(57)【要約】【課題】、ＦｃγＲＩタンパク質のヒト化を含む遺伝子組み換えマウス、並びに、それを作製し使用する方法及び構成を提供する。【解決手段】本発明は、ヒトＦｃγＲＩα鎖の細胞外部分と、マウスＦｃγＲＩα鎖の細胞内部分と、を含む、ＦｃγＲＩタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩα鎖は、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＦｃγＲＩタンパク質は、ヒトＦｃγＲＩタンパク質の正常なエフェクター機能を保持する。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃγＲＩα鎖の細胞外部分は、ＥＣ１ドメイン、ＥＣ２ドメイン、ＥＣ３ドメイン、又はこれらの組み合わせを含む。本発明はまた、ヒト細胞外領域を有するヒトＦｃγＲＩタンパク質の一部をコードする核酸分子と、マウスＦｃγＲＩタンパク質の細胞内部分をコードする核酸分子と、を含む、ゲノム断片を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＦｃγＲＩα鎖の細胞外部分と、マウスＦｃγＲＩα鎖の細胞内部分と、を含む、ＦｃγＲＩタンパク質であって、前記ＦｃγＲＩα鎖が、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＦｃγＲＩタンパク質が、ヒトＦｃγＲＩタンパク質の正常なエフェクター機能を保持する、ＦｃγＲＩタンパク質。
【請求項２】
前記ヒトＦｃγＲＩα鎖の細胞外部分が、ＥＣ１ドメイン、ＥＣ２ドメイン、ＥＣ３ドメイン、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載のＦｃγＲＩタンパク質。
【請求項３】
前記ＥＣ１ドメインが、配列番号３のエクソン３の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列によってコードされている、請求項２に記載のＦｃγＲＩタンパク質。
【請求項４】
前記ＥＣ２ドメインが、配列番号３のエクソン４の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列によってコードされている、請求項２に記載のＦｃγＲＩタンパク質。
【請求項５】
前記ＥＣ３ドメインが、配列番号３のエクソン５の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列によってコードされている、請求項２に記載のＦｃγＲＩタンパク質。
【請求項６】
前記ＦｃγＲＩα鎖の細胞内部分が、マウスＦｃγＲＩα鎖の細胞質ドメインの全体又は一部を含む、請求項１に記載のＦｃγＲＩタンパク質。
【請求項７】
前記ＦｃγＲＩα鎖が、マウスＦｃγＲＩα鎖膜貫通ドメインの全体又は一部を更に含む、請求項１に記載のＦｃγＲＩタンパク質。
【請求項８】
前記ＦｃγＲＩα鎖が、配列番号５と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＦｃγＲＩタンパク質。
【請求項９】
請求項１に記載のＦｃγＲＩタンパク質を発現する、マウス細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、単球、マクロファージ、好中球、又は樹状細胞である、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
ヒトＦｃγＲＩα鎖の細胞外部分と、マウスＦｃγＲＩα鎖の細胞内部分と、を含む、ＦｃγＲＩα鎖をコードする核酸であって、コードされる前記ＦｃγＲＩα鎖が、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、核酸。
【請求項１２】
コードされる前記ヒトＦｃγＲＩα鎖の細胞外部分が、ＥＣ１ドメイン、ＥＣ２ドメイン、ＥＣ３ドメイン、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
前記ＥＣ１ドメインが、配列番号３のエクソン３の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列によってコードされる、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
前記ＥＣ２ドメインが、配列番号３のエクソン４の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列によってコードされる、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１５】
前記ＥＣ３ドメインが、配列番号３のエクソン５の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列によってコードされる、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１６】
コードされる前記ＦｃγＲＩα鎖の細胞内部分が、マウスＦｃγＲＩα鎖の細胞質ドメインの全体又は一部を含む、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１７】
コードされる前記ＦｃγＲＩタンパク質が、マウスＦｃγＲＩα鎖膜貫通ドメインの全体又は一部を更に含む、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１８】
コードされる前記ＦｃγＲＩα鎖が、配列番号５と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１９】
請求項１１に記載の核酸を含む、マウス細胞。
【請求項２０】
前記細胞、単球、マクロファージ、好中球、又は樹状細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２０１４年４月８日出願の米国特許仮出願第６１／９７７，０３７号の利益と優先権を主張するものであり、その全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、哺乳類において免疫系の様々な機能を実行する、免疫系細胞の表面にあるタンパク質である。ＦｃＲは、様々な種類の様々な細胞上に存在し、例えば、感染細胞又は侵入病原体に付いている抗体への結合、抗体媒介性食作用又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって、微生物又は感染細胞を破壊するための食細胞又は細胞傷害性細胞の刺激といった、様々な免疫機能を媒介する。
【０００３】
ＡＤＣＣは、免疫系のエフェクター細胞が、抗体によって結合された標的細胞を溶解するプロセスである。このプロセスは、外来抗原又は細胞に事前に曝露された結果、抗体反応が生じることによるものである。ＡＤＣＣは、外来抗原又は細胞に結合される抗体自身のＦｃ領域に、エフェクター細胞の表面に発現するＦｃＲが結合することにより、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのエフェクター細胞を介して媒介され得る。高親和性ＦｃγＲ１受容体シグナルは、免疫系の制御及びエフェクター細胞の機能において重要な役割を果たしている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ヒトでは実施できなかったヒト免疫エフェクター応答に対する実験を可能にするため、マウスなど非ヒト動物を遺伝子操作し、ヒト又はハイブリッドＦｃγＲＩタンパク質を発現させるのに望ましい、認識を包含する。
【０００５】
また本発明は、内在性マウスＦｃγＲＩ遺伝子をヒト化（ヒト又はハイブリッド）ＦｃγＲＩ遺伝子と置換するのに望ましい、認識も包含する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＦｃγＲＩα鎖の細胞外部分と、マウスＦｃγＲＩα鎖の細胞内部分と、を含む、ＦｃγＲＩタンパク質を発現するマウスを提供する。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃγＲＩα鎖の細胞外部分は、ＥＣ１ドメイン、ＥＣ２ドメイン、ＥＣ３ドメイン、又はこれらの組み合わせを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ＥＣ１ドメインは、配列番号３のエクソン３に、少なくとも５０％、７０％、８５％、９０％又は９５％同一であるエクソンによってコードされる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ＥＣ２ドメインは、配列番号３のエクソン４に、少なくとも５０％、７０％、８５％、９０％又は９５％同一であるエクソンによってコードされる。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ＥＣ３ドメインは、配列番号３のエクソン５に、少なくとも５０％、７０％、８５％、９０％又は９５％同一であるエクソンによってコードされる。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＦｃγＲＩα鎖の細胞外部分と、マウスＦｃγＲＩα鎖の細胞内部分と、を含む、ＦｃγＲＩタンパク質を発現するマウスを提供し、このときマウスは、全長マウスＦｃγＲＩα鎖を検出可能に発現しない。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩα鎖の細胞内部分は、マウスＦｃγＲＩα鎖の細胞質ドメインの全体又は一部を含む。いくつかの実施形態では、マウスは、マウスＦｃγＲＩα鎖の膜貫通ドメインの全体又は一部を含む、ＦｃγＲＩα鎖を更に発現する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号５に、少なくとも７０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるＦｃγＲＩα鎖アミノ酸配列を発現するマウスを提供する。いくつかの実施形態では、ヒト又はハイブリッドＦｃγＲＩタンパク質は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、及び／又はこれらの組み合わせ上に検出可能に発現する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ヒトＦｃγＲＩタンパク質レベルは、マウス顆粒球コロニー刺激因子（ｍＧ−ＣＳＦ）の投与によって上昇する。いくつかの実施形態では、マウスＦｃγＲＩタンパク質レベルは、マウス顆粒球コロニー刺激因子（ｍＧ−ＣＳＦ）の投与によって、単球、好中球、又は樹状細胞中で上昇しない。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本発明は、マウスＦｃγＲＩ遺伝子の１つ又は２つ以上のエクソンに機能的に連結されるヒトＦｃγＲＩ遺伝子の１つ又は２つ以上のエクソンを含む、ＦｃγＲＩ遺伝子を発現するマウスを提供する。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃγＲＩ遺伝子のエクソンは、ヒトＦｃγＲＩタンパク質の１つ又は２つ以上の細胞外部分をコードする。いくつかの実施形態では、マウスＦｃγＲＩ遺伝子のエクソンは、マウスＦｃγＲＩタンパク質の１つ又は２つ以上の細胞内部分をコードする。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃγＲＩのエクソンは、エクソン３、４、５、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、マウスＦｃγＲＩの細胞内部分は、１つ又は２つ以上のマウス細胞内シグナルカスケードに機能的に連結される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＦｃγＲＩを発現するマウスを提供し、このときマウスの生殖系細胞は、機能性マウスＦｃγＲＩ遺伝子を欠く。いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＦｃγＲＩを発現するマウスを提供し、このときマウスの生殖系細胞は、全てのマウスＦｃγＲＩ遺伝子を欠く。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、そのゲノムが、ヒトＦｃγＲＩタンパク質の細胞外部分及びマウスＦｃγＲＩタンパク質の細胞内部分をコードするＦｃγＲＩ遺伝子を含む、胚幹細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩ遺伝子は、ヒトＦｃγＲＩ遺伝子のエクソン３、４、及び５を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩ遺伝子は、１つ又は２つ以上のヒト５’非翻訳領域に隣接するヒトエクソン１を更に含む。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃγＲＩタンパク質の細胞外部分は、ＥＣ１、ＥＣ２、及びＥＣ３のうち１つ又は２つ以上を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明は、そのゲノムが、配列番号５に、少なくとも７０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるＦｃγＲＩα鎖アミノ酸配列を含む、胚幹細胞を提供する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、胚幹細胞は、マウスＦｃγＲＩ遺伝子のエクソン６のアミノ酸残基を含む、ＦｃγＲＩ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、マウスＦｃγＲＩタンパク質の細胞内部分は、マウスＦｃγＲＩタンパク質の細胞質ドメインの全体又は一部を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＦｃγＲＩ遺伝子を含む胚幹細胞を提供し、このときヒトＦｃγＲＩ遺伝子は、自然界で見られるマウスゲノム中に現れる、内在性ＦｃγＲＩの座に位置する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるように胚幹から発生する、マウス胚を提供する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本発明は、トランスジェニックマウスの作製のための、本明細書に記載されるマウス胚幹細胞の使用を提供する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ヒトＦｃγＲＩタンパク質の細胞外部分と、マウスＦｃγＲＩタンパク質の細胞内部分と、を含む、ＦｃγＲＩタンパク質を発現するマウスの作製方法が開示され、この方法は、（ａ）マウス胚幹細胞を得る工程と、（ｂ）胚細胞において、内在性マウスＦｃγＲＩ遺伝子を、ヒト細胞外領域を有するヒトＦｃγＲＩタンパク質の一部をコードする核酸分子を含むゲノム断片で置換する工程と、（ｃ）（ｂ）の胚細胞を用いてマウスを作製する工程と、を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒト細胞外領域を有するヒトＦｃγＲＩタンパク質の一部をコードする核酸分子と、マウスＦｃγＲＩタンパク質の細胞内部分をコードする核酸分子と、を含む、ゲノム断片を提供する。
【００２４】
本出願において使用されるとき、用語「約」及び「およそ」は、同じ意味で使用される。本出願において使用される、約／およそを伴う、又は伴わない任意の数値は、当業者によって理解される任意の通常の変化を対象とすることを意味する。
【００２５】
本発明のその他の特徴、目的、及び利点は、以下の発明を実施するための形態に明らかとなっている。しかしながら、発明を実施するための形態は、本発明の実施形態を示しているが、限定ではなく、実例としてのみ与えられるものであることを理解されたい。発明を実施するための形態から、本発明の範囲内において様々な変更や修正が当業者に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本明細書に含まれる図面は、限定するためではなく例示目的のみのためである。
【図１】図１は、実験用マウス及び野生型対照におけるＦｃγＲＩマウス対立遺伝子の遺伝子型を示す。
【図２】図２は、実験用マウス及び野生型対照におけるヒトＦｃγＲＩ遺伝子の相対コピー数を示す。
【図３】図３は、ヒトＦｃγＲＩを１コピー有するＨｅｔ（＋／−）マウスを基準とし、平均ΔＣｔによって較正された、遺伝子コピー数の形質転換データを示す。
【図４】図４は、ヒト供血者の細胞中のＦｃγＲＩ受容体の発現を示す。
【図５】図５は、ヒトＦｃγＲＩ遺伝子、マウスＦｃγＲＩ遺伝子、及びヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子の概略図（正確な縮尺ではない）を示す。
【図６】図６は、ＭＡＩＤ  ６０７４カセットの調製プロセスの概略図（正確な縮尺ではない）を示す。
【図７】図７は、脾臓及び血液中で正常な細胞頻度を示す、ヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子を有するマウスを示す。
【図８】図８は、ヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子を有するマウスにおける骨髄系脾臓系集団を示す。
【図９】図９は、ヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子を有するマウスの脾臓のマクロファージ上での、マウスＦｃγＲＩ発現の欠損を示す。
【図１０】図１０は、ヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子を有するマウスの脾臓の単球上での、ヒトＦｃγＲＩ発現の獲得を示す。
【図１１】図１１は、内在性マウスＦｃγＲＩ遺伝子を有するマウス（ＭＡＩＤ  ６０７４ＷＴ）、及び、ヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子に関してホモ接合であるマウス（ＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯ）の腹腔から精製したマクロファージの、ＦＡＣＳ分析中のゲーティング戦略を示す。
【図１２】図１２は、内在性マウスＦｃγＲＩ遺伝子を有するマウス（ＭＡＩＤ  ６０７４ＷＴ）、及び、ヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子に関してホモ接合であるマウス（ＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯ）の腹腔のマクロファージ中の、ヒトＦｃγＲＩ及びマウスＦｃγＲＩの発現を示す。
【図１３】図１３は、内在性マウスＦｃγＲＩ遺伝子を有するマウス（ＭＡＩＤ  ６０７４ＷＴ）、及び、ヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子に関してホモ接合であるマウス（ＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯ）の骨髄由来マクロファージの、ＦＡＣＳ分析中のゲーティング戦略を示す。
【図１４】図１４は、内在性マウスＦｃγＲＩ遺伝子を有するマウス（ＭＡＩＤ  ６０７４ＷＴ）、及び、ヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子に関してホモ接合であるマウス（ＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯ）の骨髄由来マクロファージ中の、ヒトＦｃγＲＩ及びマウスＦｃγＲＩの発現を示す。
【図１５】図１５は、内在性マウスＦｃγＲＩ遺伝子を有するマウス（対照７５／２５）、及び、ヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子に関してヘテロ接合であるマウス（ＭＡＩＤ  ６０７４ＨＥＴ）の骨髄由来マクロファージの、ＦＡＣＳ分析中のゲーティング戦略を示す。
【図１６】図１６は、内在性マウスＦｃγＲＩ遺伝子を有する真得る（対照７５／２５）、及び、ヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子に関してヘテロ接合であるマウス（ＭＡＩＤ  ６０７４ＨＥＴ）の、骨髄由来マクロファージ中の、ヒトＦｃγＲＩ及びマウスＦｃγＲＩの発現を示す。
【図１７】図１７は、ＰＢＳ処理４８時間後の、ＭＡＩＤ  ６０７４ＷＴと比較した、ＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯマウスにおける、骨髄系血液集団を示す。
【図１８】図１８は、ｍＧ−ＣＳＦ処理４８時間後の、ＭＡＩＤ  ６０７４ＷＴマウスと比較した、ＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯマウスにおける、骨髄系血液集団を示す。
【図１９】図１９は、ＰＢＳ処理４８時間後の、ＭＡＩＤ  ６０７４ＷＴマウス及びＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯマウスの血液における、ヒトＦｃγＲＩ発現の欠損を示す。
【図２０】図２０は、ｍＧ−ＣＳＦ処理４８時間後の、ＭＡＩＤ  ６０７４ＷＴマウスと比較した、ＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯマウスの血液における、ヒトＦｃγＲＩ発現を示す。
【図２１】図２１は、ＰＢＳ処理４８時間後の、ＭＡＩＤ  ６０７４ＷＴ及びＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯマウスの血液における、マウスＦｃγＲＩ発現の欠損を示す。
【図２２】図２２は、ｍＧ−ＣＳＦ処理４８時間後の、ＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯマウスと比較した、ＭＡＩＤ  ６０７４ＷＴの血液における、マウスＦｃγＲＩ発現を示す。
【図２３】図２３は、ＰＢＳ処理４８時間後の、ＭＡＩＤ  ６０７４ＷＴマウスと比較した、ＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯにおける、骨髄系脾臓系集団を示す。
【図２４】図２４は、ｍＧ−ＣＳＦ処理４８時間後の、ＭＡＩＤ  ６０７４ＷＴマウスと比較した、ＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯマウスにおける、骨髄系脾臓系集団を示す。
【図２５】図２５は、ＰＢＳ処理４８時間後の、ＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯマウス及び６０７４ＷＴマウスの脾臓系単球における、ヒトＦｃγＲＩ発現の欠損を示す。
【図２６】図２６は、ｍＧ−ＣＳＦ処理４８時間後の、ＭＡＩＤ  ６０７４ＷＴマウスと比較した、ＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯマウスの脾臓における、ヒトＦｃγＲＩ発現を示す。
【図２７】図２７は、ＰＢＳ処理４８時間後の、ＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯマウスと比較した、ＭＡＩＤ  ６０７４ＷＴマウスの脾臓における、マウスＦｃγＲＩ発現を示す。
【図２８】図２８は、ｍＧ−ＣＳＦ処理４８時間後の、ＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯマウスと比較した、ＭＡＩＤ  ６０７４ＷＴマウスの脾臓における、マウスＦｃγＲＩ発現を示す。
【図２９】図２９は、ＰＢＳ又はｍＧ−ＣＳＦ処理後の、ＭＡＩＤ  ６０７４ＷＴ及びＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯマウスの細胞集団における、ヒトＦｃγＲＩ発現の要約を示す。
【図３０】図３０は、ｍＨＰＲＴ１で補正された、ＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯマウスの血液及び脾臓における、ｍＧ−ＣＳＦによって誘発されたヒトＦｃγＲＩのｍＲＮＡの上方制御を示す。
【図３１】図３１は、ＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯマウスの血液及び脾臓における、ｍＧ−ＣＳＦによって誘発されたヒトＦｃγＲＩのｍＲＮＡの上方制御を示す。
【図３２】図３２は、マウスＦｃγＲＩのヒト化のための、模式的かつ代表的な戦略を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
定義
本発明は、記載される特定の方法及び実験条件に限定されず、したがって、方法及び条件は変わり得る。本明細書で使用される専門用語は、具体的な実施形態を記載するという目的でのみ使用されるものであり、制限を意図するものではなく、したがって、本発明の範囲は特許請求の範囲によって定義されることも理解されるであろう。
【００２８】
別途記載のない限り、本明細書で使用される全ての用語及び語句は、矛盾するものが明確に示されない限り、又は、その用語又は語句が使用される文脈から明確に明らかでない限り、その用語及び語句が当該技術分野において示している意味を含む。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の実践又は試験において使用できるものの、ここでは特定の方法及び材料を記載する。
【００２９】
対象とする１つ又は２つ以上の値に対して本明細書において適用される、用語「およそ」は、示した参照値に類似する値を指す。特定の実施形態では、用語「およそ」又は「約」は、別途記載のない限り、又は文脈から明らかでない限り（かかる数が可能値の１００％を超える場合を除く）、示した参照値の、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれ以下で、いずれかの方向（より大きい又はより小さい）に含まれる、値の範囲を指す。
【００３０】
本明細書で使用されるとき、用語「生物活性のある」は、生体系内、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、又はｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、生体内）において活性を有する、任意の剤の特徴を指す。例えば、生体内に存在するとき、その生体内で生物学的作用を有する剤を、生物活性があるとみなす。特定の実施形態では、タンパク質又はポリペプチドが生物活性である場合、そのタンパク質又はポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を共有するタンパク質又はポリペプチドの部分を、典型的には「生物活性のある」部分と称する。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、用語「同等」は、観察された差異又は同等性に基づいて結論が容易に得られるように、それらの間の比較を可能にするための、互いに同一とは言えないが、十分に類似している、２つ又はそれ以上の剤、物質、状況、一連の条件などを指す。当業者は、文脈中で、同等であると考えられる２つ又はそれ以上のかかる剤、物質、状況、一連の条件などにおいて、任意の所与の状況において求められる同一性の程度を理解するであろう。
【００３２】
用語「保存的」は、あるアミノ酸残基の、類似する化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）を持つ側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基による置換を称する、保存的アミノ酸置換を説明するために本明細書で使用される。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の所望の機能的特性、例えば、受容体のリガンドへの結合能を実質的に変化させない。類似する化学的性質を持つ側鎖を有するアミノ酸群の例として、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンなどの脂肪族側鎖、セリン及びスレオニンなどの脂肪族ヒドロキシル側鎖、アスパラギン及びグルタミンなどのアミド含有側鎖、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンなどの芳香族側鎖、例えばリシン、アルギニン、及びヒスチジンなどの塩基性側鎖、アスパラギン酸及びグルタミン酸などの酸性側鎖、並びに、システイン及びメチオニンなどのイオウ含有側鎖が挙げられる。保存的アミノ酸置換基として、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リシン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、及びアスパラギン／グルタミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えばアラニンスキャニング変異導入法で使用されるような、タンパク質中の任意の天然残基の、アラニンによる置換であってよい。いくつかの実施形態では、Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ  Ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎｔｉｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３〜４５（参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示される、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリクス中で正の値を有する、保存的置換がなされる。いくつかの実施形態では、置換は、その置換がＰＡＭ２５０対数尤度マトリクス中で負でない値を有する、中程度の保存的置換である。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、用語「破壊」は、ＤＮＡ分子による（例えば、遺伝子又は遺伝子座などの内在性相同性配列による）相同組み換え事象の結果を指す。いくつかの実施形態では、破壊により、挿入、欠失、置換（substitution）、置換（replacement）、ミスセンス変異、若しくはＤＮＡ配列のフレームシフト、又はこれらの任意の組み合わせになる、又はこれらを示すことがある。挿入は、内在性配列以外の起源であってもよい、遺伝子全体又は遺伝子フラグメント、例えばエクソンの挿入を含み得る。いくつかの実施形態では、破壊により、遺伝子又は遺伝子産物（例えば、遺伝子にコードされるタンパク質）の発現及び／又は活性が増加する場合がある。いくつかの実施形態では、破壊により、遺伝子又は遺伝子産物の発現及び／又は活性が減少する場合がある。いくつかの実施形態では、破壊により、遺伝子又はコードされる遺伝子産物（例えば、コードされるタンパク質）の配列が変わる場合がある。いくつかの実施形態では、破壊により、遺伝子又はコードされる遺伝子産物（例えば、コードされるタンパク質）が切断される又は断片化される場合がある。いくつかの実施形態では、破壊により、遺伝子又はコードされる遺伝子産物が伸長する場合があり、いくつかのこのような実施形態では、破壊により、融合タンパク質の集合が達成される場合がある。いくつかの実施形態では、破壊により、遺伝子又は遺伝子産物の活性ではなくレベルに影響する場合がある。いくつかの実施形態では、破壊により、遺伝子又は遺伝子産物のレベルではなく活性に影響する場合がある。いくつかの実施形態では、破壊により、遺伝子又は遺伝子産物のレベルに顕著な影響を及ぼさない場合がある。いくつかの実施形態では、破壊により、遺伝子又は遺伝子産物の活性に顕著な影響を及ぼさない場合がある。いくつかの実施形態では、破壊により、遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性のいずれにも顕著な影響を及ぼさない場合がある。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、語句「内在性遺伝子座」又は「内在性遺伝子」は、本明細書に記載される破壊、欠失、置換、変更、又は修飾が導入される前に、親又は参照生物にある遺伝子座を指す。いくつかの実施形態では、内在性遺伝子座は、天然に存在する配列を有する。いくつかの実施形態では、内在性遺伝子座は野生型である。いくつかの実施形態では、参照生物は野生型生物である。いくつかの実施形態では、参照生物は遺伝子組み換え生物である。いくつかの実施形態では、参照生物は、実験室で繁殖された生物（野生型又は遺伝子組み換えのいずれか）である。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、語句「内在性プロモーター」は、例えば、野生型生物において、天然で内在性遺伝子と関連しているプロモーターを指す。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、用語「ＦｃγＲＩタンパク質」は、３つの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを有するα鎖を含む、高親和性免疫グロブリンＦｃ受容体を指す。
【００３７】
実例として、マウス及びヒトＦｃγＲＩα遺伝子の代表的なヌクレオチド及びアミノ酸配列を表３に示す。当業者はこの開示を読むと、１つの（又は全ての）ゲノム中の１つ又は２つ以上の内在性ＦｃγＲＩ受容体遺伝子を、１つ又は２つ以上の異種ＦｃγＲＩ遺伝子（例えば、多型変異体、サブタイプ又は変異体、別の種の遺伝子など）で置換できることを認めるであろう。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、「ＦｃγＲＩ発現細胞」は、ＦｃγＲＩを発現する細胞を指す。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩ発現細胞は、ＦｃγＲＩ受容体をその表面に発現する。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩ受容体は、細胞表面に発現したＦｃγＲＩタンパク質を介する、細胞間相互作用を媒介するのに十分な量で、細胞表面に発現する。代表的なＦｃγＲＩ発現細胞として、リンパ球、骨髄細胞、マクロファージ、好中球、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。ＦｃγＲＩ発現細胞は、免疫細胞の相互作用を制御し、様々な外来抗原又は病原体に対する免疫反応を制御するための、いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物は、非ヒト動物のもう１つの細胞表面に発現するヒト化ＦｃγＲＩ受容体を介して、免疫細胞制御を示す。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、用語「異種」は、異なる起源由来の剤又は物質を指す。例えば、ポリペプチド、遺伝子、若しくは遺伝子産物に対して使用される、又は、特定の細胞若しくは生物中に存在するとき、この用語によって、関連するポリペプチド、遺伝子、又は遺伝子産物が、１）人の手で遺伝子組み換えされたこと、２）人の手で細胞若しくは生物（若しくはこれらの前駆体）に導入されたこと（例えば、遺伝子操作により）、及び／又は、３）関連する細胞若しくは生物（例えば、関連する細胞種若しくは生物種）により天然に産生されない、若しくは天然に存在しないことが明確になる。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、用語「宿主細胞」は、異種（例えば、外来性）核酸又はタンパク質が導入されている細胞を指す。当業者はこの開示を読むと、このような用語が、特定の対象細胞を指すだけではなく、かかる細胞の子孫を指すのに使用されることも理解するだろう。ある修飾は、変異又は環境の影響のいずれかによって後続の世代で生じ得るため、このような子孫は、実際に、親細胞と同一ではなく、本明細書で使用されるとき、用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる場合がある。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、原核若しくは真核細胞である、又はこれらを含む。一般に、宿主細胞は、細胞が指定されるその生物の界にかかわらず、異種核酸若しくはタンパク質を受容する及び／又は産生するのに好適な、任意の細胞である。代表的な細胞として、原核生物及び真核生物（単細胞又は多細胞）、細菌細胞（例えば、大腸菌、バチルス種、ソトレプトマイセス種の株など）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、イラクサギンウワバなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、又は、例えば、ハイブリドーマ若しくはクアドローマなどの細胞融合体のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、又はマウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は真核であり、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３  ＥＢＮＡ、ＭＳＲ  ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（上皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ  ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ  ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ミエローマ細胞、腫瘍細胞、及び前記細胞由来の細胞株から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ又は２つ以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）を発現する網膜細胞を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、単離された細胞である、又はこれらを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は組織の一部である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は生物の一部である。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、語句「ヒトＦｃγＲＩ遺伝子」は、文脈に応じて、完全ヒト、実質的ヒト、又はヒト化部分のＦｃγＲＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、「ヒトＦｃγＲＩ」遺伝子は、完全マウスＦｃγＲＩ遺伝子とは対照的に、ヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃγＲＩ遺伝子は、１つ又は２つ以上の置換、付加、欠失、又は変異を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃγＲＩ遺伝子は、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４Ａ）、ＦｃγＲＩＢ（ＣＤ６４Ｂ）、ＦｃγＲＩＣ（ＣＤ６４Ｃ）、又はこれらの組み合わせを含む。
【００４２】
語句「ヒトＦｃγＲＩタンパク質」は、文脈に応じて、完全ヒト、実質的ヒト、又はヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子にコードされるタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、「ヒトＦｃγＲＩ」タンパク質は、完全マウスＦｃγＲＩタンパク質とは対照的に、ヒト化ＦｃγＲＩタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃγＲＩタンパク質は、１つ又は２つ以上のアミノ酸置換、付加、欠失、又は変異を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩタンパク質は、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４Ａ）、ＦｃγＲＩＢ（ＣＤ６４Ｂ）、ＦｃγＲＩＣ（ＣＤ６４Ｃ）、又はこれらの組み合わせを含む。
【００４３】
語句「ハイブリッドＦｃγＲＩ遺伝子」又は「ハイブリッドＦｃγＲＩタンパク質」は、少なくとも２種類の異なる動物種のＦｃγＲＩ配列を含む、ＦｃγＲＩ遺伝子又はタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、ハイブリッドＦｃγＲＩ遺伝子は、ヒト核酸配列の一部と、マウス核酸配列の一部と、を含む。いくつかの実施形態では、ハイブリッドＦｃγＲＩタンパク質は、ヒトアミノ酸配列の一部と、マウスアミノ酸配列の一部と、を含む。
【００４４】
用語「ヒト化」は、当該技術により理解される意味に従って本明細書で使用され、その構造（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸配列）が、非ヒト動物において天然に存在する特定の遺伝子又はタンパク質の構造と、実質的に又は同様に一致する部分を含み、関連する特定の非ヒト遺伝子又はタンパク質に存在するものとは異なる部分も含み、その代わりに、対応するヒト遺伝子又はタンパク質において存在する同等の構造とよりぴったり一致する、核酸又はタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、「ヒト化」遺伝子は、ヒトポリペプチド（例えば、ヒトタンパク質又はその一部、例えば、その特徴部）のものようなアミノ酸配列を実質的に有する、ポリペプチドをコードするものである。一例を与えるにすぎないが、膜受容体の場合、「ヒト化」遺伝子は、ヒト細胞外部分のもののようなアミノ酸配列を有する細胞外部分、及び、非ヒト（例えば、マウス）ポリペプチドのもののような残りの配列を有するポリペプチドをコードしてよい。いくつかの実施形態では、ヒト化遺伝子は、ヒト遺伝子のＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化遺伝子は、ヒト遺伝子の全ＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化タンパク質は、ヒトタンパク質を表す部分を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化タンパク質は、ヒトタンパク質の全配列を含み、ヒト遺伝子のホモログ又はオルソログに相当する非ヒト動物の内在性遺伝子座から発現される。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、配列の比較に関する用語「同一性」は、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列の同一性測定に使用できる、当該技術分野において既知である多くの異なるアルゴリズムによって判定される、同一性を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される同一性は、開始ギャップペナルティに１０．０、伸長ギャップペナルティに０．１を利用し、Ｇｏｎｎｅｔの類似性マトリクス（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  Ｉｎｃ．、２００８）を使用して、ＣｌｕｓｔａｌＷ  ｖ．１．８３（ｓｌｏｗ）アライメントを用いて判定される。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、用語「細胞内シグナルカスケード」又は「細胞内シグナル伝達」は、細胞表面から１つ又は２つ以上の細胞内標的へのシグナルの伝達を指す。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達は、標的分子（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域）のＦｃγＲ１受容体の細胞外コンポーネントへの結合により誘発される、細胞内の生理的反応を含む。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、用語「単離された」は、（１）当初産生されたとき（天然に、及び／若しくは、実験室において）、関連した成分の少なくとも一部から分離されている、並びに／又は、（２）人の手で設計され、産生され、調製され、及び／若しくは製造されている、物質及び／若しくは物体を指す。単離された物質及び／又は物体は、これらが当初関連した他の成分から、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％超が分離されていてよい。いくつかの実施形態では、単離された剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％超、純粋である。本明細書で使用されるとき、物質が実質的に他の成分を含まない場合、「純粋」である。いくつかの実施形態では、当業者によって理解されるように、物質は、例えば、１つ又は２つ以上のキャリア又は賦形剤（例えば、緩衝剤、溶媒、水など）などの他のある成分と混合された後でも、依然として「単離された」又は更には「純粋」であると考えてよく、かかる実施形態では、物質の単離割合又は純度は、かかるキャリア又は賦形剤を含めずに計算される。一例を与えるにすぎないが、いくつかの実施形態では、天然に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチドなどの生体高分子は、ａ）その起源又は誘導源に基づいて、自然界で天然の状態において伴われている成分の一部又は全てを伴わない場合、ｂ）自然界でそれを産生する種由来の同種の別のポリペプチド又は核酸を実質的に含まない場合、ｃ）自然界でそれを産生する種のものではない細胞又は他の発現系によって発現される、ないしは別の方法でこれら由来の成分を伴う場合に、「単離された」とみなす。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、化学的に合成される、又は、自然界でそれを産生するものとは異なる細胞系で合成されるポリペプチドを、「単離された」ポリペプチドとみなす。あるいは又は追加的に、いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の精製手法にかけられたポリペプチドを、ａ）自然界において関連している、及び／又はｂ）当初産生されたときに伴っていた、他の成分から分離されている限り、「単離された」ポリペプチドとみなしてもよい。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、語句「マウスＦｃγＲＩ遺伝子」は、配列番号１に示される核分子、又は、配列番号１に示される分子と実質的な同一性を有する核酸分子を含む、遺伝子を指す。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、語句「マウスＦｃγＲＩタンパク質」は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号２に示されるタンパク質と実質的な同一性を有するタンパク質を含む、タンパク質を指す。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、語句「非ヒト動物」は、ヒトではない任意の脊椎動物を指す。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、円口類、硬骨魚、軟骨魚（例えば、さめ又はエイ）、両生類、爬虫類、哺乳類、及び鳥類である。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳類は、霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、雌ウシ、又は齧歯類である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、ラット又はマウスなどの齧歯類である。
【００５１】
本明細書で広義で使用されるとき、語句「核酸」は、オリゴヌクレオチド鎖中に組み込まれている、又は組み込むことができる、任意の化合物及び／又は物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合によってオリゴヌクレオチド鎖中に組み込まれている、又は組み込むことができる、化合物及び／又は物質である。文脈から明らかであるように、いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／又はヌクレオシド）を指し、いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」はＲＮＡであり、又はこれを含み、いくつかの実施形態では、「核酸」はＤＮＡであり、又はこれを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ又は２つ以上の天然核酸残基である、これらを含む、又はこれらからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ又は２つ以上の核酸アナログである、これらを含む、又はこれらからなる。いくつかの実施形態では、核酸アナログは、ホスホジエステル骨格を利用していない点で核酸とは異なる。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、当該技術分野において既知であり、骨格中でホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する１つ又は２つ以上の「ペプチド核酸」であり、これらを含み、又はこれらからなり、本発明の範囲内であるとみなされる。あるいは又は追加的に、いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合よりも、１つ又は２つ以上のホスホロチオエート及び／又は５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ又は２つ以上の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）である、これらを含む、又はこれらからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ又は２つ以上のヌクレオシドアナログ（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、２−チオシチジン、メチル化塩基、介在塩基、及びこれらの組み合わせ）である、これらを含む、又はこれらからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、天然核酸中のものと比較して、１つ又は２つ以上の変性糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡ又はタンパク質などの機能性遺伝子産物をコードする、ヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は１つ又は２つ以上のイントロンを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、天然源からの単離、相補的鋳型を基にした重合による酵素的合成（ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、組み換え細胞又は系での複製、及び化学合成のうち、１つ又は２つ以上によって調製される。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００以上の残基長である。いくつかの実施形態では、核酸は一本鎖であり、いくつかの実施形態では、核酸は二本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードする少なくとも１つのエレメントを含むヌクレオチド配列を有し、又は、ポリペプチドをコードする配列の相補配列である。いくつかの実施形態では、核酸は酵素活性を有する。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、語句「機能的に連結」は、記載の構成要素が、意図された様式で機能させることができる関係にある、並列関係を指す。コード配列に「機能的に連結」しているコントロール配列を、コントロール配列に適した条件下でコード配列を発現させることのできるような方法でライゲーションする。「機能的に連結」された配列は、対象とする遺伝子に隣接する発現コントロール配列と、対象とする遺伝子を制御するためにトランスで、又は離れて作用する発現コントロール配列との両方を含む。本明細書で使用されるとき、用語「発現コントロール配列」は、ライゲーションされるコード配列の発現及びプロセシングさせるのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現コントロール配列として、適切な転写開始、終結、プロモーター、及びエンハンサー配列、スプライシング及びポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を高める配列、及び所望により、タンパク質分泌を高める配列が挙げられる。かかるコントロール配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。例えば、原核生物では、かかるコントロール配列は通常、プロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含み、一方真核生物では、典型的に、かかるコントロール配列は、プロモーター及び転写終結配列を含む。用語「コントロール配列」は、その存在が、発現及びプロセシングに必須である要素を含むことを意図し、その存在が有利である追加の要素、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列も含んでよい。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、人の手の作用により、設計され及び／又は産生された、遺伝子組み換えされているアミノ酸配列を有する。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、用語「組み換え」は、組み換え手段により、設計され、遺伝子組み換えされ、調製され、発現され、作製され、若しくは単離されるポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるシグナル調節タンパク質）、例えば、宿主細胞に形質移入された組み換え発現ベクターを用いて発現されるポリペプチド、組み換えコンビナトリアルヒトポリペプチドライブラリから単離されるポリペプチド（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．Ｒ．，（１９９７）ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ．１５：６２〜７０；Ａｚｚａｚｙ  Ｈ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｈｓｍｉｔｈ  Ｗ．Ｅ．，（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４２５〜４４５；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  Ｊ．Ｖ．，ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｗ．（２００２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：１２８〜１４５；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．，ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ  Ｐ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１〜３７８）、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入された動物（例えば、マウス）から単離される抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７〜６２９５；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  Ｓ−Ａ．，ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｌ．Ｌ．（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５９３〜５９７；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３６４〜３７０参照）、又は、互いに対するスプライシング選択配列エレメントを含む、任意のその他手段によって調製され、発現され、作製され、若しくは単離されるポリペプチドを指すことを意図する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のこのような選択配列エレメントは、天然に存在する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のこのような選択配列エレメントは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計される。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のこのような選択配列エレメントは、突然変異誘発（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ）を、例えば、天然源又は合成源由来の既知の配列エレメントに行った結果である。例えば、いくつかの実施形態では、組み換えポリペプチドは、対象とする起源生物（例えば、ヒト、マウスなど）のゲノムにある配列からなる。いくつかの実施形態では、組み換えポリペプチドは、突然変異誘発（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば非ヒト動物において）に起因するアミノ酸配列を有し、組み換えポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリペプチド配列由来であり、かつ関連しているものの、非ヒト動物のゲノム内にｉｎ  ｖｉｖｏで天然に存在し得ない配列である。
【００５５】
用語「置換」は、「置換された」核酸配列（例えば、遺伝子）（宿主の座（例えば、ゲノム中）にある）が、その座から除かれ、異なる「置換」核酸がその場に位置するプロセスを指すために本明細書で使用する。いくつかの実施形態では、置換された核酸配列及び置換核酸配列は、例えば、互いに相同である、及び／又は対応するエレメント（例えば、タンパク質コードエレメント、調節エレメントなど）を含むという点で、互いに同等である。いくつかの実施形態では、置換された核酸配列は、プロモーター、エンハンサー、スプライスドナー部位、スプライスレシーバー部位、イントロン、エクソン、非翻訳領域（ＵＴＲ）のうち１つ又は２つ以上を含み、いくつかの実施形態では、置換核酸配列は、１つ又は２つ以上のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、置換核酸配列は、置換された核酸配列のホモログである。いくつかの実施形態では、置換核酸配列は、置換された配列のオルソログである。いくつかの実施形態では、置換核酸配列は、ヒト核酸配列である、又はこれを含む。いくつかの実施形態では、置換核酸配列がヒト核酸配列である、又はこれを含む場合、置換された核酸配列は、齧歯類配列（例えば、マウス配列）である、又はこれを含む。このように配置された核酸配列は、このように配置された配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、５’−又は３’−非翻訳領域など）を得るために使用された起源核酸配列の一部である、１つ又は２つ以上の制御配列を含んでよい。例えば、様々な実施形態では、置換は、内在性配列を異種配列と置換し、そのように配置された核酸配列（異種配列を含む）の遺伝子産物の産生をもたらすが、内在性配列を発現しないものであり、置換は、内在性配列（例えば、ＦｃγＲＩタンパク質をコードする内在性ゲノム配列、及び１つ又は２つ以上のヒトＦｃγＲＩタンパク質をコードするＤＮＡフラグメント）によってコードされるタンパク質と類似する機能を有するタンパク質をコードする、核酸配列を有する内在性ゲノム配列のものである。様々な実施形態では、内在性遺伝子又はそのフラグメントは、対応するヒト遺伝子又はそのフラグメントと置換される。対応するヒト遺伝子又はそのフラグメントは、オルソログである、又は、置換される内在性遺伝子若しくはそのフラグメントと構造及び／若しくは機能が実質的に類似する、若しくは同一である、ヒト遺伝子又はフラグメントである。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、用語「実質的に」は、対象とする特徴又は性質の全体、又はほぼ全体の範囲又は程度を示す、定性的状態を指す。生物学的分野における当業者は、生物学的及び化学的現象が、仮にあるとしてもめったに、完了しない及び／若しくは完了に向かわない、又は絶対的結果に達成しない若しくは回避しないことを理解するだろう。したがって、用語「実質的に」は、多くの生物学的及び化学的現象に固有の完全性を欠く可能性を捕捉するために本明細書で使用される。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、語句「実質的な相同性」は、アミノ酸又は核酸配列間の比較を指す。当業者に理解されるように、２つの配列が対応する位置に相同残基を含有する場合に、通常は「実質的に相同」であるとみなされる。相同残基は同一残基であってよい。あるいは、相同残基は、構造的及び／又は機能的特徴が適切に類似する非同一残基であってよい。例えば、当業者に周知であるように、あるアミノ酸は、典型的には「疎水性」若しくは「親水性」アミノ酸として、及び／又は、「極性」若しくは「非極性」側鎖を有するものとして分類される。１つのアミノ酸を別の同じ種類のものと置換すると、「相同」置換であるとみなされ得ることが多い。典型的なアミノ酸分類を表１及び２にまとめる。
【００５８】
【表１】
2020062051.tif 000002
【００５９】
【表２】
2020062051.tif 000003
【００６０】
当該技術分野において周知であるように、アミノ酸又は核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮ、並びにアミノ酸配列に対するＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムを含む、任意の様々なアルゴリズムを用いて比較してもよい。代表的なかかるプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３〜４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；及び、Ｍｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。相同性配列の同定に加えて、上記プログラムは、典型的には、相同性の程度の指標を提供する。いくつかの実施形態では、対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上が、関連する残基長にわたって相同である場合、２つの配列が実質的に相同であるとみなす。いくつかの実施形態では、関連する残基長は完全配列である。いくつかの実施形態では、関連する残基長は少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又はそれ以上の残基である。いくつかの実施形態では、関連する残基長は、完全配列に沿った近接残基を含む。いくつかの実施形態では、関連する残基長は、完全配列に沿った非連続残基を含む。いくつかの実施形態では、関連する残基長は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又はそれ以上の残基である。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、語句「実質的な同一性」は、アミノ酸又は核酸配列間の比較を指す。当業者に理解されるように、２つの配列が対応する位置に同一残基を含有する場合に、通常は「実質的に同一」であるとみなされる。当該技術分野において周知であるように、アミノ酸又は核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮ、並びにアミノ酸配列に対するＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムを含む、任意の様々なアルゴリズムを用いて比較してもよい。代表的なかかるプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３〜４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；及び、Ｍｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。同一配列の同定に加えて、上記プログラムは、典型的には、同一性の程度の指標を提供する。いくつかの実施形態では、対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上が、関連する残基長にわたって同一である場合、２つの配列が実質的に同一であるとみなす。いくつかの実施形態では、関連する残基長は完全配列である。いくつかの実施形態では、関連する残基長は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又はそれ以上の残基である。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、語句「標的化ベクター」又は「標的化構築物」は、標的化領域を含むポリヌクレオチド分子を指す。標的化領域は、標的細胞、組織、又は動物中の配列に同一又は実質的に同一である配列を含み、相同組み換えによって、細胞、組織又は動物のゲノム内の位置への標的化構築物の組み込みをもたらす。部位特異的リコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘＰ又はＦｒｔ部位）を用いて標的化する標的化領域も含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の標的化構築物は、特に対象とする核酸配列又は遺伝子、選択マーカー、コントロール及び又は制御配列、並びに、かかる配列に関与する組み換えを助ける、又は促進するタンパク質を外来的に付加することによって介在される、組み換えを可能とするその他核酸配列を更に含む。いくつかの実施形態では、本発明の標的化構築物は、対象とする遺伝子の全体又は一部を更に含み、このとき対象とする遺伝子は、内在性配列によってコードされるタンパク質と類似の機能を有する、タンパク質全体又は一部をコードする異種遺伝子である。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、参照体との顕著な構造的同一性を示すが、参照体と比較して、１つ又は２つ以上の化学的部分の存在又はその程度において参照体と構造的に異なる、物体を指す。多くの実施形態では、変異体は参照体と機能的にも異なる。一般に、特定の物体が厳密に参照体の「変異体」であるとみなされるかどうかは、参照体との構造的同一性の程度に基づいている。当業者に理解されるように、任意の生物学的又は化学的参照体は、ある特徴的構造的エレメントを有する。変異体は、定義によると、１つ又は２つ以上のかかる特徴的構造的エレメントを共有する、異なる化学的物体である。少数の例を与えるにすぎないが、小分子は、特徴的コア構造的エレメント（例えば、大環状分子コア）及び／又は１つ若しくは２つ以上の特徴的ペンダント部分を有し、小分子の変異体は、コア構造的エレメント及び特徴的ペンダント部分を共有するが、別のペンダント部分、及び／又はコア内に存在する結合の種類（一重対二重、Ｅ対Ｚなど）が異なるものであってよく、ポリペプチドは、線形若しくは三次元空間内に互いに相対的な指定位置を有する、及び／又は、特定の生物学的機能に寄与する、複数のアミノ酸からなる特徴的配列エレメントを有してよく、核酸は、線形又は三次元空間に互いに相対的な指定位置を有する、複数のヌクレオチド残基からなる特徴的配列エレメントを有してよい。例えば、変異体ポリペプチドは、アミノ酸配列中の１つ若しくは２つ以上の差異、及び／又は、ポリペプチド骨格に共有結合される化学的部分（例えば、炭水化物、脂質など）の１つ若しくは２つ以上の差異の結果、参照ポリペプチドと異なっていてよい。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９９％である、参照ポリペプチドとの総配列同一性を示す。あるいは又は追加的に、いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、少なくとも１つの特徴的配列エレメントを参照ポリペプチドと共有しない。いくつかの実施形態では、参照ポリペプチドは、１つ又は２つ以上の生物学的活性を有する。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドの１つ又は２つ以上の生物学的活性を共有する。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドの１つ又は２つ以上の生物学的活性を欠く。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較して、低下したレベルの１つ又は２つ以上の生物学的活性を示す。多くの実施形態では、対象とするポリペプチドが、親の配列と同一であるアミノ酸配列を有しているが、特定の位置において少数の配列が変更している場合、対象とするポリペプチドが、親又は参照ポリペプチド「変異体」であるとみなされる。典型的に、変異体中の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満の残基が、親と比べて置換されている。いくつかの実施形態では、変異体は、親と比べて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個の置換された残基を有する。多くの場合、変異体は、非常に小数（例えば、５、４、３、２、又は１未満）の数の置換された機能性残基（すなわち、特定の生物活性に関与する残基）を有する。更に、変異体は、親と比較して、典型的には５、４、３、２、又は１個以下の付加又は欠失を有し、多くの場合、付加又は欠失を有さない。その上、任意の付加又は欠失は、典型的には、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１０、約９、約８、約７、約６個未満であり、一般には約５、約４、約３、又は約２個未満の残基である。いくつかの実施形態では、親又は参照ポリペプチドは天然に存在するものである。当業者に理解されるように、対象とする特定のポリペプチドの複数の変異体は、特に対象とするポリペプチドが病原菌のポリペプチドであるとき、通常天然に存在し得る。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、付随する別の核酸を運搬可能な核酸分子を指す。いくつかの実施形態では、ベクターは、染色体外複製、並びに／又は、真核及び／若しくは原核細胞などの宿主細胞中で連結される核酸の発現が可能である。作動可能に連結される遺伝子の発現の方向付けが可能なベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称する。
【００６５】
本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、（変異体、病的、変更などとは対照的に）「正常」状態又は状況において、天然に存在する、構造及び／又は活性を有する物体を指す、当該技術により理解される意味を有する。当業者は、野生型遺伝子及びポリペプチドは、多くの場合、多くの異なる形態で存在する（例えば、対立遺伝子）ことを理解するだろう。
【００６６】
本発明の様々な態様を、以下の項で詳細に説明する。この項を利用して、本発明を制限することを意図しない。各項は、本発明の任意の態様に適用できる。本出願では、「又は」の使用は、別途明記しない限り、「及び／又は」を意味する。
【００６７】
（詳細な説明）
本発明は、特に、ヒト又はヒト様免疫エフェクター応答の実験のための、ＦｃγＲＩ受容体をコードするヒト化遺伝物質を有する、改善された及び／又は遺伝子組み換えされた非ヒト動物を提供する。
【００６８】
Ｆｃ受容体
免疫グロブリンのＦｃ（すなわち、定常）領域に対する受容体（ＦｃＲ）は、免疫反応の調節において重要な働きを担っている。ＦｃＲは、宿主免疫系のアクセサリー細胞上に存在し、抗体によって結合された外来抗原の排出を促進する。ＦｃＲは、免疫系のアクセサリー細胞の活性化及び抑制反応の両方のバランスを保つのにも重要な働きを担っている。ＦｃＲは、マクロファージによる食作用、マスト細胞の脱顆粒、抗体−抗原複合体の取り込み、尾及び免疫反応の調節、並びにその他免疫系のプロセスに関与している。
【００６９】
マウス及びヒトでは、異なるＦｃＲが、それぞれ発現した抗体レパートリー中に存在する免疫グロブリンアイソタイプに特異的な、異なるアクセサリー細胞の表面上に別個に発現している。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体は、ＩｇＧ受容体（ＦｃγＲ）を介してエフェクター機能を媒介する。ＦｃγＲは、高親和性活性化ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、低親和性抑制性ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）、低親和性活性化ＦｃｇＲＩＩａ／ｃ（ＣＤ３２ａ／ｃ）、及び低親和性活性化ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の４つのグループに分類されている。各グループはマウス及びヒトの両方で存在するが、アイソフォームの数、及びこれらが存在する免疫細胞のサブセットが異なっている。例えば、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＢは、ヒトのアクセサリー細胞で発現されるが、マウスにはないと報告されている。更に、ＦｃγＲそれぞれに対する異なるＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１）の親和性が、マウスとヒトとの間で異なっている。
【００７０】
高親和性ヒトＦｃγＲＩ
ヒト高親和性ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、単量体のＩｇＧ型抗体と高い親和性（典型的には、Ｋａがおよそ１０−８〜１０−９Ｍ）で結合する、内在性膜糖タンパク質である。ＩｇＧが結合した後、ＣＤ６４は、細胞活性化を引き起こす免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を持つ、共通γ鎖（γ鎖）として知られるアクセサリー鎖と相互作用する。ヒトでは、ＣＤ６４は、マクロファージ及び単球に構成的に発現され、ＩＦＮγ及びＧ−ＣＳＦなどのサイトカインによって多形核白血球に誘導発現されることが報告されている。
【００７１】
ＦｃγＲＩ配列
ヒト、マウス、及びハイブリッド化ＦｃγＲＩの代表的な配列を、表３に示す。ｃＤＮＡ配列、後続エクソンを、交互に下線を引かれた文字で分離している。タンパク質配列では、細胞外配列に下線を引いている。参照配列は代表的なものであり、当業者は、追加の
マウス及びヒト配列を区別するため、配列エレメント又は同一性の程度を判定し、比較することができる。
【００７２】
【表３−１】
2020062051.tif 000004
【００７３】
【表３−２】
2020062051.tif 000005
【００７４】
ヒト化ＦｃγＲＩ非ヒト動物
発現する非ヒト動物の免疫細胞（例えば、骨髄細胞）の表面上にヒト化ＦｃγＲＩ受容体タンパク質を発現するが、これは、ＦｃγＲＩタンパク質をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子座の遺伝子改変の結果である、非ヒト動物が提供される。本明細書に記載される好適な例として、齧歯類、特にマウスが挙げられる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ヒト化内在性ＦｃγＲＩ遺伝子は、異種（例えば、ヒト）の遺伝物質を含み、このときヒト化内在性ＦｃγＲＩ遺伝子は、異種の遺伝物質をコードする部分を含む、ＦｃγＲＩタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、本発明のヒト化内在性ＦｃγＲＩ遺伝子は、細胞の原形質膜上に発現するＦｃγＲＩタンパク質の細胞外部分に相当する、異種のゲノムＤＮＡを含む。非ヒト動物、非ヒト胚、及びかかるヒト化内在性ＦｃγＲＩ遺伝子を含有する細胞を作るための、非ヒト動物、胚、細胞及び標的化構築物も提供される。
【００７６】
いくつかの実施形態では、内在性ＦｃγＲＩ遺伝子座が欠失している。いくつかの実施形態では、内在性ＦｃγＲＩ遺伝子座が変化しており、このとき内在性ＦｃγＲＩ遺伝子座の一部は、異種配列（例えば、ヒトＦｃγＲＩ配列全体又は一部）で置換されている。いくつかの実施形態では、全て又は実質的に全ての内在性ＦｃγＲＩ遺伝子座は、異種遺伝子座（例えば、ヒトＦｃγＲＩ遺伝子座）で置換されている。いくつかの実施形態では、異種ＦｃγＲＩ遺伝子座の一部は、内在性非ヒトＦｃγＲＩ遺伝子座内に挿入されている。いくつかの実施形態では、異種遺伝子座はヒト遺伝子座である。
【００７７】
本発明の非ヒト動物は、ヒトＦｃγＲＩ遺伝子全体又は一部を、内在性非ヒトＦｃγＲＩ遺伝子座に含む。したがって、かかる非ヒト動物は、異種ＦｃγＲＩ遺伝子を有していると説明され得る。置換された、挿入された、又は修飾された内在性ＦｃγＲＩ遺伝子座は、例えば、ＰＣＲ、ウエスタンブロット、サザンブロット、制限酵素切断片多型（ＲＦＬＰ）、又は、対立遺伝子獲得若しくは損失アッセイなどの、様々な方法を用いて検出できる。
【００７８】
様々な実施形態では、本発明によるヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子は、配列番号３のヒトＦｃγＲＩ遺伝子中に現れる第３、第４、及び第５エクソンと、少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）同一である配列をそれぞれ有する、第３、第４、及び第５エクソンを持つ、ＦｃγＲＩ遺伝子を含む。
【００７９】
様々な実施形態では、本発明によるヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子は、ヌクレオチドコード配列（例えば、ｃＤＮＡ配列）が、配列番号５中に現れるヌクレオチドと、少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）同一である、ＦｃγＲＩ遺伝子を含む。
【００８０】
様々な実施形態では、本発明の非ヒト動物によって産生されるヒト化ＦｃγＲＩタンパク質は、表３中に現れるヒトＦｃγＲＩタンパク質の細胞外部分と、少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）同一である、配列を有する、細胞外部分を有する。
【００８１】
様々な実施形態では、本発明の非ヒト動物によって産生されるヒト化ＦｃγＲＩタンパク質は、配列番号４のヒトＦｃγＲＩタンパク質中に現れるアミノ酸残基１８〜２８８と、少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）同一である、配列を有する、細胞外部分を有する。
【００８２】
様々な実施形態では、本発明の非ヒト動物によって産生されるヒト化ＦｃγＲＩタンパク質は、配列番号５に例示されるヒト化ＦｃγＲＩタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）同一である、アミノ酸配列を有する。
【００８３】
ヒトプロモーター及びヒト制御配列からこのようなタンパク質を発現する非ヒト動物を作製する構成及び方法などの、特定の多型体又は対立遺伝子多型（例えば、１アミノ酸の差異）を含む、ヒト化ＦｃγＲＩタンパク質を発現する非ヒト動物を作製する構成及び方法が提供される。いくつかの実施形態では、内在性プロモーター及び内在性制御配列からこのようなタンパク質を発現する非ヒト動物を作製する構成及び方法も提供される。これらの方法は、ヒトＦｃγＲＩタンパク質全体又は一部をコードする遺伝物質を、内在性ＦｃγＲＩ遺伝子に相当する非ヒト動物のゲノム中の正確な位置に挿入することによって、全体又は一部がヒトであるＦｃγＲＩタンパク質を発現するヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子を作製することを含む。いくつかの実施形態では、これらの方法は、挿入されたエクソンによってコードされるアミノ酸を含むヒト部分を含む、ＦｃγＲＩタンパク質をコードするエクソン３〜５ヒト化遺伝子に対応する、ゲノムＤＮＡを挿入することを含む。
【００８４】
ヒト化内在性ＦｃγＲＩ遺伝子による方法は、内在性遺伝子が比較的最小限で修飾されており、その結果、非ヒト動物において、天然のＦｃγＲＩ媒介性エフェクター反応をもたらす結果となり、様々な実施形態では、ＦｃγＲＩ配列のゲノム配列が１つのフラグメント中で修飾されているため、必要な制御配列を含むことによって正常な機能を保持する。したがって、かかる実施形態では、ＦｃγＲＩ遺伝子の修飾は、他の周辺遺伝子又は他の内在性ＦｃγＲＩ遺伝子に影響しない。更に、様々な実施形態では、修飾は、原形質上の機能的受容体の集合に影響せず、結合、及び、修飾による影響が最小限又はない受容体の細胞質部分を介する後続するシグナル伝達によって、正常なエフェクター機能を維持する。
【００８５】
内在性マウスＦｃγＲＩ遺伝子及びヒト化内在性ＦｃγＲＩ遺伝子の概略図（正確な縮尺ではない）を、図５に示す。示されるように、ヒトＦｃγＲＩ遺伝子のエクソン３〜５を含むゲノムＤＮＡが、標的化構築物によって内在性マウスＦｃγＲＩ遺伝子座内に挿入される。このゲノムＤＮＡは、Ｆｃ結合に関与する、ヒトＦｃγＲＩタンパク質の１つ又は２つ以上の細胞外ドメイン領域（例えば、アミノ酸残基２８〜３６２）をコードする遺伝子の一部を含む。
【００８６】
ヒト化内在性ＦｃγＲＩ遺伝子を有する非ヒト動物（例えば、マウス）は、当該技術分野において既知である任意の方法によって作製できる。例えば、選択マーカー遺伝子を有するヒトＦｃγＲＩ遺伝子の全体又は一部を導入する、標的化ベクターを作製できる。図５は、ヒトＦｃγＲＩのエクソン１〜５の挿入部を含む、マウスゲノムを示す。示されるように、標的化構築物は、内在性マウスＦｃγＲＩ遺伝子のエクソン１の上流の配列を含む５’相同性アーム、続いて、ヒトＦｃγＲＩ遺伝子のエクソン１〜５を含むゲノムＤＮＡフラグメント、薬剤選択カセット（例えば、ｌｏｘＰ配列の両側に隣接するネオマイシン耐性遺伝子）、及び内在性マウスＦｃγＲＩ遺伝子のエクソン６の下流の配列を含む３’相同性アームを含む。相同組み換えが起こると、内在性マウスＦｃγＲＩ遺伝子のエクソン１〜５及びエクソン６の一部は、標的化ベクター中に含まれる配列によって置換される。ヒト化内在性ＦｃγＲＩ遺伝子は、ヒトＦｃγＲＩ遺伝子のエクソン１〜５によってコードされるアミノ酸を含む、ヒト化ＦｃγＲＩタンパク質を発現する細胞又は非ヒト動物によって作られる。薬剤選択カセットは、後に続くリコンビナーゼの付加により（例えば、Ｃｒｅ処理による）、所望により除去されてよい。
【００８７】
本明細書に記載されるヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子を有するマウスに加え、更に本明細書に提供されるのは、ヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子を含む、別の遺伝子組み換え非ヒト動物である。いくつかの実施形態では、かかる非ヒト動物は、内在性ＦｃγＲＩプロモーターに機能的に連結されるヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、かかる非ヒト動物は、内在性遺伝子座からヒト化ＦｃγＲＩタンパク質を発現し、このときヒト化ＦｃγＲＩタンパク質は、ヒトＦｃγＲＩタンパク質のアミノ酸残基１６〜２９０を含む。
【００８８】
かかる非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌ウシ、雄ウシ、水牛）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）からなる群から選択されてよい。好適な遺伝子組み換え可能なＥＳ細胞が容易に入手できない非ヒト動物では、別の方法を利用して、本明細書に記載される遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製する。かかる方法は、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞又は誘導多能性細胞）を修飾すること、及び、修飾したゲノムを好適な細胞、例えば、卵母細胞に移す核移植を利用すること、及び、胚を形成する好適条件下で、修飾した細胞（例えば、修飾した卵母細胞）を非ヒト動物に懐胎させること、を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物は哺乳類である。いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物は、小型哺乳類、例えば、トビネズミ科又はネズミ上科のスーパーファミリーである。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組み換え動物は齧歯類である。いくつかの実施形態では、本発明の齧歯類は、マウス、ラット、及びハムスターから選択される。いくつかの実施形態では、本発明の齧歯類は、ネズミ上科のスーパーファミリーから選択される。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組み換え動物は、カンガルーハムスター科（例えば、マウス様ハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、新世界ラット及びマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（真正マウス及びラット、スナネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（キノボリマウス、イワマウス、尾付きラット、マダガスタルラット及びマウス）、トゲヤマネ科（例えば、トゲヤマネ）、及びメクラネズミ科（例えば、デバネズミ、タケネズミ、及びモグラネズミ）から選択される科由来である。いくつかのある実施形態では、本発明の遺伝子組み換え齧歯類は、真正マウス又はラット（ネズミ科）、スナネズミ、トゲマウス、タテガミネズミから選択される。いくつかのある実施形態では、本発明の遺伝子組み換えマウスは、ネズミ科のメンバー由来である。いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物は齧歯類である。いくつかのある実施形態では、本発明の齧歯類は、マウス及びラットから選択される。いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物はマウスである。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択される、Ｃ５７ＢＬ系統のマウスである齧歯類である。いくつかのある実施形態では、本発明のマウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１である系統からなる群から選択される、１２９系統（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９／ＳｖＪａｅ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １０：８３６；Ａｕｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９（５）：１０２４−１０２８，１０３０，１０３２参照）。いくつかのある実施形態では、本発明の遺伝子組み換えマウスは、前記１２９系統及び前記Ｃ５７ＢＬ／６系統の混合である。いくつかのある実施形態では、本発明のマウスは、前記１２９系統の混合、又は前記ＢＬ／６系統の混合である。いくつかのある実施形態では、本明細書に記載される混合の１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。いくつかの実施形態では、本発明のマウスは、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。いくつかの実施形態では、本発明のマウスは、ＢＡＬＢ系統及び別の前記系統の混合である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物はラットである。いくつかのある実施形態では、本発明のラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから選択される。いくつかのある実施形態では、本明細書に記載されるラットの系統は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される、２つ又はそれ以上の系統の混合である。
【００９２】
ヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子を有する非ヒト動物
ＦｃγＲ変異体及び遺伝子導入非ヒト動物（例えば、マウス）は、例えば、ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌらによって米国特許第６，１１１，１６６号で報告されている。
【００９３】
このような動物は、ＦｃγＲＩの発現、機能、及び制御といった分子の特徴を評価するアッセイに使用されている。しかしながら、これらは制限がないわけではなく、不都合もある。例えば、‘１６６特許に開示されるマウスは、ゲノム中に不規則に挿入されているヒトＦｃγＲＩを含有し、（１）検出されてもされなくても、意図せずに、他の遺伝子の発現及び又は機能を破壊する場合があり、（２）１つの種類のＦｃγＲの特定の実験を複雑にする、又は混乱させる、完全ヒト及び完全マウスＦｃγＲＩの両方の発現をもたらす。その上、シグナル伝達に関与するＦｃγＲＩα鎖の細胞内領域がマウスというよりはヒトであるため、ＦｃγＲＩα鎖の細胞内シグナル領域は、混乱され、破壊され、ないしは別の方法で‘１１６特許に開示されるマウスの正常なＦｃγＲＩに従わない場合がある。
【００９４】
本発明は、これら及びその他の不都合に打ち勝つ手段を提供する。本発明は、特に、マウスＦｃγＲＩをヒト又はハイブリッドＦｃγＲＩ遺伝子で置換するために、内在性マウス遺伝子座に挿入されたヒト化ＦｃγＲＩ導入遺伝子を提供する。いくつかの実施形態では、ハイブリッドＦｃγＲＩ遺伝子は内在性マウス遺伝子座に挿入され、このとき細胞外ドメインはヒト配列を含み、細胞内ドメインはマウス配列を含む。いくつかの実施形態では、ハイブリッドＦｃγＲＩ遺伝子をマウスＦｃγＲＩ遺伝子の内在性遺伝子座に挿入すると、内在性マウスＦｃγＲＩタンパク質を追加的に発現するマウスの免疫細胞上の、ヒトＦｃγＲＩタンパク質発現の分布と比較して、ヒト免疫細胞上のヒトＦｃγＲＩタンパク質の分布により似ている、免疫細胞上のＦｃγＲＩタンパク質の発現をもたらす。いくつかの実施形態では、ハイブリッドＦｃγＲＩ遺伝子をマウスＦｃγＲＩ遺伝子の内在性遺伝子座に挿入すると、適当なシグナル及び刺激によって誘導され、制御される、免疫細胞上のＦｃγＲＩタンパク質の発現をもたらす。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩα鎖が介在するＭＨＣクラスＩＩ抗原の提示は、ヒト化細胞外領域及びマウスＦｃγＲＩα鎖細胞内領域を持つハイブリッドＦｃγＲＩタンパク質を有するマウス内で、機能的に維持される。いくつかの実施形態では、内部に取り入れられたＦｃγＲＩの細胞内プロセシングは、完全ヒトＦｃγＲＩタンパク質又は非マウス細胞内領域を持つＦｃγＲＩタンパク質を有するマウスと比較して、マウス細胞内領域を持つハイブリッドＦｃγＲＩタンパク質を有するマウスにおいて保たれている。
【００９６】
本発明の非ヒト動物は、様々なアッセイに有用なヒトＦｃγＲＩを発現する、改善されたｉｎ  ｖｉｖｏシステム、及び生物由来物質（例えば、細胞）の供給源を提供する。様々な実施形態では、ＦｃγＲＩを標的とする、並びに／又は、ＦｃγＲＩシグナル及び免疫エフェクター応答を調節する、治療物質を開発するために、本発明の非ヒト動物を用いる。様々な実施形態では、ＦｃγＲＩが結合する候補治療物質（例えば、抗体）をスクリーニングし、開発するために、本発明のマウスを用いる。様々な実施形態では、特定の治療用抗体に関連する免疫エフェクター応答を判定するために、本発明の非ヒト動物を用いる。
【００９７】
内在性高親和性マウスＦｃγＲ遺伝子を発現しない遺伝子組み換え非ヒト動物は、例えば、免疫反応における個々の高親和性ＦｃγＲ遺伝子の様々な機能を明らかにするため、細胞性免疫（例えば、ＡＤＣＣ）による、ヒト治療用抗体の有効性を測定するため、免疫疾患又は異常におけるＦｃγＲの働きを判定するため、免疫疾患又は異常のモデルとして、１つ又は２つ以上のＦｃγＲタンパク質に対する抗体を生成するため、及び、対照とする別の遺伝子組み換えマウスの産生用の交配相手として、有用である。
【００９８】
一実施形態では、本発明によるマウスを用いて、（野生型マウスと比べて）マウスにある薬剤を投与することによって高親和性ＦｃγＲ遺伝子を発現しないマウスによる、細胞毒性効果の損失を判定でき、このときこの薬剤は、野生型マウスにおいてＦｃγＲ依存性細胞毒性効果を引き起こすことが知られているものである。一実施形態では、本発明のマウスに腫瘍細胞を移植し、しばらくした後、腫瘍細胞の表面上に発現される抗原に特異的な抗体を注射する。注射に先だって抗体のアイソタイプが既知であり、野生型動物で見られるＡＤＣＣと比較して、ＦｃγＲ依存性ＡＤＣＣの機能障害について動物を解析する。
【００９９】
一態様では、内在性高親和性受容体を欠くマウスを、（例えば、交配により）別の免疫不全マウスと掛け合わせ、自己免疫疾患のｉｎ  ｖｉｖｏモデルを作製できた。例えば、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスは、当該技術分野において、内部系の研究のモデル生物として通常使用される。Ｓｃｍマウスは、Ｔ若しくはＢリンパ球の産生能、又は補体系の構成要素の一部の活性化能が低下しており、効果的に感染症に対して抵抗、腫瘍を拒絶、及び移植を拒絶することができない。本発明の高親和性ＦｃγＲａサブユニット遺伝子を欠くマウスをＳＣＩＤマウスと交配し、抗体医薬（例えば、抗腫瘍抗体）の投与に反応した、宿主動物における細胞の枯渇を確認し、腫瘍細胞枯渇におけるＡＤＣＣ及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の役割をｉｎ  ｖｉｖｏで検討できる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、内在性高親和性ＦｃγＲ遺伝子の高親和性ヒトＦｃγＲ遺伝子での置換を含む、遺伝子組み換え非ヒト動物が提供される。かかる動物は、完全ヒト抗体の薬物動態及びＦｃγＲ−媒介性ＡＤＣＣの研究に有用である。加えて、ヒトＦｃγＲ遺伝子は、疾患に関連する遺伝子多型又は対立遺伝子多型を呈することが示されている。したがって、内在性高親和性ＦｃγＲ遺伝子の、特定の対立形質又は多型形質であるヒトＦｃγＲ遺伝子での置換を含む遺伝子組み換え非ヒト動物を用いて、動物において、ヒト自己免疫疾患、及び、遺伝子多型に関連する形質を研究できる。いくつかの実施形態では、ヒトＦｃγＲ遺伝子の対立形質は、ヒトＩｇＧの効力の増強に関連している。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ヒト高親和性ＦｃγＲ遺伝子多型のヒト抗体医薬の有効性に及ぼす影響が判定される。いくつかの実施形態では、抗腫瘍抗体を、ヒトＦｃγＲの第１遺伝子多型を有する第１ヒト化マウスに、また、ヒトＦｃγＲの第２遺伝子多型を有する第２ヒト化マウスにも投与し、このとき第１及び第２マウスのそれぞれがヒト腫瘍細胞を持っており、抗腫瘍抗体の抗腫瘍活性を第１マウス及び第２マウスにおいて評価する。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、第１マウス及び第２マウスにおける抗腫瘍抗体の有効性の評価に基づき、第１又は第２遺伝子多型を有し、ヒト腫瘍細胞に相当する腫瘍を有するヒトの治療に対して、治療オプションが医師によって選択される。
【０１０３】
内在性ＦｃγＲＩα鎖置換法は、動物において、天然のＦｃγＲ−媒介性シグナル伝達を比較的最小限に破壊することを利用している。様々な実施形態では、ＦｃγＲα鎖のゲノム配列を１つのフラグメント内で置換し、そのため、必要な制御配列を含めることによって正常な機能を保持する。したがって、かかる実施形態では、ＦｃγＲα鎖の修飾は、機能性ＦｃＲγ鎖分子に依存する、他の内在性ＦｃＲを損なわない。更に、様々な実施形態では、この修飾は、ＦｃγＲα鎖及び内在性ＦｃＲγ鎖が関与する機能性受容体複合体の集合に影響せず、これは、細胞表面上へのいくつかのＦｃγＲα鎖の適切な発現と、活性化受容体に起因する特定の下流シグナル伝達に重要であり得る。ＦｃＲγ鎖が欠失していないため、様々な実施形態では、内在性ＦｃγＲα鎖遺伝子のヒトＦｃγＲα鎖遺伝子での置換を有する動物は、抗体が、ＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ領域の、アクセサリー細胞の表面上に存在するヒトＦｃγＲα鎖に結合することによる、正常なエフェクター機能を処理することができる。
【０１０４】
本発明の非ヒト動物はヒト化ＦｃγＲＩタンパク質を発現するため、細胞、細胞株、及び細胞培養物を、結合及び機能性アッセイ、例えば、ＦｃγＲＩの可能性のある治療用抗体に対する結合又は機能の評価に用いる、ヒト化ＦｃγＲＩの供給源として生成することができる。様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物によって発現されるヒト化ＦｃγＲＩタンパク質は、変異体アミノ酸配列を含み得る。リガンド結合残基に関連する変異を有する変異体ヒトＦｃγＲＩタンパク質が報告されている。様々な実施形態では、本発明の非ヒト動物は、ヒト化ＦｃγＲＩタンパク質変異体を発現する。様々な実施形態では、この変異体は、リガンド結合に関連するアミノ酸位置における多型である。様々な実施形態では、本発明の非ヒト動物を用いて、ヒトＦｃγＲＩの多型変異体との相互作用によって、治療用抗体の免疫エフェクター応答を判定する。
【０１０５】
本発明の非ヒト動物由来の細胞を単離し、ａｄ  ｈｏｃで使用でき、又は多世代にわたって培養を維持できる。様々な実施形態では、本発明の非ヒト動物由来の細胞を不死化し、無制限に培養下で維持する（例えば、連続培養下）。
【０１０６】
本発明の非ヒト動物は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害のメカニズムを解明する、改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ系を提供する。
【実施例】
【０１０７】
以下の実施例は、当業者に対し、本発明の方法及び構成を作製し、使用する方法を記載するために提供され、発明者らが本発明であるとみなす範囲を制限することを意図しない。別途記載のない限り、温度は摂氏で示し、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。
【０１０８】
実施例１．内在性ＦｃγＲＩ遺伝子のヒト化
この実施例は、齧歯類（例えば、マウス）などの非ヒト哺乳類において、高親和性ＦｃγＲＩをコードする内在性遺伝子をヒト化する、代表的な方法を示す。
【０１０９】
ヒト化ＦｃγＲＩ標的化ベクター（ＭＡＩＤ６０７４）の構築
大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を、マウス染色体３上のマウスの対応配列を置換するため、ヒトＦｃγ受容体１遺伝子（プロモーター領域、シグナル＋エクトドメイン領域）を用いることによって構築した。
【０１１０】
ＢＡＣ系標的化ベクター（ＭＡＩＤ６０７３）の産生
ＦｃγＲＩの遺伝子を含むマウスＢＡＣ  ＲＰ２３−４７７ｐ２３及びヒトＢＡＣ  ＣＴＤ−２３３９ｏ２２を、ＮＣＢＩ及びＥｎｓｅｍｂｌｅのデータベースに基づき、ｂｌａｓｔ及びＢＡＣ  ｅｎｄ配列を用いて同定した。
【０１１１】
（５’遠位端）ＦｃγＲＩ遺伝子プロモーター（２５ｋｂ）から、ヒトＦｃγＲＩ遺伝子の遺伝子コドンＷ２９０（膜貫通ドメイン（ＴＭ）の前）における３’近位端までのヒト配列（その後、マウス膜貫通ドメイン及び残りの遺伝子が続く）を含む、標的化ベクターであるＬＴＶＥＣを産生する方法は、次の工程を含む。
【０１１２】
第１に、細菌における相同組み換えによって、ヒトＢＡＣ（ＣＴＤ−２３３９ｏ２２）からヒト配列の５’端を除去し、Ｉ−Ｃｅｕ１部位及びＦｃγＲＩ遺伝子の２５ｋｂのプロモーター領域を残し、ＦｃγＲ１遺伝子のイントロン５（ＴＭドメインの上流４０４ｂｐ）内に位置するｌｏｘｐｅｄ  ｐｇｋ−Ｎｅｏカセットによってヒト配列の３’端を除去し、その後ＡｓｉＳ１部位とした。
【０１１３】
第２に、細菌における相同組み換えによって、マウスＢＡＣ  ＲＰ２３−４７７ｐ２３において、マウスＦｃγＲＩ遺伝子（プロモーター（２０ｋｂ）から膜貫通ドメインまで）をＳｐｅｃカセット（マウスＴＭの前に追加された、ヒトＦｃγＲＩ配列（コドンＷ２９０）までの８ＡＡのＥＣ３ドメイン）によって除去し、Ｉ−Ｃｅｕ１及びＡｓｉＳ１部位を隣接させた。
【０１１４】
第３に、Ｉ−Ｃｅｕ１及びＡｓｉＳ１部位で消化し、ライゲーションして、ヒトＦｃγＲＩの（５’遠位端）ＦｃγＲＩ遺伝子プロモーター（２５ｋｂ）からコドンＷ２９０（膜貫通ドメインの前）における３’近位端までのヒト配列、後続にマウス膜貫通ドメイン及び残りの遺伝子を含む、ＬＴＶＥＣ（ＭＡＩＤ６０７３）を生じた。
【０１１５】
図３２は、マウスＦｃγＲＩのヒト化のための、模式的かつ代表的な戦略を示す。ＭＡＩＤ６０７４は、ＭＡＩＤ６０７３からカセットを除去したものである。接合部配列を図６に示す。
【０１１６】
標的化マウスＥＳ細胞の選択
ＭＡＩＤ  ６０７４  ＬＴＶＥＣを、マウスＥＳ細胞株Ｆ１Ｈ４内に電気穿孔法により導入した。
【０１１７】
実施例２．高親和性ＦｃγＲＩヒト化マウスの発生
この実験は、マウスの形質転換及び交配について示す。ｈＦｃｇＲ１エクトドメイン（ＭＡＩＤ  ６０７３）ＬＴＶＥＣを、親Ｆ１Ｈ４マウス胚性幹（ＥＳ）細胞内に電気穿孔法により導入した。Ｇ４１８薬剤選択により生存したコロニーを採取し、ＦｃγＲＩマウス遺伝子座内へのヒトＦｃγＲＩ配列の相同組み換えについてスクリーニングした。適切な修飾を有し、ヒトＦｃγＲＩエクトドメインがヘテロ接合されている８つのクローンを同定し、そのうちの１つをクローン６０７３Ｆ−Ｄ２とした。これらのクローン全てが、ｎｅｏカセットを有していた。
【０１１８】
クローン６０７３Ｆ−Ｄ２を、２μｇのＣｒｅプラスミドと共に電気穿孔法を行い、ｎｅｏカセットを取り除いた。コロニーを採取した後、ｎｅｏカセットを含まないことについてスクリーニングした。ｎｅｏカセットが除かれていると確認できたクローンのうち、ＥＳクローン６０７４Ｂ−Ａ１及び６０７４Ｂ−Ａ１０を、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ法を用いて顕微注射した。
【０１１９】
雄性及び雌性（ＸＹ雌性）Ｆ０  ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅを、クローン６０７４Ｂ−Ａ１及び６０７４Ｂ−Ａ１０から発生させた。これらのＦ０マウスを、クローンペア及び非クローンペアにおいて、互いに交配した。Ｆ１マウスを発生させると、これらのマウスが、ヒトＦｃγＲＩについてヘテロ接合及びホモ接合（及び野生型）であることが示された。Ｆ１マウスの外観は正常であり、Ｈｏｍ：Ｈｅｔ：ＷＴマウスの比は、予想されたメンデル比である１：２：１に従った。ヒトＦｃγＲＩについて野生型及びホモ接合である雄性及び雌性のコホートを、実験のために移した。
【０１２０】
実施例３．高親和性ＦｃγＲＩヒト化マウスの特徴
この実験は、内在性ＦｃγＲＩ遺伝子座に、実施例１に記載するヒト化ＦｃγＲＩ遺伝子構築物を含むように遺伝子組み換えされた非ヒト動物由来の細胞表面上の、高親和性ＦｃγＲＩタンパク質の特徴的発現を示す。
【０１２１】
高親和性ＦｃγＲＩヒト化マウスの遺伝子型の特徴を図１〜３に示す。マウスＦｃγＲＩの転写物は、ヒト化ＦｃγＲＩホモ接合のマウスでは検出されない。
【０１２２】
表現型の特徴の結果を図４、及び７〜１６に示す。
【０１２３】
実施例４．マウス顆粒球コロニー刺激因子（ｍＧ−ＣＳＦ）で処理した高親和性ＦｃγＲＩヒト化マウスの表現型の特徴
マウスＧ−ＣＳＦ（ｍＧ−ＣＳＦ）対リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）対照で処理したＭＡＩＤ  ６０７４（ｈＦｃγＲＩ）ＨＯマウスについて、表現型解析を実施した。皮下注射４８時間後にマウスを検査した。ＰＢＳ（ｎ＝２）又はｍＧ−ＣＳＦ（ｎ＝３）で処理したＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯマウスに対する、ＰＢＳ（ｎ＝２）又はｍＧ−ＣＳＦ（ｎ＝２）で処理した６〜７週齢のＭＡＩＤ  ６０７４ＷＴマウスのデータを示す。ＰＢＳ（ｎ＝１）又はｍＧ−ＣＳＦ（ｎ＝１）で処理したＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯマウスに対する、ＰＢＳ（ｎ＝１）又はｍＧ−ＣＳＦ（ｎ＝１）で処理した１６〜１７週齢のＭＡＩＤ  ６０７４ＷＴマウスの結果も同様であった。ＭＡＩＤ  ６０７４ＷＴ及びＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯマウスの、血液及び脾臓中の単球、マクロファージ、好中球、及び樹状細胞における、マウス又はハイブリッドＦｃγＲＩのベースライン（ＰＢＳ）及びｍＧ−ＣＳＦ誘発発現を、図１７〜３１に示す。
【０１２４】
未処理のＭＡＩＤ  ６０７４ＨＯマウスは、血液中にＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）ｍＲＮＡを発現するが、ＦＡＣＳによってタンパク質は検出されなかった。Ｇ−ＣＳＦ（４８時間）は、ＦＡＣＳによってタンパク質が検出されるように、血液及び脾臓中でＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）ｍＲＮＡの上昇を誘導した。
【０１２５】
実施例５．ヒト化高及び低親和性Ｆｃγ受容体を発現するマウスの表現型の特徴
標準的な交配手法を用いて、ヒト化高親和性及び低親和性Ｆｃγ受容体を発現したマウスを発生させた。具体的には、実施例１及び２に記載されるように発生させたヒト化高親和性ＦｃγＲＩを発現するマウスを、米国特許出願公開第２０１４／０１５４７０１号（参照することにより本明細書に組み込まれる）の実施例１〜６及び図１〜６に記載されるように発生させたヒト化低親和性ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂを発現するマウスと掛け合わせた。得られたマウスをホモ接合となるように育てた。
【０１２６】
マウスＧ−ＣＳＦ（ｍＧ−ＣＳＦ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）対照による処理後、ヒト化高及び低親和性ＦｃγＲマウスについて表現型解析を実施した。マウスに、ＰＢＳ又はｍＧ−ＣＳＦ（６２μｇ  ｓ．ｃ．、単回投与）を皮下注射した。４８時間後、処理マウスから血液及び脾臓を採取し、実施例４に記載されるようにＦＡＣＳによって表現型について特徴解析した。ヒト化高及び低親和性ＦｃγＲマウスの細胞表面表現型は、高親和性ＦｃγＲヒト化マウスについて観察された表現型と類似していた。また高親和性Ｆｃγ受容体ヒト化マウスと同様に、高及び低親和性Ｆｃγ受容体の両方がヒト化したマウスは、血液及び脾臓系の単球、マクロファージ及び好中球におけるヒトＦｃγＲＩの発現上昇が見られた。まとめると、ＦｃγＲＩヒト化マウスにおける低親和性Ｆｃγ受容体のヒト化は、顕著な表現型の変化をもたらさなかった。
【０１２７】
均等
本発明の少なくとも１つの実施形態のいくつかの態様についてこのように説明してきたが、様々な変更、改変、及び改良が当業者にとって容易に起こり得ることが、当業者によって理解される。かかる変更、改変、及び改良は、本開示の一部であると意図されており、本発明の趣旨及び範囲内であることが意図される。結果的に、前記説明及び図面は例示に過ぎず、本発明は、以下の特許請求の範囲によって詳細に記載される。
【０１２８】
特許請求される要素を修飾するため、特許請求の範囲中で「第１」、「第２」、「第３」などの順序を表す用語を使用することは、１つの特許請求される要素の別のものに対する任意の優先的、優位的順序、又は、方法における動作が行われレ得時間的順序をそれ自体が包含しないが、特許請求される要素を区別するため、ある名称を有する１つの特許請求される要素を、同じ名称を有する（ただし、順序を表す用語の使用に関して）別の要素と区別するための表示として使用するにすぎない。
【０１２９】
本明細書で使用されるとき、明細書及び特許請求の範囲において冠詞「１つの（a）」及び「１つの（an）」は、それと反対の指示が明示されていない限り、複数の指示対象を含むと理解されたい。その群の１つ又は２つ以上の構成要素間に「又は（or）」を含む特許請求の範囲又は説明は、それと反対の指示がない限り、又は文脈から明らかでない限り、その群の構成要素のうち１つ、２つ以上、又は全てが、ある製品又はプロセスに存在する、使用される、ないしは別の方法で関連する場合に、満たされると考えられる。本発明は、その群のちょうど１つの構成要素が、ある製品又はプロセスに存在する、使用される、ないしは別の方法で関連する実施形態を含む。本発明はまた、その群の構成要素の２つ以上、又は全体が、ある製品又はプロセスに存在する、使用される、ないしは別の方法で関連する実施形態も含む。更に、本発明は、特に断りのない限り、又は、矛盾若しくは不一致が起こり得ることが当業者に明らかでない限り、列挙される請求項のうち１つ又は２つ以上から、１つ又は２つ以上の制限、要素、条項、記述用語などが、同じ規準の請求項（又は、関連するときは任意の他の請求項）に応じて、別の請求項内に組み込まれる、全ての変更例、組み合わせ、及び並べ替えを包含すると理解される。要素が（例えば、マーカッシュ群又は類似の形式に）リストとして存在する場合、要素内の各下位群も開示されており、任意の要素はその群から外される場合があると理解される。一般に、本発明、又は本発明の態様が、特定の要素、特徴などを含むと指定される場合、本発明のある実施形態又は本発明の態様は、かかる要素、特徴などからなる、又は本質的になると理解されたい。簡潔にするため、これらの実施形態は、全ての場合において、本明細書において多くの言葉で具体的に規定していない。本発明の任意の実施形態又は態様は、特定の除外について明細書中に示されたかどうかに関係なく、請求項から明確に除外できることも、理解されたい。
【０１３０】
当業者は、本明細書に記載されるアッセイ又は他のプロセスで得られた値に寄与し得る、典型的な標準偏差又はエラーについて理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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