(57)【要約】      （修正有）【課題】癌の診断方法、モニタリング方法および処置に対する応答の予測方法を提供する。【解決手段】対象における癌の診断のための方法では、（ｉ）前記対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルを決定することと、（ｉｉ）（ｉ）で得られたレベルを基準値と比較することと、を含み、対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが基準値と比較して増加している場合には、対象は癌と診断され、対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが基準値と比較して減少している場合には、対象は癌と診断されない、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における癌の診断のための方法であって、
（ｉ）前記対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルを決定することと、
（ｉｉ）（ｉ）で得られたレベルを基準値と比較することと、
を含み、
前記対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが基準値と比較して増加している場合には、前記対象は癌と診断され、
前記対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが基準値と比較して減少している場合には、前記対象は癌と診断されない、
方法。
【請求項２】
癌に罹患している対象の抗血管新生療法に対する応答を予測するための方法であって、
（ｉ）前記対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルを決定することと、
（ｉｉ）（ｉ）で得られたレベルを基準値と比較することと、
を含み、
前記抗血管新生療法はドキソルビシン療法またはインターフェロン療法ではなく、
前記対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが基準値と比較して増加している場合、それは、前記抗血管新生療法に対する悪い応答を示しており、
前記対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが基準値と比較して減少している場合、それは、前記抗血管新生療法に対する良好な応答を示している、
方法。
【請求項３】
応答が、癌の早期進行として測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗血管新生療法が、ＰＤ−ＥＣＧＦのレベルの決定の後に開始される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが、組織サンプルまたは生体液サンプルである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記組織サンプルが、腫瘍に由来するサンプルであり、前記生体液サンプルが、血漿サンプルである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍が、原発性腫瘍または転移癌である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記基準値が、健康な対象に由来するサンプルまたは癌と診断されない対象に由来するサンプルにおいて決定される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
決定されるＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが、ＰＤ−ＥＣＧＦのタンパク質レベルである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ＰＤ−ＥＣＧＦのタンパク質レベルが、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットによって決定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌が、腎細胞癌（ＲＣＣ）、乳癌および結腸直腸癌からなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
対象における癌の診断、および／または抗血管新生療法に対する癌患者の応答の決定、におけるＰＤ−ＥＣＧＦの使用であって、前記抗血管新生療法がドキソルビシン療法またはインターフェロン療法ではない、使用。
【請求項１３】
前記癌が、腎細胞癌（ＲＣＣ）、乳癌および結腸直腸癌からなる群より選択される、請求項１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の分野に属し、特に、癌の診断および予後診断において有用なバイオマーカーに属し、ここで、対象由来のサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦバイオマーカーの変化するレベルが、対象における癌の診断または癌に罹患している対象の予後診断において有用である。
【背景技術】
【０００２】
腎細胞癌（ＲＣＣ）の発生率は、毎年着実に上昇している。この癌の生物学についての理解は、大幅に進展している。これらの進展により、進行した疾患を有する患者における新しい治療戦略が開発されている。
【０００３】
米国特許第８０２９９８１Ｂ２号は、ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２（ＨＩＧ２）のレベルを決定することを含む、ＲＣＣを診断する方法に関する。米国特許第７６１１８３９Ｂ２号は、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ  ２（ＥＥＦ１Ａ２）およびｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２（ＴＬＲ２）のレベルを決定することを含む、対象におけるＲＣＣの診断を確認するための方法に関する。
【０００４】
それにもかかわらず、ＲＣＣに関しては臨床診療におけるルーチン使用のためのバイオマーカーが未だに存在しない。特に過去１０年において、ＲＣＣの予後診断に用いられる方法は変化していない。一般に、その治療法は組織学によって分類され、患者は、徴候の応答の見込みがないまま、潜在的に毒性のある治療法に曝され続ける。従って、ＲＣＣの診断および／または予後診断において有望なバイオマーカーを特定する必要が当技術分野では依然として存在する。
【０００５】
世界的に見て、乳癌は、２番目に多い癌種（１０．４％；肺癌の次）であり、５番目に多い癌死亡の原因（肺癌、胃癌、肝癌および結腸癌の次）である。世界中の女性の間で、乳癌は、最も多い癌死亡の原因である。１９７０年代から世界中で症例数が大幅に増加しており、これは、西洋社会の現代的な生活様式に部分的に起因する現象である。北米の女性の乳癌の発生率は、世界で最も高い。
【０００６】
予後診断および／または治療における価値を有するいくつかの確立した乳房の分子マーカーには、ホルモン受容体（エストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）を含む）、ＨＥＲ−２癌遺伝子、Ｋｉ−６７およびｐ５３が包含される。より最近になって特定された、乳癌における分子標的には、ＣＸＣＲ４、カベオリンおよびＦＯＸＰ３が包含される。
【０００７】
世界中で毎年６５５，０００人が死亡している結腸直腸癌は、３番目に多い癌の形態であり、西洋社会において２番目に多い癌関連死の原因である。多くの結腸直腸癌は、結腸内の腺腫性ポリープから生じると考えられている。これらのきのこ形の腫瘍は通常、良性であるが、一部のものは、時間とともに癌に発達する可能性がある。大抵の場合、限局性結腸癌の診断は、結腸内視鏡検査による。
【０００８】
外科的切除は、初期の結腸直腸癌（ステージＩ〜ＩＩＩ）に対する主要な治療法であり、治癒が期待できる手術の後の予後を評価するための最も強力なツールは、切除された検体の病理学的分析である。病理病期を決定するパラメータは、最も強力な術後転帰の予測因子であるが、他の臨床的特徴、分子的特徴および組織学的特徴が、病期とは無関係に予後に影響する可能性がある。ステージＩＶの疾患を有する患者において、予後は、遠隔転移性疾患の位置および程度に、より密接に関連している。
【０００９】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のレベルは、結腸直腸癌において最も頻繁に使用される腫瘍マーカーである。このレベルは、予後を予測するために手術の前に調べることができ、処置に対する応答を評価するために治療の間に、または再発についてモニタリングするために治療の完了後に、用いることができる。ＣＡ１９−９は、結腸直腸癌において上昇する可能性がある血中マーカーである。ＭＳＩ（マイクロサテライト不安定性）は、より積極的な処置を必要とする可能性がある初期の結腸癌を特定するために、または、いくつかの癌種に関連する家族性の症候群のリスクがあるためにさらなる遺伝子検査を受けるべきである患者を特定するために、用いることができる。近年、血清ｍｉＲ−２１が、結腸直腸癌における早期の診断および予後のバイオマーカーとして提唱されている（Ｔｏｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１０５（１２）：８４９−８５９）。
【００１０】
しかし、乳癌および結腸直腸癌は両方とも発生率が高いため、前記癌の応答についての診断マーカーおよび／または予測マーカーが当技術分野では引き続き必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
本願の発明者等は、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットによってＰＤ−ＥＣＧＦタンパク質の発現レベルを分析した。免疫組織化学によって分析したところ、非癌性組織サンプルではＰＤ−ＥＣＧＦは検出されなかった（１２のうち０、０％）が、６９人のＲＣＣ患者のうち６７（９７％超）の組織サンプルで、および乳癌患者由来の組織サンプルでは１７のうち１０（５９％）で、ＰＤ−ＥＣＧＦタンパク質が観察された。従って、組織サンプルのＰＤ−ＥＣＧＦの測定は、癌の検出、診断またはモニタリングのために使用され得る。
【００１２】
さらに、治療の開始前の腫瘍におけるＰＤ−ＥＣＧＦのレベルを早期進行のリスクと相関させることにより示されるように、ＰＤ−ＥＣＧＦの発現が、腎細胞癌および結腸直腸癌を有する患者における抗血管新生療法に対する応答の予測因子であるということを本願の発明者等は見出した（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ検定およびＧｅｈａｎ−Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定、ｐ＜０．０４５）。従って、ＰＤ−ＥＣＧＦの発現は、抗血管新生療法に対する応答の予測因子として、治療に対する癌の進行を予測する上で潜在的価値を有する。
【００１３】
さらに、ＰＤ−ＥＣＧＦと腫瘍進行についての有意なハザード比の解析により表されるように、ＰＤ−ＥＣＧＦの血漿レベルが高い結腸直腸癌患者は、早期進行のリスクが有意に高かった（ハザード比、ｐ＜０．０４１）。従って、ＰＤ−ＥＣＧＦの血漿中のタンパク質レベルは、抗血管新生療法に対する応答の予測因子として、治療に対する癌の応答を予測する上で潜在的価値を有する。
【００１４】
これらの発見は、ＲＣＣ、乳癌、結腸直腸癌および他の癌種を有する患者における検出、診断、疾患モニタリングならびに応答の予測のための新規のバイオマーカーとしてのＰＤ−ＥＣＧＦの使用を裏付ける。
【００１５】
従って、第１の態様では、本発明は、対象における癌の診断のための方法であって、
（ｉ）前記対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルを決定することと、
（ｉｉ）（ｉ）で得られたレベルを基準値と比較することと、
を含み、
対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが基準値と比較して増加している場合には、対象は癌と診断され、
対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが基準値と比較して減少している場合には、対象は癌と診断されない、
方法に関する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、癌に罹患している対象の抗血管新生療法に対する応答を予測するための方法であって、
（ｉ）前記対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルを決定することと、
（ｉｉ）（ｉ）で得られたレベルを基準値と比較することと、
を含み、
前記抗血管新生療法はドキソルビシン療法またはインターフェロン療法ではなく、
対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが基準値と比較して増加している場合、それは、抗血管新生療法に対する悪い応答を示しており、
対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが基準値と比較して減少している場合、それは、抗血管新生療法に対する良好な応答を示している、
方法に関する。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、対象における癌の診断および／または抗血管新生療法に対する癌患者の応答の決定におけるＰＤ−ＥＣＧＦの使用であって、前記抗血管新生療法はドキソルビシン療法またはインターフェロン療法ではない、使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】免疫組織化学により測定された、患者または健康な対象の腫瘍組織サンプルまたは非腫瘍組織サンプルのＰＤ−ＥＣＧＦタンパク質のレベル。
【図２】免疫組織化学により測定された、ＲＣＣ癌患者の腫瘍組織サンプルのＰＤ−ＥＣＧＦタンパク質のレベル。
【図３】免疫組織化学により測定された、乳癌患者の腫瘍組織サンプルのＰＤ−ＥＣＧＦタンパク質のレベル。
【図４】腫瘍組織のＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルと関連付けられた、ＲＣＣ患者における無増悪生存のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存プロット。
【図５】健康なドナーまたは癌患者の血漿サンプルの、ＥＬＩＳＡにより測定されたＰＤ−ＥＣＧＦのタンパク質レベル。
【図６】ＲＣＣ癌患者の血漿サンプルの、ＥＬＩＳＡにより測定されたＰＤ−ＥＣＧＦのタンパク質レベル。
【図７】乳癌患者の血漿サンプルの、ＥＬＩＳＡにより測定されたＰＤ−ＥＣＧＦのタンパク質レベル。
【図８】結腸直腸癌患者の血漿サンプルの、ＥＬＩＳＡにより測定されたＰＤ−ＥＣＧＦのタンパク質レベル。
【図９】結腸直腸癌患者における腫瘍進行に対するＰＤ−ＥＣＧＦの血漿中のタンパク質レベルのハザード比の関連性。
【図１０】ＰＤ−ＥＣＧＦの血漿レベルと関連付けられた、ＲＣＣ患者における無増悪生存のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存プロット。
【図１１】ＰＤ−ＥＣＧＦの発現が変化する結腸直腸腺癌患者のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ無病生存プロット。全て完全な腫瘍（７サンプル）。参照：Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＴＣＧＡ，Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ）。
【図１２】ＰＤ−ＥＣＧＦの発現が変化する膠芽腫患者のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ全生存プロット。全て完全な腫瘍（２９１サンプル）。参照：Ｂｒｅｎｎａｎ  ＣＷ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｏｃｔ１０；１５５（２）：４６２−７７。
【図１３】ＰＤ−ＥＣＧＦの発現が変化する腎臓腎明細胞癌患者のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ全生存プロット。全て完全な腫瘍（４１３サンプル）。参照：Ｋｉｄｎｅｙ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＴＣＧＡ，Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ）。
【図１４】ＰＤ−ＥＣＧＦの発現が変化する腎臓腎明細胞癌患者のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ無病生存プロット。全て完全な腫瘍（４１３サンプル）。参照：Ｋｉｄｎｅｙ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＴＣＧＡ，Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ）。
【図１５】ＰＤ−ＥＣＧＦの発現が変化する腎臓腎明細胞癌患者のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ全生存プロット。全て完全な腫瘍（３９２サンプル）。参照：Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１３  Ｊｕｌ  ４；４９９（７４５６）：４３−９。
【図１６】ＰＤ−ＥＣＧＦの発現が変化する腎臓腎乳頭細胞癌患者のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ無病生存プロット。全て完全な腫瘍（１６１サンプル）。参照：Ｋｉｄｎｅｙ  Ｒｅｎａｌ  Ｐａｐｉｌｌａｒｙ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＴＣＧＡ，Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ）。
【図１７】ＰＤ−ＥＣＧＦの発現が変化する肺腺癌患者のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ全生存プロット。全て完全な腫瘍（２３０サンプル）。参照：Ｌｕｎｇ  Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＴＣＧＡ，Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ）。
【図１８】ＰＤ−ＥＣＧＦの発現が変化する肺腺癌患者のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ無病生存プロット。全て完全な腫瘍（２３０サンプル）。参照：Ｌｕｎｇ  Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＴＣＧＡ，Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ）。
【図１９】ＰＤ−ＥＣＧＦの発現が変化する前立腺腺癌患者のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ無病生存プロット。全て完全な腫瘍（８５サンプル）。参照：Ｔａｙｌｏｒ  ＢＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２０１０  Ｊｕｌ  １３；１８（１）：１１−２２。
【図２０】ＰＤ−ＥＣＧＦの発現が変化する精巣胚細胞癌患者のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ全生存プロット。全て完全な腫瘍（１４９サンプル）。参照：Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｎｃｅｒ（ＴＣＧＡ，Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ）。
【図２１】ＰＤ−ＥＣＧＦの発現が変化する胸腺腫患者のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ全生存プロット。全て完全な腫瘍（１２４サンプル）。参照：Ｔｈｙｍｏｍａ（ＴＣＧＡ，Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ）。
【図２２】ＰＤ−ＥＣＧＦの発現が変化する胸腺腫患者のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ無病生存プロット。全て完全な腫瘍（１２４サンプル）。参照：Ｔｈｙｍｏｍａ（ＴＣＧＡ，Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ）。
【図２３】ＰＤ−ＥＣＧＦの発現が変化する甲状腺乳頭癌患者のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ全生存プロット。全て完全な腫瘍（３８８サンプル）。参照：Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ．，Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｅｌｌ．２０１４  Ｏｃｔ  ２３；１５９（３）：６７６−９０。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
本明細書で使用される場合、「抗血管新生療法（anti-angiogenic treatment）」または「抗血管新生療法（anti-angiogenesis treatment）」なる用語は、少なくとも１種の抗血管新生剤に基づく処置に関する。「抗血管新生剤（anti-angiogenic agent）」または「抗血管新生剤（anti-angiogenesis agent）」または「血管新生阻害剤」なる用語は、限定されるものではないが腫瘍血管新生を含む血管新生（例えば、血管を形成するプロセス）を標的とする作用物質に関する。これに関連して、阻害は、血管の形成を阻止すること、および血管の成長を停止または鈍化させること、を指し得る。
【００２０】
「癌」なる用語は、制御されない細胞分裂（または生存もしくはアポトーシス抵抗性の増加）により、ならびに、隣接する他の組織に侵入し（浸潤）、リンパ管および血管を通って細胞が通常は位置することのない身体の他の領域に広がり（転移）、血流中を循環し、そして体内の他の場所の正常な組織に侵入する、という前記細胞の能力により、特徴付けられる疾患を指す。それらが浸潤および転移によって広がり得るかどうかに応じて、腫瘍は良性または悪性のいずれかに分類される。良性腫瘍は、浸潤または転移によって広がることのできない腫瘍であり、すなわち、良性腫瘍は局所的にしか増殖しない。一方、悪性腫瘍は、浸潤および転移によって広がることが可能な腫瘍である。癌に関連することが知られている生物学的プロセスには、血管新生、免疫細胞の浸潤、細胞遊走および転移が包含される。癌なる用語には、限定されるものではないが、肺癌、肉腫、悪性メラノーマ、胸膜中皮腫、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、乳癌、結腸直腸癌、腎臓癌、食道癌、腎上部癌（suprarenal cancer）、耳下腺癌、頭頸部癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、肝癌、中皮腫、多発性骨髄腫、白血病およびリンパ腫が包含される。本発明の特定の実施形態において、癌は、腎細胞癌（ＲＣＣ）、乳癌または結腸直腸癌である。「乳癌」なる用語は、最も一般的には乳管の内壁または乳管に乳を供給する小葉に由来する、乳房細胞の任意の悪性の増殖性疾患に関する。管から生じる癌は、腺管癌として知られており、小葉から生じる癌は、小葉癌として知られている。「結腸癌」、「直腸癌」または「腸癌」としても知られている「結腸直腸癌」なる用語は、結腸もしくは直腸または虫垂における制御されない細胞増殖に由来する癌を指す。「腎臓癌」または「腎臓腺癌」としても知られている「腎細胞癌」なる用語は、（顆粒細胞と混ざっているか混ざっていない）明細胞癌、好色素性癌（chromophilic cancer）、腎臓のラブドイド腫瘍、嫌色素性癌、オンコサイト癌、集合管癌、移行上皮癌および肉腫様腫瘍を含む、腎臓の任意の組織に腫瘍細胞が見出される癌に関する。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「診断」なる用語は、対象において可能性のある疾患を決定および／または特定しようとするプロセス（すなわち診断手順）およびこのプロセスによって到達した所見（すなわち診断所見）の両方を指す。そのため、それは、処置および予後についての医療上の決定を行うことを可能にする別個の異なるカテゴリーに個体の状態を分類する試みと見なすこともできる。特に、「癌の診断」なる用語は、対象において腫瘍の存在を特定または検出する能力に関する。当業者には理解されるように、この検出は、分析されるサンプルの１００％において正しい、ということを求めるものではない。しかし、それは、統計的に有意な量の分析されるサンプルが正しく分類されることを必要とする。統計的に有意な量は、当業者であれば、種々の統計的手段を用いて確立できる。前記統計的手段の例示的で非限定的な例としては、信頼区間の決定、ｐ値の決定、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定またはＦｉｓｈｅｒの判別関数等が挙げられる（例えば、Ｄｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ，  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８３を参照のこと）。信頼区間は、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。ｐ値は、好ましくは０．１未満、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満または０．０００１未満である。本発明の教示は、好ましくは、分析される所定の群または集団の対象のうちの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％において正しく診断することを可能にする。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「発現レベル」なる用語は、対象のサンプルにおける、遺伝子によって生産された遺伝子産物の測定可能な量を指し、ここで、遺伝子産物は、転写産物または翻訳産物であってよい。当業者には理解されるように、遺伝子の発現レベルは、前記遺伝子、または前記遺伝子によりコードされるタンパク質、のメッセンジャーＲＮＡのレベルを測定することによって定量できる。本発明に関しては、ＰＤ−ＥＣＧＦをコードする遺伝子の発現レベルは、前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡのレベルを測定することによって、または前記遺伝子によりコードされるタンパク質（すなわちＰＤ−ＥＣＧＦタンパク質）もしくはそのバリアントのレベルを測定することによって、決定できる。ＰＤ−ＥＣＧＦタンパク質のバリアントには、タンパク質の機能が維持されるという条件で、タンパク質の全ての生理学的に適切な翻訳後化学修飾形態（例えば、グリコシル化、リン酸化、アセチル化等）が包含される。前記用語は、限定されるものではないが飼育動物と家畜（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類）、霊長類およびヒトを含む任意の哺乳動物種のＰＤ−ＥＣＧＦタンパク質を包含する。好ましくは、ＰＤ−ＥＣＧＦタンパク質はヒトタンパク質である。
【００２３】
本明細書で使用される「血小板由来内皮細胞増殖因子（plateled derived-endothelial cell growth factor）」または「ＰＤ−ＥＣＧＦ」なる用語は、「血小板由来内皮細胞増殖因子−１（plateled derived-endothelial cell growth factor-1）」、「ＥＣＧＦ−１」もしくは「ＥＣＧＦ１」、「グリオスタチン」、「血小板由来内皮細胞マイトジェン」、「チミジンホスホリラーゼ」または「ＴＰ」としても知られており、内皮分裂促進活性を示す血小板から最初に単離された細胞質タンパク質に関する。これは、４５ｋＤａの酸性非グリコシル化タンパク質であり、４８２アミノ酸の前駆体として合成され、この前駆体からＮ末端プロセシングにより作り出される。胎盤から単離された当該タンパク質は、そのＮ末端に５つの追加のアミノ酸を含む。ＰＤ−ＥＣＧＦは、インビボでセリン残基がリン酸化され得るが、このリン酸化ステップの生物学的意義は不明である。ＰＤ−ＥＣＧＦをコードするヒト遺伝子は、２２番染色体上に位置し、Ｇｅｎｅ  ＩＤ  １８９０が割り当てられている（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ、２０１４年３月１日更新）。ＰＤ−ＥＣＧＦについて、いくつかの転写バリアントが報告されている：バリアント２、３および４と同じアイソフォーム１をコードする転写バリアント１（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋにおける受入番号ＮＭ＿００１１１３７５５．２）；５’ＵＴＲ内の別のスプライス部位を利用する転写バリアント２（ＮＭ＿００１９５３．４）；バリアント１と比較して５’ＵＴＲが異なる転写バリアント３（ＮＭ＿００１１１３７５６．２）；バリアント１と比較して５’ＵＴＲ内の別のスプライス部位を利用する転写バリアント４（ＮＭ＿００１２５７９８８．１）；および、バリアント１と比較して５’ＵＴＲ内および３’コード領域内の別のスプライス部位を利用し、アイソフォーム２をコードする転写バリアント５であって、前記アイソフォーム２がアイソフォーム１と比較してＣ末端領域に追加のセグメントを有する、転写バリアント５（ＮＭ＿００１２５７９８９．１）。ヒトＰＤ−ＥＣＧＦのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋに受入番号ＡＡＢ０３３４４．２（４８２アミノ酸、２０００年２月３日の時点でのバージョン）およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１９９７１．２（２０１４年２月１９日の時点でのＵｎｉｐｒｏｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １６７）で登録されている。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「抗血管新生療法に対する応答を予測する」なる用語は、抗血管新生療法を用いた治療的介入の後の医学的転帰の予測に関する。処置後の転帰は、例えば、不良もしくは良好な転帰（例えば、長期生存、全生存、疾患特異的生存、無増悪生存または無病生存の見込み）、再発、疾患進行、または死亡など、患者の進行についての任意の一般的な評価項目を用いて決定されてよい。当業者には理解されるように、応答の予測は、診断または評価される対象の１００％で正しい必要はない（但し、そうであることが好ましい）。しかし、当該用語は、統計的に有意な割合の対象が、治療に応答した所与の転帰を伴う可能性が高いと特定され得ることを必要とする。対象が統計的に有意であるか否かは、例えば、信頼区間の決定、ｐ値の決定、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定等、様々な周知の統計的評価手段を用いて当業者が、さらなる負担を伴うことなく、決定できる。詳細は、Ｄｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ，  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８３に記載されている。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％である。ｐ値は、好ましくは０．０５、０．０２５、０．００１未満である。限定されるものではないが疾患進行のパラメータを含め、患者の応答を決定するために広く受け入れられている任意のパラメータが本発明において使用され得る。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「基準値」なる用語は、対象または対象から採取したサンプルの臨床検査によって取得される値／データのための基準として使用される臨床検査値を指す。基準値または基準レベルは、絶対値、相対値、上限もしくは下限を有する値、値の範囲、算術平均値、中央値、平均値、または特定の対照もしくはベースラインの値と比較した値、であってよい。基準値は、例えば、試験される対象に由来するがより早い時点でのサンプルから取得された値など、個体のサンプルの値に基づいてよい。基準値は、実年齢を適合させたグループという対象の集団に由来するサンプルなど、多数のサンプルに基づいてよいか、または、試験されるサンプルを含むか含まないサンプルのプールに基づいてよい。好適な基準値は、癌の診断を決定するための、または抗血管新生療法で処置されている癌を有する対象の応答を予測するための、本発明の方法に関連して述べられる。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「サンプル」または「生体サンプル」なる用語は、対象から単離された生体物質を指す。生体サンプルは、ＲＮＡまたはタンパク質のレベルを検出するのに好適な任意の生体物質を含む。特定の実施形態において、サンプルは、研究中の対象に由来する遺伝物質（例えば、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）、ｍＲＮＡ等）を含む。サンプルは、例えば血液、唾液、血漿、血清、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、糞便、手術検体、生検から得られた検体、およびパラフィンに包埋された組織サンプルなど、任意の好適な組織または生体液から単離できる。サンプルを単離するための方法は、当業者には周知である。特に、生検からサンプルを得るための方法には、塊の大まかな分配（gross apportioning of a mass）、または顕微解剖または他の公知の細胞分離法が包含される。サンプルの保存および取り扱いを簡単にするために、サンプルを、ホルマリン固定およびパラフィン包埋することができるか、または、最初に凍結した後、急速凍結を可能にする超低温媒体に浸漬することによりＯＣＴ化合物などの低温凝固媒体（cryosolidifiable medium）中に包埋することができる。特定の実施形態において、本発明の方法に従う対象に由来するサンプルは、生体液サンプルである。特定の実施形態において、本発明の方法に従う対象に由来するサンプルは、血液、血清、血漿および組織サンプルからなる群より選択され、より好ましくは、血漿および組織サンプルからなる群より選択される。
【００２７】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」なる用語は、哺乳動物として分類される全ての動物に関し、限定されるものではないが飼育動物と家畜、霊長類およびヒト（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、またはげっ歯類）を包含する。好ましくは、対象は、任意の年齢、性別または人種の男性または女性のヒトである。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「処置」なる用語は、本明細書に記載されるような臨床状態に対する感受性の終結、防止、改善および／または低減を目的とする任意のタイプの治療を含む。好ましい実施形態において、処置なる用語は、予防的処置（すなわち、本明細書で定義されるような疾患または状態である臨床状態についての感受性を低減するための治療）に関する。従って、「処置」、「処置する」等の用語は、本明細書で使用される場合、所望の薬理学的および／または生理学的な効果を得ることを指し、ヒトを含む哺乳動物における病理学的な状態または疾患の任意の処置を包含する。この効果は、疾患またはその症状を完全または部分的に防止するという点で予防的であってよく、ならびに／または、疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用の部分的または完全な治癒という点で治療的であってよい。すなわち、「処置」には、（１）対象において疾患が発生または再発するのを防止すること、（２）疾患を阻害すること（その発症を阻止することなど）、（３）ホストが疾患またはその症状に苦しむことのないように疾患または少なくともそれに付随する症状を停止または終結させること（例えば喪失した機能、欠損した機能または欠陥のある機能を回復または修復するか非効率的なプロセスを刺激することによって、疾患またはその症状の退行を引き起こすことなど）、あるいは（４）炎症、疼痛および／または免疫不全など、疾患またはそれに付随する症状を軽減、緩和または改善すること（ここで、改善は、広い意味で使用され、パラメータの大きさの低減を少なくとも指す）が包含される。
【００２９】
本発明の癌の診断方法
本発明の著者等は、組織サンプルを免疫組織化学によって分析したところ、非癌性組織サンプルではＰＤ−ＥＣＧＦの発現は検出されない（１２のうち０、０％）が、６９人のＲＣＣ患者のうち６７（９７％超）の組織サンプルで、および乳癌患者由来の組織サンプルでは１６のうち９（５６％）で、ＰＤ−ＥＣＧＦタンパク質の発現が検出されるということを見出した（実施例１を参照のこと）。同様に、ＥＬＩＳＡによって分析したところ、１６人のＲＣＣ患者のうち１４（８７％超）の血漿サンプルで、乳癌患者由来の血漿サンプルでは１６のうち１１（６９％）で、および結腸直腸癌患者由来の血漿サンプルでは５８のうち５２（９０％）で、ＰＤ−ＥＣＧＦの発現が観察された（実施例２を参照のこと）。
【００３０】
従って、第１の態様では、本発明は、対象における癌の診断のための方法であって、
（ｉ）前記対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルを決定することと、
（ｉｉ）（ｉ）で得られたレベルを基準値と比較することと、
を含み、
対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが基準値と比較して増加している場合には、対象は癌と診断され、
対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが基準値と比較して減少している場合には、対象は癌と診断されない、
方法に関する。
【００３１】
従って、本発明の診断方法の第１のステップでは、診断が決定されるべき対象に由来するサンプルにおいてＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルが決定される。ＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルが決定されるサンプルは、潜在的腫瘍に由来する細胞を含む任意のサンプルであってよい。特定の実施形態において、潜在的腫瘍に由来する細胞を含むサンプルは、生体液サンプルである。特定の実施形態において、潜在的腫瘍に由来する細胞を含むサンプルは、潜在的腫瘍組織またはその一部である。より特定の実施形態において、前記潜在的腫瘍組織サンプルは、腎臓癌の診断が決定されるべき患者に由来する腎臓組織サンプル、または乳癌の診断が決定されるべき患者に由来する乳房組織サンプル、または結腸直腸癌の診断が決定されるべき患者に由来する結腸直腸組織サンプルである。前記サンプルは、従来の方法（例えば、生検、外科的切除または吸引）によって、関連する医療分野の当業者に周知の方法を用いることによって、得ることができる。生検からサンプルを得るための方法には、塊の大まかな分配、または顕微解剖または他の公知の細胞分離法（腎摘出および部分的腫瘍摘出を含む）が包含される。腫瘍細胞はさらに、穿刺吸引細胞診から得ることができる。サンプルの保存および取り扱いを簡単にするために、サンプルを、ホルマリン固定およびパラフィン包埋することができるか、または、最初に凍結した後、急速凍結を可能にする超低温媒体に浸漬することによりＯＣＴ化合物などの低温凝固媒体中に包埋することができる。
【００３２】
別の実施形態において、ＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルが決定されるサンプルは、診断が決定されるべき患者に由来する生体液である。好ましい実施形態において、生体液は、血液（特に末梢血）、血漿または血清から選択される。血液サンプルは、典型的には、動脈または静脈（通常は肘の内側部分または手の甲の静脈）を穿刺することによって抜き出され、血液サンプルは、気密性のあるバイアルまたはシリンジに回収される。微量法による分析のために、通常は踵または指の末節骨における毛細血管穿刺を行うことができる。血清は、全血サンプルから抗凝固剤の非存在下で、サンプルが凝固するようにサンプルを１０分間静置した後、血清（上清）から細胞（沈殿物）を分離する目的で１，５００ｒｐｍにて１０分間、サンプルを遠心分離することによって得ることができる。次に、血漿サンプルを得るために、全血を抗凝固剤と接触させ、３，０００ｒｐｍにて２０分間、遠心分離する。前記遠心分離の沈殿物は有形成分に該当し、上清は血漿に該当する。得られた血清または血漿は、本発明の方法によるサンプル分析のために保存用チューブに移されてよい。
【００３３】
本発明の診断方法の特定の実施形態において、ＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルが決定されるサンプルは、血漿サンプルまたは組織サンプルである。特定の実施形態では、乳癌の診断が決定されるべき場合、血漿サンプルにおいて、または乳房組織サンプルにおいて、ＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルが決定される。特定の代替的実施形態では、腎細胞癌（ＲＣＣ）の診断が決定されるべき場合、血漿サンプルにおいて、または腎臓組織サンプルにおいて、ＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルが決定される。別の特定の代替的実施形態では、結腸直腸癌の診断が決定されるべき場合、血漿サンプルにおいて、または結腸直腸組織サンプルにおいて、ＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルが決定される。
【００３４】
前述の通り、遺伝子の発現レベルは、当該遺伝子、または前記遺伝子によりコードされるタンパク質、または前記遺伝子によりコードされるタンパク質（すなわちＰＤ−ＥＣＧＦタンパク質）、またはそれらのバリアント、のメッセンジャーＲＮＡのレベルを測定することによって定量できる。ＰＤ−ＥＣＧＦタンパク質のバリアントには、タンパク質の機能が維持されるという条件で、タンパク質の全ての生理学的に適切な翻訳後化学修飾形態（例えば、グリコシル化、リン酸化、アセチル化等）が包含される。前記用語は、限定されるものではないが飼育動物と家畜（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類）、霊長類およびヒトを含む任意の哺乳動物種のＰＤ−ＥＣＧＦタンパク質を包含する。好ましくは、ＰＤ−ＥＣＧＦタンパク質はヒトタンパク質である。
【００３５】
遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定するために、生体サンプルを処理して組織または細胞の構造を物理的、機械的または化学的に破壊し、細胞内成分を水溶液または有機溶液中に放出させて、さらなる分析のための核酸を調製してよい。核酸は、当業者に公知であり商業的に利用可能な手順によってサンプルから抽出される。次に、当技術分野で典型的な方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌ．１−３）のいずれかによって凍結サンプルまたは新鮮なサンプルからＲＮＡが抽出される。好ましくは、抽出プロセス中のＲＮＡの分解を避けるように配慮がなされる。
【００３６】
発現レベルは、ホルマリン固定されパラフィン包埋された組織サンプルから得られたｍＲＮＡを用いて決定できる。ｍＲＮＡは、最初に脱パラフィンされる保管された病理サンプルまたは生検サンプルから単離されてよい。例示的な脱パラフィンの方法は、キシレンなどの有機溶媒でパラフィン化サンプルを洗浄することを伴う。脱パラフィンされたサンプルは、低級アルコールの水溶液で再水和できる。好適な低級アルコールには、例えば、メタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノールが包含される。脱パラフィンされたサンプルは、例えば、濃度を減少させながら低級アルコール溶液を用いる連続的洗浄により再水和されてよい。あるいは、サンプルは、同時に脱パラフィンおよび再水和される。次に、サンプルが溶解され、サンプルからＲＮＡが抽出される。サンプルはまた、切除された腫瘍など、新鮮な腫瘍組織から得ることもできる。特定の実施形態において、サンプルは、新鮮な腫瘍組織またはＯＣＴ包埋凍結組織から得ることができる。別の好ましい実施形態において、サンプルは、結腸内視鏡検査によって得ることができ、その後にパラフィン包埋できる。
【００３７】
異なるサンプル間でｍＲＮＡの発現の値を標準化するために、試験サンプル中の目的のｍＲＮＡの発現レベルを対照ＲＮＡの発現と比較することが可能である。本明細書で使用される場合、「対照ＲＮＡ」は、その発現レベルが腫瘍細胞において、非腫瘍原性細胞に対して変化しないか限られた量でしか変化しないＲＮＡに関する。好ましくは、対照ＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子に由来するｍＲＮＡであり、ハウスキーピング遺伝子は、恒常的に発現され必須の細胞機能を果たすタンパク質をコードする。本発明における使用のための好ましいハウスキーピング遺伝子には、β−２−ミクログロブリン、ユビキチン、１８−Ｓリボソームタンパク質、シクロフィリン、ＩＰＯ８、ＨＰＲＴ、ＧＡＰＤＨ、ＰＳＭＢ４、チューブリンおよびβ−アクチンが包含される。好ましい実施形態において、対照ＲＮＡは、ＧＡＰＤＨ、ＩＰＯ８、ＨＰＲＴ、β−アクチン、１８−Ｓリボソームタンパク質またはＰＳＭＢ４のｍＲＮＡである。
【００３８】
一実施形態において、相対的な遺伝子発現の定量化は、内因性の対照としてＧＡＰＤＨ、ＩＰＯ８、ＨＰＲＴ、β−アクチンまたはＰＳＭＢ４を、キャリブレーターとして市販のＲＮＡ対照を用いて、比較閾値サイクル（Ｃｔ）法に従って算出される。最終的な結果は、式：２−（サンプルのΔＣｔ−キャリブレーターのΔＣｔ）に従って決定され、ここで、キャリブレーターとサンプルのΔＣＴ値は、対照遺伝子の値から標的遺伝子のＣｔ値を差し引くことによって決定される。
【００３９】
ｍＲＮＡレベルで遺伝子発現レベルを決定するのに好適な方法には、限定されるものではないが、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ保護解析、ノーザンブロット、ＲＮＡドットブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、マイクロアレイ技術、タグを利用した方法（ＬｏｎｇＳＡＧＥおよびＳｕｐｅｒＳＡＧＥなどの変形を含む遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）など）、マイクロアレイ、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）（Ｆｌｏｗ−ＦＩＳＨ、ｑＦｉＳＨおよび二重融合ＦＩＳＨ（Ｄ−ＦＩＳＨ）などの変形を含む）等など、ｍＲＮＡの発現レベルを決定するための標準的なアッセイが包含される。
【００４０】
タンパク質レベルで遺伝子発現レベルを決定するのに好適な方法には、限定されるものではないが、前記遺伝子によりコードされるタンパク質（または抗原決定基を含むその断片）に特異的に結合する能力を有する抗体を用いることと、その後の、得られた抗体−抗原複合体の定量化など、タンパク質の発現レベルを決定するための従来の方法が包含される。特定の実施形態において、ＰＤ−ＥＣＧＦのタンパク質レベルは、ウエスタンブロットもしくはウエスタントランスファー、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、競合的ＥＩＡ（競合的酵素免疫測定）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学的手法および免疫組織化学的手法、特異的抗体を含むタンパク質のバイオチップもしくはマイクロアレイの使用に基づいた手法、または、ディップスティックなどの形式のコロイド沈殿に基づいたアッセイなど、タンパク質の発現レベルを決定するための標準的なアッセイを用いることによって定量できる。
【００４１】
これらのアッセイにおいて利用される抗体は、例えば、ポリクローナル血清、ハイブリドーマ上清またはモノクローナル抗体、抗体断片、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびヒト化抗体であってよい。同時に、抗体は、標識されていてもいなくてもよい。使用できるマーカーの例示的ではあるが非排他的な例としては、放射性同位体、酵素、フルオロフォア、化学発光試薬、酵素の基質または補因子、酵素の阻害剤、粒子、着色剤等が挙げられる。本発明において用いることができる幅広い様々な周知のアッセイが存在し、これらは、非標識化抗体（一次抗体）および標識化抗体（二次抗体）を使用する。これらの手法には、ウエスタンブロットもしくはウエスタントランスファー、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、競合的ＥＩＡ、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ、免疫細胞化学的手法および免疫組織化学的手法、特異的抗体を含むタンパク質のバイオチップもしくはマイクロアレイの使用に基づいた手法、または、ディップスティックなどの形式のコロイド沈殿に基づいたアッセイが包含される。目的のタンパク質のレベルを検出および定量する他の方法には、アフィニティークロマトグラフィー、結合リガンドアッセイ（binding-ligand assay）等が包含される。
【００４２】
一方、ＰＤ−ＥＣＧＦタンパク質のレベルの決定は、アセンブルされた対象のサンプルを含む組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を構築し、該当するタンパク質の発現レベルを免疫組織化学手法により決定することによって行うことができる。免疫染色強度は、方法の再現性を維持するために、２人以上の異なる病理学者によって評価され、一様で明確なカットオフ基準を用いてスコア付けされてよい。不一致は、同時に再評価することによって解決できる。簡潔に説明すると、免疫染色の結果は、腫瘍細胞における発現および各マーカーについての特定のカットオフを考慮に入れて、発現陰性（０）対発現陽性、および低発現（１＋）対中程度の発現（２＋）と高発現（３＋）として記録できる。一般的な基準として、カットオフは、再現性を容易にするために、および可能であれば生物学的事象を翻訳するために、選択される。あるいは、免疫染色強度は、イメージング技術および自動化された方法（Ｒｏｊｏ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（Ｆｏｌｉａ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｂｉｏｌ．２００９；４７：３４９−５４）またはＭｕｌｒａｎｅ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．２００８；８：７０７−２５）に開示されるものなど）を用いることによって評価できる。
【００４３】
あるいは、別の特定の実施形態において、ＰＤ−ＥＣＧＦタンパク質のレベルは、ウエスタンブロットによって決定される。ウエスタンブロットは、変性条件下でのゲル電気泳動によって予め分離されメンブレン（一般的にはニトロセルロース）上に固定化されたタンパク質の、特異的抗体とのインキュベーションおよび現像システム（例えば化学発光）による検出に基づく。
【００４４】
特定の実施形態において、本発明の診断方法において決定されるべきＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルは、ＰＤ−ＥＣＧＦのタンパク質レベルとして決定される。より特定の実施形態において、ＰＤ−ＥＣＧＦのタンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットまたは免疫組織化学によって決定される。
【００４５】
本明細書で使用される場合、タンパク質（より具体的には酵素）の「活性レベル」なる用語は、特に単位時間あたりに変換される基質のモルとして測定される、酵素活性の尺度を指す。
【００４６】
酵素の活性レベルを決定するためのアッセイは当業者に公知であり、これには、限定されるものではないが、初速度アッセイ、プログレス曲線アッセイ、遷移キネティクスアッセイ（transient kinetics assay）および緩和アッセイ（relaxation assay）が包含される。酵素活性の連続的アッセイには、限定されるものではないが、分光光度測定アッセイ、蛍光定量アッセイ、熱量測定アッセイ、化学発光アッセイ、光散乱アッセイおよびマイクロスケールのサーモフェレーシスアッセイ（microscale thermopheresis assay）が包含される。酵素活性の非連続的アッセイには、限定されるものではないが、放射測定アッセイおよびクロマトグラフィーアッセイが包含される。当業者には理解されるように、酵素活性に影響する可能性がある因子には、塩濃度、温度、ｐＨ、および基質濃度が含まれる。
【００４７】
本発明の診断方法の第２のステップにおいて、診断が決定されるべき対象に由来するサンプルにおけるＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルは、基準値と比較される。
【００４８】
対象における癌の診断のための本発明の方法に関しては、基準値は、健康な対象（すなわち、癌と診断されない対象）に由来するサンプルまたは癌と診断される対象に由来する非腫瘍組織サンプルにおいて決定されるＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルであり、好ましくは、基準値は、健康な対象または癌と診断されない対象に由来するサンプルにおいて決定されるＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルである。
【００４９】
この基準値が確立されると、サンプル中で発現しているＰＤ−ＥＣＧＦのレベルを前記基準値と比較でき、従って「増加した」または「減少した」発現のレベルを割り当てることができる。例えば、基準値と比較して少なくとも１．１倍、１．５倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍または１００倍超という、基準値を超える発現レベルの増加は、「増加した」発現レベルとみなされる。一方、基準値と比較して少なくとも０．９倍、０．７５倍、０．２倍、０．１倍、０．０５倍、０．０２５倍、０．０２倍、０．０１倍、０．００５倍または０．００５倍未満という、基準値を下回る発現レベルの減少は、「減少した」発現レベルとみなされる。
【００５０】
従って、基準値と比較した場合に、診断が決定されるべき対象に由来するサンプルにおけるＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルの増加が観察されるのであれば、その対象は癌と診断される。あるいは、基準値と比較した場合に、診断が決定されるべき対象に由来するサンプルにおけるＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルの減少が観察されるのであれば、その対象は癌と診断されない。
【００５１】
本発明による、抗血管新生療法に対する応答を予測するための方法
本発明の著者等は、癌患者において決定されたＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが、抗血管新生療法による処置の後に患者が早期進行を示すというリスクとの統計的に有意な相関を示すということを見出した。従って、さらなる態様では、本発明は、癌に罹患しており抗腫瘍処置を受けている対象において処置に対する応答を予測するための方法であって、
（ｉ）前記対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルを決定することと、
（ｉｉ）（ｉ）で得られたレベルを基準値と比較することと、
を含み、
対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが基準値と比較して増加している場合、それは、処置に対する癌患者の不良な応答を示しており、
対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが基準値と比較して減少している場合、それは、処置に対する癌患者の良好な応答を示している、
方法に関する。
【００５２】
特定の実施形態において、本発明は、癌に罹患している対象の抗血管新生療法に対する応答を予測するための方法であって、
（ｉ）前記対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルを決定することと、
（ｉｉ）（ｉ）で得られたレベルを基準値と比較することと、
を含み、
対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが基準値と比較して増加している場合、それは、抗血管新生療法に対する悪い応答を示しており、
対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが基準値と比較して減少している場合、それは、抗血管新生療法に対する良好な応答を示している、
方法に関する。
【００５３】
より特定の実施形態において、本発明は、癌に罹患している対象の抗血管新生療法に対する応答を予測するための方法であって、
（ｉ）前記対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルを決定することと、
（ｉｉ）（ｉ）で得られたレベルを基準値と比較することと、
を含み、
前記抗血管新生療法はドキソルビシン療法またはインターフェロン療法ではなく、
対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが基準値と比較して増加している場合、それは、抗血管新生療法に対する悪い応答を示しており、
対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが基準値と比較して減少している場合、それは、抗血管新生療法に対する良好な応答を示している、
方法に関する。
【００５４】
抗血管新生療法に対する応答を予測するための本発明の方法の第１のステップでは、処置に対する応答が予測されるべき癌に罹患している対象に由来するサンプルにおいてＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルが決定される。
【００５５】
ＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルが決定されるサンプルは、腫瘍に由来する細胞を含む任意のサンプルであってよい。特定の実施形態において、潜在的腫瘍に由来する細胞を含むサンプルは、生体液サンプルである。特定の実施形態において、腫瘍に由来する細胞を含むサンプルは、腫瘍組織またはその一部である。より特定の実施形態において、前記腫瘍組織サンプルは、腎臓癌の抗血管新生療法に対する応答が予測されるべき患者に由来する腎臓腫瘍組織サンプル、または乳癌の抗血管新生療法に対する応答が予測されるべき患者に由来する乳房腫瘍組織サンプル、または結腸直腸癌の抗血管新生療法に対する応答が予測されるべき患者に由来する結腸直腸腫瘍組織サンプルである。前記サンプルは、従来の方法（例えば、生検、外科的切除または吸引）によって、関連する医療分野の当業者に周知の方法であって本発明の診断方法に関連して前述された方法を用いることによって、得ることができる。一実施形態において、腫瘍細胞を含むサンプルは、原発性腫瘍のサンプルである。別の実施形態において、腫瘍は転移性腫瘍であり、ＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが決定されるサンプルは、転移癌に由来するサンプルである。
【００５６】
別の実施形態において、ＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルが決定されるサンプルは、処置に対する応答が予測されるべき癌に罹患している患者に由来する生体液である。好ましい実施形態において、生体液は、血液（特に末梢血）、血漿または血清から選択される。血液、血清および血漿のサンプルの取得のための方法は、当業者には公知であり、本発明の診断方法に関連して前述されている。
【００５７】
抗血管新生療法に対する応答を予測するための本発明の方法の特定の実施形態において、ＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルが決定されるサンプルは、血漿サンプルまたは組織サンプルである。特定の実施形態では、乳癌の抗血管新生療法に対する応答が予測されるべき場合、血漿サンプルにおいて、または乳房腫瘍組織サンプルにおいて、ＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルが決定される。特定の代替的実施形態では、腎細胞癌（ＲＣＣ）の抗血管新生療法に対する応答が予測されるべき場合、血漿サンプルにおいて、または腎臓腫瘍組織サンプルにおいて、ＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルが決定される。別の特定の代替的実施形態では、結腸直腸癌の抗血管新生療法に対する応答が予測されるべき場合、血漿サンプルにおいて、または結腸直腸腫瘍組織サンプルにおいて、ＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルが決定される。
【００５８】
前述の通り、遺伝子の発現レベルは、当該遺伝子、または前記遺伝子によりコードされるタンパク質、または前記遺伝子によりコードされるタンパク質（すなわちＰＤ−ＥＣＧＦタンパク質）、またはそれらのバリアント、のメッセンジャーＲＮＡのレベルを測定することによって定量できる。ＰＤ−ＥＣＧＦタンパク質のバリアントは上述されており、ここに組み込まれる。
【００５９】
ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベル（特にＰＤ−ＥＣＧＦのｍＲＮＡレベルおよびＰＤ−ＥＣＧＦのタンパク質レベル）に基づいて発現レベルを決定するための方法は、本発明の診断方法に関連して前述されており、ここに組み込まれる。
【００６０】
特定の実施形態において、本発明の方法の抗血管新生療法に対する応答の予測において決定されるべきＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルは、ＰＤ−ＥＣＧＦのタンパク質レベルとして決定される。より特定の実施形態において、ＰＤ−ＥＣＧＦのタンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットまたは免疫組織化学によって決定される。
【００６１】
特定の実施形態において、処置に対する応答の予測が本発明の方法によって決定されるべき癌に罹患している対象は、抗血管新生療法を受けており、ここで、癌の前記抗血管新生療法は、少なくとも１種の抗血管新生剤に基づく。
【００６２】
本発明に従う抗血管新生剤および抗血管新生療法には、限定されるものではないが、ベバシズマブ（アバスチン；インビトロおよびインビボのアッセイ系においてヒトＶＥＧＦＡに結合し、その生物学的活性を阻害する組換えヒト化モノクローナルＩｇＧ１抗体）などのモノクローナル抗体、ラニビズマブ（ルセンティス）などの抗体派生物、またはＦａｂ ＩＭＣ １１２１もしくはＦ２００ Ｆａｂなどの抗体断片、またはＶＥＧＦによって刺激されるチロシンキナーゼを阻害する経口利用可能な小分子（ラパチニブ（タイケルブ）、スニチニブ（スーテント）、ソラフェニブ（ネクサバール）、アキシチニブおよびパゾパニブなど）を含む、抗ＶＥＧＦ剤；スラミンおよびその派生物、ペントサンポリサルフェート、セジラニブ、パゾパニブまたはＢＩＢＦ １１２０などの抗線維芽細胞増殖因子（抗ＦＧＦ）剤；抗体ＥＧＦ剤（セツキシマブ、ゲフィチニブまたはエルロチニブなど）および抗ＨＧＦ剤（ＡＲＱ１９７、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＰＦ−０４２１７９０３、ＳＧＸ５２３、ＮＫ４またはＡＭＧ１０２など）；ならびに、アンジオスタチン、エンドスタチン、抗血管新生アンチトロンビンＩＩＩまたはｓＦＲＰ−４などの抗血管新生ポリペプチド、が包含される。
【００６３】
さらなる抗血管新生剤には、マリマスタット；ＡＧ３３４０；ＣＯＬ−３、ＢＭＳ−２７５２９１、サリドマイド、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、２−メトキシエストラジオール、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭＩＯＩ（ＧＢＳトキシン）、ペントサンポリサルフェート、アンジオポエチン２（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノマイド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン（accutin）、アンジオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板第４因子またはミノサイクリンが包含される。
【００６４】
さらなる抗血管新生剤には、限定されるものではないがアンジオスタチン、エンドスタチン、抗血管新生アンチトロンビンＩＩＩ、国際公開第２００７１１５３７６号に記載されるようなｓＦＲＰ−４、抗ＶＥＧＦ抗体（アニビズマブ（anibizumab）、ベバシズマブ（アバスチン）、Ｆａｂ ＩＭＣ １１２１およびＦ２００ Ｆａｂなど）を含む、血管新生を阻害することが可能なポリペプチドを表す抗血管新生ポリペプチドが包含される。
【００６５】
さらなる抗血管新生剤には、ペガプタニブ、スニチニブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、バタラニブおよびアフリベルセプト（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）が包含される。
【００６６】
さらなる抗血管新生剤には、ラムシルマブ（ＩＭＣ−１１２１Ｂ）およびＤＣ１０１（抗Ｆｌｋ−１ ｍＡｂとしても知られている）など、ＶＥＧＦＲ２遮断抗体が包含される。
【００６７】
特定の実施形態において、抗血管新生剤は、スニチニブ、ベバシズマブおよびＤＣ１０１を含む群から選択される。
【００６８】
一実施形態において、抗血管新生療法は、アントラサイクリン系抗生物質を含む処置ではない。別の実施形態において、抗血管新生療法は、ドキソルビシンを含む処置ではない。別の実施形態において、抗血管新生療法は、インターフェロンを含む処置ではない。別の実施形態において、抗血管新生療法は、Ｉ型インターフェロンおよび／またはＩＩ型インターフェロンを含む処置ではない。別の実施形態において、抗血管新生療法は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κおよびＩＦＮ−ωを含む処置ではない。別の実施形態において、抗血管新生療法は、ＩＦＮ−γを含む処置ではない。別の実施形態において、抗血管新生療法は、補助療法（すなわち、腫瘍の外科的切除の後のもの）である。一実施形態において、抗血管新生療法は、インターフェロンを含む補助療法ではない。別の実施形態において、抗血管新生療法は、Ｉ型インターフェロンおよび／またはＩＩ型インターフェロンを含む補助療法ではない。別の実施形態において、抗血管新生療法は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κおよびＩＦＮ−ωを含む補助療法ではない。別の実施形態において、抗血管新生療法は、ＩＦＮ−γを含む補助療法ではない。
【００６９】
特定の作用物質の抗血管新生活性を決定するためのアッセイは、限定されるものではないが国際公開第２００３０８６２９９号に記載されている。
【００７０】
本発明の方法の応答の予測の第２のステップにおいて、抗血管新生療法に対する予測が決定されるべき癌に罹患している対象に由来するサンプルにおけるＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルは、基準値と比較される。
【００７１】
抗血管新生療法による処置に対する対象における癌の応答の予測のための本発明の方法に関しては、好適な基準値は、抗血管新生療法による処置に対して良好な応答を示した癌を有するか有していた対象に由来するサンプルにおいて決定されたＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルであってよく、前記発現レベルは、患者が処置されていた時点で決定されたものである。別の実施形態において、基準値は、健康な患者（すなわち、治療に対する応答の予測が望まれる癌腫と診断されていない患者）におけるＰＤ−ＥＣＧＦのレベルである。
【００７２】
この基準値が確立されると、サンプル中で発現しているＰＤ−ＥＣＧＦのレベルを前記基準値と比較でき、従って「増加した」または「減少した」発現のレベルを割り当てることができる。例えば、基準値と比較して少なくとも１．１倍、１．５倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍または１００倍超という、基準値を超える発現レベルの増加は、「増加した」発現レベルとみなされる。一方、基準値と比較して少なくとも０．９倍、０．７５倍、０．２倍、０．１倍、０．０５倍、０．０２５倍、０．０２倍、０．０１倍、０．００５倍または０．００５倍未満という、基準値を下回る発現レベルの減少は、「減少した」発現レベルとみなされる。
【００７３】
従って、基準値と比較した場合に、処置に対する応答の予測が決定されるべき癌に罹患している対象に由来するサンプルにおけるＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルの増加が観察されれば、それは、処置に対する不良な応答を示している。あるいは、基準値と比較した場合に、処置に対する応答の予測が決定されるべき癌に罹患している対象に由来するサンプルにおけるＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルの減少が観察されれば、それは、処置に対する良好な応答を示している。
【００７４】
本発明の使用
別の態様では、本発明は、対象における癌の診断および／または抗血管新生療法に対する癌患者の応答の予測におけるＰＤ−ＥＣＧＦの使用に関する。より具体的には、本発明は、対象における癌の診断および／または抗血管新生療法に対する癌患者の応答の予測におけるＰＤ−ＥＣＧＦの使用であって、前記抗血管新生療法はドキソルビシン療法またはインターフェロン療法ではない、使用に関する。
【００７５】
「癌の診断」および「抗血管新生療法に対する癌患者の応答の予測」なる用語は、上記で定義されており、本発明による使用に同等に適用可能である。好ましい実施形態において、癌は、腎細胞癌（ＲＣＣ）、乳癌および結腸直腸癌からなる群より選択される。好ましい実施形態において、本発明による使用は、ＰＤ−ＥＣＧＦポリペプチドの使用を含む。一実施形態において、ＰＤ−ＥＣＧＦポリペプチドは、抗体またはアプタマーなど、ＰＤ−ＥＣＧＦに特異的に結合することが可能な試薬を用いてそのレベルを決定することによって使用される。好ましい実施形態において、本発明による使用は、ＰＤ−ＥＣＧＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を含む。一実施形態において、ＰＤ−ＥＣＧＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特異的プライマーのセットまたはプローブなど、ＰＤ−ＥＣＧＦをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合することが可能な試薬を用いてそのレベルを決定することによって使用される。
【００７６】
以下の実施例によって本発明を以下で説明するが、以下の実施例は、例示的なものに過ぎず、決して本発明の範囲を限定するものではないとみなされるべきである。
【実施例】
【００７７】
実施例１：患者における癌の検出、診断およびモニタリングのための癌マーカーとしての組織ＰＤ−ＥＣＧＦレベルの特定。免疫組織化学による、非癌性組織サンプルまたは腫瘍組織サンプルにおけるＰＤ−ＥＣＧＦのタンパク質レベルの決定。
【００７８】
患者に由来する腫瘍において免疫検出によりＰＤ−ＥＣＧＦの発現を分析した。マウスモノクローナル抗チミジン（thymidime）ホスホリラーゼ［Ｐ−ＧＦ、４４Ｃ］抗体を使用した（Ａｂｃａｍ、ａｂ３１５１）。
【００７９】
結果は、以下のことを示した。
・１２の非癌性組織において、ＰＤ−ＥＣＧＦは検出されなかった。従って、癌患者において非癌性組織のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルと腫瘍塊のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルとの間には有意な差がある（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、ｐ＜０．０００１）（図１）。
・免疫組織化学によって分析したところ、６９人のＲＣＣ患者のうち６７（９７％超）の組織サンプルで、および乳癌患者由来の組織サンプルでは１６のうち９（５６％）で、ＰＤ−ＥＣＧＦのタンパク質発現が観察された。
・ＰＤ−ＥＣＧＦは種々の局在（膜、細胞質および核）を有し、これは、局在に応じた発現の種々の度合を評価することを可能にする。
・ＰＤ−ＥＣＧＦは、各腫瘍の固有の特徴に依存した種々の発現レベルを示す。
【００８０】
ＰＤ−ＥＣＧＦの基底（処置前の）発現レベルを分析したところ、腫瘍は、おそらくは各腫瘍の固有の特徴に依存して、種々の基底発現レベルを示す（図２および図３）ということが観察された。
【００８１】
実施例２：患者における癌の検出、診断およびモニタリングのための癌マーカーとしての血漿ＰＤ−ＥＣＧＦレベルの特定。ＥＬＩＳＡによる、血漿サンプルにおけるＰＤ−ＥＣＧＦのタンパク質レベルの決定。
【００８２】
健康な対象および癌患者に由来する血漿においてＥＬＩＳＡによりＰＤ−ＥＣＧＦの発現を分析した。ヒトチミジンホスホリラーゼ、ＴＰ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ［ＣＳＢ−Ｅ１０８１４ｈ］を使用した。
【００８３】
結果は、以下のことを示した。
・癌患者と比較して、健康な対象では血漿ＰＤ−ＥＣＧＦレベルは検出できなかった。定量的には、健康な対象のＰＤ−ＥＣＧＦレベルと癌患者におけるＰＤ−ＥＣＧＦの血漿レベルとの間には統計的に有意な差がある（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、ｐ＝０．００１３）（図５）。
・ＥＬＩＳＡによって分析したところ、１６人のＲＣＣ患者のうち１４（８７％超）の血漿サンプルで、乳癌患者由来の血漿サンプルでは１６のうち１１（６９％）で、および結腸直腸癌患者由来の血漿サンプルでは５８のうち５２（９０％）で、ＰＤ−ＥＣＧＦのタンパク質発現が観察された。
・ＰＤ−ＥＣＧＦは、各患者の特徴に依存した種々の発現レベルを示す。
・ＰＤ−ＥＣＧＦの基底発現レベルを分析したところ、患者は、おそらくは各患者の固有の特徴に依存して、種々の基底発現レベルを示す（図６、図７および図８）ということが観察された。
【００８４】
実施例３：免疫組織化学およびＥＬＩＳＡによる、抗血管新生療法に対する応答の予測因子としてのＰＤ−ＥＣＧＦの特定。
【００８５】
患者に由来する腫瘍において免疫検出によりＰＤ−ＥＣＧＦの発現を分析した。マウスモノクローナル抗チミジンホスホリラーゼ［Ｐ−ＧＦ、４４Ｃ］抗体を使用した（Ａｂｃａｍ、ａｂ３１５１）。
【００８６】
結果は、以下のことを示した。
・６３人の患者に由来するＲＣＣ組織サンプルにおいてＰＤ−ＥＣＧＦを評価した。ＲＣＣ患者においてＰＤ−ＥＣＧＦの組織レベルの高さと早期進行のリスクの高さとの間には有意な関連性がある（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ検定とＧｅｈａｎ−Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定、ｐ＝０．０４５）（図４）。
【００８７】
一方で、患者に由来する血漿においてＥＬＩＳＡによりＰＤ−ＥＣＧＦの発現を分析した。ヒトチミジンホスホリラーゼ、ＴＰ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ［ＣＳＢ−Ｅ１０８１４ｈ］を使用した。
【００８８】
結果は、以下のことを示した。
・５２人の患者に由来する結腸直腸癌血漿サンプルにおいてＰＤ−ＥＣＧＦを評価した。結腸直腸癌患者においてＰＤ−ＥＣＧＦの血漿レベルと早期進行のリスクとの間には、疾患進行におけるＰＤ−ＥＣＧＦのレベルについての有意なハザード比によって表される有意な関連性がある（ハザード比の事後確率を用いてデータを評価し、ハザード比が１より高い事後確率は０．０４１に相当した。これは、腫瘍進行とＰＤ−ＥＣＧＦのレベルとの間の関連性を示す）（図９）。
・１４人の患者に由来するＲＣＣ血漿サンプルにおいてＰＤ−ＥＣＧＦを評価した。ＲＣＣ患者においてＰＤ−ＥＣＧＦの血漿レベルの高さと早期進行のリスクの高さとの間には有意な関連性がある（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ検定とＬｏｇ ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定、ｐ＜０．０７）（図１０）。
【００８９】
従って、ＰＤ−ＥＣＧＦの発現は、処置される患者における癌の進行を予測する上で潜在的価値を有する。これらの発見は、ＲＣＣ、乳癌、結腸直腸癌および他の癌種のための処置に対する応答の予測価値を有する新規のバイオマーカーとしてのＰＤ−ＥＣＧＦの使用を裏付ける。
【００９０】
実施例４：ＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルと癌の予後
ＰＤ−ＥＣＧＦの発現レベルと癌の予後との間の関係を分析するために、本願の発明者等は、ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ｗｗｗ．ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ）を使用することにより、ＰＤ−ＥＣＧＦの低発現または高発現を伴う癌患者に基づいてＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を生成した（図Ａ−Ｍ）。
【００９１】
以下のプロトコルに従って図１１〜図２３を生成した：ウェブサイトｗｗｗ．ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇのホームページ上の「Ｑｕｅｒｙ」を選択。Ｓｅｌｅｃｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｕｄｙから「ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ（＊）」を選択。「Ｓｅｌｅｃｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ」において「ｍＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｚ−Ｓｃｏｒｅｓ（ＲＮＡ  Ｓｅｑ  Ｖ２  ＲＳＥＭ）」のみを選択。「Ｅｎｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  ｓｅｔ」、「ＴＹＭＰ」を入力した後、「Ｓｕｂｍｉｔ」をクリック。Ｏｎｃｏｐｒｉｎｔが変化のパーセンテージ（以下の表１および表２を参照のこと）を示し、「Ｓｕｒｖｉｖａｌ」タブをクリックすると全生存Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ推定（overall survival Kaplan-Meier Estimate）が表示される。
【００９２】
【表１】
2020201278.tif 000002
【００９３】
【表２】
2020201278.tif 000003
【００９４】
結果は、以下のことを示した：
・ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴う結腸直腸腺癌の症例では、ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴わない症例よりも無病生存が悪い（図１１）；
・ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴う膠芽腫の症例では、ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴わない症例よりも全生存が悪い（図１２）；
・ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴う腎臓腎明細胞癌の症例では、ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴わない症例よりも全生存が悪い（図１３）；
・ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴う腎臓腎明細胞癌の症例では、ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴わない症例よりも無病生存が悪い（図１４）；
・ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴う腎臓腎明細胞癌の症例では、ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴わない症例よりも全生存が悪い（図１５）；
・ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴う腎臓腎乳頭細胞癌の症例では、ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴わない症例よりも無病生存が悪い（図１６）；
・ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴う肺腺癌の症例では、ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴わない症例よりも全生存が悪い（図１７）；
・ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴う肺腺癌の症例では、ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴わない症例よりも無病生存が悪い（図１８）；
・ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴う前立腺腺癌の症例では、ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴わない症例よりも無病生存が悪い（図１９）；
・ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴う精巣胚細胞癌の症例では、ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴わない症例よりも全生存が悪い（図２０）；
・ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴う胸腺腫の症例では、ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴わない症例よりも全生存が悪い（図２１）；
・ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴う胸腺腫の症例では、ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴わない症例よりも無病生存が悪い（図２２）；および
・ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴う甲状腺乳頭癌の症例では、ＰＤ−ＥＣＧＦの変化を伴わない症例よりも全生存が悪い（図２３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月28日(2020.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における癌の診断のための方法であって、
（ｉ）前記対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルを決定することと、
（ｉｉ）（ｉ）で得られたレベルを基準値と比較することと、
を含み、
前記対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが基準値と比較して増加している場合には、前記対象は癌と診断され、
前記対象に由来するサンプル中のＰＤ−ＥＣＧＦのレベルが基準値と比較して減少している場合には、前記対象は癌と診断されない、
方法。
【外国語明細書】
2020201278000001.pdf