存の技術と比べて次のいくつかの主要な利点を提供する。（１）より正確である、（２）ＲＴ−ＰＣＲに必要とされる種類の較正試料を実行する必要性を除去し、故に、スループットがより高い、（３）標準的なＰＣＲデバイスに対してＲＴ−ＰＣＲのコストが相対的に高い（約１０倍）原因である実時間好感度蛍光検出の必要性を排除する。
【０１０８】
本開示の別の態様は、本開示の方法を実行するためのデバイスを含み、本デバイスは、異なるサイズのデジタル化された別々の体積のアレイを創出する。別の態様において、本デバイスは、試料濃度勾配を創出すること、及び異なるサイズの試料体積を創出することを含む、試料のデジタル測定のダイナミックレンジを増加させるための方法を実行する。
【０１０９】
いくつかの態様において、本開示は、デジタル測定を使用して、試料の濃度を決定するための方法を提供する。本方法は、複数の液滴のうちの少なくとも１つが試料からの内容物を含む、ある体積分布を有する複数の液滴を産出することと、液滴の体積を決定することと、液滴中の試料の有無を決定することと、液滴の体積、及び検出可能な薬剤を含むことが見出された液滴の数を使用して、試料の濃度を決定することと、を含み得る。
【０１１０】
いくつかの態様において、本開示は、異なるサイズ（即ち、体積）のデジタル化された別々の体積のアレイを創出することに基づく、デジタル測定のダイナミックレンジを増加させるための方法を含む。この方法は、ダイナミックレンジを増加させるために単純にデジタル化された体積の数を増加させることよりも優れている。これは、単純にデジタル化された体積の数を増加させることが、体積が占有するエリアを増加させ、同時に、チップ上に欠陥を有する可能性を増加させ、この場合、いくつかのデジタル化された体積が適切に形成されないかまたは他の欠陥を有することになるためである。単純にデジタル化された体積の数を増加させることはまた、全てのデジタル化された体積を分析するために必要とされる時間が増加することによって、スループットを減少させる。ある特定の態様において、ダイナミックレンジは、単純にデジタル化された体積の数を増加させることよりも、異なるサイズのデジタル化された体積のアレイを創出することによって増加し得る。異なるサイズのデジタル化された体積のアレイは、ランダムアレイ（例えば、異なる直径の液滴が全て容器中に存在しランダムに分配される）であり得るか、または規則的アレイであり得る。
【０１１１】
試料増幅
本開示はまた、例えば核酸試料などの試料の増幅のための方法、デバイス、及びシステムを提供する。ある特定の態様において、試料増幅はＰＣＲを含む。更なる態様において、試料増幅はｄＰＣＲを含む。
【０１１２】
様々な態様において、試料はヌクレオチドを含む。様々な態様において、試料を増幅することは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、またはこれらの組み合わせを行うことを含む。更なる態様において、試料を増幅することは、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅を含む。
【０１１３】
任意の好適なデバイスを使用して、本開示に従う増幅を行うことができる。様々なデバイス特徴が含まれ得、これは例えば、ＰＣＲ系増幅の実行を可能にするために使用され得る、温度を維持するまたは循環させるための手段などである。他のデバイス特徴としては、温水槽、インキュベーター、及び他の熱源、ならびに閉じ込められた体積中に熱を捕捉するための断熱材を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１１４】
様々な態様において、本開示は、均一アッセイを行うための方法、デバイス、及びシステムを提供する。本明細書で使用される場合、「均一アッセイ」という用語は、全てのアッセイ構成要素が検出時に溶液相中に存在するアッセイを指す。均一アッセイでは、アッセイの構成要素は検出可能な光を散乱させない。
【０１１５】
更なる態様において、本開示は、不均一アッセイを行うための方法、デバイス、及びシステムを提供する。本明細書で使用される場合、「不均一アッセイ」という用語は、１つ以上のアッセイ構成要素が検出時に固相中に存在するアッセイを指す。不均一アッセイという用語は、「異種アッセイ」という用語と置き換え可能に使用される。ＬＡＭＰまたはローリングサークル増幅などにおける沈殿物または微粒子の形成は、異種アッセイの一般的な形態である。この種類のアッセイでは、固相構成要素は、検出可能な光を散乱させ得る。
【０１１６】
様々な態様において、本開示は、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）を行うことによる増幅のための方法、デバイス、及びシステムを提供する。デジタルＰＣＲは、試料中に存在する個々の核酸分子が、１つ以上の標的配列のＰＣＲ増幅の前に多くの別々の反応体積（例えば、チャンバまたはアリコート）に分配される方法である。試料中の個々の分子の濃度は、反応体積のうちの少なくともいくつかが標的分子を含まず、反応体積の少なくともいくつかが少なくとも１つの標的分子を含むように、調整される。標的配列の増幅は２値デジタル出力をもたらし、これにおいては、各チャンバが、対応する標的配列の存在を示すＰＣＲ産物を含むまたは含まないと特定される。検出可能なレベルのＰＣＲ最終産物を含む反応体積の数は、絶対核酸量の直接的尺度である。本開示の様々な態様において、核酸試料は、それらを別々の反応体積に分割することによって分配される。デジタル化された試料は、その後、ＰＣＲ試薬の存在下で熱循環し、それにより、核酸試料の増幅を促進する。
【０１１７】
本開示の更なる態様において、本明細書に記載の方法、システム、及びデバイスは、デジタルＥＬＩＳＡ、ＮＡＳＢＡ、及びＬＡＭＰなどの等温増幅技法に適用され得る。ＥＬＩＳＡは、タンパク質系であり、通常、タンパク質または小分子の定量に使用される。ＮＡＳＢＡ及びＬＡＭＰは、ＰＣＲを補完するために開発された等温増幅スキームである。
【０１１８】
等温増幅においては、伝統的なＰＣＲにおいてのような温度循環は発生しない。転写媒介増幅、核酸配列系増幅、ＲＮＡ技術のシグナル媒介、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、ＤＮＡのループ媒介等温増幅、等温多置換増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、シングルプライマー等温増幅、及び環状ヘリカーゼ依存性増幅など、いくつかの種類の等温核酸増幅法が存在する。
【０１１９】
ＮＡＳＢＡ（核酸配列系増幅）は、ＲＮＡを増幅するための等温（約４０℃）プロセスであり、臨床試料中のウイルスＲＮＡ及び細菌ＲＮＡの両方を検出するのに活用されてきた。ＮＡＳＢＡによって提供される利点は、（１）高い増幅効率及び速い増幅速度論を有し、１０００倍を超える増幅が１、２時間で達成され得ること、（２）ＲＴ−ＰＣＲの場合のようなゲノムｄｓＤＮＡによる偽陽性を付与しないこと、（３）イントロンフランキングプライマーを使用せずに遺伝子発現研究を行うことができること、（４）ＰＣＲに必要な程度の温度制御及びフィードバックを必要としないことである。その結果、ＮＡＳＢＡがウイルス及び最近ＲＮＡの検出に一般的となった。ＮＡＳＢＡが等温法であるということは、複数の試料を温度制御されたオーブンの使用によって同時に実行することを可能にし、これは、多くの現場作業において重要な実用的利点である。
【０１２０】
ループ媒介等温増幅を意味するＬＡＭＰは、等温条件（約６０℃）下において高い特異性、効率、及び速度でＤＮＡを増幅することができる。その増幅反応の特徴により、ＬＡＭＰは、増幅中に単一ヌクレオチドの差異を判別することができる。その結果、ＬＡＭＰは、ＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）分類に適用されてきた。ＬＡＭＰはまた、ウイルスの検出においてＲＴ−ＰＣＲよりも約１０倍高い感度を有することが示されている。加えて、ＤＮＡのＬＡＭＰ増幅が溶液の濁度を増加させるピロリン酸マグネシウムの産出と直接的に相関し得るため、ＬＡＭＰの進行は、単純な濁度計を使用してモニタリングされている。したがって、不均一アッセイを、ＬＡＭＰに起因する増幅産物を検出するために使用することができる。
【０１２１】
一態様において、本開示は、試料のデジタルループ媒介増幅を行うための方法を提供する。本方法は、複数における少なくとも１つの液滴が核酸分子（例えば、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ分子）を含む、マイクロ流体デバイス上で試料の複数の液滴を産出することと、少なくとも１つの液滴においてループ媒介増幅を行って、核酸分子の増幅された産物を産出することと、を含む。本方法は、増幅された産物を検出することも含む。いくつかの態様において、本方法は、増幅された産物を含む複数の液滴の数を決定することと、試料中の核酸分子の濃度を、複数の液滴の個々の体積、及び核酸分子中に含まれる複数の液滴の数を使用して、計算することと、を含む。マイクロ流体デバイスは、複数の液滴を形成するように構成される複数のチャンバを含み得る。
【０１２２】
ＮＡＳＢＡ及びＬＡＭＰによって提供される利益のいくつかに反して、１つの重要な欠点は、大部分の状況において有益であり得る従来の実時間様式またはバルクでの定量を行うことに伴う困難である。定量は、多くの場合、同一の条件下で増幅された標準を使用した細心の較正及び制御が求められ、これは非常に面倒であり得（特に実地研究では）、多くの場合に実用的ではない。ＬＡＭＰにおける沈殿物の検出などの不均一アッセイについては、正確な較正は特に困難であり得る。この問題は、終点検出を用いる本デジタル法によって効果的に解決される。
【０１２３】
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、等温核酸増幅法である。これは、ポリメラーゼ連鎖反応及び他の核酸増幅スキームとはいくつかの点で異なる。ＲＣＡ中、短いＤＮＡプローブは、病原体または有害変異を含むヒト遺伝子のＤＮＡなどの目的標的ＤＮＡにアニールする。その後、プローブは、ローリングサークル増幅反応のためのプライマーとして作用する。プローブの遊離端は、小さい環状ＤＮＡ鋳型にアニールする。ＤＮＡポリメラーゼを添加してプライマーを伸長させる。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーを環状ＤＮＡ鋳型の周りに連続的に伸長させて、円の多数の繰り返されたコピーから成る長いＤＮＡ産物を生成する。反応終了までに、ポリメラーゼは、元の標的ＤＮＡに係留されたコピーの鎖を持つ何千もの円鋳型のコピーを生成する。これにより、標的の空間分解能及びシグナルの迅速な増幅が可能となる。順方向プライマー及び逆方向プライマーの使用は、上記の線形増幅反応を、１時間に最大１０１２コピーを生成することができる指数関数モードへと変化させ得る。かかる定量的測定に必要な較正は煩雑であり得る。
【０１２４】
この欠点を克服するために、本開示は、ＮＡＳＢＡ及びＬＡＭＰなどのデジタル等温増幅を提供し、ここでは、デジタルＰＣＲと同様に、デジタル化された体積のアレイの使用が、デジタルＮＡＳＢＡ、デジタルＬＡＭＰ、及びローリングサークル増幅を実行するために使用される。更に、濃度勾配及び／または異なるサイズのデジタル化された体積のアレイを使用することによって、これらのデジタル測定のダイナミックレンジを効果的に増加させることができる。現行の方法は、これらの等温増幅スキームを理想的に補完して、それらをＲＮＡ及びＤＮＡの存在を測定するための定量的技法とする。本開示の別の態様において、本方法は、抗体系増幅に提供される。別の態様において、本方法は、特定の分子の認識に基づく増幅に適用される。
【０１２５】
様々な検出可能な薬剤を本開示に従って使用することができる。様々な態様において、検出可能な薬剤は蛍光性である。更なる態様において、検出可能な薬剤は発光性である。使用する検出可能な薬剤は、用いる増幅方法の種類に依存し得る。一態様において、シグナル生成は、ＥｖａＧｒｅｅｎまたはＳＹＢＲｇｒｅｅｎなどの非配列特異的フルオロフォアに由来し、このフルオロフォアは、溶液中にあるときには消光するが、二本鎖ＤＮＡに挿入され得、ここでは、フルオロフォアはずっと明るい蛍光を呈する。故に、ＰＣＲ中に生成された大量の二本鎖ＤＮＡは、蛍光の著しい増大をもたらす。別の態様においては、配列特異的蛍光プローブが使用される。一態様において、これは、ヘアピン構造などの分子指標から成り、その蛍光はその閉鎖配座では大きく消光し、その強度はそれが増幅された標的ＤＮＡにハイブリダイズすると増加する。別の態様において、これは、Ｔａｑｍａｎプローブから成り、このＴａｑｍａｎプローブは、標的ＤＮＡにハイブリダイズし、次の増幅ステップ中にプローブＤＮＡからの蛍光レポーターの開裂を受ける。
【０１２６】
これらのプローブは、無視できない背景蛍光を有し、増幅中の強度の相対的な増加は、反応に加えたプローブの量に応じて、むしろ小さくあり得る。更に、励起強度は、検出プロセスの間、視野にかけて異なり得る。いくつかの態様においては、閾値画素強度値を画像中の全ての画素から減算して、液滴中の蛍光強度が増幅産物の存在を示すのに十分大きいか否かを決定する。いくつかの態様においては、参考染料を１つ以上の非混和性流体に添加することができ、この参照染料の分光的特徴は、増幅について報告する蛍光プローブと完全に分離してもよく、その蛍光シグナルは、増幅または他の反応若しくは試薬条件に非感受性であってもよい。
【０１２７】
分析方法及びシステム
様々な態様において、本開示は、デジタルアッセイを行うための方法を提供する。複数の多分散液滴が産出され得る。液滴の少なくともいくつかは、試料を含んでもよい。試料は増幅されてもよい。試料は、検出可能な薬剤で標識されてもよい。液滴のための画像スタックが取得され得る。液滴の体積が画像スタックから決定され得る。液滴中の検出可能な薬剤の有無は、画像スタックから決定されてもよい。複数の液滴中の試料の濃度は、複数の液滴中の検出可能な薬剤の有無に基づいて決定されてもよい。
【０１２８】
画像スタックは、光学撮像によって取得されてもよい。検出可能な薬剤は、光学撮像によって検出され得る。光学撮像は、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせなどの多くの方法で行われ得る。いくつかの態様において、光学撮像は、補償光学及び撮像の使用を含む。
【０１２９】
画像スタックは、単一の液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含み得る。画像スタックは、液滴について別々の焦点深度から撮られた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００枚の画像を含んでもよい。
【０１３０】
本開示の方法は、複数の液滴に対して同時に行われてもよい。複数の多分散液滴は、１群列の多分散液滴を含み得る。群列の多分散液滴は、マルチウェルプレート中に配置され得る。
【０１３１】
液滴の体積は、ラインスキャン法、シンプルバウンダリ法、リバースウォーターシェッド法、円検出法、リバースウォーターシェッド及び円検出複合法、またはこれらの組み合わせなどの多くの方法で、画像スタックから決定され得る。検出可能な薬剤の濃度は、少なくとも３桁のダイナミックレンジに渡って、または少なくとも６桁のダイナミックレンジに渡って決定され得る。
【０１３２】
複数の多分散液滴は、第１の流体及び第２の流体を含んでもよい。第１の流体は、第２の流体と非混和であり得る。多分散液滴のエマルションは、第１の流体及び第２の流体を含む溶液を撹拌することによって形成されてもよく、第１の流体は、第２の流体中で非混泡性である。多分散液滴のエマルションを形成するために、第１の流体及び第２の流体を含む溶液を撹拌してもよい。第１の流体は、第２の流体と非混和であり得る。エマルションを第３の流体中で撹拌してもよい。第３の流体は、第２の流体と非混和であり、それにより二重エマルションを形成してもよい。流体（複数可）は、振とう、ボルテックス、超音波処理、磁石による混合、押出、フローフォーカス、またはこれらの組み合わせなどの多くの方法で撹拌し得る。撹拌は、エマルションを形成するのに十分であり得る。押出は、例えば、流体のピペッティングを含んでもよく、このピペッティングは、エマルションを産出するのに十分である。撹拌することは、マイクロ流体デバイス中で起き得る。撹拌は、例えば、ボルテックスであってもよい。産出されたエマルションは、水相及び非水相を含んでもよい。第１の流体は水を含んでもよく、第２の流体は油を含んでもよい。第１の流体は水を含んでもよく、第２の流体は油を含んでもよく、第３の流体は水を含んでもよい。
【０１３３】
複数の多分散液滴は、複数のエマルションを含み得る。複数のエマルションは、３つ以上の非混和性流体を組み合わせることによって調製され得る。第１の流体は水性であってもよい。第１の流体は試料を含んでもよい。第２の流体は油を含んでもよい。第２の流体は油を含んでもよく、第２の流体は第１の流体及び第３の流体と非混和性であってもよい。第１の流体は第３の流体とは異なり得る。第３の流体は油を含んでもよく、第３の流体は第１の流体及び第２の流体と非混和性であってもよい。
【０１３４】
複数の多分散液滴は、流体界面修飾要素を更に含み得る。流体界面修飾要素は、界面活性剤を含んでもよい。流体界面修飾要素は、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせから選択され得る。
【０１３５】
非混和性流体のうちの１つ以上は、ゲルまたは固体に変換され得る。非混和性流体は、試料を増幅する前、試料を増幅する間、または試料を増幅した後に、ゲルまたは固体に変換されてもよい。
【０１３６】
検出可能な薬剤は、蛍光性または発光性であり得る。検出可能な薬剤は、フルオレセイン、フルオレセインの誘導体、ローダミン、ローダミンの誘導体、または半導体ポリマーのうちの１つ以上を含んでもよい。試料はヌクレオチドを含んでもよい。
【０１３７】
試料を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、またはこれらの組み合わせを行ってもよい。あるいは、または組み合わせて、試料は、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅によって増幅され得る。
【０１３８】
液滴径の分布は、液滴中央径の１０００％超、５００％超、１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を有してもよい。あるいは、または組み合わせて、液滴径の分布は、液滴平均径の１０００％超、５００％超、１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を有してもよい。
【０１３９】
多分散液滴中の体積は、２倍超で、１０倍超で、１００倍超で、１０００倍超で、１００００倍超で、１０００００倍超で、１００００００倍超で、約２倍超で、約１０倍超で、約１００倍超で、約１０００倍超で、約１００００倍超で、約１０００００倍超で、または１００００００倍超で、変動してもよい。多分散液滴は、１００ナノリットル（ｎＬ）〜１フェムトリットル（ｆＬ）、１０ｎＬ〜１０ｆＬ、１ｎＬ〜１００ｆＬ、１００ｎＬ〜１ｐＬ、１０ｎＬ〜１０ｐＬ、または１ｎＬ〜１ｐＬ、約５００ｐＬ〜約５０ｆＬ、約１００ｐＬ〜約１００ｆＬの体積分布を有してもよい。多分散液滴の平均体積は、試料の増幅中に、５０％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満変化してもよい。
【０１４０】
試料の増幅は、第１の増幅サイクルを含んでもよく、多分散液滴の５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、第１の増幅サイクル後に融合し得る。
【０１４１】
第１の流体の屈折率は、第２の流体の屈折率と、２００％未満、１００％未満、６０％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満異なってもよい。
【０１４２】
様々な態様において、本開示は、デジタルアッセイを行うための方法を提供する。複数の多分散液滴が産出され得る。液滴の少なくともいくつかは、試料を含んでもよい。試料は増幅されてもよい。試料は、検出可能な薬剤で標識されてもよい。複数の多分散液滴は、フローサイトメトリーチャネルを通して流され得る。液滴の体積は、それがフローサイトメトリーチャネルを通して流れるときに決定され得る。液滴中の検出可能な薬剤の有無が決定されてもよい。複数の液滴中の試料の濃度が、複数の多分散液滴中の検出可能な薬剤の有無に基づいて決定され得る。いくつかの態様において、液滴のサイズ及び／または液滴中の試料の濃度は、液滴からの散乱光を検出することによって決定されてもよい。
【０１４３】
様々な態様において、本開示は、デジタルアッセイを行うための組成物を提供する。組成物は、第１の流体、第２の流体、界面活性剤、及び増幅試薬を含み得る。第１の流体及び第２の流体は、互いに非混和性であってもよく、撹拌時にエマルションを形成することができてもよい。いくつかの態様において、本組成物は、ヌクレオチドなどの試料、及び／または試料を標識することができる検出可能な薬剤を更に含んでもよい。試料は、検出可能な薬剤で標識されてもよい。
【０１４４】
本組成物は、核酸試料に結合することができる検出可能な薬剤を更に含んでもよい。
【０１４５】
本組成物の増幅試薬は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）試薬、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）試薬、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）試薬、またはこれらの組み合わせから選択され得る。増幅試薬は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、プローブ、またはこれらの組み合わせなどのＰＣＲ試薬を含んでもよい。
【０１４６】
本組成物は第３の流体を更に含んでもよい。第３の流体は第２の流体と非混和であり得る。本組成物は二重エマルションを形成することができてもよい。第１の流体は水性であってもよい。第１の流体は増幅試薬を含んでもよい。第２の流体は油を含んでもよい。第２の流体は第１の流体及び第３の流体と非混和性であってもよい。第１の流体は第３の流体とは異なり得る。第３の流体は油を含んでもよく、第１の流体及び第２の流体と非混和性であってもよい。
【０１４７】
本組成物は、流体界面修飾要素を更に含み得る。流体界面修飾要素は、界面活性剤を含んでもよい。流体界面修飾要素は、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせから選択され得る。
【０１４８】
本組成物は、非混和性流体のうちの１つ以上をゲルまたは固体に変換することができる固化剤またはゲル化剤を更に含み得る。
【０１４９】
いくつかの態様において、本開示は、前述の組成物のうちのいずれかを含むデジタルアッセイを行うためのキットを提供する。
【０１５０】
様々な態様において、本開示は、液滴（複数可）の体積を決定するためのシステムを提供する。本システムは、容器、撮像ソース、及びコンピューティングデバイスを含んでもよい。容器は、液滴（複数可）を保持するように構成され得る。撮像ソースは、容器中の液滴（複数可）の画像を取得するように構成され得る。コンピューティングデバイスは、プロセッサ及びメモリ（例えば、ＲＯＭ、ＲＡＭ、フラッシュメモリ、または同様のものなどの、非一時的有形コンピュータ可読記憶媒体）を含んでもよい。メモリは、プロセッサによって実行されるときに、（ｉ）撮像ソースに、液滴（複数可）の画像スタックを取得させ、（ｉｉ）プロセッサに、試料中の液滴（複数可）の体積を取得された画像スタックに基づいて決定させる、１組の命令を記憶し得る。
【０１５１】
液滴（複数可）は複数の液滴を含み得る。複数の液滴は多分散性であってもよい。容器はマルチウェルプレートを含んでもよい。
【０１５２】
撮像ソースは光学撮像ソースを含んでもよい。光学撮像ソースは、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせを行うように構成され得る。
【０１５３】
液滴（複数可）の画像スタックは、液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含み得る。画像スタックは、液滴について別々の焦点深度から撮られた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００枚の画像を含んでもよい。
【０１５４】
１組の命令は、プロセッサによって実行されるときに、プロセッサに、（ｉ）画像スタックの個々の画像における画素セット（複数可）を特定することと、（ｉｉ）画素セット（複数可）を、少なくとも１つの液滴の少なくとも一部として特定することと、（ｉｉｉ）個々の液滴（複数可）を、対応に基づいて、画素セット（複数可）から特定することと、（ｉｖ）特定された液滴（複数可）の体積を、画素セット（複数可）に基づいて決定することと、によって、液滴（複数可）の体積を決定させてもよい。少なくとも１つの液滴の少なくとも一部は、単一の液滴、複数の液滴の部分、単一の全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。
【０１５５】
１組の命令は、プロセッサによって実行されるきに、プロセッサに、取得した画像スタックに基づいて、複数の液滴の複数の体積を決定させてもよい。１組の命令は、プロセッサによって実行されるきに、更に、プロセッサに、複数の液滴の少なくともいくつかにおける検出可能な薬剤の有無を決定させてもよい。１組の命令は、プロセッサによって実行されるときに、更に、プロセッサに、複数の液滴中の試料の濃度を、複数の液滴中の検出可能な薬剤の有無、及び複数の液滴の決定された複数の体積に基づいて、決定させてもよい。試料はヌクレオチドを含んでもよい。検出可能な薬剤は、蛍光性または発光性であり得る。検出可能な薬剤は、フルオレセイン、フルオレセインの誘導体、ローダミン、ローダミンの誘導体、または半導体ポリマーを含んでもよい。
【０１５６】
複数の液滴は、ヌクレオチドを含む試料を含み得る。複数の液滴中の試料は増幅されていてもよい。複数の液滴中の試料は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、またはこれらの組み合わせを行うことによって増幅されていてもよい。試料は、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅によって増幅されていてもよい。１組の命令は、プロセッサによって実行されるときに、検出可能な薬剤の濃度が、少なくとも３桁のダイナミックレンジに渡って、または少なくとも６桁のダイナミックレンジに渡って決定されるようにし得る。
【０１５７】
様々な態様において、本開示は、液滴の体積を決定するための方法を提供する。液滴の画像スタックが取得され得る。画像スタックの個々の画像中の画素セット（複数可）が特定され得る。画素セット（複数可）は、単一の液滴、複数の液滴の部分、全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含んでもよい、少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定されてもよい。個々の液滴（複数可）は、その対応に基づいて画素セット（複数可）から特定され得る。特定された個々の液滴（複数可）の体積は、少なくとも１つの画素セット（複数可）に基づいて決定されてもよい。
【０１５８】
試料の画像スタックは、液滴（複数可）を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を取得することによって取得され得る。２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００枚の画像が液滴（複数可）について別々の焦点深度から撮られてもよい。
【０１５９】
特定された液滴（複数可）の体積は、以下の方法で画像スタックのうちの少なくとも１つの画像を使用することによって、特定された液滴（複数可）の直径を決定することで、決定され得る。１．特定された液滴（複数可）を画像スタックの複数の画像間で相関させ、複数の画像における特定された液滴（複数可）の最大径を測定し得る。２．曲線を特定された液滴（複数可）の境界に適合させ、特定された液滴（複数可）の直径を適合させた曲線に基づいて補間し得る。３．特定された液滴（複数可）の直径を画像スタックの複数の画像間で相関させ、特定された液滴（複数可）の直径を各画像中で特定し、特定された液滴（複数可）の直径を画像スタックの複数の画像におけるその直径から決定し得る。４．特定された液滴（複数可）を画像スタックの複数の画像間で相関させ、特定された液滴（複数可）の直径を各画像中で決定し、特定された液滴（複数可）の直径を、画像スタックの複数の画像におけるその直径、及び複数の画像間の画像深度の差異から決定し得る。特定された液滴（複数可）の直径を決定する他の方法も企図され、本開示の範囲内である。
【０１６０】
複数の液滴の体積が決定され得る。複数の液滴中の検出可能な薬剤の有無は、画像スタックから決定されてもよい。複数の液滴中の試料の濃度は、複数の液滴中の検出可能な薬剤の有無、及び決定された複数の液滴の体積に基づいて、決定されてもよい。
【０１６１】
試料はヌクレオチドを含んでもよい。複数の液滴中の試料は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、またはこれらの組み合わせを行うことなどによって多くの方法で増幅され得る。あるいは、または組み合わせて、試料は、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅によって増幅され得る。
【０１６２】
検出可能な薬剤の濃度は、少なくとも３桁のダイナミックレンジに渡って、または少なくとも６桁のダイナミックレンジに渡って決定され得る。検出可能な薬剤は、蛍光性または発光性であり得る。検出可能な薬剤は、フルオレセイン、フルオレセインの誘導体、ローダミン、ローダミンの誘導体、または半導体ポリマーを含んでもよい。
【０１６３】
画像スタックは、光学撮像によって取得されてもよい。光学撮像は、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせによって行われ得る。
【０１６４】
複数の多分散液滴の画像スタックを取得してもよい。複数の多分散液滴は、第１の流体及び第２の流体を含み得る。第１の流体は、第２の流体と非混和であり得る。多分散液滴のエマルションは、第１の流体及び第２の流体を含む溶液を撹拌することによって形成してもよい。画像スタックを取得するために、形成されたエマルションを撮像してもよい。第１の流体は水を含んでもよく、第２の流体は油を含んでもよい。
【０１６５】
更に、多分散液滴のエマルションは、第１の流体及び第２の流体を含む溶液を撹拌することによって形成してもよい。第１の流体は、第２の流体と非混和であり得る。また、エマルションは第３の流体中で撹拌してもよい。第３の流体は、第２の流体と非混和であり、それにより二重エマルションを形成してもよい。第１の流体は水を含んでもよく、第２の流体は油を含んでもよく、第３の流体は水を含んでもよい。流体（複数可）は、振とう、ボルテックス、超音波処理、磁石による混合、押出、フローフォーカス、またはこれらの組み合わせによってなど、多くの方法で撹拌し得る。撹拌は、エマルションを形成するのに十分であり得る。押出は、例えば、エマルション．流体のピペッティングを含んでもよく、このピペッティングは、エマルションを産出するのに十分である。撹拌することは、マイクロ流体デバイス中で起き得る。
【０１６６】
エマルションは、水相及び非水相を含んでもよい。多分散液滴は、複数のエマルションを含み得る。多分散液滴は、複数のエマルションを含み得る。複数のエマルションは、３つ以上の非混和性流体を組み合わせることによって調製され得る。３つ以上の非混和性流体は、第１の流体、第２の流体、及び第３の流体を含んでもよい。第１の流体は水性であってもよい。第２の流体は油を含んでもよい。第２の流体は第１の流体及び第３の流体と非混和性であってもよい。非混和性の第１、第２、及び／または第３の流体（複数可）は、ゲルまたは固体に変換され得る。第１の流体は第３の流体とは異なり得る。第３の流体は油を含んでもよい。第３の流体は、第１の流体及び第２の流体と非混和性であってもよい。非混和性の第３の流体は、固体またはゲルに変換され得る。第１の流体は、検出のための試料を含み得る。第１の流体の屈折率は、第２の流体の屈折率と、２００％未満、１００％未満、６０％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満異なってもよい。
【０１６７】
複数の多分散液滴は、流体界面修飾要素を更に含み得る。流体界面修飾要素は、界面活性剤を含んでもよい。流体界面修飾要素は、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせから選択され得る。例えば、流体界面修飾要素は、ＰＥＧ系界面活性剤を含んでもよい。
【０１６８】
液滴径の分布は、液滴中央径の１０００％超、５００％超、１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を有してもよい。液滴径の分布は、液滴平均径の１０００％超、５００％超、１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を有してもよい。
【０１６９】
多分散液滴中の体積は、２倍超で、１０倍超で、１００倍超で、１０００倍超で、１００００倍超で、１０００００倍超で、１００００００倍超で、約２倍超で、約１０倍超で、約１００倍超で、約１０００倍超で、約１００００倍超で、約１０００００倍超で、または１００００００倍超で、変動してもよい。
【０１７０】
多分散液滴は、１００ナノリットル（ｎＬ）〜１フェムトリットル（ｆＬ）、１０ｎＬ〜１０ｆＬ、１ｎＬ〜１００ｆＬ、１００ｎＬ〜１ｐＬ、１０ｎＬ〜１０ｐＬ、または１ｎＬ〜１ｐＬ、約５００ｐＬ〜約５０ｆＬ、約１００ｐＬ〜約１００ｆＬの体積分布を有してもよい。
【０１７１】
試料を多分散液滴における検出のために増幅してもよい。
【０１７２】
多分散液滴の平均体積は、試料の増幅中に、５０％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満変化してもよい。
【０１７３】
試料の増幅は、第１の増幅サイクルを含んでもよく、多分散液滴の５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、第１の増幅サイクル後に融合し得る。
【０１７４】
更に、画像スタックの個々の画像中の画素セット（複数可）は、個々の画像内の複数のラインスキャンを取得すること、閾値レベルを設定すること、及び閾値レベル外の複数のラインスキャン中のエリア（例えば、そのエリアは、閾値レベルを下回るかまたは上回る場合に閾値外であり得る）を画素セット（複数可）として特定することによって特定され得る。ラインスキャンが本明細書で概して考察されるが、スキャンを生成する他の方法も企図される。これらの方法としては、共焦点スキャニング、ライン照明及び収集、ニッポウディスク型スキャニングなどを挙げることができる。
【０１７５】
画像中の１つ以上の液滴を特定するために、シンプルバウンダリ法を使用してもよい。シンプルバウンダリ法を行うために、閾値を上回る画像スタックの個々の画像の１つ以上の画素セットを特定し得る。画素セットは、単一の液滴、複数の液滴の部分、全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。画素セットは、画素セットのアスペクト比を決定することによって、１つの液滴に対応するものとして特定され得る。画素セットは、画素セットのアスペクト比が閾値以下であるときに、１つの液滴に対応するものとして特定され得る。閾値は、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２であり得る。
【０１７６】
画像中の液滴（複数可）を特定するために、リバースウォーターシェッド法を行ってもよい。リバースウォーターシェッド法を行うことは、画像スタックの個々の画像の画素強度に基づいてマップを生成すること、生成されたマップ中の１つ以上の画素セットを特定すること、個々の画素セットを目的領域として特定すること、及び目的領域の境界を最良適合の円と適合させることを含み得る。画素セットは、単一の液滴の一部、複数の液滴の部分、全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。画像スタックの個々の画像は、マップを生成する前に平滑化してもよい。画像スタックの個々の画像の画素強度に基づいて生成されたマップは、位相マップを含み得る。１つ以上の画素セット（複数可）を特定するために、個々の画素が背景画素を含むかまたは液滴画素を含むかを、個々の画素の画素強度及び１つ以上の閾値に基づいて決定し得る。個々の画素セットは、個々の画素セットが必要最低限のエリアを上回るエリアを有するときに、目的領域として特定され得る。更に、個々の画素セットが複数の目的領域を含むか否かを決定してもよく、複数の目的領域を単一の目的領域に組み合わせてもよい。目的領域は、単一の液滴の一部、複数の液滴の部分、全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。
【０１７７】
画像中の１つ以上の液滴を特定するために、円検出法を行ってもよい。円検出法を行うために、閾値を上回る画像スタックの個々の画像の１つ以上の画素セットを特定し得、複数の円を特定された１つ以上の画素セット上に重ね合わせてもよく、重ね合わせた複数の円の１つ以上の円を、この１つ以上の円が少なくとも１つの所定の基準を満たさない場合に拒否してもよく、１つ以上の残りの円を、液滴に対応するものとして特定してもよい。画素セットは、単一の液滴の一部、複数の液滴の部分、全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。
【０１７８】
画像中の１つ以上の液滴を特定するために、リバースウォーターシェッド及び円検出複合法を行ってもよい。リバースウォーターシェッド及び円検出複合法を行うために、画像スタックの個々の画像の画素強度に基づくマップを生成し得、マップ中の１つ以上の画素セットを特定してもよく、個々の画素セットを目的領域として特定してもよく、複数の円を目的領域上に重ね合わせてもよく、重ね合わせた複数の円の１つ以上の円を、この１つ以上の円が少なくとも１つの所定の基準を満たさない場合に拒否してもよく、１つ以上の残りの円を、１つの液滴に対応するものとして特定してもよい。画素セットは、単一の液滴の一部、複数の液滴の部分、全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。画像スタックの個々の画像は、マップを生成する前に平滑化してもよい。画像スタックの個々の画像の画素強度に基づくマップは、位相マップを含み得る。１つ以上の画素セットを特定するために、個々の画素が、背景画素を含むかまたは液滴画素を含むかを、個々の画素の画素強度及び１つ以上の閾値に基づいて決定し得る。目的領域は、単一の液滴の一部、複数の液滴の部分、全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。
【０１７９】
個々の画素セットは、個々の画素セットが必要最低限のエリアを上回るエリアを有する場合に、目的領域を含むと決定されてもよい。少なくとも１つの所定の基準は、（ｉ）目的領域の外部境界画素の最大部分を含む１つ以上の円を選択すること、（ｉｉ）目的領域のエリアの最大部分を含む１つ以上の円を選択すること、（ｉｉｉ）目的領域とは異なる画素グループからの画素を含む１つ以上の円を拒否すること、（ｉｖ）実質的な複数のグループ外の画素を含む１つ以上の円を拒否すること、または（ｖ）円の円周の実質的な一部が前記画素グループの内部にある、１つ以上の円を判別すること、のうちの１つ以上を含んでもよい。
【０１８０】
１つ以上の円を拒否するために、複数の対で重なり合った円を検査してもよい。検査した円は、第１の円及び第２の円を含み得る。更に、第１または第２の円のうちの１つは、ユーザによって定義され得る票に基づいて拒否されてもよい。
【０１８１】
１つ以上の残りの円は、この１つ以上の残りの円を１つの液滴に割り当てることによって、１つの液滴に対応するものとして特定され得る。１つ以上の円は、（ｉ）最良の適合度統計を持つ、液滴、円に、液滴に、割り当てること、または（ｉｉ）目的領域を、エリアにおける目的領域の１つ以上の円との最大の重複を有する液滴に割り当てること、のうちの１つ以上に基づいて、１つの液滴に割り当てられてもよい。
【０１８２】
特定された液滴の体積を目的領域に基づいて決定するために、その液滴に対応する１つ以上の特定された円の１つ以上の直径を決定してもよい。
【０１８３】
様々な態様において、本開示は、デジタルアッセイを行うためのシステムを提供する。本システムは、容器、撮像ソース、及びコンピューティングデバイスを含んでもよい。容器は、複数の多分散液滴を保持するように構成され得る。液滴の少なくともいくつかは、検出可能な薬剤で標識された試料を含み得る。撮像ソースは、容器中に保持された複数の多分散液滴の画像スタックを取得するように構成され得る。コンピューティングデバイスは、撮像ソースを操作するように構成され得る。コンピューティングデバイスは、プロセッサ及びメモリ（例えば、ＲＯＭ、ＲＡＭ、フラッシュメモリ、または同様のものなどの、非一時的有形コンピュータ可読記憶媒体）を含んでもよい。メモリは、プロセッサによって実行されるときに、（ｉ）撮像ソースに、容器中に保持された複数の多分散液滴の画像スタックを取得させ、（ｉｉ）プロセッサに、複数の多分散液滴の体積を取得した画像スタックに基づいて決定させ、（ｉｉｉ）プロセッサに、複数の多分散液滴中の検出可能な薬剤の有無を決定させ、（ｉｖ）プロセッサに、複数の液滴中の試料の濃度を、複数の多分散液滴中の検出可能な薬剤の有無、及び複数の多分散液滴の体積に基づいて決定させる、１組の命令を記憶し得る。
【０１８４】
容器はマルチウェルプレートを含んでもよい。撮像ソースは光学撮像ソースを含んでもよい。光学撮像ソースは、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を行うように構成され得る。
【０１８５】
取得された画像スタックは、単一の液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含み得る。画像スタックは、単一の液滴について別々の焦点深度から撮られた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００枚の画像を含んでもよい。
【０１８６】
１組の命令は、プロセッサによって実行されるときに、プロセッサに、（ｉ）画像スタックの個々の画像（複数可）における画素セット（複数可）を特定すること、（ｉｉ）画素セット（複数可）を、少なくとも１つの液滴（単一の液滴、複数の液滴の部分、全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含み得る）の少なくとも一部に対応するものとして特定すること、（ｉｉｉ）個々の液滴を画素セット（単数または複数）から特定すること、及び（ｉｖ）特定された液滴（複数可）の体積を画素セット（複数可）に基づいて決定すること、によって、複数の多分散液滴の体積を決定させてもよい。
【０１８７】
試料はヌクレオチドを含んでもよい。試料は増幅されていてもよい。検出可能な薬剤は、蛍光性または発光性であり得る。複数の多分散液滴は、第１の流体及び第２の流体を含んでもよく、第１の流体は、第２の流体と非混和性であってもよい。
【０１８８】
本開示のシステムは、体積、及び複数の液滴中の試料の有無を分析するように構成された検出システムを更に含む。検出システムは、体積の内容物を分析するため、液滴の体積及び／または他の目的特徴を決定するための検出器を含み得る。本明細書に記載の方法は、体積（例えば、液滴及び／またはウェル）を検出及び分析することができるいずれの既知のシステムとも概して互換性がある。
【０１８９】
様々な態様において、本開示は、試料のデジタル測定を行うためのシステム及び方法を提供する。ある特定の態様において、液滴が特定され、それらの体積は、本明細書に記載のシステム及び方法を使用して測定され得る。いくつかの態様において、液滴の体積は、所与の液滴に対する画像スタックを取得することによって測定される。画像スタック中の各画像は、単一面で取られた測定に対応する。所与の液滴において２つ以上の面に対して画像を取得することで、液滴体積の決定が可能となる。液滴が十分に小さい場合、その体積を画像スタックの単一の画像においてその外観から決定することが可能であり得る。画像スタックはまた、「ｚスタック」とも称され得、これは、典型的には、焦平面が、ユーザによって選択された顕微鏡の光学システムのｚ方向の距離によって分離されるためである。所与のｚスタックの高さは、使用される顕微鏡対物の作動距離と同じ大きさであり得る。更なる態様において、所与の液滴中の試料の有無が所与の液滴について決定され得る。ある特定の態様において、液滴体積、及び複数の液滴の各々における試料の有無の決定を使用して、複数の多分散液滴中の任意の所与の液滴が試料を含み得る確率を決定することができ、その後これを使用して、試料の濃度を決定することができる。
【０１９０】
様々な態様において、本開示は、デジタル測定を使用して試料の濃度を決定するためのシステムを提供する。本システムは、体積分布を有する複数の多分散液滴を含む試料ホルダ；液滴サイズ（即ち、体積）、及び複数の多分散液滴の少なくとも１つの液滴中に含まれる検出可能な薬剤を検出するための検出器；ならびに実行可能な命令が記憶されたメモリデバイスを含むコンピュータを含むことができ、これらの命令は、プロセッサによって実行されるときに、プロセッサに、体積分布を有する複数の多分散液滴を分析して液滴の体積を決定させ、それらが検出可能な薬剤を含むか否かを分析して試料の濃度を決定させる、得る。いくつかの態様においては、試料中の検出可能な薬剤の濃度を使用して、試料濃度を計算する。様々な態様において、検出可能な薬剤の濃度は、試料の濃度と直接的に相関する。
【０１９１】
様々な態様において、液滴径、及び検出可能な薬剤の存在は、光学検出方法によって検出される。光の存在などの測定可能な光学特性を検出することによって動作する任意の検出器またはその構成要素は、光学検出器を含む。光学検出器の例としては、カメラ、光電子倍増管、フォトダイオード及びフォトダイオードアレイ、ならびに顕微鏡、及び対物レンズ、光学フィルタ、鏡などのその関連する構成要素が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９２】
ある特定の態様において、光学検出器または他の好適な検出器によって検出されたシグナルは、検出器によって測定されるシグナルを解読するために処理される。ある特定の態様において、測定された情報は、例えば光学検出器などの検出器によって獲得された情報を記憶及び／または処理するデバイス、装置、またはそれらの構成要素によって処理される。情報プロセッサの例としては、検出器によって獲得された情報を記憶するパーソナルコンピューティングデバイス、及び情報を処理するパーソナルコンピューティングデバイス上で実行されるソフトウェアが挙げられるが、これらに限定されない。他の態様において、情報プロセッサまたはその構成要素は、永久的または一時的にカメラによって獲得された光学情報を記憶するカメラ中に埋め込まれたチップの中など、検出器の中に埋め込まれ得る。他の態様において、情報プロセッサ及び検出器は、デジタルアッセイを行うために光学情報の獲得及び処理を両方行うデバイスの構成要素であり得る。
【０１９３】
また別の態様において、本システムは、デジタルアッセイを実施するためのコンピュータ可読記憶媒体を含むことができる。コンピュータ可読記憶媒体は、それに記憶された命令を有し、この命令は、コンピュータの１つ以上のプロセッサによって実行されるときに、コンピュータに、体積分布を有する複数の液滴を分析して、検出可能な薬剤を含む複数の液滴の数を決定させ、複数の液滴における液滴の数、複数の液滴のいくつかまたは全ての体積、及び１つ以上の検出可能な薬剤を含む第２の複数の液滴の数を使用して、試料中の検出可能な薬剤の濃度を決定させる。
【０１９４】
別の態様においては、体積を分析して、所与の液滴についての情報を検出及び計算するためのシステムが提供される。本システムは、１つ以上のプロセッサと、その１つ以上のプロセッサによって実行可能な命令を含むメモリデバイスとを含む。命令が１つ以上のプロセッサによって実行されるとき、本システムは、少なくともユーザ入力を受信して、体積（例えば、複数の液滴）を分析する。本システムは、体積（例えば、液滴）の数を計数し、体積分布中の複数の液滴の体積を決定し、１つ以上の検出可能な薬剤を含む液滴の数を使用して試料中の検出可能な薬剤の濃度を決定するなど、本開示の方法の態様を実行するように構成され得る。本システムはまた、ユーザにデータを提供する。ユーザに提供されるデータは、試料中の検出可能な薬剤の濃度または試料濃度を含み得る。
【０１９５】
本開示のいくつかの態様において、液滴中の１つ以上の標的分子の存在は、特定の波長域における蛍光の増加によって示される。いくつかの態様において、ＰＣＲ反応産物は、特定の波長域における蛍光（指示蛍光）の増加によって標的分子の存在を示す。いくつかの態様においては、参照薬剤を標的分子と併用することができる。この態様に従うと、液滴は、標的分子の存在の有無に関わらず、標的分子の波長域とは別の波長域において蛍光（即ち、参照蛍光）を発する。所与の液滴のセットに対して、別々の指示蛍光の画像のセットと参照蛍光の画像のセットとが取得され、各々における液滴が特定及び測定される。所与の液滴からの指示蛍光及び参照蛍光を比較し得る。いくつかの態様においては、指示蛍光対参照蛍光の比率を使用して、その特定の液滴が標的分子を含むか否かを示すことができる。他の態様において、指示蛍光の絶対強度は、液滴が標的を含むかどうかを示すのに十分であり得る。いくつかの態様においては、指示強度及び参照強度の蛍光強度を比較する前に、背景画素の平均値またはその倍数を液滴内の画素強度から減算し得る。この分析を行うことによって、液滴径のリストが取得され、測定された液滴の各々について、液滴が占有される（１つ以上の標的分子含む）か否かを規定する２値測定が取得される。その後、液滴サイズのリスト及び占有される液滴の総数を使用して、標的の試料の濃度を取得することができる。
【０１９６】
本開示の方法を適用しながらも、エマルション中の多分散液滴のサイズ、内容物、及び／または他の態様を測定するための可能な方法は多数存在する。いくつかの態様において、液滴は、フローサイトメーターを備える光学検出器によって光学的に測定することができる。この態様に従うと、液滴は大型のフローチャネルを通って流れ得、ここでは、液滴形状は変形せず、その体積は、液滴が光励起ソースを通過するときに、光電子倍増管などの光学検出器によって獲得された光散乱パターンの測定に基づいて、コンピュータソフトウェアによって決定され得る。他の態様において、液滴は狭いフローチャネルを通過し得、ここでは、液滴はチャネル幅に従う。この態様に従うと、多分散液滴の体積は、チャネル幅及びチャネルにおける個々の液滴の長さを使用してその体積を規定することによって決定され得る。
【０１９７】
様々なシグナル検出方法を本開示に従って使用することができる。様々な態様において、本方法及びシステムは、検出方法及び光学検出器を使用する液滴態様の検出を提供する。いくつかの態様において、エマルションシステムは、蛍光顕微鏡及びその関連する構成要素を備える蛍光顕微鏡光学検出器によって光学的に測定することができる。画像は、例えば、共焦点レーザー走査顕微鏡、スピニングディスク（ニッポウディスク）共焦点顕微鏡、またはプログラム可能な鏡のアレイ若しくは空間光変調器を使用して複数の焦点深度からデータを取得する顕微鏡を用いて獲得し得る。他の態様において、画像は、落射蛍光顕微鏡を用いて獲得することができる。いくつかの態様において、落射蛍光顕微鏡を用いて獲得した画像は、続いて、コンピュータソフトウェアによって実行される３Ｄデコンボリュ―ションアルゴリズムを使用して処理し得る。他の態様において、画像は、二光子顕微鏡などの多光子顕微鏡を用いて獲得することができる。他の態様において、画像は、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、明視野撮像法、暗視野撮像法、または斜照法を使用して獲得することができる。いくつかの態様において、画像は、本明細書に挙げる撮像デバイス及び方法の組み合わせ、または本方法に合理的に適用され得る任意の他の好適な撮像デバイス及び方法を使用して、獲得し得る。
【０１９８】
液滴撮像の方法は、液滴サイズ、及び液滴が目的標的分子を含むか否かの両方についての情報を提供し、この情報は、試料濃度の決定のために本方法に従って使用される。いくつかの態様において、液滴サイズ及びシグナル強度は、共焦点蛍光顕微鏡法を使用して獲得された光学情報に基づいて決定され得る。この態様に従うと、エマルションは、ウェル、チャンバ、または他の容器中に貯蔵され得、画像スタックの複数のセットがそれから獲得され得る。いくつかの態様において、所与の多分散液滴試料中の各試料エリアについて画像スタックが収集され、これは、ほぼ同じＸＹ位置（同じ試料エリア）であるが異なるＺ位置（異なる深度）にて撮られた少なくとも２枚の画像からなる。Ｚにおける間隔よりも大きい試料エリア中の液滴（複数可）は、ほぼ同じＸＹ位置であるが異なる直径で、複数のフレーム中に現れることになる。画像スタックにより、液滴サイズ、及び液滴中の標的分析物の有無を含む、様々なパラメータの決定が可能となる。
【０１９９】
いくつかの態様において、液滴径は、最大径を含むＺスタックのフレームにおいて決定される液滴の境界のみに基づいて、情報プロセッサによって決定される。他の態様においては、液滴径は、Ｚスタックにおける複数の画像にて決定される液滴の境界、及びＺ次元における画像の相対位置に基づいて、情報プロセッサによって決定される。この方法は、２つの流体の屈折率、２つの流体の相対密度、及び表面張力を含む複数の因子に応じて、球形液滴形状、またはいくつかの他の修正された形状の仮定を含み得る。
【０２００】
本開示に従って個々の液滴を特定及び選択するための方法は多数存在する。一態様において、ラインスキャンが画像内で取得され、適切な閾値レベルを設定した後、目的領域の直径が測定される。別の態様において、各画像に対する閾値が選択され、この閾値を上回るエリアが可能性のある単一の液滴と評価される。エリアが十分な円形である場合（即ち、選択された閾値レベルを下回るアスペクト比を有する）場合には、そのエリアは単一の液滴であると見なされる。液滴のリストが各画像について生成される。
【０２０１】
いくつかの態様において、画像中の液滴が特定されると、これらは画像スタックの異なるフレーム間で相関される。最大の液滴は１つ超のイメージにおいて現れることになるため、円の痕跡を画像スタックのフレームによって特定することが必要である。液滴相関は、当業者には既知である任意の数の好適な追跡アルゴリズムを使用することによって容易に達成し得る。追跡は、液滴がフレーム間で著しく移動しないことによって、及び目的液滴が極めて大きい（画素において）ことから、概して促進される。本開示に従い、特定の液滴の直径は、画像スタック中のそれに関連する最大の円の直径とし得る。あるいは、曲線を、特定の液滴の円径及びその曲線から補間した最大径に適合させ得る。その後、この最大径を液滴径として使用し得る。本開示の様々な態様においては、画像スタック中の複数の画像を取得及び使用して、所与の液滴についての様々な目的パラメータを決定し、液滴自体は、更なるアッセイを受ける必要がない。
【０２０２】
本方法は自動化が可能であり、任意の好適な方法を、液滴、及びこれらの液滴内に含まれる試料の特定、選択、及び分析に使用することができる。例示的な方法としては、ラインスキャン法、シンプルバウンダリ法、リバースウォーターシェッド法、改良リバースウォーターシェッド法、円検出法、円ハフ変換法、及びリバースウォーターシェッド及び円検出複合法が挙げられる。他の方法も企図され、本開示の範囲内である。これらの方法の各々を以下に記載する。
【０２０３】
ラインスキャン法。本開示の一態様においては、ラインスキャン法を使用して、多分散液滴システムにおいて液滴を分析することができる。この態様に従うと、画像内でラインスキャンが取得され、適切なシグナル閾値レベルを設定した後に、目的領域の直径が測定される。
【０２０４】
シンプルバウンダリ法。本開示の一態様においては、シンプルバウンダリ法を使用して、多分散液滴システムにおいて液滴を分析することができる。この態様に従うと、各画像に対する閾値が最初に選択される。閾値を上回る所与の試料中の画素セットが、可能性のある単一の液滴として評価される。画素セットが十分な円形である（即ち、選択されたレベルを下回るアスペクト比を有する）場合には、そのエリアは単一の液滴であると見なされる。続いて、液滴のリストが各画像について生成される。
【０２０５】
リバースウォーターシェッド法。本開示の一態様においては、リバースウォーターシェッド法を使用して、多分散液滴システムにおいて液滴を分析することができる。標準的なウォーターシェッド法では、画像の画素強度は、３Ｄ位相マップ中の高度として扱われる。「水」は極小値で導入され、グローバルゼロ点に対する水の高さは、全ての「プール」について同じである。水の高さが均一に上昇するにつれ、異なるプール中の水は混合することになる。異なるプールが混合する画素の場所を使用して、画像内で別々の領域を構築する。
【０２０６】
リバースウォーターシェッド法において、画素は同じように扱われるが、「水」位は、最初は画像中の最も高い「ピーク」の上に位置付けられ、その後、排水されて、画像全体で同じ水の高さを維持する。水位が下降するにつれて、最も強度の高い画素は、小さい島として水から突出することになる。これらは、液滴の可能性のある重心として記録され、各「島」のサイズは、水位が下降するときに追跡される。このプロセスは、水位が所定の閾値に下降するまで継続する。島は、単一の液滴の全てまたは一部であり得る領域として扱われる。測定ノイズに起因して、単一の液滴が、その中に、上のプロセス中に浮上した２つ以上のピークを有することが可能である。図１は、グレースケーで示す典型的な画像を表す。リバースウォーターシェッド法は、これらのパラメータ内に収まる任意の好適な手法によって行うことができる。以下の実施例３はステップの例示的なセットを記載すし、これらのステップによって、リバースウォーターシェッド法が本開示の態様に従い行われ得る。
【０２０７】
本開示のいくつかの態様に従い、リバースウォーターシェッド法は、まず各画像の背景内のシグナルの標準偏差を決定し、それにシグナル対ノイズ比（典型的には、２．５〜３．５であるが、シグナル対ノイズ比は、画像中に存在するノイズの量に応じてユーザによって調整され得る）を掛け、結果を背景画素の平均強度に加算することによって行われ得る。このプロセスは、反復して進行し得、背景カットオフの初期予測を使用して、推定背景画素（強度が初期予測未満である画素）を特定する。今度は、これらの画素の強度を使用して、背景画素の強度の平均及び標準偏差を計算する。その後、新たな平均及び標準偏差を使用して、新たな背景カットオフを予測する。新たな背景カットオフが元の背景カットオフと著しく異なる場合には、元の背景カットオフと新たな背景カットオフとが一致するまで本プロセスを繰り返す。
【０２０８】
背景カットオフを決定するための他の方法も使用することができる。いくつかの態様において、ユーザは、カットオフを定義して背景画素を特定し、上記の反復法を実施しないことを選択してもよい。いくつかの態様において、ユーザは、画像内のある特定の画素を背景画素として特定し、これらの画素から背景及び標準偏差を計算することを選択し得る。他の態様において、ユーザは、中に試料を有しない撮られた画像（即ち、暗画像）中の画素の平均及び標準偏差を計算し得る。以下に記載のように、背景画素の平均値は、蛍光を分析して、どの液滴が標的分子を含むかを決定することに使用することができる。
【０２０９】
本開示のいくつかの態様に従い、次にカットオフ閾値を選択される。カットオフ閾値は、典型的には、画像の最大画素強度で、またはその付近で選択される。このカットオフ閾値は、それが最小カットオフ閾値（ＳＣＴ）に達するまで段階的に下げられる。いくつかの態様において、ＳＣＴは、背景閾値（ＢＴ）に相当する。他の態様において、ＳＣＴは、背景画素強度の平均及び標準偏差から計算される異なる値であり得る。他の態様において、ＳＣＴは、ユーザ定義の値であり得る。ＳＣＴが決定されると、ユーザは、段階の数及び逐次的カットオフ閾値間の間隔を選択する。ＳＣＴは、液滴の一部である画素を特定するように選択される。ＢＴは、背景の一部である画素を特定するように選択される。いくつかの態様において、ＢＴはＳＣＴ未満であり得、この場合、液滴にも背景にも割り当てられていない画素がいくつか存在し得る。
【０２１０】
本開示のいくつかの態様に従い、その後、撮像分析ソフトウェアを各段階で使用して、現在の段階のカットオフ閾値を上回る画像における連結した画素のセット（以降は単純に「画素セット」と称する）を見つけることができる。いくつかの態様において、ユーザは、画素のセットが４連結か８連結かであることを要求し得る。正方アレイの画素のセットは、各画素がセット中の少なくとも１つの他の画素と平行にまたは垂直に隣接する場合に、「４連結」と見なされる。正方アレイの画素のセットは、各画素がセット中の少なくとも１つの他の画素と平行に、垂直に、または斜めに隣接する場合に、「８連結」と見なされる。いくつかの態様においては、異なる形態の連結を使用して、画像中の画素の連結したセットを定義することができる。いくつかの態様においては、ユーザによって定義される構造化要素を使用して、カットオフによって決定される画素の連結したセットを形態上閉鎖することができる。かかる画素セットのエリアが、ユーザによって定義される基準（即ち、「最低限必要なエリア」または「ＭＲＡ」）を超過する場合には、目的領域（ＲＯＩ）とマークされる。所与の画素セットがＲＯＩとして容認される前にＭＲＡを使用することによって、背景画素中のノイズを判別することが可能である。ノイズは、背景中の単離した画素が所望のＳＣＴよりも大きい強度を有するようにし得る。ユーザによって定義されるＭＲＡを使用して、かかる単離した画素を除外することができる。ＭＲＡは、ＭＲＡよりも大きいエリアを有する連結した背景画素の所与のセット全てがＳＣＴよりも大きい強度を有し得る確率が、見つかった物体が背景中のノイズではなく実際には液滴であることをユーザが確信するのに十分に小さいように、選択される。ＭＲＡのサイズは、液滴エリア内のノイズの量、及びユーザが特定を望む画像中の最小の液滴のエリアに基づいて選択され得る。
【０２１１】
ＲＯＩが画像の特定の場所に現れると、そのエリアは、カットオフ閾値が減少する際に追跡され得る。各ＲＯＩ内の最大強度画素の場所、及びＲＯＩ内の画素の値も追跡され得る。ＳＣＴによって特定される画素セットは、「グループ」と称される。グループが１つ超の液滴を含む場合、グループ内部の画素の領域は、実際に、液滴間のスペースを表し得る。３つ以上の液滴が単一のグループに含まれる場合、グループの内部に孔として現れ得る間隙が液滴間に存在し得る可能性がある。いくつかの態様においては、孔を特定するための孔−閾値（ＨＴ）を適用して、単一のグループ内部の連結した画素で構成される、可能性のある孔を見つける。ユーザ指定の孔の最小サイズは、孔を画像中のノイズと区別するように指定される。エリアが孔の最小サイズ以上である連結した画素のセットのみが、孔とマークされ得る。いくつかの態様において、ＨＴはＳＣＴと等しくあり得る。他の態様において、ユーザは、ＳＣＴと等しくなかったＨＴを選択することができる。
【０２１２】
グループの外部境界は、ＳＣＴを下回る強度のグループの外である画素に隣接する、及び／またはグループの内側にあり孔の中の画素に隣接する、グループ内の画素で構成される。これらの画素は、グループ外の画素と称される。リバースウォーターシェッド手順は、こうして、同じ液滴の一部である外部境界画素を特定し、これらの外部境界画素に対する最良適合の円を、既存の最適化方法を使用して決定する。
【０２１３】
本開示のいくつかの態様に従うと、カットオフ閾値が低下するときに、２つ以上のＲＯＩが融合し得る。特定のカットオフ閾値レベルを上回る画素セットは、より大きいカットオフ閾値に分離させた２つ以上のＲＯＩを含み得る。これが起こり得る理由は、異なるＲＯＩが、共に非常に近いために、それらの間の境界領域が現行のカットオフ閾値よりも大きい画素強度を有する、異なる液滴を表すためか、または試料中のノイズの増幅が、単一の液滴内の２つ以上の領域が極大値を呈するのに十分大きいためかのいずれかである。これらの最大値は、より大きいカットオフ閾値での別々のＲＯＩとしてアルゴリズムに現れ得る。
【０２１４】
本開示の更なる態様に従い、ユーザによって定義される基準を使用して、それらのエリアが現行のステップの同じ画素セット内に含まれる異なるＲＯＩが、（ａ）融合し、その後１つのＲＯＩとして処理されるべきか、または（ｂ）融合せず、別々のＲＯＩとして追跡されるべきかを決定することができる。これらの基準としては、（ｉ）異なるＲＯＩの最大強度画素間の距離、及び／または（ｉｉ）画素セット中でそれらを分離する最小強度画素と比較した、異なるＲＯＩの最大強度画素の値、及び／または（ｉｉｉ）異なるＲＯＩの平滑化の後の最大強度画素の値、を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２１５】
上記の基準（ｉ）については、平滑化したバージョンの画像を、実際の画像の代わりに使用することができる。画像の平滑化は、２つのＲＯＩの「ピーク」間の距離を評定することにおけるノイズの影響を減少させ得る。加えて、上記の基準（ｉ）については、ＲＯＩの中心の重心または別の推定量を使用することもできる。この例としては、各画素が重心の決定に同重量寄与する、重み付けしない重心、または各画素が重心にその強度の何らかの関数と等しい重量寄与する、重み付けした重心が挙げられる。
【０２１６】
上記の基準（ｉｉ）については、ＲＯＩが別々の液滴の部分である場合、それらは、強度が２つのＲＯＩのピークよりも著しく小さい画素の領域によって分離され得ることが予期され得る。代わりに２つのピーク間に存在する画素の強度がピークの強度と同様である場合には、２つのＲＯＩは実際には同じ液滴の一部であり、組み合わされるべきであると結論付け得る。ユーザによって定義される基準は、画像の任意の特性に依存する関数に基づき得、これらの特性としては、（ａ）ＲＯＩの最大ピーク強度、（ｂ）平滑化後のＲＯＩの最大ピーク強度、（ｃ）平均背景強度、（ｄ）背景強度の標準偏差、（ｅ）現行の画素セットを決定するために使用されるカットオフレベル、または（ｆ）任意の恣意的なユーザ指定の値を挙げることができる。
【０２１７】
上記の基準（ｉｉｉ）については、いくつかの態様において、画像中のノイズは、はるかに小さい強度の画素によって取り囲まれる最大強度のＲＯＩを含む単一の画素をもたらし得る。これは、一部の場合には平滑化によって明らかとなり得、これは、平滑化後のＲＯＩの最大画素強度が著しく低くなり得るためである。かかる平滑化が、ＲＯＩの最大強度を、ユーザによって定義されるレベルを下回って減少させる場合には、２つのＲＯＩは同じ液滴の一部であると決定され、組み合わされ得る。ユーザによって定義されるレベルは、画像の任意の特性に依存する関数であり得、これらの特性としては、（ａ）ＲＯＩの最大ピーク強度、（ｂ）平滑化後のＲＯＩの最大ピーク強度、（ｃ）平均背景強度、（ｄ）背景強度の標準偏差、（ｅ）現行の画素セットを決定するために使用されるカットオフレベル、または（ｆ）任意の恣意的なユーザ指定の値を挙げることができる。
【０２１８】
本開示のある特定の態様に従い、それらのエリアが現行のステップの同じ画素セット内に含まれる異なるＲＯＩが融合しない場合には、ＲＯＩに事前に割り当てられていなかったその画素セットの画素は、以下の２つの可能性のある方法など、いくつかの方法のうちの１つによって割り当てられる必要がある。第１に、画素セット内の割り当てられていない画素のリストを強度によって分類し、ＲＯＩのうちの１つのみに直接隣接する最大強度の画素を、そのＲＯＩに割り当てる。このプロセスを、残っている唯一の割り当てられていない画素が２つ以上の異なるＲＯＩに直接隣接するものとなるまで繰り返し、この場合、これらの画素は割り当てられていないままとなる。第２に、割り当てられていない画素は、最後のステップが終わる（即ち、ＳＣＴが使用され、その後画素セットがグループと称される）まで、割り当てられていないままであり得る。この場合、本段落の上で記載した第１の方法が、その後、グループの割り当てられていない画素の全てに適用される。
【０２１９】
本開示のある特定の態様に従い、この時点での本手順の結果を液滴画像に適用することができる。この態様に従い、液滴画像は、強度がＳＣＴを下回る画素によって分離されるグループに分割し得る。グループのうちのいくつかは単一のＲＯＩのみを含み、いくつかは２つ以上のＲＯＩを含む。境界画素は、グループ外の画素に隣接するグループに属する画素である。
【０２２０】
本開示のある特定の態様に従うと、グループが単一のＲＯＩのみから成る場合には、それは単一の液滴であると見なされ、その境界画素を円に適合させて、液滴径を取得する。
【０２２１】
本開示の更なる態様に従うと、グループが２つ以上のＲＯＩから成る場合には、そのグループからのＲＯＩのセット（即ち、１つ以上のＲＯＩを含むセット）を分析される。分析されるセットの一部である境界画素を円に適合させる。その後、ユーザによって定義される基準を最良適合の円に適用して、セットのＲＯＩを組み合わせて、単一の液滴の一部と見なすべきであるか否かを決定する。この手順は、反復して適用し、一度に１つのＲＯＩずつ液滴を統合することができる。どのＲＯＩの組み合わせを確認するかを決定するために使用し得る可能性のある基準としては、（ｉ）互いに隣接する（グループ内のそれらの内部境界が互いに近接している）ＲＯＩの対を確認すること、（ｉｉ）その最良適合の円が互いに近い中心を有するＲＯＩの対を確認すること、及び（ｉｉｉ）そのエリアが別のＲＯＩまたはＲＯＩのセットの最良適合の円の内部に実質的に存在するＲＯＩを確認すること、が挙げられるが、これらに限定されない。２つ以上のＲＯＩを組み合わせて単一の液滴と分類するべきかを決定するために使用し得る可能性のある基準としては、（ｉ）適合の質（平均２乗誤差または所与の適合度の何らかの他の統計的測定によって定義される）、（ｉｉ）最良適合の円の内に存在する、セットからのＲＯＩのエリアの量、（ｉｉｉ）画像背景中の画素から成る、最良適合の円の内のエリアの量、（ｉｖ）適合に含まれる境界画素の真円度、が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２２】
別の態様において、上記のプロトコルは、更なる改変を含み得る。この手順に対する可能性のある改変は、グループの境界画素を検査すること、及びノイズであるように見える画素のいずれの適合も含めないことを含み得る。使用し得る基準の例は、グループの内部画素に隣接しないいずれの境界画素も、境界の円へのいずれの適合にも含まれないことである。この例では、内部画素は、グループのメンバーであるが、境界画素ではない、即ち、グループ外の画素に隣接しない、画素であり得る。
【０２２３】
上述のリバースウォーターシェッド法に対する別の可能性のある改変は、ＢＴとＳＣＴとが異なり得ることであり得る。最小カットオフ閾値未満の背景閾値を使用して、特性化するには微かすぎる物体を含むエリアを背景画素のセットから排除することができる。これらのエリアは、液滴の異なる焦平面、分析される試料の焦平面の上または下からのシグナルを含み得る。これの典型的な例は、試料を蛍光顕微鏡で撮像するときに発生する。Ｚ方向の顕微鏡の分解能の限界に起因して、一方の焦平面からの蛍光は、もう一方の焦平面の画像へと裏抜けし得る。
【０２２４】
上記のリバースウォーターシェッド法に対する他の改変が本開示に従って可能である。この手順に対する可能性のある改変は、グループの境界画素を検査すること、及びノイズであるように見える画素のいずれの適合も含めないことを含み得る。使用し得る基準の例は、例えば、グループの内部画素に隣接するいずれの境界画素も境界の円へのいずれの適合にも含まれないという仮定を採用することである。この仮定に従うと、内部画素は、グループのメンバーであるが、境界画素ではない、即ち、グループ外の画素に隣接しない、画素であり得る。
【０２２５】
ある特定の態様において、リバースウォーターシェッド法は、ＢＴとＳＣＴとが異なることが認められるように改変することができる。ＳＣＴ未満のＢＴを使用して、特性化するには微かすぎる物体を含むエリアを背景画素のセットから排除することができる。これらのエリアは、液滴の異なる焦平面、分析される試料の焦平面の上または下からのシグナルを含み得る。これの典型的な例は、試料を蛍光顕微鏡で撮像するときに発生する。Ｚ方向の顕微鏡の分解能の限界に起因して、一方の焦平面からの蛍光は、もう一方の焦平面の画像へと裏抜けし得る。
【０２２６】
円検出法。本開示の一態様においては、円検出法を使用して、多分散液滴システムにおいて液滴を分析することができる。この方法に従い、閾値（上のリバースウォーターシェッド法について決定されたもの）を画像に適用する。リバースウォーターシェッド法において記載したように、ＳＣＴを使用してグループを特定することができるが、ＲＯＩは特定されない。リバースウォーターシェッド法において記載したように、孔−閾値を適用して単一のグループ内の孔を特定することもできる。孔−閾値を特定した後、リバースウォーターシェッド法において記載したように、各グループの外部境界を決定し得る。いくつかの態様においては、その後、形成されたグループの境界を円ハフ変換によって分析し得る。円ハフ変換は、分析的記述がそのために存在する形状（この場合、円）を検出するための元のハフ変換の一般化である。本開示のある特定の態様に従い、円検出法は、外部境界画素（「特徴画素」としても知られる）の座標を分析して、円の全体または一部を形成する境界画素のセットを見つける。境界画素の特定は、分析される多数の可能性のある円をもたらし、液滴である可能性の高い円のみが保持される。
【０２２７】
この方法に従い、円検出法によって特定される円を、以下の実施例５に記載のように、画像に重ね合わせることができる。円検出法において示した基準を満たさない領域は破棄され得る。例えば、１つのグループの外部境界の一部または全体から形成される円は、異なる別々のグループからの画素を含むことができない。こうしてこの方法に従って適用し得る可能性のある基準としては、（ｉ）最大可能パーセンテージのグループの境界画素に隣接して重なり合うまたは存在する可能性のある円を選択すること、（ｉｉ）境界画素に隣接して重なり合うまたは存在する円周画素の割合が可能な限り１に近い、可能性のある円を選択すること、（ｉｉｉ）それらの円周の相当量が完全にグループ内にある、可能性のある円を拒否すること、（ｉｖ）エリアが相当数のグループ外の画素を含む、可能性のある円を拒否すること、（ｖ）エリアが異なるグループ中の画素を含む、可能性のある円を拒否すること、（ｖｉ）特定のグループについて、エリアがそのグループの孔における相当数の画素を含む、可能性のある円を拒否すること、及び／または（ｖｉｉ）所与の特徴画素に対する最良適合の円が低質であると判断される（即ち、質の程度は、ユーザによって定義される統計的に計算される所与の適合度の測定であり、低質の適合は、適合がユーザによって定義される基準を満たさないものである）場合に、可能性のある円を拒否すること、を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２２８】
ある特定の態様において、この時点では重なり合う円が存在してもよい。かかる対を検査して、どちらを拒否するべきかを決定し得る。かかる対に適用し得る基準としては、（ｉ）円のうちの１つにおける固有のエリア（即ち、一方の円におけるエリアであって、他方の円にはないエリア）の量が、ユーザによって定義される全エリアの割合を下回る場合には、円のうちの１つが除去されること、及び（ｉｉ）固有の特徴画素（即ち、一方の円についての特徴画素であって、もう一方の円についての特徴画素ではない）の数が、ユーザによって定義される特徴画素の総数の割合を下回る場合には、円のうちの１つが除去されること、が挙げられるが、これらに限定されない。対のうちの１つの円が除去される場合には、どちらの円が除去されることになるかを決定するのに使用される、可能性のある基準としては、（ｉ）特徴画素の数がより少ない円を除去すること、（ｉｉ）エリアが最も小さい円を除去すること、または（ｉｉｉ）グループの一部でない画素をより多く（即ち、背景にある最大数）含む円、若しくはグループの一部として含まれないそのエリアの割合がより大きい円を除去すること、を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２２９】
上の基準を適用した後でも、互いに著しく重なり合う円が更に存在し得る。かかる円を液滴として容認するか否かを決定することは、エマルションの性質に依存し得る。いくつかのエマルションシステムにおいては、液滴が、液滴を歪める（即ち、液滴に厳密な球形以外の形状をとらせる）効果を有し得る接触表面を平坦化するような方法で共に押されているのが見られることは、一般的であり得る。この場合、ユーザは、これらの液滴を含めるのか除外するのかを、かかる液滴のサイズの決定における精度についての要件に応じて決定することができる。いくつかのシステムにおいて、小さい液滴は、はるかに大きい液滴と重なり合うことができる。この場合、より小さい液滴を描く円は、はるかに大きい円の内側のそれらのエリアのかなりの割合を有し得る。十分な小さい液滴の境界がそのグループの外部境界の一部である場合、ユーザは、この小さい液滴を容認し、それを分析に含めることを選択し得る。いくつかの態様において、円は、それらの円周のかなりの割合がグループの内部にあり得る。ある特定の態様において、ユーザによって定義される基準を使用して、グループの外部境界を歪める画像中のノイズに起因して円がアーチファクトであることを根拠として、境界の指定の割合を超える円がグループの内部にある液滴を除外することができる。いくつかの態様において、２つの可能性のある同様のサイズの液滴は、相当量の重複を有する。これは、上記のように、共に押される液滴に起因する歪みにより得る。あるいは、これは光学的な歪みに起因し得、これにより、球形の液滴が画像中では楕円形状に見える。ユーザ基準を使用して、かかる円をマークし、それらを更なる分析から除外することができる。
【０２３０】
いくつかの態様において、ユーザは、適合品質試験を液滴に適用し、正確に寸定されないと見なされたものを拒否し得る。適合度統計を円の液滴の特徴画素への最良適合に対して計算することができ、液滴は、ユーザによって定義される標準を満たさない場合に拒否され得る。他の態様において、液滴内の強度を検査することができ、液滴は、何らかの測定によって総合液滴強度が低すぎる場合に拒否され得る。これが起こり得る１つの方法は、顕微鏡のｚ方向の分解能が限定されることに起因する。ｚ方向のある位置での液滴からの蛍光は、ｚ方向の異なる位置に対して撮られた試料の画像においては大きく減少した強度で現れ得る。総合強度の試験を使用して、かかる微かな物体を特定し拒否し得る。
【０２３１】
別の態様において、上記のプロトコルは、更なる改変を含み得る。この手順に対する可能性のある改変は、グループの境界画素を検査すること、及びノイズであるように見える画素のいずれの適合も含めないことを含み得る。使用し得る基準の例は、グループの内部画素に隣接しないいずれの境界画素も、境界の円へのいずれの適合にも含まれないことである。この例では、内部画素は、グループのメンバーであるが、境界画素ではない、即ち、グループ外の画素に隣接しない、画素であり得る。
【０２３２】
上述の円検出法に対する別の可能性のある改変は、ＢＴとＳＣＴとが異なり得ることであり得る。ＳＣＴ未満のＢＴを使用して、特性化するには微かすぎる物体を含むエリアを背景画素のセットから排除することができる。これらのエリアは、液滴の異なる焦平面、分析される試料の焦平面の上または下からのシグナルを含み得る。これの典型的な例は、試料を蛍光顕微鏡で撮像するときに発生する。Ｚ方向の顕微鏡の分解能の限界に起因して、一方の焦平面からの蛍光は、もう一方の焦平面の画像へと裏抜けし得る。
【０２３３】
上記の円検出法に対する他の改変が本開示に従って可能である。この手順に対する可能性のある改変は、グループの境界画素を検査すること、及びノイズであるように見える画素のいずれの適合も含めないことを含み得る。使用し得る基準の例は、例えば、グループの内部画素に隣接するいずれの境界画素も境界の円へのいずれの適合にも含まれないという仮定を採用することである。この仮定に従うと、内部画素は、グループのメンバーであるが、境界画素ではない、即ち、グループ外の画素に隣接しない、画素であり得る。
【０２３４】
円検出法に対する別の可能性のある改変は、ＢＴとＳＣＴとが異なることが認められることである。ＳＣＴ未満のＢＴを使用して、特性化するには微かすぎる物体を含むエリアを背景画素のセットから排除することができる。これらのエリアは、液滴の異なる焦平面、分析される試料の焦平面の上または下からのシグナルを含み得る。これの典型的な例は、試料を蛍光顕微鏡で撮像するときに発生する。Ｚ方向の顕微鏡の分解能の限界に起因して、一方の焦平面からの蛍光は、もう一方の焦平面の画像へと裏抜けし得る。
【０２３５】
円を分類した後、液滴を最も良好に定義する円を使用して、どの境界画素を液滴の説明に使用すべきかを見出す。その後、これらの画素を円に適合させて、液滴に対応する最良適合の円のコレクションを取得する。
【０２３６】
他の態様において、円ハフ変換法は、画像中の境界画素を分析することによって円形物体を検出するために使用し得る、異なる特徴抽出法によって置き換えることができる。
【０２３７】
リバースウォーターシェッド及び円検出複合法。本開示の更に別の態様においては、リバースウォーターシェッド法の態様と円検出法の態様とを組み合わせて、多分散液滴システムにおける液滴の分析のためのリバースウォーターシェッド及び円検出複合法をもたらす。この方法に従い、ＲＯＩ及びグループの境界画素（即ち、ＳＣＴについて見出された画素セット）を、リバースウォーターシェッド法において記載した手順を使用して決定する。その後、各ＲＯＩに対して、円ハフ変換を、ＲＯＩを含むグループの外部境界画素でもあるＲＯＩの外部境界画素に適用する。特定のＲＯＩに対する円をユーザが決定した基準に従って分類して、そのＲＯＩの境界を描く円の最小数を見出す。ほとんどの場合、円はＲＯＩ当たり１つとなる。使用し得る可能性ある基準としては、（ｉ）ＲＯＩの外部境界画素の最大の割合を含む円を選択すること、（ｉｉ）ＲＯＩのエリアの最大の割合を含む円を選択すること、（ｉｉｉ）異なるグループからの画素を含む円を拒否すること、（ｉｖ）相当数のグループ外の画素を含む円を拒否すること、（ｖ）円の円周の相当な割合がグループの内部にある円を判別すること、を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２３８】
本開示のある特定の態様に従い、ＲＯＩに対する円の初期セットを対で検査し、２つの円のうちの一方を拒否して、もう一方を選ぶ。ここで使用し得る可能性のある基準としては、（ｉ）同じまたは同様のサイズの２つの円の中心が互いに近接している場合には、票の数が最も少ない円を拒否すること、あるいは（ｉｉ）２つの円が共通して、ユーザによって定義されるそれらの票の割合を上回る場合には、票の数が最も少ない円を拒否すること、が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、可能性のあるハフ変換円が特定のＲＯＩからの外部境界画素を含む場合には、その円は、ユーザによって定義されるそのＲＯＩエリアの割合の少なくとも一部を含まない限り、拒否され得る。この場合、必要最低限の割合は、どれだけ多くのＲＯＩの境界画素がハフ変換円と関連付けられるかに依存し得る。
【０２３９】
また、複数の液滴が互いに近接している場合、２つ以上の液滴に近いが実際にはいずれの液滴の一部でもない画素の強度は、背景と比べて上昇した強度を有し得、グループの一部として含まれて、外部グループ境界の一部を形成し得る。リバースウォーターシェッド法では、このことは、グループ中に含まれる更なる画素のせいで外部境界の部分が非円形となることになるため、困難を招き得る。実際には液滴の一部ではない外部境界画素を含むことは、精度の下がった液滴の描出である最良適合の円をもたらし得る。非円形境界に繋がる上昇した画素強度を有する２つの液滴間の領域の問題は、円ハフ変換の使用によって軽減することができ、これは、円ハフ変換が、非円形境界を形成し得る画素を適合に含めることを判別するためである。
【０２４０】
ＲＯＩと関連付けられる円（単数または複数）は、ＲＯＩが一部であり得る液滴のサイズの予測である。この情報を使用して、ＲＯＩを液滴にグループ化する。例えば、同じグループ中の２つのＲＯＩと関連付けられる円が、同様の半径を有し、かつ共に近い中心を有する場合には、これら２つのＲＯＩは同じ液滴の一部であると見なされることになる。ユーザによって定義される基準を使用して、これら２つのＲＯＩを１つの液滴に組み合わせるためには、円の半径がどの程度同様である必要があるのか、及び円の中心がどの程度近い必要があるのかを決定し得る。中心がどの程度近い必要があるのかに関する基準は、２つの円のサイズに依存し得る。
【０２４１】
ＲＯＩは、２つ以上の液滴に割り当てられ得ること、または２つ以上の液滴への割り当ての対象になり得ることが可能である。いくつかの態様において、ＲＯＩが割り当てられるべき液滴を決定するための可能性のある基準としては、（ｉ）パラメータ、液滴の各々に対する最良適合の円、を使用して、検討されるＲＯＩのみの特徴画素に対する適合度統計を計算し、ＲＯＩを、円がＲＯＩの特徴画素に対して最良適合である液滴に割り当てること、または（ｉｉ）ＲＯＩを、エリアの最大の重複を有する液滴に割り当てること、が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４２】
いくつかの態様において、円を持つ全てのＲＯＩを液滴に割り当てた後、いずれの円の一部でもない残った外部境界画素のいずれかを確認して、それらが、ユーザによって定義される既存の円の境界の距離内に存在するかを確かめる。存在する場合、これらの外部境界画素は、液滴の境界中に含まれる。液滴の境界上に未だ存在する割り当てられていない外部境界画素は、ＲＯＩの外部境界がノイズによって歪められることで、円ハフ変換がそのＲＯＩに対する許容可能な円を見出さない場合に生じ得る。この場合、各液滴についての外部境界画素を円に適合させて、サイズ及び位置を取得する。著しく重なり合う液滴は、許容され、エマルションの特性に依存し得るかかる重複の量についてユーザによって定義される基準に応じて許容または破棄され得る。境界のかなり割合がグループの内部にあるように見受けられる液滴は、ユーザによって定義される基準に応じて許容または破棄され得る。加えて、ユーザがわずかに歪んだ液滴を許容することを望む場合、ハフ変換を使用して画像中の楕円を検出することができ、ユーザ設定の基準を満たす楕円（ユーザが選択した限界未満のアスペクト比を有する楕円など）を液滴として許容することができる。
【０２４３】
この方法は、更なる改変を含み得る。この手順に対する可能性のある改変は、グループの境界画素を検査すること、及びノイズであるように見える画素のいずれの適合も含めないことを含み得る。使用し得る基準の例は、グループの内部画素に隣接しないいずれの境界画素も、境界の円へのいずれの適合にも含まれないことである。この例では、内部画素は、グループのメンバーであるが、境界画素ではない、即ち、グループ外の画素に隣接しない、画素であり得る。
【０２４４】
上述のリバースウォーターシェッド及び円検出複合法に対する別の可能性のある改変は、ＢＴとＳＣＴとが異なり得ることであり得る。ＳＣＴ未満のＢＴを使用して、特定するには微かすぎる物体を含むエリアを背景画素のセットから排除することができる。これらのエリアは、液滴の異なる焦平面、分析される試料の焦平面の上または下からのシグナルを含み得る。これの典型的な例は、試料を蛍光顕微鏡で撮像するときに発生する。Ｚ方向の顕微鏡の分解能の限界に起因して、一方の焦平面からの蛍光は、もう一方の焦平面の画像へと裏抜けし得る。
【０２４５】
上記のリバースウォーターシェッド及び円検出複合法に対する他の改変が本開示に従って可能である。この手順に対する可能性のある改変は、グループの境界画素を検査すること、及びノイズであるように見える画素のいずれの適合も含めないことを含み得る。使用し得る基準の例は、例えば、グループの内部画素に隣接するいずれの境界画素も境界の円へのいずれの適合にも含まれないという仮定を採用することである。この仮定に従うと、内部画素は、グループのメンバーであるが、境界画素ではない、即ち、グループ外の画素に隣接しない、画素であり得る。
【０２４６】
別の可能性のある改変は、ＢＴとＳＣＴとが異なることが認められることである。ＳＣＴ未満のＢＴを使用して、特性化するには微かすぎる物体を含むエリアを背景画素のセットから排除することができる。これらのエリアは、液滴の異なる焦平面、分析される試料の焦平面の上または下からのシグナルを含み得る。これの典型的な例は、試料を蛍光顕微鏡で撮像するときに発生する。Ｚ方向の顕微鏡の分解能の限界に起因して、一方の焦平面からの蛍光は、もう一方の焦平面の画像へと裏抜けし得る。
【０２４７】
別の態様において、円ハフ変換は、円を特定する異なる特徴抽出法によって代置することができる。その場合、代替的な特徴抽出法によって産出される情報を使用して液滴を特定し得る。
【０２４８】
更に別の態様においては、この方法を使用して、画像中の非円形の物体を探すことができる。円ハフ変換は、所望の形状の物体を特定する特徴抽出法によって代置し得る。
【０２４９】
占有率の決定。いくつかの態様においては、液滴を特定し、そのサイズを決定した後、蛍光強度を使用して、液滴が標的分子を含んだかを決定する。
【０２５０】
いくつかの態様において、標的分子の存在は、液滴からの蛍光の増加をもたらし得る。これらの場合、強度カットオフ基準が課され得、ここでは、強度がカットオフを超過する液滴は、占有されていると見なされ、残りは空であると見なされ得る。標的分子の存在が蛍光の減少をもたらすシステムでは、強度がカットオフを超過する液滴は、空であると見なされ、他のものは占有されていると見なされ得る。両方の場合において、カットオフと比較される液滴の強度は、（ｉ）液滴内の平均強度、（ｉｉ）液滴内のピーク強度、または（ｉｉｉ）液滴内の画素の強度の任意のユーザによって選択された関数（例えば、中央強度または強度のパーセンタイルを使用することができる）であり得る。
【０２５１】
いくつかの態様において、占有率を決定するための方法は、各液滴の２枚の蛍光画像を使用し得る。画像のうちの１枚では、蛍光の強度は、液滴が占有されていたか否かにある程度まで依存し得る。もう一方の画像では、蛍光の強度は、変わらないか、または標的分子の存在によってわずかに変化し得る。比率などの２枚の画像からの液滴の強度の関数を使用して、液滴の占有率を決定することができる。単一の画像からの強度の代わりに比率または何らかの他の関数を使用することで、可能性のある機器的アーチファクトを是正することができる。更に、より大きい液滴については、撮像される平面より上の試料中の焦平面からの蛍光が画像中に現れて、その液滴内の画素の測定された強度を増加させ得る。２枚の異なる画像からの液滴の強度を使用することで、ユーザは、これらの問題を回避することができるようになり得る。分析される液滴の強度は、（ｉ）液滴内の平均強度、（ｉｉ）液滴内のピーク強度、または（ｉｉｉ）液滴内の画素の強度の任意のユーザによって選択された関数（例えば、中央強度または強度のパーセンタイルを使用することができる）であり得る。ユーザの裁量で、強度から背景を減算差してもよい。いくつかの態様において、グループを特定するために使用される平均背景は、画像中の各画素の強度から減算される。
【０２５２】
いくつかの態様において、是正された背景画素のセットがこの段階で決定される。是正されたセットを決定するための１つの方法は、グループの内部の画素のセット（グループの内側の孔に画素を含み得る）から開始することである。ユーザの裁量で、これらの画素のセットは、１つ以上の画素によって拡張（即ち、拡大）させることができる。これらの画素のセットに含まれなかった画素は、是正された背景画素のセットを形成し得る。
【０２５３】
例示的な分析システム及び方法。本明細書で考察されるように、本開示は、エマルションシステムの複数の液滴における試料の体積及び有無を分析するように構成される検出システムを含む。図２Ａは、例示的な検出システム１０００を概略的に示す。検出システムは、ユーザＵＳによって操作されるように構成されるコンピューティングデバイス１００１、コンピューティングデバイス１００１によって操作されるように構成される撮像ソース１０４０、及び撮像プラットフォームまたはソース１０４０によって撮像されるように構成され、撮像及び分析される液滴システムまたはエマルションシステム１０５５を含んでもよいマルチウェルプレート１０５０を含んでもよい。
【０２５４】
コンピューティングデバイス１００１は、本明細書に記載の方法のうちの１つ以上を実装するようにプログラミングされ得る。コンピューティングデバイス１００１は、例えば、パーソナルコンピュータ、ワークステーション、またはサーバを含み得る。コンピューティングデバイス１００１は、プロセッサ、コンピュータプロセッサ、中央処理装置、またはＣＰＵ１００５を含み得、これらは、シングルコア若しくはマルチコアプロセッサ、または並行処理のための複数のプロセッサであり得る。
【０２５５】
コンピューティングデバイス１００１はまた、メモリ１０１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ、ハードディスクなど）を含んでもよい。メモリ１０１０は、撮像ソース１０４０によって撮られたコンピュータ可読画像ファイルなどのファイルを記憶することができる。一部の場合におけるコンピューティングデバイス１００１は、コンピューティングデバイス１００１と１つ以上のネットワークを通して通信している遠隔サーバ上に位置するものなどの、コンピューティングデバイス１００１の外部にある１つ以上の更なるデータ記憶ユニットを含み得る。
【０２５６】
コンピューティングデバイス１００１は、入力／出力またはＩ／Ｏシステム１０１５を更に備えてもよく、これは、コンピューティングデバイス１００１によって使用されて、ユーザＵＳのうちの１つ以上、１つ以上の他のコンピューティングデバイス若しくはシステム、１つ以上のネットワーク（例えば、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、エクストラネット、イントラネット、インターネット、電気通信ネットワーク、データネットワーク、セルラーデータネットワークなど）、または撮像ソース１０４０、外部メモリ、様々なアダプタなどを含む１つ以上の周辺デバイスと通信することができる。Ｉ／Ｏシステム１０１５は、ディスプレイ１０２０、ユーザインターフェース１０２５、及び通信インターフェース１０３０を備えてもよい。ディスプレイ１０２０は、例えば、タッチスクリーンディスプレイを備えてもよく、これを通してユーザインターフェース１０２５がユーザＵＳにプロジェクトされる。通信インターフェース１０３０は、コンピューティングデバイス１００１が１つ以上のネットワークに接続するためのネットワークアダプタを備えてもよい。ユーザＵＳは、例えば、コンピューティングデバイス１００１を、１つ以上のネットワークを通して遠隔操作し得る。例えば、コンピューティングデバイス１００１は、ユーザＵＳのローカルであり得る撮像ソース１０４０を操作する分散コンピューティングシステムなどのクラウドを拠点とするコンピューティングシステムを備えてもよい。コンピューティングデバイス１００１は、撮像ソース１０４０と、１つ以上のネットワークを通して、または直接通信によって、通信し得る。
【０２５７】
本明細書に記載の方法は、例えば、メモリ１０１０または他の電子記憶ユニット上などの、コンピューティングデバイス１００１の電子的格納先に記憶される、機械（またはコンピュータプロセッサ）によって実行可能なコード（またはソフトウェア）を手段として実装され得る。使用中、このコードはプロセッサ１００５によって実行され得る。いくつかの場合には、コードは、記憶ユニットから検索され、プロセッサ１００５によるアクセスに備えてメモリ１０１０に記憶され得る。いくつかの状況では、電子記憶ユニットは除外され得、機械によって実行可能な命令はメモリ１０１０に記憶される。あるいは、コードは、遠隔コンピュータシステム上で実行され得る。実行されたコードは、撮像ソース１０４０を操作して、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに従って、マルチウェルプレート１０５０を撮像及び分析してもよい。コードは、コンピューティングデバイス１００１によって自動的に実行されてもよく、あるいはユーザＵＳなどの操作者によって提供される命令に従って実行されてもよい。
【０２５８】
コードは、事前にコンパイルされ、コードを実行するように適合されたプロセッサを有する機械との使用に対して構成され得るか、あるいはランタイム中にコンパイルされ得る。コードは、コードが事前にコンパイルされた様式または現状でコンパイルされた様式で実行することを可能にするように選択され得るプログラム言語で供給され得る。
【０２５９】
コンピューティングデバイス１００１などの本明細書で提供されるシステム及び方法の態様は、プログラミング中に埋め込まれ得る。本技術の様々な態様は、典型的には、機械（またはプロセッサ）によって実行可能なコード及び／または一種の機械可読媒体中に担持される若しくは埋め込まれる関連するデータの形態にある、「製品」または「製造物品」として考えられてもよい。機械によって実行可能なコードは、メモリ（例えば、読み取り専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクなどの電子記憶ユニットに記憶され得る。「記憶」型媒体は、ソフトウェアプログラミングにいかなるときも非一時的記憶を適用し得る、コンピュータ、プロセッサ、若しくは同様のものなどの有形メモリ、または様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブ、及び同様のものなどのその関連モジュール、のうちのいずれかまたは全てを含み得る。ソフトウェアの全体または一部は、ときに、インターネットまたは様々な他の電気通信ネットワークを通して通信し得る。かかる通信は、例えば、１つのコンピュータまたはプロセッサから別のものへの、例えば、管理サーバまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのロードを可能にしてもよい。故に、ソフトウェア要素を持つ別の種類の媒体は、有線ネットワーク及び光地上ネットワークを通して、ならびに様々なエアリンクを介した、ローカルデバイス間の物理的インターフェースにかけて使用されるものなどの、光波、電波、及び電磁波を含んでもよい。有線若しくは無線リンク、光リンク、または同様のものなどのかかる波を担持する物理的要素はまた、ソフトウェアを持つ媒体と見なされてもよい。本明細書で使用される場合、非一時的な有形「記憶」媒体に限定されない限り、コンピュータまたは機械「可読媒体」という用語は、命令を実行のためにプロセッサに提供することに関わる任意の媒体を指す。
【０２６０】
よって、コンピュータによって実行可能なコードなどの機械可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波、または物理的伝送媒体が挙げられるが、これらに限定されない、多くの形態を取り得る。不揮発性記憶媒体としては、例えば、図面に示すデータベースなどを実装するために使用し得るものなどの、任意のコンピュータ（複数可）または同様のものにおける記憶デバイスのいずれかといった、光学若しくは磁気ディスクが挙げられる。揮発性記憶媒体としては、かかるコンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリが挙げられる。有形伝送媒体としては、同軸ケーブル、コンピュータシステム内にバスを備えるワイヤを含む銅線及び光ファイバーが挙げられる。搬送波伝送媒体は、電気または電磁信号、またはラジオ周波数（ＲＦ）及び赤外線（ＩＲ）データ通信中に生成されるものなどの音波若しくは光波の形態であってもよい。したがって、一般的な形態のコンピュータ可読媒体としては、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ若しくはＤＶＤ−ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード、紙テープ、孔のパターンを持つ任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップ若しくはカートリッジ、搬送波輸送データ若しくは命令、かかる搬送波を輸送するケーブル若しくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコード及び／若しくはデータを読み取り得る任意の他の媒体が挙げられる。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くは、１つ以上の命令の１つ以上の配列を実行のためにプロセッサに運ぶことに関与し得る。
【０２６１】
本開示の方法の結果は、ユーザインターフェース若しくはＵＩ１０２５または他のユーザインターフェース上でユーザに表示され得、これは、ユーザＵＳまたは他の操作者の電子デバイスのグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）を含んでもよい。ＧＵＩなどの他のＵＩは、タブレットコンピュータ、スマートフォン、ウェアラブルコンピューターなどのユーザの電子デバイスのディスプレイ上に提供され得る。ディスプレイは、例えば、容量性または抵抗性タッチディスプレイであり得る。かかるディスプレイは、本開示の他のシステム及び方法と共に使用することができる。
【０２６２】
撮像ソース１０４０は、本明細書に記載の撮像デバイス及びソースの任意のものを含み得る。撮像ソース１０４０は、例えば、光学撮像ソースを含んでもよい。撮像ソース１０４０は、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を行うように構成され得る。
【０２６３】
マルチウェルプレート１０５０は、当該技術分野で既知の任意のマルチウェルプレートを含み得る。液滴システムまたはエマルションシステム１０５５は、本明細書に記載の方法のいずれかによって生成され得る。
【０２６４】
例示的な検出システム１０００は、ユーザＵＳによって操作されて、本明細書に記載の方法のいずれかを実装してもよい。例えば、検出システム１０００は、ユーザＵＳによって操作されて、図２Ｂに概略的に示される例示的な検出方法１１００、または図２Ｃに概略的に示される例示的な検出方法１００を実装してもよい。図２Ｂの検出方法１１００は、以下のような様々なステップを含み得る。ステップ１１１０では、液滴またはエマルションシステムが生成され得る。液滴またはエマルションシステムは、振とう、ボルテックス、または他の撹拌などの本明細書に記載の多くの方法で生成され得る。ステップ１１２０では、液滴またはエマルションシステムは、本明細書に記載の多くの方法でマルチウェルプレート上に提供されてもよい。ステップ１１３０では、液滴またはエマルションシステムの画像スタックが、本明細書に記載の多くの方法で生成され得る。ステップ１１４０では、画像スタックを分析して、本明細書に記載の多くの方法で液滴を検出または認識し得る。例えば、ラインスキャン法、シンプルバウンダリ法、リバースウォーターシェッド法、円検出法、リバースウォーターシェッド及び円検出複合法、またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を使用して、液滴を検出または認識してもよい。ステップ１１５０では、試料の存在が、本明細書に記載の多くの方法で様々な液滴において検出され得る（即ち、占有が決定され得る）。ステップ１１７０では、試料の濃度が、本明細書に記載の多くの方法で（例えば、本明細書に記載の統計的方法を用いて）、様々な液滴において検出された試料の存在及び様々な液滴のサイズ分布に基づいて決定され得る。
【０２６５】
図２Ｃの検出方法１００は、以下のような様々なステップを含んでもよい。ステップ１０５では、試料を取得し得る。試料は、本明細書に記載の方法のいずれかで取得し得る。ステップ１１０では、試料からエマルションを調製する。エマルションは、本明細書に記載の方法のいずれかで調製し得る。ステップ１１５では、標的を増幅してもよい。標的は、本明細書に記載の方法のいずれかで取得し得る。ステップ１２０では、エマルションをウェルまたはチャンバに配置する。いくつかの実施形態において、ステップ１１０及び１２０は同時に発生してもよく、エマルションはウェルまたはチャンバ中で調製されてもよい。ステップ１２５では、エマルションを第１の水平位置及び第１の垂直位置にて撮像し得る。ステップ１３０では、エマルションを、同じ第１の水平位置、及び第１の垂直位置とは異なる第２の垂直位置にて撮像し得る。ステップ１３５では、撮像ステップを２＋ｎの垂直位置について繰り返してもよい。ステップ１４０では、複数の画像は、以前のステップ１２５、１３０、及び１３５を行うことなどによって獲得してもよい。ステップ１４５では、獲得した画像を液滴サイズについて分析する。獲得した画像は、本明細書に記載の方法のいずれかで分析し得る。例えば、獲得した画像は、ステップ１４５ａのラインスキャン法を使用すること、ステップ１４５ｂのシンプルバウンダリ法を使用すること、ステップ１４５ｃのリバースウォーターシェッド法を使用すること、ステップ１４５ｄの円検出法を使用すること、ステップ１４５ｅのリバースウォーターシェッド及び円検出複合法を使用すること、または上述の方法のうちの２つ以上の組み合わせを使用すること、のうちの１つ以上によって、分析してもよい。液滴は、Ｚスタックの１枚超の画像中に現れ得る。この場合には、これらの画像中の情報を上記の本明細書に記載の方法によって組み合わせて、その液滴の直径を決定し得る。ステップ１５０では、獲得した画像を液滴中の標的の存在について分析し得る。標的の存在についての分析は、本明細書に記載の方法のいずれかで行い得る。ステップ１５０は、例えば、蛍光を検出しそれについて分析するステップ１５０ａを含んでもよい。ステップ１５０は、画像をステップ１４５で液滴サイズについて分析した後に発生してもよく、あるいはステップ１４５と並行するステップとして発生してもよい。ステップ１５０は、蛍光を検出しそれについて分析するステップ１５０ａを含んでもよい。ステップ１５５では、試料中の標的濃度を計算し得る。試料中の標的濃度は、本明細書に記載の方法のいずれかで計算し得る。例えば、計算は、ステップ１４５からの液滴サイズについての画像分析、及びステップ１５０からの液滴中の標的の存在についての画像分析に基づいてもよい。
【０２６６】
上記のステップは、多くの態様及び実施形態に従う標的検出のための方法１１００及び１００を示すが、当業者であれば、本明細書に記載の教示に基づく多くの変形を認識することになる。これらのステップは、異なる順序で完了してもよい。ステップを付加しても削除してもよい。ステップのうちのいくつかはサブステップを含み得る。ステップの多くは、利益となるだけ頻繁に繰り返してもよい。
【０２６７】
方法１１００及び１００のステップまたはサブステップのうちの１つ以上は、本明細書に記載の処理要素または回路、例えば、本明細書に記載のシステム１０００のコンピューティングデバイス１００１のプロセッサまたはＣＰＵ１００５のうちの１つ以上を用いて行ってもよい。ＣＰＵ１００５のための命令は、システム１０００のメモリ１０１０に記憶され得る。これらの命令は、ＣＰＵ１００５によって実行されるときに、方法１１００及び１００のステップまたはサブステップのうちの１つ以上を行い得る。
【０２６８】
様々な態様において、本開示は、本明細書に記載のラインスキャン法、シンプルバウンダリ法、リバースウォーターシェッド法、円検出法、リバースウォーターシェッド及び円検出複合法、またはこれらの組み合わせなどの、液滴の検出または認識のための多くの方法を提供する。いくつかの態様において、液滴の検出または認識方法は、試料濃度を決定するための方法とは無関係であり得る。つまり、液滴の検出または認識方法は、本明細書に記載のデジタルアッセイを行うこと以外の多くの目的に対して使用し得る。
【０２６９】
図２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、及び２Ｈは、それぞれ、例示的な液滴認識方法１２００、１３００、１４００、１５００、及び１６００を概略的に示す。ステップ１１４０は、例えば、方法１２００、１３００、１４００、１５００、及び１６００のうちの１つ以上を適用して、画像スタックを分析し、液滴を検出または認識し得る。
【０２７０】
図２Ｄに示すように、液滴認識方法１２００は、上記のラインスキャン法と同様であるか、またはそれを含んでもよく、かつ以下のような様々なステップを含んでもよい。ステップ１２１０では、個々の画像に対する適切な閾値レベルを設定し得る。適切な閾値レベルは、例えば、画素強度閾値であってもよい。ステップ１２２０では、画像内でラインスキャンを取得し得る。ステップ１２３０では、このラインスキャンを画素セットについて分析し得る。これらの画素セットは、例えば、設定した閾値レベルであるかまたはその外であり（例えば、それを上回るかまたは下回る）、かつ隣接するラインスキャン間で接触している、ラインスキャンの断片を含んでもよい。ステップ１２４０では、液滴を画素セットから特性し得る。例えば、画素セットについてのラインスキャンの最長断片を液滴の直径と見なすことができ、液滴のサイズを直径から計算することができる。ラインスキャンが本明細書で概して考察されるが、スキャンを生成する他の方法も企図される。これらの方法としては、共焦点スキャニング、ライン照明及び収集、ニッポウディスク型スキャニングなどを挙げることができる。
【０２７１】
図２Ｅに示すように、液滴認識方法１３００は、上記のシンプルバウンダリ法と同様であってもよいか、またはそれを含んでもよく、かつ以下のような様々なステップを含んでもよい。ステップ１３１０では、適切な閾値レベルを個々の画像に設定する。ステップ１３２０では、その閾値レベルであるかまたはその外である（例えば、それを上回るかまたは下回る）エリアを、画素セット（複数可）として特定し得る。ステップ１３３０では、画素セット（複数可）のアスペクト比を測定し得る。ステップ１３４０では、アスペクト比が閾値アスペクト比の外である（例えば、概してそれを下回るが、代替的にそれを上回ってもよい）画素セット（複数可）を、単一の液滴として特定する。閾値アスペクト比は、例えば、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２．０であってもよい。ステップ１３５０では、各画像についての液滴（複数可）のリストがコンパイルされ得る。
【０２７２】
図２Ｆに示すように、液滴認識方法１４００は、上記のリバースウォーターシェッド法と同様であってもよいか、またはそれを含んでもよく、かつ以下のような様々なステップを含んでもよい。ステップ１４０５では、個々の画像の画素強度に基づく３Ｄ位相マップを生成し得る。ステップ１４１０では、位相マップを、位相マップの「ピーク」の上まで「水」（即ち、水または他の流体のコンピュータ化された合成表現）で満たし得る。位相マップは、本明細書の上で記載した多くの方法によって「水」で満たすことができる。例えば、各画像の背景内のシグナルの標準偏差を決定し、それをシグナル対ノイズ比で乗じた後、背景画素の平均強度に加算し得る。ステップ１４１５では、「水位」を低下させ得る。位相マップの「水位」は、本明細書の上で記載した多くの方法で低下させ得る。例えば、最大画素強度カットオフ閾値を見積もり、それが背景画素強度閾値に達するまで低下させてもよい。ステップ１４２０では、「突出」または「島」（即ち、最高強度画素）を、「水位」が低下するときに追跡し得る。ステップ１４２５では、かかる「突出」または「島」は、それらが必要最低限のエリアなどのユーザ定義の基準を満たす場合に、目的領域（複数可）として特定してもよい。ユーザによって定義される基準は、本明細書の上で記載した多くの方法で定義され得る。ステップ１４３０では、目的領域（複数可）を、ある特定の基準、例えば、本明細書の上で記載したものが満たされるかどうかに応じて、「水位」が低下するときに融合させてもよい。本明細書の上で記載したように、画像は、２つ以上の目的領域を融合させるか否かの決定を行う前に平滑化してもよい。ステップ１４３５では、「水位」の低下は、閾値が満たされるときに終了し得る。閾値は、本明細書に記載の背景強度閾値またはカットオフを含んでもよく、本明細書の上で記載した多くの方法で決定し得る。
【０２７３】
ステップ１４４０では、連結した画素のグループ（複数可）を画素グループ（複数可）として特定し得る。かかる特定は、本明細書の上で記載した多くの方法で行うことができる。ステップ１４４５では、画素グループ（複数可）内の間隙を、本明細書の上で記載した孔閾値を適用することなどによって、孔またはノイズとして特定し得る。孔は、例えば、液滴間の間隙を含んでもよい。ステップ１４５０では、目的領域（複数可）は、ある特定の基準、例えば、本明細書の上で記載したものが満たされるかどうかに応じて、「水位」が低下するときに、または「水位」の低下の後で、融合させ得る。本明細書の上で記載したように、画像は、２つ以上の目的領域を融合させるか否かの決定を行う前に平滑化してもよい。
【０２７４】
ステップ１４５５では、単一の目的領域しか含まない画素グループを液滴として特定し得る。ステップ１４６０では、円を単一の目的領域の境界に適合させ得る。円を分析して、本明細書の上で記載した液滴径を取得し得る。複数の目的領域を有する画素グループを本明細書の上に記載の方法に従って特定して、最も可能性のある液滴を特定し得る。ステップ１４６５では、単一の画素グループ内の目的領域を円と適合させ得る。ステップ１４７０では、最良適合の円を液滴として特定し得る。最良適合の円を分析して、本明細書の上で記載した液滴径を取得し得る。
【０２７５】
図２Ｇに示すように、液滴認識方法１５００は、上記の円検出法と同様であってもよいか、またはそれを含んでもよく、かつ以下のような様々なステップを含んでもよい。ステップ１５１０では、閾値を個々の画像に適用し得る。閾値は、本明細書の上で記載したリバースウォーターシェッド法においてのように決定してもよい。ステップ１５２０では、連結した画素のグループを画素グループとして特定し得る。かかる特定は、本明細書の上で記載したリバースウォーターシェッド法においてのように行ってもよい。ステップ１５３０では、画素グループ（複数可）内の間隙を、本明細書の上で記載した孔閾値を適用することなどによって、孔またはノイズとして特定し得る。ステップ１５４０では、画素グループ（複数可）の外部境界を決定し得る。ステップ１５５０では、円ハフ変換を画素グループ（複数可）の境界に適用する。ステップ１５６０では、ある特定の基準を満たさない円を排除し得る。この基準は、本明細書の上で記載した基準のいずれであってもよい。ステップ１５７０では、残りの円のうちの１つ以上を容認し得る。基準を本明細書の上で記載したように適用して、残りの円（複数可）を容認するか否かを決定し得る。ステップ１５８０では、容認した残りの円を使用して、液滴に対する最良の境界画素を見出す。ステップ１５９０では、境界画素を円に適合させて、液滴（複数可）に対応する最良適合の円のコレクションを取得する。これらの最良適合の円を使用して、液滴（複数可）の直径及びサイズを決定し得る。
【０２７６】
図２Ｈに示すように、液滴認識方法１６００は、上記のリバースウォーターシェッド及び円検出複合法と同様であってもよいか、またはそれを含んでもよく、かつ以下のような様々なステップを含んでもよい。ステップ１６０５、１６１０、１６１５、１６２０、１６２５、１６３０、１６３５、１６４０、及び１６４５は、それぞれ、上記のリバースウォーターシェッド法１４００のステップ１４０５、１４１０、１４１５、１４２０、１４２５、１４３０、１４３５、１４４０、及び１４４５と同様であり得る。ステップ１６０５では、個々の画像の画素強度に基づく３Ｄ位相マップを生成し得る。ステップ１６１０では、位相マップを、位相マップの「ピーク」の上まで「水」（即ち、水または他の流体のコンピュータ化された合成表現）で満たす。  位相マップは、本明細書の上で記載した多くの方法によって「水」で満たすことができる。例えば、各画像の背景内のシグナルの標準偏差を決定し、それをシグナル対ノイズ比で乗じた後、背景画素の平均強度に加算し得る。ステップ１６１５では、「水位」を低下させ得る。位相マップの「水位」は、本明細書の上で記載した多くの方法で低下させ得る。例えば、最大画素強度カットオフ閾値を見積もり、それが背景画素強度閾値に達するまで低下させてもよい。ステップ１６２０では、「突出」または「島」（即ち、最高強度画素）を、「水位」が低下するときに追跡し得る。ステップ１６２５では、かかる「突出」または「島」は、それらが必要最低限のエリアなどのユーザ定義の基準を満たす場合に、目的領域（複数可）として特定してもよい。ユーザによって定義される基準は、本明細書の上で記載した多くの方法で定義され得る。ステップ１６３０では、目的領域（複数可）を、ある特定の基準、例えば、本明細書の上で記載したものが満たされるかどうかに応じて、「水位」が低下するときに融合させてもよい。本明細書の上で記載したように、画像は、２つ以上の目的領域を融合させるか否かの決定を行う前に平滑化してもよい。ステップ１６３５では、「水位」の低下は、閾値が満たされるときに終了し得る。閾値は、本明細書に記載の背景強度閾値またはカットオフを含んでもよく、本明細書の上で記載した多くの方法で決定し得る。ステップ１６４０では、連結した画素のグループ（複数可）を画素グループ（複数可）として特定し得る。かかる特定は、本明細書の上で記載した多くの方法で行うことができる。ステップ１６４５では、目的領域（複数可）内の間隙を、本明細書の上で記載した孔閾値を適用することなどによって、孔またはノイズとして特定し得る。ステップ１６５０では、円ハフ変換を各目的領域の境界に適用する。
【０２７７】
ステップ１６５５、１６６０、１６７０、及び１６７５は、それぞれ、上記のステップ１５６０、１５７０、１５８０、及び１５９０と同様であり得る。ステップ１６５５では、ある特定の基準を満たさない円を排除し得る。この基準は、本明細書の上で記載した基準のいずれであってもよい。ステップ１６６０では、残りの円を容認し得る。ステップ１６６５では、容認した残りの円を使用して、液滴に対する最良の境界画素を見出し得る。ステップ１６７０では、境界画素を最良適合の円に適合させる。これらの最良適合の円を使用して、液滴（複数可）の直径及びサイズを決定し得る。
【０２７８】
上のステップは、本開示の様々な態様に従う、液滴を検出する及び／または液滴若しくはエマルションシステムを分析する方法１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、及び１６００を示すが、当業者であれば、本明細書に記載の教示に基づく多くの変形を認識することになる。これらのステップは、異なる順序で完了してもよい。ステップを付加しても削除してもよい。ステップのうちのいくつかはサブステップを含み得る。ステップの多くは、利益となるだけ頻繁に繰り返してもよい。
【０２７９】
方法１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、及び１６００のステップのうちの１つ以上は、本明細書に記載のコンピューティングシステム１０００を用いて行い得る。あるいは、または組み合わせて、方法１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、及び１６００のうちの１つ以上のステップは、フィールドプログラマブルゲートアレイのためのプログラム可能なアレイ論理、アプリケーション特有の統合回路、または他のプログラム可能なまたはアプリケーション特有の論理回路などの、回路または論理回路を用いて行い得る。この回路をプログラムして、方法１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、及び１６００のステップのうちの１つ以上を提供してもよく、このプログラムは、非一時的コンピュータ可読メモリ若しくは記憶媒体に記憶されたプログラム命令、または論理回路のプログラムされたステップを含んでもよい。
デジタルアッセイを行うための組成物及びキット
【０２８０】
本開示は、本明細書に記載のデジタルアッセイを行うための組成物及びキットを提供する。ある特定の態様において、デジタルＰＣＲを行うためのキット及びアッセイを提供する。
【０２８１】
様々な態様において、本開示は、デジタルアッセイを行うための組成物及びキットを提供し、これらは、第１の流体と、第２の流体であって、第１の流体及び第２の流体が互いに非混和性であり、撹拌されるとエマルションを形成することができる、第２の流体と、界面活性剤と、増幅試薬と、を含む。
【０２８２】
いくつかの態様において、本組成物は試料を更に含む。ある特定の態様において、試料はヌクレオチドである。更なる態様において、本組成物は、検出可能な薬剤を更に含み、この検出可能な薬剤は、試料を標識することができる。いくつかの態様において、試料は検出可能な薬剤で標識される。更なる態様において、本組成物は、核酸試料に結合することができる検出可能な薬剤を更に含む。
【０２８３】
様々な態様において、本組成物は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）試薬、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）試薬、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）試薬、またはこれらの組み合わせから選択される、増幅試薬を含む。いくつかの態様において、増幅試薬はＰＣＲ試薬である。ある特定の態様において、このＰＣＲ試薬は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、プローブ、またはこれらの組み合わせから選択される。
【０２８４】
いくつかの態様において、本組成物は、第３の流体を更に含み、この第３の流体は第２の流体と非混和である。ある特定の態様において、本組成物は、二重エマルションを形成することができる。
【０２８５】
様々な態様において、第１の流体は水性である。更なる態様において、第１の流体は増幅試薬を含む。いくつかの態様において、第２の流体は油である。更なる態様において、第２の流体は油であり、この第２の流体は第１の流体及び第３の流体と非混和性である。また更なる態様において、第１の流体は第３の流体とは異なる。他の態様において、第３の流体は油であり、この第３の流体は第１の流体及び第２の流体と非混和性である。
【０２８６】
いくつかの態様において、本組成物は、流体界面修飾要素を更に含む。ある特定の態様において、流体界面修飾要素は界面活性剤である。更なる態様において、流体界面修飾要素は、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせから選択される。
【０２８７】
ある特定の態様において、本組成物は、非混和性流体のうちの１つ以上をゲルまたは固体に変換することができる固化剤またはゲル化剤を更に含む。
【０２８８】
いくつかの態様において、本開示は、デジタルアッセイを行うための組成物及びキットを提供し、この組成物及びキットは、第１の流体と、第２の流体であって、第１の流体及び第２の流体が互いに非混和性であり、物理的に撹拌されるとエマルションを形成することができる、第２の流体と、界面活性剤と、ＰＣＲ試薬と、を含む。更なる態様において、ＰＣＲ試薬は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、プローブ、またはこれらの組み合わせから選択される。他の態様において、検出可能な薬剤は、核酸試料に結合することができる。
【０２８９】
ある特定の態様において、本開示は、ＰＣＲを行うための組成物及びキットを提供し、これらは、第１の流体及び第２の流体であって、第１の流体及び第２の流体が互いに非混和性である、第１の流体及び第２の流体と、核酸プライマーと、デオキシリボヌクレオチドと、核酸プライマーの伸長に好適な酵素と、蛍光標識と、増幅後に核酸試料に結合することができる検出可能な薬剤と、を含む。
【０２９０】
更なる態様において、本組成物及びキットは、ＰＣＲ増幅と互換性のある好適な緩衝剤及び安定剤を更に含み得る。
【０２９１】
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に示さない限り、下限の単位の１０分の１までの、その範囲の上限と下限との間の介在する値の各々、及びその記述された範囲の任意の他の記述された値または介在する値が、本明細書で提供される開示の内に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、これらのより小さい範囲に含まれ得、また本開示の内に包含され、記述された範囲内のいずれの特別に除外された限度にも依存する。記述された範囲がこの限度の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限度のいずれかまたは両方を除外する範囲も、本明細書で提供される開示に含まれる。
【０２９２】
本開示の装置、デバイス、システム、及びこれらの構成要素のうちのいずれの特定の寸法も、本明細書の開示を考慮して当業者には明らかとなるように、意図される用途に応じて容易に変動し得る。更に、本明細書に記載の例及び態様は、例示のためのみであること、ならびにそれを踏まえた様々な改変または変化が当業者に示唆され得、本明細書の趣旨及び権限、及び添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。本明細書に記載の態様の多数の異なる組み合わせが可能であり、かかる組み合わせは、本開示の一部と見なされる。加えて、本明細書のいずれの態様にも関連して考察される全ての特徴は、本明細書において、他の態様における使用に容易に適合され得る。異なる態様における同様の特徴に対する異なる用語または参照番号の使用は、明確に示されるもの以外は、必ずしも差異を暗示するものではない。したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲を参照することによってのみ説明されることが意図され、本明細書に開示の態様に限定されない。
【０２９３】
別途指定のない限り、本明細書に記載の方法及びプロセスは、任意の順序で実行することができる。例えば、ステップ（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を記載している方法は、最初にステップ（ａ）を行い、次にステップ（ｂ）を行い、その後ステップ（ｃ）を行って、実行することができる。あるいは、本方法は、例えば、最初にステップ（ｂ）を行い、次にステップ（ｃ）を行い、その後ステップ（ａ）を行うなど、異なる順序で実行することができる。更に、これらのステップは、別途詳細に指定されない限り、同時にまたは別々に実行することができる。
【０２９４】
本開示の好ましい態様を本明細書で示し記載してきたが、本開示は、以下に記載する本開示の特定の態様に限定されず、これは、特定の態様の変形が作製され得、それでも添付の特許請求の範囲内に含まれるためであることを理解されたい。用いられる用語は、本開示の特定の態様を説明するためのものであり、限定的であるようには意図されないことも理解されたい。代わりに、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定される。本明細書及び添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途示さない限り、複数の参照物を含む。
【０２９５】
本明細書で触れる全ての出版物、特許、及び特許出願は、個々の出版物、特許、または特許出願の各々が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２９６】
本開示の装置、デバイス、システム、及びこれらの構成要素のうちのいずれの特定の寸法も、本明細書の開示を考慮して当業者には明らかとなるように、意図される用途に応じて容易に変動し得る。更に、本明細書に記載の例及び態様は、例示のためのみであること、ならびにそれを踏まえた様々な改変または変化が当業者に示唆され得、本明細書の趣旨及び権限、及び添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。本明細書に記載の態様の多数の異なる組み合わせが可能であり、かかる組み合わせは、本開示の一部と見なされる。加えて、本明細書のいずれの態様にも関連して考察される全ての特徴は、本明細書において、他の態様における使用に容易に適合され得る。異なる態様における同様の特徴に対する異なる用語または参照番号の使用は、明確に示されるもの以外は、必ずしも差異を暗示するものではない。したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲を参照することによってのみ説明されることが意図され、本明細書に開示の態様に限定されない。
【０２９７】
実施例１
試験管中で可変体積の液滴を生成するための方法
この実施例は、本開示の一態様に従って可変体積の多分散液滴を産出するための例示的な方法を提供する。この実施例では、ＰＣＲ試験管を使用するが、任意の好適な容器を本開示に従って使用することができる。
【０２９８】
図３は、個々の試験管をボルテックスすることによるエマルションシステムの形成を示す。ステップ４Ａにおいて、反応混合物を含む水相を、適切な油−界面活性剤の混合物を事前に充填した０．２ｍＬのＰＣＲ試験管中にピペッティングした。油相は、７３％のＴｅｇｏｓｏｆｔ  ＤＥＣ、２０％の軽油、及び７％のＡＢＩＬ  ＷＥ  ０９界面活性剤から成り、これらを新しく混合し、使用の前に少なくとも３０分間平衡化した。この混合物を用いて形成したエマルションは、標準的エマルションＰＣＲ中に優れた熱安定性を示した。ステップ４Ｂにおいて、水相を油混合物中にピペッティングした後、可変サイズの液滴を、約３０００ｒｐｍで約３０秒間ボルテックスすることによって形成した。水相がボルテックス中により小さい液滴へと分裂することを促進する、小さい撹拌棒を混合物加えることによって、乳化を更に強化した。油中の界面活性剤の存在がエマルションを安定させたことで、混合物中の液滴融合の頻度が減少した。
【０２９９】
水性相と油相との両方を含むシステムを、小さいステンレス鋼ビーズを含む小さい採取用微細管に加えた。続いて、試験管を１５〜１７Ｈｚで２０秒間振とうして、エマルションを生成した。ステップ４Ｃにおいて、その後、エマルションを０．２ｍＬのＰＣＲ試験管に移し、ＰＣＲを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃ１０００  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにおいて、９５℃（ホットスタート）で３分間、ならびに９５℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間の５０サイクル実行した。
【０３００】
実施例２
マルチウェルプレート中で可変体積の液滴を生成するための方法
この実施例は、本開示の一態様に従う、可変体積の多分散液滴の産出、ならびに続く修飾及び分析のための方法を提供する。
【０３０１】
図４は、液滴−エマルションＰＣＲのための最適化したハイスループットを示す。マルチチャネルピペットが油性及び水性ＰＣＲ試薬をマルチウェルプレート上に載せた後、マルチウェルプレート全体を３０００ｒｐｍで３０秒間ボルテックスルして、乳化を誘発した。マルチウェルプレートにサーマルサイクラーアダプターを装着し、混合物を、９５℃（ホットスタート）で３分間、ならびに９５℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間の５０サイクル、ＰＣＲ増幅にかけた。その後、マルチウォールプレートをサーマルサイクラーから除去し、蛍光顕微鏡で撮像し、更なる試料の移動は不要であった。この実施例では、乳化後のいずれの液滴の不安定性（例えば、融合）も、機械処理とは無関係となる。
【０３０２】
実施例３
最良適合の円の決定
この実施例は、多分散液滴システムにおいて液滴に対する最良適合の円を決定するための方法を提供する。この態様では、液滴の境界の一部のまたは全体であると仮定される画素のセットを、既存の最適化アルゴリズムを使用して円に適合させる。この態様では、ＭＡＴＬＡＢに実装されるＮｅｌｄｅｒ−Ｍｅａｄアルゴリズムを使用する。このアルゴリズムは、以下の方程式（１）において定義される適合誤差を最小化する。
【数１】
2020060579.tif 000004
【０３０３】
この方程式では、Ｘｔｒｉａｌ及びＹｔｒｉａｌは、最適化手順における現行のステップについての円の中心の試験位置に対応する。Ｒｔｒｉａｌは、最適化手順における現行のステップについての円の試験半径に対応する。セット中のｐ番目の画素の位置であるＸｐ及びＹｐと適合されるＮｐ画素が外部画素のセット中に存在する。したがって、平方根記号の中の量は、試験中心からｐ番目の画素までの距離であり、ここから試験半径を減算して、誤差を取得する。誤差を２乗し、セット中の全ての画素を合計した後、試験半径の２乗で割って、適合誤差を取得する。
【０３０４】
最適化の一部として、現行の試験円の内部でもあるグループの内部の画素の数の計数を行う。円の内部の画素の数（ＮＣ）が、円の内部でありかつグループの内部でもある画素の数（ＮＣ，Ｇ）を超過する場合には、以下（方程式（２）で定義される通り）を適合誤差に加えることによって、現行の試験位置及び半径にペナルティーを科す。
【数２】
2020060579.tif 000005
【０３０５】
方程式（２）からの量を加えることは、液滴の境界の一部のみが適合され、ノイズのせいで、その一部が液滴の典型ではない曲率を呈するときに発生し得るように、大きすぎ、グループから著しく外れて伸長する円を最良適合の円として選択することからの最適化を呈する。いくつかの場合には、本方法は、画素当たりの適合誤差を、液滴への適合の量の評価の一部として使用する。適合における画素の数は、Ｎｐであり、画素当たりの適合誤差は、以下の方程式（ｅ）において定義される。
【数３】
2020060579.tif 000006
【０３０６】
本開示の別の態様では、平均２乗誤差を液滴への適合の量の評価に使用する。これは、以下の方程式（４）において定義される。
【数４】
2020060579.tif 000007
【０３０７】
実施例４、５、及び６は各々、本実施例に記載の方法に関する外部境界画素または特徴画素への円の適合を参照する。
【０３０８】
実施例４
液滴を特定するためのリバースウォーターシェッド法
この実施例は、本開示の態様に従ってリバースウォーターシェッド法を行うための例示的なプロセスを説明する。
【０３０９】
この態様に従い、画像に対する初期背景カットオフを、画像の４０％が背景であったと仮定することによって計算した。この初期背景カットオフについては、２０％（４０％を２で割ったものに等しい）が、背景画素強度の中央値に対応する画像強度の予測パーセンタイルである。予測した背景標準偏差は、それが画像の２０％パーセンタイルと画像の１％パーセンタイルとの間の差異の２分の１であったと仮定することによって計算した。その後、背景カットオフの初期予測は、予測中央値に予測標準偏差の２倍を足したものであった。強度が背景カットオフの初期予測未満である画素を次のステップのために選択した。選択した画素の強度の平均及び標準偏差を計算し、強度が平均未満である画像画素のパーセンテージを決定し、これは２２％であることが分かった。そのパーセンテージを、背景の中央値と対応する画像強度の予測したパーセンタイルの初期予測である２０％と比較した。これらの値は十分に一致していると判断し、選択した画素の平均及び標準偏差を、ＳＣＴ及びＢＴを計算する目的で画像中の背景の平均及び標準偏差として容認した。これらの値が十分に一致していない場合には、新たな初期背景カットオフを、背景画素強度の中央値と対応する画像強度の当時の予測パーセンタイルとして２２％を使用すること、及び本段落の最初で開始した手順を繰り返すことによって計算し得る。
【０３１０】
その後、画像についてのＳＣＴを、これまでに計算した背景の標準偏差にシグナル対ノイズ比を掛け、結果をこれまでに計算した平均背景の平均強度に加算することによって決定した。ここではシグナル対ノイズ比を３．２と選択したが、この値は、画像中のノイズの量に応じてユーザによって調整され得る。
【０３１１】
その後、画像の最大画素強度と等しかったカットオフ閾値を選択した。このカットオフ閾値を、それがＳＣＴに達するまで３０段階で低下させた。この場合、段階は、９０４．０、８７２．０、８４１．２、８１１．５、７８２．８、７５５．１、７２８．４、７０２．７、６７７．８、６５３．８、６３０．７、６０８．４、５８６．９、５６６．２、５４６．１、５２６．８、５０８．２、４９０．２、４７２．９、４５６．２、４４０．１、４２４．５、４０９．５、３９４．５、３７９．５、３６４．５、３４９．５、３３４．５、３１９．５、及び３０４．５で離間した。第１の値は画像中の最大画素強度と等しく、最後の１つは画像についてのＳＣＴと等しかった。後のステップで使用するために平滑化した画像のコピーを創出した。この実施例では、平滑化は、「［０．０５，０．１０，０．０５；０．１０，０．４０，０．１０；０．０５，０．１０，０．０５］」として（ＭＡＴＬＡＢの表記を使用して）定義した平滑化構造を用いて画像をコンボリュートした、ＭＡＴＬＡＢのｃｏｎｖ２（）関数によって行った。
【０３１２】
各ステップにて、画像分析ソフトウェアを使用して、現行のステップのカットオフ閾値を上回る画像中の画素のセット（以降は単に画素セットとして言及する）を見出した。これらの画素セットは、「水位」からの「突出」または「島」を含んでもよい。この実施例では、画素は、同じ画素セットと見なすためには４連結である必要があった。かかる画素セットのエリアが、ユーザによって定義される基準（即ち、この場合９）と等しかったかそれを超過した場合には、それを目的領域（ＲＯＩ）としてマークした。この場合、画像を、セットのエリアが十分なサイズであるかを決定する前に、ＭＡＴＬＡＢ表現ｓｔｒｅｌ（‘ｄｉｓｋ’，１）によって定義される構造化要素を用いた、ＭＡＴＬＡＢルーチン、ｉｍｃｌｏｓｅ（）を使用して閉鎖した。ＲＯＩが画像の特定の位置に現れたら、そのエリアを、カットオフ閾値が減少する際に追跡した。各ＲＯＩ内の最大強度画素の場所、及びＲＯＩ内の画素の値も追跡した。
【０３１３】
カットオフ閾値が低下するとき、２つ以上のＲＯＩは融合することが可能であった。特定のカットオフ閾値を上回る画素セットは、より大きいカットオフ閾値に分離させた２つ以上のＲＯＩを含み得る。これが起こり得る理由は、（ｉ）異なるＲＯＩが、共に非常に近いために、それらの間の境界領域が現行のカットオフ閾値よりも大きい画素強度を有する、異なる液滴を表すためか、または（ｉｉ）試料中のノイズの増幅が、単一の液滴内の２つ以上の領域が極大値を呈するのに十分大きいためかのいずれかである。これらの最大値は、より大きいカットオフ閾値での別々のＲＯＩとしてアルゴリズムに現れ得る。
【０３１４】
ユーザによって定義される基準を使用して、それらのエリアが現行のステップの同じ画素セット内に含まれた異なるＲＯＩが、融合し、その後１つのＲＯＩとして処理されるべきか、または融合せず、別々のＲＯＩとして追跡されるべきかを決定した。この決定は、（ｉ）異なるＲＯＩの最大強度画素間の距離、及び（ｉｉ）異なるＲＯＩの最大強度画素の値、及びに応じて行った。他のユーザによって定義される基準も、この決定を行うために適用し得る。
【０３１５】
この実施例では、基準（ｉ）について、画像の平滑化したコピーの最大強度画素中の距離が５画素未満であった場合には、２つのＲＯＩを融合させた後、単一のＲＯＩとして扱った。この実施例では、基準（ｉｉ）について、最大強度画素が、現行の画素セットを特定するために使用したカットオフの背景標準偏差の０．７５倍以内の強度を有する場合には、２つのＲＯＩを融合させた後、単一のＲＯＩとして扱った。その根拠は、２つの以前は別々のＲＯＩが現行のカットオフ値のものと同じ画素セット中に現れた場合には、２つの最大強度画素の間に存在する画素セット中の画素は、現行のカットオフを上回る強度を有したに違いないからである。したがって、２つのＲＯＩの各々における最大強度が共に現行のカットオフに近い場合、２つの最大値の間に存在する画素セット中の画素は最大値に近い強度を有したに違いない。したがって、２つのＲＯＩを組み合わせ、同じ液滴に割り当てた。
【０３１６】
最終ステップ（即ち、ＳＣＴを使用した時点）の後、画素セットを画素グループとして言及した。それらのエリアが同じ画素グループ内に含まれた異なるＲＯＩを融合させなかった場合、その画素グループの割り当てられていない画素をＲＯＩに割り当てた。具体的には、画素グループ内の割り当てられていない画素のリストを強度によって分類し、ＲＯＩのうちの１つのみに直接隣接した最大強度の画素を、そのＲＯＩに割り当てた。このプロセスを、残っている唯一の割り当てられていない画素が２つ以上の異なるＲＯＩに直接隣接したものとなるまで繰り返した。これらの画素は、割り当てないまま残した。
【０３１７】
リバースウォーターシェッド法を、共焦点蛍光顕微鏡法を使用して取得した多分散液滴エマルションシステムのグレースケール画像である図１の画像に適用した。図５Ａに示すように、画像を、強度が背景閾値を下回る画素によって分離されるグループに分割した。グループのうちのいくつかは単一のＲＯＩのみを含み、いくつかは２つ以上のＲＯＩを含む。図５Ａに示す境界画素は、グループ外の画素に隣接したグループに属する画素である。
【０３１８】
結果として得られた画素グループを分析し、これらの内のＲＯＩを液滴に割り当て、必ずしも以下に記載の順序で起きる必要はない以下の処理ステップに供した。
【０３１９】
ステップ１。グループが単一のＲＯＩのみを含んだ場合には、このグループを単一の液滴であると見なし、その外部境界画素を円に適合させて液滴径を取得した。
【０３２０】
ステップ２。まだ液滴に割り当てられていないＲＯＩについては、そのＲＯＩの外部境界画素に対する最良適合の円を実施例３に記載のように取得した。その後、割り当てられていないＲＯＩの各々を確認した。円の内側であったＲＯＩの画素の数が円のエリアの少なくとも３０％であった場合には、まだ液滴に割り当てられていない任意の隣接するＲＯＩ外部境界画素と組み合わせて適合を行った。２つのＲＯＩを、一方のＲＯＩの内部境界がもう一方の内部境界からゼロまたは１つの画素だけ分離しているときに、「隣接する」と見なした。図５Ａでは、二重線に見えるものによって分離したＲＯＩを隣接していると見なす。二重線は、互いに近づいて存在する２つの内部境界を表す。外部境界画素の組み合わせたセットを円に適合させ、結果を評価して、２つのＲＯＩを組み合わせ単一の液滴の一部と見なすべきかを決定した。２つのＲＯＩを組み合わせるための基準は、（ｉ）２つのＲＯＩの組み合わせについての画素当たりの適合誤差が０．１２未満であったか、または画素当たりの適合誤差が確認する元のＲＯＩの適合誤差の１．５倍未満であったこと、及び（ｉｉ）共に最良適合の円の内側の２つのＲＯＩのエリアが、ＲＯＩのエリアの少なくとも８５％であったこと、であった。２つのＲＯＩを組み合わせた場合には、これらは、以降は液滴として示し、単一体として扱う。こうして、液滴の外部境界画素は、その液滴に割り当てられたＲＯＩの外部境界画素のセットとなった。このプロセスを全ての隣接するＲＯＩで繰り返した。
【０３２１】
ステップ３。割り当てられていないＲＯＩが、割り当てられていなかった隣接するＲＯＩを有しなかった場合には、本方法は、そのＲＯＩの外部境界を円に適合させる。画素当たりの適合誤差が０．１２未満であり、最良適合の画素の内部のＲＯＩのエリアが円のエリアの少なくとも６０％であった場合、このＲＯＩを液滴として容認した。
【０３２２】
ステップ４。この方法は、その後、液滴の対を検査して、それらが実際のところ同じ液滴の一部であったかを決定した。このステップでは、確認する液滴の最良適合の円が互いに同じサイズである必要があった。本方法は、既に見出されている液滴の中心間の距離を比較した。この段階で液滴として特定した２つの領域は、実際に同じ液滴の一部であった可能性がある。液滴の対の最良適合の中心間の距離を計算し、それが液滴の各々の最良適合の半径の２０％未満であった場合には、その対を試験して、それらが実際に同じ液滴の一部であったかを確認した。２つの液滴の外部境界画素を組み合わせ、画素の組み合わせたセットを円に適合させた。検討する２つの液滴の適合誤差を合計し、外部境界画素の組み合わせたセット中の画素の数で割った。組み合わせたセットの画素当たりの適合誤差は、この量の１．５倍未満、かつ０．１２未満である必要がある。この場合、２つの液滴を組み合わせ、その後、１つの液滴と見なした。このプロセスを全ての液滴の対について繰り返した。
【０３２３】
ステップ５。次に、各画素グループを検査して、それが液滴と割り当てられていないＲＯＩとの両方を有したかを決定した。有した場合には、各液滴について、割り当てられていないＲＯＩを検査し、所与のＲＯＩのエリアの少なくとも８５％が液滴と関連付けられる最良適合の円の内部に位置したかを決定した。位置した場合には、その割り当てられていないＲＯＩは、液滴に加えるための候補であった。次に、組み合わせた外部境界画素セットを、液滴の外部画素をＲＯＩの外部境界画素と組み合わせることによって作製した。その後、組み合わせたセットを円に適合させた。ＲＯＩを液滴に割り当てるべきであると結論付ける前に満たさなければならない基準がいくつかあり、この基準は以下を含む。（ｉ）組み合わせたセットの最良適合の円の位置と液滴の最良適合の円の位置との間の距離は、３画素未満である必要がある（これは、ある数の検討事項、主に画像中の画素のサイズに依存する）、（ｉｉ）組み合わせたセットの最良適合の円の位置とＲＯＩの最良適合の円との間の距離は、ＲＯＩの最良適合の円の半径の２０％未満であった必要がある、（ｉｉｉ）組み合わせたセットの画素当たりの適合誤差は、ＲＯＩについての画素当たりの適合誤差の２倍未満であった必要がある、（ｉｖ）組み合わせたセットの画素当たりの適合誤差は、０．１２未満であった必要がある、（ｖ）組み合わせた適合の平均２乗誤差は、１．５にＲＯＩに対する最良適合の円についての平均２乗誤差を掛けた数未満であった必要がある。これらの基準の全てが満たされた場合に、ＲＯＩを液滴に割り当てた。
【０３２４】
ステップ６。このステップでは、液滴の対を検査して、それらが同じ液滴の一部であるかを決定した。いくつかの態様において、対を成す液滴は、異なる直径を有し得る。液滴の対の最良適合の中心間の距離を計算し、それが液滴の各々の最良適合の半径の５０％未満であった場合に、２つの液滴のエリアの重複量を計算した。各最良適合の円のエリアの６０％超が他の最良適合の円の内部に位置した場合に、２つの液滴の外部境界画素を組み合わせ、画素の組み合わせたセットを円に適合させた。適合が満たす必要のある基準のリストは、これまでのステップにおけるものよりも長い。乗数Ｍｅｒｒを１．５と定義した。次に、検討する２つの液滴の適合誤差を合計し、外部境界画素の組み合わせたセットにおける画素の数で割った。組み合わせたセットの画素当たりの適合誤差は、Ｍｅｒｒにこの量を掛けた数未満であり、かつ０．１２未満である必要がある。次に、組み合わせた適合の平均２乗誤差、ＭＳＥｃｏｍｂｉｎｅｄを計算した。加えて、新たな平均２乗誤差を、確認する２つの液滴の各々について計算したが、各液滴の最良適合の円を使用する代わりに、各液滴についての平均２乗誤差は、画素の組み合わせたセットの最良適合の円を各液滴に割り当てられた外部境界画素と比較することによって計算した。ＭＳＥｃｏｍｂｉｎｅｄは、Ｍｅｒｒに各液滴の新たな平均２乗誤差を掛けた数未満である必要がある。最後に、画素の組み合わせたセットについての最良適合の位置を、確認する２つの液滴の各々についての最良適合の位置から常に推移させた。第１の液滴の最良適合の位置から組み合わせたセットの最良適合の位置までの距離を決定した。差異は、第１の液滴の最良適合の半径の２０％未満である必要がある。第２の液滴の最良適合の位置から組み合わせたセットの最良適合の位置までの距離を決定した。差異は、第２の液滴の最良適合の半径の２０％未満である必要がある。これを画像中の全ての液滴の対について繰り返した。液滴の対がこれらの基準の全てを満たしたことが分かった場合には、これらを組み合わせた後、単一の液滴として処理した。液滴の全てを確認した後、０．３５をＭｅｒｒに加算し、このステップ全体を繰り返した。Ｍｅｒｒを徐々に増加させることで液滴をゆっくりと組み合わせ、誤った組み合わせの可能性を減少させた。このプロセスを、Ｍｅｒｒの値が２．９に増加するまで続けた。
【０３２５】
ステップ７。このステップは、著しい重複を有した液滴の対を、それらがより小さいサイズであるか否かに関わらず確認することを伴った。乗数Ｍｅｒｒを１．５と定義し、最小の割合Ｆｍｉｎを５０％と定義した。画像の液滴を、外部境界画素の数と最良適合の円の円周との比率によって、最大から最小へと順序付けた。液滴の対（ｉ、ｊ）を確認し、ｉは半径がより大きい液滴を指し、ｊは半径がより小さい液滴を指す。液滴ｊのエリアの少なくともＦｍｉｎが液滴ｉのエリアと重なり合った場合には、この対を確認して、それらを組み合わせるべきであるかどうかを確認した。２つ液滴の外部境界画素を組み合わせて、円に適合するセットとした。２つの液滴を組み合わせるべきであると結論付けるためには、ある数の基準を満たす必要があり、この基準は以下を含む。（ｉ）組み合わせた適合についての画素当たりの適合誤差は、０．１２未満である必要がある、（ｉｉ）組み合わせた適合の画素当たりの適合誤差は、Ｍｅｒｒに液滴ｊについての最良適合の円の画素当たりの適合誤差を掛けた数未満である必要がある、（ｉｉｉ）組み合わせた適合の平均２乗誤差は、Ｍｅｒｒに液滴ｊについての最良適合の円に対する平均２乗誤差を掛けた数未満である必要がある、（ｉｖ）組み合わせた適合についての円の中心の最良適合の位置と液滴ｊについての最良適合の円との間の距離は、液滴ｊの最良適合の半径の２０％未満である必要がある。これらの基準が全て満たされる場合には、液滴ｉ及びｊを組み合わせ、１つの液滴と見なした。
【０３２６】
ステップ８。このステップでは、各画素グループを検査し、それが液滴と割り当てられていないＲＯＩとの両方を有したかを決定した。有した場合には、各液滴について、それは割り当てられていないＲＯＩの各々を検査し、そのＲＯＩのエリアの少なくとも８５％が液滴と関連付けられる最良適合の円の内側に存在したかを決定した。位置した場合には、その割り当てられていないＲＯＩは、液滴に加えるための候補であった。次に、組み合わせた外部境界画素セットを、液滴の外部画素をＲＯＩの外部境界画素と組み合わせることによって作製した。組み合わせたセットを円に適合させた。このステップは、ＲＯＩを液滴に加える場合に満たす必要がある基準のセットを有し、これは以下を含む。（ｉ）組み合わせ適合の画素当たりの適合誤差は、ＲＯＩについての適合誤差の画素当たりの適合誤差の１．２倍未満である必要がある、及び（ｉｉ）組み合わせたセットに対する最良適合の円の中心の位置と、ＲＯＩに対する最良適合の円の中心位置との距離が、１．４画素であるか、またはＲＯＩに対する最良適合の円の半径の２０％未満である。これらの基準の全てが満たされた場合に、ＲＯＩを液滴に割り当てた。
【０３２７】
ステップ９。この段階では、液滴に割り当てられたＲＯＩが液滴の円周を完全に説明しない可能性がまだあった。画像の液滴を、外部境界画素の数と最良適合の円の円周との比率によって、最大から最小へと順序付けた。各画素グループについて、各々が０．５未満の比率を有した液滴の対を検査した。このステップは、いくつかの基準を有し、これらを、液滴を統合について更に検討する前に満たす必要があった。２つの液滴の最良適合の円の間の重複の量を計算した。２つの最良適合の円の中心間の距離を計算した。基準は以下を含んだ。（ｉ）重複のサイズは両円のエリアの３０％を超過する必要があった、（ｉｉ）２つの円の間の距離は、大きい方の最良適合の円の最良適合の半径の２０％未満である必要がある、及び（ｉｉｉ）２つの最良適合の円の間の最良適合の半径の差異は、３０％未満である必要がある。これらの基準を満たした場合には、２つの液滴の外部境界画素を組み合わせ、円を組み合わせたセットに適合させた。この手順を全ての液滴の対について繰り返した。
【０３２８】
ステップ１０。各液滴について、その後、外部画素数対最良適合の円の円周の比率を計算し、この比率が０．６５を超過しないいずれの液滴も考慮から除いた。
【０３２９】
ステップ１１。各画素グループについて、まだ液滴に割り当てられていなかった全てのＲＯＩのリストを準備した。その後、割り当てられていないＲＯＩの各々に対して、本方法によって、最大の重複を有した液滴を探した。その重複のサイズがＲＯＩ内のエリアの５０％を超過した場合には、本方法によって、ＲＯＩを液滴に割り当てるべきであるか否かを検査した。液滴に割り当てられたＲＯＩによって占有さなかった液滴の最良適合の円の内部にあるエリアを計算した。割り当てられていないＲＯＩのエリアが、液滴の最良適合の円の内部にある占有されていないエリアの１．０５倍未満であった場合には、液滴の外部境界画素と割り当てられていないＲＯＩとを組み合わせて、外部境界画素の組み合わせたセットを作製した。その後、この組み合わせたセットを円に適合させた。このステップは、ＲＯＩを液滴に加え得る前に満たす必要がある基準のセットを有し、これは以下を含む。ｉ）組み合わせ適合の画素当たりの適合誤差は、ＲＯＩについての適合誤差の画素当たりの適合誤差の１．２倍未満である必要がある、（ｉｉ）組み合わせたセットに対する最良適合の円の中心の位置と、ＲＯＩに対する最良適合の円の中心位置との距離が、１．４画素であるか、またはＲＯＩに対する最良適合の円の半径の２０％未満である、あるいは（ｉｉｉ）組み合わせたセットについての画素当たりの適合誤差の画素当たりの適合誤差は、０．１２未満である必要がある。これらの基準の全てが満たされた場合に、ＲＯＩを液滴に割り当てた。
【０３３０】
ステップ１２。その後、いずれの外部境界画素も持たないいずれのＲＯＩも、それらが液滴の最良適合の円の内部にあった場合にその液滴に割り当てた。
【０３３１】
図５Ｂは、この実施例の方法によって調製した最終の処理した画像を示す。図５Ｂの画像は図１及び５Ａに対応し、液滴として特定し得る液滴についての最良適合の境界を含む。その後、図５Ｂの画像を使用して、所与の特定した液滴の各々についての液滴サイズ及び標的分子の存在を決定し得る。
【０３３２】
実施例５
液滴を特定するための円検出法
この実施例は、本開示の態様に従って円検出法を行うための例示的なプロセスを説明する。
【０３３３】
この態様に従い、ＳＣＴを、シグナル対ノイズ比が（実施例４における３．２ではなく）２．５であったことを除き、リバースウォーターシェッド法についての実施例４で上に記載したように計算した。このＳＣＴを画像に適用して、画像内の画素グループを定義した。またＳＣＴの値を使用して、各画素グループ内の孔を特定した。画素グループを、強度が画素グループの内部のＳＣＴを下回った画素の８連結セットについて確認した。セットが９以上の画素を含んだ場合、それを孔とした。孔に隣接した画素グループ内の任意の画素のリストを画素グループの外部境界のリストに加えた。画素グループの外部境界をトリミングしてノイズ画素を排除した。トリミングした外部境界画素のリストは、少なくとも１つの内部画素に隣接した画素グループの外部境界画素のみを含んだ。トリミングした外部境界画素もこの実施例においては特徴画素と称する。円ハフ変換を各グループの特徴画素のリストに適用した。
【０３３４】
変換を、各画素グループについて３〜６０画素の範囲の円半径に対して行った。この態様に従い、標準的な変換方法を改変して、画像中のノイズの著しいレベルを占めるようにした。この改変は、使用する画像のノイズ特徴に応じて任意選択で行うことができる。画素に割り当てられた票の数は、画素が半径Ｒの円の中心であった可能性に割り当てられた重量であった。通常、所与の半径Ｒについて、この値は、単純に、画素の距離Ｒ内の特徴画素の数である。この方法において、これは、円の中心のＲ−１からＲ＋１の距離の内の特徴画素の数であった。特定の中心位置についての票の数及び各中心位置に票を投じる特徴画素のリストをＲの各値について計算した。円ハフ変換によって見出された円は、それらを外部画素のリストを円に適合させるときに取得した最良適合の円と区別するために、この実施例では「Ｈ円」と称する。後者は「円」と称する。
【０３３５】
各画素グループについて生成したＨ円のリストを以下のように削った。票が９より少ないＨ円を破棄した。また、票の数対Ｈ円の円周の比率が０．４０未満であったＨ円を破棄した。いずれかの孔画素を含んだＨ円を破棄した。次に、Ｈ円の円周を含む画素を特定し、画像中にあったそれらの数を計数した（Ｈ円は画像外に伸長し得る）。この時点で適用された基準は、以下の通りであった。（ｉ）画像の円周画素の数であるＮＣＩは、１４を超過する必要がある、（ｉｉ）ＮＣＩ対円周における画素の数の比率は、０．６０を超過する必要がある、及び（ｉｉｉ）Ｈ円に対する票の数対ＮＣＩの比率が０．５０を超過する必要がある。Ｈ円がこれらの基準を通過した場合には、画像の背景中にあった円周の割合を確認した。この割合が０．１５未満であった場合には、この段階でＨ円を容認した。この割合が０．１５未満ではないが、半径が５以下であった場合には、グループ中の画素から１画素超離れて存在するＨ円のエリアの割合を計算した。Ｈ円の半径が４または５であり、割合が０．１５以下であった場合には、この段階でＨ円を容認した。Ｈ円の半径が３であり、割合が０．２０以下であった場合には、この段階でＨ円を容認した。
【０３３６】
Ｈ円に対する票の数の画像中の円周画素の数に対する比率を、この段階でもまだ容認されたＨ円について計算した。Ｈ円を、この比率によって、サイズの最も大きいものから小さいものへと続く順で分類した。各Ｈ円を、この比率の値がより小さいＨ円の全てに対して比較した。Ｈ円の中心が互いの
【化１】
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画素以内であり、Ｈ円の半径が４未満異なる場合には、比率の値のより小さいＨ円を拒否した。図１の画像をこの方法によって分析し、このステージの結果を図６Ａに示す。この段階では重なり合うＨ円が存在した。
【０３３７】
この実施例において、次のステップは、いずれかの液滴の表現が不良であったＨ円を拒否し、その後、同じ液滴の一部を表すと判断した円を組み合わせることである。各Ｈ円を、そのＨ円に票を投じた外部境界画素のセットと関連付けた。各Ｈ円についての特徴画素のリストを円に適合させ、適合についての平均２乗誤差を計算した。この時点で、各Ｈ円は、最良適合の円（ＢＦ円）を取得するために適合された画素のセットを定義した。この実施例における更なる分析に対して、ＢＦ円を拒否した場合には、それと関連付けられたＨ円も拒否した。ＢＦ円を液滴に割り当てた場合には、関連付けられたＨ円は同じ液滴に割り当てた。平均２乗誤差が０．７０を超過する場合には、ＢＦ円を拒否した。試料中のより大きい液滴のうちのいくつかは、極めて不規則な外部境界を有したことが観察された。これは、液滴の内容物とそれらを取り囲む連続媒体との間の屈折率不一致によるものであった。大きい液滴と顕微鏡対物との間に位置する小さい液滴は、レンズとして作用することが可能であるため、より大きい液滴の境界の画像を歪める。これがより大きいＢＦ円の早まった拒否を引き起こすのを防ぐために、より大きいＢＦ円については上記の基準を緩和した。票の数（即ち、ＮＦ円に適合させた外部境界画素）が３０超であった場合には、適合の平均２乗誤差が０．７０＋０．０３×（ＮＦ−３０）を超過した場合、ＢＦ円を拒否した。
【０３３８】
次に、ＢＦ円の対のエリアが重複した量を計算し、重複のエリアが２つのＢＦ円のうちの一方のエリアの６５％超であった対のリストをコンパイルした。各対について、画素グループの一部であった円の内側のエリアの割合を計算し、固有であった（もう一方の円への票でもなかった）各円への票の割合を計算した。一方のＢＦ円について計算した割合が両方とも、もう一方についての対応する割合より小さかった場合には、第１のＢＦ円を拒否した。
【０３３９】
どちらのＢＦ円も拒否せず、異なるエリアを有した対については、別の試験を適用した。より小さいＢＦ円の内側にあるが、より大きいＢＦ円の内側ではない画素の数を計算した。その数がより小さいＢＦ円への票の数の半分未満であった場合には、このより小さいＢＦ円を拒否した。
【０３４０】
この時点までにどちらのＢＦ円も拒否していない対について、ＢＦ円の中心間の距離を計算し、２つのＢＦ円の半径間の差異を計算した。中心間の距離が２．１画素未満であり、半径間の差異が２．１画素未満であった場合には、票の数がより少ないＢＦ円を拒否した。
【０３４１】
次に、各ＢＦ円について、固有票の数を計算した。固有票は、ＢＦ円であって、それ自体これまでに拒否されていない、いずれの他のＢＦ円への票でもない票である。固有票の数が１０未満であるか、または固有票対票の総数の比率が０．４０未満であった場合には、そのＢＦ円を拒否した。
【０３４２】
各画素グループについて、いずれのＨ円にも割り当てられていなかった（割り当てなし）外部画素グループ境界画素のリストをコンパイルした。割り当てなしの画素の割合が外部画素グループ境界画素の総数の１０％未満であった場合には、拒否したＨ円を再検査した。これらのうちの各々について、固有票（いずれの容認したＨ円の一部でもなかった票）のリストをコンパイルした。かかる票の数が拒否したＨ円の円周の６０％を超過した場合、拒否したＨ円を容認したＨ円のリストに復元した。この時点での容認した全てのＨ円を、液滴であると暫定的に見なした。
【０３４３】
次に、画素グループ中の可能性のある液滴の各対を検査し、これらをそれぞれ、以下の「液滴１」及び「液滴２」と称する。固有票（即ち、一方の液滴への票であって、もう一方への票ではない票）の数を、全ての対の中の全ての液滴について計算した。固有票の数は、液滴１及び液滴２について、それぞれ、ＮＵ１及びＮＵ２とする。これらの数のいずれかが９未満であった場合には、その対を更なる試験に供した。これらの試験のために、液滴の最良適合の中心間の距離（ｄ）を計算した。また、これらの試験について、内部エリアは、共に最良適合の円の内部にあり、かつ画素グループ中にもある画素を表す。その後、４つの更なる量を計算した。これらは、ｄの液滴１最良適合の半径に対する比率（Ｄ１）、ｄの液滴２の最良適合の半径に対する比率（Ｄ２）、液滴２の内部ではない内部エリア液滴１の割合（Ｆ１）、及び液滴１の内部ではない内部エリア液滴２の割合（Ｆ２）であった。この実施例で使用する用語はこの実施例のみに適用されることを留意すべきである。
【０３４４】
以下の更なる条件及び試験を適用した。
【０３４５】
条件Ａ：ＮＵ１及びＮＵ２が共に９未満であった場合には、試験Ａを行った。試験Ａ。Ｄ１及びＤ１の両方が共に０．３未満であった場合には、最良適合の半径がより小さい液滴を拒否した。
【０３４６】
条件Ｂ：条件Ａが適用せず、ＮＵ１が９未満であった場合には、試験Ｂを行った。試験Ｂ：Ｆ１０．４未満であった場合には、液滴１を拒否した。
【０３４７】
条件Ｃ：条件Ａ及びＢが適用せず、ＮＵ２が９未満であった場合には、試験Ｃを行った。試験Ｃ：Ｆ２が０．４未満であった場合には、液滴２を拒否した。
【０３４８】
条件Ｄ：条件Ａ、Ｂ、またはＣのいずれも適用しない場合には、２部構成の試験Ｄを適用した。試験Ｄ、１部：ＮＵ１がＮＵ２未満であった場合、ならびにＤ１、Ｄ２、及びＦ１が全て０．３未満であった場合には、液滴１を拒否した。そうでない場合には、試験Ｄ、２部を適用した。試験Ｄ、２部：ＮＵ２がＮＵ１未満であった場合、ならびにＤ１、Ｄ２、及びＦ２が全て０．３未満であった場合には、液滴２を拒否した。
【０３４９】
条件Ｅ：条件Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤのいずれも適用しない場合には、試験Ｅを適用した。試験Ｅ：固有エリア画素の割合を計算し、これを、この試験のために、画素グループ中のいずれの他の液滴の内部でもない液滴の内部のエリアの割合として定義した。総合固有票の割合を計算し、これを、この試験ために、画素グループ中のいずれの他の液滴への票でもなかった液滴への票の割合として定義した。液滴１についての両方の割合が液滴２についての対応する割合よりも小さかった場合には、液滴１を拒否した。液滴２についての両方の割合が液滴１についての対応する割合よりも小さかった場合には、液滴２を拒否した。
【０３５０】
次に、画素グループ中の各液滴を個別に検査した。液滴の最良適合の円周の一部であり、画像内にある画素のリストを構築した。画素グループの内側であったが、外部境界画素と一致しないか、または隣接しない、これらの画素の割合（ＦＣ）を計算した。ＦＣが６０％を超過した場合には、液滴を拒否した。
【０３５１】
ＦＣが０．３を超過し、画素グループの内側であったが、外部境界画素と一致しないか、または隣接しない画素の数が２超であった場合には、異なる試験を行った。２つのセットを、液滴の最良適合の円周の一部であった画素のリストから創出した。第１のセット（セット１）は、液滴に割り当てられた票と一致したか、または隣接したこれらの画素から成った。第２のセット（セット２）は、画素グループの内部であったが、セット１にはなかった画素から成った。セット１における画素の強度の平均（Ａ１）及び標準偏差（Ｓ１）を計算した。セット２における画素の強度の平均（Ａ２）を計算した。Ａ１＋（２−ＦＣ）×Ｓ１がＡ２未満の場合には、液滴を拒否した。いくつかの場合には、液滴の外部境界を歪ませるノイズは、液滴よりも著しく小さいＨ円をもたらす。これらの場合には、液滴の内側に存在するＢＦ円の円周の部分は、画素グループの外部境界付近に存在する部分よりも著しく大きい平均強度を有し得る。この試験を使用して、これらのＨ円を特定し拒否した。
【０３５２】
次に、各液滴について、内部画素（即ち、最良適合の円の内側であり、かつ液滴の内部である画素）のリストを構築し、これらの画素の強度を分析した。これらの強度の９０位のパーセンタイルが、平均背景強度＋５×背景強度の標準偏差未満であった場合には、液滴を拒否した。平均背景強度＋３．５×背景強度の標準偏差（Ｎ３．５）を超える強度を有した内部画素の数が４より少なかった場合には、液滴を拒否した。強度が平均背景強度＋３．５を上回った内部画素の割合も計算した（Ｆ３．５）。Ｆ３．５が０．１０未満であった場合、液滴を拒否した。Ｆ３．５が０．１５未満であり、Ｎ３．５が２０未満であった場合、液滴を拒否した。
【０３５３】
この時点で液滴を再検査した。固有票（１つの液滴への票であって、同じく別の液滴への票ではない票）の数が５未満であった場合、液滴を拒否した。固有票の数が９未満であり、適合の平均２乗誤差が０．２５超であり、適合誤差が０．４超であった場合には、液滴を拒否した。
【０３５４】
その後、いずれの外部画素グループ境界画素も液滴に割り当てることを試みた。各液滴について、液滴の最良適合の円の内部にあったかまたはそれらに隣接したいずれの外部画素グループ境界画素も、その液滴の票（最良適合の円を取得するために使用した画素）のリストに暫定的に加えた。この手順により１つ超の液滴に加えた画素を、これらの液滴に割り当てられた票のリストから除去した。
【０３５５】
その後、各液滴への票の改定したリストを使用して、最良適合の円を取得した。
【０３５６】
次に、画素グループ中の各液滴を個別に検査した。グループの一部であるが別の液滴の一部ではない液滴の最良適合の円の内部にある画素のリストをコンパイルした。これらの画素の数が、液滴の最良適合の円の内部にあり画素グループの内部にある画素の総数の７５％未満であった場合には、以下の２つの試験（試験Ｆ及びＧ）を適用した。
【０３５７】
試験Ｆ：液滴の最良適合の円周の一部であり、画像内であった画素のリストを構築した。画素グループの内部にあったが外部境界画素と一致しないかまたはそれに隣接しない画素の割合（ＦＣ）を計算した。ＦＣが６０％を超過した場合には、液滴を拒否した。
【０３５８】
試験Ｇ：ＦＣが０．３を超過し、画素グループの内側であったが、外部境界画素と一致しないか、または隣接しない画素の数が２超であった場合には、異なる試験を行った。２つのセットを、液滴の最良適合の円周の一部であった画素のリストから創出した。第１のセット（セット１）は、液滴に割り当てられた票と一致したか、または隣接したこれらの画素から成った。第２のセット（セット２）は、画素グループの内部であったが、セット１にはなかった画素から成った。セット１における画素の強度の平均（Ａ１）及び標準偏差（Ｓ１）を計算した。セット２における画素の強度の平均（Ａ２）を計算した。Ａ１＋（２−ＦＣ）×Ｓ１がＡ２未満の場合には、液滴を拒否した。いくつかの場合には、液滴の外部境界を歪ませるノイズは、液滴よりも著しく小さい最良適合の円をもたらす。これらの場合には、液滴の内側に存在する最良適合の円の円周の部分は、画素グループの外部境界付近に存在する部分よりも著しく大きい平均強度を有し得る。この試験を使用して、これらの液滴を特定し拒否した。
【０３５９】
平均２乗誤差が１．０を超過した場合には、ＢＦ円を拒否した。しかしながら、票の数（ＮＦ円に適合させた外部境界画素）が３０超であった場合には、この要件は緩和され、液滴は、適合の平均２乗誤差が１．０＋０．０３×（ＮＦ−３０）を超過した場合に拒否した。
【０３６０】
画素当たりの最大適合誤差が０．１０を超過する場合には、液滴を拒否した。
【０３６１】
最良適合の中心までの距離が±１．１６の最良適合の半径の画素以内である液滴についての票の割合を計算する（ＦＧ）。液滴についての票の、最良適合の円周の画像中に存在する部分のサイズに対する比率も計算した（ＦＶＣ）。ＦＧが０．５未満であり、ＦＶＣが０．５７５未満である場合、液滴を拒否した。
【０３６２】
各液滴について、内部画素（最良適合の円の内部にあり、かつ画素グループの内部にある画素）のリストを構築し、これらの画素の強度を分析した。これらの強度の９０位のパーセンタイルが、平均背景強度＋５×背景強度の標準偏差未満であった場合には、液滴を拒否した。平均背景強度＋３．５×背景強度の標準偏差（Ｎ３．５）を超える強度を有した内部画素の数が４より少なかった場合には、液滴を拒否した。強度が平均背景強度＋３．５を上回った内部画素の割合も計算した（Ｆ３．５）。Ｆ３．５が０．１０未満であった場合、液滴を拒否した。Ｆ３．５が０．１５未満であり、Ｎ３．５が２０未満であった場合、液滴を拒否した。
【０３６３】
この実施例の手順を図１の画像に適用した。この方法の中間結果を図６Ａに示し、容認した液滴についての最良適合の円を図６Ｂに示す。
【０３６４】
実施例６
液滴を特定するためのリバースウォーターシェッド及び円検出複合法
この実施例は、本開示の態様に従ってリバースウォーターシェッド及び円検出複合法を行うための例示的なプロセスを説明する。
【０３６５】
この態様に従い、ＲＯＩ、画素グループ、及び外部境界画素を、リバースウォーターシェッド法を使用して決定した後、円ハフ変換を境界画素に適用した。これらの方法を組み合わせて行うことによって、更なる基準を、グループ内のＲＯＩの液滴への分類に適用した。この実施例について、３つの異なるカットオフを定義した。背景の平均及び標準偏差を、実施例４に記載のように計算した。これらは、この実施例においては、初期平均及び初期標準偏差と称する。この実施例についてのＳＣＴは、初期平均＋２．５×初期標準偏差であった。孔についてのカットオフは、初期平均＋２．７５×初期標準偏差であった。１つの更なるカットオフを適用して、どの画素が背景の一部であったかを決定した。背景カットオフは、初期平均＋２．３×背景の初期標準偏差であった。より小さいカットオフを使用して背景を定義したのは、試料中の他の焦平面に由来した蛍光を含んだ画像のエリアを排除するためであった。強度が背景カットオフ未満であった全ての画素を、最終背景の一部であると見なした。
【０３６６】
加えて、強度が背景カットオフを超える画素の４連結セット全てを検査した。セットのエリアが１０画素未満であった場合には、これらの画素を最終背景に含んだ。最終背景中の画素を使用して最終平均背景強度を計算し、これを使用して背景を減算した強度を取得した。
【０３６７】
この実施例では、実施例５のように、ＳＣＴを使用したカットオフを最初に適用した。加えて、各画素グループを、強度が画素グループの内部で孔カットオフ（ＨＴ）を下回った画素の８連結セットについて確認した。このセットが９以上の画素を含んだ場合には、それを孔とした。孔に隣接した画素グループ内の任意の画素のリストを画素グループの外部境界のリストに加えた。その後、リバースウォーターシェッド法を画像に適用した。画素グループを最初に決定することによって、リバースウォーターシェッド法によって見出したいずれのＲＯＩも、その直後にそれらが属する画素グループ中に収集した。これは、帳簿目的で行ったものであり、必須ではなかった。ＲＯＩの外部境界をトリミングしてノイズ画素を排除した。トリミングした外部境界画素のリストは、少なくとも１つの内部画素に隣接するＲＯＩの外部境界画素のみを含む。内部画素は、画素グループの一部であるがグループ外の画素に隣接しないものである。
【０３６８】
トリミングした外部境界のリストは、以下では特徴画素のリストと称する。実施例４のリバースウォーターシェッド法とは対照的に、各ＲＯＩのトリミングした外部境界画素は、この段階では円に適合させなかった。代わりに、円ハフ変換を各ＲＯＩの特徴画素のリストに適用した。変換を、各画素グループについて２〜６０画素の範囲の円半径に対して行った。この実施例では、画像中のノイズレベルの上昇により、変換を行うための改変した方法を使用した。この態様における画素に割り当てられた票の数は、画素が半径Ｒの円の中心である可能性に割り当てられた重量であった。通常、所与の半径Ｒについては、画素に割り当てられた票の数は、代わりに、画素の距離Ｒの内の特徴画素の数である。この方法では、円の中心の距離Ｒ−１、Ｒ、またはＲ＋１内の特徴画素の数であった。特定の画素についての票の数及び各画素に票を投じる特徴画素のリストを、Ｒの各値について計算した。
【０３６９】
各ＲＯＩについて生成した円のリストを以下のように削った。（ｉ）画素グループの一部ではない画素によって占有される円の、ＲＯＩが属する（非画素グループ画素）ものに対する割合が、３０％を超過する場合、円を拒否する、（ｉｉ）円の内部のグループ外の画素の数の、画素の円周に対する割合が、０．４０を超過する場合、円を拒否する、（ｉｉｉ）画素グループ外の画素である円の円周の割合が７０％を超過する場合、円を拒否する、（ｉｖ）円の内部の画素グループ外の画素の、円の内部の画素グループの画素に対する割合が、０．３０を超過する場合に、円を拒否する。
【０３７０】
その後、同じ半径の円の対を検査した。円の中心間の距離が半径の５０％未満（または５画素未満の半径について２画素未満）であった場合には、２つの円の各々に票を投じる画素のリストを比較した。３０％超の重複があった（両方の円と共通した票の数が２つのリストのうちのいずれかの３０％超である）場合には、票の数がより少ない円を拒否した。
【０３７１】
次に、異なる半径を有し得る円の対を検査した。円の中心間の距離がより大きい円の半径の５０％未満であった場合には、２つの円の各々に票を投じる画素のリストを比較した。３０％超の重複があった（両方の円と共通した票の数が、半径がより小さい円についてのリストの３０％以上である）場合には、半径がより小さい円を拒否した。  
【０３７２】
この時点でＲＯＩと関連付けられる円を、票の数によって、票の数が最も大きいものから分類した。その後、各円を、票がより少ないＲＯＩと関連付けられる全ての他の円と比較した（それぞれ円Ａ及びＢと以下で称する）。円Ｂへの票の５０％以上が円Ａにも票を投じた場合には、２つの更なる確認をその円の対に対して行った。円Ｂの内部のエリアの６０％以上が円Ａの内部にもある場合には、円Ｂを拒否した。いずれかの円が画像の縁と重なり合った場合には、検討したエリアは、円のエリアの画像中にあった部分のみであった。更なる調査のために、２つの円の中心間の距離を計算した。この距離が２つの円のうちの大きい方の半径の８９％未満であった場合には、円Ｂを拒否した。この態様に従う次のステップは、ＲＯＩを、それらについて特定された円を使用して液滴にグループ化することであった。
【０３７３】
画素グループについて、この時点で残っているものが単一のＲＯＩ円のみであった場合には、その円を使用して、液滴の寸定に使用する外部境界画素を特定した。
【０３７４】
円が２つ以上であった場合には、試験のセットを行った。各円について、その中心から画像グループ中の全ての他の円の中心までの距離を計算した後で、第１の円の半径で割った（ΔＣスケール調整済）。全ての円の対のリストを創出し、ΔＣスケール調整済によって、最も小さいものから分類した。円の対についてのΔＣスケール調整済が、０．１０未満であり、２つの円についての半径の差異の、より小さい円の半径に対する比率が、０．２０未満であった場合には、２つの円（及びそれらが関連付けられるＲＯＩ）を同じ液滴の一部に割り当てた。液滴に割り当てられていなかったこの時点でのいずれの残りの円も、別々の液滴に各々割り当てた。次に、液滴と関連付けられる票のリストを創出した。票のこれは、液滴に割り当てられた円についての全ての票を含んだ。その後、このリストを円に適合させた。
【０３７５】
単一のＲＯＩを１つ超の液滴に割り当てた可能がある。これについて確認し、これらの場合、各液滴の最良適合の中心からＲＯＩと関連付けられる円の中心までの距離を計算した。ＲＯＩを、この距離が最小であった液滴に割り当て、この距離が最大であった液滴に割り当てられた円のリストから除去した。本実施例のこのステップは、リバースウォーターシェッド法によって見出した各ＲＯＩが１つの液滴の一部のみであったと仮定する。このステップの後、液滴がいずれのＲＯＩにも割り当てられていない場合には、その液滴を拒否した。画素グループと関連付けられる液滴のリストを創出し、半径によって、半径が最も大きいものから分類した。その後、画素グループ内の全ての液滴の対を比較した。半径がより小さい最良適合の円の内側の画素の７５％以上が、半径がより大きい最良適合の円の内側でもある場合には、最良適合の半径がより小さい液滴を拒否し、拒否した液滴に割り当てられたいずれのＲＯＩも、半径がより大きい液滴に割り当てた。
【０３７６】
次に、画素グループ中の割り当てられていないＲＯＩがある場合、それらを確認して、それらを既存の液滴に割り当てるべきかを調べた。液滴の円周についての画素（円を液滴の票に適合させることによって決定した）を、ＭＡＴＬＡＢのｉｍｄｉｌａｔｅ（）関数、及びＭＡＴＬＡＢ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｔｒｅｌ（‘ｓｑｕａｒｅ’，３）によって定義された構造化要素を使用して膨張させて、マスクを産出した。割り当てられていないＲＯＩの各々について、そのトリミングした外部境界画素の５０％以上がこのマスク内にある場合には、そのＲＯＩを液滴に割り当てた。マスクの内部にあったＲＯＩの画素をその液滴への票に加えた。割り当てられたＲＯＩのリストがこれらのステップによって変化したいずれの液滴も、円に再適合させた。その後、画素グループが、それらと関連付けられた液滴を全く有しないことが分かった場合には、トリミングした外部境界画素を円に適合させ、画素グループ全体を１つの液滴として扱った。
【０３７７】
他の態様においては、代替的な方法を使用して、画像内の更なる液滴の場所を特定し得る。画素グループが、液滴の内部になかった画素を相当数有した場合、まだ液滴に割り当てられていなかったいずれのＲＯＩの外部境界画素も、円に適合させ得る。グループ外の画素との著しい重複を有しないことに加えて、これらの更なる円は、グループ内の既存の液滴との著しい重複を有しないように制約され得るという点で、更なる制約を適用し得る。
【０３７８】
非円形境界に繋がる上昇した画素強度を有する２つの液滴間の領域の問題は、円ハフ変換の使用によって軽減し、これは、円ハフ変換が、非円形境界を形成する画素を判別するためである。
【０３７９】
図７Ａは、リバースウォーターシェッド法及び円ハフ変換法を図１の画像に適用した後に産出された処理画像及び拒否した不要な円を示す。図７Ｂは、これらの円を分類して液滴を特定し位置決定した後に取得した最終結果を示す。
【０３８０】
実施例７
ｄＰＣＲ増幅及び分析
この実施例は、多分散液滴エマルションシステムを使用するヌクレオチド試料のｄＰＣＲ増幅及び分析のための方法を説明する。
【０３８１】
液滴内の増幅産物の存在を可視化するために、増幅の存在を特異的に認識した蛍光プローブを反応混合物に加えた。少量（１〜２μＭ）の赤色蛍光染料６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）を、反応混合物中で参照染料として使用した。ＲＯＸの分光的特徴は、増幅を報告するために使用した緑色蛍光プローブの分光的特徴とは容易に区別される。更に、ＲＯＸ蛍光シグナルは、増幅または他の反応若しくは試薬条件に非感受性である。参照染料から測定したもの及びプローブから測定したものである、２つの強度の比率を使用して、測定した液滴の各々から２値測定を行う。強度比率は、融合若しくは収縮に起因する液滴体積の変化または光励起出力の不要な変化による影響を受けず、これは、これらの各々が、両方の染料の蛍光強度に同等に影響して、比率を不変にすることになるためである。
【０３８２】
液滴サイズの分布のプロファイルを築くために、表面をシラン処理し、過剰体積の油−界面活性剤混合物で覆った９６ウェルプレートに、エマルションを移した。エマルションを、ＰＬＡＮ  ＡＰＯ  ２０Ｘ、０．７５  ＮＡ対物を持つマルチトラックモードのＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０共焦点顕微鏡を使用して撮像した。５４３ｎｍ（ＬＰ  ６１０）及び４８８ｎｍ（ＢＰ  ５００−５３０）のレーザー光源励起波長を使用して、ＲＯＸ及びＦＡＭ染料から蛍光シグナルを収集した。各視野について、一連の光学的断面（ｚスタック）をｚ軸に沿って異なる深度で撮像して、液滴寸法の３Ｄプロファイルを築いた。
【０３８３】
図８Ａ〜８Ｃは、データ獲得中に液滴におけるＰＣＲ増幅産物の存在を検証するための迅速な方法を示す。図８Ａ及び８Ｂ中の円は、特定された液滴を示す。図８Ａ及び８Ｂの右側のグラフは、左側の画像に示される直線に沿った蛍光強度を示す。蛍光強度を、赤色蛍光（ＲＯＸ）及び緑色蛍光（ＦＡＭ）チャネル（それぞれ、図８Ａ及び８Ｂ）における、直径が同様である２つの液滴の中心を通る線に渡って測定した。ＲＯＸで標識された液滴のうちの全てではないがいくつかは、緑色蛍光ＤＮＡレポーターによっても標識された。両方の液滴は、同様の赤色蛍光強度を有したが、液滴（２）の緑色蛍光強度は、液滴（１）よりも約２．５倍大きかった。液滴（１）のより小さいシグナルは、ＦＡＭフルオロフォアを含むＴａｑＭａｎプローブによって生成された背景強度と一致し、このことは、液滴（１）における標的ＤＮＡの不在を示した。ＦＡＭチャネルにおいて観察された液滴（２）中のより高いシグナルは、増幅がその液滴において発生したことを示した。
【０３８４】
図８Ｃは、ＲＯＸ蛍光シグナルを使用した乳化の後に測定した４８９個の液滴の液滴径の分布を示す。
【０３８５】
図９は、３つの異なる開始濃度のｄｓＤＮＡ（即ち、ヒストグラム１０Ａ中約２×１０３ｄｓＤＮＡコピー／μＬ、ヒストグラム１０Ｂ中約２×１０６ｄｓＤＮＡコピー／μＬ、及びヒストグラム１０Ｃ中約２×１０７ｄｓＤＮＡコピー／μＬ）で載せた多分散液滴の集団についての緑色対赤色の蛍光強度の比率の度数分布を示す。より低い濃度では、本質的にいずれの液滴も、ＰＣＲ後に増幅されたＤＮＡ試料を含まない（ヒストグラム１０Ａ）。この分布は、大部分は、増幅産物を欠く液滴から成り、平均ＦＡＭ／ＲＯＸ比率は０．３５であった（Ｎ＝液滴１７０１個）。中間の濃度では、いくつかの液滴はＰＣＲ後に増幅されたＤＮＡ試料を含むが、他のものは含まない（ヒストグラム１０Ｂ）。この初期標的分子濃度（約２×１０６分子／μＬ）では、２つの明確な分布が可視であり（ヒストグラム１０Ｃ）、これらの分布は、ヒストグラム１０Ａに示すものと同様の増幅されていない液滴（白色の棒）、及びＦＡＭ／ＲＯＸ比率が０．６２５超である増幅された液滴（黒色の棒）に対応する。この値は、増幅されていない液滴の平均の１．５倍超であるため、増幅された試料を含む液滴と含まない液滴との間の区別に適切な閾値となる。最も高い濃度では、本質的に全ての液滴が、ＰＣＲ後に増幅されたＤＮＡ試料を含む（ヒストグラム１０Ｃ）。更に高い初期標的分子濃度（約２×１０７分子／μＬ）では、エマルション液滴のうちのほぼ全てが、増幅された試料の検出のための閾値を上回るＦＡＭ／ＲＯＸ比率を有する（ヒストグラム１０Ｃ）。
【０３８６】
実施例８
ｄＰＣＲ後の液滴分析のための方法
この実施例は、多分散液滴エマルションシステムにおけるデジタルＰＣＲなどの、連続可変液滴体積を使用するデジタル増幅分析方法を説明する。この方法を使用し、多分散液滴を用いたデジタルアッセイを使用して、標的試料濃度ＣＳを正確に決定することができる。
【０３８７】
試料を可変サイズの液滴に分配し、標的分子の液滴への分配がポアソン統計に続く。この実施例は試料濃度を計算するための方法を提供するが、他の好適な方法を使用して試料濃度を決定し得ることが理解される。この実施例では、初期試料濃度（ＣＳ）は、所与の体積の分子の数として表される。試料を可変体積の別々の分割または「液滴」に分配し、ここで、標的分子の液滴への分配がポアソン統計に続く。デジタルアレイ中の各液滴について、また方程式（５）に示すように、標的の平均数は、その体積Ｖｉ及び初期試料濃度ＣＳに依存する。
【数５】
2020060579.tif 000009
【０３８８】
Ｐ（ｎ、ＣＳＶｉ）は、溶液中の標的分子の所与の濃度ＣＳについて、体積Ｖｉの液滴におけるｎ分子を見出す可能性である。増幅反応により、１つ超の分子を含む液滴は、実施例７に記載の蛍光レポーターなどのレポーターによって、空の液滴と区別可能となる。この方法では、液滴が空である（ｎ＝０）か、または占有されている（ｎ＞０）かのみが既知となる。関連する確率を以下の方程式（６）及び（７）に示す。
【数６】
2020060579.tif 000010
【０３８９】
標的分子の濃度ＣＳを決定するために、Ｐ（ｎ＞０、ＣＳＶｉ）を、対応する体積Ｖｉを持つ多数の液滴に渡って合計し得る。
【０３９０】
各分析ステップについて、定数の液滴Ｎｄが存在し、これらの液滴は、所与の濃度の標的分子ＣＳを有する。液滴径はランダムに異なり、これらの液滴についてのサイズ分布を図１０に示す。この分布は、図８Ｃで測定した実験分布に相当する。分布は、８〜６４ミクロンの直径のみが含まれる対数正規分布である。
【０３９１】
様々な液滴が標的分子の濃度ＣＳを有し、いくつかの場合に、濃度ＣＳはゼロであり得、これは、所与の液滴における標的分析物の欠如を示す。以下の方程式（８）に記載のように、標的分析物を含むことが決定された液滴の総数ＮＳを計数した後、占有された液滴の予期した数ＮＥと比較する。
【数７】
2020060579.tif 000011
【０３９２】
ＮＥの最確値をＣ＝ＣＳについて取得する。Ｎｄ液滴の体積を使用し、方程式（８）をＮＳに適合させて、Ｃのみを調整可能なパラメータとして、濃度の最良適合の値を取得することができる。Ｎｅｗｔｏｎ−Ｒｈａｐｓｏｎアルゴリズムを使用して、ＮＳ−ＮＥのゼロを見出した。Ｃの初期値を、方程式（８）におけるＶｉを分布の中央体積で代置し、Ｃについて解く。その後、アルゴリズムは、典型的には、Ｃの変化について、１０５分の１を下回るまで５〜１１回反復する。この時点でのＣの値をＣの最良適合の値とする。
【０３９３】
これらの計算は、この手順がどれだけ正確に所与のＣＳを予期しようとするものであり、２つの異なる試料がＣの異なる最良適合の値を生む場合には、試料が異なる濃度を有することの信頼度の計算を試みる。
【０３９４】
この方法は、各液滴の体積及びその関連の誤差の測定を含む。液滴径の誤差は、任意の所与の直径測定に適用されるガウス分布誤差によって概算することができる。液滴径を使用して液滴体積を計算するため、液滴径の誤差は、液滴体積における対応する誤差を生み、
【化２】
2020060579.tif 000012
これを方程式（９）に代入して、測定した体積に基づいて占有された液滴の予測数を出す。
【数８】
2020060579.tif 000013
【０３９５】
この例では、液滴径は、顕微鏡法によって決定する。この方法の精度は、使用する対物レンズの開口数（ＮＡ）及び撮像システムの他の構成要素に依存し得る。表面上の多数の静止液滴を撮像するためには、ＮＡは、１未満である可能性が高く、直径測定値の誤差は、典型的には、液滴のサイズとは無関係に、０．５〜１．０ミクロンである。測定誤差の２つの異なる大きさは、Ｅ１及びＥ２と見なし、示す。Ｅ１について、ガウス分布誤差の標準偏差は、液滴径に加えられ、１ミクロンまたはその液滴の直径の８％のいずれか大きい方である。相対的誤差を含めることで、計算が最大の液滴についての無視できない測定誤差を含むようにする。Ｅ２について、ガウス分布誤差の標準偏差は、液滴径に加えられ、２ミクロンまたはその液滴の直径の１５％のいずれか大きい方である。両方の場合において、測定した直径にかけられる制限が１つある。測定誤差を持つ特定の液滴径が０．５ミクロン未満の直径をもたらす場合には、その測定誤差は破棄され、新たなものをその液滴について生成する。この結果は、不偏測定誤差である。
【０３９６】
ＣＳは、本手順が決定しようとしている有効な未知の濃度であり、
【化３】
2020060579.tif 000014
は、実験者が測定した体積である。方程式（９）中の
【化４】
2020060579.tif 000015
が占有される液滴の測定数と等しくなるまでＣを変化させて、最良適合の濃度を取得する。
【０３９７】
計算を、ＣＳ＝４．４×１０−５分子／ｆＬ、及び５００〜１００００の範囲のＮｄを用いて行う。デジタルアッセイを行うための方法を検証するために使用した液滴径の短縮対数正規分布を描く図１０に示す直径の分布から、液滴サイズを導いた。計算を、液滴径の測定誤差なし（「０誤差」）ならびにＥ１及びＥ２測定誤差の場合に対して繰り返す。液滴の各数及び誤差の量について、１０００回の計算を行い、平均の最良適合の濃度、及び最良適合の濃度の分布の標準偏差を計算する。
【０３９８】
標準偏差の平均の最良適合の濃度に対する比率を「測定変動」と呼び、図１１において液滴数の範囲及び測定誤差の量についてプロットする。図１１は、測定変動が試料サイズ（即ち、液滴の数）によってどのような影響を受けるかを示す。試料濃度を４．４×１０−５分子／ｆＬに設定して行ったデジタルアッセイについてデータを生成する。測定変動は、真の試料の濃度を予測することにおけるデジタルアッセイの精度を反映し、より大きい測定変動は、より低い精度を暗示する。このシミュレーションに対しては、測定変動（縦軸）は、予測濃度分布の平均で割った標準偏差の比率として定義する。測定変動を、異なる数の液滴（図１０に示す液滴径分布から導く）について、及び液滴径のシミュレーション測定における３つの異なる量の誤差について計算する。計算の１つのセットにおいては、液滴径の測定は誤差を有しなかった（「０誤差」）。計算の別のセットにおいては、液滴径誤差分布の標準偏差は、１μｍまたは真の液滴径の８％のいずれか大きい方である（「Ｅ１誤差」）。計算の第３のセットにおいては、液滴径誤差分布の標準偏差は、２μｍまたは真の液滴径の１５％のいずれか大きい方である（「Ｅ２誤差」）。液滴径測定誤差の３つの異なる量についての測定変動における類似は、任意の所与の試料についての測定変動が、液滴間の標的分子の分布を司るポアソン統計によって支配されることを示唆する。その結果、液滴サイズ測定誤差に起因する最良適合の濃度におけるいずれの変動も、それが不偏である限り、濃度に対する影響はわずかであるか、または無視できるものである。
【０３９９】
方法が濃度の差異を判別する能力は、信頼度及び検出力の観点から説明し得る。この態様は、Ｌｉｅｂｅｒ，Ｒ．Ｌ．（１９９０）“Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐｏｗｅｒ  ｉｎ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ  Ｔｅｓｔｉｎｇ，”  Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８，３０４−３０９によって説明されている。本方法により、所与の測定についての信頼レベルを決定することが可能となり、これは、２つの異なる試料に対する測定が２つの異なる最良適合の濃度（Ｃ１及びＣ２）を生むときに特に関係がある。故に、２つの試料の濃度が異なるという主張がどれだけ信頼できるか、またそれらが異ならなかったと結論した場合に間違っている確率を知るために有用であり得る。偽陽性結果（Ｉ型誤差）のリスクは、結果が必要最低限の信頼度を有することを要求することによって制御され、偽陰性結果（ＩＩ型誤差）のリスクは、本方法が必須の検出力を有することを要求することによって制御される。
【０４００】
２つの異なる試料からの２つの最良適合の濃度の比較について、帰無仮説は、２つの試料が同じ（未知の）濃度を有することであり得る。αが、同じ濃度の２つの試料が、｜Ｃ１及びＣ２｜超異なる大きさの最良適合の濃度をもたらし得る確率である場合には、（１−α）は、帰無仮説を拒否することに関する信頼度である。（１−α）の許容可能な最小値は、偽陽性結果を制限するように選択する。偽陰性を防ぐための検出力の使用は以下で説明する。
【０４０１】
信頼レベルを予期するために使用される１つの方法は、方程式（１０）に示すＺ試験である。
【数９】
2020060579.tif 000016
【０４０２】
９５％の信頼レベルが一般的な選択であり、１．９６超のＺを要求する。Ｃｎの値は、方程式（９）の最良適合の結果に由来し、
【化５】
2020060579.tif 000017
は、Ｃｎの測定に関する分散である。この実施例では、
【化６】
2020060579.tif 000018
は、この項について扱いやすい分析的表現がないと信じられているため、予期する。信頼度を予期するための第２のシミュレーション方法を行い、Ｚ方法の結果と比較する。以降は、これらの２つの方法を、Ｚ方法及び対方法（またはＰ方法）とする。
【０４０３】
信頼度のＺ方法の予期については、ＣＳの２つの異なる値を使用する（ＣＳ１及びＣＳ２）。ＣＳ１について、５０００個の液滴のセットを短縮対数正規分布からランダムに選択し、方程式（６）を使用して、占有される液滴の数を計算する。測定誤差のＥ１サイズを使用して体積
【化７】
2020060579.tif 000019
を生成する。濃度の最良値Ｃ１を、上記のように方程式（８）を使用して取得する。標準偏差を、ＮＺ＝１０００の更なる計算を行って予期する。各々について、測定した体積
【化８】
2020060579.tif 000020
のセットを取り、方程式（６）を使用して、それらのうちのどれが占有されるかを決定することによって、ポアソン統計に起因する変動の量を決定する。その後、占有される数を、方程式（８）を使用して適合させて、更なる計算の各々についての最良適合の濃度を取得する。更なるＮＺ計算の標準偏差を方程式（９）中のσ１に使用する。その後、このプロセスをＣＳ２について繰り返す。信頼度の予測は、方程式（９）を使用して、最良適合の濃度Ｃｎ、及び測定した液滴体積
【化９】
2020060579.tif 000021
から計算することができる。
【０４０４】
信頼度のＰ方法予期について、帰無仮説は、２つの最良適合の結果（Ｃ１及びＣ２）が、各々、有効濃度
【化１０】
2020060579.tif 000022
が２つの最良適合の濃度の平均である試料から取得されるというものである。液滴径のＮｐ＝５００個の更なるセットを決定し、各々に対して、占有される液滴の数を濃度
【化１１】
2020060579.tif 000023
について決定し、Ｅ１サイズを使用して、測定した体積を生成する。最良適合の濃度
【化１２】
2020060579.tif 000024
を各セットに対して取得する。その後、Ｍｐ＝５００個の値の対を、
【化１３】
2020060579.tif 000025
のセットから代置を用いてランダムに選択し、それらの差異の絶対値
【化１４】
2020060579.tif 000026
をΔＣ＝Ｃ２−Ｃ１と比較する。ΔＣを上回る
【化１５】
2020060579.tif 000027
の割合は、αの予期、即ち、濃度
【化１６】
2020060579.tif 000028
の試料から作製した２つの測定値が互いにΔＣ超異なり得る確率を提供する。αのＰ方法予期を使用して、信頼度を計算し、これは（１−α）と等しい。
【０４０５】
信頼度の２つの予期を取得するための手順全体を、ＣＳ値の対について１００回繰り返す。各反復に対して、体積の新たなセットを各ＣＳについて生成し、方程式（６）及び（７）を使用して、各ＣＳについての占有される液滴の数を生成する。測定した体積を生成し、方程式（９）中で使用して、結果を適合させ、最良適合の濃度の新たな対（Ｃ１及びＣ２）を取得する。Ｚ方法及びＰ方法による測定値の所与の対について計算した信頼度間の差異は、典型的には、１％未満であるため、どちらの方法も検出力の計算に使用することができる。測定値を分析するためのＺ方法の１つの利点は、それが液滴の分布を生成するために数値法を必要としないことである。
【０４０６】
Ｐ方法を使用して測定値を分析することもできる。２つの異なる濃度について、検出力は、信頼度（１−α）の所望の値を超過する結果の割合である。５０％異なる２つの濃度を判別することにおける検出力の決定は、Ｎｄ＝５０００個の液滴、及びＥ１測定誤差を使用して行う。結果を、２つの濃度の小さい方の関数として図１２にプロットする。図１２では、液滴径測定誤差の標準偏差は、１μｍまたは液滴径の８％のいずれか大きい方である（「Ｅ１誤差」）。破線は、０．９５の検出力をマークし、これは、２つの試料濃度の差異の検出に失敗する５％の可能性に対応する（偽陰性、またはＩＩ型誤差）。実線は、信頼レベル（１−α）が０．９５と等しいときに５０％異なる２つの濃度のケースを判別することについての検出力である。９５％の信頼レベル（偽陽性または１型誤差を判別する）に対して、ダイナミックレンジは、２型誤差（即ち、偽陰性）が５％以下（検出力が０．９５超）である、最大濃度及び最小濃度の比率として定義される。この点は、実線と破線が交差するより大きい濃度を実線と破線が交差するより小さい濃度で割った比率にて、図１２に見出される。
【０４０７】
図１３は、液滴径測定誤差あり（「Ｅ１誤差」）の多分散液滴（灰色の円、図１０の分布から取得した直径）、または液滴径測定誤差なしの単分散液滴（黒色の三角形、全ての直径は３０μｍちょうど）に対して行うときの、デジタルアッセイの試料サイズ（液滴の数、横軸に示される）とダイナミックレンジ（縦軸に示される）との間の関係を示すグラフである。ダイナミックレンジは、アッセイを効果的に使用することができる濃度の範囲がどれだけ広範かを説明する。具体的には、ダイナミックレンジは、９５％の信頼レベル（５％の偽陽性またはＩ型誤差の可能性）を仮定して、統計的検出力が０．９５超である最大濃度及び最小濃度の比率として定義される。デジタルアッセイは、単分散液滴と比較して多分散液滴に対して行うときに、はるかに広範な範囲の濃度に対して効果的である。図１３に示すように、同じ数の液滴に対して、デジタルアッセイは、単分散液滴の分布を使用して取得し得るときよりも、多分散液滴の分布を使用するときに著しく大きいダイナミックレンジを有する。この理由から、多分散液滴の使用は、単分散液滴の使用よりも分析的に優れている。
【０４０８】
図１は、共焦点蛍光顕微鏡法を使用して取得した例示的な多分散液滴エマルションシステムのグレースケール画像である。
【０４０９】
図５Ａ及び５Ｂは、図１の画像に適用したリバースウォーターシェッド法の初期ステップの結果を示し、これは、図５Ａに示す目的領域（ＲＯＩ）の特定、及び図５Ｂに示す最適化した円領域を持つ最終の処理画像を含み、この画像から液滴サイズ及び標的分子の存在についての情報が決定される。
【０４１０】
図６Ａは、図１の画像に適用した円検出法の初期ステップを行った後に産出された処理画像を示す。図６Ｂは、図６Ａ中の円を分類して液滴を特定し位置決定した後に取得された最終結果を示す。
【０４１１】
実施例９
液滴径変化の特性評価
この実施例は、ＰＣＲ条件下での多分散液滴エマルションシステムにおける液滴サイズの分布の変化の分析、及びかかる変化の影響を最低限に抑えるための方法を説明する。
【０４１２】
液滴サイズは、蒸発または液滴融合の結果を含む、ある数の理由から変化し得る。エマルションシステムにおける液滴は、ＰＣＲ熱循環において発生するものなどの著しい温度の揺らぎを経験し得る。蒸発は、熱循環の過程に渡って発生し得、これは、液滴径の分布及び体積を改変し得る。更に、互いに近接している液滴は、いくつかの場合、液滴を含むシステムの総合表面張力を減少させる傾向に起因して、互いに融合し得る。デジタルアッセイの過程に渡る液滴径及び体積の変化は、その変化が著しいと、測定誤差を招き得る。この実施例は、加熱の効果の調査及び液滴サイズに対する機械的操作を含む、測定システムを特性評価及び最適化し、サイズ分布測定の精度を確実にするためのステップを示す。
【０４１３】
液滴融合。２つのエマルションを、一般的ＰＣＲ試薬の混合物を使用して調製した。第１のエマルションは、ＤＮＡ鋳型と緑色蛍光プローブ（ＦＡＭ）との両方を除外し、一方で、別のエマルションは、ＤＮＡ鋳型と赤色蛍光染料（ＲＯＸ）との両方を除外した。後者の場合、緑色蛍光プローブ（ＦＡＭ）の最終濃度を１．４μＭに上昇させた。２つのエマルションを１０分間沈殿させ安定させた。その後、それらを静かに再懸濁させ、試験管をゆっくりと傾けて動かしながら再懸濁し組み合わせた。最後に、組み合わせた混合物を３つのＰＣＲ試験管に等分した。第１の試験管を加熱なし（対照）試料として取っておいた。残りの２つを、１または５０サイクルのサイクル期間（ホットスタートを含む）、標準条件下で熱循環させた。再現セットを同時に実行した。
【０４１４】
図１４は、多分散液滴エマルションにおける自発的にまたは熱循環の結果として発生する液滴融合事象の度数を示す。エマルション混合物のＲＯＸ及びＦＡＭ蛍光強度を使用して、融合事象を特定した。液滴融合事象の度数を、ＲＯＸと緑色蛍光プローブとの両方を含む液滴のパーセントに反映させる。液滴は、両方の染料を含む円で示した（画像１４Ａ及び画像１４Ｂ）。乳化後の液滴不安定性、試料の取り扱い、及びピペッティングだけに起因するＦＡＭ及びＲＯＸ融合事象は、最小、即ち、６．２±２．１％の割合であることが示された（チャート１４Ｃ）。この測定は、同じ染料を含む液滴間の融合事象を含まないが、値は同等であると期待され得ることに留意されたい。ホットスタート及び１回の熱循環の後、熱をエマルション試料に適用すると、６．１±１．４％の同等の融合事象がもたらされた（チャート１４Ｃ）。５０回のサイクルに対して検出されたＦＡＭ−ＲＯＸ融合事象、５．８±１．５％も、１回のサイクルのものと同様であった（チャート１４Ｃ）。両方の加熱条件も、十分に対照アリコートの誤差の範囲内であった。
【０４１５】
融合事象は、熱循環期間に関して徐々に増加するようには見えなかったことに留意することが重要である。このことは、熱循環加熱が、液滴融合をほとんどまたは全く誘導せず、液滴の不安定性に寄与する主因は、２色のエマルションの混合及び試料の取り扱いに関係したことを示唆する。これは重要なことであり、なぜなら、少なくとも１つの標的分子を含む混合した液滴が増幅を受けて陽性シグナルを付与する一方で、増幅を受けない混合した液滴は陰性シグナルを付与するため、熱循環の前または早期に発生する融合事象はアッセイの結果を歪めないからである。対照的に、熱循環の後期に発生する融合事象は、アッセイの２値検出閾値を下回る混合した液滴をもたらし、これは液滴の誤った特性評価につながる。実験の結果は、この方法を使用すると、融合の試料の定量に対する影響が最小であることを示す。加えて、乳化及び熱循環を全て同じデバイス上で行うことによって試料の取り扱いが本プロセスから排除されると、融合がアッセイの結果に与える影響が更に小さくなり得る。乳化後の試料の取り扱いを排除する可能性のあるワークフローの例を図４に示す。
【０４１６】
液滴収縮。液滴収縮の分析を、陰性対照及び熱循環させたエマルション試料の液滴サイズ分布を比較することによって行った。エマルションを、標準ＰＣＲ混合物及び乳化プロセスを使用して調製した。融合実験と同じ熱条件を検査した。エマルション試料の液滴径分布を正規化して図１５にプロットし、これは、加熱なし、１回の熱循環、または５０回の熱循環のいずれかに供した多分散液滴エマルション中の液滴径の分布を比較する。この実験を実施して、反復的熱循環から得られた液滴サイズの変化を定量した。対照セットは、１５．４±０．１μｍの平均径を有した（１８５７個の液滴を測定）。１回の熱循環に供した多分散液滴エマルション（図１５中の三角形）は、１４．９±０．４μｍの平均径を有した（１９５２個の液滴を測定）。５０回の熱循環に供した多分散液滴エマルション（図１４中の円）は、１５．８±０．５μｍの平均径を有した（１６６０個の液滴を測定）。３つの条件についての液滴径の分布は区別できず、このことは、熱循環が液滴体積の相当の変化をもたらさないことを示す。
【０４１７】
実施例１０
最良適合の濃度とＵＶ吸光によって決定した濃度との間の比較
この実施例は、本開示の最良適合法によって決定した試料濃度と、ＵＶ吸光によって測定したものとの間で観察された十分な一致を説明する。
【０４１８】
ｅｒｂＢ２  ｄｓＤＮＡの連続希釈の最良適合の濃度を、２６０ｎｍでの吸光測定によって決定した濃度と比較した。濃度は、４桁（即ち、２×１０３、２×１０４、２×１０５、及び２×１０６のｄｓＤＮＡコピー／μＬ）の範囲に及び、各濃度にて試料は複数であった。液滴径を、本明細書に記載のようにシンプルバウンダリ法を使用して決定し、分析は、直径が７〜５０μｍ（体積１〜５００ｐＬ）の範囲である液滴を含んだ。更なるＰＣＲパラメータは、実施例７に記載したものと一致した。最良適合の濃度を、以下の方程式（８）を使用して取得した。
【数１０】
2020060579.tif 000029
【０４１９】
図１８は、上記のｅｒｂＢ２  ｄｓＤＮＡ試料についての、最良適合法によって決定した試料濃度値（縦軸に示す）と、２６０ｎｍでの吸収測定によって決定した試料濃度値（横軸に示す）との間の関係を示すグラフである。図１８における比較は、２つの方法間の十分な一致を示し、これは、それらの間の線形関係によって示されている通りである。
【０４２０】
実施例１１
最確数法を使用する液滴分析
この実施例は、標的試料の濃度を決定するための最確数（ＭＰＮ）法の使用を（実施例８に記載の方程式（８）の使用と比べて）説明する。この方法を使用すると、標的試料の濃度ＣＳは、占有されていない液滴の特定、寸定、または列挙なくして正確に決定される。
【０４２１】
チャンバ及びウェルを伴う特定の場合には、標的試料を含むチャンバまたはウェルの数を最初に決定した。アッセイを行う前にチャンバの数を事前決定した。各チャンバの体積は、サイズの別々のセットのうちの１つであり、これも、アッセイを行う前に事前決定した。
【０４２２】
チャンバ及びウェルを伴う特定の場合について、方程式（８）と同等のＭＰＮを方程式（１１）として以下に示す。
【数１１】
2020060579.tif 000030
方程式（１１）では、チャンバのｍの異なるサイズが存在する。ｉ番目のサイズについて、各チャンバの体積はＶｉであり、そのサイズのｎｉのチャンバが存在した。反応を実行した後で、ｂｉは、占有されなかったｉ番目のサイズのチャンバの数である。その後、方程式を適合させて、溶液の濃度であるＣを取得した。
【０４２３】
液滴を伴うこの方法では、方程式（１１）中の左手の項は、全液滴の総体積である。液滴は全て異なるサイズを有するため、ｎｉの各々は１に等しく、全てのｎｉの和は液滴の総数に等しい。ｍの異なるサイズが存在し、足し算を全ての液滴について行った。ｂｉは、占有されない液滴については１であり、占有される液滴については０であるため、（ｎｉ−ｂｉ）の項は、方程式（１１）の右手側の和を、占有される液滴のみの和とし、故に、方程式（１１）は、簡素化することができ、以下の方程式（１２）として表される。
【数１２】
2020060579.tif 000031
式中、Ｏｉは、占有されない液滴については１、そうでないものについては０である。この方程式はまた、Ｃについて反復して解くことができる。方程式（１２）及び方程式（８）を使用して行ったシミュレーションは、適合における統計的誤差未満の差異で、ほぼ同一の結果をもたらす。
【０４２４】
上述のように、方程式（１２）の和における項は、占有されない液滴については０である。故に、試料の総体積が分かっている場合には、試料中の占有される液滴のサイズを特定及び決定することが可能であり、その後、方程式（１２）を使用して、試料濃度を決定することができる。この方法に従うと、占有されない液滴の存在またはサイズを特定する必要はない。
【０４２５】
２つの異なる蛍光染料を、占有される液滴及び占有されない液滴の両方の寸定が必要となる方法において使用する。例えば、全ての液滴において蛍光性である染料１を使用して、液滴を寸定し、占有される液滴においてのみ著しく蛍光性である染料２を使用して、液滴が占有されるかを決定する。しかしながら、本実施例の更なる態様では、方程式（１２）を使用すると、染料２のみを使用して、この実施例に記載の方法を実施することが可能である。故に、染料２の蛍光を使用して、占有される液滴の存在及びサイズの両方を特定する。
【０４２６】
濃度が小さいとき、占有される液滴の数はそれに対応して小さくなる。この場合、大量のエマルションを、適度な数の占有される液滴についてスキャンする。この方法は、占有される液滴が寸定を必要とすることのみを要するため、分析を要する液滴の数は著しく少なくなり、こうして本方法の分析時間が著しく減少する。加えて、低濃度では、２つの占有される液滴が互いに接触する可能性は低い。接触している分析される液滴が少ないため、これらの液滴を判別する求められる計算はより少ない。故に、この方法を使用すると、算定要件が著しく減少し、それにより、液滴についてより大きい試料体積をスキャンするプロセスが簡素化される。より大きい体積をより容易にスキャンする能力は、低濃度の試料の分析を簡素化し、それにより、本方法の感度を増加させる。
【０４２７】
この実施例に記載した最確数（ＭＰＮ）法は、ＭＰＮ法を使用する際に占有されない液滴の画像を分析する必要がないという修正を伴って、他の本明細書に記載の他の方法と組み合わせることができる。本開示に記載の画像処理アルゴリズムのうちのいずれも、例えば、標的試料を欠く液滴を除外するように閾値画素強度を設定すること、及び標的試料を含むもののみを分析することによって、この実施例のＭＰＮ法と併用することができる。
【０４２８】
実施例１２
画像深度を改善するための屈折率整合
この実施例では、エマルションシステムの光学撮影を目的として、２つ以上の非混和性流体の屈折率を整合させることの利益を説明する。
【０４２９】
不連続相及び連続相を構成する流体の屈折率を整合させる能力は、データ獲得性能を強化し得る。屈折率が整合しない場合、照明（または撮像）路は偏向または歪曲され得、データ獲得中のシグナルの喪失をもたらす。エマルション液滴の曲面は、照明を回折及び散乱させるマイクロレンズとなり、溶液に深く入り込んでの撮像は、獲得したデータにおける収差の重大度を増加させた。実際には、液滴境界は、視野面が試料のより深くに焦点を合わせるにつれて、照明源が通って移動する必要がある、増加する数の重なり合った液滴からの識別が難しくなった（図１６、Ａ１〜Ａ５）。
【０４３０】
図１６は、多分散液滴エマルションを構成している流体の屈折率整合によって達成されたデータ獲得性能の改善を示す。蛍光画像は、共焦点顕微鏡を用いて、２つの異なるエマルション（それぞれ、図１６、Ａ１〜Ａ５、及び図１６、Ｂ１〜Ｂ５に示す）から次第に深くなる（左から右へ）焦平面にて獲得した。エマルションは、７３％のＴｅｇｏｓｏｆｔ  ＤＥＣ、２０％の軽油、及び７％のＡｂｉｌ  ＷＥ０９油混合物（屈折率≒１．４）を連続担体相使用して作製した。図１６、Ａ１〜Ａ５については、液滴は、水溶液中に溶解させたＰＣＲ試薬（屈折率＝１．３３）から成った。図１６、Ｂ１−Ｂ５については、液滴は、水（５０重量％）及びグリセロール（５０重量％）混合物中に溶解させたＰＣＲ試薬（屈折率＝１．３９８）から成った。水性試料（図１６、Ａ１〜Ａ５）においては、２つの非混和性流体構成要素の屈折率は全く異なり、液滴境界は、図１６、Ａ５のように、より深い焦平面にて取得された画像中で次第に明確でなくなる。一態様において、水（ｎ＝１．３３）と比較して著しく高い油混合物の屈折率（ｎ≒１．４）は、グリセロール（１００％（ｗ／ｗ）、ｎ＝１．４７４）及びスクロース（６５％（ｗ／ｗ）、ｎ＝１．４５３２）などの屈折率の高い構成要素をＰＣＲ混合物に加えることを伴う、一連の屈折率整合試験に繋がった。水とグリセロールとの混合試料（図１６、Ｂ１〜Ｂ５）においては、２つの非混和性流体構成要素の屈折率は同様であり、液滴境界は、図１６、Ｂ５のように、より深い焦平面にて取得された画像中であっても明確なままである。
【０４３１】
フッ化炭素油エマルションシステムも、それらの屈折率をより良好に整合させるために調査した。鉱油システムが水よりも著しく高い屈折率を有する一方で、フッ化炭素システムは、典型的には、水よりも僅かに低い屈折率を有する（例えば、ペルフルオロデカリン、フロリナートＦＣ−４０、フロリナートＦＣ−７０、Ｋｒｙｔｏｘ−上の表１を参照）。芳香族を含むペルフルオロ化合物は、典型的には、水よりも高い屈折率を有するため、このシステムにおいては、油の組成を改変して屈折率整合を改善させ得る。ＰＣＲ水相と混合した５％のＰｉｃｏ−Ｓｕｒｆ  １及び５５％（ｖ／ｖ）のオクタフルオロトルエンを持つ４５％（ｖ／ｖ）のフロリナートＦＣ−４０を含む油相を調査した。混合物を３０００ｒｐｍで３０秒間ボルテックスした。フッ化炭素油相と比較して水の密度がより低いこと（表１を参照）により、ｗ／ｏ液滴は油相の上に浮いた。これは、顕微鏡の作動距離内で液滴を撮像するために過剰な油の除去を必要としたが、この組み合わせにより、試料中のより深くで獲得したｚセクションの画像品質が改善された。液滴の境界の歪曲は、はるかに減少し、液滴寸法の３Ｄプロファイルを築くことにおけるより大きい範囲を可能にした。
【０４３２】
９５℃の温度で不活性のままであるはずであるいかなる油相構成要素の沸点の変化も最低限に抑えることを試みた。また、エマルションシステム添加剤の試料またはＰＣＲ試薬に与えるいかなる影響も減少させるかまたは排除するように努めた。
【０４３３】
実施例１３
密度及び間隔を制御するための多重エマルション
この実施例は、デジタルアッセイに多重エマルションを使用する利点を説明する。
【０４３４】
エマルションシステム構成要素間で屈折率の不整合がある場合、撮像中に、液滴を顕微鏡対物と可能な限り接近させて位置付けることが望ましくあり得る。倒立顕微鏡については、液滴密度が周囲の流体の密度より大きいと仮定して、液滴を容器の底に沈殿させることが可能である。鉱油を連続担体相として使用する場合、水滴は連続相よりも高密度であり、このことが、これらを底に沈殿させる。しかしながら、フッ化炭素系油を連続担体相として使用する場合、水滴は流体の上部に浮くことになる。
【０４３５】
試料液滴の場所は、二重エマルションの使用を通して制御することができる。水／油／水二重エマルションシステムにおいて、フッ化炭素油は中間層として使用することができ、これが、水滴を外側水相の底に沈める。
【０４３６】
２つの界面活性剤を、２次水層の産出について試験した（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０及びＳｐａｎ  ８０）。１％のＳｐａｎ  ８０を含むシステムは２次水層を効果的に生むことが分かった。純粋なフッ化炭素油（例えば、ＦＣ−４０）を用いて、または屈折率整合のためのフッ化炭素溶媒との何らかの組み合わせで形成した水／油／水エマルションは、２次液滴中に凝集した大量の水／油液滴を有したことが観察された。Ｋｒｙｔｏｘ  ＧＰＬ−１０７などの極めて粘性のフッ化炭素油を加えて、水／油エマルションが直ちに生じバルク油相の上に合わさって凝集しないように、ＦＣ−４０の粘度を増加させた。この方法によって、生成した水／油／水エマルションが、２次液滴の内部に凝集した大量の水／油液滴を有する可能性が少なくなった（図１７）。水滴の間隔は、油相の粘度を変動させることによって制御することができる。
【０４３７】
図１７は、２ステップの乳化プロセスで作製した水／油／水二重エマルションの蛍光画像を示す。まず、ＰＣＲ試薬を含む水溶液を、Ｋｒｙｔｏｘ  ＧＰＬ−１０７、フロリナートＦＣ−４０、及びＰｉｃｏ−Ｓｕｒｆ  １界面活性剤から成る油混合物中で乳化させた。その後、結果として得られた水／油エマルションを、水及びＳｐａｎ  ８０界面活性剤から成る水溶液中で更に乳化させて、水／油／水二重エマルションを産出した。この場合、油相はいずれの水相よりも高密度であるため、重力が二重乳化液滴を低下させて、撮像デバイスにより近接させる。画像を、共焦点顕微鏡を用いて、次第に深くなる（左から右へ）焦平面にて（３μｍ間隔で）獲得した。改善した撮像に繋がり得る、より良好に離間した液滴の利点の提供に加えて、これらの結果は、二重エマルションが、液滴の密度を改変することによって屈折率不整合の影響を最低限に抑えることに有用であり得ることを示す。
【０４３８】
本発明の好ましい態様を本明細書で示し記載してきたが、かかる態様が例示目的のみで提供されることは、当業者には明らかとなるであろう。多数の変形、変化、及び置換が、今や本発明から逸脱することなく当業者には思い浮かぶであろう。本明細書に記載の本発明の態様に対する様々な代替手段を、本発明の実施に用い得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、及びこれらの特許請求の範囲内の方法及び構造、ならびにそれらの均等物が、これによって網羅されることが意図される。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
デジタルアッセイを行うための方法であって、
複数の多分散液滴であって、前記液滴の少なくともいくつかが試料を含む、液滴を産出することと、
前記試料を増幅することと、
前記試料を検出可能な薬剤で標識することと、
液滴のための画像スタックを取得することと、
前記画像スタックから前記液滴の体積を決定することと、
前記画像スタックから前記液滴中の前記検出可能な薬剤の有無を決定することと、
前記複数の液滴中の前記試料の濃度を、前記複数の液滴中の前記検出可能な薬剤の有無に基づいて決定することと、を含む、前記方法。
（項目２）
前記画像スタックを取得することが、光学撮像を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記検出可能な薬剤を検出することが、光学撮像を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記光学撮像が、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせによって行われる、項目２または３に記載の方法。
（項目５）
前記画像スタックが、単一の液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記画像スタックが、液滴について別々の焦点深度から撮られた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００枚の画像を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記方法が、前記複数の液滴に対して同時に行われる、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記複数の多分散液滴が、１群列の多分散液滴を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記群列の多分散液滴が、マルチウェルプレート中に配置される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記液滴の体積が、ラインスキャン法、シンプルバウンダリ法、リバースウォーターシェッド法、円検出法、リバースウォーターシェッド及び円検出複合法、またはこれらの組み合わせによって、前記画像スタックから決定される、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記検出可能な薬剤の濃度が、少なくとも３桁のダイナミックレンジに渡って、または少なくとも６桁のダイナミックレンジに渡って決定される、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記複数の多分散液滴が、第１の流体及び第２の流体を含み、前記第１の流体が、前記第２の流体と非混和である、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
第１の流体及び第２の流体を含む溶液を撹拌することによって多分散液滴のエマルションを形成することを含み、前記第１の流体が、前記第２の流体と非混和である、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
第２の流体と非混和である第１の流体及び前記第２の流体を含む溶液を撹拌することによって多分散液滴のエマルションを形成することと、
前記エマルションを前記第２の流体と非混和である第３の流体中で撹拌し、それにより二重エマルションを形成することと、を含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記撹拌することが、振とう、ボルテックス、超音波処理、磁石による混合、押出、フローフォーカス、またはこれらの組み合わせから選択される、項目１３または１４に記載の方法。
（項目１６）
前記撹拌することが、エマルションを形成するのに十分である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記押出が、前記流体のピペッティングを含み、前記ピペッティングが、エマルションを産出するのに十分である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記撹拌することが、マイクロ流体デバイス中で起きる、項目１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記撹拌することが、ボルテックスを含む、項目１３または１４に記載の方法。
（項目２０）
前記エマルションが、水相及び非水相を含む、項目１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記第１の流体が水を含み、前記第２の流体が油を含む、項目１２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記第１の流体が水を含み、前記第２の流体が油を含み、前記第３の流体が水を含む、項目１４に記載の方法。
（項目２３）
前記複数の多分散液滴が、複数のエマルションを含む、項目１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記複数のエマルションが、３つ以上の非混和性流体を組み合わせることによって調製される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記第１の流体が水性である、項目１２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記第１の流体が前記試料を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記第２の流体が油である、項目１２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記第２の流体が油であり、前記第２の流体が前記第１の流体及び前記第３の流体と非混和である、項目１４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記第１の流体が、前記第３の流体とは異なる、項目１４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記第３の流体が油であり、前記第３の流体が前記第１の流体及び前記第２の流体と非混和である、項目１４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記複数の多分散液滴が、流体界面修飾要素を更に含む、項目１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記流体界面修飾要素が、界面活性剤である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記流体界面修飾要素が、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせから選択される、項目３１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記非混和性流体のうちの１つ以上をゲルまたは固体に変換することを更に含む、項目１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記非混和性流体が、前記試料を増幅する前、前記試料を増幅する間、または前記試料を増幅した後に、ゲルまたは固体に変換される、項目３４に記載の方法
（項目３６）
前記検出可能な薬剤が、蛍光性または発光性である、項目１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記検出可能な薬剤が、フルオレセイン、フルオレセインの誘導体、ローダミン、ローダミンの誘導体、または半導体ポリマーである、項目１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記試料がヌクレオチドを含む、項目１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記試料を増幅することが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、またはこれらの組み合わせを行うことを含む、項目１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記試料を増幅することが、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅を含む、項目１〜３９のいずれか一項に記載の方法。  
（項目４１）
液滴径の分布が、液滴中央径の１０００％超、５００％超、１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を有する、項目１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記液滴径の分布が、液滴平均径の１０００％超、５００％超、１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を有する、項目１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記多分散液滴における体積が、２倍超で、１０倍超で、１００倍超で、１０００倍超で、１００００倍超で、１０００００倍超で、１００００００倍超で、約２倍超で、約１０倍超で、約１００倍超で、約１０００倍超で、約１００００倍超で、約１０００００倍超で、または１００００００倍超で、変化する、項目１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記多分散液滴が、１００ナノリットル（ｎＬ）〜１フェムトリットル（ｆＬ）、１０ｎＬ〜１０ｆＬ、１ｎＬ〜１００ｆＬ、１００ｎＬ〜１ｐＬ、１０ｎＬ〜１０ｐＬ、または１ｎＬ〜１ｐＬ、約５００ｐＬ〜約５０ｆＬ、約１００ｐＬ〜約１００ｆＬの体積分布を有する、項目１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記多分散液滴の平均体積が、前記試料の増幅中に、５０％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満変化する、項目１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記試料を増幅することが、第１の増幅サイクルを含み、前記多分散液滴の５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、前記第１の増幅サイクル後に融合する、項目１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記第１の流体の屈折率が、前記第２の流体の屈折率と、２００％未満、１００％未満、６０％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満異なる、項目１２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
デジタルアッセイを行うための方法であって、
少なくともいくつかが試料を含む複数の多分散液滴を産出することと、
前記試料を増幅することと、
前記試料を検出可能な薬剤で標識することと、
前記複数の多分散液滴を、フローサイトメトリーチャネルを通して流すことと、
前記液滴の体積を、前記液滴が前記フローサイトメトリーチャネルを通して流れるときに決定することと、
前記液滴中の前記検出可能な薬剤の有無を決定することと、
前記複数の液滴中の前記試料の濃度を、前記複数の多分散液滴中の前記検出可能な薬剤の有無に基づいて決定することと、を含む、前記方法。
（項目４９）
前記試料の前記濃度を決定することが、前記液滴からの散乱光を検出することを含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
デジタルアッセイを行うための組成物であって、
第１の流体と、
第２の流体であって、前記第１の流体及び前記第２の流体が、互いに非混和であり、撹拌時にエマルションを形成することができる、第２の流体と、
界面活性剤と、
増幅試薬と、を含む、前記組成物。
（項目５１）
試料を更に含む、項目５０に記載の組成物。
（項目５２）
前記試料がヌクレオチドである、項目５１に記載の組成物。
（項目５３）
検出可能な薬剤を更に含み、前記検出可能な薬剤が、試料を標識することができる、項目５０〜５２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５４）
前記試料が、検出可能な薬剤で標識される、項目５１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５５）
核酸試料に結合することができる検出可能な薬剤を更に含む、項目５０に記載の組成物。
（項目５６）
前記増幅試薬が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）試薬、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）試薬、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）試薬、またはこれらの組み合わせから選択される、項目５０〜５５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５７）
前記増幅試薬がＰＣＲ試薬である、項目５０に記載の組成物。
（項目５８）
前記ＰＣＲ試薬が、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、プローブ、またはこれらの組み合わせから選択される、項目５７に記載の組成物。
（項目５９）
第３の流体を更に含み、前記第３の流体が前記第２の流体と非混和である、項目５０〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６０）
前記組成物が、二重エマルションを形成することができる、項目５９に記載の組成物。
（項目６１）
前記第１の流体が水性である、項目５０〜６０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６２）
前記第１の流体が前記増幅試薬を含む、項目５０〜６１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６３）
前記第２の流体が油である、項目５０〜６２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６４）
前記第２の流体が油であり、前記第２の流体が前記第１の流体及び前記第３の流体と非混和である、項目５９〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６５）
前記第１の流体が、前記第３の流体とは異なる、項目５９〜６４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６６）
前記第３の流体が油であり、前記第３の流体が前記第１の流体及び前記第２の流体と非混和である、項目５９〜６５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６７）
流体界面修飾要素を更に含む、項目５０〜６６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６８）
前記流体界面修飾要素が、界面活性剤を含む、項目６７に記載の組成物。
（項目６９）
前記流体界面修飾要素が、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせから選択される、項目６７〜６８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７０）
前記非混和性流体のうちの１つ以上をゲルまたは固体に変換することができる固化剤またはゲル化剤を更に含む、項目５０〜６９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７１）
項目５０〜７０のいずれか一項に記載の組成物を含む、デジタルアッセイを行うためのキット。
（項目７２）
少なくとも１つの液滴の体積を決定するためのシステムであって、
前記少なくとも１つの液滴を保持するように構成された容器と、
前記容器中の前記少なくとも１つの液滴の画像を取得するように構成された撮像ソースと、
前記撮像ソースを操作するように構成されたコンピューティングデバイスであって、前記コンピューティングデバイスが、プロセッサ及び非一時的有形コンピュータ可読記憶媒体を含み、前記記憶媒体が、前記プロセッサによって実行されるときに、（ｉ）前記撮像ソースに、前記少なくとも１つの液滴の画像スタックを取得させ、（ｉｉ）前記プロセッサに、前記試料中の前記少なくとも１つの液滴の体積を前記取得された画像スタックに基づいて決定させる１組の命令を記憶する、コンピューティングデバイスと、を備えるシステム。
（項目７３）
前記少なくとも１つの液滴が、複数の液滴を含む、項目７２に記載のシステム。
（項目７４）
前記複数の液滴が、多分散性である、項目７３に記載のシステム。
（項目７５）
前記容器が、マルチウェルプレートを含む、項目７２に記載のシステム。
（項目７６）
前記撮像ソースが、光学撮像ソースを含む、項目７２に記載のシステム。
（項目７７）
前記光学撮像ソースが、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせを行うように構成される、項目７６に記載のシステム。
（項目７８）
前記液滴に対する前記画像スタックが、前記少なくとも１つの液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含む、項目７２に記載のシステム。
（項目７９）
前記画像スタックが、前記少なくとも１つの液滴について別々の焦点深度から撮られた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００枚の画像を含む、項目７８に記載のシステム。
（項目８０）
前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、前記プロセッサに、（ｉ）前記画像スタックの個々の画像における少なくとも１つの画素セットを特定することと、（ｉｉ）前記少なくとも１つの画素セットを、前記少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの個々の液滴を、前記対応に基づいて、前記少なくとも１つの画素セットから特定することと、（ｉｖ）前記特定された少なくとも１つの個々の液滴の体積を、前記少なくとも１つの画素セットに基づいて決定することと、によって、前記少なくとも１つの液滴の体積を決定させる、項目７２に記載のシステム。
（項目８１）
前記少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部が、単一の液滴、複数の液滴の部分、単一の全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含む、項目８０に記載のシステム。
（項目８２）
前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるきに、前記プロセッサに、前記取得した画像スタックに基づいて、複数の液滴の複数の体積を決定させる、項目７２に記載のシステム。
（項目８３）
前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるきに、更に、前記プロセッサに、前記複数の液滴の少なくともいくつかにおける検出可能な薬剤の有無を決定させる、項目８２に記載のシステム。
（項目８４）
前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、更に、前記プロセッサに、前記複数の液滴中の試料の濃度を、前記複数の液滴中の前記検出可能な薬剤の有無、及び前記複数の液滴の決定された複数の体積に基づいて、決定させる、項目８３に記載のシステム。
（項目８５）
前記試料がヌクレオチドを含む、項目８４に記載のシステム。
（項目８６）
前記検出可能な薬剤が、蛍光性または発光性である、項目８３に記載のシステム。
（項目８７）
前記検出可能な薬剤が、フルオレセイン、フルオレセインの誘導体、ローダミン、ローダミンの誘導体、または半導体ポリマーを含む、項目８３に記載のシステム。
（項目８８）
前記少なくとも１つの液滴が、ヌクレオチドを含む試料を含む、項目７２に記載のシステム。
（項目８９）
前記少なくとも１つの液滴中の前記試料が増幅されている、項目８８に記載のシステム。
（項目９０）
前記少なくとも１つの液滴中の前記試料が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、またはこれらの組み合わせを行うことによって増幅される、項目８９に記載のシステム。
（項目９１）
前記試料が、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅によって増幅される、項目９０に記載のシステム。
（項目９２）
前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、前記検出可能な薬剤の濃度を、少なくとも３桁のダイナミックレンジに渡って、または少なくとも６桁のダイナミックレンジに渡って決定されるようにする、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
液滴の体積を決定するための方法であって、
前記液滴の画像スタックを取得することと、
前記画像スタックの個々の画像における少なくとも１つの画素セットを特定することと、
前記少なくとも１つの画素セットを、少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することと、
少なくとも１つの個々の液滴を、前記対応に基づいて、前記少なくとも１つの画素セットから特定することと、
前記特定された少なくとも１つの個々の液滴の体積を、前記少なくとも１つの画素セットに基づいて決定することと、を含む、前記方法。
（項目９４）
前記少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部が、単一の液滴、複数の液滴の部分、全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含む、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記液滴の前記画像スタックを取得することが、前記液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を取得することを含む、項目９３に記載の方法。
（項目９６）
２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００枚の画像が、前記液滴について別々の焦点深度から撮られる、項目９４に記載の方法。
（項目９７）
前記特定された少なくとも１つの液滴の体積を決定することが、前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を決定することを含む、項目９３に記載の方法。
（項目９８）
前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を決定することが、
（ｉ）前記特定された少なくとも１つの液滴を前記画像スタックの複数の画像間で相関させ、前記複数の画像における前記特定された少なくとも１つの液滴の最大径を測定すること、
（ｉｉ）曲線を前記特定された少なくとも１つの液滴の境界に適合させ、前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を、前記適合させた曲線に基づいて補間すること、
（ｉｉｉ）前記特定された少なくとも１つの液滴を前記画像スタックの複数の画像間で相関させ、各画像における前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を決定し、前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を、前記画像スタックの前記複数の画像におけるその直径から決定すること、または
（ｉｖ）前記特定された少なくとも１つの液滴を前記画像スタックの複数の画像間で相関させ、各画像における前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を決定し、前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を、前記画像スタックの前記複数の画像におけるその直径、及び前記複数の画像間の画像深度の差異から決定すること、のうちの少なくとも１つを含む、項目９７に記載の方法。
（項目９９）
複数の液滴の体積を決定することを更に含む、項目９３に記載の方法。
（項目１００）
前記複数の液滴中の検出可能な薬剤の有無を、前記画像スタックから決定することを更に含む、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記複数の液滴中の試料の濃度を、前記複数の液滴中の前記検出可能な薬剤の有無、及び前記決定された複数の液滴の体積に基づいて、決定することを更に含む、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
前記試料がヌクレオチドを含む、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
前記複数の液滴中の前記試料を増幅することを更に含む、項目１０１に記載の方法。
（項目１０４）
前記試料を増幅することが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、またはこれらの組み合わせを行うことを含む、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
前記試料を増幅することが、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅を含む、項目１０３に記載の方法。
（項目１０６）
前記検出可能な薬剤の濃度が、少なくとも３桁のダイナミックレンジに渡って、または少なくとも６桁のダイナミックレンジに渡って決定される、項目１００に記載の方法。
（項目１０７）
前記検出可能な薬剤が、蛍光性または発光性である、項目１００に記載の方法。
（項目１０８）
前記検出可能な薬剤が、フルオレセイン、フルオレセインの誘導体、ローダミン、ローダミンの誘導体、または半導体ポリマーを含む、項目１００に記載の方法。
（項目１０９）
前記画像スタックを取得することが、光学撮像を含む、項目９３に記載の方法。
（項目１１０）
前記光学撮像が、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせによって行われる、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
前記少なくとも１つの液滴の前記画像スタックを取得することが、複数の多分散液滴に対する前記画像スタックを取得することを含む、項目９３に記載の方法。
（項目１１２）
前記複数の多分散液滴が、第１の流体及び第２の流体を含み、前記第１の流体が、前記第２の流体と非混和である、項目１１１に記載の方法。
（項目１１３）
第１の流体及び第２の流体を含む溶液を撹拌することによって多分散液滴のエマルションを形成することを更に含み、前記第１の流体が、前記第２の流体と非混和である、項目１１１に記載の方法。
（項目１１４）
前記画像スタックを取得することが、前記形成されたエマルションを撮像することを含む、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記第１の流体が水を含み、前記第２の流体が油を含む、項目１１３に記載の方法。
（項目１１６）
前記第２の流体と非混和である第１の流体及び第２の流体を含む溶液を撹拌することによって多分散液滴のエマルションを形成することと、
前記エマルションを前記第２の流体と非混和である第３の流体中で撹拌し、、それにより二重エマルションを形成することと、を更に含む、項目１１１に記載の方法。
（項目１１７）
前記第１の流体が水を含み、前記第２の流体が油を含み、前記第３の流体が水を含む、項目１１６に記載の方法。
（項目１１８）
前記撹拌することが、振とう、ボルテックス、超音波処理、磁石による混合、押出、フローフォーカス、またはこれらの組み合わせから選択される、項目１１３または１１６に記載の方法。
（項目１１９）
前記撹拌することが、エマルションを形成するのに十分である、項目１１８に記載の方法。
（項目１２０）
前記押出が、前記流体のピペッティングを含み、前記ピペッティングが、エマルションを産出するのに十分である、項目１１９に記載の方法。
（項目１２１）
前記撹拌することが、マイクロ流体デバイス中で起きる、項目１１６〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２２）
前記エマルションが、水相及び非水相を含む、項目１１３または１１６に記載の方法。
（項目１２３）
前記多分散液滴が、複数のエマルションを含む、項目１１３または１１６に記載の方法。
（項目１２４）
前記多分散液滴が、複数のエマルションを含む、項目１１１に記載の方法。
（項目１２５）
前記複数のエマルションが、３つ以上の非混和性流体を組み合わせることによって調製される、項目１２４に記載の方法。
（項目１２６）
前記３つ以上の非混和性流体が、第１の流体、第２の流体、及び第３の流体を含む、項目１２５に記載の方法。
（項目１２７）
前記第１の流体が水性である、項目１２６に記載の方法。
（項目１２８）
前記第２の流体が油である、項目１２７に記載の方法。
（項目１２９）
前記第２の流体が前記第１の流体及び前記第３の流体と非混和である、項目１２７に記載の方法。
（項目１３０）
前記非混和性の第１、第２、または第３の流体のうちの少なくとも１つを、ゲルまたは固体に変換することを更に含む、項目１２７に記載の方法。
（項目１３１）
前記第１の流体が、前記第３の流体とは異なる、項目１２６に記載の方法。
（項目１３２）
前記第３の流体が油であり、前記第３の流体が前記第１の流体及び前記第２の流体と非混和である、項目１２６に記載の方法。
（項目１３３）
前記非混和性の第３の流体を固体またはゲルに変換することを更に含む、項目１３２に記載の方法。
（項目１３４）
前記第１の流体が、検出のための試料を含む、項目１２６に記載の方法。
（項目１３５）
前記第１の流体の屈折率が、前記第２の流体の屈折率と、２００％未満、１００％未満、６０％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満異なる、項目１２６に記載の方法。
（項目１３６）
前記複数の多分散液滴が、流体界面修飾要素を更に含む、項目１１１に記載の方法。
（項目１３７）
前記流体界面修飾要素が、界面活性剤を含む、項目１３６に記載の方法。
（項目１３８）
前記流体界面修飾要素が、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、項目１３６に記載の方法。
（項目１３９）
液滴径の分布が、液滴中央径の１０００％超、５００％超、１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を有する、項目１１１に記載の方法。
（項目１４０）
液滴径の分布が、液滴平均径の１０００％超、５００％超、１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を有する、項目１１１に記載の方法。
（項目１４１）
前記多分散液滴における体積が、２倍超で、１０倍超で、１００倍超で、１０００倍超で、１００００倍超で、１０００００倍超で、１００００００倍超で、約２倍超で、約１０倍超で、約１００倍超で、約１０００倍超で、約１００００倍超で、約１０００００倍超で、または１００００００倍超で、変化する、項目１１１に記載の方法。
（項目１４２）
前記多分散液滴が、１００ナノリットル（ｎＬ）〜１フェムトリットル（ｆＬ）、１０ｎＬ〜１０ｆＬ、１ｎＬ〜１００ｆＬ、１００ｎＬ〜１ｐＬ、１０ｎＬ〜１０ｐＬ、または１ｎＬ〜１ｐＬ、約５００ｐＬ〜約５０ｆＬ、約１００ｐＬ〜約１００ｆＬの体積分布を有する、項目１１１に記載の方法。
（項目１４３）
試料を前記複数の多分散液滴における検出のために増幅することを更に含む、項目１１１に記載の方法。
（項目１４４）
前記多分散液滴の平均体積が、前記試料の増幅中に、５０％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満変化する、項目１４３に記載の方法。
（項目１４５）
前記試料を増幅することが、第１の増幅サイクルを含み、前記多分散液滴の５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、前記第１の増幅サイクル後に融合する、項目１４３に記載の方法。
（項目１４６）
前記画像スタックの前記個々の画像中の前記少なくとも１つの画素セットを特定することが、前記個々の画像内で複数のスキャンを取得することと、閾値レベルを設定することと、前記閾値レベル外の前記複数のスキャン中のエリアを前記画素セットとして特定することと、を含む、項目９３に記載の方法。
（項目１４７）
前記少なくとも１つの画素セットを、少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することが、前記少なくとも１つの画素セットのアスペクト比を決定することを含む、項目９３に記載の方法。
（項目１４８）
前記少なくとも１つの画素セットが、前記少なくとも１つの画素セットの前記アスペクト比が閾値以下であるときに、少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定される、項目１４７に記載の方法。
（項目１４９）
前記閾値が、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２である、項目１４８に記載の方法。
（項目１５０）
前記閾値が、前記試料の少なくとも一部を含まない液滴を除外するのに十分である、項目１４８に記載の方法。
（項目１５１）
前記画素セットを少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することが、リバースウォーターシェッド法を行うことを含む、項目９３に記載の方法。
（項目１５２）
前記リバースウォーターシェッド法を行うことが、
前記画像スタックの前記個々の画像の画素強度に基づいて、マップを生成することと、
前記マップ中の１つ以上の画素セットを特定することと、
個々の画素セットを目的領域として特定することと、
前記目的領域の境界を少なくとも１つの最良適合の円と適合させることと、を含む、項目１５１に記載の方法。
（項目１５３）
前記少なくとも１つの最良適合の円を少なくとも１つの液滴として特定することを更に含む、項目１５２に記載の方法。
（項目１５４）
前記画像スタックの前記個々の画像を、前記マップを生成する前に平滑化することを更に含む、項目１５２に記載の方法。
（項目１５５）
前記画像スタックの前記個々の画像の画素強度に基づいて生成された前記マップが、位相マップを含む、項目１５２に記載の方法。
（項目１５６）
前記１つ以上の画素セットを特定することが、個々の画素が、前記個々の画素の前記画素強度及び１つ以上の閾値に基づいて、背景画素を含むか、または液滴画素を含むかを決定することを含む、項目１５２に記載の方法。
（項目１５７）
前記個々の画素セットが必要最低限のエリアを上回るエリアを有するときに、前記個々の画素セットが目的領域として特定される、項目１５２に記載の方法。
（項目１５８）
前記個々の画素セットが複数の目的領域を含むか否かを決定することと、前記複数の目的領域を単一の目的領域へと組み合わせることと、を更に含む、項目１５２に記載の方法。
（項目１５９）
前記画素セットを少なくとも１つの液滴の少なくとも一部として特定することが、円検出法を行うことを含む、項目９３に記載の方法。
（項目１６０）
前記円検出法を行うことが、
閾値外の前記画像スタックの前記個々の画像の１つ以上のエリアを特定することと、
複数の円を前記特定された１つ以上のエリア上に重ね合わせることと、
前記重ね合わせた複数の円のうちの１つ以上の円を、前記１つ以上の円が少なくとも１つの所定の基準を満たさないときに拒否することと、
１つ以上の残りの円を、少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部に対応するものとして特定することと、を含む、項目１５９に記載の方法。
（項目１６１）
前記少なくとも１つの画素セットを少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することが、リバースウォーターシェッド及び円検出複合法を行うことを含む、項目９３に記載の方法。
（項目１６２）
前記リバースウォーターシェッド及び円検出複合法を行うことが、
前記画像スタックの前記個々の画像の画素強度に基づいて、マップを生成することと、
前記生成されたマップ中の１つ以上の画素セットを特定することと、
個々の画素を目的領域として特定することと、
複数の円を前記目的領域上に重ね合わせることと、
前記重ね合わせた複数の円のうちの１つ以上の円を、前記１つ以上の円が少なくとも１つの所定の基準を満たさないときに拒否することと、
１つ以上の残りの円を、少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部に対応するものとして特定することと、を含む、項目１６１に記載の方法。
（項目１６３）
前記画像スタックの前記個々の画像を、前記マップを生成する前に平滑化することを更に含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１６４）
前記画像スタックの前記個々の画像の画素強度に基づいて生成された前記マップが、位相マップを含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１６５）
前記１つ以上の画素セットを特定することが、個々の画素を、前記個々の画素の前記画素強度及び１つ以上の閾値に基づいて、背景画素または液滴画素として特定することを含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１６６）
前記個々の画素セットが必要最低限のエリアを上回るエリアを有する場合に、前記個々の画素セットが目的領域を含むことが決定される、項目１６２に記載の方法。
（項目１６７）
前記少なくとも１つの所定の基準が、（ｉ）前記目的領域の外部境界画素の最大部分を含む１つ以上の円を選択すること、（ｉｉ）前記目的領域のエリアの最大部分を含む１つ以上の円を選択すること、（ｉｉｉ）前記目的領域とは異なる画素グループからの画素を含む１つ以上の円を拒否すること、（ｉｖ）実質的な複数のグループ外の画素を含む１つ以上の円を拒否すること、または（ｖ）円の円周の実質的な一部が前記画素グループの内部にある、１つ以上の円を判別すること、のうちの１つ以上を含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１６８）
前記１つ以上の円を拒否することが、前記複数の対で重なり合った円を検査することを含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１６９）
前記検査した円が、第１の円及び第２の円を含み、前記第１の円または第２の円のうちの１つを、票に基づいて拒否することを更に含む、項目１６８に記載の方法。
（項目１７０）
前記票が、ユーザによって定義される、項目１６９に記載の方法。
（項目１７１）
前記１つ以上の残りの円を少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部に対応するものとして特定することが、前記１つ以上の残りの円を少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部に割り当てることを含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１７２）
前記１つ以上の円が、（ｉ）前記目的領域を、少なくとも１つの液滴に対する最良の適合度統計を持つ円を有する前記少なくとも１つの液滴に割り当てること、または（ｉｉ）前記目的領域を、エリアにおける前記１つ以上の円との最大の重複を有する前記少なくとも１つの液滴に割り当てること、のうちの１つ以上に基づいて、前記少なくとも１つの液滴に割り当てられる、項目１７１に記載の方法。
（項目１７３）
前記特定された少なくとも１つの個々の液滴の体積を前記少なくとも１つの画素セットに基づいて決定することが、前記１つ以上の特定された円の１つ以上の直径を前記特定された少なくとも１つの個々の液滴に対応するものとして決定することを含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１７４）
デジタルアッセイを行うためのシステムであって、
複数の多分散液滴を保持するように構成された容器であって、前記液滴の少なくともいくつかが、検出可能な薬剤で標識された試料を含む、容器と、
前記容器中に保持された前記複数の多分散液滴の画像スタックを取得するように構成された撮像ソースと、
前記撮像ソースを操作するように構成されたコンピューティングデバイスであって、プロセッサ及び非一時的有形コンピュータ可読記憶媒体を含み、前記記憶媒体が、前記プロセッサによって実行されるときに、
（ｉ）前記撮像ソースに、前記容器中に保持された前記複数の多分散液滴の前記画像スタックを取得させ、
（ｉｉ）前記プロセッサに、前記複数の多分散液滴の体積を前記取得した画像スタックに基づいて決定させ、
（ｉｉｉ）前記プロセッサに、前記複数の多分散液滴中の前記検出可能な薬剤の有無を決定させ、
（ｉｖ）前記プロセッサに、前記複数の液滴中の前記試料の濃度を、前記複数の多分散液滴中の前記検出可能な薬剤の有無、及び前記複数の多分散液滴の体積に基づいて決定させる１組の命令を記憶する、コンピューティングデバイスと、を備える、システム。
（項目１７５）
前記容器が、マルチウェルプレートを含む、項目１７４に記載のシステム。
（項目１７６）
前記撮像ソースが、光学撮像ソースを含む、項目１７４に記載のシステム。
（項目１７７）
前記光学撮像ソースが、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を行うように構成される、項目１７６に記載のシステム。
（項目１７８）
前記取得された画像スタックが、単一の液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含む、項目１７４に記載のシステム。
（項目１７９）
前記画像スタックが、前記単一の液滴について別々の焦点深度から撮られた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００枚の画像を含む、項目１７８に記載のシステム。
（項目１８０）
前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、前記プロセッサに、（ｉ）前記画像スタックの少なくとも１つの個々の画像における少なくとも１つの画素セットを特定することと、（ｉｉ）前記少なくとも１つの画素セットを、少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの個々の液滴を、前記対応に基づいて特定することと、（ｉｖ）前記特定された少なくとも１つの個々の液滴の体積を、前記少なくとも１つの画素セットに基づいて決定することと、によって、前記複数の多分散液滴の体積を決定させる、項目１７４に記載のシステム。
（項目１８１）
少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部が、単一の液滴、複数の液滴の部分、全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含む、項目１８０に記載のシステム。
（項目１８２）
前記試料がヌクレオチドを含む、項目１７５に記載のシステム。
（項目１８３）
前記試料が増幅されている、項目１７５に記載のシステム。
（項目１８４）
前記検出可能な薬剤が、蛍光性または発光性である、項目１７５に記載のシステム。
（項目１８５）
前記複数の多分散液滴が、第１の流体及び第２の流体を含み、前記第１の流体が、前記第２の流体と非混和である、項目１７４に記載のシステム。
（項目１８６）
前記光学撮像が補償光学によって行われる、項目１〜４７または１０９〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８７）
前記光学撮像ソースが補償光学撮像ソースである、項目７６〜７７または１７６〜１７７のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１８８）
液滴の体積を、前記液滴が試料を含む場合にのみ測定することを含む、項目１〜４９、９２〜１７３、または１８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８９）
前記試料を含まないと決定されたあらゆる液滴を測定から除外することを含む、項目１８８に記載の方法。
【図１】
2020060579.tif 000032
【図２Ａ】
2020060579.tif 000033
【図２Ｂ】
2020060579.tif 000034
【図２Ｃ】
2020060579.tif 000035
【図２Ｄ】
2020060579.tif 000036
【図２Ｅ】
2020060579.tif 000037
【図２Ｆ】
2020060579.tif 000038
【図２Ｇ】
2020060579.tif 000039
【図２Ｈ】
2020060579.tif 000040
【図３】
2020060579.tif 000041
【図４】
2020060579.tif 000042
【図５】
2020060579.tif 000043
【図６】
2020060579.tif 000044
【図７】
2020060579.tif 000045
【図８Ａ】
2020060579.tif 000046
【図８Ｂ】
2020060579.tif 000047
【図８Ｃ】
2020060579.tif 000048
【図９】
2020060579.tif 000049
【図１０】
2020060579.tif 000050
【図１１】
2020060579.tif 000051
【図１２】
2020060579.tif 000052
【図１３】
2020060579.tif 000053
【図１４】
2020060579.tif 000054
【図１５】
2020060579.tif 000055
【図１６】
2020060579.tif 000056
【図１７】
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【図１８】
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