(57)【要約】      （修正有）【課題】標的核酸中への巨大遺伝子挿入の効率を改善する方法の提供。【解決手段】標的核酸を含むＤＮＡに相補的な１種類または複数種類のガイドＲＮＡ配列をコードする第１の外来核酸を細胞に導入すること、前記ＤＮＡに結合し、且つ前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡ配列によってガイドされる、Ｃａｓ９タンパク質をコードする第２の外来核酸を前記細胞に導入すること、前記標的核酸配列中に取り込まれる外来性核酸配列をコードする第３の外来核酸を前記細胞に導入することを含み、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡ配列および前記Ｃａｓ９タンパク質が前記ＤＮＡに共局在し、前記Ｃａｓ９タンパク質が２つ以上の二本鎖切断を形成して関心のある第１の核酸配列を除去し、前記外来性核酸配列が、前記標的核酸の２つの切断点の間に挿入される、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞において標的核酸を改変する方法であって、
前記標的核酸を含むＤＮＡに相補的な１種類または複数種類のガイドＲＮＡ配列をコードする第１の外来核酸を前記細胞に導入すること、
前記ＤＮＡに結合し、且つ前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡ配列によってガイドされる、Ｃａｓ９タンパク質をコードする第２の外来核酸を前記細胞に導入すること、
前記標的核酸配列中に取り込まれる外来性核酸配列をコードする第３の外来核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡ配列、前記Ｃａｓ９タンパク質、および前記外来性核酸配列が発現し、
前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡ配列および前記Ｃａｓ９タンパク質が前記ＤＮＡに共局在し、前記Ｃａｓ９タンパク質が２つ以上の二本鎖切断を形成して関心のある第１の核酸配列を除去し、前記外来性核酸配列が、前記標的核酸の２つの切断点の間に挿入される、
方法。
【請求項２】
前記標的核酸配列中に取り込まれる前記外来性核酸配列は、前記遺伝子置換の周辺部位に相補的な配列で挟まれている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記外来性核酸の長さが１００塩基対超〜約１００，０００塩基対である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記関心のある第１の核酸配列の長さが１００塩基対超〜約１０，０００塩基対である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が真核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ガイドＲＮＡが約１０〜約５００ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ガイドＲＮＡが約２０〜約１００ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡ配列がｃｒＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡ配列がｔｒａｃｒＲＮＡ‐ｃｒＲＮＡ融合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記外来性核酸配列が、相同組換えにより前記標的核酸配列中に挿入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記外来性核酸配列が、非相同末端結合により前記標的核酸配列中に挿入される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願データ
本願は、２０１３年１１月１９日に提出された米国仮特許出願第６１／９０６，１８８号に基づく優先権を主張するものであり、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
政府利益の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所の助成番号第Ｐ５０ＨＧ００５５５０号の政府助成を受けてなされた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
細菌および古細菌のＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成した短鎖ガイドＲＮＡに依存して、侵入する外来核酸中に存在する相補配列を分解する。Deltcheva, E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602-607 (2011); Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. & Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, E2579-2586 (2012); Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012); Sapranauskas, R. et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research 39, 9275-9282 (2011)；およびBhaya, D., Davison, M. & Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics 45, 273-297 (2011) を参照されたい。近年、ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのインビトロ再構成により、通常はトランスにコードされるｔｒａｃｒＲＮＡ（「トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」）と融合したｃｒＲＮＡ（「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」）が、そのｃｒＲＮＡに一致する標的ＤＮＡ配列をＣａｓ９タンパク質に配列特異的に切断させるのに十分であることが実証された。標的部位に相同なｇＲＮＡの発現により、Ｃａｓ９が動員され、標的ＤＮＡが分解される。H. Deveau et al, Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. Journal of Bacteriology 190, 1390 (Feb, 2008) を参照されたい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示の態様は、標的核酸中への巨大遺伝子挿入の効率改善に関する。本開示の態様は、細胞内の標的核酸からの巨大遺伝子などの巨大核酸配列の切除に関する。本開示の態様は、細胞内の標的核酸中への巨大遺伝子などの巨大核酸配列の挿入に関する。本開示の態様は、細胞内の標的核酸からの巨大遺伝子などの巨大核酸配列の切除、およびこの細胞内の標的核酸中への巨大遺伝子などの巨大核酸配列の挿入に関する。
【０００５】
本開示の態様は、標的核酸内の巨大核酸置換のための標的化ベクターのデザインに関する。
【０００６】
ある態様によれば、配列特異的ヌクレアーゼなどのＤＮＡ結合タンパク質を用いて標的核酸配列中に二本鎖切断が形成される。１つまたは複数の二本鎖切断が標的核酸配列中に形成されてもよい。ある態様によれば、第１の核酸配列が標的核酸配列から除去され、外来性核酸配列が、標的核酸配列の切断部位間または切断末端間の標的核酸配列中に挿入される。ある態様によれば、各ホモロジーアームでの二本鎖切断により、相同組換えなどによる核酸配列の挿入または置換の効率が向上または改善される。ある態様によれば、複数の二本鎖切断または複数の切断部位により、標的化ベクターからの核酸配列の取り込み効率が改善される。
【０００７】
本開示のある態様は、ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む哺乳動物などの細胞における、数千塩基（multi-kilobase）の内在性遺伝子の切除およびホモ接合型ノックイン標的置換の方法に関する。ある態様によれば、方法は選択マーカーを使用せずに実施される。
【０００８】
ある態様によれば、ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ結合タンパク質、例えばヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質を用いて、標的核酸配列中に巨大遺伝子を挿入する方法が提供される。ある態様によれば、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）に相補的な１種類または複数種類のＲＮＡ（リボ核酸）をコードする第１の外来核酸が細胞に導入され、このＤＮＡには標的核酸が含まれる。前記ＤＮＡに結合し、且つ前記１種類または複数種類のＲＮＡによってガイドされる、ヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質をコードする第２の外来核酸が細胞に導入される。前記１種類または複数種類のＲＮＡおよび前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質が発現し、前記１種類または複数種類のＲＮＡおよび前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質が前記ＤＮＡに共局在し、前記ＤＮＡ結合タンパク質が前記標的核酸を切断して、関心のある第１の核酸配列が除去される。関心のある外来性核酸配列が切断部位間で前記標的核酸配列中に挿入され、その結果、前記関心のある第１の核酸配列が除去される。ある態様によれば、複数のガイドＲＮＡが用いられてもよい。
【０００９】
本開示の範囲内の巨大核酸配列（除去対象である関心のある第１の核酸配列または挿入対象である外来性核酸配列であってもよい）は、長さが１００塩基対超〜約１００，０００塩基対、１００塩基対超〜約１０，０００塩基対、約２００塩基対〜約１００，０００塩基対、約３００塩基対〜約１００，０００塩基対、約４００塩基対〜約１００，０００塩基対、約５００塩基対〜約１００，０００塩基対、約６００塩基対〜約１００，０００塩基対、約７００塩基対〜約１００，０００塩基対、約８００塩基対〜約１００，０００塩基対、約９００塩基対〜約１００，０００塩基対、約１０００塩基対〜約１００，０００塩基対、約２０００塩基対〜約１００，０００塩基対、約３０００塩基対〜約１００，０００塩基対、約４０００塩基対〜約１００，０００塩基対、約５０００塩基対〜約１００，０００塩基対、約６０００塩基対〜約１００，０００塩基対、約７０００塩基対〜約１００，０００塩基対、約８０００塩基対〜約１００，０００塩基対、約９０００塩基対〜約１００，０００塩基対、約１０，０００塩基対〜約１００，０００塩基対、約２０，０００塩基対〜約１００，０００塩基対、約３０，０００塩基対〜約１００，０００塩基対、約４０，０００塩基対〜約１００，０００塩基対、約５０，０００塩基対〜約１００，０００塩基対、約６０，０００塩基対〜約１００，０００塩基対、約７０，０００塩基対〜約１００，０００塩基対、約８０，０００塩基対〜約１００，０００塩基対、約９０，０００塩基対〜約１００，０００塩基対、約５００塩基対〜約１０，０００塩基対、約１０００塩基対〜約１０，０００塩基対、約２０００塩基対〜約１０，０００塩基対、または約１０００塩基対〜約５，０００塩基対の核酸配列である。巨大核酸配列は、本明細書で「キロベース」または「数キロベース（multi-kilobase）」の核酸配列と呼ばれることがあり、すなわち１０００塩基対超である。
【００１０】
ある態様によれば、巨大核酸は１０００塩基対超である。ある態様によれば、挿入対象の核酸配列は、その核酸配列が挿入される細胞のゲノムに対して異種性である。ある態様によれば、標的核酸配列に挿入される外来性核酸は、その外来性核酸が置換する関心のある第１の核酸配列とは異なり得るか、または細胞の標的核酸またはゲノム中のいずれの核酸配列とも異なり得る、外来核酸配列である。ある態様によれば、関心のある第１の核酸配列の除去および外来性核酸の挿入は、同時または実質的に同時に起こる。これは、欠失が生じた後に別個に挿入が起こる方法とは区別されるべきである。
【００１１】
ある態様によれば、置換の片側に位置する単一切断部位を用いた遺伝子置換操作のために用いられる、外来配列を含む標的化ベクターが提供される。外来配列は、置換周辺のゲノムと同一の配列で挟まれている。その結果、片側での１箇所の切断のみで遺伝子置換を行うことができる。他方の末端は、ゲノムと標的化ベクター中の外来配列周辺に位置するその相補的配列（ホモロジーアーム）との間の自然組換えによって回復される。しかし、本開示の態様には、置換領域の両側の切断も含まれる。
【００１２】
ある態様によれば、細胞は、真核細胞である。ある態様によれば、細胞は、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である。ある態様によれば、細胞は、哺乳動物細胞である。
【００１３】
ある態様によれば、ＲＮＡは、約１０〜約５００ヌクレオチドである。ある態様によれば、ＲＮＡは、約２０〜約１００ヌクレオチドである。
【００１４】
ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡは、ガイドＲＮＡである。ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡは、ｃｒＲＮＡである。ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡである。ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ‐ｃｒＲＮＡ融合体である。
【００１５】
ある態様によれば、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである。
【００１６】
ある態様によれば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡに結合し、且つ１種類または複数種類のＲＮＡによってガイドされる、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質である。ある態様によれば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡに結合し、且つ１種類または複数種類のＲＮＡによってガイドされる、Ｃａｓ９タンパク質である。
【００１７】
本発明の特定の実施形態のその他の特徴および利点は、以下の実施形態およびそれらの図面の説明において、および特許請求の範囲から、さらに十分に明らかになるであろう。
【００１８】
本特許または出願ファイルは、カラーで作製された少なくとも１枚の図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、特許庁へ申請し、必要な料金を支払うことで提供される。本発明の、前述した特徴およびその他の特徴、ならびに利点は、添付の図面と共に、具体的実施形態についての以下の詳細な説明からより十分に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】１種類または２種類のＣＲＩＳＰＲ  ｓｇＲＮＡを用いたホモ接合型標的遺伝子置換。２種類のＣｒｉｓｐｒ  ｓｇＲＮＡが、イントロン１内（Ｌ１）またはポリアデニル化部位の後ろ（Ｒ１）でｈＴｈｙ１を標的化する。ｍＴｈｙ１標的化ベクタープラスミドは、ｓｇＲＮＡ部位の外側のｈＴｈｙ１ホモロジーアームで挟まれた、ｍＴｈｙ１のエキソン２および３（橙色）を含み、ｈＴｈｙ１プロモーターおよび（リーダー配列をコードする）エキソン１は保持されているが、ｓｇＲＮＡ部位は破壊されている。小さい三角形は、４種類のジェノタイピングＰＣＲ反応のためのプライマー部位を示す。
【図１Ｂ】１種類または２種類のＣＲＩＳＰＲ  ｓｇＲＮＡを用いたホモ接合型標的遺伝子置換。ｍＴｈｙ１標的化ベクターをコードするプラスミド、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするプラスミド、およびＬ１、Ｒ１、もしくは両方のｓｇＲＮＡをコードするか、またはいずれのｓｇＲＮＡもコードしないプラスミドをＰＧＰ１  ｉＰＳＣにヌクレオフェクトした。５日後、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。ｍＴｈｙ１発現を獲得および／またはｈＴｈｙ１発現を喪失した細胞の割合が示される。
【図１Ｃ】１種類または２種類のＣＲＩＳＰＲ  ｓｇＲＮＡを用いたホモ接合型標的遺伝子置換。各象限から単一のｉＰＳＣをＦＡＣＳでソートし、個別のウェル中で培養し、４種類のＰＣＲ反応を用いてジェノタイピングを行った。ＰＣＲ産物のサイズおよびサンガーシークエンシングに基づいてアレル、すなわち、天然ヒト（＋）；組換えマウス（ｍ）；２種類のｓｇＲＮＡ部位間での切除（Δ）；および２種類のｓｇＲＮＡ部位間での逆位（ｉ）、を同定した。＋／＋野生型、ｍ／＋ヘテロ接合型、ｍ／ｍホモ接合型、ｍ／Δヘテロ接合型、Δ／Δホモ接合型、およびｉ／Δヘテロ接合型のコロニーの代表的ゲルを示す。
【図１Ｄ】１種類または２種類のＣＲＩＳＰＲ  ｓｇＲＮＡを用いたホモ接合型標的遺伝子置換。ＦＡＣＳソートされたｉＰＳコロニー中の遺伝子型の頻度。結果は３回の独立実験の代表である。
【図２Ａ】ＣＲＩＳＰＲにより生じたホモ接合型欠失およびヘテロ接合型欠失の頻度。ヒトＴｈｙ１遺伝子を標的化するＣｒｉｓｐｒ  ｓｇＲＮＡ、すなわち、イントロン１内に２種類（左側：Ｌ１およびＬ２）およびｈＴｈｙ１の後ろに種々の距離で１０種類（右側：Ｒ１〜Ｒ１０）を作製した。
【図２Ｂ】ＣＲＩＳＰＲにより生じたホモ接合型およびヘテロ接合型欠失の頻度。１種類の左側ｓｇＲＮＡおよび１種類の右側ｓｇＲＮＡのペアをＰＧＰ１  ｉＰＳＣクローンにヌクレオフェクトした。陰性対照として、左側ｓｇＲＮＡのみをヌクレオフェクトした（右列）。５日後、ヒトＴｈｙ１の両アレルのホモ接合型欠失について、細胞をフローサイトメトリーで分析した。ｓｇＲＮＡ部位間の距離（Ｔｈｙ１Δ）およびｈＴｈｙ１−細胞の頻度を示す。
【図２Ｃ】ＣＲＩＳＰＲにより生じたホモ接合型およびヘテロ接合型欠失の頻度。１種類の左側ｓｇＲＮＡおよび１種類の右側ｓｇＲＮＡのペアをＴｈｙ１ｍ／＋  ＰＧＰ１  ｉＰＳＣクローンにヌクレオフェクトした。陰性対照として、左側ｓｇＲＮＡのみをヌクレオフェクトした（右列）。５日後、残存するヒトＴｈｙ１アレルのヘテロ接合型欠失およびマウスＴｈｙ１アレルの保持について、細胞をフローサイトメトリーで分析した。ｓｇＲＮＡ部位間の距離（Ｔｈｙ１Δ）およびｈＴｈｙ１−細胞の頻度を示す。
【図２Ｄ】各ｓｇＲＮＡペア由来のｈＴｈｙ１−細胞の割合から、左側ｓｇＲＮＡのみの対照由来のｈＴｈｙ１−細胞の割合を引いた割合が、Ｔｈｙ１欠失のサイズに対してプロットされる。Ｌ１またはＬ２を含むｓｇＲＮＡペアを、それぞれ黒色または赤色で示す。エラーバーは、２回の独立実験の平均値±ｓ．ｅ．ｍを示す。
【図２Ｅ】各ｓｇＲＮＡペア由来のｈＴｈｙ１−細胞の割合から、左側ｓｇＲＮＡのみの対照由来のｈＴｈｙ１−細胞の割合を引いた割合が、Ｔｈｙ１欠失のサイズに対してプロットされる。Ｌ１またはＬ２を含むｓｇＲＮＡペアを、それぞれ黒色または赤色で示す。エラーバーは、２回の独立実験の平均値±ｓ．ｅ．ｍを示す。
【図３Ａ】切除および逆位ジャンクションの配列。ＦＡＣＳでソートされた（図１に記載されるような）ｈＴｈｙ１‐ｍＴｈｙ１‐ｉＰＳＣクローンから精製したゲノムＤＮＡについてジェノタイピングＰＣＲ反応＃１を行い、同じＰＣＲプライマーを用いたサンガーシークエンシングにより分析した。得られたサンガーシークエンシングトレースにおけるダブルピークのデコンボリューションを行って、各クローンの両アレルの配列を明らかにした。ヒトＴｈｙ１座位の天然配列（配列番号１０８）。Ｃｒｉｓｐｒ  ｓｇＲＮＡ標的化部位であるＬ１（紫色）およびＲ１（赤色）はヒトＴｈｙ１座位上で２．７ｋｂ離れて位置する。予想されるヌクレアーゼ切断部位は、ＰＡＭ（下線）の６ｂｐ上流に示される。
【図３Ｂ】図１Ｄに記載のΔ／Δ二重切除ｈＴｈｙ１‐ｍＴｈｙ１‐コロニー４個の両アレルの配列（配列番号１０９〜１１２）。２個の別個のクローンで見出された配列を、×２として示す。結果は２回の独立実験の代表である。
【図３Ｃ】図１Ｄに記載のｉ／Δ逆位・切除ｈＴｈｙ１‐ｍＴｈｙ１‐コロニー５個の両アレルの配列（配列番号１１３〜１２０）。２個の別個のクローンで見出された配列を、×２として示す。結果は２回の独立実験の代表である。
【図４Ａ】ヒトＣＤ１４７ゲノム座位中へのマウスＣＤ１４７遺伝子の標的置換。ヒトＣＤ１４７遺伝子のイントロン１内（Ｌ１４７、左側）およびポリアデニル化部位の後ろ（Ｒ１４７、右側）を標的とする、９．８ｋｂ離れた２種類のＣｒｉｓｐｒ  ｓｇＲＮＡをデザインした。マウスＣＤ１４７標的化ベクタープラスミドは、ｓｇＲＮＡ部位の外側のヒトＣＤ１４７配列にマッチするホモロジーアームで挟まれたマウスＣＤ１４７のエキソン２〜７（茶色）を含む、５．８ｋｂの配列からなる。標的化コンストラクトにおいて、ヒトＣＤ１４７のプロモーターおよび（リーダー配列をコードする）エキソン１は保持されているが、ｓｇＲＮＡ部位は破壊されている。
【図４Ｂ】ヒトＣＤ１４７ゲノム座位中へのマウスＣＤ１４７遺伝子の標的置換。マウスＣＤ１４７標的化ベクターをコードするプラスミド、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするプラスミド、およびｓｇＲＮＡのいずれかもしくは両方をコードするか、またはいずれのｓｇＲＮＡもコードしないプラスミドをＰＧＰ１  ｉＰＳＣにヌクレオフェクトした。９日後、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。マウスＣＤ１４７の発現を獲得および／またはヒトＣＤ１４７の発現を喪失した細胞の割合が示される。結果は３回の独立実験の代表である。
【図５Ａ】ＣｒｉｓｐｒまたはＴＡＬＥＮを用いたいずれかの遺伝子方向での標的遺伝子置換。ヒトＴｈｙ１遺伝子のエキソン２内（Ｌ３、左側）およびポリアデニル化部位の後ろ（Ｒ１、右側）を標的とする、２．２ｋｂ離れた２種類のＣｒｉｓｐｒ  ｓｇＲＮＡをデザインした。また、同じＬ３部位およびＲ１部位を標的とする２種類のＴＡＬＥＮペアをデザインした。「ノックイン」標的化ベクターでは、構成的ｐＧＫプロモーター（赤色）の下流に蛍光ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を含む１．９ｋｂ配列が、ｓｇＲＮＡの外側でヒトＴｈｙ１配列とマッチするホモロジーアームで挟まれている。ｐＧＫ‐ｍＣｈｅｒｒｙインサートを、Ｔｈｙ１遺伝子に対して順方向または逆方向にクローニングした。ｓｇＲＮＡ部位およびＴＡＬＥＮ部位は、両方のｍＣｈｅｒｒｙ標的化コンストラクトにおいて破壊されている。
【図５Ｂ】ＣｒｉｓｐｒまたはＴＡＬＥＮを用いた、いずれかの遺伝子方向での標的遺伝子置換。Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするプラスミド、およびｓｇＲＮＡのいずれかもしくは両方をコードするプラスミド；ＴＡＬＥＮペアのいずれかもしくは両方をコードするプラスミド；または空のベクタープラスミドと共に、センスｍＣｈｅｒｒｙ標的化ベクターまたはアンチセンスｍＣｈｅｒｒｙ標的化ベクターをＰＧＰ１  ｉＰＳＣにヌクレオフェクトした。１０日後、細胞をフローサイトメトリーで分析した。ｍＣｈｅｒｒｙの発現を獲得および／またはヒトＴｈｙ１の発現を喪失した細胞の割合が示される。結果は２回の独立実験の代表である。
【図６Ａ】環状標的化ベクターまたは直線状標的化ベクターを用いた標的遺伝子置換。図１の環状プラスミドマウスＴｈｙ１標的化ベクターを、ホモロジーアームの末端のＰＣＲプライマー（小さい三角形）を用いて増幅して、直線状形態のマウスＴｈｙ１標的化ベクターを作製した。
【図６Ｂ】環状標的化ベクターまたは直線状標的化ベクターを用いた標的遺伝子置換。Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするプラスミド、およびＬ１、Ｒ１、もしくは両方のｓｇＲＮＡをコードするか、またはいずれのｓｇＲＮＡもコードしないプラスミドと共に、環状プラスミドマウスＴｈｙ１標的化ベクターまたは直線状ＰＣＲ産物マウスＴｈｙ１標的化ベクターをＰＧＰ１  ｉＰＳＣにヌクレオフェクトした。６日後、細胞をフローサイトメトリーで分析した。マウスＴｈｙ１の発現を獲得および／またはヒトＴｈｙ１の発現を喪失した細胞の頻度を示す。結果は２回の独立実験の代表である。
【図７Ａ】組換え効率へのホモロジーアーム長の影響。種々の長さのホモロジーアームを有するが、マウスＴｈｙ１のエキソン２および３を含む２．５ｋｂの配列を含む、複数バージョンのマウスＴｈｙ１標的化ベクタープラスミド（図１Ａ）を構築した。各ベクターにおける上流ホモロジーアームおよび下流ホモロジーアームの長さを示す。各マウスＴｈｙ１標的化ベクターを、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするプラスミド、およびＬ１、Ｒ１、もしくは両方のｓｇＲＮＡをコードするか、またはいずれのｓｇＲＮＡもコードしないプラスミドと共に、ＰＧＰ１  ｉＰＳＣにヌクレオフェクトした。１０日後、マウスＴｈｙ１遺伝子およびヒトＴｈｙ１遺伝子の発現について細胞をフローサイトメトリーで分析した。各蛍光象限の細胞の頻度を示す。結果は２回の独立実験の代表である。
【図７Ｂ】組換え効率へのホモロジーアーム長の影響。種々の長さのホモロジーアームを有するが、マウスＴｈｙ１のエキソン２および３を含む２．５ｋｂの配列を含む、複数バージョンのマウスＴｈｙ１標的化ベクタープラスミド（図１Ａ）を構築した。各ベクターにおける上流ホモロジーアームおよび下流ホモロジーアームの長さを示す。各マウスＴｈｙ１標的化ベクターを、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするプラスミド、およびＬ１、Ｒ１、もしくは両方のｓｇＲＮＡをコードするか、またはいずれのｓｇＲＮＡもコードしないプラスミドと共に、ＰＧＰ４  ｉＰＳＣにヌクレオフェクトした。１０日後、マウスＴｈｙ１遺伝子およびヒトＴｈｙ１遺伝子の発現について細胞をフローサイトメトリーで分析した。各蛍光象限の細胞の頻度を示す。結果は２回の独立実験の代表である。
【図８Ａ】各切断部位の片側での相同性を用いた標的遺伝子置換。図１のｍＴｈｙ１標的化ベクター（Ｏｕｔｓｉｄｅ）を、ヒトＴｈｙ１ホモロジーアームがＬ１  ｓｇＲＮＡ部位およびＲ１  ｓｇＲＮＡ部位の内側にまで延びるように改変した。マウスＴｈｙ１エキソン２および３（橙色）はこの標的化ベクター中に完全に保持されているが、マウスＴｈｙ１のイントロン１の３５０ｂｐおよびポリアデニル化部位の後ろのマウスＴｈｙ１配列の１５０ｂｐが対応するヒト配列で置換された。得られた標的化ベクター（Ｉｎｔａｃｔ）はインタクトなＬ１  ｓｇＲＮＡ部位およびＲ１  ｓｇＲＮＡ部位を含む。次に、標的化ベクター中の各ｓｇＲＮＡ部位から１塩基対を欠失させて、同様なホモロジーアームを有するがｓｇＲＮＡ部位が破壊された代替バージョン（Ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）を作製した。
【図８Ｂ】各切断部位の片側での相同性を用いた標的遺伝子置換。ＰＧＰ１  ｉＰＳＣまたはＰＧＰ４  ｉＰＳＣに、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするプラスミド、およびＬ１、Ｒ１、もしくは両方のｓｇＲＮＡをコードするか、またはいずれのｓｇＲＮＡもコードしないプラスミドと共に、マウスＴｈｙ１標的化ベクター（Ｏｕｔｓｉｄｅ、Ｉｎｔａｃｔ、またはＤｉｓｒｕｐｔｅｄ）のうちの１種類をヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクションの２日後、各条件の細胞サンプルを、生細胞染色色素であるＴｏＰｒｏ３で染色し、一定の流速および回収時間を用いたフローサイトメトリーにより分析した。ｓｇＲＮＡを有しないＯｕｔｓｉｄｅマウスＴｈｙ１標的化ベクターの生細胞数（１００）に対して生細胞数を標準化した。
【図８Ｃ】各切断部位の片側での相同性を用いた標的遺伝子置換。ＰＧＰ１  ｉＰＳＣまたはＰＧＰ４  ｉＰＳＣに、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするプラスミド、およびＬ１、Ｒ１、もしくは両方のｓｇＲＮＡをコードするか、またはいずれのｓｇＲＮＡもコードしないプラスミドと共に、マウスＴｈｙ１標的化ベクター（Ｏｕｔｓｉｄｅ、Ｉｎｔａｃｔ、またはＤｉｓｒｕｐｔｅｄ）のうちの１種類をヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクションの５日後、細胞をフローサイトメトリーで分析した。マウスＴｈｙ１の発現を獲得および／またはヒトＴｈｙ１の発現を喪失した細胞の割合を示す。結果は３回（ＰＧＰ１）および２回（ＰＧＰ４）の独立実験の代表である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本開示の実施形態は、標的核酸配列から第１の核酸配列を除去することによって標的核酸配列中への外来性核酸配列の挿入を可能にする、ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ結合タンパク質の使用に基づく。当業者には、種々の目的のためにＤＮＡに結合させるためのそのようなＤＮＡ結合タンパク質が容易に理解される。そのようなＤＮＡ結合タンパク質は天然のものであってもよい。本開示の範囲に含まれるＤＮＡ結合タンパク質としては、本明細書中でガイドＲＮＡと呼ぶＲＮＡによってガイドされ得るタンパク質が挙げられる。この態様によれば、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡにおいて共局在複合体を形成する。ヌクレアーゼ活性を有するそのようなＤＮＡ結合タンパク質は、当業者に公知であり、例えばＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在する、Ｃａｓ９タンパク質などのヌクレアーゼ活性を有する天然のＤＮＡ結合タンパク質が挙げられる。そのようなＣａｓ９タンパク質およびＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、当該技術分野で十分に裏付けられている。その全体が参照により援用される、全ての捕捉情報を含む、Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, June 2011, pp. 467-477を参照されたい。
【００２１】
ヌクレアーゼ活性を有する例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、二本鎖ＤＮＡにニックを形成するか、または二本鎖ＤＮＡを切断するように機能する。そのようなヌクレアーゼ活性は、ヌクレアーゼ活性を示す１つまたは複数のポリペプチド配列を有するＤＮＡ結合タンパク質から生じ得る。そのような例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、それぞれが二本鎖ＤＮＡの特定のストランドを切断すること、またはニックを形成することに関与する。２つの別個のヌクレアーゼドメインを有していてもよい。当業者に知られているヌクレアーゼ活性を有する例示的なポリペプチド配列としては、ＭｃｒＡ‐ＨＮＨヌクレアーゼ関連ドメインおよびＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインが挙げられる。したがって、例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、ＭｃｒＡ‐ＨＮＨヌクレアーゼ関連ドメインおよびＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのうちの１つまたは複数を含む天然タンパク質である。
【００２２】
ある態様によれば、２つ以上のヌクレアーゼドメインを有するＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼドメインのうちの１つを除いた全てが不活性化されるように修飾または改変されてもよい。そのような修飾または改変されたＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質が二本鎖ＤＮＡの一方のストランドのみを切断する、またはニックを形成するものである限り、ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼと呼ばれる。ＲＮＡによってＤＮＡまでガイドされる場合、ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼと呼ばれる。
【００２３】
例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質である。例示的なＤＮＡ結合タンパク質はＣａｓ９タンパク質である。
【００２４】
ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）では、Ｃａｓ９は、タンパク質中の２つの触媒ドメイン、すなわちＤＮＡの相補鎖を切断するＨＮＨドメインおよび非相補鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインが介在するプロセスによって、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３ｂｐ上流に平滑末端二本鎖切断を形成する。その全体が参照により援用されるJinke et al., Science 337, 816-821 (2012)を参照されたい。Ｃａｓ９タンパク質は、Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, June 2011, pp. 467-477の補足情報で確認されている以下のものを含む、多数のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在することが知られている。メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）Ｃ７株；コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Corynebacterium diphtheriae）；コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）ＹＳ‐３１４株；コリネバクテリウム・グルタニカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２  Ｋｉｔａｓａｔｏ株；コリネバクテリウム・グルタニカム  ＡＴＣＣ１３０３２  Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ株；コリネバクテリウム・グルタニカム  Ｒ株；コリネバクテリウム・クロッペンステッティイ（Corynebacterium kroppenstedtii）ＤＳＭ４４３８５株；マイコバクテリウム・アブセサス（Mycobacterium abscessus）ＡＴＣＣ１９９７７株；ノカルディア・ファルシニカ（Nocardia farcinica）ＩＦＭ１０１５２株；ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）ＰＲ４株；ロドコッカス・ジョスティイ（Rhodococcus jostii）ＲＨＡ１株；ロドコッカス・オパカス（Rhodococcus opacus）Ｂ４  ｕｉｄ３６５７３株；アシドサーマス・セルロリティカス（Acidothermus cellulolyticus）１１Ｂ株；アルスロバクター・クロロフェノリカス（Arthrobacter chlorophenolicus）Ａ６株；クリベラ・フラビダ（Kribbella flavida）ＤＳＭ１７８３６  ｕｉｄ４３４６５株；サーモモノスポラ・カーバタ（Thermomonospora curvata）ＤＳＭ４３１８３株；ビフィドバクテリウム・デンティウム（Bifidobacterium dentium）Ｂｄ１株；ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＤＪＯ１０Ａ株；スラッキア・ヘリオトリニレデューセンス（Slackia heliotrinireducens）ＤＳＭ２０４７６株；パーセフォネラ・マリナ（Persephonella marina）ＥＸ  Ｈ１株；バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）ＮＣＴＣ９４３４株；カプノサイトファガ・オクラセア（Capnocytophaga ochracea）ＤＳＭ７２７１株；フラボバクテリウム・サイクロフィルム（Flavobacterium psychrophilum）ＪＩＰ０２  ８６株；アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ８３５株；ロゼイフレクサス・キャステンホルツィイ（Roseiflexus castenholzii）ＤＳＭ１３９４１株；ロゼイフレクサス（Roseiflexus）ＲＳ１株；シネコシスティス（Synechocystis）ＰＣＣ６８０３株；エルシミクロビウム・ミヌトゥム（Elusimicrobium minutum）Ｐｅｉ１９１株；未培養細菌Ｔｅｒｍｉｔｅ  ｇｒｏｕｐ  １  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｙｌｏｔｙｐｅ  Ｒｓ  Ｄ１７；フィブロバクター・サクシノゲネス（Fibrobacter succinogenes）Ｓ８５株；バチルス・セレウス（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７株；リステリア・イノキュア（Listeria innocua）；ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）；ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）ＧＧ株；ラクトバチルス・��リバリウス（Lactobacillus salivarius）ＵＣＣ１１８株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Streptococcus agalactiae）Ａ９０９株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ  ＮＥＭ３１６株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ  ２６０３株；ストレプトコッカス・ディスガテクティアエ亜種エクイシミリス（Streptococcus dysgalactiae equisimilis）ＧＧＳ１２４株；ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Streptococcus equi zooepidemicus）ＭＧＣＳ１０５６５株；ストレプトコッカス・ガロリティカス（Streptococcus gallolyticus）ＵＣＮ３４  ｕｉｄ４６０６１株；ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）チャリス（Challis）株ＣＨ１亜株；ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）ＮＮ２０２５  ｕｉｄ４６３５３株；ストレプトコッカス・ミュータンス；ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｍ１  ＧＡＳ株；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ５００５株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ２０９６株；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ９４２９株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ１０２７０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ６１８０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ３１５株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＳＳＩ‐１株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ１０７５０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＮＺ１３１株；ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophiles）ＣＮＲＺ１０６６株；ストレプトコッカス・サーモフィラス  ＬＭＤ‐９株；ストレプトコッカス・サーモフィラス  ＬＭＧ１８３１１株；クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）Ａ３  Ｌｏｃｈ  Ｍａｒｅｅ株；クロストリジウム・ボツリヌム  Ｂ  Ｅｋｌｕｎｄ  １７Ｂ株；クロストリジウム・ボツリヌム  Ｂａ４  ６５７株；クロストリジウム・ボツリヌム  Ｆ  Ｌａｎｇｅｌａｎｄ株；クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）Ｈ１０株；フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）ＡＴＣＣ２９３２８株；ユウバクテリウム・レクターレ（Eubacterium rectale）ＡＴＣＣ３３６５６株；マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）；マイコプラズマ・モービレ（Mycoplasma mobile）１６３Ｋ株；マイコプラズマ・ペネトランス（Mycoplasma penetrans）；マイコプラズマ・シノビアエ（Mycoplasma synoviae）５３株；ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）ＤＳＭ１２１１２株；ブラジリゾビウム（Bradyrhizobium）ＢＴＡｉ１株；ニトロバクター・ハンブルゲンシス（Nitrobacter hamburgensis）Ｘ１４株；ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）ＢｉｓＢ１８；ロドシュードモナス・パルストリス  ＢｉｓＢ５株；パルビバクラム・ラバメンティボランス（Parvibaculum lavamentivorans）ＤＳ‐１株；ディノロセオバクター・シバエ（Dinoroseobacter shibae）ＤＦＬ１２株；グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Gluconacetobacter diazotrophicus）Ｐａｌ  ５  ＦＡＰＥＲＪ株；グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス  Ｐａｌ  ５  ＪＧＩ株；アゾスピリルム（Azospirillum）Ｂ５１０  ｕｉｄ４６０８５株；ロドスピリラム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum）ＡＴＣＣ１１１７０株；ディ���フォロバクター（Diaphorobacter）ＴＰＳＹ  ｕｉｄ２９９７５株；フェルミネフォロバクター・エイセニアエ（Verminephrobacter eiseniae）ＥＦ０１‐２株；ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitides）０５３４４２株；ナイセリア・メニンジティディス  ａｌｐｈａ１４；ナイセリア・メニンジティディス  Ｚ２４９１株；デスルホビブリオ・サレキシゲンス（Desulfovibrio salexigens）ＤＳＭ  ２６３８株；キャンピロバククー・ジェジュニ亜種ドイレイ（Campylobacter jejuni doylei）２６９  ９７株；キャンピロバククー・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）８１１１６株；キャンピロバククー・ジェジュニ；キャンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari）ＲＭ２１００株；ヘリコバクター・ヘパティカス（H Helicobacter hepaticus）；ウォリネラ・サクシノゲネス（Wolinella succinogenes）；トルモナス・アウエンシス（Tolumonas auensis）ＤＳＭ９１８７株；シュードアルテロモナス・アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica）Ｔ６ｃ株；シューワネラ・ペアレアナ（Shewanella pealeana）ＡＴＣＣ７００３４５株；レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）Ｐａｒｉｓ株；アクチノバチルス・サクシノゲネス（Actinobacillus succinogenes）１３０Ｚ株；パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）；フランシセラ・ツラレンシス亜種ノビシダ（Francisella tularensis novicida）Ｕ１１２株；フランシセラ・ツラレンシス亜種ハラークティカ（Francisella tularensis holarctica）；フランシセラ・ツラレンシス  ＦＳＣ  １９８株；フランシセラ・ツラレンシス亜種ツラレンシス（Francisella tularensis tularensis）；フランシセラ・ツラレンシス  ＷＹ９６‐３４１８株；およびトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）ＡＴＣＣ３５４０５株。したがって、本開示の態様は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在するＣａｓ９タンパク質に関する。
【００２５】
Ｃａｓ９タンパク質は、文献中で当業者にＣｓｎ１と呼ばれることもある。本明細書に記載される実験の対象であるストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）のＣａｓ９タンパク質配列を以下に示す。その全体が参照により援用されるDeltcheva et al., Nature 471, 602-607 (2011)を参照されたい。
【００２６】
【化１】
2020062033.tif 000002
【００２７】
ある態様によれば、ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼとしては、そのホモログおよびオルソログ、ならびにそれに対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の相同性を有し、且つヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ結合タンパク質である、タンパク質配列が挙げられる。
【００２８】
本開示の別の態様は、標的核酸中へのより大きな遺伝子の挿入などによる、標的遺伝子などの標的核酸の遺伝子改変または遺伝子編集のための、ＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合システム一般の使用に関する。当業者は、本開示に基づき、例示的なＤＮＡ結合システムを容易に特定するであろう。そのようなＤＮＡ結合システムとしては、ＺＦＮ、ＴＡＬＥ、ＴＡＬＥＮＳ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼが挙げられる。
【００２９】
ある態様によれば、１種類以上、２種類以上、または複数種類の外来核酸を細胞に導入することを含む、細胞において核酸を編集する方法が本明細書に記載される。細胞に導入される外来核酸は、１種類または複数種類のガイドＲＮＡ、１種類または複数種類のＣａｓ９タンパク質、および挿入対象の巨大核酸配列をコードする。また、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質がＤＮＡに結合し、Ｃａｓ９タンパク質がＤＮＡを切断して関心のある第１の核酸配列を除去する限り、当業者によって理解されるように、共局在複合体と呼ばれる。巨大核酸配列は、ＤＮＡに挿入される。ある別の態様によれば、細胞に導入された外来核酸は、１種類または複数種類のガイドＲＮＡ、および１種類のＣａｓ９タンパク質をコードする。
【００３０】
本開示に係る細胞には、本明細書に記載されるように外来核酸を導入でき、発現させることができるあらゆる細胞が含まれる。本明細書に記載されている本開示の基本的概念は細胞の種類によって限定されないと理解されるべきである。本開示に係る細胞としては、真核細胞、原核細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、古細菌細胞、真正細菌細胞などが挙げられる。細胞としては、酵母細胞、植物細胞、および動物細胞などの真核細胞が挙げられる。具体的な細胞としては、哺乳動物細胞が挙げられる。具体的な細胞としては、ヒト誘導多能性幹細胞などの多能性幹細胞などの幹細胞が挙げられる。
【００３１】
標的核酸としては、本明細書に記載されるように共局在複合体を形成するＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質などのＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、ニック形成または切断のために有用であり得る任意の核酸配列が挙げられる。標的核酸としては遺伝子が挙げられる。本開示の目的のために、二本鎖ＤＮＡなどのＤＮＡは標的核酸を含んでいてもよく、共局在複合体は、その共局在複合体が標的核酸に所望の効果を与えられ得るよう、その標的核酸において、またはその標的核酸に隣接して、またはその標的核酸の近傍で、ＤＮＡに結合。またはＤＮＡと共局在することができる。そのような標的核酸は、内在性（または天然）の核酸および外来性（または外来）の核酸が含んでいてもよい。当業者は、本開示に基づき、標的核酸を含むＤＮＡに共局在するガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を容易に特定またはデザインすることができる。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡが挙げられる。
【００３２】
外来核酸（すなわち、細胞の天然核酸組成物の一部でない核酸）は、当業者に公知の任意の導入方法を用いて細胞に導入されてもよい。そのような方法には、遺伝子導入法、形質導入法、ウイルス形質導入法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、ヌクレオフェクション法、ナノ粒子銃（nanoparticle bombardment）法、形質転換法、結合（conjugation）法などが含まれる。当業者は、容易に特定可能な文献資料を用いてそのような方法を容易に理解し、適用するであろう。
【００３３】
以下の実施例は本開示の代表例として記載されるものである。本開示、図面、および添付の特許請求の範囲を考慮して、これらの実施形態およびその他の同等の実施形態が明らかになるので、これらの実施例は本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３４】
実施例Ｉ
ｓｇＲＮＡ標的配列
ヒトゲノム中でのヒトＴｈｙ１およびＣＤ１４７遺伝子の特有性に基づいて、これら遺伝子の周辺の種々の位置で、計算アルゴリズムを用いてｓｇＲＮＡ（一本鎖ガイドＲＮＡ）配列（Mali, P. et al. Science 339, 823-826 (2013)）を同定した。
【００３５】
【化２】
2020062033.tif 000003
【００３６】
【化３】
2020062033.tif 000004
【００３７】
実施例ＩＩ
Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡプラスミド構築
Ｕ６プロモーターおよびｓｇＲＮＡ骨格配列をMali, P. et al. Science 339, 823-826 (2013) に記載されているように合成し（ＩＤＴ社）、以下のプライマーを用いてｐＵＣ１９からＰＣＲ増幅された、アンピシリン耐性遺伝子およびｐＢＲ３２２  ｏｒｉを含む最小プラスミド骨格中に、等温アセンブリを用いてクローニングした。
【００３８】
【化４】
2020062033.tif 000005
【００３９】
等温アセンブリを用いて種々のｓｇＲＮＡ配列をこのベクター中にクローニングした。等温アセンブリのための重複セグメントを下線で示す。全てのプライマーはＩＤＴ社から入手した。全てのＰＣＲ反応はＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＰＣＲキットを用いて行った。プラスミドは、ＴＯＰ１０株またはＳｔｂｌ３株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で維持した。
【００４０】
ヒトコドン最適化Ｃａｓ９ヌクレアーゼ遺伝子（Mali, P. et al. Science 339, 823-826 (2013)）は、プライマー５′ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣ３′（配列番号１９）および５′ＴＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧＧ３′（配列番号２０）を用いてＰＣＲ増幅し、ｐＣＤＮＡ３プラスミド骨格上のＥＦ１αプロモーターとｂＧＨポリアデニル化配列との間に等温アセンブリを用いてクローニングした。ＥＦ１αプロモーターは、以下のプライマーを用いて、ｐＥＧＩＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃２６７７７）からＰＣＲ増幅した。
【００４１】
【化５】
2020062033.tif 000006
【００４２】
ｂＧＨポリアデニル化配列は、以下のプライマーを用いて、ｐＳＴ１３７４（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１３４２６）からＰＣＲ増幅した。
【００４３】
【化６】
2020062033.tif 000007
【００４４】
プラスミド骨格は、プライマー５′ＡＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＣＴＡＧＣＴＡＧ３′（配列番号２５）および５′ＴＣＣＧＴＣＧＡＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧ３′（配列番号２６）を用いて、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）からＰＣＲ増幅した。
【００４５】
実施例ＩＩＩ
標的化プラスミドの構築
ｓｇＲＮＡ部位の周辺に相同性を有するマウスＴｈｙ１標的化ベクター（Ｏｕｔｓｉｄｅ）は、等温アセンブリを用いてクローニングした。マウスＴｈｙ１のエキソン２および３を、プライマー５′ＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＡＣＡＣＡＣＣ３′（配列番号２７）および５′ＡＡＴＡＧＧＧＡＧＧＧＣＣＧＧＧＧＴＡＣＣ３′（配列番号２８）を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６ＪゲノムＤＮＡ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からＰＣＲ増幅した。上流ヒトＴｈｙ１ホモロジーアームは、以下のプライマーを用いて、ＰＧＰ１  ｉＰＳＣゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
【００４６】
【化７】
2020062033.tif 000008
【００４７】
下流ヒトＴｈｙ１ホモロジーアームは、以下のプライマーを用いて、ＰＧＰ１ヒトｉＰＳＣゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
【００４８】
【化８】
2020062033.tif 000009
【００４９】
プラスミド骨格は、以下のプライマーを用いて、ｐＵＣ１９からＰＣＲ増幅した。
【００５０】
【化９】
2020062033.tif 000010
【００５１】
直線状バージョンのマウスＴｈｙ１標的化ベクターを、プライマー５′ＡＣ  ＣＣＴＴＣＣＣＣＴＣＣＴＡＧＡＴＣＣＣＡＡＧＣＣ３′（配列番号３５）および５′ＧＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＣＡＴＣＡＣＡＧＣ３′（配列番号３６）を用いて、元のＯｕｔｓｉｄｅ標的化ベクターからＰＣＲ増幅した。Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＰＣＲ産物を精製した。
【００５２】
より短いホモロジーアームを有するマウスＴｈｙ１標的化ベクターの複数のバージョンを、以下の３つのフォワードＰＣＲプライマーおよび３つのリバースＰＣＲプライマーの組合せを用いた等温アセンブリを用いて、元のＯｕｔｓｉｄｅ  Ｔｈｙ１標的化ベクタープラスミドからクローニングした。
【００５３】
【化１０】
2020062033.tif 000011
【００５４】
【化１１】
2020062033.tif 000012
【００５５】
プラスミド骨格は、上流Ｔｈｙ１ホモロジーアームおよび下流Ｔｈｙ１ホモロジーアームに対する相補的オーバーハングを有する以下の３つのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、ｐＵＣ１９からＰＣＲ増幅された。
【００５６】
【化１２】
2020062033.tif 000013
【００５７】
【化１３】
2020062033.tif 000014
【００５８】
等温アセンブリを用いて、より長いホモロジーアームを有するマウスＴｈｙ１標的化ベクターのバージョン（ＸＸ）をクローニングした。元のＯｕｔｓｉｄｅ  Ｔｈｙ１標的化ベクタープラスミドを、プライマー５′ＣＣＴＴＣＣＣＣＴＣＣＴＡＧＡＴＣＣＣＡＡＧＣＣ３′（配列番号４９）および５′ＧＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＣＡＴＣＡＣＡＧＣ３′（配列番号５０）を用いてＰＣＲ増幅した。プライマー５′ＴＣＴＴＧＴＴＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＴＧＣＧＧＧ３′（配列番号５１）および５′ＣＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＣＴＣＣＧＡＴＣＣＴＡＴＣ３′（配列番号５２）を用いて、ＰＧＰ１ゲノムＤＮＡから、追加の３ｋｂのＴｈｙ１上流ホモロジーアームをＰＣＲ増幅した。プライマー５′ＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＧ３′（配列番号５３）および５′ＣＣＴＣＴＣＣＣＴＴＴＴＣＣＣＴＧＧＴＴＴＴＧ３′（配列番号５４）を用いて、ＰＧＰ１ゲノムＤＮＡから追加の２．４ｋｂのＴｈｙ１下流ホモロジーアームをＰＣＲ増幅した。相補的オーバーハングを有するプラスミド骨格は、以下のプライマーを用いてｐＵＣ１９からＰＣＲ増幅した。
【００５９】
【化１４】
2020062033.tif 000015
【００６０】
各ｓｇＲＮＡ部位の周辺に相同性を有するマウスＴｈｙ１標的化ベクター（Ｉｎｔａｃｔ）を、等温アセンブリを用いてクローニングした。マウスＴｈｙ１のエキソン２および３のより短い断片を、以下のプライマーを用いて、元のＯｕｔｓｉｄｅ  Ｔｈｙ１標的化ベクタープラスミドからＰＣＲ増幅した。
【００６１】
【化１５】
2020062033.tif 000016
【００６２】
ｓｇＲＮＡ部位内の上流ホモロジーアームの拡張断片を、プライマー５′ＧＧＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＣＣＡＧＡＧ３′（配列番号５９）および５′ＡＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＣＡＣＣＣ３′（配列番号６０）を用いて、ＰＧＰ１ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ｓｇＲＮＡ部位内の下流ホモロジーアームの拡張断片を、プライマー５′ＣＡＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＴＣＣＴＣ３′（配列番号６１）および５′ＧＣＣＣＡＧＴＧＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＡＧＣ３′（配列番号６２）を用いて、ＰＧＰ１ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。残りの上流ホモロジーアーム断片および下流ホモロジーアーム断片を有するプラスミド骨格は、プライマー５′ＣＴＴＴＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧＧＧＡＧ３′（配列番号６３）および５′ＴＡＣＣＣＣＡＧＧＧＧＣＴＡＡＴＧＡＣＴＧＣＡＣ３′（配列番号６４）を用いて、元のＯｕｔｓｉｄｅ  Ｔｈｙ１標的化ベクターからＰＣＲ増幅した。
【００６３】
破壊された各ｓｇＲＮＡ部位の周辺に相同性を有するマウスＴｈｙ１標的化ベクター（Ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）を、等温アセンブリを用いてクローニングした。ｓｇＲＮＡ部位のそれぞれから１ヌクレオチドを欠失させるために、プライマー５′ＡＣＡＧＴＣＴＣＡＧＡＡＡＡＣＧＣＡＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧ３′（配列番号６５）および５′ＣＡＴＴＡＧＣＣＣＣＴＧＧＧＴＡＧＣＧＴＴＧＣＴＡＣＴＡＡＧ３′（配列番号６６）を用い、次に５′ＴＴＧＴＣＡＣＣＴＧＣＧＴＴＴＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧ３′（配列番号６７）および５′ＣＴＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＧＣＴＡＣＣＣＡＧＧＧＧＣＴＡＡＴＧ３′（配列番号６８）を用いて、Ｉｎｔａｃｔ  Ｔｈｙ１標的化ベクタープラスミドから２つのセクションをＰＣＲ増幅した。
【００６４】
等温アセンブリを用いてｍＣｈｅｒｒｙ  Ｔｈｙ１標的化ベクターをクローニングした。ｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子を、以下のプライマーを用いて、ｐＧＫプロモーターの制御下のｍＣｈｅｒｒｙおよびｂＧＨポリアデニル化配列を含むプラスミドコンストラクトからＰＣＲ増幅した。
【００６５】
【化１６】
2020062033.tif 000017
【００６６】
上流ホモロジーアームは、プライマー５′ＡＣ  ＣＣＴＴＣＣＣＣＴＣＣＴＡＧＡＴＣＣＣＡＡＧＣＣ３′（配列番号７１）および５′ＧＴＡＣＴＧＧＡＴＧＧＧＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＴＡＴＴＣ３′（配列番号７２）を用いて、ＰＧＰ１ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。下流ホモロジーアームは、プライマー５′ＴＡＣＣＣＣＡＧＧＧＧＣＴＡＡＴＧＡＣＴＧＣＡＣ３′（配列番号７３）および５′ＧＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＣＡＴＣＡＣＡＧＣ３′（配列番号７４）を用いて、ＰＧＰ１ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。プラスミド骨格は、以下のプライマーを用いて、ｐＵＣ１９からＰＣＲ増幅した。
【００６７】
【化１７】
2020062033.tif 000018
【００６８】
等温アセンブリを用いてマウスＣＤ１４７標的化ベクターをクローニングした。マウスＣＤ１４７のエキソン２〜７を、以下のプライマーを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６ＪゲノムＤＮＡ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からＰＣＲ増幅した。
【００６９】
【化１８】
2020062033.tif 000019
【００７０】
上流ホモロジーアームは、プライマー５′ＡＣＡＣＡＣＴＴＴＣＡＡＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＧ３′（配列番号７９）および５′ＣＴＣＡＣＴＧＴＧＡＣＣＴＴＧＧＡＡＣＣＴＣＧ３′（配列番号８０）を用いて、ＰＧＰ１ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。下流ホモロジーアームは、以下のプライマーを用いてＰＧＰ１ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
【００７１】
【化１９】
2020062033.tif 000020
【００７２】
相補的オーバーハングを有するプラスミド骨格は、以下のプライマーを用いて、ｐＵＣ１９からＰＣＲ増幅した。
【００７３】
【化２０】
2020062033.tif 000021
【００７４】
実施例ＩＶ
ＴＡＬＥＮアセンブリ
Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｃａｐｐｅｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙを用いてヒトＴｈｙ１遺伝子を標的化するＴＡＬＥペア（１６．５塩基長）をアセンブルした。Ｌ３  ｓｇＲＮＡ部位上を標的化するＴＡＬＥペアは、左側：５′Ｔ  ＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＣＣＣＡＴ３′（配列番号８５）；右側：５′Ｔ  ＣＴＴＴＧＴＣＴＣＡＣＧＧＧＴＣＡ３′（配列番号８６）であった。Ｒ１  ｓｇＲＮＡ部位上を標的化するＴＡＬＥＮペアは、左側：５′Ｔ  ＣＴＣＣＣＣＡＡＣＣＡＣＴＴＡＧＴ３′（配列番号８７）；右側：５′Ｔ  ＧＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＡＧＣＣＣＣ３′（配列番号８８）であった。等温アセンブリを用いてＦｏｋＩヘテロダイマーヌクレアーゼドメイン上にＴＡＬＥをクローニングした。アセンブルされたＴＡＬＥを、プライマー５′ＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＴＡＡＧＧＡＣ３′（配列番号８９）および５′ＧＧＡＡＣＣＴＧＣＣＡＣＴＣＧＡＴＧＴＧ３′（配列番号９０）を用いてＰＣＲ増幅した。Ｓｈａｒｋｅｙ変異を有するＦｏｋＩヘテロダイマーヌクレアーゼドメインであるＫＫＲおよびＥＬＤは、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ‐Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、ｐＭＧ１０（Ａｄｄｇｅｎｅ＃３１２３８）から得た。ＫＫＲ‐Ｓｈａｒｋｅｙ  ＦｏｋＩドメインは、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
【００７５】
【化２１】
2020062033.tif 000022
【００７６】
ＥＬＤ‐Ｓｈａｒｋｅｙ  ＦｏｋＩドメインは、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
【００７７】
【化２２】
2020062033.tif 000023
【００７８】
ＥＦ１αプロモーターおよびｂＧＨポリアデニル化配列を含むプラスミド骨格中にＴＡＬＥおよびＦｏｋＩヘテロダイマードメインのそれぞれをクローニングした。これを以下のプライマーを用いて、前述のＣａｓ９発現ベクターから増幅した。
【００７９】
【化２３】
2020062033.tif 000024
【００８０】
実施例Ｖ
ｉＰＳＣ培養およびトランスフェクション
Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔドナーの検証されたヒトｉＰＳＣであるＰＧＰ１およびＰＧＰ４は、Ｃｏｒｉｅｌｌ社から入手した。製造業者の説明書に従って、細胞株をマトリゲルコートプレート（ＢＤ社）上で維持し、ｍＴｅｓｒ１（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で生育した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いた継代の前、最中、および後に、１０μＭのＲｏｃｋ阻害剤Ｙ‐２７６３２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を培養に加えた。ｉＰＳＣ培養物の多能性をＴＲＡ‐１／６０  ＦＡＣＳ染色（ＢＤ社）で検証した。
【００８１】
全てのプラスミドは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏ‐ｆｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキットを用いて精製した。製造業者の説明書に従って、Ｌｏｎｚａ  ４Ｄ‐Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｘユニット（Ｂｕｆｆｅｒ  Ｐ３、Ｐｒｏｇｒａｍ  ＣＢ‐１５０）を用いて、ｉＰＳＣ細胞中にプラスミドをヌクレオフェクトした。各２０μｌのヌクレオフェクション反応について、０．２〜０．５×１０６個のｉＰＳＣに最大４μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。ヌクレオフェクション後、ｍＴｅｓｒ１培地および１０μＭ  Ｙ‐２７６３２を含む、２４ウェルおよび９６ウェルのマトリゲルコートプレート上にｉＰＳＣをプレーティングした。
【００８２】
標的化ベクターを用いたＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレオフェクション（図１Ａ〜図１Ｄ、および図３Ａ〜図３Ｃから図８Ａ〜図８Ｃ参照）では、２μｇの標的化ベクタープラスミド、０．５μｇのＣａｓ９プラスミド、および１．５μｇの総ｓｇＲＮＡプラスミドを用いた。２種類のｓｇＲＮＡを用いた場合、０．７５μｇの各プラスミドを混合した。ｓｇＲＮＡを使用しなかった場合、１．５μｇのｐＵＣ１９を代わりに用いた。
【００８３】
標的化ベクターを用いないＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレオフェクション（図２Ａ〜図２Ｅ参照）では、２μｇの総プラスミド、すなわち０．５μｇのＣａｓ９プラスミドおよび０．７５μｇの各ｓｇＲＮＡプラスミドまたは０．７５μｇのｐＵＣ１９を用いた。
【００８４】
標的化ベクターを用いるＴＡＬＥＮに基づくヌクレオフェクション（図５Ａ〜図５Ｂ参照）では、２μｇの標的化ベクタープラスミドおよび合計２μｇのＴＡＬＥＮプラスミドを用いた。１種類のＴＡＬＥＮペアを用いた１箇所のｄｓＤＮＡ切断には、１μｇの各ＴＡＬＥＮ発現ヘテロダイマープラスミドを用いた。２種類のＴＡＬＥＮペアを用いた２箇所のｄｓＤＮＡ切断には、０．５μｇの各ＴＡＬＥＮ発現ヘテロダイマープラスミドを用いた。
【００８５】
実施例ＶＩ
ＦＡＣＳ染色
ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｉＰＳＣを解離し、ＦＡＣＳバッファー：ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋０．２％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社）中で洗浄した。１０％ウシ胎仔血清を加えたＦＡＣＳバッファー中で細胞を４℃で３０分間染色した。以下の抗体、すなわち、抗ヒトＴｈｙ１  ＡＰＣ（ｅＢｉｏ５Ｅ１０）、抗マウスＴｈｙ１．２  ＰＥ（３０‐Ｈ１２）、抗ヒトＣＤ１４７  ＡＰＣ（８Ｄ１２）、抗マウスＣＤ１４７  ＰＥ（ＲＬ７３）、アイソタイプコントロール  マウスＩｇＧ１  κ  ＡＰＣ（Ｐ３．６．２．８．１）、アイソタイプコントロール  マウスＩｇＧ２ｂ  ＰＥ（ｅＢＭＧ２ｂ）は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した。細胞をＦＡＣＳバッファー中で２回洗浄した後、生細胞染色色素であるＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と共にＦＡＣＳバッファー中に再懸濁した。Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓａｍｐｌｅｒ（ＨＴＳ）を備えたＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを用いてサンプルを回収し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ社）を用いて分析した。
【００８６】
図８Ａ〜図８Ｃに示される一定した生存細胞計数のために、各サンプルを９６ウェルプレートの１つのウェル中で生育した。各ウェルを５０μｌのＴｒｙｐＬＥで解離した。次に、生細胞染色色素であるＴｏＰｒｏ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含む１５０μｌのＦＡＣＳバッファーを添加した。ＨＴＳを用いて、混合しながら１μｌ／ｓの一定速度で各ウェルからの１００μｌを分析した。
【００８７】
実施例ＶＩＩ
単一細胞ｉＰＳＣのＦＡＣＳソーティング
ＦＡＣＳソーティングでは、フィーダー細胞を含む９６ウェルプレート中に、１ウェルあたり１細胞となるようｉＰＳＣをソートした。前日の夜に、９６ウェル平底組織培養プレートをゼラチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でコーティングし、照射ＣＦ‐１マウス胎仔線維芽細胞（１プレート当たり１０６個のＭＥＦ；Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｔｅｍ社）と培養した。ソーティング前に、プレート中の培地を、１００ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、ＳＭＣ４阻害剤（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社）、および５μｇ／ｍｌフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ社）を含むｈＥＳ細胞維持培地に交換した。
【００８８】
ＦＡＣＳソーティングの前に少なくとも２時間、ＳＭＣ４阻害剤を含むｍＴｅｓｒ１でｉＰＳＣを前処理した。Ａｃｃｕｔａｓｅで細胞を解離し、前述したように染色した。ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａを用いてＭＥＦコート９６ウェルプレート中にｉＰＳＣをソートした。次に、樹立したｉＰＳＣコロニーを新しいＭＥＦコートウェルに機械的に継代した。
【００８９】
実施例ＶＩＩＩ
ＰＣＲジェノタイピング
ソートされたｉＰＳＣクローン由来のゲノムＤＮＡを９６ウェルプレートから精製した。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔポリメラーゼを用い、４セットのＰＣＲプライマーを用いて、各クローンをジェノタイピングし（図１Ａ〜図１Ｄ参照）、０．８％アガロースゲルで泳動した。
【００９０】
反応１：５′ＡＧＧＧＡＣＴＴＡＧＡＴＧＡＣＴＧＣＣＡＴＡＧＣＣ３′（配列番号９７）および５′ＡＴＧＴＴＧＧＣＡＧＴＡＡＧＣＡＴＧＴＴＧＴＴＣＣ３′（配列番号９８）。野生型Ｔｈｙ１（＋）または逆位アレル（ｉ）：３１２９ｂｐ；標的マウスＴｈｙ１アレル（ｍ）：２９０４ｂｐ；切除アレル（Δ）：３８７ｂｐ。
【００９１】
反応２：５′ＡＧＧＧＡＣＴＴＡＧＡＴＧＡＣＴＧＣＣＡＴＡＧＣＣ３′（配列番号９９）、５′ＣＴＣＡＣＣＴＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＴＧＡＣＧＴＴＣ３′（配列番号１００）、および５′ＡＣＴＧＡＡＧＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＣＡＡＣＡＡＴＧ３′（配列番号１０１）。野生型アレル（＋）：９９３ｂｐ；標的マウスアレル（ｍ）：４９０ｂｐ；切除（Δ）または逆位（ｉ）アレル：ＰＣＲ産物なし。
【００９２】
反応３：５′ＡＴＧＡＡＴＡＣＡＧＡＣＴＧＣＡＣＣＴＣＣＣＣＡＧ３′（配列番号１０２）、５′ＣＴＣＡＣＣＴＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＴＧＡＣＧＴＴＣ３′（配列番号１０３）、および５′ＣＣＡＴＣＡＡＴＣＴＡＣＴＧＡＡＧＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＣＡＡＣＡＡＴＧ３′（配列番号１０４）。野生型アレル（＋）：２３９３ｂｐ；標的マウスアレル（ｍ）：１８９１ｂｐ；切除（Δ）または逆位（ｉ）アレル：ＰＣＲ産物なし。
【００９３】
反応４：５′ＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣＣＴＡＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧ３′（配列番号１０５）、５′ＡＡＡＣＣＡＣＡＣＡＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＧＡＴＧＧ３′（配列番号１０６）、および５′ＧＴＴＴＧＧＣＣＣＡＡＧＴＴＴＣＴＡＡＧＧＧＡＧＧ３′（配列番号１０７）。野生型アレル（＋）：３０６４ｂｐ；標的マウスアレル（ｍ）：２７０７；切除（Δ）または逆位（ｉ）アレル：ＰＣＲ産物なし。
【００９４】
ｓｇＲＮＡヌクレアーゼ部位の外側に及ぶジェノタイピング反応１のプライマーを用いて、ソートされたｉＰＳＣクローン由来のゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅した。アガロースゲル抽出（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて異なるサイズのＰＣＲ産物を分離した。同じ２種類のプライマーを用いてＰＣＲ産物をサンガーシークエンスした（Ｇｅｎｅｗｉｚ社）。サンガーのトレースファイルからシングルピークおよびダブルピークを分析し、デコンボリューションを行って各クローンの両アレルの配列を確認した。
【００９５】
実施例ＩＸ
本開示の態様は、抗生物質選択マーカーを用いた場合であっても標的遺伝子置換を制限し得る、頻度の低い相同組換え（ＨＲ）（１０−３〜１０−７）の改善に関する。Deng, C. & Capecchi, M. R. Mol. Cell. Biol. 12, 3365-3371 (1992) 参照。本開示の態様は、効率的なゲノム改変、例えば長い遺伝子配列などの長い核酸配列の切除および置換のための、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S. & Gregory, P. D. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010)）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）（Joung, J. K. & Sander, J. D. Nature Reviews Molecular Cell Biology 14, 49-55 (2012)）、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Mali, P. et al. Science 339, 823-826 (2013)）などのカスタム改変ヌクレアーゼシステムの使用を想定している。本開示の態様は、従来の方法を用いた遺伝子編集に抵抗性を示し得る細胞種の使用を想定している。
【００９６】
本開示の態様は、ＮＨＥＪ修復経路（Chapman, J. R., Taylor, M. R. G. & Boulton, S. J. Molecular Cell 47, 497-510 (2012)）によって遺伝子を変異および破壊し得る（Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S. & Gregory, P. D. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010), Mali, P. et al. Science 339, 823-826 (2013)）、特異的標的部位における１つ又は複数のｄｓＤＮＡ切断の利用を想定している。本開示の態様は、ゲノムの介在部分を切除し得る（Lee, H. J., Kim, E. & Kim, J.-S. Genome Research 20, 81-89 (2010)）または転座を引き起こさせ得る（Piganeau, M. et al. Genome Research 23, 1182-1193 (2013)）、２つのｄｓＤＮＡ切断を想定している。本開示の態様は、変異または導入遺伝子を導入する（Moehle, E. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007), Hockemeyer, D. et al. Nat Biotechnol 27, 851-857 (2009)）ための、ｓｓＯＤＮ（Chen, F. et al. Nature Methods 8, 753-755 (2011), Yang, L. et al. Nucleic Acids Research (2013). doi:10.1093/nar/gkt555）またはプラスミド標的化ベクター（Yang, L. et al. Nucleic Acids Research (2013). doi:10.1093/nar/gkt555, Mali, P. et al. Science 339, 823-826 (2013)）を用いたＨＲの利用を想定している。本開示の態様は、非効率的であり得るより大きな挿入物の遺伝子挿入の効率を改善するための本明細書に記載の方法を想定している。Moehle, E. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007), Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S. & Gregory, P. D. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010)。
【００９７】
本開示の態様は、ＺＦＮ切断の結果生じ得る短い一本鎖オーバーハング間でのマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）（Orlando, S. J. et al. Nucleic Acids Research 38, e152 (2010), Cristea, S. et al. Biotechnol. Bioeng. 110, 871-880 (2013), Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N. & Yang, Y. Genome Research 23, 539-546 (2013)）および本明細書に記載の方法を用いた、数キロベースの標的遺伝子置換の作製を想定している。本開示の態様は、各ホモロジーアームでのｄｓＤＮＡ切断の形成による隣接ホモロジーアーム間のＨＲクロスオーバーの効率の改善を想定している。さらに、巨大核酸挿入の効率を改善するための、各ホモロジーアームでの複数の切断部位の利用が想定される。
【００９８】
実施例Ｘ
標的ベクターデザインの最適化
本開示の態様は、巨大核酸置換のための標的化ベクターデザインの最適化に関する。例示的なある態様によれば、Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＰＧＰ）ドナー由来のヒトｉＰＳＣにおいて、２．７ｋｂのヒトＴｈｙ１遺伝子（ｈＴｈｙ１）をそのマウスホモログ（ｍＴｈｙ１）と置換した。ヒトＴｈｙ１（ＣＤ９０）は、ヒトｉＰＳＣの表面で発現され、インビトロでの細胞生存に必須でなく、種特異的染色抗体が利用可能であるので、本明細書に記載の方法を用いた巨大遺伝子置換の例を実証するのに好都合である。この例は単なる例示であると理解されるべきであり、本開示の範囲をヒトＴｈｙ１の切除およびマウスＴｈｙ１との置換に限定することを意図するものではない。
【００９９】
ヒトＴｈｙ１をイントロン１内またはポリアデニル化配列の後ろで標的化する２種類の一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をデザインした。ｍＴｈｙ１標的化ベクタープラスミドには、切断部位の外側のヒトＴｈｙ１ホモロジーアームで挟まれた、マウスＴｈｙ１のエキソン２および３が含まれていた（図１Ａ）。両方のｄｓＤＮＡ切断が形成された場合、ｉＰＳＣの６．７％が選択を行わずにｍＴｈｙ１＋  ｈＴｈｙ１−になった（図１Ｂ）。単一細胞のＦＡＣＳソートされたｍＴｈｙ１＋  ｈＴｈｙ１−  ｉＰＳＣクローンのＰＣＲジェノタイピングにより、ホモ接合型の標的置換（ｍ／ｍ；４．７％）と、ヒトアレルの一方が置換であって他方が切除（ｍ／Δ；２％）との混在が明らかになった（図１Ｃ〜図１Ｄ）。さらに、細胞の１．６％は、ｍＴｈｙ１＋  ｈＴｈｙ１＋ダブルポジティブであった（ｍ／＋；ヘテロ接合型標的置換）。
【０１００】
最後に、細胞の１６．２％は、ｍＴｈｙ１−  ｈＴｈｙ１−ダブルネガティブであった。すなわち、ＰＣＲおよびサンガーシークエンシングにより、ホモ接合型切除（Δ／Δ）と、ｓｇＲＮＡ部位間のヘテロ接合型の逆位および切除（ｉ／Δ）との混在が明らかになった（（図１Ａ〜図１Ｄ。切除および逆位の部位で数個の挿入欠失および挿入塩基が観察されたが、最も大きな挿入欠失はわずか１５ｂｐであり、大部分のアレルは切断部位で正確に再連結されていた（図３Ａ〜図３Ｃ）。ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを用いて２つのｄｓＤＮＡ切断が形成された以前の報告では、ほとんどの切除および逆位アレルで２００ｂｐまでの挿入欠失が観察された（Lee, H. J., Kim, E. & Kim, J.-S. Genome Research 20, 81-89 (2010), Lee, H. J., Kweon, J., Kim, E., Kim, S. & Kim, J. S. Genome Research 22, 539-548 (2012), Piganeau, M. et al. Genome Research 23, 1182-1193 (2013)）。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮによって形成される５′オーバーハングとは対照的に、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは平滑末端ｄｓＤＮＡ切断を形成し（Jinek, M. et al. Science 337, 816-821 (2012)）、これは、再連結の忠実度の増大に寄与し得るものであり、より短い１９ｂｐ（Mali, P. et al. Science 339, 823-826 (2013)）および１１８ｂｐ（Cong, L. et al. Science 339, 819-823 (2013)）のＣａｓ９媒介切除についても確認されている。
【０１０１】
単一のｓｇＲＮＡのみを用いた場合、ｍＴｈｙ１ホモ接合型置換が細胞の２％超で生じ（ｍＴｈｙ１＋  ｈＴｈｙ１−；ｍ／ｍ）、ヘテロ接合型置換が細胞の４％〜６％で生じた（ｍＴｈｙ１＋  ｈＴｈｙ１＋；ｍ／＋）。ｍＴｈｙ１−  ｈＴｈｙ１−ダブルネガティブ細胞はほとんど観察されず、切除ｈＴｈｙ１アレル（Δ）は全く観察されなかった（図１Ａ〜図１Ｄ）。９．８ｋｂのヒトＣＤ１４７遺伝子をそのマウスホモログと置換した場合、またはｈＴｈｙ１を蛍光レポーターと置換した場合にも同様なパターンの結果であった（図４Ａ〜図４Ｂおよび図５Ａ〜図５Ｂ）。
【０１０２】
実施例ＸＩ
ヒトｉＰＳＣにおける標的遺伝子置換に対する相同長の影響の決定
従来の遺伝子標的化ベクターは通常、直線化プラスミドとしてトランスフェクトされる。ＺＦＮを用いる場合、ＭＭＥＪ媒介遺伝子挿入では直線状コンストラクトの方が効率的であったが、ＨＲ媒介遺伝子挿入率は環状プラスミド標的化コンストラクトの方が直線化プラスミドより高かった（Orlando, S. J. et al. Nucleic Acids Research 38, e152 (2010), Cristea, S. et al. Biotechnol. Bioeng. 110, 871-880 (2013)）。線状化ｍＴｈｙ１標的化ベクターは、環状プラスミドより遺伝子標的化がはるかに低かった（図Ａ〜Ｂ）。これは、直線化プラスミドのヌクレオフェクション効率が低いこと、または分解の増加によるものであり得る（Cristea, S. et al. Biotechnol. Bioeng. 110, 871-880 (2013)）。
【０１０３】
バクテリア人工染色体を用いたホモロジーアーム長の延長（最大約７０ｋｂ）によって、弱いまたは非同質遺伝子型の標的化ベクターを改善することができる（Valenzuela, D. M. et al. Nat Biotechnol 21, 652-659 (2003)）が、従来のＨＲ媒介遺伝子標的化では、標的化頻度が、約１４ｋｂまではホモロジーアームの長さと共に増大した（Deng, C. & Capecchi, M. R. Mol. Cell. Biol. 12, 3365-3371 (1992)）。しかし、ｄｓＤＮＡ切断の導入により、単一切断部位への導入遺伝子挿入に必要なホモロジーアーム長が約０．２〜０．８ｋｂにまで短縮される（Elliott, B., Richardson, C., Winderbaum, J., Nickoloff, J. A. & Jasin, M. Mol. Cell. Biol. 18, 93-101 (1998), Moehle, E. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007), Hockemeyer, D. et al. Nat Biotechnol 27, 851-857 (2009), Orlando, S. J. et al. Nucleic Acids Research 38, e152 (2010), Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K. & Carroll, D. G3 Genes|Genomes|Genetics 3, 657-664 (2013)）。ヒトｉＰＳＣにおける標的遺伝子置換に対する相同長の影響を調べるために、種々の長さのホモロジーアームを有するｍＴｈｙ１標的化ベクターのバージョンを構築した（図７Ａ）。元の標的化ベクターに由来する約２ｋｂのホモロジーアーム（長い、Ｌ）に加え、より短い長さである約８００ｂｐ（中間、Ｍ）または約１００ｂｐ（短い、Ｓ）を、ＨＲ媒介遺伝子挿入（Moehle, E. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007), Hockemeyer, D. et al. Nat Biotechnol 27, 851-857 (2009)）またはｓｓＯＤＮ補正（Chen, F. et al. Nature Methods 8, 753-755 (2011), Yang, L. et al. Nucleic Acids Research (2013). doi:10.1093/nar/gkt555）によく用いられる長さであるため、選択した。約５ｋｂのより長いホモロジーアーム（特に長い、Ｘ）も試験した。２つのｄｓＤＮＡ切断の場合、標的化頻度は、約２ｋｂのホモロジーアームで最も高く（ＬＬおよびＭＬ）、通常、相同性が低くなるにつれて低下したが、全体の相同性が約１．５ｋｂまでは（ＭＭ、ＬＳ、およびＳＬ）、１％を超える頻度が達成された。特に長いホモロジーアームは、遺伝子標的化効率を改善しなかった（ＸＸ対ＬＬ）。
【０１０４】
１つのｄｓＤＮＡ切断のみを用いた場合、切断部位の反対側のアーム上の相同長が最も重要であった。ＬＭベクターおよびＬＳベクターは、右側ｓｇＲＮＡで、左側ｓｇＲＮＡより高い遺伝子標的化を示し、ＭＬベクターおよびＳＬベクターは、左側ｓｇＲＮＡで、右側ｓｇＲＮＡより高い遺伝子標的化を示した（図７Ａ）。ＰＧＰ４  ｉＰＳＣでも、標的化効率はより低かったが、同じパターンの結果が観察された（図７Ｂ）。これらの結果は、ｄｓＤＮＡ切断の外側の切除された染色体が標的化ベクタープラスミド中の対応する配列にアニーリングするという、合成依存的鎖アニーリング（Synthesis-Dependent Strand Annealing）モデルと一致している（Moehle, E. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007), Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S. & Gregory, P. D. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010), Chapman, J. R., Taylor, M. R. G. & Boulton, S. J. Molecular Cell 47, 497-510 (2012)）。標的化ベクター中の異種性のマウスＴｈｙ１配列は組み込まれ、反対側のホモロジーアーム上のヒト配列に到達するまで、Ｄループを形成する。このホモロジーアームの長さが十分であると、それに続くホモロジーサーチ、およびＤループ解消のための対応する染色体部分への再アニーリングが可能になる。
【０１０５】
このモデルでは、ホモロジーアーム配列はｄｓＤＮＡ切断部位の外側に延び、異種性の置換配列は内側に存在することになる。各切断部位の両側に及ぶホモロジーアームはＰＧＰ１  ｉＰＳＣまたはＰＧＰ４  ｉＰＳＣにおいて標的化効率を向上させなかった（図８Ａ〜図８Ｃ）。今回の標的化ベクターはインタクトなｓｇＲＮＡ標的部位を含んでいたので２倍多いｉＰＳＣ死が観察されたが（図８Ｂ）、おそらく、これは細胞中の圧倒的多数のｄｓＤＮＡ切断に起因している。これらのｓｇＲＮＡ部位が単一塩基対の欠失によって破壊された場合は、細胞死の増加は観察されなかったが、標的化効率は元のｍＴｈｙ１標的化ベクターより低いままであった。科学的理論に拘束されるものではないが、これらの結果は、各ｄｓＤＮＡ切断の両方の末端が標的化ベクター中の対応する相同配列にアニーリングして別個のクロスオーバーを形成するダブルホリデイジャンクションの主要なＨＲメカニズム（Chapman, J. R., Taylor, M. R. G. & Boulton, S. J. Molecular Cell 47, 497-510 (2012)）を示唆するものではない。
【０１０６】
実施例ＸＩＩ
ヒトｉＰＳＣにおけるＣａｓ９媒介欠失の頻度とサイズとの関係の決定
全体的により大きな欠失サイズでは欠失頻度が低下するものの、腫瘍細胞株においてＺＦＮを用いた数キロベースの欠失が達成されている（Lee, H. J., Kim, E. & Kim, J.-S. Genome Research 20, 81-89 (2010), Chen, F. et al. Nature Methods 8, 753-755 (2011)）。ヒトｉＰＳＣにおけるＣａｓ９媒介欠失の頻度とサイズとの関係を明らかにするために、様々な距離で離れてｈＴｈｙ１を標的化する、２種類の左側ｓｇＲＮＡおよび１０種類の右側ｓｇＲＮＡをデザインした（図２Ａ）。標的化ベクターを用いなかったので、両方のｈＴｈｙ１アレルが破壊された細胞はｈＴｈｙ１−になった（図２Ｂ）。ｈＴｈｙ１−細胞のバックグラウンドレベルを決定するため、左側ｓｇＲＮＡのみをヌクレオフェクトした細胞を用いた（図２Ｂ、右列）。バックグラウンドレベルを上回るホモ接合型欠失の頻度は、距離が短いほど高い傾向を示した（２．７ｋｂの欠失で最大２４％および８６ｋｂの欠失で８％）が、他のｓｇＲＮＡ部位は欠失頻度がはるかに低く、常にサイズに対応しているわけではなかった（図２Ｄ）。
【０１０７】
図１Ａ〜図１Ｄに記載されるように作製されたｉＰＳＣのｍＴｈｙ１＋  ｈＴｈｙ１＋クローン株を用いて単一アレルの欠失頻度を決定した。ｍＴｈｙ１アレルは前記２種類の左側ｓｇＲＮＡ部位を含んでいないので、残りの単一のｈＴｈｙ１アレルのみが欠失の対象となった。ヘテロ接合型欠失の頻度は、同じｓｇＲＮＡペア由来のホモ接合型欠失より高いこともあったが、これらは通常数パーセント以内であった（図２Ｃ〜図２Ｅ）。科学的理論により拘束されるものではないが、Ｌ１  ｓｇＲＮＡおよびＬ２  ｓｇＲＮＡのいずれも、同じ右側ｓｇＲＮＡとペアにした場合に常により多くの欠失を生じさせるものではなかったので、標的部位での融解温度、遺伝子発現、またはクロマチン環境の違いによるｓｇＲＮＡ部位間の異なるヌクレアーゼ活性（Yang, L. et al. Nucleic Acids Research (2013). doi:10.1093/nar/gkt555）は、観察された遺伝子欠失頻度のばらつきの原因ではなさそうである。２つのｄｓＤＮＡ切断部位間のマイクロホモロジーなど、ペア特異的な変数が欠失頻度に影響している可能性がある。
【０１０８】
実施例ＸＩＩＩ
種々のヌクレアーゼを用いた遺伝子置換および遺伝子置換ベクターの最適なデザイン
ある態様によれば、本明細書に記載の遺伝子置換ベクターのデザインは、ＤＮＡ切断を引き起こすシステムに対して特有のものではないため、種々のヌクレアーゼと共に用いることができる。ＺＦＮヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを用いて効率的な数キロベースの遺伝子置換が達成されている（図５Ａ〜図５Ｂおよび未掲載データ）。１つの切断部位を用いた標的遺伝子置換はさほど効率的ではなかったが、単一の切断部位の使用により、形成される潜在的遺伝子型およびオフターゲット変異が低減する。現在の技術は、ｄｓＤＮＡ切断が変異部位または挿入部位から１００ｂｐ以内に形成される必要があり、これにより潜在的に利用可能なｓｇＲＮＡ部位が限定される（Elliott, B., Richardson, C., Winderbaum, J., Nickoloff, J. A. & Jasin, M. Mol. Cell. Biol. 18, 93-101 (1998), Yang, L. et al. Nucleic Acids Research (2013). doi:10.1093/nar/gkt555）。ある態様によれば、遺伝子周辺またはイントロン内に位置する、より幅広いヌクレアーゼ部位を用いて、巨大遺伝子置換を行うことができる。本方法の範囲内において付加的な固有ｓｇＲＮＡ部位が有用であり、遺伝子ファミリー内の保存されたコード配列が回避される。これにより、特定の領域についての複数のｓｇＲＮＡの試験が容易になる（図２Ａ〜図２Ｅ）。本明細書に記載の方法では、隣接する最大２ｋｂのホモロジーアームにより、遺伝子標的化効率が改善される（図７Ａ〜図７Ｂ）。
【０１０９】
ある態様によれば、ＺＦＮヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼなどの、ゲノム編集のためのヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ結合タンパク質を用いた、（遺伝子破壊または遺伝子挿入ではなく）標的遺伝子置換の作製方法が提供される。ある態様によれば、本明細書に記載の遺伝子置換の高い標的化効率のために選択を行わずにスクリーニングすることによる、標的クローンを単離する方法が提供される。ある態様によれば、遺伝子は、標的化に成功した細胞をＦＡＣＳにより選択およびクローニングできるように蛍光タンパク質と置換されてもよい。異種性の配列を用いた遺伝子置換は、「ノックイン」動物またはヒト細胞株での疾患モデルの作製に特に有益である。具体的な応用例としては、内在性プロモーター下流へのレポーターコンストラクトの配置、再コード化された導入遺伝子による内在性遺伝子の置換、または様々な種間の比較ゲノム科学が挙げられる。
【図１Ａ】
2020062033.tif 000025
【図１Ｂ】
2020062033.tif 000026
【図１Ｃ】
2020062033.tif 000027
【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
2020062033.tif 000033
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
2020062033.tif 000037
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月17日(2020.2.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
ある態様によれば、ＺＦＮヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼなどの、ゲノム編集のためのヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ結合タンパク質を用いた、（遺伝子破壊または遺伝子挿入ではなく）標的遺伝子置換の作製方法が提供される。ある態様によれば、本明細書に記載の遺伝子置換の高い標的化効率のために選択を行わずにスクリーニングすることによる、標的クローンを単離する方法が提供される。ある態様によれば、遺伝子は、標的化に成功した細胞をＦＡＣＳにより選択およびクローニングできるように蛍光タンパク質と置換されてもよい。異種性の配列を用いた遺伝子置換は、「ノックイン」動物またはヒト細胞株での疾患モデルの作製に特に有益である。具体的な応用例としては、内在性プロモーター下流へのレポーターコンストラクトの配置、再コード化された導入遺伝子による内在性遺伝子の置換、または様々な種間の比較ゲノム科学が挙げられる。
本開示に係る態様は以下のものも含む。
＜１＞
細胞において標的核酸を改変する方法であって、
前記標的核酸を含むＤＮＡに相補的な１種類または複数種類のガイドＲＮＡ配列をコードする第１の外来核酸を前記細胞に導入すること、
前記ＤＮＡに結合し、且つ前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡ配列によってガイドされる、Ｃａｓ９タンパク質をコードする第２の外来核酸を前記細胞に導入すること、
前記標的核酸配列中に取り込まれる外来性核酸配列をコードする第３の外来核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡ配列、前記Ｃａｓ９タンパク質、および前記外来性核酸配列が発現し、
前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡ配列および前記Ｃａｓ９タンパク質が前記ＤＮＡに共局在し、前記Ｃａｓ９タンパク質が２つ以上の二本鎖切断を形成して関心のある第１の核酸配列を除去し、前記外来性核酸配列が、前記標的核酸の２つの切断点の間に挿入される、
方法。
＜２＞
前記標的核酸配列中に取り込まれる前記外来性核酸配列は、前記遺伝子置換の周辺部位に相補的な配列で挟まれている、＜１＞に記載の方法。
＜３＞
前記外来性核酸の長さが１００塩基対超〜約１００，０００塩基対である、＜１＞に記載の方法。
＜４＞
前記関心のある第１の核酸配列の長さが１００塩基対超〜約１０，０００塩基対である、＜１＞に記載の方法。
＜５＞
前記細胞が真核細胞である、＜１＞に記載の方法。
＜６＞
前記細胞が、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である、＜１＞に記載の方法。
＜７＞
前記ガイドＲＮＡが約１０〜約５００ヌクレオチドである、＜１＞に記載の方法。
＜８＞
前記ガイドＲＮＡが約２０〜約１００ヌクレオチドである、＜１＞に記載の方法。
＜９＞
前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡ配列がｃｒＲＮＡである、＜１＞に記載の方法。
＜１０＞
前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡ配列がｔｒａｃｒＲＮＡ‐ｃｒＲＮＡ融合体である、＜１＞に記載の方法。
＜１１＞
前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、＜１＞に記載の方法。
＜１２＞
前記外来性核酸配列が、相同組換えにより前記標的核酸配列中に挿入される、＜１＞に記載の方法。
＜１３＞
前記外来性核酸配列が、非相同末端結合により前記標的核酸配列中に挿入される、＜１＞に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞において遺伝子を置換する方法（ただし置換がヒトの体内で行われる場合を除く）であって、
置換対象の遺伝子の一方の側にある標的核酸配列に相補的なガイドＲＮＡの配列をコードする第１の外来核酸を前記真核細胞に導入すること、
前記遺伝子の一方の側に切断部位を作製するためのＣａｓ９タンパク質をコードする第２の外来核酸を前記真核細胞に導入すること、および
前記遺伝子を置換するための、置換対象の前記遺伝子の両側にそれぞれ相補的であるホモロジーアーム配列とホモロジーアーム配列の間に位置する外来性核酸配列、を含む標的化ベクターを前記真核細胞に導入すること、ここで前記切断部位とは反対側のホモロジーアーム配列は前記切断部位側のホモロジーアーム配列よりも長い、
を含み、
前記ガイドＲＮＡおよび前記Ｃａｓ９タンパク質が発現し、
前記ガイドＲＮＡおよび前記Ｃａｓ９タンパク質が前記標的核酸配列に共局在し、前記Ｃａｓ９タンパク質が前記切断部位を生成して前記外来性核酸配列が前記切断部位において挿入される、方法。
【請求項２】
挿入される前記外来性核酸配列が遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記外来性核酸配列の長さが１，０００塩基対〜１００，０００塩基対である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記真核細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記真核細胞が幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記真核細胞がヒト幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記真核細胞が誘導多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記真核細胞がヒト誘導多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ガイドＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡ‐ｃｒＲＮＡ融合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子を有する核酸が、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記外来性核酸配列が、相同組換えにより前記標的核酸配列中に挿入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記外来性核酸配列の長さが１０，０００塩基対〜１００，０００塩基対である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記外来性核酸配列の長さが１，０００塩基対〜１０，０００塩基対である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ホモロジーアーム配列の各々の長さが１００塩基以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ホモロジーアーム配列の各々の長さが２ｋｂ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ホモロジーアーム配列の各々の長さが０．２〜５ｋｂである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ホモロジーアーム配列の合計長さが、１．５ｋｂ〜２ｋｂである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
置換対象の遺伝子の一方の側にある標的核酸配列に相補的なガイドＲＮＡの配列をコードする第１の外来核酸、
前記遺伝子の一方の側に切断部位を作製するためのＣａｓ９タンパク質をコードする第２の外来核酸、および
前記遺伝子を置換するための、置換対象の前記遺伝子の両側にそれぞれ相補的であるホモロジーアーム配列とホモロジーアーム配列の間に位置する外来性核酸配列、を含む標的化ベクター、ここで前記切断部位とは反対側のホモロジーアーム配列は前記切断部位側のホモロジーアーム配列よりも長い、
を含む、真核細胞において遺伝子を置換するためのシステム。
【請求項１９】
前記外来性核酸配列が遺伝子である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記外来性核酸配列の長さが１，０００塩基対〜１００，０００塩基対である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２１】
前記ガイドＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡ‐ｃｒＲＮＡ融合体である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２２】
前記外来性核酸配列の長さが１０，０００塩基対〜１００，０００塩基対である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２３】
前記外来性核酸配列の長さが１，０００塩基対〜１０，０００塩基対である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２４】
前記ホモロジーアーム配列の各々の長さが１００塩基以上である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２５】
前記ホモロジーアーム配列の各々の長さが２ｋｂ以下である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２６】
前記ホモロジーアーム配列の各々の長さが０．２〜５ｋｂである、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２７】
前記ホモロジーアーム配列の合計長さが、１．５ｋｂ〜２ｋｂである、請求項１８に記載のシステム。
【外国語明細書】
2020062033000001.pdf