(57)【要約】      （修正有）【課題】二重蛍光体を用いた酵素アッセイに使用するための細胞の提供。【解決手段】細胞の膜との複合体を形成する第一ペプチドを含む膜アンカードメイン、第一波長で第一シグナルを生成する第二ペプチドの第一出現および前記第一波長で第二シグナルを生成する前記第二ペプチドの第二出現を含むレポータードメイン、ここで、前記レポータードメインはレポーターシグナルを生成する、前記膜アンカードメインと前記レポータードメインの間に介在し、前記酵素活性へさらされると切断事象を受けるように選択される第三ペプチドを含む、切断部位、を含むレポーター構築物と、プロテアーゼを含む細胞質ゾルと、を含む細胞。【選択図】図１Ａ
2020062032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素活性に対する細胞ベースのアッセイで使用するための細胞であって、
細胞の膜との複合体を形成する第一ペプチドを含む膜アンカードメイン、
第一波長で第一シグナルを生成する第二ペプチドの第一出現および前記第一波長で第二シグナルを生成する前記第二ペプチドの第二出現を含むレポータードメイン、ここで、前記レポータードメインはレポーターシグナルを生成する、
前記膜アンカードメインと前記レポータードメインの間に介在し、前記酵素活性へさらされると切断事象を受けるように選択される第三ペプチドを含む、切断部位、を含むレポーター構築物と、
プロテアーゼを含む細胞質ゾルと、を含み、
ここで、前記レポータードメインは、前記レポータードメインの少なくとも一部が、切断事象後のプロテアーゼによる細胞の細胞質ゾルでのタンパク質分解に感受性であるように選択され、ここで、前記レポーターシグナルは、第一シグナルまたは第二シグナルのいずれか一つの非存在下で観察可能である、細胞。
【請求項２】
前記第二ペプチドの第一出現は細胞の細胞質ゾルにおける第一分解事象に感受性であり、第二ペプチドの第二出現は前記切断事象後の細胞の細胞質ゾルにおける第二分解事象に感受性であり、ここで、前記第一分解事象は結果として前記第一シグナルの生成の消失を生じさせ、前記第二分解事象は結果として前記第二シグナルの生成の消失を生じさせる、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記第二ペプチドの前記第一出現は蛍光タンパク質の第一出現であり、そして、前記第二ペプチドの前記第二出現は前記蛍光タンパク質の第二出現である請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
前記レポーター構築物は、前記第二ペプチドの前記第一出現と前記第二ペプチドの前記第二出現との間に挿入されたリンカーペプチドをさらに含む請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
前記第一ペプチドおよび前記第二ペプチドは、それぞれ配列番号１０と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
前記第三ペプチドは、ＳＮＡＲＥタンパク質またはボツリヌス神経毒切断部位を含むその断片である請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
前記レポーター構築物は、第二波長でシグナルを提供する補助レポータードメインをさらに含み、前記第二波長は前記第一波長から識別可能である、請求項１に記載の細胞。
【請求項８】
前記レポーター構築物は、５％以下のレベルのＦＲＥＴを示す請求項１に記載の細胞。
【請求項９】
前記細胞は、ボツリヌス神経毒による中毒に感受性である請求項１に記載の細胞
【請求項１０】
前記ボツリヌス神経毒は、ボツリヌス神経毒血清型Ａまたはボツリヌス神経毒血清型Ｅである請求項９に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願第６１／８９５，５３３号明細書（２０１３年１０月２５日出願）、米国仮特許出願第６１／８９７，３５２号明細書（２０１３年１０月３０日出願）、米国仮特許出願第６２／０１４，５８６号明細書（２０１４年６月１９日出願）および米国仮特許出願第６２／０５８，５３２号明細書（２０１４年１０月１日出願）の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明の分野は、プロテアーゼアッセイ、特にクロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒に関連するプロテアーゼアッセイに使用するための細胞である。
【背景技術】
【０００３】
ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）は、クロストリジウム・ボツリナムにより産生され、知られている中で最も強力な毒素である。これらの毒素は明確に認識された食中毒源であり、犠牲者の重篤な被害または死亡さえ生じさせることが多い。多数の構造的に類似のボツリヌス神経毒もしくは血清型（ＢｏＮＴ／Ａ−Ｇおよび提案されているＢｏＮＴ／Ｈ）があり、それらの各々は重鎖（約１００ｋＤ）および軽鎖（約５０ｋＤ）から構成される。重鎖は、受容体媒介性エンドサイトーシスを通して標的細胞への毒素の侵入を媒介する。いったん内部に取り込まれると、軽鎖がエンドソーム小胞内腔から細胞基質（ｃｙｔｏｓｏｌ）内へ転位置し、神経伝達物質放出にとって重要な過程である小胞−標的膜融合を媒介する基質特異的タンパク質を切断する亜鉛依存性プロテアーゼとして作用する。
【０００４】
ＢｏＮＴ基質タンパク質には、細胞膜タンパク質であるシンタキシン、表在性膜タンパク質であるＳＮＡＰ−２５および小胞膜タンパク質であるシナプトブレビン（Ｓｙｂ）が含まれる。これらのタンパク質は、ＳＮＡＲＥ（可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体）タンパク質と総称される。ＳＮＡＲＥタンパク質の切断は、細胞膜との小胞融合を遮断し、神経筋接合部での神経伝達物質放出を無効にする。ＳＮＡＲＥタンパク質の中では、特にシンタキシンおよびＳＮＡＰ−２５は、通常は標的膜上に存在するためにｔ−ＳＮＡＲＥと呼ばれており、シナプトブレビンはシナプス内のシナプス小
胞と排他的に関連しているのでｖ−ＳＮＡＲＥと呼ばれている。これら三種のタンパク質は一緒に、小胞膜と血漿膜との間の融合を媒介するために必要とされる最小機構であると考えられる複合体を形成する。ＢｏＮＴ／Ａ、ＥおよびＣはＳＮＡＰ−２５を切断するが、他方ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ、ＦおよびＧは別個の固有の部位でシナプトブレビン（Ｓｙｂ）を切断する。ＢｏＮＴ／Ｃはさらに、ＳＮＡＰ−２５に加えてシンタキシンも切断する。ＢｏＮＴは酵素として作用するので、罹患した個体に微量でさえ破壊的な作用を及ぼす可能性がある。
【０００５】
ボツリヌス毒素は食中毒源の一つであって生物テロ武器として使用される可能性があるが、治療用途がある。近年、ボツリヌス毒素は望ましくない筋収縮（例えば、斜視）に関連する、および持続性偏頭痛における状態を治療するために利用されてきた。ボツリヌス毒素は、さらに美容上の目的にも広く使用されており、この場合には皮膚の下の小筋肉の選択的麻痺が加齢に関連するしわの外観を一時的に減少させる。そのような広範な使用に伴い、ＢｏＮＴタンパク質を高感度で迅速に特徴付ける必要がある。この過程は、これらのタンパク質を単離する工程において利用される精製プロセスが有意な程度の変性を引き起こす可能性があり、結果としてこれらのタンパク質の不活性化を生じさせるために、存在するＢｏＮＴタンパク質の量を単純に定量するのではなくむしろＢｏＮＴ活性を正確に定量する必要があるので複雑になる。
【０００６】
現時点において、ＢｏＮＴを検出してそれらの活性を定量するために一般に使用される方法は、マウスを使用して毒性アッセイを実施する方法である。そのような方法は、極めて多数のマウスの使用を必要とし、多大な時間を必要とし、毒素触媒動態を試験するために使用することはできない。ＢｏＮＴタンパク質に対して開発された抗体に基づく多数のイムノアッセイシステムもまた開発されてきたが、そのようなアッセイは存在するＢｏＮＴタンパク質の量を定量するためには有用な可能性があるが、毒素の酵素活性を決定するために使用することはできない。これらの毒素の酵素活性を測定するために、例えば、切断生成物に向けられたＨＰＬＣもしくはイムノアッセイを使用してＢｏＮＴ反応生成物を検出するための方法が開発されてきた。しかしこれらの方法は、一般に複雑で、時間を消費し、（例えば、特殊化抗体を利用するための）費用が高額となることがあり、自動化することが困難であり、大規模スクリーニングのためには不適切である。
【０００７】
近年、研究者らは、酵素活性を定量するために蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）法の使用を探索し始めてきた。ＦＲＥＴ法は、二種の蛍光成分であるドナー蛍光体およびアクセプター蛍光体の使用を含んでいる。ドナー蛍光体の発光スペクトルはアクセプター蛍光体の励起スペクトルに重複し、既定条件下および適正な蛍光体の間隔および方向では、ドナー蛍光体の励起はアクセプター蛍光体からの発光を導くことができる。このエネルギー転移の効率はドナー蛍光体とアクセプター蛍光体との距離に高度に依存し、この現象を利用するために極めて多数の蛍光アッセイが開発されてきた。セルベースアッセイにおいて適用するためには、そのようなＦＲＥＴプローブを遺伝子操作によって細胞内で生成することができる。そのようなアプローチでは、蛍光タンパク質、特に国際公開第２００８／１４５３０１Ａ１号パンフレット（Ｔａｓｄｅｍｉｒ  ａｎｄ  Ｃｏｒａｚｚａへの）に記載の緑色蛍光タンパク質およびその変異体が、これらのタンパク質が蛍光を発するために補因子もしくは基質の添加を必要としないので頻回に使用されている。これらのアッセイの一部は、酵素活性を検出することができる。例えば、特許文献１（米国特許第７，７４９，７５９号（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ，Ｓｔｅｗａｒｄ  ａｎｄ  Ａｏｋｉへの））は、クロストリジウム毒素のための基質を含有する細胞の使用であって、（遺伝子構築物から発現させられる）基質には、クロストリジウム毒素によって切断されるペプチドにより分離されるドナー蛍光体およびアクセプター蛍光体が含まれる使用について開示している。クロストリジウム毒素へさらすことは基質の切断を生じさせ、その後のドナー蛍光体とアクセプター蛍光体との分離は観察された蛍光における変化を生じさせる。しかしそのようなＦＲＥＴに基づくアッセイには限界がある。ドナー蛍光体およびアクセプター蛍光体の励起スペクトルは頻回に重複し、結果としてＦＲＥＴの非存在下でさえアクセプター蛍光体からの本質的に高いバックグラウンドシグナルを生じさせる。同様に、一部のレポーター構築物では、蛍光体は、標的部位が切断されて解離しない凝集構築物内および／または凝集構築物間の蛍光体複合体を形成して自己凝集する可能性がある。さらに、より複雑な酵素結合および切断部位（例えば、クロストリジウム神経毒の酵素結合および切断部位）に適応するための切断部位としてのより長鎖のペプチド配列の使用は、そのようなペプチド配列によって分離された蛍光体間のエネルギー転移の効率を劇的に低下させることができる。
【０００８】
この低い効率および高いバックグラウンド蛍光の結果として、ＦＲＥＴベースの構築物は細胞内で過剰発現することが多く、結果として望ましくない細胞毒性および構築物凝集を生じさせる。特許文献２（米国特許第６，９３６，４２８号（Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｖｅｌｌｅｎｃｏｕｒｔへの））は、ドナーおよびアクセプター蛍光体タンパク質を利用するＦＲＥＴ構築物中のバックグラウンド蛍光が、その中に対のマルチマータンパク質蛍光体が分子内ホモダイマーを形成するために配置されている構築物を使用し、それによりバックグラウンド蛍光を生成するドナー／アクセプターヘテロダイマーの形成を減少させることによって減少させられるアプローチについて記載している。または、特許文献３（米国特許第８，０６７，２３１号（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ  ｅｔ  ａｌへの））は、細胞膜から細胞質空間への観察可能な蛍光の分布における変化が観察されるセルベースアッセイについて記載しているが、しかしそのような特性解析は高性能の光学機器および画像解析を必要とする。
【０００９】
本明細書で言及した全ての他の刊行物は、各個別の公開もしくは特許出願が特別および個別的に参照により組み込まれると指示されたのと同程度まで参照により組み込まれる。組み込まれた参考文献における用語の定義もしくは使用が本明細書に提供したその用語の定義と矛盾する、もしくは反対である場合は、本明細書に提供したその用語の定義が適用され、参考文献内のその用語の定義は適用されないものとする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第７，７４９，７５９号
【特許文献２】米国特許第６，９３６，４２８号
【特許文献３】米国特許第８，０６７，２３１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このため、ＢｏＮＴおよびＢｏＮＴ活性の迅速および正確な特性解析を提供するためには改良された組成物および方法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、例えば蛍光体または発色団のような同一レポーターの少なくとも二つの例を含む構築物を利用してボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）を検出するアッセイに使用するための組成物および方法を提供する。構築物には、構築物を細胞および／または小胞膜に付着させ、順に細胞基質内の分解活性からのレポーターの保護を提供するアンカー部位が含まれる。構築物にはさらに、アンカー部位を少なくとも一つのレポーターから分離し、さらに酵素活性（例えば、プロテアーゼ活性）のための基質としても機能する切断部位が含まれる。切断部位での酵素活性は構築物からレポーターを放出する。その後の細胞基質内のレポーターの分解は、ベースラインシグナルからの酵素活性に比例する測定可能な変化を生じさせる。
【００１３】
本発明の概念の実施形態には、酵素活性（例えば、ボツリヌス神経毒の活性）を特徴付けるために使用できるレポーター構築物およびそのようなレポーター構築物をコードする核酸を含む細胞が含まれる。レポーター構築物には、細胞の膜（例えば、血漿膜もしくは小胞膜）と相互作用する膜アンカードメイン、シグナル生成ペプチド（例えば、蛍光タンパク質に一致する、または緑色蛍光タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有するペプチド配列）の二回以上の出現を含むレポータードメインおよび膜アンカー部位とレポータードメインとの間に位置する切断部位が含まれる。シグナル生成ペプチドは識別不能なシグナルを生成し、レポータードメインにより生成される全シグナルはこれらの別個だが識別できないシグナルの凝集体である。切断部位には、酵素活性（例えば、ＳＮＡＲＥタンパク質またはそれらの断片）による切断に感受性であるペプチドが含まれ、そのような切断は細胞質内へのレポータードメインの放出を生じさせる。そのような切断部位は、二つ以上の酵素（例えば、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｅの両方）による切断に感受性であるように選択できる。レポータードメインは、細胞質内への放出後に分解事象を受け、別個の分解事象はシグナル生成ペプチドの各々からのシグナルの消失を誘発し、結果としてレポータードメインの凝集体シグナルの漸進的消失が生じる。一部の実施形態では、リンカーペプチドがシグナル生成ペプチド間に挿入されている。本発明の概念の一つの好ましい実施形態では、構築物は二つ以上の酵素によって切断することができ、単一シグナル生成ペプチドを備えるレポータードメインを有する類似の構築物に比較して第二酵素活性（例えばＢｏＮＴ／Ｅ）に比して一つの酵素活性（例えばＢｏＮＴ／Ａ）による切断の感受性に関してバイアスの減少を示す。一部の実施形態では、レポーター構築物には、レポータードメインのシグナルとは識別できるシグナルを提供する補助レポータードメインが含まれる。
【００１４】
本発明の概念のまた別の実施形態は、レポーター構築物を発現する細胞を提供する工程、その細胞を、酵素活性を含むことが疑われるサンプルと接触させる工程、および酵素活性の存在下においてレポーター構築物により生成されるシグナルの減少を観察する工程によって酵素活性を特性付けるための方法である。レポーター構築物には、細胞の膜（例えば、血漿膜もしくは小胞膜）と相互作用する膜アンカードメイン、シグナル生成ペプチド（例えば、蛍光タンパク質に対応する、および／または緑色蛍光タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有するペプチド配列）の二回以上の出現を含むレポータードメインおよび膜アンカー部位とレポータードメインとの間に位置する切断部位が含まれる。シグナル生成ペプチドは、識別不能なシグナルを生成し、レポータードメインにより生成される全シグナルはこれらの別個だが識別できないシグナルの凝集体であるように、識別不能なシグナルを生成する。切断部位には、酵素活性（例えば、ＳＮＡＲＥタンパク質またはそれらの断片）による切断に感受性であるペプチドが含まれ、そのような切断は細胞質内へのレポータードメインの放出を生じさせる。レポータードメインは、細胞質内への放出後に別個の分解事象によりシグナル生成ペプチドの各々からのシグナルの消失が誘発され、結果としてレポータードメインの凝集体シグナルの漸進的消失が生じる分解事象を受ける。一部の実施形態では、レポータードメインの凝集体シグナルは、分解事象からのシグナル生成ペプチドの一つからのシグナルの消失後に観察することができる。本発明の概念の一つの好ましい実施形態では、構築物は二つ以上の酵素によって切断することができ、単一シグナル生成ペプチドを備えるレポータードメインを有する類似の構築物に比較して第二酵素活性（例えばＢｏＮＴ／Ｅ）に比して一つの酵素活性（例えばＢｏＮＴ／Ａ）による切断の感受性に関してバイアスの減少を示す。
【００１５】
本発明の概念の一部の方法では、レポータードメインにより提供されるシグナルから識別することができ、レポーター構築物のレポータードメインからシグナルを正規化するために利用できる参照シグナルが提供される。一部の実施形態では、参照シグナルは、構築物を備える補助レポーターを含めることによって提供されるが、このとき補助レポーターはレポータードメインから識別可能なシグナルを生成し、酵素活性による影響を受けない。他の実施形態では、参照シグナルは、細胞を細胞色素（例えば、膜色素または細胞核／核色素）と接触させる工程によって提供される。そのような細胞色素は、細胞を酵素活性と接触させる工程の前、工程中または工程後に細胞と接触させることができる。
【００１６】
すなわち、本発明の実施形態には、酵素活性を特性付けるためのレポーター構築物であって、細胞の膜との複合体を形成する第一ペプチドを含む膜アンカードメイン、第一波長で第一シグナルを生成する第二ペプチドの第一出現および前記第一波長で第二シグナルを生成する前記第二ペプチドの第二出現を含むレポータードメインであって、前記レポータードメインは前記第一シグナルおよび前記第二シグナルの総和である凝集体シグナルを生成するレポータードメイン、第三ペプチドを含む切断部位であって、前記切断部位は前記膜アンカードメインと前記レポータードメインの前記二つ以上の出現の内の少なくとも二つとの間に挿入される切断部位とを含み、前記第三ペプチドは、前記酵素活性へさらさせると切断事象を受けるように選択され、前記レポータードメインは、レポータードメインの少なくとも一部分が切断事象後にタンパク質分解に感受性であり、前記凝集体シグナルが前記第一シグナルまたは前記第二シグナルのいずれか一つの非存在下で観察可能であるように選択される、レポーター構築物が含まれ、
好ましくは、前記第二ペプチドの前記第一出現は細胞質ゾル内の第一分解事象に感受性であり、前記第二ペプチドの前記第二出現は切断事象後の細胞質ゾル内の第二分解事象に感受性であり、前記第一分解事象は結果として前記第一シグナルの生成の消失を生じさせ、前記第二分解事象は結果として前記第二シグナルの生成の消失を生じさせるものであり、
好ましくは、前記第二ペプチドは、蛍光タンパク質であり、
好ましくは、前記第二ペプチドの前記第一出現と前記第二ペプチドの前記第二出現との間に挿入されたリンカーペプチドをさらに含み、
好ましくは、前記第二ペプチドは、配列番号１０と少なくとも８０％の配列同一性を有し、
好ましくは、前記第三ペプチドは、ＳＮＡＲＥタンパク質またはその断片であり、
好ましくは、第二波長でシグナルを提供する補助レポータードメインをさらに含み、前記第二波長は前記第一波長から識別可能であり、
好ましくは、前記レポーター構築物は、前記第二ペプチドの単一出現を含む類似のレポーター構築物に比較して前記第一酵素活性と第二酵素活性との間の減少した選択性バイアスを示し、前記第三ペプチドは、前記第一酵素活性または前記第二酵素活性のいずれかへさらさせた後に切断事象を受けるように選択され、
好ましくは、前記第一酵素活性はＢｏＮＴ／Ａと関連付けられており、前記第二酵素活性はＢｏＮＴ／Ｅと関連付けられ、
好ましくは、前記レポーター構築物は、有用なレベルのＦＲＥＴを示さない。
【００１７】
また、本発明の実施形態には、第一酵素活性を特徴付ける方法であって、  細胞の膜との複合体を形成する第一ペプチドを含む膜アンカードメイン、第一波長で第一シグナルを生成する第二ペプチドの第一出現および前記第一波長で第二シグナルを生成する前記第二ペプチドの第二出現を含むレポータードメインであって、前記レポータードメインは前記第一シグナルおよび前記第二シグナルの総和である凝集体シグナルを生成するレポータードメイン、そして、第三ペプチドを含む切断部位であって、前記切断部位は前記膜アンカードメインと前記レポータードメインの前記二つ以上の出現の内の少なくとも二つとの間に挿入される切断部位とを含み、そして、ここで前記第三ペプチドは、前記第一酵素活性へさらさせると切断事象を受けるように選択され、前記レポータードメインの少なくとも一部分は、レポータードメインの少なくとも一部分が切断事象後にタンパク質分解に感受性であるように選択されるレポーター構築物を発現する細胞を提供する工程、前記細胞を、前記第一酵素活性を含むことが疑われるサンプルと接触させる工程、および、前記サンプルが前記第一酵素活性を含む場合に前記検出可能なシグナルの減少を観察する工程、とを含み、  前記凝集体シグナルは前記第一シグナルまたは前記第二シグナルのいずれか一つの非存在下で観察可能である方法が含まれ、
好ましくは、前記第二ペプチドは、蛍光タンパク質であり、
好ましくは、前記方法は、前記第二ペプチドの単一出現を含む類似のレポーター構築物を利用するアッセイと比較して前記第一酵素活性と第二酵素活性との間で減少した選択性を示し、前記第三ペプチドは、前記第一酵素活性または前記第二酵素活性のいずれかにさらさせると切断事象を受けるように選択され、
好ましくは、前記第一酵素活性はＢｏＮＴ／Ａと関連付けられており、前記第二酵素活性はＢｏＮＴ／Ｅと関連付けられ、
好ましくは、前記第二ペプチドは、配列番号１０と少なくとも８０％の配列同一性を有し、
好ましくは、前記第三ペプチドは、ＳＮＡＲＥタンパク質またはその断片であり、
好ましくは、前記レポーター構築物は、参照シグナルを生成する参照レポーターをさらに含み、前記参照シグナルは前記検出可能なシグナルから識別可能であり、前記サンプルの前記酵素活性とは無関係である、
好ましくは、前記参照シグナルは、前記凝集体シグナルを正規化するために使用され、
好ましくは、前記細胞を細胞色素と接触させる工程をさらに含み、前記細胞色素は、前記凝集体シグナルから識別可能である色素シグナルを提供するように選択され、
好ましくは、前記色素シグナルは、前記凝集体シグナルを正規化するために使用され、
好ましくは、前記細胞は、前記細胞を前記サンプルと接触させる前に前記細胞色素と接触させられ、
好ましくは、前記細胞は、前記細胞が前記サンプルを接触させられた後に前記細胞色素と接触させられる、
好ましくは、前記細胞は、前記同一時間間隔中に前記細胞色素および前記サンプルと接触させられ、
好ましくは、前記レポーター構築物は、有用なレベルのＦＲＥＴを示さない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】本発明の概念の構築物を略図により描出し、典型的な結果を示す図である。図１Ａ〜１Ｃは、様々な立体構造にある二つの同一のレポーターペプチドを有する、本発明の概念の構築物を示す略図である。図１Ｄは、図１Ａに示したように構成されたレポーターを利用する、二種の異なるボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｅ）についてのセルベースアッセイの典型的な結果を示す図である。単一レポーターを有する類似の構築物を発現する細胞についての結果もまた示した。驚くべきことに、ＢｏＮＴ／ＡとＢｏＮＴ／Ｅとの感受性間のバイアスは、本発明の概念の構築物を発現する細胞内では劇的に減少する。
【図１Ｂ】本発明の概念の構築物を略図により描出し、典型的な結果を示す図である。図１Ａ〜１Ｃは、様々な立体構造にある二つの同一のレポーターペプチドを有する、本発明の概念の構築物を示す略図である。図１Ｄは、図１Ａに示したように構成されたレポーターを利用する、二種の異なるボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｅ）についてのセルベースアッセイの典型的な結果を示す図である。単一レポーターを有する類似の構築物を発現する細胞についての結果もまた示した。驚くべきことに、ＢｏＮＴ／ＡとＢｏＮＴ／Ｅとの感受性間のバイアスは、本発明の概念の構築物を発現する細胞内では劇的に減少する。
【図１Ｃ】本発明の概念の構築物を略図により描出し、典型的な結果を示す図である。図１Ａ〜１Ｃは、様々な立体構造にある二つの同一のレポーターペプチドを有する、本発明の概念の構築物を示す略図である。図１Ｄは、図１Ａに示したように構成されたレポーターを利用する、二種の異なるボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｅ）についてのセルベースアッセイの典型的な結果を示す図である。単一レポーターを有する類似の構築物を発現する細胞についての結果もまた示した。驚くべきことに、ＢｏＮＴ／ＡとＢｏＮＴ／Ｅとの感受性間のバイアスは、本発明の概念の構築物を発現する細胞内では劇的に減少する。
【図１Ｄ】本発明の概念の構築物を略図により描出し、典型的な結果を示す図である。図１Ａ〜１Ｃは、様々な立体構造にある二つの同一のレポーターペプチドを有する、本発明の概念の構築物を示す略図である。図１Ｄは、図１Ａに示したように構成されたレポーターを利用する、二種の異なるボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｅ）についてのセルベースアッセイの典型的な結果を示す図である。単一レポーターを有する類似の構築物を発現する細胞についての結果もまた示した。驚くべきことに、ＢｏＮＴ／ＡとＢｏＮＴ／Ｅとの感受性間のバイアスは、本発明の概念の構築物を発現する細胞内では劇的に減少する。
【図２Ａ】二つの同一のレポーターおよび第三の異なるレポーターを含む、本発明の概念の構築物を示す略図である。
【図２Ｂ】二つの同一のレポーターおよび第三の異なるレポーターを含む、本発明の概念の構築物を示す略図である。
【図２Ｃ】二つの同一のレポーターおよび第三の異なるレポーターを含む、本発明の概念の構築物を示す略図である。
【図２Ｄ】二つの同一のレポーターおよび第三の異なるレポーターを含む、本発明の概念の構築物を示す略図である。
【図２Ｅ】二つの同一のレポーターおよび第三の異なるレポーターを含む、本発明の概念の構築物を示す略図である。
【図２Ｆ】二つの同一のレポーターおよび第三の異なるレポーターを含む、本発明の概念の構築物を示す略図である。
【図２Ｇ】二つの同一のレポーターおよび第三の異なるレポーターを含む、本発明の概念の構築物を示す略図である。
【図２Ｈ】二つの同一のレポーターおよび第三の異なるレポーターを含む、本発明の概念の構築物を示す略図である。
【図２Ｉ】二つの同一のレポーターおよび第三の異なるレポーターを含む、本発明の概念の構築物を示す略図である。
【図２Ｊ】二つの同一のレポーターおよび第三の異なるレポーターを含む、本発明の概念の構築物を示す略図である。
【図２Ｋ】二つの同一のレポーターおよび第三の異なるレポーターを含む、本発明の概念の構築物を示す略図である。
【図３】構築物が細胞膜アンカードメインを含む、本発明のセルベースアッセイを示す図である。
【図４】構築物が小胞膜アンカードメインを含む、本発明のセルベースアッセイを示す図である。
【図５】本発明によるアッセイ法を示す図である。
【図６】本発明による代替アッセイ法を示す図である。
【図７】蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）および第二色素についての励起および発光スペクトルを示す図である。
【図８】第二色素の使用を組み込んでいる本発明の概念のアッセイ法を示す略図である。
【図９Ａ】補正の非存在下および第二色素を使用したデータ正規化を行った各々の場合の、本発明の概念のアッセイからの典型的なデータを示す図である。
【図９Ｂ】補正の非存在下および第二色素を使用したデータ正規化を行った各々の場合の、本発明の概念のアッセイからの典型的なデータを示す図である。
【図９Ｃ】対応するボツリヌス毒素の非存在下および存在下における、本発明の概念の構築物を発現する細胞の蛍光顕微鏡および明視野顕微鏡を使用して撮影された顕微鏡写真を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の概念の実施形態は、一つの保護された領域および一つの分析物感受性領域内で観察できるレポーター成分もしくは領域を隔離する構成を含む（例えばトランスフェクションおよび／またはマイクロインジェクション後の発現により導入される）構築物を含む一つ以上の細胞を利用する。レポーター成分は、二つ以上の同一レポーターを含むことができる。そのような保護された領域は、細胞膜および／または小胞膜に近接していてよい。分析物感受性領域と分析物との相互作用は、切断事象により保護された領域からのレポーターの放出を生じさせ、この切断事象はレポーターの分解およびレポーターからのシグナル内の観察可能な変化を生じさせる。分析物の例は、タンパク質分解酵素を含むことができ、そのような場合、分析物感受性領域は、酵素基質として機能できる切断部位であってよい。
【００２０】
本発明の主題の様々な目的、特徴、態様および利点は、その中で同様の数字が同様の成分を表す添付の図面とともに、好ましい実施形態についての下記の説明からより明白になるであろう。
【００２１】
本発明の概念の実施形態には、そのような構築物が、引き続いて対象の分析物（例えば、クロストリジウム・ボツリナムおよび／またはクロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）毒素）にさらされた細胞内で発現させられる方法が含まれる。そのような細胞は、分裂停止細胞であってよい。本発明の概念の構築物の新規な配列および組成物はそのようなアッセイの機序および性能特性に直接的な影響を有することを理解されたい。本発明の概念の好ましい実施形態では、対象の分析物にさらすことは、構築物の分析物感受性領域もしくはドメインで切断事象を生じさせ、結果としてそれらの各々が検出可能なシグナルを生じさせる二つ以上の同一シグナル生成領域（例えば、対の同一蛍光体）を運ぶレポーター領域を含む構築物断片の放出を生じさせる。ＦＲＥＴ対（例えば、異種ＦＲＥＴ対として配列された相違する蛍光体および／または同種ＦＲＥＴ対として配列された類似もしくは同一蛍光体）として配列された蛍光体を利用する構築物および方法とは異なり、構築物断片として放出されたレポーターのシグナル生成領域の各々は、切断事象の前および直後の両方で検出可能な凝集体に直接的に寄与する。例えば、一部の実施形態では、そのような凝集体シグナルは、シグナル生成領域の各々から観察されたシグナルの近似的総和（または他の関数）であってよい。本発明の概念の構築物およびアッセイでは、検出の原理を形成する検出可能なシグナルにおける変化は切断事象に引き続いて細胞質ゾル内で発生する複数の分解事象の結果であるが、これは対の同一シグナル生成領域（例えば、一対の本質的に同一の蛍光体）の一つの消失が依然として発光レポーター断片を提供するからである。単一レポーターを利用する構築物では、放出された構築物断片で発生する単一分解事象は単一レポーターの断片化および検出可能なシグナルの消失を生じさせる可能性がある。同様に、検出可能なシグナルがレポーター（例えば、異種ＦＲＥＴおよび／または同種ＦＲＥＴを実施するために配列された対の蛍光体を利用する構築物）間の相互作用の結果である二重レポーターを利用する構築物では、単一分解事象に起因する単一シグナル生成領域の断片化はさらにその構築物からの検出可能なシグナルの消失を生じさせる。
【００２２】
対照的に、切断事象後の二つ以上の同一／識別不能なシグナル生成領域を放出するように構成されている本発明の概念の構築物に向けられた切断事象により生成されるレポーター含有断片は、単一生成領域の出現の一つで発生する単一分解事象後に検出可能なシグナルを提供し続けることができる。構築物切断断片による検出可能なシグナルの生成を停止させるためには複数の分解事象が必要とされるので、検出可能なシグナルは分析物濃度の上昇につれて減少するが、高分析物濃度で（単一レポーター構築物またはシグナル生成のための対のレポーターに依存する構築物に比較して）持続する。これは、本発明の概念の
構築物に基づくアッセイのための改良されたダイナミックレンジを生じさせることができる。
【００２３】
本発明の概念の構築物の構成は、様々な方法で配列できる。下記の説明は、レポーター構築物の機能的ドメイン、例えば、膜アンカー（Ａ）、切断部位（Ｂ）、一次シグナル生成領域／レポーターの複数の出現（Ｃ、Ｃ’）および一部の例では二次レポーター（Ｄ）がリンカー領域もしくはリンカー（−）によって様々な配列で結合されているように描出した多数の例を含んでいる。下記の図面およびそれらの説明では、これらのリンカーの存在を任意選択的と見なせることを理解されたい。したがって、本発明の概念の実施形態では、リンカーとして記述される一つ以上の部分を削除できる。一部の実施形態では、本発明の概念のリンカー領域は、さらにまたその領域の機能に直接的には含まれない機能的領域の部分もまた含むことができる。例えば、レポーターがタンパク質蛍光体である場合は、リンカーは蛍光内に直接的には包含されないタンパク質蛍光体配列の一部分であってよい。同様に、リンカーは、プロテアーゼ基質として直接的には機能しない切断部位配列の一部分であってよい。または、本発明の概念の他の実施形態では、リンカーは合成または遺伝子操作ペプチド配列であってよく、これは、例えばシグナル生成領域間のＦＲＥＴ（即ち、同種ＦＲＥＴおよび／または異種ＦＲＥＴ）を有用ではないレベル（例えば、約５％未満）へ減少させるように設計できる。そのような合成ペプチド配列は、柔軟性配列（ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、剛性配列（ｒｉｇｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または柔軟性および剛性部分の両方を備える配列であってよい。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９は、典型的な合成リンカー配列を示す。一部の実施形態では、リンカー領域は、所望の長さ、柔軟性および／または他の望ましい構造的特徴を提供するために、そのようなリンカー配列（例えば、コンカテマー様配列）の反復出現を含むことができる。本明細書で使用するように、用語「リンカー」は、酵素分析物によって切断される切断部位を意味するものではなく、むしろレポーター構築物の他の機能的領域を結合する構造的領域を意味することを理解されたい。
【００２４】
一部の実施形態では、レポーター含有領域は、蛍光体および／または発色団である一次レポーターの少なくとも二つの例を含有することができる。本発明の概念の一部の実施形態では、一次レポーターの二つの例は、同一アミノ酸配列を有する。他の実施形態では、一次レポーターの二つの例は、異なる組成物を有することができるが、実質的に類似（即ち、８０％以上の重複を示す）の励起および発光スペクトルを有することができる。好ましい実施形態では、一次レポーターは蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（配列番号１０）または緑色蛍光タンパク質の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するペプチドであってよい。好適な蛍光タンパク質蛍光体には、黄色蛍光タンパク質（例えば、ｅＹＦＰ、配列番号１１）、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質（配列番号１２）、ｍＢａｎａｎａ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ（配列番号１３）、ＹＰｅｔタンパク質、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＥＧＦＰ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ｍＰｌｕｍ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、黄色蛍光タンパク質の誘導体、ｍＣｉｔｒｉｎｅの誘導体、Ｖｅｎｕｓの誘導体、ＹＰｅｔタンパク質の誘導体および／または緑色蛍光タンパク質変異体が含まれる。特に好ましい実施形態では、一次レポーターは、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光タンパク質由来のモノマー蛍光タンパク質、例えばＳｉｒｉｕｓ、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＥＢＦＰ２、ＴａｇＢＦＰ、ｍＴｕｒｑｏｉｓｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、ｍＵｋＧ１、ｍＡＧ１、ＡｃＧＦＰ１、ＴａｇＧＦＰ２、ＥＤＦＰ、ｍＷａｓａｂｉ、ＥｍＧＦＰ、ＴａｇＹＦＰ、ｅＹＦＰ（配列番号１１）、Ｔｏｐａｚ、ＳＹＦＰ２、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｍＫＯ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＲｕｂｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅおよび／またはｍＫｅｉｍａであってよい（“Ｆ１ｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ”（Ｃｈｕｄａｋｏｖ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．９０：１１０３−１１６３，２０１０）を参照されたい）。同様に、好適な一次レポーターは、Ａ２０６Ｋ突然変異を含むオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質由来のタンパク質蛍光体であってよい。または、一次レポーターは、非蛍光体および／または非発色団、例えば、蛍光クエンチャーであってよい。
【００２５】
本発明の概念の構築物内では、レポーター含有部分内の一次レポーターの配列は、それらが相互から十分遠くに離れているようであってよい、および／またはそれらが実質的に有用ではない（すなわち、５％未満の）ＦＲＥＴ（例えば、同種ＦＲＥＴ）エネルギー転移を示すように方向付けることができる。予期された低レベルの同種ＦＲＥＴエネルギー転移は、約１％以下、約０．１％以下または約０．０１％以下および／または約０．００１％以下の蛍光間エネルギー転移（ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｓ）であってよい。同様に、予期された低レベルの同種ＦＲＥＴエネルギー転移は、観察可能なシグナルのバックグラウンドノイズの約１０％以下、約１％以下または約０．１％以下、約０．０１％以下および／または約０．００１％以下であってよい。または、本発明の構築物の一部の実施形態では、一次レポーター１２０、１３０は、それらが有意な（すなわち、約１％より大きい）同種ＦＲＥＴエネルギー転移を示すように配列することができる。そのような現象は、リンカー領域またはそのような一次レポーター間に挿入されたリンカーの長さを使用して制御することができる。本発明の概念の一部の実施形態では、そのようなリンカーは、２０、３０、４０、５０個、またはそれら以上のアミノ酸長を有することができる。同様に、そのようなリンカーは、構築物がその天然の折り畳まれた状態にあるときに少なくとも約４、約６、約８、約１０、約１５、約２０ｎｍ（ナノメートル）、またはそれら以上の線寸法を有していてよい。
【００２６】
本発明の概念の構築物の一次レポーターが二つ以上の蛍光成分を含むことができることは予期されている。例えば、異なるものであるが重複する励起および発光スペクトルを備える一対の蛍光体は一次レポーターの単一例として機能するＦＲＥＴ対として配列することができよう。同様に、一対の同一蛍光体は、一次レポーターの単純例（例えば、蛍光異方性によって検出される）として機能する同種ＦＲＥＴ対として配列することができよう。例えば、そのような実施形態では、レポーター構築物は一対の一次蛍光体を含むことができるが、このとき各一次蛍光体は異種ＦＲＥＴ対として配列された、異なるものであるが重複する励起および発光スペクトルを備える二つの蛍光体を含んでいる。または、そのような実施形態では、レポーター構築物は一対の一次蛍光体を含むことができるが、このとき各一次蛍光体は同種ＦＲＥＴ対として配列された類似もしくは同一の励起および発光スペクトルを備える二つの蛍光体を含むことができよう。
【００２７】
上述したように、本発明の概念の構築物のドメインは、様々な方法で配列できる。Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｃ’配列として特徴付けることができる本発明の概念の好ましい実施形態は、図１Ａに略図で示した。そのようなレポーター構築物は、介在性アンカー／切断部位リンカー１５０により切断部位１６０に連結されている膜アンカー１７０を含むことができる。切断部位は、順に切断部位／レポーターリンカー１６５によって一対の同一一次レポーター１２０の第一実例（ｆｉｒｓｔ  ｉｎｓｔａｎｃｅ）に連結されている。一対の同一一次レポーター１２０のこの第一実例は、介在性一次レポーター／一次レポーターリンカー１４０によって一対の同一一次レポーター１３０の第二実例に連結されている。そのような実施形態では、レポーター含有領域は、一次レポーターの少なくとも二つの例を含有することができる。そのような構造を有するレポーター構築物の一つの例を配列番号１４に示した。
【００２８】
レポーター構築物の代替配列（Ａ−Ｃ−Ｂ−Ｃ’として特徴付けることができる）は、膜アンカー１７０が介在性アンカー／切断部位リンカー１２５によって一対の同一一次レポーター１２０の第一実例に連結されている、図１Ｂに略図により示した。一対の同一一次レポーター１２０の第一実例は、第一切断部位／蛍光リンカー１６５Ａによって切断部位１６０に連結されている。切断部位１６０は、さらに順に第二切断部位／蛍光リンカー１６５Ｂによって一対の同一一次レポーター１３０の第二実例にも連結されている。そのような残留レポーター１２０からの発光は、例えば、ベースラインもしくは正規化シグナ
ルとして使用できる。
【００２９】
レポーター構築物のまた別の代替配列（Ｃ−Ａ−Ｂ−Ｃ’として特徴付けることができる）は、一対の同一一次レポーター１２０の第一実例が介在性アンカー／一次レポーターリンカー１２５によって膜アンカー部分１７０に連結されている図１Ｃに示した。膜アンカー１７０はさらに、アンカー／切断部位リンカー１５０によって切断部位１６０に連結されている。切断部位１６０は、順に、切断部位／レポーターリンカー１６５によって同一の一次レポーター１３０の一対の第二実例に連結されている。そのような残留レポーター１２０からの発光は、例えば、ベースラインもしくは正規化シグナルとして使用できる。この立体構造の一つの描出を示したが、レポーターリンカー１４０はそのような実施形態において切断部位１６０のどちらの側にも（ｏｎ  ｅｉｔｈｅｒ  ｓｉｄｅ）配置できることを理解されたい。
【００３０】
図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃに示した構築物についての立体配置では、例えばプロテアーゼによる切断部位１６０の加水分解は、膜アンカードメイン１７０からの一つ以上の一次レポーター１２０、１３０の放出を生じさせる。切断部位は、このため、少なくとも部分的に特異的酵素活性についてそのような構築物に基づくアッセイの特異性を決定し、好ましくは、酵素活性が構築物のペプチド骨格および相互作用部位に酵素を提供して基質特異性の少なくとも一部分を付与する認識部位の切断を生じさせる加水切断部位を含んでいる。一部の実施形態では、切断部位は、標的酵素の非活性部位（ｅｘｏｓｉｔｅ）またはアロステリック部位と相互作用する領域を含むことができる。本発明の概念の好ましい実施形態では、切断部位は、ボツリヌス神経毒ＢｏＮＴプロテアーゼ活性、例えばＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆおよび／またはＢｏＮＴ／Ｇによる切断に対して感受性である。切断部位配列は、二種以上の異なるＢｏＮＴ（例えば、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｅの両方）のための切断部位および認識部位を提供するように選択または設計できると予期されている。一部の実施形態では、切断部位は、完全配列またはＳＮＡＲＥタンパク質に由来する配列、例えばシナプト
ソーム関連タンパク質（例えば、ＳＮＡＰ−２５；配列番号１０）、小胞関連膜タンパク質（例えば、ＶＡＭＰもしくはシナプトブレビン；配列番号１１）および／またはシンタキシン由来配列を含むことができる。好適な切断部位配列の例には、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８が含まれる。
【００３１】
上述したように、膜アンカードメインからの放出は、保護領域から一つ以上の一次レポーターが拡散するのを許容できる。そのような保護された領域は、細胞膜および／または小胞膜への近傍を含むことができる。その末端に向けて、アンカードメインは、細胞膜局在性ペプチドおよび／または小胞膜局在性ペプチドを含むことができる。そのようなアンカー領域は、ペプチド鎖の少なくとも一部分が細胞の膜を通って進入および／または通過する膜貫通領域を含むことができる。または、アンカー領域は、細胞による翻訳後プロセッシング後に、細胞の膜と相互作用する部位を提供するパルミトイル化部位を含むことができる。または、膜アンカー部位は、膜結合受容体もしくはリガンドと相互作用するペプチド配列を含むことができる。本発明の概念の一部の実施形態では、アンカードメインは、シナプトブレビン（例えば、シナプトブレビンの膜貫通ペプチド）および／またはＳＮＡＰ−２５（例えば、ＳＮＡＰ−２５のパルミトイル化領域）に由来する配列を含むことができる。本発明の概念の他の実施形態では、膜アンカードメインは、シンタキシンまたはシンタキシン断片であってよい。
【００３２】
上述のように、アンカー領域１７０からいったん放出されると、一次レポーターは細胞質ゾル内に拡散できる。二つ以上の一次レポーターの使用は、多数の技術的利点を提供する。切断をうけ、二つ以上の一次レポーターを放出する構築物の利点は、上記に記載した。他の利点には、構築物についてのより低い発現レベルを利用する能力（それにより毒性および／または構築物凝集のリスクを最小限に抑える）および／またはセルベースアッセイにおいてはるかに少数の細胞を利用する能力が含まれる。さらに、複数の一次レポーターにより生成された相対的に強度のシグナルは、より安定で、再現性のあるベースライン測定値を提供することができ、これはさらにノイズからのシグナルのより強固な識別を許容することによりアッセイ感受性を増加させるためにも役立つ。以前の研究者ら（Ａ．Ｇ．ｖｏｎ  Ａｒｍｉｎ，Ｘ．Ｗ．Ｄｅｎｇ，ａｎｄ  Ｍ．Ｇ．Ｓｔａｃｅｙ；Ｇｅｎｅ  ２２１（１９９８），ｐｐ．３５−４３）は、遺伝子発現についてのマーカーとして二組以上の黄色蛍光タンパク質配列を組み込んでいる構築物を利用して細胞全体を通して明るい蛍光を見いだしたが、そのような構築物は、本発明の概念の構築物に唯一の特徴であるだけではなくセルベースアッセイにおいてそれらを利用するために不可欠である分解事象を証明できなかったことに留意されたい。
【００３３】
驚くべきことに、本発明者らは、複数の一次レポーターを含むレポーター領域を備える構築物は、レポーター領域が一次レポーターの単一出現を含有する類似の構築物に比較して酵素標的間で異なる選択性を提供できることを見いだした。この一つの例は、細胞がＡ−Ｂ−Ｃ−Ｃ’配列内に二つのｅＹＦＰタンパク質蛍光体を含む本発明の概念の構築物またはＡ−Ｂ−Ｃ配列にある単一のｅＹＦＰタンパク質蛍光体を含む類似の構築物のいずれかを含むＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｅへのセルベースアッセイの反応についての比較データを示す図１Ｄにおいて見いだされる。ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｅはどちらも
両方の構築物の切断部位を認識および切断するが、単一蛍光体構築物はＢｏＮＴ／Ｅ神経毒に比してＢｏＮＴ／Ａ神経毒に対しておよそ８０倍のバイアス（すなわち、ＥＣ５０によって表示すると、およそ８０倍良好な感受性）を有する（図１Ｄ、３７℃を参照されたい）。「二重蛍光体」レポーター構築物（すなわち、二つのｅＹＦＰ蛍光体を有する構築物）を発現する細胞を使用して実施した同一試験は、ＢｏＮＴ／Ａに対する類似の感受性を示したが、ＢｏＮＴ／Ｅに対しては増加した感受性を示し、アッセイバイアスを２６倍に低減させた。アッセイバイアスにおけるこの低減は、好都合にも二つ以上の酵素分析物に向けられたアッセイのために同一構築物を使用することを許容する。理論によって拘束されることを望まなくても、本発明者らは、追加の蛍光体ペプチド配列の使用が構築物の切断ドメイン内のより多数の認識部位への改良された接近を提供する三次構造を付与すると考えている。
【００３４】
本発明の概念の一部の実施形態では、レポーター構築物は、二つ以上の一次レポーターに加えて、一次レポーターとは異なる二次レポーターを含むことができる。二次レポーターは、一次レポーターの化学構造とは別個もしくは異なる化学構造を有することができる。そのような二次レポーターは、一次レポーターの励起スペクトルに重複する発光スペクトルを有することができる。そのような実施形態では、構築物は、有意なＦＲＥＴ（すなわち、約１％より大きい）が二次レポーターと一次レポーターとの間で発生するように配列できる。好ましい実施形態では、二次レポーターは、蛍光タンパク質、例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、ｍＢａｎａｎａ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔタンパク質、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＥＧＦＰ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ｍＰｌｕｍ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、黄色蛍光タンパク質の誘導体、ｍＣｉｔｒｉｎｅの誘導体、Ｖｅｎｕｓの誘導体、ＹＰｅｔタンパク質の誘導体および／または緑色蛍光タンパク質変異体である。
【００３５】
好ましくは、レポーター構築物は、有意もしくは有用なＦＲＥＴが二次レポーターと一次レポーターとの間で発生しない（すなわち、発生するＦＲＥＴの程度が５％以下である）ように配置することができる。レポーター構築物内の二次レポーターと少なくとも一つの一次レポーターの配列は、それらが本質的に有用ではない（つまり、５％以下である）ＦＲＥＴを示すようにそれらが相互から十分に離れているようであってよい。予期された有用ではないレベルのＦＲＥＴエネルギー転移は、関連バックグラウンド蛍光の約１０％以下、約５％以下、約１％以下または約０．１％以下であってよい。これは、二次レポーターと一次レポーターとの間の十分な間隔を提供するリンカーを選択することによって実施できる。本発明の概念の一部の実施形態では、そのようなリンカーは、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５個、またはそれら以上のアミノ酸長を有することができる。同様に、二つの一次レポーター間のリンカーは、構築物がその天然の折り畳まれた状態にあるときに少なくとも約４、約６、約８、約１０、約１５、約２０ｎｍ、またはそれら以上の長さを有していてよい。好適なリンカーは、合成ペプチドを含むことができ、そのようなペプチドは、柔軟性ペプチド、剛性ペプチドであってよい、または柔軟性および剛性両方の部分を含むことができる。
【００３６】
本発明の概念の一部の実施形態では、二次レポーターからのシグナルもしくは発光は、レポーター含有部分の一つ以上のレポーターから観察されたシグナルを調整または正規化するために有用な参照データもしくは正規化データとして利用することができ、それによりそのような構築物を利用するアッセイの正確さおよび／または感受性が改良される。他の実施形態では、二次レポーターからのシグナルもしくは発光は、アッセイの反応を発生させることのできる獲得された画像内の位置を同定するために画像認識システムを利用することができ、それによりデータ獲得が単純化される。
【００３７】
そのような二次レポーター（構造Ａ−Ｄ−Ｂ−Ｃ−Ｃ’（式中、「Ｄ」は二次レポーターを表す）を有すると特徴付けることができる）を含む実施形態の一つの例は、図２Ａに略図により示した。そのようなレポーター構築物では、膜アンカー２７０は、介在性アンカー／二次レポーターリンカー２８５により二次レポーター２８０に連結されている。第二アンカー２８０はさらに、二次レポーター／切断部位リンカー２５５によって切断部位２６０に連結されている。切断部位２６０は、順に、切断部位／一次レポーターリンカー２６５によって一対の同一一次レポーター２２０の第一実例に連結しており、一対の同一一次レポーター２２０の第一実例および一対の同一一次レポーター２３０の第二実例は介在性一次レポーター／一次レポーターリンカー２４０によって結合されている。
【００３８】
二つ以上の一次レポーターおよび少なくとも一つの二次レポーター（Ｄ−Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｃ’と記述できる）を備えるレポーター構築物の代替実施形態は、図２Ｂに略図により描出した。この実施形態では、二次レポーター２８０は、介在性アンカー／二次レポーターリンカー２８５により膜アンカー２７０に結合されている。膜アンカー２７０は、順に、アンカー／切断部位リンカー２５０によって切断部位２６０に連結されている。一次レポーター／一次レポーターリンカー２４０によって結合されている一対の同一一次レポーター２２０、２３０は、順に、切断部位／一次レポーターリンカー２６５によって切断部位２６０へ付着させられている。
【００３９】
図２Ｃは、一対の同一一次レポーター２２０の第一実例が一次レポーター／二次レポーターリンカー２７５によって二次レポーター２８０へ結合されているレポーター構築物（Ｃ−Ｄ−Ａ−Ｂ−Ｃ’と記述できる）の一つの実施形態を略図により描出している。二次レポーター２８０は、順に、介在性アンカー／二次レポーターリンカー２７５により膜アンカー２７０に結合されている。膜アンカー２７０はさらに、それらの間に挿入されたアンカー／切断部位リンカー２５０を用いて、切断部位リンカー２６０に結合されている。一対の同一一次レポーター２３０の第二実例もまた、切断部位／一次レポーターリンカー２６５によって切断部位２６０に結合されている。
【００４０】
図２Ｄは、二次レポーター２８０が一対の同一一次レポーター２２０の第一実例に一次レポーター／二次レポーターリンカー２７５によって結合されているレポーター構築物（Ｄ−Ｃ−Ａ−Ｂ−Ｃ’と記述できる）の一つの実施形態を略図により描出している。一対の同一一次レポーター２２０の第一実例は、順にそれらの間に挿入されたアンカー／一次レポーターリンカー２４５を備える膜アンカー２７０に結合されている。膜アンカー２７０はさらに、アンカー／切断部位リンカー２５０によって切断部位２６０に結合されている。一対の同一一次レポーター２３０の第二実例は、介在性切断部位／一次レポーターリ
ンカー２４０によって切断部位２６０に結合されている。
【００４１】
図２Ｅは、膜アンカー２７０がアンカー／二次レポーターリンカー２８５によって二次レポーター２８０へ結合されているレポーター構築物（Ａ−Ｄ−Ｃ−Ｂ−Ｃ’と記述できる）の一つの実施形態を略図により描出している。二次レポーター２８０もまた、介在性一次レポーター／二次レポーターリンカー２７５によって一対の同一一次レポーター２２０の第一実例に結合されている。一対の同一一次レポーター２２０の第一実例は、順に、切断部位／一次レポーターリンカー２６５Ａによって切断部位２６０に結合されている。一対の一次レポーター２３０の第二実例もまた、また別の切断部位／一次レポーターリン
カー２６５Ｂによってこの切断部位２６０に結合されている。
【００４２】
図２Ｆは、膜アンカー２７０が一対の同一一次レポーター２２０の第一実例に介在性アンカー／一次レポーターリンカー２４５によって結合されているレポーター構築物（Ａ−Ｃ−Ｄ−Ｂ−Ｃ’と記述できる）の一つの実施形態を略図により描出している。二次レポーター２８０もまた、一次レポーター／二次レポーターリンカー２７５によって一対の同一一次レポーター２２０の第一実例に連結されている。この二次レポーター２８０は、二次レポーター／切断部位リンカー２５５によって切断部位２６０に連結されている。引き続いて、切断部位２６０は、切断部位／一次レポーターリンカー２６５によって一対の同
一一次レポーター２３０の第二実例に結合されている。
【００４３】
図２Ｇは、膜アンカー２７０が一対の同一一次レポーター２２０の第一実例にアンカー／一次レポーターリンカー２４５によって結合されているレポーター構築物（Ａ−Ｃ−Ｂ−Ｃ’−Ｄと記述できる）の一つの実施形態を略図により描出している。一対の同一一次レポーター２２０の第一実例は、第一切断部位／一次レポーターリンカー２６５Ａによって切断部位２６０に結合されている。切断部位２６０は、さらに第二切断部位／一次レポーターリンカー２６５Ｂによって一対の同一一次レポーター２３０の第二実例にも結合されている。二次レポーター２８０もまた、介在性一次レポーター／二次レポーターリンカー２７５によって一対の同一一次レポーター２３０の第二実例に結合されている。
【００４４】
図２Ｈは、膜アンカー２７０が一対の同一一次レポーター２２０の第一実例にアンカー／一次レポーターリンカー２４５によって結合されているレポーター構築物（Ａ−Ｃ−Ｂ−Ｄ−Ｃ’と記述できる）の一つの実施形態を略図により描出している。一対の同一一次レポーター２２０のこの第一実例は、切断部位／一次レポーターリンカー２６５によって切断部位２６０に結合されている。切断部位２６０はさらに、二次レポーター／切断部位リンカー２５５によって二次レポーター２８０に結合されている。一対の同一一次レポーター２３０の第二実例もまた、介在性一次レポーター／二次レポーターリンカー２７５によって二次レポーター２８０に結合されている。
【００４５】
図２Ｉは、膜アンカー２７０がアンカー／切断部位リンカー２５０によって切断部位２６０へ結合されているレポーター構築物（Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｃ’と記述できる）の一つの実施形態を略図により描出している。この切断部位２６０は、切断部位／一次レポーターリンカー２６５によって一対の同一一次レポーター２２０の第一実例に結合されている。一対の同一一次レポーター２２０のこの第一実例もまた、第一一次レポーター／二次レポーターリンカー２７５Ａによって二次レポーター２８０に結合されている。一対の同一一次レポーター２３０の第二実例もまた、第二一次レポーター／二次レポーターリンカー２
７５Ｂによって二次レポーター２８０に結合されている。
【００４６】
図２Ｊは、一対の同一一次レポーター２２０の第一実例が介在性アンカー／一次レポーターリンカー２４５によって膜アンカー２７０へ結合されているレポーター構築物（Ｃ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｃ’と記述できる）の一つの実施形態を略図により描出している。膜アンカー２７０はさらに、アンカー／切断部位リンカー２５０によって切断部位２６０に結合されている。切断部位２６０は引き続いて、切断部位／二次レポーターリンカー２５５によって二次レポーター２８０に連結されている。一対の同一一次レポーター２３０の第二実例もまた、一次レポーター／二次レポーターリンカー２７５によって二次レポーターに連結されている。
【００４７】
図２Ｋは、一対の同一一次レポーター２２０の第一実例が介在性アンカー／一次レポーターリンカー２４５によって膜アンカー２７０へ結合されているレポーター構築物（Ｃ−Ａ−Ｂ−Ｃ’−Ｄと記述できる）の一つの実施形態を略図により描出している。膜アンカー２７０はさらに、アンカー／切断部位リンカー２５０によって切断部位２６０に結合されている。切断部位２６０は引き続いて、アンカー／一次レポーターリンカー２６５によって一対の同一一次レポーター２３０の第二実例に連結されている。二次レポーター２８０もまた、一次レポーター／二次レポーターリンカー２７５によって一対の同一一次レポ
ーター２３０の第二実例に連結されている。
【００４８】
一部の実施形態では、一次レポーターは、介在性リンカーによって二次レポーターに接続される。そのような実施形態の一部では、一次／二次リンカーは、一次レポーターと二次レポーターとの間で有意なＦＲＥＴを提供しない（すなわち、５％未満）ように選択される。例えば、一次／二次レポーターリンカーは、ＦＲＥＴをごくわずかな（すなわち、＜５％）の量にまで減少させるために一次レポーターと二次レポーターとの間の距離および／または方向を維持するための長さ、形状および／または剛性を有するように選択できる。他の実施形態では、一次／二次レポーターリンカーは、一次レポーターと二次レポーターとの間の有用な程度のＦＲＥＴ（すなわち、＞５％）を提供するために構成できる。
【００４９】
図３は、本発明の概念の典型的なアッセイ３００を示す略図である。細胞膜３１０および細胞質ゾル３１５を備える細胞は、細胞膜アンカー部分３５０、切断部位３４０および二つの同一のレポーター３３０、３３５を含む構築物を発現した。細胞膜３１０に固定されると、レポーター３３０、３３５は強力なシグナル３６０、３６５を生成する。アッセイを実施するために、細胞は、切断部位３４０に作用できる酵素活性３２０にさらさせる。切断部位のペプチド骨格の加水分解はレポーターを細胞質ゾル３１５内へ放出する。その後の複数の分解事象は、結果として改変シグナル３７０、３７５を生成する分解されたレポーター３３０Ａ、３３５Ａを生じさせる。本発明の概念の一部の実施形態では、レポーターは蛍光タンパク質であり、分解された蛍光タンパク質からの蛍光シグナルは減少させられる。
【００５０】
図４は、本発明の概念の代替アッセイ４００を示す図である。細胞膜４１０、細胞質ゾル４１５および小胞４２０を備える細胞は、小胞膜アンカー部分４５０、切断部位４４０および二つのレポーター４３０、４３５を含む構築物を発現した。小胞４２０に固定されると、レポーター４３０、４３５は強力なシグナル４６０、４６５を生成する。アッセイを実施するために、細胞は、切断部位４４０に作用できる酵素活性４２５にさらさせる。切断部位の加水分解はレポーターを放出し、結果としてレポーター４３０、４３５の放出を生じさせる。その後の複数の分解事象は、結果として改変シグナル４７０、４７５を生成する分解されたレポーター４３０Ａ、４３５Ａを生じさせる。本発明の概念の一部の実施形態では、レポーターは蛍光タンパク質であり、分解された蛍光タンパク質からの蛍光シグナルは減少させられる。
【００５１】
異なるアンカー部位を利用することに加えて、本発明の概念のアッセイは、様々な異なる試験プロトコルを使用することができる。そのような試験プロトコルの一つの実施形態は図５に示した。最初に（５１０）、本発明の概念の構築物を発現する細胞が用意される。ベースラインもしくは第一シグナルが獲得され（５２０）、次に細胞は酵素活性にさらさせる（５３０）。例えば、酵素活性（例えば、ＢｏＮＴ）を含有するサンプルを細胞を含有する培地に添加することができる。インキュベーション期間後、第二シグナルを検出することができ（５４０）、引き続いて第一シグナルと比較することができる（５５０）。そのような第一および第二シグナルは、即時測定値、経時的に得られた平均測定値および／または速度測定値であってよい。
【００５２】
本発明の概念の試験方法の代替実施形態は図６に示した。最初に（６１０）、本発明の概念の構築物を発現する細胞が用意される。細胞は次に、酵素活性にさらさせる（６２０）。例えば、酵素活性（例えば、ＢｏＮＴ）を含有するサンプルを細胞を含有する培地に添加することができる。第一インキュベーション期間後、ベースラインもしくは第一シグナルが検出され（６３０）、第二インキュベーション期間後には第二シグナルが検出され（６４０）、引き続いて第一シグナルと比較される（６５０）。そのような第一および第二シグナルは、即時測定値、経時的に得られた平均測定値および／または速度測定値であってよい。
【００５３】
本発明の概念のまた別の実施形態では、上述した構築物を発現する細胞は、構築物とは別個であり、ＢｏＮＴ活性とは独立したシグナルを生成できる一種以上の第二色素（例えば、細胞結合色素、例えば膜色素もしくは核染色／色素）にさらさせる。そのような第二色素は、分析物（例えば、ＢｏＮＴもしくは他の酵素活性）の存在とは無関係である方法で細胞の膜および／または核と結び付けることができ、正規化のために使用できるベースラインもしくは参照シグナルを生成するために使用できる。例えば、上述した構築物を発現する細胞は、細胞の核もしくは細胞膜と結び付ける色素にさらさせることができ、順にベースライン蛍光シグナルを提供する。本発明の概念の好ましい実施形態では、そのような第二色素は、膜色素の発光波長が細胞内で発現された構築物のレポーター蛍光体の発光波長から識別可能であるように選択される。本発明の概念の一部の実施形態では、第二色素は、有効励起波長の範囲が構築物のレポーター蛍光体の有効励起波長の範囲と重複し、第二色素およびレポーター蛍光体両方の同時の励起、したがってベースラインシグナルおよびレポーター蛍光体シグナルの同時獲得を許容するように選択できる。本発明の概念の他の実施形態では、第二色素は、有効励起波長の範囲がレポーター蛍光体の有機励起波長の範囲と有意には重複せず、ベースライン蛍光の選択的励起を許容するように選択できる。好適な第二色素の例には、ＣＥＬＬＭＡＳＫ（商標）ｄｅｅｐ  ｒｅｄ細胞膜染色として現在公知である色素である４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロライド（ＤＡＰＩ）およびＨＯＥＣＨＳＴ３３４２（商標）として現在公知である核染色色素が含まれる。本発明の概念の好ましい実施形態では、第二色素は、ＦＲＥＴに起因してエネルギー移動が本質的にほとんど発生しない（すなわち、約５％未満）ように、構築物のレポーター蛍光体の励起および発光スペクトルとほとんどから全く重複しない励起
および発光スペクトルを提供するように選択される。好適な第二色素（「Ｃｅｌｌ  Ｍａｓｋ」と示される、ＣＥＬＬＭＡＳＫ（商標）ｄｅｅｐ  ｒｅｄ細胞膜染色として現在公知である色素）およびＹＦＰレポーター蛍光体の励起および発光スペクトルの例は、図７に示した。本発明者らは、他の好適な第二色素はタンパク質（例えば、抗体）または細胞に対する親和性を有し、他の蛍光もしくは他の容易に検出可能な分子とコンジュゲート化しくは複合体化されている他の高分子を含むことができることを予期している。
【００５４】
第二色素と細胞との凝集は対象の分析物の存在もしくは活性とは無関係であるので、それらは細胞数、密度および／または分布の独立尺度であるベースラインシグナルを提供することができる。そのようなベースラインシグナルは、本発明の概念のアッセイを実施する経過において細胞から得られたレポーターシグナルの正規化において相当に大きな有用性を有する。例えば、対象の分析物もしくは活性に反応性であるレポーター構築物から測定されたレポーターシグナルと膜色素からの蛍光の形態にある測定されたベースラインシグナルとの間の比率としてのそのようなアッセイの結果を表示することは、細胞数、密度
および／または分布における差に起因する試験部位から試験部位へのレポーターシグナルの強度における変化についての補正を提供する。これは、有益にもそのようなアッセイの精度を改良し、これは順に有効感受性の改良をもたらす。さらに、そのようなベースラインシグナルは、蛍光以外のレポーターシグナルについてのそのような正規化を提供するために利用できることも理解されたい。
【実施例】
【００５５】
１．図８に略図により示したように、図１Ａに示した構築物をコードする発現ベクターを用いて形質転換された細胞を９６ウエルプレート内に播種し（８１０）、５％のＣＯ２にて３７℃で一晩インキュベートする。
２．細胞を次に細胞培養培地で洗浄し、その直後に（典型的には）１００μＬ／ウエルで細胞培養培地中へ希釈されたＢｏＮＴにさらされる（８２０）。
３．細胞を次に３７℃で５％のＣＯ２にて（典型的には）４８時間にわたりインキュベートする。
４．４８時間のインキュベーション期間の終了時に、細胞を第二色素で染色する（８３０）。様々な第二色素は、様々なプロトコルを使用して適用されてよい。
【００５６】
プロトコルＡ：ＤＡＰＩおよびＨＯＥＣＨＳＴ３３４２（商標）として現在公知である色素に関する有用性。
１．細胞培養培地中の２５μＬの５μＭのＤＡＰＩまたは２５μｇ／ｍＬのＨＯＥＣＨＳＴ３３４２（商標）として現在公知である色素を９６ウエルプレートの各ウエルに直接加え、１μＭのＤＡＰＩまたは５μｇ／ｍＬのＨＯＥＣＨＳＴ３３４２（商標）として現在公知である色素の最終濃度が得られる。核色素の有用な最終濃度は、０．００１〜１０μＭまたは０．１〜５０μｇ／ｍＬの範囲に及ぶ。希釈溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）濃度は、適切に調整されてよい。
２．細胞を（典型的には）３７℃、５％のＣＯ２にて３０分間にわたりインキュベートする。
【００５７】
プロトコルＢ：ＣＥＬＬＭＡＳＫ（商標）ｄｅｅｐ  ｒｅｄ細胞膜染色として現在公知である色素に関する有用性。
１．ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のリン酸緩衝食塩液中の０．６２５〜１０μｇ／ｍＬの希釈溶液を調整する（５μｇ／ｍＬが典型的である）。
２．ＢｏＮＴ含有細胞培養培地を各ウエルから取り除く。
３．５０μＬの膜色素希釈溶液を各ウエルに直接加える。
４．細胞を（典型的には）３７℃、５％のＣＯ２にて２０分間にわたりインキュベートする。
【００５８】
膜色素にさらさせた後、試験プレートは自動プレート洗浄装置を使用してリン酸緩衝食塩液で洗浄する。プレートは次に、構築物の蛍光体および使用した第二色素についての近似励起および発光波長を備えるフィルターを使用して蛍光マイクロプレートリーダー上で読み取る（８４０）。例えば、ＤＡＰＩおよびＨＯＥＣＨＳＴ３３４２（商標）として現在公知である色素は、約３４５ｎｍの励起波長および約４８５ｎｍの発光波長を使用して特徴付けることができるが、他方ＣＥＬＬＭＡＳＫ（商標）ｄｅｅｐ  ｒｅｄ細胞膜染色として現在公知である色素は約６５０ｎｍの励起波長および約６８０ｎｍの発光波長を使用して特徴付けることができる。構築物の蛍光体の測定は、蛍光体に特徴的な励起および発光波長を使用して、膜色素の測定とは無関係に行われる。データ分析のためには、直接的に励起された構築物の蛍光体発光（すなわちＢｏＮＴ感受性成分）を例えば構築物蛍光体の発光を第二色素発光（すなわち、ＢｏＮＴ非感受性成分）で割ることによって正規化する（８５０）。
【００５９】
第二色素と組み合わせて上述したようにレポーター構築物を用いて実施したアッセイの典型的な結果は、図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに示した。図９Ａは、レポーター構築物を含有する細胞をプロテアーゼ（この例では、プロテアーゼはＢｏＮＴ／Ａであり、構築物はＢｏＮＴ／Ａに対する切断部位を含んでいる）と接触させる工程からの典型的な未補正の結果を示している。この例における検出限界（ＬＯＤ）は１０ｐＭのＢｏＮＴ／Ａであり、定量限界（ＬＯＱ）は１００ｐＭである。図９Ｂは、上記の手法において記載したように同一細胞に適用された第二色素からの発光データを使用して図９Ａからの蛍光データの正規化の影響を図示している。図９Ｂに示したデータについてのＬＯＤは３ｐＭに減少し、ＬＯＱは１０ｐＭに減少する。図９Ｃは、構築物の蛍光体の発光波長で（左から右へ）明視野蛍光顕微鏡、および、細胞に適用された第二色素の発光波長での蛍光顕微鏡によるＢｏＮＴ／Ａ反応性構築物を有する細胞を含有する二つのウエルの顕微鏡写真を示す図である。顕微鏡写真の上方シリーズ内のウエルはＢｏＮＴ／Ａにさらさせなかった。顕微鏡写真の下方シリーズ内のウエルは１ｎＭのＢｏＮＴ／Ａにさらさせた。構築物の蛍光体からの蛍光の消失は、１ｎＭのＢｏＮＴ／Ａウエル（すなわち、下方シリーズ）中で明白である。これとは対照的に、第二色素からの発光はＢｏＮＴ／Ａにさらさせなかったウエルの発光と類似の、しかし別個であり、相違するレベルおよび分布で維持される。
【００６０】
これらのプロトコルの変形もまた有効な可能性がある。例えば、第二色素は細胞をＢｏＮＴと接触させる前に、本質的に細胞をＢｏＮＴと接触させるのと同時に、または細胞をＢｏＮＴに接触させた後の４８時間未満の間隔を空けて適用することができる。同様に、細胞を第二色素にさらさせる前およびさらさせた後の追加の洗浄工程も予期されている。
【００６１】
本発明の概念のアッセイは、個々の細胞のイメージングおよび／または分析よりむしろ液量の直接的な蛍光測定に依存していることを理解されたい。したがって、それらは単純蛍光光度計（例えば、マイクロプレート蛍光光度計）を使用して実施することができ、そして有益にも自動化および高スループットスクリーニングプロセスへの適応に高度に柔軟である。データ分析は、例えば細胞計数（ｃｅｌｌ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）、個別細胞の識別および特異的な細胞内（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）領域もしくは区画内に局在する蛍光の同定などのプロセッサ−インテンシブ画像プロセッシング作業を含んでいないので、同様に直接的である。
【００６２】
データ正規化目的のためのベースラインシグナルを提供することに加えて、そのような第二色素は他の目的に機能することができる。例えば、それより少ない細胞数は、そのような試験部位からのデータをフラグ付けする、または廃棄することを許容する、正確なアッセイ結果を提供するために不十分であると見なされるベースラインシグナル値を確定することができる。同様に、それより多い細胞数は正確なアッセイ結果を提供するには（例えば、蛍光を特徴付けるために利用されるシステム内の光学的限界に起因して）多すぎると見なされるベースラインシグナル値を確定することができる。アッセイの経過中に加えられる特異的試薬を備えるそのような第二色素の包含もまた、例えば自動化アッセイシステムが適正に実施されることを検証するために、アッセイプロセス中にそのような試薬が試験部位へ実際に送達されたことを検証するために使用することができる。
【００６３】
好ましい実施形態では、特性解析される酵素活性は、ボツリヌス毒素と結び付けられ、切断配列が適切にマッチさせられる。本出願の記載において、ＢｏＮＴは、ＳＮＡＲＥタンパク質配列もしくはＳＮＡＲＥタンパク質配列の一部分を切断できる天然もしくは改変ＢｏＮＴであると規定できる。例えば、ＢｏＮＴ／Ａ、ＥおよびＣはＳＮＡＰ−２５を切断し、ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ、ＦおよびＧは単一だが異なる部位でシナプトブレビン（Ｓｙｂ）を切断する。ＢｏＮＴ／Ｃはさらに、ＳＮＡＰ−２５に加えてシンタキシンも切断する。結果として、ＢｏＮＴ／Ａ、ＥおよびＣの特性解析のための構築物は、ＳＮＡＰ−２５の全部または一部分を含む切断部位配列を含むことができる。同様に、ＢｏＮＴ  Ｂ、Ｄ、ＦおよびＧを特性解析するための構築物は、シナプトブレビンの各感受性領域の全部もしくは部分を含む切断部位配列を含むことができる。または、ＢｏＮＴ／Ｃ活性は、シンタキシンの全部もしくは一部に由来する配列を備える切断部位を含む構築物を利用して特性付けることができよう。
【００６４】
予期された切断部位配列は、有益にもＳＮＡＲＥタンパク質、モチーフもしくはムテイン（突然変異タンパク質）を含むことができる。タンパク質の「ムテイン」は、本明細書では、例えば天然タンパク質と少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を有する組成物を含む、対応する天然タンパク質との少なくとも３０％同一性を有すると解釈することができる。同一性からの変動は、付加、欠失および置換のいずれか一つ以上を含む可能性がある。予期されたムテインには、断片形、短縮形および融合タンパク質が含まれる。
【００６５】
さらに、本発明の概念の細胞が二つ以上の構築物を発現するために改変できることが予期されている。そのような構築物は、例えば、それらの各レポーターの発光スペクトルによって識別することができ、様々な酵素活性の本質的に独立した同時の測定を提供できよう。または、そのような構築物は、異なる基質配列を備える同一酵素の活性を測定できよう。例えば、第一構築物はＳＮＡＰ−２５に由来する切断部位を含むことができ、第二構築物はシンタキシンに由来する切断部位を含むことができようが、どちらもＢｏＮＴ／Ｃ活性を特徴付けるために使用される。そのような実施形態では、両方の構築物からの結果の比較は、精度、ダイナミックレンジおよび／または特異性を改良することができる。
【００６６】
本発明の概念のまた別の実施形態は、二次レポーターを組み込んでいるキットである。そのようなキットは、上述したような適切な検出構築物を発現する細胞および第二色素（例えば、膜色素）を含有することができる。任意選択的に、そのようなキットは、使用者がアッセイを実施するための取扱説明書を含むことができる。一部の実施形態では、そのようなキットは、好適な細胞培養培地を含むコントロールもしくは較正材料、および、特性解析すべきサンプルの酵素活性に対応する酵素活性を含むことができる。これに関連して、コントロールサンプルは、アッセイ性能を検証するために使用されるサンプルである
と理解され、較正サンプルは、定量的もしくは定性的結果を提供するためのアッセイの出力を較正するために使用されるサンプルであると理解されている。例えば、ＢｏＮＴを含有すると疑われるサンプル中、そのようなコントロールおよび／または較正サンプルは対応するＢｏＮＴを含む可能性があろう。一部の実施形態では、そのようなコントロールおよび／または較正サンプルは、プレミックスして、本質的に使用準備が整った状態で提供することができる。他の実施形態では、（例えば、安定ファクターのために）そのようなコントロールおよび／または較正サンプルは、好適な培養培地の第一容器および酵素活性
のストック液の第二容器として提供することができる。そのような実施形態では、第一および第二容器は、異なる輸送および／または保管条件を必要とすることがあり、したがって同一キットの残りの部分とは別個に輸送および／または保管されてよい。
【００６７】
本発明の概念の他の実施形態には、上述した構築物を利用する無細胞アッセイが含まれる。そのようなアッセイは、例えば、その中では小胞が構築物の膜アンカー部分と相互作用するために好適な一つ以上の部位を有する無細胞小胞懸濁液を利用することができよう。そのような小胞は、本発明の概念の構築物と一緒に、構築物のリンカー部分の切断が加水分解のために培地中にレポーターを放出するように、レポーターを加水分解できるプロテアーゼまたは類似の酵素を含む培地中に懸濁させることができる。または、構築物のアンカー部分により認識される部位は好適な表面化学的性質を備える適切な寸法の微粒子に
連結させることができる。そのような微粒子は、立体ブロッカー、例えばプロテアーゼまたは類似の酵素の接近を妨害しながらボツリヌス毒素が微粒子表面に接近するのを許容する高分子量デキストランもしくはポリアクリレートを有することができる。そのために、プロテアーゼまたは類似の酵素は、そのような選択性を強化するために、高分子量形態（例えば、高分子量分子のポリマーまたはコンジュゲートとして）で提供されてよい。
【００６８】
当業者には、本明細書に記載した以外のより多数の改変が本明細書に記載の本発明の概念から逸脱せずに可能であることは明白なはずである。このため本発明の主題は、添付の特許請求の範囲内を除いて制限されるべきではない。さらに、特許明細書および特許請求の範囲の両方を解釈する際に、全ての用語はこの状況に一致する極めて広い考えられる方法で解釈すべきである。特に、用語「含む」および「含んでいる」は、本明細書で言及した要素、成分もしくは工程が明示的には言及されない他の要素、成分または工程とともに存在してよい、もしくは利用できる、または結合できることを示している非排他的方法で要素、成分または工程を意味すると解釈すべきである。本明細書がＡ、Ｂ、Ｃ．．．．およびＮからなる群から選択される何かの少なくとも一つについて言及する場合は、本文は、Ａ＋Ｎ、またはＢ＋Ｎなどではない群からの唯一の要素を要求していると解釈すべきである。
【図１Ａ】
2020062032.tif 000003
【図１Ｂ】
2020062032.tif 000004
【図１Ｃ】
2020062032.tif 000005
【図１Ｄ】
2020062032.tif 000006
【図２Ａ】
2020062032.tif 000007
【図２Ｂ】
2020062032.tif 000008
【図２Ｃ】
2020062032.tif 000009
【図２Ｄ】
2020062032.tif 000010
【図２Ｅ】
2020062032.tif 000011
【図２Ｆ】
2020062032.tif 000012
【図２Ｇ】
2020062032.tif 000013
【図２Ｈ】
2020062032.tif 000014
【図２Ｉ】
2020062032.tif 000015
【図２Ｊ】
2020062032.tif 000016
【図２Ｋ】
2020062032.tif 000017
【図３】
2020062032.tif 000018
【図４】
2020062032.tif 000019
【図５】
2020062032.tif 000020
【図６】
2020062032.tif 000021
【図７】
2020062032.tif 000022
【図８】
2020062032.tif 000023
【図９Ａ】
2020062032.tif 000024
【図９Ｂ】
2020062032.tif 000025
【図９Ｃ】
2020062032.tif 000026
【配列表】
2020062032000001.app