(57)【要約】      （修正有）【課題】がんを治療するためのＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ関連組成物および方法。【解決手段】Ｔ細胞標的化ノックアウト位置の二本鎖切断および一本鎖切断から選択される切断事象を提供するように構成される、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子に由来する標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含んでなる、ｇＲＮＡ分子。及び、Ｃａｓ９分子をコードする配列をさらに含んでなる核酸を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子に由来する標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含んでなる、ｇＲＮＡ分子。
【請求項２】
前記標的化ドメインが、Ｔ細胞標的化ノックアウト位置の５００、４００、３００、２００、１００、５０、２５、または１０ヌクレオチド以内の二本鎖切断および一本鎖切断から選択される切断事象を提供するように構成される、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記標的化ドメインが、Ｔ細胞標的化ノックダウン位置に十分に近い、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質を標的化するように設計されて、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の発現が低下、低減または抑制される、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記標的化ドメインが、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子のプロモーター領域を標的化するように設計される、請求項３に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５】
前記標的化ドメインが、表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉ、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２のいずれかからの標的化ドメイン配列と同一のまたは３ヌクレオチド以下異なる配列を含んでなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項６】
前記標的化ドメインが、表１Ａ〜Ｆまたは表１３Ａ〜Ｋのものから選択される、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項７】
前記標的化ドメインが、表２Ａ〜Ｉまたは表１４Ａ〜Ｋのものから選択される、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項８】
前記標的化ドメインが、表３Ａ〜Ｈまたは表１５Ａ〜Ｆのものから選択される、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項９】
前記標的化ドメインが、表４Ａ〜Ｉまたは表１６Ａ〜Ｋのものから選択される、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１０】
前記標的化ドメインが、表５Ａ〜Ｉまたは表１７Ａ〜Ｋのものから選択される、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１１】
前記標的化ドメインが、表６Ａ〜Ｉまたは表１８Ａ〜Ｋのものから選択される、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１２】
前記標的化ドメインが、表７Ａ〜Ｈ、表１９Ａ〜Ｊ、表３１または表３２のものから選択される、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１３】
前記標的化ドメインが、表８Ａ〜Ｈまたは表２０Ａ〜Ｊのものから選択される、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１４】
前記標的化ドメインが、表９Ａ〜Ｉまたは表２１Ａ〜Ｋのものから選択される、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１５】
前記標的化ドメインが、表１０Ａ〜Ｉまたは表２２Ａ〜Ｋのものから選択される、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１６】
前記標的化ドメインが、表１１Ａ〜Ｉまたは表２３Ａ〜Ｊのものから選択される、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１７】
前記標的化ドメインが、表１２Ａ〜Ｉまたは表２４Ａ〜Ｋのものから選択される、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１８】
前記標的化ドメインが、表２５Ａ〜Ｇまたは表２９のものから選択される、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１９】
前記標的化ドメインが、表２６Ａ〜Ｇまたは表２７のものから選択される、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２０】
前記ｇＲＮＡが、モジュラーｇＲＮＡ分子である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２１】
前記ｇＲＮＡが、キメラｇＲＮＡ分子である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２２】
前記標的化ドメインが、１６または１７ヌクレオチド長以上である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２３】
前記標的化ドメインが、１６または１７ヌクレオチド長である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２４】
前記標的化ドメインが、１８ヌクレオチド長である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２５】
前記標的化ドメインが、１９ヌクレオチド長である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２６】
前記標的化ドメインが、２０ヌクレオチド長である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２７】
前記標的化ドメインが、２１ヌクレオチド長である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２８】
前記標的化ドメインが、２２ヌクレオチド長である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２９】
前記標的化ドメインが、２３ヌクレオチド長である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３０】
前記標的化ドメインが、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３１】
５’から３’方向に、
標的化ドメイン；
第１の相補的ドメイン；
連結ドメイン；
第２の相補的ドメイン；
隣接ドメイン；および
テールドメイン
を含んでなる、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３２】
２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；
合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長の標的化ドメイン
を含んでなる、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３３】
２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；
合わせると少なくとも３０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長の標的化ドメイン
を含んでなる、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３４】
２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；
合わせると少なくとも３５ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長の標的化ドメイン
を含んでなる、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３５】
２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；
合わせると少なくとも４０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長の標的化ドメイン
を含んでなる、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３６】
（ａ）ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含んでなる、ｇＲＮＡ分子をコードする配列を含んでなる核酸。
【請求項３７】
前記ｇＲＮＡ分子が、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子である、請求項３６に記載の核酸。
【請求項３８】
前記標的化ドメインが、Ｔ細胞標的化ノックアウト位置の５００、４００、３００、２００、１００、５０、２５、または１０ヌクレオチド以内の二本鎖切断および一本鎖切断から選択される切断事象を提供するように構成される、請求項３６に記載の核酸。
【請求項３９】
前記標的化ドメインが、Ｔ細胞標的化ノックダウン位置に十分に近い、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質を標的化するように設計されて、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の発現が低下、低減または抑制される、請求項３６に記載の核酸。
【請求項４０】
前記標的化ドメインが、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子のプロモーター領域を標的化するように設計される、請求項３６に記載の核酸。
【請求項４１】
前記標的化ドメインが、表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉ、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２のいずれかからの標的化ドメイン配列から同一のまたは３つ以下のヌクレオチドが異なる配列を含んでなる、請求項３６に記載の核酸。
【請求項４２】
前記標的化ドメインが、表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉ、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２のものから選択される、請求項３６に記載の核酸。
【請求項４３】
前記ｇＲＮＡが、モジュラーｇＲＮＡ分子である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項４４】
前記ｇＲＮＡが、キメラｇＲＮＡ分子である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項４５】
前記標的化ドメインが、１６または１７ヌクレオチド長以上である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項４６】
前記標的化ドメインが、１６または１７ヌクレオチド長である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項４７】
前記標的化ドメインが、１８ヌクレオチド長である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項４８】
前記標的化ドメインが、１９ヌクレオチド長である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項４９】
前記標的化ドメインが、２０ヌクレオチド長である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５０】
前記標的化ドメインが、２１ヌクレオチド長である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５１】
前記標的化ドメインが、２２ヌクレオチド長である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５２】
前記標的化ドメインが、２３ヌクレオチド長である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５３】
前記標的化ドメインが、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５４】
５’から３’方向に
標的化ドメイン；
第１の相補的ドメイン；
連結ドメイン；
第２の相補的ドメイン；
隣接ドメイン；および
テールドメイン
を含んでなる、請求項３６〜５４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５５】
２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；
合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長の標的化ドメイン
を含んでなる、請求項３６〜５４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５６】
２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；
合わせると少なくとも３０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長の標的化ドメイン
を含んでなる、請求項３６〜５４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５７】
２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；
合わせると少なくとも３５ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長の標的化ドメイン
を含んでなる、請求項３６〜５４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５８】
２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；
合わせると少なくとも４０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長の標的化ドメイン
を含んでなる、請求項３６〜５４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５９】
（ｂ）Ｃａｓ９分子をコードする配列をさらに含んでなる、請求項３６〜５８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６０】
前記Ｃａｓ９分子が、ｅａＣａｓ９分子である、請求項５９に記載の核酸。
【請求項６１】
前記ｅａＣａｓ９分子が、ニッカーゼ分子を含んでなる、請求項６０に記載の核酸。
【請求項６２】
前記ｅａＣａｓ９分子が、標的核酸中に二本鎖切断を形成する、請求項６０に記載の核酸。
【請求項６３】
前記ｅａＣａｓ９分子が、標的核酸中に一本鎖切断を形成する、請求項６０に記載の核酸。
【請求項６４】
前記一本鎖切断が、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインがそれに相補的である前記標的核酸鎖中に形成される、請求項６３に記載の核酸。
【請求項６５】
前記一本鎖切断が、ｇＲＮＡの標的化ドメインがそれに相補的である鎖以外の前記標的核酸鎖中に形成される、請求項６３に記載の核酸。
【請求項６６】
前記ｅａＣａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を含んでなるが、皆無のまたは有意でないＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を含んでなる、請求項６０に記載の核酸。
【請求項６７】
前記ｅａＣａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメインニッカーゼである、請求項６０に記載の核酸。
【請求項６８】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｄ１０に変異を含んでなる、請求項６０に記載の核酸。
【請求項６９】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を含んでなるが、皆無のまたは有意でないＨＮＨ様ドメイン切断活性を含んでなる、請求項６０に記載の核酸。
【請求項７０】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインニッカーゼである、請求項６０に記載の核酸。
【請求項７１】
前記ｅａＣａｓ９分子が、Ｈ８４０に変異を含んでなる、請求項６０に記載の核酸。
【請求項７２】
前記Ｃａｓ９分子が、ｅｉＣａｓ９分子である、請求項５９に記載の核酸。
【請求項７３】
前記Ｃａｓ９分子が、ｅｉＣａｓ９融合タンパク質分子（例えば、ｅｉＣａｓ９−ＫＲＡＢドメイン融合物などのｅｉＣａｓ９転写リプレッサードメイン融合物）である、請求項７２に記載の核酸。
【請求項７４】
（ｃ）ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の第２の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを有する、本明細書に記載される第２のｇＲＮＡ分子をコードする配列をさらに含んでなる、請求項３６〜７３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項７５】
前記第２のｇＲＮＡ分子が、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子である、請求項７４に記載の核酸。
【請求項７６】
前記第２のｇＲＮＡの標的化ドメインが、Ｔ細胞標的化ノックアウト位置の５００、４００、３００、２００、１００、５０、２５、または１０ヌクレオチド以内の二本鎖切断および一本鎖切断から選択される切断事象を提供するように構成される、請求項７４に記載の核酸。
【請求項７７】
前記第２のｇＲＮＡの標的化ドメインが、Ｔ細胞標的化ノックダウン位置に十分に近い、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質を標的化するように設計されて、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の発現が低下、低減または抑制される、請求項７４に記載の核酸。
【請求項７８】
前記第２のｇＲＮＡの標的化ドメインが、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子のプロモーター領域を標的化するように設計される、請求項７４に記載の核酸。
【請求項７９】
前記第２のｇＲＮＡの標的化ドメインが、表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉ、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２のいずれかからの標的化ドメイン配列と同一のまたは３ヌクレオチド以下異なる配列を含んでなる、請求項７４に記載の核酸。
【請求項８０】
前記第２のｇＲＮＡの標的化ドメインが、表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉ、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２のものから選択される、請求項７４に記載の核酸。
【請求項８１】
前記第２のｇＲＮＡ分子が、モジュラーｇＲＮＡ分子である、請求項７４〜８０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８２】
前記第２のｇＲＮＡ分子が、キメラｇＲＮＡ分子である、請求項７４〜８０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８３】
前記標的化ドメインが、１６または１７ヌクレオチド長以上である、請求項７４〜８０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８４】
前記標的化ドメインが、１６または１７ヌクレオチド長である、請求項７４〜８０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８５】
前記標的化ドメインが、１８ヌクレオチド長である、請求項７４〜８０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８６】
前記標的化ドメインが、１９ヌクレオチド長である、請求項７４〜８０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８７】
前記標的化ドメインが、２０ヌクレオチド長である、請求項７４〜８０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８８】
前記標的化ドメインが、２１ヌクレオチド長である、請求項７４〜８０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８９】
前記標的化ドメインが、２２ヌクレオチド長である、請求項７４〜８０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９０】
前記標的化ドメインが、２３ヌクレオチド長である、請求項７４〜８０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９１】
前記標的化ドメインが、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である、請求項７４〜８０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９２】
前記第２のｇＲＮＡ分子が、５’から３’方向に、
標的化ドメイン；
第１の相補的ドメイン；
連結ドメイン；
第２の相補的ドメイン；
隣接ドメイン；および
テールドメイン
を含んでなる、請求項７４〜９１のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９３】
前記第２のｇＲＮＡ分子が、
２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；
合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長の標的化ドメイン
を含んでなる、請求項７４〜９２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９４】
前記第２の分子ｇＲＮＡが、
２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；
合わせると少なくとも３０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長の標的化ドメイン
を含んでなる、請求項７４〜９２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９５】
前記第２のｇＲＮＡ分子が、
２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；
合わせると少なくとも３５ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長の標的化ドメイン
を含んでなる、請求項７４〜９２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９６】
前記第２のｇＲＮＡ分子が、
２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；
合わせると少なくとも４０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長の標的化ドメイン
を含んでなる、請求項７４〜９２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９７】
第３のｇＲＮＡ分子をさらに含んでなる、請求項７４〜９６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９８】
第４のｇＲＮＡ分子をさらに含んでなる、請求項９７に記載の核酸。
【請求項９９】
（ｂ）請求項５９〜７３のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子をコードする配列をさらに含んでなる、請求項３６に記載の核酸。
【請求項１００】
前記核酸が、（ｃ）第２のｇＲＮＡ分子をコードする配列を含まない、請求項９９に記載の核酸。
【請求項１０１】
（ａ）および（ｂ）のそれぞれが同一核酸分子上に存在する、請求項１００に記載の核酸。
【請求項１０２】
前記核酸分子がＡＡＶベクターである、請求項１００に記載の核酸。
【請求項１０３】
（ａ）が第１の核酸分子上に存在し；（ｂ）が第２の核酸分子上に存在する、請求項１０１に記載の核酸。
【請求項１０４】
前記第１および第２の核酸分子がＡＡＶベクターである、請求項１０３に記載の核酸。
【請求項１０５】
（ｂ）請求項５９〜７３のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子をコードする配列；および
（ｃ）請求項（ｃｌａｍｓ）７４〜９６に記載の第２のｇＲＮＡ分子をコードする配列
をさらに含んでなる、請求項３６に記載の核酸。
【請求項１０６】
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のそれぞれが、同一核酸分子上に存在する、請求項１０５に記載の核酸。
【請求項１０７】
前記核酸分子がＡＡＶベクターである、請求項１０６に記載の核酸。
【請求項１０８】
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の１つが、第１の核酸分子上でコードされ；
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の２つ目および３つ目が、第２の核酸分子上でコードされる、請求項１０５に記載の核酸。
【請求項１０９】
前記第１および第２の核酸分子がＡＡＶベクターである、請求項１０８に記載の核酸。
【請求項１１０】
（ａ）が第１の核酸分子上に存在し；（ｂ）および（ｃ）が第２の核酸分子上に存在する、請求項１０８に記載の核酸。
【請求項１１１】
前記第１および第２の核酸分子がＡＡＶベクターである、請求項１１０に記載の核酸。
【請求項１１２】
（ｂ）が第１の核酸分子上に存在し；（ａ）および（ｃ）が第２の核酸分子上に存在する、請求項１０８に記載の核酸。
【請求項１１３】
前記第１および第２の核酸分子がＡＡＶベクターである、請求項１１２に記載の核酸。
【請求項１１４】
（ｃ）が第１の核酸分子上に存在し；（ｂ）および（ａ）が第２の核酸分子上に存在する、請求項１０８に記載の核酸。
【請求項１１５】
前記第１および第２の核酸分子がＡＡＶベクターである、請求項１１４に記載の核酸。
【請求項１１６】
前記第１の核酸分子がＡＡＶベクター以外であり、前記第２の核酸分子がＡＡＶベクターである、請求項１０３、１０８、１１０、１１２、または１１４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１１７】
前記核酸が、（ａ）のｇＲＮＡ分子をコードする配列と作動可能に連結するプロモーターを含んでなる、請求項３６〜５８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１１８】
前記核酸が、（ｃ）の第２のｇＲＮＡ分子をコードする配列と作動可能に連結する第２のプロモーターを含んでなる、請求項７４〜９６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１１９】
前記プロモーターおよび第２のプロモーターが、互いに異なる、請求項１１７または１１８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１２０】
前記プロモーターおよび第２のプロモーターが、同一である、請求項１１７または１１８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１２１】
前記核酸が、（ｂ）のＣａｓ９分子をコードする配列と作動可能に連結するプロモーターを含んでなる、請求項５９〜７３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１２２】
ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される、第２の遺伝子を標的化するｇＲＮＡ分子をさらに含んでなる、請求項３６〜９６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１２３】
ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される、少なくとも１つの追加的遺伝子を標的化するｇＲＮＡ分子をさらに含んでなる、請求項３６〜９６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１２４】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載の（ａ）ｇＲＮＡ分子を含んでなる、組成物。
【請求項１２５】
請求項５９〜７３のいずれか一項に記載の（ｂ）Ｃａｓ９分子をさらに含んでなる、請求項１２４に記載の組成物。
【請求項１２６】
請求項７４〜９６のいずれか一項に記載の（ｃ）第２のｇＲＮＡ分子をさらに含んでなる、請求項１２４または１２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２７】
第３のｇＲＮＡ分子をさらに含んでなる、請求項１２６に記載の組成物。
【請求項１２８】
第４のｇＲＮＡ分子をさらに含んでなる、請求項１２７に記載の組成物。
【請求項１２９】
ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の２つ以上を標的化する少なくとも２つのｇＲＮＡ分子を含んでなる、組成物。
【請求項１３０】
前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の２つ以上に対する少なくとも２つのｇＲＮＡ分子が、表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉ、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２のいずれかからの標的化ドメイン配列と同一のまたは３ヌクレオチド以下異なる配列を含んでなる、請求項１２９に記載の組成物。
【請求項１３１】
前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ遺伝子の２つ以上に対する少なくとも２つのｇＲＮＡ分子が、表１Ａ−Ｉ、表２Ａ−Ｉ、表３Ａ−Ｈ、表４Ａ−Ｉ、表５Ａ−Ｉ、表６Ａ−Ｉ、表７Ａ−Ｈ、表８Ａ−Ｈ、表９Ａ−Ｉ、表１０Ａ−Ｉ、表１１Ａ−Ｉ、表１２Ａ−Ｉ、表１３Ａ−Ｋ、表１４Ａ−Ｋ、表１５Ａ−Ｆ、表１６Ａ−Ｋ、表１７Ａ−Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２のものから選択される、請求項１２９に記載の組成物。
【請求項１３２】
（ｂ）請求項５９〜７３のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子をさらに含んでなる、請求項１２７〜１２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３３】
ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の２つ以上を標的化する、請求項７４〜９６のいずれか一項に記載の（ｃ）第２のｇＲＮＡ分子をさらに含んでなる、請求項１２９〜１３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３４】
第３のｇＲＮＡ分子をさらに含んでなる、請求項１３３に記載の組成物。
【請求項１３５】
第４のｇＲＮＡ分子をさらに含んでなる、請求項１３４に記載の組成物。
【請求項１３６】
細胞を
（ａ）請求項１〜３５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ；
（ｂ）請求項５９〜７３のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子；および
任意選択的に、（ｃ）請求項７４〜９６のいずれか一項に記載の第２のｇＲＮＡ分子
に接触させるステップを含んでなる、細胞を改変する方法。
【請求項１３７】
第３のｇＲＮＡ分子をさらに含んでなる、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
第４のｇＲＮＡ分子をさらに含んでなる、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記細胞を（ａ）、（ｂ）、および任意選択的に（ｃ）に接触させるステップを含んでなる、請求項１３６〜１３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記ｇＲＮＡ分子が請求項１〜３５のいずれか一項から選択される、請求項１３６〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記細胞が、がんに罹患している対象に由来する、請求項１３６〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記細胞が、がんを有する対象またはさもなければ前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子のＴ細胞標的位置における変異から恩恵を被る対象に由来する、請求項１３６〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記細胞がＴ細胞である、請求項１３６〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記Ｔ細胞が、遺伝子操作Ｔ細胞である、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記遺伝子操作Ｔ細胞が、遺伝子操作キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記遺伝子操作Ｔ細胞が、遺伝子操作ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）Ｔ細胞である、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４７】
前記Ｔ細胞が、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数のＴ細胞標的位置変異を導入する前に、ＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように遺伝子操作される、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４８】
前記Ｔ細胞が、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数のＴ細胞標的位置変異を導入した後に、ＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように遺伝子操作される、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４９】
前記Ｔ細胞が、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数のＴ細胞標的位置変異を導入するのと同時に、ＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように遺伝子操作される、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１５０】
前記接触させるステップが、生体外で実施される、請求項１３６〜１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記接触細胞が、対象の身体に戻される、請求項１３６〜１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記細胞が、がんを有する対象に由来する、請求項１３６〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５３】
前記細胞内のＴ細胞標的位置の配列の知識を得るステップを含んでなる、請求項１３６〜１５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５４】
前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の一部を配列決定することで、前記細胞内のＴ細胞標的位置配列の知識を得るステップを含んでなる、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
Ｔ細胞標的位置変異を誘導するステップを含んでなる、請求項１３６〜１５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５６】
接触させるステップが、前記細胞を（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の少なくとも１つをコードする核酸に接触させるステップを含んでなる、請求項１３６〜１５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５７】
接触させるステップが、前記細胞を請求項３６〜１２３のいずれか一項に記載の核酸に接触させるステップを含んでなる、請求項１３６〜１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５８】
接触させるステップが、（ｂ）のＣａｓ９分子、（ａ）および任意選択的に（ｃ）をコードする核酸を前記細胞に送達するステップを含んでなる、請求項１３６〜１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５９】
接触させるステップが、（ｂ）のＣａｓ９分子、（ａ）のｇＲＮＡ分子、および任意選択的に（ｃ）の第２のｇＲＮＡ分子を前記細胞に送達するステップを含んでなる、請求項１３６〜１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６０】
接触させるステップが、（ａ）のｇＲＮＡ分子、任意選択的に（ｃ）の第２のｇＲＮＡ分子、および（ｂ）のＣａｓ９分子をコードする核酸を前記細胞に送達するステップを含んでなる、請求項１３６〜１５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６１】
対象（または前記対象に由来する細胞）を
（ａ）請求項１〜３５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ；
（ｂ）請求項５９〜７３のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子；および
任意選択的に、（ｃ）請求項７４〜９６のいずれか一項に記載の第２のｇＲＮＡ
に接触させるステップを含んでなる、対象を治療する方法。
【請求項１６２】
第３のｇＲＮＡ分子をさらに含んでなる、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
第４のｇＲＮＡ分子をさらに含んでなる、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
（ａ）、（ｂ）、および任意選択的に（ｃ）を前記対象に接触させるステップをさらに含んでなる、請求項１６１〜１６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６５】
前記対象が、がんに罹患している、請求項１６１〜１６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６６】
前記がんが、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、多発性骨髄腫、腎細胞がん（ＲＣＣ）、神経芽細胞腫、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、メラノーマ、肉腫、前立腺がん、肺がん、食道がん、肝細胞がん、膵臓がん、星細胞腫、中皮腫、頭頸部がん、および髄芽細胞腫からなる群から選択される、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
前記対象が、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子のＴ細胞標的位置における変異から恩恵を被る、請求項１６１〜１６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６８】
前記対象が、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数の変異から恩恵を被る、請求項１６１〜１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６９】
前記対象が、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の２つ以上の変異から恩恵を被る、請求項１６１〜１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７０】
前記対象が、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の３つ以上の変異から恩恵を被る、請求項１６１〜１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７１】
前記対象が、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の４つ以上の変異から恩恵を被る、請求項１６１〜１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７２】
前記対象が、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の５つ以上の変異から恩恵を被る、請求項１６１〜１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７３】
前記対象が、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の６つ以上の変異から恩恵を被る、請求項１６１〜１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７４】
前記対象が、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ遺伝子の７つ以上の変異から恩恵を被る、請求項１６１〜１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７５】
前記対象が、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子のそれぞれの変異から恩恵を被る、請求項１６１〜１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７６】
前記対象におけるＴ細胞標的位置の配列の知識を得るステップを含んでなる、請求項１６１〜１７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７７】
前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数またはその一部を配列決定することで、前記対象におけるＴ細胞標的位置の配列の知識を得るステップを含んでなる、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中で、Ｔ細胞標的位置変異を誘導するステップを含んでなる、請求項１６１〜１７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７９】
前記対象の細胞が、生体外で、（ａ）、（ｂ）、および任意選択的に（ｃ）に接触される、請求項１６１〜１７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８０】
前記対象の細胞が、Ｔ細胞である、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
前記Ｔ細胞が、ＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように遺伝子操作される、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
前記Ｔ細胞が、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数のＴ細胞標的位置変異を誘導する前に、ＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように遺伝子操作される、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８３】
前記Ｔ細胞が、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数のＴ細胞標的位置変異を誘導した後に、ＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように遺伝子操作される、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８４】
前記Ｔ細胞が、前記ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数のＴ細胞標的位置変異を誘導するのと同時に、ＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように遺伝子操作される、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８５】
前記細胞が、前記対象の身体に戻される、請求項１７９〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８６】
前記治療が、細胞を前記対象の身体に導入するステップを含んでなり、前記細胞対象が、生体外で、（ａ）、（ｂ）、および任意選択的に（ｃ）に接触される、請求項１７９〜１８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８７】
接触させるステップが、前記対象を（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の少なくとも１つをコードする核酸に接触させるステップを含んでなる、請求項１６１〜１８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８８】
接触させるステップが、前記対象を請求項３６〜１２３のいずれか一項に記載（ａｎｙ  ｏｆ  ａｎｙ  ｏｆ）の核酸に接触させるステップを含んでなる、請求項１６１〜１８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８９】
接触させるステップが、（ｂ）のＣａｓ９分子と、（ａ）および任意選択的に（ｃ）をコードする核酸を前記対象に送達するステップを含んでなる、請求項１６１〜１８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９０】
接触させるステップが、（ｂ）のＣａｓ９分子、（ａ）のｇＲＮＡ、および任意選択的に（ｃ）の第２のｇＲＮＡを前記対象に送達するステップを含んでなる、請求項１６１〜１８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９１】
接触させるステップが、（ａ）のｇＲＮＡ分子、任意選択的に（ｃ）の第２のｇＲＮＡ、および（ｂ）のＣａｓ９をコードする核酸を前記対象に送達するステップを含んでなる、請求項１６１〜１８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９２】
ｇＲＮＡ、核酸、または本明細書に記載される組成物、およびがんを有する対象またはＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数のＴ細胞標的位置における変異から恩恵を被る対象に由来する細胞を含んでなる、反応混合物。
【請求項１９３】
（ａ）請求項１〜３５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子、またはｇＲＮＡをコードする核酸、および以下の１つまたは複数、
（ｂ）請求項５９〜７３のいずれか一項に記載のＣａｓ９分子；
（ｃ）請求項７４〜９６のいずれか一項に記載の第２のｇＲＮＡ分子；および
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）の１つまたは複数をコードする核酸
を含んでなる、キット。
【請求項１９４】
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の１つまたは複数をコードする核酸を含んでなる、請求項１９３に記載のキット。
【請求項１９５】
Ｔ細胞標的位置を標的化する第３のｇＲＮＡ分子をさらに含んでなる、請求項１９４に記載のキット。
【請求項１９６】
Ｔ細胞標的位置を標的化する第４のｇＲＮＡ分子をさらに含んでなる、請求項１９５に記載のキット。
【請求項１９７】
前記ｇＲＮＡが、その５’末端またはその近く（例えば、その５’末端の１〜１０、１〜５、または１〜２ヌクレオチド以内）の修飾を含んでなる、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項１９８】
前記ｇＲＮＡが、その３’末端またはその近く（例えば、その３’末端の１〜１０、１〜５、または１〜２ヌクレオチド以内）の修飾を含んでなる、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項１９９】
前記ｇＲＮＡが、その５’末端にまたはその近く（例えば、その５’末端の１〜１０、１〜５、または１〜２ヌクレオチド以内）の修飾と、またはその３’末端にまたはその近く（例えば、その３’末端の１〜１０、１〜５、または１〜２ヌクレオチド以内）の修飾を含んでなる、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項２００】
前記修飾が、Ｔ細胞内に導入された際に、ヌクレアーゼに対する前記ｇＲＮＡの安定性増大の提示を引き起こす、請求項１９７〜１９９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項２０１】
前記修飾が、Ｔ細胞内に導入された際に、前記ｇＲＮＡの先天性免疫応答低下の提示を引き起こす、請求項１９７〜１９９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項２０２】
前記先天性免疫応答が、サイトカイン発現の誘導を伴う、請求項２０１に記載のｇＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示が本明細書に参照により援用される、２０１４年４月１８日に出願された米国仮特許出願６１／９８１，６３６第号明細書、および２０１５年３月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／１３８，２４６号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本明細書は、配列表（「配列表２０１１２７１−０００５  ＥＭ０３４ＰＣＴ．ｔｘｔ」と命名された．ｔｘｔファイルとして、２０１５年４月１７日に電子的に提出された）を参照する。．ｔｘｔファイルは２０１５年４月１７日に作成されて、サイズは１１，４００，０００バイトである。配列表の内容全体は、本明細書に参照により援用される。
【０００３】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ関連方法、標的核酸配列を編集するための組成物および構成要素、または標的核酸配列の発現調節、および遺伝子操作Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体の養子免疫伝達を含んでなるがん免疫療法に関連したそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子操作Ｔ細胞の養子免疫伝達は、治療法としての臨床用試験段階に入った。典型的に、アプローチは、１）アフェレーシス療法によって対象から白血球を得るステップと；２）Ｔ細胞を選択／富化するステップと；３）サイトカイン処理によってＴ細胞を活性化するステップと；４）レトロウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入または電気穿孔によって、クローン化Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子を導入するステップと；５）サイトカイン処理によってＴ細胞を増殖させるステップと；６）通常はリンパ枯渇によって対象を馴化させるステップと；７）遺伝子操作Ｔ細胞を対象に輸液するステップとからなる。
【０００５】
クローン化ＴＣＲ遺伝子（ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ）起源としては、特定の悪性腫瘍がある個人から単離された稀なＴ細胞集団と、特定の腫瘍抗原または腫瘍細胞で免疫化されたＴ細胞受容体−ヒト化マウスから単離された、Ｔ細胞クローンとが挙げられる。養子免疫伝達に続いて、ＴＣＲ遺伝子操作Ｔ細胞は、腫瘍細胞表面の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質によって提示される、それらの同族の抗原ペプチドを認識する。抗原結合は、シグナルトランスダクション経路を刺激して、Ｔ細胞活性化および増殖をもたらす。次に、刺激されたＴ細胞は、典型的に、グランザイムＢ、パーフォリン、およびグラニュリシンを含んでなる分泌複合体を伴う細胞毒性抗腫瘍細胞応答を開始して、腫瘍細胞アポトーシスを誘導する。
【０００６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子は、典型的に、モノクローナル抗体の一本鎖抗体変数断片（ｓｃＦｖ）ドメインに由来して、ヒンジおよび膜貫通ドメインを通じて細胞質内エフェクタードメインに融合する、細胞外腫瘍抗原結合ドメインを含んでなる、人工Ｔ細胞受容体をコードする。エフェクタードメインは、典型的に、Ｔ細胞共受容体複合体のＣＤ３−ζ鎖に由来して、ＣＤ２８および／またはＣＤ１３７受容体タンパク質に由来するドメインもまた含み得る。ＣＡＲ細胞外ドメインは、ＴＣＲ遺伝子操作Ｔ細胞について記載されるように、ＭＨＣ非依存性様式で腫瘍抗原に結合して、細胞毒性抗腫瘍作用に至るＴ細胞の活性化および増殖をもたらす。
【０００７】
これまでのところ、少なくとも１５種の異なる腫瘍抗原が、遺伝子操作Ｔ細胞の臨床試験で標的化されている。いくつかの試験では、抗腫瘍活性が報告されている。最大の成功は、血液悪性腫瘍で得られている。例えば、Ｂ細胞抗原であるＣＤ１９を標的化するように遺伝子操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞の養子免疫伝達は、リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、およびＢ細胞急性リンパ球性白血病がある対象において、複数の部分的および完全寛解をもたらした。対照的に、その他の腫瘍型、特に腎細胞がん、神経芽細胞腫、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、メラノーマ、肉腫、および前立腺がんをはじめとする固形腫瘍を標的化する試験は、あまり成功していない。これらの試験の多くでは、非常に少数の患者が客観的応答を経験した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、養子性に移入された遺伝子操作Ｔ細胞の抗腫瘍有効性を改善する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書で考察される方法および組成物は、対象への遺伝子操作Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体の投与を含んでなる免疫療法アプローチを使用した、がん治療を提供する。がんに罹患している対象を治療するアプローチは、対象からＴ細胞を分離して、それらががん細胞によって発現される抗原を標的化するように遺伝子を組み替え、次に、それらを対象に再導入する、養子細胞移入と称される方法である。Ｔ細胞の遺伝子を組み替える方法としては、それぞれ特定のがん抗原を特異的に認識する、膜貫通ＴＣＲまたはＣＡＲタンパク質をコードする、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子の導入が挙げられる。理論による拘束は望まないが、腫瘍が発現する抗原のＴＣＲまたはＣＡＲタンパク質と抗原結合ドメインとの結合は、シグナル伝達カスケードを開始して、Ｔ細胞の活性化と増殖、そして究極的には、細胞毒性免疫応答を通じてがん細胞の破壊をもたらすと考えられる（Ｋｅｒｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３  ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ  １３，５２５−５４１）。
【００１０】
遺伝子修飾されたＴ細胞を使用する養子細胞移入は、固形および血液悪性腫瘍の治療薬として、臨床試験段階に入っている。これまでのところ結果は、入り交じっている。血液悪性腫瘍（特にリンパ腫、ＣＬＬ、およびＡＬＬ）では、いくつかの第１相および第２相試験において患者の大部分が、少なくとも部分寛解を示し、患者によっては完全寛解を示した（Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ，Ｊ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｂｌｏｏｄ  １１９，２７０９−２７２０）。しかし、（メラノーマ、腎細胞がん、および結腸直腸がんをはじめとする）大多数の腫瘍型では、より少ない応答が観察されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｂｌｏｏｄ  １１４，５３５−５４６；Ｌａｍｅｒｓ，Ｃ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２０１３  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１，９０４−９１２；Ｗａｒｒｅｎ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５，Ｓ１−Ｓ２）。したがって、がん治療において、修飾Ｔ細胞の養子免疫伝達有効性を改善する必要性が存在する。
【００１１】
遺伝子修飾されたＴ細胞のがん治療薬としての有効性を制限する要因としては、（１）例えば、養子免疫伝達に続くＴ細胞の限定的増殖などのＴ細胞増殖；（２）例えば、腫瘍環境内因子によるＴ細胞アポトーシス誘導などのＴ細胞生存；および（３）例えば、宿主免疫細胞およびがん細胞によって分泌される阻害因子による、細胞毒性Ｔ細胞機能の阻害などのＴ細胞機能が挙げられる。本明細書に記載される方法および組成物は、Ｔ細胞の増殖、生存および／または機能に影響を与える、Ｔ細胞発現遺伝子の発現を修飾することで、これらの制限に対処する。
【００１２】
一実施形態では、本明細書で考察される方法および組成物を使用して、Ｔ細胞増殖に影響を及ぼし得る（例えば、Ｔ細胞増殖を阻害する遺伝子を不活性化することで）。一実施形態では、本明細書で考察される方法および組成物を使用して、Ｔ細胞生存に影響を及ぼし得る（例えば、遺伝子仲介Ｔ細胞アポトーシスを不活性化することで）。一実施形態では、本明細書で考察される方法および組成物を使用して、Ｔ細胞機能に影響を及ぼし得る（例えば、免疫抑制および抑制（例えば、アネルギー誘導）シグナル伝達因子をコードする遺伝子を不活性化することで）。上に記載される方法および組成物を個々にまたは組み合わせて使用して、例えば、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞生存、Ｔ細胞機能、またはそれらの任意の組み合わせなどのがん治療薬としての遺伝子修飾された細胞の有効性を制限する要素の１つまたは複数に影響を及ぼし得ることが、本明細書で検討される。
【００１３】
本明細書で考察される方法および組成物を使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子を改変することで、Ｔ細胞の増殖、生存および／または機能に影響を及ぼし得る。一実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物を使用して、例えば、ＣＢＬＢおよび／またはＰＴＰＮ６遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子を改変することで、Ｔ細胞増殖に影響を及ぼし得る。一実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物を使用して、例えば、ＦＡＳおよび／またはＢＩＤ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子を改変することで、Ｔ細胞生存に影響を及ぼし得る。一実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物を使用して、例えば、ＣＴＬＡ４および／またはＰＤＣＤ１および／またはＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子または遺伝子群を改変することで、Ｔ細胞機能に影響を及ぼし得る。
【００１４】
１つのアプローチでは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子が、独立して、標的ノックアウトまたはノックダウンとして標的化されて、例えば、Ｔ細胞の増殖、生存および／または機能に影響を与える。一実施形態では、アプローチは、１つのＴ細胞発現遺伝子（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子）をノックアウトまたはノックダウンするステップを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の内２つなどのＴ細胞が発現する２つの遺伝子をそれぞれ独立してノックアウトまたはノックダウンするステップを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の内３つなどのＴ細胞が発現する３つの遺伝子をそれぞれ独立してノックアウトまたはノックダウンするステップを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の内４つなどのＴ細胞が発現する４つの遺伝子をそれぞれ独立してノックアウトまたはノックダウンするステップを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の内５つなどのＴ細胞が発現する５つの遺伝子をそれぞれ独立してノックアウトまたはノックダウンするステップを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の内６つなどのＴ細胞が発現する６つの遺伝子をそれぞれ独立してノックアウトまたはノックダウンするステップを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の内７つなどのＴ細胞が発現する７つの遺伝子をそれぞれ独立してノックアウトまたはノックダウンするステップを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子などのＴ細胞が発現する８つの遺伝子をそれぞれ独立してノックアウトまたはノックダウンするステップを含んでなる。
【００１５】
上に記載される遺伝子に加えて、遺伝子操作Ｔ細胞の有効性に影響を及ぼすために、いくつかのその他のＴ細胞発現遺伝子が標的化されてもよい。これらの遺伝子としては、ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ、およびＴＧＦＢＲＩＩＩが挙げられるが、これに限定されるものではない（Ｋｅｒｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．２０１３  ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ  １３，５２５−５４１）。本明細書では、本明細書で開示される方法を使用して、ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩまたはＴＧＦＢＲＩＩＩ遺伝子の１つまたは複数が、個々にまたは組み合わせて改変され得ることが検討される。本明細書で開示される方法を使用して、ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩまたはＴＧＦＢＲＩＩＩ遺伝子の１つまたは複数が、個々に、または上に記載される８つの遺伝子（すなわち、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子）の任意の１つまたは複数との組み合わせで、改変され得ることがさらに検討される。
【００１６】
一態様では、本明細書で考察される方法および組成物を使用して、例えば、プロモーター領域などの非コードまたはコード領域、または例えば、イントロンまたはエクソン配列などの転写配列などの遺伝子を標的化することで、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数が改変されて、Ｔ細胞の増殖、生存および／または機能に影響を及ぼしてもよい。一実施形態では、発現改変およびノックアウトのために、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子のコード配列、例えば、初期コード領域などのコード領域が、標的化される。
【００１７】
別の態様では、本明細書で考察される方法および組成物を使用して、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子のコード配列を標的化することで、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子が改変されて、Ｔ細胞の増殖、生存および／または機能に影響を及ぼしてもよい。一実施形態では、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子のコード配列などの遺伝子が標的化されて、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数の欠失または変異を含んでなる改変を誘導することで、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数がそれぞれノックアウトされて、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数の発現が排除されて、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数の１つまたは２つの対立遺伝子がノックアウトされる。一実施形態では、方法は、挿入または欠失を含んでなる改変を提供する。本明細書に記載されるように、標的ノックアウトアプローチは、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）を含んでなるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用する、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって媒介される。
【００１８】
一実施形態では、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子の初期コード配列が標的化されて、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数が、それぞれノックアウトされる。一実施形態では、標的化は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは２つの対立遺伝子に影響を及ぼす。一実施形態では、標的ノックアウトアプローチは、機能性ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子産物の発現を低下させまたは排除する。一実施形態では、方法は、挿入または欠失を含んでなる改変を提供する。
【００１９】
別の態様では、本明細書で考察される方法および組成物を使用して、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、３’ＵＴＲ、および／またはポリアデニル化シグナルなどのＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子の非コード配列を標的化することで、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子が改変されて、Ｔ細胞機能に影響を及ぼしてもよい。一実施形態では、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子の非コード配列などの遺伝子が標的化されて、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子の欠失または変異を含んでなる改変を誘導することで、遺伝子がノックアウトされ、例えば、遺伝子の発現が排除されて、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは２つの対立遺伝子がノックアウトされる。一実施形態では、方法は、挿入または欠失を含んでなる改変を提供する。
【００２０】
「Ｔ細胞標的ＦＡＳノックアウト位置」は、本明細書の用法では、ＮＨＥＪ媒介改変によって改変されると、機能性ＦＡＳ遺伝子産物発現の低下または排除（例えば、機能性ＦＡＳ遺伝子産物発現のノックアウト）がもたらされる、ＦＡＳ遺伝子中の位置を指す。一実施形態では、位置は、ＦＡＳ遺伝子コード領域、例えば、初期コード領域にある。
【００２１】
「Ｔ細胞標的ＢＩＤノックアウト位置」は、本明細書の用法では、ＮＨＥＪ媒介改変によって改変されると、機能性ＢＩＤ遺伝子産物発現の低下または排除（例えば、機能性ＢＩＤ遺伝子産物発現のノックアウト）がもたらされる、ＢＩＤ遺伝子中の位置を指す。一実施形態では、位置は、例えば、初期コード領域などのＢＩＤ遺伝子コード領域にある。
【００２２】
「Ｔ細胞標的ＣＴＬＡ４ノックアウト位置」は、本明細書の用法では、ＮＨＥＪ媒介改変によって改変されると、機能性ＣＴＬＡ４遺伝子産物発現の低下または排除（例えば、機能性ＣＴＬＡ４遺伝子産物発現のノックアウト）がもたらされる、ＣＴＬＡ４遺伝子中の位置を指す。一実施形態では、位置は、例えば、初期コード領域などのＣＴＬＡ遺伝子コード領域にある。
【００２３】
「Ｔ細胞標的ＰＤＣＤ１ノックアウト位置」は、本明細書の用法では、ＮＨＥＪ媒介改変によって改変されると、機能性ＰＤＣＤ１遺伝子産物発現の低下または排除（例えば、機能性ＰＤＣＤ１遺伝子産物発現のノックアウト）がもたらされる、ＰＤＣＤ１遺伝子中の位置を指す。一実施形態では、位置は、ＰＤＣＤ１遺伝子コード領域、例えば、初期コード領域にある。
【００２４】
「Ｔ細胞標的ＣＢＬＢノックアウト位置」は、本明細書の用法では、ＮＨＥＪ媒介改変によって改変されると、機能性ＣＢＬＢ遺伝子産物発現の低下または排除（例えば、機能性ＣＢＬＢ遺伝子産物発現のノックアウト）がもたらされる、ＣＢＬＢ遺伝子中の位置を指す。一実施形態では、位置は、例えば、初期コード領域などのＣＢＬＢ遺伝子コード領域にある。
【００２５】
「Ｔ細胞標的ＰＴＰＮ６ノックアウト位置」は、本明細書の用法では、ＮＨＥＪ媒介改変によって改変されると、機能性ＰＴＰＮ６遺伝子産物発現の低下または排除（例えば、機能性ＰＴＰＮ６遺伝子産物発現のノックアウト）がもたらされる、ＰＴＰＮ６遺伝子中の位置を指す。一実施形態では、位置は、例えば、初期コード領域などのＰＴＰＮ６遺伝子コード領域にある。
【００２６】
「Ｔ細胞標的ＴＲＡＣノックアウト位置」は、本明細書の用法では、ＮＨＥＪ媒介改変によって改変されると、機能性ＴＲＡＣ遺伝子産物発現の低下または排除（例えば、機能性ＴＲＡＣ遺伝子産物発現のノックアウト）がもたらされる、ＴＲＡＣ遺伝子中の位置を指す。一実施形態では、位置は、例えば、初期コード領域などのＴＲＡＣ遺伝子コード領域にある。
【００２７】
「Ｔ細胞標的ＴＲＢＣノックアウト位置」は、本明細書の用法では、ＮＨＥＪ媒介改変によって改変されると、機能性ＴＲＢＣ遺伝子産物発現の低下または排除（例えば、機能性ＴＲＢＣ遺伝子産物発現のノックアウト）がもたらされる、ＴＲＢＣ遺伝子中の位置を指す。一実施形態では、位置は、例えば、初期コード領域などのＴＲＢＣ遺伝子コード領域にある。
【００２８】
別の態様では、本明細書で考察される方法および組成物を使用して、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子のプロモーター領域を標的化することで、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の発現が改変されて、Ｔ細胞機能に影響を及ぼしてもよい。一実施形態では、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子のプロモーター領域が標的化されて、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の発現がノックダウンされる。標的化ノックダウンアプローチは、機能性ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、および／またはＰＴＰＮ６遺伝子産物の発現を低下させまたは排除する。本明細書に記載されるように、標的化ノックダウンは、転写リプレッサードメインまたはクロマチン修飾タンパク質に融合された酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）またはｅｉＣａｓ９を標的化して、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢおよび／またはＰＴＰＮ６遺伝子の転写を改変して、例えば、転写を妨げ、減少させ、または低下させることで媒介される。
【００２９】
「Ｔ細胞標的ＦＡＳノックダウン位置」は、本明細書の用法では、例えば、本明細書に記載されるｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質によって標的化されると、機能性ＦＡＳ遺伝子産物発現の低下または排除がもたらされる、ＦＡＳ遺伝子中の位置を指す。一実施形態では、転写は低下または排除される。一実施形態では、位置は、ＦＡＳプロモーター配列中にある。一実施形態では、ＦＡＳ遺伝子のプロモーター配列中の位置は、本明細書に記載されるように、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質によって標的化される。
【００３０】
「Ｔ細胞標的ＢＩＤノックダウン位置」は、本明細書の用法では、例えば、本明細書に記載されるｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質によって標的化されると、機能性ＢＩＤ遺伝子産物発現の低下または排除がもたらされる、ＢＩＤ遺伝子中の位置を指す。一実施形態では、転写は低下または排除される。一実施形態では、位置は、ＢＩＤプロモーター配列中にある。一実施形態では、ＢＩＤ遺伝子のプロモーター配列中の位置は、本明細書に記載されるように、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質によって標的化される。
【００３１】
「Ｔ細胞標的ＣＴＬＡ４ノックダウン位置」は、本明細書の用法では、例えば、本明細書に記載されるｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質によって標的化されると、機能性ＣＴＬＡ４遺伝子産物発現の低下または排除がもたらされる、ＣＴＬＡ４遺伝子中の位置を指す。一実施形態では、転写は低下または排除される。一実施形態では、位置は、ＣＴＬＡ４プロモーター配列中にある。一実施形態では、ＣＴＬＡ４遺伝子のプロモーター配列中の位置は、本明細書に記載されるように、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質によって標的化される。
【００３２】
「Ｔ細胞標的ＰＤＣＤ１ノックダウン位置」は、本明細書の用法では、例えば、本明細書に記載されるｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質によって標的化されると、機能性ＰＤＣＤ１遺伝子産物発現の低下または排除がもたらされる、ＰＤＣＤ１遺伝子中の位置を指す。一実施形態では、転写は低下または排除される。一実施形態では、位置は、ＰＤＣＤ１プロモーター配列中にある。一実施形態では、ＰＤＣＤ１遺伝子のプロモーター配列中の位置は、本明細書に記載されるように、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質によって標的化される。
【００３３】
「Ｔ細胞標的ＣＢＬＢノックダウン位置」は、本明細書の用法では、例えば、本明細書に記載されるｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質によって標的化されると、機能性ＣＢＬＢ遺伝子産物発現の低下または排除がもたらされる、ＣＢＬＢ遺伝子中の位置を指す。一実施形態では、転写は低下または排除される。一実施形態では、位置は、ＣＢＬＢプロモーター配列中にある。一実施形態では、ＣＢＬＢ遺伝子のプロモーター配列中の位置は、本明細書に記載されるように、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質によって標的化される。
【００３４】
「Ｔ細胞標的ＰＴＰＮ６ノックダウン位置」は、本明細書の用法では、例えば、本明細書に記載されるｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質によって標的化されると、機能性ＰＴＰＮ６遺伝子産物発現の低下または排除がもたらされる、ＰＴＰＮ６遺伝子中の位置を指す。一実施形態では、転写は低下または排除される。一実施形態では、位置は、ＰＴＰＮ６プロモーター配列中にある。一実施形態では、ＰＴＰＮ６遺伝子のプロモーター配列中の位置は、本明細書に記載されるように、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質によって標的化される。
【００３５】
「Ｔ細胞標的ＦＡＳ位置」とは、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、Ｔ細胞標的ＦＡＳノックアウト位置および／またはＴ細胞標的ＦＡＳノックダウン位置のいずれか指す。
【００３６】
「Ｔ細胞標的ＢＩＤ位置」とは、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、Ｔ細胞標的ＢＩＤノックアウト位置および／またはＴ細胞標的ＢＩＤノックダウン位置のいずれかを指す。
【００３７】
「Ｔ細胞標的ＣＴＬＡ４位置」とは、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、Ｔ細胞標的ＣＴＬＡ４ノックアウト位置および／またはＴ細胞標的ＣＴＬＡ４ノックダウン位置のいずれかを指す。
【００３８】
「Ｔ細胞標的ＰＤＣＤ１位置」とは、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、Ｔ細胞標的ＰＤＣＤ１ノックアウト位置および／またはＴ細胞標的ＰＤＣＤ１ノックダウン位置のいずれかを指す。
【００３９】
「Ｔ細胞標的ＣＢＬＢ位置」とは、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、Ｔ細胞標的ＣＢＬＢノックアウト位置および／またはＴ細胞標的ＣＢＬＢノックダウン位置のいずれかを指す。
【００４０】
「Ｔ細胞標的ＰＴＰＮ６位置」とは、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、Ｔ細胞が標的ＰＴＰＮ６ノックアウト位置および／またはＴ細胞標的ＰＴＰＮ６ノックダウン位置のいずれかを指す。
【００４１】
「Ｔ細胞ＴＲＡＣ標的位置」とは、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、Ｔ細胞標的ＴＲＡＣノックアアウト位置のいずれかを指す。
【００４２】
「Ｔ細胞標的ＴＲＢＣ位置」とは、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、Ｔ細胞標的ＴＲＢＣノックアウト位置のいずれかを指す。
【００４３】
「Ｔ細胞が標的化ノックアウト位置をす」とは、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、Ｔ細胞標的ＦＡＳノックアウト位置、Ｔ細胞標的ＢＩＤノックアウト位置、Ｔ細胞標的ＣＴＬＡ４ノックアウト位置、Ｔ細胞標的ＰＤＣＤ１ノックアウト位置、Ｔ細胞標的ＣＢＬＢノックアウト位置、Ｔ細胞標的ＰＴＰＮ６ノックアウト位置、Ｔ細胞標的ＴＲＡＣノックアウト位置、またはＴ細胞標的ＴＲＢＣノックアウト位置のいずれかを指す。
【００４４】
「Ｔ細胞標的化ノックダウン位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、Ｔ細胞標的ＦＡＳノックダウン位置、Ｔ細胞標的ＢＩＤノックダウン位置、Ｔ細胞標的ＣＴＬＡ４ノックダウン位置、Ｔ細胞標的ＰＤＣＤ１ノックダウン位置、Ｔ細胞標的ＣＢＬＢノックダウン位置、またはＴ細胞標的ＰＴＰＮ６ノックダウン位置のいずれかを指す。「Ｔ細胞標的位置」は、本明細書ににおける用法では、本明細書に記載されるように、Ｔ細胞標的ノックアウト位置またはＴ細胞標的ノックダウン位置のいずれかを指す。
【００４５】
一態様では、本明細書で開示されるのは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子からの標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含んでなる、単離されたまたは非天然ｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡ分子である。
【００４６】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置に十分に近い二本鎖切断または一本鎖切断などの切断事象を提供して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置のＮＨＥＪに関連する改変などの改変を可能にするように構成される。一実施形態では、標的化ドメインは、例えば、二本鎖または一本鎖切断などの切断事象が、Ｔ細胞標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド内に位置するように構成される。例えば、二本鎖または一本鎖切断などの切断は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置の上流または下流に位置し得る。
【００４７】
一実施形態では、第２の標的化ドメインを含んでなる第２のｇＲＮＡ分子が、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置に十分に近い二本鎖切断または一本鎖切断などの切断事象を提供して、単独でまたは第１のｇＲＮＡ分子によって配置される切断との組み合わせで、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置のＮＨＥＪに関連する改変などの改変を可能にするように構成される。一実施形態では、第１および第２のｇＲＮＡ分子標的化ドメインは、例えば、二本鎖または一本鎖切断などの切断事象が、標的位置１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド内のｇＲＮＡ分子のそれぞれから独立して位置するように構成される。一実施形態では、例えば、二本鎖または一本鎖切断などの切断は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子のＴ細胞標的位置のヌクレオチドの両側に位置する。一実施形態では、例えば、二本鎖または一本鎖切断などの切断は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置のヌクレオチドの上流または下流などの片側に位置する。
【００４８】
一実施形態では、一本鎖切断は、下で考察されるように、第２のｇＲＮＡ分子によって配置される追加的一本鎖切断を伴う。例えば、標的化ドメインは、例えば、２つの一本鎖切断などの切断事象が、Ｔ細胞標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド内に位置するように構成される。一実施形態では、第１および第２のｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９ニッカーゼを誘導すると、一本鎖切断が、第２のｇＲＮＡによって配置される互いに十分に近い追加的一本鎖切断を伴い、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置改変をもたらすように構成される。一実施形態では、第１および第２のｇＲＮＡ分子は、例えば、Ｃａｓ９がニッカーゼである場合、第２のｇＲＮＡによって配置される一本鎖切断が、第１のｇＲＮＡ分子によって配置される切断の１０、２０、３０、４０、または５０ヌクレオチド内であるように構成される。一実施形態では、２つのｇＲＮＡ分子は、異なる鎖上の同一位置に、または互いに少数のヌクレオチド内に、切断を配置させるように設計されて、例えば、二本鎖切断を本質的に模倣する。
【００４９】
一実施形態では、二本鎖切断は、下で考察されるように、第２のｇＲＮＡ分子によって配置される追加的二本鎖切断を伴い得る。例えば、第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、二本鎖切断が、例えば、標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド内などのＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置の上流に位置するように構成され；第２のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、二本鎖切断が、例えば、標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド内などのＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置の下流に位置するように構成される。
【００５０】
一実施形態では、二本鎖切断は、第２のｇＲＮＡ分子および第３のｇＲＮＡ分子によって配置される２つの追加的一本鎖切断を伴い得る。例えば、第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、二本鎖切断が、例えば、標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド内などのＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置の上流に位置するように構成され；第２および第３のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、２つの一本鎖切断が、例えば、標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド内などのＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置の下流に位置するように構成される。一実施形態では、第１、第２、および第３のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、例えば、二本鎖または一本鎖切断などの切断事象が、各ｇＲＮＡ分子から独立して位置するように構成される。
【００５１】
一実施形態では、第１および第２の一本鎖切断は、第３のｇＲＮＡ分子および第４のｇＲＮＡ分子によって配置される、２つの追加的一本鎖切断を伴い得る。例えば、第１および第２のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、２つの一本鎖切断が、例えば、標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド内などのＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置の上流に位置するように構成され；第３および第４のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、２つの一本鎖切断が、例えば、標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド内などのＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置の下流に位置するように構成される。
【００５２】
本明細書では、複数のｇＲＮＡが使用されて、（１）近傍の２つの一本鎖切断、（２）例えば、位置の側面に位置する２つの二本鎖切断（例えば１つのＤＮＡを除去して、例えば欠失変異を生じる）または遺伝子中に、例えば初期コード領域内などのコード領域に２つ以上のインデルが生じる、（３）位置側面に位置する１つの二本鎖切断および２つの対合ニック（例えば１つのＤＮＡを除去して、例えば欠失を挿入する）または（４）位置の両側に各２つの４つの一本鎖切断が生じる場合、それらは同一Ｔ細胞標的位置を標的化することが検討される。本明細書では、複数のｇＲＮＡを使用して、同一遺伝子の２つ以上の位置が標的化されてもよいことがさらに検討される。
【００５３】
２つ以上のｇＲＮＡを使用して、例えば、二本鎖または一本鎖切断などの２つ以上の切断事象が標的核酸中に配置される場合、２つ以上の切断事象は、同一であるかまたは異なるＣａｓ９タンパク質によって生成されてもよいことが検討される。例えば、２つのｇＲＮＡを使用して、標的核酸中に二本鎖切断が配置される場合、単一Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用して、双方の二本鎖切断が生成されてもよい。２つ以上のｇＲＮＡを使用して、標的核酸中に２つ以上の一本鎖切断（ニックとも称される）が配置される場合、単一Ｃａｓ９ニッカーゼを使用して、２つ以上のニックが生成されてもよい。２つ以上のｇＲＮＡを使用して、標的核酸中に少なくとも１つの二本鎖切断および少なくとも１つの一本鎖切断が配置される場合、例えば、１つのＣａｓ９ヌクレアーゼおよび１つのＣａｓ９ニッカーゼなどの２つのＣａｓ９タンパク質が使用されてもよい。２つ以上のＣａｓ９タンパク質が使用される場合、２つ以上のＣａｓ９タンパク質が順次送達されて、標的核酸中の所望の位置における、一本鎖切断に対する二本鎖切断の特異性が制御されてもよいことが検討される。別の実施形態では、２つ以上のＣａｓ９タンパク質が使用される場合、Ｃａｓ９タンパク質は、異なる生物種に由来してもよい。例えば、２つ以上のｇＲＮＡを使用して、標的核酸中に、少なくとも１つの二本鎖切断および少なくとも１つの一本鎖切断が配置される場合、二本鎖切断を生じるＣａｓ９ヌクレアーゼは、１つの細菌種に由来してもよく、一本鎖切断を生じるＣａｓ９ニッカーゼは、異なる細菌種に由来してもよい。
【００５４】
細胞内で２つ以上の遺伝子が改変のために標的化される場合、標的化核酸は、例えば、１つまたは複数のＣａｓ９タンパク質による切断によって改変されてもよい。例えば、２つの遺伝子がノックアウトのために標的化されるなど、例えば２つの遺伝子が改変のために標的化される場合、同一または異なるＣａｓ９タンパク質を使用して、各遺伝子が標的化されてもよい。一実施形態では、双方の遺伝子（または細胞内で標的化される各遺伝子）は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって切断されて、二本鎖切断が生じる。別の実施形態では、双方の遺伝子（または細胞内で標的化される各遺伝子）は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって切断されて、二本鎖切断が生じる。別の実施形態では、細胞内の１つまたは複数の遺伝子が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼでの切断によって改変されてもよく、同一細胞内の１つまたは複数の遺伝子が、Ｃａｓ９ニッカーゼでの切断によって改変されてもよい。２つ以上のＣａｓ９タンパク質を使用して、細胞内で、例えば異なる遺伝子などの標的核酸が切断される場合、Ｃａｓ９タンパク質は、異なる細菌種に由来してもよい。例えば、細胞内の１つまたは複数の遺伝子は、１つの細菌種に由来するＣａｓ９タンパク質による切断によって改変されてもよく、同一細胞内の１つまたは複数の遺伝子は、異なる細菌種に由来するＣａｓ９タンパク質による切断によって改変されてもよい。異なる生物種に由来する２つ以上のＣａｓ９タンパク質が使用される場合、それらが、同時送達されまたは順次送達されて、標的核酸の所望の位置における所望の遺伝子中の切断特異性が制御されてもよいことが検討される。
【００５５】
いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインおよび第２のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、対向する標的鎖核酸分子と相補的である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、ＰＡＭが外側を向くように構成される。
【００５６】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、標的ドメインの例えばＡｌｕ反復などの反復要素などの望まれない標的染色体要素を回避するように設計される。ｇＲＮＡ分子は、第１、第２、第３および／または第４のｇＲＮＡ分子であってもよい。
【００５７】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、ヌクレオチドが改変されないように、例えば、コード領域のヌクレオチドなどのあらかじめ選択されたヌクレオチドから十分遠くに、切断事象を配置させるように設計される。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、イントロン／エクソン境界または天然スプライスシグナルから十分遠くに、イントロン切断事象を配置させて、エクソン配列改変または望まれないスプライシング事象を回避するように設計される。ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるように、第１、第２、第３および／または第４のｇＲＮＡ分子であってもよい。
【００５８】
その他の実施形態では、例えば、ノックアウトのために、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の例えば初期コード領域などのコード領域中の位置が標的化される。一実施形態では、標的化ドメインは、表１Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表５Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１３Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１７Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２のいずれか１つからの標的化ドメイン配列と同一のまたは１、２、３、４、または５ヌクレオチド以下異なる配列を含んでなる。
【００５９】
一実施形態では、標的化ドメインは、表１Ａ〜Ｉのものから選択される。その他の実施形態では、標的化ドメインは、次のとおりである。
【化１】
2020062029.tif 000002
【００６０】
一実施形態では、標的化ドメインは、表３Ａ〜Ｈのものから選択される。その他の実施形態では、標的化ドメインは、次のとおりである。
【化２】
2020062029.tif 000003
【００６１】
一実施形態では、標的化ドメインは、表５Ａ〜Ｉのものから選択される。その他の実施形態では、標的化ドメインは、次のとおりである。
【化３】
2020062029.tif 000004
【００６２】
一実施形態では、標的化ドメインは、表７Ａ〜Ｈのものから選択される。その他の実施形態では、標的化ドメインは、次のとおりである。
【化４】
2020062029.tif 000005
【００６３】
一実施形態では、標的化ドメインは、表９Ａ〜Ｉのものから選択される。その他の実施形態では、標的化ドメインは、次のとおりである。
【化５】
2020062029.tif 000006
【００６４】
一実施形態では、標的化ドメインは、表１１Ａ〜Ｉのものから選択される。その他の実施形態では、標的化ドメインは、次のとおりである。
【化６】
2020062029.tif 000007
【００６５】
一実施形態では、Ｔ細胞標的ノックアウト位置が、例えば、初期コード領域などのＦＡＳコード領域であり、２つ以上のｇＲＮＡを使用して、例えば、２つの一本鎖切断または２つの二本鎖切断、または一本鎖および二本鎖切断の組み合わせなどの切断が配置されて、例えば、標的核酸配列中に１つまたは複数のインデルが生成する場合、各ガイドＲＮＡは、表１Ａ〜Ｆまたは表１３Ａ〜Ｋの１つから独立して選択される。
【００６６】
一実施形態では、Ｔ細胞標的ノックアウト位置が、例えば、初期コード領域などのＢＩＤコード領域であり、２つ以上のｇＲＮＡを使用して、例えば、２つの一本鎖切断または２つの二本鎖切断、または一本鎖および二本鎖切断の組み合わせなどの切断が配置されて、例えば、標的核酸配列中に１つまたは複数のインデルが生成する場合、各ガイドＲＮＡは、表３Ａ〜Ｈまたは表１５Ａ〜Ｋの１つから独立して選択される。
【００６７】
一実施形態では、Ｔ細胞標的ノックアウト位置が、例えば、初期コード領域などのＣＴＬＡ４コード領域であり、２つ以上のｇＲＮＡを使用して、例えば、２つの一本鎖切断または２つの二本鎖切断、または一本鎖および二本鎖切断の組み合わせなどの切断が配置されて、例えば、標的核酸配列中に１つまたは複数のインデルが生成する場合、各ガイドＲＮＡは、表５Ａ〜Ｉまたは表１７Ａ〜Ｋの１つから独立して選択される。
【００６８】
一実施形態では、Ｔ細胞標的ノックアウト位置が、例えば、初期コード領域などのＰＤＣＤ１コード領域であり、２つ以上のｇＲＮＡを使用して、例えば、２つの一本鎖切断または２つの二本鎖切断、または一本鎖および二本鎖切断の組み合わせなどの切断が配置されて、例えば、標的核酸配列中に１つまたは複数のインデルが生成する場合、各ガイドＲＮＡは、表７Ａ〜Ｈ、表１９Ａ〜Ｊまたは表３１または表３２の１つから独立して選択される。
【００６９】
その他の実施形態では、標的化ドメインは、次のとおりである。
【化７】
2020062029.tif 000008
【化８】
2020062029.tif 000009
【化９】
2020062029.tif 000010
【００７０】
さらに、別の実施形態では、Ｔ細胞標的ノックアウト位置が、例えば、初期コード領域などのＰＤＣＤ１コード領域であり、標的核酸配列中に、例えば１つまたは複数のインデルが生じる場合、切断が１０％を超える効率で生成するように、各ガイドＲＮＡは、表７Ａ〜Ｈ、表１９Ａ〜Ｊ、表３１または表３２の１つから独立して選択される。
【００７１】
一実施形態では、標的化ドメインは、次のとおりである。
【化１０】
2020062029.tif 000011
【００７２】
一実施形態では、Ｔ細胞標的ノックアウト位置が、例えば、初期コード領域などのＣＢＬＢコード領域であり、２つ以上のｇＲＮＡを使用して、例えば、２つの一本鎖切断または２つの二本鎖切断、または一本鎖および二本鎖切断の組み合わせなどの切断が配置されて、例えば、標的核酸配列中に１つまたは複数のインデルが生成する場合、各ガイドＲＮＡは、表９Ａ〜Ｉまたは表２１Ａ〜Ｋの１つから独立して選択される。
【００７３】
一実施形態では、Ｔ細胞標的ノックアウト位置が、例えば、初期コード領域などのＰＴＰＮ６コード領域であり、２つ以上のｇＲＮＡを使用して、例えば、２つの一本鎖切断または２つの二本鎖切断、または一本鎖および二本鎖切断の組み合わせなどの切断が配置されて、例えば、標的核酸配列中に１つまたは複数のインデルが生成する場合、各ガイドＲＮＡは、表１１Ａ〜Ｉまたは表２３Ａ〜Ｊの１つから独立して選択される。
【００７４】
一実施形態では、Ｔ細胞標的ノックアウト位置が、例えば、初期コード領域などのＴＲＡＣコード領域であり、２つ以上のｇＲＮＡを使用して、例えば、２つの一本鎖切断または２つの二本鎖切断、または一本鎖および二本鎖切断の組み合わせなどの切断が配置されて、例えば、標的核酸配列中に１つまたは複数のインデルが生成する場合、各ガイドＲＮＡは、表２５Ａ〜Ｇまたは表２９の１つから独立して選択される。
【００７５】
その他の実施形態では、標的化ドメインは、次のとおりである。
【化１１】
2020062029.tif 000012
【００７６】
別の実施形態では、Ｔ細胞標的ノックアウト位置が、例えば、初期コード領域などのＴＲＡＣコード領域であり、１つ以上のｇＲＮＡを使用して、例えば、２つの一本鎖切断または２つの二本鎖切断、または一本鎖および二本鎖切断の組み合わせなどの切断が配置されて、例えば、標的核酸配列中に１つまたは複数のインデルが生成する場合、切断が１０％を超える効率で生成するように、各ガイドＲＮＡは、表２５Ａ〜Ｇまたは表２９の１つから独立して選択される。
【００７７】
一実施形態では、標的化ドメインは、次のとおりである。
【化１２】
2020062029.tif 000013
【００７８】
一実施形態では、Ｔ細胞標的ノックアウト位置が、例えば、初期コード領域などのＴＲＢＣコード領域であり、２つ以上のｇＲＮＡを使用して、例えば、２つの一本鎖切断または２つの二本鎖切断、または一本鎖および二本鎖切断の組み合わせなどの切断が配置されて、例えば、標的核酸配列中に１つまたは複数のインデルが生成する場合、各ガイドＲＮＡは、表２６Ａ〜Ｇまたは表２７の１つから独立して選択される。
【００７９】
その他の実施形態では、標的化ドメインは、次のとおりである。
【化１３】
2020062029.tif 000014
【化１４】
2020062029.tif 000015
【化１５】
2020062029.tif 000016
【００８０】
一実施形態では、Ｔ細胞標的ノックアウト位置が、例えば、初期コード領域などのＴＲＢＣコード領域であり、１つ以上のｇＲＮＡを使用して、例えば、２つの一本鎖切断または２つの二本鎖切断、または一本鎖および二本鎖切断の組み合わせなどの切断が配置されて、例えば、標的核酸配列中に１つまたは複数のインデルが生成する場合、切断が１０％を超える効率で生成するように、各ガイドＲＮＡは、表２６Ａ〜Ｇまたは表２７の１つから独立して選択される。
【００８１】
一実施形態では、標的化ドメインは、次のとおりである。
【化１６】
2020062029.tif 000017
【００８２】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、Ｔ細胞ノックダウン標的位置に十分に近い、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質（例えば、転写リプレッサードメインに融合されたｅｉＣａｓ９）を標的化するように設計されて、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の発現を低下、低減または抑制する。一実施形態では、標的化ドメインは、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子のプロモーター領域を標的化するように設計されて、転写開始（ｉｎｉｔａｔｉｏｎ）、１つまたは複数の転写エンハンサーまたはアクチベーター、および／またはＲＮＡポリメラーゼの結合を妨げる。１つまたは複数のｇＲＮＡを使用して、ｅｉＣａｓ９が、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子のプロモーター領域に標的化されもよい。
【００８３】
一実施形態では、例えばノックダウンのために、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６プロモーター領域が標的化される場合、標的化ドメインは、表２Ａ〜Ｉ、表４Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表８Ａ〜Ｈ、表１０Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉ、表１４Ａ〜Ｋ、表１６Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表２０Ａ〜Ｊ、表２２Ａ〜Ｋ、または表２４Ａ〜Ｋのいずれか１つからの標的化ドメイン配列と同一のまたは１、２、３、４、または５ヌクレオチド以下異なる配列を含んでなり得る。一実施形態では、標的化ドメインは、表２Ａ〜Ｉのものから選択される。その他の実施形態では、標的化ドメインは、次のとおりである。
【化１７】
2020062029.tif 000018
【化１８】
2020062029.tif 000019
【００８４】
一実施形態では、標的化ドメインは、表４Ａ〜Ｉのものから選択される。その他の実施形態では、標的化ドメインは、次のとおりである。
【化１９】
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【化２０】
2020062029.tif 000021
【００８５】
一実施形態では、標的化ドメインは、表６Ａ〜Ｉのものから選択される。その他の実施形態では、標的化ドメインは、次のとおりである。
【化２１】
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【００８６】
一実施形態では、標的化ドメインは、表８Ａ〜Ｈのものから選択される。その他の実施形態では、標的化ドメインは、次のとおりである。
【化２２】
2020062029.tif 000023
【００８７】
一実施形態では、標的化ドメインは、表１０Ａ〜Ｉのものから選択される。その他の実施形態では、標的化ドメインは、次のとおりである。
【化２３】
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【００８８】
一実施形態では、標的化ドメインは、表１２Ａ〜Ｉのものから選択される。その他の実施形態では、標的化ドメインは、次のとおりである。
【化２４】
2020062029.tif 000025
【００８９】
一実施形態では、Ｔ細胞標的化ノックダウン位置がＦＡＳプロモーター領域であり、２つ以上のｇＲＮＡを使用して、ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質（例えば、ｅｉＣａｓ９転写リプレッサードメイン融合タンパク質）が標的核酸配列中に配置される場合、各ガイドＲＮＡは、表２Ａ〜Ｉまたは表１４Ａ〜Ｋの１つから独立して選択される。
【００９０】
一実施形態では、Ｔ細胞標的化ノックダウン位置がＢＩＤプロモーター領域であり、２つ以上のｇＲＮＡを使用して、ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質（例えば、ｅｉＣａｓ９転写リプレッサードメイン融合タンパク質）が標的核酸配列中に配置される場合、各ガイドＲＮＡは、表４Ａ〜Ｉまたは表１６Ａ〜Ｋの１つから独立して選択される。
【００９１】
一実施形態では、Ｔ細胞標的化ノックダウン位置がＣＴＬＡ４プロモーター領域であり、２つ以上のｇＲＮＡを使用して、ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質（例えば、ｅｉＣａｓ９転写リプレッサードメイン融合タンパク質）が標的核酸配列中に配置される場合、各ガイドＲＮＡは、表６Ａ〜Ｉまたは表１８Ａ〜Ｋの１つから独立して選択される。
【００９２】
一実施形態では、Ｔ細胞標的化ノックダウン位置がＰＤＣＤ１プロモーター領域であり、２つ以上のｇＲＮＡを使用して、ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質（例えば、ｅｉＣａｓ９転写リプレッサードメイン融合タンパク質）が標的核酸配列中に配置される場合、各ガイドＲＮＡは、表８Ａ〜Ｈまたは表２０Ａ〜Ｊの１つから独立して選択される。
【００９３】
一実施形態では、Ｔ細胞標的化ノックダウン位置がＣＢＬＢプロモーター領域であり、２つ以上のｇＲＮＡを使用して、ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質（例えば、ｅｉＣａｓ９転写リプレッサードメイン融合タンパク質）が標的核酸配列中に配置される場合、各ガイドＲＮＡは、表１０Ａ〜Ｉまたは表２２Ａ〜Ｋの１つから独立して選択される。
【００９４】
一実施形態では、Ｔ細胞標的化ノックダウン位置がＰＴＰＤ６プロモーター領域であり、２つ以上のｇＲＮＡを使用して、ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質（例えば、ｅｉＣａｓ９転写リプレッサードメイン融合タンパク質）が標的核酸配列中に配置される場合、各ガイドＲＮＡは、表１２Ａ〜Ｉまたは表２４Ａ〜Ｋの１つから独立して選択される。
【００９５】
一実施形態では、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子と相補的な標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡなどのｇＲＮＡは、モジュラーｇＲＮＡである。その他の実施形態では、ｇＲＮＡは、単分子またはキメラｇＲＮＡである。
【００９６】
一実施形態では、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子と相補的な標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長以上を含んでなる。一実施形態では、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子に由来する標的ドメインと相補的な標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長以上である。一実施形態では、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。本明細書に記載されるようなｇＲＮＡは、５’から３’方向に、標的化ドメイン（「コアドメイン」、および任意選択的に「二次ドメイン」を含んでなる）；第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、隣接ドメインおよびテールドメインは、合わせて単一ドメインとされる。
【００９７】
一実施形態では、標的化ドメインは、１６ヌクレオチドを含んでなる。
【００９８】
一実施形態では、標的化ドメインは、１７ヌクレオチドを含んでなる。
【００９９】
一実施形態では、標的化ドメインは、１８ヌクレオチドを含んでなる。
【０１００】
一実施形態では、標的化ドメインは、１９ヌクレオチドを含んでなる。
【０１０１】
一実施形態では、標的化ドメインは、２０ヌクレオチドを含んでなる。
【０１０２】
一実施形態では、標的化ドメインは、２１ヌクレオチドを含んでなる。
【０１０３】
一実施形態では、標的化ドメインは、２２ヌクレオチドを含んでなる。
【０１０４】
一実施形態では、標的化ドメインは、２３ヌクレオチドを含んでなる。
【０１０５】
一実施形態では、標的化ドメインは、２４ヌクレオチドを含んでなる。
【０１０６】
一実施形態では、標的化ドメインは、２５ヌクレオチドを含んでなる。
【０１０７】
一実施形態では、標的化ドメインは、２６ヌクレオチドを含んでなる。
【０１０８】
本明細書に記載されるようなｇＲＮＡは、５’から３’方向に、標的化ドメイン（「コアドメイン」、および任意選択的に「二次ドメイン」を含んでなる）；第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメイン含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、隣接ドメインおよびテールドメインは、合わせて単一ドメインとされる。
【０１０９】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長以上の標的化ドメインを含んでなる。
【０１１０】
別の実施形態では、ｇＲＮＡは、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；合わせると少なくとも３０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長以上の標的化ドメインを含んでなる。
【０１１１】
別の実施形態では、ｇＲＮＡは、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；合わせると少なくとも３５ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長以上の標的化ドメインを含んでなる。
【０１１２】
別の実施形態では、ｇＲＮＡは、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；合わせると少なくとも４０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長以上の標的化ドメインを含んでなる。
【０１１３】
例えば、二本鎖または一本鎖切断などの切断事象は、Ｃａｓ９分子によって生じる。Ｃａｓ９分子は、例えば、標的核酸中に二本鎖切断を形成するｅａＣａｓ９分子、または標的核酸中に一本鎖切断を形成するｅａＣａｓ９分子などの酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）分子（例えば、ニッカーゼ分子）であってもよい。代案としては、いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）分子であってもよく、または例えば、Ｋｒｕｅｐｐｅｌ結合ボックス（ＫＲＡＢ）に融合されてｅｉＣａｓ９−ＫＲＡＢ融合タンパク質分子を生じるｅｉＣａｓ９分子などの修飾ｅｉＣａｓ９分子であってもよい。
【０１１４】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、二本鎖切断を触媒する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、ＨＮＨ様領域切断活性を含んでなるが、Ｎ末端ＲｕｖＣ様領域切断活性はほぼ皆無である。この場合、ｅａＣａｓ９分子はＨＮＨ様ドメインニッカーゼであり、例えば、ｅａＣａｓ９分子はＤ１０に、例えばＤ１０Ａなどの変異を含んでなる。その他の実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様領域切断活性を含んでなるが、ＨＮＨ様領域切断活性はほぼ皆無である。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子はＮ末端ＲｕｖＣ様領域ニッカーゼであり、例えば、ｅａＣａｓ９分子はＨ８４０に、例えばＨ８４０Ａなどの変異を含んでなる。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子はＮ末端ＲｕｖＣ様領域ニッカーゼであり、例えば、ｅａＣａｓ９分子はＮ８６３に、例えばＮ８６３Ａなどの変異を含んでなる。
【０１１６】
一実施形態では、一本鎖切断は、ｇＲＮＡの標的化ドメインがそれに対して相補的である、標的核酸鎖中に形成される。別の実施形態では、一本鎖切断は、ｇＲＮＡの標的化ドメインがそれに対して相補的である鎖以外の標的核酸鎖中に形成される。
【０１１７】
別の態様では、本明細書で開示されるのは、本明細書で開示されるように、（ａ）例えばＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置などの標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含んでなる、ｇＲＮＡ分子をコードする配列を含んでなるＤＮＡなどの例えば、単離または非天然核酸核酸である。
【０１１８】
一実施形態では、核酸は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置に十分に近い二本鎖切断または一本鎖切断などの切断事象を提供するように構成された標的化ドメインを含んでなる、第１のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡ分子をコードして、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置のＮＨＥＪに関連する改変などの改変をそれぞれ可能にする。
【０１１９】
一実施形態では、核酸は、例えば、Ｔ細胞ノックダウン標的位置に十分近い、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質（例えば、転写抑制領域に融合されたｅｉＣａｓ９）を標的化するように設計された標的化ドメインを含んでなる、第１のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡ分子をコードして、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の発現を低下、低減または抑制する。
【０１２０】
一実施形態では、核酸は、例えば、表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉ、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２のいずれか１つからの標的化ドメイン配列と同一のまたは１、２、３、４、または５ヌクレオチド以下異なる配列を含んでなる、標的化ドメインを含んでなる第１のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡ分子をコードする。一実施形態では、核酸は、表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉ、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２のものから選択される標的化ドメインを含んでなる、ｇＲＮＡ分子をコードする。
【０１２１】
一実施形態では、核酸は、モジュラーｇＲＮＡをコードして、例えば、１つまたは複数の核酸が、モジュラーｇＲＮＡをコードする。その他の実施形態では、核酸は、キメラｇＲＮＡをコードする。核酸は、例えば、１６ヌクレオチド長以上を含んでなる標的化ドメインを含んでなる、第１のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡをコードしてもよい。核酸は、例えば、１６ヌクレオチド長以上を含んでなる標的化ドメインを含んでなる、第１のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡをコードしてもよい。一実施形態では、核酸は、例えば、１７ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第１のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡをコードする。その他の実施形態では、核酸は、例えば、１８ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第１のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡをコードする。なおもその他の実施形態では、核酸は、例えば、１９ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第１のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡをコードする。なおもその他の実施形態では、核酸は、例えば、２０ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第１のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡをコードする。なおもその他の実施形態では、核酸は、例えば、２１ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第１のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡをコードする。なおもその他の実施形態では、核酸は、例えば、２２ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第１のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡをコードする。なおもその他の実施形態では、核酸は、例えば、２３ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第１のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡをコードする。なおもその他の実施形態では、核酸は、例えば、２４ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第１のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡをコードする。なおもその他の実施形態では、核酸は、例えば、２５ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第１のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡをコードする。なおもその他の実施形態では、核酸は、例えば、２６ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第１のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡをコードする。
【０１２２】
一実施形態では、核酸は、５’から３’方向に、標的化ドメイン（「コアドメイン」、および任意選択的に「二次ドメイン」を含んでなる）；第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含んでなるｇＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、隣接ドメインおよびテールドメインは、合わせて単一ドメインとされる。
【０１２３】
一実施形態では、核酸は、例えば、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長以上の標的化ドメインを含んでなる第１のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡをコードする。
【０１２４】
一実施形態では、核酸は、例えば、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；合わせると少なくとも３０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長以上の標的化ドメインを含んでなる第１のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡをコードする。
【０１２５】
一実施形態では、核酸は、例えば、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；合わせると少なくとも３５ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長以上の標的化ドメインを含んでなる第１のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡをコードする。
【０１２６】
一実施形態では、例えば第１のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡをコードする核酸は、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；合わせると少なくとも４０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長以上の標的化ドメインを含んでなる。
【０１２７】
一実施形態では、核酸は、（ａ）例えば、本明細書で開示されるように、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含んでなる、第１のｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡ分子をコードする配列を含んでなり、（ｂ）Ｃａｓ９分子をコードする配列をさらに含んでなる。
【０１２８】
一実施形態では、核酸は、支配ｇＲＮＡ分子をコードする配列をさらに含んでなる。
【０１２９】
Ｃａｓ９分子は、例えば、標的核酸中に二本鎖切断を形成するｅａＣａｓ９分子または標的核酸中に一本鎖切断を形成するｅａＣａｓ９分子などの酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）分子（例えば、ニッカーゼ分子）であってもよい。代案としては、いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）分子であってもよく、または例えば、Ｋｒｕｅｐｐｅｌ結合ボックス（ＫＲＡＢ）に融合されてｅｉＣａｓ９−ＫＲＡＢ融合タンパク質分子を生じるｅｉＣａｓ９分子などの修飾ｅｉＣａｓ９分子であってもよい。
【０１３０】
本明細書で開示される核酸は、（ａ）本明細書で開示されるように、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含んでなる、ｇＲＮＡ分子をコードする配列；（ｂ）Ｃａｓ９分子をコードする配列を含んでなってもよく、（ｃ）（ｉ）ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の第２の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを有する、本明細書に記載される、第２のｇＲＮＡ分子をコードする配列、および任意選択的に、（ｉｉ）ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の第３の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを有する本明細書に記載される、第３のｇＲＮＡ分子をコードする配列；および任意選択的に、（ｉｉｉ）ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の第４の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを有する本明細書に記載される、第４のｇＲＮＡ分子をコードする配列をさらに含んでなる。
【０１３１】
一実施形態では、第２のｇＲＮＡ分子をコードする核酸は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置に十分に近い二本鎖切断または一本鎖切断などの切断事象を提供するように構成された標的化ドメインを含んでなり、単独でまたは第１のｇＲＮＡ分子によって配置された切断との組み合わせで、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置のＮＨＥＪに関連する改変などの改変を可能にする。
【０１３２】
一実施形態では、核酸は、Ｔ細胞ノックダウン標的位置に十分近い、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質（例えば、転写抑制領域に融合されたｅｉＣａｓ９）を標的化するように設計された標的化ドメインを含んでなる第２のｇＲＮＡ分子をコードして、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の発現を低下、低減または抑制する。
【０１３３】
一実施形態では、第３のｇＲＮＡ分子をコードする核酸は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置に十分に近い二本鎖切断または一本鎖切断などの切断事象を提供するように構成された標的化ドメインを含んでなり、単独でまたは第１および／または第２のｇＲＮＡ分子によって配置された切断との組み合わせで、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置のＮＨＥＪに関連する改変などの改変を可能にする。
【０１３４】
一実施形態では、核酸は、Ｔ細胞ノックダウン標的位置に十分近い、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質（例えば、転写抑制領域に融合されたｅｉＣａｓ９）を標的化するように設計された標的化ドメインを含んでなる第３のｇＲＮＡ分子をコードして、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の発現を低下、低減または抑制する。
【０１３５】
一実施形態では、第４のｇＲＮＡ分子をコードする核酸は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置に十分に近い二本鎖切断または一本鎖切断などの切断事象を提供するように構成された標的化ドメインを含んでなり、単独でまたは第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、および第３のｇＲＮＡ分子によって配置された切断との組み合わせで、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置のＮＨＥＪに関連する改変などの改変を可能にする。
【０１３６】
一実施形態では、核酸は、Ｔ細胞ノックダウン標的位置に十分近い、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質（例えば、転写抑制領域に融合されたｅｉＣａｓ９）を標的化するように設計された標的化ドメインを含んでなる第４のｇＲＮＡ分子をコードして、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の発現を低下、低減または抑制する。
【０１３７】
一実施形態では、核酸は、第２のｇＲＮＡ分子をコードする。第２のｇＲＮＡは、第１のｇＲＮＡ分子と同じＴ細胞標的位置を標的化するように選択される。任意選択的に、核酸は第３のｇＲＮＡをコードしてもよく、さらに任意選択的に、核酸は第４のｇＲＮＡ分子をコードしてもよい。一実施形態では、第３のｇＲＮＡ分子および第４のｇＲＮＡ分子は、第１および第２のｇＲＮＡ分子と同じＴ細胞標的位置を標的化するように選択される。
【０１３８】
一実施形態では、核酸は、表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉ、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、または表２６Ａ〜Ｇ表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２の１つからの標的化ドメイン配列と同一のまたは１、２、３、４、または５ヌクレオチド以下異なる配列を含んでなる、標的化ドメインを含んでなる第２のｇＲＮＡ分子をコードする。一実施形態では、核酸は、表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉ、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、または表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２のものから選択される、標的化ドメインを含んでなる第２のｇＲＮＡ分子をコードする。一実施形態では、第３または第４のｇＲＮＡ分子が存在する場合、第３および第４のｇＲＮＡ分子は、表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉ、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２の１つから独立して選択される標的化ドメイン配列と同一のまたは１、２、３、４、または５ヌクレオチド以下異なる配列を含んでなる、標的化ドメインを含んでなってもよい。さらなる実施形態では、第３または第４のｇＲＮＡ分子が存在する場合、第３および第４のｇＲＮＡ分子は、表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉ、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２のものから独立して選択される、標的化ドメインを含んでなってもよい。
【０１３９】
一実施形態では、核酸はモジュラーｇＲＮＡである第２のｇＲＮＡをコードし、例えば、１つまたは複数の核酸分子がモジュラーｇＲＮＡをコードする。その他の実施形態では、核酸はキメラｇＲＮＡである第２のｇＲＮＡをコードする。その他の実施形態では、核酸が第３または第４のｇＲＮＡをコードする場合、第３および第４のｇＲＮＡはモジュラーｇＲＮＡまたはキメラｇＲＮＡであってもよい。複数のｇＲＮＡが使用される場合、モジュラーまたはキメラｇＲＮＡの任意の組み合わせが使用されてもよい。
【０１４０】
核酸は、１６ヌクレオチド長以上を含んでなる標的化ドメインを含んでなる第２、第３、および／または第４のｇＲＮＡをコードしてもよい。一実施形態では、核酸は、１６ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第２のｇＲＮＡをコードする。一実施形態では、核酸は、１７ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第２のｇＲＮＡをコードする。その他の実施形態では、核酸は、１８ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第２のｇＲＮＡをコードする。なおもその他の実施形態では、核酸は、１９ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第２のｇＲＮＡをコードする。なおもその他の実施形態では、核酸は、２０ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第２のｇＲＮＡをコードする。なおもその他の実施形態では、核酸は、２１ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第２のｇＲＮＡをコードする。なおもその他の実施形態では、核酸は、２２ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第２のｇＲＮＡをコードする。なおもその他の実施形態では、核酸は、２３ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第２のｇＲＮＡをコードする。なおもその他の実施形態では、核酸は、２４ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第２のｇＲＮＡをコードする。なおもその他の実施形態では、核酸は、２５ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第２のｇＲＮＡをコードする。なおもその他の実施形態では、核酸は、２６ヌクレオチド長の標的化ドメインを含んでなる第２のｇＲＮＡをコードする。
【０１４１】
一実施形態では、標的化ドメインは、１６ヌクレオチドを含んでなる。
【０１４２】
一実施形態では、標的化ドメインは、１７ヌクレオチドを含んでなる。
【０１４３】
一実施形態では、標的化ドメインは、１８ヌクレオチドを含んでなる。
【０１４４】
一実施形態では、標的化ドメインは、１９ヌクレオチドを含んでなる。
【０１４５】
一実施形態では、標的化ドメインは、２０ヌクレオチドを含んでなる。
【０１４６】
一実施形態では、標的化ドメインは、２１ヌクレオチドを含んでなる。
【０１４７】
一実施形態では、標的化ドメインは、２２ヌクレオチドを含んでなる。
【０１４８】
一実施形態では、標的化ドメインは、２３ヌクレオチドを含んでなる。
【０１４９】
一実施形態では、標的化ドメインは、２４ヌクレオチドを含んでなる。
【０１５０】
一実施形態では、標的化ドメインは、２５ヌクレオチドを含んでなる。
【０１５１】
一実施形態では、標的化ドメインは、２６ヌクレオチドを含んでなる。
【０１５２】
一実施形態では、核酸は、５’から３’方向に、標的化ドメイン（「コアドメイン」、および任意選択的に「二次ドメイン」を含んでなる）；第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含んでなる、第２、第３、および／または第４のｇＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、隣接ドメインおよびテールドメインは、合わせて単一ドメインとされる。
【０１５３】
一実施形態では、核酸は、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；合わせると少なくとも２０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長以上の標的化ドメインを含んでなる、第２、第３、および／または第４のｇＲＮＡをコードする。
【０１５４】
一実施形態では、核酸は、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；合わせると少なくとも３０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長以上の標的化ドメインを含んでなる、第２、第３、および／または第４のｇＲＮＡをコードする。
【０１５５】
一実施形態では、核酸は、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；合わせると少なくとも３５ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長以上の標的化ドメインを含んでなる、第２、第３、および／または第４のｇＲＮＡをコードする。
【０１５６】
一実施形態では、核酸は、２５ヌクレオチド長以下の連結ドメイン；合わせると少なくとも４０ヌクレオチド長の隣接およびテールドメイン；および１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長以上の標的化ドメインを含んでなる、第２、第３、および／または第４のｇＲＮＡをコードする。
【０１５７】
上述されるように、核酸は、（ａ）ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含んでなる、ｇＲＮＡ分子をコードする配列、および（ｂ）Ｃａｓ９分子をコードする配列を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、（ａ）および（ｂ）は、例えば同一ベクター、例えば同一ウイルスベクター、例えば同一アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどの同一核酸分子上に存在する。一実施形態では、核酸分子はＡＡＶベクターである。記載される組成物および方法のいずれかで使用されてもよい代表的ＡＡＶベクターとしては、ＡＡＶ１ベクター、修飾ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、修飾ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、修飾ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、修飾ＡＡＶ５ベクター、修飾ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ６ベクター、修飾ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、修飾ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ１０ベクター、修飾ＡＡＶ．ｒｈ１０ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３ベクター、修飾ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ４３ベクター、修飾ＡＡＶ．ｒｈ４３ベクター、ａＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１ベクター、および修飾ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１ベクターが挙げられる。その他の実施形態では、（ａ）は、例えば第１のベクター、例えば第１のウイルスベクター、例えば第１のＡＡＶベクターなどの第１の核酸分子上に存在し；（ｂ）は、例えば第２のベクター、例えば第２のベクター、例えば第２のＡＡＶベクターなどの第２の核酸分子上に存在する。第１および第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよい。
【０１５８】
その他の実施形態では、核酸は、（ｃ）（ｉ）本明細書に記載されるような第２のｇＲＮＡ分子をコードする配列をさらに含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、核酸は、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）（ｉ）を含んでなる。（ａ）および（ｃ）（ｉ）のそれぞれは、例えば同一ベクター、例えば同一ウイルスベクター、例えば同一アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどの同一核酸分子上に存在してもよい。一実施形態では、核酸分子はＡＡＶベクターである。
【０１５９】
その他の実施形態では、（ａ）および（ｃ）（ｉ）は、異なるベクター上にある。例えば（ａ）は、例えば第１のベクター、例えば第１のウイルスベクター、例えば第１のＡＡＶベクターなどの第１の核酸分子上に存在してもよく；（ｃ）（ｉ）は、例えば第２のベクター、例えば第２のベクター、例えば第２のＡＡＶベクターなどの第２の核酸分子上に存在してもよい。一実施形態では、第１および第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターである。
【０１６０】
別の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）（ｉ）のそれぞれは、例えば同一ベクター、例えば同一ウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターなどの同一核酸分子上に存在する。一実施形態では、核酸分子はＡＡＶベクターである。交互の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）実施形態では、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）（ｉ）の１つは、例えば第１のベクター、例えば第１のウイルスベクター、例えば第１のＡＡＶベクターなどの第１の核酸分子上でコードされ；（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）（ｉ）の２つめおよび３つめは、例えば第２のベクター、例えば第２のベクター、例えば第２のＡＡＶベクターなどの第２の核酸分子上でコードされる。第１および第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよい。
【０１６１】
一実施形態では、（ａ）は、例えば第１のベクター、例えば第１のウイルスベクター、第１のＡＡＶベクターなどの第１の核酸分子上に存在し；（ｂ）および（ｃ）（ｉ）は、例えば第２のベクター、例えば第２のベクター、例えば第２のＡＡＶベクターなどの第２の核酸分子上に存在する。第１および第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよい。
【０１６２】
その他の実施形態では、（ｂ）は、例えば第１のベクター、例えば第１のウイルスベクター、例えば第１のＡＡＶベクターなどの第１の核酸分子上に存在し；（ａ）および（ｃ）（ｉ）は、例えば第２のベクター、例えば第２のベクター、例えば第２のＡＡＶベクターなどの第２の核酸分子上に存在する。第１および第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよい。
【０１６３】
その他の実施形態では、（ｃ）（ｉ）は、例えば第１のベクター、例えば第１のウイルスベクター、例えば第１のＡＡＶベクターなどの第１の核酸分子上に存在し；（ｂ）および（ａ）は、例えば第２のベクター、例えば第２のベクター、例えば第２のＡＡＶベクターなどの第２の核酸分子上に存在する。第１および第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよい。
【０１６４】
別の実施形態では、のそれぞれ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）（ｉ）は、例えは異なるベクター、例えば異なるウイルスベクター、例えば異なるＡＡＶベクターなどの異なる核酸分子上に存在する。例えば、（ａ）は第１の核酸分子上に、（ｂ）は第２の核酸分子上に、（ｃ）（ｉ）は第３の核酸分子上にあってもよい。第１、第２、および第３の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよい。
【０１６５】
別の実施形態では、第３および／または第４のｇＲＮＡ分子が存在する場合、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）、および（ｃ）（ｉｉｉ）のそれぞれは、例えば同一ベクター、例えば同一ウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターなどの同一核酸分子上に存在してもよい。一実施形態では、核酸分子はＡＡＶベクターである。交互の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）、および（ｃ）（ｉｉｉ）のそれぞれは、例えば異なるベクター、例えば異なるウイルスベクター、例えば異なるＡＡＶベクターなどの異なる核酸分子上に存在してもよい。さらなる実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）、および（ｃ）（ｉｉｉ）のそれぞれは、例えば、ＡＡＶベクターなどの２つ以上の核酸分子であるが、５つ未満の核酸分子上に存在してもよい。
【０１６６】
本明細書に記載される核酸は、例えば、本明細書に記載されるプロモーターなどの（ａ）のｇＲＮＡ分子をコードする配列と作動可能に連結するプロモーターを含んでなってもよい。核酸は、例えば、本明細書に記載されるプロモーターなどの（ｃ）の第２、第３および／または第４のｇＲＮＡ分子をコードする配列と作動可能に連結する第２のプロモーターをさらに含んでなってもよい。プロモーターおよび第２のプロモーターは、互いに異なる。いくつかの実施形態では、プロモーターおよび第２のプロモーターは同一である。
【０１６７】
本明細書に記載される核酸は、例えば、本明細書に記載されるプロモーターなどの（ｂ）のＣａｓ９分子をコードする配列と作動可能に連結するプロモーターをさらに含んでなってもよい。
【０１６８】
別の態様では、本明細書で開示されるのは、本明細書に記載されるように、（ａ）ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含んでなる、ｇＲＮＡ分子を含んでなる組成物である。（ａ）の組成物は、例えば、本明細書に記載されるようなＣａｓ９分子などの（ｂ）Ｃａｓ９分子をさらに含んでなってもよい。（ａ）および（ｂ）の組成物は、例えば、本明細書に記載される第２、第３および／または第４のｇＲＮＡ分子などの（ｃ）第２、第３および／または第４のｇＲＮＡ分子をさらに含んでなってもよい。一実施形態では、組成物は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の２つ以上を標的化する少なくとも２つのｇＲＮＡ分子を含んでなってもよい。一実施形態では、組成物は、支配ｇＲＮＡ分子、または支配ｇＲＮＡ分子をコードする核酸をさらに含んでなる。
【０１６９】
別の態様では、本明細書で開示されるのは、細胞を（ａ）例えば本明細書に記載されるようなｇＲＮＡなどのＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ；（ｂ）例えば本明細書に記載されるようなＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子；および任意選択的に、（ｃ）例えば本明細書に記載されるようなｇＲＮＡなどのＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子を標的化する第２、第３および／または第４のｇＲＮＡに接触させるステップを含んでなる、例えば細胞標的核酸の構造を改変し、例えば配列を改変するなどの細胞を改変する方法である。一実施形態では、方法は、細胞内に、支配ｇＲＮＡ分子、または支配ｇＲＮＡ分子をコードする核酸を細胞内に導入するステップをさらに含んでなる。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞を（ａ）および（ｂ）に接触させるステップを含んでなる。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞を（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）に接触させるステップを含んでなる。
【０１７２】
（ａ）および任意選択的に（ｃ）のｇＲＮＡは、表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉ、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２のいずれかから独立して選択されてもよく、または表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉ、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２のいずれかから独立して選択される標的化ドメイン配列と１、２、３、４、または５ヌクレオチド以下異なるｇＲＮＡから独立して選択されてもよい。
【０１７３】
一実施形態では、例えば細胞の標的核酸構造を改変し、例えば配列を改変するなどの細胞を改変する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の２つ以上を改変するステップを含んでなる。細胞内で２つ以上遺伝子が改変される場合、細胞は、（ａ）例えば、本明細書に記載されるようなｇＲＮＡの２つ以上などのＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の２つ以上を標的化するｇＲＮ；（ｂ）例えば、本明細書に記載されるようなＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子；および任意選択的に、（ｃ）例えば、本明細書に記載されるようなｇＲＮＡなどの（ａ）中で選択される２つ以上の遺伝子をそれぞれ標的化する第２、第３および／または第４のｇＲＮＡに接触される。一実施形態では、方法は、細胞内に、支配ｇＲＮＡ分子、または支配ｇＲＮＡ分子をコードする核酸を細胞内に導入するステップをさらに含んでなる。
【０１７４】
一実施形態では、細胞を改変する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の２つ以上を改変するステップを含んでなる。
【０１７５】
一実施形態では、細胞を改変する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の３つ以上を改変するステップを含んでなる。
【０１７６】
一実施形態では、細胞を改変する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の４つ以上を改変するステップを含んでなる。
【０１７７】
一実施形態では、細胞を改変する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の５つ以上を改変するステップを含んでなる。
【０１７８】
一実施形態では、細胞を改変する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の６つ以上を改変するステップを含んでなる。
【０１７９】
一実施形態では、細胞を改変する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の７つ以上を改変するステップを含んでなる。
【０１８０】
一実施形態では、細胞を改変する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子のそれぞれを改変するステップを含んでなる。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、方法は、がんに罹患している対象に由来する細胞を接触させるステップを含んでなる。細胞は、Ｔ細胞標的位置に変異を有することで恩恵を被る対象に由来してもよい。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、開示される方法で接触される細胞はＴ細胞である。接触させるステップは、生体外で実施されてもよく、接触細胞は、接触させるステップ後に対象の身体に戻されてもよい。Ｔ細胞は、例えば、遺伝子操作ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）Ｔ細胞または遺伝子操作ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）Ｔ細胞などの遺伝子操作Ｔ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数にＴ細胞標的位置変異を導入する前、後、またはそれと同時に、ＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように遺伝子操作されてもよい。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような細胞を改変する方法は、接触させるステップの前に、細胞内のＴ細胞標的位置の配列の知識を得るステップを含んでなる。細胞内のＴ細胞標的位置の配列の知識を得るステップは、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の、またはＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の一部の配列決定によってもよい。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、方法の接触させるステップは、細胞を例えば本明細書に記載されるベクター、例えばＡＡＶベクター、例えばＡＡＶベクターなどの（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の少なくとも１つを発現する核酸に接触させるステップを含んでなる。いくつかの実施形態では、方法の接触させるステップは、細胞を例えばベクター、例えばＡＡＶベクターなどの（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のそれぞれを発現する核酸に接触させるステップを含んでなる。別の実施形態では、方法の接触させるステップは、（ｂ）のＣａｓ９分子と、（ａ）のｇＲＮＡをコードする核酸と、任意選択的に、（ｃ）（ｉ）の第２のｇＲＮＡと、（さらに任意選択的に、第３のｇＲＮＡ（ｃ）（ｉｖ）および／または第４のｇＲＮＡ（ｃ）（ｉｉｉ）とを細胞に送達するステップを含んでなる。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、方法の接触させるステップは、細胞を例えばベクター、例えばＡＡＶベクターなどの（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の少なくとも１つを発現する核酸に接触させるステップを含んでなる。いくつかの実施形態では、方法の接触させるステップは、細胞を例えばベクター、例えばＡＡＶベクターなどの（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のそれぞれを発現する核酸に接触させるステップを含んでなる。一実施形態では、接触させるステップは、細胞を例えばベクター、例えばＡＡＶベクター、ＡＡＶ１ベクター、修飾ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、修飾ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、修飾ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、修飾ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、ａ修飾ＡＡＶ５ベクター、ＡＶ６ベクター、修飾ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、修飾ＡＡＶ７ベクター、ａＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ１０ベクター、修飾ＡＡＶ．ｒｈ１０ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３ベクター、修飾ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ４３ベクター，修飾ＡＡＶ．ｒｈ４３ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１ベクター、および修飾ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１ベクターなどの核酸に接触させるステップを含んでなる。
【０１８６】
一実施形態では、接触させるステップは、タンパク質またはｍＲＮＡとして（ｂ）のＣａｓ９分子と、（ａ）および任意選択的に（ｃ）をコードする核酸とを細胞に送達するステップを含んでなる。
【０１８７】
一実施形態では、接触させるステップは、タンパク質またはｍＲＮＡとして（ｂ）のＣａｓ９分子と、ＲＮＡとして（ａ）のｇＲＮＡと、任意選択的にＲＮＡとして（ｃ）の第２のｇＲＮＡとを細胞に送達するステップを含んでなる。
【０１８８】
一実施形態では、接触させるステップは、ＲＮＡとして（ａ）のｇＲＮＡと、任意選択的にＲＮＡとして第２のｇＲＮＡ（ｃ）と、（ｂ）のＣａｓ９分子をコードする核酸とを細胞に送達するステップを含んでなる。
【０１８９】
別の態様では、本明細書で開示されるのは、対象（または対象に由来する細胞）を
（ａ）例えば、本明細書で開示されるｇＲＮＡなどのＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ；
（ｂ）例えば、本明細書で開示されるＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子；
任意選択的に、（ｃ）（ｉ）例えば本明細書で開示される第２のｇＲＮＡなどのＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡ、さらに任意選択的に、（ｃ）（ｉｉ）ａ第３のｇＲＮＡ、なおもさらに任意選択的に、（ｃ）（ｉｉｉ）例えば、本明細書で開示される第３および第４のｇＲＮＡなどのＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子を標的化する第４のｇＲＮＡ
に接触させるステップを含んでなる、例えば対象の標的核酸の構造、例えば配列を改変するなどのがんに罹患している対象を治療する方法である。一実施形態では、方法は、支配ｇＲＮＡ分子または支配ｇＲＮＡ分子をコードする核酸を対象にまたは対象の細胞に導入するステップをさらに含んでなる。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、接触させるステップは、（ａ）および（ｂ）を接触させるステップを含んでなる。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、接触させるステップは、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）（ｉ）を接触させるステップを含んでなる。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、接触させるステップは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）、および（ｃ）（ｉｉ）を接触させるステップを含んでなる。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、接触させるステップは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）、および（ｃ）（ｉｉｉ）を接触させるステップを含んでなる。
【０１９４】
（ａ）または（ｃ）（例えば、（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）、または（ｃ）（ｉｉｉ）のｇＲＮＡは、表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉ、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２のいずれかから独立して選択されてもよく、または表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉ、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２のいずれかから独立して選択される標的化ドメイン配列と１、２、３、４、または５ヌクレオチド以下異なるｇＲＮＡから独立して選択されてもよい。
【０１９５】
一実施形態では、がんに罹患している対象を治療する方法は、例えば、対象の２つ以上の標的核酸（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の２つ以上）の構造、例えば配列を改変するなどＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の２つ以上を改変するステップを含んでなる。２つ以上の遺伝子が対象（または対象に由来する細胞）内で改変される場合、対象（または対象に由来する細胞）は、（ａ）例えば、本明細書に記載されるようなｇＲＮＡの２つ以上などのＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の２つ以上を標的化するｇＲＮ；（ｂ）例えば、本明細書に記載されるようなＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子；および任意選択的に、（ｃ）例えば、本明細書に記載されるようなｇＲＮＡなどの（ａ）で選択される２つ以上の遺伝子をそれぞれ標的化する、第２、第３および／または第４のｇＲＮＡに接触される。一実施形態では、方法は、支配ｇＲＮＡ分子または支配ｇＲＮＡ分子をコードする核酸を対象にまたは対象の細胞に導入するステップをさらに含んでなる。
【０１９６】
一実施形態では、がんに罹患している対象を治療する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の２つ以上を改変するステップを含んでなる。
【０１９７】
一実施形態では、がんに罹患している対象を治療する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の３つ以上を改変するステップを含んでなる。
【０１９８】
一実施形態では、がんに罹患している対象を治療する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の４つ以上を改変するステップを含んでなる。
【０１９９】
一実施形態では、がんに罹患している対象を治療する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の５つ以上を改変するステップを含んでなる。
【０２００】
一実施形態では、がんに罹患している対象を治療する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の６つ以上を改変するステップを含んでなる。
【０２０１】
一実施形態では、がんに罹患している対象を治療する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の７つ以上を改変するステップを含んでなる。
【０２０２】
一実施形態では、がんに罹患している対象を治療する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子のそれぞれを改変するステップを含んでなる。
【０２０３】
一実施形態では、方法は、対象においてＴ細胞標的位置の配列の知識を得るステップを含んでなる。
【０２０４】
一実施形態では、方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数、またはＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数の一部の配列決定によって、対象においてＴ細胞標的位置の配列の知識を得るステップを含んでなる。
【０２０５】
一実施形態では、方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置に、変異を誘導するステップを含んでなる。
【０２０６】
一実施形態では、方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数のＴ細胞標的位置に、変異を誘導するステップを含んでなる。
【０２０７】
一実施形態では、方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の２つ以上の中のＴ細胞標的位置に、変異を誘導するステップを含んでなる。
【０２０８】
一実施形態では、方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の３つ以上の中のＴ細胞標的位置に、変異を誘導するステップを含んでなる。
【０２０９】
一実施形態では、方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の４つ以上のＴ細胞標的位置に、変異を誘導するステップを含んでなる。
【０２１０】
一実施形態では、方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の５つ以上のＴ細胞標的位置に、変異を誘導するステップを含んでなる。
【０２１１】
一実施形態では、方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の６つ以上のＴ細胞標的位置に、変異を誘導するステップを含んでなる。
【０２１２】
一実施形態では、方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の７つ以上のＴ細胞標的位置に、変異を誘導するステップを含んでなる。
【０２１３】
一実施形態では、方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子のそれぞれのＴ細胞標的位置に、変異を誘導するステップを含んでなる。
【０２１４】
一実施形態では、方法は、ＮＨＥＪによって、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数のＴ細胞標的位置に、変異を誘導するステップを含んでなる。
【０２１５】
一実施形態では、対象の細胞は、生体外で（ａ）、（ｂ）、および任意選択的に（ｃ）に接触される。一実施形態では、細胞は対象の身体にに戻される。一実施形態では、対象の細胞は、生体外でＴ細胞に接触される。Ｔ細胞は、例えば、遺伝子操作ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）Ｔ細胞または遺伝子操作ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）Ｔ細胞などの遺伝子操作Ｔ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数にＴ細胞標的位置変異を導入する前、後、またはそれと同時に、ＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように遺伝子操作されてもよい。
【０２１６】
方法が、（１）ＮＨＥＪによってＴ細胞標的位置に変異を誘導するステップ、または（２）例えば、プロモーター領域を標的化することで、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の発現をノックダウンするステップを含んでなる場合、（ｂ）のＣａｓ９および例えば（ａ）のガイドＲＮＡなどの少なくとも１つのガイドＲＮＡが、接触させるステップに包含される。
【０２１７】
別の態様では、本明細書で開示されるのは、ｇＲＮＡ、核酸、または本明細書に記載される組成物、および例えば、がんを有する対象またはＴ細胞標的位置における変異から恩恵を被る対象に由来する細胞などの細胞を含んでなる反応混合物である。
【０２１８】
別の態様では、本明細書で開示されるのは、
（ａ）本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、またはｇＲＮＡをコードする核酸、および以下の１つまたは複数；
（ｂ）例えば本明細書に記載されるＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子、またはＣａｓ９をコードする核酸またはｍＲＮＡ；
（ｃ）（ｉ）例えば本明細書に記載される第２のｇＲＮＡ分子などの第２のｇＲＮＡ分子、または（ｃ）（ｉ）をコードする核酸；
（ｃ）（ｉｉ）例えば本明細書に記載される第２のｇＲＮＡ分子などの第３のｇＲＮＡ分子、または（ｃ）（ｉｉ）をコードする核酸；
（ｃ）（ｉｉｉ）例えば本明細書に記載される第２のｇＲＮＡ分子などの第４のｇＲＮＡ分子、または（ｃ）（ｉｉｉ）をコードする核酸
を含んでなるキットである。
【０２１９】
一実施形態では、キットは、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）、および（ｃ）（ｉｉｉ）の１つまたは複数をコードするＡＡＶベクター、例えば本明細書に記載されるＡＡＶベクターなどの核酸を含んでなる。一実施形態では、キットは、支配ｇＲＮＡ分子、または支配ｇＲＮＡ分子をコードする核酸をさらに含んでなる。
【０２２０】
一態様では、本開示は、本明細書で支配ｇＲＮＡ分子と称され、細胞または対象内に導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素をコードする核酸上の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含んでなる、ｇＲＮＡ分子を特徴とする。一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子をコードする核酸、または標的遺伝子ｇＲＮＡ分子をコードする核酸を標的化する。一実施形態では、支配ｇＲＮＡは、例えばＣａｓ９分子などのＣａｓ９構成要素または標的遺伝子ｇＲＮＡ分子をコードする配列中の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含んでなる。一実施形態では、標的ドメインは、細胞内のその他核酸配列との最小の相同性で設計され、または最小の相同性を有して、例えばオフターゲット切断が最小化される。例えば、支配ｇＲＮＡ上の標的化ドメインは、オフターゲット効果を低下させまたは最小化するように選択され得る。一実施形態では、支配ｇＲＮＡの標的ドメインは、Ｃａｓ９分子の制御またはコード領域内に配置され、または制御領域と転写領域の間に配置され得る。一実施形態では、支配ｇＲＮＡの標的ドメインは、標的遺伝子ｇＲＮＡ分子の制御またはコード領域内に配置され、または標的遺伝子ｇＲＮＡの制御領域と転写領域の間に配置され得る。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、例えば、Ｃａｓ９分子をコードする核酸、または標的遺伝子ｇＲＮＡ分子をコードする核酸を不活性化するなどの改変するステップは、標的核酸配列の切断によって、またはＣａｓ９分子／支配ｇＲＮＡ分子複合体の標的核酸配列への結合によってもたらされ得ると考えられる。
【０２２１】
本明細書で開示されるように、組成物、反応物混合物、およびキットはまた、例えば、本明細書で開示される支配ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子も含み得る。
【０２２２】
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のまたは同等の方法および材料が、本発明でまたは本発明の試験で使用され得るが、適切な方法および材料は下述のとおりである。本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その内容全体を参照により援用する。これに加えて、材料、方法、および実施例は、例証のみを意図し、制限は意図されない。
【０２２３】
数字およびアルファベットの見出しおよび小見出しをはじめとする見出しは、組織化と提示を目的とし、制限は意図されない。
【０２２４】
本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【０２２５】
最初に簡単に図面を説明する。
【図面の簡単な説明】
【０２２６】
【図１Ａ−Ｇ】いくつかの代表的なｇＲＮＡの描写である。
【図１Ａ】部分的にストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する（または部分的に配列をモデルにしている）、モジュラーｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（それぞれ出現順に配列番号４２および４３）；
【図１Ｂ】Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４４）；
【図１Ｃ】Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４５）；
【図１Ｄ】Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４６）；
【図１Ｅ】Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４７）；
【図１Ｆ】ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に部分的に由来するモジュラーｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（それぞれ出現順に配列番号４８および４９）；
【図１Ｇ】Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のモジュラーｇＲＮＡ分子のアライメントを描写する（それぞれ出現順に配列番号５０〜５３）。
【図２Ａ−Ｇ】Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＲＮＡ  ＢＩＯＬ．２０１３；１０（５）：７２６−７３７）からのＣａｓ９配列のアライメントを描写する。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号３）；Ｌｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号４）。モチーフ：これは４つの配列に基づくモチーフである：全ての４つの配列中で保存される残基は、一文字アミノ酸略号によって示され；「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、例えば、２０の天然起源アミノ酸のいずれかである、任意のアミノ酸を示す。
【図３Ａ−Ｂ】Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌで開示されるＣａｓ９分子からのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインのアライメントを示す（それぞれ出現順に配列番号５４〜１０３）。図３Ｂの最後の行は、４つの高度に保存された残基を特定する。
【図４Ａ−Ｂ】配列外れ値を除外して、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．で開示されるＣａｓ９分子からのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインのアライメントを示す（それぞれ出現順に配列番号１０４〜１７７）。図４Ｂの最後の行は、３つの高度に保存された残基を特定する。
【図５Ａ−Ｃ】Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．で開示されるＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインのアライメントを示す（それぞれ出現順に配列番号１７８〜２５２）。図５Ｃの最後行は、保存残基を特定する。
【図６Ａ−Ｂ】配列外れ値を除外して、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．で開示されるＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインのアライメントを示す（それぞれ出現順に配列番号２５３〜３０２）。図６Ｂの最後の行は、３つの高度に保存された残基を特定する。
【図７Ａ−Ｂ】Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびナイセリア・メニンジチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からのＣａｓ９配列のアライメントを描写する。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「Ｇ」で示される。Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）；Ｎｍ：Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）。モチーフ：これは２つの配列に基づくモチーフである：双方の配列で保存される残基は、単一アミノ酸名称によって示される；「＊」は、２つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、例えば、２０の天然起源アミノ酸のいずれかである、任意のアミノ酸を示し、「−」は、例えば、２０の天然起源アミノ酸のいずれかである、任意のアミノ酸または不在を示す。
【図８】Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９をコードする核酸配列を示す（配列番号３０３）。「Ｒ」によって示される配列はＳＶ４０  ＮＬＳであり；「Ｇ」として示される配列はＨＡタグであり；かつ「Ｏ」によって示される配列は、合成ＮＬＳ配列である。残りの（印のない）配列は、読み取り枠（ＯＲＦ）である。
【図９Ａ】Ｃａｓ９（認識（ＲＥＣ）およびヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブ）の２つのローブに関して、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のドメイン構成、およびアミノ酸位置を含めたＣａｓ９ドメインの構成を描写する概略図を示す。
【図９Ｂ】８３  Ｃａｓ９オルソログ全体にわたる各ドメインパーセント相同性と共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ドメイン構成を描写する概略図を示す。
【図１０Ａ】二重鎖構造としてＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する、単分子ｇＲＮＡ分子の代表的構造を示す（配列番号４０）。
【図１０Ｂ】二重鎖構造としてＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に部分的に由来する、単分子ｇＲＮＡ分子の代表的構造を示す（配列番号４１）。
【図１１】Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用して、２９３個の細胞中のＴＲＢＣ遺伝子に対して生成された、ｇＲＮＡの活性を評価する実験からの結果を示す。２９３ｓは、１つはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９をコードし、もう１つは記載されたｇＲＮＡをコードする、２つのプラスミドで形質移入された。グラフは、複製サンプルから単離されたゲノムＤＮＡ上で実施されたＴ７Ｅ１アッセイから計算された、各ｇＲＮＡについてＴＲＢＣ２遺伝子座で観察された、平均％ＮＨＥＪを要約する。
【図１２】Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用して、２９３個の細胞中のＴＲＢＣ遺伝子に対して整斉された、ｇＲＮＡの活性を評価する実験からの結果を示す。２９３個の細胞は、１つはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９をコードし、もう１つは記載されたｇＲＮＡをコードする、２つのプラスミドで形質移入された。グラフは、二連のサンプルから単離されたゲノムＤＮＡ上で実施されたＴ７Ｅ１アッセイから計算された、各ｇＲＮＡについてＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２遺伝子座の双方で観察された平均％ＮＨＥＪを示す。
【図１３】Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用して、２９３個の細胞中のＴＲＡＣ遺伝子に対して生成された、ｇＲＮＡの活性を評価する実験からの結果を示す。２９３個の細胞は、１つはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９をコードし、もう１つは記載されたｇＲＮＡをコードする、２つのプラスミドで形質移入された。グラフは、複製サンプルから単離されたゲノムＤＮＡ上で実施されたＴ７Ｅ１アッセイから計算された、各ｇＲＮＡについてＴＲＡＣ遺伝子座で観察された、平均％ＮＨＥＪを示す。
【図１４】Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用して、２９３個の細胞中のＴＲＡＣ遺伝子に対して生成された、ｇＲＮＡの活性を評価する実験からの結果を示す。２９３個の細胞は、１つはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９をコードし、もう１つは記載されたｇＲＮＡをコードする、２つのプラスミドで形質移入された。グラフは、複製サンプルから単離されたゲノムＤＮＡ上で実施されたＴ７Ｅ１アッセイから計算された、各ｇＲＮＡについてＴＲＡＣ遺伝子座で観察された、平均％ＮＨＥＪを示す。
【図１５】Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用して、２９３個の細胞中のＰＤＣＤ１遺伝子に対して生成された、ｇＲＮＡの活性を評価する実験からの結果を示す。２９３個の細胞は、１つはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９をコードし、もう１つは記載されたｇＲＮＡをコードする、２つのプラスミドで形質移入された。グラフは、複製サンプルから単離されたゲノムＤＮＡ上で実施されたＴ７Ｅ１アッセイから計算された、各ｇＲＮＡについてＰＤＣＤ１遺伝子座で観察された、平均％ＮＨＥＪを示す。
【図１６】Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用して、２９３個の細胞中のＰＤＣＤ１遺伝子に対して生成された、ｇＲＮＡの活性を評価する実験からの結果を示す。２９３個の細胞は、１つはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９をコードし、もう１つは記載されたｇＲＮＡをコードする、２つのプラスミドで形質移入された。グラフは、複製サンプルから単離されたゲノムＤＮＡ上で実施されたＴ７Ｅ１アッセイから計算された、各ｇＲＮＡについてＰＤＣＤ１遺伝子座で観察された、平均％ＮＨＥＪを示す。
【図１７Ａ−Ｃ】Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびＴＲＢＣおよびＴＲＡＣ遺伝子特異的ｇＲＮＡの送達に起因する、ＣＤ４＋Ｔ細胞内のＣＤ３発現の喪失を示す結果を描写する。
【図１７Ａ】Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよび示されるｇＲＮＡ（ＴＲＢＣ−２１０（ＧＣＧＣＵＧＡＣＧＡＵＣＵＧＧＧＵＧＡＣ）（配列番号４１３）、ＴＲＡＣ−４（ＧＣＵＧＧＵＡＣＡＣＧＧＣＡＧＧＧＵＣＡ）（配列番号４５３）またはＡＡＶＳ１（ＧＵＣＣＣＣＵＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＧＵＧ）（配列番号５１２０１））で電気穿孔され、ＡＰＣ−ＣＤ３抗体で染色され、ＦＡＣＳで分析された、ＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。細胞は、電気穿孔の２日および３日後に分析された。
【図１７Ｂ】（Ａ）のプロットのからのＣＤ３陰性集団の定量化を示す。
【図１７Ｃ】ＴＲＢＣ２およびＴＲＡＣ遺伝子座で実施されたＴ７Ｅ１アッセイから得られた％ＮＨＥＪを示す。
【図１８Ａ−Ｃ】ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰの送達に起因する、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞内のＣＤ３発現の喪失を示す結果を描写する。
【図１８Ａ】ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９／ｇＲＮＡＴＲＡＣ−２３３（ＧＵＧＡＡＵＡＧＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＵＵＧＵＣＡ）（配列番号：４７４）ＲＮＰで電気穿孔され、ＡＰＣ−ＣＤ３抗体で染色され、ＦＡＣＳによって分析された、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を示す。細胞は、電気穿孔の１日、２日、および３日後に分析された。
【図１８Ｂ】（Ａ）のプロットのからのＣＤ３陰性集団の定量化を示す。
【図１８Ｃ】ＴＲＡＣ遺伝子座で実施されたＴ７Ｅ１アッセイ％から得られたＮＨＥＪを示す。
【図１９】５’  ＡＲＣＡキャップの構造を示す。
【図２０】Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡでの電気穿孔後における、生存Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の定量化からの結果を描写する。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびそれぞれの修飾ｇＲＮＡで電気穿孔された。電気穿孔の２４時間後、１×１０５個の細胞は、ＦＩＴＣコンジュゲートアネクシンＶ特異的抗体によって室温で１５分間染色され、フローサイトメトリーによる分析直前のヨウ化プロピジウムによる染色がそれに続いた。アネクシンＶまたはＰＩのいずれでも染色されなかった細胞の百分率が、棒グラフで報告される。
【図２１Ａ−Ｃ】ＴＲＡＣを標的化するＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９／ｇＲＮＡＲＮＰの送達に起因する、未感作ＣＤ３＋Ｔ細胞中のＣＤ３発現の喪失を描写する。
【図２１Ａ】（標的化ドメインＧＵＧＡＡＵＡＧＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＵＵＧＵＣＡ（配列番号４７４）があるＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９／ｇＲＮＡで電気穿孔された未感作ＣＤ３＋Ｔ細胞を描写し、ＴＲＡＣを標的化するＲＮＰはＡＰＣ−ＣＤ３抗体で染色され、ＦＡＣＳによって分析された。細胞は、電気穿孔の４日後に分析された。陰性対照は、標的化ドメインＧＵＧＡＡＵＡＧＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＵＵＧＵＣＡ（配列番号４７４）のあるｇＲＮＡがあり、機能性Ｃａｓ９がない細胞である。
【図２１Ｂ】図２１ＡのプロットからのＣＤ３陰性集団の定量化を描写する。
【図２１Ｃ】ＴＲＡＣ遺伝子座で実施されたＴ７Ｅ１アッセイ％から得られたＮＨＥＪを描写する。
【図２２】（標的化ドメインＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＵＧＣＵＡＣＡＡＣＵ（配列番号５０８）がある）Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびＰＤＣＤ１  ｇＲＮＡ、またはＰＤＣＤ１を標的化する（標的化ドメインＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＵＧＣＵＡＣＡＡＣＵ（配列番号５０８）がある）Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９／ｇＲＮＡＲＮＰの送達後のＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞のＰＤＣＤ１遺伝子座におけるゲノム編集を描写する。２４、４８、および７２時間目にＰＤＣＤ１遺伝子座で実施されたＴ７Ｅ１アッセイから得られた、％ＮＨＥＪの定量化。ｍＲＮＡ送達と比較して、ＲＮＰでより高レベルの％ＮＨＥＪが検出された。
【０２２７】
定義
「ドメイン」は、本明細書の用法では、タンパク質または核酸部分を記述するために使用される。特に断りのない限り、ドメインは、任意の特定の機能特性を有する必要はない。
【０２２８】
２つの配列間の相同性または配列同一性（用語は本明細書で同義的に使用される）の計算は、次のようにして実施される。配列は、最適な比較目的で整列され（例えば、最適アライメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の片方または双方にギャップが装入され得て、非相同配列は比較目的で無視され得る）。最適アライメントは、Ｂｌｏｓｕｍ６２重み行列による、ギャップペナルティ１２、ギャップ延長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５で、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して、最高スコアとして評価される。次に対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド配列部位にある、アミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、分子は、その位置において同一である。２つの配列間の同一性百分率は、配列によって共有される同一の位置数の関数である。
【０２２９】
「支配ｇＲＮＡ分子」は、本明細書の用法では、細胞または対象に導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素をコードする配列を含んでなる核酸上の標的ドメインと、相補的な標的化ドメインを含んでなる、ｇＲＮＡ分子を指す。支配ｇＲＮＡは、内在性細胞または対象配列を標的化しない。一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、（ａ）Ｃａｓ９分子をコードする核酸上；（ｂ）ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子を標的化する標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡをコードする核酸（標的遺伝子ｇＲＮＡ）上；または例えば（ａ）および（ｂ）の双方などの２つ以上の上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素をコードする核酸上の標的配列と相補的な標的化ドメインを含んでなる。一実施形態では、例えばＣａｓ９分子または標的遺伝子ｇＲＮＡをコードするなどのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素をコードする核酸分子は、支配ｇＲＮＡ標的化ドメインと相補的な２つ以上の標的ドメインを含んでなる。理論による拘束は望まないが、支配ｇＲＮＡ分子はＣａｓ９分子と複合体形成し、例えば、切断によってまたは核酸の結合によって、標的核酸のＣａｓ９媒介性不活性化がもたらされ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成要素の生成中断または低下がもたらされると考えられる。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、標的遺伝子ｇＲＮＡがあるＣａｓ９分子を含んでなり、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子を改変する複合体；および支配ｇＲＮＡ分子があるＣａｓ９分子を含んでなり、例えば、Ｃａｓ９分子または標的遺伝子ｇＲＮＡ分子などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成要素のさらなる生成を妨げるように機能する複合体の２つの複合体を形成する。一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体は、例えば、Ｃａｓ９分子の転写領域、エクソン、またはイントロンをコードする配列である、Ｃａｓ９分子をコードする配列と作動可能に連結するプロモーターなどの制御領域配列と結合し、またはその切断を促進する。一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体は、例えば、ｇＲＮＡ分子と作動可能に連結するプロモーターの制御領域配列、またはｇＲＮＡ分子をコードする配列などと結合し、またはその切断を促進する。一実施形態では、例えば、Ｃａｓ９標的化支配ｇＲＮＡ分子、または標的遺伝子ｇＲＮＡ標的化支配ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９分子／標的遺伝子ｇＲＮＡ分子複合体媒介遺伝子標的化の効果を制限する。一実施形態では、支配ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９分子／標的遺伝子ｇＲＮＡ分子複合体の活性に、時間的、発現レベル、またはその他の制限を課す。一実施形態では、支配ｇＲＮＡは、オフターゲットまたはその他の望まれない活性を低下させる。一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９システムの構成要素の生成を例えば、全体的にまたは実質的に全体的に阻害するなど阻害して、それによってその活性を制限し、またはそれに影響を与える。
【０２３０】
「修飾物質」は、本明細書の用法では、例えば、対象分子または遺伝子配列の活性（例えば、酵素活性、転写活性、または翻訳活性）、量、分布、または構造を改変し得る薬剤などの実体を指す。一実施形態では、調節は、例えば、共有結合または非共有結合の破壊などの切断、または例えば、部分の対象分子への付着などの共有結合または非共有結合の形成を含んでなる。一実施形態では、修飾物質は、対象分子の三次元、二次、三次、または四次構造を変化させる。修飾物質は、対象活性を増大させ、低下させ、開始し、または排除し得る。
【０２３１】
「大分子」は、本明細書の用法では、少なくとも２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｋＤの分子量を有する分子を指す。大分子としては、タンパク質、ポリペプチド、核酸、生物製剤、および炭水化物が挙げられる。
【０２３２】
「ポリペプチド」は、本明細書の用法では、１００個未満のアミノ酸残基を有するアミノ酸のポリマーを指す。一実施形態では、それは５０、２０、または１０個未満のアミノ酸残基を有する。
【０２３３】
「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」は、本明細書の用法では、例えば、正順ＮＨＥＪ（ｃＮＨＥＪ）、代替ＮＨＥＪ（ａｌｔＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、および合成依存性マイクロホモロジー媒介末端結合（ＳＤ−ＭＭＥＪ）をはじめとする、ライゲーション媒介修復および／または非テンプレート媒介修復を指す。
【０２３４】
例えば、参照Ｃａｓ９分子または参照ｇＲＮＡなどの「参照分子」は、本明細書の用法では、例えば、修飾または候補Ｃａｓ９分子などである対象Ｃａｓ９分子または対象ｇＲＮＡ分子などの対象分子が、それに対して比較される分子を指す。例えば、Ｃａｓ９分子は、参照Ｃａｓ９分子のヌクレアーゼ活性の１０％以下を有するとして特徴付けられ得る。参照Ｃａｓ９分子の例としては、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子などである、天然起源Ｃａｓ９分子などの天然起源未修飾Ｃａｓ９分子が挙げられる。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、それが比較されるＣａｓ９分子と、最も近い配列同一性または相同性を有する天然起源Ｃａｓ９分子である。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、例えば、変異などの変化がその上で起こった親形態である、天然起源または既知の配列などの配列である。
【０２３５】
「置換」または「交換された」は、分子修飾に関連した本明細書の用法では、プロセスの制限は必要でなく、置換実体が存在することのみを示唆する。
【０２３６】
「小分子」は、本明細書の用法では、例えば、約２ｋＤ未満、約１．５ｋＤ未満、約１ｋＤ未満、または約０．７５ｋＤ未満などの約２ｋＤ未満の分子量を有する化合物を指す。
【０２３７】
「対象」は、本明細書の用法では、ヒトまたは非ヒト動物のどちらを意味してもよい。用語は、哺乳類（例えば、ヒト、その他の霊長類、ブタ、齧歯類（例えば、マウスおよびラットまたはハムスター）、ウサギ、モルモット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、およびヤギ）を含むが、これに限定されるものではない。一実施形態では、対象はヒトである。他の実施形態では、対象は家禽である。
【０２３８】
「治療する（Ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書の用法では、例えば、（ａ）疾患を阻害し、すなわち、その進行を抑止または予防し；（ｂ）疾患を緩和し、すなわち、疾病状態の退縮を引き起こし；および（ｃ）疾患を治癒させることをはじめとする、例えば、ヒトなどの哺乳類の疾患の治療を意味する。
【０２３９】
「Ｘ」は、アミノ酸配列の文脈で、本明細書の用法では、特に断りのない限り、任意のアミノ酸（例えば、２０個の天然アミノ酸のいずれか）を指す。
【発明を実施するための形態】
【０２４０】
がん免疫療法を改善する
一態様では、本明細書に記載される組成物および方法を使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数の（ｏｎｅ  ｏｒｅ  ｍｏｒｅ）Ｔ細胞発現遺伝子を改変することで、遺伝子操作Ｔ細胞の増殖に影響を及ぼし得る。遺伝子操作Ｔ細胞が効果的な抗腫瘍応答をするためには、それらは、１）対象への移入に続いて適切に増殖し、十分な数の特異的腫瘍標的化Ｔ細胞を提供し；２）対象において必要な抗腫瘍活性を維持するのに十分な時間生存し；３）遺伝子操作Ｔ細胞が機能性抗腫瘍表現型を維持するように、腫瘍環境内で免疫細胞、腫瘍細胞、およびその他の細胞によって産生される抑制因子の影響を回避する必要がある。不十分な増殖および／または生存、ならびに阻害因子感受性は、がんに罹患している対象における、遺伝子操作Ｔ細胞の有効性の欠如の一因たり得る。本明細書で開示される方法および組成物は、がん治療法としての遺伝子操作Ｔ細胞の有効性を改善するために、これらの問題に対処する。
【０２４１】
一実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法を使用して、ＣＢＬＢ遺伝子を改変することで、遺伝子操作Ｔ細胞の増殖に影響を及ぼし得る。理論による拘束は望まないが、Ｃａｓｉｔａｓ  Ｂ系統リンパ腫ｂタンパク質（ＣＢＬＢによってコードされる）発現の低下または不在は、対象への移入に続く、遺伝子操作Ｔ細胞の増殖を促進するための外来性インターロイキンシグナル伝達に対する必要性を低下させると考えられる（Ｓｔｒｏｍｎｅｓ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２０，３７２２−３７３４）。
【０２４２】
一実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法を使用して、ＰＴＰＮ６遺伝子を改変することで、遺伝子操作Ｔ細胞の増殖に影響を及ぼし得る。理論による拘束は望まないが、Ｓｒｃ相同性領域２ドメイン含有ホスファターゼ−１タンパク質（ＰＴＰＮ６によってコードされる）の発現低下または不在は、移入されたＴ細胞の短期蓄積の増大をもたらし、それは引き続いて抗腫瘍活性を改善すると考えられる（Ｓｔｒｏｍｎｅｓ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８９，１８１２−１８２５）。
【０２４３】
一実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法を使用して、ＦＡＳ遺伝子を改変することで、遺伝子操作Ｔ細胞の増殖に影響を及ぼし得る。理論による拘束は望まないが、Ｆａｓタンパク質発現の低下または不在が、多くのがん型によって発現される因子であるＦａｓリガンドによるＴ細胞アポトーシスの誘導を阻害すると考えられる（Ｄｏｔｔｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，２００５  Ｂｌｏｏｄ  １０５，４６７７−４６８４）。
【０２４４】
一実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法を使用して、ＢＩＤ遺伝子を改変することで、遺伝子操作Ｔ細胞の増殖に影響を及ぼし得る。理論による拘束は望まないが、Ｂｉｄタンパク質発現の低下または不在が、Ｆａｓ経路活性化に続くＴ細胞アポトーシスの誘導を妨げると考えられる（Ｌｅｉ，Ｘ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２２，３０−３６）。
【０２４５】
一実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法を使用して、ＣＴＬＡ４遺伝子を改変することで、遺伝子操作Ｔ細胞に対する免疫抑制性因子の効果を低下させ得る。理論による拘束は望まないが、細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４によってコードされる）発現の低下または不在が、腫瘍環境内で抗原提示細胞によって発現されるＣＤ８０またはＣＤ８６の結合に続く、非応答性状態（「アネルギー」）の誘導を抑止すると考えられる（Ｓｈｒｉｋａｎｔ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ，１９９９  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１，４８３−４９３）。
【０２４６】
一実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法を使用して、ＰＤＣＤ１遺伝子を改変することで、遺伝子操作Ｔ細胞に対する免疫抑制性因子の効果を低下させ得る。理論による拘束は望まないが、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤＣＤ１によってコードされる）発現の低下または不在が、腫瘍環境内で腫瘍細胞または細胞によって発現されるＰＤ１リガンドの結合によって、Ｔ細胞アポトーシス誘導を妨げると考えられる（Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６６，２４４３−２４５４）。
【０２４７】
一実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法を使用して、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子を改変することで、Ｔ細胞特異性および安全性が改善され得る。理論による拘束は望まないが、Ｔ細胞受容体（ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣによってコードされる）発現の低下または不在が、Ｔ細胞受容体認識および宿主組織応答を排除することで、移植片対宿主病を妨げると考えられる。したがってこのアプローチを使用して、「汎用」Ｔ細胞が生成され得る（Ｔｏｒｉｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｂｌｏｏｄ  １１９，５６９７−５７０５）。また、理論による拘束は望まないが、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子発現の低下または不在は、内在性Ｔ細胞受容体と外来性導入遺伝子操作Ｔ細胞受容体との誤った対合形成を低下させまたは排除し、ひいては治療効果を好転させると考えられる（Ｐｒｏｖａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８，８０７−８１５）。
【０２４８】
一実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法を使用して、遺伝子操作Ｔ細胞を使用することで、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数を低下させて、がん免疫療法の処置を改善させ得る。
【０２４９】
本明細書で開示されるのは、本明細書に記載される組成物および方法を使用して、がん経由免疫療法を処置するアプローチである。
【０２５０】
１つのアプローチでは、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数が、標的ノックアウトまたはノックダウンとして標的化され、例えば、Ｔ細胞の増殖、生存および／または機能に影響を及ぼす。一実施形態では、前記アプローチは、１つのＴ細胞発現遺伝子（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子）をノックアウトまたはノックダウンするステップを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の内２つなどのＴ細胞が発現する２つの遺伝子をそれぞれノックアウトまたはノックダウンするステップを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の内３つなどのＴ細胞が発現する３つの遺伝子をそれぞれノックアウトまたはノックダウンするステップを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の内４つなどのＴ細胞が発現する４つの遺伝子をそれぞれノックアウトまたはノックダウンするステップを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の内５つなどのＴ細胞が発現する５つの遺伝子をそれぞれノックアウトまたはノックダウンするステップを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の内６つなどのＴ細胞が発現する６つの遺伝子をそれぞれノックアウトまたはノックダウンするステップを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の内７つなどのＴ細胞が発現する７つの遺伝子をそれぞれノックアウトまたはノックダウンするステップを含んでなる。別の実施形態では、アプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子などのＴ細胞が発現する８つの遺伝子をそれぞれノックアウトまたはノックダウンするステップを含んでなる。
【０２５１】
一実施形態では、方法は、疾患発症後に対象の治療を開始するステップを含んでなる。一実施形態では、方法は、例えば、がんの発症後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、２４、または３６ヶ月間などの疾患発症の十分後に、対象への治療を開始するステップを含んでなる。
【０２５２】
一実施形態では、方法は、進行した病期にある対象の治療開始を含んでなる。
【０２５３】
全体的に、全ての病期における対象の治療開始は、対象に恩恵をもたらすことが期待される。
【０２５４】
本明細書で開示される組成物および方法を使用して治療されてもよいがんとしては、血液のがんおよび固形腫瘍が挙げられる。例えば、本明細書で開示される組成物および方法を使用して治療されてもよいがんとしては、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＥＬＬ）、多発性骨髄腫、腎細胞がん（ＲＣＣ）、神経芽細胞腫、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、メラノーマ、肉腫、前立腺がん、肺がん、食道がん、肝細胞がん、膵臓がん、星細胞腫、中皮腫、頭頸部がん、および髄芽細胞腫が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２５５】
例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子を改変する方法
本明細書で開示されるように、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子が、例えば、本明細書に記載されるようなＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介法を使用して、遺伝子編集によって標的化（例えば、改変）され得る。
【０２５６】
本明細書で考察される方法および組成物は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子中のＴ細胞標的位置の標的化（例えば、改変）を提供する。Ｔ細胞標的位置は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介法を使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子を標的化（例えば、改変）するなどの、遺伝子編集によって、標的化（例えば、改変）され得る。
【０２５７】
本明細書で開示されるのは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子中のＴ細胞標的位置を標的化（例えば、改変）する方法である。
【０２５８】
Ｔ細胞標的位置の標的化（例えば、改変）は、例えば、
（１）例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などをノックアウトする１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子：
（ａ）例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子のコード領域近傍またはその内部の１つまたは複数のヌクレオチドの挿入または欠失（例えば、ＮＨＥＪ媒介挿入または欠失）、または
（ｂ）例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の少なくとも一部をはじめとするゲノム配列の欠失（例えば、ＮＨＥＪ媒介欠失）、または
（２）例えば、遺伝子のプロモーター領域などの非コード領域を標的化することで、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）分子またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質によって媒介される、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、および／またはＰＴＰＮ６遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子のノックダウン
によって達成される。
【０２５９】
全てのアプローチは、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の標的化（例えば、改変）を生じる。
【０２６０】
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子のコード領域の近くに、１つまたは複数の切断を導入する。別の実施形態では、本明細書に記載される方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の少なくとも一部の側面に位置する、２つ以上の切断を導入する。２つ以上の切断は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の少なくとも一部を含むゲノム配列を除去する（例えば、欠失させる）。別の実施形態では、本明細書に記載される方法は、Ｔ細胞標的化ノックダウン位置のプロモーター領域を標的化することで、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）分子またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質によって媒介される、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、および／またはＰＴＰＮ６遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子をノックダウンするステップを含んでなる。全ての本明細書に記載される方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の標的化（例えば、改変）をもたらす。
【０２６１】
例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の標的化（例えば、改変）は、任意の機序により媒介され得る。例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の改変に関連し得る代表的機序としては、非相同末端結合（例えば、古典的または代替）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、相同指向修復（例えば、内在性供与体テンプレート媒介性）、ＳＤＳＡ（合成依存性鎖アニーリング）、一本鎖アニーリングまたは一本鎖浸潤が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２６２】
例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子中のインデルまたは欠失の導入による、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子のノックアウト
一実施形態では、方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子遺伝子（ｇｅｎｅ  ｇｅｎｅｓ）などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子のＴ細胞標的ノックアウト位置の近傍（例えば、初期コード領域）に、もう１つのヌクレオチドの挿入または欠失を導入するステップを含んでなる。本明細書に記載されるように、一実施形態では、方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子のコード領域（例えば、開始コドンから５００ｂｐ内などの初期コード領域、または例えば、開始コドンからの最初の５００ｂｐ下流などの残りのコード配列）などのＴ細胞標的ノックアウト位置に、１つまたは複数の切断（例えば、一本鎖切断または二本鎖切断）を導入するステップを含んでなる。理論による拘束は望まないが、切断のＮＨＥＪ媒介修復は、Ｔ細胞標的ノックアウト位置内近傍へのインデルのＮＨＥＪ媒介性導入を可能にすると考えられる。
【０２６３】
一実施形態では、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子中のＴ細胞標的ノックアウト位置に、またはその近傍に、（例えば、１つのｇＲＮＡ分子によって配置される）一本鎖切断が導入される。一実施形態では、（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼがある）単一ｇＲＮＡ分子が使用されて、例えば、コード領域（例えば、開始コドンから５００ｂｐ内などの初期コード領域、または例えば、開始コドンからの最初の５００ｂｐ下流などの残りのコード配列）などのＴ細胞標的ノックアウト位置に、またはその近傍に、一本鎖切断が生じる。一実施形態では、切断は、例えば、Ａｌｕ反復などの反復要素などである、望まれない標的染色体要素を回避するように位置する。
【０２６４】
一実施形態では、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子中のＴ細胞標的ノックアウト位置に、またはその近傍に、二本鎖切断（例えば、１つのｇＲＮＡ分子によって配置される）が導入される。一実施形態では、（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ以外のＣａｓ９ヌクレアーゼがある）単一ｇＲＮＡ分子が使用されて、例えば、コード領域（例えば、開始コドンから５００ｂｐ内などの初期コード領域、または例えば、開始コドンからの最初の５００ｂｐ下流などの残りのコード配列）などのＴ細胞標的ノックアウト位置に、またはその近傍に、二本鎖切断が生じる。一実施形態では、切断は、例えば、Ａｌｕ反復などの反復要素などである、望まれない標的染色体要素を回避するように位置する。
【０２６５】
一実施形態では、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子中のＴ細胞標的ノックアウト位置に、またはその近傍に、（例えば、２つのｇＲＮＡ分子によって配置される）２つの一本鎖切断が導入される。一実施形態では、（例えば、１つまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼ（ｎｉｃｋｃａｓｅｓ）がある）２つのｇＲＮＡ分子が使用されて、例えば、コード領域（例えば、開始コドンから５００ｂｐ内などの初期コード領域、または例えば、開始コドンからの最初の５００ｂｐ下流などの残りのコード配列）などのＴ細胞標的ノックアウト位置に、またはその近傍に、２つの一本鎖切断が生じる。一実施形態では、ｇＲＮＡｓ分子は、双方の一本鎖切断が、Ｔ細胞標的ノックアウト位置の上流または下流に位置するように構成される。別の実施形態では、 （例えば、２つのＣａｓ９ニッカーゼ（ｎｉｃｋｃａｓｅｓ）がある）２つのｇＲＮＡ分子が使用されて、Ｔ細胞標的ノックアウト位置に、またはその近傍に、２つの一本鎖切断が生じ、例えば、ｇＲＮＡ分子は、１つの一本鎖切断がＴ細胞標的ノックアウト位置の上流に位置し、第２の一本鎖切断が下流に位置するように構成される。一実施形態では、切断は、例えば、Ａｌｕ反復などの反復要素などである、望まれない標的染色体要素を回避するように位置する。
【０２６６】
一実施形態では、２つの切断セット（例えば、２つの二本鎖切断）が、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子中の１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子中のＴ細胞標的ノックアウト位置に導入され（例えば、２つのｇＲＮＡ分子によって配置され）、またはその近傍にある。一実施形態では、（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼでない１つまたは２つのＣａｓ９ヌクレアーゼがある）２つのｇＲＮＡ分子が使用されて、例えば、コード領域（例えば、開始コドンから５００ｂｐ内などの初期コード領域、または例えば、開始コドンからの最初の５００ｂｐ下流などの残りのコード配列）などのＴ細胞標的ノックアウト位置の側面に位置する、２つの二本鎖切断が生じる。一実施形態では、ｇＲＮＡｓ分子は、切断セットの双方が、Ｔ細胞標的ノックアウト位置の上流または下流に位置するように構成される。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、１つの切断セットがＴ細胞標的ノックアウト位置上流に位置して、第２の切断セットが下流に位置するように構成される。一実施形態では、切断は、例えば、Ａｌｕ反復などの反復要素などである、望まれない標的染色体要素を回避するように位置する。
【０２６７】
一実施形態では、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子のＴ細胞標的ノックアウト位置に、またはその近傍に、２つの切断セット（例えば、１つの二本鎖切断および１対の一本鎖切断）が導入される（例えば、３つのｇＲＮＡ分子によって配置される）。一実施形態では、３つのｇＲＮＡ分子（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよび１つまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼがある）が使用されて、例えば、コード領域（例えば、開始コドンから５００ｂｐ内などの初期コード領域、または例えば、開始コドンからの最初の５００ｂｐ下流などの残りのコード配列）などのＴ細胞標的ノックアウト位置の側面に位置する、２つの切断セットが生じる。一実施形態では、ｇＲＮＡｓ分子は、切断セットの双方が、Ｔ細胞標的ノックアウト位置の上流または下流に位置するように構成される。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、１つの切断セットがＴ細胞標的ノックアウト位置上流に位置して、第２の切断セットが下流に位置するように構成される。一実施形態では、切断は、例えば、Ａｌｕ反復などの反復要素などである、望まれない標的染色体要素を回避するように位置する。
【０２６８】
一実施形態では、２つの切断セット（例えば、２対の一本鎖切断）が、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子中の１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子中のＴ細胞標的ノックアウト位置に導入され（例えば、４つのｇＲＮＡ分子によって配置される）、またはその近傍にある。一実施形態では、（例えば、１つまたは複数のＣａｓ９ニッカーゼがある）４つのｇＲＮＡ分子が使用されて、例えば、コード領域（例えば、開始コドンから５００ｂｐ内などの初期コード領域、または例えば、開始コドンからの最初の５００ｂｐ下流などの残りのコード配列）などのＴ細胞標的ノックアウト位置の側面に位置する、２つの切断セットが生じる。一実施形態では、ｇＲＮＡｓ分子は、切断セットの双方が、Ｔ細胞標的ノックアウト位置の上流または下流に位置するように構成される。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、１つの切断セットがＴ細胞標的ノックアウト位置上流に位置して、第２の切断セットが下流に位置するように構成される。一実施形態では、切断は、例えば、Ａｌｕ反復などの反復要素などである、望まれない標的染色体要素を回避するように位置する。
【０２６９】
一実施形態では、２つ以上（例えば、３つまたは４つ）のｇＲＮＡ分子が、１つのＣａｓ９分子と共に使用される。別の実施形態では、２つ以上（ｔｗｏ  ｏｒｅ  ｍｏｒｅ）（例えば、３つまたは４つ）のｇＲＮＡが、２つ以上のＣａｓ９分子と共に使用される場合、少なくとも１つのＣａｓ９分子は、他のＣａｓ９分子とは異なる生物種に由来する。例えば、２つのｇＲＮＡ分子が２つのＣａｓ９分子と共に使用される場合、１つのＣａｓ９分子は１つの生物種に由来し得て、もう１つＣａｓ９分子は異なる生物種に由来し得る。双方のＣａｓ９種が使用されて、所望通りに、一本または二本鎖切断が生じる。
【０２７０】
細胞内で２つ以上の遺伝子が改変のために標的化される場合、標的化核酸は、例えば、１つまたは複数のＣａｓ９タンパク質による切断によって改変されてもよい。例えば、２つの遺伝子がノックアウトのために標的化されるなど、例えば２つの遺伝子が改変のために標的化される場合、同一または異なるＣａｓ９タンパク質を使用して、各遺伝子が標的化されてもよい。一実施形態では、双方の遺伝子（または細胞内で標的化される各遺伝子）は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって切断されて二本鎖切断が生じる。別の実施形態では、双方の遺伝子（または細胞内で標的化される各遺伝子）は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって切断されて二本鎖切断が生じる。別の実施形態では、細胞内の１つまたは複数の遺伝子が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼでの切断によって改変されてもよく、同一細胞内の１つまたは複数の遺伝子が、Ｃａｓ９ニッカーゼでの切断によって改変されてもよい。２つ以上のＣａｓ９タンパク質を使用して、細胞内で、例えば異なる遺伝子などの標的核酸が切断される場合、Ｃａｓ９タンパク質は、異なる細菌種に由来してもよい。例えば、細胞内の１つまたは複数の遺伝子は、１つの細菌種に由来するＣａｓ９タンパク質による切断によって改変されてもよく、同一細胞内の１つまたは複数の遺伝子は、異なる細菌種に由来するＣａｓ９タンパク質による切断によって改変されてもよい。異なる生物種に由来する２つ以上のＣａｓ９タンパク質が使用される場合、それらは、同時送達されまたは順次送達されて、標的核酸の所望の位置における所望の遺伝子中の切断特異性が制御されてもよいことが検討される。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインおよび第２のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、対向する標的鎖核酸分子と相補的である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、ＰＡＭが外側を向くように構成される。
【０２７２】
例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子遺伝子（ｇｅｎｅ  ｇｅｎｅｓ）などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の少なくとも一部をはじめとするゲノム配列を欠失させることで（例えば、ＮＨＥＪ媒介欠失）、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子をノックアウトする
一実施形態では、方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子遺伝子（ｇｅｎｅ  ｇｅｎｅｓ）などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の少なくとも一部を含んでなるゲノム配列の欠失を導入するステップを含んでなる。本明細書に記載されるように、一実施形態では、方法は、１つはＴ細胞標的ノックアウト位置の５’およびもう１つは３’に（すなわち、側面に位置する）２つの二本鎖切断を導入するステップを含んでなる。一実施形態では、例えば、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ分子などの２つのｇＲＮＡは、２つの切断セット（例えば、２つの二本鎖切断、１つの二本鎖切断および１対の一本鎖切断または２対の一本鎖切断）が、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子中のＴ細胞標的ノックアウト位置の対向する側に位置するように設計される。
【０２７３】
一実施形態では、方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子遺伝子（ｇｅｎｅ  ｇｅｎｅｓ）などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の少なくとも一部を含むゲノム配列を除去する（例えば、ＮＨＥＪ媒介欠失）ステップを含んでなる。本明細書に記載されるように、一実施形態では、方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子遺伝子（ｇｅｎｅ  ｇｅｎｅｓ）など（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子遺伝子（ｇｅｎｅ  ｇｅｎｅｓ）などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の例えば初期コード領域などのコード領域、または例えばプロモーター、エンハンサー、イントロン、３’ＵＴＲ、および／またはポリアデニル化シグナルなどの非コード配列などの非コード領域）の１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子中の領域の側面に位置する、２つの切断セット（例えば１対の二本鎖切断、１つの二本鎖切断または１対の一本鎖切断、または２対の一本鎖切断）を導入するステップを含んでなる。理論による拘束は望まないが、切断のＮＨＥＪ媒介修復は、例えば、本明細書に記載されるようなＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子遺伝子（ｇｅｎｅ  ｇｅｎｅｓ）などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の改変を可能にして、遺伝子の発現を低下させまたは排除して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子遺伝子（ｇｅｎｅ  ｇｅｎｅｓ）などの例えば１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の対立遺伝子の片方または双方をノックアウトすると考えられる。
【０２７４】
一実施形態では、２つの切断セット（例えば、２つの二本鎖切断）が、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子中の１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子中のＴ細胞標的ノックアウト位置に導入され（例えば、２つのｇＲＮＡ分子によって配置され）、またはその近傍にある。一実施形態では、（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼでない１つまたは２つのＣａｓ９ヌクレアーゼがある）２つのｇＲＮＡ分子が使用されて、Ｔ細胞標的ノックアウト位置の側面に位置する２つの切断セットが生じ、例えば、ｇＲＮＡ分子は、１つの切断のセットが、Ｔ細胞標的ノックアウト位置の上流に位置して、第２の切断セットが下流に位置するように構成される。一実施形態では、切断は、例えば、Ａｌｕ反復などの反復要素などである、望まれない標的染色体要素を回避するように位置する。
【０２７５】
一実施形態では、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子のＴ細胞標的ノックアウト位置に、またはその近傍に、２つの切断セット（例えば、１つの二本鎖切断および１対の一本鎖切断）が導入される（例えば、３つのｇＲＮＡ分子によって配置される）。一実施形態では、３つのｇＲＮＡ分子（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよび１つまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼがある）が使用されて、Ｔ細胞標的ノックアウト位置の側面に位置する２つ切断セットを生じ、例えば、ｇＲＮＡ分子は、１つの切断セットがＴ細胞標的ノックアウト位置の上流に位置し、第２の切断のセットが下流に位置するように構成される。一実施形態では、切断は、例えば、Ａｌｕ反復などの反復要素などである、望まれない標的染色体要素を回避するように位置する。
【０２７６】
一実施形態では、２つの切断セット（例えば、２対の一本鎖切断）が、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子中の１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子中のＴ細胞標的ノックアウト位置に導入され（例えば、４つのｇＲＮＡ分子によって配置され）、またはその近傍にある。一実施形態では、（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよび１つまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼがある）４つのｇＲＮＡ分子が使用されて、Ｔ細胞標的ノックアウト位置の側面に位置する２つ切断セットを生じ、例えば、ｇＲＮＡ分子は、１つの切断セットがＴ細胞標的ノックアウト位置の上流に位置し、第２の切断のセットが下流に位置するように構成される。一実施形態では、切断は、例えば、Ａｌｕ反復などの反復要素などである、望まれない標的染色体要素を回避するように位置する。
【０２７７】
一実施形態では、２つ以上（例えば、３つまたは４つ）のｇＲＮＡ分子が、１つのＣａｓ９分子と共に使用される。別の実施形態では、２つ以上（ｔｗｏ  ｏｒｅ  ｍｏｒｅ）（例えば、３つまたは４つ）のｇＲＮＡが、２つ以上のＣａｓ９分子と共に使用される場合、少なくとも１つのＣａｓ９分子は、他のＣａｓ９分子とは異なる生物種に由来する。例えば、２つのｇＲＮＡ分子が２つのＣａｓ９分子と共に使用される場合、１つのＣａｓ９分子は１つの生物種に由来し得て、もう１つＣａｓ９分子は異なる生物種に由来し得る。双方のＣａｓ９種が使用されて、所望通りに、一本または二本鎖切断が生じる。
【０２７８】
細胞内で２つ以上の遺伝子が改変のために標的化される場合、標的化核酸は、例えば、１つまたは複数のＣａｓ９タンパク質による切断によって改変されてもよい。例えば、２つの遺伝子がノックアウトのために標的化されるなど、例えば２つの遺伝子が改変のために標的化される場合、同一または異なるＣａｓ９タンパク質を使用して、各遺伝子が標的化されてもよい。一実施形態では、双方の遺伝子（または細胞内で標的化される各遺伝子）は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって切断されて、二本鎖切断が生じる。別の実施形態では、双方の遺伝子（または細胞内で標的化される各遺伝子）は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって切断されて、二本鎖切断が生じる。別の実施形態では、細胞内の１つまたは複数の遺伝子が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼでの切断によって改変されてもよく、同一細胞内の１つまたは複数の遺伝子が、Ｃａｓ９ニッカーゼでの切断によって改変されてもよい。２つ以上のＣａｓ９タンパク質を使用して、細胞内で、例えば異なる遺伝子などの標的核酸が切断される場合、Ｃａｓ９タンパク質は、異なる細菌種に由来してもよい。例えば、細胞内の１つまたは複数の遺伝子は、１つの細菌種に由来するＣａｓ９タンパク質による切断によって改変されてもよく、同一細胞内の１つまたは複数の遺伝子は、異なる細菌種に由来するＣａｓ９タンパク質による切断によって改変されてもよい。異なる生物種に由来する２つ以上のＣａｓ９タンパク質が使用される場合、それらが、同時送達されまたは順次送達されて、標的核酸の所望の位置における所望の遺伝子中の切断特異性が制御されてもよいことが検討される。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインおよび第２のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、対向する標的鎖核酸分子と相補的である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、ＰＡＭが外側を向くように構成される。
【０２８０】
酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）分子によって媒介される、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、および／またはＰＴＰＮ６遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子のノックダウン
標的化ノックダウンアプローチは、機能性ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、および／またはＰＴＰＮ６遺伝子産物の発現を低下させまたは排除する。本明細書に記載されるように、一実施形態では、標的化ノックダウンは、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）分子または転写リプレッサードメインまたはクロマチン改変タンパク質に融合されたｅｉＣａｓ９を標的化することで媒介されて、例えばＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、Ｐおよび／またはＰＴＰＮ６遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の転写を例えば妨げ、低下させ、または低減させるなど、転写を改変する。
【０２８１】
本明細書で考察される方法および組成物を使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢおよび／またはＰＴＰＮ６遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の発現を改変して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、および／またはＰＴＰＮ６遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子のプロモーター領域を標的化することで、ＨＩＶ感染症またはＡＩＤＳが治療または予防されてもよい。一実施形態では、プロモーター領域は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、および／またはＰＴＰＮ６遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の発現ノックダウンを標的化する。標的化ノックダウンアプローチは、機能性ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、および／またはＰＴＰＮ６遺伝子産物の発現を低下させまたは排除する。本明細書に記載されるように、一実施形態では、標的化ノックダウンは、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質（例えば、転写リプレッサードメインまたはクロマチン修飾タンパク質に融合されたｅｉＣａｓ９）を標的化することで媒介されて、例えばＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、Ｐおよび／またはＰＴＰＮ６遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の転写を例えば妨げ、低下させ、または低減させるなど、転写を改変する。
【０２８２】
一実施形態では、１つまたは複数のｅｉＣａｓ９を使用して、１つまたは複数の内在性転写因子の結合が妨げられてもよい。別の実施形態では、ｅｉＣａｓ９は、クロマチン修飾タンパク質に融合され得る。クロマチン状態を改変することは、標的遺伝子の発現低下をもたらし得る。１つまたは複数のクロマチン修飾タンパク質に融合した１つまたは複数のｅｉＣａｓ９を使用して、クロマチン状態が改変されてもよい。
【０２８３】
２つ以上の遺伝子が細胞内で改変の標的になる場合、標的核酸は、例えば、１つまたは複数のｅｉＣａｓ９タンパク質またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質によって改変されてもよい。２つ以上のｅｉＣａｓ９タンパク質またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質が使用される場合、ｅｉＣａｓ９タンパク質またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質は、異なる細菌種に由来してもよい。例えば、細胞内の１つまたは複数の遺伝子は、１つの細菌種に由来するｅｉＣａｓ９タンパク質またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質によって改変されてもよく、同一細胞内の１つまたは複数の遺伝子は、異なる細菌種に由来するｅｉＣａｓ９タンパク質またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質によって改変されてもよい。異なる生物種に由来する２つ以上のｅｉＣａｓ９タンパク質またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質が使用される場合、それらが、同時送達されまたは順次送達されて、標的核酸の所望の位置における所望の遺伝子中の切断特異性が制御されてもよいことが検討される。
【０２８４】
理論による拘束は望まないが、遺伝子操作Ｔ細胞の養子免疫伝達は、がんの可能な治療法を提供してもよいと考えられる。細胞表面受容体をコードする遺伝子が、Ｔ細胞中に挿入される。遺伝子操作Ｔ細胞は、大部分の正常組織から腫瘍細胞を識別するのに使用され得る、腫瘍関連抗原を検出できる。
【０２８５】
標的遺伝子（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子）の１つまたは２つの対立遺伝子のノックアウトまたはノックダウンは疾患発症後に実施されてもよいが、好ましくは疾患経過の早期に実施される。
【０２８６】
Ｉ．ｇＲＮＡ分子
ｇＲＮＡ分子は、本明細書での用法では、ｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体の標的核酸への特異的標的化または自動誘導を促進する核酸を指す。ｇＲＮＡ分子は、本明細書で「キメラ」ｇＲＮＡと称されることもある単分子（単一ＲＮＡ分子を有する）、またはモジュラー（２つ以上、典型的に２つの別々のＲＮＡ分子を含んでなる）であり得る。ｇＲＮＡ分子は、いくつかのドメインを含んでなる。ｇＲＮＡ分子ドメインは、下で詳述される。
【０２８７】
その上にドメインが示されるいくつかの代表的なｇＲＮＡ構造は、図１に提供される。理論による拘束は望まないが、ｇＲＮＡの活性形態の三次元形態、または鎖内または鎖間相互作用に関して、高度相補性領域は、図１で時に二本鎖として示され、その他の描写は、本明細書で提供される。
【０２８８】
一実施形態では、単分子ｇＲＮＡまたはキメラｇＲＮＡは、好ましくは、５’から３方向に、
標的化ドメイン（例えば、表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉ、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２のいずれかからの標的化ドメインなどのＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中の標的核酸と相補的な；
第１の相補的ドメイン；
連結ドメイン；
（第１の相補性ドメインと相補的な）第２の相補性ドメイン；
隣接ドメイン；および
任意選択的に、テールドメイン
を含んでなる。
【０２８９】
一実施形態では、モジュラーｇＲＮＡは、
好ましくは、５’から３’方向に、標的化ドメイン（例えば、表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉ、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２からの標的化ドメインなどのＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子中の標的核酸と相補的な；および
第１の相補的ドメインを含んでなる第１の鎖、および
好ましくは、５’から３’方向に、任意選択的に、５’伸長ドメイン；
第２の相補的ドメイン；
隣接ドメイン；および
任意選択的に、テールドメインを含んでなる第２の鎖
を含んでなる。
【０２９０】
ドメインは、下で簡単に考察される。
標的化ドメイン
図１は、標的化ドメインの配置の例を提供する。
【０２９１】
標的化ドメインは、標的核酸の標的配列と、例えば、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％相補的であり、例えば、完全に相補的である、相補的なヌクレオチド配列を含んでなる。標的化ドメインはＲＮＡ分子の一部であり、したがって塩基ウラシル（Ｕ）を含んでなる一方で、ｇＲＮＡ分子をコードする任意のＤＮＡは、塩基チミン（Ｔ）を含んでなる。理論による拘束は望まないが、一実施形態において、標的配列と標的化ドメインとの相補性は、標的核酸とｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体との相互作用の特異性に寄与すると考えられる。標的化ドメインおよび標的配列対合中では、標的化ドメイン中のウラシル塩基が、標的配列中のアデニン塩基と対合するものと理解される。一実施形態では、標的ドメインそれ自体が、５’から３’方向に、任意選択の二次ドメイン、およびコアドメインを含んでなる。一実施形態では、コアドメインは、標的配列と完全に相補的である。一実施形態では、標的化ドメインは、５〜５０ヌクレオチド長である。標的化ドメインがそれと相補的である標的核酸の鎖は、本明細書で相補鎖と称される。ドメインのヌクレオチドの一部または全部は、例えば、本明細書のセクションＶＩＩＩに見られる修飾などの修飾を有し得る。
【０２９２】
一実施形態では、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。
【０２９３】
一実施形態では、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。
【０２９４】
一実施形態では、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。
【０２９５】
一実施形態では、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。
【０２９６】
一実施形態では、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。
【０２９７】
一実施形態では、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。
【０２９８】
一実施形態では、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。
【０２９９】
一実施形態では、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。
【０３００】
一実施形態では、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。
【０３０１】
一実施形態では、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。
【０３０２】
一実施形態では、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。
【０３０３】
一実施形態では、標的化ドメインは、１６ヌクレオチドを含んでなる。
【０３０４】
一実施形態では、標的化ドメインは、１７ヌクレオチドを含んでなる。
【０３０５】
一実施形態では、標的化ドメインは、１８ヌクレオチドを含んでなる。
【０３０６】
一実施形態では、標的化ドメインは、１９ヌクレオチドを含んでなる。
【０３０７】
一実施形態では、標的化ドメインは、２０ヌクレオチドを含んでなる。
【０３０８】
一実施形態では、標的化ドメインは、２１ヌクレオチドを含んでなる。
【０３０９】
一実施形態では、標的化ドメインは、２２ヌクレオチドを含んでなる。
【０３１０】
一実施形態では、標的化ドメインは、２３ヌクレオチドを含んでなる。
【０３１１】
一実施形態では、標的化ドメインは、２４ヌクレオチドを含んでなる。
【０３１２】
一実施形態では、標的化ドメインは、２５ヌクレオチドを含んでなる。
【０３１３】
一実施形態では、標的化ドメインは、２６ヌクレオチドを含んでなる。
【０３１４】
標的化ドメインは、下でより詳細に考察される。
【０３１５】
第１の相補的ドメイン
図１Ａ〜１Ｇは、第１の相補的ドメインの例を提供する。
【０３１６】
第１の相補的ドメインは、第２の相補的ドメインと相補的であり、一実施形態では、第２の相補的ドメインと、少なくともいくつかの生理的条件下で二重鎖領域を形成するのに十分な相補性を有する。一実施形態では、第１の相補的ドメインは、５〜３０ヌクレオチド長である。一実施形態では、第１の相補的ドメインは、５〜２５ヌクレオチド長である。一実施形態では、第１の相補的ドメインは、７〜２５ヌクレオチド長である。一実施形態では、第１の相補的ドメインは、７〜２２ヌクレオチド長である。一実施形態では、第１の相補的ドメインは、７〜１８ヌクレオチド長である。一実施形態では、第１の相補的ドメインは、７〜１５ヌクレオチド長である。一実施形態では、第１の相補的ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。
【０３１７】
一実施形態では、第１の相補的ドメインは、５’から３’方向に、５’サブドメイン、中心サブドメイン、および３’サブドメインである、３つのサブドメインを含んでなる。一実施形態では、５’サブドメインは、例えば、４、５、６、７、８または９など、４〜９ヌクレオチド長である。一実施形態では、中心サブドメインは、例えば、１など、１、２、または３ヌクレオチド長である。一実施形態では、３’サブドメインは、例えば、４〜２２、４〜１８、または４〜１０、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５など、３〜２５ヌクレオチド長である。
【０３１８】
第１の相補的ドメインは、天然起源の第１の相補的ドメインとの相同性を共有し、またはそれに由来し得る。一実施形態では、それは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の第１の相補的ドメインなどの本明細書で開示される第１の相補的ドメインと、少なくとも５０％の相同性を有する。
【０３１９】
第１の相補的ドメインのヌクレオチドの一部または全部は、例えば、本明細書のセクションＶＩＩＩに見られる修飾などの修飾を有し得る。
【０３２０】
第１の相補的ドメインは、下でより詳細に考察される。
【０３２１】
連結ドメイン
図１Ａ〜１Ｇは、連結ドメインの例を提供する。
【０３２２】
連結ドメインは、単分子ｇＲＮＡの第１の相補的ドメインと第２の相補的ドメインとを連結するのに役立つ。連結ドメインは、第１および第２の相補的ドメインを共有結合的にまたは非共有結合的に連結し得る。一実施形態では、連結は、共有結合である。一実施形態では、連結ドメインは、第１および第２の相補的ドメインと共有結合的に連結し、例えば、図１Ｂ〜１Ｅを参照されたい。一実施形態では、連結ドメインは、第１の相補的ドメインと第２の相補的ドメインの間に挿入された共有結合であり、またはそれを含んでなる。典型的に、連結ドメインは、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０などの１つまたは複数のヌクレオチドを含んでなる。
【０３２３】
モジュラーｇＲＮＡ分子中では、相補的ドメインのハイブリダイゼーションによって、２つの分子が結合され、例えば、図１Ａを参照されたい。
【０３２４】
多種多様な連結ドメインが、単分子ｇＲＮＡ分子中で使用するのに適する。連結ドメインは、共有結合からなり得て、または例えば、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長などの１つまたは少数のヌクレオチド程度に短くあり得る。一実施形態では、連結ドメインは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５ヌクレオチド長以上である。一実施形態では、連結ドメインは、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１０、または２〜５ヌクレオチド長である。一実施形態では、連結ドメインは、例えば、第２の相補的ドメインに対して５’であるｔｒａｃｒＲＮＡの配列などの天然起源配列と相同性を共有し、またはそれに由来する。一実施形態では、連結ドメインは、本明細書で開示される連結ドメインと、少なくとも５０％の相同性を有する。
【０３２５】
連結ドメインのヌクレオチドの一部または全部は、例えば、本明細書のセクションＶＩＩＩに見られる修飾などの修飾を有し得る。
【０３２６】
連結ドメインは、下でより詳細に考察される。
【０３２７】
５’伸長ドメイン
一実施形態では、モジュラーｇＲＮＡは、本明細書で５’伸長ドメインと称される、第２の相補的ドメインに対して５’の追加的な配列を含んでなり得て、例えば、図１Ａを参照されたい。一実施形態では、５’伸長ドメインは、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、または２〜４ヌクレオチド長である。一実施形態では、５’伸長ドメインは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長以上である。
【０３２８】
第２の相補的ドメイン
図１Ａ〜１Ｇは、第２の相補的ドメインの例を提供する。
【０３２９】
第２の相補的ドメインは、第１の相補的ドメインと相補的であり、一実施形態では、第２の相補的ドメインと、少なくともいくつかの生理的条件下で二重鎖領域を形成するのに十分な相補性を有する。例えば、図１Ａ〜図１Ｂに示されるように、一実施形態では、第２の相補的ドメインは、例えば、二重鎖領域からループアウトする配列などの第１の相補的ドメインとの相補性を欠く配列を含み得る。一実施形態では、第２の相補的ドメインは、５〜２７ヌクレオチド長である。一実施形態では、それは、第１の相補性領域より長い。
【０３３０】
一実施形態では、第２の相補的ドメインは、７〜２７ヌクレオチド長である。一実施形態では、第２の相補的ドメインは、７〜２５ヌクレオチド長である。一実施形態では、第２の相補的ドメインは、７〜２０ヌクレオチド長である。一実施形態では、第２の相補的ドメインは、７〜１７ヌクレオチド長である。一実施形態では、相補的ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長である。
【０３３１】
一実施形態では、第２の相補的ドメインは、５’から３’方向に、５’サブドメイン、中心サブドメイン、および３’サブドメインである、３つのサブドメインを含んでなる。一実施形態では、５’サブドメインは、例えば、４〜２２、４〜１８、または４〜１０、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５など、３〜２５ヌクレオチド長である。一実施形態では、中心サブドメインは、例えば、３など、１、２、３、４または５ヌクレオチド長である。一実施形態では、３’サブドメインは、例えば、４、５、６、７、８または９など、４〜９ヌクレオチド長である。
【０３３２】
一実施形態では、第１の相補的ドメインの５’サブドメインおよび３’サブドメインは、第２の相補的ドメインの３’サブドメインおよび５’サブドメインとそれぞれ相補的であり、例えば、完全に相補的である。
【０３３３】
第２の相補的ドメインは、天然起源の第２の相補的ドメインとの相同性を共有し、またはそれに由来し得る。一実施形態では、それは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の第１の相補的ドメインなどの本明細書で開示される第２の相補的ドメインと、少なくとも５０％の相同性を有する。
【０３３４】
第２の相補的ドメインのヌクレオチドの一部または全部は、例えば、本明細書のセクションＶＩＩＩに見られる修飾などの修飾を有し得る。
【０３３５】
隣接ドメイン
図１Ａ〜１Ｇは、隣接ドメインの例を提供する。
【０３３６】
一実施形態では、隣接ドメインは、５〜２０ヌクレオチド長である。一実施形態では、隣接ドメインは、天然起源隣接ドメインと相同性を共有し、またはそれに由来し得る。一実施形態では、それは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）隣接ドメインなどの本明細書で開示される隣接ドメインと、少なくとも５０％の相同性を有する。
【０３３７】
隣接ドメインのヌクレオチドの一部または全部は、例えば、本明細書のセクションＶＩＩＩに見られる修飾などの修飾を有し得る。
【０３３８】
７）テールドメイン
図１Ａ〜１Ｇは、テールドメインの例を提供する。
【０３３９】
図１Ａおよび図１Ｂ〜１Ｆのテールドメインの検査によって見られるように、広範囲のテールドメインが、ｇＲＮＡ分子で使用するのに適する。一実施形態では、テールドメインは、０（不在）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長である。一実施形態では、テールドメインヌクレオチドは、天然起源テールドメインの５’末端からの配列に由来し、またはそれと相同性を共有し、例えば、図１Ｄまたは図１Ｅを参照されたい。一実施形態では、テールドメインは、互いに相補的で、少なくともいくつかの生理的条件下では、二重鎖領域を形成する配列を含む。
【０３４０】
一実施形態では、テールドメインは、不在であり、または１〜５０ヌクレオチド長である。一実施形態では、テールドメインは、天然起源隣接テールドメインと相同性を共有し、またはそれに由来し得る。一実施形態では、それは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）テールドメインなどの本明細書で開示されるテールドメインと、少なくとも５０％の相同性を有する。
【０３４１】
一実施形態では、テールドメインは、生体外または生体内転写法に関連する、３’末端のヌクレオチドを含む。ｇＲＮＡの生体外転写のためにＴ７プロモーターが使用される場合、これらのヌクレオチドは、ＤＮＡテンプレートの３’末端の前に存在する、任意のヌクレオチドであってもよい。生体内転写のためにＵ６プロモーターが使用される場合、これらのヌクレオチドは、ＵＵＵＵＵＵ配列であってもよい。交互の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが利用される場合、これらのヌクレオチドは、様々な数であってもまたはウラシル塩基であってもよく、または交互の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）塩基を含んでもよい。
【０３４２】
ｇＲＮＡ分子のドメインは、下で詳述される。
【０３４３】
標的化ドメイン
ｇＲＮＡの「標的化ドメイン」は、標的核酸上の「標的ドメイン」と相補的である。コアドメイン標的を含んでなる標的核酸鎖は、本明細書で標的核酸の「相補鎖」と称される。標的化ドメインの選択の指標は、例えば、Ｆｕ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１４（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８）およびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ  ＳＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３０１１）にある。
【０３４４】
一実施形態では、標的化ドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長である。
【０３４５】
一実施形態では、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。
【０３４６】
一実施形態では、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。
【０３４７】
一実施形態では、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。
【０３４８】
一実施形態では、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。
【０３４９】
一実施形態では、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。
【０３５０】
一実施形態では、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。
【０３５１】
一実施形態では、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。
【０３５２】
一実施形態では、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。
【０３５３】
一実施形態では、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。
【０３５４】
一実施形態では、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。
【０３５５】
一実施形態では、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。
【０３５６】
一実施形態では、標的化ドメインは、１６ヌクレオチドを含んでなる。
【０３５７】
一実施形態では、標的化ドメインは、１７ヌクレオチドを含んでなる。
【０３５８】
一実施形態では、標的化ドメインは、１８ヌクレオチドを含んでなる。
【０３５９】
一実施形態では、標的化ドメインは、１９ヌクレオチドを含んでなる。
【０３６０】
一実施形態では、標的化ドメインは、２０ヌクレオチドを含んでなる。
【０３６１】
一実施形態では、標的化ドメインは、２１ヌクレオチドを含んでなる。
【０３６２】
一実施形態では、標的化ドメインは、２２ヌクレオチドを含んでなる。
【０３６３】
一実施形態では、標的化ドメインは、２３ヌクレオチドを含んでなる。
【０３６４】
一実施形態では、標的化ドメインは、２４ヌクレオチドを含んでなる。
【０３６５】
一実施形態では、標的化ドメインは、２５ヌクレオチドを含んでなる。
【０３６６】
一実施形態では、標的化ドメインは、２６ヌクレオチドを含んでなる。一実施形態では、標的化ドメインは、１０＋／−５、２０＋／−５、３０＋／−５、４０＋／−５、５０＋／−５、６０＋／−５、７０＋／−５、８０＋／−５、９０＋／−５、または１００＋／−５ヌクレオチド長である。
【０３６７】
一実施形態では、標的化ドメインは、２０＋／−５ヌクレオチド長である。
【０３６８】
一実施形態では、標的化ドメインは、２０＋／−１０、３０＋／−１０、４０＋／−１０、５０＋／−１０、６０＋／−１０、７０＋／−１０、８０＋／−１０、９０＋／−１０、または１００＋／−１０ヌクレオチド長である。
【０３６９】
一実施形態では、標的化ドメインは、３０＋／−１０ヌクレオチド長である。
【０３７０】
一実施形態では、標的化ドメインは、１０〜１００、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０または１０〜１５ヌクレオチド長である。
【０３７１】
他の実施形態では、標的化ドメインは、２０〜１００、２０〜９０、２０〜８０、２０〜７０、２０〜６０、２０〜５０、２０４０、２０〜３０、または２０〜２５ヌクレオチド長である。
【０３７２】
典型的に標的化ドメインは、標的配列との完全相補性を有する。いくつかの実施形態では標的化ドメインは、標的化ドメインの対応するヌクレオチドと相補的でない、１、２、３、４、５、６、７または８ヌクレオチドを有し、またはそれを含む。
【０３７３】
一実施形態では、標的ドメインは、その５’末端の５ヌクレオチド以内にある、標的化ドメインの対応するヌクレオチドと相補的な１、２、３、４または５ヌクレオチドを含む。一実施形態では、標的ドメインは、その３’末端の５ヌクレオチド以内にある、標的化ドメインの対応するヌクレオチドと相補的な１、２、３、４または５ヌクレオチドを含む。
【０３７４】
一実施形態では、標的ドメインは、その５’末端の５ヌクレオチド以内にある、標的化ドメインの対応するヌクレオチドと相補的でない、１、２、３または４ヌクレオチドを含む。一実施形態では、標的ドメインは、その３’末端の５ヌクレオチド以内にある、標的化ドメインの対応するヌクレオチドと相補的でない、１、２、３または４ヌクレオチドを含む。
【０３７５】
一実施形態では、相補性の程度は、ｇＲＮＡのその他の性質と合わせて、Ｃａｓ９分子の標的核酸への標的化を可能にするのに十分である。
【０３７６】
いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、例えば、標的化ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、標的化ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた、２つの連続する非相補的ヌクレオチドなどの標的ドメインと相補的でない２連続ヌクレオチド（「非相補的ヌクレオチド」）を含んでなる。
【０３７７】
一実施形態では、標的化ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、標的化ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた領域内にある２連続ヌクレオチドは、いずれも標的化ドメインと相補的でない。
【０３７８】
一実施形態では、標的化ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内、標的化ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内、または標的化ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた領域内に、非相補的ヌクレオチドはない。
【０３７９】
一実施形態では、標的化ドメインヌクレオチドは、例えば、セクションＶＩＩＩで提供されるタイプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、標的化ドメインは、例えば、分解の影響を受けにくくする、または例えば、より低い免疫原性などより生体適合性にする修飾などの１つまたは複数の修飾を含んでなる。一例として、標的化ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで、またはセクションＶＩＩＩからのその他の修飾で、修飾され得る。一実施形態では、標的化ドメインのヌクレオチドは、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化、またはセクションＶＩＩＩからのその他の修飾などの２’修飾を含んでなり得る。
【０３８０】
いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、１、２、３、４、５、６、７または８つ以上の修飾を含む。一実施形態では、標的化ドメインは、その５’末端の５ヌクレオチド以内にある、１、２、３、または４つの修飾を含む。一実施形態では、標的化ドメインは、その３’末端の５ヌクレオチド以内にある、１、２、３、または４程度の数の修飾を含んでなる。
【０３８１】
いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、例えば、標的化ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、標的化ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチドなどの２連続ヌクレオチドの修飾を含んでなる。
【０３８２】
一実施形態では、標的化ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、標的化ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた領域内にある２連続ヌクレオチドは、いずれも修飾されていない。一実施形態では、標的化ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、標的化ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた領域内にあるヌクレオチドは、いずれも修飾されていない。
【０３８３】
標的化ドメイン中の修飾は、セクションＩＶに記載されるシステム中で候補修飾を試験することで評価され得る標的化効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補標的化ドメインを有するｇＲＮＡは、セクションＩＶのシステム中で評価され得る。候補標的化ドメインは、選択された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得る。
【０３８４】
いくつかの実施形態では、全ての修飾ヌクレオチドは、標的ドメイン中に存在する対応するヌクレオチドと相補的であり、ハイブリダイズできる。他の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７または８つ以上の修飾ヌクレオチドは、標的ドメイン中に存在する対応するヌクレオチドと相補的でなくまたはハイブリダイズできない。
【０３８５】
一実施形態では、標的化ドメインは、好ましくは、５’→３’方向に、二次ドメインおよびコアドメインを含んでなる。これらのドメインは、下でより詳細に考察される。
【０３８６】
標的化ドメインのコアドメインおよび二次ドメイン
標的化ドメインの「コアドメイン」は、標的核酸上の「コアドメイン標的」と相補的である。一実施形態では、コアドメインは、標的化ドメインの３’末端から約８〜約１３ヌクレオチド（例えば、標的化ドメインの最も３’側の８〜１３ヌクレオチド）を含んでなる。
【０３８７】
一実施形態では、二次ドメインは不在であり、または任意選択である。
【０３８８】
一実施形態では、コアドメインおよび標的化ドメインは、独立して６＋／−２、７＋／−２、８＋／−２、９＋／−２、１０＋／−２、１１＋／−２、１２＋／−２、１３＋／−２、１４＋／−２、１５＋／−２、または１６＋−２ヌクレオチド長である。
【０３８９】
一実施形態では、コアドメインおよび標的化ドメインは、独立して１０＋／−２ヌクレオチド長である。
【０３９０】
一実施形態では、コアドメインおよび標的化ドメインは、独立して１０＋／−４ヌクレオチド長である。
【０３９１】
一実施形態では、コアドメインおよび標的化ドメインは、独立して６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６ヌクレオチド長である。
【０３９２】
一実施形態では、コアおよび標的化ドメインは、独立して３〜２０、４〜２０、５〜２０、６〜２０、７〜２０、８〜２０、９〜２０、１０〜２０または１５〜２０ヌクレオチド長である。
【０３９３】
一実施形態では、コアおよび標的化ドメインは、独立して、例えば、６〜１５、７〜１４、７〜１３、６〜１２、７〜１２、７〜１１、７〜１０、８〜１４、８〜１３、８〜１２、８〜１１、８〜１０または８〜９など３〜１５ヌクレオチド長である。
【０３９４】
コアドメインは、コアドメイン標的と相補的である。典型的に、コアドメインは、コアドメイン標的との正確な相補性を有する。いくつかの実施形態では、コアドメインは、コアドメインの対応するヌクレオチドと相補的でない、１、２、３、４または５ヌクレオチドを有し得る。一実施形態では、相補性の程度は、ｇＲＮＡのその他の性質と合わせて、Ｃａｓ９分子の標的核酸への標的化を可能にするのに十分である。
【０３９５】
ｇＲＮＡの標的化ドメインの「二次ドメイン」は、標的核酸の「二次ドメイン標的」と相補的である。
【０３９６】
一実施形態では、二次ドメインは、コアドメインに対して５’に配置される。
【０３９７】
一実施形態では、二次ドメインは不在であり、または任意選択である。
【０３９８】
一実施形態では、標的化ドメインが、２６ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、１２〜１７ヌクレオチド長である。
【０３９９】
一実施形態では、標的化ドメインが、２５ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、１２〜１７ヌクレオチド長である。
【０４００】
一実施形態では、標的化ドメインが、２４ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、１１〜１６ヌクレオチド長である。
【０４０１】
一実施形態では、標的化ドメインが、２３ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、１０〜１５ヌクレオチド長である。
【０４０２】
一実施形態では、標的化ドメインが、２２ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、９〜１４ヌクレオチド長である。
【０４０３】
一実施形態では、標的化ドメインが、２１ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、８〜１３ヌクレオチド長である。
【０４０４】
一実施形態では、標的化ドメインが、２０ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、７〜１２ヌクレオチド長である。
【０４０５】
一実施形態では、標的化ドメインが、１９ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、６〜１１ヌクレオチド長である。
【０４０６】
一実施形態では、標的化ドメインが、１８ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、５〜１０ヌクレオチド長である。
【０４０７】
一実施形態では、標的化ドメインが、１７ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、４〜９ヌクレオチド長である。
【０４０８】
一実施形態では、標的化ドメインが、１６ヌクレオチド長であり、コアドメイン（標的化ドメインの３’末端から数えられる）が、８〜１３ヌクレオチド長であれば、二次ドメインは、３〜８ヌクレオチド長である。
【０４０９】
一実施形態では、二次ドメインは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチド長である。
【０４１０】
二次ドメインは、二次ドメイン標的と相補的である。典型的に、二次ドメインは、二次ドメイン標的との正確な相補性を有する。いくつかの実施形態では、二次ドメインは、二次ドメインの対応するヌクレオチドと相補的でない、１、２、３、４または５ヌクレオチドを有し得る。一実施形態では、相補性の程度は、ｇＲＮＡのその他の性質と合わせて、Ｃａｓ９分子の標的核酸への標的化を可能にするのに十分である。
【０４１１】
一実施形態では、コアドメインヌクレオチドは、例えば、セクションＶＩＩＩで提供されるタイプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、コアドメインは、例えば、分解の影響を受けにくくする、または例えば、より低い免疫原性などより生体適合性にする修飾などの１つまたは複数の修飾を含んでなる。一例として、コアドメインの骨格は、ホスホロチオエートで、またはセクションＶＩＩＩからのその他の修飾で、修飾され得る。一実施形態では、コアドメインのヌクレオチドは、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化、またはセクションＶＩＩＩからのその他の修飾などの２’修飾（例えば、リボース上の２’位における修飾）を含んでなり得る。典型的に、コアドメインは、１、２、または３つ以下の修飾を含有する。
【０４１２】
コアドメイン中の修飾は、セクションＩＶに記載されるシステム中で候補修飾を試験することで評価され得る標的化効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補コアドメインを有するｇＲＮＡは、セクションＩＶに記載されるシステム中で評価され得る。候補コアドメインは、選択された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得る。
【０４１３】
一実施形態では、二次ドメインヌクレオチドは、例えば、セクションＶＩＩＩで提供されるタイプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、二次ドメインは、例えば、分解の影響を受けにくくする、または例えば、より低い免疫原性などより生体適合性にする修飾などの１つまたは複数の修飾を含んでなる。一例として、二次ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで、またはセクションＶＩＩＩからのその他の修飾で、修飾され得る。一実施形態では、二次ドメインのヌクレオチドは、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化、またはセクションＶＩＩＩからのその他の修飾などの２’修飾を含んでなり得る。典型的に、二次ドメインは、１、２、または３つ以下の修飾を含有する。
【０４１４】
二次ドメイン中の修飾は、セクションＩＶに記載されるシステム中で候補修飾を試験することで評価され得る標的化効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補二次ドメインを有するｇＲＮＡは、セクションＩＶに記載されるシステム中で評価され得る。候補二次ドメインは、選択された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得る。
【０４１５】
一実施形態では、（１）コアドメインとその標的の間の相補性程度、および（２）二次ドメインとその標的の間の相補性程度は、異なってもよい。一実施形態では、（１）が、（２）を上回ってもよい。一実施形態では、（１）が、（２）を下回ってもよい。一実施形態では、（１）および（２）が同一であってもよく、例えば、それぞれが、その標的と完全に相補的であってもよい。
【０４１６】
一実施形態では、（１）コアドメインのヌクレオチドの修飾数（例えば、セクションＶＩＩＩからの修飾）、および（２）二次ドメインのヌクレオチドの修飾数（例えば、セクションＶＩＩＩからの修飾）は、異なってもよい。一実施形態では、（１）が、（２）を下回ってもよい。一実施形態では、（１）が、（２）を上回ってもよい。一実施形態では、（１）および（２）が同一であり、例えば、それぞれが、修飾を含まなくてもよい。
【０４１７】
第１および第２の相補的ドメイン
第１の相補的ドメインは、第２の相補的ドメインと相補的である。
【０４１８】
典型的に第１の相補的ドメインは、第２の相補的ドメイン標的との正確な相補性を有しない。いくつかの実施形態では、第１の相補的ドメインは、第２の相補的ドメインの対応するヌクレオチドと相補的でない１、２、３、４または５ヌクレオチドを有し得る。一実施形態では、例えば、３ヌクレオチドなどの１、２、３、４、５または６ヌクレオチドは、二本鎖中で対合せず、例えば、非二重鎖領域またはループアウト領域を形成する。一実施形態では、例えば、３ヌクレオチドのループアウトなどの不対またはループアウト領域が、第２の相補的ドメイン上に存在する。一実施形態では、不対領域は、第２の相補的ドメインの５’末端から例えば、４番目などの１、２、３、４、５、または６番目のヌクレオチドで開始する。
【０４１９】
一実施形態では、相補性の程度は、ｇＲＮＡのその他の性質と合わせて、Ｃａｓ９分子の標的核酸への標的化を可能にするのに十分である。
【０４２０】
一実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、
独立して、６＋／−２、７＋／−２、８＋／−２、９＋／−２、１０＋／−２、１１＋／−２、１２＋／−２、１３＋／−２、１４＋／−２、１５＋／−２、１６＋／−２、１７＋／−２、１８＋／−２、１９＋／−２、または２０＋／−２、２１＋／−２、２２＋／−２、２３＋／−２、または２４＋／−２ヌクレオチド長；
独立して、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長；または
独立して、５〜２４、５〜２３、５〜２２、５〜２１、５〜２０、７〜１８、９〜１６、または１０〜１４ヌクレオチド長
である。
【０４２１】
一実施形態では、第２の相補的ドメインは、例えば、第１の相補的ドメインよりもヌクレオチドが６個分より長いなど、例えば、２、３、４、５、または６個分より長い。
【０４２２】
一実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、独立して、例えば、セクションＶＩＩＩで提供されるタイプの修飾などの修飾を含まない。
【０４２３】
一実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、独立して、例えば、ドメインが分解の影響を受けにくくする、または例えば、それをより低い免疫原性などより生体適合性にする修飾などの１つまたは複数の修飾を含んでなる。一例として、ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで、またはセクションＶＩＩＩからのその他の修飾で、修飾され得る。一実施形態では、ドメインのヌクレオチドは、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化、またはセクションＶＩＩＩからのその他の修飾などの２’修飾を含んでなり得る。
【０４２４】
一実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、独立して、１、２、３、４、５、６、７または８つ以上の修飾を含む。一実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、独立して、その５’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４つの修飾を含む。一実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、独立して、その３’末端の２ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含む。
【０４２５】
一実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、独立して、例えば、ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、またはドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチドなどの２連続ヌクレオチドに、修飾を含む。一実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、独立して、ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、またはドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた領域内にある修飾された２連続ヌクレオチドを含まない。一実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、独立して、ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、またはドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた領域内にある、修飾されたヌクレオチドを含まない。
【０４２６】
相補的ドメイン中の修飾は、セクションＩＶに記載されるシステム中で候補修飾を試験することで評価され得る標的化効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補相補的ドメインを有するｇＲＮＡは、セクションＩＶに記載されるシステム中で評価され得る。候補相補的ドメインは、選択された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得る。
【０４２７】
一実施形態では、第１の相補的ドメインは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの天然起源の第１の相補的ドメイン、または例えば、図１Ａ〜１Ｇなどで本明細書に記載される第１の相補的ドメインなどの、参照の第１の相補的ドメインと、少なくとも６０、７０、８０、８５％、９０％または９５％の相同性を有し、またはそれと１、２、３、４、５、または６個以下のヌクレオチドが異なる。
【０４２８】
一実施形態では、第２の相補的ドメインは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの天然起源の第２の相補的ドメイン、または例えば、図１Ａ〜１Ｇなどで本明細書に記載される第２の相補的ドメインなどの、参照の第２の相補的ドメインと、少なくとも６０、７０、８０、８５％、９０％、または９５％の相同性を有し、またはそれと１、２、３、４、５、または６個以下のヌクレオチドが異なる。
【０４２９】
第１および第２の相補的ドメインによって形成される二重鎖領域は、典型的に６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２塩基対長である（任意のループアウトまたは不対ヌクレオチドを除いて）。
【０４３０】
いくつかの実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、二重鎖化した際に、例えば、ｇＲＮＡ配列中の１１の対形成ヌクレオチドを含んでなる（１つの対形成鎖は下線付き、１つは太字）。
【化２５】
2020062029.tif 000026
【０４３１】
いくつかの実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、二重鎖化した際に、例えば、ｇＲＮＡ配列の１５の対形成ヌクレオチドを含んでなる（１つの対形成鎖は下線付き、１つは太字）。
【化２６】
2020062029.tif 000027
【０４３２】
いくつかの実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、二重鎖化した際に、例えば、ｇＲＮＡ配列中の１６の対形成ヌクレオチドを含んでなる（１つの対形成鎖は下線付き、１つは太字）。
【化２７】
2020062029.tif 000028
【０４３３】
いくつかの実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、二重鎖化した際に、例えば、ｇＲＮＡ配列中の２１の対形成ヌクレオチドを含んでなる（１つの対形成鎖は下線付き、１つは太字）。
【化２８】
2020062029.tif 000029
【０４３４】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、交換されて、例えばｇＲＮＡ配列中のポリ−Ｕ配列が除去される（交換ヌクレオチドは下線付き）。
【化２９】
2020062029.tif 000030
【０４３５】
５’伸長ドメイン
一実施形態では、モジュラーｇＲＮＡは、第２の相補的ドメインに対して５’の追加的な配列を含んでなり得る。一実施形態では、５’伸長ドメインは、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、または２〜４ヌクレオチド長である。一実施形態では、５’伸長ドメインは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長以上である。
【０４３６】
一実施形態では、５’伸長ドメインヌクレオチドは、例えば、セクションＶＩＩＩで提供されるタイプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、分解の影響を受けにくくする、または例えば、より低い免疫原性などより生体適合性にする修飾などの１つまたは複数の修飾を含んでなる。一例として、５’伸長ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで、またはセクションＶＩＩＩからのその他の修飾で、修飾され得る。一実施形態では、５’伸長ドメインのヌクレオチドは、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化、またはセクションＶＩＩＩからのその他の修飾などの２’修飾を含んでなり得る。
【０４３７】
いくつかの実施形態では、５’伸長ドメインは、１、２、３、４、５、６、７または８程度の数の修飾を含んでなり得る。一実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、モジュラーｇＲＮＡ分子中などのその５’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含んでなる。一実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、モジュラーｇＲＮＡ分子中などのその３’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含んでなる。
【０４３８】
いくつかの実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、５’伸長ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、５’伸長ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または５’伸長ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチドなどの２連続ヌクレオチドに、修飾を含んでなる。一実施形態では、５’伸長ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、５’伸長ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または５’伸長ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチドは、修飾されていない。一実施形態では、５’伸長ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、５’伸長ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または５’伸長ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れたクレオチドは、修飾されていない。
【０４３９】
５’伸長ドメイン中の修飾は、セクションＩＶに記載されるシステム中で候補修飾を試験することで評価されるｇＲＮＡ分子効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補５’伸長ドメインを有するｇＲＮＡは、セクションＩＶに記載されるシステム中で評価され得る。候補５’伸長ドメインは、選択された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得る。
【０４４０】
一実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの天然起源の５’伸長ドメインと、例えば、図１Ａおよび図１Ｇで本明細書に記載される５’伸長ドメインなどの参照５’伸長ドメインと、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％の相同性を有し、またはそれと１、２、３、４、５、または６個以下のヌクレオチドが異なる。
【０４４１】
連結ドメイン
単分子ｇＲＮＡ分子中では、連結ドメインは、第１および第２の相補的ドメインの間に配置される。モジュラーｇＲＮＡ分子中では、２つの分子は、互いに相補的ドメインによって結合する。
【０４４２】
一実施形態では、連結ドメインは、１０＋／−５、２０＋／−５、３０＋／−５、４０＋／−５、５０＋／−５、６０＋／−５、７０＋／−５、８０＋／−５、９０＋／−５、または１００＋／−５ヌクレオチド長である。
【０４４３】
一実施形態では、連結ドメインは、２０＋／−１０、３０＋／−１０、４０＋／−１０、５０＋／−１０、６０＋／−１０、７０＋／−１０、８０＋／−１０、９０＋／−１０、または１００＋／−１０ヌクレオチド長である。
【０４４４】
一実施形態では、連結ドメインは、１０〜１００、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０または１０〜１５ヌクレオチド長である。他の実施形態では、連結ドメインは、２０〜１００、２０〜９０、２０〜８０、２０〜７０、２０〜６０、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３０、または２０〜２５ヌクレオチド長である。
【０４４５】
一実施形態では、連結ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長である。
【０４４６】
一実施形態では、連結ドメインは、共有結合である。
【０４４７】
一実施形態では、連結ドメインは、典型的に、第１の相補的ドメインの３’末端、および／または第２の相補的ドメインの５−末端に隣接する、またはそれから１、２、または３ヌクレオチド以内である、二重鎖領域を含んでなる。一実施形態では、二重鎖領域は、２０＋／−１０塩基対の長さであり得る。一実施形態では、二重鎖領域は、１０＋／−５、１５＋／−５、２０＋／−５、または３０＋／−５塩基対の長さであり得る。一実施形態では、二重鎖領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５塩基対の長さであり得る。
【０４４８】
典型的に、二重鎖領域を形成する配列は、互いに正確な相補性を有するが、いくつかの実施形態では１、２、３、４、５、６、７または８個程度の数のヌクレオチドが、対応するヌクレオチドと相補的でない。
【０４４９】
一実施形態では、連結ドメインヌクレオチドは、例えば、セクションＶＩＩＩで提供されるタイプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、連結ドメインは、例えば、分解の影響を受けにくくする、または例えば、より低い免疫原性などより生体適合性にする修飾などの１つまたは複数の修飾を含んでなる。一例として、連結ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで、またはセクションＶＩＩＩからのその他の修飾で、修飾され得る。一実施形態では、連結ドメインのヌクレオチドは、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化、またはセクションＶＩＩＩからのその他の修飾などの２’修飾を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、連結ドメインは、１、２、３、４、５、６、７または８程度の数の修飾を含んでなり得る。
【０４５０】
連結ドメイン中の修飾は、セクションＩＶに記載されるシステム中で候補修飾を試験することで評価され得る標的化効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補連結ドメインを有するｇＲＮＡは、セクションＩＶに記載されるシステム中で評価され得る。候補連結ドメインは、選択された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得る。
【０４５１】
一実施形態では、連結ドメインは、例えば、図１Ａ〜１Ｇで本明細書に記載される連結ドメインなどの参照連結ドメインと、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％の相同性を有し、またそれと１、２、３、４、５，または６個以下のヌクレオチドが異なる。
【０４５２】
隣接ドメイン
一実施形態では、隣接ドメインは、６＋／−２、７＋／−２、８＋／−２、９＋／−２、１０＋／−２、１１＋／−２、１２＋／−２、１３＋／−２、１４＋／−２、１４＋／−２、１６＋／−２、１７＋／−２、１８＋／−２ヌクレオチド長である。
【０４５３】
一実施形態では、隣接ドメインは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１４、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長である。
【０４５４】
一実施形態では、隣接ドメインは、５〜２０、７〜１８、９〜１６、または１０〜１４ヌクレオチド長である。
【０４５５】
一実施形態では、隣接ドメインヌクレオチドは、例えば、セクションＶＩＩＩで提供されるタイプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、隣接ドメインは、例えば、分解の影響を受けにくくする、または例えば、より低い免疫原性などより生体適合性にする修飾などの１つまたは複数の修飾を含んでなる。一例として、隣接ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで、またはセクションＶＩＩＩからのその他の修飾で、修飾され得る。一実施形態では、隣接ドメインのヌクレオチドは、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化、またはセクションＶＩＩＩからのその他の修飾などの２’修飾を含んでなり得る。
【０４５６】
いくつかの実施形態では、隣接ドメインは、１、２、３、４、５、６、７または８程度の数の修飾を含んでなり得る。一実施形態では、隣接ドメインは、例えば、モジュラーｇＲＮＡ分子中などのその５’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含んでなる。一実施形態では、標的ドメインは、例えば、モジュラーｇＲＮＡ分子中などのその３’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含んでなる。
【０４５７】
いくつかの実施形態では、隣接ドメインは、例えば、隣接ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、隣接ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または隣接ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチドなどの２連続ヌクレオチドの修飾を含んでなる。一実施形態では、隣接ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、隣接ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または隣接ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチドは、修飾されていない。一実施形態では、隣接ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、隣接ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または隣接ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れたヌクレオチドは、修飾されていない。
【０４５８】
隣接ドメイン中の修飾は、セクションＩＶに記載されるシステム中で候補修飾を試験することで評価されるｇＲＮＡ分子効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補隣接ドメインを有するｇＲＮＡは、セクションＩＶに記載されるシステム中で評価され得る。候補隣接ドメインは、選択された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得る。
【０４５９】
一実施形態では、隣接ドメインは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの天然起源の隣接ドメインと、または例えば、図１Ａ〜１Ｇで本明細書に記載される隣接ドメインなどの参照隣接ドメインと、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％の相同性を有し、またはそれと１、２、３、４、５，または６個以下のヌクレオチドが異なる。
【０４６０】
テールドメイン
一実施形態では、テールドメインは、１０＋／−５、２０＋／−５、３０＋／−５、４０＋／−５、５０＋／−５、６０＋／−５、７０＋／−５、８０＋／−５、９０＋／−５、または１００＋／−５ヌクレオチド長である。
【０４６１】
一実施形態では、テールドメインは、２０＋／−５ヌクレオチド長である。
【０４６２】
一実施形態では、テールドメインは、２０＋／−１０、３０＋／−１０、４０＋／−１０、５０＋／−１０、６０＋／−１０、７０＋／−１０、８０＋／−１０、９０＋／−１０、または１００＋／−１０ヌクレオチド長である。
【０４６３】
一実施形態では、テールドメインは、２５＋／−１０ヌクレオチド長である。
【０４６４】
一実施形態では、テールドメインは、１０〜１００、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０または１０〜１５ヌクレオチド長である。
【０４６５】
他の実施形態では、テールドメインは、２０〜１００、２０〜９０、２０〜８０、２０〜７０、２０〜６０、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３０、または２０〜２５ヌクレオチド長である。
【０４６６】
一実施形態では、テールドメインは、１〜２０、１〜１、１〜１０、または１〜５ヌクレオチド長である。
【０４６７】
一実施形態では、テールドメインヌクレオチドは、例えば、セクションＶＩＩＩで提供されるタイプの修飾などの修飾を含まない。しかし、一実施形態では、テールドメインは、例えば、分解の影響を受けにくくする、または例えば、より低い免疫原性などより生体適合性にする修飾などの１つまたは複数の修飾を含んでなる。一例として、テールドメインの骨格は、ホスホロチオエートで、またはセクションＶＩＩＩからのその他の修飾で、修飾され得る。一実施形態では、テールドメインのヌクレオチドは、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化、またはセクションＶＩＩＩからのその他の修飾などの２’修飾を含んでなり得る。
【０４６８】
いくつかの実施形態では、テールドメインは、１、２、３、４、５、６、７または８程度の数の修飾を有し得る。一実施形態では、標的ドメインは、その５’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含んでなる。一実施形態では、標的ドメインは、その３’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含んでなる。
【０４６９】
一実施形態では、テールドメインは、テール二重鎖領域を形成し得る、テール二本鎖ドメインを含んでなる。一実施形態では、テール二重鎖領域は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２塩基対の長さであり得る。一実施形態では、テール二重鎖ドメインに対して３’に、さらなる一本鎖ドメインが存在する。一実施形態では、このドメインは、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長である。一実施形態では、これは、４〜６ヌクレオチド長である。
【０４７０】
一実施形態では、テールドメインは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の天然起源のテールドメイン、または例えば、図１Ａ〜１Ｇで本明細書に記載されるテールドメインなどの参照テールドメインと、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９８または９９％の相同性を有し、または１、２、３、４、５，または６個以下のヌクレオチドが異なる。
【０４７１】
一実施形態では、隣接およびテールドメインは、一緒になって、以下の配列を構成する。
【化３０】
2020062029.tif 000031
【０４７２】
一実施形態では、テールドメインは、例えば、転写のためにＵ６プロモーターが使用される場合などに、３’配列ＵＵＵＵＵＵを含んでなる。
【０４７３】
一実施形態では、テールドメインは、例えば、転写のためにＨ１プロモーターが使用される場合などに、３’配列ＵＵＵＵを含んでなる。
【０４７４】
一実施形態では、テールドメインは、例えば、使用されるｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターの終結シグナル次第で、変動する３’Ｕの数を含んでなる。
【０４７５】
一実施形態では、テールドメインは、Ｔ７プロモーターが使用される場合、ＤＮＡテンプレートに由来する変動する３’配列を含んでなる。
【０４７６】
一実施形態では、テールドメインは、例えば、ＲＮＡ分子を生成するために、生体外転写が使用される場合などに、ＤＮＡテンプレートに由来する変動する３’配列を含んでなる。
【０４７７】
一実施形態では、テールドメインは、例えば、転写を駆動するために、ｐｏｌ−ＩＩプロモーターが使用される場合などに、ＤＮＡテンプレートに由来する変動する３’配列を含んでなる。
【０４７８】
テールドメイン中の修飾は、セクションＩＶに記載されるシステム中で候補修飾を試験することで評価され得る標的化効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補テールドメインを有するｇＲＮＡは、セクションＩＶに記載されるシステム中で評価され得る。候補テールドメインは、選択された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得る。
【０４７９】
いくつかの実施形態では、テールドメインは、例えば、テールドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、テールドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、またはテールドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチドなどの２連続ヌクレオチドの修飾を含んでなる。一実施形態では、テールドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、テールドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、またはテールドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチドは、修飾されていない。一実施形態では、テールドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、テールドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、またはテールドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れたヌクレオチドは、修飾されていない。
【０４８０】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、
５’［標的化ドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［連結ドメイン］−［第２の相補的ドメイン］−［隣接ドメイン］−［テールドメイン］−３’の構造を有し、
式中、
標的化ドメインは、コアドメインおよび任意選択的に二次ドメインを含んでなり、１０〜５０ヌクレオチド長であり；
第１の相補的ドメインは、５〜２５ヌクレオチド長であり、一実施形態では、本明細書で開示される参照の第１の相補的ドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％の相同性を有し；
連結ドメインは、１〜５ヌクレオチド長であり；
隣接ドメインは、５〜２０ヌクレオチド長であり、一実施形態では、本明細書で開示される参照隣接相補的ドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％の相同性を有し；
および
テールドメインは不在であり、またはヌクレオチド配列は、１〜５０ヌクレオチド長であり、一実施形態では、本明細書で開示される参照テールドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％の相同性を有する。
【０４８１】
代表的なキメラｇＲＮＡ
一実施形態では、単分子ｇＲＮＡまたはキメラｇＲＮＡは、好ましくは、５’から３方向に、
例えば、（標的核酸と相補的な）１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチドなどを含んでなる標的化ドメイン；
第１の相補的ドメイン；
連結ドメイン；
（第１の相補的ドメインと相補的な）第２の相補的ドメイン；
隣接ドメイン；および
テールドメイン
を含んでなり、
式中、
（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなり；
（ｂ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがあり；または
（ｃ）第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０４８２】
一実施形態では、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）からの配列は、天然起源ｇＲＮＡの対応する配列と、または本明細書に記載されるｇＲＮＡと、少なくとも６０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９％の相同性を有する。
【０４８３】
一実施形態では、隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０４８４】
一実施形態では、第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０４８５】
一実施形態では、第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０４８６】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長である。
【０４８７】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６ヌクレオチド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。
【０４８８】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１７ヌクレオチド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。
【０４８９】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１８ヌクレオチド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。
【０４９０】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１９ヌクレオチド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。
【０４９１】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２０ヌクレオチド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。
【０４９２】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２１ヌクレオチド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。
【０４９３】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２２ヌクレオチド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。
【０４９４】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２３ヌクレオチド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。
【０４９５】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２４ヌクレオチド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。
【０４９６】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２５ヌクレオチド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。
【０４９７】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２６ヌクレオチド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。
【０４９８】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６ヌクレオチド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０４９９】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６ヌクレオチド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５００】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６ヌクレオチド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５０１】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１７ヌクレオチド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５０２】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１７ヌクレオチド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５０３】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１７ヌクレオチド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５０４】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１８ヌクレオチド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５０５】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１８ヌクレオチド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５０６】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１８ヌクレオチド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５０７】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１９ヌクレオチド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５０８】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１９ヌクレオチド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５０９】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１９ヌクレオチド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５１０】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２０ヌクレオチド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長であり；隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５１１】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２０ヌクレオチド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５１２】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２０ヌクレオチド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５１３】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２１ヌクレオチド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５１４】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２１ヌクレオチド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５１５】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２１ヌクレオチド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５１６】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２２ヌクレオチド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５１７】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２２ヌクレオチド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは２２ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチド対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５１８】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２２ヌクレオチド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは２２ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５１９】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２３ヌクレオチド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５２０】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２３ヌクレオチド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５２１】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２３ヌクレオチド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５２２】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２４ヌクレオチド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５２３】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２４ヌクレオチド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５２４】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２４ヌクレオチド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５２５】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２５ヌクレオチド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５２６】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２５ヌクレオチド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは２５ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチド対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５２７】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２５ヌクレオチド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは２５ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５２８】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２６ヌクレオチド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５２９】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２６ヌクレオチド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５３０】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２６ヌクレオチド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５３１】
一実施形態では、単分子またはキメラのｇＲＮＡ分子（標的化ドメイン、第１の相補的ドメイン、連結ドメイン、第２の相補的ドメイン、隣接ドメイン、および任意選択的に、テールドメインを含んでなる）は以下の配列を含んでなり、その中では標的化ドメインが２０個のＮとして描写されるが、それは任意の配列および１６〜２６ヌクレオチド長の範囲であり得て、その中ではｇＲＮＡ配列に６個のＵが続き、それはＵ６プロモーターの終結シグナルの役割を果たすが、それは不在またはより少数のどちらかであり得る：
【化３１】
2020062029.tif 000032
一実施形態では、単分子またはキメラのｇＲＮＡ分子は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡ分子である。
【０５３２】
いくつかの実施形態では、単分子またはキメラのｇＲＮＡ分子（標的化ドメイン、第１の相補的ドメイン、連結ドメイン、第２の相補的ドメイン、隣接ドメイン、および任意選択的に、テールドメインを含んでなる）は以下の配列を含んでなり、その中では標的化ドメインが２０個のＮとして描写されるが、それは任意の配列および１６〜２６ヌクレオチド長の範囲であり得て、その中ではｇＲＮＡ配列に６個のＵが続き、それはＵ６プロモーターの終結シグナルの役割を果たすが、それは不在またはより少数のどちらかであり得る：
【化３２】
2020062029.tif 000033
一実施形態では、単分子またはキメラのｇＲＮＡ分子は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡ分子である。
【０５３３】
代表的なキメラｇＲＮＡの配列および構造体もまた、図１０Ａ〜１０Ｂに示される。
【０５３４】
代表的なモジュラーｇＲＮＡ
一実施形態では、モジュラーｇＲＮＡは、
好ましくは、５’から３’方向に、
例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０，２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチドを含んでなる標的化ドメイン、
第１の相補的ドメイン
を含んでなる第１の鎖と；
好ましくは、５’から３’方向に、
任意選択的に、５’伸長ドメイン、
第２の相補的ドメイン、
隣接ドメイン、および
テールドメイン
を含んでなる第２の鎖と
を含んでなり、
式中、
（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなり；
（ｂ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがあり；または
（ｃ）第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５３５】
一実施形態では、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）からの配列は、天然起源ｇＲＮＡの対応する配列と、または本明細書に記載されるｇＲＮＡと、少なくとも６０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９％の相同性を有する。
【０５３６】
一実施形態では、隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５３７】
一実施形態では、第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５３８】
一実施形態では、第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５３９】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６連続ヌクレオチド）を有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長である。
【０５４０】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６ヌクレオチド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。
【０５４１】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１７ヌクレオチド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。
【０５４２】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１８ヌクレオチド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。
【０５４３】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１９ヌクレオチド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。
【０５４４】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２０ヌクレオチド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。
【０５４５】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２１ヌクレオチド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。
【０５４６】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２２ヌクレオチド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。
【０５４７】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２３ヌクレオチド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。
【０５４８】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２４ヌクレオチド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含んでなり、それをを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。
【０５４９】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２５ヌクレオチド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。
【０５５０】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２６ヌクレオチド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。
【０５５１】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６ヌクレオチド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５５２】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６ヌクレオチド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは１６ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチド対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５５３】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６ヌクレオチド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは１６ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５５４】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１７ヌクレオチド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５５５】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１７ヌクレオチド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５５６】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１７ヌクレオチド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５５７】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１８ヌクレオチド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５５８】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１８ヌクレオチド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５５９】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１８ヌクレオチド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５６０】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１９ヌクレオチド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５６１】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１９ヌクレオチド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５６２】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１９ヌクレオチド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５６３】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２０ヌクレオチド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５６４】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２０ヌクレオチド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５６５】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２０ヌクレオチド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５６６】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２１ヌクレオチド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５６７】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２１ヌクレオチド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５６８】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２１ヌクレオチド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５６９】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２２ヌクレオチド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５７０】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２２ヌクレオチド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５７１】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２２ヌクレオチド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５７２】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２３ヌクレオチド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５７３】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２３ヌクレオチド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５７４】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２３ヌクレオチド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５７５】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２４ヌクレオチド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５７６】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２４ヌクレオチド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５７７】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２４ヌクレオチド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５７８】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２５ヌクレオチド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５７９】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２５ヌクレオチド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５８０】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２５ヌクレオチド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５８１】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２６ヌクレオチド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
【０５８２】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２６ヌクレオチド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０５８３】
一実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２６ヌクレオチド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０５８４】
ＩＩ．ｇＲＮＡをデザインする方法
標的ドメインを選択し、デザインし、検証する方法をはじめとする、ｇＲＮＡをデザインする方法が本明細書に記載される。代表的な標的化ドメインもまた、本明細書で提供される。本明細書で考察される標的化ドメインは、本明細書に記載されるｇＲＮＡに組み込み得る。
【０５８５】
標的配列の選択および検証、ならびにオフターゲット分析の方法は、例えば、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３  ＳＣＩＥＮＣＥ  ３３９（６１２１）：８２３−８２６；Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＴ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ，３１（９）：８２７−３２；Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  ＮＡＴ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４４６３５７４；Ｈｅｉｇｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  ＮＡＴ  ＭＥＴＨＯＤＳ  １１（２）：１２２−３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２８１２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４４８１２１６；Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４４６３１８１；Ｘｉａｏ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４３８９６６２に記載される。
【０５８６】
いくつかの実施形態では、ソフトウェアツールが利用されて、例えば、ゲノム全体にわたる総オフターゲット活性の最小化など、使用者の標的配列中のｇＲＮＡの選択が最適化され得る。オフターゲット活性は、切断以外であってもよい。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用するそれぞれの可能なｇＲＮＡ選択肢では、ソフトウェアツールが、特定数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のミスマッチ塩基対を含有するゲノム全域で、全ての可能なオフターゲット配列（ＮＡＧまたはＮＧＧ  ＰＡＭのどちらかに先行する）を同定し得る。各オフターゲット配列における切断効率は、例えば、実験的に誘導される重みづけスキームを使用して予測され得る。それぞれの可能なｇＲＮＡは、次に、その全予測オフターゲット切断に従って格付けされ得て；最高位のｇＲＮＡは、最大のオンターゲットと最小のオフターゲット切断を有する可能性が高いものに相当する。例えば、ｇＲＮＡベクター構築のための自動化された試薬デザイン、オンターゲットサーベイヤーアッセイ用のプライマー設計、および次世代シーケンシングを介したオフターゲット切断のハイスループット検出と定量化のためのプライマーデザインなどのその他の機能もまた、ツールに包含され得る。候補ｇＲＮＡ分子は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書のセクションＩＶに記載されようにして、評価され得る。
【０５８７】
いくつかの実施形態では、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、およびＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９と共に使用されるｇＲＮＡが、例えば、公共ツールｃａｓ−ｏｆｆｉｎｄｅｒに基づく特定用途向けｇＲＮＡ設計ソフトウェアを使用するなど、ＤＮＡ配列検索アルゴリズムを使用して同定される（Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１４；３０（１０）：１４７３−１４７５）。前記特定用途向けｇＲＮＡ設計ソフトウェアは、それらの全ゲノムでのオフターゲット性向を計算した後に、ガイドをスコアする。典型的に、完全な一致から７つのミスマッチに至るマッチが、１７〜２４の長さに至るガイドのために検討される。ひとたびオフターゲット部位が計算的に判定されたら、各ガイドについて集約スコアが計算されて、ウェブインタフェースを使用して、表形式の出力に要約された。ＰＡＭ配列に隣接する可能なｇＲＮＡ部位を同定するのに加えて、ソフトウェアはまた、選択されたｇＲＮＡ部位と、１、２、３つ以上のヌクレオチドが異なる、全てのＰＡＭ隣接配列も同定する。各遺伝子のゲノムのＤＮＡ配列は、ＵＣＳＣゲノムブラウザから得られ、配列は、公的に利用可能なＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒプログラムを使用して、反復要素についてスクリーニングされる。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒは、反復要素および低複雑度領域について、供試ＤＮＡ配列を検索する。結果は、所与のクエリー配列中に存在する反復の詳細な注釈である。
【０５８８】
同定に続いて、ｇＲＮＡは、標的部位に対するそれらの距離、それらの直交性、および５’Ｇの存在の１つまたは複数に基づいて階層に格付けされた（例えばＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の場合はＮＧＧ  ＰＡＭ、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の場合はＮＮＧＲＲ（例えばＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲＶ）ＰＡＭ、およびＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓ）の場合は、ＮＮＮＮＧＡＴＴまたはＮＮＮＮＧＣＴＴＰＡＭなどの妥当な（ｒｅｌａｖａｎｔ）ＰＡＭを含有するヒトゲノム中の近いマッチの同定に基づく）。直交性は、標的配列に対する最小数のミスマッチを含有するヒトゲノム中の配列数を指す。「高レベルの直交性」または「良好な直交性」は、例えば、ヒトゲノム中に意図される標的以外の同一配列を有さず、または標的配列中に１つまたは２つのミスマッチを含有する任意の配列を有さない、２０量体標的化ドメインを指してもよい。良好な直交性がある標的化ドメインが選択されて、オフターゲットＤＮＡ切断が最小化される。これは、非限定的例であり、多様なストラテジーを利用して、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、およびＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはその他のＣａｓ９酵素と共に使用される、ｇＲＮＡを同定し得るものと理解される。
【０５８９】
２つの設計および階層化ストラテジーを利用して、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、およびＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９酵素と共に使用される、代表的ｇＲＮＡが同定される。
【０５９０】
ｇＲＮＡを設計および階層化する第１のストラテジー
第１のストラテジーでは、公的に利用可能なウェブベースのＺｉＦｉＴサーバを使用して、ｇＲＮＡと共に使用されるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９が同定された（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  Ｊａｎ  ２６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４４６３５７４、オリジナルの参考文献については、Ｓａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，ＮＡＲ  ３５：Ｗ５９９−６０５；Ｓａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，ＮＡＲ  ３８：Ｗ４６２−８を参照されたい）。ＰＡＭ配列に隣接する可能なｇＲＮＡ部位を同定するのに加えて、ソフトウェアはまた、選択されたｇＲＮＡ部位と、１、２、３つ以上のヌクレオチドが異なる、全てのＰＡＭ隣接配列も同定する。各遺伝子のゲノムのＤＮＡ配列は、ＵＣＳＣゲノムブラウザから得られ、配列は、公的に利用可能なＲｅｐｅａｔ−Ｍａｓｋｅｒプログラムを使用して、反復要素についてスクリーニングされた。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒは、反復要素および低複雑度領域について、供試ＤＮＡ配列を検索する。結果は、所与のクエリー配列中に存在する反復の詳細な注釈である。同定に続いて、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９と共に使用されるｇＲＮＡが、５階層に格付けされた。
【０５９１】
第１階層ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、標的部位に対するそれらの距離、それらの直交性、および５’Ｇ（ＮＧＧ  ＰＡＭを含有するヒトゲノム中の近いマッチのＺｉＦｉＴ同定に基づく）の存在に基づいて選択された。直交性は、標的配列に対する最小数のミスマッチを含有するヒトゲノム中の配列数を指す。「高レベルの直交性」または「良好な直交性」は、例えば、ヒトゲノム中に同一配列を有さず、または標的配列中に１つまたは２つのミスマッチを含有する任意の配列を有さない、２０量体ｇＲＮＡを指してもよい。良好な直交性がある標的化ドメインが選択されて、オフターゲットＤＮＡ切断が最小化される（ｍｉｍｉｎｉｚｅ）。全ての標的では、１７量体および２０量体双方のｇＲＮＡが設計された。ｇＲＮＡはまた、単一ｇＲＮＡヌクレアーゼ切断および二重ｇＲＮＡニッカーゼストラテジーの双方について選択された。ｇＲＮＡを選択する基準、およびいずれのストラテジーに対していずれのｇＲＮＡが使用され得るかという判定は、いくつかの考察に基づく：
【０５９２】
単一ｇＲＮＡヌクレアーゼ切断および二重ｇＲＮＡ対形成「ニッカーゼ」ストラテジーの双方で、ｇＲＮＡが同定された。ｇＲＮＡを選択する基準、およびそれに対してｇＲＮＡが使用され得る、二重ｇＲＮＡ対形成「ニッカーゼ」ストラテジーの判定は２つの考察に基づく：
１．
ｇＲＮＡ対は、ＤＮＡ上で、ＰＡＭ上が外側を向き、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９ニッカーゼによる切断が、５’オーバーハングをもたらすような配向であるべきである。
２．
二重ニッカーゼ対による切断が、妥当な出現頻度で全介在配列の欠失をもたらすという仮説。しかし、二重ニッカーゼ対による切断はまた、多くの場合、ｇＲＮＡの１つのみの部位にインデル変異をもたらし得る。候補ペア構成要素は、１つのｇＲＮＡ部位に単にインデル変異を引き起こす場合と比較して、全配列をいかに効率的に除去するかについて試験され得る。
【０５９３】
第１階層のｇＲＮＡ分子のための標的化ドメインは（１）例えば、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中などの標的位置からの妥当な距離、（２）高レベルの直交性、および（３）５’Ｇの存在に基づいて選択された。第２階層のｇＲＮＡの選択のためには、５’Ｇに対する必要性が除外されたが、距離制限が要求され、高レベルの直交性が要求された。第３階層の選択は、同一距離制限と５’Ｇに対する必要性を使用したが、良好な直交性の必要条件が除外された。第４階層の選択は、同一距離制限を使用したが、良好な直交性および５’Ｇから開始するという必要条件が除去された。第５階層の選択は、良好な直交性およびさ５’Ｇの必要条件が除外されて、より長い配列（例えば、追加的転写標的部位の５００ｂｐ上流または下流などのコード配列の残りの部分）がスキャンされた。階層は、非包括的であることに留意されたい（各ｇＲＮＡｉｓは、１回のみ列挙される）。場合によっては、ｇＲＮＡは、特定の階層基準に基づいて同定されなかった。
【０５９４】
上で考察されるように、ｇＲＮＡは、示されるように、単一ｇＲＮＡヌクレアーゼ切断について、ならびに二重ｇＲＮＡ対形成「ニッカーゼ」ストラテジーについて同定された。
【０５９５】
Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９と共に使用されるｇＲＮＡは、ＰＡＭ配列の存在についてゲノムＤＮＡ配列をスキャンすることにより手動で同定された。これらのｇＲＮＡは、２つの階層に区別された。第１階層ｇＲＮＡでは、標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で選択された。第２階層ｇＲＮＡでは、標的化ドメインは、残りのコード配列中（第１の５００ｂｐの下流）で選択された。階層は、非包括的であることに留意されたい（各ｇＲＮＡは、ストラテジーについて１回のみ列挙される）。場合によっては、ｇＲＮＡは、特定の階層基準に基づいて同定されなかった。
【０５９６】
代表的標的化ドメイン（第１のストラテジー）
以下は、第１の設計および階層化ストラテジーに従った代表的標的化ドメインを提供する表である。一例として、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、およびＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓ）標的では、１７量体または２０量体標的化ドメインが設計された。
【０５９７】
表１Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合し、良好な直交性を有して、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。一実施形態では、２つのｇＲＮＡを使用して、２つのＣａｓ９ヌクレアーゼまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼが標的化され、例えば、表１に示される、Ａ群からの標的化ドメインがあるｇＲＮＡが、Ｂ群からの任意の標的化ドメインがあるｇＲＮＡと対にされ得る。
【０５９８】
【表１】
2020062029.tif 000034
【０５９９】
【表２】
2020062029.tif 000035
【０６００】
表１Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６０１】
【表３】
2020062029.tif 000036
【０６０２】
表１Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６０３】
【表４】
2020062029.tif 000037
【０６０４】
表１Ｄは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６０５】
【表５】
2020062029.tif 000038
【０６０６】
表１Ｅは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りのコード配列中で結合する（最初の５００ｂｐの下流）。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６０７】
【表６】
2020062029.tif 000039
【０６０８】
表１Ｆは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６０９】
【表７】
2020062029.tif 000040
【０６１０】
表１Ｇは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りのコード配列中で結合する（最初の５００ｂｐの下流）。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６１１】
【表８】
2020062029.tif 000041
【０６１２】
表１Ｈは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６１３】
【表９】
2020062029.tif 000042
【０６１４】
表１Ｉは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りのコード配列中で結合する（最初の５００ｂｐの下流）。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６１５】
【表１０】
2020062029.tif 000043
【０６１６】
表２Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６１７】
【表１１】
2020062029.tif 000044
【０６１８】
表２Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６１９】
【表１２】
2020062029.tif 000045
【０６２０】
表２Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６２１】
【表１３】
2020062029.tif 000046
【０６２２】
表２Ｄは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６２３】
【表１４】
2020062029.tif 000047
【０６２４】
表２Ｅは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６２５】
【表１５】
2020062029.tif 000048
【０６２６】
表２Ｆは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６２７】
【表１６】
2020062029.tif 000049
【０６２８】
表２Ｇは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用したＦＡＳ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６２９】
【表１７】
2020062029.tif 000050
【０６３０】
表２Ｈは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６３１】
【表１８】
2020062029.tif 000051
【０６３２】
表２Ｉは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６３３】
【表１９】
2020062029.tif 000052
【０６３４】
表３Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。一実施形態では、２つのｇＲＮＡが使用されて、２つのＣａｓ９ヌクレアーゼまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼが標的化され、例えば、表３に示される、Ａ群からの標的化ドメインがあるｇＲＮが、Ｂ群からの任意の標的化ドメインがあるｇＲＮＡと対にされ得て、または表３に示される、Ｃ群からの標的化ドメインがあるｇＲＮＡが、Ｄ群からの任意の標的化ドメインがあるｇＲＮＡと対にされ得る。
【０６３５】
【表２０】
2020062029.tif 000053
【０６３６】
【表２１】
2020062029.tif 000054
【０６３７】
表３Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６３８】
【表２２】
2020062029.tif 000055
【０６３９】
表３Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６４０】
【表２３】
2020062029.tif 000056
【０６４１】
表３Ｄは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６４２】
【表２４】
2020062029.tif 000057
【０６４３】
表３Ｅは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りのコード配列中で結合する（最初の５００ｂｐの下流）。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６４４】
【表２５】
2020062029.tif 000058
【０６４５】
表３Ｆは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６４６】
【表２６】
2020062029.tif 000059
【０６４７】
表３Ｇは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用したＢＩＤ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りのコード配列中で結合する（最初の５００ｂｐの下流）。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６４８】
【表２７】
2020062029.tif 000060
【０６４９】
表３Ｈは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６５０】
【表２８】
2020062029.tif 000061
【０６５１】
表４Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６５２】
【表２９】
2020062029.tif 000062
【０６５３】
表４Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６５４】
【表３０】
2020062029.tif 000063
【０６５５】
表４Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６５６】
【表３１】
2020062029.tif 000064
【０６５７】
表４Ｄは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６５８】
【表３２】
2020062029.tif 000065
【０６５９】
表４Ｅは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６６０】
【表３３】
2020062029.tif 000066
【０６６１】
表４Ｆは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６６２】
【表３４】
2020062029.tif 000067
【０６６３】
表４Ｇは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用したＢＩＤ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６６４】
【表３５】
2020062029.tif 000068
【０６６５】
表４Ｈは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６６６】
【表３６】
2020062029.tif 000069
【０６６７】
表４Ｉは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６６８】
【表３７】
2020062029.tif 000070
【０６６９】
表５Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。一実施形態では、２つのｇＲＮＡが使用されて、２つのＣａｓ９ヌクレアーゼまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼが標的化され、例えば、表５に示される、Ａ群からの標的化ドメインがあるｇＲＮＡが、Ｂ群からの任意の標的化ドメインがあるｇＲＮＡと対にされ得て、または表５に示される、Ｃ群からの標的化ドメインがあるｇＲＮＡが、Ｄ群からの任意の標的化ドメインがあるｇＲＮＡと対にされ得る。
【０６７０】
【表３８】
2020062029.tif 000071
【０６７１】
【表３９】
2020062029.tif 000072
【０６７２】
表５Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６７３】
【表４０】
2020062029.tif 000073
【０６７４】
表５Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６７５】
【表４１】
2020062029.tif 000074
【０６７６】
表５Ｄは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６７７】
【表４２】
2020062029.tif 000075
【０６７８】
表５Ｅは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りのコード配列中で結合する（最初の５００ｂｐの下流）。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６７９】
【表４３】
2020062029.tif 000076
【０６８０】
表５Ｆは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６８１】
【表４４】
2020062029.tif 000077
【０６８２】
表５Ｇは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用したＣＴＬＡ４遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りのコード配列中で結合する（最初の５００ｂｐの下流）。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６８３】
【表４５】
2020062029.tif 000078
【０６８４】
表５Ｈは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６８５】
【表４６】
2020062029.tif 000079
【０６８６】
表５Ｉは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用したＣＴＬＡ４遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りのコード配列中で結合する（最初の５００ｂｐの下流）。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０６８７】
【表４７】
2020062029.tif 000080
【０６８８】
表６Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６８９】
【表４８】
2020062029.tif 000081
【０６９０】
表６Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６９１】
【表４９】
2020062029.tif 000082
【０６９２】
表６Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６９３】
【表５０】
2020062029.tif 000083
【０６９４】
表６Ｄは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６９５】
【表５１】
2020062029.tif 000084
【０６９６】
表６Ｅは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６９７】
【表５２】
2020062029.tif 000085
【０６９８】
表６Ｆは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０６９９】
【表５３】
2020062029.tif 000086
【０７００】
表６Ｇは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用したＣＴＬＡ４遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７０１】
【表５４】
2020062029.tif 000087
【０７０２】
表６Ｈは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７０３】
【表５５】
2020062029.tif 000088
【０７０４】
表６Ｉは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７０５】
【表５６】
2020062029.tif 000089
【０７０６】
表７Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。一実施形態では、２つのｇＲＮＡが使用されて、２つのＣａｓ９ヌクレアーゼまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼが標的化され、例えば、表７に示される、Ａ群からの標的化ドメインがあるｇＲＮＡが、Ｂ群からの任意の標的化ドメインがあるｇＲＮＡと対にされ得て、または表７に示される、Ｃ群からの標的化ドメインがあるｇＲＮＡが、Ｄ群からの任意の標的化ドメインがあるｇＲＮＡと対にされ得る。
【０７０７】
【表５７】
2020062029.tif 000090
【０７０８】
【表５８】
2020062029.tif 000091
【０７０９】
表７Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７１０】
【表５９】
2020062029.tif 000092
【０７１１】
表７Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７１２】
【表６０】
2020062029.tif 000093
【０７１３】
表７Ｄは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７１４】
【表６１】
2020062029.tif 000094
【０７１５】
表７Ｅは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りのコード配列中で結合する（最初の５００ｂｐの下流）。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７１６】
【表６２】
2020062029.tif 000095
【０７１７】
表７Ｆは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７１８】
【表６３】
2020062029.tif 000096
【０７１９】
表７Ｇは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りのコード配列中で結合する（最初の５００ｂｐの下流）。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７２０】
【表６４】
2020062029.tif 000097
【０７２１】
表７Ｈは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りのコード配列中で結合する（最初の５００ｂｐの下流）。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７２２】
【表６５】
2020062029.tif 000098
【０７２３】
表８Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７２４】
【表６６】
2020062029.tif 000099
【０７２５】
表８Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７２６】
【表６７】
2020062029.tif 000100
【０７２７】
表８Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７２８】
【表６８】
2020062029.tif 000101
【０７２９】
表８Ｄは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７３０】
【表６９】
2020062029.tif 000102
【０７３１】
表８Ｅは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７３２】
【表７０】
2020062029.tif 000103
【０７３３】
表８Ｆは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックダウントの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７３４】
【表７１】
2020062029.tif 000104
【０７３５】
表８Ｇは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７３６】
【表７２】
2020062029.tif 000105
【０７３７】
表８Ｈは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７３８】
【表７３】
2020062029.tif 000106
【０７３９】
表９Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。一実施形態では、２つのｇＲＮＡが使用されて、２つのＣａｓ９ヌクレアーゼまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼが標的化され、例えば、表９に示される、Ａ群からの標的化ドメインがあるｇＲＮＡが、Ｂ群からの任意の標的化ドメインがあるｇＲＮＡと対にされ得て、または表９に示される、Ｃ群からの標的化ドメインがあるｇＲＮＡが、Ｄ群からの任意の標的化ドメインがあるｇＲＮＡと対にされ得る。
【０７４０】
【表７４】
2020062029.tif 000107
【０７４１】
【表７５】
2020062029.tif 000108
【０７４２】
表９Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７４３】
【表７６】
2020062029.tif 000109
【０７４４】
表９Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７４５】
【表７７】
2020062029.tif 000110
【０７４６】
表９Ｄは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７４７】
【表７８】
2020062029.tif 000111
【０７４８】
表９Ｅは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りのコード配列中で結合する（最初の５００ｂｐの下流）。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７４９】
【表７９】
2020062029.tif 000112
【０７５０】
表９Ｆは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７５１】
【表８０】
2020062029.tif 000113
【０７５２】
表９Ｇは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りのコード配列中で結合する（最初の５００ｂｐの下流）。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７５３】
【表８１】
2020062029.tif 000114
【０７５４】
表９Ｈは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７５５】
【表８２】
2020062029.tif 000115
【０７５６】
表９Ｉは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りのコード配列中で結合する（最初の５００ｂｐの下流）。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７５７】
【表８３】
2020062029.tif 000116
【０７５８】
表１０Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７５９】
【表８４】
2020062029.tif 000117
【０７６０】
表１０Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７６１】
【表８５】
2020062029.tif 000118
【０７６２】
表１０Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７６３】
【表８６】
2020062029.tif 000119
【０７６４】
表１０Ｄは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７６５】
【表８７】
2020062029.tif 000120
【０７６６】
表１０Ｅは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７６７】
【表８８】
2020062029.tif 000121
【０７６８】
表１０Ｆは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７６９】
【表８９】
2020062029.tif 000122
【０７７０】
表１０Ｇは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７７１】
【表９０】
2020062029.tif 000123
【０７７２】
表１０Ｈは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７７３】
【表９１】
2020062029.tif 000124
【０７７４】
表１０Ｉは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７７５】
【表９２】
2020062029.tif 000125
【０７７６】
表１１Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。一実施形態では、２つのｇＲＮＡを使用して、２つのＣａｓ９ヌクレアーゼまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼが標的化され、例えば、表１１に示される、Ａ群からの標的化ドメインがあるｇＲＮＡが、Ｂ群からの任意の標的化ドメインがあるｇＲＮＡと対にされ得る。
【０７７７】
【表９３】
2020062029.tif 000126
【０７７８】
【表９４】
2020062029.tif 000127
【０７７９】
表１１Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７８０】
【表９５】
2020062029.tif 000128
【０７８１】
表１１Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７８２】
【表９６】
2020062029.tif 000129
【０７８３】
表１１Ｄは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７８４】
【表９７】
2020062029.tif 000130
【０７８５】
表１１Ｅは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りのコード配列中で結合する（最初の５００ｂｐの下流）。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７８６】
【表９８】
2020062029.tif 000131
【０７８７】
表１１Ｆは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７８８】
【表９９】
2020062029.tif 000132
【０７８９】
表１１Ｇは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りのコード配列中で結合する（最初の５００ｂｐの下流）。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７９０】
【表１００】
2020062029.tif 000133
【０７９１】
表１１Ｈは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７９２】
【表１０１】
2020062029.tif 000134
【０７９３】
表１１Ｉは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りのコード配列（最初の５００ｂｐの下流）内で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０７９４】
【表１０２】
2020062029.tif 000135
【０７９５】
表１２Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７９６】
【表１０３】
2020062029.tif 000136
【０７９７】
表１２Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、良好な直交性を有し、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０７９８】
【表１０４】
2020062029.tif 000137
【０７９９】
表１２Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、Ｇから開始する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８００】
【表１０５】
2020062029.tif 000138
【０８０１】
表１２Ｄは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合して、Ｇから開始しない。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８０２】
【表１０６】
2020062029.tif 000139
【０８０３】
表１２Ｅは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに２２２ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の７２２ｂｐ上流および１ｋｂ下流に及ぶ）で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８０４】
【表１０７】
2020062029.tif 000140
【０８０５】
表１２Ｆは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８０６】
【表１０８】
2020062029.tif 000141
【０８０７】
表１２Ｇは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに２２２ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の７２２ｂｐ上流および１ｋｂ下流に及ぶ）で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８０８】
【表１０９】
2020062029.tif 000142
【０８０９】
表１２Ｈは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８１０】
【表１１０】
2020062029.tif 000143
【０８１１】
表１２Ｉは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに２２２ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の７２２ｂｐ上流および１ｋｂ下流に及ぶ）で結合する。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８１２】
【表１１１】
2020062029.tif 000144
【０８１３】
本明細書で開示される標的化ドメインは、表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉに記載される１７量体を含んでなってもよく、例えば、１８ヌクレオチド以上の標的化ドメインは、表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉに記載される１７量体ｇＲＮＡを含んでなってもよい。
【０８１４】
本明細書で開示される標的化ドメインは、表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉに記載される２０量体ｇＲＮＡを含んでなってもよく、例えば、２１ヌクレオチド以上の標的化ドメインは、表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉに記載される２０量体ｇＲＮＡを含んでなってもよい。
【０８１５】
ｇＲＮＡを設計および階層化する第２のストラテジー
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、およびＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９酵素と共に使用されるｇＲＮＡを同定するために使用された第２のストラテジーは、第１のストラテジーとは、次のように異なった。
【０８１６】
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と共に使用されるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、およびＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９は、ＤＮＡ配列検索アルゴリズムを使用して同定された。ガイドＲＮＡ設計は、公共ツールｃａｓ−ｏｆｆｉｎｄｅｒに基づく、特定用途向けガイドＲＮＡ設計ソフトウェアを使用して実施された（参考文献：Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ：ａ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｔｈａｔ  ｓｅａｒｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｓ９  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１４  Ｆｅｂ  １７．Ｂａｅ  Ｓ，Ｐａｒｋ  Ｊ，Ｋｉｍ  ＪＳ．ＰＭＩＤ：２４４６３１８１）。前記特定用途向けガイドＲＮＡ設計ソフトウェアは、それらの全ゲノムでのオフターゲット性向を計算した後に、ガイドをスコアする。典型的に、完全な一致から７つのミスマッチに至るマッチが、１７〜２４の長さに至るガイドのために検討される。ひとたびオフターゲット部位が計算的に評価されたら、各ガイドについて集約スコアが計算されて、ウェブインタフェースを使用して、表形式の出力に要約される。ＰＡＭ配列に隣接する可能なｇＲＮＡ部位を同定するのに加えて、ソフトウェアはまた、選択されたｇＲＮＡ部位と、１、２、３つ以上のヌクレオチドが異なる、全てのＰＡＭ隣接配列も同定する。各遺伝子のゲノムのＤＮＡ配列は、ＵＣＳＣゲノムブラウザから得られ、配列は、公的に利用可能なＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒプログラムを使用して、反復要素についてスクリーニングされる。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒは、反復要素および低複雑度領域について、供試ＤＮＡ配列を検索する。結果は、所与のクエリー配列中に存在する反復の詳細な注釈である。
【０８１７】
同定に続いて、ｇＲＮＡは、標的部位に対するそれらの距離またはそれらの直交性に基づいて、階層に格付けされた（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の場合はＮＧＧＰＡＭ、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の場合はＮＮＧＲＲ（例えば、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲＶ）ＰＡＭ、およびＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓｓ）の場合はＮＮＮＮＧＡＴＴまたはＮＮＮＮＧＣＴＴ  ＰＡＭなどの妥当な（ｒｅｌａｖａｎｔ）ＰＡＭを含有するヒトゲノム中の近いマッチの同定に基づく。直交性は、標的配列に対する最小数のミスマッチを含有するヒトゲノム中の配列数を指す。「高レベルの直交性」または「良好な直交性」は、例えば、ヒトゲノム中に意図される標的以外の同一配列を有さず、または標的配列中に１つまたは２つのミスマッチを含有する任意の配列を有さない、２０量体ｇＲＮＡを指してもよい。良好な直交性がある標的化ドメインが選択されて、オフターゲットＤＮＡ切断が最小化される。
【０８１８】
一例として、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓｓ）標的では、１７量体、または２０量体ｇＲＮＡが設計された。別の例として、１８量体、１９量体、２０量体、２１量体、２２量体、２３量体、および２４量体ｇＲＮＡを標的化するＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が設計された。本明細書で開示される標的化ドメインは、本明細書で開示される標的化ドメインに記載される１７量体を含んでなってもよく、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される１７量体を含んでなってもよく、例えば、１８ヌクレオチド以上の標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される１７量体ｇＲＮＡを含んでなってもよい。
【０８１９】
本明細書で開示される標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される１８量体を含んでなってもよく、例えば、１９ヌクレオチド以上の標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される１８量体ｇＲＮを含んでなってもよい。
【０８２０】
本明細書で開示される標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される１９量体を含んでなってもよく、例えば、２０ヌクレオチド以上の標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される１９量体ｇＲＮＡを含んでなってもよい。
【０８２１】
本明細書で開示される標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される２０量体ｇＲＮＡを含んでなってもよく、例えば、２１ヌクレオチド以上の標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される２０量体ｇＲＮＡを含んでなってもよい。
【０８２２】
本明細書で開示される標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される２１量体を含んでなってもよく、例えば、２２ヌクレオチド以上の標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される２１量体ｇＲＮＡを含んでなってもよい。
【０８２３】
本明細書で開示される標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される２２量体を含んでなってもよく、例えば、２３ヌクレオチド以上の標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される２２量体ｇＲＮＡを含んでなってもよい。
【０８２４】
本明細書で開示される標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される２３量体を含んでなってもよく、例えば、２４ヌクレオチド以上の標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される２３量体ｇＲＮＡを含んでなってもよい。
【０８２５】
本明細書で開示される標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される２４量体を含んでなってもよく、例えば、２５ヌクレオチド以上の標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される２４量体ｇＲＮＡを含んでなってもよい。
【０８２６】
単一ｇＲＮＡヌクレアーゼ切断および二重ｇＲＮＡ対形成「ニッカーゼ」ストラテジーの双方で、ｇＲＮＡが同定された。ｇＲＮＡを選択する基準、およびいずれのストラテジーに対していずれのｇＲＮＡが使用され得るかという判定は、いくつかの考察に基づく：
１．ｇＲＮＡ対は、ＤＮＡ上で、ＰＡＭ上が外側を向き、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９ニッカーゼによる切断が、５’オーバーハングをもたらすような配向であるべきである。
２．二重ニッカーゼ対による切断が、妥当な出現頻度で全介在配列の欠失をもたらすという仮説。しかし、それはまたｇＲＮＡの１つのみの部位にインデル変異をもたらすことが多い。候補ペア構成要素は、１つのｇＲＮＡ部位に単にインデル変異を引き起こす場合と比較して、全配列をいかに効率的に除去するかについて試験され得る。
【０８２７】
本明細書で考察される標的化ドメインは、本明細書に記載されるｇＲＮＡに組み込み得る。
【０８２８】
ノックアウトストラテジーを設計するために、いくつかの実施形態では、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の階層１  ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインが、標的部位からのそれらの距離およびそれらの直交性に基づいて選択された（ＰＡＭはＮＧＧである）。階層１  ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、（１）例えば、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中などの標的位置との妥当な距離、および（２）高レベルの直交性に基づいて選択された。階層２  ｇＲＮＡの選択では、高レベルの直交性は要求されなかった。階層３  ｇＲＮＡは、良好な直交性の要求が除外され、より長い配列（例えば、コード配列の残りの部分）がスキャンされた。階層は、非包括的であることに留意されたい（各ｇＲＮＡｉｓは、１回のみ列挙される）。場合によっては、ｇＲＮＡは、特定の階層基準に基づいて同定されなかった。
【０８２９】
ノックアウトストラテジー設計するために、いくつかの実施形態では、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓ）のための階層１  ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択されて、高レベルの直交性を有した。Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓ）のための階層２  ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、高い直交性は要求されなかった。Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓ）のための階層３  ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、５００ｂｐ下流の残りのコード配列中で選択された。階層は、非包括的であることに留意されたい（各ｇＲＮＡｉｓは、１回のみ列挙される）。場合によっては、ｇＲＮＡは、特定の階層基準に基づいて同定されなかった。
【０８３０】
ノックアウトストラテジーを設計するために、いくつかの実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の階層１  ｇｒＮＡ分子の標的化ドメインが、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、高レベルの直交性を有し、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の階層２  ｇｒＮＡ分子の標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、いかなる直交性レベルも要求されず、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の階層３  ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、残りの下流コード配列中で選択されて、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の階層４  ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、ＮＮＧＲＲＶ  ＰＡＭを含んだ。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の階層５ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、残りの下流コード配列中で選択されて、ＮＮＧＲＲＶ  ＰＡＭを含んだ。階層は、非包括的であることに留意されたい（各ｇＲＮＡｉｓは、１回のみ列挙される）。場合によっては、ｇＲＮＡは、特定の階層基準に基づいて同定されなかった。
【０８３１】
ノックダウンストラテジーのためのｇＲＮＡ分子を設計するために、いくつかの実施形態では、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のための階層１  ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインが、転写開始部位の上流および下流の最初の５００ｂｐ内で選択され、高レベルの直交性を有した。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のための階層２  ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、転写開始部位の上流および下流の最初の５００ｂｐ内で選択され、高い直交性は要求されなかった。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のための階層３  ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、転写開始部位の上流および下流のさらに５００ｂｐ内（例えば、転写開始部位上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で選択された。階層は、非包括的であることに留意されたい（各ｇＲＮＡｉｓは、１回のみ列挙される）。場合によっては、ｇＲＮＡは、特定の階層基準に基づいて同定されなかった。
【０８３２】
ノックダウンストラテジーのためのｇＲＮＡ分子を設計するために、いくつかの実施形態では、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓ）のための階層１  ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインが、転写開始部位の上流および下流の最初の５００ｂｐ内で選択され、高レベルの直交性を有した。Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓ）のための階層２  ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、転写開始部位の上流および下流の最初の５００ｂｐ内で選択され、高い直交性は要求されなかった。Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓ）のための階層３  ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、転写開始部位の上流および下流のさらに５００ｂｐ内（例えば、転写開始部位の上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で選択された。階層は、非包括的であることに留意されたい（各ｇＲＮＡｉｓは、１回のみ列挙される）。場合によっては、ｇＲＮＡは、特定の階層基準に基づいて同定されなかった。
【０８３３】
ノックダウンストラテジーのためのｇＲＮＡ分子を設計するために、いくつかの実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の階層１  ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインが、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択されて、高レベルの直交性、およびＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の階層２  ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、直交性は要求されず、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のための階層３  ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、転写開始部位の上流および下流のさらに５００ｂｐ内（例えば、転写開始部位上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の階層４  ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＶである。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のための階層５  ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、転写開始部位の上流および下流のさらに５００ｂｐ内（転写開始部位上流および下流の１ｋｂに及ぶ）で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＶである。階層は、非包括的であることに留意されたい（各ｇＲＮＡｉｓは、１回のみ列挙される）。場合によっては、ｇＲＮＡは、特定の階層基準に基づいて同定されなかった。
【０８３４】
代表的標的化ドメイン（第２のストラテジー）
以下は、第２の設計および階層化ストラテジーに従った代表的標的化ドメインを提供する表である。一例として、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓ）標的では、１７量体、または２０量体ｇＲＮＡが設計された。別の例として、１８量体、１９量体、２０量体、２１量体、２２量体、２３量体、および２４量体ｇＲＮＡを標的化するＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が設計された。
【０８３５】
表１３Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０８３６】
【表１１２】
2020062029.tif 000145
【０８３７】
表１３Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０８３８】
【表１１３】
2020062029.tif 000146
【０８３９】
表１３Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列を超えて、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０８４０】
【表１１４】
2020062029.tif 000147
【０８４１】
表１３Ｄは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、高レベルの直交性を有し、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０８４２】
【表１１５】
2020062029.tif 000148
【０８４３】
表１３Ｅは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内から選択され、直交性のレベルは要求されず、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０８４４】
【表１１６】
2020062029.tif 000149
【０８４５】
表１３Ｆは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りの下流コード配列中で選択され、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０８４６】
【表１１７】
2020062029.tif 000150
【０８４７】
表１３Ｇは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、ＮＮＧＲＲＶ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０８４８】
【表１１８】
2020062029.tif 000151
【０８４９】
表１３Ｈは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りの下流コード配列中で選択され、ＮＮＧＲＲＶ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０８５０】
【表１１９】
2020062029.tif 000152
【０８５１】
表１３Ｉは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０８５２】
【表１２０】
2020062029.tif 000153
【０８５３】
表１３Ｊは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０８５４】
【表１２１】
2020062029.tif 000154
【０８５５】
表１３Ｋは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列を超えて、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０８５６】
【表１２２】
2020062029.tif 000155
【０８５７】
表１４Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、高レベルの直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８５８】
【表１２３】
2020062029.tif 000156
【０８５９】
表１４Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択されて、高い直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８６０】
【表１２４】
2020062029.tif 000157
【０８６１】
表１４Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（例えば、転写開始部位の１ｋｂ上流および下流に及ぶ）で選択される。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８６２】
【表１２５】
2020062029.tif 000158
【０８６３】
表１４Ｄは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、高レベルの直交性、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８６４】
【表１２６】
2020062029.tif 000159
【０８６５】
表１４Ｅは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、直交性は要求されず、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８６６】
【表１２７】
2020062029.tif 000160
【０８６７】
表１４Ｆは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（例えば、転写開始部位の１ｋｂ上流および下流に及ぶ）で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８６８】
【表１２８】
2020062029.tif 000161
【０８６９】
表１４Ｇは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＶである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８７０】
【表１２９】
2020062029.tif 000162
【０８７１】
表１４Ｈは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の１ｋｂ上流および下流に及ぶ）で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＶである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８７２】
【表１３０】
2020062029.tif 000163
【０８７３】
表１４Ｉは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、高レベルの直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８７４】
【表１３１】
2020062029.tif 000164
【０８７５】
表１４Ｊは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択されて、高い直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８７６】
【表１３２】
2020062029.tif 000165
【０８７７】
表１４Ｋは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＦＡＳ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（例えば、転写開始部位の１ｋｂ上流および下流に及ぶ）で選択される。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８７８】
【表１３３】
2020062029.tif 000166
【０８７９】
表１５Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０８８０】
【表１３４】
2020062029.tif 000167
【０８８１】
表１５Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０８８２】
【表１３５】
2020062029.tif 000168
【０８８３】
表１５Ｃは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、高レベルの直交性を有し、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０８８４】
【表１３６】
2020062029.tif 000169
【０８８５】
表１５Ｄは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用したＢＩＤ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内から選択され、直交性のレベルは要求されず、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０８８６】
【表１３７】
2020062029.tif 000170
【０８８７】
表１５Ｅは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用したＢＩＤ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りの下流コード配列中で選択され、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０８８８】
【表１３８】
2020062029.tif 000171
【０８８９】
表１５Ｆは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０８９０】
【表１３９】
2020062029.tif 000172
【０８９１】
表１６Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、高レベルの直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８９２】
【表１４０】
2020062029.tif 000173
【０８９３】
表１６Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択されて、高い直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８９４】
【表１４１】
2020062029.tif 000174
【０８９５】
表１６Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（例えば、転写開始部位の１ｋｂ上流および下流に及ぶ）で選択される。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８９６】
【表１４２】
2020062029.tif 000175
【０８９７】
表１６Ｄは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、高レベルの直交性、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０８９８】
【表１４３】
2020062029.tif 000176
【０８９９】
表１６Ｅは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、直交性は要求されず、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９００】
【表１４４】
2020062029.tif 000177
【０９０１】
表１６Ｆは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（例えば、転写開始部位の１ｋｂ上流および下流に及ぶ）で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９０２】
【表１４５】
2020062029.tif 000178
【０９０３】
表１６Ｇは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、ＮＮＧＲＲＶ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９０４】
【表１４６】
2020062029.tif 000179
【０９０５】
表１６Ｈは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りの下流コード配列中で選択され、ＮＮＧＲＲＶ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９０６】
【表１４７】
2020062029.tif 000180
【０９０７】
表１６Ｉは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、高レベルの直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９０８】
【表１４８】
2020062029.tif 000181
【０９０９】
表１６Ｊは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択されて、高い直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９１０】
【表１４９】
2020062029.tif 000182
【０９１１】
表１６Ｋは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＢＩＤ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（例えば、転写開始部位の１ｋｂ上流および下流に及ぶ）で選択される。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９１２】
【表１５０】
2020062029.tif 000183
【０９１３】
表１７Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９１４】
【表１５１】
2020062029.tif 000184
【０９１５】
表１７Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９１６】
【表１５２】
2020062029.tif 000185
【０９１７】
表１７Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列を超えて、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９１８】
【表１５３】
2020062029.tif 000186
【０９１９】
表１７Ｄは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、高レベルの直交性を有し、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９２０】
【表１５４】
2020062029.tif 000187
【０９２１】
表１７Ｅは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内から選択され、直交性のレベルは要求されず、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９２２】
【表１５５】
2020062029.tif 000188
【０９２３】
表１７Ｆは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りの下流コード配列中で選択され、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９２４】
【表１５６】
2020062029.tif 000189
【０９２５】
表１７Ｇは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、ＮＮＧＲＲＶ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９２６】
【表１５７】
2020062029.tif 000190
【０９２７】
表１７Ｈは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りの下流コード配列中で選択され、ＮＮＧＲＲＶ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９２８】
【表１５８】
2020062029.tif 000191
【０９２９】
表１７Ｉは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９３０】
【表１５９】
2020062029.tif 000192
【０９３１】
表１７Ｊは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９３２】
【表１６０】
2020062029.tif 000193
【０９３３】
表１７Ｋは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列を超えて、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９３４】
【表１６１】
2020062029.tif 000194
【０９３５】
表１８Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、高レベルの直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９３６】
【表１６２】
2020062029.tif 000195
【０９３７】
表１８Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択されて、高い直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９３８】
【表１６３】
2020062029.tif 000196
【０９３９】
表１８Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（例えば、転写開始部位の１ｋｂ上流および下流に及ぶ）で選択される。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９４０】
【表１６４】
2020062029.tif 000197
【０９４１】
表１８Ｄは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、高レベルの直交性、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９４２】
【表１６５】
2020062029.tif 000198
【０９４３】
表１８Ｅは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、直交性は要求されず、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９４４】
【表１６６】
2020062029.tif 000199
【０９４５】
表１８Ｆは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（例えば、転写開始部位の１ｋｂ上流および下流に及ぶ）で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９４６】
【表１６７】
2020062029.tif 000200
【０９４７】
表１８Ｇは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＶである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９４８】
【表１６８】
2020062029.tif 000201
【０９４９】
表１８Ｈは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の１ｋｂ上流および下流に及ぶ）で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＶである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９５０】
【表１６９】
2020062029.tif 000202
【０９５１】
表１８Ｉは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、高レベルの直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９５２】
【表１７０】
2020062029.tif 000203
【０９５３】
表１８Ｊは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択されて、高い直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９５４】
【表１７１】
2020062029.tif 000204
【０９５５】
表１８Ｋは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＴＬＡ４遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（例えば、転写開始部位の１ｋｂ上流および下流に及ぶ）で選択される。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９５６】
【表１７２】
2020062029.tif 000205
【０９５７】
表１９Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９５８】
【表１７３】
2020062029.tif 000206
【０９５９】
表１９Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９６０】
【表１７４】
2020062029.tif 000207
【０９６１】
表１９Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列を超えて、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９６２】
【表１７５】
2020062029.tif 000208
【０９６３】
表１９Ｄは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、高レベルの直交性を有し、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９６４】
【表１７６】
2020062029.tif 000209
【０９６５】
表１９Ｅは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内から選択され、直交性のレベルは要求されず、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９６６】
【表１７７】
2020062029.tif 000210
【０９６７】
表１９Ｆは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りの下流コード配列中で選択され、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９６８】
【表１７８】
2020062029.tif 000211
【０９６９】
表１９Ｇは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、ＮＮＧＲＲＶ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９７０】
【表１７９】
2020062029.tif 000212
【０９７１】
表１９Ｈは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りの下流コード配列中で選択され、ＮＮＧＲＲＶ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９７２】
【表１８０】
2020062029.tif 000213
【０９７３】
表１９Ｉは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９７４】
【表１８１】
2020062029.tif 000214
【０９７５】
表１９Ｊは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列を超えて、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９７６】
【表１８２】
2020062029.tif 000215
【０９７７】
表２０Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、高レベルの直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９７８】
【表１８３】
2020062029.tif 000216
【０９７９】
表２０Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択されて、高い直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９８０】
【表１８４】
2020062029.tif 000217
【０９８１】
表２０Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（例えば、転写開始部位の１ｋｂ上流および下流に及ぶ）で選択される。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９８２】
【表１８５】
2020062029.tif 000218
【０９８３】
表２０Ｄは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、高レベルの直交性、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９８４】
【表１８６】
2020062029.tif 000219
【０９８５】
表２０Ｅは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、直交性は要求されず、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９８６】
【表１８７】
2020062029.tif 000220
【０９８７】
表２０Ｆは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（例えば、転写開始部位の１ｋｂ上流および下流に及ぶ）で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９８８】
【表１８８】
2020062029.tif 000221
【０９８９】
表２０Ｇは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＶである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９９０】
【表１８９】
2020062029.tif 000222
【０９９１】
表２０Ｈは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の１ｋｂ上流および下流に及ぶ）で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＶである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９９２】
【表１９０】
2020062029.tif 000223
【０９９３】
表２０Ｉは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、高レベルの直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９９４】
【表１９１】
2020062029.tif 000224
【０９９５】
表２０Ｊは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＤＣＤ１遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（例えば、転写開始部位の１ｋｂ上流および下流に及ぶ）で選択される。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【０９９６】
【表１９２】
2020062029.tif 000225
【０９９７】
表２１Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【０９９８】
【表１９３】
2020062029.tif 000226
【０９９９】
表２１Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０００】
【表１９４】
2020062029.tif 000227
【１００１】
表２１Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列を超えて、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１００２】
【表１９５】
2020062029.tif 000228
【１００３】
表２１Ｄは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、高レベルの直交性を有し、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１００４】
【表１９６】
2020062029.tif 000229
【１００５】
表２１Ｅは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内から選択され、直交性のレベルは要求されず、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１００６】
【表１９７】
2020062029.tif 000230
【１００７】
表２１Ｆは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りの下流コード配列中で選択され、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１００８】
【表１９８】
2020062029.tif 000231
【１００９】
表２１Ｇは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、ＮＮＧＲＲＶ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０１０】
【表１９９】
2020062029.tif 000232
【１０１１】
表２１Ｈは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りの下流コード配列中で選択され、ＮＮＧＲＲＶ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０１２】
【表２００】
2020062029.tif 000233
【１０１３】
表２１Ｉは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０１４】
【表２０１】
2020062029.tif 000234
【１０１５】
表２１Ｊは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０１６】
【表２０２】
2020062029.tif 000235
【１０１７】
表２１Ｋは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列を超えて、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０１８】
【表２０３】
2020062029.tif 000236
【１０１９】
表２２Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、高レベルの直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０２０】
【表２０４】
2020062029.tif 000237
【１０２１】
表２２Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択されて、高い直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０２２】
【表２０５】
2020062029.tif 000238
【１０２３】
表２２Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（例えば、転写開始部位の１ｋｂ上流および下流に及ぶ）で選択される。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０２４】
【表２０６】
2020062029.tif 000239
【１０２５】
表２２Ｄは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、高レベルの直交性、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０２６】
【表２０７】
2020062029.tif 000240
【１０２７】
表２２Ｅは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、直交性は要求されず、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０２８】
【表２０８】
2020062029.tif 000241
【１０２９】
表２２Ｆは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（例えば、転写開始部位の１ｋｂ上流および下流に及ぶ）で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０３０】
【表２０９】
2020062029.tif 000242
【１０３１】
表２２Ｇは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＶである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０３２】
【表２１０】
2020062029.tif 000243
【１０３３】
表２２Ｈは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（転写開始部位の１ｋｂ上流および下流に及ぶ）で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＶである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０３４】
【表２１１】
2020062029.tif 000244
【１０３５】
表２２Ｉは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、高レベルの直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０３６】
【表２１２】
2020062029.tif 000245
【１０３７】
表２２Ｊは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択されて、高い直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０３８】
【表２１３】
2020062029.tif 000246
【１０３９】
表２２Ｋは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＣＢＬＢ遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（例えば、転写開始部位の１ｋｂ上流および下流に及ぶ）で選択される。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０４０】
【表２１４】
2020062029.tif 000247
【１０４１】
表２３Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０４２】
【表２１５】
2020062029.tif 000248
【１０４３】
表２３Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０４４】
【表２１６】
2020062029.tif 000249
【１０４５】
表２３Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列を超えて、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０４６】
【表２１７】
2020062029.tif 000250
【１０４７】
表２３Ｄは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、高レベルの直交性を有し、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０４８】
【表２１８】
2020062029.tif 000251
【１０４９】
表２３Ｅは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内から選択され、直交性のレベルは要求されず、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０５０】
【表２１９】
2020062029.tif 000252
【１０５１】
表２３Ｆは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りの下流コード配列中で選択され、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０５２】
【表２２０】
2020062029.tif 000253
【１０５３】
表２３Ｇは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、ＮＮＧＲＲＶ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０５４】
【表２２１】
2020062029.tif 000254
【１０５５】
表２３Ｈは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りの下流コード配列中で選択され、ＮＮＧＲＲＶ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０５６】
【表２２２】
2020062029.tif 000255
【１０５７】
表２３Ｉは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０５８】
【表２２３】
2020062029.tif 000256
【１０５９】
表２３Ｊは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列を超えて、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０６０】
【表２２４】
2020062029.tif 000257
【１０６１】
表２４Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、高レベルの直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０６２】
【表２２５】
2020062029.tif 000258
【１０６３】
表２４Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択されて、高い直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０６４】
【表２２６】
2020062029.tif 000259
【１０６５】
表２４Ｃは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに７３ｂｐ上流および５００ｂｐ下流内（転写開始部位の５７３ｂｐ上流および１ｋｂ下流に及ぶ）で選択される。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０６６】
【表２２７】
2020062029.tif 000260
【１０６７】
表２４Ｄは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、高レベルの直交性、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０６８】
【表２２８】
2020062029.tif 000261
【１０６９】
表２４Ｅは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、直交性は要求されず、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０７０】
【表２２９】
2020062029.tif 000262
【１０７１】
表２４Ｆは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに５００ｂｐ上流および下流内（例えば、転写開始部位の１ｋｂ上流および下流に及ぶ）で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０７２】
【表２３０】
2020062029.tif 000263
【１０７３】
表２４Ｇは、第４階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに７３ｂｐ上流および５００ｂｐ下流内（転写開始部位の５７３ｂｐ上流および１ｋｂ下流に及ぶ）で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０７４】
【表２３１】
2020062029.tif 000264
【１０７５】
表２４Ｈは、第５階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに７３ｂｐ上流および５００ｂｐ下流内（転写開始部位の５７３ｂｐ上流および１ｋｂ下流に及ぶ）で選択され、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＶである。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０７６】
【表２３２】
2020062029.tif 000265
【１０７７】
表２４Ｉは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択され、高レベルの直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０７８】
【表２３３】
2020062029.tif 000266
【１０７９】
表２４Ｊは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位の最初の５００ｂｐ上流および下流内で選択されて、高い直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０８０】
【表２３４】
2020062029.tif 000267
【１０８１】
表２４Ｋは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＰＴＰＮ６遺伝子ノックダウンの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、転写開始部位のさらに７３ｂｐ上流および５００ｂｐ下流内（転写開始部位の５７３ｂｐ上流および１ｋｂ下流に及ぶ）で選択される。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、例えば、本明細書に記載されるようなｅｉＣａｓ９融合タンパク質などのＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｅｉＣａｓ９分子と共に使用され得る。
【１０８２】
【表２３５】
2020062029.tif 000268
【１０８３】
表２５Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。一実施形態では、２つのｇＲＮＡを使用して、２つのＣａｓ９ヌクレアーゼまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼが標的化され、例えば、表２５−１に示される、Ａ群からの標的化ドメインがあるｇＲＮＡが、Ｂ群からの標的化ドメインがあるｇＲＮＡと対にされ得る。
【１０８４】
【表２３６】
2020062029.tif 000269
【１０８５】
【表２３７】
2020062029.tif 000270
【１０８６】
表２５Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０８７】
【表２３８】
2020062029.tif 000271
【１０８８】
表２５Ｃは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、高レベルの直交性を有し、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。一実施形態では、２つのｇＲＮＡを使用して、２つのＣａｓ９ヌクレアーゼまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼが標的化され、例えば、表２５−２に示される、Ａ群からの標的化ドメインがあるｇＲＮＡが、Ｂ群からの標的化ドメインがあるｇＲＮＡと対にされ得る。
【１０８９】
【表２３９】
2020062029.tif 000272
【１０９０】
【表２４０】
2020062029.tif 000273
【１０９１】
表２５Ｄは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用したＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内から選択され、直交性のレベルは要求されず、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０９２】
【表２４１】
2020062029.tif 000274
【１０９３】
表２５Ｅは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用したＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りの下流コード配列中で選択され、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０９４】
【表２４２】
2020062029.tif 000275
【１０９５】
表２５Ｆは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０９６】
【表２４３】
2020062029.tif 000276
【１０９７】
表２５Ｇは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１０９８】
【表２４４】
2020062029.tif 000277
【１０９９】
表２６Ａは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＴＲＢＣ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。一実施形態では、２つのｇＲＮＡを使用して、２つのＣａｓ９ヌクレアーゼまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼが標的化され、例えば、表２６−１に示される、Ａ群からの標的化ドメインがあるｇＲＮＡが、Ｂ群からの標的化ドメインがあるｇＲＮＡと対にされ得る。
【１１００】
【表２４５】
2020062029.tif 000278
【１１０１】
【表２４６】
2020062029.tif 000279
【１１０２】
表２６Ｂは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＴＲＢＣ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１１０３】
【表２４７】
2020062029.tif 000280
【１１０４】
表２６Ｃは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＴＲＢＣ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内で選択され、高レベルの直交性を有し、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。一実施形態では、２つのｇＲＮＡを使用して、２つのＣａｓ９ヌクレアーゼまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼが標的化され、例えば、表２６−２に示される、Ａ群からの標的化ドメインがあるｇＲＮＡが、Ｂ群からの標的化ドメインがあるｇＲＮＡと対にされ得る。
【１１０５】
【表２４８】
2020062029.tif 000281
【１１０６】
【表２４９】
2020062029.tif 000282
【１１０７】
表２６Ｄは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用したＴＲＢＣ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、コード配列の最初の５００ｂｐ内から選択され、直交性のレベルは要求されず、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１１０８】
【表２５０】
2020062029.tif 000283
【１１０９】
表２６Ｅは、第３階層パラメータに従って選択された、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用したＴＲＢＣ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、残りの下流コード配列中で選択され、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを含んだ。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１１１０】
【表２５１】
2020062029.tif 000284
【１１１１】
表２６Ｆは、第１階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＴＲＢＣ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性を有した。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１１１２】
【表２５２】
2020062029.tif 000285
【１１１３】
表２６Ｇは、第２階層パラメータに従って選択された、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９を使用した、ＴＲＢＣ遺伝子ノックアウトの標的化ドメインを提供する。標的化ドメインは、開始コドン下流の最初の５００ｂｐのコード配列中で結合して、良好な直交性は要求されなかった。標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書で検討される。表中の標的化ドメインのいずれでも、二本鎖切断（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を生じる、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用され得る。一実施形態では、二重標的化が使用されて、対向するＤＮＡ鎖と相補的な２つの標的化ドメインと共に、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９ニッカーゼが使用されて対向するＤＮＡ鎖上に２つのニックが生じ、例えば、任意のマイナス鎖標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡが、２つのｇＲＮＡが、ＰＡＭが外側を向きｇＲＮＡの５’末端間の距離が０〜５０ｂｐであるようにＤＮＡ上で配向するという条件で、プラス鎖標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡと対にされてもよい。
【１１１４】
【表２５３】
2020062029.tif 000286
【１１１５】
本明細書で開示される標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される１７量体を含んでなってもよく、例えば、１８ヌクレオチド以上の標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される１７量体ｇＲＮＡを含んでなってもよい。
【１１１６】
本明細書で開示される標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される１８量体を含んでなってもよく、例えば、１９ヌクレオチド以上の標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される１８量体ｇＲＮを含んでなってもよい。
【１１１７】
本明細書で開示される標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される１９量体を含んでなってもよく、例えば、２０ヌクレオチド以上の標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される１９量体ｇＲＮＡを含んでなってもよい。
【１１１８】
本明細書で開示される標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される２０量体ｇＲＮＡを含んでなってもよく、例えば、２１ヌクレオチド以上の標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される２０量体ｇＲＮＡを含んでなってもよい。
【１１１９】
本明細書で開示される標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される２１量体を含んでなってもよく、例えば、２２ヌクレオチド以上の標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される２１量体ｇＲＮＡを含んでなってもよい。
【１１２０】
本明細書で開示される標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される２２量体を含んでなってもよく、例えば、２３ヌクレオチド以上の標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される２２量体ｇＲＮＡを含んでなってもよい。
【１１２１】
本明細書で開示される標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される２３量体を含んでなってもよく、例えば、２４ヌクレオチド以上の標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される２３量体ｇＲＮＡを含んでなってもよい。
【１１２２】
本明細書で開示される標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される２４量体を含んでなってもよく、例えば、２５ヌクレオチド以上の標的化ドメインは、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２に記載される２４量体ｇＲＮＡを含んでなってもよい。
【１１２３】
ＩＩＩ．Ｃａｓ９分子
多様な生物種のＣａｓ９分子が、本明細書に記載される方法および組成物で使用され得る。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９分子が、本明細書の開示の多くの対象である一方で、本明細書で列挙されるその他の生物種からの、それに由来する、またはそのＣａｓ９タンパク質をベースとする、Ｃａｓ９分子もまた使用され得る。換言すれば、本明細書の記述の多くが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９分子を利用する一方で、その他の生物種からのＣａｓ９分子が、それらを置き換え得る。そのような種としては、アシドボラクス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ）、アクチノバチルス・プルロニューモニアエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｉｓ）、アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種、アリシクリフィルス・デニトリフィカンス（Ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ）、カンジダツス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｃｏｌｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マトルコチイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅ）、ユウバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリア綱（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕ���）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトラム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シナエディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア科（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌、メチロシスチス科（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）種、メチロシナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベッセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア・メニンジチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、パルビバクラム・ラバメンチボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム属（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ）種、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）種、スポロラクトバチルス・ビネア（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、サブドリグラヌルム属（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ）種、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、またはベルミネフロバクター・エイセニア（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｉｓｅｎｉａｅ）が挙げられる。
【１１２４】
Ｃａｓ９分子、またはＣａｓ９ポリペプチドは、本明細書での用法では、ｇＲＮＡ分子と相互作用し得て、ｇＲＮＡ分子と協調して、標的ドメインおよびＰＡＭ配列を含んでなる部位に復帰または局在する分子、またはポリペプチドを指す。Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチドと言う用語は、本明細書の用法では、天然Ｃａｓ９分子を指し、例えば、表１００の最も良く似た天然Ｃａｓ９分子または配列などの参照配列と、例えば、少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる、遺伝子操作、改変、または修飾されたＣａｓ９分子、またはＣａｓ９ポリペプチドを指す。
【１１２５】
Ｃａｓ９ドメイン
結晶構造は、２つの異なる天然細菌Ｃａｓ９分子（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４３（６１７６）：１２４７９９７，２０１４）について、およびガイドＲＮＡがあるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（例えば、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの合成融合物）（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５６：９３５−９４９，２０１４；およびＡｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３５７９）について評価された。
【１１２６】
天然Ｃａｓ９分子は、認識（ＲＥＣ）ローブおよびヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブの２つのローブを含んでなり；そのそれぞれは、本明細書に記載されるドメインをさらに含んでなる。図８Ａ〜８Ｂは、一次構造中の重要なＣａｓ９ドメイン構成の概略図を提供する。本開示全体を通じて使用されるドメイン命名法および各ドメインに包含されるアミノ酸残基の番号付与は、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．に記載されるようである。アミノ酸残基の番号付与は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９を参照する。
【１１２７】
ＲＥＣローブは、アルギニンに富む架橋らせん（ＢＨ）、ＲＥＣ１ドメイン、およびＲＥＣ２ドメインを含んでなる。ＲＥＣローブは、その他の既知のタンパク質と構造的類似性を有せず、それがＣａｓ９特異的機能ドメインであることが示唆される。ＢＨドメインは、長いα−らせんおよびアルギニンに富む領域であり、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列のアミノ酸６０〜９３を含んでなる。ＲＥＣ１ドメインは、例えば、ｇＲＮＡまたはａｔｒａｃｒＲＮＡなどの反復：抗反復二本鎖の認識に重要であり、したがって標的配列を認識することでＣａｓ９活性に重要である。ＲＥＣ１ドメインは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列のアミノ酸９４〜１７９および３０８〜７１７に、２つのＲＥＣ１モチーフを含んでなる。これらの２つのＲＥＣ１ドメインは、直鎖一次構造内ではＲＥＣ２ドメインによって隔てられるが、三次構造に構築されてＲＥＣ１ドメインを形成する。ＲＥＣ２ドメインまたはその部分はまた、反復：抗反復二本鎖の認識における役割を有してもよい。ＲＥＣ２ドメインは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列のアミノ酸１８０〜３０７を含んでなる。
【１１２８】
ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン（本明細書ではＲｕｖＣ様ドメインとも称される）、ＨＮＨドメイン（本明細書ではＨＮＨ様ドメインとも称される）、およびＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含んでなる。ＲｕｖＣドメインは、レトロウイルスインテグラーゼスーパーファミリー構成要素との構造類似性を有して、例えば、標的核酸分子の非相補鎖などの一本鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、それぞれＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列のアミノ酸１〜５９、７１８〜７６９、および９０９〜１０９８にある、３つの分割ＲｕｖＣモチーフ（ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、およびＲｕｖＣＩＩＩ、当該技術分野で一般にＲｕｖＣＩドメイン、またはＮ末端ＲｕｖＣドメイン、ＲｕｖＣＩＩドメイン、およびＲｕｖＣＩＩＩドメインと称されることが多い）から構築される。ＲＥＣ１ドメインと同様に、３つのＲｕｖＣモチーフは、一次構造内ではその他のドメインによって直線的に隔離されるが、三次構造内では、３つのＲｕｖＣモチーフに構築されてＲｕｖＣドメインが形成する。ＨＮＨドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼとの構造的類似性を有し、例えば、標的核酸分子の相補鎖などの一本鎖を切断する。ＨＮＨドメインは、ＲｕｖＣＩＩ〜ＩＩＩモチーフの間にあり、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列のアミノ酸７７５〜９０８を含んでなる。ＰＩドメインは、標的核酸分子のＰＡＭと相互作用し、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９．配列のアミノ酸１０９９〜１３６８を含んでなる。
【１１２９】
ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメイン
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨ様ドメインおよびＲｕｖＣ様ドメインを含んでなる。一実施形態では、切断活性は、ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインに依存する。例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインのドメインの１つまたは複数を含んでなり得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドであり、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、以下に記載されるＲｕｖＣ様ドメイン、および／または例えば、以下に記載されるＨＮＨ様ドメインなどのＨＮＨ様ドメインなどのＲｕｖＣ様ドメインを含んでなる。
【１１３０】
ＲｕｖＣ様ドメイン
一実施形態では、ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、標的核酸分子の非相補鎖などの一本鎖を切断する。Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、２つ以上のＲｕｖＣ様ドメイン（例えば、１、２、３つ以上のＲｕｖＣ様ドメイン）を含み得る。一実施形態では、ＲｕｖＣ様ドメインは、少なくとも５、６、７、８アミノ酸長であるが、２０、１９、１８、１７、１６または１５アミノ酸長以下である。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、約１５アミノ酸長などの約１０〜２０個のアミノ酸のＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなる。
【１１３１】
Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン
いくつかの天然Ｃａｓ９分子は、２つ以上のＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり、切断はＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに依存する。したがって、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり得る。代表的なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、以下に記載される。
【１１３２】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、式Ｉ、
Ｄ−Ｘ１−Ｇ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｇ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号８）
のアミノ酸配列を含んでなる、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり、
式中、
Ｘ１は、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｌ、およびＴから選択され（例えば、Ｉ、Ｖ、およびＬから選択され）；
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およびＩから選択され）；
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択され；
Ｘ４は、Ｓ、Ｙ、Ｎ、およびＦ（例えば、Ｓ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｔ、およびＦから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬから選択され）；
Ｘ６は、Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｓ、およびＬ（例えば、Ｗ）から選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｖ、およびＧから選択され（例えば、ＡおよびＳから選択され）；
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｍ、およびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、Ｍ、およびＬから選択され）；
Ｘ９は、Δ（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｍ、およびＲから選択され、または、例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびΔから選択される）で表記される、任意のアミノ酸から選択され、または不在である。
【１１３３】
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号８の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【１１３４】
実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、切断能力がある。
【１１３５】
実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、切断能力がない。
【１１３６】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、式ＩＩ、
Ｄ−Ｘ１−Ｇ−Ｘ２−Ｘ３−Ｓ−Ｘ５−Ｇ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号９）
のアミノ酸配列を含んでなる、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり、
式中、
Ｘ１は、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｌ、およびＴから選択され（例えば、Ｉ、Ｖ、およびＬから選択され）；
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およびＩから選択され）；
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｔ、およびＦから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬから選択され）；
Ｘ６は、Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｓ、およびＬ（例えば、Ｗ）から選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｖ、およびＧから選択され（例えば、ＡおよびＳから選択され）；
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｍ、およびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、Ｍ、およびＬから選択され）；
Ｘ９は、任意のアミノ酸から選択されまたは不在であり（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｍ、およびＲから選択され、または例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびΔから選択される）。
【１１３７】
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号９の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【１１３８】
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＩＩＩ、
Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｘ２−Ｘ３−Ｓ−Ｖ−Ｇ−Ｗ−Ａ−Ｘ８−Ｘ９（配列番号１０）
のアミノ酸配列を含んでなり、
式中、
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およびＩから選択され）；
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択され；
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｍ、およびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、Ｍ、およびＬから選択され）；
Ｘ９は、任意のアミノ酸から選択されまたは不在であり（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｍ、およびＲから選択され、または例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびΔから選択される）。
【１１３９】
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号１０の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【１１４０】
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＩＩＩ、
Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｔ−Ｎ−Ｓ−Ｖ−Ｇ−Ｗ−Ａ−Ｖ−Ｘ（配列番号１１）
のアミノ酸配列を含んでなり、
式中、
Ｘは、非極性アルキルアミノ酸またはヒドロキシルアミノ酸であり、例えば、Ｘは、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびＴから選択される（例えば、ｅａＣａｓ９分子は、図２Ａ〜２Ｇに示されるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり得る（Ｙとして示される））。
【１１４１】
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号１１の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【１１４２】
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、図３Ａ〜３Ｂまたは図７Ａ〜７Ｂなどの本明細書で開示される、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインの配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。一実施形態では、図３Ａ〜３Ｂまたは図７Ａ〜７Ｂで同定された高度に保存された残基の内、１つ、２つ、または３つ全てが存在する。
【１１４３】
一実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、図４Ａ〜４Ｂまたは図７Ａ〜７Ｂなどの本明細書で開示される、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインの配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。一実施形態では、図４Ａ〜４Ｂまたは図７Ａ〜７Ｂで同定された高度に保存された残基の内、１つ、２つ、３つまたは４つ全てが存在する。
【１１４４】
追加的ＲｕｖＣ様ドメイン
Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに加えて、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、１つまたは複数の追加的ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、２つの追加的ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり得る。好ましくは、追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、１５未満のアミノ酸長、例えば、５〜１０アミノ酸長、例えば、８アミノ酸長などの少なくとも５アミノ酸長である。
【１１４５】
追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、
Ｉ−Ｘ１−Ｘ２−Ｅ−Ｘ３−Ａ−Ｒ−Ｅ（配列番号１２）
のアミノ酸配列を含んでなり得て、
式中、
Ｘ１はＶまたはＨであり，
Ｘ２はＩ、ＬまたはＶ（例えば、ＩまたはＶ）であり；
Ｘ３はＭまたはＴである。
【１１４６】
一実施形態では、追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、
Ｉ−Ｖ−Ｘ２−Ｅ−Ｍ−Ａ−Ｒ−Ｅ（配列番号１３）
のアミノ酸配列を含んでなり、
式中、
Ｘ２はＩ、ＬまたはＶ（例えば、ＩまたはＶ）である（例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇまたは図７Ａ〜７Ｂに示される、追加的ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり得る（Ｂとして示される））。
【１１４７】
追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｈ−Ｈ−Ａ−Ｘ１−Ｄ−Ａ−Ｘ２−Ｘ３（配列番号１４）のアミノ酸配列を含んでなり得て、
式中、
Ｘ１はＨまたはＬであり；
Ｘ２はＲまたはＶであり；および
Ｘ３はＥまたはＶである。
【１１４８】
一実施形態では、追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、
Ｈ−Ｈ−Ａ−Ｈ−Ｄ−Ａ−Ｙ−Ｌ（配列番号１５）
のアミノ酸配列を含んでなる。
【１１４９】
一実施形態では、追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号１２、１３、１４または１５の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【１１５０】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインの側面に位置する配列は、式Ｖ：Ｋ−Ｘ１’−Ｙ−Ｘ２’−Ｘ３’−Ｘ４’−Ｚ−Ｔ−Ｄ−Ｘ９’−Ｙ（配列番号：１６）の配列であり、
式中、
Ｘ１’は、ＫおよびＰから選択され、
Ｘ２’はＶ、Ｌ、Ｉ、およびＦ（例えばＶ、Ｉ、およびＬ）から選択され；
Ｘ３’は、Ｇ、Ａ、およびＳ（例えば、Ｇ）から選択され、
Ｘ４’はＬ、Ｉ、Ｖ、およびＦ（例えば、Ｌ）から選択され；
Ｘ９’は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、およびＱから選択され；
Ｚは、例えば、上述されるようなＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインである。
【１１５１】
ＨＮＨ様ドメイン
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、例えば、二本鎖核酸分子の相補鎖などの一本鎖相補的ドメインを切断する。一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、少なくとも１５、２０、２５アミノ酸長であるが、４０、３５または３０以下のアミノ酸長であり、例えば、２０〜３５アミノ酸長、例えば、２５〜３０アミノ酸長である。代表的なＨＮＨ様ドメインは、以下に記載される。
【１１５２】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、式ＶＩ：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｈ−Ｘ４−Ｘ５−Ｐ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｎ−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号１７）のアミノ酸配列を有するＨＮＨ様ドメインを含んでなり、
式中、
Ｘ１は、Ｄ、Ｅ、Ｑ、およびＮ（例えば、ＤおよびＥ）から選択され；
Ｘ２は、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｍ、およびＫから選択され；
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ａ、およびＬ（例えば、Ａ、Ｉ、およびＶ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷ（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬ）から選択され；
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷから選択され；
Ｘ７は、Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｔ、およびＫ（例えば、ＳおよびＡ）から選択され；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から選択され；
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され；
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され；
Ｘ１１は、Ｄ、Ｓ、Ｎ、Ｒ、Ｌ、およびＴ（例えば、Ｄ）から選択され；
Ｘ１２は、Ｄ、Ｎ、およびＳから選択され；
Ｘ１３は、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＲ（例えば、Ｓ）から選択され；
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、およびＦ）から選択され；
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択され；
Ｘ１６は、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｔ、およびＦ（例えば、Ｌ、Ｒ、およびＫ）から選択され；
Ｘ１７は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ａ、およびＴから選択され；
Ｘ１８は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、およびＡ（例えば、ＬおよびＩ）から選択され；
Ｘ１９は、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｅ、Ｓ、およびＡ（例えば、ＴおよびＶ）から選択され；
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡから選択され；
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され；
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され；
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから選択される。
【１１５３】
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号１７の配列と、少なくとも１つであるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【１１５４】
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、切断能力がある。
【１１５５】
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、切断能力がない。
【１１５６】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、式ＶＩＩ、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｈ−Ｘ４−Ｘ５−Ｐ−Ｘ６−Ｓ−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｄ−Ｓ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｎ−Ｋ−Ｖ−Ｌ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号１８）
のアミノ酸配列を含んでなるＨＮＨ様ドメインを含んでなり、
式中、
Ｘ１は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ２は、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｍ、およびＫから選択され；
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ａ、およびＬ（例えば、Ａ、Ｉ、およびＶ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷ（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬ）から選択され；
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷから選択され；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から選択され；
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され；
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され；
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、およびＦ）から選択され；
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択され；
Ｘ１９は、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｅ、Ｓ、およびＡ（例えば、ＴおよびＶ）から選択され；
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡから選択され；
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され；
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され；
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから選択される。
【１１５７】
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号１８の配列と、１、２、３、４、または５つの残基が異なる。
【１１５８】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、式ＶＩＩ、
Ｘ１−Ｖ−Ｘ３−Ｈ−Ｉ−Ｖ−Ｐ−Ｘ６−Ｓ−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｄ−Ｓ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｎ−Ｋ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含んでなるＨＮＨ様ドメインを含んでなる。
式中、
Ｘ１は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、およびＷから選択され；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から選択され；
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され；
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され；
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、およびＦ）から選択され；
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択され；
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡから選択され；
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され；
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され；
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから選択される。
【１１５９】
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号１９の配列と、１、２、３、４、または５つの残基が異なる。
【１１６０】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、式ＶＩＩＩ、Ｄ−Ｘ２−Ｄ−Ｈ−Ｉ−Ｘ５−Ｐ−Ｑ−Ｘ７−Ｆ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｘ１２−Ｓ−Ｉ−Ｄ−Ｎ−Ｘ１６−Ｖ−Ｌ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｓ−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号２０）
のアミノ酸配列を有するＨＮＨ様ドメインを含んでなる。
式中、
Ｘ２は、ＩおよびＶから選択され；
Ｘ５は、ＩおよびＶから選択され；
Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ９は、ＩおよびＬから選択され；
Ｘ１０は、ＫおよびＴから選択され；
Ｘ１２は、ＤおよびＮから選択され；
Ｘ１６は、Ｒ、Ｋ、およびＬから選択され；Ｘ１９は、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ２０は、ＳおよびＲから選択され；
Ｘ２２は、Ｋ、Ｄ、およびＡから選択され；
Ｘ２３は、Ｅ、Ｋ、Ｇ、およびＮから選択される（例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、本明細書に記載されるようなＨＮＨ様ドメインを含んでなり得る）。
【１１６１】
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号２０の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【１１６２】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、式ＩＸ、
Ｌ−Ｙ−Ｙ−Ｌ−Ｑ−Ｎ−Ｇ−Ｘ１’−Ｄ−Ｍ−Ｙ−Ｘ２’−Ｘ３’−Ｘ４’−Ｘ５’−Ｌ−Ｄ−Ｉ−Ｘ６’−Ｘ７’−Ｌ−Ｓ−Ｘ８’−Ｙ−Ｚ−Ｎ−Ｒ−Ｘ９’−Ｋ−Ｘ１０’−Ｄ−Ｘ１１’−Ｖ−Ｐ（配列番号２１）
のアミノ酸配列を含んでなる。
式中、
Ｘ１’は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ２’は、ＶおよびＴから選択され；
Ｘ３’は、ＧおよびＤから選択され；
Ｘ４’は、Ｅ、Ｑ、およびＤから選択され；
Ｘ５’は、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ６’は、Ｄ、Ｎ、およびＨから選択され；
Ｘ７’は、Ｙ、Ｒ、およびＮから選択され；
Ｘ８’は、Ｑ、Ｄ、およびＮから選択され；Ｘ９’は、ＧおよびＥから選択され；
Ｘ１０’は、ＳおよびＧから選択され；
Ｘ１１’は、ＤおよびＮから選択され；および
Ｚは、例えば、上述されるようなＨＮＨ様ドメインである。
【１１６３】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、配列番号２１の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる、アミノ酸配列を含んでなる。
【１１６４】
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、例えば、図５Ａ〜５Ｃまたは図７Ａ〜７Ｂなどの本明細書で開示されるＨＮＨ様ドメインの配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。一実施形態では、図５Ａ〜５Ｃまたは図７Ａ〜７Ｂ１で同定された高度に保存された残基の内、片方または双方が存在する。
【１１６５】
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、例えば、図６Ａ〜６Ｂまたは図７Ａ〜７Ｂなどの本明細書で開示されるＨＮＨ様ドメインの配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。一実施形態では、図６Ａ〜６Ｂ、または図７Ａ〜７Ｂで同定された高度に保存された残基の内、１つ、２つ、３つ全てが存在する。
【１１６６】
Ｃａｓ９機能
ヌクレアーゼおよびヘリカーゼ機能
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、標的核酸分子を切断する能力がある。典型的に野性型Ｃａｓ９分子は、標的核酸分子の双方の鎖を切断する。Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチドを遺伝子操作して、ヌクレアーゼ切断（またはその他の性質）を改変して、例えば、ニッカーゼである、または標的核酸を切断する能力を欠く、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチド（ｐｅｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を提供し得る。標的核酸分子を切断する能力があるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、本明細書でｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドと称される。
【１１６７】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、以下の機能の１つまたは複数を含んでなる：
ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を切断する能力；
一実施形態では２つのニッカーゼ活性の存在である、二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生成する能力；
エンドヌクレアーゼ活性；
エキソヌクレアーゼ活性；および
ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力。
【１１６８】
一実施形態では、酵素的に活性なまたはｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、双方の鎖を切断して、二本鎖切断をもたらす。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子は、例えば、それに対してｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖、またはｇＲＮＡとハイブリダイズする鎖と相補的な鎖などの１本の鎖のみを切断する。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性を含んでなる。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性を含んでなる。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨドメインに関連する切断活性およびＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性を含んでなる。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、活性のまたは切断能力があるＨＮＨ様ドメインと、不活性のまたは切断能力がないＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含んでなる一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、不活性のまたは切断能力がないＨＮＨ様ドメインと、活性のまたは切断能力があるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含んでなる。
【１１６９】
いくつかのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ｇＲＮＡ分子と相互作用する能力を有し、ｇＲＮＡ分子と連結してコア標的ドメインに局在するが、標的核酸を切断できず、あるいは効率的な速度で切断できない。皆無のまたはほぼ皆無の切断活性を有するＣａｓ９分子は、本明細書でｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９ポリペプチドと称される。例えば、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９ポリペプチドは、切断活性が欠損し得て、または本明細書に記載されるアッセイによる測定で、例えば、標準Ｃａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９ポリペプチドの２０、１０、５、１または０．１％未満などの実質的により低い切断活性を有する。
【１１７０】
標的化およびＰＡＭ
ＡＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子と相互作用し得るポリペプチドであり、ｇＲＮＡ分子と協調して、標的ドメインおよびａＰＡＭ配列を含んでなる部位に局在する。
【１１７１】
一実施形態では、標的核酸と相互作用して切断するｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドの能力は、ＰＡＭ配列依存性である。ＰＡＭ配列は、標的核酸中の配列である。一実施形態では、標的核酸の切断は、ＰＡＭ配列の上流で起こる。異なる細菌種からのｅａＣａｓ９分子は、異なる配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識し得る。一実施形態では、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧ，ＮＡＧ、ＮＧＡを認識して、その配列から、例えば、３〜５塩基対などの１〜１０塩基対上流で、標的核酸配列の切断を誘導する。例えば、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１３；３３９（６１２１）：８２３−８２６を参照されたい。一実施形態では、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧＮＧおよび／またはＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）を認識して、これらの配列の例えば、３〜５塩基対などの１〜１０塩基対上流で、標的核酸配列の切断を誘導する。例えば、Ｈｏｒｖａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１０；３２７（５９６２）：１６７−１７０，ａｎｄ  Ｄｅｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ  ２００８；１９０（４）：１３９０−１４００を参照されたい。一実施形態では、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧおよび／またはＮＡＡＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ））を認識して、この配列の例えば、３〜５塩基対など１〜１０塩基対上流で、コア標的核酸配列切断を誘導する。例えば、Ｄｅｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ  ２００８；１９０（４）：１３９０−１４００を参照されたい。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲ（（Ｒ）＝ＡまたはＧ）を認識して、例えば、その配列から３〜５塩基対上流などの１〜１０塩基対上流の標的核酸配列の切断を誘導する。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＴ（Ｒ）＝ＡまたはＧ）を認識して、例えば、その配列から３〜５塩基対上流などの１〜１０塩基対上流の標的核酸配列の切断を誘導する。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＶ（Ｒ）＝ＡまたはＧ）を認識して、例えば、その配列から３〜５塩基対上流などの１〜１０塩基対上流の標的核酸配列の切断を誘導する。一実施形態では、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＮＮＧＡＴＴまたはＮＮＮＧＣＴＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ａ、ＧまたはＣを認識して、例えば、その配列から３〜５塩基対上流などの１〜１０塩基対上流の標的核酸配列の切断を誘導する。例えば、Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＥＡＲＬＹ  ＥＤＩＴＩＯＮ  ２０１３，１−６を参照されたい。Ｃａｓ９分子が、ＰＡＭ配列を認識する能力は、例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１２，３３７：８１６に記載される形質転換アッセイを使用して判定され得る。前述の実施形態では、Ｎは、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれかの任意のヌクレオチ��残基であり得る。
【１１７２】
本明細書で考察されるように、Ｃａｓ９分子は遺伝子操作されて、Ｃａｓ９分子のＰＡＭ特異性が改変され得る。
【１１７３】
代表的な天然起源Ｃａｓ９分子は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３  １０：５，７２７−７３７に記載される。このようなＣａｓ９分子としては、クラスター１細菌科、クラスター２細菌科、クラスター３細菌科、クラスター４細菌科、クラスター５細菌科、クラスター６細菌科、クラスター７細菌科、クラスター８細菌科、クラスター９細菌科、クラスター１０細菌科、クラスター１１細菌科、クラスター１２細菌科、クラスター１３細菌科、クラスター１４細菌科、クラスター１５細菌科、クラスター１６細菌科、クラスター１７細菌科、クラスター１８細菌科、クラスター１９細菌科、クラスター２０細菌科、クラスター２１細菌科、クラスター２２細菌科、クラスター２３細菌科、クラスター２４細菌科、クラスター２５細菌科、クラスター２６細菌科、クラスター２７細菌科、クラスター２８細菌科、クラスター２９細菌科、クラスター３０細菌科、クラスター３１細菌科、クラスター３２細菌科、クラスター３３細菌科、クラスター３４細菌科、クラスター３５細菌科、クラスター３６細菌科、クラスター３７細菌科、クラスター３８細菌科、クラスター３９細菌科、クラスター４０細菌科、クラスター４１細菌科、クラスター４２細菌科、クラスター４３細菌科、クラスター４４細菌科、クラスター４５細菌科、クラスター４６細菌科、クラスター４７細菌科、クラスター４８細菌科、クラスター４９細菌科、クラスター５０細菌科、クラスター５１細菌科、クラスター５２細菌科、クラスター５３細菌科、クラスター５４細菌科、クラスター５５細菌科、クラスター５６細菌科、クラスター５７細菌科、クラスター５８細菌科、クラスター５９細菌科、クラスター６０細菌科、クラスター６１細菌科、クラスター６２細菌科、クラスター６３細菌科、クラスター６４細菌科、クラスター６５細菌科、クラスター６６細菌科、クラスター６７細菌科、クラスター６８細菌科、クラスター６９細菌科、クラスター７０細菌科、クラスター７１細菌科、クラスター７２細菌科、クラスター７３細菌科、クラスター７４細菌科、クラスター７５細菌科、クラスター７６細菌科、クラスター７７細菌科、またはクラスター７８細菌科のＣａｓ９分子が挙げられる。
【１１７４】
代表的な天然起源Ｃａｓ９分子としては、クラスター１細菌科のＣａｓ９分子が挙げられる。例としては、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（例えば、ＳＦ３７０、ＭＧＡＳ１０２７０、ＭＧＡＳ１０７５０、ＭＧＡＳ２０９６、ＭＧＡＳ３１５、ＭＧＡＳ５００５、ＭＧＡＳ６１８０、ＭＧＡＳ９４２９、ＮＺ１３１およびＳＳＩ−１株）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、ＬＭＤ−９株）、Ｓ．シュードポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）（例えば、ＳＰＩＮ  ２００２６株）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（例えば、ＵＡ１５９、ＮＮ２０２５株）、Ｓ．マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）（例えば、ＮＣＴＣ１１５５８株）、Ｓ．ガロリチカス（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）（例えば、ＵＣＮ３４、ＡＴＣＣＢＡＡ−２０６９株）、Ｓ．エクイヌス（Ｓ．ｅｑｕｉｎｅｓ）（例えば、ＡＴＣＣ９８１２、ＭＧＣＳ１２４株）、Ｓ．ディスガラクチアエ（Ｓ．ｄｙｓｄａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、ＧＧＳ１２４株）、Ｓ．ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）（例えば、ＡＴＣＣ７００３３８株）、Ｓ．アンギノーサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）（例えば、Ｆ０２１１株）、Ｓ．アガラクチアエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、ＮＥＭ３１６、Ａ９０９株）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（例えば、Ｆ６８５４株）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）（Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ））、例えば、Ｃｌｉｐ１１２６２株）、エンテロコッカス・イタリクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｔａｌｉｃｕｓ）（例えば、ＤＳＭ  １５９５２株）、またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）（例えば、１，２３１，４０８株）のＣａｓ９分子が挙げられる。その他の例示的Ｃａｓ９分子は、ナイセリア・メニンジチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｅａｒｌｙ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１３，１−６）のＣａｓ９分子である。
【１１７５】
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、
配列番号１〜４と、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有し；
比較すると、２、５、１０、１５、２０、３０、または４０％以下のアミノ酸残基が異なり；
少なくとも１、２、５、１０または２０個のアミノ酸であるが、１００、８０、７０、６０、５０、４０または３０個以下のアミノ酸が異なり；または
本明細書に記載される任意のＣａｓ９分子配列、または例えば、本明細書で列挙され、またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３  １０：５，７２７−７３７；Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｅａｒｌｙ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１３，１−６に記載される生物種に由来するＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子配列と同一であるアミノ酸配列を含んでなる。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、以下の機能の１つまたは複数を含んでなる：ニッカーゼ活性；二本鎖切断活性（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；またはｇＲＮＡ分子と一緒に、標的核酸に局在する能力。
【１１７６】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇのコンセンサス配列のアミノ酸配列を含んでなり、その中では、「＊」は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、およびＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９分子のアミノ酸配列中の対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し、「−」は、任意のアミノ酸を示す。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列の配列と、少なくとも１個であるが、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のアミノ酸残基が異なる。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図７Ａ〜７Ｂの配列番号７のアミノ酸配列を含んでなり、その中では、「＊」は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９分子のアミノ酸配列中の対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し、「−」は、任意のアミノ酸を示し、「−」は任意のアミノ酸または不在を示す。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図７Ａ〜７Ｂで開示される配列番号６または７の配列と、少なくとも１個であるが、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のアミノ酸残基が異なる。
【１１７７】
いくつかのＣａｓ９分子の配列の比較は、特定領域が保存されていることを示唆する。これらは、次のように同定される。
領域１（残基１〜１８０、または領域１’の場合は残基１２０〜１８０）
領域２（残基３６０〜４８０）；
領域３（残基６６０〜７２０）；
領域４（残基８１７〜９００）；および
領域５（残基９００〜９６０）。
【１１７８】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域１〜５を含んでなり、十分な追加的Ｃａｓ９分子配列と共に、例えば、本明細書に記載される少なくとも１つの活性を有するＣａｓ９分子などの生物活性分子を提供する。一実施形態では、領域１〜６のそれぞれは、独立して、例えば、図２Ａ〜２Ｇまたは図７Ａ〜７Ｂからの配列などの本明細書に記載されるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドの対応する残基と、５０％、６０％、７０％、または８０％の相同性を有する。
【１１７９】
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域１と称されるアミノ酸配列を含んでなり：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１８０と、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（番号付与は図２Ａ〜２Ｇのモチーフ配列に準拠する；図２Ａ〜２ＧのＣａｓ９配列中の残基の５２％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１８０と、少なくとも１、２、５、１０または２０個のアミノ酸であるが、９０、８０、７０、６０、５０、４０または３０個以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列の１〜１８０と同一である。
【１１８０】
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域１’と称されるアミノ酸配列を含んでなり、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１２０〜１８０と５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（図２Ａ〜２Ｇの４つのＣａｓ９配列中の残基の５５％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１２０〜１８０と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸であるが、３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列の１２０〜１８０と同一である。
【１１８１】
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域２と称されるアミノ酸配列を含んでなり：
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸３６０〜４８０と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（図２Ａ〜２Ｇの４つのＣａｓ９配列中の残基の５２％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸３６０〜４８０と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸であるが、３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列の３６０〜４８０と同一である。
【１１８２】
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域３と称されるアミノ酸配列を含んでなり：
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸６６０〜７２０と５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（図２Ａ〜２Ｇの４つのＣａｓ９配列中の残基の５６％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸６６０〜７２０と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸であるが、３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列の６６０〜７２０と同一である。
【１１８３】
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域４と称されるアミノ酸配列を含んでなり：
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸８１７〜９００と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（図２Ａ〜２Ｇの４つのＣａｓ９配列中の残基の５５％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸８１７〜９００と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸であるが、３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列の８１７〜９００と同一である。
【１１８４】
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域５と称されるアミノ酸配列を含んでなり：
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸９００〜９６０と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（図２Ａ〜２Ｇの４つのＣａｓ９配列中の残基の６０％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸９００〜９６０と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸であるが、３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列の９００〜９６０と同一である。
【１１８５】
遺伝子操作または改変Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチド
例えば、天然Ｃａｓ９分子などの本明細書に記載されるＣａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチドは、ニッカーゼ活性、ヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；ｇＲＮＡ分子と機能的に結合する能力；および核酸上の部位を標的化する（またはそれに局在する）能力（例えば、ＰＡＭ認識および特異性）をはじめとするいくつかの性質のいずれかを有し得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、これらの性質の全てまたは一部を含み得る。典型的な実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と協調して核酸中の部位に局在する能力を有する。例えば、ＰＡＭ特異性、切断活性、またはヘリカーゼ活性などのその他機能は、Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチド中でより幅広く変動し得る。
【１１８６】
Ｃａｓ９分子は、遺伝子操作Ｃａｓ９分子および遺伝子操作Ｃａｓ９ポリペプチドを含む（遺伝子操作は、この文脈の用法では、単にＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが参照配列と異なることを意味して、プロセスまたは起源制限を暗示しない）。遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、（天然またはその他の標準Ｃａｓ９分子と比較して）改変されたヌクレアーゼ活性、または改変されヘリカーゼ活性などの改変された酵素的性質を含んでなり得る。本明細書で考察されるように、遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ニッカーゼ活性（二本鎖ヌクレアーゼ活性との対比で）を有し得る。一実施形態では、遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、１つまたは複数のまたは任意のＣａｓ９活性に対する顕著な影響なしに、例えば、そのサイズを減少させるアミノ酸配列の欠失などの、そのサイズを変化させる改変を有し得る。一実施形態では、遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＰＡＭ認識に影響を及ぼす改変を含んでなり得る。例えば、遺伝子操作Ｃａｓ９分子は、内在性野生型ＰＩドメインによって認識されるもの以外のＰＡＭ配列を認識するように改変され得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と、配列が異なり得るが、１つまたは複数のＣａｓ９機能に顕著な改変を有しない。
【１１８７】
所望の性質があるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、天然Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドなどの親ポリペプチドの改変などの、いくつかの様式で生成されて、所望の性質を有する改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが提供され得る。例えば、例えば、天然または遺伝子操作Ｃａｓ９分子などの親Ｃａｓ９分子との１つまたは複数の変異または差異が導入され得る。このような変異および差異としては、置換（例えば、非必須アミノ酸の保存的置換または置換）；挿入；または欠失が挙げられる。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、親Ｃａｓ９分子などの標準と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０または５０の変異であるが、２００、１００、または８０未満の変異などの１つまたは複数の変異または差異を含んでなり得る。
【１１８８】
一実施形態では、単数の変異または複数の変異は、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９活性などのＣａｓ９活性に対する実質的効果を有しない。一実施形態では、単数の変異または複数の変異は、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９活性などのＣａｓ９活性に対する実質的効果を有する。
【１１８９】
非切断および修飾切断Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチド
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と異なる切断特性を含んでなり、例えば、それは最も近い相同性を有する天然Ｃａｓ９分子と異なる。例えば、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子と、例えば、次のように異なり得る：例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子）と比較して二本鎖核酸切断（エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）の低下または増大を調節するその能力；例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子）と比較して、核酸分子の非相補鎖または核酸分子の相補鎖などの核酸の一本鎖切断（ニッカーゼ活性）の低下または増大を調節するその能力；または例えば、二本鎖または一本鎖核酸分子などの核酸分子を切断する能力が、除去され得る。
【１１９０】
修飾切断ｅａＣａｓ９分子およびｅａＣａｓ９ポリペプチド
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、以下の機能の１つまたは複数を含んでなる：Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性；ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性およびＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性。
【１１９１】
一実施形態ではｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、活性のまたは切断能力があるＨＮＨ様ドメイン（例えば、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１などの本明細書に記載されるＨＮＨ様ドメイン）と、不活性なまたは切断能力がないＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含んでなる。代表的な不活性のまたは切断能力がないＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインにアスパラギン酸の変異を有し得て、例えば、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列の９位のアスパラギン酸、または配列番号７の１０位のアスパラギン酸が、例えば、アラニンで置換され得る。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインにおいて野性型と異なり、標的核酸を切断せず、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１または．１％未満の有意により低い効率で切断する。参照Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子のような、天然Ｃａｓ９分子などの天然未修飾Ｃａｓ９分子であり得る（ｃａｎ  ｂｙ）。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然Ｃａｓ９分子である。
【１１９２】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、不活性のまたは切断能力がないＨＮＨドメインと、活性のまたは切断能力があるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含んでなる。（例えば、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６などの本明細書に記載されるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン）。代表的な不活性のまたは切断能力がないＨＮＨ様ドメインは、以下の１つまたは複数の変異を有し得る：例えば、図２Ａ〜２Ｇの位置８５６に示されるヒスチジンなどのＨＮＨ様ドメインのヒスチジンが、例えば、アラニンで置換され得て；例えば、図２Ａ〜２Ｇの位置８７０および／または図２Ａ〜２Ｇの位置８７９に示されるアスパラギンなどのＨＮＨ様ドメインの１つまたは複数のアスパラギンが、例えば、アラニンで置換され得る。一実施形態では、ｅａＣａｓ９は、ＨＮＨ様ドメインにおいて野性型と異なり、標的核酸を切断せず、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１または０．１％未満の有意により低い効率で切断する。参照Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子のような、天然Ｃａｓ９分子などの天然未修飾Ｃａｓ９分子であり得る（ｃａｎ  ｂｙ）。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然Ｃａｓ９分子である。
【１１９３】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、不活性のまたは切断能力がないＨＮＨドメインと、活性のまたは切断能力があるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含んでなる。（例えば、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６などの本明細書に記載されるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン）。代表的な不活性のまたは切断能力がないＨＮＨ様ドメインは、以下の１つまたは複数の変異を有し得る：例えば、図２Ａ〜２Ｇの位置８５６に示されるヒスチジンなどのＨＮＨ様ドメインのヒスチジンが、例えば、アラニンで置換され得て；例えば、図２Ａ〜２Ｇの位置８７０および／または図２Ａ〜２Ｇの位置８７９に示されるアスパラギンなどのＨＮＨ様ドメインの１つまたは複数のアスパラギンが、例えば、アラニンで置換され得る。一実施形態では、ｅａＣａｓ９は、ＨＮＨ様ドメインにおいて野性型と異なり、標的核酸を切断せず、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１または０．１％未満の有意により低い効率で切断する。参照Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子のような、天然Ｃａｓ９分子などの天然未修飾Ｃａｓ９分子であり得る（ｃａｎ  ｂｙ）。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然Ｃａｓ９分子である。
【１１９４】
標的核酸の片方または双方の鎖を切断する能力の改変
一実施形態では、代表的なＣａｓ９機能は、ＰＡＭ特異性、切断活性、およびヘリカーゼ活性の９つまたは複数を含んでなる。変異は、例えば、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインなどの１つまたは複数のＲｕｖＣ様ドメイン；ＨＮＨ様ドメイン；ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメイン外の領域に存在し得る。いくつかの実施形態では、変異は、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣ様などのＲｕｖＣ様ドメインに存在する。いくつかの実施形態では、変異（ｓ）は、ＨＮＨ様ドメインに存在する。いくつかの実施形態では、変異は、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインなどの双方のＲｕｖＣ様ドメインに存在する。
【１１９５】
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）配列に関してＲｕｖＣドメインまたはＨＮＨドメインに起きてもよい代表的変異としては、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａおよび／またはＤ９８６Ａが挙げられる。
【１１９６】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣドメイン中に、および／またはＨＮＨドメイン中に、標準Ｃａｓ９分子と比較して１つまたは複数の差異を含んでなる、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９ポリペプチドであり、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９ポリペプチドは、核酸を切断せず、または野生型（ｗｉｌｄｙｐｅ）よりも有意により低い効率で切断し、例えば、本明細書に記載されるような切断アッセイにおける野性型と比較して、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、標準Ｃａｓ９分子の５０、２５、１０、または１％未満で切断する。
【１１９７】
例えば、置換などの特定の配列が、標的化活性、切断活性などの１つまたは複数の活性に影響を及ぼしてもよいかどうかは、例えば、変異が保存的であるかどうかを評価することで、またはセクションＩＶに記載される方法によって、評価または予測され得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子の文脈で使用されるような「非必須」アミノ酸残基は、Ｃａｓ９活性（例えば、切断活性）を無効化することなく、またはより好ましくは、実質的に改変することなく、例えば、ｅａＣａｓ９分子のような天然起源Ｃａｓ９分子などのＣａｓ９分子の野生型配列から改変され得る残基である一方で、「必須」アミノ酸残基の変更は、実質的な活性（例えば、切断活性）喪失をもたらす。
【１１９８】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と異なる切断特性を含んでなり、例えば、それは最も近い相同性を有する天然Ｃａｓ９分子と異なる。例えば、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子と、次のように異なり得る：例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のＣａｓ９分子）と比較して二本鎖切断の切断（ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｂｒｅａｋ）（エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）の低下または増大を調節するその能力；例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のＣａｓ９分子）と比較して、核酸分子の非相補鎖または核酸分子の相補鎖などの核酸の一本鎖切断（ニッカーゼ活性）の低下または増大を調節するその能力；または例えば、二本鎖または一本鎖核酸分子などの核酸分子を切断する能力が、除去され得る。
【１１９９】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、以下の機能の１つまたは複数を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドである：ＲｕｖＣドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性およびＲｕｖＣドメインに関連する切断活性。
【１２００】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、核酸分子（二本鎖のまたは一本鎖核酸分子のいずれも）を切断せず、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１または０．１％未満の有意により低い効率で核酸分子を切断する、ｅｉＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドである。参照Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９分子のような、天然Ｃａｓ９分子などの天然未修飾Ｃａｓ９分子であり得る。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然Ｃａｓ９分子である。一実施形態では、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣドメインに関連する実質的切断活性およびＨＮＨドメインに関連する切断活性を欠く。
【１２０１】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列に示されるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の固定アミノ酸残基を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドであり、１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、２００アミノ酸残基）に、図２Ａ〜２Ｇまたは配列番号７で開示されるコンセンサス配列中の「−」によって表示される、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のアミノ酸配列と異なる、１つまたは複数のアミノ酸を有する（例えば、置換を有する）。
【１２０２】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列の固定配列に対応する配列が、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の固定残基と１、２、３、４、５、１０、１５、または２０％以下異なり、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の「＊」によって同定される残基に対応する配列が、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子の対応する配列からの「＊」残基と、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０％以下異なり；図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の「−」によって同定される残基に対応する配列が、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））Ｃａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子の対応する配列からの「−」残基と、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５５、または６０％以下異なる配列を含んでなる。
【１２０３】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列に示されるＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の固定アミノ酸残基を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドであり、１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、２００アミノ酸残基）に、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中で「−」によって表示される、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のアミノ酸配列と異なる、１つまたは複数のアミノ酸を有する（例えば、置換を有する）。
【１２０４】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列の固定配列に対応する配列が、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の固定残基と１、２、３、４、５、１０、１５、または２０％以下異なり、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の「＊」によって同定される残基に対応する配列が、例えば、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子の対応する配列からの「＊」残基と、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０％以下異なり；図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の「−」によって同定される残基に対応する配列が、例えば、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子の対応する配列からの「−」残基と、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５５、または６０％以下異なる配列を含んでなる。
【１２０５】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列に示されるＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の固定アミノ酸残基を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドであり、１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、２００アミノ酸残基）に、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中で「−」によって表示される、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のアミノ酸配列と異なる、１つまたは複数のアミノ酸を有する（例えば、置換を有する）。
【１２０６】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列の固定配列に対応する配列が、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の固定残基と１、２、３、４、５、１０、１５、または２０％以下異なり、
図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の「＊」によって同定される残基に対応する配列が、例えば、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）Ｃａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子の対応する配列からの「＊」残基と、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０％以下異なり；
図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の「−」によって同定される残基に対応する配列が、例えば、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）Ｃａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子の対応する配列からの「−」残基と、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５５、または６０％以下異なる、配列を含んでなる。
【１２０７】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列に示されるＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕｌａ）の固定アミノ酸残基を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドであり、１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、２００アミノ酸残基）に、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中で「−」によって表示される、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕｌａ）アミノ酸配列と異なる、１つまたは複数のアミノ酸を有する（例えば、置換を有する）。
【１２０８】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列の固定配列に対応する配列が、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の固定残基と１、２、３、４、５、１０、１５、または２０％以下異なり、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の「＊」によって同定される残基に対応する配列が、例えば、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕｌａ）Ｃａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子の対応する配列からの「＊」残基と、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０％以下異なり、
図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の「−」によって同定される残基に対応する配列が、例えば、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕｌａ）Ｃａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子の対応する配列からの「−」残基と、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５５、または６０％以下異なる、配列を含んでなる。
【１２０９】
一実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子などの改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、異なる生物種の２つ以上の天然Ｃａｓ９分子などの、例えば、２つ以上の（ｔｗｏ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）異なるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドなどの融合物であり得る。例えば、１つの生物種の天然Ｃａｓ９分子断片が、第２の生物種のＣａｓ９分子断片に融合され得る。一例として、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子の断片が、ＨＮＨ様ドメインを含んでなるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）以外の生物種（例えば、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子の断片に融合され得る。
【１２１０】
ＰＡＭ認識が改変されたまたはＰＡＭ認識がないＣａｓ９分子
天然起源Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、およびＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）について、上に記載されるＰＡＭ認識配列などの特定のＰＡＭ配列を認識し得る。
【１２１１】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と同一ＰＡＭ特異性を有する。その他の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、それに最も近い配列相同性を有する天然Ｃａｓ９分子に関連しないＰＡＭ特異性、または天然Ｃａｓ９分子に関連しないＰＡＭ特異性を有する。例えば、天然Ｃａｓ９分子は改変され得て、例えば、ＰＡＭ認識が改変されて、例えば、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが認識するＰＡＭ配列が改変されて、オフターゲット部位が減少されおよび／または特異性が改善され；またはＰＡＭ認識要求が排除される。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は改変され得て、例えば、ＰＡＭ認識配列の長さが増大され、および／またはＣａｓ９特異性が高い同一性レベルに改善されて、例えば、オフターゲット部位が減少されて特異性が増大される。一実施形態では、ＰＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０または１５アミノ酸長である。
【１２１２】
異なるＰＡＭ配列を認識しおよび／またはオフターゲット活性の低下を有するＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、指向性進化を使用して作成され得る。Ｃａｓ９分子の指向性進化のために使用され得る代表的な方法およびシステムは、例えば、Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１，４７２（７３４４）：４９９−５０３に記載される。候補Ｃａｓ９分子は、例えば、セクションＩＶに記載される方法によって評価され得る。
【１２１３】
ＰＡＭ認識を媒介するＰＩドメインの改変が、下で考察される。
【１２１４】
改変ＰＩドメインがある合成Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチド
現行のゲノム編集法は、使用されるＣａｓ９分子が認識するＰＡＭ配列によって標的化され得る標的配列の多様性に限りがある。合成Ｃａｓ９分子（またはＳｙｎ−Ｃａｓ９分子）、または合成Ｃａｓ９ポリペプチド（またはＳｙｎ−Ｃａｓ９ポリペプチド）は、本明細書での用法では、１つの細菌種に由来するＣａｓ９コアドメインと、機能改変ＰＩドメイン、すなわち、例えば、異なる細菌種に由来する、Ｃａｓ９コアドメインに天然に関連する以外のＰＩドメインとを含んでなるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドを指す。
【１２１５】
一実施形態では、改変ＰＩドメインは、Ｃａｓ９コアドメインがそれに由来する天然Ｃａｓ９によって認識されるＰＡＭ配列と、異なるＰＡＭ配列を認識する。一実施形態では、改変ＰＩドメインは、Ｃａｓ９コアドメインがそれに由来する天然Ｃａｓ９によって認識される同一ＰＡＭ配列を認識するが、異なる親和性または特異性で認識する。Ｓｙｎ−Ｃａｓ９分子またはＳｙｎ−Ｃａｓ９ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｔｉｄｅ）は、それぞれ、Ｓｙｎ−ｅａＣａｓ９分子またはＳｙｎ−ｅａＣａｓ９ポリペプチドまたはＳｙｎ−ｅｉＣａｓ９分子、Ｓｙｎ−ｅｉＣａｓ９ポリペプチドであり得る。
【１２１６】
Ｓｙｎ−Ｃａｓ９分子またはＳｙｎ−Ｃａｓ９ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｔｉｄｅ）の例は、
ａ）例えば、ａＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９コアドメインなどの表１００または２００からのＣａｓ９コアドメインなどのＣａｓ９コアドメイン；
ｂ）表４００および５００から選択される生物種ＸＣａｓ９配列に由来する改変ＰＩドメインを含んでなる。
【１２１７】
一実施形態では、前記改変ＰＩドメインのＲＫＲモチーフ（ＰＡＭ結合モチーフ）は、Ｃａｓ９コアドメインに関連する天然または内在性ＰＩドメインのＲＫＲモチーフの配列と比較した、１、２、または３つのアミノ酸残基における差異；第１、第２、または第３の位置におけるアミノ酸配列の差異；第１および第２の位置、第１および第３の位置、または第２および第３の位置におけるアミノ酸配列の差異を含んでなる。
【１２１８】
一実施形態では、Ｃａｓ９コアドメインは、表１００からの生物種Ｘ  Ｃａｓ９に由来するＣａｓ９コアドメインを含んでなり、前記改変ＰＩドメインは、表１００からの生物種Ｙ  Ｃａｓ９に由来するＰＩドメインを含んでなる。
【１２１９】
一実施形態では、生物種Ｘ  Ｃａｓ９のＲＫＲモチーフは、生物種Ｙ  Ｃａｓ９のＲＫＲモチーフ以外である。
【１２２０】
一実施形態では、改変ＰＩドメインのＲＫＲモチーフは、ＸＸＹ、ＸＮＧ、およびＸＮＱから選択される。
【１２２１】
一実施形態では、改変ＰＩドメインは、表１００からの前記生物種Ｙの天然ＰＩドメインのアミノ酸配列と、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、または１００％相同性を有する。
【１２２２】
一実施形態では、改変ＰＩドメインは、前記表１００からの第２の生物種の天然ＰＩドメインのアミノ酸配列と、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、または１以下のアミノ酸残基が異なる。
【１２２３】
一実施形態では、Ｃａｓ９コアドメインはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）コアドメインを含んでなり、改変ＰＩドメインは、Ａ．デニトリフィカンス（Ａ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＰＩドメイン；Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＰＩドメイン；Ｈ．ムステラエ（Ｈ．ｍｕｓｔｅｌａｅ）ＰＩドメイン；または表５００から選択される生物種ＸＰＩドメインの改変ＰＩドメインを含んでなる。
【１２２４】
一実施形態では、Ｃａｓ９コアドメインはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）コアドメインを含んでなり、改変ＰＩドメインは、Ａ．デニトリフィカンス（Ａ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＰＩドメイン；Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＰＩドメイン；Ｈ．ムステラエ（Ｈ．ｍｕｓｔｅｌａｅ）ＰＩドメイン；または表５００から選択される生物種ＸＰＩドメインの改変ＰＩドメインを含んでなる。
【１２２５】
一実施形態では、Ｃａｓ９コアドメインはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）コアドメインを含んでなり、改変ＰＩドメインは、Ａ．デニトリフィカンス（Ａ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＰＩドメイン；Ｈ．ムステラエ（Ｈ．ｍｕｓｔｅｌａｅ）ＰＩドメイン；または表５００から選択される生物種ＸＰＩドメインの改変ＰＩドメインを含んでなる。
【１２２６】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、前記Ｃａｓ９コアドメインと前記改変ＰＩドメインの間に配置されるリンカーをさらに含んでなる。
【１２２７】
一実施形態では、リンカーは、本明細書の他の箇所に記載される、Ｃａｓ９コアドメインと異種ＰＩドメインの間に配置されるリンカーを含んでなる。適切なリンカーは、セクションＶにさらにに記載される。
【１２２８】
Ｓｙｎ−Ｃａｓ９分子で使用される代表的改変ＰＩドメインは、表４００および５００に記載される。表４００および５００で言及される８３Ｃａｓ９オルソログの配列は、表１００に提供される。表３００は、既知のＰＡＭ配列があるＣａｓ９オルソログ、および対応するＲＫＲモチーフを提供する。
【１２２９】
一実施形態では、Ｓｙｎ−Ｃａｓ９分子またはＳｙｎ−Ｃａｓ９ポリペプチドはまた、サイズ最適化されてもよく、例えば、Ｓｙｎ−Ｃａｓ９分子またはＳｙｎ−Ｃａｓ９ポリペプチドは、１つまたは複数の欠失、および任意選択的に欠失側面に位置するアミノ酸残基間に配置される１つまたは複数のリンカーを含んでなる。一実施形態では、Ｓｙｎ−Ｃａｓ９分子またはＳｙｎ−Ｃａｓ９ポリペプチドは、ＲＥＣ欠失を含んでなる。
【１２３０】
サイズ最適化Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチド
本明細書に記載される遺伝子操作Ｃａｓ９分子および遺伝子操作Ｃａｓ９ポリペプチドとしては、例えば、本質的に天然立体配座、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性、および／または標的核酸分子認識などの所望のＣａｓ９特性をなおも保つ一方で、分子サイズを低下させる欠失を含んでなる、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが挙げられる。本明細書で提供されるのは、１つまたは複数の欠失および任意選択的に１つまたは複数のリンカーを含んでなる、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドであり、リンカーは、欠失側面に位置するアミノ酸残基間に配置される。参照Ｃａｓ９分子中の適切な欠失を同定する方法、欠失およびリンカーがあるＣａｓ９分子を生成する方法、およびこのようなＣａｓ９分子を使用する方法は、この文献を検討することにより当業者には明らかであろう。
【１２３１】
例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９分子などの欠失があるＣａｓ９分子は、例えば、低下したアミノ酸数を有するなど、対応する天然Ｃａｓ９分子よりも小型である。Ｃａｓ９分子のより小さなサイズは、送達方法の融通性を増大させ、その結果ゲノム編集の有用性を高める。Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、結果として生じる本明細書に記載されるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドの活性に実質的に影響を及ぼさず、またはそれを低下させない、１つまたは複数の欠失を含んでなり得る。本明細書に記載される欠失を含んでなるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチド中で維持される機能としては、ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を切断する能力；
一実施形態では２つのニッカーゼ活性の存在である、二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生成する能力；
エンドヌクレアーゼ活性；
エキソヌクレアーゼ活性；
ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力；
および例えば、標的核酸またはａｇＲＮＡなどの核酸分子の認識活性
の１つまたは複数が挙げられる。
【１２３２】
本明細書に記載されるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドの活性は、本明細書または当該技術分野で記載される、活性アッセイを使用して評価され得る。
【１２３３】
欠失に適する領域を同定する
Ｃａｓ９分子の欠失に適する領域は、多様な方法によって同定され得る。例えば、表１００に列挙されるもののいずれか１つなどの様々な細菌種に由来する天然オルソロガスＣａｓ９分子は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造にモデル化され得て（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５６：９３５−９４９，２０１４）、タンパク質の三次元立体構造と比較して、選択されたＣａｓ９オルソログ全域の保存レベルが調べられる。例えば、標的核酸分子および／またはｇＲＮＡとの境界面などのＣａｓ９活性に関与する領域から空間的に遠位に位置する、低保存または非保存領域は、Ｃａｓ９活性に実質的に影響を及ぼさずまたは低下させない欠失の候補領域またはドメインに相当する。
【１２３４】
ＲＥＣ最適化Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチド
ＲＥＣ最適化Ｃａｓ９分子、またはＲＥＣ最適化Ｃａｓ９ポリペプチドは、本明細書での用法では、ＲＥＣ２ドメインおよびＲＥ１ＣＴドメインの片方または双方に欠失（集合的にＲＥＣ欠失）を含んでなるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドを指し、欠失は、同族ドメイン中のアミノ酸残基の少なくとも１０％を構成する。ＲＥＣ最適化Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｔｉｄｅ）、またはｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９ポリペプチドであり得る。代表的ＲＥＣ最適化Ｃａｓ９分子またはＲＥＣ最適化Ｃａｓ９ポリペプチドは、
ａ）ｉ）ＲＥＣ２欠失；
ｉｉ）ＲＥＣ１ＣＴ欠失；または
ｉｉｉ）ＲＥＣ１ＳＵＢ欠失
から選択される欠失を含んでなる。
【１２３５】
任意選択的に、リンカーは、欠失側面に位置するアミノ酸残基間に配置される。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、１つの欠失のみまたは２つの欠失のみを含む。Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＲＥＣ２欠失およびＲＥＣ１ＣＴ欠失を含んでなり得る。Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＲＥＣ２欠失およびＲＥＣ１ＳＵＢ欠失を含んでなり得る。
【１２３６】
概して、欠失は、同族ドメインのアミノ酸の少なくとも１０％を含有し、例えば、ＲＥＣ２欠失は、ＲＥＣ２ドメイン中のアミノ酸の少なくとも１０％を含む。欠失は、その同族ドメインのアミノ酸残基の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％；その同族ドメインの全てのアミノ酸残基；その同族ドメインの外部のアミノ酸残基；その同族ドメインの外部の複数のアミノ酸残基；その同族ドメインのＮ末端に隣接するアミノ酸残基；その同族ドメインのＣ末端に隣接するアミノ酸残基；その同族のＮ末端に隣接するアミノ酸残基、およびその同族ドメインのＣ末端に隣接するアミノ酸残基；その同族ドメインのＮ末端の例えば、最高５、１０、１５、または２０個などの複数のアミノ酸残基；その同族ドメインのＣ末端の例えば、最高５、１０、１５、または２０個などの複数のアミノ酸残基；その同族ドメインのＮ末端の例えば、最高５、１０、１５、または２０個などの複数のアミノ酸残基、およびその同族ドメインのＣ末端の例えば、最高５、１０、１５、または２０個などの複数のアミノ酸残基を含んでなり得る。
【１２３７】
一実施形態では、欠失は、その同族ドメイン；その同族ドメインのＮ末端アミノ酸残基；その同族ドメインのＣ末端アミノ酸残基を越えない。
【１２３８】
ＲＥＣ最適化Ｃａｓ９分子またはＲＥＣ最適化Ｃａｓ９ポリペプチドは、欠失側面に位置する、アミノ酸残基間に配置されるリンカーを含み得る。ＲＥＣ最適化Ｃａｓ９分子中のＲＥＣ欠失側面に位置するアミノ酸残基（ｒｅｓｉｄｅｓ）間で使用される適切なリンカーは、セクションＶで開示される。
【１２３９】
一実施形態では、ＲＥＣ最適化Ｃａｓ９分子またはＲＥＣ最適化Ｃａｓ９ポリペプチドは、任意のＲＥＣ欠失および結合リンカー以外のアミノ酸配列を含んでなり、例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子、またはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９などの表１００に記載されるＣａｓ９分子のアミノ酸配列と、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、または１００％の相同性を有する。
【１２４０】
一実施形態では、ＲＥＣ最適化Ｃａｓ９分子またはＲＥＣ最適化Ｃａｓ９ポリペプチドは、任意のＲＥＣ欠失および結合リンカー以外のアミノ酸配列を含んでなり、例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子、またはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９分子などの表１００に記載されるＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９のアミノ酸配列と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５以下のアミノ酸残基が異なる。
【１２４１】
一実施形態では、ＲＥＣ最適化Ｃａｓ９分子またはＲＥＣ最適化Ｃａｓ９ポリペプチドは、任意のＲＥＣ欠失および結合リンカー以外のアミノ酸配列を含んでなり、例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子、またはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９分子などの表１００に記載されるＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９のアミノ酸配列と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５％以下のアミノ酸残基が異なる。
【１２４２】
配列比較のために、典型的に１つの配列が参照配列の役割を果たし、それと試験配列とが比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピュータに入力されて、必要ならば部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータが使用され得てまたは代案のパラメータてが指定され得る。次に配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づいて、標準配列と比較して、試験配列のパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列アラインメント法は、当該技術分野で周知である。比較のための最適配列アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動アライメントおよび目視検査（例えば、Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）によって、実施され得る。
【１２４３】
配列同一性百分率および配列類似性を判定するのに適するアルゴリズムの２つの例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に利用可能である。
【１２４４】
２つのアミノ酸配列間の同一性百分率はまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ，（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７）のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して、評価され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性百分率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのどちらか、およびギャップ重み付け１６、１４、１２、１０、８、６、または４および長さ重み付け１、２、３、４、５、または６を使用して、判定され得る。
【１２４５】
８３個の天然Ｃａｓ９オルソログについて、代表的ＲＥＣ欠失の配列情報が表１００に提供される。異なる細菌種に由来する代表的Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列は、下に示される。
【１２４６】
【表２５４】
2020062029.tif 000287
【１２４７】
【表２５５】
2020062029.tif 000288
【１２４８】
【表２５６】
2020062029.tif 000289
【１２４９】
【表２５７】
2020062029.tif 000290
【１２５０】
【表２５８】
2020062029.tif 000291
【１２５１】
【表２５９】
2020062029.tif 000292
【１２５２】
【表２６０】
2020062029.tif 000293
【１２５３】
【表２６１】
2020062029.tif 000294
【１２５４】
【表２６２】
2020062029.tif 000295
【１２５５】
【表２６３】
2020062029.tif 000296
【１２５６】
【表２６４】
2020062029.tif 000297
【１２５７】
【表２６５】
2020062029.tif 000298
【１２５８】
【表２６６】
2020062029.tif 000299
【１２５９】
【表２６７】
2020062029.tif 000300
【１２６０】
【表２６８】
2020062029.tif 000301
【１２６１】
【表２６９】
2020062029.tif 000302
【１２６２】
ＰＩドメインは、表４００および５００に提供される。
【１２６３】
【表２７０】
2020062029.tif 000303
【１２６４】
【表２７１】
2020062029.tif 000304
【１２６５】
【表２７２】
2020062029.tif 000305
【１２６６】
【表２７３】
2020062029.tif 000306
【１２６７】
【表２７４】
2020062029.tif 000307
【１２６８】
【表２７５】
2020062029.tif 000308
【１２６９】
以下は、表１００に列挙されるＣａｓ９オルソログのアミノ酸配列である。
配列番号３０４
【化３３】
2020062029.tif 000309
配列番号３０５
【化３４】
2020062029.tif 000310
配列番号３０６
【化３５】
2020062029.tif 000311
配列番号３０７
【化３６】
2020062029.tif 000312
配列番号３０８
【化３７】
2020062029.tif 000313
配列番号３０９
【化３８】
2020062029.tif 000314
配列番号３１０
【化３９】
2020062029.tif 000315
配列番号３１１
【化４０】
2020062029.tif 000316
配列番号３１２
【化４１】
2020062029.tif 000317
配列番号３１３
【化４２】
2020062029.tif 000318
配列番号３１４
【化４３】
2020062029.tif 000319
配列番号３１５
【化４４】
2020062029.tif 000320
配列番号３１６
【化４５】
2020062029.tif 000321
配列番号３１７
【化４６】
2020062029.tif 000322
配列番号３１８
【化４７】
2020062029.tif 000323
配列番号３１９
【化４８】
2020062029.tif 000324
配列番号３２０
【化４９】
2020062029.tif 000325
配列番号３２１
【化５０】
2020062029.tif 000326
配列番号３２２
【化５１】
2020062029.tif 000327
配列番号３２３
【化５２】
2020062029.tif 000328
配列番号３２４
【化５３】
2020062029.tif 000329
配列番号３２５
【化５４】
2020062029.tif 000330
配列番号３２６
【化５５】
2020062029.tif 000331
配列番号３２７
【化５６】
2020062029.tif 000332
配列番号３２８
【化５７】
2020062029.tif 000333
配列番号３２９
【化５８】
2020062029.tif 000334
配列番号３３０
【化５９】
2020062029.tif 000335
配列番号３３１
【化６０】
2020062029.tif 000336
配列番号３３２
【化６１】
2020062029.tif 000337
配列番号３３３
【化６２】
2020062029.tif 000338
配列番号３３４
【化６３】
2020062029.tif 000339
配列番号３３５
【化６４】
2020062029.tif 000340
配列番号３３６
【化６５】
2020062029.tif 000341
配列番号３３７
【化６６】
2020062029.tif 000342
配列番号３３８
【化６７】
2020062029.tif 000343
配列番号３３９
【化６８】
2020062029.tif 000344
配列番号３４０
【化６９】
2020062029.tif 000345
配列番号３４１
【化７０】
2020062029.tif 000346
配列番号３４２
【化７１】
2020062029.tif 000347
配列番号３４３
【化７２】
2020062029.tif 000348
配列番号３４４
【化７３】
2020062029.tif 000349
配列番号３４５
【化７４】
2020062029.tif 000350
配列番号３４６
【化７５】
2020062029.tif 000351
配列番号３４７
【化７６】
2020062029.tif 000352
配列番号３４８
【化７７】
2020062029.tif 000353
配列番号３４９
【化７８】
2020062029.tif 000354
配列番号３５０
【化７９】
2020062029.tif 000355
配列番号３５１
【化８０】
2020062029.tif 000356
配列番号３５２
【化８１】
2020062029.tif 000357
配列番号３５３
【化８２】
2020062029.tif 000358
配列番号３５４
【化８３】
2020062029.tif 000359
配列番号３５５
【化８４】
2020062029.tif 000360
配列番号３５６
【化８５】
2020062029.tif 000361
配列番号３５７
【化８６】
2020062029.tif 000362
配列番号３５８
【化８７】
2020062029.tif 000363
配列番号３５９
【化８８】
2020062029.tif 000364
配列番号３６０
【化８９】
2020062029.tif 000365
配列番号３６１
【化９０】
2020062029.tif 000366
配列番号３６２
【化９１】
2020062029.tif 000367
配列番号３６３
【化９２】
2020062029.tif 000368
配列番号３６４
【化９３】
2020062029.tif 000369
配列番号３６５
【化９４】
2020062029.tif 000370
配列番号３６６
【化９５】
2020062029.tif 000371
配列番号３６７
【化９６】
2020062029.tif 000372
配列番号３６８
【化９７】
2020062029.tif 000373
配列番号３６９
【化９８】
2020062029.tif 000374
配列番号３７０
【化９９】
2020062029.tif 000375
配列番号３７１
【化１００】
2020062029.tif 000376
配列番号３７２
【化１０１】
2020062029.tif 000377
配列番号３７３
【化１０２】
2020062029.tif 000378
配列番号３７４
【化１０３】
2020062029.tif 000379
配列番号３７５
【化１０４】
2020062029.tif 000380
配列番号３７６
【化１０５】
2020062029.tif 000381
配列番号３７７
【化１０６】
2020062029.tif 000382
配列番号３７８
【化１０７】
2020062029.tif 000383
配列番号３７９
【化１０８】
2020062029.tif 000384
配列番号３８０
【化１０９】
2020062029.tif 000385
配列番号３８１
【化１１０】
2020062029.tif 000386
配列番号３８２
【化１１１】
2020062029.tif 000387
配列番号３８３
【化１１２】
2020062029.tif 000388
配列番号３８４
【化１１３】
2020062029.tif 000389
配列番号３８５
【化１１４】
2020062029.tif 000390
配列番号３８６
【化１１５】
2020062029.tif 000391
【１２７０】
Ｃａｓ９分子をコードする核酸
例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、本明細書で提供される。
【１２７１】
代表的Ｃａｓ９分子をコードする核酸またはＣａｓ９ポリペプチドは、Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３，３９９（６１２１）：８１９−８２３；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１３，１５３（４）：９１０−９１８；Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３，３９９（６１２１）：８２３−８２６；Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１２，３３７（６０９６）：８１６−８２１に記載される。Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする別の代表的核酸は、図８に黒色で示される。
【１２７２】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、合成核酸配列であり得る。例えば、合成核酸分子は、例えば、セクションＶＩＩＩに記載されるようにして、化学修飾され得る。一実施形態では、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡは、（例えば、以下の全てなどの１つまたは複数の特性を有する：それは、キャッピングされ、ポリアデニル化され、５−メチルシチジンおよび／またはプソイドウリジンで置換される。
【１２７３】
それに加えてまたは代案としては、合成核酸配列は、コドン最適化され得て、例えば、少なくとも１つの一般的でないコドンあまり一般的でないコドンは、一般的コドンによって置換されている。例えば、合成核酸は、例えば、本明細書に記載される哺乳類発現系内での発現のために最適化された、最適化メッセンジャーｍＲＮＡの合成を誘導し得る。
【１２７４】
さらに、または代案としては、ａＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含んでなってもよい。核局在化配列は、当該技術分野で公知である。
【１２７５】
以下に提供されるのは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子をコードする代表的なコドン最適化核酸配列である。
配列番号２２
【化１１６】
2020062029.tif 000392
【化１１７】
2020062029.tif 000393
【１２７６】
以下に提供されるのは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子の対応するアミノ酸配列である。
配列番号２３
【化１１８】
2020062029.tif 000394
【１２７７】
以下に提供されるのは、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子をコードする代表的なコドン最適化核酸配列である。
配列番号２４
【化１１９】
2020062029.tif 000395
【１２７８】
以下に提供されるのは、Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子の対応するアミノ酸配列である。
配列番号２５
【化１２０】
2020062029.tif 000396
【１２７９】
以下に提供されるのは、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列である。
配列番号２６
【化１２１】
2020062029.tif 000397
【１２８０】
以下に提供されるのは、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９のＣａｓ９分子（Ｃａｓ９  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｏｆ  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９）をコードする代表的なコドン最適化核酸配列である。
配列番号３９
【化１２２】
2020062029.tif 000398
【１２８１】
上記Ｃａｓ９配列のいずれかが、Ｃ末端でペプチドまたはポリペプチドと融合する場合、停止コドンは除外されるものと理解される。
【１２８２】
その他のＣａｓ分子およびＣａｓポリペプチド
本明細書で開示される発明を実施するために、様々なタイプのＣａｓ分子またはＣａｓポリペプチドが使用され得る。いくつかの実施形態では、ＩＩ型ＣａｓシステムのＣａｓ分子が使用される。その他の実施形態では、その他のＣａｓシステムのＣａｓ分子が使用される。例えば、Ｉ型またはＩＩＩ型Ｃａｓ分子が使用されてもよい。代表的なＣａｓ分子（およびＣａｓシステム）は、例えば、Ｈａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００５，１（６）：ｅ６０およびＭａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１１，９：４６７−４７７に記載され、双方の参考文献は、その内容全体が参照により本明細書に援用される。代表的なＣａｓ分子（およびＣａｓシステム）は、表６００にもまた示される。
【１２８３】
【表２７６】
2020062029.tif 000399
【１２８４】
【表２７７】
2020062029.tif 000400
【１２８５】
【表２７８】
2020062029.tif 000401
【１２８６】
【表２７９】
2020062029.tif 000402
【１２８７】
【表２８０】
2020062029.tif 000403
【１２８８】
ＩＶ．候補分子の機能解析
候補Ｃａｓ９分子、候補ｇＲＮＡ分子、候補Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるように評価され得る。例えば、Ｃａｓ９分子のエンドヌクレアーゼ活性評価する代表的な方法は、例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１２，３３７（６０９６）：８１６−８２１に記載される。
【１２８９】
結合および切断アッセイ：Ｃａｓ９分子のエンドヌクレアーゼ活性を試験する
Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、標的核酸を結合および切断する能力は、プラスミド切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、合成または生体外転写ｇＲＮＡ分子が、９５℃に加熱して緩慢に室温に冷却することで、反応に先だってプレアニールされる。天然または制限消化直線化プラスミドＤＮＡ（３００ｎｇ（約８ｎＭ））が、１０ｍＭのＭｇＣｌ２存在下または不在下において、Ｃａｓ９プラスミド切断緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）中の精製Ｃａｓ９タンパク質分子（５０〜５００ｎＭ）およびｇＲＮＡ（５０〜５００ｎＭ、１：１）と共に、３７℃で６０分間インキュベートされる。反応は、５×ＤＮＡローディングバッファー（３０％グリセロール、１．２％ＳＤＳ、２５０ｍＭのＥＤＴＡ）によって停止され、０．８または１％アガロースゲル電気泳動法によって分離され、臭化エチジウム染色によって視覚化される。得られた分解産物は、Ｃａｓ９分子が、双方のＤＮＡ鎖を切断するか、または二本鎖の１本のみを切断するかどうかを示す。例えば、直鎖ＤＮＡ生成物は、双方のＤＮＡ鎖の切断を示す。ニックの入った開環状生成物は、二本鎖の１本のみが切断されていることを示す。
【１２９０】
代案としては、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、標的核酸に結合して切断する能力は、オリゴヌクレオチドＤＮＡ切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ）が、１×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液中の５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび約３〜６ｐｍｏｌ（約２０〜４０ｍＣｉ）の［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰと、５０μＬの反応物中で３７℃で３０分間インキュベートすることで、放射性標識される。加熱不活性化（６５℃で２０分間）後、カラムに通して反応物が精製され、組み込まれていない標識が除去される。標識オリゴヌクレオチドと、等モル量の未標識相補的オリゴヌクレオチドとの９５℃で３分間のアニーリングによって、二本鎖基質（１００ｎＭ）が生成され、室温への緩慢な冷却がそれに続く。切断アッセイでは、９５℃で３０秒間加熱することでｇＲＮＡ分子がアニールされ、室温への緩慢な冷却がそれに続く。Ｃａｓ９（５００ｎＭ最終濃度）が、切断アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、５％グリセロール）中のアニールされたｇＲＮＡ分子（５００ｎＭ）と共に、総容積９μｌでプレインキュベートされる。１μｌの標的ＤＮＡ（１０ｎＭ）の添加によって反応が開始され、３７℃で１時間インキュベートされる。２０μｌのローディング色素（ホルムアミド中の５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％ＳＤＳ、５％グリセロール）の添加によって反応物がクエンチされ、９５℃で５分間加熱される。分解産物は、７Ｍ尿素を含有する１２％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離され、ホスホロイメージングによって視覚化される。得られた分解産物は、相補鎖、非相補鎖、またはその双方が切断されたかどうかを示す。
【１２９１】
これらのアッセイの片方または双方を使用して、候補ｇＲＮＡ分子または候補Ｃａｓ９分子の適合性が評価され得る。
【１２９２】
結合アッセイ：Ｃａｓ９分子の標的ＤＮＡへの結合を試験する
Ｃａｓ９分子の標的ＤＮＡへの結合を評価する代表的な方法は、例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１２；３３７（６０９６）：８１６−８２１に記載される。
【１２９３】
例えば、電気泳動移動度シフト解析では、脱イオン水中で各鎖（１０ｎｍｏｌ）を混合して、９５℃で３分間加熱し、室温に緩慢に冷却することで、標的ＤＮＡ二本鎖が形成される。全てのＤＮＡは、１×ＴＢＥを含有する８％天然ゲル上で精製される。ＤＮＡバンドは、ＵＶシャドーイングによって視覚化され、切除されて、ゲル小片をＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに浸漬することで溶出される。溶出されＤＮＡは、エタノール沈殿されて、ＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶解される。ＤＮＡサンプルは、［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを使用して、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで３７℃で３０分間にわたり５’末端標識される。ポリヌクレオチドキナーゼは、６５℃で２０分間加熱変性され、カラムを使用して、組み込まれていない放射性標識が除去される。結合アッセイは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、および１０％グリセロールを含有する緩衝液中で、総容積１０μｌで実施される。Ｃａｓ９タンパク質分子は、等モル量のプレアニールｇＲＮＡ分子でプログラムされて、１００ｐＭから１μＭに滴定される。放射性標識ＤＮＡが、２０ｐＭの最終濃度に添加される。サンプルは、３７℃で１時間インキュベートされ、１×ＴＢＥおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する８％天然ポリアクリルアミドゲル上で、４℃で分離される。ゲルは乾燥されて、ＤＮＡはホスホロイメージングによって視覚化される。
【１２９４】
示差走査型蛍光定量法（Ｆｌｏｕｒｉｍｅｔｒｙ）（ＤＳＦ）
Ｃａｓ９−ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の熱安定性は、ＤＳＦによって測定され得る。この技術は、例えば、ｇＲＮＡなどの結合ＲＮＡ分子の添加などの好ましい条件下で増大され得る、タンパク質の熱安定性を測定する。
【１２９５】
アッセイは、１つはｇＲＮＡ：Ｃａｓ９タンパク質の最良の化学量論比を試験し、もう１つはＲＮＰ形成のための最良の溶液条件を判定する、２つの異なるプロトコルを使用して実施される。
【１２９６】
ＲＮＰ複合体を形成するための最良の溶液を判定するために、Ｃａｓ９の２ｕＭ水溶液＋１０×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｓ−６６５０）が３８４ウェルプレート内に分注される。次に、様々なｐＨの溶液中で希釈された等モル量のｇＲＮＡ、および塩が添加される。室温で１０秒間インキュベートし、短時間遠心分離してあらゆる気泡を除去いた後、  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  ソフトウェアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、１０秒毎に１℃の温度増大で２０℃から９０℃への勾配が実行される。
【１２９７】
第２のアッセイは、上記アッセイ１からの最適緩衝液中で、様々な濃度のｇＲＮＡと２ｕＭ  Ｃａｓ９を混合して、３８４ウェルプレート内で、室温で１０秒間インキュベートすることからなる。等容積の最適緩衝液＋１０×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｓ−６６５０）が添加され、プレートはＭｉｃｒｏｓｅａｌ（登録商標）Ｂ粘着剤（ＭＳＢ−１００１）で密封される。あらゆる気泡を除去するための短時間遠心分離に続いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、１０秒毎に１℃の温度増大で２０℃から９０℃への勾配が実行される。
【１２９８】
Ｖ．ゲノム編集アプローチ
一般に、本明細書に記載される方法に従った任意の遺伝子の改変は、任意の機序によって媒介され得て、任意の方法は特定の機序に限定されないものと理解される。遺伝子改変に関連し得る代表的機序としては、非相同末端結合（例えば、古典的または代替）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、相同指向修復（例えば、内在性供与体テンプレート媒介性）、ＳＤＳＡ（合成依存性鎖アニーリング）、一本鎖アニーリングまたは一本鎖浸潤が挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書に記載されるのは、ＮＨＥＪを使用して、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢまたは、ＰＴＰＮ６６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の対立遺伝子の片方または双方を標的ノックアウトする代表的方法である（セクションＶ．１を参照されたい）。別の実施形態では、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の標的化ノックダウンの代表的方法が提供される（セクションＶ．２を参照されたい）。ノックダウンまたはノックアウトまたはそれらの組み合わせのために、開示される方法が、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の２つ以上を標的化してもよいことがさらに検討される。
【１２９９】
Ｖ．１  遺伝子ターゲッティングのためのＮＨＥＪアプローチ
本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ誘導非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を使用して、標的遺伝子特異的ノックアウトが実施され得る。ヌクレアーゼ誘導ＮＨＥＪはまた、対象遺伝子中の配列挿入を除去す（例えば、欠失させ）るのにも使用され得る。
【１３００】
理論による拘束は望まないが、一実施形態では、本明細書に記載される方法に関連するゲノムの改変は、ヌクレアーゼ誘導ＮＨＥＪと、ＮＨＥＪ修復経路の誤りがちな性質とに依存すると考えられる。ＮＨＥＪは、２つの末端を共に連結することで、ＤＮＡ中の二本鎖切断を修復する；しかし、通常、元の配列は、それらが二本鎖切断によって形成された真にその通りの２つの適合性末端が、完璧にライゲートされた場合に限り、復元される。二本鎖切断のＤＮＡ末端は、しばしば酵素的プロセッシングの対象であり、末端の再結合に先だって、片方または双方の鎖に、ヌクレオチドの付加または除去がもたらされる。これは、ＮＨＥＪ修復部位におけるＤＮＡ配列の挿入および／または欠失（インデル）変異の存在をもたらす。これらの変異の３分の２は、典型的に、読み枠を改変し、したがって、非機能性タンパク質が生じる。それに加えて、読み枠を維持するが、顕著な量の配列を挿入または欠失させる変異は、タンパク質の機能性を破壊し得る。タンパク質の重要な機能ドメインの変異は、重要でない領域の変異よりもおそらく許容性が低いので、これは遺伝子座依存性である。
【１３０１】
ＮＨＥＪによって生成されるインデル変異は、自然界では予測不可能である；しかし、所与の切断部位では、おそらく小規模なマイクロホモロジー領域のために、特定のインデル配列が好まれ、母集団中で大きな比率を占める。欠失の長さは、幅広く変動し得て；最も一般的には、１〜５０ｂｐの範囲であるが、それらは１００〜２００ｂｐを超える範囲に容易に達し得る。挿入はより短い傾向があり、多くの場合、切断部位に隣接して取り囲む、短い配列重複を含む。しかし、大きな挿入を得ることが可能であり、これらの場合、挿入配列は、多くの場合、ゲノムのその他の領域に、または細胞内に存在するプラスミドＤＮＡにトレースされている。
【１３０２】
ＮＨＥＪは変異原性過程であるので、特定の最終配列の生成が要求されない限り、それはまた小規模な配列モチーフを欠失させるのにも使用され得る。二本鎖切断が、短い標的配列の近くで標的化される場合、ＮＨＥＪによって引き起こされる修復欠失変異は、頻繁に望まれないヌクレオチドに及び、したがってそれを除去する。より大型のＤＮＡ断片の欠失では、配列の両側に１つずつ２つの二本鎖切断が導入されて、介在配列全体が除去され、末端の間にＮＨＥＪがもたらされ得る。これらのアプローチの双方を使用して、特定のＤＮＡ配列が欠失され得る；しかし、ＮＨＥＪの誤りがちな性質は、修復部位に、インデル変異をなおも生成してもよい。
【１３０３】
二本鎖切断ｅａＣａｓ９分子と、一本鎖、またはニッカーゼ、ｅａＣａｓ９分子との双方を本明細書に記載される方法および組成物で使用して、ＮＨＥＪ媒介インデルが生成され得る。例えば、対象遺伝子の早期コード領域のようなコード領域などの遺伝子に標的化されるＮＨＥＪ媒介インデルを使用して、対象遺伝子がノックアウト（すなわち発現排除）され得る。例えば、対象遺伝子の早期コード領域は、コード配列の第１のエクソン内の、または転写開始部位の５００ｂｐ以内（例えば、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００または５０ｂｐ未満）の転写開始部位直後の配列を含む。
【１３０４】
一実施形態では、ＮＨＥＪ媒介インデルが、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子中に導入される。Ｃａｓ９二本鎖ヌクレアーゼまたはＣａｓ９一本鎖ニッカーゼを使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の任意の２つなどの２つのＴ細胞発現遺伝子中に変異体が導入される一実施形態では、Ｃａｓ９二本鎖ヌクレアーゼまたは一本鎖ニッカーゼに加えて、双方の遺伝子を標的化する個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が提供される。Ｃａｓ９二本鎖ヌクレアーゼまたはＣａｓ９一本鎖ニッカーゼを使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の任意の３つなどの３つのＴ細胞発現遺伝子中に変異体が導入される一実施形態では、Ｃａｓ９二本鎖ヌクレアーゼまたは一本鎖ニッカーゼに加えて、全ての３つの遺伝子を標的化する個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が提供される。Ｃａｓ９二本鎖ヌクレアーゼまたはＣａｓ９一本鎖ニッカーゼを使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の任意の４つなどの４つのＴ細胞発現遺伝子中に変異体が導入される一実施形態では、Ｃａｓ９二本鎖ヌクレアーゼまたは一本鎖ニッカーゼに加えて、全ての４つの遺伝子を標的化する個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が提供される。Ｃａｓ９二本鎖ヌクレアーゼまたはＣａｓ９一本鎖ニッカーゼを使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の任意の５つなどの５つのＴ細胞発現遺伝子中に変異体が導入される一実施形態では、Ｃａｓ９二本鎖ヌクレアーゼまたは一本鎖ニッカーゼに加えて、全ての５つの遺伝子を標的化する個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が提供される。Ｃａｓ９二本鎖ヌクレアーゼまたはＣａｓ９一本鎖ニッカーゼを使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の任意の６つなどの６つのＴ細胞発現遺伝子中に変異体が導入される一実施形態では、Ｃａｓ９二本鎖ヌクレアーゼまたは一本鎖ニッカーゼに加えて、全ての６つの遺伝子を標的化する個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が提供される。Ｃａｓ９二本鎖ヌクレアーゼまたはＣａｓ９一本鎖ニッカーゼを使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の任意の７つなどの７つのＴ細胞発現遺伝子中に変異体が導入される一実施形態では、Ｃａｓ９二本鎖ヌクレアーゼまたは一本鎖ニッカーゼに加えて、全ての７つの遺伝子を標的化する個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が提供される。Ｃａｓ９二本鎖ヌクレアーゼまたはＣａｓ９一本鎖ニッカーゼを使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子の任意の８つなどの８つのＴ細胞発現遺伝子中に変異体が導入される一実施形態では、Ｃａｓ９二本鎖ヌクレアーゼまたは一本鎖ニッカーゼに加えて、全ての８つの遺伝子を標的化する個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が提供される。
【１３０５】
標的位置に対する二本鎖または一本鎖切断の配置
ＮＨＥＪ媒介インデルを誘導する目的で、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼが二本鎖切断を生じる一実施形態では、例えば、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡが、１つの二本鎖切断を標的位置のヌクレオチド近傍に配置させるように構成される。一実施形態では、切断部位は、標的位置から０〜３０ｂｐ（例えば、標的位置から３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｂｐ未満）離れている。
【１３０６】
ＮＨＥＪ媒介インデルを誘導する目的でＣａｓ９ニッカーゼと複合体形成する２つのｇＲＮＡが、２つの一本鎖切断を誘導する一実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡである２つのｇＲＮＡが、標的位置のヌクレオチドにＮＨＥＪ修復を提供するように、２つの一本鎖切断を配置させるように構成される。一実施形態では、ｇＲＮＡは、切断を異なる鎖上の同一位置に、または互いに少数のヌクレオチド以内に、配置させるように構成されて、二本鎖切断が本質的に模倣される。一実施形態では、より近いニックは、標的位置から０〜３０ｂｐ（例えば、標的位置から３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｂｐ未満）離れており、２つのニックは、互いに２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、または４０〜４５ｂｐ）であり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０ｂｐ以下）離れている。一実施形態では、ｇＲＮＡは、一本鎖切断を標的位置のヌクレオチドのどちらかの側に配置させるように構成される。
【１３０７】
二本鎖切断ｅａＣａｓ９分子と、一本鎖、またはニッカーゼ、ｅａＣａｓ９分子との双方を本明細書に記載される方法および組成物で使用して、標的位置の両側に切断が生成され得る。二本鎖または対形成一本鎖切断は、標的位置の両側に生成されて、２つの切断で核酸配列が除去されてもよい（例えば、２つの切断間の領域が欠失される）。一実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡである２つのｇＲＮＡは、二本鎖切断を標的位置の両側に配置させるように構成される。交互の実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡである３つのｇＲＮＡは、二本鎖切断（すなわち、１つのｇＲＮＡがｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体形成する）と、２つの一本鎖切断または対の一本鎖切断（すなわち、２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体形成する）とが、標的位置の両側に配置されるように構成される。別の実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡである４つのｇＲＮＡは、２対の一本鎖切断（すなわち、２対の２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体形成する）が、標的位置の両側に生じるように構成される。二本鎖切断、または対の２つの一本鎖ニックのより近い方は、理想的には、標的位置の０〜５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０または２５ｂｐ以下）にある。ニッカーゼが使用される場合、対の２つのニックは、互いに２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、または４０〜４５ｂｐの間）であり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０ｂｐ以下）離れている。
【１３０８】
Ｖ．２  標的化ノックダウン
遺伝子をＤＮＡレベルで変異させることで発現を恒久的に排除するまたは減少させるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子ノックアウトとは異なり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓノックダウンは、人工転写因子の使用を通じて、一時的な遺伝子発現低下を可能にする。Ｃａｓ９タンパク質の双方のＤＮＡ切断ドメインで重要な残基を変異させることは（例えば、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異）、触媒能のないＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９、死滅Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９としてもまた知られている）の生成をもたらす。触媒能のないＣａｓ９はｇＲＮＡと複合体形成して、ｇＲＮＡの標的化ドメインによって特定化されたＤＮＡ配列に局在するが、それは標的ＤＮＡを切断しない。ｄＣａｓ９と、例えば、転写抑制ドメインなどのエフェクタードメインとの融合は、ｇＲＮＡによって特定化された任意のＤＮＡ部位へのエフェクターの動員を可能にする。ｅｉＣａｓ９それ自体は、コード配列中の早期領域に動員された場合に、転写を妨げ得ることが示されている一方で、より堅固な抑制は、転写抑制ドメイン（例えばＫＲＡＢ、ＳＩＤまたはＥＲＤ）をＣａｓ９に融合させて、それを遺伝子のプロモーター領域に動員することで達成され得る。プロモーターのＤＮＡｓｅＩ高感受性領域は、Ｃａｓ９タンパク質にアクセスできる可能性が高く、また内在性転写因子のための部位を保有する可能性も高いので、これらの領域を標的化することで、おそらくより効率的な遺伝子抑制または活性化がもたらされてもよい。特に遺伝子抑制については、内在性転写因子の結合部位をブロックすることで、遺伝子発現の下方制御を助けることが、本明細書で検討される。別の実施形態では、ｅｉＣａｓ９は、クロマチン改変タンパク質に融合され得る。改変クロマチン状態は、標的遺伝子の発現低下をもたらし得る。
【１３０９】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、既知の転写応答要素（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）に、既知の上流活性化配列（ＵＡＳ）に、および／または標的ＤＮＡの発現を調節できることが疑われる未知のまたは既知の機能がある配列に、標的化され得る。
【１３１０】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子ノックダウンを使用して、望まれない対立遺伝子または転写物の発現を低下させ得る。本明細書で検討されるのは、遺伝子の恒久的な破壊が、理想的でない筋書きである。これらの筋書きでは、部位特異的抑制を使用して、発現が一時的に低下または排除されてもよい。ヌクレアーゼが任意のＤＮＡ配列を切断して変異を引き起こし得るのに対し、Ｃａｓリプレッサーは、活発に転写される遺伝子のプロモーター領域に標的化された場合にのみ効果を有してもよいので、Ｃａｓリプレッサーのオフターゲット効果が、Ｃａｓヌクレアーゼのものよりも重篤性が低いこともまた本明細書で検討される。しかし、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトが恒久的である一方で、抑制は、Ｃａｓリプレッサーが細胞内に存在する場合に限り持続してもよい。リプレッサーがもはや存在しなくなると、内在性転写因子および遺伝子制御要素は、発現をその天然状態に復元する可能性が高い。
【１３１１】
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子ノックダウンを使用して、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の発現が低下され得る。本明細書に記載されるｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質を使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の任意の２つなどの２つのＴ細胞発現遺伝子がノックダウンされる一実施形態では、ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質に加えて、双方の遺伝子を標的化する個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が提供される。ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質を使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の任意の３つなどの３つのＴ細胞発現遺伝子がノックダウンされる一実施形態では、ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質に加えて、全ての３つの遺伝子を標的化する個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が提供される。ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質を使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の任意の４つなどの４つのＴ細胞発現遺伝子がノックダウンされる一実施形態では、ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質に加えて、全ての４つの遺伝子を標的化する個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が提供される。ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質を使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の任意の５つなどの５つのＴ細胞発現遺伝子がノックダウンされる一実施形態では、ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質に加えて、全ての５つの遺伝子を標的化する個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が提供される。ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質を使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６遺伝子の任意の６つなどの６つのＴ細胞発現遺伝子がノックダウンされる一実施形態では、ｅｉＣａｓ９またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質に加えて、全ての６つの遺伝子を標的化する個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が提供される。
【１３１２】
Ｖ．３  一本鎖アニーリング
一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）は、標的核酸中に存在する２つの反復配列間の二本鎖切断を修復する、別のＤＮＡ修復プロセスである。ＳＳＡ経路によって使用される反復配列は、一般に３０ヌクレオチド長を超える。切断末端に切除が生じて、標的核酸の双方の鎖上の反復配列が示される。切除後、反復配列を含有する一本鎖オーバーハングをＲＰＡタンパク質で被覆して、反復配列が、例えばそれ自体などと不適切にアニーリングするのを妨げる。ＲＡＤ５２は、オーバーハング上の反復配列のそれぞれと結合し、配列を整列させて、相補的反復配列のアニーリングを可能にする。アニーリング後、オーバーハングの一本鎖フラップは切断される。新しいＤＮＡ合成があらゆるギャップを充填し、ライゲーションがＤＮＡ二本鎖を回復させる。プロセッシングの結果として、２つの反復間のＤＮＡ配列が欠失する。欠失の長さは、使用される２つの反復の位置、および切除の経路または処理能力をはじめとする、多くの要素に左右され得る。
【１３１３】
ＨＤＲ経路とは対照的に、ＳＳＡは、標的核酸配列を改変または修正するのにテンプレート核酸を必要としない。それに代えて、相補的反復配列が使用される。
【１３１４】
Ｖ．４  その他のＤＮＡ修復経路
ＳＳＢＲ（一本鎖切断修復）
ゲノム内の一本鎖切断（ＳＳＢ）は、上で論じたＤＳＢ修復機序とは別個の機序であるＳＳＢＲ経路によって修復される。ＳＳＢＲ経路は、ＳＳＢ検出、ＤＮＡ末端プロセッシング、ＤＮＡギャップ充填、およびＤＮＡライゲーションの４つの主要な段階を有する。より詳細な説明は、Ｃａｌｄｅｃｏｔｔ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９，６１９−６３１（Ａｕｇｕｓｔ  ２００８）に記載され、概要は本明細書に記載される。
【１３１５】
ＳＳＢが形成する第１段階では、ＰＡＲＰ１および／またはＰＡＲＰ２は、切断を認識して修復機構を動員する。ＤＮＡ切断におけるＰＡＲＰ１の結合および活性は一過性であり、損傷におけるＳＳＢｒタンパク質複合体の巣状滞留または安定性を促進することで、ＳＳＢｒを加速するようである。議論の余地はあるが、これらのＳＳＢｒタンパク質中で最重要であるのはＸＲＣＣ１であり、これは、ＤＮＡの３’および５’末端のクリーニングに関与するタンパク質をはじめとする、ＳＳＢｒプロセスの複数の酵素的構成要素と相互作用して、安定化し刺激する分子スキャフォールドとして機能する。例えば、ＸＲＣＣ１は、末端プロセッシングを促進するいくつかのタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼβ、ＰＮＫ、および３つのヌクレアーゼ、ＡＰＥ１、ＡＰＴＸ、およびＡＰＬＦ）と相互作用する。ＡＰＥ１は、エンドヌクレアーゼ活性を有する。ＡＰＬＦは、エンドヌクレアーゼおよび３’から５’方向エキソヌクレアーゼ機能を示す。ＡＰＴＸは、エンドヌクレアーゼおよび３’から５’方向エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【１３１６】
全部ではないとしても大多数のＳＳＢの３’および／または５’末端は「損傷を受け」ているため、この末端プロセッシングはＳＳＢＲの重要な段階である。末端プロセッシングは、一般に、末端がライゲーションできるように、損傷を受けた３’末端をヒドロキシル化状態に回復させ、およびおよび／または（ａｎｄ  ａｎｄ／ｏｒ）損傷を受けた５’末端をリン酸部分に、回復させることを伴う。損傷を受けた３’末端をプロセスできる酵素としては、ＰＮＫＰ、ＡＰＥ１、およびＴＤＰ１が挙げられる。損傷を受けた５’末端をプロセスできる酵素としては、ＰＮＫＰ、ＤＮＡポリメラーゼβ、およびＡＰＴＸが挙げられる。ＬＩＧ３（ＤＮＡリガーゼＩＩＩ）はまた、末端プロセッシングにも関与する。ひとたび末端がクリーニングされたら、ギャップ充填が起こり得る。
【１３１７】
ＤＮＡギャップ充填段階では、典型的に存在するタンパク質は、ＰＡＲＰ１、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＸＲＣＣ１、ＦＥＮ１（フラップエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｃｕｌｅａｓｅ）１）、ＤＮＡポリメラーゼδ／ε、ＰＣＮＡ、およびＬＩＧ１である。短いパッチ修復および長いパッチ修復の２つのギャップ充填様式がある。短いパッチ修復は、欠損している単一ヌクレオチドを挿入することを伴う。いくつかのＳＳＢでは、「ギャップ充填」は、２つ以上のヌクレオチドを転置し続けるかもしれない（最高１２塩基の転置が報告されている）。ＦＥＮ１は、転置された５’残基を除去するエンドヌクレアーゼである。Ｐｏｌβをはじめとする複数のＤＮＡポリメラーゼは、ＳＳＢの修復に関与し、ＤＮＡポリメラーゼの選択は、ＳＳＢの起源とタイプによって影響を受ける。
【１３１８】
第４段階では、ＬＩＧ１（リガーゼＩ）またはＬＩＧ３（リガーゼＩＩＩ）などのＤＮＡリガーゼが、末端の連結を触媒する。短いパッチ修復はリガーゼＩＩＩを利用して、長いパッチ修復はリガーゼＩを利用する。
【１３１９】
時に、ＳＳＢＲは、複製−共役する。この経路には、ＣｔＩＰ、ＭＲＮ、ＥＲＣＣ１、およびＦＥＮ１の１つまたは複数が関与し得る。ＳＳＢＲを促進してもよい追加的要素としては、ａＰＡＲＰ、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＰＡＲＧ、ＸＲＣＣ１、ＤＮＡポリメラーゼｂ、ＤＮＡポリメラーゼｄ、ＤＮＡポリメラーゼｅ、ＰＣＮＡ、ＬＩＧ１、ＰＮＫ、ＰＮＫＰ、ＡＰＥ１、ＡＰＴＸ、ＡＰＬＦ、ＴＤＰ１、ＬＩＧ３、ＦＥＮ１、ＣｔＩＰ、ＭＲＮ、およびＥＲＣＣ１が挙げられる。
【１３２０】
ＭＭＲ（ミスマッチ修復）
細胞は、ＭＭＲ、ＢＥＲ、およびＮＥＲの３つの切除修復経路を包含する：切除修復経路は、典型的に、ＤＮＡの１本鎖上の損傷を認識して、次にエキソ／エンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅａｓｅｓ）が損傷を除去し、ＤＮＡポリメラーゼによって順次充填され、最終的にリガーゼによってシールされる、１〜３０ヌクレオチドのギャップを残すという共通の特徴を有する（ｈａｃｅ）。より詳細な全体像は、Ｌｉ，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００８）１８：８５−９８に記載され、概要は、本明細書で提供される。
【１３２１】
ミスマッチ修復（ＭＭＲ）は、誤対合ＤＮＡ塩基上で機能する。
【１３２２】
ＭＳＨ２／６またはＭＳＨ２／３複合体は、どちらもミスマッチ認識および修復開始に重要な役割を果たすＡＴＰアーゼ活性を有する。ＭＳＨ２／６が、塩基−塩基ミスマッチを優先的に認識して、１または２ヌクレオチドの誤対合を同定する一方で、ＭＳＨ２／３は、より大型のＩＤ誤対合を優先的に認識する。
【１３２３】
ｈＭＬＨ１は、ｈＰＭＳ２とヘテロ二量体化して、ＡＴＰアーゼ活性を有しＭＭＲの複数の段階で重要であるｈＭｕｔＬαを形成する。これは、ＥＸＯ１が関与する３’ニック誘導ＭＭＲにおいて重要な役割を果たす、ＰＣＮＡ／複製因子Ｃ（ＲＦＣ）依存性エンドヌクレアーゼ活性を有する。（ＥＸＯ１は、ＨＲおよびＭＭＲの双方に参加する。）これは、ミスマッチが誘発する切除の終了を制御する。リガーゼＩは、この経路の関連リガーゼである。ＭＭＲを促進してもよい追加的要素としては、ＥＸＯ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＭＬＨ３、ＤＮＡ  Ｐｏｌｄ、ＲＰＡ、ＨＭＧＢ１、ＲＦＣ、およびＤＮＡリガーゼＩが挙げられる。
【１３２４】
塩基切除修復（ＢＥＲ）
塩基切除修復（ＢＥＲ）経路は、細胞周期全体を通じて活性であり；それは、ゲノムからの小型非らせん歪み塩基損傷を除去する主な原因となる。対照的に、関連ヌクレオチド切除修復経路（次のセクションで考察される）は、嵩高いらせん歪み損傷を修復する。より詳細な説明は、Ｃａｌｄｅｃｏｔｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９，６１９−６３１（Ａｕｇｕｓｔ  ２００８）に記載され、概要は本明細書に記載される。
【１３２５】
ＤＮＡ塩基損傷に際して、塩基切除修復（ＢＥＲ）が開始されて、プロセスは、５つの主要な段階に簡略化され得る：（ａ）損傷を受けたＤＮＡ塩基の除去；（ｂ）後続の塩基部位の切開；（ｃ）ＤＮＡ末端のクリーンアップ；（ｄ）修復ギャップ内への修正ヌクレオチド挿入；および（ｅ）ＤＮＡ骨格内の残りのニックのライゲーション。これらの最終段階は、ＳＳＢＲと類似する。
【１３２６】
第１段階では、損傷特異的ＤＮＡグリコシラーゼが、塩基を糖リン酸骨格に結合するＮグリコシド連結の切断を通じて、損傷を受けた塩基を切除する。次に、関連リアーゼ活性があるＡＰエンドヌクレアーゼ−１（ＡＰＥ１）または二機能性ＤＮＡグリコシラーゼがリン酸ジエステル骨格を切開して、ＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ）を生じた。ＢＥＲの第３段階は、ＤＮＡ末端のクリーンアップを伴う。ＢＥＲの第４段階は、新規相補的ヌクレオチドを修復ギャップ内に付加するＰｏｌβによって実施され、最終段階で、ＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩがＤＮＡ骨格内の残りのニックをシールする。これで、損傷を受けたＤＮＡ塩基の大部分（約８０％）が修復される、短いパッチＢＥＲ経路が完了する。しかし、段階３の５’末端が、末端プロセッシング活性に対して抵抗性であれば、Ｐｏｌβによる１個のヌクレオチド挿入に続いて、ポリメラーゼは複製的ＤＮＡポリメラーゼであるＰｏｌδ／εに切り替わり、次にそれは、ＤＮＡ修復ギャップに約２〜８個のヌクレオチドを付加する。これは、５’フラップ構造を作り出し、それは、処理能力要素である増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に結合する、フラップエンドヌクレアーゼ−１（ＦＥＮ−１）によって認識され切除される。次にＤＮＡリガーゼＩが、ＤＮＡ骨格内の残りのニックをシールして、長いパッチＢＥＲを完了する。ＢＥＲ経路を促進してもよい追加的要素としては、ＤＮＡグリコシラーゼ、ＡＰＥ１、Ｐｏｌｂ、Ｐｏｌｄ、Ｐｏｌｅ、ＸＲＣＣ１、リガーゼＩＩＩ、ＦＥＮ−１、ＰＣＮＡ、ＲＥＣＱＬ４、ＷＲＮ、ＭＹＨ、ＰＮＫＰ、およびＡＰＴＸが挙げられる。
【１３２７】
ヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）
ヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）は、ＤＮＡから嵩高いらせん歪み損傷を除去する重要な切除機序である。ＮＥＲに関する加的な詳細は、Ｍａｒｔｅｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５，４６５−４８１（２０１４）にあり、概要は本明細書に記載される。広域経路ＮＥＲは、２つのより小型の経路である、全ゲノムＮＥＲ（ＧＧ−ＮＥＲ）と、転写と共役する修復ＮＥＲ（ＴＣ−ＮＥＲ）とを包含する。ＧＧ−ＮＥＲおよびＴＣ−ＮＥＲは、ＤＮＡ損傷を認識するために異なる要素を使用する。しかし、それらは、損傷切開、修復、およびライゲーションのための同一機構を利用する。
【１３２８】
ひとたび障害が認識されたら、細胞は、損傷を含有する短い一本鎖ＤＮＡ断片を除去する。エンドヌクレアーゼＸＰＦ／ＥＲＣＣ１およびＸＰＧ（ＥＲＣＣ５によってコードされる）は、損傷のどちらかの側で損傷を受けた鎖を切断し、２２〜３０ヌクレオチドの一本鎖ギャップを生成することで、損傷を除去する。次に、細胞は、ＤＮＡギャップ充填合成およびライゲーションを実行するこのプロセスに関与するのは、ＰＣＮＡ、ＲＦＣ、ＤＮＡ  Ｐｏｌδ、ＤＮＡ  ＰｏｌεまたはＤＮＡ  Ｐｏｌκ、およびＤＮＡリガーゼＩまたはＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩである。ライゲーションステップの実行のために、自己複製細胞が、ＤＮＡ  ＰｏｌεおよびＤＮＡリガーゼＩを利用する傾向がある一方で、非自己複製細胞は、ＤＮＡ  Ｐｏｌδ、ＤＮＡ  Ｐｏｌκ、およびｔｈｅＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩ複合体を利用する傾向がある。
【１３２９】
ＮＥＲは、ＸＰＡ−Ｇ、ＰＯＬＨ、ＸＰＦ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＡ−Ｇ、およびＬＩＧ１の要素を伴い得る。転写共役ＮＥＲ（ＴＣ−ＮＥＲ）は、ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＸＰＢ、ＸＰＤ、ＸＰＧ、ＥＲＣＣ１、およびＴＴＤＡの要素を伴い得る。ＮＥＲ修復経路を促進してもよい追加的要素としては、ＸＰＡ−Ｇ、ＰＯＬＨ、ＸＰＦ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＡ−Ｇ、ＬＩＧ１、ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＸＰＡ、ＸＰＢ、ＸＰＣ、ＸＰＤ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、ＴＴＤＡ、ＵＶＳＳＡ、ＵＳＰ７、ＣＥＴＮ２、ＲＡＤ２３Ｂ、ＵＶ−ＤＤＢ、ＣＡＫ部分複合体、ＲＰＡ、およびＰＣＮＡが挙げられる。
【１３３０】
鎖間架橋（ＩＣＬ）
ＩＣＬ修復経路と称される専用経路が、鎖間架橋を修復する。異なるＤＮＡ鎖中の塩基間の鎖間架橋、または共有結合架橋が、複製または転写中に起こり得る。ＩＣＬ修復は、具体的には、核酸分解活性、損傷乗り越え合成（ＴＬＳ）、およびＨＤＲである、複数の修復プロセスの協調を伴う。ヌクレアーゼが、架橋塩基のどちらかの側のＩＣＬを切除するように動員される一方で、ＴＬＳおよびＨＤＲは、協調して切断された鎖を修復する。ＩＣＬ修復は、以下の要素を伴い得る：例えば、ＸＰＦおよびＲＡＤ５１Ｃなどのエンドヌクレアーゼ、ＲＡＤ５１などのエンドヌクレアーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼζおよびＲｅｖ１）などの損傷乗り越えポリメラーゼ、および例えば、ＦａｎｃＪなどのファンコーニ貧血（ＦＡ）タンパク質。
【１３３１】
その他の経路
哺乳類には、いくつかのその他のＤＮＡ修復経路が存在する。
【１３３２】
損傷乗り越え合成（ＴＬＳ）は、欠陥複製事象後に残される一本鎖切断の修復経路であり、例えば、ＤＮＡ  ｐｏｌζおよびＲｅｖ１などの損傷乗り越えポリメラーゼが関与する。
【１３３３】
誤りのない複製後修復（ＰＲＲ）は、欠陥複製事象後に残される一本鎖切断修復の別の経路である。
【１３３４】
Ｖ．５  ゲノム編集法におけるｇＲＮＡの例
本明細書に記載されるようなｇＲＮＡ分子を二本鎖切断または一本鎖切断を生成するＣａｓ９分子と共に使用して、例えば、標的位置または標的遺伝子シグネチャなどの標的核酸の配列が改変され得る。これらの方法で有用なｇＲＮＡ分子は、以下に記載される。
【１３３５】
一実施形態では、例えば、キメラｇＲＮＡなどのｇＲＮＡは、それが以下の特性の１つまたは複数を含んでなるように構成される；
ａ）それは、例えば、二本鎖切断を生じるＣａｓ９分子の標的化に際して、二本鎖切断が、（ｉ）標的位置の５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０，４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内にあるように、または（ｉｉ）十分に密接しているので標的位置が末端切除領域内にあるように配置され得る；
ｂ）それは、例えば、（ｉ）１６、（ｉｉ）１７、（ｉｉｉ）１８、（ｉｖ）１９、（ｖ）２０、（ｖｉ）２１、（ｖｉｉ）２２、（ｖｉｉｉ）２３、（ｉｘ）２４、（ｘ）２５、または（ｘｉ）２６ヌクレオチドの標的化ドメインなどの少なくとも１６ヌクレオチドの標的化ドメインを有する；
ｃ）（ｉ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）テールおよび隣接ドメインからの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドを含んでなり、またはそれと、１、２、３、４、５；６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含んでなる；
（ｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドがあり、またはそれと、１、２、３、４、５；６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある；
（ｉｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４個のヌクレオチドなどの第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４個のヌクレオチドがあり、またはそれと、１、２、３、４、５；６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある；
（ｉｖ）テールドメインが、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０ヌクレオチド長であり、例えば、それは、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）テールドメインからの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のヌクレオチドを含んでなり；またはそれと、１、２、３、４、５；６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含んでなり；または
（ｖ）テールドメインが、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）テールドメインなどの天然起源テールドメインの１５、２０、２５、３０、３５、４０ヌクレオチド、または全ての対応する部分を含んでなる。
【１３３６】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３３７】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３３８】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３３９】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉｖ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３４０】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｖ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３４１】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｖｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３４２】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｖｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３４３】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｖｉｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３４４】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉｘ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３４５】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｘ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３４６】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｘｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３４７】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｃの特性を含んでなるように構成される。
【１３４８】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ、ｂ、およびｃの特性を含んでなるように構成される。
【１３４９】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３５０】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３５１】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３５２】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３５３】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３５４】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３５５】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３５６】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３５７】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３５８】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３５９】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３６０】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３６１】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３６２】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３６３】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３６４】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３６５】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３６６】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３６７】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３６８】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３６９】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３７０】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３７１】
一実施形態では、例えば、キメラｇＲＮＡなどのｇＲＮＡは、それが以下の特性の１つまたは複数を含んでなるように構成される；
ａ）ｇＲＮＡの片方または双方が、例えば、一本鎖切断を生じるＣａｓ９分子の標的化に際して、一本鎖切断が、（ｉ）標的位置の５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内にあるように、または（ｉｉ）十分に密接しているので標的位置が末端切除領域内にあるように位置し得る；
ｂ）片方または双方が、例えば、（ｉ）１６、（ｉｉ）、１７、（ｉｉｉ）１８、（ｉｖ）１９、（ｖ）２０、（ｖｉ）２１、（ｖｉｉ）２２、（ｖｉｉｉ）２３、（ｉｘ）２４、（ｘ）２５、または（ｘｉ）２６ヌクレオチドの標的化ドメインなどの少なくとも１６ヌクレオチドの標的化ドメインを有し；
ｃ）（ｉ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）テールおよび隣接ドメインからの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドを含んでなり、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含んでなる；
（ｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドがあり、またはそれと、１、２、３、４、５；６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある；
（ｉｉｉ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または個の５４ヌクレオチドなどの第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがあり、またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある；
ｉｖ）テールドメインが、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０ヌクレオチド長であり、例えば、それは、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）テールドメインからの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のヌクレオチドを含んでなり；またはそれと、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含んでなり；または
（ｖ）テールドメインが、例えば、天然Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）テールドメインなどの天然テールドメインの１５、２０、２５、３０、３５、４０ヌクレオチド、または全ての対応する部分を含んでなる。
【１３７２】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３７３】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３７４】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３７５】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉｖ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３７６】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｖ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３７７】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｖｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３７８】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｖｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３７９】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｖｉｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３８０】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｉｘ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３８１】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｘ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３８２】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｂ（ｘｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３８３】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それがａおよびｃの特性を含んでなるように構成される。
【１３８４】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ、ｂ、およびｃの特性を含んでなるように構成される。
【１３８５】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３８６】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３８７】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３８８】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３８９】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３９０】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３９１】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３９２】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３９３】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３９４】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３９５】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３９６】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３９７】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３９８】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１３９９】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４００】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４０１】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４０２】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４０３】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４０４】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４０５】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４０６】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、それが（ｉｎ）ａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４０７】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｄ１０Ａ変異などの変異をＤ１０に有するＣａｓ９分子のような、ＲｕｖＣ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＨＮＨ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。
【１４０８】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｈ８４０Ａなどの変異をＨ８４０に有するＣａｓ９分子のような、ＨＮＨ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。
【１４０９】
一実施形態では、例えば、第１および第２のｇＲＮＡを含んでなる１対のキメラｇＲＮＡなどの１対のｇＲＮＡは、それらが、以下の特性の１つまたは複数を含んでなるように構成される；
ａ）ｇＲＮＡの片方または双方が、例えば、一本鎖切断を生じるＣａｓ９分子の標的化に際して、一本鎖切断が、（ｉ）標的位置の５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０，４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内にあるように、または（ｉｉ）十分に密接しているので標的位置が末端切除領域内にあるように位置し得る；
ｂ）片方または双方が、例えば、（ｉ）１６、（ｉｉ）１７、（ｉｉｉ）１８、（ｉｖ）１９、（ｖ）２０、（ｖｉ）２１、（ｖｉｉ）２２、（ｖｉｉｉ）２３、（ｉｘ）２４、（ｘ）２５、または（ｘｉ）２６ヌクレオチドの標的化ドメインなどの少なくとも１６ヌクレオチドの標的化ドメインを有する；
ｃ）以下の片方または双方：
（ｉ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）テールおよび隣接ドメインからの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドを含んでなり、またはそれと、１、２、３、４、５；６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含んでなる；
（ｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドなどの少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３個のヌクレオチドがあり、またはそれと、１、２、３、４、５；６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある；
（ｉｉｉ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの３’に、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｇＲＮＡの対応する配列からの少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４個のヌクレオチドなどの第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがあり、またはそれと、１、２、３、４、５；６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列がある；
（ｉｖ）テールドメインが、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０ヌクレオチド長であり、例えば、それは、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）テールドメインからの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のヌクレオチドを含んでなり；または（ｏｒ，ｏｒ）それと、１、２、３、４、５；６、７、８、９または１０個以下のヌクレオチドが異なる配列を含んでなり；または
（ｖ）テールドメインが、例えば、天然起源Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）テールドメインなどの天然起源テールドメインの１５、２０、２５、３０、３５、４０個のヌクレオチド、または全ての対応する部分を含んでなる；
ｄ）ｇＲＮＡが、標的核酸とハイブリダイズする際に、それらが、０〜５０、０〜１００、０〜２００、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０または少なくとも５０ヌクレオチドによって隔てられるように構成される；
ｅ）第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡによって生成される切断が、異なる鎖上にある；
ｆ）ＰＡＭが外側を向く。
【１４１０】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４１１】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４１２】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｉｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４１３】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｉｖ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４１４】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｖ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４１５】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｖｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４１６】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｖｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４１７】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｖｉｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４１８】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｉｘ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４１９】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｘ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４２０】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｂ（ｘｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４２１】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａおよびｃの特性を含んでなるように構成される。
【１４２２】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ、ｂ、およびｃの特性を含んでなるように構成される。
【１４２３】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４２４】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４２５】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【１４２６】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４２７】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４２８】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４２９】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４３０】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【１４３１】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４３２】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４３３】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４３４】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４３５】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【１４３６】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４３７】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｉｉ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４３８】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４３９】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４４０】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【１４４１】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４４２】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｖ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４４３】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４４４】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４４５】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【１４４６】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４４７】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４４８】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４４９】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４５０】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【１４５１】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４５２】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４５３】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４５４】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４５５】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【１４５６】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４５７】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４５８】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４５９】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４６０】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【１４６１】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４６２】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｖｉｉｉ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４６３】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４６４】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４６５】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【１４６６】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４６７】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｉｘ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４６８】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４６９】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４７０】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【１４７１】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４７２】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４７３】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４７４】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、およびｃ（ｉｉ）の特性を含んでなるように構成される。
【１４７５】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、ｃ、およびｄの特性を含んでなるように構成される。
【１４７６】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、ｃ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４７７】
一実施形態では、ｇＲＮＡの片方または双方は、それがａ（ｉ）、ｂ（ｘｉ）、ｃ、ｄ、およびｅの特性を含んでなるように構成される。
【１４７８】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｄ１０Ａ変異などの変異をＤ１０に有するＣａｓ９分子のような、ＲｕｖＣ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＨＮＨ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。
【１４７９】
一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｈ８４０Ａなどの変異をＨ８４０に有するＣａｓ９分子のような、ＨＮＨ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。一実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、Ｎ８６３Ａなどの変異をＮ８６３に有するＣａｓ９分子のような、ＨＮＮ活性が不活性化されているＣａｓ９分子などのＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼ分子と共に使用される。
【１４８０】
ＶＩ．標的細胞
例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体などのＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子を使用して、例えば、多種多様な細胞内で標的核酸を編集するなど、細胞が操作され得る。
【１４８１】
一実施形態では、細胞は、例えば、本明細書に記載されるような１つまたは複数の標的遺伝子を編集する（例えば、変異を誘導する）ことで操作される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の標的遺伝子（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子）の発現が調節される。別の実施形態では、細胞は、１つまたは複数の標的遺伝子を編集する（例えば、変異を誘導する）ことで、および／または例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数の標的遺伝子の発現を調節することで、生体外で操作されて、対象に投与される。生体外操作のための標的細胞の起源としては、例えば、対象の血液、対象の臍帯血、または対象の骨髄が挙げられる。生体外操作のための標的細胞の起源としては、例えば、異種供与者血液、臍帯血、または骨髄もまた挙げられる。
【１４８２】
分子本明細書に記載されるＣａｓ９およびｇＲＮＡは、標的細胞に送達され得る。一実施形態では、標的細胞は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋未感作Ｔ細胞、中枢記憶Ｔ細胞、またはエフェクター記憶Ｔ細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、幹細胞記憶Ｔ細胞、リンパ系前駆細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）または樹状細胞などのＴ細胞である。一実施形態では、標的細胞は、例えば、対象から作成されて、操作され、改変された（例えば、変異誘導された）、または例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数の標的遺伝子の発現が操作されて、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋未感作Ｔ細胞、中枢記憶Ｔ細胞、またはエフェクター記憶Ｔ細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、幹細胞記憶Ｔ細胞などのＴ細胞、リンパ系前駆細胞または造血幹細胞に分化した、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞などの、ｉＰＳ細胞、またはｉＰＳ細胞に由来する細胞である。
【１４８３】
一実施形態では、標的細胞は、特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子（例えば、ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ遺伝子）を含有するように改変されている。別の実施形態では、ＴＣＲは、例えば、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＧＰ１００、Ｔ細胞１によって認識されるメラノーマ抗原（ＭＡＲＴ１）、メラノーマ抗原Ａ３（ＭＡＧＥＡ３）、ＮＹＥＳＯ１またはｐ５３などの腫瘍関連抗原に対する結合特異性を有する。
【１４８４】
一実施形態では、標的細胞は、特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含有するように改変されている。一実施形態では、ＣＡＲは、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＥＲＢＢ２、ＧＤ２、α−葉酸受容体、ルイスＹ抗原、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）または腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）などの腫瘍関連抗原に対する結合特異性を有する。
【１４８５】
別の実施形態では、標的細胞は、例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲなどによって、以下の腫瘍抗原の１つまたは複数に結合するように改変されている。腫瘍抗原としては、ＡＤ０３４、ＡＫＴ１、ＢＲＡＰ、ＣＡＧＥ、ＣＤＸ２、ＣＬＰ、ＣＴ−７、ＣＴ８／ＨＯＭ−ＴＥＳ−８５、ｃＴＡＧＥ−１、フィビュリン−１、ＨＡＧＥ、ＨＣＡ５８７／ＭＡＧＥ−Ｃ２、ｈＣＡＰ−Ｇ、ＨＣＥ６６１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−Ｃｗ、ＨＯＭ−ＨＤ−２１／ガレクチン９、ＨＯＭ−ＭＥＥＬ−４０／ＳＳＸ２、ＨＯＭ−ＲＣＣ−３．１．３／ＣＡＸＩＩ、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＢ６、Ｈｕ、ＨＵＢ１、ＫＭ−ＨＮ−３、ＫＭ−ＫＮ−１、ＫＯＣ１、ＫＯＣ２、ＫＯＣ３、ＫＯＣ３、ＬＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−４ａ、ＭＰＰ１１、ＭＳＬＮ、ＮＮＰ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ＮＹ−ＢＲ−６２、ＮＹ−ＢＲ−８５、ＮＹ−ＣＯ−３７、ＮＹ−ＣＯ−３８、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−５、ＮＹ−ＬＵ−１２、ＮＹ−ＲＥＮ−１０、ＮＹ−ＲＥＮ−１９／ＬＫＢ／ＳＴＫ１１、ＮＹ−ＲＥＮ−２１、ＮＹ−ＲＥＮ−２６／ＢＣＲ、ＮＹ−ＲＥＮ−３／ＮＹ−ＣＯ−３８、ＮＹ−ＲＥＮ−３３／ＳＮＣ６、ＮＹ−ＲＥＮ−４３、ＮＹ−ＲＥＮ−６５、ＮＹ−ＲＥＮ−９、ＮＹ−ＳＡＲ−３５、ＯＧＦｒ、ＰＬＵ−１、Ｒａｂ３８、ＲＢＰＪκ、ＲＨＡＭＭ、ＳＣＰ１、ＳＣＰ−１、ＳＳＸ３、ＳＳＸ４、ＳＳＸ５、ＴＯＰ２Ａ、ＴＯＰ２Ｂ、またはチロシナーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【１４８６】
ＶＩＩ．構成要素の標的細胞への生体外送達
例えば、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子などの構成要素は、多様な送達方法および調合物を使用して、多様な形態で標的細胞内に導入され得て、例えば、表７００および８００を参照されたい。Ｃａｓ９またはｇＲＮＡ構成要素が、送達のためにＤＮＡとしてコードされる場合、ＤＮＡは、必須ではないが典型的に制御領域を含んでもよく、例えば、プロモーターを含んでなり、発現をもたらす。Ｃａｓ９分子配列の有用なプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ、ＥＦ−１ａ、ＥＦＳ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、またはＣＡＧプロモーターが挙げられる。ｇＲＮＡの有用なプロモーターとしては、例えば、Ｈ１、ＥＦ−１ａ、ｔＲＮＡまたはＵ６プロモーターが挙げられる。同様のまたは異なる強度があるプロモーターを選択して、構成要素の発現が調整され得る。Ｃａｓ９分子をコードする配列は、例えば、ＳＶ４０ＮＬＳなどの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含んでなってもよい。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡ分子のプロモーターは、独立して、誘導性、組織特異的、または細胞特異的であってもよい。
【１４８７】
表７００は、構成要素が標的細胞に送達され得る形式の例を提供する。
【１４８８】
【表２８１】
2020062029.tif 000404
【１４８９】
表８００は、例えば、本明細書に記載されるようなＣａｓ９分子構成要素およびｇＲＮＡ分子構成要素などのＣａｓシステム構成要素の様々な送達方法を要約する。
【１４９０】
【表２８２】
2020062029.tif 000405
【１４９１】
Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子のＤＮＡベースの送達
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子）および／またはｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡは、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、細胞内に送達され得る。例えば、Ｃａｓ９をコードするおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、ベクター（例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクター）、非ベクターベースの方法（例えば、裸のＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を使用して）、またはそれらの組み合わせによって、送達され得る。
【１４９２】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ベクター（例えば、ウイルスベクター／ウイルスまたはプラスミド）によって送達される。
【１４９３】
ベクターは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子をコードする配列を含んでなり得る。ベクターはまた、例えば、Ｃａｓ９分子配列と融合した、（例えば、核局在化、核小体局在化、ミトコンドリア局在化のための）シグナルペプチドをコードする配列を含んでなり得る。例えば、ベクターは、Ｃａｓ９分子をコードする配列に融合された、核局在化配列（例えば、ＳＶ４０からの）を含んでなり得る。
【１４９４】
例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、２Ａ配列、およびスプライス受容体またはドナーなどの１つまたは複数の調節的／制御要素が、ベクターに包含され得る。一実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶプロモーター）によって認識される。別の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（例えば、Ｕ６プロモーター）によって認識される。別の実施形態では、プロモーターは、調節プロモーター（例えば、誘導性プロモーター）である。別の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、ウイルスプロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、非ウイルスプロモーターである。
【１４９５】
一実施形態では、ベクターまたは送達ビヒクルは、ウイルスベクター（例えば、組換えウイルス生成のための）である。一実施形態では、ウイルスは、ＤＮＡウイルス（例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡウイルス）である。一実施形態では、ウイルスは、ＲＮＡウイルス（例えば、ｓｓＲＮＡウイルス）である。代表的なウイルスベクター／ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられる。
【１４９６】
一実施形態では、ウイルスは、分裂細胞に感染する。別の実施形態では、ウイルスは、非分裂細胞に感染する。別の実施形態では、ウイルスは、分裂および非分裂細胞の双方に感染する。別の実施形態では、ウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれ得る。別の実施形態では、ウイルスは、例えば、ヒトにおいて免疫低下を有するように改変される。別の実施形態では、ウイルスは、複製能力がある。別の実施形態では、ウイルスは複製欠陥であり、例えば、ビリオン複製および／またはパッケージングの追加的なラウンドに必要な遺伝子のための１つまたは複数のコード領域が、その他の遺伝子で置換されまたは欠失される。別の実施形態では、ウイルスは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の一過性の発現を引き起こす。別の実施形態では、ウイルスは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、９ヶ月間、１年間、２年間、または恒久的などの持続性の発現を引き起こす。ウイルスのパッケージング容量は、例えば、少なくとも約４ｋｂ〜少なくとも約３０ｋｂ、例えば、少なくとも約５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、または５０ｋｂなどで変動してもよい。
【１４９７】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、組換えレトロウイルスによって送達される。別の実施形態では、レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス）は、例えば、宿主ゲノムへの組み込みを可能にするものなどの逆転写酵素を含んでなる。一実施形態では、レトロウイルスは、複製能力がある。別の実施形態では、レトロウイルスは複製欠陥であり、例えば、ビリオン複製およびパッケージングの追加的なラウンドに必要な遺伝子のための１つまたは複数のコード領域が、その他の遺伝子で置換されまたは欠失される。
【１４９８】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、組換えレンチウイルスによって送達される。例えば、レンチウイルスは、例えば、ウイルス複製に必要な１つまたは複数の遺伝子を含まないなど、複製欠陥である。
【１４９９】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、組換えアデノウイルスによって送達される。別の実施形態では、アデノウイルスは、ヒトにおいて免疫低下を有するように改変される。
【１５００】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、組換えＡＡＶによって送達される。一実施形態では、ＡＡＶは、例えば、本明細書に記載されるような標的細胞などの宿主細胞に、そのゲノムを組み込み得る。別の実施形態では、ＡＡＶは、例えば、共にアニールされて二本鎖ＤＮＡを形成する双方の鎖をパッケージするｓｃＡＡＶなどの、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）である。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、修飾ＡＡＶ２（例えば、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆおよび／またはＳ６６２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ３、修飾ＡＡＶ３（例えば、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆおよび／またはＴ４９２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、修飾ＡＡＶ６（例えば、Ｓ６６３Ｖおよび／またはＴ４９２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ  ｒｈ１０、そしてＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、およびＡＡＶ２／６などの偽型ＡＡＶをはじめとする、開示される方法で使用されてもよいＡＡＶ血清型はまた、開示される方法で使用され得る。
【１５０１】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、本明細書に記載されるウイルスの１つまたは複数のハイブリッドなどのハイブリッドウイルスによって送達される。
【１５０２】
パッケージング細胞が使用されて、標的細胞を感染させる能力があるウイルス粒子が形成される。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージし得る２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージし得るψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常は、核酸ベクターをウイルス粒子内にパッケージする産生細胞株によって生成される。ベクターは、典型的に、パッケージングと（妥当な場合）引き続く宿主または標的細胞への組み込みに必要な最小のウイルス配列を含有し、その他のウイルス配列は、例えばＣａｓ９などの発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置換される。例えば、遺伝子治療で使用されるＡＡＶベクターは、典型的に、パッケージングおよび宿主または標的細胞内の遺伝子発現に必要なＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。欠損しているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスに提供される。この後、ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列が欠如しているヘルパープラスミドを含有する、細胞株内にパッケージされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染する。ヘルパーウイルスは、ヘルパープラスミドからのＡＡＶベクター複製とＡＡＶ遺伝子発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のために、顕著な量でパッケージされない。アデノウイルスの混入は、例えば、それに対してアデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い、加熱処理によって低下させ得る。
【１５０３】
一実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型および／または組織型の認識能力を有する。例えば、ウイルスベクターは、異なる／代案のウイルス外被糖タンパク質による偽型であり得て；細胞型特異的受容体によって改変され（例えば、ペプチドリガンド、一本鎖抗体、成長因子などの標的化リガンドに組み込むためのウイルス外被糖タンパク質の遺伝子修飾）；および／または改変されて、一端がウイルス糖タンパク質を認識して、もう一方の末端が標的細胞表面部分を認識する、二重特異性がある分子ブリッジを有する（例えば、リガンド受容体、モノクローナル抗体、アビジン−ビオチン、および化学的結合）。
【１５０４】
一実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型特異的発現を達成する。例えば、組織特異的プロモーターが構築されて、特異的標的細胞のみで導入遺伝子（Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ）の発現が制限され得る。ベクターの特異性はまた、導入遺伝子発現のマイクロＲＮＡ依存性調節によって媒介され得る。一実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスベクターと標的細胞膜との融合効率の増大を有する。例えば、融合能力がある赤血球凝集素（ＨＡ）などのが組み込みまれて、細胞内へのウイルス取り込みが増大され得る。一実施形態では、ウイルスベクターは、核局在化能力を有する。例えば、（細胞分裂中に）核膜の分解を要し、したがって非分裂細胞に感染しない特定のウイルスは、ウイルスのマトリックスタンパク質に核局在化ペプチドを組み込むように改変され得て、それによって非増殖性細胞への形質導入が可能になる。
【１５０５】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、（例えば、裸のＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を使用して）非ベクターベースの方法によって送達される。例えば、ＤＮＡは、例えば、有機修飾シリカまたはケイ酸塩（Ｏｒｍｏｓｉｌ）、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ  ［２０１２］  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １２：６３２２−２７に記載されるような）、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、脂質媒介形質移入、デンドリマー、無機ナノ粒子、カルシウムリン酸塩、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。
【１５０６】
一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で、細胞をＣａｓ９および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡと混合し、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスを適用するステップを含んでなる。一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベットに混合物を供給する装置（例えばポンプ）と連結する容器内で、細胞がＣａｓ９および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡと混合され、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内では、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達される、システムを使用して実施される。
【１５０７】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ベクターおよび非ベクターベースの方法の組み合わせによって送達される。例えば、ビロソームは、不活性化ウイルス（例えば、ＨＩＶまたはインフルエンザウイルス）と組み合わされたリポソームを含んでなり、それはウイルスまたはリポソーム法単独のどちらよりも効率的な遺伝子移入をもたらし得る。
【１５０８】
一実施形態では、送達ビヒクルは、非ウイルスベクターである。一実施形態では、非ウイルスベクターは、無機ナノ粒子である。代表的な無機ナノ粒子としては、例えば、磁性ナノ粒子（例えば、Ｆｅ３ＭｎＯ２）、およびシリカが挙げられる。ナノ粒子の外面は、ペイロードの付着（例えば、コンジュゲーションまたは捕捉）を可能にする正荷電ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリン）にコンジュゲートされ得る。一実施形態では、非ウイルスベクターは、有機ナノ粒子である。代表的有機ナノ粒子としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で被覆された中性ヘルパー脂質、および脂質で被覆されたプロタミン核酸複合体に加えて、カチオン性脂質を含有するＳＮＡＬＰリポソームが挙げられる。
【１５０９】
遺伝子移入のための代表的脂質は、下で表９００に示される。
【１５１０】
【表２８３】
2020062029.tif 000406
【１５１１】
【表２８４】
2020062029.tif 000407
【１５１２】
遺伝子移入のための代表的なポリマーは、下で表１０００に示される。
【１５１３】
【表２８５】
2020062029.tif 000408
【１５１４】
一実施形態では、ビヒクルは、標的化修飾を有して、例えば、細胞特異的抗原、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖、および細胞透過性ペプチドなどのナノ粒子およびリポソームの標的細胞アップデート（ｕｐｄａｔｅ）が増大される。一実施形態では、ビヒクルは、融合性およびエンドソーム不安定化ペプチド／ポリマーを利用する。一実施形態では、ビヒクルは、酸誘発性立体構造変化を受ける（例えば、カーゴのエンドソーム漏出を加速するために）。一実施形態では、例えば、細胞区画内の放出のために、刺激切断可能ポリマーが使用される。例えば、還元性細胞環境内で切断されるジスルフィドベースのカチオン性ポリマーが、使用され得る。
【１５１５】
一実施形態では、送達ビヒクルは、生物学的非ウイルス送達ビヒクルである。一実施形態では、ビヒクルは、弱毒型細菌（例えば、侵入性であるが弱毒化されて発病を予防して導入遺伝子を発現するように、天然にまたは人工的に改変されている（例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、特定のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、および改変大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）；栄養および組織特異的親和性を有して特定細胞を標的化する細菌；修飾表面タンパク質を有して標的細胞特異性を改変する細菌）である。一実施形態では、ビヒクルは、遺伝子修飾されたバクテリオファージである（例えば、改変ファージは、大きなパッケージング容量を有し、免疫原性がより低く、哺乳類プラスミド維持配列を含有して、組み込まれた標的化リガンドを有する）。一実施形態では、ビヒクルは、哺乳類ウイルス様粒子である。例えば、修飾ウイルス粒子が生成され得る（例えば、「空の」粒子精製と、それに続く、所望のカーゴがあるウイルスの生体外構築によって）。ビヒクルはまた改変されて、標的化リガンドが組み込まれ、標的組織特異性が改変され得る。一実施形態では、ビヒクルは、生物学的リポソームである。例えば、生物学的リポソームは、ヒト細胞（例えば、対象に由来する球状構造に分解された赤血球である赤血球ゴーストに由来するリン脂質ベースの粒子（例えば、組織標的化が、様々な組織または細胞特異的リガンドの付着によって達成され得る）；またはエンドサイトーシス起源の分泌型エキソソーム−対象由来膜結合ナノ小胞（３０〜１００ｎｍ）（例えば、様々な細胞型から生成され得て、したがってリガンド標的化の必要なしに細胞に取り込まれ得る）である。
【１５１６】
一実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子構成要素および／またはｇＲＮＡ分子構成要素などの、Ｃａｓシステムの構成要素以外の１つまたは複数の核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）が送達される。一実施形態では、核酸分子は、Ｃａｓシステムの構成要素の１つまたは複数と同時に、送達される。一実施形態では、核酸分子は、Ｃａｓシステムの構成要素の１つまたは複数が送達される（例えば、約３０分間、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日間、３日間、１週間、２週間、または４週間未満）前または後に送達される。一実施形態では、核酸分子は、例えば、Ｃａｓ９分子構成要素および／またはｇＲＮＡ分子構成要素などのＣａｓシステムの構成要素の１つまたは複数とは、異なる手段によって送達される。核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれかによって送達され得る。例えば、核酸分子は、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスなどのウイルスベクターによって送達され得て、Ｃａｓ９分子構成要素および／またはｇＲＮＡ分子構成要素は、電気穿孔によって送達され得る。一実施形態では、核酸分子は、ＴＲＡＣ遺伝子、ＴＲＢＣ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子をコードする。
【１５１７】
Ｃａｓ９分子をコードするＲＮＡの送達
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質）をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡ分子は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、例えば、本明細書に記載される標的細胞などの細胞内に送達され得る。例えば、Ｃａｓ９をコードするおよび／またはｇＲＮＡをコードするＲＮＡは、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ［２０１２］Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １２：６３２２−２７に記載されるような）、脂質媒介形質移入、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。
【１５１８】
一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で、細胞をＣａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９融合物タンパク質（ｐｒｏｔｉｅｎｓ））をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡ分子と混合し、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスを適用するステップを含んでなる。一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベットに混合物を供給する装置（例えばポンプ）と連結する容器内で、容器内で、細胞がＣａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９融合物タンパク質（ｐｒｏｔｉｅｎｓ））をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡ分子と混合され、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内では、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達される、システムを使用して実施される。
【１５１９】
Ｃａｓ９分子タンパク質の送達
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質）は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、細胞内に送達され得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質分子は、例えば、ｂｙマイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ［２０１２］Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １２：６３２２−２７に記載されるような）、脂質媒介形質移入、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。送達は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ、またはｇＲＮＡを伴い得る。
【１５２０】
一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で、細胞をＣａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９融合物タンパク質）とｇＲＮＡ分子ありまたはなしで混合し、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスを適用するステップを含んでなる。一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベットに混合物を供給する装置（例えばポンプ）と連結する容器内で、容器内で、細胞がＣａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９融合物タンパク質（ｐｒｏｔｉｅｎｓ））とｇＲＮＡ分子ありまたはなしで混合され、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内では、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達される、システムを使用して実施される。
【１５２１】
ＶＩＩＩ．修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、例えば、特にｇＲＮＡなどの核酸中に存在し得るが、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、またはｓｉＲＮＡなどのその他の形態のＲＮＡにもまた存在し得る。本明細書に記載される「ヌクレオシド」は、５つの炭素砂糖分子（ペントースまたはリボース）またはその誘導体と、１つの有機塩基、プリンまたはピリミジン、またはその誘導体とを含有する化合物と定義される。本明細書に記載される「ヌクレオチド」は、リン酸基をさらに含んでなるヌクレオシドと定義される。
【１５２２】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の１つまたは複数を含み得る：
（ｉ）例えば、リン酸ジエステル骨格結合中の非結合リン酸酸素の片方または双方および／または結合リン酸酸素の１つまたは複数の置換などの改変；
（ｉｉ）例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシルなどのリボース糖の構成要素の置換などの改変；
（ｉｉｉ）リン酸部分の「デホスホ」リンカーによる徹底的な置換；
（ｉｖ）天然起源核酸塩基の修飾または置換；
（ｖ）リボースリン酸骨格の置換または修飾；
（ｖｉ）例えば、末端リン酸基の除去、修飾または置換または部分のコンジュゲーションなどのオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾；および
（ｖｉｉ）糖の修飾。
【１５２３】
上に列挙される修飾を混合して、２、３、４つ以上の修飾を有し得る、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドが提供され得る。例えば、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、修飾糖および修飾核酸塩基を有し得る。一実施形態では、ｇＲＮＡの各塩基は修飾され、例えば、全ての塩基が、例えば、全てホスホロチオエート基であるなど、修飾リン酸基を有する。一実施形態では、単分子またはモジュラーｇＲＮＡ分子の全ての、または実質的に全てのリン酸基は、ホスホロチオエート基で置換される。
【１５２４】
一実施形態では、例えば、本明細書に記載されるような修飾を有するヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドが、例えば、「修飾核酸」などの核酸に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、修飾核酸は、１、２、３つ以上の修飾ヌクレオチドを含んでなる。いくつかの実施形態では、修飾核酸内の位置の少なくとも５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）は、修飾ヌクレオチドである。
【１５２５】
未修飾核酸は、例えば、細胞ヌクレアーゼによって分解され易くあり得る。例えば、ヌクレアーゼは、核酸リン酸ジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様では、本明細書に記載される修飾核酸は、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有し得て、例えば、ヌクレアーゼに安定性が導入される。
【１５２６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、細胞集団内に導入されると、先天性免疫応答の低下を示し得る。「先天性免疫応答」という用語は、一般にウイルス性または細菌起源である、一本鎖核酸をはじめとする外来性核酸に対する細胞性応答を含み、それは、具体的にはインターフェロンであるサイトカインの発現と放出の誘導、および細胞死を内包する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、主溝相互作用パートナーの核酸との結合を妨害し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、細胞集団内に導入されると、先天性免疫応答の低下を示して、そしてまた主溝相互作用パートナーの核酸との結合も妨害し得る。
【１５２７】
化学基の定義
本明細書の用法では、「アルキル」は、直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素基を指すことが意図される。アルキル基の例としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（例えば、ｎ−プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（例えば、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル）、ペンチル（例えば、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル）などが挙げられる。アルキル基は、１〜約２０個、２〜約２０個、１〜約１２個、１〜約８個、１〜約６個、１〜約４個、または１〜約３個の炭素原子を含有し得る。
【１５２８】
本明細書の用法では、「アリール」は、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、インダニル、インデニルなどの単環または多環（例えば、２、３または４つの融合環を有する）芳香族炭化水素を指す。いくつかの実施形態では、アリール基は、６〜約２０個の炭素原子を有する。
【１５２９】
本明細書の用法では、「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有する脂肪族基を指す。
【１５３０】
本明細書の用法では、「アルキニル」は、２〜１２個の炭素原子を含有し、１つまたは複数の三重結合を有することで特徴付けられる、直鎖または分枝炭化水素鎖を指す。アルキニル基の例としては、エチニル、プロパルギル、および３−ヘキシニルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【１５３１】
本明細書の用法では、「アリールアルキル」または「アラルキル」は、アルキル水素原子がアリール基で置換された、アルキル部分を指す。アラルキルは、２つ以上の水素原子がアリール基で置換されている基を含む。「アリールアルキル」または「アラルキル」の例としては、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、９−フルオレニル、ベンズヒドリル、およびトリチル基が挙げられる。
【１５３２】
本明細書の用法では、「シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素を有する環式、二環式、三環式、または多環式非芳香族炭化水素基を指す。シクロアルキル部分の例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【１５３３】
本明細書の用法では、「ヘテロシクリル」は、複素環系の一価の基を指す。典型的なヘテロシクリルとしては、制限なしに、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、およびモルホリニルが挙げられる。
【１５３４】
本明細書の用法では、「ヘテロアリール」は、複素環式芳香族環系の一価の基を指す。ヘテロアリール部分の例としては、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、ピロリル、フラニル、インドリル、チオフェニルピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、キノリル、およびプテリジニルが挙げられる、が、これに限定されるものではない。
【１５３５】
リン酸塩骨格修飾
リン酸基
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドのリン酸基は、異なる置換基による、１つまたは複数の酸素の置換によって修飾され得る。さらに、例えば、内修飾核酸に存在する修飾ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されるような修飾リン酸塩による、未修飾リン酸部分の徹底的な置換を含み得る。いくつかの実施形態では、リン酸骨格の修飾は、非荷電リンカーまたは非相称の電荷分布がある荷電リンカーのどちらかをもたらす改変を含み得る。
【１５３６】
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルが挙げられる。いくつかの実施形態では、リン酸骨格部分中の非架橋リン酸酸素原子の１つが、以下の基のいずれかによって置換され得る：イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、ＢＲ３（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る）、Ｃ（例えば、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る）、またはＯＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールであり得る）。未修飾リン酸基中の亜リン酸原子は、アキラルである。しかし、上の原子または原子群の１つによる非架橋酸素の１つの置換は、亜リン酸原子をキラルにし得て；すなわち、このようにして修飾されたリン酸基中の亜リン酸原子が、立体中心である。ステレオジェン亜リン酸原子は、「Ｒ」構造（本明細書のＲｐ）または「Ｓ」構造（本明細書のＳｐ）のどちらかを有し得る。
【１５３７】
ホスホロジチオエートは、双方の非架橋酸素がイオウで置換されている。ホスホロジチオエートのリン中心はアキラルであり、それは、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を排除する。いくつかの実施形態では、非架橋酸素の片方または双方の修飾はまた、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、およびＯＲ（Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールであり得る）から独立して選択される基による、非架橋酸素の置換も含み得る。
【１５３８】
リン酸塩リンカーはまた、窒素（架橋ホスホロアミデート）、イオウ（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）による、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素）の置換によって修飾され得る。置換は、どちらかの連結酸素で、または双方の連結酸素で起こり得る。
【１５３９】
リン酸基の置換
リン酸基は、リン非含有コネクターによって置換され得る。いくつかの実施形態では、荷電リン酸基は、中性部分によって置換され得る。
【１５４０】
リン酸基を置換し得る部分の例としては、制限なしに、例えば、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、酸化エチレンリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。
【１５４１】
リボリン酸骨格の置換
核酸を模倣し得るスキャフォールドもまた構築され得て、その中では、リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲートによって置換される。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、サロゲート骨格によって係留され得る。例としては、制限なしに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシドサロゲートが挙げられる。
【１５４２】
糖修飾
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖類に１つまたは複数の修飾を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で、修飾または置換され得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基の修飾は核酸の安定性を高め得るが、それは、ヒドロキシルが、もはや脱プロトン化して、２’−アルコキシドイオンを形成し得ないためである。２’−アルコキシドは、リンカーリン原子上の分子内求核攻撃によって、分解を触媒し得る。
【１５４３】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、式中、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（式中、Ｒは、例えば、Ｈまたは任意選択的に置換されたアルキルであり得て、ｎは、０〜２０（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、および４〜２０）の整数であり得る）が挙げられる。いくつかの実施形態では、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾は、「ロックド」核酸（ＬＮＡ）を含み得て、その中では、２’ヒドロキシルが、例えば、Ｃ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって同一リボース糖の４’炭素に連結され得て、代表的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋；Ｏ−アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）、およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ−アミノ、（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）が挙げられる。いくつかの実施形態では、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾としては、メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えば、ＰＥＧ誘導体）が挙げられる。
【１５４４】
「デオキシ」修飾としては、水素（すなわち、例えば、部分的ｄｓＲＮＡのオーバーハング部分のデオキシリボース糖）；ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード）；アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミノ（式中、アミノは、例えば、本明細書に記載されるようであり得る）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；および本明細書に記載されるようなアミノで任意選択的に置換されてもよい、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルが挙げられる。
【１５４５】
糖類は、リボース中の対応する炭素と逆の立体化学的配置を有する、１つまたは複数の炭素もまた含有し得る。したがって、修飾核酸としては、例えば、糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドが挙げられる。ヌクレオチド「単量体」は、例えば、αヌクレオシドなど、糖の１’位にα結合を有し得る。修飾核酸としては、Ｃ−１’の核酸塩基を欠失している「脱塩基」糖もまた挙げられる。これらの脱塩基糖はまた、構成糖原子の１つまたは複数でさらに修飾され得る。修飾核酸はとしてはまた、例えばＬ−ヌクレオシドなどのＬ形態の１つまたは複数の糖も挙げられる。
【１５４６】
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖類リボースを含む。代表的な修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドとしては、制限なしに、リボース中の酸素の置換（例えば、イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、または例えば、メチレンまたはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する）；リボース環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボース環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、ホスホロアミダート骨格もまた有するモルホリノなどの追加的な炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成する）が挙げられる。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドとしては、多環形態（例えば、トリシクロ；および（例えば、リボースがリン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位で置換されるＲ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡなどの）グリコール核酸（ＧＮＡ）などの「アンロックド」形態、トレオース核酸（ＴＮＡ、リボースがα−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換される）が挙げられる。
【１５４７】
核酸塩基上の修飾
修飾核酸に組み込まれ得る、本明細書に記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの核酸塩基は、修飾または完全に置換されて、修飾核酸に組み込まれ得る、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを提供し得る。ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジンアナログから独立して選択され得る。いくつかの実施形態では、核酸塩基としては、例えば、天然に存在する塩基の合成誘導体が挙げられる。
【１５４８】
ウラシル
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、プソイドウリジン（ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレン含有−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｃｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミジン（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｎｅ）を有する）、１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−���オ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジン（ψｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−アラ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）ウリジン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、キサンチン、およびヒポキサンチンが挙げられる。
【１５４９】
シトシン
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、５−アザ−シチジン、６−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃｔ）、５−ホルミル−シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、α−チオ−シチジン、２’−Ｏ−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’−Ｆ−アラ−シチジン、２’−Ｆ−シチジン、および２’−ＯＨ−アラ−シチジンが挙げられる。
【１５５０】
アデニン
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデノシン、７−デアザ−８−アザ−アデノシン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデノシン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシジルカルバモイル（ｇｌｙｃｉｎｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）−アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデノシン、２−メチルチオ−アデノシン、２−メトキシ−アデノシン、α−チオ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６−メチル−２’−デオキシアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸塩）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、２’−Ｆ−アラ−アデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−アラ−アデノシン、およびＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノンアデシル）−アデノシンが挙げられる。
【１５５１】
グアニン
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ウィブトシン（ｙＷ）、ペルオキシウィブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシウィブトシン（ＯＨｙＷ）、低修飾ヒドロキシウィブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７−デアザ−グアノシン、クエオシン（Ｑ）、エポキシクエオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−クエオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−クエオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチル−グアノシン（ｍ’Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアノシン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、α−チオ−グアノシン、２’−Ｏ−メチル−グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ’Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ’Ｉｍ）、Ｏ６−フェニル−２’−デオキシイノシン、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸塩）（Ｇｒ（ｐ））、１−チオ−グアノシン、Ｏ６−メチル−グアノシン、Ｏ６−メチル−２’−デオキシグアノシン、２’−Ｆ−アラ−グアノシン、および２’−Ｆ−グアノシンが挙げられる。
【１５５２】
代表的修飾ｇＲＮＡ
いくつかの実施形態では、修飾核酸は修飾ｇＲＮＡであり得る。表１Ａ〜Ｉ、表２Ａ〜Ｉ、表３Ａ〜Ｈ、表４Ａ〜Ｉ、表５Ａ〜Ｉ、表６Ａ〜Ｉ、表７Ａ〜Ｈ、表８Ａ〜Ｈ、表９Ａ〜Ｉ、表１０Ａ〜Ｉ、表１１Ａ〜Ｉ、表１２Ａ〜Ｉ、表１３Ａ〜Ｋ、表１４Ａ〜Ｋ、表１５Ａ〜Ｆ、表１６Ａ〜Ｋ、表１７Ａ〜Ｋ、表１８Ａ〜Ｋ、表１９Ａ〜Ｊ、表２０Ａ〜Ｊ、表２１Ａ〜Ｋ、表２２Ａ〜Ｋ、表２３Ａ〜Ｊ、表２４Ａ〜Ｋ、表２５Ａ〜Ｇ、表２６Ａ〜Ｇ、表２７、表２９、表３１、または表３２からの標的化ドメインを含んでなる任意のｇＲＮＡをはじめとする、本明細書に記載されるｇＲＮＡのいずれでも、このセクションに従って修飾され得るものと理解される。本明細書で考察されるように、一過性に発現されまたは送達される核酸は、例えば、細胞ヌクレアーゼによって分解を起こし易くあり得る。したがって、一態様では、本明細書に記載される修飾ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する安定性を導入する、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有し得る。理論による拘束は望まないが、本明細書に記載される特定の修飾ｇＲＮＡはまた、特定の細胞から、特に本発明の細胞（例えば、Ｔ細胞）の先天性免疫応答低下を引き起こし得ると考えられている。上述のように「先天性免疫応答」という用語は、一般にウイルス性または細菌起源である、一本鎖核酸をはじめとする外来性核酸に対する細胞性応答を含み、それは、具体的にはインターフェロンであるサイトカインの発現と放出の誘導、および細胞死を内包する。
【１５５３】
例えば、本明細書で考察されるように、本発明者らは、ｇＲＮＡの５’末端が、真核生物ｍＲＮＡキャップ構造またはキャップアナログの組み入れによって修飾された場合に、特定の細胞型（例えば、Ｔ細胞）における生体外遺伝子編集における改善を見た。本発明は、５’キャッピングｇＲＮＡで観察された改善が、その他の様式で修飾されたｇＲＮＡに拡張されて、同一タイプの構造的または機能的結果が達成され得るという認識を包含する（例えば、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドの組み入れによって、３’ポリＡ配列の組み入れによっておよび／または生体外転写ｇＲＮＡが仔ウシ腸管アルカリホスファターゼなどのホスファターゼによる処理によって修飾され、５’三リン酸基が除去される場合など）。
【１５５４】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で考察される方法および組成物は、ｇＲＮＡがそれらの５’末端でまたはその近く（例えば、それらの５’末端の１〜１０、１〜５、または１〜２ヌクレオチド以内）で修飾されている、方法および組成物を提供する。一実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端は、図１９に示されるように、真核生物ｍＲＮＡキャップ構造またはキャップアナログ（例えば、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、または３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ抗逆転キャップアナログ（ＡＲＣＡ））の組み入れによって修飾される。キャップまたはキャップアナログは、ｇＲＮＡの化学合成または生体外転写のどちらかの間に組み入れ得る。一実施形態では、生体外転写ｇＲＮＡは、ホスファターゼ（例えば、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼ）による処理によって修飾され、５’三リン酸基が除去される。
【１５５５】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その３’末端にまたはその近く（例えば、その３’末端の１〜１０、１〜５、または１〜２ヌクレオチド以内）に修飾を含んでなる。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端は、１つまたは複数の（例えば、２５〜２００個の）アデニン（Ａ）残基の付加によって修飾される。ポリＡ配列は、ｇＲＮＡをコードする核酸（例えば、プラスミド、ＰＣＲ産物、ウイルスゲノム）に含まれ得て、または化学合成中に、またはポリアデノシンポリメラーゼ（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）を使用した生体外転写に続いて、ｇＲＮＡに付加され得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、３’末端Ｕリボースで修飾され得る。例えば、Ｕリボースの２つの末端ヒドロキシル基が、アルデヒド基に酸化され得て、同時のリボース環の開環が、下に示される（下に示される）修飾ヌクレオシドをもたらす：
【化１２３】
2020062029.tif 000409
式中、「Ｕ」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。別の実施形態では、３’末端Ｕが、下で示されるように２’３’環状リン酸エステルで修飾され得る：
【化１２４】
2020062029.tif 000410
式中、「Ｕ」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載される修飾ヌクレオチドの１つまたは複数を組み込むことで、分解に対して安定化され得る、３’ヌクレオチドを含有してもよい。この実施形態では、例えば、ウリジンは、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、および５−ブロモウリジンで、または本明細書に記載される修飾ウリジンのいずれかなどの修飾ウリジンで置換され得て；アデノシンおよびグアノシンは、例えば、８−ブロモグアノシンなどの８位に修飾がある修飾アデノシンまたはグアノシンによって、または本明細書に記載される修飾アデノシンおよびグアノシンのいずれかによって置換され得る。
【１５５６】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その５’末端またはその近くの修飾と、その３’末端またはその近くの修飾との双方を含んでなる。一実施形態では、生体外転写ｇＲＮＡは、５’キャップ構造またはキャップアナログと、３’ポリＡ配列との双方を含有する。一実施形態では、生体外転写ｇＲＮＡは、ホスファターゼ（例えば、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼ）による処理によって修飾されて５’三リン酸基が除去され、３’ポリＡ配列を含んでなる。
【１５５７】
前述の事項が末端修飾に焦点を合わせる一方で、本明細書で考察される方法および組成物は、ｇＲＮＡ配列中の１つまたは複数の非末端位置および／または１つまたは複数の末端位置に、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む、ｇＲＮＡを使用してもよいものと理解される。
【１５５８】
いくつかの実施形態では、糖修飾リボヌクレオチドがｇＲＮＡに組み込まれ得て、例えば、２’ＯＨ基が、Ｈ、ＯＲ、Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、ハロ、ＳＨ、ＳＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）；またはシアノ（ＣＮ）から選択される基によって置換される。いくつかの実施形態では、リン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）基で、本明細書に記載されるように修飾され得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのヌクレオチドの１つまたは複数は、それぞれ独立して、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチルなどの２’−糖修飾；または例えば、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、アデノシン（Ａ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、シチジン（Ｃ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、ウリジン（Ｕ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチルをはじめとする２’−フルオロ修飾；グアノシン（Ｇ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、および任意のそれらの組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない、修飾または未修飾ヌクレオチドであり得る。
【１５５９】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡとしては「ロックド」核酸（ＬＮＡ）が挙げられ、その中では、２’ＯＨ基が、例えばＣ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって、同一リボース糖上の４’炭素と結合し得て代表的架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋；Ｏ−アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）、およびアミノアルコキシまたはＯ（ＣＨ２） ｎ−アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）が挙げられる。。
【１５６０】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡとしては、多環である修飾ヌクレオチド（例えば、トリシクロ；およびグリコール核酸（ＧＮＡ）などの「アンロックド」形態（例えば、リボースが、リン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位によって置換される、Ｒ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ）、またはトレオース核酸（リボースが、α−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換される、ＴＮＡ）が挙げられる。
【１５６１】
一般に、ｇＲＮＡ分子としては、酸素を有する５員環である、糖類リボースが挙げられる。代表的な修飾ｇＲＮＡｓとしては、制限なしに、リボース中の酸素の置換（例えば、イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、または例えば、メチレンまたはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する）；リボース環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボース環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、例えば、ホスホロアミダート骨格もまた有するモルホリノなどの追加的炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成する）が挙げられる。糖アナログ改変の大部分は２’位置に局在するが、４’位置をはじめとするその他の部位も修飾の対象となる。一実施形態では、ｇＲＮＡは、４’−Ｓ、４’−Ｓｅまたは４’−Ｃ−アミノメチル−２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含んでなる。
【１５６２】
いくつかの実施形態では、例えば、７−デアザ−アデノシンなどのデアザヌクレオチドが、ｇＲＮＡに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンなどのＯ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチドが、ｇＲＮＡに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子中の１つまたは複数のまたは全てのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである。
【１５６３】
ｍｉＲＮＡ結合部位
マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡｓ）は、天然細胞性１９〜２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。それらは、例えば、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲなどで、適切なｍｉＲＮＡ結合部位を有する核酸分子に結合し、遺伝子発現を下方制御する。理論による拘束は望まないが、下方制御は、核酸分子安定性の低下または翻訳阻害のどちらかによると考えられる。例えば、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡなどの本明細書で開示されるＲＮＡ種は、例えば、その３’ＵＴＲなどに、ｍｉＲＮＡ結合部位を含んでなり得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、選択された細胞型内の発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ）の下方制御を促進するように選択され得る。一例として、肝臓に豊富なマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１２２に対する結合部位の組み込みは、肝臓における対象遺伝子の発現を阻害し得る。
【１５６４】
ＸＩ．支配ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９システムの活性を制限するためのその使用
例えば、Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡなどの核酸を使用しまたはそれを含む、方法および組成物は、「支配ｇＲＮＡ分子」をさらに使用しまたはそれを含み得る。支配ｇＲＮＡは、細胞または対象に導入されたその他のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素の活性を制限し得る。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、細胞または対象に導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素をコードする配列を含んでなる、核酸上の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含んでなる。一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、（ａ）Ｃａｓ９分子をコードする核酸上；（ｂ）ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子を標的化する標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡをコードする核酸（標的遺伝子ｇＲＮＡ）上；または例えば（ａ）および（ｂ）の双方などの２つ以上の上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素をコードする核酸上の標的配列と相補的な標的化ドメインを含んでなる。支配ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子と複合体形成して、システムの構成要素を不活性化し得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子／支配ｇＲＮＡ分子複合体は、Ｃａｓ９分子をコードする配列を含んでなる、核酸を不活性化する。一実施形態では、Ｃａｓ９分子／支配ｇＲＮＡ分子複合体は、標的遺伝子ｇＲＮＡ分子をコードする配列を含んでなる、核酸を不活性化する。一実施形態では、Ｃａｓ９分子／支配ｇＲＮＡ分子複合体は、Ｃａｓ９分子／標的遺伝子ｇＲＮＡ分子複合体の活性に、時間的、発現レベル、またはその他の制限を課す。一実施形態では、Ｃａｓ９分子／支配ｇＲＮＡ分子複合体は、オフターゲットまたはその他の望まれない活性を低下させる。一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成要素を負制御するために、コード配列、または例えば、プロモーターなどの制御領域を標的化する。例えば、支配ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９分子のコード配列を、または例えば、Ｃａｓ９分子コード配列の発現を制御するプロモーターなどの制御領域を、またはそれらの２つの間に配置される配列を標的化し得る。一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、コード配列を、または例えば、プロモーターなどの標的遺伝子ｇＲＮＡの制御領域を標的化する。一実施形態では、例えば、Ｃａｓ９標的化または標的遺伝子ｇＲＮＡ標的化、支配ｇＲＮＡ分子、またはそれをコードする核酸などの支配ｇＲＮＡは、例えば、Ｃａｓ９分子またはそれをコードする核酸よりも後に別々に導入される。例えば、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクターなどの第１のベクターは、Ｃａｓ９分子および１つまたは複数の標的遺伝子ｇＲＮＡ分子をコードする核酸を導入し得て、例えば、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクターなどの第２のベクターは、例えば、Ｃａｓ９標的化または標的遺伝子ｇＲＮＡ標的化、ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子をコードする核酸を導入し得る。一実施形態では、第２のベクターは、第１のベクターの後に導入され得る。その他の実施形態では、例えば、Ｃａｓ９標的化または標的遺伝子ｇＲＮＡ標的化、支配ｇＲＮＡ分子、またはそれをコードする核酸などの支配ｇＲＮＡ分子は、例えば、同時にまたは同一ベクター内で、Ｃａｓ９分子またはそれをコードする核酸と共に導入され得るが、例えば、しばらくするとＣａｓ９転写が低下するように、後から活性化される、プロモーターまたはエンハンサーなどの転写制御要素の下にある。一実施形態では、転写制御因子は、内因的に活性化される。一実施形態では、転写要素は、外部トリガーの導入を通じて活性化される。
【１５６５】
典型的に、例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子をコードする核酸配列は、例えば、Ｃａｓ９分子をコードする核酸などのそれが負に調節する構成要素とは異なる、例えば、プロモーターなどの制御領域の制御下にある。一実施形態では、「異なる制御領域」は、単に、例えば、調節される双方の配列と機能的に（機能的に）連結するプロモーターなどの１つの制御領域の制御下にないことを指す。一実施形態では、異なるは、制御領域の種類またはタイプが「異なる制御領域」を指す。例えば、Ｃａｓ９標的化ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子をコードする配列は、例えば、Ｃａｓ９分子をコードする核酸などのそれが負に調節する構成要素をコードする（ｅｎｃｏｄｅｓ  ｉｓ）配列よりも低い発現レベルを有し、またはそれよりも後に発現される、例えば、プロモーターなどの制御領域の制御下にある。
【１５６６】
一例として、例えば、Ｃａｓ９標的化支配ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡ分子をコードする配列は、例えば、ヒトＵ６核内低分子プロモーター、またはヒトＨ１プロモーターなどの本明細書に記載される制御領域（例えば、プロモーター）の制御下にあり得る。一実施形態では、例えば、Ｃａｓ９分子をコードする核酸などのそれが負に制御する構成要素をコードする配列は、例えば、ＣＭＶ、ＥＦ−１ａ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、ＣＡＧ制御プロモーターなどの本明細書に記載される制御領域（例えば、プロモーター）の制御下にあり得る。
【実施例】
【１５６７】
以下の実施例は単なる例示であり、本発明の範囲または内容をどのようにも限定することは意図されない。
【１５６８】
実施例１：ｇＲＮＡのクローニングおよび最初のスクリーニング
候補ｇＲＮＡの適合性は、本実施例に記載されるように評価され得る。キメラｇＲＮＡについて記載されるが、アプローチはまた、モジュラーｇＲＮＡを評価するのにも使用され得る。
【１５６９】
ベクターにｇＲＮＡをクローニングする
各ｇＲＮＡ毎に、１対の重複オリゴヌクレオチドが設計されて入手される。オリゴヌクレオチドは、アニールされて、長いキメラｇＲＮＡの上流Ｕ６プロモーターおよび残りの配列を含有する、消化ベクター骨格にライゲートされる。プラスミドは配列確認されて、十分な量の形質移入品質のＤＮＡを生成するために準備される。交互の（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ）プロモーターを使用して、生体内転写（例えば、Ｈ１プロモーター）または生体外転写（例えば、Ｔ７プロモーター）が駆動されてもよい。
【１５７０】
直鎖ｄｓＤＮＡ分子中でｇＲＮＡをクローニングする（ＳＴＩＴＣＨＲ）
各ｇＲＮＡ毎に、単一オリゴヌクレオチドが設計されて入手される。Ｕ６プロモーターおよびｇＲＮＡスキャフォールド（例えば、第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインをはじめとする、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡに由来する配列をはじめとする、標的化ドメイン以外の全てを含む）は、別々にＰＣＲ増幅されて、ｄｓＤＮＡ分子として精製される。ｇＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドがＰＣＲ反応で使用されて、オリゴヌクレオチド中で特定化された標的化ドメインによって連結する、Ｕ６およびｇＲＮＡスキャフォールドを縫い合わせる。結果として生じるｄｓＤＮＡ分子（ＳＴＩＴＣＨＲ生成物）は、形質移入のために精製される。交互の（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ）プロモーターを使用して、生体内転写（例えば、Ｈ１プロモーター）または生体外転写（例えば、Ｔ７プロモーター）が駆動されてもよい。任意のｇＲＮＡスキャフォールドを使用して、任意の細菌種に由来するＣａｓ９と適合性のｇＲＮＡが生成されてもよい。
【１５７１】
最初のｇＲＮＡスクリーニング
試験される各ｇＲＮＡは、プラスミド発現Ｃａｓ９および小量のＧＦＰ発現プラスミドと共に、ヒト細胞に形質移入される。予備実験では、これらの細胞は、９３Ｔ、Ｋ５６２またはＵ２ＯＳなどの不死化ヒト細胞株であり得る。代案としては、初代ヒト細胞が使用されてもよい。この場合、細胞は、最終的な治療細胞標的（例えば、赤血球系細胞）に関連があってもよい。可能な治療標的細胞集団と類似した初代細胞の使用は、内在性クロマチンおよび遺伝子発現の文脈で、遺伝子標的化比率に関する重要な情報を提供してもよい。
【１５７２】
形質移入は、（リポフェクタミンまたはＦｕｇｅｎｅなどの）脂質移入を使用して、または（Ｌｏｎｚａヌクレオフェクションなどの）電気穿孔によって実施されてもよい。形質移入に続いて、ＧＦＰ発現は、蛍光顕微鏡検査またはフローサイトメトリーのどちらかによって判定され、一貫した高レベルの形質移入が確認され得る。これらの予備形質移入は、異なるｇＲＮＡおよび異なる標的化アプローチ（１７量体、２０量体、ヌクレアーゼ、二重ニッカーゼなど）を含んでなり、いずれのｇＲＮＡ／ｇＲＮＡ組み合わせが最大活性を与えるかが判定され得る。
【１５７３】
各ｇＲＮＡの切断効率は、Ｔ７Ｅ１タイプアッセイまたは配列決定によって、標的遺伝子座におけるＮＨＥＪ誘導インデル形成を測定することで、評価されてもよい。代案としては、ＣｅｌＩ／Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼなどのその他のミスマッチ感受性酵素もまた使用されてもよい。
【１５７４】
Ｔ７Ｅ１アッセイでは、ＰＣＲアンプリコンは、およそ５００〜７００ｂｐであり、意図される切断部位は、アンプリコン中に非対称的に配置される。ＰＣＲ産物の増幅、精製、およびサイズ検証に続いて、９５℃に加熱して、次に、緩慢に冷却することで、ＤＮＡは変性され再ハイブリダイズされる。ハイブリダイズＰＣＲ産物は、次に、非完全にマッチするＤＮＡを認識して切断する、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（またはその他のミスマッチ感受性酵素）で消化される。最初のテンプレートＤＮＡ中にインデルが存在する場合、アンプリコンは変性されて再アニールされ、それは異なるインデルを有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションをもたらし、ひいては完全にはマッチしない二本鎖ＤＮＡをもたらす。消化産物は、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動法によって視覚化されてもよい。切断されたＤＮＡの割合（切断および比切断密度で除した分解産物密度）を使用して、次の方程式を使用して、パーセントＮＨＥＪが推定されてもよい：％ＮＨＥＪ＝（１−（１−切断割合） １／２）。Ｔ７Ｅ１アッセイは、約２〜５％ＮＨＥＪに至るまで感受性である。
【１５７５】
Ｔ７Ｅ１アッセイの代わりに、またはそれに加えて、配列決定が使用されてもよい。サンガー配列決定では、精製ＰＣＲアンプリコンがプラスミド骨格にクローン化され、形質転換されて、単一プライマーでミニプレップされて配列決定される。Ｔ７Ｅ１によってＮＨＥＪ比率を判定した後に、サンガー配列決定を使用して、インデルの正確な性質が判定されてもよい。
【１５７６】
配列決定はまた、次世代配列決定技術を使用して実施されてもよい。次世代配列決定を使用する場合、アンプリコンは３００〜５００ｂｐであってもよく、意図される切断部位は非対称的に配置される。ＰＣＲに続いて、例えば、（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ上の）ハイスループット配列決定で使用される次世代配列決定アダプターおよびバーコード（例えばＩｌｌｕｍｉｎａ多重アダプターおよびインデクス）が、アンプリコンの末端に付加されてもよい。この方法は、非常に低いＮＨＥＪ比率の検出を可能にする。
【１５７７】
実施例２：ＮＨＥＪによる遺伝子標的化の評価
遺伝子標的化効率のさらなる評価のために、最初の試験で最大レベルのＮＨＥＪを誘導するｇＲＮＡが選択され得る。この場合、細胞は疾病対象に由来し、したがって関連変異を有する。
【１５７８】
形質移入に続いて（通常は形質移入の２〜３日後）、ゲノムＤＮＡが形質移入細胞の混合集団から単離されてもよく、ＰＣＲを使用して標的領域が増幅されてもよい。ＰＣＲに続いて、所望の変異体（標的遺伝子のノックアウトまたは標的配列モチーフの除去のどちらか）を生成する遺伝子標的化効率が、配列決定によって判定されてもよい。サンガー配列決定では、ＰＣＲアンプリコンは、５００〜７００ｂｐ長であってもよい。次世代配列決定では、ＰＣＲアンプリコンは、３００〜５００ｂｐ長であってもよい。遺伝子機能のノックアウトが目的である場合、配列決定を使用して、遺伝子機能を破壊することが予期されるフレームシフトまたは大規模な欠失または挿入をもたらすＮＨＥＪ誘導インデルを、対立遺伝子の何パーセントが受けたかが評価されてもよい。特定の配列モチーフの除去が目的であれば、配列決定を使用して、この配列に広がる対立遺伝子の何パーセントが、ＮＨＥＪ誘導欠失を受けたかが評価されてもよい。
【１５７９】
実施例３：２９３個の細胞内のｇＲＮＡのスクリーニング
Ｔ細胞受容体β（ＴＲＢＣ）のｇＲＮＡのスクリーニング
標的ＮＨＥＪ効率が最大のｇＲＮＡを同定するために、４２個のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）および２７個のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡが選択された（表２７）。Ｕ６プロモーター、ｇＲＮＡ標的領域、および適切なＴＲＡＣＲ配列（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））から構成されるＤＮＡテンプレートは、ＰＣＲ  ＳＴＩＴＣＨＲ反応によって作成された。引き続いて、このＤＮＡテンプレートは、ＣＭＶプロモーター下流で、適切なＣａｓ９（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）をコードするＤＮＡプラスミドと共にリポフェクタミン３０００を使用して、２９３個の細胞に形質移入された。ゲノムＤＮＡは、形質移入の４８〜７２時間後に細胞から単離された。Ｔ細胞受容体β遺伝子（ＴＲＢＣ）における修飾比率を判定するために、表２８に列挙されるプライマーによる遺伝子座ＰＣＲを使用して、標的領域が増幅された。ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物上でＴ７Ｅ１アッセイが実施された。簡単に述べると、このアッセイは、ＰＣＲ産物の融解と、それに続く再アニーリングステップを伴う。遺伝子修飾が起こった場合、挿入または欠失のいくらかの出現頻度のために、完全なマッチではない二本鎖生成物が存在する。これらの二本鎖生成物は、ミスマッチ部位におけるＴ７エンドヌクレアーゼ１酵素による切断に対して感受性である。したがって、Ｔ７Ｅ１切断の量を分析することで、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体による切断効率を判定することが可能である。Ｔ７Ｅ１切断から％ＮＨＥＪ測定値を提供するために使用される式は、次のとおりである：（１００＊（１−（（１−（切断割合））＾０．５）））。この分析の結果は、図１１および図１２に示される。
【１５８０】
【表２８６】
2020062029.tif 000411
【１５８１】
【表２８７】
2020062029.tif 000412
【１５８２】
【表２８８】
2020062029.tif 000413
【１５８３】
【表２８９】
2020062029.tif 000414
【１５８４】
Ｔ細胞受容体α（ＴＲＡＣ）のｇＲＮＡのスクリーニング
標的ＮＨＥＪ効率が最大のｇＲＮＡを同定するために、１８個のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）および１３個のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡが選択された（表２９）。Ｕ６プロモーター、ｇＲＮＡ標的領域、および適切なＴＲＡＣＲ配列（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））から構成されるＤＮＡテンプレートは、ＰＣＲ  ＳＴＩＴＣＨＲ反応によって作成された。引き続いて、このＤＮＡテンプレートは、ＣＭＶプロモーター下流で、適切なＣａｓ９（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）をコードするＤＮＡプラスミドと共にリポフェクタミン３０００を使用して、２９３個の細胞に形質移入された。ゲノムＤＮＡは、形質移入の４８〜７２時間後に細胞から単離された。Ｔ細胞受容体α遺伝子（ＴＲＡＣ）における修飾比率を判定するために、表３０に列挙されるプライマーによる遺伝子座ＰＣＲを使用して、標的領域が増幅された。ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物上でＴ７Ｅ１アッセイが実施された。簡単に述べると、このアッセイは、ＰＣＲ産物の融解と、それに続く再アニーリングステップを伴う。遺伝子修飾が起こった場合、挿入または欠失のいくらかの出現頻度のために、完全なマッチではない二本鎖生成物が存在する。これらの二本鎖生成物は、ミスマッチ部位におけるＴ７エンドヌクレアーゼ１酵素による切断に対して感受性である。したがって、Ｔ７Ｅ１切断の量を分析することで、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体による切断効率を判定することが可能である。Ｔ７Ｅ１切断から％ＮＨＥＪ測定値を提供するために使用される式は、次のとおりである：（１００＊（１−（（１−（切断割合））＾０．５）））。この分析の結果は、図１３および図１４に示される。
【１５８５】
【表２９０】
2020062029.tif 000415
【１５８６】
【表２９１】
2020062029.tif 000416
【１５８７】
ＰＤ−１受容体のｇＲＮＡのスクリーニング
標的ＮＨＥＪ効率が最大のＲＮＡを同定するために、４８個のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）および２７個のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡが選択された（表３１および３２を参照されたい）。Ｕ６プロモーター、ｇＲＮＡ標的領域、および適切なＴＲＡＣＲ配列（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））から構成されるＤＮＡテンプレートは、ＰＣＲ  ＳＴＩＴＣＨＲ反応によって作成された。引き続いて、このＤＮＡテンプレートは、ＣＭＶプロモーター下流で、適切なＣａｓ９（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））をコードするＤＮＡプラスミドと共にリポフェクタミン３０００を使用して、２９３個の細胞に形質移入された。ゲノムＤＮＡは、形質移入の４８〜７２時間後に細胞から単離された。ＰＤ−１遺伝子（ＰＤＣＤ１）における修飾比率を判定するために、表３３に列挙されるプライマーによる遺伝子座ＰＣＲを使用して標的領域が増幅された。ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物上でＴ７Ｅ１アッセイが実施された。簡単に述べると、このアッセイは、ＰＣＲ産物の融解と、それに続く再アニーリングステップを伴う。遺伝子修飾が起こった場合、挿入または欠失のいくらかの出現頻度のために、完全なマッチではない二本鎖生成物が存在する。これらの二本鎖生成物は、ミスマッチ部位におけるＴ７エンドヌクレアーゼ１酵素による切断に対して感受性である。したがって、Ｔ７Ｅ１切断の量を分析することで、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体による切断効率を判定することが可能である。Ｔ７Ｅ１切断から％ＮＨＥＪ測定値を提供するために使用される式は、次のとおりである：（１００＊（１−（（１−（切断割合））＾０．５）））。表３１に示されるこのｇＲＮＡの分析結果は、図１５および図１６に示される。同様の実験は、表３２で示されるものをはじめとする、本明細書に記載される（ｄｅｓｃｒｉｎｂｅｄ）その他のｇＲＮＡで実施され得る。
【１５８８】
【表２９２】
2020062029.tif 000417
【１５８９】
【表２９３】
2020062029.tif 000418
【１５９０】
【表２９４】
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【１５９１】
【表２９５】
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【１５９２】
【表２９６】
2020062029.tif 000421
【１５９３】
実施例４：酵素合成および初代Ｔ細胞へのｇＲＮＡの送達
ＲＮＡ分子としてのＣａｓ９ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡのＴ細胞への送達
初代ＣＤ４＋Ｔ細胞内のＣａｓ９媒介切断を実証するために、ＴＣＲβ鎖（ＴＲＢＣ−２１０（ＧＣＧＣＵＧＡＣＧＡＵＣＵＧＧＧＵＧＡＣ）（配列番号４１３））またはＴＣＲα鎖（ＴＲＡＣ−４（ＧＣＵＧＧＵＡＣＡＣＧＧＣＡＧＧＧＵＣＡ）（配列番号４５３））に対して設計された、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９およびｇＲＮＡが、電気穿孔を通じてＲＮＡ分子としてＴ細胞に送達された。この実施形態では、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの双方が、Ｔ７ポリメラーゼを使用して生体外転写された。５’ＡＲＣＡキャップが転写と同時に双方のＲＮＡ種に付加された一方で、ポリＡテールは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼによって、転写後にＲＮＡ種の３’末端に付加された。ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２遺伝子座にＣＤ４＋Ｔ細胞修飾を生成するために、１０μｇのＣａｓ９ｍＲＮＡおよび１０μｇのＴＲＢＣ−２１０（ＧＣＧＣＵＧＡＣＧＡＵＣＵＧＧＧＵＧＡＣ）（配列番号４１３）ｇＲＮＡが、電気穿孔によって細胞に導入された。同一実験において、本発明者らはまた、１０μｇのＴＲＡＣ−４（ＧＣＵＧＧＵＡＣＡＣＧＧＣＡＧＧＧＵＣＡ）（配列番号４５３）ｇＲＮＡと共に、１０μｇのＣａｓ９ｍＲＮＡを導入することで、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化した。ＡＡＶＳ１（ＧＵＣＣＣＣＵＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＧＵＧ）（配列番号５１２０１）ゲノム部位を標的化するｇＲＮＡが、実験対照として使用された。電気穿孔に先だって、Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳおよび組換え体ＩＬ−２が添加されたＲＰＭＩ  １６４０中で培養された。細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して活性化され、少なくとも３日間増殖された。活性化Ｔ細胞へのｍＲＮＡの導入に引き続いて、電気穿孔の２４、４８、および７２時間後に、ＣＤ３に対して特異的なフルオレセイン（ＡＰＣ）コンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによって、細胞上のＣＤ３発現がモニターされた。７２時間目に、ＣＤ３陰性細胞集団が観察された（図１７Ａおよび図１７Ｂ）。ＣＤ３陰性細胞の発生が、ＴＲＢＣ遺伝子座におけるゲノム編集の結果であることを確認するために、ＴゲノムＤＮＡが収集されてＴ７Ｅ１アッセイが実施された。確かに、データは、ＴＲＢＣ２遺伝子座およびＴＲＡＣ遺伝子座におけるＤＮＡ修飾の存在を確認する（図１７Ｃ）。
【１５９４】
Ｔ細胞へのＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰの送達
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞内のＣａｓ９媒介切断を実証するために、ＴＣＲα鎖（ＴＲＡＣ−２３３（ＧＵＧＡＡＵＡＧＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＵＵＧＵＣＡ）（配列番号４７４））に対して設計されたＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９およびｇＲＮＡが、電気穿孔によってリボ核酸タンパク質複合体（ＲＮＰ）として送達された。この実施形態では、Ｃａｓ９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現され精製された。具体的には、Ｃａｓ９をコードするＨＪ２９プラスミドが、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）２（ＤＥ３）化学コンピテント細胞（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃７１４００−４）に形質転換され、選択のための適切な抗生物質と共にＬＢプレート上に播種され、３７℃で一晩培養された。適切な抗生物質が添加された脳心臓浸出物ブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｂ９９９３）の１０ｍＬのスタータ培養に４つのコロニーが接種されて、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７°Ｃで培養された。一晩の培養後、スタータ培養が、補給剤に加えて適切な抗生物質が添加された１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｔ７０６０）に添加されて、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養された。温度が１８℃に徐々に低下されて、ＯＤ６００が２．０を超えたら、０．５ｍＭのＩＰＴＧの添加によって遺伝子の発現が誘導された。誘導は一晩継続され、遠心分離による細胞の収集と、ＴＧ３００（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、プロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃８８２６６））中への再懸濁がそれに続き、−８０℃で保存された。
【１５９５】
細胞は冷凍懸濁液の解凍によって溶解され、１８０００ｐｓｉに設定されたＬＭ１０  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）の２回の通過がそれに続いた。抽出物は、遠心分離を通じて清澄化され、４℃でのＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ＃３０２３０）とのバッチ培養を通じて、可溶性抽出物が捕捉された。スラリーを重力流カラム内に注ぎ入れ、ＴＧ３００＋３０ｍＭイミダゾールで洗浄し、次に、ＴＧ３００＋３００ｍＭイミダゾールで関心のあるタンパク質が溶出された。Ｎｉ溶出剤は、等容積のＨＧ１００（５０ｍＭ  ＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ）で希釈されて、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ＃１７−１１５２−０１）上に装入されて、３０カラム容積でＨＧ１００からＨＧ１０００（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１０００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ）への勾配で溶出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでのアッセイ後、適切な画分が貯留され、ＨＧ１５０（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ  ＴＣＥＰ）で平衡化されたＳＲＴ１０  ＳＥＣ３００カラム（Ｓｅｐａｘ＃２２５３００−２１２３０）上への装入のために濃縮された。画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってアッセイされ、適切に貯留され、少なくとも５ｍｇ／ｍｌに濃縮された。
【１５９６】
ｇＲＮＡは、Ｔ７ポリメラーゼを使用した生体外転写によって生成された。５’  ＡＲＣＡキャップが転写と同時にＲＮＡに付加された一方で、ポリＡテールは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼによって、転写後にＲＮＡ種の３’末端に付加された。細胞への導入前に、精製Ｃａｓ９とｇＲＮＡを混合して、１０分間にわたり複合体を形成させた。ＲＮＰ溶液は、引き続いて電気穿孔によってＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞内に導入された。電気穿孔の前後に、細胞は、１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中で培養された。細胞上のＣＤ３発現は、ＣＤ３に対して特異的なフルオレセインコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによって、電気穿孔の２４、４８、および７２時間後にモニターされた。４８および７２時間目に、ＣＤ３陰性細胞集団が観察された（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。ＣＤ３陰性細胞の発生が、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるゲノム編集の結果であることを確認するために、ＴゲノムＤＮＡが収集されてＴ７Ｅ１アッセイが実施された。確かに、データは、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＤＮＡ修飾の存在を確認する（図１８Ｃ）。
【１５９７】
実施例５：Ｔ細胞生存に対するｇＲＮＡ修飾の影響を評価する
ｇＲＮＡ修飾がＴ細胞生存にどのような影響を及ぼすかを評価するために、修飾存在下または不在下で、ＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡ（ＧＵＣＣＣＣＵＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＧＵＧ）（配列番号５１２０１）と組み合わせて、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９  ｍＲＮＡが、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に送達された。具体的には、（１）５’抗逆転キャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップ（図１９を参照されたい）およびポリＡテールがあるｇＲＮＡ、（２）５’  ＡＲＣＡキャップのみがあるｇＲＮＡ、（３）ポリＡテールのみがあるｇＲＮＡ、（４）いかなる修飾もないｇＲＮＡの４つの異なる修飾の組み合わせが分析された。全ての４つの上述の（ａｆｏｒｅｍｅｎｔｉｏｎ）修飾ｇＲＮＡバージョンを生成するために、ＤＮＡテンプレートは、Ｔ７プロモーター、ＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡ標的配列（ＧＵＣＣＣＣＵＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＧＵＧ）（配列番号５１２０１）、およびＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＴＲＡＣＲ配列を含んでなる。全てのｇＲＮＡについて、７．５ｍＭ  ＵＴＰ、７．５ｍＭ  ＧＴＰ、７．５ｍＭ  ＣＴＰ、および７．５ｍＭ  ＡＴＰの存在下で、Ｔ７ポリメラーゼが使用されて、ｇＲＮＡが生成された。ｇＲＮＡを５’  ＡＲＣＡキャップで修飾するために、６．０ｍＭのＡＲＣＡアナログが、ＮＴＰプールに添加された。その結果、１．５ｍＭのＧＴＰのみが添加された一方で、ＮＴＰプールの残りは、７．５ｍＭ  ＵＴＰ、７．５ｍＭ  ＣＴＰ、および７．５ｍＭ  ＡＴＰの同一濃度のままであった。ｇＲＮＡにポリＡテールを付加するために、生体外ポリメラーゼ反応終了後に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製された組換えポリＡポリメラーゼを使用して、転写されたｇＲＮＡ末端に一連のＡが付加された。終止は、ＤＮａｓｅ  ＩによるＤＮＡテンプレートの排除によって達成された。ポリＡテール反応は、およそ４０分間にわたり実施された。ｇＲＮＡ修飾にかかわりなく、全てのｇＲＮＡ調製品は、フェノール：クロロホルム（ｃｈｏｒｏｆｏｒｍ）抽出と、それに続くイソプロパノール沈殿によって精製された。ひとたびｇＲＮＡが生成したら、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞は、（５’  ＡＲＣＡキャップおよびポリＡテールにより修飾された）Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよび４つの異なる修飾ＡＡＶＳ１特異的ｇＲＮＡの１つで電気穿孔された。電気穿孔に続いて、アネクシンＶおよびヨウ化プロピジウム二重染色を実施することで、細胞生存率が評価された。アネクシンＶおよびＰＩ染色されない生細胞画分が、フローサイトメトリーによって判定された。結果は、図２０に定量化される。生細胞画分に基づいて、電気穿孔によって導入された場合に、５’  ＡＲＣＡキャップおよびポリＡテールの双方で（ｗｕｔｈ）修飾されたｇＲＮＡが、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に対して最も毒性が低いと結論付けられる。
【１５９８】
実施例６：未感作Ｔ細胞へのＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰの送達
未感作Ｔ細胞内のＣａｓ９媒介切断を実証するために、ＴＣＲα鎖に対して設計された、標的化ドメインＧＵＧＡＡＵＡＧＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＵＵＧＵＣＡ（配列番号４７４）があるＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９およびｇＲＮＡが、電気穿孔によってリボ核酸タンパク質複合体（ＲＮＰ）として送達された。この実施形態では、Ｃａｓ９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現され精製された。具体的には、Ｃａｓ９をコードするＨＪ２９プラスミドが、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）２（ＤＥ３）化学コンピテント細胞（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃７１４００−４）に形質転換され、選択のための適切な抗生物質と共にＬＢプレート上に播種され、３７℃で一晩培養された。適切な抗生物質が添加された脳心臓浸出物ブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｂ９９９３）の１０ｍＬのスタータ培養に４つのコロニーが接種されて、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養された。一晩の培養後、スタータ培養が、補給剤に加えて適切な抗生物質が添加された１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｔ７０６０）に添加されて、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養された。温度が１８℃に徐々に低下されて、ＯＤ６００が２．０を超えたら、０．５ｍＭのＩＰＴＧの添加によって遺伝子の発現が誘導された。誘導は一晩継続され、遠心分離による細胞の収集と、ＴＧ３００（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、プロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃８８２６６））中への再懸濁がそれに続き、−８０℃で保存された。
【１５９９】
細胞は冷凍懸濁液の解凍によって溶解され、１８０００ｐｓｉに設定されたＬＭ１０  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）の２回の通過がそれに続いた。抽出物は、遠心分離を通じて清澄化され、４℃でのＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ＃３０２３０）とのバッチ培養を通じて、可溶性抽出物が捕捉された。スラリーを重力流カラム内に注ぎ入れ、ＴＧ３００＋３０ｍＭイミダゾールで洗浄し、次にＴＧ３００＋３００ｍＭイミダゾールで関心のあるタンパク質が溶出された。Ｎｉ溶出剤は、等容積のＨＧ１００（５０ｍＭ  ＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ）で希釈されて、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ＃１７−１１５２−０１）上に装入されて、３０カラム容積でＨＧ１００からＨＧ１０００（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１０００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ）への勾配で溶出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでのアッセイ後、適切な画分が貯留され、ＨＧ１５０（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ  ＴＣＥＰ）で平衡化されたＳＲＴ１０  ＳＥＣ３００カラム（Ｓｅｐａｘ＃２２５３００−２１２３０）上への装入のために濃縮された。画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってアッセイされ、適切に貯留され、少なくとも５ｍｇ／ｍｌに濃縮された。
【１６００】
標的化ドメインＧＵＧＡＡＵＡＧＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＵＵＧＵＣＡ（配列番号４７４）があるｇＲＮＡは、Ｔ７ポリメラーゼを使用した生体外転写によって生成された。５’ＡＲＣＡキャップが転写と同時にＲＮＡに付加された一方で、ポリＡテールは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼによって、転写後にＲＮＡ種の３’末端に付加された。この実施形態では、Ｔ細胞は、フィコール勾配と、それに続くＣＤ３磁性ビーズを使用した正の選択によって新鮮臍帯血から単離された。細胞は、引き続いて、１０％ＦＢＳ、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍｌ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中で培養された。単離の２４時間後、細胞は、精製Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを室温で１０分間インキュベートすることで生成された、ＲＮＰ溶液で電気穿孔された。細胞上のＣＤ３発現は、電気穿孔の９６時間後に、ＣＤ３に対して特異的なＡＰＣコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによってモニターされた。ＣＤ３陰性細胞集団が細胞内で観察され、その中では、ｇＲＮＡおよび非機能性Ｃａｓ９が投与された陰性対照と対比して、機能性ＲＮＰ複合体が提供された（図２１Ａおよび図２１Ｂ）。ＣＤ３陰性細胞の発生が、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるゲノム編集の結果であることを確認するために、ＴゲノムＤＮＡが収集されてＴ７Ｅ１アッセイが実施された。確かに、データは、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＤＮＡ修飾の存在を確認する（図２１Ｃ）。
【１６０１】
実施例７：ＲＮＡ分子としてのまたはＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰとしてのＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡのＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞への送達によってＰＤＣＤ１遺伝子座を標的化する
ＲＮＡ分子としてのＣａｓ９ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡのＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞への送達
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞中のＰＤＣＤ１遺伝子座におけるＣａｓ９媒介切断を実証するために、ＰＤＣＤ１遺伝子座に対して設計された標的化ドメインＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＵＧＣＵＡＣＡＡＣＵ（配列番号５０８）があるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９およびａｇＲＮＡが、電気穿孔を通じてＲＮＡ分子としてＴ細胞に送達された。この実施形態では、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの双方が、Ｔ７ポリメラーゼを使用して生体外転写された。５’ＡＲＣＡキャップが転写と同時に双方のＲＮＡ種に付加された一方で、ポリＡテールは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼによって、転写後にＲＮＡ種の３’末端に付加された。ＰＤＣＤ１遺伝子座におけるＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞修飾を生成するために、標的化ドメインＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＵＧＣＵＡＣＡＡＣＵ（配列番号５０８）がある１０μｇのＣａｓ９ｍＲＮＡおよび１０μｇのｇＲＮＡが、電気穿孔によって細胞に導入された。電気穿孔に先だって、Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ  １６４０中で培養された。２４、４８、および７２時間目に、ゲノムＤＮＡが単離されて、ＰＤＣＤ１遺伝子座においてＴ７Ｅ１アッセイが実施された。確かに、データは、ＰＤＣＤ１遺伝子座におけるＤＮＡ修飾の存在を確認する（図２２）。
【１６０２】
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞へのＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰの送達
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞内のＰＤＣＤ１遺伝子座におけるＣａｓ９媒介切断を実証するために、標的化ドメインＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＵＧＣＵＡＣＡＡＣＵ（配列番号５０８）があるＰＤＣＤ１遺伝子座に対してＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９およびｇＲＮＡが設計されて、電気穿孔によってリボ核酸タンパク質複合体（ＲＮＰ）として送達された。この実施形態では、Ｃａｓ９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現され精製された。具体的には、Ｃａｓ９をコードするＨＪ２９プラスミドが、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）２（ＤＥ３）化学コンピテント細胞（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃７１４００−４）に形質転換され、選択のための適切な抗生物質と共にＬＢプレート上に播種され、３７℃で一晩培養された。適切な抗生物質が添加された脳心臓浸出物ブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｂ９９９３）の１０ｍＬのスタータ培養に４つのコロニーが接種されて、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養された。一晩の培養後、スタータ培養が、補給剤に加えて適切な抗生物質が添加された１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｔ７０６０）に添加されて、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養された。温度が１８℃に徐々に低下されて、ＯＤ６００が２．０を超えたら、０．５ｍＭのＩＰＴＧの添加によって遺伝子の発現が誘導された。誘導は一晩継続され、遠心分離による細胞の収集と、ＴＧ３００（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、プロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃８８２６６））中への再懸濁がそれに続き、−８０℃で保存された。
【１６０３】
細胞は冷凍懸濁液の解凍によって溶解され、１８０００ｐｓｉに設定されたＬＭ１０  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）の２回の通過がそれに続いた。抽出物は、遠心分離を通じて清澄化され、４℃でのＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ＃３０２３０）とのバッチ培養を通じて、可溶性抽出物が捕捉された。スラリーを重力流カラム内に注ぎ入れ、ＴＧ３００＋３０ｍＭイミダゾールで洗浄し、次にＴＧ３００＋３００ｍＭイミダゾールで関心のあるタンパク質が溶出された。Ｎｉ溶出剤は、等容積のＨＧ１００（５０ｍＭ  ＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ）で希釈されて、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ＃１７−１１５２−０１）上に装入されて、３０カラム容積でＨＧ１００からＨＧ１０００（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１０００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ）への勾配で溶出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでのアッセイ後、適切な画分が貯留され、ＨＧ１５０（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ  ＴＣＥＰ）で平衡化されたＳＲＴ１０  ＳＥＣ３００カラム（Ｓｅｐａｘ＃２２５３００−２１２３０）上への装入のために濃縮された。画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってアッセイされ、適切に貯留され、少なくとも５ｍｇ／ｍｌに濃縮された。
【１６０４】
標的化ドメインＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＵＧＣＵＡＣＡＡＣＵ（配列番号５０８）があるｇＲＮＡは、Ｔ７ポリメラーゼを使用した生体外転写によって生成された。５’ＡＲＣＡキャップが転写と同時にＲＮＡに付加された一方で、ポリＡテールは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼによって、転写後にＲＮＡ種の３’末端に付加された。細胞への導入前に、精製Ｃａｓ９とｇＲＮＡを混合して、１０分間にわたり複合体を形成させた。ＲＮＰ溶液は、引き続いて電気穿孔によってＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞内に導入された。電気穿孔の前後に、細胞は、１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中で培養された。２４、４８、および７２時間目に、ゲノムＤＮＡが単離されて、ＰＤＣＤ１遺伝子座においてＴ７Ｅ１アッセイが実施された。確かに、データは、ＰＤＣＤ１遺伝子座におけるＤＮＡ修飾の存在を確認する（図２２）。
【１６０５】
参照による援用
全本明細書で言及されるての文献、特許、配列表、および特許出願は、あたかも個々の出版物、特許、配列表、または特許出願が、具体的にそして個別に、参照により援用されると示されるかのように、その内容全体を参照により本明細書に援用する。矛盾する場合は、本明細書の任意の定義をはじめとして、本出願が優先される。
【１６０６】
同等物
当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識し、または見極めることができるであろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。その他の実施形態もまた、以下の特許請求の範囲内である。
【図１Ａ】
2020062029.tif 000422
【図１Ｂ】
2020062029.tif 000423
【図１Ｃ】
2020062029.tif 000424
【図１Ｄ】
2020062029.tif 000425
【図１Ｅ】
2020062029.tif 000426
【図１Ｆ−Ｇ】
2020062029.tif 000427
【図２Ａ】
2020062029.tif 000428
【図２Ｂ】
2020062029.tif 000429
【図２Ｃ】
2020062029.tif 000430
【図２Ｄ】
2020062029.tif 000431
【図２Ｅ】
2020062029.tif 000432
【図２Ｆ】
2020062029.tif 000433
【図２Ｇ】
2020062029.tif 000434
【図３Ａ】
2020062029.tif 000435
【図３Ｂ】
2020062029.tif 000436
【図４Ａ】
2020062029.tif 000437
【図４Ｂ】
2020062029.tif 000438
【図５Ａ】
2020062029.tif 000439
【図５Ｂ】
2020062029.tif 000440
【図５Ｃ】
2020062029.tif 000441
【図６Ａ】
2020062029.tif 000442
【図６Ｂ】
2020062029.tif 000443
【図７Ａ】
2020062029.tif 000444
【図７Ａ−】
2020062029.tif 000445
【図７Ｂ】
2020062029.tif 000446
【図８】
2020062029.tif 000447
【図９】
2020062029.tif 000448
【図１０Ａ−Ｂ】
2020062029.tif 000449
【図１１】
2020062029.tif 000450
【図１２】
2020062029.tif 000451
【図１３】
2020062029.tif 000452
【図１４】
2020062029.tif 000453
【図１５】
2020062029.tif 000454
【図１６】
2020062029.tif 000455
【図１７Ａ】
2020062029.tif 000456
【図１７Ｂ】
2020062029.tif 000457
【図１７Ｃ】
2020062029.tif 000458
【図１８Ａ】
2020062029.tif 000459
【図１８Ｂ】
2020062029.tif 000460
【図１８Ｃ】
2020062029.tif 000461
【図１９】
2020062029.tif 000462
【図２０】
2020062029.tif 000463
【図２１Ａ】
2020062029.tif 000464
【図２１Ｂ】
2020062029.tif 000465
【図２１Ｃ】
2020062029.tif 000466
【図２２】
2020062029.tif 000467
【配列表】
2020062029000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月19日(2019.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2020062029000001.pdf
2020062029000002.pdf
2020062029000003.pdf
2020062029000004.pdf