(57)【要約】【課題】本発明が解決しようとする課題は、安全性プロファイルを損なうことなく、また好ましくは不便な投与レジメンを必要としない、効力は有意に増加した免疫寛容誘導性DNA免疫療法ワクチンを提供することである。【解決手段】本発明は、細胞に保持された抗原、例えばインスリンと、分泌される免疫改変因子、例えばTGF-β、IL-10及び任意選択でIL-2とを同時発現する/コードするマルチシストロン性ベクター/プラスミドに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
i.インスリン抗原;
ii.TGF-β;及び
iii.IL-10
をコードするプラスミド。
【請求項２】
前記インスリン抗原がプロインスリン、プレプロインスリン、及びそれらの機能性又は免疫優性ペプチド断片からなる群から選択される、請求項1に記載のプラスミド。
【請求項３】
前記インスリン抗原がエンドソーム標的化インスリンである、請求項1又は2に記載のプラスミド。
【請求項４】
前記プラスミドがIL-10よりも少なくとも1/2未満の量でインスリン抗原及びTGF-βを発現する、請求項1から3のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項５】
前記プラスミドがインターロイキン-2(IL-2)を更に同時発現する、請求項1から4のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項６】
前記プラスミドが、(i)インスリン抗原コード配列とTGF-βコード配列を分離するFMDV 2Aエレメント、(ii)TGF-βコード配列とIL-10コード配列を分離するEMCV IRESエレメント、及び(iii)IL-10コード配列とIL-2コード配列を分離する2Aエレメント、を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項７】
TGF-βコード配列が構成的に活性なTGF-βをコードする、請求項1から6のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項８】
前記プラスミドが、(i)エンドソーム標的化プレプロインスリンコード配列、(ii)FMDV 2Aエレメント、(iii)TGF-βコード配列、(iv)EMCV IRESエレメント、(v)IL-10コード配列、(vi)P 2Aエレメント、(vii)IL-2コード配列、(viii)ポリアデニル化/終止エレメント、(ix)セレクション遺伝子、(x)複製起点、(xi)真核生物プロモーターエレメント、(xii)真核生物翻訳開始配列、(xiii)エンドソーム選別配列、及び(xiv)任意選択でイントロン、を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項９】
請求項1から8のいずれか一項に記載のプラスミドを含むDNA免疫療法ワクチン。
【請求項１０】
I型糖尿病の遅延又は予防において使用するための、請求項9に記載のDNA免疫療法ワクチン、又は請求項1から8のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項１１】
皮下投与のための、請求項9に記載のDNA免疫療法ワクチン、又は請求項1から8のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項１２】
筋肉内投与のための、請求項9に記載のDNA免疫療法ワクチン、又は請求項1から8のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項１３】
食塩水及び/又は緩衝液及び/又はキレート剤を含む、請求項9に記載のDNA免疫療法ワクチン、又は請求項1から8のいずれか一項に記載のプラスミドを含む医薬組成物。
【請求項１４】
前記緩衝液がいかなるウイルス、脂質同時パッケージング剤、又は縮合剤も含まない、請求項13に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
GLP-1Rアゴニストを更に含む、請求項13又は14に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原特異的T細胞反応性を低減させるための免疫寛容誘導性(tolerogeneic)DNA免疫療法ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のワクチン手法によれば、精製タンパク質/抗原は、そのタンパク質/抗原に免疫応答を特異的に刺激するためにヒト/患者/動物に注射される。このワクチン手法は、主として抗体産生に影響を及ぼす傾向があるが、T細胞は抗原のT細胞記憶を生成する以外は有意に影響されない傾向がある。したがって、従来のワクチン手法は、T細胞駆動による疾患、例えば1型糖尿病(T1D)の処置及び/又は予防に関して、それがT細胞、特にCD8+ T細胞の活性化がこの疾患の原因因子と考えられることから、適切であると考えられない。免疫寛容誘導性のタンパク質ベースのワクチンを用いる実験的手法は、T細胞関連疾患ではなく、主としてB細胞産生抗体を標的としている。
【０００３】
DNAベースのワクチンは、タンパク質ベースのワクチンとは対照的に、通常、特定の抗原をコードするプラスミドであり、これらのプラスミドは宿主体内で細胞により取り込まれる(「トランスフェクトされる」)。次いで、これらのトランスフェクトされた宿主細胞は抗原を産生し、免疫系、特に循環T細胞に提示するために抗原を小フラグメント(T細胞エピトープ)へとプロセシングする。T細胞は全タンパク質ではなくこれらの小さい抗原フラグメントだけを検出し得るので、この手法は、例えばT1D病理の重要な駆動因子である、特にCD8+ T細胞(又は細胞傷害性T細胞)に対するT細胞応答を優先的に改変させる。したがって、タンパク質ワクチンではないDNAワクチンは、T細胞応答を誘導するのに適している。現在ヒトでの使用において利用可能なDNAワクチンはないが、獣医学的使用に対して許可されたウマ伝染性貧血ウイルス、ウエストナイルウイルス、及びある特定のイヌがんに対する免疫を誘導する3種の刺激性プラスミドDNAワクチンがある。
【０００４】
刺激性DNAワクチンとは対照的に、免疫寛容誘導性DNA免疫療法ワクチンは、抗原への免疫反応を抑制することを意図し、抗原に対する免疫応答を活性化するのではない。これらのワクチンは、コードされた抗原に対する免疫を刺激せず、又は刺激のタイプを変えない(例えばアレルギーに対する抗原減感作ワクチン接種の手法が行うように)が、その代りに自己反応性のT細胞の枯渇、機能の欠如、及び/又は死滅を引き起こす。そうするためには、抗原は、共刺激又は炎症効果なく、免疫系に提示されなければならない、そうでない場合には刺激性免疫応答を活性化する可能性がある。免疫系によって無視されるか又は免疫系に対して寛容化される抗原を提示するこの手法は、自己免疫疾患の処置において価値があり得るが、それは、その疾患の特定の機序が標的化され、その全免疫応答を全身的に抑制するのではないからである。したがって、免疫寛容誘導性DNA免疫療法ワクチンは、望ましくない免疫応答をモジュレートする穏和な方法である。
【０００５】
T1D特異的免疫寛容誘導性DNA免疫療法ワクチンの最終目標は、ベータ細胞機能及び内因性インスリン産生を保存することである。これは、疾患の予防又は遅延を介して(特にモニタリングが困難であり、生活の「正常性」が主に患者の主導である小児コホート及び若年成人層コホートにおいて特に有益である)、又はT1D診断後の最初の6か月の後に起こる場合が多い最小限モニタリング及びインスリン使用の「ハネムーン期」の延長を介して生じ得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第6083919号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Zeller JC, Panoskaltsis-Mortari A, Murphy WJ等, 1999 J Immunol. 163(7):3684〜91
【非特許文献２】Dabo S, Meurs EF. 2012 Viruses 4(11):2598〜635
【非特許文献３】Donnelly ML, Hughes LE, Luke G等, 2001 J Gen Virol. 82(Pt 5):1027〜41
【非特許文献４】J Bacteriol. 1994 Jan;176(1):198〜205
【非特許文献５】J Biotechnol. 2004 Jul 1;111(1):17〜30
【非特許文献６】Cell. 2002 Sep 6;110(5):551〜61
【非特許文献７】2008 J Immunol. 181(12):8298〜307
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
DNAベースのワクチンが安全であることは知られているが、臨床試験で試験された(刺激性又は免疫寛容誘導性)DNAワクチンはいずれも、例えばT1Dの独立した治療法として十分な効力を有していない。当技術分野において周知の免疫寛容誘導性DNAワクチンはほとんど有効性を示さず、典型的には、所望する効果を誘導するために高度な人為的システムが必要であった。したがって、安全性プロファイルを損なうことなく、また好ましくは不便な投与レジメンを必要としない、効力は有意に増加した免疫寛容誘導性DNA免疫療法ワクチンが当技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、細胞に保持された抗原、例えばインスリンと、分泌される免疫改変因子、例えばTGF-β、IL-10及び任意選択でIL-2とを同時発現する/コードするマルチシストロン性ベクター/プラスミドに関する。本発明は、更に、そのようなプラスミドを含むDNA免疫療法ワクチン、並びにそのような医薬製剤及びそれらのキットに関する。本発明は、最後に、そのような生成物の医薬上の使用、並びにそのようなプラスミドを産生する方法に関する。
【００１０】
本明細書のプラスミド/DNA免疫療法ワクチンは、主として、T細胞により駆動される自己免疫疾患、例えば1型糖尿病(T1D)の処置において治療上の可能性を有する。
【００１１】
一態様において、本発明は、i.インスリン抗原;ii.TGF-β;及びiii.IL-10をコードするプラスミドを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】環状のプラスミド地図を示す図である。
【図２】図1のプラスミドのベクター産物に関するmRNA及び翻訳されたタンパク質の地図を示す図である。
【図３】G30針による3つの注射経路におけるプラスミド剪断安定性を示す図である。
【図４】30℃での増殖によるプラスミド保持表現型の確認(17時間のインキュベーションを使用する1〜50継代、及び22時間のインキュベーションを使用する51〜100継代)を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の発明者は、複数の分泌されたサイトカイン並びに細胞内に保持された抗原の発現を単一プロモーター/マルチシストロン性mRNAから駆動する単一ベクターを本明細書で提供した。
【００１４】
単一細胞における治療の全成分をコードする単一ベクターを用いるDNA免疫療法ワクチン接種は、異なるベクターによる細胞のランダムトランスフェクションがすべての成分の発現を保証せず、又は所与の特定のトランスフェクト細胞からの任意の特定比率の成分の発現でさえも保証しないので、単一成分の発現をそれぞれ駆動する個別のベクター/プラスミドの混合物を用いる免疫療法ワクチン接種よりはるかに好ましい。
【００１５】
単一のマルチシストロン性プラスミド/ベクターのトランスフェクションは、トランスフェクト細胞の周囲に特別に操作された局所的環境/微小環境をもたらす。このように、免疫モジュレーターの組合せを抗原に添加し、そうでない場合に有害事象及び広範な免疫抑制を引き起こし得る高全身性免疫モジュレーターの用量を必要とすることなく、それらが単一T細胞の所望する免疫学的効果を強化するようにすることができる。
【００１６】
DNA免疫療法ワクチンでトランスフェクトした宿主細胞の免疫モジュレーター産物のこの局所的制限により、T細胞応答の改変に相乗的であるが、効果に対する十分な頻度で投与することができない、及び/又は所望の応答を付与するように用量設定することができない非常に強力なサイトカインホルモンを、許容しがたい有害事象なく、安全に使用することができる。
【００１７】
例えば、インターロイキン-10(IL-10)及びトランスフォーミング増殖因子-β1(TGF-β1)はともに、ナイーブCD4+ T細胞から制御性T細胞(Treg)を誘導することができることが知られている。しかし、IL-10/TGF-β1の組合せは、2つのサイトカインのいずれかの単独よりもTregを誘導する際に相乗効果(15〜20倍高く効果的)を提供し(米国特許第6083919号)、この組合せは更に、どちらかのサイトカイン単独よりも広範な標的細胞の集団において免疫寛容をもたらす(Zeller JC, Panoskaltsis-Mortari A, Murphy WJ等  1999 J Immunol. 163(7):3684〜91)。
【００１８】
更に、インターロイキン-2(IL-2)は、Tregを拡大し安定させることが知られているが、一方でまた炎症反応にも寄与し得る。しかし、IL-2とIL-10の組合せは、炎症性刺激よりもむしろ抑制性Tregをもたらす。循環T細胞が本明細書のDNA免疫療法ワクチンでトランスフェクトされた細胞に遭遇する際、それらはIL-10及びIL-2の最適以下の濃度に一時的に曝露される。循環T細胞は寛容の方にわずかに傾いており、循環T細胞が同時発現される抗原(例えばインスリン)に対しても反応性である場合、それらはトランスフェクト細胞に結合し、したがって、より長期間、免疫モジュレーター曝露を受け、更に、抑制効果のためにそれらをプログラム/再教育する別のシグナルも受け取る。このように、コードされた抗原に応答性であるこれらのT細胞は、トランスフェクトされた細胞に遭遇する場合、抑制性表現型に選択的に再教育される。
【００１９】
本明細書のプラスミド/ベクター/DNA免疫療法ワクチンは、したがって、発現されたサイトカインホルモンによって疾患に直接影響を及ぼすというよりは、自己免疫の部位(例えばT1Dにおける膵臓)で蓄積する抗原特異的Tregを誘導して疾患を抑制するように設計される。
【００２０】
抗原(T1Dの例におけるインスリン)に加えて、本明細書のベクター/オペロン/プラスミドは、ともに抗原提示細胞及びT細胞機能を相乗的に抑制し、Tregの誘導を駆動する、少なくとも2つのサイトカイン(例えばTGF-β1及びIL-10)をコードする。この効果は、それが抗原への効果的曝露と組み合わせて生じる場合も増強される。
【００２１】
一実施形態において、TGF-β1は、機能のためのプロセシング又は炎症環境を必要としない構成的に活性な形態である。Tregは、抗原及びTGF-β1への曝露を介してナイーブT細胞から産生することができるが、しかしTregは、それらがTh17エフェクター細胞に脱分化及び変換し、次いで、より多くの、少なくない、自己免疫破壊を生じ得る。IL-10とTGF-β1との組み合わせは、より強力な免疫モジュレーターであることに加えて、Tregよりも病原性Th17細胞を産生する環境を抑制する。
【００２２】
一実施形態において、本明細書のマルチシストロン性ベクターは、抗原、TGF-β1、IL-10に加えて、IL-2もコードする。IL-2はTreg数を増やし、それらの表現型を安定させ(Treg細胞がエフェクターT細胞に脱分化するのを防止する)、したがって、炎症を起こした標的組織でのそれらの機能上の寿命を長くする。
【００２３】
抗原と組み合わせた、これらの3つのサイトカイン(TGF-β1、IL-10及びIL-2)は、以下の機序:(i)抗原特異的抑制性Tregの生成の有意な増強、(ii)Treg寿命の延長、及び、(iii)炎症/自己反応性の抑制における個々のTreg細胞当たりの有効性の増大、によって寛容性の誘導に関する周知の相乗効果を有する。しかし、必要濃度の全身的注入精製サイトカインは、例えば、(i)過剰TGF-β1による致死性繊維症、(ii)インフルエンザ様の病状、(iii)過剰IL-2による毛細血管漏出症候群、(iv)慢性感染症に至る広範な免疫抑制、(v)腫瘍成長の増強、並びに、(vi)過剰IL-10による貧血等の複数の深刻な、又は致死の可能性のある副作用さえも有する可能性がある。
【００２４】
同じベクター/プラスミドからのこれらのサイトカインの同時発現によって、したがって免疫系に抗原を提示する同じ細胞によって、ベクターは、そうでない場合に高用量の精製サイトカイン投与に起因し得る全身作用及び対応する副作用なく、免疫寛容を誘導するための望ましい局所環境を達成する。
【００２５】
「ネイキッド」/「裸の」プラスミド/ベクターDNA(ベクター及び緩衝液単独)の注入は、取り込み及びトランスフェクション速度が非常に低く、約100,000のプラスミド分子のうちの1つ未満が細胞をトランスフェクトし、一方、残りは分解されるので、いかなる生物学的作用もない。トランスフェクションのこの極めて低い非効率は、トランスフェクト細胞を分配し制限するためのセーフティ機構を提供する。
【００２６】
成熟タンパク質の投与又は高効率ウイルスベクター形質導入のいずれかによる、全身的活性量のこれらのいずれかのサイトカインの投与は、不可能でないにしても、安全で有効な用量について用量設定するのは困難であり得る。少数の高発現ミクロ環境で分布される極めて少量の全身的用量に対して総曝露を制限することによって、非常に有利な安全性及び有効性プロファイルが得られる。
【００２７】
本明細書における抗原とこれら3つのサイトカインとの組み合わせは、T1D発症から有効に保護し、更に疾患の進行を安定的に逆転させることが可能であると考えられる。裸のDNAプラスミド/ベクター注入のトランスフェクション効率が低いため、これらの組換えタンパク質を産生する細胞はほとんどなく、したがって、サイトカインがコードされているプラスミド/ベクターからの血清サイトカインレベルに検出可能な変化はない。したがって、プラスミド/ベクターによりにコードされている抗原(プレプロインスリン)以外の抗原に対する検出可能な免疫刺激又は免疫抑制はない。これは望ましい安全性プロファイルをもたらす。
【００２８】
通常、DNAワクチンは、皮下(s.c.)注射に関しては実施が不十分であり、したがって、典型的には筋肉内注射(多くの場合エレクトロポレーションによる)を使用して投与されるか、或いは、面倒なデバイス並びにかなりのメンテナンス及び較正を必要とする皮内ジェット注射を使用して投与される。筋肉内注射に伴う副作用問題のほとんどはアジュバント関連(注射部位刺激)であるので、それらの問題は本明細書の裸のDNA免疫療法ワクチンフォーマットにとっては懸念材料ではない。更に、注射される容量は、通常比較的少ないため、重大な筋肉の張り及び疼痛をもたらさない。一実施形態において、注射される容量は1ml以下である。別の実施形態において、注射される容量は、約0.6又は0.5mlである。ともかく、本明細書で提供されるマルチサイトカインプラスミド/ベクターは、s.c.経路によって投与された場合であっても、T1Dからの予防を提供することが予想外に認められ、それにより患者に対する複数の可能性のある投与フォーマットが可能である。
【００２９】
局所的相乗作用の提供に加えて、単一プラスミド/ベクター及び単一プロモーターによって3つ又は4つの翻訳産物すべてをコードすることにより、規制の負荷量及び薬物物質放出基準は、本明細書のマルチシストロン性プラスミドの提供で更に簡易化される。
【００３０】
反対に、それぞれのタンパク産物が個別のプラスミドから産生される場合、その際には同じトランスフェクト細胞からの同時発現の相乗的値は、それぞれのプラスミド/ベクタートランスフェクションが異なる細胞を標的とするような独立事象であるので、失われるか又は低減される可能性がある。3〜4つの組換えタンパク質が2、3又は4つの個々のプラスミド/ベクターから産生される場合、トランスフェクト細胞の局所環境におけるいかなる相乗効果も潜在的に失われる;更に、いくつかの個々の臨床試験がそれ故必要となり得る(各プラスミド及び各組合せについて1試験)。単一プラスミド/ベクター及び単一mRNAからすべてのタンパク質を産生することによって、複数の個々の分子を試験する必要性、及び複合のプラスミド/ベクターフォーマットに固有の理想的な同時パッケージング比の決定が免除される。
【００３１】
本発明に適する任意のベクターフォーマットを本明細書において使用することができ、例えば、プラスミド(複製型又は受動型)、ミニサークル、直鎖状ベクター(MiLVs)、ウイルスベクター(組み込み型[例えば、レンチウイルス]及び非組み込み型[例えば、アデノウイルス]の両方)、コスミド、細菌人工染色体(BAC)、ヒト人工染色体(HAC)等である。
【００３２】
更に、任意の許容されるトランスフェクション増強方法も本明細書において使用することができ、例えば、エレクトロポレーション、ソノポレーション(超音波増強、マイクロバブルコントラスト増強が有る場合又は無い場合)、脂質/ポリマー凝集体、流体力学(高注入容量による圧力)、バイオ弾道/遺伝子銃(圧縮ガスによる皮膚を介した沈着)等である。
【００３３】
一実施形態において、非複製エピソームプラスミドDNAは、i)単一プラスミドトランスフェクションに由来するmRNAの複数コピー、及び、ii)mRNA及び他のDNAベクターフォーマットに対するプラスミド核酸の安定性及び機能の増強、により本明細書で使用される。したがって、mRNA及びDNAベースの両発現系は細胞内輸送及び共局在化を提供することができるが、プラスミドベースの系は投与の制御及び永続性の増大を提供する。
【００３４】
一実施形態において、プラスミド/ベクターは、以下の4つのタンパク質をコードする:
i)抗原、
ii)TGFベータ1(TGF-β1)、
iii)インターロイキン-10、及び
iv)インターロイキン-2。
【００３５】
一実施形態において、抗原は、エンドソーム標的化(endosomally-targeted)T1D関連抗原、例えばインスリン又はGAD65である。エンドソームの標的化は、例えば、Ii/CD74融合体、LIMPII/SCARB融合体、又はトランスフェリン受容体融合体を介して行うことができる。
【００３６】
一実施形態において、TGF-β1は活性形態である。
【００３７】
1つのプラスミド/ベクターから4つのタンパク質の発現は、例えば、所望の配列がA)個別のプロモーター、B)新しいリボソームを加えて各セグメントを翻訳するIRES(配列内リボソーム進入部位)配列、又はC)翻訳されてリボソームの休止/スキップを誘導し、単一オープンリーディングフレームから個別のポリペプチドの産生をもたらす、ウイルス2A配列(例えば、FMDV 2A又はTaV 2A配列)のいずれかで分離される場合、可能である。しかし、実際上、これらのそれぞれの戦略は複雑であり、実現は困難である。
【００３８】
単一プラスミド/ベクターからの4つの独立したタンパク質の発現は、それぞれの遺伝子に個別のプロモーターを有することにより最も容易に達成される。しかし、このフォーマットには、A)過剰な長さの多数のプロモーターによって非常に大きく、不安定であり、生成が困難なプラスミドをもたらすこと、B)相互に対して翻訳タンパク質の予測不可能な挙動をもたらされること(それらはもはや相互に対して固定比で産生されない)、C)それぞれのプロモーターは独立してサイレンシングされ、いくつかの遺伝子が選択的に発現され得るが、他のものは完全な有効性が求められないこと、及び、D)制御上の容易性が欠如することにおいて重大な欠点がある。反対に、IRESエレメント及び2A配列はmRNAレベル及び翻訳レベルに作動し、単一のプロモーターから固定比のそれぞれのタンパク質を再生可能に同時発現する。
【００３９】
それぞれの4つのクラスのIRESエレメントは、機能に関する異なる補因子要件、並びに翻訳されるべき下流遺伝子に関する異なる配列要件を有する。例えば、EMCV(EndoMyoCarditisウイルス)IRESは、すべての真核生物翻訳開始因子を利用する630塩基対1型IRESであり、CrPv(クリケット麻痺ウイルス)IRESは必要な補因子を有さないが非標準開始コドンを利用する200塩基対4型IRESである。
【００４０】
異なるクラスのIRESエレメントが利用される場合、それぞれのタイプのIRESエレメントをそれぞれのプラスミドで一度だけ使用することができるようにそれらは互いに干渉し、また一緒に使用される場合には、異なるタイプのIRESエレメントは、予測するのが困難な方法で相互に弱化する(有効性の低下)。
【００４１】
更に、遺伝子/IRESの組合せをシャッフルすると、遺伝子とIRESエレメントとの相互作用は静的ではなく隣接するヌクレオチド配列の状況に依存的であるので、予測不可能な比の翻訳産物がもたらされる。更に、IRESエレメントは、開始時又は開始直後に最初の数個のアミノ酸位置に対して制限をかける。例えば、CrPv IRESは、最初のアミノ酸が標準メチオニンではなくアラニンであることを要件とし、EMCV IRESは、最初の3つのコドン内のP、W、C、R又はKアミノ酸を許容することができない。一実施形態において、EMCV IRESによって課されたN-末端アミノ酸制限に適応するために、DNAワクチンは、IL-10遺伝子のN末端に対して3個のアラニン伸長を含有する。
【００４２】
更に、各IRESエレメントは、230bpから700bpを超える範囲の相当な数の塩基対を含み;したがって、多数のIRESエレメントの包含は、多くが自発的な欠失及び組換えによって不安定になり、工業的に生産することが困難になる程度まで、プラスミド/ベクターのサイズ及び複雑性を増す。更に、IRESエレメントがそれらを含有する転写mRNAに付与する高度の二次構造によって、それらはトランスフェクトされた細胞において病原体認識受容体を活性化し(Dabo S, Meurs EF. 2012 Viruses 4(11):2598〜635)、意図される寛容誘導に対抗する刺激効果を生じる可能性を高める。
【００４３】
2A配列は、IRESエレメントとは異なり、相互に作用せず、したがって、安定的で一貫した性能を提供する。しかし、それらはそれ自体翻訳されるため、最終翻訳タンパク質産物の折り畳み、機能及び安定性に影響を及ぼす。すべての2A配列は、分離される配列の5'末端に重要なC末端融合(19-22aa)をもたらし、またプロリンで3'配列を開始する。いくつかのタンパク質はこれらの改変に許容的であり、いくつかは許容的でなく、2A配列の使用に対して実際的な制限をもたらす。例えば、インターロイキン-10生成物は2A尾部に許容的であるが、インターロイキン-2及びTGF-β1の両方はミスフォールドされ、2Aタグの上流で発現された場合は機能を喪失する。したがって、2A配列により分離されるいくつかの独立したタンパク質を発現することは可能であるが、本明細書の4つのタンパク質のうちの2つは、2Aタグで終止することはできないため、他の戦略が利用されなければならない。
【００４４】
各タイプの2Aアミノ酸配列がタンパク質翻訳中にリボソーム機能を改変する場合、それは2Aファミリーの2つのコア特性において異なる効率、すなわち(i)並置の遺伝子産物の分離と(ii)第2の遺伝子産物への処理能力(再開)とを有する。異なる2A配列は、ペプチド骨格を破壊するリボソーム休止を発生させる(2つの別々のタンパク質をもたらす)ことでの異なる効率、並びに第2の遺伝子産物のペプチド合成を再開することでの異なる効率を有する。
【００４５】
タンパク産物を分離し、タンパク質翻訳を再開する2A配列の能力は、2Aアミノ酸配列に依存する(Donnelly ML, Hughes LE, Luke G等, 2001 J Gen Virol. 82(Pt 5):1027〜41)。2Aアミノ酸配列における小規模な変異は、5%未満(>95%融合)から完全分離(0%融合又は100%分離)の範囲で、分離され融合された隣接する遺伝子産物の有意に異なる混合を生じる。
【００４６】
更に、本発明者は、2つの隣接するタンパク質産物をコードする近接のアミノ酸配列が2A配列の再開及び分離の効率にも影響し、報告した結果から有意な偏差がもたらされることを本明細書において発見した。したがって、再開効率は使用される2Aアミノ酸配列のタイプ並びに近接のアミノ酸配列によって提供される環境に応じて変化するので、プレ2A遺伝子産物の比率及びタンパク質の分離は、使用した2Aアミノ酸配列とその状況の両方によって決定される。
【００４７】
一実施形態において、「FMDV 2A」は、本明細書の抗原コード配列とTGF-β1コード配列の間に挿入され、タンパク質産物の100%分離、並びに1:1の比率が生じる。
【００４８】
別の実施形態において、「TaV 2A」は、本明細書のIL-10コード配列とIL-2コード配列の間に挿入し、約50%の個別産物並びに10対6の比率のタンパク質産物を得ることができる。したがって、各トランスフェクト細胞は、エフェクターT細胞を刺激することが不可能な比較的低用量のインターロイキン-2と、T細胞をTreg表現型にかたよらせる高用量のインターロイキン-10を送達する。融合IL-10/IL-2の産生は不都合であるので、TaV 2Aセグメントの切断効率を高める操作を試みた。TaV 2Aの翻訳領域上流を延長して2Aエレメントへの上流配列の影響を低減するエレメントである「インスレーターセグメント」を2Aセグメントの前に挿入する試みは、分離を改善しなかった。融合問題を解決する別の試みにおいて、GSGの翻訳タンパク質配列を有する上流アンカプラーセグメントが付加された。しかし、このアプローチでは切断効率の増加的改善が生じただけであった。
【００４９】
そのため、TAV 2AによるIL-10コード遺伝子とIL-2コード遺伝子の分離から生じるサイトカイン融合体は免疫原性であると思われる。
【００５０】
さらなる実施形態において、本明細書のベクター/プラスミドは「P 2A」セグメントを有する。P2AによるIL-10コード遺伝子とIL-2コード遺伝子の分離は、タンパク質産物の完全又はほぼ完全な分離、IL-2と比較して少なくとも2倍の(又はおそらくは最大で4倍若しくは5倍以下の)IL-10の比をもたらす。
【００５１】
上記のIRES単独及び2A単独の系の欠点に取り組むため、本明細書の4つのcDNA配列(抗原、TGF-β1、IL-10、IL-2)は、単一のIRESの前後にペアで配置させる。各ペアは2A配列により更に分離され、これはリボソームスキッピング及びポリタンパク質ペアの各配列からの独立したタンパク質の産生を誘導する。TGF-β1及びIL-2が融合体のN末端側にない可能性があるので、それらのうちの1つは中央のIRES部位で終止しなければならず、他方はmRNA配列の翻訳部分を終止しなければならない。
【００５２】
したがって、本明細書の発現タンパク質及びIRES/2Aエレメントのクロノロジー/配列は以下のとおりであり得る:(i)抗原、(ii)FMDV 2A、(iii)TGFベータ1、(iv)IRES、(v)IL-10、(vi)P 2A、及び(vii)IL-2。結果として、4つのすべてのタンパク質は、安定的で予測可能な方法で単一オペロン/遺伝子断片から独立して発現させることができる。これらの各タンパク質は単一mRNAから発現されるので、各産物の比は固定されており、例えば、IL-10よりも過剰のIL-2を生成することはできない。
【００５３】
コードされた遺伝子の分離にIRES及び2Aのエレメントの組合せを使用することに加えて、本明細書の代替解決策は2つのmRNAを生成する双方向プロモーターの使用であり得る。これらのmRNAは、それぞれ、1つのmRNA分子において4つ全部ではなくペアのタンパク質をコードする。したがって、同等の配置は、双方向性哺乳動物プロモーターの周囲に適切に配置されたペアの発現カセットを利用し、2A配列及び/又はIRESエレメントの分離を利用して構築され得る。しかし、このアプローチは、主として大きなサイズの双方向性プロモーターによる不都合だけでなく、1つの医薬品に含まれる個別のmRNAエレメントを有する規定負荷が増加する可能性による不都合に関連している。したがって、本明細書の好ましい実施形態は、双方向性プロモーターではなく単一プロモーター及びIRESと2Aのエレメントの組合せを利用する。
【００５４】
理論上、いくつかの2A配列を細胞内の内因性プロテアーゼ感受性配列と置き換えることができる。しかし、本明細書発明者は、そのようなプロテアーゼが重大な不都合(例えば、融合タンパク質産物の分泌をもたらす報告された機能の欠如)と関連していることを本明細書において発見した。
【００５５】
サイトカインホルモンがコードされているプラスミドの局所環境内での免疫系に抗原がプロセシングされ提示されるためには、抗原がトランスフェクト細胞内に保持されなければならない。1型糖尿病の場合には、活性インスリンの産生は、トランスフェクト細胞からそれが分泌されるか又はそうでなければ放出されるならば、血糖の望ましくない降下を潜在的にもたらす。
【００５６】
抗原分泌を回避するために、任意の分泌シグナルを抗原コード配列から除去すること、例えば、プレプロインスリンをコードする核酸配列から分泌シグナルコード配列を除去することができ、したがって、プレプロインスリンではなくプロインスリンが生成され、それにより、抗原がトランスフェクト細胞の内部に蓄積され得る。この翻訳された抗原産物(例えばインスリン)は活発に分泌されない一方、CD8+ T細胞による攻撃に起因する壊死により溶解中に放出される可能性がある。更に、インスリンのシグナル配列は、疾患関連エピトープ(自己免疫潜在的に引き起こす)を含有することが知られている領域であり、したがってシグナル配列の包含は、より広い寛容誘導とより高い疾患減少確率を確実にする。
【００５７】
更に、抗原の細胞質内保持は、プロテアソームを介したプロセシング及びMHCクラスI経路を介した提示のみを可能にし、CD8+ T細胞を介して細胞内病原体を検出する。CD4+ T細胞は炎症誘発性サイトカインの重要な寄与因子であり、すべてではないにしてもほとんどの自己免疫抑制性TregはCD4+であるので、MHCクラスIIを含めるような抗原提示の拡大は、CD4+ T細胞によって認識され、有利となり得る。
【００５８】
MHCクラスIIプロセシング及びCD4+ T細胞刺激は、この経路へのアクセスが細胞外抗原のエンドサイトーシスを介するので、通常、細胞内抗原を含んでいない。通常、トランスフェクト細胞内で産生されるタンパク質産物は、デフォルトの細胞内/プロテアソームプロセシング経路及びMHCクラスIを介してのみ提示され、CD8+ T細胞効果をもたらすがCD4+ T細胞効果はもたらさない。免疫調節のためにCD4+及びCD8+ T細胞の両方を標的とするために、好ましい実施形態は、MHCクラスII提示をもたらす因子も含む。
【００５９】
原則として、MHCクラスII提示を誘導するために、抗原は、エンドソーム区画に融合体を向けさせる任意のパートナーに融合され得るが、活性及び曝露において機能上の差がある。鉄輸送タンパク質受容体としても知られているトランスフェリン受容体は、原形質膜/細胞外空隙からエンドソームまでのサイクルで融合し、したがって、B細胞、マクロファージ等などの他の免疫細胞を全抗原に曝露することもできる。LimpII/SCARB融合体はエンドソームを直接標的とするが、優先的には初期のエンドソームを標的とし、時には抗原の過剰プロセシング及び完全破壊を生じる。MHCクラスIIが後期エンドソーム局在化に使用するのと同じシャペロンシグナルを利用するIi(CD74)融合体は、抗原及びMHCクラスIIを同じ発達段階の同じ小胞に送達し、MHCクラスIIの状況において抗原を効果的に提示する可能性を最大限にする。更に、Ii融合体からのエンドソーム選別でさえ、プレプロインスリン分泌配列は不活性にされなければならないか、又は抗原がまたプロセシングの前に分泌され喪失される。
【００６０】
或いは、インスリン抗原分泌の遮断は、本明細書では、粗面小胞体上のSRP(シグナル認識粒子)による分泌タグ除去に必要な2つのアミノ酸を変異させることによって達成された。Ala(A)からGlu(E)への変異は、プレプロインスリンの成熟及び分泌を完全に防止するが、最良の免疫寛容を誘導するために抗原の必要なエピトープ構造は維持している。
【００６１】
一実施形態において、プラスミドDNAワクチンが本明細書において使用される。プラスミドは、例えば大腸菌(E. coli)において増殖/複製され、培地から単離/精製され、続いて、液体製剤、例えば水、食塩水、PBS液体製剤に、又は皮内ジェット注射、鼻腔内投与若しくは吸入用の凍結乾燥粉末として製剤化される。一実施形態において、本明細書のプラスミドは、任意選択で安定化剤を含む、水性医薬製剤に製剤化される。任意の適切な微生物系をプラスミド産生に利用することができる。
【００６２】
製剤の安定剤としては、限定するものではないが、キレート剤、例えば、そうでなければDNAの分解に関与し得るMg++及びFe+++を捕捉するためのEDTA、EGTA、若しくはDPTA、及び/又はプラスミドを非特異的分解作用から保護するクエン酸が挙げられる。一実施形態において、本明細書のプラスミドは、等張PBS、或いはTRIS+クエン酸塩+EDTA中で製剤化することができる。このようなプラスミドは、安定しており、産生が容易であり、使用において安全で便利であるという長所を有する。
【００６３】
別の実施形態において、送達剤、例えば、ウイルス、脂質、リポソーム、同時パッケージング物等を本発明に関して添加することができる。しかし、本明細書での送達剤の使用には、免疫、ウイルスの組込み等に関する潜在的な問題を有する可能性がある。
【００６４】
定義
抗原:本明細書のDNA免疫療法ワクチンは、抗原をコードする。本明細書の抗原は、免疫系のT細胞成分によって認識され得る任意のタイプの免疫原性疾患関連タンパク質又はそのフラグメントであり得る。例えば、1型糖尿病の処置又は予防の場合には、インスリン抗原を使用することができる。一例において、インスリン抗原は、InsB 9-23免疫優性(immunodominant)ペプチドである。本明細書の多発性硬化症DNA免疫療法ワクチンについては、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質(MOG)及び/又はプロテオリピッドタンパク質(PLP)抗原を抗原として使用することができる。脱毛、多発性筋炎/皮膚筋炎、セリアック病及びタンパク質アレルゲン(例えば落花生タンパク質ara h 2)からの代表的な抗原に対する同様のタンパク抗原コード配列もまた、本明細書のDNA免疫療法ワクチンにおける使用に適した抗原の例である。
【００６５】
抗原標的化:一実施形態において、本明細書の抗原は、エンドソーム標的化される。本明細書の抗原としては、全タンパク質、分泌欠損プレタンパク質、又はそれらの機能的又は免疫優性のペプチド断片が挙げられる。
【００６６】
例えば、本明細書のインスリン抗原は、免疫調節療法において使用するための抗原であって、グルコース低下剤ではない。したがって、それがMHC分子上で循環T細胞に提示されることを確実にするためにそれは完全にはプロセシング/成熟又は分泌されないものとする。したがって、本明細書のDNA免疫療法ワクチンは、血液中のインスリンレベルを増加させず、むしろ、免疫系、特にT細胞への抗原の提示を増加させる。
【００６７】
したがって、本明細書のインスリン抗原は、小さな免疫優性ペプチドをコードするフラグメント(例えば、同等のT細胞エピトープを提示する、シフトレジスターペプチド(shifted register peptide)を含む、インスリンB鎖9-23ペプチド)、必要な分泌配列を欠損するがそれ以外は無傷である完全プロインスリン、又は分泌配列を含有するが分泌機能を阻止するように改変されているプレプロインスリンムテインであり得る。
【００６８】
本明細書におけるインスリン抗原の例には以下が含まれる:
【００６９】
マウスプロインスリン(配列番号1):FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
【００７０】
ヒトプロインスリン(配列番号2):FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
【００７１】
分泌されない改変型マウスプレプロインスリン(wtプレプロインスリンに対する置換は太字及び下線で示した(配列番号3)):
【化１】
2020062057.tif 000002
【００７２】
分泌されない改変型ヒトプレプロインスリン(wtプレプロインスリンに対する置換は太字及び下線で示した(配列番号4)):
【化２】
2020062057.tif 000003
【００７３】
マウスwtプレプロインスリン(配列番号5):ALWMRLLPLLALLALWGPDPAQAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
【００７４】
ヒトwtプレプロインスリン(配列番号6):MALWMRLLPLLALLALWGPDPAQAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
【００７５】
マウスとヒトの間で同一のインスリンペプチド「InsB 9-23」:SHLVEALYLVCGERG(配列番号7)
【００７６】
改変型InsB 9-23(wt InsB 9-23に対する置換は太字及び下線で示した(配列番号8)及び(配列番号27)):
【化３】
2020062057.tif 000004
【００７７】
したがって本明細書のインスリン抗原は、トランスフェクトされた宿主細胞のサイトゾルに蓄積される可能性があり、したがって、MHCクラスIによって提示され得るか、又は細胞溶解の際に放出され得る。
【００７８】
MHCクラスII提示をもたらすエンドソームの標的化は、抗原配列と、細胞質の「YXXφ」配列(式中、Yはチロシンであり、Xは任意のアミノ酸であり、φは嵩高い疎水性アミノ酸、例えばトリプトファン又はイソロイシンである)、「[DE]XXXL[LI]」(ここで、D及びEはそれぞれアスパラギン酸又はグルタミン酸であり、一方L及びIはそれぞれロイシン及びイソロイシンである)、又は「DXXLL」エンドソーム/リソソーム選別シグナルと膜貫通領域を形成するリーダー配列との融合によって本明細書において達成することができ、これらは以下の例示的配列において下線を付している。したがって、これらのシグナルを含むタンパク質ドメインは、エンドソーム/リソソームを標的又はサイクルし以下のものを含む:トランスフェリン受容体、LimpII、又はインバリアント鎖、MHC IIシャペロンとしても知られている、CD74、又はIi、又は任意の同様のドメイン。
【００７９】
本明細書のエンドソーム標的化ドメインの例としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる:マウスCD74/インバリアント鎖(Ii)エンドソーム標的化ドメイン(配列番号9):MDDQRDLISNHEQLPILGNRPREPERCSRGALYTGVSVLVALLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTITSQNLQLESLRMKLP
【００８０】
ヒトCD74/インバリアント鎖(Ii)エンドソーム標的化ドメイン(配列番号10):MHRRRSRSCREDQKPVMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTITSQNLQLESLRMKLP
【００８１】
1型糖尿病:1型糖尿病(T1D)は、自己侵襲的なT細胞が膵臓のランゲルハンス島に浸潤し、インスリン産生ベータ細胞集団を特異的に破壊することにより重要な役割を果たす、慢性の自己免疫疾患であると考えられる。かなりの数の膵島細胞が破壊されれば、インスリン量が低下し、又はインスリンが全く存在しなくなり、患者にインスリン欠乏症及び高血糖症を引き起こす。したがって、T1D患者は十分なインスリンを産生することができず、必要なホルモンの規則的な注射が生涯にわたり要求される。一部の1型糖尿病患者は、1型糖尿病と2型糖尿病の両方の症状のある糖尿病疾患である、「1.5型糖尿病」、「潜在性自己免疫性糖尿病/LADA」、「二重糖尿病」等と診断される。したがって、1型糖尿病及び2型糖尿病の両方の系統のあるすべての糖尿病疾患もまた、本明細書の用語「1型糖尿病」に含まれる。
【００８２】
免疫寛容誘導性DNAワクチン:本明細書のDNAに基づいた免疫療法ワクチン/ベクター/プラスミドは、正常で健全な「自己」細胞を破壊する原因である免疫系の部分をスイッチオフ又はダウンレギュレートするように設計されており、したがって、T細胞に基づく自己免疫を予防又は改善する。
【００８３】
本明細書で使用される場合の用語「DNA免疫療法ワクチン」とは、DNA分子を含む化合物又は組成物であって、対象が1つ又は複数の疾患を発症する危険性を減らすために前記対象に投与される化合物又は組成物を意味する。
【００８４】
いくつかの実施形態において、本明細書のDNAベースの免疫療法ワクチンは、特定の抗原をコードするプラスミド/ベクターである。ワクチン接種後、これらのプラスミドは、言いかえれば、宿主の体内の抗原提示細胞にトランスフェクトされることにより取り込まれる。次いで、「トランスフェクトされた」宿主細胞は、抗原を産生し、免疫系、特にT細胞に抗原の小さいフラグメントを提示する。このアプローチによって、コードされた抗原に対する特異的T細胞応答が改変されるとともに、他の(コードされていない、又は「無関係な」)抗原に対する免疫応答の改変が最小限になる。極めて少数の宿主細胞だけが、典型的には本明細書のDNAワクチンプラスミド/ベクターで形質転換されるが、このことは、おそらく10万分の1未満、50万の1、又は100万の分の1未満のプラスミド/ベクター分子が最終的に宿主細胞に入ることを意味する。したがって、本明細書のDNAワクチンは、T1D患者又はT1Dを発症する危険性のある患者において抗原、例えばインスリンに対する免疫応答をモジュレートするための非常に穏やかで特異的なアプローチを示す。
【００８５】
プラスミド:プラスミドは、小さな環状の二本鎖DNA分子として細菌で最も一般的に見つかる小DNA分子である。人工プラスミドは、分子クローニングにおいてベクターとして広く使用され、宿主生物内の組換えDNA配列の複製を駆動するのに有用である。プラスミドは、免疫療法DNAワクチンとしての使用に適するように操作され得る。プラスミドは、適切な宿主内で自律的に複製することが可能なDNAの1単位であるレプリコンと考えられる。プラスミドはある細菌から別の細菌に伝達される可能性があり、それは3つの主要な機序:形質転換、形質導入及び接合によって同じであるか又は異なる細菌種であり得る。DNAワクチンプラスミドは、受動形質転換により宿主細胞によって取り込まれ得るが、通常は比較的低速度である。本明細書のプラスミドは、細菌中で効率的に、しかしタンパク質発現は駆動せずに、複製する。本明細書のプラスミドは、更に、ヒト及び他の哺乳動物、例えばマウスにおいて、タンパク質発現を駆動するが、しかしプラスミドの複製は駆動しない。一実施形態において、pVAX1ベクター(Invitrogen/LifeTechnologies社)は、本発明の一部であるエレメントの挿入において足場として本明細書で使用される。本明細書における他の適切なベクター足場は、真核生物プロモーターエレメント、原核生物の高コピー複製起点、及びプラスミドメンテナンスのための選択系を含有する任意のベクター骨格を含む。
【００８６】
選択遺伝子及び選択系:一態様において、本明細書のDNA免疫療法ワクチンは、製造目的のための選択遺伝子/選択マーカーを含む。本明細書の選択可能なマーカーは、例えば細胞毒素に対する耐性を付与する遺伝子であり、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン等の抗生物質である。
【００８７】
本明細書の他のタイプの適切な選択系は、例えば、条件付き致死性サイレンシングシステム(例えばCcdA/CcdB若しくはParD/ParE Hok/Sokタイプのシステム)、又は産生細胞株のゲノム欠損を補完し、したがって、そうでなければ生存できない宿主の増殖を可能にする配列(例えばdapD-若しくはpyrF-栄養要求性の補完、infA-翻訳開始補完、等)を含む。
【００８８】
選択マーカーを含む、プラスミド/DNAワクチンを保有する産生細胞は、毒素/抗生物質/条件に曝露された場合に生存するが、プラスミド配列の取り込みに失敗したものは死滅する。このようであるので、一実施形態において、本明細書のDNAワクチンは、産生細胞、例えば大腸菌における高収率/純度及びより効率的な産生/複製を提供するために、選択マーカーをコードする核酸配列を含む。
【００８９】
抗生物質選択は一般的な研究室での戦略であるが、抗生物質なしの選択系に関連した、例えばより効果的な制御プロセスに関連した、有利性がある可能性がある。ミニサークル、合成した直鎖状ベクター等の選択機序を含有しないベクターもまた本明細書において使用することができるが、これらの実施は、特に産生及び品質管理コストの増加に起因する産生におけるある種の欠点を伴う。
【００９０】
補完(「レスキュー」)の戦略の例は先行技術において知られているが、これらの戦略には様々な不都合がある。
【００９１】
代謝の補完系例えばdapD[リシン生合成]系又はpyrF[ウリジン生合成]系は、高密度大腸菌の産生中に「栄養共生」をもたらすことが多く、その場合、プラスミド含有細菌は必要とされる化合物を過剰に産生、分泌し、それによりプラスミドを含有しない付近の細菌用の選択圧を「緩める」。
【００９２】
本明細書における適切な選択系の別の例は、タンパク質合成に必要とされるIF1/開始因子1をコードする、必須タンパク質をコードするプラスミド、例えばinfAである。この選択系においては、infAタンパク質が分泌されないので、栄養共生は生じない。しかし、必要なタンパク質/infAを外因的に補完する方法はないので、プラスミドを更に改変するか、又はプラスミド欠損細胞を拡大することは不可能である。(J Bacteriol. 1994 Jan;176(1):198〜205、及びJ Biotechnol. 2004 Jul 1;111(1):17〜30)。
【００９３】
infA選択系に伴う不利益の回避するため、リステリア・モノサイトゲネス(L. monocytogenes)の侵入タンパク質遺伝子prfA由来の温度感受性翻訳スイッチ(又は「サーモセンサー」)を有する代替選択系が本明細書において提供されている(Cell. 2002 Sep 6;110(5):551-61)。標準の組換え技術によってinfAの大腸菌ゲノムコピーの上流にRNA「サーモセンサー」配列のヘアピン形成部分を配置することにより、それらの発現は発酵温度の調節によって制御されるようになり、37℃でプラスミド非含有細胞は緩慢に増殖し、<30℃の温度では急速に細胞死する。したがって、操作された温度感受性大腸菌産生株をwt infAを発現するプラスミドで形質転換すると、すべての温度で完全に正常な増殖速度となり、37℃でのプラスミドを含まない増殖及び30℃でのプラスミドに対する厳密な選択が可能になる。更に、この系は、wt大腸菌がプラスミドを保持する選択的圧力を生じず、したがって、それは培養において8時間以内に失われ、治療用プラスミドの環境的な永続性が保証されない。
【００９４】
wt大腸菌infAヌクレオチド配列(配列番号11):
ATGGCCAAAGAAGACAATATTGAAATGCAAGGTACCGTTCTTGAAACGTTGCCTAATACCATGTTCCGCGTAGAGTTAGAAAACGGTCACGTGGTTACTGCACACATCTCCGGTAAAATGCGCAAAAACTACATCCGCATCCTGACGGGCGACAAAGTGACTGTTGAACTGACCCCGTACGACCTGAGCAAAGGCCGCATTGTCTTCCGTAGTCGCTGA
【００９５】
infA遺伝子の翻訳から得られるwt大腸菌IF1タンパク質配列(最初のメチオニン/MはprfA融合体に含まれない(配列番号12)):
MAKEDNIEMQGTVLETLPNTMFRVELENGHVVTAHISGKMRKNYIRILTGDKVTVELTPYDLSKGRIVFRSR
【００９６】
DNA免疫療法ワクチンプラスミドを産生するための本明細書において使用される大腸菌産生細胞株は、したがって、以下の温度感受性prfAヌクレオチド配列を保有し得る:
【００９７】
wt  リステリア・モノサイトゲネス  prfA(「サーモセンサーヘアピン」)ヌクレオチド配列(シャインダルガーノに下線、ATG開始点は太字(配列番号13)):
【化４】
2020062057.tif 000005
【００９８】
wt  リステリア・モノサイトゲネス  prfAタンパク質配列(配列番号13の翻訳から得られる、大腸菌IF1の上流に融合):
【００９９】
MNAQ
複製起点(「Ori」):複製起点(origin of replication)は複製起点(replication origin)とも呼ばれ、DNA鎖の複製が開始されるゲノム内の特定の配列である。一実施形態において、本明細書における複製起点の部位は、細菌大腸菌産生細胞株での複製は可能であるが、哺乳動物宿主細胞、すなわちワクチン接種される対象/ヒト/患者の身体由来の細胞での複製は不可能である「pUC Ori」を含む。本明細書における他の適切な細菌の複製起点としては、限定するものではないが、R6K、pBR322、ColE1、pMB1、15A、pSC101等が挙げられる。一態様において、本明細書における複製起点は、より効率的な産生のための高プラスミド/バイオマス比をもたらす高コピーバージョンである。複製起点を含有していないベクター、例えばミニサークル、合成直鎖状ベクター等もまた、本明細書において使用することができる。
【０１００】
プロモーター:プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始するDNAの領域である。プロモーターは、遺伝子の転写開始部位の近く、同じ鎖上でDNAの上流に位置し、これはセンス鎖の5'領域方向である。転写が起こるためには、RNAポリメラーゼは遺伝子の近くのDNAに結合していいなければならない。プロモーターは、特定のDNA配列、例えば応答エレメントを含有しているが、これは、RNAポリメラーゼに、及びRNAポリメラーゼを動員する転写因子に確実な初期結合部位を提供する。転写因子は、特定のプロモーターに結合し遺伝子発現を制御する特定のアクチベーター配列又はリプレッサー配列を有する。したがって、プロモーターは、他の制御領域、例えばエンハンサー、サイレンサー、境界エレメント/インスレーターと協力して機能し、所与の遺伝子の転写のレベルを導く重要なエレメントを表わす。古典的プロモーターは、単一メッセンジャーRNA(mRNA)の産生を駆動するが、本明細書の双方向性プロモーターは、プロモーターの上流及び下流の両方で、プロモーターに直接隣接している2つのmRNAの産生を駆動する。
【０１０１】
一実施形態において、真核生物プロモーターが本明細書において使用される。真核生物プロモーターは、例えばいくつかのウイルスプロモーター、並びに広い発現を示すプロモーター等、必ずしも1遺伝子/1プロモータールールに従うわけではない(すなわち、ニューロン単独の発現等の狭い細胞型特異性を有していない)。大きな多重遺伝子mRNA分子の広範な転写を駆動することが可能な本明細書におけるプロモーターの例は、以下のものを挙げることができる:ウイルスCMV最初期(IE)及びSV40プロモーター;内因性EF1a、PGK1、Ubc及びベータアクチンプロモーター;及び合成プロモーター例えばCAGハイブリッドプロモーター。他の多くの適切な哺乳動物のプロモーターが存在し、またより多くのものが合成生物学の取り組みによって設計されている。ヒト細胞において所望する発現特性を生じる任意のプロモーターを、本明細書におけるDNA免疫療法ワクチンプラスミドで使用することができる。
【０１０２】
エンハンサー:エンハンサーは、mRNA転写物を産生する際にプロモーターの効率を高めるDNAエレメントである。本明細書におけるエンハンサーは、適合し得るか(例えばSV40エンハンサー/CMVプロモーター)、又は非適合である。真核生物の機能に適する任意のエンハンサー/プロモーターの組合せも本明細書において使用することができる。
【０１０３】
真核生物の翻訳開始:真核生物の翻訳開始配列は、通常「コザック」コンセンサス配列と呼ばれる。mRNA分子上のコザック配列は、そこからタンパク質がコードされている、翻訳開始部位としてのリボソームによって認識される。真核細胞リボソームは、タンパク質翻訳を開始するために、この配列又はそれらの変異体を必要とする。コザック配列は縮重又は可変性であり、コンセンサス配列と一致することは稀である。実際、コンセンサスコザック配列は、典型的には、哺乳動物mRNAから単離された野性型変異体よりも効率的ではない。弱いコザック配列は天然mRNAから規則的に単離され、低含量のタンパク質の翻訳調節において役割を果たすようであるが、本明細書におけるDNA免疫療法ワクチンは、好ましくは中効率又は高効率のコザック配列をコードしている。本明細書における有用なコザック配列の例は、以下のヌクレオチド配列を含む:gccRccATGG(配列番号14)、ここで、小文字の塩基は最も一般的なヌクレオチドであるが変化する可能性があり、大文字のヌクレオチドは固定されており(RはA又はGの塩基に対するIUPAC不確定コードである)、ATGは+1位のメチオニンコドンの翻訳開始部位を示す。
【０１０４】
エンドソーム選別シグナル(endosome sorting signal):エンドソームは、真核細胞内部で膜に包まれた区画である。いくつかのタンパク質はエンドソームに輸送され、その中でペプチド断片に分解され得る。ペプチド断片は、エンドソームに存在するMHC分子と結合し、MHC/ペプチド複合体を形成することができ、続いてこれが細胞表面に輸送されて循環T細胞、特にCD4+ T細胞に提示され得る。タンパク質のエンドソームへの選別は、タンパク質の細胞質ドメイン内に存在するシグナルによって媒介される。エンドソームのシグナルは、通常、短い直鎖状アミノ酸配列である。本明細書における抗原は、好ましくは、エンドソーム選別シグナル、例えばYXXφ、[DE]XXXL[LI]、又はDXXLLエンドソーム/リソソーム選別シグナルを使用するエンドソームを標的とする。エンドソーム選別シグナルは、様々な天然に存在する又は合成のエンドソーム選別シグナルを含む。本明細書における例としては、Cd74/インバリアント鎖/Ii、LimpII/SCARB、又はトランスフェリン受容体に存在するエンドソーム選別シグナルが挙げられる。薬学的に許容され、所望の機能を提供する任意のエンドソーム標的化ドメインを利用することができる。そのようなエンドソーム標的化ドメインの抗原への融合は、その効果を増大させるために翻訳時にそれらをエンドソームの区画に向ける。抗原のエンドソーム選別は、MHCクラスI複合体における構成的提示に加えて、免疫寛容性のより完全でより強力な誘導のために、またTregの拡大の可能性のために、プロセシング及びMHCクラスII複合体における免疫系への提示を付与する(これはMHCクラスI/抗原複合体を介しては達成することができない)。一実施形態において、本明細書における免疫寛容誘導性DNAワクチンは、抗原とCD74/インバリアント鎖/Iiとの融合をコードし、エンドソーム標的化とMHCクラスIIを介した抗原の提示を駆動する。
【０１０５】
イントロン:イントロンは、mRNA内の非コード配列である。いくつかのイントロンがmRNAの翻訳及び機能を有意に増強させることが知られている。したがって、イントロン配列の組み入れもまた本明細書において使用され得る。標準イントロン、例えばβ‐グロビン又は哺乳動物スプライシングコンベンションに従う任意のイントロン、例えばMCM7を利用することができる。一実施形態において、本明細書におけるDNA免疫療法ワクチンベクターは、1つ又は複数のイントロンをコードする配列を含む。別の実施形態において、本明細書におけるDNA免疫療法ワクチンベクターは、イントロンをコードする配列を保有しない。
【０１０６】
リボソーム休止タグ:本発明に関して、タンパク質産物を分離するために、本明細書のDNA免疫療法ワクチンベクター/プラスミド中のタンパク質コード配列間に1つ又は複数のリボソーム休止タグ配列を含めるのが有利であり得る。
【０１０７】
一例は、ウイルス「FMDV 2Aタグ」(口蹄疫ウイルス2Aタグ)である。FMDV 2Aの翻訳されたアミノ酸配列は、APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP -(配列番号15)である。FMDV 2Aタグは、リボソームを休止し、再開することができる。FMDV 2Aタグの前後の翻訳産物の比はほぼ1:1であり、得られたタンパク質産物は、通常完全に分離されている。これらのタイプのリボソームタグは、これまで、2つの異なるドメイン、例えば組換え抗体産生における重鎖及び軽鎖の同時発現に関して使用されてきた。しかし、本発明の発明者は、それらが、隣接する産物の分離と、リボソーム再開の固有の効率による発現タンパク質の割合の調節の両方のために、マルチシストロン性DNAワクチンに関して有用であるという驚くべき発見をした。翻訳産物の1:1比率を促進する配列タグは、本明細書において好ましくは、1:1比率で(又はほぼその比率で)例えばインスリン抗原と強力なサイトカイン、例えばTGF-βが好ましくは産生されるはずである2つのタンパク質コード配列の間に挿入される。
【０１０８】
本明細書におけるリボソーム休止タグ配列の別の例は、ウイルス配列タグ「TaV 2A」(ゾセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルス2A - TaV 2Aの翻訳されたアミノ酸配列:RAEGRGSLLTCGDVEENPGP(配列番号16))である。このタグの前/上流と後/下流の翻訳産物の比率は50:1(又はそれとほぼ同じ比率)であると報告されている。本発明の発明者は、1つの翻訳産物が絶対的に他よりも優勢であることが不可欠である場合にこのタイプのタグを使用して発現レベルを調節することができるが、隣接するサイトカイン産物の分離が文献に開示されている配列に対して50%未満であり、発現比率は約10:6であるという驚くべき発見をした。本発明に関して、2Aタイプのリボソーム休止タグ配列は、好ましくは、同じベクター/プラスミドによってコードされている2つのタンパク質の異なる発現レベルをもたらすはずである。抗炎症サイトカイン(例えばIL-10)に対して少量の多面発現性サイトカイン(例えばIL-2)発現は本明細書において望ましく、また融合産物は望ましくない。
【０１０９】
本明細書におけるリボソーム休止タグアミノ酸配列のさらなる例は、ウイルス配列「P 2A(ブタテチオウイルス(Porcine teschovirus)-1 2A(ATNFSLLKQAGDVEENPGP(配列番号17)である。P 2A配列は、本明細書においてIL-10とIL-2との間に挿入した場合、適切に機能し、IL-10とIL-2との間の発現比が>5:1でほぼ完全な分離が生じる。
【０１１０】
或いは、プラスミド発現ポリタンパク質間を内因性切断することができるプロテイナーゼ感受性配列を本明細書において使用することができる。フューリン感受性配列(RAKRモチーフを認識)又はカルボキシペプチダーゼ感受性配列(RRRR、RKRR又はRRKRモチーフを認識)は、タンパク質産物を分離するために本明細書において使用することができる。しかし、本発明の発明者は、フューリンもカルボキシペプチダーゼ切断配列も本明細書における分離された産物をもたらさず、したがって、望ましくないIL-10/IL-2融合タンパク質の分泌につながるという驚くべき発見をした。
【０１１１】
TGF-b/β/β1(形質転換増殖因子ベータ/β1):TGF-βは、ほとんどの細胞の増殖、細胞分化及び他の機能を調節する分泌タンパク質である。TGF-βは、例えば同時に受け取られる他のサイトカインシグナルに応じて、状況依存的な方法で細胞運命及び表現型に対する有意な効果を有する非常に強力なサイトカインである。内因性TGF-βは、生産細胞の外膜表面と会合した潜在形態で産生され、活性型の成熟及び放出のために(例えばCD36及びプラスミンプロテイナーゼを発現する炎症性マクロファージによる)活性化を必要とする。一実施形態において、本明細書のTGF-βは構成的に活性な改変型である。これは、223位及び225位のシステインをジスルフィド架橋の形成が不可能なアミノ酸と置き換えることにより達成される。例えば、セリン又はバリンを使用して223位及び225位のシステインを置き換える。これは、局所的微環境に放出される活性プロタンパク質構造をもたらす。
【０１１２】
ヒト内在性TGF-β1配列-配列番号18:
MPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS
【０１１３】
構成的に活性で分泌される改変型ヒトTGF-β1配列(wt TGF-β1に対する置換は太字及び下線で示す) -  配列番号19:
【化５】
2020062057.tif 000006
【０１１４】
使用され得る別の改変型ヒトTGF-β1配列は、配列番号25である:
MPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHSSSDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS
【０１１５】
ターミネーター配列:転写ターミネーターは、転写中に遺伝子の末端をマークする核酸配列の区画である。転写複合体の放出によりRNAポリメラーゼ及び関連の転写機構はフリーになり、新しいmRNAの転写を開始する。更に、同じ細胞因子が鋳型化されていない「ポリAテイル」を付加し、これはmRNAの寿命及び機能性を優位に増強する。本明細書における適切な転写ターミネーターの一例は、「bGH_PA」ターミネーターを含む、CGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG (配列番号20)。
【０１１６】
任意の許容されるターミネーター配列を本明細書において利用することができる。バリエーションは、2つの逆方向のmRNAを産生する双方向性プロモーターの例における2つの異なる隣接するターミネーター配列の使用を含む。
【０１１７】
一実施形態において、本発明のプラスミドは、配列番号24に記載した配列を有する。
【０１１８】
第2の実施形態において、本発明のプラスミドは、配列番号26の配列を有する:完全(注釈なし)プラスミド配列
GACTCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCACTGCAGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTAGGTAAGTTAATGAGACAGATAGAAACTGGTCTTGTAGAAACAGAGTAGTCGCCTGCTTTTCTGCCAGGTGCTGACTTCTCTCCCCTGGGCTTTTTTCTTTTTCTCAGGTTGAAAAGAAGAAGACGAAGAAGACGAAGAAGACAAACCGTCGTCGACTGCCATGCGCCGCTGATTAACGCCGCCACCATGGCCCACCGACGCAGATCCAGAAGCTGCCGTGAGGACCAGAAGCCCGTGATGGATGATCAGAGGGACCTTATCTCTAACAATGAACAACTGCCAATGCTCGGCAGACGGCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCAGAGGAGCCTTGTACACGGGGTTCTCCATTTTAGTGACTCTCCTTCTCGCCGGCCAAGCTACCACCGCCTACTTTCTGTACCAACAGCAAGGCAGACTAGACAAACTGACAATCACAAGCCAGAACCTTCAGCTGGAGTCTCTGCGGATGAAGCTGCCCGCTTTGTGGATGAGATTGCTTCCTCTACTTGCTCTCCTGGCGCTCTGGGGACCTGACCCCGAGCAAGAGTTTGTTAATCAGCACCTGTGTGGGAGTCATCTGGTGGAGGCACTCTATTTAGTGTGCGGAGAGAGGGGCTTCTTCTACACTCCAAAGACCAGACGGGAGGCCGAAGACCTTCAAGTGGGGCAAGTAGAACTGGGTGGCGGACCCGGTGCCGGGAGCCTTCAGCCGCTCGCCCTGGAGGGCTCTCTTCAGAAACGCGGCATCGTGGAGCAGTGTTGCACATCCATTTGCTCACTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACGGAAGCGGAGTGAAGCAGACGTTGAATTTTGATTTGTTGAAGTTGGCGGGGGATGTGGAGAGCAATCCGGGGCCGATGCCCCCTAGTGGCCTCAGACTTTTGTTATTGTTATTACCGCTTTTATGGCTCTTGGTGCTGACACCGGGCCGTCCGGCTGCTGGCTTGTCGACTTGTAAGACAATTGATATGGAATTGGTGAAACGAAAACGGATTGAGGCCATCCGAGGACAGATTTTGAGCAAGCTGCGGCTTGCCTCGCCACCCTCGCAAGGGGAAGTCCCACCCGGACCTCTACCAGAAGCAGTCCTAGCGCTGTACAACAGTACAAGAGATAGAGTGGCCGGGGAATCCGCAGAACCAGAGCCTGAGCCTGAAGCCGATTATTATGCAAAGGAAGTGACTAGGGTCCTGATGGTCGAGACCCATAACGAAATCTACGACAAATTCAAACAAAGTACCCACTCTATCTACATGTTCTTCAACACCAGTGAGCTAAGAGAAGCCGTGCCCGAACCTGTGCTTCTTTCCCGCGCAGAACTCCGCCTCTTGAGACTCAAATTGAAAGTTGAACAACACGTAGAGCTTTACCAGAAATACTCTAATAATTCATGGCGATATCTTTCTAATCGTCTCCTCGCCCCATCTGACAGCCCTGAATGGCTCTCCTTCGACGTTACGGGAGTTGTGCGCCAGTGGCTCAGCAGAGGCGGAGAGATAGAGGGCTTTCGGCTGAGCGCACATAGCTCTAGCGACTCAAGGGACAACACATTGCAAGTGGATATTAACGGTTTTACAACTGGACGGAGAGGGGACCTGGCGACCATCCACGGCATGAATAGACCTTTCCTGCTGCTGATGGCTACTCCCCTGGAGAGGGCACAGCACTTACAGTCTTCCAGACACCGGCGCGCCCTGGATACAAACTACTGCTTCAGCTCCACCGAAAAGAACTGTTGCGTGCGGCAGCTGTACATTGACTTCAGAAAGGATCTGGGCTGGAAGTGGATTCATGAGCCCAAGGGGTATCATGCCAACTTCTGTCTTGGGCCATGCCCATACATCTGGTCACTGGATACCCAGTACTCCAAAGTTCTGGCCTTGTACAATCAACACAACCCTGGAGCTTCCGCCGCTCCTTGCTGTGTGCCCCAAGCCCTAGAGCCCCTGCCCATCGTTTATTATGTCGGACGCAAGCCCAAAGTAGAACAGCTATCAAATATGATCGTGAGAAGCTGCAAGTGTAGCTGATAAACGCGTCGAGCATGCATCTAGGGCGGCCAATTCCGCCCCTCTCCCCCCCACCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGTAGACAGCGGAACCCCCCACCTGGCGATAGATGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGCAACCTGCCTAACATGCTTCGAGATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGGATCAGCTGGACAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTCCCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTGAGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAACGGGAGCGGCGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGTACAGAATGCAGCTGCTGAGCTGCATCGCCCTGAGCCTGGCCCTGGTGACCAACAGCGCACCCACGTCCTCTAGCACCAAGAAGACCCAGTTACAGTTGGAGCATCTACTTTTAGACCTGCAAATGATTTTGAACGGCATCAACAACTACAAGAATCCTAAACTTACTCGCATGCTTACCTTCAAATTTTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAACTGAAGCACTTGCAATGTCTGGAGGAAGAACTCAAGCCGCTGGAGGAAGTTCTCAACCTCGCGCAGTCCAAGAATTTCCACCTCCGGCCAAGAGACCTGATCAGTAACATTAATGTGATAGTGCTGGAGCTGAAGGGAAGCGAGACTACATTTATGTGCGAGTACGCCGATGAAACCGCTACAATCGTCGAGTTCCTGAATAGATGGATCACATTTTGCCAGTCAATTATCTCTACTCTGACATGATAACTCGAGGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGGCCAAAGAAGACAATATTGAAATGCAAGGTACCGTTCTTGAAACGTTGCCTAATACCATGTTCCGCGTAGAGTTAGAAAACGGTCACGTGGTTACTGCACACATCTCCGGTAAAATGCGCAAAAACTACATCCGCATCCTGACGGGCGACAAAGTGACTGTTGAACTGACCCCGTACGACCTGAGCAAAGGCCGCATTGTCTTCCGTAGTCGCTGATAAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT
【０１１９】
第3の実施形態において、本発明のプラスミドは、配列番号28の配列を有する:完全(注釈なし)プラスミド配列
GACTCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTAGGTAAGTTAATGAGACAGATAGAAACTGGTCTTGTAGAAACAGAGTAGTCGCCTGCTTTTCTGCCAGGTGCTGACTTCTCTCCCCTGGGCTTTTTTCTTTTTCTCAGGTTGAAAAGAAGAAGACGAAGAAGACGAAGAAGACAAACCGTCGTCGACTGCCATGCGCCGCTGATTAACGCCGCCACCATGGCCCACCGACGCAGATCCAGAAGCTGCCGTGAGGACCAGAAGCCCGTGATGGATGATCAGAGGGACCTTATCTCTAACAATGAACAACTGCCAATGCTCGGCAGACGGCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCAGAGGAGCCTTGTACACGGGGTTCTCCATTTTAGTGACTCTCCTTCTCGCCGGCCAAGCTACCACCGCCTACTTTCTGTACCAACAGCAAGGCAGACTAGACAAACTGACAATCACAAGCCAGAACCTTCAGCTGGAGTCTCTGCGGATGAAGCTGCCCGCTTTGTGGATGAGATTGCTTCCTCTACTTGCTCTCCTGGCGCTCTGGGGACCTGACCCCGAGCAAGAGTTTGTTAATCAGCACCTGTGTGGGAGTCATCTGGTGGAGGCACTCTATTTAGTGTGCGGAGAGAGGGGCTTCTTCTACACTCCAAAGACCAGACGGGAGGCCGAAGACCTTCAAGTGGGGCAAGTAGAACTGGGTGGCGGACCCGGTGCCGGGAGCCTTCAGCCGCTCGCCCTGGAGGGCTCTCTTCAGAAACGCGGCATCGTGGAGCAGTGTTGCACATCCATTTGCTCACTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACGGAAGCGGAGTGAAGCAGACGTTGAATTTTGATTTGTTGAAGTTGGCGGGGGATGTGGAGAGCAATCCGGGGCCGATGCCCCCTAGTGGCCTCAGACTTTTGTTATTGTTATTACCGCTTTTATGGCTCTTGGTGCTGACACCGGGCCGTCCGGCTGCTGGCTTGTCGACTTGTAAGACAATTGATATGGAATTGGTGAAACGAAAACGGATTGAGGCCATCCGAGGACAGATTTTGAGCAAGCTGCGGCTTGCCTCGCCACCCTCGCAAGGGGAAGTCCCACCCGGACCTCTACCAGAAGCAGTCCTAGCGCTGTACAACAGTACAAGAGATAGAGTGGCCGGGGAATCCGCAGAACCAGAGCCTGAGCCTGAAGCCGATTATTATGCAAAGGAAGTGACTAGGGTCCTGATGGTCGAGACCCATAACGAAATCTACGACAAATTCAAACAAAGTACCCACTCTATCTACATGTTCTTCAACACCAGTGAGCTAAGAGAAGCCGTGCCCGAACCTGTGCTTCTTTCCCGCGCAGAACTCCGCCTCTTGAGACTCAAATTGAAAGTTGAACAACACGTAGAGCTTTACCAGAAATACTCTAATAATTCATGGCGATATCTTTCTAATCGTCTCCTCGCCCCATCTGACAGCCCTGAATGGCTCTCCTTCGACGTTACGGGAGTTGTGCGCCAGTGGCTCAGCAGAGGCGGAGAGATAGAGGGCTTTCGGCTGAGCGCACATAGCTCTAGCGACTCAAGGGACAACACATTGCAAGTGGATATTAACGGTTTTACAACTGGACGGAGAGGGGACCTGGCGACCATCCACGGCATGAATAGACCTTTCCTGCTGCTGATGGCTACTCCCCTGGAGAGGGCACAGCACTTACAGTCTTCCAGACACCGGCGCGCCCTGGATACAAACTACTGCTTCAGCTCCACCGAAAAGAACTGTTGCGTGCGGCAGCTGTACATTGACTTCAGAAAGGATCTGGGCTGGAAGTGGATTCATGAGCCCAAGGGGTATCATGCCAACTTCTGTCTTGGGCCATGCCCATACATCTGGTCACTGGATACCCAGTACTCCAAAGTTCTGGCCTTGTACAATCAACACAACCCTGGAGCTTCCGCCGCTCCTTGCTGTGTGCCCCAAGCCCTAGAGCCCCTGCCCATCGTTTATTATGTCGGACGCAAGCCCAAAGTAGAACAGCTATCAAATATGATCGTGAGAAGCTGCAAGTGTAGCTGATAAACGCGTCGAGCATGCATCTAGGGCGGCCAATTCCGCCCCTCTCCCCCCCACCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGTAGACAGCGGAACCCCCCACCTGGCGATAGATGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGCAACCTGCCTAACATGCTTCGAGATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGGATCAGCTGGACAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTCCCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTGAGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAACGGGAGCGGCGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGTACAGAATGCAGCTGCTGAGCTGCATCGCCCTGAGCCTGGCCCTGGTGACCAACAGCGCACCCACGTCCTCTAGCACCAAGAAGACCCAGTTACAGTTGGAGCATCTACTTTTAGACCTGCAAATGATTTTGAACGGCATCAACAACTACAAGAATCCTAAACTTACTCGCATGCTTACCTTCAAATTTTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAACTGAAGCACTTGCAATGTCTGGAGGAAGAACTCAAGCCGCTGGAGGAAGTTCTCAACCTCGCGCAGTCCAAGAATTTCCACCTCCGGCCAAGAGACCTGATCAGTAACATTAATGTGATAGTGCTGGAGCTGAAGGGAAGCGAGACTACATTTATGTGCGAGTACGCCGATGAAACCGCTACAATCGTCGAGTTCCTGAATAGATGGATCACATTTTGCCAGTCAATTATCTCTACTCTGACATGATAACTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGGCCAAAGAAGACAATATTGAAATGCAAGGTACCGTTCTTGAAACGTTGCCTAATACCATGTTCCGCGTAGAGTTAGAAAACGGTCACGTGGTTACTGCACACATCTCCGGTAAAATGCGCAAAAACTACATCCGCATCCTGACGGGCGACAAAGTGACTGTTGAACTGACCCCGTACGACCTGAGCAAAGGCCGCATTGTCTTCCGTAGTCGCTGATAAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT
【０１２０】
第4の実施形態において、本発明のプラスミドは、配列番号29の配列を有する:完全(注釈なし)プラスミド配列
GACTCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTAGGTAAGTTAATGAGACAGATAGAAACTGGTCTTGTAGAAACAGAGTAGTCGCCTGCTTTTCTGCCAGGTGCTGACTTCTCTCCCCTGGGCTTTTTTCTTTTTCTCAGGTTGAAAAGAAGAAGACGAAGAAGACGAAGAAGACAAACCGTCGTCGACTGCCATGCGCCGCTGATTAACGCCGCCACCATGGCCCACCGACGCAGATCCAGAAGCTGCCGTGAGGACCAGAAGCCCGTGATGGATGATCAGAGGGACCTTATCTCTAACAATGAACAACTGCCAATGCTCGGCAGACGGCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCAGAGGAGCCTTGTACACGGGGTTCTCCATTTTAGTGACTCTCCTTCTCGCCGGCCAAGCTACCACCGCCTACTTTCTGTACCAACAGCAAGGCAGACTAGACAAACTGACAATCACAAGCCAGAACCTTCAGCTGGAGTCTCTGCGGATGAAGCTGCCCGCTTTGTGGATGAGATTGCTTCCTCTACTTGCTCTCCTGGCGCTCTGGGGACCTGACCCCGAGCAAGAGTTTGTTAATCAGCACCTGTGTGGGAGTCATCTGGTGGAGGCACTCTATTTAGTGTGCGGAGAGAGGGGCTTCTTCTACACTCCAAAGACCAGACGGGAGGCCGAAGACCTTCAAGTGGGGCAAGTAGAACTGGGTGGCGGACCCGGTGCCGGGAGCCTTCAGCCGCTCGCCCTGGAGGGCTCTCTTCAGAAACGCGGCATCGTGGAGCAGTGTTGCACATCCATTTGCTCACTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACGGAAGCGGAGTGAAGCAGACGTTGAATTTTGATTTGTTGAAGTTGGCGGGGGATGTGGAGAGCAATCCGGGGCCGATGCCCCCTAGTGGCCTCAGACTTTTGTTATTGTTATTACCGCTTTTATGGCTCTTGGTGCTGACACCGGGCCGTCCGGCTGCTGGCTTGTCGACTTGTAAGACAATTGATATGGAATTGGTGAAACGAAAACGGATTGAGGCCATCCGAGGACAGATTTTGAGCAAGCTGCGGCTTGCCTCGCCACCCTCGCAAGGGGAAGTCCCACCCGGACCTCTACCAGAAGCAGTCCTAGCGCTGTACAACAGTACAAGAGATAGAGTGGCCGGGGAATCCGCAGAACCAGAGCCTGAGCCTGAAGCCGATTATTATGCAAAGGAAGTGACTAGGGTCCTGATGGTCGAGACCCATAACGAAATCTACGACAAATTCAAACAAAGTACCCACTCTATCTACATGTTCTTCAACACCAGTGAGCTAAGAGAAGCCGTGCCCGAACCTGTGCTTCTTTCCCGCGCAGAACTCCGCCTCTTGAGACTCAAATTGAAAGTTGAACAACACGTAGAGCTTTACCAGAAATACTCTAATAATTCATGGCGATATCTTTCTAATCGTCTCCTCGCCCCATCTGACAGCCCTGAATGGCTCTCCTTCGACGTTACGGGAGTTGTGCGCCAGTGGCTCAGCAGAGGCGGAGAGATAGAGGGCTTTCGGCTGAGCGCACATAGCTCTAGCGACTCAAGGGACAACACATTGCAAGTGGATATTAACGGTTTTACAACTGGACGGAGAGGGGACCTGGCGACCATCCACGGCATGAATAGACCTTTCCTGCTGCTGATGGCTACTCCCCTGGAGAGGGCACAGCACTTACAGTCTTCCAGACACCGGCGCGCCCTGGATACAAACTACTGCTTCAGCTCCACCGAAAAGAACTGTTGCGTGCGGCAGCTGTACATTGACTTCAGAAAGGATCTGGGCTGGAAGTGGATTCATGAGCCCAAGGGGTATCATGCCAACTTCTGTCTTGGGCCATGCCCATACATCTGGTCACTGGATACCCAGTACTCCAAAGTTCTGGCCTTGTACAATCAACACAACCCTGGAGCTTCCGCCGCTCCTTGCTGTGTGCCCCAAGCCCTAGAGCCCCTGCCCATCGTTTATTATGTCGGACGCAAGCCCAAAGTAGAACAGCTATCAAATATGATCGTGAGAAGCTGCAAGTGTAGCTGATAAACGCGTCGAGCATGCATCTAGGGCGGCCAATTCCGCCCCTCTCCCCCCCACCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGTAGACAGCGGAACCCCCCACCTGGCGATAGATGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGCAACCTGCCTAACATGCTTCGAGATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGGATCAGCTGGACAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTCCCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTGAGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAACGGGAGCGGCGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGTACAGAATGCAGCTGCTGAGCTGCATCGCCCTGAGCCTGGCCCTGGTGACCAACAGCGCACCCACGTCCTCTAGCACCAAGAAGACCCAGTTACAGTTGGAGCATCTACTTTTAGACCTGCAAATGATTTTGAACGGCATCAACAACTACAAGAATCCTAAACTTACTCGCATGCTTACCTTCAAATTTTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAACTGAAGCACTTGCAATGTCTGGAGGAAGAACTCAAGCCGCTGGAGGAAGTTCTCAACCTCGCGCAGTCCAAGAATTTCCACCTCCGGCCAAGAGACCTGATCAGTAACATTAATGTGATAGTGCTGGAGCTGAAGGGAAGCGAGACTACATTTATGTGCGAGTACGCCGATGAAACCGCTACAATCGTCGAGTTCCTGAATAGATGGATCACATTTTGCCAGTCAATTATCTCTACTCTGACATGATAACTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGGCCAAAGAAGACAATATTGAAATGCAAGGTACCGTTCTTGAAACGTTGCCTAATACCATGTTCCGCGTAGAGTTAGAAAACGGTCACGTGGTTACTGCACACATCTCCGGTAAAATGCGCAAAAACTACATCCGCATCCTGACGGGCGACAAAGTGACTGTTGAACTGACCCCGTACGACCTGAGCAAAGGCCGCATTGTCTTCCGTAGTCGCTGATAAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT
【０１２１】
本明細書において使用される用語「GLP-1/GLP-1ペプチド/GLP-1Rアゴニストペプチド」は、GLP-1分子/ペプチド/タンパク質/変異体/アゴニストを本明細書では意味し、それらはGLP-1受容体のアゴニストであることを意味するGLP-1Rアゴニスト機能を有する分子である。このクラスの薬剤は、通常、糖尿病、特に2型糖尿病の処置に使用される。成熟「ヒトGLP-1」のアミノ酸配列は次のとおりである:HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(配列番号21)。
【０１２２】
本明細書で使用される場合の用語「GLP-1類似体」は、GLP-1(配列番号15)の変異体である、ペプチド又は化合物を意味する。用語「GLP-1類似体」及び「類似体」は、本明細書において同義的に使用されてもよい。
【０１２３】
GLP-1類似体は、i)改変されているアミノ酸残基に対応する(すなわち、GLP-1(配列番号15)の対応する位置)ヒトGLP-1(配列番号15)のアミノ酸残基の数、及び、ii)実際の改変に言及することによって説明することができる。
【０１２４】
用語のGLP-1誘導体とは、GLP-1類似体の誘導体を意味する。GLP-1類似体の文脈で本明細書において使用される場合の用語「誘導体」とは、1つ又は複数の置換基がGLP-1類似体に共有結合で結合されている化学的に改変されたGLP-1類似体を意味する。本明細書で使用される場合の用語「置換基」とは、GLP-1タンパク質/アゴニスト/類似体にコンジュゲートされている化学的部分又は基/側鎖基を意味する。誘導体は、アミド、炭水化物、アルキル基、アシル基、エステル等から選択される1つ又は複数の改変を含み得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、置換基は、例えば、22、23、27、34、35及び36位からなる群から選択されるアミノ酸位置のうちの1つで、前記ポリペプチド中のアミノ酸残基を介して共有結合されている。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、GLP-1誘導体は、親油性部分を含む置換基を含む。本明細書で使用される場合の用語「親油性部分」とは、6個よりも多く30個未満の炭素原子を有する脂肪族部分又は環式炭化水素部分を意味し、ここで、前記炭化水素部分はさらなる置換基を含んでいてもよい。
【０１２７】
GLP-1アゴニストの例としては、(限定するものではないが)エクセナチド、リラグルチド、リキシセンチド、アルビグルチド、ダルグルチド、タスポグルチド、及びセマグルチドが挙げられる。本明細書におけるプラスミドを使用するDNA免疫療法ワクチンは、例えば最近の発病したT1D患者の処置において、最初に並行GLP-1Rアゴニスト処置と組み合わせることができる。GLP-1の同時投与は、長期的であっても一時的であってもよく、また非経口経路に加えて経口経路を含んでいてもよい。
【０１２８】
リラグルチド:(配列番号22):
【化６】
2020062057.tif 000007
【０１２９】
セマグルチド(配列番号23):
【化７】
2020062057.tif 000008
【０１３０】
本明細書における医薬組成物は、好ましくは、少なくとも50%の水、より好ましくは少なくとも60%の水、より好ましくは少なくとも75%の水、より好ましくは少なくとも90%の水、より好ましくは少なくとも95%の水、最も好ましくは少なくとも99%の水を含む水性製剤である。本明細書における医薬組成物は、或いは乾燥製剤、例えば再構成、吸入、鼻腔内点滴注入、皮内投与等を目的とした凍結乾燥製剤等であってもよい。
【０１３１】
本明細書の医薬製剤は、好ましくは、形質転換、たとえばエレクトロポレーションを増強する方法を使用することなく投与される。一実施形態において、医薬製剤は、非経口投与、例えば皮下投与、皮内投与、静脈内投与、筋内投与等を意図する。別の実施形態において、本明細書における医薬組成物は、更に、局所投与、経口投与、直腸投与、又は吸入投与され得る。
【０１３２】
本明細書における医薬組成物は、局所反応を誘導し得るあらゆる縮合剤又は他の賦形剤を添加しないことが好ましい。本明細書における製剤は、好ましくは、フリーラジカルスカベンジャー(例えば1%エタノール)、及び/又はキレート剤例えば2価カチオンスカベンジャー(例えばEDTA[CAS #60-00-4]、EGTA[CAS #67-42-5]、又はDPTA[CAS #67-43-6])を水性プラスミドDNAの安定性を高めるために含有することができる。本明細書における医薬組成物は、更に、食塩水及び/又は緩衝液の形態をしていてもよく、或いは食塩水を含む且つ/又は緩衝液(例えば、PBS-リン酸緩衝食塩水、トリス緩衝液又は同等の薬学的に許容される緩衝液)を含んでいてもよい。本明細書における医薬製剤は、他の典型的なワクチン成分、例えば水酸化アルミニウム、フェノール、ソルビトール、シリコーン等に加えていかなるアジュバントも含まないのが好ましい。
【０１３３】
投与:本明細書におけるDNA免疫療法ワクチンは、T1D患者、又はT1Dを発症する危険のある患者に投与することができる。ワクチンは、例えば毎日、隔日、週に2回、週に1回、月に2回、月に1回、隔月、年に4回、又は年に1回投与することができ、頻度は一般的な必要性又は個々の必要性により調節することができる。本明細書における免疫療法は、長期的であってもよい。療法の期間は、例えば1か月、2か月、3か月、6か月、1年、2年、3年、5年、6年、7年、8年、9年、又は10年であり得る。
【０１３４】
実施形態
以下の実施形態は本発明を説明するものであり、一切限定的に理解されるものではない。すべての実施形態はあらゆる可能な方法で組み合わせることができることを理解されたい。
【０１３５】
1.i.抗原;
ii.TGF-β;及び
iii.IL-10
をコードするプラスミド。
【０１３６】
2.前記抗原がインスリン抗原である、実施形態1に記載のプラスミド。
【０１３７】
3.(i)抗原、例えばインスリン抗原;(ii)TGF-β/TGF-β1(例えば構成的に活性な形態);及び(iii)IL-10を(好ましくは単一のオペロンから)同時発現する/コードするプラスミド。
【０１３８】
4.前記インスリン抗原がプロインスリン、分泌不可能なプレプロインスリン、又はそれらの機能性若しくは免疫優性ペプチド断片からなる群から選択される、実施形態1から3のいずれかに記載のプラスミド。
【０１３９】
5.前記インスリン抗原がプロインスリン、プレプロインスリン、及びそれらの機能性又は免疫優性ペプチド断片からなる群から選択される、実施形態1から4のいずれかに記載のプラスミド。
【０１４０】
6.前記インスリン抗原がエンドソーム標的化インスリンである、実施形態1から5のいずれかに記載のプラスミド。
【０１４１】
7.前記プラスミドがインスリン抗原とTGF-βを約1:1の比で発現する、実施形態1から6のいずれかに記載のプラスミド。
【０１４２】
8.前記プラスミドがIL-10よりも少なくとも1/200未満の量でインスリン抗原及びTGF-βを発現する、実施形態1から7のいずれかに記載のプラスミド。
【０１４３】
9.前記プラスミドがIL-10よりも少なくとも1/2未満の量でインスリン抗原及びTGF-βを発現する、実施形態1から8のいずれかに記載のプラスミド。
【０１４４】
10.前記プラスミドがインターロイキン-2(IL-2)を更に同時発現する、実施形態1から9のいずれかに記載のプラスミド。
【０１４５】
11.前記プラスミドが抗原(例えばインスリン)及びTGF-βよりも過剰のIL-10及びIL-2を発現する、実施形態1から10のいずれかに記載のプラスミド。
【０１４６】
12.前記プラスミドがTGF-β及びインスリン抗原よりも少なくとも約1倍、2倍、5倍又は少なくとも約100倍のIL-10及びIL-2を発現する(IL-10+IL-2のインスリン+TGF-βに対する比が少なくとも1:1、又は2:1、又は5:1、又は100:1であり得る)、実施形態1から11のいずれかに記載のプラスミド。
【０１４７】
13.前記プラスミドがTGF-β及びインスリン抗原よりも少なくとも約100倍、200倍、500倍又は少なくとも約1000倍のIL-10及びIL-2を発現する(IL-10+IL-2のインスリン+TGF-βに対する比が少なくとも100:1、又は200:1、又は500:1、又は1000:1であり得る)、実施形態1から12のいずれかに記載のプラスミド。
【０１４８】
14.前記プラスミドが約1:1〜100:1、例えば1:1〜50:1、例えば1:1〜25:1、例えば1:1〜10:1、或いは1:1〜5:1、或いは1:1〜3:1、或いは1:1〜2:1の比でIL-10及びIL-2を発現する、実施形態1から13のいずれかに記載のプラスミド。或いは、発現されたIL-10と発現されたIL-2との間の比は、約1:1、1:0.9、1:0.8、1:0,7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2、又は1:0.1であってもよい。
【０１４９】
15.前記プラスミドが、(i)インスリン抗原コード配列とTGF-βコード配列を分離するFMDV 2Aエレメント、(ii)TGF-βコード配列とIL-10コード配列を分離するEMCV IRESエレメント、及び(iii)IL-10コード配列とIL-2コード配列を分離する2Aエレメントを含む、実施形態1から14のいずれかに記載のプラスミド。
【０１５０】
16.前記プラスミドが
(i)インスリン抗原コード配列とTGF-βコード配列を分離する2Aエレメント(例えばFMDV 2A又はP 2Aエレメント)、
(ii)TGF-βコード配列とIL-10コード配列を分離するEMCV IRESエレメント(或いは双方向プロモーター)(好ましくは、3つのアラニンアミノ酸がIL-10遺伝子のN末端にじかにコードされている)、及び
(iii)IL-10コード配列及びIL-2コード配列を分離する2Aエレメント(例えばP 2Aエレメント)
を含む、実施形態1から15のいずれかに記載のプラスミド。
【０１５１】
17.TGF-βコード配列が構成的に活性なTGF-β、好ましくは、構成的に活性なヒトTGF-β1をコードする、実施形態1から16のいずれかに記載のプラスミド。
【０１５２】
18.前記プラスミドが、
(i)エンドソーム標的化プレプロインスリンコード配列、
(ii)FMDV 2Aエレメント、
(iii)TGF-βコード配列、
(iv)EMCV IRESエレメント、
(v)IL-10コード配列、
(vi)P 2Aエレメント、
(vii)IL-2コード配列、
(viii)  ポリアデニル化/終止エレメント、
(ix)選択遺伝子、
(x)複製起点、
(xi)真核生物プロモーターエレメント、
(xii)真核生物翻訳開始配列、
(xiii)エンドソーム選別配列、及び
(xiv)任意選択でイントロン
を含む、実施形態1から17のいずれかに記載のプラスミド。
【０１５３】
19.前記プラスミドが以下のエレメント:
(i)プロモーター(例えばCMV IEプロモーター)、
(ii)イントロン(非コードリーダー配列内に位置する)、及び
(iii)真核生物翻訳開始配列(例えばKozakエレメント)、
(iv)エンドソーム標的化抗原コード配列(例えばエンドソーム標的化ヒト分泌欠損プレプロインスリンコード配列)、
(v)抗原コード配列とTGF-βコード配列を好ましくは分離するFMDV 2Aエレメント、
(vi)TGF-βコード配列(例えば、構成的に活性なヒトTGF-βコード配列、好ましくは構成的に活性なヒトTGF-β1コード配列)、
(vii)TGF-βコード配列とIL-10コード配列を分離する、EMCV IRESエレメント(或いは双方向真核生物プロモーター)、
(viii)IL-10コード配列(例えば、3つのアラニンアミノ酸N末端付加を有するヒトIL-10コード配列)、
(ix)IL-10コード配列とIL-2コード配列を分離する、2Aエレメント、例えばP 2Aエレメント、
(x)IL-2コード配列(例えばヒトIL-2コード配列)、
(xi)終止エレメント(例えばbGH_PA終止エレメント)、
(xii)セレクション遺伝子(例えば、カナマイシンコード配列又はwt infAコード配列)、
(xiii)複製起点(例えば、原核生物の複製起点、例えばpUC ori)
を含む、実施形態1から18のいずれかに記載のプラスミド。
【０１５４】
20.エレメント(i)〜(xiii)が発現の順序で配置されている、実施形態18に記載のプラスミド。
【０１５５】
21.プラスミドのDNA配列が配列番号24に記載されている通りであるか、又は本質的に配列番号24に記載されている通りである、実施形態1から20のいずれかに記載のプラスミド。
【０１５６】
22.例えば1つ又は複数の抗原及び/又はサイトカインに1、2、3又は4個のアミノ酸置換を生じる、いくつかのマイナーな改変が本明細書の配列番号24に対して行われる、実施形態21に記載のプラスミド。
【０１５７】
23.プラスミドのDNA塩基配列が配列番号26に記載した通りであるか、1つ又は複数の抗原及び/又はサイトカインに1、2、3又は4個のアミノ酸置換を生じる配列番号26の改変体、或いは配列番号26と同じポリペプチド配列の発現を生じる配列番号26の改変体である、実施形態1から20のいずれかに記載のプラスミド。
【０１５８】
24.プラスミドのDNA配列が、配列番号26に記載の通りであるか、配列番号26とは異なる100塩基未満を有する配列番号26の改変体である、実施形態1から20のいずれかに記載のプラスミド。
【０１５９】
25.プラスミドのDNA配列が配列番号28に記載の通りであるか、1つ又は複数の抗原及び/又はサイトカインに1、2、3又は4個のアミノ酸置換を生じる配列番号28の改変体、或いは配列番号28と同じポリペプチド配列の発現を生じる配列番号28の改変体である、実施形態1から20のいずれかに記載のプラスミド。
【０１６０】
26.プラスミドのDNA配列が、配列番号28に記載の通りであるか、配列番号28とは異なる100塩基未満を有する配列番号28の改変体である、実施形態1から20のいずれかに記載のプラスミド。
【０１６１】
27.プラスミドのDNA配列が配列番号29に記載の通りであるか、1つ又は複数の抗原及び/又はサイトカインに1、2、3又は4個のアミノ酸置換を生じる配列番号29の改変体、或いは配列番号29と同じポリペプチド配列の発現を生じる配列番号29の改変体である、実施形態1〜20のいずれかに記載のプラスミド。
【０１６２】
28.プラスミドのDNA配列が、配列番号29に記載の通りであるか、配列番号29とは異なる100塩基未満を有する配列番号29の改変体である、実施形態1から20のいずれかに記載のプラスミド。
【０１６３】
29.前記プラスミドが配列番号25又は10個未満の塩基置換を有する配列番号25を含むTGF-β遺伝子を含む、実施形態1から20のいずれかに記載のプラスミド。
【０１６４】
30.I型糖尿病の遅延又は予防において使用するための、実施形態1から29のいずれかに記載のプラスミド。
【０１６５】
31.筋肉内投与、皮内投与、鼻腔内投与、又は皮下投与のための、実施形態1から30のいずれかに記載のプラスミド。
【０１６６】
32.皮下投与のための、実施形態31に記載のプラスミド。
【０１６７】
33.筋肉内注射のための、実施形態31に記載のプラスミド。
【０１６８】
34.対象の病状、例えばI型糖尿病、早期発症型I型糖尿病、又は発症のリスクの高いI型糖尿病(1,5型糖尿病型の状態を含む)の処置において使用するための、実施形態1から33のいずれかに記載のプラスミド。
【０１６９】
35.実施形態1〜34のいずれかに記載のプラスミドを含む、DNA免疫療法ワクチン。
【０１７０】
36.I型糖尿病の遅延又は予防において使用するための、実施形態35に記載のDNA免疫療法ワクチン。
【０１７１】
37.筋肉内投与、皮内投与、鼻腔内投与、又は皮下投与のための、実施形態35又は36に記載のDNA免疫療法ワクチン。
【０１７２】
38.皮下投与のための、実施形態37に記載のDNA免疫療法ワクチン。
【０１７３】
39.筋肉内投与のための、実施形態37に記載のDNA免疫療法ワクチン。
【０１７４】
40.生着させた細胞の生存及び有効性を延長させるために、他の種類の医学的処置、例えばβ細胞/β幹細胞療法、β細胞/β幹細胞移植等と組み合わせて、又は並行して使用される、実施形態35から39のいずれか一項に記載のDNA免疫療法ワクチン。
【０１７５】
41.前記医薬組成物が食塩水及び/又は緩衝液及び/又はキレート剤を含む、実施形態34から39のいずれかに記載のDNA免疫療法ワクチン、又は実施形態1から34のいずれかに記載のプラスミドを含む医薬組成物。
【０１７６】
42.前記医薬組成物が生理食塩水及び/又は緩衝液及び/又はキレート剤及び/又はエタノールを含む、実施形態35から40のいずれかに記載のDNA免疫療法ワクチン、又は実施形態1から34のいずれかに記載のプラスミドを含む医薬組成物。
【０１７７】
43.エタノールの体積/体積百分率が5%未満、4%未満、3%未満、2%未満又は1%未満である、実施形態41又は42に記載の医薬組成物。
【０１７８】
44.前記組成物がウイルス、脂質同時パッケージング剤、又は縮合剤のいずれも含まない、実施形態41から43のいずれかに記載の医薬組成物。
【０１７９】
45.前記組成物がGLP-1Rアゴニストを更に含む、実施形態41から44のいずれかに記載の医薬組成物。
【０１８０】
46.前記組成物がGLP-1類似体/GLP-1Rアゴニストを更に含む、実施形態41から44のいずれかに記載の医薬組成物。
【０１８１】
47.前記GLP-1類似体又は前記GLP-1Rアゴニストがリラグルチド、セマグルチド又はそれらの混合物から選択される、実施形態45又は46に記載の医薬組成物。
【０１８２】
48.実施形態41から47のいずれかに記載の医薬組成物とGLP-1類似体/GLP-1Rアゴニスト(例えばリラグルチド及び/又はセマグルチド)を含む医薬組成物を含むキット。
【０１８３】
49.(i)前記プラスミドで適切な条件下にてトランスフェクトした宿主細胞、例えば大腸菌等の細菌起源の宿主細胞をインキュベートする工程、及び(ii)前記プラスミドを回収/精製する工程を含む、実施形態1から34のいずれかに記載のプラスミドの製造方法。
【０１８４】
50.前記宿主細胞が大腸菌infA熱感受性株である、実施態様49に記載の方法。
【０１８５】
51.実施形態1から31のいずれかに記載のプラスミドを含むDNA免疫療法ワクチンを、任意選択でGLP-1類似体/GLP-1Rアゴニストと組み合わせて投与する工程を含む、T1Dを発症する危険性のある患者又は最近T1Dと診断された患者における1型糖尿病(T1D)又はそれらの症状の発症を遅延させる方法。
【０１８６】
52.実施形態1から34のいずれかに記載のプラスミドを含むDNA免疫療法ワクチンを、任意選択でGLP-1類似体/GLP-1Rアゴニストと組み合わせて投与する工程を含む、個体においてβ細胞機能及び/又は内因性インスリン産生を保存する方法。
【０１８７】
53.実施形態1から34のいずれかに記載のプラスミドを含むワクチンを、任意選択でGLP-1類似体/GLP-1Rアゴニスト(例えばリラグルチド及び/又はセマグルチド)と組み合わせて投与する工程を含む、糖尿病の個体を処置する方法。
【０１８８】
54.実施態様1から34のいずれかに記載のプラスミドを含む、T1Dを発症する危険性のある患者又は最近T1Dと診断された患者における1型糖尿病(T1D)症状の発症を予防又は遅延させるためのワクチン。
【０１８９】
55.実施形態1から33のいずれかに記載のプラスミドを含むDNA免疫療法ワクチンを、任意選択でGLP-1類似体/GLP-1Rアゴニスト(例えばリラグルチド及び/又はセマグルチド)と組み合わせて投与する工程を含む、1型糖尿病(T1D)を有する個体又はT1Dを発症する危険性のあるヒトにおいてインスリンの用量を低減する方法。
【実施例】
【０１９０】
非肥満性糖尿病マウス(1型糖尿病のNODマウスモデル):自己免疫における免疫機能は、in vitroでは十分に評価することができない細胞間相互作用の複合ネットワークに依存する。
【０１９１】
本明細書における疾患抑制及び/又は処置の評価はNODマウスモデルで実施されたが、このモデルは、ほとんどのマウスが12〜30週齢の間に高血糖濃度(BGV、尾静脈針刺し及び携帯型メーターから決定される血糖値)を発症する多遺伝子性自然発症モデルである。疾患の発生及び進行は予測不能であり、30週齢(WoA)での総発生率は60%〜95%の範囲に及び、診断(2連続のBGV測定値>250)から末期(2連続のBGV測定値600以上)での進行は2日〜4週間の範囲に及ぶ。連続する測定における高いBGVの再現が必要であるが、それはマウスが食物及び水を適宜摂取することができる場合に免疫病理学によって引き起こされるBGVよりも高い中程度のBGV変動性をもたらすためである。
【０１９２】
本明細書におけるプラスミドヌクレオチド配列の例:配列番号24:完全(注釈なし)プラスミド配列(6,401塩基対)
GACTCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCACTGCAGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTAGGTAAGTTAATGAGACAGATAGAAACTGGTCTTGTAGAAACAGAGTAGTCGCCTGCTTTTCTGCCAGGTGCTGACTTCTCTCCCCTGGGCTTTTTTCTTTTTCTCAGGTTGAAAAGAAGAAGACGAAGAAGACGAAGAAGACAAACCGTCGTCGACTGCCATGCGCCGCTGATTAACGCCGCCACCATGGCCCACCGACGCAGATCCAGAAGCTGCCGTGAGGACCAGAAGCCCGTGATGGATGATCAGAGGGACCTTATCTCTAACAATGAACAACTGCCAATGCTCGGCAGACGGCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCAGAGGAGCCTTGTACACGGGGTTCTCCATTTTAGTGACTCTCCTTCTCGCCGGCCAAGCTACCACCGCCTACTTTCTGTACCAACAGCAAGGCAGACTAGACAAACTGACAATCACAAGCCAGAACCTTCAGCTGGAGTCTCTGCGGATGAAGCTGCCCGCTTTGTGGATGAGATTGCTTCCTCTACTTGCTCTCCTGGCGCTCTGGGGACCTGACCCCGAGCAAGAGTTTGTTAATCAGCACCTGTGTGGGAGTCATCTGGTGGAGGCACTCTATTTAGTGTGCGGAGAGAGGGGCTTCTTCTACACTCCAAAGACCAGACGGGAGGCCGAAGACCTTCAAGTGGGGCAAGTAGAACTGGGTGGCGGACCCGGTGCCGGGAGCCTTCAGCCGCTCGCCCTGGAGGGCTCTCTTCAGAAACGCGGCATCGTGGAGCAGTGTTGCACATCCATTTGCTCACTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACGGAAGCGGAGTGAAGCAGACGTTGAATTTTGATTTGTTGAAGTTGGCGGGGGATGTGGAGAGCAATCCGGGGCCGATGCCCCCTAGTGGCCTCAGACTTTTGTTATTGTTATTACCGCTTTTATGGCTCTTGGTGCTGACACCGGGCCGTCCGGCTGCTGGCTTGTCGACTTGTAAGACAATTGATATGGAATTGGTGAAACGAAAACGGATTGAGGCCATCCGAGGACAGATTTTGAGCAAGCTGCGGCTTGCCTCGCCACCCTCGCAAGGGGAAGTCCCACCCGGACCTCTACCAGAAGCAGTCCTAGCGCTGTACAACAGTACAAGAGATAGAGTGGCCGGGGAATCCGCAGAACCAGAGCCTGAGCCTGAAGCCGATTATTATGCAAAGGAAGTGACTAGGGTCCTGATGGTCGAGACCCATAACGAAATCTACGACAAATTCAAACAAAGTACCCACTCTATCTACATGTTCTTCAACACCAGTGAGCTAAGAGAAGCCGTGCCCGAACCTGTGCTTCTTTCCCGCGCAGAACTCCGCCTCTTGAGACTCAAATTGAAAGTTGAACAACACGTAGAGCTTTACCAGAAATACTCTAATAATTCATGGCGATATCTTTCTAATCGTCTCCTCGCCCCATCTGACAGCCCTGAATGGCTCTCCTTCGACGTTACGGGAGTTGTGCGCCAGTGGCTCAGCAGAGGCGGAGAGATAGAGGGCTTTCGGCTGAGCGCACATGTATCTGTGGACTCAAGGGACAACACATTGCAAGTGGATATTAACGGTTTTACAACTGGACGGAGAGGGGACCTGGCGACCATCCACGGCATGAATAGACCTTTCCTGCTGCTGATGGCTACTCCCCTGGAGAGGGCACAGCACTTACAGTCTTCCAGACACCGGCGCGCCCTGGATACAAACTACTGCTTCAGCTCCACCGAAAAGAACTGTTGCGTGCGGCAGCTGTACATTGACTTCAGAAAGGATCTGGGCTGGAAGTGGATTCATGAGCCCAAGGGGTATCATGCCAACTTCTGTCTTGGGCCATGCCCATACATCTGGTCACTGGATACCCAGTACTCCAAAGTTCTGGCCTTGTACAATCAACACAACCCTGGAGCTTCCGCCGCTCCTTGCTGTGTGCCCCAAGCCCTAGAGCCCCTGCCCATCGTTTATTATGTCGGACGCAAGCCCAAAGTAGAACAGCTATCAAATATGATCGTGAGAAGCTGCAAGTGTAGCTGATAAACGCGTCGAGCATGCATCTAGGGCGGCCAATTCCGCCCCTCTCCCCCCCACCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGTAGACAGCGGAACCCCCCACCTGGCGATAGATGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCTGCCGCTCATTCTAGTGCCCTTCTTTGCTGCCTGGTCCTGCTCACCGGGGTGCGAGCTAGCCCTGGACAAGGGACACAATCCGAAAACTCGTGCACCCACTTCCCGGGCAACCTCCCTAACATGCTGAGGGACCTCCGTGATGCCTTCAGTAGAGTGAAGACGTTCTTCCAAATGAAAGATCAGTTAGATAACCTGCTCCTGAAGGAGTCACTCTTAGAAGACTTCAAAGGATACCTCGGCTGCCAAGCACTTAGCGAGATGATTCAATTCTACTTAGAAGAAGTCATGCCTCAAGCTGAGAATCAAGACCCCGACATCAAAGCTCATGTGAATTCTTTGGGAGAAAATTTGAAGACTTTGCGGCTGCGGCTGCGGAGATGTCACCGCTTTCTGCCCTGTGAGAACAAATCAAAAGCGGTCGAGCAAGTTAAGAATGCCTTCAATAAGCTACAAGAGAAGGGCATCTACAAAGCAATGAGCGAGTTTGATATCTTTATCAATTACATTGAAGCCTACATGACAATGAAGATTAGGAATGCCGCGGGGAGCGGCGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGTACAGAATGCAGCTGCTGAGCTGCATCGCCCTGAGCCTGGCCCTGGTGACCAACAGCGCACCCACGTCCTCTAGCACCAAGAAGACCCAGTTACAGTTGGAGCATCTACTTTTAGACCTGCAAATGATTTTGAACGGCATCAACAACTACAAGAATCCTAAACTTACTCGCATGCTTACCTTCAAATTTTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAACTGAAGCACTTGCAATGTCTGGAGGAAGAACTCAAGCCGCTGGAGGAAGTTCTCAACCTCGCGCAGTCCAAGAATTTCCACCTCCGGCCAAGAGACCTGATCAGTAACATTAATGTGATAGTGCTGGAGCTGAAGGGAAGCGAGACTACATTTATGTGCGAGTACGCCGATGAAACCGCTACAATCGTCGAGTTCCTGAATAGATGGATCACATTTTGCCAGTCAATTATCTCTACTCTGACATGATAACTCGAGGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGGCCAAAGAAGACAATATTGAAATGCAAGGTACCGTTCTTGAAACGTTGCCTAATACCATGTTCCGCGTAGAGTTAGAAAACGGTCACGTGGTTACTGCACACATCTCCGGTAAAATGCGCAAAAACTACATCCGCATCCTGACGGGCGACAAAGTGACTGTTGAACTGACCCCGTACGACCTGAGCAAAGGCCGCATTGTCTTCCGTAGTCGCTGATAAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT
【０１９３】
(実施例1)
抗原をコードするプラスミドの抗原+IL-10をコードするプラスミドとの比較:
プラスミド骨格における免疫刺激性CpG配列の枯渇がT1Dの有効なDNA免疫療法治療にとって必要であることが先行技術において示唆されている。したがって、この実験は、既に公開された実験の後でモデル化された(2008 J Immunol. 181(12):8298-307)。
【０１９４】
NODマウスに、週に1回の用量のプラスミドを9週(齢)で開始して8回投与した:空ベクター(pVAX1(50ug))を投与するか、又はpVAX1-プロインスリンAg(エンドソーム内で標的とされない、プレプロインスリンではない)、又は、CpG枯渇化pVAX1-プロインスリンAg、又は2シストロン性構築物pVAX1-IL10-IRESプロインスリンAgを等モル比で投与した。
【０１９５】
投与はすべてイソフルラン麻酔下で左大腿四頭筋内に筋肉内投与し、PBS+EDTA中にプラスミドのみを含有していた。BGVを週単位ですべてのマウスにおいて評価し、1型糖尿病の発生を、250mg/dlを超える2つのBGV測定値に基づいて記録した。30週齢又はBGVが600に到達するまでマウスを評価し、その後屠殺した。
【０１９６】
この実験の結果(Table 1(表1))は、A)、CpG枯渇は有効性にとって必要でも有益でもないこと、B)免疫調節サイトカインの封入は有意に有効性を増加させること、及びC)プラスミド骨格(空ベクター)は未処置の群と同等であること、を証明している。
【０１９７】
【表１】
2020062057.tif 000009
【０１９８】
(実施例2)
抗原、IL-10、IL-2及びTGF-βをコードするプラスミドから得られる発現タンパク質産物
マルチシストロン性プラスミドは、TGF-β、IL-10、及び任意選択でIL-2を同時発現するように作製した。Freestyle293細胞を一過性にトランスフェクトし、無血清培地で培養した。上清は収集し、72時間後にELISA定量化に供した。
【０１９９】
下記のtable 2(表2)の結果は以下のことを示す:A)複数の独立したサイトカインの発現が単一ベクターから達成される、B)かなりの量の各サイトカインが予測された比率で産生される、C)小さな配列変化が、第一世代IL-10/プロインスリンプラスミドからのIL-10発現を有意に改善する、及び、D)プラスミド骨格(空ベクター)又は抗原(IIAg)のエンドソーム標的化はいずれもサイトカイン産生又は調節異常を誘導しない。
【０２００】
【表２】
2020062057.tif 000010
【０２０１】
(実施例3)
疾患抑制に対するTGF-β及びIL-2の影響
マルチシストロン性プラスミドを、屠殺(糖尿病の発症)又は30週まで投与が毎週1回続けられたことを除き、実施例1と同様にNODマウスにおいて疾患予防について評価した。10週間の投与後に、10の標準的な高度灌流組織に対する病理学、全血球算定、及び臨床化学を含む、完全な剖検のために各群(開始n=24)から1匹のマウスを発送した。注射部位の物理的損傷による軽い筋肉破壊及び再成長を除き、非投与動物からの偏差はなかった。
【０２０２】
下記のtable 3(表3)の結果は以下のことを示す:A)TGFβの付加は有効性を有意に高める、B)インターロイキン-2の封入は有効性を高め、症状を誘発しない可能性がある、C)IL-10及び抗原を発現するプラスミドによる長期投与は疾患予防において有効性を高める、及びD)TGF-β、IL-10及びIL-2を発現するプラスミドによる長期投与は、いかなる安全シグナルも生じずに有効性を高める。
【０２０３】
【表３】
2020062057.tif 000011
【０２０４】
(実施例4)
IRESエレメント、イントロン、並びに皮下投与の評価
マルチシストロン性プラスミドは、長期的小児投与をより良好に模倣するために投与をより早期で(5週で)開始する点を除き、実施例3と同様にしてNODマウスにおいて疾患予防に対して評価した。イントロンを含有するpVAX1-IIAg/TGFβ/IL10及びpVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2プラスミドを検証することに加え、他の対照群を試験した。特に、EMCV[脳心筋炎ウイルス由来]に対する異なるIRESセグメント(CrPV[クリケット麻痺ウイルス由来])は、その必要性を評価するためのイントロンセグメントの欠失と同様に、有効性の予想される増加について評価した。親プラスミド(pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2)と比較して有効性に明白な欠如があったので、CrPV及びイントロン非含有(n.i.=イントロンなし)の群は早期に終了した。更に、この実験において利用したマウスのコホートは、以前のコホートよりも疾患のより急速な疾患の進行を経験し、診断から屠殺までの時間が平均1.25週で以前の実験の2.75ではなかった。最後に、皮下投与群が追加された。この群には、トリプルサイトカインプラスミド(pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2)を麻酔なしで首筋の皮下注射スペースに毎週1回注射した。
【０２０５】
table 4(表4)の結果は以下のことを示す:A)EMCV IRESエレメントは、CrPV IRESよりも有意に良好な有効性を提供する、B)イントロンの(CD74エンドソーム指向標的化領域内に位置しているこのプラスミドにおける)封入は、有効性を有意に高める、C)IL-2の封入は軽度の疾患設定においては最小限の有益性しか提供しないが、その存在は、進行性疾患設定においては処置の有効性及び頑健性を増大させる、並びに、D)ほとんどのDNAワクチン適用において効果がない皮下投与が、本明細書では、最適化することなくとも適度の有効性と疾患の有意な遅延を示す。
【０２０６】
【表４】
2020062057.tif 000012
【０２０７】
(実施例5)
市販の抗生物質非含有の選択と抗生物質選択系との比較
代わりのプラスミド骨格を、カナマイシン耐性を除去する目的で欧州医薬品庁の指針に従い評価した。同じ挿入物(IIAg/TGFβ/IL10/IL2、イントロンを含む)をNature Technology NTC9385R「ナノプラスミド」骨格にクローニングした。得られたプラスミドは、処置を11週(後期開始)で開始し、NTC9385Rベースのプラスミドを失敗により早期に終了したという点を除き、実施例3と同様にNODマウスにおいて評価した。
【０２０８】
下記のtable 5(表5)の結果は以下のことを示す:A)プラスミド骨格の選択系に対する変更が驚いたことにプラスミドの有効性に対する有意な変化を誘発する、及びB)処置の遅い開始が早期の変換をもたらす。他の関連実験からのデータは、これらの免疫寛容誘導性DNAワクチンプラスミドによる投与が有効性を有するのに2〜4週間を必要とするため、処置の後期開始は処置が有効になる前に糖尿病のいくつかの初期症例が生じることを示す。
【０２０９】
【表５】
2020062057.tif 000013
【０２１０】
(実施例6)
抗原を含有又は非含有のプラスミドによる疾患抑制の有効性
プラスミドの機能におけるコードされた抗原の役割を決定するため、2種類の実験を実施した(実施例6及び実施例7)。CD74標的ドメイン及び3つのすべての分泌サイトカインを保持しながら抗原(プレプロインシスリン)コード領域を除去する目的で、代わりのプラスミドを評価した。得られたプラスミドは、処置が11週(後期開始)に開始されたことを除き、実施例3と同様にNODマウスにおいて評価した。
【０２１１】
この実験は、抗原部分は完全な有効性にとって必要であり、プラスミドの機能を駆動するのが単にサイトカイン産生だけではないことを証明している。これは、処置の抗原特異性を証明するために必要とされる2つの基準のうちの1つである。
【０２１２】
【表６】
2020062057.tif 000014
【０２１３】
(実施例7)
無関係な抗原ワクチンの有効性に対する本明細書の抗原免疫療法の影響
プラスミドの機能におけるコードされた抗原の役割の決定するため、2種類の実験を実施した(実施例6及び実施例7)。NODマウスは、実施例3と同様に、PBS注射で偽処置されたか、pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2プラスミドで処置された。4回の投与後(すなわち13週齢で)、各マウスを、100μlの1:1アラム懸濁液中の無関係の抗原(ニワトリオボアルブミン、OVA)50μgで腹腔内免疫した。偽処置又はプラスミド処置は、免疫処置の3週間(21日)後に屠殺するまで週1回継続され、その時点で血清を収集した。オボアルブミン抗原に対するクラススイッチされた(IgG及びIgG2aの総計)抗体は、市販のELISAキットによって決定された。プラスミド処置群と偽処置群との間にそれらの総抗OVA IgGレベルで有意差は認められず、いずれの群も抗OVA IgG2aを産生しなかった。
【０２１４】
下記のtable 7(表7)の結果は、プラスミドは標的化の疾患と関係する免疫応答を抑制するが、無関係な抗原(すなわち、プラスミドによってコードされていない任意の抗原)への免疫反応性は抑制しないことを示す。これは、処置の抗原特異性を証明するために必要とされる2つの基準のうちの2番目である。小児科患者の処置には標準的な小児期ワクチン接種の同時投与が関与するので、これは薬剤、例えばメトトレキセート又はシクロスポリンAによる全身性/一般的免疫抑制よりも重要な有利性である。
【０２１５】
【表７】
2020062057.tif 000015
【０２１６】
これらの値は、非有意p値0.377及び信頼区間-1.99〜4.87をもたらす。これらの結果は、免疫調節プラスミドによる処置はプラスミドによってコードされていない他の抗原に対する免疫応答に影響を及ぼさないこと、したがって広汎性又は全身性の免疫抑制をもたらさないことを示唆している。
【０２１７】
(実施例8)
プラスミドから発現される個々のタンパク質産物
TaV 2Aエレメントは、予期せぬ本明細書のIL-10+IL-2融合産物をもたらし(データは示さず)、したがって、別の分離戦略を評価した。初期の分離技術は、TaV 2A配列の上流伸長(分泌されるIL-10の急速な分解及び欠如をもたらす)及びカルボキシペプチダーゼ切断部位(トランスフェクト細胞株の死を誘発)を含んでいた。評価したさらなる分離戦略は、GSG-TaV 2A、フューリン切断部位、フューリン部位に続くTaV 2A、P 2A及びE 2A(ウマ鼻炎ウイルスA)であった。
【０２１８】
Freestyle293細胞を一過性にトランスフェクトし、無血清培養で培養した。細胞ペレットと上清の両方を収集し、72時間後に半定量的マルチカラーウェスタンブロッティングに供した。
【０２１９】
下記のtable 8(表8)の結果は以下のことを示す:A)予期せず、タンパク質分解性切断部位はIL-10遺伝子とIL-2遺伝子との間で機能しない、B)
IL-10とIL-2の間のGSGタグ(デカップラー配列)は、伸長されたインスレーター配列より好ましい、C)P 2AはTaV 2A又はE 2Aのいずれかよりも好ましい、及びD)2A配列は、発現された上流タンパク質、例えばIL-10の分解及び分泌に対して有意で予期しない効果を有し得る。
【０２２０】
【表８】
2020062057.tif 000016
【０２２１】
(実施例9)
市販の選択系と本明細書において提供される感熱性選択系との比較、並びにIL-2をコードするプラスミドとIL-2をコードしないプラスミドとの間の比較(皮下投与)
プラスミド骨格を、カナマイシン耐性を除去する目的で欧州医薬品庁の指針に従い、創出し、評価した。修正された挿入物(IIAg/GSG-FMDV 2A/TGFβ/EMCV IRES/IL10/GSGP 2A/IL2、上流非コード領域にイントロンを含む)を、Nature Technology「RNA-OUT」選択マーカーを含有する追加導入/最小限改変pVAX1ベクター又は骨格としてwt infA(「pNN」)をコードする同等の最小限改変されたpVAX1ベクターのいずれかにクローニングした。更に、追加のSV40エンハンサーエレメントを含有するか、又はIL-2に欠損があるプラスミドを産生した。得られたプラスミドを、投与が週1回、或いは週3回(推奨)のいずれかの皮下注射であることを除き、実施例3と同様にNODマウスにおいて評価した。
【０２２２】
下記のtabel 9+table 10(表9+表10)で示される結果は以下のことを示す:A)pVAX1骨格中のカナマイシン抗生物質耐性に対するRNA-OUTの市販の交換は、依然として、予想外に期待以下の性能である、B)infA補完抗生物質非含有選択系は親pVAX1ベクターと同等に機能する、C)インターロイキン-2は最適な有効性にとって必要である、D)SV40エンハンサーエレメントの付加は有効性を改善しない、及びE)修正されたトリプルサイトカイン挿入物は十分な機能性を保持する。
【０２２３】
【表９】
2020062057.tif 000017
【０２２４】
【表１０】
2020062057.tif 000018
【０２２５】
(実施例10)
プラスミド中止後の免疫寛容効果の持続性試験
以前の実験(table 9(表9)に示す)において、pNN-IIAg/FMDV/TGFβ/IL10/P2A/IL2群は30週年齢で屠殺されず、プラスミドの投与を中止した。更に10週間、合計40週齢まで血糖値を追跡し、プラスミドが免疫寛容性の持続状態を誘導したかどうか、又は継続的投与が有効性にとって必要だったかどうかを評価した。
【０２２６】
以下のtabel 11(表11)に示す結果は、30週齢までの安定的無病状態が投与の中止後、速やかに悪化するので、継続投与は免疫寛容性の持続性に必要であることを示す。プラスミド投与により遭遇し得るすべての有害事象もまた投与で止まることが予想されるので、これは有益な安全性プロファイルを示す。
【０２２７】
【表１１】
2020062057.tif 000019
【０２２８】
(実施例11)
注射時のプラスミド安定性及び持続性の試験
プラスミド投与に伴う重要な問題は投与時の分解である。注射の場合には、圧力下で細針を通過する大きく粘性のプラスミド分子が受ける剪断力は、プラスミドの共有結合で閉じた環状構造を破壊し、それを直鎖状にし、トランスフェクション能力の低下と急速な破壊の両方が生じる。ほとんどのプラスミドは、臨床使用で許容されるサイズの針を通過する注射の際に直鎖状形態への5〜15%の分解を有し、これは有効性の低下、又は損失を補うための多量の初回量の必要性のいずれかにつながる。プラスミドを解き剪断分解への感受性をもたらす可能性のあるいくつかのタイプの配列構造は、注射プロトコルによる強健性及び信頼性を高める意図で、開示されているプラスミドにおいて意図的に最小限にされている。粘性、したがって濃度に応じて変化し得るプラスミドの剪断分解を評価するため、ヒトリードプラスミドは、5、7及び9mg/mlの濃度までトリEDTA緩衝液で再懸濁し、G30針を3回通過させ(排出し、注射器に再度引き込み、再度排出する)、1マイクログラムの試料を、注入プロセスを通過しなかった基準サンプルに対してアガロースゲルで泳動させた。
【０２２９】
図3に示した結果は、驚いたことに、プラスミドがいずれかの試験した濃度又は粘度においても3回の注射経過によって顕著には分解されないことを示す。プラスミド分解は、両方とも小さなバンドのスミアリング(6kbでの主スーパーコイルバンドとゲル底又は約600bpの小さなプロセス不純物バンドの間の)として可視化することができる。このような直鎖状化/分解のスミアは、注入プロセスによって通過したいかなる試料に対しても見られない。この強健な物理的安定性は投与に際して非常に望ましく、両方とも予想されるよりも、又は文献で既に報告されているよりも高い。
【０２３０】
(実施例12)
infA補完系によるプラスミド保持の検証
infAに基づくプラスミド保持選択系が希望通りに機能することを確認するため、プラスミド形質転換細菌を100継代増殖させた(1継代当たり約36倍加/世代、合計3,600世代の潜在的ドリフト又はプラスミド喪失を試験した)。1〜100継代は、1週当たり11継代、37℃で週当たり2継代、30℃で各週1継代生じた。すべて、15マイクログラム/mlのナリジクス酸(naladixic acid)を補充した液体の動物性フリーLB培地(Teknova soy-tone)中で実施した(プラスミド存在のためのではなくDH5αベース株のために選択)。グリセロールストックを各継代から生成し、100継代すべてが同時処理のために得られるまで保持した。
【０２３１】
グリセロールストックの擦り取りを使用し、真空マニホールドを使用するQiagen miniprepキットについての供給業者の指示により処理した5mlの一晩培養物に接種した(ゲルサイズ制約のため、1実施につき16又は32培養物)。細胞インプット正規化のためのOD600測定値を収集する試みはなされず、すべてのprepは基準容量に基づいて実施された。1マイクロリットルの各miniprepをPstI/XhoI消化に供し、各miniprepから得られるプラスミド濃度に対する補正なしで、挿入物(約4Kbp)から骨格(約2.4Kbp)を分解した。各ゲルを、未消化プラスミドの第1の試料レーンで、隣接するTridye 2-Log ladder(NEB https://www.neb.com/products/n3200-2-log-dna-ladder-01-100-kb)と共に泳動し、SybrSafe色素で可視化した。ゲルの画像において、核酸量に対して調節しなかったにもかかわらず、すべての消化レーンは、プラスミドの存在と予測される消化パターンの両方を示している(継代1〜16、17〜48、49〜80及び81〜100に関する画像を参照)。
【０２３２】
さらなる確認として、1〜100継代のグリセロールストックを50セクターの抗生物質フリー及び動物性フリーのLB寒天平板上に画線し、30℃で一晩インキュベートした。画線接種量を調節することは試みなかった。図4に示したように、すべてのグリセロールストックを代表する画線は、顕著な増殖をもたらし、したがってプラスミド保持をもたらした。
【０２３３】
(実施例13)
infA補完系によるスケールアップのための適合性
infAに基づくプラスミド保持選択系が生産スケールで希望通りに機能することを確認するため、プラスミド形質転換細菌を、特定の収率増強温度シフト工程を備えた50Lパイロット流加発酵槽運転で使用した。酵母抽出物を添加した最少培地を利用し、倍加速度を0.88/時間まで下げた。流加培養を接種後17時間00分後に開始し、pO2カスケードパラメーターの連続増加によって30%での溶存酸素の調節を実現した(32時間15分撹拌、40時間30分加圧、次いで45時間40分空気流)。予想したように、バイオマス増加率は42℃へのシフト直後に減少した。産生されたプラスミドDNAの量は、溶解直後の収量を模倣する小規模プラスミド抽出法を使用して1.03±0.17g/Lと推定された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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