(57)【要約】【課題】生体試料中のエリスロポエチンやＥＳＡ製剤をウエスタンブロッティング法により簡便に検出する技術を提供する。【解決手段】生体試料中のエリスロポエチンを検出する方法であって、生体試料に、界面活性剤及び還元剤を接触させる工程（ａ）と、前記界面活性剤及び前記還元剤を接触させた前記生体試料を、沈殿及び上清に分離する工程（ｂ）と、前記上清中のエリスロポエチンをウエスタンブロッティングにより検出する工程（ｃ）と、を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中のエリスロポエチンを検出する方法であって、
生体試料に、界面活性剤及び還元剤を接触させる工程（ａ）と、
前記界面活性剤及び前記還元剤を接触させた前記生体試料を、沈殿及び上清に分離する工程（ｂ）と、
前記上清中のエリスロポエチンをウエスタンブロッティングにより検出する工程（ｃ）と、を含む、方法。
【請求項２】
前記界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、オクチルフェノキシポリエトキシルエタノール（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ−２０）及びポリオキシエチレンラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ−３５）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記還元剤が、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）及びシステインからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｂ）の後前記工程（ｃ）の前に、
前記上清にＰｅｐｔｉｄｅ  Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｆ（ＰＮＧａｓｅＦ）を接触させる工程を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記生体試料が、腎臓組織、肝臓組織、血漿、血清又は尿である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
界面活性剤及び還元剤を含む、生体試料中のエリスロポエチン検出用キット。
【請求項７】
前記界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ−２０）及びポリオキシエチレンラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ−３５）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記還元剤が、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）及びシステインからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、請求項６又は７に記載のキット。
【請求項９】
ＰＮＧａｓｅＦを更に含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリスロポエチンを検出する方法及びキットに関する。より詳細には、本発明は、生体試料中のエリスロポエチンを検出する方法及び生体試料中のエリスロポエチン検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチンは、赤血球の産生を促進する造血因子の１種である。医薬品として、赤血球造血刺激因子製剤（ＥＳＡ製剤）と呼ばれるエリスロポエチン類似化合物が開発されている。ＥＳＡ製剤は、腎性貧血の治療に使用されているが、筋肉への酸素供給量を高め持久力を向上させる目的で、長距離系スポーツ（自転車ロードレース、クロスカントリースキー等）のドーピングにも使用され問題となっている。
【０００３】
血液中のエリスロポエチン濃度の測定は、貧血、赤血球増加症等の診断に必要である。また、ＥＳＡ製剤の濃度の測定は、腎性貧血の治療効果の確認やドーピング検査等に必要である。
【０００４】
しかしながら、生体試料中には様々な夾雑物が存在するため、従来、生体試料中のエリスロポエチンやＥＳＡ製剤をウエスタンブロッティング法により検出することは困難であった。例えば、非特許文献１の第４６７頁左欄第４２〜４９行等には、尿、血清、血漿中のエリスロポエチンをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出するためには、試料をまずイムノアフィニティー精製することが必須であることが記載されている。生体試料中のエリスロポエチンやＥＳＡ製剤をイムノアフィニティー精製するためには多大な手間や労力を必要とする。このため、生体試料中のエリスロポエチンやＥＳＡ製剤は、ＥＬＩＳＡ法や質量分析法により測定されてきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Reichel C., Recent developments in doping testing for erythropoietin, Anal Bioanal Chem., 401 (2), 463-481, 2011.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、生体試料中のエリスロポエチンやＥＳＡ製剤をＥＬＩＳＡ法により測定するためには比較的大量（１００μＬ程度）の生体試料を必要とする。また、生体試料中のエリスロポエチンやＥＳＡ製剤を質量分析法で測定するためには高価な装置が必要であり、また熟練した高度な技術が必要である。そこで、本発明は、生体試料中のエリスロポエチンやＥＳＡ製剤をウエスタンブロッティング法により簡便に検出する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］生体試料中のエリスロポエチンを検出する方法であって、生体試料に、界面活性剤及び還元剤を接触させる工程（ａ）と、前記界面活性剤及び前記還元剤を接触させた前記生体試料を、沈殿及び上清に分離する工程（ｂ）と、前記上清中のエリスロポエチンをウエスタンブロッティングにより検出する工程（ｃ）と、を含む、方法。
［２］前記界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、オクチルフェノキシポリエトキシルエタノール（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ−２０）及びポリオキシエチレンラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ−３５）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、［１］に記載の方法。
［３］前記還元剤が、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）及びシステインからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記工程（ｂ）の後前記工程（ｃ）の前に、前記上清にＰｅｐｔｉｄｅ  Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｆ（ＰＮＧａｓｅＦ）を接触させる工程を更に含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記生体試料が、腎臓組織、肝臓組織、血漿、血清又は尿である、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］界面活性剤及び還元剤を含む、生体試料中のエリスロポエチン検出用キット。
［７］前記界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ−２０）及びポリオキシエチレンラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ−３５）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、［６］に記載のキット。
［８］前記還元剤が、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）及びシステインからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、［６］又は［７］に記載のキット。
［９］ＰＮＧａｓｅＦを更に含む、［６］〜［８］のいずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、生体試料中のエリスロポエチンやＥＳＡ製剤をウエスタンブロッティング法により簡便に検出する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実験例１におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図２】実験例２におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図３】（ａ）及び（ｂ）は、実験例３において、ラット血漿をそのままウエスタンブロッティングに供した結果を示す写真である。
【図４】（ａ）及び（ｂ）は、実験例４において、ラット血漿をそのままウエスタンブロッティングに供した結果を示す写真である。
【図５】実験例４において、ラット血漿を界面活性剤及び還元剤で処理してウエスタンブロッティングに供した結果を示す写真である。
【図６】実験例５におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図７】（ａ）及び（ｂ）は、実験例６におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図８】（ａ）〜（ｃ）は、実験例７におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図９】（ａ）及び（ｂ）は、実験例８におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［生体試料中のエリスロポエチンを検出する方法］
（第１実施形態）
第１実施形態に係る、生体試料中のエリスロポエチンを検出する方法は、生体試料に、界面活性剤及び還元剤を接触させる工程（ａ）と、前記界面活性剤及び前記還元剤を接触させた前記生体試料を、沈殿及び上清に分離する工程（ｂ）と、前記上清中のエリスロポエチンをウエスタンブロッティングにより検出する工程（ｃ）とを含む方法である。本実施形態の方法によれば、エリスロポエチンの定性的な検出だけでなく、エリスロポエチンを定量することも可能である。
【００１１】
本実施形態の方法において、エリスロポエチンは、赤血球造血刺激因子製剤（ＥＳＡ製剤）であってもよい。具体的なＥＳＡ製剤としては、エポエチンアルファ（商品名エスポー）、エポエチンベータ（商品名エポジン）、ダルベポエチンアルファ（商品名ネスプ）等の遺伝子組換えエリスロポエチン製剤、エポエチンベータに直鎖メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を化学的に結合させて長時間の持続作用を実現したミルセラ等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１２】
実施例において後述するように、発明者らは、生体試料に界面活性剤及び還元剤を接触させて沈殿と上清に分離し、上清をウエスタンブロッティングに供することにより、生体試料中のエリスロポエチンやＥＳＡ製剤を簡便に検出できることを明らかにした。以下、本実施形態の方法の各工程について説明する。
【００１３】
（工程（ａ））
本工程において、生体試料に、界面活性剤及び還元剤を接触させる。界面活性剤及び還元剤は、同時に生体試料に接触させてもよいし、界面活性剤を生体試料に接触させた後に還元剤を接触させてもよいし、還元剤を生体試料に接触させた後に界面活性剤を接触させてもよい。
【００１４】
生体試料、界面活性剤及び還元剤を接触させる時間は、例えば、１０〜３０時間であってもよく、１５〜２０時間であってもよい。また、生体試料、界面活性剤及び還元剤を接触させる温度は、例えば１５〜４５℃であってもよく、例えば、２０〜４０℃であってもよく、例えば、約３７℃であってもよい。
【００１５】
生体試料としては、腎臓組織、肝臓組織、血漿、血清、尿等を好適に用いることができる。生体試料が由来する種は特に限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、サル等が挙げられる。腎臓組織、肝臓組織は、組織の破砕物等であってよい。従来のＥＬＩＳＡ法によるエリスロポエチンの検出では、約１００μＬの生体試料を必要とするのに対し、本実施形態の方法によれば、数μＬの生体試料でエリスロポエチンやＥＳＡ製剤を検出することができる。また、操作が簡便であり、質量分析法よりも検出感度が高い。生体試料の量は、適宜調整することができるが、例えば、１〜１０μＬであってもよく、例えば、１〜３μＬであってもよい。
【００１６】
本実施形態の方法において、界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＡＳ番号：１５１−２１−３）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＣＡＳ番号：９０１６−４５−９）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＣＡＳ番号：９００２−９３−１）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ−２０、ＣＡＳ番号：９００５−６４−５）及びポリオキシエチレンラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ−３５、ＣＡＳ番号：９００２−９２−０）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を用いることができる。界面活性剤は１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
【００１７】
また、還元剤としては、２−メルカプトエタノール（ＣＡＳ番号：６０−２４−２）、ジチオトレイトール（ＣＡＳ番号：３４８３−１２−３）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、ＣＡＳ番号：５１８０５−４５−９）及び（ＣＡＳ番号：５２−９０−４）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を用いることができる。ＴＣＥＰ及びシステインは塩酸塩であってもよい。還元剤は１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
【００１８】
また、上述した界面活性剤と還元剤を任意に組み合わせて用いることができる。例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０及び２−メルカプトエタノールの組み合わせ、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び２−メルカプトエタノールの組み合わせ、ドデシル硫酸ナトリウム及び２−メルカプトエタノールの組み合わせ、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０及びジチオトレイトールの組み合わせ、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びジチオトレイトールの組み合わせ、ドデシル硫酸ナトリウム及びジチオトレイトールの組み合わせ等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１９】
ドデシル硫酸ナトリウムの濃度は、生体試料に界面活性剤及び還元剤を添加した混合液における終濃度で０．１〜１％程度であってよく、例えば約０．５％であってよい。また、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０の濃度は、終濃度で０．１〜５％程度であってよく、例えば０．２〜４％であってよく、例えば約２．５％であってよい。また、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度は、終濃度で０．１〜５％程度であってよく、例えば０．２〜４％であってよく、例えば約２．５％であってよい。また、Ｔｗｅｅｎ−２０の濃度は、終濃度で０．１〜５％程度であってよく、例えば０．２〜４％であってよく、例えば約２．５％であってよい。また、Ｂｒｉｊ−３５の濃度は、終濃度で０．１〜５％程度であってよく、例えば０．２〜４％であってよく、例えば約２．５％であってよい。
【００２０】
また、２−メルカプトエタノールの濃度は、終濃度で０．１〜１％程度であってよく、例えば０．４〜０．８％であってよく、例えば約０．７５％であってよい。また、ジチオトレイトールの濃度は、終濃度で０．１〜１％程度であってよく、例えば０．４〜０．８％であってよく、例えば約０．７５％であってよい。また、ＴＣＥＰの濃度は、終濃度で０．１〜１％程度であってよく、例えば０．４〜０．８％であってよく、例えば約０．７５％であってよい。また、システインの濃度は、終濃度で０．１〜１％程度であってよく、例えば０．４〜０．８％であってよく、例えば約０．７５％であってよい。
【００２１】
（工程（ｂ））
本工程において、前記界面活性剤及び前記還元剤を接触させた前記生体試料を、沈殿及び上清に分離する。本工程は、例えば遠心分離により好適に行うことができる。遠心分離の条件としては、例えば、２０００×ｇで１５〜３０秒間遠心分離する条件が挙げられる。また、遠心分離時の温度は特に限定されず、例えば４〜２５℃であってよい。
【００２２】
（工程（ｃ））
本工程において、前記上清中のエリスロポエチンをウエスタンブロッティングにより検出する。ウエスタンブロッティングは通常の方法により行うことができる。具体的には、まず、工程（ｂ）で回収した上清をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により展開する。続いて、ニトロセルロース膜、ポリフッカビニリデン（ＰＶＤＦ）膜等の膜に転写する。続いて、ブロッキング溶液中でブロッキング処理を行う。
【００２３】
ブロッキング溶液としては、市販のブロッキング試薬を用いてもよいし、ウシ血清アルブミン溶液、スキムミルク溶液等を用いてもよい。なかでも、スキムミルク溶液が好ましく、５％スキムミルク溶液が特に好ましい。続いて、抗エリスロポエチン抗体を用いて膜に転写されたエリスロポエチン又はＥＳＡ製剤を検出する。抗エリスロポエチン抗体としては、市販の抗体を用いることができ、例えば、抗エリスロポエチン抗体（カタログ番号「ｓｃ−５２９０」、サンタクルーズ社）等を用いることができる。
【００２４】
（第２実施形態）
第２実施形態に係る、生体試料中のエリスロポエチンを検出する方法は、第１実施形態の方法における工程（ｂ）の後工程（ｃ）の前に、上清にＰｅｐｔｉｄｅ  Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｆ（ＰＮＧａｓｅＦ）を接触させる工程を更に含む方法である。第２実施形態における工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、第１実施形態における工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）と同様である。
【００２５】
ＰＮＧａｓｅＦとしては、Ｎ−グリコシド型糖鎖とタンパク質との結合部位（ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ結合）を特異的に切断するものであれば特に制限されず、例えば大腸菌由来のＰＮＧａｓｅＦ（酵素番号：３．５．１．５２）を用いることができる。
【００２６】
また、ＰＮＧａｓｅＦの使用量は、生体試料に応じて適宜調整することができ、例えば、工程（ｂ）で得られた上清数μＬあたり１ｍＵ程度用いることが好適である。ここで、ＰＮＧａｓｅＦの活性は、３７℃、ｐＨ８．５において、フェツイン由来のダンシル化糖ペプチドから１分間に１μｍｏｌの糖鎖を遊離させる酵素活性を１Ｕとする。
【００２７】
実施例において後述するように、生体試料を、第１実施形態の方法と、第２実施形態の方法でそれぞれ処理し、同時にウエスタンブロッティングすることにより、脱糖鎖されたエリスロポエチンのバンドと脱糖鎖されていないエリスロポエチンのバンドを比較することができる。この結果、バンドのシフトが認められた場合、検出されたバンドがエリスロポエチンのバンドであることを確認することができる。
【００２８】
また、生体試料をＰＮＧａｓｅＦ処理で脱糖鎖することにより、生体試料中のエリスロポエチンやＥＳＡ製剤をウエスタンブロッティングで検出する場合の検出感度を高めることができる。
【００２９】
現在、エリスロポエチンのドーピング検査は生体試料として尿を用いて行われている。これに対し、本実施形態の方法によれば、生体試料として血液（血漿又は血清）を用いてエリスロポエチンのドーピング検査を行うことが可能となる。
【００３０】
［生体試料中のエリスロポエチン検出用キット］
１実施形態において、本発明は、界面活性剤及び還元剤を含む、生体試料中のエリスロポエチン検出用キットを提供する。本実施形態のキットにより、上述した、生体試料中のエリスロポエチンを検出する第１実施形態の方法を実施することができる。
【００３１】
本実施形態のキットにおいて、界面活性剤、還元剤については、上述したものと同様である。すなわち、界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０及びＢｒｉｊ−３５からなる群より選択される少なくとも１種の化合物であってもよい。界面活性剤は１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
【００３２】
また、還元剤は、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、ＴＣＥＰ及びシステインからなる群より選択される少なくとも１種の化合物であってもよい。還元剤は１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
【００３３】
本実施形態のキットは、ＰＮＧａｓｅＦを更に含んでいてもよい。ＰＮＧａｓｅＦについては上述したものと同様である。この場合、上述した第２実施形態の方法を実施することができる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３５】
［実験例１］
（ＥＳＡ製剤のウエスタンブロッティング）
様々なＥＳＡ製剤をウエスタンブロッティングに供して検出した。ＥＳＡ製剤としては、遺伝子組換えヒトエリスロポエチン、エポジン（中外製薬）、エスポー（協和発酵キリン）、ネスプ（協和発酵キリン）、ミルセラ（中外製薬）を使用した。
【００３６】
各ＥＳＡ製剤０．０１〜１．０μｇ／１〜１０μＬをそれぞれ２本のマイクロチューブに入れた。続いて、水又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０μＬとした。続いて、各マイクロチューブに、１μＬの変性バッファー（１％ドデシル硫酸ナトリウム）をそれぞれ添加し、１００℃で３分間加熱した。続いて、１１μＬのスタビライジングバッファー（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２４ｍＭ  ＥＤＴＡ、４％２−メルカプトエタノール、２％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）をそれぞれ添加した。
【００３７】
続いて、各ＥＳＡ製剤のマイクロチューブの一方に、それぞれ２μＬのＰＮＧａｓｅＦ（５００ｍＵ／ｍＬ、カタログ番号「４４５０」、タカラバイオ社）を添加して混合し、３７℃で１５〜２０時間インキュベートした。もう一方のチューブには、水又はＰＢＳを２μＬ添加し、同様に３７℃で１５〜２０時間インキュベートした。
【００３８】
続いて、ＰＮＧａｓｅＦ処理しなかった各ＥＳＡ製剤及びＰＮＧａｓｅＦ処理した各ＥＳＡ製剤を１０％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。
【００３９】
続いて、ウエスタンブロッティングによりエリスロポエチンを検出した。ブロッキングには、５％スキムミルクを使用した。１次抗体には、抗エリスロポエチン抗体（カタログ番号「ｓｃ−５２９０」、サンタクルーズ社）を使用した。２次抗体には、抗マウスＩｇＧ抗体（カタログ番号「１１５−０３５−１６６」、ジャクソン社）を使用した。
【００４０】
図１はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図１中、レーン１はＰＮＧａｓｅＦ処理しなかった遺伝子組換えヒトエリスロポエチンの結果であり、レーン２はＰＮＧａｓｅＦ処理により脱糖鎖した遺伝子組換えヒトエリスロポエチンの結果であり、レーン３はＰＮＧａｓｅＦ処理しなかったエポジンの結果であり、レーン４はＰＮＧａｓｅＦ処理により脱糖鎖したエポジンの結果であり、レーン５はＰＮＧａｓｅＦ処理しなかったエスポーの結果であり、レーン６はＰＮＧａｓｅＦ処理により脱糖鎖したエスポーの結果であり、レーン７はＰＮＧａｓｅＦ処理しなかったネスプの結果であり、レーン８はＰＮＧａｓｅＦ処理により脱糖鎖したネスプの結果であり、レーン９はＰＮＧａｓｅＦ処理しなかったミルセラの結果であり、レーン１０はＰＮＧａｓｅＦ処理により脱糖鎖したミルセラの結果である。
【００４１】
この結果から、ＥＳＡ製剤をウエスタンブロッティングにより検出できることが明らかとなった。
【００４２】
［実験例２］
（エリスロポエチンの検出感度の検討１）
脱糖鎖の有無で、エリスロポエチンの検出感度を比較した。エリスロポエチンとしては遺伝子組換えラットエリスロポエチンを使用した。
【００４３】
具体的には、３７０、３７、３．７、０．３７ｐｇに段階希釈したエリスロポエチンをそれぞれ２本のマイクロチューブに入れ、実験例１と同様にして、一方をＰＮＧａｓｅＦ処理し、もう一方をＰＮＧａｓｅＦ処理せずにウエスタンブロッティングにより検出した。なお、抗エリスロポエチン抗体（カタログ番号「ｓｃ−５２９０」、サンタクルーズ社）は、ヒトエリスロポエチン及びラットエリスロポエチンの双方を検出することができる。
【００４４】
図２はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図２中、「ｒＥｐｏ」は遺伝子組換えラットエリスロポエチンを示し、「脱糖鎖（−）」はＰＮＧａｓｅＦ処理しなかった結果を示し、「脱糖鎖（＋）」はＰＮＧａｓｅＦ処理した結果を示す。
【００４５】
その結果、ＰＮＧａｓｅＦ処理しなかった場合には、３７０ｐｇが検出限界であった。一方、ＰＮＧａｓｅＦ処理した場合には、３．７ｐｇまで検出することができた。以上の結果から、ＰＮＧａｓｅＦ処理で脱糖鎖することにより、エリスロポエチンの検出感度が１０〜１００倍高くなることが明らかとなった。
【００４６】
［実験例３］
（エリスロポエチンの検出感度の検討２）
実験例２と同様にして、８４００、８４０、８４、８．４ｐｇに段階希釈した脱糖鎖後のエリスロポエチンをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。図３（ａ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルを亜鉛染色した結果を示す写真である。図３（ａ）中、「Ｍ」は分子量マーカーを示し、「１」〜「４」はレーン番号を示す。
【００４７】
図３（ａ）に示すように、一列おきに分子量マーカーを流し、分子量サイズの確認を行った。その結果、レーン１でのみ、脱糖鎖後のエリスロポエチンが２２ｋＤａの分子サイズで検出された。続いて、レーン１〜４のそれぞれについて、２２ｋＤａのタンパク質バンドのゲルを切り出し、ゲル内消化を行った後、質量分析により、エリスロポエチンの検出を行った。
【００４８】
図３（ｂ）は、バンドを切り出した後のゲルの写真である。図３（ｂ）中、「Ａ」〜「Ｅ」は切り出したバンドの位置を示す。図３（ｂ）に示すように、レーン１では、３６ｋＤａのバンドも亜鉛染色で染色されたため、切り出して質量分析を行った（バンドＥ）。
【００４９】
その結果、８４００ｐｇのエリスロポエチンを質量分析に供した場合にのみ、エリスロポエチンを検出することができた。
【００５０】
実験例２、３の結果から、質量分析よりもウエスタンブロッティングのほうが検出感度が高いことが明らかとなった。
【００５１】
［実験例４］
（血液試料中のエリスロポエチンのウエスタンブロッティングによる検出１）
血液試料をウエスタンブロッティングに供し、エリスロポエチンを検出した。血液試料としては、低酸素環境下でエリスロポエチンの発現を誘導したラット血漿を使用した。動物実験は北里大学実験動物委員会の承認を得て実施した（許可番号２０１６−０３３、２５−２）。
【００５２】
具体的には、ラットを７％Ｏ２、９３％Ｎ２の低酸素環境下に４時間置いた後、血液を採取し、血漿を分離して試料とした。また、比較のために、低酸素環境下に置いていないラットからも血液を採取し、血漿を分離して試料とした。続いて、各血漿試料を、そのまま１０μＬ／レーン相当量アプライしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、実験例１と同様にしてウエスタンブロッティングによりエリスロポエチンを検出した。
【００５３】
図４（ａ）及び（ｂ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図４（ａ）は露光時間２秒で撮影した写真であり、図４（ｂ）は、露光時間５秒で撮影した写真である。図４（ａ）及び（ｂ）中、レーン１、２は低酸素環境下に置いていないラットの結果であり、レーン３、４は低酸素環境下に４時間置いたラットの結果である。また、エリスロポエチンは３４ｋＤａと４３ｋＤａの間に検出されることが期待された。
【００５４】
図４（ａ）及び（ｂ）中、黒く見える部分は非特異的なバンドである。血漿中には大量の夾雑物が存在するため、非特異的反応が強すぎてエリスロポエチンを検出することができないことが確認された。また、図４（ａ）よりも露光時間を長くした図４（ｂ）では、本来エリスロポエチンが検出される領域まで非特異的なバンドが侵食してしまい、やはりエリスロポエチンを検出することができなかった。
【００５５】
続いて、４時間低酸素環境下においてエリスロポエチンの発現を誘導したラット及び低酸素環境下に置いていないラットから採取した血漿１０μＬずつをそれぞれ２本のマイクロチューブに入れた。続いて、各マイクロチューブに、１μＬの変性バッファー（１％ドデシル硫酸ナトリウム）、をそれぞれ添加し、１００℃で３分間加熱した。続いて、１１μＬのスタビライジングバッファー（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２４ｍＭ  ＥＤＴＡ、４％２−メルカプトエタノール、２％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）をそれぞれ添加して混合した。
【００５６】
続いて、各ラット血漿のマイクロチューブの一方に、それぞれ２μＬのＰＮＧａｓｅＦ（５００ｍＵ／ｍＬ、カタログ番号「４４５０」、タカラバイオ社）を添加して混合し、３７℃で１５〜２０時間インキュベートした。もう一方のチューブには、水又はＰＢＳを２μＬ添加し、同様に３７℃で１５〜２０時間インキュベートした。
【００５７】
続いて、ＰＮＧａｓｅＦ処理しなかった各ラット血漿及びＰＮＧａｓｅＦ処理した各ラット血漿を、室温、２０００×ｇで１５〜３０秒間遠心分離し、上清を回収した。続いて、回収した各上清を１０〜２０％のグラディエントアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。続いて、実験例１と同様にして、ウエスタンブロッティングによりエリスロポエチンを検出した。
【００５８】
図５はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図５中、レーン１〜４はＰＮＧａｓｅＦ処理していないラット血漿の結果であり、レーン５〜８はＰＮＧａｓｅＦ処理したラット血漿の結果である。また、レーン１、２及び５、６は低酸素環境下に置いていないラットの結果であり、レーン３、４及び７、８は低酸素環境下に４時間置いたラットの結果である。また、「Ｅｐｏ」及び矢印は脱糖鎖していないエリスロポエチンのバンドの位置を示し、「ｄｅｇＥｐｏ」及び矢印は脱糖鎖したエリスロポエチンのバンドの位置を示す。
【００５９】
その結果、血液試料に界面活性剤及び還元剤を接触させることにより、非特異的なバンドが薄くなり、エリスロポエチンのバンドを検出することが可能となることが明らかとなった。
【００６０】
また、血液試料に界面活性剤及び還元剤を接触させ、更にＰＮＧａｓｅＦ処理することにより、エリスロポエチンのバンドがシフトしたことが明らかとなった。バンドのシフトは、糖鎖の切断によりエリスロポエチンの分子量が小さくなったことを示す。したがって、バンドシフトを検出することにより、検出されたバンドがエリスロポエチンであることを確認することができる。
【００６１】
［実験例５］
（界面活性剤の検討）
血液試料に、界面活性剤及び還元剤を様々な組み合わせで接触させた後、ウエスタンブロッティングに供し、エリスロポエチンを検出した。血液試料としては、７％Ｏ２、９３％Ｎ２の低酸素環境下に４時間置いてエリスロポエチンの発現を誘導したラット血漿を使用した。
【００６２】
具体的には、ラット血漿１０μＬずつを１２本のマイクロチューブに入れた。続いて、各マイクロチューブに、表１に示す組成の試薬をそれぞれ添加し、１００℃で３分間加熱した。
【００６３】
表１中、１〜１２の数字は試料番号を示し、「＋」は添加したことを示し、「−」は添加しなかったことを示す。また、「ＳＤＳ」は終濃度０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを示し、「ＮＰ４０」は終濃度２％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０を示し、「ＴｒＸ」は、終濃度２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を示し、「Ｔｒｉｓ」は終濃度６２．５ｍＭのＴｒｉｓ（ＣＡＳ番号：７７−８６−１）−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）を示し、「ＥＤＴＡ」は終濃度２４ｍＭのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＣＡＳ番号：６３８１−９２−６）を示す。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
続いて、各試料を、３７℃ウォーターバス中で１５〜２０時間インキュベートした後、室温、２０００×ｇで１５〜３０秒間遠心分離し、上清を回収した。続いて、回収した各上清を、１０％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。続いて、実験例１と同様にして、ウエスタンブロッティングによりエリスロポエチンを検出した。
【００６６】
図６はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。レーン１〜１２にそれぞれ試料番号１〜１２の試料をアプライした。その結果、試料番号２、６、８、９、１２の試料で非特異的バンドの出現が少ないことが明らかとなった。
【００６７】
この結果から、非特異的バンドを減らすためには、還元剤の添加が必須であることが明らかとなった。また、界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウムに加えてＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０又はＴｒｉｔｏｎＸ−１００を組み合わせて用いると、非特異的バンドがより減少する傾向が認められた。
【００６８】
［実験例６］
（血液試料中のエリスロポエチンのウエスタンブロッティングによる検出２）
ラットにＥＳＡ製剤を静脈注射した。ＥＳＡ製剤としてはネスプを使用し、９０μｇ／５０ｋｇ体重の投与量で投与した。続いて、３０分後に血漿試料を採取した。続いて、採取した血漿試料を、同日に実験を行ったコントロールの血漿で１０倍、１００倍、１，０００倍に段階希釈した。続いて、段階希釈した各血漿試料１０μＬずつをそれぞれ２本のマイクロチューブに入れた。
【００６９】
続いて、各マイクロチューブに、１μＬの変性バッファー（１０％ドデシル硫酸ナトリウム）をそれぞれ添加し、１００℃で３分間加熱した。続いて、１μＬの水をそれぞれ添加した。続いて、１０μＬのスタビライジングバッファー（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２４ｍＭ  ＥＤＴＡ、４％２−メルカプトエタノール、２％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）をそれぞれ添加して混合した。
【００７０】
続いて、各試料のマイクロチューブの一方に、それぞれ２μＬのＰＮＧａｓｅＦ（５００ｍＵ／ｍＬ、カタログ番号「４４５０」、タカラバイオ社）を添加して混合し、３７℃で１５〜２０時間インキュベートした。もう一方のチューブには、水を２μＬ添加し、同様に３７℃で１５〜２０時間インキュベートした。
【００７１】
続いて、ＰＮＧａｓｅＦ処理しなかった各試料及びＰＮＧａｓｅＦ処理した各試料を、室温、２０００×ｇで１５〜３０秒間遠心分離し、上清を回収した。続いて、回収した各上清を１０％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。続いて、実験例１と同様にして、ウエスタンブロッティングによりエリスロポエチンを検出した。また、比較のために、段階希釈した血漿試料をそのままＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングに供した。
【００７２】
図７（ａ）及び（ｂ）はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図７（ａ）中、レーン１〜４は血漿をそのまま用いた結果であり、レーンＡはＰＮＧａｓｅＦ処理していないネスプを実験例１と同様にそのままゲルに流した結果であり、レーンＢはＰＮＧａｓｅＦ処理したネスプを実験例１と同様にそのままゲルに流した結果である。また、レーン１はネスプ投与前に回収したコントロールの血漿の結果であり、レーン２はコントロール血漿を用いて１００倍希釈したネスプ投与後の血漿の結果であり、レーン３はコントロール血漿を用いて１０倍希釈したネスプ投与後の血漿の結果であり、レーン４は希釈していないネスプ投与後の血漿の結果である。
【００７３】
また、図７（ｂ）中、レーン１〜４はＰＮＧａｓｅＦ処理していない試料の結果であり、レーン５〜８はＰＮＧａｓｅＦ処理した試料の結果であり、レーンＡはＰＮＧａｓｅＦ処理していないネスプの結果であり、レーンＢはＰＮＧａｓｅＦ処理したネスプの結果である。また、レーン１及び５はコントロール血漿を用いて１，０００倍希釈した血漿の結果であり、レーン２及び６はコントロール血漿を用いて１００倍希釈した血漿の結果であり、レーン３及び７はコントロール血漿を用いて１０倍希釈した血漿の結果であり、レーン４及び８は希釈していない血漿の結果である。
【００７４】
図７（ｂ）中、黒矢頭はＰＮＧａｓｅＦ処理していないネスプのバンドの位置を示し、白矢頭はＰＮＧａｓｅＦ処理後のネスプのバンドの位置を示す。
【００７５】
その結果、図７（ａ）に示すように、血漿試料そのままでは非特異的反応が強すぎてエリスロポエチン製剤であるネスプを検出することができないことが確認された。一方、図７（ｂ）のレーン４に示すように、血漿試料に界面活性剤及び還元剤を接触させることで、希釈していない血漿においてもネスプを検出することができたことが確認された。更に、図７（ｂ）のレーン７、８に示すように、ＰＮＧａｓｅＦ処理することにより１０倍希釈した血漿及び希釈していない血漿においてもネスプを検出することができたことが確認された。
【００７６】
［実験例７］
（尿試料中のエリスロポエチンのウエスタンブロッティングによる検出）
ラットにＥＳＡ製剤を静脈注射した。ＥＳＡ製剤としてはネスプを使用し、９０μｇ／５０ｋｇ体重の投与量で投与した。続いて、３０分後に尿試料を回収した。続いて、回収した尿試料を、ネスプ投与前に回収したコントロール尿で１０倍及び１００倍に段階希釈した。続いて、希釈していない尿試料、段階希釈した各尿試料及びコントロールの尿試料各１０μＬずつをそれぞれ２本のマイクロチューブに入れた。
【００７７】
続いて、各マイクロチューブに、１μＬの変性バッファー（１０％ドデシル硫酸ナトリウム）をそれぞれ添加し、１００℃で３分間加熱した。続いて、１μＬの水をそれぞれ添加した。続いて、１０μＬのスタビライジングバッファー（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２４ｍＭ  ＥＤＴＡ、４％２−メルカプトエタノール、２％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）をそれぞれ添加して混合した。
【００７８】
続いて、各試料のマイクロチューブの一方に、それぞれ２μＬのＰＮＧａｓｅＦ（５００ｍＵ／ｍＬ、カタログ番号「４４５０」、タカラバイオ社）を添加して混合し、３７℃で１５〜２０時間インキュベートした。もう一方のチューブには、水を２μＬ添加し、同様に３７℃で１５〜２０時間インキュベートした。
【００７９】
続いて、ＰＮＧａｓｅＦ処理しなかった各試料及びＰＮＧａｓｅＦ処理した各試料を、室温、２０００×ｇで１５〜３０秒間遠心分離し、上清を回収した。続いて、回収した各上清を１０％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。続いて、実験例１と同様にして、ウエスタンブロッティングによりエリスロポエチンを検出した。また、比較のために、希釈していない尿試料、段階希釈した各尿試料及びネスプ投与前に回収したコントロールの尿試料をそのままＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングに供した。また、比較のために、ネスプ及び遺伝子組換えヒトエリスロポエチンもＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングに供した。
【００８０】
図８（ａ）〜（ｃ）はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図８（ａ）は尿試料をそのままＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングに供した結果であり、図８（ｂ）はＰＮＧａｓｅＦ処理していない尿試料の結果であり、図８（ｃ）はＰＮＧａｓｅＦ処理した尿試料の結果である。
【００８１】
図８（ａ）中、レーン１はネスプ投与前に回収したコントロール尿試料の結果であり、レーン２はコントロール尿試料を用いて１００倍希釈した、ネスプ投与後の尿試料の結果であり、レーン３はコントロール尿試料を用いて１０倍希釈したネスプ投与後の尿試料の結果であり、レーン４は希釈していないネスプ投与後の尿試料の結果である。また、レーンＡは遺伝子組換えヒトエリスロポエチンの結果であり、レーンＢはネスプの結果である。
【００８２】
また、図８（ｂ）中、レーン１はコントロールの尿試料の結果であり、レーン２は１００倍希釈した尿試料の結果であり、レーン３は１０倍希釈した尿試料の結果であり、レーン４は希釈していない尿試料の結果である。また、レーンＡは遺伝子組換えヒトエリスロポエチンの結果であり、レーンＢはネスプの結果である。
【００８３】
また、図８（ｃ）中、レーン１はコントロールの尿試料の結果であり、レーン２は１００倍希釈した尿試料の結果であり、レーン３は１０倍希釈した尿試料の結果であり、レーン４は希釈していない尿試料の結果である。また、レーンＣはＰＮＧａｓｅＦ処理したネスプの結果である。
【００８４】
また、図８（ａ）〜（ｃ）中、「ｒｈＥｐｏ」は遺伝子組換えヒトエリスロポエチンを実験例１と同様にそのままゲルに流したバンドの位置を示し、「ネスプ」はネスプを実験例１と同様にそのままゲルに流したバンドの位置を示し、写真の下の数字はネスプの投与量を示す。また、白矢頭はＰＮＧａｓｅＦ処理後のネスプのバンドの位置を示す。
【００８５】
その結果、図８（ａ）に示すように、尿試料そのままではエリスロポエチンを検出することができないことが確認された。また、図８（ｂ）に示すように、尿血漿試料に界面活性剤及び還元剤を接触させた場合においてもネスプの検出は困難であった。一方、図８（ｃ）のレーン４に示すように、ＰＮＧａｓｅＦ処理することにより、ネスプを検出することができたことが確認された。
【００８６】
［実験例８］
（血液試料中のエリスロポエチンのウエスタンブロッティングによる検出３）
ＥＳＡ製剤を投与した慢性腎不全による腎性貧血の患者の血漿中のＥＳＡ製剤をウエスタンブロッティングにより検出した。患者１は、ＥＳＡ製剤としてミルセラ１００μｇの皮下注投与を受けていた。投与３日後に血漿を採取した。患者２は、ＥＳＡ製剤としてミルセラ５０μｇの皮下注投与を受けていた。投与２８日後に血漿を採取した。続いて、各血漿試料１０μＬずつをそれぞれ２本のマイクロチューブに入れた。
【００８７】
続いて、各マイクロチューブに、１μＬの変性バッファー（１０％ドデシル硫酸ナトリウム）をそれぞれ添加し、１００℃で３分間加熱した。続いて、１μＬの水をそれぞれ添加した。続いて、１０μＬのスタビライジングバッファー（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２４ｍＭ  ＥＤＴＡ、４％２−メルカプトエタノール、２％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）をそれぞれ添加して混合した。
【００８８】
続いて、各試料のマイクロチューブの一方に、それぞれ２μＬのＰＮＧａｓｅＦ（５００ｍＵ／ｍＬ、カタログ番号「４４５０」、タカラバイオ社）を添加して混合し、３７℃で１５〜２０時間インキュベートした。もう一方のチューブには、水を２μＬ添加し、同様に３７℃で１５〜２０時間インキュベートした。
【００８９】
続いて、ＰＮＧａｓｅＦ処理しなかった各試料及びＰＮＧａｓｅＦ処理した各試料を、室温、２０００×ｇで１５〜３０秒間遠心分離し、上清を回収した。続いて、回収した各上清を１０％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。続いて、実験例１と同様にして、ウエスタンブロッティングによりエリスロポエチンを検出した。また、比較のために、ミルセラ及び遺伝子組換えヒトエリスロポエチンもＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングに供した。また、比較のために、採取した血漿試料４μＬずつをそのままＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングに供した。
【００９０】
図９（ａ）及び（ｂ）はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図９（ａ）中、レーン１は患者１の血漿をそのまま用いた結果であり、レーン２は患者２の血漿をそのまま用いた結果であり、「Ａ−」は遺伝子組換えヒトエリスロポエチンをＰＮＧａｓｅＦ処理せずにＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングに供した結果であることを示す。
【００９１】
また、図９（ｂ）中、レーン１はＰＮＧａｓｅＦ処理しなかった患者１の血漿の結果であり、レーン２はＰＮＧａｓｅＦ処理しなかった患者１の血漿の結果であり、レーン３はＰＮＧａｓｅＦ処理した患者１の血漿の結果であり、レーン４はＰＮＧａｓｅＦ処理した患者２の血漿の結果である。
【００９２】
また、「Ａ−」は遺伝子組換えヒトエリスロポエチンをＰＮＧａｓｅＦ処理せずにＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングに供した結果であることを示し、「Ａ＋」は遺伝子組換えヒトエリスロポエチンをＰＮＧａｓｅＦ処理してＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングに供した結果であることを示し、「Ｂ−」はミルセラをＰＮＧａｓｅＦ処理せずにＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングに供した結果であることを示し、「Ｂ＋」はミルセラをＰＮＧａｓｅＦ処理してＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングに供した結果であることを示し、黒矢頭はＰＮＧａｓｅＦ処理していないミルセラのバンドの位置を示し、白矢頭はＰＮＧａｓｅＦ処理後のミルセラのバンドの位置を示す。
【００９３】
その結果、図９（ａ）に示すように、血漿試料そのままでは非特異的反応が強すぎてエリスロポエチン製剤であるミルセラを検出することができないことが確認された。一方、図９（ｂ）のレーン１、２に示すように、血漿試料に界面活性剤及び還元剤を接触させることで、血漿中のミルセラを検出することができたことが確認された。
【００９４】
更に、図９（ｂ）のレーン３に示すように、患者１の血漿では、ＰＮＧａｓｅＦ処理することにより、ミルセラのバンドがシフトしたことが明らかとなった。なお、図９（ｂ）のレーン４に示すように、患者２の血漿では、ＰＮＧａｓｅＦ処理後のバンドが薄すぎて位置がはっきりしなかった。
【００９５】
以上の結果から、ヒト血漿中のミルセラは、少なくとも皮下注後約１ヵ月程度であれば検出できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明によれば、生体試料中のエリスロポエチンやＥＳＡ製剤をウエスタンブロッティング法により簡便に検出する技術を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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