(57)【要約】【解決手段】金属種の細胞障害性を調節できる材料として、機能性金属種材料と、前記機能性金属種材料に選択的に結合するペプチドと、を備えるようにする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性金属種材料と、
前記機能性金属種材料に選択的に結合するペプチドと、
を備える、機能性が改変された材料。
【請求項２】
前記ペプチドは、前記機能性金属種材料に対してファージディスプレイシステムを用いたランダムペプチドライブラリからスクリーニングされたペプチドである、請求項１に記載の材料。
【請求項３】
前記機能性金属種材料は、抗菌性材料である、請求項１又は２に記載の材料。
【請求項４】
前記機能性金属種材料は、酸化銅を主体とする材料である、請求項１〜３のいずれかに記載の材料。
【請求項５】
前記機能性金属種材料は、粒子材料である、請求項１〜４のいずれかに記載の材料。
【請求項６】
前記粒子材料は、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる程度の粒子サイズを有する、請求項５に記載の材料。
【請求項７】
前記機能性金属種材料は、酸化銅を主体とする材料であり、前記ペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＡＴＰＦＳＰＱＶ）を備える、請求項１〜６のいずれかに記載の材料。
【請求項８】
前記ペプチドは、環状体である、請求項７に記載の材料。
【請求項９】
配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＡＴＰＦＳＰＱＶ）を備えるペプチドを含む、酸化銅結合剤。
【請求項１０】
前記ペプチドは環状体である、請求項９に記載の酸化銅結合剤。
【請求項１１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＡＴＰＦＳＰＱＶ）を備えるペプチドを含む、酸化銅の細胞障害性抑制剤。
【請求項１２】
酸化銅を含む材料と、配列番号１で表されるアミノ酸配列を備えるペプチドと、を備える、抗菌剤剤。
【請求項１３】
請求項１２に記載の抗菌剤を、微生物による汚染可能性のある被汚染表面に備える、抗菌化デバイス。
【請求項１４】
請求項１２に記載の抗菌剤を、微生物による汚染可能性のある被汚染表面に供給する工程、を備える、抗菌方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、金属種結合性ペプチド及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
金属自体、その酸化物又はイオンなどと特異的に相互作用して、複合化粒子を形成するペプチドが報告されている（特許文献１〜３）。こうしたペプチドは、その作用は必ずしも明らかではないが、特定範囲の金属種（金属、無機金属化合物又はイオン）と相互作用して、金属種を検出したり回収したりすることが知られている。
【０００３】
一方、金属ナノ粒子をペプチドでコーティングすることにより、ランタノイド金属種の粒子のオートファジー活性を変化させることが報告されている（非特許文献１）。さらに、ペプチドによるナノ粒子のコーティングにより、例えば、水不溶性薬剤のドラッグデリバリー性の向上や、薬剤の安定化が可能であることが報告されている（特許文献４〜６）。
【０００４】
また、銀、白金、酸化銅（ＣｕＯ）などのナノ粒子が、抗菌剤として知られている。また、酸化亜鉛（ＺｎＯ）などのナノ粒子には、細胞毒性が報告されている（非特許文献２）。金属種ナノ粒子は、細胞内において活性酸素を発生させ、ＤＮＡ断片化、タンパク質不活性化等を介して細胞死を促進すると考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表2013-531618号公報
【特許文献２】特開2015-40208号公報
【特許文献３】特開2015-82985号公報
【特許文献４】国際公開第１９９８／０１４１７４号
【特許文献５】国大公開第２００３／０６６０２１号
【特許文献６】特開２０１０−１８６０４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nature Materials 11, 817-826(2012)
【非特許文献２】Mateirals 2012, 5, 2850-2871
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
例えば、酸化銅や酸化亜鉛などの金属は、銀やプラチナに比較してコスト的にも有利であるが、抗菌性がある反面、アレルギーや健常細胞に対する細胞毒性など細胞障害性を呈する可能性もある。また、こうした金属種やその粒子による抗菌性作用が生じる理由は必ずしも明らかではないことから、その細胞障害性をどのようにして低減するかも判明していないのが現状である。
【０００８】
本明細書は、金属種の細胞障害性を調節できる材料を提供する。また、かかる材料を利用した複合材料も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、金属種の結合性を有するペプチドに着目した。そして、酸化銅に結合するペプチドを探索した結果、かかるペプチドと酸化銅粒子とを複合化すると、酸化銅粒子の抗菌性が低下する現象を見出した。金属種ナノ粒子による抗菌性などの機能が、変化することは、本発明者らといえども予測できない事象であった。本明細書は、かかる知見に基づき以下の手段を提供する。
【００１０】
［１］機能性金属種材料と、
前記機能性金属種材料に選択的に結合するペプチドと、
を備える、機能性が改変された材料。
［２］前記ペプチドは、前記機能性金属種材料に対してファージディスプレイシステムを用いたランダムペプチドライブラリからスクリーニングされたペプチドである、［１］に記載の材料。
［３］前記機能性金属種材料は、抗菌性材料である、［１］又は［２］に記載の材料。
［４］前記機能性金属種材料は、酸化銅を主体とする材料である、［１］〜［３］のいずれかに記載の材料。
［５］前記機能性金属種材料は、粒子材料である、［１］〜［４］のいずれかに記載の材料。
［６］前記粒子材料は、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる程度の粒子サイズを有する、［５］に記載の材料。
［７］前記機能性金属種材料は、酸化銅を主体とする材料であり、前記ペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＡＴＰＦＳＰＱＶ）を備える、［１］〜［６］のいずれかに記載の材料。
［８］前記ペプチドは、環状体である、［７］に記載の材料。
［９］配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＡＴＰＦＳＰＱＶ）を備えるペプチドを含む、酸化銅結合剤。
［１０］前記ペプチドは環状体である、［９］に記載の酸化銅結合剤。
［１１］配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＡＴＰＦＳＰＱＶ）を備えるペプチドを含む、酸化銅の細胞障害性抑制剤。
［１２］酸化銅を含む材料と、配列番号１で表されるアミノ酸配列を備えるペプチドと、を備える、抗菌剤。
［１３］［１２］に記載の抗菌剤を、微生物による汚染可能性のある被汚染表面に備えて、抗菌化された製品。
［１４］［１２］に記載の抗菌剤を、微生物による汚染可能性のある被汚染表面に供給する工程、を備える、抗菌方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】バイオパニングよりクローニングされたファージクローンと酸化銅（ＣｕＯ）粒子との結合性を示す図である。
【図２】ファージ表面に提示されたペプチドのアミノ酸配列に基づいて化学合成して得たＣｕＯ結合性ペプチドとＣｕＯ粒子との結合性をＥＬＩＳＡによって評価した結果を示す図である。
【図３】ペプチドコーティングＣｕＯ粒子のＳＥＭ及びＥＤＸによる観察結果を示す図であり、（ａ）〜（ｄ）は、ＣｕＢＰ１コーティングＣｕＯ粒子に関し、（ｅ）〜（ｈ）は、ＣｕＯ粒子に関する。（ａ）及び（ｄ）は、ＳＥＭ観察結果を示し、（ｂ）及び（ｆ）は、ＥＤＸによる酸素原子のマッピング結果を示し、（ｃ）及び（ｇ）は窒素原子のマッピング結果を示し、（ｄ）及び（ｈ）は硫黄原子のマッピング結果をそれぞれ示す。
【図４】ＣｕＢＰ１、ＣｕＯ及びＣｕＢＰ１コーティングＣｕＯの大腸菌における抗菌評価結果を示す図である。
【図５】種々の大腸菌における抗菌評価結果（その２）を示す図である。
【図６】大腸菌以外の微生物に対する抗菌評価結果を示す図である。
【図７】ＣｕＢＰ１コーティングＣｕＯ粒子とＣｕＯ粒子との粒子径の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書の開示は、金属種材料に選択的に結合するペプチドが、前記金属種材料の機能性を変化させるという知見に基づいている。かかる金属種材料特異的結合ペプチドによる金属種材料が有する機能性の変化は、単に、表面にペプチドが選択的に結合するという現象からは予測することは困難である。例えば、本来的に抗菌性を発揮する金属種材料の表面にペプチドが結合したことで、金属種材料が防除すべき微生物に対する抗菌性が低下することを予測することはできない。ペプチドは、本来的に細胞表面に存在するものであり、単に、金属種材料の表面にペプチドが結合して非共有結合相互作用で結合している場合において、金属種材料固有の機能性が提供するとは当業者といえども考えにくいからである。
【００１３】
本発明者らは、酸化銅に対して特異的に結合することを見出したペプチドが、酸化銅表面に非共有結合相互作用で結合させたとき、酸化銅の抗菌性が低下することを見出したが、金属種材料の機能性とそれに非共有結合相互作用で特異的に結合するペプチドによる作用は、これに限定されない。
【００１４】
例えば、酸化銅による抗菌性は、銅イオンの溶出や粒子の大きな等と推測されている。本発明者らが、Ｔ７ファージディスプレイシステムなどのファージディスプレイシステムを用いたランダムペプチドライブラリから金属種に対する結合性に基づいてスクリーニングしたペプチドは、多様な金属種、すなわち、金属単体と結合するほか、金属イオンと結合して無機金属化合物粒子を生成することを報告している（特許文献１等）。したがって、金属種材料と特異的結合性を有するペプチドは、金属イオンへの結合性も有しているといえる。したがって、こうしたペプチドは、銅イオンの溶出抑制に貢献している考えられる。また、金属種材料のみでは生じにくいペプチドの疎水性等に基づく凝集性によって金属種材料のサイズが増大していると考えられる。
【００１５】
一方、金属種材料とペプチドとの複合化は、金属種材料を保護する作用もある。すなわち、金属種材料が本来的に有する機能性を長期にわたって発揮させることも可能である。
【００１６】
以上のことから、金属種材料特異的結合ペプチドは、その特異的結合対象である金属種材料の機能性を調節できるペプチドであるといえる。
【００１７】
以下、本明細書に開示する機能改変材料、酸化銅結合剤、細胞障害性抑制剤、抗菌剤、抗菌製品及び抗菌方法について詳細に説明する。
【００１８】
本明細書において、金属種とは、金属、合金、金属イオン及び金属無機化合物を含んでいる。金属としては、リチウム（Ｌｉ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、ルビジウム（Ｒｂ）、セシウム（Ｃｓ）などのアルカリ金属、カルシウム（Ｃａ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、バリウム（Ｂａ）及びラジウム（Ｒａ）であるアルカリ土類金属、ベリリウム（Ｂｅ）、マグネシウム（Ｍｇ）、亜鉛（Ｚｎ）、カドミウム（Ｃｄ）、水銀（Ｈｇ）であるマグネシウム族元素、スカンジウム（Ｓｃ）、イットリウム（Ｙ）、ランタン（Ｌａ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ネオジム（Ｎｄ）などのランタノイド系などの希土類元素、アルミニウム（Ａｌ）、ガリウム（Ｇａ）及びインジウム（Ｉｎ）、タリウム（Ｔｌ）などのアルミニウム族元素、チタン（Ｔｉ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、スズ（Ｓｎ）、ハフニウム（Ｈｆ）、鉛（Ｐｂ）などのスズ族元素、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）及びニッケル（Ｎｉ）である鉄族元素、バナジウム（Ｖ）、ニオブ（Ｎｂ）及びタンタル（Ｔａ）などの土酸金属、クロム（Ｃｒ）、モリブデン（Ｍｏ）及びタングステン（Ｗ）などのクロム族元素、マンガン（Ｍｎ）、テクネチウム、レニウム（Ｒｅ）のマンガン族元素、銅（Ｃｕ）、銀（Ａｇ）及び金（Ａｕ）などの貴金属、ほか、水銀（Ｈｇ）、ルテニウム（Ｒｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）が挙げられる。
【００１９】
本明細書において、金属イオンとは、金属元素に関し可能性ある酸化数の価数のイオンの状態も含まれる。
【００２０】
本明細書において、金属無機化合物とは、金属元素に関し可能性ある酸化数での酸化物、水酸化物、無機酸塩及び有機酸塩を含んでいる。
【００２１】
（機能改変材料）
本明細書に開示される機能性金属種材料は、機能性金属種材料と、前記機能性金属種材料に選択的に結合するペプチドと、を備えることができる。
【００２２】
（機能性金属種材料）
本材料における機能性金属種材料は特に限定されない。金属種材料には、種々の機能性が見出されている。例えば、酸化銅（ＣｕＯ）についての抗菌性や細胞障害性、ＺｎＯについての細胞毒性等、酸化ネオジムについてのオートファジー、酸化銅、銀や白金による抗菌性等が挙げられる。例えば、金属種材料が抗菌性材料の場合、銀、白金、酸化銅等が挙げられる。なお、ここで、機能性とは、用途に直接関連するものでなく、金属種材料に基づく化学的又は生物的特徴を含む特徴であればよい。
【００２３】
機能性金属種材料は、金属種を含んでいれば足りる。機能性やその機能性に基づく用途に応じて、例えば、金属種を材料の質量の例えば５０％以上、また例えば５０％超（主体として含むともいう。）、また例えば６０％以上、また例えば７０％以上、また例えば８０％以上、また例えば９０％以上、また例えばさらに含んでいてもよい。
【００２４】
機能性金属種材料の形態は特に限定されない。例えば、シート状体、フィルム状体、それ自体なんらかの意図的な三次元形状を備えていてもよいほか、不定形状、薄片状、粒子状、針状等の形態を採ることができる。また、機能性金属種材料は、別に準備された所望の形状の基材の表面に付与された金属種材料層又は金属種材料の凹部や凸部などの独立した３次元物体であってもよい。例えば、基材の表面上の金属元素を含む層は、例えば、溶射、メッキ他、公知の種々の方法で得ることができる、また、基材の表面に形成された金属元素を含む凹部は、金属元素を含む層状体に層状の基材を重ねた上で、基材表面から層体に向かってエッチングなどで欠損を形成することで、金属元素を含む層状体を露出させることで得ることができる。
【００２５】
金属種材料に特異的に結合するペプチドとの相互作用等を考慮すると、金属種材料は、粒子状の材料であることが好ましい。
【００２６】
また、例えば、金属種材料が抗菌性材料である場合、平滑ないし適度な粗さの表面を有する形態、粒子状である場合など、種々の形態で抗菌性を発揮できることについては当業者において周知である。金属種材料が抗菌性粒子の場合、エンドサイトーシスにより真核細胞内に取り込まれる程度の大きさを有していることが有利な場合がある。かかる場合、例えば、当該粒子径は、例えば１０ｎｍ〜１００μｍの範囲にあるか、あるいは、平均粒子径が１０ｎｍ〜１００ｎｍであるとすることができる。粒子状の金属種材料の粒子径は、例えば、レーザー回折散乱法などにより測定することができる。
【００２７】
(機能性金属種材料に特異的に結合するペプチド)
金属種材料に結合するペプチドとは、共有結合以外の相互作用により、ペプチドと金属種材料とが複合できる程度の結合状態を意味する。典型的には、液性媒体中において、本ペプチドと、例えば粒子状の金属種材料とが結合し、複合粒子として分離できる程度の結合状態が挙げられる。概して、こうした相互作用は、静電的結合、イオン結合、水素結合等が挙げられるが、本明細書における「結合」は、これらに限定されるものではない。
【００２８】
また、金属種材料に特異的に結合するペプチドとは、単一の金属元素に由来する金属種にのみに特異的に結合するペプチドことを意味するものではなく、複数の金属元素に由来する金属種に特異的に結合するペプチドであってもよい。
【００２９】
金属種材料に特異的に結合するペプチドは、例えば、金属種材料の粒子に対するＴ７ファージディスプレイシステムを用いたランダムペプチドライブラリから、粒子とファージとのアフィニティーに基づいてスクリーニングする方法により得ることができる。かかる方法は、いずれも出願人による、特開２０１６−８８８４６号公報、特開平２０１６−１１７６３号公報、特開２０１６−１１７６６４号公報、特開２０１７−２２２６１４号公報、特表２０１７−５１２２４９号公報において既に開示されている。
【００３０】
この方法は、ファージ表面にランダムなアミノ酸配列のペプチドを提示させたランダムペプチドライブラリを作製し、このライブラリと特定金属種材料（典型的には粒子を用いる）とを接触させて相互作用させたのち、材料と複合化できたペプチドを、未結合のファージと分離して、材料と結合したファージを濃縮する。なお、スクリーニングに用いる金属種材料は、例えば、濃縮等を考慮すると、金属元素単体粒子や金属元素の無機化合物粒子が好適である。
【００３１】
次いで、濃縮されたファージをさらに大腸菌に感染させて増殖し、再び、特定金属種粒子との結合性に基づいて濃縮することを繰り返す。最終的に、粒子と結合性の高いファージをクローニングし、DNA等を解析して、提示しているペプチドのアミノ酸配列を特定することができる。かかるシステムとしては、商業的に入手可能であり、特に限定するものではないが、例えば、Ｔ７ファージディスプレイシステム（Novagen）などを用いることができる。
【００３２】
かかるペプチドは、その長さは特に限定するものではないが、例えば、４個以上２０個以下のアミノ酸残基、また例えば、４個以上１４個以下、また例えば、４個以上１２個以下のアミノ酸配残基を有することができる。また、構成アミノ酸残基も特に限定するものではないが、一般的には生合成される２０種類のアミノ酸残基から選択されるものである。
【００３３】
本ペプチドは、Ｌ体のアミノ酸残基のポリマーであることが好ましいが、Ｄ体ポリマーであることを排除するものではない。
【００３４】
また、金属種材料に特異的に結合するペプチドは、直鎖状であってもよいし環状体であってもよい。環状体の場合、環化には種々の方法があるが、例えば、配列番号１で表されるような特異的結合性を示すアミノ酸配列の両末端に少なくともシステイン（あるいはより末端側にセリンを備えるようにしてもよい。）を導入し、２つのシステイン間のジスルフィド結合を用いることができる。ジスルフィド結合は、ヨウ素や過酸化水素などの酸化剤の存在下において生じさせることができ、ペプチドを環状化することができる。
【００３５】
例えば、本発明者らは、酸化銅（ＣｕＯ）粒子を標的粒子としてＴ７ファージディスプレイシステムを用いたスクリーニングによって、配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＡＴＰＦＳＰＱＶ）を有するペプチドが得られている。このペプチドは、ファージ状には、Ｎ末及びＣ末の両末端にそれぞれ、ＳＣ−及び−ＣＳが付加されたアミノ酸配列（ＳＣＡＴＰＦＳＰＱＶＣＳ）からなるペプチドとして、末端の２個のシステイン（Ｃ）がジスルフィド結合により架橋し環状化した状態で提示されている。この提示状態はライブラリ中の全てのペプチドに共通であるため、末端のＳＣ及びＣＳは、酸化銅（ＣｕＯ）に対する特異的結合性には関連しないものである。配列番号１で表されるアミノ酸配列が、酸化銅（ＣｕＯ）（粒子）に特異的に結合するペプチドが有するべきアミノ酸配列であると考えられる。
【００３６】
こうしたペプチドは、公知の化学合成法のほか、遺伝子工学的な方法等、当業者において周知の方法により取得することができる。
【００３７】
また、ペプチドは、標識物質を備えていてもよい。標識物質を備えていることにより、金属種材料と結合した本ペプチドを識別できるようになり、金属種材料との複合状態を確認できることになるため都合がよい。標識としては特に限定しないで公知の各種標識物質を用いることができる。標識物質は、目視にて識別可能なものであってもよいし、所定の波長の光によって発光等するものであってもよい。また、それ自体、着色しているもののほか、他の化合物との反応等により発色可能なものであってもよい。また、標識物質はビーズ等の担体に保持されていてもよい。こうした標識物質としては、たとえば、着色ビーズ、金コロイド、蛍光化合物、酵素タンパク質が挙げられる。また、標識物質には、抗体−抗体反応を利用したもの、ビオチン−アビジン結合を利用したものなどの標識結合物質を包含する。標識結合物質は、標識物質を結合する物質であり、こうした標識結合物質も標識物質として機能できる。
【００３８】
なお、標識物質は、公知の方法で結合される。典型的には、本ペプチドに対して適数個のリンカーペプチドを介して本ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に付与される。さらに、ペプチドは、アフィニティークロマトグラフィー等を用いて回収可能なように、タグを備えていてもよい。タグは、抗原（エピトープ）等であってもよいし、公知のHisタグのほか、ビオチン等を用いることができる。こうしたタグは適当なリンカーを介して結合されていてもよい。
【００３９】
本材料は、金属種材料とそれに特異的に結合するペプチドとを、生理的条件下で接触させることで、容易に相互作用し結合して、金属種材料のペプチドと接触可能な表面に、ペプチドが結合する形態で複合化したコンポジットを構成できる。金属種材料に対するペプチドの接触形態は、例えば、金属種材料に対するペプチド含有液体の種々の形態の塗布又はコーティング、同液体への金属種材料の添加、浸漬、混合等の形態が挙げられる。また、こうした金属種材料とペプチドとの複合形態は、例えば、種々の形状の金属種材料への被覆、コート、含浸又は付着（スポッティング）が挙げられる。例えば、金属種材料の平坦なあるいは曲面を含む表面に対して所望のパターンでペプチドを複合化することもできる。さらにまた、例えば、金属種材料への分散等の形態を採ることができる。
【００４０】
金属種材料とペプチドとの複合化のための液体媒体としては、用いるペプチドが金属種材料結合能を発揮できる限り、いかなる液体媒体であってもよい。液性媒体は、水性媒体であっても有機溶媒であってもよく、これらの混合媒体であってもよい。典型的には、中性付近のバッファ等やそれらを含む混液等用いることができる。例えば、ｐＨは、特に限定されないが、５以上８以下程度とすることができ、塩濃度も特に限定されないが、１０ｍＭ以上１Ｍ以下とすることができる。温度も、特に限定されないで、温度制御なくて容易に結合を実現できるが、典型的には、４℃以上８０℃以下、より好ましくは１０℃以上４０℃以下とすることができ、さらに好ましくは１５℃以上３０℃以下とすることができる。また、両者の接触のための時間は、特に限定しないが、１０分程度から数時間程度とすることができ、好ましくは３０分以上８時間以下とすることができ、上限時間はより好ましくは６時間以下、さらに好ましくは４時間以下程度とすることができる。また、より好ましくは１時間以上３時間以下程度とすることができる。
【００４１】
また、ペプチドの金属種材料結合能を発揮させるための液体媒体中の本ペプチド濃度及び金属種材料濃度も特に限定されないが、例えば、本ペプチドが２０ｎＭ以上の濃度であることが好ましく、金属種材料濃度が１００μＭ以上であることが好ましい。
【００４２】
金属種材料とペプチドとを複合化後、用いた液性媒体を乾燥等により除去することもできる。特異的に結合したペプチドは、液体媒体除去後においても、一定の相互作用により金属種材料と複合化している。
【００４３】
なお、本明細書は、上記したペプチドをコードするDNAなどのポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドを含むベクター、こうしたポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞も提供される。アミノ酸配列が特定されたペプチドをコードするDNA等の取得や発現用ベクターの構築は、当該分野において周知の手法によって当業者であれば容易に実施できる。タンパク質の発現のためのベクターは、ペプチドを発現させるための宿主細胞の種類に応じてその要素が選択される。
【００４４】
機能性金属種材料と当該金属種材料に特異的に結合するペプチドとの複合材料が、金属種材料の本来の機能性を変化させることは、例えば、無機金属化合物である酸化銅（ＣｕＯ）に結合性を有するペプチドは、銅イオンとも特異的結合性を有しており、そのため、銅イオンの溶出を抑制することから、機能性を変化させることができると考えられる。また、ペプチドとの複合化により、本来的には凝集しにくい金属種材料を凝集化でき、粒子サイズを増大させてその機能性を変化させることができると考えられる。
【００４５】
例えば、金属種材料の抗菌性を、ペプチドとの特異的結合により低減する場合には、本材料は、細胞障害性やアレルギーなどの炎症反応が抑制された静菌性を発揮することができると考えられる。すなわち、細胞障害を惹起しないことは、本来的な組織の免疫反応を過剰に刺激しないことが期待される。同時に、ペプチドによる複合化は、金属種材料自体の外部から保護する働きもある。このため、抑制された抗菌性をより長く発揮できると考えられる。
【００４６】
以上のことから、本複合材料は、金属種材料が本来的に有する機能性が変化した材料となっている。
【００４７】
（酸化銅（ＣｕＯ）結合剤等）
本明細書によれば、配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＡＴＰＦＳＰＱＶ）を有するペプチドを含む酸化銅結合剤が提供される。また、このペプチドを含む、銅又は銅イオン結合剤も提供される。さらにまた、このペプチドの結合性を利用して、酸化銅（ＣｕＯ）などの銅無機化合物、銅及び銅イオンを回収し、検出することができる。なお、特に、銅イオンなどの金属元素イオンを無機化できる活性をミネラリゼーション活性という。したがって、本明細書によれば、このペプチドを用いた、銅無機化合物、銅及び銅イオンを回収し、検出する方法のほか、このペプチドを含む、これら金属種の回収剤及び検出剤も提供される。
【００４８】
（細胞障害性抑制剤）
本明細書によれば、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む細胞障害性抑制剤も提供される。かかるペプチドは、酸化銅（ＣｕＯ）の抗菌性を減弱するほか、そのアレルギー反応や細胞障害性を抑制することができる。
【００４９】
（抗菌剤及び抗菌化デバイス）
本明細書によれば、酸化銅（ＣｕＯ）を含む材料と、配列番号１で表されるアミノ酸配列を備えるペプチドと、を備える抗菌剤提供される。酸化銅に（ＣｕＯ）特異的に結合するペプチドは、酸化銅（ＣｕＯ）から溶出する銅イオンを捕捉し、また、酸化銅（ＣｕＯ）を凝集させることで、酸化銅（ＣｕＯ）の抗菌性を減弱しつつ作用することができる。かかる抗菌剤は、抗菌性が減弱されていることにより、細胞障害性が低減されている。したがって、細胞障害性、アレルギー反応性を低減するという観点で、抗菌性を調節すべき場合において有用である。
【００５０】
例えば、かかる抗菌剤を、ヒトなどの動物に投与した場合、意図しないアレルギー反応や細胞障害性を回避して、減弱されているものの所望の特性の抗菌性を作用させることができる。
【００５１】
かかる抗菌剤は、抗菌性を有する金属種材料、例えば、銀、白金、酸化銅（ＣｕＯ）を含む材料とこれらの金属種に特異的に結合するペプチドとを複合化することにより、得ることができる。複合化については、既に述べた通りである。
【００５２】
本明細書によれば、こうした抗菌剤を、微生物等による汚染可能性のある被汚染表面に備える、抗菌化デバイスが提供される。この抗菌化デバイスによれば、例えば、ヒトなどの生体内に留置されたり挿入された場合において、意図しないアレルギー反応や細胞障害性を回避して、減弱されているものの所望の特定の抗菌性を留置部位において作用させることができる。例えば、カテーテル等、生体内に留置、挿入する医療デバイスは、抗菌性が求められるが、一方で細胞障害性も抑制されるべきである。本明細書に開示される抗菌剤をデバイスの被汚染表面に備えることで、細胞障害性やアレルギー反応を抑制し、調節された抗菌性を発揮して、留置部位を微生物等による感染から保護することができる。
【００５３】
デバイスの被汚染表面に対する抗菌剤の適用は、例えば、種々のコーティング、ディッピング、スポッティング等などの公知の技術により可能である。例えば、抗菌剤を含む液性媒体を、デバイス表面に供給して乾燥させるなどして、デバイス表面を修飾できる。
【００５４】
かかる抗菌剤は、デバイスの一部においてのみ供給され、別の部位においては、例えば、抗菌剤としての金属種材料のみが供給されていてもよい。こうすることで、デバイスの部位ごとに容易に抗菌性を変化させることができる。
【００５５】
（抗菌方法）
本明細書によれば、こうした抗菌剤を、デバイスの微生物による汚染可能性のある被汚染表面に供給する工程、を備える、抗菌方法も提供される。この抗菌方法によれば、デバイスの被汚染表面に調節された抗菌性を提供することができる。デバイスに対する抗菌剤の供給等は、既に述べたとおりである。
【実施例】
【００５６】
以下、本明細書の開示を実施例を挙げて具体的に説明する。なお、以下の実施例は、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００５７】
（ランダムペプチド提示型T7ファージライブラリの構築）
２種類のオリゴヌクレオチドプライマーT7-Libup（ATG ATT ACC AGG ATC CGA ATT CAG GTG GAG GTT CG、配列番号２）、T7-Libdown（ACT ATC GTC GGC CGC AAG CTT TTA GCT、配列番号３）を用いて、PCR反応を行い、テンプレートDNA（CGA ATT CAG GTG GAG GTT CGT GT（配列番号４）(NNK)9-12 TGT AGC TAA AAG CTT GCG GCC GA、配列番号５）を増幅した。N＝A２５％、T２５％、G２５％、C２５％（A/T/G/Cの等量混合塩基）
K＝A０％、T５０％、G５０％、C０％の混合塩基
【００５８】
増幅したDNA断片は、一般的なプロトコールに従ってフェノール処理、ブタノール濃縮を行った後、QIAquick PCR Purificationkit（QIAGEN）を用いて精製した。精製したDNAは、制限酵素Hind III、Eco RI（タカラバイオ）で処理した後、T7 select 10-3 vector arm(Novagen)にライゲーションし、T7ファージゲノムを構築した。
【００５９】
構築したファージゲノムを、T7select packaging溶液（Novagen）と混合することで、ランダムペプチド遺伝子導入型のT7ゲノムDNAを有するT7ファージを構築した。この際、一部を用いて構築されたファージ集団の数を計測したところ、１．０×１０6〜４．０×１０7の配列多様性を有するファージライブラリが構築されていることを確認した。
【００６０】
構築したファージ集団は、OD660nm＝０．６〜１．０まで培養した大腸菌E.coli BLT5403株に感染させ増幅後、８％ポリエチレングリコール、０．２２μｍフィルター処理を行うことで濃縮・精製した。精製後にファージ数を計測した結果、各ライブラリは約１．０×１０12pfu／mlのファージを有しており、ペプチドファージ１種あたり１００，０００〜１，０００，０００倍に増幅していることを確認した。
【実施例２】
【００６１】
（ランダムペプチド提示型T7ファージライブラリを用いたＣｕＯ粒子に対するバイオパンニング）
実施例１にて作製したランダムペプチド提示型T7ファージライブラリにより、酸化銅（ＣｕＯ）に結合するペプチドを提示するT7ファージの単離を試みた。
【００６２】
洗浄した酸化銅（ＣｕＯ）粒子に、構築したファージライブラリを混合し、室温にて振とうした。１時間後、遠心分離（６０００ｒｐｍ、３分）により粒子を沈殿させ上清を除去した。沈降した酸化銅粒子を洗浄後液（ＴＢＳＴバッファ）を加えて懸濁し、再び、遠心分離・上清除去を繰り返すことで洗浄して、非特異的に結合しているファージを除去した。洗浄後の粒子は、OD660nm ＝０．６〜１．０まで培養した大腸菌E.coli BLT 5403溶液１０ｍｌと混合し、大腸菌が完全に溶菌するまで３７℃で培養を行った。溶菌後、Novagenのプロトコールに従い、ファージを濃縮・精製した。
【００６３】
バイオパンニング４ラウンド後のファージプールから、単クローン化を行い、その中から、ランダムに単離した８０クローンについて、DNA配列を解読し、提示ペプチドのアミノ酸配列を調べた。その結果、８０クローン中、７８クローンが同じアミノ酸配列（ＳＣＡＴＰＦＳＰＱＶＣＳ）（配列番号６）を提示したファージであった。DNA配列解析に基づくアミノ酸配列を表１に示す。異なるペプチドが２クローン存在したが、いずれも、中央部分に終止コドンを有していた。
【００６４】
【表１】
2020062356.tif 000002
【００６５】
候補となる７８クローンの中から、ランダムに３クローン（１Ａ、４Ｇ及び８Ｅ）を選抜後、これらを再培養後、酸化銅粒子に対する結合性を再度評価した。なお、比較対象として、クローン６Ｅ、１０とし、ネガティブコントロールとして、ファージを添加していない試験系（ペプチドなし）を準備した。独立した３回の結合性試験の結果を図１に示す。
【００６６】
図１に示すように、選抜した３個のクローンは、コントロールと比較していずれも酸化銅粒子に対する高い結合性を示した。本結果から、この３個のクローンは、ファージ上に提示されたペプチドを介して、酸化銅粒子表面に結合していると考えられた。選抜クローンに共通して提示されたペプチドをＣｕＢＰ１（ＣｕＯ Binding Peptide）と命名した。
【実施例３】
【００６７】
（ペプチドの化学合成とＣｕＯ粒子結合の再評価）
ＣｕＯ粒子への再結合が確認された選抜クローン（１Ａ、４Ｇ、８Ｅ）が提示するペプチドＣｕＢＰ１について、合成ペプチドを調製した。ペプチド合成は、9-fluoromethyloxycarbonyl（Fmoc）基を用いた固相合成法にて行った。Ｎ末端は、Ｔ７ファージｇ１０配列由来のGly−Gly−Gly−Serを介してBiotin化処理した。
【００６８】
合成したＣｕＢＰ１を逆相クロマトグラフィー及び液体クロマトグラフィー質量分析にて評価した結果、目的とするＣｕＢＰ１が９９．０％以上の純度で合成できていることを確認した。
【００６９】
本合成ペプチドについて、ＥＬＩＳＡ法にてＣｕＯ粒子への結合評価を行った。合成ペプチド（終濃度１０μＭ）とのＣｕＯ粒子（５００μｇ）と混合し、室温で１時間振とう後、遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分）によって、ＣｕＯ粒子を沈降させ、上清を除去した。洗浄操作を１０回繰り返した後、ＴＢＳＴバッファ（５０ｍＭＮａＣｌ、０．５％Tween、ｐＨ７．４）に再懸濁した。本溶液にストレプトアビジンホ−スラディッシュパーオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）コンジュゲート（Invitogen）を加え、室温で反応後、洗浄操作を行いＣｕＯ粒子と３’，３’，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、和光純薬工業）を混合した。発色を確認した後、１ＮＨＣｌを添加して反応を停止させ、マイクロプレートリーダーSpectra Max Plus 384（Molecular Devices）にて、４５０ｎｍの
吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡの結果を、図２に示す。
【００７０】
なお、本試験のコントロールとして、酸化銅（Ｉ）：Ｃｕ2Ｏに対する結合が確認されているペプチドＣＮ８６を、参考文献をもとに選出した（Thai,C.K. et al.,  Biotheconology and Bioengeneering, Vol. 87, p.129-137, 2004）。本ペプチドについても、上記と同様の手法で、ペプチド合成を実施した。合成した両ペプチドのアミノ酸配列（配列番号６、７）を以下の表に示す。
【００７１】
【表２】
2020062356.tif 000003
【００７２】
図２に示すように、ＣｕＢＰ１は、ファージ表面上に提示された場合と同様、ＣｕＯ粒子への結合が再確認できた。これに対して、公知のペプチドであるＣＮ８６は、ＣｕＯ粒子への結合が認められなかった。
【実施例４】
【００７３】
（ペプチドコーティングＣｕＯ粒子の調製）
（ＣｕＯ粒子の調製）
メタノール：アセトン＝１：１の混合液にＣｕＯ粒子（Sigma Aldrich、粒径５０ｎｍ以下）５〜１０ｍｇを加え、超音波装置Bioruptor UCD-50（コスモバイオ）にて１０分間洗浄処理した。遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分間）によってＣｕＯ粒子を沈降後に上清を除去し、イソプロパノールで同様の洗浄を二回行った。続いてＴＢＳ−Ｔバッファ（５０〜１００ｍＭTｒｉｓ，１５０〜３００ｍＭＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ，ｐＨ７．４）で二度洗浄し、終濃度２．５ｍｇ／ｍＬになるようＴＢＳ−Ｔバッファに希釈した。
【００７４】
（ペプチドコーティング）
実施例３で合成したペプチド（ＣｕＢＰ１）（ＳＣＡＴＰＦＳＰＱＶＣＳ）を用いて、調製したＣｕＯ粒子とペプチドとが質量比１：１になるように、ＴＢＳ−Ｔバッファ（５０ｍＭＴｒｉｓ，５００ｍＭＮａＣｌ，０．５％Ｔｗｅｅｎ，ｐＨ７．４）に混合した。この混合溶液をマイクロチューブ対応恒温振盪機（Ｄｅｅｐｗｅｌｌ Ｍａｘｉｍｉｚｅｒ，タイテック）を使用して室温で２時間振とうし、ＣｕＯ粒子表面にペプチドをコーティングした。ペプチドコーティングしたＣｕＯ粒子をＣｕＯ−ＣｕＢＰ１と記す。
【００７５】
（ＣｕＯ−ＣｕＢＰ１の走査型電子顕微鏡・エネルギー分散型Ｘ線分析による観察）
走査型電子顕微鏡（Scanning Electron Microscope,ＳＥＭ）、およびエネルギー分散型Ｘ線分析（Energy Dispersive X-ray spectrometry,ＥＤＸ）には、日立ハイテクノノロジー社製を用いた。ＣｕＯ粒子、およびＣｕＯ−ＣｕＢＰ１粒子を含有する調製溶液をナノパーコレーター（日本電子）上にそれぞれスポットし、クリンベンチ内で十分乾燥させて観察用試料を調製した。装置の詳細な操作手順は、付属のプロトコールに従った。ＳＥＭ−ＥＤＸ解析にて、ＣｕＢＰ１を表面にコーティングしたＣｕＯ粒子を観察した。結果を図３に示す。図３（ａ）〜（ｄ）は、ＣｕＯ−ＣｕＢＰ１であり、（ｅ）〜（ｈ）は、ＣｕＯ粒子を示す。
【００７６】
図３（ａ）及び（ｅ）に示すように、ＳＥＭ観察では、いずれの粒子も凝集して塊を形成していた。また、図３（ｂ）に示すように、ＣｕＯ−ＣｕＢＰ１には、酸素原子のほか、図３（ｃ）〜（ｄ）に示すように、ペプチドに特徴的である窒素原子及び硫黄原子を観察できた。これに対して、図３（ｆ）〜（ｈ）に示すように、コントロールであるＣｕＯ粒子については、酸素原子は観察されたが、窒素原子及び硫黄原子を観察できなかった。以上のことからＣｕＯ−ＣｕＢＰ１には、ペプチドがコーティングされていることがわかった。
【実施例５】
【００７７】
（ＣｕＯ−ＣｕＢＰ１の抗菌性の評価）
（微生物の培養）
微生物として、大腸菌、乳酸菌、腸内細菌、腐敗細菌、環境細菌、酵母を使用した。大腸菌はタカラバイオ、それ以外は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター（NBRC: NIRE Biological Resource Center）より入手した。各菌体の学名および生育条件（培地、温度）を、表３に示す。それぞれ最適な培養条件下で対数増殖期（OD600 nm = 0.8）になるよう培養した。各培地（LB, MRS, YPD）は、Sigma Aldrich より入手した。
【００７８】
【表３】
2020062356.tif 000004
【００７９】
（抗菌性評価）
対数増殖期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．８）にまで増殖した各微生物を遠心分離で集菌し、滅菌水で２回洗浄した。滅菌水に各微生物を懸濁後、終濃度０．５ｍｇ／ｍＬになるようＣｕＯ粒子もしくはＣｕＯ−ＣｕＢＰ１粒子をそれぞれ添加し、全量１００μＬになるよう滅菌水で調製した。本溶液を常温で３時間振盪後、適時希釈して各培養プレートに播種し、表３の培養温度にて１６時間静置条件下で培養した。生育したコロニー数を目視で計測し、コロニー形成単位：培養液１ｍＬ中に含まれる微生物数（colony forming unit；ＣＦＵ／ｍＬ）を算出した。
【００８０】
（大腸菌に対する抗菌効果）
ＣｕＯ−ＣｕＢＰ１粒子及びＣｕＯ粒子を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）に対する抗菌効果を評価した。これらの粒子で処理した大腸菌を希釈してプレートに播種し、生育したコロニー数（ＣＦＵ／ｍＬ）を計測する手法によって抗菌性を評価した。
ＣｕＯ−ＣｕＢＰ１添加時（０．５ｍｇ／ｍＬ）の大腸菌生菌数を図４に示す。
【００８１】
図４に示すように、ＣｕＯ粒子ではこれまでの報告と同様、大腸菌に対する大幅な抗菌効果が認められ、生育数は１．０ｘ１０3ＣＦＵ／ｍＬであった。一方、ＣｕＯ−ＣｕＢＰ１粒子では、１．０ｘ１０4ＣＦＵ／ｍＬを示し、抗菌効果が１０倍程度弱まることが確認された。なお、ペプチドには、自身が抗菌性を示す抗菌ペプチドも数多く知られている。しかしＣｕＢＰ１のみを添加した試験では、大腸菌コロニー数に変化が認められなかったことから、ＣｕＢＰ１自身は抗菌性に影響しないことが示唆された。
【００８２】
また、ＪＭ１０９以外の大腸菌を２種（ＮＢＲＣ３３０１，ＥＲ２５０７）追加し、同様の抗菌試験を行った。結果は、図５に示すように、いずれの大腸菌でもＪＭ１０９と同様で、抗菌能が低減される効果であった。
【００８３】
（他微生物における抗菌効果）
さらに６種類の微生物についての上記と同様の抗菌試験を行った。結果を図６に示す。図６に示すように、いずれの微生物も対数増殖期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．８）まで増殖後にＣｕＯ粒子を添加したが、微生物によって生菌速度が異なるため最終的に得られるコロニー数には違いがあった（１．０ｘ１０4〜５．０ｘ１０7ＣＦＵ／ｍＬ）。ＣｕＯ粒子による抗菌効果は微生物によって差が認められ、高い抗菌効果を示す微生物（乳酸菌L.delbruekii、腐敗細菌S. inulinus、酵母S. cerevisiae）がある一方、あまり抗菌効果の認められない微生物（乳酸菌L. helveticus、腸内細菌E. hirae、環境細菌M. fujisawaense）もあったが、ＣｕＯ−ＣｕＢＰ１は、いずれも、ＣｕＯ粒子よりも抗菌性が弱まる結果であった。以上のことから、微生物間によって差はあるものの、ＣｕＯ粒子表面をペプチドコーティングすることで、微生物に対する抗菌性を低減する効果が明らかとなった。
【実施例６】
【００８４】
（ＣｕＯ−ＢＰ１の粒子径の測定）
（Dynamic Light Scattering）
Dynamic Light Scattering (DLS)測定は、ゼータサイザー ナノ ZSP（Malvern Instruments）、キュベットはFisherbrand disposable cuvettes を使用した。測定条件は、積算回数：１２回、測定温度：２５℃、散乱角度：１７３°backscatter (NIBS default) で行った。詳細な操作手順は、付属のプロトコールに従った。ペプチドコーティングした粒子の粒径を評価した結果を図７に示す。
【００８５】
図７に示すように、Dynamic Light Scattering (DLS)測定によって、コーティング前後のCuO粒子の粒径を測定した。その結果、ＣｕＯ−ＣｕＢＰ１では、平均粒径９５５nmを示し、コーティング前よりも粒径向上が確認された。一般的にナノ粒子の粒径が大きい場合、抗菌性が低減することが知られているため、ＣｕＢＰ１を介して粒子が凝集したことが影響して、抗菌性が低減したと考えられた。
【配列表フリーテキスト】
【００８６】
配列番号１、６、７：人工ペプチド
配列番号２〜５：合成ポリヌクレオチド
【図１】
2020062356.tif 000005
【図２】
2020062356.tif 000006
【図３】
2020062356.tif 000007
【図４】
2020062356.tif 000008
【図５】
2020062356.tif 000009
【図６】
2020062356.tif 000010
【図７】
2020062356.tif 000011
【配列表】
2020062356000001.app