(57)【要約】  【課題】イン・ビボ型バイオセンサのプローブにおいて、酵素およびレドックスメディエータの外部への流出を防止して、耐久性を向上させる。  【解決手段】バイオセンサプローブのセンシング部分を構成するベースとなる絶縁性基板の表面の一部に所定形状の凹部領域を設け、その凹部領域内に検知層を形成する。【選択図】図１５
2020159958.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオセンサ用のプローブであって、
主面を有する絶縁性基板と、
前記絶縁性基板の主面上の少なくとも一部に形成された導電性薄膜と、
導電性薄膜上の一部に規定された作用電極と、
前記作用電極が規定された導電性薄膜以外の導電性薄膜上の一部に規定された対極と、
前記作用電極または対極が規定された導電性薄膜以外の導電性薄膜上の一部に形成された参照電極と、
前記作用電極上に形成された検知層と、
前記作用電極、前記検知層、前記参照電極、および前記対極を被覆する生体性適合保護膜と、を備え、
前記作用電極が規定された絶縁性基板の主面の少なくとも一部に隆起した少なくとも２本の突堤部および、前記少なくとも２本の突堤部に挟まれた主面の領域を内底面として備える凹部領域が形成され、前記凹部領域の内底面上に前記導電性薄膜と検知層が形成されているプローブ。
【請求項２】
前記２本の突堤部は、それぞれ、頂点と、頂点から内底面に向かって傾斜した第１の傾斜部（内向傾斜部）と、頂点から内底面とは反対の外側に向かって傾斜した第２の傾斜部（外向傾斜部）とを備え、第１の傾斜部の傾斜角度は、第２の傾斜部の傾斜角度よりも大きい、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記頂点から第２の傾斜部を経て、絶縁性基板の端面である第３の傾斜部が連続し、第３の傾斜部の傾斜角度は、第２の傾斜部の傾斜角度よりも大きい、請求項１または２に記載のプローブ。
【請求項４】
前記凹部領域のそれぞれの隆起部の第２の傾斜部は、隆起部の頂点から外側面にかけて、傾斜角度が段階的に大きくなる形状とした請求項１〜３のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項５】
前記検知層は、少なくともレドックスメディエータおよび検体応答性酵素を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項６】
前記検知層は、レドックスメディエータを含むメディエータ層および検体応答性酵素を含む酵素層から構成される多層膜である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項７】
バイオセンサ用のプローブの製造方法であって、
プローブのベースとなる絶縁性基板の主表面の少なくとも一部に凹部領域を形成する工程；
前記絶縁性基板の少なくとも一部に導電性薄膜を形成する工程；
前記凹部領域の内底面に形成された導電性薄膜上に検知層を形成する工程；
前記絶縁性基板に形成された、異なる導電性薄膜上に、参照電極および対極を、それぞれ、形成する工程；ならびに、
前記参照電極、前記対極および前記検知層を生体性適合保護膜で被覆する工程
を含む、プローブの製造方法。
【請求項８】
前記凹部領域を形成する工程は、絶縁性基板の主面上の凹部領域を形成しようとする領域の外側の２点それぞれからレーザーを走査することによって、それぞれ隆起部を形成し、形成された複数の隆起部のうち、前記凹部領域を形成しようとする領域を構成する少なくとも２本の隆起部を１組の突堤部とし、これら少なくとも２本の突堤部に挟まれた主面の領域を内底面とする、請求項７に記載のプローブの製造方法。
【請求項９】
前記レーザーはCO2レーザーである請求項７または８に記載のプローブの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、例えば、液体試料の被検体に含まれる特定物質の濃度を計測するバイオセンサを構成するプローブおよびその製造方法に関する。より詳しくは、本開示により、体内に挿入されるバイオセンサプローブに形成された検知層に含まれる酵素やメディエータの漏出または変質を防止することによって、バイオセンサの耐久性を向上したバイオセンサプローブおよびその製造方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサとは、生体の有する分子認識能を利用あるいは模倣して物質を計測するシステムであり、例えば、酵素−基質、抗原−抗体、ホルモン−レセプターなどの組合せのうち一方を検体（測定対象物質）とし、他方を受容体として検体とその受容体との間の分子認識反応によって発生する化学的な変化をトランスデューサーで電気信号に変換し、得られた電気信号の強さに応じて検体の量を測定する測定装置である。
【０００３】
バイオセンサに用いる生体分子として、上記以外にも遺伝子、糖鎖、脂質、ペプチド、細胞、組織なども含まれる。なかでも、酵素を用いたバイオセンサは盛んに開発が行われており、その代表例が、自己血糖測定に用いられるグルコース酸化酵素（Glucose oxidase; GOx）やグルコース脱水素酵素 (Glucose dehydrogenase; GDH)などを用いた電気化学式グルコースセンサである。
【０００４】
自己血糖測定に用いられる電気化学式グルコースセンサは、概略、その表面に電極が形成された絶縁性基板の上に、スペーサーを介してカバーが配置されている構成である。前記電極上には検体応答性酵素、レドックスメディエータ（電子伝達体）等を含む試薬が配置されており、この部分が分析部となる。この分析部には、血液を導入するための流路の一端が連通しており、前記流路の他端は外部に向かって開口しており、ここが血液供給口となる。このようなセンサを用いた血糖値の測定は、例えば、次のようにして行われる。すなわち、まず、前記センサを専用の測定装置（メータ）にセットする。そして、指先等をランセットで傷つけて出血させ、これに前記センサの血液供給口を接触させる。血液は、毛細管現象によりセンサの流路に吸い込まれ、これを通って分析部に導入され、ここで、前記試薬と接触する。そして、検体応答性酵素E（例えば、GOx、GDH）は、血液中のグルコースと特異的に反応することでグルコースを酸化する。レドックスメディエータMは、酸化によって発生した電子を受容する。電子を受容して還元されたレドックスメディエータMは、電極で電気化学的に酸化される。還元体レドックスメディエータMの酸化によって得られる電流値や電荷量などの大きさから、血液中のグルコース濃度、すなわち血糖値が簡便に検出される。
【０００５】
このような電気化学式血糖センサは、糖尿病治療における血糖値管理に重要な役割を果たし、糖尿病患者は血糖値に基づく適切なインスリン投与や食事制限を行うことができる。しかしながら、一日に何度も血糖値を測定しなければならず、その都度血液採取をすることは患者に苦痛を強いることとなるので、生活の質（Quality of Life; QOL）を維持することが困難であった。
【０００６】
すでに埋め込み型電気化学式グルコースセンサが開発されている。このような埋め込み型電気化学式グルコースセンサ1の本体10を生体2に貼り付けてプローブ11を生体内に挿入して継続的に血糖値の測定を行う（図１および２）。これにより、その都度血液採取することなく、長時間にわたり血糖値を測定することができる。
【０００７】
厚生労働省は、「平成9年遠隔診療通知（平成9年12月24日付け健政発第1075号厚生省健康政策局長通知）」を行い、遠隔診療の基本的考え方や医師法第20条等との関係から留意すべき事項を示した。その後、情報通信機器の開発・普及の状況を踏まえ、２０１５年８月１０日付けで情報通信機器を用いた診療（いわゆる「遠隔診療」）について各都道府県知事に向けて事務連絡を行った。２０１５年通知により、遠隔診療は事実上解禁され、２０１６年には情報通信機器3（スマートフォン）と専用アプリケーションを用いて、バイオセンサ1と無線データ通信する遠隔診療ツールが世の中に出回り始めた（図３）。さらに、２０１７年７月１４日付けで、遠隔診療の取扱いについて、再度周知、明確化する趣旨で通知（医政発0714第4号）が行われた。２０１５年通知によれば、遠隔診療は、当事者が医師および患者本人であることが確認できる限り、テレビ電話や、電子メール、ソーシャルネットワーキングサービス等の情報通信機器を組み合わせた遠隔診療についても、直接の対面診療に代替し得る程度の患者の心身の状況に関する有用な情報が得られる場合には、直ちに医師法第20条等に抵触するものではない、とした。この２０１７年通知によって、情報通信機器を利用した遠隔診療がさらに発展するであろう。したがって、埋め込み型センサの需要はますます高まることが期待される。
【０００８】
従来のイン・ビボ型（埋め込み型）のバイオセンサの構成として、主面を有するベース基板と、前記ベース基板の主面上に形成され、作用極と対極とを有する電極層と、被検体と反応する試薬層と、前記試薬層を含む、被検体と試薬が反応する空間を覆う生体性適合膜と、を備えたものであった（特許文献１）。また、イン・ビトロ型のバイオセンサでは、絶縁性の基板の表面に、少なくとも測定電極と対電極を形成し、その上に少なくとも一部を覆うように試薬層を形成し、試薬層の厚さを調整するための絶縁部を設け、試薬層を形成するための絶縁部が、凹部を形成したバイオセンサもある（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第８３２６３９３号明細書
【特許文献２】特開２０００−２２１１５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記従来のイン・ビボの埋め込み型センサは、そのプローブを長時間体内に挿入するので、構成要素である検体応答性酵素やレドックスメディエータが流出する機会が増大する。検体応答性酵素やレドックスメディエータがセンサ外部に流出すれば、センサ感度が劣化するのみならず、生体に対して害を与えることとなる。また、検体応答性酵素やレドックスメディエータが外部に流出すれば、センサの耐久性も低下する。したがって、検体応答性酵素やレドックスメディエータの流出を防止する対策が非常に重要である。
【００１１】
従来のイン・ビボの埋め込み型のバイオセンサでは、ベースとなる絶縁性基板上に電極層を形成し、その上に検知層を形成し、その試薬層を生体性適合の保護膜で覆って、検体応答性酵素やレドックスメディエータなどの試薬が外部に流出することを防止しているが、絶縁性基板上に形成した検知層に対して、保護膜の膜厚が薄くなる部分が生じ、試薬が膜の外部に漏れ出す場合があり、その結果、バイオセンサの測定の耐久性が低下してしまうのであった。
【００１２】
したがって、本開示では、バイオセンサの測定の耐久性を向上するために、ベース基板上に形成した検知層に対して、保護膜の膜厚が薄くなる部分が存在しないバイオセンサプローブおよびその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この課題を解決するために、本開示では、イン・ビボ型（埋め込み型）のバイオセンサにおいて、バイオセンサプローブのセンシング部分を構成するベースとなる絶縁性基板の表面の一部に凹部領域を設け、その凹部領域内に検知層を形成する。
【００１４】
より具体的には、本開示は、バイオセンサ用のプローブであって、
主面を有する絶縁性基板と、
前記絶縁性基板の主面上の少なくとも一部に形成された導電性薄膜と、
導電性薄膜上の一部に規定された作用電極と、
前記作用電極が規定された導電性薄膜以外の導電性薄膜上の一部に規定された対極と、
前記作用電極または対極が規定された導電性薄膜以外の導電性薄膜上の一部に形成された参照電極と、
前記作用電極上に形成された検知層と、
前記作用電極、前記検知層、前記参照電極、および前記対極を被覆する生体性適合保護膜と、を備え、
前記作用電極が規定された絶縁性基板の主面の少なくとも一部に隆起した少なくとも２本の突堤部および、前記少なくとも２本の突堤部に挟まれた主面の領域を内底面として備える凹部領域が形成され、前記凹部領域の内底面上に前記導電性薄膜と検知層が形成されているプローブを提供する。
【００１５】
本開示の態様は、前記凹部領域が少なくとも２本の突堤部で構成されていることを特徴とする。前記少なくとも２本の突堤部をつなぐように横行する１または複数の突堤部をさらに形成して、凹部領域をコの字型やロの字型その他の形状に構成することもできる。
絶縁性基板の表面から突堤部の上端までの高さは５〜９０μｍであり、好ましくは１０〜５０μｍであり、より好ましくは１５〜３０μｍである。
【００１６】
凹部領域の寸法や角度は、上面図において長手方向および横手方向のそれぞれを略４等分する３つの線分を接触式表面形状測定装置（Dektak XT）で走査して得られたプロファイルから算出した平均値である。
【００１７】
本開示によるイン・ビボ型バイオセンサ用のプローブの製造方法は、
プローブのベースとなる絶縁性基板の表側の一部に凹部領域を形成する工程、
前記絶縁性基板の表側および凹部領域の全面、ならびに裏面に導電性薄膜を形成する工程、
前記凹部領域の内底面上の導電性薄膜上に検知層を形成する工程；ならびに、
前記作用電極、前記参照電極、前記対極および前記検知層を生体性適合保護膜で被覆する工程
を含む。
【００１８】
絶縁性基板の表側の一部に凹部領域を形成する工程において、絶縁性基板に凹部領域を形成できる方法であれば、プレス加工、エッチング加工、レーザー加工、研削加工などのいずれの方法も用いることができる。本開示によるプローブにおいて、所望する形状の凹部領域を形成する方法としては、レーザー加工が好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本開示によれば、絶縁性基板の表側の一部に形成した凹部領域内に検知層を形成したので、検知層上の保護膜の膜厚を十分に厚く形成することが可能となり、その結果、試薬の外部への漏出や保護膜内の試薬の変質を防ぐことができる。これにより、バイオセンサの測定の耐久性を向上することができた。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】埋め込み型バイオセンサが生体（人体）に取り付けられた状態を示す概略図。
【図２】生体（人体）に取り付けられた状態の埋め込み型バイオセンサを示す断面図。
【図３】スマートフォンと測定データを無線通信する埋め込み型バイオセンサの概略図。
【図４】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。
【図５】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。
【図６】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。
【図７】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。
【図８】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブ表側の上面図。
【図９】図８におけるA-A’切断線での断面図。
【図１０】図９におけるB-B’切断線での断面図。
【図１１】図９におけるC-C’切断線での断面図。
【図１２】本開示によるひとつの実施形態の製造工程において、レーザー加工による絶縁性基板（ＰＥＴ基板）上への凹部領域の形成過程を示す図。
【図１３】本開示によるひとつの実施形態の製造工程において、レーザー加工による絶縁性基板（ＰＥＴ基板）上への凹部領域の形成過程を示す図。
【図１４】本開示によるひとつの実施形態の製造工程において、レーザー加工による絶縁性基板（ＰＥＴ基板）上への凹部領域の形成過程を示す図。
【図１５】本開示によるひとつの実施形態のプローブ先端の絶縁性基板（ＰＥＴ基板）の縦断面図。
【図１６】本開示によるひとつの実施形態の製造工程において、プローブ先端に保護膜を形成する過程を示す図。
【図１７】本開示による一つの実施形態の保護膜が形成されたプローブ先端の縦断面図。
【図１８】本開示によるひとつの実施形態の製造工程において、絶縁性基板（ＰＥＴ基板）上に、レーザー加工により形成した凹部領域を示す図：（ａ）上面図および（ｂ）凹部領域のプロファイル。
【図１９】本開示による別の実施形態の製造工程において、絶縁性基板（ＰＥＴ基板）上に、レーザー加工により形成した凹部領域を示す図：（ａ）上面図および（ｂ）凹部領域のプロファイル。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
１．埋め込み型バイオセンサのプローブの製造方法
本開示のひとつの実施形態の埋め込み型バイオセンサ1のプローブ11の製造方法を説明する。以下に示す構造および製造方法は、本開示のひとつの具体例であり、本開示の特徴を有する所望の凹部領域が形成されていれば、下記した構成に限定されるものではない。
【００２２】
（１）絶縁性基板の準備
埋め込み型バイオセンサ1は本体10とプローブ11を含み、プローブ11は、概略、生体内に挿入するセンシング部分およびバイオセンサ本体10の内部回路と電気的接続するための端子部分からなる鍵形状である。センシング部分は体内に挿入できるように細く形成され、端子部分はバイオセンサ本体10に挿入して電気的接続を形成するように一定の大きさを有する。したがって、まず、鍵形状の絶縁性基板111を準備する（図４ａ）。上段には表側から見た上面図を示し、下段には裏側から見た上面図を示す（以下、同様）。この絶縁性基板111は、生体内に挿入するプローブとして使用できる材料および厚さであれば、特に限定されることなく、例えば、約200 μm厚のポリエチレンテレフタレート (PET)を用いることができる。
鍵形状の絶縁性基板111は、材料を裁断することによって準備するが、裁断する方法は、特に限定されず、レーザーカット、ピナクルダイを用いたダイカットなどの分野公知の方法で裁断することができる。
【００２３】
（２）凹部領域の形成
次に、絶縁性基板111のセンシング部分の先端の表側の表面に、長手方向に沿って凹部領域112を形成する（図４ｂ）。
凹部領域の形成方法として、プレス加工、エッチング加工、レーザー加工、研削加工などのいずれの方法を用いることができるが、本発明の実施形態においては、レーザー加工による方法を用いている。この方法の特徴は、絶縁性基板を掘り下げて凹部領域を形成するのではなく、絶縁性基板111をレーザー照射して熱で溶かしながらその部分を隆起させて突堤部を形成することで、凹部領域112を形成している。すなわち、本実施形態の凹部領域112は、絶縁性基板111の表面に隆起した２本の突堤部1121および、２本の突堤部1121に挟まれた領域である内底面1122から構成され、内底面1122は絶縁性基板111の表面に相当する。
本開示による凹部領域は少なくとも２本の突堤部で構成される溝状の開放形態であるが、前記少なくとも２本の突堤部をつなぐように横行する１または複数のさらなる突堤部によってコの字型の突堤部で構成される半閉鎖形態またはロの字型の突堤部で構成される閉鎖形態とすることもできる。
【００２４】
（３）導電性薄膜の形成
絶縁性基板111の両面に、炭素または金、銀、白金もしくはパラジウムなどの金属よりなる群から選択される導電性金属材料をスパッタ法、蒸着法、イオンプレーティングなどにより堆積することによって導電性薄膜113を形成する（図５ｃ）。これにより、絶縁性基板111の表側の表面において、凹部領域の突堤部および内底面から凹部領域が形成されていない領域にわたって連続的に導電性薄膜が形成され、同様に、絶縁性基板111の裏側の表面の全面にも連続的に導電性薄膜が形成される。導電性薄膜の好ましい厚さは、10 nm〜数百nmである。
【００２５】
（４）電極リードの形成
絶縁性基板111の表側に形成した導電性薄膜113にレーザー描写することによって絶縁性基板111の表面に達する深さの溝114を形成して、作用電極リード113aと参照電極リード113bに分離して電気的絶縁する（図５ｄ）。
【００２６】
（５）絶縁膜の形成
絶縁性基板111の表側に、作用電極115および参照電極116ならびに本体10と電気接続するための作用電極用端子115aおよび参照電極用端子116aとして用いる領域を除いた部分に、スパッタ法、スクリーン印刷法などにより、開口を有する絶縁膜117aを形成し、絶縁性基板111の裏側に、対極118および本体10と電気接続するための対極用端子118aとして用いる領域を除いた部分に、スパッタ法、スクリーン印刷法などにより、開口を有する絶縁膜117bを形成する（図６ｅ）。絶縁膜の好ましい厚さは、5〜40 μmである。
【００２７】
（６）参照電極の形成
絶縁性基板111の表側に形成した絶縁膜117aの参照電極用の開口にAg/AgClをスクリーン印刷法、ディスペンサ法およびインクジェット法などにより堆積させて、参照電極116を形成する（図６ｆ）。参照電極の好ましい厚さは、5〜40 μmである。
【００２８】
（７）検知層の形成
凹部領域112の作用電極115の上に、レドックスメディエータの水溶液および検体応答性酵素の水溶液を混合させ、その混合水溶液を塗布乾燥して、少なくとも、レドックスメディエータおよび検体応答性酵素を含む検知層119を形成する（図７ｇ）。また、検知層の導電性を向上させるために、レドックスメディエータおよび検体応答性酵素の混合水溶液の前に、炭素粒子懸濁液などの導電性粒子を先に塗布乾燥してもよい。本開示において、「検体応答性酵素」とは、検体の酸化または還元を特異的に触媒することのできる生化学物質を意味する。バイオセンサの検出目的に使用できれば、いかなる生化学物質でもよい。例えば、グルコースを検体とする場合、適した検体応答性酵素は、グルコース酸化酵素（Glucose oxidase; GOx）やグルコース脱水酵素 (Glucose dehydrogenase; GDH)などである。「レドックスメディエータ」とは、電子伝達を仲介する酸化還元物質を意味し、バイオセンサにおいて、検体（アナライト）の酸化還元反応によって生じる電子の伝達を担う。例えば、フェナジン誘導体などが含まれるが、これに限定されず、バイオセンサの検出目的に使用できれば、いかなる酸化還元物質でもよい。
【００２９】
また、以下にレドックスメディエータの合成の一例を示す。
［合成例：カルボキシル基を有するフェナジン誘導体の合成］
1-メトキシフェナジンにN-アルキル化剤を作用して、例えば、5-(4-カルボキシブチル)-1-メトキシフェナジニウム硝酸塩を合成する。さらに、末端カルボキシル基にN-ヒドロキシスクシンイミドを付加してカルボキシル基の反応性が向上した、5-{[(2,5-ジオキソピリジン-1-イル)オキシ]-5-オキソペンチル}-1-メトキシフェナジニウム硝酸塩を合成する。対応するN-アルキル化剤を選択して、所望のN-アルキルカルボキシフェナジニウム塩を合成することができる。
【００３０】
【化１】
2020159958.tif 000003
【００３１】
合成例で得られた、5-{[(2,5-ジオキソピリジン-1-イル)オキシ]-5-オキソペンチル}-1-メトキシフェナジニウム硝酸塩（Ph-C5-Su）：
【００３２】
【化２】
2020159958.tif 000004
を0.6 mg計り取り、100 mM 2-モルホリノエタンスルホン酸 (MES)緩衝液（pH 6.0）120 μLに溶解した。別途、ポリ（L-リジン）塩酸塩（株式会社ペプチド研究所 Code 3075; M.W.>12000, 透析によるカットオフ）を5 mg計り取り、100 mM MES緩衝液（pH 6.0）1 mLに溶解した。上記２つの溶液を混合し、４時間、室温にて撹拌しながら反応させた。
反応溶液は、溶出バッファーとしてPBSを用いるPD-10カラム（GEヘルスケア）によるゲルろ過クロマトグラフィーに付した。ゲルろ過後の溶液を遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ-4 30k；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を行った。
上記の手順により、ポリ（L-リジン）塩酸塩にフェナジンが共有結合した高分子量ポリマー（PLL-C5-Ph_1）を得た。
得られたPLL-C5-Ph_1の溶液は、マイクロプレート (greiner bio-one UV-STAR MICROPALLETE 96 WELL F-BODEN)およびプレートリーダー (TECAN infinite M200 PRO)により測定しながら、PBSで386nmの吸光度を約11に調整した。また、吸光度はPBSの測定吸光度をブランク値として減じた値を用いた。
【００３３】
本開示において、検知層は、少なくともレドックスメディエータおよび検体応答性酵素を含み、レドックスメディエータの水溶液および検体応答性酵素の水溶液を順次塗布乾燥して、レドックスメディエータを含むメディエータ層および検体応答性酵素を含む酵素層から構成される多層膜であってもよい。また、検知層の好ましい厚さは、1〜80 μmである。
【００３４】
（８）保護膜の形成
センシング部分を、センサ保護用の生体適合性樹脂を含む溶液に浸漬して、センシング部分の両面、側面および端面に保護膜120を形成する（図７ｈ）。保護膜120は、作用電極用端子115a、参照電極用端子116aおよび対極用端子118aを被覆することなく、少なくとも、作用電極115、参照電極116、対極118および検知層119を被覆し、生体内に挿入される長さ以上に形成する。保護膜の好ましい厚さは、5〜200 μmである。
【００３５】
センサ保護用の生体適合性樹脂として、限定されないが、ポリ（4-ビニルピリジン）を用いることができ、ポリ（4-ビニルピリジン）はポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE)などの架橋剤により架橋されていてもよく、例えば、ポリ(tert-ブチルメタクリレート)-b-ポリ(4-ビニルピリジン)、ポリスチレン-co-4-ビニルピリジン-co-オリゴ[プロピレングリコールメチルエーテル]メタクリレートなどが挙げられる。
【００３６】
図１６を参照して、保護膜の形成手順を詳説する。鍵型プローブのセンシング部分の軸を下方に向けて、容器に収容された生体適合保護膜形成用の樹脂溶液に浸漬する。プローブの製造条件に依存するが、１または複数回浸漬を繰り返す。適当回数の浸漬が終了したら、前記プローブの裏側の面（すなわち、縦断面における台形の下底）を下にして静置する。この状態で、室温（１８〜２５℃）にて３〜６０時間乾燥させる。
【００３７】
２．埋め込み型バイオセンサのプローブの内部構造
本開示のひとつの実施形態の埋め込み型バイオセンサ1のプローブ11のプローブの内部構造をさらに説明する。
【００３８】
図８に、センシング部分に保護膜まで形成された状態のプローブ11の表側から見た上面図を示す。図８のA-A’切断線での断面図を図９に示す。絶縁性基板111の両側に導電性薄膜113が形成されている。表側の導電性薄膜113では、溝114によって作用電極リード113aと参照電極リード113bの２つのリードに分離され、電気的に絶縁されている。作用電極リード113aの一部が作用電極115として機能する。センシング部分の先端または先端付近には、凹部領域112が形成され、その側面および内底面まで連続的に導電性薄膜113が形成され、したがって、凹部領域112の内底面に形成された導電性薄膜113が作用電極115として機能することとなる。
【００３９】
ここで、本実施形態において、凹部領域112は、絶縁性基板の主面から隆起する突堤部1121を設けることにより形成されている。すなわち、凹部領域112は、元の絶縁性基板111の主面を加工しないで、そのままの形状で構成するので、凹部領域の内底面1112は、絶縁性基板111の他の主面と同じ水準にある。
本実施形態において、凹部領域は、プローブ先端の長手方向に並列する２本の突堤部で構成されているため、短手方向に横行する突堤部が存在しないが（図９ａ）、閉鎖形態の突堤部により凹部領域が構成された場合の断面図を図９ｂに図示する。
【００４０】
この作用電極115上に検知層119が形成されている。検知層119は図９では、一層で示されているが、作用電極上にメディエータ層119aを形成し、その上にレドックスメディエータ層119bを形成して二層構造とすることができ、実施形態に依存して、その他の構成も許容される。
【００４１】
また、絶縁膜117aの開口部分に参照電極116が形成されて、参照電極リード113bと電気的に接続している。裏側の導電性薄膜113は対極リード113cとなり、その一部が対極118として機能する。
なお、図９において、プローブ内部の基本的構造を説明する趣旨から、凹部領域の形状は簡便に描写している。
【００４２】
図９のB-B’切断線での断面図を図１０に示す。絶縁性基板111の表側の主面上に凹部領域112が形成され、この凹部領域112の表面上に作用電極115が形成され、その上に検知層119が形成され、裏側に対極118が形成されている。さらに、センシング部分の周囲全体が本開示の保護膜120で被覆されていることが分かる。
なお、図１０において、プローブ内部の基本的構造を説明する趣旨から、凹部領域の形状は簡便に描写している。
【００４３】
図９のC-C’切断面での断面図を図１１に示す。絶縁性基板111の表側に、溝114で電気的に分離された作用電極リード113aと参照電極リード113bとが形成され、その上に絶縁膜117aが形成されている。絶縁膜117aの開口部に参照電極116が形成されている。基板111の裏側に対極リード113cが形成され、その上に絶縁膜117bが形成されている。さらに、センシング部分の周囲全体が本開示の保護膜120で被覆されていることが分かる。また、参照電極116は、ここでは表側に配置したが、裏側に配置してもよい。
【００４４】
図１５は、プローブ先端部分の短手方向での絶縁性基板111の縦断面図を示し、凹部領域の突堤部の形状をより詳細に描写している。絶縁性基板111の主面（図の上側）には、凹部領域112が形成されている。この凹部領域112は、絶縁性基板111を掘って形成したのではなく、絶縁性基板111の表面上に隆起する突堤部1121を形成し、突堤部に挟まれた主面の領域を内底面1122として凹部領域112を形成している。すなわち、凹部領域112は、絶縁性基板111の主面の一部である内底面1122と、この内底面1122を挟むように隆起した突堤部1121により構成されている。このように、凹部領域112の内底面1122は、絶縁性基板111の本来の主面上の平面部分を加工しないでそのまま用いているので、凹部領域112の内底面1122の表面は平滑であり、導電体等が塗布しやすい形状になっている。
【００４５】
凹部領域112の突堤部1121は、頂点1121aと、頂点から内底面に向かって傾斜した第１の傾斜部（内向傾斜部）1121bと、頂点から内底面とは反対の外側に向かって傾斜した第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cとを備えている。第１の傾斜部（内向傾斜部）1121bの傾斜角度（図１５では１８０度−θ１）は、第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cの傾斜角度（図１５では１８０度−θ２）よりも大きい。また、突堤部1121は、山状に隆起した形状になっているので、第１の傾斜部（内向傾斜部）1121bの傾斜角度（図１５では１８０度−θ１）および第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cの傾斜角度（図１５では１８０度−θ２）は、ともに９０度未満となっている。
【００４６】
プローブ先端を保護膜用の樹脂溶液に浸漬したときに、第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cに沿って樹脂溶液が付着し、第１の傾斜部（内向傾斜部）1121bに沿って、樹脂溶液が内底面1122に流れ込み、乾燥することによって保護膜120が形成される。凹部領域112の突堤部1121を形成する場所に限定はないが、図１５においては、絶縁性基板111の両縁に突堤部1121が形成され、縦断面形状において、上底の長さが下底の長さより短い略等脚台形となる。このような構成とすることで、凹部領域112の上方に多くの樹脂溶液が滞留し、凹部領域112内に形成された検知層119上方の保護膜120の膜厚が厚くなる。
【００４７】
以下、保護膜120の膜厚が厚くなる理由について、詳細に説明する。第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cの傾斜角度が９０度未満となる場合、プローブのセンシング部分の縦断面における形状は、台形の両脚が上方に向かうに従い、内側に閉じた形状になっている。
本発明者らが、プローブのセンシング部分の縦断面における形状が略長方形の場合と比較して、縦断面における形状が上底の長さが下底の長さより短い略台形の場合、検知層側上部の保護膜の厚さが増大することを初めて確認した。
これは、保護膜120をプローブに塗布する際に、プローブに付着した保護膜を形成する樹脂溶液は、表面張力により球形になろうとするが、重力および内部のプローブ形状に依存して、保護膜の形状が定まる。縦断面形状が略長方形の場合には、上辺と縦辺とが形成する角（センシング部分を立体的にみたとき、辺）が、樹脂溶液の流動を妨害するため、球状になりにくく、センシング部分の表側の表面上に存在する樹脂溶液量が少なくなる。
一方、本実施形態での保護膜の形状では、上方に存在する樹脂溶液に対して、両脚横に存在する樹脂溶液が、第２の傾斜部1121cに沿って流れ込み、一体となり、球状になりやすくなる。結果として、センシング部分の表側の表面上に存在する樹脂溶液量が多くなると想定される。
そのような構成により、検知層表面上方の保護膜120の膜厚を十分に確保することができるので、検知層119に含まれる試薬がプローブ外部に漏出することが防止される。さらに、凹部領域112の開口部周囲に沿って上方に隆起する突堤部1121が形成されているので、絶縁性基板111の凹部領域112内で検知層119に含まれた試薬が、水平方向に拡散することが防止されるのである。
【００４８】
また、プローブのセンシング部分の縦断面において、突堤部の頂点1121aから第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cを経て、絶縁性基板111の端面である第３の傾斜部111aが連続している。この第３の傾斜部111aの傾斜角度（図１５では１８０度−θ３）は、第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cの傾斜角度よりも大きい。
言い換えれば凹部領域112の突堤部の頂点1121aから絶縁性基板111の裏側の表面までの外側斜面は、傾斜角度が段階的に大きくなる形状となっている。このような形状とすることで、両脚横に存在する樹脂溶液が、まず、傾斜角度のきつい第３の傾斜部111aに沿って流れ、そして傾斜角度が第３の傾斜部111aより緩やかな第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cに沿って減速した状態で流れ込むことになる。そして、検知層119の上方に存在する樹脂溶液と一体となるので、球状になりやすくなる。結果として、センシング部分の表側の主面上に存在する樹脂溶液量が多くなると想定される。
【００４９】
突堤部の頂点1121aから外側面にかけて形成される第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cは、レーザー加工によるものである。レーザーの熱によって、絶縁性基板111の表面が溶解し、谷部が形成される。そして、溶解した部分は、山状に隆起して突堤部を形成する。この突堤部の頂点から谷部にかけて形成される斜面が第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cとなる。
そして、絶縁性基板から個別のプローブを裁断する際には、この谷部の谷底に沿ってほぼ鉛直方向に裁断するので、この裁断面によって形成される第３の傾斜部111aの傾斜角度は、第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cの傾斜角度に対して大きくなる。
【実施例】
【００５０】
［実施例１］
＜プローブの作製＞
（１）絶縁性基板の準備
ポリエチレンテレフタレート (PET)シート（東レ株式会社製ルミラーR E20 #188; 189 μm厚）を使用した。
【００５１】
（２）凹部領域の形成
図４ｂに示す絶縁性基板111のセンシング部分の先端の表側の表面にあたる部分の長手方向に沿って、上面図において略長方形の凹部領域112を形成した。
この実施例においては、レーザー加工により、凹部領域を形成した。波長９．３μｍ、出力１０Ｗ、連続波として発振するCO2レーザーを用いた。
１２（ａ）に示すように、絶縁性基板111の上方よりレーザーを走査しながらレーザー照射する。レーザーは、絶縁性基板111の主面上の凹部領域を形成しようとする領域の外側の短手方向に所定の距離を離した２点それぞれに照射する。
１２（ｂ）に示すように、レーザーを照射すると、照射した部分は熱によって掘り下げられ、その両側には隆起した部分が形成される。
図１２（ｃ）に示すように、レーザーを更に照射すると、照射した部分はさらに掘り下げられ、その両側に形成された隆起部はさらに高く形成される。その結果、絶縁性基板111の主面には、４本の隆起部が形成される。このとき、形成された複数の隆起部のうち、前記凹部領域を形成しようとする領域を構成する少なくとも２本の隆起部を１組の突堤部とし、これら少なくとも２本の突堤部に挟まれた主面の領域を内底面とする。そして、この実施形態では並列する２本の突堤部1121と、それらに挟まれた領域である内底面1122とにより凹部領域112が形成される。
このようにして形成した凹部領域を上面から観察した顕微鏡像を図１８（ａ）に示す。併せて、凹部領域112の短手方向に走査して計測したプロファイルを図１８（ｂ）に示す。横軸はμｍ単位、縦軸はｎｍ単位で表示されている。
【００５２】
上記の観察から、凹部領域の長手方向の長さが約２５００μｍ、幅が２４０μｍの開口を有する凹部領域が形成されていることが確認された。
より詳細には、図１８（ｂ）のプロファイルから理解されるように、縦断面図において山状に隆起した突堤部の高さは約２０μｍである。
そして、凹部領域112は、頂点1121aと、頂点から内底面に向かって傾斜した第１の傾斜部（内向傾斜部）1121bと、頂点から内底面とは反対の外側に向かって傾斜した第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cとを備えている。また、凹部領域112の第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cに連続して、第３の傾斜角度を有する第３の傾斜部111aを備えている。
第１の傾斜部（内向傾斜部）1121bの傾斜角度（図１５では１８０度−θ１）は約４０度であり、第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cの傾斜角度（図１５では１８０度−θ２）は約３０度であることが確認できる。第３の傾斜部111aの傾斜角度（図１５では１８０度−θ３）は、約８０度であることが確認できる。
したがって、本開示の製造方法により、縦断面において、第１の傾斜部（内向傾斜部）1121bの傾斜角度は第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cの傾斜角度より大きく、第３の傾斜部111aの傾斜角度（図１５では１８０度−θ３）は第２の傾斜部（外向傾斜部）1121cの傾斜角度よりも大きいプローブ先端を形成することができた。
このように、凹部領域112の突堤部の頂点1121aから突堤部の外側面を通って絶縁性基板の裏側の表面にかけて、傾斜角度が段階的に大きくなる形状となっている。
【００５３】
比較のため、絶縁性基板111の表側の表面をレーザーにより掘り下げて形成した凹部領域を上面から観察した顕微鏡像を図１９（ａ）に示す。併せて、凹部領域112の短手方向に走査して計測したプロファイルを図１９（ｂ）に示す。横軸はμｍ単位、縦軸はｎｍ単位で表示されている。
【００５４】
本実施形態の方法により形成した凹部領域の内底面の表面は、図１８（ｂ）に示すように平滑であり、一方、比較の実施形態の方法により形成した凹部領域の内底面の表面は、図１９（ｂ）に示すように非常に粗かった。
【００５５】
（３）導電性薄膜の形成
図５ｃおよび図１３（ｄ）に示すように、前記絶縁性基板の両面に、スパッタ法により金を堆積することによって、導電性薄膜（厚さ30 nm）を形成した。その結果、図１８（ａ）に示すように、前記凹部領域を上面から観察した顕微鏡象から、絶縁性基板111の上表面、形成された凹部領域の内壁および内底面を含めて全体に導電性薄膜が形成されたことが確認された。
【００５６】
（４）電極リードの形成
図５ｄおよび図１３（ｅ）に示すように、絶縁性基板の表側に形成した導電性薄膜にレーザー描写することによって絶縁性基板の表面に達する深さの溝を形成して、作用電極リードと参照電極リードに分離して電気的分離した。
【００５７】
（５）絶縁膜の形成
図６ｅに示すように、絶縁性基板の表側に、作用電極および参照電極ならびに、埋め込み型バイオセンサの本体と電気接続するための作用電極用端子および参照電極用端子として用いる領域を除いた部分に開口を有する絶縁膜をスクリーン印刷法により形成し、絶縁性基板の裏側に、対極および本体と電気接続するための対極用端子として用いる領域を除いた部分に開口を有する絶縁膜（厚さ１０から２０ μm）をスクリーン印刷法により形成した。
【００５８】
（６）参照電極の形成
図６ｆに示すように、絶縁性基板の表側に形成した絶縁膜の参照電極用の開口にAg/AgClをスクリーン印刷法により堆積させて、参照電極（厚さ１０から１５ μm）を形成した。
【００５９】
（７）検知層の形成
図７ｇに示すように、絶縁性基板の表側に形成した絶縁膜の開口部から露出した導電性薄膜を作用電極とし、その上に、炭素粒子懸濁液として、ケッチェンブラックEC600JD（ライオン・スペシャリティ・ケミカルズ株式会社）をテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（和光純薬株式会社）0.2%水溶液で2mg/mlになるように懸濁させた溶液を0.18μlをインクジェット装置（Labojet3000:マイクロジェット社製）塗布し乾燥させた。その後、レドックスメディエータである合成したPLL-Phと、検体応答性酵素であるグルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-依存性）（BBI international GDH GLD1）と、グルタルアルデヒド溶液（和光純薬工業株式会社）の混合水溶液を0.12μlを同様にインクジェット装置により塗布し乾燥して二層構造の検知層119を形成した。
【００６０】
（８）絶縁性基板用PETシートの裁断
図４〜７では、基板上での各構成要素の位置関係が明確になるように、鍵形状に裁断した基板に対して種々の構成要素を形成するように図示しているが、実際のプローブ作製に際しては、裁断前の絶縁性基板用PETシートに対して、複数のプローブパターンを形成した後、保護膜形成工程前に、加工された基板を鍵形状に裁断した。
この実施例において、レーザー加工によりPETシートの裁断を行った。
【００６１】
図１４（ｆ）および（ｇ）に示すように、複数のプローブパターンに対して各構成要素を形成した後、凹部領域の形成の際のレーザーの熱によって突堤部が形成された外周の谷部の谷底にレーザーを照射して、個々のプローブに裁断した。
【００６２】
図９におけるB-B’切断線での断面図に相当する、より具体的な絶縁性基板の縦断面図を図１５に示す。
【００６３】
（９）保護膜の形成
図７ｈおよび図１６に示すように、センシング部分を、架橋剤および保護膜用ポリマーを含むエタノール溶液に浸漬して、センシング部分の両面、側面および端面に保護膜（厚さ5-40 μm）を形成した。
より具体的には、Poly(tert-butyl methacrylate)-b-poly(4-vinyl pyridine)（株式会社ゼネラルサイエンスコーポレーション）を１０％（重量/体積）になるようにエタノールに溶解させた溶液と、Poly(styrene-co-4-vinylpyridine-co-oligo[propylene glycol methylether]methacrylate),random（株式会社ゼネラルサイエンスコーポレーション）を１０％（重量/体積）になるようにエタノールに溶解させた溶液と、Poly(ethylene glycol) diglycidyl ether（Sigma-Aldrich）を１０％（重量/体積）になるようにエタノールに溶解させた溶液と、緩衝液として、4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acidを２００ｍMとエタノールを調製し、保護膜溶液に上記で作製したプローブを浸漬し、10分乾燥後に再度浸漬を15回繰返し、２４時間分以上乾燥をすることによって、架橋した保護膜を形成し、プローブAを得た。
保護膜が形成されたプローブ先端の短手方向の縦断面を図１７に示す。
【００６４】
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
プローブAを３極式のポテンショスタット（ビー・エー・エス株式会社）に取り付け、37℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7)中にプローブを設置した。このPBS溶液に500秒ごとにグルコースを50、150、300、500 mg/dLずつ添加して、継続的に電流応答値（nA）を測定した。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。
【００６５】
［耐久性］
プローブAを37℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7)中で保管した。保管１日目、３日目、８日目および１１日目に、プローブAを３極式のポテンショスタット（ビー・エー・エス株式会社）に取り付けて、37℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7)中にプローブを設置した。このPBS溶液に500秒ごとにグルコースを50、150、300、500 mg/dLずつ添加して、継続的に電流応答値（nA）を測定した。１日目のグルコース濃度500 mg/dLでの電流応答値を100%として、各濃度での応答率 (%)を算出した。結果を表１にまとめた。
【００６６】
［比較例１］
実施例１において、絶縁性基板に凹部領域を形成しない以外は、実施例１と同様にして、プローブBを得た。
実施例１と同様にして、プローブBの耐久性を測定し、算出した結果を表１にまとめた。
【００６７】
【表１】
2020159958.tif 000005
【００６８】
プローブ先端付近に凹部領域を形成し、その中に作用電極を形成したプローブＡは、凹部領域を形成しない従来のプローブＢと比較して、応答性の低下が抑えられている。
したがって、本開示のように所定の形状の凹部領域内に検知層を形成するので、検知層に含まれる成分が保護膜内で移動して、プローブ外部に漏出することが抑制され、その結果、バイオセンサの測定の耐久性が向上されたことが実証できた。
【００６９】
凹部領域内に検知層が、ほぼ平坦の厚みで設けられ、検知層表面からの保護膜の膜厚は十分に確保することができるので、検知層に含まれる試薬がプローブ外部に漏出することが防止される。さらに、凹部領域の開口部周囲に沿って上方に隆起する突堤部が形成されているので、検知層に含まれた試薬が絶縁性基板の上表面の高さまで達したとしても、水平方向に拡散することが防止される。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本開示の少なくとも検体応答性酵素およびレドックスメディエータを含む検知層および前記検知層上に形成した保護膜を備えた膜構造体は、埋め込み型バイオセンサのプローブに有用である。
【符号の説明】
【００７１】
1     埋め込み型バイオセンサ
10    本体
11    プローブ
111   絶縁性基板
111a  傾斜部
112   凹部領域
1121  突堤部
1121a 頂点
1121b 内向傾斜部
1121c 外向傾斜部
1122  内底部
113   導電性薄膜
113a  作用電極リード
113b  参照電極リード
113c  対極リード
114   溝
115   作用電極
116   参照電極
117   絶縁膜
118   対極
119   検知層
120   保護膜
2     生体
3     情報通信機器
【図１】
2020159958.tif 000006
【図２】
2020159958.tif 000007
【図３】
2020159958.tif 000008
【図４】
2020159958.tif 000009
【図５】
2020159958.tif 000010
【図６】
2020159958.tif 000011
【図７】
2020159958.tif 000012
【図８】
2020159958.tif 000013
【図９】
2020159958.tif 000014
【図１０】
2020159958.tif 000015
【図１１】
2020159958.tif 000016
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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