(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｔ細胞を製造する方法の提供。【解決手段】標的細胞の表面の特異的抗原部分を認識する細胞表面受容体を発現するＴ細胞を製造する方法が提供される。（１）ドナー被験体から得られたリンパ球の集団を富化することと、（２）活性化Ｔ細胞の集団を産生するために、１又は複数のＴ細胞刺激剤でリンパ球の集団を刺激することであって、刺激が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることと、（３）形質導入されたＴ細胞の集団を産生するために、単一サイクルの形質導入を使用して細胞表面受容体をコードする核酸分子を含むウイルスベクターによって活性化Ｔ細胞の集団に形質導入することと、（４）操作されたＴ細胞の集団を産生するために、所定の時間に亘って形質導入されたＴ細胞の集団を拡大する、方法。また、操作されたＴ細胞の集団及びその医薬組成物を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞の表面の特異的抗原部分を認識する細胞表面受容体を発現するＴ細胞を製造する方法であって、
ドナー被験体から得られたリンパ球の集団を富化することと、
活性化Ｔ細胞の集団を産生するために、１又は複数のＴ細胞刺激剤で前記リンパ球の集団を刺激することであって、前記刺激が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることと、
形質導入されたＴ細胞の集団を産生するために、単一サイクルの形質導入を使用して前記細胞表面受容体をコードする核酸分子を含むウイルスベクターによって前記活性化Ｔ細胞の集団に形質導入することであって、前記形質導入が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることと、
操作されたＴ細胞の集団を産生するために、所定の時間に亘って前記形質導入されたＴ細胞の集団を拡大することであって、前記拡大が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記細胞表面受容体がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的細胞ががん細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記がん細胞がＢ細胞悪性腫瘍である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞表面受容体が抗ＣＤ１９  ＣＡＲである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記１又は複数のＴ細胞刺激剤が抗ＣＤ３抗体及びＩＬ−２である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記レトロウイルスベクターがＭＳＧＶ１ガンマレトロウイルスベクターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記形質導入されたＴ細胞の集団を拡大する前記所定の時間が３日である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記リンパ球の集団の富化から前記操作されたＴ細胞の産生までの時間が６日である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記操作されたＴ細胞をがん患者の治療に使用する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記がん患者と前記ドナー被験体とが同一の個体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記閉鎖系が閉鎖バッグ系である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞の集団がナイーブＴ細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記操作されたＴ細胞の集団の約３５％〜４３％がナイーブＴ細胞を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記操作されたＴ細胞の集団の少なくとも約３５％がナイーブＴ細胞を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記操作されたＴ細胞の集団の少なくとも約４３％がナイーブＴ細胞を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
標的細胞の表面の特異的抗原部分を認識する細胞表面受容体を発現する操作されたＴ細胞の集団であって、
ドナー被験体から得られたリンパ球の集団を富化することと、
活性化Ｔ細胞の集団を産生するために、１又は複数のＴ細胞刺激剤で前記リンパ球の集団を刺激することであって、前記刺激が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることと、
形質導入されたＴ細胞の集団を産生するために、単一サイクルの形質導入を使用して前記細胞表面受容体をコードする核酸分子を含むウイルスベクターによって前記活性化Ｔ細胞の集団に形質導入することであって、前記形質導入が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることと、
操作されたＴ細胞の集団を産生するために、所定の時間に亘って前記形質導入されたＴ細胞の集団を拡大することであって、前記拡大が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることと、
を含む方法によって産生される、集団。
【請求項１９】
前記細胞表面受容体がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１８に記載の集団。
【請求項２０】
前記標的細胞ががん細胞である、請求項１８に記載の集団。
【請求項２１】
前記がん細胞がＢ細胞悪性腫瘍である、請求項２０に記載の集団。
【請求項２２】
前記細胞表面受容体が抗ＣＤ１９  ＣＡＲである、請求項１８に記載の集団。
【請求項２３】
前記１又は複数のＴ細胞刺激剤が抗ＣＤ３抗体及びＩＬ−２である、請求項１８に記載の集団。
【請求項２４】
前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１８に記載の集団。
【請求項２５】
前記レトロウイルスベクターがＭＳＧＶ１ガンマレトロウイルスベクターである、請求項２４に記載の集団。
【請求項２６】
前記形質導入されたＴ細胞の集団を拡大する所定の時間が３日である、請求項１８に記載の集団。
【請求項２７】
前記リンパ球の集団の富化から前記操作されたＴ細胞の産生までの時間が６日である、請求項１８に記載の集団。
【請求項２８】
前記操作されたＴ細胞をがん患者の治療に使用する、請求項２７に記載の集団。
【請求項２９】
前記がん患者と前記ドナー被験体とが同じ個体である、請求項２８に記載の集団。
【請求項３０】
前記閉鎖系が閉鎖バッグ系である、請求項１８に記載の集団。
【請求項３１】
前記操作されたＴ細胞の集団がナイーブＴ細胞を含む、請求項１８に記載の集団。
【請求項３２】
前記操作されたＴ細胞の集団の約３５％〜４３％がナイーブＴ細胞を含む、請求項３１に記載の集団。
【請求項３３】
前記操作されたＴ細胞の集団の少なくとも約３５％がナイーブＴ細胞を含む、請求項３１に記載の集団。
【請求項３４】
前記操作されたＴ細胞の集団の少なくとも約４３％がナイーブＴ細胞を含む、請求項３１に記載の集団。
【請求項３５】
請求項１８〜３４のいずれか一項に記載の前記操作されたＴ細胞の集団を含む医薬組成物。
【請求項３６】
治療的有効用量の前記操作されたＴ細胞を含む、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記細胞表面受容体がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記ＣＡＲがＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲである、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記治療的有効用量が体重１ｋｇ当たり約１００万超〜約３００万未満の操作されたＴ細胞である、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記治療的有効用量が約２００万の操作されたＴ細胞／ｋｇである、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
Ｔ細胞を製造する方法であって、
（ａ）リンパ球の集団を得ることと、
（ｂ）活性化Ｔ細胞の集団を産生するために、１又は複数の刺激剤によって前記リンパ球の集団を刺激することであって、前記刺激が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることと、
（ｃ）形質導入されたＴ細胞の集団を産生するために、少なくとも１サイクルの形質導入を使用して前記細胞表面受容体をコードする核酸分子を含むウイルスベクターによって前記活性化Ｔ細胞の集団に形質導入することであって、前記形質導入が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることと、
（ｄ）操作されたＴ細胞の集団を産生するために、前記形質導入されたＴ細胞の集団を拡大することであって、前記拡大が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることと、を含む、方法。
【請求項４２】
前記細胞表面受容体がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす、２０１４年２月４日付で出願された米国仮特許出願番号第６１／９３５，８３３号の利益を主張する。
【０００２】
［合衆国政府の利益に関する陳述］
本発明は、保健社会福祉省の一機関である国立癌研究所（ＮＣＩ）との共同研究及び開発協定の成果において創造された。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
がんの治療における使用のため操作された自己Ｔ細胞を産生するプロセスは、長時間を要し（１０日〜２４日）、２サイクルのレトロウイルス形質導入を含み、市販用途にあまり適していない（非特許文献１及び２を参照されたい）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kochenderfer et al., Blood.  2012 119: 2709-2720
【非特許文献２】Johnson, et al., Blood. 2009; 114(3):535-546
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、これらの制限を克服するためＴ細胞製造プロセスに対する改良を行うことが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書に記載されるある特定の実施の形態によれば、標的細胞の表面の特定抗原部分を認識する細胞表面受容体を発現するＴ細胞を製造する方法が提供される。本明細書において、ある特定の実施の形態では、標的細胞の表面の特異的抗原部分を認識する細胞表面受容体を発現するＴ細胞を製造する方法であって、ドナー被験体から得られたリンパ球の集団を富化することと、活性化Ｔ細胞の集団を産生するために１又は複数のＴ細胞刺激剤で上記リンパ球の集団を刺激することであって、上記刺激が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることと、形質導入されたＴ細胞の集団を産生するために単一サイクルの形質導入を使用して細胞表面受容体をコードする核酸分子を含むウイルスベクターによって上記活性化Ｔ細胞の集団に形質導入することであって、上記形質導入が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることと、操作されたＴ細胞の集団を産生するために所定の時間に亘って上記形質導入されたＴ細胞の集団を拡大することであって、上記拡大が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることとを含む、方法が提供される。ある特定の実施の形態では、細胞表面受容体はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であってもよい。ある特定の実施の形態では、標的細胞はがん細胞であってもよい。ある特定の実施の形態では、がん細胞はＢ細胞悪性腫瘍であってもよい。ある特定の実施の形態では、細胞表面受容体は抗ＣＤ１９  ＣＡＲであってもよい。ある特定の実施の形態では、抗ＣＤ１９  ＣＡＲはＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢｚ  ＣＡＲであってもよい。ある特定の実施の形態では、１又は複数のＴ細胞刺激剤は抗ＣＤ３抗体及びＩＬ−２であってもよい。ある特定の実施の形態では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターであってもよい。ある特定の実施の形態では、レトロウイルスベクターはＭＳＧＶ１ガンマレトロウイルスベクターであってもよい。ある特定の実
施の形態では、ＭＳＧＶ１ガンマレトロウイルスベクターは、ＭＳＧＶ−ＦＭＣ６３−２８Ｚ又はＭＳＧＶ−ＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢｚガンマレトロウイルスベクターであってもよい。ある特定の実施の形態では、形質導入されたＴ細胞の集団を拡大する所定の時間は３日であってもよい。ある特定の実施の形態では、リンパ球の集団の富化から操作されたＴ細胞の産生までの時間が６日であってもよい。ある特定の実施の形態では、操作されたＴ細胞をがん患者の治療に使用してもよい。ある特定の実施の形態では、がん患者とドナー被験体とは同一の個体であってもよい。ある特定の実施の形態では、閉鎖系は閉鎖バッグ系であってもよい。ある特定の実施の形態では、細胞の集団はナイーブＴ細胞を含んでもよい。ある特定の実施の形態では、操作されたＴ細胞の集団の約３５％〜４３％がナイーブＴ細胞を含んでもよい。ある特定の実施の形態では、操作されたＴ細胞の集団の少なくとも約３５％がナイーブＴ細胞を含んでもよい。ある特定の実施の形態では、操作されたＴ細胞の集団の少なくとも約４３％がナイーブＴ細胞を含んでもよい。
【０００７】
本明細書に記載される実施の形態によれば、本明細書に開示される方法によって産生された標的細胞の表面の特異的抗原部分を認識する細胞表面受容体を発現する操作されたＴ細胞の集団が提供される。本明細書において、ある特定の実施の形態では、ドナー被験体から得られたリンパ球の集団を富化することと、活性化Ｔ細胞の集団を産生するために１又は複数のＴ細胞刺激剤で上記リンパ球の集団を刺激することであって、上記刺激が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることと、形質導入されたＴ細胞の集団を産生するために単一サイクルの形質導入を使用して細胞表面受容体をコードする核酸分子を含むウイルスベクターによって上記活性化Ｔ細胞の集団に形質導入することであって、上記形質導入が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることと、操作されたＴ細胞の集団を産生するために所定の時間に亘って上記形質導入されたＴ細胞の集団を拡大することであって、上記拡大が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることとを含む方法が提供される。ある特定の実施の形態では、操作されたＴ細胞の集団は本明細書に記載されるもののいずれであってもよい。
【０００８】
本明細書に記載されるある特定の実施の形態によれば、操作されたＴ細胞の集団を含む医薬組成物が提供される。本明細書において、特定の実施態様では本明細書に記載される操作されたＴ細胞の集団を含む医薬組成物が提供される。ある特定の実施の形態では、医薬組成物は治療的有効用量の操作されたＴ細胞を含んでもよい。ある特定の実施の形態では、細胞表面受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であってもよい。ある特定の実施の形態では、ＣＡＲはＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲであってもよい。ある特定の実施の形態では、治療的有効用量は、体重１キログラム当たり約１００万より多く、かつ約３００万未満の操作されたＴ細胞（細胞／ｋｇ）であってもよい。ある特定の実施の形態では、治療的有効用量は約２００万の操作されたＴ細胞／ｋｇであってもよい。
【０００９】
本明細書に記載されるある特定の実施の形態によれば、Ｔ細胞を製造する方法が提供される。本明細書では、リンパ球の集団を得ることと、活性化Ｔ細胞の集団を産生するために１又は複数の刺激剤によって上記リンパ球の集団を刺激することであって、上記刺激が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることと、形質導入されたＴ細胞の集団を産生するために少なくとも１サイクルの形質導入を使用して細胞表面受容体をコードする核酸分子を含むウイルスベクターによって上記活性化Ｔ細胞の集団に形質導入することであって、上記形質導入が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることと、操作されたＴ細胞の集団を産生するために上記形質導入されたＴ細胞の集団を拡大することであって、上記拡大が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることとを含む、Ｔ細胞を製造する方法が提供される。ある特定の実施の形態では、操作されたＴ細胞の集団は本明細書に記載されるもののいずれであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本明細書に記載されるある特定の実施形態によるＴ細胞製造プロセス（「改良された」プロセス）を説明する図である。Ｔ細胞の倍加時間は被験体ごとにわずかに変化し得るため、目的の標的用量を送達するのに総細胞数が不十分である場合にはバッグ内での７２時間を超える（すなわち３日〜６日）追加の増殖時間を考慮する（＊を参照されたい）。
【図２】１つの実施形態による従来使用されていたプロセス（「従来の」プロセス）と比較した改良されたプロセスを説明する図である。
【図３】１つの実施形態による従来のプロセスと比較した改良されたプロセスにおける培養拡大を説明する棒グラフである。ｙ軸は５試行（ｘ軸）の各々の細胞の拡大倍数を示す。培養拡大倍数は大規模操作の試行において従来のプロセスと改良されたプロセスとで同様である。
【図４】１つの実施形態による、ＣＤ３＋細胞表現型（図４Ａ）及びＣＤ３＋細胞活性化（図４Ｂ）において、従来のプロセス及び改良されたプロセスにおける６日目及び１０日目のＴ細胞表現型を図に示されるマーカーにより説明する一連のグラフを示す図である。Ｔ細胞表現型は従来のプロセスと改良されたプロセスとで同等であるが、６日目の細胞はより未分化である。Ｔｅｆｆ＝エフェクターＴ細胞、Ｔｅｍ＝エフェクターメモリーＴ細胞、Ｔｃｍ＝セントラルメモリーＴ細胞。
【図５】１つの実施形態による、従来のプロセス及び改良されたプロセスにおける６日目の細胞表現型を説明する一連のグラフを示す図である。
【図６】１つの実施形態による、改良されたプロセスの刺激相、形質導入相、及び拡大相の間の毎日の細胞数を示す概略図である。
【図７】１つの実施形態による、ＭＳＧＶ１ガンマレトロウイルス骨格（配列番号４）の核酸配列を示す図である。
【図８】１つの実施形態による、バッグを被覆するため使用したＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）濃度の関数として形質導入効率を示す図である。ＲＮ＝μｇ／ｍＬ単位のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）濃度。２名のドナーからのＰＬ０７バッグにおける形質導入から６日後に結果を測定した。
【図９】１つの実施形態による、洗浄工程を含む及び洗浄工程を含まない形質導入効率を示す図である。Ｏｒｉｇｅｎ  ＰｅｒｍａＬｉｆｅ（商標）バッグ内での形質導入から６日後に結果を測定した。
【図１０】１つの実施形態による、ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）培地における形質導入効率に対するＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）濃度の影響を示す図である。ＲＮ＝μｇ／ｍＬ単位のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）濃度。「開放」は、形質導入がＡＩＭ  Ｖ（登録商標）＋５％ヒト血清中、プレートにおいて実施された条件を示す。
【図１１】１つの実施形態による、ＦＡＣＳによって評価される、ＣＤ１９＋Ｎａｌｍ６細胞と４時間に亘ってコインキュベーションした後のＣＤ１０７ａ発現及びＩＦＮ−ガンマ発現によって測定される、形質導入されたＴ細胞の活性を示す図である。「開放」は、形質導入がＡＩＭ  Ｖ（登録商標）＋５％ヒト血清中、プレートにおいて実施された条件を示す。対照Ｔは、凍結されたＣＡＲ陽性の形質導入されたＰＢＭＣの参照試料を示す。
【図１２】最適化プロファイルのための速度制御冷凍チャンバーの温度プロファイル（下の線）及び製品温度（上の線）を示す図である。表示されるプロファイルは、重要な領域のみを示すため短縮されている。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書に記載される実施形態によれば、病理学的な疾患又は状態を有する患者の治療に有用な可能性のあるＴ細胞調製剤を製造する方法又はプロセスが提供される。Ｔ細胞産物に対する既知の生産方法とは対照的に、本明細書に記載される方法及びプロセスは、およそ６日間という著しく短い時間で完了されることにより、細胞を臨床へと至らせる重要
な時間的利益を提供する。また、本明細書において、本明細書に記載される方法を使用して産生された、操作されたＴ細胞の集団、及びその医薬組成物が提供される。
【００１２】
ある特定の実施形態では、標的細胞の表面の特異的抗原部分を認識する細胞表面受容体を発現するＴ細胞を製造するため、記載される方法を使用してもよい。該細胞表面受容体は、野生型又は組換えのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、又は標的細胞と関連する抗原部分を認識することができる任意の他の表面受容体であってもよい。ＣＡＲ及びＴＣＲによって認識される抗原部分の形態はわずかに異なる。ＣＡＲは、単鎖タンパク質としてＣＡＲを発現することを可能とする、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を標的結合ドメインとして有する。このことから、ＣＡＲが標的細胞表面の無傷のタンパク質の一部である天然のがん抗原を認識することが可能となる。ＴＣＲは、ある特定の細胞の表面のＭＨＣタンパク質によって提示される特異的ペプチドと結合するように設計される２つのタンパク質鎖を有する。ＴＣＲは標的細胞表面に発現されるＭＨＣ分子との関連でペプチドを認識することから、ＴＣＲはがん細胞の表面に直接提示されるがん抗原のみならず、腫瘍、炎症性の及び感染した微小環境、並びに二次リンパ器官において抗原提示細胞によって提示されるがん抗原をも認識する潜在的な能力を有する。抗原提示細胞は、免疫応答の増幅を担う天然の免疫系細胞である。
【００１３】
したがって、本明細書に記載される実施形態によれば、細胞表面受容体を発現する製造されたＴ細胞を、限定されないが、感染した細胞、損傷した細胞、又は機能不全の細胞を含む任意の標的細胞を標的化し、死滅させるため使用してもよい。かかる標的細胞の例として、がん細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、機能不全の活性化された炎症性細胞（例えば、炎症性内皮細胞）、及び機能不全免疫反応に関与する細胞（例えば、自己免疫疾患に関与する細胞）が挙げられる。
【００１４】
幾つかの態様では、抗原部分はがん又はがん細胞と関連する。このような抗原部分は、７０７−ＡＰ（７０７アラニンプロリン）、ＡＦＰ（α（ａ）−フェトプロテイン）、ＡＲＴ−４（Ｔ４細胞により認識される腺癌抗原）、ＢＡＧＥ（Ｂ抗原；ｂ−カテニン／ｍ、ｂ−カテニン／変異型）、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）、Ｂｃｒ−ａｂｌ（ブレイクポイントクラスター領域−アベルソン）、ＣＡＩＸ（炭酸脱水酵素ＩＸ）、ＣＤ１９（分化抗原群１９）、ＣＤ２０（分化抗原群２０）、ＣＤ２２（分化抗原群２２）、ＣＤ３０（分化抗原群３０）、ＣＤ３３（分化抗原群３３）、ＣＤ４４ｖ７／８（分化抗原群４４、エクソン７／８）、ＣＡＭＥＬ（メラノーマ上のＣＴＬ認識抗原）、ＣＡＰ−１（がん胎児抗原ペプチド−１）、ＣＡＳＰ−８（カスパーゼ−８）、ＣＤＣ２７ｍ（細胞分裂周期タンパク質２７変異型）、ＣＤＫ４／ｍ（サイクリン依存性キナーゼ４変異型）、ＣＥＡ（がん胎児性抗原）、ＣＴ（がん／精巣（抗原））、Ｃｙｐ−Ｂ（シクロフィリンＢ）、ＤＡＭ（分化抗原メラノーマ）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（上皮成長因子受容体、バリアントＩＩＩ）、ＥＧＰ−２（上皮糖タンパク質２）、ＥＧＰ−４０（上皮糖タンパク質４０）、Ｅｒｂｂ２、３、４（赤芽球性白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ−２、−３、−４）、ＥＬＦ２Ｍ（伸長因子２変異型）、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１（Ｅｔｓバリアント遺伝子６／急性骨髄性白血病１遺伝子ＥＴＳ）、ＦＢＰ（葉酸結合タンパク質）、ｆＡｃｈＲ（胎児性アセチルコリン受容体）、Ｇ２５０（糖タンパク質２５０）、ＧＡＧＥ（Ｇ抗原）、ＧＤ２（ジシアロガングリオシド２）、ＧＤ３（ジシアロガングリオシド３）、ＧｎＴ−Ｖ（Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｖ）、Ｇｐ１００（糖タンパク質１００ｋＤ）、ＨＡＧＥ（ヘリカーゼ抗原）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ヒト上皮成長因子受容体−２／神経系；ＥＧＦＲ２としても知られる）、ＨＬＡ−Ａ（ヒト白血球型抗原−Ａ）、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）、ＨＳＰ７０−２Ｍ（熱ショックタンパク質７０−２変異型）、ＨＳＴ−２（ヒト印環腫瘍−２）、ｈＴＥＲＴ若しくはｈＴＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）、ｉＣＥ（腸管カルボキシルエステラーゼ）、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２（インターロイキン−１３受容体サブユニットα−２）、ＫＩＡＡ０２
０５、ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体）、κ−軽鎖、ＬＡＧＥ（Ｌ抗原）、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ（低比重脂質受容体／ＧＤＰ−Ｌ−フコース：ｂ−Ｄ−ガラクトシダーゼ２−ａ−Ｌフコシルトランスフェラーゼ）、ＬｅＹ（ルイスＹ抗体）、Ｌ１ＣＡＭ（Ｌ１細胞接着分子）、ＭＡＧＥ（メラノーマ抗原）、ＭＡＧＥ−Ａ１（メラノーマ関連抗原１）、メソテリン、マウスＣＭＶ感染細胞、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ（Ｔ細胞１により認識されるメラノーマ抗原／メラノーマ抗原Ａ）、ＭＣ１Ｒ（メラノコルチン１受容体）、ミオシン／ｍ（ミオシン変異型）、ＭＵＣ１（ムチン１）、ＭＵＭ−１、−２、−３（メラノーマ遍在変異型１、２、３）、ＮＡ８８−Ａ（患者Ｍ８８のＮＡ  ｃＤＮＡクローン）、ＮＫＧ２Ｄ（ナチュラルキラー群２、メンバーＤ）リガンド、ＮＹ−ＢＲ−１（ニューヨーク乳房分化抗原１）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（ニューヨーク食道扁平上皮細胞がん−１）、がん胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、Ｐ１５（タンパク質１５）、ｐ１９０  ｍｉｎｏｒ  ｂｃｒ−ａｂｌ（１９０ＫＤのｂｃｒ−ａｂｌのタンパク質）、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ（前骨髄球性白血病／レチノイン酸受容体ａ）、ＰＲＡＭＥ（メラノーマの優先的発現抗原）、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＲＡＧＥ（腎臓抗原）、ＲＵ１若しくはＲＵ２（腎臓遍在型１又は２）、ＳＡＧＥ（肉腫抗原）、ＳＡＲＴ−１若しくはＳＡＲＴ−３（腫瘍拒絶扁平上皮抗原１又は３）、ＳＳＸ１、−２、−３、−４（滑膜肉腫Ｘ１、−２、−３、−４）、ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）、ＴＡＧ−７２（腫瘍関連糖タンパク質７２）、ＴＥＬ／ＡＭＬ１（トランスローケーションＥｔｓファミリー白血病／急性骨髄性白血病１）、ＴＰＩ／ｍ（トリオースリン酸イソメラーゼ変異型）、ＴＲＰ−１（チロシナーゼ関連タンパク質１、又はｇｐ７５）、ＴＲＰ−２（チロシナーゼ関連タンパク質２）、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２（ＴＲＰ−２／イントロン２）、ＶＥＧＦ−Ｒ２（血管内皮細胞増殖因子受容体２）、又はＷＴ１（ウイルムス腫瘍遺伝子）を含み得るが、それらに限定されない。
【００１５】
幾つかの態様において、細胞表面受容体は、抗７０７−ＡＰ  ＴＣＲ、抗ＡＦＰ  ＴＣＲ、抗ＡＲＴ−４  ＴＣＲ、抗ＢＡＧＥ  ＴＣＲ、抗Ｂｃｒ−ａｂｌ  ＴＣＲ、抗ＣＡＭＥＬ  ＴＣＲ、抗ＣＡＰ−１  ＴＣＲ、抗ＣＡＳＰ−８  ＴＣＲ、抗ＣＤＣ２７ｍ  ＴＣＲ、抗ＣＤＫ４／ｍ  ＴＣＲ、抗ＣＥＡ  ＴＣＲ、抗ＣＴ  ＴＣＲ、抗Ｃｙｐ−Ｂ  ＴＣＲ、抗ＤＡＭ  ＴＣＲ、抗ＴＣＲ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＴＣＲ、抗ＥＬＦ２Ｍ  ＴＣＲ、抗ＥＴＶ６−ＡＭＬ１  ＴＣＲ、抗Ｇ２５０  ＴＣＲ、ＧＡＧＥ  ＴＣＲ、抗ＧｎＴ−Ｖ  ＴＣＲ、抗Ｇｐ１００  ＴＣＲ、抗ＨＡＧＥ  ＴＣＲ、抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ＴＣＲ、抗ＨＬＡ−Ａ  ＴＣＲ、抗ＨＰＶ  ＴＣＲ、抗ＨＳＰ７０−２Ｍ  ＴＣＲ、抗ＨＳＴ−２  ＴＣＲ、抗ｈＴＥＲＴ  ＴＣＲ若しくは抗ｈＴＲＴ  ＴＣＲ、抗ｉＣＥ  ＴＣＲ、抗ＫＩＡＡ０２０５、抗ＬＡＧＥ（Ｌ抗原）、抗ＬＤＬＲ／ＦＵＴ  ＴＣＲ、抗ＭＡＧＥ
ＴＣＲ、抗ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ  ＴＣＲ、抗ＭＣ１Ｒ  ＴＣＲ、抗ミオシン／ｍ  ＴＣＲ、抗ＭＵＣ１  ＴＣＲ、抗ＭＵＭ−１、−２、−３  ＴＣＲ、抗ＮＡ８８−Ａ  ＴＣＲ、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ、抗Ｐ１５  ＴＣＲ、抗ｐ１９０  ｍｉｎｏｒ
ｂｃｒ−ａｂｌ  ＴＣＲ、抗Ｐｍｌ／ＲＡＲａ  ＴＣＲ、抗ＰＲＡＭＥ  ＴＣＲ、抗ＰＳＡ  ＴＣＲ、抗ＰＳＭＡ  ＴＣＲ、抗ＲＡＧＥ  ＴＣＲ、抗ＲＵ１  ＴＣＲ若しくは抗ＲＵ２  ＴＣＲ、抗ＳＡＧＥ  ＴＣＲ、抗ＳＡＲＴ−１  ＴＣＲ若しくは抗ＳＡＲＴ−３
ＴＣＲ、抗ＳＳＸ１、−２、−３、−４  ＴＣＲ、抗ＴＥＬ／ＡＭＬ１  ＴＣＲ、抗ＴＰＩ／ｍ  ＴＣＲ、抗ＴＲＰ−１  ＴＣＲ、抗ＴＲＰ−２  ＴＣＲ、抗ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２  ＴＣＲ、又は抗ＷＴ１  ＴＣＲを含むが、それらに限定されない、がん細胞上の特異的抗原部分を認識する任意のＴＣＲである。
【００１６】
他の態様では、細胞表面受容体は、Ｔ細胞によって発現され得る、がん細胞上の特異的抗原部分を認識する任意のＣＡＲである。ある特定のＣＡＲは、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）及びシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータ鎖）を含む。他のＣＡＲは、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）、シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータ鎖）、及び共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８）を含む。さらに、他のＣＡＲは、
抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）、シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータ鎖）、及び２つの共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８及び４−１ＢＢ）を含む。本明細書に記載される方法に従って作製されるＴ細胞によって発現され得る表面受容体ＣＡＲの例として、限定されないが、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、抗ＣＡＩＸ  ＣＡＲ、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、抗ＣＤ２０  ＣＡＲ、抗ＣＤ２２  ＣＡＲ、抗ＣＤ３０  ＣＡＲ、抗ＣＤ３３  ＣＡＲ、抗ＣＤ４４ｖ７／８  ＣＡＲ、抗ＣＥＡ  ＣＡＲ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ、抗ＥＧＰ−２、抗ＥＧＰ−４０  ＣＡＲ、抗Ｅｒｂｂ２、３、４  ＣＡＲ、抗ＦＢＰ  ＣＡＲ、抗ｆＡｃｈＲ  ＣＡＲ、抗ＧＤ２  ＣＡＲ、抗ＧＤ３  ＣＡＲ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＣＡＲ、抗ＩＬ−１３Ｒ−ａ２  ＣＡＲ、抗ＫＤＲ  ＣＡＲ、抗κ−軽鎖ＣＡＲ、抗ＬｅＹ  ＣＡＲ、抗Ｌ１ＣＡＭ  ＣＡＲ、抗ＭＡＧＥ−Ａ１  ＣＡＲ、抗メソテリンＣＡＲ、抗マウスＣＭＶ感染細胞に対するＣＡＲ、抗ＭＵＣ１  ＣＡＲ、抗ＮＫＧ２ＤリガンドＣＡＲ、抗ＮＹ−ＢＲ−１  ＣＡＲ、抗ｈ５Ｔ４  ＣＡＲ、抗ＰＳＣＡ  ＣＡＲ、抗ＰＳＭＡ  ＣＡＲ、抗ＴＡＡ  ＣＡＲ、抗ＴＡＧ−７２  ＣＡＲ、又は抗ＶＥＧＦ−Ｒ２  ＣＡＲが挙げられる。１つの態様では、細胞表面受容体は任意の抗ＣＤ１９  ＣＡＲである。１つの態様では、抗ＣＤ１９  ＣＡＲとして、細胞外ｓｃＦｖドメイン、ＣＤ２８分子の細胞内部分及び／又は膜貫通部分、ＣＤ２８分子の任意の細胞外部分、及び細胞内ＣＤ３ゼータドメインが挙げられる。また、抗ＣＤ１９  ＣＡＲは、ＣＤ８細胞外及び／又は膜貫通領域、細胞外免疫グロブリンＦｃドメイン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、又は４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＩＬ−２の受容体、Ｆｃガンマ受容体等の１若しくは複数の追加のシグナル伝達ドメイン、又は免疫受容体チロシン系活性化モチーフを含む他の共刺激ドメイン等の追加のドメインが挙げられる。
【００１７】
ある特定の実施形態では、細胞表面受容体は、Kochenderfer et al., J Immunother. 2009 September; 32(7): 689-702「Construction and Pre-clinical Evaluation of an Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor」に記載される、ＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又は
ＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ等の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ等であり、その主題は、ＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現するＴ細胞を産生するため使用されるベクターを構築する方法を提供する目的で、引用することにより本明細書の一部をなす。
【００１８】
他の実施形態では、抗原部分はウイルス感染細胞（すなわち、ウイルス抗原部分）と関連する。このような抗原部分は、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）抗原（例えば、ＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２）、Ａ型肝炎ウイルス抗原（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）、Ｂ型肝炎ウイルス抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｅＡｇ）、Ｃ型肝炎ウイルス抗原（例えば、エンベロープ糖タンパク質Ｅ１及びＥ２）、単純ヘルペス１型、２型、若しくは８型（ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、又はＨＳＶ８）ウイルス抗原（例えば、糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ、ｇＣ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＪ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＭ、ＵＬ２０、ＵＬ３２、ＵＳ４３、ＵＬ４５、ＵＬ４９Ａ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のウイルス抗原（例えば、糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ、ｇＣ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＪ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＭ、又は他のエンベロープタンパク質）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のウイルス抗原（糖タンパク質ｇｐ１２０、ｇｐ４１、又はｐ２４）、インフルエンザウイルス抗原（例えば、ヘマグルチニン（ＨＡ）又はノイラミダーゼ（ＮＡ））、麻疹又は流行性耳下腺炎のウイルス抗原、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のウイルス抗原（例えば、Ｌ１、Ｌ２）、パラインフルエンザウイルスのウイルス抗原、風疹ウイルスのウイルス抗原、呼吸器抱合体ウイルス（ＲＳＶ）のウイルス抗原、又は水痘帯状疱疹ウイルスのウイルス抗原を含み得るが、それらに限定されない。かかる実施形態では、細胞表面受容体は任意のＴＣＲ、又は標的ウイルス感染細胞上の上述のウイルス抗原のいずれかを認識する任意のＣＡＲであってもよい。
【００１９】
他の実施形態では、抗原部分は免疫又は炎症の機能不全を有する細胞と関連する。かかる抗原部分として、限定されないが、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、プロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、又は病原性の自己免疫プロセスに関与する若しくはそれと関連する任意の他の組織特異的抗原が挙げられ得る。
【００２０】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、ドナー被験体から得られたリンパ球の集団を富化する工程を含んでもよい。該ドナー被験体は、本明細書に記載される方法によって作製される細胞の集団で治療されるがん患者（すなわち、自家ドナー）であってもよく、又は本明細書に記載される方法によって作製される細胞集団の作製によって、異なる個体若しくはがん患者の治療に使用されるリンパ球試料を提供する個体（すなわち、同種異系ドナー）であってもよい。リンパ球の集団は、当該技術分野で使用される任意の好適な方法によってドナー被験体から得られてもよい。例えば、リンパ球の集団は、任意の好適な体外の方法、静脈穿刺、又は血液及び／又はリンパ球の試料が得られる他の採血方法によって得られてもよい。１つの実施形態では、リンパ球の集団はアフェレーシスによって得られる。
【００２１】
リンパ球の集団の富化は、限定されないが、分離培地（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（登録商標）ＨＬＡ  Ｔｏｔａｌ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｃｏｃｋｔａｉｌ、リンパ球分離培地（ＬＳＡ）（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、品番０８５０４９４Ｘ）等）の使用、細胞の大きさ、濾過若しくはエルトリエーションによる形状若しくは密度の分離、免疫磁気分離法（例えば、磁気活性化セルソーティングシステム、ＭＡＣＳ）、蛍光分離法（例えば、蛍光活性化セルソーティングシステム、ＦＡＣＳ）、又はビーズに基づくカラム分離法を含む任意の好適な分離方法によって達成されてもよい。
【００２２】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、活性化Ｔ細胞の集団を産生するための１又は複数のＴ細胞刺激剤によりリンパ球の集団を刺激する工程を含んでもよい。活性化Ｔ細胞の集団を産生するため使用され得る１又は複数の好適なＴ細胞刺激剤の任意の組合せとして、限定されないが、Ｔ細胞の刺激分子若しくは共刺激分子を標的とする抗体若しくはその機能性フラグメント（例えば、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、又はその機能性フラグメント）、Ｔ細胞サイトカイン（例えば、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα））、又は任意の他の好適なマイトジェン（例えば、テトラデカノイルホルボールアセテート（ＴＰＡ）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ））、又はＴ細胞刺激性若しくは共刺激性の分子に対する天然リガンドが挙げられる。
【００２３】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるリンパ球の集団を刺激する工程は、所定の温度で、所定の時間に亘って、及び／又は所定レベルのＣＯ２の存在下で１又は複数のＴ細胞刺激剤によりリンパ球の集団を刺激することを含んでもよい。ある特定の実施形態では、刺激に対する所定の温度は、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、又は約３９度であってもよい。ある特定の実施形態では、刺激に対する所定の温度は約３４℃〜３９℃であってもよい。ある特定の実施形態では、刺激に対する所定の温度は約３５℃〜３７℃であってもよい。ある特定の実施形態では、刺激に対する好ましい所定の温度は約３６℃〜３８℃であってもよい。ある特定の実施形態では、刺激に対する所定の温度は約３６℃〜３７℃、又はより好ましくは約３７℃であってもよい。ある特定の実施
形態では、リンパ球の集団を刺激する工程は、所定の時間に亘って１又は複数のＴ細胞刺激剤でリンパ球の集団を刺激することを含む。ある特定の実施形態では、刺激に対する所定の時間は約２４時間〜７２時間であってもよい。ある特定の実施形態では、刺激に対する所定の時間は約２４時間〜３６時間、約３０時間〜４２時間、約３６時間〜４８時間、約４０時間〜５２時間、約４２時間〜５４時間、約４４時間〜５６時間、約４６時間〜５８時間、約４８時間〜６０時間、約５４時間〜６６時間、又は約６０時間〜７２時間であってもよい。ある特定の実施形態では、刺激に対する所定の時間は約４８時間又は少なくとも約４８時間であってもよい。ある特定の実施形態では、刺激に対する所定の時間は、約４４時間〜５２時間であってもよい。ある特定の実施形態では、刺激に対する所定の時間は約４０時間〜４４時間、約４０時間〜４８時間、約４０時間〜５２時間、又は約４０時間〜５６時間であってもよい。ある特定の実施形態では、リンパ球の集団を刺激する工程は、所定レベルのＣＯ２の存在下で１又は複数のＴ細胞刺激剤でリンパ球の集団を刺激することを含んでもよい。ある特定の実施形態では、刺激に対する所定レベルのＣＯ２は約１．０％〜１０％のＣＯ２であってもよい。ある特定の実施形態では、刺激に対する所定のレベルのＣＯ２は約１．０％、約２．０％、約３．０％、約４．０％、約５．０％、約６．０％、約７．０％、約８．０％、約９．０％、又は約１０．０％のＣＯ２であってもよい。ある特定の実施形態では、刺激に対する所定レベルのＣＯ２は約３％〜７％のＣＯ２であってもよい。ある特定の実施形態では、刺激に対する所定レベルのＣＯ２は約４％〜６％のＣＯ２であってもよい。ある特定の実施形態では、刺激に対する所定レベルのＣＯ２は約４．５％〜５．５％のＣＯ２であってもよい。ある特定の実施形態では、刺激に対する所定レベルのＣＯ２は約５％のＣＯ２であってもよい。幾つかの実施形態では、リンパ球の集団を刺激する工程は、任意の組合せの所定の温度で、所定の時間に亘って、及び／又は所定レベルのＣＯ２の存在下で１又は複数のＴ細胞刺激剤でリンパ球の集団を刺激することを含んでもよい。例えば、１つの実施形態では、リンパ球の集団を刺激する工程は、約３６℃〜３８℃の所定の温度で、約４４時間〜５２時間の所定の時間に亘って、約４．５％〜５．５％のＣＯ２という所定レベルのＣＯ２の存在下で１又は複数のＴ細胞刺激剤でリンパ球の集団を刺激することを含んでもよい。
【００２４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるリンパ球の集団を刺激する工程に使用されるリンパ球の集団は、所定の濃度のリンパ球であってもよい。ある特定の実施形態において、リンパ球の所定の濃度は約０．１〜１０．０×１０６細胞／ｍＬであってもよい。ある特定の実施形態において、リンパ球の所定の濃度は約０．１〜１．０×１０６細胞／ｍＬ、１．０〜２．０×１０６細胞／ｍＬ、約１．０〜３．０×１０６細胞／ｍＬ、約１．０〜４．０×１０６細胞／ｍＬ、約１．０〜５．０×１０６細胞／ｍＬ、約１．０〜６．０×１０６細胞／ｍＬ、約１．０〜７．０×１０６細胞／ｍＬ、約１．０〜８．０×１０６細胞／ｍＬ、１．０〜９．０×１０６細胞／ｍＬ、又は約１．０〜１０．０×１０６細胞／ｍＬであってもよい。ある特定の実施形態において、リンパ球の所定の濃度は約１．０〜２．０×１０６細胞／ｍＬであってもよい。ある特定の実施形態において、リンパ球の所定の濃度は約１．０〜１．２×１０６細胞／ｍＬ、約１．０〜１．４×１０６細胞／ｍＬ、約１．０〜１．６×１０６細胞／ｍＬ、約１．０〜１．８×１０６細胞／ｍＬ、又は約１．０〜２．０×１０６細胞／ｍＬであってもよい。ある特定の実施形態において、リンパ球の所定の濃度は、少なくとも約０．１×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約１．０×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約１．１×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約１．２×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約１．３×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約１．４×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約１．５×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約１．６×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約１．７×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約１．８×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約１．９×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約２．０×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約４．０×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約６．０×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約８．０×１０６細胞／ｍＬ、又は少なくとも約１０．０×１０６細胞／ｍＬであってもよい。
【００２５】
幾つかの実施形態では、リンパ球の集団を刺激する工程に従って、抗ＣＤ３抗体（又はその機能性フラグメント）、抗ＣＤ２８抗体（又はその機能性フラグメント）、又は抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の組合せを使用してもよい。任意の可溶性又は固定化された抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、及び／又は抗ＣＤ２８の抗体又はそれらの機能性フラグメントを使用してもよい（例えば、クローンＯＫＴ３（抗ＣＤ３）、クローン１４５−２Ｃ１１（抗ＣＤ３）、クローンＵＣＨＴ１（抗ＣＤ３）、クローンＬ２９３（抗ＣＤ２８）、クローン１５Ｅ８（抗ＣＤ２８））。幾つかの態様では、上記抗体を、限定されないがＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（例えば、ＭＡＣＳ  ＧＭＰ  ＣＤ３  ｐｕｒｅ  １ｍｇ／ｍＬ、Ｐａｒｔ  Ｎｏ．  １７０−０７６−１１６）及びｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｃ．を含む当該技術分野で既知の供給元から商業的に購入してもよい。さらに、当業者は、どのようにして標準的な方法によって抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８の抗体を産生するかを理解する。本明細書に記載される方法で使用される任意の抗体は、バイオ医薬品に関する関連機関のガイドラインを順守するように優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）のもと製造されなければならない。幾つかの実施形態では、リンパ球の集団を刺激する工程に従って使用され得る１又は複数のＴ細胞刺激剤は、Ｔ細胞サイトカインの存在下でＴ細胞刺激性又は共刺激性の分子を標的とする抗体又はその機能性フラグメントを含む。１つの態様では、１又は複数のＴ細胞刺激剤は抗ＣＤ３抗体及びＩＬ−２を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞刺激剤は、約２０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度の抗ＣＤ３抗体を含んでもよい。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３抗体の濃度は、約２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、又は約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３抗体の濃度は約５０ｎｇ／ｍＬであってもよい。代替的な実施形態では、Ｔ細胞活性化は必要ではない。かかる実施形態では、活性化Ｔ細胞の集団を産生するためリンパ球の集団を刺激する工程は上記方法から省略され、Ｔリンパ球に対して富化され得るリンパ球の集団を以下の工程に従って形質導入する。
【００２６】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、形質導入されたＴ細胞の集団を産生するため単一サイクルの形質導入を使用して、細胞表面受容体をコードする核酸分子を含むウイルスベクターによって活性化Ｔ細胞の集団に形質導入する工程を含んでもよい。幾つかの組換えウイルスは、細胞に遺伝子材料を送達するウイルスベクターとして使用されている。形質導入工程と関連して使用され得るウイルスベクターは、限定されないが、組換えレトロウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクター、組換えアデノウイルスベクター、及び組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、任意の同種指向性ウイルスベクター又は両種指向性ウイルスベクターであってもよい。１つの態様では、活性化Ｔ細胞の集団に形質導入するため使用されるウイルスベクターは、ＭＳＧＶ１ガンマレトロウイルスベクターである。１つの態様では、かかるＭＳＧＶ１ガンマレトロウイルスベクターは、図６（配列番号４）に示される骨格核酸配列を含んでもよく、ここで、細胞表面受容体（例えば、ＣＡＲ又はＴＣＲ）の配列を含む核酸フラグメントは、ＭＳＧＶ１ガンマレトロウイルスベクターの配列を含む核酸フラグメントと連結される。ある特定の実施形態では、活性化Ｔ細胞の集団に形質導入するため使用されるウイルスベクターは、Kochenderfer et al., J Immunother. 2009 September; 32(7): 689‐702に記載されるＭＳＧＶ−ＦＭＣ６３−２８Ｚレトロウイルスベクター又はＭＳＧＶ−ＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺレトロウイルスベクターであってもよく、その主題は、該出版物の「Materials and Methods」の欄の「Construction of the MSGV-FMC63-28Z and MSGV-FMC63-CD828BBZ Recombinant Retroviral Vectors」に提示されるレトロウイルスベクターを構築する方法を提供する目的で引用することにより本明細書の一部をなす。この実施形態の１つの態様によれば、ウイルスベクターを、ウイルスベクター製造に特異的な培地中の培養において増殖させる。本明細書に記載される方法に従って、ウイルスベクター接種材料にお
いて任意の好適な増殖培地及び／又はウイルスベクターを増殖させるサプリメントを使用してもよい。幾つかの態様によれば、その後、形質導入工程の間にウイルスベクターを以下に記載される血清不含培地に添加してもよい。
【００２７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される活性化Ｔ細胞の集団に形質導入する工程は、所定の時間に亘って、所定の温度で、及び／又は所定レベルのＣＯ２の存在下で行われてもよい。ある特定の実施形態では、形質導入に対する所定の温度は、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、又は約３９℃であってもよい。ある特定の実施形態では、形質導入に対する所定の温度は、約３４℃〜３９℃であってもよい。ある特定の実施形態では、形質導入に対する所定の温度は約３５℃〜３７℃であってもよい。ある特定の実施形態では、形質導入に対する好ましい所定の温度は約３６℃〜３８℃であってもよい。ある特定の実施形態では、形質導入に対する所定の温度は約３６℃〜３７℃、又はより好ましくは約３７℃であってもよい。ある特定の実施形態では、形質導入に対する所定の時間は約１２時間〜３６時間であってもよい。ある特定の実施形態では、形質導入に対する所定の時間は、約１２時間〜１６時間、約１２時間〜２０時間、約１２時間〜２４時間、約１２時間〜２８時間、又は約１２時間〜３２時間であってもよい。ある特定の実施形態では、形質導入に対する所定の時間は約２０時間又は少なくとも約２０時間であってもよい。ある特定の実施形態では、形質導入に対する所定の時間は約１６時間〜２４時間であってもよい。ある特定の実施形態では、形質導入に対する所定の時間は少なくとも約１４時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２４時間、又は少なくとも約２６時間であってもよい。幾つかの実施形態では、活性化Ｔ細胞の集団に形質導入する工程は、所定レベルのＣＯ２でウイルスベクターによって活性化Ｔ細胞の集団を形質導入することを含んでもよい。ある特定の実施形態では、形質導入に対する所定レベルのＣＯ２は約１．０％〜１０％のＣＯ２であってもよい。ある特定の実施形態では、形質導入に対する所定レベルのＣＯ２は約１．０％、約２．０％、約３．０％、約４．０％、約５．０％、約６．０％、約７．０％、約８．０％、約９．０％、又は約１０．０％のＣＯ２であってもよい。ある特定の実施形態では、形質導入に対する所定レベルのＣＯ２は約３％〜７％のＣＯ２であってもよい。ある特定の実施形態では、形質導入に対する所定レベルのＣＯ２は約４％〜６％のＣＯ２であってもよい。ある特定の実施形態では、形質導入に対する所定レベルのＣＯ２は約４．５％〜５．５％のＣＯ２であってもよい。ある特定の実施形態では、形質導入に対する所定レベルのＣＯ２は約５％のＣＯ２であってもよい。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される活性化Ｔ細胞の集団に形質導入する工程は、任意の組合せの所定の時間に亘り、所定の温度で、及び／又は所定レベルのＣＯ２の存在下で行われてもよい。例えば、１つの態様では、活性化Ｔ細胞の集団に形質導入する工程は、約３６℃〜３８℃の所定の温度、約１６時間〜約２４時間の所定時間、及び約４．５％〜約５．５％のＣＯ２という所定レベルのＣＯ２の存在下であることを含んでもよい。
【００２８】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、所定時間に亘って形質導入されたＴ細胞の集団を拡大して、操作されたＴ細胞の集団を産生する工程を含んでもよい。拡大のための所定の時間は、（ｉ）患者に投与するための少なくとも１回用量に対して操作されたＴ細胞の集団中の十分な数の細胞、（ｉｉ）典型的なより長いプロセスと比較して有利な割合の幼若な細胞を含む操作されたＴ細胞の集団、又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方の産生を可能とする任意の好適な時間であってもよい。この時間は、Ｔ細胞によって発現される細胞表面受容体、使用されるベクター、治療的効果を有するため必要とされる用量、及び他の変数に依存する。したがって、幾つかの実施形態では、拡大のための所定の時間は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、又は２１日超であってもよい。幾つかの態様では、拡大のための所定の時間は、当該技術で既知の拡大方法よりも短縮される。例えば、拡大のための所定の時間は、少なく
とも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％短縮されてもよく、又は７５％超短縮されてもよい。１つの態様では、拡大のための所定の時間は約３日である。この態様では、リンパ球の集団の富化から操作されたＴ細胞の産生までの時間は約６日である。ある特定の実施形態では、形質導入されたＴ細胞の集団を拡大する工程は、所定の温度で及び／又は所定レベルのＣＯ２の存在下で行われてもよい。ある特定の実施形態では、上記所定の温度は約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、又は約３９℃であってもよい。ある特定の実施形態では、上記所定の温度は約３４℃〜３９℃であってもよい。ある特定の実施形態では、所定の温度は約３５℃〜３７℃であってもよい。ある特定の実施形態では、好ましい所定の温度は約３６℃〜３８℃であってもよい。ある特定の実施形態では、上記所定の温度は約３６℃〜３７℃、又はより好ましくは約３７℃であってもよい。幾つかの実施形態では、形質導入されたＴ細胞の集団を拡大する工程は、所定レベルのＣＯ２の存在下で形質導入されたＴ細胞の集団を拡大することを含む。ある特定の実施形態では、所定レベルのＣＯ２は１．０％〜１０％のＣＯ２であってもよい。ある特定の実施形態では、所定レベルのＣＯ２は、約１．０％、約２．０％、約３．０％、約４．０％、約５．０％、約６．０％、約７．０％、約８．０％、約９．０％、又は約１０．０％のＣＯ２であってもよい。ある特定の実施形態では、所定レベルのＣＯ２は約４．５％〜５．５％のＣＯ２であってもよい。ある特定の実施形態では、所定レベルのＣＯ２は約５％のＣＯ２であってもよい。ある特定の実施形態では、所定レベルのＣＯ２は約３．５％、約４．０％、約４．５％、約５．０％、約５．５％、又は約６．５％のＣＯ２であってもよい。幾つかの実施形態では、形質導入されたＴ細胞の集団を拡大する工程は、任意の組合せの所定の温度で及び／又は所定レベルのＣＯ２の存在下で行われてもよい。例えば、１つの実施形態では、形質導入されたＴ細胞の集団を拡大する工程は、約３６℃〜３８℃の所定の温度、及び約４．５％〜５．５％のＣＯ２という所定レベルのＣＯ２の存在下であることを含んでもよい。
【００２９】
幾つかの態様では、本明細書に記載の方法の各工程を閉鎖系で行う。ある特定の実施形態では、該閉鎖系は、任意の好適な細胞培養バッグ（例えば、ミルテニーバイオテクのＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ細胞分化バッグ、Ｏｒｉｇｅｎ  ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌのＰｅｒｍａＬｉｆｅ（登録商標）細胞培養バッグ）を使用する閉鎖バッグ培養系である。幾つかの実施形態では、上記閉鎖バッグ培養系で使用される細胞培養バッグは、形質導入工程の間、組換えヒトフィブロネクチンタンパク質で被覆される。ある特定の実施形態では、上記閉鎖バッグ培養系で使用される細胞培養バッグは、形質導入工程の間、組換えヒトフィブロネクチンタンパク質フラグメントで被覆される。該組換えヒトフィブロネクチンフラグメントは、３つの機能性ドメイン、すなわち中央細胞結合ドメイン、ヘパリン結合ドメインＩＩ、及びＣＳ１配列を含んでもよい。組換えヒトフィブロネクチンタンパク質又はそのフラグメントを、標的細胞及びウイルスベクターの共局在を補助することによって免疫細胞のレトロウイルス形質導入の遺伝子効率を上げるため使用してもよい。ある特定の実施形態では、上記組換えヒトフィブロネクチンフラグメントはＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（タカラバイオ株式会社；日本）である。ある特定の実施形態では、上記細胞培養バッグは、約１μｇ／ｍＬ〜６０μｇ／ｍＬ、好ましくは約１μｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬの濃度で組換えヒトフィブロネクチンフラグメントで被覆されてもよい。ある特定の実施形態では、上記細胞培養バッグは、約１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬ、又は約４０μｇ／ｍＬ〜６０μｇ／ｍＬの濃度の組換えヒトフィブロネクチンフラグメントで被覆されてもよい。ある特定の実施形態において、細胞培養バッグは、約１μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ、約１２μｇ／ｍＬ、約１３μｇ／ｍＬ、約１４μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ、約１６μｇ／ｍＬ、約１７μｇ／ｍＬ、約１８μｇ／ｍＬ、
約１９μｇ／ｍＬ、又は約２０μｇ／ｍＬの組換えヒトフィブロネクチンフラグメントで被覆されてもよい。ある特定の実施形態において、細胞培養バッグは、約２μｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ〜２５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ〜３０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ〜３５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬ、又は約２μｇ／ｍＬ〜６０μｇ／ｍＬの組換えヒトフィブロネクチンフラグメントで被覆されてもよい。ある特定の実施形態において、細胞培養バッグは、少なくとも約２μｇ／ｍＬ、少なくとも約５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１５μｇ／ｍＬ、少なくとも約２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２５μｇ／ｍＬ、少なくとも約３０μｇ／ｍＬ、少なくとも約４０μｇ／ｍＬ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ、又は少なくとも約６０μｇ／ｍＬの組換えヒトフィブロネクチンフラグメントで被覆されてもよい。ある特定の実施形態において、細胞培養バッグは、少なくとも約１０μｇ／ｍＬの組換えヒトフィブロネクチンフラグメントで被覆されてもよい。ある特定の実施形態では、上記閉鎖バッグ培養系で使用される細胞培養バッグは、形質導入工程の間、ヒトアルブミン血清（ＨＳＡ）でブロックされてもよい。代替的な実施形態では、上記細胞培養バッグは、形質導入工程の間、ＨＳＡでブロックされない。他の態様では、血清が添加されていない血清不含培養培地を使用して、（ａ）リンパ球の集団を刺激する工程、（ｂ）活性化Ｔ細胞の集団に形質導入する工程、及び（ｃ）形質導入されたＴ細胞の集団を拡大する工程のうちの１又は複数を行う。別の態様では、（ａ）リンパ球の集団を刺激する工程、（ｂ）活性化Ｔ細胞の集団に形質導入する工程、及び（ｃ）形質導入されたＴ細胞の集団を拡大する工程は、血清不含培養培地を使用して各々行われる。本明細書で言及される「血清不含培地」又は「血清不含培養培地」の用語は、使用される増殖培地が血清（例えば、ヒト血清又はウシ血清）で補足されていないことを意味する。言い換えれば、培養培地に培養細胞の生存率、活性化及び増殖を支持する目的で別々に個別の異なる成分として血清を添加しない。本明細書に記載される方法に従って、任意の好適な培養培地としてＴ細胞増殖培地を浮遊状態の細胞の培養に使用してもよい。例えば、Ｔ細胞増殖培地として、限定されないが、適量の緩衝液、マグネシウム、カルシウム、ピルビン酸ナトリウム、及び重炭酸ナトリウムを含む無菌の低グルコース溶液が挙げられ得る。１つの態様では、Ｔ細胞増殖培地はＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であるが、当業者はどのようにして同様の培地を作製するかを理解する。操作されたＴ細胞を産生する典型的な方法とは対照的に、本明細書に記載される方法は、血清（例えば、ヒト又はウシ）で補足されていない培養培地を使用する。
【００３０】
本明細書に記載される実施形態によれば、標的細胞表面の特異的抗原部分を認識する細胞表面受容体を発現するＴ細胞を製造する方法は、（１）ドナー被験体から得られたリンパ球の集団を富化することと、（２）活性化Ｔ細胞の集団を産生するために１又は複数のＴ細胞刺激剤で該リンパ球の集団を刺激することであって、該刺激が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることと、（３）形質導入されたＴ細胞の集団を産生するために単一サイクルの形質導入を使用して細胞表面受容体をコードする核酸分子を含むウイルスベクターによって該活性化Ｔ細胞の集団に形質導入することであって、該形質導入が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることと、（４）操作されたＴ細胞の集団を産生するために所定の時間に亘って該形質導入されたＴ細胞の集団を拡大することであって、該拡大が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることとを含んでもよい。
【００３１】
別の実施形態では、標的細胞表面の特異的抗原部分を認識する細胞表面受容体を発現するＴ細胞を製造する方法は、（１）ドナー被験体から得られたリンパ球の集団を富化することと、（２）形質導入されたＴ細胞の集団を産生するために単一サイクルの形質導入を使用して細胞表面受容体をコードする核酸分子を含むウイルスベクターでリンパ球の集団に形質導入することであって、該形質導入が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることと、（３）操作されたＴ細胞の集団を産生するために所定の時間に亘って該形質導
入されたＴ細胞の集団を拡大することであって、該拡大が血清不含培養培地を使用して閉鎖系で行われることとを含んでもよい。
【００３２】
１つの実施形態では、上記プロセス又は方法は、限定されないが、（１）患者からのアフェレーシス産物の回収、及び閉鎖系での単核細胞の分離、（２）閉鎖系でＴ細胞の細胞増殖を刺激するためのＩＬ２の存在下でのＣＤ３に対する抗体による単核細胞集団の刺激、（３）閉鎖系でガンマレトロウイルスベクターを使用する、Ｔ細胞にがん標的細胞の表面の特異的抗原部分を認識させることを可能とする新たな細胞表面受容体遺伝子の導入又は形質導入、（４）閉鎖系における形質導入されたＴ細胞の拡大、並びに（５）がん患者に再投与するため閉鎖系において拡大された自己Ｔ細胞の洗浄及び調製を含んでもよい。幾つかの態様では、上記拡大工程は３日であり、１週間未満で全製造プロセスが完了することを可能とする。Ｔ細胞が活発に増殖しているプロセス工程２〜４は、ヒト血清を含有しない規定の細胞培養培地（すなわち、血清不含培地）中で行われる。このプロセスによって産生されるＴ細胞は生体活性を示し、がん細胞表面の標的抗原によって活性化された状態になり、それに反応してガンマインターフェロンを産生する。本明細書に記載される方法の幾つかの態様として、
このプロセスは、Ｔ細胞製造中の汚染可能性が最小である閉鎖系で行う、
上記プロセスは、臨床用途のＴ細胞の産生に適している、
ヒト血清を含有しない細胞培養培地で細胞を増殖させる、
閉鎖バッグ系において受容体遺伝子をＴ細胞に導入する、
細胞をわずか６日で臨床用途用に作製することができる、及び、
細胞はｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的活性の指標となる生物学的活性を示す、
が挙げられる。
【００３３】
これらの態様は、以下の通り現在当該技術分野で使用されている方法に対して幾つかの違い及び／又は改良を提供する。ヒト血清不含細胞培養培地の使用は、プロセスにおいて原材料に由来するヒト病原体の導入機会を最小化し、将来容易に入手することができなくなる可能性のある原材料の使用を回避する。さらに、種々の血清ロットが再現性及びプロセスの信頼性を保証するために重要な培養検査及びリリースを必要とすることから、かかる使用はＧＭＰコンプライアンスを支持する。血清不含培地中でのＴ細胞の増殖は、以前に報告されているが（Carstens et al., ISCT meeting in San Diego, 2012; Zuliani, 2011）、以前はがんを治療するための臨床用途のＴ細胞を産生するプロセスに組み込まれ
ておらず、先の研究は、血清不含培地におけるＴ細胞活性化、形質導入、及び拡大がロバストであることを示していない。本明細書に記載される研究において検討される改良されたプロセスにおいて、抗ＣＤ３モノクローナル抗体及びＩＬ２の使用をＴ細胞集団の刺激のため維持した。さらに、閉鎖系バッグにおける細胞培養は、細胞培養中の汚染の可能性を予防する顕著な利点を提供し、ｃＧＭＰ製造及び産物の商品化に適した簡略化され、短縮されたプロセスを提供し得る。この実用化の重要性は、Ｔ細胞増殖に関する文献に記載される多くのプロセスが幅広い商業用途に適していないことから、意義深いものである。
【００３４】
以前は、ガンマレトロウイルスベクターによるウイルス形質導入が効率的ではなく、ウイルスと細胞とをＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）で被覆したウェルの底に遠心分離する、「スピノキュレーション（spinocculation）」と呼ばれる開放プロセスがマイクロタイタープレートで行われていた。このプロセスは、通常、形質導入効率を最大化するため連日２回繰り返される。形質導入が、（プレートではなく）ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）で被覆されたバッグを使用して閉鎖バッグ系において行われ、該プロセスが２回ではなく１回で実施されるように、本明細書に記載される方法の幾つかの実施形態に従って、この形質導入工程を修正した。また、本明細書に記載される方法は、当該技術分野で昔から使用されてきた開放系フラスコではなく閉鎖系細胞培養バッグでの細胞の増殖を含んでもよい。幾つかの文献（Lamers et al, Cytotherapy 2008, 10: 406-416、Tumanin
i et al, Cytotherapy 2013, 11, 1406-1415）がバッグ系における形質導入の報告を含むものの、これらの場合、本明細書に記載される方法とは異なり、血清を含有する細胞培養培地において完了された少なくとも２回の形質導入、及び少なくとも９日間の拡大時間を含む。本明細書に記載される実施形態における開発研究は、血清不含培地中でのバッグにおける形質導入が実行可能であるばかりでなく、形質導入水準が単一の形質導入及びわずか３日間の拡大後の更なる臨床開発に許容可能であることを実証する。
【００３５】
幾つかの実施形態では、上に記載の方法によって産生される操作されたＴ細胞の集団は、後日細胞を使用してもよいように、任意に凍結保存されてもよい。したがって、操作されたＴ細胞の集団の凍結保存方法が本明細書において提供される。かかる方法は、希釈溶媒を用いて操作されたＴ細胞の集団を洗浄及び濃縮する工程を含んでもよい。幾つかの態様では、希釈溶媒は、生理食塩水、０．９％生理食塩水、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ（ＰＬ）、５％デキストロース／０．４５％ＮａＣｌ生理食塩水溶液（Ｄ５）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、又はそれらの組合せである。幾つかの態様では、細胞の生存率及び解凍後の細胞の回復の改善のため、洗浄し、濃縮した細胞にＨＳＡを添加してもよい。別の態様では、洗浄溶液は、生理食塩水であり、洗浄し、濃縮した細胞をＨＳＡ（５％）により補足する。また、上記方法は、凍結保存混合物を作製する工程を含んでもよく、ここで、該凍結保存混合物は希釈溶液中に希釈された細胞の集団及び好適な凍結保存溶液を含む。幾つかの態様では、凍結保存溶液は、限定されないがＣｒｙｏＳｔｏｒ１０（BioLife Solutions）を含む任意の好適な凍結保存溶液であってもよく、操作されたＴ細胞の希釈
溶液と１：１又は２：１の比率で混合されてもよい。ある特定の実施形態では、上記凍結保存混合物に最終濃度約１．０％〜１０％のＨＳＡを与えるため、ＨＳＡを添加してもよい。ある特定の実施形態では、上記凍結保存混合物に最終濃度約１．０％、約２．０％、約３．０％、約４．０％、約５．０％、約６．０％、約７．０％、約８．０％、約９．０％、又は約１０．０％のＨＳＡを与えるためＨＳＡを添加してもよい。ある特定の実施形態では、上記凍結保存混合物に最終濃度約１％〜３％のＨＳＡ、約１％〜４％のＨＳＡ、約１％〜５％のＨＳＡ、約１％〜７％のＨＳＡ、約２％〜４％のＨＳＡ、約２％〜５％のＨＳＡ、約２％〜６％のＨＳＡ、又は約２％〜７％のＨＳＡを与えるためＨＳＡを添加してもよい。ある特定の実施形態では、上記凍結保存混合物中に最終濃度約２．５％のＨＳＡを与えるためＨＳＡを添加してもよい。例えば、ある特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の集団の凍結保存は、０．９％の生理食塩水で細胞を洗浄することと、洗浄した細胞に最終濃度５％のＨＳＡを添加することと、該細胞をＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ１０で１：１（最終凍結保存混合物中、最終濃度２．５％のＨＳＡのため）に希釈することとを含んでもよい。また、幾つかの実施形態では、上記方法は凍結保存混合物を凍結する工程を含む。１つの態様では、凍結保存混合物１ｍＬ当たり約１×１０６〜約１．５×１０７の細胞濃度で規定の凍結サイクルを使用して速度制御型冷凍庫において上記凍結保存混合物を凍結する。また、上記方法は、気相の液体窒素中で上記凍結保存混合物を保存する工程を含んでもよい。
【００３６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生される操作されたＴ細胞の集団を所定の用量で凍結保存してもよい。ある特定の実施形態では、所定の用量は治療的有効用量であってもよく、以下に提示される任意の治療的有効用量であってもよい。操作されたＴ細胞の所定の用量は、Ｔ細胞によって発現される細胞表面受容体（例えば、細胞に発現される細胞表面受容体の親和性及び密度）、標的細胞の種類、治療される疾患若しくは病態の特徴、又は両方の組合せに依存し得る。ある特定の実施形態では、操作されたＴ細胞によって発現される細胞表面受容体は、Kochenderfer et al., J Immunother. 2009 September; 32(7): 689-702に記載されるＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭ
Ｃ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ等の抗ＣＤ１９  ＣＡＲであってもよく、その主題は、ＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現するＴ細胞を産生するため使用されるベクターを構築する方法を提供する目的で引用することに
より本明細書の一部をなす。ある特定の実施形態では、ＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞の所定の用量は、約１００万より多く、かつ約３００万未満の形質導入された操作されたＴ細胞／ｋｇであってもよい。ある特定の実施形態では、ＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞の所定の用量は、体重１キログラム当たり約１００万より多く、かつ約２００万までの形質導入された操作されたＴ細胞（細胞／ｋｇ）であってもよい。ある特定の実施形態では、ＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞の所定の用量は、体重１キログラム当たり１００万より多く、かつ約２００万までの形質導入された操作されたＴ細胞（細胞／ｋｇ）であってもよい。ある特定の実施形態では、ＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞の所定の用量は、少なくとも約２００万〜約３００万未満の形質導入された操作されたＴ細胞／ｋｇであってもよい。ある特定の実施形態では、ＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞の好ましい所定の用量は、約２００万の形質導入された操作されたＴ細胞／ｋｇであってもよい。ある特定の実施形態では、ＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞の所定の用量は、少なくとも約２００万の形質導入された操作されたＴ細胞／ｋｇであってもよい。ある特定の実施形態では、ＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞の所定の用量は、約２００万、約２１０万、約２２０万、約２３０万、約２４０万、約２５０万、約２６０万、約２７０万、約２８０万、又は約２９０万の形質導入された操作されたＴ細胞／ｋｇであってもよい。ある特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の集団は、体重１キログラム当たり約１００万の操作されたＴ細胞（細胞／ｋｇ）の所定の用量で凍結保存されてもよい。ある特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の集団は、約５０万〜約１００万の操作されたＴ細胞／ｋｇの所定の用量で凍結保存されてもよい。ある特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の集団は、少なくとも約１００万、少なくとも約２００万、少なくとも約３００万、少なくとも約４００万、少なくとも約５００万、少なくとも約６００万、少なくとも約７００万、少なくとも約８００万、少なくとも約９００万、少なくとも約１０００万の操作されたＴ細胞／ｋｇの所定の用量で凍結保存されてもよい。他の態様では、操作されたＴ細胞の集団は、１００万細胞／ｋｇ未満、１００万細胞／ｋｇ、２００万細胞／ｋｇ、３００万細胞／ｋｇ、４００万細胞／ｋｇ、５００万細胞／ｋｇ、６００万細胞／ｋｇ、７００万細胞／ｋｇ、８００万細胞／ｋｇ、９００万細胞／ｋｇ、１０００万細胞／ｋｇ、１０００万細胞／ｋｇより多く、２０００万細胞／ｋｇより多く、３０００万細胞／ｋｇより多く、４０００万細胞／ｋｇより多く、５０００万細胞／ｋｇより多く、６０００万細胞／��ｇより多く、７０００万細胞／ｋｇより多く、８０００万細胞／ｋｇより多く、９０００万細胞／ｋｇより多く、又は１億細胞／ｋｇより多い所定の用量で凍結保存されてもよい。ある特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の集団は、約１００万〜約２００万の操作されたＴ細胞／ｋｇの所定の用量で凍結保存されてもよい。他の実施形態では、操作されたＴ細胞の集団は、約１００万細胞／ｋｇ〜約２００万細胞／ｋｇ、約１００万細胞／ｋｇ〜約３００万細胞／ｋｇ、約１００万細胞／ｋｇ〜約４００万細胞／ｋｇ、約１００万細胞／ｋｇ〜約５００万細胞／ｋｇ、約１００万細胞／ｋｇ〜約６００万細胞／ｋｇ、約１００万細胞／ｋｇ〜約７００万細胞／ｋｇ、約１００万細胞／ｋｇ〜約８００万細胞／ｋｇ、約１００万細胞／ｋｇ〜約９００万細胞／ｋｇ、約１００万細胞／ｋｇ〜約１０００万細胞／ｋｇの所定の用量で凍結保存されてもよい。ある特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の集団の所定の用量は、被験体の体重に基づいて計算されてもよい。ある特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の集団は、約０．５ｍＬ〜２００ｍＬの凍結保存培地中に凍結保存されてもよい。ある特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の集団は、約０．５ｍＬ、約１．０ｍＬ、約５．０ｍＬ、約１０．０ｍＬ、約２０ｍＬ、約３０ｍＬ、約４０ｍＬ、約５０ｍＬ、約６０ｍＬ、約７０ｍＬ、約８０ｍＬ、約９０ｍＬ、又は約１００ｍＬの凍結保存培地中に凍結保存されてもよい。ある特定の実施
形態では、操作されたＴ細胞の集団は、約１０ｍＬ〜３０ｍＬ、約１０ｍＬ〜５０ｍＬ、約１０ｍＬ〜７０ｍＬ、約１０ｍＬ〜９０ｍＬ、約５０ｍＬ〜７０ｍＬ、約５０ｍＬ〜９０ｍＬ、約５０ｍＬ〜１１０ｍＬ、約５０ｍＬ〜１５０ｍＬ、又は約１００ｍＬ〜２００ｍＬの凍結保存培地中に凍結保存されてもよい。ある特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の集団は、好ましくは約５０ｍＬ〜７０ｍＬの凍結保存培地中に凍結保存されてもよい。
【００３７】
疾患又は病態を有する被験体において、該被験体に治療的有効量又は治療的有効用量の操作されたＴ細胞を投与することによって疾患又は病態を治療するために使用され得る操作されたＴ細胞の集団を産生するため、本明細書に記載される方法を使用する。そのようにして、標的細胞表面の特異的抗原部分を認識する細胞表面受容体を発現する操作されたＴ細胞の集団は、本明細書で提供される方法によって産生される。本明細書に記載される方法によって産生される操作されたＴ細胞で治療され得る病態として、限定されないが、がん、ウイルス感染症、急性若しくは慢性の炎症、自己免疫疾患、又は任意の他の免疫機能不全が挙げられる。操作されたＴ細胞の投薬により患者を治療する方法の例は、Kochenderfer, et al., J Clin Oncol. 2014 Aug 25. pii: JCO.2014.56.2025 (「Chemotherapy-Refractory Diffuse Large B-Cell Lymphoma and Indolent B-Cell Malignancies Can Be Effectively Treated With Autologous T Cells Expressing an Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor」と題される)、及びKochenderfer et al. Blood. 2012 Mar 22;119(12):2709-20 （「B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells」と題される）に見られ、それらの主題は、操作されたＴ細胞の投薬で患者を治療する標準的な作業に関する詳細を提供する目的で、本明細書に完全に記載されるかのように、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【００３８】
幾つかの実施形態によれば、上に記載される方法によって産生される操作されたＴ細胞の集団は、１又は複数の細胞の亜集団を含んでもよい。ある特定の実施形態では、１又は複数の細胞の亜集団として、限定されないが、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、及び／又はセントラルメモリーＴ細胞が挙げられ得る。以下の実施例２に提示されるように、本明細書に記載される方法を使用することが、１０日以上から６日に培養期間を単に減少することに加えて、ナイーブＴ細胞の存在（representation）を増大し、分化したエフェクターＴ細胞の存在を減少しながら、より幼若なＴ細胞の分布をもたらすことは予想外であった。ある特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の集団は、ナイーブＴ細胞の亜集団を含んでもよい。ある特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の集団の約３４％〜４３％はナイーブＴ細胞の亜集団を含んでもよい。ある特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の集団の少なくとも約３５％はナイーブＴ細胞の亜集団を含んでもよい。ある特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の集団の少なくとも約４０％はナイーブＴ細胞の亜集団を含んでもよい。ある特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の集団の少なくとも約３４％、少なくとも約３５％、少なくとも約３６％、少なくとも約３７％、少なくとも約３８％、少なくとも約３９％、少なくとも約４０％、少なくとも約４１％、少なくとも約４２％、少なくとも約４３％、又は少なくとも約４４％はナイーブＴ細胞の亜集団を含んでもよい。ある特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞の亜集団を含んでもよい。ある特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の集団の約１５％以下はセントラルメモリーＴ細胞の亜集団を含んでもよい。ある特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の集団の約１５％以下、約１４％以下、約１３％以下、約１２％以下、約１１％以下はセントラルメモリーＴ細胞の亜集団を含んでもよい。
【００３９】
本明細書において言及される場合、「がん」は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、腺様嚢胞がん、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、肛門が
ん、虫垂がん、星細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系、Ｂ細胞白血病、リンパ腫若しくは他のＢ細胞悪性腫瘍、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、中枢神経系がん、子宮頚部がん、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増多症、結腸がん、結直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、胚芽腫、中枢神経系、子宮内膜がん、上衣芽腫、上衣腫、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、目がん、骨の線維性組織球腫、悪性及び骨肉腫、胆嚢がん、胃（腹部の）がん、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、軟部組織肉腫、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、グリオーマ、有毛細胞性白血病、頭頚部がん、心臓がん、肝細胞（肝）がん、組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内メラノーマ、膵島細胞腫瘍（膵臓内分泌腺）、カポジ肉腫、腎がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、白血病、口唇及び口腔がん、肝がん（原発性）、非浸潤性小葉がん（ＬＣＩＳ）、肺がん、リンパ腫、マクログロブリン血症、男性乳がん、骨の悪性線維性組織球腫及び骨肉腫、髄芽腫、髄上皮腫、メラノーマ、メルケル細胞がん、中皮腫、ＮＵＴ遺伝子が関与する原発性不明縦隔腫瘍を伴う転移性扁平上皮性頸部がん、口腔がん（mouth cancer）、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄腫、多発性骨髄増多症、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん（oral cancer）、口腔がん（oral cavity cancer）、口腔咽頭がん、骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、
膵がん、乳頭腫症、パラガングリオーマ、副鼻腔及び鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、中分化型松果体腫瘍、松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠期乳がん、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞（腎）がん、腎盂尿管移行上皮がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、セザリー症候群、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、頸部扁平上皮がん、腹部の（胃）がん、テント上原始神経外胚葉腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚、精巣がん、咽喉がん、胸腺腫及び胸腺がん、甲状腺がん、腎盂尿管の移行上皮がん、絨毛性腫瘍、尿管及び腎盂がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ヴァルデンストレムマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍を含むが、それらに限定されない表面抗原又はがんマーカーと関連する任意のがんであってもよい。
【００４０】
幾つかの態様において、がんはＢ細胞悪性腫瘍である。Ｂ細胞悪性腫瘍の例として、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ／ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、節外性（ＭＡＬＴリンパ腫）、節性（単球様Ｂ細胞リンパ腫）、脾臓びまん性大細胞リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病／リンパ腫、バーキットリンパ腫、及びリンパ芽球性リンパ腫を含むが、それらに限定されない。
【００４１】
本明細書で言及される「ウイルス感染」は、宿主の疾患又は病態を引き起こす任意のウイルスによってもたらされる感染症であってもよい。本明細書に記載される方法によって産生される操作されたＴ細胞で治療され得るウイルス感染症の例として、限定されないが、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）によって引き起こされるウイルス感染症、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、若しくはＣ型肝炎ウイルスによって引き起こされるウイルス感染症、単純ヘルペス１型ウイルス、単純ヘルペス２型ウイルス、若しくは単純ヘルペス８型ウイルスによって引き起こされるウイルス感染症、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）によって引き起こされるウイルス感染症、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされるウイルス感染症、インフルエンザウイルスによって引き起こされるウイルス感染症、麻疹若しくは流行性耳下腺炎のウイルスによって引き起こされるウイルス感染
症、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によって引き起こされるウイルス感染症、パラインフルエンザウイルスによって引き起こされるウイルス感染症、風疹ウイルスによって引き起こされるウイルス感染症、呼吸器抱合体ウイルス（ＲＳＶ）によって引き起こされるウイルス感染症、又は水痘帯状疱疹ウイルスによって引き起こされるウイルス感染症が挙げられる。幾つかの態様では、ウイルス感染症は、ウイルス感染症を有する被験体におけるがんの発症を導く又は結果として生じる可能性がある（例えば、ＨＰＶ感染症は子宮頸、外陰部、膣、陰茎、肛門、口腔咽頭のがんを含む幾つかのがんの発症を引き起こすか、又はそれらと関連する可能性があり、ＨＩＶ感染症はカポジ肉腫の発症を引き起こす可能性がある）。
【００４２】
本明細書に記載される方法によって産生される操作されたＴ細胞で治療され得る慢性炎症性疾患、自己免疫疾患又は任意の他の免疫機能不全の例として、限定されないが、多発性硬化症、狼瘡及び乾癬が挙げられる。
【００４３】
本明細書で状態又は疾患に関して使用される「治療する」、「治療すること」、又は「治療」の用語は、状態若しくは疾患の予防、状態若しくは疾患の発症の開始若しくは速度の減速、状態若しくは疾患の発症リスクの減少、状態若しくは疾患と関連する症状の発症の予防若しくは遅延、状態若しくは疾患と関連する症状の減少若しくは終了、状態若しくは疾患の完全な若しくは部分的な退行の発生、又はそれらの何らかの組合せを指す場合がある。
【００４４】
「治療的有効量」又は「治療的有効用量」は、標的細胞を死滅させることによる標的の状態を予防する若しくは治療する、又は該状態と関連する症状を緩和する等の被験体において所望の治療的効果を生み出す操作されたＴ細胞の量である。所与の被験体における治療の有効性に関して最も有効な結果は、限定されないが、操作されたＴ細胞の特性（寿命、活性、薬物動態、薬効及びバイオアベイラビリティを含む）、被験体の生理学的状態（年齢、性別、疾患の種類及びステージ、全身状態、与えられる投薬量に対する反応性、及び医薬の種類を含む）、使用される任意の組成物中の任意の薬学的に許容可能な担体（単数又は複数）の特徴、及び投与経路を含む様々な要因に応じて変化する。また、操作されたＴ細胞の治療的有効用量は、Ｔ細胞によって発現される細胞表面受容体（例えば、細胞上に発現される細胞表面受容体の親和性及び密度）、標的細胞の種類、治療される疾患若しくは病態の特徴、又はそれらの組合せに依存する。したがって、幾つかの態様では、形質導入された操作されたＴ細胞の治療的有効用量は、体重１キログラム当たり約１００万〜約２００万の形質導入された操作されたＴ細胞（細胞／ｋｇ）である。したがって、幾つかの態様では、形質導入された操作されたＴ細胞の治療的有効用量は、約１００万〜約３００万の形質導入された操作されたＴ細胞／ｋｇである。ある特定の実施形態では、上記治療的有効用量は、約２００万の形質導入された操作されたＴ細胞／ｋｇである。ある特定の実施形態では、上記治療的有効用量は、少なくとも約２００万の形質導入された操作されたＴ細胞／ｋｇである。ある特定の実施形態では、上記治療的有効用量は、少なくとも約１００万、少なくとも約２００万、少なくとも約３００万、少なくとも約４００万、少なくとも約５００万、少なくとも約６００万、少なくとも約７００万、少なくとも約８００万、少なくとも約９００万、少なくとも約１０００万の操作されたＴ細胞／ｋｇである。他の態様において、治療的有効用量は、１００万細胞／ｋｇ未満、１００万細胞／ｋｇ、２００万細胞／ｋｇ、３００万細胞／ｋｇ、４００万細胞／ｋｇ、５００万細胞／ｋｇ、６００万細胞／ｋｇ、７００万細胞／ｋｇ、８００万細胞／ｋｇ、９００万細胞／ｋｇ、１０００万細胞／ｋｇ、１０００万細胞／ｋｇより多く、２０００万細胞／ｋｇより多く、３０００万細胞／ｋｇより多く、４０００万細胞／ｋｇより多く、５０００万細胞／ｋｇより多く、６０００万細胞／ｋｇより多く、７０００万細胞／ｋｇより多く、８０００万細胞／ｋｇより多く、９０００万細胞／ｋｇより多く、又は１億細胞／ｋｇより多くてもよい。他の実施形態において、治療的有効用量は、約１００万細胞／ｋｇ〜約２
００万細胞／ｋｇ、約１００万細胞／ｋｇ〜約３００万細胞／ｋｇ、約１００万細胞／ｋｇ〜約４００万細胞／ｋｇ、約１００万細胞／ｋｇ〜約５００万細胞／ｋｇ、約１００万細胞／ｋｇ〜約６００万細胞／ｋｇ、約１００万細胞／ｋｇ〜約７００万細胞／ｋｇ、約１００万細胞／ｋｇ〜約８００万細胞／ｋｇ、約１００万細胞／ｋｇ〜約９００万細胞／ｋｇ、約１００万細胞／ｋｇ〜約１０００万細胞／ｋｇであってもよい。ある特定の実施形態では、治療的有効用量の合計（患者一人当たりの形質導入された細胞）は、約１×１０６の形質導入された細胞、約１×１０６〜約１×１０７の形質導入された細胞、１×１０７〜約１×１０８の形質導入された細胞、１×１０８〜約１×１０９の形質導入された細胞、約１×１０９〜約１×１０１０の形質導入された細胞、約１×１０１０〜約１×１０１１の形質導入された細胞、約１×１０１１の形質導入された細胞、又は約１×１０１１を超えるの形質導入された細胞に達する数であってもよい。１つの態様では、上記治療的有効用量は、約１×１０８〜約２×１０８の形質導入された細胞であってもよい。臨床及び薬理学の分野の当業者は、通例の実験を通して、すなわち、化合物の投与に対する被験体の応答をモニターし、それに従って投薬量を調整することにより、治療的有効量を決定することができる。ある特定の実施形態では、操作されたＴ細胞によって発現される細胞表面受容体は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲである。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ１９  ＣＡＲはKochenderfer et al., J Immunother. 2009 September ; 32(7): 689-702に記載されるようにＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲであってもよく、その主題は、ＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現するＴ細胞を産生するため使用されるベクターを構築する方法を提供する目的で引用することにより本明細書の一部をなす。ある特定の実施形態では、ＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞の治療的有効用量は、体重１キログラム当たり約１００万より多く、かつ約３００万未満の形質導入された操作されたＴ細胞（細胞／ｋｇ）であってもよい。ある特定の実施形態では、ＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞の治療的有効用量は、体重１キログラム当たり約１００万より多く、かつ約２００万未満の形質導入された操作されたＴ細胞（細胞／ｋｇ）であってもよい。ある特定の実施形態では、ＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞の治療的有効用量は、約２００万〜約３００万未満の形質導入された操作されたＴ細胞／ｋｇである。ある特定の実施形態では、ＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞の治療的有効用量は、約２００万、約２１０万、約２２０万、約２３０万、約２４０万、約２５０万、約２６０万、約２７０万、約２８０万、又は約２９０万の形質導入された操作されたＴ細胞／ｋｇである。ある特定の実施形態では、ＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現���る操作されたＴ細胞の好ましい治療的有効用量は、約２００万の形質導入された操作されたＴ細胞／ｋｇである。ある特定の実施形態では、ＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞の治療的有効用量は少なくとも約２００万の形質導入された操作されたＴ細胞／ｋｇである。
【００４５】
幾つかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される方法で産生される操作されたＴ細胞の集団を含んでもよい。また、ある特定の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。薬学的に許容可能な担体は、１つの組織、器官又は身体の一部から別の組織、器官又は身体の一部への目的の細胞の運搬又は輸送に関与する、薬学的に許容可能な材料、組成物、又はビヒクルであってもよい。例えば、上記担体は、液体又は固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、若しくはカプセル化材料、又はそれらの幾つかの組合せであってもよい。担体の各成分は、製剤の他の原料と適合性でなくてはならないという点で「薬学的に許容可能」でなくてはならない。また、担体の各成分は、上記担体が接触し得る任意の組織、器官、又は身体の一部との接触に適していなければならず、すなわち、毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、又はその治療上の利益を過剰
に上回る任意の他の合併症のリスクを伴ってはならないことを意味する。
【００４６】
本明細書で使用される「約」の用語は、提示される値の範囲又は値の範囲の５％又は１０％以内を意味する。
【００４７】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を説明することを意図する。したがって、考察される具体的な実施形態は、本発明の範囲に対する制限と解釈されない。例えば、以下の実施例は抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で形質導入されたＴ細胞に関し、当業者は、本明細書に記載される方法が任意のＣＡＲで形質導入されたＴ細胞に適用され得ることを理解するであろう。本発明の範囲から逸脱することなく、様々な等価物、変更及び修飾を行い得ることが当業者に明らかであり、かかる等価物の実施形態が本明細書に包含されることが理解される。さらに、本開示において引用される全ての参考文献は、本明細書に完全に記述されるかのようにそれらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【実施例】
【００４８】
実施例１：ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子改変自己細胞の作製
１つの実施形態による、例示的なＴ細胞製造プロセス（「改良された」プロセス）の概観を図１に提示する。この改良されたプロセスは、Ｔ細胞産物の特性を維持しながら、従来使用されるＴ細胞を製造するプロセス（「従来の」プロセス）に対する改良を含む（これらの改良を説明する図２を参照されたい）。具体的には、予想外なことに、改良されたプロセスは血清の使用を排除することができる閉鎖プロセスである。さらに、この改良されたプロセスは、単一サイクルの形質導入を使用して形質導入されたＴ細胞の集団を産生する。さらに、このプロセスを使用して合計６日間の拡大を経た細胞は、１０日間の拡大を経た細胞と比較して、より幼若な免疫表現型プロファイルを呈する。このプロセスは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を、例えばＣＤ１９に対して発現する標的数の形質転換されたＴ細胞を含む製品を再現性よく製造することができるが、これらの方法を任意のＣＡＲによって形質導入されたＴ細胞に応用する。
【００４９】
具体的には、上記プロセスは、標準的なアフェレーシスの機器及び手順を使用して回収されたアフェレーシス産物に適合するように設計され、リンパ球に対して被験体のアフェレーシスを富化し、組換えＩＬ−２及び抗ＣＤ３抗体の存在下での規定の培養期間の間に被験体のＴ細胞を活性化し、Ｔ細胞が選択的に生存して増殖するｅｘ  ｖｉｖｏ培養環境を提供し、一貫した範囲の形質移入効率の範囲内でＣＤ１９キメラ抗原受容体を発現するように操作されたレトロウイルスベクターを使用して被験体のＴ細胞に形質移入を行い、産物に関連する不純物を一貫したレベルまで減少し（産物関連不純物として、被験体に由来する開始材料中の非Ｔ細胞が挙げられる）、プロセス関連不純物を一貫したレベルまで減少する（プロセス関連不純物として増殖培地、サイトカイン、及び他のプロセス試薬が挙げられる）。
【００５０】
アフェレーシス回収。Ｃｏｂｅ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒａ、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｏｐｔｉａ（登録商標）、Ｆｅｎｗａｌ（商標）Ａｍｉｃｕｓ（登録商標）等の標準的なアフェレーシス機器又は等価物を使用して白血球を回収した（白血球アフェレーシス）。白血球アフェレーシスプロセスは、通常およそ２００ｍＬ〜４００ｍＬの患者に由来するアフェレーシス産物を生じる。該アフェレーシス産物を、その場での製造プロセスに供してもよく、又は任意に異なる場所での製造プロセスを経るための施設へと１℃〜１０℃で輸送してもよい。図１に概説されるように、更なるプロセス工程をＩＳＯ７細胞培養プロセス区域（又は類似のクリーンルームタイプの環境）において行ってもよい。
【００５１】
減容。適切な場合、改良されたプロセスの減容工程を、Ｓｅｐａｘ（登録商標）２の実
験機器（テキサス州ヒューストンのBiosafe SA）等の細胞処理器具又は等価物を使用して行い、標準的な無菌チュービングキットを使用して実施した。各被験体に由来する細胞の数及び入ってくる供給材料の容量（およそ２００ｍＬ〜４００ｍＬ）におけるばらつきを考慮すると、減容工程はおよそ１２０ｍＬまで細胞の容量を標準化するように設計される。アフェレーシスの容量が１２０ｍＬ未満である場合、減容工程を行う必要はなく、細胞はリンパ球富化工程へと直接運ばれる。減容工程は、各被験体から受ける細胞の容量を標準化し、単核細胞を保持し、一貫した細胞収率及び高い細胞生存率を達成し、閉鎖系を維持して汚染リスクを最小化するように設計される。
【００５２】
リンパ球富化。減容工程に続き、器具の製造業者によって開発され推奨される分離プロトコル（ＮｅａｔＣｅｌｌ  Ｐｒｏｇｒａｍ）を使用し、標準的な無菌チュービングキットを使用して、Ｓｅｐａｘ（登録商標）２等の細胞処理器具又は等価物において、細胞をフィコールを基本とする分離に供した。リンパ球富化工程は、ＲＢＣ及び顆粒球等の産物関連不純物を減少し、単核細胞を富化及び濃縮し、フィコール等のプロセス関連残留物を洗浄及び減少し、細胞活性化用の調製物に増殖培地中の細胞を配合し、また同様に一貫した細胞収率及び高い細胞生存率を達成する。閉鎖系は、環境汚染を最小化する。
【００５３】
上記プロセスは、周囲温度においてＩＳＯ７エリアで行われてもよく、全ての接続は、無菌チュービング溶接機を使用して行われるか、又はＩＳＯ５ラミナーフローフードにおいて行われてもよい。
【００５４】
Ｔ細胞活性化。Ｔ細胞活性化工程は、リンパ球富化により新たに調製された細胞、又は先に凍結保存された細胞のいずれかを用いて行われ得る。凍結保存細胞を使用する場合、開発されたプロトコルを用いて使用前に細胞を解凍してもよい。
【００５５】
Ｔ細胞活性化工程は、Ｔ細胞を選択的に活性化してレトロウイルスベクター形質導入に対して受容性とし、全ての他の細胞型の生存可能な集団を減少し、一貫した細胞収率及び高いＴ細胞生存率を達成し、閉鎖系を維持して汚染リスクを最小化する。
【００５６】
洗浄１。Ｔ細胞活性化工程の後、製造業者により開発されたプロトコルを使用し、標準的な無菌キット中の新鮮な培養培地によりＳｅｐａｘ（登録商標）２等の細胞処理器具又は等価物を使用して細胞を洗浄した。任意には、レトロウイルスベクターによる形質導入のため調製物中におよそ１００ｍＬの最終容量まで細胞を濃縮した。洗浄１の工程は、抗ＣＤ３抗体、使用済みの増殖培地及び細胞残屑等のプロセス関連残留物を減少し、一貫した細胞収率及び高いＴ細胞生存率を達成し、閉鎖系を維持して汚染リスクを最小化し、形質導入を開始するのに適した低容量で十分な数の生存可能なＴ細胞を濃縮及び送達する。
【００５７】
レトロウイルス形質導入。最初にバッグをＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（日本のタカラバイオ株式会社）等の組換えフィブロネクチン又はそのフラグメントで被覆し、その後活性化細胞の形質導入に先立って規定の手順に従ってレトロウイルスベクターとインキュベートすることによって予め調製された、細胞培養バッグ（Ｏｒｉｇｅｎ  ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌのＰＬ２４０又は同等物）に新しい細胞増殖培地中の洗浄１の工程による活性化細胞を移した。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）による被覆（１０μｇ／ｍＬ）を２℃〜８℃の温度で２０時間±４時間行い、希釈緩衝液で洗浄し、その後、３７℃±１℃、５％±０．５％のＣＯ２でおよそ１８０分間〜２１０分間、解凍したレトロウイルスベクターとインキュベートした。上記バッグに細胞を添加した後、３７℃±１℃、５％±０．５％のＣＯ２で２０時間±４時間形質導入を行った。レトロウイルス形質導入工程は、効率的な形質導入が行われ得るように制御された条件下でレトロウイルスベクターの存在下、活性化Ｔ細胞を培養し、一貫した細胞収率及び高い細胞生存率を達し、閉鎖系を維持して、汚染リスクを最小化する。
【００５８】
洗浄２。レトロウイルス形質導入工程に続いて、製造業者によって開発されたプロトコルを使用し、標準的な無菌キットにおいて、Ｓｅｐａｘ（登録商標）２等の細胞処理器具又は等価物を使用して新しい増殖培地で細胞を洗浄し、該細胞を拡大工程用の調製物中およそ１００ｍＬの最終容量まで濃縮した。洗浄２の工程は、レトロウイルスベクター粒子、ベクター製造のプロセス残留物、使用済み増殖培地、及び細胞残屑等のプロセス関連残留物を減少し、一貫した細胞収率及び高い細胞生存率を達成し、閉鎖系を維持して汚染リスクを最小化し、使用済み増殖培地を拡大工程の開始に適した規定の容量中に標的数の細胞を含む新しい培地に交換するように設計される。
【００５９】
Ｔ細胞拡大。洗浄２の工程からの細胞を培養バッグ（Ｏｒｉｇｅｎ  ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌのＰＬ３２５又は等価物）に無菌的に移し、新しい細胞増殖培地で希釈して、３７℃±１℃、５％±０．５％のＣＯ２でおよそ７２時間培養した。細胞密度を５日目から毎日測定した。Ｔ細胞の倍化時間は被験体ごとにわずかに変化し得ることから、総細胞数が標的用量のＣＡＲ陽性Ｔ細胞／被験体の体重ｋｇを送達するのに不十分である場合には、７２時間を超える（すなわち、３日〜６日）の追加の増殖時間が必要な場合がある。Ｔ細胞拡大工程は、有効な用量の供給のために十分な数の形質導入された細胞を産生するため制御された条件下で細胞を培養し、閉鎖系を維持して汚染リスクを最小化し、一貫した細胞収率及び高い細胞生存率を達成するように設計される。１つのかかる有効な用量又は標的用量として、それぞれＭＳＧＶ−ＦＭＣ６３−２８Ｚレトロウイルスベクター又はＭＳＧＶ−ＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺレトロウイルスベクターのいずれかによる形質導入を介して産生された２×１０６のＦＭＣ６３−２８Ｚ  ＣＡＲ陽性又はＦＭＣ６３−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ陽性のＴ細胞／被験体の体重ｋｇ（±２０％）が挙げられ、いずれもKochenderfer et al., J Immunother. 2009 September; 32(7): 689-702に詳述され、そ
の主題は、完全に本明細書に記述されるかのように、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【００６０】
洗浄３及び濃縮。Ｔ細胞拡大工程に続き、製造業者によって開発されたプロトコルを使用して標準的な無菌キットにおいてＳｅｐａｘ（商標）２等の細胞処理器具又は等価物を使用し、０．９％の生理食塩水で細胞を洗浄し、該細胞を配合及び凍結保存のため調製物中およそ３５ｍＬの最終容量まで濃縮した。洗浄３の工程は、レトロウイルス産生プロセス残留物、使用済み増殖培地、及び細胞残屑等のプロセス関連残留物を減少し、一貫した細胞収率及び高い細胞生存率を達成し、閉鎖系を維持して汚染リスクを最小化するように設計される。
【００６１】
一旦細胞を濃縮し、０．９％生理食塩水で洗浄すれば、適切な細胞用量を最終凍結保存製品の作製用に配合してもよい。細胞を凍結保存用に調製し、下記実施例４に提示される方法に従って凍結保存した。
【００６２】
実施例２：細胞培養バッグで拡大されたＴ細胞の増殖成績
本明細書に記載される実施形態は、６日間操作された自己Ｔ細胞療法の効率的な産生を提供する。従来技術に対する以下の改良、すなわち、従来使用されていた２４日間、１４日間又は１０日間のいずれかに代えて６日間の短縮されたプロセス（これは製品リリースに必要な検査の数を減らす（ＲＣＲ検査を含む））、効力及び有効性を増すためより高い割合の幼若Ｔ細胞を含む、改良されたＴ細胞製品、より短い製造時間を相殺するためのより多数の細胞で開始され得る培養、本明細書に記載される方法の工程を行うための閉鎖系、Ｔ細胞の増殖を支持するヒト血清不含培養条件の特定、バッグ内での単一サイクルのレトロウイルス形質導入、フラスコではなくバッグ内で行われる細胞培養物の活性化及び拡大、並びに凍結製品の提供が達成された。複数のがんの適応症の治療のための新規な操作された末梢血自己Ｔ細胞療法（ｅＡＣＴ）の開発及び商品化にこれらの改良を使用した。
開発プログラムから得られた細胞は、従来の方法によって増殖された細胞と同じ表現型及び活性プロファイルを維持した。
【００６３】
操作されたＴ細胞の作製。図２は、改良されたプロセスにおける本明細書に記載される改良を含むＴ細胞製造プロセスの概観を示す。簡潔には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する被験体からアフェリシス、スプリット（split）により得て
、従来技法及び本明細書に記載される改良された技法を使用し並行して操作した。５つの研究は、最終洗浄及び凍結保存操作を除いて、６日目の増殖を通して全てのプロセス工程を評価した。２つの追加研究では、ここでもリンパ腫患者に由来するアフェレーシス産物を使用して、アフェレーシス材料の最初のプロセスから最終的な配合及び凍結工程で改良されたプロセスを行った。
【００６４】
閉鎖Ｓｅｐａｘ  ２プロセスによってＰＢＭＣのフィコール分離によりリンパ球に対してアフェレーシス産物（すなわち「試料」）を富化した。その後、開発中のプロトタイプサプリメント（Life TechnologiesのＴ細胞ＳＲ培地サプリメント）によって補足された
血清不含培地（Life TechnologiesのＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標））中、閉鎖培養バッグに
おいてリンパ球を増殖させ、抗ＣＤ３抗体及びｒＩＬ−２（組換えＩＬ−２）を用いてＴ細胞活性化のため４８時間に亘って（０日目〜２日目）刺激した。その後、活性化Ｔ細胞を閉鎖Ｓｅｐａｘ  ２プロセスを使用して洗浄した。
【００６５】
製造プロセスの２日目〜３日目、ガンマレトロウイルスベクターを使用して、活性化Ｔ細胞に抗ＣＤ１９  ＣＡＲを形質導入した。以下の通り、閉鎖系において形質導入を完了した。閉鎖細胞培養バッグ（すなわち、Ｏｒｉｇｅｎ  ＰｅｒｍａＬｉｆｅ（商標）のＰＬ２４０バッグ）を２μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬのＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）で被覆した後、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）を除去し、該バッグを緩衝食塩水で洗浄した。その後、ガンマレトロウイルスを閉鎖系バッグに導入し、続いてインキュベーション期間に供した。その後、レトロウイルスベクターを含むバッグに活性化Ｔ細胞を直接添加し、３７℃で一晩インキュベートした。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）被覆培養バッグに由来する材料を取り出し、細胞拡大のため別々の細胞培養バッグに入れた。任意の洗浄工程を細胞拡大の前に追加してもよい。抗生物質を含まない閉鎖バッグ系において形質導入されたＴ細胞を３日間（３日目から６日目まで）拡大した。その後、得られた操作されたＴ細胞を回収し、凍結保存した（凍結保存は任意の工程である。）
【００６６】
操作されたＴ細胞表現型。（ｉ）ＣＡＲ遺伝子発現の確認、（ｉｉ）Ｔ細胞集団純度の確認、及び（ｉｉｉ）Ｔ細胞サブセットマーカーＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、並びに機能的競合マーカーＣＤ２７及びＣＤ２８の細胞表面発現を使用して操作されたＴ細胞の集団に存在する細胞表現型の特定、のため、操作されたＴ細胞を蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって解析した。
【００６７】
操作されたＴ細胞の活性。また、抗原（Ａｇ）陽性（すなわち、ＣＤ１９＋）標的細胞との共培養後の操作されたＴ細胞によるインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の産生を測定するため、操作されたＴ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養バイオアッセイを使用して解析した。また、ＦＡＣＳによって、操作されたＴ細胞によるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の細胞内産生、及びＡｇ陽性標的細胞との共培養後のＣＤ１０７ａの発現について操作されたＴ細胞を解析した。
【００６８】
増殖研究。細胞の増殖が安定であり、従来の研究のものと一致し同様（又はより良好）であったことを確認するため、Ｔ細胞の増殖及び生存率を各実験において評価した。
【００６９】
凍結保存。６日目に細胞を生理食塩水で洗浄した後、５％までＨＳＡを添加し、該細胞
をＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）１０（BioLife Solutions（商標））と１：１で混合した。
その後、規定の凍結サイクルを使用して速度制御型冷凍庫で細胞を凍結した後、気相の液体窒素中に保存した。このプロセスによって１ｍＬ当たり約１×１０６〜１．５×１０７の細胞の凍結保存及び解凍に成功し得たことを示した。ＨＳＡを含む生理食塩水は良好又は試験した他の溶液（例えば、ＰＬ／Ｄ５）より良好であり、ＨＳＡにより凍結−解凍の回復が改善された。
【００７０】
トリパンブルー排除、また同様にＦＡＣＳ（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖまた同様に７ＡＡＤに対するＦＡＣＳに基づく染色）によって解凍時の生存率について細胞を評価した。細胞は、解凍後、ＩＦＮ−ガンマによって測定される表現型及び生物学的機能を保持した。
【００７１】
結果
培地増殖サプリメントと合わせた血清不含培地中で増殖研究を行った。これらの研究では、成績は変化しやすく、５％ヒト血清を含有する培地（ＡＩＭＶ）と同様の表現型をもたらした培地として成功を定義した。上に記載される方法に使用した血清不含培地は、優れたＴ細胞増殖、及びＡＩＭＶにおける増殖に類似する表現型をもたらした。１つの予想外の観察は、優れた増殖及び生存率を達成するため、細胞密度がおよそ１．５×１０６／ｍＬに達した場合に細胞を継代しなければならないことであった。この細胞濃度で細胞を継代しない場合、生存率が低下する場合があった。しかしながら、およそ０．４×１０６／ｍＬ〜１．５×１０６／ｍＬの範囲では、フラスコ又は閉鎖バッグ系のいずれかで、細胞は３７℃の培養において２４時間以下の倍加時間で良好に増殖した。
【００７２】
新たな受容体遺伝子がガンマレトロウイルスベクターを使用してＴ細胞に導入される、操作されたＴ細胞を作製するプロセスは、形質導入が成功し得るように細胞が活発に増殖していることを必要とする。ここではＴ細胞を抗ＣＤ１９  ＣＡＲを形質導入したが、本明細書に記載されるプロセスを任意のＣＡＲ又はＴＣＲに使用してもよい。開放Ｔフラスコ又は閉鎖細胞培養バッグ系のいずれかにおいて、ヒトＴ細胞増殖が抗ＣＤ３抗体及びＩＬ２を使用してＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）培地中で刺激され得ることを実証した。ＦＡＣＳを使用して、ＣＦＳＥで染色された細胞がこの刺激の間、ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）培地又は５％ヒト血清を含むＡＩＭＶにおいて等しく良好に増殖したことを実証した。Ｔ細胞の増殖が他のインキュベーション時間で見られたが、抗ＣＤ３抗体及びＩＬ２との２日間のインキュベーションがＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）培地で活発に増殖する細胞を得るために最適であることが実証された。
【００７３】
閉鎖バッグ系におけるＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）培地中での形質導入を見るため様々な条件を評価した。本発明の１つの新規な態様は、閉鎖バッグ系におけるＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）培地中での形質導入を達成するため開発された特定の順番の工程である。記載されるプロセスは、操作が単純であるが、従来使用される条件と同様の形質導入頻度を提供するという利点を有する。形質導入プロトコルに先に含まれる工程（例えば、ＨＳＡ等のタンパク質による被覆表面のブロッキング）は必要ではないことがわかった。形質導入頻度は、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）被覆細胞培養バッグからの除去後の細胞の洗浄によって影響を受けない。
【００７４】
刺激プロセス開始後６日目又は１０日目のいずれかの細胞の表現型解析は、ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）培地では、該細胞が同様のバッグ又は一般的に使用されるプレート系においてＡＩＭＶ培地中で増殖させた細胞とほとんど同じであることを明らかにした（図４及び図５を参照されたい）。同様に、ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）培地中、単純な閉鎖プロセスバッグ系で産生された細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養アッセイにおいてＡｇ陽性標的細胞に応答してＩＦＮガンマを産生可能であり、この向上したプロセスによって製造されたＴ細胞は生物学的に活性であることを実証する。
【００７５】
下記表１は、本明細書に記載される改良されたプロセスを使用する６日目のＩＦＮガンマ産生（ｐｇ／ｍｌ）を示す。
【００７６】
【表１】
2020078310.tif 000003
【００７７】
別の予想外の観察は、１０日以上から本発明の６日へと培養期間を単純に減少することによって、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞の存在の増大、及び分化したエフェクターＴ細胞の出現の減少と共に、より幼若なＴ細胞の分布をもたらしたことである（図４及び図５を参照されたい）。これは、製品の効力及び他の特性に有利な影響を有する。具体的には、３日間のみの培養の後に拡大した産物から十分な細胞を回収することができる。拡大し、形質導入された細胞の回収のための刺激の開始からの合計時間は６日であり、およそ１×１０８〜２×１０８のＣＡＲ陽性細胞の用量を維持する（図６）。より多数の細胞が必要な場合、バッグ内で確実に細胞を増殖させ続け、１０日以上で細胞培養物を回収することができる。代替的には、開始集団中により多くの細胞を使用して、６日の期間内により大きな細胞集団を作製することができる。
【００７８】
さらに、６日目の細胞を０．９％生理食塩水で更に洗浄し、最終製品の配合物に配合し、凍結保存した、リンパ腫の患者由来のアフェレーシスを用いるフルスケールでの２つの研究を行った。６日目の細胞産物を多くのパラメーターについて解凍前及び解凍後に評価した。凍結前の水準と比較して解凍から３日目のＣＡＲ陽性Ｔ細胞の割合に顕著な差はなく、凍結保存プロトコルがＣＡＲ発現に支障がないことを示唆した。さらに、ＣＡＲ陽性細胞はＣＤ１９陽性標的との共培養後、引き続きＩＦＮ−ガンマ放出によって測定されるようにＣＤ１９特異的抗原を認識することを示した。解凍時の該細胞の生存率は、２つの試験した産物についてそれぞれ９０％及び７９％であった。
【００７９】
実施例３：閉鎖系における形質導入条件の開発
以前に、ＰＢＭＣの形質導入を６ウェルプレートにおいて処理された非組織培養において行った。１０μｇ／ｍＬのＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）を用い、２℃〜８℃で一晩、又は室温で２時間、プレートを被覆した。インキュベーションの後、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）を除去し、プレートを２．５％ＨＳＡで３０分間ブロックした後、ＨＢＳＳ＋５ｍＭ  ＨＥＰＥＳで洗浄した。プレートを基板とするプロセスにおいて、被覆したウェルにレトロウイルスベクターをアプライし、遠心分離機にて回転させた後、およそ７５％のウイルス上清を除去し、その後、スピノキュレーションにより形質導入のための細胞を添加した。
【００８０】
本明細書に提示されるように、閉鎖細胞培養バッグ内でのＰＢＭＣへの形質導入に対するＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）の濃度を最適化するため、及びＨＳＡ洗浄及びウイルス上清の除去が形質導入に影響を及ぼすかどうかを特定するため、３つの研究を完了した。細胞活性化、形質導入、及び拡大をＡＩＭ  Ｖ（商標）培地＋５％ヒト血清で行う、Ｏ
ｒｉｇｅｎ  ＰｅｒｍａＬｉｆｅ（商標）のＰＬ０７バッグにおいて第１の実験を行った。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）の濃度範囲２μｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬを３名の別々のドナーに由来するＰＢＭＣにおいて評価した。１０μｇ／ｍＬ及び４０μｇ／ｍＬのＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）の濃度におけるプレートでの形質導入とバッグでの形質導入、又は９５％信頼水準でＨＳＡブロッキングをせずに行われた形質導入とに顕著な差はなかった。しかしながら、同じ信頼水準において、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）濃度の２μｇ／ｍＬまでの低下、又は形質導入前のバッグからのレトロウイルスベクターの除去は、下記表２に示されるように形質導入効率の中程度の減少を明らかにした。
【００８１】
【表２】
2020078310.tif 000004
【００８２】
２名の別々のドナーに由来するＰＢＭＣを使用するOrigen PermaLife（商標）のＰＬ０７バッグにおけるＡＩＭ  Ｖ（登録商標）培地＋５％ヒト血清における第２の研究は、第１の研究による結果を確認し、バッグ内の最大形質導入効率は１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬのＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）の範囲で起こることを実証した（図８を参照されたい）。さらに、ＨＳＡブロック工程は、上記プロセスを増強せず、又は形質導入効率を上げない（図９を参照されたい）。さらに、上記研究は、形質導入された細胞の表現型（ＣＤ４５ＲＡ／ＣＣＲ７）はＨＳＡブロック工程の排除によって影響を受けないことを示した。
【００８３】
第３の研究では、２名のドナーに由来するＰＢＭＣをOrigen PermaLife（商標）のＰＬ７０バッグにおいてＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）＋２．５％サプリメント、又はＡＩＭ  Ｖ（商標）＋５％ＨＳＡのいずれかで２日間刺激した。２日目、細胞を洗浄し、ＰＬ３０又は６ウェルプレートにおいてレトロウイルスベクターで形質導入を行った。形質導入中の細胞濃度は０．５×１０６／ｍＬであった。３日目、形質導入された細胞をＴ１７５フラスコ（対照として）又はＰＬ３０バッグのいずれかに移した。６日目又は７日目、効力については共培養アッセイで、またＣＡＲ発現及び表現型についてはＦＡＣＳにより細胞を
評価した。図１０は、形質導入頻度に対するＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）濃度の影響を示し、ここで、５μｇ／ｍＬを上回るＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）がバッグ内での形質導入頻度に影響を有しなかった。図１１は、標的細胞上でのＣＤ１９抗原認識に応答する細胞活性化（ＣＤ１０７ａ発現及びＩＦＮ−ガンマ産生）の基準を評価した場合、これらの条件で試験した細胞の活性は同様であったことを示す。この場合、形質導入された細胞をＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ６細胞と共に４時間インキュベートした後、ＣＤ１０７ａについての細胞表面発現、及び細胞内ＩＦＮ−ガンマ産生について染色した。
【００８４】
したがって、本明細書で提供される方法によれば、バッグが１０μｇ／ｍＬのＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）で被覆され、ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）培地＋２．５％サプリメントを使用してバッグ内で形質導入を行い、ＨＳＡによるブロッキング工程が形質導入効率に対する影響、又は細胞の効力若しくは表現型に対する影響を何ら有さず、バッグ内での形質導入がプレートにおける形質導入と同様の表現型を有するＴ細胞産物を生じ、形質導入中の該バッグへの細胞の添加に先立つレトロウイルスベクターの除去が全体的な形質導入頻度を上げず、わずかに減少し得るプロセスを支持する。
【００８５】
実施例４：製造された抗ＣＤ１９  ＣＡＲ＋  Ｔ細胞に対する凍結保存工程の開発
製造された抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の凍結保存に最適な条件を決定するため、一連の開発研究を行った。研究は、解凍時の高い生存率に対する条件、凍結産物の配合、最適化された凍結プロトコルを確立するため、及び細胞表現型及び効力に対する凍結解凍の影響を特定するため設計された。以下の解析手段、すなわち解凍前及び後のトリパンブルー排除による細胞計数、解凍後のＦＡＣＳによるアネキシン染色、ＣＡＲ＋  Ｔ細胞及び表現型（ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ）を特定するためのＦＡＣＳ染色、解凍後の凍結保存細胞の培養における増殖、及びＣＤ１９＋細胞との共培養後のＩＦＮ−ガンマ産生による効力を採用して成績を評価した。
【００８６】
レトロウイルスベクターによって形質導入されたＰＢＭＣを使用して、上述の成績基準を評価した。開発研究では、最終凍結保存容量２０ｍＬ中３×１０６／ｍＬ〜１２×１０６／ｍＬの濃度範囲の凍結保存された細胞を使用した。実際の臨床製品の細胞密度は、被験体の体重及びＣＡＲ形質導入頻度に基づいてこの範囲内に含まれると考えられる。顕著な差のないＯｒｉＧｅｎのＣＳ５０バッグ又はＡＦＣのＫｒｙｏＳｕｒｅ（商標）２０−Ｆバッグのいずれかにおいて研究を行った。
【００８７】
形質導入された細胞を洗浄し、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む又は含まない、０．９％生理食塩水、又はＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ（登録商標）Ａ及びＤ５  １／２生理食塩水（５％デキストロース／０．４５％  ＮａＣｌ）の１：１混合物のいずれかを含有する溶液に再懸濁した。その後、細胞を１：１又は１：２の比率でＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０と混合した。様々な研究において、細胞を速度制御型冷凍庫（ＣＲＦ）で凍結保存し、気相ＬＮ２で２日を超えて保存した後、解凍して生存率、ＣＡＲ発現、表現型及び活性について評価した。幾つかの実験では、対照として細胞を８０％ヒトＡＢ血清＋２０％  ＤＭＳＯと１：１で混合した。
【００８８】
解凍時の細胞回復は、２．５％の最終濃度のＨＳＡが凍結保存産物に含まれた場合に増強された（表３）。さらに、ＨＳＡと共に凍結された細胞は、より高い生存率を維持し、培養に戻した場合により速く増殖を開始し、より迅速に高い細胞生存率を取り戻した（表４）。
【００８９】
【表３】
2020078310.tif 000005
【００９０】
【表４】
2020078310.tif 000006
【００９１】
０．９％生理食塩水とＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ（登録商標）Ａ／Ｄ５  １／２生理食塩水とを比較する研究は、解凍時の回復、解凍後の培養における細胞の増殖成績又は表現型に顕著な差はなかったことを示した（表５）。また、細胞をＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ１０により１：２に希釈した場合とＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ１０により１：１に希釈した場合とで、これらのパラメーターにおける改善はなかった。凍結保存産物におけるＨＳＡの最終濃度２．５％によるＴ細胞希釈物中での５％ヒト血清を用いた実験の大半で、成績は８０％ヒトＡＢ血清／２０％ＤＭＳＯによる１：１中で凍結した細胞のものと
等しいかそれを上回った。したがって、細胞を０．９％生理食塩水で洗浄し、ＨＳＡを５％まで添加した後、細胞をＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ１０で１：１に希釈する、最終凍結保存産物を選択することを決定した。
【００９２】
【表５】
2020078310.tif 000007
【００９３】
０．４５％生理食塩水、２．５％ＨＳＡ及び５０％のＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ１０の選択した配合、及びＯｒｉｇｅｎ（商標）のＣＳ２５０バッグ中の最終産物容量およそ５０ｍＬ〜６０ｍＬに対して凍結サイクルの開発を行った。各試行に対し、単一の培地配合及び容量を使用して全ての試行を個別に行った。バッグから空気をパージし、バッグの外側表面に熱電対を取り付けることによって産物の温度をモニターした。Ｃｕｓｔｏｍ
ＢｉｏＧｅｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標）、Ｐａｒｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＺＣ０２１等のＣＳ２５０バッグを収容するように設計された凍結カセットに個別のバッグを入れ、速度制御型冷凍庫の凍結ラックの中段に置いた。
【００９４】
どこで温度スパイク（temperature spike）が開始するのかを決定するのを補助するた
め、一連の凍結サイクルを評価して、０．４５％生理食塩水、２．５％ＨＳＡ及び５０％ＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ１０が自然に核形成した点を特定した。各試行の後、満足のいく試料温度プロファイルが作製されるまで凍結プロトコルに対する修正を行った。満足のいく試料の作製のための基準は、冷スパイク（cold spike）が融解熱を可能な最大の
程度まで相殺すること、及び上記試料が１℃／分の冷却速度を実行することであった。速度制御型冷凍庫（ＣＲＦ）において５０ｍＬのバッグに対して最適化されたプロトコルを表６に示し、該チャンバー及び産物の対応する温度プロファイルを図１２に示す。
【００９５】
【表６】
2020078310.tif 000008
【図１】
2020078310.tif 000009
【図２】
2020078310.tif 000010
【図３】
2020078310.tif 000011
【図４】
2020078310.tif 000012
【図５】
2020078310.tif 000013
【図６】
2020078310.tif 000014
【図７−１】
2020078310.tif 000015
【図７−２】
2020078310.tif 000016
【図８】
2020078310.tif 000017
【図９】
2020078310.tif 000018
【図１０】
2020078310.tif 000019
【図１１】
2020078310.tif 000020
【図１２】
2020078310.tif 000021
【配列表】
2020078310000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月19日(2020.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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