(57)【要約】【課題】キメラ第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドおよびその使用を提供すること。【解決手段】本発明は、ＶＷＦのＤ’ドメインおよびＤ３ドメインを含むＶＷＦ断片、該ＶＷＦ断片と異種部分を含むキメラタンパク質、または該ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質、ならびにそれを使用する方法を提供する。本発明のＶＷＦ断片を含むポリペプチド鎖はＦＶＩＩＩタンパク質を含むポリペプチド鎖と結合または会合し、ＶＷＦ断片を含むポリペプチド鎖は、内因性ＶＷＦのＦＶＩＩＩタンパク質との結合を防止または阻害できる。ＦＶＩＩＩの半減期制限因子である内因性ＶＷＦのＦＶＩＩＩとの結合を防止または阻害することで、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期延長を誘導できる。本発明はまた、ヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ＶＷＦ断片を使用する方法またはキメラタンパク質も含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
凝固は、血液が凝血塊を形成する複雑な過程である。凝固は、止血、すなわち破損した血管からの血液損失の休止にとっての重要な役割であり、破損した血管壁は、血小板とフィブリン含有凝血塊で覆われて出血が止まり、破損した血管の修復が開始される。凝固の障害は、放血（出血）または閉塞性凝血（血栓症）のリスクを高め得る。
【背景技術】
【０００２】
凝固は、血管の損傷により血管内膜が傷ついたほぼ直後から開始される。血液が組織因子などのタンパク質に曝露されると、血小板および凝固因子である血漿タンパク質のフィブリノゲンが変化し始める。血小板は損傷部位ですぐに血栓を形成し、これは一次止血と呼ばれる。同時に二次止血が生じる：凝固（coagulationまたはclotting）因子と呼ばれる血漿中のタンパク質が複雑に次々と反応してフィブリン鎖を形成し、血小板の血栓を強化する。非限定的な凝固因子には、第Ｉ因子（フィブリノゲン）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）、組織因子、第Ｖ因子（プロアクセレリン、不安定因子）、第ＶＩＩ因子（安定因子、プロコンバーチン）、第ＶＩＩＩ因子（抗血友病Ａ因子）、第ＩＸ因子（抗血友病Ｂ因子またはクリスマス因子）、第Ｘ因子（スチュアート・プラウアー因子）、第ＸＩ因子（血漿トロンボプラスチン前駆因子）、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）、第ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定因子）、ＶＷＦ、プレカリクレイン（フレッチャー因子）、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）（フィッツジェラルド因子）、フィブロネクチン、抗トロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プラスミノーゲン、アルファ２−抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター−１（ＰＡＩ１）およびプラスミノーゲン活性化因子インヒビター−２（ＰＡＩ２）が含まれるがこれらに限定されない。
【０００３】
血友病Ａは出血性疾患であり、凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をコードする遺伝子の欠乏を原因とし、新生児男子１０，０００人に１〜２人が罹患している。Graw et al.,Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005)。血友病Ａ患者は、精製された、または組換え産生されたＦＶＩＩＩの輸液により治療され得る。しかし、市販のＦＶＩＩＩ製品はすべて半減期が約８〜１２時間であることが知られており、患者に頻回の静脈内投与をしなければならない。Weiner M.A. and Cairo, M.S., Pediatric Hematology Secrets, Lee, M.T., 12. Disorders of Coagulation, Elsevier Health Sciences, 2001; Lillicrap, D. Thromb. Res.  122 Suppl 4:S2-8 (2008)を参照されたい。さらに、ＦＶＩＩＩの半減期を延長するため多くのアプローチが試行されている。たとえば、凝固因子の半減期を延長するために開発中のアプローチには、ペグ化、グリコペグ化およびアルブミンとの複合体化が含まれる。Dumont et al., Blood. 119(13): 3024-3030（２０１２年１月１３日オンライン発表）を参照されたい。しかし、タンパク質操作を使用しても、現在開発中の長時間作用性ＦＶＩＩＩ製品は、半減期が改善されてはいるが、前臨床動物モデルで約１．５〜２倍しか延長されていない。同文献参照。ヒトでは一貫性のある結果が示されており、たとえば血友病Ａ患者においてｒＦＶＩＩＩＦｃはＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比べて約１．７倍の半減期改善があったことが報告された。同文献参照。したがって、わずかな改善であっても、半減期の延長は、他のＴ１／２（半減期）制限因子の存在を示唆し得る。Liu,T. et al., 2007 ISTHミーティング、アブストラクト#P-M-035; Henrik, A. et al., 2011 ISTHミーティング、アブストラクト#P=MO-181;Liu, T. et al., 2011 ISTHミーティング、アブストラクト#P-WE-131を参照されたい。
【０００４】
血漿中のフォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）は、約１２時間（９〜１５時間の範囲）の半減期を有する。http://www.nhlbi.nih.gov/guidelines/vwd/2_scientificoverview.htm（最終確認２０１１年１０月２２日）。ＶＷＦ半減期は、グリコシル化パターン、ＡＤＡＭＴＳ−１３（トロンボスポンジンモチーフ−１３を含むディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）およびＶＷＦの様々な突然変異などの数々の要因に影響され得る。
【０００５】
血漿中、９５〜９８％のＦＶＩＩＩが全長ＶＷＦとの強固な非共有結合複合体として循環する。この複合体の形成は、インビボのＦＶＩＩＩの適切な血漿レベルの維持にとって重要である。Lenting et al., Blood. 92(11): 3983-96 (1998); Lenting et al., J. Thromb. Haemost.5(7): 1353-60 (2007)。全長野生型ＦＶＩＩＩは、多くの場合は１本の重鎖（分子量２００ｋｄ）と１本の軽鎖（分子量７３ｋｄ）を有するヘテロダイマーとして存在する。ＦＶＩＩＩがタンパク質分解により重鎖３７２位と７４０位、ならびに軽鎖１６８９位で活性化されると、ＦＶＩＩＩに結合したＶＷＦは活性化されたＦＶＩＩＩから切り離される。活性化されたＦＶＩＩＩは、活性化された第ＩＸ因子、カルシウムおよびリン脂質と一緒に（「テナーゼ複合体」）、第Ｘ因子の活性化に関与し、大量のトロンビンを生成する。次にトロンビンはフィブリノゲンを切断して可溶性フィブリンモノマーを形成し、これは次に自動的に重合して可溶性フィブリンポリマーを形成する。トロンビンは第ＸＩＩＩ因子も活性化し、第ＸＩＩＩ因子はカルシウムとともに可溶性フィブリンポリマーを架橋し安定化させ、架橋（不溶性）フィブリンを形成する。活性化ＦＶＩＩＩはタンパク質分解により血中から速やかに除去される。
頻回投与と投与スケジュールから生じる不便のせいで、投与回数が少なくてよい、すなわち、１．５〜２倍という半減期の限界よりも長い半減期を有するＦＶＩＩＩ製品の開発がなおも必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Graw et al., Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005)
【非特許文献２】Weiner M.A. and Cairo, M.S., Pediatric Hematology Secrets, Lee, M.T.,12. Disorders of Coagulation, Elsevier Health Sciences, 2001
【非特許文献３】Lillicrap, D. Thromb. Res.  122 Suppl 4:S2-8 (2008)
【非特許文献４】Dumont et al., Blood. 119(13): 3024-3030（２０１２年１月１３日オンライン発表）
【非特許文献５】Lenting et al., Blood. 92(11): 3983-96 (1998); Lenting et al., J.Thromb. Haemost. 5(7): 1353-60 (2007)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、第ＶＩＩＩ因子（「ＦＶＩＩＩ」）タンパク質と付加部分（「ＡＭ」）を含むキメラタンパク質に関し、付加部分は、内因性ＶＷＦのＦＶＩＩＩタンパク質への結合を阻害または防止する。ＦＶＩＩＩタンパク質と付加部分は、内因性ＶＷＦ存在下での付加部分の解離を防止するために、共有結合により互いに結合している。一実施形態では、共有結合はペプチド結合、ジスルフィド結合、または内因性ＶＷＦ存在下でＦＶＩＩＩタンパク質から付加部分を解離させない強力なリンカーである。別の実施形態では、付加部分は、ＦＶＩＩＩタンパク質がＶＷＦクリアランス経路を通じて排除されるのを防止する。他の実施形態では、付加部分は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＶＷＦ結合部位を遮蔽またはブロックすることによって、内因性ＶＷＦのＦＶＩＩＩタンパク質への結合を阻害または防止する。たとえば、ＶＷＦ結合部位は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＡ３ドメインまたはＣ２ドメインか、またはＡ３ドメインとＣ２ドメインの両方に位置する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、共有結合により互いに連結したＦＶＩＩＩタンパク質と付加部分を含むコンストラクトを含み、該キメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期の制限を誘導する、たとえば全長ＶＷＦタンパク質または成熟ＶＷＦタンパク質などのＦＶＩＩＩ半減期制限因子を含まない。したがって、いくつかの実施形態では、キメラタンパク質のＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、内因性ＶＷＦの存在下で、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期の制限を超えて延長可能である。
【０００９】
ある特定の実施形態では、付加部分は、少なくとも１つのＶＷＦ様ＦＶＩＩＩ保護特性を有する。ＶＷＦ様ＦＶＩＩＩ保護特性の例としては、限定ではないが、１または複数のプロテアーゼ切断からのＦＶＩＩＩタンパク質保護、ＦＶＩＩＩタンパク質の活性化からの保護、ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖および／または軽鎖の安定化、または１もしくは複数のスカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩタンパク質の排除の防止が挙げられる。一実施形態では、付加部分は、ポリペプチド部分、非ポリペプチド部分またはその両方を含む。別の実施形態では、付加部分は、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約６００、少なくとも約６５０、少なくとも約７００、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約８５０、少なくとも約９００、少なくとも約９５０または少なくとも約１０００アミノ酸長のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり得る。ある特定の実施形態では、付加部分は、ＶＷＦ断片、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、またはそれらの任意の組合せを含む。他の実施形態では、付加部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、またはそれらの任意の組合せを含む非ポリペプチド部分である。
【００１０】
ある特定の実施形態では、付加部分は、ＶＷＦのＤ’ドメインおよびＤ３ドメインを含むＶＷＦ断片を含み、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質と付加部分（ＶＷＦ断片）の共有結合に加えて、ＦＶＩＩＩタンパク質と非共有結合により結合している。一例では、ＶＷＦ断片は、モノマーである。別の例では、ＶＷＦ断片は、互いの１または複数と連結した２、３、４、５または６個のＶＷＦ断片を含む。
【００１１】
一態様では、キメラタンパク質は、付加部分、たとえばＶＷＦ断片と、少なくとも１つの異種部分（Ｈ１）と、付加部分たとえばＶＷＦ断片と異種部分（Ｈ１）の間の随意のリンカーとを含む。一実施形態では、異種部分（Ｈ１）は、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長する部分、たとえば、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択されるポリペプチド、または、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される非ポリペプチド部分を含み得る。一実施形態では、異種部分（Ｈ１）は第１Ｆｃ領域を含む。別の実施形態では、異種部分（Ｈ１）は、少なくとも約５０アミノ酸、少なくとも約１００アミノ酸、少なくとも約１５０アミノ酸、少なくとも約２００アミノ酸、少なくとも約２５０アミノ酸、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約３５０アミノ酸、少なくとも約４００アミノ酸、少なくとも約４５０アミノ酸、少なくとも約５００アミノ酸、少なくとも約５５０アミノ酸、少なくとも約６００アミノ酸、少なくとも約６５０アミノ酸、少なくとも約７００アミノ酸、少なくとも約７５０アミノ酸、少なくとも約８００アミノ酸、少なくとも約８５０アミノ酸、少なくとも約９００アミノ酸、少なくとも約９５０アミノ酸または少なくとも約１０００のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、キメラタンパク質は、付加部分たとえばＶＷＦ断片と異種部分（Ｈ１）の間のリンカーを含み、該リンカーは切断可能なリンカーである。
【００１２】
別の態様では、キメラタンパク質のＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩと、少なくとも１つの異種部分（Ｈ２）を含む。一実施形態では、異種部分（Ｈ２）は、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長することができ、たとえば、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択されるポリペプチド、または、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、およびそれらの任意の組合せを含む非ポリペプチド部分である。特定の実施形態では、異種部分（Ｈ２）は第２Ｆｃ領域を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、ＶＷＦ断片、第１異種部分およびリンカーを含む第１ポリペプチド鎖と、ＦＶＩＩＩタンパク質および第２異種部分を含む第２ポリペプチド鎖を含み、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖は互いに共有結合で連結している。一例では、第１異種部分と第２異種部分は、共有結合、たとえばジスルフィド結合、ペプチド結合またはリンカーで互いに連結しており、この共有結合は、第１ポリペプチド鎖のＶＷＦ断片が内因性ＶＷＦとインビボで置換されるのを防止する。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質と第２異種部分の間のリンカーは切断可能なリンカーである。
【００１４】
ある特定の実施形態では、ＶＷＦ断片に連結した第１異種部分（Ｈ１）と、ＦＶＩＩＩタンパク質に連結した第２異種部分（Ｈ２）は、プロセス可能なリンカー、たとえばｓｃＦｃリンカーに連結する。
【００１５】
さらに他の実施形態では、キメラタンパク質のＦＶＩＩＩタンパク質は、第３異種部分（Ｈ３）、第４異種部分（Ｈ４）、第５異種部分（Ｈ５）、第６異種部分（Ｈ６）またはそれらの任意の組合せをさらに含む。一実施形態では、第３異種部分（Ｈ３）、第４異種部分（Ｈ４）、第５異種部分（Ｈ５）、第６異種部分（Ｈ６）のうちの１または複数は、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長できる。別の実施形態では、第３異種部分（Ｈ３）、第４異種部分（Ｈ４）、第５異種部分（Ｈ５）および第６異種部分（Ｈ６）はＦＶＩＩＩのＣ末端またはＮ末端に連結するか、またはＦＶＩＩＩの２つのアミノ酸の間に挿入される。他の実施形態では、第３異種部分（Ｈ３）、第４異種部分（Ｈ４）、第５異種部分（Ｈ５）、または第６異種部分（Ｈ６）のうちの１または複数は、少なくとも約５０アミノ酸、少なくとも約１００アミノ酸、少なくとも約１５０アミノ酸、少なくとも約２００アミノ酸、少なくとも約２５０アミノ酸、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約３５０アミノ酸、少なくとも約４００アミノ酸、少なくとも約４５０アミノ酸、少なくとも約５００アミノ酸、少なくとも約５５０アミノ酸、少なくとも約６００アミノ酸、少なくとも約６５０アミノ酸、少なくとも約７００アミノ酸、少なくとも約７５０アミノ酸、少なくとも約８００アミノ酸、少なくとも約８５０アミノ酸、少なくとも約９００アミノ酸、少なくとも約９５０アミノ酸または少なくとも約１０００アミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質と第２異種部分の間のリンカー、またはＶＷＦ断片と第１異種部分の間のリンカーは、リンカーのＮ末端領域に第１切断部位（Ｐ１）を、リンカーのＣ末端領域に第２切断部位（Ｐ２）を、またはその両方をさらに含む。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質と付加部分の間のリンカー、ＦＶＩＩＩタンパク質と第２異種部分の間のリンカー、およびＶＷＦ断片と第１異種部分の間のリンカーのうちの１または複数は、約１〜約２０００アミノ酸長を有する。
【００１７】
他の実施形態では、キメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質と付加部分を含み、これらはＦＶＩＩＩタンパク質と付加部分の間のリンカーにより連結しており、リンカーはさらにソルターゼ認識モチーフ、たとえば配列ＬＰＸＴＧ（配列番号１０６）を含む。
【００１８】
本発明は、フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）のＤ’ドメインとＤ３ドメインを含むＶＷＦ断片に関し、ＶＷＦ断片は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合し、内因性ＶＷＦのＦＶＩＩＩタンパク質への結合を阻害する。一実施形態では、本発明のＶＷＦ断片は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２７４ではない。一実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＶＷＦ断片なしでは、野生型ＦＶＩＩＩに匹敵する半減期を有する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩと、ＦＶＩＩＩの半減期を延長できる異種部分を含む融合タンパク質である。異種部分は、ポリペプチド部分、非ポリペプチド部分またはその両方であり得る。異種ポリペプチド部分は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択され得る。他の実施形態では、異種部分は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分であり、たとえばＦｃ領域である。さらに他の実施形態では、非ポリペプチド部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、またはそれらの任意の組合せからなる群より選択される。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖を含み、第１ポリペプチド鎖はＦＶＩＩＩと第１Ｆｃ領域を含み、第２ポリペプチド鎖はＦＶＩＩＩなしの第２Ｆｃ領域を含む。
【００１９】
別の実施形態では、ＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩの半減期を延長する。Ｄ’ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸７６４〜８６６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり得る。また、Ｄ３ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸８６７〜１２４０と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり得る。ある特定の実施形態では、ＶＷＦ断片は、配列番号２の残基１０９９、残基１１４２またはその両方に対応する残基で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、ＶＷＦ断片は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。ＶＷＦ断片は、ＶＷＦのＤ１ドメイン、Ｄ２ドメインまたはＤ１とＤ２ドメインをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＶＷＦ断片は、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、ＣＫドメイン、それらの１または複数の断片、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択されたＶＷＦドメインをさらに含む。他の実施形態では、ＶＷＦ断片は、ペグ化、グリコシル化、ヘシル化（hesylated）、またはポリシアル酸化されている。
【００２０】
本発明はまた、本明細書に記載のＶＷＦ断片、異種部分、およびＶＷＦ断片と異種部分の間に随意のリンカーを含むキメラタンパク質に関する。異種部分は、ポリペプチド部分、非ポリペプチド部分またはその両方であり得る。一実施形態では、異種ポリペプチド部分は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される。別の実施形態では、異種非ポリペプチド部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される。特定の実施形態では、異種部分は第１Ｆｃ領域である。キメラタンパク質は、第２Ｆｃ領域をさらに含み得、第２Ｆｃ領域は第１Ｆｃ領域に連結または結合されているか、ＶＷＦ断片に連結または結合されている。
【００２１】
一態様では、本発明のキメラタンパク質は、
（ａａ）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ２−Ｈ２、
（ｂｂ）Ｈ２−Ｌ２−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ、
（ｃｃ）Ｈ１−Ｌ１−Ｖ−Ｌ２−Ｈ２および
（ｄｄ）Ｈ２−Ｌ２−Ｖ−Ｌ１−Ｈ１
からなる群より選択される式を含み、
ここでＶは、本明細書に記載のＶＷＦ断片のうちの１または複数であり、
Ｌ１とＬ２はそれぞれ随意のリンカーであり；
Ｈ１は第１異種部分であり；
（−）はペプチド結合または１もしくは複数のアミノ酸であり；
Ｈ２は随意の第２異種部分である。
【００２２】
一実施形態では、Ｈ１は、第１異種部分であり、たとえば当技術分野で既知の半減期を延長する分子である。一実施形態では、第１異種部分はポリペプチドである。第１異種ポリペプチド部分は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される。別の実施形態では、Ｈ１は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される非ポリペプチド部分である。Ｈ２は、随意の第２異種部分であり、たとえば当技術分野で既知の半減期を延長する分子である。一実施形態では、第２異種部分は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択され得る。別の実施形態では、Ｈ２は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される非ポリペプチド部分である。ある特定の実施形態では、Ｈ１は第１Ｆｃ領域であり、Ｈ２は第２Ｆｃ領域である。第１Ｆｃ領域と第２Ｆｃ領域は、同じでも異なっていてもよく、リンカーまたは共有結合、たとえばジスルフィド結合により互いに連結し得る。別の実施形態では、第２Ｆｃ領域は第ＶＩＩＩ因子タンパク質に連結または結合される。随意に、半減期延長因子であって、ＶＷＦ断片、第１異種部分または第２異種部分に連結している第３異種部分のＨ３が存在し得る。第３異種部分の非限定的な例は、ポリペプチド部分、非ポリペプチド部分またはその両方を含み得る。一実施形態では、第３異種ポリペプチド部分は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、またはそれらの任意の組合せからなる群より選択され得る。別の実施形態では、Ｈ２は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される非ポリペプチド部分である。いくつかの実施形態では、Ｈ３は、切断可能リンカー、たとえばトロンビン切断可能リンカーにより、ＶＷＦ断片または第１もしくは第２異種部分に連結している。リンカーの非限定的な例は、本明細書に別途開示される。
【００２３】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＶＷＦ断片、ＦＶＩＩＩタンパク質および随意のＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質の間のリンカーを含むキメラタンパク質を提供する。ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質に結合され得る。一実施形態では、キメラタンパク質は、異種部分に連結している、本明細書に記載のＶＷＦ断片を含む。異種部分は、タンパク質の半減期を延長する部分であり得、ポリペプチド、非ポリペプチド部分、またはその両方を含む。そのような異種ポリペプチド部分の例としては、たとえば、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、それらの任意の誘導体またはバリアント、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。非ポリペプチド部分の例としては、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。別の実施形態では、異種部分はＶＷＦ断片に連結した第１Ｆｃ領域である。他の実施形態では、キメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質に連結した第２Ｆｃ領域を含む。ＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質は、それぞれリンカーで第１Ｆｃ領域または第２Ｆｃ領域に連結していてよい。さらに他の実施形態では、キメラタンパク質は、第１異種部分たとえば第１Ｆｃ領域に連結した本明細書に記載のＶＷＦ断片と、第２異種部分たとえば第２Ｆｃ領域に連結したＦＶＩＩＩタンパク質を含み、ＶＷＦ断片はリンカーまたは共有結合により第２異種部分（たとえば第２Ｆｃ領域）またはＦＶＩＩＩタンパク質にさらに連結しているか、または第１異種部分（たとえばＦｃ領域）はリンカーまたは共有結合によりＦＶＩＩＩタンパク質または第２異種部分（たとえば第２Ｆｃ領域）にさらに連結している。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質のＦＶＩＩＩは、部分Ｂドメインを有する。いくつかの実施形態では、部分Ｂドメインを有するＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩ１９８（配列番号１０５）である。他の実施形態では、キメラタンパク質は、ソルターゼ認識モチーフをさらに含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本発明の結果、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、ＶＷＦ断片なしのＦＶＩＩＩタンパク質または野生型ＦＶＩＩＩと比べて延長される。ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、ＶＷＦ断片なしのＦＶＩＩＩタンパク質の半減期よりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍または少なくとも約１２倍長い。一実施形態では、ＦＶＩＩＩの半減期は、野生型ＦＶＩＩＩの半減期よりも、約１．５倍から約２０倍、約１．５倍から約１５倍または約１．５倍から約１０倍長い。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩの半減期は、野生型ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦ断片なしのＦＶＩＩＩタンパク質と比べて、約２倍から約１０倍、約２倍から約９倍、約２倍から約８倍、約２倍から約７倍、約２倍から約６倍、約２倍から約５倍、約２倍から約４倍、約２倍から約３倍、約２．５倍から約１０倍、約２．５倍から約９倍、約２．５倍から約８倍、約２．５倍から約７倍、約２．５倍から約６倍、約２．５倍から約５倍、約２．５倍から約４倍、約２．５倍から約３倍、約３倍から約１０倍、約３倍から約９倍、約３倍から約８倍、約３倍から約７倍、約３倍から約６倍、約３倍から約５倍、約３倍から約４倍、約４倍から約６倍、約５倍から約７倍または約６倍から約８倍延長される。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩの半減期は、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間または少なくとも約１０８時間である。さらに他の実施形態では、ＦＶＩＩＩの半減期は、約１５時間〜約２週、約１６時間〜約１週、約１７時間〜約１週、約１８時間〜約１週、約１９時間〜約１週、約２０時間〜約１週、約２１時間〜約１週、約２２時間〜約１週、約２３時間〜約１週、約２４時間〜約１週、約３６時間〜約１週、約４８時間〜約１週、約６０時間〜約１週、約２４時間〜約６日、約２４時間〜約５日、約２４時間〜約４日、約２４時間〜約３日または約２４時間〜約２日である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、対象当たりのＦＶＩＩＩタンパク質の平均半減期は、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間（１日）、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間（２日）、約５４時間、約６０時間、約７２時間（３日）、約８４時間、約９６時間（４日）、約１０８時間、約１２０時間（５日）、約６日、約７日（１週）、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日または約１４日である。
【００２６】
別の態様では、本発明のキメラタンパク質は、
（ａ）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ３−Ｃ−Ｌ２−Ｈ２、
（ｂ）Ｈ２−Ｌ２−Ｃ−Ｌ３−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ、
（ｃ）Ｃ−Ｌ２−Ｈ２−Ｌ３−Ｖ−Ｌ１−Ｈ１、
（ｄ）Ｈ１−Ｌ１−Ｖ−Ｌ３−Ｈ２−Ｌ２−Ｃ、
（ｅ）Ｈ１−Ｌ１−Ｖ−Ｌ３−Ｃ−Ｌ２−Ｈ２、
（ｆ）Ｈ２−Ｌ２−Ｃ−Ｌ３−Ｖ−Ｌ１−Ｈ１、
（ｇ）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ３−Ｈ２−Ｌ２−Ｃ、
（ｈ）Ｃ−Ｌ２−Ｈ２−Ｌ３−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ、
（ｉ）Ｈ２−Ｌ３−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ−Ｌ２−Ｃ、
（ｊ）Ｃ−Ｌ２−Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ３−Ｈ２、
（ｋ）Ｖ−Ｌ２−Ｃ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ３−Ｈ２および
（ｌ）Ｈ２−Ｌ３−Ｈ１−Ｌ１−Ｃ−Ｌ２−Ｖ
からなる群より選択される式を含み、
ここでＶは本明細書に記載のＶＷＦ断片であり；
Ｌ１とＬ２はそれぞれ随意のリンカー、たとえばトロンビン切断可能リンカーであり；
Ｌ３は、随意のリンカーであり、たとえばｓｃＦｃリンカー、たとえばプロセス可能なリンカーであり；
Ｈ１またはＨ２はそれぞれ随意の異種部分であり；
ＣはＦＶＩＩＩタンパク質であり；
（−）はペプチド結合または１もしくは複数のアミノ酸である。
【００２７】
別の態様では、本発明のキメラタンパク質は、
（ｍ）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｃ、
（ｎ）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１：Ｃ−Ｌ２−Ｈ２、
（ｏ）Ｈ１−Ｌ１−Ｖ：Ｈ２−Ｌ２−Ｃ、
（ｐ）Ｈ１−Ｌ１−Ｖ：Ｃ−Ｌ２−Ｈ２、
（ｑ）Ｖ：Ｃ−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２、
（ｒ）Ｖ：Ｈ１−Ｌ１−Ｃ：Ｈ２、
（ｓ）Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｃ：Ｖ、
（ｔ）Ｃ：Ｖ−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２および
（ｕ）Ｃ：Ｈ１−Ｌ１−Ｖ：Ｈ２、
からなる群より選択される式を含み、
ここでＶは本明細書に記載のＶＷＦ断片であり；
Ｌ１とＬ２はそれぞれ随意のリンカー、たとえばトロンビン切断可能リンカーであり；
Ｈ１またはＨ２はそれぞれ随意の異種部分であり；
ＣはＦＶＩＩＩタンパク質であり；
（−）はペプチド結合または１もしくは複数のアミノ酸であり；
（：）は、Ｈ１とＨ２間、ＶとＣ間、およびＶとＨ１とＣとＨ２間の化学的または物理的結合である。（：）は、化学結合を表し、たとえば少なくとも１つの非ペプチド結合を表す。ある特定の実施形態では、化学結合すなわち（：）は共有結合である。いくつかの実施形態では、Ｈ１とＨ２間の結合は共有結合であり、たとえばジスルフィド結合である。他の実施形態では、化学結合すなわち（：）は非共有相互作用であり、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、ファンデルワース相互作用、水素結合である。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質とＶＷＦ断片間の結合は非共有結合である。他の実施形態では、（：）は非ペプチド共有結合である。さらに他の実施形態では、（：）はペプチド結合である。一実施形態では、Ｈ１は第１異種部分である。一実施形態では、第１異種部分は、ＦＶＩＩＩ活性の半減期を延長できる。別の実施形態では、第１異種部分は、ポリペプチド、非ポリペプチドまたはその両方である。一実施形態では、第１異種ポリペプチド部分は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択され得る。別の実施形態では、非ポリペプチド部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、Ｈ２は第２異種部分である。第２異種部分も当技術分野で既知の半減期延長因子であり得、ポリペプチド、非ポリペプチド部分またはその両方の組合せであり得る。一実施形態では、第２異種部分は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される。ある特定の実施形態では、非ポリペプチド部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される。特定の実施形態では、Ｈ１は第１Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、Ｈ２は第２Ｆｃ領域である。随意に、半減期延長因子である第３異種部分のＨ３が存在し得る。Ｈ３は、Ｖ、Ｃ、Ｈ１またはＨ２のうちの１または複数に随意のリンカー、たとえば切断可能なリンカー、たとえばトロンビン切断可能リンカーにより連結していてよい。第３異種部分の非限定的な例は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＡＳ配列およびヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）またはそれらの誘導体を含み得る。
【００２８】
ある特定の実施形態では、式（ａ）から（ｕ）のＶＷＦ断片、ＦＶＩＩＩタンパク質、第１異種部分および／または第２異種部分を互いに結合するのに使用されるリンカーのうちの１または複数が切断可能リンカーである。キメラタンパク質で使用される切断部位の１または複数は、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ−２、グランザイム−Ｂ、ＴＥＶ、エンテロキナーゼ、プロテアーゼ３Ｃ、ソルターゼＡ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７およびＭＭＰ−２０からなる群より選択されるプロテアーゼにより切断され得る。他の実施形態では、式（ａ）から（ｌ）で使用される１または複数のリンカー（たとえば、Ｌ３）はプロセス可能なリンカーを含む。プロセス可能リンカーは、分泌後細胞内酵素により切断され得る。プロセス可能なリンカーは、リンカーのＮ末端領域に第１切断部位（Ｐ１）、リンカーのＣ末端領域に第２切断部位（Ｐ２）、またはその両方を含み得る。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明で使用されるリンカーのうちの１または複数は、少なくとも約１〜２０００アミノ酸長である。特定の実施形態では、本発明で使用されるリンカーのうちの１または複数は、少なくとも約２０、３５、４２、４８、７３、９８、１４４、２８８、３２４、５７６または８６４アミノ酸長である。特定の実施形態では、リンカーのうちの１または複数は、ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドを含む。ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４であり得る。
【００３０】
他の態様では、キメラタンパク質のＦＶＩＩＩタンパク質は、機能的第ＶＩＩＩ因子タンパク質である。ＦＶＩＩＩタンパク質は、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ｂドメイン、Ａ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、それらの１または複数の断片およびそれらの任意の組合せからなる群より選択されるＦＶＩＩＩの１または複数のドメインを含み得る。一実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、Ｂドメインまたはその一部分を含む。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＳＱＢドメインが欠損したＦＶＩＩＩである。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、一本鎖ＦＶＩＩＩを含む。さらに他の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩの重鎖と第ＶＩＩＩ因子の軽鎖を含み、重鎖と軽鎖は互いに金属結合で結合している。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）に対する親和性が低いかまたは結合しない。たとえば、本発明に有用なＦＶＩＩＩタンパク質は、ＬＲＰに対する親和性を低下させるかＬＲＰとの結合を排除する少なくとも１つのアミノ酸の置換を含み得る。少なくとも１つのアミノ酸の置換の非限定的な例は、全長成熟ＦＶＩＩＩの残基４７１、残基４８４、残基４８７、残基４９０、残基４９７、残基２０９２、残基２０９３またはそれらの２つ以上の組合せに対応する残基である。いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質のＦＶＩＩＩタンパク質は、置換されていないＦＶＩＩＩタンパク質よりも安定するようにＦＶＩＩＩタンパク質を誘導する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、Ａ２ドメインに少なくとも１つのアミノ酸置換およびＡ３ドメインに少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここでＡ２ドメインとＡ３ドメインは互いに共有結合している。Ａ２ドメインのアミノ酸置換の非限定的な例は、全長成熟ＦＶＩＩＩの残基６６２または６６４に対応する残基である。さらに、Ａ３ドメインのアミノ酸置換の非限定的な例は、全長成熟ＦＶＩＩＩの残基１８２６または１８２８に対応する残基である。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載のＶＷＦ断片または本明細書に記載のキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または第１ヌクレオチド鎖と第２ヌクレオチド鎖を含む１組のポリヌクレオチドを提供し、該第１ヌクレオチド鎖はＶＷＦ断片をコードし、第２ヌクレオチド鎖はキメラタンパク質の第２Ｆｃ領域または凝固因子またはその断片をコードする。一実施形態では、１組のポリヌクレオチドは、サブチリシン様プロタンパク質転換酵素ファミリーに属するプロタンパク質転換酵素をコードする第３ポリヌクレオチド鎖をさらに含む。プロタンパク質転換酵素の非限定的な例としては、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン３型（ＰＡＣＥまたはＰＣＳＫ３）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン５型（ＰＣＳＫ５またはＰＣ５）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン７型（ＰＣＳＫ７またはＰＣ７）または酵母Ｋｅｘ２が挙げられる。さらに他の態様では、本発明は、ポリヌクレオチドまたは１組のポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドまたは１組のポリヌクレオチドに機能的に連結した１または複数のプロモーターを含むベクター、または第１ベクターと第２ベクターを含む１組のベクターを含み、第１ベクターは１組のポリヌクレオチドの第１ポリヌクレオチド鎖をコードし、第２ベクターは１組のポリヌクレオチドの第２ポリヌクレオチド鎖をコードする。１組のベクターは、ＰＣ５またはＰＣ７をコードする第３ポリヌクレオチド鎖を含む第３ベクターをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ベクターはＰＡＣＥをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＣＥはＶＷＦ断片のＤ１Ｄ２ドメインを切断する。
【００３２】
いくつかの態様では、本発明は、ＶＷＦ断片、キメラタンパク質、ポリヌクレオチド、１組のポリヌクレオチド、ベクターまたは１組のベクター、および薬剤的に許容可能な担体を含む医薬組成物に関する。本発明の組成物は、第ＶＩＩＩ因子の半減期を延長できる。他の態様では、本発明は、ポリヌクレオチド、１組のポリヌクレオチド、ベクターまたは１組のベクターを含む宿主細胞を含む。
【００３３】
他の態様では、本発明は、ＦＶＩＩＩタンパク質、付加部分、および随意のリンカーを含むキメラタンパク質に関し、付加部分は内因性ＶＷＦがＦＶＩＩＩタンパク質に結合するのを阻害または阻止し、少なくとも１つのＶＷＦ様ＦＶＩＩＩ保護特性を有する。ＶＷＦ様ＦＶＩＩＩ保護特性は、１または複数のプロテアーゼ切断からのＦＶＩＩＩタンパク質の保護、活性化からのＦＶＩＩＩタンパク質の保護、ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖および／または軽鎖の安定化、または１もしくは複数のスカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩタンパク質排除の阻止を含む。
【００３４】
キメラタンパク質の付加部分は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＶＷＦ結合部位を遮蔽またはブロックすることで内因性ＶＷＦのＦＶＩＩＩタンパク質への結合を阻害または防止できる。いくつかの実施形態では、ＶＷＦ結合部位は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＡ３ドメインまたはＣ２ドメインか、またはＦＶＩＩＩタンパク質のＡ３ドメインとＣ２ドメインの両方に位置する。別の実施形態では、ＶＷＦ結合部位は、配列番号１６のアミノ酸１６６９〜１６８９および２３０３〜２３３２に対応するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、付加部分はポリペプチド、非ポリペプチド部分またはその両方である。付加部分として有用なポリペプチドは、少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００アミノ酸長のアミノ酸配列を含み得る。たとえば付加部分として有用なポリペプチドは、ＶＷＦ断片、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、半減期を延長する他の技術、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択され得る。付加部分として有用な非ポリペプチド部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択され得る。一実施形態では、付加部分は本明細書に記載のＶＷＦ断片である。付加部分とＦＶＩＩＩタンパク質は、たとえばリンカーで連結されるか、互いに結合している。リンカーは、切断可能なリンカー、たとえばトロンビン切断可能リンカーを含み得る。
【００３５】
一態様では、本発明は、ＦＶＩＩＩタンパク質が内因性ＶＷＦと結合するのを防止または阻害する方法を提供し、方法は、有効量のＶＷＦ断片、キメラタンパク質、ポリヌクレオチド、または１組のポリヌクレオチドを、ＦＶＩＩＩタンパク質またはＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞に添加することを含み、ＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩタンパク質に結合する。別の態様では、本発明は、ＦＶＩＩＩタンパク質が内因性ＶＷＦと結合するのを防止または阻害する方法を含み、方法は、有効量のキメラタンパク質、ポリヌクレオチド、または１組のポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に添加することを含み、ＶＷＦ断片がＦＶＩＩＩタンパク質に結合するのでＦＶＩＩＩタンパク質の結合を防止または阻害する。いくつかの態様では、本発明は、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長または増加する方法を含み、方法は、有効量のＶＷＦ断片、キメラタンパク質、ポリヌクレオチド、または１組のポリヌクレオチドを、ＦＶＩＩＩタンパク質またはＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞か、またはそれを必要とする対象に添加することを含み、ＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩタンパク質に結合する。他の態様では、本発明は、細胞からのＦＶＩＩＩタンパク質の排除を防止または阻害する方法に関し、方法は、有効量のＶＷＦ断片、キメラタンパク質、ポリヌクレオチド、または１組のポリヌクレオチドを、ＦＶＩＩＩタンパク質またはＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞か、またはそれを必要とする対象に添加することを含み、ＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩタンパク質に結合する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、有効量のＶＷＦ断片、キメラタンパク質、ポリヌクレオチドまたは１組のポリヌクレオチドを投与することを含む、治療を必要とする対象の出血性疾患または障害を治療する方法に関し、出血性疾患または障害は、出血性血液凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉内への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、消化器系出血、脳内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙内出血、腹膜後隙内出血および腸腰筋外筒（illiopsoassheath）内出血からなる群より選択される。他の実施形態では、治療は予防的か応需型である。さらに他の実施形態では、本発明は、２Ｎ型フォンウィルブランド病関連の疾患または障害を治療する方法であり、治療を必要とする患者に有効量のＶＷＦ断片、キメラタンパク質、ポリヌクレオチドまたは１組のポリヌクレオチドを投与することを含み、疾患や障害が治療される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
共有結合により連結された第ＶＩＩＩ因子（「ＦＶＩＩＩ」）タンパク質と付加部分（ＡＭ）を含むキメラタンパク質であって、前記付加部分は内因性ＶＷＦが前記ＦＶＩＩＩタンパク質に結合するのを阻害または防止する、キメラタンパク質。
（項目２）
前記共有結合により、前記付加部分が内因性ＶＷＦの存在下で前記ＦＶＩＩＩタンパク質から解離することが防止される、項目１に記載のキメラタンパク質。
（項目３）
前記共有結合がペプチド結合である、項目１または２に記載のキメラタンパク質。
（項目４）
前記共有結合がジスルフィド結合である、項目１から３のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目５）
前記共有結合が、前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記付加部分の間のリンカーである、項目１から４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目６）
前記付加部分が、前記ＦＶＩＩＩタンパク質がＶＷＦクリアランス経路を通じて排除されるのを防止する、項目１から５のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目７）
前記付加部分が、前記ＦＶＩＩＩタンパク質上のＶＷＦ結合部位を遮蔽またはブロックすることで、内因性ＶＷＦが前記ＦＶＩＩＩタンパク質に結合するのを防止または阻害する、項目１から６のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目８）
前記ＶＷＦ結合部位が、前記ＦＶＩＩＩタンパク質のＡ３ドメインまたはＣ２ドメイン、またはＡ３ドメインとＣ２ドメインの両方に位置する、項目７に記載のキメラタンパク質。
（項目９）
前記ＶＷＦ結合部位が、配列番号１６のアミノ酸１６６９〜１６８９と２３０３〜２３３２に対応するアミノ酸配列である、項目８に記載のキメラタンパク質。
（項目１０）
前記キメラタンパク質がＦＶＩＩＩ半減期制限因子を含まない、項目１から９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目１１）
前記ＦＶＩＩＩ半減期制限因子は全長ＶＷＦタンパク質または成熟ＶＷＦタンパク質を含む、項目１０に記載のキメラタンパク質。
（項目１２）
ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が、内因性ＶＷＦの存在下で前記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期限界を超えて延長される、項目１から１１のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目１３）
前記付加部分が少なくとも１つのＶＷＦ様ＦＶＩＩＩ保護特性を有する、項目１から１２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目１４）
前記ＶＷＦ様ＦＶＩＩＩ保護特性が、前記ＦＶＩＩＩタンパク質を１または複数のプロテアーゼ切断から保護すること、前記ＦＶＩＩＩタンパク質を活性化から保護すること、前記ＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖および／または軽鎖を安定させることまたは前記ＦＶＩＩＩタンパク質が１または複数のスカベンジャー受容体により排除されるのを防止することを含む、項目１３に記載のキメラタンパク質。
（項目１５）
前記付加部分がポリペプチド、非ポリペプチド部分またはその両方を含む、項目１から１４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目１６）
前記ポリペプチドが、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約６００、少なくとも約６５０、少なくとも約７００、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約８５０、少なくとも約９００、少なくとも約９５０または少なくとも約１０００アミノ酸長のアミノ酸配列を含む、項目１５に記載のキメラタンパク質。
（項目１７）
前記付加部分が、ＶＷＦ断片、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、またはそれらの任意の組合せを含む、項目１から１６のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目１８）
前記非ポリペプチド部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体またはそれらの任意の組合せを含む、項目１７に記載のキメラタンパク質。
（項目１９）
前記付加部分が、ＶＷＦのＤ’ドメインとＤ３ドメインを含むＶＷＦ断片を含み、前記ＶＷＦ断片は共有結合に加えて非共有結合により前記ＦＶＩＩＩタンパク質と結合している、項目１７に記載のキメラタンパク質。
（項目２０）
前記ＶＷＦ断片がモノマーである、項目１７または１９に記載のキメラタンパク質。
（項目２１）
前記ＶＷＦ断片が、互いの１または複数に連結した２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＶＷＦ断片を含む、項目１９または２０に記載のキメラタンパク質。
（項目２２）
前記ＶＷＦ断片が、少なくとも１つの異種部分（Ｈ１）と、随意のリンカーを前記ＶＷＦ断片と前記異種部分（Ｈ１）の間に含む、項目１から２１のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目２３）
前記ＶＷＦ断片に連結した前記少なくとも１異種部分（Ｈ１）が、ポリペプチド、非ポリペプチド部分またはその両方を含む、項目２２に記載のキメラタンパク質。
（項目２４）
前記異種部分（Ｈ１）がＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長する部分を含む、項目２２または２３に記載のキメラタンパク質。
（項目２５）
前記異種部分（Ｈ１）が、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、またはそれらの任意の組合せを含む、項目２４に記載のキメラタンパク質。
（項目２６）
前記非ポリペプチド部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、またはそれらの任意の組合せを含む、項目２４に記載のキメラタンパク質。
（項目２７）
前記異種部分（Ｈ１）が、第１Ｆｃ領域を含む、項目２５に記載のキメラタンパク質。
（項目２８）
前記異種部分（Ｈ１）が、少なくとも約５０アミノ酸、少なくとも約１００アミノ酸、少なくとも約１５０アミノ酸、少なくとも約２００アミノ酸、少なくとも約２５０アミノ酸、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約３５０アミノ酸、少なくとも約４００アミノ酸、少なくとも約４５０アミノ酸、少なくとも約５００アミノ酸、少なくとも約５５０アミノ酸、少なくとも約６００アミノ酸、少なくとも約６５０アミノ酸、少なくとも約７００アミノ酸、少なくとも約７５０アミノ酸、少なくとも約８００アミノ酸、少なくとも約８５０アミノ酸、少なくとも約９００アミノ酸、少なくとも約９５０アミノ酸または少なくとも約１０００アミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、項目２４に記載のキメラタンパク質。
（項目２９）
前記キメラタンパク質が、前記ＶＷＦ断片と前記異種部分（Ｈ１）の間に切断可能リンカーであるリンカーを含む、項目２２に記載のキメラタンパク質。
（項目３０）
前記切断可能リンカーが、１または複数の切断可能部位を含む、項目２９に記載のキメラタンパク質。
（項目３１）
前記切断可能リンカーが、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ−２、グランザイム−Ｂ、ＴＥＶ、エンテロキナーゼ、プロテアーゼ３Ｃ、ソルターゼＡ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７、およびＭＭＰ−２０からなる群より選択されるプロテアーゼにより切断されることが可能である、項目29から30のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目３２）
前記切断可能リンカーが、ＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫ（配列番号５６）を含む、項目２９に記載のキメラタンパク質。
（項目３３）
前記切断可能リンカーが、ＲＲＲＲ（配列番号５２）、ＲＫＲＲＫＲ（配列番号５３）、ＲＲＲＲＳ（配列番号５４）、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号４７）、ＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号４８）、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号４９）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号５０）、ＬＶＰＲＧ（配列番号５５）、ＡＬＲＰＲＶＶＧＧＡ（配列番号５１）、ＫＬＴＲＡＥＴ（配列番号２９）、ＤＦＴＲＶＶＧ（配列番号３０）、ＴＭＴＲＩＶＧＧ（配列番号３１）、ＳＰＦＲＳＴＧＧ（配列番号３２）、ＬＱＶＲＩＶＧＧ（配列番号３３）、ＰＬＧＲＩＶＧＧ（配列番号３４）、ＩＥＧＲＴＶＧＧ（配列番号３５）、ＬＴＰＲＳＬＬＶ（配列番号３６）、ＬＧＰＶＳＧＶＰ（配列番号３７）、ＶＡＧＤＳＬＥＥ（配列番号３８）、ＧＰＡＧＬＧＧＡ（配列番号３９）、ＧＰＡＧＬＲＧＡ（配列番号４０）、ＡＰＬＧＬＲＬＲ（配列番号４１）、ＰＡＬＰＬＶＡＱ（配列番号４２）、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４３）、ＤＤＤＫＩＶＧＧ（配列番号４４）、ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号４５）およびＬＰＫＴＧＳＥＳ（配列番号４６）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む１または複数の切断部位を含む、項目２９から３２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目３４）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質がＦＶＩＩＩおよび少なくとも１つの異種部分（Ｈ２）を含む、項目１から３３のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目３５）
前記異種部分（Ｈ２）が、前記ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長できる、項目３４に記載のキメラタンパク質。
（項目３６）
前記異種部分（Ｈ２）が、ポリペプチド、非ポリペプチド部分またはその両方を含む、項目３４または３５に記載のキメラタンパク質。
（項目３７）
前記異種部分（Ｈ２）が、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、またはそれらの任意の組合せを含む、項目３４または３５に記載のキメラタンパク質。
（項目３８）
前記非ポリペプチド部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、その誘導体、またはそれらの任意の組合せを含む、項目３４または３５に記載のキメラタンパク質。
（項目３９）
前記異種部分（Ｈ２）が、第２Ｆｃ領域を含む、項目３４に記載のキメラタンパク質。
（項目４０）
前記ＶＷＦ断片、第１異種部分およびリンカーを含む第１ポリペプチド鎖と、前記ＦＶＩＩＩタンパク質と第２異種部分を含む第２ポリペプチド鎖を含み、前記第１ポリペプチド鎖と前記第２ポリペプチド鎖が互いに共有結合により連結している、項目１から３９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目４１）
前記第１異種部分と前記第２異種部分が互いに共有結合により連結しており、前記共有結合は前記第１ポリペプチド鎖中の前記ＶＷＦ断片が内因性ＶＷＦインビボで置換されるのを防止する、項目４０に記載のキメラタンパク質。
（項目４２）
前記共有結合がジスルフィド結合である、項目４１に記載のキメラタンパク質。
（項目４３）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質がリンカーにより前記第２異種部分（Ｈ２）と連結している、項目３４から４２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目４４）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記第２異種部分の間の前記リンカーが切断可能リンカーである、項目４３に記載のキメラタンパク質。
（項目４５）
前記第１異種部分（Ｈ１）と前記第２異種部分（Ｈ２）がリンカーで連結されている、項目３４から４4に記載のキメラタンパク質。
（項目４６）
前記リンカーがｓｃＦｃリンカーである、項目４５に記載のキメラタンパク質。
（項目４７）
前記ｓｃＦｃリンカーがプロセス可能なリンカーである、項目４６に記載のキメラタンパク質。
（項目４８）
以下からなる群より選択される式を含む、項目１〜４７に記載のキメラタンパク質：（ａ）  Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ３−Ｃ−Ｌ２−Ｈ２、
（ｂ）  Ｈ２−Ｌ２−Ｃ−Ｌ３−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ、
（ｃ）  Ｃ−Ｌ２−Ｈ２−Ｌ３−Ｖ−Ｌ１−Ｈ１、
（ｄ）  Ｈ１−Ｌ１−Ｖ−Ｌ３−Ｈ２−Ｌ２−Ｃ、
（ｅ）  Ｈ１−Ｌ１−Ｖ−Ｌ３−Ｃ−Ｌ２−Ｈ２、
（ｆ）  Ｈ２−Ｌ２−Ｃ−Ｌ３−Ｖ−Ｌ１−Ｈ１、
（ｇ）  Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ３−Ｈ２−Ｌ２−Ｃ、
（ｈ）  Ｃ−Ｌ２−Ｈ２−Ｌ３−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ、
（ｉ）  Ｈ２−Ｌ３−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ−Ｌ２−Ｃ、
（ｊ）  Ｃ−Ｌ２−Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ３−Ｈ２、
（ｋ）  Ｖ−Ｌ２−Ｃ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ３−Ｈ２および
（ｌ）  Ｈ２−Ｌ３−Ｈ１−Ｌ１−Ｃ−Ｌ２−Ｖ
（式中、
ＶはＶＷＦのＤ’ドメインおよびＤ３ドメインを含むＶＷＦ断片を含み；
Ｌ１は随意のリンカーであり；
Ｌ２は随意のリンカーであり；
（ａ）〜（ｆ）のＬ３は随意のリンカーであり、
（ｇ）〜（ｌ）のＬ３は随意のｓｃＦｃリンカーであり、
Ｈ１とＨ２はそれぞれ随意の異種部分を含み；
ＣはＦＶＩＩＩタンパク質を含み、
（−）はペプチド結合または１または複数のアミノ酸である）。
（項目４９）
以下からなる群より選択される式を含む、項目１〜４７に記載のキメラタンパク質：（ｍ）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｃ、
（ｎ）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１：Ｃ−Ｌ２−Ｈ２；
（ｏ）Ｈ１−Ｌ１−Ｖ：Ｈ２−Ｌ２−Ｃ；
（ｐ）Ｈ１−Ｌ１−Ｖ：Ｃ−Ｌ２−Ｈ２；
（ｑ）Ｖ：Ｃ−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２；
（ｒ）Ｖ：Ｈ１−Ｌ１−Ｃ：Ｈ２；
（ｓ）Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｃ：Ｖ、
（ｔ）Ｃ：Ｖ−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２、および
（ｕ）Ｃ：Ｈ１−Ｌ１−Ｖ：Ｈ２、
（式中、
ＶはＶＷＦのＤ’ドメインおよびＤ３ドメインを含むＶＷＦ断片であり；
Ｌ１は随意のリンカーであり；
Ｌ２は随意のリンカーであり；
Ｈ１は第１異種部分であり；
Ｈ２は第２異種部分であり；
ＣはＦＶＩＩＩタンパク質であり；
（−）はペプチド結合または１または複数のアミノ酸であり、
（：）は前記Ｈ１と前記Ｈ２の間の共有結合である）。
（項目５０）
前記ＶＷＦ断片と前記ＦＶＩＩＩタンパク質が前記共有結合、前記ペプチド結合または前記１または複数のアミノ酸に加えて非共有結合により互いに結合している、項目４８および４９に記載のキメラタンパク質。
（項目５１）
前記ＶＷＦ断片が、内因性ＶＷＦが前記ＦＶＩＩＩタンパク質と結合するのを阻害または防止する、項目４８および４９に記載のキメラタンパク質。
（項目５２）
前記Ｈ１と前記Ｈ２の間の前記共有結合が、ジスルフィド結合である、項目４９から５１のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目５３）
Ｈ１がポリペプチド、非ポリペプチド部分またはその両方を含む、項目４８から５２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目５４）
Ｈ１が、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、またはそれらの任意の組合せを含む、項目５３に記載のキメラタンパク質。
（項目５５）
Ｈ１が、第１Ｆｃ領域を含む、項目５３または５４に記載のキメラタンパク質。
（項目５６）
前記非ポリペプチド部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、その誘導体、またはそれらの任意の組合せを含む、項目５３に記載のキメラタンパク質。
（項目５７）
Ｈ２が、ポリペプチド、非ポリペプチド部分またはその両方を含む、項目４８から５６のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目５８）
Ｈ２が、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、またはそれらの任意の組合せを含む、項目５７に記載のキメラタンパク質。
（項目５９）
Ｈ２が第２Ｆｃ領域を含む、項目４８から５８のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目６０）
前記非ポリペプチド部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、またはそれらの任意の組合せ．を含む、項目５９に記載のキメラタンパク質。
（項目６１）
前記共有結合はジスルフィド結合である、項目６０に記載のキメラタンパク質。
（項目６２）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質が第３異種部分（Ｈ３）を含む、項目１から６１のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目６３）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質が第４異種部分（Ｈ４）を含む、項目１から６２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目６４）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質が第５異種部分（Ｈ５）を含む、項目１から６３のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目６５）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質が第６異種部分（Ｈ６）を含む、項目１から６４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目６６）
前記第３異種部分（Ｈ３）、前記第４異種部分（Ｈ４）、前記第５異種部分（Ｈ５）、前記第６異種部分（Ｈ６）のうちの１または複数がＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長できる、項目6１から６５のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目６７）
前記第３異種部分（Ｈ３）、前記第４異種部分（Ｈ４）、前記第５異種部分（Ｈ５）、前記第６異種部分（Ｈ６）がＦＶＩＩＩのＣ末端またはにＮ末端に連結しているか、またはＦＶＩＩＩの２つのアミノ酸の間に挿入されている、項目１から６６のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目６８）
前記第３異種部分（Ｈ３）、前記第４異種部分（Ｈ４）、前記第５異種部分（Ｈ５）、前記第６異種部分（Ｈ６）のうちの１または複数が、少なくとも約５０アミノ酸、少なくとも約１００アミノ酸、少なくとも約１５０アミノ酸、少なくとも約２００アミノ酸、少なくとも約２５０アミノ酸、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約３５０アミノ酸、少なくとも約４００アミノ酸、少なくとも約４５０アミノ酸、少なくとも約５００アミノ酸、少なくとも約５５０アミノ酸、少なくとも約６００アミノ酸、少なくとも約６５０アミノ酸、少なくとも約７００アミノ酸、少なくとも約７５０アミノ酸、少なくとも約８００アミノ酸、少なくとも約８５０アミノ酸、少なくとも約９００アミノ酸、少なくとも約９５０アミノ酸または少なくとも約１０００アミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、項目１から６７のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目６９）
前記ＦＶＩＩＩの半減期が、野生型ＦＶＩＩＩよりも少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍または少なくとも約１２倍長く延長される、項目１から６８のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目７０）
ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間または少なくとも約１０８時間である、項目１から６９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目７１）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記第２異種部分の間の前記リンカーまたは前記ＶＷＦ断片と前記第１異種部分の間の前記リンカーが、前記リンカーのＮ末端領域に第１切断部位（Ｐ１）を、前記リンカーのＣ末端領域に第２切断部位（Ｐ２）を、またはその両方を含む、項目２２から７０のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目７２）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記第２異種部分の間の前記リンカー、前記ＶＷＦ断片と前記第１異種部分の間の前記リンカーまたはその両方が、ＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫ（配列番号５６）を含む、項目２２から７１のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目７３）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記第２異種部分の間の前記リンカー、前記ＶＷＦ断片と前記第１異種部分の間の前記リンカーまたはその両方が、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ−２、グランザイム−Ｂ、ＴＥＶ、エンテロキナーゼ、プロテアーゼ３Ｃ、ソルターゼＡ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７およびＭＭＰ−２０からなる群より選択されるプロテアーゼにより切断される、項目２２から７１のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目７４）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記第２異種部分の間の前記リンカー、前記ＶＷＦ断片と前記第１異種部分の間の前記リンカーまたはその両方が、ＲＲＲＲ（配列番号５２）、ＲＫＲＲＫＲ（配列番号５３）、ＲＲＲＲＳ（配列番号５４）、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号４７）、ＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号４８）、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号４９）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号５０）、ＬＶＰＲＧ（配列番号５５）、ＡＬＲＰＲＶＶＧＧＡ（配列番号５１）、ＫＬＴＲＡＥＴ（配列番号２９）、ＤＦＴＲＶＶＧ（配列番号３０）、ＴＭＴＲＩＶＧＧ（配列番号３１）、ＳＰＦＲＳＴＧＧ（配列番号３２）、ＬＱＶＲＩＶＧＧ（配列番号３３）、ＰＬＧＲＩＶＧＧ（配列番号３４）、ＩＥＧＲＴＶＧＧ（配列番号３５）、ＬＴＰＲＳＬＬＶ（配列番号３６）、ＬＧＰＶＳＧＶＰ（配列番号３７）、ＶＡＧＤＳＬＥＥ（配列番号３８）、ＧＰＡＧＬＧＧＡ（配列番号３９）、ＧＰＡＧＬＲＧＡ（配列番号４０）、ＡＰＬＧＬＲＬＲ（配列番号４１）、ＰＡＬＰＬＶＡＱ（配列番号４２）、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４３）、ＤＤＤＫＩＶＧＧ（配列番号４４）、ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号４５）およびＬＰＫＴＧＳＥＳ（配列番号４６）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目２２から７３のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目７５）
前記第１酵素的切断部位と前記第２酵素的切断部位が同一であるかまたは異なる、項目７１から７４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目７６）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記付加部分の間の前記リンカー、前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記第２異種部分の間の前記リンカー、および前記ＶＷＦ断片と前記第１異種部分の間の前記リンカーのうちの１または複数が、約１〜約２０００アミノ酸長である、項目５から７５のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目７７）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記付加部分の間の前記リンカー、前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記第２異種部分の間の前記リンカー、および前記ＶＷＦ断片と前記第１異種部分の間の前記リンカーのうちの１または複数が、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００または２０００アミノ酸である、項目５から７５のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目７８）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記付加部分の間の前記リンカー、前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記第２異種部分の間の前記リンカー、および前記ＶＷＦ断片と前記第１異種部分の間の前記リンカーのうちの１または複数が、ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドを含む、項目５から７7のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目７９）
前記ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたはＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎの式を有し、式中ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または１００からなる群より選択される製の整数である、項目７８に記載のキメラタンパク質。
（項目８０）
前記（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４である、項目７９に記載のキメラタンパク質。
（項目８１）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記付加部分前記リンカーが切断可能リンカーである、項目５から８０のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目８２）
前記切断可能リンカーが、１または複数のトロンビン切断部位を含む、項目８１に記載のキメラタンパク質。
（項目８３）
前記切断可能リンカーが、ＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫ（配列番号５６）を含む、項目８１または８２に記載のキメラタンパク質。
（項目８４）
切断可能リンカーが、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ−２、グランザイム−Ｂ、ＴＥＶ、エンテロキナーゼ、プロテアーゼ３Ｃ、ソルターゼＡ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７およびＭＭＰ−２０からなる群より選択されるプロテアーゼにより切断される、項目81から８3のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目８５）
前記切断可能リンカーが、ＲＲＲＲ（配列番号５２）、ＲＫＲＲＫＲ（配列番号５３）、ＲＲＲＲＳ（配列番号５４）、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号４７）、ＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号４８）、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号４９）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号５０）、ＬＶＰＲＧ（配列番号５５）、ＡＬＲＰＲＶＶＧＧＡ（配列番号５１）、ＫＬＴＲＡＥＴ（配列番号２９）、ＤＦＴＲＶＶＧ（配列番号３０）、ＴＭＴＲＩＶＧＧ（配列番号３１）、ＳＰＦＲＳＴＧＧ（配列番号３２）、ＬＱＶＲＩＶＧＧ（配列番号３３）、ＰＬＧＲＩＶＧＧ（配列番号３４）、ＩＥＧＲＴＶＧＧ（配列番号３５）、ＬＴＰＲＳＬＬＶ（配列番号３６）、ＬＧＰＶＳＧＶＰ（配列番号３７）、ＶＡＧＤＳＬＥＥ（配列番号３８）、ＧＰＡＧＬＧＧＡ（配列番号３９）、ＧＰＡＧＬＲＧＡ（配列番号４０）、ＡＰＬＧＬＲＬＲ（配列番号４１）、ＰＡＬＰＬＶＡＱ（配列番号４２）、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４３）、ＤＤＤＫＩＶＧＧ（配列番号４４）、ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号４５）およびＬＰＫＴＧＳＥＳ（配列番号４６）．からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目８１から８３のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目８６）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記付加部分の間の前記リンカーが、ソルターゼ認識モチーフをさらに含む、項目5から８5のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目８７）
前記ソルターゼ認識モチーフが、ＬＰＸＴＧ（配列番号１０６）配列を含む、項目８６に記載のキメラタンパク質。
（項目８８）
前記ＶＷＦ断片がＶＷＦのＤ’ドメインおよびＤ３ドメインを含む、項目１９から８７のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目８９）
前記ＶＷＦ断片が、内因性ＶＷＦがＦＶＩＩＩタンパク質に結合するのを阻害または防止する、項目８８に記載のキメラタンパク質。
（項目９０）
前記ＶＷＦ断片の前記Ｄ’ドメインのアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸７６４〜８６６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、項目８８または８９に記載のキメラタンパク質。
（項目９１）
前記ＶＷＦ断片の前記Ｄ３ドメインのアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸８６７〜１２４０と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、項目８８から９０のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目９２）
前記ＶＷＦ断片が、配列番号２の残基１０９９、残基１１４２または残基１０９９と１１４２の両方に対応する残基で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、項目８８から９１のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目９３）
前記ＶＷＦ断片の配列中、システインではないアミノ酸が、配列番号２の残基１０９９、残基１１４２、または残基１０９９と１１４２の両方に対応する残基で置換されている、項目８８から９１のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目９４）
前記ＶＷＦ断片の配列が、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０を含む、項目８８から９３のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目９５）
前記ＶＷＦ断片が、ＶＷＦのＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、またはＤ１とＤ２ドメインをさらに含む、項目８８から９４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目９６）
前記ＶＷＦ断片が、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、ＣＫドメイン、それらの１または複数の断片、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択されるＶＷＦドメインをさらに含む、項目８８から９５のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目９７）
前記ＶＷＦ断片が、（１）ＶＷＦのＤ’およびＤ３ドメインまたはそれらの断片；（２）ＶＷＦのＤ１、Ｄ’、およびＤ３ドメインまたはそれらの断片；（３）ＶＷＦのＤ２、Ｄ’およびＤ３ドメインまたはそれらの断片；（４）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ’およびＤ３ドメインまたはそれらの断片；または（５）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ’、Ｄ３およびＡ１ドメインまたはそれらの断片から本質的になるか、またはそれらからなる、項目８８から９５のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目９８）
機能的に連結されているＶＷＦのシグナルペプチドをさらに含む、項目８８から９７のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目９９）
前記ＶＷＦ断片がペグ化、グリコシル化、ヘシル化（hesylated）またはポリシアル化されている、項目１９から９８のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目１００）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質が、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ｂドメイン、Ａ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、それらの１または複数の断片、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択されるＦＶＩＩＩの１または複数ドメインを含む、項目１から９９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０１）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質が、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメインおよびＣ１ドメイン、ならびに随意のＣ２ドメインを含む、項目１００に記載のキメラタンパク質。
（項目１０２）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質が、Ｂドメインまたはその一部分を含む、項目１００または１０１に記載のキメラタンパク質。
（項目１０３）
配列番号１６または配列番号１８と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、項目１００から１０２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０４）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質が、ＳＱＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩである、項目１００から１０３のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０５）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質が、一本鎖ＦＶＩＩＩを含む、項目１００から１０４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０６）
前記一本鎖ＦＶＩＩＩが、全長成熟第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（配列番号１６）の残基１６４８、残基１６４５またはその両方、またはＳＱＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子（配列番号１８）の残基７５４、残基７５１またはその両方に`対応する残基で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、項目１０５に記載のキメラタンパク質。
（項目１０７）
前記アミノ酸置換がアルギニンではないアミノ酸である、項目１０６に記載のキメラタンパク質。
（項目１０８）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質が、第１鎖と第２鎖を含み、前記第１鎖はＦＶＩＩＩの重鎖を含み、前記第２鎖は第ＶＩＩＩ因子の軽鎖を含み、前記重鎖と前記軽鎖は金属結合で結合している、項目１から１０７のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
（項目１０９）
項目１から１０８のいずれか一項に記載のキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目１１０）
ＰＣ５、ＰＣ７またはフーリンをコードする追加のポリヌクレオチド配列をさらに含む、項目１１０に記載のポリヌクレオチド。
（項目１１１）
ＶＷＦのＤ１ドメインとＤ２ドメインをコードする追加のポリヌクレオチド配列をさらに含む、項目１０９または１１０に記載のポリヌクレオチド。
（項目１１２）
項目１０９から１１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組に機能的に連結した１または複数プロモーターを含むベクター（単数）またはベクター（複数）。
（項目１１３）
ＰＣ５、ＰＣ７またはフーリンをコードする第２ポリヌクレオチド鎖を含む追加のベクターをさらに含む、項目１１２のベクター（単数）またはベクター（複数）。
（項目１１４）
ＶＷＦのＤ１ドメインおよびＤ２ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含む追加のベクターをさらに含む、項目１１２または１１３のベクター（単数）またはベクター（複数）。
（項目１１５）
項目１０９から１１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは項目１１２から１１４のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目１１６）
ＰＣ５、ＰＣ７またはフーリンをコードする追加のベクターを含む、項目１１５に記載の宿主細胞。
（項目１１７）
ＶＷＦのＤ１ドメインおよびＤ２ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含む追加のベクターをさらに含む、項目１１５または１１６に記載の宿主細胞。
（項目１１８）
哺乳動物細胞である、項目１１５または１１８に記載の宿主細胞。
（項目１１９）
前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞およびＢＨＫ細胞からなる群より選択される、項目１１８に記載の宿主細胞。
（項目１２０）
項目１から１０８のいずれか一項に記載のキメラタンパク質、項目１０９または１１１に記載のポリヌクレオチド、項目１１２または１１４に記載のベクター、または項目１１５から１１８のいずれか一項に記載の宿主細胞と薬剤的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
（項目１２１）
ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦダブルノックアウト（「ＤＫＯ」）マウスにおける前記キメラタンパク質のＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が、ＶＷＦ断片なしのキメラタンパク質のＦＶＩＩＩタンパク質の半減期と比べて延長される、項目１２０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２２）
前記ＦＶＩＩＩの半減期が、野生型ＦＶＩＩＩと比べて少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍または少なくとも４０倍長く延長される、項目１２０または１２１に記載の組成物。
（項目１２３）
第ＶＩＩＩ因子の半減期が少なくとも６時間、少なくとも７時間少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１５時間、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間または少なくとも約１０８時間である、項目１２０または１２２に記載の組成物。
（項目１２４）
局所性投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与および経口投与からなる群より選択される経路で投与される、項目１２０から１２３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２５）
前記非経口投与が静脈内または皮下投与である、項目１２４に記載の組成物。
（項目１２６）
治療を必要とする対象の出血性疾患または病状を治療するのに使用される、項目１２０から１２５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２７）
前記出血性疾患または病状が、出血性血液凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉内への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、消化器系出血、脳内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙内出血、腹膜後隙内出血、腸腰筋外筒（illiopsoassheath）内出血およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、項目１２６に記載の組成物。
（項目１２８）
前記対象が、手術を受ける予定である、項目１２６または１２７に記載の組成物。
（項目１２９）
前記治療は予防的または応需的である、項目１２６または１２７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３０）
項目１から１０８のいずれか一項に記載の前記キメラタンパク質、項目１０９から１１１のいずれか一項に記載の前記ポリヌクレオチド、項目１１２から１１４のいずれか一項に記載の前記ベクター、項目１１５から１１９のいずれか一項に記載の前記宿主細胞または項目１２０から１２９のいずれか一項に記載の前記組成物の有効量を必要とする対象に加えることを含む、ＦＶＩＩＩタンパク質の内因性ＶＷＦとの相互作用を防止または阻害する方法であって、前記ＶＷＦ断片は前記ＦＶＩＩＩタンパク質の内因性ＶＷＦとの相互作用を防止または阻害する、方法。
（項目１３１）
ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期制限因子を除去または低減する方法であって、項目１から１０８のいずれか一項に記載の前記キメラタンパク質、項目１０９から１１１のいずれか一項に記載の前記ポリヌクレオチド、項目１１２から１１４のいずれか一項に記載の前記ベクター、項目１１５から１１９のいずれか一項に記載の前記宿主細胞または項目１２０から１２９のいずれか一項に記載の前記組成物の有効量を加えることを含み、前記キメラタンパク質または前記ポリヌクレオチド、前記ベクターにコードされるかまたは前記宿主細胞により発現される前記キメラタンパク質は、前記ＦＶＩＩＩタンパク質の内因性ＶＷＦとの相互作用を防止または阻害する、方法。
（項目１３２）
ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長または増加する方法であって、項目１から１０８のいずれか一項に記載の前記キメラタンパク質、項目１０９から１１１のいずれか一項に記載の前記ポリヌクレオチド、項目１１２から１１４のいずれか一項に記載の前記ベクター、項目１１５から１１９のいずれか一項に記載の前記宿主細胞または項目１２０から１２９のいずれか一項に記載の前記組成物の有効量を加えることを含み、前記キメラタンパク質の前記ＶＷＦ断片は、前記ＦＶＩＩＩタンパク質の内因性ＶＷＦとの相互作用を防止または阻害する、方法。
（項目１３３）
ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が、野生型ＦＶＩＩＩよりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍または少なくとも約１２倍長く延長される、項目１３２に記載の方法。
（項目１３４）
第ＶＩＩＩ因子の半減期が、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間または少なくとも約１０８時間である、項目１３３に記載の方法。
（項目１３５）
治療を必要とする対象における出血性疾患または病状を治療する方法であって、項目１から１０８のいずれか一項に記載の前記キメラタンパク質、項目１０９から１１１のいずれか一項に記載の前記ポリヌクレオチド、項目１１２から１１４のいずれか一項に記載の前記ベクター、項目１１５から１１９のいずれか一項に記載の前記宿主細胞または項目１２０から１２９のいずれか一項に記載の前記組成物の有効量を前記対象に投与することを含み、前記出血性疾患または病状が、出血性血液凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉内への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、消化器系出血、脳内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙内出血、腹膜後隙内出血、腸腰筋外筒（illiopsoassheath）内出血、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、方法。
（項目１３６）
前記治療が、予防的またはオンデマンド（応需的）である、項目１３５に記載の方法。
（項目１３７）
前記有効量が、０．１μｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇである、項目１３０から１３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３８）
前記キメラタンパク質、前記ポリヌクレオチド、前記宿主細胞または前記組成物が、局所性投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与および経口投与からなる群より選択される経路で投与される、項目１３０から１３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３９）
前記非経口投与が、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与および皮内投与からなる群より選択される、項目１３８に記載の方法。
（項目１４０）
前記対象がヒトである、項目１３０から１３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４１）
前記対象が血友病Ａ患者である、項目１４０に記載の方法。
（項目１４２）
キメラタンパク質を作製する方法であって、１または複数の宿主細胞を項目１０９から１１１のいずれか一項に記載の前記ポリヌクレオチドまたは項目１１２から１１４のいずれか一項に記載の前記ベクターで形質移入し、前記宿主細胞内でＶＷＦ断片またはキメラタンパク質を発現させることを含む、方法。
（項目１４３）
前記ベクターが、プロセシング酵素をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目１４２に記載の方法。
（項目１４４）
前記プロセシング酵素がＰＡＣＥである、項目１４３に記載の方法。
（項目１４５）
ＰＡＣＥが、前記ＶＷＦ断片のＤ１Ｄ２ドメインを切断する、項目１４４に記載の方法。
（項目１４６）
１または複数の宿主細胞をＶＷＦのＤ１ドメインとＤ２ドメインを発現するポリヌクレオチド配列で形質移入することをさらに含む、請求１４２および１４３に記載の方法。
（項目１４７）
項目１から１０８のいずれか一項に記載の前記キメラタンパク質を構築する方法であって、ソルターゼ酵素の存在下で共有結合により付加部分を前記ＦＶＩＩＩタンパク質に連結することを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１−１】図１Ａ〜Ｆは、ＶＷＦタンパク質の概略図である。図１Ａは、配列番号７３のアミノ酸１〜２７６（配列番号２のアミノ酸７６４〜１０３９）を含む２つのＶＷＦ断片を示す。ＶＷＦ−００１は、ＶＷＦのプレ／プロペプチド配列なしで合成されるが、ＶＷＦ−００９はプレ／プロペプチド配列（Ｄ１およびＤ２ドメイン）と共に合成される。ＶＷＦ−００９のプレペプチドは合成中に切断され、ＶＷＦ−００９はプロペプチドとＤ’およびＤ３ドメイン配列を含む。図１Ｂは、配列番号７３のアミノ酸１〜４７７（配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０）を含む３つのＶＷＦ断片を示す。ＶＷＦ−００２は、プレ／プロペプチド配列なしで合成される。ＶＷＦ−０１０はＤ’Ｄ３ドメインに加えてＤ１Ｄ２ドメインを含む。ＶＷＦ−０１３は、配列番号７２の残基３３６および３７９でシトシンと置き換わっているアラニン残基に加えて、Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメインを含む。図１Ｃは、Ｄ’Ｄ３ドメインとＡ１ドメインの一部分を含む２つのＶＷＦ断片を示す。ＶＷＦ−００３は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２７４を有する。ＶＷＦ−０１１はＤ’Ｄ３ドメインに加えてＤ１Ｄ２ドメインを含む。図１Ｄは、ＶＷＦ−００４とＶＷＦ−０１２の２つのコンストラクトを示す。ＶＷＦ−００４は、Ｄ’Ｄ３ドメインと完全配列のＡ１ドメインを含む。ＶＷＦ−０１２は、Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメインと完全配列のＡ１ドメインを含む。図１Ｅは３つのコンストラクトを示す。ＶＷＦ−００６は、ＶＷＦのＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメインとＣＫドメイン（システインノットドメイン）を含む。ＶＷＦ−００８は全長ＶＷＦである。ＶＷＦ−０３１（ＶＷＦ−Ｆｃ）は、切断可能リンカーで一本鎖Ｆｃ領域（asingle Fc region）に連結されたＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメインを含むコンストラクトを示す。ＶＷＦ−０５３はＤ１Ｄ２ドメインである。図１Ｆは、プロペプチド（Ｄ１およびＤ２ドメイン）と成熟サブユニット（Ｄ’、Ｄ３、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｄ４、Ｂ１−３、Ｃ１−２ドメイン）を含む全長ＶＷＦタンパク質を示す。ＶＷＦタンパク質は約２５０ｋＤａのタンパク質であり、ジスルフィド結合によりマルチマー（＞２０ＭＤａ）を形成する。ＶＷＦタンパク質は、非共有結合複合体としてＦＶＩＩＩ（９５〜９８％）と結合し、プロテアーゼ切断／活性からのＦＶＩＩの保護、重鎖と軽鎖の安定化およびスカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩ排除の防止により、ＦＶＩＩの半減期の半減期を延長する。ＶＷＦタンパク質は、ＶＷＦ受容体によるＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ複合体の排除およびｒＦＶＩＩＩＦｃの飲作用と再循環の防止により、ＦＶＩＩＩの半減期を制限することもできる。
【図１−２】図１Ａ〜Ｆは、ＶＷＦタンパク質の概略図である。図１Ａは、配列番号７３のアミノ酸１〜２７６（配列番号２のアミノ酸７６４〜１０３９）を含む２つのＶＷＦ断片を示す。ＶＷＦ−００１は、ＶＷＦのプレ／プロペプチド配列なしで合成されるが、ＶＷＦ−００９はプレ／プロペプチド配列（Ｄ１およびＤ２ドメイン）と共に合成される。ＶＷＦ−００９のプレペプチドは合成中に切断され、ＶＷＦ−００９はプロペプチドとＤ’およびＤ３ドメイン配列を含む。図１Ｂは、配列番号７３のアミノ酸１〜４７７（配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０）を含む３つのＶＷＦ断片を示す。ＶＷＦ−００２は、プレ／プロペプチド配列なしで合成される。ＶＷＦ−０１０はＤ’Ｄ３ドメインに加えてＤ１Ｄ２ドメインを含む。ＶＷＦ−０１３は、配列番号７２の残基３３６および３７９でシトシンと置き換わっているアラニン残基に加えて、Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメインを含む。図１Ｃは、Ｄ’Ｄ３ドメインとＡ１ドメインの一部分を含む２つのＶＷＦ断片を示す。ＶＷＦ−００３は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２７４を有する。ＶＷＦ−０１１はＤ’Ｄ３ドメインに加えてＤ１Ｄ２ドメインを含む。図１Ｄは、ＶＷＦ−００４とＶＷＦ−０１２の２つのコンストラクトを示す。ＶＷＦ−００４は、Ｄ’Ｄ３ドメインと完全配列のＡ１ドメインを含む。ＶＷＦ−０１２は、Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメインと完全配列のＡ１ドメインを含む。図１Ｅは３つのコンストラクトを示す。ＶＷＦ−００６は、ＶＷＦのＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメインとＣＫドメイン（システインノットドメイン）を含む。ＶＷＦ−００８は全長ＶＷＦである。ＶＷＦ−０３１（ＶＷＦ−Ｆｃ）は、切断可能リンカーで一本鎖Ｆｃ領域（asingle Fc region）に連結されたＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメインを含むコンストラクトを示す。ＶＷＦ−０５３はＤ１Ｄ２ドメインである。図１Ｆは、プロペプチド（Ｄ１およびＤ２ドメイン）と成熟サブユニット（Ｄ’、Ｄ３、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｄ４、Ｂ１−３、Ｃ１−２ドメイン）を含む全長ＶＷＦタンパク質を示す。ＶＷＦタンパク質は約２５０ｋＤａのタンパク質であり、ジスルフィド結合によりマルチマー（＞２０ＭＤａ）を形成する。ＶＷＦタンパク質は、非共有結合複合体としてＦＶＩＩＩ（９５〜９８％）と結合し、プロテアーゼ切断／活性からのＦＶＩＩの保護、重鎖と軽鎖の安定化およびスカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩ排除の防止により、ＦＶＩＩの半減期の半減期を延長する。ＶＷＦタンパク質は、ＶＷＦ受容体によるＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ複合体の排除およびｒＦＶＩＩＩＦｃの飲作用と再循環の防止により、ＦＶＩＩＩの半減期を制限することもできる。
【図２】ＶＷＦ：ＦＶＩＩＩヘテロダイマーコンストラクトの例の概略図である。左側のコンストラクトは、全長ＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメイン（配列番号７３のアミノ酸１〜４７７）を有し、配列番号７２の残基３３６と３７９のアラニン置換を含むＶＷＦ断片を示す。キメラタンパク質コンストラクト（ＦＶＩＩＩ０６４／０６５）は、リンカーで第１Ｆｃ領域に連結されたＶＷＦ断片のＣ末端を含み、ＦＶＩＩＩは第２Ｆｃ領域に連結され、第２Ｆｃ領域はリンカーでＶＷＦ断片のＮ末端にさらに連結されている（たとえば、式Ｃ−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ−Ｌ２−Ｈ２、ここでＶはＶＷＦ断片であり、ＣはＦＶＩＩＩであり、Ｈ１とＨ２はＦｃ領域であり、Ｌ１とＬ２は切断可能リンカーである）。図２ｂのコンストラクトは細胞内プロセスされたＶＷＦ：ＦＶＩＩＩヘテロダイマーコンストラクトであり、第２ＦｃとＶＷＦ断片のＮ末端の間のリンカーは切断されている。ＦＶＩＩＩ−０６４は、ＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメイン（Ｃ３３６ＡとＣ３７９が置換されている、配列番号７３のアミノ酸１〜４７７）を含む。ＦＶＩＩＩ−０６５は、ＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメイン（配列番号７３のアミノ酸１〜２７６）を含む。ＦＶＩＩＩ−１３６は、細胞内プロテアーゼ酵素でプロセスされ得るリンカーでＤ’Ｄ３断片−Ｆｃに連結されたＦＶＩＩＩＦｃを含む。ＦＶＩＩＩ−１３６が発現すると、酵素は第２Ｆｃ（ＦＶＩＩＩ−ＬＣに融合）とＶＷＦＤ’Ｄ３断片（第１Ｆｃに融合）の間のリンカーを切断し、ＦＶＩＩＩ−ＬＣに融合（または連結）したＦｃ領域はＶＷＦ断片に融合（連結）した第１Ｆｃと共有結合（たとえば、ジスルフィド結合）を形成する。ＦＶＩＩＩ−１４８は、Ｄ’Ｄ３断片を有する一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃである（Ｒ１６４５Ａ／Ｒ１６４８Ａ突然変異をＦＶＩＩＩ遺伝子に導入することによる一本鎖ＦＶＩＩＩ）。
【図３】ＶＷＦとＦｃの間の様々なリンカーの例を含むＶＷＦ：ＦＶＩＩＩヘテロダイマーコンストラクトの例の概略図である。コンストラクト（ＦＶＩＩＩ−０６４、ＦＶＩＩＩ−１５９、ＦＶＩＩＩ−１６０、ＦＶＩＩＩ−１７８およびＦＶＩＩＩ−１７９）は、式Ｃ−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ−Ｌ２−Ｈ２で表される共通の構造を有するが、異なるリンカーまたはアミノ酸置換の例を含む。図示のコンストラクトは、同一のＶＷＦ断片、すなわちＶＷＦのＤ’およびＤ３ドメイン（すなわち、アミノ酸Ｃ３３６ＡとＣ３７９Ａが置換されている配列番号７３のアミノ酸１〜４７７）を含む。コンストラクトＦＶＩＩＩ６４は、ＶＷＦ断片とＦｃ（すなわち、Ｈ２）の間に２０アミノ酸を有するトロンビン切断可能リンカー（すなわち、Ｌ２）を有する。コンストラクトＦＶＩＩＩ１５９は、ＶＷＦ断片とＦｃ（すなわち、Ｈ２）の間に３５アミノ酸を有するトロンビン切断可能リンカー（すなわち、Ｌ２）を有する。コンストラクトＦＶＩＩＩ１６０は、ＶＷＦ断片とＦｃ（すなわち、Ｈ２）の間に４８アミノ酸を有するトロンビン切断可能リンカー（すなわち、Ｌ２）を有する。コンストラクトＦＶＩＩＩ−１８０、ＦＶＩＩＩ−１８１およびＦＶＩＩＩ−１８２は、それぞれＫ２０９２Ａ突然変異をＦＶＩＩＩＣ１ドメインに、Ｋ２０９３Ａ突然変異をＦＶＩＩＩＣ１ドメインに、Ｋ２０９２Ａ／Ｋ２０９３Ａ突然変異をＦＶＩＩＩＣ１ドメインに含むＦＶＩＩＩ−１６０の誘導体である。コンストラクトＦＶＩＩＩ−１７８は、ＶＷＦ断片とＦｃ（すなわち、Ｈ２）の間に７３アミノ酸を有するトロンビン切断可能リンカー（すなわち、Ｌ２）を有する。コンストラクトＦＶＩＩＩ−１７９は、９８アミノ酸を有するトロンビン切断可能リンカー（すなわち、Ｌ２）をＶＷＦ断片とＦｃ（すなわち、Ｈ２）の間に有する。
【図４−１】ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦコンストラクトの例の概略図であり、ＶＷＦはＶＷＦのＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３断片であり、リンカーは切断部位、たとえば、トロンビン切断部位を含む可変長のリンカーであり、ＳＣＦＶＩＩＩはＲ１６４５Ａ／Ｒ１６４８Ａ置換を含む一本鎖ＦＶＩＩＩであり、Ｈは異種部分、たとえばイムノグロブリン定常領域またはその一部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を複合体化する部分および／またはＰＥＧ、アルブミンまたはアルブミン断片、アルブミン結合部分、ＨＰＡ配列、ポリシアル化部分および／またはポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）の部分および／またはＨＥＳ、またはＰＡＳ配列などであり、ＨＣＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩの重鎖であり、ＬＣＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩの軽鎖であり、Ｆｃはイムノグロブリン定常領域のＦｃ領域である。図４Ａは、ＶＷＦ−リンカー−ＳＣＦＶＩＩＩの式を有する。図４Ｂは、ＶＷＦ−リンカー−Ｈ−リンカー−ＳＣＦＶＩＩＩの式を有する。リンカー（ＶＷＦとＨの間の第１リンカーおよびＨとＳＣＦＶＩＩＩの間の第２リンカー）は、同一でも異なっていてもよい。図４Ｃは、ＶＷＦ−リンカー−ＳＣＦＶＩＩＩ−リンカー−Ｈの式を有する。リンカー（ＶＷＦとＳＣＦＶＩＩＩの間の第１リンカーおよびＳＣＦＶＩＩＩとＨの間の第２リンカー）は、同一でも異なっていてもよい。図４Ｄは、ＶＷＦ−リンカー−ＨＣＦＶＩＩＩ−Ｈ−リンカー−ＬＣＦＶＩＩＩの式を有する。リンカー（ＶＷＦとＨＣＦＶＩＩＩの間の第１リンカーおよびＨとＬＣＦＶＩＩＩの間の第２リンカー）は、同一でも異なっていてもよい。図４Ｅは、ＨＣＦＶＩＩＩ−Ｈ−ＬＣＦＶＩＩＩ−リンカー−第１Ｆｃ−リンカー−ＶＷＦ−リンカー−第２Ｆｃの式を有する。リンカー（ＬＣＦＶＩＩＩと第１Ｆｃの間の第１リンカー、第１ＦｃとＶＷＦの間の第２リンカーおよびＶＷＦと第２Ｆｃの間の第３リンカー）は、同一でも異なっていてもよい。リンカーは切断可能リンカーであり得る。たとえば、第１ＦｃとＶＷＦの間のリンカーは、そのリンカーのＮ末端および／またはＣ末端に切断部位を含む切断可能リンカーであり得る。第１Ｆｃと第２Ｆｃは同一でも異なっていてもよい。図４Ｆは、ＨＣＦＶＩＩＩ−Ｈ−ＬＣＦＶＩＩＩ−リンカー−第１Ｆｃ−リンカー−ＶＷＦ−リンカー−第２Ｆｃの式を有する。リンカー（ＬＣＦＶＩＩＩと第１Ｆｃの間の第１リンカー、第１ＦｃとＶＷＦの間の第２リンカーおよびＶＷＦと第２Ｆｃの間の第３リンカー）は、同一でも異なっていてもよい。１または複数のリンカーが切断可能リンカーであり得る。たとえば、第１ＦｃとＶＷＦの間のリンカーは、そのリンカーのＮ末端および／またはＣ末端に切断部位を含む切断可能リンカーであり得る。第１Ｆｃと第２Ｆｃは同一でも異なっていてもよい。図４Ｇは、ＳＣＦＶＩＩＩ−リンカー−Ｆｃ−リンカー−ＶＷＦ−Ｈ−リンカー−Ｆｃの式を有する。図４Ｈは、ペグ化またはヘシル化（Hesylated）ＳＣＦＶＩＩＩ−リンカー−Ｆｃ−リンカー−ＶＷＦ−Ｈ−リンカー−Ｆｃの式を有する。リンカー（ＳＣＦＶＩＩＩと第１Ｆｃの間の第１リンカー、第１ＦｃとＶＷＦの間の第２リンカーおよびＨと第２Ｆｃの間の第３リンカー）は、同一でも異なっていてもよい。１または複数のリンカーが切断可能リンカーであり得る。たとえば、第１ＦｃとＶＷＦの間のリンカーは、そのリンカーのＮ末端および／またはＣ末端に切断部位を含む切断可能リンカーであり得る。第１Ｆｃと第２Ｆｃは同一でも異なっていてもよい。
【図４−２】ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦコンストラクトの例の概略図であり、ＶＷＦはＶＷＦのＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３断片であり、リンカーは切断部位、たとえば、トロンビン切断部位を含む可変長のリンカーであり、ＳＣＦＶＩＩＩはＲ１６４５Ａ／Ｒ１６４８Ａ置換を含む一本鎖ＦＶＩＩＩであり、Ｈは異種部分、たとえばイムノグロブリン定常領域またはその一部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を複合体化する部分および／またはＰＥＧ、アルブミンまたはアルブミン断片、アルブミン結合部分、ＨＰＡ配列、ポリシアル化部分および／またはポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）の部分および／またはＨＥＳ、またはＰＡＳ配列などであり、ＨＣＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩの重鎖であり、ＬＣＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩの軽鎖であり、Ｆｃはイムノグロブリン定常領域のＦｃ領域である。図４Ａは、ＶＷＦ−リンカー−ＳＣＦＶＩＩＩの式を有する。図４Ｂは、ＶＷＦ−リンカー−Ｈ−リンカー−ＳＣＦＶＩＩＩの式を有する。リンカー（ＶＷＦとＨの間の第１リンカーおよびＨとＳＣＦＶＩＩＩの間の第２リンカー）は、同一でも異なっていてもよい。図４Ｃは、ＶＷＦ−リンカー−ＳＣＦＶＩＩＩ−リンカー−Ｈの式を有する。リンカー（ＶＷＦとＳＣＦＶＩＩＩの間の第１リンカーおよびＳＣＦＶＩＩＩとＨの間の第２リンカー）は、同一でも異なっていてもよい。図４Ｄは、ＶＷＦ−リンカー−ＨＣＦＶＩＩＩ−Ｈ−リンカー−ＬＣＦＶＩＩＩの式を有する。リンカー（ＶＷＦとＨＣＦＶＩＩＩの間の第１リンカーおよびＨとＬＣＦＶＩＩＩの間の第２リンカー）は、同一でも異なっていてもよい。図４Ｅは、ＨＣＦＶＩＩＩ−Ｈ−ＬＣＦＶＩＩＩ−リンカー−第１Ｆｃ−リンカー−ＶＷＦ−リンカー−第２Ｆｃの式を有する。リンカー（ＬＣＦＶＩＩＩと第１Ｆｃの間の第１リンカー、第１ＦｃとＶＷＦの間の第２リンカーおよびＶＷＦと第２Ｆｃの間の第３リンカー）は、同一でも異なっていてもよい。リンカーは切断可能リンカーであり得る。たとえば、第１ＦｃとＶＷＦの間のリンカーは、そのリンカーのＮ末端および／またはＣ末端に切断部位を含む切断可能リンカーであり得る。第１Ｆｃと第２Ｆｃは同一でも異なっていてもよい。図４Ｆは、ＨＣＦＶＩＩＩ−Ｈ−ＬＣＦＶＩＩＩ−リンカー−第１Ｆｃ−リンカー−ＶＷＦ−リンカー−第２Ｆｃの式を有する。リンカー（ＬＣＦＶＩＩＩと第１Ｆｃの間の第１リンカー、第１ＦｃとＶＷＦの間の第２リンカーおよびＶＷＦと第２Ｆｃの間の第３リンカー）は、同一でも異なっていてもよい。１または複数のリンカーが切断可能リンカーであり得る。たとえば、第１ＦｃとＶＷＦの間のリンカーは、そのリンカーのＮ末端および／またはＣ末端に切断部位を含む切断可能リンカーであり得る。第１Ｆｃと第２Ｆｃは同一でも異なっていてもよい。図４Ｇは、ＳＣＦＶＩＩＩ−リンカー−Ｆｃ−リンカー−ＶＷＦ−Ｈ−リンカー−Ｆｃの式を有する。図４Ｈは、ペグ化またはヘシル化（Hesylated）ＳＣＦＶＩＩＩ−リンカー−Ｆｃ−リンカー−ＶＷＦ−Ｈ−リンカー−Ｆｃの式を有する。リンカー（ＳＣＦＶＩＩＩと第１Ｆｃの間の第１リンカー、第１ＦｃとＶＷＦの間の第２リンカーおよびＨと第２Ｆｃの間の第３リンカー）は、同一でも異なっていてもよい。１または複数のリンカーが切断可能リンカーであり得る。たとえば、第１ＦｃとＶＷＦの間のリンカーは、そのリンカーのＮ末端および／またはＣ末端に切断部位を含む切断可能リンカーであり得る。第１Ｆｃと第２Ｆｃは同一でも異なっていてもよい。
【図５】ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦヘテロダイマー同時形質移入系の概略図である。コンストラクトＦＶＩＩＩ−１５５は、Ｆｃ領域に連結した全長ＦＶＩＩＩ配列（アラニン残基がアルギニン残基と１６４５と１６４８で置き換わっている）を含む。ＶＷＦ−０３１は、トロンビン切断可能リンカーで別のＦｃ領域に連結されているＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３断片（アラニン残基がシステイン残基と３３６と３７９で置き換わっている）を含む。細胞内プロセシング後、コンストラクトＦＶＩＩＩ−１５５は、一方のＦｃ断片に融合された全長一本鎖ＦＶＩＩＩ（ＳＣＦＶＩＩＩ）を産生し、コンストラクトＶＷＦ−０３１は、他方のＦｃ断片に連結された４７７アミノ酸Ｄ’Ｄ３断片を産生する。ＳＣＦＶＩＩＩまたはＤ’Ｄ３断片に連結されたＦｃ断片の間に２つの共有結合が形成され得、それによって、所望の最終生成物の主な特徴であるＦＶＩＩＩとＤ’Ｄ３の共有結合が可能になる。
【図６】図６はＶＷＦ−００９の非還元および還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３  １−２７６アミノ酸×６ＨＩＳ）であり、ＶＷＦ−００９がモノマーとして存在することを示す。プロセスなしは、プロペプチド（Ｄ１Ｄ２ドメイン）を有するＶＶＦ−００９を意味する。
【図７】図７は、ＶＷＦ−００２（Ｄ’Ｄ３  １−４７７アミノ酸×６ｈｉｓ）またはＶＷＦ−０１０（Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３  １−４７７アミノ酸×６ｈｉｓ）の非還元および還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥであり、ＶＷＦ−００２がモノマーとして存在し、ＶＷＦ−０１０がダイマーとして存在するのを示す。
【図８】図２（ｂ）に示されるＦＶＩＩＩ−ＶＷＦヘテロダイマーのトロンビン消化を示す。レーン１はマーカーを示す。レーン２はトロンビンなしのｒＦＶＩＩＩ−Ｆｃである。レーン３はｒＦＶＩＩＩ−Ｆｃとトロンビンである。レーン５はＦＶＩＩＩＦｃ−ＶＷＦである。レーン６はＦＶＩＩＩＦｃ−ＶＷＦとトロンビンを示す。Ａ１はＦＶＩＩＩのＡ１ドメインを指し、Ａ２はＦＶＩＩＩのＡ２ドメインを指し、Δａ３ＬＣはＦＶＩＩＩの軽鎖を指す。
【図９】図９Ａ、Ｂは、ＦＶＩＩＩ比色アッセイで測定したＦＶＩＩＩ活性を示す。図９Ａは、ＨｅｍＡマウスにおけるｒＦＶＩＩＩとｒＦＶＩＩＩＦｃの薬物動態プロファイルを示す。図９Ｂは、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦダブルノックアウト（ＤＫＯ）マウスにおけるｒＦＶＩＩＩとｒＦＶＩＩＩＦｃの薬物動態プロファイルを示す。Ｙ軸はＦＶＩＩＩ活性をｍＩＵ／ｍＬで示し、Ｘ軸は時間を示す。
【図１０Ａ】プラスミド注射４８時間後のｍＦＶＩＩＩ血漿レベル（ｍＩＵ／ｍＬ）およびＶＷＦ発現レベル（ｎＭ／ｍＬ）で示されるＤ’Ｄ３断片によるＦＶＩＩＩ保護を示す。ＦＶＩＩＩ保護に用いられるＶＷＦ断片は、ＶＷＦ−００１（２７６アミノ酸、モノマー）、ＶＷＦ−００９（２７６アミノ酸、モノマー）、ＶＷＦ−００２（４７７アミノ酸、モノマー）、ＶＷＦ−０１０（４７７アミノ酸、ダイマー）、ＶＷＦ−００３（５１１アミノ酸、モノマー）、ＶＷＦ−０１１（５１１アミノ酸、ダイマー）、ＶＷＦ−００４（７１６アミノ酸、モノマー）、ＶＷＦ−０１２（７１６アミノ酸、ダイマー）、ＶＷＦ−００６およびＶＷＦ−００８である。
【図１０Ｂ】同上
【図１１】ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおけるＤ’Ｄ３断片と共投与した場合のｒＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの薬物動態プロファイルを示す。図１１Ａは、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおけるｒＢＤＤ−ＦＶＩＩＩとＶＷＦ−００２、またはｒＢＤＤ−ＦＶＩＩＩとＶＷＦ−０１０の共投与、またはｒＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ単独投与後のＦＶＩＩＩ比色アッセイで測定されたＦＶＩＩＩ活性（ｍＩＵ／ｍＬ）を示す。図１１Ｂは、投与後のＶＷＦ−００２とＶＷＦ−０１０の血漿レベル（ｎｇ／ｍＬ）を示す。Ｘ軸は、時間を時間で表す。
【図１２】ＶＷＦＤ’Ｄ３発現マウスにおけるｒＦＶＩＩＩＦｃの薬物動態プロファイルを示す。図１２Ａは、プラスミドＤＮＡをコードするＤ’Ｄ３ドメインの水圧注入（ＨＤＩ）（−５日目）、ｒＦＶＩＩＩＦｃの静脈内投与（０日目）、および薬物動態試料回収（０日目〜３日目）の時間軸を示す。図１２Ｂは、Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメイン（４７７アミノ酸）のＨＤＩを受けたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウス（円）とシステイン置換を有するＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメイン（４７７アミノ酸）のＨＤＩを受けたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウス（矩形）の比色アッセイで測定されたｒＦＶＩＩＩＦｃ注射後の血漿ＦＶＩＩＩ活性（ｍＩＵ／ｍＬ）を示す。Ｄ’Ｄ３ドメインのＨＤＩを受けなかった対照マウスのＦＶＩＩＩ活性を三角形で示す。図１０Ｃは、Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ダイマーまたはＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３モノマーＤＮＡコンストラクトのＨＤＩ投与後のＤ’Ｄ３血漿レベル（ｎｇ／ｍＬ）を示す。Ｘ軸は、時間を時間で表す。
【図１３】ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦＤＫＯマウスにおけるＨＤＩによるＤ’Ｄ３−Ｆｃリンカー選択を示す。異なる長さのリンカー（２０アミノ酸（ＦＶＩＩＩ−０６４）、３５アミノ酸（ＦＶＩＩＩ−１５９）または４８アミノ酸（ＦＶＩＩＩ−１６０））Ｄ’Ｄ３ドメインとＦｃ領域の間に挿入した。ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスのＨＤＩ後ＦＶＩＩＩ比色アッセイでＦＶＩＩＩ活性（ｍＩＵ／ｍｌ）を測定した。
【図１４】ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦＤＫＯマウスにおける一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ／Ｄ’Ｄ３ヘテロダイマーのＨＤＩを示す。プロセスされた（二本鎖）ｒＦＶＩＩＩＦｃ−Ｄ’Ｄ３（ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１３６）および一本鎖ｒＦＶＩＩＩＦｃ−Ｄ’Ｄ３（ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１４８）のＦＶＩＩＩ活性をＨＤＩの２４時間後および４８時間後測定した。
【図１５】Ｏｃｔｅｔアッセイによる固定化ｈＶＷＦに対するＦＶＩＩＩ−１５５／ＶＷＦ−０３１ヘテロダイマーの結合親和性を示す図である。ＦＶＩＩＩＦｃ、ＦＶＩＩＩおよびＩｇＧは対照としても使用された。ｘ軸は時間を秒で示し、ｙ軸は結合をナノメートル（ｎｍ）で示す。
【図１６】ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ欠乏（ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯ）マウスにおけるＦＶＩＩＩ−１５５／ＶＷＦ−０３１薬物動態を示す図である。ｘ軸は、時間を時間で示し、ｙ軸はＦＶＩＩＩのインプットに対する回収をパーセントで示す。
【図１７】ＶＷＦ断片コンストラクトの例の概略図であり、ＶＷＦはＶＷＦのＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３断片であり、リンカーは切断部位、たとえば、トロンビン切断部位を含む可変長のリンカーであり、Ｈは異種部分、たとえばイムノグロブリン定常領域またはその一部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を複合体化する部分および／またはＰＥＧ、アルブミンまたはアルブミン断片、アルブミン結合部分、ＨＡＰ配列、ポリシアル化部分および／またはポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）の部分および／またはＨＥＳ、またはＰＡＳ配列などであり、ＦｃはイムノグロブリンのＦｃ領域である。図１７Ａは、Ｄ１Ｄ２−Ｄ’部分（partial）Ｄ３−Ｈ−部分Ｄ３−リンカー−Ｆｃの式を有する。図１７Ｂは、Ｄ１Ｄ２−部分Ｄ’−Ｈ−部分Ｄ’Ｄ３−リカー−Ｆｃの式を有する。図１７Ｃは、Ｄ１Ｄ２−ペグ化またはヘシル化（Hesylated）Ｄ’Ｄ３−リンカー−Ｆｃの式を有する。リンカーは随意に切断され得る。
【図１８Ａ】ＦＶＩＩＩＦｃがＨｅｍＡ（ひし形）およびＤＫＯ（正方形）血漿の両方で経時的にＦＶＩＩＩ活性を失うのを示す。ＦＶＩＩＩ活性は、比色アッセイで測定される。Ｘ軸は時間を時間で示し、ｙ軸は相対的な活性を示す。
【図１８Ｂ】ＦＶＩＩＩ活性の喪失が、重鎖（ＨＣ）の解離または分解によることを示す。左側のパネルはバイオラッド４〜１５％ゲル中ヒツジ抗ＦＶＩＩＩポリクローナル抗体を用いての免疫沈降アッセイを示す。ゲルは還元され、バイオラッドシステムで画像化される。レーン１はバイオラッド未染色マーカーを示し、レーン２はＦＶＩＩＩＦｃとＰＢＳを示し、レーン３はＦＶＩＩＩＦｃとＤＫＯ血漿を示し、レーン５はヒツジ抗ＦＶＩＩＩポリクローナル抗体のみを示す。右側のパネルはＦＶＩＩＩ抗重鎖抗体（ＧＭＡ０１２）を用いてのゲルのウェスタン分析を示す。レーン１はバイオラッド未染色マーカーを示し、レーン２はＦＶＩＩＩＦｃとＰＢＳを示し、レーン３はＦＶＩＩＩＦｃとＤＫＯ血漿を示し、レーン４はヒツジ抗ＦＶＩＩＩポリクローナル抗体のみを示す。
【図１９】比色アッセイによるＤＫＯマウス血漿（左側パネル）およびＨｅｍＡマウス血漿（右側パネル）における時間関数としての野生型ＦＶＩＩＩＦｃ（円）、ｓｃＦＶＩＩＩＦｃ（一本鎖ＦＶＩＩＩ）（黒三角形）またはＦＶＩＩＩ：ＶＷＦヘテロダイマー（たとえば、ＦＶＩＩＩ１５５／ＶＷＦ３１）（白三角形）のＦＶＩＩＩ活性を示す。Ｙ軸は、相対的なＦＶＩＩＩ活性を示す。野生型ＦＶＩＩＩＦｃは、ＦＶＩＩＩの二本鎖（すなわち、ＦＶＩＩＩ重鎖とＦＶＩＩＩ軽鎖が非共有結合的に一緒に保持されている）を含むので、ＦＶＩＩＩ重鎖、Ｆｃと融合したＦＶＩＩＩ軽鎖およびＦｃのみの３本の鎖を有する。ＳｃＦＶＩＩＩＦｃは、ＦＶＩＩＩ一本鎖を含むので、Ｆｃと融合した一本鎖ＦＶＩＩＩの１本と、Ｆｃのみの１本の２本の鎖を有する。ＦＶＩＩＩ：ＶＷＦヘテロダイマー（たとえば、ＦＶＩＩＩ１５５／ＶＷＦ０３１）は、Ｆｃと融合した一本鎖ＦＶＩＩＩと、Ｆｃと融合したＶＷＦ断片（Ｄ’Ｄ３）を含む。
【図２０】異なる濃度のＰＣ５またはＰＡＣＥ（フーリン）によるＶＷＦ断片（たとえば、ＶＷＦ−０３１（Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３Ｆｃ））のＤ１Ｄ２ドメインのプロセシングを示す。Ｄ１Ｄ２プロセシングはバイオラッドイメージャーにより還元条件でバイオラッド４〜１５％ゲル上に示される。レーン１はＶＷＦ０３１のみを示し、レーン２はＰＣ５のみを示し、レーン３はＰＡＣＥのみを示し、レーン４はＶＷＦ０３１と２．５％ＰＣ５を示し、レーン５はＶＷＦ０３１と５％ＰＣ５を示し、レーン６はＶＷＦ０３１と７．５％ＰＣ５を示し、レーン７はＶＷＦ０３１と１０％ＰＣ５を示し、レーン８はＶＷＦ０３１と２．５％ＰＡＣＥを示し、レーン９はＶＷＦ０３１と５％ＰＡＣＥを示し、レーン１０は７．５％ＶＷＦ０３１を示し、レーン１１はＶＷＦ０３１と１０％ＰＡＣＥを示す。
【図２１Ａ】ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ｏｃｔｅｔ装置によるＦＶＩＩＩ：ＶＷＦヘテロダイマー（たとえば、ＦＶＩＩＩ−１５５／ＶＷＦ−０３１）結合アッセイを示す。アッセイでは、ＡＰＳセンサーを用いて全長ＶＷＦを捕捉した。全長ＶＷＦへのＦＶＩＩＩＦｃとＦＶＩＩＩの結合を左下のパネルに示す。ＦＶＩＩＩＹ１６８０（ＶＷＦに親和性のないミュータント）とＦＶＩＩＩ：ＶＷＦヘテロダイマー（ＦＶＩＩＩ１５５／ＶＷＦ０３１）が結合しないことが右下のパネルに示されている。
【図２１Ｂ】ＦＶＩＩＩ：ＶＷＦヘテロダイマー（たとえば、ＦＶＩＩＩ−１５５／ＶＷＦ−０３１）の別の結合アッセイを示す。このアッセイでは、コンストラクト（ＶＷＦ０３１コンストラクト、ＦＶＩＩＩ−１５５／ＶＷＦ０３１またはＦＶＩＩＩ）がプロテインＧセンサー上に固定化された。コンストラクトとＦＶＩＩＩの結合が測定された。
【図２２】表面プラスマ共鳴（surface plasma resonance）実験で測定されたＶＷＦ  Ｄ’Ｄ３ドメインとＦＶＩＩＩ分子の結合親和性を示す。ＶＷＦ０３１コンストラクト（１００ＲＵ）は１０００ＲＵ抗ヒトＩｇＧにより補足された。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、１：１適合（ｆｉｔ）の単回動態モードに当てはめられた。全数は４であった。
【図２３】ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスに投与された場合のＦＶＩＩＩＦｃ／ＶＷＦヘテロダイマーコンストラクトの異なるリンカー長が薬物動態に及ぼす影響を示す。３つの異なるリンカー（４８アミノ酸、７３アミノ酸または９８アミノ酸）をＤ’Ｄ３とＦｃの間に挿入した、すなわちＶＷＦ０３１、ＶＷＦ０３５およびＶＷＦ０３６である。５分値（％）に標準化したＦＶＩＩＩ活性をＹ軸に示す。
【図２４−１】ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩのソルターゼ連結の例を示す。図２４Ａ）は、（１）Ｃ末端でソルターゼ認識モチーフ（たとえば、ＬＰＸＴＧ）と融合したＶＷＦ断片および（２）Ｎ末端にグリシン（ｎ）を有するＦＶＩＩＩの、２つの連結コンストラクトを示す。ソルターゼと反応後、ＶＷＦ断片とソルターゼ認識モチーフはＦＶＩＩＩのＮ末端に連結する。図２４Ｂ）は、（１）Ｃ末端でソルターゼ認識モチーフと融合したＦＶＩＩＩおよび（２）Ｎ末端にグリシン（ｎ）を有するＶＷＦ断片の、２つの連結コンストラクトを示す。ソルターゼと反応後、ＦＶＩＩＩとソルターゼ認識モチーフはＶＷＦ断片のＮ末端でＶＷＦ断片に連結する。図２４Ｃ）は、（１）可変長リンカーによりソルターゼ認識モチーフと融合したＶＷＦ断片および（２）Ｎ末端でグリシン（ｎ）と融合したＦＶＩＩＩの、２つの連結コンストラクトを示す。ソルターゼと反応後、リンカーによりソルターゼ認識モチーフと融合されたＶＷＦはＦＶＩＩＩのＮ末端に連結する。図２４Ｄ）は、（１）可変長リンカーによりソルターゼ認識モチーフと融合したＦＶＩＩＩおよび（２）Ｎ末端でグリシン（ｎ）と融合したＦＶＩＩＩの、２つの連結コンストラクトを示す。ソルターゼと反応後、リンカーによりソルターゼ認識モチーフと融合されたＦＶＩＩＩはＶＷＦ断片のＮ末端に連結する。図２４Ｅ）は、可変長リンカーによりソルターゼ認識モチーフに融合されたＶＷＦ断片を含む連結コンストラクトを示し、ここでソルターゼ認識モチーフもまた、可変長リンカーによりＦｃに融合されたプロテアーゼ切断部位（たとえば，トロンビン切断部位）に融合されている。
【図２４−２】ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩのソルターゼ連結の例を示す。図２４Ａ）は、（１）Ｃ末端でソルターゼ認識モチーフ（たとえば、ＬＰＸＴＧ）と融合したＶＷＦ断片および（２）Ｎ末端にグリシン（ｎ）を有するＦＶＩＩＩの、２つの連結コンストラクトを示す。ソルターゼと反応後、ＶＷＦ断片とソルターゼ認識モチーフはＦＶＩＩＩのＮ末端に連結する。図２４Ｂ）は、（１）Ｃ末端でソルターゼ認識モチーフと融合したＦＶＩＩＩおよび（２）Ｎ末端にグリシン（ｎ）を有するＶＷＦ断片の、２つの連結コンストラクトを示す。ソルターゼと反応後、ＦＶＩＩＩとソルターゼ認識モチーフはＶＷＦ断片のＮ末端でＶＷＦ断片に連結する。図２４Ｃ）は、（１）可変長リンカーによりソルターゼ認識モチーフと融合したＶＷＦ断片および（２）Ｎ末端でグリシン（ｎ）と融合したＦＶＩＩＩの、２つの連結コンストラクトを示す。ソルターゼと反応後、リンカーによりソルターゼ認識モチーフと融合されたＶＷＦはＦＶＩＩＩのＮ末端に連結する。図２４Ｄ）は、（１）可変長リンカーによりソルターゼ認識モチーフと融合したＦＶＩＩＩおよび（２）Ｎ末端でグリシン（ｎ）と融合したＦＶＩＩＩの、２つの連結コンストラクトを示す。ソルターゼと反応後、リンカーによりソルターゼ認識モチーフと融合されたＦＶＩＩＩはＶＷＦ断片のＮ末端に連結する。図２４Ｅ）は、可変長リンカーによりソルターゼ認識モチーフに融合されたＶＷＦ断片を含む連結コンストラクトを示し、ここでソルターゼ認識モチーフもまた、可変長リンカーによりＦｃに融合されたプロテアーゼ切断部位（たとえば，トロンビン切断部位）に融合されている。
【図２５】ＦＶＩＩＩ１５５とＦＶＩＩＩ１９８の概略的比較を示す。ＦＶＩＩＩ１５５は一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃをコードする。ＦＶＩＩＩ１９８は一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ分子２２６Ｎ６を含む部分Ｂドメインである。２２６は、ＦＶＩＩＩ  ＢドメインのＮ末端の２２６アミノ酸を表し、Ｎ６はＢドメインの６つのＮグリコシル化部位を表す。
【図２６】図２６Ａ）はＤＫＯ血漿中のＦＶＩＩＩ１５５とＦＶＩＩＩ１９８の相対的活性を時間関数として測定した安定性アッセイを示す。図からわかるように、ＦＶＩＩＩ１９８中の部分Ｂドメインの存在により、ＦＶＩＩＩ１５５と比較して一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃの安定性が増大した；図２６Ｂ）は、ＤＫＯマウスにおけるＦＶＩＩＩ１９８、ＦＶＩＩＩ１５５および二本鎖（ｄｃＦＶＩＩＩＦｃ）の半減期の比較を示す。図からわかるように、一本鎖ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ１５５）の半減期は、二本鎖ＦＶＩＩＩの１．５倍であった。２６６Ｎ６  Ｂドメイン（ＦＶＩＩＩ１９８）を有する一本鎖ＦＶＩＩＩの半減期は、さらに１．５倍増加した。グラフは、時間関数としてのＦＶＩＩＩの５分値に対する回収（％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
定義
ある実体に先行する「ａ」または「ａｎ」という用語は、その実体の１または複数を指し、たとえば、「ａ  ヌクレオチド配列」は、１または複数のヌクレオチド配列を表すものと理解される。したがって、「ａ（またはａｎ）」、「１または複数」および「少なくとも１」は、本明細書では交換可能に使用され得る。
【００３９】
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、単数形ならびに複数形の核酸を包含するものとし、単離された核酸分子またはコンストラクト、たとえばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）やプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合または非一般的な結合（たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）中に見出されるようなアミド結合）を含む。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１または複数の核酸セグメント、たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドは、天然環境から取り除かれた核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡとする。たとえば、ベクターに含まれる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されたと考えられる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞内で維持されるか、または溶液中の他のポリヌクレオチドから（部分的または実質的に）精製される組換えポリヌクレオチドが含まれる。単離ＲＮＡ分子は、インビボまたはインビトロで本発明のポリヌクレオチドのＲＮＡ転写物を含む。本発明による単離ポリヌクレオチドまたは核酸は、合成された分子をさらに含む。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位または転写終了シグナルなどの調節因子を含み得る。
【００４０】
本明細書では、「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部分である。「終始コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）は典型的にはアミノ酸に翻訳されないがコード領域の一部とされるのに対し、いかなる隣接配列、たとえばプロモーター、リボソーム結合部位、転写終結区、イントロンなどもコード領域の一部ではない。コード領域の境界は、典型的には、得られたポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端のスタートコドンと、得られたポリペプチドのカルボキシル末端をコードする３’末端により決定される。本発明の２つ以上のコード領域が、１つのポリヌクレオチドコンストラクトに、たとえば１つのベクター上に、または別のポリヌクレオチドコンストラクトに、たとえば別の（異なる）ベクター上に存在し得る。したがって、１つのベクターはコード領域を１つだけ含んでも、または２つ以上のコード領域を含んでもよく、たとえば以下に記載するように、１つのベクターが結合ドメイン−Ａと結合ドメイン−Ｂを別々にコードできる、ということになる。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、本発明の結合ドメインをコードする核酸に融合した、または融合していない異種コード領域をコードし得る。異種コード領域は、限定ではないが、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインなどの特化した因子またはモチーフを含む。
【００４１】
哺乳動物細胞が分泌する、ある特定のタンパク質は、粗面小胞体全体に伸長するタンパク質鎖の輸出が開始されると成熟タンパク質から切断される分泌シグナルペプチドと関連付けられる。当業者であれば、シグナルペプチドは一般にポリペプチドのＮ末端に融合され、完全または「全長」ポリペプチドから切断されて分泌または「成熟」型のポリペプチドを産生することがわかる。ある特定の実施形態では、ネイティブのシグナルペプチド、たとえばイムノグロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、またはそれと機能的に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、たとえばヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼシグナルペプチドまたはその機能的誘導体が使用され得る。
【００４２】
「下流」という用語は、基準ヌクレオチド配列の３’側に配置されているヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、下流ヌクレオチド配列は、転写開始点に続く配列に関する。たとえば、遺伝子の翻訳開始コドンは転写開始部位の下流に位置する。
【００４３】
「上流」という用語は、基準ヌクレオチド配列の５’側に配置されているヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、上流ヌクレオチド配列は、コード領域の５’側に配置された配列または転写開始点に続く配列に関する。たとえば、ほとんどのプロモーターは転写開始部位の上流に位置する。
【００４４】
本明細書では、「調節領域」という用語は、関連のコード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性または翻訳に影響する、コード領域の上流（５’非翻訳配列）、内部、または下流（３’非翻訳配列）に配置されたヌクレオチド配列を指す。調節領域は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化識別配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含み得る。コード領域が真核生物細胞内で発現することが意図される場合、ポリアデニル化シグナルと転写終結配列は通常はコード配列の３’側に配置される。
【００４５】
遺伝子産物、たとえばポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１または複数のコード領域に機能的に結合するプロモーターおよび／または他の転写または翻訳制御因子を含み得る。機能的結合では、遺伝子産物、たとえばポリペプチドのコード領域が、調節領域（複数可）の影響または制御下で遺伝子産物が発現するように、１または複数の調節領域と結合している。たとえば、コード領域とプロモーターは、プロモーター機能の誘導により、該コード領域にコードされる遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写がもたらされるならば、および、プロモーターとコード領域の間の連結の性質が、プロモーターが該遺伝子産物の発現を指令する能力を阻害しなければ、またはＤＮＡ鋳型が転写される能力を阻害しなければ、「機能的に結合」している。プロモーターを除く他の転写制御因子、たとえばエンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終結シグナルも、コード領域と機能的に連結して遺伝子産物の発現を指令できる。
【００４６】
さまざまな転写制御領域が当業者には既知である。これらには、限定ではないが、脊椎動物細胞で機能する転写制御領域、たとえば限定ではないが、サイトメガロウイルス類（イントロンＡとつながった最初期プロモーター）、サルウイルス４０（初期プロモーター）およびレトロウイルス類（たとえばラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメントが含まれる。他の転写制御領域は、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβグロブリンなど脊椎動物遺伝子由来のもの、ならびに真核生物細胞における遺伝子発現を制御できる他の配列を含む。追加の適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導プロモーター（たとえば、インターフェロンまたはインターロイキンにより誘導されるプロモーター）を含む。
【００４７】
同様に、さまざまな翻訳制御因子が当業者には既知である。これらは、限定ではないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、およびピコルナウイルス類由来の因子（特に配列内リボソーム進入部位すなわちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）を含む。
【００４８】
本明細書では、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、たとえばＲＮＡまたはポリペプチドを産生する過程を指す。発現は、限定ではないが、ポリヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはその他任意のＲＮＡ産物への転写、およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を含む。発現により「遺伝子産物」が産生される。本明細書では、遺伝子産物は、核酸、たとえば遺伝子の転写により産生されたメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されたポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載される遺伝子産物は、たとえばポリアデニル化またはスプライシングなどの転写後修飾された核酸、またはたとえばメチル化、グリコシル化、脂質添加、他のタンパク質サブユニットとの結合、またはタンパク質切断などの翻訳後修飾されたポリペプチドをさらに含む。
【００４９】
「ベクター」は核酸を宿主細胞にクローニングおよび／または移入するための任意のビヒクルを指す。ベクターは、別の核酸セグメントを付着させて、付着したセグメントの複製を生じさせ得るレプリコンであり得る。「レプリコン」は、インビボで複製の自律単位として機能する、すなわち、それ自体の制御下での複製が可能な、任意の遺伝因子（たとえばプラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を指す。「ベクター」という用語は、インビトロ、エックスビボまたはインビボで核酸を細胞に導入するウイルスビヒクルおよび非ウイルスビヒクルの両方を含む。たとえば、プラスミド、修飾真核生物ウイルスまたは修飾細菌ウイルスを含む多数のベクターが当技術分野では知られ使用されている。適切なベクターへのポリヌクレオチドの挿入は、適当なポリヌクレオチド断片を相補的付着末端を有する選択されたベクターに結合させることで達成され得る。
【００５０】
ベクターは、ベクターを組み込まれた細胞の選択または特定を可能にする選択マーカーまたはレポーターをコードするように操作され得る。選択マーカーまたはレポーターの発現により、ベクターに含まれる他のコード領域を組込み発現する宿主細胞の特定および／または選択が可能になる。当技術分野で知られ使用されている選択マーカー遺伝子の例としては、次のものが挙げられる：アンピリシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどの耐性を与える遺伝子ならびに；表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわちアントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子など。当技術分野で知られ使用されているレポーターの例としては、次のものが挙げられる：ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）など。選択マーカーはレポーターとも見なされ得る。
【００５１】
「プラスミド」という用語は、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子をしばしば担持し、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態をとる染色体外因子を指す。そのような因子は、任意の供給源に由来する、選択された遺伝子産物を得るための適当な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞内に導入することができる、多くのヌクレオチド配列が連結または組換えされたユニークな構成になっている、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡの自律複製配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列、線状、環状もしくは高次コイル状であり得る。
【００５２】
使用され得る真核生物ウイルスベクターは、限定ではないが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルス、たとえば、ワクチニアウイルスベクター、バキュロウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターを含む。非ウイルスベクターは、プラスミド、リポソーム、帯電脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−タンパク質複合体および生体高分子を含む。
【００５３】
「クローニングベクター」は、たとえばプラスミド、ファージまたはコスミドなどの、別の核酸セグメントを付着させて付着したセグメントの複製を可能にする、複製開始点を含み連続的に（sequentially）複製する核酸の単位長さである「レプリコン」を指す。特定のクローニングベクターは、一細胞タイプで複製が可能な、たとえば細菌であり、別の、たとえば真核生物細胞で発現が可能である。クローニングベクターは、典型的には、目的の核酸配列を挿入するためのベクターおよび／または１もしくは複数の多重クローニング部位を含む細胞の選択に使用され得る１または複数の配列を含む。
【００５４】
「発現ベクター」という用語は、宿主細胞に挿入された核酸配列が挿入後発現できるように設計されたビヒクルを指す。挿入された核酸配列は、上述のように、調節領域に機能的に結合して配置される。
【００５５】
ベクターは、当技術分野で既知の方法、たとえば、形質移入、電気穿孔、微量注入、形質移入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃またはＤＮＡベクタートランスポーターの使用により、宿主細胞に挿入される。
【００５６】
「培養」「培養する」「培養すること」は、本発明では、細胞成長または分割を可能にするインビトロ条件下で細胞をインキュベートすることかまたは細胞が生きている状態を維持することを意味する。本発明では、「培養された細胞」は、インビトロで増殖された細胞を意味する。
【００５７】
本明細書では、「ポリペプチド」は、１個の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含するものとし、アミノ結合（ペプチド結合としても知られる）で線状に連結されたモノマー（アミノ酸）でできた分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、任意のアミノ酸の鎖または２つ以上のアミノ酸の鎖を指し、生成物の特定の長さは意味しない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」またはその他本明細書でアミノ酸の鎖または２つ以上のアミノ酸の鎖を指して使用される用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」という用語はこれらのすべての用語の代わりに、または交換可能に使用され得る。「ポリペプチド」という用語は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、または非天然アミノ酸による修飾を含むがそれらに限定はされない発現後修飾をされたポリペプチドの生成物も指すものとする。ポリペプチドは、天然生体供給源由来または組換え技術により産生され得るが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されない。化学合成を含むあらゆる方法で生成され得る。
【００５８】
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、バリアントまたは誘導体は、その自然な環境には存在していないポリペプチドを指す。特定の精製レベルは要求されない。たとえば、単離されたポリペプチドは、その未変性または自然の環境から単純に取り除かれ得る。宿主細胞内で発現した組換え産生されたポリペプチドやタンパク質は、任意適切な手法で分離され、分画され、または部分的もしくは実質的に精製された未変性または組換えポリペプチドと同様に、本発明の目的で単離されたとみなされる。
【００５９】
本発明には、ポリペプチドの断片またはバリアント、およびそれらの任意の組合せも含まれる。「断片」または「バリアント」という用語は、本発明のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子に言及するとき、基準ポリペプチドの少なくとも一部の特徴（たとえば、ＦｃＲｎ結合ドメインまたはＦｃバリアントとのＦｃＲｎ結合親和性、ＦＶＩＩＩバリアントの凝固活性またはＶＷＦ断片のＦＶＩＩＩ結合活性）を保持するあらゆるポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片は、本明細書で別途記載の特異的抗体断片に加えてタンパク質分解断片ならびに欠失断片を含むが、天然の全長ポリペプチド（または成熟ポリペプチド）は含まない。本発明のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子のバリアントは、上述の断片を含み、アミノ酸置換、欠失または挿入により改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。天然バリアントでも非天然バリアントでもよい。非天然バリアントは、当技術分野で既知の変異誘発技法を用いて産生され得る。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸の置換、欠失または付加を含み得る。
【００６０】
本明細書で使用される「ＶＷＦ断片（単数または複数）」は、ＦＶＩＩＩと相互作用し、ＦＶＩＩＩが通常全長ＶＷＦにより与えられる特性、たとえば、ＦＶＩＩＩａに対する早発活性化の防止、早期タンパク質分解の防止、早期排除をもたらし得るリン脂質膜との結合の防止、ＶＷＦに結合したＦＶＩＩＩではなく裸のＦＶＩＩＩを結合し得るＦＶＩＩＩ排除レセプターとの結合の防止および／またはＦＶＩＩＩ重鎖と軽鎖相互作用の安定化を少なくとも１または複数保持する、あらゆるＶＷＦ断片を意味する。本明細書では、「ＶＷＦ断片」という用語は、全長または成熟ＶＷＦタンパク質を含まない。特定の実施形態では、本明細書では、「ＶＷＦ断片」はＶＷＦタンパク質のＤ’ドメインとＤ３ドメインを含むが、ＶＷＦタンパク質のＡ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメインおよびＣＫドメインは含まない。
【００６１】
「半減期制限因子」または「ＦＶＩＩＩ半減期制限因子」は、本明細書では、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が野生型ＦＶＩＩＩよりも１．５倍または２倍を超えて延長されないようにする因子を意味する（たとえば、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）またはＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標））。たとえば、全長または成熟ＶＷＦは、ＦＶＩＩＩとＶＷＦの複合体が１または複数のＶＷＦ排除経路により系から排除されるのを誘導することで、ＦＶＩＩＩ半減期制限因子として作用し得る。一例では、内因性ＶＷＦは、ＦＶＩＩＩ半減期制限因子である。別の例では、ＦＶＩＩＩタンパク質に非共有結合的に結合した全長組換えＶＷＦ分子はＦＶＩＩＩ半減期制限因子である。
【００６２】
本明細書では、「内因性ＶＷＦ」という用語は、血漿中に自然に存在するＶＷＦ分子を意味する。内因性ＶＷＦ分子はマルチマーであり得るが、モノマーまたはダイマーでもあり得る。血漿中の内因性ＶＷＦは、ＦＶＩＩＩに結合してＦＶＩＩＩと非共有結合複合体を形成する。
【００６３】
「保存的アミノ酸置換」では、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている。塩基性側鎖（たとえば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーが当技術分野で定義されている。したがって、ポリペプチド中のアミノ酸が同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸で置き換えられている場合、その置換は保存的とみなされる。別の実施形態では、一連なりのアミノ酸は、側鎖ファミリーメンバーの順および／または組成が異なる構造的に類似の一連なりで保存的に置換され得る。
【００６４】
当技術分野で知られるように、２つのポリペプチド間の「配列同一性」は、第１ポリペプチドのアミノ酸配列を第２ポリペプチドの配列と比較することで決定される。本明細書では、限定ではないがＢＥＳＴＦＩＴプログラム（ウィスコンシン・シーケンス・アナリシス・パッケージ、Ｕｎｉｘ（登録商標）用バージョン８、ジェネティクス・コンピューター・グループ、ユニバーシティー・リサーチ・パーク、５７５サイエンスドライブ、マディソン、ＷＩ５３７１１）などの当技術分野で既知の方法およびコンピュータープログラム／ソフトウェアを用いて、特定のポリペプチドが別のポリペプチドと少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％同一であるかを決定できる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)のローカル相同性アルゴリズムを用いて２つの配列間の最良の相同セグメントを見出す。特定の配列が、たとえば、本発明による基準配列と９５％同一であるかどうかをＢＥＳＴＦＩＴまたは他の任意の配列整列プログラムを用いて決定する場合、パラメーターは、当然ながら、同一性のパーセンテージが基準ポリペプチド配列の全長にわたり計算されるように、また、基準配列のアミノ酸総数の５％までの相同性のギャップが許容されるように設定される。
【００６５】
本明細書では、ＶＷＦ配列またはＦＶＩＩＩタンパク質配列における「対応するアミノ酸」または「相当するアミノ酸」は、第１ＶＷＦまたはＦＶＩＩＩ配列と第２ＶＷＦまたはＦＶＩＩＩ配列の間の同一性または類似性を最大にする配列比較により同定される。第２ＶＷＦまたはＦＶＩＩＩ配列中の相当するアミノ酸を特定するのに使用される数は、対応する第１ＶＷＦまたはＦＶＩＩＩ配列のアミノ酸を同定するのに使用される数に基づく。
【００６６】
「融合」または「キメラ」タンパク質は、自然には連結されない第２アミノ酸配列に連結された第１アミノ酸配列を含む。通常は別のタンパク質に存在するアミノ酸配列が、一緒に融合ポリペプチドとされ得るか、または、通常は同一のタンパク質に存在するアミノ酸配列が、融合ポリペプチド内で新たな配置にされ得、たとえば、本発明の第ＶＩＩＩ因子ドメインとイムノグロブリンＦｃドメインが融合される。融合タンパク質は、たとえば化学合成により、またはペプチド領域が所望の関係にコードされているポリヌクレオチドを作製し翻訳することで、生成される。キメラタンパク質は、共有結合、非ペプチド結合または非共有結合により第１アミノ酸配列と結合した第２アミノ酸配列をさらに含み得る。
【００６７】
本明細書では、「半減期」という用語は、特定のポリペプチドのインビボでの生物学的半減期を指す。半減期は、対象に投与した量のうち、その動物の血中および／または他の組織から半分の量が排除されるのに要する時間で表される。所与のポリペプチドのクリアランス曲線が時間関数として構築される場合、その曲線は通常は、高速のα相とより長いβ相の二相からなる。α相は、典型的には、投与されたＦｃポリペプチドの血管内と血管外の間のスペースにおける平衡状態を表し、部分的には、ポリペプチドのサイズにより決定される。β相は、典型的には、血管内スペースにおけるポリペプチドの異化を表す。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩを含むキメラタンパク質は、単相性なので、α相をもたず、単一のβ相のみを有する。したがって、ある特定の実施形態では、半減期という用語は、本明細書ではβ相のポリペプチドの半減期を指す。ヒトのヒト抗体の典型的なβ相半減期は２１日である。
【００６８】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに使用される「異種」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、それが比較されている部分のものとは異なる部分に由来することを意味する。したがって、ＶＷＦ断片に連結された異種ポリペプチドは、ＶＷＦ断片に連結された、ＶＷＦ断片の天然の部分ではないポリペプチド鎖を意味する。たとえば、異種ポリヌクレオチドまたは抗原は、異なる種、ある個体の異なる細胞種、または別の個体の同一または異なる細胞種に由来し得る。
【００６９】
本明細書では、「連結した（linked）」という用語は、第２アミノ酸配列またはヌクレオチド配列に共有結合または非共有結合で結合した第１アミノ酸配列またはヌクレオチド配列に関する。「共有結合的に連結した」または「共有結合的連結」という用語は、共有結合たとえばジスルフィド結合、ペプチド結合、または１もしくは複数のアミノ酸たとえば連結された２つの部分の間のリンカーを指す。第１アミノ酸またはヌクレオチド配列は、第２アミノ酸またはヌクレオチド配列に直接連結しても接していてもよく、あるいは介在配列が第１配列を第２配列に共有結合的に連結していてもよい。「連結した」は、第１アミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端での第２アミノ酸配列への融合を意味するだけでなく、第１アミノ酸配列（または第２アミノ酸配列）全体を第２アミノ酸配列（または第１アミノ酸配列）の任意の２つのアミノ酸の間に挿入することも含む。一実施形態では、第１アミノ酸配列は、ペプチド結合またはリンカーにより第２アミノ酸配列に結合され得る。第１ヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合またはリンカーにより第２ヌクレオチド配列に結合され得る。リンカーは、（ポリペプチド鎖の）ペプチドもしくはポリペプチド、または（ヌクレオチド鎖の）ヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖、または（ポリペプチド鎖およびポリヌクレオチド鎖の両方の）任意の化学部分であり得る。共有結合は（−）またはハイフンで示される場合がある。
【００７０】
本明細書では、「と結合した（associated with）」という用語は、第１アミノ酸鎖と第２アミノ酸鎖の間に形成された共有結合または非共有結合を指す。一実施形態では、「と結合した」という用語は、共有結合、非ペプチド結合または非共有結合を意味する。いくつかの実施形態ではこの結合はコロンすなわち（：）により示される。別の実施形態では、ペプチド結合を除く共有結合を意味する。他の実施形態では、本明細書では、「共有結合した」という用語は、共有結合、たとえばジスルフィド結合、ペプチド結合、または１もしくは複数のアミノ酸（たとえばリンカー）による２つの部分の結合を意味する。たとえば、アミノ酸のシステインは第２システイン残基のチオール基とジスルフィド結合またはブリッジを形成できるチオール基を含む。ほとんどの天然のＩｇＧ分子において、ＣＨ１とＣＬ領域はジスルフィド結合で結合し、２つの重鎖はカバットの付番方式による２３９と２４２に対応する位置（ＥＵ付番方式による２２６または２２９）で２つのジスルフィド結合により結合している。共有結合の例としては、ペプチド結合、金属結合、水素結合、ジスルフィド結合、シグマ結合、パイ結合、デルタ結合、グリコシド結合、アグノスティック（agnostic）結合、屈曲結合、双極子結合、パイ背面結合、二重結合、三重結合、四重結合、五重結合、六重結合、コンジュゲーション、ハイパーコンジュゲーション、芳香族性、ハプト数（hapticity）または半結合性が挙げられるが、これらに限定されない。非共有結合の非限定的な例には、イオン結合（たとえば、陽イオン−パイ結合または塩結合）、金属結合、水素結合（たとえば、二水素結合、二水素錯体、低障壁水素結合、または対称水素結合）、ファンデルワース力、ロンドン分散力、機械的接着、ハロゲン結合、金親和性、インターカレーション、スタッキング、エントロピー力または化学極性が含まれる。
【００７１】
本明細書では「モノマー−ダイマーハイブリッド」は、ジスルフィド結合で互いに結合した第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖を含むキメラタンパク質を指し、第１鎖は、凝固因子、たとえば第ＶＩＩＩ因子、およびＦｃ領域を含み、第２鎖は、凝固因子なしでＦｃ領域を含むか、本質的にＦｃ領域からなるか、Ｆｃ領域からなる。したがって、モノマー−ダイマーハイブリッドコンストラクトは、１つの凝固因子のみを有するモノマーの側面と、２つのＦｃ領域を有するダイマーの側面とを含むハイブリッドである。
【００７２】
本発明では、「切断部位」または「酵素的切断部位」という用語は、酵素により識別される部位を指す。特定の酵素的切断部位は、細胞内プロセス部位を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、凝固カスケード中に活性化された酵素により切断される酵素的切断部位を有し、凝血塊形成部位でそのような切断が生じる。そのような部位の例としては、例えば、トロンビン、第ＸＩａ因子または第Ｘａ因子に認識される部位が含まれる。例示的なＦＸＩａ切断部位は、たとえば、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号４７）とＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号４８）を含む。例示的なトロンビン切断部位は、たとえばＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号４９）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号５０）、ＬＶＰＲＧ（配列番号５５）およびＡＬＲＰＲ（配列番号５１のアミノ酸１から５）を含む。他の酵素的切断部位は、当技術分野で既知である。
【００７３】
本明細書では、「プロセス部位」または「細胞内プロセス部位」という用語は、ポリペプチド翻訳後に機能する酵素の標的である、ポリペプチド内の酵素的切断部位の一種を指す。一実施形態では、そのような酵素はゴルジルーメンからトランスゴルジコンパートメントへの輸送中に機能する。細胞内プロセス酵素は、細胞からタンパク質が分泌される前にポリペプチドを切断する。そのようなプロセス部位の例としては、たとえば、エンドペプチターゼのＰＡＣＥ／フーリン（ＰＡＣＥは対合塩基性アミノ酸切断酵素の略語である）ファミリーに標的化されるようなものが含まれる。これらの酵素は、ゴルジ膜に局在し、配列モチーフＡｒｇ−［任意の残基］−（ＬｙｓまたはＡｒｇ）−Ａｒｇのカルボキシ末端側のタンパク質を切断する。本明細書では、酵素の「フーリン」ファミリーは、たとえば、ＰＣＳＫ１（ＰＣ１／Ｐｃ３としても知られる）、ＰＣＳＫ２（ＰＣ２としても知られる）、ＰＣＳＫ３（フーリンまたはＰＡＣＥとしても知られる）、ＰＣＳＫ４（ＰＣ４としても知られる）、ＰＣＳＫ５（ＰＣ５またはＰＣ６としても知られる）、ＰＣＳＫ６（ＰＡＣＥ４としても知られる）またはＰＣＳＫ７（ＰＣ７／ＬＰＣ、ＰＣ８、またはＳＰＣ７としても知られる）を含む。他のプロセス部位は当技術分野で既知である。
【００７４】
「フーリン」という用語は、ＥＣ  Ｎｏ．３．４．２１．７５に対応する酵素を指す。フーリンは、サブチリシン様プロタンパク質転換酵素であり、ＰＡＣＥ（対合塩基性アミノ酸切断酵素）としても知られる。フーリンは、不活性な前駆タンパク質のセクションを除去し生物学的に活性なタンパク質に変換する。細胞内輸送中、プロペプチドはゴルジ内のフーリン酵素により成熟ＶＷＦ分子から切断される。
【００７５】
２つ以上のプロセスまたは切断部位を含むコンストラクトにおいては、そのような部位は同じでも異なっていてもよいことが理解される。
【００７６】
本明細書では、止血障害とは、フィブリン凝塊を形成する能力の障害または形成不能により、自動的または外傷の結果としての出血傾向を特徴とする、遺伝的に受け継がれた、または獲得された病状を意味する。そのような障害の例には血友病が含まれる。血友病の３つの主要な型は、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子の欠乏）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子の欠乏または「クリスマス病」）および血友病Ｃ（第ＸＩ因子の欠乏、軽度の出血傾向）である。他の止血障害は、たとえば、フォンウィルブランド病、第ＸＩ因子の欠乏（ＰＴＡ欠乏）、第ＸＩＩ因子の欠乏、フィブリノゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子もしくは第ＸＩＩＩ因子の欠乏または構造異常、ＧＰＩｂの欠損または欠乏であるベルナール・スーリエ症候群を含む。ＶＷＦの受容体ＧＰＩｂが欠乏する場合があり、一次凝血塊形成（一次止血）不足、出血傾向の増大、グランツマンおよびネーゲリ血小板無力症（グランツマン血小板無力症）がもたらされ得る。（急性および慢性）肝不全では肝臓の凝固因子産生が不十分となり、出血リスクが高まる。
【００７７】
本発明のキメラ分子は予防的に使用できる。本明細書では、「予防的治療」という用語は、出血エピソード前の分子投与を指す。一実施形態では、一般的止血薬を必要とする対象は、手術中であるか手術予定である。本発明のキメラタンパク質は、予防薬として手術前または後に投与され得る。本発明のキメラタンパク質は、急性出血エピソードを制御するため手術前または後に投与され得る。手術は、限定ではないが、肝臓移植、肝臓切除、歯科的処置または幹細胞移植を含み得る。
【００７８】
本発明のキメラタンパク質は、オンデマンド（「発症時」とも呼ばれる）治療にも使用される。「オンデマンド治療」または「発症時治療」という用語は、出血エピソードの症状に応じた、または出血の原因となり得る活動前のキメラ分子投与を指す。一態様では、オンデマンド（発症時）治療は、外傷後などの出血開始時、または手術前など出血が予測される場合に対象に与えられ得る。別の態様では、オンデマンド治療は、接触競技など出血リスクを増大させる活動の前に投与され得る。
【００７９】
本明細書では、「急性出血」という用語は、原因に関係なく出血エピソードを指す。たとえば、対象は外傷、尿毒症、遺伝的出血障害（たとえば、第ＶＩＩ因子の欠乏）、血小板障害、または凝固因子に対する抗体産生による抵抗性を有しうる。
【００８０】
本明細書では、「治療する」、「治療」、「治療すること」は、たとえば、疾患または状態の重症度の軽減；疾患経過期間の低減；疾患または状態に関連する１または複数の症状の寛解；必ずしも疾患または状態が治癒するとは限らないがその疾患または状態を有する対象に薬効を提供；または疾患または状態に関連する１または複数の症状の予防を指す。一実施形態では、「治療すること」、「治療」という用語は、本発明のキメラタンパク質またはＶＷＦ断片を投与することにより対象において少なくとも約１ＩＵ／ｄＬ、２ＩＵ／ｄＬ、３ＩＵ／ｄＬ、４ＩＵ／ｄＬ、５ＩＵ／ｄＬ、６ＩＵ／ｄＬ、７ＩＵ／ｄＬ、８ＩＵ／ｄＬ、９ＩＵ／ｄＬ、１０ＩＵ／ｄＬ、１１ＩＵ／ｄＬ、１２ＩＵ／ｄＬ、１３ＩＵ／ｄＬ、１４ＩＵ／ｄＬ、１５ＩＵ／ｄＬ、１６ＩＵ／ｄＬ、１７ＩＵ／ｄＬ、１８ＩＵ／ｄＬ、１９ＩＵ／ｄＬまたは２０ＩＵ／ｄＬのＦＶＩＩＩトラフレベルを維持することを意味する。別の実施形態では、「治療すること」、「治療」は、約１から約２０ＩＵ／ｄＬ、約２から約２０ＩＵ／ｄＬ、約３から約２０ＩＵ／ｄＬ、約４から約２０ＩＵ／ｄＬ、約５から約２０ＩＵ／ｄＬ、約６から約２０ＩＵ／ｄＬ、約７から約２０ＩＵ／ｄＬ、約８から約２０ＩＵ／ｄＬ、約９から約２０ＩＵ／ｄＬまたは約１０から約２０ＩＵ／ｄＬのＦＶＩＩＩトラフレベルを維持することを意味する。疾患または状態の治療または治療することは、対象におけるＦＶＩＩＩ活性を、非血友病対象におけるＦＶＩＩＩ活性の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％に匹敵するレベルに維持することも含み得る。治療に必要な最低トラフレベルは、１または複数の既知の方法で測定でき、各人に合わせて調節（増減）できる。
【００８１】
キメラタンパク質
本発明は、ＦＶＩＩＩ半減期制限因子（たとえば内因性ＶＷＦ）がインビボでＦＶＩＩＩタンパク質と結合することを防止または阻害する第ＶＩＩＩ因子タンパク質の半減期を延長することに関する。内因性ＶＷＦは、約９５％〜約９８％のＦＶＩＩＩと結合して非共有結合複合体になる。ＦＶＩＩＩタンパク質と結合した内因性ＶＷＦは、ＦＶＩＩＩを様々な方法で保護する。たとえば、（約２５０ｋＤａのマルチマーとしての）全長ＶＷＦは、ＦＶＩＩＩをプロテアーゼ切断とＦＶＩＩＩ活性化から保護し、ＦＶＩＩＩ重鎖および／または軽鎖を安定させ、スカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩの排除を防止できる。しかし、同時に、内因性ＶＷＦは、飲作用を防止し、ＶＷＦクリアランス経路を通じてＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ複合体を系から排除することで、ＦＶＩＩＩ半減期を制限する。実施例にも示されるように、内因性ＶＷＦは、半減期延長因子と融合したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が野生型ＦＶＩＩＩの約２倍に延長されることを防止する半減期制限因子であると考えられている。したがって、本発明は、内因性ＶＷＦとＦＶＩＩＩタンパク質の相互作用を付加部分を用いて防止または阻害することで、ＦＶＩＩＩタンパク質がＶＷＦクリアランス経路を通じて排除されるのを防止し、および／または飲作用を誘導する。一実施形態では、付加部分は、ＦＶＩＩＩタンパク質の内因性ＶＷＦとの結合を防止または阻害でき、少なくとも１つのＶＷＦ様ＦＶＩＩＩ保護特性を有する。さらに、付加部分は、内因性ＶＷＦとの相互作用を防止または阻害することで、ＦＶＩＩＩが系から排除されるのを低下させる。本発明の付加部分は、（たとえば、非共有結合により）ＦＶＩＩＩタンパク質と結合または連結しおよび／または物理的もしくは化学的にＦＶＩＩＩタンパク質のＶＷＦ結合部位をブロックする。したがって、付加部分と結合したＦＶＩＩＩタンパク質は、１または複数のＶＷＦクリアランス受容体により、野生型ＦＶＩＩＩまたは付加部分と結合していないＦＶＩＩＩと比較して、血中からゆっくりと排除される。
【００８２】
本発明の付加部分の例としては、たとえば、ポリペプチドまたはＦＶＩＩＩタンパク質の化学的もしくは物理的修飾、付加、欠失、または変異が含まれる。本発明において有用な付加部分は、ポリペプチド、非ポリペプチド部分または両方を含み得る。付加部分として有用なポリペプチドの非限定的な例は、たとえば、本明細書に記載のＶＷＦ断片、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、トランスフェリンまたはその断片、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＨＡＰ配列、ＰＡＳ配列、またはそれらの任意の組合せを含む。非ポリペプチド部分の非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、またはそれらの任意の組合せを含む。本発明において有用な他のそのような部分は、当技術分野で既知である。
【００８３】
一実施形態では、付加部分は、共有結合または非共有結合によりＦＶＩＩＩタンパク質と結合（または連結）している。しかし、一部の例では、付加部分とＦＶＩＩＩタンパク質の間の物理的ブロックまたは化学的結合（たとえば、非共有結合）は、内因性ＶＷＦの存在下でＦＶＩＩＩタンパク質と付加部分を含む安定した複合体を提供するには強度が不十分であり得る。たとえば、他の接続部なしにＦＶＩＩＩタンパク質と非共有結合を形成するＶＷＦ断片は、インビボの内因性ＶＷＦの存在下ではＶＷＦ断片（たとえば、組換えＶＷＦ、すなわち、ｒＶＷＦ）が内因性ＶＷＦに置き換わりＦＶＩＩＩタンパク質から容易に解離し得る。したがって、内因性ＶＷＦと非共有結合したＦＶＩＩＩタンパク質は、ＶＷＦクリアランス経路を通じて系から排除される。付加部分とＦＶＩＩＩタンパク質の解離を防止するために、いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質と付加部分の間の連結は共有結合であり、たとえば、ペプチド結合、１または複数のアミノ酸、またはジスルフィド結合である。ある特定の実施形態では、付加部分とＦＶＩＩＩタンパク質の間の結合（すなわち、連結）はペプチド結合またはリンカーＦＶＩＩＩタンパク質と付加部分の間のリンカー（「ＦＶＩＩＩ／ＡＭリンカー」）である。リンカーの非限定的な例は本明細書に別途記載されている。いくつかの実施形態では、付加部分は、少なくとも約１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００または４０００アミノ酸を含むか、主としてそれらからなるか、それらからなるポリペプチドである。他の実施形態では、付加部分は、約１００〜約２００アミノ酸、約２００〜約３００アミノ酸、約３００〜約４００アミノ酸、約４００〜約５００アミノ酸、約５００〜約６００アミノ酸、約６００〜約７００アミノ酸、約７００〜約８００アミノ酸、約８００〜約９００アミノ酸または約９００〜約１０００アミノ酸を含むか、主としてそれらからなるか、それらからなるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質と共有結合している付加部分は本明細書に別途記載されているＶＷＦ断片である。
【００８４】
ある特定の実施形態では、付加部分は、ＦＶＩＩＩタンパク質の１または複数のＶＷＦ結合部位と（たとえば、共有結合的に）化学的に結合しているかまたは物理的にブロックしている。ＦＶＩＩＩタンパク質のＶＷＦ結合部位は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＡ３ドメインまたはＣ２ドメイン内に位置する。さらに他の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質のＶＷＦ結合部位はＡ３ドメインおよびＣ２ドメイン内に位置する。たとえば、ＦＶＩＩＩタンパク質のＶＷＦ結合部位は配列番号１６のアミノ酸１６６９〜１６８９および／または２３０３〜２３３２に相当し得る［全長成熟ＦＶＩＩＩ］。
【００８５】
他の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、付加部分と連結したＦＶＩＩＩタンパク質を含み、付加部分はＶＷＦ分子、たとえばＤ’ドメインとＤ３ドメインを含むがＶＷＦクリアランス受容体結合部位を含まないＶＷＦ断片であり、ＦＶＩＩＩタンパク質のＶＷＦ結合部位を遮蔽または保護して、ＦＶＩＩＩタンパク質と内因性ＶＷＦの相互作用を阻害または防止する。ある特定の実施形態では、付加部分はＶＷＦ断片である。本発明に有用なＶＷＦ断片は、Ｄ’ドメインとＤ３ドメインを含み、１または複数のＶＷＦ様特性の利点をなおもＦＶＩＩＩタンパク質に与えるが、ＶＷＦ断片はＶＷＦクリアランス経路を経ない。ＦＶＩＩＩタンパク質と付加部分はリンカー（たとえば、ＦＶＩＩＩ／ＡＭリンカー）により共有結合され得る。一実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーであり得る。リンカーの非限定的な例は本明細書に別途開示されている。
【００８６】
さらに他の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質とイムノグロブリン定常領域またはその一部分（すなわち、付加部分）を含み、イムノグロブリン定常領域またはその一部分はＦＶＩＩＩタンパク質のＶＷＦ結合部位を遮蔽または保護して、ＦＶＩＩＩタンパク質と内因性ＶＷＦの相互作用を阻害または防止する。さらに他の実施形態では、イムノグロブリン定常領域またはその一部分はＦｃ領域である。
【００８７】
一態様では、本発明は、本明細書に開示のＶＷＦ断片の１または複数を含むキメラまたは融合タンパク質またはハイブリッド、およびその使用に関する。キメラまたは融合タンパク質は、１または複数の異種部分（本明細書ではＨまたはＨ１と示される場合がある）に融合または連結し得る。一実施形態では、異種部分（Ｈ１）は、ＶＷＦ断片とともに自然に生じないおよび／またはＶＷＦ断片と連結した異種ペプチドまたは異種ポリペプチドである。別の実施形態では、異種部分（Ｈ１）は、非ポリペプチド部分、たとえば化学修飾またはペプチドまたはポリペプチドと非ポリペプチド部分の組合せである。いくつかの実施形態では、ＶＷＦ断片はリンカー（本明細書では「ＶＷＦリンカー」とも呼ばれる）により異種部分（Ｈ１）に連結または接続されている。一実施形態では、ＶＷＦリンカーは、切断可能リンカーである。ＶＷＦ断片と異種部分（Ｈ１）の間のリンカーの非限定的な例が本明細書に別途開示されている。
【００８８】
一実施形態では、本発明で有用な異種部分（Ｈ１）は、ＶＷＦ断片の生物学的活性や機能（たとえば、ＦＶＩＩＩタンパク質との結合または連結）に大幅に影響を与えることなく、ＶＷＦ断片の１または複数の薬物動態特性を改善する。別の実施形態では、ＶＷＦ断片と連結した異種部分（Ｈ１）は、ＶＷＦ断片の半減期を延長できる。異種ポリペプチド部分の非限定的な例は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、またはそれらの２つ以上の組合せを含む。異種非ポリペプチド部分の非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、またはそれらの任意の組合せを含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、異種部分（Ｈ１）は、ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を共有結合により接続するのに使用され得る。共有結合をもたらすことができる異種部分の例としては、限定ではないが、イムノグロブリン定常領域もしくはたとえばＦｃ領域などのヒンジ領域を含むその一部分、またはＦｃＲｎ結合パートナーが含まれる。特定の例では、ＦＶＩＩＩタンパク質は第１Ｆｃ領域に連結され、ＶＷＦ断片は第２Ｆｃ領域に連結され、第１Ｆｃ領域と第２Ｆｃ領域は１または複数のジスルフィド結合を形成している。
【００９０】
いくつかの実施形態では、異種部分（本明細書では「Ｈ」または「Ｈ１」と呼ばれる場合がある）はイムノグロブリン定常領域またはその一部分である。イムノグロブリン定常領域またはその一部分の非限定的な例は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ヒンジドメインおよびそれらの２つ以上の組合せからなる群より選択され得る。一実施形態では、イムノグロブリン定常領域またはその一部分は、少なくとも１つのＣＨ１ドメイン、少なくとも１つのＣＨ２ドメイン、少なくとも１つのＣＨ３ドメイン、少なくとも１つのＣＨ４ドメインまたはそれらの機能的断片を含む。別の実施形態では、イムノグロブリン定常領域またはその一部分は、少なくとも１つのヒンジドメインまたはその一部分と少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部分（たとえば、ヒンジ−ＣＨ２方向）を含む。他の実施形態では、イムノグロブリン定常ドメインまたはその一部分は、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部分と少なくとも１つのＣＨ３ドメインまたはその一部分（たとえば、ＣＨ２−ＣＨ３方向）を含む。組合せの例としては、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジドメインが挙げられ、Ｆｃ領域（またはＦｃドメイン）、たとえば、第１Ｆｃ領域としても知られるが、これらに限定されない。他の実施形態では、異種部分（Ｈ１）はリンカーによりＶＷＦ断片に連結されている。ある特定の実施形態では、異種部分（Ｈ１）は、本明細書で別途記載のとおり、ＦｃＲｎ結合パートナーである。他の実施形態では、異種部分（Ｈ１）はヒンジ領域である。
【００９１】
ある特定の実施形態では、キメラタンパク質は、第２（または追加の）異種部分（本明細書では「Ｈ２」と呼ばれる場合がある）をさらに含む。なお、第１異種部分（Ｈ１）と第２異種部分（Ｈ２）は交換可能に使用され得、同じでも異なっていてもよい。第２異種部分（Ｈ２）は、ＦＶＩＩＩタンパク質またはキメラタンパク質の他の部分にペプチド結合、１または複数のアミノ酸またはリンカー（たとえば、ＦＶＩＩＩに連結される場合はＦＶＩＩＩリンカー）により連結され得る。そのようなコンストラクトはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦヘテロダイマーと呼ばれる場合がある。一実施形態では、異種部分（Ｈ２）は、異種ポリペプチドを含む。別の実施形態では、異種部分（Ｈ２）は、非ポリペプチド部分を含む。他の実施形態では、異種部分（Ｈ２）は、異種部分と非ポリペプチド部分の組合せを含む。第２異種部分（Ｈ２）は、半減期延長因子であり得る。第２異種ポリペプチド部分（Ｈ２）の非限定的な例としては、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、またはそれらの２つ以上の組合せが挙げられる。異種非ポリペプチド部分の非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。ある特定の実施形態では、第１異種部分（Ｈ１）と第２異種部分は同じかまたは異なる。第１異種部分（Ｈ１）と第２異種部分（Ｈ２）の一方または両方は、キメラタンパク質中のＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長し得、非共有結合よりも強力な接続、すなわち、キメラタンパク質のＦＶＩＩＩタンパク質とＶＷＦ断片の間の１または複数の共有結合による接続、または両方を与え得る。第１異種部分（Ｈ１）に融合または連結したＶＷＦ断片がＦＶＩＩＩタンパク質と内因性ＶＷＦタンパク質の間の相互作用を防止または阻害することで半減期の上限を除去すると、該異種部分に融合されたＦＶＩＩＩタンパク質は最大限有効となり得、野生型ＦＶＩＩＩよりも２倍長い半減期を有することができる。
【００９２】
ある特定の実施形態では、ＶＷＦ断片に連結した第１異種部分（たとえば、第１Ｆｃ領域）と、ＦＶＩＩＩタンパク質に連結した第２異種部分（たとえば、第２Ｆｃ領域）は互いに結合し、該結合によりＶＷＦ断片が内因性ＶＷＦとインビボで置き換わるのを防止する。一実施形態では、第２異種部分は第２Ｆｃ領域であり、該第２Ｆｃ領域は、共有結合、たとえば、ジスルフィド結合、ペプチド結合またはリンカー（１または複数のアミノ酸）により、第１異種部分、たとえば、第１Ｆｃ領域に連結または結合されている。たとえば、ＦＶＩＩＩタンパク質に１端で連結した第２異種部分（たとえば、第２Ｆｃ領域）は、ＶＷＦ断片と連結した第１異種部分（たとえば、第１Ｆｃ領域）とリンカー（たとえば、ｓｃＦｃリンカー）によりさらに連結し得るか、または共有結合または非共有結合により第１異種部分と結合し得る。別の実施形態では、第２異種部分（たとえば、第２Ｆｃ領域）は既に第１異種部分に連結しているＶＷＦ断片に連結する。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、ＶＷＦ断片と第１異種部分を含む第１ポリペプチド鎖と、ＦＶＩＩＩタンパク質と第２異種部分を含む第２ポリペプチド鎖を含み、ここで第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖は結合しており、第１異種部分を含む第１ポリペプチド鎖と第２異種部分を含む第２ポリペプチド鎖の間のこの結合は共有結合なので、ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質は互いに相互作用を維持できる。同時に、ＦＶＩＩＩタンパク質と非共有結合を形成できる内因性ＶＷＦは、ＶＷＦ断片を含む共有結合したポリペプチド鎖と置き換わることができない。
【００９３】
第１異種部分（Ｈ１）とＶＷＦ断片（たとえば、ＶＷＦリンカー）の間のリンカーは、切断可能リンカー、たとえば、トロンビン切断可能リンカーであり得る。切断可能リンカーは、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ−２、グランザイム−Ｂ、ＴＥＶ、エンテロキナーゼ、プロテアーゼ３Ｃ、ソルターゼＡ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−２０、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択されるプロテアーゼにより切断され得る。これらの切断可能リンカーは、凝固カスケードの活性化後、ＶＷＦ断片が切断されてＦＶＩＩＩタンパク質から解離するのを可能にし、結果としてＦＶＩＩＩタンパク質の活性能は最大限となる。
【００９４】
他の実施形態では、キメラタンパク質はＶＷＦ断片、切断可能リンカー、第１異種部分（Ｈ１）、プロセス可能なリンカー、ＦＶＩＩＩタンパク質および第２異種部分（Ｈ２）を任意の順番で含む１本のポリペプチド鎖として産生される。合成後、プロセス可能なリンカーは、分泌前に細胞内プロテアーゼ酵素により切断され得、上述のように２本のポリペプチド鎖が生成される。分泌前、一本鎖コンストラクトでは、第２異種部分（たとえば、第２Ｆｃ領域）がプロセス可能なリンカーによりＶＷＦ断片に連結され得る。ある特定の実施形態では、１または複数のリンカーが１または複数の切断部位を含み得る。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、第３異種部分（本明細書では「Ｈ３」と呼ばれる場合がある）をさらに含む。第３異種部分（Ｈ３）は、半減期延長因子であり得る。異種部分（Ｈ３）は、異種ポリペプチド、非ポリペプチド部分またはその両方を含み得る。第３異種部分（Ｈ３）の非限定的な例としては、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、その任意の誘導体またはバリアント、またはそれらの２つ以上の組合せが挙げられる。非ポリペプチド部分の非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、またはそれらの任意の組合せを含む。ＶＷＦ断片に連結した第１異種部分（Ｈ１）、ＦＶＩＩＩタンパク質に連結した第２異種部分（Ｈ２）および第３異種部分（Ｈ３）は同じでも異なっていてもよい。一実施形態では、第１異種部分（Ｈ１）は第２異種部分（Ｈ２）とは同じだが、第３異種部分（Ｈ３）とは異なる。別の実施形態では、第３異種部分（Ｈ３）はキメラタンパク質のＦＶＩＩＩタンパク質またはＶＷＦ断片に融合または連結している。いくつかの実施形態では、第３異種部分は、ＦＶＩＩＩタンパク質の１または複数のドメイン内に、またはＦＶＩＩＩタンパク質の２つのドメインの間に挿入されている。
【００９６】
一実施形態では、キメラタンパク質は、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖を含み、第１鎖は随意のリンカー（たとえば、ＦＶＩＩＩリンカー）で第１異種部分（Ｈ１）、たとえば第１Ｆｃ領域に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質を含み、第２鎖は、随意のリンカー（たとえば、ＶＷＦリンカー）で第２異種部分（Ｈ２）、たとえば第２Ｆｃ領域に連結されたＶＷＦ断片を含む。ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩ重鎖とＦＶＩＩＩ軽鎖の間（すなわち、配列番号１６のアミノ酸残基１６４８）に第３異種部分（Ｈ３）、たとえば任意の半減期延長部分、たとえばアルブミンまたはＰＡＳ配列をさらに含み得るので、一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質である。あるいは、ＦＶＩＩＩタンパク質は二本鎖タンパク質、すなわち、ＦＶＩＩＩ重鎖とＦＶＩＩＩ軽鎖が互いに共有結合または非共有結合（たとえば金属結合）していてもよく、重鎖は第３異種部分（Ｈ３）、たとえば非構造的半減期延長ポリペプチド、アルブミンまたはその断片またはＰＡＳ配列にさらに連結している。別の実施形態では、キメラタンパク質は第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖を含み、第１鎖は、随意のリンカー（たとえばＦＶＩＩＩリンカー）で第１異種部分（Ｈ１）、たとえば第１Ｆｃ領域に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質を含み、第２鎖は、第３異種部分（Ｈ３）、たとえば非構造的半減期延長ポリペプチド、アルブミンまたはＰＡＳ配列に連結されている、随意のリンカーで第２異種部分（Ｈ２）、たとえば第２Ｆｃ領域に連結されているＶＷＦ断片を含む。いくつかの実施形態では、第３異種部分（Ｈ３）（たとえば、半減期延長ポリペプチド）は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端またはＮ末端に連結され得、またはＦＶＩＩＩタンパク質の２つのドメイン間か、ＦＶＩＩＩタンパク質のドメイン内の２つのアミノ酸間に挿入され得る。
【００９７】
他の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、第４異種部分（本明細書では「Ｈ４」と呼ばれる場合がある）および／または第５異種部分（本明細書では「Ｈ５」と呼ばれる場合がある）をさらに含む。第４または第５異種部分も、半減期延長因子であり得る。第４異種部分および／または第５異種部分は第３異種部分と同じでも異なっていてもよい。異種部分は、異種ポリペプチド、非ポリペプチド部分または両方の組合せを含み得る。第４または第５異種部分の非限定的な例としては、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、その任意の誘導体またはバリアント、またはそれらの２つ以上の組合せが挙げられる。非ポリペプチド部分の非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、またはそれらの任意の組合せを含む。第１異種部分、第２異種部分、第３異種部分、第４異種部分、第５異種部分は同じでも異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、第４異種部分（たとえば、半減期延長ポリペプチド）は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端またはＮ末端に連結され得、またはＦＶＩＩＩタンパク質の２つのドメイン間か、ＦＶＩＩＩタンパク質のドメイン内の２つのアミノ酸間に挿入され得る。他の実施形態では、第５異種部分（たとえば、半減期延長ポリペプチド）も、ＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端またはＮ末端に連結され得、またはＦＶＩＩＩタンパク質の２つのドメイン間か、ＦＶＩＩＩタンパク質のドメイン内の２つのアミノ酸間に挿入され得る。
【００９８】
ある特定の実施形態では、キメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＶＷＦ断片、第１異種部分、第２異種部分、第３異種部分、第４異種部分および第５異種部分を含み、第１異種部分と第２異種部分はＦＶＩＩＩタンパク質を含む鎖とＶＷＦ断片を含む鎖の間に結合（たとえば、共有結合）を形成し、第３異種部分、第４異種部分および第５異種部分は半減期延長因子であり、ＦＶＩＩＩタンパク質を含む鎖とＶＷＦ断片を含む鎖の間の結合はＦＶＩＩＩとＶＷＦ断片間の非共有結合の相互作用よりも強いので、内因性ＶＷＦがＦＶＩＩＩタンパク質にインビボ、インビトロまたはエックスビボで結合するのを防止する。
【００９９】
他の実施形態では、キメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＶＷＦ断片、第１異種部分、第２異種部分、第３異種部分、第４異種部分、第５異種部分および第６異種部分（本明細書では「Ｈ６」と呼ばれる場合がある）を含み、第１異種部分と第２異種部分はＦＶＩＩＩタンパク質を含む鎖とＶＷＦ断片を含む鎖の間に結合を形成し、第３異種部分、第４異種部分、第５異種部分および第６異種部分は半減期延長因子であり、ＦＶＩＩＩタンパク質を含む鎖とＶＷＦ断片を含む鎖の間の結合はＦＶＩＩＩとＶＷＦ断片間の相互作用よりも強いので、内因性ＶＷＦがＦＶＩＩＩタンパク質にインビボ、インビトロまたはエックスビボで結合するのを防止する。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、
（ａａ）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ２−Ｈ２、
（ｂｂ）Ｈ２−Ｌ２−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ、
（ｃｃ）Ｈ１−Ｌ１−Ｖ−Ｌ２−Ｈ２および
（ｄｄ）Ｈ２−Ｌ２−Ｖ−Ｌ１−Ｈ１
からなる群より選択される式を含み、ここでＶは本明細書に記載のVWF断片を含み；
Ｌ１とＬ２はそれぞれ随意のリンカーを含み；
Ｈ１は第１異種部分を含み；
Ｈ２は随意の第２異種部分を含む。第１異種部分と第２異種部分の一方または両方は半減期延長部分であり得る。一実施形態では、Ｈ１は、ポリペプチド部分、非ポリペプチド部分またはその両方を含む。Ｈ１として有用なポリペプチド部分は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、それらの任意の誘導体もしくはバリアントまたは任意の組合せを含み得る。非ポリペプチド部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸およびヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体もしくはバリアント、またはそれらの任意の組合せを含み得る。別の実施形態では、Ｈ２は、ポリペプチド、非ポリペプチド部分またはその両方を含む。Ｈ２として有用なポリペプチド部分は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、それらの任意の誘導体もしくはバリアントまたは任意の組合せを含み得る。非ポリペプチド部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体もしくはバリアント、またはそれらの任意の組合せを含み得る。ある特定の実施形態では、式（ａａ）と（ｂｂ）のＨ１とＨ２間のリンカーはプロセス可能リンカーである。他の実施形態では、式（ａａ）と（ｂｂ）のＶＷＦ断片とＨ１間のリンカーは、切断可能リンカーであり、たとえばトロンビンにより切断され得るトロンビン切断可能リンカーである。
【０１０１】
本明細書では、ポリペプチド式の方向はＮ末端（左）からＣ末端（右）である。たとえば、式Ｈ−Ｌ−Ｖは、式ＮＨ２−Ｈ−Ｌ−Ｖ−ＣＯＯＨを意味する。一実施形態では、本明細書に記載の式は、２つの部分の間の追加配列を含み得る。たとえば、式Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ２−Ｈ２は、特に断らないかぎり、ＶのＮ末端に、ＶとＬ１の間に、Ｌ１とＨ１の間に、Ｌ２またはＨ２の間に、またはＨ２のＣ末端にさらに配列を含み得る。別の実施形態では、ハイフン（−）はペプチド結合または１もしくは複数のアミノ酸を意味する。
【０１０２】
特定の実施形態では、キメラタンパク質は、（ａ１）Ｖ−Ｈ、（ａ２）Ｈ−Ｖ、（ａ３）Ｖ−Ｌ−Ｈ、（ａ４）Ｈ−Ｌ−Ｖ、（ａ５）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｈ２、（ａ６）Ｈ２−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ、（ａ７）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２、（ａ８）Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｖ、（ａ９）Ｖ−Ｈ１：Ｈ２、（ｂ１）Ｈ２：Ｈ１−Ｖ、（ｂ２）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ２−Ｈ２、（ｂ３）Ｈ２−Ｌ２−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ、（ｂ４）Ｈ１−Ｖ−Ｈ２、（ｂ５）Ｈ１−Ｌ１−Ｖ−Ｌ２−Ｈ２および（ｂ６）Ｈ２−Ｌ２−Ｖ−Ｌ１−Ｈ１からなる群より選択される１または複数の式を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、ここでＶは本明細書に記載のＶＷＦ断片のうちの１または複数を含み、Ｌ、Ｌ１またはＬ２はリンカーを含み、ＨまたはＨ１は第１異種部分を含む。一実施形態では、第１異種部分（Ｈ１）は、ポリペプチド、非ポリペプチド部分またはその両方であり得る。異種ポリペプチド部分は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＰＡ配列、またはそれらの任意の組合せを含み得る。Ｈ１として有用な非ポリペプチド部分の非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、またはそれらの任意の組合せを含む。別の実施形態では、Ｈ２は、第２異種部分を含む。第２異種部分は、ポリペプチド、非ポリペプチド部分またはその両方であり得る。異種ポリペプチド部分は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、またはそれらの任意の組合せを含み得る。Ｈ１として有用な非ポリペプチド部分の非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、またはそれらの任意の組合せを含む。ある特定の実施形態では、第１異種部分と第２異種部分の間のリンカーは、プロセス可能なリンカーである。他の実施形態では、ＶＷＦ断片と第１異種部分または第２異種部分の間のリンカーは切断可能リンカーであり、１または複数の切断部位、たとえばトロンビン切断可能リンカーを含む。
【０１０３】
本発明のキメラタンパク質は、（ａａ）、（ｂｂ）、（ｃｃ）、（ｄｄ）、（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ａ４）、（ａ５）、（ａ６）、（ａ７）、（ａ８）、（ａ９）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｂ４）、（ｂ５）および（ｂ６）からなる群より選択される式と、式のＶＷＦ断片、第１異種部分（たとえば、第１Ｆｃ領域）または第２異種部分（たとえば、第２Ｆｃ領域）と共有結合または非共有結合しているＦＶＩＩＩタンパク質を含む。一実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、共有結合もしくは非共有結合により、またはリンカーによりＶＷＦ断片に連結または結合している。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、共有結合もしくは非共有結合により、またはリンカーにより第１異種部分または第２異種部分に連結し得る。
【０１０４】
一実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質に共有結合で連結しているか非共有結合している、本明細書に記載のＶＷＦ断片を含む。たとえば、キメラタンパク質は、ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含み得、ここでＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質は、共有結合の非ペプチド結合、ペプチド結合、非共有結合により、またはリンカー、たとえば切断可能リンカーにより結合している。特定の実施形態では、ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質は、１または複数のジスルフィド結合により互いに結合または相互作用する。別の特定の実施形態では、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質と、ＦＶＩＩＩのＡ３ドメインで、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインで、またはＦＶＩＩＩのＡ３ドメインとＣ２ドメインの両方で、非共有結合により、結合または相互作用する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質と結合または相互作用するＶＷＦ断片は、第１異種部分に連結または融合している。他の実施形態では、ＶＷＦ断片と結合または相互作用しているＦＶＩＩＩタンパク質は、さらに第２異種部分に連結している。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質と結合または相互作用しているＶＷＦ断片は、さらに第１異種部分に連結し、ＦＶＩＩＩタンパク質はさらに第２異種部分に連結している。ある特定の実施形態では、ＶＷＦ断片と第１異種部分を含む第１ポリペプチド鎖と、ＦＶＩＩＩタンパク質と第２異種部分を含む第２ポリペプチド鎖が互いに結合しており、該結合によりＦＶＩＩＩタンパク質は他の部分、たとえば内因性ＶＷＦと相互作用できない。一実施形態では、該結合は、共有結合、たとえばジスルフィド結合である。
【０１０５】
ＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質はそれぞれ、リンカー、たとえば切断可能リンカー、たとえばトロンビン切断可能リンカーにより第１および第２異種部分に結合または接続され得る。ＶＷＦ断片と第１異種部分の間のリンカーは、本明細書ではＶＷＦリンカーと呼ばれ得る。ＦＶＩＩＩタンパク質と第２異種部分の間のリンカーは、本明細書ではＦＶＩＩＩリンカーと呼ばれ得る。または、ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質はいずれも、リンカー、たとえば切断可能リンカー、たとえばトロンビン切断可能リンカーにより第１および第２異種部分に結合または接続され得る。ある特定の実施形態では、ＶＷＦ断片に連結した第１異種部分は、ポリペプチド、非ポリペプチド部分またはその両方を含む。第１異種ポリペプチド部分の非限定的な例は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、またはそれらの２つ以上の組合せを含む。非ポリペプチド部分の非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳまたはＨＡＥＳ）、それらの誘導体またはバリアント、またはそれらの任意の組合せを含む。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質に連結した第２異種部分は、ポリペプチド、非ポリペプチド部分またはその両方を含む。第２異種部分の非限定的な例は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、またはそれらの２つ以上の組合せを含む。非ポリペプチド部分の非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳまたはＨＡＥＳ）、それらの誘導体またはバリアント、またはそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態では、ＶＷＦ断片は、ソルターゼ媒介インビトロタンパク質連結を用いてＦＶＩＩＩに結合される。いくつかの実施形態では、ソルターゼ認識モチーフが用いられる。
【０１０６】
一実施形態では、第１異種部分はイムノグロブリン定常領域またはその一部分である。特定の実施形態では、第１異種部分は第１Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、第２異種部分はイムノグロブリン定常領域またはその一部分である。特定の実施形態では、第２異種部分は第２Ｆｃ領域である。特定の実施形態では、キメラタンパク質は、本明細書に記載のＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含み、ここでＶＷＦ断片は、Ｆｃ領域であるイムノグロブリン定常領域またはその一部分に連結している。別の実施形態では、キメラタンパク質は、本明細書に記載のＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含み、ここでＦＶＩＩＩタンパク質は、Ｆｃ領域であるイムノグロブリン定常領域またはその一部分に連結している。他の実施形態では、キメラタンパク質は、本明細書に記載のＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含み、ここでＶＷＦ断片は第１Ｆｃ領域である第１イムノグロブリン定常領域に連結し、ＦＶＩＩＩタンパク質は第２Ｆｃ領域である第２イムノグロブリン定常領域に連結し、ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質は非共有結合により互いに結合または相互作用しているか、または第１Ｆｃ領域と第２Ｆｃ領域は共有結合により互いに結合している。さらに他の実施形態では、第１異種部分に連結したＶＷＦ断片は、さらに第２異種部分、たとえば第２Ｆｃ領域にリンカー、たとえばプロセス可能なリンカーにより連結されている。一態様では、ＶＷＦ断片は、第１異種部分に、リンカー、たとえばＶＷＦリンカー、たとえば切断可能リンカーにより連結されている。別の態様では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、第２異種部分に、リンカー、たとえばＦＶＩＩＩリンカー、たとえば切断可能リンカーにより連結されている。異種部分の非限定的な例は本明細書で別途開示されており、たとえばイムノグロブリン定常領域またはその一部分（段落［０１６５］〜［０１６９］）、アルブミン、その断片またはバリアント（段落［０１７０〜［０１７４］）、ＨＡＰ配列（段落［０２７３］）、トランスフェリン、その断片またはバリアント（段落［０１８０］〜［０１８１］）、ポリマー、たとえばポリエチレングリコール（段落［０１８２］〜［０１８９］）、ＨＥＳ（段落［０１９０］〜［０１９５］）、またはＰＳＡ（段落［０１９６］〜）およびＰＡＳ配列（段落［０１７５］〜［０１７８］）である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、
（ａ）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ３−Ｃ−Ｌ２−Ｈ２、
（ｂ）Ｈ２−Ｌ２−Ｃ−Ｌ３−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ、
（ｃ）Ｃ−Ｌ２−Ｈ２−Ｌ３−Ｖ−Ｌ１−Ｈ１、
（ｄ）Ｈ１−Ｌ１−Ｖ−Ｌ３−Ｈ２−Ｌ２−Ｃ、
（ｅ）Ｈ１−Ｌ１−Ｖ−Ｌ３−Ｃ−Ｌ２−Ｈ２、
（ｇ）Ｈ２−Ｌ２−Ｃ−Ｌ３−Ｖ−Ｌ１−Ｈ１、
（ｇ）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ３−Ｈ２−Ｌ２−Ｃ、
（ｇ）Ｃ−Ｌ２−Ｈ２−Ｌ３−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ、
（ｉ）Ｈ２−Ｌ３−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ−Ｌ２−Ｃ、
（ｊ）Ｃ−Ｌ２−Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ３−Ｈ２、
（ｋ）Ｖ−Ｌ２−Ｃ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ３−Ｈ２および
（ｌ）Ｈ２−Ｌ３−Ｈ１−Ｌ１−Ｃ−Ｌ２−Ｖ、
からなる群より選択される式を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、ここでＶは本明細書に記載のＶＷＦ断片であり；
Ｌ１とＬ２はそれぞれ随意のリンカー、たとえば切断可能リンカー、たとえばトロンビン切断可能リンカーであり；
Ｌ３は、随意のリンカーであり、たとえばプロセス可能なリンカーであり；
Ｈ１およびＨ２はそれぞれ随意の異種部分であり；
ＣはＦＶＩＩＩタンパク質であり；
（−）はペプチド結合または１もしくは複数のアミノ酸である。
【０１０８】
他の態様では、本発明のキメラタンパク質は、
（ｍ）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−Ｃ、
（ｎ）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１：Ｃ−Ｌ２−Ｈ２；
（ｏ）Ｈ１−Ｌ１−Ｖ：Ｈ２−Ｌ２−Ｃ；
（ｐ）Ｈ１−Ｌ１−Ｖ：Ｃ−Ｌ２−Ｈ２；
（ｑ）Ｖ：Ｃ−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２；
（ｒ）Ｖ：Ｈ１−Ｌ１−Ｃ：Ｈ２；
（ｓ）Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｃ：Ｖ、
（ｔ）Ｃ：Ｖ−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２および
（ｕ）Ｃ：Ｈ１−Ｌ１−Ｖ：Ｈ２
からなる群より選択される式を含み、ここでＶは本明細書に記載のＶＷＦ断片であり；
Ｌ１とＬ２はそれぞれ随意のリンカー、たとえばトロンビン切断可能リンカーであり；
Ｈ１またはＨ２はそれぞれ随意の異種部分であり；
（−）はペプチド結合または１もしくは複数のアミノ酸であり；
ＣはＦＶＩＩＩタンパク質であり；
（：）はＨ１とＨ２の間の化学的または物理的結合である。
【０１０９】
一実施形態では、異種部分のうちの１または複数は半減期延長因子である。半減期延長因子は当技術分野で既知であり、そのような半減期延長因子の非限定的な例は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはその断片、それらの誘導体またはバリアント、またはそれらの２つ以上の組合せを含む。非ポリペプチド部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１１０】
一実施形態では、式（ｍ）から（ｕ）の（：）は、化学結合を表し、たとえば少なくとも１つの非ペプチド結合を表す。ある特定の実施形態では、化学結合すなわち（：）は共有結合である。他の実施形態では、化学結合すなわち（：）は共有相互作用であり、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、ファンデルワース相互作用、水素結合である。他の実施形態では、（：）は非ペプチド共有結合である。さらに他の実施形態では、（：）はペプチド結合である。さらに他の実施形態では、式（ｍ）から（ｕ）の（：）は、２つの配列間の物理的な結合を表し、ここで第１配列の一部分は第２配列に近接し、第２配列が別の部分と相互作用するのを第１配列が遮蔽またはブロックし、さらに、この物理的結合は第２配列を他の部分と相互作用させることなく維持される。
【０１１１】
本明細書では、式（ａ）〜（ｕ）は、本発明のコンストラクトの非限定的な例として含まれるにすぎない。ポリペプチド式の向きは方向はＮ末端（左）からＣ末端（右）として示される。たとえば、式Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ３−Ｃ−Ｌ２−Ｈ２は、式ＮＨ２−Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ３−Ｃ−Ｌ２−Ｈ２−ＣＯＯＨを意味する。さらに、（：）は、特に断らないかぎり、２つのポリペプチド鎖間の、第１鎖のいずれかの部分と第２鎖のいずれかの部分の間の共有結合または非共有結合による結合または相互作用であり得る。たとえば式Ｖ−Ｈ１：Ｈ２−Ｃは、２つのポリペプチド鎖を有し、第１鎖はＶ−Ｈ１であり、第２鎖はＣ−Ｈ２であり、ここで第１鎖のＶは第２鎖のＣと相互作用または結合し、および／または第１鎖のＨ１は第２鎖のＨ２と相互作用または結合する。いくつかの実施形態では、（：）は、共有結合の非ペプチド結合または非共有結合を意味する。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、キメラタンパク質は、
（１）Ｖ：Ｃ、
（２）Ｈ−Ｖ：ＣまたはＣ：Ｖ−Ｈ、
（３）Ｖ：Ｃ−ＨまたはＨ−Ｃ：Ｖ、
（４）Ｖ−Ｈ１：Ｈ２−ＣまたはＨ１−Ｖ：Ｃ−Ｈ２、
（５）Ｖ：Ｃ−Ｈ１：Ｈ２またはＨ２：Ｈ１−Ｃ：Ｖ、
（６）Ｈ２：Ｈ１−Ｖ：ＣまたはＣ：Ｖ−Ｈ１：Ｈ２、
（７）Ｈ−Ｌ−Ｖ：ＣまたはＣ：Ｖ−Ｌ−Ｈ、
（８）Ｖ：Ｃ−Ｌ−ＨまたはＨ−Ｌ−Ｃ：Ｖ、
（９）Ｖ−ＣまたはＣ−Ｖ、
（１０）Ｈ−Ｖ−ＣまたはＣ−Ｖ−Ｈ、
（１１）Ｖ−Ｈ−ＣまたはＣ−Ｈ−Ｖ、
（１２）Ｖ−Ｃ−ＨまたはＨ−Ｃ−Ｖ、
（１３）Ｖ−Ｈ１−Ｃ−Ｈ２またはＨ２−Ｃ−Ｈ１−Ｖ、
（１４）Ｈ１−Ｖ−Ｃ−Ｈ２またはＨ２−Ｃ−Ｖ−Ｈ１、
（１５）Ｈ１−Ｖ−Ｈ２−ＣまたはＣ−Ｈ２−Ｖ−Ｈ１、
（１６）Ｖ−Ｈ１−Ｈ２−ＣまたはＣ−Ｈ２−Ｈ１−Ｖ、
（１７）Ｖ−Ｌ−ＣまたはＣ−Ｌ−Ｖ、
（１８）Ｈ−Ｌ−Ｖ−ＣまたはＣ−Ｖ−Ｌ−Ｈ、
（１９）Ｈ−Ｖ−Ｌ−ＣまたはＣ−Ｌ−Ｖ−Ｈ、
（２０）Ｖ−Ｌ−Ｈ−ＣまたはＣ−Ｈ−Ｌ−Ｖ、
（２１）Ｖ−Ｈ−Ｌ−ＣまたはＣ−Ｌ−Ｈ−Ｖ、
（２２）Ｖ−Ｌ−Ｃ−ＨまたはＨ−Ｃ−Ｌ−Ｖ、
（２３）Ｖ−Ｃ−Ｌ−ＨまたはＨ−Ｌ−Ｃ−Ｖ、
（２４）Ｈ−Ｌ１−Ｖ−Ｌ２−ＣまたはＣ−Ｌ２−Ｖ−Ｌ１−Ｈ、
（２５）Ｖ−Ｌ−Ｈ１：Ｈ２−ＣまたはＣ−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ−Ｖ、
（２６）Ｖ−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ−ＣまたはＣ−Ｌ−Ｈ２：Ｈ１−Ｖ、
（２７）Ｖ：Ｃ−Ｈ１−Ｈ２またはＨ２−Ｈ１−Ｃ：Ｖ、
（２８）Ｈ２−Ｈ１−Ｖ：ＣまたはＣ：Ｖ−Ｈ１−Ｈ２、
（２９）Ｖ：Ｃ−Ｌ−Ｈ１：Ｈ２またはＨ２：Ｈ１−Ｌ−Ｃ：Ｖ、
（３０）Ｈ２：Ｈ１−Ｌ−Ｖ：ＣまたはＣ：Ｖ−Ｌ−Ｈ１：Ｈ２、
（３１）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１：Ｈ２−Ｌ２−ＣまたはＬ−Ｌ２−Ｈ２：Ｈ１−Ｌ１−Ｖ、
（３２）Ｖ：Ｃ−Ｌ−Ｈ１−Ｈ２またはＨ２−Ｈ１−Ｌ−Ｃ：Ｖ、
（３３）Ｖ：Ｃ−Ｈ１−Ｌ−Ｈ２またはＨ２−Ｌ−Ｈ１−Ｃ：Ｖ、
（３４）Ｖ：Ｃ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ２−Ｈ２またはＨ２−Ｌ２−Ｈ１−Ｌ１−Ｃ：Ｖ、
（３５）Ｈ２−Ｈ１−Ｖ：ＣまたはＣ：Ｖ−Ｈ１−Ｈ２、
（３６）Ｈ２−Ｈ１−Ｌ−Ｖ：ＣまたはＣ：Ｖ−Ｌ−Ｈ１−Ｈ２、
（３７）Ｈ２−Ｌ−Ｈ１−Ｖ：ＣまたはＣ：Ｖ−Ｈ１−Ｌ−Ｈ２、
（３８）Ｈ２−Ｌ２−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ：ＣまたはＣ：Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ２−Ｈ２、
（３９）Ｖ−Ｌ１−Ｈ−Ｌ２−ＣまたはＣ−Ｌ２−Ｈ−Ｌ１−Ｖ、
（４０）Ｖ−Ｌ１−Ｃ−Ｌ２−ＨまたはＨ−Ｌ２−Ｃ−Ｌ１−Ｖ、
（４１）Ｖ−Ｌ−Ｈ１−Ｃ−Ｈ２またはＨ２−Ｃ−Ｈ１−Ｌ−Ｖ、
（４２）Ｖ−Ｈ１−Ｃ−Ｌ−Ｈ２またはＨ２−Ｌ−Ｃ−Ｈ１−Ｖ、
（４３）Ｖ−Ｈ１−Ｌ−Ｃ−Ｈ２またはＨ２−Ｃ−Ｌ−Ｈ１−Ｖ、
（４４）Ｈ１−Ｌ−Ｖ−Ｃ−Ｈ２またはＨ２−Ｃ−Ｖ−Ｌ−Ｈ１、
（４５）Ｈ１−Ｖ−Ｌ−Ｃ−Ｈ２またはＨ２−Ｃ−Ｌ−Ｖ−Ｈ１、
（４６）Ｈ１−Ｖ−Ｃ−Ｌ−ＨまたはＨ−Ｌ−Ｃ−Ｖ−Ｈ１、
（４７）Ｈ１−Ｌ−Ｖ−Ｈ２−ＣまたはＣ−Ｈ２−Ｖ−Ｌ−Ｈ１、
（４８）Ｈ１−Ｖ−Ｌ−Ｈ２−ＣまたはＣ−Ｈ２−Ｌ−Ｖ−Ｈ１、
（４９）Ｈ１−Ｖ−Ｈ２−Ｌ−ＣまたはＣ−Ｌ−Ｈ２−Ｖ−Ｈ１、
（５０）Ｖ−Ｌ−Ｈ１−Ｈ２−ＣまたはＣ−Ｈ２−Ｈ１−Ｌ−Ｖ、
（５１）Ｖ−Ｈ１−Ｌ−Ｈ２−ＣまたはＣ−Ｈ２−Ｌ−Ｈ１−Ｖ、
（５２）Ｖ−Ｈ１−Ｈ２−Ｌ−ＣまたはＣ−Ｌ−Ｈ２−Ｈ１−Ｖ、
（５３）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ２−Ｃ−Ｈ２またはＨ２−Ｃ−Ｌ２−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ、
（５４）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｃ−Ｌ２−Ｈ２またはＨ２−Ｌ２−Ｃ−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ、
（５５）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ２−Ｃ−Ｌ３−Ｈ２またはＨ２−Ｌ３−Ｃ−Ｌ２−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ、
（５６）Ｖ−Ｈ１−Ｌ１−Ｃ−Ｌ２−Ｈ２またはＨ２−Ｌ２−Ｃ−Ｌ１−Ｈ１−Ｖ、
（５７）Ｈ１−Ｌ１−Ｖ−Ｌ２−Ｃ−Ｈ２またはＨ２−Ｃ−Ｌ２−Ｖ−Ｌ１−Ｈ１、
（５８）Ｈ１−Ｌ１−Ｖ−Ｃ−Ｌ２−Ｈ２またはＨ２−Ｌ２−Ｃ−Ｖ−Ｌ１−Ｈ１、
（５９）Ｈ１−Ｌ１−Ｖ−Ｌ２−Ｃ−Ｌ３−Ｈ２またはＨ２−Ｌ３−Ｃ−Ｌ２−Ｖ−Ｌ１−Ｈ１、
（６０）Ｈ１−Ｖ−Ｌ１−Ｃ−Ｌ２−Ｈ２またはＨ２−Ｌ２−Ｃ−Ｌ１−Ｖ−Ｈ１、
（６１）Ｈ１−Ｌ１−Ｖ−Ｌ２−Ｈ２−ＣまたはＣ−Ｈ２−Ｌ２−Ｖ−Ｌ１−Ｈ１、
（６２）Ｈ１−Ｌ１−Ｖ−Ｈ２−Ｌ２−ＣまたはＣ−Ｌ２−Ｈ２−Ｖ−Ｌ１−Ｈ１、
（６３）Ｈ１−Ｌ１−Ｖ−Ｌ２−Ｈ２−Ｌ３−ＣまたはＣ−Ｌ３−Ｈ２−Ｌ２−Ｖ−Ｌ１−Ｈ１、
（６４）Ｈ１−Ｖ−Ｌ１−Ｈ２−Ｌ２−ＣまたはＣ−Ｌ２−Ｈ２−Ｌ１−Ｖ−Ｈ１、
（６５）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ２−Ｈ２−ＣまたはＣ−Ｈ２−Ｌ２−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ、
（６６）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｈ２−Ｌ２−ＣまたはＣ−Ｌ２−Ｈ２−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ、
（６７）Ｖ−Ｌ１−Ｈ１−Ｌ２−Ｈ２−Ｌ３−ＣまたはＣ−Ｌ３−Ｈ２−Ｌ２−Ｈ１−Ｌ１−Ｖ、
（６８）Ｖ−Ｈ１−Ｌ１−Ｈ２−Ｌ２−ＣまたはＣ−Ｌ２−Ｈ２−Ｌ１−Ｈ１−Ｖ
からなる群より選択される式を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、ここでＶは本明細書に記載のＶＷＦ断片であり；
ＣはＦＶＩＩＩタンパク質であり；
ＨまたはＨ１は異種部分または第１異種部分であり；
Ｈ２は第２異種部分であり；
第１と第２異種部分は同じでも異なっていてもよく；
Ｌ、Ｌ１またはＬ２は随意のリンカーであり；
（−）はペプチド結合であるか、１または複数のアミノ酸であり；
（：）は化学的または物理的結合である。リンカーは同じでも異なっていてもよく、それぞれ１または複数の酵素的切断部位を含む切断可能リンカーであってもよい。異種部分は、当技術分野で既知の半減期延長技術、ポリペプチド、非ポリペプチド部分またはその両方であり得る。ポリペプチド部分は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、それらの任意の誘導体またはバリアント、またはそれらの任意の組合せ（たとえば、Ｆｃ領域）を含み得る。非ポリペプチド部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体もしくはバリアント、またはそれらの任意の組合せを含み得る。Ｈ、Ｈ１またはＨ２はそれぞれ、特徴に基づき選択され得、すべて同じでもそれぞれ異なっていてもよい。異種部分の非限定的な例は本明細書で別途開示されており、たとえば、イムノグロブリン定常領域またはその一部分（［０１０１］〜［０１２９］）、アルブミンまたはその断片もしくはバリアント（段落［０１３０］〜［０１３３］）、ポリマー、たとえばポリエチレングリコール（段落［０１４２］〜［０１４９］）およびＰＡＳ配列（段落［０１３５］〜［０１３８］）である。本明細書では、式（１）〜（６８）は、本発明のコンストラクトの非限定的な例として含まれるにすぎない。
【０１１３】
一実施形態では、（：）は、化学結合を表し、たとえば少なくとも１つの非ペプチド結合を表す。ある特定の実施形態では、化学結合すなわち（：）は共有結合である。他の実施形態では、化学結合すなわち（：）は共有相互作用であり、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、ファンデルワース相互作用、水素結合である。他の実施形態では、（：）は非ペプチド共有結合である。さらに他の実施形態では、（：）はペプチド結合である。さらに他の実施形態では、（：）は、２つの配列間の物理的な結合を表し、ここで第１配列の一部分は第２配列に近接し、第２配列が別の部分と相互作用するのを第１配列が遮蔽またはブロックし、さらに、この物理的結合は第２配列を他の部分と相互作用させることなく維持される。
【０１１４】
一実施形態では、キメラタンパク質のＶＷＦ断片に連結している第１異種部分（ＨまたはＨ１）は、第１Ｆｃ領域である。別の実施形態では、キメラタンパク質のＦＶＩＩＩタンパク質に連結している第２異種部分（またはＨ２）は第２Ｆｃ領域である。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、２本のポリペプチド鎖、ＦＶＩＩＩ（たとえば一本鎖ＦＶＩＩＩ）をコードするアミノ酸配列と第１異種部分（たとえば第１Ｆｃ領域）を含むか、本質的にそれらからなるか、それらからなる第１鎖と、Ｄ’ドメインとＤ３ドメインを含むＶＷＦ断片をコードするアミノ酸配列、第２異種部分（たとえば、第２Ｆｃ領域）およびＶＷＦ断片と第２Ｆｃドメイン間のリンカー（たとえば、ＶＷＦリンカー）を含むか、本質的にそれからなるか、それからなる第２鎖、を含む。ＶＷＦ断片と第２Ｆｃドメインの間のリンカーは、トロンビン切断リンカーであり得る。いくつかの実施形態では、一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩ配列内のＮ末端、Ｃ末端または１または複数の部位に連結した第３異種部分、たとえば半減期延長因子を含む。
【０１１６】
他の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、３本のポリペプチド鎖を含み、ここで第１鎖は、ＦＶＩＩＩの重鎖を含むか、本質的にそれからなるか、それからなり、第２鎖は、第１異種部分（たとえば、第１Ｆｃ領域）と融合したＦＶＩＩＩの軽鎖を含むか、本質的にそれからなるか、それからなり、第３ポリペプチド鎖は、Ｄ’ドメインとＤ３ドメインを含むＶＷＦ断片、第２異種部分（たとえば第２Ｆｃ領域）およびリンカーを含むか、本質的にそれらからなるか、それらからなる。ＶＷＦ断片と第２異種部分の間のリンカーは、トロンビン切断可能リンカーであり得る。いくつかの実施形態では、重鎖ＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩ配列内のＮ末端、Ｃ末端または１または複数の部位に連結し得る第３異種部分、たとえば半減期延長因子に連結している。
【０１１７】
さらに他の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、２本のポリペプチド鎖を含み、第１鎖はＦＶＩＩＩの重鎖を含むか、本質的にそれからなるか、それからなり、第２鎖はＦＶＩＩＩの軽鎖、第１異種部分（たとえば、第１Ｆｃ領域）、第１リンカー（たとえば、１または複数の細胞内プロセス部位を含むプロテアーゼ切断部位）、ＶＷＦ断片、第２リンカー（たとえば、トロンビン切断可能リンカー）および第２異種部分（たとえば、第２Ｆｃ領域）を含むか、本質的にそれらからなるか、それらからなり、ここでＦＶＩＩＩの軽鎖は第１異種部分（たとえば、第１Ｆｃ領域）に連結され、該第１異種部分はさらに第１リンカー（たとえば、１または複数の細胞内プロセス部位を含むプロテアーゼ切断部位を有するプロセス可能なリンカー）によりＶＷＦ断片に連結されており、ここでＶＷＦ断片は第２Ｆｃ領域に第２リンカー（たとえば、トロンビン切断可能リンカー）により連結されている。ある特定の実施形態では、第１リンカーと第２リンカーは同一であるか異なっている。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、１本のポリペプチド鎖を含み、該ポリペプチド鎖は、一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質、第１異種部分（たとえば、第１Ｆｃ領域）、第１リンカー（たとえば、トロンビン切断可能リンカー）、ＶＷＦ断片、第２リンカー（たとえば、トロンビン切断可能リンカー）および第２異種部分（たとえば、第２Ｆｃ領域）を含み、ここで一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質は第１異種部分に連結され、第１リンカーによりＶＷＦ断片にも連結され、ＶＷＦ断片は第２Ｆｃ領域に第２リンカーにより連結されている。一実施形態では、第１リンカーは、第１切断可能部位と第２切断可能部位を含む切断可能リンカーである。別の実施形態では、第２リンカーは、１つか２つの切断可能部位を含む切断可能リンカーである。特定の実施形態では、第２リンカーはトロンビン切断可能リンカーである。本発明で有用なリンカーは、どのような長さでもよく、たとえば少なくとも１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００または７００アミノ酸長であり得る。たとえば、リンカーは、２０アミノ酸、３５アミノ酸、４２アミノ酸、７３アミノ酸または９８アミノ酸であり得る。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、ＶＷＦ断片は、ペプチド結合により直接、またはリンカーにより、ＦＶＩＩＩタンパク質に連結している。ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を直接またはリンカーを介して連結する１つの方法として、酵素的結合（たとえば、ソルターゼ）が使用できる。たとえば、ソルターゼは、カルボキシル末端局在化シグナルを識別し切断することで表面タンパク質を改変する原核生物酵素の一群を指す。ソルターゼ酵素のほとんどの基質では、識別シグナルは、モチーフＬＰＸＴＧ（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−任意−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ（配列番号１０６）、次いで高疎水性膜貫通シーケンス、次いでアルギニンなどの塩基性残基のクラスターからなる。切断はＴｈｒとＧｌｙの間に生じ、Ｔｈｒ残基を介して結合パートナーの活性部位Ｃｙｓ残基に一過性に結合し、次いでタンパク質を細胞壁に共有結合させるペプチド転移が生じる。いくつかの実施形態では、結合パートナーはＧｌｙ（ｎ）を含む。
【０１２０】
一実施形態では、随意のリンカーによりソルターゼ認識モチーフに連結されたＶＷＦ断片は、ソルターゼによりＧｌｙ（ｎ）に連結されたＦＶＩＩＩタンパク質と融合し得、ここでｎは任意の整数であり得る。結合コンストラクトは、ＶＷＦ断片（コンストラクトのＮ末端部分）とＦＶＩＩＩタンパク質（コンストラクトのＣ末端部分）を含み、ここでソルターゼ認識モチーフが間に挿入される。例となるコンストラクトが図２４（Ａ）に示されている。別の結合コンストラクトは、ＶＷＦ断片（コンストラクトのＮ末端部分、リンカー、ソルターゼ認識モチーフおよびＦＶＩＩＩタンパク質（コンストラクトのＣ末端部分）（たとえば、図２４（Ｃ））を含む。別の実施形態では、随意のリンカーによりソルターゼ認識モチーフに連結されたＦＶＩＩＩタンパク質は、ソルターゼによりＧｌｙ（ｎ）に連結されたＶＷＦ断片と融合し得、ここでｎは任意の整数であり得る。得られた結合コンストラクトは、ＦＶＩＩＩタンパク質（コンストラクトのＮ末端部分）とＶＷＦ断片（コンストラクトのＣ末端部分）を含み、ここでソルターゼ認識モチーフが間に挿入される。例となるコンストラクトが図２４（Ｂ）に示されている。別の得られた結合コンストラクトは、ＦＶＩＩＩタンパク質（コンストラクトのＮ末端部分）、リンカー、ソルターゼ認識モチーフおよびＶＷＦ断片（コンストラクトのＣ末端部分）（たとえば、図２４（Ｄ））を含む。他の実施形態では、第１の随意のリンカーでソルターゼ認識モチーフに連結されたＶＷＦ断片は、第２の随意のリンカーでトロンビン切断部位に連結された異種部分、たとえばイムノグロブリン定常領域またはその一部分、たとえばＦｃ領域に融合され得る。得られたコンストラクトは、ＶＷＦ断片（Ｎ末端部分）、第１リンカー、ソルターゼ認識モチーフ、プロテアーゼ切断部位、第２の随意のリンカーおよび異種部分（たとえば、図２４（Ｅ））を含み得る。ある特定の実施形態では、この得られたコンストラクトは、ＦＶＩＩＩタンパク質と第２異種部分、たとえばイムノグロブリン定常領域またはその一部分、たとえば第２Ｆｃ領域を含むキメラタンパク質の一部である。一例では、別の例では、キメラタンパク質は、３本のポリペプチド鎖、ＶＷＦ断片を含む第１鎖、第１リンカー、ソルターゼ認識モチーフ、プロテアーゼ切断部位、第２の随意のリンカー、第１異種部分ＦＶＩＩＩタンパク質の軽鎖および第２異種部分を含む第２鎖、およびＦＶＩＩＩタンパク質の重鎖を含む第３鎖を含む。
【０１２１】
さらに他の実施形態では、互いに共有結合しているか共有結合で連結しているＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含む本発明のキメラタンパク質は、ＶＷＦ断片なしのＦＶＩＩＩタンパク質よりも免疫原性が低い。低下した免疫原性には、限定ではないが、体液性免疫反応の低下、たとえば中和抗体力価の低下、またはＦＶＩＩＩに対する細胞媒介免疫反応の低下、たとえば様々なサイトカインの産生が含まれる。
【０１２２】
さらに他の実施形態では、本発明の結果、ＦＶＩＩＩタンパク質（またはキメラタンパク質）の半減期は、ＶＷＦ断片なしのＦＶＩＩＩタンパク質または野生型ＦＶＩＩＩと比べて延長される。ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、ＶＷＦ断片なしのＦＶＩＩＩタンパク質の半減期よりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍または少なくとも約１２倍長い。一実施形態では、ＦＶＩＩＩの半減期は、野生型ＦＶＩＩＩの半減期よりも、約１．５倍から約２０倍、約１．５倍から約１５倍または約１．５倍から約１０倍長い。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩの半減期は、野生型ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦ断片なしのＦＶＩＩＩタンパク質と比べて、約２倍から約１０倍、約２倍から約９倍、約２倍から約８倍、約２倍から約７倍、約２倍から約６倍、約２倍から約５倍、約２倍から約４倍、約２倍から約３倍、約２．５倍から約１０倍、約２．５倍から約９倍、約２．５倍から約８倍、約２．５倍から約７倍、約２．５倍から約６倍、約２．５倍から約５倍、約２．５倍から約４倍、約２．５倍から約３倍、約３倍から約１０倍、約３倍から約９倍、約３倍から約８倍、約３倍から約７倍、約３倍から約６倍、約３倍から約５倍、約３倍から約４倍、約４倍から約６倍、約５倍から約７倍または約６倍から約８倍延長される。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩの半減期は、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間または少なくとも約１０８時間である。さらに他の実施形態では、ＦＶＩＩＩの半減期は、約１５時間〜約２週、約１６時間〜約１週、約１７時間〜約１週、約１８時間〜約１週、約１９時間〜約１週、約２０時間〜約１週、約２１時間〜約１週、約２２時間〜約１週、約２３時間〜約１週、約２４時間〜約１週、約３６時間〜約１週、約４８時間〜約１週、約６０時間〜約１週、約２４時間〜約６日、約２４時間〜約５日、約２４時間〜約４日、約２４時間〜約３日または約２４時間〜約２日である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、対象当たりのＦＶＩＩＩタンパク質の平均半減期は、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間（１日）、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間（２日）、約５４時間、約６０時間、約７２時間（３日）、約８４時間、約９６時間（４日）、約１０８時間、約１２０時間（５日）、約６日、約７日（１週）、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日または約１４日である。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、ＶＷＦ断片と共有結合したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦダブルノックアウト（「ＤＫＯ」）マウスにおいてＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩモノマー−ダイマーハイブリッドからなるポリペプチドと比較して延長可能である。
【０１２５】
Ａ）フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）断片
ＶＷＦ（Ｆ８ＶＷＦとしても知られる）は血漿中に存在する大きいマルチマー糖タンパク質であり、内皮（バイベル・パラーデ小体中）、巨核球（血小板のα顆粒）および内皮下結合組織において恒常的に産生される。基本のＶＷＦモノマーは２８１３アミノ酸タンパク質である。各モノマーは、特異的機能を有するいくつかの特異的ドメインＤ’およびＤ３ドメイン（一緒に第ＶＩＩＩ因子に結合する）、Ａ１ドメイン（血小板ＧＰＩｂ−受容体、ヘパリン、および／またはおそらくはコラーゲンに結合する）、Ａ３ドメイン（コラーゲンに結合する）、Ｃ１ドメイン（活性化されるとその内部でＲＧＤドメインが血小板インテグリンαＩＩｂβ３に結合する）およびタンパク質のＣ末端側の端部の「システインノット」ドメイン（ＶＷＦは血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）およびβ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（βＨＣＧ）と共有する）を含む。
【０１２６】
ヒトＶＷＦの２８１３モノマーアミノ酸配列は、ジェンバンクの受託番号＿ＮＰ＿０００５４３．２＿＿として報告されている。ヒトＶＷＦをコードするヌクレオチド配列が、ジェンバンクの受託番号＿＿ＮＭ＿０００５５２．３＿として報告されている。ヒトＶＷＦのヌクレオチド配列は、配列番号１とされている。配列番号２は配列番号１にコードされるアミノ酸配列である。ＶＷＦの各ドメインは表１に列挙されている。
【０１２７】
【表１−１】
2020078338.tif 000002
【表１−２】
2020078338.tif 000003
【表１−３】
2020078338.tif 000004
【表１−４】
2020078338.tif 000005
【表１−５】
2020078338.tif 000006
【表１−６】
2020078338.tif 000007
【表１−７】
2020078338.tif 000008
【表１−８】
2020078338.tif 000009
【表１−９】
2020078338.tif 000010
【表１−１０】
2020078338.tif 000011
【表１−１１】
2020078338.tif 000012
【表１−１２】
2020078338.tif 000013
【表１−１３】
2020078338.tif 000014
【表１−１４】
2020078338.tif 000015
【０１２８】
本発明は、ＶＷＦのＤ’ドメインおよびＤ３ドメインを含むフォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）断片に関し、ＶＷＦ断片は内因性ＶＷＦ（全長ＶＷＦ）のＦＶＩＩＩタンパク質への結合を阻害する。一実施形態では、ＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩタンパク質に結合するか（bind）または会合される（associated）。ＦＶＩＩＩタンパク質と結合または会合することで、本発明のＶＷＦ断片は、ＦＶＩＩＩをプロテアーゼ切断とＦＶＩＩＩ活性化から保護し、ＦＶＩＩＩ重鎖および／または軽鎖を安定させ、スカベンジャー受容体によるＦＶＩＩＩの排除を防止する。別の実施形態では、ＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩタンパク質と結合または会合し、ＦＶＩＩＩタンパク質のリン脂質および活性化プロテインＣとの結合をブロックまたは防止する。ＦＶＩＩＩタンパク質と内因性の全長ＶＷＦの結合を防止または阻害することで、本発明のＶＷＦ断片はＶＷＦクリアランス受容体によるＦＶＩＩＩの排除を低減し、ＦＶＩＩＩの半減期を延長する。したがって、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期延長は、ＦＶＩＩＩタンパク質に対するＶＷＦクリアランス受容体結合部位を持たないＶＷＦ断片との結合または会合と、ＶＷＦ断片によるＶＷＦクリアランス受容体結合部位を有する内因性ＶＷＦからのＦＶＩＩＩタンパク質の遮蔽または保護による。ＶＷＦ断片と結合しているか保護されているＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質のリサイクルも可能にする。したがって、ＶＷＦ断片は、全長成熟ＶＷＦではありえない。全長ＶＷＦ分子に含まれるＶＷＦクリアランス経路受容体結合部位を排除することで、本発明のＦＶＩＩＩ／ＶＷＦヘテロダイマーはＶＷＦクリアランス経路から解離し、さらにＦＶＩＩＩ半減期が延長される。
【０１２９】
Ｄ’ドメインとＤ３ドメインを含むＶＷＦ断片は、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、ＣＫドメイン、それらの１または複数の断片、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択されるＶＷＦドメインをさらに含み得る。一実施形態では、ＶＷＦ断片は、（１）ＶＷＦのＤ’およびＤ３ドメインまたはその断片；（２）ＶＷＦのＤ１、Ｄ’およびＤ３ドメインまたはその断片；（３）ＶＷＦのＤ２、Ｄ’およびＤ３ドメインまたはその断片；（４）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ’およびＤ３ドメインまたはその断片；または（５）ＶＷＦのＤ１、Ｄ２、Ｄ’、Ｄ３およびＡ１ドメインまたはその断片を含むか、本質的にそれらからなるか、それらからなる。本明細書に記載のＶＷＦ断片は、ＶＷＦクリアランス受容体に結合する部位を含まない。別の実施形態では、本明細書に記載のＶＷＦ断片は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２７４ではない。本発明のＶＷＦ断片は、ＶＷＦ断片に連結または融合した任意の他の配列を含み得るが、全長ＶＷＦではない。たとえば、本明細書に記載のＶＷＦ断片は、シグナルペプチドをさらに含み得る。
【０１３０】
一実施形態では、本発明のＶＷＦ断片は、ＶＷＦのＤ’ドメインおよびＤ３ドメインを含み、ここでＤ’ドメインは、配列番号２のアミノ酸７６４〜８６６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、ここでＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩタンパク質と結合し、内因性ＶＷＦ断片のＦＶＩＩＩタンパク質への結合を遮蔽、阻害または防止する。別の実施形態では、ＶＷＦ断片は、ＶＷＦのＤ’ドメインおよびＤ３ドメインを含み、ここでＤ３ドメインは、配列番号２のアミノ酸８６７〜１２４０と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり、ここでＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩタンパク質と結合するか、または内因性ＶＷＦ断片のＦＶＩＩＩタンパク質への結合を阻害または防止する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＶＷＦ断片は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のＶＷＦのＤ’ドメインおよびＤ３ドメインを含むか、本質的にそれらからなるか、それらからなり、ここでＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩタンパク質と結合するか、または内因性ＶＷＦ断片のＦＶＩＩＩタンパク質への結合を阻害または防止する。他の実施形態では、ＶＷＦ断片は、配列番号２のアミノ酸２３〜１２４０と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のＤ１、Ｄ２、Ｄ’およびＤ３ドメインを含むか、本質的にそれらからなるか、それらからなり、ここでＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩタンパク質と結合するか、または内因性ＶＷＦ断片のＦＶＩＩＩタンパク質への結合を阻害または防止する。さらに他の実施形態では、ＶＷＦ断片は、機能的に連結されたシグナルペプチドをさらに含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本発明のＶＷＦ断片は、（１）Ｄ’Ｄ３ドメイン、Ｄ１Ｄ’Ｄ３ドメイン、Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメインまたはＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメインと、（２）最高約１０アミノ酸（たとえば、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０から配列番号２のアミノ酸７６４〜１２５０の任意の配列）、最高約１５アミノ酸（たとえば、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０から配列番号２のアミノ酸７６４〜１２５５の任意の配列）、最高約２０アミノ酸（たとえば、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０から配列番号２のアミノ酸７６４〜１２６０の任意の配列）、最高約２５アミノ酸（たとえば、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０から配列番号２のアミノ酸７６４〜１２６５の任意の配列）または最高約３０アミノ酸（たとえば、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４０から配列番号２のアミノ酸７６４〜１２６０の任意の配列）の追加のＶＷＦ配列から本質的になるか、それらからなる。特定の実施形態では、Ｄ’ドメインおよびＤ３ドメインを含むかまたは本質的にそれらからなるＶＷＦ断片は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２７４でも全長成熟ＶＷＦでもない。
【０１３２】
他の実施形態では、Ｄ１Ｄ２ドメインに連結したＤ’Ｄ３ドメインを含むＶＷＦ断片は、細胞内切断部位、たとえば、（ＰＡＣＥまたはＰＣ５による切断部位）をさらに含み、発現後Ｄ１Ｄ２ドメインのＤ’Ｄ３ドメインからの切断を可能にしている。細胞内切断部位の非限定的な例は本明細書で別途開示されている。
【０１３３】
さらに他の実施形態では、ＶＷＦ断片は、Ｄ’ドメインおよびＤ３ドメインを含むが、（１）配列番号２のアミノ酸１２４１〜２８１３、（２）配列番号２のアミノ酸１２７０〜アミノ酸２８１３、（３）配列番号２のアミノ酸１２７１〜アミノ酸２８１３、（４）配列番号２のアミノ酸１２７２〜アミノ酸２８１３、（５）配列番号２のアミノ酸１２７３〜アミノ酸２８１３および（６）配列番号２のアミノ酸１２７４〜アミノ酸２８１３からなる群より選択されるアミノ酸配列は含まない。
【０１３４】
さらに他の実施形態では、本発明のＶＷＦ断片は、Ｄ’ドメイン、Ｄ３ドメインおよびＡ１ドメインに対応するアミノ酸配列を含むか、本質的にそれらからなるか、それらからなり、ここでアミノ酸配列は配列番号２のアミノ酸７６４〜１４７９と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり、ＶＷＦはＦＶＩＩＩに結合する。特定の実施形態では、ＶＷＦ断片は配列番号２のアミノ酸７６４〜１２７４ではない。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本発明のＶＷＦ断片は、Ｄ’ドメインおよびＤ３ドメインを含むが、（１）Ａ１ドメイン、（２）Ａ２ドメイン、（３）Ａ３ドメイン、（４）Ｄ４ドメイン、（５）Ｂ１ドメイン、（６）Ｂ２ドメイン、（７）Ｂ３ドメイン、（８）Ｃ１ドメイン、（９）Ｃ２ドメイン、（１０）ＣＫドメイン、（１１）ＣＫドメインおよびＣ２ドメイン、（１２）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメインおよびＣ１ドメイン、（１３）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、（１４）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、（１５）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメインおよびＢ１ドメイン、（１６）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ１ドメインおよびＤ４ドメイン、（１７）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｄ４ドメイン、およびＡ３ドメイン、（１８）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ａ３ドメイン、およびＡ２ドメイン、（１９）ＣＫドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ａ３ドメイン、Ａ２ドメインおよびＡ１ドメインおよび（２０）それらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１つのＶＷＦドメインは含まない。
【０１３６】
さらに他の実施形態では、ＶＷＦ断片は、Ｄ’Ｄ３ドメインおよび１または複数のドメインまたはモジュールを含む。そのようなドメインまたはモジュールの例には、限定ではないが、Zhour et al., Blood ２０１２年４月６日オンライン発表: DOI 10.1182/blood-2012-01-405134に開示のドメインおよびモジュールが含まれる。たとえば、ＶＷＦ断片は、Ｄ’Ｄ３ドメインおよび１または複数のドメイン、またはＡ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ４Ｎモジュール、ＶＷＤ４モジュール、Ｃ８−４モジュール、ＴＩＬ−４モジュール、Ｃ１モジュール、Ｃ２モジュール、Ｃ３モジュール、Ｃ４モジュール、Ｃ５モジュール、Ｃ５モジュール、Ｃ６モジュール、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択されるモジュールを含み得る。
【０１３７】
さらに他の実施形態では、ＶＷＦ断片は異種部分に連結され、異種部分はＶＷＦ断片のＮ末端またはＣ末端に連結されるか、ＶＷＦ断片の２つのアミノ酸の間に挿入される。たとえば、ＶＷＦ断片の異種部分の挿入部位は、Ｄ’ドメイン、Ｄ３ドメイン、またはその両方の中にあり得る。異種部分は、半減期延長因子であり得る。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、本発明のＶＷＦ断片はマルチマー、たとえば、ダイマー、トライマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマーまたはより高次のマルチマーを形成する。他の実施形態では、ＶＷＦ断片は、ＶＷＦ断片を１つだけ有するモノマーである。いくつかの実施形態では、本発明のＶＷＦ断片は、１または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または修飾を有し得る。一実施形態では、ＶＷＦ断片は、アミノ酸置換、欠失、付加または修飾を含み得るので、ＶＷＦ断片はジスルフィド結合の形成またはダイマーもしくはマルチマーの形成ができない。別の実施形態では、アミノ酸置換はＤ’ドメインおよびＤ３ドメイン中である。特定の実施形態では、本発明のＶＷＦ断片は、配列番号２の残基１０９９、残基１１４２、または残基１０９９と１１４２の両方に対応する残基での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。少なくとも１つのアミノ酸の置換は、野生型ＶＷＦで自然に生じないどのアミノ酸でもよい。たとえば、アミノ酸置換は、システイン以外のあらゆるアミノ酸、たとえば、イソロイシン、アラニン、ロイシン、アスパラギン、リジン、アスパラギン酸、メチオニン、フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、セリン、チロシン、アルギニンまたはヒスチジンであり得る。別の例では、アミノ酸置換は、ＶＷＦ断片のマルチマー形成を防止または阻害する１または複数のアミノ酸を有する。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、本明細書で有用なＶＷＦ断片は、さらに修飾されてＦＶＩＩＩとの相互作用が改善され得、たとえばＦＶＩＩＩに対する結合親和性が改善され得る。非限定的な例として、ＶＷＦ断片は、セリン残基を配列番号２のアミノ酸７６４に対応する残基に、リジン残基を配列番号２のアミノ酸７７３に対応する残基に含む。残基７６４および／または７７３は、ＶＷＦ断片のＦＶＩＩＩに対する結合親和性に貢献し得る。他の実施形態では、ＶＷＦ断片は他の修飾を有し得、たとえば、断片はペグ化、グリコシル化、ヘシル化（hesylated）またはポリシアル酸化され得る。
【０１４０】
Ｂ）異種部分
異種部分は、異種ポリペプチドまたは異種非ポリペプチド部分であり得る。ある特定の実施形態では、異種部分は、当技術分野で既知の、ポリペプチド、非ポリペプチド部分またはそれらの組合せを含む半減期延長分子である。異種ポリペプチド部分は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、トランスフェリンまたはその断片、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、それらの誘導体またはバリアント、またはそれらの任意の組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、非ポリペプチド結合部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、またはそれらの任意の組合せを含む。ある特定の実施形態では、１つ、２つ、３つまたはそれより多くの異種部分があり得、それらは同じかまたは異なる分子であり得る。
【０１４１】
１）イムノグロブリン定常領域またはその一部分
イムノグロブリン定常領域は、ＣＨ（定常重）ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２など）と呼ばれるドメインで構成される。アイソタイプ（すなわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）により、定常領域は３つか４つのＣＨドメインで構成され得る。一部のアイソタイプ（たとえばＩｇＧ）定常領域はヒンジ領域も含む。Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garl and Publishing, N.Y., N.Yを参照されたい。
【０１４２】
本発明のキメラタンパク質を産生するイムノグロブリン定常領域またはその一部分は、多くの異なる供給源から得られ得る。好ましい実施形態では、イムノグロブリン定常領域またはその一部分はヒトイムノグロブリンに由来する。しかし、イムノグロブリン定常領域またはその一部分はたとえばげっ歯類（たとえばマウス、ラット、ウサギ、モルモット）または非ヒト霊長類（たとえばチンパンジー、マカク）種を含む別の哺乳動物種のイムノグロブリン由来でもあり得ることが理解される。さらに、イムノグロブリン定常領域またはその一部分は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含むあらゆるイムノグロブリンクラスおよびＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むあらゆるイムノグロブリンアイソタイプ由来であり得る。一実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１が使用される。
【０１４３】
様々なイムノグロブリン定常領域の遺伝子配列（たとえばヒト定常領域遺伝子配列）が公的アクセス可能に登録されている。定常領域ドメイン配列は、特定のエフェクター機能を有して（または特定のエフェクター機能を欠いて）または免疫原性を減少させる特定の修飾を有して選択され得る。抗体および抗体をコードする遺伝子の多くの配列が発表されており、適切なＩｇ定常領域配列（たとえばヒンジ、ＣＨ２、および／またはＣＨ３配列またはその一部分）が当技術分野で知られる技法によりこれらの配列から引き出され得る。上述のいずれかの方法により得られた遺伝子材料は、次いで本発明のポリペプチドを得るために改変または合成され得る。なお、本発明の範囲には、定常領域のＤＮＡ配列のアレル、バリアントおよび突然変異が包含されることがさらに理解される。
【０１４４】
イムノグロブリン定常領域またはその一部分の配列は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応と目的のドメインを増殖させるために選択されたプライマーを用いてクローン化され得る。抗体からイムノグロブリン定常領域またはその一部分の配列をクローン化するために、ｍＲＮＡがハイブリドーマ、脾臓またはリンパ細胞から単離され、ＤＮＡに逆転写され、抗体遺伝子がＰＣＲ増殖され得る。ＰＣＲ増殖方法は、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８００，１５９号；同第４，９６５，１８８号；および、たとえば、“PCR Protocols:  A Guide to Methods and Applications” Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al.  1989. Gene 77:51; Horton et al.  1993.  Methods Enzymol.  217:270に詳述されている。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーまたは発表されている重鎖および軽鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づきより特異的なプライマーにより開始され得る。上述のように、ＰＣＲは、抗体軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するのにも使用され得る。この場合、ライブラリーは、コンセンサスプライマーまたはマウス定常領域プローブなどのより大きい同属プローブによりスクリーニングされ得る。抗体遺伝子の増殖に適した多くのプライマーセットは当技術分野で既知である（たとえば、精製抗体のＮ末端配列に基づく５’プライマー（Benhar and Pastan.  1994.  Protein Engineering  7:1509）；ｃＤＮＡ末端の高速増殖（Ruberti, F. et al.1994. J. Immunol. Methods 173:33）；抗体リーダー配列（Larrick et al.  1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250））。抗体配列のクローン化は、本明細書に参照として組み込まれる、１９９５年１月２５日に出願されたNewmanらの米国特許第５，６５８，５７０号にさらに記載されている。
【０１４５】
本明細書で使用されるイムノグロブリン定常領域は、全てのドメインおよびヒンジ領域またはそれらの部分を含み得る。一実施形態では、イムノグロブリン定常領域またはその一部分は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域、すなわち、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含む。
【０１４６】
本明細書では、「Ｆｃ領域」という用語は、ポリペプチドの中で天然イムノグロブリンのＦｃ領域に対応する部分、すなわちＦｃドメインの２本の重鎖の二量体結合により形成された部分と定義される。天然Ｆｃ領域は、別のＦｃ領域とホモダイマーを形成する。一方、「遺伝的融合Ｆｃ領域」または「一本鎖Ｆｃ領域」（ｓｃＦｃ領域）という用語は、本明細書では、１本のポリペプチド鎖内で遺伝子連結されたＦｃドメイン（すなわち、単一の連続的遺伝配列でコードされている）で構成される合成二量体Ｆｃ領域を指す。
【０１４７】
一実施形態では、「Ｆｃ領域」という用語は、１本のイムノグロブリン重鎖の中でパパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域（すなわちＩｇＧ重鎖定常領域の第１残基を１１４としてＩｇＧの残基２１６から始まり、その抗体のＣ末端で終了する部分を指す。したがって、完全なＦｃドメインは少なくとも１つのヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。
【０１４８】
イムノグロブリン定常領域のＦｃ領域は、イムノグロブリンのアイソタイプにより、ヒンジ領域の他にもＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含み得る。イムノグロブリンのＦｃ領域を含むキメラタンパク質は、安定性の増加、血清半減期の増加（Capon et al., 1989, Nature 337:525を参照）ならびに胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）などのＦｃ受容体への結合（米国特許第６，０８６，８７５号、同第６，４８５，７２６号、同第６，０３０，６１３；国際公開第０３／０７７８３４号；米国公開特許第２００３−０２３５５３６号Ａ１）（これら文献は参照によりその全容を本明細書に組み込まれる）を含むいくつかの望ましい特性をキメラタンパク質に付与する。
【０１４９】
イムノグロブリン定常領域またはその一部分は、ＦｃＲｎ結合パートナーであり得る。ＦｃＲｎは成体上皮組織において活性であり、小腸ルーメン、気道、鼻腔面、膣表面および、結腸および直腸表面（米国特許第６，４８５，７２６号）で発現する。ＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎに結合するイムノグロブリンの一部分である。
【０１５０】
ＦｃＲｎ受容体は、ヒトを含むいくつかの哺乳動物種から単離されている。ヒトＦｃＲｎ、サルＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎおよびマウスＦｃＲｎの配列が知られている（Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180:2377）。ＦｃＲｎ受容体は、比較的低いｐＨでＩｇＧに結合し（しかしＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥなどの他のイムノグロブリンクラスには結合しない）、管腔から漿膜方向にＩｇＧを経細胞的に能動的に輸送し、ＩｇＧを間質液に見出される比較的高いｐＨで解放する。それは、肺および腸上皮（Israel et al. 1997, Immunology 92:69）腎近位尿細管上皮（Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol.Renal Physiol. 282:F358）を含む成体上皮組織（米国特許第６，４８５，７２６号、同第６，０３０，６１３号、同第６，０８６，８７５号；国際公開第０３／０７７８３４号；米国公開特許第２００３−０２３５５３６号Ａ１）ならびに鼻腔上皮、膣表面および胆管表面で発現する。
【０１５１】
本発明で有用なＦｃＲｎ結合パートナーは、全ＩｇＧ、ＩｇＧのＦｃ断片およびＦｃＲｎ受容体の完全結合領域を含む他の断片を含むＦｃＲｎ受容体に特異的に結合され得る分子を包含する。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域はＸ線結晶解析に基づき記述されている（Burmeister et al. 1994, Nature 372:379）。ＦｃがＦｃＲｎと接触する主な領域は、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの間の接合付近である。Ｆｃ−ＦｃＲｎの接触部はすべて一本のＩｇ重鎖内にある。ＦｃＲｎ結合パートナーは、全ＩｇＧ、ＩｇＧのＦｃ断片およびＦｃＲｎの完全結合領域を含む他のＩｇＧの断片を含む。主な接触部位は、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１および３１４、およびＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８および４３３〜４３６を含む。イムノグロブリンまたはイムノグロブリン断片もしくは領域のアミノ酸の付番に関してはすべてKabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Mdを参照した。
【０１５２】
Ｆｃ領域またはＦｃＲｎに結合するＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎによる上皮バリア全体を効果的に行き来できるので、所望の治療分子を全身投与する非侵襲的手段を提供する。さらに、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含む融合タンパク質は、ＦｃＲｎを発現する細胞に飲食される。しかし、分解のマーキングをされるかわりに、これらの融合タンパク質はリサイクルされ再び血中に出され、これらのタンパク質のインビボ半減期を延長する。ある特定の実施形態では、イムノグロブリン定常領域の部分は、Ｆｃ領域または典型的にはジスルフィド結合および他の非特異的相互作用で別のＦｃ領域または別のＦｃＲｎ結合パートナーと結合してダイマーおよびより高次のマルチマーを形成するＦｃＲｎ結合パートナーである。
【０１５３】
２つのＦｃＲｎ受容体は単一のＦｃ分子と結合できる。結晶学的データは、各ＦｃＲｎ分子がＦｃホモダイマーの１つのポリペプチドと結合することを示唆している。一実施形態では、ＦｃＲｎ結合パートナー、たとえばＩｇＧのＦｃ断片を生理活性分子に連結させることで、生理活性分子を経口、頬内、舌下、膣内、鼻腔または肺経路のエアロゾル投与、または眼内経路で送達する手段が提供される。別の実施形態では、キメラタンパク質は、侵襲的、たとえば、皮下、静脈内投与され得る。
【０１５４】
ＦｃＲｎ結合パートナー領域は、分子またはその一部分であり、ＦｃＲｎ受容体に特異的に結合され、次いでＦｃ領域のＦｃＲｎ受容体により能動輸送され得る。特異的に結合するとは、２つの分子が、生理学的条件下で比較的安定な複合体を形成すること指す。特異的結合は、通常は低親和性と中程度から高い能力を有する非特異的結合と区別して、高親和性と低から中程度の能力に特徴づけられる。典型的には、結合は、親和性定数ＫＡが１０６Ｍ−１よりも高い場合、または１０８Ｍ−１よりも高い場合に特異的と考えられる。必要ならば、非特異的結合は、結合条件を変えることにより、実質的に特異的結合に影響を及ぼすことなく低下され得る。適切な結合条件、たとえば分子の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合に与える時間、ブロッキング剤（血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度などは、ルーチンの技法を用いる当業者により最適化され得る。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、１または複数の切断されたＦｃ領域を含み、それらは尚も十分なＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合特性が備わっている。たとえば、ＦｃＲｎに結合するＦｃ領域の一部分（すなわちＦｃＲｎ結合部分）は、ＩｇＧ１のアミノ酸およそ２８２〜４３８、ＥＵ付番（一次接触部位はＣＨ２ドメインのアミノ酸２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１および３１４であり、アミノ酸残基３８５〜３８７、４２８およびＣＨ３ドメインの４３３〜４３６）で構成される。したがって、本発明のＦｃ領域は、ＦｃＲｎ結合部分を含み得るかそれからなり得る。ＦｃＲｎ結合部分は、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプの重鎖に由来し得る。一実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１の抗体由来のＦｃＲｎ結合部分が使用される。別の実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ４の抗体由来のＦｃＲｎ結合部分が使用される。
【０１５６】
別の実施形態では、「Ｆｃ領域」は、Ｆｃドメインの、またはＦｃドメイン由来のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒンジ（たとえば、上部、中央および／または下部ヒンジ領域）ドメイン（ＥＵ付番による抗体Ｆｃ領域のアミノ酸およそ２１６〜２３０）、ＣＨ２ドメイン（ＥＵ付番による抗体Ｆｃ領域のアミノ酸およそ２３１〜３４０）、ＣＨ３ドメイン（ＥＵ付番による抗体Ｆｃ領域のアミノ酸およそ３４１〜４３８）、ＣＨ４ドメインまたはそのバリアント、一部分または断片のうちの少なくとも１つを含む。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、完全Ｆｃドメイン（すなわち、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＨ３ドメイン（またはその一部分）に融合したヒンジドメイン（またはその一部分）、ＣＨ２ドメイン（またはその一部分）に融合したヒンジドメイン（またはその一部分）、ＣＨ３ドメイン（またはその一部分）に融合したＣＨ２ドメイン（またはその一部分）、ヒンジドメイン（またはその一部分）とＣＨ３ドメイン（またはその一部分）の両方に融合したＣＨ２ドメイン（またはその一部分）を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。さらに他の実施形態では、Ｆｃ領域は、少なくともＣＨ２ドメイン（たとえば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）の一部分が欠失している。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵ番号２２１〜４４７に対応するアミノ酸を含むかそれらからなる。
【０１５７】
本明細書でＦ、Ｆ１、またはＦ２と呼ばれるＦｃ領域は、多様な供給源から得られ得る。一実施形態では、ポリペプチドのＦｃ領域は、ヒトイムノグロブリン由来である。しかし、Ｆｃ領域は、たとえば、げっ歯類（たとえばマウス、ラット、ウサギ、モルモット）または非ヒト霊長類（たとえばチンパンジー、マカク）種を含む別の哺乳動物種のイムノグロブリン由来であってもよいことが理解される。さらに、Ｆｃドメインまたはその部分のポリペプチドはＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む任意のイムノグロブリンクラス、およびＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のイムノグロブリンアイソタイプ由来であり得る。別の実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１が用いられる。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、Ｆｃバリアントは、前記野生型Ｆｃドメインを含むＦｃ領域により与えられる少なくとも１エフェクター機能を変更する（たとえば、Ｆｃ領域がＦｃ受容体（たとえばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃγＲＩＩＩ）または補体タンパク質（たとえばＣ１ｑ）に結合する、または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣＣ）を引き起こす能力の向上または低下）。他の実施形態では、Ｆｃバリアントは、改変システイン残基を提供する。
【０１５９】
本発明のＦｃ領域は、エフェクター機能および／またはＦｃＲまたはＦｃＲｎ結合に変化（たとえば増強または低減）を与えることがわかっている当技術分野で既知のＦｃバリアントを用いてよい。具体的には、本発明の結合分子は、たとえば国際公開公報ＷＯ８８／０７０８９Ａ１、ＷＯ９６／１４３３９Ａ１、ＷＯ９８／０５７８７Ａ１、ＷＯ９８／２３２８９Ａ１、ＷＯ９９／５１６４２Ａ１、ＷＯ９９／５８５７２Ａ１、ＷＯ００／０９５６０Ａ２、ＷＯ００／３２７６７Ａ１、ＷＯ００／４２０７２Ａ２、ＷＯ０２／４４２１５Ａ２、ＷＯ０２／０６０９１９Ａ２、ＷＯ０３／０７４５６９Ａ２、ＷＯ０４／０１６７５０Ａ２、ＷＯ０４／０２９２０７Ａ２、ＷＯ０４／０３５７５２Ａ２、ＷＯ０４／０６３３５１Ａ２、ＷＯ０４／０７４４５５Ａ２、ＷＯ０４／０９９２４９Ａ２、ＷＯ０５／０４０２１７Ａ２、ＷＯ０４／０４４８５９、ＷＯ０５／０７０９６３Ａ１、ＷＯ０５／０７７９８１Ａ２、ＷＯ０５／０９２９２５Ａ２、ＷＯ０５／１２３７８０Ａ２、ＷＯ０６／０１９４４７Ａ１、ＷＯ０６／０４７３５０Ａ２およびＷＯ０６／０８５９６７Ａ２；米国特許公開ＵＳ２００７／０２３１３２９、ＵＳ２００７／０２３１３２９、ＵＳ２００７／０２３７７６５、ＵＳ２００７／０２３７７６６、ＵＳ２００７／０２３７７６７、ＵＳ２００７／０２４３１８８、ＵＳ２００７０２４８６０３、ＵＳ２００７０２８６８５９、ＵＳ２００８００５７０５６；または米国特許５，６４８，２６０；５，７３９，２７７；５，８３４，２５０；５，８６９，０４６；６，０９６，８７１；６，１２１，０２２；６，１９４，５５１；６，２４２，１９５；６，２７７，３７５；６，５２８，６２４；６，５３８，１２４；６，７３７，０５６；６，８２１，５０５；６，９９８，２５３；７，０８３，７８４；７，４０４，９５６および７，３１７，０９１（すべて参照により本明細書に組み込む）に開示のアミノ酸位置の１または複数での変更（たとえば置換）を含み得る。一実施形態では、特定の変更（たとえば当技術分野で開示の１または複数のアミノ酸の特定の置換）が、開示のアミノ酸位置の１または複数でなされ得る。別の実施形態では、異なる変更（たとえば当技術分野で開示の１または複数のアミノ酸位置の異なる置換）が、開示のアミノ酸位置の１または複数でなされ得る。
【０１６０】
ＩｇＧのＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーは、部位特異的変異誘発などの周知の手順に従い修飾され得、ＦｃＲｎに結合される修飾ＩｇＧまたはそのＦｃ断片もしくは部分を生じる。そのような修飾は、接触部位から離れた修飾ならびにＦｃＲｎへの結合性を保存または増強させる接触部位内の修飾を含む。たとえば、次のヒトＩｇＧ１Ｆｃ（Ｆｃγ１）の１つのアミノ酸残基は、ＦｃＲｎに対するＦｃ結合親和性を実質的に失うことなく置換され得る：Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｋ２４８Ａ、Ｄ２４９Ａ、Ｍ２５２Ａ、Ｔ２５６Ａ、Ｅ２５８Ａ、Ｔ２６０Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ２６９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｅ２７２Ａ、Ｌ２７４Ａ、Ｎ２７６Ａ、Ｙ２７８Ａ、Ｄ２８０Ａ、Ｖ２８２Ａ、Ｅ２８３Ａ、Ｈ２８５Ａ、Ｎ２８６Ａ、Ｔ２８９Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ａ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９４Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｙ２９６Ｆ、Ｎ２９７Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｒ３０１Ａ、Ｖ３０３Ａ、Ｖ３０５Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｌ３０９Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｄ３１２Ａ、Ｎ３１５Ａ、Ｋ３１７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｑ、Ｐ３３１Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｔ３３５Ａ、Ｓ３３７Ａ、Ｋ３３８Ａ、Ｋ３４０Ａ、Ｑ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ａ、Ｑ３４７Ａ、Ｒ３５５Ａ、Ｅ３５６Ａ、Ｍ３５８Ａ、Ｔ３５９Ａ、Ｋ３６０Ａ、Ｎ３６１Ａ、Ｑ３６２Ａ、Ｙ３７３Ａ、Ｓ３７５Ａ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｑ、Ｅ３８０Ａ、Ｅ３８２Ａ、Ｓ３８３Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｑ３８６Ａ、Ｅ３８８Ａ、Ｎ３８９Ａ、Ｎ３９０Ａ、Ｙ３９１Ｆ、Ｋ３９２Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｓ４００Ａ、Ｄ４０１Ａ、Ｄ４１３Ａ、Ｋ４１４Ａ、Ｒ４１６Ａ、Ｑ４１８Ａ、Ｑ４１９Ａ、Ｎ４２１Ａ、Ｖ４２２Ａ、Ｓ４２４Ａ、Ｅ４３０Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ４３７Ａ、Ｑ４３８Ａ、Ｋ４３９Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４４ＡおよびＫ４４７Ａ。ここで、たとえばＰ２３８Ａは、位置番号２３８でアラニンで置換される野生型プロリンを表す。一例として、特定の実施形態は、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位を除去するＮ２９７Ａ突然変異を含む。アラニンに加えて、他のアミノ酸も上述した位置で野生型アミノ酸を置換し得る。突然変異は、Ｆｃに単独で導入されて、ネイティブのＦｃとは異なる１００を超えるＦｃ領域を生じ得る。さらに、これらの個々の突然変異の２、３またはそれ以上の組合せが一緒に導入され得、数百倍のＦｃ領域を生じる。さらに、本発明のコンストラクトのＦｃ領域の１つが突然変異されるがコンストラクトの他のＦｃ領域は全く突然変異されないか、またはどちらも突然変異されるが異なる突然変異であり得る。
【０１６１】
上記の突然変異のなかにはＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーに新規の機能性を与えるものがあり得る。たとえば一実施形態はＮ２９７Ａを組込み、高度に保存されるＮ−グリコシル化部位を除去する。この突然変異の効果により免疫原性が低下するので、Ｆｃ領域の循環半減期が増加し、Ｆｃ領域は、ＦｃＲｎに対する親和性を損なうことなくＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＩＡと結合できなくなる（Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591）。上述の突然変異から生じる新規の機能性のさらなる例としては、ＦｃＲｎに対する親和性が、場合によっては野生型よりも増加することがある。この親和性の増加は、「オン」速度の増加、「オフ」速度の低下、または「オン」速度の増加と「オフ」速度の低下の両方を反映し得る。ＦｃＲｎに対する親和性を増加させると考えられている突然変異の例は、限定ではないが、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａを含む（Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591）。
【０１６２】
さらに、少なくとも３つのヒトＦｃガンマ受容体が、ＩｇＧ下部のヒンジ領域において、一般的にはアミノ酸２３４−２３７で、結合部位を識別するようである。したがって、新規の機能性と免疫原性低下の可能性の別の例は、この領域の突然変異から、たとえばヒトＩｇＧ１「ＥＬＬＧ」のアミノ酸２３３−２３６をＩｇＧ２「ＰＶＡ」（１つのアミノ酸が欠失）由来の対応する配列で置き換えることで、生じ得る。さまざまなエフェクター機能を仲介するＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、そのような突然変異が導入されている場合はＩｇＧ１に結合しないことが示されている。Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77およびArmour et al. 1999, Eur. J.Immunol. 29:2613.
【０１６３】
一実施形態では、イムノグロブリン定常領域またはその一部分、たとえばＦｃ領域は、配列ＰＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ（配列番号３）を含み、随意にさらにＨＱＳＬＧＴＱ（配列番号４）、ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号５）、ＨＱＮＩＳＤＧＫ（配列番号６）またはＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号７）より選択される配列をさらに含む、ポリペプチドである（米国特許第５，７３９，２７７号）。
【０１６４】
別の実施形態では、イムノグロブリン定常領域またはその一部分は、ヒンジ領域またはその一部分に、別のイムノグロブリン定常領域またはその一部分と１または複数のジスルフィド結合を形成するアミノ酸配列を含む。イムノグロブリン定常領域またはその一部分によるジスルフィド結合は、第ＦＶＩＩＩを含む１ポリペプチドとＶＷＦ断片を含む第２ポリペプチドを一緒にして、内因性ＶＷＦがＶＷＦ断片を置換しないように、また、ＦＶＩＩＩに結合しないようにする。したがって、第１イムノグロブリン定常領域またはその一部分と第２イムノグロブリン定常領域またはその一部分の間のジスルフィド結合は、内因性ＶＷＦとＦＶＩＩＩタンパク質の間の相互作用を防止する。ＶＷＦとＦＶＩＩＩタンパク質間のこの相互作用の阻害により、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は２倍という制限を超えることができる。ヒンジ領域またはその一部分は、１または複数のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン、それらの断片およびそれらの任意の組合せにさらに連結し得る。特定の例では、イムノグロブリン定常領域またはその一部分は、ヒンジ領域とＣＨ２領域（たとえば、Ｆｃ領域のアミノ酸２２１〜３４０を含む。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、イムノグロブリン定常領域またはその一部分は、ヘミグリコシル化されている。たとえば、２つのＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含むキメラタンパク質は、第１のグリコシル化Ｆｃ領域（たとえばグリコシル化ＣＨ２領域）またはＦｃＲｎ結合パートナーと、第２の非グリコシル化（aglycosylated）Ｆｃ領域（たとえば非グリコシル化ＣＨ２領域）またはＦｃＲｎ結合パートナーを含み得る。一実施形態では、リンカーがグリコシル化Ｆｃ領域と非グリコシル化Ｆｃ領域の間に介在し得る。別の実施形態では、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーは、完全にグリコシル化されており、すなわち、Ｆｃ領域全てがグリコシル化されている。他の実施形態では、Ｆｃ領域はグリコシル化されていないかもしれず、すなわち、どのＦｃ部分も非グリコシル化されていない。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分（たとえば、Ｆｃバリアント）にアミノ酸置換を含み、Ｉｇ定常領域の抗原非依存性エフェクター機能、特にタンパク質の循環半減期が改変される。
【０１６７】
そのようなタンパク質は、これらの置換がないタンパク質と比べて、ＦｃＲｎへの結合の増加または低下を示すので、血清中の半減期が増加または低下する。ＦｃＲｎに対する親和性が向上したＦｃバリアントは、血清半減期がより長いことが予測されるので、そのような分子は、投与されるポリペプチドが長い半減期を有することが望ましい、哺乳動物を治療する方法、たとえば慢性の疾患または疾病を治療する方法において、有用な適応を有する（たとえば米国特許第７，３４８，００４号、同第７，４０４，９５６号および同第７，８６２，８２０号を参照）。一方、ＦｃＲｎ結合親和性が低下したＦｃバリアントは、より短い半減期を有すると考えられるので、そのような分子もまた、たとえばインビボでの画像診断用または血中に長期間存在すると出発ポリペプチドが毒性副作用をもつ状況など、循環時間の短縮が有利であり得るような哺乳動物への投与において、有用である。ＦｃＲｎ結合親和性が低下したＦｃバリアントはまた、胎盤を貫通しにくいので、妊婦の疾患や疾病の治療にも有用である。さらに、ＦｃＲｎ結合親和性低下が望ましいかもしれない他の用途は、脳、腎臓および／または肝臓での局在化が所望される用途を含む。１つの例示的実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、血管から腎臓糸球体上皮を通過する輸送の低減を示す。別の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、脳から血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する血管裂孔への輸送の低減を示す。一実施形態では、ＦｃＲｎ結合性が改変されたタンパク質は、Ｉｇ定常領域の「ＦｃＲｎ結合ループ」内に１または複数のアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナー（たとえば１つか２つのＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナー）を含む。ＦｃＲｎ結合ループは、野生型全長Ｆｃ領域のアミノ酸残基２８０〜２９９（ＥＵ付番による）で構成される。他の実施形態では、本発明のキメラタンパク質の改変されたＦｃＲｎ結合親和性を有するＩｇ定常領域またはその一部分は、１５ÅのＦｃＲｎ「接触ゾーン」内に１または複数のアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含む。本明細書では、１５ÅのＦｃＲｎ「接触ゾーン」という用語は、野生型全長Ｆｃ部分の次の位置に残基を含む：２４３〜２６１、２７５〜２８０、２８２〜２９３、３０２〜３１９、３３６〜３４８、３６７、３６９、３７２〜３８９、３９１、３９３、４０８、４２４、４２５〜４４０（ＥＵ付番）。他の実施形態では、本発明の改変されたＦｃＲｎ結合親和性を有するＩｇ定常領域またはその一部分は、次のＥＵ位置のいずれか１つに対応するアミノ酸位置に１または複数のアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含む：２５６、２７７〜２８１、２８３〜２８８、３０３〜３０９、３１３、３３８、３４２、３７６、３８１、３８４、３８５、３８７、４３４（たとえば、Ｎ４３４ＡまたはＮ４３４Ｋ）および４３８。ＦｃＲｎ結合活性を改変した例示的アミノ酸置換が、国際公開公報ＷＯ０５／０４７３２７（参照により本明細書に組み込む）に開示されている。
【０１６８】
本発明で用いられるＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーは、当技術分野で知られるキメラタンパク質のグリコシル化を改変するアミノ酸置換も含み得る。たとえば、ＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質に連結したキメラタンパク質のＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーは、グリコシル化の低下をもたらす突然変異（たとえば、Ｎ−またはＯ−結合グリコシル化）を有するＦｃ領域、または野生型Ｆｃ部分の改変されたグリコフォーム（たとえば、低フコースまたはフコースをもたないグリカン）を含み得る。
【０１６９】
一実施形態では、本発明の未加工のキメラタンパク質は、本明細書に記載のＩｇ定常領域またはその一部分から互いに独立して選択される、構成成分である２つ以上のＩｇ定常領域またはその一部分を有する遺伝的融合Ｆｃ領域（すなわちｓｃＦｃ領域）を含み得る。一実施形態では、二量体Ｆｃ領域のＦｃ領域は同じである。別の実施形態では、Ｆｃ領域のうち少なくとも２つが異なる。たとえば、本発明のタンパク質のＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーは、同数のアミノ酸残基を含むか、または長さが１または複数アミノ酸残基（たとえば、約５アミノ酸残基（たとえば、１、２、３、４、または５アミノ酸残基）、約１０残基、約１５残基、約２０残基、約３０残基、約４０残基または約５０残基）だけ異なっていてもよい。さらに他の実施形態では、本発明のＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーは、配列が１または複数のアミノ酸位置で異なり得る。たとえば、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーの少なくとも２つは、約５アミノ酸位置（たとえば、１、２、３、４または５アミノ酸位置）、約１０位置、約１５位置、約２０位置、約３０位置、約４０位置または約５０位置）で異なり得る。
【０１７０】
２）アルブミンまたはその断片もしくはバリアント
ある特定の実施形態では、ＶＷＦ断片に連結した異種部分またはＦＶＩＩＩタンパク質に連結した異種部分は、アルブミンまたはその機能的断片である。他の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質とアルブミンまたはその断片を含み、アルブミンまたはその断片がＦＶＩＩＩタンパク質上のＶＷＦ結合部位を遮蔽または保護し、ＦＶＩＩＩタンパク質の内因性ＶＷＦとの相互作用が阻害または防止される。
【０１７１】
全長型では６０９アミノ酸のタンパク質である人血清アルブミン（ＨSＡまたはＨＡ）は、血清浸透圧の重要な比率を担い、内因性および外因性リガンドの担体としても機能する。本明細書では、「アルブミン」という用語は、全長アルブミンまたはその機能的断片、バリアント、誘導体もしくは類似体を含む。
【０１７２】
一実施形態では、キメラタンパク質は、本明細書に記載のＶＷＦ断片およびアルブミンまたはその断片もしくはバリアントを含み、ＶＷＦ断片はアルブミンまたはその断片もしくはバリアントに連結している。別の実施形態では、キメラタンパク質は、互いに結合したＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含み、ＶＷＦ断片はアルブミンまたはその断片もしくはバリアントに連結しているか、第ＶＩＩＩ活性を有する該タンパク質はアルブミンまたはその断片もしくはバリアントに連結しているか、またはＶＷＦ断片と第ＶＩＩＩ活性を有する該タンパク質の両方がアルブミンまたはその断片もしくはバリアントに連結している。他の実施形態では、アルブミンまたはその断片もしくはバリアントに連結したＶＷＦ断片を含むキメラタンパク質は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分（たとえばＦｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳおよびＰＥＧからなる群より選択される異種部分にさらに連結している。さらに他の実施形態では、キメラタンパク質は、互いに結合したＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含み、ＦＶＩＩＩタンパク質はアルブミンまたはその断片もしくはバリアントに連結し、イムノグロブリン定常領域またはその一部分（たとえばＦｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳおよびＰＥＧからなる群より選択される異種部分にさらに連結している。さらに他の実施形態では、キメラタンパク質は、アルブミンまたはその断片もしくはバリアントに連結したＶＷＦ断片と、アルブミンまたはその断片もしくはバリアントに連結したＦＶＩＩＩタンパク質を含み、ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質は互いに結合しており、ＶＷＦ断片活性はイムノグロブリン定常領域またはその一部分（たとえばＦｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳおよびＰＥＧからなる群より選択される第１異種部分とさらに連結し、ＦＶＩＩＩタンパク質活性はイムノグロブリン定常領域またはその一部分（たとえば、Ｆｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳおよびＰＥＧからなる群より選択される第２異種部分とさらに連結している。
【０１７３】
他の実施形態では、ＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質に連結した異種部分は、ＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長する（または延長する能力がある）アルブミンまたはその断片もしくはバリアントである。アルブミンまたはその断片もしくはバリアントのさらなる例は、米国特許出願２００８／０１９４４８１Ａ１、２００８／０００４２０６Ａ１、２００８／０１６１２４３Ａ１、２００８／０２６１８７７Ａ１または２００８／０１５３７５１Ａ１またはＰＣＴ出願公開２００８／０３３４１３Ａ２、２００９／０５８３２２Ａ１または２００７／０２１４９４Ａ２に開示されている。
【０１７４】
３）アルブミン結合部分
ある特定の実施形態では、ＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質に連結した異種部分は、アルブミン結合ペプチド、細菌アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合抗体断片、またはそれらの任意の組合せを含むアルブミン結合部分である。たとえば，アルブミン結合タンパク質は、細菌アルブミン結合タンパク質、抗体またはドメイン抗体を含む抗体断片であり得る（米国特許第６，６９６，２４５号参照）。アルブミン結合タンパク質は、たとえばレンサ球菌Ｇタンパク質の１種などの細菌アルブミン結合ドメインであり得る（Konig,T. and Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83）。結合パートナーとして用いることができるアルブミン結合ペプチドの他の例は、たとえばＣｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓコンセンサス配列をもつものがあり、Ｘａａ１はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｒｐであり；Ｘａａ２はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＬｙｓであり；Ｘａａ３はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり；Ｘａａ４はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、米国特許出願第２００３／００６９３９５号またはDennis et al. (Dennis et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 35035-35043)に記載されている。
【０１７５】
４）ＰＡＳ配列
他の実施形態では、ＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質に連結した異種部分は、ＰＡＳ配列である。一実施形態では、キメラタンパク質は本明細書に記載のＶＷＦ断片とＰＡＳ配列を含み、ＶＷＦ断片はＰＡＳ配列に連結している。別の実施形態では、本発明のキメラタンパク質はＦＶＩＩＩタンパク質とＰＡＳ配列を含み、ＰＡＳ配列はＦＶＩＩＩタンパク質上のＶＷＦ結合部位を遮蔽または保護し、ＦＶＩＩＩタンパク質の内因性ＶＷＦとの相互作用が阻害または防止される。
【０１７６】
本明細書では、ＰＡＳ配列は主としてアラニンおよびセリン残基を含むか、または主としてアラニン、セリンおよびプロリン残基を含むアミノ酸配列を意味し、該アミノ酸配列は生理学的条件下でランダムコイル立体構造を形成する。したがって、ＰＡＳ配列は、キメラタンパク質中の異種部分の一部として使用され得るアラニン、セリンおよびプロリンを含むか、本質的にそれらからなるか、それらからなる構成単位、アミノ酸ポリマーまたは配列カセットである。しかし、当業者であれば、アラニン、セリンおよびプロリン以外の残基が少数の構成要素としてＰＡＳ配列に加えられた場合でもアミノ酸ポリマーがランダムコイル立体構造を取り得ることを知っている。本明細書では、「少数の構成要素」という用語は、アラニン、セリンおよびプロリン以外のアミノ酸がある程度、たとえば、最大約１２％すなわちＰＡＳ配列の１００アミノ酸中約１２、最大約１０％すなわちＰＡＳ配列の１００アミノ酸中約１０、最大約９％すなわち１００アミノ酸中約９、最大約８％すなわち１００アミノ酸中約８、約６％すなわち１００アミノ酸中約６、約５％すなわち１００アミノ酸中約５、約４％すなわち１００アミノ酸中約４、約３％すなわち１００アミノ酸中約３、約２％すなわち１００アミノ酸中約２、約１％すなわち１００アミノ酸中約１でＰＡＳ配列に加えられ得ることを意味する。アラニン、セリンおよびプロリンではないアミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌからなる群より選択され得る。
【０１７７】
生理学的条件下では、一連のＰＡＳ配列はランダムコイル立体構造を形成するので、ＶＷＦ因子または凝固活性タンパク質に対し、インビボおよび／またはインビトロの増加した安定性を仲介できる。ランダムコイルドメイン自体は安定構造や機能を利用しないので、それが融合するＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質により仲介される生物学的活性は本質的に保存される。他の実施形態では、ランダムコイルドメインを形成するＰＡＳ配列は血漿中のタンパク質分解、免疫原性、等電点／静電的挙動、細胞表面受容体への結合または内部移行については生物学的に不活性であるが、生分解性は保持しており、ＰＥＧなどの合成ポリマーよりも明白に利点を提供する。
【０１７８】
ランダムコイル立体構造を形成するＰＡＳ配列の非限定的な例は、ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（配列番号８）、ＡＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳ（配列番号９）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳＳ（配列番号１０）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳ（配列番号１１）、ＳＳＰＳＡＰＳＰＳＳＰＡＳＰＳＰＳＳＰＡ（配列番号１２）、ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ（配列番号１３）およびＡＳＡＡＡＰＡＡＡＳＡＡＡＳＡＰＳＡＡＡ（配列番号１４）またはそれらの任意の組合せからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ＰＡＳ配列のさらなる例は、たとえば、米国特許出願公開２０１０／０２９２１３０Ａ１およびＰＣＴ出願公開ＷＯ２００８／１５５１３４Ａ１に記載されている。
【０１７９】
５）ＨＡＰ配列
ある特定の実施形態では、ＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質に連結した異種部分は、グリシンに富むホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）である。ＨＡＰ配列は、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、１２０アミノ酸、１４０アミノ酸、１６０アミノ酸、１８０アミノ酸、２００アミノ酸、２５０アミノ酸、３００アミノ酸、３５０アミノ酸、４００アミノ酸、４５０アミノ酸または５００アミノ酸長のグリシンの反復配列を含み得る。一実施形態では、ＨＡＰ配列は、該ＨＡＰ配列に融合または連結した部分の半減期を延長できる。ＨＡＰ配列の非限定的な例は、限定ではないが（Ｇｌｙ）ｎ、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたはＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含み、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。一実施形態では、ｎは２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０である。別の実施形態では、ｎは５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００である。たとえばSchlapschy M et al., Protein Eng. Design Selection, 20: 273-284 (2007)を参照されたい。
【０１８０】
６）トランスフェリンまたはその断片
ある特定の実施形態では、ＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質に連結した異種部分は、トランスフェリンまたはその断片である。本発明のキメラタンパク質の作製にはあらゆるトランスフェリンが使用できる。一例として、野生型ヒトＴｆ（Ｔｆ）は６７９アミノ酸のタンパク質であり、約７５ＫＤａ（グリコシル化を除く）であり、２つの主なドメインであるＮ（約３３０アミノ酸）とＣ（約３４０アミノ酸）を有し、おそらくは遺伝子重複に起因する。ジェンバンク受託番号ＮＭ００１０６３、ＸＭ００２７９３、Ｍ１２５３０、ＸＭ０３９８４５、ＸＭ０３９８４７およびＳ９５９３６（www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照されたい（すべて参照により本明細書に組み込む）。トランスフェリンは、ＮドメインとＣドメインの２つのドメインを含む。ＮドメインはＮ１ドメインとＮ２ドメインの２つのサブドメインを含み、ＣドメインはＣ１ドメインとＣ２ドメインの２つのサブドメインを含む。
【０１８１】
一実施形態では、キメラタンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリンスプライスバリアントを含む。一例では、トランスフェリンスプライスバリアントは、ヒトトランスフェリンのスプライスバリアント、たとえばジェンバンク受託ＡＡＡ６１１４０であり得る。別の実施形態では、キメラタンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリン配列のうち１または複数ドメイン、たとえばＮドメイン、Ｃドメイン、Ｎ１ドメイン、Ｎ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメインまたはそれらの任意の組合せを含む。
【０１８２】
７）ポリマー、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
他の実施形態では、ＶＷＦ断片に結合した異種部分または凝固活性たとえばＦＶＩＩＩ活性を有するタンパク質は、限定ではないが、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストランまたはポリビニルアルコールを含む当技術分野で既知の可溶性ポリマーである。可溶性ポリマーなどの異種部分は、ＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質内の任意の位置またはＮ末端もしくはＣ末端に結合し得る。さらに他の実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質とＰＥＧを含み、ＰＥＧはＦＶＩＩＩタンパク質上のＶＷＦ結合部位を遮蔽または保護するので、ＦＶＩＩＩタンパク質の内因性ＶＷＦとの相互作用が阻害または防止される。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、キメラタンパク質は、本明細書に記載のＶＷＦ断片とＰＥＧを含み、ＶＷＦ断片はＰＥＧに連結している。別の実施形態では、キメラタンパク質は、互いに結合したＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含み、ＶＷＦ断片はＰＥＧに連結しているか、ＦＶＩＩＩタンパク質はＰＥＧに連結しているか、またはＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質の両方がＰＥＧに連結している。他の実施形態では、ＰＥＧに連結したＶＷＦ断片を含むキメラタンパク質は、イムノグロブリン定常領域またはその一部分（たとえばＦｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳおよびアルブミンまたはその断片もしくはバリアントからなる群より選択された異種部分にさらに連結している。さらに他の実施形態では、キメラタンパク質は、互いに結合したＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含み、ＦＶＩＩＩタンパク質はイムノグロブリン定常領域またはその一部分（たとえばＦｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳおよびアルブミンまたはその断片もしくはバリアントからなる群より選択された異種部分にさらに連結している。さらに他の実施形態では、キメラタンパク質は、ＰＥＧに連結したＶＷＦ断片と、ＰＥＧに連結したＦＶＩＩＩタンパク質を含み、ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質は互いに結合しており、ＶＷＦ断片活性はイムノグロブリン定常領域またはその一部分（たとえばＦｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳおよびアルブミンまたはその断片もしくはバリアントからなる群より選択された第１異種部分とさらに連結し、ＦＶＩＩＩタンパク質活性はイムノグロブリン定常領域またはその一部分（たとえばＦｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ、およびアルブミンまたはその断片もしくはバリアントからなる群より選択された第２異種部分とさらに連結している。
【０１８４】
本発明はまた、本発明のキメラタンパク質の化学修飾された誘導体も提供し、ポリペプチドの可溶性、安定性および循環時間の増加、または免疫原性の低下などの追加の利点を提供し得る（米国特許第４，１７９，３３７号参照）。修飾される化学部分は、限定ではないが、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストランおよびポリビニルアルコールを含む水溶性ポリマーからなる群より選択され得る。キメラタンパク質は、分子内のランダムな位置で、またはＮ末端もしくはＣ末端で、または分子内の所定の位置で修飾され得、１、２、３またはそれ以上の結合された化学部分を含み得る。
【０１８５】
ポリマーは、任意の分子量でよく、分岐していてもしていなくてもよい。ポリエチレングリコールについては、一実施形態では、取扱および製造しやすいように、分子量は約１ｋＤａから約１００ｋＤａである。所望のプロファイル（たとえば、所望の徐放時間、あるとすれば生体活性への影響、取り扱いやすさ、抗原性欠如の程度、およびポリエチレングリコールがタンパク質または類似体に与えるその他既知の影響）により、他のサイズも使用できる。たとえば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０、０００、１０、５００、１１、０００、１１、５００、１２、０００、１２、５００、１３、０００、１３、５００、１４、０００、１４、５００、１５、０００、１５、５００、１６、０００、１６、５００、１７、０００、１７、５００、１８、０００、１８、５００、１９、０００、１９、５００、２０、０００、２５、０００、３０、０００、３５、０００、４０、０００、４５、０００、５０、０００、５５、０００、６０、０００、６５、０００、７０、０００、７５、０００、８０、０００、８５、０００、９０、０００、９５、０００または１００、０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコールは、分岐構造を有し得る。分岐ポリエチレングリコールは、たとえば米国特許第５，６４３，５７５号;Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev et al.,Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999);およびCaliceti et al., Bioconjug.Chem. 10:638-646 (1999)に記載されており、それらの全容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８７】
本発明のキメラタンパク質、ＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質に結合するポリエチレングリコール部分の数（すなわち置換度）も様々であり得る。たとえば、本発明のペグ化タンパク質は、平均して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０またはそれより多くのポリエチレングリコール分子に連結し得る。同様に、平均置換度は、タンパク質分子あたりのポリエチレングリコール部分１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９または１８〜２０などの範囲内。置換度を決定する方法は、たとえばDelgadoet al., Crit. Rev.Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992)に記載されている。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質はペグ化され得る。ペグ化第ＶＩＩＩ因子は、第ＶＩＩＩ因子と少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子で形成された接合体を指し得る。
【０１８９】
他の実施形態では、本発明で使用されるＦＶＩＩＩタンパク質は、１または複数のポリマーと接合されている。ポリマーは、水溶性であり得、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子に接合された他の部分に共有結合または非共有結合的で結合し得る。ポリマーの非限定的な例は、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリンまたはポリ（アクリロイルモルホリン）であり得る。ポリマー接合ＦＶＩＩＩのその他の種類が米国特許第７，１９９，２２３号に開示されている。
【０１９０】
８）ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）
ある特定の実施形態では、ＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質に連結した異種部分はポリマーであり、たとえばヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）またはそれらの誘導体である。一実施形態では、キメラタンパク質は、本明細書に記載のＶＷＦ断片とＨＥＳを含み、ＶＷＦ断片はＨＥＳに連結している。他の実施形態では、本発明のキメラタンパク質はヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）と融合したＦＶＩＩＩタンパク質を含み、ヒドロキシエチルデンプンまたはそれらの誘導体はＦＶＩＩＩタンパク質上のＶＷＦ結合部位を内因性ＶＷＦから遮蔽または保護し、ＦＶＩＩＩタンパク質の内因性ＶＷＦとの相互作用を阻害または防止する。
【０１９１】
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、天然のアミロペクチンの誘導体であり、体内のαアミラーゼにより分解される。ＨＥＳは、トウモロコシデンプン中に最大９５重量％の濃度で存在する炭水化物ポリマーのアミロペクチンの置換誘導体である。ＨＥＳは有利な生物学的特性を示すので、病院では血管内用量の代用剤として血液希釈治療に使用されている（Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987);およびWeidler et al.,Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498 (1991)).
【０１９２】
アミロペクチンはグルコース部分を含み、主鎖にはα−１，４−グリコシド結合が存在し、分岐部位ではα−１，６−グリコシド結合が見出される。この分子の物理化学的特性は、主にグリコシド結合の種類により決定される。ニックの入ったα−１，４−グリコシド結合により、巻きあたり約６グルコースモノマーのらせん構造が生成する。このポリマーの物理化学的特性ならびに生化学的特性は、置換を介して修飾され得る。アルカリ性ヒドロキシエチル化によりヒドロキシエチル基を導入することができる。反応条件を改変することにより、未置換のグルコースモノマー中の各ヒドロキシ基のヒドロキシエチル化に対する異なる反応性を使用することが可能である。このため、当業者はある程度まで置換パターンに影響を与えることができる。
【０１９３】
ＨＥＳは、主として分子量分布と置換度により特徴付けられる。ＤＳと呼ばれる置換度はモル置換に関し、当業者には知られている。上記引用したSommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987)の特に２７３ページを参照されたい。
【０１９４】
一実施形態では、ヒドロキシエチルデンプンの平均分子量（重量平均）は、１〜３００ｋＤ、２〜２００ｋＤ、３〜１００ｋＤまたは４〜７０ｋＤである。ヒドロキシエチルデンプンは、置換モル度が０．１〜３、好ましくは０．１〜２、より好まくは、０．１〜０．９、好ましくは０．１〜０．８、およびＣ２：Ｃ６間の置換の比率がヒドトキシエチル基に対し２〜２０の範囲をさらに示し得る。約１３０ｋＤの平均分子量を有するＨＥＳの非限定的な例は、置換度が０．２〜０．８たとえば０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８、好ましくは０．４〜０．７たとえば０．４、０．５、０．６または０．７のＨＥＳである。特定の実施形態では、約１３０ｋＤの平均分子量を有するＨＥＳは、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ社のＶＯＬＵＶＥＮ（登録商標）である。ＶＯＬＵＶＥＮ（登録商標）は、人工的なコロイドであり、たとえば血液量不足の治療と予防の治療指標で使用される血液量代用剤として用いられる。ＶＯＬＵＶＥＮ（登録商標）の特徴は、平均分子量１３０、０００±２０、０００Ｄ、モル置換度０．４およびＣ２：Ｃ６比約９：１である。他の実施形態では、ヒドロキシエチルデンプンの平均分子量の範囲は、たとえば、４〜７０ｋＤまたは１０〜７０ｋＤまたは１２〜７０ｋＤまたは１８〜７０ｋＤまたは５０〜７０ｋＤまたは４〜５０ｋＤまたは１０〜５０ｋＤまたは１２〜５０ｋＤまたは１８〜５０ｋＤまたは４〜１８ｋＤまたは１０〜１８ｋＤまたは１２〜１８ｋＤまたは４〜１２ｋＤまたは１０〜１２ｋＤまたは４〜１０ｋＤである。さらに他の実施形態では、ヒドロキシエチルデンプンの使用される平均分子量の範囲は、４ｋＤ超７０ｋＤ未満、たとえば約１０ｋＤ、または９〜１０ｋＤまたは１０〜１１ｋＤまたは９〜１１ｋＤ、または約１２ｋＤの範囲、または１１〜１２ｋＤ）または１２〜１３ｋＤまたは１ｌ〜１３ｋＤ、または約１８ｋＤ、または１７〜１８ｋＤまたは１８〜１９ｋＤまたは１７〜１９ｋＤの範囲、または約３０ｋＤ、または２９〜３０または３０〜３１ｋＤの範囲、または約５０ｋＤ、または４９〜５０ｋＤまたは５０〜５１ｋＤまたは４９〜５１ｋＤの範囲である。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、異種部分は、異なる平均分子量および／または異なる置換度および／または異なるＣ２：Ｃ６置換比率を有するヒドロキシエチルデンプンの混合物であり得る。したがって，ヒドロキシエチルデンプンの混合物は、異なる平均分子量および異なる置換度および異なるＣ２：Ｃ６置換比率を有して用いられてもよいし、あるいは異なる平均分子量および異なる置換度および同じかほぼ同じＣ２：Ｃ６置換比率を有して用いられてもよいし、あるいは異なる平均分子量およびおよび同じかほぼ同じ置換度および異なるＣ２：Ｃ６置換比率を有して用いられてもよいし、あるいは同じかほぼ同じ分子量および異なる置換度および異なるＣ２：Ｃ６置換比率を有して用いられてもよいし、あるいは異なる平均分子量およびおよび同じかほぼ同じ置換度および同じかほぼ同じＣ２：Ｃ６置換比率を有して用いられてもよいし、あるいは同じかほぼ同じ分子量および異なる置換度および同じかほぼ同じＣ２：Ｃ６置換比率を有して用いられてもよいし、あるいは同じかほぼ同じ分子量および同じかほぼ同じ置換度および異なるＣ２：Ｃ６置換比率を有して用いられてもよいし、あるいはほぼ同じ分子量およびほぼ同じ置換度およびほぼ同じＣ２：Ｃ６置換比率を有して用いられてもよい。
【０１９６】
９）ポリシアル酸（ＰＳＡ）
ある特定の実施形態では、ＶＷＦ断片またはＦＶＩＩＩタンパク質に連結した非ポリペプチド異種部分はポリマーであり、たとえばポリシアル酸（ＰＳＡ）またはそれらの誘導体である。ポリシアル酸（ＰＳＡ）は天然のシアル酸非分岐ポリマーであり、特定の細菌株により、また哺乳動物では特定の細胞内で産生される（RothJ., et al. (1993) in Polysyalic Acid: From Microbes to Man, eds Roth J.,Rutishauser U., Troy F. A. (Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland), pp 335-348）。ポリシアル酸は上はｎ＝約８０以上のシアル酸残基から下はｎ＝２までの様々な重合化度で、限定的な酸水解により、またはノイラミニダーゼによる消化により、またはポリマーの天然の細菌由来型の分割により産生され得る。異なるポリシアル酸の組成も様々なので、ホモポリマー型、すなわち神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）の胚型上にも見出される大腸菌Ｋ１株およびＢ群髄膜炎菌の莢膜多糖体を含むα−２，８−連結ポリシアル酸が存在する。また、大腸菌Ｋ９２（株）と髄膜炎菌Ｃ群ポリサッカライドの交互α−２，８α−２，９ポリシアル酸などのヘテロポリマー型も存在する。シアル酸は、髄膜炎菌Ｗ１３５群またはＹ群などのシアル酸以外のモノマーとの交互コポリマー中にも見出され得る。ポリシアル酸は、病原性細菌による免疫および補体系の回避ならびに胎発生中の幼若ニューロンのグリア接着性の調節（ポリマーは抗接着機能を有する）を含む重要な生物学的機能を有する（Cho and Troy, P.N.A.S., USA, 91 (1994) 11427-11431）が、哺乳動物のポリシアル酸受容体は未解明である。大腸菌Ｋ１（株）のα−２，８−連結ポリシアル酸は「コロミン酸」としても知られ、本発明の例示に（様々な長さで）使用されている。ポリシアル酸をポリペプチドに結合または接合する様々な方法が記載されている（たとえば、その全容が本明細書に参照として組み込まれる米国特許第５，８４６，９５１号；ＷＯ−Ａ−０１８７９２２および米国特許出願２００７／０１９１５９７Ａ１を参照されたい）。
【０１９７】
Ｃ）ＦＶＩＩＩタンパク質
「ＦＶＩＩＩタンパク質」は、本明細書では、特に断らない限り、通常の凝固における役割の機能的ＦＶＩＩＩポリペプチドを意味する。ＦＶＩＩＩタンパク質という用語は、凝固経路における全長野生型第ＶＩＩＩ因子の機能を保持しているその機能的断片、バリアント、類似体または誘導体を含む。「ＦＶＩＩＩタンパク質」は、ＦＶＩＩＩポリペプチド（またはタンパク質）またはＦＶＩＩＩと交換可能に使用される。ＦＶＩＩＩ機能の例としては、限定ではないが、凝固活性能、第ＩＸ因子の補因子として作用する能力、またはＣａ２＋とリン脂質の存在下で第ＩＸ因子とテナーゼ複合体を形成する能力が挙げられ、該複合体は次いで第Ｘ因子をＸａの活性型に変換する。ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒト、ブタ、犬、ラットまたはマウスのＦＶＩＩＩタンパク質であり得る。さらに、ヒトと他の種のＦＶＩＩＩの比較から、機能の要件と考えられる保存残基が特定されている（Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); US 6,251,632）。
【０１９８】
凝固系の機能を評価する多くの試験が利用可能である：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試験、比色アッセイ、ＲＯＴＥＭアッセイ、プロトロンビン時間（ＰＴ）試験（ＩＮＲの決定にも使用される）、フィブリノゲン試験（Ｃｌａｕｓｓ法が多い）、血小板数、血小板機能試験（ＰＦＡ−１００が多い）、ＴＣＴ、出血時間、混合試験（患者の血漿が健常血漿と混ざった場合に異常が修正されるかどうか）、凝固因子アッセイ、抗リン酸抗体、Ｄ−ダイマー、遺伝子試験（たとえば第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ、プロトロンビン突然変異Ｇ２０２１０Ａ）、希釈ラッセル蛇毒時間（ｄＲＶＶＴ）、種々の血小板機能試験、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧまたはＳｏｎｏｃｌｏｔ）、トロンボエラストメトリー（ＴＥＭ（登録商標）たとえばＲＯＴＥＭ（登録商標））またはオイグロブリン溶解時間（ＥＬＴ）。
【０１９９】
ａＰＴＴ試験は、「内因性」（接触活性化経路とも呼ばれる）と一般凝固経路の両方の有効性を測定する機能指標である。この試験は、一般的には、市販の組換え凝固因子、たとえばＦＶＩＩＩまたはＦＩＸの凝固活性の測定に使用される。この試験は、外因性経路を測定するプロトロンビン時間（ＰＴ）と組み合わせて使用される。
【０２００】
ＲＯＴＥＭ分析は、凝固時間、凝血塊形成、凝血塊安定性と溶解などの止血の全体的動態の情報を提供する。トロンボエラストメトリーの様々なパラメータは、血漿凝固系の活性、血小板機能、線維素溶解またはこれらの相互作用に影響を及ぼす多くの要因による。このアッセイにより二次止血が完全に把握できる。
【０２０１】
ＦＶＩＩＩポリペプチドとポリヌクレオチド配列ならびに多くの機能的断片、突然変異および修飾型が知られている。ヒトＦＶＩＩＩ配列（全長）の例を以下の配列番号１６または１８に示す。
【０２０２】
【表２】
2020078338.tif 000016
【０２０３】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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*下線を付した核酸はシグナルペプチドをコードする。
【０２０４】
ＦＶＩＩＩポリペプチドは、全長ＦＶＩＩＩ、全長ＦＶＩＩＩからＮ末端のＭｅｔを削除したもの、成熟ＦＶＩＩＩ（シグナル配列を削除）、Ｎ末端にＭｅｔを付加した成熟ＦＶＩＩＩおよび／またはＢドメインが完全または部分欠失したを含む。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩバリアントは、完全または部分欠失のＢドメイン欠失を含む。
【０２０５】
ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子が単離され哺乳動物細胞において発現された（Toole, J. J., et al., Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J., et al., Nature 312:326-330(1984); Wood, W. I., et al., Nature 312:330-337 (1984); Vehar, G. A., et al.,Nature 312:337-342 (1984); ＷＯ８７／０４１８７；ＷＯ８８／０８０３５；ＷＯ８８／０３５５８；および米国特許第４，７５７，００６号）。ＦＶＩＩＩアミノ酸配列は、米国特許第４，９６５，１９９号に示されるように、ｃＤＮＡから推定された。さらに、完全にまたは部分的にＢ−ドメインが欠失したＦＶＩＩＩが米国特許第４，９９４，３７１号および同第４，８６８，１１２号に示されている。いくつかの実施形態では、米国特許第５，００４，８０３号に示されるように、ヒトＦＶＩＩＩＢ−ドメインがヒト第Ｖ因子Ｂ−ドメインで置換されている。ヒト第ＶＩＩＩ因子をコードするｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列がそれぞれ米国出願公報第２００５／０１００９９０号の配列番号１７と１６に示されている。
【０２０６】
ブタのＦＶＩＩＩ配列がToole, J. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942(1986)に発表されている。さらに、ブタ脾臓ｃＤＮＡライブラリー由来のＦＶＩＩＩ配列のＰＣＲ増殖で得られた完全なブタのｃＤＮＡ配列がHealey, J.F., et al., Blood 88:4209-4214 (1996)に報告されている。全ドメイン、全サブユニットおよび特定のアミノ酸配列の置換を有するヒト／ブタのハイブリッドＦＶＩＩＩがLollarおよびRungeによる米国特許第５，３６４，７７１号およびＷＯ９３／２００９３に開示されている。より最近では、ブタＦＶＩＩＩのＡ１およびにＡ２ドメインと、対応するヒトドメインに置換されたブタのＡ１および／またはＡ２ドメインを有するキメラＦＶＩＩＩのヌクレオチドと対応するアミノ酸配列がＷＯ９４／１１５０３に報告された。米国特許第５，８５９，２０４号、Lollar,J. S.もブタのｃＤＮＡと推定アミノ酸配列を開示している。米国特許第６，４５８，５６３号はＢ−ドメイン欠失ブタＦＶＩＩＩを開示している。
【０２０７】
Lollar, J. S.に授与された米国特許第５，８５９，２０４号は、抗原性が低下し、免疫応答性が低下したＦＶＩＩＩの機能的突然変異を報告している。Lollar, J. S.に授与された米国特許第６，３７６，４６３号も、免疫応答性が低下したＦＶＩＩＩの機能的突然変異を報告している。Saenko et alの米国出願公報第２００５／０１００９９０号は、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインにおける機能的突然変異を報告している。
【０２０８】
一実施形態では、ＦＶＩＩＩ（またはキメラタンパク質のＦＶＩＩＩ部分）は、配列番号１８のアミノ酸１〜１４３８または配列番号１６のアミノ酸１〜２３３２のＦＶＩＩＩアミノ酸配列（シグナル配列なし）または配列番号１５および配列番号１８のアミノ酸−１９〜１４３８または配列番号１５および配列番号１６のアミノ酸−１９〜２３３２のＦＶＩＩＩアミノ酸配列（シグナル配列あり）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり得、ＦＶＩＩＩは凝固活性を有し、たとえば、補因子として第ＩＸ因子を活性化して第Ｘ因子を活性化第Ｘ因子に変換する。ＦＶＩＩＩ（またはキメラタンパク質のＦＶＩＩＩ部分）は、配列番号１８のアミノ酸１〜１４３８または配列番号１６のアミノ酸１〜２３３２のＦＶＩＩＩアミノ酸配列（シグナル配列なし）と同一であり得る。ＦＶＩＩＩはシグナル配列をさらに含み得る。
【０２０９】
ＦＶＩＩＩの「Ｂ−ドメイン」は、本明細書では、当技術分野で既知の内部アミノ酸配列アイデンティティおよびタンパク質切断部位により定義されるＢ−ドメイン、たとえば、全長ヒトＦＶＩＩＩの残基Ｓｅｒ７４１−Ａｒｇ１６４８と同じである。その他のヒトＦＶＩＩＩドメインは、次のアミノ酸残基により定義される：Ａ１、残基Ａｌａ１−Ａｒｇ３７２；Ａ２、残基Ｓｅｒ３７３−Ａｒｇ７４０；Ａ３、残基Ｓｅｒ１６９０−Ａｓｎ２０１９；Ｃ１、残基Ｌｙｓ２０２０−Ａｓｎ２１７２；Ｃ２、残基Ｓｅｒ２１７３−Ｔｙｒ２３３２。Ａ３−Ｃ１−Ｃ２配列は、残基Ｓｅｒ１６９０−Ｔｙｒ２３３２を含む。残りの配列である残基Ｇｌｕ１６４９−Ａｒｇ１６８９は、通常ａ３酸性領域と呼ばれる。ブタ、マウスおよびイヌＦＶＩＩＩのＢ−ドメインを含む全ドメインの境界の位置も当技術分野では既知である。一実施形態では、ＦＶＩＩＩのＢドメインは欠失している（「Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子」または「ＢＤＤＦＶＩＩＩ」）。ＢＤＤＦＶＩＩＩの一例はＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）（組換えＢＤＤＦＶＩＩＩ）であり、表４の配列の第ＶＩＩＩ因子部分とおなじ配列を有する（ＢＤＤＦＶＩＩＩ重鎖に二重下線を付し、Ｂドメインはイタリック体であり、ＢＤＤＦＶＩＩＩ軽鎖は普通の書体である）。
【０２１０】
【表４】
2020078338.tif 000023
【０２１１】
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
2020078338.tif 000026
【表５−４】
2020078338.tif 000027
*下線を付した核酸はシグナルペプチドをコードする。
【０２１２】
「Ｂ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩ」は、米国特許第６，３１６，２２６号、同第６，３４６，５１３号、同第７，０４１，６３５号、同第５，７８９，２０３号、同第６，０６０，４４７号、同第５，５９５，８８６号、同第６，２２８，６２０号、同第５，９７２，８８５号、同第６，０４８，７２０号、同第５，５４３，５０２号、同第５，６１０，２７８号、同第５，１７１，８４４号、同第５，１１２，９５０号、同第４，８６８，１１２および同第６，４５８，５６３号に開示された完全または部分欠失を有し得る。いくつかの実施形態では、本発明のＢ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩ配列は、米国特許第６，３１６，２２６号（同第６，３４６，５１３号も）第４カラム４行から第５カラム２８行および実施例１〜５に開示の欠失のいずれか１つを含む。別の実施形態では、Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子はＳ７４３／Ｑ１６３８Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（ＳＱＢＤＤＦＶＩＩＩ）（たとえばアミノ酸７４４からアミノ酸１６３７の欠失を有する第ＶＩＩＩ因子、たとえば配列番号１６のアミノ酸１〜７４３とアミノ酸１６３８〜２３３２すなわち配列番号１８を有する第ＶＩＩＩ因子）である。いくつかの実施形態では、本発明のＢ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、米国特許第５，７８９，２０３号（および同第６，０６０，４４７号、同第５，５９５，８８６号および同第６，２２８，６２０号）の第２カラム２６〜５１行および実施例５〜８に開示の欠失を有する。いくつかの実施形態では、Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、米国特許第５，９７２，８８５号第１カラム２５行から第２カラム４０行；米国特許第６，０４８，７２０号第６カラム１〜２２行および実施例１；米国特許第５，５４３，５０２号第２カラム１７〜４６行；米国特許第５，１７１，８４４号第４カラム２２行〜第５カラム３６行；米国特許第５，１１２，９５０号第２カラム５５〜６８行，図２および実施例１；米国特許第４，８６８，１１２号第２カラム２行〜第１９カラム２１行および表２；米国特許第７，０４１，６３５号第２カラム１行〜第３カラム１９行，第３カラム４０行第４カラム６７行，第７カラム４３行〜第８カラム２６行および第１１カラム５行〜第１３カラム３９行；または米国特許第６，４５８，５６３号第４カラム２５〜５３行に開示の欠失を有する。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、Ｂ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、Ｂドメインのほとんどの欠失を有するが、ＷＯ９１／０９１２２に開示のように、一次翻訳産物から２本のポリペプチド鎖へのインビボのタンパク分解プロセスに不可欠なＢドメインのアミノ末端配列をなおも含んでいる。いくつかの実施形態では、Ｂ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、アミノ酸７４７〜１６３８が欠失して、すなわち事実上Ｂドメインが完全に欠失して構築される。Hoeben R.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990)。Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、ＦＶＩＩＩのアミノ酸７７１〜１６６６またはアミノ酸８６８〜１５６２欠失も含み得る。Meulien P., et al.  Protein Eng.2(4): 301-6 (1988)。本発明の一部であるさらなるＢ−ドメイン欠失は次のアミノ酸欠失を含む:９８２〜１５６２または７６０〜１６３９（Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)）、７９７〜１５６２（Eaton,et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)）、７４１〜１６４６（Kaufman（ＰＣＴ出願公開ＷＯ８７／０４１８７））、７４７〜１５６０（Sarver,et al., DNA (1987) 6:553-564)）、７４１〜１６４８（Pasek（ＰＣＴ出願第８８／００８３１号)）または８１６〜１５９８または７４１〜１６４８（Lagner(Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597)）。他の実施形態では、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩは、全長ＦＶＩＩＩ配列のアミノ酸配列に対応する、１または複数のＮ連結グリコシル化部位、たとえば残基７５７、７８４、８２８、９００、９６３または随意に９４３を保持しているＢ−ドメインの断片を含むＦＶＩＩＩポリペプチドを含む。Ｂ−ドメイン断片の例は、Miao,H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda, A, et al., J. Thromb.Haemost. 6: 1352-1359 (2008)およびPipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9:2235-2242 (2011)に開示されるようなＢ−ドメインの２２６アミノ酸または１６３アミノ酸を含む（すなわち、Ｂドメインの第１の２２６アミノ酸または１６３アミノ酸が保持されている）。いくつかの実施形態では、部分Ｂドメインを有するＦＶＩＩＩやＦＶＩＩＩ１９８（配列番号１０５）である。ＦＶＩＩＩ１９８は、一本鎖ＦＶＩＩＩＦｃ分子−２２６Ｎ６を含む部分Ｂドメインである。２２６はＦＶＩＩＩ  Ｂ−ドメインのＮ末端の２２６アミノ酸を表し、Ｎ６はＢ−ドメインの６つのＮ−グリコシル化部位を表す。さらに他の実施形態では、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩは、点変異を残基３０９（ＰｈｅからＳｅｒ）にさらに有してＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質の発現を向上させる。Miao,H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004)を参照されたい。さらに他の実施形態では、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩは、Ｂ−ドメインの一部分は含むが、１または複数のフーリン切断部位は含まない（たとえばＡｒｇ１３１３とＡｒｇ１６４８）ＦＶＩＩＩポリペプチドを含む。Pipe,S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011)を参照されたい。前述の欠失はすべて、どのＦＶＩＩＩ配列中であってもよい。
【０２１４】
本発明で有用なＦＶＩＩＩタンパク質は、１または複数の追加の異種配列または化学的もしくは物理的修飾を有するＦＶＩＩＩを含み得るが、それらはＦＶＩＩＩ凝固活性には影響を及ぼさない。そのような異種配列または化学的もしくは物理的修飾は、ＦＶＩＩＩタンパク質のＣ末端またはＮ末端に融合してもよいし、ＦＶＩＩＩタンパク質の２つのアミノ酸残基の１または複数の間に挿入されてもよい。そのようなＦＶＩＩＩタンパク質中の修飾は、ＦＶＩＩＩ凝固活性またはＦＶＩＩＩ機能には影響を与えない。一実施形態では、挿入によりＦＶＩＩＩタンパク質の薬物動態特性（たとえば半減期）が向上する。別の実施形態では、２、３、４、５または６部位よりも多くの部位に挿入されうる。
【０２１５】
一実施形態では、ＦＶＩＩＩはアルギニンの直後のアミノ酸１６４８（全長第ＶＩＩＩ因子または配列番号１６中）で、アミノ酸７５４（Ｓ７４３／Ｑ１６３８Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子または配列番号１６中）で、または対応するアルギニン残基（他のバリアント中）で切断され、１本の重鎖と１本の軽鎖になる。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩは、金属イオン媒介非共有結合により連結または結合している１本の重鎖と１本の軽鎖を含む。
【０２１６】
他の実施形態では、ＦＶＩＩＩはアルギニンの直後のアミノ酸１６４８（全長第ＶＩＩＩ因子または配列番号１６中）で、アミノ酸７５４（Ｓ７４３／Ｑ１６３８Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子または配列番号１８中）で、または対応するアルギニン残基（他のバリアント中）で切断されていない一本鎖ＦＶＩＩＩである。一本鎖ＦＶＩＩＩは、１または複数のアミノ酸置換を含み得る。一実施形態では、アミノ酸置換は、全長成熟第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（配列番号１６）の残基１６４８、残基１６４５もしくはその両方に対応する残基、またはＳＱＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子（配列番号１８）の残基７５４、残基７５１もしくはその両方に対応する残基である。アミノ酸置換は、アルギニン、たとえば、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セレノシステイン、セリン、チロシン、ヒスチジン、オルニチン、ピロリジン（pyrrolysine）またはタウリンを除くどのアミノ酸でもよい。
【０２１７】
ＦＶＩＩＩは、トロンビンによりさらに切断されてＦＶＩＩＩａとして活性化し、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）の補因子となり得る。活性化ＦＩＸは活性化ＦＶＩＩＩと一緒にＸａｓｅ複合体を形成し、第Ｘ因子を活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）に変換する。活性化するために、ＦＶＩＩＩは、３つのアルギニン残基、アミノ酸３７２、７４０および１６８９（Ｂ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩ配列中アミノ酸３７２、７４０および７９５に相当）の後ろでトロンビンにより切断され、切断により５０ｋＤａのＡ１、４３ｋＤａのＡ２および７３ｋＤａのＡ３−Ｃ１−Ｃ２鎖を有するＦＶＩＩＩａが生成する。一実施形態では、本発明で有用なＦＶＩＩＩタンパク質は、非活性ＦＶＩＩＩである。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は活性ＦＶＩＩＩである。
【０２１８】
ＶＷＦ断片と連結または結合したＦＶＩＩＩポリペプチドを有するタンパク質は、配列番号１６または１８と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含み得、該配列はＦＶＩＩＩ凝固活性を有し、たとえば第ＩＸ因子を補因子として活性化し第Ｘ因子を活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）に変換する。
【０２１９】
本明細書では、「ハイブリッド」ポリペプチドおよびタンパク質は、随意の第１異種部分と融合した第１ポリペプチド鎖、たとえばＶＷＦ断片と、随意の第２異種部分と融合した第２ポリペプチド鎖、たとえばＦＶＩＩＩタンパク質が組み合わされてヘテロダイマーを形成していることを意味する。一実施形態では、ハイブリッド中の第１ポリペプチドと第２ポリペプチドは、電荷−電荷または疎水性相互作用などのタンパク質−タンパク質相互作用により互いに結合している。別の実施形態では、ハイブリッド中の第１ポリペプチドと第２ポリペプチドは、ジスルフィドまたは他の共有結合（複数可）により互いに結合している。ハイブリッドは、たとえば米国特許出願第２００４／１０１７４０号や同第２００６／０７４１９９号に記載されている。第２ポリペプチドは、第１ポリペプチドの同一コピーであっても、非同一ポリペプチドであってもよい。一実施形態では、第１ポリペプチドは、ＶＷＦ断片−Ｆｃ融合タンパク質であり、第２ポリペプチドはＦｃＲｎ結合ドメインを含むか、本質的にそれからなるか、それからなるポリペプチドであり、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドは互いに結合している。別の実施形態では、第１ポリペプチドは、ＶＷＦ断片−Ｆｃ融合タンパク質を含み、第２ポリペプチドはＦＶＩＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含んで、ハイブリッドがヘテロダイマーになっている。第１ポリペプチドと第２ポリペプチドは、第１Ｆｃ領域と第２Ｆｃ領域間の共有結合、たとえばジスルフィド結合を通じて結合し得る。第１ポリペプチドと第２ポリペプチドはさらに、ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質間の結合により、互いに結合し得る。
【０２２０】
Ｄ）リンカー
本発明のキメラタンパク質は、リンカーをさらに含む。１または複数のリンカーは、任意の２つのタンパク質間に、たとえば付加部分とＦＶＩＩＩタンパク質の間（「ＦＶＩＩＩ／ＡＭリンカー」と呼ばれることもある）、ＶＷＦ断片と第１異種部分、たとえば第１Ｆｃ領域の間（「ＶＷＦリンカー」と呼ばれることもある）、ＦＶＩＩＩタンパク質と第２異種部分、たとえば第２Ｆｃ領域の間（「ＦＶＩＩＩリンカー」と呼ばれることもある）、ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質の間（たとえばＦＶＩＩＩ／ＡＭリンカー）、ＶＷＦ断片と第２異種部分の間および／またはＦＶＩＩＩタンパク質と第１異種部分の間に存在し得る。リンカーは互いに同じかまたは異なる配列を有し得る。一実施形態では、リンカーは、ポリペプチドリンカーである。別の実施形態では、リンカーは、非ポリペプチドリンカーである。
【０２２１】
本発明で有用なリンカーは、任意の有機分子を含み得る。一実施形態では、リンカーは、ポリマーであり、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である。別の実施形態では、リンカーはアミノ酸配列（たとえばポリペプチドリンカー）である。ポリペプチドリンカーは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００または２０００アミノ酸を含み得る。リンカーは、１〜５アミノ酸、１〜１０アミノ酸、１〜２０アミノ酸、１０〜５０アミノ酸、５０〜１００アミノ酸、１００〜２００アミノ酸、２００〜３００アミノ酸、３００〜４００アミノ酸、４００〜５００アミノ酸、５００〜６００アミノ酸、６００〜７００アミノ酸、７００〜８００アミノ酸、８００〜９００アミノ酸または９００〜１０００アミノ酸を含み得る。
【０２２２】
ポリペプチドリンカーの例は当技術分野では周知である。一実施形態では、リンカーは、配列Ｇｎを含む。リンカーは、配列（ＧＡ）ｎを含み得る。リンカーは、配列（ＧＧＳ）ｎを含み得る。他の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２０）を含む。さらに他の実施形態では、リンカーは、配列（ＧＧＳ）ｎ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２１）を含む。これれらの例では、ｎは１〜１００の整数であり得る。他の例では、ｎは１〜２０の整数であり得、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０であり得る。リンカーの例としては、限定ではないが、ＧＧＧ、ＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号２２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号２３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２４）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号２５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２６）、表１３のリンカー（配列番号９２、９３および９４）および表１４Ａのリンカー（配列番号９５、９６および９７）が挙げられる。リンカーはＶＷＦ断片の活性や第ＶＩＩＩ因子の凝固活性を排除または減少させることはない。随意に、リンカーは、たとえば立体障害効果をさらに減少させ、ＶＷＦ断片または第ＶＩＩＩ因子部分をその標的結合部位によりアクセスしやすくすることで、ＶＷＦ断片の活性や第ＶＩＩＩ因子タンパク質の凝固活性を増大する。
【０２２３】
一実施形態では、キメラタンパク質に有用なリンカーは１５〜２５アミノ酸長である。別の実施形態では、キメラタンパク質に有用なリンカーは１５〜２０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質のリンカーは１０〜２５アミノ酸長である。他の実施形態では、キメラタンパク質のリンカーは１５アミノ酸長である。さらに他の実施形態では、キメラタンパク質のリンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２７）であり、Ｇはグリシンを表し、Ｓはセリンを表し、ｎは１〜２０の整数である。
【０２２４】
Ｅ）切断部位
リンカーは、１つの分子を別の分子から遊離させるために、化学的（たとえばエステル結合の加水分解）、酵素的（すなわちプロテアーゼ切断配列の組込み）または光分解（たとえば３−アミノ−３−（２−ニトロフェニル）プロピオン酸（ＡＮＰ）などの発色団）のいずれかで切断され得る部分も含み得る。
【０２２５】
一実施形態では、リンカーは切断可能リンカーである。切断可能リンカーはＮ末端またはＣ末端、またはその両方に１または複数の切断部位を含み得る。別の実施形態では、切断可能リンカーは、１または複数の切断可能部位から本質的になるか、それらからなる。他の実施形態では、切断可能リンカーは、本明細書に記載の異種アミノ酸リンカー配列またはポリマーおよび１または複数の切断可能部位を含む。
【０２２６】
ある特定の実施形態では、切断可能リンカーは、宿主細胞内（すなわち細胞内プロセシング部位）で切断され得る１または複数の切断部位を含む。切断部位の非限定的例は、ＲＲＲＲ（配列番号５２）、ＲＫＲＲＫＲ（配列番号５３）およびＲＲＲＲＳ（配列番号５４）を含む。
【０２２７】
他の実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカーを含むキメラタンパク質が対象に投与された後、プロテアーゼにより切断される１または複数の切断部位を含む。一実施形態では、切断部位は第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ−２、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７およびＭＭＰ−２０からなる群より選択されるプロテアーゼにより切断される。別の実施形態では、切断部位は、ＦＸＩａ切断部位（たとえば、ＫＬＴＲ↓ＡＥＴ（配列番号２９））、ＦＸＩａ切断部位（ｅ．ｇ、ＤＦＴＲ↓ＶＶＧ（配列番号３０））、ＦＸＩＩａ切断部位（たとえば、ＴＭＴＲ↓ＩＶＧＧ（配列番号３１））、カリクレイン切断部位（たとえば、ＳＰＦＲ↓ＳＴＧＧ（配列番号３２））、ＦＶＩＩａ切断部位（たとえば、ＬＱＶＲ↓ＩＶＧＧ（配列番号３３））、ＦＩＸａ切断部位（たとえば、ＰＬＧＲ↓ＩＶＧＧ（配列番号３４））、ＦＸａ切断部位（たとえば、ＩＥＧＲ↓ＴＶＧＧ（配列番号３５））、ＦＩＩａ（トロンビン）切断部位（たとえばＬＴＰＲ↓ＳＬＬＶ（配列番号３６））、エラスターゼ−２切断部位（たとえばＬＧＰＶ↓ＳＧＶＰ（配列番号３７））、グランザイム−Ｂ切断（たとえばＶＡＧＤ↓ＳＬＥＥ（配列番号３８））、ＭＭＰ−１２切断部位（たとえば、ＧＰＡＧ↓ＬＧＧＡ（配列番号３９））、ＭＭＰ−１３切断部位（たとえば、ＧＰＡＧ↓ＬＲＧＡ（配列番号４０））、ＭＭＰ−１７切断部位（たとえば、ＡＰＬＧ↓ＬＲＬＲ（配列番号４１））、ＭＭＰ−２０切断部位（たとえば、ＰＡＬＰ↓ＬＶＡＱ（配列番号４２））、ＴＥＶ切断部位（たとえば、ＥＮＬＹＦＱ↓Ｇ（配列番号４３））、エンテロキナーゼ切断部位（たとえば、ＤＤＤＫ↓ＩＶＧＧ（配列番号４４））、プロテアーゼ３Ｃ（ＰＲＥＳＣＩＳＳＩＯＮ（商標））切断部位（たとえば、ＬＥＶＬＦＱ↓ＧＰ（配列番号４５））、およびソルターゼＡ切断部位（たとえば、ＬＰＫＴ↓ＧＳＥＳ）（配列番号４６）からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、ＦＸＩａ切断部位は、限定ではないが、たとえば、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号４７）およびＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号４８）を含む。非限定の例示的トロンビン切断部位は、たとえば、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号４９）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号５０）およびＬＶＰＲＧ（配列番号５５）およびＡＬＲＰＲ（たとえば、ＡＬＲＰＲＶＶＧＧＡ（配列番号５１））を含むか、本質的にそれからなるか、それからなる配列を含む。
【０２２８】
特定の実施形態では、切断部位はＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫ（配列番号５６）である。
【０２２９】
ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞および作製方法
本発明では、本明細書に記載のＶＷＦ断片をコードするポリヌクレオチド、ＶＷＦ断片と異種部分を含むキメラタンパク質、ＦＶＩＩＩタンパク質と付加部分を含むキメラタンパク質、またはＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質も提供される。ＶＷＦ断片が一本のポリペプチド鎖としてキメラタンパク質の異種部分またはＦＶＩＩＩタンパク質に連結している場合、本発明は異種部分またはＦＶＩＩＩタンパク質に連結しているＶＷＦ断片をコードするポリヌクレオチドに関する。キメラタンパク質が第１および第２ポリペプチド鎖を含み、第１ポリペプチド鎖はＶＷＦ断片と第１異種部分（たとえば第１Ｆｃ領域）を含み、第２ポリペプチド鎖は第２異種部分（たとえば第２Ｆｃ領域）を含み、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖は互いに結合している場合、ポリヌクレオチドは第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列を含み得る。一実施形態では、第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列は同じポリヌクレオチド上にある。別の実施形態では、第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列は、２つの異なるポリヌクレオチド（たとえば異なるベクター）上にある。ある特定の実施形態では、本発明は、第１ヌクレオチド鎖と第２ヌクレオチド鎖を含む１組のポリヌクレオチドに関し、第１ヌクレオチド鎖はキメラタンパク質のＶＷＦ断片をコードし、第２ヌクレオチド鎖はＦＶＩＩＩタンパク質をコードする。
【０２３０】
他の実施形態では、１組のポリヌクレオチドは、タンパク質コンバターゼをコードする追加のヌクレオチド鎖（たとえば、キメラポリペプチドが１本のポリヌクレオチド鎖によりコードされる場合は第２ヌクレオチド鎖、またはキメラタンパク質が２本のポリヌクレオチド鎖によりコードされる場合は第３ヌクレオチド鎖）をさらに含む。タンパク質コンバターゼは、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン５型（ＰＣＳＫ５またはＰＣ５）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン７型（ＰＣＳＫ７またはＰＣ５）、酵母Ｋｅｘ２、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン３型（ＰＡＣＥまたはＰＣＳＫ３）およびそれらの２つ以上の組合せからなる群より選択され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質コンバターゼはＰＡＣＥ、ＰＣ５またはＰＣ７である。特定の実施形態では、タンパク質コンバターゼはＰＣ５またはＰＣ７である。参照により本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４３５６８を参照されたい。別の実施形態では、タンパク質コンバターゼはＰＡＣＥ／フーリンである。
【０２３１】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＶＷＦのＤ’ドメインとＤ３ドメインを含むＶＷＦ断片をコードする第１ヌクレオチド配列と、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする第２ヌクレオチド配列と、ＶＷＦのＤ１ドメインとＤ２ドメインをコードする第３ヌクレオチド配列を含む１組のポリヌクレオチドを含む。この実施形態では、Ｄ１ドメインとＤ２ドメインは、適切なＤ’Ｄ３ドメインのジスルフィド結合形成と折り畳みのために、別々に発現される（ＶＷＦ断片のＤ’Ｄ３ドメインに連結していない）。Ｄ１Ｄ２ドメインの発現は、シスでもトランスでもよい。
【０２３２】
本明細書では、発現ベクターは、適切な宿主細胞内に導入されたときに、挿入されたコード配列の転写と翻訳に必要な要素を含む、またはＲＮＡウイルスベクターの場合は、複製と翻訳に必要な要素を含む、任意の核酸コンストラクトを指す。発現ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルスおよびそれらの誘導体を含み得る。
【０２３３】
本発明の発現ベクターは、ＶＷＦ断片をコードするポリヌクレオチドまたはＶＷＦ断片を含むキメラタンパク質を含む。
【０２３４】
一実施形態では、ＶＷＦ断片、第２異種部分（たとえば、第２Ｆｃ領域）またはＦＶＩＩＩタンパク質のコード配列は、発現制御配列に機能的に連結されている。本明細書では、２つの核酸配列は、核酸配列の各構成要素がその機能性を保持できるように共有結合されている場合に、機能的に連結されている。コード配列と遺伝子発現制御配列は、遺伝子発現制御配列の影響または制御下でコード配列の発現または転写および／または翻訳が行われるように共有結合されている場合に、機能的に連結されているといわれる。２つのＤＮＡ配列は、５’遺伝子発現配列におけるプロモーターの誘導によりコード配列が転写され、２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が（１）フレームシフト突然変異の導入をもたらさないか、（２）プロモーター領域がコード配列の転写を指令する能力を阻害しないか、または（３）対応するＲＮＡ転写産物がタンパク質に翻訳される能力を阻害しない場合に、機能的に連結されているといわれる。したがって、ある遺伝子発現配列は、該遺伝子発現配列がある翻訳核酸配列の転写をもたらし、得られた転写産物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳される場合に、その翻訳核酸配列に機能的に連結されているということになる。
【０２３５】
本明細書では、遺伝子発現制御配列は、機能的に連結している翻訳核酸の効率的な転写と翻訳を促進するプロモーター配列やプロモーターとエンハンサーの組合せなどの、任意の調節ヌクレオチド配列である。遺伝子発現制御配列は、たとえば構成型または誘導型プロモーターなどの哺乳動物またはウイルスプロモーターであり得る。構成型哺乳動物プロモーターは、限定ではないが、次の遺伝子のプロモーターを含む：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルベートキナーゼ、βアクチンプロモーターおよび他の構成型プロモーター。真核生物細胞において構成機能のある例示的なウイルスプロモーターは、たとえばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス（たとえば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）および他のレトロウイルス由来のプロモーターならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターを含む。他の構成型プロモーターが当業者には知られている。本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターは、誘導型プロモーターも含む。誘導型プロモーターは、誘導剤の存在下で発現する。たとえば、メタロチオネインプロモーターは、ある金属イオンの存在下で誘導され転写と翻訳を促進する。他の誘導型プロモーターが当業者には知られている。
【０２３６】
一般に、遺伝子発現制御配列は、必要に応じて転写と翻訳の開始にそれぞれ関与する５’非転写および５’非翻訳配列、たとえばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などを含むものとする。特に、そのような５’非転写配列は、機能的に連結した翻訳核酸の転写制御用プロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。遺伝子発現配列は、随意に任意のエンハンサー配列または上流のアクティベーター配列を含む。
【０２３７】
ウイルスベクターは、限定ではないが、次のウイルス由来の核酸配列を含む：レトロウイルス、たとえばモロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、ネズミ乳房腫瘍ウイルスおよびラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクチニアウイルス；ポリオウイルス；およびレトロウイルスなどのＲＮＡウイルス。当技術分野では周知の他のベクターを容易に用いることができる。ある特定のウイルスベクターは、重要ではない遺伝子が目的の遺伝子と置き換わっている非細胞変性真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスは、そのライフサイクルがゲノムウイルスＲＮＡをＤＮＡに逆転写し、プロウイルスを宿主細胞のＤＮＡに組み込むことを含む、レトロウイルスを含む。レトロウイルスは、ヒト遺伝子治療の治験が承認されている。もっとも有用なのは、複製欠損性（すなわち、所望のタンパク質の合成を指令できるが、感染粒子は生産できない）のレトロウイルスである。そのような遺伝子改変レトロウイルス発現ベクターは、インビボでの高効率の遺伝子形質移入に関し汎用性がある。複製欠損性レトロウイルスを産生する標準的なプロトコル（外因性遺伝材料をプラスミドに組み込むステップ、プラスミドを用いてのパッケージング細胞株の形質移入ステップ、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生ステップ、組織培地からのウイルス粒子の回収ステップおよび標的細胞をウイルス粒子で感染させるステップを含む）がKriegler,M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., NewYork (1990)およびMurry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press,Inc., Cliffton, N.J. (1991)に提供されている。
【０２３８】
一実施形態では、ウイルスは、二本鎖ＤＮＡウイルスのアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは操作により複製欠損性になり得るので、多様な細胞型および種の感染が可能である。さらに熱および脂質溶媒安定性；造血細胞を含む様々な系の細胞への高形質移入発生頻度；および重感染阻止の欠如などの利点があるので、複数組の形質導入が可能である。報告によると、アデノ随伴ウイルスは、部位特定的にヒト細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得るので、挿入変異と挿入された遺伝子のレトロウィルス感染症の特徴の発現の可能性が最小限となる。さらに、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、組織培養において選択的圧力の非存在下で１００継代を超え、アデノ随伴ウイルスのゲノム組込みは比較的安定した減少であることが示唆されている。アデノ随伴ウイルスは染色体外でも機能できる。
【０２３９】
他のベクターは、プラスミドベクターを含む。プラスミドベクターは、当技術分野で広く記載されており、当業者には周知である。たとえば Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Secod Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照されたい。ここ数年、プラスミドベクターは、宿主ゲノム内で複製し組み込まれることができないため、インビボで細胞に遺伝子を送達するのに特に有利であることが見出されている。しかし、宿主細胞に適合したプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で機能的にコードされた遺伝子由来のペプチドを発現し得る。業者から入手可能な一般的に使用されるプラスミドは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、様々なｐｃＤＮＡプラスミド、ｐＲＣ／ＣＭＶ、様々なｐＣＭＶプラスミド、ｐＳＶ４０およびｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔを含む。特定のプラスミドの追加の例には、以下すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）のｐｃＤＮＡ３．１、カタログ番号Ｖ７９０２０；ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏ、カタログ番号Ｖ８７０２０；ｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−Ｈｉｓ、カタログ番号Ｖ８６３２０；およびｐＢｕｄＣＥ４．１、カタログ番号Ｖ５３２２０が含まれる。他のプラスミドは当業者には周知である。また、プラスミドは、特定のＤＮＡ断片を除去および／または付加する標準的な分子生物学の技法を用いて特別に設計してもよい。
【０２４０】
本発明のタンパク質を産生するのに使用され得る一昆虫発現系では、オートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が外部遺伝子の発現用ベクターとして用いられる。このウイルスはヨトウガ細胞内で成長する。コード配列は、ウイルスの非重要領域（たとえば多角体遺伝子）にクローン化されＡＣＮＰＶプロモーター（たとえば多角体プロモーター）の制御下に置かれ得る。コード配列の挿入が成功すると、多角体遺伝子が不活化され、非閉塞組換えウイルス（すなわち、ウイルスは多角体遺伝子がコードするタンパク性被膜をもたない）が産生される。これらの組換えウイルスは次に、中で挿入遺伝子が発現するヨトウガ細胞の感染に使用される（たとえば、Smith et al. (1983)J Virol 46:584；米国特許第４、２１５、０５１号を参照）。この発現系のさらなる例はAusubel et al., eds. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscienceに見出され得る。
【０２４１】
本発明のタンパク質を産生するのに使用され得る別の系は、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系であり、「ＧＳ発現系」とも呼ばれる（Lonza Biologics PLC, Berkshire UK）。この発現系は、米国特許第５，９８１，２１６号で詳述されている。
【０２４２】
哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルス系の発現系が使用され得る。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、コード配列はアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、たとえば後期プロモーターおよび三者間リーダー配列へと溶解され得る。このキメラ遺伝子は、次に、インビトロまたはインビボの組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非重要領域（たとえばＥ１またはＥ３領域）への挿入により、感染宿主において生存可能であり、ペプチドを発現できる組換えウイルスが生成する。たとえばLogan& Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci USA81:3655を参照されたい。あるいは、ワクチニア７．５Ｋプロモーターが使用され得る。たとえばMackett et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:7415; Mackett et al. (1984) J Virol 49:857; Panicali et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:4927を参照されたい。
【０２４３】
産生効率を上げるため、ポリヌクレオチドは、酵素的切断部位により分離される本発明のタンパク質の複数単位をコードするように設計され得る。得られたポリペプチドは、ポリペプチドユニットを回収するために（たとえば適切な酵素で処理して）切断され得る。これによって、１つのプロモーターによるポリペプチドの収量が増加し得る。適切なウイルス発現系内で使用された場合、ｍＲＮＡにコードされる各ポリペプチドの翻訳は転写物の内側でたとえば配列内リボソーム進入部位のＩＲＥＳにより指令される。したがって、ポリシストロニックなコンストラクトは、１つの巨大なポリシストロニックｍＲＮＡの転写を指令し、次にそれが複数の個々のポリペプチドの翻訳を指令する。この方法は、ポリタンパク質の産生と酵素的処理を排除し、１つのプロモーターによるポリペプチドの収量が大幅に増加し得る。
【０２４４】
形質転換に使用されるベクターは、通常は形質転換体の特定に用いられる選択マーカーを含む。細菌系の選択マーカーは、アンピリシンやカナマイシンなどの抗生物質耐性遺伝子を含み得る。培養された哺乳動物細胞において使用される選択マーカーは、ネオマイシン、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を与える遺伝子を含む。選択マーカーは増幅可能な選択マーカーであり得る。増幅可能な一選択マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子である。Simonsen C C et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:2495-9。選択マーカーはThilly (1986)Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Mass.で概説されており、選択マーカーの選択は当業者レベルで行われる。
【０２４５】
選択マーカーは、目的の遺伝子と同時に別のプラスミド上で細胞に導入されてもよいし、同じプラスミド上で細胞に導入されてもよい。同じプラスミドの場合、選択マーカーと目的の遺伝子は別のプロモーターか同じプロモーターの制御下であり得、後者の配置はジシストロニックなメッセージを産生する。このタイプのコンストラクトは当技術分野では既知である（たとえば米国特許第４，７１３，３３９号）。
【０２４６】
発現ベクターは、組換え産生タンパク質の精製を容易にするタグをコードできる。限定ではないが、以下の例が挙げられる：産生されるタンパク質のコード配列がｌａｃ  ｚコード領域とともにフレームを揃えてベクター内に連結されてタグ付き融合タンパク質を産生し得る、ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al. (1983) EMBO J 2:1791）；ｐＧＥＸベクターはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグとともに本発明のタンパク質の発現に使用され得る。これらのタンパク質は通常は溶解性があり、グルタチオン−アガロースビーズの吸着とそれに続く自由グルタチオンの存在下での溶出により細胞から容易に精製され得る。ベクターは、精製後にタグを容易に除去するためにを切断部位（トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼまたはＰＲＥＳＣＩＳＳＩＯＮ  ＰＲＯＴＥＡＳＥ（商標）（Pharmacia、ニュージャージー州ピーバック））を含む。
【０２４７】
発現ベクター（単数または複数）は次に、ポリペプチドを発現する適切な標的細胞に形質移入または共形質移入される。当技術分野で既知の形質移入の技法には、限定ではないが、カルシウムリン酸沈殿（Wigleret al. (1978) Cell14:725）、電気穿孔（Neumann et al. (1982) EMBO J 1:841）およびリポソーム系試薬が含まれる。様々な宿主発現ベクター系が、原核生物細胞と真核生物細胞の両方を含め、本明細書に記載のタンパク質を発現するのに使用され得る。これらには、限定ではないが、適切なコード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（たとえば大腸菌）などの微生物；適切なコード配列を含む組換え酵母または真菌発現ベクターで形質転換された酵母または糸状菌；適切なコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（たとえば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；適切なコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルスまたはタバコモザイクウイルス）に感染させたかまたは組換えプラスミド発現ベクター（たとえば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞（たとえば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、Ｃｏｓ、ＨｅＬａ、ＨＫＢ１１およびＢＨＫ細胞）を含む動物細胞系が含まれる。
【０２４８】
一実施形態では、宿主細胞は、真核生物細胞である。本明細書では、真核生物細胞とは、明確な核を有するあらゆる動物や植物を指す。動物の真核生物細胞は、脊椎動物たとえば哺乳動物の細胞および無脊椎動物たとえば昆虫の細胞を含む。植物の真核生物細胞は、限定ではないが、具体的には酵母細胞を含み得る。真核生物細胞は、たとえば細菌などの原核生物細胞とは区別される。
【０２４９】
ある特定の実施形態では、真核生物細胞は哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、哺乳動物由来の任意の細胞である。哺乳動物細胞は、限定ではないが、具体的には、哺乳動物細胞株を含む。一実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。別の実施形態では、哺乳動物細胞はヒト胎児由来腎臓細胞株ＨＥＫ２９３細胞である。ＨＥＫ２９３細胞はAmerican Type Culture Collection（バージニア州マナサス）からＣＲＬ−１５３３として、Invitrogen（カリフォルニア州カールスバッド）から２９３−Ｈ  細胞、カタログ番号１１６３１−０１７または２９３−Ｆ細胞、カタログ番号１１６２５−０１９として入手可能である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は網膜由来のヒト細胞株ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞はCｒｕｃｅｌｌ（オランダ国ライデン）から入手可能である。他の実施形態では、哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。ＣＨＯ細胞はAmerican Type Culture Collection（バージニア州マナサス）から入手可能である（たとえば、ＣＨＯ−Ｋ１；ＣＣＬ−６１）。さらに他の実施形態では、哺乳動物細胞ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞である。ＢＨＫ細胞はAmerican Type Culture Collection（バージニア州マナサス）から入手可能である（たとえばＣＲＬ−１６３２）。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はＨＥＫ２９３細胞とヒトＢ細胞株のハイブリッド細胞株であるＨＫＢ１１細胞である。Mei et al., Mol. Biotechnol. 34(2): 165-78 (2006)。
【０２５０】
一実施形態では、本発明のＶＷＦ断片またはキメラタンパクをコードするプラスミドは、たとえばゼオシン抵抗性などの選択マーカーをさらに含み、ＶＷＦ断片またはキメラタンパクを産生するためにＨＥＫ２９３細胞に形質移入される。
【０２５１】
別の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃ融合コード配列と第１選択マーカー、たとえばゼオシン抵抗性遺伝子を含む第１プラスミドと、ＶＷＦ断片−Ｆｃコード配列と第２選択マーカー、たとえばネオマイシン抵抗性遺伝子を含む第２プラスミドが、第ＶＩＩＩ因子−ＦｃとＶＷＦ−Ｆｃのハイブリッドを産生するためにＨＥＫ２９３細胞に共形質移入される。第１プラスミドと第２プラスミドは、同量（すなわち１：１の比率）で導入されても異なる量で導入されてもよい。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃ融合コード配列と第１選択マーカー、たとえばゼオシン抵抗性遺伝子を含む第１プラスミドと、ＶＷＦ断片−Ｆｃコード配列と第２選択マーカー、たとえばネオマイシン抵抗性遺伝子を含む第２プラスミドと、タンパク質コンバターゼのコード配列（たとえばＰＣ５またはフーリン）と第３選択マーカー、たとえばハイグロマイシン抵抗性遺伝子を含む第３プラスミドが、第ＶＩＩＩ因子−ＶＷＦ断片のハイブリッドを産生するためにＨＥＫ２９３細胞に共形質移入される。第１プラスミドと第２プラスミドは、同量（すなわち１：１の比率）で導入されても異なる量で導入されてもよい。ある特定の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃ融合コード配列と第１選択マーカー、たとえばゼオシン抵抗性遺伝子を含む第１プラスミドと、タンパク質コンバターゼのコード配列（たとえばＰＣ５またはフーリン）と第２選択マーカー、たとえばハイグロマイシン抵抗性遺伝子を含む第２プラスミドが、第ＶＩＩＩ因子−ＶＷＦ−断片のハイブリッドを産生するためにＨＥＫ２９３細胞に共形質移入される。一実施形態では、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ配列とＶＷＦ断片−Ｆｃ配列をコードするヌクレオチド配列が接続されて単一のポリペプチドをコードする。別の実施形態では、配列ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ配列とＶＷＦ断片−Ｆｃ配列をコードするヌクレオチドが２本のポリペプチド鎖としてコードされ得る。第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃ融合コード配列とＶＷＦ断片−Ｆｃコード配列のプロモーターは、異なっていても同じでもよい。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、フーリンを含むプラスミドが第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃコード配列および／またはＶＷＦ断片−Ｆｃコード配列を含むプラスミドと共形質移入される。いくつかの実施形態では、フーリンタンパク質は、第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃ融合コード配列を含むプラスミドと同じプラスミド上にある。いくつかの実施形態では、フーリンタンパク質は、ＶＷＦ断片−Ｆｃコード配列を含むプラスミドと同じプラスミド上にある。いくつかの実施形態では、フーリンタンパク質は別のプラスミド上にある。
【０２５４】
さらに他の実施形態では、形質移入細胞は安定的に形質移入されている。これらの細胞は当業者には既知の一般的な技法を用いて安定細胞株として選択され維持され得る。
【０２５５】
タンパク質のＤＮＡコンストラクトを含む宿主細胞は適切な増殖培地で培養される。本明細書では、「適切な増殖培地」とは、細胞の成長に必要な栄養分を含む培地を意味する。細胞の成長に必要な栄養分は、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン類、ミネラル類および成長因子を含み得る。随意に、培地は１または複数の選択因子を含み得る。随意に培地はウシ胎仔血清または胎児血清（ＦＣＳ）を含み得る。一実施形態では、培地は実質的にＩｇＧを含まない。増殖培地は一般に、たとえば薬物選択または必須栄養分不足により、ＤＮＡコンストラクト上のまたはＤＮＡコンストラクトと共形質移入された選択マーカーにより補われるＤＮＡコンストラクトを含む細胞を選択する。培養哺乳動物細胞は一般に、市販の血清含有または無血清培地（たとえばＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）で成長する。一実施形態では、培地はＣＤ２９３である（Invitrogen,カリフォルニア州カールスバッド）。別の実施形態では、培地はＣＤ１７である（Invitrogen, カリフォルニア州カールスバッド）。使用される特定の細胞株に適した培地の選択は、選択マーカーの選択は当業者レベルで行われる。
【０２５６】
ＶＷＦ断片と第２異種部分またはＦＶＩＩＩタンパク質を共発現するために、宿主細胞は、ＶＷＦ断片と第２異種部分またはＦＶＩＩＩタンパク質の両方を発現させる条件下で培養される。本明細書では、培養するとは、生体細胞をインビトロで少なくとも特定の時間維持することを指す。維持するとは、生体細胞数の増加を含み得るが、必ずしも含む必要はない。たとえば、培地で維持された細胞は、数は変化しないかもしれないが、生存可能であり、所望の産物、たとえば組換えタンパク質または組換え融合タンパク質を産生する能力がある。真核生物細胞の適切な培養条件は当技術分野では周知であり、適切な培地、サプリメント、温度、ｐＨ、酸素飽和度などの選択を含む。商業目的では、培養には、振とうフラスコ、回転瓶、ホローファイバーバイオリアクター、撹拌槽型バイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、Ｗａｖｅバイオリアクターその他の様々なタイプの任意のスケールアップ系の使用を含み得る。
【０２５７】
細胞培養条件はまた、ＶＷＦ断片と第２異種部分またはＦＶＩＩＩタンパク質を結合させるように選択される。ＶＷＦ断片および／またはＦＶＩＩＩタンパク質を発現させる条件は、ビタミンＫ供給源の存在を含み得る。たとえば，一実施形態では、安定形質移入されたＨＥＫ２９３細胞は、４ｍＭグルタミンを補充されたＣＤ２９３培地（Invitrogen，カリフォルニア州カールスバッド）またはＯｐｔｉＣＨＯ培地（Invitrogen，カリフォルニア州カールスバッド）で培養される。
【０２５８】
一態様では、本発明は、本発明のＶＷＦ断片を発現、作製または産生する方法に関し、該方法は（ａ）宿主細胞をＶＷＦ断片をコードするポリヌクレオチドで形質移入することと、（ｂ）ＶＷＦ断片を発現するのに適した条件下で、培地で宿主細胞を培養し、ＶＷＦ断片が発現することを含む。一実施形態では、本発明は、成熟ＶＷＦタンパク質またはその断片を産生する方法に関し、該方法は（ａ）ＶＷＦのプロペプチドと融合した、ＶＷＦタンパク質またはその断片をコードする第１ポリヌクレオチドと、タンパク質コンバターゼ、たとえばＰＣ５、ＰＣ７またはフーリンをコードする第２ポリヌクレオチドで宿主細胞を形質移入することと、（ｂ）成熟ＶＷＦタンパク質またはその断片を発現するのに適した条件下で、培地で宿主細胞を培養することを含む。ＶＷＦタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドは、ＶＷＦのプレペプチドと融合してもよい。プレペプチド配列は、小胞体に挿入中、分泌前に切断され得る。
【０２５９】
別の態様では、本発明は、異種部分またはＦＶＩＩＩタンパク質と連結または結合したＶＷＦ断片を含むキメラタンパク質を発現、作製または産生する方法に関し、該方法は（ａ）１または複数の宿主細胞をキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは１組のポリヌクレオチドで形質移入することと、（ｂ）キメラタンパク質を発現するのに適した条件下で、培地で宿主細胞を培養することを含む。一実施形態では、本発明は、キメラタンパク質を発現、作製または産生する方法に関し、該方法は（ａ）異種部分に連結したＶＷＦ断片をコードする第１ポリヌクレオチドと、異種部分に連結したＦＶＩＩＩタンパク質をコードする第２ポリヌクレオチドで宿主細胞を形質移入することと、（ｂ）キメラタンパク質を発現するのに適した条件下で、培地で宿主細胞を培養することを含む。第１ポリヌクレオチドと第２ポリヌクレオチドは１つのベクターまたは２つベクターの中にあり得る。別の実施形態では、本発明は、キメラタンパク質を発現、作製または産生する方法に関し、該方法は（ａ）異種部分に連結したＶＷＦ断片をコードする第１ポリヌクレオチドと、異種部分に連結したＦＶＩＩＩタンパク質をコードする第２ポリヌクレオチドと、タンパク質コンバターゼをコードする第３ポリヌクレオチドで宿主細胞を形質移入することと、（ｂ）キメラタンパク質を発現するのに適した条件下で、培地で宿主細胞を培養することを含む。他の実施形態では、本発明は、キメラタンパク質を発現、作製または産生する方法に関し、該方法は（ａ）異種部分に連結したＤ’ドメインとＤ３ドメインを含むＶＷＦ断片をコードする第１ポリヌクレオチドと、異種部分に連結したＦＶＩＩＩタンパク質をコードする第２ポリヌクレオチドと、ＶＷＦのＤ１ドメインとＤ２ドメインをコードする第３ポリヌクレオチドで宿主細胞を形質移入することと、（ｂ）キメラタンパク質を発現するのに適した条件下で、培地で宿主細胞を培養することを含む。一実施形態では、第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチドおよび第３ポリヌクレオチドは、１つのベクターまたは別々のベクターの中にあり得る。別の実施形態では、第１ポリヌクレオチドと第２ポリヌクレオチドは１つのベクターの中にあり得、第３ポリヌクレオチドは別のベクターの中にあり得る。他の実施形態では、第１ポリヌクレオチドと第３ポリヌクレオチドは１つのベクターの中にあり得、第２ポリヌクレオチドは別のベクターの中にあり得る。いくつかの実施形態では、第２ポリヌクレオチドと第３ポリヌクレオチドは１つのベクターの中にあり得、第１ポリヌクレオチドは別のベクターの中にあり得る。
【０２６０】
さらなる実施形態では、ＶＷＦ断片を含むタンパク質産物またはＶＷＦ断片を含むキメラタンパク質は培地中に分泌される。培地は細胞から分離され、濃縮され、濾過された後、たとえばプロテインＡカラムと１回か２回のアニオン交換カラムなど、２回か３回アフィニティーカラムを通される。
【０２６１】
ある特定の態様では、本発明は本明細書に記載の方法で産生されたＶＷＦ断片またはキメラポリペプチドに関する。
【０２６２】
インビトロでの産生は、スケールアップして本発明の所望の改変ポリペプチドを大量に得ることが可能である。組織培地条件下での哺乳動物細胞培養の技法は当技術分野で既知であり、たとえばエアリフトリアクターまたは連続撹拌リアクター内での同種性懸濁培養、またはたとえばホローファイバー、マイクロカプセル中、寒天マイクロビーズまたはセラミックカートリッジ上での固定化または閉じ込め細胞培養を含む。必要な場合および／または所望により、ポリペプチドの溶液は慣習的クロマトグラフィー法、たとえばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。
【０２６３】
医薬組成物
本発明のＶＷＦ断片またはキメラタンパク質を含む組成物は、適切な薬剤的に許容可能な担体を含み得る。たとえば、活性化合物を加工して作用部位への送達用に設計された調製物にするのを促進する賦形剤および／または補助剤を含み得る。
【０２６４】
医薬組成物は、ボーラス注射による非経口（すなわち静脈内、皮下または筋肉内）投与するように製剤され得る。注射用製剤は、添加剤を加えられ、単位剤形、たとえばアンプルまたは分割投与容器に入れられ得る。組成物は、懸濁液、溶液または油性もしくは水性ビヒクル中の乳剤の剤形をとり得、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの製剤用の剤を含み得る。あるいは、活性成分は、たとえば発熱性物質除去水などの適切なビヒクルとともに構成される粉末剤形でもよい。
【０２６５】
非経口投与に適した製剤は、たとえば水溶塩などの水溶形態の活性化合物の水溶液も含む。さらに、適切な油性注射用懸濁液として活性化合物の懸濁液が投与されうる。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、油脂、たとえばゴマ油または合成脂肪酸エステル、たとえばエチルオレエートまたはトリグリセリドを含む。水系注射用懸濁液は、たとえばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよびデキストランを含む、懸濁液の粘性を増加するような物質を含有し得る。随意に、懸濁液は安定剤も含有し得る。本発明の分子を細胞または間質スペースに送達するためにカプセル化するのにリポソームも使用され得る。例となる薬剤的に許容可能な担体は、生理学的に適合性のある溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。いくつかの実施形態では、組成物は等張剤、たとえば糖、マンニトールやソルビトールなどのポリアルコールまたは塩化ナトリウムを含む。他の実施形態では、組成物は、薬剤的に許容可能な物質、たとえば湿潤剤または少量の補助剤たとえば湿潤剤や乳化剤、保存料または緩衝剤を含み、これらは活性成分の保存期間や有効性を高める。
【０２６６】
本発明の組成物は、たとえば液体（たとえば注射液や輸液用の溶液）、分散剤、懸濁剤、半固形および固形剤を含む様々な剤形であり得る。好ましい剤形は、投与モードと治療用途に依存する。
【０２６７】
組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散剤、リポソームまたは他の高薬物濃度に適した秩序構造で製剤され得る。無菌注射液は、適切な溶媒中必要量の活性成分を必要に応じて上述の成分１つまたはそれらの併用と合わせ、濾過滅菌することで調製され得る。一般に、分散剤は、基剤の分散剤媒体と上記のうちの必要な成分を含む無菌ビヒクルに活性成分を組み込むことで調製される。無菌注射液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末および滅菌濾過済み溶液からの任意の所望される追加成分を産生する真空乾燥と凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、たとえばレシチンなどのコーティングを用いることや、分散剤の場合は必要な粒径を維持することや、界面活性剤の使用により、維持され得る。注射組成物の吸収時間の延長は、組成物中に吸収を遅らせる剤、たとえばモノステアレート塩やゼラチンを含むことで可能になり得る。
【０２６８】
活性成分は、徐放剤またはデバイスとともに製剤され得る。そのような剤とデバイスの例には、移植片、経皮貼付剤およびマイクロカプセル化送達システムが含まれる。生分解性、生体適合性ポリマー、たとえばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が使用され得る。そのような剤とデバイスを調製する方法は当技術分野では既知である。たとえばSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
【０２６９】
注射デポー製剤は、ポリラクリド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することで作製できる。薬物とポリマーの比率および使用するポリマーの性質により、薬物放出速度を制御できる。他の例示的生分解性ポリマーは、ポリオルトエステルおよびポリ無水物である。注射デポー製剤は、リポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を捕捉することでも調製できる。
【０２７０】
補充的活性化合物を組成物に組み込むことができる。一実施形態では、本発明のＶＷＦ断片またはキメラタンパク質は別の凝固因子またはそのバリアント、断片、類似体もしくは誘導体を用いて製剤される。たとえば凝固因子は、限定ではないが、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロトロンビン、フィブリノゲン、フォンウィルブランド因子または組換え可溶組織因子（ｒｓＴＦ）あるいはそれらのいずれかの活性化型を含む。止血薬の凝固因子は、抗線維素溶解薬物、たとえばεアミノカプロン酸、トラネキサム酸も含み得る。
【０２７１】
用量レジメンは最適な所望の反応が得られるように調節してよい。たとえば単回ボーラスを投与してもよく、分割用量をある期間投与してもよく、治療状況の緊急事態によっては用量を比例的に増やしても減らしてもよい。非経口組成物を単位剤形として製剤することは、投与しやすさと用量の均一性の点で有利である。たとえばRemington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980)を参照されたい。
【０２７２】
活性化合物の他にも、液体剤形は不活成分、たとえば水、エチルアルコール、エチルカルボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルを含み得る。
【０２７３】
適切な薬剤的担体の非限定的な例は、E. W. MartinのRemington's Pharmaceutical Sciencesにも記載されている。賦形剤の例の一部は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦、米、小麦、チョーク、シリカゲル、ナトリウムステアレート、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。組成物は、ｐＨ緩衝試薬および湿潤または乳化剤も含み得る。
【０２７４】
経口投与では、医薬組成物は一般的な手段により調製される錠剤またはカプセル剤の剤形を取り得る。組成物は液体として、たとえばシロップまたは懸濁液としても調製できる。液体は、懸濁剤（たとえばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または食用硬化油）、乳化剤（レシチンまたはアカシア）、非水系ビヒクル（たとえばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分離植物油）および保存料（たとえばメチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を含み得る。調製物は、香味料、着色剤および甘味料も含み得る。あるいは、組成物は、水や別の適切なビヒクルと一緒に構成される乾燥製品としてもよい。
【０２７５】
頬内投与では、組成物は錠剤または一般的なプロトコルに従ってトローチ剤の剤形をとり得る。
【０２７６】
吸入による投与では、本発明にしたがって使用される化合物は、噴射剤、たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素または他の適切な気体を随意に含み、賦形剤を含むかまたは含まない噴霧エアロゾルとして、または加圧容器やネブライザーからのエアロゾルスプレーとして好都合にも送達される。加圧エアロゾルの場合、用量単位は定量を送達するための弁を設けることで決定され得る。吸入器や注入器で使用される、たとえばゼラチンのカプセル剤およびカートリッジは、化合物と適切な粉末基剤たとえばラクトースやデンプンの粉末混合物を含んで製剤され得る。
【０２７７】
医薬組成物は、たとえば一般的な座薬基剤、たとえばココアバターや他のグリセリドを含む座薬または停留浣腸として直腸投与用にも製剤できる。
【０２７８】
遺伝子治療
出血性血液凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉内への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、消化器系出血、脳内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙内出血、腹膜後隙内出血および腸腰筋外筒（illiopsoassheath）内出血からなる群より選択される出血性疾患または疾病を治療するための遺伝子治療法を用いて、インビボで哺乳動物、たとえばヒト患者において産生される、本発明のＶＷＦ断片またはそのキメラタンパク質は、治療上有益である。一実施形態では、出血性疾患または疾病は血友病である。別の実施形態では、出血性疾患または疾病は血友病Ａである。このことは、適切な発現制御配列に機能的に連結した適切なＶＷＦ断片またはキメラタンパク質をコードする核酸の投与を含む。ある特定の実施形態では、これらの配列はウイルスベクターに組み込まれる。そのような遺伝子治療に適切なウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクチニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。ウイルスベクターは、複製欠失ウイルスベクターであり得る。他の実施形態ではアデノウイルスベクターはＥ１遺伝子またはＥ３遺伝子に欠失がある。アデノウイルスベクターが使用される場合、哺乳動物は選択マーカー遺伝子をコードする核酸に曝露されないかもしれない。他の実施形態では、配列は当業者には既知の非ウイルスベクターに組み込まれる。
【０２７９】
ＶＷＦ断片またはキメラタンパク質を使用する方法
本発明の一態様は、ＦＶＩＩＩが内因性ＶＷＦと相互作用するのを、ＦＶＩＩＩ上のＶＷＦ結合部位を内因性ＶＷＦからブロックまたは遮蔽することで、防止または阻害することに関する。一実施形態では、本発明は、野生型ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩモノマー−ダイマーハイブリッドよりも長い半減期を有するＦＶＩＩＩタンパク質を構築する方法に関し、該方法は付加部分をＦＶＩＩＩタンパク質と共有結合させることでＦＶＩＩＩタンパク質と付加部分を含むキメラタンパク質を作製することを含み、付加部分はＦＶＩＩＩタンパク質が内因性ＶＷＦと相互作用するのを遮蔽または防止する。該方法で有用なキメラタンパク質は、本明細書に記載のあらゆる１または複数のキメラタンパク質を含む。
【０２８０】
本発明の別の態様は、野生型ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩモノマー−ダイマーハイブリッドよりも長い半減期を有するＦＶＩＩＩタンパク質を必要とする対象に投与する方法を含み、該ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩをコードするアミノ酸配列とＦｃ領域からなる第１鎖と、Ｆｃ領域からなる第２鎖の２本のポリペプチド鎖からなり、該方法は、本明細書記載のＶＷＦ断片または本明細書記載のキメラタンパク質を対象に投与することを含む。モノマー−ダイマーハイブリッド中のＦＶＩＩＩアミノ酸配列は、ＳＱＦＶＩＩＩまたは野生型ＦＶＩＩＩであり得る。
【０２８１】
一実施形態では、本発明は、内因性ＶＷＦがＦＶＩＩＩタンパク質と相互作用するのを防止または阻害するために、付加部分、たとえば本明細書記載のＶＷＦ断片またはＶＷＦ断片を含むキメラタンパク質を使用する方法に関する。別の実施形態では、ＶＷＦ断片と相互作用できるＦＶＩＩＩタンパク質は、内因性ＦＶＩＩＩである。他の実施形態では、ＶＷＦ断片と相互作用できるＦＶＩＩＩタンパク質は、ＶＷＦ断片またはＶＷＦ断片を含むキメラタンパク質と別に、その前または後で対象に投与される、または同時に対象に投与されるＦＶＩＩＩ組成物である。他の実施形態では、ＶＷＦ断片と結合できるＦＶＩＩＩタンパク質は、ＶＷＦ断片またはキメラタンパク質と一緒に対象に投与されるＦＶＩＩＩ組成物である。さらに他の実施形態では、ＶＷＦ断片と結合できるＦＶＩＩＩタンパク質は、キメラタンパク質中でＶＷＦ断片と一緒に存在するかまたはＶＷＦ断片と結合しているＦＶＩＩＩである。ＶＷＦ断片またはＶＷＦ断片を含むキメラタンパク質はＦＶＩＩＩタンパク質と結合または会合して、ＶＷＦ断片またはキメラタンパク質と結合したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長する。ＶＷＦ断片またはキメラタンパク質と結合したＦＶＩＩＩタンパク質は、ＶＷＦのクリアランス経路から遮蔽または保護されるので、ＶＷＦ断片またはキメラタンパク質と結合していないＦＶＩＩＩタンパク質と比べてクリアランス率が低い。遮蔽されたＦＶＩＩＩタンパク質は、したがって、ＶＷＦ断片またはキメラタンパク質と結合またはや会合していないＦＶＩＩＩタンパク質と比べて長い半減期を有する。ある特定の実施形態では、本発明のＶＷＦ断片またはキメラタンパク質と会合しているかまたは保護されるＦＶＩＩＩタンパク質は、ＶＷＦクリアランス受容体により排除されない。．他の実施形態では、ＶＷＦ断片またはキメラタンパク質と会合しているかまたは保護されるＦＶＩＩＩタンパク質は、ＶＷＦ断片と会合しておらずまたは保護されていないＦＶＩＩＩタンパク質よりもゆっくりと系から排除される。
【０２８２】
一態様では、本発明のＶＷＦ断片またはそれを含むキメラタンパク質は、ＶＷＦ断片またはキメラタンパク質がＶＷＦクリアランス受容体結合部位を含まないので、血中からのクリアランス率が低い。ＶＷＦ断片は、ＶＷＦ断片と結合または会合したＦＶＩＩＩがＶＷＦクリアランス経路を通じて系から排除されるのを防止または阻害する。本発明にとって有用なＶＷＦ断片は、内因性ＶＷＦにより提供される少なくとも１または複数のＶＷＦ様ＦＶＩＩＩ保護特性を提供することもできる。ある特定の実施形態では、ＶＷＦ断片は１または複数のＦＶＩＩＩクリアランス受容体結合部位をマスクすることもできるので、ＦＶＩＩＩ自体のクリアランス経路による除去が回避できる。
【０２８３】
別の態様では、本発明のＶＷＦ断片またはキメラタンパク質は、２Ｎ型フォンウィルブランド疾患（ＶＷＤ）関連の疾病または疾患の治療または防止に使用され得る。２Ｎ型ＶＷＤは、欠損ＶＷＦのＦＶＩＩＩとの結合に起因するＶＷＦ質的異常であり、低レベル循環ＦＶＩＩＩをもたらす。したがって、本発明のＶＷＦ断片またはキメラタンパク質がＦＶＩＩＩタンパク質に結合し、または結合されることは、ＦＶＩＩＩタンパク質の安定化のみならず、ＦＶＩＩＩタンパク質が血中から排除されることも防止する。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、ＶＷＦ断片またはキメラタンパク質によるＦＶＩＩＩタンパク質の内因性ＶＷＦへの結合防止は、インビトロまたはインビボであり得る。
【０２８５】
断片およびＦＶＩＩＩタンパク質を含むＶＷＦ断片またはキメラタンパク質を必要とする対象に投与することを含む、ＦＶＩＩＩタンパク質半減期を増加させる方法も提供される。血漿中、全長ＶＷＦに結合または会合した非活性化ＦＶＩＩＩの半減期は約１２時間から１４時間である。ＶＷＦの循環がほとんどないＶＷＤの３型では、ＦＶＩＩＩの半減期はたったの約６時間であり、そのような患者はＦＶＩＩＩの循環の低下により軽度から中程度の血友病Ａの症状を示す。本発明のＶＷＦ断片と連結または結合したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、全長ＶＷＦと連結または結合した非活性化ＦＶＩＩＩの半減期と比べて、少なくとも約１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．６倍、２．７．倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍または４．０倍増加し得る。一実施形態では、キメラタンパク質のＶＷＦ断片と連結または結合したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、全長ＶＷＦと連結または結合した非活性化ＦＶＩＩＩの半減期と比べて、少なくとも約２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、７倍、８倍、９倍または１０倍増加する。別の実施形態では、キメラタンパク質のＶＷＦ断片と連結または結合したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、全長ＶＷＦと連結または結合した非活性化ＦＶＩＩＩの半減期と比べて、約２〜約５倍、約３〜約１０倍、約５〜約１５倍、約１０〜約２０倍、約１５〜約２５倍、約２０〜約３０倍、約２５〜約３５倍、約３０〜約４０倍、約３５〜約４５倍増加する。特定の実施形態では、キメラタンパク質のＶＷＦ断片と連結または結合したＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、ＦＶＩＩＩとＶＷＦダブルノックアウトマウスの野生型ＦＶＩＩＩの半減期と比べて、少なくとも約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０倍増加する。いくつかの実施形態では、第１異種部分、たとえば第１Ｆｃ領域と融合したＶＷＦ断片と第２異種部分、たとえば第２Ｆｃ領域に連結したＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質の半減期は、ＦＶＩＩＩタンパク質と２つのＦｃ領域を含み、ＦＶＩＩＩタンパク質が２つのＦｃ領域のうち１つと連結している（すなわちＦＶＩＩＩモノマー−ダイマーハイブリッド）キメラタンパク質の半減期よりも長い。他の実施形態では、第１異種部分、たとえば第１Ｆｃ領域と融合したＶＷＦ断片と第２異種部分、たとえば第２Ｆｃ領域に連結したＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質の半減期は、ＦＶＩＩＩタンパク質と２つのＦｃ領域を含み、ＦＶＩＩＩタンパク質が２つのＦｃ領域のうち１つと連結している（すなわちＦＶＩＩＩモノマー−ダイマーハイブリッド）キメラタンパク質の半減期の少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４．０倍、４．５倍または５．０倍である。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、本発明の結果として、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期はＶＷＦ断片なしのＦＶＩＩＩタンパク質または野生型ＦＶＩＩＩと比べて延長される。ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、ＶＷＦ断片なしのＦＶＩＩＩタンパク質の半減期よりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍または少なくとも約１２倍長い。一実施形態では、ＦＶＩＩＩの半減期は、野生型ＦＶＩＩＩの半減期よりも、約１．５倍から約２０倍、約１．５倍から約１５倍または約１．５倍から約１０倍長い。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩの半減期は、野生型ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦ断片なしのＦＶＩＩＩタンパク質と比べて約２倍から約１０倍、約２倍から約９倍、約２倍から約８倍、約２倍から約７倍、約２倍から約６倍、約２倍から約５倍、約２倍から約４倍、約２倍から約３倍、約２．５倍から約１０倍、約２．５倍から約９倍、約２．５倍から約８倍、約２．５倍から約７倍、約２．５倍から約６倍、約２．５倍から約５倍、約２．５倍から約４倍、約２．５倍から約３倍、約３倍から約１０倍、約３倍から約９倍、約３倍から約８倍、約３倍から約７倍、約３倍から約６倍、約３倍から約５倍、約３倍から約４倍、約４倍から約６倍、約５倍から約７倍または約６倍から約８倍延長される。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩの半減期は、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間または少なくとも約１０８時間である。さらに他の実施形態では、ＦＶＩＩＩの半減期は約１５時間〜約２週、約１６時間〜約１週、約１７時間〜約１週、約１８時間〜約１週、約１９時間〜約１週、約２０時間〜約１週、約２１時間〜約１週、約２２時間〜約１週、約２３時間〜約１週、約２４時間〜約１週、約３６時間〜約１週、約４８時間〜約１週、約６０時間〜約１週、約２４時間〜約６日、約２４時間〜約５日、約２４時間〜約４日、約２４時間〜約３日または約２４時間〜約２日である。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、対象あたりの平均ＦＶＩＩＩタンパク質半減期は、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間（１日）、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間（２日）、約５４時間、約６０時間、約７２時間（３日）、約８４時間、約９６時間（４日）、約１０８時間、約１２０時間（５日）、約６日、約７日（１週）、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日または約１４日である。
【０２８８】
特定の実施形態では、本発明のキメラタンパク質の半減期は野生型ＦＶＩＩＩまたはＢＤＤ  ＦＶＩＩＩの半減期よりも約２倍長い。別の実施形態では、キメラタンパク質の半減期は、野生型ＦＶＩＩＩまたはＢＤＤ  ＦＶＩＩＩの半減期よりも約３倍長い。
【０２８９】
さらに、本発明は、有効量のＶＷＦ断片またはキメラタンパク質（たとえば第１異種部分、たとえば第１Ｆｃ領域と融合したＶＷＦ断片と、第２異種部分、たとえば第２Ｆｃ領域に連結したＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質であり、ＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩタンパク質と結合または会合している）を投与することを含む、出血性疾患または疾病を治療する方法を提供する。一実施形態では、出血性疾患または疾病は、出血性血液凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉内への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、消化器系出血、脳内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙内出血、腹膜後隙内出血および腸腰筋外筒（illiopsoassheath）内出血からなる群より選択される。特定の実施形態では、出血性疾患または疾病は血友病Ａである。
【０２９０】
本発明により調製されるＶＷＦ断片および付加部分たとえば本明細書に記載のＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質は、当業者には認識される多くの用途があり、該用途は限定ではないが止血障害を有する対象を治療する方法と一般的止血薬を必要とする対象を治療する方法を含む。一実施形態では、本発明は、治療的有効量のＶＷＦ断片またはキメラタンパク質を投与することを含む、止血障害を有する対象を治療する方法に関する。
【０２９１】
キメラタンパク質中のＦＶＩＩＩタンパク質部分は、負に帯電したリン酸表面で第ＩＸ因子に対し補因子として機能しＸａｓｅ複合体を形成することで、止血障害を治療または防止する。活性化凝固因子のリン酸表面への結合により、このプロセスが血管損傷部位に局在化される。リン酸表面で、第ＶＩＩＩａ因子は、第ＩＸａ因子により第Ｘ因子活性化速度を最高約２００，０００倍高め、第２のトロンビン大量生成をもたらす。
【０２９２】
付加部分たとえばＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質は、あらゆる止血障害の治療に使用できる。本発明のキメラタンパク質の投与により治療され得る止血障害は、限定ではないが、血友病Ａならびに第ＶＩＩＩ因子関連の欠乏や構造的異常を含む。一実施形態では、止血障害は血友病Ａである。
【０２９３】
付加部分たとえばＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質は、止血障害をもつ対象の予防的治療に使用され得る。本発明のキメラタンパク質は、止血障害をもつ対象の急性出血エピソードの治療に使用され得る。別の実施形態では、止血障害は欠損凝固因子、たとえばフォンウィルブランド因子の結果であり得る。一実施形態では、止血障害は先天的疾患である。別の実施形態では、止血障害は後天的疾患である。後天的疾患は、根底にある二次的疾患または病状に起因し得る。無関係の条件の例は、限定ではないが、癌、自己免疫疾患または妊娠である。後天的疾患は、高齢や根底にある二次的疾患治療の服薬（たとえば癌化学療法）にも起因し得る。
【０２９４】
本発明は、先天的止血障害はないが、たとえば抗ＦＶＩＩＩ抗体の発生や手術などの二次的疾患または病状から止血障害を獲得する対象を治療する方法にも関する。このように、本発明は、本発明の方法により調製されるＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質を有効量で投与することを含む、一般的止血薬を必要とする対象を治療する方法に関する。
【０２９５】
本発明は、本明細書に記載のＶＷＦ断片、キメラタンパク質、またはそれらをコードするポリヌクレオチドを有効量で投与することを含む、ＦＶＩＩＩの免疫原性を低下させるかまたはＦＶＩＩＩに対するより低い免疫原性を誘導する方法にも関する。
【０２９６】
一実施形態では、一般的止血薬を必要とする対象は、手術中であるか手術を受ける予定である。ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質は、予防レジメンとして手術の前、途中または後で投与できる。ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質は、急性出血エピソードを制御するために手術の前、途中または後で投与できる。
【０２９７】
ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質は、急性出血エピソードはあるが止血障害のない対象を治療するのに使用され得る。急性出血エピソードは、重度の外傷、たとえば手術、自動車事故、創傷、挫創、銃創、または制御不能な出血をもたらす他のあらゆる外傷的事象に起因し得る。出血エピソードの非限定的例としては、出血性血液凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉内への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、消化器系出血、脳内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙内出血、腹膜後隙内出血、腸腰筋外筒（illiopsoassheath）内出血、およびそれらの任意の組合せが挙げられる。
【０２９８】
予防的適応では、本発明のキメラタンパク質またはＶＷＦ断片を含む１または複数の組成物またはそれらの組合せをまだ疾患状態にはない患者に投与し、疾患または疾病に関連する症状に対し該患者の耐性を強化するかまたはそのような症状を軽減する。そのような量は「予防有効用量」と定義される。治療的適応では、疾患が軽減または終息するまで、および患者が疾患症状の一部または完全寛解を示すまで、比較的高用量（たとえば、用量あたり約１〜４００ｍｇ／ｋｇのポリペプチド、ラジオイムノコンジュゲートでは５〜２５ｍｇ用量の使用が一般的であり、細胞毒−薬物修飾ポリペプチドはさらに高い用量）を比較的短い間隔に投与することが必要な場合がある。その後、患者に予防治療法を施すことができる。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質、ＶＷＦ断片または組成物は、出血エピソード用の治療、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉内への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷（頭部外傷）、消化器系出血、脳内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙内出血、腹膜後隙内出血または腸腰筋外筒（illiopsoassheath）内出血を含むオンデマンド治療に使用される。対象は、外科的予防、周術期マネジメントまたは手術のための処置を必要とし得る。そのような手術は、たとえば、小手術、大手術、抜歯、扁桃腺切除、鼡径ヘルニア切開、滑膜切除、人工膝関節全置換、開頭術、骨接合、外傷手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術または関節置換手術を含む。
【０３００】
一実施形態では、ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質は、静脈内、皮下、筋肉内またはあらゆる粘膜面を介して、たとえば経口、舌下、頬内、鼻腔内、直腸内、膣内または肺を経由する経路で投与される。ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質は、キメラタンパク質が出血部位に対し徐放されるような生体高分子の固体支持体内に埋め込まれるかそこに結合され得、または包帯／ドレッシング材に埋め込まれ得る。ＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質の用量は対象と使用される特定の投与経路により変動し得る。用量は、０．１〜１００，０００μｇ／ｋｇ（体重）であり得る。一実施形態では、用量範囲は０．１〜１，０００μｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量範囲は０．１〜５００μｇ／ｋｇである。タンパク質は、連続的に、または特定の間隔を置いて投与され得る。インビトロアッセイを用いて最適な用量範囲および／または投与スケジュールを決定することができる。凝固因子活性を測定するインビトロアッセイは当技術分野では既知であり、たとえばＳＴＡ−ＣＬＯＴ  ＶＩＩａ−ｒＴＦ凝固アッセイまたはＲＯＴＥＭ凝固アッセイがある。さらに、有効用量は、動物モデル、たとえば血友病のイヌから得られる用量応答曲線から推定され得る（Mount et al. 2002, Blood 99(8):2670）。
【０３０１】
これまで本発明を詳述してきたが、本発明は以下の実施例を参照することでより明白に理解できる。ただし、以下の実施例は単なる例示目的であり、本発明を限定するものではない。本明細書中で参照されるすべての特許文献および刊行物は、参照により明示的に組み込まれる。
【実施例】
【０３０２】
別途言及がない限り、本実施例を通して次の材料と方法を用いた。
【０３０３】
材料と方法
一般に、別途示されない限り、本発明の実施は化学、生物物理学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば、抗体技術）、および電気泳動の標準的な技法の従来の技法を用いる。例えば、Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、 Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510,Paul, S., Humana Pr (1996)、 Antibody Engineering: A  Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr(1996)、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., CS.H.L. Press, Pub.(1999)、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992)を参照のこと。
【０３０４】
実施例１：様々なＶＷＦドメインのクローニング（図１）
（ａ）ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐００１、００２、００３および００４のクローニング
ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐００１〜００４はＶＷＦ断片をコードするヌクレオチド配列を含有し、それらの断片はＶＷＦ‐Ｄ’Ｄ３Ａタンパク質配列のアミノ酸１〜２７６（００１）、アミノ酸ｓ１〜４７７（００２）、アミノ酸１〜５１１（００３）およびアミノ酸１−７１６（００４）である。アミノ酸番号付はプロペプチドを含まない成熟ＶＷＦ配列を表し、配列番号２のアミノ酸７６４〜１０３９（００１）、アミノ酸７６４〜１２４０（００２）、アミノ酸７６４〜１２７４（００３）、およびアミノ酸７６４〜１４７９（００４）にそれぞれ対応する。全ての４つのコンストラクトが合成されたタンパク質の適切な分泌を可能にするＦＶＩＩＩシグナルペプチドをＮ末端に有し、続いてタンパク質精製に使用される６×ＨｉｓタグをＣ末端に有する。上記のコンストラクトは次のプライマーの組合せを用いることにより合成された：
ｐＳＹＮ  ＶＷＦ‐００１：
ＶＩＩＩシグナルおよびＢｓｉＷＩ部位を有するＥＳＣ４８‐Ｆｗｄ‐ＶＷＦ‐Ｄ’Ｄ３ＴＣＧＣＧＡＣＧＴＡＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＴＴＧＣＧＡＴＴＣＴＧＣＴＴＴＡＧＣＣＴ
ＡＴＣＣＴＧＴＣＧＧＣＣＣＣＣＣＡＴＧ（配列番号５７）
６ＨｉｓおよびＮｏｔＩ部位を有するＥＳＣ５０‐Ｒｅｖ‐ＶＷＦ‐部分的Ｄ’Ｄ３（１〜２７６アミノ酸）
ＴＧＡＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣＡＣＴＴＴＴＣＴＧＧＴＧＴＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧ（配列番号５８）
ｐＳＹＮ  ＶＷＦ‐００２：
ＶＩＩＩシグナルおよびＢｓｉＷＩ部位を有するＥＳＣ４８‐Ｆｗｄ‐ＶＷＦ‐Ｄ’Ｄ３ＴＣＧＣＧＡＣＧＴＡＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＴＴＧＣＧＡＴＴＣＴＧＣＴＴＴＡＧＣＣＴＡＴＣＣＴＧＴＣＧＧＣＣＣＣＣＣＡＴＧ（配列番号５９）
６ＨｉｓおよびＮｏｔＩ部位を有するＥＳＣ５１‐Ｒｅｖ‐ＶＷＦ  Ｄ’Ｄ３（１〜４７７アミノ酸）
ＴＧＡＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＴＣＣＴＧＧＣＡＧＧＣＴＴＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＧＴＴＧＡＣＡＡＣ（配列番号６０）
ｐＳＹＮ  ＶＷＦ‐００３：
ＶＩＩＩシグナルおよびＢｓｉＷＩ部位を有するＥＳＣ４８‐Ｆｗｄ‐ＶＷＦ‐Ｄ’Ｄ３ＴＣＧＣＧＡＣＧＴＡＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＴＴＧＣＧＡＴＴＣＴＧＣＴＴＴＡＧＣＣＴＡＴＣＣＴＧＴＣＧＧＣＣＣＣＣＣＡＴＧ（配列番号６１）
６ＨｉｓおよびＮｏｔＩ部位を有するＥＳＣ５２−Ｒｅｖ‐ＶＷＦ‐Ｄ’Ｄ３部分的Ａ１（１〜５１１アミノ酸）
ＴＧＡＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＴＡＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＡＡＣＧＧＣＧＧＴＴＣ（配列番号６２）
ｐＳＹＮ  ＶＷＦ‐００４：
ＶＩＩＩシグナルおよびＢｓｉＷＩ部位を有するＥＳＣ４８‐Ｆｗｄ‐ＶＷＦ‐Ｄ’Ｄ３ＴＣＧＣＧＡＣＧＴＡＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＴＴＧＣＧＡＴＴＣＴＧＣＴＴＴＡＧＣＣＴＡＴＣＣＴＧＴＣＧＧＣＣＣＣＣＣＡＴＧ（配列番号６３）
６ＨｉｓおよびＮｏｔＩ部位を有するＥＳＣ５３‐Ｒｅｖ‐ＶＷＦ‐Ｄ’Ｄ３Ａ１（１−７１６アミノ酸）
ＴＧＡＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＴＧＴＧＣＣＡＴＧＴＧＧＧＧ（配列番号６４）
ＶＷＦ‐００１、００２、００３および００４コンストラクトに由来するタンパク質はモノマーとして存在することが考えられる。
【０３０５】
ＥＳＣ４８／ＥＳＣ５０、ＥＳＣ４８／ＥＳＣ５１、ＥＳＣ４８／ＥＳＣ５２、ＥＳＣ４８／ＥＳＣ５３のプライマーの組合せおよびテンプレートとしての全長ＶＷＦプラスミドを用い、２段階ＰＣＲ増幅サイクル：９４℃２分；２１サイクルの（９６℃３０秒、６８℃２分）を用いて５０μｌのＰＣＲ反応を実施した。正しいサイズのバンド（ＶＷＦ００１について約９６０ｂｐ；ＶＷＦ００２について約１４６０、ＶＷＦ００３について約１５２０ｂｐ；およびＶＷＦ００４について約２１５０ｂｐ）を、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州、バレンシア）を用いてゲル精製し、そして、ｐｃＤＮＡ４のＢｓｉＷＩ制限部位とＮｏｔＩ制限部位にクローン化して、それぞれ、ｐＳＹＮ−ＶＷＦ００１、００２、００３および００４を作製した。
【０３０６】
（ｂ）ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐００６のクローニング
ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐００６はＶＷＦのＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３‐ＣＫ（システインノット）ドメインを含有する。このコンストラクトをクローン化するためにＤ３ドメインの一部とＣＫドメインを含有するＤＮＡ断片の合成を外注した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ‐配列番号１２２０２６、下記参照）。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔコンストラクトの断片をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶで消化したｐＳＹＮ‐ＶＷＦ００８、すなわち、全長ＶＷＦをコードするベクターにサブクローン化した。
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ‐配列番号−１２２０２６（配列番号６５）
ＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＡＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＡＴＧＣＡＡＧＡＡＡＣＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＴＴＧＡＧＣＴＧＴＴＴＧＡＣＧＧＧＧＡＧＧＴＧＡＡＴＧＴＧＡＡＧＡＧＧＣＣＣＡＴＧＡＡＧＧＡＴＧＡＧＡＣＴＣＡＣＴＴＴＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＣＧＧＴＡＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＴＣＣＧＴＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＡＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＴＧＴＧＧＣＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＡＴＴＴＴＧＡＴＧＧＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＡＡＴＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＴＣＣＡＡＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＴＴＴＧＧＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＣＧＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＴＣＴＧＧＡＣＴＣＡＴＣＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＣＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＧＡＴＧＧＴＧＧＡＴＴＣＣＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＴＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＣＴＧＣＡＡＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＣＣＡＴＡＴＣＴＧＧＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＴＴＡＣＧＡＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＴＧＡＧＴＣＣＡＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＣＧＣＣＴＧＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴＧＣＣＴＡＴＧＣＣＣＡＣＧＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＣＣＧＧＧＡＧＡＡＣＧＧＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＧＡＧＴＧＧＣＧＣＴＡＴＡＡＣＡＧＣＴＧＴＧＣＡＣＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＡＧＴＣＡＣＧＴＧＴＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＡＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧＣＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＧＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＧＡＣＣＴＧＣＧＴＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＴＧＡＧＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＧＴＴＴＴＧＣＣＴＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＡＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＴＣＣＣＡＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＣＡＣＴＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＣＡＡＣＣＴＣＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＡＧＣＣＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣＣＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＣＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＴＣＴＧＴＡＴＧＴＧＧＡＴＧＡＧＡＣＧＣＴＣＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＧＴＧＡＴＡＣＴＣＡＣＴＴＣＴＧＣＡＡＧＧＴＣＡＡＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＡＣＴＴＣＴＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧＧＴＣＡＣＡＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＴＴＧＡＴＧＡＡＣＡＣＡＡＧＴＧＴＣＴＴＧＣＴＧＡＧＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＡＣＡＣＡＴＧＴＧＡＧＧＡＧＣＣＴＧＡＧＴＧＣＡＡＣＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＣＣＡＧＧＣＴＧＣＡＧＴＡＴＧＴＣＡＡＧＧＴＧＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＡＧＡＧＧＴＧＧＡＴＡＴＣ
【０３０７】
（ｃ）ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐００９、０１０、０１１、０１２および０１３のクローニング
ｐＳＹＮ  ＶＷＦ００８コンストラクトはｐｃＤＮＡ３．１に全長ＶＷＦ配列（配列番号２のアミノ酸１〜２８１３）を含有する。それは７６３アミノ酸のプロペプチド（すなわち、Ｄ１Ｄ２ドメイン）とそれに続く残りの２０５０アミノ酸の成熟ＶＷＦの配列を含む。ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐００９、０１０、０１１および０１２はそれぞれＶＷＦ００１、００２、００３および００４と同じコード配列を含有するが、ＦＶＩＩＩシグナルペプチ
ドの代わりにＤ１Ｄ２ドメイン（ＶＷＦプロペプチド）をＮ末端に追加で有する。ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐００８はＡｒｇ９０７にＢａｍＨＩ部位を有し、コード領域の末端に（終止コドンの後に）ＮｏｔＩ部位を有する。ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐００８、００１、００２、００３および００４はＢａｍＨＩ制限酵素とＮｏｔＩ制限酵素で消化された。ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐００１（４２３ｂｐ）、ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐００２（１０２６ｂｐ）、ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐００３（１１２８ｂｐ）およびｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐００４（１７４３ｂｐ）の挿入配列をＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩで消化したｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐００８（８２４２ｂｐ）にライゲーションしてｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐００９（Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３：アミノ酸１〜１０３９ｏｆ配列番号２）；ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ−０１０（Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３：配列番号２のアミノ酸１〜１２４０）；ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０１１（Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３：配列番号２のアミノ酸１〜１２７４）；ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０１２（Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３：アミノ酸１〜１４７９）を得た。全ての４コンストラクトは６×ＨｉｓタグをＣ末端に有する。形質移入細胞では、ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐００９、０１０、０１１、および０１２はプロペプチドを含んで合成されるが、分泌産物は細胞内プロセッシングのためにプロペプチド（Ｄ１Ｄ２）を全く含まない。ＶＷＦ‐００９およびＶＷＦ‐０１０をそれぞれ例として使用する図６および図７に示されるように、ＶＷＦ‐００９コンストラクトから発現したタンパク質はモノマーとして存在し、ＶＷＦ‐０１０、０１１、および０１２コンストラクトから発現したタンパク質はダイマーとして存在すると考えられる。
【０３０８】
ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０１０が、配列番号７３に対応する２つの点突然変異Ｃ３３６ＡおよびＣ３７９Ａに有するｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０１３を作製するために使用された（アミノ酸番号付はＤ１Ｄ２ドメインを含まない成熟ＶＷＦ配列、すなわち、ＶＷＦ配列２を表す）。これらの突然変異はＶＷＦ  Ｄ’Ｄ３ドメインの二量体化を防止すると予想される。
【０３０９】
（ｄ）ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０２５および０２９のクローニング
ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０２５はｐＬＩＶＥベクターに全長ＶＷＦの野生型Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３配列を含有し、ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０２９はｐＬＩＶＥベクターにＣ３３６Ａ／Ｃ３７９Ａ突然変異を有するＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメインを含有する。ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０２５および０２９をクローニングするため、次のプライマーの組合せを使用した：
ＮｈｅＩ部位を有するＥＳＣ８９‐ｆｗｄ＝ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＣＧ（配列番号６６）
ＳａｌＩを有するＥＳＣ９１‐ｒｅｖ＝ＣＴＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＴＣＧＡＣＴＣＧＴＣＡＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧ（配列番号６７）
【０３１０】
ＥＳＣ８９／ＥＳＣ９１プライマーの組合せおよびテンプレートとしてｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０１０（ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０２５用）プラスミドかｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０１３（ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０２９用）プラスミドを用い、３段階ＰＣＲ増幅サイクル：９４℃−２分；２１サイクルの（９６℃‐３０秒、５５℃‐３０秒、６８℃‐４分）を用いて５０μｌのＰＣＲ反応を実施した。予想サイズのバンド（約３８００ｂｐ）を、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州、バレンシア）を用いてゲル精製し、そして、ｐＬＩＶＥ‐Ｍｉｒｕｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールスバッド）のＮｈｅＩ制限部位とＳａｌＩ制限部位にクローン化してｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０２５および０２９を作製した。
【０３１１】
（ｅ）ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０３１のクローニング
ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０３１はＶＷＦ  Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３（Ｃ３３６Ａ／Ｃ３７９Ａ）配列とＦｃ配列の中間に４８アミノ酸長のトロンビン切断可能リンカー（８×ＧＧＧＧＳ（配列番号１１０）＋トロンビン部位）を有するＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３（Ｃ３３６Ａ／Ｃ３７９Ａ）‐Ｆｃコンストラクトである。このコンストラクトを作製するためにコンストラクトｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐０６４（下のＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦコンストラクトを参照のこと）よりＶＷＦ‐Ｆｃ領域を増幅した。ｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦをＸｂａＩとＮｈｅＩで消化した。結果生じたＶＷＦ断片とＦｃ領域を含有する４１６５ｂｐの挿入領域を、ＬＷ２２／ＬＷ２３のプライマーの組合せによりＶＷＦとＦｃの領域を増幅するためにテンプレートとして使用した。
ＦＶＩＩＩシグナル配列とＢｓｉＷＩ部位を有するＬＷ２２−ＦＷＤ‐ＶＷＦ‐Ｄ’Ｄ３ＧＣＧＣＣＧＧＣＣＧＴＡＣＧＡＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＴＴＧＣＧＡＴＴＣＴＧＣＴＴＴＡＧＣＣＴＡＴＣＣＴＧＴＣＧＧＣＣＣＣＣＣＡＴＧ（配列番号６８）
終止コドンとＮｏｔＩ部位を有するＬＷ２３‐Ｒｅｖ‐Ｆｃ
ＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣ（配列番号６９）
ＶＷＦ０３１のヌクレオチド配列（配列番号１０８）
1    ATGATTCCTG CCAGATTTGC CGGGGTGCTG CTTGCTCTGG CCCTCATTTT
51    GCCAGGGACC CTTTGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCA TCCACGGCCC
101    GATGCAGCCT TTTCGGAAGT GACTTCGTCA ACACCTTTGA TGGGAGCATG
151    TACAGCTTTG CGGGATACTG CAGTTACCTC CTGGCAGGGG GCTGCCAGAA
201    ACGCTCCTTC TCGATTATTG GGGACTTCCA GAATGGCAAG AGAGTGAGCC
251    TCTCCGTGTA TCTTGGGGAA TTTTTTGACA TCCATTTGTT TGTCAATGGT
301    ACCGTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATGCCCTATG CCTCCAAAGG
351    GCTGTATCTA GAAACTGAGG CTGGGTACTA CAAGCTGTCC GGTGAGGCCT
401    ATGGCTTTGT GGCCAGGATC GATGGCAGCG GCAACTTTCA AGTCCTGCTG
451    TCAGACAGAT ACTTCAACAA GACCTGCGGG CTGTGTGGCA ACTTTAACAT
501    CTTTGCTGAA GATGACTTTA TGACCCAAGA AGGGACCTTG ACCTCGGACC
551    CTTATGACTT TGCCAACTCA TGGGCTCTGA GCAGTGGAGA ACAGTGGTGT
601    GAACGGGCAT CTCCTCCCAG CAGCTCATGC AACATCTCCT CTGGGGAAAT
651    GCAGAAGGGC CTGTGGGAGC AGTGCCAGCT TCTGAAGAGC ACCTCGGTGT
701    TTGCCCGCTG CCACCCTCTG GTGGACCCCG AGCCTTTTGT GGCCCTGTGT
751    GAGAAGACTT TGTGTGAGTG TGCTGGGGGG CTGGAGTGCG CCTGCCCTGC
801    CCTCCTGGAG TACGCCCGGA CCTGTGCCCA GGAGGGAATG GTGCTGTACG
851    GCTGGACCGA CCACAGCGCG TGCAGCCCAG TGTGCCCTGC TGGTATGGAG
901    TATAGGCAGT GTGTGTCCCC TTGCGCCAGG ACCTGCCAGA GCCTGCACAT
951    CAATGAAATG TGTCAGGAGC GATGCGTGGA TGGCTGCAGC TGCCCTGAGG
1001    GACAGCTCCT GGATGAAGGC CTCTGCGTGG AGAGCACCGA GTGTCCCTGC
1051    GTGCATTCCG GAAAGCGCTA CCCTCCCGGC ACCTCCCTCT CTCGAGACTG
1101    CAACACCTGC ATTTGCCGAA ACAGCCAGTG GATCTGCAGC AATGAAGAAT
1151    GTCCAGGGGA GTGCCTTGTC ACTGGTCAAT CCCACTTCAA GAGCTTTGAC
1201    AACAGATACT TCACCTTCAG TGGGATCTGC CAGTACCTGC TGGCCCGGGA
1251    TTGCCAGGAC CACTCCTTCT CCATTGTCAT TGAGACTGTC CAGTGTGCTG
1301    ATGACCGCGA CGCTGTGTGC ACCCGCTCCG TCACCGTCCG GCTGCCTGGC
1351    CTGCACAACA GCCTTGTGAA ACTGAAGCAT GGGGCAGGAG TTGCCATGGA
1401    TGGCCAGGAC ATCCAGCTCC CCCTCCTGAA AGGTGACCTC CGCATCCAGC
1451    ATACAGTGAC GGCCTCCGTG CGCCTCAGCT ACGGGGAGGA CCTGCAGATG
1501    GACTGGGATG GCCGCGGGAG GCTGCTGGTG AAGCTGTCCC CCGTCTATGC
1551    CGGGAAGACC TGCGGCCTGT GTGGGAATTA CAATGGCAAC CAGGGCGACG
1601    ACTTCCTTAC CCCCTCTGGG CTGGCGGAGC CCCGGGTGGA GGACTTCGGG
1651    AACGCCTGGA AGCTGCACGG GGACTGCCAG GACCTGCAGA AGCAGCACAG
1701    CGATCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGCGT
1751    GCGCGGTCCT GACGTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG TGCCGTCAGC
1801    CCGCTGCCCT ACCTGCGGAA CTGCCGCTAC GACGTGTGCT CCTGCTCGGA
1851    CGGCCGCGAG TGCCTGTGCG GCGCCCTGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG
1901    CGGGGAGAGG CGTGCGCGTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCCG CTGTGAGCTG
1951    AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGCGGGACCC CCTGCAACCT
2001    GACCTGCCGC TCTCTCTCTT ACCCGGATGA GGAATGCAAT GAGGCCTGCC
2051    TGGAGGGCTG CTTCTGCCCC CCAGGGCTCT ACATGGATGA GAGGGGGGAC
2101    TGCGTGCCCA AGGCCCAGTG CCCCTGTTAC TATGACGGTG AGATCTTCCA
2151    GCCAGAAGAC ATCTTCTCAG ACCATCACAC CATGTGCTAC TGTGAGGATG
2201    GCTTCATGCA CTGTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCTT GCTGCCTGAC
2251    GCTGTCCTCA GCAGTCCCCT GTCTCATCGC AGCAAAAGGA GCCTATCCTG
2301    TCGGCCCCCC ATGGTCAAGC TGGTGTGTCC CGCTGACAAC CTGCGGGCTG
2351    AAGGGCTCGA GTGTACCAAA ACGTGCCAGA ACTATGACCT GGAGTGCATG
2401    AGCATGGGCT GTGTCTCTGG CTGCCTCTGC CCCCCGGGCA TGGTCCGGCA
2451    TGAGAACAGA TGTGTGGCCC TGGAAAGGTG TCCCTGCTTC CATCAGGGCA
2501    AGGAGTATGC CCCTGGAGAA ACAGTGAAGA TTGGCTGCAA CACTTGTGTC
2551    TGTCGGGACC GGAAGTGGAA CTGCACAGAC CATGTGTGTG ATGCCACGTG
2601    CTCCACGATC GGCATGGCCC ACTACCTCAC CTTCGACGGG CTCAAATACC
2651    TGTTCCCCGG GGAGTGCCAG TACGTTCTGG TGCAGGATTA CTGCGGCAGT
2701    AACCCTGGGA CCTTTCGGAT CCTAGTGGGG AATAAGGGAT GCAGCCACCC
2751    CTCAGTGAAA TGCAAGAAAC GGGTCACCAT CCTGGTGGAG GGAGGAGAGA
2801    TTGAGCTGTT TGACGGGGAG GTGAATGTGA AGAGGCCCAT GAAGGATGAG
2851    ACTCACTTTG AGGTGGTGGA GTCTGGCCGG TACATCATTC TGCTGCTGGG
2901    CAAAGCCCTC TCCGTGGTCT GGGACCGCCA CCTGAGCATC TCCGTGGTCC
2951    TGAAGCAGAC ATACCAGGAG AAAGTGTGTG GCCTGTGTGG GAATTTTGAT
3001    GGCATCCAGA ACAATGACCT CACCAGCAGC AACCTCCAAG TGGAGGAAGA
3051    CCCTGTGGAC TTTGGGAACT CCTGGAAAGT GAGCTCGCAG TGTGCTGACA
3101    CCAGAAAAGT GCCTCTGGAC TCATCCCCTG CCACCTGCCA TAACAACATC
3151    ATGAAGCAGA CGATGGTGGA TTCCTCCTGT AGAATCCTTA CCAGTGACGT
3201    CTTCCAGGAC TGCAACAAGC TGGTGGACCC CGAGCCATAT CTGGATGTCT
3251    GCATTTACGA CACCTGCTCC TGTGAGTCCA TTGGGGACTG CGCCGCATTC
3301    TGCGACACCA TTGCTGCCTA TGCCCACGTG TGTGCCCAGC ATGGCAAGGT
3351    GGTGACCTGG AGGACGGCCA CATTGTGCCC CCAGAGCTGC GAGGAGAGGA
3401    ATCTCCGGGA GAACGGGTAT GAGGCTGAGT GGCGCTATAA CAGCTGTGCA
3451    CCTGCCTGTC AAGTCACGTG TCAGCACCCT GAGCCACTGG CCTGCCCTGT
3501    GCAGTGTGTG GAGGGCTGCC ATGCCCACTG CCCTCCAGGG AAAATCCTGG
3551    ATGAGCTTTT GCAGACCTGC GTTGACCCTG AAGACTGTCC AGTGTGTGAG
3601    GTGGCTGGCC GGCGTTTTGC CTCAGGAAAG AAAGTCACCT TGAATCCCAG
3651    TGACCCTGAG CACTGCCAGA TTTGCCACTG TGATGTTGTC AACCTCACCT
3701    GTGAAGCCTG CCAGGAGCCG ATATCTGGCG GTGGAGGTTC CGGTGGCGGG
3751    GGATCCGGCG GTGGAGGTTC CGGCGGTGGA GGTTCCGGTG GCGGGGGATC
3801    CGGTGGCGGG GGATCCCTGG TCCCCCGGGG CAGCGGCGGT GGAGGTTCCG
3851    GTGGCGGGGG ATCCGACAAA ACTCACACAT GCCCACCGTG CCCAGCTCCA
3901    GAACTCCTGG GCGGACCGTC AGTCTTCCTC TTCCCCCCAA AACCCAAGGA
3951    CACCCTCATG ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACATGCGTG GTGGTGGACG
4001    TGAGCCACGA AGACCCTGAG GTCAAGTTCA ACTGGTACGT GGACGGCGTG
4051    GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCGCGG GAGGAGCAGT ACAACAGCAC
4101    GTACCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTCCT GCACCAGGAC TGGCTGAATG
4151    GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGCCCTCCC AGCCCCCATC
4201    GAGAAAACCA TCTCCAAAGC CAAAGGGCAG CCCCGAGAAC CACAGGTGTA
4251    CACCCTGCCC CCATCCCGGG ATGAGCTGAC CAAGAACCAG GTCAGCCTGA
4301    CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TATCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG
4351    AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCACGCCTC CCGTGTTGGA
4401    CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTACAGCAA GCTCACCGTG GACAAGAGCA
4451    GGTGGCAGCA GGGGAACGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG
4501    CACAACCACT ACACGCAGAA GAGCCTCTCC CTGTCTCCGG GTAAATGA
ＶＷＦ０３１のタンパク質配列（配列番号１０９）
1    MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM
51    YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG
101    TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL
151    SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC
201    ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC
251    EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME
301    YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC
351    VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD
401    NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG
451    LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM
501    DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG
551    NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS
601    PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL
651    NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD
701    CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD
751    AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM
801    SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV
851    CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS
901    NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE
951    THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD
1001    GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI
1051    MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF
1101    CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA
1151    PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE
1201    VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEP ISGGGGSGGG
1251    GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSLVPRGSGG GGSGGGGSDK THTCPPCPAP
1301    ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV
1351    EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI
1401    EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE
1451    SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL
1501    HNHYTQKSLS LSPGK*
【表１９】
2020078338.tif 000028
【０３１２】
ＬＷ２２／ＬＷ２３増幅（約２３００ｂｐ）から得られたＰＣＲ産物をＢｓｉＷＩ／ＮｏｔＩで消化したｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐００２にクローン化してｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０１４中間体を得た。ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０１４はＦＶＩＩＩシグナルペプチド‐Ｄ’Ｄ３‐２０アミノ酸トロンビン切断可能リンカーとその後にＦｃ領域を含有する。
【０３１３】
Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃコンストラクトを作製するために標準的なＰＣＲ方法によってＬＷ２４／ＬＷ２７プライマーの組合せを用いてｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０１３からＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３領域を増幅した。
ＢｓｉＷＩ部位を有するＬＷ２４‐Ｆｗｄ‐ＶＷＦ  Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３クローニングオリゴ
ＧＣＧＣＣＧＧＣＣＧＴＡＣＧＡＴＧＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＣＧＧＧＧＴＧ（配列番号７０）
ＥｃｏＲＶを有するＬＷ２７‐Ｒｅｖ‐ＶＷＦ  Ｄ’Ｄ３オリゴ
ＣＣＡＣＣＧＣＣＡＧＡＴＡＴＣＧＧＣＴＣＣＴＧＧＣＡＧＧＣＴＴＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧ（配列番号７１）
【０３１４】
ＬＷ２２／ＬＷ２３増幅（約３７５０ｂｐ）から得られたＰＣＲ産物をＢｓｉＷＩ／ＥｃｏＲＶで消化したｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０１４にクローン化してｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０１５中間体を得た。ＶＷＦ断片とＦｃ領域の間のリンカーの長さを変更してｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０３１を得た。
【０３１５】
全長ＶＷＦタンパク質配列が表１に示されている。
ＶＷＦ‐Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３タンパク質配列１ｂ（配列番号７２）
1    MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM
51    YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG
101    TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL
151    SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC
201    ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC
251    EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME
301    YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC
351    VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD
401    NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG
451    LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM
501    DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG
551    NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS
601    PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL
651    NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD
701    CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD
751    AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM
801    SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV
851    CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS
901    NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE
951    THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD
1001    GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI
1051    MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCACF
1101    CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY ECEWRYNSCA
1151    PACQVTCQHPEPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE
1201    VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEP* 
ＶＷＦ‐Ｄ’Ｄ３タンパク質配列２（配列番号７３）
1    SLSCRPPMVK LVCPADNLRA EGLECTKTCQ NYDLECMSMG CVSGCLCPPG
51    MVRHENRCVA LERCPCFHQG KEYAPGETVK IGCNTCVCRD RKWNCTDHVC
101    DATCSTIGMA HYLTFDGLKY LFPGECQYVL VQDYCGSNPG TFRILVGNKG
151    CSHPSVKCKK RVTILVEGGE IELFDGEVNV KRPMKDETHF EVVESGRYII
201    LLLGKALSVV WDRHLSISVV LKQTYQEKVC GLCGNFDGIQ NNDLTSSNLQ
251    VEEDPVDFGN SWKVSSQCAD TRKVPLDSSP ATCHNNIMKQ TMVDSSCRIL
301    TSDVFQDCNK LVDPEPYLDV CIYDTCSCES IGDCACFCDT IAAYAHVCAQ
351    HGKVVTWRTA TLCPQSCEER NLRENGYECE WRYNSCAPAC QVTCQHPEPL
401    ACPVQCVEGC HAHCPPGKIL DELLQTCVDP EDCPVCEVAG RRFASGKKVT
451    LNPSDPEHCQ ICHCDVVNLT CEACQEP
【０３１６】
実施例２：ＦＶＩＩＩ‐Ｆｃを含み、ＶＷＦ‐Ｄ’Ｄ３ドメインを２つ目のＦｃ鎖のアミノ末端に含むヘテロ二量体コンストラクト（ＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦ‐Ｆｃヘテロダイマー、図２）
（ａ）ｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ−０６４のクローニング
ＦＶＩＩＩ−０６４プラスミドは、細胞内での合成の間にプロセッシングを受ける酵素切断部位を有する単鎖ＦＣ（ｓｃＦｃ）スキャフォールドを含む。そのコンストラクトは全長ＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合ドメイン（Ｄ’Ｄ３）を有する。
【０３１７】
プラスミド（ｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ−０６４）を、Ｄ’Ｄ３ドメインがＦＶＩＩＩに結合し、そして、ＦＶＩＩＩのリン脂質および活性化型プロテインＣとの相互作用を防止する、および／または内在性ＶＷＦへの結合を防止または阻害するＦＶＩＩＩ‐ＦｃとＶＷＦ‐Ｆｃのヘテロダイマーの発現のために設計した。ｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐０６４に由来するタンパク質は、ＦＶＩＩＩ‐ＦｃサブユニットのＣ末端が６×（ＧＧＧＧＳ）ポリペプチドリンカー（配列番号７４）によってＶＷＦ  Ｄ’Ｄ３‐ＦｃサブユニットのＮ末端に結合されている単一ポリペプチドとして細胞内で発現する。加えて、ＲＲＲＲＳ（配列番号７５）配列とＲＫＲＲＫＲ（配列番号７６）配列をそのポリペプチドリンカーの５’末端と３’末端にそれぞれ挿入し、各配列の最後のＡｒｇの前でプロプロテイン転換酵素によって細胞内切断が起こるようにした。したがって、それらの細胞は、ＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ鎖がＲＲＲＲＳ配列（配列番号７５）をＣ末端に有するが、リンカー配列の残りの部分が除去されている二重鎖ＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ／Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃヘテロダイマーを発現することができる。別の３×（ＧＧＧＧＳ）ポリペプチドリンカー（配列番号２８）をトロンビン切断部位と共にＶＷＦドメインとＦｃ領域の中間に導入して、一度、ＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦヘテロ二量体タンパク質がトロンビンによって活性化されるとＦＶＩＩＩからのＶＷＦ断片の遊離を促進してＦＶＩＩＩが他の凝固因子と相互作用するようにする。
【０３１８】
１つ目のＦｃ領域の一部と続いて６×（ＧＧＧＧＳ）（配列番号７４）、ＶＷＦ‐Ｄ’Ｄ３ドメイン（１〜４７７アミノ酸；Ｃ３３６Ａ／Ｃ３７９Ａ突然変異）、３×（ＧＧＧＧＳ）（配列番号２８）、トロンビン切断部位および２つ目のＦｃの一部を含有するＤＮＡ断片の合成を外注した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ‐配列番号１０３０６９、下記参照）。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔコンストラクトの断片をＳａｌＩ／ＲｓＲＩＩで消化した、２つのＦｃドメインの中間に切断可能リンカーを有するＦＶＩＩＩ‐ＦｃコンストラクトであるｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐０４９にサブクローン化した。
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ‐配列番号１０３０６９（配列番号８２）：
ＣＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣ
ＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＣＣＴＡＴＣＣＴＧＴＣＧＧＣＣＣＣＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＴＧＡＣＡＡＣＣＴＧＣＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＴＧＴＡＣＣＡＡＡＡＣＧＴＧＣＣＡＧＡＡＣＴＡＴＧＡＣＣＴＧＧＡＧＴＧＣＡＴＧＡＧＣＡＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＣＣＣＧＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＧＧＣＡＴＧＡＧＡＡＴＣＧＡＴＧＴＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＣＴＴＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＧＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＴＧＧＣＴＧＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＣＧＧＧＡＣＣＧＧＡＡＧＴＧＧＡＡＣＴＧＣＡＣＡＧＡＣＣＡＴＧＴＧＴＧＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＴＣＣＡＣＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＧＣＣＣＡＣＴＡＣＣＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＣＧＧＧＣＴＣＡＡＡＴＡＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＧＧＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＴＡＣＧＴＴＣＴＧＧＴＧＣＡＧＧＡＴＴＡＣＴＧＣＧＧＣＡＧＴＡＡＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＴＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＡＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＡＴＧＣＡＡＧＡＡＡＣＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＴＴＧＡＧＣＴＧＴＴＴＧＡＣＧＧＧＧＡＧＧＴＧＡＡＴＧＴＧＡＡＧＡＧＧＣＣＣＡＴＧＡＡＧＧＡＴＧＡＧＡＣＴＣＡＣＴＴＴＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＣＧＧＴＡＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＴＣＣＧＴＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＡＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＴＧＴＧＧＣＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＡＴＴＴＴＧＡＴＧＧＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＡＡＴＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＴＣＣＡＡＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＴＴＴＧＧＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＣＧＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＴＣＴＧＧＡＣＴＣＡＴＣＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＣＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＧＡＴＧＧＴＧＧＡＴＴＣＣＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＴＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＣＴＧＣＡＡＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＣＣＡＴＡＴＣＴＧＧＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＴＴＡＣＧＡＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＴＧＡＧＴＣＣＡＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＣＧＣＣＧＣＡＴＴＣＴＧＣＧＡＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴＧＣＣＴＡＴＧＣＣＣＡＣＧＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＣＣＧＧＧＡＧＡＡＣＧＧＧＴＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＧＴＧＧＣＧＣＴＡＴＡＡＣＡＧＣＴＧＴＧＣＡＣＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＡＧＴＣＡＣＧＴＧＴＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＡＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧＣＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＧＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＧＡＣＣＴＧＣＧＴＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＴＧＡＧＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＧＴＴＴＴＧＣＣＴＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＡＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＴＣＣＣＡＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＣＡＣＴＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＣＡＡＣＣＴＣＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＡＧＣＣＧＡＴＣＧＡＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＧＧＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＧＴＣＡ
【０３１９】
（ｂ）ｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐０６５のクローニング
ＦＶＩＩＩ‐０６５プラスミドは２つ目のＦｃ領域に結合したＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメインの最初の２７６アミノ酸を含む。ＶＷＦ断片は、ＥＳＣ１７とＥＳＣ４１のプライマーの組合せを用いて全長ＶＷＦプラスミドｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐００８からＰＣＲで増幅された。
ＣｌａＩを有するＥＳＣ１７‐Ｆｗｄ‐ＶＷＦクローニングオリゴ
ＧＴＣＣＧＧＣＡＴＧＡＧＡＡＴＣＧＡＴＧＴＧＴＧ（配列番号７７）
ＥｃｏＲＶを有するＥＳＣ４１‐Ｒｅｖ‐ＶＷＦ
ＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＡＧＡＴＡＴＣＡＧＡＧＧＣＡＣＴＴＴＴＣ（配列番号７８）
【０３２０】
予想サイズのバンド（約６９２ｂｐ）を、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州、バレンシア）を用いてゲル精製し、そして、ｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐０６４のＣｌａＩ部位とＥｃｏＲＶ部位にクローン化してｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐０６５を作製した。
【０３２１】
実施例３：ｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐１５９、１６０、１７８、１７９のクローニング（図３）
ＶＷＦ断片とＦｃ領域の間のリンカーの長さを変えるために、ｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐０６４中のＶＷＦと２０アミノ酸リンカーの開始点の接合点にＥｃｏＲＶ部位を導入し、次にサイズ可変リンカーを用いてｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐０６４中の２０アミノ酸リンカーを置換した。新しいＤＮＡコンストラクトは、３５アミノ酸リンカー、４８アミノ酸リンカー、７３アミノ酸リンカーおよび９８アミノ酸リンカーをそれぞれ含有するｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐１５９、１６０、１７８、および１７９である。
【０３２２】
ｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐１５９に３５アミノ酸リンカーを挿入するために２つのオリゴ（ＥＳＣ７８‐１０５ｂｐとＥＳＣ７９−１０７ｂｐ）をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アイオワ州、コーラルビル）から購入した。標準的なＰＣＲ方法を用いてオリゴをアニールし、そして、伸長させた：
プライマー：
ＥｃｏＲＶ部位を有するＥＳＣ７８‐Ｆｗｄ
ＡＡＡＧＴＧＣＣＴＣＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＧＧ（配列番号７９）
ＲｓＲＩＩ部位を有するＥＳＣ７９‐Ｒｅｖ
ＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＴＧＡＣＧＧＴＣＣＧＣＣＣＡＧＧＡＧＴＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＧＣＣＴＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＧＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＣ（配列番号８０）
【０３２３】
ＥＳＣ７８／ＥＳＣ７９プライマーコンボを用い、３段階ＰＣＲ増幅サイクル：２５サイクルの（９６℃３０秒、５５℃３０秒、６８℃３０秒）を用いて５０μｌのＰＣＲオリゴアニーリング伸長反応を実施した。予想サイズのバンド（約１８６ｂｐ）を、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州、バレンシア）を用いてゲル精製し、そして、ｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐０６４のＥｃｏＲＶ制限部位とＲｓＲＩＩ制限部位にクローン化してｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐１５９を作製した。
【０３２４】
（ｂ）ｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐１６０、１７８、および１７９のクローニング
ｐＳＹＮ‐ＶＩＩＩ−１６０はＶＷＦ断片とＦｃ領域の中間に４８アミノ酸リンカーを有する。４８アミノ酸リンカー（ＩＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＶＰＲＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号８１）およびＦｃ領域の一部をコードするＤＮＡ断片の合成を外注した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ配列番号１３２６０１、下記参照）。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔコンストラクトの断片をＥｃｏＲＶ／ＲｓＲＩＩで消化したｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐０１５９（上述）にサブクローン化した。
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ配列番号１３２６０１（配列番号８３）
ＡＡＡＧＴＧＣＣＴＣＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＧＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣ
【０３２５】
ｐＳＹＮ‐ＶＩＩＩ−１７８はＶＷＦ断片とＦｃ領域の中間に７３アミノ酸リンカーを有する。７３アミノ酸リンカー（ＩＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＶＰＲＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号８４）およびＦｃ領域の一部をコードするＤＮＡ断片の合成を外注した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ配列番号１４４８４９、下記参照）。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔコンストラクトの断片をＥｃｏＲＶ／ＲｓＲＩＩで消化したｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐０１５９（上述）にサブクローン化した。
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ配列番号１４４８４９（配列番号８５）
ＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＡＧＣＣＧＡＴＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＧＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣ
【０３２６】
ｐＳＹＮ‐ＶＩＩＩ−１７９はＶＷＦ断片とＦｃ領域の中間に９８アミノ酸リンカーを有する。９８アミノ酸リンカー（ＩＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＶＰＲＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号８６）およびＦｃ領域の一部をコードするＤＮＡ断片の合成を外注した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ配列番号１４４８４９下記参照）。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔコンストラクトの断片をＥｃｏＲＶ／ＲｓＲＩＩで消化したｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐０１５９（上述）にサブクローン化した。
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ配列番号１４４８４９（配列番号８７）
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【０３２７】
ｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐１８０、１８１、および１８２のクローニング
ｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐１８０、１８１、および１８２をｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐１６０から構築した。Ｋ２０９３Ａ突然変異またはＦ２０９３Ａ突然変異またはＫ２０９３Ａ／Ｆ２０９３Ａ突然変異をｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐１６０中のＦＶＩＩＩのＣ１ドメインに導入してｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐１８０、ｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐１８１およびｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐１８２をそれぞれ形成した。
【０３２８】
ＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦ‐Ｆｃヘテロダイマータンパク質配列（配列番号８８）
（ＦＶＩＩＩ配列アミノ酸位置１〜１４５７；下線領域はＦｃ領域を表し、波線の下線は１つ目のＦｃとＶＷＦ断片の中間の切断可能リンカーを表し、二重下線領域はＶＷＦ断片を表し、太字領域はＶＷＦ断片とＦｃの中間の可変長切断可能リンカーを表す。リンカーの長さはＦＶＩＩＩ‐０６４、１５９、１６０、１７８、および１７９コンストラクトで変化する）。
【表２０−１】
2020078338.tif 000029
【表２０−２】
2020078338.tif 000030
【０３２９】
実施例４：ＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦ  ＤＮＡコンストラクトの例（図４）
図４に示されるように従来の組換えＤＮＡ技法を用いてＶＷＦ断片とＦＶＩＩＩタンパク質をリンカーまたは別のタンパク質またはポリペプチドによって連結することができる。図４ＡではＶＷＦのＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメインを４８アミノ酸リンカー−ＩＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＶＰＲＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８９）によってＦＶＩＩＩタンパク質に結合し、ＦＶＩＩＩを成熟前排除から守る。Ｄ’Ｄ３のＦＶＩＩＩ保護活性をさらに強化するために、アルブミンまたはＰＡＳ配列（異種部分）などの半減期延長能を有する別のタンパク質またはポリペプチドをコンストラクトに組み入れることができる。異種部分、例えば、アルブミンタンパク質またはＰＡＳ配列をＦＶＩＩＩ分子の様々な位置に組み入れることができる。ＦＶＩＩＩのＮ末端（４Ｂ）、ＦＶＩＩＩのＣ末端（４Ｃ）、またはＢ領域（４Ｄ）に組み入れられた少数の例が図４Ｂ〜４Ｄに示された。それらのコンストラクトではそれらの追加のタンパク質配列がＤ’Ｄ３保護活性を強化し、そして、ＦＶＩＩＩ半減期をさらに延長させることができるだろう。
【０３３０】
加えて、図４Ｅ〜４Ｇに示されるように異種部分、例えば、アルブミンまたはＰＡＳ配列をＦＶＩＩＩ／ＶＷＦヘテロダイマーコンストラクトに組み入れることもできる。図４Ｅでは異種部分、例えば、アルブミンまたはＰＡＳ配列をＦＶＩＩＩ‐１４８のＦＶＩＩＩ  Ｂドメイン領域に組み入れる。図４Ｆでは異種部分、例えば、アルブミンまたはＰＡＳ配列をＦＶＩＩＩ‐１３６のＦＶＩＩＩ  Ｂドメイン領域に組み入れる。図４Ｇでは異種部分、例えば、アルブミンまたはＰＡＳ配列をリンカーとして使用してＤ’Ｄ３断片とＦｃを連結する。それらの構成ではＤ’Ｄ３、Ｆｃ、および半減期延長因子である異種部分（例えば、アルブミン／ＰＡＳ配列）の相乗効果がＦＶＩＩＩ半減期の延長に期待される。
【０３３１】
実施例５：ＦＶＩＩＩＦｃ‐ＶＷＦヘテロダイマー用の共形質移入系のプラスミド構築（図５）
３つのＤＮＡコンストラクトを含有する共形質移入系をＦＶＩＩＩＦｃ‐ＶＷＦヘテロダイマー産生のために作製した。第１のＤＮＡコンストラクトであるｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐１５５は、単鎖ＦＶＩＩＩタンパク質が１つのＦｃ断片に直接的に融合させられたＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ融合タンパク質をコードしており、第２のＤＮＡコンストラクトはｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０３１であり、それは（実施例１において前述した）Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ融合タンパク質をコードする。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を８０：１５：５の比率でそれら２つのプラスミドと第３のプラスミド（ＰＣ５）で形質移入した。ＰＣ５を用いる共形質移入は、我々が成熟Ｄ’Ｄ３ドメインを有するようにＤ１領域およびＤ２領域の完全なプロペプチドプロセッシングを確実にすることができる。合成されたタンパク質はＦＶＩＩＩＦｃ／Ｄ’Ｄ３ＦｃヘテロダイマーおよびＤ’Ｄ３Ｆｃホモダイマーとして分泌され、ＦＶＩＩＩＦｃ／Ｄ’Ｄ３Ｆｃヘテロダイマーはタンパク質精製によってＤ’Ｄ３Ｆｃホモダイマーと分離された。
ｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐１５５成熟タンパク質配列解析（配列番号９０）：
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ｐＳＹＮ‐ＦＶＩＩＩ‐１５５ＤＮＡ配列解析（配列番号９１）：
ａｔｇｃａａａｔａｇａｇｃｔｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｔｃｔｔｔｃｔｇｔｇｃｃｔｔｔｔｇｃｇａｔｔｃｔｇｃｔｔｔａｇｔｇｃｃａｃｃａｇａａｇａｔａｃｔａｃｃｔｇｇｇｔｇｃａｇｔｇｇａａｃｔｇｔｃａｔｇｇｇａｃｔａｔａｔｇｃａａａｇｔｇａｔｃｔｃｇｇｔｇａｇｃｔｇｃｃｔｇｔｇｇａｃｇｃａａｇａｔｔｔｃｃｔｃｃｔａｇａｇｔｇｃｃａａａａｔｃｔｔｔｔｃｃａｔｔｃａａｃａｃｃｔｃａｇｔｃｇｔｇｔａｃａａａａａｇａｃｔｃｔｇｔｔｔｇｔａｇａａｔｔｃａｃｇｇａｔｃａｃｃｔｔｔｔｃａａｃａｔｃｇｃｔａａｇｃｃａａｇｇｃｃａｃｃｃｔｇｇａｔｇｇｇｔｃｔｇｃｔａｇｇｔｃｃｔａｃｃａｔｃｃａｇｇｃｔｇａｇｇｔｔｔａｔｇａｔａｃａｇｔｇｇｔｃａｔｔａｃａｃｔｔａａｇａａｃａｔｇｇｃｔｔｃｃｃａｔｃｃｔｇｔｃａｇｔｃｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｔｇｇｔｇｔａｔｃｃｔａｃｔｇｇａａａｇｃｔｔｃｔｇａｇｇｇａｇｃｔｇａａｔａｔｇａｔｇａｔｃａｇａｃｃａｇｔｃａａａｇｇｇａｇａａａｇａａｇａｔｇａｔａａａｇｔｃｔｔｃｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｃａｔａｃａｔａｔｇｔｃｔｇｇｃａｇｇｔｃｃｔｇａａａｇａｇａａｔｇｇｔｃｃａａｔｇｇｃｃｔｃｔｇａｃｃｃａｃｔｇｔｇｃｃｔｔａｃｃｔａｃｔｃａｔａｔｃｔｔｔｃｔｃａｔｇｔｇｇａｃｃｔｇｇｔａａａａｇａｃｔｔｇａａｔｔｃａｇｇｃｃｔｃａｔｔｇｇａｇｃｃｃｔａｃｔａｇｔａｔｇｔａｇａｇａａｇｇｇａｇｔｃｔｇｇｃｃａａｇｇａａａａｇａｃａｃａｇａｃｃｔｔｇｃａｃａａａｔｔｔａｔａｃｔａｃｔｔｔｔｔｇｃｔｇｔａｔｔｔｇａｔｇａａｇｇｇａａａａｇｔｔｇｇｃａｃｔｃａｇａａａｃａａａｇａａｃｔｃｃｔｔｇａｔｇｃａｇｇａｔａｇｇｇａｔｇｃｔｇｃａｔｃｔｇｃｔｃｇｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔａａａａｔｇｃａｃａｃａｇｔｃａａｔｇｇｔｔａｔｇｔａａａｃａｇｇｔｃｔｃｔｇｃｃａｇｇｔｃｔｇａｔｔｇｇａｔｇｃｃａｃａｇｇａａａｔｃａｇｔｃｔａｔｔｇｇｃａｔｇｔｇａｔｔｇｇａａｔｇｇｇｃａｃｃａｃｔｃｃｔｇａａｇｔｇｃａｃｔｃａａｔａｔｔｃｃｔｃｇａａｇｇｔｃａｃａｃａｔｔｔｃｔｔｇｔｇａｇｇａａｃｃａｔｃｇｃｃａｇｇｃｇｔｃｃｔｔｇｇａａａｔｃｔｃｇｃｃａａｔａａｃｔｔｔｃｃｔｔａｃｔｇｃｔｃａａａｃａｃｔｃｔｔｇａｔｇｇａｃｃｔｔｇｇａｃａｇｔｔｔｃｔａｃｔｇｔｔｔｔｇｔｃａｔａｔｃｔｃｔｔｃｃｃａｃｃａａｃａｔｇａｔｇｇｃａｔｇｇａａｇｃｔｔａｔｇｔｃａａａｇｔａｇａｃａｇｃｔｇｔｃｃａｇａｇｇａａｃｃｃｃａａｃｔａｃｇａａｔｇａａａａａｔａａｔｇａａｇａａｇｃｇｇａａｇａｃｔａｔｇａｔｇａｔｇａｔｃｔｔａｃｔｇａｔｔｃｔｇａａａｔｇｇａｔｇｔｇｇｔｃａｇｇｔｔｔｇａｔｇａｔｇａｃａａｃｔｃｔｃｃｔｔｃｃｔｔｔａｔｃｃａａａｔｔｃｇｃｔｃａｇｔｔｇｃｃａａｇａａｇｃａｔｃｃｔａａａａｃｔｔｇｇｇｔａｃａｔｔａｃａｔｔｇｃｔｇｃｔｇａａｇａｇｇａｇｇａｃｔｇｇｇａｃｔａｔｇｃｔｃｃｃｔｔａｇｔｃｃｔｃｇｃｃｃｃｃｇａｔｇａｃａｇａａｇｔｔａｔａａａａｇｔｃａａｔａｔｔｔｇａａｃａａｔｇｇｃｃｃｔｃａｇｃｇｇａｔｔｇｇｔａｇｇａａｇｔａｃａａａａａａｇｔｃｃｇａｔｔｔａｔｇｇｃａｔａｃａｃａｇａｔｇａａａｃｃｔｔｔａａｇａｃｔｃｇｔｇａａｇｃｔａｔｔｃａｇｃａｔｇａａｔｃａｇｇａａｔｃｔｔｇｇｇａｃｃｔｔｔａｃｔｔｔａｔｇｇｇｇａａｇｔｔｇｇａｇａｃａｃａｃｔｇｔｔｇａｔｔａｔａｔｔｔａａｇａａｔｃａａｇｃａａｇｃａｇａｃｃａｔａｔａａｃａｔｃｔａｃｃｃｔｃａｃｇｇａａｔｃａｃｔｇａｔｇｔｃｃｇｔｃｃｔｔｔｇｔａｔｔｃａａｇｇａｇａｔｔａｃｃａａａａｇｇｔｇｔａａａａｃａｔｔｔｇａａｇｇａｔｔｔｔｃｃａａｔｔｃｔｇｃｃａｇｇａｇａａａｔａｔｔｃａａａｔａｔａａａｔｇｇａｃａｇｔｇａｃｔｇｔａｇａａｇａｔｇｇｇｃｃａａｃｔａａａｔｃａｇａｔｃｃｔｃｇｇｔｇｃｃｔｇａｃｃｃｇｃｔａｔｔａｃｔｃｔａｇｔｔｔｃｇｔｔａａｔａｔｇｇａｇａｇａｇａｔｃｔａｇｃｔｔｃａｇｇａｃｔｃａｔｔｇｇｃｃｃｔｃｔｃｃｔｃａｔｃｔｇｃｔａｃａａａｇａａｔｃｔｇｔａｇａｔｃａａａｇａｇｇａａａｃｃａｇａｔａａｔｇｔｃａｇａｃａａｇａｇｇａａｔｇｔｃａｔｃｃｔｇｔｔｔｔｃｔｇｔａｔｔｔｇａｔｇａｇａａｃｃｇａａｇｃｔｇｇｔａｃｃｔｃａｃａｇａｇａａｔａｔａｃａａｃｇｃｔｔｔｃｔｃｃｃｃａａｔｃｃａｇｃｔｇｇａｇｔｇｃａｇｃｔｔｇａｇｇａｔｃｃａｇａｇｔｔｃｃａａｇｃｃｔｃｃａａｃａｔｃａｔｇｃａｃａｇｃａｔｃａａｔｇｇｃｔａｔｇｔｔｔｔｔｇａｔａｇｔｔｔｇｃａｇｔｔｇｔｃａｇｔｔｔｇｔｔｔｇｃａｔｇａｇｇｔｇｇｃａｔａｃｔｇｇｔａｃａｔｔｃｔａａｇｃａｔｔｇｇａｇｃａｃａｇａｃｔｇａｃｔｔｃｃｔｔｔｃｔｇｔｃｔｔｃｔｔｃｔｃｔｇｇａｔａｔａｃｃｔｔｃａａａｃａｃａａａａｔｇｇｔｃｔａｔｇａａｇａｃａｃａｃｔｃａｃｃｃｔａｔｔｃｃｃａｔｔｃｔｃａｇｇａｇａａａｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｇｔｃｇａｔｇｇａａａａｃｃｃａｇｇｔｃｔａｔｇｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｔｇｃｃａｃａａｃｔｃａｇａｃｔｔｔｃｇｇａａｃａｇａｇｇｃａｔｇａｃｃｇｃｃｔｔａｃｔｇａａｇｇｔｔｔｃｔａｇｔｔｇｔｇａｃａａｇａａｃａｃｔｇｇｔｇａｔｔａｔｔａｃｇａｇｇａｃａｇｔｔａｔｇａａｇａｔａｔｔｔｃａｇｃａｔａｃｔｔｇｃｔｇａｇｔａａａａａｃａａｔｇｃｃａｔｔｇａａｃｃａａｇａａｇｃｔｔｃｔｃｔｃａａａａｃｃｃａｃｃａｇｔｃｔｔｇａａａｇｃｃｃａｔｃａｇｇｃｇｇａａａｔａａｃｔｃｇｔａｃｔａｃｔｃｔｔｃａｇｔｃａｇａｔｃａａｇａｇｇａａａｔｔｇａｃｔａｔｇａｔｇａｔａｃｃａｔａｔｃａｇｔｔｇａａａｔｇａａｇａａｇｇａａｇａｔｔｔｔｇａｃａｔｔｔａｔｇａｔｇａｇｇａｔｇａａａａｔｃａｇａｇｃｃｃｃｃｇｃａｇｃｔｔｔｃａａａａｇａａａａｃａｃｇａｃａｃｔａｔｔｔｔａｔｔｇｃｔｇｃａｇｔｇｇａｇａｇｇｃｔｃｔｇｇｇａｔｔａｔｇｇｇａｔｇａｇｔａｇｃｔｃｃｃｃａｃａｔｇｔｔｃｔａａｇａａａｃａｇｇｇｃｔｃａｇａｇｔｇｇｃａｇｔｇｔｃｃｃｔｃａｇｔｔｃａａｇａａａｇｔｔｇｔｔｔｔｃｃａｇｇａａｔｔｔａｃｔｇａｔｇｇｃｔｃｃｔｔｔａｃｔｃａｇｃｃｃｔｔａｔａｃｃｇｔｇｇａｇａａｃｔａａａｔｇａａｃａｔｔｔｇｇｇａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｃｃａｔａｔａｔａａｇａｇｃａｇａａｇｔｔｇａａｇａｔａａｔａｔｃａｔｇｇｔａａｃｔｔｔｃａｇａａａｔｃａｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｃｃｃｔａｔｔｃｃｔｔｃｔａｔｔｃｔａｇｃｃｔｔａｔｔｔｃｔｔａｔｇａｇｇａａｇａｔｃａｇａｇｇｃａａｇｇａｇｃａｇａａｃｃｔａｇａａａａａａｃｔｔｔｇｔｃａａｇｃｃｔａａｔｇａａａｃｃａａａａｃｔｔａｃｔｔｔｔｇｇａａａｇｔｇｃａａｃａｔｃａｔａｔｇｇｃａｃｃｃａｃｔａａａｇａｔｇａｇｔｔｔｇａｃｔｇｃａａａｇｃｃｔｇｇｇｃｔｔａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｇｔｔｇａｃｃｔｇｇａａａａａｇａｔｇｔｇｃａｃｔｃａｇｇｃｃｔｇａｔｔｇｇａｃｃｃｃｔｔｃｔｇｇｔｃｔｇｃｃａｃａｃｔａａｃａｃａｃｔｇａａｃｃｃｔｇｃｔｃａｔｇｇｇａｇａｃａａｇｔｇａｃａｇｔａｃａｇｇａａｔｔｔｇｃｔｃｔｇｔｔｔｔｔｃａｃｃａｔｃｔｔｔｇａｔｇａｇａｃｃａａａａｇｃｔｇｇｔａｃｔｔｃａｃｔｇａａａａｔａｔｇｇａａａｇａａａｃｔｇｃａｇｇｇｃｔｃｃｃｔｇｃａａｔａｔｃｃａｇａｔｇｇａａｇａｔｃｃｃａｃｔｔｔｔａａａｇａｇａａｔｔａｔｃｇｃｔｔｃｃａｔｇｃａａｔｃａａｔｇｇｃｔａｃａｔａａｔｇｇａｔａｃａｃｔａｃｃｔｇｇｃｔｔａｇｔａａｔｇｇｃｔｃａｇｇａｔｃａａａｇｇａｔｔｃｇａｔｇｇｔａｔｃｔｇｃｔｃａｇｃａｔｇｇｇｃａｇｃａａｔｇａａａａｃａｔｃｃａｔｔｃｔａｔｔｃａｔｔｔｃａｇｔｇｇａｃａｔｇｔｇｔｔｃａｃｔｇｔａｃｇａａａａａａａｇａｇｇａｇｔａｔａａａａｔｇｇｃａｃｔｇｔａｃａａｔｃｔｃｔａｔｃｃａｇｇｔｇｔｔｔｔｔｇａｇａｃａｇｔｇｇａａａｔｇｔｔａｃｃａｔｃｃａａａｇｃｔｇｇａａｔｔｔｇｇｃｇｇｇｔｇｇａａｔｇｃｃｔｔａｔｔｇｇｃｇａｇｃａｔｃｔａｃａｔｇｃｔｇｇｇａｔｇａｇｃａｃａｃｔｔｔｔｔｃｔｇｇｔｇｔａｃａｇｃａａｔａａｇｔｇｔｃａｇａｃｔｃｃｃｃｔｇｇｇａａｔｇｇｃｔｔｃｔｇｇａｃａｃａｔｔａｇａｇａｔｔｔｔｃａｇａｔｔａｃａｇｃｔｔｃａｇｇａｃａａｔａｔｇｇａｃａｇｔｇｇｇｃｃｃｃａａａｇｃｔｇｇｃｃａｇａｃｔｔｃａｔｔａｔｔｃｃｇｇａｔｃａａｔｃａａｔｇｃｃｔｇｇａｇｃａｃｃａａｇｇａｇｃｃｃｔｔｔｔｃｔｔｇｇａｔｃａａｇｇｔｇｇａｔｃｔｇｔｔｇｇｃａｃｃａａｔｇａｔｔａｔｔｃａｃｇｇｃａｔｃａａｇａｃｃｃａｇｇｇｔｇｃｃｃｇｔｃａｇａａｇｔｔｃｔｃｃａｇｃｃｔｃｔａｃａｔｃｔｃｔｃａｇｔｔｔａｔｃａｔｃａｔｇｔａｔａｇｔｃｔｔｇａｔｇｇｇａａｇａａｇｔｇｇｃａｇａｃｔｔａｔｃｇａｇｇａａａｔｔｃｃａｃｔｇｇａａｃｃｔｔａａｔｇｇｔｃｔｔｃｔｔｔｇｇｃａａｔｇｔｇｇａｔｔｃａｔｃｔｇｇｇａｔａａａａｃａｃａａｔａｔｔｔｔｔａａｃｃｃｔｃｃａａｔｔａｔｔｇｃｔｃｇａｔａｃａｔｃｃｇｔｔｔｇｃａｃｃｃａａｃｔｃａｔｔａｔａｇｃａｔｔｃｇｃａｇｃａｃｔｃｔｔｃｇｃａｔｇｇａｇｔｔｇａｔｇｇｇｃｔｇｔｇａｔｔｔａａａｔａｇｔｔｇｃａｇｃａｔｇｃｃａｔｔｇｇｇａａｔｇｇａｇａｇｔａａａｇｃａａｔａｔｃａｇａｔｇｃａｃａｇａｔｔａｃｔｇｃｔｔｃａｔｃｃｔａｃｔｔｔａｃｃａａｔａｔｇｔｔｔｇｃｃａｃｃｔｇｇｔｃｔｃｃｔｔｃａａａａｇｃｔｃｇａｃｔｔｃａｃｃｔｃｃａａｇｇｇａｇｇａｇｔａａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃｃｔｃａｇｇｔｇａａｔａａｔｃｃａａａａｇａｇｔｇｇｃｔｇｃａａｇｔｇｇａｃｔｔｃｃａｇａａｇａｃａａｔｇａａａｇｔｃａｃａｇｇａｇｔａａｃｔａｃｔｃａｇｇｇａｇｔａａａａｔｃｔｃｔｇｃｔｔａｃｃａｇｃａｔｇｔａｔｇｔｇａａｇｇａｇｔｔｃｃｔｃａｔｃｔｃｃａｇｃａｇｔｃａａｇａｔｇｇｃｃａｔｃａｇｔｇｇａｃｔｃｔｃｔｔｔｔｔｔｃａｇａａｔｇｇｃａａａｇｔａａａｇｇｔｔｔｔｔｃａｇｇｇａａａｔｃａａｇａｃｔｃｃｔｔｃａｃａｃｃｔｇｔｇｇｔｇａａｃｔｃｔｃｔａｇａｃｃｃａｃｃｇｔｔａｃｔｇａｃｔｃｇｃｔａｃｃｔｔｃｇａａｔｔｃａｃｃｃｃｃａｇａｇｔｔｇｇｇｔｇｃａｃｃａｇａｔｔｇｃｃｃｔｇａｇｇａｔｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｇｃｔｇｃｇａｇｇｃａｃａｇｇａｃｃｔｃｔａｃｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃｔｃｃａｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｃｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａａｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｔｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａ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【０３３２】
その他のＶＷＦ断片と構築されたＦＶＩＩＩＦＣ‐ＶＷＦヘテロダイマーが下に記載されている。
【表６−１】
2020078338.tif 000031
【表６−２】
2020078338.tif 000032
【表６−３】
2020078338.tif 000033
【表６−４】
2020078338.tif 000034
【表６−５】
2020078338.tif 000035
【０３３３】
実施例６：タンパク質精製
ＶＷＦ断片のタンパク質精製
ＶＷＦ断片を二段階精製方法により精製した。硫酸ニッケル帯電ＩＭＡＣ（固定化金属親和性クロマトグラフィー）カラムを一次精製のために使用し、フラクトゲルＤＥＡＥイオン交換カラムを最終精製のために使用した。詳細な精製方法を下で説明する。
【０３３４】
（ａ）ニッケルＩＭＡＣでのＶＷＦ断片の一次精製
１４ｍＬのニッケルＩＭＡＣセファロースＨＰカラム［ＸＫ２６／３］をｐＨ７．５の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾールおよび０．０５％のツイーン２０で平衡化した。約７．２ＬのＶＷＦ条件培地を１００ｍＬのｐＨ７．５の１ＭのＨＥＰＥＳと６００ｍＬの５ＭのＮａＣｌで調節した。次に、８０ｍＬの１Ｍのイミダゾール（ｐＨ７．５）を１０ｍＭの終濃度になるまで添加した。その７．８Ｌの調節されたＶＷＦ条件培地を次に２〜８℃において１０ｍＬ／分［１１３ｃｍ／時間］の速度でカラムに負荷した。洗浄ステップを１３．３ｍＬ／分［１５０ｃｍ／時間］の速度で実施した。まず、順流｛“ダウンフロー”｝でｐＨ７．５の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾールおよび０．０５％のツイーン２０を用いて２×カラム体積（ＣＶ）の洗浄を実施した。次に逆流｛“アップフロー”｝でｐＨ７．５の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾールおよび０．０５％のツイーン２０を用いて３×ＣＶの洗浄を実施した。最後に順流｛“ダウンフロー”｝でｐＨ７．５の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾールおよび０．０５％のツイーン２０を用いて３×ＣＶの洗浄を実施した。５０％Ｂ１（ｐＨ７．５の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾールおよび０．０５％のツイーン２０）への１０×ＣＶの濃度勾配として溶出を実施した。画分体積を１０ｍＬに設定した。次に１００％Ｂ１を用いてそのカラムから吸着物を除去した。これにｐＨ７．５の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾールおよび０．０５％のツイーン２０を用いる洗浄が続いた。１ＮのＮａＯＨを用いて２回目の吸着物除去を実施した。次に、ｐＨ７．８の１Ｍのトリス、１ＭのＮａＣｌで、続いてｐＨ７．５の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾールおよび０．０５％のツイーン２０をそのカラムに流した。最後に５ＣＶの２０％エタノール含有ＤＰＢＳをそのカラムに流し、そして、４℃で保存した。
【０３３５】
（ｂ）フラクトゲルＤＥＡＥでのＶＷＦ断片の二次精製
ＶＷＦ断片の二次精製をｐＨ７．５においてフラクトゲルＤＥＡＥで実施した。まず、変性性賦形剤または還元性賦形剤を使用することなく凝集種を分裂させる試みにおいて２０ｍＬのＶＷＦニッケルＩＭＡＣ溶離液（ＶＷＦ断片ピークに対応する）を２００ｍｇのＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４双性イオン性界面活性剤で調節した。界面活性剤が溶解した後にタンパク質を室温で約１５分間放置した。次に４グラムのトレハロース、１ｍＬの１０％のツイーン２０、ｐＨ７．５の５ｍＬの１ＭのＨＥＰＥＳおよび１７４ｍＬの「Ｍｉｌｌｉ‐Ｑ」水を用いてタンパク質を調節した。平衡化緩衝液「Ａ１２」はｐＨ７．５の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１％Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、０．０５％のツイーン２０であった。溶出緩衝液「Ｂ１」はｐＨ７．５の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０００ｍＭのＮａＣｌ、１％のトレハロース、０．０５％のツイーン２０であった。５０％Ｂ１への１０ＣＶの濃度勾配、さらに５Ｃ+Ｖの保持、それに続く１００％Ｂ１へのステップとして溶出を実施した。次に０．８５％のリン酸、続いてｐＨ７．５の１Ｍのトリス、１ＭのＮａＣｌを用いてカラムから吸着物を除去した。次に１ＮのＮａＯＨ、２ＭのＮａＣｌ、続いてｐＨ７．５の１Ｍのトリス、１ＭのＮａＣｌを用いてカラムから吸着物を除去した。次に、保管のためにｐＨ７．５の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌおよび２０％のエタノールをそのカラムに流した。
【０３３６】
（ｃ）ＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦヘテロダイマーのタンパク質精製
ＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦヘテロダイマーを親和性カラム（ＧＥ  ＶＩＩＩセレクト）によって最初に精製し、次にフラクトガル（Ｆｒａｃｔｇａｌ）ＴＭＡＥイオン交換カラムで精製した(McCue JT, Selvitelli K, Walker J, J Chromatogr A. 2009 Nov6; 1216(45):7824-30. Epub 2009 Sep 23.) 。
【０３３７】
ＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐３１の精製のために接線流濾過（ＴＦＦ）ステップを用いて清澄化条件培地と緩衝液交換した。次に濾過液中の目的タンパク質を、親和性クロマトグラフィーを用いて捕捉した。弱陰イオン交換クロマトグラフィーステップが続いてＨＭＷ種を減少させた。その分子の純度とサイズの両方をＨＰＬＣ‐ＳＥＣとＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって評価した。ＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐３１の様々なドメインの存在をウエスタンブロッティングによってさらに確認した。その分子の特異的な活性をＢ‐ドメイン欠失ＦＶＩＩＩと比べた。
【０３３８】
（ｄ）ＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦヘテロダイマーのトロンビン消化（図８）
ＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦ‐ＦｃヘテロダイマーまたはＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ（対照）をトロンビン切断緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、５％のグリセロール）中で１：１０の比率でトロンビンと混合した。その反応物を３７℃で２０分間インキュベートした。消化産物を４〜１２％還元トリス・グリシンゲルで泳動した。未消化タンパク質を対照として使用した。クマシー染色によりバンドを視覚化した。
【０３３９】
（ｅ）ＯｃｔｅｔアッセイによるＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐０３１のＶＷＦ結合能の評価
ＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐０３１のＶＷＦ結合能を、トリス結合緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）を用いたＦｏｒｔｅＢｉｏＯｃｔｅｔ３８４装置での２５℃におけるバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）ベースの測定値（Ｏｃｔｅｔアッセイ）によって決定した。ＦＶＩＩＩ結合を判定するためのＯｃｔｅｔアッセイはヒトフォンウィルブランド因子（ｈＶＷＦ）（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＨＣＶＷＦ‐０１９１）のＡＰＳバイオセンサーへの疎水性固定とそれに続く１．０％ウシ血清アルブミン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号００１−０００−１６１）の結合に基づいた。簡単に説明すると、ｈＶＷＦ（３８．５ｎＭ）をトリス緩衝液中に希釈し、そして、ＡＰＳバイオセンサー全体に６００秒間負荷して反応プローブ上に約３．０〜３．５ｎｍの結合層を生じさせた。対照ＡＰＳプローブにリファレンスサブトラクション用にｈＶＷＦが存在しない１．０％ＢＳＡを負荷した。負荷後、全てのプローブをトリス緩衝液中で３００秒間インキュベートして新しい基線を確立した。その後、バイオセンサープローブをＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐０３１、ＦＶＩＩＩＦｃ原薬、またはｒＦＶＩＩＩ（６０ｎＭ）の溶液中において室温で５分間インキュベートし、５分の解離ステップがそれに続いた。Ｏｃｔｅｔデータ分析ソフトウェアを使用して引き算されたデータ（反応プローブ−参照プローブ）から結合応答（ｎｍ）が得られた。図１５に示されるように、ｒＦＶＩＩＩＦｃとｒＦＶＩＩＩのＶＷＦ結合親和性と比較すると、ＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐０３１のＶＷＦ結合親和性は非常に減じられた。このことは、ＦＶＩＩＩＦｃ／ＶＷＦヘテロダイマー内のＤ’Ｄ３断片による全長ＶＷＦからのＦＶＩＩＩの遮蔽の成功を示している。
【０３４０】
実施例７．ＶＷＦ‐ＦＶＩＩＩ相互作用はＦＶＩＩＩ半減期延長の制限因子である
循環ＦＶＩＩＩの大部分はＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦ複合体として存在する（血漿ＦＶＩＩＩの９５％超）。このＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦ相互作用はＶＷＦ排除経路を介したＦＶＩＩＩ排除を促進し、そうしてＶＷＦの半減期（Ｔ１／２）をＦＶＩＩＩの半減期延長の限度にする。この仮説を評価するためにＦｃ技術によるＦＶＩＩＩ半減期延長の限度をＦＶＩＩＩ欠損マウス（完全ＶＷＦ遺伝子を有するＨｅｍＡマウス）およびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ欠損（ＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦダブル・ノックアウト（ＤＫＯ））マウスにおいて試験した。
【０３４１】
ＨｅｍＡマウスまたはＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦ  ＤＫＯマウスをＨｅｍＡマウスでは１２５ＩＵ／ｋｇの、またはＤＫＯマウスでは２００ＩＵ／ｋｇの単一静脈内用量のｒＦＶＩＩＩまたはｒＦＶＩＩＩＦｃで処置した。血液試料をＨｅｍＡマウスでは７２時間まで、またはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスでは８時間まで採取した。ＦＶＩＩＩ発色性アッセイにより血漿試料のＦＶＩＩＩ活性を測定した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎｅプログラムを用いて２ｒＦＶＩＩＩ分散の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを分析した。
【０３４２】
表７および図９に示されるように、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスではｒＦＶＩＩＩＦｃはｒＦＶＩＩＩのＴ１／２（すなわち、０．２５時間のＴ１／２）と比べて約４．８倍長いＴ１／２（すなわち、１．２時間のＴ１／２）を示した。対照的に、ＨｅｍＡマウスにおいて試験されると、ｒＦＶＩＩＩＦｃのみがｒＦＶＩＩＩと比べて１．８倍長いＴ１／２を有した。ｒＦＶＩＩＩＦｃのＴ１／２は１３．７時間であった。その時間は内在性マウスＶＷＦの半減期と一致する。このことは、ＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦ相互作用がＦＶＩＩＩ半減期延長の制限因子であることを示している。２倍より長いＦＶＩＩＩ半減期延長を達成するためにはＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦ相互作用を排除しなくてはならない。
【表７】
2020078338.tif 000036
【０３４３】
ＦＶＩＩＩ発色性アッセイ
ＤｉａＰｈａｒｍａのＣＯＡＴＥＳＴ  ＳＰ  ＦＶＩＩＩキット（ロット番号Ｎ０８９０１９）を使用してＦＶＩＩＩ活性を測定し、そして、全てのインキュベーションを３７℃のプレート・ヒーター上で振盪しながら実施した。
【０３４４】
ｒＦＶＩＩＩ標準物質の範囲は１００ｍＩＵ／ｍＬから０．７８ｍＩＵ／ｍＬまでであった。プールした通常のヒト血漿アッセイ対照試料と血漿試料（１×Ｃｏａｔｅｓｔ緩衝液で希釈）をＩｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢ９６ウェルプレートに２つ組で添加した（２５μＬ／ウェル）。新規に調製したＩＸａ／ＦＸ／リン脂質混合物（５０μＬ）、２５μＬの２５ｍＭのＣａＣｌ２および５０μＬのＦＸａ基質を各ウェルに順次添加し、各添加の間に５分のインキュベーションを行った。基質とインキュベートした後に２５μＬの２０％酢酸を添加して発色反応を停止させ、そして、ＯＤ４０５の吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭＡＸプラス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）装置で測定した。データをＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェア（第５．２版）で分析した。定量下限（ＬＬＯＱ）は７．８ｍＩＵ／ｍＬである。
【０３４５】
実施例８．ＶＷＦ  Ｄ’Ｄ３ダイマーはＦＶＩＩＩのタンパク質分解と排除からＦＶＩＩＩを保護する（図１０）
ＶＷＦ欠損マウスにおける内在性マウスＦＶＩＩＩの排除からそれを保護するＶＷＦ断片の能力によってそれらの断片のＦＶＩＩＩ保護活性を評価した。表８の列１（図１、実施例１）に記載される様々なＶＷＦ断片をそれらの対応するＤＮＡコンストラクトの１００μｇ／マウスでの流体力学的注入によりＶＷＦ欠損マウスの血液循環に導入した。注入から４８時間後に血漿試料を採取し、そして、ＦＶＩＩＩ発色性アッセイによりマウスＦＶＩＩＩ血漿中活性を測定した。ＶＷＦ発現レベルＶＷＦ  ＥＬＩＳＡによりを測定した。
【０３４６】
試験された４つの異なる長さのＶＷＦ断片は２７６アミノ酸、４７７アミノ酸、５１１アミノ酸、および７１６アミノ酸である。２７６〜７１６アミノ酸の範囲を試験してＶＷＦの排除受容体の結合ドメイン（７１６アミノ酸）を有しないＦＶＩＩＩ結合（２７６アミノ酸）に必要とされる長さのＶＷＦ断片を見出した。全長ＶＷＦおよびＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ＣＫマルチマーをＦＶＩＩＩ保護の陽性対照として使用した。血液循環ではＤ１Ｄ２ドメインを有して合成されたＶＷＦ断片はダイマーとして存在し、ＶＷＦ断片がＤ１Ｄ２ドメインを有さずに合成されるとモノマーとして存在する。
【０３４７】
流体力学的注入後の血漿中のマウスＦＶＩＩＩ活性の上昇はＶＷＦ断片のＦＶＩＩＩ保護効果を評価する。表８および図１０Ａ〜Ｂに示されるようにＤ’Ｄ３断片の最初の２７６アミノ酸は同様の注入前／後ＦＶＩＩＩ血漿レベル（図１０Ａ）によって示されるようなＦＶＩＩＩ保護活性を有しなかった。しかしながら、その他のＶＷＦ断片の導入はＦＶＩＩＩ血漿レベルのかなりの上昇を誘導した。このことは、それらのＶＷＦ断片がＦＶＩＩＩをその排除経路から保護することができることを示している。
【表８】
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【０３４８】
注入後の血漿ＦＶＩＩＩ活性と全長ＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメインを含有するＶＷＦ断片の血漿抗原レベルの比率は表８に記載された。同様の注入後ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ比率が全長ＶＷＦとＶＷＦ断片の２つのダイマー型より観察された。このことは、それらの２つのＶＷＦ断片ダイマーが全長ＶＷＦと同じＦＶＩＩＩ保護を提供することを意味する。加えて、ＶＷＦ断片ダイマーアイソフォームよりそれらの対応するモノマーと比べて３倍高いＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ比率が観察された：Ｄ’Ｄ３（４７７アミノ酸）ダイマーは３８．７ｍＩＵ／ｎｍｏｌのＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ比率を有し、Ｄ’Ｄ３（４７７アミノ酸）モノマーは１１．６ｍＩＵ／ｎｍｏｌのＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ比率を有し、Ｄ’Ｄ３Ａ１（５１１アミノ酸）ダイマーは３２．９ｍＩＵ／ｎｍｏｌのＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ比率を有し、そして、Ｄ’Ｄ３（５１１アミノ酸）モノマーは１３．８ｍＩＵ／ｎｍｏｌのＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ比率を有しており、このことはＶＷＦ断片のダイマーアイソフォームがそれらの対応するモノマーと比べてより好適なＦＶＩＩＩ保護を提供することを示している。
【表９】
2020078338.tif 000038
【０３４９】
流体力学的注入：
流体力学的注入はマウスおよびラットなどの小動物の肝臓への効率的で安全な非ウイルス性遺伝子送達方法である。その方法は、動物の体重の１０分の１の体積でのエンドトキシンを含まない裸プラスミドＤＮＡ／生理食塩水溶液の訳５〜７秒での急速注入として元々記載された。その裸プラスミドＤＮＡは目的の遺伝子を含有し、そして、導入されたＤＮＡに由来する肝臓産生標的化タンパク質は注入後２４時間以内に検出され得る。その後、血漿試料を採取して発現タンパク質の治療上の特性を試験した。
【０３５０】
この特許出願の本明細書において実施された全ての流体力学的注入について、２ｍｌの０．９％滅菌生理食塩水溶液中のプラスミドＤＮＡを２０〜３５グラムの体重のマウスに静脈内尾静脈注入により約４〜７秒以内に送達した。正常な活性が再開するまでマウスを最初の２時間の間に厳密にモニターした。眼窩後血液採取により血液試料を採取した後、次に血漿試料を得て、さらなる分析のために−８０℃で貯蔵した。
【０３５１】
ＶＷＦ  ＥＬＩＳＡ：
ヤギ抗ヒトＶＷＦ抗体（親和性精製済み、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＧＡＶＷＦ‐ＡＰ）を０．５ｕｇ／ウェルで捕捉抗体として使用し、そして、ＶＷＦ‐ＥＩＡ−Ｄ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＶＷＦ‐ＥＩＡ‐Ｄ、１：１００希釈）をＶＷＦ  ＥＬＩＳＡのための検出抗体として使用した。ＥＬＩＳＡアッセイを標準的なＥＬＩＳＡ技法に従って実施し、ＴＭＢをＨＲＰ基質として使用し、ＰＢＳＴ／１．５％のＢＳＡ／０．５ＭのＮａＣｌ緩衝液をブロッキング緩衝液および結合緩衝液として使用した。アッセイ標準物質の範囲は１００ｎｇ〜０．７８ｎｇであり、アッセイの検出下限（ＬＬＯＱ）７．８ｎｇ／ｍＬである。
【０３５２】
実施例９：全長ＶＷＦ  Ｄ’Ｄ３断片の共投与がＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおけるｒＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩの半減期を延長する（図１１）
実施例８は、全長Ｄ’Ｄ３断片が内在性ＦＶＩＩＩをその排除経路から保護することができることを示した。Ｄ’Ｄ３タンパク質のＦＶＩＩＩ保護活性をさらに評価するために、ＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ｒＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩ）とＤ’Ｄ３ダイマー（ＶＷＦ‐０１０）またはｒＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩとＤ’Ｄ３モノマー（ＶＷＦ‐００２）をｒＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩについては２００ＩＵ／ｋｇ、Ｄ’Ｄ３ダイマーについては７７０μｇ／ｋｇ、およびＤ’Ｄ３モノマーについては５９０μｇ／ｋｇで静脈内注射により共投与した。その後、ｒＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩのＰＫプロファイルをその注入後の血漿中活性によりモニターした。Ｄ’Ｄ３断片の短いインビボ半減期のため、最初の共注入から３時間後の時点で別の用量のＤ’Ｄ３を同じ経路により投与して所望のＤ’Ｄ３血漿レベルを維持した。
【０３５３】
ＰＫ分析のために注入後５分、３０分、１時間、２時間、４時間および６時間で眼窩後血液採取により血漿試料を得て、そして、血漿ＦＶＩＩＩ活性とＤ’Ｄ３抗原レベルをＦＶＩＩＩ発色性アッセイとＶＷＦ  ＥＬＩＳＡにより分析した。
【０３５４】
図１１および表１０に示されるようにＤ’Ｄ３モノマーはｒＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩの半減期を２．５倍延長し、その回収率を１．８倍改善した。Ｄ’Ｄ３ダイマーはｒＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩの半減期を４．１倍延長し、その回収率を３．５倍改善した。改善された平均滞留時間、クリアランスおよびＡＵＣも両方のＤ’Ｄ３アイソフォームより観察された。しかしながら、Ｄ’Ｄ３ダイマーはそのモノマー型と比べて全てのＰＫパラメーターでより良い結果を達成した。
【０３５５】
まとめると、改善されたｒＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩのＰＫプロファイルに示されるように、全長Ｄ’Ｄ３の共注入がＦＶＩＩＩをその排除経路から保護する。この発見の潜在的な臨床的価値はさらに評価を受ける必要がある。
【表１０】
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【０３５６】
実施例１０．Ｄ１Ｄ２ドメインを有して合成されたＤ’Ｄ３モノマーとそのダイマーアイソフォームは同じＦＶＩＩＩ保護活性を有し、そして、ＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいてＦＶＩＩＩＦｃの半減期を約４倍さらに延長させる（図１２）
Ｄ’Ｄ３ドメインのＦＶＩＩＩ保護能を定量化し、そして、Ｄ’Ｄ３二量体化がそのＦＶＩＩＩ保護活性に必要であるか判定するために２つのＤＮＡコンストラクト（すなわち、（Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３をコードするＤＮＡ配列を含有する）ＶＷＦ‐０２５および（Ｃ３３６ＡとＣ３７９Ａの突然変異を有するＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３コドンＤＮＡを含有する）ＶＷＦ‐０２９）の各々を流体力学的注入によりＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスに投与した。この注入によりＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウス内でＤ’Ｄ３ダイマー発現（ＶＷＦ‐０２５）またはモノマー発現（ＶＷＦ‐０２９）が引き起こされた。流体力学的注入後の第５日に単回静脈内用量のｒＦＶＩＩＩＦｃを２００ＩＵ／ｋｇで投与し、そして、ｒＦＶＩＩＩＦｃＩＶ注入後５分、４時間、８時間、１６時間、２４時間、３１時間、４０時間、５５時間、６６時間で血漿試料を採取した。無感作ＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて同じ用量で実施したｒＦＶＩＩＩＦｃのＰＫ試験をｒＦＶＩＩＩＦｃ半減期の基線として使用した。ＦＶＩＩＩ発色性アッセイにより血漿ＦＶＩＩＩ活性を分析した。血漿Ｄ’Ｄ３レベルをＶＷＦ  ＥＬＩＳＡにより測定し、そして、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムを用いてｒＦＶＩＩＩＦｃのＰＫプロファイルを分析した。
【０３５７】
表１１および図１２に示されるように循環中のＶＷＦのＤ’Ｄ３断片を用いてｒＦＶＩＩＩＦｃの初期回収率が４２％からＤ’Ｄ３ダイマーについて７５％に、およびＤ’Ｄ３モノマーについて６０％に上昇した。ｒＦＶＩＩＩＦｃのＴ１／２も２．５時間からそれぞれ９．３時間および９．２時間に増加した。Ｔ１／２と同様に、改善された平均滞留時間、クリアランス、および量の分布もＤ’Ｄ３モノマー発現マウスおよびＤ’Ｄ３ダイマー発現マウスより観察された。全体では、我々はＤ’Ｄ３モノマー発現マウスとＤ’Ｄ３ダイマー発現マウスの両方でｒＦＶＩＩＩＦｃの半減期に関して約８倍の改善、およびＡＵＣに関して６倍の改善を観察する。そのダイマーアイソフォームと同じく、ＶＷＦのプロペプチド（Ｄ１Ｄ２）を有して合成された全長ＶＷＦのＤ’Ｄ３モノマーは全長ＶＷＦ分子のように完全なＦＶＩＩＩ保護効果を提供するのに充分である。
【０３５８】
ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスではＷＴ−ＦＶＩＩＩは０．２５時間のＴ１／２を有する。Ｆｃ融合技術によってＦＶＩＩＩのＴ１／２が１．２時間に増加した。それは約４．８倍の増加である。Ｆｃ融合技術をＤ’Ｄ３ドメインと組み合わせると、ＦＶＩＩＩのＴ１／２は９．３時間（Ｄ’Ｄ３ダイマー）と９．２時間（Ｄ’Ｄ３モノマー）に増加した。それらは総計で約３７倍の増加である（表１０）。この結果はＦＶＩＩＩの半減期延長に対するＦｃ融合とＤ’Ｄ３  ＶＷＦ断片の相乗効果を実証した。
【表１１】
2020078338.tif 000040
【０３５９】
実施例１１：ＨｅｍＡマウスにおけるＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦヘテロダイマーのＰＫ
ＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦヘテロダイマー（例えば、ＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐０３１）のリード候補のＰＫプロファイルを、内在性ＶＷＦからＦＶＩＩＩを遮蔽するそれらの能力とＦＶＩＩＩの半減期を延長させるそれらの能力を評価するためにＨｅｍＡマウスにおいて試験する。
【０３６０】
ＨｅｍＡマウスを２００ＩＵ／ｋｇの単回静脈内用量のリード候補で処置し、その後、５分、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間および１２０時間で血漿試料を採取し、ＦＶＩＩＩ発色性アッセイにより血漿中活性を試験し、そして、ＦＶＩＩＩ分散の半減期をＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムにより計算する。
【０３６１】
至適なＦＶＩＩＩ／ＶＷＦヘテロダイマー構成では、ＦＶＩＩＩの内在性ＶＷＦへの結合を完全に阻害し、それに関してｒＦＶＩＩＩの基線半減期が、実施例７に示されるように、７．６時間から０．２５時間に減少する。Ｄ’Ｄ３断片がＦＶＩＩＩと非共有結合で結合するとき、約８倍の半減期に対する利益が観察された（実施例９）。ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦヘテロダイマーのリード候補ではＶＷＦ断片はＦＶＩＩＩ分子と共有結合で結合し、より好適なＦＶＩＩＩ保護が達成され得る場合がある。本願の発明は２倍の上限を越えてＦＶＩＩＩの半減期をさらに延長する可能性を与え、利用可能な半減期延長技術の組合せを用いてＨｅｍＡ患者はより好適な長期作用性ＦＶＩＩＩ分散を近い将来に期待することができた。
【０３６２】
ＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐０３１のＰＫプロファイルをＨｅｍＡマウスとＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて試験して内在性ＶＷＦからＦＶＩＩＩ部分を遮蔽するＤ’Ｄ３断片の能力を評価した。ＨｅｍＡマウスまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスを２００ＩＵ／ｋｇの単回静脈内用量のＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐０３１で処置し、次に投与後５分、８時間、２４時間、および４８時間で血漿試料を採取した。血漿試料のＦＶＩＩＩ活性をＦＶＩＩＩ発色性アッセイにより試験し、そして、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムを用いてＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐０３１の半減期を計算した。
【０３６３】
大いに減じられた固定化ＶＷＦへの結合がバイオレイヤー干渉法（図１５、Ｏｃｔｅｔ；Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、メンロパーク）によってｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＦＶＩＩＩと比べてＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐０３１に対して検出された。このことは、その分子内のＤ’Ｄ３ドメインが天然型ＶＷＦ分子へのＦＶＩＩＩの結合の阻止に成功したことを示す。したがって、２つの異なるマウス株において同様のｒＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐０３１の半減期が期待された。試験結果が図１６と表１２Ａに記載されている。予想通り、ｒＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐０３１がＨｅｍＡマウスとＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスの両方で同等のＰＫプロファイルを有した。このことは、ＦＶＩＩＩＦｃ／ＶＷＦヘテロダイマーの半減期が内在性ＶＷＦの半減期と無関係であることを示している。それらの結果は、ｒＦＶＩＩＩＦｃと内在性ＶＷＦの間の相互作用のＶＷＦ  Ｄ’Ｄ３ドメインによる阻害がＦＶＩＩＩの半減期の上限の撤廃を可能とし、ＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメイン無しで達成され得る半減期を越えてＦＶＩＩＩの半減期を延長させる可能性を開く（野生型ＦＶＩＩＩの約２倍）ことを示す。
【表１２Ａ】
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【０３６４】
ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおけるＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐０３１のｔ１／２をＦＶＩＩＩＦｃと比較することによりＤ’Ｄ３ドメインのＦＶＩＩＩ保護能を評価した。単回静脈内投与の後にＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐０３１については５分、８時間、２４時間および４８時間の時点、およびＦＶＩＩＩＦｃについては５分、１時間、２時間、４時間、６時間および８時間の時点で血液試料を採取した。血漿試料のＦＶＩＩＩ活性をＦＶＩＩＩ発色性アッセイにより試験し、そして、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムを用いてＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐０３１の半減期を計算した。
【０３６５】
図１６Ｂおよび表１２ＢはＤＫＯマウスにおいてｒＦＶＩＩＩＦｃと比較してＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐０３１に対して著しく改善されたＰＫプロファイル、すなわち、約６倍のｔ１／２の増加、および約５倍のクリアランスとＡＵＣの増加を示す。この結果は、ＦＶＩＩＩＦｃ／ＶＷＦヘテロダイマー中のＤ’Ｄ３ドメインがいくつかの排除経路からＦＶＩＩＩ部分を保護し、そうして全長ＶＷＦによって通常提供される保護のうちのいくらを提供することを示している。この結論はＨｅｍＡマウスにおいても確認される。ＨｅｍＡマウスにおいてｒＦＶＩＩＩＦｃと比較されると、ｒＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐０３１はより短いｔ１／２とより少ないＡＵＣを示した。このことは、この構成、すなわち、Ｄ’Ｄ３ドメイン（ＶＷＦ‐０３１）がＦＶＩＩＩタンパク質（ｒＦＶＩＩＩ‐１５５）の内在性ＶＷＦへの結合の防止に成功し、ある程度までの半減期延長特性ならびにＦＶＩＩＩの半減期制限特性を有することを意味する。全長ＶＷＦは２５０ｋＤａであり、内在性ＶＷＦが最大で２ＭＤａであり得るようなマルチマーを形成し、したがって、５５ｋＤａのＶＷＦのＤ’Ｄ３領域がこの背景でさらに大きい内在性ＶＷＦによって通常もたらされるのと同じ保護を提供しないことはこの仮説と矛盾しない。そのＶＷＦ断片は内在性ＶＷＦがｒＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐０３１に結合することを防止するので、この特定のコンストラクトではＨｅｍＡマウスにおいて半減期が減少する。したがって、表１２Ｂ中の結果によって、ｒＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐０３１分子はＦＶＩＩＩの半減期延長因子（内在性ＶＷＦ）がｒＦＶＩＩＩ‐１５５／ＶＷＦ‐０３１に結合することを防止することができることが示されている。しかしながら、その実験は、ＦＶＩＩＩの半減期制限因子の除去が以前に示された１．５倍または２倍を越えてＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長する可能性を開いたことを示している。ＦＶＩＩＩが図４に示されるような他の半減期延長要素と組み合わせられると、ＦＶＩＩＩの２倍の半減期延長の上限の突破が達成され得るだろう。
【表１２Ｂ】
2020078338.tif 000042
【０３６６】
実施例１２：ＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３ヘテロダイマーのＤ’Ｄ３‐Ｆｃリンカーの最適化（図１３）
ｒＦＶＩＩＩＦｃがＶＷＦ排除経路を避け、２倍ＦＶＩＩＩの半減期延長の上限を撤廃することができるようにするために、ＶＷＦ  Ｄ’Ｄ３断片をｒＦＶＩＩＩＦｃ分子に組み入れ（図２）、ＦＶＩＩＩＦｃ／ＶＷＦヘテロダイマーを生じさせた。ｒＦＶＩＩＩＦｃと内在性ＶＷＦの間の相互作用を排除し、Ｄ’Ｄ３ＦＶＩＩＩの保護能力を最大化するために、Ｄ’Ｄ３ドメインとＦｃ領域の間のリンカーを調節して至適なＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３結合を可能とした。Ｄ’Ｄ３ドメインはより至適なリンカーによって、あまり最適ではないリンカーコンストラクトよりも高度のＦＶＩＩＩ保護を有することが可能となる。このことはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおけるＤＮＡコンストラクトの流体力学的注入によって試験され得る。より至適なコンストラクトはＦＶＩＩＩＦｃ／Ｄ’Ｄ３ヘテロダイマーのより高度な定常状態のタンパク質発現をもたらす。
【０３６７】
３種の異なるＦＶＩＩＩＦｃ／Ｄ’Ｄ３ヘテロダイマー（図３、実施例３）を最適リンカーの選択のために設計した。Ｄ’Ｄ３ドメインとＦｃ領域の間に可能なリンカーが表１３に記載された。それらのＤＮＡコンストラクトを１００μｇ／マウスで流体力学的注入（「ＨＤＩ」）によりＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスに投与し、そして、ＨＤＩから４８時間後に血漿試料を採取した。循環ＦＶＩＩＩＦｃ／Ｄ’Ｄ３ヘテロダイマー活性をＦＶＩＩＩ発色性アッセイにより分析した。
【０３６８】
研究結果は図１３に示された。ＨＤＩから４８時間後にＦＶＩＩＩ‐０６４とＦＶＩＩＩ‐１５９が同様の発現レベルに達した。このことは、２０アミノ酸リンカーと３５アミノ酸リンカーが同様のレベルのＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３相互作用を促進することを示している。別の面では、ＦＶＩＩＩ‐１６０はＦＶＩＩＩ‐０６４よりも顕著に高い発現を示した。このことは、４８アミノ酸リンカーによって、２０アミノ酸リンカーおよび３５アミノ酸リンカーと比べてより好適なＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３結合が可能となることを意味する。
【０３６９】
ＶＷＦ断片とＦｃ領域の間の至適なリンカーはＦＶＩＩＩＦｃ／ＶＷＦヘテロダイマーの重要な要素のうちの１つである。最も好適なリンカーを見出すことによって、ＦＶＩＩＩとＶＷＦ断片の間の至適な相互作用が可能となり、ＦＶＩＩＩの内在性ＶＷＦへの結合が防止され、ＦＶＩＩＩがＶＷＦ排除経路を避けることが可能となり、そして、ＦＶＩＩＩの半減期が血漿ＶＷＦの半減期を越えて延長する。
【表１３】
2020078338.tif 000043
【０３７０】
実施例１３：単鎖ＦＶＩＩＩの安定性
単鎖ＦＶＩＩＩタンパク質はその二重鎖アイソフォームよりも安定であり得た。この仮説を試験するために２つのＤＮＡコンストラクト：ＦＶＩＩＩ‐１３６（Ｄ’Ｄ３ドメインを有するプロセッシング可能ＦＶＩＩＩＦｃ）およびＦＶＩＩＩ‐１４８（ＦＶＩＩＩ重鎖と軽鎖の間の切断を防止するためのＲ１６４５Ａ／Ｒ１６４８Ａ突然変異を含有し、Ｄ’Ｄ３ドメインを有する単鎖（ＳＣ）ＦＶＩＩＩＦｃ）を作製した。
【０３７１】
両方のプラスミドを流体力学的注入によりＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスに投与した。注入から２４時間後と４８時間後に血漿試料を採取して２つのＦＶＩＩＩＦｃ／Ｄ’Ｄ３アイソフォームの発現レベルを測定した。図１４に示されるように、両方の時点でより好適な発現の傾向がＳＣ−ＦＶＩＩＩＦｃ／Ｄ’Ｄ３コンストラクト（ＦＶＩＩＩ‐１４８）（ｐ＝０．１２、ｐ＝０．１９）によって観察された。このことは、単鎖ＦＶＩＩＩがその二重鎖アイソフォーム（ＦＶＩＩＩ‐１３６）よりも安定であり得た、またはより好適に発現し得たことを示している。２つのＦＶＩＩＩアイソフォームのＰＫプロファイルとそれらの細胞培養発現レベルをさらに調査する。より好適なタンパク質産生とより好適なインビボＦＶＩＩＩ半減期を達成するために単鎖ＦＶＩＩＩアイソフォームを使用して従来の二重鎖アイソフォームと置換することが可能であり得ただろう。
【０３７２】
実施例１４．ＰＥＧ化
１個以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子をＦＶＩＩＩタンパク質、ＶＷＦ断片、または両方のあらゆる領域内に結合させることができる。ＦＶＩＩＩは結晶構造に基づくとその表面に遊離システインを有さないので（PDB:2R7E,Shen et al., Blood 111:1240 (2008); PDB:3CDZ, Ngo, Structure, 16:597-606 (2008)）、１つのアプローチはシステイン含有ペプチド（例えば、ＧＧＧＳＧＣＧＧＧＳ）（配列番号１０７）をＦＶＩＩＩタンパク質、ＶＷＦ断片、または両方に挿入または結合することである。その後、マレイミドを含有するＰＥＧ分子を組換えＦＶＩＩＩタンパク質に導入されたシステインに特異的に複合体化させることができる。簡単に説明すると、Ｃｙｓ挿入を含有する組換えＦＶＩＩＩタンパク質を標準的な分子的技術により構築することができ、そして、哺乳類発現系（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、およびＣＡＰ細胞）で発現した組換えＦＶＩＩＩタンパク質を親和性クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーにより精製することができる。導入されたシステインのチオール基を露出させるために精製された組換えＦＶＩＩＩタンパク質をトリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）によって還元し、次にマレイミドＰＥＧと反応させる。結果生じる組換えＦＶＩＩＩタンパク質を凝血原活性と半減期延長について試験する。
【０３７３】
参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願番号第６１／６７０，５５３号に開示される位置のうちの少なくとも１つまたは他の適切な挿入部位にＰＥＧを結合させる。ＦＶＩＩＩ発色性アッセイを用いてＰＥＧ化組換えＦＶＩＩＩタンパク質のＦＶＩＩＩ活性を分析する。上で説明したようにＨｅｍＡマウスとＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいてＰＥＧ化組換えＦＶＩＩＩタンパク質のＰＫを分析する。
【０３７４】
実施例１５：ＨｅｍＡ血漿およびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ二重ノックアウト（ＤＫＯ）血漿におけるＦＶＩＩＩの安定性
様々なＦＶＩＩＩＦｃ融合体の血漿安定性をＨｅｍＡ血漿またはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦダブル・ノックアウト（ＤＫＯ）血漿において試験した。安定性アッセイのために５ＩＵ／ｍｌの様々なＦＶＩＩＩＦｃタンパク質をマウスＨｅｍＡ血漿かＤＫＯ血漿のどちらかと３７℃で保温した。アリコットを様々な時点で採取してＦＶＩＩＩ発色性アッセイにより活性を測定した。各時点の活性を２つ組で測定し、そして、平均活性を時間の関数としてプロットした。
【０３７５】
ＦＶＩＩＩＦｃ免疫沈降アッセイのために５μｇのＦＶＩＩＩＦｃを２５０μｌのＰＢＳまたはマウスＤＫＯ血漿のどちらかと３７℃で２４時間保温した。５μｇのヒツジ抗ＦＶＩＩＩポリクローナル抗体（ａｂ６１３７０）を室温で１時間添加し、そして１００μｌのプロテインＡビーズを添加することによりＦＶＩＩＩＦｃを免疫沈降した。４回の１ｍｌのＰＢＳ洗浄の後にビーズを５０μｌの１×還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ緩衝液に再懸濁した。煮沸後に２０μｌの試料（すなわち、約１μｇのＦＶＩＩＩＦｃ）を４〜１５％Ｂｉｏ‐Ｒａｄ無染色ゲルに負荷した。ゲルをＢｉｏ‐ｒａｄシステムにより視覚化し、続いてＦＶＩＩＩ抗重鎖抗体（ＧＭＡ０１２）によりウェスタン分析した。
【０３７６】
ＦＶＩＩＩＦｃ（分離したＦＶＩＩＩ重鎖と軽鎖を有し、非共有結合性相互作用によってつなげられている二重鎖ＦＶＩＩＩ分子）の活性はＨｅｍＡ血漿とＤＫＯ血漿の両方で経時的に減少する（図１８Ａ）。ＶＷＦ介在性保護が無いため、ＦＶＩＩＩＦｃ活性の喪失はＤＫＯ血漿においてより顕著であった。ＦＶＩＩＩ活性のこの喪失は主にＦＶＩＩＩ重鎖（ＨＣ）の解離または分解のためであった。ＤＫＯ血漿中での２４時間の保温の後にＦＶＩＩＩＦｃ重鎖の約７５％の減少が観察された（図１８Ｂ）。軽鎖（ＬＣ）（データを示さず）または非プロセッシング化／単鎖ＦＶＩＩＩＦｃ（すなわち、軽鎖と重鎖がなお共有結合でつなげられているＦＶＩＩＩ分子、すなわち、ゲルの写真の中の一番上のバンド）（図１８Ｂ）のどちらにも著しい減少が観察されなかった。
【０３７７】
ＶＷＦがＦＶＩＩＩの安定性をインビボで増加させると主張されているので、我々は、キメラタンパク質であるＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦヘテロダイマー（ＦＶＩＩＩ１５５：ＶＷＦ３１、Ｆｃを介してＦＶＩＩＩに共有結合で結合したＶＷＦ  Ｄ’Ｄ３を有する）がＨｅｍＡ血漿およびＤＫＯ血漿においてより安定であるか試験した。図１９に示される血漿安定性データより、Ｄ’Ｄ３の存在がＨｅｍＡ血漿とＤＫＯ血漿の両方においてＦＶＩＩＩＦｃの安定性を増加させた。Ｄ’Ｄ３を有しない単鎖ＦＶＩＩＩＦｃ（ｓｃＦＶＩＩＩ）をこれらの実験において対照として使用した。図１９より、単鎖ＦＶＩＩＩは二重鎖ＦＶＩＩＩＦｃよりも安定であった。しかしながら、Ｄ’Ｄ３の存在が単鎖ＦＶＩＩＩＦｃ分子の血漿安定性をさらに著しく増加させた。このことは、Ｄ’Ｄ３が重鎖と軽鎖を一つにつなげることによるだけでなく、他のいくつかの未知の機構を介してＦＶＩＩＩを安定化することを示唆している。
【０３７８】
実施例１６：ＶＷＦプロセッシングのためのフューリン／ＰＡＣＥの使用
ＶＷＦは非常に大きいプロペプチド（すなわち、ＶＷＦのＤ１Ｄ２ドメイン、約８５ｋＤａ）を含有するという意味で独特のタンパク質である。ＶＷＦプロペプチドはＶＷＦ分子の適切な折り畳み構造のための内部シャペロンとして働く。２つの酵素、すなわち、ＰＣ５とフューリン（ＰＡＣＥ）をＶＷＦプロセッシングについて試験した。ＶＷＦ０３１コンストラクト（Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３Ｆｃ）を様々な濃度のＰＣ５またはＰＡＣＥのどちらかとＨＥＫ２９３細胞中に一時的に共形質移入した。４日後に組織培養培地を収集し、プロテインＡプルダウンの対象とした。より低い濃度（２．５％）であってもフューリン（ＰＡＣＥ）は１０％のＰＣ５よりもＤ’Ｄ３Ｆｃ（図２０）からのプロペプチド（Ｄ１Ｄ２）の除去に効率的であった。Ｄ１Ｄ２の存在がＤ’Ｄ３のＦＶＩＩＩとの相互作用の防止に関係があるとされているので、Ｄ１Ｄ２の除去は重要である。
【０３７９】
実施例１７：ＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦヘテロダイマー内のＶＷＦ断片がＦＶＩＩＩの全長ＶＷＦとの相互作用を防止する
ＦｏｒｔｅＢｉｏのＯｃｔｅｔ装置を使用してＦＶＩＩＩコンストラクト１５５／ＶＷＦ３１ヘテロダイマーの全長ＶＷＦへの結合を試験した（図２１Ａ）。結合アッセイのためにＡＰＳセンサーを使用して全長ＶＷＦを捕捉し、続いて１％のＢＳＡを用いてブロッキングを行った。ブロッキング後に様々なＦＶＩＩＩコンストラクトをＶＷＦ結合について試験した。予想通り、野生型ＦＶＩＩＩとＦＶＩＩＩＦｃはＶＷＦセンサーに強固に結合した。ＶＷＦに低い親和性しか持たない、または親和性を持たないことが知られているＦＶＩＩＩのＹ１６８０Ｆ変異体は著しく減少したＶＷＦ結合を示した。ＦＶＩＩＩ１５５／ＶＷＦ３１ヘテロダイマーは全長ＶＷＦに全く結合せず、ＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦヘテロダイマー中のＤ’Ｄ３によるＦＶＩＩＩの遮蔽を確認した。
【０３８０】
同じ実験を逆方向で実施して、ＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦヘテロダイマー中のＤ’Ｄ３部分が共有結合でＤ’Ｄ３に結合していない他のＦＶＩＩＩ分子と相互作用することができるか判定した。図２１Ｂに示されるように、プロテインＧセンサーに固定化されるとＶＷＦ３１（Ｄ’Ｄ３Ｆｃ）コンストラクトだけでもＦＶＩＩＩに強固に結合することができる。しかしながらＦＶＩＩＩ１５５：ＶＷＦ３１ヘテロダイマー中のＤ’Ｄ３はＦＶＩＩＩへのどのような結合も示さなかった。ＦＶＩＩＩと共にプロテインＧのみを対照として使用した。これらの結合実験により、ヘテロダイマー中のＤ’Ｄ３が共有結合でそれに結合している１個のみのＦＶＩＩＩ分子と相互作用し、ＦＶＩＩＩが全長野生型ＶＷＦ分子と相互作用することを防止することができることが確認された。
【０３８１】
ＦＶＩＩＩ分子に対するＶＷＦ  Ｄ’Ｄ３の正確な結合親和性を決定するためにＶＷＦ０３１を用いて表面プラズマ共鳴実験を実施した（図２２）。抗ヒトＩｇＧを使用することによりＶＷＦ０３１コンストラクト（Ｄ’Ｄ３Ｆｃ）を捕捉し、そして、Ｂ‐ドメイン欠失ＦＶＩＩＩをＤ’Ｄ３Ｆｃ含有チップの上に通した。約１０ｎＭのＫＤをＦＶＩＩＩについて観察した。この親和性は全長野生型ＶＷＦ分子と比べて約２５倍低く、これまでに文献中で報告されているものと類似している。
【０３８２】
実施例１８：Ｄ’Ｄ３とＦｃの中間にある様々なリンカーの長さのヘテロダイマー活性とＰＫに対する効果
Ｄ’Ｄ３とＦｃの中間にあるトロンビン切断可能リンカーの長さを変えることがＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦヘテロダイマーのＰＫと活性に対するどのような効果でも有するか調べるために様々なＶＷＦコンストラクトをＦＶＩＩＩ１５５と共に共発現した。表１４Ａに記載される３種の異なるリンカーの長さを有するコンストラクトを試験した（ＶＷＦ０３１、ＶＷＦ０３５およびＶＷＦ０３６）。各プラスミドをＦＶＩＩＩ１５５プラスミド（実施例５）と混合し、ＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。形質移入後第４日において細胞培養培地を回収し、１０ＩＵ／ｍｌのＦＶＩＩＩ発色活性まで濃縮した。
【０３８３】
濃縮された細胞培地を次に８〜１２週齢のＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスに１００ＩＵ／１０ｍＬ／ｋｇの用量で投与した。投与後５分、８時間、１６時間、２４時間、３２時間および４８時間の時点で血漿試料を採取した。血漿試料のＦＶＩＩＩ活性をＦＶＩＩＩ発色性アッセイにより分析し、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ‐Ｐｈｏｅｎｉｘプログラムを用いて半減期を計算した。
【０３８４】
図２３に示されるように、Ｄ’Ｄ３とＦｃ断片の間のリンカーの長さを４８アミノ酸から７３アミノ酸または９８アミノ酸までに増加させたとき、対応するＦＶＩＩＩＦｃ／ＶＷＦヘテロダイマーの半減期が増加し、そして、それぞれ１２．２時間と１３．３時間に達した。これは４８アミノ酸長の変異体の１．５〜１．６倍の増加である。これまでのところ、９８アミノ酸リンカーがＤ’Ｄ３断片のＦＶＩＩＩ保護活性を活用するのに最適なリンカーであり、そして、そのリンカーがＦＶＩＩＩＦｃ／ＶＷＦヘテロダイマーに組み入れられてその半減期をさらに改善する。
【０３８５】
ＦＶＩＩＩ活性に対するリンカーの効果を比較するために、様々なＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦヘテロダイマーを発現する細胞に由来する組織培養培地に対してＦＶＩＩＩ発色アッセイとａＰＴＴアッセイを実施した。ヘテロダイマーコンストラクトについてａＰＴＴ活性は発色活性と比べて２倍低下したが、リンカーがトロンビン部位の隣にＰＡＲ１部位も含有するときを除いて、様々なリンカーの間で著しい差異は見られなかった（表１４Ｂ）。
【表１４Ａ】
2020078338.tif 000044
【表１４Ｂ】
2020078338.tif 000045
【０３８６】
実施例１９：ソルターゼ酵素を使用するＦＶＩＩＩのＶＷＦ断片との結合
別の態様では、ＶＷＦ断片（例えば、Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３またはＤ’Ｄ３ドメイン）はソルターゼ介在性インビトロタンパク質連結方法を用いることによってＦＶＩＩＩに結合される。一例では、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ソルターゼＡ（ＬＰＸＴＧ）認識モチーフをＶＷＦ断片のＣ末端に導入し、Ｇｌｙ（ｎ）残基をＦＶＩＩＩのＮ末端に導入した（グリシン残基の数は変わり得る）。使用されるＦＶＩＩＩ分子は単鎖または二重鎖のどちらかであり得る。ソルターゼ触媒ペプチド転移反応はＶＷＦ断片を共有結合でＦＶＩＩＩに結合する。逆方向の認識モチーフもこれらの２つのタンパク質を結合するために使用することができ、その場合我々はＮ末端にＦＶＩＩＩを有し、Ｇｌｙ（ｎ）を有するＣ末端にＬＰＸＴＧモチーフとＶＷＦ断片を有する（ソルターゼ連結の参照例に図２４を見られたい）。ＬＰＸＴＧモチーフとグリシン残基を他のソルターゼ認識配列によって置換することができる。
【０３８７】
ソルターゼＡ認識配列を含有するＶＷＦ断片とＦｃの融合タンパク質も作製した。Ｆｃ融合コンストラクトのためにソルターゼ認識配列とトロンビン切断部位を含有するＧＳリンカーを介してＶＷＦ  Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３断片をＩｇＧのＦｃ領域と融合した（表１５および１６）。一旦、タンパク質を発現してプロテインＡカラムで精製すれば、Ｆｃ領域をトロンビン切断によって除去することができる。その後、結果生じるソルターゼＡ認識部位を有するＶＷＦ断片をＦＶＩＩＩ分子との連結のために使用することができる（図２４のＥ行、ソルターゼ連結の参照例）。
【０３８８】
ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０５１はＶＷＦ断片とＦｃ領域の中間にソルターゼ部位とトロンビン部位を含む５４アミノ酸リンカーを有する。５４アミノ酸リンカー（ＩＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＥＴＧＡＬＲＰＲＶＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号９８）とＦｃ領域の一部をコードするＤＮＡ断片の合成を外注した（Ｇｅｎｅｗｉｚ配列番号１０−２１０７４６３１３、下記参照）。そのＧｅｎｅｗｉｚコンストラクトの断片をＥｃｏＲＶ／ＲｓＲＩＩで消化したｐＳＹＮ‐ＶＷＦ‐０３１にサブクローン化した。
【０３８９】
Ｇｅｎｅｗｉｚ配列番号１０−２１０７４６３１３（配列番号９９）
AGGAGCCGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGGGGATCCTTACCTGAAACTGGAGCCCTGCGGCCCCGGGTCGTCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCGTCAGTCTT
【０３９０】
Ｎ末端ペンタグリシン含有単鎖ＦＶＩＩＩの配列が表１７および１８に示される。
表１５：ｐＳＹＮ‐ＶＷＦ０５１（ＶＷＦ断片とＦｃの中間にソルターゼＡ認識モチーフとトロンビン切断可能リンカーを有するＶＷＦ  Ｄ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３Ｆｃ）のヌクレオチド配列（配列番号１００）
1    ATGATTCCTG CCAGATTTGC CGGGGTGCTG CTTGCTCTGG CCCTCATTTT
51    GCCAGGGACC CTTTGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCA TCCACGGCCC
101    GATGCAGCCT TTTCGGAAGT GACTTCGTCA ACACCTTTGA TGGGAGCATG
151    TACAGCTTTG CGGGATACTG CAGTTACCTC CTGGCAGGGG GCTGCCAGAA
201    ACGCTCCTTC TCGATTATTG GGGACTTCCA GAATGGCAAG AGAGTGAGCC
251    TCTCCGTGTA TCTTGGGGAA TTTTTTGACA TCCATTTGTT TGTCAATGGT
301    ACCGTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATGCCCTATG CCTCCAAAGG
351    GCTGTATCTA GAAACTGAGG CTGGGTACTA CAAGCTGTCC GGTGAGGCCT
401    ATGGCTTTGT GGCCAGGATC GATGGCAGCG GCAACTTTCA AGTCCTGCTG
451    TCAGACAGAT ACTTCAACAA GACCTGCGGG CTGTGTGGCA ACTTTAACAT
501    CTTTGCTGAA GATGACTTTA TGACCCAAGA AGGGACCTTG ACCTCGGACC
551    CTTATGACTT TGCCAACTCA TGGGCTCTGA GCAGTGGAGA ACAGTGGTGT
601    GAACGGGCAT CTCCTCCCAG CAGCTCATGC AACATCTCCT CTGGGGAAAT
651    GCAGAAGGGC CTGTGGGAGC AGTGCCAGCT TCTGAAGAGC ACCTCGGTGT
701    TTGCCCGCTG CCACCCTCTG GTGGACCCCG AGCCTTTTGT GGCCCTGTGT
751    GAGAAGACTT TGTGTGAGTG TGCTGGGGGG CTGGAGTGCG CCTGCCCTGC
801    CCTCCTGGAG TACGCCCGGA CCTGTGCCCA GGAGGGAATG GTGCTGTACG
851    GCTGGACCGA CCACAGCGCG TGCAGCCCAG TGTGCCCTGC TGGTATGGAG
901    TATAGGCAGT GTGTGTCCCC TTGCGCCAGG ACCTGCCAGA GCCTGCACAT
951    CAATGAAATG TGTCAGGAGC GATGCGTGGA TGGCTGCAGC TGCCCTGAGG
1001    GACAGCTCCT GGATGAAGGC CTCTGCGTGG AGAGCACCGA GTGTCCCTGC
1051    GTGCATTCCG GAAAGCGCTA CCCTCCCGGC ACCTCCCTCT CTCGAGACTG
1101    CAACACCTGC ATTTGCCGAA ACAGCCAGTG GATCTGCAGC AATGAAGAAT
1151    GTCCAGGGGA GTGCCTTGTC ACTGGTCAAT CCCACTTCAA GAGCTTTGAC
1201    AACAGATACT TCACCTTCAG TGGGATCTGC CAGTACCTGC TGGCCCGGGA
1251    TTGCCAGGAC CACTCCTTCT CCATTGTCAT TGAGACTGTC CAGTGTGCTG
1301    ATGACCGCGA CGCTGTGTGC ACCCGCTCCG TCACCGTCCG GCTGCCTGGC
1351    CTGCACAACA GCCTTGTGAA ACTGAAGCAT GGGGCAGGAG TTGCCATGGA
1401    TGGCCAGGAC ATCCAGCTCC CCCTCCTGAA AGGTGACCTC CGCATCCAGC
1451    ATACAGTGAC GGCCTCCGTG CGCCTCAGCT ACGGGGAGGA CCTGCAGATG
1501    GACTGGGATG GCCGCGGGAG GCTGCTGGTG AAGCTGTCCC CCGTCTATGC
1551    CGGGAAGACC TGCGGCCTGT GTGGGAATTA CAATGGCAAC CAGGGCGACG
1601    ACTTCCTTAC CCCCTCTGGG CTGGCGGAGC CCCGGGTGGA GGACTTCGGG
1651    AACGCCTGGA AGCTGCACGG GGACTGCCAG GACCTGCAGA AGCAGCACAG
1701    CGATCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGCGT
1751    GCGCGGTCCT GACGTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG TGCCGTCAGC
1801    CCGCTGCCCT ACCTGCGGAA CTGCCGCTAC GACGTGTGCT CCTGCTCGGA
1851    CGGCCGCGAG TGCCTGTGCG GCGCCCTGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG
1901    CGGGGAGAGG CGTGCGCGTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCCG CTGTGAGCTG
1951    AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGCGGGACCC CCTGCAACCT
2001    GACCTGCCGC TCTCTCTCTT ACCCGGATGA GGAATGCAAT GAGGCCTGCC
2051    TGGAGGGCTG CTTCTGCCCC CCAGGGCTCT ACATGGATGA GAGGGGGGAC
2101    TGCGTGCCCA AGGCCCAGTG CCCCTGTTAC TATGACGGTG AGATCTTCCA
2151    GCCAGAAGAC ATCTTCTCAG ACCATCACAC CATGTGCTAC TGTGAGGATG
2201    GCTTCATGCA CTGTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCTT GCTGCCTGAC
2251    GCTGTCCTCA GCAGTCCCCT GTCTCATCGC AGCAAAAGGA GCCTATCCTG
2301    TCGGCCCCCC ATGGTCAAGC TGGTGTGTCC CGCTGACAAC CTGCGGGCTG
2351    AAGGGCTCGA GTGTACCAAA ACGTGCCAGA ACTATGACCT GGAGTGCATG
2401    AGCATGGGCT GTGTCTCTGG CTGCCTCTGC CCCCCGGGCA TGGTCCGGCA
2451    TGAGAACAGA TGTGTGGCCC TGGAAAGGTG TCCCTGCTTC CATCAGGGCA
2501    AGGAGTATGC CCCTGGAGAA ACAGTGAAGA TTGGCTGCAA CACTTGTGTC
2551    TGTCGGGACC GGAAGTGGAA CTGCACAGAC CATGTGTGTG ATGCCACGTG
2601    CTCCACGATC GGCATGGCCC ACTACCTCAC CTTCGACGGG CTCAAATACC
2651    TGTTCCCCGG GGAGTGCCAG TACGTTCTGG TGCAGGATTA CTGCGGCAGT
2701    AACCCTGGGA CCTTTCGGAT CCTAGTGGGG AATAAGGGAT GCAGCCACCC
2751    CTCAGTGAAA TGCAAGAAAC GGGTCACCAT CCTGGTGGAG GGAGGAGAGA
2801    TTGAGCTGTT TGACGGGGAG GTGAATGTGA AGAGGCCCAT GAAGGATGAG
2851    ACTCACTTTG AGGTGGTGGA GTCTGGCCGG TACATCATTC TGCTGCTGGG
2901    CAAAGCCCTC TCCGTGGTCT GGGACCGCCA CCTGAGCATC TCCGTGGTCC
2951    TGAAGCAGAC ATACCAGGAG AAAGTGTGTG GCCTGTGTGG GAATTTTGAT
3001    GGCATCCAGA ACAATGACCT CACCAGCAGC AACCTCCAAG TGGAGGAAGA
3051    CCCTGTGGAC TTTGGGAACT CCTGGAAAGT GAGCTCGCAG TGTGCTGACA
3101    CCAGAAAAGT GCCTCTGGAC TCATCCCCTG CCACCTGCCA TAACAACATC
3151    ATGAAGCAGA CGATGGTGGA TTCCTCCTGT AGAATCCTTA CCAGTGACGT
3201    CTTCCAGGAC TGCAACAAGC TGGTGGACCC CGAGCCATAT CTGGATGTCT
3251    GCATTTACGA CACCTGCTCC TGTGAGTCCA TTGGGGACTG CGCCGCATTC
3301    TGCGACACCA TTGCTGCCTA TGCCCACGTG TGTGCCCAGC ATGGCAAGGT
3351    GGTGACCTGG AGGACGGCCA CATTGTGCCC CCAGAGCTGC GAGGAGAGGA
3401    ATCTCCGGGA GAACGGGTAT GAGGCTGAGT GGCGCTATAA CAGCTGTGCA
3451    CCTGCCTGTC AAGTCACGTG TCAGCACCCT GAGCCACTGG CCTGCCCTGT
3501    GCAGTGTGTG GAGGGCTGCC ATGCCCACTG CCCTCCAGGG AAAATCCTGG
3551    ATGAGCTTTT GCAGACCTGC GTTGACCCTG AAGACTGTCC AGTGTGTGAG
3601    GTGGCTGGCC GGCGTTTTGC CTCAGGAAAG AAAGTCACCT TGAATCCCAG
3651    TGACCCTGAG CACTGCCAGA TTTGCCACTG TGATGTTGTC AACCTCACCT
3701    GTGAAGCCTG CCAGGAGCCG ATATCTGGCG GTGGAGGTTC CGGTGGCGGG
3751    GGATCCGGCG GTGGAGGTTC CGGCGGTGGA GGTTCCGGTG GCGGGGGATC
3801    CGGTGGCGGG GGATCCTTAC CTGAAACTGG AGCCCTGCGG CCCCGGGTCG
3851    TCGGCGGTGG AGGTTCCGGT GGCGGGGGAT CCGACAAAAC TCACACATGC
3901    CCACCGTGCC CAGCTCCAGA ACTCCTGGGC GGACCGTCAG TCTTCCTCTT
3951    CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA
4001    CATGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC
4051    TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA
4101    GGAGCAGTAC AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC
4151    ACCAGGACTG GCTGAATGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA
4201    GCCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC
4251    CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAT GAGCTGACCA
4301    AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC
4351    ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC
4401    CACGCCTCCC GTGTTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC
4451    TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC
4501    GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT
4551    GTCTCCGGGT AAATGA                                     
【表１６−１】
2020078338.tif 000046
【表１６−２】
2020078338.tif 000047
表１７：ＦＶＩＩＩ２６５（Ｎ末端にペンタグリシンを有するＦＶＩＩＩ単鎖分子）のヌクレオチド配列（配列番号１０２）
1    ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG
51    CTTTAGTGGA GGAGGAGGAG GAGCCACCAG AAGATACTAC CTGGGTGCAG
101    TGGAACTGTC ATGGGACTAT ATGCAAAGTG ATCTCGGTGA GCTGCCTGTG
151    GACGCAAGAT TTCCTCCTAG AGTGCCAAAA TCTTTTCCAT TCAACACCTC
201    AGTCGTGTAC AAAAAGACTC TGTTTGTAGA ATTCACGGAT CACCTTTTCA
251    ACATCGCTAA GCCAAGGCCA CCCTGGATGG GTCTGCTAGG TCCTACCATC
301    CAGGCTGAGG TTTATGATAC AGTGGTCATT ACACTTAAGA ACATGGCTTC
351    CCATCCTGTC AGTCTTCATG CTGTTGGTGT ATCCTACTGG AAAGCTTCTG
401    AGGGAGCTGA ATATGATGAT CAGACCAGTC AAAGGGAGAA AGAAGATGAT
451    AAAGTCTTCC CTGGTGGAAG CCATACATAT GTCTGGCAGG TCCTGAAAGA
501    GAATGGTCCA ATGGCCTCTG ACCCACTGTG CCTTACCTAC TCATATCTTT
551    CTCATGTGGA CCTGGTAAAA GACTTGAATT CAGGCCTCAT TGGAGCCCTA
601    CTAGTATGTA GAGAAGGGAG TCTGGCCAAG GAAAAGACAC AGACCTTGCA
651    CAAATTTATA CTACTTTTTG CTGTATTTGA TGAAGGGAAA AGTTGGCACT
701    CAGAAACAAA GAACTCCTTG ATGCAGGATA GGGATGCTGC ATCTGCTCGG
751    GCCTGGCCTA AAATGCACAC AGTCAATGGT TATGTAAACA GGTCTCTGCC
801    AGGTCTGATT GGATGCCACA GGAAATCAGT CTATTGGCAT GTGATTGGAA
851    TGGGCACCAC TCCTGAAGTG CACTCAATAT TCCTCGAAGG TCACACATTT
901    CTTGTGAGGA ACCATCGCCA GGCGTCCTTG GAAATCTCGC CAATAACTTT
951    CCTTACTGCT CAAACACTCT TGATGGACCT TGGACAGTTT CTACTGTTTT
1001    GTCATATCTC TTCCCACCAA CATGATGGCA TGGAAGCTTA TGTCAAAGTA
1051    GACAGCTGTC CAGAGGAACC CCAACTACGA ATGAAAAATA ATGAAGAAGC
1101    GGAAGACTAT GATGATGATC TTACTGATTC TGAAATGGAT GTGGTCAGGT
1151    TTGATGATGA CAACTCTCCT TCCTTTATCC AAATTCGCTC AGTTGCCAAG
1201    AAGCATCCTA AAACTTGGGT ACATTACATT GCTGCTGAAG AGGAGGACTG
1251    GGACTATGCT CCCTTAGTCC TCGCCCCCGA TGACAGAAGT TATAAAAGTC
1301    AATATTTGAA CAATGGCCCT CAGCGGATTG GTAGGAAGTA CAAAAAAGTC
1351    CGATTTATGG CATACACAGA TGAAACCTTT AAGACTCGTG AAGCTATTCA
1401    GCATGAATCA GGAATCTTGG GACCTTTACT TTATGGGGAA GTTGGAGACA
1451    CACTGTTGAT TATATTTAAG AATCAAGCAA GCAGACCATA TAACATCTAC
1501    CCTCACGGAA TCACTGATGT CCGTCCTTTG TATTCAAGGA GATTACCAAA
1551    AGGTGTAAAA CATTTGAAGG ATTTTCCAAT TCTGCCAGGA GAAATATTCA
1601    AATATAAATG GACAGTGACT GTAGAAGATG GGCCAACTAA ATCAGATCCT
1651    CGGTGCCTGA CCCGCTATTA CTCTAGTTTC GTTAATATGG AGAGAGATCT
1701    AGCTTCAGGA CTCATTGGCC CTCTCCTCAT CTGCTACAAA GAATCTGTAG
1751    ATCAAAGAGG AAACCAGATA ATGTCAGACA AGAGGAATGT CATCCTGTTT
1801    TCTGTATTTG ATGAGAACCG AAGCTGGTAC CTCACAGAGA ATATACAACG
1851    CTTTCTCCCC AATCCAGCTG GAGTGCAGCT TGAGGATCCA GAGTTCCAAG
1901    CCTCCAACAT CATGCACAGC ATCAATGGCT ATGTTTTTGA TAGTTTGCAG
1951    TTGTCAGTTT GTTTGCATGA GGTGGCATAC TGGTACATTC TAAGCATTGG
2001    AGCACAGACT GACTTCCTTT CTGTCTTCTT CTCTGGATAT ACCTTCAAAC
2051    ACAAAATGGT CTATGAAGAC ACACTCACCC TATTCCCATT CTCAGGAGAA
2101    ACTGTCTTCA TGTCGATGGA AAACCCAGGT CTATGGATTC TGGGGTGCCA
2151    CAACTCAGAC TTTCGGAACA GAGGCATGAC CGCCTTACTG AAGGTTTCTA
2201    GTTGTGACAA GAACACTGGT GATTATTACG AGGACAGTTA TGAAGATATT
2251    TCAGCATACT TGCTGAGTAA AAACAATGCC ATTGAACCAA GAAGCTTCTC
2301    TCAAAACCCA CCAGTCTTGA AGGCCCATCA GGCCGAAATA ACTCGTACTA
2351    CTCTTCAGTC AGATCAAGAG GAAATTGACT ATGATGATAC CATATCAGTT
2401    GAAATGAAGA AGGAAGATTT TGACATTTAT GATGAGGATG AAAATCAGAG
2451    CCCCCGCAGC TTTCAAAAGA AAACACGACA CTATTTTATT GCTGCAGTGG
2501    AGAGGCTCTG GGATTATGGG ATGAGTAGCT CCCCACATGT TCTAAGAAAC
2551    AGGGCTCAGA GTGGCAGTGT CCCTCAGTTC AAGAAAGTTG TTTTCCAGGA
2601    ATTTACTGAT GGCTCCTTTA CTCAGCCCTT ATACCGTGGA GAACTAAATG
2651    AACATTTGGG CCTCCTCGGC CCATATATAA GAGCAGAAGT TGAAGATAAT
2701    ATCATGGTAA CTTTCAGAAA TCAGGCCTCT CGTCCCTATT CCTTCTATTC
2751    TAGCCTTATT TCTTATGAGG AAGATCAGAG GCAAGGAGCA GAACCTAGAA
2801    AAAACTTTGT CAAGCCTAAT GAAACCAAAA CTTACTTTTG GAAAGTGCAA
2851    CATCATATGG CACCCACTAA AGATGAGTTT GACTGCAAAG CCTGGGCTTA
2901    TTTCTCTGAT GTTGACCTGG AAAAAGATGT GCACTCAGGC CTGATTGGAC
2951    CCCTTCTGGT CTGCCACACT AACACACTGA ACCCTGCTCA TGGGAGACAA
3001    GTGACAGTAC AGGAATTTGC TCTGTTTTTC ACCATCTTTG ATGAGACCAA
3051    AAGCTGGTAC TTCACTGAAA ATATGGAAAG AAACTGCAGG GCTCCCTGCA
3101    ATATCCAGAT GGAAGATCCC ACTTTTAAAG AGAATTATCG CTTCCATGCA
3151    ATCAATGGCT ACATAATGGA TACACTACCT GGCTTAGTAA TGGCTCAGGA
3201    TCAAAGGATT CGATGGTATC TGCTCAGCAT GGGCAGCAAT GAAAACATCC
3251    ATTCTATTCA TTTCAGTGGA CATGTGTTCA CTGTACGAAA AAAAGAGGAG
3301    TATAAAATGG CACTGTACAA TCTCTATCCA GGTGTTTTTG AGACAGTGGA
3351    AATGTTACCA TCCAAAGCTG GAATTTGGCG GGTGGAATGC CTTATTGGCG
3401    AGCATCTACA TGCTGGGATG AGCACACTTT TTCTGGTGTA CAGCAATAAG
3451    TGTCAGACTC CCCTGGGAAT GGCTTCTGGA CACATTAGAG ATTTTCAGAT
3501    TACAGCTTCA GGACAATATG GACAGTGGGC CCCAAAGCTG GCCAGACTTC
3551    ATTATTCCGG ATCAATCAAT GCCTGGAGCA CCAAGGAGCC CTTTTCTTGG
3601    ATCAAGGTGG ATCTGTTGGC ACCAATGATT ATTCACGGCA TCAAGACCCA
3651    GGGTGCCCGT CAGAAGTTCT CCAGCCTCTA CATCTCTCAG TTTATCATCA
3701    TGTATAGTCT TGATGGGAAG AAGTGGCAGA CTTATCGAGG AAATTCCACT
3751    GGAACCTTAA TGGTCTTCTT TGGCAATGTG GATTCATCTG GGATAAAACA
3801    CAATATTTTT AACCCTCCAA TTATTGCTCG ATACATCCGT TTGCACCCAA
3851    CTCATTATAG CATTCGCAGC ACTCTTCGCA TGGAGTTGAT GGGCTGTGAT
3901    TTAAATAGTT GCAGCATGCC ATTGGGAATG GAGAGTAAAG CAATATCAGA
3951    TGCACAGATT ACTGCTTCAT CCTACTTTAC CAATATGTTT GCCACCTGGT
4001    CTCCTTCAAA AGCTCGACTT CACCTCCAAG GGAGGAGTAA TGCCTGGAGA
4051    CCTCAGGTGA ATAATCCAAA AGAGTGGCTG CAAGTGGACT TCCAGAAGAC
4101    AATGAAAGTC ACAGGAGTAA CTACTCAGGG AGTAAAATCT CTGCTTACCA
4151    GCATGTATGT GAAGGAGTTC CTCATCTCCA GCAGTCAAGA TGGCCATCAG
4201    TGGACTCTCT TTTTTCAGAA TGGCAAAGTA AAGGTTTTTC AGGGAAATCA
4251    AGACTCCTTC ACACCTGTGG TGAACTCTCT AGACCCACCG TTACTGACTC
4301    GCTACCTTCG AATTCACCCC CAGAGTTGGG TGCACCAGAT TGCCCTGAGG
4351    ATGGAGGTTC TGGGCTGCGA GGCACAGGAC CTCTACTGA            
【表１８−１】
2020078338.tif 000048
【表１８−２】
2020078338.tif 000049
【０３９１】
実施例２０：ＨｅｍＡ血漿およびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ二重ノックアウト（ＤＫＯ）血漿におけるＦＶＩＩＩ１９８の血漿安定性およびＰＫ
ＦＶＩＩＩ１９８（単鎖ＦＶＩＩＩＦｃ分子‐２２６Ｎ６を含有する部分的Ｂ‐ドメインである；２２６はＦＶＩＩＩ  Ｂ‐ドメインのＮ末端２２６アミノ酸を表し、Ｎ６はＢ‐ドメイン中の６つのＮ−グリコシル化部位を表す）の血漿安定性をＦＶＩＩＩ／ＶＷＦダブル・ノックアウト（ＤＫＯ）血漿中において単鎖ＦＶＩＩＩＦｃ（ＦＶＩＩＩ１５５／Ｆｃ）と比較した。ＦＶＩＩＩ１５５とＦＶＩＩＩ１９８の模式図を図２５に見ることができる。
【０３９２】
安定性アッセイのために５ＩＵ／ｍｌのＦＶＩＩＩ１９８タンパク質またはＦＶＩＩＩＦｃタンパク質をマウス血漿またはＤＫＯ血漿と３７℃で保温した。ＦＶＩＩＩ発色性アッセイによる活性測定のためにアリコットを様々な時点で採取した。各時点における活性を２つ組で測定し、そして、平均活性を時間の関数としてプロットした。安定性アッセイでは部分的Ｂ‐ドメインの存在が単鎖ＦＶＩＩＩＦｃの安定性を増加させた（図２６Ａ）。
【０３９３】
ＦＶＩＩＩ１９８（単鎖−Ｂ２２６Ｎ６）の半減期もＤＫＯマウスにおいてＦＶＩＩＩ１５５（単鎖Ｂ‐ドメイン欠失ＦＶＩＩＩ）と比較した。ＦＶＩＩＩ１９８はＦＶＩＩＩ１５５と比べて少なくとも約１．５倍長い半減期を有する（図２６Ｂ）。これらの実験は、ＦＶＩＩＩ安定性とそのインビボ半減期の間に相関があり得ると示唆している。
ＦＶＩＩＩ１９８（部分的Ｂ‐ドメインである２２６Ｎ６を有するＦＶＩＩＩＦｃ）のヌクレオチド配列（配列番号１０４）
1    ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG
51    CTTTAGTGCC ACCAGAAGAT ACTACCTGGG TGCAGTGGAA CTGTCATGGG
101    ACTATATGCA AAGTGATCTC GGTGAGCTGC CTGTGGACGC AAGATTTCCT
151    CCTAGAGTGC CAAAATCTTT TCCATTCAAC ACCTCAGTCG TGTACAAAAA
201    GACTCTGTTT GTAGAATTCA CGGATCACCT TTTCAACATC GCTAAGCCAA
251    GGCCACCCTG GATGGGTCTG CTAGGTCCTA CCATCCAGGC TGAGGTTTAT
301    GATACAGTGG TCATTACACT TAAGAACATG GCTTCCCATC CTGTCAGTCT
351    TCATGCTGTT GGTGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCTGAATATG
401    ATGATCAGAC CAGTCAAAGG GAGAAAGAAG ATGATAAAGT CTTCCCTGGT
451    GGAAGCCATA CATATGTCTG GCAGGTCCTG AAAGAGAATG GTCCAATGGC
501    CTCTGACCCA CTGTGCCTTA CCTACTCATA TCTTTCTCAT GTGGACCTGG
551    TAAAAGACTT GAATTCAGGC CTCATTGGAG CCCTACTAGT ATGTAGAGAA
601    GGGAGTCTGG CCAAGGAAAA GACACAGACC TTGCACAAAT TTATACTACT
651    TTTTGCTGTA TTTGATGAAG GGAAAAGTTG GCACTCAGAA ACAAAGAACT
701    CCTTGATGCA GGATAGGGAT GCTGCATCTG CTCGGGCCTG GCCTAAAATG
751    CACACAGTCA ATGGTTATGT AAACAGGTCT CTGCCAGGTC TGATTGGATG
801    CCACAGGAAA TCAGTCTATT GGCATGTGAT TGGAATGGGC ACCACTCCTG
851    AAGTGCACTC AATATTCCTC GAAGGTCACA CATTTCTTGT GAGGAACCAT
901    CGCCAGGCGT CCTTGGAAAT CTCGCCAATA ACTTTCCTTA CTGCTCAAAC
951    ACTCTTGATG GACCTTGGAC AGTTTCTACT GTTTTGTCAT ATCTCTTCCC
1001    ACCAACATGA TGGCATGGAA GCTTATGTCA AAGTAGACAG CTGTCCAGAG
1051    GAACCCCAAC TACGAATGAA AAATAATGAA GAAGCGGAAG ACTATGATGA
1101    TGATCTTACT GATTCTGAAA TGGATGTGGT CAGGTTTGAT GATGACAACT
1151    CTCCTTCCTT TATCCAAATT CGCTCAGTTG CCAAGAAGCA TCCTAAAACT
1201    TGGGTACATT ACATTGCTGC TGAAGAGGAG GACTGGGACT ATGCTCCCTT
1251    AGTCCTCGCC CCCGATGACA GAAGTTATAA AAGTCAATAT TTGAACAATG
1301    GCCCTCAGCG GATTGGTAGG AAGTACAAAA AAGTCCGATT TATGGCATAC
1351    ACAGATGAAA CCTTTAAGAC TCGTGAAGCT ATTCAGCATG AATCAGGAAT
1401    CTTGGGACCT TTACTTTATG GGGAAGTTGG AGACACACTG TTGATTATAT
1451    TTAAGAATCA AGCAAGCAGA CCATATAACA TCTACCCTCA CGGAATCACT
1501    GATGTCCGTC CTTTGTATTC AAGGAGATTA CCAAAAGGTG TAAAACATTT
1551    GAAGGATTTT CCAATTCTGC CAGGAGAAAT ATTCAAATAT AAATGGACAG
1601    TGACTGTAGA AGATGGGCCA ACTAAATCAG ATCCTCGGTG CCTGACCCGC
1651    TATTACTCTA GTTTCGTTAA TATGGAGAGA GATCTAGCTT CAGGACTCAT
1701    TGGCCCTCTC CTCATCTGCT ACAAAGAATC TGTAGATCAA AGAGGAAACC
1751    AGATAATGTC AGACAAGAGG AATGTCATCC TGTTTTCTGT ATTTGATGAG
1801    AACCGAAGCT GGTACCTCAC AGAGAATATA CAACGCTTTC TCCCCAATCC
1851    AGCTGGAGTG CAGCTTGAGG ATCCAGAGTT CCAAGCCTCC AACATCATGC
1901    ACAGCATCAA TGGCTATGTT TTTGATAGTT TGCAGTTGTC AGTTTGTTTG
1951    CATGAGGTGG CATACTGGTA CATTCTAAGC ATTGGAGCAC AGACTGACTT
2001    CCTTTCTGTC TTCTTCTCTG GATATACCTT CAAACACAAA ATGGTCTATG
2051    AAGACACACT CACCCTATTC CCATTCTCAG GAGAAACTGT CTTCATGTCG
2101    ATGGAAAACC CAGGTCTATG GATTCTGGGG TGCCACAACT CAGACTTTCG
2151    GAACAGAGGC ATGACCGCCT TACTGAAGGT TTCTAGTTGT GACAAGAACA
2201    CTGGTGATTA TTACGAGGAC AGTTATGAAG ATATTTCAGC ATACTTGCTG
2251    AGTAAAAACA ATGCCATTGA ACCAAGAAGC TTCTCTCAGA ATTCAAGACA
2301    CCCTAGCACT AGGCAAAAGC AATTTAATGC CACCACAATT CCAGAAAATG
2351    ACATAGAGAA GACTGACCCT TGGTTTGCAC ACAGAACACC TATGCCTAAA
2401    ATACAAAATG TCTCCTCTAG TGATTTGTTG ATGCTCTTGC GACAGAGTCC
2451    TACTCCACAT GGGCTATCCT TATCTGATCT CCAAGAAGCC AAATATGAGA
2501    CTTTTTCTGA TGATCCATCA CCTGGAGCAA TAGACAGTAA TAACAGCCTG
2551    TCTGAAATGA CACACTTCAG GCCACAGCTC CATCACAGTG GGGACATGGT
2601    ATTTACCCCT GAGTCAGGCC TCCAATTAAG ATTAAATGAG AAACTGGGGA
2651    CAACTGCAGC AACAGAGTTG AAGAAACTTG ATTTCAAAGT TTCTAGTACA
2701    TCAAATAATC TGATTTCAAC AATTCCATCA GACAATTTGG CAGCAGGTAC
2751    TGATAATACA AGTTCCTTAG GACCCCCAAG TATGCCAGTT CATTATGATA
2801    GTCAATTAGA TACCACTCTA TTTGGCAAAA AGTCATCTCC CCTTACTGAG
2851    TCTGGTGGAC CTCTGAGCTT GAGTGAAGAA AATAATGATT CAAAGTTGTT
2901    AGAATCAGGT TTAATGAATA GCCAAGAAAG TTCATGGGGA AAAAATGTAT
2951    CGTCAGAAAT AACTCGTACT ACTCTTCAGT CAGATCAAGA GGAAATTGAC
3001    TATGATGATA CCATATCAGT TGAAATGAAG AAGGAAGATT TTGACATTTA
3051    TGATGAGGAT GAAAATCAGA GCCCCCGCAG CTTTCAAAAG AAAACACGAC
3101    ACTATTTTAT TGCTGCAGTG GAGAGGCTCT GGGATTATGG GATGAGTAGC
3151    TCCCCACATG TTCTAAGAAA CAGGGCTCAG AGTGGCAGTG TCCCTCAGTT
3201    CAAGAAAGTT GTTTTCCAGG AATTTACTGA TGGCTCCTTT ACTCAGCCCT
3251    TATACCGTGG AGAACTAAAT GAACATTTGG GACTCCTGGG GCCATATATA
3301    AGAGCAGAAG TTGAAGATAA TATCATGGTA ACTTTCAGAA ATCAGGCCTC
3351    TCGTCCCTAT TCCTTCTATT CTAGCCTTAT TTCTTATGAG GAAGATCAGA
3401    GGCAAGGAGC AGAACCTAGA AAAAACTTTG TCAAGCCTAA TGAAACCAAA
3451    ACTTACTTTT GGAAAGTGCA ACATCATATG GCACCCACTA AAGATGAGTT
3501    TGACTGCAAA GCCTGGGCTT ATTTCTCTGA TGTTGACCTG GAAAAAGATG
3551    TGCACTCAGG CCTGATTGGA CCCCTTCTGG TCTGCCACAC TAACACACTG
3601    AACCCTGCTC ATGGGAGACA AGTGACAGTA CAGGAATTTG CTCTGTTTTT
3651    CACCATCTTT GATGAGACCA AAAGCTGGTA CTTCACTGAA AATATGGAAA
3701    GAAACTGCAG GGCTCCCTGC AATATCCAGA TGGAAGATCC CACTTTTAAA
3751    GAGAATTATC GCTTCCATGC AATCAATGGC TACATAATGG ATACACTACC
3801    TGGCTTAGTA ATGGCTCAGG ATCAAAGGAT TCGATGGTAT CTGCTCAGCA
3851    TGGGCAGCAA TGAAAACATC CATTCTATTC ATTTCAGTGG ACATGTGTTC
3901    ACTGTACGAA AAAAAGAGGA GTATAAAATG GCACTGTACA ATCTCTATCC
3951    AGGTGTTTTT GAGACAGTGG AAATGTTACC ATCCAAAGCT GGAATTTGGC
4001    GGGTGGAATG CCTTATTGGC GAGCATCTAC ATGCTGGGAT GAGCACACTT
4051    TTTCTGGTGT ACAGCAATAA GTGTCAGACT CCCCTGGGAA TGGCTTCTGG
4101    ACACATTAGA GATTTTCAGA TTACAGCTTC AGGACAATAT GGACAGTGGG
4151    CCCCAAAGCT GGCCAGACTT CATTATTCCG GATCAATCAA TGCCTGGAGC
4201    ACCAAGGAGC CCTTTTCTTG GATCAAGGTG GATCTGTTGG CACCAATGAT
4251    TATTCACGGC ATCAAGACCC AGGGTGCCCG TCAGAAGTTC TCCAGCCTCT
4301    ACATCTCTCA GTTTATCATC ATGTATAGTC TTGATGGGAA GAAGTGGCAG
4351    ACTTATCGAG GAAATTCCAC TGGAACCTTA ATGGTCTTCT TTGGCAATGT
4401    GGATTCATCT GGGATAAAAC ACAATATTTT TAACCCTCCA ATTATTGCTC
4451    GATACATCCG TTTGCACCCA ACTCATTATA GCATTCGCAG CACTCTTCGC
4501    ATGGAGTTGA TGGGCTGTGA TTTAAATAGT TGCAGCATGC CATTGGGAAT
4551    GGAGAGTAAA GCAATATCAG ATGCACAGAT TACTGCTTCA TCCTACTTTA
4601    CCAATATGTT TGCCACCTGG TCTCCTTCAA AAGCTCGACT TCACCTCCAA
4651    GGGAGGAGTA ATGCCTGGAG ACCTCAGGTG AATAATCCAA AAGAGTGGCT
4701    GCAAGTGGAC TTCCAGAAGA CAATGAAAGT CACAGGAGTA ACTACTCAGG
4751    GAGTAAAATC TCTGCTTACC AGCATGTATG TGAAGGAGTT CCTCATCTCC
4801    AGCAGTCAAG ATGGCCATCA GTGGACTCTC TTTTTTCAGA ATGGCAAAGT
4851    AAAGGTTTTT CAGGGAAATC AAGACTCCTT CACACCTGTG GTGAACTCTC
4901    TAGACCCACC GTTACTGACT CGCTACCTTC GAATTCACCC CCAGAGTTGG
4951    GTGCACCAGA TTGCCCTGAG GATGGAGGTT CTGGGCTGCG AGGCACAGGA
5001    CCTCTACGAC AAAACTCACA CATGCCCACC GTGCCCAGCT CCAGAACTCC
5051    TGGGCGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAACCCAA GGACACCCTC
5101    ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACATGC GTGGTGGTGG ACGTGAGCCA
5151    CGAAGACCCT GAGGTCAAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC GTGGAGGTGC
5201    ATAATGCCAA GACAAAGCCG CGGGAGGAGC AGTACAACAG CACGTACCGT
5251    GTGGTCAGCG TCCTCACCGT CCTGCACCAG GACTGGCTGA ATGGCAAGGA
5301    GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGCCCT CCCAGCCCCC ATCGAGAAAA
5351    CCATCTCCAA AGCCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTACACCCTG
5401    CCCCCATCCC GGGATGAGCT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT
5451    GGTCAAAGGC TTCTATCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG GAGAGCAATG
5501    GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACGC CTCCCGTGTT GGACTCCGAC
5551    GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA
5601    GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC
5651    ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAATG A         
ＦＶＩＩＩ１９８のタンパク質配列（配列番号１０５）
1    MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP
51    PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
101    DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
151    GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
201    GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
251    HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
301    RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
351    EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
401    WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
451    TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
501    DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
551    YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
601    NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
651    HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
701    MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
751    SKNNAIEPRS FSQNSRHPST RQKQFNATTI PENDIEKTDP WFAHRTPMPK
801    IQNVSSSDLL MLLRQSPTPH GLSLSDLQEA KYETFSDDPS PGAIDSNNSL
851    SEMTHFRPQL HHSGDMVFTP ESGLQLRLNE KLGTTAATEL KKLDFKVSST
901    SNNLISTIPS DNLAAGTDNT SSLGPPSMPV HYDSQLDTTL FGKKSSPLTE
951    SGGPLSLSEE NNDSKLLESG LMNSQESSWG KNVSSEITRT TLQSDQEEID
1001    YDDTISVEMK KEDFDIYDED ENQSPRSFQK KTRHYFIAAV ERLWDYGMSS
1051    SPHVLRNRAQ SGSVPQFKKV VFQEFTDGSF TQPLYRGELN EHLGLLGPYI
1101    RAEVEDNIMV TFRNQASRPY SFYSSLISYE EDQRQGAEPR KNFVKPNETK
1151    TYFWKVQHHM APTKDEFDCK AWAYFSDVDL EKDVHSGLIG PLLVCHTNTL
1201    NPAHGRQVTV QEFALFFTIF DETKSWYFTE NMERNCRAPC NIQMEDPTFK
1251    ENYRFHAING YIMDTLPGLV MAQDQRIRWY LLSMGSNENI HSIHFSGHVF
1301    TVRKKEEYKM ALYNLYPGVF ETVEMLPSKA GIWRVECLIG EHLHAGMSTL
1351    FLVYSNKCQT PLGMASGHIR DFQITASGQY GQWAPKLARL HYSGSINAWS
1401    TKEPFSWIKV DLLAPMIIHG IKTQGARQKF SSLYISQFII MYSLDGKKWQ
1451    TYRGNSTGTL MVFFGNVDSS GIKHNIFNPP IIARYIRLHP THYSIRSTLR
1501    MELMGCDLNS CSMPLGMESK AISDAQITAS SYFTNMFATW SPSKARLHLQ
1551    GRSNAWRPQV NNPKEWLQVD FQKTMKVTGV TTQGVKSLLT SMYVKEFLIS
1601    SSQDGHQWTL FFQNGKVKVF QGNQDSFTPV VNSLDPPLLT RYLRIHPQSW
1651    VHQIALRMEV LGCEAQDLYD KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL
1701    MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR
1751    VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL
1801    PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD
1851    GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK*
【０３９４】
実施例２１．ＶＷＦのＤ１Ｄ２タンパク質の発現
Ｄ’Ｄ３ドメインの適切な折り畳み構造はそのＦＶＩＩＩへの結合に必須である。ＶＷＦプロペプチド（Ｄ１Ｄ２−アミノ酸１〜７６３）が効率的なジスルフィド結合の形成とＤ’Ｄ３の折畳みに必要とされる。それはＤ’Ｄ３の折畳みの内部シャペロンとして作用する。ＶＷＦ断片を作製するＶＷＦコンストラクトは発現してＶＷＦプロペプチド（すなわち、Ｄ１Ｄ２ドメイン）がＤ’Ｄ３ドメインに直接的に結合し、Ｄ’Ｄ３の規則的な（すなわち、ｃｉｓでの）細胞内プロセッシングの間に除去され得るか、他のプラスミド、すなわちｔｒａｎｓで発現し得る。我々は、Ｄ１Ｄ２がｃｉｓまたはｔｒａｎｓのどちらかで発現することができるような方式でＦＶＩＩＩ‐ＶＷＦヘテロダイマーを消化した。
【０３９５】
クローニングＶＷＦ０５３：ＶＷＦ０５３クローンはＤ１Ｄ２のｔｒａｎｓでの発現のためにＶＷＦプロペプチド（Ｄ１Ｄ２ドメイン）を発現する。ＶＷＦプロペプチドはＥＳＣ５４とＥＳＣ１２４を使用して全長からＰＣＲ増幅された。
ＢｓｉＷＩ部位を有するＥＳＣ５４‐ＶＷＦフォワード（配列番号１１１）
（ＣＧＣＴＴＣＧＣＧＡＣＧＴＡＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＣＧＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＴＧＣＴＣ）
ＮｏｔＩ部位を有するＥＳＣ１２４−Ｄ１Ｄ２クローニングオリゴ‐リバース（配列番号１１２）
（ＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＣＴＴＴＴＧＣＴＧＣＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＧＣ）
【０３９６】
ＰＣＲ産物はＢｓｉＷＩとＮｏｔＩで消化され、そして、ＢｓｉＷＩ／ＮｏｔＩで消化されたｐＣＤＮＡ４にライゲーションされた。
ＶＷＦ０５３（ＶＷＦ  Ｄ１Ｄ２−プロペプチド）のヌクレオチド配列（配列番号１１３）
1    ATGATTCCTG CCAGATTTGC CGGGGTGCTG CTTGCTCTGG CCCTCATTTT
51    GCCAGGGACC CTTTGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCA TCCACGGCCC
101    GATGCAGCCT TTTCGGAAGT GACTTCGTCA ACACCTTTGA TGGGAGCATG
151    TACAGCTTTG CGGGATACTG CAGTTACCTC CTGGCAGGGG GCTGCCAGAA
201    ACGCTCCTTC TCGATTATTG GGGACTTCCA GAATGGCAAG AGAGTGAGCC
251    TCTCCGTGTA TCTTGGGGAA TTTTTTGACA TCCATTTGTT TGTCAATGGT
301    ACCGTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATGCCCTATG CCTCCAAAGG
351    GCTGTATCTA GAAACTGAGG CTGGGTACTA CAAGCTGTCC GGTGAGGCCT
401    ATGGCTTTGT GGCCAGGATC GATGGCAGCG GCAACTTTCA AGTCCTGCTG
451    TCAGACAGAT ACTTCAACAA GACCTGCGGG CTGTGTGGCA ACTTTAACAT
501    CTTTGCTGAA GATGACTTTA TGACCCAAGA AGGGACCTTG ACCTCGGACC
551    CTTATGACTT TGCCAACTCA TGGGCTCTGA GCAGTGGAGA ACAGTGGTGT
601    GAACGGGCAT CTCCTCCCAG CAGCTCATGC AACATCTCCT CTGGGGAAAT
651    GCAGAAGGGC CTGTGGGAGC AGTGCCAGCT TCTGAAGAGC ACCTCGGTGT
701    TTGCCCGCTG CCACCCTCTG GTGGACCCCG AGCCTTTTGT GGCCCTGTGT
751    GAGAAGACTT TGTGTGAGTG TGCTGGGGGG CTGGAGTGCG CCTGCCCTGC
801    CCTCCTGGAG TACGCCCGGA CCTGTGCCCA GGAGGGAATG GTGCTGTACG
851    GCTGGACCGA CCACAGCGCG TGCAGCCCAG TGTGCCCTGC TGGTATGGAG
901    TATAGGCAGT GTGTGTCCCC TTGCGCCAGG ACCTGCCAGA GCCTGCACAT
951    CAATGAAATG TGTCAGGAGC GATGCGTGGA TGGCTGCAGC TGCCCTGAGG
1001    GACAGCTCCT GGATGAAGGC CTCTGCGTGG AGAGCACCGA GTGTCCCTGC
1051    GTGCATTCCG GAAAGCGCTA CCCTCCCGGC ACCTCCCTCT CTCGAGACTG
1101    CAACACCTGC ATTTGCCGAA ACAGCCAGTG GATCTGCAGC AATGAAGAAT
1151    GTCCAGGGGA GTGCCTTGTC ACTGGTCAAT CCCACTTCAA GAGCTTTGAC
1201    AACAGATACT TCACCTTCAG TGGGATCTGC CAGTACCTGC TGGCCCGGGA
1251    TTGCCAGGAC CACTCCTTCT CCATTGTCAT TGAGACTGTC CAGTGTGCTG
1301    ATGACCGCGA CGCTGTGTGC ACCCGCTCCG TCACCGTCCG GCTGCCTGGC
1351    CTGCACAACA GCCTTGTGAA ACTGAAGCAT GGGGCAGGAG TTGCCATGGA
1401    TGGCCAGGAC ATCCAGCTCC CCCTCCTGAA AGGTGACCTC CGCATCCAGC
1451    ATACAGTGAC GGCCTCCGTG CGCCTCAGCT ACGGGGAGGA CCTGCAGATG
1501    GACTGGGATG GCCGCGGGAG GCTGCTGGTG AAGCTGTCCC CCGTCTATGC
1551    CGGGAAGACC TGCGGCCTGT GTGGGAATTA CAATGGCAAC CAGGGCGACG
1601    ACTTCCTTAC CCCCTCTGGG CTGGCGGAGC CCCGGGTGGA GGACTTCGGG
1651    AACGCCTGGA AGCTGCACGG GGACTGCCAG GACCTGCAGA AGCAGCACAG
1701    CGATCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGCGT
1751    GCGCGGTCCT GACGTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG TGCCGTCAGC
1801    CCGCTGCCCT ACCTGCGGAA CTGCCGCTAC GACGTGTGCT CCTGCTCGGA
1851    CGGCCGCGAG TGCCTGTGCG GCGCCCTGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG
1901    CGGGGAGAGG CGTGCGCGTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCCG CTGTGAGCTG
1951    AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGCGGGACCC CCTGCAACCT
2001    GACCTGCCGC TCTCTCTCTT ACCCGGATGA GGAATGCAAT GAGGCCTGCC
2051    TGGAGGGCTG CTTCTGCCCC CCAGGGCTCT ACATGGATGA GAGGGGGGAC
2101    TGCGTGCCCA AGGCCCAGTG CCCCTGTTAC TATGACGGTG AGATCTTCCA
2151    GCCAGAAGAC ATCTTCTCAG ACCATCACAC CATGTGCTAC TGTGAGGATG
2201    GCTTCATGCA CTGTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCTT GCTGCCTGAC
2251    GCTGTCCTCA GCAGTCCCCT GTCTCATCGC AGCAAAAGG
ＶＷＦ０５３（ＶＷＦ  Ｄ１Ｄ２−プロペプチド）のタンパク質配列（配列番号１１４）
1    MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM
51    YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG
101    TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL
151    SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC
201    ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC
251    EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME
301    YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC
351    VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD
401    NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG
451    LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM
501    DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG
551    NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS
601    PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL
651    NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD
701    CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD
751    AVLSSPLSHR SKR                                        
【０３９７】
特定の実施形態の前述の説明は本発明の一般的な性質を充分に明らかにしているので、他者は当業者の知識を応用することにより、過度の実験を行うこと無く、本発明の全般的な考えから逸脱すること無く、そのような特定の実施形態を様々な用途のために容易に改変および／または改造することができる。したがって、そのような改造および改変は、本明細書において提示された教示と指導に基づき、開示された実施形態の同等物の意味と範囲の内にあるものとする。本明細書における用語法または用語は、当業者が本教示と指導に照らして本明細書の用語または用語法を理解することができるように、説明を目的とするものであり、制限を目的とするものではないと理解されるべきである。
【０３９８】
本発明の他の実施形態は本明細書において開示される本発明の明細および実施を考慮すると当業者に明らかである。本明細書と実施例は例示のみとされ、本発明の真の範囲と精神は次の特許請求の範囲によって示される。
【０３９９】
本明細書において引用された全ての特許および出版物は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【図１−１】
2020078338.tif 000050
【図１−２】
2020078338.tif 000051
【図２】
2020078338.tif 000052
【図３】
2020078338.tif 000053
【図４−１】
2020078338.tif 000054
【図４−２】
2020078338.tif 000055
【図５】
2020078338.tif 000056
【図６】
2020078338.tif 000057
【図７】
2020078338.tif 000058
【図８】
2020078338.tif 000059
【図９】
2020078338.tif 000060
【図１０Ａ】
2020078338.tif 000061
【図１０Ｂ】
2020078338.tif 000062
【図１１】
2020078338.tif 000063
【図１２】
2020078338.tif 000064
【図１３】
2020078338.tif 000065
【図１４】
2020078338.tif 000066
【図１５】
2020078338.tif 000067
【図１６】
2020078338.tif 000068
【図１７】
2020078338.tif 000069
【図１８Ａ】
2020078338.tif 000070
【図１８Ｂ】
2020078338.tif 000071
【図１９】
2020078338.tif 000072
【図２０】
2020078338.tif 000073
【図２１Ａ】
2020078338.tif 000074
【図２１Ｂ】
2020078338.tif 000075
【図２２】
2020078338.tif 000076
【図２３】
2020078338.tif 000077
【図２４−１】
2020078338.tif 000078
【図２４−２】
2020078338.tif 000079
【図２５】
2020078338.tif 000080
【図２６】
2020078338.tif 000081
【配列表】
2020078338000001.app