(57)【要約】【課題】本発明の課題は、重粒子線照射後の腫瘍疾患について予後を検査する方法を提供することである。【解決手段】本発明は、重粒子線照射前における第１の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現と、重粒子線照射後における第２の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現とを比較する比較工程を含み、前記第１の腫瘍組織と前記第２の腫瘍組織とは同一の生体に由来する同種の腫瘍組織であり、前記第１の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現よりも前記第２の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現が高いことが、腫瘍疾患の予後が良好であることの指標である、腫瘍疾患の予後の検査方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
重粒子線照射前における第１の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現と、重粒子線照射後における第２の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現とを比較する比較工程を含み、
前記第１の腫瘍組織と前記第２の腫瘍組織とは同一の生体に由来する同種の腫瘍組織であり、
前記第１の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現よりも前記第２の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現が高いことが、腫瘍疾患の予後が良好であることの指標である、
腫瘍疾患の予後の検査方法。
【請求項２】
前記第２の腫瘍組織は、３Ｇｙ（ＲＢＥ）以上７４．４Ｇｙ（ＲＢＥ）以下の線量を照射されたものである、
請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
前記第２の腫瘍組織は、重粒子線を１回以上２０回以下照射されたものである、請求項１又は２に記載の検査方法。
【請求項４】
前記第１の腫瘍組織及び前記第２の腫瘍組織は、子宮がんの組織である、請求項１から３のいずれかに記載の検査方法。
【請求項５】
前記比較工程において、ＰＤ−Ｌ１発現は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いて特定される、請求項１から４のいずれかに記載の検査方法。
【請求項６】
ＰＤ−Ｌ１を定量可能な成分を含む、重粒子線治療後の予後を診断するためのコンパニオン診断用組成物。
【請求項７】
前記ＰＤ−Ｌ１を定量可能な成分として抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む、請求項６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍疾患の予後の検査方法、及び、コンパニオン診断用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍疾患は日本人の死因の上位を占め、各種治療方法が開発されている。このような治療方法のひとつとして放射線治療が挙げられる。放射線治療とは、Ｘ線等の放射線を患部に照射することで腫瘍細胞に損傷を与える治療法である。
【０００３】
Ｘ線照射は生体内の免疫機構に影響を及ぼし得ることが知られる。例えば、非特許文献１では、Ｘ線照射により腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１発現が増加したことが報告されている。ＰＤ−Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌｄｅａｔｈ  ｌｉｇａｎｄ  １）とは、腫瘍細胞表面に発現するタンパク質であり、Ｔ細胞応答を抑制又は停止させる、いわゆる免疫チェックポイントタンパク質である。そのため、腫瘍疾患の放射線治療において、Ｘ線照射と、抗ＰＤ−Ｌ１抗体等の免疫チェックポイント阻害薬投与との併用が有効であり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓａｔｏ  Ｈ，ｅｔａｌ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７  Ｎｏｖ  ２４；８（１）：１７５１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７−０１７−０１８８３−９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、照射する放射線の種類によって生体に生じる影響は異なり得る。このため、放射線治療の実績が多いＸ線以外の放射線を生体に照射した際に生じる免疫機構への影響は未だ十分に解明されていない。例えば、重粒子線治療の分野において、重粒子線照射後の腫瘍疾患の予後の予測について十分に検討されていない。
【０００６】
本発明は、上記の状況に鑑みてなされたものであり、重粒子線照射後の腫瘍疾患について予後を検査する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、重粒子線照射前後の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現を指標とすることで上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的に、本発明は以下を提供する。
【０００８】
（１）  重粒子線照射前における第１の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現と、重粒子線照射後における第２の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現とを比較する比較工程を含み、
前記第１の腫瘍組織と前記第２の腫瘍組織とは同一の生体に由来する同種の腫瘍組織であり、
前記第１の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現よりも前記第２の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現が高いことが、腫瘍疾患の予後が良好であることの指標である、
腫瘍疾患の予後の検査方法。
【０００９】
（２）  前記第２の腫瘍組織は、３Ｇｙ（ＲＢＥ）以上７４．４Ｇｙ（ＲＢＥ）以下の線量を照射されたものである、
（１）に記載の検査方法。
【００１０】
（３）  前記第２の腫瘍組織は、重粒子線を１回以上２０回以下照射されたものである、（１）又は（２）に記載の検査方法。
【００１１】
（４）  前記第１の腫瘍組織及び前記第２の腫瘍組織は、子宮がんの組織である、（１）から（３）のいずれかに記載の検査方法。
【００１２】
（５）  前記比較工程において、ＰＤ−Ｌ１発現は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いて特定される、（１）から（４）のいずれかに記載の検査方法。
【００１３】
（６）  ＰＤ−Ｌ１を定量可能な成分を含む、重粒子線治療後の予後を診断するためのコンパニオン診断用組成物。
【００１４】
（７）  前記ＰＤ−Ｌ１を定量可能な成分として抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む、（６）に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、重粒子線照射後の腫瘍疾患について予後を検査する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】重粒子線照射によるＰＤ−Ｌ１発現への影響を示す図である。
【図２】重粒子線照射によるＰＤ−Ｌ１発現への影響を示す図である。
【図３】重粒子線照射によるＰＤ−Ｌ１発現と、患者の予後との関係を示す図である。
【図４】重粒子線照射によるＰＤ−Ｌ１発現と、患者の予後との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明するが、本発明はこれに特に限定されない。
【００１８】
＜腫瘍疾患の予後の検査方法＞
本発明の検査方法は、重粒子線照射前における第１の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現と、重粒子線照射後における第２の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現とを比較する比較工程を含む腫瘍疾患の予後の検査方法である。該比較工程において、第１の腫瘍組織と第２の腫瘍組織とは同一の生体に由来する同種の腫瘍組織であり、かつ、第１の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現よりも第２の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現が高いことが、腫瘍疾患の予後が良好であることの指標である。
【００１９】
ＰＤ−Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌｄｅａｔｈ  ｌｉｇａｎｄ  １）とは、細胞表面に発現するタンパク質であり、Ｔ細胞応答を抑制又は停止させる、免疫チェックポイントタンパク質として知られる。腫瘍細胞は免疫機構による攻撃により排除されることが知られているが、ＰＤ−Ｌ１が細胞表面に発現する腫瘍細胞は、該免疫機構による排除を回避しがちであることが解明されつつある。
【００２０】
Ｘ線照射が、ＰＤ−Ｌ１発現等の生体内の免疫機構に影響を及ぼし得ることが知られている。しかし、照射する放射線の種類によって生体に生じる影響は異なり得るため、放射線照射による免疫機構への影響は未だ十分に解明されていない。
【００２１】
本発明者らの検討の結果、放射線の１種である重粒子線を、腫瘍組織を含む患部に照射すると、腫瘍組織（典型的には、該腫瘍組織を構成する腫瘍細胞）のＰＤ−Ｌ１発現が増加する場合があることが見出された。そして、極めて意外なことに、そのようなＰＤ−Ｌ１発現動態を示した患者は、重粒子線照射後にＰＤ−Ｌ１発現が増加しないか、又は、ＰＤ−Ｌ１発現の増加が乏しい患者と比較して、腫瘍疾患の予後が良好であることがわかった。本発明はこのような新規な知見に基づき完成したものである。
【００２２】
さらに、従来、Ｘ線照射によって腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１発現が増加することが知られていたが、ＰＤ−Ｌ１発現の増加効果は、Ｘ線照射よりも重粒子線照射の方が高い傾向にあることもわかった。
【００２３】
以下、本発明の検査方法の詳細について説明する。
【００２４】
（比較工程）
比較工程は、重粒子線照射前及び後のそれぞれにおける腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現を特定し、それらを比較する工程である。重粒子線照射前における腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現を「第１の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現」ともいい、重粒子線照射後における腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現を「第２の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現」ともいう。
【００２５】
［重粒子線照射］
本発明において「重粒子線照射前」とは、患者が重粒子線を照射される前（つまり、重粒子線治療前）の任意の時点である。すなわち、重粒子線照射前における腫瘍組織（第１の腫瘍組織）は、重粒子線照射を受けたことのない組織である。「重粒子線照射前」とは、例えば、重粒子線を照射される１〜３０日前等であってもよい。
【００２６】
本発明において「重粒子線照射後」とは、患者が重粒子線を照射された後の任意の時点である。「重粒子線照射後」とは、例えば、重粒子線を照射された当日〜３日後等であってもよい。例えば、「重粒子線照射後における腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現（第２の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現）」とは、好ましくは、重粒子線照射を行った当日又は翌日に採取された腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現を意味する。複数回の照射を行った場合は、好ましくは、最後の照射日の当日又は翌日に採取された第２の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現を意味する。
【００２７】
重粒子線照射後における腫瘍組織（第２の腫瘍組織）は、任意の線量の重粒子線を照射された組織である。腫瘍組織に照射される線量は、特に限定されず、対象の腫瘍組織の治療において通常照射される線量であってもよい。
【００２８】
第２の腫瘍組織に照射された重粒子線の線量の下限は、好ましくは３Ｇｙ（ＲＢＥ）以上、より好ましくは１２Ｇｙ（ＲＢＥ）以上であってもよい。第２の腫瘍組織に照射された重粒子線の線量の上限は、好ましくは７４．４Ｇｙ（ＲＢＥ）以下、より好ましくは３６Ｇｙ（ＲＢＥ）以下であってもよい。第２の腫瘍組織には、線量の合計が上記範囲となるように重粒子線が照射されていればよく、照射回数は１回であっても複数回（例えば２〜２０回）であってもよい。上記において、「Ｇｙ（ＲＢＥ：ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）」とは臨床線量の単位である。なお、本出願時における保険医療、先進医療、臨床試験等で照射され得る重粒子線の総線量の最高値は７４．４Ｇｙ（ＲＢＥ）である。
【００２９】
なお、第２の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現を特定した後、腫瘍組織を含む患部にさらに重粒子線照射を行ってもよい。すなわち、ＰＤ−Ｌ１発現の特定後に患者に重粒子線治療を継続してもよい。
【００３０】
重粒子線照射後における腫瘍組織（第２の腫瘍組織）は、重粒子線を任意の回数照射されたものであってもよい。照射回数の下限は、好ましくは１回以上である。照射回数の上限は、好ましくは２０回以下である。照射の頻度は特に限定されないが、通常、週４回の照射、かつ／又は、２週間で少なくとも６回以上の照射が行われる。
【００３１】
重粒子線照射後における腫瘍組織（第２の腫瘍組織）の好ましい態様としては、３Ｇｙ（ＲＢＥ）×４回（１日１回照射×連続４日）重粒子線を照射した組織等が挙げられる。
【００３２】
なお、重粒子線照射後における腫瘍組織（第２の腫瘍組織）について、照射される重粒子線の線量、重粒子線の照射回数、及び１回の照射あたりの重粒子線の線量等は、治療対象である腫瘍疾患に応じて適宜設定できる。例えば、治療対象である腫瘍疾患が子宮がん（例えば、子宮頸部腺がん）であれば、３Ｇｙ（ＲＢＥ）×４回（１日１回照射×連続４日）の線量及び頻度で重粒子線を照射する治療スケジュールが知られている。
【００３３】
重粒子線照射は、従来知られた方法を採用できる。例えば、高エネルギー粒子線加速器（サイクロトロン、シンクロトロン等）を用いて、炭素イオン線等の重粒子を高速に加速させ、腫瘍組織に照射する方法等が挙げられる。高エネルギー粒子線加速器としては、重粒子線がん治療装置「ＨＩＭＡＣ」（日本国  放射線医学総合研究所）が挙げられる。
【００３４】
［腫瘍組織］
第１の腫瘍組織と第２の腫瘍組織とは同一の生体に由来する同種の腫瘍組織であれば、その種類等は特に限定されない。腫瘍組織は、繰り返し生検可能な部位由来であること、重粒子線照射（重粒子線治療）の対象である腫瘍由来であること、低い侵襲性で採取できること等のいずれか１以上を満たすものが好ましい。このような腫瘍組織としては、限局性固形がんが挙げられる。腫瘍組織は、原発性、転移性のいずれであってもよい。より具体的には、子宮がん（子宮頸がん、子宮体がん、子宮肉腫等）、膵臓がん、肝臓がん、肺がん、頭頸部がん、骨軟部悪性腫瘍、骨肉腫、大腸がん等が挙げられる。
【００３５】
腫瘍組織が由来する生体としては、任意の生物であり得る。好ましい生体は哺乳類（ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ等）である。
【００３６】
腫瘍組織は患部から任意の方法で採取されたものであり得る。腫瘍組織の形態は、病理診断等に用いられる任意の形態（スメア、組織切片、細胞等）であり得る。
【００３７】
［ＰＤ−Ｌ１発現の特定］
第１及び第２の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現は、タンパク質の発現の有無や発現量を検出できる任意の方法で特定される。例えば、高い特異性でＰＤ−Ｌ１発現を特定できることから、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いて特定してもよい。抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いる場合、腫瘍組織と抗ＰＤ−Ｌ１抗体とを接触させ、該抗体と結合した腫瘍組織中のＰＤ−Ｌ１を検出することでＰＤ−Ｌ１発現の有無や発現量を特定できる。
【００３８】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ポリクロナール抗体及びモノクロナール抗体のいずれでもよい。必要に応じて、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を認識する二次抗体を用いてもよい。なお、かかる抗ＰＤ−Ｌ１抗体、及び、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を認識する二次抗体には、これらの抗体の存在を容易に識別するために、従来公知のラベルが施されていてもよい。例えば、ラベルとしては蛍光標識が挙げられる。
【００３９】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体は市販の抗体（デュルバルマブ等）であってもよい。
【００４０】
なお、ＰＤ−Ｌ１発現の特定方法は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いた方法に限定されず、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する種々の化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、低分子等）を用いてもよい。
【００４１】
第１及び第２の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現は、ＰＤ−Ｌ１発現の特定に用いた方法に応じて、その有無や発現量を特定する。特定のための方法は適宜選択でき、組織化学的染色法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリーを用いた分析、ウェスタンブロット法等が挙げられる。
【００４２】
特定された第１及び第２の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現は、その有無や発現量等の観点から比較する。第１の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現よりも第２の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現が高ければ、腫瘍疾患の予後が良好であると予測することができる。「第１の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現よりも第２の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現が高い」とは、例えば、（１）第１の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現が陰性であり、第２の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現が陽性であること、（２）第１の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現量が、第２の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現量よりも少ないこと、等が挙げられる。
【００４３】
本発明において、予後の検査対象である「腫瘍疾患」とは、第１及び第２の腫瘍組織が由来する腫瘍と対応する疾患である。例えば、第１及び第２の腫瘍組織が子宮がんの組織である場合、予後の検査対象である腫瘍疾患は、子宮がんである。
【００４４】
本発明において「予後」とは、重粒子線照射後の経過を意味する。予後は、局所制御（重粒子線を照射した部位の腫瘍サイズ）、無増悪生存期間（腫瘍の増悪がない状態での生存期間）、生存期間（重粒子線照射後の全生存期間）等の観点から評価される。これらの観点のうち、患者のＱＯＬ（ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ）と直接関連することから、無増悪生存期間が重要である。本発明の検査方法によって腫瘍疾患の予後が良好であると予測された生体は、無増悪生存期間が長い傾向にある。
【００４５】
＜重粒子線照射の予後を診断するためのコンパニオン診断用組成物＞
上記のとおり、本発明者らは、重粒子線照射前後のＰＤ−Ｌ１発現の変化を指標として重粒子線照射（重粒子線治療）の予後を診断できることを見出した。かかる知見に基づき、本発明は、ＰＤ−Ｌ１を定量可能な成分を含む、重粒子線治療後の予後を診断するためのコンパニオン診断用組成物も提供する。
【００４６】
本発明において「ＰＤ−Ｌ１を定量可能な成分」とは、試料（腫瘍組織、腫瘍細胞等）中のＰＤ−Ｌ１を定量できる成分を意味する。このような成分としては、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、タンパク質、ペプチド、低分子等が挙げられる。これらのうち、試料中のＰＤ−Ｌ１を特異的に検出しやすいという観点から抗ＰＤ−Ｌ１抗体が好ましい。抗ＰＤ−Ｌ１抗体としては、上記［ＰＤ−Ｌ１発現の特定］の項で挙げたものを使用できる。
【００４７】
本発明において「重粒子線治療後の予後を診断するためのコンパニオン診断」とは、重粒子線照射前後（重粒子線治療前後）のＰＤ−Ｌ１発現の変化を指標として重粒子線治療を受けた患者の予後を把握し、重粒子線治療の継続可否や、該患者に投与しようとする医薬品の種類及び量等の決定を補助することを意味する。
【００４８】
本発明のコンパニオン診断用組成物には、ＰＤ−Ｌ１を定量可能な成分の機能を損なわない範囲で、検査用試薬等に配合される公知の成分（例えば、添加剤）を配合できる。このような成分としては、緩衝剤、安定化剤、抗菌剤等が挙げられる。各成分の種類や配合量は、得ようとする効果に応じて適宜調整される。
【００４９】
本発明のコンパニオン診断用組成物を、ＰＤ−Ｌ１を定量可能な成分の種類に応じた方法を用いて試料中のＰＤ−Ｌ１を定量することで、重粒子線照射の予後の診断に使用できる。例えば、以下の方法により、本発明のコンパニオン診断用組成物を用いて重粒子線照射の予後を診断できる。
（１）試料として重粒子線照射前の腫瘍組織、及び重粒子線照射後の腫瘍組織を準備する。
（２）本発明のコンパニオン診断用組成物を用いて各腫瘍組織中のＰＤ−Ｌ１を定量する。
（３）重粒子線照射前後の腫瘍組織中のＰＤ−Ｌ１の量を比較し、重粒子線照射前の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１量よりも重粒子線照射後の腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１量が多いことを、腫瘍疾患の予後が良好であることを指標として、重粒子線照射を受けた患者の予後を診断する。
【００５０】
本発明のコンパニオン診断用組成物の適用対象である腫瘍組織は、上記［腫瘍組織］の項で挙げたものを使用できる。
【００５１】
＜重粒子線治療の予後の診断方法＞
上記のとおり、本発明者らは、重粒子線照射前後のＰＤ−Ｌ１発現の変化を指標として重粒子線治療（重粒子線照射）の予後を診断できることを見出した。かかる知見に基づき、本発明は、重粒子線照射前後のＰＤ−Ｌ１発現の変化を指標とした、重粒子線治療の予後の診断方法も提供する。
【００５２】
本発明の診断方法において、重粒子線照射前後のＰＤ−Ｌ１発現の変化は、上記＜腫瘍疾患の予後の検査方法＞の項で挙げた手法を採用できる。
【実施例】
【００５３】
以下に、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５４】
＜試験１：重粒子線照射によるＰＤ−Ｌ１発現への影響−１＞
以下の方法で腫瘍細胞に重粒子線照射を行い、腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現の変化を検討した。比較として、重粒子線の代わりにＸ線照射を行った試験も実施した。
【００５５】
（１）腫瘍細胞へのＸ線又は重粒子線の照射
腫瘍細胞（ヒト子宮頸部腺がん細胞（ＨｅＬａ細胞））に、重粒子線（炭素イオン線）又はＸ線を、物理線量として２Ｇｙ（ＲＢＥ）から１０Ｇｙ（ＲＢＥ）の範囲の数点で照射した。重粒子線照射には重粒子線がん治療装置（日本国  放射線医学総合研究所）を用いた。Ｘ線照射にはＸ線発生装置「ＴＩＴＡＮ」（島津産機システムズ株式会社製）を用いた。
【００５６】
（２）腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現の定量
重粒子線又はＸ線を照射された腫瘍細胞の細胞表面のＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現量を定量するため、照射４８時間後、細胞と抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）とを４℃で２０分間反応させた。次いで、同条件で、上記の抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対する蛍光色素付き抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ６４７  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）とさらに反応させた。反応後、フローサイトメーター（「ＣｙｔｏＦＬＥＸ」、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて、細胞表面の蛍光量「ＭＦＩ」（ＰＤ−Ｌ１タンパク質の量に相当する）を測定した。その結果を図１に示す。図１中、ＭＦＩの値が高いほど、ＰＤ−Ｌ１発現量が多いことを意味する。
【００５７】
（３）結果
図１に示されるとおり、重粒子線（炭素イオン線）を照射された腫瘍細胞は、ＰＤ−Ｌ１発現量が増加し、その増加量はＸ線を照射した場合よりも多かった。
【００５８】
なお、本例では腫瘍細胞としてヒト子宮頸部腺がん細胞を用いたが、重粒子線（炭素イオン線）を、骨肉腫細胞、膵臓がん細胞、又は大腸がん細胞に、物理線量として５Ｇｙ（ＲＢＥ）照射した場合、照射していない場合と比較して、ＰＤ−Ｌ１発現が増加する場合があることを確認した（データは示していない）。
【００５９】
＜試験２：重粒子線照射によるＰＤ−Ｌ１発現への影響−２＞
以下の方法で、子宮頸部腺がん患者の腫瘍組織における、重粒子線（炭素イオン線）治療によるＰＤ−Ｌ１発現の変化を検討した。なお、本試験は、量子科学技術研究開発機構放射線医学総合研究所の倫理審査委員会からの承諾取得済みである。
【００６０】
（１）腫瘍組織の採取
下記クライテリア（Ａ）乃至（Ｃ）の全てに合致する、３３名の子宮頸部腺がん患者につき、以下に示す治療前後の各時点において腫瘍のバイオプシーを行い、腫瘍組織を採取した。
治療前（重粒子線照射前）：重粒子線照射開始日よりも４週間以上前
治療後（重粒子線照射後）：重粒子線１２Ｇｙ（ＲＢＥ）（１日１回３Ｇｙ（ＲＢＥ）×４回）照射後、かつ、最後の重粒子線照射日から３日以内
【００６１】
［クライテリア］
（Ａ）国際産婦人科連合の分類（２００８年度版）に基づき、組織学的にステージＩＩＢ期からＩＶＡ期に分類され、未治療である。
（Ｂ）２０歳から８５歳までの女性である。
（Ｃ）米国東海岸がん臨床試験グループの全身状態評価が０から２である。
（除外規定）なお、コンピュータ断層撮影により傍大動脈リンパ節で最小直径１センチ以上である患者、コンピュータ断層撮影により遠隔転移が疑われる患者、重篤な骨盤内感染、精神疾患、重篤な糖尿病、又は重複がんを有する患者は除外した。
【００６２】
（２）腫瘍組織の免疫染色
採取した各腫瘍組織を組織固定後にパラフィン包埋し、薄切した。薄切された標本を、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ｃｌｏｎｅ  Ｅ３Ｌ１Ｎ，  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、次いで、該抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対する病理鏡検用色素付き二次抗体と反応させた。二次抗体反応後の標本をｓｉｇｎａｌｓｔａｉｎ  ＤＡＢ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で染色することによりＰＤ−Ｌ１を染色し、顕微鏡観察により、以下の基準に従ってＰＤ−Ｌ１発現の有無（陽陰性）を判定した。図２に、得られた結果のうち、２名の患者の腫瘍組織についての結果を示す。
【００６３】
［ＰＤ−Ｌ１発現の判定基準］
陽性：細胞表面に染色が確認された細胞数が１％以上である。
陰性：細胞表面に染色が確認された細胞数が１％未満である。
【００６４】
図２中、（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ、患者１の治療前及び治療後の結果であり、（Ｃ）及び（Ｄ）は、それぞれ、患者２の治療前及び治療後の結果である。
【００６５】
患者１は、重粒子線治療前はＰＤ−Ｌ１発現が陽性であったが、治療後は陰性となった。患者２は、重粒子線治療前はＰＤ−Ｌ１発現が陰性であったが、治療後は陽性となった。その他の患者についても重粒子線治療前後（重粒子線照射前後）のＰＤ−Ｌ１発現動態は一様ではなかった。
【００６６】
＜試験３：ＰＤ−Ｌ１発現動態による腫瘍疾患の予後への影響＞
上記試験２で得られた結果を踏まえて、重粒子線照射によるＰＤ−Ｌ１発現動態の違いが、腫瘍疾患の予後にもたらす影響を以下で検討した。
【００６７】
（１）患者のグループ分け
試験２と同様のクライテリアに全て合致する３２名の子宮頸部腺がん患者を以下の３つのグループにわけた。なお、本例では、「重粒子線照射前はＰＤ−Ｌ１発現が陽性であったが、照射後は陰性である患者」は数が少ないため、データから割愛した。
グループ１：重粒子線照射前後のいずれもＰＤ−Ｌ１発現が陽性である。
グループ２：重粒子線照射前はＰＤ−Ｌ１発現が陰性であったが、照射後は陽性である。
グループ３：重粒子線照射前後のいずれもＰＤ−Ｌ１発現が陰性である。
【００６８】
（２）患者の予後の評価
各グループの患者の予後を、以下の３観点から評価した。その結果を図３に示す。
局所制御（Ｌｏｃａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）：重粒子線を照射した部位の腫瘍サイズ
無増悪生存期間（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）：腫瘍の増悪がない状態での生存期間
生存期間（Ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）：重粒子線照射後の全生存期間
【００６９】
図３中、「（Ａ）局所制御」において、「Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ」の値が小さいほど、腫瘍サイズが大きくなったことを意味する。「（Ｂ）無増悪生存期間」において、「Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ」の値が小さいほど、無増悪生存期間が短かったことを意味する。「（Ｃ）生存期間」において、「Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ」の値が小さいほど、生存期間が短かったことを意味する。これらの観点のうち、無増悪生存期間が長いことは、患者の良好な予後の指標として特に重要である。
【００７０】
図３に示されるとおり、重粒子線照射後のＰＤ−Ｌ１発現が陽性であるグループ１及び２は、無増悪生存期間が比較的長く、腫瘍疾患の予後が良好である傾向にあった。
【００７１】
グループ１乃至３の患者を、重粒子線照射後のＰＤ−Ｌ１発現が陽性であるかどうかという観点で区分けし、図３の結果を書き換えたものを図４に示す。この図から、重粒子線照射後のＰＤ−Ｌ１発現が陽性であれば、無増悪生存期間が長く、予後が良好である傾向にあることが明確に理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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