(57)【要約】      （修正有）【課題】複数の撮像位置で撮像した撮像結果を用いた再構成画像の品質を向上する顕微鏡装置を提供する。【解決手段】試料Ｗに含まれる蛍光物質の一部を活性化する活性化光Ｌ２と、活性化された蛍光物質の少なくとも一部を励起する励起光Ｌ１を照射する照明光学系４と、対物レンズ２１と、蛍光物質からの蛍光の少なくとも一部に対して非点収差を発生させる非点収差光学系６１を有し、蛍光の像を形成する結像光学系５と、結像光学系５が形成した像を撮像する撮像部６と、試料Ｗにおける撮像位置を対物レンズ２１の光軸方向２１ａに沿って移動する駆動部５０と、制御部４２とを有する顕微鏡１であって、制御部４２は、撮像部５０に、第１の撮像位置および第１の撮像位置とは異なる第２の撮像位置において、それぞれ複数のフレーム数で撮像させる。【選択図】図１
2020042283.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含まれる蛍光物質の一部を活性化する活性化光と、前記活性化された蛍光物質の少なくとも一部を励起する励起光を照射する照明光学系と、
対物レンズと、前記蛍光物質からの蛍光の少なくとも一部に対して非点収差を発生させる非点収差光学系を有し、前記蛍光の像を形成する結像光学系と、
前記結像光学系が形成した像を撮像する撮像部と、
前記試料における撮像位置を前記対物レンズの光軸方向に沿って移動する駆動部と、
制御部と
を有し、
前記制御部は、前記撮像部に、第１の撮像位置および前記第１の撮像位置とは異なる第２の撮像位置において、それぞれ複数のフレーム数で撮像させ、
前記制御部は、前記第１の撮像位置における撮像と、第２の撮像位置における撮像とを行う撮像動作を複数回行うことを特徴とする
顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡装置、撮像方法およびプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＴＯＲＭ、ＰＡＬＭ等のSingle-molecule Localization Microscopy法を利用した顕微鏡装置がある（例えば、特許文献１参照）。
特許文献１  米国特許出願公開公報２００８／０１８２３３６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
当該顕微鏡装置において、試料の厚み方向について広い範囲で試料の構造を再構成するには、試料と光学系とを光軸方向に相対的に移動して、複数の撮像位置で蛍光を撮像する必要がある。そこで、複数の撮像位置で撮像した撮像結果を用いた再構成画像の品質の向上が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の第１の態様においては、試料に含まれる蛍光物質の一部を活性化する活性化光と、活性化された蛍光物質の少なくとも一部を励起する励起光を照射する照明光学系と、対物レンズと、蛍光物質からの蛍光の少なくとも一部に対して非点収差を発生させる非点収差光学系を有し、蛍光の像を形成する結像光学系と、結像光学系が形成した像を撮像する撮像部と、試料における撮像位置を対物レンズの光軸方向に沿って移動する駆動部と、制御部とを有する顕微鏡であって、制御部は、撮像部に、第１の撮像位置および第１の撮像位置とは異なる第２の撮像位置において、それぞれ複数のフレーム数で撮像させる。
【０００５】
本発明の第２の態様においては、試料に含まれる蛍光物質の一部を活性化する活性化光と、活性化された蛍光物質の少なくとも一部を励起する励起光を照射する照明光学系と、対物レンズと、蛍光物質からの蛍光の少なくとも一部に対して非点収差を発生させる非点収差光学系を有し、蛍光の像を形成する結像光学系と、結像光学系が形成した像を撮像する撮像部と、試料における撮像位置を対物レンズの光軸方向に沿って移動する駆動部とを有する顕微鏡装置において、撮像部に、第１の撮像位置および第１の撮像位置とは異なる第２の撮像位置において、それぞれ複数のフレーム数で撮像させる撮像方法が提供される。
【０００６】
本発明の第３の態様においては、試料に含まれる蛍光物質の一部を活性化する活性化光と、活性化された蛍光物質の少なくとも一部を励起する励起光を照射する照明光学系と、対物レンズと、蛍光物質からの蛍光の少なくとも一部に対して非点収差を発生させる非点収差光学系を有し、蛍光の像を形成する結像光学系と、結像光学系が形成した像を撮像する撮像部と、試料における撮像位置を対物レンズの光軸方向に沿って移動する駆動部とを有する顕微鏡装置を制御するコンピュータに、撮像部に、第１の撮像位置および第１の撮像位置とは異なる第２の撮像位置において、それぞれ複数のフレーム数で撮像させる手順を実行させるプログラムが提供される。
【０００７】
なお、上記の発明の概要は、本発明の特徴の全てを列挙したものではない。また、これらの特徴群のサブコンビネーションもまた、発明となりうる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本実施形態に係る顕微鏡装置１を示す図である。
【図２】結像光学系５および撮像素子４０を示す図である。
【図３】試料Ｗにおける位置Ｚ２からの蛍光の光路および蛍光の像を示す図である。
【図４】試料Ｗにおける位置Ｚ１に存在する蛍光物質からの蛍光の光路および蛍光の像を示す図である。
【図５】試料Ｗにおける位置Ｚ３に存在する蛍光物質からの蛍光の光路および蛍光の像を示す図である。
【図６】画像処理部７による画像処理の一例を示す図である。
【図７】重心位置Ｑの３次元分布情報のデータ構成４５の一例である。
【図８】顕微鏡装置１の動作シーケンスの模式図である。
【図９】顕微鏡装置１の撮像処理を示すフローチャートである。
【図１０】撮像処理における撮像条件を入力する画面の一例である。
【図１１】蛍光の重心位置の３次元分布情報を示す模式図である。
【図１２】試料Ｗの再構成の表示画像を設定する画面１５０の一例である。
【図１３】レイヤごとに色分けされた表示画像ＣＬ１を示す。
【図１４】レイヤ間における試料の厚み方向の重なりを示す模式図である。
【図１５】重なりＬｗに含まれる重心位置を表示する表示画像ＣＬ２を説明する模式図である。
【図１６】顕微鏡装置１の他の動作シーケンスの模式図である。
【図１７】撮像処理における撮像条件を入力する画面の他例である。
【図１８】蛍光の重心位置の３次元分布情報を示す模式図である。
【図１９】レイヤごとに色分けされた表示画像ＣＬ３を示す。
【図２０】パスごとに色分けされた表示画像ＣＬ４を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、発明の実施の形態を通じて本発明を説明するが、以下の実施形態は特許請求の範囲にかかる発明を限定するものではない。また、実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。
【００１０】
実施形態に係る顕微鏡装置は、例えば、ＳＴＯＲＭ、ＰＡＬＭ等のSingle-molecule Localization Microscopy法を利用した顕微鏡装置である。本実施形態に係る顕微鏡装置は、３次元の超解像画像を生成可能である。実施形態に係る顕微鏡装置は、１種類の蛍光物質で標識（ラベル）された試料の蛍光観察、及び２種類以上の蛍光物質で標識された試料の蛍光観察のいずれにも利用できる。
【００１１】
試料は、生きた細胞（ライブセル）を含むものでもよいし、ホルムアルデヒド溶液等の組織固定液を用いて固定された細胞を含むものでもよく、組織等でもよい。蛍光物質は、シアニン（ｃｙａｎｉｎｅ）染料等の蛍光色素でもよいし、蛍光タンパク質でもよい。蛍光色素は、活性化された状態である活性化状態で励起光を受けた場合に蛍光を発するレポータ色素を含む。また、蛍光色素は、活性化光を受けてレポータ色素を活性化状態にするアクティベータ色素を含む場合がある。蛍光色素がアクティベータ色素を含まない場合、レポータ色素は、活性化光を受けて活性化状態になる。蛍光色素は、例えば、２種類のシアニン（ｃｙａｎｉｎｅ）染料を結合させた染料対（例、Ｃｙ３−Ｃｙ５染料対（Ｃｙ３、Ｃｙ５は登録商標）、Ｃｙ２−Ｃｙ５染料対（Ｃｙ２、Ｃｙ５は登録商標）、Ｃｙ３−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７染料対（Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒは登録商標））、１種類の染料（例、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒは登録商標））である。蛍光タンパク質は、例えばＰＡ−ＧＦＰ、Ｄｒｏｎｐａなどである。
【００１２】
図１は、本実施形態に係る顕微鏡装置１を示す図である。顕微鏡装置１は、ステージ２、光源装置３と、照明光学系４と、結像光学系５と、撮像部６と、画像処理部７と、制御装置８とを備える。制御装置８は、顕微鏡装置１の各部を包括的に制御する制御部４２を備える。制御装置８は、ソフトウェアプログラムを読み込むことによって、後述する手順を実行するコンピュータであってよい。
【００１３】
ステージ２は、カバーガラス５１を保持する。カバーガラス５１は、観察対象の試料Ｗを保持する。より具体的には、図１に示すように、ステージ２上にカバーガラス５１が載置され、カバーガラス５１上に試料Ｗが載置されている。なお、ステージ２はＸＹ面内で移動してもよいし、しなくてもよい。
【００１４】
光源装置３は、活性化光源１０ａ、励起光源１０ｂ、シャッタ１１ａ、及びシャッタ１１ｂを備える。活性化光源１０ａは、試料Ｗに含まれる蛍光物質の一部を活性化する活性化光Ｌ２を発する。ここでは、蛍光物質がレポータ色素を含み、アクティベータ色素を含まないものとする。蛍光物質のレポータ色素は、活性化光Ｌ２が照射されることで、蛍光を発することが可能な活性化状態となる。蛍光物質は、レポータ色素およびアクティベータ色素を含むものでもよく、この場合、アクティベータ色素は、活性化光Ｌ２を受けた場合にレポータ色素を活性状態にする。なお、蛍光物質は、例えばＰＡ−ＧＦＰ、Ｄｒｏｎｐａなどの蛍光タンパク質でもよい。
【００１５】
励起光源１０ｂは、試料Ｗにおいて活性化された蛍光物質の少なくとも一部を励起する励起光Ｌ１を発する。蛍光物質は、活性化状態において励起光Ｌ１が照射されると、蛍光を発するか、不活性化される。蛍光物質は、不活性化された状態（以下、不活性化状態という）において活性化光Ｌ２が照射されると、再度、活性化状態となる。
【００１６】
活性化光源１０ａおよび励起光源１０ｂは、例えば、レーザ光源などの固体光源を含み、それぞれ、蛍光物質の種類に応じた波長のレーザ光を発する。活性化光源１０ａの射出波長、励起光源１０ｂの射出波長は、例えば、約４０５ｎｍ、約４５７ｎｍ、約４８８ｎｍ、約５３２ｎｍ、約５６１ｎｍ、約６４０ｎｍ、約６４７ｎｍなどから選択される。ここでは、活性化光源１０ａの射出波長が約４０５ｎｍであり、励起光源１０ｂの射出波長が約４８８ｎｍ、約５６１ｎｍ、約６４７ｎｍから選択される波長であるとする。
【００１７】
シャッタ１１ａは、制御部４２により制御され、活性化光源１０ａからの活性化光Ｌ２を通す状態と、活性化光Ｌ２を遮る状態とを切り替え可能である。シャッタ１１ｂは、制御部４２により制御され、励起光源１０ｂからの励起光Ｌ１を通す状態と、励起光Ｌ１を遮る状態とを切り替え可能である。
【００１８】
また、光源装置３は、ミラー１２、ダイクロイックミラー１３、音響光学素子１４、及びレンズ１５を備える。ミラー１２は、例えば、励起光源１０ｂの射出側に設けられる。励起光源１０ｂからの励起光Ｌ１は、ミラー１２で反射し、ダイクロイックミラー１３に入射する。
【００１９】
ダイクロイックミラー１３は、例えば、活性化光源１０ａの射出側に設けられる。ダイクロイックミラー１３は、活性化光Ｌ２を透過し、励起光Ｌ１を反射する特性を有する。ダイクロイックミラー１３を透過した活性化光Ｌ２と、ダイクロイックミラー１３で反射した励起光Ｌ１は、同じ光路を通って音響光学素子１４に入射する。
【００２０】
音響光学素子１４は、例えば音響光学フィルタなどである。音響光学素子１４は、制御部４２に制御され、活性化光Ｌ２の光強度および励起光Ｌ１の光強度のそれぞれを調整可能である。また、音響光学素子１４は、制御部４２に制御され、活性化光Ｌ２、励起光Ｌ１のそれぞれについて、音響光学素子１４を通る状態である通光状態と、音響光学素子１４により遮られる状態または強度が低減される状態である遮光状態とを切り替え可能である。例えば、蛍光物質がレポータ色素を含みアクティベータ色素を含まない場合、制御部４２は、試料Ｗに対し、活性化光Ｌ２および励起光Ｌ１が同時に照射されるように、音響光学素子１４を制御する。また、蛍光物質がレポータ色素およびアクティベータ色素を含む場合、制御部４２は、例えば、活性化光Ｌ２の照射後に励起光Ｌ１が試料Ｗに照射されるように、音響光学素子１４を制御する。
【００２１】
レンズ１５は、例えばカプラであり、音響光学素子１４からの活性化光Ｌ２、励起光Ｌ１を導光部材１６に集光する。なお、顕微鏡装置１は、光源装置３の少なくとも一部を備えなくてもよい。例えば、光源装置３は、ユニット化されており、顕微鏡装置１に交換可能（取り付け可能、取り外し可能）に設けられていてもよい。例えば、光源装置３は、顕微鏡装置１による観察時などに、顕微鏡装置１に取り付けられてもよい。
【００２２】
照明光学系４は、試料Ｗに含まれる蛍光物質の一部を活性化する活性化光Ｌ２と、活性化された蛍光物質の少なくとも一部を励起する励起光Ｌ１とを照射する。照明光学系４は、光源装置３からの活性化光Ｌ２と励起光Ｌ１とを試料Ｗに照射する。照明光学系４は、導光部材１６、レンズ１７、レンズ１８、フィルタ１９、ダイクロイックミラー２０、及び対物レンズ２１を備える。
【００２３】
導光部材１６は、例えば光ファイバであり、活性化光Ｌ２、励起光Ｌ１をレンズ１７へ導く。図１等において、導光部材１６の射出端から試料Ｗまでの光路を点線で示す。レンズ１７は、例えばコリメータであり、活性化光Ｌ２、励起光Ｌ１を平行光に変換する。レンズ１８は、例えば、活性化光Ｌ２、励起光Ｌ１を対物レンズ２１の瞳面の位置に集光する。フィルタ１９は、例えば、活性化光Ｌ２および励起光Ｌ１を透過し、他の波長の光の少なくとも一部を遮る特性を有する。ダイクロイックミラー２０は、活性化光Ｌ２および励起光Ｌ１を反射し、試料Ｗの蛍光物質が発する蛍光の波長帯の光を透過する特性を有する。フィルタ１９からの光は、ダイクロイックミラー２０で反射し、対物レンズ２１に入射する。試料Ｗは、観察時に対物レンズ２１の前側焦点面に配置される。
【００２４】
活性化光Ｌ２、励起光Ｌ１は、上述のような照明光学系４により、試料Ｗに照射される。なお、上述した照明光学系４は一例であり、適宜、変更可能である。例えば、上述した照明光学系４の一部が省略されてもよい。また、照明光学系４は、光源装置３の少なくとも一部を含んでいてもよい。また、照明光学系４は、開口絞り、照野絞りなどを備えてもよい。
【００２５】
結像光学系５は、試料Ｗに含まれる蛍光物質からの蛍光の像を形成する。結像光学系５は、試料Ｗから射出された蛍光の一次像を形成する第１光学系５Ａと、第１光学系５Ａにおいて生成された一次像から、撮像部６における二次像としての蛍光の像を形成する第２光学系５Ｂとを備える。第１光学系５Ａは、対物レンズ２１、ダイクロイックミラー２０、フィルタ２４、レンズ２５、光路切替部材２６を備える。第２光学系５Ｂは、レンズ２７、レンズ２８、及び非点収差光学系としてのシリンドリカルレンズ６１を備える。
【００２６】
結像光学系５は、対物レンズ２１およびダイクロイックミラー２０を照明光学系４と共用している。図１などにおいて、試料Ｗと撮像部６との間の光路を実線で示す。また、駆動部５０は対物レンズ２１を当該対物レンズ２１の光軸方向、すなわち図１におけるＺ方向に移動する。
【００２７】
試料Ｗからの蛍光は、対物レンズ２１およびダイクロイックミラー２０を通ってフィルタ２４に入射する。フィルタ２４は、試料Ｗからの光のうち所定の波長帯の光が選択的に通る特性を有する。フィルタ２４は、例えば、試料Ｗで反射した照明光、外光、迷光などを遮断する。フィルタ２４は、例えば、フィルタ１９およびダイクロイックミラー２０とユニット化され、このフィルタユニット２９は、交換可能に設けられる。フィルタユニット２９は、例えば、光源装置３から射出される光の波長（例、活性化光Ｌ２の波長、励起光Ｌ１の波長）、試料Ｗから放射される蛍光の波長などに応じて交換しても良いし、複数の励起、蛍光波長に対応した単一のフィルタユニットを利用しても良い。
【００２８】
フィルタ２４を通った光は、レンズ２５を介して光路切替部材２６に入射する。レンズ２５から射出された光は、光路切替部材２６を通過した後、中間像面５ｂに一次像を結ぶ。光路切替部材２６は、例えばプリズムであり、結像光学系５の光路に挿脱可能に設けられる。光路切替部材２６は、例えば、制御部４２により制御される駆動部（図示せず）によって、結像光学系５の光路に挿脱される。光路切替部材２６は、結像光学系５の光路に挿入された状態において、試料Ｗからの蛍光を内面反射によって撮像部６へ向かう光路へ導く。
【００２９】
撮像部６は、結像光学系５（第１観察光学系５）が形成した像を撮像する。撮像部６は、撮像素子４０および制御部４１を備える。撮像素子４０は、例えばＣＭＯＳイメージセンサであるが、ＣＣＤイメージセンサなどでもよい。撮像素子４０は、例えば、二次元的に配列された複数の画素を有し、各画素にフォトダイオードなどの光電変換素子が配置された構造である。撮像素子４０は、例えば、光電変換素子に蓄積された電荷を、読出回路によって読み出す。撮像素子４０は、読み出された電荷をデジタルデータに変換し、画素の位置と階調値とを関連付けたデジタル形式のデータ（例、画像のデータ）を出力する。制御部４１は、制御装置８の制御部４２から入力される制御信号に基づいて撮像素子４０を動作させ、撮像画像のデータを制御装置８に出力する。また、制御部４１は、電荷の蓄積期間と電荷の読み出し期間を制御装置８に出力する。
【００３０】
なお、上述した結像光学系５は一例であり、適宜、変更可能である。例えば、上述した結像光学系５の一部が省略されてもよい。また、結像光学系５は、開口絞り、視野絞りなどを備えてもよい。
【００３１】
本実施形態に係る顕微鏡装置１は、観察範囲の設定などに利用される第２観察光学系３０を備える。第２観察光学系３０は、試料Ｗから観察者の視点Ｖｐに向かう順に、対物レンズ２１、ダイクロイックミラー２０、フィルタ２４、レンズ２５、ミラー３１、レンズ３２、ミラー３３、レンズ３４、レンズ３５、ミラー３６、及びレンズ３７を備える。観察光学系３０は、対物レンズ２１からレンズ２５までの構成を結像光学系５と共用している。
【００３２】
試料Ｗからの光は、レンズ２５を通った後に、光路切替部材２６が結像光学系５の光路から退避した状態において、ミラー３１に入射する。ミラー３１で反射した光は、レンズ３２を介してミラー３３に入射し、ミラー３３で反射した後に、レンズ３４およびレンズ３５を介してミラー３６に入射する。ミラー３６で反射した光は、レンズ３７を介して、視点Ｖｐに入射する。第２観察光学系３０は、例えば、レンズ３５とレンズ３７との間の光路に試料Ｗの中間像を形成する。レンズ３７は、例えば接眼レンズであり、観察者は、中間像を観察することにより観察範囲の設定などを行うことができる。
【００３３】
制御装置８は、顕微鏡装置１の各部を総括して制御する。制御装置８は、制御部４２および画像処理部７を備える。制御部４２は、制御部４１から供給される電荷の蓄積期間と電荷の読み出し期間を示す信号に基づいて、音響光学素子１４に、光源装置３からの光を通す通光状態と、光源装置３からの光を遮る遮光状態とを切り替える制御信号を供給する。音響光学素子１４は、この制御信号に基づいて、通光状態と遮光状態とを切り替える。制御部４２は、音響光学素子１４を制御し、試料Ｗに活性化光Ｌ２が照射される期間、及び試料Ｗに活性化光Ｌ２が照射されない期間を制御する。また、制御部４２は、音響光学素子１４を制御し、試料Ｗに励起光Ｌ１が照射される期間、及び、試料Ｗに励起光Ｌ１が照射されない期間を制御する。制御部４２は、音響光学素子１４を制御し、試料Ｗに照射される活性化光Ｌ２の光強度および励起光Ｌ１の光強度を制御する。制御部４２は、撮像部６を制御し、撮像素子４０に撮像を実行させる。
【００３４】
なお、制御部４２の代わりに制御部４１は、電荷の蓄積期間と電荷の読み出し期間を示す信号（撮像タイミングの情報）に基づいて、音響光学素子１４に遮光状態と通光状態とを切り替える制御信号を供給し、音響光学素子１４を制御してもよい。制御部４２は、撮像部６から撮像結果としてのデータを取得する。画像処理部７は、撮像部６の撮像結果を用いて、個々の像の重心位置を求めるなどの画像処理を行う。制御部４２は、撮像部６に複数のフレーム期間で撮像させ、画像処理部７は、複数のフレーム期間で得られた撮像結果の少なくとも一部を用いて１枚の画像を生成する。
【００３５】
制御装置８は、例えば、記憶装置４３および表示装置４４のそれぞれと通信可能に接続される。表示装置４４は、例えば、液晶ディスプレイなどである。表示装置４４は、例えば、顕微鏡装置１の各種設定を示す画像、撮像部６による撮像画像、撮像画像から生成された画像などの各種画像を表示する。制御部４２は、表示装置４４を制御し、表示装置４４に各種画像を表示させる。例えば、制御部４２は、画像処理部７が生成したＳＴＯＲＭ画像、ＰＡＬＭ画像などの超解像画像のデータを表示装置４４に供給し、この画像を表示装置４４に表示させる。例えば、顕微鏡装置１は、観察対象の試料Ｗの超解像画像をライブ映像で表示すること等もできる。記憶装置４３は、例えば磁気ディスクや光学ディスクなどであり、顕微鏡装置１の各種設定のデータ、撮像部６による撮像結果のデータ、画像処理部７が生成した画像のデータなど各種データを記憶する。制御部４２は、例えば、記憶装置４３に記憶された超解像画像のデータを表示装置４４に供給し、超解像画像を表示装置４４に表示させることができる。制御部４２は、記憶装置４３を制御し、各種データを記憶装置４３に記憶させる。
【００３６】
図２は、結像光学系５および撮像素子４０を示す図である。なお、図１において結像光学系５は光路切替部材２６で光軸５ａが折れ曲がる光学系であるが、図２では、結像光学系５をストレートな光学系として概念的に示した。また、図２において、対物レンズ２１とシリンドリカルレンズ６１との間の構成の図示を省略した。ここでは、結像光学系５の光軸５ａに平行な方向をＺ方向とし、Ｚ方向に垂直かつ互いに垂直な２方向をＸ方向、Ｙ方向とする。Ｘ方向は、例えば、撮像素子４０の水平方向であり、Ｙ方向は例えば撮像素子４０の垂直方向である。
【００３７】
シリンドリカルレンズ６１は、垂直方向と水平方向のいずれか一方だけにパワー（屈折力）を有する光学部材である。ここでは、シリンドリカルレンズ６１は、ＸＺ面内でパワーを有し、ＹＺ面内でパワーを有さないものとして説明する。なお、非点収差光学系は、シリンドリカルレンズ６１の代わりに、垂直方向と水平方向の双方にパワーを持ち、これら２方向でパワーが異なるトロイダルレンズを使用したものでもよい。
【００３８】
図３は、試料Ｗにおける位置Ｚ２からの蛍光の光路および蛍光の像を示す図である。まず、ＸＺ面における光路について説明する。シリンドリカルレンズ６１には、試料Ｗにおいて位置Ｚ２に存在する蛍光物質からの蛍光が平行光として入射する。この蛍光は、シリンドリカルレンズ６１での屈折により集光しつつ撮像素子４０へ向かう。Ｘ方向における蛍光の像の幅Ｗｘは、ＸＺ面における焦点に相当する位置Ｚ４において最小となる。また、幅Ｗｘは、位置Ｚ４から、試料Ｗと反対側（＋Ｚ側）に離れるにつれて、大きくなる。
【００３９】
次に、ＹＺ面における光路について説明する。シリンドリカルレンズ６１には、試料Ｗにおける位置Ｚ２に存在する蛍光物質からの蛍光が平行光として入射する。この蛍光は、シリンドリカルレンズ６１でほぼ屈折せずに、レンズ２８入射する。この蛍光は、レンズ２８の屈折により集光しつつ撮像素子４０へ向かう。Ｙ方向における蛍光の像の幅Ｗｙは、ＹＺ面における焦点に相当する位置Ｚ６において最小となる。幅Ｗｙは、位置Ｚ６から、試料Ｗと同じ側（−Ｚ側）に離れるにつれて、大きくなる。
【００４０】
位置Ｚ４と位置Ｚ６の中間の位置Ｚ５においては、Ｘ方向における蛍光の像の幅ＷｘとＸ方向における蛍光の像の幅Ｗｙが等しくなり、蛍光の像は真円となる。したがって、位置Ｚ５に撮像素子４０を配置した場合、試料Ｗにおける位置Ｚ２に存在する蛍光物質からの蛍光の像として真円の像が取得される。
【００４１】
図４は、試料Ｗにおける位置Ｚ１に存在する蛍光物質からの蛍光の光路および蛍光の像を示す図である。位置Ｚ１は、位置Ｚ２に対して、撮像素子４０と反対側（−Ｚ側）である。ＸＺ面において、Ｘ方向における蛍光の像の幅Ｗｘは、位置Ｚ４より試料Ｗ側（−Ｚ側）に離れた位置で最小となる。一方、ＹＺ面において、Ｙ方向における蛍光の像の幅Ｗｙは、位置Ｚ５において最小となる。したがって、位置Ｚ５に撮像素子４０を配置した場合、試料Ｗにおける位置Ｚ１に存在する蛍光物質からの蛍光の像としてＸ方向を長軸とする楕円形の像が取得される。
【００４２】
図５は、試料Ｗにおける位置Ｚ３に存在する蛍光物質からの蛍光の光路および蛍光の像を示す図である。位置Ｚ３は、位置Ｚ２に対して、撮像素子４０と同じ側（＋Ｚ側）である。ＸＺ面において、Ｘ方向における蛍光の像の幅Ｗｘは、位置Ｚ５において最小となる。一方、ＹＺ面において、Ｙ方向における蛍光の像の幅Ｗｙは、位置Ｚ６より試料Ｗと反対側（＋Ｚ側）に離れた位置で最小となる。したがって、位置Ｚ５に撮像素子４０を配置した場合、試料Ｗにおける位置Ｚ３に存在する蛍光物質からの蛍光の像としてＹ方向を長軸とする楕円形の像が取得される。
【００４３】
このように、蛍光の像の幅Ｗｘと幅Ｗｙとの関係、例えば比率は、試料ＷにおけるＺ方向（対物レンズ２１の光軸２１aと同じ方向）の位置に応じて変化する。よって、画像処理部７は、例えば、楕円ガウシアンフィッティングを行って、蛍光の像の重心位置に加えて幅Ｗｘおよび幅Ｗｙを特定する。これにより、画像処理部７は重心位置から蛍光の像に対応する蛍光物質のＸＹ面内の位置を特定するとともに、幅Ｗｘおよび幅Ｗｙの関係に基づいてＺ方向の位置を特定することができる。
【００４４】
図６は、所定の撮像位置における、画像処理部７による画像処理の一例を示す図である。ここで、撮像位置とは、試料Ｗにおける対物レンズ２１の前側焦点の位置である。
【００４５】
図６において、符号Ｐ１からＰｎは予め定められた撮像フレーム期間で得られた撮像結果を表す。活性化光Ｌ２強度に応じた確率で活性化された蛍光物質が、励起光Ｌ１の照射により蛍光を発するので、１フレームにおいては当該確率に応じた数の蛍光物質が蛍光を発し、フレーム間で見ると互いに異なる蛍光物質が蛍光を発している。
【００４６】
画像処理部７は、撮像画像Ｐ１からＰｎのそれぞれについて、各画像に含まれる蛍光の像の重心位置およびＸＹ方向のそれぞれの幅を算出する。画像処理部７は、例えば、この領域の画素値の分布に対して楕円ガウシアンフィッティングを行うことにより、重心のＸＹ位置および幅Ｗｘ、Ｗｙを算出する。画像処理部７は、算出された幅Ｗｘ、Ｗｙの関係から、予め格納されたテーブル等を参照して当該重心のＺ方向の位置も特定する。これにより、画像処理部７は、例えば、蛍光の像Ｉｍの重心位置Ｑが算出され、複数の撮像画像Ｐ１からＰｎに含まれる複数の蛍光の像に応じた複数の重心位置Ｑの少なくとも一部を用いて、重心位置Ｑの３次元分布情報を生成する。また、３次元分布情報に基づいて、３次元超解像画像ＳＰ１を生成し、表示する。当該超解像画像ＳＰ1は試料Ｗの３次元構造を再構成したものになっている。なお、所定の撮像位置において得られた３次元分布情報をレイヤと称する。
【００４７】
図６の例で、３次元超解像度画像ＳＰ１は、見る方向をユーザが指定できるような３次元画像として示されている。これに代えてまたはこれに加えて、ＸＹ平面への投影画像ＳＰ２およびＸＺ平面への投影画像ＳＰ３が表示されてもよい。
【００４８】
図７は、重心位置Ｑの３次元分布情報のデータ構成４５の一例である。図７の例において、重心位置Ｑを識別する番号に当該重心位置ＱのＸＹＺ座標が対応付けられている。さらに、輝度Ｂおよび幅Ｗｘ、Ｗｙが対応付けられてよい。当該構成による３次元分布情報が記憶装置４３に記憶される。
【００４９】
上記図６で説明した通り、顕微鏡装置１によれば対物レンズ２１を光軸方向に固定した状態でも、試料Ｗの厚さ方向（すなわち対物レンズの光軸方向２１ａ）の構造を再構成することができる。しかしながら、対物レンズ２１を光軸方向２１ａについて固定した状態では、構造を再構成できる厚さ方向の範囲は、撮像位置を中心として、結像光学系５の被写界深度や蛍光の強度、撮像素子のＳ／Ｎ比、シリンドリカルレンズ６１の焦点距離等により制限されてしまう。試料Ｗを観察する場合に、構造を再構成できる厚み方向の範囲は３００ｎｍ程度である。そこで、本実施形態では、対物レンズ２１を駆動部５０により対物レンズ２１の光軸方向２１ａに移動させつつ撮像部６により蛍光の像を撮像することで、厚み方向に広い範囲にわたって試料Ｗの構造を再構成する。
【００５０】
図８は顕微鏡装置１の動作シーケンスの模式図である。図９は顕微鏡装置１の撮像処理を示すフローチャートである。また、図１０は撮像処理における撮像条件を入力する画面の一例である。
【００５１】
撮像部６が所定の撮像位置において複数回の撮像を行うことを１の撮像処理単位とする。また、図７に示すように、予め決められた複数の撮像位置における画像取得手順をパスという。よって、パスは、例えば、撮像位置１から撮像位置８まで対物レンズ２１が、対物レンズ２１の光軸５aの方向に移動し、撮像することである。なお、これらの用語は説明を簡略化するために用いているものであって、権利範囲を限定するものではない。
【００５２】
図９のフローチャートに示されるように、まず、撮像処理において撮像条件が設定される（Ｓ１００）。この場合に、顕微鏡装置１は表示装置４４に図１０に示すような画面１００を表示する。制御装置８は、画面１００を通じて、撮像条件としての、撮像最下面の位置、撮像最上面の位置、Ｚ方向のステップサイズ、各撮像位置で取得するフレーム数および３次元分布情報を記憶するファイル名の入力を受け付ける。
【００５３】
図１０の例では、ユーザにより撮像位置の番号とそれに対応するフレーム数が手動で入力される。これに代えて、あらかじめ定められたルールに基づいて、撮像位置に対するフレーム数が自動的に計算されてもよい。例えば、染色された細胞内組織の密度が細胞の下層ほど高く、上層ほど密度が低くなるような場合に、撮像位置がカバーガラス５１から離れるほどフレーム数を多くすることが好ましい。
【００５４】
さらに各パス内における撮像順序も指定できてよい。例えば、初期設定では、上記のように下の撮像位置から上の撮像位置への順次移動が選択されている。この撮像順序に代えて、上から下、偶数番号の撮像位置が先で奇数番号の撮像位置が後、ランダム等の撮像順序が選択できるようになっていてもよい。
また、例えば、図８に示すＺ１〜Ｚ８の撮像位置に移動する場合に、Ｚ１、Ｚ８、Ｚ２、Ｚ７、Ｚ３、Ｚ６、Ｚ５の撮像順序を指定することもできる。この撮像順序により、試料の輪郭が明瞭な画像を得ることが可能となる。
【００５５】
上記撮像条件が入力されて撮像開始ボタンが押されると、制御装置８は当該撮像条件から撮像位置、すなわち駆動部５０による駆動量を算出する（Ｓ１０２）。この場合に、隣接するレイヤ間で試料Ｗの厚み方向の一部が重なるよう撮像位置および・または他の撮像条件が設定されることが好ましい。図８には、レイヤ数が８でパス数が１の動作シーケンスの例が示されている。
【００５６】
照明光学系４は光源３からの活性化光Ｌ２および励起光Ｌ１を試料Ｗ１に照射し（Ｓ１０４）、撮像部６による撮像（Ｓ１０６）を撮像位置に対応した所定のフレーム数行う（Ｓ１０８：Ｎｏ）。
【００５７】
所定のフレーム数の撮像が完了したら（Ｓ１０８：Ｙｅｓ）、駆動部５０は対物レンズ２１を次の撮像位置に移動させる（Ｓ１０９）。算出された撮像位置について上記ステップＳ１０４からＳ１０９を繰り返す（Ｓ１１０：Ｎｏ）。
【００５８】
最終の撮像位置における撮像が完了したら（Ｓ１１０：Ｙｅｓ）、制御部８は最終のパスに至ったか否かを判断する(Ｓ１１１)。最終のパスに至っていない場合に(Ｓ１１１：Ｎｏ)、次のパスへ移行し、ステップＳ１０４からＳ１１０を繰り返す。最終のパスに至った場合に(Ｓ１１１：Ｙｅｓ)、撮像処理が終了する。
【００５９】
以上、本実施形態によれば、ＳＴＯＲＭ等の方法で試料の構造を再構成する場合において、シリンドリカルレンズの焦点距離 等から制限される厚み方向の範囲よりも広い範囲で、試料の構造を再構成することができる。特に、撮像位置ごとに異なるフレーム数の撮像結果を基にして試料の構造を再構成するので、試料の形状や性質に応じた再構成画像の画質の向上を見込むことができる。
【００６０】
上記撮像処理中にまたは撮像処理後に、画像処理部７は各々の撮像フレームにおいて図６で説明したように、蛍光の重心位置を特定する。画像処理部７はさらに、撮像位置ごとに撮像処理単位に含まれる各々の撮像フレームで特定された重心位置の３次元分布情報を図７に示したデータ構成のファイルとして記憶装置４３に記憶する。
【００６１】
図１１は、複数の撮像位置での撮像により特定された複数のレイヤを示す模式図である。図１１には、レイヤ数が３でパス数が１の場合が示されている。
【００６２】
画像処理部７は、パスごとかつレイヤごと、すなわち、撮影処理単位ごとに特定した蛍光の重心位置を、パスおよびレイヤを識別する情報に対応付けて、記憶装置４３に記憶する。試料空間における各蛍光の重心のＺ位置は、駆動部５０の駆動量に基づく撮像位置と、各レイヤ内での蛍光の重心のＺ位置（撮像された蛍光画像から算出される重心のＺ位置）とを用いて特定される。撮像位置とは、上述したように、試料における対物レンズ２１の前側焦点の位置であるが、前側焦点の位置は、カバーガラス５１を基準とした位置でもよい。
【００６３】
図１２は、試料Ｗの再構成の表示画像を設定する画面１５０の一例である。画面１５０は表示装置４４に表示されて、パス、レイヤまたはその両方を視覚的に区別して表示するか否かの設定を受け付ける。
【００６４】
図１２では、視覚的に区別する方法として表示色を用いる例が示されている。この場合にパスとレイヤとで色の三属性のうちの異なるもの、例えばパスは色相、レイヤは明度、で区別してもよい。これにより、パスごとかつレイヤごとの両方を視覚的に区別することができる。
【００６５】
表示色に代えてまたは表示色に加えて、ハッチングや形状、例えば丸、三角、バツ印等で視覚的に区別できるようにしてもよい。
【００６６】
画面１５０の領域１５２は、レイヤごとの色分けをするか否かを選択するものであり、領域１５４はパスごとの色分けをするか否かを選択するものである。領域１５２の右側には、白抜きの各レイヤが上下方向に並んだ状態が模式的に表されており、さらにその右側には、色分けを選択した場合にレイヤごとに色分けがされる状態が模式的に表されている。領域１５４の右側には、白抜きの各パスが左右方向に並んだ状態が模式的に表されており、さらにその右側には、色分けを選択した場合にパスごとに色分けがされる状態が模式的に表されている。また、ボックス１５６は表示するＺ方向の範囲の下限を入力するものであり、ボックス１５７は上限を入力するものである。さらに、ボックス１５８は表示するパスの下限を入力するものであり、ボックス１５９は上限を入力するものである。
【００６７】
画面１５０にはさらに撮影処理で得られたデータ構成及びデータ範囲の情報が表示される。データ構成としては、レイヤの厚み、レイヤ数及びパス数が表示される。
【００６８】
図１３は、図１１の３次元分布情報を用いて、図１２の設定によりレイヤごとに色分けされた表示画像ＣＬ１を示す。ただし、図中にカラーを用いることができないので、白、ハッチング、黒を用いてカラーの代用とした。
【００６９】
画像処理部７は、記憶装置４３に記憶された蛍光の重心位置を呼び出し、レイヤを識別する情報に基づいて、色を割り当てる。画像処理部７は、レイヤ１の蛍光の重心位置に白を割り当て、レイヤ２の蛍光の重心位置にハッチングを割り当て、レイヤ３の蛍光の重心位置に黒を割り当て、表示画像ＣＬ１を生成して、表示装置４４に表示する。
【００７０】
以上、本実施形態によれば、画像処理部７が複数のレイヤのいずれに属する重心位置であるかを視覚的に区別可能に表示するので、レイヤ間において対物レンズ２１とステージ２のドリフト（例えば、位置ずれとして現れる）がどの程度あったかをユーザが容易に認識することができる。
【００７１】
図１４は、レイヤ間における試料の厚み方向の重なりを示す模式図である。上記した通り、複数の撮像位置は、その結果として生成される３次元分布情報の一部が、試料の厚み方向に重なるように設定されることが好ましい。図１４においては、レイヤ１とレイヤ２との間に重なりＬｗがあることを示している。そこで、図１２の設定画面１５０において、手動によりまたは自動により、重なりＬｗに含まれる重心位置を表示するよう設定できることが好ましい。
【００７２】
図１５は、重なりＬｗに含まれる重心位置を表示する表示画像ＣＬ２を説明する模式図である。画像処理部７は、各レイヤの３次元分布情報の中から、重なりＬｗに含まれるＺ座標を有する重心位置を特定する。図１５に示す例では、レイヤ１およびレイヤ２で破線で囲まれた重心位置が、重なりＬｗに含まれるものであると特定されている。
【００７３】
画像処理部７は、レイヤ１における上記重心位置に白を割り当て、レイヤ２の上記重心位置にハッチングを割り当てて、表示画像ＣＬ２を生成して、表示装置４４に表示する。これにより、レイヤ間における対物レンズ２１とステージ２のドリフトの程度をより容易に認識することができる。
【００７４】
図１６は、顕微鏡装置１の他の動作シーケンスの模式図である。図１７は図１６に対応した撮像処理における撮像条件を入力する画面１１０の例である。
【００７５】
図１６の例において、顕微鏡装置１はパスを複数回繰り返す。具体的には、パス１からパス１０まで１０回のパスを繰り返す。
【００７６】
パスの数は、図１７の画面１１０を用いてユーザから入力される。さらに、画面１１０は、図１０の画面１００と同様に、撮像最下面の位置、撮像最上面の位置、Ｚ方向のステップサイズ、各パス内における撮像順序および３次元分布情報を記憶するファイル名の入力を受け付ける。画面１１０はさらに、各レイヤに用いる全フレーム数の入力も受け付ける。
【００７７】
図１６および図１７の撮像処理も、図９のフローチャートに沿って実行されてよい。この場合に、ステップＳ１０２において、画面１１０から入力された全フレーム数をパス数で割ることにより、各パスの各撮像位置で取得するフレーム数、すなわち各撮像処理単位のフレーム数が算出される。例えば各撮像位置について全パスの合計で用いるフレーム数が１００００であり、パス数が１０の場合に、各撮像位置で得るフレーム数は１０００となる。なお、図８から図１０の例のように、撮像位置ごとにフレーム数が異なってもよい。
【００７８】
これにより、図１６に示すように、撮像位置１から８を順に移動する動作を１パスとして、これを１０回繰り返す。言い換えると、各撮像位置にパスの回数分移動し、それぞれの撮像位置で上記撮像処理単位分のフレームが撮像される。
【００７９】
ＳＴＯＲＭ、ＰＡＬＭ等のSingle-molecule Localization Microscopy法を利用した顕微鏡装置では、上述したように、撮像フレーム数が多くなるため、パスを１回に設定して撮像を行うと、撮像時間が後になるにつれて蛍光物質が褪色してしまい、例えば、一番最初の撮像位置におけるレイヤと、一番最後の撮像位置におけるレイヤとで、蛍光物質の量が大きく異なってしまう場合がある。
本実施形態によれば、複数パスを設定することが出来るので、レイヤ間での退色による蛍光物質の量の差を低減することができ、レイヤ間での画質の差を低減することができる。
【００８０】
図１８は、複数のパスおよび複数の撮像位置での撮像により特定された複数のレイヤを示す模式図である。図１８には、レイヤ数が３でパス数が２の場合が示されている。
【００８１】
図１９は、図１８のパスを用いて、レイヤごとに色分けされた表示画像ＣＬ３を示す。ただし、図１３と同様の理由により、白、ハッチング、黒を用いてカラーの代用とした。
【００８２】
画像処理部７は、記憶装置４３に記憶された蛍光の像のＸＹＺ位置を呼び出し、少なくともレイヤを識別する情報に基づいて、色を割り当てる。画像処理部７は、全パスに含まれるレイヤ１の蛍光の像に白を割り当て、全パスに含まれるレイヤ２の蛍光の像にハッチングを割り当て、全パスに含まれるレイヤ３の蛍光の像に黒を割り当てた表示画像ＣＬ３を生成し、表示装置４４に表示する。この場合に、レイヤ１からレイヤ３まで色を凡例として示すとともに、パスごとには区別されていないことを「全パス」の文字列等で示すことが好ましい。
【００８３】
以上、本実施形態によれば、画像処理部７が複数のレイヤのいずれの撮像結果に基づいて特定された３次元位置であるかを視覚的に区別可能に表示するので、レイヤ間の撮像時間の違いにより生じる試料Wと対物レンズ間において生じるドリフト（位置ずれ）がどの程度あったかをユーザが容易に認識することができる。
【００８４】
図２０は、図１８のレイヤを用いて、パスごとに色分けされた表示画像ＣＬ４を示す。ただし、白と黒を用いてカラーの代用とした。
【００８５】
画像処理部７は、記憶装置４３に記憶された蛍光の像のＸＹＺ位置を呼び出し、少なくともパスを識別する情報に基づいて、色を割り当てる。図１２の例において、画像処理部７は、パス１に含まれる全レイヤの蛍光の像に白を割り当て、パス２に含まれる全レイヤの蛍光の像に黒を割り当て、表示画像ＣＬ４を生成し、表示装置４４に表示する。その場合に、画像処理部７は凡例として、パス１の色とパス２の色を示すとともに、レイヤごとには区別されていないことを「全レイヤ」の文字列等で示すことが好ましい。
【００８６】
以上、本実施形態によれば、画像処理部７が複数のパスのいずれの撮像結果に基づいて特定された３次元位置であるかを視覚的に区別可能に表示するので、パス間において試料Ｗのドリフトがどの程度あったかをユーザが容易に認識することができる。
【００８７】
また、各撮像位置でフレーム数を全て撮像してから次の撮像位置に移動していくと、時間的に後の撮像位置ほど蛍光が退色してしまっており、十分な画質が得られないおそれがある。これに対し、図１６のシーケンスを用いた実施形態によれば、各レイヤで用いるフレーム数を複数のパスに分散して撮像するので、時間的に後の撮像位置でも良好な画質を得ることができる。
【００８８】
なお、図１１、図１５、図１８から図２０では、３次元分布情報が「画像」として示されているが、これは説明のためのものである。すなわち、表示装置４４に「表示画像」として表示させる場合以外においては、画像処理部７は画像を生成しなくてよく、図７に示されるようなデータのまま扱えばよい。
【００８９】
なお、上記実施形態においては、駆動部５０が対物レンズ２１を光軸方向５ａに移動することにより撮像位置を移動させた。これに代えて、駆動部５０がステージ２を対物レンズ２１の光軸方向５ａすることにより撮像位置を移動させてもよい。
【００９０】
また、２種類の蛍光物質を用いる場合には、例えば複数パスのうち奇数のパスには一の蛍光物質を励起する波長の励起光を照射し、偶数のパスに他の蛍光物質を励起する波長の励起光を照射してもよい。
【００９１】
以上、本発明を実施の形態を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施の形態に記載の範囲には限定されない。上記実施の形態に、多様な変更または改良を加えることが可能であることが当業者に明らかである。その様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、特許請求の範囲の記載から明らかである。
【００９２】
特許請求の範囲、明細書、および図面中において示した装置、システム、プログラム、および方法における動作、手順、ステップ、および段階等の各処理の実行順序は、特段「より前に」、「先立って」等と明示しておらず、また、前の処理の出力を後の処理で用いるのでない限り、任意の順序で実現しうることに留意すべきである。特許請求の範囲、明細書、および図面中の動作フローに関して、便宜上「まず、」、「次に、」等を用いて説明したとしても、この順で実施することが必須であることを意味するものではない。
【符号の説明】
【００９３】
１  顕微鏡装置、２  ステージ、３  光源装置、４  照明光学系、５  結像光学系、６  撮像部、７  画像処理部、８  制御装置、１０ａ  活性化光源、１０ｂ  励起光源、１１ａ  シャッタ、１１ｂ  シャッタ、１３  ダイクロイックミラー、１４  音響光学素子、１５  レンズ、１６  導光部材、１７  レンズ、１８  レンズ、１９  フィルタ、２０  ダイクロイックミラー、２１  対物レンズ、２４  フィルタ、２５  レンズ、２６  光路切替部材、２８  レンズ、２９  フィルタユニット、３０  観察光学系、３１  ミラー、３２  レンズ、３３  ミラー、３４  レンズ、３５  レンズ、３６  ミラー、３７  レンズ、４０撮像素子、４１  制御部、４２  制御部、４３  記憶装置、４４  表示装置、５０  駆動部、５１ カバーガラス、６１  シリンドリカルレンズ、１００  画面、１１０  画面、１５０  画面、１５２  領域、１５４  領域、１５６  ボックス、１５７  ボックス、１５８  ボックス、１５９  ボックス
【図１】
2020042283.tif 000003
【図２】
2020042283.tif 000004
【図３】
2020042283.tif 000005
【図４】
2020042283.tif 000006
【図５】
2020042283.tif 000007
【図６】
2020042283.tif 000008
【図７】
2020042283.tif 000009
【図８】
2020042283.tif 000010
【図９】
2020042283.tif 000011
【図１０】
2020042283.tif 000012
【図１１】
2020042283.tif 000013
【図１２】
2020042283.tif 000014
【図１３】
2020042283.tif 000015
【図１４】
2020042283.tif 000016
【図１５】
2020042283.tif 000017
【図１６】
2020042283.tif 000018
【図１７】
2020042283.tif 000019
【図１８】
2020042283.tif 000020
【図１９】
2020042283.tif 000021
【図２０】
2020042283.tif 000022