(57)【要約】【課題】家禽のノックアウト卵を提供する。【解決手段】オボムコイドおよびオボアルブミンからなる群から選ばれる少なくとも１種の卵管特異的遺伝子がノックアウトされ、かつ、オボムコイドおよびオボアルブミンからなる群から選ばれる少なくとも１種の卵内アレルゲンタンパク質が低減又は消失されたノックアウト家禽の卵。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オボムコイドおよびオボアルブミンからなる群から選ばれる少なくとも１種の卵管特異的遺伝子がノックアウトされ、かつ、オボムコイドおよびオボアルブミンからなる群から選ばれる少なくとも１種の卵内アレルゲンタンパク質が低減又は消失されたノックアウト家禽の卵。
【請求項２】
請求項１記載のノックアウト家禽の卵であって、
前記ノックアウトされた卵管特異的遺伝子をコードする塩基配列において、PAM配列より5’側または3’側の領域近傍に塩基の欠失、置換、または挿入を有している、ノックアウト家禽の卵。
【請求項３】
請求項１または２に記載のノックアウト家禽の卵であって、
前記卵管特異的遺伝子がホモノックアウトされており、前記卵管特異的遺伝子の遺伝子型がnull(-/-)である、ノックアウト家禽の卵。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のノックアウト家禽の卵であって、
前記卵管特異的遺伝子がオボムコイド遺伝子である、ノックアウト家禽の卵。
【請求項５】
請求項４に記載のノックアウト家禽の卵であって、
オボムコイドをコードする塩基配列において、配列番号６(OVMTg2)に示される塩基配列に相当する領域およびその近傍領域に塩基の欠失、置換、または挿入を有している、ノックアウト家禽の卵。
【請求項６】
請求項４または５に記載のノックアウト家禽の卵であって、
内在性のオボムコイドを実質的に含まない、ノックアウト家禽の卵。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のノックアウト家禽の卵であって、
前記卵管特異的遺伝子がオボアルブミンである、ノックアウト家禽の卵。
【請求項８】
請求項７に記載のノックアウト家禽の卵であって、
オボアルブミンをコードする塩基配列において、配列番号１(OVATg1)に示される塩基配列に相当する領域およびその近傍領域に塩基の欠失、置換、または挿入を有している、ノックアウト家禽の卵。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のノックアウト家禽の卵由来のノックアウト家
禽。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノックアウト家禽の卵及びそれに由来する個体、ノックイン家禽の卵並びに濃厚卵白に関する。
また、本発明は、外因性遺伝子の発現産物の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでオボアルブミン翻訳開始点上流2.8kbpあるいはこの2.8kbpに更に上流のestrogen-responsive enhancer elementを結合したプロモーターにより卵内にヒトインターフェロンβを発現誘導する試みが行われている(非特許文献１)。この例では遺伝子導入はノックインではなく、レンチウイルスベクターを用いて行われており、ゲノム上の様々な場所に、また場合によっては複数個のベクター遺伝子が挿入されていることが示されている。このような遺伝子導入形態と一致して、卵内に分泌されるヒトインターフェロンβの濃度は大きくばらついており、６羽のニワトリの濃度平均が3.5-426μg/mlである。さらに、同一個体由来の卵であっても非常に濃度にゆらぎがありインターフェロンβの発現が極めて不安定であることがデータから読み取れる。更に、染色体上の様々な位置に挿入されているため、ジーンサイレンシング等の効果を受け、G1ニワトリでインターフェロンβを比較的多く発現したものの子孫(G2)が、総じてその発現量を減らす傾向が認められる。
【０００３】
非特許文献２では全身性に発現するアクチンプロモーターを用い、レトロウイルスベクターを用いて全身にFv-Fc蛋白質を発現するトランスジェニックキメラニワトリ(G0)を作製している。このG0ニワトリの中には5mg/mlと高濃度のFv-Fc蛋白質を発現するものも認められたが、ウイルス感染をニワトリ胚において行っている為、遺伝子の導入の有無、挿入コピー数、挿入位置が同一個体の各細胞でまちまちになるというモザイク状の遺伝子導入となっている。このため、高濃度の蛋白質を発現するG0キメラ個体の子孫のトランスジェニック個体は挿入遺伝子の数や位置がまちまちであり、G0キメラ個体の性質を完全に引き継ぐことはありえず、実際G1世代では2mg/ml以下にG1世代では0.8mg/ml以下に留まっている。また、ウイルス感染したキメラニワトリの生殖系細胞において外因性遺伝子の導入がなされていないことも多い。したがって、たまたま１羽あるいは数羽程度の蛋白質高発現ニワトリをG0世代に得ることが可能であっても、同じ性質、遺伝情報を有する個体を増やすことはできない。このようなG0個体間あるいはG0-G1世代間の不均一性は、外来蛋白質を生産するニワトリを大量に飼育することで多くの卵を得て蛋白質の大量生産を行ういわゆる「動物工場」を構築する上で致命的な欠点である。
【０００４】
非特許文献４では卵管特異的遺伝子オボアルブミンを、TALEN法を用いて遺伝子破壊した例が示されている。しかし、この文献ではオボアルブミンがヘテロ型(+/-)で欠損したヒヨコが得られたことを示すに留まり、このような家禽が将来卵を産生し得るか、またnull(-/-)の遺伝子型の卵やこれに由来する個体が得られるか、更にはホモノックアウト雌(-/-)が卵を産むか、このオボアルブミン蛋白質を消失した卵から個体を生じ得るか、予見できない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Lillico, S.G. et al. Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 1771-1776 (2007).
【非特許文献２】Kamihira et al. High-Level Expression of Single-Chain Fv-Fc Fusion Protein in Serum and Egg White of Genetically Manipulated Chickens by Using a Retroviral Vector. Journal of Virology, p.10864-10874 (2005).
【非特許文献３】van de Lavoir MC, Diamond JH, Leighton PA, Mather-Love C, Heyer BS, Bradshaw R, Kerchner A, Hooi LT, Gessaro TM, Swanberg SE et al: Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature 2006, 441(7094):766-769.
【非特許文献４】Park, T. S., Lee, H. J., Kim, K. H., Kim, J. S. & Han, J. Y. Targeted gene knockout in chickens mediated by TALENs. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12716-12721 (2014).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、卵管特異的遺伝子にコードされるタンパク質の発現量を低減もしくは消失させた家禽卵を提供することを目的とする。
また、本発明は、外因性遺伝子の発現が安定し、かつ、遺伝子産物発現量の多い家禽卵を提供することを目的とする。
さらに、本発明はノックイン技術により鶏卵に外来遺伝子産物を発現した際に効率良く外来遺伝子産物を回収する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下のノックアウト家禽の卵及びノックイン家禽の卵を提供するものである。またノックイン家禽の卵から効率良く外来遺伝子産物を調製する方法を提供するものである。
本発明は、一態様において、
〔１〕オボアルブミン、オボムコイド、オボムチン、オボトランスフェリン、オボインヒビター及びリゾチームからなる群から選ばれる少なくとも１種の卵管特異的遺伝子がノックアウトされ、かつ、オボアルブミン、オボムコイド、オボムチン、オボトランスフェリン、オボインヒビター及びリゾチームからなる群から選ばれる少なくとも１種の卵内アレルゲンタンパク質が低減又は消失されたノックアウト家禽の卵に関する。
【０００８】
ここで、本発明のノックアウト家禽の卵は、一実施の形態において、
〔２〕上記〔１〕に記載のノックアウト家禽の卵であって、
前記ノックアウトされた卵管特異的遺伝子をコードする塩基配列において、PAM配列より5’側または3’側の領域近傍に塩基の欠失、置換、または挿入を有していることを特徴とする。
また、本発明のノックアウト家禽の卵は、一実施の形態において、
〔３〕上記〔１〕または〔２〕に記載のノックアウト家禽の卵であって、
前記卵管特異的遺伝子がホモノックアウトされており、前記卵管特異的遺伝子の遺伝子型がnull(-/-)であることを特徴とする。
また、本発明のノックアウト家禽の卵は、一実施の形態において、
〔４〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のノックアウト家禽の卵であって、
前記卵管特異的遺伝子がオボアルブミンであることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明のノックアウト家禽の卵は、一実施の形態において、
〔５〕上記〔４〕に記載のノックアウト家禽の卵であって、
オボアルブミンをコードする塩基配列において、配列番号１(OVATg1)に示される塩基配列に相当する領域およびその近傍領域に塩基の欠失、置換、または挿入を有していることを特徴とする。
また、本発明のノックアウト家禽の卵は、一実施の形態において、
〔６〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のノックアウト家禽の卵であって、
前記卵管特異的遺伝子がオボムコイド遺伝子であることを特徴とする。
また、本発明のノックアウト家禽の卵は、一実施の形態において、
〔７〕上記〔６〕に記載のノックアウト家禽の卵であって、
オボムコイドをコードする塩基配列において、配列番号６(OVMTg2)に示される塩基配列に相当する領域およびその近傍領域に塩基の欠失、置換、または挿入を有していることを特徴とする。
また、本発明のノックアウト家禽の卵は、一実施の形態において、
〔８〕上記〔６〕または〔７〕に記載のノックアウト家禽の卵であって、
内在性のオボムコイドを実質的に含まないことを特徴とする。
【００１０】
また、本発明は、別の態様において、
〔９〕上記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載のノックアウト家禽の卵由来のノックアウト家禽に関する。
【００１１】
また、本発明は、別の態様において、
〔１０〕卵管特異的遺伝子プロモーターの制御下に外因性遺伝子がホモ又はヘテロでノックインされ、かつ、外因性遺伝子の発現産物が卵内で安定高発現しているノックイン家禽の卵であって、
前記卵管特異的遺伝子プロモーターが、オボアルブミン、オボムコイド、オボムチン、オボトランスフェリン、オボインヒビター及びリゾチームからなる群から選ばれる少なくとも１種の卵管特異的遺伝子のプロモーターである、ノックイン家禽の卵に関する。
【００１２】
ここで、本発明のノックイン家禽の卵は、一実施の形態において、
〔１１〕上記〔１０〕に記載のノックイン家禽の卵であって、
前記卵管特異的遺伝子プロモーターが、オボアルブミン遺伝子のプロモーターであり、前記外因性遺伝子が薬剤耐性遺伝子とともにオボアルブミン遺伝子のエクソン２に挿入されていることを特徴とする。
また、本発明のノックイン家禽の卵は、一実施の形態において、
〔１２〕上記〔１０〕または〔１１〕に記載のノックイン家禽の卵であって、
前記外因性遺伝子が、オボアルブミンをコードする塩基配列における配列番号１(OVATg1)に示される塩基配列に相当する領域およびその近傍、または、配列番号２４(OVATg2)に示される塩基配列に相当する領域およびその近傍に挿入されていることを特徴とする。
また、本発明のノックイン家禽の卵は、一実施の形態において、
〔１３〕上記〔１０〕〜〔１２〕のいずれかに記載のノックイン家禽の卵であって、
前記外因性遺伝子によりコードされるタンパク質が、卵１個あたり1mg以上で含まれることを特徴とする。
また、本発明のノックイン家禽の卵は、一実施の形態において、
〔１４〕上記〔１０〕〜〔１３〕のいずれかに記載のノックイン家禽の卵であって、
前記外因性遺伝子の発現産物が濃厚卵白に優位に発現することを特徴とする。
また、本発明のノックイン家禽の卵は、一実施の形態において、
〔１５〕上記〔１０〕〜〔１４〕のいずれかに記載のノックイン家禽の卵であって、
前記外因性遺伝子が、インターフェロンβ、免疫グロブリン、または、コラーゲンをコードする遺伝子であることを特徴とする。
また、本発明のノックイン家禽の卵は、一実施の形態において、
〔１６〕上記〔１０〕〜〔１５〕のいずれかに記載のノックイン家禽の卵であって、
前記外因性遺伝子がヒト由来の遺伝子であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明は、別の態様において、
〔１７〕オボアルブミン遺伝子プロモーターの制御下に外因性遺伝子がホモ又はヘテロでノックインされたノックイン家禽の卵由来の濃厚卵白であって、
安定高発現している前記外因性遺伝子の発現産物を優位に含む、濃厚卵白に関する。
【００１４】
また、本発明は、別の態様において、
〔１８〕外因性遺伝子の安定高発現により前記外因性遺伝子の発現産物を含む、ノックイン家禽の卵を作製する方法であって、
（ａ）家禽始原生殖細胞の卵管特異的遺伝子プロモーターの制御下に前記外因性遺伝子をノックインする工程と、
（ｂ）前記家禽生殖細胞を用いて、前記卵管特異的遺伝子プロモーターの制御下に前記外因性遺伝子をホモ又はヘテロでノックインした雌家禽を作製する工程と、
（ｃ）前記雌家禽から得られた前記外因性遺伝子を発現する家禽卵を得る工程と
を含む、方法に関する。
【００１５】
ここで、本発明の外因性遺伝子の安定高発現により前記外因性遺伝子の発現産物を含む、ノックイン家禽の卵を作製する方法は、一実施の形態において、
〔１９〕上記〔１８〕に記載の外因性遺伝子の安定高発現により前記外因性遺伝子の発現産物を含む、ノックイン家禽の卵を作製する方法であって、
前記工程(ａ)が、(ｉ)前記卵管特異的遺伝子プロモーターの制御下にある翻訳開始点の5’側領域、前記外因性遺伝子、薬剤耐性遺伝子ユニット、および、前記翻訳開始点の3’側領域を含むドナーコンストラクトと、(ｉｉ)標的配列、および、異なる薬剤耐性遺伝子ユニットを含むベクターとを用いて、前記外因性遺伝子をゲノム編集により導入する工程であることを特徴とする。
また、本発明の外因性遺伝子の安定高発現により前記外因性遺伝子の発現産物を含む、ノックイン家禽の卵を作製する方法は、一実施の形態において、
〔２０〕上記〔１９〕に記載の外因性遺伝子の安定高発現により前記外因性遺伝子の発現産物を含む、ノックイン家禽の卵を作製する方法であって、
前記工程(ａ)における前記卵管特異的遺伝子プロモーターが、オボアルブミン遺伝子プロモーターであって、
前記工程(ｄ)が、前記家禽卵の濃厚卵白から前記外因性遺伝子の発現産物を回収する工程であることを特徴とする。
また、本発明の外因性遺伝子の安定高発現により前記外因性遺伝子の発現産物を含む、ノックイン家禽の卵を作製する方法は、一実施の形態において、
〔２１〕上記〔１９〕または〔２０〕に記載の外因性遺伝子の安定高発現により前記外因性遺伝子の発現産物を含む、ノックイン家禽の卵を作製する方法であって、
前記工程(ａ)が、(ｉ)オボアルブミン翻訳開始点の5’側2.8kb、前記外因性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子ユニット、および、オボアルブミン翻訳開始点の3’側3.0kbを含むドナーコンストラクトと、(ｉｉ)前記標的配列としての配列番号２４に示される塩基配列、および、ネオマイシン耐性遺伝子ユニットを含むベクターとを用いて、前記外因性遺伝子をCRISPRにより導入する工程であることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明は、別の態様において、
〔２２〕ノックイン家禽の卵より外因性遺伝子の発現産物を調製する方法であって、
上記〔１８〕〜〔２１〕のいずれかに記載の方法における前記工程(ｃ)の後に、(ｄ)前記家禽卵から前記外因性遺伝子の発現産物を回収する工程をさらに含む、方法に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のノックイン家禽の卵は、全身で同一場所に同一の外因性遺伝子(非家禽由来の遺伝子)挿入がなされたノックイン家禽個体により生産され、個体間での蛋白質発現量の差異は小さく、世代を超えてその遺伝情報と形質を正しく伝播することが出来る。さらに、遺伝子ノックインの位置を卵管特異的遺伝子にすることで外因性遺伝子発現を卵管に限局できる。このため全身性に発現させた場合と比べて発生過程やニワトリの健康に影響をおよぼす可能性が明らかに少なく、優れている。加えてオボムコイドなど卵白で高発現する遺伝子の制御下に外因性遺伝子を発現させることで外因性遺伝子の発現効率が高くなり、さらに好ましい。加えて、遺伝子ノックインをゲノム編集により行うと効率良くノックインニワトリが樹立可能であるが、このような新しい技法を用いても卵管に外来遺伝子を発現可能なこと、卵白に外来遺伝子発現産物が蓄積されることを確認した。また、外来遺伝子由来産物が卵白内の濃厚卵白に多く存在することを初めて明らかにし、これにより外来遺伝子産物を含む卵、好ましい実施形態では卵白遺伝子の遺伝子座に外来遺伝子をノックインした卵の濃厚卵白を含む領域を回収することで効率良く外来遺伝子由来産物を回収することができる。
本発明のノックアウト家禽の卵は、ノックアウトされる遺伝子が卵管特異的遺伝子であり、発生に影響することが懸念されるが、本発明者は、このようなノックアウト家禽の卵が得られることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ニワトリオボアルブミン遺伝子の標的配列(OVATg1の標的配列)。大文字がsgRNA認識部位、隣接する下線部がPAM配列を示す。
【図２】ニワトリオボムコイド遺伝子の標的配列(OVMTg2の標的配列)。大文字がsgRNA認識部位、隣接する下線部がPAM配列を示す。
【図３】CRISPRによるオボアルブミン遺伝子破壊例。大文字(下線)がsgRNA認識部位、隣接する囲い部分がPAM配列を示す。変異した配列の欠失部は-(ハイフン)、変異部は大文字で表記。OVATg1のMetは翻訳開始部位を示す。
【図４Ａ】CRISPRによるオボムコイド遺伝子破壊例。大文字(下線)がsgRNA認識部位、隣接する囲い部分がPAM配列を示す。
【図４Ｂ】上段：オボムコイド遺伝子が破壊されたニワトリの例。写真の移植始原生殖細胞由来ニワトリ(黒)のオボムコイド遺伝子は片アレルで図２のTg2領域の5塩基が欠損している。ニワトリゲノムの当該領域をセンス側、アンチセンス側それぞれから塩基配列を解析した結果を示す。下段：ニワトリ個体に認められたオボムコイド遺伝子変異の例(F1ニワトリ)。１から３１塩基の欠損が認められた。
【図５Ａ】オボアルブミン遺伝子座へのヒトインターフェロンβ遺伝子ノックインとゲノムPCRによるノックインの証明。プライマー１(P1)〜プライマー８(P8)は以下の配列に対応。P1:配列15、P2:配列17、P3:配列16、P4:配列14、P5:配列18、P6:配列20、P7:配列21、P8:配列19。Nested PCRの結果、ノックイン始原生殖細胞(PGCs)由来ゲノムにのみ想定サイズの増幅産物を認める(写真、矢印).
【図５Ｂ】キメラニワトリ精子におけるオボアルブミン遺伝子座へのヒトインターフェロンβ遺伝子ノックインの証明。４羽のキメラニワトリ(411-414)、１羽のネガティブコントロールニワトリ(416、NC)の精液ゲノム及びノックイン細胞(PCIFNKI#4)ゲノムを配列１８と１９(3’UTR)、配列１５と14(5’OVAp_out-IFN)、配列１５と２２(5’OVAp_out-OVA(ATG))のプライマーを用いて増幅した。予期されるサイズに出現したバンドを*で示す。411，412においてポジティブコントロールと同程度の相対強度のノックインシグナルを認める。
【図５Ｃ】オボアルブミン遺伝子座にヒトインターフェロンβ遺伝子がノックインされたニワトリ。図５Ｂの411と412の後代ニワトリ(雌)の写真および、後代血液由来ゲノムをPCR解析し、オボアルブミン遺伝子座にIFNドナーコンストラクトがノックインされたことを示す。野生型(WT：ネガティブコントロール)ニワトリの血液、ノックイン後代(KI)ニワトリの血液ゲノム及びノックイン細胞(KI PGC：ポジティブコントロール)由来ゲノムを配列18と19(ノックイン3’領域)、配列１５と１４(ノックイン5’領域)、配列１５と２２(内在性オボアルブミン)のプライマーを用いて増幅した。予期されるサイズに出現したバンドを*で示す。411，412後代においてポジティブコントロールと同パターンのシグナルを認め、後代ニワトリのオボアルブミン遺伝子座にIFNドナーコンストラクトがノックインされたと判断できる。
【図６Ａ】ニワトリオボアルブミン遺伝子の標的配列(２ヶ所, OVATg1とOVATg2の標的配列)。大文字がsgRNA認識部位、隣接する下線部がPAM配列を示す。
【図６Ｂ】ニワトリ始原生殖細胞オボアルブミン遺伝子座への遺伝子ノックインの効率化。導入群１と導入群２ではノックインの効率は変わっておらず、細胞数は導入群２の方が多いことから、導入群２の導入法がより好ましい。導入群２と導入群３では導入群３の方がノックイン効率が高いと考えられ、導入群３の導入法がより好ましい。
【図７】オボアルブミン遺伝子座へのヒト免疫グロブリン遺伝子ノックインとゲノムPCRによるノックインの証明。プライマー１(P1)〜プライマー８(P8)は以下の配列に対応。P1:配列15、P2:配列17、P3:配列29、P4:配列28、P5:配列18、P6:配列20、P7:配列21、P8:配列19。Nested PCRの結果、ノックイン始原生殖細胞(PGCs)由来ゲノムにのみ想定サイズの増幅産物を認める(写真、矢印)
【図８】オボアルブミン遺伝子座へのヒトコラーゲン遺伝子ノックインとゲノムPCRによるノックインの証明。プライマー１(P1)〜プライマー８(P8)は以下の配列に対応。P1:配列15、P2:配列17、P3:配列29、P4:配列28、P5:配列18、P6:配列20、P7:配列21、P8:配列31。Nested PCRの結果、ノックイン始原生殖細胞(PGCs)由来ゲノムにのみ想定サイズの増幅産物を認める(写真、矢印)
【図９】インターフェロンβノックイン雌ニワトリの生産する卵の像。卵黄周囲の濃厚卵白に白濁が認められる。
【図１０】卵白成分の抗ヒトインターフェロンβ抗体を用いたウエスタンブロット像。ノックインニワトリ由来卵に組換えヒトインターフェロンβ(矢印部)が発現し、水溶性卵白よりも濃厚卵白において単位体積あたりより多くのヒトインターフェロンβ蛋白質が存在する。相対濃度で濃厚卵白のほうが水溶性卵白の100倍多いことがわかる。
【図１１】ヒトインターフェロンβノックインニワトリの産んだ卵白におけるヒトインターフェロンβの分布。複数のニワトリ由来卵(KI egg1, 2)において水溶性卵白よりも濃厚卵白で多くのインターフェロンβ蛋白質が認められる(囲い部分)。濃厚卵白中の組換えヒトインターフェロンβは約50mg/mlの濃度で存在するオボアルブミン蛋白質の十分の一であるから(黒矢印)約5mg/ml程度と推定される。
【図１２】インターフェロンβノックインニワトリの産む卵に含まれるインターフェロンβ蛋白質発現の安定性。１週間に渡り(d1〜d7)、卵を採取し、濃厚卵白に含まれるヒトインターフェロンβをCBB染色により同定した。期間中安定したインターフェロンβの発現が認められた。
【図１３】濃厚卵白遠心後の白色沈殿像  無処理１および様々な処理(２−１０)を加えたインターフェロンβノックインニワトリの産む卵の濃厚卵白を遠心し、白色沈殿の量を比較した。２−１０はいずれも１に比べると白色沈殿量が減少している。図１３ではそれぞれのチューブに濃厚卵白液200μlを加え、3Mの飽和アルギニン溶液４倍量(800μｌ)を加え転倒混和したもの(チューブ２)、3Mの飽和アルギニン溶液４倍量(800μl)を加え超音波破砕を行ったもの(チューブ３)、少量のアルギニン(20mg)を加え転倒混和したのちPBSにより1mlにしたもの(チューブ４)、少量のアルギニン塩酸塩(20mg)を加え転倒混和したのちPBSにより1mlにしたもの(チューブ５)、PBSにより1mlにし、超音波破砕を行ったもの(チューブ６)、飽和量以上のアルギニン塩酸塩(200mg)を加えて転倒混和したもの(チューブ７)、3Mの飽和アルギニン溶液２倍量(400μl)を加え超音波破砕を行ったもの(チューブ８)、少量のアルギニン塩酸塩(20mg)を加え超音波破砕したもの(チューブ９)、少量の食塩(40mg)を加え超音波破砕したもの(チューブ１０)である。20k×Gで15分遠心すると白色沈殿は認められるが、いずれも無処理(チューブ１)の場合より減少しており、特に超音波破砕を行ったもののうちチューブ３，６，８，９で顕著に減少していた。
【図１４】様々な処理を行った濃厚卵白上清の電気泳動像。レーン０は遠心処理を行っていない濃厚卵白をレーン１−１０は図１３のチューブ１−１０の上清をそれぞれ泳動に供される大元の卵白量を同一にして泳動したものである。黒矢印がヒトインターフェロンβのバンドを示す。
【図１５】ヒトインターフェロンβノックインニワトリ由来卵に含まれるヒトインターフェロンβの活性。濃厚卵白粗精製物、濃厚卵白遠心上清、水溶性卵白いずれにおいてもヒトインターフェロンβの活性が認められる。
【図１６】オボムコイドヘテロノックアウト(G1世代:ORF5塩基欠損)雄、雌とその後代に認められるオボムコイドヘテロ、ホモノックアウトおよび野生型ニワトリのゲノム。
【図１７】異なるG1個体から得られた濃厚卵白の電気泳動像。野生型ニワトリ(ctrl)由来濃厚卵白、５羽(＃584,＃766,＃714,＃645,＃640)のヒトインターフェロンβノックインニワトリ由来の濃厚卵白をそれぞれ電気泳動している。矢印がヒトインターフェロンβのバンドを示す。
【図１８】ヒトインターフェロンβノックインニワトリ由来卵に含まれるヒトインターフェロンβ(下段)と市販の組換えヒトインターフェロンβ(上段)との活性比較。バイオアッセイ用細胞の培養上清をQuanti-Blue基質液に添加した像。バイオアッセイ時に細胞に添加する卵白上清ならびに市販インターフェロンβを5倍ずつ段階的に希釈しており、基質液の変色から0.01μg/μlの市販インターフェロンβに対して卵白上清は625倍以上の濃度のインターフェロンβを含むとわかる。
【図１９】G1世代とG2世代ヒトインターフェロンβノックインニワトリ由来卵におけるインターフェロンβ蛋白質(左)。G1由来卵とG2(３羽の雌ニワトリ)由来卵の濃厚卵白内のヒトインターフェロンβ濃度はほぼ同等である。またG2由来卵もG1由来卵と同様に白濁する。
【図２０】オボアルブミン遺伝子座へヒト抗体遺伝をノックインしたニワトリ由来卵白の抗ヒト免疫グロブリン抗体を用いたウエスタンブロット像。ノックインニワトリ由来卵(hIgG KI)には野生型(ctrl)由来卵白中に存在しない組換えヒト抗体(矢印部ｈIgG)が発現する(左図)。また、非還元状態で電気泳動すると市販のヒト抗体(Herceptin)と同じ移動度を呈することから抗体複合体を形成することがわかる(右図)。1/2k(1/2000), 1/200, 1/20は卵白の希釈率を示す。バンド濃度から推定し、抗体複合体の濃度は1mg/ml以上である。
【図２１】オボムコイドホモノックアウト(OVM-/-、G2世代)由来の卵。卵は外見上野生型のものと著しい違いを認めず(左図)、卵白、卵黄とも加熱によって凝固するため(右図)、調理等加工する上で野生型の卵と同様に扱うことが可能である。
【図２２】オボムコイドホモノックアウト(OVM-/-、G2世代)由来の卵を孵化させて得られたG3世代のオボムコイドホモノックアウト個体(上図)。OVM-/-雌とOVM-/-雄を交配し得られた。内在性のオボムコイド遺伝子だけでなく卵のオボムコイドが存在せずともニワトリは発生できる。フラグメント解析により、オボムコイド遺伝子が欠損している領域が5bpホモ欠損していることがわかる(下図)。
【図２３】４系統のインターフェロンβ雌ノックインニワトリ由来卵の写真。図９と同様に全て濃厚卵白が白濁している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明では、家禽の始原生殖細胞の遺伝子をゲノム編集により改変し、遺伝子改変した始原生殖細胞に由来するノックイン又はノックアウトの雌家禽を得、この雌から本発明のノックイン又はノックアウト家禽の卵を得る。
【００２０】
本明細書において、「ノックアウト家禽の卵」は、ノックアウトされた遺伝子の遺伝子型がヘテロ(+/-)あるいはホモ(-/-； null)の雌の家禽が産んだ卵の両方を含む。ノックアウトされる遺伝子が卵管で発現し、卵白に集積する卵内アレルゲンの遺伝子の場合、ヘテロノックアウト家禽の卵では卵内アレルゲンタンパク質が低減されたノックアウト家禽の卵になる。一方、ホモノックアウト雌の家禽が産んだ卵は、卵内アレルゲンタンパク質が消失されたノックアウト家禽の卵になる。
本明細書において、「ノックイン家禽の卵」は、ノックインされた遺伝子の遺伝子型がヘテロ(+/-)の雌の家禽が産んだ卵、或いは、ノックインされた遺伝子の遺伝子型がホモ(+/+)の家禽受精卵の両方を含む。ノックインされた遺伝子の遺伝子型がヘテロ(+/-)の雌の家禽が産んだ卵と比較して、ノックインされた遺伝子の遺伝子型がホモ(+/+)の雌の家禽が産んだ卵の方が、外因性遺伝子の発現産物が多く含まれる。
【００２１】
ゲノム編集は、二本鎖DNAの切断とその修復のエラーを利用して遺伝子改変を行う技術であり、標的の二本鎖DNAを切断できるヌクレアーゼ、前記ヌクレアーゼと結合もしくは複合化したDNA認識成分を使用することができる。ゲノム編集としては、ZFN(zinc finger nuclease)、TALEN、CRISPRが挙げられる。例えば、ZFNでは、FokI(ヌクレアーゼ)とジンクフィンガーモチーフ(DNA認識成分)が用いられ、TALENでは、FokI(ヌクレアーゼ)とTALエフェクター(DNA認識成分)が用いられ、CRISPRでは、Cas9(ヌクレアーゼ)とguide RNA(gRNA, DNA認識成分)が用いられる。ゲノム編集に用いられるヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性を有していればよく、ヌクレアーゼ以外にDNAポリメラーゼ、リコンビナーゼなどを用いることもできる。
【００２２】
家禽としては、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、オナガドリ、チャボ、ハト、ダチョウ、キジ、ホロホロチョウなどが挙げられ、好ましくはニワトリ、ウズラなどが挙げられる。
始原生殖細胞は雄と雌のいずれでもよい。ニワトリなどの家禽始原生殖細胞は浮遊性の細胞であり、BRL細胞やSTO細胞などのフィーダー細胞存在下で培養される。または適当なサイトカインを培地に添加することでフィーダー細胞非存在下で培養しても良い。
【００２３】
ゲノム編集により改変される遺伝子は、卵管特異的遺伝子であり、具体的にはオボアルブミン、オボムコイド、オボムチン、オボトランスフェリン、オボインヒビター、リゾチームなどが挙げられる。
ゲノム編集により遺伝子機能はノックアウトにより消失する。ゲノム編集により、遺伝子の少なくとも１つの塩基が欠失もしくは挿入する場合、フレームシフトにより遺伝子機能は消失し得、フレームシフトが起こらない場合でも一部のアミノ酸が欠失することで機能が消失し得る。また、欠失や置換によって終止コドンが生じて機能が消失することもある。
【００２４】
ゲノム編集により外因性遺伝子をノックインする場合、外因性遺伝子が卵管特異的遺伝子座にノックインされると、卵管特異的遺伝子の発現産物の代わりに外因性遺伝子の発現産物を含む卵が得られるので好ましい。このような外因性遺伝子の発現産物であるタンパク質としては、様々な分泌性のタンパク質やペプチドが考えられ、抗体(モノクローナル抗体)又はその断片(例えばscFv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、一本鎖抗体、scFv、dsFvなど)、酵素、ホルモン、成長因子、サイトカイン、インターフェロン、コラーゲン、細胞外マトリクス分子、ワクチンなどの機能性ポリペプチド、アゴニスト性タンパク質、アンタゴニスト性タンパク質などが挙げられる。外因性遺伝子がコードするタンパク質は、ヒトに投与する医薬になり得る生理活性タンパク質の場合、哺乳動物由来、好ましくはヒト由来である。また、プロテインＡや蜘蛛の糸を構成するタンパク質などの工業的に使用可能なタンパク質の場合、微生物(細菌、酵母など)、植物、動物を含む任意の生物由来のタンパク質、あるいは人工的なタンパク質をコードする外因性遺伝子が挙げられる。
【００２５】
外因性遺伝子は単一の遺伝子であっても複数の遺伝子であっても良い。複数の遺伝子の場合には、複数の遺伝子が卵管特異的遺伝子の制御下に発現できればよく、複数の遺伝子をIRESなどの配列を介在させて発現させたり、2Aペプチドをコードする配列などを介在させて複数の蛋白質をオボアルブミンプロモーターの制御下に一度に発現させ、ペプチドを切断する形で発現させても良い。
外因性タンパク質は、適切なシグナルペプチドを付加してもよく、家禽類で発現しやすくするためにコドンユーセージを変更してもよい。
【００２６】
本発明のノックイン家禽の卵の好ましい一実施の形態においては、外因性遺伝子の発現産物は濃厚卵白に優位に発現する。ここで「優位」とは、(ア)濃厚卵白における外因性遺伝子の発現量が、質量でノックイン卵全体における外因性遺伝子の発現量に対して50％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上或いは98％以上であることを意味するか、または、(イ)濃厚卵白以外の卵中における外因性遺伝子の発現量と比較した際に、濃厚卵白における外因性遺伝子の発現量の相対濃度が1.1倍以上、好ましくは2倍以上、より好ましくは10倍以上で発現することを意味する。濃厚卵白にはノックインされた外因性遺伝子の発現産物が濃縮されているので、精製が容易である。また、外因性遺伝子の発現産物は活性型で発現され得る。濃厚卵白は、外因性遺伝子の発現産物により白濁することがあるが、白濁したタンパク質は、超音波処理、アルギニン塩酸塩などの可溶化剤の添加などにより容易に可溶化することができる。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態において、濃厚卵白に発現されたノックイン遺伝子の発現産物は、溶解状態であってもよく、非溶解状態であってもよい。非溶解状態のノックイン遺伝子の発現産物は、活性なタンパク質として精製可能である。ノックイン遺伝子の発現産物は、可溶化して精製することが望ましい。精製には、カラム、透析などの通常の精製手段が使用される。ゲノム編集としては、ジンクフィンガー、TALEN、CRISPRなどが挙げられ、TALEN、CRISPRが好ましく、CRISPRがより好ましい。ゲノム編集の方法は次々に開発されてきており、これらに限定されず、今後開発されるゲノム編集方法は全て本発明で使用可能である。
【００２８】
ゲノム編集によりノックインを行う場合、薬剤耐性遺伝子を有用な外因性遺伝子とともにゲノムに安定的に組み込み、それによりノックインされた始原生殖細胞を選別するのが好ましい。薬剤耐性遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子(Neor)、ハイグロマイシン耐性遺伝子(Hygr)、ピューロマイシン耐性遺伝子(Puror)、ブラストサイジン耐性遺伝子(blastr)、ゼオシン耐性遺伝子(Zeor)などが挙げられ、ネオマイシン耐性遺伝子(Neor)あるいはピューロマイシン耐性遺伝子(Puror)が好ましい。
【００２９】
外因性遺伝子を卵管特異的遺伝子座にノックインする場合、卵管特異的遺伝子の翻訳開始点に外因性遺伝子の翻訳開始点を合致させることが好ましい。外因性遺伝子は一本鎖や二本鎖の核酸として始原生殖細胞に導入されれば良く、二本鎖の核酸の場合、プラスミドベクターやBAC(bacterial artificial chromosome)ベクター等の形で導入されれば良い。ノックインにより翻訳開始点を合致させる場合には卵管特異的遺伝子の翻訳開始点周辺の遺伝子配列を外因性遺伝子の翻訳開始点の直前に挿入すれば良い。
卵管特異的遺伝子としてオボアルブミン遺伝子を選択し、オボアルブミン遺伝子プロモーター制御下に外因性遺伝子を導入する場合、好ましい形態として、当該外因性遺伝子の５’端が、オボアルブミンをコードする塩基配列における配列番号１(OVATg1)に示される塩基配列に相当する領域、または、配列番号２４(OVATg2)に示される塩基配列に相当する領域に挿入された形態を挙げることができる。より好ましくはオボアルブミンの翻訳開始点に外因性遺伝子の翻訳開始点を挿入すれば良い。
【００３０】
外因性遺伝子を卵管特異的遺伝子座にノックインし、このニワトリ個体を得て、卵を得た場合、外因性遺伝子産物を回収するために、卵の卵白を回収することが望ましい。更に効率よく回収するためには卵黄周囲にある濃厚卵白を含む領域を回収することが望ましい。
【００３１】
ゲノム編集を行い遺伝子機能をノックアウトにより消失させる場合、上記薬剤耐性遺伝子をゲノム編集を行う際の遺伝子導入時に始原生殖細胞に導入し、薬剤耐性遺伝子に基づき選別することが好ましい。薬剤耐性遺伝子の導入と薬剤選択は安定的でも一過的でも良く、ノックアウトの場合一過的が望ましい。薬剤耐性遺伝子は上記のものなどが挙げられ、ピューロマイシン耐性遺伝子(Puror)あるいはゼオシン耐性遺伝子(Zeor)が好ましい。薬剤耐性遺伝子はジンクフィンガー、TALEN、CRISPRプラスミドと独立した形でも、プラスミドに組み込まれる形でも良く、薬剤耐性遺伝子がゲノム編集の為のプラスミドに組み込まれる形が好ましい。
【００３２】
本発明において卵管特異的遺伝子をノックアウトする際、ノックアウトの対象となる卵管特異的遺伝子をコードする塩基配列において、塩基の欠失、置換、または挿入を生じさせることにより、当該卵管特異的遺伝子にフレームシフトやナンセンス変異を起こさせて、タンパク質が発現しないようにすることができる。例えば、CRISPRを用いてノックアウトを行うとき、PAM配列より5’側または3’側の領域近傍に塩基の欠失、置換、または挿入を生じさせることができる。PAM配列より5’側または3’側の領域近傍とは、例えば、PAM配列より約1〜50塩基、好ましくは約1〜15塩基以内とすることができる。
本発明のノックアウト家禽の卵は、一実施の形態として、以下に限定されないが、卵管特異的遺伝子としてオボアルブミン、または、オボムコイドをノックアウトした形態を挙げることができる。卵管特異的遺伝子として、オボアルブミンをノックアウトする際の好ましい一実施の形態としては、配列番号１(OVATg1)に示される塩基配列に相当する領域およびその近傍領域に塩基の欠失、置換、または挿入を生じさせることができる。また、卵管特異的遺伝子として、オボムコイドをノックアウトする際の好ましい一実施の形態としては、配列番号６(OVMTg2)に示される塩基配列に相当する領域およびその近傍領域に塩基の欠失、置換、または挿入を生じさせることができる。
ここで、例えば、「配列番号１(OVATg1)に示される塩基配列に相当する領域」というとき、オボムコイド遺伝子のホモログにおける対応する領域も含み、当業者であれば、対象の家禽により当該塩基配列に相当する領域を把握することができる。
オボムコイドの分泌前蛋白質は、(開始メチオニンを１として)210アミノ酸(210aa)より構成され、1-24aaにシグナルペプチドを有する。また、配列番号１(OVATg1)のPAM配列は、38-39aa部に相当する。よって、本発明のオボムコイド遺伝子をノックアウトした家禽の卵は、一実施の形態において、少なくとも160aa以降を含まない、好ましくは100aa以降を含まない、より好ましくは38aa以降を含まないオボムコイド変異蛋白質を発現する。
また、本発明のオボムコイド遺伝子をノックアウトした家禽の卵は、好ましい実施の形態において、内在性のオボムコイドを実質的に含まない。内在性のオボムコイドを実質的に含まないとは、ノックアウト雌家禽のオボムコイド遺伝子がホモでノックアウトされることにより、当該ノックアウト雌家禽より産生される卵中に、内在性のオボムコイドが消失している状態をいう。
【００３３】
１つの実施形態において、本発明の遺伝子改変方法により得られた、遺伝子改変された家禽始原生殖細胞から常法に従い遺伝子改変された家禽を生産することができる。さらに遺伝子改変された家禽から卵(ノックイン及びノックアウト)を得ることが出来る。具体的な手順を以下に示す。
【００３４】
遺伝子改変された始原生殖細胞をレシピエント初期胚の胚盤葉、血液中もしくは生殖巣領域に移植する。好ましくは孵卵後2〜3日程度、血流循環開始前後の時期の血流中に数百から数千個程度の細胞を顕微注射により移植する。また、移植前にレシピエントの内在性の始原生殖細胞を薬剤や電離放射線により予め不活化させたり、数を減らしても良い。移植胚を常法に従って孵卵操作を継続し、移植個体を孵化させる。移植、孵化操作は卵殻の変更を含むシステム培養であっても、卵殻の変更を行わない窓開け法でも良い。孵化した個体は通常の飼育により生体(キメラ個体)として性成熟させることが出来る。これを野生型もしくは遺伝子改変個体あるいは遺伝子改変キメラ個体と交配することにより移植細胞由来の遺伝子改変の生じた家禽を後代として生産できる。本発明で得られるゲノム編集された始原生殖細胞は増殖能力が高く、キメラ個体において数多くの受精能力の高い精子或いは卵子になる。この際、効率を上げるために、配偶子のゲノムに含まれる遺伝子改変の頻度を調査し、移植細胞の寄与率を評価した上で交配試験を行ったり、後代の羽毛色による判定を行ったりしてもよい。遺伝子改変された雌始原生殖細胞を移植した雌キメラ家禽と雄始原生殖細胞を移植した雄キメラ家禽交配させることで、ホモ型の遺伝子改変家禽を得ることができる。また、家禽個体内に限らず、将来in vitroで始原生殖細胞を生殖細胞に分化させる等の技術が開発された場合には、これを用いた人工受精や顕微授精により遺伝子改変された家禽を生産することができる。
【００３５】
図２、図４Ａ、図４Ｂ、図１６において、OVMTg2のPAM配列は「agg」であるが、ニワトリのオボムコイドのOVMTg2に対応する配列はNCBIのデータベースで２種類あり、OVMTg2の配列は、TTTCCCAACGCTACAGACA(t or a)ggと表記し得る。本発明は、このような多型を全て包含する。
【００３６】
本発明の他の実施形態において、ゲノム編集は始原生殖細胞の培養を経由せずに、初期胚に各種ウイルスベクターを感染させて或いはプラスミドベクターをリポソーム複合体として初期胚血液中に注入することで、内在性の始原生殖細胞を遺伝子操作し、キメラ個体及び組換え後代を樹立してもよい。ゲノム編集により得られる始原生殖細胞は遺伝子改変効率が高く、かつ、家禽の組み換え後代や遺伝子改変後代を得るのに十分高い生殖能力を有しており、この実施形態においても有用である。本実施形態においては、始原生殖細胞の培養操作を伴うことなく(内在性の)始原生殖細胞の遺伝子改変が可能である。
【００３７】
ゲノム編集による遺伝子操作に用いるウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。これらのウイルスベクターは、培養始原生殖細胞あるいは内在性の始原生殖細胞のゲノム編集のいずれにも使用できる。
例えば、内在性の始原生殖細胞をゲノム編集を用いて改変するには、各社から販売されているゲノム編集用ウイルスベクターを用いて任意の標的配列を認識、切断するヌクレアーゼやsgRNAを発現するウイルスベクターを構築し、パッケージングにより感染可能な形態とし、家禽初期胚の胚盤葉、血液や生殖巣領域等始原生殖細胞の存在する場所に投与することで始原生殖細胞におけるゲノム編集を行い、後代に遺伝子改変個体や遺伝子改変産物を得ることが可能である。市販のゲノム編集用ウイルスベクターは国内外の多くの会社が販売しているが、例えばアデノ随伴ベクターを用いたTakara社の「AAVpro(登録商標) CRISPR/Cas9 Helper Free System (AAV2)」やレンチウイルスベクターを用いたSystem Biosciences, LLCの「Lentiviral CRISPR/ Cas9 System」などが挙げられる。遺伝子改変がノックインの場合、ゲノム編集に必要なウイルスベクターとノックインされる遺伝子を含むウイルスベクター、プラスミド、Bacベクター、一本鎖や二本鎖のDNA等を併用することができる。
【００３８】
また、ウイルスベクターを使わない、あるいは併用する形態のゲノム編集用プラスミドやドナーコンストラクトをリポソーム複合体など細胞膜を透過可能な形態にし、家禽初期胚の胚盤葉、血液や生殖巣領域等始原生殖細胞の存在する場所に投与することで始原生殖細胞におけるゲノム編集を行い、後代に遺伝子改変個体や遺伝子改変産物を得ることが可能である。
【００３９】
上記方法により得られる本発明のノックイン家禽の卵は、外因性遺伝子の発現産物が卵内で安定高発現する。ここで、外因性遺伝子の発現産物が卵内で安定高発現するとは、異なる個体由来でも卵１個あたり約1mg以上の外因性遺伝子がコードするタンパク質を発現することをいう。好ましくは卵１個あたり約10mg以上、より好ましくは卵１個あたり約100mg以上の外因性タンパク質を発現する形態を挙げることができる。また、例えば、ニワトリの卵管特異的遺伝子の遺伝子座に外因性遺伝子をノックインした場合、ノックイン雌鶏の卵において認められる外因性遺伝子産物(蛋白質)の発現は、濃厚卵白において濃度が5mg/mlと従来のノックインに依らないランダムな遺伝子導入に比べて遥かに高濃度であると共に、外因性遺伝子の挿入位置が均一であるため個体間や同一個体における発現のばらつきが小さい。更に、ニワトリ個体で実際に発現する遺伝子の翻訳開始点にノックインする技術を用いていることから、G2世代以降でサイレンシングなどの影響を受け発現低下することがない。
【００４０】
本法による卵管特異的遺伝子の遺伝子座に外因性遺伝子をノックインした場合、ノックイン雌鶏の卵において認められる外因性遺伝子産物(蛋白質)の分布は水溶性卵白に比べて濃厚卵白での濃度が高い。このため、濃厚卵白を含む領域を回収することで効率よく外因性遺伝子産物を回収することが出来る。
本法により得られる卵白アレルゲン遺伝子のホモノックアウトニワトリを飼養し、卵を得ることで卵白アレルゲン蛋白質を欠損した卵を得ることができる。このような卵は低アレルゲン性であることが想定される。非特許文献４ではヘテロ型のオボアルブミンノックアウトニワトリの例が示されているが、ホモノックアウトニワトリが得られるか、更にホモノックアウトニワトリから卵が得られるかについては当時の技術常識を総合しても予見できないし、当該文献からも予見できない。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
＜製造例１＞
ニワトリ雄始原生殖細胞を用いたゲノム編集
（製造例１−１）
オボアルブミン(OVA)遺伝子座へのノックインおよびオボムコイド(OVM)ノックアウトのための遺伝子構築
ニワトリ雄始原生殖細胞株を用い、オボアルブミンならびにオボムコイド遺伝子を標的としてCRISPR法の適用を行った。図１(オボアルブミン)、図２(オボムコイド)に示すようにそれぞれOVATg1、OVMTg2の標的としての適性を検討した。
図１に示すオボアルブミン遺伝子の標的配列を標的とし、CRISPR用プラスミドを構築した。
まず、配列番号１(OVATg1)を標的として配列番号２，配列番号３で示されるオリゴDNAを合成し、T4 Polynucleotide Kinaseを用いて5’末端をリン酸化した後、両者の混合液を98℃まで加熱し、室温までゆるやかに冷却することでアニールした。このDNA断片をプラスミドpx330(AddGENE,米国)のNotI部位に配列番号４のピューロマイシン耐性遺伝子ユニットを挿入したプラスミドpx330-Puror のBbsI切断部位に挿入した(px330-Puror-OVATg1)。さらにpx330-Puror-OVATg1のピューロマイシン耐性遺伝子ユニットを配列番号５で示すネオマイシン耐性遺伝子ユニットに置き換えたプラスミドを構築した(px330-Neor-OVATg1)。
図２に示すオボムコイド遺伝子の標的配列を標的とし、CRISPR用プラスミドを構築した。配列番号６(OVMTg2)を標的として配列番号７と配列番号８で示されるオリゴDNAを合成し、リン酸化後、アニールし、プラスミドpx330-PurorのBbsI切断部位に挿入した(px330-Puror-OVMTg2)。
【００４２】
（製造例１−２）
オボアルブミン、オボムコイド遺伝子ノックアウト
横斑プリマスロック雄胚血液中より採取し、株化したニワトリ雄始原生殖細胞(非特許文献３に準拠して調製)に上述の遺伝子(プラスミド)を一過的に導入した。1×105〜5×105個の雄始原生殖細胞株をPBSで洗浄し、OPTI-MEMに懸濁後、3μlのリポフェクタミン2000(Life Technologies,  米国)を用いて1.6μgのpx330-Neor-OVATg1を遺伝子導入した。具体的には、リポフェクタミン2000とプラスミドを80μl OPTI-MEM中で混合し、雄始原生殖細胞株と混合後室温で5分程度静置し、その後抗生物質を含まない培地を500μl添加し、37℃で1〜4時間程度静置した上でフィーダー細胞上に播種した。遺伝子導入後2〜4日の間、ネオマイシン(G418二硫酸塩、ナカライテスク、日本)終濃度0.5mg/mlで添加し、これを洗浄除去した後に1〜2週間の培養を行った。培養後に細胞を回収し、ゲノムDNAを抽出後、配列番号９，配列番号１０で示されるオリゴDNAプライマーを用いたPCR法によりオボアルブミン遺伝子の一部領域を増幅し、TAベクター(pGEM-T Easy, Promega, 米国)にサブクローンし、配列番号１(OVATg1)を含む領域のゲノム塩基配列を解析した。図３に示すように開始コドンの欠失、置換を含む変異を確認した。
次に、オボムコイド遺伝子を標的とした同様の解析を行った。上述と同様に1×105〜5×105個の雄始原生殖細胞株にリポフェクタミン2000を用いてpx330-Puror-OVMTg2を1.6μg遺伝子導入し、導入後2〜4日の間、ピューロマイシンを終濃度1μg/mlで添加した。ピューロマイシンを洗浄除去した後に1〜2週間の培養を行ない、細胞を回収し、ゲノムDNAを抽出後、配列番号１１，配列番号１２で示されるオリゴDNAプライマーを用いたPCR法によりオボムコイド遺伝子の一部領域を増幅し、TAベクターにサブクローンし、配列番号６(OVMTg2)を含む領域のゲノム塩基配列を解析した。解析した23クローン中21クローン(91％)においてオボムコイド遺伝子の配列番号６(OVMTg2)を含む領域で遺伝子の欠失が認められた。一方、対照群として薬剤選択を行わなかったものの遺伝子欠損は24クローン中0個(0％)であった。OVMTg2を含む領域に認められた遺伝子変異の例を図４Ａに示す。これらのことは家禽始原生殖細胞の遺伝子をゲノム編集する上で、薬剤耐性遺伝子導入と薬剤による一過的選択が変異の効率を顕著に上昇しうること、特にピューロマイシン耐性遺伝子とピューロマイシンによる薬剤選択で高い変異効率が得られることを示している。
【００４３】
（製造例１-３）
ゲノム編集ニワトリの樹立
(製造例１-２)に記載した要領で横斑プリマスロック種始原生殖細胞にpx330-Puror-OVMTg2を遺伝子導入し、薬剤選択した細胞を培養し、白色レグホン種2.5日胚(レシピエント胚)の血液中に顕微注射により移植を行った。移植に先立ち、レシピエント胚内在性の始原生殖細胞数を減少させる目的で孵卵操作前の受精卵に電離放射線を5Gyまたは6Gy照射した。電離放射線照射はガンマセル40(カナダ原子力公社)を用いたガンマ線照射により行った。
【００４４】
孵卵2.5日後、卵の突端側に直径2cm程度の窓を開けて胚を露呈し、ハンバーガーハミルトンステージ13から15までのレシピエント胚血液中に約1000〜5000個の薬剤選択済み細胞(1〜2μlのPBSに懸濁)を微小ガラス針を用いて移植した。窓をセロハンテープで密閉後、温度38.5℃、湿度60〜80％で培養し孵化させた(キメラヒヨコ(G0))。８羽の雄キメラヒヨコを性成熟させ、精液を採取した。精液よりゲノムDNAを抽出後、配列番号１１，配列番号１２で示されるオリゴDNAプライマーを用いたPCR法によりオボムコイド遺伝子の一部領域を増幅し、TAベクターにサブクローンし、配列番号６(OVMTg2)を含む領域のゲノム塩基配列を解析した。高頻度に変異の見られたキメラニワトリ＃372，＃376(いずれもサブクローンした１１クローン中１０クローンにオボムコイド遺伝子の変異が見られた)を野生型の横斑プリマスロック種雌と交配させ、それぞれの後代１９羽中に１１羽、１４羽中に６羽のオボムコイド変異ニワトリ(ヒヨコ)を見出した。オボムコイド遺伝子変異の一例を図４Ｂ上段に示す。この個体ではオボムコイドタンパク質のシグナルペプチド直下部より変異を起こす５塩基の欠損が認められ、片アレルにオボムコイド遺伝子のフレームシフト変異を有している。また、オボムコイドゲノムの標的領域を中心に認められる代表的な変異(遺伝子欠損)の例を図４Ｂ下段に示した。ここに代表されるようなオボムコイドタンパク質のシグナルペプチド直下部よりフレームシフト変異を生じるオボアルブミンヘテロノックアウトの雌雄個体を複数得ており、これら個体を性成熟後交配することでオボムコイドのホモノックアウトニワトリ作出が可能である。
【００４５】
＜製造例２＞
オボアルブミン遺伝子座へのヒトインターフェロン遺伝子ノックイン
（製造例２−１）
始原生殖細胞樹立へのノックインとノックインキメラニワトリの樹立
オボアルブミン遺伝子の翻訳開始点に外因性遺伝子(ヒトインターフェロンβ;IFNβ)を挿入することを目的とし、配列番号１３に示されるヒトインターフェロンβ遺伝子を導入したドナーコンストラクト(IFNβドナーコンストラクト)を作製した。このドナーコンストラクトはオボアルブミン翻訳開始点の5’側約2.8kb、ヒトインターフェロンβ遺伝子、薬剤耐性遺伝子ユニット(PGK-Puror)、オボアルブミン翻訳開始点の3’側約3.0kbから構成される。このドナーコンストラクトをプラスミドpBlue ScriptII(SK+))(Stratagene,米国  現Agilent technologies)に挿入しpBS-IFNβドナーとした。製造例１と同様に1×105〜5×105個の始原生殖細胞株にリポフェクタミン2000を用いてpx330-Neor-OVATg1を0.8μg、pBS- IFNβドナーを0.8μg同時に遺伝子導入し、導入後3日以降、ピューロマイシンを終濃度1μg/mlで添加した。適宜培地交換を行い、終濃度1μg/mlのピューロマイシン存在下で増殖する細胞を回収し、ゲノムDNAを調製した。ドナーコンストラクトがオボアルブミン遺伝子座にノックインされていることをゲノムPCRにより確認した。5’領域についてドナーコンストラクトの外因性遺伝子とドナーコンストラクトに含まれないオボアルブミンの5’領域に対するプライマーを用いたPCRを以下のように行った。配列番号１４に示されるインターフェロンβに対するアンチセンスプライマーと配列番号１５に示すオボアルブミン翻訳開始点の5’側約3.0kbの領域に対するセンスプライマーを用いてPCRを行い、さらに増幅産物に対して配列番号１６に示すインターフェロンβに対するアンチセンスプライマーと配列番号１７に示すオボアルブミン翻訳開始点の5’側約2.85kbでドナーコンストラクトには含まれない領域に対するセンスプライマーを用いてPCRを行った(nested PCR)。図５Ａに示すようにpx330-Neor-OVATg1と共にドナーコンストラクトを導入し、薬剤選択した始原生殖細胞(ノックインPGCs)由来ゲノムを鋳型とした場合、ドナーコンストラクトが挿入された際に期待される約2.9kの位置に増幅産物が認められるのに対し、対照の遺伝子導入を行っていない始原生殖細胞由来ゲノム(対照PGCs)を鋳型とした場合、増幅産物は認められない。
【００４６】
同様に、3’領域についてについてドナーコンストラクトの外因性遺伝子とドナーコンストラクトに含まれないオボアルブミンの3’領域に対するプライマーを用いたゲノムPCRにより確認した。配列番号１８に示す薬剤耐性遺伝子ユニットに対するセンスプライマーと配列番号１９に示すオボアルブミン翻訳開始点の3’側約3.4kbの領域に対するアンチセンスプライマーを用いてPCRを行い、さらに増幅産物に対して配列番号２０に示す薬剤耐性遺伝子ユニットに対するセンスプライマーと配列番号２１に示すオボアルブミン翻訳開始点の3’側約3.2kbでドナーコンストラクトには含まれない領域に対するセンスプライマーを用いてPCRを行った(nested PCR)。図５Ａに示すようにpx330-Neor-OVATg1と共にドナーコンストラクトを導入し、薬剤選択した始原生殖細胞(ノックインPGCs)由来ゲノムを鋳型とした場合、ドナーコンストラクトが挿入された際に期待される約3.4kの位置に増幅産物が認められるのに対し、対照の遺伝子導入を行っていない始原生殖細胞(対照PGCs)由来ゲノムを鋳型とした場合、増幅産物は認められない。以上のことから、薬剤選択された細胞集団の中に外因性遺伝子部分を含むドナーコンストラクトがオボアルブミン遺伝子座にノックインされた細胞が存在すると考えられる。
【００４７】
このIFNβドナーコンストラクトがノックインされた細胞を含む始原生殖細胞を、(製造例１−３)と同じ手法によりレシピエント胚に移植後孵化させ、４羽の雄キメラニワトリを得た(＃411〜＃414)。これらより精液を採取し、ゲノムDNAを採取後、配列番号１８と配列番号１９のプライマー(オボアルブミン遺伝子にノックインされたインターフェロンの3’側を増幅)、配列番号１５と配列番号１４のプライマー(オボアルブミン遺伝子にノックインされたインターフェロンの5’側を増幅)、配列番号１５と配列番号２２のプライマー(ノックインされていないオボアルブミンを増幅)を用いてそれぞれPCRを行った(図５Ｂ)。キメラニワトリ＃411と＃412においてオボアルブミン遺伝子座へのインターフェロンノックインを明瞭に示すシグナルが3’側、5’側で共に認められ、特に＃411は移植した親株と遜色のないシグナル強度で認められることから、精子中に親株と同程度インターフェロンがノックインされた細胞が存在すると考えられる。  
【００４８】
キメラニワトリ＃411と＃412を雌野生型ニワトリ(横斑プリマスロック種)と交配し、それぞれ２８羽の後代、１９羽の後代を得た。この後代より羽軸を採取し、ゲノムDNAを採取後、上述と同様に配列番号１８と配列番号１９のプライマー(オボアルブミン遺伝子にノックインされたインターフェロンの3’側を増幅)、配列番号１５と配列番号１４のプライマー(オボアルブミン遺伝子にノックインされたインターフェロンの5’側を増幅)、配列番号１５と配列番号２２のプライマー(ノックインされていないオボアルブミンを増幅)を用いてそれぞれPCRを行った。また、野生型の羽軸由来のゲノム(ネガティブコントロール(NC))、および移植したインターフェロンドナーベクターノックイン始原生殖細胞由来のゲノム(ポジティブコントロール(PC))を用いて同じPCRを行った。#411由来後代２８羽のうち８羽と＃412由来後代１９羽のうち５羽において、それぞれポジティブコントロールと同様のオボアルブミン遺伝子座へのインターフェロンノックインを明瞭に示すシグナルが3’側、5’側で共に認められた。＃411由来後代(雌)と＃412由来後代(雌)のPCR産物電気泳動像を図５Ｃにそれぞれ示す。このことより、これらの後代雌ニワトリではオボアルブミン遺伝子座にインターフェロンドナーベクターがノックインされていると判断される。
【００４９】
（製造例２−２）
ノックイン効率の改善
遺伝子ノックインの効率改善について検討を行った。まず、上述製造例２−１のインターフェロンβドナーコンストラクトの薬剤耐性ユニットをPGK-PurorからSV40Pe-Neor(配列番号２３)に置換したIFNβ-Neoドナーコンストラクト＜配列番号３３＞を作製した。このドナーコンストラクトはオボアルブミン翻訳開始点の5’側約2.8kb、ヒトインターフェロンβ遺伝子、薬剤耐性遺伝子ユニット(SV40Pe-Neor)、オボアルブミン翻訳開始点の3’側約3.0kbから構成される。このドナーコンストラクトをプラスミドpBlue ScriptII(SK+)に挿入しpBS-IFNβ-Neoドナーとした。また、図６Ａに示すようにOVATg1と一部重なるオボアルブミンの標的配列OVATg2(配列番号２４)を標的とし、CRISPR用プラスミドを構築した。配列番号２５と配列番号２６でそれぞれ示されるオリゴDNAを合成し、製造例１−１と同様にリン酸化後、アニールし、DNA断片をpx330のBbsI切断部位に挿入するとともに、NotI部位に配列番号４のピューロマイシン耐性ユニットを挿入したプラスミドpx330-Puror-OVATg2を構築した。約5×105個の始原生殖細胞株を調製し、3分割した後に、製造例２−１と同様にリポフェクタミン2000を用いてpx330-Neor-OVATg1を0.8μg、pBS-IFNβドナー(ピューロマイシン耐性遺伝子ユニットを持つ)を0.8μg(導入群１)もしくはpx330-Puror-OVATg1を0.8μg、pBS-IFNβ-Neoドナーを0.8μg(導入群２)もしくはpx330-Puror-OVATg2を0.8μg、pBS-IFNβ-Neoドナーを0.8μg(導入群３)それぞれ同時に遺伝子導入し、(導入群１)は製造例２−１同様導入後3日以降、ピューロマイシンを終濃度1μg/mlで添加した。一方、(導入群２)と(導入群３)は製造例１−２と同様に遺伝子導入後2〜4日の間、終濃度1μg/mlのピューロマイシン存在下で培養し、洗浄後、終濃度0.5mg/mlのネオマイシンを添加し培養を行った。導入後24日後に各導入群の細胞数をそれぞれ計測した所、導入群１の2×104に対し、導入群２と３では1×105の薬剤耐性細胞が認められた。また、それぞれの群より細胞を回収し、ゲノムDNAを調製後、製造例２−１と同様に配列番号１８と配列番号１９のプライマー(オボアルブミン遺伝子にノックインされたインターフェロンの3’側を増幅)、配列番号１５と配列番号１４のプライマー(オボアルブミン遺伝子にノックインされたインターフェロンの3’側を増幅)、配列番号１５と配列番号２２のプライマー(ノックインされていないオボアルブミンを増幅)を用いてそれぞれPCRを行った。なお、導入群２と３については配列番号１８のプライマーの代わりに配列番号７１のプライマーを用いた(図６Ｂ)。導入群１と２との間でPCRシグナル強度比の大きな違いを認めないことから、導入群２のピューロマイシンで短期間選択後、ネオマイシン選択する方法のほうが迅速に目的細胞を調製可能と考えられる。また、導入群３は導入群２と比較してノックインされていないオボアルブミンが殆ど認められないことから、より効率の良いノックインが起こっていると考えられる。以上より、OVATｇ2配列を標的とし、CRISPRコンストラクトにピューロマイシン耐性遺伝子をドナーコンストラクトにネオマイシン耐性遺伝子をそれぞれ挿入し、始原生殖細胞に導入後一過的にピューロマイシンで選択し、その後ネオマイシンで選択を行うことで迅速かつ高効率に外因性遺伝子のオボアルブミン遺伝子座へのノックインが可能になると考えられる。
【００５０】
＜製造例３＞
オボアルブミン遺伝子座へのヒト抗体遺伝子ノックイン
上記製造例２−１のインターフェロンβドナーコンストラクトのヒトインターフェロンβの代わりに配列番号２７に示されるヒト免疫グロブリン遺伝子を導入したドナーコンストラクト(免疫グロブリンドナーコンストラクト)を作製した。このドナーコンストラクトはオボアルブミン翻訳開始点の5’側約2.8kbの下流に卵白リゾチームシグナルペプチド、ヒト免疫グロブリン重鎖、furinタンパク質切断標的配列、2A自己プロセッシング性ペプチド、卵白リゾチームシグナルペプチド、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子をそれぞれコードする遺伝子を連結して配置し、薬剤耐性遺伝子ユニット(PGK-Puror)、オボアルブミン翻訳開始点の3’側約3.0kbから構成されている。このドナーコンストラクトが転写、翻訳されることで免疫グロブリンの重鎖と軽鎖からなる抗体タンパク質を発現する。
【００５１】
プラスミドpBlue ScriptII(SK+)に免疫グロブリンドナーコンストラクトを挿入しpBS-免疫グロブリンドナー(pBS- IgG(Hc+Lc)ドナー)とした。上記pBS-IFNβドナーと同様の手法により雄ニワトリ始原生殖細胞にノックイン後ピューロマイシンで選択し、選択された細胞のゲノムを鋳型としてPCRを行なった。5’側は配列番号１５のプライマーと配列番号２８に示される卵白リゾチームシグナルペプチドに対するアンチセンスプライマーによるPCRの後、増幅産物に対して配列番号１７のプライマーと配列番号２９に示す卵白リゾチームシグナルペプチドに対するアンチセンスプライマーを用いてPCRを行った(nested PCR)。3’側は上記EGFPドナーやpBS-IFNβドナーのノックイン時と同様に配列番号１８と配列番号１９に示すプライマーを用いたPCRの後、増幅産物に対して配列番号２０と配列番号２１に示すプライマーを用いてnested PCRを行った。図７に示すように、免疫グロブリンドナーを用いた場合でも始原生殖細胞のオボアルブミン遺伝子へのノックインが認められた。
更に製造例２−２と同様に免疫グロブリンドナーコンストラクトの薬剤耐性ユニットをPGK-PurorからSV40Pe-Neor(配列番号２３)に置換した免疫グロブリン-Neoドナーコンストラクト(配列番号３０)を作製した。このドナーコンストラクトはオボアルブミン翻訳開始点の5’側約2.8kbの下流に卵白リゾチームシグナルペプチド、ヒト免疫グロブリン重鎖、furinタンパク質切断標的配列、2A自己プロセッシング性ペプチド、卵白リゾチームシグナルペプチド、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子をそれぞれコードする遺伝子を連結して配置し、薬剤耐性遺伝子ユニット(SV40Pe-Neor)、オボアルブミン翻訳開始点の3’側約3.0kbから構成されている。このドナーコンストラクトをプラスミドpBlue ScriptII(SK+)に挿入しpBS-免疫グロブリン-Neoドナーとした。製造例１−２と同様の方法でpx330-Puror-OVATg2を0.8μgとpBS-免疫グロブリン-Neoドナー0.8μgを約2×105個の始原生殖細胞株に3μlのリポフェクタミン2000を用いて遺伝子導入し、遺伝子導入後2〜4日の間、終濃度1μg/mlのピューロマイシン存在下で培養し、洗浄後、終濃度0.5mg/mlのネオマイシンを添加し培養を行った。３週間程度の培養の後、得られた免疫グロブリンノックイン細胞を含む細胞集団を(製造例１−３)と同じ手法によりレシピエント胚に移植後孵化させ免疫グロブリンノックイン生殖巣キメラニワトリを樹立した。後代にオボアルブミン遺伝子座にヒト免疫グロブリン遺伝子がノックインされたニワトリが得られ、卵白にヒト免疫グロブリンの重鎖と軽鎖からなる抗体タンパク質を発現する。
【００５２】
＜製造例４＞
オボアルブミン遺伝子座へのヒトコラーゲン遺伝子ノックイン
上記製造例２−１のインターフェロンβドナーコンストラクトのヒトインターフェロンβの代わりに配列番号３１に示されるヒトＩ型コラーゲン遺伝子を導入したドナーコンストラクト(コラーゲンドナーコンストラクト)を作製した。このドナーコンストラクトはオボアルブミン翻訳開始点の5’側約2.8kbの下流に卵白リゾチームシグナルペプチド、ヒトＩ型コラーゲンα1鎖(COLLAGEN1A1)、furinタンパク質切断標的配列、2A自己プロセッシング性ペプチド、卵白リゾチームシグナルペプチド、ヒトＩ型コラーゲンα2鎖(COLLAGEN1A2)遺伝子をそれぞれコードする遺伝子を連結して配置し、薬剤耐性遺伝子ユニット(PGK-Puror)、オボアルブミン翻訳開始点の3’側約3.0kbから構成されている。このドナーコンストラクトが転写、翻訳されることでヒトＩ型コラーゲンα1鎖とα2鎖からなるＩ型コラーゲンタンパク質を発現する。
プラスミドpBlue ScriptII(SK+)にコラーゲンドナーコンストラクトを挿入しpBS-COL1(A1+A2)ドナーとした。 上記ppBS-IFNβドナー、pBS-IgG(Hc+Lc)ドナーと同様の手法によりpBS-COL1(A1+A2)ドナーを雄ニワトリ始原生殖細胞にノックイン後ピューロマイシンで選択し、選択された細胞のゲノムを鋳型としてPCRを行なった。5’側はpBS-IgG(Hc+Lc)ドナーと同様、配列番号１５のプライマーと配列番号２８に示される卵白リゾチームシグナルペプチドに対するアンチセンスプライマーによるPCRの後、増幅産物に対して配列番号１７のプライマーと配列番号２９に示す卵白リゾチームシグナルペプチドに対するアンチセンスプライマーを用いてPCRを行った(nested PCR)。3’側は上記pBS-IFNβドナー、pBS-IgG(Hc+Lc)ドナーのノックイン時と同様に配列番号１８と配列番号１９に示すプライマーを用いたPCRの後、増幅産物に対して配列番号２０と配列番号２１に示すプライマーを用いてnested PCRを行った。図８に示すように、コラーゲンドナーを用いた場合でも始原生殖細胞のオボアルブミン遺伝子へのノックインが認められた。
【００５３】
更に製造例２−２と同様にコラーゲンドナーコンストラクトの薬剤耐性ユニットをPGK-PurorからSV40Pe-Neor(配列番号２３)に置換したコラーゲン-Neoドナーコンストラクト(配列番号３２)を作製した。このドナーコンストラクトはオボアルブミン翻訳開始点の5’側約2.8kbの下流に卵白リゾチームシグナルペプチド、ヒトＩ型コラーゲンα1鎖(COLLAGEN1A1)、furinタンパク質切断標的配列、2A自己プロセッシング性ペプチド、卵白リゾチームシグナルペプチド、ヒトＩ型コラーゲンα2鎖(COLLAGEN1A2)遺伝子をそれぞれコードする遺伝子を連結して配置し、薬剤耐性遺伝子ユニット(SV40Pe-Neor)、オボアルブミン翻訳開始点の3’側約3.0kbから構成されている。このドナーコンストラクトをプラスミドpBlue ScriptII(SK+)に挿入しpBS-コラーゲン-Neoドナーとした。製造例１−２と同様の方法でpx330-Puror-OVATg2を0.8μgとpBS-コラーゲン-Neoドナー0.8μgを約2×105個の始原生殖細胞株に3μlのリポフェクタミン2000を用いて遺伝子導入し、遺伝子導入後2〜4日の間、終濃度1μg/mlのピューロマイシン存在下で培養し、洗浄後、終濃度0.5 mg/mlのネオマイシンを添加し培養を行った。３週間程度の培養の後、得られたコラーゲンノックイン細胞を含む細胞集団を(製造例１−３)と同じ手法によりレシピエント胚に移植後孵化させ免疫グロブリンノックイン生殖巣キメラニワトリを樹立した。後代にオボアルブミン遺伝子座にヒト免疫グロブリン遺伝子がノックインされたニワトリが得られ、卵白にヒトＩ型コラーゲンのα1とα2からなる複合体タンパク質を発現する。
【００５４】
＜実施例１＞
上記製造例２−１に記されたようにオボアルブミン遺伝子座の翻訳開始点にヒトインターフェロンβドナーベクターがノックインされた雌ニワトリ、雄ニワトリを樹立した。
【００５５】
（１）ノックインニワトリとノックイン卵の性状
樹立したノックインニワトリは、発生異常や顕著な病態を示すこと無く、性成熟に達し、ノックイン雌ニワトリは産卵を始めた。卵殻を割り、内容物を検証した所、卵黄の周囲に白濁した濃厚卵白が確認された。一方粘性の低い水溶性卵白は野生型の卵と同様に存在した。典型的な割卵像を図９に示す。
【００５６】
（２）インターフェロンの同定、濃厚卵白に多い可能性
次に、卵白におけるヒトインターフェロンβの存在について検証を行った。
濃厚卵白、水溶性卵白をそれぞれスポイトを用いて回収し、等量のサンプルバッファー(0.125M Tris pH6.8, 10% 2-ME, 4% SDS, 10%グリセロール  0.1％BPB)を加え、これをそれぞれ10倍ずつ計３段階に希釈し、5-20％のアクリルアミドゲルで電気泳動により分離を行ったのちにPVDF膜に転写し、スキムミルクで膜への抗体分子の非特異吸着をブロッキングした後、1000倍希釈した抗ヒトインターフェロンβ抗体(abcam ab85803  ウサギポリクローナル)を一次抗体、1000倍希釈した抗ウサギHRP結合抗体(GEヘルスケアNA934V)を二次抗体としたウエスタンブロットを行った。結果を図１０に示す。
【００５７】
リコンビナントの精製ヒトインターフェロンβ(Wako rhIFN-β)と同位置の約30kDaの場所に抗体で認識されるバンドが認められた。また、このバンドは野生型の卵では全く検出されなかった。図１０各レーンの1, 1/10, 1/100は相対泳動量を示しており、同じ数字であれば同量の卵白液が泳動されている。興味深いことに、水溶性卵白では微量のインターフェロンしか同定されなかった。
このことは濃厚卵白に遺伝子ノックインによる組換え発現蛋白質が比較的多く含まれる可能性を示唆している。
【００５８】
（３）濃厚卵白にインターフェロン蛋白質が多く認められる(約5mg/mlと推定)
次に、野生型卵(NC: negative control)、２つのヒトインターフェロンβノックインニワトリ由来卵(KI egg1および2)の水溶性卵白と濃厚卵白を採取し、等量ずつ計２段階の希釈をして5-20％アクリルアミドゲルで電気泳動し、クマシーブリリアントブルー染色(ナカライ  CBBステインワン)により卵白に含まれる蛋白質の可視化を行った。結果を図１１に示す。先のウエスタンブロットの結果と同様、約30kDaの位置に野生型卵には存在せず、２つのノックイン卵に存在する明瞭なバンドが認められ、ヒトインターフェロンβであることが分かる。また、ウエスタンブロットの結果と同様に、このヒトインターフェロンβのバンドは水溶性卵白を電気泳動した場合には殆ど認められない。CBB染色したバンドのシグナルを比較すると、オボトランスフェリンやオボアルブミンなど他の卵白成分は水溶性卵白と濃厚卵白では量が殆ど変わらないにも関わらず、ヒトインターフェロンβ量が大きく異なることから、オボアルブミン遺伝子座にノックインにより発現させたヒトインターフェロンβは濃厚卵白に優位に集積することが明らかとなった。
【００５９】
更に、CBB染色像を解析することで、卵白に含まれるヒトインターフェロンの濃度が推定可能である。CBB染色は蛋白量にほぼ比例して青色を呈する。相対量１のヒトインターフェロンβのシグナル濃度をNIH Imageを用いて定量し、相対量1/10のオボアルブミンと比較すると1.01：1となる。オボアルブミンは卵白蛋白質のほぼ半分を占め、約50mg/mlの濃度であるため、ヒトインターフェロンβは約5mg/ml程度とみなされる。  
【００６０】
本法による発現では濃度が5mg/mlと遥かに高濃度であると共に、外来遺伝子の挿入位置が均一であるため個体間や同一個体における発現のばらつきが小さい。更に、ニワトリ個体で実際に発現する遺伝子の翻訳開始点にノックインする技術を用いていることから、G2世代以降でサイレンシングなどの影響を受け発現低下することがない。図１２は一週間にわたる３回の採卵(day1, day4, day7)による各卵白中のインターフェロンを比較したものであるが、NIH Imageで定量比較すると1：0.92：0.96となり、濃厚卵白におけるインターフェロン濃度のばらつきは殆ど認められない。また、このノックイン卵は採卵後摂氏18℃で保存したものを同時に割卵したものであるが、外来蛋白質であるインターフェロンが１週間に渡り、顕著な分解等を受けること無く安定して卵白中に存在することを示している。
【００６１】
（４）異なった固体由来卵におけるインターフェロンの発現(インターフェロン発現の安定性)。
初卵を産んでから３ヶ月後の４羽のインターフェロンノックイン雌より卵を得て割卵した(図２３)。いずれの卵においても濃厚卵白の白濁が認められた。また、５羽のニワトリ(＃584,＃766,＃714,＃645,＃640)から卵を得てそれぞれの濃厚卵白を上記(3)と同様に電気泳動、CBB染色を行った。全ての卵でヒトインターフェロンのバンドを認めた(図１７)。NIH imageで定量比較すると＃584,＃766,＃714,＃645,＃640のインターフェロン濃度は1.0:1.0:0.94:0.91:0.89となる。これは、非特許文献１でみられる個体間の分泌濃度のゆらぎ(5μg/ml-100μg/ml)と比べると最大-最小の濃度差11％以内と極めて安定しており、個体間で差がないことは複数の組換えニワトリを用いて組換え蛋白質を大量に得ようとする場合に有利な点である。
【００６２】
＜実施例２＞
（１）濃厚卵白からの効率のよいインターフェロン抽出の試み(可溶化処理が可能)
濃厚卵白に高濃度のインターフェロンβが存在することが分かったが、このインターフェロンβを一般的に活用するには卵白から抽出され、精製されることが望ましい。精製技術には分子量や化学的性状に基づいた様々なカラム処理などがあるが、カラム処理を行うには対象となる蛋白質が水溶液となっていることが望ましい。水溶液と不溶物は遠心操作により分離可能である。そこで、濃厚卵白中のインターフェロンが水溶液に含まれるか、不溶物なのか検討した。
濃厚卵白を200μl採取し、20k×Gで15分遠心すると白色の沈殿画分と液体の画分に分離が可能である(図１３チューブ１)。液体の画分をアクリルアミドゲル電気泳動するとヒトインターフェロンβは含まれるものの(図１４レーン１)、同量の分離前濃厚卵白(図１４レーン０)よりは明らかに量が少ない。したがって、遠心により生ずる白色沈殿部に多くのインターフェロンが含まれると考えられた。そこで、白色沈殿を減らし、インターフェロンの収量を増加させる幾つかの試みを行った。図１３ではそれぞれのチューブに濃厚卵白液200μlを加え、3Mの飽和アルギニン溶液４倍量(800μl)を加え転倒混和したもの(チューブ２)、3Mの飽和アルギニン溶液４倍量(800μl)を加え超音波破砕を行ったもの(チューブ３)、少量のアルギニン(20mg)を加え転倒混和したのちPBSにより1mlにしたもの(チューブ４)、少量のアルギニン塩酸塩(20mg)を加え転倒混和したのちPBSにより1mlにしたもの(チューブ５)、PBSにより1mlにし、超音波破砕を行ったもの(チューブ６)、飽和量以上のアルギニン塩酸塩(200mg)を加えて転倒混和したもの(チューブ７)、3Mの飽和アルギニン溶液２倍量(400μl)を加え超音波破砕を行ったもの(チューブ８)、少量のアルギニン塩酸塩(20mg)を加え超音波破砕したもの(チューブ９)、少量の食塩(40mg)を加え超音波破砕したもの(チューブ１０)などである。20k×Gで15分遠心すると白色沈殿は認められるが、いずれも無処理(チューブ１)の場合より減少しており、特に超音波破砕を行ったもののうちチューブ３，６，８，９で顕著に減少していた。
【００６３】
上清を回収し、大元の濃厚卵白に対する泳動量が均一になるようにサンプル調製を行い、アクリルアミドゲルで電気泳動をおこなった(図１４)。図１４のレーン番号は図１３のチューブ番号に対応しており、レーン０は濃厚卵白を分離せずに同量泳動したものである。レーン２からレーン１０は、量の多少はあるものの、いずれも無処理(レーン１)のものより多くのインターフェロンβを含んでいた。特に、3Mの飽和アルギニン溶液４倍量を加え超音波破砕を行ったもの(レーン３)が多くのインターフェロンβを含んでいた。これらのことは超音波破砕のような物理的処理やアルギニン、アルギニンバッファー添加のような化学的処理(より限定的には不溶蛋白質の可溶化処理)によって濃厚卵白より水溶性の画分に抽出されるインターフェロンβの量が増大することを示している。チューブ３の3Mの飽和アルギニン溶液４倍量を加え超音波破砕を行ったものを20k×Gで15分間遠心し、上清を回収したのちPBS中で一昼夜透析を行った(以下濃厚卵白粗精製物と呼ぶ)。濃厚卵白粗精製物は透明であり析出物は認められず、一連の処理により白濁部から上清に移行したものは可溶化されたと考えられる。
【００６４】
（２）鶏卵に生産したインターフェロンの活性
バイオアッセイにより、水溶性卵白、濃厚卵白、濃厚卵白粗精製物のインターフェロン活性について検討した。HEK-blue IFN-α/β(Invivogen)は培地にヒトインターフェロンβを添加することでアルカリフォスファターゼを分泌する培養細胞であり、アルカリフォスファターゼの基質液(Quanti-Blue ; Invivogen)に反応後の培地を加え、基質液の変化(Quanti-Blueの場合赤色から青色への変色)を見る事でヒトインターフェロンβの活性の有無を見ることが出来る。HEK-blue IFN-α/βの培養液中にヒトインターフェロンノックイン卵由来の水溶性卵白、濃厚卵白(20k×Gで１５分遠心後の上清)、濃厚卵白粗精製物(チューブ３由来))を添加した。また、ネガティブコントロールとして野生型鶏卵の水溶性卵白ならびにPBSをポジティブコントロールとして組換えヒトインターフェロンをそれぞれ添加した。細胞を20時間培養し、培養上清をQuanti-Blue基質液に添加し、摂氏37℃で１時間反応させた。結果を図１５に示す。
インターフェロンノックイン(IFN-KI)卵の水溶性卵白、濃厚卵白の遠心上清、濃厚卵白の粗精製物いずれにおいてもヒトインターフェロンβの活性が認められ、未精製のノックイン卵産物にインターフェロン活性が認められるとともに、超音波破砕やアルギニンバッファーによる可溶化処理を行っても活性があることを示している。したがって鶏卵由来インターフェロンは鶏卵のまま未加工や遠心分画など簡単な加工を行っても、また可溶化、精製などのプロセスをとっても利用可能である。
【００６５】
（３）鶏卵に生産したインターフェロンの活性定量
バイオアッセイにより濃厚卵白中のインターフェロン活性を測定した。(２)と同様にHEK-blue IFN-α/βの培養液中にヒトインターフェロンノックイン卵由来(初卵後３ヶ月で採卵)の濃厚卵白(超音波破砕後20k×Gで15分遠心後の上清)を５倍ずつ連続希釈して10μlずつ添加した。比較として市販の組換えヒトインターフェロンβ(和光純薬)10μ/mlを同様に５倍ずつ連続希釈して10μlずつ添加した。細胞を20時間培養し、培養上清をQuanti-Blue基質液に添加し、摂氏37℃で１時間反応させた。結果を図１８に示す。上段市販のヒトインターフェロンを添加した培養上清の反応系は、赤色と青色が混在するウエルが左から４番目にあるのに対し、濃厚卵白を添加した培養上清(下段)は左から８番目に存在する(希釈系列は共に左が濃く、右が薄い)。従って濃厚卵白のインターフェロン活性は市販の10μ/mlのインターフェロンより625倍以上高く、6.25mg/ml以上と想定される。濃厚卵白はこの時点で約16ml程度取れたことから、卵１個に市販品換算で約100mg相当の活性を有するヒトインターフェロンが得られた事になる。和光純薬の組換えヒトインターフェロンβは20μgの市価が39,000円であり、100mgは195,000,000円(約2億円)に相当する。本法を用いることで、活性でみても極めて大量のヒト組換え蛋白質を生産することが可能である。
【００６６】
（４）G2世代のノックインニワトリの卵解析
G1のノックインニワトリ(雄)を野生型の雌と交配し、G2ノックインニワトリ(雄および雌)を樹立した。G2ノックインニワトリを性成熟させ、卵を得て割卵した(図１９右)。G1由来卵と同様に得られた卵は全て濃厚卵白が白濁していた。更に３羽のG2ノックインニワトリより卵を得て濃厚卵白を電気泳動した。G1由来卵の濃厚卵白を比較のために電気泳動した。CBB染色像はG2由来の卵でもG1同様にインターフェロンのシグナルが認められる。以上により、卵管遺伝子にノックインした外来遺伝子の鶏卵への発現が世代を超えて安定的に行われると示された。これにより、ノックインニワトリを用いた組換え蛋白質生産の大規模化や経時的な安定運用が担保される。
【００６７】
＜実施例３＞
製造例３で記したようにして得られた、ヒトオボアルブミン遺伝子座へヒト抗体遺伝子をノックインしたニワトリから卵を得た。卵白におけるヒト抗体蛋白質の存在について検証を行った。卵白を、等量のサンプルバッファー(0.125M Tris pH6.8, 4% SDS, 10%グリセロール  0.1％BPBなお、2-MEは含まない)を加え、これをそれぞれ10倍ずつ計３段階に希釈し、5-20％のアクリルアミドゲルで電気泳動により分離を行ったのちにPVDF膜に転写し、スキムミルクで膜への抗体分子の非特異吸着をブロッキングした後、1000倍希釈した抗ヒトイムノグロブリン抗体(Jackson Immuno Research、Anti-Human IgG F(ab))を一次抗体、1000倍希釈した抗ウサギHRP結合抗体(Jackson Immuno Research、Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L))を二次抗体としたウエスタンブロットを行った。結果を図２０に示す。
リコンビナントの精製ヒト抗体(商品名：ハーセプチン、ロッシュ)と同位置の約200kDaの場所に抗体で認識されるバンドが認められた(図２０右)。また、このバンドは野生型の卵では全く検出されなかった(図２０左)。これらのことから、鶏卵内で正常なサブユニット構成でヒト抗体複合体が存在すると考えられる。図２０各レーンの1/20, 1/200,1/2ｋ(＝1/2000)は卵白の原液を１とした相対泳動量を示している。濃度既知のハーセプチンの泳動量との比較により、抗体複合体の濃度が1mg/ml以上であると推定される(図２０右)。
【００６８】
＜実施例４＞
（１）オボムコイドホモ型遺伝子ノックアウトニワトリ
オボムコイドは卵白蛋白質であるが、初期発生過程における発現動態や発生における機能は解析されておらず、機能欠失が及ぼす影響も全くわかっていない。製造例１−３で示したように、我々はゲノム編集技術により、ヘテロ型のオボムコイドノックアウトニワトリ(雄および雌)を作製した。さらにこれらを交配することでオボムコイドを完全欠損するニワトリ(ホモ型のオボムコイドノックアウトニワトリ)を樹立した。図１６に示すようにオボムコイドの蛋白質をコードするエクソン３の同じ場所５塩基を欠損した雄、雌ヘテロノックアウトニワトリを性成熟後交配し、後代を得た。図１６に示すように後代の中には野生型、ヘテロ型ノックアウトに加えてホモ型のノックアウトニワトリが得られた。また、オボムコイドのホモ型ノックアウトニワトリは雄、雌が得られており、いずれも野生型と同様に健康で形態の異常なく成長を続けている。このことから、オボムコイドは機能欠失により致死や形態異常等の初期発生に影響を及ぼすものではないことを初めて明らかにすることができた。
【００６９】
（２）オボムコイドノックアウトニワトリ卵の有効性
ホモ型のオボムコイドノックアウトニワトリはオボムコイドを分泌しないため、オボムコイドを含まない卵を生産する。オボムコイドは非常に強力なアレルゲン物質であり、加熱や酵素による分解によってもアレルゲン性を失わないことが知られている。オボムコイドを欠損した卵は当然オボムコイドによる強いアレルゲン性を持たないことから、低アレルギー性の卵として生食、加工食品、ワクチン製造、化粧品原料等卵を用いる全ての製造物のアレルギー性を大きく低減させるのに役に立つことが自明である。
【００７０】
（３）オボムコイドノックアウトニワトリ卵の性状
ホモ型のノックアウトニワトリの雌は産卵する。少なくとも６ヶ月に渡り野生型と同様ほぼ毎日産卵した。割卵像を図２１左に示す。外観上は野生型の卵と違いは認められない。また、加熱により凝固するなど、加工性も通常の鶏卵と顕著な違いを認めない(図２１右)。
更に、ホモ型ノックアウトニワトリ同士の交配に依りニワトリ固体が発生し得る。5bpホモ欠損個体の雌雄を交配した卵を孵卵した結果G3世代のオボムコイド5bpホモ欠損個体が得られている(図２３)。このことはオボムコイド遺伝子だけでなく、オボムコイド蛋白質が欠損していてもニワトリは発生するすなわちオボムコイドがニワトリ発生に必須ではないことを示している。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
＊ノックイン遺伝子のさらなる発現量の増大
今回の実施例で得られたインターフェロンβの濃度は5mg/mlと非常に高いものであったが、更に卵内における組換え蛋白質の濃度の向上を図ることが可能である。
１．ノックイン遺伝子のホモ化
解析した鶏卵の親の遺伝子型はオボアルブミン遺伝子座の片アリルにヒトインターフェロンβが挿入されたもの(ヘテロ型遺伝子ノックイン)である。ヘテロ型遺伝子ノックイン親同士の交配やノックイン始原生殖細胞を有する生殖巣キメラ個体同士の交配により両アリルにヒトインターフェロンβが挿入された個体(ホモ型遺伝子ノックイン)を作製すれば、より高濃度の組換え蛋白質を発現する個体を得ることが出来る。
２．シグナルペプチドやコドンユーセージの改良
今回オボアルブミン遺伝子の翻訳開始点にはヒトインターフェロンβのcDNAをノックインしている。したがってシグナルペプチドはヒトインターフェロンβのシグナルペプチドであり、ニワトリ卵管細胞に最適化しているものではない。ニワトリ卵管で高効率に分泌するためのシグナルペプチドとしては実際に卵管から分泌される蛋白質のシグナルペプチドが挙げられ、例えば卵白リゾチームのMRSLLILVLCFLPLAALGやオボトランスフェリンのMKLILCTVLSLGIAAVCFAなどが挙げられる。また、これに限らずニワトリ細胞で高効率に蛋白質を分泌できる人工または天然のシグナルペプチドでも良い。これらシグナルペプチドを目的蛋白質のN端に含む蛋白質をオボアルブミン遺伝子座にノックインすることでより高濃度の目的蛋白質生産が可能である。さらにノックインするcDNAの塩基配列をニワトリで用いられるコドン使用頻度に併せて最適化することで蛋白質生産の向上を図る事ができる。
３．挿入遺伝子数の増大
今回ノックインした遺伝子は１つだけであったが、複数個の遺伝子を転写、翻訳が可能な形で連結してノックインし、同時に発現させることで発現量を増大させることが出来る。複数個の遺伝子は単一の遺伝子であっても複数種の遺伝子であっても良く、数もいくつあっても良い。具体的には、遺伝子ノックインに際し、複数の遺伝子をIRESなどの配列を介在させて挿入することでより多くの転写、翻訳を行い、遺伝子産物を得ることが出来る。また、2Aペプチドなどを介在させて複数の蛋白質をオボアルブミンプロモーターの制御下に一度に発現させ、ペプチドを切断することでより多くの蛋白質生産が可能である。
ヒト抗体遺伝子の軽鎖遺伝子と重鎖遺伝子ならびにヒトＩ型コラーゲン遺伝子のα1とα2をそれぞれ2Aペプチドの遺伝子を介して連結し、ノックインしたニワトリは好ましい実施形態の１つである。
４．ノックアウトニワトリ卵の有効性
ホモ型のオボムコイドノックアウトニワトリはオボムコイドを分泌しないため、オボムコイドを含まない卵を生産する。オボムコイドは非常に強力なアレルゲン物質であり、加熱や酵素による分解によってもアレルゲン性を失わないことが知られている。オボムコイドを欠損した卵は当然オボムコイドによる強いアレルゲン性を持たないことから、低アレルギー性の卵として生食、加工食品、ワクチン製造、化粧品原料等卵を用いる全ての製造物のアレルギー性を大きく低減させるのに役に立つことが自明である。また、交配やゲノム編集された始原生殖細胞を用いることで外因性遺伝子の発現を卵白アレルゲンノックアウトニワトリの卵で行うことも可能であり、このようにして生産された外因性遺伝子産物は精製時のアレルゲン除去過程が容易になることが自明である。
オボムコイド以外の卵管特異的遺伝子をノックアウトした家禽卵は、同様にアレルギー性を大きく低減させるのに役に立つ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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