(57)【要約】【課題】高精度な測定を安定して行えるようにする。【解決手段】液槽１０に第１の液体２０と、第１の液体２０と液液界面を形成して接する第２の液体３０とを収容し、第１の液体２０内で触媒反応を進行させて生成された触媒反応生成物を第１の液体２０内に閉じ込めつつ、第１の液体２０内に配置した作用極４０と第２の液体３０内に配置した対極５０とを用いて触媒反応生成物を電気化学的に測定する触媒反応生成物の電気化学的測定方法において、液槽１０の内部に第１の液体２０が透過可能であって第１の液体２０を保持することができる保持材９０を設置し、第１の液体２０を保持材９０に保持させた状態で触媒反応の進行と触媒反応生成物の測定とを行う。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液槽に、第１の液体と、前記第１の液体と液液界面を形成して接する第２の液体とを収容し、前記第１の液体内で触媒反応を進行させて生成された触媒反応生成物を前記第１の液体内に閉じ込めつつ、前記第１の液体内に配置した作用極と前記第２の液体内に配置した対極とを用いて前記触媒反応生成物を電気化学的に測定する触媒反応生成物の電気化学的測定方法であって、
前記液槽の内部に、前記第１の液体が透過可能であって前記第１の液体を保持することができる保持材を設置し、
前記第１の液体を前記保持材に保持させた状態で、前記触媒反応の進行と前記触媒反応生成物の測定とを行うことを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的測定方法。
【請求項２】
請求項１に記載の触媒反応生成物の電気化学的測定方法において、
前記保持材に前記第１の液体を滴下した後に前記第２の液体を前記液槽に流し入れる準備工程を有することを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的測定方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の触媒反応生成物の電気化学的測定方法において、
前記保持材は、表面が親水性の多孔質体で構成されることを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的測定方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の触媒反応生成物の電気化学的測定方法において、
前記保持材は、含水によってハイドロゲルを形成する高分子で構成されることを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的測定方法。
【請求項５】
請求項１から４までの何れかに記載の触媒反応生成物の電気化学的測定方法において、
前記保持材に触媒を担持させることを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的測定方法。
【請求項６】
請求項１から５までの何れかに記載の触媒反応生成物の電気化学的測定方法において、
前記保持材を、前記液槽の底面上に構成したウェルの内部に設置することを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的測定方法。
【請求項７】
請求項１から５までの何れかに記載の触媒反応生成物の電気化学的測定方法において、
１つの前記液槽の内部に、複数の前記作用極と、前記作用極の各々に対応する複数の前記保持材とを設けて、複数の相互に独立した前記触媒反応の進行及び前記触媒反応生成物の測定を行うことを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的測定方法。
【請求項８】
請求項６に記載の触媒反応生成物の電気化学的測定方法において、
１つの前記液槽の内部に、複数の前記作用極と、前記作用極の各々に対応する複数の前記ウェル及び前記保持材とを設けて、複数の相互に独立した前記触媒反応の進行及び前記触媒反応生成物の測定を行うことを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的測定方法。
【請求項９】
第１の液体内で触媒反応を進行させて生成された触媒反応生成物を電気化学的に測定することができる電気化学測定装置であって、
液槽と、
前記液槽の内部に設けられた作用極と、
前記液槽の内部の、前記作用極が面する局所的な空間に設置され、前記第１の液体が透過可能であって前記第１の液体を保持することができる保持材とを備えることを特徴とする電気化学測定装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の電気化学測定装置において、
前記保持材は、表面が親水性の多孔質体で構成されていることを特徴とする電気化学測定装置。
【請求項１１】
請求項９に記載の電気化学測定装置において、
前記保持材は、含水によってハイドロゲルを形成する高分子で構成されていることを特徴とする電気化学測定装置。
【請求項１２】
請求項９から１１までの何れかに記載の電気化学測定装置において、
前記保持材は、触媒を担持することができることを特徴とする電気化学測定装置。
【請求項１３】
請求項９から１２までの何れかに記載の電気化学測定装置において、
前記液槽の底面上にウェルが構成され、
前記保持材は前記ウェルの内部に設置されていることを特徴とする電気化学測定装置。
【請求項１４】
請求項９から１２までの何れかに記載の電気化学測定装置において、
前記液槽の内部に、複数の前記作用極と、前記作用極の各々に対応する複数の前記保持材とが設けられていることを特徴とする電気化学測定装置。
【請求項１５】
請求項１３に記載の電気化学測定装置において、
前記液槽の内部に、複数の前記作用極と、前記作用極の各々に対応する複数の前記ウェル及び前記保持材とが設けられていることを特徴とする電気化学測定装置。
【請求項１６】
溶液を収容することができる液槽がＬＳＩチップ上に搭載された構造を有し、前記溶液内で進行する触媒反応によって生成される触媒反応生成物の電気化学的測定に用いるトランスデューサであって、
前記液槽の底面に画定されたセンサ領域には、前記ＬＳＩチップにアレイ状に配列されて設けられている複数の電極が位置し、
前記複数の電極の各々の上には、水溶液が透過可能であって前記水溶液を保持することができる保持材が個別に備えられていることを特徴とするトランスデューサ。
【請求項１７】
請求項１６に記載のトランスデューサにおいて、
前記保持材は、表面が親水性の多孔質体で構成されていることを特徴とするトランスデューサ。
【請求項１８】
請求項１６に記載のトランスデューサにおいて、
前記保持材は、含水によってハイドロゲルを形成する高分子で構成されていることを特徴とするトランスデューサ。
【請求項１９】
請求項１６から１８までの何れかに記載のトランスデューサにおいて、
前記センサ領域には、アレイ状に配列された複数のウェルが形成されており、
前記複数の電極の各々は前記複数のウェルの各々に位置しており、
前記保持材は前記複数のウェルの各々の内部に備えられていることを特徴とするトランスデューサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は測定溶液内で進行する触媒反応によって生成されて測定溶液に溶解している触媒反応生成物を電気化学的に測定する触媒反応生成物の電気化学的測定方法、電気化学測定装置及びその電気化学的測定に用いるトランスデューサに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素反応等、触媒反応によって生成されて測定溶液に溶解している触媒反応生成物の測定においては、測定の感度は測定溶液中の触媒反応生成物の濃度によって決まり、測定溶液中の触媒反応生成物の濃度を向上させるためには例えば触媒反応時間をより長くするのが好ましく、また測定溶液の体積をより小さくするのが好ましい。
【０００３】
しかるに、測定溶液を極微量とすると蒸発によって測定溶液の体積が減少し、測定が不可能になってしまうことがあり、このような問題の発生は触媒反応時間を長くすると、より顕著となる。
【０００４】
このような測定溶液の蒸発を回避することができる構成が特許文献１や非特許文献１に記載されており、特許文献１にはＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay：酵素結合免疫吸着法）に関連する測定手法において、酵素反応場である親水性溶媒の液滴を収容部（ウェル）内に位置させ、その液滴が位置する収容部を疎水性溶媒によって密閉する構成が記載されている。
【０００５】
また、非特許文献１には同様にＥＬＩＳＡに関連する測定手法において、親水性表面に疎水性領域を形成して親水性領域のパターンを形成し、その親水性領域のパターンに位置する酵素反応場である液滴をオイルによって覆う構成が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／１２１３１０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】S. Sakakihara et al., “A Single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array”, Lab Chip, 2010, 10, 3355-3362
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、触媒反応場である測定溶液（以下、第１の液体と言う）を第２の液体で覆うようにすれば、第１の液体の蒸発を防ぐことができ、よって蒸発によって第１の液体の体積が減少し、測定が不可能になってしまうといった問題の発生を回避することができる。
【０００９】
しかるに、このように第１の液体が第２の液体によって覆われている状態は、触媒反応の進行過程や触媒反応生成物の測定過程において、安定かつ適切に維持されていなければならず、例えば振動や衝撃等が加わったりして第１の液体と第２の液体の液液界面が乱されたり、第１の液体の液塊の形状が大きく変化するといった状況が生じると、触媒反応の進行や測定はその影響を受け、測定精度の低下や測定ミスの原因となり得る。
【００１０】
ウェルを用いる場合でも振動や衝撃等により、第１の液体の一部がウェルの外へ流出したり、逆に第２の液体がウェルに流入する等の事態が起こり得る。
【００１１】
この発明の目的はこのような問題に鑑み、第１の液体の液塊を強力に保持して、第１の液体が第２の液体によって覆われている状態を安定かつ適切に維持することができるようにし、よって高精度な測定を安定して行えるようにした測定方法及び測定装置を提供することにあり、さらにその測定に用いるトランスデューサを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
請求項１の発明によれば、液槽に第１の液体と、第１の液体と液液界面を形成して接する第２の液体とを収容し、第１の液体内で触媒反応を進行させて生成された触媒反応生成物を第１の液体内に閉じ込めつつ、第１の液体内に配置した作用極と第２の液体内に配置した対極とを用いて触媒反応生成物を電気化学的に測定する触媒反応生成物の電気化学的測定方法において、液槽の内部に第１の液体が透過可能であって第１の液体を保持することができる保持材を設置し、第１の液体を保持材に保持させた状態で触媒反応の進行と触媒反応生成物の測定とを行う。
【００１３】
請求項２の発明では請求項１の発明において、保持材に第１の液体を滴下した後に第２の液体を液槽に流し入れる準備工程を有する。
【００１４】
請求項３の発明では請求項１又は２の発明において、保持材は表面が親水性の多孔質体で構成される。
【００１５】
請求項４の発明では請求項１又は２の発明において、保持材は含水によってハイドロゲルを形成する高分子で構成される。
【００１６】
請求項５の発明では請求項１から４までの何れかの発明において、保持材に触媒を担持させる。
【００１７】
請求項６の発明では請求項１から５までの何れかの発明において、保持材を液槽の底面上に構成したウェルの内部に設置する。
【００１８】
請求項７の発明では請求項１から５までの何れかの発明において、１つの液槽の内部に複数の作用極と、作用極の各々に対応する複数の保持材とを設けて、複数の相互に独立した触媒反応の進行及び触媒反応生成物の測定を行う。
【００１９】
請求項８の発明では請求項６の発明において、１つの液槽の内部に複数の作用極と、作用極の各々に対応する複数のウェル及び保持材とを設けて、複数の相互に独立した触媒反応の進行及び触媒反応生成物の測定を行う。
【００２０】
請求項９の発明によれば、第１の液体内で触媒反応を進行させて生成された触媒反応生成物を電気化学的に測定することができる電気化学測定装置は、液槽と、液槽の内部に設けられた作用極と、液槽の内部の作用極が面する局所的な空間に設置され、第１の液体が透過可能であって第１の液体を保持することができる保持材とを備える。
【００２１】
請求項１０の発明では請求項９の発明において、保持材は表面が親水性の多孔質体で構成されているものとされる。
【００２２】
請求項１１の発明では請求項９の発明において、保持材は含水によってハイドロゲルを形成する高分子で構成されているものとされる。
【００２３】
請求項１２の発明では請求項９から１１までの何れかの発明において、保持材は触媒を担持することができるものとされる。
【００２４】
請求項１３の発明では請求項９から１２までの何れかの発明において、液槽の底面上にウェルが構成され、保持材はウェルの内部に設置されているものとされる。
【００２５】
請求項１４の発明では請求項９から１２までの何れかの発明において、液槽の内部に複数の作用極と、作用極の各々に対応する複数の保持材とが設けられているものとされる。
【００２６】
請求項１５の発明では請求項１３の発明において、液槽の内部に複数の作用極と、作用極の各々に対応する複数のウェル及び保持材とが設けられているものとされる。
【００２７】
請求項１６の発明によれば、溶液を収容することができる液槽がＬＳＩチップ上に搭載された構造を有し、溶液内で進行する触媒反応によって生成される触媒反応生成物の電気化学的測定に用いるトランスデューサは、液槽の底面に画定されたセンサ領域にＬＳＩチップにアレイ状に配列されて設けられている複数の電極が位置され、複数の電極の各々の上には水溶液が透過可能であって水溶液を保持することができる保持材が個別に備えられているものとされる。
【００２８】
請求項１７の発明では請求項１６の発明において、保持材は表面が親水性の多孔質体で構成されているものとされる。
【００２９】
請求項１８の発明では請求項１６の発明において、保持材は含水によってハイドロゲルを形成する高分子で構成されているものとされる。
【００３０】
請求項１９の発明では請求項１６から１８までの何れかの発明において、センサ領域にはアレイ状に配列された複数のウェルが形成され、複数の電極の各々は複数のウェルの各々に位置し、保持材は複数のウェルの各々の内部に備えられているものとされる。
【発明の効果】
【００３１】
この発明による触媒反応生成物の電気化学的測定方法によれば、第１の液体の液塊は保持材によって作用極上に強力に保持されるので、液槽に振動や衝撃等が加わっても、第１の液体と第２の液体の液液界面が乱されたり、第１の液体の液塊の形状が大きく変化するといったことは発生せず、第１の液体が第２の液体によって覆われている状態を安定かつ適切に維持することができ、よって高精度の測定を安定して行うことができる。
【００３２】
また、この発明による電気化学測定装置及びトランスデューサによれば、そのような触媒反応生成物の電気化学的測定に用いて好適な電気化学測定装置及びトランスデューサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】この発明による電気化学測定装置の概要を説明するための図。
【図２】Ａは保持材の第１の形成例を説明するための図、Ｂは保持材の第２の形成例を説明するための図、Ｃは保持材の第３の形成例を説明するための図、Ｄは保持材の第４の形成例を説明するための図。
【図３】Ａは保持材の第５の形成例を説明するための図、Ｂは保持材の第６の形成例を説明するための図。
【図４】ウェルを用いる保持材の設置を説明するための図。
【図５】Ａはこの発明によるトランスデューサの一実施例を示す平面図、Ｂはその断面図。
【図６】図５Ａに示したトランスデューサの斜視図。
【図７】図５Ａに示したトランスデューサにおける電極の配列を説明するための図。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
この発明の実施形態を図面を参照して実施例により説明する。
【００３５】
この発明では第１の液体内で進行する触媒反応によって生成されて第１の液体に溶解している触媒反応生成物の測定に電気化学的測定を用いる。図１はこの発明による電気化学的測定を行う電気化学測定装置の概要を示したものである。
【００３６】
電気化学測定装置は液槽１０を備え、液槽１０には第１の液体２０と、第１の液体２０と液液界面を形成して接する第２の液体３０とが収容されている。第１の液体２０は図１に示したように液槽１０の底面１１上に位置され、第２の液体３０によって覆われている。
【００３７】
作用極４０は液槽１０の底面１１に配置されて第１の液体２０内に位置している。対極５０及び参照極６０は第２の液体３０内に配置され、第１の液体２０と第２の液体３０の液液界面を介して作用極４０と電気的に接続されている。図１中、７０は塩橋を示す。
【００３８】
作用極４０、対極５０及び参照極６０はこの例ではポテンショスタット８０に接続されており、ポテンショスタット８０は可変電源８１と電圧計８２と電流計８３とを含んで構成されている。
【００３９】
この構成において、触媒反応生成物は第２の液体３０には溶解せず、第１の液体２０内に閉じ込められ、触媒反応生成物が作用極４０において酸化又は還元反応をすることで作用極４０に電流が流れ、この電流を測定することで触媒反応生成物の測定、即ち検出や定量を行えるものとなっている。
【００４０】
なお、図１では簡略化して作用極４０を１つのみ示しているが、作用極４０は例えばアレイ状に配列されて複数配置される。これら複数の作用極４０は具体的には基板に形成されたものとなっており、この複数の作用極４０が形成された基板が液槽１０の底面１１に位置される。複数の作用極４０に対し、第１の液体２０は作用極４０の各々に対応して相互に連続することなく各独立した液塊とされ、第２の液体３０はこれら第１の液体２０の複数の液塊のすべてとそれぞれ液液界面を形成して接する連続した１つの液塊とされる。
【００４１】
以下、この発明による電気化学的測定方法をＥＬＩＳＡに用いる場合について説明する。
【００４２】
ＥＬＩＳＡは試料中に含まれる抗原または抗体を酵素で標識し、その酵素の反応生成物を測定することで、抗原抗体複合体の検出、定量を行うもので、例えばサンドイッチ法のＥＬＩＳＡを電気化学的測定方法によって行う場合、
（１）作用極の直上または近傍表面を担体として捕捉抗体を固定化
（２）ブロッキング剤を添加
（３）検出抗原を添加
（４）一次抗体を添加
（５）酵素標識した二次抗体を添加
（６）基質を含む第１の液体（測定溶液）を添加、酵素反応により作用極近傍に酵素反応生成物を蓄積
（７）作用極を用い、酵素反応生成物を電気化学的に定量
といった操作を一般的に行う。なお、洗浄、インキュベーション等の操作は上記では省略している。
【００４３】
この電気化学的測定方法において、この発明では図１に示したように第１の液体２０全体を第２の液体３０で覆う操作を追加する。
【００４４】
第２の液体３０には第１の液体２０に不溶で、かつ導電性を有する液体を用いる。ＥＬＩＳＡにおいて第１の液体２０には通常緩衝能を有する水溶液を使用するため、第２の液体３０には水に不溶で、かつ導電性を得るための支持塩を溶解可能な有機溶媒を用いる。
【００４５】
このような溶媒のうち、電気化学的測定の溶媒として扱いやすい、即ち常温において液状で、測定電位範囲内において水及び電極材料（金や白金等）との反応性が低い液体を用いるのが好ましい。例として挙げれば、ニトロベンゼン、ジクロロベンゼン、ニトロフェニルオクチルエーテル、ジクロロエタン、ジクロロブタン、ジクロロヘキサン、オクタノール、デカジエンが好適である。
【００４６】
また、これらの溶媒に可溶で、液体に導電性を付与することが可能な支持塩には、一般的な非水溶液中での電気化学的測定に使用される支持塩を使用することができる。例として挙げれば、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、過塩素酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン及びスルホン酸イオンのうち、いずれか１つをアニオンとして有し、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、アンモニウムイオン及び任意のアルキル鎖長を有するテトラアルキルアンモニウムイオンのうち、いずれか１つをカチオンとして有する塩が好適である。
【００４７】
標識酵素及び基質の組み合わせには、電気化学活性を有し、かつ第１の液体２０に可溶で第２の液体３０に不溶な生成物を生成可能な組み合わせが選択される。第１の液体２０が水溶液、第２の液体３０が前述した有機溶媒である場合、標識酵素と基質の組み合わせとしては例えばアルカリホスファターゼとｐ−アミノフェニルリン酸の組み合わせや西洋わさびペルオキシダーゼとフェリシアン化カリウムの組み合わせが好適である。
【００４８】
次に、第１の液体２０が第２の液体３０によって覆われている状態を安定かつ適切に維持することができるようにすべく、この発明において設ける保持材について説明する。
【００４９】
保持材は第１の液体２０が透過可能であって、第１の液体２０を保持することができるものとされ、表面が親水性の多孔質体や含水によってハイドロゲルを形成する高分子で構成される。保持材は図１では図示を省略しているが液槽１０の内部の第１の液体２０を位置させる箇所、即ち作用極４０が面する局所的な空間に設置される。
【００５０】
図２及び図３は保持材の各種形成例を示したものである。なお、図２及び図３では１つの作用極４０についてのみ示しており、作用極４０はこの例では円形の表面形状を有するものとなっている。図２〜３中、１００は作用極４０が形成されている基板を示す。
【００５１】
＜第１の形成例：図２Ａ＞
保持材９１を多孔質体によって形成する。多孔質体の材料としては、孔径０．１〜１０μｍ程度のセルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロース、適宜親水化処理を施したポリフッ化ビニリデン等の有機高分子よりなる材料や、シリカ、シリコン、アルミナ等の無機材料が好適である。
【００５２】
有機高分子の多孔質体よりなる保持材９１は、原料となる高分子を適当な溶媒に溶解させ、溶液９１’をスポッティング、スクリーン印刷、インクジェット印刷等の手法で作用極４０上に選択的に配置したのち、溶媒を乾燥させることで形成することができる。ここで、溶媒は必要に応じて適当な架橋剤を含むものとする。
【００５３】
例えば、ニトロセルロースをメチルイソブチルケトン溶媒中に溶解させ、溶液９１’の液滴をマイクロピペットを用いて作用極４０上に滴下したのち、自然乾燥により溶媒を除去すれば、ニトロセルロースの多孔質体よりなる保持材９１を形成することができる。
【００５４】
無機材料の多孔質体よりなる保持材９１は、例えばゾルゲル法により多孔質シリカを作用極４０上に形成する手法や、陽極酸化法により多孔質シリコン、多孔質アルミナを作用極４０上に形成する手法を用いることによって形成することができる。
【００５５】
＜第２の形成例：図２Ｂ＞
保持材９２は多孔質体よりなる。この例では上述したような材料よりなる多孔質体を予め成型して小片９２’を形成し、その小片９２’を作用極４０上に貼り付けることによって保持材９２とする。
【００５６】
＜第３の形成例：図２Ｃ＞
例えばスピンコーティング等の手法により作用極４０が位置する基板１００上に多孔質体をシート状に形成し、その多孔質体に第１の液体２０及び第２の液体３０に不溶な樹脂を含浸させて全ての孔に樹脂を充填した樹脂含浸シート状多孔質体９３を形成したのち、適当な溶剤によって作用極４０上の樹脂のみ選択的に溶解除去する。これにより、保持材９４を形成することができる。
【００５７】
例えば、ニトロセルロースをメチルイソブチルケトン溶媒中に溶解させ、溶液をスピンコーティングによって作用極４０が位置する基板１００上にコートしたのち、自然乾燥により溶媒を除去すればシート状の多孔質体を形成することができる。さらに、この多孔質体上にネガ型の感光性樹脂を滴下、含浸させ、フォトリソグラフィにより作用極４０上の感光性樹脂のみ選択的に除去すれば、多孔質体よりなる保持材９４を形成することができる。
【００５８】
＜第４の形成例：図２Ｄ＞
第３の形成例と同様に形成したシート状多孔質体９３’に、第１の液体２０及び第２の液体３０に不溶な樹脂をスポッティング、スクリーン印刷、インクジェット印刷等の手法で、作用極４０以外の領域に選択的に含浸、配置することで、保持材９４を形成することができる。図２Ｄ中、９３は樹脂含浸シート状多孔質体を示す。
【００５９】
＜第５の形成例：図３Ａ＞
多孔質体は凝集した微粒子によっても形成することができ、直径０．１〜１０μｍ程度のポリスチレン微粒子、シリカ微粒子、アルミナ微粒子、タンパク質の分離、精製等に用いられる磁性微粒子、アフィニティーカラムの担体として用いられるアガロース微粒子等を作用極４０上で凝集させることで多孔質体よりなる保持材９５を形成することができる。
【００６０】
微粒子の凝集には例えば微粒子同士を結着させるためのバインダー分子を用いてもよく、バインダー分子と微粒子を適当な溶媒に懸濁し、懸濁液９５’の液滴を作用極４０上に滴下したのち、溶媒を乾燥させれば、微粒子の凝集体よりなる保持材９５を形成することができる。バインダー分子として加熱、光照射等の操作によって結着過程が進行する分子を用いる場合は、溶媒乾燥前、あるいは乾燥後にこれらの操作を実行する。
【００６１】
なお、微粒子は直流電圧あるいは交流電圧を印加した作用極４０上に、電気泳動力あるいは誘電泳動力を用いて凝集させてもよい。
【００６２】
＜第６の形成例：図３Ｂ＞
含水によってハイドロゲルを形成する高分子によって保持材９６を形成する。含水によってハイドロゲルを形成する高分子としては、ポリアクリルアミド、アガロース、アルギン酸ナトリウム、コラーゲン等が好適である。これらハイドロゲルは原料となる高分子を適当な溶媒に溶解させ、溶液９６’をスポッティング、スクリーン印刷、インクジェット印刷等の手法で作用極４０上に選択的に配置したのち、溶媒を乾燥させることで保持材９６を形成することができる。ここで、溶媒は必要に応じて適当な架橋剤を含むものとする。
【００６３】
例えば、高分子としてコラーゲン、架橋剤としてグルタルアルデヒドをリン酸緩衝液に溶解させ、溶液９６’の液滴をマイクロピペットを用いて作用極４０上に滴下したのち、室温にて架橋反応を進行させれば、コラーゲンのハイドロゲルよりなる保持材９６を形成することができる。
【００６４】
以上、保持材の各種形成例について説明したが、図２Ａに示した第１の形成例や図３Ａ，Ｂに示した第５及び第６の形成例において、高分子の溶液９１’，９６’や微粒子の懸濁液９５’を作用極４０上に滴下する際、滴下した溶液９１’，９６’や懸濁液９５’が所望の領域以外に広がってしまうことを防ぐため、液槽１０の底面１１上にウェルを構成してもよい。
【００６５】
図４はこのように液槽１０の底面１１に位置する基板１００上にウェル１０５が構成された例を示したものであり、作用極４０はウェル１０５に位置している。ウェル１０５は例えば第１の液体２０及び第２の液体３０に不溶な疎水性樹脂をフォトリソグラフィやスクリーン印刷等の手法で基板１００上に選択的に配置することで形成することができる。図４中、１０６は硬化した樹脂層を示す。なお、図４では図２Ａと同様、高分子の溶液９１’が乾燥されて保持材９１が形成される例を示しており、溶液９１’はウェル１０５に滴下される。これにより、保持材９１はウェル１０５の内部に設置される。
【００６６】
このように第１の液体２０が透過可能であって、第１の液体２０を保持することができ、第１の液体２０及び第２の液体３０に不溶な保持材を作用極４０上に設けることにより、作用極４０上に第１の液体２０の液塊を強力に保持することが可能となる。保持材は上記した保持材９１，９２，９４，９５及び９６のいずれであっても同様に機能し、以下においてはこれら保持材９１，９２，９４，９５及び９６をまとめて言う場合、保持材９０と言う。
【００６７】
保持材９０は複数の作用極４０の各々に対応して設けられ、また保持材９０を設置するウェル１０５を設ける場合もウェル１０５及び保持材９０は複数の作用極４０の各々に対応して設けられる。
【００６８】
第２の液体３０は、保持材９０に第１の液体２０を滴下した後に液槽１０に流し入れられる。ＥＬＩＳＡにおける酵素反応の進行と酵素反応生成物の測定は、第１の液体２０が保持材９０に保持された状態で行われ、複数の作用極４０においては複数の相互に独立した酵素反応の進行及び酵素反応生成物の測定を行うことができる。
【００６９】
ここまでＥＬＩＳＡを例に、この発明による触媒反応生成物の電気化学的測定方法について説明したが、この発明による触媒反応生成物の電気化学的測定方法によれば、以下の効果を得ることができる。
【００７０】
１）保持材９０によって第１の液体２０の液塊は作用極４０上に強力に保持されるので、液槽１０に振動や衝撃等が加わっても第１の液体２０が第２の液体３０によって覆われている状態を安定かつ適切に維持することができ、よって高精度の測定を安定して行うことができる。
【００７１】
２）３次元的な構造体である保持材９０は、平面と比較して表面積が大きく、触媒の担持量を大幅に増加させることができるため、触媒反応が効率よく進行し、測定感度を顕著に向上させることができる。
【００７２】
なお、この発明は触媒反応生成物の測定に電気化学的測定を用いるものであるため、多孔質体やハイドロゲルのように物質拡散と導通経路を確保することができるもので保持材９０が構成されていれば、保持材９０が触媒反応場に存在することは不利とはならない。
【００７３】
この発明による電気化学的測定方法は、第１の液体２０中で進行する触媒反応による生成物が測定対象であり、その触媒反応の進行に伴って触媒反応生成物の第１の液体２０中での濃度が増大し、その触媒反応生成物が電気化学的に測定可能であって、かつそれが溶解しない第２の液体３０を選べるならば、その測定に適用することができる。
【００７４】
なお、上述したＥＬＩＳＡの例では触媒として酵素を用いているが、触媒はこれに限らない。例えば、金属触媒、リボザイム、酵素を表面あるいは内部に有する細胞、オルガネラ、またはこれらを人工的に吸着、結合させた微粒子、ベシクル等を用いることもできる。
【００７５】
また、上述したＥＬＩＳＡの例では触媒を作用極４０の直上または底面１１の作用極４０の近傍の部位に担持する手法として、予め作用極４０または底面１１のその近傍部位の表面に吸着させた捕捉抗体に、検出抗原、一次抗体を介して酵素標識二次抗体を相互作用させ、抗原−抗体−酵素複合体を形成することで、間接的に触媒を担持する手法を用いたが、触媒を担持する手法はこれに限らない。例えば、予め前記表面に吸着させたプローブＤＮＡに、プローブＤＮＡと相補的で、かつ触媒で標識された一本鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせることで、間接的に触媒を担持してもよい。
【００７６】
同様に、予め前記表面に吸着させた抗原、ペプチド、糖鎖等に、これら分子に特異的に吸着し、かつ触媒で標識された抗体、レクチン等を相互作用させることで、間接的に触媒を担持してもよい。
【００７７】
このような担持手順は、前記表面に吸着させた物質と、触媒で標識された物質との相互作用の有無や程度を測定する目的で、ＤＮＡチップやプロテインチップと同様の測定を行う際に用いることができる。
【００７８】
あるいは、触媒そのものの活性を測定することを目的とした場合は、触媒を直接前記表面に担持してもよい。
【００７９】
次に、上述した触媒反応生成物の電気化学的測定に用いて好適なこの発明によるトランスデューサの構成について図５〜７を参照して説明する。
【００８０】
このトランスデューサはバイオＬＳＩチップと称されるもので、溶液１１０を収容することができる液槽１２０がＬＳＩチップ１３０上に搭載された構成となっている。液槽１２０の中央には穴１２１が形成されており、ＬＳＩチップ１３０はこの穴１２１の下端に穴１２１を塞ぐように配置されている。
【００８１】
ＬＳＩチップ１３０及び液槽１２０は基板１４０上に搭載固定されており、基板１４０にはトランスデューサの制御を行う外部装置との接続用の多数の配線パターン１４１が形成されている。図５Ｂ中、１５０はＬＳＩチップ１３０と配線パターン１４１とを接続するボンディングワイヤを示す。
【００８２】
ＬＳＩチップ１３０の上面にはセンサ領域１３１が構成されている。図５Ａ及び図６ではセンサ領域１３１をハッチングを付して示しており、液槽１２０の底面の穴１２１の位置にセンサ領域１３１は画定されている。
【００８３】
図５及び図６では詳細図示を省略しているが、この例ではセンサ領域１３１に、作用極として機能するφ４０μｍの電極１３２が２５０μｍピッチで２０×２０＝４００個、アレイ状に配列されて形成されている。図７は電極１３２が配列形成されているセンサ領域１３１の一部を示したものである。電極１３２の構成材料はこの例では金とされ、電極１３２以外の少なくともセンサ領域１３１を含むＬＳＩチップ１３０の上面はシリコン窒化膜よりなるものとされている。ＬＳＩチップ１３０は各電極１３２での酸化又は還元反応を電流値として検出し、増幅する機能等を備えている。
【００８４】
上記のような構成を有するＬＳＩチップ１３０において、この例では前述の図２及び図３に示したような水溶液が透過可能であって、水溶液を保持することができる保持材９０が各電極１３２の上に個別に備えられているか、あるいは図４に示したようなウェル１０５がセンサ領域１３１にアレイ状に配列されて形成されて、各電極１３２はウェル１０５に位置し、各ウェル１０５の内部に保持材９０が備えられているものとされる。このような構造を有することにより、このトランスデューサは触媒反応が営まれる第１の液体の液塊を各電極１３２上に強く保持することができるものとなっている。なお、図５及び図６において溶液１１０として示しているものは第１の液体を覆う第２の液体であって、第１の液体の微小な液塊の図示は省略している。図５Ｂ中に示した対極１６０及び参照極１７０はトランスデューサとは別部品とされ、測定時に第２の液体中に投入される。
【符号の説明】
【００８５】
１０  液槽                              １１  底面
２０  第１の液体                        ３０  第２の液体
４０  作用極                            ５０  対極
６０  参照極                            ７０  塩橋
８０  ポテンショスタット                ８１  可変電源
８２  電圧計                            ８３  電流計
９０，９１，９２，９４，９５，９６  保持材
９１’， ９６’  溶液                    ９２’  小片
９３  樹脂含浸シート状多孔質体          ９３’  シート状多孔質体
９５’  懸濁液                          １００  基板
１０５  ウェル                          １０６  樹脂層
１１０  溶液                            １２０  液槽
１２１  穴                              １３０  ＬＳＩチップ
１３１  センサ領域                      １３２  電極
１４０  基板                            １４１  配線パターン
１５０  ボンディングワイヤ              １６０  対極
１７０  参照極
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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