(57)【要約】      （修正有）【課題】短時間で生体試料を透明化できる生体試料の透明化方法、及び短時間で生体試料を透明化できる生体試料透明化剤の提供。【解決手段】リン酸の水溶液を用いて生体試料を透明化する工程を備える、生体試料の透明化方法。水溶液におけるリン酸の濃度が４．０Ｍ以上である、生体試料の透明化方法。水溶液の屈折率が１．３５以上である、生体試料の透明化方法。水溶液に生体試料を接触させる時間は５時間以下である、生体試料の透明化方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸の水溶液を用いて生体試料を透明化する工程を備える、生体試料の透明化方法。
【請求項２】
前記水溶液における前記リン酸の濃度が４．０Ｍ以上である、請求項１に記載の生体試料の透明化方法。
【請求項３】
前記水溶液の屈折率が１．３５以上である、請求項１又は請求項２に記載の生体試料の透明化方法。
【請求項４】
前記水溶液に前記生体試料を接触させる時間は５時間以下である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の生体試料の透明化方法。
【請求項５】
リン酸の水溶液である、生体試料透明化剤。
【請求項６】
前記水溶液における前記リン酸の濃度が４．０Ｍ以上である、請求項５に記載の生体試料透明化剤。
【請求項７】
前記水溶液の屈折率が１．３５以上である、請求項５又は請求項６に記載の生体試料透明化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料の透明化方法及び生体試料透明化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物、植物等の生体由来の試料を観察する際に、試料内部での光の散乱を抑制して深部の視認性を高める（透明化）方法が種々検討されている。例えば、特許文献１の実施例には、所定濃度の尿素と、非イオン性の界面活性剤と、グリセロールとを純水に溶解して得た透明化剤を用いてマウスの体組織を透明化する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１６１１４３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に記載された方法では、生体試料を充分に透明化するために数日から数週間の処理を要する。そこで、処理工程の効率化の観点から、より短時間で生体試料を透明化できる技術の開発が待たれている。
本発明は上記事情に鑑み、短時間で生体試料を透明化できる生体試料の透明化方法、及び短時間で生体試料を透明化できる生体試料透明化剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記課題を達成するための手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞リン酸の水溶液を用いて生体試料を透明化する工程を備える、生体試料の透明化方法。
＜２＞前記水溶液における前記リン酸の濃度が４．０以上である、＜１＞に記載の生体試料の透明化方法。
＜３＞前記水溶液の屈折率が１．３５以上である、＜１＞又は＜２＞に記載の生体試料の透明化方法。
＜４＞前記水溶液に前記生体試料を接触させる時間は５時間以下である、＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載の生体試料の透明化方法。
＜５＞リン酸の水溶液である、生体試料透明化剤。
＜６＞前記水溶液における前記リン酸の濃度（２５℃）が４．０Ｍ以上である、＜５＞に記載の生体試料透明化剤。
＜７＞前記水溶液の屈折率が１．３５以上である、＜５＞又は＜６＞に記載の生体試料透明化剤。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、短時間で生体試料を透明化できる生体試料の透明化方法、及び短時間で生体試料を透明化できる生体試料透明化剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】透明化処理前後のマウス肝臓の写真である。
【図２】透明化処理前後のマウス腎臓の写真である。
【図３】透明化処理前後のマウス肺の写真である。
【図４】透明化処理前後のＣｏｌｏｎ−２６培養細胞の顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。以下の実施形態において、その構成要素（要素ステップ等も含む）は、特に明示した場合を除き、必須ではない。数値及びその範囲についても同様であり、本発明を制限するものではない。
本明細書において「工程」との語には、他の工程から独立した工程に加え、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、当該工程も含まれる。
【０００９】
＜生体試料の透明化方法＞
本開示の生体試料の透明化方法は、リン酸の水溶液を生体試料に接触させる工程（透明化工程）を備える。
【００１０】
本発明者らの検討の結果、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）の水溶液を生体試料に接触させる工程を含む透明化方法は、他の方法に比べて短時間で生体試料を透明化できることがわかった。この理由としては、水溶液中のリン酸は分極の大きい３価の陰イオンとなって水の屈折率（１．３３）を高め、生体試料の細胞膜におけるリン脂質の屈折率（１．４５程度）に近づけるように作用すること、及びリン酸の分子量が小さいために生体試料への浸透性に優れていることが考えられる。
【００１１】
本開示において生体試料の「透明化」とは、処理後の生体試料の可視光透過率が処理前に比べて上昇する現象を意味し、具体的には４００ｎｍ〜８００ｎｍの波長域の少なくとも一部において透過率が上昇していれば透明化したと判断する。すなわち生体試料の「透明化」には、生体試料に含まれる色素の減少又は消失が伴っていても、伴っていなくてもよい。
【００１２】
（透明化工程）
透明化工程を実施する方法は特に制限されず、一般的な手法で行うことができる。例えば、リン酸の水溶液に試料を接触（浸漬等）させた状態で、所望の透明度が得られるまで放置することで行うことができる。
【００１３】
リン酸の水溶液に含まれるリン酸の濃度は特に制限されず、透明化処理の対象となる生体試料の状態、所望の透明度等に応じて選択できる。リン酸の濃度が高いほど水溶液の屈折率が上昇する傾向にあり、処理後に高い透明度が得られる傾向にある。例えば、水溶液におけるリン酸の濃度は、４．０Ｍ以上であってもよく、８．０Ｍ以上であってもよく、１０．０Ｍ以上であってもよく、１２．０Ｍ以上であってもよい。水溶液におけるリン酸の濃度の上限は特に制限されないが、１４．２Ｍ程度が上限値（飽和濃度）である。
本開示において水溶液に含まれるリン酸の濃度は、２５℃における濃度とする。
リン酸の水溶液の屈折率は特に制限されず、透明化処理の対象となる生体試料の状態、所望の透明度等に応じて選択できる。例えば、リン酸の水溶液の屈折率は、１．３５（リン酸濃度４．０Ｍ程度での屈折率）以上であってもよく、１．４０以上であってもよく、１．４２以上であってもよい。
リン酸の水溶液の屈折率の上限は特に制限されないが、１．４３程度が上限値（リン酸の飽和濃度で得られる値）である。
本開示においてリン酸の水溶液の屈折率は、２０℃における波長５８９．２９ｎｍの光線（ナトリウムＤ線）に対する屈折率とする。
【００１４】
リン酸の水溶液に試料を接触させる時間（処理時間）は特に制限されず、透明化処理の対象となる生体試料の状態、所望の透明度等に応じて選択できる。例えば、１５分以上であってもよく、３０分以上であってもよい。処理時間の上限値は特に制限されないが、生体試料に与えるダメージを抑制する観点からは５時間以下であってもよく、３時間以下であってもよく、１時間以下であってもよい。
【００１５】
リン酸の水溶液は、必要に応じ、リン酸以外の成分を含有してもよい。例えば、界面活性剤を添加して生体試料への浸透性や脱色効率を高めてもよい。その他、ｐＨ調整剤、粘度調整剤、酸化防止剤、防腐剤、保湿剤、脱色剤等の添加剤を必要に応じて含有してもよい。リン酸の水溶液は、リン酸をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解したものであってもよい。
【００１６】
本開示の方法は、透明化工程に加えて他の工程を備えていてもよい。例えば、生体試料を固定する工程（固定工程）を備えていてもよく、生体試料の色素を除去する工程（脱色工程）を備えていてもよい。
【００１７】
（固定工程）
固定工程を実施する方法は特に制限されず、一般的な手法で行うことができる。生体試料を固定することで、生体試料の劣化を抑制でき、物理的強度や化学的安定性を向上することができる。
【００１８】
固定に用いる固定剤の種類は特に制限されず、公知のものから選択できる。例えば、ホルムアルデヒド、ファーマー液（酢酸とエタノールの混合液）、グルタルアルデヒド、アセトン等が挙げられる。固定剤は、有効成分をＰＢＳ等の溶媒に溶解した状態であってもよい。
【００１９】
生体試料や生体試料中の蛍光タンパク質へのダメージを抑制する観点からは、固定剤としてはホルムアルデヒドを含むものが好ましい。ホルムアルデヒドを含む固定剤を用いて試料の固定を行う場合、固定剤中のホルムアルデヒドの濃度は特に制限されず、所望の透明度、試料の種類、処理条件等に応じて選択できる。例えば、固定剤全体の０．１質量％〜１０質量％の範囲内から選択してもよい。
【００２０】
（脱色工程）
脱色工程を実施する方法は特に制限されず、一般的な手法で行うことができる。脱色工程を実施することで、透明化した生体試料の視認性をより高めることができる。
【００２１】
脱色に用いる脱色剤の種類は特に制限されず、公知のものから選択できる。例えば、界面活性剤、有機溶剤等が挙げられる。脱色剤は、有効成分をＰＢＳ等の溶媒に溶解した状態であってもよい。
【００２２】
（生体試料）
本開示の方法で処理される生体試料は特に制限されず、動物、植物、菌類等のあらゆる生物に由来する試料であってよい。生体試料は遺伝子組み換え、化学処理等の加工がなされたものであってもよい。
【００２３】
生体試料が動物に由来するものである場合、動物の種類は特に制限されない。例えば、哺乳類、爬虫類、鳥類、両生類、魚類等の脊椎動物であってもよく、貝類、昆虫類、甲殻類、線虫類等の無脊椎動物であってもよい。また、試料は動物の内臓、脳、骨、筋肉、神経、皮膚、胚、毛等の各種器官又は組織であってもよい。
【００２４】
生体試料が植物に由来するものである場合、植物の種類は特に制限されない。例えば、被子植物及び裸子植物のいずれであってもよく、被子植物の場合、単子葉植物及び双子葉植物のいずれであってもよい。また、試料は植物の葉、根、茎、胚、花弁、果実、種子、表皮等の各種器官又は組織であってもよい。
【００２５】
生体試料が菌類に由来するものである場合、菌類の種類は特に制限されない。例えば、キノコ類、カビ類等であってもよい。
【００２６】
＜生体試料透明化剤＞
本開示の生体試料透明化剤（以下、透明化剤ともいう）は、リン酸の水溶液である。
本開示の透明化剤によれば、他の方法に比べて短時間で生体試料を透明化できる。また、有機溶媒等を用いて生体試料を透明化する方法に比べて試料を構成する細胞や蛍光タンパク質への影響が小さいため、処理後の試料を良好な状態に維持することができる。
【００２７】
本開示の透明化剤は、上述した生体試料の透明化方法に用いるものであってもよい。透明化剤の詳細及び好ましい態様は、上述した透明化方法で使用する透明化剤の詳細及び好ましい態様と同様である。
【００２８】
透明化剤は、透明化方法に使用する他の試薬（固定剤、脱色剤等）と組み合わせたキットの状態であってもよい。また、透明化剤の状態は特に限定されず、液状、ゲル状等から選択できる。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。ただし、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００３０】
＜実施例１  マウス肝臓の透明化処理＞
マウス（ＩＣＲ、１０〜３０週齢）の肝臓を４質量％ホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液に４８時間浸漬（２５℃）して固定し、ＰＢＳで洗浄した。
【００３１】
洗浄後の試験片を、ＰＢＳ、１４．２Ｍリン酸のＰＢＳ溶液（屈折率：１．４３）、１１．４Ｍリン酸のＰＢＳ溶液（屈折率：１．４２）、８．５Ｍリン酸のＰＢＳ溶液（屈折率：１．４０）、及び比較用の透明化剤として尿素を４Ｍ、グリセロールを１０％（ｗ／ｖ）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１０％（ｗ／ｖ）含む水溶液（国際公開第２０１２／１６１１４３号に記載された透明化剤）にそれぞれ６０分間浸漬（２５℃）した。
【００３２】
浸漬前と浸漬後の試験片の写真を図１に示す。図１において上段は浸漬前の試験片の写真、下段は浸漬前の試験片の写真であり、左から順にＰＢＳ（１）、１４．２Ｍリン酸のＰＢＳ溶液（２）、１１．４Ｍリン酸のＰＢＳ溶液（３）、８．５Ｍリン酸のＰＢＳ溶液（４）、比較用の透明化剤（５）に浸漬する前と浸漬した後の試験片である。
【００３３】
図１に示すように、リン酸のＰＢＳ溶液で処理した試験片は６０分間の浸漬で透明化し、背後のチェッカーパターン（４ｍｍ×４ｍｍ）が透けて見えた。これに対して比較用の透明化剤で処理した試験片は充分に透明化が進まなかった。
【００３４】
＜実施例２  マウス腎臓の透明化処理＞
マウス（ＩＣＲ、１０〜３０週齢）の腎臓を４質量％ホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液に４８時間浸漬（２５℃）して固定し、ＰＢＳで洗浄して試験片を作製した。
【００３５】
洗浄後の試験片を、ＰＢＳ、１４．２Ｍリン酸のＰＢＳ溶液（屈折率：１．４３）、１１．４Ｍリン酸のＰＢＳ溶液（屈折率：１．４２）、８．５Ｍリン酸のＰＢＳ溶液（屈折率：１．４０）、及び比較用の透明化剤として尿素を４Ｍ、グリセロールを１０％（ｗ／ｖ）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１０％（ｗ／ｖ）含む水溶液（国際公開第２０１２／１６１１４３号に記載された透明化剤）にそれぞれ６０分間浸漬（２５℃）した。
【００３６】
浸漬前と浸漬後の試験片の写真を図１に示す。図１において上段は浸漬前の試験片の写真、下段は浸漬前の試験片の写真であり、左から順にＰＢＳ（１）、１４．２Ｍリン酸のＰＢＳ溶液（２）、１１．４Ｍリン酸のＰＢＳ溶液（３）、８．５Ｍリン酸のＰＢＳ溶液（４）、比較用の透明化剤（５）に浸漬する前と浸漬した後の試験片である。
【００３７】
図２に示すように、リン酸のＰＢＳ溶液で処理した試験片は６０分間の浸漬で透明化し、背後のチェッカーパターン（４ｍｍ×４ｍｍ）が透けて見えた。これに対して比較用の透明化剤で処理した試験片は充分に透明化が進まなかった。
【００３８】
＜実施例３  マウス肺の透明化処理＞
マウス（ＩＣＲ、１０〜３０週齢）の肺を４質量％ホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液に４８時間浸漬（２５℃）して固定し、ＰＢＳで洗浄して試験片を作製した。
【００３９】
洗浄後の試験片を、ＰＢＳ、１４．２Ｍリン酸のＰＢＳ溶液（屈折率：１．４３）、１１．４Ｍリン酸のＰＢＳ溶液（屈折率：１．４２）、８．５Ｍリン酸のＰＢＳ溶液（屈折率：１．４０）、及び比較用の透明化剤として尿素を４Ｍ、グリセロールを１０％（ｗ／ｖ）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１０％（ｗ／ｖ）含む水溶液（国際公開第２０１２／１６１１４３号に記載された透明化剤）にそれぞれ６０分間浸漬（２５℃）した。
【００４０】
浸漬前と浸漬後の試験片の写真を図１に示す。図１において上段は浸漬前の試験片の写真、下段は浸漬前の試験片の写真であり、左から順にＰＢＳ（１）、１４．２Ｍリン酸のＰＢＳ溶液（２）、１１．４Ｍリン酸のＰＢＳ溶液（３）、８．５Ｍリン酸のＰＢＳ溶液（４）、比較用の透明化剤（５）に浸漬する前と浸漬した後の試験片である。
【００４１】
図３に示すように、リン酸のＰＢＳ溶液で処理した試験片は６０分間の浸漬で透明化し、背後のチェッカーパターン（４ｍｍ×４ｍｍ）が透けて見えた。比較用の透明化剤で処理した試験片もある程度透明化処理が進んでいた。
【００４２】
実施例１〜３の結果に示すように、本開示の透明化剤によれば短時間で生体試料を透明化できることがわかった。比較用の透明化剤では、生体試料の種類によって短時間で充分に透明化できない場合があった。
【００４３】
＜実施例４  Ｃｏｌｏｎ−２６培養細胞の透明化処理＞
ＣｅｌｌＭａｓｋ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、登録商標）で染色したＣｏｌｏｎ−２６培養細胞を４質量％ホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液に４８時間浸漬（２５℃）して固定し、ＰＢＳで洗浄して試験片を作製した。
【００４４】
洗浄後のＣｏｌｏｎ−２６培養細胞を、１４．２Ｍリン酸のＰＢＳ溶液に浸漬（２５℃）した。浸漬直前（０ｈ）、浸漬から１８時間後（１８ｈ）、浸漬から２４時間後（２４ｈ）、及び浸漬から４８時間後（４８ｈ）に、Ｃｏｌｏｎ−２６培養細胞の細胞膜を蛍光顕微鏡で観察した。結果を図４に示す。図中のバーは５０μｍである。
【００４５】
図４の蛍光画像（上段）に示すように、リン酸のＰＢＳ溶液で処理した後も細胞の輪郭が確認された。一方、同じ細胞膜を明視野で観察（下段）すると、細胞がほとんど視認できなかった。以上の結果から、本発明の透明化方法では細胞の形状を維持しながら生体試料を透明化できることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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