(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子の肝特異的発現を増強しうる核酸調節要素、これらの調節要素を使用する方法、およびこれらの要素の使用を提供する。【解決手段】特定の配列またはそれらの機能性断片からなる群から選ばれる配列を含む、肝特異的遺伝子発現を増強するための６００ヌクレオチドまたはそれ未満の核酸調節要素。核酸調節要素は、遺伝子治療を用いる用途に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列、またはそれらの機能性断片からなる群から選ばれる配列を含む、肝特異的遺伝子発現を増強するための６００ヌクレオチドまたはそれ未満の核酸調節要素。
【請求項２】
配列番号３、配列番号１、配列番号２、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列、またはそれらの機能性断片からなる群から選ばれる配列を含む、請求項１に記載の核酸調節要素。
【請求項３】
請求項１に記載の調節要素またはその相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする６００ヌクレオチドまたはそれ未満の核酸調節要素。
【請求項４】
プロモーターおよびトランスジーンに機能的に連結された請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸調節要素を含む核酸発現カセット。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の２以上の核酸調節要素を含む、請求項４に記載の核酸発現カセット。
【請求項６】
それらの２以上の調節要素が同一である、請求項５に記載の核酸発現カセット。
【請求項７】
該プロモーターが肝特異的プロモーターである、請求項４〜６のいずれか１項に記載の核酸発現カセット。
【請求項８】
該プロモーターがトランスチレチン（ＴＴＲ）遺伝子由来である、請求項７に記載の核酸発現カセット。
【請求項９】
該プロモーターが最小プロモーターである、請求項４〜８のいずれか１項に記載の核酸発現カセット。
【請求項１０】
該トランスジーンが治療用タンパク質をコードしている、請求項４〜９のいずれか１項に記載の核酸発現カセット。
【請求項１１】
該治療用タンパク質が凝固因子である、請求項１０に記載の核酸発現カセット。
【請求項１２】
該治療用タンパク質が因子ＩＸである、請求項１１に記載の核酸発現カセット。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の調節要素を含むベクター。
【請求項１４】
請求項４〜１２のいずれか１項に記載の核酸発現カセットを含む、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
ウイルスベクター、特にレンチウイルスまたはＡＡＶベクターである、請求項１３または１４に記載のベクター。
【請求項１６】
遺伝子治療における、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸調節要素の使用。
【請求項１７】
・請求項４〜１２のいずれか１項に記載の核酸発現カセットを肝細胞内に導入し、
・トランスジーンタンパク質産物を該肝細胞内で発現させることを含む、肝細胞においてタンパク質を発現させるための方法。
【請求項１８】
・請求項１０に記載の核酸発現カセット、または請求項１０に記載の核酸発現カセットを含むベクターを対象の肝臓内に導入し、
・治療量のタンパク質を肝臓内で発現させることを含む、遺伝子治療を要する対象に対する遺伝子治療の方法。
【請求項１９】
・請求項１１もしくは１２に記載の核酸発現カセット、または請求項１１もしくは１２に記載の核酸発現カセットを含むベクターを対象の肝臓内に導入し、
・治療量の凝固因子を肝臓内で発現させることを含む、血友病Ｂの治療のための、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の肝特異的発現を増強しうる核酸調節要素、これらの調節要素を使用する方法、およびこれらの要素の使用に関する。これらの核酸調節要素を含有する発現カセットおよびベクターも開示する。本発明は、遺伝子治療を用いる用途に特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、代謝、止血および感染防御に関与するタンパク質の合成を含む、体内の非常に多様な必須機能を果たしている。多数の後天的、複合的および遺伝的疾患（狭義には肝疾患、および肝疾患を直接は招かないが主に体内の他の部位で発現する幾つかの遺伝性障害）が肝臓における遺伝子発現の改変に関連づけられている。幾つかの具体例には、血友病ＡもしくはＢ、家族性高コレステロール血症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症またはα−アンチトリプシン欠損症が含まれる。また、肝臓は、しばしば、病原体（例えば、肝炎ウイルス）の感染を受ける。最後に、肝臓は悪性トランスフォーメーションを受け、肝癌（肝細胞癌）を引き起こし、あるいは医薬治療および化学療法、薬物またはアルコール乱用の結果として機能低下しうる。したがって、肝臓において機能性遺伝子を発現させて必要なタンパク質を補充し、または例えばＲＮＡ干渉もしくはドミナントネガティブ抑制タンパク質により改変遺伝子産物もしくは望ましくない遺伝子産物の発現を遮断し、または変性肝臓の肝細胞機能を回復させるために遺伝子治療を用いることに、相当な且つ関心が寄せられつつある。免疫刺激性サイトカインのような適切な遺伝子での肝細胞の形質導入も、例えばウイルス性肝炎または肝腫瘍に対する免疫応答を誘導するのに有用でありうる（Ｂａｒａｊａｓら，２００１；Ｖｉｌｌａら，２００１）。
【０００３】
肝遺伝子治療における主要課題の１つは肝特異的治療遺伝子発現の達成である（Ｘｉａら，２００４；Ｐｒｉｅｔｏら，２００３）。哺乳類肝細胞のインビボ標的化は、肝実質、肝動脈または肝門脈内にＤＮＡまたはウイルスベクターを注入することにより行われている。アデノウイルスベクターは、全身投与された場合であっても、マウスにおいては主として肝臓を標的化するが（Ｗｏｏｄら，１９９９）、肺および骨格筋にも感染しうる。さらに、アデノウイルスの肝特異性はヒトにおいては未だ実証されていない。アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）またはレンチウイルスベクターのような他のベクターも肝細胞を形質導入しうるが、この場合も、標的外遺伝子発現を招く非肝細胞の形質導入が生じうる（ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅら，２００２）。遺伝子発現を局在化するためのもう１つの方法は転写標的化によるものである。一般に、転写標的化は全てのインビボ遺伝子治療用途に非常に望ましい。なぜなら、それは非標的細胞におけるトランスジーンの発現を妨げて、生理的調節を模倣しうるからである（Ｔｅｎｅｎｂａｕｍら，２００３；Ｓｃｈａｇｅｎら，２００４）。適切な肝特異的転写要素の使用は治療用遺伝子の発現を肝細胞に限定するはずである。例えば、主として肝臓において活性である幾つかのプロモーターが細胞特異的遺伝子運搬に既に使用されている（Ｋｕｒｉｙａｍａら，１９９１；Ｋｉｓｔｎｅｒら，１９９６）。しかし、機能的組織特異性は稀にしか実証されていない。さらに、遺伝子治療における肝特異的プロモーターの使用の主な欠点はその大きなサイズである。なぜなら、多数のベクターは、限られたクローニング空間を有するに過ぎず、および／または遺伝子治療法において広く使用されているサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）もしくは長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター配列のような強力（ウイルス）プロモーターと比較して低い活性を有するからである。
【０００４】
臨床効果を達成するために必要なウイルスベクターの量を減少させるための方法としては、組織特異的トランスジーン発現の増強が望ましい。特異性および活性の両方を増強するために、シス作用性調節要素の使用が提示されている。典型的には、これはエンハンサー配列［すなわち、配向には無関係に、比較的長い距離にわたる（標的プロモーターから数キロベースまで離れている）場合であっても、プロモーターの活性を増強し、シスで作用する可能性を有する核酸配列］に関係している。しかし、エンハンサー機能は必ずしもそのような長い距離に限定されるわけではない。それらは、与えられたプロモーターの近くにおいても機能しうるからである。肝臓に関しては、（しばしば、ハウスキーピング肝細胞特異的細胞プロモーターに加えて）レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター内にそのような器官特異的調節配列を組込むための多数のアプローチが現在までに報告されている（Ｆｅｒｒｙら，１９９８；Ｇｈｏｓｈら，２０００；Ｍｉａｏら，２０００；Ｆｏｌｌｅｎｚｉら，２００２）。肝特異的プロモーターおよびエンハンサーを使用することによりベクター媒介遺伝子発現を肝細胞に限定する利点は、例えば、トランスジーンによりコードされるタンパク質に対する免疫応答を誘導する可能性の減少を含む（Ｐａｓｔｏｒｅら，１９９９；Ｂｒｏｗｎら，２００６，２００７）。
【０００５】
肝特異的遺伝子のための幾つかのエンハンサー配列が記載されている。ＷＯ９５／０１１３０８は、トランスジーンおよびプロモーターに連結された肝細胞特異的調節領域（ＨＣＲ）エンハンサーを含む遺伝子治療用ベクターを記載している。ヒトアポリポタンパク質Ｅ−肝細胞調節領域（ＡｐｏＥ−ＨＣＲ）はアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子の肝特異的発現のための遺伝子座調節領域である。ＡｐｏＥ−ＨＣＲはＡｐｏＥ／Ｃｌ／Ｃｌｌ遺伝子座に位置し、７７１ｂｐの全長を有し、肝臓における遺伝子ＡｐｏＥおよびＡｐｏＣ−ｌの発現において重要である（Ｓｉｍｏｎｅｔら，１９９３）。ＷＯ０１／０９８４８２においては、この特異的ＡｐｏＥエンハンサー配列またはそのトランケート化体と肝プロモーターとの組合せが示唆されている。（非トランケート化）ＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサーをヒトα−アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーターと組合せたベクター構築物は最高レベルの治療用タンパク質をインビボで産生することが可能であり（Ｍｉａｏら，２０００）、異種トランスジーンと共に使用された場合に持続的発現をもたらしうることが示された（Ｍｉａｏら，２００１）。注目すべきことに、これらの著者は、インビボ肝遺伝子発現を増強するためのシス配列の重要性を示しているだけでなく、組織培養およびインビボ研究における遺伝子発現の相関性の欠如を再び強調している。
【０００６】
例えばｐＡＡＶ−ＡｐｏＨＣＲ−ＡＡＴ−ＦＩＸＩＡ構築物（ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅら，２００７）において使用されたこのＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ＡＡＴ発現カセットは、公知の最も強力な肝特異的ＦＩＸ発現構築物の１つであり、重篤な血友病Ｂを有するヒトでの第１／２相用量増加臨床研究において成功裏に適用されている（Ｍａｎｎｏら，２００６）。このｈＦＩＸ小型遺伝子の発現は、ヒトＡＡＴプロモーターに連結されたＡｐｏＥ−ＨＣＲから駆動される。ヒトＡＡＴ遺伝子の５’−隣接配列は、約１．２ｋｂの全長を有する、遠位エンハンサーおよび近位配列を含む複数のシス調節要素を含有する。主として肝臓において、そしてそれよりは低い度合ではあるが、ＡＡＴを発現することが知られている他の組織においても、遺伝子発現を導くことによりインビボで組織特異性を付与するためには、それで十分であることが示された（Ｓｈｅｎら，１９８９）。ＡｐｏＥエンハンサーと組合されたこの１．２ｋｂの領域の３４７ｂｐの断片はインビボで長期肝特異的遺伝子発現を達成しうる（Ｌｅら，１９９７）。興味深いことに、この短いほうのプロモーターは、より大きなＡＡＴプロモーター断片に関して報告されているものより大きな特異性で、発現を肝臓へと標的化する（Ｙｕｌｌら，１９９５）。
【０００７】
他のキメラ肝特異的構築物、例えば、ＡＡＴプロモーターおよびアルブミンもしくはＢ型肝炎エンハンサー（Ｋｒａｍｅｒら，２００３）またはアルコールデヒドロゲナーゼ６（ＡＤＨ６）基底プロモーター（アポリポタンパク質Ｅエンハンサー要素の２つの縦列コピーに連結されているもの）を含有するものも、文献において提示されている（Ｇｅｈｒｋｅら，２００３）。後者の刊行物の著者は、このエンハンサー−プロモーターの組合せの比較的小さいサイズ（１０６８ｂｐ）の重要性を強調している。
【０００８】
トランスジーン産物の治療レベルを長期間にわたってもたらしうるためには、遺伝子導入ベクターは、好ましくは、特異的に調節された高い発現を可能にすると同時に、該トランスジーンが挿入されるのに十分なクローニング空間を保有する。すなわち、高度かつ組織特異的な発現を達成するために使用される調節要素は、好ましくは、限られた長さのものであるに過ぎない。しかし、これまでに開示されている遺伝子治療用ベクターはいずれも、全てのこれらの基準を満たしているわけではない。実際、遺伝子治療用ベクターは、所望の標的細胞、特に肝細胞における発現レベルおよび／または発現特異性の点で十分に強固ではない。プロモーター／エンハンサーのサイズの減少は、しばしば、発現レベルおよび／または発現特異性を妨げたが、より大きな配列の使用は、しばしば、ベクター機能、パッケージングおよび／またはトランスフェクション／形質導入効率の阻害により遺伝子運搬の効率を損なう。したがって、有効な遺伝子治療のための肝臓におけるトランスジーン発現の治療レベルを達成するベクターが当技術分野において必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第９５／０１１３０８号
【特許文献２】国際公開第２００１／０９８４８２号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂａｒａｊａｓら，２００１
【非特許文献２】Ｖｉｌｌａら，２００１
【非特許文献３】Ｘｉａら，２００４
【非特許文献４】Ｐｒｉｅｔｏら，２００３
【非特許文献５】Ｗｏｏｄら，１９９９
【非特許文献６】ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅら，２００２
【非特許文献７】Ｔｅｎｅｎｂａｕｍら，２００３
【非特許文献８】Ｓｃｈａｇｅｎら，２００４
【非特許文献９】Ｋｕｒｉｙａｍａら，１９９１
【非特許文献１０】Ｋｉｓｔｎｅｒら，１９９６
【非特許文献１１】Ｆｅｒｒｙら，１９９８
【非特許文献１２】Ｇｈｏｓｈら，２０００
【非特許文献１３】Ｍｉａｏら，２０００
【非特許文献１４】Ｆｏｌｌｅｎｚｉら，２００２
【非特許文献１５】Ｐａｓｔｏｒｅら，１９９９
【非特許文献１６】Ｂｒｏｗｎら，２００６
【非特許文献１７】Ｂｒｏｗｎら，２００７
【非特許文献１８】Ｓｉｍｏｎｅｔら，１９９３
【非特許文献１９】Ｍｉａｏら，２００１
【非特許文献２０】ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅら，２００７
【非特許文献２１】Ｍａｎｎｏら，２００６
【非特許文献２２】Ｓｈｅｎら，１９８９
【非特許文献２３】Ｌｅら，１９９７
【非特許文献２４】Ｙｕｌｌら，１９９５
【非特許文献２５】Ｋｒａｍｅｒら，２００３
【非特許文献２６】Ｇｅｈｒｋｅら，２００３
【発明の概要】
【００１１】
遺伝子治療に使用される構築物の肝特異的発現の効率を特にインビボで増加させることが本発明の目的である。同時に、高度の構造的密集性を有する構築物を使用してこれを達成することが本発明の目的である。前記目的は、（最小プロモーターを使用した場合でさえも）組織特異性を保有する一方でプロモーター発現を増強する特異的調節要素を提供することにより達成される。特に重要なのは、これらの調節要素サイズが小さいことであり、これは、この転写制御単位を、大きなエフェクター遺伝子と組合されている場合であっても任意のタイプのウイルスまたは非ウイルスベクター内に収容することを可能にする。それらの限られた長さにもかかわらず、本発明で提供される調節要素は、遺伝子治療において使用される、より長い通常の核酸発現カセットと比較して類似したレベル、そして典型的にはより一層高いレベルまで、トランスジーンの発現を増強しうる。
【００１２】
したがって、第１の態様においては、配列番号３、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列またはそれらの機能性断片からなる群から選ばれる配列を含む、肝特異的遺伝子発現を増強するための６００ヌクレオチドまたはそれ未満の核酸調節要素を提供する。
【００１３】
もう１つの特定の実施形態においては、該核酸調節要素は、配列番号３、配列番号１、配列番号２、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列またはそれらの機能性断片からなる群から選ばれる配列を含む。さらにもう１つの特定の実施形態においては、該核酸調節要素は、配列番号３、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列またはそれらの機能性断片を含む。
【００１４】
もう１つの実施形態においては、配列番号３、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列またはそれらの機能性断片からなる群から選ばれる配列を含む調節要素にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする６００ヌクレオチドまたはそれ未満の核酸調節要素を提供する。
【００１５】
もう１つの実施形態においては、配列番号３、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４およびこれらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列からなる群から選ばれる配列の少なくとも２つの断片を含む６００ヌクレオチドまたはそれ未満の核酸調節要素を提供する。もう１つの特定の実施形態においては、これらの断片の少なくとも２つは互いに異なる。さらにもう１つの特定の実施形態においては、全ての断片は互いに異なる。もう１つの特定の実施形態においては、少なくとも２つの断片は同一である。もう１つの特定の実施形態においては、少なくとも２つの断片の少なくとも１つは機能性断片である。もう１つの特定の実施形態においては、全ての断片は、挙げられている配列の機能性断片である。
【００１６】
もう１つの態様においては、該調節要素は、遺伝子またはトランスジーンを発現させるために使用される。したがって、プロモーターに機能的に連結された、本明細書に記載されている核酸調節要素を含む核酸発現カセットを提供する。この態様のもう１つの実施形態においては、該核酸発現カセットの核酸調節要素はプロモーターおよびトランスジーンに機能的に連結されている。
【００１７】
特定の実施形態においては、２以上の核酸調節要素を含有する該核酸発現カセットを提供する。この場合、これらの２以上の核酸調節要素はプロモーターに、そして場合によってはトランスジーンに機能的に連結されている。もう１つの特定の実施形態においては、それらの２以上の調節要素の少なくとも２つは同一または実質的に同一（例えば、９０％または９５％同一）である。さらにもう１つの特定の実施形態においては、それらの２以上の調節要素の全ては同一または実質的に同一である。もう１つの特定の実施形態においては、それらの２以上の調節要素の少なくとも２つは互いに同一でない。
【００１８】
特定の実施形態においては、提供する核酸発現カセット内に含有されるプロモーターは肝特異的プロモーターである。もう１つの特定の実施形態においては、該肝特異的プロモーターはトランスチレチン（ＴＴＲ）遺伝子に由来する。さらにもう１つの特定の実施形態においては、該ＴＴＲプロモーターは最小プロモーター、最も厳密には、配列番号１７に記載されている最小プロモーターである。
【００１９】
もう１つの特定の実施形態においては、提供する核酸発現カセット内に含有されるプロモーターは最小プロモーターである。
【００２０】
該トランスジーンは、ＲＮＡまたはポリペプチド（タンパク質）のような遺伝子産物を典型的にコードする核酸発現カセット内に含有されうる。特定の実施形態においては、該トランスジーンは治療用タンパク質をコードする。もう１つの特定の実施形態においては、該治療用タンパク質は凝固因子である。さらにもう１つの特定の実施形態においては、該治療用タンパク質（または凝固因子）は因子ＩＸである。
【００２１】
本明細書に記載されている核酸発現カセット、そして調節要素でさえも、そのまま使用されうる。しかし、典型的な実施形態においては、該発現カセットは核酸ベクターの一部となる。したがって、もう１つの態様においては、本明細書に記載されている調節要素を含むベクターを提供する。特定の実施形態においては、該ベクターは、本出願に開示されている核酸発現カセットを含む。特定の実施形態においては、提供するベクターはウイルスベクター、特にレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスまたはＡＡＶベクター、より厳密には、レンチウイルスまたはＡＡＶベクターである。もう１つの実施形態においては、該ベクターは非ウイルスベクターである。さらにもう１つの実施形態においては、該ベクターはウイルス要素および非ウイルス要素の両方を含有する。
【００２２】
該肝特異的調節要素、該発現カセットおよびそれらのいずれかを含有するベクターは遺伝子治療目的に使用されうることが当業者に明らかである。したがって、遺伝子治療における、本明細書に記載されている核酸調節要素の使用が想定される。もう１つの特定の実施形態においては、遺伝子治療における、本明細書に開示されている核酸発現カセットの使用を開示する。さらにもう１つの特定の実施形態においては、本出願は、遺伝子治療のための、本明細書に記載されているベクターの使用を想定している。特定の実施形態においては、想定される遺伝子治療は肝特異的遺伝子治療である。もう１つの特定の実施形態においては、該遺伝子治療は、肝臓において生じた疾患に対する遺伝子治療である。
【００２３】
本発明のもう１つの態様においては、
・本明細書に記載されている核酸調節要素がプロモーターおよびトランスジーンに機能的に連結された核酸発現カセットを肝細胞内に導入し、
・トランスジーン産物を該肝細胞内で発現させる工程を含む、肝細胞においてトランスジーン産物を発現させるための方法を提供する。
もう１つの特定の実施形態においては、該トランスジーン産物はタンパク質である。もう１つの実施形態においては、該トランスジーン産物はＲＮＡである。もう１つの特定の実施形態においては、該方法をインビトロで行う。もう１つの特定の実施形態においては、該方法をエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で行う。もう１つの特定の実施形態においては、該方法をインビボで行う。
【００２４】
遺伝子治療を要する対象における遺伝子治療の方法も本発明において提供する。これらの方法は、典型的には、
・核酸発現カセット（該核酸発現カセットにおいては、本明細書に記載されている核酸調節要素が、プロモーター、および治療用タンパク質をコードするトランスジーンに機能的に連結されている）を対象の肝臓内に導入し、
・治療量の該（治療用）タンパク質を肝臓内で発現させる工程を含む。
【００２５】
該核酸発現カセットそれ自体を導入する代わりに、該方法は、核酸発現カセット（該核酸発現カセットにおいては、本明細書に記載されている核酸調節要素が、プロモーター、および治療用タンパク質をコードするトランスジーンに機能的に連結されている）を含有するベクターを対象の肝臓内に導入することも可能である。一般に、それを要する対象は哺乳動物、最も厳密にはヒトであろう。典型的には、それを要する対象は、ある症状、最も厳密には、疾患に特徴的な症状を有するであろう。もう１つの特定の実施形態においては、該方法は、治療量の該治療用タンパク質を発現させることにより、症状の改善を要する対象の症状を改善する工程を更に含む。
【００２６】
特定の実施形態においては、該方法は、血友病Ｂを有する対象の治療に使用されうる。この実施形態においては、該方法は、
・核酸発現カセット（該核酸発現カセットにおいては、本明細書に記載されている核酸調節要素が、プロモーター、および凝固因子、特に因子ＩＸをコードするトランスジーンに機能的に連結されている）またはそのような核酸発現カセットを含むベクターを対象の肝臓内に導入し、
・治療量の該凝固因子（特に因子ＩＸ）を肝臓内で発現させるさせる工程を含む。
【００２７】
これらの方法は、治療量の該凝固因子（特に因子ＩＸ）を肝臓内で発現させることにより血友病Ｂの症状を改善する工程を更に含みうる。
【００２８】
（詳細な説明）
定義
本発明は特定の実施形態に関して及び或る図面を参照して以下に説明されるが、本発明はそれらに限定されるものではなく、特許請求のみによって限定される。特許請求の範囲におけるいずれの引用表示も本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。記載されている図面は概要図に過ぎず、限定的なものではない。図面においては、該要素の幾つかのサイズは誇張されていることがあり、例示を目的として、実物大では描かれていないことがある。「含む」なる語が本明細書および特許請求の範囲において用いられている場合、それは他の要素または工程を除外しない。単数形が用いられている場合、特に示されていない限り、これは複数形のその名詞を含む。
【００２９】
さらに、本明細書および特許請求の範囲における第１、第２、第３などの語は、類似要素を区別するために用いられており、必ずしも、連続的または時間的順序を示すために用いられているわけではない。そのように用いられる用語は適切な状況下で互換可能であり、本明細書に記載されている本発明の実施形態は、本明細書に記載または例示されているもの以外の他の順序においても実施可能であると理解されるべきである。
【００３０】
以下の用語または定義は専ら本発明の理解を補助するために記載されている。本明細書中に特に示されていない限り、本明細書中で用いる全ての用語は、本発明の当業者に認識されているものと同じ意義を有する。当技術分野における定義および用語に関しては、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ４７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）が実施者に参考になる。本明細書に記載されている定義は、当業者に理解されているものより狭い範囲を有すると解釈されるべきではない。
【００３１】
本明細書中で用いる「調節要素」は、遺伝子の転写、特に遺伝子の組織特異的転写を調節および／または制御しうる転写制御要素、特に非コード化シス作用性転写制御要素を意味する。調節要素は、少なくとも１つの転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）、より厳密には、組織特異的転写因子に対する少なくとも１つの結合部位、最も厳密には、肝特異的転写因子に対する少なくとも１つの結合部位を含む。典型的には、本明細書中で用いる調節要素は、プロモーター駆動性遺伝子発現を、該調節要素を伴わない該プロモーター単独の遺伝子転写と比較して増加または増強する。したがって、調節要素は特にエンハンサー配列を含む。尤も、転写を増強する調節要素は典型的な遠上流エンハンサー配列に限定されるものではなく、それが調節する遺伝子から任意の距離において存在しうると理解されるべきである。実際、転写を調節する配列は、インビボでそれが調節する遺伝子の上流（例えば、プロモーター領域）または下流（例えば、３’ＵＴＲ内）に位置することが可能であり、該遺伝子の至近距離または遥か遠くに位置しうることが、当技術分野において公知である。注目すべきことに、本明細書に開示されている調節要素は、典型的には、天然に存在する配列、そのような調節要素の（部分の）組合せ、または調節要素の幾つかのコピーである。すなわち、天然に存在しない配列自体も調節要素として想定される。本明細書中で用いる調節要素は、転写制御に関与する、より大きな配列の一部、例えば、プロモーター配列の一部でありうる。しかし、典型的には、調節要素のみでは、転写を開始させるのに十分ではなく、この目的にはプロモーターを要する。
【００３２】
本出願において用いる「肝特異的発現」は、他の組織と比較した場合の肝臓における（ＲＮＡおよび／またはポリペプチドとしての）（トランス）遺伝子の優先的または優勢な発現を意味する。特定の実施形態においては、該（トランス）遺伝子発現の少なくとも５０％が肝臓内で生じる。より厳密な実施形態においては、該（トランス）遺伝子発現の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％または１００％が肝臓内で生じる。特定の実施形態においては、肝特異的発現は、他の臓器、例えば脾臓、筋肉、心臓および／または肺への、発現された遺伝子産物の漏出が存在しないことを含む。必要に応じて変更を加えて、肝細胞特異的発現にも同じことが当てはまり、それは肝特異的発現の特定の形態とみなされうる。本出願の全体において、発現に関して肝特異的と示されている場合、肝細胞特異的発現も明らかに想定される。同様に、本出願において組織特異的発現が用いられている場合、該組織を主として構成する細胞型の細胞型特異的発現も想定される。
【００３３】
本出願において用いる「機能性断片」なる語は、肝特異的発現を調節する能力を保有する、本明細書に開示されている配列の断片を意味する。すなわち、それらは尚も組織特異性をもたらし、それらは、それらが由来する配列と同様に（しかし、おそらくは同じ度合ではないが）、（トランス）遺伝子の発現を調節しうる。断片は、それらが由来する配列からの少なくとも１０個の連続的ヌクレオチドを含む。他の特定の実施形態においては、断片は、それらが由来する配列からの少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５または少なくとも４０個の連続的ヌクレオチドを含む。
【００３４】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ（する）」なる語およびその文法的等価体は、温度および塩濃度の一定条件下、標的核酸分子に核酸分子がハイブリダイズしうることを意味する。典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、天然二重鎖の融解温度（Ｔｍ）よりせいぜい２５℃〜３０℃（例えば、２０℃、１５℃、１０℃または５℃）低い温度である。Ｔｍを計算するための方法は当技術分野でよく知られている。非限定的な具体例を挙げると、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを達成するための代表的な塩および温度条件は６５℃における１×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳである。ＳＳＣなる略語は、核酸ハイブリダイゼーション溶液中で使用されるバッファーを意味する。１リットルの２０×（２０倍濃度）ストックＳＳＣバッファー溶液（ｐＨ７．０）は１７５．３ｇの塩化ナトリウムおよび８８．２ｇのクエン酸ナトリウムを含有する。ハイブリダイゼーションを達成するための典型的な時間は１２時間である（全般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８７を参照されたい）。
【００３５】
本明細書中で用いる「核酸発現カセット」なる語は、１以上の所望の細胞型、組織または器官において（トランス）遺伝子発現を導く１以上の転写制御要素（限定的なものではないが例えば、プロモーター、エンハンサーおよび／または調節要素、ポリアデニル化配列およびイントロン）を含む核酸分子を意味する。核酸発現カセットは、該核酸配列が挿入されている細胞における内因性遺伝子の発現を導くことも想定されるが、典型的には、それらはトランスジーンをも含有するであろう。
【００３６】
本明細書中で用いる「機能的に連結」なる語は、種々の核酸分子要素が機能的に連結されており互いに相互作用しうるような、それぞれに対する該核酸分子要素の配置を意味する。そのような要素には、プロモーター、エンハンサーおよび／または調節要素、ポリアデニル化配列、１以上のイントロンおよび／またはエキソン、ならびに発現されるべき関心遺伝子のコード配列（すなわち、トランスジーン）が含まれうるが、これらに限定されるものではない。それらの核酸配列要素は、適切に配向している又は機能的に連結されている場合には、互いの活性をモジュレーションするように一緒に作用し、最終的には該トランスジーンの発現のレベルに影響を及ぼしうる。モジュレーションは、特定の要素の活性のレベルの増加、減少または維持を意味する。他の要素に対する各要素の位置は各要素の５’末端および３’末端として表されることが可能であり、いずれかの特定の要素の間の距離は、それらの要素間の介在ヌクレオチドまたは塩基対の数により示されうる。
【００３７】
本出願において用いる「プロモーター」なる語は、それが機能的に連結されている対応核酸コード配列（例えば、トランスジーンまたは内因性遺伝子）の転写を直接的または間接的に調節する核酸配列を意味する。プロモーターは、転写を調節するよう単独で機能しうる。あるいはプロモーターは１以上の他の調節配列（例えば、エンハンサーまたはサイレンサー）と共に作用しうる。本出願の文脈においては、プロモーターは、典型的には、トランスジーンの転写を調節するよう調節要素に機能的に連結される。
【００３８】
本明細書に記載されている調節要素がプロモーターおよびトランスジーンの両方に機能的に連結されている場合、該調節要素は、（１）該トランスジーンの有意な度合の肝特異的発現をインビボ（および／または肝細胞／肝細胞系でインビトロ）でもたらすことが可能であり、および／または（２）肝臓（および／またはインビトロで肝細胞／肝細胞系）における該トランスジーンの発現のレベルを増加させることが可能である。本明細書中で用いる「最小プロモーター」は、発現を尚も導きうるが（例えば組織特異的）発現の調節に寄与する配列の少なくとも一部を欠く、完全サイズのプロモーターの一部である。この定義は、遺伝子の発現を導きうるが組織特異的にその遺伝子を発現する能力を喪失している、（組織特異的）調節要素が欠失しているプロモーターと、遺伝子の（おそらくは低下した）発現を駆動しうるが組織特異的にその遺伝子を発現する能力を必ずしも喪失していない、（組織特異的）調節要素が欠失しているプロモーターとの両方を含む。最小プロモーターは当技術分野において詳細に記載されており、本明細書には最小プロモーターの非限定的な一覧が記載されている。
【００３９】
本明細書中で用いる「トランスジーン」なる語は、核酸配列が挿入された細胞において発現されるべきポリペプチドまたはポリペプチドの一部をコードする特定の核酸配列を意味する。しかし、トランスジーンは、典型的には、核酸配列が挿入された細胞における特定のポリペプチドの量を減少させるために、ＲＮＡとして発現されることも可能である。これらのＲＮＡ分子には、ＲＮＡ干渉により機能を果たす分子（ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ）、マイクロ−ＲＮＡ調節（ｍｉＲ）、触媒性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。該核酸配列をどのようにして細胞内に導入するかは本発明にとって本質的ではなく、それは、例えば、ゲノム内への又はエピソーム性プラスミドとしての組込みによるものでありうる。注目すべきことに、該トランスジーンの発現は、核酸配列が挿入された細胞の小集団に限局されうる。「トランスジーン」なる語は、（１）細胞において天然では見いだされない核酸配列（すなわち、異種核酸配列）、（２）それが導入された細胞において天然で見出される核酸配列の突然変異形態である核酸配列、（３）それが導入された細胞において天然で見出される同じ（すなわち、相同）または類似した核酸配列の追加的コピーを付加するよう働く核酸配列、あるいは（４）それが導入された細胞において発現が誘導される、天然に存在する又は相同なサイレント核酸配列を含むと意図される。「突然変異形態」は、野生型または天然に存在する配列とは異なる１以上のヌクレオチドを含有する核酸配列を意味する。すなわち、突然変異核酸配列は１以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を含有する。いくつかの場合には、トランスジーンは、トランスジーン産物が細胞から分泌されるよう、リーダーペプチドまたはシグナル配列をコードする配列を含みうる。
【００４０】
本出願で用いる「ベクター」なる語は、別の核酸分子（挿入核酸分子）、例えばｃＤＮＡ分子（これに限定されるものではない）が挿入されていることが可能である、核酸分子、通常は二本鎖ＤＮＡを意味する。ベクターは、該挿入核酸分子を適切な宿主細胞内に運搬するために使用される。ベクターは、該挿入核酸分子を転写するのを可能にする、場合によっては転写産物をポリペプチドに翻訳するのを可能にする必要な要素を含有しうる。該挿入核酸分子は宿主細胞に由来することが可能であり、あるいは異なる細胞または生物に由来することが可能である。ベクターは、宿主細胞内に入ると、宿主染色体ＤＮＡからは独立して又はそれと同時に複製されることが可能であり、該ベクターおよびその挿入核酸分子の幾つかのコピーが産生されうる。したがって、「ベクター」なる語は、標的細胞内への遺伝子導入を促進する遺伝子運搬ビヒクルとしても定義されうる。この定義は非ウイルスベクターおよびウイルスベクターの両方を含む。非ウイルスベクターはカチオン脂質、リポソーム、ナノ粒子、ＰＥＧ、ＰＥＩなどを包含するが、これらに限定されるものではない。ウイルスベクターはウイルスに由来し、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルスベクターなどを包含するが、これらに限定されるものではない。必ずしもそうであるわけではないが典型的には、ウイルスベクターは複製欠損型であり、この場合、複製に必須のウイルス遺伝子が該ウイルスベクターから除去されているため、該ベクターは、与えられた細胞における複製能を喪失している。しかし、幾つかのウイルスベクターは、与えられた細胞（例えば、癌細胞）において特異的に複製するよう適合化されることが可能であり、典型的には、（癌）細胞特異的（癌）細胞溶解を誘発するために使用される。
【００４１】
本発明の第１の態様においては、配列番号３、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４からなる群から選ばれる配列を含む６００ヌクレオチドまたはそれ未満の、肝特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節要素を提供する。特定の実施形態においては、該核酸調節要素は、これらの配列のいずれかに対して８０％の配列同一性、より厳密には８５％の配列同一性、より一層厳密には９０％の配列同一性、さらに厳密には９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。もう１つの特定の実施形態においては、該核酸調節要素は、これらの配列の（またはこれらの配列に対して高い比率の配列同一性を共有する配列の）機能性断片を含む。肝特異的遺伝子発現に関与する配列の特定方法は実施例の節に概説されている。
【００４２】
本明細書に記載されている調節要素が、限られた長さしか有さないのに完全に機能性であることは、相当な利点である。これは、ベクターまたは核酸発現カセットにおいて、それらの負荷容量を不適切に制限することなく、該調節要素の使用を可能にする。したがって、該核酸調節要素は６００ヌクレオチド長またはそれ未満、５５０ヌクレオチド長またはそれ未満、５００ヌクレオチド長またはそれ未満、４５０ヌクレオチド長またはそれ未満、４００ヌクレオチド長またはそれ未満、３５０ヌクレオチド長またはそれ未満、より厳密には３００ヌクレオチド長またはそれ未満、２５０ヌクレオチド長またはそれ未満、２００ヌクレオチド長またはそれ未満、１７５ヌクレオチド長またはそれ未満、より一層厳密には１５０ヌクレオチド長またはそれ未満、１２５ヌクレオチド長またはそれ未満、１１０ヌクレオチド長またはそれ未満、さらに厳密には１００ヌクレオチド長またはそれ未満、９０ヌクレオチド長またはそれ未満、８０ヌクレオチド長またはそれ未満、７５ヌクレオチド長またはそれ未満、７０ヌクレオチド長またはそれ未満、６５ヌクレオチド長またはそれ未満、６０ヌクレオチド長またはそれ未満、５５ヌクレオチド長またはそれ未満、５０ヌクレオチド長またはそれ未満である。しかし、開示されている核酸調節要素は調節活性を（すなわち、転写の特異性および／または活性に関して）保有しており、したがってそれらは特に、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチドまたは５０ヌクレオチドの最小長を有すると理解されるべきである。
【００４３】
さらに、特定の実施形態においては、肝特異的遺伝子発現を増強するための６００ヌクレオチドまたはそれ未満の核酸調節要素は、配列番号３、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列、またはそれらの機能性断片から実質的になる。すなわち、該調節要素は、例えば、クローニング目的に使用される配列（任意例に関しては、配列番号１８〜３１として記載されている配列を参照されたい）を更に含みうるが、前記配列は該調節要素の必須部分を構成する。例えば、それらは、より大きな調節領域（例えば、プロモーター）の部分を構成しない。もう１つの特定の実施形態においては、肝特異的遺伝子発現を増強するための６００ヌクレオチドまたはそれ未満の核酸調節要素は、配列番号３、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列、またはそれらの機能性断片からなる。
【００４４】
該核酸配列は二本鎖または一本鎖分子としてのＤＮＡまたはＲＮＡとして提供されうる。該配列が一本鎖核酸として提供される場合、相補鎖は、開示されている配列番号と同等であるとみなされ、同様に、本明細書に記載されている核酸構築物および方法ならびにそれらの使用において使用されると想定される。したがって、特定の実施形態においては、該核酸調節要素は、配列番号３、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列またはそれらの機能性断片の相補鎖を含む。もう１つの特定の実施形態においては、該調節要素は前記配列の相補鎖から実質的になる。さらにもう１つの特定の実施形態においては、該調節要素は、挙げられている配列の相補鎖からなる。
【００４５】
さらに、本明細書中に挙げられている配列にハイブリダイズする、特に、本明細書に開示されている配列の相補体にハイブリダイズする配列も、核酸調節要素として使用されうると想定される。ハイブリダイズ（する）は、典型的には、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ（する）」ことを意味する。挙げられている配列にハイブリダイズする配列は、それらがハイブリダイズする配列と等しい長さである必要はない。しかし、核酸調節要素として使用されるこれらのハイブリダイズする配列は、特に、本明細書に記載されている調節要素のサイズ限界を超えないことに注目されるべきである。さらに、特定の実施形態においては、配列番号３、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列またはそれらの機能性断片にハイブリダイズする核酸のサイズは、それがハイブリダイズする配列と、長さにおいて２５％以上、厳密には、長さにおいて２０％以上、より厳密には、長さにおいて１５％以上、最も厳密には、長さにおいて１０％以上は異ならない。
【００４６】
本明細書に開示されている配列の幾つかは長さにおいて非常に制限されており、また、幾つかは他のものより相当に短い。したがって、より短い配列の場合には特に、同一配列の２以上のコピーを含む調節配列、あるいは更には、挙げられている配列の２つの異なる配列を含む調節要素を製造することが可能である。幾つかの配列（または同一配列のコピー）をモジュラー的に組合せることも全ての配列に関して勿論可能であるが、本明細書において定められている調節要素のサイズを超えない、すなわち、６００ヌクレオチドを超えない（あるいはより厳密には４００ヌクレオチドを超えない、あるいは更に厳密には３００または２５０ヌクレオチドを超えない）配列の組合せが特に想定される。非常に特定の実施形態においては、本明細書に開示されている核酸調節要素は、新規（人工的）調節配列を製造するために組合される挙げられている配列の少なくとも２つの機能性断片を含む。もう１つの特定の実施形態においては、これらの少なくとも２つの機能性断片は非同一断片である。もう１つの実施形態においては、それらの少なくとも２つの機能性断片の少なくとも２つは互いに同一である。もう１つの非常に特定の実施形態においては、新規（人工的）調節配列を製造するために、挙げられている配列の２つの断片（そのうちの少なくとも１つはそれ自体は機能性ではない）を組合せる。
【００４７】
本明細書に開示されている配列は、インビボで肝特異的遺伝子の転写を制御する、特に、以下の遺伝子を制御する調節配列である：セルピン（ｓｅｒｐｉｎ）ペプチダーゼインヒビター、クレードＡメンバー１［α−アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１；ＧｅｎｅＩＤ  ５２６５）としても公知である］、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ（ＡＰＯＣ１；ＧｅｎｅＩＤ  ３４１）、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＶ（ＡＰＯＣ４；ＧｅｎｅＩＤ  ３４６）、アポリポタンパク質Ｈ（ＡＰＯＨ；ＧｅｎｅＩＤ  ３５０）；トランスチレチン（ＴＴＲ；ＧｅｎｅＩＤ  ７２７６）、アルブミン（ＡＬＢ；ＧｅｎｅＩＤ  ２１３）、アルドラーゼＢ（ＡＬＤＯＢ；ＧｅｎｅＩＤ  ２２９）、シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＥ、ポリペプチド１（ＣＹＰ２Ｅ１；ＧｅｎｅＩＤ  １５７１）、フィブリノーゲンアルファ鎖（ＦＧＡ；ＧｅｎｅＩＤ  ２２４３）、トランスフェリン（ＴＦ；ＧｅｎｅＩＤ  ７０１８）、ハプトグロビン関連タンパク質（ＨＰＲ；ＧｅｎｅＩＤ  ３２５０）。特定の実施形態においては、該調節要素は、ＳＥＲＰＩＮＡ１調節要素、すなわち、インビボでＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の発現を制御する調節要素を含む。もう１つの特定の実施形態においては、該調節要素は、配列番号３、配列番号１、配列番号２から選ばれるＳＥＲＰＩＮＡ１調節配列を含む。さらにもう１つの特定の実施形態においては、該調節要素は配列番号３を含む。
【００４８】
本明細書に開示されている核酸調節要素は核酸発現カセットにおいて使用されうる。したがって、本発明の１つの態様においては、本明細書に記載されている調節要素がプロモーターに機能的に連結されている核酸発現カセットを提供する。もう１つの実施形態においては、該調節要素はプロモーターおよびトランスジーンに機能的に連結されている。
【００４９】
当業者に理解されているとおり、機能的に連結（されている）は、機能的活性を有することを意味し、天然の位置的連結には必ずしも関連していない。実際、核酸発現カセットにおいて使用される場合、該調節要素は、典型的には、プロモーターの直上流に位置するが（これが一般的な場合であるが、該核酸発現カセット内の位置の限定または除外として決定的に解釈されるべきではない）、これが必ずしもインビボで当てはまるわけではない。例えば、遺伝子の下流に天然で存在し、その転写に影響を及ぼす或る調節要素配列は、プロモーターの上流に位置する場合と同様に機能しうる。したがって、特定の実施形態においては、該調節配列の調節または増強効果は位置に非依存的である。さらに、該調節配列は、個々のプロモーターまたは遺伝子配列に非依存的に、発現に対するそれらの効果をもたらしうる。
【００５０】
したがって、それらは、それらの天然プロモーターと共に、および別のプロモーターと共に、核酸発現カセットにおいて使用されうる。特に、該調節要素は、それ自体が肝特異的ではない（または最小プロモーターの場合、それを肝特異性にするのに寄与する要素を欠く）プロモーターからでさえも、組織特異的発現を導きうる。しかし、肝特異的プロモーターは、もちろん、肝特異性を増強するため、および／または他の組織における発現の漏出を回避するためにも使用されうる。該肝特異的プロモーターは肝細胞特異的プロモーターであることが可能であり、あるいはそうでないことも可能である。トランスジーンはそれ自身のプロモーターから転写されることが可能であるが、該プロモーターは核酸発現カセットにおけるトランスジーンのプロモーターである必要はない。特定の実施形態においては、該核酸発現カセットは遺伝子治療に使用される。この実施形態においては、該プロモーターは同種（相同）（すなわち、該核酸発現カセットでトランスフェクトされるべき動物（特に哺乳動物）と同じ種からのもの）または異種（非相同）（すなわち、該発現カセットでトランスフェクトされるべき哺乳動物の種とは異なる起源からのもの）でありうる。したがって、本明細書に記載されている調節要素と組合された場合に該プロモーターが機能的である限り、該プロモーターの起源は任意の単細胞原核生物もしくは真核生物、任意の脊椎動物もしくは無脊椎動物または任意の植物であることが可能であり、あるいは更には合成プロモーター（すなわち、非天然配列を有するもの）でありうる。特定の実施形態においては、該プロモーターは哺乳類プロモーター、特にマウスまたはヒトプロモーターである。もう１つの特定の実施形態においては、該プロモーターは哺乳類肝特異的プロモーターである。さらにもう１つの特定の実施形態においては、該プロモーターはヒト肝特異的プロモーターである。もう１つの実施形態においては、該プロモーターはウイルスプロモーターである。もう１つの実施形態においては、該ウイルスプロモーターは肝特異的ウイルスプロモーターである。該プロモーターは誘導性または構成的プロモーターでありうる。
【００５１】
該核酸発現カセットの長さを最小にするために、該調節要素は最小プロモーターに連結されることが特に想定される。特定の実施形態においては、使用されるプロモーターは１０００ヌクレオチド長またはそれ未満、９００ヌクレオチド長またはそれ未満、８００ヌクレオチド長またはそれ未満、７００ヌクレオチド長またはそれ未満、６００ヌクレオチド長またはそれ未満、５００ヌクレオチド長またはそれ未満、４００ヌクレオチドまたはそれ未満、３００ヌクレオチド長またはそれ未満、あるいは２５０ヌクレオチド長またはそれ未満である。使用されうるプロモーターの具体例には、ＡｐｏＡ−Ｉプロモーター、ＡｐｏＡ−ＩＩプロモーター、ＡｐｏＡ−ＩＶプロモーター、ＡｐｏＢプロモーター、ＡｐｏＣ−Ｉプロモーター、ＡｐｏＣ−ＩＩプロモーター、ＡｐｏＣ−ＩＩＩプロモーター、ＡｐｏＥプロモーター、アルブミンプロモーター、α−フェトプロテインプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１（ＰＣＫ１）プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ２（ＰＣＫ２）プロモーター、トランスチレチン（ＴＴＲ）プロモーター、α−アンチトリプシン（ＡＡＴまたはＳＥＲＰＩＮＡ１）プロモーター、ＴＫ（チミジンキナーゼ）プロモーター、ヘモペキシンプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ６プロモーター、コレステロール７アルファ−ヒドロキシラーゼプロモーター、因子ＩＸプロモーター、α−ミクログロブリンプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーターおよびＨＢＶプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらのプロモーターはいずれも、最小プロモーターとして使用されることが可能であり、これらは当技術分野において十分に記載されている（例えば、Ｇｅｈｒｋｅら，２００３；Ｖａｎｄｅｎｄｒｉｅｓｓｃｈｅら，２００７；ＷＯ０１／０９８４８２を参照されたい）。特に想定される最小プロモーターはＴＴＲ最小プロモーターであり、より厳密には、配列番号１７に定められているものである。時には、最小プロモーターは基礎またはコアプロモーターと称される。これらは、どの配列が該プロモーターにおいて欠けているかに関して若干異なりうるが、それらの調節配列（の部分）を欠く全てのそのようなプロモーターが最小プロモーターの定義の範囲内で想定される。
【００５２】
本明細書に開示されている調節配列は該核酸発現カセットにおいて使用されうる。特定の実施形態においては、ただ１つの調節要素が該発現カセット内に含まれる。もう１つの特定の実施形態においては、２以上の調節要素が該核酸発現カセット内に含まれる。すなわち、それらは、それらの調節（および／または増強）効果を増強するためにモジュラー的に組合される。もう１つの特定の実施形態においては、同一調節要素の２以上のコピーが該核酸発現カセットにおいて使用される。例えば、調節要素の２、３、４、５、６、７、８、９、１０コピーが縦列反復として提供されうる。さらにもう１つの特定の実施形態においては、該核酸発現カセットに含まれる２以上の調節要素は少なくとも２つの異なる調節要素を含む。両方の実施形態は互いに排他的ではなく、本明細書に記載されている核酸発現カセットにおいて両方の同一または非同一調節要素を互いに組合せることが可能である。調節要素の組合せは該核酸発現カセットにおける１つの調節要素として機能するため、この実施形態は１つの調節要素における配列の組合せと概ね同等である。しかし、それらの配列のそれぞれは調節要素自体として機能するため、それらを調節配列の組合せと称するのが、および２以上の調節配列を含有する核酸発現カセットと称するのが好ましい。理論上は、（クローニングの実施可能性以外の点では）該発現カセット内に含まれうる調節要素の数に上限は存在しないが、１つの実施形態においては、該核酸発現カセット内の全調節要素の長さは１０００ヌクレオチドを超えないことが特に想定される。他の特定の実施形態においては、該調節要素の全長は９００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、５５０ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、１７５ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１２５ヌクレオチド、１１０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、５５ヌクレオチドまたは５０ヌクレオチドを超えない。しかし、該調節要素に関して定められる最小長は、核酸発現カセットにおいて使用される調節要素またはその組合せにも適用される。
【００５３】
該核酸発現カセットの負荷はプロモーターおよび調節要素の両方に影響されるため、特定の実施形態においては、該核酸発現カセットにおけるプロモーターおよび調節要素の全長は１０００ヌクレオチド長またはそれ未満、９００ヌクレオチド長またはそれ未満、８００ヌクレオチド長またはそれ未満、７５０ヌクレオチド長またはそれ未満、７００ヌクレオチド長またはそれ未満、６００ヌクレオチド長またはそれ未満、５５０ヌクレオチド長またはそれ未満、５００ヌクレオチド長またはそれ未満、４５０ヌクレオチド長またはそれ未満、４００ヌクレオチドまたはそれ未満、３５０ヌクレオチド長またはそれ未満、３００ヌクレオチド長またはそれ未満、あるいは更には２５０ヌクレオチド長またはそれ未満であると想定される。
【００５４】
非常に特定の実施形態においては、該核酸調節要素は該核酸発現カセットにおける唯一の調節（および／または増強）要素であり、例えば、該プロモーター内にはそれ以外に存在する調節要素は存在せず、あるいは該構築物内には追加的なエンハンサーは存在しない。もう１つの特定の実施形態においては、配列番号３、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、これらの配列のいずれかに対して９５％の同一性を有する配列、またはそれらの機能性断片は、該調節要素または該核酸発現カセットのいずれかにおいて存在する唯一の調節（および／または増強）配列である。すなわち、該調節要素は他の調節または増強配列を含有しない。
【００５５】
既に示されているとおり、該調節配列は、個々のプロモーターまたは（トランス）遺伝子配列に非依存的に、発現に対するそれらの効果をもたらしうる。したがって、機能的に連結されたプロモーターおよび調節要素が成功裏に該配列を転写する限り、（トランス）遺伝子の性質は本発明において重要ではない。特定の実施形態においては、該核酸発現カセットは遺伝子治療において使用され、該トランスジーンは主として肝臓において発現されるであろう。幾つかの場合には、該遺伝子産物は合成後に血流中にも分泌されうる。したがって、血流中に循環されるべき核酸（例えば、ＲＮＡ）および／またはポリペプチドをコードする任意のトランスジーンが本出願の範囲内に含まれる。
【００５６】
典型的には、該トランスジーンは、免疫応答、造血、炎症、細胞成長および増殖、細胞系譜分化ならびに／またはストレス応答に関与するポリペプチドをコードする核酸分子であろう。
【００５７】
該トランスジーンは、該プロモーター（および／または、該核酸発現カセットが遺伝子治療に使用される場合には、それが導入される動物、特に哺乳動物）と同種または異種でありうる。また、該トランスジーンは完全長ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ配列またはそれらの任意の断片、サブユニットもしくは突然変異体（少なくとも何らかの生物活性を有するもの）でありうる。特に、該トランスジーンは、小型遺伝子（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）、すなわち、そのイントロン配列の一部分、大部分または全部を欠く遺伝子配列でありうる。したがって、該トランスジーンは、場合によっては、イントロン配列を含有しうる。場合によっては、該トランスジーンは、ハイブリッド核酸配列、すなわち、同種および／または異種ｃＤＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡ断片から構築された核酸配列でありうる。該トランスジーンはまた、場合によっては、１以上の天然に存在するｃＤＮＡおよび／またはゲノム配列の突然変異体でありうる。
【００５８】
該トランスジーンは、当技術分野でよく知られた１以上の方法を用いて、適切な量で単離され、入手されうる。これらの方法およびトランスジーンの単離に有用な他の方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）、ならびにＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｖｏｌ．１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９８７）に記載されている。
【００５９】
トランスジーン突然変異配列の使用も本出願において想定される。突然変異トランスジーンは、野生型配列と比較して１以上のヌクレオチド置換、欠失および／または挿入を含有するトランスジーンである。該ヌクレオチド置換、欠失および／または挿入は、アミノ酸／核酸配列において野生型アミノ酸／核酸配列とは異なる遺伝子産物（すなわち、タンパク質またはＲＮＡ）を与えうる。そのような突然変異体の製造は当技術分野でよく知られている。
【００６０】
特定の実施形態においては、該トランスジーンによりコードされる産物はタンパク質である。もう１つの特定の実施形態においては、該産物は治療用タンパク質である。
【００６１】
本出願において想定されるトランスジーン（および治療用タンパク質）の非網羅的かつ非限定的な一覧には以下のものが含まれる：因子ＶＩＩＩ，因子ＩＸ、因子ＶＩＩ、因子Ｘ、フォン・ヴィルブランド因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン９（ＩＬ−９）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＸＣＬ５）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、単球誘引物質タンパク質１（ＭＣＰ−１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、アファミン（ＡＦＭ）、α１−アンチトリプシン、α−ガラクトシダーゼＡ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、ＡＴＰ７ｂ、オルニチントランスカルバモイラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、リポタンパク質リパーゼ、アポリポタンパク質、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ−Ｒ）、アルブミン、グルコース−６−ホスファターゼ、抗体をコードするトランスジーン、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、抗ウイルスドミナントネガティブタンパク質、およびそれらの断片、サブユニットまたは突然変異体。
【００６２】
非常に特定の実施形態においては、該核酸発現カセットはトランスジーンを含有しないが、該プロモーターに機能的に連結された調節要素を使用して内因性遺伝子（したがって、これは増強および／または組織特異的発現の点でトランスジーンと等価である）の発現を駆動させる。該核酸発現カセットは細胞のゲノム内に組込まれるか、またはエピソーム状態で維持されうる。
【００６３】
他の配列（例えば、イントロンおよび／またはポリアデニル化配列）も、典型的にはトランスジーン産物の発現を更に増強または安定化させるために、該核酸発現カセット内に組込まれうる。本明細書に記載されている発現カセットにおいては任意のイントロンが使用されうる。「イントロン」なる語は、核スプライシング装置により認識されスプライシングされるのに十分な程度に大きな、イントロン全体の任意の部分を含む。典型的には、該発現カセットの構築および操作を促進する該発現カセットのサイズを可能な限り小さく維持するためには、短い機能性イントロン配列が好ましい。幾つかの実施形態においては、該イントロンは、該発現カセット内のコード配列によりコードされるタンパク質をコードする遺伝子から得られる。該イントロンは該コード配列の５’側、該コード配列の３’側、または該コード配列内に位置しうる。該コード配列の５’側に該イントロンが位置する利点は、ポリアデニル化シグナルの機能を該イントロンが妨げる可能性を最小にすることである。
【００６４】
ポリＡ尾部の合成を導く任意のポリアデニル化シグナルが、本明細書に記載されている発現カセットにおいて有用であり、それらの具体例は当業者によく知られている（例えば、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル）。
【００６５】
本出願に記載されている発現カセットは、例えば、通常は肝臓において発現され利用されるタンパク質を発現させるために、または肝臓において発現され次いで他の身体部分への輸送のために血流へと輸出されるタンパク質（例えば、因子ＩＸタンパク質）を発現させるために使用されうる。したがって、幾つかの特定の実施形態においては、本発明の発現カセットは、疾患の症状を改善する治療量のポリペプチド（または他の遺伝子産物、例えばＲＮＡ）を発現させるために使用されうる。原理的には、内因性遺伝子の発現を増強することも可能であるが、典型的には、該遺伝子産物は該発現カセット内のコード配列（すなわち、トランスジーン）によりコードされる。本明細書中で用いる「治療量」は、疾患を症状を改善する量である。そのような量は、典型的には、該遺伝子産物および疾患の重症度に左右されるが、おそらくは通常の実験により、当業者により決定されうる。実施例の節には、治療量の因子ＩＸの発現がどのようにして達成されるかが記載されている。
【００６６】
特定の実施形態においては、本出願に記載されている発現カセットは、長期にわたり、コード配列によりコードされる遺伝子産物の治療量の発現を導く。実際、治療レベルが達成される限り、新たな治療は必要でない。典型的には、治療的発現は少なくとも２０日間、少なくとも５０日間、少なくとも１００日間、少なくとも２００日間、そして幾つかの場合には、３００日間またはそれ以上持続すると想定される。該コード配列によりコードされる遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）の発現は、例えば該遺伝子産物の治療的発現が達成されたかどうかを評価するために、当技術分野において認識されているいずれかの手段、例えば、抗体に基づくアッセイ、例えばウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡアッセイにより測定されうる。該遺伝子産物の発現は、該遺伝子産物の酵素活性または生物活性を検出するバイオアッセイにおいても測定されうる。
【００６７】
もう１つの態様においては、本出願は、本明細書に記載されている調節要素を含むベクターを提供する。もう１つの特定の実施形態においては、該ベクターは、本明細書に記載されている発現カセットを含有する。該ベクターはエピソーム性ベクター（すなわち、宿主細胞のゲノム内に組込まれないベクター）であることが可能であり、あるいは宿主細胞ゲノム内に組込まれるベクターであることが可能である。エピソーム性ベクターの具体例には、（染色体外）プラスミド、および該発現カセットのみから構成され細菌配列を欠くいわゆるミニサークルが含まれ、宿主細胞ゲノム内に組込まれるベクターの具体例には、ウイルスベクターが含まれる。
【００６８】
代表的なプラスミドベクターには、ｐＵＣベクター、ブルースクリプト（ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ベクター（ｐＢＳ）およびｐＢＲ３２２、または細菌配列を欠くそれらの誘導体（ミニサークル）が含まれる。該プラスミドベクターの幾つかは、トランスフェクトされた細胞におけるエピソーム性プラスミドの持続性を増強する要素を組込むために適合化されうる。そのような配列は、転写単位に連結されたスカフォールド／マトリックス結合領域モジュールに対応するＳ／ＭＡＲが含まれる（Ｊｅｎｋｅら，２００４；Ｍａｎｚｉｎｉら，２００６）。
【００６９】
代表的なウイルスベクターには、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスおよびレンチウイルスに由来するベクターが含まれる。あるいは、ウイルス成分および非ウイルス成分を組合せるために、遺伝子運搬系が使用されうる（例えば、ナノ粒子またはウイロソーム）（Ｙａｍａｄａら，２００３）。
【００７０】
レトロウイルスおよびレンチウイルスは、感染後に自分自身の遺伝子を宿主細胞染色体内に挿入する能力を有するＲＮＡウイルスである。ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を欠くが、細胞に感染し標的細胞の染色体内に自分自身の遺伝子を挿入する能力を保有するレトロウイルスおよびレンチウイルスベクターが開発されている（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９０；Ｎａｌｄｉｎｉら，１９９６）。レンチウイルスと古典的なモロニー−マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に基づくレトロウイルスベクターとの相違は、レンチウイルスベクターは分裂細胞および非分裂細胞の両方に形質導入しうるが、ＭＬＶに基づくレトロウイルスベクターは分裂細胞にしか形質導入できないことである。
【００７１】
アデノウイルスベクターは、生きた対象に直接投与されるように設計される。レトロウイルスベクターとは異なり、アデノウイルスベクターゲノムのほとんどは宿主細胞の染色体内に組込まれない。実際、アデノウイルスベクターを使用して細胞内に導入された遺伝子は、長期にわたって存続する染色体外要素（エピソーム）として核内に維持される。アデノウイルスベクターは、気道上皮細胞、内皮細胞、肝細胞および種々の腫瘍を含む多種多様な組織における分裂細胞および非分裂細胞に形質導入する（Ｔｒａｐｎｅｌｌ，１９９３）。
【００７２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒトおよび幾つかの他の霊長類種に感染する小さなｓｓＤＮＡウイルスであり、疾患を引き起こすことは知られておらず、結果的に非常に軽度な免疫応答を引き起こす。ＡＡＶは分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染することが可能であり、そのゲノムを宿主細胞のゲノム内に組み込みうる。ＡＡＶベクターのクローニング容量は比較的限られたものではあるが、これらの特徴は、ＡＡＶを、遺伝子治療用のウイルスベクターを作製するための非常に魅力的な候補にする。
【００７３】
もう１つのウイルスベクターは、大きな二本鎖ＤＮＡウイルスである単純ヘルペスウイルスに由来する。もう１つのｄｓＤＮＡであるワクシニアウイルスの組換え形態は大きなインサートを収容することが可能であり、相同組換えにより作製される。
【００７４】
特定の実施形態においては、該ベクターはウイルスベクターである。他の特定の実施形態においては、該ベクターはＡＡＶベクターである。他の実施形態においては、該ベクターはレンチウイルスベクターである。
【００７５】
もう１つの特定の態様においては、本明細書に記載されている核酸調節要素、核酸発現カセットおよびベクターは遺伝子治療において使用されうる。標的細胞においてインビトロで、また、特にインビボで、治療用遺伝子産物の発現を達成するよう意図された遺伝子治療プロトコールは、当技術分野において詳細に記載されている。これらには、プラスミドＤＮＡ（裸またはリポソーム内）の筋肉内注射、間質注射、気道内点滴、内皮への適用、肝実質内への投与、および静脈内または動脈内投与（例えば、肝動脈内、肝静脈内）が含まれるが、これらに限定されるものではない。標的細胞に対するＤＮＡの利用可能性を向上させるための種々の装置が開発されている。単純なアプローチは、ＤＮＡを含有するカテーテルまたは移植可能な物質と標的細胞とを物理的に接触させることである。もう１つのアプローチは、高圧下で標的組織内に液体のカラムを噴射する無針ジェット注射装置を使用することである。これらの運搬法は、ウイルスベクターを運搬するためにも用いられうる。標的化遺伝子運搬に対するもう１つのアプローチは、細胞への核酸の特異的標的化のための核酸−またはＤＮＡ−結合性物質が結合しているタンパク質または合成リガンドからなる分子コンジュゲートの使用である（Ｃｒｉｓｔｉａｎｏら，１９９３）。
【００７６】
特定の実施形態においては、肝細胞の遺伝子治療のための、本明細書に記載されている核酸調節要素、核酸発現カセットまたはベクターの使用が想定される。もう１つの特定の実施形態においては、該調節要素、発現カセットまたはベクターの使用はインビボでの遺伝子治療のためのものである。さらにもう１つの特定の実施形態においては、該使用は、血友病を治療するための、特に血友病Ｂを治療するための遺伝子治療の方法のためのものである。
【００７７】
哺乳類肝細胞内への遺伝子導入は、エクスビボ法およびインビボ法の両方を用いて行われている。エクスビボアプローチは、肝細胞の回収、長期発現ベクターでのインビトロ形質導入、および門脈循環内への該形質導入肝細胞の再導入を要する（Ｋａｙら，１９９２；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら，１９９１）。インビボ標的化は、肝実質、肝動脈または門脈内へのＤＮＡまたはウイルスベクターの注入により、および転写標的化により行われている（Ｋｕｒｉｙａｍａら，１９９１；Ｋｉｓｔｎｅｒら，１９９６）。最近の方法は、裸ＤＮＡの門脈内運搬（Ｂｕｄｋｅｒら，１９９６）および流体力学的尾静脈トランスフェクション（Ｌｉｕら，１９９９；Ｚｈａｎｇら，１９９９）をも含む。
【００７８】
もう１つの態様においては、肝細胞内でタンパク質を発現させるための方法を提供する。該方法は、本明細書に記載されている核酸発現カセット（またはベクター）を肝細胞内に導入し、該肝細胞内でトランスジーンタンパク質産物を発現させる工程を含む。これらの方法はインビトロおよびインビボの両方で行われうる。
【００７９】
遺伝子治療を要する対象に対する遺伝子治療方法も提供する。該方法は、治療用タンパク質をコードするトランスジーンを含有する核酸発現カセットを該対象の肝臓内に導入し、治療量の該治療用タンパク質を肝臓内で発現させる工程を含む。もう１つの実施形態においては、該方法は、治療用タンパク質をコードするトランスジーンを含有する核酸発現カセットを含むベクターを該対象の肝臓内に導入し、治療量の該治療用タンパク質を肝臓内で発現させる工程を含む。
【００８０】
非常に特定の実施形態においては、該核酸発現カセット内のトランスジーンによりコードされる治療用タンパク質は因子ＩＸであり、該方法は、血友病Ｂの治療方法である。遺伝子治療により肝臓内で因子ＩＸを発現させることにより、血友病Ｂが治療されうる（Ｓｎｙｄｅｒら，１９９９）。
【００８１】
もう１つの態様においては、治療用タンパク質をコードするトランスジーンを含有する核酸発現カセットと医薬上許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。もう１つの実施形態においては、該医薬組成物は、治療用タンパク質をコードするトランスジーンを含有する核酸発現カセットを含有するベクターと医薬上許容される担体とを含む。他の特定の実施形態においては、該トランスジーンは因子ＩＸをコードしており、該医薬組成物は血友病Ｂを治療するためのものである。
【００８２】
これらの医薬組成物の製造のための、本明細書に開示されている調節要素の使用も想定される。
【００８３】
本明細書においては本発明の装置に関する特定の実施形態、特定の構成および配置ならびに物質が記載されているが、本発明の範囲および精神から逸脱することなく形態および詳細における種々の変更または修飾が施されうると理解されるべきである。以下の実施例は、特定の実施形態を更に例示するために記載されており、それらは本出願を限定するものとみなされるべきではない。本出願は特許請求の範囲のみにより限定される。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】ｐＡＡＶ−ＴＴＲｍｉｎ（Ｅ）−ＦＩＸＩＡ構築物の概要図を示し、トランスチレチンの最小プロモーターの上流に種々の肝特異的エンハンサーが挿入されている箇所が示されている。該エンハンサーの名称および略語が該構築物の下の表に挙げられている。用いられている略語は以下のとおりである：ＩＴＲ：ウイルス逆方向末端反復；ＴＴＲｍｉｎ：トランスチレチン最小プロモーター；ＦＩＸ第１エキソン：ヒト因子ＩＸ遺伝子の第１エキソン；イントロンＡ：ヒト因子ＩＸ遺伝子の第１イントロンの１．４ｋｂ断片；ｈＦＩＸ：ヒト因子ＩＸ遺伝子のエキソン２〜８；３’ＵＴＲ：７０ｂｐにおいてトランケート化されている、ヒト因子ＩＸ遺伝子の３’非翻訳領域；ｂＧＨｐＡ：ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル。
【図２】トランスチレチン最小プロモーターの上流に肝特異的エンハンサー反復を含有するｐＡＡＶ−ＴＴＲｍｉｎ（Ｅ）ｎ−ＦＩＸＡ構築物の概要図である。Ａ１×２：ＡｐｏＣ４エンハンサー（配列番号４）の２つのコピー；Ｓｅｒｐ×３：セルピナ（ｓｅｒｐｉｎａ）１エンハンサー３配列（配列番号３）の３つのコピー；Ｓ２×６：セルピナ１エンハンサー２配列（配列番号２）の６つのコピー。他の略語は図１の場合と同じである。
【図３】肝細胞特異的エンハンサーのインビボ妥当性を詳細に示す。成体Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける２μｇのプラスミドＤＮＡの流体力学的遺伝子運搬によるトランスフェクションの２日後にヒトＦＩＸ特異的ＥＬＩＳＡを用いて、因子ＩＸ（ＦＩＸ）の発現を測定した。エンハンサーの略語に関しては表ＩＩＩを参照されたい。Ｓｅｒｐエンハンサー（配列番号３）が矢印で示されている。
【図４】三重反復セルピナ（ｓｅｒｐｉｎａ）１エンハンサー３（配列番号３）配列のインビボ妥当性を示す。成体Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける０．５、１または２μｇ（示されているとおり）のプラスミドＤＮＡの流体力学的遺伝子運搬によるトランスフェクションの２４または４８時間後にヒトＦＩＸ特異的ＥＬＩＳＡを用いて、因子ＩＸ（ＦＩＸ）の発現を測定した。ＴＴＲｍｉｎ：エンハンサーの非存在下にトランスチレチン最小プロモーターを含有する構築物；Ｓｅｒｐｘ３：図２に示されている三重反復セルピナ１エンハンサー３（配列番号３）配列を含有する構築物；ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ＡＡＴ：既に記載されているとおりの（Ｍｉａｏら，２０００）、ＡｐｏＥエンハンサーおよびＡＡＴプロモーターを兼ね備えている構築物。
【図５】マウスにおけるＡＡＶ９−ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐ−ＦＩＸＩＡ（丸印）およびＣ５７／Ｂｌ６マウス（ｎ＝３〜５）におけるＡＡＶ９−ＴＴＲｍｉｎ−ＦＩＸＩＡ（正方形）の静脈内注射後のＦＩＸ発現を示す。ｈＦＩＸ発現レベルを、種々の時間間隔（ｄｐｉ：感染後日数）で集めたクエン酸化血漿においてＥＬＩＳＡにより測定した。
【図６】ヒトＦＩＸ（ｈＦＩＸ）ｍＲＮＡ発現が専ら肝臓に限局され、一方、ＦＩＸ遺伝子はいずれの他の組織においても発現されなかった（３×１０１２  ベクターゲノムでの注射の際）ことを示している。Ａ．ＡＡＶ９−ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐ−ＦＩＸＡ注射マウスの種々の器官からの全ＲＮＡに関するＲＴ−ｑＰＣＲ。マウスグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｍＧＡＰＤＨ）ハウスキーピング遺伝子が定量的遺伝子発現に関する対照として使用されている。Ｂ．ＲＴ−ｑＰＣＲにより測定された種々の器官における（肝臓におけるｈＦＩＸ  ｍＲＮＡコピー数に対する）相対ｈＦＩＸ  ｍＲＮＡコピー数。
【実施例】
【００８５】
（実施例１）
肝特異的調節配列の特定
序論
組織特異的エンハンサー／調節モジュールを発見し特徴づけるための計算的アプローチを用いた。そららが含有するモチーフの予備知識は不要である。該アプローチは以下の工程から実質的になる：
（１）正常組織のマイクロアレイ発現データの統計解析に基づいて高度に発現される組織特異的遺伝子の特定。
（２）公的に利用可能なゲノムデータベースからの対応プロモーター配列の抽出。
（３）新規距離差行列（ＤＤＭ）アプローチ（Ｄｅ  Ｂｌｅｓｅｒら，２００７）を用いる、調節モジュールおよびそれらが含有するモチーフの特定。ＤＤＭアプローチにより、調節要素、エンハンサーおよびサイレンサーの両方を検出した。ついでこれらの要素を、それらが含有するモチーフのセットとしてモデル化した。
（４）つぎに、高発現組織特異的遺伝子のゲノムコンテクストを、これらのセットの一部であるモチーフのクラスターに関して検索した。これらのクラスターが、幾つかの種において高度に保存された領域に一致する場合、これらの領域を推定エンハンサーモジュールとみなした。低発現組織特異的遺伝子および推定サイレンサーモジュールに関して、同じことが行われうることに注目されたい。
【００８６】
最小構築物内の含有がレポーター遺伝子の発現を増強するかどうかを試験することにより、該候補エンハンサーモジュールの妥当性評価を行った（実施例２および３を参照されたい）。
【００８７】
距離差行列（ＤＤＭ）アプローチ
ＤＤＭ法のための入力として、５９個の高（過剰）発現肝特異的遺伝子の転写開始部位の上流の配列のセット、および５９個の過少発現肝特異的遺伝子の転写開始部位の上流の配列の等サイズのセットを使用した。参照配列番号（ＲｅｆＳｅｑ；公開２００８年３月２８日；配列修正に関してはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｓｕｔｉｌｓ／ｇｉｒｅｖｈｉｓｔ．ｃｇｉを参照されたい）により示されている該肝特異的遺伝子の一覧を表１に示す。該ＤＤＭ法の目的は、過剰または過少発現に強く関連している転写因子結合部位を特定することであった。
【００８８】
【表１】
2020078316.tif 000002
【００８９】
距離差行列アプローチは他文献に詳細に記載されている（Ｄｅ  Ｂｌｅｓｅｒら，２００７）。簡潔に説明すると、ある与えられた刺激に対する、示差的に調節される肝特異的遺伝子のプロモーターの２つのセットの応答性は、プロモーターの両セットにより共有される転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）により説明されうると予想されうる。尤も、これは応答の方向性を説明しないかもしれない。ＴＦＢＳの共通セットと並んで、プロモーターの各セットは、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされる遺伝子群のプロモーターに、より特徴的な１以上のＴＦＢＳを含有する可能性があり、観察される示差的挙動を少なくとも部分的に説明しうるであろう。これらの「示差的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）」ＴＦＢＳは、以下の手法を用いて見出されうる。第１に、Ｍａｔｃｈ（商標）プログラム（ＫｅＩら，２００３）、または位置特異的重み行列（ＰＷＭ）のプレコンパイル化ライブラリーを使用して当該プログラム上でＴＦＢＳを予測するいずれかの他の類似プログラムのための入力として、各セットの各プロモーターを使用する。プロモーター当たりのＰＷＭ当たりの予測ＴＦＢＳの数（さらに、カウントと称される）であるその結果を、各行がプロモーター配列に対応し列が使用ＰＷＭに対応する行列の形態で集める。該列は更に、ＰＷＭ−ベクトルと称され、ＰＷＭを、プロモーター当たりの予測ＴＦＢＳのその数により特徴づけるものである。プロモーター当たりのＰＷＭ当たりの予測ＴＦＢＳの総数を用いる選択は、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の調節領域が多コピーの強固モチーフおよびより弱いコピーを含有するというＰａｐａｔｓｅｎｋｏら（Ｐａｐａｔｓｅｎｋｏら，２００２）の観察により動機づけられる。一般に、転写因子に対する複数の結合部位の存在は重要な役割を果たしていると考えるのが合理的である。さらに、ＴＦＢＳのペアを共有するプロモーターを伴う遺伝子は、ただ１つのＴＦＢＳを共通に有するプロモーターを伴う遺伝子よりも、共発現される可能性が有意に高いことが、酵母において示された（Ｐｉｌｐｅｌら，２００１）。この観察と一致して、複合エンハンサー要素を得るための単一肝特異的ＴＦＢＳの単なる組合せは、失望させる結果を与えた（Ｌｅｍｋｅｎら，２００５）。ＤＤＭ法は過剰表現（ｏｖｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）および関連性（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の両方を考慮するものであるため、プロモーター当たりの複数のマッチを考慮することは、過剰表現による推定機能性ＴＦＢＳを発見するのを助けうる。２つのＴＦＢＳは、行列内のそれらの対応列が類似している場合に、相関しているとみなされる。それらの列の間の類似性は、距離関数を用いて測定されうる。このアプローチを用いて、プロモーターの両セットにおけるＴＦＢＳに関して、全てのＴＦＢＳ関連性を要約する距離行列を構築する。最後に、ＤＤＭを計算し、この行列上で多次元尺度法（ＭＤＳ）を行って二次元におけるその含量を可視化することにより、観察された示差的遺伝子発現に寄与しないＴＦＢＳ（それらはＤＤＭ−ＭＤＳプロットの原点付近に位置づけられる）を、観察された示差的遺伝子発現��もたらす可能性のある「偏向」ＴＦＢＳから区別することが可能である。ＭＤＳ法は、強く関連しているＴＦＢＳを、より弱く関連しているＴＦＢＳよりも密集してプロットするため、それは、他の方法を用いた場合にはしばしば曖昧となる該プロモーターデータベース内のＴＦＢＳ間の相互作用のほとんどを際立たせて表示する。あるいは、結果は表において要約されうる。
【００９０】
この手法の原理は、（他方の条件と比較した場合の一方の条件の）個々の過剰表現および関連性に基づく。実際、多数の転写因子は肝臓内で特異的にアップレギュレーションされることが公知であるが、これは、これらがインビボでの遺伝子発現のアップレギュレーションに関与していることを必然的に示唆するものではない。一方の条件においては重要であるが他方の条件においては重要でないモジュールは、それらを構成するＴＦＢＳの過剰表現により特徴づけられ、関連づけられるであろう。これは２つの関連ＴＦＢＳに関しては低いＤＤ値を与え、一方、過剰表現されたＴＦＢＳおよび共通のＴＦＢＳに関するＤＤ値は高くなるであろう。ＴＦＢＳ（およびモジュール）がプロモーターの第１または第２セットのいずれかに典型的なものであるかどうかは、元のＤＤＭの列値の和の符号から推論されうる。
【００９１】
最高肝特異的遺伝子発現に（非常にストリンジェントな条件を用いた場合に）関連している因子を表ＩＩに要約する。
【００９２】
【表２】
2020078316.tif 000003
【００９３】
表ＩＩに示したＰ値は、ＭＤＳプロットの原点とマッピングされたＴＦＢＳとの間の距離を計算することにより、ＤＤＭ−ＭＤＳプロトコールを用いて決定した。この距離は、このＴＦＢＳが該プロモーターデータセットにおいて過剰表現されている度合を定量する。つぎに、この距離に関してＰ値を推定する。該ＤＤＭ−ＭＤＳ法を１０，０００個のランダムセットに適用し、それぞれのマッピングされたＴＦＢＳからＤＤＭ−ＭＤＳプロットの原点までの生じた距離を得た。ついで実際の距離のＰ値を、この実際の距離を超える対応「バックグラウンド距離」の割合から計算した。個々の仮説検定のＱ値は、それにおいて該検定が有意とされうる最小「偽発見率（Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ）（ＦＤＲ）」である。ＦＤＲは、誤って棄却された帰無仮説（第１種の過誤）の予測比率をコントロールする。例えば、０．０２（２％）のｑ値は、この結果が偽陽性であるという１：５０の確率が存在することを意味する。
【００９４】
つぎに、それらの５９個のアップレギュレーションされる遺伝子のゲノムコンテクストを、表ＩＩに記載されている因子に対するＴＦＢＳに富む（種間）保存領域に関して検索した。上流配列および下流配列の両方を考慮した。該検索は、複数の種にわたって保存されている結合部位に関するもの、および単一結合部位ではなくモチーフの組合せに関するものであったため、特定された配列が遺伝子発現の調節に実際に関与している確率は増加する。実際、ある与えられたプロモーターにおける転写因子結合部位の単なる存在または非存在は、高レベルの組織特異的発現をもたらすのに十分なものではないことが、十分に確認されている。高レベルの組織特異的発現をもたらす鍵となるのは、特定の染色体コンテクストにおける「レギュロン」としてのＴＦＢＳの組合せである。注目すべきことに、ＤＤＭによれば、Ｅ１２およびＥ４７結合部位以外のＴＦＢＳは、異なるメンバーから構成されるモジュールを形成する傾向にある（すなわち、それらは、ＤＤＭ−ＭＤＳプロットにおいて、より「関連」している（より接近（密集）して位置する））。
【００９５】
このアプローチは、表ＩＩＩに要約されている、前記転写因子結合部位に富む１４個の調節配列の特定をもたらした。ついでこれらの１４個の配列を、インビボでのそれらの調節（増強）特性の妥当性評価のために選択した。実施例２および３を参照されたい。
【００９６】
【表３】
2020078316.tif 000004
【００９７】
（実施例２）
肝特異的調節エンハンサー配列のインビボ妥当性評価
材料および方法
ｐＡＡＶ−ＴＴＲｍｉｎ−ＦＩＸＩＡの構築
まず、ＤＮＡｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を該製造業者の説明に従い使用して、正常マウス肝ゲノムＤＮＡを抽出した。ついで、トランスチレチンマウス遺伝子の５’配列のＰｕｂｍｅｄ配列（ＢＣ０２４７０２／Ｍ１９５２４）に基づいて設計された以下のプライマーを使用して、このマウス肝ゲノムＤＮＡからＴＴＲ最小（ＴＴＲｍｉｎ）プロモーターとその５’ＵＴＲの部分とを増幅した。
フォワードプライマー：ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＡＣＣＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＣＡＴＴＴＣＧＴＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＴＴＣ（配列番号１５）（ＮｏｔＩおよびＡｃｃ６５Ｉ制限部位を含有する）。
リバースプライマー：ＡＧＣＧＣＴＡＧＣＣＡＧＧＡＧＣＴＴＧＴＧＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＡＣＧＧＣ（配列番号１６）（ＮｈｅＩ部位を含有する）。
上流エンハンサー配列を欠くＴＴＲｍｉｎプロモーターはＣｏｓｔａら（Ｃｏｓｔａら，１９８６，１９８９）により記載されている。ＴＴＲｍｉｎの開始位置は−２０２（Ｃａｐ部位に対するもの）に位置し、該配列はＴＴＲエキソン１における翻訳開始部位の前の５’非翻訳領域において終結する（配列番号１７を参照されたい；ＮＣＢＩ配列ＢＣ０２４７０２およびＭ１９５２４を参照されたい）。
【００９８】
ＰＣＲのために、氷上の高圧滅菌ミクロ遠心チューブに以下の成分を加えた：１０×  ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｐｆｘ反応混合物（５．０μｌ）、プライマー混合物（それぞれ１０μＭ、１．５μｌ）、鋳型ＤＮＡ（１００ｎｇ）、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位）。それらを高圧滅菌し、蒸留水をつぎ足して５０μｌとした。該鋳型を９５℃で２分間変性させ、ついで３５サイクルのＰＣＲ（変性：９５℃で１５秒間、アニーリング：５８℃で３０秒間、伸長：６８℃で１分間）を行い、ついで６８℃で５分間の最終伸長（ｋｂ当たり）を行った。得られたＴＴＲｍｉｎ配列は配列番号１７として示されている。
【００９９】
ｐＡＡＶ−ＴＴＲｍｉｎ−ＦＩＸＩＡプラスミドを得るために、該ＰＣＲ産物をＮｏｔＩおよびＮｈｅＩで制限処理し、ｐＡＡＶ−ＦＩＸＩＡの因子ＩＸ小型遺伝子の上流の対応ＮｏｔＩ−ＮｈｅＩ部位内にクローニングした。ＦＩＸ小型遺伝子（ＦＩＸＩＡと称される）は、既に記載されているとおり（Ｍｉａｏら，２００１）、ヒトＦＩＸ  ｃＤＮＡの第１エキソンおよびそれに続くトランケート化イントロンＡおよびＦＩＸ  ｃＤＮＡの残部およびトランケート化７０ｂｐ  ３’ＵＴＲから構成される。ウシ成長ホルモン（ＧＨ）ポリＡを転写終結シグナルとして使用した。
【０１００】
ｐＡＡＶ−ＦＩＸＩＡは、ｐＡＡＶ−ＡｐｏＨＣＲ−ＡＡＴ−ＦＩＸＩＡに由来する無プロモーター構築物である。このｐＡＡＶ−ＡｐｏＨＣＲ−ＡＡＴ−ＦＩＸＩＡプラスミドは既に記載されており（ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅら，２００７）、血友病Ｂに対する、ＡＡＶに基づく肝指向性遺伝子治療治験において既に使用されているＡＡＶ−ＡｐｏＨＣＲ−ＡＡＴ−ＦＩＸベクター（Ｍａｎｎｏら，２００６）に類似している。
【０１０１】
ｐＡＡＶ−ＡｐｏＨＣＲ−ＡＡＴ−ＦＩＸＩＡの構築
対照目的に使用するｐＡＡＶ−プラスミドを作製するために、ｐＡＡＶ−ＭＣＳプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  ＪｏＩＩａ，ＣＡ，ＵＳＡ）をＮｏｔＩで制限処理し、ｐＢＳ−ＨＣＲＨＰ−ＦＩＸＩＡプラスミドをＳｐｅＩで制限処理した。付着末端をクレノウフラグメントで埋めた後、それらの２つの断片を平滑末端連結により連結した。ｐＢＳ−ＨＣＲＨＰ−ＦＩＸＩＡはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎのＣ．Ｍｉａｏ博士から快く贈呈された（Ｍｉａｏら，２００１）。より短いＡＡＴプロモーター断片は、より大きなＡＡＴプロモーター断片に関して報告されているものより大きな特異性で発現を肝臓に標的化するため（Ｙｕｌｌら，１９９５）、３４７ｂｐの短いＡＡＴプロモーター断片を使用して本発明者らの構築物にクローニングした。
【０１０２】
エンハンサーの合成およびｐＡＡＶ−ＴＴＲｍｉｎ−ＦＩＸＩＡ内へのエンハンサーの組込み
エンハンサー（表ＩＩＩを参照されたい）をＡｃｃ６５Ｉに隣接させ、Ａｃｃ６５ＩでのｐＡＡＶ−ＴＴＲｍｉｎ−ＦＩＸＩＡの制限処理の後、ＴＴＲｍｉｎの上流にクローニングした。該ＴＴＲｍｉｎの上流に複数のエンハンサーのクローニングが可能となるよう、ＡｓｃＩおよびＭｌｕＩ部位（アイソシゾマー）をＡｃｃ６５Ｉ部位の直前または直後にエンハンサー含有断片内に組込んだ。これらの制限部位に隣接する調節要素は配列番号１８〜３１として示されている。これは、該ベクターのＭｌｕＩ制限処理、およびＭｌｕＩ／ＡｓｃＩ制限処理エンハンサー含有断片への連結の後で達成された。得られた構築物の概要図を図１に示す。また、該エンハンサーの幾つか（Ｓｅｒｐ（配列番号３）、Ａ１（配列番号４）、Ｓ２（配列番号２））に関しては、ＴＴＲｍｉｎプロモーターの上流に複数のエンハンサー反復を挿入した（図２に示されているとおり）。全ての得られた構築物はＤＮＡ配列決定により実証された。
【０１０３】
流体力学的遺伝子運搬
肝細胞系における発現構築物のインビトロ発現レベルはそのインビボ性能を予測しないことが十分に確認されている。実際、ある与えられたトランスジーンの肝臓内発現レベルを直接的に評価するためには、インビボでの流体力学的肝遺伝子運搬により、種々の発現カセットを比較することが、より適切である（Ｍｉａｏら，２０００）。成体Ｃ５７／Ｂｌ６系統を使用した。動物実験はＫ．Ｕ．Ｌｅｕｖｅｎの動物倫理委員会により承認された。動物を生物安全性レベルＩＩ条件下で収容した。記載されているとおりに（Ｌｉｕら，１９９９）、流体力学的遺伝子運搬によりマウスに注射した。簡潔に説明すると、マウスを拘束ホルダー内に配置し、赤外線灯下で尾部を加熱した後、体積２ｍｌのダルベッコリン酸緩衝食塩水（該マウスの体重の１０％と等価）中の種々の用量（０．５−１−２μｇ）のそれぞれのプラスミドを５〜７秒の短い時間枠で尾静脈内に注射した。この方法は、肝細胞の効率的なインビボトランスフェクションをもたらすことが示されている。Ｑｉａｇｅｎ  ＥｎｄｏＦｒｅｅキット（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を該製造業者の説明に従い使用して、内毒素非含有プラスミドＤＮＡを抽出した。全身麻酔下、レトロオービタル（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ）採血により血液を集めた。２０％  ０．１Ｍクエン酸ナトリウム（凝血を防ぐためのもの）を含有する血漿サンプル中のヒトＦＩＸの存在を、酵素結合イムノソルベントアッセイ（Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍｅ  ＦＩＸ  ＥＬＩＳＡ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて判定した。各コホートはベクター当たり用量当たり５匹のマウスを含んでいた。
【０１０４】
結果
インシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で特定された肝細胞特異的調節エンハンサー要素の、インビボ発現に対する効果を評価するために、ｈＦＩＸを発現する発現構築物を流体力学的遺伝子運搬（２μｇ  ＤＮＡ）により肝細胞内にトランスフェクトした。これらの構築物においては、ＴＴＲｍｉｎプロモーターによりｈＦＩＸ発現を駆動し、あるいはＤＤＭアルゴリズムおよび多次元尺度法により特定された、ＴＦＢＳに非常に富む進化的に保存された肝細胞特異的エンハンサーと組合されたＴＴＲｍｉｎプロモーターにより、ｈＦＩＸ発現を駆動した。図３に示されている結果は、試験されたエンハンサーの大多数（ＡＬ、Ａ１、Ａ２、Ａｌｄｏ、Ａｐｏ、Ｆ、Ｓ１、Ｓｅｒｐ、Ｓ２、Ｔ１およびＴ２）が、ｈＦＩＸ発現を駆動するためにＴＴＲｍｉｎプロモーターを使用した場合に得られたレベルと比較してレシピエントマウスの血漿中のｈＦＩＸ発現レベルにおける有意な増加（＞４０％）をもたらしたことを示している（図３）。したがって、試験したエンハンサーの約８０％（１１／１４）は、有意に改善されたｈＦＩＸ発現レベルをもたらしており、このことは該ＤＤＭ予測アルゴリズムの妥当性を更に証明している。特筆すべきことに、特に、より短い特定された配列が発現の増強において効率的である。すなわち、試験された４００ヌクレオチドより長い２つの配列（Ａ３、Ｈ）は、この実験においては、有意に増加したＦＩＸレベルを与えなかった。しかし、これは、これらの配列の生理的役割を除外するものではない。ｐＡＡＶ−ＴＴＲｍＳｅｒｐ−ＦＩＸＩＡ構築物でのインビボ肝トランスフェクションの後で、最高のＦＩＸレベルが得られた。これらのレベルは、該ＴＴＲｍｉｎプロモーターを使用した場合と比較して７倍増加した。注目すべきことに、因子ＩＸ発現は全ての構築物に関して肝臓に限局されており、（例えば脾臓における）発現の「漏出（ｌｅａｋａｇｅ）」は観察されなかった。
【０１０５】
（実施例３）
幾つかの肝特異性調節エンハンサー配列のモジュールのインビボ妥当性評価
これらのエンハンサー／調節要素の効力の妥当性を更に評価するために、複数のエンハンサー反復をＴＴＲｍｉｎプロモーターの上流に組込んだ（例えば、Ａ１：反復２×、Ｓ２：反復６×またはＳｅｒｐ：反復３×；図２を参照されたい）。該結果は、複数のエンハンサーの組込みが循環ｈＦＩＸレベルにおける付加的な増加をもたらしたことを示している（図３および４）。実際、Ｓｅｒｐ３エンハンサーの三重反復を含有するｐＡＡＶ−ＴＴＲｍＳｅｒｐ３−ＦＩＸＩＡ構築物でのインビボ肝トランスフェクションの後で、最高のＦＩＸレベルが得られた（図４）。これは、試験した全ての用量（０．５−１−２μｇ  ＤＮＡ）で確認された。その構築物で得られたＦＩＸレベルは、ｐＡＡＶ−ＴＴＲｍｉｎ−ＦＩＸ構築物で得られたレベルより約２０〜２５倍高く、公知の最も強固（ロウバスト）な肝細胞特異的発現カセットの１つ（すなわち、ｐＡＡＶ−Ａｐｏ−ＨＣＲ−ＡＡＴ−ＦＩＸ）で得られたものより有意に高い（図４）。僅か２μｇのＤＮＡを使用して、ほぼ生理的なＦＩＸレベルを得ることができた（正常ＦＩＸレベル：５０００ｎｇ／ｍｌ＝１００％）。注目すべきことに、ｐＡＡＶ−Ａｐｏ−ＨＣＲ−ＡＡＴ−ＦＩＸプラスミドで得られたＦＩＸ濃度は、この構築物での生理的ＦＩＸレベルの１０〜４０％の既に報告されている濃度（Ｍｉａｏら，２０００）と良く合致しており、これは該データの信頼性を証明している。総合すると、これらの結果は、肝細胞特異的プロモーター／エンハンサーの新規作製が強固（ロウバスト）なＦＩＸ発現レベルをもたらしたことを示しており、これにより、該エンハンサー修飾構築物の優秀性を証明している。
【０１０６】
（実施例４）
調節要素の更なる組合せ
同一エンハンサーの幾つかのコピーを使用する代わりに該エンハンサーの種々の組合せをつくることにより、該エンハンサーの妥当性を更に評価する。相補的ＴＦＢＳを有するエンハンサーを使用する組合せとして類似した転写因子結合部位を有するエンハンサーを使用する両方の組合せをＴＴＲ最小プロモーターとの組合せにおいて試験する。特定された調節要素の一部分を使用して、例えば、配列番号１〜１４の或る領域のみ、特に、転写因子結合部位を有するそれらの領域を使用して（必ずしもそれらに限定されるわけではない）、更なる組合せをつくる。そのようにすることにより、新たなより一層強力な調節／増強配列が得られうる。
【０１０７】
（実施例５）
ＡＡＶベクター遺伝子運搬による肝特異的調節エンハンサー配列のインビボ妥当性評価
材料および方法
細胞系および培養条件
２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｌｎ）、１００  ＩＵ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンおよび１０％  熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｅｒｅｌｂｅｋｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）で補足されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で細胞を培養した。
【０１０８】
ＡＡＶベクターの製造：ＡＡＶ９−ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐ−ＦＩＸＩＡ
実施例２と同じ肝細胞特異的発現構築物（ｐＡＡＶ−ＴＴＲｍｉｎ−ＦＩＸＩＡ）から因子ＩＸを発現する、ＡＡＶに基づくベクターを作製した。特に、エンハンサーＳｅｒｐ（配列番号３；表ＩＩＩを参照されたい）の組込みを有する構築物をＡＡＶウイルスベクター内へのパッケージングに使用した。一例としては、該構築物をパッケージングするために、遺伝子治療のための有望なベクターであることが知られているＡＡＶ血清型９ウイルスベクター（Ｖａｎｄｅｎｄｒｉｅｓｓｃｈｅら  ２００７）を選択して、ＡＡＶ９−ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐ−ＦＩＸＩＡを得た。Ｇａｏら（２００２）、Ｍｉｎｇｏｚｚｉら（２００３）およびＧｅｈｒｋｅ（２００３）に記載されているとおり、ＡＡＶ９血清型の製造のために、製造業者の説明（リン酸カルシウムトランスフェクションキット，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従うリン酸カルシウムトランスフェクションによりＡＡＶ２−ベクターＤＮＡ（２６μｇ／１０ｃｍディッシュ）、アデノウイルスヘルパープラスミド（５２μｇ／１０ｃｍディッシュ）ならびにＲｅｐ２およびＣａｐ９を発現するＡＡＶヘルパープラスミド（２６μｇ／１０ｃｍディッシュ）で２９３細胞をトランスフェクトすることにより、ヒトＦＩＸを発現するＡＡＶベクターが高力価で製造された。
【０１０９】
トランスフェクションの２日後、連続的な凍結−解凍サイクルおよび音波処理により細胞を細胞溶解した。ライセートをベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ）およびデオキシコラート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理し、ついで連続的な３ラウンドの塩化セシウム密度超遠心分離に付した。ＡＡＶ粒子を含有する画分を、Ａｍｉｃｏｎフィルター（Ｍｉｌｌｉｏｒｅ）を使用して濃縮し、ＰＢＳ  １ｍＭ  ＭｇＣｌ２で洗浄した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、およびヒト因子ＦＩＸ（ｈＦＩＸ）ｃＤＮＡ配列に特異的なプライマー（フォワード［エキソン５］５’ＡＧＧＧＡＴＡＴＣＧＡＣＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡ（配列番号３２）、プローブ［エキソン５−エキソン６］５’ＡＧＴＣＣＴＧＴＧＡＡＣＣＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣ（配列番号３３）、リバース−エキソン６：５’ＧＴＧＡＧＣＴＴＡＧＡＡＧＴＴＴＧＴＧＡＡＡＣＡＧ（配列番号３４））またはポリアデニル化シグナル（フォワード：５’ＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴ（配列番号３５）、プローブ：５’ＴＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣ（配列番号３６）、リバース：５’ＧＧＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧ（配列番号３７））を使用する定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により、ベクターゲノム力価を測定した。
【０１１０】
動物研究
動物実験手法はＫ．Ｕ．Ｌｅｕｖｅｎの動物倫理委員会により承認された。動物を生物安全性レベルＩＩ条件下で収容した。Ｖａｎｄｅｎｄｒｉｅｓｓｃｈｅら（２００７）に記載されているとおりに、ＡＡＶ９−ＴＴＲｍｉｎ−ＦＩＸＩＡまたはＡＡＶ９−ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐ−ＦＩＸＩＡベクターをマウスに注射した。簡潔に説明すると、３×１０９または３×１０１２  ＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）を成体Ｃ５７Ｂｌ６マウス（２〜５マウス／群）の尾静脈内に注射（ｉ．ｖ．）した。全身麻酔下、レトロオービタル（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ）採血により血液を集めた。ヒトＦＩＸ特異的ＥＬＩＳＡ（Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍｅ／Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて、クエン酸化マウス血漿中でヒトＦＩＸ発現を測定した。
【０１１１】
シリカ膜に基づく精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により種々の器官から単離された全ＲＮＡにおいて、ヒトＦＩＸ  ｍＲＮＡレベルを分析した。簡潔に説明すると、ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して各サンプルからの２μｇの全ＲＮＡを逆転写に付し、ついで、全ＲＮＡの２０ｎｇに対応するｃＤＮＡ量を、前記のＦＩＸプライマーを使用する（Ｑ）ＰＣＲにより増幅した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよびプライマー（フォワード：ＴＧＴＧＴＣＣＧＴＣＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡ（配列番号３８）、プローブ  ＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＣＡ（配列番号３９）、リバース  ＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧＡ（配列番号４０））を使用して、ｈＦＩＸ  ｍＲＮＡレベルをマウスグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子のｍＲＮＡレベルに対して正規化した。ゲノムＤＮＡ増幅を排除するためのＲＴの存在下および非存在下、ＲＮＡサンプルを増幅した。増幅されたＰＣＲ断片のサイズを１．５％  アガロースゲル上で確認した。
【０１１２】
結果
前記実施例においては、ウイルスベクターに頼らずに高圧裸ＤＮＡ遺伝子運搬（流体力学的トランスフェクション）により、ＤＮＡを肝臓に運搬した。ここでは、ｐＡＡＶ−ＴＴＲｍｉｎ−ＦＩＸＩＡおよびｐＡＡＶ−ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐ−ＦＩＸＩＡ構築物をＡＡＶウイルスベクター内にパッケージングした。これらのベクターは、高圧流体力学的トランスフェクションに頼ることなく、遺伝子を肝臓内に直接的に導入しうる。肝臓内へのＡＡＶ遺伝子運搬は臨床的に重要なアプローチであり、それらはウイルス遺伝子を欠き、長期的遺伝子発現の可能性を有する。一例として、ＡＡＶ血清型９を使用した（Ｖａｎｄｅｎｄｒｉｅｓｓｃｈｅ  ２００７）。
【０１１３】
ＡＡＶ９ベクターでの肝形質導入の後、Ｓｅｒｐエンハンサー（配列番号３；表ＩＩＩを参照されたい）の優れた性能が証明された。特に、ＡＡＶ９−ＴＴＲｍｉｎ−ＦＩＸＩＡおよびＡＡＶ９−ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐ−ＦＩＸＩＡベクターを５×１０９  ゲノムコピー（ｇｃ）／マウスの用量で成体Ｃ５７Ｂｌ／６マウスへの尾静脈注射により静脈内注射した。図５に示す結果は、Ｓｅｒｐエンハンサーの組込みがＦＩＸ発現レベルにおける強固な増加を招いたことを示している。また、該ＡＡＶ９ベクターにおけるＳｅｒｐエンハンサーの含有の後のＦＩＸタンパク質レベルの増加は、ＡＡＶ９−ＴＴＲｍｉｎ−ＦＩＸＩＡをＡＡＶ９−ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐ−ＦＩＸＩＡと比較した場合の相対ＦＩＸ  ｍＲＮＡレベルにおける１０倍の増加と一致した。特筆すべきことに、ＡＡＶ９−ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐ−ＦＩＸＩＡベクターは、比較的低い用量（２００日後に５×１０９  ｇｃ／マウスにおいて正常ＦＩＸレベルの＞３０％）で、持続的な治療ＦＩＸレベルに到達した。これはその効力を強調するものである。
【０１１４】
さらに、ＡＡＶ９−ＴＴＲｍｉｎＳｅｒｐ−ＦＩＸＩＡが注射されたマウスの種々の器官からの全ＲＮＡに対するＲＴ−ｑＰＣＲにより、ｈＦＩＸ  ｍＲＮＡ発現は専ら肝臓に限局され、該ＦＩＸ遺伝子はいずれの他の組織においても発現されないことが示された（図６）。マウス当たり３×１０１２  ゲノムコピー（ｇｃ）の極端に高いベクター用量（これは他の組織における遺伝子運搬を保証するものである）が注射された場合でさえも、これが確認され、極めて高いＦＩＸレベル（１００％または５，０００ｎｇ／ｍｌとして定められる正常ｈＦＩＸレベルの＞１００００％、すなわち、５００，０００ｎｇ／ｍｌを超える）が得られた。それでも、ＦＩＸ  ｍＲＮＡは肝臓内でしか発現されず、これは該発現の組織特異性を証明している。
【０１１５】
【表４】
2020078316.tif 000005
2020078316.tif 000006
2020078316.tif 000007
2020078316.tif 000008
2020078316.tif 000009
【図１】
2020078316.tif 000010
【図２】
2020078316.tif 000011
【図３】
2020078316.tif 000012
【図４】
2020078316.tif 000013
【図５】
2020078316.tif 000014
【図６】
2020078316.tif 000015
【配列表】
2020078316000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月18日(2020.2.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７又は配列番号１４に示された配列、若しくは配列番号７又は配列番号１４に対して９５％の同一性を有する配列、若しくは配列番号７又は配列番号１４の機能性断片を含む１００ヌクレオチド又はそれ未満の核酸調節要素を含む、肝特異的遺伝子発現の増強のための核酸発現カセットであって、該核酸調節要素は、肝特異的プロモーター及びトランスジーンに機能的に連結されており、該機能性断片の配列は、肝特異的遺伝子発現を増強することができることを特徴とする、核酸発現カセット。
【請求項２】
請求項１に記載の１００ヌクレオチド又はそれ未満の核酸調節要素を２以上含む、請求項１に記載の核酸発現カセット。
【請求項３】
２以上の調節要素が同一である、請求項２に記載の核酸発現カセット。
【請求項４】
２以上の核酸調節要素が、３つの反復からなる、請求項３に記載の核酸発現カセット。
【請求項５】
プロモーターが、トランスチレチン（ＴＴＲ）遺伝子由来である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸発現カセット。
【請求項６】
プロモーターが、最小プロモーターである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸発現カセット。
【請求項７】
トランスジーンが、治療用タンパク質をコードしている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸発現カセット。
【請求項８】
治療用タンパク質が、凝固因子である、請求項７に記載の核酸発現カセット。
【請求項９】
治療用タンパク質が、因子ＩＸである、請求項８に記載の核酸発現カセット。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸発現カセットを含むベクター。
【請求項１１】
ウイルスベクターである、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
ウイルスベクターが、レンチウイルス又はＡＡＶベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸発現カセットを含む、遺伝子治療用医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸発現カセットを含む、肝細胞においてタンパク質を発現させるための医薬組成物であって、
該発現が、
・請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸発現カセットを肝細胞に導入すること；
・該肝細胞においてトランスジーンタンパク質産物を発現させること
を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項７に記載の核酸発現カセット又は請求項７に記載の核酸発現カセットを含むベクターを含む、遺伝子治療を要する対象のための遺伝子治療用医薬組成物であって、該遺伝子治療が、
・請求項７に記載の核酸発現カセット又は請求項７に記載の核酸発現カセットを含むベクターを対象の肝臓に導入すること；
・治療量の該タンパク質を肝臓内で発現させること
を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
血友病Ｂの治療のための、請求項１５に記載の医薬組成物であって、該治療が、
・請求項８若しくは９に記載の核酸発現カセット、又は請求項８若しくは９に記載の核酸発現カセットを含むベクターを対象の肝臓に導入すること；
・治療量の凝固因子を肝臓内で発現させること
を含む、医薬組成物。