(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞によって発現されるヌクレアーゼ活性を有する酵素を、ＤＮＡ上の標的位置に導くための１種類または複数種類のガイドＲＮＡを用いる、細胞におけるＤＮＡの多重改変方法。【解決手段】標的ＤＮＡに相補的であり且つ酵素を標的ＤＮＡにガイドする、１種類または複数種類のＲＮＡをコードする第１の外来核酸を細胞に導入するステップであって、１種類または複数種類のＲＮＡおよび酵素が、標的ＤＮＡへの共局在複合体の構成要素であるステップと、１種類または複数種類のドナー核酸配列をコードする第２の外来核酸配列を細胞に導入するステップとのサイクルを含み、このサイクルを所望の回数繰り返して細胞において多重ＤＮＡ改変を行う、Ｃａｓ９を用いた細胞における多重ゲノム改変方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成、且つ前記標的ＤＮＡを部位特異的に切断する酵素を発現する細胞において前記標的ＤＮＡに複数の変化を生じさせる方法であって、
（ａ）標的ＤＮＡに相補的であり且つ前記酵素を前記標的ＤＮＡにガイドする、１種類または複数種類のＲＮＡをコードする第１の外来核酸を前記細胞に導入すること、ここで、前記１種類または複数種類のＲＮＡおよび前記酵素が、前記標的ＤＮＡへの共局在複合体の構成要素である、
１種類または複数種類のドナー核酸配列をコードする第２の外来核酸を前記細胞に導入すること、ここで、前記１種類または複数種類のＲＮＡおよび前記１種類または複数種類のドナー核酸の配列が発現し、前記１種類または複数種類のＲＮＡおよび前記酵素が前記標的ＤＮＡに共局在し、前記酵素により前記標的ＤＮＡが切断され、前記ドナー核酸が前記標的ＤＮＡに挿入されて前記細胞中に変化したＤＮＡが生成する、および、
ステップ（ａ）を複数回繰り返して前記細胞において前記ＤＮＡに複数の変化を生じさせることを含む、方法。
【請求項２】
前記酵素が、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素がＣａｓ９である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が真核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡが、約１０〜約５００ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡが、約２０〜約１００ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１種類または複数種類のＲＮＡが、ガイドＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記１種類または複数種類のＲＮＡが、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記１種類または複数種類のドナー核酸配列が、組換えにより挿入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記１種類または複数種類のドナー核酸配列が、相同組換えにより挿入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１種類または複数種類のＲＮＡおよび前記１種類または複数種類のドナー核酸配列が、１種類または複数種類のプラスミド上に存在する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願データ
本願は、２０１３年７月９日に提出された米国仮特許出願第６１／８４４１６８号に基づく優先権を主張するものであり、あらゆる目的のため、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
政府の利益の説明
本発明は、米国エネルギー省助成金番号ＤＥ−ＦＧ０２−０２ＥＲ６３４４５、全米科学財団助成金番号ＮＳＦ−ＳｙｎＢＥＲＣ、および全米科学財団助成金番号ＳＡ５２８３−１１２１０の国庫助成により行われた。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
細菌および古細菌のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成した短鎖ガイドＲＮＡに依存して、侵入する外来核酸中に存在する相補配列を分解する。Deltcheva, E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602-607 (2011); Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. & Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, E2579-2586 (2012); Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012); Sapranauskas, R. et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research 39, 9275-9282 (2011)；およびBhaya, D., Davison, M. & Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics 45, 273-297 (2011)を参照されたい。近年、ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのインビトロ再構成により、通常はトランスにコードされるｔｒａｃｒＲＮＡ（「トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」）と融合したｃｒＲＮＡ（「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」）が、そのｃｒＲＮＡに一致する標的ＤＮＡ配列をＣａｓ９タンパク質に配列特異的に切断させるのに十分であることが実証された。標的部位に相同なｇＲＮＡの発現により、Ｃａｓ９が動員され、標的ＤＮＡが分解される。H. Deveau et al, Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. Journal of Bacteriology 190, 1390 (Feb, 2008)を参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本開示の態様は、ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ結合タンパク質など、細胞によって発現されるヌクレアーゼ活性を有する酵素を、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）上の標的位置に導くための１種類または複数種類のガイドＲＮＡ（リボ核酸）を用いる、細胞におけるＤＮＡの多重改変（multiplex modification）に関し、酵素によりＤＮＡが切断され、相同組換えなどにより外来性ドナー核酸がこのＤＮＡに挿入される。本開示の態様は、細胞についてＤＮＡ改変のステップを繰り返して、または反復して、細胞内に複数のＤＮＡ改変を有する細胞を作成することを含む。改変には、外来性ドナー核酸の挿入が含まれ得る。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
外来性核酸の多重挿入は、複数のＲＮＡをコードする核酸および複数の外来性ドナー核酸を、同時形質転換などにより、酵素を発現する細胞に導入する単一のステップによって達成することができる。このステップにおいて、ＲＮＡが発現し、複数種類のＲＮＡのそれぞれにより酵素がＤＮＡの特定部位にガイドされ、酵素によりＤＮＡが切断され、複数種類の外来性核酸のうちの１種類がこのＤＮＡの切断部位に挿入される。この態様によれば、細胞中のＤＮＡに多くの変化または改変が単一サイクルで生じる。
【０００６】
外来性核酸の多重挿入は、１種類以上または複数種類のＲＮＡをコードする１種類または複数種類の核酸、および１種類以上または複数種類の外来性核酸を、酵素を発現する細胞に導入する反復ステップまたはサイクルによって細胞において達成することができる。このステップまたはサイクルにおいては、ＲＮＡが発現し、酵素がＤＮＡの特定部位にガイドされ、酵素によりＤＮＡが切断され、外来性核酸がこのＤＮＡの切断部位に挿入され、その結果、細胞内のＤＮＡ中に変化または外来性ＤＮＡの挿入を複数有する細胞が得られる。ある態様によれば、酵素を発現する細胞は、天然に酵素を発現する細胞であってもよく、酵素をコードし且つ細胞によって発現され得る核酸を細胞に導入することなどにより、酵素を発現するように遺伝子的に変化させた細胞であってもよい。このようにして、本開示の態様は、酵素を発現する細胞にＲＮＡを導入し、外来性ドナー核酸をこの細胞に導入し、ＲＮＡが発現し、ＲＮＡ、酵素、およびＤＮＡの共局在複合体が形成され、酵素によりこのＤＮＡが酵素的に切断され、ドナー核酸がこのＤＮＡに挿入されるステップの繰り返しを含む。上記ステップの繰り返しまたは反復により、複数の座位での細胞の多重遺伝子改変をもたらし、すなわち、遺伝子変化を複数有する細胞が得られる。
【０００７】
ある態様によれば、上記繰り返し方法により相同組換え率を上昇させる方法が提供される。ある実施形態によれば、Ｃａｓ９依存性ゲノムＤＮＡ切断により、相同組換え率が劇的に上昇して外来性ＤＮＡが刺激される。別の態様によれば、外来性ドナー核酸には、切断部位に隣接する相同配列またはアームが含まれる。別の態様によれば、外来性ドナー核酸には、切断配列を除去するための配列が含まれる。別の態様によれば、外来性ドナー核酸には、切断部位に隣接する相同配列またはアーム、および切断部位を除去するための配列が含まれる。このようにして、外来性ドナーＤＮＡを取り込まない細胞に対する負の選択（negative selection）としてＣａｓ９を用いることができる。したがって、組換え頻度が高い細胞を同定するための負の選択方法が提供される。
【０００８】
ある態様によれば、本開示の範囲に含まれるＤＮＡ結合タンパク質または酵素には、ガイドＲＮＡと複合体を形成するタンパク質が含まれ、ガイドＲＮＡは複合体を二本鎖ＤＮＡ配列にガイドし、ここで複合体はＤＮＡ配列に結合する。ある態様によれば、酵素は、ＤＮＡに結合し且つＲＮＡにガイドされるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質などの、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質（RNA guided DNA binding protein）であってもよい。ある態様によれば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質はＣａｓ９タンパク質である。
【０００９】
本開示のこの態様は、ＲＮＡおよびＤＮＡ結合タンパク質の二本鎖ＤＮＡへの共局在、またはＲＮＡおよびＤＮＡ結合タンパク質の二本鎖ＤＮＡとの共局在と呼ぶことができる。このようにして、ＤＮＡ結合タンパク質・ガイドＲＮＡ複合体を用いて二本鎖ＤＮＡの複数部位を切断して、外来性ドナーＤＮＡの多重挿入などの遺伝子の多重改変を有する細胞を作成することができる。
【００１０】
ある態様によれば、標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成し且つ前記標的ＤＮＡを部位特異的に切断する酵素を発現する細胞において標的ＤＮＡに複数の変化を生じさせる方法が提供される。この方法には、（ａ）標的ＤＮＡに相補的であり且つ前記酵素を前記標的ＤＮＡにガイドする、１種類または複数種類のＲＮＡをコードする第１の外来核酸を細胞に導入すること、ここで、前記１種類または複数種類のＲＮＡおよび前記酵素が、前記標的ＤＮＡへの共局在複合体の構成要素である、１種類または複数種類のドナー核酸配列をコードする第２の外来核酸を前記細胞に導入すること、ここで、前記１種類または複数種類のＲＮＡおよび前記１種類または複数種類のドナー核酸配列が発現し、前記１種類または複数種類のＲＮＡおよび前記酵素が前記標的ＤＮＡに共局在し、前記酵素により前記標的ＤＮＡが切断され、前記ドナー核酸が前記標的ＤＮＡに挿入されて、前記細胞中に変化したＤＮＡが生成するステップ、およびステップ（ａ）を複数回繰り返して前記細胞においてＤＮＡに複数の変化を生じさせることが含まれる。
【００１１】
ある態様によれば、細胞は、真核細胞である。ある態様によれば、細胞は、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である。ある態様によれば、細胞は、哺乳動物細胞である。
【００１２】
ある態様によれば、ＲＮＡは約１０〜約５００ヌクレオチドである。ある態様によれば、ＲＮＡは約２０〜約１００ヌクレオチドである。
【００１３】
ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡは、ガイドＲＮＡである。ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である。
【００１４】
ある態様によれば、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである。
【００１５】
本実施形態の特定の実施形態のその他の特徴および利点は、以下の実施形態およびその図面の説明において、および特許請求の範囲から、さらに十分に明らかになるであろう。
【００１６】
本実施形態の上記および他の特徴および利点は、添付されている図面と併せて、以下の例示的な実施形態の詳細な説明から、より十分に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ｃａｓ９を介したＲＮＡ誘導型ゲノム切断の模式図である。
【図２】Ｃａｓ９を用いた酵母中での多重ゲノム改変を示す模式図である。
【図３】酵母の熱耐性に重要な４つの座位を標的化するオリゴヌクレオチドを用いたアレル置換を示す模式図である。
【図４】１サイクル後および２サイクル後の１細胞あたりの改変数を示すグラフである。
【図５Ａ】変異を有する株の表である。
【図５Ｂ】種々の株についての熱ショックに対する熱耐性を示す図である。
【図６Ａ】形質転換頻度についてのグラフデータを示す図である。
【図６Ｂ】個々の組換え頻度についてのグラフデータを示す。
【図６Ｃ】ｃａｎ１座位およびＫａｎＭＸ座位における同時組換え頻度についてのグラフデータを示す図である。
【図７】２つの座位の多重線状カセットの取り込みについてのグラフデータを示す図である。
【図８Ａ】３０℃での倍加時間の変化倍率についてのグラフデータを示す図である。
【図８Ｂ】３７℃での倍加時間の変化倍率についてのグラフデータを示す図である。
【図８Ｃ】定常期後期の培養から細胞を播種した、４２℃での倍加時間の変化倍率についてのグラフデータを示す図である。
【図８Ｄ】対数増殖期後期の培養から細胞を播種した、４２℃での倍加時間の変化倍率についてのグラフデータを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本開示の実施形態は、ＤＮＡに共局在して、ＤＮＡを消化または切断して相同組換えなどにより外来性ＤＮＡを挿入するための、外来性ＤＮＡと、ＤＮＡ結合タンパク質などのヌクレアーゼ酵素と、ガイドＲＮＡとの反復使用に基づく。当業者には、種々の目的のためにＤＮＡに結合させるそのようなＤＮＡ結合タンパク質が容易に理解される。そのようなＤＮＡ結合タンパク質は天然のものであってよい。本開示の範囲に含まれるＤＮＡ結合タンパク質としては、本明細書中でガイドＲＮＡと呼ぶＲＮＡによってガイドされ得るタンパク質が挙げられる。この態様によれば、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡにおいて共局在複合体を形成する。ヌクレアーゼ活性を有するそのようなＤＮＡ結合タンパク質は、当業者に公知であり、例えばＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在する、Ｃａｓ９タンパク質などのヌクレアーゼ活性を有する天然のＤＮＡ結合タンパク質が挙げられる。そのようなＣａｓ９タンパク質およびＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、当該技術分野で十分に裏付けられている。その全体が参照により援用される、全ての追加情報を含む、Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, June 2011, pp. 467-477を参照されたい。
【００１９】
ヌクレアーゼ活性を有する例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、二本鎖ＤＮＡにニックを形成するか、または二本鎖ＤＮＡを切断するように機能する。そのようなヌクレアーゼ活性は、ヌクレアーゼ活性を示す１つまたは複数のポリペプチド配列を有するＤＮＡ結合タンパク質から生じ得る。そのような例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、それぞれが二本鎖ＤＮＡの特定のストランドを切断すること、またはニックを形成することに関与する、２つの別個のヌクレアーゼドメインを有していてもよい。当業者に知られているヌクレアーゼ活性を有する例示的なポリペプチド配列としては、ＭｃｒＡ−ＨＮＨヌクレアーゼ関連ドメインおよびＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインが挙げられる。したがって、例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、ＭｃｒＡ−ＨＮＨヌクレアーゼ関連ドメインおよびＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのうちの１つまたは複数を含む天然タンパク質である。
【００２０】
例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質である。例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。
【００２１】
ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）では、Ｃａｓ９は、タンパク質中の２つの触媒ドメイン、すなわちＤＮＡの相補鎖を切断するＨＮＨドメインおよび非相補鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインが仲介するプロセスにより、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３ｂｐ上流に平滑末端の二本鎖切断を形成する。その全体が参照により援用されるJinke et al., Science 337, 816-821 (2012)を参照されたい。Ｃａｓ９タンパク質は、Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, June 2011, pp. 467-477の補足情報で確認されている以下のものを含む、多数のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在することが知られている。メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）Ｃ７株；コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Corynebacterium diphtheriae）； コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）ＹＳ−３１４株；コリネバクテリウム・グルタニカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２  Ｋｉｔａｓａｔｏ株；コリネバクテリウム・グルタニカム  ＡＴＣＣ１３０３２  Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ株；コリネバクテリウム・グルタニカム  Ｒ株；コリネバクテリウム・クロッペンステッティイ（Corynebacterium kroppenstedtii）ＤＳＭ４４３８５株；マイコバクテリウム・アブセサス（Mycobacterium abscessus）ＡＴＣＣ１９９７７株；ノカルディア・ファルシニカ（Nocardia farcinica）ＩＦＭ１０１５２株；ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）ＰＲ４株；ロドコッカス・ジョスティイ（Rhodococcus jostii）ＲＨＡ１株；ロドコッカス・オパカス（Rhodococcus opacus）Ｂ４  ｕｉｄ３６５７３株；アシドサーマス・セルロリティカス（Acidothermus cellulolyticus）１１Ｂ株；アルスロバクター・クロロフェノリカス（Arthrobacter chlorophenolicus）Ａ６株；クリベラ・フラビダ（Kribbella flavida）ＤＳＭ１７８３６  ｕｉｄ４３４６５株；サーモモノスポラ・カーバタ（Thermomonospora curvata）ＤＳＭ４３１８３株；ビフィドバクテリウム・デンティウム（Bifidobacterium dentium）Ｂｄ１株；ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＤＪＯ１０Ａ株；スラッキア・ヘリオトリニレデューセンス（Slackia heliotrinireducens）ＤＳＭ２０４７６株；パーセフォネラ・マリナ（Persephonella marina）ＥＸ  Ｈ１株；バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）ＮＣＴＣ９４３４株；カプノサイトファガ・オクラセア（Capnocytophaga ochracea）ＤＳＭ７２７１株；フラボバクテリウム・サイクロフィルム（Flavobacterium psychrophilum）ＪＩＰ０２８６株；アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ８３５株；ロゼイフレクサス・キャステンホルツィイ（Roseiflexus castenholzii）ＤＳＭ１３９４1株；ロゼイフレクサス（Roseiflexus）ＲＳ１株；シネコシスティス（Synechocystis）ＰＣＣ６８０３株；エルシミクロビウム・ミヌトゥム（Elusimicrobium minutum）Ｐｅｉ１９１株；未培養細菌Ｔｅｒｍｉｔｅ  ｇｒｏｕｐ１  ｐｈｙｌｏｔｙｐｅ  Ｒｓ  Ｄ１７；フィブロバクター・サクシノゲネス（Fibrobacter succinogenes）Ｓ８５株；バチルス・セレウス（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７株；リステリア・イノキュア（Listeria innocua）； ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）；ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）ＧＧ株；ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）ＵＣＣ１１８株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Streptococcus agalactiae）Ａ９０９株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ  （ＮＥＭ３１６株；（Streptococcus agalactiae ２６０３株；ストレプトコッカス・ディスガテクティアエ亜種エクイシミリス（Streptococcus dysgalactiae equisimilis）ＧＧＳ１２４株；ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Streptococcus equi zooepidemicus）ＭＧＣＳ１０５６５株；（Streptococcus gallolyticus）ＵＣＮ３４  ｕｉｄ４６０６１株；ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii Challis subst）ＣＨ１株；ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）Ｎ２０２５  ｕｉｄ４６３５３株；ストレプトコッカス・ミュータンス；ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｍ１  ＧＡＳ株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ５００５；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ２０９６株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ９４２９株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ１０２７０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ６１８０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ３１５株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＳＳＩ−１；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ１０７５０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＮＺ１３１株；ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophiles）ＣＮＲＺ１０６６株；ストレプトコッカス・サーモフィラス  ＬＭＤ−９株；ストレプトコッカス・サーモフィラス  ＬＭＧ１８３１１株；クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）Ａ３  Ｌｏｃｈ  Ｍａｒｅｅ株；クロストリジウム・ボツリヌム  Ｂ  Ｅｋｌｕｎｄ  １７Ｂ株；クロストリジウム・ボツリヌム  Ｂａ４  ６５７株；クロストリジウム・ボツリヌム  Ｆ  Ｌａｎｇｅｌａｎｄ株；クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）Ｈ１０株；フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）ＡＴＣＣ２９３２８株；ユウバクテリウム・レクターレ（Eubacterium rectale）ＡＴＣＣ３３６５６株；マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）；マイコプラズマ・モービレ（Mycoplasma mobile）１６３Ｋ株；マイコプラズマ・ペネトランス（Mycoplasma penetrans）；マイコプラズマ・シノビアエ（Mycoplasma synoviae）５３株；ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）ＤＳＭ１２１１２株；ブラジリゾビウム（Bradyrhizobium）ＢＴＡｉｌ株；ニトロバクター・ハンブルゲンシス（Nitrobacter hamburgensis）Ｘ１４株；ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）ＢｉｓＢ  １８株；ロドシュードモナス・パルストリス  ＢｉｓＢ５株；パルビバクラム・ラバメンティボランス（Parvibaculum lavamentivorans）ＤＳ−１株；ディノロセオバクター・シバエ（Dinoroseobacter shibae）ＤＦＬ１２株；グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Gluconacetobacter diazotrophicus）Ｐａｌ５  ＦＡＰＥＲＪ株；グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス  Ｐａｌ５  ＪＧＩ株；アゾスピリルム（Azospirillum）Ｂ５１０  ｕｉｄ４６０８５株；ロドスピリラム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum）ＡＴＣＣ１１１７０株；ディアフォロバクター（Diaphorobacter）ＴＰＳＹ  ｕｉｄ２９９７５株；フェルミネフォロバクター・エ���セニアエ（Verminephrobacter eiseniae）ＥＦ０１−２株；ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitides）０５３４４２株；ナイセリア・メニンジティディス  ａｌｐｈａ１４株；ナイセリア・メニンジティディス  Ｚ２４９１株；デスルホビブリオ・サレキシゲンス（Desulfovibrio salexigens）ＤＳＭ２６３８株；キャンピロバクター・ジェジュニ亜種ドイレイ（Campylobacter jejuni doylei）２６９  ９７株；キャンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）８１１１６株；キャンピロバクター・ジェジュニ；キャンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari）ＲＭ２１００株；ヘリコバクター・ヘパティカス（Helicobacter hepaticus）； ウォリネラ・サクシノゲネス（Wolinella succinogenes）；トルモナス・アウエンシス（Tolumonas auensis）ＤＳＭ９１８７株；シュードアルテロモナス・アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica）Ｔ６ｃ株；シューワネラ・ペアレアナ（Shewanella pealeana）ＡＴＣＣ７００３４５株；レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）Ｐａｒｉｓ株；アクチノバチルス・サクシノゲネス（Actinobacillus succinogenes）１３０Ｚ株；パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）；フランシセラ・ツラレンシス亜種ノビシダ（Francisella tularensis novicida）Ｕ１１２株；フランシセラ・ツラレンシス亜種ハラークティカ（Francisella tularensis holarctica）；フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）ＦＳＣ１９８株；フランシセラ・ツラレンシス；フランシセラ・ツラレンシス  ＷＹ９６−３４１８株；およびトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）ＡＴＣＣ３５４０５株。したがって、本開示の態様は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在するＣａｓ９タンパク質に関する。
【００２２】
Ｃａｓ９タンパク質は、文献中で当業者にＣｓｎ１と呼ばれることもある。本明細書に記載される実験の対象であるストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）のＣａｓ９タンパク質の配列を以下に示す。その全体が参照により援用されるDeltcheva et al., Nature 471, 602-607 (2011)を参照されたい。
【００２３】
【化１】
2020062044.tif 000002
【００２４】
ある態様によれば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質には、ＤＮＡに結合し且つＲＮＡによってガイドされ、ＤＮＡを切断する能力を保持している、Ｃａｓ９のホモログおよびオルソログが含まれる。ある態様によれば、Ｃａｓ９タンパク質としては、ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）由来の天然Ｃａｓ９について記載した配列、およびその配列に対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の相同性を有し、且つＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質などのＤＮＡ結合タンパク質である、タンパク質配列が挙げられる。
【００２５】
ある態様によれば、必要に応じて部位特異的なＲＮＡ誘導型ゲノム切断を可能にし、且つ、外来性ドナー核酸の挿入によるゲノム改変を可能にする、改変Ｃａｓ９−ｇＲＮＡシステムが提供される。ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ上の標的部位または標的座位に相補的である。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡキメラであってもよい。Ｃａｓ９は標的ゲノムＤＮＡに、またはその近傍に結合する。１種類または複数種類のガイドＲＮＡは標的ゲノムＤＮＡに、またはその近傍に結合する。Ｃａｓ９は標的ゲノムＤＮＡを切断し、外来性ドナーＤＮＡがこの切断部位でＤＮＡに挿入される。
【００２６】
したがって、方法は、ガイドＲＮＡをＣａｓ９タンパク質および外来性ドナー核酸と共に使用して、ＲＮＡをコードする核酸および外来性ドナー核酸の挿入、ＲＮＡの発現、ＤＮＡを切断するようなＲＮＡ、Ｃａｓ９、およびＤＮＡの共局在化、および外来性ドナー核酸の挿入を繰り返することによって、Ｃａｓ９発現細胞内のＤＮＡに外来性ドナー核酸を多重挿入する方法に関する。方法ステップを所望の回数繰り返して、任意の数のＤＮＡ改変が生じるようにしてもよい。したがって、本開示の方法は、本明細書に記載のＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを用いて細胞の多重遺伝子改変および多重エピジェネティック改変をもたらす、標的遺伝子の編集に関する。
【００２７】
本開示の別の態様は、ヒト細胞などの細胞のゲノムＤＮＡなどのＤＮＡに外来性ドナー核酸を多重挿入するための、ＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合システム一般の使用に関する。当業者は、本開示に基づき、例示的なＤＮＡ結合システムを容易に特定するであろう。
【００２８】
本開示に係る細胞は、本明細書に記載されているように外来核酸を導入および発現させることができる任意の細胞を含む。本明細書に記載されている本開示の基本的概念は細胞型によって限定されないと理解されるべきである。本開示に係る細胞には、真核細胞、原核細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、古細菌細胞、真正細菌細胞などが含まれる。細胞には、酵母細胞、植物細胞、および動物細胞などの真核細胞が含まれる。具体的な細胞としては、ヒト細胞などの哺乳動物細胞が挙げられる。さらに、細胞には、ＤＮＡの改変が有益であるか、または望ましい、任意の細胞が含まれる。
【００２９】
標的核酸としては、本明細書に記載される共局在複合体がニック形成または切断のいずれかに有用であり得る任意の核酸配列が挙げられる。標的核酸としては、遺伝子が挙げられる。本開示の目的のためには、二本鎖ＤＮＡなどのＤＮＡは標的核酸を含んでいてもよく、共局在複合体は、その共局在複合体が標的核酸に対する所望の効果を与えられ得るよう、その標的核酸において、またはその標的核酸に隣接して、またはその標的核酸の近傍で、ＤＮＡに結合、またはその他の方法でＤＮＡと共局在することができる。そのような標的核酸は、内在性の（または天然の）核酸および外来性の（または外来の）核酸を含んでいてもよい。当業者は、本開示に基づき、標的核酸を含むＤＮＡに共局在するガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を容易に特定またはデザインすることができる。当業者はさらに、標的核酸を含むＤＮＡに同様に共局在する転写制御因子タンパク質または転写制御領域を特定することができる。ＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡが含まれる。ある態様によれば、本開示の実施に有用な材料および方法は、例示的な株および培地、プラスミド構築、プラスミドの形質転換、一過性ｇＲＮＡカセットおよびドナー核酸のエレクトロポレーション、ドナーＤＮＡを有するｇＲＮＡプラスミドでのＣａｓ９発現細胞の形質転換、Ｃａｓ９のガラクトース誘導、酵母ゲノム中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ標的の特定など、あらゆる目的のため、その全体が参照により援用されるDi Carlo, et al., Nucleic Acids Research, 2013, vol. 41, No. 7 4336-4343に記載のものを含む。本発明の実施において当業者に有用な情報、材料、および方法を含む別の参考文献は、あらゆる目的のため、それぞれその全体が参照により援用されるMali,P., Yang,L., Esvelt,K.M., Aach,J., Guell,M., DiCarlo,J.E., Norville,J.E. and Church,G.M. (2013) RNA-Guided human genome engineering via Cas9. Science, 10.1126fscience. l232033; Storici,F., Durham,C.L., Gordenin,D.A. and Resnick,M.A. (2003) Chromosomal site-specific double-strand breaks are efficiently targeted for repair by oligonucleotides in yeast. PNAS, 100, 14994-14999; およびJinek,M., Chylinski,K., Fonfara,l., Hauer,M., Doudna,J.A. and Charpentier,E. (2012) A programmable dual-RNA-Guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337, 816-821に記載されている。
【００３０】
外来核酸（すなわち、細胞の天然核酸組成物の一部でない核酸）は、当業者に公知の任意の導入方法を用いて細胞に導入されてもよい。そのような方法には、遺伝子導入法、形質導入法、ウイルス形質導入法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、ヌクレオフェクション法、ナノ粒子銃（nanoparticle bombardment）法、形質転換法、結合（conjugation）法などが含まれる。当業者は、容易に特定可能な文献資料を用いてそのような方法を容易に理解し、適用するであろう。
【００３１】
以下の実施例は本開示の代表例として記載するものである。本開示、図面、および添付の特許請求を考慮して、これらの実施形態および他の同等の実施形態が明らかになるので、これらの実施例は、本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３２】
実施例Ｉ
酵母におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いた多重遺伝子編集の一般的プロセス
ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcous pyogenes）のＣＲＩＳＰＲ免疫系由来のＣａｓ９を用いて、相同組換えを促進し、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharaomyces cerevisiae）において形質転換ＤＮＡを組み換えない細胞に対して選択する。Ｃａｓ９を用いたＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断の一般的な方法を図１に示す。Ｃａｓ９、ガイドＲＮＡ、および標的ＤＮＡの間で共局在複合体が形成される。Ｃａｓ９により標的ＤＮＡ中に二本鎖切断が生じる。次に、相同組換えによりドナーＤＮＡがＤＮＡに挿入される。ドナーＤＮＡには、切断部位の両側に隣接配列、およびＣａｓ９切断部位を除去する配列が含まれる。その結果、ドナーＤＮＡが、ゲノムＤＮＡであってもよいＤＮＡ中に組み込まれる。
【００３３】
Ｃａｓ９を用いた酵母における多重ＤＮＡ改変による高頻度ドナーＤＮＡ組換えの一般的な方法を、図２を参照して以下に記載する。天然のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼＣａｓ９を有さない細胞を、細胞によるＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼＣａｓ９の発現を可能にするＤＮＡで形質転換してもよい。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼＣａｓ９を発現する細胞を成長させる。１種類または複数種類のガイドＲＮＡの細胞への導入および発現のために、１種類または複数種類のガイドＲＮＡおよび当業者に公知の選択マーカーをコードする１種類または複数種類の核酸を含むプラスミドを作成する。図２に示するように、細胞のゲノムＤＮＡに異なる遺伝子、すなわち遺伝子Ａ、遺伝子Ｂ、遺伝子Ｃ、遺伝子Ｄ、および遺伝子Ｅを挿入するために用いられるガイドＲＮＡをコードする核酸をそれぞれが有するプラスミドのプールが示されている。遺伝子Ａ、遺伝子Ｂ、遺伝子Ｃ、遺伝子Ｄ、および遺伝子Ｅの二本鎖ドナーＤＮＡを含むドナーＤＮＡのプールも提供される。
【００３４】
細胞を洗浄し、酢酸リチウムで馴化する。細胞をさらに洗浄してもよく、例えばＤＮＡカセットなど、二本鎖オリゴヌクレオチドなどの外来性ドナー核酸のプール、およびガイドＲＮＡをコードする核酸を含むプラスミドを細胞と混合してもよい。図２に示されているように、ＰＥＧ３３５０および酢酸リチウムを用いて、外来性ドナー核酸およびプラスミドで細胞を形質転換する。
【００３５】
図２に示されるように、選択マーカーを用いて１種類または複数種類のガイドＲＮＡについて細胞を選択する。選択された細胞は、１種類または複数種類のガイドＲＮＡを発現する。ガイドＲＮＡと、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼＣａｓ９と、ＤＮＡとの１種類または複数種類の共局在複合体が細胞中で形成される。エンドヌクレアーゼによりＤＮＡが切断され、ドナー核酸が相同組換えなどの組換えによって細胞に挿入される。次に、細胞のプラスミドを除去（cure）した後、細胞について必要に応じて上記ステップを１回またはさらに繰り返す。複数のサイクルを行ってもよい。複数のサイクルを経た細胞は、高い組換え頻度を示す。または、プラスミドを維持している細胞を非選択（deselect）とするか、あるいはプラスミドを有する細胞を選択するための培地中に細胞を入れる。その後、細胞成長ステップで始まるプロセスを繰り返す。したがって、方法は、前のサイクルで既に改変された細胞を繰り返すか、または前のサイクルから改変されなかった細胞を選択し、この非改変細胞をさらに繰り返して本明細書に記載されるＤＮＡの改変を行うことを含む。
【００３６】
実施例ＩＩ
詳細な繰り返しプロトコール
（ウラシル栄養要求株、構成的Ｃａｓ９発現）細胞を、５ｍｌのＳＣ酵母培地またはＳＣ＋ＦＯＡ（１００μｇ／ｍｌ）中で、光学密度０．８〜１．０まで成長させる。細胞を２２５０×ｇで３分間スピンし、１０ｍｌの水で１回洗浄する。細胞をスピンし、１ｍｌの１００ｍＭ酢酸リチウムに再懸濁する。細胞をペレット化し、５００μｌの１００ｍＭ酢酸リチウムに再懸濁する。５０μｌの細胞；１ｎｍｏｌの二本鎖オリゴヌクレオチドプール、各５μｇのガイドＲＮＡ（ウラシルマーカーを有するｐ４２６ベクター）を含み、７０μｌまで水を加えて所望の最終体積にしたＤＮＡ混合物；２４０μｌの５０％ＰＥＧ３３５０；および３６μｌの１Ｍ酢酸リチウムをこの順番で添加することにより、形質転換混合物を調製する。混合物を３０℃で３０分間インキュベートする。次に、混合物をボルテックスし、混合物を４２℃で２０分間インキュベートすることにより細胞に熱ショックを与える。次に、細胞をペレット化し、上清を除去する。細胞を５ｍｌのＳＣ−ウラシルに播種して、ウラシル遺伝子を含むｇＲＮＡプラスミドを選択する。細胞を２日間回復させる。２日後、１００μｌの細胞培養物を５ｍｌの新たに調製したＳＣに播種し、１２時間成長させてプラスミド維持について非選択とする。次に、１００μｌのＳＣ培養細胞を５ｍｌのＳＣ＋ＦＯＡ（１００μｇ／ｍＬ）培地に播種して、プラスミドを有する細胞を選択する。これにより、プロセスの１サイクルが完了する。このプロセスを、所望のサイクル回数分、反復する。プロセス全体は、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１５サイクル、２０サイクル、２５サイクルなどを含んでいてもよい。
【００３７】
実施例ＩＩＩ
選択された変異体における熱ショックに対する熱耐性
本明細書に記載の方法を用いて、選択された変異体における熱ショックに対する熱耐性が示された。ノックアウトまたは点突然変異により酵母の熱耐性を増大させることが示されている遺伝子を、本明細書に記載のガイドＲＮＡ−Ｃａｓ９システムにより標的化した。変異について、４個の遺伝子、すなわちＵＢＣ１、ＳＣＨ９、ＴＦＳ１、およびＲＡＳ２を選択した。ＳＣＨ９は、浸透圧ストレス（osmostress）、栄養素、および環境ストレスの遺伝子を制御するタンパク質キナーゼである。ＴＦＳ１は、カルボキシペプチダーゼＹおよびＩｒａ２ｐを阻害し、Ｒａｓ  ＧＡＰ活性を阻害し、ＤＮＡ複製ストレスに応答する。ＲＡＳ２は、窒素飢餓を制御するＧＴＰ結合タンパク質であり、ストレス応答経路に関与する。ＳＣＨ９、ＴＦＳ１、およびＲＡＳ２のそれぞれについて、コード領域にセリンからアラニンへの変異を含むアレルであるドナーＤＮＡを作成した。ＵＢＣ１−Ｅ２はユビキチン結合酵素である。リン酸化部位を除去することで熱耐性を生じる点突然変異を含むドナーＤＮＡを作成した。
【００３８】
本明細書に記載の方法を用いて、変化を付与する二本鎖オリゴヌクレオチドと共に、遺伝子座位のＣａｓ９に切断を誘導するようにデザインされたガイドＲＮＡを用いて、遺伝子を標的化した。図３に示されているように、酵母における熱耐性を担う４つの座位を標的化するオリゴヌクレオチドを用いてアレル置換が実現された。模式図に従い、遺伝子のうちの１つに対するガイドＲＮＡをコードする核酸がそれぞれ組み込まれた４種類のプラスミド、すなわち、ＵＢＣ１  ｇＲＮＡプラスミド、ＴＦＳ１  ｇＲＮＡプラスミド、ＳＣＨ９  ｇＲＮＡプラスミド、およびＲＡＳ２  ｇＲＮＡプラスミドを作成した。各プラスミドは対応する二本鎖ドナーオリゴヌクレオチド、すわなち、ｕｂｃ１（Ｓ９７Ａ）二本鎖オリゴヌクレオチド、ｔｆｓ１（タグ）二本鎖オリゴヌクレオチド、ｓｃｈ９（タグ）二本鎖オリゴヌクレオチド、およびｒａｓ（タグ）二本鎖オリゴヌクレオチドを有していた。プラスミドおよびそれに対応する二本鎖ドナーオリゴヌクレオチドをプールとして、酵母を同時形質転換した。２サイクルを行い、細胞集団中の細胞の割合の関数として、１細胞あたりの改変数を図４に示す。多数の細胞が、２サイクル後に１個および２個の改変を含んでいた。１個の三重変異体を単離することができた（未掲載データ）。
【００３９】
図５Ａは、１個のドナーオリゴヌクレオチドで形質転換された株、２個のドナーオリゴヌクレオチドで形質転換された株、および３個のドナーオリゴヌクレオチドで形質転換された株を示す、本明細書に記載の方法から得られた株の表である。図５Ｂは、インキュベーションしなかった場合と比較した４２℃で３時間のインキュベーションの効果、および野生型細胞の数のわずかな減少を示している。図５Ｂはまた、インキュベーションしなかった場合と比較した５５℃で２時間のインキュベーションの効果を示している。５５℃での熱ショックに最も耐性のあった変異体はｓｃｈ９、ｓｃｈ９  ｔｆｓ１、およびｔｆｓ１  ｕｂｃ１（ｓ９７ａ）であった。
【００４０】
図６は概して、２つの座位についての多重オリゴヌクレオチド取り込みの最適化に関するグラフ情報を提供する。図６Ａは、形質転換に用いた各プラスミドの量（μｇ）に対する形質転換の頻度を示す。図６Ｂは、形質転換に用いた各プラスミドの量（μｇ）に対する個々の組換え頻度を示す。図６Ｃは、形質転換に用いた各プラスミドの量（μｇ）に対するｃａｎ１座位およびＫａｎＭＸ座位における同時組換えの頻度を示す。
【００４１】
図７は概して、２つの座位での多重線状カセット取り込みに関するグラフ情報を提供する。グラフは、最も左側のバーが、ｐ４２６  ｇＲＮＡ  ＡＤＥ２＋ＨｙｇＲカセットの形質転換頻度、次のバーが、ｐ４２６  ｇＲＮＡ  ＣＡＮ１＋Ｇ４１８Ｒカセットの形質転換頻度、次の３つのバーが、ｐ４２６  ｇＲＮＡ＋ＡＤＥ２  ｐ４２６  ｇＲＮＡ  ＣＡＮ１＋ＨｙｇＲカセット＋Ｇ４１８Ｒカセットの形質転換頻度を示す。
【００４２】
図８は概して、選択された変異体についての高温における対数増殖中の倍加時間を示す増殖率の分析を示す。図８Ａは、野生型および同定された変異体の３０℃での倍加時間の変化倍率をグラフ化したものである。図８Ｂは、野生型および同定された変異体の３７℃での倍加時間の変化倍率をグラフ化したものである。図８Ｃは、野生型および定常期後期の培養から播種されたとして同定された変異体の４２℃での倍加時間の変化倍率をグラフ化したものである。図８Ｄは、野生型および対数増殖期後期の培養から播種されたとして同定された変異体の４２℃での倍加時間の変化倍率をグラフ化したものである。グラフデータは、ｓｃｈ９  ｔｆｓ１およびｔｆｓ１  ｕｂｃ１（Ｓ９７Ａ）において３７℃で倍加時間が短くなっていることを示している。グラフデータは、ｒａｓ２  ｔｆｓ１、ｓｃｈ９  ｕｂｃ１（Ｓ９７Ａ）、ｔｆｓ１  ｕｂｃ１（Ｓ９７Ａ）、およびｒａｓ２  ｔｆｓ１  ｕｂｃ１（Ｓ９７Ａ）において４２℃で倍加時間が短くなっていることを示している。
【図１】
2020062044.tif 000003
【図２】
2020062044.tif 000004
【図３】
2020062044.tif 000005
【図４】
2020062044.tif 000006
【図５Ａ】
2020062044.tif 000007
【図５Ｂ】
2020062044.tif 000008
【図６Ａ】
2020062044.tif 000009
【図６Ｂ】
2020062044.tif 000010
【図６Ｃ】
2020062044.tif 000011
【図７】
2020062044.tif 000012
【図８Ａ】
2020062044.tif 000013
【図８Ｂ】
2020062044.tif 000014
【図８Ｃ】
2020062044.tif 000015
【図８Ｄ】
2020062044.tif 000016
【配列表】
2020062044000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月21日(2020.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
図８は概して、選択された変異体についての高温における対数増殖中の倍加時間を示す増殖率の分析を示す。図８Ａは、野生型および同定された変異体の３０℃での倍加時間の変化倍率をグラフ化したものである。図８Ｂは、野生型および同定された変異体の３７℃での倍加時間の変化倍率をグラフ化したものである。図８Ｃは、野生型および定常期後期の培養から播種されたとして同定された変異体の４２℃での倍加時間の変化倍率をグラフ化したものである。図８Ｄは、野生型および対数増殖期後期の培養から播種されたとして同定された変異体の４２℃での倍加時間の変化倍率をグラフ化したものである。グラフデータは、ｓｃｈ９  ｔｆｓ１およびｔｆｓ１  ｕｂｃ１（Ｓ９７Ａ）において３７℃で倍加時間が短くなっていることを示している。グラフデータは、ｒａｓ２  ｔｆｓ１、ｓｃｈ９  ｕｂｃ１（Ｓ９７Ａ）、ｔｆｓ１  ｕｂｃ１（Ｓ９７Ａ）、およびｒａｓ２  ｔｆｓ１  ｕｂｃ１（Ｓ９７Ａ）において４２℃で倍加時間が短くなっていることを示している。
本開示に係る態様を以下に例示する。
＜１＞
標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成、且つ前記標的ＤＮＡを部位特異的に切断する酵素を発現する細胞において前記標的ＤＮＡに複数の変化を生じさせる方法であって、
（ａ）標的ＤＮＡに相補的であり且つ前記酵素を前記標的ＤＮＡにガイドする、１種類または複数種類のＲＮＡをコードする第１の外来核酸を前記細胞に導入すること、ここで、前記１種類または複数種類のＲＮＡおよび前記酵素が、前記標的ＤＮＡへの共局在複合体の構成要素である、
１種類または複数種類のドナー核酸配列をコードする第２の外来核酸を前記細胞に導入すること、ここで、前記１種類または複数種類のＲＮＡおよび前記１種類または複数種類のドナー核酸の配列が発現し、前記１種類または複数種類のＲＮＡおよび前記酵素が前記標的ＤＮＡに共局在し、前記酵素により前記標的ＤＮＡが切断され、前記ドナー核酸が前記標的ＤＮＡに挿入されて前記細胞中に変化したＤＮＡが生成する、および、
ステップ（ａ）を複数回繰り返して前記細胞において前記ＤＮＡに複数の変化を生じさせることを含む、方法。
＜２＞
前記酵素が、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞
前記酵素がＣａｓ９である、＜１＞に記載の方法。
＜４＞
前記細胞が真核細胞である、＜１＞に記載の方法。
＜５＞
前記細胞が、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である、＜１＞に記載の方法。
＜６＞
前記ＲＮＡが、約１０〜約５００ヌクレオチドである、＜１＞に記載の方法。
＜７＞
前記ＲＮＡが、約２０〜約１００ヌクレオチドである、＜１＞に記載の方法。
＜８＞
前記１種類または複数種類のＲＮＡが、ガイドＲＮＡである、＜１＞に記載の方法。
＜９＞
前記１種類または複数種類のＲＮＡが、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である、＜１＞に記載の方法。
＜１０＞
前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、＜１＞に記載の方法。
＜１１＞
前記１種類または複数種類のドナー核酸配列が、組換えにより挿入される、＜１＞に記載の方法。
＜１２＞
前記１種類または複数種類のドナー核酸配列が、相同組換えにより挿入される、＜１＞に記載の方法。
＜１３＞
前記１種類または複数種類のＲＮＡおよび前記１種類または複数種類のドナー核酸配列が、１種類または複数種類のプラスミド上に存在する、＜１＞に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡに相補的なガイドＲＮＡと共局在複合体を形成し、且つ前記標的ＤＮＡを部位特異的に切断するＣａｓ９酵素を発現する細胞においてＤＮＡに外来性核酸配列を多重挿入する方法であって、
（ａ）複数種類のガイドＲＮＡおよび複数種類の外来性ドナー核酸配列を前記細胞に導入すること、ここで、前記複数種類のガイドＲＮＡのそれぞれが前記Ｃａｓ９酵素と前記ＤＮＡの特定の部位で共局在複合体を形成し、
前記Ｃａｓ９酵素により前記ＤＮＡが切断されて切断部位が形成され、該切断部位に前記複数種類の外来性ドナー核酸配列のうちの１つが挿入され、前記細胞は真核細胞である、および、
（ｂ）ステップ（ａ）を複数回繰り返して前記細胞において前記ＤＮＡに複数の変化を生じさせることを含む、方法。
【請求項２】
前記細胞が、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ガイドＲＮＡが、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記外来性ドナー核酸配列が、組換えにより挿入される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記外来性ドナー核酸配列が、相同組換えにより挿入される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ガイドＲＮＡが、プラスミド上に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記外来性ドナー核酸配列が前記切断部位の両側に隣接する相同配列またはアームを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記外来性ドナー核酸配列が前記切断部位を除去するための配列を含む、請求項１に記載の方法。
【外国語明細書】
2020062044000001.pdf