(57)【要約】【課題】キメラタンパク質の提供。【解決手段】本発明は、式：Ｃａｓｐ−Ｈｔ１−Ｈｔ２（式中、Ｃａｓｐは、カスパーゼドメインであり；Ｈｔ１は、第１のヘテロ二量体化ドメインであり；Ｈｔ２は、第２のヘテロ二量体化ドメインである）を有するキメラタンパク質であって、一方のキメラタンパク質由来のＨｔ１が、他方のキメラタンパク質由来のＨｔ２とヘテロ二量体化して、前記２つのカスパーゼドメインのホモ二量体化を引き起こすように、二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）の存在下で、相同対の前記キメラタンパク質が相互作用する、キメラタンパク質を提供する。本発明はまた、このようなタンパク質を含む細胞、および養子細胞療法におけるその使用を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、養子細胞療法（ＡＣＴ）に有用なキメラタンパク質に関する。キメラタンパク質は、自殺遺伝子として作用して、キメラタンパク質を発現する細胞を排除することを可能にし得る。本発明はまた、このようなキメラタンパク質をコードする核酸、このような核酸を含む細胞、およびその治療的用途を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
養子細胞療法
養子免疫療法は、確立された発展的治療アプローチである。同種異系造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の状況では、血液学的悪性腫瘍の再発を処置するために、ドナーリンパ球注入（ＤＬＩ）が頻繁に行われる。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、転移性メラノーマの処置に有効である。Ｔ細胞の遺伝子工学は、Ｔ細胞療法の範囲および効力を大きく増加させる：Ｔ細胞受容体移入は、細胞内癌抗原の標的化を可能にする一方、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、表面癌抗原または系統特異的抗原の標的化を可能にする。臨床的応答は、両方のアプローチで観察されており、多数のさらなる試験が進行中である。
【０００３】
養子免疫療法後に、急性有害事象が起こり得る。移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）は、ＤＬＩの一般的かつ深刻な合併症である。操作されたＴ細胞の投与はまた、毒性をもたらした。例えば、メラノーマ抗原に対する天然Ｔ細胞受容体移入研究では、オンターゲットオフ腫瘍毒性が報告されている；腎細胞癌腫抗原炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）に再指向されたＴ細胞は、予想外の肝毒性をもたらした。ＣＤ１９  ＣＡＲ治療後には、免疫活性化症候群が報告されている。最後に、ベクター誘導性挿入突然変異誘発は、リンパ増殖性障害の理論上のリスクをもたらす。これらの毒性の発生率および重症度は、予測不可能である。さらに、治療用タンパク質または小分子（これらの有害事象は、通常、治療薬の半減期を減少させる）とは対照的に、Ｔ細胞は生着および複製し、急激な毒性の増大をもたらす可能性がある。
【０００４】
自殺遺伝子
自殺遺伝子は、許容され得ない毒性に面して、養子移入された細胞（例えば、Ｔ細胞）の選択的な破壊を可能にする、遺伝的にコードされた機構である。臨床研究では、２つの自殺遺伝子：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）および誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）が試験されている。
【０００５】
単純ヘルペスウイルスＩ由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子は、造血幹細胞移植後の再発性悪性腫瘍およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）リンパ球増殖を処置するためのドナーＴ細胞注入において、インビボ自殺スイッチとして使用されている。しかしながら、移植片対宿主病を引き起こすＴ細胞の破壊は不完全であり、ＨＳＶ−ＴＫを活性化するためのプロドラッグとしてのガンシクロビル（または類似体）の使用は、サイトメガロウイルス感染に対する抗ウイルス薬としてのガンシクロビルの投与を妨げる。また、免疫抑制されたヒト免疫不全ウイルス患者および骨髄移植患者においても、ＨＳＶ−ＴＫ指向性の免疫応答は、ＨＳＶ−ＴＫ形質導入細胞の除去をもたらし、注入されたＴ細胞の持続性を損ない、したがって注入されたＴ細胞の効力を損なう。
【０００６】
元のｉＣａｓｐ９分子では、カスパーゼ９の背後にある活性化機構が利用された。カスパーゼ９の活性化に最も必要なことは、カスパーゼ９がホモ二量体化するためのエネルギー障壁を克服することである。ホモ二量体は構造変化を受け、一対の二量体の一方のタンパク質分解ドメインが活性化する。生理学的には、これは、ＡＰＡＦ−１へのカスパーゼ９のＣＡＲＤドメインの結合によって起こる。ｉＣａｓｐ９では、ＡＰＡＦ−１ドメインは、二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）に選択的に結合するように突然変異された改変ＦＫＢＰ１２で置き換えられている。ＣＩＤの存在は、ホモ二量体化および活性化をもたらす。ｉＣａｓｐ９は、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）に融合した改変ヒトカスパーゼ９に基づく（Ｓｔｒａａｔｈｏｆら、（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０５：４２４７−４２５４）。これは、ＡＰ１９０３として公知の小分子ＣＩＤの存在下で、条件付きの二量体化を可能にする。ＡＰ１９０３は実験薬物であり、野生型ＦＫＢＰ１２と相互作用しないので、生物学的に不活性であると考えられる。しかしながら、この薬剤を用いた臨床経験は、非常に少数の患者に限定されている（Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ，Ａら、（２０１１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５，１６７３−１６８３；およびＩｕｌｉｕｃｃｉ，Ｊ．Ｄら、（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１，８７０−８７９）。ＡＰ１９０３はまた、比較的大きな極性分子であり、血液脳関門を通過する可能性が低い。
【０００７】
代替的なアプローチでは、エクセキューショナーカスパーゼは、タバコエッチウイルス（ＴｅＶ）タンパク質分解部位をカスパーゼ３または６または７に導入すること、およびラパマイシンの存在下で組換えられるスプリットＴＥＶプロテアーゼと共発現させることを伴う複雑な戦略を使用して、小分子によって活性化され得る（Ｍｏｒｇａｎら、（２０１４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．５４４：１７９−２１３）。多くの理由により、これは、臨床的に有用な自殺スイッチのための不十分な戦略である：第１に、非常に複雑な３つの別個のタンパク質が必要である：それぞれ、改変カスパーゼおよびスプリットＴｅＶプロテアーゼの２つの成分；第２に、ＴｅＶ成分は異種であり、免疫原性である可能性がある；最後に、この戦略は、下流にあるアピカルカスパーゼよりも低感受性のプロテアーゼ感受性カスパーゼ分子しか活性化することができない。
【０００８】
ＦＡＳのＣＩＤ活性化に基づく自殺遺伝子が記載されている（Ａｍａｒａら、（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０，２６５１−２６５５）。これも活性化をこのＣＩＤに依存しており、アポトーシスカスケードを直接活性化しないので、（ＦＡＳ耐性を介した）回避が可能である。
【０００９】
実験的ＣＩＤの必要性に取って代わる標準医薬品に基づくホモ二量体化系は、魅力的な代替手段であろう。しかしながら、利用可能なホモ二量体化小分子医薬品はない。
【００１０】
他の自殺遺伝子が提案されており、例えば、全長ＣＤ２０は、Ｔ細胞において発現された場合、Ｔ細胞を治療用抗ＣＤ２０抗体リツキシマブによる溶解に対して感受性にし得る（Ｉｎｔｒｏｎａ，Ｍら、（２０００）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１，６１１−６２０）。抗体認識に関するこのテーマでは、さらなる自殺遺伝子も記載されており、例えば、ＲＱＲ８は、Ｔ細胞をＣＤ２０に対して感受性にするが、全長ＣＤ２０分子よりもコンパクトである（Ｐｈｉｌｉｐ，Ｂら、（２０１４）Ｂｌｏｏｄ  ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１４−０１−５４５０２０）；短縮型ＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲｔ）は、細胞を抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂによる溶解に対して感受性にする（Ｗａｎｇ，Ｘら、（２０１１）Ｂｌｏｏｄ  １１８，１２５５−１２６３）；細胞表面上において発現されたｍｙｃエピトープタグは、細胞を抗ｍｙｃ抗体による溶解に対して感受性にする（Ｋｉｅｂａｃｋら、（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５，６２３−６２８）。これらの抗体依存性アプローチの主な限界は、作用する高い局所濃度における治療用抗体のバイオアベイラビリティへの依存性である。例えば、溶解抗体は、巨大病変に対して特に有効ではないことが公知であり、抗体に基づく自殺遺伝子の限界は、高い抗体濃度に達しない場所に常在する細胞が逃れることである。さらに、特定の状況（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞によって誘導される重症マクロファージ活性化症候群またはサイトカインストーム）では、モノクローナル抗体によって誘導されるさらなる免疫活性化は、自殺遺伝子の活性化が処置しようとしている臨床状況に対して有害であり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｔｒａａｔｈｏｆら、（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０５：４２４７−４２５４
【非特許文献２】Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ，Ａら、（２０１１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５，１６７３−１６８３
【非特許文献３】Ｉｕｌｉｕｃｃｉ，Ｊ．Ｄら、（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１，８７０−８７９
【非特許文献４】Ｍｏｒｇａｎら、（２０１４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．５４４：１７９−２１３
【非特許文献５】Ａｍａｒａら、（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０，２６５１−２６５５
【非特許文献６】Ｉｎｔｒｏｎａ，Ｍら、（２０００）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１，６１１−６２０
【非特許文献７】Ｐｈｉｌｉｐ，Ｂら、（２０１４）Ｂｌｏｏｄ  ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１４−０１−５４５０２０
【非特許文献８】Ｗａｎｇ，Ｘら、（２０１１）Ｂｌｏｏｄ  １１８，１２５５−１２６３
【非特許文献９】Ｋｉｅｂａｃｋら、（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５，６２３−６２８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、上記欠点を伴わない代替的な自殺遺伝子が必要である。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
式：
Ｈｔ１−Ｈｔ２−Ｃａｓｐ
（式中、
Ｃａｓｐは、カスパーゼドメインであり；
Ｈｔ１は、第１のヘテロ二量体化ドメインであり；
Ｈｔ２は、第２のヘテロ二量体化ドメインである）を有するキメラタンパク質であって、一方のキメラタンパク質由来のＨｔ１が、他方のキメラタンパク質由来のＨｔ２とヘテロ二量体化して、前記２つのカスパーゼドメインのホモ二量体化を引き起こすように、二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）の存在下で、相同対の前記キメラタンパク質が相互作用する、キメラタンパク質。
（項目２）
Ｈｔ１が、同じキメラタンパク質内のＨｔ２とヘテロ二量体化しない、項目１に記載のキメラタンパク質。
（項目３）
前記カスパーゼドメインが、以下の群：カスパーゼ−８、カスパーゼ−９およびカスパーゼ−１０から選択されるイニシエーターカスパーゼを含む、項目１または２に記載のキメラタンパク質。
（項目４）
前記カスパーゼドメインが、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７から選択されるエクセキューショナーカスパーゼを含む、項目１または２に記載のキメラタンパク質。
（項目５）
一方のヘテロ二量体化ドメインがＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）を含み、他方のヘテロ二量体化ドメインがｍＴＯＲのＦＲＢドメインを含む、先行する項目のいずれかに記載のキメラタンパク質。
（項目６）
Ｈｔ１がＦＲＢを含み、Ｈｔ２がＦＫＢＰを含む、項目５に記載のキメラタンパク質。（項目７）
前記ＣＩＤがラパマイシンまたはラパマイシン類似体である、項目５または６に記載のキメラタンパク質。
（項目８）
カスパーゼドメインと、ｍＴＯＲのＦＲＢドメインを含むヘテロ二量体化ドメインとを含む、キメラタンパク質。
（項目９）
先行する項目のいずれかに記載のキメラタンパク質をコードする、核酸配列。
（項目１０）
１つまたはそれを超える項目９に記載の核酸配列（複数も可）と、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含む、核酸構築物。
（項目１１）
カスパーゼドメインとＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）を含むヘテロ二量体化ドメインとを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列と、項目８に記載のキメラタンパク質をコードする核酸配列とを含む、核酸構築物。
（項目１２）
構造：
Ｈｔ１−Ｃａｓｐ−ｃｏｅｘｐｒ−Ｈｔ２−Ｈｔ２
（式中：
Ｃａｓｐは、カスパーゼドメインをコードする核酸配列であり；
Ｈｔ１は、第１のヘテロ二量体化ドメインをコードする核酸配列であり；
Ｈｔ２は、第２のヘテロ二量体化ドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、Ｈｔ１−ＣａｓｐおよびＨｔ２−Ｈｔ２の共発現を可能にする核酸配列である）を有する核酸構築物であって、
前記核酸構築物の発現が、キメラタンパク質Ｈｔ１−Ｃａｓｐおよびインターフェースタンパク質Ｈｔ２−Ｈｔ２の生産をもたらし、各キメラタンパク質由来のＨｔ１が、前記インターフェースタンパク質由来のＨｔ２ドメインとヘテロ二量体化して、前記２つのカスパーゼドメインのホモ二量体化を引き起こすように、二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）の存在下で、一対の前記キメラタンパク質Ｈｔ１−Ｃａｓｐ９が相互作用する、核酸構築物。（項目１３）
Ｈｔ１がＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）を含み、Ｈｔ２がｍＴＯＲのＦＲＢドメインを含む、項目１２に記載の核酸構築物。
（項目１４）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列も含む、項目１１〜１３のいずれかに記載の核酸構築物。
（項目１５）
項目９に記載の核酸配列または項目１０〜１４のいずれかに記載の核酸構築物を含む、ベクター。
（項目１６）
目的のヌクレオチドも含む項目９に記載の核酸配列を含む、ベクター。
（項目１７）
前記ベクターを標的細胞の形質導入に使用する場合、前記標的細胞が、項目１〜８のいずれかに記載のキメラタンパク質およびキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体を共発現するように、前記目的のヌクレオチドがキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体をコードする、項目１６に記載のベクター。
（項目１８）
項目１〜８のいずれかに記載のキメラタンパク質を発現する、細胞。
（項目１９）
項目７に記載のキメラタンパク質および項目８に記載のキメラタンパク質を含む、項目１６に記載の細胞。
（項目２０）
２つのタンパク質：
Ｈｔ１−ＣａｓｐおよびＨｔ２−Ｈｔ２
（式中、Ｈｔ１−Ｃａｓｐは、カスパーゼドメイン（Ｃａｓｐ）および第１のヘテロ二量体化ドメイン（Ｈｔ１）を含むキメラタンパク質であり；Ｈｔ２−Ｈｔ２は、２つの第２のヘテロ二量体化ドメイン（Ｈｔ２）を含むインターフェースタンパク質である）を発現する細胞であって、
各キメラタンパク質由来のＨｔ１が、前記インターフェースタンパク質由来のＨｔ２ドメインとヘテロ二量体化して、前記２つのカスパーゼドメインのホモ二量体化を引き起こすように、二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）の存在下で、一対の前記キメラタンパク質Ｈｔ１−Ｃａｓｐ９が相互作用する、細胞。
（項目２１）
項目９に記載の核酸配列を含む、項目１８〜２０のいずれかに記載の細胞。
（項目２２）
造血幹細胞、リンパ球またはＴ細胞である、項目１８〜２１のいずれかに記載の細胞。（項目２３）
項目１８〜２２のいずれかに記載の細胞を作製するための方法であって、項目１５〜１７のいずれかに記載のベクターを細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程を含む、方法。
（項目２４）
項目１８〜２２のいずれかに記載の細胞を排除するための方法であって、前記細胞を二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）に曝露する工程を含む、方法。
（項目２５）
前記ＣＩＤがラパマイシンまたはラパマイシン類似体である、項目２４に記載の方法。（項目２６）
被験体における疾患を予防または処置するための方法であって、項目１８〜２２のいずれかに記載の細胞を前記被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目２７）
以下：
（ｉ）項目１５〜１７のいずれかに記載のベクターを、被験体から単離された細胞の試料に形質導入またはトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）前記形質導入／トランスフェクト細胞を患者に投与する工程
を含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
癌を処置するための、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記被験体への項目１８〜２２のいずれかに記載の細胞の投与によって引き起こされる、前記被験体における病理学的免疫反応を予防および／または処置するための方法であって、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体を前記被験体に投与する工程を含む、方法。（項目３０）
前記病理学的免疫反応が、以下の群：移植片対宿主病；オンターゲットオフ腫瘍毒性；免疫活性化症候群；およびリンパ増殖性障害から選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
以下：
（ｉ）項目１８〜２２のいずれかに記載の細胞を前記被験体に投与する工程；
（ｉｉ）病理学的免疫反応の発症について、前記被験体をモニタリングする工程；および（ｉｉｉ）前記被験体が、病理学的免疫反応を発症するまたは発症した兆候を示す場合、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体を前記被験体に投与する工程
を含む、項目２６に記載の被験体における疾患を処置するための方法。
（項目３２）
造血幹細胞移植、リンパ球注入または養子細胞移入に使用するための、項目１８〜２２のいずれかに記載の細胞。
（項目３３）
被験体への項目１８〜２２のいずれかに記載の細胞の投与によって引き起こされる病理学的免疫反応の予防または処置に使用するための、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＲａｐＣａｓｐ９に対する異なるアプローチを示す図案。（ａ）２つの分子を別個に発現させる二重構築物（ｄｏｕｂｌｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）。各分子は、それぞれＦＫＢＰ１２またはＦＲＢのいずれかと融合したＣａｓｐ９の触媒ドメインを有する。（ｂ）ＦＫＢＰ１２およびＦＲＢを互いに直接融合し、次いで、フレキシブルリンカーによってＣａｓｐ９の触媒ドメインに融合した単一構築物（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）。この方向では、自己ヘテロ二量体化は不可能であるはずである。（ｃ）カスパーゼ９の触媒ドメインがＦＲＢおよびＦＫＢＰ１２に隣接する単一構築物。ここでは、自己ヘテロ二量体化が起こり得るので、この反復が十分に機能するとは予想されない。（ｄ）ＦＫＢＰ１２に融合したカスパーゼ９の触媒ドメインおよび別個の小タンパク質（これは、ＦＲＢの２つのコピーの融合物である）を共発現させる二重構築物。
【００１４】
【図２】ヘテロ二量体化剤を用いてカスパーゼ９を活性化することが可能であることの実証。Ｔ細胞にｅＧＦＰのみを形質導入し（図２ａ）、または（ｅＧＦＰを共発現する）ＦＫＢＰ１２−ｄＣａｓｐ９および（ｅＢＦＰ２を共発現する）ＦＲＢ−ｄＣａｓｐ９を同時形質導入した（図２ｂ）。非形質導入Ｔ細胞が内部対照として作用するように、意図的に、Ｔ細胞を部分的にのみ形質導入した。次いで、Ｔ細胞を漸減濃度のラパマイシンに曝露した。４８時間後、細胞をアネキシンＶおよび７ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによって分析して、蛍光タンパク質を発現する生存細胞の割合を調べた。最低濃度のラパマイシンの存在下であっても、ｅＧＦＰおよびｅＢＦＰ２の両方を発現するＴ細胞は、非常に有効に排除された。
【００１５】
【図３】ＲａｐＣａｓｐ９変異体の機能。Ｔ細胞に（ａ）ｅＧＦＰのみを形質導入し；（ｂ）それぞれｅＧＦＰおよびｅＢＦＰ２と共発現するＦＫＢＰ１２−Ｃａｓｐ９およびＦＲＢ−Ｃａｓｐ９を二重形質導入し；（ｃ）ＦＲＢ−ＦＫＢＰ１２−Ｃａｓｐ９を形質導入し；（ｄ）ＦＲＢ−Ｃａｓｐ９−ＦＫＢＰ１２および（ｅ）ＦＢＰ１２−Ｃａｓｐ９−２Ａ−ＦＲＢ−ＦＲＢｗを形質導入した。一定割合の細胞のみが形質導入され、陰性細胞は内部陰性対照として作用した。Ｔ細胞を２．５ｎＭラパマイシンに４８時間曝露した。次いで、Ｔ細胞をアネキシンＶおよび７ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。アネキシンＶおよび７ＡＡＤ染色によって決定した場合の生存細胞におけるｅＧＦＰとｅＢＦＰ２との対比を示す。
【００１６】
【図４】ラパマイシンおよびラパログ。Ａ）ラパマイシン；Ｂ）Ｃ−２０−メチルアリルラパマイシン（ｍｅｔｈｙｌｌｙｒｌｒａｐａｍｙｃｉｎ）（ＭａＲａｐ）；Ｃ）Ｃ１６（Ｓ）−ブチルスルホンアミドラパマイシン（Ｃ１６−ＢＳ−Ｒａｐ）；Ｄ）Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン（ｍｅｈｙｌｉｎｄｏｌｅｒａｐａｍｙｃｉｎ）（Ｃ１６−ｉＲａｐ）；およびＥ）Ｃ１６−（Ｓ）−７−メチルインドールラパマイシン（ＡＰ２１９７６／Ｃ１６−ＡｉＲａｐ）。
【００１７】
【図５】実施例３で試験した構築物の概要。
【００１８】
【図６】実施例３のゲーティング戦略の概要。
【００１９】
【図７−１】図５に示されている構築物をトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞の、様々な濃度のラパマイシンと共にインキュベートした後の殺滅を示す研究。
【図７−２】図５に示されている構築物をトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞の、様々な濃度のラパマイシンと共にインキュベートした後の殺滅を示す研究。
【図８−１】図５に示されている構築物をトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞の、様々な濃度のラパマイシンと共にインキュベートした後の殺滅を示す研究。
【図８−２】図５に示されている構築物をトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞の、様々な濃度のラパマイシンと共にインキュベートした後の殺滅を示す研究。
【図９−１】図５に示されている構築物をトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞の、様々な濃度のラパマイシンと共にインキュベートした後の殺滅を示す研究。
【図９−２】図５に示されている構築物をトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞の、様々な濃度のラパマイシンと共にインキュベートした後の殺滅を示す研究。
【００２０】
【図１０】図７、８および９に示されているＦＡＣＳデータを要約したグラフ。
【００２１】
【図１１】ラパマイシン対テムシロリムスの存在下におけるＪｕｒｋａｔ細胞の殺滅を比較したグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の態様の要約
本発明者らは、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体などの二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）の存在下で二量体化する新たな自殺遺伝子を開発した。
【００２３】
ラパマイシンおよびラパマイシン類似体は、ｍＴＯＲのＦＲＢドメインとＦＫＢＰ１２との間のインターフェースを生成することによって、ヘテロ二量体化を誘導する。この会合は、ｍＴＯＲ活性部位へのＦＫＢＰ１２のアクセスの遮断をもたらし、その機能を阻害する。ｍＴＯＲは非常に大きなタンパク質である一方、ラパマイシンとの相互作用に必要なｍＴＯＲの正確な小セグメントが公知であり、使用され得る。
【００２４】
本発明者らは、ラパマイシンによって媒介されるヘテロ二量体化を使用して、カスパーゼのホモ二量体化を誘導することが可能であることを示した。特に、本発明者らは、驚くべきことに、（ｉ）ｍＴＯＲのＦＲＢドメイン（ｉｉ）ＦＫＢＰ１２；および（ｉｉｉ）カスパーゼを含むマルチドメイン分子を作製し、前記分子の一方のコピーのＦＲＢドメインと、前記分子の別のコピーのＦＫＢ１２ドメインとの間のヘテロ二量体化を使用して、カスパーゼドメインのホモ二量体化を引き起こすことが可能であることを示した。
【００２５】
したがって、本発明の第１の態様の第１の実施形態では、本発明は、式：
Ｈｔ１−Ｈｔ２−Ｃａｓｐ
（式中、
Ｃａｓｐは、カスパーゼドメインであり；
Ｈｔ１は、第１のヘテロ二量体化ドメインであり；
Ｈｔ２は、第２のヘテロ二量体化ドメインである）を有するキメラタンパク質であって、一方のキメラタンパク質由来のＨｔ１が、他方のキメラタンパク質由来のＨｔ２とヘテロ二量体化して、前記２つのカスパーゼドメインのホモ二量体化を引き起こすように、二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）の存在下で、相同対の前記キメラタンパク質が相互作用するキメラタンパク質を提供する。
【００２６】
構成は、Ｈｔ１が同じキメラタンパク質内のＨｔ２と有意な程度にヘテロ二量体化しないようなものである。
【００２７】
カスパーゼドメインは、以下の群：カスパーゼ−８、カスパーゼ−９およびカスパーゼ−１０から選択されるイニシエーターカスパーゼ、またはカスパーゼ−３およびカスパーゼ−７から選択されるエクセキューショナーカスパーゼを含み得る。
【００２８】
本発明の第１の態様のこの第１の実施形態のマルチドメインタンパク質では、一方のヘテロ二量体化ドメインはＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）を含み得、他方のヘテロ二量体化ドメインはｍＴＯＲのＦＲＢドメインを含み得る。
【００２９】
このヘテロ二量体化ドメインの組み合わせでは、適切なＣＩＤは、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体である。
【００３０】
本発明の第１の態様の第２の実施形態では、カスパーゼドメインと、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）を含むヘテロ二量体化ドメインとを含むキメラタンパク質、およびカスパーゼドメインと、ｍＴＯＲのＦＲＢドメインを含むヘテロ二量体化ドメインとを含むキメラタンパク質が提供される。
【００３１】
本発明のこの態様の第３の実施形態では、２つのタンパク質：
Ｈｔ１−ＣａｓｐおよびＨｔ２−Ｈｔ２
（式中、Ｈｔ１−Ｃａｓｐは、カスパーゼドメイン（Ｃａｓｐ）および第１のヘテロ二量体化ドメイン（Ｈｔ１）を含むキメラタンパク質であり；Ｈｔ２−Ｈｔ２は、２つまたはそれを超える第２のヘテロ二量体化ドメイン（Ｈｔ２）を含むインターフェースタンパク質である）であって、
各キメラタンパク質由来のＨｔ１が、前記インターフェースタンパク質由来のＨｔ２ドメインとヘテロ二量体化して、前記２つのカスパーゼドメインのホモ二量体化を引き起こすように、二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）の存在下で、一対の前記キメラタンパク質Ｈｔ１−Ｃａｓｐ９が相互作用する２つのタンパク質が提供される。
【００３２】
本発明のこの態様の第４の実施形態では、式：
Ｈｔ１−Ｃａｓｐ−Ｈｔ２
（式中、
Ｃａｓｐは、カスパーゼドメインであり；
Ｈｔ１は、第１のヘテロ二量体化ドメインであり；
Ｈｔ２は、第２のヘテロ二量体化ドメインである）を有するキメラタンパク質であって、一方のキメラタンパク質由来のＨｔ１が、他方のキメラタンパク質由来のＨｔ２とヘテロ二量体化して、前記２つのカスパーゼドメインのホモ二量体化を引き起こすように、二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）の存在下で、相同対の前記キメラタンパク質が相互作用するキメラタンパク質が提供される。
【００３３】
本発明の第１の態様のこの第４の実施形態では、一方のヘテロ二量体化ドメインがＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）を含み、他方のヘテロ二量体化ドメインがｍＴＯＲのＦＲＢドメインを含み、ＣＩＤがラパマイシンまたはその誘導体である場合には、２つのカスパーゼドメインのホモ二量体化を引き起こすために、５ｎｍ未満（ｌｅｓｓ  ｔｈａｔ）、例えば１〜３ｎｍまたは約１ｎｍの濃度が使用され得る。
【００３４】
キメラタンパク質は、ＦＫＢＰ１２に融合したカスパーゼドメインを含み得、インターフェースタンパク質は、２つまたはそれを超えるＦＲＢドメインの融合物であり得る。これらの２つまたはそれを超えるＦＲＢドメインは、インターフェースとして作用して、２つのＦＫＢＰ１２−Ｃａｓｐドメインを互いに結合する（ｂｒｉｎｉｎｇ）。
【００３５】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様にしたがうキメラタンパク質をコードする核酸配列を提供する。
【００３６】
核酸は、複数の核酸配列を含む核酸構築物の形態であり得る。例えば、構築物は、１つまたはそれを超える本発明の第２の態様にしたがう核酸配列（複数も可）と、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含み得る。
【００３７】
核酸構築物は、
ｉ）カスパーゼドメインと、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）を含むヘテロ二量体化ドメインとを含むキメラタンパク質をコードする第１の核酸配列；
ｉｉ）カスパーゼドメインと、ｍＴＯＲのＦＲＢドメインを含むヘテロ二量体化ドメインとを含むキメラタンパク質をコードする第２の核酸配列
を含み得る。
【００３８】
構造：
Ｈｔ１−Ｃａｓｐ−ｃｏｅｘｐｒ−Ｈｔ２−Ｈｔ２
（式中：
Ｃａｓｐは、カスパーゼドメインをコードする核酸配列であり；
Ｈｔ１は、第１のヘテロ二量体化ドメインをコードする核酸配列であり；
Ｈｔ２は、第２のヘテロ二量体化ドメインをコードする核酸配列であり；ならびに
ｃｏｅｘｐｒは、Ｈｔ１−ＣａｓｐおよびＨｔ２−Ｈｔ２の共発現を可能にする核酸配列である）を有する核酸構築物であって、
前記核酸構築物の発現が、キメラタンパク質Ｈｔ１−Ｃａｓｐおよびインターフェースタンパク質Ｈｔ２−Ｈｔ２の生産をもたらし、各キメラタンパク質由来のＨｔ１が、前記インターフェースタンパク質由来のＨｔ２ドメインとヘテロ二量体化して、前記２つのカスパーゼドメインのホモ二量体化を引き起こすように、二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）の存在下で、一対の前記キメラタンパク質Ｈｔ１−Ｃａｓｐが相互作用する核酸構築物も提供される。
【００３９】
Ｈｔ１はＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）を含み得、Ｈｔ２はｍＴＯＲのＦＲＢドメインを含み得る。
【００４０】
核酸構築物はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み得る。
【００４１】
第３の態様では、本発明は、本発明の第２の態様にしたがう核酸配列または核酸構築物を含むベクターを提供する。
【００４２】
ベクターを標的細胞の形質導入に使用する場合、標的細胞が、本発明の第１の態様にしたがうキメラタンパク質およびキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体を共発現するように、ベクターはまた、目的のヌクレオチド（例えば、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体をコードするヌクレオチド配列）を含み得る。
【００４３】
第４の態様では、本発明は、本発明の第１の態様にしたがうキメラタンパク質を発現する細胞を提供する。
【００４４】
細胞は、
ｉ）カスパーゼドメインと、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）を含むヘテロ二量体化ドメインとを含む第１のキメラタンパク質；および
ｉｉ）カスパーゼドメインと、ｍＴＯＲのＦＲＢドメインを含むヘテロ二量体化ドメインとを含む第２のキメラタンパク質
を含み得る。
【００４５】
２つのタンパク質：
Ｈｔ１−ＣａｓｐおよびＨｔ２−Ｈｔ２
（式中、Ｈｔ１−Ｃａｓｐは、カスパーゼドメイン（Ｃａｓｐ）および第１のヘテロ二量体化ドメイン（Ｈｔ１）を含むキメラタンパク質であり；Ｈｔ２−Ｈｔ２は、２つの第２のヘテロ二量体化ドメイン（Ｈｔ２）を含むインターフェースタンパク質である）を発現する細胞であって、
各キメラタンパク質由来のＨｔ１が、前記インターフェースタンパク質由来のＨｔ２ドメインとヘテロ二量体化して、前記２つのカスパーゼドメインのホモ二量体化を引き起こすように、二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）の存在下で、一対の前記キメラタンパク質Ｈｔ１−Ｃａｓｐ９が相互作用する細胞も提供される。
【００４６】
細胞は、本発明の第２の態様にしたがう核酸配列または構築物を含み得る。
【００４７】
細胞は、例えば、造血幹細胞、リンパ球またはＴ細胞であり得る。
【００４８】
本発明の第４の態様にしたがう細胞を作製するための方法であって、本発明の第３の態様にしたがうベクターを細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程を含む方法も提供される。
【００４９】
本発明の第４の態様の細胞を排除するための方法であって、前記細胞を二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）に曝露する工程を含む方法も提供される。
【００５０】
ＣＩＤは、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体であり得る。
【００５１】
被験体における疾患を予防または処置するための方法であって、本発明の第４の態様の細胞を前記被験体に投与する工程を含む方法も提供される。
【００５２】
前記方法は、以下：
（ｉ）本発明の第２の態様にしたがうベクターを、被験体から単離された細胞の試料に形質導入またはトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）前記形質導入／トランスフェクト細胞を患者に投与する工程
を含み得る。
【００５３】
前記方法は、癌を処置するためのものであり得る。
【００５４】
被験体への本発明の第４の態様の細胞の投与によって引き起こされる、前記被験体における病理学的免疫反応を予防および／または処置するための方法であって、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体を前記被験体に投与する工程を含む方法も提供される。
【００５５】
前記病理学的免疫反応は、以下の群：移植片対宿主病；オンターゲットオフ腫瘍毒性；免疫活性化症候群；およびリンパ増殖性障害から選択され得る。
【００５６】
被験体における疾患を処置または予防するための方法は、以下：
（ｉ）本発明の第４の態様にしたがう細胞を前記被験体に投与する工程；
（ｉｉ）病理学的免疫反応の発症について、前記被験体をモニタリングする工程；および（ｉｉｉ）前記被験体が、病理学的免疫反応を発症するまたは発症した兆候を示す場合、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体を前記被験体に投与する工程
を含み得る。
【００５７】
造血幹細胞移植、リンパ球注入または養子細胞移入に使用するための本発明の第４の態様にしたがう細胞も提供される。
【００５８】
被験体への本発明の第４の態様にしたがう細胞の投与によって引き起こされる病理学的免疫反応の予防または処置に使用するためのラパマイシンまたはラパマイシン類似体も提供される。
【００５９】
したがって、本発明は、許容され得ない毒性に面して、養子移入された細胞の選択的な破壊を可能にする自殺遺伝子であって、ラパマイシンおよび／またはその類似体によって活性化される自殺遺伝子を提供する。
【００６０】
ラパマイシンは、十分に理解されている特性、優れたバイオアベイラビリティ、および分布容積を有する標準的な医薬品であって、広く利用可能な標準的な医薬品である。ラパマイシンはまた、処置されている状態を悪化させず、実際にそれは免疫抑制剤であるので、その自殺遺伝子機能だけではなく、望ましくない毒性に対する有益な効果を有する可能性が高い。
【００６１】
詳細な説明
キメラタンパク質
本発明は、自殺遺伝子として作用するキメラタンパク質に関する。キメラタンパク質を発現する細胞は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体などの二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）の投与によって、インビボまたはインビトロで排除され得る。
【００６２】
キメラタンパク質は、式：
Ｈｔ１−Ｈｔ２−Ｃａｓｐ
（式中、
Ｃａｓｐは、カスパーゼドメインであり；
Ｈｔ１は、第１のヘテロ二量体化ドメインであり；および
Ｈｔ２は、第２のヘテロ二量体化ドメインである）を有し得る。
【００６３】
キメラタンパク質は、式：
Ｈｔ１−Ｈｔ２−Ｌ−Ｃａｓｐ
（式中、Ｃａｓｐ、Ｈｔ１およびＨｔ２は、上記に定義される通りであり、Ｌは、任意選択のリンカーである）を有し得る。
【００６４】
構成は、Ｈｔ１が同じキメラタンパク質分子内のＨｔ２と有意にヘテロ二量体化しないが、二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）の存在下で２つのキメラタンパク質が一緒になると、一方のキメラタンパク質由来のＨｔ１が他方のキメラタンパク質由来のＨｔ２とヘテロ二量体化して、２つのカスパーゼドメインのホモ二量体化を引き起こすようなものであるべきである。
【００６５】
構成は、Ｈｔ１が同じキメラタンパク質内のＨｔ２と有意な程度にヘテロ二量体化しないようなものである。例えば、本発明の第１の態様にしたがうこの実施形態のキメラタンパク質を発現する細胞では、ＣＩＤの存在は、同じキメラタンパク質内のヘテロ二量体化よりも大きな割合の、２つのキメラタンパク質間の二量体化を引き起こすべきである。細胞もしくは細胞集団では、または溶液中では、同じ分子内においてヘテロ二量体化されるキメラタンパク質の量は、ＣＩＤの存在下で別個のキメラタンパク質分子においてヘテロ二量体化されるキメラタンパク質の量の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満または１％未満であり得る。
【００６６】
キメラタンパク質は、配列番号１として示されている配列を含み得る。
【化１−１】
2020078359.tif 000002
【化１−２】
2020078359.tif 000003
【００６７】
上記配列では、「ＦＫＢＰ１２」は、ＦＫＢＰ１２の配列を指す；「ｄＣａｓｐ９」は、Ｃａｓｐ９の触媒ドメインを指す；「Ｌ１」は、１リピートリンカーである；「ＦＭＤ−２Ａ」は、口蹄疫２Ａ様ペプチドＥＲＡＶである；「ＦＲＢ」は、ｍＴＯＲのＦＲＢドメインである；「Ｌ３」は、２リピートリンカーである；「ＦＲＢｗ」は、コドンゆらぎ処理されたＦＲＢである。
【００６８】
第２の実施形態では、本発明は、ＣＩＤがラパマイシンまたはラパマイシン類似体である「二分子」自殺遺伝子系を提供する。
【００６９】
したがって、本発明はまた、ｉ）カスパーゼドメインと、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）を含むヘテロ二量体化ドメインとを含むキメラタンパク質；およびｉｉ）カスパーゼドメインと、ｍＴＯＲのＦＲＢドメインを含むヘテロ二量体化ドメインとを含むキメラタンパク質を提供する。
【００７０】
Ｔ細胞などの細胞がこれらのキメラタンパク質の両方を発現する場合、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体の存在は、ｉ）のＦＫＢＰ含有ドメインと、ｉｉ）のＦＲＢ含有ドメインとのヘテロ二量体化を引き起こし、それにより、ｉ）およびｉｉ）由来のカスパーゼドメインホモ二量体化を引き起こす。
【００７１】
本発明のこの実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号２または３として示されている配列を含み得る。
【化２−１】
2020078359.tif 000004
【化２−２】
2020078359.tif 000005
【００７２】
第３の実施形態では、本発明は、第２の実施形態よりも小さいフットプリントを用いる代替的「二分子」アプローチを提供する。ここでは、Ｈｔ１はカスパーゼと融合され、Ｈｔ２−Ｈｔ２融合物から構成される第２の分子が共発現される。ＣＩＤの存在下では、Ｈｔ２−Ｈｔ２は、２つのＨｔ１−Ｃａｓｐ分子を同時に伴う。実際、これは、ＦＲＢ−ＦＲＢとＦＫＢＰ１２−Ｃａｓｐ９を共発現させ、ラパマイシンで活性化することによって実行され得る。好都合には、これらの成分は、口蹄疫２Ａ様ペプチドと共発現され得る。第２のＨｔ２（例えば、ＦＲＢ）コード配列は、組換えを防止するためにコドンゆらぎ処理され得る。
【化３−１】
2020078359.tif 000006
【化３−２】
2020078359.tif 000007
【００７３】
上記配列では、「ＦＫＢＰ１２」は、ＦＫＢＰ１２を指す；「ｄＣａｓｐ９」は、Ｃａｓｐ９の触媒ドメインである；「Ｌ１」は、１リピートリンカーである；「ＦＭＤ−２Ａ」は、口蹄疫２Ａ様ペプチドＥＲＡＶである；「ＦＲＢ」は、ｍＴＯＲのＦＲＢドメインである；「Ｌ２」は、２リピートリンカーである；「ＦＲＢｗ」は、コドンゆらぎ処理されたＦＲＢである。
【００７４】
カスパーゼ
カスパーゼ、またはシステイン−アスパラギン酸プロテアーゼまたはシステイン依存性アスパラギン酸特異的プロテアーゼ（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｓｐａｒｔａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）は、アポトーシスにおいて本質的な役割を果たすシステインプロテアーゼファミリーである。
【００７５】
ヒトでは、１２種のカスパーゼが同定されている。２種類のアポトーシスカスパーゼ：イニシエーターカスパーゼおよびエクセキューショナーカスパーゼがある。カスパーゼ−２、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９およびカスパーゼ−１０などのイニシエーターカスパーゼは、不活性な前駆型のエフェクターカスパーゼを切断し、それにより、それらを活性化する。次いで、カスパーゼ−３、カスパーゼ−６およびカスパーゼ−７などのエクセキューショナーカスパーゼは、細胞内の他のタンパク質基質を切断して、アポトーシス過程を引き起こす。
【００７６】
本発明の第１の態様のキメラタンパク質のカスパーゼドメインは、カスパーゼ−２；カスパーゼ−８、カスパーゼ−９およびカスパーゼ−１０から選択されるイニシエーターカスパーゼ；またはカスパーゼ−３、カスパーゼ−６およびカスパーゼ−７から選択されるエクセキューショナーカスパーゼを含み得る。
【００７７】
特に、本発明の第１の態様のキメラタンパク質のカスパーゼドメインは、カスパーゼ−９を含み得る。カスパーゼ９は、重要なイニシエーターカスパーゼであるので、その活性化は、アポトーシス誘導の非常に鋭敏なトリガーである。さらに、活性化に必要なものは、ホモ二量体化およびタンパク質分解切断ではなく、ホモ二量体化のみである。
【００７８】
全長カスパーゼ−９は、配列番号５として示されている配列を有する。
【化４】
2020078359.tif 000008
【００７９】
カスパーゼ９は、例えば、カスパーゼリクルートドメインを取り除くために短縮化され得る。短縮型カスパーゼ−９は、配列番号６として示されている。
【化５】
2020078359.tif 000009
【００８０】
本発明の第１の態様のキメラタンパク質は、配列番号５もしくは配列番号６、またはホモ二量体化能力を保持し、したがってアポトーシスを引き起こす、それらの断片もしくは変異型を含み得る。
【００８１】
変異型カスパーゼ−９配列は、配列番号５または６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
【００８２】
２つのポリペプチド配列間の同一性の割合は、ＢＬＡＳＴ（これは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいて無料で利用可能である）などのプログラムによって容易に決定され得る。
【００８３】
インビボでは、プロテアーゼカスパーゼ９は、アポトソームとして公知の多成分経路の中心的関与物であり、胚形成中の細胞の排除、ならびに細胞死を引き起こす生理的学的応答および電離放射線または化学療法薬などの致死的細胞傷害を制御する。カスパーゼ９の機能は、限定的なタンパク質分解によって、活性型のカスパーゼ３および７を生成し、それにより、アポトーシスシグナルを実行段階に伝達することである。しかしながら、大型サブユニットと小型サブユニットとの間のタンパク質分解が、潜在チモーゲンを触媒型に変換しないという点において、カスパーゼ９は、その類縁物質の中では異例である。実際、活性化には、ホモ二量体化が必要である。
【００８４】
ヘテロ二量体化ドメイン
マクロライドラパマイシンおよびＦＫ５０６は、細胞タンパク質のヘテロ二量体化を誘導することによって作用する。各薬物は、高親和性でＦＫＢＰ１２タンパク質に結合して薬物−タンパク質複合体を作り、続いてこれが、それぞれｍＴＯＲ／ＦＲＡＰおよびカルシニューリンに結合し、不活性化する。ｍＴＯＲのＦＫＢＰ−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインは、目的のタンパク質に融合され得る単離された８９アミノ酸のタンパク質部分として定義され、適用されている。次いで、ラパマイシンは、ＦＫＢＰ１２またはＦＫＢＰ１２と融合したタンパク質へのＦＲＢ融合物の接近を誘導し得る。
【００８５】
本発明の文脈では、ヘテロ二量体化ドメインの一方（Ｈｔ１またはＨｔ２）は、ＦＲＢもしくはその変異型であり得るか、またはＦＲＢもしくはその変異型を含み得、ヘテロ二量体化ドメインの他方（Ｈｔ２またはＨｔ１）は、ＦＫＢＰ１２もしくはその変異型であり得るか、またはＦＫＢＰ１２もしくはその変異型を含み得る。
【００８６】
ラパマイシンは、理想的な二量体化剤のいくつかの特性を有する：これは、ＦＫＢＰ１２に結合すると、ＦＲＢに対して高い親和性（ＫＤ＜１ｎＭ）を有し、ｍＴＯＲのＦＲＢドメインに対して高特異的である。ラパマイシンは、哺乳動物において好ましい薬物動態学的および薬力学的プロファイルを有する有効な治療用免疫抑制剤である。異なる薬物動態学的および力学的特性を有するラパマイシンの薬理学的類似体、例えばエベロリムス、テムシロリムスおよびデフォロリムス（Ｂｅｎｊａｍｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１１）もまた、臨床状況に応じて使用され得る。
【００８７】
ラパマイシンの結合および内因性ｍＴＯＲの不活性化を防止するために、ＦＲＢと接触するラパマイシンの表面は改変され得る。「隆起した」ラパマイシンに適合するバーフェイス（ｂｕｒｆａｃｅ）を形成するためのＦＲＢドメインの代償的変異は、内在性ｍＴＯＲタンパク質ではなくＦＲＢ変異型のみとの二量体化相互作用を修復する。
【００８８】
Ｂａｙｌｅら（Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏ；２００６；１３；９９−１０７）には、様々なラパマイシン類似体または「ラパログ」およびそれらの対応する改変ＦＲＢ結合ドメインが記載されている。例えば、それぞれの各相補的結合ドメインと組み合わせて図３に示されているように、Ｂａｙｌｅら（２００６）には、Ｃ−２０−メチルアリルラパマイシン（ＭａＲａｐ）、Ｃ１６（Ｓ）−ブチルスルホンアミドラパマイシン（Ｃ１６−ＢＳ−Ｒａｐ）およびＣ１６−（Ｓ）−７−メチルインドールラパマイシン（ＡＰ２１９７６／Ｃ１６−ＡｉＲａｐ）が記載されている。他のラパマイシン／ラパグログとしては、シロリムスおよびタクロリムスが挙げられる。
【００８９】
キメラタンパク質のヘテロ二量体化ドメインは、配列番号７〜配列番号１１として示されている配列もしくはそれらの変異型の１つであり得るか、またはこれを含み得る。
【化６】
2020078359.tif 000010
【００９０】
変異型配列は、有効な二量体化系を提供する限り、配列番号７〜１１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。すなわち、配列が、２つのキメラタンパク質の十分な共局在化を促進して、２つのカスパーゼドメインのホモ二量体化を可能にする限り。
【００９１】
配列番号８として示されている「野生型」ＦＲＢドメインは、ヒトｍＴＯＲのアミノ酸２０２５〜２１１４を含む。ヒトｍＴＯＲのアミノ酸ナンバリングシステムを使用すれば、本発明のキメラタンパク質のＦＲＢ配列は、以下の位置：２０９５位、２０９８位、２１０１位の１つまたはそれより多く（ｏｎｅ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）においてアミノ酸置換を含み得る。
【００９２】
本発明のキメラタンパク質に使用される変異型ＦＲＢは、２０９５位、２０９８位および２１０１位において以下のアミノ酸の１つを含み得る：
２０９５：Ｋ、Ｐ、ＴまたはＡ
２０９８：Ｔ、Ｌ、ＨまたはＦ
２１０１：ＷまたはＦ
【００９３】
Ｂａｙｌｅら（上記）には、２０９５位、２０９８位および２１０１位のアミノ酸にしたがってアノテーションされた以下のＦＲＢ変異体：ＫＴＷ、ＰＬＦ、ＫＬＷ、ＰＬＷ、ＴＬＷ、ＡＬＷ、ＰＴＦ、ＡＴＦ、ＴＴＦ、ＫＬＦ、ＰＬＦ、ＴＬＦ、ＡＬＦ、ＫＴＦ、ＫＨＦ、ＫＦＦ、ＫＬＦが記載されている（表１を参照のこと）。Ｂａｙｌｅらの表１および図５Ａに示されているように、これらの変異体は、ラパマイシンおよびラパログに様々な程度に結合することができる。本発明のキメラタンパク質は、これらのＦＲＢ変異体の１つを含み得る。
【００９４】
リンカー
リンカーは、カスパーゼドメインおよびヘテロ二量体化ドメイン（複数も可）を空間的に分離するために含められ得る。
【００９５】
本発明の第１の態様の第１の実施形態では、キメラタンパク質は、単一分子中では、ＣＩＤの存在下で互いにヘテロ二量体化し得ないような構成で保持された２つのヘテロ二量体化ドメインを含むが、一方の分子上のＨｔ１は、同じヘテロ二量体化ドメインを有する別のキメラ分子上のＨｔ２とヘテロ二量体化し得る（図１Ｂ）。Ｈｔ１およびＨｔ２がカスパーゼドメインに隣接する設計（Ｈｔ１−Ｃａｓｐ−Ｈｔ２）では、活性化は、Ｈｔ１およびＨｔ２が互いに連結された設計よりも劣っていたが、これは、単一ＣＩＤに対する単一分子由来のＨｔ１およびＨｔ２の非生産的結合を防止することの重要性を示している。
【００９６】
この実施形態では、リンカー（Ｌ１）は、触媒ドメインがホモ二量体化し得るような十分なフレキシビリティを提供するべきであるが、ホモ二量体化のエネルギー障壁が克服されない程のフレキシビリティを提供するべきではない（図１）。例えば、リンカーは、１５アミノ酸長未満、１０アミノ酸長未満または５〜１５もしくは５〜１０アミノ酸長であり得る。
【００９７】
本発明の第１の態様の第２の実施形態では、キメラタンパク質は、ＣＩＤの存在下で第２のキメラタンパク質上の相補的ヘテロ二量体化ドメインとヘテロ二量体化することができる単一ヘテロ二量体化ドメインを含む。
【００９８】
代替構成では、２つのヘテロ二量体化ドメインは、長いリンカー（Ｌ２）を有する単一分子上に提供され得、式：
Ｈｔ１−Ｃａｓｐ１−Ｌ２−Ｈｔ２−Ｃａｓｐ２
を有する構築物を提供する。
【００９９】
ＨＴおよびＣａｓｐドメインは、いずれかの順序でリンカーの両側にあり得る。
【０１００】
この実施形態では、リンカーＬ２は、第１のヘテロ二量体化ドメインが第２のヘテロ二量体化ドメインとヘテロ二量体化し得、；「第１のキメラタンパク質」に対応する分子の一部のカスパーゼドメインが「第２のキメラタンパク質」に対応する分子の一部のカスパーゼドメインとホモ二量体化し得るような十分なフレキシビリティを付与し得る。
【０１０１】
本発明の第１の態様の第３の実施形態では、Ｃａｓｐは、他方のヘテロ二量体化ドメインの２つまたはそれを超えるコピーの融合物である第２の分子ではなく、単一ヘテロ二量体化ドメインに融合される。２つの分子は、共発現され得る。この場合、第２の分子は、ＣＩＤの存在下で２つまたはそれを超えるＣａｓｐドメインを互いに伴うインターフェースとして作用する。この場合、ヘテロ二量体化ドメインの２つまたはそれを超えるコピーは、それらを活性化するのに十分な程度にＣａｓｐ９ドメインの接近を可能にするように融合されなければならない。
【０１０２】
インターフェースタンパク質は、２つを超えるＨｔ２ドメインを含む多量体であり得る。例えば、コイルドコイルドメインなどの多量体化リンカーを使用して、単一インターフェースタンパク質中の複数のＨｔ２ドメインを結合させることが可能である。
【０１０３】
この実施形態では、インターフェースタンパク質は、式Ｈｔ２−Ｌ２−Ｈｔ２、またはＨｔ２−Ｌ２（式中、Ｌ２は、コイルドコイルドメインである）を有し得る。
【０１０４】
コイルドコイルは、２〜７本のα−ヘリックスがロープの縄のように互いに巻き付いた構造モチーフである。コイルドコイルドメインの構造は、当技術分野で周知である。例えば、Ｌｕｐａｓ＆Ｇｒｕｂｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；２００７；７０；３７−３８）に記載されている。
【０１０５】
コイルドコイルは、通常、疎水性（ｈ）および荷電（ｃ）アミノ酸残基の反復パターンｈｘｘｈｃｘｃ（ヘプタッドリピートと称される）を含有する。ヘプタッドリピートにおける位置は、通常、ａｂｃｄｅｆｇ（ａおよびｄは疎水性の位置であり、イソロイシン、ロイシンまたはバリンによって占有されることが多い）と表示される。この反復パターンを有する配列がα−ヘリックス二次構造にフォールディングされると、疎水性残基が左回りにヘリックス周囲にゆるやかに巻き付いた「ストライプ」として提示される両親媒性構造の形成を引き起こす。２本のこのようなヘリックスが細胞質中でそれら自体を配列する最も好ましい方法は、親水性アミノ酸間に挟まれた互いに対して疎水性鎖を巻き付けることである。したがって、それは、オリゴマー化のための熱力学的推進力を提供する疎水性表面の埋没である。コイルドコイルインターフェースのパッキングは非常に堅固であり、残基およびｄ残基の側鎖間のほぼ完全なファンデルワールス接触を伴う。
【０１０６】
コイルドコイルドメインを含有するタンパク質の例としては、限定されないが、キネシンモータータンパク質、Ｄ型肝炎デルタ抗原、古細菌ボックスＣ／Ｄ  ｓＲＮＰコアタンパク質、軟骨−オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）、マンノース結合タンパク質Ａ、コイルドコイルセリンリッチタンパク質１、ポリペプチド放出因子２、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＲＥ、Ｌａｃリプレッサーまたはアポリポタンパク質Ｅが挙げられる。
【０１０７】
二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）
二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）は、同じＨｔ１およびＨｔ２ドメインを有する別個のキメラ分子上のＨｔ１とＨｔ２との間のヘテロ二量体化を誘導する任意の分子であり得る。
【０１０８】
ＣＩＤは、ラパマイシンに対する改善されたまたは異なる薬物力学的特性または薬物動態学的特性を有するが、同じ広範な作用機序を有するラパマイシンまたはラパマイシン類似体（「ラパログ」）であり得る。（例えば、図４に示されているように）ＣＩＤは、相補的ＦＫＢＰ１２またはＦＲＢに対する操作された特異性を有する変化したラパマイシンであり得る。Ｂａｙｌｅら（２００６、上記）には、Ｃ１６および／またはＣ２０において官能化された様々なラパログが記載されている。
【０１０９】
第１のカテゴリーのこのようなラパログの例としては、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムスおよびデフォロリムスが挙げられる。第２のカテゴリーのラパログの例としては、Ｃ−２０−メチルアリルラパマイシン（ＭａＲａｐ）；Ｃ１６（Ｓ）−ブチルスルホンアミドラパマイシン（Ｃ１６−ＢＳ−Ｒａｐ）；Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン（Ｃ１６−ｉＲａｐ）；およびＣ１６−（Ｓ）−７−メチルインドールラパマイシン（ＡＰ２１９７６／Ｃ１６−ＡｉＲａｐ）が挙げられる。
【０１１０】
ＣＩＤの存在下におけるカスパーゼドメインのホモ二量体化は、ＣＩＤの非存在下で生じるカスパーゼ活性よりも２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１，０００倍または１０，０００倍高いカスパーゼ活性化をもたらし得る。
【０１１１】
ラパマイシンは、強力な免疫抑制剤である。ラパマイシンの類似体（ラパログ）は、毎日臨床使用されている。現代のラパログは、優れたバイオアベイラビリティおよび分布容積を有する。それらは強力な免疫抑制剤であるが、（自殺遺伝子を活性化するための）低用量は、副作用が最小であるはずである。さらに、ｍＡｂの投与とは異なり、ラパマイシンおよび類似体の薬理学的効果は、自殺遺伝子が活性化を必要とする臨床状況（例えば、オフ腫瘍毒性または免疫過活性化症候群）において非常に有利であり得る。
【０１１２】
核酸配列
本発明の第２の態様は、本発明にしたがうキメラタンパク質をコードする核酸配列を提供する。
【０１１３】
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」および「核酸」は、互いに同義語であることを意図する。
【０１１４】
当業者であれば、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が、遺伝コードの縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることを理解する。加えて、当業者であれば、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するために、ルーチンな技術を使用して、本明細書記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチド置換を行い得ると理解されよう。
【０１１５】
本発明の第２の態様にしたがう核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。それらは、単鎖または二本鎖であり得る。それらはまた、その中に合成ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なる種類の改変が当技術分野で公知である。これらとしては、メチルホスホネート骨格およびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端におけるアクリジンまたはポリリシン鎖の付加が挙げられる。本明細書記載の使用の目的のために、ポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能な任意の方法によって改変され得ると理解すべきである。このような改変は、目的のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増強するために行われ得る。
【０１１６】
ヌクレオチド配列に関して、用語「変異体」、「相同体」または「誘導体」は、配列からのまたは配列への１つ（またはそれを超える）核酸の任意の置換、変異、改変、置き換え、欠失または付加を含む。
【０１１７】
本発明のこの態様の第１の実施形態では、式：
Ｈｔ１−Ｈｔ２−Ｌ−Ｃａｓｐ
（式中、
Ｈｔ１は、第１のヘテロ二量体化ドメインであり；
Ｈｔ２は、第２のヘテロ二量体化ドメインであり、
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
Ｃａｓｐは、カスパーゼドメインである）を有するキメラタンパク質をコードする核酸が提供される。
【０１１８】
核酸配列は、配列番号１として示されているキメラタンパク質配列またはその変異体をコードし得る。
【０１１９】
例えば、ヌクレオチド配列は、配列番号１２として示されている配列を含み得る。
【化７−１】
2020078359.tif 000011
【化７−２】
2020078359.tif 000012
【０１２０】
本発明のこの態様の第２の実施形態では、式：Ｈｔ１−Ｌ−Ｃａｓｐ
（式中、
Ｈｔ１は、ヘテロ二量体化ドメインであり、
Ｌは、任意選択のリンカーであり；
Ｃａｓｐは、カスパーゼドメインである）を有するキメラタンパク質をコードする核酸配列が提供される。
【０１２１】
核酸配列は、配列番号２もしくは３として示されているキメラタンパク質配列またはその変異体をコードし得る。
【０１２２】
例えば、ヌクレオチド配列は、配列番号１３または１４として示されている配列を含み得る。
【化８−１】
2020078359.tif 000013
【化８−２】
2020078359.tif 000014
【０１２３】
この第２の実施形態では、核酸配列は、両キメラタンパク質をコードする構築物の形態で提供され得る。
【０１２４】
構築物は、式：
Ｈｔ１−Ｌ２−Ｃａｓｐ−ｃｏｅｘｐｒ−Ｈｔ２−Ｌ２−Ｃａｓｐ
（式中、
Ｈｔ１は、第１のヘテロ二量体化ドメインであり；
Ｌ１およびＬ２は、任意選択のリンカー（これは同じものでもよいし、または異なるものでもよい）であり；
Ｃｏｅｘｐｒは、２つのタンパク質：Ｈｔ１−Ｌ１−ＣａｓｐおよびＨｔ２−Ｌ２−Ｃａｓｐの共発現を可能にする配列であり；
Ｈｔ２は、第２のヘテロ二量体化ドメインであり；
Ｃａｓｐは、カスパーゼドメインである）を有するポリタンパク質をコードし得る。
【０１２５】
同じまたは類似の配列（例えば、２つのカスパーゼドメイン）をコードする核酸配列が存在する場合、配列の一方は、相同組換えを回避するために、コドンゆらぎ処理され得る。
【０１２６】
第３の実施形態では、以下の式：
Ｈｔ１−Ｃａｓｐ−ｃｏｅｘｐｒ−Ｈｔ２−Ｈｔ２
（式中、
Ｃａｓｐは、カスパーゼドメインであり；
Ｈｔ１は、第１のヘテロ二量体化ドメインであり；
Ｃｏｅｘｐｒは、タンパク質Ｈｔ１−ＣａｓｐおよびＨｔ２−Ｈｔ２の共発現を可能にする配列、例えば切断部位であり；
Ｈｔ２は、二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）の存在下でＨｔ１とヘテロ二量体化する第２のヘテロ二量体化ドメインである）を有する配列をコードする核酸配列が提供される。
【０１２７】
第２のタンパク質Ｈｔ２−Ｈｔ２をコードする配列では、Ｈｔ２をコードする配列の一方は、相同組換えを回避するために、コドンゆらぎ処理され得る。
【０１２８】
第３の実施形態にしたがう核酸構築物は、配列番号１５に示されている配列を有し得る。
【化９−１】
2020078359.tif 000015
【化９−２】
2020078359.tif 000016
【０１２９】
高度の類似性を有する核酸配列、例えばカスパーゼ配列（複数も可）またはＦＲＢ配列は、組換えを回避するために、コドンゆらぎ処理され得る。
【０１３０】
核酸構築物
本発明はまた、
ｉ）カスパーゼドメインと、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）を含むヘテロ二量体化ドメインとを含むキメラタンパク質をコードする第１の核酸配列；および
ｉｉ）カスパーゼドメインと、ｍＴＯＲのＦＲＢドメインを含むヘテロ二量体化ドメインとを含むキメラタンパク質をコードする第２の核酸配列
を含む核酸構築物を提供する。
【０１３１】
本発明はまた、１つまたはそれを超えるキメラタンパク質（複数も可）をコードする核酸配列と、さらなる目的の核酸配列（ＮＯＩ）とを含む核酸構築物を提供する。ＮＯＩは、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし得る。
【０１３２】
核酸配列は、２つまたはそれを超える核酸配列の共発現を可能にする配列によって接続され得る。例えば、構築物は、内部プロモーター、内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）配列、または切断部位をコードする配列を含み得る。ポリペプチドが産生されたら、切断部位は自己切断され得、いかなる外部切断活性も必要とせずに、個別のタンパク質へと即時に切断される。
【０１３３】
配列番号１６または１７として示されている配列を有する口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２ａ自己切断ペプチドを含む様々な自己切断部位が公知である：
【化１０】
2020078359.tif 000017
【０１３４】
共発現配列は、内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）であり得る。共発現配列は、内部プロモーターであり得る。
【０１３５】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
Ｔ細胞受容体またはＴＣＲは、Ｔ細胞の表面に見られる分子であって、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与する分子である。ＴＣＲと抗原との間の結合は、比較的低い親和性であり、変性する：多くのＴＣＲは同じ抗原を認識し、多くの抗原は同じＴＣＲによって認識される。
【０１３６】
ＴＣＲは、２本の異なるタンパク質鎖から構成される（すなわち、それは、ヘテロ二量体である）。Ｔ細胞の９５％では、これは、アルファ（α）およびベータ（β）鎖からなるのに対して、Ｔ細胞の５％では、これは、ガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖からなる。この比率は、個体発生中および疾患状態で変化する。
【０１３７】
ＴＣＲが抗原ペプチドおよびＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）と係合すると、Ｔリンパ球は、関連酵素、共受容体、専門化されたアダプター分子、および活性化または放出された転写因子によって媒介される一連の生化学的事象によって活性化される。
【０１３８】
本発明の核酸構築物またはベクターは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖またはＴＣＲδ鎖をコードする核酸配列を含み得る。それは、例えば、ＴＣＲα鎖をコードする核酸配列およびＴＣＲβ鎖をコードする核酸配列；またはＴＣＲγ鎖をコードする核酸配列またはＴＣＲδ鎖をコードする核酸配列を含み得る。２つの核酸配列は、２つのＴＣＲ鎖の共発現を可能にする配列、例えば内部プロモーター、ＩＲＥＳ配列または切断部位、例えば自己切断部位によって接続され得る。
【０１３９】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
目的の核酸配列（ＮＯＩ）は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし得る。
【０１４０】
古典的なＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に結び付けるキメラＩ型膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的にはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来する１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）であるが、リガンドなどの抗原結合部位を含む他のフォーマットに基づくことも可能である。スペーサードメインは、膜からバインダーを単離し、好適な配向をもたせるのに必要であり得る。使用される一般的なスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。より小型のスペーサー、例えば、抗原によっては、ＣＤ８αからのストーク、さらにはＩｇＧ１ヒンジ単独でも十分であり得る。膜貫通ドメインは、細胞膜にタンパク質をつなぎ止め、スペーサーを、細胞内シグナル伝達ドメインを含む、または細胞内シグナル伝達ドメインに関連するエンドドメインに結び付ける。
【０１４１】
初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ζのγ鎖のどちらかの細胞内部分に由来する細胞内シグナル伝達ドメインを有していた。したがって、これらの第一世代受容体は、免疫学的シグナル１を伝達するもので、同種標的細胞のＴ細胞による致死を誘発するのに十分ではあったが、Ｔ細胞を十分に活性化して増殖および生存をもたらすことはなかった。この限界を克服するため、複合シグナル伝達ドメインが構築された：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分とＣＤ３ζの細胞内部分の融合により、抗原認識後活性化シグナルおよび共刺激シグナルを同時に伝達することができる第二世代受容体がもたらされる。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これは、Ｔ細胞増殖を誘発する最も強力な共刺激シグナル、すなわち免疫学的シグナル２を供給する。また、生存シグナルを伝達する密接に関連したＯＸ４０および４１ＢＢなど、ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含む一部の受容体も記載されている。活性化シグナル、増殖シグナルおよび生存シグナルを伝達することができる細胞内シグナル伝達ドメインを有するさらにいっそう強力な第三世代ＣＡＲが現在記載されている。
【０１４２】
ＣＡＲをコードする核酸は、例えば、レトロウイルスベクターを用いてＴ細胞に移入され得る。こうして、多数の抗原特異的Ｔ細胞が、養子細胞移入のために生成され得る。ＣＡＲが標的抗原と結合したとき、これにより、活性化シグナルの、それが発現されるＴ細胞への伝達がもたらされる。すなわち、ＣＡＲは、標的抗原を発現する細胞に向けたＴ細胞の特異性および細胞傷害性を誘導する。
【０１４３】
ベクター
第３の態様では、本発明は、本発明の核酸配列または核酸構築物を含むベクターを提供する。
【０１４４】
本発明はまた、１つまたはそれを超える本発明の核酸配列（複数も可）または核酸構築物（複数も可）と、場合により１つまたはそれを超える（ｏｎｅ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）さらなる目的の核酸配列（ＮＯＩ）とを含むベクターまたはベクターのキットを提供する。このようなベクターは、それが、１つまたはそれを超える本発明の第１の態様にしたがうキメラタンパク質（複数も可）と、場合により１つまたはそれを超える他の目的のタンパク質（ＰＯＩ）とを発現するように、核酸配列（複数も可）または核酸構築物（複数も可）を宿主細胞に導入するために使用され得る。キットはまた、ＣＩＤを含み得る。
【０１４５】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾンベースのベクターまたは合成ｍＲＮＡであり得る。
【０１４６】
ベクターは、Ｔ細胞をトランスフェクトまたは形質導入することができるものであり得る。
【０１４７】
ベクターを標的細胞の形質導入に使用する場合、標的細胞がキメラタンパク質およびキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体を共発現するように、ＮＯＩは、例えば、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体をコードし得る。
【０１４８】
細胞
本発明はまた、本発明の第１の態様にしたがうキメラタンパク質を含む細胞に関する。
【０１４９】
細胞は、本発明の第１の態様の第１の実施形態にしたがう２つのヘテロ二量体化ドメインを有するキメラタンパク質を発現し得る。
【０１５０】
細胞は、本発明の第１の態様の第２の実施形態にしたがう２つのキメラタンパク質（カスパーゼドメインと、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）を含むヘテロ二量体化ドメインとを含むもの；およびカスパーゼドメインと、ｍＴＯＲのＦＲＢドメインを含むヘテロ二量体化ドメインとを含むもの）を発現し得る。
【０１５１】
各キメラタンパク質由来のＨｔ１が、インターフェースタンパク質由来のＨｔ２ドメインとヘテロ二量体化して、２つのカスパーゼドメインのホモ二量体化を引き起こすように（図１ｄを参照のこと）、二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）の存在下で、一対のキメラタンパク質Ｈｔ１−Ｃａｓｐ９が相互作用するように、２つのタンパク質：
Ｈｔ１−ＣａｓｐおよびＨｔ２−Ｈｔ２
（式中、Ｈｔ１−Ｃａｓｐは、カスパーゼドメイン（Ｃａｓｐ）および第１のヘテロ二量体化ドメイン（Ｈｔ１）を含むキメラタンパク質であり；Ｈｔ２−Ｈｔ２は、２つの第２のヘテロ二量体化ドメイン（Ｈｔ２）を含むインターフェースタンパク質である）を発現する細胞も提供される。
【０１５２】
細胞は、例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫細胞であり得る。
【０１５３】
細胞は、造血幹細胞などの幹細胞であり得る。
【０１５４】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫において中心的役割を担うリンパ球のタイプである。それらは、細胞表面におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など、他のリンパ球とは区別することができる。下記で概説する通り、様々なタイプのＴ細胞がある。
【０１５５】
ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、形質細胞および記憶Ｂ細胞へのＢ細胞の成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスで他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、それらの表面でＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面でＭＨＣクラスＩＩ分子によりペプチド抗原と共に提示されたときに活性化される。これらの細胞は、種々のサイトカインを分泌することにより、種々のタイプの免疫応答を促進する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含む、幾つかのサブタイプのうちの１つに分化し得る。
【０１５６】
細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また移植拒絶にも関与する。ＣＴＬは、それらの表面でＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全有核細胞の表面に存在する、ＭＨＣクラスＩに関連した抗原に結合することにより標的を認識する。調節性Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−１０、アデノシンおよび他の分子を通じて、ＣＤ８＋細胞はアネルギー状態に不活化され得、実験的自己免疫脳脊髄炎などの自己免疫疾患を防止する。
【０１５７】
記憶Ｔ細胞は、感染の消散後長期にわたって持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同種抗原に再曝露されると、迅速に多数のエフェクターＴ細胞に拡大し、過去の感染に対する「記憶」をもつ免疫系を提供する。記憶Ｔ細胞は、３つのサブタイプ：セントラル記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）および２タイプのエフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。記憶細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。記憶Ｔ細胞は、典型的には細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【０１５８】
以前にはサプレッサーＴ細胞として知られていた、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持に非常に重要である。それらの主たる役割は、免疫反応の終末に向けてＴ細胞媒介性免疫を制止し、胸腺での負の選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０１５９】
ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主なクラス−天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞については記載されている。
【０１６０】
天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても知られている）は、胸腺で生じ、ＴＳＬＰで活性化された骨髄性（ＣＤ１１ｃ＋）樹状細胞および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方と発達中のＴ細胞との間の相互作用に関連付けられている。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在により他のＴ細胞からは区別され得る。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、調節性Ｔ細胞の発達を防止し得るため、致命的な自己免疫疾患ＩＰＥＸが引き起こされ得る。
【０１６１】
適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても知られている）は、正常な免疫応答中に生じ得る。
【０１６２】
ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）は、先天性免疫系の一部を形成する細胞溶解性細胞の１タイプである。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存的にウイルス感染細胞からの内生シグナルに対して、迅速な応答を提供する。
【０１６３】
ＮＫ細胞（自然リンパ球の群に属する）は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生じる共通のリンパ性前駆細胞から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺で分化および成熟し、次いでそこから循環系に入ることが知られている。
【０１６４】
幹細胞は、専門化された細胞に分化し得る未分化細胞である。哺乳動物では、大きく２種類の幹細胞：胚盤胞の内部細胞塊から単離される胚性幹細胞、および様々な組織に見られる成体幹細胞がある。成体生物では、幹細胞および前駆細胞は、体の修復系として作用して、成体組織を補充する。発生中の胚では、幹細胞は、すべての専門化された細胞（外胚葉、内胚葉および中胚葉（人工多能性幹細胞を参照のこと））に分化し得るが、血液、皮膚または腸組織などの再生器官の正常な代謝回転も維持する。
【０１６５】
ヒトでは、３つの公知の利用可能な自己成体幹細胞源がある：
１．採取による抽出（すなわち、骨穿孔）を必要とする骨髄。
２．脂肪吸引による抽出を必要とする脂肪組織。
３．アフェレーシスによる抽出を必要とする血液（血液をドナーから採血し、幹細胞を抽出して血液の他の部分をドナーに戻す機械に通す）。
【０１６６】
成体幹細胞は、医学療法、例えば骨髄移植において頻繁に使用される。現在、幹細胞は人工的に増殖され、筋肉または神経などの様々な組織の細胞と一致する特徴を有する専門化された細胞型に変換（分化）され得る。体細胞核移植または脱分化によって生成された胚性細胞株および自己胚性幹細胞もまた、細胞療法のための専門化された細胞型を生成するために使用され得る。
【０１６７】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、すべての他の血液細胞を生じさせる血液細胞であり、中胚葉に由来する。それらは、ほとんどの骨のコアに含まれる赤色骨髄に存在する。
【０１６８】
それらは、骨髄（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）およびリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を生じさせる。造血組織は、長期および短期の再生能を有する細胞、ならびにコミットした多能性、複能性および単能性の前駆細胞を含有する。
【０１６９】
ＨＳＣは、異種集団である。血中におけるリンパ球と骨髄子孫との比（Ｌ／Ｍ）によって区別される３つのクラスの幹細胞が存在する。骨髄偏向型（Ｍｙ−ｂｉ）ＨＳＣは、低いＬ／Ｍ比（０〜３）を有するのに対して、リンパ偏向型（Ｌｙ−ｂｉ）ＨＳＣは、大きな比（＞１０）を示す。第３のカテゴリーは、Ｌ／Ｍ比が３〜１０であるバランス型（Ｂａｌａ）ＨＳＣからなる。骨髄偏向型ＨＳＣおよびバランス型ＨＳＣのみが、持続的な自己複製特性を有する。
【０１７０】
本発明のキメラタンパク質発現細胞は、上記で挙げた細胞タイプのいずれでもよい。
【０１７１】
本発明の第１の態様にしたがう１つまたはそれを超えるキメラタンパク質を発現するＴ細胞またはＮＫ細胞は、患者自身の末梢血から（第１団）、またはドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状況において（第２団）、または非関連ドナーからの末梢血（第３団）からエキソビボで作製され得る。
【０１７２】
あるいは、本発明の第１の態様にしたがう１つまたはそれを超えるキメラタンパク質を発現するＴ細胞またはＮＫ細胞は、Ｔ細胞への誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のエキソビボ分化から誘導され得る。あるいは、溶解機能を保持し、治療薬として作用することができる不死化Ｔ細胞系も使用され得る。
【０１７３】
すべてのこれらの実施形態では、キメラタンパク質（複数も可）発現細胞は、ウイルスベクターの形質導入、またはＤＮＡもしくはＲＮＡのトランスフェクションなどの手段によって、前記キメラタンパク質または各キメラタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ、および場合によりＮＯＩを導入することによって生成される。
【０１７４】
本発明の細胞は、被験体由来のエキソビボＴ細胞またはＮＫ細胞であり得る。Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料に由来し得る。Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体による処理によって、本発明の第１の態様にしたがう１つまたはそれを超えるキメラタンパク質をコードする核酸を形質導入される前に、活性化および／または増殖され得る。
【０１７５】
本発明のＴ細胞またはＮＫ細胞は、
（ｉ）上記被験体または他の供給源から、Ｔ細胞またはＮＫ細胞含有試料を単離すること；ならびに
（ｉｉ）本発明の第２の態様にしたがう１つまたはそれを超える核酸配列（複数も可）をＴ細胞またはＮＫ細胞に形質導入またはトランスフェクトすることによって作製され得る。
【０１７６】
本発明はまた、１つまたはそれを超える本発明の第１の態様にしたがうキメラタンパク質（複数も可）を含むＴ細胞またはＮＫ細胞と、ＣＩＤとを含むキットを提供する。
【０１７７】
医薬組成物
本発明はまた、本発明の第４の態様にしたがう複数の細胞を含有する医薬組成物に関する。医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。医薬組成物は、１つまたはそれを超えるさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を場合により含み得る。このような製剤は、例えば、静脈内注入に適切な形態であり得る。
【０１７８】
方法
本発明はまた、本発明の第４の態様にしたがう細胞を作製するための方法であって、本発明の第３の態様にしたがうベクターを細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程を含む方法を提供する。
【０１７９】
ベクターは、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。
【０１８０】
本発明はまた、本発明の第４の態様にしたがう細胞を排除するための方法であって、前記細胞をＣＩＤ（例えば、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体）に曝露する工程を含む方法を提供する。細胞は、インビボまたはインビトロでＣＩＤに曝露され得る。細胞の排除は、ＣＩＤによって誘導されるカスパーゼドメインのホモ二量体化後に、カスパーゼの活性化によって誘導されるアポトーシスによって引き起こされ得る。
【０１８１】
ＣＩＤは、医薬組成物の形態で投与され得る。医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。医薬組成物は、１つまたはそれを超えるさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を場合により含み得る。このような製剤は、例えば、静脈内注入に適切な形態であり得る。
【０１８２】
本発明はまた、被験体への本発明の第４の態様にしたがう細胞の投与によって引き起こされる、前記被験体における病理学的免疫反応を予防および／または処置するための方法であって、ＣＩＤ（例えば、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体）を前記被験体に投与する工程を含む方法を提供する。
【０１８３】
病理学的免疫反応は、以下の群：移植片対宿主病；オンターゲットオフ腫瘍毒性；免疫活性化症候群；およびリンパ増殖性障害から選択され得る。
【０１８４】
本発明はまた、被験体における疾患を処置または予防するための方法であって、本発明の第４の態様にしたがう細胞を前記被験体に投与する工程を含む方法を提供する。細胞は、上記に定義される医薬組成物の形態であり得る。
【０１８５】
前記方法は、以下：
（ｉ）本発明の第３の態様にしたがうベクターを、被験体から単離された細胞の試料に形質導入またはトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）前記形質導入／トランスフェクト細胞を患者に投与する工程
を含み得る。
【０１８６】
疾患を処置するための方法は、本発明の細胞の治療用途に関する。本明細書では、疾患に関連する少なくとも１つの症候を緩和、軽減もしくは改善するために、および／または疾患進行を遅延、軽減もしくは阻止するために、前記細胞は、既存の疾患または症状を有する被験体に投与され得る。
【０１８７】
疾患を予防するための方法は、本発明の免疫細胞の予防用途に関する。本明細書では、疾患の原因を予防もしくは弱めるために、または疾患に関連する少なくとも１つの症候の発症を軽減もしくは予防するために、このような細胞は、疾患をまだ罹っていない被験体、および／または疾患のいずれの症候も示していない被験体に投与され得る。被験体は、疾患を発症する素因を有し得るか、または疾患を発症するリスクを有すると考えられ得る。
【０１８８】
本発明によって提供される疾患を処置するための方法は、疾患進行をモニタリングすること、および任意の毒性活性をモニタリングすること、ならびに被験体に投与されるＣＩＤの用量を調整して、許容され得るレベルの疾患進行および毒性活性を提供することを含み得る。
【０１８９】
疾患進行のモニタリングは、それらが軽減／改善または増加／悪化しているかを決定するために、疾患に関連する症候を経時的に評価することを意味する。
【０１９０】
毒性活性は、被験体への投与後に本発明の細胞によって引き起こされる有害効果に関する。毒性活性としては、例えば、免疫学的毒性、胆汁毒性および呼吸窮迫症候群が挙げられ得る。
【０１９１】
特に、本発明は、被験体における疾患を処置するための方法であって、以下：
（ｉ）本発明の第４の態様にしたがう細胞を前記被験体に投与する工程；
（ｉｉ）病理学的免疫反応の発症について、前記被験体をモニタリングする工程；および（ｉｉｉ）前記被験体が、病理学的免疫反応を発症するまたは発症した兆候を示す場合、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体を前記被験体に投与する工程
を含む方法を提供する。
【０１９２】
本発明は、疾患の処置および／または予防において使用するための本発明の細胞を提供する。
【０１９３】
細胞は、例えば、造血幹細胞移植、リンパ球注入または養子細胞移入に使用するためのものであり得る。
【０１９４】
本発明はまた、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における本発明の細胞の使用に関する。
【０１９５】
本発明はまた、毒性活性を処置および／または予防するための、本発明の第１の態様にしたがうキメラタンパク質の二量体化を誘導することができるＣＩＤ剤を提供する。
【０１９６】
本発明はまた、細胞における本発明の第１の態様にしたがうキメラタンパク質の一対のカスパーゼドメインの活性化に使用するためのＣＩＤ剤を提供する。
【０１９７】
本発明の細胞および方法によって処置ならびに／または予防すべき疾患は、ウイルス感染症などの感染症であり得る。
【０１９８】
本発明の方法はまた、例えば自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片対宿主拒絶における、病的免疫応答の制御に関するものであり得る。
【０１９９】
本発明の細胞がＴＣＲまたはＣＡＲを発現する場合、それらは、膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌（腎細胞）、白血病、肺癌、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、前立腺癌および甲状腺癌などの癌性疾患の処置に有用であり得る。
【０２００】
本発明のＴＣＲ／ＣＡＲ発現細胞は、標的細胞、例えば癌細胞を殺滅させることができる。
【０２０１】
本発明はまた、被験体への本発明の第４の態様にしたがう細胞の投与によって引き起こされる病理学的免疫反応の予防または処置に使用するためのラパマイシンまたはラパマイシン類似体を提供する。
【０２０２】
本発明の細胞は、改変細胞または非改変細胞を患者に投与する任意の細胞療法に使用され得る。細胞療法の例は、ＣＤ３４＋幹細胞移植後の養子Ｔ細胞移入である。幹細胞移入後におけるＴ細胞の投与は、患者レシピエントにおける免疫系の再構成を促進するのに役立つ。適合関連または非関連ドナーが利用不可能であるか、または広範なドナー探索のために疾患が過度に攻撃的である場合、ＨＬＡハプロタイプ一致家族ドナーの使用が有効であり得る。このようなドナーは、親、兄弟姉妹または二等親血縁者であり得る。このような注入は免疫回復を増強し、それにより、ウイルス感染を軽減し、再発性白血病細胞を除去し得る。しかしながら、ドナー幹細胞移植片におけるアロ反応性Ｔ細胞の共存は、ドナー細胞がレシピエントに対して反応する移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）（これは、レシピエントの皮膚、腸、肝臓および他の器官を徐々に損傷し得る）を引き起こし得る。
【０２０３】
細胞療法の他の例としては、天然細胞または異種遺伝子を発現するように遺伝子操作された細胞の使用が挙げられる。これらの処置は、血液障害を含む多くの障害に使用されるが、これらの治療は、負の副作用を有し得る。別の方法では、罹患細胞の機能を代替することによって障害を処置するために、例えば間葉系間質細胞などの多くの種類の成熟細胞に分化し得る未成熟前駆細胞が使用され得る。本発明は、細胞療法に使用されるドナー細胞の考えられる負の効果を取り除くための迅速で有効な機構を提供する。
【０２０４】
本発明は、ドナーＴ細胞移植後のヒト患者における移植片対宿主病の効果を軽減する方法であって、本発明にしたがうベクターを、ドナー細胞培養物中のヒトドナーＴ細胞にトランスフェクトまたは形質導入する工程；形質導入またはトランスフェクトされたドナーＴ細胞を前記患者に投与する工程；続いて、前記患者における移植片対宿主病の存在または非存在を検出する工程；および二量体化化学誘導剤（ＣＩＤ）を、移植片対宿主病の存在が検出される患者に投与する工程を含む方法を提供する。Ｔ細胞は、アロ反応性除去がされていないもの（ｎｏｎ−ａｌｌｏｄｅｐｌｅｔｅｄ）であり得る。
【０２０５】
本発明は、幹細胞移植の方法であって、ハプロタイプ一致幹細胞移植物をヒト患者に投与する工程；およびハプロタイプ一致ドナーＴ細胞を前記患者に投与する工程を含み、ハプロタイプ一致ドナー細胞培養物中で、本発明にしたがうベクターを前記Ｔ細胞にトランスフェクトまたは形質導入する方法を提供する。
【０２０６】
細胞は、ドナー細胞培養物中のアロ反応性除去がなされていないヒトドナーＴ細胞であり得る。
【０２０７】
本発明はまた、幹細胞移植の方法であって、ハプロタイプ一致幹細胞移植物をヒト患者に投与する工程；およびアロ反応性除去したハプロタイプ一致ドナーＴ細胞を前記患者に投与する工程を含み、ハプロタイプ一致ドナー細胞培養物中で、本発明にしたがうベクターを前記Ｔ細胞にトランスフェクトまたは形質導入する方法を提供する。
【０２０８】
ハプロタイプ一致幹細胞移植物は、ＣＤ３４＋ハプロタイプ一致幹細胞移植物であり得る。ヒトドナーＴ細胞は、患者のＴ細胞とハプロタイプ一致であり得る。患者は、幹細胞移植によって緩和され得る任意の疾患または障害であり得る。患者は、固形腫瘍または血液もしくは骨髄の癌などの癌を有し得る。患者は、血液または骨髄疾患を有し得る。患者は、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーを有し得る。
【０２０９】
ドナー細胞培養物は、骨髄試料または末梢血から調製され得る。ドナー細胞培養物は、ドナー末梢血単核細胞から調製され得る。いくつかの実施形態では、ドナーＴ細胞は、トランスフェクションまたは形質導入の前に、ドナー細胞培養物からアロ反応性除去される。形質導入またはトランスフェクトされたＴ細胞は、患者への投与前に、ＩＬ−２の存在下で培養され得る。
【０２１０】
実施例により本発明をさらに記載するが、これは、本発明を実施する上で当業者を助ける役割を果たすことを意味するもので、本発明の範囲をいかなる意味にせよ限定する意図はない。
【実施例】
【０２１１】
実施例１−キメラタンパク質を発現するＴ細胞の生産
異なる構築物をＴ細胞に形質導入した。二分子ｒａｐＣａｓｐ９（図１ａ）については、２つのベクター（一方は、内部リボソームエントリー配列によって緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰと共発現されるＦＫＢＰ１２−Ｃａｓｐ９をコードし、他方は、青色蛍光タンパク質ｅＢＦＰ２と共発現されるＦＲＢ−Ｃａｓｐ９をコードする）をＴ細胞に形質導入した。一分子ｒａｐＣａｓｐ９（図１ｂ）については、ｅＧＦＰと共発現される各ｒａｐＣａｓｐ９をコードする１つのベクターのみをＴ細胞に形質導入した。ＦＫＢ１２−Ｃａｓｐ９およびＦＲＢ−ＦＲＢｗを提供した構築物は、トリシストロン性カセットでコードされ、それにより、ＦＭＤ−２Ａ様ペプチドを使用してＦＫＢＰ１２−Ｃａｓｐ９およびＦＲＢ−ＦＲＢｗを共発現させ、ｅＧＦＰをＩＲＥＳと共発現させた。意図的に、Ｔ細胞を部分的にのみ形質導入したので、細胞培養内では、一定割合の細胞が依然として非形質導入状態であり、内部陰性対照として作用した。さらなる対照として、ｅＧＦＰのみをコードするベクターをＴ細胞に形質導入して、形質導入細胞に対するラパマイシンの非特異的効果を除いた。
【０２１２】
実施例２−ラパマイシンを用いたキメラタンパク質発現細胞の排除試験
Ｔ細胞を異なる濃度のラパマイシンに曝露し、４８時間インキュベートした。この後、Ｔ細胞をアネキシンＶおよび７ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存細胞をゲーティングし、蛍光タンパク質を発現する細胞の集団を調べることによって、形質導入集団および非形質導入集団の生存を明確に測定することができた。予想通り、二重ＦＲＢ−Ｃａｓｐ９およびＦＫＢＰ１２−Ｃａｓｐ９アプローチは、二重陽性細胞のみの有効な排除をもたらした。ＦＫＢＰ１２−ＦＲＢ−Ｃａｓｐ９構築物は、単一陽性細胞の有効な排除をもたらした。ＦＫＢＰ１２−Ｃａｓｐ９−ＦＲＢ構築物は、最小の排除をもたらした。ＦＫＢＰ１２−Ｃａｓｐ９／ＦＲＢ−ＦＲＢｗは、単一陽性細胞の有効な排除をもたらした。対照は、特異的な排除をもたらさなかった（図２および３）。
【０２１３】
実施例３−幅広い構築物の試験
図５に示されている構築物を生成し、Ｊｕｒｋａｔ細胞に形質導入した。形質導入細胞を非形質導入（ＮＴ）細胞と混合して、構築物陽性細胞および構築物陰性細胞の両方が集団内に含まれるようにした。ラパマイシンを０、１、１０、１００および１０００ｎＭの濃度で添加し、細胞を２４時間インキュベートした。回収後、細胞をＰＩおよびアネキシンＶで染色し、ＦＡＣＳによって分析した。結果を図６〜９に示し、図１０に要約する。
【０２１４】
本発明の第１の態様の第１の実施形態にしたがって定義される構成を有する構築物（すなわち、ＭＰ２０２４４）は、このアッセイにおいて非常に良好なパフォーマンスを示し、１ｎＭを超えるおよびそれを含むすべての濃度のラパマイシンでトランスフェクト細胞の非常に効率的な殺滅をもたらした。
【０２１５】
本発明の第１の態様の第２の実施形態にしたがって定義される構成を有する一対の構築物（すなわち、ＭＰ２０２０６およびＭＰ２０２０７）も非常に良好なパフォーマンスを示し、１ｎＭを超えるおよびそれを含むすべての濃度のラパマイシンでトランスフェクト細胞の非常に効率的な殺滅をもたらした。
【０２１６】
本発明の第１の態様の第３の実施形態にしたがって定義される構成を有する構築物（すなわち、ＭＰ２０２６５）も良好なパフォーマンスを示し、１ｎＭラパマイシンではいくらかの殺滅をもたらし、１０ｎＭおよびそれを超える濃度のラパマイシンでは効率的な殺滅をもたらした。
【０２１７】
本発明の第１の態様の第４の実施形態にしたがって定義される構成を有する構築物（すなわち、ＭＰ２０２６３、ＭＰ２０２６４およびＭＰ２１０６７）は、１ｎＭラパマイシンでは良好なパフォーマンスを示したが、より高濃度のラパマイシンでは、殺滅があまり効率的ではなかった。
【０２１８】
実施例４−テムシロリムスを用いた構築物の試験
実施例３に記載されているものと同等の実験において、図５に示されている構築物を発現する細胞を、ラパマイシンおよびテムシロリムス（ラパマイシン類似体）の両方で処理した。
【０２１９】
実施例３に概説されている実験と同様に、形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を非形質導入（ＮＴ）と混合して、構築物を発現する細胞および非形質導入細胞の両方を含有する集団を得た。
【０２２０】
２×１０５個の細胞／ウェルの濃度の細胞を処理しないでおくか、または以下の濃度のラパマイシンもしくはテムシロリムスで処理した：０．０１、０．１、１、１０ｎＭ（のラパマイシンまたはテムシロリムスのいずれか）。
【０２２１】
細胞を２４時間インキュベートし、次いで、アネキシンＶおよびＰＩで染色し、ＦＡＣＳによって分析した。結果を図１１に示す。
【０２２２】
図５に示されている様々な構築物を用いたところ、テムシロリムスの存在下では、ラパマイシンの存在下で先に観察されたのと同等のＪｕｒｋａｔ細胞殺滅パターンが観察された。
【０２２３】
特に、本発明の第１の態様の第１の実施形態にしたがって定義される構成を有する構築物ＭＰ２０２４４；ならびに本発明の第１の態様の第２の実施形態にしたがって定義される構成を有する一対の構築物ＭＰ２０２０６およびＭＰ２０２０７は両方とも、良好なパフォーマンスを示した。両方とも、１ｎＭを超えるおよびそれを含むすべての濃度のテムシロリムスでトランスフェクト細胞の効率的な殺滅をもたらした。
【０２２４】
上記の明細書で挙げた出版物は全て、参照により本明細書に援用する。本発明の記載された方法および系の様々な改変および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態と共に記載したが、請求されている本発明は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解するべきである。事実、分子生物学または関連分野における専門家にとって明白な、本発明を実施するために記載された方法の様々な改変も以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
2020078359.tif 000030
【図１１】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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