(57)【要約】【課題】容易に、光学顕微鏡および観察装置の両方で、試料の同一箇所を観察することができる観察方法を提供する。【解決手段】本発明に係る観察方法は、第１マーカーを有する容器上で、光学顕微鏡を用いて、試料を観察する工程と、光学顕微鏡で観察した位置と第１マーカーの位置との位置関係を求める工程と、容器上で試料を樹脂包埋することによって、試料が包埋され、かつ、第１マーカーの痕が形成された樹脂ブロックを形成する工程と、樹脂ブロックを、第２マーカーを有する試料ホルダーに取り付ける工程と、光学顕微鏡で観察した位置と第１マーカーの位置との位置関係に基づいて、第２マーカーの位置と光学顕微鏡で観察した位置との位置関係を求める工程と、を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１マーカーを有する容器上で、光学顕微鏡を用いて、試料を観察する工程と、
前記光学顕微鏡で観察した位置と前記第１マーカーの位置との位置関係を求める工程と、
前記容器上で前記試料を樹脂包埋することによって、前記試料が包埋され、かつ、前記第１マーカーの痕が形成された樹脂ブロックを形成する工程と、
前記樹脂ブロックを、第２マーカーを有する試料ホルダーに取り付ける工程と、
前記光学顕微鏡で観察した位置と前記第１マーカーの位置との位置関係に基づいて、前記第２マーカーの位置と前記光学顕微鏡で観察した位置との位置関係を求める工程と、
を含む、観察方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記試料ホルダーを、走査電子顕微鏡の試料ステージに取り付ける工程と、
前記第２マーカーの位置と前記光学顕微鏡で観察した位置との位置関係に基づいて、前記試料ステージ上における前記第２マーカーの位置から、前記試料ステージ上における前記光学顕微鏡で観察した位置を求める工程と、
前記光学顕微鏡で観察した位置を、前記走査電子顕微鏡で観察する工程と、
を含む、観察方法。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記試料ホルダーに取り付けられた前記樹脂ブロックを、研磨する工程を含む、観察方法。
【請求項４】
請求項３において、
前記研磨は、イオンによる研磨、または機械研磨である、観察方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、
前記第１マーカーは、同心円、または同心多角形である、観察方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、
前記第１マーカーは、前記容器上に形成された金属膜である、観察方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、
前記容器は、他の第１マーカーを有し、
前記樹脂ブロックを形成する工程では、前記他の第１マーカーの痕が形成されず、
前記第１マーカーと前記光学顕微鏡で観察した位置との位置関係を求める工程では、前記他の第１マーカーの位置から前記第１マーカーの位置を求め、前記第１マーカーと前記光学顕微鏡で観察した位置との位置関係を求める、観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡と電子顕微鏡との間で同一箇所を観察可能とする手法が知られている（例えば、特許文献１参照）。例えば、培養細胞を光学顕微鏡で蛍光観察し、同じ場所を走査電子顕微鏡で観察することで、蛍光観察で注目した細胞を、高倍率で詳細に観察することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平８−１６２０５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
走査電子顕微鏡において生体試料を観察するためには、試料作製が必要となる。例えば、培養容器上の培養細胞を光学顕微鏡と走査電子顕微鏡で観察する場合、光学顕微鏡では細胞内部の蛍光を観察するのに対して、走査電子顕微鏡では細胞表面を観察することとなる。そのため、光学顕微鏡で得られた蛍光情報と、走査電子顕微鏡で得られた細胞表面の構造と、が一致しない。
【０００５】
したがって、光学顕微鏡で蛍光観察を行った後、走査電子顕微鏡で観察する前に、培養細胞の内部を観察できるように、試料を加工しなければならない。しかしながら、光学顕微鏡で観察した箇所を走査電子顕微鏡で観察可能に加工して、その位置を走査電子顕微鏡で観察することは困難であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る観察方法の一態様は、
第１マーカーを有する容器上で、光学顕微鏡を用いて、試料を観察する工程と、
前記光学顕微鏡で観察した位置と前記第１マーカーの位置との位置関係を求める工程と、
前記容器上で前記試料を樹脂包埋することによって、前記試料が包埋され、かつ、前記第１マーカーの痕が形成された前記樹脂ブロックを形成する工程と、
前記樹脂ブロックを、第２マーカーを有する試料ホルダーに取り付ける工程と、
前記光学顕微鏡で観察した位置と前記第１マーカーの位置との位置関係に基づいて、前記第２マーカーの位置と前記光学顕微鏡で観察した位置との位置関係を求める工程と、
を含む。
【０００７】
このような観察方法では、第２マーカーの位置と光学顕微鏡で観察した位置との位置関係を求めることができるため、容易に、光学顕微鏡および走査電子顕微鏡等の他の観察装置の両方で、試料の同一箇所を観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本実施形態に係る観察方法の一例を示すフローチャート。
【図２】培養細胞を光学顕微鏡で観察している様子を示す図。
【図３】培養容器を培養容器の底から見た図。
【図４】細胞を樹脂包埋する工程を説明するための図。
【図５】細胞を樹脂包埋する工程を説明するための図。
【図６】樹脂ブロックを模式的に示す図。
【図７】樹脂ブロックを試料ホルダーに取り付ける様子を模式的に示す図。
【図８】樹脂ブロックを試料ホルダーに取り付けた状態を模式的に示す図。
【図９】樹脂ブロックを研磨する工程を説明するための図。
【図１０】樹脂ブロックを研磨する工程を説明するための図。
【図１１】走査電子顕微鏡の試料ステージに試料ホルダーを取り付けた状態を模式的に示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の好適な実施形態について図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００１０】
１．  観察方法
まず、本実施形態に係る観察方法について、図面を参照しながら説明する。
【００１１】
本実施形態に係る観察方法は、第１マーカーを有する容器上で、光学顕微鏡を用いて、試料を観察する工程と、光学顕微鏡で観察した位置と第１マーカーの位置との位置関係を求める工程と、容器上で試料を樹脂包埋することによって、試料が包埋され、かつ、第１マーカーの痕が形成された樹脂ブロックを形成する工程と、樹脂ブロックを、第２マーカーを有する試料ホルダーに取り付ける工程と、光学顕微鏡で観察した位置と第１マーカーの位置との位置関係に基づいて、第２マーカーの位置と光学顕微鏡で観察した位置との位置関係を求める工程と、を含む。
【００１２】
図１は、本実施形態に係る観察方法の一例を示すフローチャートである。以下では、培養細胞を、光学顕微鏡および走査電子顕微鏡で観察する場合について説明する。
【００１３】
（１）光学顕微鏡観察（Ｓ１０）
図２は、細胞２を光学顕微鏡２０で観察している様子を示す図である。図３は、培養容器１０を模式的に示す平面図である。なお、図３は、培養容器１０を、培養容器１０の底から見た図である。
【００１４】
図２に示すように、培養容器１０上で培養された細胞２を、光学顕微鏡２０で観察する。
【００１５】
培養容器１０としては、培養ディッシュ（シャーレ）や、ガラス板などを用いることができる。図３に示すように、培養容器１０上には、観察した位置を特定するためのマーカー１２が設けられている。マーカー１２は、複数設けられている。図３に示す例では、９つのマーカー１２が、３行３列に配置されている。隣り合うマーカー１２の間隔は、例えば、２ｍｍ程度である。なお、マーカー１２の配置は特に限定されない。
【００１６】
マーカー１２は、光学顕微鏡および電子顕微鏡の観察方向から見て、同心円の形状を有している。そのため、光学顕微鏡観察および走査電子顕微鏡観察の両方において、マーカー１２の中心の位置を特定しやすい。なお、マーカー１２の形状は、同心円に限定されず、例えば、同心多角形であってもよい。
【００１７】
マーカー１２には、それぞれマーカー１２を特定するための番号が付されている。図２に示す例では、９つのマーカー１２に対して、それぞれ、Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３，Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３の番号が付されている。
【００１８】
培養容器１０は、例えば、ガラスである。マーカー１２は、培養容器１０に成膜された金属膜である。例えば、培養容器１０上に金属蒸着することによって、マーカー１２を形成することができる。金属膜の厚さは、例えば、数十ｎｍ程度である。マーカー１２は、光学顕微鏡および走査電子顕微鏡の両方で観察可能であって、かつ、後述するように樹脂包埋されたときに樹脂にマーカーが転写可能に構成されていれば、金属膜に限定されない。
【００１９】
細胞２の観察は、例えば、光学顕微鏡２０による蛍光観察によって行われる。具体的には、細胞２を蛍光色素等で標識して、光学顕微鏡２０で蛍光観察を行う。これにより、細胞や、細胞内小器官などの細胞を構成する構造の局在を観察することができる。光学顕微鏡２０による観察は、図２に示す例では、倒立顕微鏡を用いて、培養容器１０を底から観察している。なお、光学顕微鏡２０による観察は、図示はしないが、正立顕微鏡を用いて、培養容器１０の上から観察してもよい。
【００２０】
（２）観察位置とマーカーの位置との位置関係を求める（Ｓ１２）
光学顕微鏡２０で細胞２を観察した位置（以下、「光顕観察位置」ともいう）とマーカー１２の位置との位置関係を求める。具体的には、光学顕微鏡２０の座標系において、光顕観察位置の座標（Ｘ１，Ｙ１）とマーカー１２の座標（Ｘ２，Ｙ２）を記録する。
【００２１】
例えば、光学顕微鏡２０の試料ステージの座標を読み取ることで、光顕観察位置の座標（Ｘ１，Ｙ１）と、マーカー１２の座標（Ｘ２，Ｙ２）と、を取得する。そして、取得した光顕観察位置の座標（Ｘ１，Ｙ１）と、マーカー１２の座標（Ｘ２，Ｙ２）と、を記録する。このとき、光顕観察位置の座標（Ｘ１，Ｙ１）とともに複数のマーカー１２の座標（Ｘ２，Ｙ２）を取得してもよい。このようにして、光顕観察位置とマーカー１２の位置との位置関係を求めることができる。以下では、工程Ｓ１２において、光顕観察位置の座標（Ｘ１，Ｙ１）と、Ａ１の番号が付されたマーカー１２（以下、「Ａ１マーカー」ともいう）の座標（Ｘ２，Ｙ２）が記録された場合について説明する。
【００２２】
（３）樹脂包埋（Ｓ１４）
次に、細胞２を固定、脱水、および樹脂包埋する。
【００２３】
図４および図５は、細胞２を樹脂包埋する工程を説明するための図である。
【００２４】
図４に示すように、培養容器１０上に液状の樹脂４を流し込み、細胞２に包埋用容器３０を被せ、包埋用容器３０のなかで樹脂４を硬化させる。次に、図５に示すように、培養容器１０から硬化した樹脂４を引きはがす。これにより、細胞２が包埋された樹脂ブロック４０を形成できる。
【００２５】
図６は、樹脂ブロック４０を模式的に示す図である。
【００２６】
マーカー１２を構成する金属膜およびマーカー１２に付した番号を構成する金属膜は、培養容器１０の底面との間に段差を形成する。そのため、図６に示すように、樹脂ブロック４０には、マーカー１２およびマーカー１２に付した番号が転写される。この結果、樹脂ブロック４０には、マーカー１２の痕４２およびマーカー１２に付した番号の痕が形成される。
【００２７】
（４）樹脂ブロックの試料ホルダーへの取り付け（Ｓ１６）
樹脂ブロック４０を、試料ホルダー５０に取り付ける。
【００２８】
図７は、樹脂ブロック４０を、試料ホルダー５０に取り付ける様子を模式的に示す図である。図８は、樹脂ブロック４０を、試料ホルダー５０に取り付けた状態を模式的に示す図である。
【００２９】
図７および図８に示すように、試料ホルダー５０は、マーカー５２を有している。図７および図８に示す例では、試料ホルダー５０は、複数（図示の例では３つ）のマーカー５２を有している。なお、マーカー５２の配置は特に限定されない。マーカー５２は、光学顕微鏡および走査電子顕微鏡の両方で確認可能であれば、その形状および大きさは特に限定されない。
【００３０】
図７および図８に示す例では、樹脂ブロック４０を試料ホルダー５０の孔に挿入することで、樹脂ブロック４０を試料ホルダー５０に取り付けている。なお、樹脂ブロック４０の試料ホルダー５０への取り付け方法は特に限定されない。
【００３１】
（５）観察位置と試料ホルダーのマーカーとの位置関係を求める（Ｓ１８）
次に、光顕観察位置とマーカー１２の位置との位置関係に基づいて、光顕観察位置と試料ホルダー５０のマーカー５２の位置との位置関係を求める。具体的には、樹脂ブロック４０が試料ホルダー５０に取り付けられた状態において、光顕観察位置の座標（Ｘ１´，Ｙ１´）とマーカー５２の座標（Ｘ３，Ｙ３）を記録する。
【００３２】
まず、樹脂ブロック４０が取り付けられた試料ホルダー５０を光学顕微鏡２０の試料ステージにセットする。次に、光学顕微鏡２０でマーカー１２の痕を見つける。マーカー１２の痕４２は、観察した細胞２との位置関係を求めたマーカー１２によって樹脂ブロック４０に形成されたマーカー１２の痕４２である。すなわち、ここではＡ１マーカー１２の痕である。そして、Ａ１マーカー１２の痕４２の座標（Ｘ２´，Ｙ２´）を、光学顕微鏡２０の試料ステージの座標を読み取ることで取得する。
【００３３】
次に、取得したＡ１マーカー１２の痕４２の座標（Ｘ２´，Ｙ２´）と、工程Ｓ１２で記録したＡ１マーカー１２の座標（Ｘ２，Ｙ２）と、に基づいて、工程Ｓ１２における座標系と工程Ｓ１８における座標系との間の座標変換を行うための変換式を求める。次に、求めた変換式と、工程Ｓ１２で記録した光顕観察位置の座標（Ｘ１，Ｙ１）と、を用いて、光顕観察位置の座標（Ｘ１´，Ｙ１´）を求める。
【００３４】
次に、マーカー５２の座標（Ｘ３，Ｙ３）を、光学顕微鏡２０の試料ステージの座標を読み取ることで取得する。以上の工程により、光顕観察位置の座標（Ｘ１´，Ｙ１´）とマーカー５２の座標（Ｘ３，Ｙ３）を取得できる。なお、本工程において、複数のマーカー５２の座標を取得してもよい。
【００３５】
（６）樹脂ブロックの研磨（Ｓ２０）
次に、樹脂ブロック４０を研磨する。樹脂ブロック４０の研磨は、試料ホルダー５０に取り付けられた状態で行われる。
【００３６】
図９および図１０は、樹脂ブロック４０を研磨する工程を説明するための図である。樹脂ブロック４０の研磨は、図９に示すように、研磨装置６を用いた機械研磨であってもよいし、図１０に示すように、イオンビームＩＢを用いた研磨であってもよい。樹脂ブロック４０を研磨することによって、細胞２の内部を樹脂ブロック４０の表面に露出させることができる。
【００３７】
なお、樹脂ブロック４０の研磨により、樹脂ブロック４０に形成されたマーカーの痕４２が消失する場合がある。このような場合でも、光顕観察位置の座標（Ｘ１´，Ｙ１´）
とマーカー５２の座標（Ｘ３，Ｙ３）が記録されているため、光顕観察位置を見失わない。
【００３８】
（７）走査電子顕微鏡観察（Ｓ２２）
図１１は、走査電子顕微鏡６０の試料ステージ６２に試料ホルダー５０を取り付けた状態を模式的に示す図である。
【００３９】
次に、樹脂ブロック４０が取り付けられた試料ホルダー５０を走査電子顕微鏡６０の試料ステージ６２にセットして、光学顕微鏡２０で観察した位置で走査電子顕微鏡観察を行う。
【００４０】
まず、樹脂ブロック４０が取り付けられた試料ホルダー５０を走査電子顕微鏡６０の試料ステージ６２にセットする。次に、試料ホルダー５０のマーカー５２の座標（ｘ３，ｙ３）を、試料ステージの座標を読み取ることで取得する。
【００４１】
次に、取得したマーカー５２の座標（ｘ３，ｙ３）と、工程Ｓ１８で記録されたマーカー５２の座標（Ｘ３，Ｙ３）とに基づいて、光学顕微鏡２０の座標系と走査電子顕微鏡６０の座標系との間の座標変換を行うための変換式を求める。
【００４２】
次に、求めた変換式と、工程Ｓ１８で記録した光顕観察位置の座標（Ｘ１´，Ｙ１´）と、を用いて、走査電子顕微鏡６０の座標系（試料ステージ６２上）における光顕観察位置の座標（ｘ１，ｙ１）を求める。そして、求めた座標（ｘ１，ｙ１）に試料ステージ６２を移動させる。これにより、光顕観察位置を、走査電子顕微鏡６０で観察することができる。
【００４３】
上記のように、樹脂ブロック４０を研磨することによって細胞２の内部が樹脂ブロック４０の表面に露出している。そのため、走査電子顕微鏡６０において、細胞２の内部の構造を観察できる。したがって、本実施形態によれば、蛍光観察により観察した細胞２の内部の現象と、走査電子顕微鏡６０で観察した細胞２の内部の構造と、を比較することができる。
【００４４】
以上の工程により、光学顕微鏡２０および走査電子顕微鏡６０の両方で、同一箇所を観察することができる。
【００４５】
本実施形態に係る観察方法は、例えば、以下の特徴を有する。
【００４６】
本実施形態に係る観察方法は、マーカー１２を有する培養容器１０上で、光学顕微鏡２０を用いて、試料を観察する工程と、光学顕微鏡２０で観察した位置とマーカー１２の位置との位置関係を求める工程と、培養容器１０上で試料を樹脂包埋することによって、試料が包埋され、かつ、マーカー１２の痕４２が形成された樹脂ブロック４０を形成する工程と、樹脂ブロック４０を、マーカー５２を有する試料ホルダー５０に取り付ける工程と、光学顕微鏡で観察した位置とマーカー１２の位置との位置関係に基づいて、マーカー５２の位置と光学顕微鏡で観察した位置との位置関係を求める工程と、を含む。
【００４７】
さらに、本実施形態に係る観察方法では、試料ホルダー５０を、走査電子顕微鏡６０の試料ステージ６２に取り付ける工程と、マーカー５２の位置と光学顕微鏡２０で観察した位置との位置関係に基づいて、試料ステージ６２上におけるマーカー５２の位置から、試料ステージ６２上における光学顕微鏡２０で観察した位置を求める工程と、光学顕微鏡２０で観察した位置を走査電子顕微鏡６０で観察する工程と、を含む。
【００４８】
このように、本実施形態に係る観察方法では、マーカー５２の位置と光学顕微鏡２０で観察した位置との位置関係を求めることができるため、容易に、光学顕微鏡２０および走査電子顕微鏡６０の両方で、試料の同一箇所を観察することができる。
【００４９】
本実施形態に係る観察方法は、試料ホルダー５０に取り付けられた樹脂ブロック４０を研磨する工程を含む。本実施形態に係る観察方法では、マーカー５２の位置と光学顕微鏡２０で観察した位置との位置関係を求めることができるため、研磨により樹脂ブロック４０に形成されたマーカー１２の痕４２が消えても、光学顕微鏡２０で観察した位置を特定できる。
【００５０】
さらに、本実施形態に係る観察方法では、研磨によって試料の断面加工が可能であるため、例えば、ダイヤモンドナイフによる切片作製等と比べて、樹脂ブロック４０の広い範囲を観察可能である。さらに、例えば、ダイヤモンドナイフで切片を作製する場合、樹脂ブロックをトリミングする必要があるが、トリミングの作業は熟練が必要であり、長時間の作業が必要となる。これに対して、研磨による断面加工は、容易であり、短時間で加工ができる。
【００５１】
本実施形態に係る観察方法では、マーカー１２は、培養容器１０上に形成された金属膜である。そのため、樹脂ブロック４０の引きはがしが容易である。例えば、マーカーとして、培養容器１０に溝を形成した場合、溝に樹脂が入り込むため、樹脂ブロック４０を引きはがし難い。また、例えば、マーカー１２を疎に形成することによって、より容易に樹脂ブロック４０を引きはがすことができる。
【００５２】
２．  変形例
なお、本発明は上述した実施形態に限定されず、本発明の要旨の範囲内で種々の変形実施が可能である。
【００５３】
２．１．  第１変形例
例えば、工程Ｓ１２において、光顕観察位置とＡ１マーカー１２の位置との位置関係を求めたにも関わらず、樹脂ブロック４０に傷が入るなどして、Ａ１マーカー１２の痕４２の位置の特定が困難になる場合がある。このような場合には、Ａ１マーカー１２以外の他のマーカー１２の痕４２の座標からＡ１マーカー１２の座標を推測することができる。
【００５４】
第１変形例では、マーカー１２の位置と光顕観察位置との位置関係を求める工程では、Ａ１マーカー１２以外の他のマーカー１２の位置からＡ１マーカー１２の位置を求め、Ａ１マーカー１２と光顕観察位置との位置関係を求める。そのため、第１変形例では、容易に、光学顕微鏡２０および走査電子顕微鏡６０の両方で、試料の同一箇所を観察することができる。
【００５５】
２．２．  第２変形例
上記の実施形態では、樹脂ブロック４０の研磨の後に、走査電子顕微鏡観察を行ったが、樹脂ブロック４０の研磨と走査電子顕微鏡観察を繰り返してもよい。これにより、細胞２の深さ方向の情報を取得することができる。また、例えば、細胞２の３次元再構築像を得ることができる。
【００５６】
２．３．  第３変形例
なお、上記の実施形態では、光学顕微鏡２０と走査電子顕微鏡６０で同一箇所を観察する場合について説明したが、光学顕微鏡２０とその他の観察装置で同一箇所を観察する場合にも適用可能である。
【００５７】
本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【００５８】
２…細胞、４…樹脂、６…研磨装置、１０…培養容器、１２…マーカー、２０…光学顕微鏡、３０…包埋用容器、４０…樹脂ブロック、４２…痕、５０…試料ホルダー、５２…マーカー、６０…走査電子顕微鏡、６２…試料ステージ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2020136052.tif 000008
【図７】
2020136052.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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