(57)【要約】      （修正有）【課題】ライゲーションを促進する方法の提供。【解決手段】Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ；および１，２−エチレングリコール、１，２−プロパンジオール（１，２−ＰｒＤ）、などから選択される１つ以上の低分子ライゲーションエンハンサーを１％（ｖ／ｖ）から２０％（ｖ／ｖ）の濃度で含むリガーゼ反応バッファーであって、当該１つ以上の小分子ライゲーションエンハンサーを含まないリガーゼ反応バッファー中のライゲーション反応における１つまたは複数のＤＮＡフラグメントの分子内ライゲーションまたは分子間ライゲーションと比較して、ライゲーション反応における１つまたは複数のＤＮＡフラグメントの分子内ライゲーションまたは分子間ライゲーションを少なくとも２５％高めることが可能であるリガーゼ反応バッファー；を含む組成物。【選択図】図６
2020062021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガーゼおよび分子量が１０００ダルトン未満の１つ以上の低分子ライゲーションエンハンサーを含む組成物。
【請求項２】
１つ以上の低分子エンハンサーが１％（ｖ／ｖ）から５０％（ｖ／ｖ）の濃度で含まれるリガーゼ反応バッファーをさらに含み、リガーゼ反応バッファーが、１つもしくは複数のポリヌクレオチドフラグメントの分子内ライゲーションまたは分子間ライゲーションを少なくとも２５％高めることが可能である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
１つ以上の低分子ライゲーションエンハンサーが、２から２０個の炭素を含む場合により置換された直鎖または分枝鎖のジオールまたはポリオール、アルコール、双性イオン性化合物、および極性非プロトン性分子から選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
場合により置換された直鎖または分枝鎖のジオールまたはポリオールが、１，２−エチレングリコール、１，２−プロパンジオール（１，２−ＰｒＤ）、１，３−ＰｒＤ、グリセロール、ペンタエリスリトール、ソルビトール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、ネオペンチルグリコール、２−メチル−１，３−プロパンジオール、２，２−ジメチル−１，３−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール  １，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，９−ノナンジオール、１，１２−ドデカンジオール、２，２’−ジメチルプロピレングリコール、１，３−ブチルエチルプロパンジオール、メチルプロパンジオール、メチルペンタンジオール、プロピレングリコールメチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、トリプロピレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールイソブチルエーテル、エチレングリコールメチルエーテル、エチレングリコールエチルエーテル、エチレングリコールブチルエーテル、ジエチレングリコールフェニルエーテル、およびプロピレングリコールフェノールエーテルからなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
アルコールが、２から２０個の炭素を含む場合により置換された直鎖または分枝鎖の脂肪族の一級、二級または三級のアルコール鎖アルキレン基または多価分枝鎖アルキル基である、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
双性イオン性化合物は、２から５０個の炭素を含み、場合により置換された直鎖または分枝鎖であり、アンモニウム、ホスホニウム、スルホニウムのカチオン性基、カルボキシレート、ホスフェートまたはサルフェートのアニオン性基をさらに含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
極性非プロトン性分子が、Ｎ−アルキルカプロラクタム、ジメチルカプリル／カプリンアミド、Ｎ−アルキルピロリドン、ジフェニルスルホン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルイミダゾリジン−２−オン、アセトニトリル、アセトン、ジグリム、テトラグリム、テトラヒドロフラン、ジメチルアセトアミド、およびジメチルホルムアルデヒドからなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
１つ以上の低分子エンハンサーは、プロピレングリコールおよびエチレングリコールエーテルを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
１つ以上の低分子エンハンサーは、１，２−エチレングリコール、１，２−ＰｒＤ、１，３−プロパンジオール、イソプロピルアルコール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオールからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
低分子エンハンサーは、四級アンモニウムまたはホスホニウムカチオンおよびカルボキシレートアニオンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
低分子エンハンサーは、１，２−ＰｒＤ、１，３−ＰｒＤ、エチレングリコール、エタノール、イソプロパノール、およびベタインからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
低分子エンハンサーがＤＭＳＯである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
低分子エンハンサーが１，２−ＰｒＤである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
ポリエチレングリコールをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
低分子エンハンサーの量は、１％（ｖ／ｖ）から２０％（ｖ／ｖ）の範囲にある、請求項１から１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
少なくとも２個の核酸フラグメントをさらに含み、核酸フラグメントが、互いにライゲーションのための平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡであり、ならびにリガーゼがＤＮＡリガーゼである、請求項１から１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
少なくとも２個の核酸フラグメントをさらに含み、核酸フラグメントが、互いにライゲーションのための１塩基オーバーハングを有する二本鎖ＤＮＡであり、ならびにリガーゼがＤＮＡリガーゼである、請求項１から１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
ＤＮＡリガーゼが、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  Ｌｉｇａｓｅ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リガーゼおよびＳｓｏ７−リガーゼ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１から１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
場合によりＰＥＧ５０００−１０，０００を含むバッファー中に、０．０１から２００単位／μｌの制限エンドヌクレアーゼ、０．０１から２０００単位／μｌのリガーゼ、０．０１から２００単位／μのポリヌクレオチドキナーゼを含む、請求項１から１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
１つ以上の低分子ライゲーションエンハンサーが、１，２−ＰｒＤおよびグリセロールである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１から１８のいずれかに記載の組成物、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）非存在のライゲーションバッファーを含む、反応混合物。
【請求項２２】
核酸フラグメント間のライゲーションを促進する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の組成物と、複数の核酸フラグメントとをライゲーションバッファー中で混合すること、および
（ｂ）ライゲーションを起こさせること、ここで、ライゲーション効率が、低分子エンハンサー非存在下でのライゲーション効率と比較して少なくとも２５％促進される
を含む、方法。
【請求項２３】
ライゲーションが分子内である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ライゲーションが分子間である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
複数の核酸フラグメントが、平滑末端、１塩基オーバーハングまたは付着端を有する二本鎖ＤＮＡである、請求項２２から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
ライゲーション効率が、宿主細胞のエレクトロポレーションによって決定される場合、少なくとも４倍に高まっている、請求項２２から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
ポリヌクレオチドライブラリを作製する方法であって、
請求項１９または２０に記載の組成物をポリヌクレオチド増幅産物に加えることと、
コンピテント宿主細胞を形質転換するために分子内ライゲーションを起こさせることと
を含む、方法。
【請求項２８】
コンピテント細胞を形質転換することは、さらに、エレクトロポレーションを含む、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
１個または２個の塩基の付着端、平滑末端または末端オーバーハングを含む二本鎖核酸を、分子間または分子内のライゲーション反応によって接続することができる。しかし、平滑末端または１個または２個の塩基オーバーハングを含むポリヌクレオチドのライゲーションは、非常に効率が悪いことがわかっている。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００は、末端が平滑化した二本鎖ポリヌクレオチドのライゲーションを促進させることができるが、この試薬は、その後に行われるクローニングおよびライブラリ調製の一般的な工程であるコンピテント細胞のエレクトロポレーションを妨害することが報告されている。
【０００２】
制限エンドヌクレアーゼ開裂ＤＮＡを用いて付着端を作製すると、Ｈａｙａｓｈｉら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４（１９）：７６１７−７６３０（１９８６））では、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよび６％から１０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ６０００を用い、４塩基オーバーハングを含む二本鎖ＤＮＡをライゲーションし、分子内ライゲーションを促進し、二価カチオンまたはポリアミンを含む１０％  ＰＥＧ６０００が分子間ライゲーションを高める。Ｐｈｅｉｆｆｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１（２２）：７８５３−７１（１９８３））は、ポリマー（例えばＰＥＧ）、ウシ血清アルブミンまたはグリコーゲンが、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いた制限エンドヌクレアーゼ開裂によって作られた平滑末端のライゲーションを刺激することができることを報告した。この参考文献では、著者らは、もっと小さな分子であるＰＥＧ２００またはＰＥＧ４００は、ライゲーションにほとんど影響を与えないと報告した。Ｘｉａｏら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）３５：１２９−１３３（２００７））は、リガーゼ検出反応の有効性および特異性について、有機化合物であるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（Ｕｎｉｑｅｍａ  Ａｍｅｒｉｃａ  ＬＬＣ、ウィルミントン、ＤＥ）、グリセロール、ホルムアルデヒドおよびＰＥＧ６０００の効果を観察した。彼らは、ＰＥＧ６０００を除くこれらすべての化合物が、低濃度（０から１％）でライゲーション効率を阻害するが、Ｔｗｅｅｎ−２０を用いると効率が急上昇し、次いで顕著に低下することを報告した。ＤＭＳＯ、グリセロールおよびホルムアルデヒドは、二本鎖ＤＮＡのニック接合部でのライゲーション反応の効率を妨害した。
【０００３】
平滑末端または付着端を有する二本鎖ポリヌクレオチドは、一般的に、制限エンドヌクレアーゼの消化またはフラグメント化およびポリッシングの産物である。１塩基オーバーハングを有する二本鎖ポリヌクレオチドは、一般的に、ノンプルーフリーディングポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅産物であるか、またはｄＡを平滑末端のフラグメントに付加した産物である。または、１塩基オーバーハングのポリッシングによって、平滑末端を得ることができる。一般的に、コンピテント細胞の形質転換を含むクローニング工程の前に制限エンドヌクレアーゼによって開裂したポリヌクレオチドまたはＰＣＲによって増幅したポリヌクレオチドをベクターに分子間ライゲーションすることが必要である。
【０００４】
一本鎖ポリヌクレオチドの分子間ライゲーションは、例えば、ｃＤＮＡライブラリのために、一本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ）に対するバーコード配列のライゲーションを含む方法（Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９（１９）：５２２７−３２（１９９１））またはｍｉｃｒｏＲＮＡクローニング（Ａｒａｖｉｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５７９（２６）：５８３０−４０（２００５）Ｅｐｕｂ  ２００５））またはシークエンシングまたはマルチアレイ技術によって行われる。下流の反応を妨害せずに、一本鎖ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドの分子間ライゲーションおよび分子内ライゲーションの効率を高めることが望ましいであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｈａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４（１９）：７６１７−７６３０（１９８６）
【非特許文献２】Ｐｈｅｉｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１（２２）：７８５３−７１（１９８３）
【非特許文献３】Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）３５：１２９−１３３（２００７）
【非特許文献４】Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９（１９）：５２２７−３２（１９９１）
【非特許文献５】Ａｒａｖｉｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５７９（２６）：５８３０−４０（２００５）Ｅｐｕｂ  ２００５）
【発明の概要】
【０００６】
一般的に、第１の態様では、組成物は、リガーゼおよび分子量が１０００ダルトン未満の１つ以上の低分子ライゲーションエンハンサーを含む。
【０００７】
種々の実施形態は、以下の１つ以上の特徴を含む：
・あるリガーゼ反応バッファーは１％（ｖ／ｖ）から５０％（ｖ／ｖ）の濃度の低分子エンハンサーを含み、１つもしくは複数のポリヌクレオチドフラグメントの分子内ライゲーションまたは分子間ライゲーションを、エンハンサー非存在下で得られるものよりも少なくとも２５％高めることが可能である；
・１つ以上の低分子ライゲーションエンハンサーは、２から２０個の炭素を含む場合により置換された直鎖または分枝鎖のジオールまたはポリオール、アルコール、双性イオン性化合物、極性非プロトン性分子から選択される；
・場合により置換された直鎖または分枝鎖のジオールまたはポリオールは、１，２−エチレングリコール、１，２−ＰｒＤ、１，３−ＰｒＤ、グリセロール、ペンタエリスリトール、ソルビトール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、ネオペンチルグリコール、２−メチル−１，３−プロパンジオール、２，２−ジメチル−１，３−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール  １，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，９−ノナンジオール、１，１２−ドデカンジオール、２，２’−ジメチルプロピレングリコール、１，３−ブチルエチルプロパンジオール、メチルプロパンジオール、メチルペンタンジオール、プロピレングリコールメチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、トリプロピレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールイソブチルエーテル、エチレングリコールメチルエーテル、エチレングリコールエチルエーテル、エチレングリコールブチルエーテル、ジエチレングリコールフェニルエーテル、プロピレングリコールフェノールエーテルからなる群から選択される；
・アルコールは、２から２０個の炭素を含む場合により置換された直鎖または分枝鎖の脂肪族の一級、二級または三級のアルコール鎖アルキレン基または多価分枝鎖アルキル基である；
・双性イオン性化合物は、２から５０個の炭素を含み、場合により置換された直鎖または分枝鎖であり、アンモニウム、ホスホニウム、スルホニウムのカチオン性基、カルボキシレート、ホスフェートまたはサルフェートのアニオン性基をさらに含む；
・極性非プロトン性分子は、Ｎ−アルキルカプロラクタム、ジメチルカプル／カプリンアミド、Ｎ−アルキルピロリドン、ジフェニルスルホン、ＤＭＳＯ、Ｎ，Ｎ’−ジメチルイミダゾリジン−２−オン（ＤＭＩ）、アセトニトリル、アセトン、ジグリム、テトラグリム、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアルデヒド（ＤＭＦ）からなる群から選択される；
・１つ以上の低分子エンハンサーは、プロピレングリコールとエチレングリコールエーテルとを含む；
・１つ以上の低分子エンハンサーは、１，２−エチレングリコール、１，２−ＰｒＤ、１，３−プロパンジオール、イソプロピルアルコール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオールからなる群から選択される；
・低分子エンハンサーは、四級アンモニウムまたはホスホニウムカチオンおよびカルボキシレートアニオンからなる群から選択される；
・低分子エンハンサーは、１，２−ＰｒＤ、１，３−プロパンジオール、エチレングリコール、エタノール、イソプロパノール、ベタインからなる群から選択される；
・低分子エンハンサーはＤＭＳＯである；
・低分子エンハンサーは、１，２−ＰｒＤである；
・組成物は、さらにＰＥＧを含む；
・低分子エンハンサーの量は、２％（ｖ／ｖ）から２０％（ｖ／ｖ）の範囲にある；
・少なくとも２個の核酸フラグメント、ここで、核酸フラグメントは、互いにライゲーションのための平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡであり、ならびにリガーゼがＤＮＡリガーゼである；
・少なくとも２個の核酸フラグメント、ここで、核酸フラグメントは、互いにライゲーションのための１塩基オーバーハングを有する二本鎖ＤＮＡであり、ならびにリガーゼがＤＮＡリガーゼである；および／または
・ＤＮＡリガーゼが、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  Ｌｉｇａｓｅ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リガーゼ、Ｓｓｏ７−リガーゼ融合物からなる群から選択される。
【０００８】
一般的に、第２の態様では、リガーゼ、１つ以上の低分子ライゲーションエンハンサー、およびＰＥＧ非存在のライゲーションバッファーを含む反応混合物が提供される。
【０００９】
一般的に、第３の態様では、核酸フラグメント間のライゲーションを促進する方法が提供され、この方法は、分子量が１０００ダルトン未満の低分子ライゲーションエンハンサーを、複数の核酸フラグメントおよびリガーゼと、ライゲーションバッファー中で混合すること；およびライゲーションさせることを含み、ここで、ライゲーション効率は、低分子エンハンサー非存在下でのライゲーション効率と比較して少なくとも２５％高まる。
【００１０】
種々の実施形態は、以下の１つ以上の特徴を含む。
・ライゲーションは分子内である。
・ライゲーションは分子間である。
・複数の核酸フラグメントは、平滑末端、１塩基オーバーハングまたは付着端を有する二本鎖ＤＮＡである、および／または
・ライゲーション効率は、宿主細胞のエレクトロポレーションによって決定される場合、少なくとも４倍に高まっている。
【００１１】
一般的に、第４の態様では、分子量が１０００ダルトン未満の１つ以上の低分子ライゲーションエンハンサーおよび、場合により、ＰＥＧ  ５０００−１０，０００を含むバッファー中、０．０１から２００単位／μｌの制限エンドヌクレアーゼ、０．０１から２０００単位／μｌのリガーゼ、０．０１から２００単位／μｌのポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を含む組成物が提供される。
【００１２】
種々の実施形態は、以下の１つ以上の特徴を含む：
・リガーゼはＴ４リガーゼである；
・１つ以上の低分子ライゲーションエンハンサーは、１，２−ＰｒＤを含む；および／または
・１つ以上の低分子ライゲーションエンハンサーは、１，２−ＰｒＤおよびグリセロールである。
【００１３】
一般的に、第５の態様では、ポリヌクレオチドライブラリを作製するための方法が提供され、この方法は、１つ以上の低分子ライゲーションエンハンサーおよび、場合によりＰＥＧ５０００−１０，０００を含むバッファー中の０．０１から２００単位／μｌの制限エンドヌクレアーゼ、０．０１から２０００単位／μｌのリガーゼ、０．０１から２００単位／μｌのＰＮＫを、ポリヌクレオチド増幅産物に加えることと、およびコンピテント宿主細胞を形質転換させるために分子内ライゲーションを起こさせることとを含む。
【００１４】
ある実施形態は、エレクトロポレーションを用いてコンピテント細胞を形質転換することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１のＡからＣは、１，２−Ｐｒｄの量を増やしつつ、二本鎖線状プラスミドＤＮＡのライゲーションによる再環状化の結果を示す。ライゲーションしたＤＮＡを、その後、コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内で形質転換し、その後、寒天アンピシリン選択プレートに接種する。成功した形質転換の程度は、プレート上のコロニーの数によって示される。１，２−ＰｒＤ濃度が高いほど、形質転換体の数が多い。Ａは、１，２−ＰｒＤ非存在下でのライゲーション産物を示す。Ｂは、４％の１，２−ＰｒＤ存在下でのライゲーション産物を示す。Ｃは、６％の１，２−ＰｒＤ存在下でのライゲーション産物を示す。
【図２】図２は、ＰｈｉＸ−１７４ゲノムＤＮＡのＨａｅｌｌｌ制限エンドヌクレアーゼ開裂産物であった平滑末端のＤＮＡフラグメントを用いたリガーゼ活性タイターアッセイの結果を示す。１，２−ＰｒＤ非存在下で、および６％  １，２−ＰｒＤ存在下でのリガーゼ活性を２倍リガーゼ希釈系列で決定した。記号「＊」は、等価なレベルのライゲーションを示し、ライゲーション効率が４倍高まっていることを示す。最初のレーンと最後のレーンは、ＤＮＡマーカーを含んでいる。
【図３】図３のＡからＣは、ライゲーションして環状化したプラスミドを適切に生成するとき、特定の制限酵素（Ａｈｄｌ、ＢｃｉＶＩおよびＢｅｄ）を用いてｐＵＣ１９プラスミドがどのように開裂して１個、２個、３個のフラグメントを生成するかを示す。Ａｈｄｌの認識配列（配列番号１−上部および底部のストランド）、ＢｃｉＶＩの認識配列（配列番号２および３−上部および底部のストランド）およびＢｅｄ（配列番号４−底部のストランド）を示す。Ａは、１塩基３’オーバーハングを含む線状プラスミドの、環状化したベクターへのライゲーションの予想産物を示す。Ｂは、ベクターを開裂させることによって得られる１塩基オーバーハングを含む２個のフラグメントの環状化したライゲーション産物を示す。これは、それぞれ１塩基３’オーバーハングを含む２個のフラグメントをライゲーションして環状にする「挿入ベクター」クローニングのためのモデルシステムである。Ｃは、１塩基５’オーバーハングを含む３個のフラグメントの環状化したライゲーション産物を示す。３個すべてのフラグメント片が存在し、正しい配置にあるライゲーションした構築物のみから、生存可能な形質転換体が生じ、その後、寒天アンピシリン選択プレートの上にコロニーが生じる。２個のフラグメントが整列するだけでは、βラクタマーゼアンピシリン耐性遺伝子を構築せず、従って、アンピシリン耐性コロニーを生成しない。
【図４】図４のＡからＣは、図３のＡからＣに記載したような１個、２個、３個のｐＵＣ１９フラグメントのセットについて、＋／−１２％の１，２−Ｐｒを用いて達成されたライゲーション産物のアガロースゲル電気泳動分析を示す。Ｍで示されるマーカーのレーンは、１μｇの２−ｌｏｇ  ＤＮＡラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．（ＮＥＢ）、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、＃３２００）に対応する。（１）は、２６８６−ｂｐ直鎖ＡｈｄＩ−ｐＵＣ１９フラグメントであり；（２）は、１５２７−ｂｐおよび１１５９−ｂｐのＢｃｉＶＩフラグメントであり；（３）は、２つの長さ（２２７５−ｂｐおよび２８７−ｂｐ）の３Ｂｅｄフラグメントであり、第３の１２４−ｂｐフラグメントはこのゲルでは見えない；（４）は、２２７５−ｂｐおよび２８７−ｂｐＢｅｄフラグメントから作られる直線化した中間体ライゲーション産物であり；（５）は、きわめて形質転換可能な望ましい産物である望ましいライゲーションした／環状化したプラスミドであり、（６）は、きわめて形質転換可能ではない、異なる種類の線状および環状の望ましくないコンカテマーライゲーション産物である。Ａは、Ａｈｄｌ−ｐＵＣ１９を指す（図３のＡを参照）。Ｂは、ＢｃｉＶＩ−ｐＵＣ１９を指す（図３のＢを参照）。Ｃは、ＢｃｃＩ−ｐＵＣ１９を指す（図３のＣを参照）。
【図５】図５は、１，２−ＰｒＤの量を変えたもの、１，２−ＰｒＤを含まないもの、ＰＥＧを含有するＱｕｉｃｋリガーゼ（商標）バッファー（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いた一般的なライゲーションバッファーを用い、ＤＮＡライゲーション（およびその後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換）を比較したヒストグラムを示す。ライゲーションバッファーに１，２−ＰｒＤを加えると、ＤＮＡライゲーションが、ＰＥＧを含有するＱｕｉｃｋリガーゼと少なくとも同程度まで高まった。Ｙ軸は、１０ｐｇ  ＤＮＡあたりの形質転換体である（形質転換（ｗ）／化学的なコンピテント細胞）。Ｘ軸は、一般的なリガーゼバッファー（ＲＬＢ）であり、括弧内には、添加した１，２−ＰｒＤの割合を与えている。クイックリガーゼバッファー（ＱＬＢ）は、ライゲーションを促進させるためにＰＥＧを含む。
【図６】図６は、Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＮＧＳ）ライブラリ調製によって、低分子エンハンサーによるＴ４  ＤＮＡリガーゼのライゲーション効率が高まることを示す。ＰＥＧを含むリガーゼバッファー（Ｑｕｉｃｋリガーゼバッファー、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）中のＴ４  ＤＮＡリガーゼ、または低分子エンハンサーを含むリガーゼバッファー（ライゲーションバッファー、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）中のＴ４  ＤＮＡリガーゼのいずれかを用い、２００ｂｐにフラグメント化した５ｎｇの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡを用いてライブラリを調製した。「テンプレートなし」のコントロールは、ＤＮＡ以外のすべての試薬を含んでおり、全体的なワークフローを流した。ライブラリの収率は、小さなリガーゼエンハンサー存在下では、少なくとも約５倍増加した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施形態では、分子量が１０００ダルトン未満、９００ダルトン未満、８００ダルトン未満、７００ダルトン未満、６００ダルトン未満、５００ダルトン未満または４００ダルトン未満の低分子は、ライゲーションエンハンサーとして役立つことが特定されている。低分子エンハンサーの例としては、２から２０個の炭素を含む直鎖または分枝鎖のジオールまたはポリオールが挙げられる。例としては、場合により置換された直鎖または分枝鎖のアルキレングリコール、ペンタエリスリトール、ソルビトール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、ネオペンチルグリコール、例えば、プロピレングリコールおよびエチレングリコールエーテル、例えば、１，２−エチレングリコール、１，２−ＰｒＤ、１，３−ＰｒＤ、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、２−メチル−１，３−プロパンジオール、２，２’−ジメチルプロピレングリコール、１，３−ブチルエチルプロパンジオール、メチルプロパンジオール、メチルペンタンジオール、プロピレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールエチルエーテル、プロピレングリコール  ブチルエーテル、ジエチレングリコールフェニルエーテル、プロピレングリコールフェノールエーテル、プロピレングリコールメチルエーテル、トリプロピレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールイソブチルエーテル、エチレングリコールメチルエーテル、またはこれらの混合物が挙げられる。
【００１７】
低分子ライゲーションエンハンサーのさらなる例としては、置換された直鎖または分枝鎖であってもよいアルコールが挙げられ、２から２０個の炭素を含む一級、二級、三級のアルコール鎖アルキレン基または多価分枝鎖アルキル基、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、ｉ−またはｎｅｏ−ペンタノール、ｎ−ヘキサノール、ｎ−ヘプタノール、ｎ−オクタノール、２−エチルヘキサノール、ｎ−ノナノールおよびこれらの混合物が挙げられる。
【００１８】
低分子エンハンサーのさらなる例としては、場合により置換された直鎖または分枝鎖であり、２から５０個の炭素を含み、アンモニウム、ホスホニウムまたはスルホニウムのカチオン性基、カルボキシレート、ホスフェートまたはサルフェートアニオン性基を含む双性イオン性化合物が挙げられ、例えば、スルホベタインまたはカルボキシベタイン、アミノ酸、アミノスルホン酸、アルカロイドが挙げられる。
【００１９】
さらなる例としては、Ｎ−アルキルカプロラクタム、ジメチルカプリル／カプリンアミド、Ｎ−アルキルピロリドン、ジフェニルスルホン、ＤＭＳＯ、ＤＭＩ、アセトニトリル、アセトン、ジグリム、テトラグリム、ＴＨＦ、ジメチルアセトアミド、ＤＭＦからなる群から選択される極性非プロトン性分子が挙げられる。
【００２０】
１つ以上の上述の低分子エンハンサーを、ポリヌクレオチドと１つまたは複数のリガーゼの調製物に加え、ライゲーションを促進させることができる。
【００２１】
低分子エンハンサーは、１個のヌクレオチド伸長部を有するか、または平滑末端を有する二本鎖核酸のライゲーションを容易にするのに有用である。また、２から６塩基、またはもっと長い伸長部を含む二本鎖核酸のライゲーションまたは一本鎖核酸ライゲーションを含む、任意の種類のライゲーションを促進させるために、エンハンサーを使用してもよい。「核酸」との用語は、本明細書で使用する場合、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、および片方のストランドがＤＮＡであり、他方がＲＮＡであるか、または分子の一部が二本鎖ＤＮＡであり、一部が二本鎖ＲＮＡ、または一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡである二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ分子を指す。
【００２２】
「リガーゼ」との用語は、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドを結合するため、または１個のポリヌクレオチドの両末端を接続するために一般的に用いられる酵素を指す。リガーゼとしては、ＡＴＰ依存性二本鎖ポリヌクレオチドリガーゼ、ＮＡＤ＋”依存性二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼおよび一本鎖ポリヌクレオチドリガーゼが挙げられる。本発明の実施形態は、リガーゼが、ＥＣ  ６．５．１．１（ＡＴＰ依存性リガーゼ）、ＥＣ  ６．５．１．２（ＮＡＤ＋−依存性リガーゼ）、ＥＣ  ６．５．１．３（ＲＮＡリガーゼ）に記載されている任意のリガーゼから選択される、ライゲーションの促進を記述する（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＵＢＭＢ）の推奨に基づく酵素の命名体系に関する情報を集めたものであり、ＥＣ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）数が与えられているそれぞれの種類の特性決定された酵素を記載するＥｘＰＡＳｙ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｐｏｒｔａｌ  ｈａｖｉｎｇ  ａ  ＵＲＬ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇを参照）。リガーゼの具体例としては、微生物リガーゼ、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼおよびＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）という熱に安定なＤＮＡリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）の一部、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ファージリガーゼ、例えば、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、およびこれらの突然変異体が挙げられる。突然変異体の例としては、ＤＮＡ結合ドメインとリガーゼとを含む融合リガーゼが挙げられる。融合リガーゼの例としては、Ｓｓｏ７−Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｓｓｏ７−Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｓｓｏ７−Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｓｓｏ７−Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｓｓｏ７−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ、Ｓｓｏ７−ＡｍｐリガーゼＤＮＡリガーゼ  Ｓｓｏ７が挙げられる。他の突然変異体は、アデニル化ＤＮＡのライゲーションのみを可能にするような、リガーゼの触媒ドメイン中に突然変異を含んでいてもよい（例えば、リジンの突然変異）。一例は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼにおいて、１５９位でのリジンが任意の他のアミノ酸に変わった突然変異である（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ＮＰ＿０４９８１３  ａｔ  ＮＣＢＩ）。他の例としては、Ｔ４  ＲＮＡ  リガーゼ１およびＴ４  ＲＮＡ  リガーゼ２およびこれらの突然変異体、例えば、Ｓｓｏ７融合タンパク質、Ｔ４の先端を切断し、変異した（Ｋ２２７Ｑ）ＲＮＡリガーゼが挙げられる。
【００２３】
２個以上の核酸を接続するために本明細書に記載する１つ以上のリガーゼに加えられる任意の低分子エンハンサーの利点は、実施例に記載したアッセイまたは当該技術分野で既知の任意のリガーゼアッセイ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ２０１１／１２のページ１７２−１７３および１０８−１１０に記載されているリガーゼアッセイを用いて確認することができる。このようなアッセイは、マーカー（例えば、抗生物質耐性）を含むＤＮＡをベクターに挿入することと、この産物を、マーカーの存在を検出するようにクローニングすることと、２個または３個またはこれより多い核酸フラグメントを整列させることと、形質転換によって宿主細胞にライゲーション産物を導入し、ライゲーションされたポリヌクレオチドによってコードされる表現型の発言を決定することとを含む。
【００２４】
ある状況では、当業者は、困難なライゲーションを容易にするために、ＰＥＧをさらに含有するライゲーションバッファーを使用するかもしれない。残念なことに、ＰＥＧは、エレクトロポレーションを妨害するので、この工程の前に除去しなければならない。図５は、低分子エンハンサーが存在し、ＰＥＧが存在しない状態で、どのようにして困難なライゲーションが達成され得るのかを示す。このことは、ライゲーション効率が増大するだけではなく、エレクトロポレーションの前にＰＥＧからＤＮＡを生成する必要もなくなるため有益である。
【００２５】
本発明の実施形態では、任意のライゲーション反応について、０．０１−２０００単位／μｌのリガーゼ、例えば、１−１０００単位／μｌのリガーゼまたは４−２００単位／μｌのリガーゼと共に、エンハンサーをライゲーションバッファーに、１％−５０％（ｖ／ｖ）、２％−５０％（ｖ／ｖ）、３％−５０％（ｖ／ｖ）、４％−５０％（ｖ／ｖ）、５％−５０％（ｖ／ｖ）、１％−４５％（ｖ／ｖ）、１％−４０％（ｖ／ｖ）、１％−３５％（ｖ／ｖ）、１％−３０％（ｖ／ｖ）、１％−２５％（ｖ／ｖ）、１％−２５％（ｖ／ｖ）、１％−１５％（ｖ／ｖ）の濃度で加えられる。リガーゼバッファー中にＰＥＧが存在するとき、ＰＥＧ非存在下で使用する場合よりも低分子エンハンサー濃度を２分の１に減らして使用し、ＰＥＧ単独でみられるよりもライゲーションをさらに促進させることができる。例えば、低分子エンハンサーは、ＰＥＧ非存在下で１０％−１８％（ｖ／ｖ）の範囲で使用され、ＰＥＧと一緒では、５％−９％（ｖ／ｖ）の低分子エンハンサーを使用することができる。一実施形態では、末端が平滑化した二本鎖核酸ライゲーションは、ＰＥＧ非存在下で低分子エンハンサーを約４％（ｖ／ｖ）で使用する。他の酵素、例えば、制限エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｄｐｎｌ、またはＰＮＫ、例えば、Ｔ４  ＰＮＫがリガーゼ反応混合物に含まれてもよく、いずれの酵素も０．０１−２００単位／μｌ、例えば、０．０５−５０単位／μｌの範囲の濃度で加えることができる。ライゲーション反応の一例では、ベクターを含み、別個の核酸の形態で挿入する核酸フラグメントの混合物は、低分子エンハンサー存在下で望ましいライゲーション産物を与えることができる。特に、エンハンサーの濃度は、単一種の分子や、ベクターと挿入物の組み合わせのような核酸混合物のコンカテマー化よりも環状化が好ましくなるように選択される。１塩基オーバーハングを含む分子について、望ましいライゲーション反応を少なくとも２５％促進することが可能であり、例えば、促進の全体的な範囲は、少なくとも１．２５倍から７５倍、例えば、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍またはこれ以上であり、ＰＥＧを含むか、または含まない状態で、平滑末端の分子について、少なくとも２５％促進することが可能であり、促進の全体的な範囲は、例えば、少なくとも１．２５倍、２倍、３倍、４倍である。
【００２６】
表１は、ライゲーションの低分子エンハンサーを列挙している。以下の２つのライゲーション試験系を用い、並列してすべてを試験した。（ａ）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによって作られる５００ｂｐアンプリコンをＴ突出ベクター内でクローニング；（ｂ）Ａｈｄｌ−線状プラスミドの再環状化。両方のライゲーション試験系は、１塩基オーバーハングを含むＤＮＡを使用した。
【００２７】
【表１】
2020062021.tif 000003
【００２８】
表２は、６％  １，２−ＰｒＤによるライゲーションの促進、その後の形質転換を示し、ここで、クローニングされる挿入物は、オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって作られる合成カセットであるか、またはＰＣＲアンプリコンである。この試験は、１塩基３’Ａオーバーハングを含むＤＮＡフラグメントをクローニングするように特異的に設計されたＱｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ（＃２３１１２４）からの市販のクローニングベクターを使用した。
【００２９】
【表２】
2020062021.tif 000004
【００３０】
二本鎖または一本鎖のポリヌクレオチドのライゲーションの促進が、１個の反応管で行われることが望ましい他の反応と適合性であることがここに示されている。例えば、以下の実施例７に記載するような部位特異的突然変異誘発は、１個の反応管で少なくとも３つの異なる酵素反応（制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ）を行うことを可能にしている。
【００３１】
低分子リガーゼエンハンサーは、複数のＮｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＮＧＳ）プラットフォームのための低ナノグラムのポリヌクレオチドの入力を伴う迅速なライブラリ調製プロトコルの開発を可能にする。主な改良点は、以下である。１つ以上の低分子エンハンサーによるリガーゼのライゲーション効率の上昇、これらの低分子存在下でのｄＡＴＰ阻害に対するリガーゼの許容性。図６は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼに対する低分子ライゲーションエンハンサーの有益な効果を示す。別の用途は、リガーゼを用いてポリヌクレオチドフラグメントをライゲーションするときに通常は課題となる長いヘアピンアダプターの使用である。これらは、低分子エンハンサー存在下、ライゲーション効率が高い状態でポリヌクレオチドフラグメントに簡単にライゲーションされる。
【００３２】
本明細書に引用するあらゆる参考文献、および２０１１年５月６日出願の米国仮出願第６１／４８３，３４８号は、本発明に組み込まれる。
【実施例】
【００３３】
［実施例１］
ライゲーション効率アッセイ
Ａ．ライゲーション反応
反応混合物は、ＤＮＡを５０から１００ｎｇで含み、１，２−ＰｒＤを異なる濃度で含んでいた。次いで、１μｌの一般的な濃度（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、＃Ｍ０２０２；４００単位）または１μｌの高濃度のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、＃Ｍ０２０２；２０００単位）を、ｌｘＴ４  ＤＮＡリガーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｉｐｗｉｃｈ、ＭＡ、＃Ｂ０２０２）またはｌｘ  Ｑｕｉｃｋリガーゼ（商標）バッファー（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、＃Ｂ２２００）中、最終容積２１μｌに加えた。
【００３４】
標準的なアッセイは、１００ｎｇのＤＮＡ、１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、２１μｌの×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼバッファー、さまざまな量のエンハンサーを使用する。しかし、本願発明者らは、（ａ）種々の濃度および種類のＤＮＡリガーゼ、（ｂ）種々のライゲーションバッファー（特に、一般的なものおよびＱｕｉｃｋリガーゼ）についても試験し、比較し、１％−１２％の１，２−ＰｒＤで一定のライゲーション促進がみられた。
【００３５】
特段別の記載がない限り、ライゲーション反応物を室温（２５℃）で１０分間インキュベーションし、次いで、氷の上に２分間置いた。ある実験では、６５℃で２０分間インキュベーションすることによって、リガーゼを熱によって殺した。ライゲーション反応を１％アガロースゲル電気泳動によって分析し、ＤＮＡ種を同定し、形質転換の効率を決定した。
【００３６】
Ｂ．形質転換効率の決定
それぞれのライゲーション反応から容積２μｌを５０μｌの化学的なコンピテント（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、＃Ｃ２９８７Ｉ）またはエレクトロコンピテント（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、＃Ｃ２９８９Ｋ）ＤＨ５アルファ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞とともにインキュベーションした。
【００３７】
化学的なコンピテント細胞形質転換について、細胞−ＤＮＡ混合物を氷上で３０分間インキュベーションし、４２℃で３０秒間熱ショックを与え、次いで、氷に５分間戻した。容積が９５０μｌのＳＯＣ培地（２％植物ペプトンまたはＴｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％酵母抽出物、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、２０ｍＭのグルコース）を細胞−ＤＮＡ混合物に加え、その後、攪拌しつつ、３７℃で１時間の増殖期間に進んだ。容積が２５−５０μｌのＳＯＣ中に適切に希釈した細胞を、１００Ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＲｉｃｈ  Ａｇａｒプレート（リットルあたりの組成：１０ｇ大豆ペプトン、５ｇ酵母抽出物、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＭｇＣｌ２−６Ｈ２Ｏ、１ｇのデキストロース、１５グラムの寒天）の上に広げた。プレートを反転させ、３７℃で１６時間インキュベーションし、その後、総コロニー数を定量した。
【００３８】
エレクトロコンピテント細胞形質転換プロトコルの場合、細胞−ＤＮＡ混合物に対してエレクトロポレーションを行い、直後に、９５０μｌのあらかじめ３７℃に暖めておいたＳＯＣ培地を加え、その後、攪拌しながら、３７℃で１時間の成長期間へと進んだ。希釈、プレートへの接種、インキュベーション、コロニーの定量を上の実施例１Ａに記載したように行った。
【００３９】
ライゲーション条件あたりのコロニー数は、ライゲーション反応中に環状化したＤＮＡの生成と相関関係にあった。
【００４０】
［実施例２］
１塩基オーバーハングを含むＤＮＡのライゲーションの促進
図３のＡに記載されるように、Ａｈｄｌを用い、ｐＵＣ１９プラスミドの直線化が達成され、１塩基オーバーハングが生成した。開裂したＤＮＡのライゲーションは、１，２−ＰｒＤ存在下および非存在下、１００ｎｇのＤＮＡと４００  ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼを含む２０μｌのライゲーション反応物中、１６℃で２０分間行い、次いで、６５℃で４５分間加熱し、リガーゼを不活化した。ライゲーションしたＤＮＡを用いた細胞の形質転換は、実施例１に記載するように化学的なコンピテントＮＥＢ  Ｔｕｒｂｏ（商標）細胞（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、＃Ｃ２９８４Ｈ）を用い、２μｌのライゲーション混合物（１０ｎｇのＤＮＡを含む。）を用い、成長期間２０分で行った。結果は、１，２−ＰｒＤが形質転換の量を高めるということであった（図１のＡ−Ｃを参照）。
【００４１】
［実施例３］
平滑末端を含むＤＮＡのライゲーションの促進
ライゲーションエンハンサーの有効性は、以下のような平滑末端のＤＮＡについても確立された。６％  １，２−ＰｒＤ存在下および非存在下で、２０００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを２倍段階希釈したもの、２００ｎｇのＰｈｉＸ１７４−ＨａｅＩＩＩ消化物（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、＃Ｎ３０２６）、２０μｌあたり２００ｎｇのｐｈｉＸ１７４−ＨａｅＩＩＩ平滑末端のフラグメントを含む一般的なリガーゼバッファーを含む２０μｌの反応物を設定した。反応物を室温（２５℃）で３０分間インキュベートし、その後、１％アガロースゲルで電気泳動した。１，２−ＰｒＤは、このタイター反応において、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ活性を４倍に高めた。
【００４２】
［実施例４］
スーパーコイル化ＤＮＡを用いたモックライゲーション反応によって決定される場合、１，２−ＰｒＤのみを用いても促進なし
２０００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ存在下および非存在下、１２％  １，２−ＰｒＤ存在下または非存在下で、ＩＸの一般的なＤＮＡリガーゼバッファー中、１ｎｇのスーパーコイル化ｐＵＣ１９  ＤＮＡを含むモックＤＮＡライゲーションを設定した。実施例１の標準的なプロトコルを用いてライゲーション反応を行い、化学的なコンピテントＤＨ５アルファ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を用いて形質転換を行った。２ｐｇのスーパーコイル化ＤＮＡを含む１ｍｌのＳＯＣ成長培地をの１：２０希釈物４０μｌをアガロース寒天に接種し、一晩インキュベーションした。形質転換体の数は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼが存在するかしないかに関わらず、１，２−ＰｒＤの存在によって統計的に変化しなかった。
【００４３】
表３は、プラスミドｐＵＣ１９のスーパーコイル化ＤＮＡ形態を用い、１，２−ＰｒＤが、形質転換に影響を及ぼさず、妨害もしないというコントロール実験の結果を示す。これは、促進は、ライゲーション工程で起こり、形質転換工程では起こらないことを示す。
【００４４】
【表３】
2020062021.tif 000005
【００４５】
［実施例５］
１個、２個または３個のＤＮＡフラグメントを線形ベクターへライゲーションする効率の増大と再環状化
１個のフラグメントライゲーション（再環状化）、２個のフラグメントライゲーション（クローニング）、３個のフラグメントライゲーション（整列）反応を１，２−ＰｒＤ存在下で行った（図３のＡ−Ｃを参照）。ｐＵＣ１９プラスミド構築物の制限消化は、１％アガロースゲル電気泳動を用いて反応を監視することによって、完結させた。終了したら、反応物を６５℃で２０分間インキュベーションすることによって、すべての制限酵素を熱によって不活化した。ＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）スピンカラムを用いることによってＤＮＡを精製し、１％アガロースゲル電気泳動によって既知のＤＮＡ標準と比較して定量した。図４のＡ−Ｃに示すゲル電気泳動分析は、制限されたｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡを用いた１個（線形化）、２個、３個のフラグメントライゲーション反応を用いて作られた生成物を示した。Ａｈｄｌ、ＢｃｉＶＩまたはＢｅｄですでに制限され、種々の１塩基オーバーハングが残った１００ｎｇのＤＮＡを用い、図３のＡ−Ｃに記載されるようにライゲーション反応を行った。それぞれの２１μｌのライゲーション反応から、表４で分析するように２μｌを形質転換のために使用し、図４のＡ−Ｃに記載するように、ｔｒｉｓ−ホウ酸塩を用いて調製した１％アガロースゲルに１９μｌを流した。これらの図は、それぞれのプラスミド試験系について、矢印５で示されるように、ライゲーションした環状化プラスミドの量に対し、１，２−ＰｒＤが顕著に有益な効果をもつことを示す。これは、非常に形質転換可能なＤＮＡの環状化した形態である。
【００４６】
以下の表４は、ＩＸ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼバッファーと、第１欄に列挙したように（また、図３のＡ−Ｃで図示したように）制限した１００ｎｇのｐＵＣ１９  ＤＮＡを用い、ＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）スピンカラムを用いて精製し、既知のＤＮＡ標準（ラムダ−Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメント）に対して定量した基本的なプロトコルで記載するような、図３のＡ−Ｃで記載される構築物に対して行ったライゲーションの結果を示す。ライゲーションは、２０００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを用い、１２％  １，２−ＰｒＤが存在する状態および存在しない状態で、室温（２５℃）で１０分間行った。それぞれのライゲーション反応から容積２μｌを、実施例１に記載したような化学的なコンピテントＤＨ５アルファ細胞へと形質転換した。ＳＯＣ培地中ｎ成長の１：２０希釈物のうち、容積４０μｌを、アンピシリンを追加したＲｉｃｈ  Ａｇａｒ培地プレートに接種した。この容積は、元々のライゲーション反応からの２０ｐｇのＤＮＡに対応していた。
【００４７】
【表４】
2020062021.tif 000006
【００４８】
［実施例６］
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼバッファーおよびＰＥＧ６０００を含有するＱｕｉｃｋリガーゼ（商標）バッファー中、１，２−ＰｒＤ存在下および非存在下で達成された形質転換体の数の比較
実施例１に記載した条件に従って、５０ｎｇのＡｈｄｌ−線形ｐＵＣ１９二本鎖ＤＮＡ（１塩基オーバーハングを含む。）を用い、両バッファー中でライゲーションを行った。合計で１０ｐｇのＤＮＡ（ＳＯＣ成長の１：２０希釈物４０μｌ）をプレートごとに使用し、３７℃で１６時間後に形質転換体の数を計測した。図５は、二本鎖ＤＮＡ末端をライゲーションするのが最も困難な場合でさえ、一般的なリガーゼバッファー中の１，２−ＰｒＤが、ＰＥＧを含有する（クイックリガーゼ）バッファーよりも大きい形質転換度を達成したことを示す。
【００４９】
［実施例７］
複数の低分子エンハンサーを用いた、平滑末端のＤＮＡ、およびＴ／Ａオーバーハングを含むＤＮＡのライゲーション
Ｑｕｉｃｋリガーゼバッファー中のＴ４リガーゼについて、また、Ｔａｑリガーゼ反応バッファー（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）について、実施例１に従って反応条件を利用した。５−１０％のＰＥＧ６０００に加え、５％−１５％のグリセロール、１−８％の１，２−ＰｒＤが、末端が平滑化した二本鎖ＤＮＡまたはＴ／Ａオーバーハンを含むＤＮＡとともに、反応混合物に一緒に含まれていた。実施例１に記載したような化学的なコンピテント細胞を用い、ライゲーションしたＤＮＡを宿主細胞へと形質転換した。ＰＥＧ６０００のみがコントロールとして存在する場合のライゲーション効率と比較して、ＰＥＧ６０００に加え、グリセロールおよび１，２−ＰｒＤが含まれる場合、ライゲーション効率の少なくとも２５％の増大が、複数のサンプルで観察された。エレクトロポレーションを用い、ライゲーションされたＤＮＡが宿主細胞に導入される場合（実施例１を参照）、コントロールと比べて少なくとも５０倍の増大が観察された。
【００５０】
［実施例８］
複数酵素混合物を用いて、高忠実度増幅反応からの、平滑末端産物をリン酸化し、ライゲーションする方法
０．０１−２００単位／μｌのＤｐｎｌ、４−２００単位／μｌのＴ４  リガーゼ、０．０１−２０単位／μｌのＴ４  ＰＮＫ、バッファー、３−１０％の１，２−ＰｒＤ、３−１０％のＰＥＧ６０００、２−２０％のグリセロールを上述のリガーゼバッファー中に含む酵素混合物を、リン酸化していないプロモーターを用いて得られ、目的のＤＮＡを含む末端プライマーおよびプラスミドに対して末端を修飾していないＰＣＲ増幅産物に加えた。
【００５１】
１個の反応管の中で、Ｔ４  ＰＮＫを用いてＰＣＲ産物をリン酸化し、末端をライゲーションして、Ｔ４  ＰＮＫまたはＴａｑリガーゼを用いて閉環を形成した。元々のテンプレートをＤｐｎｌを用いて開裂させ、望ましくないコロニーのバックグラウンドを低下させた。
【００５２】
環状化した産物を使用し、細胞を形質転換した。低分子ライゲーションエンハンサーを含まないコントロールと比較して、形質転換した宿主細胞のコロニーの数の顕著な増加が得られ、１つの工程でテンプレートを除去し、リン酸化し、ライゲーションする能力は、完全に部位特異的な突然変異誘発の効率を顕著に高めた。
【図１】
2020062021.tif 000007
【図２】
2020062021.tif 000008
【図３】
2020062021.tif 000009
【図４】
2020062021.tif 000010
【図５】
2020062021.tif 000011
【図６】
2020062021.tif 000012
【配列表】
2020062021000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月27日(2019.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ；および
（ｉｉ）１，２−エチレングリコール、１，２−プロパンジオール（１，２−ＰｒＤ）、１，３−ＰｒＤ、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、２−メチル−１，３−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，９−ノナンジオール、１，１２−ドデカンジオール、２，２’−ジメチルプロピレングリコール、１，３−ブチルエチルプロパンジオール、メチルプロパンジオールおよびメチルペンタジオールからなる群から選択される１つ以上の低分子ライゲーションエンハンサーを１％（ｖ／ｖ）から２０％（ｖ／ｖ）の濃度で含むリガーゼ反応バッファーであって、当該１つ以上の小分子ライゲーションエンハンサーを含まないリガーゼ反応バッファー中のライゲーション反応における１つまたは複数のＤＮＡフラグメントの分子内ライゲーションまたは分子間ライゲーションと比較して、ライゲーション反応における１つまたは複数のＤＮＡフラグメントの分子内ライゲーションまたは分子間ライゲーションを少なくとも２５％高めることが可能であるリガーゼ反応バッファー；
を含む組成物。
【外国語明細書】
2020062021000001.pdf