(57)【要約】      （修正有）【課題】酢酸誘導性プロモーターを利用して目的とする遺伝子転写を阻害することにより、Ｌ−アミノ酸を生産する方法を提供する。【解決手段】酢酸誘導性プロモーターを、染色体内の目的遺伝子の終止コドンの下流に前記目的遺伝子の転写に対して反対の向きに導入して形質転換された、Ｌ−アミノ酸生産能を有する組換えコリネ型微生物を培養する段階であって、前記目的遺伝子がＬ−アミノ酸の生合成経路の分岐点に位置する遺伝子である、段階を含むＬ−アミノ酸の生産方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）酢酸誘導性プロモーターを、染色体内の目的遺伝子の終止コドンの下流に導入させ
て形質転換された、Ｌ−アミノ酸生産能を有する組換えコリネ型微生物を培養する段階；
及び
２）前記培養段階で酢酸を添加することにより、培養中、前記目的遺伝子の発現を低下
させ、前記組換えコリネ型微生物のＬ−アミノ酸生産能を強化する段階；
を含むＬ−アミノ酸の生産方法。
【請求項２】
前記終止コドンの下流は、前記目的遺伝子の終止コドンと転写ターミネータの上流との
間であることを特徴とする、請求項１に記載のＬ−アミノ酸の生産方法。
【請求項３】
前記酢酸誘導性プロモーターは、配列番号１または配列番号２の塩基配列を有すること
を特徴とする、請求項１に記載のＬ−アミノ酸の生産方法。
【請求項４】
前記目的遺伝子は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼサブユニットＥ１をコードする遺伝子
（ＮＣｇｌ１２１６７）、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ＮＣｇｌ１
１３６）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイルアラニル−Ｄ−グルタミン酸−２，６−ジア
ミノピメリン酸リガーゼをコードする遺伝子（ＮＣｇｌ２０８３）及びジヒドロジピコリ
ン酸合成酵素をコードする遺伝子（ＮＣｇｌ１８９６）からなる群から一つ以上の遺伝子
が選択されることを特徴とする、請求項１に記載のＬ−アミノ酸の生産方法。
【請求項５】
前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−リジンまたはＬ−トレオニンであることを特徴とする、請求
項４に記載のＬ−アミノ酸の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子転写阻害方法を用いたＬ−アミノ酸の生産方法に関する。
【０００２】
本出願は、大韓民国特許庁（ＫＩＰＯ）に２０１３年１０月１１日に出願された特許文
献１と２０１４年７月１８日に出願された特許文献２の利益を主張し、その内容全体が本
明細書に参照として組み込まれる。
本発明の一つまたはそれ以上の実施例は、遺伝子転写阻害方法を用いたＬ−アミノ酸の
生産方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
コリネ型微生物において、各種炭素源から解糖系（Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）を経て生成
されたピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）は、オキサロ酢酸  （ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ
）を経てアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）に転換される。当該アスパラギン酸は、
各生合成経路を経てトレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、メチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉ
ｎｅ）、イソロイシン（Iｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）及びリジン（Lｙｓｉｎｅ）のようなアミ
ノ酸類に転換される（図１）。したがって、アミノ酸生合成の過程で分岐点に位置した遺
伝子の発現を阻害することにより、副産物の生産を減らし、目的とするアミノ酸の生産を
増大させることができる。
【０００４】
前記のように微生物を遺伝工学的または代謝工学的技術を利用して、目的物質を高力価
で生産することができる菌株として開発するためには、微生物内の種々の代謝過程に関連
する遺伝子の発現を選択的に調節することができなければならない。最近、遺伝子の発現
を低下させるための「人工的収束転写（artificial convergent transcription）」とい
う技術が報告された（非特許文献１）。前記人工的収束転写技術は、目的遺伝子の転写タ
ーミネータ（transcription terminator）の下流に当該遺伝子転写方向の逆方向に進行す
るプロモーターを挿入することにより、各プロモーター由来のＲＮＡポリメラーゼ複合体
（RNA polymerase complex）が転写過程中に、互いに衝突を起こして、目的遺伝子の発現
を低下させる技術である。
【０００５】
そこで、本発明者らは、酢酸誘導性プロモーターを目的遺伝子の転写方向の逆方向に進
行するように挿入し、酢酸が存在する条件で選択的に目的遺伝子の発現を阻害する技術を
開発し、これを分岐点に位置する遺伝子の発現を阻害するのに効果的に適用して、Ｌ−ア
ミノ酸の生産性の向上したコリネ型微生物を提供することができることを確認し、本発明
を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国特許出願第１０−２０１３−０１２１０９０号公報
【特許文献２】韓国特許出願第１０−２０１４−００９１３０７号公報
【特許文献３】韓国登録特許０１５９８１２号
【特許文献４】韓国登録特許０９２４０６５号
【特許文献５】韓国登録特許１９９４-０００１３０７
【特許文献６】韓国登録特許２０３１１２６号、参照２０１１-０１２７９５５
【特許文献７】韓国登録公開番号２０１３-００６１５７０
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Krylov et al., J Mol Microbiol Biotechnol, 18:1-13, 2010
【非特許文献２】Gerstmeir et al., J Biotechnol, 104, 99-122, 2003
【非特許文献３】Ｂｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１２、１３：Ｒ４０
【非特許文献４】Blombach B et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2007 Sep;76(3):615-23
【非特許文献５】Appl. Microbiol.Biotechnol.(1999) 52:541-545
【非特許文献６】Mateos et al., J Bacteriol, 176(23), 7362-7371, 1994
【非特許文献７】Patek et al., Biotechnology letters, Vol 19, No 11, 1997
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、酢酸誘導性プロモーターを利用して目的とする遺伝子転写を阻害する
ことにより、Ｌ−アミノ酸を生産する方法を提供することにある。
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、  
１）酢酸誘導性プロモーターを、染色体内の目的遺伝子の終止コドンの下流に導入して形
質転換された、Ｌ−アミノ酸生産能を有する組換えコリネ型微生物を培養する段階；及び
２）前記培養段階において酢酸を添加することにより、培養中、前記目的遺伝子の発現を
低下させ、前記組換えコリネ型微生物のＬ−アミノ酸生産能を強化する段階；
を含むＬ−アミノ酸の生産方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
以下、本発明に係る実施例を添付した図面を参照して詳しく説明し、明細書の全体で、
各図面に提示された同一な参照符号は同一な部材を示す。これに関連し、これら実施例は
、他の具体的な形で実施することもでき、これらに限定的なものではないことを理解しな
ければならない。したがって、これら実施例は、本発明の態様を説明するために、単に図
面を参照して記載したものに過ぎない。「少なくとも１つ」のような表現が構成要素のリ
ストに先行して記載された場合には、全構成要素のリストを変更するものであり、そのリ
ストの各構成要素を変更するものではない。以下、本発明を詳しく説明する。
【００１１】
一態様として、本発明は、
１）酢酸誘導性プロモーターを染色体内の目的遺伝子の終止コドンの下流に導入して形
質転換された、Ｌ−アミノ酸生産能を有する組換えコリネ型微生物を培養する段階；及び
２）前記培養段階において酢酸を添加することにより、培養中、前記目的遺伝子の発現
を低下させ、前記組換えコリネ型微生物のＬ−アミノ酸生産能を強化する段階；
を含むＬ−アミノ酸の生産方法を提供する。
【００１２】
本発明における用語「酢酸誘導性プロモーター（ａｃｅｔａｔｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ
ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」とは、酢酸が存在する条件で発現誘導活性を有するプロモーター
を意味する。
【００１３】
コリネ型微生物において、酢酸は、酢酸キナーゼ（ａｃｅｔａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ、ａ
ｃｋＡ、ＮＣｇｌ２６５６）とホスホトランスアセチラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓ
ａｃｅｔｙｌａｓｅ、ｐｔａ、ＮＣｇｌ２６５７）により、またはスクシニルＣｏＡ：酢
酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ｓｕｃｃｉｎｙｌ−ＣｏＡ：  ａｃｅｔａｔｅ  ＣｏＡ
−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ａｃｔＡ、ＮＣｇｌ２４８０）により、アセチルＣｏＡ（ａ
ｃｅｔｙｌ  ＣｏＡ）に転換された後、グリオキシル酸回路のイソクエン酸リアーゼ（ｉ
ｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｌｙａｓｅ、ａｃｅＡ、ＮＣｇｌ２２４８）の作用を経て代謝され
る。大腸菌では、アセチルＣｏＡシンテターゼ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈｅｔ
ａｓｅ、ａｃｓ、ｂ４０６９）により酢酸がアセチルＣｏＡに転換される（非特許文献２
）。酢酸代謝に関与する前記遺伝子は、酢酸が存在する条件で発現が誘導される。したが
って、これら遺伝子プロモーターを用いる場合、酢酸が存在する条件で特異的に遺伝子の
発現を誘導することができる。
【００１４】
ここで酢酸誘導性プロモーターとして、イソクエン酸リアーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ
ｌｙａｓｅ）をコードする遺伝子（ａｃｅＡ、ＮＣｇｌ２２４８）のプロモーターまた
は酢酸キナーゼ（ａｃｅｔａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）をコードする遺伝子（ａｃｋＡ、ＮＣ
ｇｌ２６５６）とホスホトランスアセチラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓａｃｅｔｙｌ
ａｓｅ）をコードする遺伝子（ｐｔａ、ＮＣｇｌ２６５７）オペロンのプロモーター、即
ち、ｐｔａ遺伝子の上流プロモーターが挙げられる。より具体的には、前記酢酸誘導性プ
ロモーター中、ａｃｅＡ遺伝子プロモーターは、配列番号１で記載される塩基配列を有し
、ａｃｅＡ遺伝子の上流４８６個の塩基対（ｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ）とオープンリーディ
ングフレーム（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）のＮ−末端から３６個
の塩基対を含む。
【００１５】
また他の酢酸誘導性プロモーターであるｐｔａ遺伝子の上流プロモーターは、配列番号
２で記載される塩基配列を有し、ｐｔａ遺伝子の上流の３４０個の塩基対を含む。
【００１６】
また、酢酸により目的遺伝子の発現を誘導することができれば、本発明の範囲に含まれ
ることは自明である。その例として、配列番号１または２の塩基配列を含むか、又は前記
配列番号１または２の塩基配列の保存配列を含みながら、１つ以上の位置で１つまたは多
数個（タンパク質のアミノ酸残基の立体構造における位置や種類によって異なるが、具体
的には、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個）の塩基が置換、
欠失、挿入、付加、または逆転された塩基配列を含むことができるが、前記誘導性プロモ
ーターの機能を維持または強化させることができるものであれば、配列番号１または２の
塩基配列に対し、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に
好ましくは９７％以上の相同性を有する塩基配列を含むことができ、前記塩基の置換、欠
失、挿入、付加、または逆転などには、前記誘導性プロモーターの機能を維持する限り、
天然に生じる変異体配列または人為的な変異配列も含むことができる。
【００１７】
本発明における用語「相同性」とは、互いに異なる２つの塩基配列間の同一性を意味す
るが、点数（ｓｃｏｒｅ）、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、類似度（ｓｉｍｉｌａｒｉｔ
ｙ）などの媒介変数（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を計算するＢＬＡＳＴ２．０を利用する当業
者によく知られている方法で決定することができるが、特にこれに限定されない。
【００１８】
本発明において、特に言及しない限り、前記用語「上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）」は、５
’方向をいい、前記用語「下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）」は、３’方向を意味する。
【００１９】
本発明において、染色体内の目的遺伝子は、各種炭素源からトレオニン（Ｔｈｒｅｏｎ
ｉｎｅ）、メチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ
）及びリジン（Ｌｙｓｉｎｅ）などのアミノ酸類の生合成過程に関与する遺伝子であり、
特に、生合成経路で分岐点に位置する遺伝子になり得る。  
【００２０】
例えば、リジンの場合、ピルビン酸をアセチルＣｏＡ（ａｃｅｔｙｌ  ＣｏＡ）に転換
するのに関連するピルビン酸デヒドロゲナーゼサブユニットＥ１（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄ
ｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｅ１、ａｃｅＥ、ＮＣｇｌ２１６７）遺伝
子、アスパラギン酸からホモセリン（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎ）を生成するホモセリンデヒド
ロゲナーゼ（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ｈｏｍ、ＮＣｇｌ１
１３６）遺伝子、そして、リジンの前駆体であるメソ−２，６−ジアミノピメリン酸（ｍ
ｅｓｏ−２，６−Ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ）を利用して菌体の合成に用いるＵＤ
Ｐ−Ｎ−アセチルムラモイルアラニル−Ｄ−グルタミン酸−２，６−ジアミノピメリン酸
リガーゼ（ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｏｙｌａｌａｎｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｔａｍ
ａｔｅ−２，６−ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ  ｌｉｇａｓｅ、ｍｕｒＥ、ＮＣｇｌ
２０８３）遺伝子などが生合成経路の分岐点に位置する。
【００２１】
また、トレオニンの場合は、アスパラギン酸からリジンの生成に関与するジヒドロジピ
コリン酸合成酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｐｉｃｏｌｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ｄａ
ｐＡ、ＮＣｇｌ１８９６）遺伝子、メチオニンの場合は、ホモセリンからトレオニンの生
成に関与するホモセリンキナーゼ（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ、  ｔｈｒＢ、
ＮＣｇｌ１１３７）遺伝子が分岐点である。ピルビン酸由来のアミノ酸であるアラニン（
Ａｌａｎｉｎｅ）、バリン（Ｖａｌｉｎｅ）の場合、ピルビン酸をアセチルＣｏＡ（ａｃ
ｅｔｙｌ  ＣｏＡ）に転換するのに関連するピルビン酸デヒドロゲナーゼサブユニットＥ
１（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｅ１、ａｃｅＥ
、ＮＣｇｌ２１６７）遺伝子が分地点に位置する。
【００２２】
ここで、目的遺伝子の具体的な例として、ピルビン酸デヒドロゲナーゼサブユニットＥ
１をコードする遺伝子（ａｃｅＥ、ＮＣｇｌ２１６７）、ホモセリンデヒドロゲナーゼを
コードする遺伝子（ｈｏｍ、ＮＣｇｌ１１３６）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイルアラ
ニル−Ｄ−グルタミン酸−２，６−ジアミノピメリン酸リガーゼをコードする遺伝子（ｍ
ｕｒＥ、ＮＣｇｌ２０８３）またはジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子（
ｄａｐＡ、ＮＣｇｌ１８９６）からなる群から選択され得るが、これに限定されるもので
はない。
【００２３】
具体的には、ピルビン酸デヒドロゲナーゼサブユニットＥ１（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅ
ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｅ１、ａｃｅＥ、ＮＣｇｌ２１６７）は、解
糖系の最終代謝物であるピルビン酸をＴＣＡ回路（ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉ
ｄ  ｃｙｃｌｅ）に流入させるのに関与するＰＤＨＣ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒ
ｏｇｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の構成タンパク質の一つである。したがって、ａｃｅ
Ｅ遺伝子の発現量を低下させることにより、ＴＣＡ回路への炭素源の流入を弱化させ、リ
ジン生合成の方に炭素源の流入を増やしてリジンの生産を増加させることができる。
【００２４】
ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、
ｈｏｍ、ＮＣｇｌ１１３６）は、アスパラギン酸セミアルデヒド（ａｓｐａｒｔａｔｅ  
ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ）からホモセリン（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ）を合成する酵素で
ある。アスパラギン酸セミアルデヒドは、リジン生合成経路の中間前駆体の一つであるた
め、ｈｏｍ遺伝子の活性を低下させることにより、ホモセリン合成経路への炭素源の流入
を弱化させ、リジン生合成の方に炭素源の流入を増やしてリジンの生産を増加させること
ができる。
【００２５】
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイルアラニル−Ｄ−グルタミン酸−２，６−ジアミノピメ
リン酸リガーゼ（ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｏｙｌａｌａｎｙｌ−Ｄ−ｇｌｕ
ｔａｍａｔｅ−２，６−ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ  ｌｉｇａｓｅ、ｍｕｒＥ、Ｎ
Ｃｇｌ２０８３）は、菌体の合成に関与する酵素であり、メソ−２，６−ジアミノピメリ
ン酸（ｍｅｓｏ−２，６−Ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ）を菌体の合成のために用い
る。メソ−２，６−ジアミノピメリン酸は、また、リジン生合成の前駆体として用いられ
、ｍｕｒＥ遺伝子の活性を低下させることにより、菌体の合成への炭素源の流入を弱化さ
せ、リジン生合成経路への炭素源の流入を増やしてリジンの生産を増加させることができ
る。
【００２６】
ジヒドロジピコリン酸合成酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｐｉｃｏｌｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔ
ｈａｓｅ、ｄａｐＡ、ＮＣｇｌ１８９６）は、アスパラギン酸セミアルデヒド（ａｓｐａ
ｒｔａｔｅ  ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ）を用いてリジンの生成に関与する酵素である。
アスパラギン酸セミアルデヒドは、トレオニン生合成経路の中間前駆体の一つであるため
、ｄａｐＡ遺伝子の活性を低下させることにより、リジン合成経路への炭素源の流入を弱
化させ、トレオニン生合成の方に炭素源の流入を増やしてトレオニンの生産を増加させる
ことができる。
【００２７】
本発明における用語「終止コドン（ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ）」とは、ｍＲＮＡ上のコド
ンのうち、アミノ酸を指定せずに、タンパク質の合成過程が終了したことを知らせる信号
として作用するコドンであり、一般に、ＵＡＡ、ＵＡＧ、ＵＧＡの３つが終止コドンとし
て用いられる。
【００２８】
本発明における用語「転写ターミネータ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎ
ａｔｏｒ）」とは、ＧＣ塩基が多く存在する逆反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａ
ｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を意味し、ヘアピンループ（ｈａｉｒｐｉｎ  ｌｏｏｐ）を形成
することにより、遺伝子の転写を終結させる。
【００２９】
本発明では、前述のように、目的遺伝子の発現を低下させるための目的として、酢酸誘
導性プロモーターを目的遺伝子の終止コドンの下流、好ましくは、終止コドンと転写ター
ミネータの上流との間に導入させることができる。酢酸誘導性プロモーターを用いること
により、目的遺伝子の発現を低下させられる時点で酢酸により目的遺伝子を逆方向に転写
させて、ＲＮＡポリメラーゼ複合体（ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）
が転写過程中に衝突を起こすようにして目的遺伝子発現を低下させる。
【００３０】
前記目的遺伝子の発現を低下させられる時点は、培養時期のいつでも可能であり、より
具体的には、培養前または培養中であってもよい。
【００３１】
本発明における用語「形質転換」とは、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードす
るタンパク質が発現できるようにすることを意味する。導入されたポリヌクレオチドは、
宿主細胞内で発現さえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、または染
色体外に位置することができる。また、前記ポリヌクレオチドは、目的タンパク質をコー
ドするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現
できるものであれば、どのような形で導入されてもよい。
【００３２】
本発明で用いるＬ−アミノ酸生産能を有するコリネ型微生物は、コリネバクテリウム（
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）属、アスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、及びミクロバクテ
リウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ）の微生物を含む概念である。この
ようなコリネ型微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・サ
ーモアミノゲネス（ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・フラー
ウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタム（ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）及びこれらから製造されたＬ−アミノ酸
を生産する突然変異体または菌株などを挙げることができ、好ましくは、コリネバクテリ
ウム・グルタミクムであるが、これらの例に限定されるものではない。
【００３３】
より具体的には、本発明において、コリネ型微生物としてコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株（旧寄託番号ＫＦＣＣ１０８８１、特許文献３参照）、
コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ菌株（特許文献４参照）、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３４７Ｐ菌株（旧寄託番号ＫＦＣＣ１０７５
０、特許文献５参照）を使用した。
【００３４】
また、本発明において、コリネ型微生物としてコリネバクテリウム・グルタミクムＣＪ
３Ｐ菌株を使用しており、これは、バインダー（Ｂｉｎｄｅｒ）などの報告によりコリネ
バクテリウム・グルタミクム野生株（ＡＴＣＣ１３０３２）を親株にして、リジン生産効
率に関連する遺伝子の３種（ｐｙｃ（Ｐ４５８Ｓ）、ｈｏｍ（Ｖ５９Ａ）、ｌｙｓＣ（Ｔ
３１１Ｉ））に対して変異を導入することにより、リジン生産能を有するようになった菌
株である（非特許文献３）。
【００３５】
また、他のコリネ型微生物としてコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２２
２Ｐ菌株を使用しているが、これは、Ｌ−トレオニン生産菌株である（特許文献６）。
【００３６】
本発明の一具現例において、本願発明の配列番号１または配列番号２の塩基配列を有す
るプロモーターが導入されたコリネ型微生物は、すべて親株に比べてＬ−リジンまたはＬ
−トレオニン生産能が増加した。
【００３７】
本発明の方法において、コリネ型微生物の培養は、当業界で知られている任意の培養条
件及び培養方法を使用することができる。
【００３８】
コリネ型菌株の培養のために用いられる培地としては、例えば、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  
Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ｂｙ  ｔｈｅ  
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎ
ｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡ、１９８１）に公知された培地がある。
【００３９】
培地の成分中、用いられる糖源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フル
クトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油
、ヒマシ油、ココナッツ油などのような油及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノ
ール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有
機酸が含まれる。これら物質は、個別にまたは混合物として用いることができる。
【００４０】
用いられる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ
浸漬液、大豆、及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も
、個別にまたは混合物として用いることができる。
【００４１】
用いられるリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは
これに相応するナトリウムを含有する塩が含まれる。また、培養培地は、成長に必要な硫
酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有しなければならない。最後に、前記物
質に加えて、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が用いられる。また、培養培地
に適切な前駆体が用いられる。前記原料は、培養過程で培養物に適切な方法により回分式
または連続式で添加することができる。
【００４２】
前記微生物の培養中、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化
合物またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方法で用いて培養物のｐＨを調節
することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用い気泡の生
成を抑制することができる。好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素−含
有気体（例えば、空気）を注入する。培養の温度は、通常２０℃〜４５℃、好ましくは２
５℃〜４０℃である。培養時間は、所望のＬ−アミノ酸の生成量が最大に得られるまで続
けることができるが、好ましくは、１０〜１６０時間である。
【００４３】
本発明の方法において、培養は、バッチ工程、フェドバッチ及び繰り返しフェドバッチ
工程のような連続式または回分式で行うことができる。このような培養方法は、当業界に
おいて周知であり、任意の方法を用いることができる。
【００４４】
本発明における用語「培養段階」とは、培地調製時期及び培養中の時期のいずれも含む
ことができる。
【００４５】
本発明の前記培養段階で生産されたＬ−アミノ酸は、さらに精製または回収する段階を
含むことができ、前記精製または回収方法は、本発明の微生物の培養方法、例えば、回分
式、連続式または流加式培養方法等に応じて、当該分野で公知となった適切な方法を用い
て培養液から目的とするＬ−アミノ酸を精製または回収することができる。
【００４６】
本発明において、前記培養段階で生産されたＬ−アミノ酸は、トレオニン、メチオニン
、イソロイシン、リジン、バリンまたはアラニンからなる群から選択されたものの一つで
あってもよく、好ましくはリジンまたはトレオニンである。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】コリネ型微生物におけるアミノ酸生合成過程の分岐点を示した図である。
【図２】ａ）は、ａｃｅＥ遺伝子の終止コドンと転写ターミネータの上流の間に、ｂ）は、転写ターミネータの下流にａｃｅＡ遺伝子プロモーターを挿入して、ａｃｅＥ遺伝子転写方向の逆方向に進行させることで、ａｃｅＥ遺伝子の発現を阻害することを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
以下、本発明を実施例により詳しく説明する。しかし、これら実施例は、本発明を例示
的に説明するためのものであり、本発明の範囲はこのような実施例に限定されるものでは
ない。
【実施例】
【００４９】
実施例１：酢酸誘導性プロモーターの選定
イソクエン酸リアーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｌｙａｓｅ、ａｃｅＡ、ＮＣｇｌ２２
４８）は、グリオキシル酸回路（ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌｅ）の主要な酵素であ
り、その遺伝子は、酢酸が存在する条件で発現される。また、酢酸キナーゼ（ａｃｅｔａ
ｔｅ  ｋｉｎａｓｅ、ａｃｋＡ、ＮＣｇｌ２６５６）とホスホトランスアセチラーゼ（ｐ
ｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓａｃｅｔｙｌａｓｅ、ｐｔａ、ＮＣｇｌ２６５７）も酢酸の代謝
過程に関与する酵素としてオペロンを形成しており、酢酸が存在する条件で発現が強化さ
れる。前記のようなａｃｅＡ遺伝子とｐｔａ−ａｃｋＡオペロンのプロモーター部位は、
既に公知となっている（非特許文献２）。
【００５０】
本実施例では、酢酸が存在する条件の下で目的遺伝子の転写を阻害する目的として用い
るために、ａｃｅＡ遺伝子プロモーター及びｐｔａ−ａｃｋオペロンのプロモーター、即
ち、ｐｔａ遺伝子の上流プロモーター部位を選定した。アメリカ国立衛生研究所の遺伝子
バンク（ＮＩＨ  ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されたａｃｅＡ遺伝子（ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ
ｇｌ２２４８）の塩基配列を基にして、ａｃｅＡ遺伝子の上流４８６個の塩基対（ｂａｓ
ｅ  ｐａｉｒ）とオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍ
ｅ、ＯＲＦ）のＮ−末端から３６個の塩基対を含む塩基配列（配列番号１）を確保した。
また、アメリカ国立衛生研究所の遺伝子バンクに登録されたｐｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ登録
番号ＮＣｇｌ２６５７）の塩基配列を基にしてｐｔａ遺伝子の上流３４０個の塩基対を含
む塩基配列（配列番号２）を確保した。
【００５１】
実施例２：ａｃｅＥ遺伝子発現阻害用ベクターの製作
ピルビン酸デヒドロゲナーゼサブユニットＥ１（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇ
ｅｎａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｅ１、ａｃｅＥ、ＮＣｇｌ２１６７）は、解糖系の最終代
謝物であるピルビン酸をＴＣＡ回路（ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｙｃｌ
ｅ）に流入させることに関与するＰＤＨＣ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａ
ｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の構成タンパク質の一つである。したがって、ａｃｅＥ遺伝子の
発現量を低下させることによりＴＣＡ回路への炭素源の流入を弱化させ、リジン生合成の
方に炭素源の流入を増やしてリジンの生産を増加させることができる（非特許文献４）。
【００５２】
ａｃｅＥ遺伝子の下流にａｃｅＡ遺伝子プロモーターを挿入して、ａｃｅＥ遺伝子転写
方向の逆方向に進行させることで、、酢酸が存在する条件の下で選択的にａｃｅＥ遺伝子
の発現を阻害するようにした（図２）。
【００５３】
まず、ＣＬＣメインワークベンチソフトウェア（ＣＬＣ  ｍａｉｎ  ｗｏｒｋｂｅｎｃ
ｈ  ｓｏｆｔｗａｒｅ；  ＣＬＣ  ｂｉｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用し、ａｃｅＥ遺伝子
の転写ターミネータ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）を予測した
。転写ターミネータは、ＧＣ塩基が多く存在する逆反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａ
ｔ）配列であり、この部位においてヘアピンループ（ｈａｉｒｐｉｎ  ｌｏｏｐ）を形成
して遺伝子の転写を終結させる。ａｃｅＥ遺伝子の転写ターミネータを予測した結果、ａ
ｃｅＥ遺伝子の終止コドン（ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ）から下流に２１番目の塩基から５６
番目の塩基まで３６個の塩基対（ｂａｓｅ  ｐａｉｒ）がヘアピンループ（ｈａｉｒｐｉ
ｎ  ｌｏｏｐ）構造をなして転写ターミネータとして予測された。これに基づいた本実施
例では、ａｃｅＥ遺伝子転写ターミネータの上流または下流にａｃｅＡ遺伝子プロモータ
ーを挿入して、ａｃｅＥ遺伝子転写方向の逆方向に進行することができるベクター２種を
作製した。
【００５４】
＜２−１＞  ａｃｅＥ遺伝子発現阻害用ｐＤＺ−ａｃｅＥ１−ＰａｃｅＡベクターの作
製
ａｃｅＥ遺伝子終止コドンの下流、即ち、終止コドンと転写ターミネータの上流との間
に、ａｃｅＡ遺伝子プロモーターを挿入するためのベクターを作製した。
【００５５】
コリネバクテリウム・グルタミクム由来のａｃｅＥ遺伝子の断片を確保するために、コ
リネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型とし、断片
の５’末端に制限酵素ＸｂａＩ認識部位と３’末端に制限酵素ＳｐｅＩ認識部位を挿入し
たプライマー（配列番号３及び４）を合成した。合成したプライマーを用いてＰＣＲを行
い、、ａｃｅＥ遺伝子開始コドン（ｓｔａｒｔ  ｃｏｄｏｎ）から２４７４番目の塩基か
ら終止コドンである２７６９番目の塩基まで２９６  ｂｐを含むＤＮＡ断片を得た。また
、断片の５’末端に制限酵素ＳｐｅＩ認識部位と３’末端に制限酵素ＸｂａＩ認識部位を
挿入したプライマー（配列番号５及び６）を合成し、ＰＣＲを行い、ａｃｅＥ遺伝子終止
コドンの下流３００  ｂｐを含むＤＮＡ断片を確保した。ポリメラーゼはＰｆｕＵｌｔｒ
ａＴＭ  Ｈｉｇｈ−ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用
いて、ＰＣＲ条件は、変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；及び重合７２
℃、３０秒を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。
【００５６】
前記２つのＰＣＲ増幅産物と予め制限酵素ＸｂａＩで切断して準備した染色体導入用ｐ
ＤＺベクター（特許文献４）を、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫ
ＡＲＡ、ＪＰ）を利用し、クローニングしてｐＤＺ−ａｃｅＥ１ベクターを作製した。
【００５７】
配列番号3: aceE-P1F 5’- ccggggatcctctagacctccggcccatacgttgc -3’ 
配列番号4: aceE-P1R 5’- ttgagactagttattcctcaggagcgtttg -3’
配列番号5: aceE-P2F 5’- gaataactagtctcaagggacagataaatc -3’
配列番号6: aceE-P2R 5’- gcaggtcgactctagagaccgaaaagatcgtggcag -3’
【００５８】
コリネバクテリウム・グルタミクム由来のａｃｅＡ遺伝子プロモーター断片を確保する
ために、断片の５’末端及び３’末端にそれぞれＳｐｅ  Ｉ制限酵素部位を挿入したプラ
イマー（配列番号７及び８）を合成した。コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１
１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型とし、合成したプライマーを用いＰＣＲを行い、配列番
号１の塩基配列を有する約５００ｂｐのプロモーター部位を増幅した。前記ＰＣＲ増幅産
物とｐＤＺ−ａｃｅＥ１ベクターを制限酵素ＳｐｅＩで処理して得たＤＮＡ切片を、Ｉｎ
−ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ、ＪＰ）を利用し、クローニン
グしてｐＤＺ−ａｃｅＥ１−ＰａｃｅＡベクターを作製した。
【００５９】
配列番号7: PaceA-P3F 5’- gtcccttgagactagtagcactctgactacctctg -3’ 
配列番号8: PaceA-P3R 5’- ctgaggaataactagtttcctgtgcggtacgtggc -3’
【００６０】
＜２−２＞  ａｃｅＥ遺伝子発現阻害用ｐＤＦ−ａｃｅＥ２−ＰａｃｅＡベクターの作
製
ａｃｅＥ遺伝子転写ターミネータの下流にａｃｅＡ遺伝子プロモーターを挿入するため
のベクターを作製した。
【００６１】
コリネバクテリウム・グルタミクム由来のａｃｅＥ遺伝子断片を確保するために、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型とし、断片の
５’末端に制限酵素ＸｂａＩ認識部位と３’末端に制限酵素ＳｐｅＩ認識部位を挿入した
プライマー（配列番号９及び１０）を合成した。合成したプライマーを用いてＰＣＲを行
い、、ａｃｅＥ遺伝子の開始コドンから２５３８番目の塩基から終止コドンの下流６２番
目の塩基まで２９４  ｂｐを含むＤＮＡ断片を得た。また、断片の５’末端に制限酵素Ｓ
ｐｅＩ認識部位と３’末端に制限酵素ＸｂａＩ認識部位を挿入したプライマー（配列番号
１１及び１２）を用いてＰＣＲを行い、ａｃｅＥ遺伝子終止コドンの下流６９番目の塩基
から３６２番目の塩基まで２９４  ｂｐを含むＤＮＡ断片を確保した。ポリメラーゼはＰ
ｆｕＵｌｔｒａＴＭ  Ｈｉｇｈ−ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は、変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；及
び重合７２℃、３０秒を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。
【００６２】
前記２つのＰＣＲ増幅産物と、予め制限酵素ＸｂａＩで切断して準備した染色体導入用
ｐＤＺベクターを、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ、ＪＰ
）を利用し、クローニングしてｐＤＺ−ａｃｅＥ２ベクターを作製した。
【００６３】
配列番号9:  aceE-P4F 5’- ccggggatcctctagaggtcccaggcgactacacc -3’
配列番号10: aceE-P4R 5’- gagctactagtacgacgaatcccgccgccagacta -3’
配列番号11: aceE-P5F 5’- gtcgtactagtagctctttttagccgaggaacgcc -3’
配列番号12: aceE-P5R 5’- gcaggtcgactctagacatgctgttggatgagcac -3’
【００６４】
コリネバクテリウム・グルタミクム由来のａｃｅＡ遺伝子プロモーター断片を確保する
ために、断片の５’末端及び３’末端にそれぞれ制限酵素ＳｐｅＩ認識部位を挿入したプ
ライマー（配列番号１３及び１４）を合成した。コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣ
ＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型とし、合成したプライマーを用いてＰＣＲを行い
、配列番号１の塩基配列を有する約５００  ｂｐのプロモーター部位を増幅した。前記Ｐ
ＣＲ増幅産物とｐＤＺ−ａｃｅＥ２ベクターを制限酵素ＳｐｅＩで処理して得たＤＮＡ切
片を、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ、ＪＰ）を利用し、
クローニングしてｐＤＺ−ａｃｅＥ２−ＰａｃｅＡベクターを作製した。
【００６５】
配列番号13: PaceA-P6F 5’- aaaaagagctactagtagcactctgactacctctg -3’ 
配列番号14: PaceA-P6R 5’- gattcgtcgtactagtttcctgtgcggtacgtggc -3’
【００６６】
実施例３：ａｃｅＥ遺伝子の下流ａｃｅＡ遺伝子プロモーター挿入株の製作
前記実施例２で作製したベクターｐＤＺ−ａｃｅＥ１−ＰａｃｅＡとｐＤＺ−ａｃｅＥ
２−ＰａｃｅＡを、それぞれ電気パルス法を用いてＬ−リシン生産菌株であるコリネバク
テリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐに形質転換させ（非特許文献５）、染色体
上のａｃｅＥ遺伝子終止コドンの下流にａｃｅＡ遺伝子プロモーターを挿入してａｃｅＥ
遺伝子転写方向の逆方向に進行させた菌株を、ＰＣＲを行い分離することにより、Ｌ−リ
ジンを生産する菌株を獲得し、これをそれぞれコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣ
Ｍ１１０１６Ｐ：：  ａｃｅＥ１−ＰａｃｅＡとコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣ
ＣＭ１１０１６Ｐ：：  ａｃｅＥ２−ＰａｃｅＡと命名した。コリネバクテリウム・グル
タミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：  ａｃｅＥ１−ＰａｃｅＡはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＣＡ０１−２２７１の名称で韓国微生物保存センター
に２０１３年６月１２日に寄託番号ＫＣＣＭ１１４３２Ｐとして国際寄託した。作製した
菌株は、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：  ａｃｅＥ１−ＰａｃｅＡの場合、配列番号３と配列
番号６、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：  ａｃｅＥ２−ＰａｃｅＡの場合、配列番号９と配列
番号１２をプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、目的部位に対する塩基配列
の分析を通じてその塩基配列を最終確認した。
【００６７】
実施例４：ａｃｅＥ遺伝子の下流ａｃｅＡ遺伝子プロモーター挿入株のリジン生産能の比
較
親株として用いたコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株及び実
施例３で作製したＬ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ
１１０１６Ｐ：：  ａｃｅＥ１−ＰａｃｅＡとＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：  ａｃｅＥ２−
ＰａｃｅＡを、Ｌ−リジン生産のために下記のような方法で培養した。
【００６８】
下記種培地２５  ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナー−バッフルフラスコにコリネバ
クテリウム・グルタミクム親株ＫＣＣＭ１１０１６ＰとＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：  ａｃ
ｅＥ１−ＰａｃｅＡ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：  ａｃｅＥ２−ＰａｃｅＡを接種し、３
０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。下記生産培地２４ｍｌを含有する２５
０  ｍｌのコーナー−バッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃で７２時間
、２００ｒｐｍで振とう培養した。前記種培地と生産培地の組成は、それぞれ下記の通り
である。
【００６９】
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ４
ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ８ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミ
ンＨＣｌ１０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチン酸アミド２０
００μｇ（蒸留水１Lを基準）
【００７０】
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロ
コシ浸漬固形分（Ｃｏｒｎ  Ｓｔｅｅｐ  Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４
１ｇ、ＭｇＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン ＨＣｌ１０
００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチン酸アミド３０００μｇ、Ｃ
ａＣＯ３  ３０ｇ（蒸留水１Lを基準）。
【００７１】
培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によりＬ−リジンの生産量を測定した。酢酸（ａｃ
ｅｔａｔｅ）を添加していない場合、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０
１６ＰとＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：  ａｃｅＥ１−ＰａｃｅＡ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：
：  ａｃｅＥ２−ＰａｃｅＡに対する培養液中のＬ−リジン濃度は、以下の表１の通りで
ある。
【００７２】
【表１】
2020078312.tif 000002
【００７３】
また、生産培地に酢酸５ｇ/Ｌを添加した以外は、同様の方法で菌株を培養し、Ｌ−リ
ジン生産能を比較した。培養液中のＬ−リジン濃度は、以下の表２の通りである。
【００７４】
【表２】
2020078312.tif 000003
【００７５】
前記表１に示されるように、酢酸が存在しない条件でＫＣＣＭ１１０１６Ｐ  ：：  ａ
ｃｅＥ１−ＰａｃｅＡ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ  ：：  ａｃｅＥ２−ＰａｃｅＡ菌株は、
親株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐとリジン生産能に変化がないことを確認した。
【００７６】
しかし、前記表２に示されるように、酢酸が存在する条件では、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ
：：  ａｃｅＥ１−ＰａｃｅＡ菌株の場合、親株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べてリジン
の生産能が３．６％以上、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ  ：：  ａｃｅＥ２−ＰａｃｅＡ菌株の
場合は親株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べて、リジンの生産能が２．５％以上向上したこと
を確認することができた。
【００７７】
そして、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ  ：：  ａｃｅＥ１−ＰａｃｅＡとＫＣＣＭ１１０１６
Ｐ  ：：  ａｃｅＥ２−ＰａｃｅＡを比較すると、ａｃｅＥ遺伝子の転写ターミネータの
上流側、即ち、終止コドンと転写ターミネータの上流との間に、ａｃｅＡプロモーターを
挿入したＫＣＣＭ１１０１６Ｐ  ：：  ａｃｅＥ１−ＰａｃｅＡの場合は、リジンの生産
においてより効果的であることから、挿入部位として遺伝子終止コドンの下流、即ち、終
止コドンと転写ターミネータ上流との間を用いることが遺伝子発現をより効果的に阻害す
ることが分かる。
【００７８】
実施例５：ａｃｅＥ遺伝子発現阻害用ｐＤＺ−ａｃe E−Ｐｐｔａベクターの作製
酢酸キナーゼ（ａｃｅｔａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ、ａｃｋＡ、ＮＣｇｌ２６５６）とホス
ホトランスアセチラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓａｃｅｔｙｌａｓｅ、ｐｔａ、ＮＣ
ｇｌ２６５７）は、酢酸代謝過程に関与する酵素としてオペロンを形成しており、イソク
エン酸リアーゼと同様に酢酸が存在する条件で発現が強化される。したがって、これら遺
伝子プロモーターを用いる場合、酢酸が存在する条件で特異的に遺伝子の発現を誘導する
ことができる。
【００７９】
本実施例では、酢酸が存在する条件の下でａｃｅＥ遺伝子の発現を阻害する目的で、ｐ
ｔａ−ａｃｋオペロンのプロモーター、即ち、ｐｔａ遺伝子の上流プロモーター部位を利
用するためのベクターを作製した。
【００８０】
ａｃｅＥ遺伝子の発現を阻害するために、ａｃｅＥ遺伝子終止コドンの下流、即ち、終
止コドンと転写ターミネータの上流との間にｐｔａ遺伝子プロモーターを挿入して、ａｃ
ｅＥ遺伝子転写方向の逆方向に進行させることができるベクターを作製した。
【００８１】
コリネバクテリウム・グルタミクム由来のａｃｅＥ遺伝子断片を確保するためにコリネ
バクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型とし、実施例２
と同様の方法でｐＤＺ−ａｃｅＥ１ベクターを作製した。
【００８２】
コリネバクテリウム・グルタミクム由来のｐｔａ遺伝子プロモーター断片を確保するた
めに、断片の５’末端及び３’末端にそれぞれ制限酵素ＳｐｅＩ認識部位を有するように
考案したプライマー（配列番号１５及び１６）を合成した。コリネバクテリウム・グルタ
ミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型とし、合成したプライマーを用いてＰ
ＣＲを行い、配列番号２の塩基配列を有する約３４０  ｂｐのプロモーター部位を増幅し
た。前記ＰＣＲ増幅産物とｐＤＺ−ａｃｅＥ１ベクターを制限酵素ＳｐｅＩで処理して得
たＤＮＡ切片を、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（TAKARA、JP）を利用し
、クローニングしてｐＤＺ−ａｃｅＥ１−Ｐｐｔａベクターを作製した。
【００８３】
配列番号15: Ppta-P7F 5’- gtcccttgagactagtctttgctggggtcagatttg-3’ 
配列番号16: Ppta-P7R 5’- ctgaggaataactagtacatcgcctttctaatttc-3’
【００８４】
実施例６：ａｃｅＥ遺伝子の下流ｐｔａ遺伝子プロモーター挿入株の作製及びリジン生産
能の比較
前記実施例５で作製したベクターｐＤＺ−ａｃｅＥ１−Ｐｐｔａを実施例３と同様の方
法で、Ｌ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６
Ｐに形質転換させ、染色体上のａｃｅＥ遺伝子終止コドンの下流にｐｔａ遺伝子プロモー
ターを挿入して、ａｃｅＥ遺伝子転写方向の逆方向に進行させた菌株をＰＣＲを行い分離
することにより、Ｌ−リジンを生産する菌株を獲得してＫＣＣＭ１１０１６Ｐ  ：：  ａ
ｃｅＥ１−Ｐｐｔａと命名した。作製菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ  ：：  ａｃｅＥ１−Ｐ
ｐｔａは、配列番号３と配列番号６をプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、
目的部位に対する塩基配列の分析を通じてその塩基配列を最終確認した。
【００８５】
作製した菌株を、実施例４と同様の方法で培養し、そこから回収されたＬ−リジンの濃
度を測定した。酢酸を添加していない場合、培養液中のＬ−リジン濃度は下記の表３の通
りである。
【００８６】
【表３】
2020078312.tif 000004
【００８７】
また、生産培地に酢酸５ｇ／Ｌを添加した以外は、同様の方法で菌株を培養し、Ｌ−リ
ジン生産能を比較した。培養液中のＬ−リジン濃度は、以下の表４の通りである。
【００８８】
【表４】
2020078312.tif 000005
【００８９】
前記表３に示されるように、酢酸が存在しない条件でＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：  ａｃ
ｅＥ１−Ｐｐｔａ菌株は、親株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐとリジン生産能に変化がないことを
確認した。
【００９０】
しかし、前記表４に示されるように、酢酸が存在する条件では、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ
：：  ａｃｅＥ１−Ｐｐｔａ菌株は、親株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べてリジンの生産能
が２．４％以上向上したことを確認することができた。
【００９１】
また、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：  ａｃｅＥ１−ＰａｃｅＡ菌株がＫＣＣＭ１１０１６
Ｐ：：  ａｃｅＥ１−Ｐｐｔａ菌株よりリジン生産能がより良いことから、酢酸が存在す
る条件でａｃｅＡ遺伝子プロモーターを用いることがｐｔａ遺伝子プロモーターを用いる
ことより、目的遺伝子の発現をより効果的に阻害することが分かる。
【００９２】
実施例７：ａｃｅＥ遺伝子の下流ａｃｅＡ遺伝子プロモーター挿入株の作製
前記実施例２で作製したベクターｐＤＺ−ａｃｅＥ１−ＰａｃｅＡを、実施例３と同様
の方法でＬ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０７５
０、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ及びＣＪ３Ｐ３種の菌株に形質転換させ、染色体上のａｃｅＥ
遺伝子終止コドンの下流にａｃｅＡ遺伝子プロモーターを挿入して、ａｃｅＥ遺伝子転写
方向の逆方向に進行させた菌株をＰＣＲを行い分離することにより、Ｌ−リジンを生産す
るＫＦＣＣ１０７５０  ：：  ａｃｅＥ１−ＰａｃｅＡ、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ  ：：  
ａｃｅＥ１−ＰａｃｅＡとＣＪ３Ｐ  ：：  ａｃｅＥ１−ＰａｃｅＡ３種の菌株を獲得し
た。作製した菌株は、配列番号３と配列番号６をプライマーとして用いてＰＣＲを行うこ
とにより、目的部位に対する塩基配列の分析を通じてその塩基配列を最終確認した。
【００９３】
作製した菌株を、実施例４と同様の方法で培養し、そこから回収したＬ−リジンの濃度
を測定した。酢酸を添加していない場合、培養液中のＬ−リジン濃度は以下の表５の通り
である。
【００９４】
【表５】
2020078312.tif 000006
【００９５】
また、生産培地に酢酸５ｇ／Ｌを添加した以外は、同様の方法で菌株を培養し、Ｌ−リ
ジン生産能を比較した。培養液中のＬ−リジン濃度は以下の表６の通りである。
【００９６】
【表６】
2020078312.tif 000007
【００９７】
前記表５に示されるように、酢酸が存在しない条件でＫＦＣＣ１０７５０  ：：  ａｃ
ｅＥ１−ＰａｃｅＡ、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ  ：：  ａｃｅＥ１−ＰａｃｅＡ及びＣＪ３
Ｐ  ：：  ａｃｅＥ１−ＰａｃｅＡの３種の菌株は、親株とリジン生産能に変化がないこ
とを確認した。
【００９８】
しかし、前記表６に示されるように、酢酸が存在する条件では、リジンの生産能がＫＦ
ＣＣ１０７５０  ：：  ａｃｅＥ１−ＰａｃｅＡ菌株は、親株比５％、ＫＣＣＭ１０７７
０Ｐ  ：：  ａｃｅＥ１−ＰａｃｅＡ菌株は、親株比２．８％、  ＣＪ３Ｐ  ：：  ａｃ
ｅＥ１−ＰａｃｅＡ菌株は、親株比１５％がそれぞれ向上したことを確認することができ
た。
【００９９】
実施例８：ｈｏｍ遺伝子発現阻害用ベクターの作製
Ｌ−リジン生合成経路と同様の基質を用いるＬ−トレオニン生合成経路を弱化させて、
Ｌ−リジン生産能力を増加させることができる。Ｌ−トレオニン生合成経路を弱化させる
ために、アスパラギン酸からホモセリン（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎ）を生成するホモセリンデ
ヒドロゲナーゼ（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ｈｏｍ、ＮＣｇ
ｌ１１３６）の酵素活性を減少させる方法が挙げられる。
【０１００】
コリネバクテリウム・グルタミクムにおいてｈｏｍ遺伝子は、ｔｈｒＢ遺伝子とｈｏｍ
−ｔｈｒＢオペロンを形成しており、転写ターミネータはｔｈｒＢ遺伝子の下流に存在す
る。そして、ｈｏｍ−ｔｈｒＢオペロンの上流、即ち、ｈｏｍ遺伝子の上流にプロモータ
ーが存在し、さらにｔｈｒＢ遺伝子ＯＲＦの上流にも２番目のプロモーターが存在するこ
とが報告されている（非特許文献６）。したがって、ｈｏｍ遺伝子終止コドンの下流にａ
ｃｅＡ遺伝子プロモーターを挿入して、ｈｏｍ遺伝子転写方向の逆方向に進行させて、酢
酸が存在する条件で選択的にｈｏｍ遺伝子の発現を阻害するようにし、ｔｈｒＢ遺伝子の
発現を維持するためにｔｈｒＢ遺伝子ＯＲＦの上流に２番目のプロモーター配列を追加し
た。
【０１０１】
本実施例では、ｈｏｍ遺伝子終止コドンの下流とｔｈｒＢ遺伝子の上流との間に、ａｃ
ｅＡ遺伝子プロモーターを挿入するための組換えベクターを作製した。
【０１０２】
コリネバクテリウム・グルタミクム由来のｈｏｍ遺伝子断片を確保するために、コリネ
バクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型とし、断片の５
’末端に制限酵素ＸｂａＩ認識部位と３’末端に制限酵素ＳｐｅＩ認識部位を有するよう
に考案したプライマー（配列番号１７及び１８）を合成した。合成したプライマーを用い
てＰＣＲを行い、ｈｏｍ遺伝子の開始コドンから１０３９番目の塩基から終止コドンであ
る１３３８番目の塩基まで３００  ｂｐを含むＤＮＡ断片を得た。ｈｏｍ遺伝子発現の阻
害のために、ｈｏｍ−ｔｈｒＢオペロンの間にａｃｅＡプロモーターが挿入されても、ｔ
ｈｒＢ遺伝子は発現が維持されなければならない。そこで、ｈｏｍ遺伝子終止コドンの下
流３００  ｂｐを含むＤＮＡ断片の作製時、３２  ｂｐのｔｈｒＢプロモーター配列をＤ
ＮＡ断片の５’側に挿入したプライマー（配列番号１９及び２０）を合成した。このプラ
イマー（配列番号１９及び２０）を用いてＰＣＲを行い、断片の５’末端に制限酵素Ｓｐ
ｅＩ認識部位と３’末端に制限酵素ＸｂａＩ認識部位を有する３４４  ｂｐのＤＮＡ断片
を確保した。ＰＣＲは、実施例２と同様の条件で行った。
【０１０３】
前記２つのＰＣＲ増幅産物と、予め制限酵素ＸｂａＩで切断して準備した染色体導入用
ｐＤＺベクターを、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ、ＪＰ
）を利用し、クローニングしてｐＤＺ−ｈｏｍベクターを作製した。
【０１０４】
配列番号17: hom-h1F 5’- ccggggatcctctagaccaggtgagtccacctacg -3’ 
配列番号18: hom-h1R 5’-  gaggcggatcactagtttagtccctttcgaggcgg -3’
配列番号19: hom-h2F 5’- actagtgatccgcctcgaaagggac -3’
配列番号20: hom-h2R 5’- gcaggtcgactctagagactgcggaatgttgttgtg -3’
【０１０５】
コリネバクテリウム・グルタミクム由来のａｃｅＡ遺伝子プロモーター断片を確保する
ために、断片の５’末端及び３’末端にそれぞれ制限酵素ＳｐｅＩ認識部位を挿入したプ
ライマー（配列番号２１及び２２）を合成した。コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣ
ＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型とし、合成したプライマーを用いてＰＣＲを行い
、配列番号１の塩基配列を有する約５００  ｂｐのプロモーター部位を増幅した。前記Ｐ
ＣＲ増幅産物とｐＤＺ−ｈｏｍベクターを制限酵素ＳｐｅＩで処理して得たＤＮＡ切片を
、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ、ＪＰ）を利用し、クロ
ーニングしてｐＤＺ−ｈｏｍ−ＰａｃｅＡベクターを作製した。
【０１０６】
配列番号21: PaceA-h3F 5’- gaggcggatcactagtagcactctgactacctctg -3’ 
配列番号22: PaceA-h3R 5’- aagggactaaactagtttcctgtgcggtacgtggc -3’
【０１０７】
実施例９：ｈｏｍ遺伝子の下流ａｃｅＡ遺伝子プロモーター挿入株の作製及びリジン生産
能の比較
前記実施例８で作製したベクターｐＤＺ−ｈｏｍ−ＰａｃｅＡを実施例３と同様の方法
で、Ｌ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ
に形質転換させ、染色体上のｈｏｍ遺伝子終止コドンの下流にａｃｅＡ遺伝子プロモータ
ーを挿入して、ｈｏｍ遺伝子転写方向の逆方向に進行させた菌株をＰＣＲを行い分離する
ことにより、Ｌ−リジンを生産するＫＣＣＭ１１０１６Ｐ  ：：  ｈｏｍ−ＰａｃｅＡを
獲得した。作製した菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ  ：：  ｈｏｍ−ＰａｃｅＡは、配列番号
１７と配列番号２０をプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、目的部位に対す
る塩基配列の分析を通じてその塩基配列を最終確認した。
【０１０８】
親株として用いたコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株と作製
したＫＣＣＭ１１０１６Ｐ  ：：  ｈｏｍ−ＰａｃｅＡ菌株を、Ｌ−リジン生産のために
、実施例４と同様の方法で培養し、そこから回収したＬ−リジンの濃度を測定した。酢酸
を添加していない場合、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６ＰとＫＣ
ＣＭ１１０１６Ｐ  ：：  ｈｏｍ−ＰａｃｅＡに対する培養液中のＬ−リジン濃度は、以
下の表７の通りである。
【０１０９】
【表７】
2020078312.tif 000008
【０１１０】
また、生産培地に酢酸５ｇ/Ｌを添加した以外は、同様の方法で菌株を培養し、Ｌ−リ
ジン生産能を比較した。培養液中のＬ−リジン濃度は、以下の表８の通りである。
【０１１１】
【表８】
2020078312.tif 000009
【０１１２】
前記表７に示されるように、酢酸が存在しない条件でＫＣＣＭ１１０１６Ｐ  ：：  ｈ
ｏｍ−ＰａｃｅＡ菌株は、親株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐとリジン生産能に変化がないことを
確認した。
【０１１３】
しかし、前記表８に示されるように、酢酸が存在する条件でＫＣＣＭ１１０１６Ｐ  ：
：  ｈｏｍ−ＰａｃｅＡ菌株は、親株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べてリジンの生産能が２
．６％以上向上することを確認することができた。
【０１１４】
実施例１０：ｍｕｒＥ遺伝子発現阻害用ベクターの作製
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイルアラニル−Ｄ−グルタミン酸−２，６−ジアミノピメ
リン酸リガーゼ（ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｏｙｌａｌａｎｙｌ−Ｄ−ｇｌｕ
ｔａｍａｔｅ−２，６−ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ  ｌｉｇａｓｅ、ｍｕｒＥ、Ｎ
Ｃｇｌ２０８３）は、リジン生合成の前駆体として用いられるメソ−２，６−ジアミノピ
メリン酸（ｍｅｓｏ−２，６−Ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ）を利用して菌体の合成
に利用するが、ｍｕｒＥ遺伝子の活性を低下させることにより、菌体の合成への炭素源の
流入を弱化させ、リジン生合成経路に炭素源の流入を増やしてリジンの生産を増加させる
ことができる。
【０１１５】
コリネバクテリウム・グルタミクムにおいてｍｕｒＥ遺伝子（ＮＣｇｌ２０８３）は、
ＮＣｇｌ２０７６からＮＣｇｌ２０８２までの７個の遺伝子と共にオペロンをなしている
。オペロンの転写は、ＮＣｇｌ２０８３  ｍｕｒＥ遺伝子から始めてＮＣｇｌ２０７６遺
伝子の方向に進められる。したがって、転写ターミネータは、ＮＣｇｌ２０７６遺伝子の
下流に存在する。ｍｕｒＥ遺伝子終止コドンの下流にａｃｅＡ遺伝子プロモーターを挿入
して、ｍｕｒＥ遺伝子転写方向の逆方向に進行させ、酢酸が存在する条件で選択的にｍｕ
ｒＥ遺伝子の発現を阻害するようにして、オペロンの最初に位置するｍｕｒＥ遺伝子以外
の残りの７個の遺伝子の発現を維持するために、ＮＣｇｌ２０８２遺伝子ＯＲＦの上流に
ｍｕｒＥオペロンのプロモーターを追加で挿入した。
【０１１６】
本実施例では、ｍｕｒＥ遺伝子終止コドンの下流にａｃｅＡ遺伝子プロモーターを挿入
するための組換えベクターを作製した。
【０１１７】
コリネバクテリウム・グルタミクム由来のｍｕｒＥ遺伝子断片を確保するために、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型とし、断片の
５’末端に制限酵素ＸｂａＩ認識部位と３’末端に制限酵素ＸｈｏＩ認識部位を有するよ
うに考案したプライマー（配列番号２３及び２４）を合成した。合成したプライマーを用
いてＰＣＲを行い、ｍｕｒＥ遺伝子の開始コドンから１２６７番目の塩基から終止コドン
である１５６６番目の塩基まで３００  ｂｐを含むＤＮＡ断片を得た。また、断片の５’
末端に制限酵素ＸｈｏＩ認識部位と３’末端に制限酵素ＸｂａＩ認識部位を有するように
考案したプライマー（配列番号２５及び２６）を合成し、ＰＣＲを行い、ｍｕｒＥ遺伝子
終止コドンの下流１０番目の塩基から２９２  ｂｐを含むＤＮＡ断片を確保した。ＰＣＲ
は、実施例２と同様の条件で行った。前記２つのＰＣＲ増幅産物と予め制限酵素ＸｂａＩ
で切断して準備した染色体導入用ｐＤＺベクターを、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ  Ｋｉｔ（TAKARA、JP）を利用し、クローニングしてｐＤＺ−ｍｕｒＥベクターを作製
した。
【０１１８】
配列番号23: mur-m1F 5’- ccggggatcctctagaaaccctcgttcagaggtgc -3’ 
配列番号24: mur-m1R 5’- ttgtgatcatctcgagctatccttcttccgtagtaag -3’
配列番号25: mur-m2F 5’- agctcgagatgatcacaatgacccttgg -3’
配列番号26: mur-m2R 5’- gcaggtcgactctagacatgagcataaatgtcagc -3’
【０１１９】
コリネバクテリウム・グルタミクム由来のａｃｅＡ遺伝子プロモーター断片を確保する
ために、断片の５’末端に制限酵素ＸｈｏＩ認識部位を有するように考案したプライマー
（配列番号２７及び２８）を合成した。コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１
０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型とし、合成したプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列番
号１の塩基配列を有する約５００  ｂｐのプロモーター部位を増幅した。また、コリネバ
クテリウム・グルタミクム由来のｍｕｒＥオペロンのプロモーター部位を確保するために
、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型とし、
断片の３  ’末端に制限酵素ＸｈｏＩ認識部位を有するように考案したプライマー（配列
番号２９及び３０）を合成した。合成したプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｍｕｒＥ遺
伝子ＯＲＦの上流の３００  ｂｐを含むＤＮＡ断片を得た。前記２つのＰＣＲ増幅産物と
ｐＤＺ−ｍｕｒＥベクターを制限酵素ＸｈｏＩで処理して得たＤＮＡ切片を、Ｉｎ−ｆｕ
ｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（TAKARA、JP）を利用し、クローニングしてｐＤＺ−
ｍｕｒＥ−ＰａｃｅＡ−ＰｍｕｒＥベクターを作製した。
【０１２０】
配列番号27: mur-m3F 5’- tcatcagcagcactctgactacctctg -3’ 
配列番号28: mur-m3R 5’- agaaggatagctcgagttcctgtgcggtacgtggc -3’
配列番号29: mur-m4F 5’- agagtgctgctgatgatcctcgatttg -3’ 
配列番号30: mur-m4R 5’- ttgtgatcatctcgagggttttctctcctccacagg -3’
【０１２１】
実施例１１：ｍｕｒＥ遺伝子の下流ａｃｅＡ遺伝子プロモーター挿入株の作製及びリジン
生産能の比較
前記実施例１０で作製したベクターｐＤＺ−ｍｕｒＥ−ＰａｃｅＡ−ＰｍｕｒＥを実施
例３と同様の方法でＬ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣ
Ｍ１１０１６Ｐに形質転換させ、染色体上のｍｕｒＥ遺伝子終止コドンの下流にａｃｅＡ
遺伝子プロモーターを挿入して、ｍｕｒＥ遺伝子転写方向の逆方向に進行させた菌株をＰ
ＣＲを行い、分離することにより、Ｌ−リジンを生産するＫＣＣＭ１１０１６Ｐ  ：：  
ｍｕｒＥ−ＰａｃｅＡ−ＰｍｕｒＥを獲得した。作製した菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ  ：
：  ｍｕｒＥ−ＰａｃｅＡ−ＰｍｕｒＥは、配列番号２３と配列番号２６をプライマーと
用いてＰＣＲを行うことにより、目的部位に対する塩基配列の分析を通じてその塩基配列
を最終確認した。
【０１２２】
親株として用いたコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株と作製
されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ  ：：  ｍｕｒＥ−ＰａｃｅＡ−ＰｍｕｒＥをＬ−リジン生
産のために、実施例４と同様の方法で培養し、そこから回収したＬ−リジンの濃度を測定
した。酢酸を添加していない場合、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１
６ＰとＫＣＣＭ１１０１６Ｐ  ：：  ｍｕｒＥ−ＰａｃｅＡ−ＰｍｕｒＥに対する培養液
中のＬ−リジン濃度は以下の表９の通りである。
【０１２３】
【表９】
2020078312.tif 000010
【０１２４】
また、生産培地に酢酸５ｇ/Ｌを添加した以外は、同様の方法で菌株を培養し、Ｌ−リ
ジン生産能を比較した。培養液中のＬ−リジン濃度は、以下の表１０の通りである。
【０１２５】
【表１０】
2020078312.tif 000011
【０１２６】
前記表９に示されるように、酢酸が存在しない条件でＫＣＣＭ１１０１６Ｐ  ：：  ｍ
ｕｒＥ−ＰａｃｅＡ−ＰｍｕｒＥ菌株は、親株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐとリジン生産能に変
化がないことを確認した。
【０１２７】
しかし、前記表１０に示されるように、酢酸が存在する条件でＫＣＣＭ１１０１６Ｐ  
：：  ｍｕｒＥ−ＰａｃｅＡ−ＰｍｕｒＥ菌株は、親株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べてリ
ジンの生産能が２．８％以上向上したことを確認することができた。
【０１２８】
実施例１２：ｄａｐＡ遺伝子発現阻害用ベクターの作製
Ｌ−トレオニン生合成経路と同様の基質を用いるＬ−リジン生合成経路を弱化させるこ
とにより、Ｌ−トレオニン生産能力を増加させることができる。Ｌ−リジン生合成経路を
弱化させるために、アスパラギン酸からリジンの生成に関与するジヒドロジピコリン酸合
成酵素（dihydrodipicolinate synthase、dapA、NCgl1896）遺伝子の活性を減少させる方
法が挙げられる。
【０１２９】
コリネバクテリウム・グルタミクムにおいてｄａｐＡ遺伝子は、ＯＲＦ４（ＮＣｇｌ１
８９５）遺伝子とｄａｐＡ−ＯＲＦ４オペロンを形成しており、したがって、転写ターミ
ネータは、ＯＲＦ４遺伝子の下流に存在する。そして、ｄａｐＡ−ＯＲＦ４オペロンの上
流、即ち、ｄａｐＡ遺伝子の上流にプロモーターが存在し、さらにＯＲＦ４遺伝子の上流
にもプロモーター配列が存在することが報告されている（非特許文献７）。したがって、
ｄａｐＡ遺伝子終止コドンの下流にａｃｅＡ遺伝子プロモーターを挿入して、ｄａｐＡ遺
伝子転写方向の逆方向に進行させ、酢酸が存在する条件で選択的にｄａｐＡ遺伝子の発現
を阻害するようにし、ＯＲＦ４遺伝子の発現を維持するためにＯＲＦ４遺伝子の上流のプ
ロモーター部位１００  ｂｐ配列をＯＲＦ４遺伝子ＯＲＦの上流に追加した。
【０１３０】
本実施例では、ｄａｐＡ遺伝子終止コドンの下流にａｃｅＡ遺伝子プロモーターを挿入
するための組換えベクターを作製した。
【０１３１】
コリネバクテリウム・グルタミクム由来のｄａｐＡ遺伝子断片を確保するために、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型とし、断片の
５’末端に制限酵素ＸｂａＩ認識部位と３’末端に制限酵素ＳｐｅＩ認識部位を有するよ
うに考案したプライマー（配列番号３１及び３２）を合成した。合成したプライマーを用
いてＰＣＲを行い、ｄａｐＡ遺伝子の開始コドンから６０６番目の塩基から終止コドンで
ある９０６番目の塩基まで３０１  ｂｐを含むＤＮＡ断片を得た。また、断片の５’末端
に制限酵素ＳｐｅＩ認識部位と３’末端に制限酵素ＸｂａＩ認識部位を挿入したプライマ
ー（配列番号３３及び３４）を合成してＰＣＲを行い、ＯＲＦ４遺伝子の発現を維持する
ことができるように、ｄａｐＡ遺伝子の開始コドンから８０９番目の塩基から終止コドン
の下流２番目の塩基まで１００  ｂｐのプロモーター配列をさらに含み、ｄａｐＡ遺伝子
終止コドンの下流２１３  ｂｐを含むＤＮＡ断片を確保した。ＰＣＲは、実施例２と同様
の条件で進めた。前記２つのＰＣＲ増幅産物と、予め制限酵素ＸｂａＩで切断して準備し
た染色体導入用ｐＤＺベクターを、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡ
ＫＡＲＡ、ＪＰ）を利用し、クローニングしてｐＤＺ−ｄａｐＡベクターを作製した。
【０１３２】
配列番号31: dapA-d1F 5’- ccggggatcctctagatgtttggcttgctttgggc -3’ 
配列番号32: dapA-d1R 5’- gttgatgcactagtttatagaactccagcttt-3’
配列番号33: dapA-d2F 5’- ttctataaactagtgcatcaacgtaggagatcc -3’
配列番号34: dapA-d2R 5’- gcaggtcgactctagacgttctgggaaccctgag -3’
【０１３３】
コリネバクテリウム・グルタミクム由来のａｃｅＡ遺伝子のプロモーター断片を確保す
るために、断片の５’末端及び３’末端にそれぞれ制限酵素ＳｐｅＩ認識部位を挿入した
プライマー（配列番号３５及び３６）を合成した。コリネバクテリウム・グルタミクムＫ
ＣＣＭ１１０１６Ｐの染色体ＤＮＡを鋳型とし、合成したプライマーを用いてＰＣＲを行
い、配列番号１の塩基配列を有する約５００  ｂｐのプロモーター部位を増幅した。前記
ＰＣＲ増幅産物と、ｐＤＺ−ｄａｐＡベクターを制限酵素ＳｐｅＩで処理して得たＤＮＡ
切片を、In-fusion Cloning Kit(TAKARA、JP)を利用し、クローニングしてｐＤＺ−ｄａ
ｐＡ−ＰａｃｅＡベクターを作製した。
【０１３４】
配列番号35: PaceA-d3F 5’- acgttgatgcactagtagcactctgactacctctg -3’ 
配列番号36: PaceA-d3R 5’- agttctataaactagtttcctgtgcggtacgtggc -3’
【０１３５】
実施例１３：ｄａｐＡ遺伝子の下流ａｃｅＡ遺伝子プロモーター挿入株の作製及びトレオ
ニン生産能の比較
Ｌ−トレオニン生産株において、ｄａｐＡ遺伝子発現阻害効果を確認するために、Ｌ−
トレオニン生産株であるＫＣＣＭ１１２２２Ｐ（特許文献７）に前記実施例１２で作製し
たベクターｐＤＺ−ｄａｐＡ−ＰａｃｅＡを実施例３と同様の方法で形質転換させ、染色
体上のｄａｐＡ遺伝子の下流にａｃｅＡ遺伝子プロモーターを挿入してｄａｐＡ遺伝子転
写方向の逆方向に進行させた菌株をＰＣＲを行い分離することにより、Ｌ−トレオニンを
生成するＫＣＣＭ１１２２２Ｐ  ：：  ｄａｐＡ  −ＰａｃｅＡを獲得した。作製した菌
株ＫＣＣＭ１１２２２Ｐ  ：：  ｄａｐＡ−ＰａｃｅＡは、配列番号３１と配列番号３４
をプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、目的部位に対する塩基配列の分析を
通じてその塩基配列を最終確認した。
【０１３６】
親株として用いたコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２２２Ｐ菌株と作製
したＫＣＣＭ１１２２２Ｐ  ：：  ｄａｐＡ−ＰａｃｅＡ菌株は、Ｌ−トレオニン生産の
ために下記のような方法で培養した。
【０１３７】
種培地２５  ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナー−バッフルフラスコに各菌株を接種
して、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、生産培地２４  ｍｌ
を含有する２５０ｍｌのコーナー−バッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種して、３
０℃で４８時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。前記種培地と生産培地の組成は、それ
ぞれ下記の通りである。
【０１３８】
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ４
ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チア
ミンＨＣｌ  １０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチン酸アミド
２０００μｇ  （蒸留水１Lを基準）
【０１３９】
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロ
コシ浸漬固形分（Ｃｏｒｎ  Ｓｔｅｅｐ  Ｓｏｌｉｄｓ）５  ｇ、尿素３  ｇ、ＫＨ２Ｐ
Ｏ４  １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン HCl１０
００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチン酸アミド３０００μｇ、Ｃ
ａＣＯ３  ３０ｇ（蒸留水１Lを基準）。
【０１４０】
培養を終了した後、ＨＰＬＣを用いて培養液中のＬ−トレオニンの濃度を分析した。酢
酸を添加していない場合、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２２２ＰとＫ
ＣＣＭ１１２２２Ｐ：：  ｄａｐＡ−ＰａｃｅＡに対する培養液中のＬ−トレオニン濃度
は、以下の表１１の通りである。
【０１４１】
【表１１】
2020078312.tif 000012
【０１４２】
また、生産培地に酢酸５ｇ/Ｌを添加した以外は、同様の方法で菌株を培養し、Ｌ−ト
レオニン生産能を比較した。培養液中のＬ−トレオニン濃度は、以下の表１２の通りであ
る。
【０１４３】
【表１２】
2020078312.tif 000013
【０１４４】
前記表１１に示されるように、酢酸が存在しない条件でＫＣＣＭ１１２２２Ｐ：：  ｄ
ａｐＡ−ＰａｃｅＡ菌株は、親株ＫＣＣＭ１１２２２Ｐに比べてもトレオニン生産能に変
化がないことを確認した。
【０１４５】
しかし、前記表１２に示されるように、酢酸が存在する条件では、ＫＣＣＭ１１２２２
Ｐ：：  ｄａｐＡ−ＰａｃｅＡ菌株の場合、親株ＫＣＣＭ１１２２２Ｐに比べてトレオニ
ン生産能が５０％以上向上したことを確認することができた。
【受託番号】
【０１４６】
受託機関：韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms）（
国際寄託機関）
受託番号：KCCM11432P
受託日：2013.06.12
【０１４７】
前述したように、本発明は、酢酸誘導性プロモーターを利用することにより、適切な時
間内に酢酸を添加することにより、目的遺伝子の発現を低下させ、目的とするＬ−アミノ
酸を高収率で生産することができるため、Ｌ−アミノ酸の生産に効果的に利用することが
できる。
【０１４８】
前記実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらに限定さ
れるものではないと理解するべきである。各実施例で説明した特徴及び特性は、他の実施
例において他の類似した特徴や特性を利用することができるものであると通常理解しなけ
ればならない。
【０１４９】
本発明の一つまたはそれ以上の実施例は、図面を参照して説明され、当業者に形態及び
具体的な面で多様な変更が、後述する特許請求の範囲により定義される本発明の意味と範
囲を逸脱することなく行うことができるものと理解されるべきである。
2020078312.tif 000014
【図１】
2020078312.tif 000015
【図２】
2020078312.tif 000016
【配列表】
2020078312000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月4日(2020.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列で表されるプロモーターを、染色体内
の目的遺伝子の終止コドンの下流に前記目的遺伝子の転写に対して反対の向きに導入させ
て形質転換された、Ｌ−アミノ酸を生産する組換えコリネ型微生物を培養する段階であっ
て、前記目的遺伝子がＬ−アミノ酸の生合成経路の分岐点に位置する遺伝子である、段階
を含むＬ−アミノ酸の生産方法。
【請求項２】
前記終止コドンの下流は、前記目的遺伝子の終止コドンと転写ターミネータの上流との
間であることを特徴とする、請求項１に記載のＬ−アミノ酸の生産方法。
【請求項３】
前記目的遺伝子は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼサブユニットＥ１をコードする遺伝子
（ＮＣｇｌ１２１６７）、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ＮＣｇｌ１
１３６）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイルアラニル−Ｄ−グルタミン酸−２，６−ジア
ミノピメリン酸リガーゼをコードする遺伝子（ＮＣｇｌ２０８３）及びジヒドロジピコリ
ン酸合成酵素をコードする遺伝子（ＮＣｇｌ１８９６）からなる群から一つ以上の遺伝子
が選択されることを特徴とする、請求項１に記載のＬ−アミノ酸の生産方法。
【請求項４】
前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−リジンまたはＬ−トレオニンであることを特徴とする、請求
項３に記載のＬ−アミノ酸の生産方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明は以下を提供する。
［１］１）酢酸誘導性プロモーターを、染色体内の目的遺伝子の終止コドンの下流に導入
させて形質転換された、Ｌ−アミノ酸生産能を有する組換えコリネ型微生物を培養する段
階；及び
２）上記培養段階で酢酸を添加することにより、培養中、上記目的遺伝子の発現を低下
させ、上記組換えコリネ型微生物のＬ−アミノ酸生産能を強化する段階；
を含むＬ−アミノ酸の生産方法。
［２］上記終止コドンの下流は、上記目的遺伝子の終止コドンと転写ターミネータの上流
との間であることを特徴とする、上記［１］に記載のＬ−アミノ酸の生産方法。
［３］上記酢酸誘導性プロモーターは、配列番号１または配列番号２の塩基配列を有する
ことを特徴とする、上記［１］に記載のＬ−アミノ酸の生産方法。
［４］上記目的遺伝子は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼサブユニットＥ１をコードする遺
伝子（ＮＣｇｌ１２１６７）、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ＮＣｇ
ｌ１１３６）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイルアラニル−Ｄ−グルタミン酸−２，６−
ジアミノピメリン酸リガーゼをコードする遺伝子（ＮＣｇｌ２０８３）及びジヒドロジピ
コリン酸合成酵素をコードする遺伝子（ＮＣｇｌ１８９６）からなる群から一つ以上の遺
伝子が選択されることを特徴とする、上記［１］に記載のＬ−アミノ酸の生産方法。
［５］上記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−リジンまたはＬ−トレオニンであることを特徴とする、
上記［４］に記載のＬ−アミノ酸の生産方法。
以下、本発明に係る実施例を添付した図面を参照して詳しく説明し、明細書の全体で、
各図面に提示された同一な参照符号は同一な部材を示す。これに関連し、これら実施例は
、他の具体的な形で実施することもでき、これらに限定的なものではないことを理解しな
ければならない。したがって、これら実施例は、本発明の態様を説明するために、単に図
面を参照して記載したものに過ぎない。「少なくとも１つ」のような表現が構成要素のリ
ストに先行して記載された場合には、全構成要素のリストを変更するものであり、そのリ
ストの各構成要素を変更するものではない。以下、本発明を詳しく説明する。
【外国語明細書】
2020078312000001.pdf