(57)【要約】【課題】本発明は、膵島／β細胞系列方向への分化経路にそって中間細胞型を分離し特徴付けることや、分化における更なる段階に適した系列前駆物質などの細胞を使用することを課題とする。【解決手段】ヒト胚体内胚葉細胞及び１０ｎｇ／ｍｌ以上のアクチビンＡを含むインビトロ細胞培養物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト胚体内胚葉細胞及び１０ｎｇ／ｍｌ以上のアクチビンＡを含むインビトロ細胞培養物。
【請求項２】
前記ヒト胚体内胚葉細胞がヒト多能性細胞に由来する、請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項３】
ヒト多能性細胞をさらに含む、請求項１または２に記載の細胞培養物。
【請求項４】
前記多能性細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項２または３に記載の細胞培養物。
【請求項５】
血清を含む培地を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞培養物。
【請求項６】
前記培地が５％未満の血清を含む、請求項５に記載の細胞培養物。
【請求項７】
ノーダル、アクチビンＢ、ＷＮＴ３αおよびその組み合わせからなる群より選択される増殖因子をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養物。
【請求項８】
前記ヒト多能性幹細胞の少なくとも１５％がヒト胚体内胚葉細胞に分化する、請求項３〜７のいずれか１項に記載の細胞培養物。
【請求項９】
胚体内胚葉細胞及び３０ｎｇ／ｍｌ以上のアクチビンＡを含むインビトロ細胞集団。
【請求項１０】
前記ヒト胚体内胚葉細胞がヒト多能性細胞に由来する、請求項９に記載の細胞集団。
【請求項１１】
多能性細胞をさらに含む、請求項９または１０に記載の細胞集団。
【請求項１２】
前記多能性細胞が胚性幹細胞である、請求項１０または１１に記載の細胞集団。
【請求項１３】
血清を含む培地をさらに含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項１４】
前記培地が５％未満の血清を含む、請求項１３に記載の細胞集団。
【請求項１５】
ノーダル、アクチビンＢ、ＷＮＴ３αまたはその組み合わせをさらに含む、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項１６】
前記ヒト多能性幹細胞の少なくとも９５％がヒト胚体内胚葉細胞に分化する、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の細胞培養物。
【請求項１７】
ヒト胚体内胚葉細胞をインビトロで作製する方法であって、
ヒト多能性幹細胞を含む細胞集団を得る工程、及び、
該細胞集団に１０ｎｇ／ｍｌ以上のアクチビンＡを供給して、該細胞集団においてヒト胚体内胚葉細胞を産生する工程、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記ヒト多能性幹細胞の少なくとも１５％がヒト胚体内胚葉細胞に分化する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞集団がノーダル、アクチビンＢ、ＷＮＴ３αまたはその組み合わせをさらに含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞集団に血清を供給する工程をさらに含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記血清を供給する工程は、漸増濃度の血清を供給する工程を含む、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００３年１２月２３日に出願された、名称「ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯ
ＤＥＲＭ（胚体内胚葉）」の米国仮特許出願第６０／５３２，００４号明細書に対する米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権と、２００４年７月９日に出願された、名称「ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ ＣＥＬＬ ＳＵＲＦＡＣＥ ＲＥＣＥＰＴＯＲ ＦＯＲ ＴＨＥ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ（胚体内胚葉分離用ケモカ
イン細胞表面受容体）」の米国仮特許出願第６０／５８６，５６６号明細書に対する米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権と、２００４年７月１４日に出願された、名称「ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ ＣＥＬＬ ＳＵＲＦＡＣＥ ＲＥＣＥＰＴＯＲ ＦＯＲ ＴＨＥ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ（胚体内胚葉分離用ケモカ
イン細胞表面受容体）」の米国仮特許出願第６０／５８７，９４２号明細書に対する米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権とを主張する正規特許出願である。上記優先権を伴う各出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００２】
本発明は、医学および細胞生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、哺乳類胚体内胚葉細胞を含む組成物と、そのような細胞の作製、分離および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
胚性幹（ＥＳ）細胞や胚性生殖（ＥＧ）細胞などのヒト多能性幹細胞は、まず１９９４年に、線維芽細胞フィーダーを使用しない培養（Ｂｏｎｇｏ ｅｔ ａｌ．、１９９４）、そして線維芽細胞フィーダーを使用した培養（Ｈｏｇａｎ、１９９７）において分離された。その後、Ｔｈｏｍｓｏｎ、ＲｅｕｂｉｎｏｆｆおよびＳｈａｍｂｌｏｔｔが、有糸分裂的に不活性化したマウスの支持細胞層を用いてヒトＥＳおよびＥＧ細胞の連続培養を確立した（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．、２０００；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．、１９９８；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９８）。
ヒトＥＳおよびＥＧ細胞（ｈＥＳＣ）は、ヒト発生の初期段階の研究、並びに糖尿病やパーキンソン病などのいくつかの病状における治療的介入に極めて貴重な機会を提供する。例えば、ｈＥＳＣに由来するインシュリン産生β細胞の使用により、ドナー膵臓からの細胞を利用する現在の細胞療法に多大な進歩をもたらす。しかしながら、現在、ｈＥＳＣからインシュリン産生β細胞を生成する方法は知られていない。そのため、ドナー膵臓の膵島細胞を利用する糖尿病用の細胞治療法は、移植に必要な良質の膵島細胞の不足により制限されている。一人のＩ型糖尿病患者に対する細胞療法では、約８×１０８個の膵島細胞の移植を必要とする。（Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００１ａ；Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００１ｂ）。よって、臓器移植を成功させるのに十分な膵島細胞を得るためには、少なくとも２つの健康なドナー臓器が必要である。ｈＥＳＣは、ヒト細胞療法用に相当な量の良質の分化細胞を発生させるための出発物質の源を提供する。
ｈＥＳＣが細胞療法の用途に非常に適している所以たる二つの特性は、多能性と、遺伝子変化が蓄積することなく、これらの細胞を培養物中において長期間維持する能力である。多能性は、３つの一次胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）全ての誘導体に分化し、引いては、胚体外組織（例えば、胎盤）および生殖細胞に加え、成熟した生物体の全体細胞型を形成する、ｈＥＳＣの能力により定義される。多能性は、ｈＥＳＣに並はずれた有用性を付与するが、この特性はまた、これらの細胞とその誘導体を研究および取り扱う上で、独自の難題をもたらす。多種多様な細胞型が、分化ｈＥＳＣ培養物中に発生し得ることから、非常に多くの細胞型が、非常に低い効率で作製される。さらに、特定の細胞型の作製を評価する上での成功は、適切なマーカーを明確にすることに大きく依存している。効率の良い、一定方向への分化を達成することは、ｈＥＳＣの治療への応用にとってかなり重要な
ことである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
細胞療法の用途において有用な細胞を生成する出発物質としてｈＥＳＣを使用するためには、上述の問題を克服することが有益である。例えば、膵島細胞移植治療に必要なレベルの細胞物質にするためには、分化のかなり初期段階で、膵島／β細胞系列の方向にｈＥＳＣを効率的に誘導することが有益である。
また、分化プロセスの効率的な誘導に加えて、膵島／β細胞系列方向への分化経路にそって中間細胞型を分離し特徴付けることや、分化における更なる段階に適した系列前駆物質などの細胞を使用することも有益である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のいくつかの実施形態は、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に関連するものである。前記胚体内胚葉細胞は、腸管または腸管に由来する器官の細胞に分化し得る多分化能細胞である。ある実施形態によると、胚体内胚葉細胞は、哺乳類細胞であり、好適な一実施形態においては、胚体内胚葉細胞はヒト細胞である。本発明のいくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、一定のマーカーを発現する場合もあれば、顕著には発現しない場合もある。いくつかの実施形態においては、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１、およびＣＲＩＰ１から選択される一以上のマーカーが、胚体内胚葉細胞において発現する。他の実施形態においては、ＯＣＴ４、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７から選択される一以上のマーカーは、胚体内胚葉細胞において顕著に発現することはない。
本発明の他の実施形態により、多能性細胞から胚体内胚葉を作製する方法を説明する。いくつかの実施形態において、多能性細胞は桑実胚に由来する。いくつかの実施形態においては、多能性幹細胞は、幹細胞である。これらの方法で使用される幹細胞としては、胚性幹細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。胚性幹細胞は、胚の内部細胞塊または胚の生殖隆起に由来し得る。胚性幹細胞は、これらに限定されはしないが、ヒトを含むさまざまな哺乳類種を始めとした、さまざまな動物種に由来し得る。好適な一実施形態においては、ヒト胚性幹細胞が、胚体内胚葉の作製に使用される。
本発明のいくつかの実施形態においては、一以上の増殖因子が、多能性細胞から胚体内胚葉細胞への分化プロセス（分化工程）で使用される。分化プロセスにおいて使用される前記一以上の増殖因子は、ＴＧＦβスーパーファミリーの増殖因子を含んでいてもよい。そのような実施形態において、前記一以上の増殖因子は、増殖因子のＴＧＦβスーパーファミリーのノーダル／アクチビンおよび／またはＢＭＰサブグループを含む。いくつかの実施形態において、前記一以上の増殖因子は、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａまたはこれら増殖因子のあらゆる組み合わせからなる群から選択される。
本発明の実施形態はまた、胚体内胚葉細胞で濃縮された細胞の集団に関する。ある実施形態において、胚体内胚葉細胞は、分離または実質的に精製される。いくつかの実施形態において、分離または実質的に精製された胚体内胚葉細胞は、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣおよび/またはＳＯＸ７マーカーより、ＳＯＸ１７および/またはＣＸＲＣ４マーカーを高度に発現する。
また、胚体内胚葉で細胞集団を濃縮する方法も検討されている。いくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞の表面には存在するが、混合細胞集団内の他の細胞の表面には存在しない分子に結合する試薬に細胞を接触させ、その試薬に結合した細胞を分離することにより、胚体内胚葉細胞を混合細胞集団から分離あるいは実質的に精製することができる。ある実施形態において、胚体内胚葉細胞の表面に存在する分子はＣＸＣＲ４である。
本発明のさらに別の実施形態は、ＣＸＣＲ４抗体、ＳＤＦ−１リガンドまたはＣＸＣＲ４
に対する他のリガンドに関するものであり、濃縮、分離または実質的に精製された形態で胚体内胚葉細胞を得るために使用することができる。例えば、ＣＸＣＲ４抗体、ＳＤＦ−１リガンドまたはＣＸＣＲ４に対する他のリガンドは、親和性による分離や磁気による分離などの方法において試薬として使用し、試薬に結合する胚体内胚葉細胞の調整物を濃縮、分離または実質的に精製することができる。
本明細書に記載されている発明の他の実施形態は、多能性細胞や胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物などの組成物に関する。ある実施形態において、細胞培養物は、幹細胞と胚体内胚葉細胞とを共に含む。そのような培養物に存在する幹細胞の数は、その培養物中の胚体内胚葉細胞の数より多くても、等しくても、または少なくてもよい。いくつかの実施形態において、幹細胞はヒト胚性幹細胞である。ある実施形態において、ｈＥＳＣは、支持細胞層で維持される。そのような実施形態において、支持細胞層の細胞は、ヒト、マウスまたは他の適切な生物体から得られる、線維芽細胞などの細胞であってもよい。
また、本発明のいくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞とｈＥＳＣを含む組成物は、一以上の増殖因子も含む。そのような増殖因子としては、ＴＧＦβスーパーファミリーの増殖因子を挙げることができる。そのような実施形態において、前記一以上の増殖因子は、増殖因子のＴＧＦβスーパーファミリーのノーダル／アクチビンおよび／またはＢＭＰサブグループを含む。いくつかの実施形態において、前記一以上の増殖因子は、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａまたはこれら増殖因子のあらゆる組み合わせからなる群から選択される。
本発明の他の実施形態は、以下番号を付した項目を参照して説明する。
１．ヒト細胞を含む細胞培養物であって、前記ヒト細胞の少なくとも約１０％が胚体内胚葉細胞であり、前記胚体内胚葉細胞が、腸管またはそれに由来する器官の細胞に分化し得る多分化能細胞である細胞培養物。
２．前記ヒト細胞の少なくとも約５０％が、胚体内胚葉細胞である項目１に記載の細胞培養物。
３．前記ヒト細胞の少なくとも約８０％が、胚体内胚葉細胞である項目１に記載の細胞培養物。
４．前記胚体内胚葉細胞が、ＳＯＸ１７およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるマーカーを発現する項目１に記載の細胞培養物。
５．前記胚体内胚葉細胞において、ＳＯＸ１７およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるマーカーの発現が、ＯＣＴ４、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７からなる群から選択されるマーカーの発現より多い項目４に記載の細胞培養物。
６．前記胚体内胚葉細胞が、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７からなる群から選択されるマーカーを発現しない項目４に記載の細胞培養物。
７．前記胚体内胚葉細胞が、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４およびＨＮＦ３ｂからなる群から選択されるマーカーを発現する項目４に記載の細胞培養物。
８．前記胚体内胚葉細胞が、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１からなる群から選択されるマーカーを発現する項目４に記載の細胞培養物。
９．前記胚体内胚葉細胞が、ＳＯＸ１７およびＣＸＣＲ４を発現する項目１に記載の細胞培養物。
１０．前記胚体内胚葉細胞において、ＳＯＸ１７およびＣＸＣＲ４の発現が、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７の発現より多い項目９に記載の細胞培養物。
１１．前記胚体内胚葉細胞が、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７を発現しない項目９に記載の細胞培養物。
１２．前記胚体内胚葉細胞が、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４およびＨＮＦ３ｂを発現する項目９に記載の細胞培養物。
１３．前記胚体内胚葉細胞が、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１からなる群から選択されるマーカーを発現する項目９に記載の細胞
培養物。
１４．前記細胞培養物において、多能性細胞約１個につき少なくとも約２個程度の胚体内胚葉細胞が存在する項目１に記載の細胞培養物。
１５．前記多能性細胞が、胚性幹細胞を含む項目１４に記載の細胞培養物。
１６．前記胚性幹細胞が、桑実胚、胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）および胚の生殖隆起からなる群から選択される組織に由来する項目１５に記載の細胞培養物。
１７．さらに、約１０％未満の血清を含む培地を含む項目１に記載の細胞培養物。
１８．さらに、ＴＧＦβスーパーファミリーのノーダル／アクチビンサブグループの増殖因子を含む項目１に記載の細胞培養物。
１９．さらに、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される増殖因子を含む項目１に記載の細胞培養物。
２０．細胞を含む細胞集団であって、前記細胞の少なくとも約９０％が、ヒト胚体内胚葉細胞であり、前記ヒト胚体内胚葉細胞が、腸管またはそれに由来する器官の細胞に分化し得る多分化能細胞である細胞集団。
２１．前記細胞の少なくとも約９５％が、ヒト胚体内胚葉細胞である項目２０に記載の細胞集団。
２２．前記細胞の少なくとも約９８％が、ヒト胚体内胚葉細胞である項目２０に記載の細胞集団。
２３．前記ヒト胚体内胚葉細胞が、ＳＯＸ１７およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるマーカーを発現する項目２０に記載の細胞集団。
２４．前記ヒト胚体内胚葉細胞において、ＳＯＸ１７およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるマーカーの発現が、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７からなる群から選択されるマーカーの発現より多い項目２３に記載の細胞集団。
２５．前記ヒト胚体内胚葉細胞が、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７からなる群から選択されるマーカーを発現しない項目２３に記載の細胞集団。
２６．前記ヒト胚体内胚葉細胞が、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４およびＨＮＦ３ｂからなる群から選択されるマーカーを発現する項目２３に記載の細胞集団。
２７．前記胚体内胚葉細胞が、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１からなる群から選択されるマーカーを発現する項目２３に記載の細胞集団。
２８．前記ヒト胚体内胚葉細胞が、ＳＯＸ１７およびＣＸＣＲ４を発現する項目２０に記載の細胞集団。
２９．前記ヒト胚体内胚葉細胞において、ＳＯＸ１７およびＣＸＣＲ４の発現が、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７の発現より多い項目２８に記載の細胞集団。
３０．前記ヒト胚体内胚葉細胞が、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７を発現しない項目２８に記載の細胞集団。
３１．前記ヒト胚体内胚葉細胞が、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４およびＨＮＦ３ｂを発現する項目２８に記載の細胞集団。
３２．前記胚体内胚葉細胞が、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１からなる群から選択されるマーカーを発現する項目２８に記載の細胞集団。
３３．前記細胞集団において、多能性細胞約１個につき少なくとも約２個程度のヒト胚体内胚葉細胞が存在する項目２０に記載の細胞集団。
３４．前記多能性細胞が、胚性幹細胞を含む項目３３に記載の細胞集団。
３５．前記胚性幹細胞が、桑実胚、胚のＩＣＭおよび胚の生殖隆起から選択される組織に由来する項目３４に記載の細胞集団。
３６．胚体内胚葉細胞の作製方法であって、前記方法は、
多能性ヒト細胞を含む細胞集団を得る工程と、
腸管またはそれに由来する器官の細胞に分化し得る多分化能細胞である胚体内胚葉細胞へ
の、前記多能性細胞の分化を促進するのに十分な量のＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも一つの増殖因子を前記細胞集団に供給する工程と、
胚体内胚葉細胞が形成するための十分な時間を与える工程とを含み、前記胚体内胚葉細胞が形成するための十分な時間を、前記細胞集団における胚体内胚葉細胞の存在を検出することにより決定した胚体内胚葉細胞の作製方法。
３７．前記多能性細胞の少なくとも約１０％が、胚体内胚葉細胞に分化する項目３６に記載の方法。
３８．前記多能性細胞の少なくとも約５０％が、胚体内胚葉細胞に分化する項目３６に記載の方法。
３９．前記多能性細胞の少なくとも約７０％が、胚体内胚葉細胞に分化する項目３６に記載の方法。
４０．前記多能性細胞の少なくとも約８０％が、胚体内胚葉細胞に分化する項目３６に記載の方法。
４１．前記細胞集団における胚体内胚葉細胞の存在の検出が、前記細胞集団の細胞において、ＳＯＸ１７およびＣＸＣＲ４からなる群から選択される少なくとも一つのマーカー、並びにＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７からなる群から選択される少なくとも一つのマーカーの発現を検出することを含み、前記胚体内胚葉細胞において、ＳＯＸ１７およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるマーカーの発現が、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７からなる群から選択されるマーカーの発現より多い項目３６に記載の方法。
４２．前記細胞集団における胚体内胚葉細胞の存在の検出が、前記細胞集団の細胞において、ＳＯＸ１７およびＣＸＣＲ４からなる群から選択される少なくとも一つのマーカー、並びにＡＦＰ、ＴＭおよびＳＯＸ７からなる群から選択される少なくとも一つのマーカーの発現を検出することを含み、前記胚体内胚葉細胞において、ＳＯＸ１７およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるマーカーの発現が、ＡＦＰ、ＴＭおよびＳＯＸ７からなる群から選択されるマーカーの発現より多い項目３６に記載の方法。
４３．前記マーカーの少なくとも一つの発現が、Ｑ−ＰＣＲにより測定される項目４２に記載の方法。
４４．前記マーカーの少なくとも一つの発現が、免疫細胞化学により測定される項目４２に記載の方法。
４５．前記細胞集団における胚体内胚葉細胞の存在の検出が、前記細胞集団の細胞において、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１からなる群から選択される少なくとも一つのマーカー、並びにＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７からなる群から選択される少なくとも一つのマーカーの発現を検出することを含み、前記胚体内胚葉細胞において、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１からなる群から選択されるマーカーの発現が、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７からなる群から選択されるマーカーの発現より多い項目３６に記載の方法。
４６．前記少なくとも一つの増殖因子が、ＴＧＦβスーパーファミリーのノーダル／アクチビンサブグループのものである項目３６に記載の方法。
４７．前記少なくとも一つの増殖因子が、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される項目４６に記載の方法。
４８．前記少なくとも一つの増殖因子が、ノーダルである項目４７に記載の方法
４９．前記の少なくとも一つの増殖因子が、アクチビンＡである項目４７に記載の方法。５０．前記少なくとも一つの増殖因子が、アクチビンＢである項目４７に記載の方法。
５１．ＴＧＦβスーパーファミリーの複数の増殖因子を供給する項目３６に記載の方法。５２．前記複数の増殖因子が、ノーダル、アクチビンＡおよびアクチビンＢを含む項目５１に記載の方法。
５３．前記少なくとも一つの増殖因子を、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で供給する項目３６に記載の方法。
５４．前記少なくとも一つの増殖因子を、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給する項目３６に記載の方法。
５５．前記少なくとも一つの増殖因子を、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給する項目３６に記載の方法。
５６．前記少なくとも一つの増殖因子を、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給する項目３６に記載の方法。
５７．前記少なくとも一つの増殖因子を、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給する項目３６に記載の方法。
５８．前記細胞集団を、約１０％未満の血清を含む培地で増殖させる項目３６に記載の方法。
５９．前記多能性細胞が、幹細胞を含む項目３６に記載の方法。
６０．前記多能性細胞が、胚性幹細胞を含む項目５９に記載の方法。
６１．前記胚性幹細胞が、桑実胚、胚のＩＣＭおよび胚の生殖隆起からなる群から選択される組織に由来する項目６０に記載の方法。
６２．項目３６に記載の方法により作製される胚体内胚葉細胞。
６３．胚体内胚葉細胞で濃縮された細胞集団を作製する方法であって、前記方法が、
腸管またはそれに由来する器官の細胞に分化し得る多分化能細胞である胚体内胚葉細胞を産生するように、多能性ヒト細胞の集団内の細胞を分化させる工程と、
前記胚体内胚葉細胞においては発現するが、前記細胞集団内に存在する他の細胞型においては実質的に発現しないマーカーに結合する試薬を、前記細胞集団に供給する工程と、
前記試薬に結合した前記胚体内胚葉細胞を、前記細胞集団内に存在する他の細胞型から分離することにより、胚体内胚葉細胞で濃縮された細胞集団を作製する工程とを含む方法。６４．前記分化させる工程が、さらに、多能性ヒト細胞を含む細胞集団を得ることと、腸管またはそれに由来する器官の細胞に分化し得る多分化能細胞である胚体内胚葉細胞への前記多能性細胞の分化を促進するのに十分な量でＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも一つの増殖因子を前記細胞集団に供給することと、胚体内胚葉細胞が形成するための十分な時間を与えることとを含み、前記胚体内胚葉細胞が形成するための十分な時間を、前記細胞集団における胚体内胚葉細胞の存在を検出することにより決定した項目６３に記載の方法。
６５．検出することが、前記細胞集団の細胞において、ＳＯＸ１７およびＣＸＣＲ４からなる群から選択される少なくとも一つのマーカー、並びにＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７からなる群から選択される少なくとも一つのマーカーの発現を検出することを含み、前記胚体内胚葉細胞において、ＳＯＸ１７およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるマーカーの発現が、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７からなる群から選択されるマーカーの発現より多い項目６３に記載の方法。
６６．検出することが、前記細胞集団の細胞において、ＳＯＸ１７およびＣＸＣＲ４からなる群から選択される少なくとも一つのマーカー、並びにＡＦＰ、ＴＭおよびＳＯＸ７からなる群から選択される少なくとも一つのマーカーの発現を検出することを含み、前記胚体内胚葉細胞において、ＳＯＸ１７およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるマーカーの発現が、ＡＦＰ、ＴＭおよびＳＯＸ７からなる群から選択されるマーカーの発現より多い項目６３に記載の方法。
６７．検出することが、前記細胞集団の細胞において、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１からなる群から選択される少なくとも一つのマーカー、並びにＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７からなる群から選択される少なくとも一つのマーカーの発現を検出することを含み、前記胚体内胚葉細胞において、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１からなる群から選択されるマーカーの発現が、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７からなる群から選択されるマーカーの発現より多い項目６３に記載の方法。６８．前記細胞の少なくとも約９５％が、胚体内胚葉細胞である項目６３に記載の方法。６９．前記細胞の少なくとも約９８％が、胚体内胚葉細胞である項目６３に記載の方法
７０．前記マーカーが、ＣＸＣＲ４である項目６３に記載の方法。
７１．前記試薬が、抗体である項目６３に記載の方法。
７２．前記抗体が、ＣＸＣＲ４に親和性を有する項目７１に記載の方法。
７３．項目６３に記載の方法により作製される胚体内胚葉細胞で濃縮された集団。
７４．前記胚体内胚葉細胞が、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７からなる群から選択されるマーカーを顕著に発現することのない項目４または９のいずれか一つに記載の細胞培養物。
７５．前記胚体内胚葉細胞が、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７からなる群から選択されるマーカーを顕著に発現することのない項目２３または２８のいずれか一つに記載の細胞集団。
当然のことながら、上記方法および組成物は、生体外で培養される細胞に関する。しかしながら、上記の生体外で分化させた細胞組成物は、生体内用に使用してもよい。
本発明の更なる実施形態は、２００３年１２月２３日に出願された、名称「ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ（胚体内胚葉）」の米国仮特許出願第６０／５３２，００４
号明細書、２００４年７月９日に出願された、名称「ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ ＣＥＬＬ ＳＵＲＦＡＣＥ ＲＥＣＥＰＴＯＲ ＦＯＲ ＴＨＥ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ（胚体内胚葉分離用ケモカイン細胞表面受容体）」の米国仮特
許出願第６０／５８６，５６６号明細書、および２００４年７月１４日に出願された、名称「ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ ＣＥＬＬ ＳＵＲＦＡＣＥ ＲＥＣＥＰＴＯＲ ＦＯＲ ＴＨＥ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ（胚体内胚葉分離用ケ
モカイン細胞表面受容体）」の米国仮特許出願第６０／５８７，９４２号明細書にも記載されている場合があり、それらの全内容を引用することにより本明細書の一部とする。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、ｈＥＳＣからベータ細胞を作製するために提案された分化経路を示す模式図である。前記経路における第一段階は、ＥＳ細胞を胚体内胚葉系列に関係づけ、ＥＳ細胞の、膵臓内胚葉、内分泌内胚葉または島／β細胞への更なる分化において周知の初期段階の一つを現す。この移行の媒介に有用ないくつかの因子は、これらに限定されるものではないが、アクチビン、ノーダルおよびＢＭＰを含むＴＧＦβファミリーのメンバーである。胚体内胚葉標的細胞を明示する典型的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＭＩＸ１およびＣＸＣＲ４である。
【図２】図２は、保存モチーフの位置を示し、ＧＥＮＯＶＡＣ社による免疫化処理に使用された領域にスポットを当てた、ヒトＳＯＸ１７ｃＤＮＡを示す図である。
【図３】図３は、ＳＯＸ１７が、ＳＯＸ７に最も密接に関係し、ＳＯＸ１８に対しては幾分関係性が低いことを示す関係系統樹である。ＳＯＸ１７タンパク質は、同一種内のＳＯＸ群Ｆ亜科の他のメンバーより、種同属体の間でより密接に関係している。
【図４】図４は、ラット抗ＳＯＸ１７抗体を用いて調べたウェスタンブロットを示す。このブロットは、繊維芽細胞で過剰発現したヒトＳＯＸ１７タンパク質に対するこの抗体の特異性（レーン１）や、ＥＧＦＰとの免疫反応性の欠如（レーン２）、また最も密接に関係したＳＯＸファミリーメンバーであるＳＯＸ７（レーン３）を示す。
【図５】図５Ａ〜Ｂは、相当数のＡＦＰ＋同時標識細胞（Ａ）を示すＳＯＸ１７＋細胞のクラスターを示す顕微鏡写真である。これは、ＡＦＰ＋細胞がほとんどまたは全く見られない他のＳＯＸ１７＋クラスター（Ｂ）とは著しい対照を成している。
【図６】図６Ａ〜Ｃは、壁側内胚葉およびＳＯＸ１７を示す顕微鏡写真である。パネルＡは、ｈＥＳ細胞のランダムに分化した培養物中における、壁側内胚葉細胞の細胞表面に位置するヒトトロンボモジュリン（ＴＭ）タンパク質に対する免疫細胞化学法を示している。パネルＢは、ＴＭおよびＳＯＸ１７に対し二重標識した、Ａに示したものと同一の領域である。パネルＣは、ＤＡＰＩで標識された核を有する同一領域の位相差画像である。ＤＡＰＩで標識された核とＳＯＸ１７標識の完全な相関性に注目されたい。
【図７】図７Ａ〜Ｂは、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によるＳＯＸ１７遺伝子発現と、ＳＯＸ１７特異抗体による抗ＳＯＸ１７陽性細胞とを示す棒グラフである。パネルＡは、未分化対照培地（ＳＲ２０）と比較して、レチノイン酸（ＲＡ）はＳＯＸ１７発現を強力に抑制する一方で、アクチビンＡはＳＯＸ１７遺伝子発現を増加させることを示している。パネルＢは、同一のパターンを示し、これら同程度の変化は、ＳＯＸ１７＋細胞数に反映されており、これは、ＳＯＸ１７遺伝子発現の定量ＰＣＲ測定が、単一細胞レベルでの変化に高度に反映されていることを示している。
【図８】図８Ａは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中、ランダムに分化させた細胞がＡＦＰの大幅な発現増加を示す一方で、アクチビンＡの存在下における分化ｈＥＳＣの培養物のＡＦＰ遺伝子発現が低レベルにとどまることを示す棒グラフである。発現量には約７倍の差がある。図８Ｂ〜Ｃは、１０％ＦＢＳのみの場合（上）に対して、アクチビンＡ処理状態（下）において見られる非常に少ない小さなＡＦＰ＋細胞クラスターにより示されるように、アクチビンＡによるＡＦＰ発現の抑制も、単一細胞レベルにおいて明白であることを示す２枚の顕微鏡写真の画像である。
【図９】図９Ａ〜Ｂは、フローサイトメトリーを用いたＡＦＰ＋細胞数の定量化を示す比較画像である。この図は、アクチビンＡの存在下（右のパネル）および不在下（左のパネル）におけるＡＦＰ遺伝子発現（図８Ａ）における変化の大きさが、ＡＦＰ＋細胞数に厳密に対応することを示しており、これは、単一細胞レベルで生じる変化を示すための定量ＰＣＲ分析の有用性をさらに裏付けている。
【図１０】図１０Ａ〜Ｆは、ノーダル、アクチビンＡおよびアクチビンＢ（ＮＡＡ）にｈＥＳＣを暴露することにより、５日間（Ａ〜Ｃ）でＳＯＸ１７＋細胞の数が著しく増加することを示す顕微鏡写真である。各領域に存在する総細胞数をＳＯＸ１７＋細胞の相対存在量と比較することにより、ＤＡＰＩで染色された核（Ｄ〜Ｆ）により示されているように、ＮＡＡによる５日間の処理後、全細胞の約３０〜５０％が、ＳＯＸ１７に対し免疫反応性を有することが分かる。
【図１１】図１１は、分化ｈＥＳＣにおいて、アクチビンＡ（０、１０、３０又は１００ｎｇ／ｍＬ）が、ＳＯＸ１７遺伝子発現を用量依存的に増加させることを示す棒グラフである。発現は、接着培養での３日間の処理後、すでに激しく増加しており、その後の１、３および５日間の浮遊培養中も引き続き同様に増加している。
【図１２】図１２Ａ〜Ｃは、ＭＩＸＬ１（パネルＡ）、ＧＡＴＡ４（パネルＢ）およびＨＮＦ３ｂ（パネルＣ）の発現に対するアクチビンＡの効果を示す棒グラフである。また、アクチビンＡ用量依存的増加は、胚体内胚葉のその他の３つのマーカーである、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４およびＨＮＦ３ｂに関しても見られる。アクチビンの投与量に応じて増加する発現の程度は、ＳＯＸ１７に関して観察されたものと非常に類似しており、これは、アクチビンＡが、４つ全ての遺伝子（ＳＯＸ１７＋、ＭＩＸＬ１＋、ＧＡＴＡ４＋およびＨＮＦ３ｂ＋）を共に発現する細胞の集団を特定していることを強く示唆している。
【図１３】図１３Ａ〜Ｃは、ＡＦＰ（パネルＡ）、ＳＯＸ７（パネルＢ）およびＳＰＡＲＣ（パネルＣ）の発現に対するアクチビンＡの効果を示す棒グラフである。臓側内胚葉のマーカーＡＦＰの発現は、アクチビンＡの用量に依存して減少している。いくつかの時点において、原始内胚葉（ＳＯＸ７）および壁側内胚葉（ＳＰＡＲＣ）のマーカーは、変化していないか、または抑制されており、これは、アクチビンＡが、これらの胚外内胚葉細胞型を特定する働きをしないことを示唆している。これは、ＳＯＸ１７、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４およびＨＮＦ３ｂの発現の増加が、アクチビンＡに応じた胚体内胚葉細胞数の増加によるものであることをさらに裏付けている。
【図１４】図１４Ａ〜Ｂは、ＺＩＣ１（パネルＡ）およびＢｒａｃｈｙｕｒｙ（パネルＢ）の発現に対するアクチビンＡの効果を示す棒グラフである。神経マーカーＺＩＣ１の一貫した発現は、神経分化へのアクチビンＡ用量依存的効果がないことを示す。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現の減少によって示されているように、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍＬを用いた処理を介した中胚葉の分化は著しく抑制されている。これは、おそらく、中内胚葉前駆体からの胚体内胚葉の特異化が進んだ結果であろう。未処理の対照培養物と比較して、分化後期では、少量のアクチビンＡを用いた処理（１０および３０ｎｇ／ｍＬ）により、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現が維持されている。
【図１５】図１５Ａ〜Ｂは、アクチビンを用いた処理により壁側内胚葉の分化が低減したことを示す顕微鏡写真である。血清のみで分化させた場合、ＴＭｈｉの壁側内胚葉の領域が、培養物（Ａ）全体に渡って見られた。一方、アクチビンが含まれており（Ｂ）、尚且つＴＭ免疫反応性の全体的な強度が低い場合、ＴＭ＋細胞への分化は殆ど見られない。
【図１６】図１６Ａ〜Ｄは、アクチビンＡおよびアクチビンＢを用いた処理によるマーカーの発現を示す顕微鏡写真である。アクチビンＡおよびアクチビンＢを用いて４日間連続でｈＥＳＣを処理し、ＳＯＸ１７、ＡＦＰおよびＴＭ抗体で三重標識した。パネルＡは、ＳＯＸ１７；パネルＢはＡＦＰ；パネルＣはＴＭ：そしてパネルＤが位相（Ｐｈａｓｅ）／ＤＡＰＩである。ＡＦＰ（Ｂ）およびＴＭ（Ｃ）免疫反応性の完全な欠如に関連した多数のＳＯＸ１７陽性細胞（Ａ）に注目されたい。
【図１７】図１７は、ｈＥＳＣからの、生体外での胚体内胚葉および臓側内胚葉の発生を示す顕微鏡写真である。臓側内胚葉の領域は、ＡＦＰｈｉ／ＳＯＸ１７ｌｏ／−により同定されるが、胚体内胚葉は、全く反対の特性、ＳＯＸ１７ｈｉ／ＡＦＰｌｏ／−を示す。これら二つの領域が互いに近接しているため、この領域を選択した。しかしながら、ＡＦＰｈｉ細胞のいずれの領域からも完全に孤立して、ＳＯＸ１７ｈｉ／ＡＦＰｌｏ／−の領域が見られることが頻繁にある。これは、胚体内胚葉細胞が、臓側内胚葉細胞とは別個に発生することを示唆している。
【図１８】図１８は、ＴＧＦβファミリーのリガンドと受容体を表す図である。ＡＲ ＳｍａｄｓとＢＲ Ｓｍａｄｓを活性化する因子は、ヒト胚性幹細胞から胚体内胚葉を作製する上で有用である。（Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８７：２６５−７６参照）。
【図１９】図１９は、ＴＧＦβ因子を単独および組合せて用いて処理した結果として、経時的にＳＯＸ１７発現の誘導を示す棒グラフである。
【図２０】図２０は、ＴＧＦβ因子の組合せを用いて処理した結果として、経時的にＳＯＸ１７＋細胞数の増加を示す棒グラフである。
【図２１】図２１は、ＴＧＦβ因子の組合せを用いて処理した結果として、経時的にＳＯＸ１７発現の誘導を示す棒グラフである。
【図２２】図２２は、アクチビンＡが、ＳＯＸ１７＋細胞数の用量依存的な増加を引き起こすことを示す棒グラフである。
【図２３】図２３は、アクチビンＡおよびアクチビンＢで処理された培養物へのＷｎｔ３ａの添加により、アクチビンＡおよびアクチビンＢのみにより引き起こされたレベル以上にＳＯＸ１７の発現が増加することを示す棒グラフである。
【図２４】図２４Ａ〜Ｃは、胚体内胚葉への分化が、ＦＢＳの少ない条件下で増強されることを示す棒グラフである。２％のＦＢＳ（２ＡＡ）を含む培地におけるアクチビンＡおよびＢを用いたｈＥＳＣの処理は、１０％のＦＢＳを含む培地（１０ＡＡ）における同様の処理と比べて、２〜３倍高いレベルのＳＯＸ１７発現を引き起こす（パネルＡ）。また、胚体内胚葉マーカーＭＩＸＬ１（パネルＢ）の誘導も同様に影響され、ＡＦＰ（臓側内胚葉）（パネルＣ）は、１０％ＦＢＳ条件下より２％ＦＢＳ条件下で、より大きく抑制されている。
【図２５】図２５Ａ〜Ｄは、培養物中、ＳＯＸ１７＋細胞が分離していることを示す顕微鏡写真である。ＳＯＸ１７免疫反応細胞は、ｈＥＳＣコロニー（Ｃ、Ｄ）の分化領域縁部に存在し、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）（パネルＢ）で標識されるが、ＯＣＴ４（パネルＣ）での同時標識はされない。さらに、ＯＣＴ４＋未分化ｈＥＳＣ（矢じり形で示す）およびＳＯＸ１７＋細胞（矢印）のいずれにおいても、核のＤＡＰＩ標識により、明瞭な有糸分裂像が見られる（Ｄ）。
【図２６】図２６は、様々な培地条件下での分化ｈＥＳＣにおけるＣＸＣＲ４の相対的発現量を示す棒グラフである。
【図２７】図２７Ａ〜Ｄは、図２６に示した同様の分化処理全体に渡って、胚体内胚葉マーカーに関するパネルが、いかにＣＸＣＲ４と非常によく似た発現パターンを共有しているかを示す棒グラフである。
【図２８】図２８Ａ〜Ｅは、図２６に示した同様の処理全体に渡って、中胚葉（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＭＯＸ１）、外胚葉（ＳＯＸ１、ＺＩＣ１）および臓側内胚葉（ＳＯＸ７）のマーカーが、いかにＣＸＣＲ４の発現に対し逆相関性を呈するかを示す棒グラフである。
【図２９】図２９Ａ〜Ｆは、図２６〜２８に示した培地条件の内の３つに関して、ＳＯＸ１７免疫反応細胞における相対的な差異を示す顕微鏡写真である。
【図３０】図３０Ａ〜Ｃは、分化培地に添加したアクチビンＡの濃度が高くなるにつれ、ＣＸＣＲ４＋の細胞数が増加することを示すフローサイトメトリーによるドットプロットである。
【図３１】図３１Ａ〜Ｄは、高用量のアクチビンＡによる処理（Ａ１００−ＣＸ＋）により分離されたＣＸＣＲ４＋細胞が、母集団（Ａ１００）よりも胚体内胚葉マーカーでさらに濃縮されていることを示す棒グラフである。
【図３２】図３２は、母集団における遺伝子発現、並びに、蛍光標識細胞分取法（ＦＡＣＳ）を用いて分離されたＣＸＣＲ４＋およびＣＸＣＲ４−細胞からの遺伝子発現を示す棒グラフである。これは、ＣＸＣＲ４＋細胞が、各母集団に存在するＣＸＣＲ４の遺伝子発現を本質的にすべて含み、ＣＸＣＲ４−集団は、ＣＸＣＲ４遺伝子発現をほとんどまたは全く含まないことを示している。
【図３３】図３３Ａ〜Ｄは、これら非胚体内胚葉マーカーの発現においては既に抑制されている、高用量アクチビンＡ処理により分離されたＣＸＣＲ４＋細胞における中胚葉（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＭＯＸ１）、外胚葉（ＺＩＣ１）および臓側内胚葉（ＳＯＸ７）の遺伝子発現の減少を示す棒グラフである。
【図３４−１】図３４Ａ〜Ｍは、胚体内胚葉細胞の同定に使用することのできるマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーである、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１の発現解析は、パネルＧ〜Ｌにそれぞれ示されている。また、先に説明した系列標識遺伝子である、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７、ＴＭ、ＺＩＣ１およびＭＯＸ１の発現解析は、パネルＡ〜Ｆにそれぞれ示されている。パネルＭは、ＣＸＣＲ４の発現解析を示している。パネルＡ〜Ｍそれぞれに関して、ｈＥＳＣと表示した列は、精製されたヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示し、２ＮＦは、アクチビンを添加することなく２％ＦＢＳで処理した細胞を示し、０．１Ａ１００は、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍｌ、０．１％ＦＢＳで処理した細胞を示し、１Ａ１００は、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍｌ、１％ＦＢＳで処理した細胞を示し、そして、２Ａ１００は、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍｌ、２％ＦＢＳで処理した細胞を示す。
【図３４−２】図３４Ａ〜Ｍは、胚体内胚葉細胞の同定に使用することのできるマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーである、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１の発現解析は、パネルＧ〜Ｌにそれぞれ示されている。また、先に説明した系列標識遺伝子である、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７、ＴＭ、ＺＩＣ１およびＭＯＸ１の発現解析は、パネルＡ〜Ｆにそれぞれ示されている。パネルＭは、ＣＸＣＲ４の発現解析を示している。パネルＡ〜Ｍそれぞれに関して、ｈＥＳＣと表示した列は、精製されたヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示し、２ＮＦは、アクチビンを添加することなく２％ＦＢＳで処理した細胞を示し、０．１Ａ１００は、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍｌ、０．１％ＦＢＳで処理した細胞を示し、１Ａ１００は、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍｌ、１％ＦＢＳで処理した細胞を示し、そして、２Ａ１００は、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍｌ、２％ＦＢＳで処理した細胞を示す。
【図３４−３】図３４Ａ〜Ｍは、胚体内胚葉細胞の同定に使用することのできるマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーである、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１の発現解析は、パネルＧ〜Ｌにそれぞれ示されている。また、先に説明した系列標識遺伝子である、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７、ＴＭ、ＺＩＣ１およびＭＯＸ１の発現解析は、パネルＡ〜Ｆにそれぞれ示されている。パネルＭは、ＣＸＣＲ４の発現解析を示している。パネルＡ〜Ｍそれぞれに関して、ｈＥＳＣと表示した列は、精製されたヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示し、２ＮＦは、アクチビンを添加することなく２％ＦＢＳで処理した細胞を示し、０．１Ａ１００は、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍｌ、０．１％ＦＢＳで処理した細胞を示し、１Ａ１００は、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍｌ、１％ＦＢＳで処理した細胞を示し、そして、２Ａ１００は、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍｌ、２％ＦＢＳで処理した細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
原腸形成と呼ばれるヒト発生初期における極めて重要な段階は、受精後２〜３週間で生じる。原腸形成が極めて重要である理由は、三つの一次胚葉が初めて特定化され組織化されるのがこの時だからである（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｓｃｈｏｅｎｗｏｌｆ ａｎ
ｄ Ｓｍｉｔｈ， ２０００）。外胚葉は、体の外皮および全神経系の最終形成をつかさどる一方で、心臓、血液、骨、骨格筋、および他の結合組織は、中胚葉に由来する。胚体内胚葉は、食道、胃、小腸および大腸を含む全腸管、並びに肺、肝臓、胸腺、副甲状腺、甲状腺、胆嚢、および膵臓などの腸管に由来する器官の形成をつかさどる胚葉と定義される（Ｇｒａｐｉｎ−Ｂｏｔｔｏｎ ａｎｄ Ｍｅｌｔｏｎ，２０００；Ｋｉｍｅｌｍａｎ ａ
ｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，２０００；Ｔｒｅｍｂｌａｙ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｗｅｌｌ
ｓ ａｎｄ Ｍｅｌｔｏｎ，１９９９；Ｗｅｌｌｓ ａｎｄ Ｍｅｌｔｏｎ，２０００）。胚体内胚葉と、原始内胚葉と呼ばれる、完全に別個の系列の細胞とを区別することは非常に重要である。原始内胚葉は、主として、胚体外組織、主に、ライヘルト膜の細胞外マトリックス物質と胎盤の卵黄嚢の壁側および臓側内胚葉部分の形成をつかさどる。
原腸形成の間、胚体内胚葉形成の過程は、中内胚葉細胞（中胚葉または内胚葉を形成することのできる細胞）が原始線条と呼ばれる構造を通って移動する、細胞移動現象から始まる。胚体内胚葉は、線条前部を通り、そして結節（線条最前部における特殊構造）を通って移動する細胞に由来する。移動が生じるにつれ、胚体内胚葉は、まず、腸管最前部に位置し、腸管後端の形成で終了する。
Ｃｏｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｆｅｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｄｏｕｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｔｒｅｍｂｌａｙ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｓｔａｉｎｉｅｒ，１９９９；Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｈｕｄｓｏｎ 
ｅｔ ａｌ．，１９９７によるゼブラフィッシュとツメガエル、およびＫａｎａｉ−Ａｚ
ｕｍａ ｅｔ ａｌ．，２００２によるマウスにおける研究などの、胚体内胚葉形成に関する生体内解析は、ヒト胚性幹細胞を用いて、培養皿内でいかに特定の胚葉細胞型を発生させるかに関する基礎を築いている。培養皿内での発生を再現させる上で大きな障害となる、生体外ＥＳＣ培養に関連した二つの側面がある。第一に、組織化された胚葉または器官構造が作製されない。胚葉および器官に特異な遺伝子マーカーの大部分は、ｈＥＳＣ分化培養系において、不均一に発現する。したがって、器官特定の境界がこのように欠如していることから、特定の組織や細胞型の形成を評価するのは困難である。また、特定の胚葉内の一細胞型または組織型において発現するほとんど全ての遺伝子は、別の種類の胚葉の他の細胞または組織型においても発現する。特定の境界がない場合、１〜３個の遺伝子の小標本を用いて遺伝子発現特異性を決定する手段は殆ど無い。したがって、非常に多くの遺伝子を検査しなければならず、そのいくつかは目的の器官または組織の特定の細胞型に存在するものであったり、また、いくつかは、発現しないものであったりする。第二に、特定の発生経路をたどるためには、遺伝子発現パターンのタイミングが非常に重要である。
さらに複雑な問題として、注意すべきは、生体外における幹細胞分化は、いくぶん非同期的に生じ、生体内と比較すると、かなり非同期的に生じるようである。そのため、一細胞
群では、原腸形成に関与する遺伝子が発現している一方で、別の細胞群では、最終分化を始めていることもある。さらに、外因性因子適用の有無にかかわらず、ｈＥＳＣ単層または胚様体（ＥＢ）の操作により、全体的な遺伝子発現パターンおよび分化状態に関して、大きな差異が生じる場合がある。これらの理由から、培養物に、効果的に特定の分化経路をたどらせるために、異種細胞混合物内の遺伝子発現パターンによって外因性因子の適用時期を決める必要がある。また、培養容器内の細胞の形態学的関連を考慮することも有益である。いわゆる胚様体へと形成される場合、ｈＥＳＣに均一に影響を及ぼす能力は、培養容器内でｈＥＳＣコロニーおよび／または単層として増殖分化させたｈＥＳＣほど最適ではない場合もある。
異種性と非同期性の上記問題に対処する効果的な方法として、本発明のいくつかの実施形態では、細胞を分化させる方法を、分化経路において中間細胞型を濃縮、分離および／または精製する方法と組み合わせることを検討する。
本発明の実施形態は、幹細胞などの多能性細胞を、多分化能胚体内胚葉細胞へと分化させることにより、培養物中に胚体内胚葉細胞を作製する新規且つ特定の方法に関する。本明細書に使用されている、「多分化能」または「多分化能細胞」とは、他の特定の細胞型を限定数発生させる細胞型のことを言う。前述のように、胚体内胚葉細胞は、外胚葉または中胚葉から産生される組織に分化するのではなく、腸管や、腸管に由来する器官に分化する。ある好適な実施形態において、胚体内胚葉細胞は、ｈＥＳＣに由来する。そのような工程は、膵臓、肝臓、肺、胃、腸および甲状腺などのヒト内胚葉由来組織の効率的作製の基礎を提供することができる。例えば、胚体内胚葉の作製が、幹細胞の機能性インスリン産生β細胞への分化における第一段階である場合もある。有用な量のインスリン産生β細胞を得るため、膵島／β細胞運命に達する前に生じる各分化段階において、効率よく分化させることが望ましい。幹細胞の胚体内胚葉細胞への分化は、おそらく機能性膵島／β細胞の作製（図１に示す）に向かう最も初期の段階に相当するため、この段階で効率よく分化させることは特に望ましい。
多能性細胞を胚体内胚葉細胞に効率よく分化させることが望ましいことから、本発明のいくつかの態様は、多能性細胞を約５０〜８０％胚体内胚葉細胞へ転換する、インビトロ方法論に関する。通常、そのような方法には、時間的に特定された所定のやり方における培養物や増殖因子に関する条件の適用が含まれる。胚体内胚葉細胞に特異的に結合する試薬を使用することで、細胞集団内の他の細胞から胚体内胚葉細胞を分離および／または精製することにより、胚体内胚葉細胞でその細胞集団をさらに濃縮することができる。よって、本発明の態様は、胚体内胚葉細胞と、そのような細胞を作製並びに分離および／または精製する方法とに関する。
細胞培養物または細胞集団内の胚体内胚葉細胞の量を測定するためには、培養物または集団において、他の細胞からこの細胞型を識別する方法が望ましい。従って、本発明のある実施形態は、その存在、不在および／または相対的発現量が胚体内胚葉に特異的である細胞マーカーと、そのようなマーカーの発現を検出および測定する方法とに関する。本明細書において使用する、「発現」とは、材料または物質の生成、並びに材料または物質の生成レベルまたは量のことを言う。よって、特異的なマーカーの発現を測定するということは、マーカーの存在または不在を簡易に検出すること、あるいは発現するマーカーの相対量または絶対量のいずれかを検出することを言う。本明細書に使用する、「マーカー」は、観察または検出できるあらゆる分子のことを指す。例えば、マーカーは、特異的遺伝子の転写物などの核酸、遺伝子のポリペプチド生成物、非遺伝子生成物ポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質，リポタンパクまたは小分子を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明のいくつかの実施形態において、マーカーの発現の有無および／または量は、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により測定される。例えば、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ、ＳＯＸ７、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１、ＣＲＩＰ１などの一定の遺伝子マーカーや、本明細書に記載している他のマーカーにより産生される転写物の量は
、定量Ｑ−ＰＣＲにより測定される。他の実施形態においては、上記遺伝子により発現したタンパク質の検出に免疫組織化学が使用される。さらに別の実施形態において、そのようなマーカーの量または相対的比率の確認および測定には、Ｑ−ＰＣＲおよび免疫組織化学技術の両方を利用する。
上記のような方法を利用することにより、一以上の適切なマーカーの発現を測定するために、胚体内胚葉細胞を同定するだけでなく、細胞培養物あるいは細胞集団における胚体内胚葉細胞の比率を求めることも可能である。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、作製される胚体内胚葉細胞または細胞集団は、非胚体内胚葉細胞型または細胞集団より約２桁多い量のＳＯＸ１７および／またはＣＸＣＲ４遺伝子を発現する。他の実施形態において、作製される胚体内胚葉細胞または細胞集団は、非胚体内胚葉細胞型または細胞集団より３桁以上多い量のＳＯＸ１７および／またはＣＸＣＲ４遺伝子を発現する。さらに別の実施形態において、作製される胚体内胚葉細胞または細胞集団は、非胚体内胚葉細胞型または細胞集団より、約２桁あるいは３桁以上多い量のＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１からなる群から選択される一以上のマーカーを発現する。
本発明の更なる態様は、胚体内胚葉と、胚体内胚葉細胞で濃縮された細胞集団とを含む細胞培養物に関する。そのため、ある実施形態は、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に関するものであり、培養物中、前記細胞の少なくとも約５０〜８０％が、胚体内胚葉細胞である。好適な一実施形態は、ヒト細胞を含む細胞培養物に関するものであり、培養物中、ヒト細胞の少なくとも約５０〜８０％が、胚体内胚葉細胞である。分化方法の効率は、一定のパラメーターを変更することにより調整できるため、本明細書に記載した分化方法では、多能性細胞の胚体内胚葉への転換は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９５％以上でありうる。前記一定のパラメーターとしては、細胞増殖条件、増殖因子濃度および培養段階のタイミングが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の別の実施形態においては、幹細胞集団などの多能性細胞集団の、実質的に純粋な胚体内胚葉細胞集団への転換を検討する。
本明細書に記載している組成物および方法には、いくつかの有用な特性がある。例えば、胚体内胚葉を含む細胞培養物および細胞集団、並びにそのような細胞培養物および細胞集団を作製する方法は、ヒト発生の初期段階をモデル化する上で有用である。さらに、本明細書に記載の組成物と方法は、糖尿病などの病状における治療行為にも役立つ。例えば、胚体内胚葉は、限られた数の組織のみの源となるため、純粋な組織または細胞型の発生に使用することができる。
【０００８】
多能性細胞からの胚体内胚葉の作製
本明細書に記載されている胚体内胚葉細胞培養物および胚体内胚葉細胞を含む組成物は、胚性幹細胞などの多能性細胞から作製される。本明細書で使用している、「胚性、胚の（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」とは、単一の接合体に始まり、発達した配偶子細胞以外の多能性または全能性細胞をもはや含まない多細胞性構造体に終わる、生物体の一連の発生段階を指す。配偶子融合により誘導された胚に加え、用語「胚性、胚の（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」は、体細胞核移植により誘導された胚も指す。胚体内胚葉細胞を誘導する好ましい方法では、胚体内胚葉作製のための出発物質として、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を利用する。この方法で使用される胚性幹細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊または胚の生殖隆起から得られたものに由来する細胞であってもよい。ヒト幹細胞は、当技術分野において周知の方法を用いて、実質的に分化することなく多能性の状態で培養物中に維持できる。そのような方法は、例えば、米国特許第５，４５３，３５７号明細書、第５，６７０，３７２号明細書、第５，６９０，９２６号明細書、第５，８４３，７８０号明細書、第６，２００，８０６号明細書および第６，２５１，６７１号明細書に記載されており、これらの全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
本明細書に記載されている方法のいくつかの実施形態において、ｈＥＳＣは、支持細胞層で維持される。そのような実施形態においては、ｈＥＳＣを多能性の状態で維持できるいかなる支持細胞層も、本明細書に記載されている方法において使用することができる。ヒト胚性幹細胞の培養に一般に使用される一支持細胞層は、マウス線維芽細胞の層である。さらに最近では、ヒト線維芽細胞の支持細胞層が、ｈＥＳＣの培養に使用するために開発されている（米国特許出願第２００２／００７２１１７号明細書参照。この全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる）。本明細書に記載されている方法の別の実施形態は、支持細胞層を使用することなく、多能性ｈＥＳＣの維持を可能にする。そのような方法は、米国特許出願第２００３／０１７５９５６号明細書に記載されており、その全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
ここで使用されるヒト胚性幹細胞は、血清の有無にかかわらず培養物中に維持することができる。いくつかの実施形態においては、血清代替物が使用される。別の実施形態においては、米国特許出願第２００３／０１９０７４８号明細書に記載されているような、無血清培養技術が使用される。この特許出願の全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
幹細胞は、胚体内胚葉への分化が望まれるまで、定期的な継代培養によって、培養物中、多能性の状態で維持される。いくつかの実施形態においては、胚体内胚葉への分化を促進するのに十分な量のＴＧＦβスーパーファミリーの増殖因子を幹細胞培養物に提供することにより、胚体内胚葉に分化させる。胚体内胚葉の作製に有用なＴＧＦβスーパーファミリーの増殖因子は、ノーダル／アクチビンまたはＢＭＰサブグループから選択される。本明細書に記載されている分化方法に係るいくつかの実施形態において、増殖因子は、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびＢＭＰ４からなる群から選択される。さらに、増殖因子Ｗｎｔ３ａおよび他のＷｎｔファミリーメンバーは、胚体内胚葉細胞の作製に有用である。本発明のある実施形態においては、上記増殖因子はいかなる組み合わせでも使用できる。
本明細書に記載されている分化方法の実施形態のいくつかに関して、上記増殖因子は、幹細胞の少なくとも一部の、胚体内胚葉への分化を促進するのに十分な濃度で培養物中に存在するよう、細胞に提供される。本発明のいくつかの実施形態において、上記増殖因子は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌまたは約５０００ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で細胞培養物中に存在する。
本発明のある実施形態において、上記増殖因子は、添加後、細胞培養物から除去する。例えば、増殖因子は、添加後、約１日以内、約２日以内、約３日以内、約４日以内、約５日以内、約６日以内、約７日以内、約８日以内、約９日以内又は１０日以内に除去してもよい。好適な実施形態において、増殖因子は、添加の約４日後に除去する。
胚体内胚葉細胞の培養物は、少量の血清を含むか、あるいは、血清を含まない培地で増殖させることができる。本発明のある実施形態において、血清濃度は、約０．０５％ｖ／ｖ〜約２０％ｖ／ｖの範囲であればよい。例えば、ある実施形態において、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、約１５％（ｖ／ｖ）未満または約２０％（ｖ／ｖ）未満であってもよい。いくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、血清なしで増殖させる。他の実施形態におい
ては、胚体内胚葉細胞は、血清代替物を用いて増殖させる。さらに別の実施形態において、胚体内胚葉細胞は、Ｂ２７の存在下で増殖させる。そのような実施形態において、Ｂ２７サプリメントの濃度は、約０．２％ｖ／ｖ〜約２０％ｖ／ｖの範囲であればよい。
ｈＥＳＣ培養物の胚体内胚葉への進行は、胚体内胚葉に特有のマーカーの発現を測定することによりモニターすることができる。いくつかの実施形態において、あるマーカーの発現は、マーカーの有無を検出することにより測定される。また、あるマーカーの発現は、細胞培養物または細胞集団の細胞内におけるマーカーの存在量を測ることにより測定される。そのような実施形態において、マーカーの発現測定は、定性的測定であっても定量的測定であってもよい。マーカー遺伝子により作製される発現マーカーを定量化する一方法は、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を利用したものである。Ｑ−ＰＣＲを行う方法は、当技術分野においては周知である。また、当技術分野において周知となっている他の方法も、マーカー遺伝子発現の定量化に使用できる。例えば、マーカー遺伝子産物の発現は、目的のマーカー遺伝子産物に特異な抗体を使用することにより検出することができる。本発明のいくつかの実施形態において、胚体内胚葉に特有のマーカー遺伝子の発現のほかに、ｈＥＳＣや他の細胞型に特有のマーカー遺伝子の著しい発現の欠如も測定される。
以下の実施例においてさらに説明するように、胚体内胚葉の信頼できるマーカーは、ＳＯＸ１７遺伝子である。そのため、本明細書に記載されている方法により作製される胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現することにより、ＳＯＸ１７遺伝子産物を産生する。胚体内胚葉の他のマーカーは、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１である。本発明のいくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、原始および臓側内胚葉に特有のＳＯＸ７マーカー遺伝子（表１参照）より高いレベルでＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現する。さらに、いくつかの実施形態においては、ＳＯＸ１７マーカー遺伝子の発現が、ｈＥＳＣに特有のＯＣＴ４マーカー遺伝子の発現より多い。本発明の他の実施形態において、胚体内胚葉細胞は、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣまたはトロンボモジュリン（ＴＭ）マーカー遺伝子より高いレベルでＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現する。本発明のある実施形態において、本明細書に記載されている方法により作製されるＳＯＸ１７発現胚体内胚葉細胞は、有意水準または量のＰＤＸ１を発現しない（ＰＤＸ１陰性）。
胚体内胚葉の別のマーカーは、ＣＸＣＲ４遺伝子である。ＣＸＣＲ４遺伝子は、リガンドが化学誘引物質ＳＤＦ−１である細胞表面ケモカイン受容体をエンコードする。成体における、ＣＸＣＲ４受容体を有する細胞の主な役割は、造血細胞の骨髄への移動、リンパ球輸送および様々なＢ細胞とマクロファージ血液細胞系列の分化であると考えられている［Ｋｉｍ，Ｃ．およびＢｒｏｘｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．６５
、６−１５（１９９９）］。また、ＣＸＣＲ４受容体は、ＨＩＶ−１のＴ細胞侵入のための共同受容体としても機能する［Ｆｅｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２、
８７２−８７７（１９９６）］。［ＭｃＧｒａｔｈ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ２１３、４４２−４５６（１９９９）］により行われた広範囲に及ぶ一連の
研究では、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４とその特異なリガンド、ＳＤＦ−１［Ｋｉｍ，Ｃ．，およびＢｒｏｘｍｙｅｒ，Ｈ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．６５、６−１
５（１９９９）］の発現は、マウスの初期発生および成人期において描写された。いずれかの遺伝子が、遺伝子導入マウス内で分裂した場合に、後期胚の致死を引き起こすことが実証されたとき［Ｎａｇａｓａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ、３８２、６３５−６３８（１９９６）］、Ｍａ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１０、４６３−４７１（１９９９）］、発生過程におけるＣＸＣＲ４／ＳＤＦ１の相互作用が明らかになった。ＭｃＧｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．は、ＲＮａｓｅ保護とインサイツハイブリッド形成方法論を組合せて使用し、ＣＸＣＲ４が、初期原腸陥入胚（Ｅ７．５）の間に検出される最も大量のケモカイン受容体メッセンジャーＲＮＡであることを実証した。原腸陥入胚では、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１シグナル伝達は、原条胚葉細胞の移動を誘導することに主に関与しているようであり、このとき存在する胚体内胚葉、中胚葉および胚外中胚葉で見られる。Ｅ７．２〜７．８のマウス胚において、ＣＸＣＲ４とアルファフェトプロテインは互いに排他的
であり、臓側内胚葉において発現しないことを示している［ＭｃＧｒａｔｈ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ２１３、４４２−４５６（１９９９）］。
本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に記載されている方法により作製される胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現する。他の実施形態において、本明細書に記載されている方法により作製される胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４マーカー遺伝子および胚体内胚葉の他のマーカーを発現する。他のマーカーとしては、ＳＯＸ１７、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のいくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ７マーカー遺伝子より高いレベルでＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現する。さらに、いくつかの実施形態においては、ＣＸＣＲ４マーカー遺伝子の発現が、ＯＣＴ４マーカー遺伝子の発現より多い。本発明の他の実施形態において、胚体内胚葉細胞は、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣまたはトロンボモジュリン（ＴＭ）マーカー遺伝子より高いレベルでＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現する。本発明のある実施形態において、本明細書に記載されている方法により作製される、ＣＸＣＲ４を発現する胚体内胚葉細胞は、有意水準または量のＰＤＸ１を発現しない（ＰＤＸ１陰性）。
当然のことながら、内胚葉細胞におけるＣＸＣＲ４の発現が、ＳＯＸ１７の発現を妨げることはない。従って、本発明のいくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７およびＣＸＣＲ４マーカー遺伝子のいずれも、ＳＯＸ７マーカー遺伝子より高いレベルで発現するものである。さらに、いくつかの実施形態においては、ＳＯＸ１７およびＣＸＣＲ４マーカー遺伝子の両方の発現が、ＯＣＴ４マーカー遺伝子の発現より多い。本発明の他の実施形態において、胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７およびＣＸＣＲ４マーカー遺伝子のいずれも、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣまたはトロンボモジュリン（ＴＭ）マーカー遺伝子より高いレベルで発現する。本発明のある実施形態において、本明細書に記載されている方法により作製される、ＳＯＸ１７／ＣＸＣＲ４を発現する胚体内胚葉細胞は、有意水準または量のＰＤＸ１を発現しない（ＰＤＸ１陰性）。
当然のことながら、ＳＯＸ１７および／またはＣＸＣＲ４マーカーの発現は、分化条件により、胚体内胚葉細胞内において様々なレベルで誘導される。そのため、本発明のいくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞または細胞集団におけるＳＯＸ１７マーカーおよび／またはＣＸＣＲ４マーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞または細胞集団、例えば、多能性幹細胞におけるＳＯＸ１７マーカーおよび／またはＣＸＣＲ４マーカーの発現より少なくとも約２倍から少なくとも約１万倍多い。本発明の他の実施形態において、胚体内胚葉細胞または細胞集団におけるＳＯＸ１７マーカーおよび／またはＣＸＣＲ４マーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞または細胞集団、例えば、多能性幹細胞におけるＳＯＸ１７マーカーおよび／またはＣＸＣＲ４マーカーの発現より、少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約２５００倍、少なくとも約５０００倍、少なくとも約７５００倍、または少なくとも約１０，０００倍多い。いくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞または細胞集団におけるＳＯＸ１７マーカーおよび／またはＣＸＣＲ４マーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞または細胞集団、例えば、多能性幹細胞におけるＳＯＸ１７マーカーおよび／またはＣＸＣＲ４マーカーの発現よりはるかに多い。
当然のことながら、本発明のいくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞または細胞集団におけるＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１からなる群から選択されるマーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞または細胞集団におけるＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１の発現に比べ増加する。
また、当然のことながら、胚体内胚葉細胞における、ＳＯＸ１７マーカーの発現量と、Ｏ
ＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭおよび／またはＳＯＸ７マーカーの発現量との間には、広範な差がある。同様に、胚体内胚葉細胞における、ＣＸＣＲ４マーカーの発現量と、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭおよび／またはＳＯＸ７マーカーの発現量との間には、広範な差異が存在する。そのため、本発明のいくつかの実施形態において、ＳＯＸ１７マーカーまたはＣＸＣＲ４マーカーの発現は、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭおよび／またはＳＯＸ７マーカーの発現より、少なくとも約２倍から少なくとも約１万倍多い。本発明の他の実施形態において、ＳＯＸ１７マーカーまたはＣＸＣＲ４マーカーの発現は、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭおよび／またはＳＯＸ７マーカーの発現より、少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約２５００倍、少なくとも約５０００倍、少なくとも約７５００倍または少なくとも約１００００倍多い。いくつかの実施形態においては、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭおよび／またはＳＯＸ７マーカーが、胚体内胚葉細胞において著しく発現することはない。
当然のことながら、本発明のいくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞におけるＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１からなる群から選択されるマーカーの発現は、胚体内胚葉細胞におけるＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭおよび／またはＳＯＸ７の発現に比べ増加する。
【０００９】
胚体内胚葉を含む組成物
本発明のいくつかの態様は、幹細胞などの多能性細胞と胚体内胚葉細胞のいずれをも含む細胞集団および細胞培養物などの組成物に関する。例えば、本明細書に記載されている方法を用いて、ｈＥＳＣおよび胚体内胚葉細胞の混合物を含む組成物を作製することができる。いくつかの実施形態においては、多能性細胞約９５個につき、少なくとも約５個の胚体内胚葉細胞を含む組成物が作製される。他の実施形態においては、多能性細胞約５個につき、少なくとも約９５個の胚体内胚葉細胞を含む組成物が作製される。さらに、多能性細胞に対する胚体内胚葉細胞の比率がその他の比率である組成物が検討される。例えば、多能性細胞約１００万個につき、少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、多能性細胞約１０万個につき、少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、多能性細胞約１万個につき、少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、多能性細胞約１０００個につき、少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、多能性細胞約５００個につき、少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、多能性細胞約１００個につき、少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、多能性細胞約１０個につき、少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、多能性細胞約５個につき、少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、多能性細胞約２個につき、少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、多能性細胞約１個につき、少なくとも約２個の胚体内胚葉細胞、多能性細胞約１個につき、少なくとも約５個の胚体内胚葉細胞、多能性細胞約１個につき、少なくとも約１０個の胚体内胚葉細胞、多能性細胞約１個につき、少なくとも約２０個の胚体内胚葉細胞、多能性細胞約１個につき、少なくとも約５０個の胚体内胚葉細胞、多能性細胞約１個につき、少なくとも約１００個の胚体内胚葉細胞、多能性細胞約１個につき、少なくとも約１０００個の胚体内胚葉細胞、多能性細胞約１個につき、少なくとも約１万個の胚体内胚葉細胞、多能性細胞約１個につき、少なくとも約１０万個の胚体内胚葉細胞、および多能性細胞約１個につき、少なくとも約１００万個の胚体内胚葉細胞を含む組成物が検討される。本発明のいくつかの実施形態において、多能性細胞は、ヒト多能性幹細胞である。ある実施形態において、幹細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊または胚の生殖隆起に由来する。他のある実施形態において、多能性細胞は、胚形成期を過ぎて発達した多細胞性構造体の生殖腺または生殖組織に由来する。
本発明のいくつかの態様は、少なくとも約５％から少なくとも約９５％の胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団に関する。いくつかの実施形態において、細胞培養物ま
たは細胞集団は、哺乳類細胞を含む。好適な実施形態において、細胞培養物または細胞集団は、ヒト細胞を含む。例えば、ある特定の実施形態は、ヒト細胞を含む細胞培養物に関し、このヒト細胞の少なくとも約５％から少なくとも約９５％が、胚体内胚葉細胞である。本発明の他の実施形態は、ヒト細胞を含む細胞培養物に関し、このヒト細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または９０％より多くが、胚体内胚葉細胞である。
本発明の更なる実施形態は、ヒト胚体内胚葉細胞などのヒト細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物に関するものであり、ＳＯＸ１７またはＣＸＣＲ４マーカーのいずれかの発現が、ヒト細胞の少なくとも約５％において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）および／またはＳＯＸ７マーカーの発現より多い。他の実施形態においては、ＳＯＸ１７またはＣＸＣＲ４マーカーのいずれかの発現が、ヒト細胞の少なくとも約１０％において、ヒト細胞の少なくとも約１５％において、ヒト細胞の少なくとも約２０％において、ヒト細胞の少なくとも約２５％において、ヒト細胞の少なくとも約３０％において、ヒト細胞の少なくとも約３５％において、ヒト細胞の少なくとも約４０％において、ヒト細胞の少なくとも約４５％において、ヒト細胞の少なくとも約５０％において、ヒト細胞の少なくとも約５５％において、ヒト細胞の少なくとも約６０％において、ヒト細胞の少なくとも約６５％において、ヒト細胞の少なくとも約７０％において、ヒト細胞の少なくとも約７５％において、ヒト細胞の少なくとも約８０％において、ヒト細胞の少なくとも約８５％において、ヒト細胞の少なくとも約９０％において、ヒト細胞の少なくとも約９５％においてまたは９５％を超えるヒト細胞において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭおよび／またはＳＯＸ７マーカーの発現より多い。
当然のことながら、本発明のいくつかの実施形態は、ヒト胚体内胚葉細胞などのヒト細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物に関するものであり、ＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１からなる群から選択される一以上のマーカーの発現は、ヒト細胞の少なくとも約５％から少なくとも約９５％を超えるヒト細胞において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭおよび／またはＳＯＸ７マーカーの発現より多い。
本発明のさらに別の実施形態は、ヒト胚体内胚葉細胞などのヒト細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物に関するものであり、ＳＯＸ１７とＣＸＣＲ４マーカーの両方の発現が、ヒト細胞の少なくとも約５％において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭおよび／またはＳＯＸ７マーカーの発現より多い。他の実施形態においては、ＳＯＸ１７とＣＸＣＲ４マーカーの両方の発現が、ヒト細胞の少なくとも約１０％において、ヒト細胞の少なくとも約１５％において、ヒト細胞の少なくとも約２０％において、ヒト細胞の少なくとも約２５％において、ヒト細胞の少なくとも約３０％において、ヒト細胞の少なくとも約３５％において、ヒト細胞の少なくとも約４０％において、ヒト細胞の少なくとも約４５％において、ヒト細胞の少なくとも約５０％において、ヒト細胞の少なくとも約５５％において、ヒト細胞の少なくとも約６０％において、ヒト細胞の少なくとも約６５％において、ヒト細胞の少なくとも約７０％において、ヒト細胞の少なくとも約７５％において、ヒト細胞の少なくとも約８０％において、ヒト細胞の少なくとも約８５％において、ヒト細胞の少なくとも約９０％において、ヒト細胞の少なくとも約９５％においてまたは９５％を超えるヒト細胞において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭおよび／またはＳＯＸ７マーカーの発現より多い。
当然のことながら、本発明のいくつかの実施形態は、ヒト胚体内胚葉細胞などのヒト細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物に関するものであり、ＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１マーカーの発現は、ヒト細胞の少なくとも約５％から少なくとも約９
５％を超えるヒト細胞において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭおよび／またはＳＯＸ７マーカーの発現より多い。
本発明の更なる実施形態は、ヒト内胚葉細胞などの哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物に関するものであり、ＳＯＸ１７またはＣＸＣＲ４マーカーいずれかの発現は、内胚葉細胞の少なくとも約５％において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭおよび／またはＳＯＸ７マーカーの発現より多い。他の実施形態において、ＳＯＸ１７またはＣＸＣＲ４マーカーいずれかの発現は、内胚葉細胞の少なくとも約１０％において、内胚葉細胞の少なくとも約１５％において、内胚葉細胞の少なくとも約２０％において、内胚葉細胞の少なくとも約２５％において、内胚葉細胞の少なくとも約３０％において、内胚葉細胞の少なくとも約３５％において、内胚葉細胞の少なくとも約４０％において、内胚葉細胞の少なくとも約４５％において、内胚葉細胞の少なくとも約５０％において、内胚葉細胞の少なくとも約５５％において、内胚葉細胞の少なくとも約６０％において、内胚葉細胞の少なくとも約６５％において、内胚葉細胞の少なくとも約７０％において、内胚葉細胞の少なくとも約７５％において、内胚葉細胞の少なくとも約８０％において、内胚葉細胞の少なくとも約８５％において、内胚葉細胞の少なくとも約９０％において、内胚葉細胞の少なくとも約９５％において、または９５％を超える内胚葉細胞において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭおよび／またはＳＯＸ７マーカーの発現より多い。
当然のことながら、本発明のいくつかの実施形態は、哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物に関するものであり、ＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１からなる群から選択される一以上のマーカーの発現が、内胚葉細胞の少なくとも約５％から少なくとも約９５％を超える内胚葉細胞において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭおよび／またはＳＯＸ７マーカーの発現より多い。
本発明のさらに他の実施形態は、ヒト内胚葉細胞などの哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物に関するものであり、ＳＯＸ１７とＣＸＣＲ４マーカーの両方の発現が、内胚葉細胞の少なくとも約５％において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭおよび／またはＳＯＸ７マーカーの発現より多い。他の実施形態においては、ＳＯＸ１７とＣＸＣＲ４マーカーの両方の発現が、内胚葉細胞の少なくとも約１０％において、内胚葉細胞の少なくとも約１５％において、内胚葉細胞の少なくとも約２０％において、内胚葉細胞の少なくとも約２５％において、内胚葉細胞の少なくとも約３０％において、内胚葉細胞の少なくとも約３５％において、内胚葉細胞の少なくとも約４０％において、内胚葉細胞の少なくとも約４５％において、内胚葉細胞の少なくとも約５０％において、内胚葉細胞の少なくとも約５５％において、内胚葉細胞の少なくとも約６０％において、内胚葉細胞の少なくとも約６５％において、内胚葉細胞の少なくとも約７０％において、内胚葉細胞の少なくとも約７５％において、内胚葉細胞の少なくとも約８０％において、内胚葉細胞の少なくとも約８５％において、内胚葉細胞の少なくとも約９０％において、内胚葉細胞の少なくとも約９５％、または９５％を越える内胚葉細胞において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭおよび／またはＳＯＸ７マーカーの発現より多い。
当然のことであるが、本発明のいくつかの実施形態は、哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物に関するものであり、ＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１マーカーの発現は、内胚葉細胞の少なくとも約５％から少なくとも約９５％を超える内胚葉細胞において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭおよび／またはＳＯＸ７マーカーの発現より多い。
本明細書に記載されている方法を用いて、胚体内胚葉細胞を含み、実質的に他の細胞型を含まない組成物を作製することができる。細胞培養物または細胞集団内の細胞に関して、「実質的に含まない」という表現は、細胞培養物または細胞集団が含まない特定の細胞型が、細胞培養物または細胞集団に存在する細胞総数の約５％未満の量で存在することを意味する。本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に記載されている方法により作
製される胚体内胚葉細胞集団または細胞培養物は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ、ＴＭ、ＺＩＣ１またはＢＲＡＣＨマーカー遺伝子を著しく発現する細胞を実質的に含まない。
本発明の一実施形態において、マーカー遺伝子の発現に基づいて胚体内胚葉細胞を表した場合、ＳＯＸ１７高、ＭＩＸＬ１高、ＡＦＰ低、ＳＰＡＲＣ低、トロンボモジュリン低、ＳＯＸ７低、ＣＸＣＲ４高となる。
【００１０】
胚体内胚葉の濃縮、分離および／または精製
本発明のさらなる態様に関して、胚体内胚葉細胞は、そのような細胞に特異な親和性標識を使用することにより、濃縮、分離および／または精製することができる。胚体内胚葉細胞に特異な親和性標識の例としては、胚体内胚葉細胞の細胞表面には存在するが、本明細書に記載されている方法により作製される細胞培養物において見られる他の細胞型には実質的に存在しないポリペプチドなどのマーカー分子に特異的な抗体、リガンドまたは他の結合剤が挙げられる。いくつかの実施形態においては、ＣＸＣＲ４に結合する抗体が、胚体内胚葉細胞の濃縮、分離または精製のための親和性標識として使用される。また、他の実施形態においては、ケモカインＳＤＦ−１または他のＳＤＦ−１系分子も、親和性標識として使用することができる。そのような分子としては、ＳＤＦ−１断片、ＳＤＦ−１融合物、またはＳＤＦ−１模倣物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
抗体を作製する方法、およびそれらを細胞分離に使用する方法は、当技術分野において周知であり、そのような方法は、本明細書に記載されている細胞や抗体を用いて実施することができる。一実施形態において、ＣＸＣＲ４に結合する抗体は、電磁ビーズに付着させた後、細胞間および基質接着性を低下させるよう酵素的に処理した細胞培養物中の胚体内胚葉細胞に結合させる。そして、細胞／抗体／ビーズ複合体を、ビーズ結合胚体内胚葉細胞を非結合細胞から分離するために使用する変動磁界に曝す。一旦、胚体内胚葉細胞を培養物中の他の細胞から物理的に分離すると、抗体結合を破壊し、その細胞を適切な組織培養培地に再度蒔き培養する。
本発明の実施形態において、濃縮、分離または精製された胚体内胚葉細胞培養物または集団を得る更なる方法を検討する。例えば、いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ４抗体は、細胞間および基質接着性を低下させるよう処理された胚体内胚葉含有細胞培養物と共に培養される。その後、細胞を洗浄し、遠心分離し、再懸濁させる。そして、細胞懸濁液を、一次抗体に結合し得るＦＩＴＣ標識抗体などの二次抗体と共に培養する。その後、その細胞を洗浄し、遠心分離し、緩衝液中に再懸濁させる。そして、細胞懸濁液を、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）を用いて分析選別する。ＣＸＣＲ４陽性細胞を、ＣＸＣＲ４陰性細胞とは別に回収することにより、そのような細胞型を分離することができる。必要に応じて、分離された細胞組成物は、親和性を利用した別の方法を利用するか、あるいは胚体内胚葉に特異的な、同じまたは別のマーカーを用いてさらに一連の選別を行なうことにより、さらに精製することができる。
本発明の他の実施形態において、胚体内胚葉は、ＣＸＣＲ４に結合するリガンドまたは他の分子を用いて、濃縮、分離および／または精製される。いくつかの実施例において、その分子は、ＳＤＦ−１、或いはその断片、融合物または模倣物である。
好適な実施形態において、胚体内胚葉細胞は、幹細胞培養物が、胚体内胚葉系列に沿って分化するよう誘導された後、濃縮され、他の非胚体内胚葉細胞から分離および／または精製される。当然のことながら、上記濃縮、分離および精製方法は、分化のどの段階においても、上記のような培養物と共に採用することができる。
また、上述の方法に加え、胚体内胚葉細胞は、細胞を分離する他の技術により分離してもよい。さらに、胚体内胚葉細胞は、前記胚体内胚葉細胞の選択的生存または選択的増殖を促進する増殖条件で、連続継代培養法により濃縮または分離してもよい。
本明細書に記載されている方法を用いて、濃縮、分離および／または精製された組織および／または胚体内胚葉細胞の集団は、少なくともいくらか分化した、幹細胞培養物または集団などの多能性細胞培養物または細胞集団から生体外で作製することができる。いくつ
かの実施形態において、細胞は、ランダムに分化する。しかしながら、好適な実施形態において、細胞は、主として胚体内胚葉に分化するように誘導される。いくつかの好適な濃縮、分離および／または精製方法は、ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉の生体外での作製に関する。本明細書に記載されている方法を用いて、細胞集団または細胞培養物の胚体内胚葉含有量を、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して、少なくとも約２倍から約１０００倍に濃縮することができる。いくつかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して、少なくとも約５倍から約５００倍に濃縮することができる。他の実施形態において、胚体内胚葉細胞は、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して、少なくとも約１０倍から約２００倍まで濃縮することができる。さらに他の実施形態において、胚体内胚葉細胞は、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して、少なくとも約２０倍から約１００倍まで濃縮することができる。さらに他の実施形態において、胚体内胚葉細胞は、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して、少なくとも約４０倍から約８０倍まで濃縮することができる。ある実施形態において、胚体内胚葉細胞は、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して、少なくとも約２倍から約２０倍まで濃縮することができる。
本発明について、一般的に説明してきたが、ある特定の実施例を参照することにより一層理解を深めることができる。それら実施例は、あくまでも説明のみを目的としてここに挙げられており、何ら限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００１１】
以下の実施例の多くは、多能性ヒト細胞の使用について説明している。多能性ヒト細胞の作製方法は、当技術分野において周知であり、米国特許第５，４５３，３５７号明細書、第５，６７０，３７２号明細書、第５，６９０，９２６号明細書、第６，０９０，６２２号明細書、第６，２００，８０６号明細書および第６，２５１，６７１号明細書、並びに米国特許出願公開第２００４／０２２９３５０号明細書を含む多数の科学出版物に記載されており、これらの全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【００１２】
実施例１
ヒトＥＳ細胞
内胚葉発生に関して研究するため、正常な核型を維持しながら、培養物中、一見無制限に分裂可能な、多能性のヒト胚性幹細胞を用いた。ＥＳ細胞は、分離に際し免疫学的または機械的方法のいずれかを使用し、５日目の胚の内部細胞塊から得た。具体的には、患者によるインフォームド・コンセントを得た後、体外受精サイクルの余剰の凍結受精卵から、ヒト胚性幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５を得た。解凍すると同時に、孵化した胚盤胞は、ＥＳ培地（ＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、ＩＴＳサプリメント）において、マウスの胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上に蒔き培養した。胚は培養皿に付着し、約２週間後、未分化ｈＥＳＣの領域を、ＭＥＦを入れた新しい皿に移植した。移植は、機械的に切離し、ディスパーゼを用いて短時間分解し、引き続き細胞クラスターを機械的に除去し、洗浄し、そして再度蒔くことにより行なった。誘導以後、ｈＥＳＣｙｔ−２５は、１００回に渡り連続継代した。胚体内胚葉を作製するための出発物質としてｈＥＳＣｙｔ−２５ヒト胚性幹細胞株を用いた。
当技術分野における当業者にとっては当然のことであるが、幹細胞または他の多能性細胞も、本明細書に記載されている分化方法のための出発物質として使用することができる。例えば、当技術分野において周知の方法により分離することのできる、胚の生殖隆起から得られる細胞を、多能性細胞出発物質として使用することができる。
【００１３】
実施例２
ｈＥＳＣｙｔ−２５特性
ヒト胚性幹細胞株のｈＥＳＣｙｔ−２５は、培養物中において、１８カ月に渡り正常な形態、核型、増殖、および自己複製特性を維持した。この細胞株は、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ−
４およびＴＲＡ−１−６０抗原に対し強い免疫反応を示し、それら全抗原は、未分化ｈＥＳＣに特有なものであり、また、他の樹立したｈＥＳＣ株と同一の形態およびアルカリホスファターゼ活性を示す。さらに、ヒト幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５はまた、懸濁培養をした場合、容易に胚様体（ＥＢ）を形成する。多能性を実証するがごとく、ｈＥＳＣｙＴ−２５は、３つの主要な胚葉に対応する様々な細胞型に分化する。外胚葉の産生は、ＺＩＣ１に関してはＱ−ＰＣＲにより、またネスチンおよびさらに成熟したニューロンマーカーに関しては免疫細胞化学（ＩＣＣ）により立証した。β−ＩＩＩチューブリンの免疫細胞化学的染色が、初期ニューロンの特徴である細長い細胞のクラスターにおいて観察された。先に、レチノイン酸を用いてＥＢを懸濁処理し、多能性幹細胞の、胚外系列の臓側内胚葉（ＶＥ）への分化を誘導した。処理した細胞は、５４時間の処理によりＶＥの二つのマーカーである、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）およびＳＯＸ７を高いレベルで発現した。単層で分化した細胞は、免疫細胞化学的染色により示されるように、弧発的な斑状にＡＦＰを発現した。また、下記に説明するように、ｈＥＳＣｙＴ−２５細胞株は、ＡＦＰが発現することなく、ＳＯＸ１７に対するリアルタイムの定量ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）と免疫細胞化学により確認されるように、胚体内胚葉を形成することもできた。中胚葉への分化を立証するために、いくつかの時点で、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ遺伝子の発現に関し、分化ＥＢを分析した。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現は、実験の間、漸次増加した。上記の点から、ｈＥＳＣｙＴ−２５株は、三つの胚葉に対応する細胞を形成する能力により示されるように、多能性を有する。
【００１４】
実施例３
ＳＯＸ１７抗体の作製
ｈＥＳＣ培養物において胚体内胚葉を同定する上での主要な障害は、適切な手段がないことである。そこで、ヒトＳＯＸ１７タンパク質に対して産生される抗体の作製を行なった。
マーカーＳＯＸ１７は、原腸形成の間に形成されるにつれ、胚体内胚葉全体において発現し、その発現は、器官形成が開始される頃まで、（発現量は、Ａ−Ｐ軸に沿って異なるが）腸管内で維持される。また、ＳＯＸ１７は、胚外内胚葉細胞のサブセットにおいても発現する。中胚葉または外胚葉では、このタンパク質の発現は観察されていない。現在、ＳＯＸ１７は、胚外系列を除外するためにマーカーと併用した場合、胚体内胚葉系列に対する適切なマーカーであることが分かっている。
ここに詳細に説明するように、ＳＯＸ１７抗体は、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞の作製を目的とした、各種処理と分化方法の効果を具体的に調べるのに利用した。また、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣおよびトロンボモジュリンに反応する他の抗体も、臓側および壁側内胚葉（胚外内胚葉）の産生を除外するために使用した。
ＳＯＸ１７に対する抗体を作製するため、ＳＯＸ１７タンパク質（図２）のＣ末端のアミノ酸１７２−４１４（配列番号：２）に対応するヒトのＳＯＸ１７ｃＤＮＡ（配列番号：１）の一部を、抗体製造会社、ＧＥＮＯＶＡＣ社（フライベルク、ドイツ）において、そこで開発された方法により、ラットの遺伝子による免疫化に用いた。遺伝子による免疫化方法は、米国特許第５，８３０，８７６号明細書、第５，８１７，６３７号明細書、第６，１６５，９９３号明細書および第６，２６１，２８１号明細書、並びに国際公開第ＷＯ００／２９４４２号および第ＷＯ９９／１３９１５号に見られ、これらの全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
また、遺伝子による免疫化のための他の適切な方法は、非特許文献にも記載されている。例えば、Ｂａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１６：６１６−６２０、１９９４に、遺伝子免疫化によるモノクローナル抗体の作製（ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）について記載しており、その全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。特定のタンパク質に対して抗体を産生する遺伝子免疫法の具体的な例は、例えば、Ｃｏｓｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．、（１９９８）Ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍ
ｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ ｃａｕｓｅｓ ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ ａｎｄ ａｌｌｏｗｓ ｐｒｏｄ
ｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｎａｔｉｖｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１４５８−
１４６５；Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｇｅｎｅ ｇｕｎ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｒａｐｉｄ 
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ｔｏ ｔｈｅ Ｆｌｔ−３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １７：５６９−５７
６；Ｓｃｈｍｏｌｋｅ ｅｔ ａｌ．、（１９９８）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｇ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ 
ｂｙ Ｅ２−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：４５４１−
４５４５；Ｋｒａｓｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、（１９９９）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ａｎ ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍ
ｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７３：１１９−１
２９；およびＵｌｉｖｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．、（１９９６）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ａ ｄｅｆｉｎｅｄ ｐｏｒｔｉｏｎ 
ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ ｃｙｔｏ
ｔｏｘｉｎ ｂｙ ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５１
：１９１−１９４に見られ、これらの全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
ＳＯＸ７およびＳＯＸ１８は、図３に示す関係系統樹に描かれているように、ＳＯＸ１７に対し最も近いＳｏｘファミリーである。ＳＯＸ１７抗体が、ＳＯＸ１７に特異的であり、尚且つ、その最も近いファミリーメンバーと反応しないことを立証するために、陰性対照として、ヒトのＳＯＸ７ポリペプチドを使用した。具体的には、遺伝子免疫化により作製された抗体が、ＳＯＸ１７に特異的であることを立証するために、ＳＯＸ７および他のタンパク質を、ヒト線維芽細胞において発現させた後、ウェスタンブロットおよびＩＣＣによりＳＯＸ１７抗体との交差反応を分析した。ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７およびＥＧＦＰ発現ベクターの作製、それらのヒト線維芽細胞への形質移入、およびウェスタンブロットによる分析には、例えば、以下の方法を用いた。ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７およびＥＧＦＰの作製に使われた発現ベクターは、それぞれｐＣＭＶ６（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、ロックヴィル、メリーランド州）、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、カリフォルニア州）およびｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社、パロアルト、カリフォルニア州）であった。タンパク質の製造には、テロメラーゼ不死化ＭＤＸヒト線維芽細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、カリフォルニア州）の存在下で、スーパーコイルＤＮＡに一過性に形質移入した。形質移入後３６時間で、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、インディアナポリス、インディアナ州）を含む、５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコール酸塩において、全細胞溶解物を回収した。ＮｕＰＡＧＥ（４〜１２％の勾配ポリアクリルアミド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、エレクトロブロッティングによりＰＤＶＦ膜（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ社、カリフォルニア州）に移植した細胞タンパク質１００μｇのウェスタンブロット分析では、１０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、ミズーリ州）において、１／１０００に希釈したラットのＳＯＸ１７抗血清、引き続き、アルカリホスファターゼ標識抗ラットＩｇＧ（Ａｌｋａｌｉｎｅ 
Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｒａｔ ＩｇＧ）（Ｊａｃｋ
ｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウエスト・グローブ
、ペンシルバニア州）で検出し、ベクターブラックアルカリホスファターゼ染色（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｌａｃｋ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州）により明
らかにした。採用したタンパク質サイズ基準は、広範囲のカラーマーカー（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、ミズーリ州）であった。図４において、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７またはＥＧＦＰ ｃＤＮＡが一過性に形質移入されたヒト線維芽細胞から作製した抽出タンパク質
を、ＳＯＸ１７抗体を用いてウェスタンブロット上で検出した。ｈＳＯＸ１７形質移入細胞からの抽出タンパク質のみが、ヒトのＳＯＸ１７タンパク質の予測分子量４６Ｋｄａに近い５１Ｋｄａまでのバンドを生じさせた。ヒトのＳＯＸ７またはＥＧＦＰ形質移入細胞のいずれかから作られた抽出物に対するＳＯＸ１７抗体の反応は全くなかった。さらに、ＳＯＸ１７抗体は、ｈＳＯＸ１７発現コンストラクトを形質移入されたヒト線維芽細胞の核を明確に標識したが、ＥＧＦＰのみを形質移入された細胞は標識しなかった。このように、ＳＯＸ１７抗体は、ＩＣＣにより特異性を示した。
【００１５】
実施例４
胚体内胚葉のマーカーとしてのＳＯＸ１７抗体の検証
ＳＯＸ１７抗体が、ヒトＳＯＸ１７タンパク質に対して特異的であり、さらには、胚体内胚葉を標識する証拠として、部分的に分化したｈＥＳＣを、ＳＯＸ１７とＡＦＰ抗体で同時標識した。ＳＯＸ遺伝子ファミリーサブグループＦ（図３）の近縁関係にあるメンバーであるＳＯＸ７やＳＯＸ１７およびＡＦＰは、それぞれ臓側内胚葉で発現することが実証されている。しかしながら、ＡＦＰおよびＳＯＸ７は、胚体内胚葉細胞において、ＩＣＣにより検出できるレベルでは発現しないため、本物の胚体内胚葉細胞に対する陰性マーカーとして用いることができる。ＳＯＸ１７抗体は、離散的にグループ化した細胞として存在するか、或いはＡＦＰ陽性細胞と混ざり合う細胞集団を標識することが明らかにされた。特に、図５Ａは、少数のＳＯＸ１７細胞が、ＡＦＰで同時標識されたことを示している。しかしながら、ＳＯＸ１７＋細胞の場にＡＦＰ＋細胞が、殆どまたは全くない領域も見られた（図５Ｂ）。同様に、壁側内胚葉も、ＳＯＸ１７を発現すると報告されているため、壁側マーカーＳＰＡＲＣおよび／またはトロンボモジュリン（ＴＭ）と共にＳＯＸ１７で同時標識している抗体は、壁側内胚葉であるＳＯＸ１７＋細胞を同定するのに使用することができる。図６Ａ〜Ｃに示すように、トロンボモジュリンとＳＯＸ１７とで同時標識された壁側内胚葉細胞は、ｈＥＳ細胞のランダムな分化により産生された。
上記の細胞標識実験から見て、胚体内胚葉細胞は、マーカープロファイルＳＯＸ１７ｈｉ／ＡＦＰｌｏ／［ＴＭｌｏまたはＳＰＡＲＣｌｏ］により同定することができる。すなわち、ＳＯＸ１７マーカーの発現は、臓側内胚葉に特有のＡＦＰマーカーおよび壁側内胚葉に特有のＴＭまたはＳＰＡＲＣマーカーの発現より多い。従って、ＳＯＸ１７に対しては陽性であるが、ＡＦＰおよびＴＭまたはＳＰＡＲＣに対しては陰性である細胞が、胚体内胚葉である。
胚体内胚葉を予測するＳＯＸ１７ｈｉ／ＡＦＰｌｏ／ＴＭｌｏ／ＳＰＡＲＣｌｏマーカープロファイルの特異性の更なる証拠を得るべく、ＳＯＸ１７およびＡＦＰ遺伝子発現を、量的に抗体標識細胞の相対数と比較した。図７Ａに示されているように、レチノイン酸（臓側内胚葉誘導物質）またはアクチビンＡ（胚体内胚葉誘導物質）で処理したｈＥＳＣでは、ＳＯＸ１７ｍＲＮＡの発現量に、１０倍の差が生じた。この結果は、ＳＯＸ１７抗体標識細胞数における１０倍の差を反映していた（図７Ｂ）。さらに、図８Ａに示されているように、ｈＥＳＣのアクチビンＡ処理により、ＡＦＰ遺伝子発現は、処理しなかった場合に比べ６．８倍抑制された。これは、図８Ｂ〜Ｃに示されているように、これらの培養物におけるＡＦＰ標識細胞の数の著しい減少により、視覚的に示された。さらにこれを定量化するために、ＡＦＰ遺伝子発現におけるこの約７倍の減少が、フローサイトメトリーにより測定したＡＦＰ抗体標識細胞数が同様に７倍減少した結果であることが立証された（図９Ａ〜Ｂ）。この結果は、Ｑ−ＰＣＲにより確認される、遺伝子発現における量的変化が、抗体染色により観察される、細胞型の特異性における変化を反映することを示す点
において極めて重要である。
ノーダルファミリーメンバー（ノーダル、アクチビンＡおよびアクチビンＢ−ＮＡＡ）の存在下におけるｈＥＳＣの培養により、ＳＯＸ１７抗体標識細胞は、時間と共に著しく増加した。５日間継続したアクチビン処理により、５０％を超える細胞が、ＳＯＸ１７で標識された（図１０Ａ〜Ｆ）。５日間のアクチビン処理後、ＡＦＰで標識された細胞は、ほとんどまたは全くなかった。
つまり、ヒトのＳＯＸ１７タンパク質のカルボキシ末端２４２アミノ酸に対して産生された抗体は、ウェスタンブロットでヒトのＳＯＸ１７タンパク質を同定したが、その最も近いＳＯＸファミリー類縁体である、ＳＯＸ７は認識しなかった。ＳＯＸ１７抗体は、主としてＳＯＸ１７＋／ＡＦＰｌｏ／−（標識細胞の９５％を超える）である分化ｈＥＳＣ培養物中の細胞の一部、並びにＳＯＸ１７およびＡＦＰ（臓側内胚葉）で同時標識しているわずかなパーセンテージ（＜５％）の細胞も認識した。ｈＥＳＣ培養物のアクチビン処理により、ＳＯＸ１７遺伝子発現およびＳＯＸ１７標識細胞が著しく増加し、ＡＦＰｍＲＮＡの発現やＡＦＰ抗体で標識された細胞の数は著しく抑制された。
【００１６】
実施例５
Ｑ−ＰＣＲ遺伝子発現測定
以下の実験では、ｈＥＳＣ分化に対する様々な処理の効果を調べる主な測定法として、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を採用した。具体的には、遺伝子発現のリアルタイム測定結果を、Ｑ−ＰＣＲにより複数の時点で、複数のマーカー遺伝子に関して分析した。細胞集団の全体的な動態に関する理解を深めるために、望ましいおよび望ましくない細胞型に特有のマーカー遺伝子を評価した。Ｑ−ＰＣＲ分析の長所としては、その感度が極めて高いことや、ゲノム配列が容易に入手可能であるため、必要なマーカーの開発が比較的容易であることが挙げられる。さらに、Ｑ−ＰＣＲの極めて高い感度により、非常に大きな集団内の比較的少数の細胞から遺伝子発現を検出することが可能となる。また、極めて低レベルの遺伝子発現を検出する性能により、その集団内での「分化傾向」が示される。これらの細胞表現型の明らかな分化に先立って、免疫細胞化学技法を用いては、特定の分化経路に沿った傾向を認識することはできない。このため、Ｑ−ＰＣＲは、分化処理の成果を調べる免疫細胞化学技法を少なくとも補完するものであり、尚且つ、その技法より潜在的にはるかに優れた分析方法を提供する。さらに、Ｑ−ＰＣＲは、分析の準ハイスループットスケールでの定量フォーマットにおける分化プロトコルの成果を評価するメカニズムを提供する。
ここで取ったアプローチは、Ｒｏｔｏｒ Ｇｅｎｅ３０００装置（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）でＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎケミストリを用い、且つ、ツーステップＲＴ−ＰＣ
Ｒフォーマットを使用して、相対的な定量化を行うことであった。このようなアプローチにより、将来、更なるマーカー遺伝子を分析するためのｃＤＮＡサンプルを保存することが可能となり、よって、サンプル間の逆転写効率におけるばらつきを避けることができる。
プライマーは、極力、エキソン同士の境界上に位置するか、或いは少なくとも８００ｂｐのイントロンにまたがるように設計した。これは、コンタミしたゲノムＤＮＡからの増幅を排除するように実験的に決定されたものである。イントロンを含まないマーカー遺伝子を採用した場合、またはマーカー遺伝子が偽遺伝子を有する場合、ＲＮＡサンプルのデオキシリボヌクレアーゼＩ処理を行なった。
我々は、細胞サンプルにおける遺伝子発現に関する幅広いプロファイルの説明を提供するために、標的または非標的細胞型の多数のマーカーの遺伝子発現の測定には、通常Ｑ−ＰＣＲを利用した。ｈＥＳＣ分化（具体的には、外胚葉、中胚葉、胚体内胚葉、および胚外内胚葉）の初期段階に関するマーカーで、そのための有効なプライマーセットが入手可能なものを下記表１に挙げている。また、これらのプライマーセットのヒト特異性も立証された。これは、ｈＥＳＣが多くの場合マウス支持細胞層で増殖することから、重要な事である。最も一般的には、それぞれの条件において三組のサンプルを採取し、個別に、各定
量に関連した生物学的変動を評価するためにそれぞれのサンプルを二つずつ分析した。
ＰＣＲテンプレートを作成するために、総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて分離し、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いて定
量した。総ＲＮＡ３５０〜５００ｎｇからの逆転写は、ｏｌｉｇｏ−ｄＴおよびランダムプライマーの混合物を含むｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素キット（ＢｉｏＲａｄ社）を使用して行なった。各２０μＬの反応物は、その後、総量１００μＬまで希釈し、３μＬを、４００ｎＭの順方向および逆方向プライマーと５μＬの２Ｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ社）とを含む、各１０μＬのＱ−ＰＣＲ反応物に使用した。２段階のサイクリングパラメータを使用し、８５〜９４°Ｃ（各プライマーセットの単位複製配列の融解温度によって具体的に選択された）で５秒間の変性と、引き続き、６０°Ｃで４５秒間のアニール／伸長を採用した。蛍光データは、各伸長段階の最後の１５秒間に収集した。３ポイント１０倍希釈シリーズ（ｔｈｒｅｅ ｐｏｉｎｔ、１０−ｆｏｌｄ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｓｅｒｉｅｓ）を、各回ごとに検量線を作成するために使用し、この検量
線に基づいて、サイクル閾値（Ｃｔ）を定量値に変換した。各サンプルの定量化された値を、ハウスキーピング遺伝子能力に対して規準化した後、三組のサンプルに関して平均および標準偏差を計算した。ＰＣＲサイクルの終わりに際し、融解曲線分析を行い、反応物の特異性を確認した。単一の特定産物が、そのＰＣＲ単位複製配列に適したＴｍで単一のピークにより示された。さらに、逆転写酵素なしで行われた反応は、陰性対照としての役目を果たし、増幅しない。
Ｑ−ＰＣＲ法を確立する上での第一段階は、実験系に適したハウスキーピング遺伝子（ＨＧ）を検証することであった。ＲＮＡインプット、ＲＮＡの完全性および逆転写効率に関する全サンプルの規準化にＨＧが使用されるため、規準化が有意であるためには、ＨＧが、全種類のサンプルにおいて、長期に渡り一定レベルで発現することが重要であった。我々は、分化ｈＥＳＣにおいて、サイクロフィリンＧ、ヒポキサンチン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ）、ベータ−２−ミクログロブリン、ヒドロキシメチルビアン（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｂｉａｎｅ）シンターゼ（ＨＭＢＳ）、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）、およびグルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）ベータ（ＧＵＳ）の発現量を測定した。我々の得た結果は、ベータ−２−ミクログロブリンの発現量が、分化するにしたがって上昇することを示した。従って、規準化のためのこの遺伝子の使用は除外した。他の遺伝子は、長時間に渡り、且つ全処理を通して一定の発現量を示した。我々は、通常、サイクロフィリンＧおよびＧＵＳの双方を使用し、全サンプルに関する規準化因子を計算した。多数のＨＧを使用することにより、規準化プロセスに伴う変動性を低減すると同時に、相対的な遺伝子発現値の信頼性を高める。
規準化に使用する遺伝子を得た後、Ｑ−ＰＣＲを使用し、様々な実験処理を施す全サンプルにおいて、多くのマーカー遺伝子の相対的な遺伝子発現量を求めた。使用したマーカー遺伝子を選択したのは、それらが、初期胚葉の典型的な特定集団において濃縮を示すからであり、特に、胚体内胚葉および胚外内胚葉において、特異的に発現する遺伝子グループに集中したためである。これらの遺伝子およびそれらの相対的な濃縮分析結果を、表１に示す。
【表１】
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多くの遺伝子が、一以上の胚葉で発現するため、同一実験において、多くの遺伝子の発現量を定量的に比較することが有益である。ＳＯＸ１７は、胚体内胚葉において発現し、臓側および壁側内胚葉では少しばかり発現する。ＳＯＸ７およびＡＦＰは、この初期発生の時点において臓側内胚葉で発現する。ＳＰＡＲＣおよびＴＭは、壁側内胚葉で発現し、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙは初期中胚葉で発現する。
胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７ｍＲＮＡを高度に発現し、ＡＦＰおよびＳＯＸ７（臓側内胚葉）、ＳＰＡＲＣ（壁側内胚葉）およびＢｒａｃｈｙｕｒｙ（中胚葉）の発現レベルは低いものと予想された。さらに、ＺＩＣ１をここで使用し、初期外胚葉の誘導をさらに排除した。最終的に、ＧＡＴＡ４およびＨＮＦ３ｂが、胚体および胚外内胚葉の両方において発現した。従って、それらは、胚体内胚葉におけるＳＯＸ１７の発現と相関する（表１）。典型的な実験を、図１１〜１４に示している。図１１〜１４は、表１に記載されているマーカー遺伝子が、各種サンプル間でいかに互いに相関しているかを示しており、それにより、胚体内胚葉および胚外内胚葉、並びに中胚葉および神経細胞型に特異的な分化パターンを明示している。
上記のデータから、アクチビン投与量の増加が、ＳＯＸ１７遺伝子発現の増加をもたらしたことは明らかである。さらに、このＳＯＸ１７発現は、主に、胚外内胚葉ではなく胚体内胚葉を示した。この結論は、ＳＯＸ１７遺伝子発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７およびＳＰＡＲＣ遺伝子発現と逆相関にあるという観察結果に基づいている。
【００１７】
実施例６
ヒトＥＳ細胞の胚体内胚葉への誘導分化
ヒトＥＳ細胞培養物は、それらの未分化の状態が能動的に維持されない条件下で培養された場合、ランダムに分化する。この不均一な分化により、壁側および臓側内胚葉（ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣおよびＳＯＸ７発現）の双方からなる胚外内胚葉細胞、並びにＺＩＣ１、ネスチン（外胚葉）およびＢｒａｃｈｙｕｒｙ（中胚葉）の発現によって示される、初期の外胚葉および中胚葉誘導体が産生される。胚体内胚葉細胞の出現は、ＥＳ細胞培養物における特異的な抗体マーカーの欠如により、従来検証または特定されていない。そのため、ＥＳ細胞培養物における初期胚体内胚葉の産生は、あまりよく研究されていない。胚体内胚葉細胞に対するよい抗体試薬の入手が不可能なため、性質決定のほとんどは、外胚葉および胚外内胚葉に集中している。概して、ランダムに分化したＥＳ細胞培養物には、ＳＯＸ１７ｈｉ胚体内胚葉細胞と比較すると、非常に多くの胚外および神経外胚葉細胞型がある。
未分化ｈＥＳＣコロニーは、繊維芽細胞フィーダーの床で増殖するため、コロニーの縁部は、コロニーの内側に存在するそれらの細胞とは異なる別の形態を呈する。これらの外縁細胞の多くは、それほど均一ではなくより大きな細胞体の形態や、ＯＣＴ４の高発現量により識別できる。ＥＳ細胞は、分化し始めると、未分化ＥＳ細胞と比較してＯＣＴ４発現量が増加または減少するとされている。未分化閾（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ 
ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）に対するＯＣＴ４発現量の上下変化は、多能性の状態から脱した分化の初期段階を意味する可能性がある。
未分化のコロニーを、ＳＯＸ１７免疫細胞化学により調べた際、時折ＳＯＸ１７陽性細胞の小さな１０〜１５個の細胞集団が、その周辺のランダムな場所、および未分化のＥＳＣコロニー間の接合部で検出された。上述のように、これらのコロニー外縁に散在したポケットは、コロニーがサイズ的に大きくなり、より多くなるにつれ、古典的ＥＳＣ形態とは異なった分化をする最初の細胞の数個となるようであった。若くて小さな完全に未分化のコロニー（＜１ｍｍ；４〜５日目）は、コロニー内または縁部においてＳＯＸ１７陽性細胞は全く見られなかった。一方、古くて大きいコロニー（直径１〜２ｍｍ、＞５日目）には、いくつかのコロニーの周辺、または先に説明した古典的ｈＥＳＣ形態とは異なって分化した縁部の内側の領域において、散在し孤立した斑状のＳＯＸ１７陽性ＡＦＰ陰性細胞があった。これが有効なＳＯＸ１７抗体の最初の発生であったとすれば、そのような初期の「未分化」ＥＳＣ培養物で発生する胚体内胚葉細胞は、これまで立証されたことはない。
Ｑ−ＰＣＲによるＳＯＸ１７およびＳＰＡＲＣ遺伝子発現量の逆相関に基づくと、大部分のＳＯＸ１７陽性ＡＦＰ陰性細胞は、抗体同時標識により壁側マーカーに対し陰性を示すであろう。これは、図１５Ａ〜Ｂで示されているように、ＴＭを発現している壁側内胚葉細胞に関して明確に立証された。ノーダル因子アクチビンＡおよびＢへの暴露により、ＴＭ発現強度およびＴＭ陽性細胞数は著しく減少した。アクチビン処理培養物におけるＳＯＸ１７、ＡＦＰおよびＴＭ抗体を用いた三重標識により、ＡＦＰおよびＴＭに対しても陰性であったＳＯＸ１７陽性細胞のクラスターが観察された（図１６Ａ〜Ｄ）。これらは、分化ＥＳＣ培養物におけるＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞の最初の細胞を示すものである（図１６Ａ〜Ｄおよび図１７）。
上述のＳＯＸ１７抗体およびＱ−ＰＣＲのツールを使用し、ＳＯＸ１７ｈｉ／ＡＦＰｌｏ／ＳＰＡＲＣ／ＴＭｌｏ胚体内胚葉細胞になるようにＥＳＣを効果的にプログラムミングすることのできる数々の手法を調べた。我々は、ＳＯＸ１７遺伝子発現に関するＱ−ＰＣＲによる集団レベルと、ＳＯＸ１７タンパク質の抗体標識による個々の細胞レベルとで測定した、これら細胞の数および増殖能力を増強することを目的とした様々な分化手順を適用した。
生体外の細胞培養物において胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞を作製する際に使用する、ノーダル／アクチビン／ＢＭＰなどのＴＧＦβファミリー増殖因子の効果を分析し、説明したのは、我々が初めてであった。典型的な実験では、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰまたはそれら増殖因子の組み合わせを、未分化ヒト幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５の培養物に添加し、分化プロセスを開始させた。
図１９に示されているように、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを添加したところ、分化開始後４日目までに、未分化ｈＥＳＣに対し、１９倍のＳＯＸ１７遺伝子発現の誘導が起きた。アクチビンファミリーの第二のメンバーであるアクチビンＢをアクチビンＡと共に添加したところ、混合アクチビン処理後４日目までに未分化ｈＥＳＣに対し、３７倍の誘導が起きた。最後に、ノーダル／アクチビンおよびＢＭＰサブグループＢＭＰ４からＴＧＦβファミリー第三のメンバーを、アクチビンＡおよびアクチビンＢと共に添加したところ、発光量比は未分化ｈＥＳＣの５７倍まで増加した（図１９）。アクチビンおよびＢＭＰを用いたＳＯＸ１７の誘導を、因子無添加培地である対照と比較した場合、４日目の時点で、５倍、１０倍および１５倍の誘導が起きていた。アクチビンＡ、ＢおよびＢＭＰを用いた三重処理後５日目までに、ＳＯＸ１７は、ｈＥＳＣに比べ７０倍を超えて誘導された。これらのデータは、ノーダル／アクチビンＴＧＦβファミリーメンバーの高投与量お
よび長時間処理により、ＳＯＸ１７発現が増加することを示している。
ノーダルおよび関連分子アクチビンＡ、ＢおよびＢＭＰは、生体内または生体外における胚体内胚葉形成およびＳＯＸ１７の発現を促進する。さらに、ＢＭＰを添加することにより、ＳＯＸ１７の誘導が高まるが、これはおそらく、ノーダルコレセプターであるクリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）の更なる誘導によるものであろう。
我々は、ＢＭＰ４とアクチビンＡおよびＢの組み合わせにより、ＳＯＸ１７の誘導、引いては、胚体内胚葉形成が、相加的に増強されることを立証した。アクチビンＡおよびＢとの組み合わせで、長時間（＞４日）ＢＭＰ４を添加していると、壁側および臓側内胚葉、並びに胚体内胚葉においてＳＯＸ１７が誘導されることもある。したがって、本発明のいくつかの実施形態において、添加４日以内に、前記処理においてＢＭＰ４を除くことが大切である。
個々の細胞レベルでＴＧＦβ因子を用いた処理の効果を求めるため、ＳＯＸ１７抗体標識を使用し、ＴＧＦβ因子添加の経時変化を調べた。先に図１０Ａ〜Ｆで示したように、ＳＯＸ１７標識細胞の相対数は、時間と共に著しく増加した。相対的に定量化（図２０）した場合、ＳＯＸ１７標識細胞は、２０倍を超える増加を示している。この結果は、細胞数およびＳＯＸ１７遺伝子発現量のいずれも、ＴＧＦβ因子への暴露時間とともに増加していることを示している。図２１に示されているように、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびＢＭＰ４への暴露４日後、ＳＯＸ１７誘導のレベルは、未分化ｈＥＳＣの１６８倍に到達した。また、図２２は、ＳＯＸ１７陽性細胞の相対数もまた、投与量に依存していたことを示している。アクチビンＡの投与量が１００ｎｇ／ｍＬ以上である場合、ＳＯＸ１７遺伝子発現および細胞数を強力に誘導することができた。
ＴＧＦβファミリーメンバーに加えて、Ｗｎｔ分子ファミリーが、胚体内胚葉の特異化および／または維持に役立つ場合もある。アクチビンのみで処理したサンプルに対し、アクチビンとＷｎｔ３ａとを用いて処理したサンプルにおいて、ＳＯＸ１７遺伝子発現が増加したことにより示されているように、Ｗｎｔ分子の使用も、ｈＥＳＣを胚体内胚葉に分化させるのに有益であった（図２３）。
上記実験の全ては、添加因子と共に１０％の血清を含む組織培養培地を使用して行なった。驚くべきことに、図２４Ａ〜Ｃに示されているように、血清濃度が、添加アクチビンの存在下におけるＳＯＸ１７発現量に影響を及ぼすことを発見した。血清レベルを１０％から２％に低下させた場合、ＳＯＸ１７発現は、アクチビンＡおよびＢの存在下、３倍になった。
最後に、図２５Ａ〜Ｄに示したように、アクチビンにより誘導されたＳＯＸ１７＋細胞が、培養物中において分離することを立証した。矢印は、ＰＣＮＡ／ＤＡＰＩで標識された有糸分裂プレートパターン（ｍｉｔｏｔｉｃ ｐｌａｔｅ ｐａｔｔｅｒｎ）および位相差有糸分裂プロファイル（ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｉｔｏｔｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅ
）からも明らかなように有糸分裂中のＳＯＸ１７／ＰＣＮＡ／ＤＡＰＩで標識された細胞を示す。
【００１８】
実施例７
ケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）発現は、中胚葉、外胚葉または臓側内胚葉用のマーカーではなく、胚体内胚葉用マーカーと相関する
上述のごとく、ＴＧＦβファミリー、より具体的には、アクチビン／ノーダルサブファミリーのサイトカインの適用により、ＥＳＣは胚体内胚葉細胞層に分化すべく誘導される。さらに、分化培養培地におけるウシ胎児血清（ＦＢＳ）の割合が、ＥＳＣからの胚体内胚葉分化の効率に影響することを明らかにした。この影響とは、培地においてアクチビンＡが所定の濃度である場合、ＦＢＳレベルが高くなると、胚体内胚葉への最大分化が阻害されるというものである。外因性アクチビンＡの不在下では、胚体内胚葉系列へのＥＳＣの分化は非常に非効率的であり、ＦＢＳ濃度がＥＳＣの分化プロセスに及ぼす影響は、かなり緩やかである。
これらの実験では、ｈＥＳＣは、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを含むまたは含まない、
０．５％、２．０％または１０％のＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地（インビトロゲン社、カールスバッド、カリフォルニア州；カタログ番号６１８７０−０３６）で６日間増殖させることにより分化させた。さらに、分化の最初３日間は、アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍＬと併せて、０．５％から２．０％の範囲のＦＢＳ勾配も採用した。６日後、各培養条件の複製サンプルを収集し、リアルタイム定量ＰＣＲにより相対的遺伝子発現を分析した。残りの細胞は、ＳＯＸ１７タンパク質の免疫蛍光検出用に準備した。
ＣＸＣＲ４の発現量は、使用した７つの培養条件により、著しく変化した（図２６）。一般に、ＣＸＣＲ４発現量は、アクチビンＡで処理した培養物で多く（Ａ１００）、外因性アクチビンＡを入れなかった培養物では少なかった（ＮＦ）。さらに、Ａ１００で処理した培養物において、ＣＸＣＲ４発現は、ＦＢＳ濃度が最も低い時、最も高かった。相対的発現がアクチビンＡを加えなかった状態（ＮＦ）にむしろ近いほど、１０％ＦＢＳの条件下でＣＸＣＲ４レベルは著しく低下した。
上述のごとく、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１およびＨＮＦ３β遺伝子の発現は、胚体内胚葉としての細胞の特性と一致する。７つの分化条件の全てにおいて、これら４つの遺伝子の相対的発現は、ＣＸＣＲ４のそれと酷似している（図２７Ａ〜Ｄ）。これは、ＣＸＣＲ４も、胚体内胚葉のマーカーであることを示している。
外胚葉および中胚葉系列は、それらの各種マーカーの発現により胚体内胚葉と識別される。初期中胚葉は、ＢｒａｃｈｙｕｒｙおよびＭＯＸ１遺伝子を発現し、一方、新生神経外胚葉はＳＯＸ１およびＺＩＣ１を発現する。図２８Ａ〜Ｄは、外因性アクチビンＡを添加しなかった培養物が、中胚葉および外胚葉遺伝子の発現で選択的に濃縮され、アクチビンＡで処理した培養物の中では、１０％のＦＢＳ条件においても、中胚葉および外胚葉マーカー発現のレベルが増加したことを示している。これらの発現パターンは、ＣＸＣＲ４とは逆であり、ＣＸＣＲ４が、この発生時期においてＥＳＣ由来の中胚葉または外胚葉ではあまり発現しないことを明らかにした。
哺乳類発生の初期、胚外系列への分化も起こる。ここで特に関連性があるのは、ＳＯＸ１７を含む、胚体内胚葉と共通の多くの遺伝子の発現を共有する臓側内胚葉の分化である。胚体内胚葉を胚外臓側内胚葉と識別するためには、これら二つの間で異なったマーカーを調べなくてはならない。ＳＯＸ７は、臓側内胚葉では発現するが、胚体内胚葉系列では発現しないマーカーの代表である。よって、ＳＯＸ７発現の不在下で、強度のＳＯＸ１７遺伝子発現を示す培養状態は、臓側内胚葉ではなく、胚体内胚葉を含む傾向にある。ＳＯＸ７はアクチビンＡを加えなかった培養物で高度に発現しており、また、ＳＯＸ７はＦＢＳが１０％含まれたときアクチビンＡの存在下でも発現の増加を示したことが、図２８Ｅに示されている。このパターンは、ＣＸＣＲ４の発現パターンとは逆であることから、ＣＸＣＲ４が、臓側内胚葉では高度に発現されないことを示唆している。
上記各分化条件下で存在するＳＯＸ１７免疫反応（ＳＯＸ１７＋）細胞の相対数も求めた。ｈＥＳＣを、高用量アクチビンＡの存在下、低ＦＢＳ濃度（０．５％〜２．０％）で分化させた場合、ＳＯＸ１７＋細胞は、培養物全体に渡り偏在的に分布した。高用量アクチビンＡを使用するが、含まれるＦＢＳが１０％（ｖ／ｖ）である場合、ＳＯＸ１７＋細胞の出現頻度はかなり低く、培養物全体に渡り均等に分布するのではなく、常に孤立したクラスターとして出現した（図２９ＡおよびＣ並びにＢおよびＥ）。外因性アクチビンＡを使用しなかった場合、ＳＯＸ１７＋細胞の更なる減少が見られた。これらの条件下でも、ＳＯＸ１７＋細胞は、クラスターとして出現した。これらクラスターは、高容量アクチビンＡ、低濃度ＦＢＳで処理した場合に見られるものより小さく、はるかにまれであった（図２９ＣおよびＦ）。これらの結果は、ＣＸＣＲ４の発現パターンが、胚体内胚葉遺伝子発現と一致しているだけでなく、各条件下における胚体内胚葉細胞の数とも一致していることを立証している。
【００１９】
実施例８
胚体内胚葉で濃縮する分化条件は、ＣＸＣＲ４陽性細胞の比率を増加させる
アクチビンＡの投与量も、胚体内胚葉がＥＳＣから誘導される効率に影響を及ぼす。この
実施例は、アクチビンＡの投与量増加により、培養物中のＣＸＣＲ４＋細胞の比率が高くなることを実証している。
ｈＥＳＣは、０．５％〜２％ＦＢＳ（分化の最初の３日間で０．５％から１．０％へ、そして２．０％へと増加した）および０、１０または１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ培地で分化させた。７日間分化させた後、細胞を、室温で５分間、２％ 
ＦＢＳおよび２ｍＭ（ＥＤＴＡ）を含みＣａ２＋／Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳにおいて分離させた。細胞は、３５ｕｍのナイロンフィルターを通して濾過し、数を数え、ペレット状にした。ペレットは、少量の５０％のヒト血清／５０％の正常なロバ血清で再懸濁させ、非特異的抗体結合部位を遮断するために氷上で２分間培養した。これに、５０ｕＬ（約１０５個の細胞を含む）につき、１ｕＬのマウス抗ＣＸＣＲ４抗体（アブカム（Ａｂｃａｍ）社、カタログ番号ａｂ１０４０３−１００）を添加し、４５分間氷上で標識化を行なった。細胞を、２％のヒト血清（緩衝液）を含むＰＢＳ５ｍＬを添加することにより洗浄し、ペレット状にした。緩衝液５ｍＬで２回目の洗浄を完了し、その後、細胞は、１０５個の細胞ごとに緩衝液５０ｕＬに再懸濁させた。二次抗体（ＦＩＴＣ標識ロバ抗マウス；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７１５−０９６−１５１
）を、最終濃度５ｕｇ／ｍＬで加え、３０分間標識化し、その後、上述のように緩衝液で二度洗浄した。細胞は緩衝液中、５×１０６個の細胞／ｍＬで再懸濁させ、フローサイトメトリー・コアファシリティー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｃｏｒｅ ｆａｃｉｌｉ
ｔｙ）（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）において、ス
タッフによりＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ社）を使用して分析および選別した。細胞は、リアタイム定量ＰＣＲにより、遺伝子発現解析のために総ＲＮＡを引き続き分離するため、ＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ社）の中に直接回収した。
分化培養培地において、アクチビンＡの投与量が増加するにつれ、フローサイトメトリーにより求めたＣＸＣＲ４＋細胞の数の著しい増加が観察された（図３０Ａ〜Ｃ）。ＣＸＣＲ４＋細胞は、Ｒ４ゲート内にあったものであり、このゲートは、イベントの０．２％がＲ４ゲート内に位置する二次抗体のみの対照を使用して設定した。ＣＸＣＲ４＋細胞数の著しい増加は、アクチビンＡの投与量が増加するにつれて生じた胚体内胚葉遺伝子発現の力強い増加と相関する（図３１Ａ〜Ｄ）。
【００２０】
実施例９
ＣＸＣＲ４陽性細胞の分離により胚体内胚葉遺伝子発現を濃縮し、中胚葉、外胚葉および臓側内胚葉のマーカーを発現する細胞を減少させる
上記実施例８において同定したＣＸＣＲ４＋およびＣＸＣＲ４−細胞を回収し、相対的な遺伝子発現を分析し、母集団の遺伝子発現を同時に測定した。
ＣＸＣＲ４遺伝子発現の相対量は、アクチビンＡの投与量の増加と共に著しく増加した（図３２）。これは、ＣＸＣＲ４＋細胞のアクチビンＡ用量依存的な増加と非常によく相関した（図３０Ａ〜Ｃ）。各集団から分離したＣＸＣＲ４＋細胞が、その集団におけるＣＸＣＲ４遺伝子発現ほぼ全ての原因であったことも明白である。これは、これらの細胞を回収するＦＡＣＳ法の効率の良さを立証している。
遺伝子発現解析は、ＣＸＣＲ４＋細胞に、ＣＸＣＲ４遺伝子発現の大部分のみでなく、胚体内胚葉のマーカーに関する他の遺伝子発現も含まれることを明らかにした。図３１Ａ〜Ｄに示されているように、ＣＸＣＲ４＋細胞は、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＨＮＦ３ＢおよびＭＩＸＬ１に関して、親Ａ１００集団よりもさらに濃縮された。さらに、ＣＸＣＲ４−画分には、これらの胚体内胚葉マーカーに関する遺伝子発現は殆どなかった。また、ＣＸＣＲ４＋およびＣＸＣＲ４−集団は、中胚葉、外胚葉および胚外内胚葉のマーカーに関し逆パターンの遺伝子発現を示した。図３３Ａ〜Ｄは、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＭＯＸ１、ＺＩＣ１およびＳＯＸ７の遺伝子発現に関して、Ａ１００母集団と比較し、ＣＸＣＲ４＋細胞が激減したことを示している。このＡ１００母集団においては、アクチビンＡの投与量が少ないかまたは全くない条件に比べ、これらのマーカーの発現はもともと低かった。これ
らの結果は、高用量アクチビンＡの存在下で分化させたｈＥＳＣからＣＸＣＲ４＋細胞を分離することにより、胚体内胚葉で高度に濃縮され、且つ、実質的に純胚体内胚葉である集団が得られることを明らかにしている。
【００２１】
実施例１０
ＣＸＣＲ４を用いた、細胞集団内の胚体内胚葉細胞の定量化
細胞培養物または細胞集団に存在する胚体内胚葉細胞の比率の定量化を確認するために、ＣＸＣＲ４および胚体内胚葉の他のマーカーを発現している細胞をＦＡＣＳにより分析した。前記比率の定量化は、本明細書において先に求めたもの、並びに、２００３年１２月２３日に出願された、名称「ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ（胚体内胚葉）」
の米国仮特許出願第６０／５３２，００４号明細書において求められたものであり、この全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
上記実施例で説明したような方法を用いて、ｈＥＳＣを分化させ胚体内胚葉を作製した。具体的には、分化細胞培養物において示される収率および純度を増加させるため、培地の血清濃度を以下のように制御した：１日目は０．２％ＦＢＳ、２日目は１．０％ＦＢＳ、そして３〜６日目は２．０％ＦＢＳとした。分化した培養物は、三つの細胞表面エピトープ、Ｅ−カドヘリン、ＣＸＣＲ４、およびトロンボモジュリンを用いて、ＦＡＣＳで分取した。そして、分取した細胞集団は、Ｑ−ＰＣＲにより分析し、胚体および胚外内胚葉並びに他の細胞型に関するマーカーの相対的発現量を求めた。最適に分化した培養物から採取したＣＸＣＲ４分取細胞は、純度９８％を超える胚体内胚葉細胞を分離する結果となった。
表２は、ここで説明した方法を用いてｈＥＳＣから分化させた胚体内胚葉培養物に関するマーカー分析の結果示す。
【表２】
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具体的には、表２は、ＣＸＣＲ４およびＳＯＸ１７陽性細胞（内胚葉）が、細胞培養物中の細胞の７０％〜８０％を占めることを示している。これらのＳＯＸ１７を発現している細胞のうち、２％未満がＴＭ（壁側内胚葉）を発現し、１％未満がＡＦＰ（臓側内胚葉）を発現した。ＳＯＸ１７／ＣＸＣＲ４陽性細胞の比率から、ＴＭ陽性およびＡＦＰ陽性細胞（壁側および臓側内胚葉の合計：３％）の比率を差し引くと、細胞培養物の約６７％から約７７％が胚体内胚葉であったことが分かる。細胞の約１０％は、ｈＥＳＣのマーカーであるＥ−カドヘリン（ＥＣＡＤ）に陽性であり、細胞の約１０〜２０％は他の細胞型であった。
ＦＡＣＳ分離前に得られる分化細胞培養物中の胚体内胚葉の純度は、ＦＢＳ濃度を５〜６日間の分化過程を通して０．５％以下に維持することにより、上記の低血清処理と比較して改善できることが分かった。しかしながら、５〜６日間の分化過程を通して０．５％以下に細胞培養物を維持することは、作製される胚体内胚葉細胞総数を減少させることにもなる。
ここに記載した方法により作製された胚体内胚葉細胞は、それほど分化を伴わず、５０日間を超えてアクチビンの存在下、培養物中に維持し増殖させた。そのような場合、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３βの発現は、培養期間中維持される。さらに、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＺＩＣ１およびＢＲＡＣＨは、これらの培養物において検出されなかった。そのような細胞は、それほど分化を伴わず、実質的に５０日を越えて培養物中で維持し、増殖させることができるようである。
【００２２】
実施例１１
胚体内胚葉細胞の更なるマーカー
以下の実験では、ＲＮＡを、精製した胚体内胚葉およびヒト胚性幹細胞集団から分離した。その後、精製した各集団から得たＲＮＡの遺伝子チップ分析により遺伝子発現を分析した。また、Ｑ−ＰＣＲも行い、胚体内胚葉のマーカーとして、胚体内胚葉では発現するが、胚性幹細胞では発現しない遺伝子の可能性をさらに調査した。
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を、２０％のノックアウト血清リプレースメント、４ｎｇ／ｍＬの組換え型ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、およびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で維持した。ｈＥＳＣは、１００ｎｇ／ｍＬの組換え型ヒトアクチビンＡ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、およびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ培地で５日間培養することにより、胚体内胚葉に分化させた。ＦＢＳの濃度は、以下のように日毎に変化させた：０．１％（一日目）、０．２％（２日目）、２％（３〜５日目）。
遺伝子発現解析用にｈＥＳＣおよび胚体内胚葉の精製集団を得るため、蛍光活性細胞分離法（ＦＡＣＳ）により細胞を分離した。ｈＥＳＣは、ＳＳＥＡ４抗原（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ社、カタログ番号ＦＡＢ１４３５Ｐ）を使用して、胚体内胚葉は、ＣＸＣＲ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＦＡＢ１７０Ｐ）を使用して、免疫精製を行なっ
た。細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号２５３００−０５４）を用いて分離し、２％のヒト血清を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、非特異的結合を遮断するために１０分間氷上で１００％のヒト血清中に再懸濁させた。８００ｕＬのヒト血清中、５×１０６個の細胞に対し、フィコエリトリン標識抗体２００ｕＬを添加することにより、氷上で３０分間染色を行なった。細胞は、ＰＢＳ緩衝液８ｍＬで二度洗浄し、ＰＢＳ緩衝液１ｍＬ中に再懸濁させた。ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇ
ｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのコアファシリティにより、ＦＡＣＳ分離が行われた。細胞は、
ＲＬＴ溶解緩衝液中に直接回収し、ＲＮＡは、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ社）の使用説明に従いＲＮｅａｓｙにより分離した。
アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製プラットフォームおよびＵ１３３ Ｐｌ
ｕｓ ２．０高密度オリゴヌクレオチドアレイを使用し、発現プロファイルデータを作製
するため、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ社（ダラム、ノースカロライナ）に
、精製したＲＮＡを二部提出した。提示されたデータは、ｈＥＳＣおよび胚体内胚葉の２つの集団の間で、特異的に発現した遺伝子を同定する群比較である。ｈＥＳＣにおいて見られた発現量を超えて、力強い上昇変化を示した遺伝子を、胚体内胚葉に極めて特有である新しいマーカー候補として選択した。選択した遺伝子は、上述のように、Ｑ−ＰＣＲにより分析し、遺伝子チップ上で見られる遺伝子発現変化を検証し、またｈＥＳＣが分化する間のこれら遺伝子の発現パターンも調べた。
図３４Ａ〜Ｍは、一定のマーカーに関する遺伝子発現結果を示している。結果は、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの添加後１日目、３日目および５日目に分析した細胞培養物、５日間の分化過程の終わりに精製したＣＸＣＲ４発現胚体内胚葉細胞（ＣＸＤＥ）、および精製ヒト胚性幹細胞（ＨＥＳＣ）について示している。図３４Ｃおよび図３４Ｇ〜Ｍを比較することにより、六つのマーカー遺伝子ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１が、互いにほぼ等しく、またＣＸＣＲ４およびＳＯＸ
１７／ＳＯＸ７の発現パターンとも等しい発現パターンを示すことが立証されている。先に説明したように、ＳＯＸ１７は、胚体内胚葉およびＳＯＸ７発現胚外内胚葉の両方において発現する。ＳＯＸ７は胚体内胚葉で発現しないため、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７の比率により、全体として集団内で見られるＳＯＸ１７発現に対する胚体内胚葉の寄与について信頼性のある推定が得られる。パネルＧ〜ＬおよびＭのパネルＣに対する類似性は、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１が、胚体内胚葉のマーカーである可能性が高く、胚外内胚葉細胞においては著しく発現することはないことを示している。
当然のことながら、ここに記載したＱ−ＰＣＲの結果は、ＩＣＣによりさらに確認することができる。
本明細書に記載した方法、組成物および装置は、好適な実施形態の現時点での代表的および模範的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。当技術分野における当業者は、本発明の精神に包含され、開示内容の範囲により明確にされる変更および他の用途を考え付くこともあろう。よって、種々の代替および変更が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、ここに開示した本発明に帰することは当業者にとっては明らかであろう。
請求項および本開示事項全体に渡って使用されている、「本質的に〜から成る」という表現により、その表現の中に記載されたあらゆる要素を含み、記載されている要素に関する開示において特定した働きあるいは作用を妨げたり寄与したりすることのない他の要素に限定された、あらゆる要素を含むことを意味する。よって、「本質的に〜から成る」という表現は、記載されている要素は必要、すなわち必須であるが、他の要素は任意であり、記載されている要素の働きまたは作用に影響するかどうかによって存在する場合もあれば存在しない場合もあることを示している。
【参考文献】
【００２３】
本特許出願においては、多数の文献および特許参考文献が引用されている。本特許出願において引用された全ての参考文献は、その全内容を引用することにより本明細書の一部とされる。
いくつかの参考文献に関しては、本文中、完全な典拠を記載している。その他の参考文献に関しては、本文中、著者および年度により言及しており、その完全な典拠を以下に示す。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４−１】
2020078342.tif 000038
【図３４−２】
2020078342.tif 000039
【図３４−３】
2020078342.tif 000040
【配列表】
2020078342000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月27日(2020.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＯＸ１７及びＨＮＦ３ｂを発現するヒト胚体内胚葉細胞をインビトロで生成する方法であって、（ａ）ヒト多能性細胞幹細胞の集団を培養し、（ｂ）前記ヒト多能性幹細胞が、ＳＯＸ１７及びＨＮＦ３ｂを発現するヒト内胚葉細胞に分化するのに十分な時間、２％（ｖ／ｖ）以下の血清及び少なくとも３０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含む培地で前記集団を培養することによりヒト多能性幹細胞の集団を分化させ、前記集団に、ＳＯＸ１７及びＨＮＦ３ｂを発現するヒト胚体内胚葉細胞を生成させることを含む、方法。
【請求項２】
培地が、（ａ）ヒト多能性幹細胞の胚体内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な量のＢＭＰ４、又は（ｂ）ヒト多能性幹細胞の胚体内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な量のアクチビンＢをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地中のアクチビンＡの濃度が、約３０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記培地中のアクチビンＢの濃度が、約１０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記培地中のＢＭＰ４の濃度が、約１０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記培地が、ヒト多能性幹細胞の胚体内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な量のＷｎｔファミリーメンバーをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＷｎｔファミリーメンバーがＷｎｔ３Ａである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記のヒト多能性細胞幹細胞の集団が、外胚葉系列由来の細胞を実質的に含まない、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。