(57)【要約】      （修正有）【課題】呼吸器疾患、特に特発性肺線維症および慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）関連遺伝子特異的ｓｉＲＮＡおよびこれを含む高効率二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の提供。【解決手段】細胞内に効率的に伝達されるようにするために、二重らせんＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の両末端に親水性物質および疎水性物質を単純共有結合またはリンカー媒介共有結合を利用して接合された形態の構造を持ち、水溶液で二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の疎水性相互作用によってナノ粒子形態で転換されることができる、高効率二重らせんオリゴＲＮＡ構造体であって、二重らせんオリゴＲＮＡ構造体に含まれたｓｉＲＮＡは、呼吸器疾患、特に特発性肺線維症およびＣＯＰＤ関連遺伝子であるＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡである、高効率二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜６００および配列番号６０２〜６０４番から選択されたいずれか一つの配列を持つセンス鎖とそれに相補的な配列を持つアンチセンス鎖を含むＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖は、１９〜３１個のヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１に記載のＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、３５、４２、５９、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１２４、１５３、１６６、１８７、１９７、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１２、２１８、２２１、２２３、３０１、３０２、３０３、３０５、３０６、３０７、３０９、３１７、３２３、３２９、４０９、４１０、４１５、４１７、４１８、４２０、４２２、４２４、４２７、４２９、５０４、５０５、５０６、５０７、５１４、５１５、５２２、５２３、５２４、５２５、６０２、６０３および６０４番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列を持つセンス鎖とそれに相補的な配列を持つアンチセンス鎖を含むことを特徴とする請求項１に記載のＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖は、一つ以上の化学的修飾を含むことを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載のＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡ。
【請求項５】
前記化学的修飾は、ヌクレオチド内糖構造の２’炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ３（メチル）、−ＯＣＨ３（メトキシ）、−ＮＨ２、−Ｆ（フッ素）、−Ｏ−２−メトキシエチル−Ｏ−プロピル、−Ｏ−２−メチルチオエチル、−Ｏ−３−アミノプロピル、−Ｏ−３−ジメチルアミノプロピル、−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミドまたは−Ｏ−ジメチルアミドオキシエチルへの置換による修飾；ヌクレオチド内糖構造内の酸素が硫黄に置き換えられた修飾；ヌクレオチド結合のホスホロチオエートまたはボラノホスフェート、メチルホスホネート結合への修飾；及びＰＮＡ、ＬＮＡまたはＵＮＡ形態への修飾から選択された一つ以上の修飾であることを特徴とする請求項４に記載のＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端に一つ以上のリン酸基が結合されていることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれかに記載のＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡ。
【請求項７】
下記の構造式１の構造を持つ二重らせんオリゴＲＮＡ構造体：
Ａ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ    （構造式１）
（前記構造式１で、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、ＸおよびＹはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカー媒介された共有結合を意味して、ＲはＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを意味する）。
【請求項８】
下記の構造式２の構造を持つ請求項７に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体：
【化１】
2020062023.tif 000012
（前記構造式２で、Ｓは、請求項７に記載のｓｉＲＮＡのセンス鎖、ＡＳは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を意味して、Ａ、Ｂ、ＸおよびＹは、請求項７に記載の構造式１での定義と同様である）。
【請求項９】
下記の構造式３または構造式４の構造を持つ請求項８に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体：
【化２】
2020062023.tif 000013
（前記構造式３および構造式４で、Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｙ、ＳおよびＡＳは、請求項８に記載の構造式２での定義と同様であり、５’および３’は、ｓｉＲＮＡセンス鎖の５’末端および３’末端を意味する）。
【請求項１０】
ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡは、請求項１から請求項６のいずれかに記載のｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項７から請求項９のいずれかに記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１１】
前記親水性物質の分子量は、２００〜１０，０００であることを特徴とする請求項７から請求項１０のいずれかに記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１２】
前記親水性物質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンで構成された群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項１１に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１３】
前記親水性物質は、下記の構造式５または構造式６の構造を持つことを特徴とする請求項７から請求項１０のいずれかに記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体：
（Ａ’ｍ−Ｊ）ｎ    （構造式５）
（Ｊ−Ａ’ｍ）ｎ    （構造式６）
（前記構造式５および構造式６で、Ａ’は、親水性物質単量体を、Ｊはｍ個の親水性物質単量体の間またはｍ個の親水性物質単量体とｓｉＲＮＡを互いに連結するリンカー、ｍは１〜１５の整数、ｎは１〜１０の整数を意味して、親水性物質単量体Ａ’は下記の化合物（１）〜化合物（３）から選択されたいずれか一つの化合物であり、前記リンカー（Ｊ）は、ＰＯ３−、ＳＯ３およびＣＯ２で構成された群から選択される）。
2020062023.tif 000014
【請求項１４】
前記疎水性物質の分子量は、２５０〜１，０００であることを特徴とする請求項７から請求項１０のいずれかに記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１５】
前記疎水性物質は、ステロイド誘導体、グリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン、脂肪酸、リン脂質、及びリポポリアミンで構成された群から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１６】
前記ステロイド誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルマート、コレスタニルホルマートおよびコレステリルアミンで構成された群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１７】
前記グリセリド誘導体は、モノ−、ジ−およびトリ−グリセリドから選択されることを特徴とする請求項１５に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１８】
前記Ｘ、ＹおよびＺで表される共有結合は、非分解性結合または分解性結合であることを特徴とする請求項７から請求項１７のいずれかに記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１９】
前記非分解性結合は、アミド結合またはリン酸化結合であることを特徴とする請求項１８に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項２０】
前記分解性結合は、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンハイドライド結合、生分解性結合または酵素分解性結合であることを特徴とする請求項１８に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項２１】
前記親水性物質に受容体媒介内包作用（ＲＭＥ）を介してターゲット細胞内在化を増進させる受容体と特異的に結合する特性を持つリガンドが追加的に結合されたことを特徴とする請求項７から請求項２０のいずれかに記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項２２】
前記リガンドは、ターゲット受容体特異的抗体やアプタマー、ペプチド、葉酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＮＡＧ）、ブドウ糖及びマンノースで構成された群から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項２３】
前記親水性物質のｓｉＲＮＡと結合された反対側末端部位にアミン基またはポリヒスチジン基が追加的に導入されたことを特徴とする請求項７から請求項２０のいずれかに記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項２４】
前記アミン基またはポリヒスチジン基は、一つ以上のリンカーを介して親水性物質または親水性ブロックと連結されたことを特徴とする請求項２３に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項２５】
前記アミン基では、第一級〜第三級アミン基中から選択されたことを特徴とする請求項２３に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項２６】
前記ポリヒスチジン基は、３〜１０個のヒスチジンを含むことを特徴とする請求項２３に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項２７】
請求項７から請求項２６のいずれかに記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子。
【請求項２８】
互いに異なる配列を持つｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が混合されて構成されることを特徴とする請求項２７に記載のナノ粒子。
【請求項２９】
請求項１から請求項６のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ、請求項７から請求項２６のいずれかに記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、または請求項２７または請求項２８に記載のナノ粒子を有効成分として含む薬学的組成物。
【請求項３０】
前記薬学的組成物は、呼吸器疾患を予防または治療するための薬学的組成物であることを特徴とする請求項２９に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
前記呼吸器疾患は、喘息、特発性肺線維症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎭咳去痰、急性下気道感染症、気管支炎、細気管支炎、急性上気道感染症、咽喉炎、扁桃炎及び喉頭炎で構成された群から選択されることを特徴とする請求項３０に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
前記呼吸器疾患は、特発性肺線維症または慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）であることを特徴とする請求項３０に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
請求項２９から請求項３２のいずれかに記載の組成物を含む凍結乾燥された形態の剤形。
【請求項３４】
請求項１から請求項３３のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ、二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、ナノ粒子、組成物または剤形を予防または治療を要する個体に投与することを特徴とする呼吸器疾患の予防または治療方法。
【請求項３５】
前記呼吸器疾患は、喘息、特発性肺線維症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎭咳去痰、急性下気道感染症、気管支炎、細気管支炎、急性上気道感染症、咽喉炎、扁桃炎及び喉頭炎で構成された群から選択されることを特徴とする請求項３４に記載の呼吸器疾患の予防または治療方法。
【請求項３６】
前記呼吸器疾患は、特発性肺線維症または慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）であることを特徴とする請求項３５に記載の呼吸器疾患の予防または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、呼吸器疾患関連遺伝子特異的ｓｉＲＮＡおよびこれを含む高効率二重らせんオリゴＲＮＡ構造体に関し、前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、細胞内に効率的に伝達されるようにするために、二重らせんＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の両末端に親水性物質および疎水性物質を単純共有結合またはリンカー媒介（ｌｉｎｋｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）共有結合を利用して接合された形態の構造を持ち、水溶液で前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の疎水性相互作用によってナノ粒子形態に転換されることができる。前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体に含まれたｓｉＲＮＡは、呼吸器疾患、特に特発性肺線維症および慢性閉鎖性肺疾患（Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ、以下‘ＣＯＰＤ’という）関連遺伝子、特にＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ−１特異的なｓｉＲＮＡであることが好ましい。
【０００２】
また、本発明は、前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の製造方法および前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含む呼吸器疾患、特に特発性肺線維症およびＣＯＰＤを予防または治療するための薬剤学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子の発現を抑制する技術は、疾病治療のための治療剤開発および標的検証において重要なツールである。この技術で、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下「ＲＮＡｉ」という）は、その役割が発見された以後、多様な種類の哺乳動物細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ）で配列特異的にｍＲＮＡに作用することが明らかになった（Ｓｉｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２００５，８３：７６４−７７３）。長い鎖のＲＮＡ二本鎖が細胞に伝達されると、伝達されたＲＮＡ二本鎖はＤｉｃｅｒというエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）によって２１〜２３塩基対（ｂａｓｅ  ｐａｉｒ，ｂｐ）でプロセッシングされた短い干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、以下「ｓｉＲＮＡ」という）に変換されて、ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）に結合してガイド（アンチセンス）鎖が、ターゲットｍＲＮＡを認識して分解する過程を介してターゲット遺伝子の発現を配列特異的に阻害する（ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ：ＢＡＳＩＣ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＣＥＮＴ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２００２．１，５０３−５１４）。
【０００４】
ベルトラン（Ｂｅｒｔｒａｎｄ）研究グループの研究によると、同じターゲット遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＳＯ）に比べてｓｉＲＮＡが生体内／外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ）でｍＲＮＡ発現の阻害効果が優れて、該当効果が長く持続される効果を持つと明らかになった（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｓｉＲＮＡｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００２．２９６：１０００−１００４）。
【０００５】
また、ｓｉＲＮＡの作用機序は、ターゲットｍＲＮＡと相補的に結合して配列特異的に標的遺伝子の発現を調節するので、既存の抗体ベース医薬品や化学物質（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｒｕｇ）に比べて適用できる対象が画期的に拡大する可能性がある長所を持つ（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｔｏｗａｒｄｓ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡｓ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ．２００６  １３（４）：６６４−６７０）。
【０００６】
ｓｉＲＮＡなどの優れた効果および多様な使用範囲にもかかわらず、ｓｉＲＮＡが治療剤として開発されるためには、ｓｉＲＮＡの安定性改善と細胞伝達効率改善によって、ｓｉＲＮＡがターゲット細胞に効果的に伝達されなければならない（Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．２００６  Ｊａｎ；１１（１−２）：６７−７３）。
【０００７】
前記問題を解決するために、体内安定性改善のためにｓｉＲＮＡの一部ヌクレオチドまたは骨格（ｂｏａｃｋｂｏｎｅ）を核酸分解酵素抵抗性を持つように修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）するかウィルス性ベクター（ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）、リポソームまたはナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）等の伝達体の利用などに対する研究が活発に試みられている。
【０００８】
アデノウィルスやレトロウィルスなどのウィルス性ベクターを利用した伝達システムは、形質注入効率（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃａｃｙ）が高いが、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）および発ガン性（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）が高い。一方、ナノ粒子を含む非ウィルス性（ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ）伝達システムは、ウィルス性伝達システムに比べて細胞伝達効率は低い方であるが、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）が高く、ターゲット特異的に伝達が可能で、内包されているＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを細胞または組織に吸収（ｕｐｔａｋｅ）および内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）等の改善された伝達効果が高いだけでなく、細胞毒性および免疫誘発（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）が殆どない長所を有していて、現在はウィルス性伝達システムに比べて有力な伝達方法と評価されている（Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉＲＮＡ  ｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００７  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ３；１１７（１２）：３６２３−３６３２）。
【０００９】
前記非ウィルス性伝達システムのうちナノ伝達体（ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ）を利用する方法は、リポソーム、陽イオン高分子複合体などの様々な高分子を使用することによってナノ粒子を形成して、ｓｉＲＮＡをこのようなナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、すなわちナノ伝達体（ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ）に担持して細胞に伝達する形態を持つ。ナノ伝達体を利用する方法のうち主に活用される方法は、高分子ナノ粒子（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、高分子ミセル（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｉｃｅｌｌｅ）、リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）等があるが、この中でリポプレックスを利用した方法は、カチオン性脂質で構成されて細胞のエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）のアニオン性脂質と相互作用してエンドソームの脱安定化効果を誘発して、細胞内で（に）伝達する役割をする（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１５；９３（２１）：１１４９３−８，１９９６）。
【００１０】
また、ｓｉＲＮＡパッセンジャー（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ；センス（ｓｅｎｓｅ））鎖の末端部位に化学物質などを連結して増進された薬物動態（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）的特徴を持つようにして、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で高い効率を誘導できることが知られている（Ｎａｔｕｒｅ  １１；４３２（７０１４）：１７３−８，２００４）。この時ｓｉＲＮＡセンス（ｓｅｎｓｅ；パッセンジャー（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ））またはアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｃｅ；ガイド（ｇｕｉｄｅ））鎖の末端に結合された化学物質の性質によりｓｉＲＮＡの安定性が変わる。例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）のような高分子化合物が接合された形態のｓｉＲＮＡはカチオン性物質が存在する条件でｓｉＲＮＡのアニオン性リン酸基と相互作用して複合体を形成することによって、改善されたｓｉＲＮＡ安定性を持つ伝達体となる（Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １２９（２）：１０７−１６，２００８）。特に高分子複合体で構成されたミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）は薬品伝達運搬体として使われる他のシステムである、小球体（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）またはナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）等に比べてその大きさが小さく分布が非常に一定で、自発的に形成される構造であるため、製剤の品質管理および再現性確保が容易である長所がある。
【００１１】
また、ｓｉＲＮＡの細胞内伝達効率性を向上させるために、ｓｉＲＮＡに生体適合性高分子である親水性物質（例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ））を単純共有結合またはリンカー媒介（ｌｉｎｋｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）共有結合で接合させたｓｉＲＮＡ接合体を介して、ｓｉＲＮＡの安定性確保および効率的な細胞膜透過性のための技術が開発された（大韓民国登録特許公報第８８３４７１号参照）。しかし、ｓｉＲＮＡの化学的修飾およびポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）を接合させること（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）だけでは生体内での低い安定性とターゲット組織への伝達がスムーズでない短所は依然として残る。このような短所を解決するために、オリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡのような二重らせんオリゴＲＮＡに親水性および疎水性物質が結合された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が開発されたが、前記構造体は、疎水性物質の疎水性相互作用によってＳＡＭｉＲＮＡＴＭ（ｓｅｌｆ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｉｃｅｌｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＲＮＡ）と命名された自己組み立てナノ粒子を形成することになるが、ＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術は、既存の伝達技術に比べて非常にサイズが小さいながらも均一な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）ナノ粒子を収得できる長所を持つ。
【００１２】
ＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術の具体的な例として、親水性物質としてＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）が使用されるが、ＰＥＧは合成ポリマー（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ）で、よく医薬品特にタンパク質の水溶性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）増加および薬物動態（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）の調節のために使用された。ＰＥＧはすべての合成ポリマーがそうであるように、多分散系（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ）物質で、一つのバッチ（ｂａｔｃｈ）のポリマーは、他の個数の単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の総計からなり分子量がガウス曲線形態を示し、多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｖａｌｕｅ，Ｍｗ／Ｍｎ）で物質の同質性程度を表現する。すなわち、ＰＥＧが低い分子量（３〜５ｋＤａ）である時、約１．０１の多分散指数を示して高い分子量（２０ｋＤａ）である時、約１．２との高い多分散指数を示して、高い分子量であるほど物質の同質性が相対的に低い特徴を見せる（Ｆ．Ｍ．Ｖｅｒｏｎｅｓｅ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２００１）２２：４０５−４１７）。したがって、ＰＥＧを医薬品に結合させた場合、接合体にＰＥＧの多分散的特徴が反映されて単一物質の検証が容易ではない短所があって、ＰＥＧの合成および精製過程の改善を通じて低い多分散地数を持つ物質を生産する傾向にあるが、特に分子量が小さい物質にＰＥＧを結合させた場合、結合が容易にできたかに対する確認が容易でない不便な点があるなど物質の多分散性特徴による問題点が存在する（Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ  Ｍ．Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  ａｎｄ  Ｇｉａｎｆｒａｎｃｏ  Ｐａｓｕｔ．ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ，ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．ＤＲＵＧ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  ＴＯＤＡＹ（２００５）１０（２１）：１４５１−１４５８）。
【００１３】
これにより、最近では既存自己組み立てナノ粒子であるＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術の改良された形態で、ＳＡＭｉＲＮＡＴＭを構成する二重らせんＲＮＡ構造体の親水性物質を一定の分子量を持つ均一な１〜１５の単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）と必要に応じてリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含む基本単位をブロック（ｂｌｏｃｋ）化して、これを必要に応じて適切な個数を使用することによって、既存のＳＡＭｉＲＮＡＴＭに比べてより小さい大きさを持ちまた多分散性が画期的に改善された新しい形態の伝達体技術が開発された。
【００１４】
一方、バイオ新薬は、目標遺伝子配列またはタンパク質構造特異的に作用するので、非臨床代理モデル（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｍｏｄｅｌ）で効能および安全性を評価するためには、代理モデルの種（ｓｐｅｃｉｅｓ）においてもヒトにおける該当バイオ新薬と同じメカニズム（ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）で作用する物質が追加的に要求される。したがって、追加的にヒトで同じメカニズムを含む物質を探し出す困難を避けるために、治療対象であるヒトと非臨床代理モデルであるマウスにおいて同じメカニズムで作用できる物質を開発することが必要である。
【００１５】
特発性肺線維症（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ、以下‘ＩＰＦ’という）は、肺胞壁に慢性炎症細胞が浸透しながら肺を固くする様々な変化が発生しながら肺組織の重度の構造的変化を引き起こして次第に肺機能が低下して、結局は死亡に至る疾患で、今までのところ効果的な治療方法がなく、通常症状が現れて診断すると、生存期間中央値が３〜５年程度しかない非常に予後が悪い疾病である。発生頻度は、外国の場合、人口１０万人当たり約３〜５人程度と報告されて、通常５０代以後に発病率が高く、男が女より２倍ほど発生率が高いとされている。
【００１６】
ＩＰＦの発明原因はまだ明確に解明されていないが、喫煙者で頻度が高く、抗うつ剤、胃−食道逆流による慢性的肺吸入、金属粉塵、木材粉塵、または溶媒剤吸入などがＩＰＦの発生と関連がある危険因子として報告されたことがあるが、多くの患者には確実な因果関係がある因子を探すことができない。
【００１７】
ＩＰＦは、治療しないと継続的に悪化して、患者の約５０％以上が３〜５年内に死亡すると知られて、また、一旦疾病が進行されて完全に繊維化で固まった後にはどんな治療をしても好転されないため、治療するならば早期に治療する場合に効果がある可能性が高いと予測している。現在使用されている治療剤としては、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）とアザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、またはシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）の併合療法を使用する方法が知られているが、特別な効果を示すとは言い難く、様々な繊維化抑制剤が動物実験および小規模の患者群で試みられたが明確な効果が立証されたものがない状態である。特に、末期ＩＰＦ患者では肺移植の他には効果的な治療方法がない実情である。したがって、より効率的なＩＰＦの治療剤開発が切に望まれている状況である。
【００１８】
一方、喘息と共に代表的な肺疾患の一つであるＣＯＰＤは、非可逆的な気道の閉塞を伴う点で喘息とは異なり、繰り返される感染、有害な粒子やガスの吸引や喫煙によって発生する肺の異常な炎症反応とこれに伴って完全に可逆的でなく次第に進行される気流制限を示す呼吸器疾患である（Ｐａｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，１６３：１２５６−１２７６，２００１）。ＣＯＰＤは、気道および肺実質炎症による細気管支および肺実質の病理学的変化によって発生する疾病で、閉鎖性細気管支炎および肺気腫（肺実質破壊）を特徴とする。ＣＯＰＤの種類には、慢性閉鎖性気管支炎（Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）、慢性細気管支炎（Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ）および肺気腫（Ｅｍｐｈｙｓｅｍａ）がある。ＣＯＰＤの場合、好中球の数が増加して、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＭＩＰ−２のようなサイトカインの分泌が増加する。また、気道に炎症が生じて、筋肉壁が厚くなり、粘液分泌が増加して気管支閉鎖が現れる。気管支が閉鎖されると、肺胞は拡張されて損傷されて酸素と二酸化炭素の交換能力が損なわれるようになり、呼吸不全発生が高まる。
【００１９】
世界的にＣＯＰＤの深刻性が浮び上がっているが、これはＣＯＰＤが１９９０年には疾患による死亡原因のうち６位であったが２０２０年には３位になると予測され、１０大疾患のうち唯一その発病率が増加する疾患であるためである。ＣＯＰＤは有病率が高く、呼吸障害を招いて、ＣＯＰＤの診断と治療に必要な直接医療費が多く発生するだけでなく、呼吸困難障害発生や休職によって発生する損失や早期死亡による損失などの間接医療費も相当なものになるため、世界的にも社会−経済的な問題となっている（慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）診療指針．２００５．慢性気道閉鎖性疾患臨床研究センター．ｐ．３０−３１）。
【００２０】
現存するどんな治療薬剤もＣＯＰＤの特徴である長期的肺機能減少を緩和させると確認されたことはない。したがって、ＣＯＰＤで薬物療法は主に症状あるいは合併症を減少させる目的で使用する。この中気管支拡張剤は、代表的なＣＯＰＤ対症療法治療剤で、抗炎症剤や副腎皮質ホルモンなどが主に処方されるがその効果が僅かで適用範囲が狭く副作用発生の憂慮が大きい。その他の薬品では、インフルエンザワクチンだけがＣＯＰＤ患者において深刻な病症と死亡を約５０％まで減少させることができると知られている（慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）診療指針．２００５．慢性気道閉鎖性疾患臨床研究センター．ｐ．５２−５８）。
【００２１】
一方、多くの遺伝的因子が個人のＣＯＰＤ発生危険を増加（あるいは減少）させると推定される。現在まで証明された遺伝的な危険因子としては、α１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎの遺伝的欠乏がある。喫煙がＣＯＰＤ発病危険を非常に増加させるが、若年層で早く進行される汎小葉型肺気腫（ｐａｎｌｏｂｕｌａｒ  ｅｍｐｈｙｓｅｍａ）の発生と肺機能減少はひどい遺伝的欠乏を見せる喫煙者と非喫煙者が共に現れる。α１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ遺伝子の他にＣＯＰＤ病因と関係すると確認された他の遺伝子はまだないが、ＣＯＰＤ患者に現れる基本的な細胞的、分子的そして遺伝子的な異常状態に対する研究を通じて疾病のバイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）を識別して診断に活用したり、新しい治療方法発掘に活用するための試みが進行中である（Ｐ．Ｊ．Ｂａｒｎｅｓ  ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｓｔｏｃｋｅｌｙ．ＣＯＰＤ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ．（２００５）２５：１０８４−１１０６）。特に遺伝子マイクロアレイ（ｇｅｎｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）やプロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）等の方法を通じてＣＯＰＤの診断および治療ターゲットを選定する研究が盛んに行われているが、ＣＯＰＤ敏感性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を持たせる遺伝因子分析および喫煙によって誘発されるＣＯＰＤ症状の悪化の原因に対する分析が主に行われている（Ｐｅｔｅｒ  Ｊ．Ｃａｓｔａｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＣＯＰＤ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ．Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１０，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．３  ５２６−５３４）。
【００２２】
ＣＴＧＦ（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＣＣＮ２）はＣＣＮ  ｆａｍｉｌｙに属するｍａｔｒｉｃｅｌｌｕｌａｒタンパク質中一つで、細胞結合（ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）、移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、傷回復（ｗｏｕｎｄ  ｒｅｐａｉｒ）等の多様な生物学的過程（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）に関与すると知られている分泌サイトカインで、ＣＴＧＦの過発現は、強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、線維症（ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）および傷跡形成のような症状の主な原因と考えられる（Ｂｒｉｇｓｔｏｃｋ  ＤＲ．Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＣＣＮ２，ＣＴＧＦ）  ａｎｄ  ｏｒｇａｎ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｓｉｇｎａｌ（２０１０）４（１）：１−４）。特に線維症と関連してＣＴＧＦは、ＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β）と共に慢性線維症（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を誘発したり繊維形成を誘発する条件でＥＣＭ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ  ｍａｔｒｉｘ）生産を促進させる役割をすると知られていて、最近ＣＴＧＦの発現を阻害したり、作用を抑制する試料や物質を処理することによって異常なＣＴＧＦの発現による視覚障害（ｏｃｕｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）や筋萎縮症（Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）を治療できると知られているが、呼吸器疾患との関連性は提示されたことがない（米国登録特許番号第７６２２４５４号、米国公開特許番号第２０１２０１６４１５１号）。
【００２３】
２８ＣＹＲ６１（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ６１）もＣＣＮ  ｆａｍｉｌｙに属するＥＣＭ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ  ｍａｔｒｉｘ）関連信号タンパク質（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）で、細胞結合（ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）、移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）等の多様な細胞活動（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）を調節すると知られている。精製されたＣＹＲ６１は、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎと類似する方式で内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）の付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）と拡散（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）を促進して、ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙはないが線維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）のｍｉｔｏｇｅｎ効果を強化する作用をする（ＭＡＲＩＡ  Ｌ．ＫＩＲＥＥＶＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｒ６１，ａ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ａ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−Ｅａｒｌｙ  Ｇｅｎｅ、Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ａｐｒ．１９９６，ｐ．１３２６−１３３４）。
【００２４】
Ｐｌｅｋｈｏ１（Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｆａｍｉｌｙ  Ｏ  ｍｅｍｂｅｒ  １）は、ｐｌａｓｍａ膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）や核（ｎｕｃｌｅｕｓ）に存在して、タンパク質リン酸化酵素（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）ＣＫ２α１（Ｃａｓｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ２，ａｌｐｈａ  １）の非酵素的調節因子（ｎｏｎ−ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）として作用して、Ｃａｓｐａｓｅ  ３によって分解された時生成されたＣ−末端片がＡＰ−１作用を抑制することによってアポトーシス（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に関与すると報告されている（Ｄｅｎｉｓ  Ｇ．Ｂｏｓｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＫＩＰ−１，ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｈａｔ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  ＣＫ２．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）２７５，１４２９５−１４３０６；Ｌｉｎｇｑｉａｎｇ  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｏｍａｉｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＣＫＩＰ−１  ｉｎ  ＡＰ−１  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００５）２４，７６６−７７８）。
【００２５】
前記説明したとおり、呼吸器疾患、特に特発性肺線維症およびＣＯＰＤの有病率が高まっている状況であるが、まだ根本的に特発性肺線維症およびＣＯＰＤを予防および治療できる効果を持つ治療剤はない状況である。したがって、副作用がなく高い予防および治療効果を含む特発性肺線維症およびＣＯＰＤ治療剤に対する市場の需要は非常に大きい状況である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明の目的は、前記のような問題点を解決しようと、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１に特異的でありかつ非常に高い効率でその発現を阻害できる新規ｓｉＲＮＡおよびこれを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、およびそのような二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の製造方法を提供するところにある。
【００２７】
また、本発明の他の目的は、前記ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的なｓｉＲＮＡまたはそのようなｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を有効成分として含む呼吸器疾患、特に特発性肺線維症およびＣＯＰＤ予防または治療用薬剤学的組成物を提供することである。
【００２８】
本発明のさらに他の目的は、前記ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的なｓｉＲＮＡまたは、そのようなｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を利用して呼吸器疾患、特に特発性肺線維症およびＣＯＰＤを予防または治療する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明では配列番号１〜６００番および６０２番〜６０４番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｎｄ）である第１のオリゴヌクレオチドとそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖である第２のオリゴヌクレオチドからなる呼吸器疾患関連遺伝子であるＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを提供する。
【００３０】
本発明でのｓｉＲＮＡは、一般的なＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）作用を持つ全ての物質を含む概念で、前記ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡにはＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｈＲＮＡなども含まれることは、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者には自明である。
【００３１】
前記配列番号１〜１００番または６０２〜６０４番は、ＣＴＧＦ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）に特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖配列で、配列番号１０１〜２００番は、Ｃｙｒ６１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）に特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖配列であり、配列番号２０１〜３００番は、Ｐｌｅｋｈｏ１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）に特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖配列で、配列番号３０１〜４００番はＣＴＧＦ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）に特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖配列であり、配列番号４０１〜５００番はＣｙｒ６１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）に特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖配列で、配列番号５０１〜６００番はＰｌｅｋｈｏ１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）に特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖配列である。
【００３２】
本発明に係るｓｉＲＮＡは、好ましくは配列番号１〜１０、３５、４２、５９、６０２、６０３、６０４、３０１〜３０３、３０５〜３０７、３０９、３１７、３２３および３２９番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列をセンス鎖として含むＣＴＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ、
配列番号１０１〜１１０、１２４、１５３、１６６、１８７、１９７、４０９、４１０、４１５、４１７、４１８、４２０、４２２、４２４、４２７および４２９番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列をセンス鎖として含むＣｙｒ６１特異的ｓｉＲＮＡ、または
配列番号２０１〜２１０、２１２、２１８、２２１、２２３、５０４〜５０７、５１４、５１５および５２２〜５２５番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列をセンス鎖として含むＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡである。
【００３３】
さらに好ましくは、配列番号４、５、８、９、３５、４２、５９、６０１、６０２、６０４、３０１、３０３、３０７および３２３番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列をセンス鎖として含むＣＴＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ、
配列番号１０２、１０４、１０７、１０８、１２４、１５３、１６６、１８７、１９７、４１０、４２２および４２４番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列をセンス鎖として含むＣｙｒ６１特異的ｓｉＲＮＡ、または
配列番号２０６〜２０９、２１２、２１８、２２１、２２３、５０７、５１５および５２５番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列をセンス鎖として含むＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡであり、
最も好ましくは、配列番号４２、５９、６０２または３２３に係るいずれか一つの配列をセンス鎖として含むＣＴＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ、
配列番号１２４、１５３、１８７、１９７または４２４番の配列をセンス鎖として含むＣｙｒ６１特異的ｓｉＲＮＡ、または
配列番号２１２、２１８、２２１、２２３または５２５番の配列をセンス鎖として含むＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡである。
【００３４】
特に、本発明に係るヒトＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡ中一部は、マウスＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１の発現を同時に阻害できる効果を有していることが確認された。
【００３５】
前記ヒトおよびマウスＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１発現を同時に抑制できるｓｉＲＮＡは、好ましくは配列番号６または８番に係るＣＴＧＦ特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖、配列番号１０２、１０４または１０５番に係るＣｙｒ６１特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖、または、配列番号２０４、２０７または、２０８番に係るＰｌｅｋｈｏ１特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖を含む。
【００３６】
前記ｓｉＲＮＡは、最も好ましくは、配列番号６番に係るＣＴＧＦ特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖、配列番号１０２番に係るＣｙｒ６１特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖、または、配列番号２０７番に係るＰｌｅｋｈｏ１特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖を含む。
【００３７】
本発明に係るｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖は、１９〜３１個のヌクレオチドからなることが好ましく、前記配列番号１〜配列番号６０４番から選択されたいずれか一つの配列を含むセンス鎖およびこれに相補的なアンチセンス鎖を含む。
【００３８】
本発明で提供されるＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡは、該当遺伝子を暗号化するｍＲＮＡと相補的に結合することができるように設計された塩基配列を持つので、該当遺伝子の発現を効果的に抑制できることを特徴とする。また、前記ｓｉＲＮＡの３’末端に一つまたは二つ以上の非結合（ｕｎｐａｉｒｅｄ）されたヌクレオチドを持つ構造であるオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を含んでもよい。
【００３９】
また、前記ｓｉＲＮＡの生体内安定性向上のために、核酸分解酵素抵抗性付与および非特異的免疫反応減少のための様々な修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含んでもよい。前記ｓｉＲＮＡを構成する第１または第２オリゴヌクレオチドの修飾は一つ以上のヌクレオチド内糖構造の２’炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ３（メチル）、−ＯＣＨ３（メトキシ）、−ＮＨ２、−Ｆ（フッ素）、−Ｏ−２−メトキシエチル−Ｏ−プロピル（ｐｒｏｐｙｌ）、−Ｏ−２−メチルチオエチル（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｅｔｈｙｌ）、−Ｏ−３−アミノプロピル、−Ｏ−３−ジメチルアミノプロピル、−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミドまたは−Ｏ−ジメチルアミドオキシエチルへの置換による修飾；ヌクレオチド内糖（ｓｕｇａｒ）構造内の酸素が硫黄に置き換えられた修飾；及びヌクレオチド結合のホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）またはボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ），メチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）結合への修飾から選択された一つ以上の修飾が組み合わせて使用でき、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄａｃｉｄ）またはＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）形態への修飾も使用可能である（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．５５：ｐｐ６１−６５  ２００４、ＵＳ５，６６０，９８５、ＵＳ５，９５８，６９１、ＵＳ６，５３１，５８４、ＵＳ５，８０８，０２３、ＵＳ６，３２６，３５８、ＵＳ６，１７５，００１；Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：１１３９−１１４３，２００３；ＲＮＡ，９：１０３４−１０４８，２００３；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３１：５８９−５９５，２００３；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８（１７）５７６１−５７７３，２０１０；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９（５）１８２３−１８３２，２０１１）。
【００４０】
本発明で提供されるＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡは、該当遺伝子の発現を低下させるだけでなく、該当タンパク質の発現を顕著に阻害させる。
【００４１】
本発明の他の様態として、呼吸器疾患関連遺伝子、特に、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡの生体内への効率的な伝達および安定性向上のために、ｓｉＲＮＡの両末端に親水性物質および疎水性物質が接合された形態の接合体を提供する。
【００４２】
前記のとおりｓｉＲＮＡに親水性物質および疎水性物質が結合されたｓｉＲＮＡ接合体の場合、疎水性物質の疎水性相互作用によって自己組み立てナノ粒子を形成するようになるが（大韓民国特許登録番号第１２２４８２８号参照）、このような接合体は、体内への伝達効率および体内での安定性がきわめて優秀なだけでなく、粒子の大きさが均一性が優秀でＱＣ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）が容易であるため、薬物としての製造工程が簡単である長所がある。
【００４３】
一つの好ましい具体例として、本発明に係るＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、下記の構造式（１）のような構造を持つことが好ましい：
Ａ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ  （構造式１）
前記構造式（１）で、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、ＸおよびＹはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカー媒介された共有結合を意味して、ＲはＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを意味する。
【００４４】
より好ましくは、本発明に係るＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、下記の構造式（２）の構造を持つ：
【化１】
2020062023.tif 000003
前記構造式（２）で、Ａ、Ｂ、ＸおよびＹは、前記構造式（１）での定義と同様であり、Ｓは、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡのセンス鎖、ＡＳは、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を意味する。
【００４５】
より好ましくは、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、下記の構造式３または４の構造を持つ：
【化２】
2020062023.tif 000004
前記構造式３および構造式４で、Ａ、Ｂ、Ｓ、ＡＳ、ＸおよびＹは、前記構造式１での定義と同様であり、５’および３’は、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡセンス鎖の５’末端および３’末端を意味する。
【００４６】
前記構造式１〜構造式４でのＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体のアンチセンス鎖の５’末端にリン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｇｒｏｕｐ）が一つ〜三つ結合されてもよく、ｓｉＲＮＡの代わりにｓｈＲＮＡが使用されてもよいことは本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者には自明である。
【００４７】
前記構造式１〜構造式４での親水性物質は分子量が２００〜１０，０００（請求項１０）であるカチオン性または非イオン性高分子物質であることが好ましく、さらに好ましくは１，０００〜２，０００である非イオン性高分子物質である。例えば、親水性高分子化合物としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリオキサゾリン（請求項１１）などの非イオン性親水性高分子化合物を使用することが好ましいが、必ずしもこれに限定されるのではない。
【００４８】
特に、構造式１〜構造式４での親水性物質（Ａ）は、下記の構造式５または構造式６のような形態の親水性物質ブロック（ｂｌｏｃｋ）形態で利用されるが、このような親水性物質ブロックを必要に応じて適切な個数（構造式５または構造式６でのｎ）を使用することによって、一般合成高分子物質などを使用する場合に発生し得る多分散性による問題点を大きく改善することができる：
（Ａ’ｍ−Ｊ）ｎ    （構造式５）
（Ｊ−Ａ’ｍ）ｎ    （構造式６）
前記構造式５および構造式６で、Ａ’は、親水性物質単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）を、Ｊはｍ個の親水性物質単量体の間またはｍ個の親水性物質単量体とｓｉＲＮＡを互いに連結するリンカー、ｍは１〜１５の整数、ｎは１〜１０の整数を意味して、（Ａ’ｍ−Ｊ）または（Ｊ−Ａ’ｍ）で表される繰り返し単位が親水性物質ブロックの基本単位に該当する。
【００４９】
前記構造式５または構造式６のような親水性物質ブロックを持つ場合、本発明に係るＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、下記の構造式７または構造式８のような構造を持つことができる：
（Ａ’ｍ−Ｊ）ｎ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ    （構造式７）
（Ｊ−Ａ’ｍ）ｎ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ    （構造式８）
前記構造式７および構造式８で、Ｘ、Ｒ、ＹおよびＢは、構造式１での定義と同様であり、Ａ’、Ｊ、ｍおよびｎは、構造式５および構造式６での定義と同様である。
【００５０】
前記構造式５及び構造式６で、親水性物質単量体（Ａ’）は、非イオン性親水性高分子の単量体中本発明の目的に合致するものなら制限なしに使用が可能で、好ましくは表１に記載された化合物（１）〜化合物（３）から選択された単量体、さらに好ましくは化合物（１）の単量体が使用され、化合物（１）でＧは好ましくはＣＨ２、Ｏ、ＳおよびＮＨから選択される。
【００５１】
特に、親水性物質単量体の中でも化合物（１）で表される単量体には様々な官能基を導入することができ、生体内親和性が良く免疫反応を少なく誘導するなど生体適合性（ｂｉｏ−ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）が優れるとともに、構造式７または構造式８に係る構造体内に含まれたｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの生体内安定性を増加させて、伝達効率を増加させることができる長所を有していて、本発明に係る構造体の製造に非常に適している。
【表１】
2020062023.tif 000005
【００５２】
構造式５〜構造式８での親水性物質（親水性物質ブロック）は総分子量が１，０００〜２，０００の範囲内であることが好ましい。したがって、例えば、構造式７および構造式８で化合物（１）に係るヘキサエチレングリコール（Ｈｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、すなわちＧがＯで、ｍが６である物質が使用される場合ヘキサエチレングリコールスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）の分子量が３４４であるため、繰り返し回数（ｎ）は３〜５が好ましい。
【００５３】
特に、本発明は必要に応じて前記構造式５および構造式６で（Ａ’ｍ−Ｊ）または（Ｊ−Ａ’ｍ）ｎで表される親水性基の繰り返し単位、すなわち親水性物質ブロック（ｂｌｏｃｋ）がｎと表される適切な個数で使用され得ることを特徴とする。前記各親水性物質ブロック内に含まれる親水性物質単量体であるＡ’とリンカーであるＪは、独立して各親水性物質ブロックの間に同じであってもよく、異なってもよい。すなわち、親水性物質ブロックが三つ使用される場合（ｎ＝３）、最初のブロックには化合物（１）に係る親水性物質単量体が、二番目のブロックには化合物（２）に係る親水性物質単量体が、三番目のブロックには化合物（３）に係る親水性物質単量体が使用されるなど、すべての親水性物質ブロック別に他の親水性物質単量体が使用されてもよく、すべての親水性物質ブロックに化合物（１）〜化合物（３）に係る親水性物質単量体で選択されたいずれか一つの親水性物質単量体が同様に使用されてもよい。同様に、親水性物質単量体の結合を媒介するリンカーも、各親水性物質ブロック別に全て同じリンカーが使用されてもよく、各親水性物質ブロック別に異なるリンカーが使用されてもよい。また、親水性物質単量体の個数であるｍも各親水性物質ブロックの間に同じであってもよく、異なってもよい。すなわち、最初の親水性物質ブロックでは、親水性物質単量体が三つ連結（ｍ＝３）され、二番目の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が五つ（ｍ＝５）、三番目の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が四つ連結（ｍ＝４）されるなど、それぞれ異なる個数の親水性物質単量体が使用されてもよく、すべての親水性物質ブロックで同じ個数の親水性物質単量体が使用されてもよい。
【００５４】
また、本発明で前記リンカー（Ｊ）は、ＰＯ３−、ＳＯ３およびＣＯ２で構成された群から選択されることが好ましいが、これに制限されず、使用される親水性物質の単量体などに応じて本発明の目的に合致する限りいかなるリンカーでも使用できることは当業者には自明である。
【００５５】
前記構造式１〜構造式４，構造式７および構造式８での疎水性物質（Ｂ）は、疎水性相互作用を介して構造式１〜構造式４，構造式７および構造式８に係るオリゴヌクレオチド構造体で構成されたナノ粒子を形成する役割をする。前記疎水性物質は、分子量が２５０〜１，０００であることが好ましく、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体、グリセリド（ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）誘導体、グリセロールエーテル（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｅｔｈｅｒ）、ポリプロピレングリコール（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和炭化水素（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）、ジアシルホスファチジルコリン（ｄｉａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、脂肪酸（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ）、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）、リポポリアミン（ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ）等が使用されるが、これに制限されず、本発明の目的に合致するものであればいかなる疎水性物質も使用可能である点は、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者には自明である。
【００５６】
前記ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルマート、コレスタニルホルマートおよびコレステリルアミンからなる群で選択されてもよく、前記グリセリド誘導体は、モノ−、ジ−およびトリ−グリセリドなどから選択されるが、この時、グリセリドの脂肪酸としては、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和脂肪酸が好ましい。
【００５７】
特に、前記疎水性物質の中でも飽和または不飽和炭化水素やコレステロールが、本発明に係るオリゴヌクレオチド構造体の合成段階で容易に結合させることができる長所を有している点から好ましく、Ｃ２４炭化水素、特にｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄを含むテトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ）が最も好ましい。
【００５８】
前記疎水性物質は、親水性物質の反対側末端（ｄｉｓｔａｌ  ｅｎｄ）に結合され、ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖のどの位置に結合されても構わない。
【００５９】
本発明に係る構造式１〜構造式４、構造式７および構造式８で親水性物質ブロックまたは疎水性物質とＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡは単純共有結合またはリンカー媒介された共有結合（ＸまたはＹ）によって結合される。前記共有結合を媒介するリンカーは、親水性物質、または疎水性物質とＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡの末端で共有結合して、必要に応じて特定環境で分解が可能な結合を提供する限り特に限定されるのではない。したがって、前記リンカーは、本発明に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の製造過程中ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡおよび／または親水性物質（または、疎水性物質）を活性化するために結合させるいかなる化合物も使用されることができる。前記共有結合は、非分解性結合または分解性結合のうちいずれでもよい。この時、非分解性結合としては、アミド結合またはリン酸化結合があり、分解性結合としては、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンハイドライド結合、生分解性結合または酵素分解性結合などがあるが、これに限定されない。
【００６０】
また、前記構造式１〜構造式４、構造式７および構造式８でのＲ（または、ＳおよびＡＳ）で表されるｓｉＲＮＡは、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的に結合できる特性を持つｓｉＲＮＡならばいずれも制限なしに使用可能で、好ましくは本発明では配列番号１〜６００および６０２〜６０４から選択されたいずれか一つの配列を含むセンス鎖とそれに相補的な配列を持つアンチセンス鎖で構成される。
【００６１】
特に、本発明に係る前記構造式１〜構造式４、構造式７および構造式８に含まれるｓｉＲＮＡは、好ましくは配列番号１〜１０、３５、４２、５９、６０２〜６０４または３０１〜３０３、３０５〜３０７、３０９、３１７、３２３および３２９番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列をセンス鎖として含むＣＴＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ、
配列番号１０１〜１１０、１２４、１５３、１６６、１８７、１９７、４０９、４１０、４１５、４１７、４１８、４２０、４２２、４２４、４２７および４２９番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列をセンス鎖として含むＣｙｒ６１特異的ｓｉＲＮＡ、または
配列番号２０１〜２１０番、２１２、２１８、２２１、２２３、５０４〜５０７、５１４、５１５および５２２〜５２５番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列をセンス鎖として含むＰｌｅｋｈｏ１特異的なｓｉＲＮＡである。
【００６２】
さらに好ましくは、配列番号４、５、８、９、３５、４２、５９、６０２、６０３、６０４、３０１、３０３、３０７および３２３番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列をセンス鎖として含むＣＴＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ、
配列番号１０２、１０４、１０７、１０８、１２４、１５３、１６６、１８７、１９７、４１０、４２２および４２４番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列をセンス鎖として含むＣｒｙ６１特異的ｓｉＲＮＡ、または
配列番号２０６〜２０９、２１２、２１８、２２１、２２３、５０７、５１５および５２５番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列をセンス鎖として含むＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡであり、
最も好ましくは配列番号４２、５９、６０２または３２３番に係るいずれか一つの配列をセンス鎖として含むＣＴＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ、
配列番号１２４、１５３、１８７、１９７または４２４番に係るいずれか一つの配列をセンス鎖として含むＣｒｙ６１特異的ｓｉＲＮＡ、または
配列番号２１２、２１８、２２１、２２３または５２５番の配列をセンス鎖で含むＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡである。
【００６３】
また、配列番号６または８番に係るヒトおよびマウスに対するＣＴＧＦ特異的ｓｉＲＮＡセンス鎖、配列番号１０２、１０４または１０５番に係るヒトおよびマウスに対するＣｙｒ６１特異的なｓｉＲＮＡセンス鎖、または配列番号２０４、２０７または２０８番に係るヒトおよびマウスに対するＰｌｅｋｈｏ１特異的なｓｉＲＮＡセンス鎖を含むｓｉＲＮＡも特に好ましいが、これは、前記配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡが、ヒトおよびマウスに対するＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１発現を同時に抑制できる効果を持つためであり、配列番号６番に係るヒトおよびマウスに対するＣＴＧＦ特異的ｓｉＲＮＡセンス鎖、配列番号１０２番に係るヒトおよびマウスに対するＣｙｒ６１特異的なｓｉＲＮＡセンス鎖、または配列番号２０７番に係るヒトおよびマウスに対するＰｌｅｋｈｏ１特異的なｓｉＲＮＡセンス鎖を含むｓｉＲＮＡが最も好ましい。
【００６４】
本発明はまた、本発明に係るＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体において、前記構造体内の親水性物質のｓｉＲＮＡと結合された反対側末端部位にアミン基またはポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基が追加的に導入されてもよい。
【００６５】
これは、本発明に係るＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含む伝達体の細胞内導入とエンドソーム脱出を容易にするためのものであって、すでに量子ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ）、デンドリマー（Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）などの伝達体の細胞内導入とエンドソーム脱出を容易にするためにアミン基の導入とポリヒスチジン基が利用できる点およびその効果が報告されている。
【００６６】
具体的に、伝達体の末端あるいは外側に修飾された１次アミン基は、生体内ｐＨでプロトン化されながら負電荷を帯びる遺伝子と静電気的相互作用によって結合体を形成して、細胞内流入後でエンドソームの低いｐＨで緩衝効果を持つ内部３次アミンによりエンドソームの脱出が容易になるにつれ、リソソームの分解から伝達体を保護することができると知られおり（高分子ベースハイブリッド物質を利用した遺伝子伝達および発現抑制、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３，ｐｐ２５４−２５９）、
非必須アミノ酸の一つであるヒスチジンは、残基（−Ｒ）にイミダゾリン（ｐｋａ３  ６．０４）を持つので、エンドソームとリソソームで緩衝能力（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）を増加させる効果があって、リポソームをはじめとする非ウィルス性遺伝子伝達体（ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）でエンドソーム脱出効率を上げるために、ヒスチジン修飾を利用することができる点が知られている（Ｎｏｖｅｌ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｓｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｍａ  ＨｅｐＧ２  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １１８，ｐｐ２６２−２７０）。
【００６７】
前記アミン基またはポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基は、一つ以上のリンカーを介して親水性物質または親水性ブロックと連結されることができる。
【００６８】
本発明の構造式１に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の親水性物質にアミン基またはポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基が導入される場合には、構造式９のような構造を持つことができる：
Ｐ−Ｊ１−Ｊ２−Ａ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ  （構造式９）
前記構造式９で、Ａ、Ｂ、Ｒ、ＸおよびＹは、構造式１での定義と同様であり、Ｐは、アミン基またはポリヒスチジン基を意味して、Ｊ１とＪ２は、リンカーとして、独立して単純共有結合、ＰＯ３−、ＳＯ３、ＣＯ２、Ｃ２−１２のアルキル、アルケニル、アルキニルから選択されるが、これに限定されず、使用される親水性物質により本発明の目的に合致するＪ１とＪ２はいかなるリンカーでも使用できることは当業者には自明である。
【００６９】
好ましくは、アミン基が導入された場合には、Ｊ２は単純共有結合またはＰＯ３−、Ｊ１はＣ６アルキルであることが好ましいが、これに限定されない。
【００７０】
また、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基が導入された場合には構造式９では、Ｊ２は単純共有結合またはＰＯ３−、Ｊ１は化合物（４）が好ましいが、これに限定されない。
【化３】
2020062023.tif 000006
【００７１】
また、構造式９に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の親水性物質が構造式５または構造式６に係る親水性物質ブロックで、これにアミン基またはポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基が導入される場合には、構造式１０または構造式１１と同じ構造を持つことができる：
Ｐ−Ｊ１−Ｊ２−（Ａ’ｍ−Ｊ）ｎ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ    （構造式１０）
Ｐ−Ｊ１−Ｊ２−（Ｊ−Ａ’ｍ）ｎ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ    （構造式１１）
前記構造式１０および構造式１１で、Ｘ、Ｒ、Ｙ、Ｂ、Ａ’、Ｊ、ｍおよびｎは、構造式５または構造式６での定義と同様であり、Ｐ、Ｊ１およびＪ２は、構造式９での定義と同様である。
【００７２】
特に、前記構造式１０および構造式１１において、親水性物質はＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡセンス鎖の３’末端に結合された形態であることが好ましく、この場合前記構造式９〜構造式１１は次の構造式１２〜構造式１４の形態を持つことができる：
【化４】
2020062023.tif 000007
前記構造式１２〜構造式１４で、Ｘ、Ｒ、Ｙ、Ｂ、Ａ、Ａ’、Ｊ、ｍ、ｎ．Ｐ、Ｊ１およびＪ２は、前記構造式９〜構造式１１での定義と同様であり、５’および３’は、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡセンス鎖の５’末端および３’末端を意味する。
【００７３】
本発明で導入されることができるアミン基では、第一級〜第三級アミン基が使用され、一次アミン基が使用されることが特に好ましい。前記導入されたアミン基は、アミン塩で存在することもできるが、例えば一次アミン基の塩はＮＨ３＋の形態で存在することができる。
【００７４】
また、本発明で導入されることができるポリヒスチジン基は、３〜１０個のヒスチジンを含むことが好ましく、特に好ましくは５〜８個、最も好ましくは６個のヒスチジンを含む。追加的にヒスチジン以外に一つ以上のシステインが含まれてもよい。
【００７５】
したがって、本発明に係るＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体およびこれから形成されたナノ粒子にターゲッティングモイアティが備わると、効率的にターゲット細胞への伝達を促進して、比較的低い濃度の投与量でもターゲット細胞に伝達されて高いターゲット遺伝子発現調節機能を示し、他臓器および細胞への非特異的なＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡの伝達を防止することができる。
【００７６】
これにより、本発明は、前記構造式１〜構造式４、構造式７および構造式８に係る構造体にリガンド（Ｌ）、特に受容体媒介内包作用（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＲＭＥ）を介してターゲット細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させる受容体と特異的に結合する特性を持つリガンド（ｌｉｇａｎｄ）が追加的に結合された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を提供して、例えば構造式１に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体にリガンドが結合された形態は、下記の構造式１５のような構造を持つ：
（Ｌｉ−Ｚ）−Ａ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ    （構造式１５）
前記構造式１５で、Ａ、Ｂ、ＸおよびＹは、前記構造式１での定義と同様であり、Ｌは受容体媒介内包作用（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＲＭＥ）を介してターゲット細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させる受容体と特異的に結合する特性を持つリガンド、Ｚは、単純共有結合または親水性物質ブロック内の親水性物質単量体とリガンドの結合を媒介するリンカーを意味して、ｉは、１〜５の整数、好ましくは１〜３の整数である。
【００７７】
前記構造式１５でのリガンドは、好ましくはターゲット細胞特異的に細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させるＲＭＥ特性を持つターゲット受容体特異的抗体やアプタマー、ペプチド；または、葉酸（Ｆｏｌａｔｅ、一般にｆｏｌａｔｅとｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄは互いに交差使用されており、本発明での葉酸は、自然状態または人体で活性化状態であるｆｏｌａｔｅを意味する）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，ＮＡＧ）等のヘキソアミン（ｈｅｘｏａｍｉｎｅ）、ブドウ糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）をはじめとする糖や炭水化物（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）等の化学物質などで選択されるが、これに限定されるのではない。
【００７８】
また、前記構造式１５での親水性物質Ａは、構造式５および構造式６に係る親水性物質ブロックの形態で使用されることができる。
【００７９】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、前記ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造する方法を提供する。
【００８０】
本発明に係るＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造する過程は、例えば、
（１）固形支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）をベースに親水性物質を結合させる段階；
（２）前記親水性物質が結合された固形支持体をベースにＲＮＡ一本鎖を合成する段階；
（３）前記ＲＮＡ一本鎖５’末端に疎水性物質を共有結合させる段階；
（４）前記ＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を合成する段階；
（５）合成が完了すれば固形支持体からＲＮＡ−高分子構造体およびＲＮＡ一本鎖を分離精製する段階；及び
（６）製造されたＲＮＡ−高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖のアニーリングにより二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造する段階；
を含む。
【００８１】
本発明での固形支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）は、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）が好ましいが、これに限定されず、ポリスチレン、シリカゲル、セルロースペーパーなどが使用されてもよい。ＣＰＧである場合、径は４０〜１８０μｍであることが好ましく、５００〜３０００Åの孔隙の大きさを持つことが好ましい。前記段階（５）以後、製造が完了されると、精製されたＲＮＡ−高分子構造体およびＲＮＡ一本鎖は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器で分子量を測定して、目的するＲＮＡ−高分子構造体およびＲＮＡ一本鎖が製造されたか否かを確認することができる。前記製造方法において（２）段階で合成されたＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を合成する段階（４）は、（１）段階以前または（１）段階〜（５）段階のうちいずれか一つの過程中に実行されても構わない。
【００８２】
また、（２）段階で合成されたＲＮＡ一本鎖と相補的配列を含むＲＮＡ一本鎖は、５’末端にリン酸基が結合された形態で利用されたことを特徴とする製造方法であってもよい。
【００８３】
一方、本発明は、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体に追加的にリガンドが結合された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体の製造方法を提供する。
【００８４】
リガンドが結合されたＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを含むオリゴＲＮＡ構造体を製造する方法は、例えば、
（１）官能基が結合されている固形支持体に親水性物質を結合させる段階；
（２）官能基−親水性物質が結合されている固形支持体をベースにＲＮＡ一本鎖を合成する段階；
（３）前記ＲＮＡ一本鎖の５’末端に疎水性物質を共有結合させる過程で合成する段階；
（４）前記ＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を合成する段階；
（５）合成が完了すると、固形支持体から官能基−ＲＮＡ−高分子構造体および相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を分離する段階；
（６）前記官能基を利用して親水性物質末端にリガンドを結合してリガンド−ＲＮＡ−高分子構造体一本鎖を製造する段階；及び
（７）製造されたリガンド−ＲＮＡ−高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖のアニーリングによりリガンド−二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造する段階；
を含む。
【００８５】
前記（６）段階以後、製造が完了すると、リガンド−ＲＮＡ−高分子構造体および相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を分離精製した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器で分子量を測定して目的するリガンド−ＲＮＡ−高分子構造体および相補的なＲＮＡが製造されたかを確認することができる。製造されたリガンド−ＲＮＡ−高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖のアニーリングによりリガンド−二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造することができる。前記製造方法において（３）段階で合成されたＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を合成する段階（４）は、独立的な合成過程として（１）段階以前または（１）段階〜（６）段階のうちいずれか一つの過程中実行されても構わない。
【００８６】
本発明のさらに他の様態として、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子を提供する。
【００８７】
すでに先に説明したとおり、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１遺伝子特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、疎水性および親水性物質を共に含んでいる両親媒性であり、親水性の部分は、体内に存在する水分子と水素結合などの相互作用を介して親和力を有していて外側へ向かうようになり、疎水性物質は、それらの間の疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を介して内側へ向かうようになり、熱力学的に安定したナノ粒子を形成するようになる。すなわち、ナノ粒子の中心に疎水性物質が位置するようになり、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡの外側方向に親水性物質が位置して、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを保護する形態のナノ粒子を形成する。このように形成されたナノ粒子は、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡの細胞内伝達向上およびｓｉＲＮＡ効能を向上させる。
【００８８】
本発明に係るナノ粒子は、同じ配列を持つｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体だけで形成されてもよく、互いに異なる配列を持つｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体で構成されること（請求項２８）を特徴とするが、本発明での互いにことなる配列を持つｓｉＲＮＡは、他のターゲット遺伝子、例えばＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的なｓｉＲＮＡであってもよく、同じターゲット遺伝子特異性を持ちながらその配列が異なる場合も含まれて解釈される。
【００８９】
また、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的なｓｉＲＮＡ以外に他の呼吸器疾患関連遺伝子特異的なｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が本発明に係るナノ粒子に含まれてもよい。
【００９０】
また、本発明は他の様態として、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１および／またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡ、これを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体および／または前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子を含む呼吸器疾患、特に特発性肺線維症およびＣＯＰＤの予防または治療用組成物を提供する。
【００９１】
本発明に係るＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡ、これを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体および／または前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子を有効成分として含む組成物は、肺動脈リモデリング（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）および気道リモデリング（ａｉｒｗａｙ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）を抑制して、本発明のＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡまたはこれを含む組成物は呼吸器疾患の予防または治療に効果を奏するものである。
【００９２】
特に、本発明に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含む呼吸器疾患予防または治療用組成物には、
配列番号１〜１００番または６０２〜６０４番および３０１〜４００番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列、好ましくは配列番号１〜１０、３５、４２、５９、６０２〜６０４、３０１〜３０３、３０５〜３０７、３０９、３１７、３２３および３２９番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列、さらに好ましくは配列番号４、５、８、９、３５、４２、５９、６０２〜６０４、３０１、３０３、３０７および３２３番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列、最も好ましくは配列番号４２、５９、６０２または３２３番に係る配列を含むセンス鎖およびこれと相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含むＣＴＧＦ特異的なｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、
配列番号１０１〜２００番および４００〜５００番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列、好ましくは配列番号１０１〜１１０、１２４、１５３、１６６、１８７、１９７、４０９、４１０、４１５、４１７、４１８、４２０、４２２、４２４、４２７および４２９番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列、さらに好ましくは配列番号１０２、１０４、１０７、１０８、１２４、１５３、１６６、１８７、１９７、４１０、４２２および４２４番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列、最も好ましくは配列番号１２４、１５３、１８７、１９７または４２４番の配列を含むセンス鎖およびこれと相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含むＣｙｒ６１特異的なｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、または
配列番号２０１〜３００番および５０１〜６００番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列、好ましくは配列番号２０１〜２１０、２１２、２１８、２２１、２２３、５０４〜５０７、５１４、５１５および５２２〜５２５番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列、さらに好ましくは配列番号２０６〜２０９、２１２、２１８、２２１、２２３、５０７、５１５および５２５番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列、最も好ましくは配列番号２１２、２１８、２２１、２２３または５２５番の配列を含むセンス鎖およびこれと相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含むＰｌｅｋｈｏ１特異的なｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が含まれてもよい。
【００９３】
また、配列番号６または８番の配列、好ましくは配列番号６番に係るヒトおよびマウスＣＴＧＦに共に特異的なｓｉＲＮＡセンス鎖およびこれと相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含むＣＴＧＦ特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、
配列番号１０２、１０４および１０５番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列、好ましくは配列番号１０２番に係るヒトおよびマウスＣｙｒ６１に共に特異的なｓｉＲＮＡセンス鎖およびこれと相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含むＣｙｒ６１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、または
配列番号２０４、２０７および２０８番で構成された群から選択されたいずれか一つの配列、好ましくは配列番号２０７番に係るヒトおよびマウスＰｌｅｋｈｏ１に共に特異的なｓｉＲＮＡセンス鎖およびこれと相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含むＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が含まれてもよい。
【００９４】
また、前記ＣＴＧＦ特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、Ｃｙｒ６１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体および／またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が混合された形態で含まれてもよく、追加的にＣＴＧＦ、Ｃｒｙ６１やＰｌｅｋｈｏ１以外の他の呼吸器疾患関連遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡ、またはこれを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が、本発明に係る組成物に追加的に含まれてもよい。
【００９５】
前記のとおり、ＣＴＧＦ、Ｃｒｙ６１および／またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡ、または前記ＣＴＧＦ、Ｃｒｙ６１および／またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体と共に、追加的に他の呼吸器疾患関連遺伝子特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を全て含む呼吸器疾患予防または治療用組成物を利用する場合、併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）のように相乗的な効果を奏することができる。
【００９６】
本発明に係る組成物が予防または治療できる呼吸器疾患としては、例えば特発性肺線維症、喘息、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎭咳去痰、急性下気道感染症（気管支炎および細気管支炎）、咽喉炎、扁桃炎、喉頭炎のような急性上気道感染症などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
また、本発明に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子を含む呼吸器疾患予防または治療用組成物に含まれるナノ粒子もＣＴＧＦ、Ｃｒｙ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体で選択されたいずれか一つの構造体だけで純粋に構成されてもよく、ＣＴＧＦ、Ｃｒｙ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が２種以上混合された形態で構成されてもよい。
【００９８】
本発明の組成物は、投与のために前記記載した有効成分以外に追加で薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造してもよい。薬剤学的に許容可能な担体は、本発明の有効成分と両立可能であるべきで、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のうち一つの成分または二つ以上の成分を混合して使用でき、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形で製剤化することができる。特に、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）された形態の剤形で製剤化して提供することが好ましい。凍結乾燥剤形製造のために本発明が属する技術分野で通常知られている方法が使用でき、凍結乾燥のための安定化剤が追加されてもよい。さらには、当分野の適正な方法でまたはレミントン薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）に開示されている方法を利用して、各疾病に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化することができる。
【００９９】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる有効成分などの含有量および投与方法は、通常の患者の症候と疾病の深刻度に基づいて本技術分野の通常の専門家が決めることができる。また、散剤、精製、カプセル剤、液剤、注射剤、軟こう剤、シロップ剤などの様々な形態で製剤化することができて、単位投与量または多投与量容器、例えば密封されたアンプルおよびビンなどで提供されてもよい。
【０１００】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または、非経口投与が可能である。本発明に係る薬剤学的組成物の投与経路は、これらに限定されず、例えば、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下または局所投与が可能である。特に呼吸器疾患治療のために気管支内点滴注入による肺への投与も可能である。本発明に係る組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、方法、排泄率および疾病の重症度等によりその範囲が多様であり、本技術分野の通常の専門家が容易に決めることができる。また、臨床投与のために、公知の技術を利用して本発明の薬剤学的組成物を適した剤形で製剤化することができる。
【０１０１】
また、本発明は、本発明に係る二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、これを含むナノ粒子および前記二重らせんオリゴＲＮＡ構造体または前記ナノ粒子を予防または治療を要する患者に投与することを含む呼吸器疾患、特に特発性肺線維症およびＣＯＰＤの予防および治療方法を提供する。
【発明の効果】
【０１０２】
本発明に係るＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡ、これを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含む治療用組成物は、副作用がなく高い効率でＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１の発現を抑制して、呼吸器疾患、特に特発性肺線維症およびＣＯＰＤ治療効果を奏することができるので、現在適切な治療剤がない呼吸器疾患、特に特発性肺線維症およびＣＯＰＤ治療に非常に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】本発明に係る二重らせんオリゴ高分子構造体で構成されたナノ粒子の模式図。
【図２】本発明に係る配列番号１〜１０、１０１〜１１０、２０１〜２１０番に係る配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡでヒト線維芽細胞の細胞株を形質転換させた後、確認されたターゲット遺伝子発現阻害量を示すグラフである。Ａ：配列番号１〜１０番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの５または２０ｎＭ処理によるＣＴＧＦ発現量グラフ、Ｂ：配列番号１０１〜１１０番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの５または２０ｎＭ処理によるＣｙｒ６１発現量グラフ、Ｃ：配列番号２０１〜２１０番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの５または２０ｎＭ処理によるＰｌｅｋｈｏ１発現量グラフ。
【図３】本発明の配列番号１、３、４、８、９、１０、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、２０４、２０６、２０７、２０８、２０９または２１０番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡでヒト線維芽細胞の細胞株を形質転換させた後、確認されたターゲット遺伝子発現阻害量グラフである。Ａ：配列番号１、３、４、８、９または１０番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの０．２または１ｎＭ処理によるＣＴＧＦ発現量グラフ、Ｂ：配列番号１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８または１０９番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの０．２または１ｎＭ処理によるＣｙｒ６１発現量グラフ、Ｃ：配列番号２０４、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ０．２または１ｎＭ処理によるＰｌｅｋｈｏ１発現量グラフ。
【図４】本発明に係る配列番号３５、４２、５９、６０２、６０３、６０４、１２４、１５３、１６６、１８７、１９７、２１２、２１８、２２１または２２３番に係る配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡでヒト肺癌細胞株を形質転換させた後、確認されたターゲット遺伝子発現阻害量を現わすグラフである。Ａ：配列番号３５、４２、５９、６０２、６０３、６０４番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの０．０４、０．２または１ｎＭ処理によるＣＴＧＦ発現量グラフ、Ｂ：配列番号１２４、１５３、１６６、１８７、１９７番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの０．５、１または５ｎＭ処理によるＣｙｒ６１発現量グラフ、Ｃ：配列番号２１２、２１８、２２１または２２３番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの０．５、１または５ｎＭ処理によるＰｌｅｋｈｏ１発現量グラフ。
【図５】本発明に係る配列番号４２、５９、６０２番に係る配列をセンス鎖として持つＳＡＭｉＲＮＡでヒト肺癌細胞株を形質転換させた後、確認されたターゲット遺伝子発現阻害量を示すグラフ。
【図６】本発明の配列番号３０１〜３３０、４０１〜４３０、５０１〜５３０番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡでマウス線維芽細胞の細胞株を形質転換させた後、確認されたターゲット遺伝子発現阻害量グラフである。Ａ：配列番号３０１〜３３０番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの２０ｎＭ処理によるＣＴＧＦ発現量グラフ、Ｂ：配列番号４０１番〜４３０番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの２０ｎＭ処理によるＣｙｒ６１発現量グラフ、Ｃ：配列番号５０１〜５３０番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの２０ｎＭ処理によるＰｌｅｋｈｏ１発現量グラフ。
【図７】本発明の配列番号４０４〜４０６、４０８〜４１０、４１４〜４１８、４２０〜４２２、４２４、４２７、４２９、４３０、５０３〜５０９、５１４〜５１７、５１９、５２１〜５２６または５２８番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡでマウス線維芽細胞の細胞株を形質転換させた後、確認されたターゲット遺伝子発現阻害量グラフでありる。Ａ：配列番号４０４〜４０６、４０８〜４１０、４１４〜４１８、４２０〜４２２、４２４、４２７、４２９、４３０番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの５ｎＭ処理によるＣｙｒ６１発現量グラフ、Ｂ：配列番号５０３〜５０９、５１４〜５１７、５１９、５２１〜５２６または５２８番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの５ｎＭ処理によるＰｌｅｋｈｏ１発現量グラフ。
【図８】本発明の配列番号３０１、３０３、３０７、３２３、４１０、４２２、４２４、５０７、５１５または５２５番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡでマウス線維芽細胞の細胞株を形質転換させた後、確認されたターゲット遺伝子発現阻害量グラフである。Ａ：配列番号３０１、３０３、３０７または３２３番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの０．２、１、５ｎＭ処理によるＣＴＧＦ発現量グラフ、Ｂ：配列番号４１０、４２２または４２４番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの０．２、１、５ｎＭ処理によるＣｙｒ６１発現量グラフ、Ｃ：配列番号５０７、５１５または、５２５番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの０．２、１、５ｎＭ処理によるＰｌｅｋｈｏ１発現量グラフ。
【図９】本発明の配列番号４、５、６、８、９、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１０９、２０２、２０４、２０６〜２０９、３０７、４２４または５２５番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡでマウス線維芽細胞の細胞株を形質転換させた後、確認されたターゲット遺伝子発現阻害量グラフである。Ａ：配列番号４、５、６、８、９または３０７番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの５ｎＭ処理によるＣＴＧＦ発現量グラフ、Ｂ：配列番号１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１０９または、４２４番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの５ｎＭ処理によるＣｙｒ６１発現量グラフ、Ｃ：配列番号２０２、２０４、２０６〜２０９または５２５番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの５ｎＭ処理によるＰｌｅｋｈｏ１発現量グラフ。
【図１０】本発明の配列番号６、８、１０２、１０４、１０５、２０４、２０７、２０８、３０７、４２４または５２５番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡでマウス線維芽細胞の細胞株を形質転換させた後、確認されたターゲット遺伝子発現阻害量グラフである。Ａ：配列番号６、８または、３０７番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの５または２０ｎＭ処理によるＣＴＧＦ発現量グラフ、Ｂ：配列番号１０２、１０４、１０５または４２４番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの５または２０ｎＭ処理によるＣｙｒ６１発現量グラフ、Ｃ：配列番号２０４、２０７、２０８または５２５番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡの５または２０ｎＭ処理によるＰｌｅｋｈｏ１発現量グラフ。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１０４】
以下、添付された実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、このような実施例は本発明の技術的思想の内容と範囲を簡単に説明するための例示するものであって、これによって本発明の技術的範囲が限定されたり変更されるのではない。また、このような例示に基づいて本発明の技術的思想の範囲の中で様々な変形と変更が可能であることは当業者には当然である。
【０１０５】
≪実施例１．ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１の目標塩基配列デザインおよびｓｉＲＮＡの製造≫
ＣＴＧＦ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）遺伝子のｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿００１９０１）、Ｃｙｒ６１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）遺伝子のｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿００１５５４）、Ｐｌｅｋｈｏ１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）遺伝子のｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿０１６２７４）、ＣＴＧＦ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）遺伝子のｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿０１０２１７）、Ｃｙｒ６１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）遺伝子のｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿０１０５１６）、またはＰｌｅｋｈｏ１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）遺伝子のｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿０２３３２０）に結合できる目標塩基配列（センス鎖）を６０４種をデザインして、前記目標塩基配列の相補的配列であるアンチセンス鎖のｓｉＲＮＡを製造した。
【０１０６】
まず、バイオニア（株）で開発された遺伝子デザインプログラム（Ｔｕｒｂｏ  ｓｉ−Ｄｅｓｉｇｎｅｒ）を使用して、該当遺伝子のｍＲＮＡ配列でｓｉＲＮＡが結合できる目標塩基配列をデザインした。本発明に係る呼吸器疾患関連遺伝子に対するｓｉＲＮＡは、１９個のヌクレオチドで構成されたセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖で構成された二本鎖構造である。また、ある遺伝子の発現を阻害しない配列のｓｉＲＮＡであるｓｉＣＯＮＴ（配列番号６０１をセンス鎖として持つ）を製造した（表４）。前記ｓｉＲＮＡは、β−シアノエチルホスホロアミダイト（β−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）を利用してＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結して製造した（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：４５３９−４５５７，１９８４）。具体的に、ＲＮＡ合成機（３８４  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ，ＢＩＯＮＥＥＲ，ＫＯＲＥＡ）を使用して、ヌクレオチドが付着された固形支持体上で、遮断除去（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）、結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）、酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）およびキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）からなる一連の過程を繰り返して望む長さのＲＮＡを含む反応物を収得した。前記反応物をＤａｉｓｏｇｅｌ  Ｃ１８（Ｄａｉｓｏ，Ｊａｐａｎ）カラムが取り付けられたＨＰＬＣ  ＬＣ９１８（Ｊａｐａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｊａｐａｎ）でＲＮＡを分離および精製して、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｊａｐａｎ）を利用して目標塩基配列と合致するか否かを確認した。以後、センスとアンチセンスＲＮＡ鎖を結合させて、目的する二本鎖ｓｉＲＮＡ（配列番号１〜６０４）を製造した。
【０１０７】
≪実施例２．二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（ＰＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ）の製造≫
本発明で製造した二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（ＰＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ）は、下記の構造式１６のような構造を持つ。
【化５】
2020062023.tif 000008
【０１０８】
前記構造式１６で、ＳはｓｉＲＮＡのセンス鎖；ＡＳはｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖；ＰＥＧは親水性物質でポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）；Ｃ２４は疎水性物質でジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）が含まれたテトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ）；５’および３’は二重らせんオリゴＲＮＡセンス鎖末端の方向性を意味する。
【０１０９】
前記構造式１６でのｓｉＲＮＡのセンス鎖は、大韓民国公開特許公報第２０１２−０１１９２１２号の実施例１に記載された方法により製造された３’ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ、Ｍｎ＝２，０００）−ＣＰＧを支持体として先述した方式のとおりβ−シアノエチルホスホロアミダイトを利用してＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結していく方法により３’末端部位にポリエチレングリコールが結合されたセンス鎖の二重らせんオリゴＲＮＡ−親水性物質構造体を合成した後、ジスルフィド結合が含まれているテトラドコサンを５’末端に結合して望むＲＮＡ−高分子構造体のセンス鎖を製造した。前記鎖とアニーリングを行うアンチセンス鎖の場合、先述した反応を介してセンス鎖と相補的な配列のアンチセンス鎖を製造した。
【０１１０】
合成が完了すると、６０℃の温湯器（ｗａｔｅｒ  ｂａｔｈ）で２８％（ｖ／ｖ）アンモニア（ａｍｍｏｎｉａ）を処理して合成されたＲＮＡ一本鎖とＲＮＡ高分子構造体をＣＰＧから引き離した後、脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）反応を介して保護残基を除去した。保護残基が除去されたＲＮＡ一本鎖およびＲＮＡ−高分子構造体は、７０℃のオーブンでＮ−メチルピロリドン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎ）、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）およびトリエチルアミントリハイドロフルオリド（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｔｒｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｄｅ）を体積比１０：３：４の割合で処理して２’ＴＢＤＭＳ（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）を除去した。
【０１１１】
前記反応物をＤａｉｓｏｇｅｌ  Ｃ１８（Ｄａｉｓｏ，Ｊａｐａｎ）カラムが取り付けられたＨＰＬＣ  ＬＣ９１８（Ｊａｐａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｊａｐａｎ）でＲＮＡを分離および精製して、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｊａｐａｎ）を利用して目標塩基配列と合致するか否かを確認した。以後、それぞれの二重らせんオリゴＲＮＡ高分子構造体を製造するために、センス鎖とアンチセンス鎖を同量混合して１Ｘアニーリングバッファー（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭカリウムアセテート（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、２ｍＭマグネシウムアセテート（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、ｐＨ７．０〜７．５）に入れて、９０℃恒温水槽で３分反応させた後、再び３７℃で反応させて、配列番号４２、５９、６０２、１２４、１５３、１８７、１９７、２１２、２１８、２２１、２２３、３２３、４２４、５２５または６０１番の配列をセンス鎖として含ｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（以下、それぞＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−ｈＣＴＧＦ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−ｈＣｙｒ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−ｈＰｌｅｋ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−ｍＣＴＧＦ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−ｍＣｙｒ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−ｍＰｌｅｋ、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ−ＣＯＮＴという。）をそれぞれ製造した。製造された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、電気泳動を介してアニーリングされたことを確認した。
【０１１２】
≪実施例３．改善された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ）の製造≫
本発明で製造した改善された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は、親水性物質をＰＥＧの代わりに親水性物質ブロックである［ＰＯ３−−ヘキサエチレングリコール］４（以下、‘Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ’という、構造式１７参照）を使用したもので、下記の構造式１７のような構造を持つ。
【０１１３】
【化６】
2020062023.tif 000009
前記構造式１７で、ＳはＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡのセンス鎖；ＡＳはＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１またはＰｌｅｋｈｏ１特異的ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖；［Ｈｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ］４は親水性物質単量体；Ｃ２４は疎水性物質でジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）が含まれたテトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ）；５’および３’は二重らせんオリゴＲＮＡ内のセンス鎖末端の方向性を意味する。
前記構造式１７によるＭｏｎｏ−ＨＥＧ  ＳＡＭｉＲＮＡの構造は、下記の構造式１８のように表すことができる。
【０１１４】
【化７】
2020062023.tif 000010
【０１１５】
前記反応物をＤａｉｓｏｇｅｌ  Ｃ１８（Ｄａｉｓｏ，Ｊａｐａｎ）カラムが取り付けられたＨＰＬＣ  ＬＣ９１８（Ｊａｐａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｊａｐａｎ）でＲＮＡを分離および精製して、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｊａｐａｎ）を利用して目標塩基配列と合致するか否かを確認した。以後、それぞれの二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を製造するために、センス鎖とアンチセンス鎖を同量混合して１Ｘアニーリングバッファー（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭカリウムアセテート（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、２ｍＭマグネシウムアセテート（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、ｐＨ７．０〜７．５）に入れて、９０℃恒温水槽で３分反応させた後、再び３７℃で反応させて、配列番号４２、５９、６０２、１２４、１５３、１８７、１９７、２１２、２１８、２２１、２２３、３２３、４２４、５２５または６０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（以下、それぞれ  Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ｈＣＴＧＦ、Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ｈＣｙｒ、Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ｈＰｌｅｋ、Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ｍＣＴＧＦ、Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ｍＣｙｒ、Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ｍＰｌｅｋ  Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ＣＯＮＴという。）をそれぞれ製造した。製造された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体は電気泳動を介してアニーリングされたことを確認した。
【０１１６】
≪実施例４．改善された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ）からなるナノ粒子の製造および大きさ測定≫
前記実施例３で製造された二重らせんオリゴＲＮＡ構造体（Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ）は、二重らせんオリゴＲＮＡの末端に結合された疎水性物質の間の疎水性相互作用によってナノ粒子、すなわちミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）を形成するようになる（図１）。
【０１１７】
Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ｈＣＴＧＦ、Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ｈＣｙｒ、Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ｈＰｌｅｋ、Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ｍＣＴＧＦ、Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ｍＣｙｒ、Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ｍＰｌｅｋ、Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ＣＯＮＴからなるナノ粒子の大きさＰＤＩ（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）分析を介して該当Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡで構成されたナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）の形成を確認した。
【０１１８】
実施例４−１．ナノ粒子の製造
前記Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ｈＣＴＧＦを１．５ｍＬ  ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）に５０μｇ／ｍＬの濃度で溶解した後、−７５℃、５ｍＴｏｒｒ条件で４８時間凍結乾燥を介してナノ粒子パウダーを製造した後、溶媒であるＤＰＢＳに溶解して均質化されたナノ粒子を製造した。Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ｈＣｙｒ、Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ｈＰｌｅｋ、Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ｍＣＴＧＦ、Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ｍＣｙｒ、Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ｍＰｌｅｋ、Ｍｏｎｏ−ＨＥＧ−ＳＡＭｉＲＮＡ−ＣＯＮＴからなるナノ粒子も同様の方法で製造した。
【０１１９】
実施例４−２．ナノ粒子の大きさおよび多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ，ＰＤＩ）測定
ゼータ電位測定機（ｚｅｔａ−ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）を介して前記ナノ粒子の大きさを測定した。
【０１２０】
実施例４−１で製造された均質化されたナノ粒子は、ゼータ電位測定機（Ｎａｎｏ−ＺＳ、ＭＡＬＶＥＲＮ、英国）で大きさを測定したが、物質に対する屈折率（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）は１．４５９、吸収率（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）は０．００１にして、溶媒であるＤＰＢＳの温度２５℃およびそれに応じた粘度（ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）は１．０２００および屈折率は１．３３５の値を入力して測定した。１回の測定は１５回繰り返しで構成された大きさ測定からなり、これを６回繰り返した。ＰＤＩ値が低いほど該当粒子が均等に分布していることを示す数値で、本発明のナノ粒子は非常に均一な大きさで形成されることが分かった。
【０１２１】
≪実施例５．ヒト線維芽細胞（ＭＲＣ−５）の細胞株でヒトに対するターゲット遺伝子特異的ｓｉＲＮＡを利用したターゲット遺伝子の発現抑制確認≫
前記実施例１で製造された配列番号１番〜１０番、１０１番〜１１０番、２０１番〜２１０番および６０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを利用して繊維細胞株であるヒト線維芽細胞（ＭＲＣ−５）を形質転換させて、前記形質転換された線維芽細胞（ＭＲＣ−５）の細胞株で目標遺伝子の発現様子を分析した。
【０１２２】
実施例５−１．ヒト線維芽細胞の細胞株の培養
韓国細胞株銀行（ＫＣＬＢ、Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｂａｎｋ，Ｋｏｒｅａ）から入手したヒト線維芽細胞（ＭＲＣ−５）の細胞株をＲＰＭＩ−１６４０培養培地（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ）で３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１２３】
実施例５−２．ヒト線維芽細胞の細胞株への目標ｓｉＲＮＡの形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
前記実施例５−１で培養された１．８×１０５線維芽細胞（ＭＲＣ−５）の細胞株を３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で６−ｗｅｌｌプレートで１８時間ＲＰＭＩ１６４０で培養した後、培地を除去した後、各ｗｅｌｌ当たり５００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ，ＵＳＡ）を分株した。
【０１２４】
一方、リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）３．５μＬとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２４６．５μＬを混合して混合液を製造して、室温で５分間反応させた後、前記実施例１で製造したそれぞれの配列番号１〜１０、１０１〜１０、２０１〜２１０および６０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ（１ｐｍｏｌｅ／μＬ）の５または２０μＬをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２３０μＬに添加して最終濃度が５または２０ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。前記リポフェクタミンＲＮＡｉマックス混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で１５分間反応させて、形質注入用溶液を製造した。
【０１２５】
その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分株された腫瘍細胞株の各ｗｅｌｌに形質注入用溶液をそれぞれ５００μＬずつ分株して６時間培養した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を除去した。そこにＲＰＭＩ１６４０培養培地１ｍＬずつ分株した後２４時間３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１２６】
実施例５−３．ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの定量分析
前記実施例５−２で形質注入された細胞株から全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を利用してターゲット遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。
【０１２７】
実施例５−３−１．形質注入された細胞からＲＮＡ分離およびｃＤＮＡ製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ  Ｃｅｌｌ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，ＢＩＯＮＥＥＲ，Ｋｏｒｅａ）を利用して、前記実施例５−２で形質注入された細胞株から全ＲＮＡを抽出して、抽出されたＲＮＡはＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０，Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）を利用して、下記の方法でｃＤＮＡを製造した。具体的に、０．２５ｍＬエッペンドルフチューブに入っているＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）でチューブ当たり抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れて総体積が２０μＬになるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸溜水を添加した。これを遺伝子増幅器（ＭｙＧｅｎｉｅＴＭ  ９６  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ，ＢＩＯＮＥＥＲ，Ｋｏｒｅａ）で３０℃で１分間ＲＮＡとプライマーを混成化して、５２℃で４分間ｃＤＮＡを製造する二つの過程を６回繰り返した後、９０℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
【０１２８】
実施例５−３−２．ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの相対定量分析
前記実施例５−３−１で製造されたｃＤＮＡを鋳型にしてリアルタイムＰＣＲを介して呼吸器疾患関連遺伝子ｍＲＮＡの相対量を下記の方法で定量した。９６−ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに前記実施例５−３−１で製造されたｃＤＮＡを蒸溜水で５倍希釈して、ターゲット遺伝子ｍＲＮＡ発現量分析のために希釈されたｃＤＮＡ  ３μＬと２×ＧｒｅｅｎＳｔａｒＴＭ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ，Ｋｏｒｅａ）を２５μＬ、蒸溜水１９μＬ、ｑＰＣＲプライマー（表２；Ｆ、Ｒそれぞれ１０ｐｍｏｌｅ／μＬ；ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）を３μＬ入れて混合液を作った。一方、ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ、以下ＨＫ遺伝子）のＲＰＬ１３Ａ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ１３ａ）を標準遺伝子とした。前記混合液が入った９６−ｗｅｌｌプレートをＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ，Ｋｏｒｅａ）を利用して下記のような反応を行った：９５℃で１５分間反応して酵素の活性化およびｃＤＮＡの二次構造をなくした後、９４℃で３０秒変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃で３０秒アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｓｃａｎ）の四つの過程を４２回繰り返し行って、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持して、５５℃から９５℃まで融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）を分析した。ＰＣＲが終了した後、それぞれ収得したターゲット遺伝子のＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）値は、ＧＡＰＤＨ遺伝子を介して補正されたターゲット遺伝子のＣｔ値を求めた後、遺伝子発現阻害を起こさないコントロール配列のｓｉＲＮＡ（配列番号６０１番、ｓｉＣＯＮＴ）が処理された実験群を対照群としてΔＣｔ値の差を求めた。
【０１２９】
前記ΔＣｔ値と計算式２（−ΔＣｔ）×１００を利用してＣＴＧＦ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号１番〜１０番の配列をセンス鎖として持つ）が処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を相対定量した（図２のＡ）。また、Ｃｙｒ６１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号１０１番〜１１０番の配列をセンス鎖として持つ）が処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を相対定量し（図２のＢ）、Ｐｌｅｋｈｏ１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号２０１番〜２１０番の配列をセンス鎖として持つ）が処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を相対定量した（図２のＣ）。
【０１３０】
その結果、本発明のいくつかの種のｓｉＲＮＡは高い目標遺伝子発現阻害を示すことを確認することができた。また、高効率のｓｉＲＮＡを選別するために、５ｎＭ濃度で各遺伝子に対するｍＲＮＡ発現量が高く減少された配列番号１、３、４、８、９、１０、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、２０４、２０６、２０７、２０８、２０９および２１０番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを選択した。
【０１３１】
【表２】
2020062023.tif 000011
【０１３２】
≪実施例６．ヒト線維芽細胞（ＭＲＣ−５）の細胞株で高効率のヒトに対するターゲット遺伝子特異的ｓｉＲＮＡ選定≫
前記実施例５−３−２で選定された配列番号１、３、４、８、９、１０、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、２０４、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０および６０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを利用してヒト線維芽細胞（ＭＲＣ−５）を形質転換させて、前記形質転換された線維芽細胞（ＭＲＣ−５）の細胞株でターゲット遺伝子の発現様子を分析して高効率のｓｉＲＮＡを選定した。
【０１３３】
実施例６−１．ヒト線維芽細胞の細胞株の培養
韓国細胞株銀行（ＫＣＬＢ、Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｂａｎｋ，Ｋｏｒｅａ）から入手したヒト線維芽細胞（ＭＲＣ−５）の細胞株は実施例５−１と同じ条件で培養した。
実施例６−２．ヒト線維芽細胞の細胞株への目標ｓｉＲＮＡの形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
前記実施例６−１で培養された１．８×１０５線維芽細胞（ＭＲＣ−５）の細胞株を３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で６−ｗｅｌｌプレートで１８時間ＲＰＭＩ１６４０で培養した後、培地を除去した後、各ｗｅｌｌ当たり５００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ，ＵＳＡ）を分株した。
【０１３４】
一方、リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）３．５μＬとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２４６．５μＬを混合して混合液を製造して、室温で５分間反応させた後、前記実施例１で製造したそれぞれの配列番号１、３、４、８、９、１０、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、２０４、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０および６０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ（１ｐｍｏｌｅ／μＬ）の０．２または１μＬをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２３０μＬに添加して最終濃度が０．２または１ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。前記リポフェクタミンＲＮＡｉマックス混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で１５分間反応させて、形質注入用溶液を製造した。
【０１３５】
その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分株された腫瘍細胞株の各ｗｅｌｌに形質注入用溶液をそれぞれ５００μＬずつ分株して６時間培養した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を除去した。そこにＲＰＭＩ１６４０培養培地１ｍＬずつ分株した後２４時間３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１３６】
実施例６−３．ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの定量分析
前記実施例６−２で形質注入された細胞株から前記実施例４−３と同じ方法で全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を利用してターゲット遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。ｓｉＲＮＡの低濃度処理によるターゲット遺伝子発現阻害量観察により各ｓｉＲＮＡの効能を明確に確認することができて、８、１０７および２０６番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡは非常に低い濃度でも比較的高いターゲット遺伝子発現阻害を示すことを確認した（図３）。
【０１３７】
≪実施例７．ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）でヒトに対するターゲット遺伝子特異的ｓｉＲＮＡを利用したターゲット遺伝子の発現抑制確認≫
前記実施例１で製造された配列番号３５、４２、５９、６０２、６０３、６０４、１２４、１５３、１６６、１８７、１９７、２１２、２１８、２２１、２２３および６０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを利用して肺腫瘍細胞株であるヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）を形質転換させて、前記形質転換された肺癌細胞（Ａ５４９）の細胞株で目標遺伝子の発現様子を分析した。
【０１３８】
実施例７−１．ヒト肺癌細胞の細胞株の培養
米国種菌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）から入手したヒト肺癌細胞（Ａ５４９）の細胞株は、ＤＭＥＭ培養培地（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ）で３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１３９】
実施例７−２．ヒト肺癌細胞の細胞株への目標ｓｉＲＮＡの形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
前記実施例７−１で１．２×１０５肺癌細胞（Ａ５４９）の細胞株を３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で６−ｗｅｌｌプレートで１８時間ＤＭＥＭで培養した後、培地を除去した後、各ウェル（ｗｅｌｌ）当たり５００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ，ＵＳＡ）を分株した。
【０１４０】
一方、リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）３．５μＬとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２４６．５μＬを混合して混合液を製造して、室温で５分間反応させた後、前記実施例１で製造したそれぞれの配列番号３５、４２、５９、６０２、６０３、６０４、１２４、１５３、１６６、１８７、１９７、２１２、２１８、２２１および２２３番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ（１ｐｍｏｌｅ／μＬ）の１μＬをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２３０μＬに添加して最終濃度が５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．２ｎＭおよび０．０４ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。前記リポフェクタミンＲＮＡｉマックス混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で１５分間反応させて、形質注入用溶液を製造した。
【０１４１】
その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分株された腫瘍細胞株の各ウェル（ｗｅｌｌ）に形質注入用溶液をそれぞれ５００μＬずつ６時間培養した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を除去した。そこにＲＰＭＩ１６４０培養培地１ｍＬを分株した後２４時間３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１４２】
実施例７−３．ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの定量分析
前記実施例７−２で形質注入された細胞株から全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を利用してターゲット遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。
【０１４３】
実施例７−３−１．形質注入された細胞からＲＮＡ分離およびｃＤＮＡ製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ  Ｃｅｌｌ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，ＢＩＯＮＥＥＲ，Ｋｏｒｅａ）を利用して、前記実施例５−２で形質注入された細胞株から全ＲＮＡを抽出して、抽出されたＲＮＡは、ＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０，Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）を利用して、下記の方法でｃＤＮＡを製造した。具体的に、０．２５ｍＬエッペンドルフチューブに入っているＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）に一チューブ当たり抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れて総体積が２０μＬになるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸溜水を添加した。これを遺伝子増幅器（ＭｙＧｅｎｉｅＴＭ  ９６  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ，ＢＩＯＮＥＥＲ，Ｋｏｒｅａ）で３０℃で１分間ＲＮＡとプライマーを混成化して、５２℃で４分間ｃＤＮＡを製造する二つの過程を６回繰り返した後、９０℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
【０１４４】
実施例７−３−２．ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの相対定量分析
前記実施例７−３−１で製造されたｃＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲを介して呼吸器疾患関連遺伝子ｍＲＮＡの相対量を下記の方法で定量した。９６−ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに前記実施例６−３−１で製造されたｃＤＮＡを蒸溜水で５倍希釈して、ターゲット遺伝子ｍＲＮＡ発現量分析のために希釈されたｃＤＮＡ  ３μＬと２×ＧｒｅｅｎＳｔａｒＴＭ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ，Ｋｏｒｅａ）を２５μＬ、蒸溜水１９μＬ、ｑＰＣＲプライマー（表２；Ｆ、Ｒそれぞれ１０ｐｍｏｌｅ／μＬ；ＢＩＯＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ）を３μＬ入れて混合液を作った。一方、ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの発現量を正規化するために、ハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ、以下ＨＫ遺伝子）のＲＰＬ１３Ａ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ１３ａ）を標準遺伝子とした。前記混合液が入った９６−ｗｅｌｌプレートをＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ，Ｋｏｒｅａ）を利用して下記のような反応を行った：９５℃で１５分間反応して酵素の活性化およびｃＤＮＡの二次構造をなくした後、９４℃で３０秒変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃で３０秒アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｓｃａｎ）の四つの過程を４２回繰り返し行って、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持して、５５℃から９５℃まで融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）を分析した。ＰＣＲが終了した後、それぞれ収得したターゲット遺伝子のＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）値は、ＧＡＰＤＨ遺伝子を介して補正されたターゲット遺伝子のＣｔ値を求めた後、遺伝子発現阻害を起こさないコントロール配列のｓｉＲＮＡ（配列番号６０１番、ｓｉＣＯＮＴ）が処理された実験群を対照群としてΔＣｔ値の差を求めた。
【０１４５】
前記ΔＣｔ値と計算式２（−ΔＣｔ）×１００を利用してＣＴＧＦ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号１３２、４２、５９、６０２、６０３、６０４番の配列をセンス鎖として持つ）が処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を相対定量した（図４のＡ）。また、Ｃｙｒ６１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号１２４、１５３、１６６、１８７、１９７番の配列をセンス鎖として持つ）が処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を相対定量し（図４のＢ）、Ｐｌｅｋｈｏ１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号２１２、２１８、２２１、２２３番の配列をセンス鎖として持つ）が処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を相対定量した（図４のＣ）。
【０１４６】
その結果、本発明のいくつかの種のｓｉＲＮＡは、高い目標遺伝子発現阻害を示すことを確認することができた。また、高効率のｓｉＲＮＡを選別するために５ｎＭ濃度で各遺伝子に対するｍＲＮＡ発現量が高く減少した配列番号４２、５９、６０２、１２４、１５３、１８７、１９７、２１２、２１８、２２１および２２３番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを選択した。
【０１４７】
≪実施例８．二重らせんオリゴ高分子構造体からなるナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）によるヒト肺癌細胞（Ａ５４９）の細胞株でターゲット遺伝子の発現阻害≫
前記実施例７−３−２で選定された配列番号４２、５９、６０２、１２４、１５３、１８７、１９７、２１２、２１８、２２１および２２３番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを含むＳＡＭｉＲＮＡ  ＬＰからなるナノ粒子を利用してヒト肺癌細胞（Ａ５４９）を形質転換させて、前記形質転換された肺癌細胞（Ａ５４９）の細胞株でターゲット遺伝子の発現様子を分析した。
【０１４８】
実施例８−１．ヒト肺癌細胞の細胞株の培養
米国種菌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）から入手したヒト肺癌細胞（Ａ５４９）の細胞株は実施例７−１と同じ条件で培養した。
【０１４９】
実施例８−２．ヒト肺癌細胞の細胞株への目標ＳＡＭｉＲＮＡの形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
前記実施例８−１で培養された１．２×１０５肺癌細胞（Ａ５４９）細胞株を３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で１２−ｗｅｌｌプレートで１８時間ＲＰＭＩ１６４０で培養した後、培地を除去した後、各ｗｅｌｌ当たり同量のＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ，ＵＳＡ）を分株した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地１００μＬと前記実施例４−２で製造したＳＡＭｉＲＮＡＬＰおよびｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡＬＰを５０μｇ／ｍＬの濃度でＤＰＢＳに添加して、実施例５−１と同じ方法で−７５℃、５ｍＴｏｒｒ条件で４８時間凍結乾燥して均一なナノ粒子を製造した。その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに分株された腫瘍細胞株の各ウェルに形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）用溶液を２００ｎＭの濃度で処理して、３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下に計４８時間培養した。
【０１５０】
実施例８−３．ターゲット遺伝子のｍＲＮＡの相対的定量分析
前記実施例８−２で形質注入された細胞株から前記実施例６−３と同じ方法で全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を利用してターゲット遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。ｓｉＲＮＡの低濃度処理によるターゲット遺伝子発現阻害量観察により各ｓｉＲＮＡの効能を明確に確認することができて、４２、５９および６０２番をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡは、非常に低い濃度でも比較的高いターゲット遺伝子発現阻害を示すことを確認した（図５）。
【０１５１】
≪実施例９．マウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の細胞株でマウスに対するターゲット遺伝子特異的ｓｉＲＮＡを利用したターゲット遺伝子の発現抑制確認≫
前記実施例１で製造された配列番号３０１〜３３０、４０１〜４３０、５０１〜５３０および６０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを利用して繊維細胞株であるマウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）を形質転換させて、前記形質転換された線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の細胞株で目標遺伝子の発現様子を分析した。
【０１５２】
実施例９−１．マウス線維芽細胞の細胞株の培養
米国種菌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）から入手したマウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の細胞株をＲＰＭＩ−１６４０培養培地（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ）で３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１５３】
実施例９−２．ヒト線維芽細胞の細胞株への目標ｓｉＲＮＡの形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
前記実施例９−１で培養された１×１０５線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の細胞株を３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で１２−ｗｅｌｌプレートで１８時間ＲＰＭＩ１６４０で培養した後、培地を除去した後、各ｗｅｌｌ当たり５００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ，ＵＳＡ）を分株した。
【０１５４】
一方、リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）１．５μＬとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２４８．５μＬを混合して混合液を製造して、室温で５分間反応させた後、前記実施例１で製造したそれぞれの配列番号３０１〜３３０、４０１〜４３０、５０１〜５３０および６０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ（１ｐｍｏｌｅ／μＬ）の５または２０μＬをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２３０μＬに添加して最終濃度が５または２０ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。前記リポフェクタミンＲＮＡｉマックス混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で２０分間反応させて、形質注入用溶液を製造した。
【０１５５】
その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分株された腫瘍細胞株の各ｗｅｌｌに形質注入用溶液をそれぞれ５００μＬずつ分株して６時間培養した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を除去した。そこにＲＰＭＩ１６４０培養培地１ｍＬずつ分株した後２４時間３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１５６】
実施例９−３．ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの定量分析
前記実施例９−２で形質注入された細胞株から前記実施例５−３と同じ方法で全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を利用してターゲット遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。
【０１５７】
ＣＴＧＦ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号３０１番〜３３０番の配列をセンス鎖として持つ）が処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を相対定量した（図６のＡ）。また、Ｃｙｒ６１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号４０１番〜４３０番の配列をセンス鎖として持つ）が処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を相対定量して（図６のＢ）、Ｐｌｅｋｈｏ１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号５０１番〜５３０番の配列をセンス鎖として持つ）が処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を相対定量した（図６のＣ）。
【０１５８】
その結果、本発明のいくつかの種のｓｉＲＮＡは、高い目標遺伝子発現阻害を示すことを確認することができた。また、高効率のｓｉＲＮＡを選別するために２０ｎＭ濃度でＣＴＧＦ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）に対するｍＲＮＡ発現量が高く減少した配列番号３０１、３０２、３０３、３０５、３０６、３０７、３０９、３１７、３２３または３２９番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを選択して、Ｃｙｒ６１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）に対するｍＲＮＡ発現量が高く減少した配列番号４０９、４１０、４１５、４１７、４１８、４２０、４２２、４２４、４２７また、４２９番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを選択して、Ｐｌｅｋｈｏ１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）に対するｍＲＮＡ発現量が高く減少した配列番号５０４、５０５、５０６、５０７、５１４、５１５、５２２、５２３、５２４または５２５番の配列をセンス鎖として含むｓｉＲＮＡを選択した。
【０１５９】
また、さらに好ましい効率を持つｓｉＲＮＡを選別するために、５ｎＭ濃度でＣＴＧＦ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）に対するｍＲＮＡ発現量が高く減少した配列番号３０１、３０３、３０７または３２３番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを選択して、Ｃｙｒ６１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）に対するｍＲＮＡ発現量が高く減少した配列番号４１０、４２２または４２４番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを選択して、Ｐｌｅｋｈｏ１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）に対するｍＲＮＡ発現量が高く減少した配列番号５０７、５１５または５２５番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを選択した（図７）。
【０１６０】
≪実施例１０．マウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）細胞株で高効率のマウスに対するターゲット遺伝子特異的ｓｉＲＮＡ選定≫
前記実施例９−３で選定された配列番号３０１、３０３、３０７、３２３、４１０、４２２、４２４、５０７、５１５、５２５および６０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡを利用してマウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）細胞株でターゲット遺伝子の発現様子を分析して高効率のｓｉＲＮＡを選定した。
【０１６１】
実施例１０−１．マウス線維芽細胞の細胞株の培養
米国種菌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）から入手したマウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の細胞株は、前記実施例９−１と同じ条件で培養した。
【０１６２】
実施例１０−２．ヒト線維芽細胞の細胞株への目標ｓｉＲＮＡの形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
前記実施例１０−１で培養された１×１０５線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の細胞株を３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で１２−ｗｅｌｌプレートで１８時間ＲＰＭＩ１６４０で培養した後、培地を除去した後、各ｗｅｌｌ当たり５００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ，ＵＳＡ）を分株した。
【０１６３】
一方、リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）１．５μＬとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２４８．５μＬを混合して混合液を製造して、室温で５分間反応させた後、前記実施例１で製造したそれぞれの配列番号３０１、３０３、３０７、３２３、４１０、４２２、４２４、５０７、５１５、５２５および６０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ（１ｐｍｏｌｅ／μＬ）の０．２、１または５μＬをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２３０μＬに添加して最終濃度が０．２、１または５ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。前記リポフェクタミンＲＮＡｉマックス混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で２０分間反応させて、形質注入用溶液を製造した。
【０１６４】
その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分株された腫瘍細胞株の各ｗｅｌｌに形質注入用溶液をそれぞれ５００μＬずつ分株して６時間培養した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を除去した。そこにＲＰＭＩ１６４０培養培地１ｍＬずつ分株した後２４時間３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１６５】
実施例１０−３．ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの定量分析
前記実施例１０−２で形質注入された細胞株から前記実施例５−３と同じ方法で全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を利用してターゲット遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。
【０１６６】
ＣＴＧＦ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号３０１、３０３、３０７、３２３番の配列をセンス鎖として持つ）が処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を相対定量した（図８のＡ）。また、Ｃｙｒ６１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号４１０、４２２、４２４番の配列をセンス鎖として持つ）が処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を相対定量して（図８のＢ）、Ｐｌｅｋｈｏ１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号５０７、５１５、５２５番の配列をセンス鎖として持つ）が処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を相対定量した（図８のＣ）。
【０１６７】
その結果、各ターゲット遺伝子特異的なｓｉＲＮＡは濃度依存的にターゲット遺伝子の発現を阻害することが確認され、配列番号３０７、４２４および５２５番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡは非常に低い濃度でも比較的高い目標遺伝子発現阻害効果が維持されることが確認されて高効率のｓｉＲＮＡとして選定された。
【０１６８】
≪実施例１１．マウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の細胞株でヒトに対する目標遺伝子特異的ｓｉＲＮＡを利用したターゲット遺伝子の発現抑制確認≫
バイオ新薬の作用部位が主にタンパク質構造や遺伝子配列のように種（ｓｐｅｃｉｅｓ）特異的であるため、バイオ新薬開発過程で効率性確保のためには治療薬物の同一性が大変重要である。前記実施例１で設計されたヒトに対するターゲット遺伝子特異的なｓｉＲＮＡとマウスターゲット遺伝子との間の遺伝子配列相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を分析して、マウス線維芽細胞でターゲット遺伝子発現阻害効果を確認するｓｉＲＮＡ配列を選定した。
【０１６９】
選定されたｓｉＲＮＡ配列は、前記実施例１で製造されたヒトに対する目標遺伝子特異的なｓｉＲＮＡである配列番号４、５、６、８、９、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１０９、２０２、２０４、２０６、２０７、２０８および２０９番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ、マウスに対する目標遺伝子特異的なｓｉＲＮＡである配列番号３０７、４２４および５２５の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡおよび対照群である６０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡで、これを利用して線維芽細胞株であるマウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の細胞株でターゲット遺伝子の発現様子を分析して、ヒト遺伝子をベースに設計されたｓｉＲＮＡのマウス細胞で効能を確認した。
【０１７０】
実施例１１−１．マウス線維芽細胞の細胞株の培養
米国種菌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）から入手したマウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の細胞株は、前記実施例９−１と同じ条件で培養した。
【０１７１】
実施例１１−２．ヒト線維芽細胞の細胞株への目標ｓｉＲＮＡの形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
前記実施例１１−１で培養された１．８×１０５線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の細胞株を３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で６−ｗｅｌｌプレートで１８時間ＲＰＭＩ１６４０で培養した後、培地を除去した後、各ｗｅｌｌ当たり５００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ，ＵＳＡ）を分株した。
【０１７２】
一方、リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）３．５μＬとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２４６．５μＬを混合して混合液を製造して、室温で５分間反応させた後、前記実施例１で製造したそれぞれの配列番号４、５、６、８、９、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１０９、２０２、２０４、２０６、２０７、２０８、２０９、３０７、４２４、５２５および６０１番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡ（１ｐｍｏｌｅ／μＬ）の５または２０μＬをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２３０μＬに添加して最終濃度が５または２０ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。前記リポフェクタミンＲＮＡｉマックス混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で１５分間反応させて、形質注入用溶液を製造した。
【０１７３】
その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分株された腫瘍細胞株の各ｗｅｌｌに形質注入用溶液をそれぞれ５００μＬずつ分株して６時間培養した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を除去した。そこにＲＰＭＩ１６４０培養培地１ｍＬずつ分株した後２４時間３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１７４】
実施例１１−３．ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの定量分析
前記実施例１１−２で形質注入された細胞株から前記実施例５−３と同じ方法で全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を利用してターゲット遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。ＣＴＧＦ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号３０７番）またはＣＴＧＦ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号４、５、６、８または９番）が処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を相対定量した（図９のＡ）。また、Ｃｙｒ６１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号４２４番の配列をセンス鎖として持つ）またはＣｙｒ６１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号１０２、１０４、１０５、１０７、１０８または１０９番の配列をセンス鎖として持つ）が処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を相対定量して（図９のＢ）、Ｐｌｅｋｈｏ１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号５２５番の配列をセンス鎖として持つ）またはＰｌｅｋｈｏ１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号２０２、２０４、２０６、２０７、２０８または２０９の配列をセンス鎖として持つ）が処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を相対定量した（図９のＣ）。
【０１７５】
その結果、各ヒトに対するターゲット遺伝子特異的なｓｉＲＮＡは配列相同性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）によりターゲット遺伝子の発現を阻害することが確認されて、配列番号６、８、１０２、１０４、１０５、２０４、２０７および２０８番の配列をセンス鎖として持つｓｉＲＮＡは、２０ｎＭで比較的高い目標遺伝子発現阻害を示し、この中でも６、１０２および２０７番ｓｉＲＮＡは、マウス細胞株でもＩＣ５０（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ５０％）が２０ｎＭ未満と確認されて、低い濃度でも比較的高い目標遺伝子発現阻害効果が維持されて高効率のｓｉＲＮＡであることが確認された（図１０）。
【図１】
2020062023.tif 000015
【図２】
2020062023.tif 000016
【図３】
2020062023.tif 000017
【図４】
2020062023.tif 000018
【図５】
2020062023.tif 000019
【図６】
2020062023.tif 000020
【図７】
2020062023.tif 000021
【図８】
2020062023.tif 000022
【図９】
2020062023.tif 000023
【図１０】
2020062023.tif 000024
【配列表】
2020062023000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月27日(2019.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造式１の構造を持つ二重らせんオリゴＲＮＡ構造体：
Ａ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ    （構造式１）
（前記構造式１で、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、ＸおよびＹはそれぞれ独立して単純共有結合またはリンカー媒介された共有結合を意味して、ＲはＣｙｒ６１特異的ｓｉＲＮＡを意味し、
前記親水性物質は、下記の構造式５または構造式６の構造を有し：
（Ａ’ｍ−Ｊ）ｎ    （構造式５）
（Ｊ−Ａ’ｍ）ｎ    （構造式６）
前記構造式５および構造式６で、Ａ’は、親水性物質単量体であり、Ｊはｍ個の親水性物質単量体の間を連結するリンカー又はｍ個の親水性物質単量体とｓｉＲＮＡとを連結するリンカーであり、ｍは１〜１５の整数、ｎは１〜１０の整数であり、親水性物質単量体Ａ’は下記の化合物（１）の化合物であり、
2020062023.tif 000025
前記リンカー（Ｊ）は、ＰＯ３−、ＳＯ３およびＣＯ２からなる群から選択される）。
【請求項２】
下記の構造式２の構造を持つ請求項１に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体：
【化１】
2020062023.tif 000026
（前記構造式２で、Ｓは、請求項１に記載のｓｉＲＮＡのセンス鎖、ＡＳは、請求項１に記載のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を意味して、Ａ、Ｂ、ＸおよびＹは、請求項１に記載の構造式１での定義と同様である）。
【請求項３】
下記の構造式３または構造式４の構造を持つ請求項２に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体：
【化２】
2020062023.tif 000027
（前記構造式３および構造式４で、Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｙ、ＳおよびＡＳは、請求項２に記載の構造式２での定義と同様であり、５’および３’は、ｓｉＲＮＡセンス鎖の５’末端および３’末端を意味する）。
【請求項４】
前記Ｃｙｒ６１特異的ｓｉＲＮＡは、配列番号１０１〜２００及び４０１〜５００からなる群から選択されるセンス鎖及びそれに相補的な配列を持つアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡである、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項５】
前記親水性物質の分子量は、２００〜１０，０００であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項６】
前記疎水性物質の分子量は、２５０〜１，０００であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項７】
前記疎水性物質は、ステロイド誘導体、グリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン、脂肪酸、リン脂質、及びリポポリアミンで構成された群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項８】
前記ステロイド誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルマート、コレスタニルホルマートおよびコレステリルアミンで構成された群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項９】
前記グリセリド誘導体は、モノ−、ジ−およびトリ−グリセリドから選択されることを特徴とする請求項７に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１０】
前記Ｘ又はＹで表される共有結合は、非分解性結合または分解性結合であることを特徴とする請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１１】
前記非分解性結合は、アミド結合またはリン酸化結合であることを特徴とする請求項１０に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１２】
前記分解性結合は、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンハイドライド結合、生分解性結合または酵素分解性結合であることを特徴とする請求項１０に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１３】
前記親水性物質に受容体媒介内包作用（ＲＭＥ）を介してターゲット細胞内在化を増進させる受容体と特異的に結合する特性を持つリガンドが追加的に結合されたことを特徴とする請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１４】
前記リガンドは、ターゲット受容体特異的抗体やアプタマー、ペプチド、葉酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＮＡＧ）、ブドウ糖及びマンノースで構成された群から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１５】
前記親水性物質のｓｉＲＮＡと結合された反対側末端部位にアミン基またはポリヒスチジン基が追加的に導入されたことを特徴とする請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１６】
前記アミン基またはポリヒスチジン基は、一つ以上のリンカーを介して親水性物質または親水性ブロックと連結されたことを特徴とする請求項１５に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１７】
前記アミン基は、第一級〜第三級アミン基中から選択されたことを特徴とする請求項１５に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１８】
前記ポリヒスチジン基は、３〜１０個のヒスチジンを含むことを特徴とする請求項１５に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１９】
請求項１から請求項１８のいずれか一項に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子。
【請求項２０】
互いに異なる配列を持つｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体が混合されて構成されることを特徴とする請求項１９に記載のナノ粒子。
【請求項２１】
請求項１から請求項１８のいずれか一項に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、または請求項１９または請求項２０に記載のナノ粒子を有効成分として含む薬学的組成物。
【請求項２２】
前記薬学的組成物は、呼吸器疾患を予防または治療するための薬学的組成物であることを特徴とする請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記呼吸器疾患は、喘息、特発性肺線維症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎭咳去痰、急性下気道感染症、気管支炎、細気管支炎、急性上気道感染症、咽喉炎、扁桃炎及び喉頭炎で構成された群から選択されることを特徴とする請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記呼吸器疾患は、特発性肺線維症または慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）であることを特徴とする請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
請求項２１から請求項２４のいずれかに記載の組成物を含む凍結乾燥された形態の製剤。
【請求項２６】
呼吸器疾患の予防または治療用医薬の製造における、請求項１から請求項２５のいずれか一項に記載の二重らせんオリゴＲＮＡ構造体、ナノ粒子、薬学的組成物または製剤の使用。
【請求項２７】
前記呼吸器疾患は、喘息、特発性肺線維症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎭咳去痰、急性下気道感染症、気管支炎、細気管支炎、急性上気道感染症、咽喉炎、扁桃炎及び喉頭炎で構成された群から選択されることを特徴とする請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記呼吸器疾患は、特発性肺線維症または慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）であることを特徴とする請求項２７に記載の使用。
【外国語明細書】
2020062023000001.pdf