(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳動物細胞を用いて哺乳動物タンパク質を産生するための、最適な培地を提供する。【解決手段】アスパラギンで補充されたグルタミンフリー細胞培養培地を開示する。更に、アスパラギンを補充されたグルタミンフリー哺乳動物細胞培養における組換えタンパク質（例えば抗体）の生産方法を開示する。この培地を用いることで、細胞生存度、培養寿命、比生産性及び／又は最終の組換えタンパク質力価を、重大な有害作用無く強化することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドを、該ポリペプチドを発現している哺乳動物宿主細胞において産生する方法において、アスパラギン含有のグルタミンフリー産生培養培地における培養の産生期で哺乳動物宿主細胞を培養することを含んでなる方法。
【請求項２】
アスパラギンが２．５ｍＭから１５ｍＭの範囲の濃度で添加される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アスパラギンが７．５ｍＭから１０ｍＭの範囲の濃度で添加される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アスパラギンが１０ｍＭの濃度で添加される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アスパラギンが１０ｍＭの濃度で添加される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組換え宿主細胞が真核生物宿主細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記真核生物宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物宿主細胞がｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞である請求項８６に記載の方法。
【請求項１０】
産生培地が無血清である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
産生培地が
１）エネルギー源；
２）必須アミノ酸；
３）ビタミン；
４）遊離脂肪酸；及び
５）微量元素
から成る群から選択される一又は複数の成分を含有する請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
産生培養培地が
１）ホルモン及び他の増殖因子；
２）塩及びバッファー；及び
３）ヌクレオシド
から成る群から選択される一又は複数の成分を更に含有する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
産生期が回分又は流加培養期である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドを単離する工程を更に含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
細胞生存度、培養寿命、比生産性及び単離後の最終組換えタンパク質力価の一又は複数を決定することを更に含んでなる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞生存度、培養寿命、比生産性及び最終組換えタンパク質力価の少なくとも一つが、同じ組成のグルタミン含有産生培地で産生される同じポリペプチドと比較して増加される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ポリペプチドが哺乳動物糖タンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ポリペプチドが抗体、抗体断片及びイムノアドヘシンからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、抗体断片から形成された多重特性抗体から成る群から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
抗体又は抗体断片が、キメラ、ヒト化又はヒトである請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
抗体又は抗体断片が、治療用抗体又はそれらの生物学的に機能的な断片である請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記治療用抗体が、抗ＨＥＲ２抗体 抗ＣＤ２０抗体；抗ＩＬ-８抗体；抗ＶＥＧＦ抗体；抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体；抗ＣＤ１８抗体；抗免疫ＩｇＥ抗体；抗Ａｐｏ-２受容体抗体；抗組織因子（ＴＦ）抗体；抗ヒトα４β７インテグリン抗体；抗ＥＧＦＲ抗体；抗ＣＤ３抗体；抗ＣＤ２５抗体；抗ＣＤ４抗体；抗ＣＤ５２抗体；抗Ｆｃ受容体抗体；抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体；胸部上皮細胞に対する抗体；結腸癌細胞に結合する抗体；抗ＣＤ３８抗体；抗ＣＤ３３抗体；抗ＣＤ２２抗体；抗ＥｐＣＡＭ抗体；抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体；抗ＲＳＶ抗体；抗ＣＭＶ抗体；抗ＨＩＶ抗体；抗肝炎抗体；ＣＡ１２５抗体；抗αｖβ３抗体；抗ヒト腎細胞癌抗体；抗ヒト１７-１Ａ抗体；抗ヒト直腸結腸腫瘍抗体；ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒト黒色腫抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮癌；及び抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体及び抗ＨＬＡ ＤＲ抗体からなる群から選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
治療用抗体が、ＨＥＲ受容体、ＶＥＧＦ、ＩｇＥ、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ４０、ＢＲ３又はＤＲ５に結合する抗体である請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＨＥＲ受容体がＨＥＲ１及び／又はＨＥＲ２である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＨＥＲ受容体がＨＥＲ２である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記治療用抗体が、配列番号：１６、１７、１８及び１９から成る群から選択される重及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を有する請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記治療用抗体がＣＤ２０に結合する抗体である請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記治療用抗体が、配列番号：１−１５から成る群から選択される重及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を有する請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記治療用抗体がＶＥＧＦに結合する抗体である請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記治療用抗体が、配列番号：２０−２５から成る群から選択される重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を有する請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記治療用抗体がＣＤ１１ａを結合する抗体である請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記治療用抗体が、配列番号：２６−２９から成る群から選択される重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を有する請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記治療用抗体がＤＲ５受容体に結合する請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記治療用抗体が、Ａｐｏｍａｂｓ１．１、２．１、３．１、４．１、５．１、５．２、５．３、６．１、６．２、６．３、７．１、７．２、７．３，８．１、８．３、９．１、１．２、２．２、３．２、４．２、５．２、６．２、７．２、８．２、９．２、１．３、２．２、３．３、４．３、５．３、６．３、７．３、８．３、９．３、及び２５．３から成る群から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記治療用抗体がＡｐｏｍａｂ ８．３又はＡｐｏｍａｂ ７．３である請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記治療用抗体がＡｐｏｍａｂ ７．３である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記治療用抗体が抗ＢＲ３抗体又はＢＲ３-Ｆｃイムノアドヘシンである請求項２３に記載の方法。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが治療用ポリペプチドである請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
治療用ポリペプチドが、成長ホルモン放出因子、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ-１-アンチトリプシン；インスリンＡ-鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子及びヴォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えばプロテインＣ；心房ナトリウム利尿因子；肺表面活性物質；プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子-α及び-β；エンケファリナーゼ；ランテス（ＲＡＮＴＥＳ(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ-１-α）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；リラキシンＡ-鎖；リラキシンＢ-鎖；プロ・リラキシン；マウス・ゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク、例えばβ‐ラクタマーゼ；デオキシリボヌクレアーゼ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えばＣＴＬＡ-４；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は増殖因子の受容体；プロテインＡ又はＤ；リウマトイド因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン-３、-４、-５又は-６（ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＮＴ-５、ＮＴ-６）、又は神経成長因子、例えばＮＧＦ-β；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子、例えばａＦＧＦ及びｂＦＧＦ；上皮成長因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦアルファ及びＴＧＦベータ、ＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４又はＴＧＦ-β５を含む；インスリン様増殖因子-Ｉ及び-ＩＩ（ＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦＩＩ）；ｄｅｓ（１-３）-ＩＧＦ-Ｉ（脳ＩＧＦ-Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４及びＣＤ４０；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン-α、-β、及び、-γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ及びＧ-ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ-１からＩＬ-１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表層膜タンパク質；崩壊促進因子；ウィルス抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ-４及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４受容体；及び前記ポリペプチドの断片から成る群から選択される請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
産生期におけるポリペプチドの産生のための使用準備済のグルタミンフリー細胞培養培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概してグルタミンフリー細胞培養培地に関する。本発明は更にグルタミンフリー哺乳動物細胞培養における、抗体等の組換えタンパク質の生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物細胞は臨床利用のための哺乳動物タンパク質の産生の主要なシステムとなっており、主に、適切に折畳まれ組み合わせられた異種タンパク質を生産するそれらの能力、及び翻訳後修飾のそれらの能力による。抗体を含む異種タンパク質の組換え生産の間、細胞培養培地にグルタミンを有することが一般的である。Ｌ-グルタミンは必須アミノ酸であり、培養における細胞のための主要エネルギー及び窒素源と考えられる。多くの市販の培地は、基本配合に含まれるか又は使用の際に液体培地配合に添加される遊離Ｌ-グルタミンで調製される。従って、成長のために必要なグルタミンを細胞自身が産生するＧＳ ＮＳ０及びＧＳ ＣＨＯ細胞株等のグルタミン合成酵素を形質移入された細胞株のためのものを除き、全ての哺乳動物細胞培養培地はグルタミンを有する。グルタミンは様々な濃度で広く使用され、基本培地では典型的には１から２０ｍＭ、流加培養過程のフィードにおいてはずっと高い濃度で使用される。例えばＬ-グルタミンの濃度は、Ａｍｅｓ培地では０．５ｍＭでありＭＣＤＰ培地１３１では１０ｍＭである。DMEM/Ham's Nutrient Mixture F-12 (50:50)が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞と使用される専有培地のための開始配合としてしばしば使用される。DMEM/Ham’s Nutrient Mixture F-12におけるＬ-グルタミンは２．５ｍＭである。Serum-Free/Protein Free Hybridoma MediumにおけるＬ-グルタミン濃度は２．７ｍＭである。ＤＭＥＭ、ＧＭＥＭ、ＩＭＤＭ及びＨ-Ｙ培地のＬ-グルタミンは４ｍＭであり、その中でＩＭＤＭが専有のハイブリドーマ細胞培養培地のための開始配合としてしばしば使用される。ハイブリドーマ細胞は、培地に見られる平均レベルより上のＬ-グルタミンの濃度においてより良く成長すると一般的に考えられている。(Dennis R. Conrad, Glutamine in Cell Culture, Sigma-Aldrich Media Expert)。
【０００３】
グルタミンが細胞培養物に蓄積するアンモニアの主要供給源であることが示された（Markus Schneider,等. 1996, Journal of Biotechnology 46:161-185による概説を参照）。従って、細胞培養培地のグルタミンを低下させることはＮＨ４＋レベルの蓄積を著しく低減し、結果としてより低い細胞傷害性となった（Markus Schneider,等. 1996,上掲を参照）。低減されたＮＨ４＋細胞傷害性はより高い細胞生存度となり、従って培養寿命を延長した。ＣＨＯ細胞を使用した推定グルタミン消費研究に基づくと、細胞は１日当たり０．３−０．４ｍＭの割合でグルタミンを消費しうることが示唆された（Miller,等. 1988, Biotechnol. Bioeng. 32: 947-965）。Altamirano等(2001, J. Biotechnol. 110:171-9)は、組換え型ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｒｈｕｔ-ＰＡ）を生産するＣＨＯ細胞の再分布に関する、グルタミン酸によるグルタミン置換の効果及びグルタミン酸及び糖代謝間の平衡を研究した。グルタミンがグルタミンで置換されグルコース異化代謝と平衡（炭素窒素比率、Ｃ／Ｎ比率）となった時、細胞代謝が再分布されｒｈｕｔ-ＰＡの生産により有利に炭素及びエネルギー源を利用することを強いられることが分かった。また、接着培養においてＣＨＯ細胞は、培地におけるグルタミン酸からのグルタミンの合成を細胞に可能にする内因性のグルタミン合成酵素活性により、添加グルタミン無しで成長することが可能であることが報告された(Sanfeliu and Stephanopoulos, 1999, Biotechnol. Bioeng. 64:46-53)。しかしながら、グルタミン含有培地におけるコントロール培養と比較して、グルタミンフリー培地の細胞成長速度は遅くなり、Ｇ０／Ｇ１期に分布した細胞の割合は増加した。グルタミン及びグルタミン酸の減少は細胞死を導いた。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、少なくとも部分的には、組換えタンパク質は、グルタミンフリー生産培地を使用した哺乳類宿主細胞において何れの重大な有害作用無く生産されるだけでなく、事実、産生期におけるグルタミンフリー培地の使用は細胞生存度、培養寿命、比生産性及び／又は最終の組換えタンパク質力価を著しく増加するという予期しなかった発見に基づく。
【０００５】
本発明は、また、アスパラギンのグルタミンフリー生産培地への添加は、グルタミンフリー生産培地を使用した哺乳動物宿主細胞における細胞生存度、培養寿命、比生産性及び／又は最終の組換えタンパク質力価を、重大な有害作用無く更に強化することができるという予期しなかった発見に基づく。
【０００６】
一態様では、本発明は、ポリペプチドを発現している哺乳動物宿主細胞における前記ポリペプチドの生産の過程に関し、アスパラギンで補充されたグルタミンフリー生産培地において培養の産生期にて哺乳動物細胞を培養することを含んでなる。
一実施態様では、哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
別の実施態様では、哺乳類宿主細胞はｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞である。
更に別の実施態様では、生産培地は無血清である。
更なる実施態様では、生産培養培地は、
１）エネルギー源；
２）必須アミノ酸；
３）ビタミン；
４）遊離脂肪酸；及び
５）微量元素
から成る群から選択される一又は複数の成分を含有する。
なお更なる実施態様では、生産培養培地は、
１）ホルモン及び他の増殖因子；
２）塩及びバッファー；及び
３）ヌクレオシド
から成る群から選択される一又は複数の成分を更に含有する。
【０００７】
全ての実施態様において、生産期は、例えば回分又は流加培養期でありうる。
全ての実施態様において、該過程は前記ポリペプチドを単離する工程を更に含んでもよい。
更なる実施態様では、単離に続いて細胞生存度、培養寿命、比生産性及び単離後の最終組換えタンパク質力価の一又は複数が決定されてもよい。
また更なる実施態様では、細胞生存度、培養寿命、比生産性及び最終組換えタンパク質力価の少なくとも一つが、同じ組成のグルタミン含有生産培地において生産される同じポリペプチドと比較して増加される。
更なる態様では、本発明は、生産期におけるポリペプチドの生産のための使用準備済のグルタミンフリー細胞培養培地に関する。
更に別の実施態様では、ポリペプチドは哺乳動物糖タンパク質である。
他の実施態様では、ポリペプチドは、抗体、抗体断片及びイムノアドヘシンからなる群から選択される。
【０００８】
全ての実施態様において、ポリペプチドは、例えば抗体又は抗体の生物学的に機能的な断片でありうる。代表的な抗体断片はＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【０００９】
また更なる実施態様では、抗体又は抗体断片はキメラ、ヒト化又はヒトである。治療用抗体は、限定するものではないが、抗ＨＥＲ２抗体 抗ＣＤ２０抗体；抗ＩＬ-８抗体；抗ＶＥＧＦ抗体；抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体；抗ＣＤ１８抗体；抗ＩｇＥ抗体；抗Ａｐｏ-２受容体抗体；抗組織因子（ＴＦ）抗体；抗ヒトα４β７インテグリン抗体；抗ＥＧＦＲ抗体；抗ＣＤ３抗体；抗ＣＤ２５抗体；抗ＣＤ４抗体；抗ＣＤ５２抗体；抗Ｆｃ受容体抗体；抗癌胎児抗原（ＣＥＡ）抗体；胸部上皮細胞に対する抗体；結腸癌細胞に結合する抗体；抗ＣＤ３８抗体；抗ＣＤ３３抗体；抗ＣＤ２２抗体；抗ＥｐＣＡＭ抗体；抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体；抗ＲＳＶ抗体；抗ＣＭＶ抗体；抗ＨＩＶ抗体；抗肝炎抗体；抗ＣＡ１２５抗体；抗αｖβ３抗体；抗ヒト腎細胞癌抗体；抗ヒト１７-１Ａ抗体；抗ヒト直腸結腸腫瘍抗体；ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒト黒色腫抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮癌；及び抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体、及び抗ＨＬＡ ＤＲ抗体を含む。
【００１０】
他の実施態様では、治療用抗体は、ＨＥＲ受容体、ＶＥＧＦ、ＩｇＥ、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ４０又はＤＲ５と結合する抗体である。
他の実施態様では、治療用抗体は、抗ＢＲ３抗体又はＢＲ３-Ｆｃイムノアドヘシンである。
【００１１】
本発明の他の実施態様では、組換え宿主細胞において発現されるポリペプチドは治療的抗体である。例えば治療用ポリペプチドは、成長ホルモン放出因子、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ-１-アンチトリプシン；インスリンＡ-鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子及びヴォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えばプロテインＣ；心房ナトリウム利尿因子；肺表面活性物質；プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子-α及び-β；エンケファリナーゼ；ランテス（ＲＡＮＴＥＳ(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ-１-α）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；リラキシンＡ-鎖；リラキシンＢ-鎖；プロ・リラキシン；マウス・ゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク、例えばβ‐ラクタマーゼ；デオキシリボヌクレアーゼ；ＩｇＥ；細胞傷害性Tリンパ球抗原（ＣＴＬＡ）、例えばＣＴＬＡ-４；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン類又は増殖因子の受容体；プロテインＡ又はＤ；リウマトイド因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン-３、-４、-５又は-６（ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＮＴ-５、ＮＴ-６）、又は神経成長因子、例えばＮＧＦ-β；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子、例えばａＦＧＦ及びｂＦＧＦ；上皮成長因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング成育因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦアルファ及びＴＧＦベータ、ＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４又はＴＧＦ-β５を含む；インスリン様増殖因子-Ｉ及び-ＩＩ（ＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦＩＩ）；ｄｅｓ（１-３）-ＩＧＦ-Ｉ（脳ＩＧＦ-Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４及びＣＤ４０；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン-α、-β、及び、-γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ及びＧ-ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ-１からＩＬ-１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表層膜タンパク質；崩壊促進因子；ウィルス抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ-４及びＶＣＡＭ）；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４受容体；及び前記ポリペプチドの断片から成る群から選択される。
【００１２】
全ての実施態様において、組換え宿主細胞は真核生物宿主細胞であり得、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む哺乳類宿主細等である。
これら及び他の態様は、実施例及び添付の請求項を含む下記の説明から明瞭となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】グルタミン、グルタメート、アスパラギン及びアスパレートの異なる濃度の効果を評価する要因実験計画法（Full Factorial Design of Experiment (DOE) ）による力価結果のＡｐｏｍａｂ抗体キューブプロット分析。モデルは、１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたグルタミンフリー培地においてより高い力価が得られることを予測する。
【図２】グルタミン、グルタメート、アスパラギン及びアスパレートの異なる濃度の効果を評価する要因実験計画法による力価結果のＢＲ３-Ｆｃイムノアドヘシンキューブプロット分析。モデルは、１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたグルタミンフリー培地においてより高い力価が得られることを予測する。
【図３】グルタミン、グルタメート、アスパラギン及びアスパレートの異なる濃度の効果を評価する要因実験計画法による力価結果の抗ＶＥＧＦ抗体キューブプロット分析。モデルは、１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたグルタミンフリー培地においてより高い力価が得られることを予測する。
【図４】Ａｐｏｍａｂ抗体価へのグルタミンフリー、低グルタメート及び高アスパレート条件下でのアスパラギンの影響。グルタミンフリー培地において、Ａｐｏｍａｂ抗体価は、アスパラギン無しでのグルタミンフリー培地と比較して２．５−１５ｍＭアスパラギンの存在下で著しく増加した。これらの条件下でグルタメートの有無は力価に影響が無かった。
【図５】グルタミンフリー及び低グルタメート条件における様々なアスパラギン及びアスパレート濃度にわたるＡｐｏｍａｂ抗体価生産。これらの条件下でアスパラギン酸を０から１０ｍＭに増加した時正の滴定効果が観察された。
【図６】Ａ−Ｃ。１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたグルタミンフリー培地の力価への影響。Ａｐｏｍａｂ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体及びＢＲ３-Ｆｃイムノアドヘシンの最終力価はグルタミン含有培地と比較してグルタミンフリー培地において著しく高かった。
【図７】Ａ及びＢ。１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２グルタミンフリー培地の力価への影響。Ａｐｏｍａｂ抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体の最終力価はグルタミン含有ＤＭＥＭ Ｆ１２培地と比較してグルタミンフリーＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において著しく高かった。
【図８】Ａ−Ｃ。１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたグルタミンフリー培地の細胞比生産性（Ｑｐ）への影響。Ａｐｏｍａｂ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体及びＢＲ３-Ｆｃイムノアドヘシンの細胞比生産性はグルタミン含有培地と比較してグルタミンフリー培地において著しく高かった。
【図９】Ａ及びＢ。１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２グルタミンフリー培地の細胞比生産性（Ｑｐ）への影響。Ａｐｏｍａｂ抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体の細胞比生産性はグルタミン含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地と比較してグルタミンフリーＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において著しく高かった。
【図１０】Ａ−Ｃ。１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたグルタミンフリー培地の細胞生存率への影響。Ａｐｏｍａｂ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体及びＢＲ３-Ｆｃイムノアドヘシンの細胞生存率はグルタミン含有培地と比較してグルタミンフリー培地において高かった。
【図１１】Ａ及びＢ。１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２グルタミンフリー培地の細胞生存率への影響。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において、グルタミンフリー培地における細胞生存率の一貫した改善はなかった。生存率はグルタミン含有培地と比較してＡｐｏｍａｂ抗体でより高く、抗ＶＥＧＦ抗体でより低かった。
【図１２】Ａ−Ｃ。１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたグルタミンフリー培地のアンモニア形成への影響。アンモニアは通常グルタミン含有培地と比較してグルタミンフリー培地でより低かった。
【図１３】Ａ及びＢ。１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２グルタミンフリー培地のアンモニア形成への影響。アンモニアはグルタミン含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地と比較してグルタミンフリーＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において著しく低減された。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
定義
用語「細胞培養培地」、「培養培地」及び「栄養分混合物」とは、哺乳動物細胞を増殖させるのに用いられる栄養液を意味し、典型的には一又は複数の以下のカテゴリからの少なくとも一成分を提供する：
１）エネルギー源、通常はグルコース等の炭水化物の形態：
２）幾つかの又は全ての必須アミノ酸、通常は２０のアミノ酸の基本的なセットに加えてシステイン：
３）ビタミン及び／又は典型的には低濃度で必要とされる他の有機化合物：
４）遊離脂肪酸：及び
５）微量元素、微量元素は典型的には非常に低濃度、通常はマイクロモルの範囲で必要とされる無機化合物又は天然に生じる元素。
【００１５】
栄養分混合物は以下のカテゴリの何れかからの一又は複数の成分で任意に補充されうる。
１）ホルモン及び他の増殖因子、例えばインスリン、トランスフェリン及び上皮成長因子；
２）塩類及びバッファー、例えばカルシウム、マグネシウム及びリン酸塩；及び
３）ヌクレオシド及び塩基、例えばアデノシン及びチミジン。
培地が、いかなる哺乳類由来の血清（例えば、胎児性牛血清（ＦＢＳ））をも必須的に含まない細胞培養液は通常「無血清」である。「必須的に無」とは、細胞培養液が約０から５％の血清、好ましくは０から１％の血清及び最も好ましくは０から０．１％の血清を含むことを意味する。有利には、無血清と「確定」された培地を使用することができ、培養液中の各々の組成の同一性及び濃度は既知である（即ち、牛下垂体抽出（ＢＰＥ）のような不確定な組成が培養液中に存在しないこと）。
【００１６】
本発明の関連において、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養」という表現は互換的で、全てのそのような命名は子孫も含む。従って、「形質転換体」及び「形質転換（宿主）細胞」には、初代適用細胞及び植え次ぎ回数を考慮せずに初代から派生した培養細胞が含まれる。また、全ての子孫は、故意又は偶発的な変異に由来して、ＤＮＡ含量が正確に同一でなくてもよいと理解されている。当初形質転換された細胞でスクリーニングされたのと同様な機能又は生物学的活性を持つ変異体子孫も含まれる。明確な命名が意図される場合は、内容から明らかであろう。
【００１７】
用語「動物宿主細胞」、「動物細胞」、「動物組換え宿主細胞」等は、無脊椎動物、非哺乳動物脊椎動物（例えばトリ、爬虫類及び両生類）及び哺乳動物細胞を包含する。無脊椎動物細胞の例は以下の虫細胞を含む：ヨトウガ（イモムシ）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）及びカイコ。例えばLuckow等, Bio/Technology, 6:47-55 (1988); Miller等, in Genetic Engineering, Setlow, J. K.等,版, Vol. 8(Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279;及びMaeda等, Nature, 315:592-594 (1985)を参照のこと。
【００１８】
「哺乳類宿主細胞」、「哺乳類細胞」、「哺乳類組換体宿主細胞」等の用語は、適当な栄養素及び増殖因子を含んでなる単層培養又は懸濁培養の状態にする場合に増殖及び生存することが可能な哺乳類由来の株化細胞を意味する。特定の株化細胞に対して必要な栄養分及び増殖因子は、例えば、Mammalian Cell Culture(Mather, J.P.編, Plenum Press, N.Y. [1984])、及びBarnes及びSato,Cell, 22:649(1980)に記載されているように、過度の実験をすることなく、経験的に直ぐに決定することができる。典型的には、細胞は、関心のある特定の糖タンパク質を多量に発現し培地に分泌することができ、この目的のために培養することができる。しかしながら、細胞は同様に種々の他の目的のために培養されることができ、本発明の範囲は組換え型タンパク質の生産のためだけに細胞を培養することに限られていない。本発明の培地において増殖可能な適切な哺乳類株化細胞の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎ＣＶＩ株(COS-7, ATCCR CRL 1651)；ヒト胎児腎臓株２９３Ｓ(Graham等, J. Gen. Virolo., 36:59 (1977))；ベビーハムスター腎臓細胞(BHK, ATCCR CCL 10)；マウスセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243 (1980))；マウス腎細胞(CVI-76, ATCCR CCL 70)；アフリカミドリザル腎細胞(VERO-76, ATCCR CRL-1587)；ヒト子宮頸癌細胞(HELA, ATCCR CCL 2)；イヌ腎細胞(MDCK, ATCCR CCL 34)；バッファローラット肝細胞(BRL 3A, ATCCR CRL 1442)；ヒト肺細胞(W138, ATCCR CCL 75)；ヒト肝細胞(Hep G2, HB 8065)；マウス乳癌細胞(MMT 060562, ATCCR CCL 5I)；ラット肝細胞癌細胞(HTC, MI.54, Baumann等, J. Cell Biol., 85:1 (1980))；及びＴＲ-１細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44 (1982))及びハイブリドーマ株化細胞を含む。ＣＨＯ細胞(Urlab and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))が本発明を実施するために好ましい株化細胞である。本発明の方法での使用に適切なＣＨＯ細胞は以下の文献にも記述されている：EP 117,159, published Aug. 29, 1989;米国特許第4,766,075号;同第4,853,330号; 同第5,185,259号; Lubiniecki等, in Advances in Animal Cell Biology and Technology for Bioprocesses, Spier等,版(1989), pp. 442-451。ここでの使用に適切な既知のＣＨＯ由来細胞は、例えばＣＨＯ／-ＤＨＦＲ(Urlaub and Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980))、ＣＨＯ-Ｋ１ ＤＵＸ Ｂ１１(Simonsen and Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2495-2499(1983); Urlaub and Chasin, supra)、及びｄｐ１２．ＣＨＯ細胞(EP 307,247 published Mar. 15, 1989)を含む。好ましい宿主細胞はＣＨＯ-Ｋ１ ＤＵＸ Ｂ１１及びｄｐ１２．ＣＨＯ細胞を含む。
【００１９】
「ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞」はジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ細胞を意味する。哺乳動物細胞の組換え型タンパク質の生産は、臨床利用のための大きく複雑なグリコシル化ポリペプチドの多量の製造を可能にした。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＤＨＦＲ-細胞及び増幅可能であり選択可能なマーカーＤＨＦＲは、臨床的に有用な量の産物を生産する株化細胞を得るために通常用いられる。(Urlab, G. and Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220; Kaufman, R. J. and Sharp, P. (1982) J. Mol. Biol., 159, 601-621; Gasser, C. S., Simonsen, C. S., Schilling, J. W. and Schmike, R. T. (1982) Proc. Natl Sci. USA, 79, 6522-6526)。
【００２０】
「期」とは、実施者により熟知されているような細胞のある培養時期を意味する。
細胞培養の「増殖期」は、細胞が通常迅速に分裂する指数関数的な細胞増殖（対数期）の期間を意味する。この期の間、細胞は通常１から４日の所定期間、細胞増殖が最大になるような条件下で培養される。宿主細胞の増殖周期は、過度の実験を行うことなく、想定される特定の宿主細胞に対して決定され得る。増殖期の間、細胞は必要な添加物を含む栄養性培地中、通常は約３０から４０℃、好ましくは約３７℃にて加湿され制御された空気環境中、特定の細胞系において至適増殖が達成されるように培養される。細胞は、およそ１から４日、通常はおよそ２から３日の一時期間増殖期に維持される。
【００２１】
細胞培養の「過渡期」とは、生産期の培養条件が充実する一時期を意味する。過渡期において温度のような環境因子が増殖条件から生産条件へと移行される。
細胞培養の「生産期」とは、細胞増殖が平衡に達する一時期を意味する。生産期の間、対数細胞増殖は終了しタンパク質の生産が主となる。この時期の間、タンパク質生産を維持を補助し所望のタンパク質産物を得るために培地は通常補充される。
【００２２】
ここで使用される「流加細胞培養系」なる用語は、最初に動物細胞及び培地が培養容器に供給され、追加的な培養栄養素が培養プロセスの間に、培養の終了まで定期的な細胞及び／又は産生物採取を伴って又は伴わずに連続的又は回分して該培地に投入される、流加培養を意味する。流加培養は、周期的に全培養物（細胞及び培地を含む）が取り除かれ新鮮な培地と交換される「半連続流加培養」を含む。流加培養は、細胞培養のための全成分（動物細胞と全培養栄養素を含む）が培養プロセス開始時に培養容器に供給される単なる「回分培養（batch culture）」とは区別される。流加培養はさらに、上清がプロセス中培養容器から除去されない限りにおいて潅流培養とも区別される（潅流培養では、細胞は例えばマイクロキャリアへの固着化、被包、濾過等によって培地で抑制され、培地は連続的又は断続的に培養容器に導入され、除去される）。しかし、流加細胞培養中の、検査目的の試料の除去は考慮される。
【００２３】
ここで用いられる場合、用語「グルタミン」は、タンパク質合成のためのアミノ酸ビルディングブロックとして、及び細胞培養のエネルギー源として認識されるアミノ酸Ｌ-グルタミン（３文字表記で「Ｇｌｎ」及び１文字表記で「Ｑ」としても各々知られる）を意味する。従って用語「グルタミン」及び「Ｌ-グルタミン」はここでは互換的に用いられる。
「グルコース」なる語は、別個の又は結合したα-Ｄ-グルコースもしくはβ-Ｄ-グルコースを意味する。α-及びβ-グルコース形態は溶液中で相互転換可能である。
【００２４】
「重量モル浸透圧濃度」なる表現は、水溶液中に溶解した溶質粒子の浸透圧の基準単位である。溶質粒子はイオン及び非イオン化分子を含む。重量モル浸透圧濃度は、１kgの水に溶解した浸透圧活性粒子の濃度（つまりオスモル）として表される（３８℃でＨ２Ｏの１ｍＯｓｍ／ｋｇは１９ｍｍＨｇの浸透圧に相当する）。「重量モル浸透圧濃度」は１リットルの水溶液中に溶解した溶質粒子の数を意味する。培地の重量モル浸透圧濃度を増加するために該培地に添加できる溶質としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、非代謝性ポリマー、ビタミン、イオン、塩、糖類、代謝産物、有機酸、脂質等が挙げられる。好ましい実施態様では、ここに説明する所望の重量モル浸透圧濃度範囲を得るために、培養培地におけるアミノ酸及びＮａＣｌの濃度が増加される。ここで用いる場合、略語「ｍＯｓｍ」は「ミリオスモル／ｋｇ Ｈ２Ｏ」を意味する。
【００２５】
用語「細胞密度」はここで使用される場合、任意体積の培地に存在する細胞の数を意味する。
用語「細胞生存度」はここで使用される場合、培養条件又は実験バリエーションの一定条件下で、培養中の細胞が生存する能力を示す。ここで使用される場合、該用語はまた、その時間における培養物中の全細胞数（生及び死）と関連した特定の時間に生存している細胞の部分を意味する。
【００２６】
「アミノ酸（類）」なる用語は、天然発生する全てのＤ及びＬ立体異性形態のαアミノ酸類と、その類似体及び誘導体を意味する。類似体は、アミノ酸の原子が、通常同様の特性を有する異なる原子で置換されたものとして定義される。誘導体は、別の分子又は原子が結合したアミノ酸として定義される。誘導体は例えば、アミノ基のアセチル化されたもの、カルボキシル基のアミノ化されたもの、又はシステインを形成する２つのシステイン分子の硫黄残基の酸化されたものを含む。
【００２７】
「タンパク質」とは、鎖長が三次及び／又は四次構造のより高いレベルを生産するのに十分であるアミノ酸の配列を意味する。これは、「ペプチド」又はそのような構造を持たない他の小分子量薬とは区別される。典型的には、ここでのタンパク質は少なくとも約１５−２０ｋＤ、好ましくは少なくとも約２０ｋＤの分子量を有するであろう。ここでの定義範囲に含まれるタンパク質の例には、あらゆる哺乳動物タンパク質、特に、治療用及び診断用タンパク質、例えば治療用及び診断用抗体、一般に、一又は複数の鎖間及び／又は鎖内ジスルフィド結合を含む多鎖ポリペプチドを含む、一又は複数のジスルフィド結合を含むタンパク質が含まれる。
【００２８】
「治療用タンパク質」又は「治療用ポリペプチド」なる用語は、その適応症又は作用機序にかかわらず、疾患の治療に使用されるタンパク質を意味する。治療用タンパク質がクリニックにおいて有用であるためには、それが多量に製造されなければならない。治療用タンパク質又は他のタンパク質の「製造スケール」の生産は、製造されるタンパク質及び需要に応じて、約４００Ｌから約８００００Ｌの範囲の細胞培養を利用する。典型的には、そのような製造スケールの生産は、約４００Ｌから約２５０００Ｌの細胞培養サイズを利用する。この範囲内において、特手の細胞培養サイズ、例えば４０００Ｌ、約６０００Ｌ、約８０００、約１００００、約１２０００Ｌ、約１４０００Ｌ、又は約１６０００Ｌが利用される。
【００２９】
ここで使用される場合、「興味のポリペプチド」は一般に約１０以上のアミノ酸を有するペプチド及びタンパク質を意味する。ポリペプチドは宿主細胞に同属であり得、又は好ましくは外因性であり得、それらは異種性を意味し、つまり活用される宿主細胞に対して外来であり、例えば非ヒト哺乳類により生産されたヒトタンパク質、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。好ましくは哺乳類のポリペプチド（哺乳類生物に元々由来したポリペプチド）が使用され、培地に直接分泌されるものがより好ましい。用語「ポリペプチド」又は「興味のポリペプチド」は具体的には抗体、特に哺乳類ポリペプチドに結合する抗体、例えば下に挙げられる哺乳類ポリペプチド又はそれらの断片の何れか、並びにイムノアドヘシン（ポリペプチド-Ｉｇ融合）、例えば下に挙げる哺乳類ポリペプチド又はそれらの断片の何れかを含んでなるものを含む。
【００３０】
哺乳動物ポリペプチドの例は、限定するものではないが、膜貫通分子（例えば受容体）及び増殖因子などのリガンドを含む。例示的なポリペプチドは、レニン；成長ホルモン放出因子、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；インターフェロン、例えばインターフェロン-α、-β、及び、-γ；リポタンパク質；アルファ-１-アンチトリプシン；インスリンＡ-鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子及びヴォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えばプロテインＣ；心房ナトリウム利尿因子；肺表面活性物質；プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-ＰＡ）、ｔ-ＰＡ変異体を含む；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；腫瘍壊死因子-α及び-β；エンケファリナーゼ；ランテス（ＲＡＮＴＥＳ(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ-１-α）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ-鎖；リラキシンＢ-鎖；プロ・リラキシン；マウス・ゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク、例えばβ‐ラクタマーゼ；デオキシリボヌクレアーゼ；ＩｇＥ；細胞傷害性Tリンパ球抗原（ＣＴＬＡ）、例えばＣＴＬＡ-４；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン類又は増殖因子の受容体；プロテインＡ又はＤ；リウマトイド因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン-３、-４、-５又は-６（ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＮＴ-５、ＮＴ-６）、又は神経成長因子、例えばＮＧＦ-β；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子、例えばａＦＧＦ及びｂＦＧＦ；上皮成長因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング成育因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦアルファ及びＴＧＦベータ、ＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４又はＴＧＦ-β５を含む；インスリン様増殖因子-Ｉ及び-ＩＩ（ＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦＩＩ）；ｄｅｓ（１-３）-ＩＧＦ-Ｉ（脳ＩＧＦ-Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４及びＣＤ４０；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン-α、-β、及び、-γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ及びＧ-ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ-１からＩＬ-１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表層膜タンパク質；崩壊促進因子；ウィルス抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ-４及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４受容体；Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ヘッジホッグ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、及び上に挙げ��ポリペプチドの何れかの断片を含む。Ａｐｏ２Ｌ（ＴＲＡＩＬ）及びその変異体は、例えば米国特許出願公開第20040186051号に開示される。抗ＶＥＧＦ抗体は、例えば、米国特許第8,994,879号;同第7,060,269号;同第7,169,901号;及び同第7,297,334号に開示される。抗ＣＤ２０抗体は、例えば、米国特許出願公開第20060246004号に開示される。ＢＲ３ポリペプチド、抗ＢＲ３抗体及びＢＲ３-Ｆｃイムノアドヘシンは、例えば米国特許出願公開第20050070689号に記載されている。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を示す。構造的に、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である(すなわち、「異種」である)アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ(ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む)、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭ等の任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００３２】
上記したように、ある実施態様ではタンパク質は抗体である。「抗体」（Ａｂｓ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は同じ構造的特徴を持つ糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示す一方、免疫グロブリンは抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子の双方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、また骨髄腫により増大したレベルで生産される。
【００３３】
「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、特に、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する完全長抗体又はインタクトなモノクローナル抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、ポリクローナル抗体、多価抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成された多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、ダイアボディ、及びｓｃＦｖ分子等の単鎖分子、並びに抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ）を包含する。
【００３４】
特に断らない限りは、本明細書全体を通して「多価抗体」という表現は三又はそれ以上の抗原結合部位を含む抗体を指すために使用される。例えば、多価抗体は三又はそれ以上の抗原結合部位を持つように典型的には操作されており、一般には天然配列ＩｇＭ又はＩｇＡ抗体ではない。
用語「完全長抗体」、「無傷の抗体」及び「完全抗体」は、ここで互換性をもって使用され、実質的に無傷の形態の抗体を意味し、下に定義されるような抗体断片ではない。用語はＦｃ領域を持つ重鎖を有する抗体を特に意味する。
【００３５】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部のみを有し、一般的にはインタクトな抗体の抗原結合部位を含み、これにより抗原に結合する能力を維持する。一実施態様では、抗体断片は完全な抗体の抗原結合部位を含んでなるために、抗原結合能を有する。他の実施態様では、抗体断片は、例えばＦｃ領域を含んでなるものは、完全な抗体に存在する場合のＦｃ領域に通常関連する生物学的な機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期の調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合の少なくとも一を保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全な抗体と実質的に類似したインビボ半減期を有する一価性抗体である。例えば、このような抗体断片は、インビボ安定性を断片に与えることができるＦｃ配列に結合した抗原結合アームを含んでもよい。
【００３６】
抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片と、容易に結晶化する能力を反映して命名された残りの「Ｆｃ」断片を産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、依然抗原と架橋結合が可能であるＦ（ａｂ’）２断片を産生する。
【００３７】
「Ｆａｂ断片」は、重鎖及び軽鎖可変ドメインを有し、また軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合もまた知られている。本定義によって包含される抗体断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦａｂ断片；（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に一又は複数のシステイン残基を持つＦａｂ断片であるＦａｂ'断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦｄ断片；（ｉｖ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に一又は複数のシステイン残基とＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦｄ'断片；（ｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを持つＦｖ断片；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward等, Nature 341, 544-546 (1989)）；（ｖｉｉ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉｉｉ）ヒンジ領域がジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂ'断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｘ）単鎖抗体分子（例えば単鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）（Bird等, Science 242:423-426(1988);及びHuston等, PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)）；（ｘ）同一のポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を持つ「ダイアボディー」（例えば、EP 404,097; WO 93/11161;及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）；（ｘｉ）相補的軽鎖ポリペプチドと共に抗原結合領域対を形成するタンデムＦｄセグメント対（ＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１）を含む「線形抗体」(Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)；及び米国特許第5641870号)が含まれる。
【００３８】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を有する最小の抗体断片である。一実施態様では、二本鎖Ｆｖ種は強固な非共有結合の一つの重鎖可変ドメインと一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、一つの重鎖可変ドメインと一つの軽鎖可変ドメインが、軽鎖及び重鎖が二本鎖Ｆｖ種におけるものに類似した「二量体」構造で会合しうるように、可動性ペプチドリンカーによって共有的に連結されうる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ-ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を形成するのはこの構造においてである。集合的には、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性でではあるが、抗原を認識しそれに結合する能力を有している。
【００３９】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照。
【００４０】
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持ち、その断片が同一のポリペプチド鎖(ＶＨ-ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に結合した重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含む抗体断片を指す。非常に短いために同一鎖上で二つのドメイン間での対形成を可能にするリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは二価又は二重特異的でありうる。ダイアボディは、例えばEP 404,097; WO93/1161; Hudson等, (2003) Nat. Med. 9:129-134;及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)に更に十分に記載されている。トリアボディ及びダイアボディはまたHudson等, (2003) Nat. Med. 9:129-134に記載されている。
【００４１】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、例えば少量で存在しうる天然に生じる突然変異などの、可能な突然変異体を除いて、集団を含む個々の抗体が同一である。従って、「モノクローナル」との形容は、個別の抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり単一抗原に向けられる。ある実施態様では、このようなモノクローナル抗体は、通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスにより得られる。例えば、この選択プロセスは、雑種細胞クローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンからの、唯一のクローンの選択とすることができる。重要なのは、選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的への親和性の向上、標的結合配列のヒト化、細胞培養液中におけるその産生の向上、インビボでの免疫原性の低減、多選択性抗体の生成等が可能になること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も、本発明のモノクローナル抗体であることである。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の調製物は、それらが他の免疫グロブリンで通常汚染されていないという点で有利である。
【００４２】
「モノクローナル」との修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を任意の特定の方法で生産する必要があると解釈されるものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法(例えば、Kohler及びMilstein., Nature, 256:495-97(1975); Hongoら, Hybridoma, 14(3):253-260(1995), Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版. 1988); Hammerlingら: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, 563-681(Elsevier, N.Y., 1981))、組換えＤＮＡ法(例えば、米国特許第4,816,567号を参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clackson等, Nature, 352: 624-628(1991); Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597(1992); Sidhu等, J. Mol. Biol., 338(2):299-310(2004); Lee等, J. Mol. Biol., 340(5):1073-1093(2004); Fellouse, Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 101(34):12467-12472(2004);及びLee等, J. Immunol. Methods, 284(1-2):119-132(2004)、及びヒト免疫グロブリン座位又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する、ヒト又はヒト様抗体を動物において生成させるための技術(例えば、国際公開第1998/24893号; 国際公開第1996/34096号; 国際公開第1996/33735号; 国際公開第1991/10741号; Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551(1993); Jakobovits等, Nature, 362: 255-258(1993); Bruggemannら, Year in Immunol., 7:33(1993); 米国特許第5,545,807号; 同5,545,806号; 同5,569,825号; 同5,625,126号; 同5,633,425号; 及び同5,661,016号; Marks等, Bio/Technology, 10: 779-783(1992); Lonberg等, Nature, 368:856-859(1994); Morrison, Nature, 368:812-813(1994); Fishwild等, Nature Biotechnol., 14:845-851(1996); Neuberger, Nature Biotechnol., 14:826(1996);及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93(1995)を参照)を含む、様々な技術により作製されてよい。
【００４３】
ここでのモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応配列に一致するか又は類似するが、鎖の残りは、他の種由来の又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片における対応配列に一致するか又は類似する「キメラ」抗体(免疫グロブリン)を含む(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。
【００４４】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域からの残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種の高頻度可変領域からの残基(ドナー抗体)によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲｓがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部をまた含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。また例として、Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma &amp; Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；及び米国特許第6,982,321号及び同第7,087,409号を参照。また、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)も参照のこと。抗原刺激に応答して抗体を産生するように修飾されているが、その内在性遺伝子座が無効になっているトランスジェニック動物、例えば免疫化ゼノマウスに抗原を投与することによってヒト抗体を調製することができる(例として、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術に関する米国特許第6075181号及び同第6150584号を参照)。また、例えば、ヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成したヒト抗体に関するLi等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)も参照のこと。ヒト化抗体はまた、ＰｒｉｍａｔｉｚｅｄＴＭを含み、抗体の抗原結合領域は興味の抗原を有するマカクザルを免疫化することによって生産される抗体に由来する。
【００４５】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここで開示されたヒト抗体を製造するための何れかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、当該分野で知られている様々な技術を使用して生産することが可能である。一実施態様では、ヒト抗体はファージライブラリから選択される。このファージライブラリはヒト抗体を発現する(Vaughan等 Nature Biotechnology 14:309-314 (1996)；Sheets等 Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 6157-6162 (1998)；Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。また、ヒト抗体は、内因性イムノグロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されているトランスジェニック動物、例えばマウスにヒトイムノグロブリン遺伝子座を導入することによって作製されうる。抗原負荷によりヒト抗体産生が観察される。これは、遺伝子再構成、アセンブリ及び抗体レパートリを含めすべての点でヒトにおいて見られるものと非常に類似している。この手法は、例えば米国特許第5545807号、同第5545806号；同第5569825号；同第5625126号；同第5633425号；同第5661016号、及び以下の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368:812-13 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)；Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化により調製されてよい(このＢリンパ球は個体から回収されても、インビトロで免疫化されていてもよい)。例えば、Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；Boerner等, J. Immunol., 147 (1): 86-95 (1991)；及び米国特許第5750373号を参照のこと。
【００４６】
「親和成熟」抗体とは、変化を有しない親抗体と比較し、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、抗体の一又は複数のＣＤＲ／ＨＶＲにおける一又は複数の変化を伴うものである。好ましい親和成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において知られる手順によって生産される。例えば、Marks等 Bio/Technology, 10：779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメイン混合による親和成熟について記載している。ＣＤＲ／ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、例えばBarbas等, Proc Nat Acad. Sci, USA 91：3809-3813(1994)；Schier等, Gene, 169：147-155(1995)；Yelton等, J. Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等, J. Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol.226：889-896(1992)に記載されている。
【００４７】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを意味する。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と称されうる。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と称されうる。これらのドメインは一般に抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含む。
【００４８】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体間で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。それは、軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の相補性決定領域(ＣＤＲ)又は高頻度可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する、３つのＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＨＶＲは、ＦＲにより近接して保たれ、他の鎖のＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)を参照)。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害性への抗体の関与を示す。
【００４９】
ここで使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。例えば、高頻度可変領域は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含み；ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、ＶＬに３つ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を示し、特にＨ３は抗体に良好な特異性を与える際に特有の役割を果たすように思われる。例えば、Xu等 Immunity 13:37-45 (2000)；Johnson及びWu, Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo編, Human Press, Totowa, NJ, 2003)を参照。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は機能的であり、軽鎖が無い状態で安定である。例えば、Hamers-Casterman等 Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等 Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)を参照のこと。
【００５０】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別されるタイプの一つが割り当てられる。
【００５１】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体(免疫グロブリン)は異なるクラスが割り当てられる。免疫グロブリンには５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、さらにこれらのいくつかは、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス(イソ型)に分かれる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られており、一般的に、例えばAbbas等 Cellular and Mol. Immunology, 第4版.(W. B. Saunders, Co., 2000)に記載されている。抗体は、抗体と、一又は複数の他のタンパク質又はペプチドとの共有又は非共有結合により形成される、大きな融合分子の一部とすることができる。
【００５２】
「Ｆｃ領域」という用語は、無傷の抗体のパパイン消化で生じ得る免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域又は変異体Ｆｃ領域である。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般的に、二つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、場合によってはＣＨ４ドメインを含む。
【００５３】
ここで使用する「Ｆｃ領域鎖」という表現は、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖のうちの１つを意味する。
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる）は、別のドメインと親密な対にならないという点で独特である。代わりに、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が、無傷の天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挿入される。炭水化物はドメイン-ドメイン対の代替物を提供し、ＣＨ２ドメインの安定化を助けることができると推測される。Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)。、ここでＣＨ２ドメインは天然配列のＣＨ２ドメインまたは変異体ＣＨ２ドメインとすることができる。
【００５４】
「ＣＨ３ドメイン」は、残基Ｃ末端からＦｃ領域のＣＨ２ドメインへの伸長を含む。ここでのＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメイン又は変異体ＣＨ３ドメイン（例えばそれらの一方の鎖に「隆起」が導入され、それらの他方の鎖に「キャビティ」が導入されたＣＨ３ドメイン；出典明記によりここに援用する米国特許第5,821,333号を参照）でありうる。このような変異体ＣＨ３ドメインは、ここに記述される多重特異性（例えば二重特異性）抗体を生産するために使用されうる。
【００５５】
「ヒンジ領域」は、天然配列のヒンジ領域か、または変異体ヒンジ領域とすることができる。変異体ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は、通常、１つのポリペプチド鎖につき少なくとも１つのシステイン残基を保持しており、よって２つの変異体ヒンジ領域のポリペプチド鎖は２つの鎖の間にジスルフィド結合を形成することができる。本発明の好ましいヒンジ領域はは、天然配列のヒトヒンジ領域、例えば天然配列のヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
【００５６】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つの「エフェクター機能」を有する。例示的「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーション等が含まれる。このようなエフェクター機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わさることを必要とし、そのような抗体のエフェクター機能を評価するための当技術分野で既知の様々なアッセイを使用して評価される。
【００５７】
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に由来するＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する。「変異体ポリペプチドを含む。天然配列のヒトＦｃ領域には、天然配列のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域(非Ａ-及びＡアロタイプ)；天然配列のヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域；及び天然配列のヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域；並びにその自然に生じる変異体が含まれる。
【００５８】
「インタクトな」抗体は、抗原結合可変領域、並びに軽鎖定常ドメイン(ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を有するものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体でありうる。好ましくは、インタクトな抗体は、一又は複数のエフェクター機能を有する。
【００５９】
「親抗体」又は「野生型」抗体は、ここに開示された抗体変異体と比較して一又は複数のアミノ酸配列改変を欠くアミノ酸配列を含む抗体である。よって、親抗体は一般にここに開示された抗体変異体の対応する高頻度可変領域のアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる少なくとも一つの高頻度可変領域を有している。親ポリペプチドは、天然配列（つまり天然に生じる）抗体（天然に生じる対立遺伝子変異体）、又は天然に生じる配列の既存のアミノ酸配列修飾（例えば挿入、欠失及び／又は他の改変）を有する抗体を含みうる。開示全体を通して、「野生型」、「ＷＴ」、「ｗｔ」及び「親」又は「親の」抗体は交換可能に使用される。
【００６０】
ここで使用される場合、「抗体変異体」又は「変異体抗体」は、親抗体のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する抗体を意味する。好ましくは、抗体変異体は、天然には見出されないアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインを含む。かかる変異体は親抗体と１００％未満の配列同一性又は類似性を必ず有している。好ましい実施態様では、抗体変異体は、親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインの何れかのアミノ酸配列と、約７５％から１００％未満、より好ましくは約８０％から１００％未満、より好ましくは約８５％から１００％未満、より好ましくは約９０％から１００％未満、及び最も好ましくは約９５％から１００％未満のアミノ酸配列同一性又は類似性があるアミノ酸配列を有する。抗体変異体は一般に一又は複数のその高頻度可変領域中に又はそれに隣接して一又は複数のアミノ酸変更を含むものである。
【００６１】
「可変Ｆｃ領域」は、少なくとも一つのアミノ酸修飾により天然配列Ｆｃ領域のものとは異なるアミノ酸配列を有する。ある実施態様では、変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、例えば、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域に約１から約１０のアミノ酸置換、及び好ましくは約１から約５のアミノ酸置換を有する。例えば、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域に約１から約１０のアミノ酸置換、及び好ましくは約１から約５のアミノ酸置換を有する。ここでの変異体Ｆｃ領域は、典型的には、例えば、天然配列Ｆｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性、又はそれらと少なくとも約９０％の配列同一性、又はそれらと少なくとも約９５％の配列同一性を有する。
【００６２】
抗体「エフェクター機能」は抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に帰因するその生物学的活性を意味する。抗体エフェクター機能の例は、Ｃｌｑ結合及び補体依存性細胞傷害性；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ＡＤＣＣ)；食作用；細胞表面受容体のダウンレギュレーション(例えばＢ細胞受容体)；及びＢ細胞活性化を含む。
【００６３】
「抗体依存性細胞媒介細胞傷害性」又は「ＡＤＣＣ」は、ある種の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)に結合した分泌Ｉｇはこれらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒で標的細胞を死滅させ得る細胞傷害性の形態を意味する。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞うち、ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の464ページの表３に要約されている。関心ある分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第5,500,362号又は同5,821,337号に記述されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）が含まれる。あるいは又は加えて、関心ある分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynesら, PNAS (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価してもよい。
【００６４】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。ある実施態様では、その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣｓとＮＫ細胞が好適である。エフェクター細胞はそれらの天然供給源、例えばここに記載される血液又はＰＢＭＣ等から単離されてもよい。
【００６５】
「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載するために使用される。幾つかの実施態様では、ＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。幾つかの実施態様では、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性型受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害型受容体」）が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型受容体FcγRIIAは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫受容体活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ITAM)を含んでいる。阻害型受容体ＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫受容体阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ITIM)を含んでいる(Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994);及びde Haas等, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に総説されている。他のＦｃＲは、ここでは、将来的に同定されるものも含めて、「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。
【００６６】
また、「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」なる用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送と(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie等, Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton等, J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton等)を参照)。
【００６７】
インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又は変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。国際公開公報００／４２０７２(Presta) にＦｃＲへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。例としてShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
【００６８】
「補体依存性細胞傷害性」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を意味する。古典的補体経路の活性化は、その同族抗原に結合する（適切なサブクラスの）抗体への補体系の第１の成分(Ｃｌｑ)の結合により開始される。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているようなＣＤＣアッセイを実施することができる。改変されたＦｃ領域アミノ酸配列（変異Ｆｃ領域を有するポリペプチド）及び増加又は減少されたＣ１ｑ結合能力を有するポリペプチド変異体が、例えば米国特許第6,194,551 B1号及びWO 1999/51642に記載されている。例えばIdusogie等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)も参照のこと。
【００６９】
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有さない抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改善を生じせしめるその一又は複数のＣＤＲにおける一又は複数の改変を伴うものである。一実施態様では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当技術分野で公知の手法により生産される。Marks等 Bio/Technology 10:779-783 (1992)は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟を記述する。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム変異誘発が、Barbas等 Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier等 Gene 169:147-155 (1995);Yelton等 J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson等, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); and Hawkins等 J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)により記載されている。
【００７０】
「治療用抗体」なる用語は疾患の治療に使用される抗体を意味する。治療用抗体は様々な作用機序を有しうる。治療用抗体は抗原に結合し、抗原に関連した標的の正常な機能を中和しうる。例えば、癌の生存に必要とされるタンパク質の活性を阻止するモノクローナル抗体は細胞死を引き起こす。他の治療用抗体は抗原に結合し、抗原に関連した標的の正常な機能を活性化させうる。例えば、モノクローナル抗体は細胞上のタンパク質に結合しアポトーシスシグナルを惹起させうる。また他のモノクローナル抗体は疾患組織にのみ発現される標的抗原に結合しうる；モノクローナル抗体への毒性ペイロード(有効な薬剤)、例えば化学療法剤又は放射性剤のコンジュゲーションは、疾患組織への毒性ペイロードの特異的送達のための薬剤をつくり、健康な組織への害を減少させることができる。治療用抗体の「生物学的に機能的な断片」は、インタクトな抗体に起因する生物学的機能の幾らか又は全てとはいかないまでも少なくとも一つを示し、該機能は標的抗原への特異的結合を少なくとも含む。
【００７１】
抗体は何れのタンパク質にも結合し得、限定するものではないが、ＨＥＲ受容体ファミリーのメンバー、例えばＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、及びＣＤ３４；細胞接着分子、ＬＦＡ-１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ-４、ＩＣＡＭ-１、ＶＣＡＭ及びαｖ／β３インテグリン（それらのα又はβサブユニットを含む（例えば抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体））；増殖因子、ＶＥＧＦ等；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；及びプロテインＣを含む。他の例示的なタンパク質は、成長ホルモン（ＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）を含む；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α-１-アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば第ＶＩＩＩＣ因子、組織因子及びヴォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えばプロテインＣ；心房ナトリウム利尿因子；肺表面活性物質；プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；腫瘍壊死因子-α及び-β；エンケファリナーゼ；ランテス（ＲＡＮＴＥＳ (regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ-１-α）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）；ミュラー管抑制因子；リラキシンＡ-鎖；リラキシンＢ-鎖；プロ・リラキシン；マウス・ゴナドトロピン関連ペプチド；デオキシリボヌクレアーゼ；インヒビン；アクチビン；ホルモン類又は増殖因子の受容体；プロテインＡ又はＤ；リウマトイド因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン-３、-４、-５又は-６（ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＮＴ-５、ＮＴ-６）、又は神経成長因子、例えばＮＧＦ-β；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子、例えばａＦＧＦ及びｂＦＧＦ；上皮成長因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング成育因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦアルファ及びＴＧＦベータ、ＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４又はＴＧＦ-β５を含む；インスリン様増殖因子-Ｉ及び-ＩＩ（ＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦＩＩ）；ｄｅｓ（１-３）-ＩＧＦ-Ｉ（脳ＩＧＦ-Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン-α、-β、及び、-γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ及びＧ-ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ-１からＩＬ-１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表層膜タンパク質；崩壊促進因子（ＤＡＦ）；ウィルス抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；イムノアドヘシン；抗体；及び上に挙げたポリペプチドの何れか���生物学的に活性な断片又は変異体を含む。多くの他の抗体及び／又は他のタンパク質が本発明により使用されることが可能であり、上記リストは限定するものではない。
【００７２】
特に興味深い治療用抗体は、臨床腫瘍学的実践又は開発におけるものを含み、例えば市販のＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、ＲＡＰＴＩＶＡ（登録商標）（エファリズマブ）、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ）、及びＸＯＬＡＩＲ（登録商標）（オマリズマブ）、並びに抗アミロイドβ（Ａβ）、抗ＣＤ４（ＭＴＲＸ１０１１Ａ）、抗ＥＧＦＬ７（ＥＧＦ様ドメイン７）、抗ＩＬ１３、Ａｐｏｍａｂ（抗ＤＲ５標的アポトーシス促進性受容体アゴニスト（ＰＡＲＡ）、抗ＢＲ３（ＣＤ２６８、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＡＦＦ-Ｒ、ＢＡＦＦ受容体）、抗β７インテグリン・サブユニット、ダセツズマブ（抗ＣＤ４０）、ＧＡ１０１（抗ＣＤ２０モノクローナル抗体）、ＭｅｔＭＡｂ（抗ＭＥＴ受容体チロシンキナーゼ）、抗ニューロピリン-１（ＮＲＰ１）、オクレリズマブ（抗ＣＤ２０抗体）、抗-ＯＸ４０リガンド、抗酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）、ペルツズマブ（ＨＥＲ二量体化阻害剤（ＨＤＩ）、及びｒｈｕＭＡｂ ＩＦＮα等である。
【００７３】
抗体の「生物学的に機能的な断片」は無傷の抗体の一部分のみを含み、ここで、該部分は無傷抗体に存在する場合、その部分に通常は関連する機能の少なくとも一つ、多い場合は殆ど又は全てを保持している。一実施態様では、抗体の生物学的に機能的な断片は無傷抗体の抗原結合部位を含み、よって抗原に結合する能力を保持している。他の実施態様では、抗体の生物学的に機能的な断片、例えばＦｃ領域を含むものは、無傷抗体に存在する場合、Ｆｃ領域に通常関係する生物学的機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合の少なくとも一つを保持する。一実施態様では、抗体の生物学的に機能的な断片は無傷抗体と実質的に同様なインビボ半減期を有する一価抗体である。例えば、抗体のかかる生物学的に機能的な断片は断片にインビボ安定性を付与することができるＦｃ配列に結合した抗原結合アームを含みうる。
【００７４】
「診断タンパク質」という用語は、疾患の診断に使用されるタンパク質を意味する。
「診断用抗体」なる用語は、疾患のための診断用試薬として使用される抗体を意味する。診断用抗体は、特定の疾患に特に関連し、又はそこでの発現増加を示す標的抗原に結合しうる。診断用抗体は、例えば、患者からの生体試料、又は患者における腫瘍のような疾患部位の診断画像における標的を検出するために使用することができる。診断用抗体の「生物学的に機能的な断片」は、インタクトな抗体に起因する生物学的機能の幾らか又は全てとはいかないまでも少なくとも一つを示し、該機能は標的抗原への特異的結合を少なくとも含む。
「精製された」は、分子が、それが含まれている試料の少なくとも８０−９０重量％の濃度で試料中に存在することを意味する。精製されたタンパク質は、抗体を含み、好ましくは本質的に純粋であり望ましくは本質的に均一である（つまり混在タンパク質を含まない）。
【００７５】
「本質的に純粋な」タンパク質は、組成物の全重量に基づいて少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％のタンパク質を含むタンパク質組成物を意味する。
「本質的に均質な」タンパク質は、組成物の全重量に基づいて少なくとも約９９重量％のタンパク質を含むタンパク質組成物を意味する。
【００７６】
ここで使用される場合、「可溶な」とは、水溶液中において完全に溶存し、目視で評価して、可視できる粒子がなく透明からわずかに乳白色の溶液になることを意味する。溶液の濁度(又はタンパク質の溶解度)のさらなるアッセイは１ｃｍ経路長セルを用い、３４０〜３６０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することより実施され、２０ｍｇ／ｍｌの濁度は０．０５吸光単位未満である。
【００７７】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され及び単離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク様又は非タンパク様溶質が含まれる。ある実施態様では、抗体は、（１）例えばローリー法で測定したときに９５重量％より多くの抗体まで、ある実施態様では９９重量％より多くの抗体まで、（２）例えばスピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度に、あるいは、（３）例えばクーマシーブルーあるいは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで、精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツ抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
【００７８】
「プロテインＡ」と「ＰｒｏＡ」という用語はここでは交換可能に使用され、その天然源から回収されるプロテインＡ、合成的に（例えば、ペプチド合成あるいは組換え技術により）産生されるプロテインＡ、及びＦｃ領域のようなＣＨ２／ＣＨ３領域を持つタンパク質と結合する能力を保持しているその変異体を包含する。プロテインＡはRepligen、Pharmacia及びFermatechから商業的に購入することができる。プロテインＡは一般に固相担体材料上に固定化される。「ＰｒｏＡ」なる用語もまたプロテインＡが共有結合したクロマトグラフィー固体担体マトリックスを含むアフィニティクロマトグラフィー樹脂又はカラムを意味する。
【００７９】
「クロマトグラフィー」なる用語は、混合物中の対象の溶質が、混合物の個々の溶質が移動相の影響下で、又は結合及び溶離プロセスにおいて、静止媒体を通して移動する速度の差の結果として混合物中の他の溶質から分離されるプロセスを意味する。
【００８０】
「アフィニティクロマトグラフィー」及び「プロテインアフィニティクロマトグラフィー」なる用語はここでは交換可能に使用され、対象のタンパク質又は対象の抗体が可逆的かつ特異的に生体分子特異的リガンドに結合されるタンパク質分離技術を意味する。好ましくは、生体分子特異的リガンドは、クロマトグラフィー固相物質に共有的に結合し、溶液がクロマトグラフィー固相材料に接触するとき溶液中の対象のタンパク質に接近可能である。対象のタンパク質（例えば抗体、酵素、又は受容体タンパク質）はクロマトグラフィー工程中に生体分子特異的リガンド（例えば抗原、基質、共因子、又はホルモン）に対するその特異的結合親和性を保持する一方、混合物中の他の溶質及び／又はタンパク質はリガンドには有意には又は特異的には結合しない。固定されたリガンドへの対象のタンパク質の結合は、汚染タンパク質又はタンパク質不純物がクロマトグラフィー媒体を通過することを許容する一方、対象のタンパク質は固相物質上の固定化リガンドに特異的に結合したままである。ついで、対象の特異的に結合したタンパク質は低ｐＨ、高ｐＨ、高塩、競合リガンド等で固定化リガンドから活性形態で除去され、先にカラムを通過することが可能にされた汚染タンパク質又はタンパク質不純物を含まない溶離バッファーと共にクロマトグラフィーカラムを通過させられる。任意の成分を、その各特異的な結合タンパク質、例えば抗体を精製するためのリガンドとして使用することができる。
【００８１】
「非アフィニティクロマトグラフィー」及び「非アフィニティ精製」なる用語は、アフィニティクロマトグラフィーが利用されない精製プロセスを意味する。非アフィニティクロマトグラフィーは、対象の分子（例えばタンパク質、例えば抗体）及び固相マトリックス間の非特異的相互作用に依存するクロマトグラフィー技術を含む。
【００８２】
「カチオン交換樹脂」は負に荷電し、よって、固相の上又は中を通過する水溶液中のカチオンと交換される遊離のカチオンを有する固相を意味する。固相に結合してカチオン交換樹脂を形成する負に荷電したリガンドは、例えば、カルボキシレート又はスルホネートでありうる。市販のカチオン交換樹脂は、カルボキシ-メチル-セルロース、アガロース上に固定化されたスルホプロピル（ＳＰ）（例えば、SP-SEPHAROSE FAST FLOW又はSP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE(商標)、Pharmacia製）及びアガロース上に固定化されたスルホニル（例えば、S-SEPHAROSE FAST FLOW(商標)、Pharmacia製）を含む。「混合モードイオン交換樹脂」はカチオン、アニオン、及び疎水性部分で共有的に修飾された固相を意味する。市販の混合モードイオン交換樹脂は、弱いカチオン交換基、低濃度のアニオン交換基、及びシリカゲル固相支持体マトリックスに結合した疎水性リガンドを含むBAKERBOND ABXTM(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)である。
【００８３】
「アニオン交換樹脂」は、例えばそれに結合した第４級アミノ基等の一又は複数の正荷電リガンドを有する、正に荷電した固相を意味するためにここで使用される。市販のアニオン交換樹脂は、ＤＥＡＥセルロース、QAE SEPHADEXTM及びFAST Q SEPHAROSETM (Pharmacia)を含む。
【００８４】
「バッファー」は、その酸-塩基結合成分の作用によりｐＨ変化に抗する溶液を意味する。例えばバッファーの所望のｐＨに応じて使用できる様々なバッファーが、Biological Systems, Gueffroy, D.,版 Calbiochem Corporation (1975)に記載されている。一実施態様では、バッファーは、約２から約９、あるいは約３から約８、あるいは約４から約７、あるいは約５から約７の範囲のｐＨを有する。この範囲内にｐＨを制御するバッファーの非限定的例は、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、トリス、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、及びアンモニウムバッファー、並びにこれらの組み合わせを含む。
【００８５】
「負荷バッファー」は、対象とするポリペプチド分子及び一又は複数の不純物を含む組成物をイオン交換樹脂に負荷するのに使用するものである。負荷バッファーは、対象とするポリペプチド分子（及び一般には一又は複数の不純物）がイオン交換樹脂に結合するような、又は対象のタンパク質が不純物が樹脂に結合している間、カラムを通過するような、伝導率及び／又はｐＨを有する。
【００８６】
「中間バッファー」は、対象とするポリペプチド分子の溶離に先立って、一又は複数の不純物をイオン交換樹脂から溶離するのに使用される。中間バッファーの伝導率及び／又はｐＨは、一又は複数の不純物がイオン交換樹脂から溶離されるが、対象とするポリペプチドの有意な量は溶離されないようなものである。
【００８７】
「洗浄バッファー」なる用語は、ここで用いられる場合、対象とするポリペプチド分子の溶離に先立って、イオン交換樹脂を洗浄又は再平衡化するのに使用されるバッファーを意味する。簡便には、洗浄バッファー及び負荷バッファーは同じであってもよいが、そうである必要はない。
「溶離バッファー」は、対象とするポリペプチドを固相から溶離するのに使用される。溶離バッファーの伝導率及び／又はｐＨは、対象とするポリペプチドがイオン交換樹脂から溶離されるようなものである。
【００８８】
「再生バッファー」は、イオン交換樹脂を再生してそれが再利用できるようにするのに使用される。再生バッファーは、実質的に全ての不純物と対象とするポリペプチドをイオン交換樹脂から除去するのに必要な伝導率及び／又はｐＨを有する。
【００８９】
ここで使用される「実質的に同様の」又は「実質的に同じ」なる用語は、当業者が、２つの値の差異が、該値（例えばＫｄ値）により測定される生物学的特徴の点において生物学的及び／又は統計的有意性が殆どないか又はないと考えるように、２つの数値（例えば一方は本発明の抗体に関連し、他方は参照／コンパレータ抗体）の間に十分に高度な類似性があることを示す。前記２つの値の差異は、参照／コンパレータ抗体値の関数として、例えば約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、及び／又は約１０％未満である。
【００９０】
「実質的に低減」又は「実質的に異なる」は、量又は数的値に関してここで使用される場合（化学的工程の還元への参照としてではなく）、２つの数値（一般的に一つは分子に関連し他方は参照／コンパレータ分子に関連する）間の十分に高い度合いでの差異を示し、当業者であれば、該値(例えばＫｄ値)により測定される生物学的特徴の範囲内で、２つの値の間に、統計的に有意な差異があるとみなすであろう。前記２つの値の間の差異は、例えば、参照／コンパレータ分子に対する値の関数として、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、及び／又は約５０％以上である。
【００９１】
ここで使用される「ベクター」なる用語は、それが連結している他の核酸を輸送することのできる核酸分子を意味するものである。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは付加的なＤＮＡセグメントがライゲートされうる環状二本鎖ＤＮＡを意味する。他のタイプのベクターはファージベクターである。他のタイプのベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムへライゲーションすることができる。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞内において自己複製することができる(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入によって宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、宿主ゲノムと共に複製される。更に、ある種のベクターは、それらが作用可能に連結している遺伝子の発現を方向づけ得る。このようなベクターは、ここでは、「組換え発現ベクター」、あるいは単に「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術で利用される発現ベクターは、しばしばプラスミドの形をとる。本明細書では、プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」及び「ベクター」を交換可能に使用することができる。
【００９２】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要ならば間隙を導入し、如何なる同類置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって著作され、そのソースコードは米国著作権庁(ワシントン D.C.，20559)に使用者用書類と共に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社（サウスサンフランシスコ, カリフォルニア）から公的に入手可能であり、又はソースコードからコンパイルされうる。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされなければならない。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され、変動しない。
【００９３】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対するある程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。
【００９４】
アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることが理解されるであろう。特に断らない限りは、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて直ぐ上の段落に記載されるようにして得られる。
【００９５】
「パーセント(％)核酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後の、参照Ｄ因子コード配列中のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ついで、配列同一性はより長い配列に対して計算される。すなわち、たとえより短い配列がより長い配列の一部と１００％の配列同一性を示すとしても、全体の配列同一性は１００％未満となろう。
【００９６】
「治療」は治療的処置及び予防又は阻害的処置の両方を意味する。治療が必要なものには、既に疾患に罹患しているもの並びに予防すべき疾患あるものが含まれる。ここでの「治療」は疾患及び特定の疾患の徴候及び症状の軽減を包含する。
「障害」とはタンパク質による治療から利益を被る何れかの状態である。これには慢性及び急性の障害又は疾患、例えば問題となる障害に哺乳類を罹患し易くする病理学的状態を包含する。本明細書において治療すべき障害の非限定的な例は、癌腫及びアレルギーを含む。
【００９７】
治療の目的のための「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物、例えばヒト、非ヒト高等霊長類、他の脊椎動物、家畜、及び動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００９８】
Ｂ．本発明を実施するための例示的な方法及び材料
本発明の実施には、特に示さない限り、当業者の技量内にある分子生物学の一般的技法等を用いる。このような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook等, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel等,版, 1987 updated); Essential Molecular Biology (T. Brown版, IRL Press 1991); Gene Expression Technology (Goeddel版, Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell等,版, Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology II (R. Wu等,版, Academic Press 1995); PCR:A Practical Approach (M. McPherson等, IRL Press at Oxford University Press 1991); Oligonucleotide Synthesis (M. Gait版, 1984); Cell Culture for Biochemists (R. Adams版, Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller & M. Calos版, 1987); Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler版, 1991); Animal Cell Culture (J. Pollard等,版, Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, 2nd版 (R. Freshney等,版, Alan R. Liss 1987); Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed等,版, Wiley-Liss 1990); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.);Wirth M. and Hauser H. (1993); Immunochemistry in Practice, 3rd edition, A. Johnstone & R. Thorpe, Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996; Techniques in Immunocytochemistry, (G. Bullock & P. Petrusz版, Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989); Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir & C. Blackwell,版); Current Protocols in Immunology (J. Coligan等,版 1991); Immunoassay (E. P. Diamandis & T.K. Christopoulos,版, Academic Press, Inc., 1996); Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed) Academic Press, New York; Ed Harlow and David Lane, Antibodies A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Antibody Engineering, 2nd edition (C. Borrebaeck,版, Oxford University Press, 1995);及びthe series Annual Review of Immunology; the series Advances in Immunologyを参照。
【００９９】
１．グルタミンフリー細胞培養培地を用いた哺乳動物宿主細胞におけるタンパク質の組換え生産
本発明は哺乳動物宿主細胞における大量タンパク質組換え生産に関し、アスパラギンで補充されたグルタミンフリー細胞培養培地を使用する。哺乳動物細胞は、主に、適切に折畳まれ組み合わせられた異種タンパク質を生産するそれらの能力、及び翻訳後修飾のそれらの能力のために、臨床利用のための哺乳動物タンパク質の産生の主要なシステムとなった。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及び様々な他の哺乳動物源から得られた細胞株、例えばマウスミエローマ（ＮＳ０）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ-２９３）及びヒト網膜細胞が、治療用抗体を含む生物製剤の生産に対して規制当局によって承認されている。これらのうち、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）が最も一般的に使用されている工業的宿主であり、異種タンパク質の生産に一般的に使用されている。よって、ジヒドロ葉酸レダクターゼネガティブ（ＤＨＦＲ-）ＣＨＯ細胞を含むＣＨＯにおける大規模な抗体の生産方法が当該分野でよく知られている（例えば、Trill等, Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):553-60 (1995)を参照)。
【０１００】
最初に、所望の組換えタンパク質をコードする核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)は、クローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含み、各々は下に記載されている。用いられうる任意のシグナル配列、複製開始点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、及び転写終結配列は公知であり、PCT Publication WO 97/25428に更に詳細に記載される。
【０１０１】
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、タンパク質コード化核酸配列に機能的に連結されたプロモータを含む。プロモータは、構造遺伝子の開始コドンの上流（５’）に位置する否翻訳配列であり（一般に約１００〜１０００ｂｐ以内）、それらが機能的に連結する特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する。このようなプロモーターは典型的に誘導的及び構成的の２クラスに分類される。誘導的なプロモーターは、養分の有無又は温度変化等の培養条件のある変化に対応してその制御の下でＤＮＡからの転写レベルを上昇させるプロモーターである。現時点で、多種の潜在宿主細胞により認識される非常に多くのプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素の消化によって供給源ＤＮＡからプロモーターを排除し、ベクターに単離したプロモーター配列を挿入することで、所望のタンパク質をコードするＤＮＡに機能的に結合している。
【０１０２】
原核生物及び真核生物宿主との使用に適したプロモーターは当技術分野で公知であり、PCT Publication No. WO97/25428に更に詳細に記載されている。
上に列挙した成分の一又は複数を含んでなる適切なベクターの構築は、標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片は、切断され、調整され、所望の形態に再ライゲーションされ、必要なプラスミドを生成する。
構築したプラスミド中の正しい配列を確認するための分析には、通例、ライゲーション混合物を用いて大腸菌Ｋ１２ ２９４株（ATCC31,446）を形質転換し、成功した形質転換体を適宜アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択することができる。それらの形質転換体からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化、及び／又は当該分野で公知の標準的な技術を使用して配列化させることにより分析する(例えば、Messing等, Nucleic Acids Res. 1981, 9:309; Maxam等, Methods in Enzymology 1980, 65:499)。
【０１０３】
哺乳動物細胞において一過性に発現させる発現ベクターを使用してもよい。一般に、一過性発現は、宿主細胞が、発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次いで、発現ベクターによりコードされる所望のポリペプチドが高レベルで合成されるように、宿主細胞において十分に複製可能な発現ベクターを使用することを含む(Sambrook等, 上掲)。適切な発現ベクター及び宿主細胞を含む一過性発現系は、クローンＤＮＡによりコードされるポリペプチドの簡便なポジティブな同定、並びに所望の生物学的又は生理学的特性についてのかかるポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。
【０１０４】
組換え脊椎動物細胞培養での所望の異種タンパク質の合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 1981, 293:620-625 ； Mantei等, Nature 1979, 281:40-46；欧州特許第117060号；及び欧州特許第117058号に記載されている。
大量生産のために、本発明によると、哺乳動物宿主細胞はトランスフェクトされ、好ましくは上記の発現ベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増殖のために適切に修飾された栄養培地で培養される。
トランスフェクトは、任意のコード化配列が、実際に発現するか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを称する。多くのトランスフェクトの方法、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションは、通常、当業者に知られている。成功裏のトランスフェクトは、このベクターの操作の任意の表示が宿主細胞内で生じる場合に、一般的に認識される。
【０１０５】
形質転換とは、染色体外要素として又は染色体組込み体により、ＤＮＡが複製可能なように生物にＤＮＡを導入することを意味する。使用する宿主細胞に従い、形質転換はかかる細胞に適切な標準技術を使用して行われる。上掲Sambrook等に記載のような塩化カルシウムを使用するカルシウム処理、又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物又は細胞壁バリアを有する他の細胞に使用される。アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いた感染が特定の植物細胞の形質転換に使用され、(Shaw等, Gene 1983, 23:315及びPCT Publication No. WO 89/05859)に記載される。更に、植物は超音波処理を使用して形質移入されうる、PCT Publication No. WO 91/00358 published 10 January 1991。
【０１０６】
このような細胞壁を持たない哺乳動物細胞には、リン酸カルシウム沈殿法(Graham and van der Eb, Virology 1978, 52:456-457)が用いられうる。哺乳動物細胞宿主システム形質転換の一般的な態様は、米国特許第4,399,216号に記載される。哺乳動物細胞の形質転換のための様々な技術は、また、Keown等 Methods in Enzymology 1990, 185:527-537及びMansour等 Nature 1988, 336:348-352を参照。
【０１０７】
通常、大規模生産の間、生産周期を開始するために、通常は少数の形質転換組換え宿主細胞を数日間培養にて増殖させる。一旦細胞が数回の複製を受けたところで、それらを、発酵を受ける準備がなされているより大きな容器に移す。細胞が増殖される培地及び生産サイクル中に存在する酸素、窒素及び二酸化炭素のレベルは生産プロセスに対して有意な影響を有しうる。増殖パラメータは各細胞株に対して特に決定され、これらのパラメータは最適な増殖及び生産条件を確保するために頻繁に測定される。
【０１０８】
細胞が十分な数まで増殖したところで、それらは大規模な生産タンクに移され、より長い期間、増殖される。プロセスのこの時点で、組換えタンパク質を収集することができる。典型的には、細胞を操作して細胞培養培地中にポリペプチドを分泌させるので、精製プロセスの第一工程は培地から細胞を分離することである。収集は、通常、収集細胞培養液(HCCF)を生産するための遠心分離と濾過を含む。ついで、培地に、細胞片、望まれないタンパク質、塩、ミネラル分他は他の望まれない元素を除去する更なる数工程の精製工程を施す。精製プロセスの終わりでは、タンパク質は非常に純粋で、ヒトの治療用途に適している。
【０１０９】
このプロセスは過去数十年にわたって多くの研究と改良の主題であったが、抗体等組換えタンパク質の大規模な商業的生産において更なる改善の余地がある。従って、哺乳類宿主細胞培養の細胞生存度、寿命、及び比生産性の増加、及び生産される組換えタンパク質の力価の改善は、生産される組換えタンパク質の価格に、また治療用タンパク質の場合は薬物生産物の価格及び可用性に真の影響を有する。
【０１１０】
本発明は、細胞培養過程の生産期において添加アスパラギンを有するグルタミンフリー培養培地を用いた、哺乳動物細胞培養における異種タンパク質の生産のための改良された方法に関する。本発明の過程において使用される培養培地は、哺乳動物宿主細胞におけるタンパク質の組換え生産のための何れかの市販の培地に基づくことが可能であり、特にＣＨＯ細胞である。
【０１１１】
市販の培養培地の例は、ハムＦ１０（Sigma）、基礎培地（「ＭＥＭ」（Sigma））、ＲＰＭＩ-１６４０（Sigma）、及びダルベッコ変法イーグル培地（「ＤＭＥＭ」（Sigma））を含む。何れのこのような培地は、必要に応じて、ホルモン及び／又はその他増殖因子（例えばインスリン、トランスフェリン又は上皮細胞成長因子）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、バッファー（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えばＧｅｎｔａｍｙｃｉｎＴＭ薬）、微量元素（最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される）及びグルコース又は等価なエネルギー源で補充されてもよい。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。更に、本発明の培養培地は、グルタミンが成分として除外されているならば、Ham and McKeehan, Meth. Enz., 58: 44 (1979); Barnes and Sato, Anal. Biochem., 102: 255 (1980);米国特許第4,767,704号;米国特許第4,657,866号;米国特許第4,927,762号;米国特許第5,122,469号又は米国特許第4,560,655号;WO 90/03430;及びWO 87/00195に記載される何れかの培地に基づくこと可能である。
【０１１２】
グルタミンフリー条件下ではアスパラギンが必要とされ、これは哺乳動物細胞はグルタミンの存在下においてのみアスパラギンを合成できるからである。アスパラギンは、アスパラギン合成酵素が存在する場合にグルタミンからアミド転移により合成される。アスパラギンは、好ましくは２．５ｍＭ〜１５ｍＭの範囲の濃度で培地に加えられる。本発明の様々な実施態様おいて、アスパラギンの好ましい濃度は少なくとも２．５ｍＭでなければならない。好ましい実施態様では、アスパラギンは１０ｍＭの濃度で加えられる。
一般に、哺乳動物細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコル及び実用的な技術は、ここに記載の細胞培養培地を用いた組換えタンパク質の生産に見い出され、また適合されることができる。
【０１１３】
特定の細胞株に対する培地のための必要な成分及び増殖因子は、それらの濃度を含め、過度の実験法を用いることなく経験的に決定され、例えばMammalian Cell Culture, Mather,版 (Plenum Press: NY, 1984); Barnes and Sato, Cell, 22: 649 (1980) or Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler,版 (IRL Press, 1991)に記載される。適切な培地は、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ-１２に基づく配合などの基本培地成分を有し（ＤＭＥＭ及びＨＡＭ Ｆ１２培地及び特に無血清培地の組成については、American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, Sixth Edition, 1988, pages 346-349に記載の培養培地配合を参照）、アミノ酸、塩類、糖及びビタミン等の幾つかの成分の濃度の変更を伴い、場合によっては、グリシン、ヒポキサンチン及びチミジン；組換え型ヒトインスリン、加水分解ペプトン、例えばPRIMATONE HSO又はPRIMATONE RLO (Sheffield, England)、又は等価なもの；細胞保護剤、例えばPLURONIC F68O又は等価なプルロニックポリオル；GENTAMYCINO；及び微量元素を含む。特定のアミノ酸の高レベルの存在により特徴付けられる米国特許第5,122,469号に記載の培地の配合、並びに下記のＰＳ-２０は特に適切である。
【０１１４】
本発明の糖タンパク質は、多様な細胞培養条件下で所望する糖タンパク質を発現する成長細胞によって生産され得る。例えば、大規模又は小規模なタンパク質の生産のための細胞培養手順が本発明において潜在的に有用である。これに限定するものではないが、流動床バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、ローラーボトル培養、又は攪拌タンクバイオリアクターシステムを含む手順が使用され、後者の２つのシステムではマイクロキャリアを伴うか伴わず、バッチ式、流加式、又は連続式で操作される。
【０１１５】
特定の実施態様では、本発明の細胞培養は、攪拌タンクバイオリアクターシステム及び流加式培養法によって行われる。好ましい流加式培養では、哺乳動物宿主細胞及び培養培地は培養容器へ最初に供給され、さらなる培養培養栄養分は、培養の停止前に周期細胞及び／又は生産物の収集を伴うか伴わず、連続的に又は不連続的な増量によって培養中の培養液へ供給される。流加式培養は、例えば、定期的に全培養液(細胞及び培地を含む）を除き、そして新鮮な培地に置き換える、半連続式流加培養を含むことが可能である。流加式培養は、培養過程が開始される時点において細胞培養に対する全ての構成成分（細胞及び全ての培養栄養分を含む）が培養容器へ供給され、単純培養法とは異なる。さらに、流加式培養は、上清が培養過程中に培養容器から取り除かれない点においては、灌流培養法とは区別され得る（灌流培養において細胞は、例えば、濾過、封入、マイクロキャリアーへ固定する等により培養物中へ拘束され、培養液は連続的もしくは断続的に導入され、そして培養容器から取り除かれる）。
【０１１６】
さらに、培養される細胞は、考え得る所定の宿主細胞及び所定の生産計画に適した計画もしくは定法のいずれかに従って繁殖され得る。従って、本発明では、単一段階又は複数の段階による培養方法を考慮する。単一段階培養において、宿主細胞は培養環境へ接種され、速やかな発明の処理過程が、細胞培養の単一段階培養期の間利用される。場合によっては、複数段階培養が想定される。複数段階培養において、細胞は幾つかの段階又は時期において培養されてもよい。例えば、細胞は、おそらく保存サンプルから取り出され増殖及び良好な生存性を促進するのに適した培地へ接種されるような最初の段階又は増殖期培養にて増殖され得る。細胞は、宿主細胞培養物に新しい培養液を添加することにより適当な一時期間、増殖期に維持されてもよい。
【０１１７】
本発明の好ましい状態に従って、流加式又は連続的細胞培養条件は、細胞培養の増殖期において哺乳類細胞の成長を促進するために、工夫される。温度、ｐＨ、溶存酸素（ＤＯ２）及びこれに同種の培養条件は、所定の宿主の用いられるもので、当業者にとって明らかである。通常、ｐＨは酸（例えば、ＣＯ２）又は塩基（例えば、Ｎａ２ＣＯ３又はＮａＯＨ）約６．５から７．５の間のレベルに設定される。ＣＨＯ細胞のような哺乳類細胞を培養するために適切は温度範囲は、３０から４０℃の間であって、好ましくは３７℃であり、適切なＤＯ２は大気飽和濃度が５から９０％である。
所定の段階において、細胞は細胞培養の生産期又は生産段階のものを接種するために使用され得る。場合によっては、上述したように生産期又は生産段階は接種もしくは増殖期又は増殖段階と連続てきであってもよい。
【０１１８】
哺乳類、例えばＣＨＯ細胞における標的タンパク質の生産は典型的には、半連続プロセスを使用し、これにより細胞は様々な期間で「シードトレイン」中で培養され、接種用の発酵槽へ周期的に移され、大規模に生産発酵槽に播種するよう十分な細胞量を生成される。このように、所望のタンパク質の生産に使用される細胞は、最大の所定の細胞齢までの様々な期間培養される。培養中のシード密度、ｐＨ、ＤＯ２及び温度、生産培養の持続時間、回収の作動条件等の細胞培養プロセスのパラメーターは、使用される特定細胞株及び培養培地の関数であり、過度の実験法無しに経験的に決定されることができる。本発明に従い、細胞培養の産生期の間、細胞培養環境が制御される。好ましい態様では、細胞培養過程の生産期は、細胞培養の生産期に対するパラメーターが保証される細胞培養の過渡期によって先行される。
【０１１９】
抗体等の所望のポリペプチドは、分泌シグナルを持たずに直接精製された場合には宿主細胞溶解物から回収するが、分泌したポリペプチドとして培養培地から回収してもよい。ポリペプチドが膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて膜から切り離すか、又は酵素的切断によりその細胞外領域を切り離すことができる。
ポリペプチドがヒト起源のもの以外の組み換え細胞内で生成される場合、ヒトのタンパク質ないしポリペプチドは含まない。しかしながら、通常は所望のポリペプチドに関して実質的に均一な調製物を得るために組み換え細胞タンパク質ないしポリペプチドからポリペプチドを回収ないし精製することが必要である。第一工程として、培養培養液ないし溶解物を遠心分離して粒子状の細胞破壊物を取り除く。その後異種ポリペプチドは、適切な精製手順の例である次の手順により、夾雑物溶質性タンパク質及びポリペプチドから精製される：SP-SepharoseO又はCM-SepharoseO等のイオン交換カラムでの分画；ヒドロキシアパタイト；疎水性相互作用クロマトグラフィー；エタノール沈殿；クロマトフォーカシング；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックス(登録商標)Ｇ-７５を用いるゲル濾過；及び／又はダイアフィルトレーション。
組換えポリペプチドは、例えばアフィニティークロマトグラフィーにより単離できる。
【０１２０】
またフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）のようなプロテアーゼ阻害剤は、精製の間のタンパク質分解を抑制するのに役立ち、抗生物質は付随する汚染物質の増加を防ぐことを包含しうる。当該分野の技術者は、抗体を含む組換えタンパク質の精製及び単離のために適切な精製方法が、ここで使用されることができ、必要であれば標準的な技術を使用して修飾されることを理解しているであろう。
【０１２１】
遺伝子発現は、ここに提供される配列に基づき、適切な標識プローブを使用し、例えば一般的なサザンブロッティング、mRNAの転写を定量化するための簡便なノーザンブロッティング(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980, 77:5201-5205)、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、又はin situハイブリダイゼーションによって、直接に試料から測定することができる。種々の標識、最も一般的には、放射性同位元素、特に３２Ｐを用いることができる。しかしながら、ポリヌクレオチドへの導入にビオチン-修飾ヌクレオチドを利用すること等、他の技術も用いることができる。ビオチンは、次いで、アビジン又は抗体への結合ための部位として機能し、それは、放射性核種、蛍光剤、酵素等の幅広い標識で標識することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ‐ＲＮＡハイブリッド二本鎖、又はＤＮＡ-タンパク質二本鎖を含む特定の二本鎖を認識することができる抗体が使用されうる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【０１２２】
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。免疫組織化学的染色技術では、細胞試料を、典型的には脱水と固定によって調製し、結合した遺伝子産物に対し特異的な標識化抗体と反応させるが、この標識は通常は視覚的に検出可能であり、例えば酵素的標識、蛍光標識、又はルミネサンス標識等である。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。
【０１２３】
２．抗体
好ましい実施態様では、本発明の方法は、治療用抗体及び診断用抗体を含む抗体の組換え生産のために使用される。本発明の範囲である抗体は、限定するものではないが：抗ＨＥＲ２抗体、トラスツズマブ（HERCEPTIN（登録商標））を含む (Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992),米国特許第5,725,856号)；抗ＣＤ２０抗体、米国特許第5,736,137号 に記載のキメラ抗ＣＤ２０「Ｃ２Ｂ８」(RITUXAN（登録商標）)、米国特許第5,721,108B1号に記載の２Ｈ７抗体のキメラ又はヒト化変異体又はトシツモマブ(BEXXAR（登録商標）)；抗ＩＬ-８ (St John等, Chest, 103:932 (1993),及びInternational Publication No. WO 95/23865)；抗ＶＥＧＦ抗体、ヒト化及び／又は親和性成熟抗ＶＥＧＦ抗体、例えばヒト化抗ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１ AVASTIN（登録商標）を含む（Kim等, Growth Factors, 7:53-64 (1992), International Publication No. WO 96/30046及びWO 98/45331, published October 15, 1998）；抗ＰＳＣＡ抗体(WO01/40309)；抗ＣＤ４０抗体、Ｓ２Ｃ６及びそれらのヒト化変異体を含む(WO00/75348)；抗ＣＤ１１ａ(米国特許第5,622,700号, WO 98/23761, Steppe等, Transplant Intl. 4:3-7 (1991),及びHourmant等, Transplantation 58:377-380 (1994))；抗ＩｇＥ(Presta等, J. Immunol. 151:2623-2632 (1993),及びInternational Publication No. WO 95/19181)；抗ＣＤ１８(米国特許第5,622,700号, issued April 22, 1997、又はWO 97/26912, published July 31, 1997)；抗ＩｇＥ （Ｅ２５、Ｅ２６及びＥ２７を含む；米国特許第5,714,338号, issued February 3, 1998又は米国特許第5,091,313号, issued February 25, 1992, WO 93/04173 published March 4, 1993,又はInternational Application No. PCT/US98/13410 filed June 30, 1998,米国特許第5,714,338号)；抗Ａｐｏ-２受容体抗体(WO 98/51793 published November 19, 1998)；抗ＴＮＦ-α抗体、ｃＡ２（REMICADE(登録商標）)、ＣＤＰ５７１及びＭＡＫ-１９５を含む(米国特許第5,672,347号 issued September 30, 1997, Lorenz等, J. Immunol. 156(4):1646-1653 (1996),及びDhainaut等, Crit. Care Med. 23(9):1461-1469 (1995)を参照)；抗組織因子（ＴＦ）(European Patent No. 0 420 937 B1 granted November 9, 1994)；抗ヒトα4β7インテグリン(WO 98/06248 published February 19, 1998)；抗ＥＧＦＲ(WO 96/40210 published December 19, 1996に記載のキメラ又はヒト化２２５抗体)；抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ３(米国特許第4,515,893 号issued May 7, 1985)；抗ＣＤ２５又は抗ｔａｃ抗体例えばＣＨＩ-６２１(SIMULECT（登録商標）) 及び(ZENAPAX（登録商標）) (米国特許第5,693,762号 issued December 2, 1997を参照)；抗ＣＤ４抗体例えばｃＭ-７４１２抗体 (Choy等, Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996))；抗ＣＤ５２抗体、例えばＣＡＭＰＡＴＨ-１Ｈ (Riechmann等, Nature 332:323-337 (1988))；抗Ｆｃ受容体抗体、例えばＦｃγＲＩに向けられたＭ２２抗体、Graziano等, J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995)に記載される；抗癌胎児抗原（ＣＥＡ）抗体、例えばｈＭＮ-１４(Sharkey等, Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s (1995)；胸部上皮細胞に対する抗体、ｈｕＢｒＥ-３、ｈｕ-Ｍｃ ３及びＣＨＬ６を含む (Ceriani等, Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995);及びRichman等, Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995))；結腸癌細胞に結合する抗体、例えばＣ２４２(Litton等, Eur J. Immunol. 26(1):1-9 (1996))；抗CD38抗体、例えばＡＴ １３／５ (Ellis等, J. Immunol. 155(2):925-937 (1995))；抗ＣＤ３３抗体、例えばＨｕ Ｍ１９５(Jurcic等, Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s (1995)及びＣＭＡ-６７６又はＣＤＰ７７１；抗CD22抗体、例えばLL2又はLymphoCide (Juweid等, Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s (1995))；抗ＥｐＣＡＭ抗体、例えば17-1A (PANOREX（���録商標）)；抗GpIIb/IIIa抗体、例えばアブシキシマブ又はｃ７Ｅ３ Ｆａｂ (REOPRO（登録商標））；抗ＲＳＶ抗体、例えばＭＥＤＩ-４９３ (SYNAGIS（登録商標）)；抗ＣＭＶ抗体、例えばPROTOVIR（登録商標）；抗ＨＩＶ抗体、例えばＰＲＯ５４２；抗肝炎抗体、例えば抗Ｈｅｐ Ｂ抗体 OSTAVIR（登録商標）；抗ＣＡ １２５抗体OvaRex；抗イディオタイプＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２；抗αvβ3抗体VITAXIN（登録商標）；抗ヒト腎細胞癌抗体、例えばｃｈ-Ｇ２５０；ＩＮＧ-１；抗ヒト１７-１Ａ抗体（３６２２Ｗ９４）；抗ヒト直腸結腸腫瘍抗体（Ａ３３）；ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒト黒色腫抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮癌（ＳＦ-２５）；及び抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体、例えばＳｍａｒｔ ＩＤ１０及び抗ＨＬＡ ＤＲ抗体Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ-１）を含む。ここに記載の抗体のための好まし標的抗原は：ＨＥＲ２受容体、ＶＥＧＦ、ＩｇＥ、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、及びＣＤ４０である。これらの抗体の多くは、癌を含む様々な疾患を治療するために診療において広く使用される。
ある特定の実施態様では、本発明の方法は、以下の抗体及び組換えタンパク質の生産のために使用される。
【０１２４】
抗ＣＤ２０抗体
リツキシマブ(リツキサン(RITUXAN)(登録商標))抗体は、ＣＤ２０抗原に対する遺伝子的操作が施されたキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体である。リツキシマブは１９９８年４月７日に発行された米国特許第５７３６１３７号(Anderson等)において「Ｃ２Ｂ８」と呼ばれている抗体である。リツキシマブは、再発性又は難治性低悪性度又は濾胞性(follicular)の、ＣＤ２０陽性、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の患者の治療のためのものである。インビトロ作用機序の研究では、リツキシマブは、ヒト補体に結合し、補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)を介してリンパ系Ｂ細胞系統を溶解することが実証されている（Reff等, Blood 83(2):435-445 (1994)）。また、それは抗体依存性細胞性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)に対するアッセイで有意な活性を有している。より最近では、リツキシマブはトリチウム標識チミジン取り込みアッセイにおいて抗増殖効果を有しており、アポトーシスを直接誘導することが示されたが、他の抗ＣＤ１９及びＣＤ２０抗体は誘導しない(Maloney等, Blood 88:637a (1996))。リツキシマブ及び化学療法剤及び毒素間の相乗効果もまた実験的に観察されている。特に、リツキシマブは、ドキソルビシン、ＣＤＤＰ、ＶＰ-１６、ジフテリア毒素及びリシンの細胞傷害性効果に対する薬物耐性ヒトＢ細胞リンパ腫細胞系の感受性を高める(Demidem等 Cancer Chemotherapy &amp; Radiopharmaceuticals 12(3):177-186 (1997))。インビボ前臨床研究では、リツキシマブが、おそらくは補体及び細胞媒介プロセスを介してカニクイザルの末梢血、リンパ節及び骨髄のＢ細胞を減少させることが示されている（Reff等 Blood 83(2):435-445 (1994)）。
【０１２５】
ＣＤ２０抗体に関する特許及び特許出願は、米国特許第5,776,456号、同第5,736,137号、同第6,399,061号、及び同第5,843,439号、並びに米国特許出願公開第US 2002/0197255A1号、同第US 2003/0021781A1号、同第US 2003/0082172 A1号、同第US 2003/0095963 A1号、同第US 2003/0147885 A1号(Anderson等)；米国特許第6,455,043B1号及びWO00/09160(Grillo-Lopez, A.)；WO00/27428(Grillo-Lopez and White)；WO00/27433(Grillo-Lopez and Leonard)；WO00/44788(Braslawsky等)；WO01/10462(Rastetter, W.);WO01/10461(Rastetter and White)；WO01/10460(White and Grillo-Lopez)；米国特許出願公開第US2002/0006404号及びWO02/04021(Hanna and Hariharan)；米国特許出願公開第US2002/0012665 A1号及びWO01/74388(Hanna, N.)；米国特許出願公開第US 2002/0058029 A1号(Hanna, N.)；米国特許出願公開第US 2003/0103971 A1号(Hariharan and Hanna)；米国特許出願公開第US2002/0009444A1号及びWO01/80884(Grillo-Lopez, A.)；WO01/97858(White, C.)；米国特許出願公開第US2002/0128488A1号及びWO02/34790(Reff, M.)；W)02/060955(Braslawsky等)；WO2/096948(Braslawsky等)；WO02/079255(Reff and Davies)；米国特許第6,171,586B1号、及びWO98/56418(Lam等)；WO98/58964(Raju, S.)；WO99/22764(Raju, S.)；WO99/51642、米国特許第6,194,551B1号、米国特許第6,242,195B1号、米国特許第6,528,624B1号、及び米国特許第6,538,124号(Idusogie等)；WO00/42072(Presta, L.)；WO00/67796(Curd等)；WO01/03734(Grillo-Lopez等)；米国特許出願公開第US 2002/0004587A1号及びWO01/77342(Miller and Presta)；米国特許出願公開第US2002/0197256号(Grewal, I.)；米国特許出願公開第US 2003/0157108 A1号(Presta, L.)；米国特許第6,090,365B1号、同第6,287,537B1号、同第6,015,542号、同第5,843,398号、及び同第5,595,721号、(Kaminski等)；米国特許第5,500,362号、同第5,677,180号、同第5,721,108号、及び同第6,120,767(Robinson等)号；米国特許第6,410,391B1(Raubitschek等)；米国特許第6,224,866B1及びWO00/20864(Barbera-Guillem, E.)；WO01/13945(Barbera-Guillem, E.)；WO00/67795(Goldenberg)；米国特許出願公開第US 2003/01339301 A1号及びWO00/74718(Goldenberg and Hansen)；WO00/76542(Golay等)；WO01/72333(Wolin and Rosenblatt)；米国特許第6,368,596B1 号(Ghetie等)；米国特許出願公開第US2002/0041847 A1号,(Goldenberg, D.)；米国特許出願公開第US2003/0026801A1 号(Weiner and Hartmann)；WO02/102312(Engleman, E.)；米国特許出願公開第2003/0068664号(Albitar等)；WO03/002607(Leung, S.)；WO 03/049694及びUS 2003/0185796 A1(Wolin等)；WO03/061694(Sing and Siegall)；US 2003/0219818 A1(Bohen等)；US 2003/0219433 A1及びWO 03/068821(Hansen等)を含み、各々を出典明記により本明細書中に援用する。また、米国特許第5,849,898号及び欧州出願公開第330,191号(Seed等)；米国特許第4,861,579号及びEP332,865A2(Meyer and Weiss)；米国特許第4,861,579号(Meyer等)及びWO95/03770 (Bhat等)も参照のこと。
【０１２６】
リツキシマブを用いた治療に関する刊行物は： Perotta and Abuel "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab" Abstract # 3360 Blood 10(1)(part 1-2): p. 88B (1998); Stashi等, "Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathic thrombocytopenic purpura" Blood 98(4):952-957 (2001); Matthews, R. "Medical Heretics" New Scientist (7 Apr., 2001); Leandro等, "Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion" Ann Rheum Dis 61:833-888 (2002); Leandro等, "Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response. Arthritis & Rheumatism 44(9): S370 (2001); Leandro等, "An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus", Arthritis & Rheumatism 46(1):2673-2677 (2002); Edwards and Cambridge "Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes" Rheumatology 40:205-211 (2001); Edwards等, "B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders" Biochem. Soc. Trans. 30(4):824-828 (2002); Edwards等, "Efficacy and safety of Rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatism 46(9): S197 (2002); Levine and Pestronk "IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab" Neurology 52: 1701-1704 (1999); DeVita等, "Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheumatism 46:2029-2033 (2002); Hidashida等, "Treatment of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis with rituximab." Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; October 24-29; New Orleans, La. 2002; Tuscano, J. "Successful treatment of Infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab" Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; October 24-29; New Orleans, La. 2002. Sarwal等, N. Eng. J. Med. 349(2):125-138 (July 10, 2003) reports molecular heterogeneity in acute renal allograft rejection identified by DNA microarray profilingを含む。
【０１２７】
様々な実施態様において、本発明はヒト化抗ＣＤ２０抗体を含んで成る医薬品組成物を提供する。ある実施態様では、本発明のヒト化抗体組成物は更に、ＩｇＧ Ｆｃにアミノ酸改変を含み、野生型ＩｇＧ Ｆｃを持つ抗体に対し、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１２５倍、更により好ましくは少なくとも１５０倍から約１７０倍のヒトＦｃＲｎに対する増加された結合親和性を呈する。
【０１２８】
ＩｇＧのＮグリコシル化部位はＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７である。本発明のヒト化抗体組成物はＦｃ領域を有する先のヒト化抗体の何れかの組成物を含み、組成物中の抗体の約８０−１００％（好ましくは約９０−９９％）はフコースを欠損し、糖タンパク質のＦｃ領域に結合した成熟コア炭水化物構造を含む。このような組成物はヒトＩｇＧと相互作用する際にＦｃ（ＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）ほど効果的ではないが、Ｆｃ（ＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）への結合を驚くほど改善することがここで証明された。Ｆｃ（ＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）は正常で健康なアフリカ系アメリカ人及びコーカサス人において、Ｆｃ（ＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）より一般的である。Lehrnbecher等 Blood 94:4220 (1999)参照。歴史的には、最も一般的に使用される工業的宿主の一つであるチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)において生産された抗体は、約２から６％をフコシル化されていない集団に含む。YB2/0及びLec13は、しかしながら、78から98%の非フコシル化種を持つ抗体を生産できる。Shinkawa等 J Bio. Chem. 278 (5), 3466-347 (2003)は、ＹＢ２／０及びＬｅｃ１３細胞で生産された抗体は、少ないＦＵＴ８活性を有し、インビトロで有意に増加したＡＤＣＣ活性を示すことを報告している。減少したフコース量の抗体の生産はまた例えばLi等, (GlycoFi) 「Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris」Nature Biologyオンライン刊行物 22 Jan. 2006；Niwa R.等, Cancer Res. 64(6):2127-2133 (2004)；米国出願公開第2003/0157108号(Presta)；米国特許第6602684号及び米国出願公開第2003/0175884号 (Glycart Biotechnology)；米国出願公開第2004/0093621号、米国出願公開第2004/0110704号、米国出願公開第2004/0132140号(全て協和発酵工業)に記載されている。
【０１２９】
二重特異性ヒト化抗体は、抗体の一アームが少なくとも本発明のヒト化抗体のＨ及び／又はＬ鎖の抗原結合領域を有し、他方のアームが第二の抗原に対するＶ領域結合特異性を有する。特定の実施態様では、抗原は、ＣＤ-２０、ＣＤ３、ＣＤ６４、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ又は他のＮＫ活性化リガンドから成る群から選択される。
【０１３０】
抗ＨＥＲ２抗体
マウスＨＥＲ２抗体４Ｄ５の組換えヒト化型（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８、ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２、トラスツズマブ又はハーセプチン(登録商標)；米国特許第５８２１３３７号）は、広範な抗癌治療を先に受けたＨＥＲ２過剰発現転移性乳癌を持つ患者において臨床的に活性である（Baselga等, J. Clin. Oncol. 14:737-744(1996)）。トラスツズマブは、腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現する転移性乳癌を有する患者の治療のために、１９９８年９月２５日、食品医薬品局から販売認可を受けた。２００６年１１月に、ＦＤＡは、ＨＥＲ２陽性、節陽性乳癌の患者のアジュバント治療に対し、ドキソルビシン、シクロホスファミド及びパクリタキセルを有する治療計画の一部としてハーセプチンを承認した。
【０１３１】
様々な実施態様において、本発明は、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体を含んで成る医薬品組成物を提供する。様々な特性を有するＨＥＲ２抗体が、Tagliabue等, Int. J. Cancer 47:933-937 (1991); McKenzie等, Oncogene 4:543-548 (1989); Maier等, Cancer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus等, Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski等, PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus等, Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu等, Int. J. Cancer 53:401-408 (1993); WO94/00136; Kasprzyk等, Cancer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock等, Cancer Res. 51:4575-4580 (1991); Shawver等, Cancer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteaga等, Cancer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth等, J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992);米国特許5,783,186号;及びKlapper等, Oncogene 14:2099-2109 (1997)に記述されている。
【０１３２】
抗ＶＥＧＦ抗体
ヒト抗ＶＥＧＦ抗体huA4.6.1 AVASTIN（登録商標）等、ヒト化及び／又は親和性成熟抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体(Kim等, Growth Factors, 7:53-64 (1992), International Publication No. WO 96/30046及びWO 98/45331, published October 15, 1998)が、癌の治療に対しＦＤＡに承認された。様々な実施態様において、本発明はヒト化抗ＶＥＧＦ抗体を含んでなる医薬品組成物を提供する。
【０１３３】
抗ＣＤ１１ａ抗体
ヒト化抗ＣＤ１１ａ抗体エファリズマブ又はＲａｐｔｉｖａ（登録商標）（米国特許第6,037,454号）は、乾癬の治療のための処置として、２００３年１０月２７日に食品医薬品局から販売認可を受けた。一実施態様は、抗ヒトＣＤ１１ａ抗体を含んでなる医薬品組成物を提供する。
【０１３４】
Ａｐｏｍａｂ抗体
ＤＲ５受容体（抗ＤＲ５）抗体に対する抗体がまた、本発明に従い生成されることができる。このような抗ＤＲ５抗体は、具体的にはPCT公開番号WO 2006/083971に開示される全ての抗体変異体を含み、例えばＡｐｏｍａｂ１．１、２．１、３．１、４．１、５．１、５．２、５．３、６．１、６．２、６．３、７．１、７．２、７．３、８．１、８．３、９．１、１．２、２．２、３．２、４．２、５．２、６．２、７．２、８．２、９．２、１．３、２．２、３．３、４．３、５．３、６．３、７．３、８．３、９．３、及び２５．３と称される抗ＤＲ５抗体、特にＡｐｏｍａｂ８．３及びＡｐｏｍａｂ７．３、好ましくはＡｐｏｍａｂ７．３等である。WO2006/083971の内容は出典明記によりその全体を本明細書中に援用する。Ａｐｏｍａｂは、完全ヒトモノクローナル抗体であり、典型的にはアポトーシスを誘導するよう設計されたＤＲ５標的のアポトーシス促進受容体アゴニスト（ＰＡＲＡ）である。アポトーシスは天然過程であり、癌性のものを含め損傷した又は不必要な細胞が死に、体から除去される。アポトーシス促進受容体ＤＲ５は広範囲の悪性において発現される。
【０１３５】
抗ＢＲ３抗体及びイムノアドヘシン
ＢＲ３（抗ＢＲ３）抗体に対する抗体及びＢＲ３-Ｆｃイムノアドヘシンが、本発明により生産されることができる。このような抗ＢＲ３抗体及びイムノアドヘシンは具体的には米国特許出願公開第20050070689号に開示される全ての変異体を含む。米国特許出願公開第20050070689号の全内容は出典明記によりその全体を本明細書中に援用する。
【０１３６】
３．抗体の組換え生産の一般的な方法
ここに記載される抗体及び他の組換えタンパク質は、組換えＤＮＡ技術の周知の技術により生産されることができる。従って、上記に特に特定した抗体に加え、熟練した技術者は、興味の抗原に対する抗体を例えば下記技術を用いて生成することができる。
【０１３７】
抗原の選択及び調製
ここに記載の抗体は、興味の抗原に向けられる。好ましくは抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患又は障害を患っている哺乳動物への抗体の投与はその哺乳動物において治療的利点となることができる。しかしながら、非ポリペプチド抗原（例えば腫瘍関連糖脂質抗原；米国特許5,091,178を参照）に向けられる抗体も考慮される。抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通分子（例えば受容体）又はリガンド例えば増殖因子等でありうる。例示的な抗原は、下記セクション（３）に記載されるそれらのタンパク質を含む。本発明により包含される抗体に対する例示的な分子標的は、ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０；ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー、例えばＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４受容体；細胞接着分子、ＬＦＡ-１、Ｍａｃ１、ｐ１５０，９５、ＶＬＡ-４、ＩＣＡＭ-１、ＶＣＡＭ及びαｖ／β３インテグリン（それらのα又はβサブユニットを含む（例えば抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体））；増殖因子、ＶＥＧＦ等；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ-４；プロテインＣ、又はここに記載する他の抗原の何れかを含む。上に挙げた抗体に対する抗原は特にここに記載の範囲内に含まれる。
【０１３８】
場合によっては他の分子にコンジュゲートされる溶質抗原又はそれらの断片は、抗体を生成するための免疫原として使われることができる。受容体等の膜貫通分子に対して、それらの断片（例えば受容体の細胞外ドメイン）が免疫原として使用されることができる。あるいは、膜貫通分子を発現している細胞が免疫原として使用されることができる。このような細胞は、天然源（例えば癌細胞株）に由来することが可能であり、又は組換え型技術によって膜貫通分子を発現するよう形質変換された細胞でありうる。
他の抗原及び抗体を調製するのに有用なそれらの形態は、当技術分野のものにとって明瞭であろう。
【０１３９】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは関連抗原及びアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射により動物において産生させる。関連抗原を、二官能性又は誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通したコンジュゲーション）、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を通した）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣＩ２、又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここで、Ｒ及びＲ１は異なったアルキル基である）を使用して、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン又は大豆トリプシン阻害剤に結合させるのが有用でありうる。
【０１４０】
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ（それぞれウサギ又はマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は同じ抗原のコンジュゲートで追加免疫されるが、異なるタンパク質に及び／又は異なる架橋試薬によってコンジュゲートされる。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【０１４１】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作成することができる。
【０１４２】
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。免疫化の後、リンパ球を単離し、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
【０１４３】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ-欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【０１４４】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、ＨＡＴ培地等の培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫株、例えばSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手可能なＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びAmerican Type Culture Collection, Rockville, Maryland USAから入手可能なＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞等。ヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために記述されている(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【０１４５】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって決定される。
【０１４６】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、ハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【０１４７】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡセファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培地又は腹水液から分離又は精製される。好ましくは、ここに記載されるプロテインＡセファロース法が使用される。
【０１４８】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な手順（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブの使用による）を使用して、直ぐに単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好適な入手源となる。ひとたび分離されれば、ＤＮＡは発現ベクター中に配され、組換え宿主細胞中におけるモノクローナル抗体の合成を達成するために、例えば、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、あるいは骨髄腫細胞で免疫グロブリンタンパク質を他の形で産生しないもののような宿主細胞中へ形質移入される。
ＤＮＡはまた例えば相同のマウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインをコード配列に置換することにより（米国特許第４８１６５６７号; Morrisonら, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)）、あるいは非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全て又は一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合で連結することによって、改変することができる。
【０１４９】
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【０１５０】
更なる実施態様では、モノクローナル抗体は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載されている技術を使用して作製される抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用する、マウス及びヒト抗体の単離をそれぞれ記載している。次の刊行物は、鎖シャッフリング(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783 (1992))、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993))による高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の生産を記載している。よって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なハイブリドーマ法に対する実行可能な代替手段である。
【０１５１】
ヒト化及びヒト抗体
ヒト化抗体には非ヒトである供給源由来の一又は複数のアミノ酸残基がそこに導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的には齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988))に従って実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には幾らかのＣＤＲ残基と場合によっては幾らかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１５２】
ヒト化抗体の作製に使用されるヒト可変ドメインの選択は、軽鎖及び重鎖何れも、抗原性を減らすために重要である。いわゆる「ベストフィット」方法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。ついで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトＦＲとして受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993))。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列から得られた特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta等, J. Immnol., 151:2623 (1993)）。
【０１５３】
更には、抗体は、抗原に対する高い親和性及びその他の望ましい生物学的特性を保持してヒト化されることが一般に好ましい。この目的を達成するために、一方法では、親の配列及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念上のヒト化産物を分析するプロセスにより、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者に周知である。選択された候補免疫グロブリン配列の、ありそうな三次元立体配置的構造を図解し表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を検査することにより、候補免疫グロブリン配列が機能する際に残基が果たすと思われる役割を分析することができ、つまり候補免疫グロブリンの、その抗原に対する結合能に影響する残基を分析することができる。このように、レシピエント及び重要な配列からＦＲ残基を選択して組み合わせることにより、所望の抗体特性、例えば標的とする抗原に対する親和性の増大を達成することができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原の結合に対する影響に、直接的にかつ最も実質的に関わっている。
【０１５４】
別法として、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。例えばJakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann等, Year in Immuno., 7:33 (1993);及びDuchosal等, Nature 355:258 (1992)を参照。ヒト抗体はまたファージディスプレイライブラリーから誘導することもできる (Hoogenboom等, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan等, Nature Biotech 14:309 (1996)）。
【０１５５】
抗体断片
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) and Brennan等, Science, 229:81 (1985)を参照)。しかし、これらの断片は今は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167 (1992))。他のアプローチ法では、Ｆ（ａｂ’）２断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第93/16185号を参照。
【０１５６】
多重特異性抗体
多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する。このような分子は通常は二つの抗原を結合させるのみであるが(すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂｓ)、三重特異性抗体のような更なる特異性を持つ抗体もここで使用される場合この表現に包含される。
【０１５７】
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において知られている。完全長二重特異性抗体の伝統的な生産は、二つの鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖軽鎖対の同時発現に基づく（Milstein等, Nature, 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成されるが、かなり面倒であり、生成物収率は低い。同様の手順が国際公開第93/08829号、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-36569(1991)に開示されている。
【０１５８】
W096/27011に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより、大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１５９】
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体もまた含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞を標的化するため（米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために提案された（WO 91/00360, WO 92/200373,及びEP 03089）。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、多くの架橋技術と共に米国特許第4676980号に開示されている。
【０１６０】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) はインタクトな抗体をタンパク分解性に切断してＦ（ａｂ’）２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再変換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【０１６１】
細菌の進歩は大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片を直接回収することを容易にし、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このように形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現している細胞及び正常ヒトＴ細胞との結合、並びにヒト胸部腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発することが可能であった。
【０１６２】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し単離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成する。この方法はまた抗体ホモ二量体の生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。該断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーによりＶＬにＶＨを結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照。あるいは、抗体は、Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載されるような「線状抗体」でありえる。簡潔には、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対の直列型のＦｄ区分（ＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１）を含む。線状抗体は二重特異性又は単一特異性でありえる。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１６３】
イムノアドヘシン
最も簡単で最も直接的なイムノアドヘシンの設計は、アドヘシンの結合ドメイン(例えば、受容体の細胞外ドメイン(ＥＣＤ))を免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域と組み合わせるものである。通常は、本発明のイムノアドヘシンを調製する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸を、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸にＣ末端的に融合されるが、Ｎ末端融合もまた可能である。
典型的には、そのような融合において、コード化されるキメラポリペプチドは免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持する。融合はまた定常ドメインのＦｃ領域のＣ末端、又は重鎖のＣＨ１又は軽鎖の対応する領域にＮ末端に直ぐになされる。融合がなされる正確な部位は重要なものではない；特定の部位がよく知られており、イムノアドヘシンの生物学的活性、分泌、又は結合特性を最適化するために選択されうる。
【０１６４】
好適な実施態様では、アドヘシン配列が免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃ領域のＮ末端に融合される。アドヘシン配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、ＩｇＧのＦｃを化学的に定めるパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４として残基２１６）、又は他の免疫グロブリンの類似部位が融合において使用される。特に好適な実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列はＩｇＧ重鎖の（ａ）ヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３又は（ｂ）ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合される。
【０１６５】
二重特異的イムノアドヘシンについては、イムノアドヘシンは多量体として、特にヘテロ二量体又はヘテロ四量体として組み立てられる。一般には、これらの組み立てられた免疫グロブリンは既知の単位構造を有している。基本的な四鎖構造単位はＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥが存在する型である。四鎖単位はより高分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される；ＩｇＭは一般にジスルフィド結合によって一緒に保持される四つの基本単位の五量体として存在する。ＩｇＡグロブリン、そして時折ＩｇＧグロブリンが血清中に多量体型で存在しうる。多量体の場合、四つの単位の各々は同じでも異なっていてもよい。
【０１６６】
ここに記載した範囲内の様々な組み立てられたイムノアドヘシンの例は以下に概略的に模式化される：
ＡＣＬ-ＡＣＬ；
ＡＣＨ-（ＡＣＨ、ＡＣＬ-ＡＣＨ、ＡＣＬ-ＶＨＣＨ、又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ）；
ＡＣＬ-ＡＣＨ-（ＡＣＬ-ＡＣＨ、ＡＣＬ-ＶＨＣＨ、ＶＬＣＬ-ＡＣＨ、又はＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ）
ＡＣＬ-ＶＨＣＨ-（ＡＣＨ、又はＡＣＬ-ＶＨＣＨ、又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ）；
ＶＬＣＬ-ＡＣＨ-（ＡＣＬ-ＶＨＣＨ、又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ）；及び
（Ａ-Ｙ）ｎ-（ＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ）２、
ここで、各Ａは同一又は異なったアドヘシンアミノ酸配列を示し；
ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ｎは１より大きい整数であり；
Ｙは共有結合架橋剤の残基を示す。
【０１６７】
簡潔のため、先の構造はキーとなる特徴を示しているのみである；これらは、免疫グロブリンの結合する(Ｊ)又は他のドメインを示していないしジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子にそれらが占める通常の位置に存在させることができる。
あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の３’末端に、ヒンジとＣＨ２ドメインの間、又はＣＨ２とＣＨ３ドメインの間の何れかで融合される。同様な作成物がHoogenboom等,Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
【０１６８】
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖はアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、アドヘシンに直接的に融合されるかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは典型的にはアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時発現される。分泌時に雑種重鎖及び軽鎖が共有結合的に結合されて、二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造を提供する。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば1989年3月28日に発行された米国特許第4,816,567号に開示されている。
【０１６９】
イムノアドヘシンは最も簡便には免疫グロブリンｃＤＮＡ配列にインフレームでアドヘシン部分をコードするｃＤＮＡ配列を融合させることにより構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合もまた使用することができる(例えば、Aruffo等,Cell61:1303-1313(1990)；及びStamenkovic等,Cell66:1133-1144(1991)を参照)。融合の後者のタイプは、発現に対してＩｇ調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、脾臓又は抹消血リンパ球から取り出されたｃＤＮＡライブラリーからの刊行された配列に基づいて、ハイブリダイゼーションにより、又はポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)法により単離することができる。「アドヘシン」をコードするｃＤＮＡとイムノアドヘシンの免疫グロブリンが、選ばれた宿主細胞において効率的な発現を指示するプラスミドベクター内にタンデムに挿入される。
【０１７０】
本発明の更なる詳細は、以下の非制限的な実施例において提供される。
全ての特許、特許出願、刊行物、産物説明及びプロトコルが本出願の全体にわたって引用され、その開示は出典明記によりその全体を本明細書中に援用する。
【０１７１】
実施例
以下の実施例は、図示する目的のみに対して提供され、いかなる形であれ本発明の範囲を制限することを目的としない。実施例において示される市販の試薬は、特に明記しない限り製造業者の指示に従って用いられた。以下の実施例及び明細書中を通してＡＴＣＣＲ受入番号により明記されるそれらの細胞の供給源は、American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaである。
【０１７２】
実施例1
グルタミンフリー生産培地におけるポリペプチドの生産
材料及び方法：
細胞株。これらの研究において、Ａｐｏｍａｂ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体及び融合タンパクＢＲ３-Ｆｃをそれぞれ発現するＣＨＯ宿主細胞を使用した。宿主細胞を懸濁液及び無血清培養に適用した。マスター又はワーキング・セル・バンクとして冷凍ストックを下記の培地において調製した。
３７ｏＣ及び５％ＣＯ２に維持されたThermo Scientific Forma（登録商標）reach-in CO2加湿インキュベーターにおいて、２５０ｍＬ又は１ＬのCorning（登録商標）ベント付振とうフラスコを使用して細胞株を維持した。フラスコを、カスタムメイドのアルミニウム基質プラットフォームを用いたNew Brunswick Scientific Innova（登録商標）-2100 platform shaker上で１５０ｒｐｍの速度で攪拌した。細胞培養物を新鮮な培地を用いて３又は４日ごとに継代し、０．１１％又は０．２０％の血中血球容積（ＰＣＶ）で播種した。ＰＣＶは１０-ｍＬのガラス KIMAX（登録商標）USA ＰＣＶ管を用いて得られた。
【０１７３】
培養培地及び状態。培地研究は一分割、二分割、又は分割で播種された２５０ｍＬのCorningのベント付振とうフラスコを使用して、０．２０％ＰＣＶの１００ｍＬ作動容積で開始され、全ての場合において５００ｍＬ作動容積の１ＬのCorning（登録商標）ベント付き振とうフラスコの供給源からの細胞培養物を使用した。ＰＣＶは１０-ｍＬのガラス KIMAX（登録商標）USA ＰＣＶ管を用いて得られた。
研究開始前に細胞培養物をSorvall（登録商標）RT 6000B遠心分離機で５分間１０００ｒｐｍで遠心分離し、グルタミン含有の播種培地とそれぞれの試験培地との１００％の培地交換を完了した。グルタミン、グルタメート、アスパラギン及びアスパレートの異なる濃度を異なる試験培地で評価した。以下の濃度を試験した：グルタミン０−１０ｍＭ、グルタメート１−１０ｍＭ、アスパラギン０−１５ｍＭ、アスパレート１−１０ｍＭ。培地状態を要因ＤＯＥ分析で評価した。
【０１７４】
グルタミンフリー培地の効果をまた市販のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で試験した。培地を、余分のアスパラギン（全体で１０ｍＭ）、アスパレート（全体で１０ｍＭ）、グルタミン（グルタミン含有培地に対して全部で１０ｍＭ）、グルタメート（全体で１ｍＭ）、及びグルコース（全体で８ｇ／Ｌ）と共に５倍濃度（７．０５ｇ／Ｌ）で使用した。グルタミンフリー及びグルタミン含有培地をＡｐｏｍａｂ及び抗ＶＥＧＦ抗体発現細胞を使用して比較した。
振とうフラスコは、３７°Ｃ及び５％ＣＯ２で維持されたThermo Scientific Forma（登録商標）reach-in ＣＯ２加湿インキュベーターにおいて維持された。フラスコを、カスタムメイドのアルミニウム基質プラットフォームを用いたNew Brunswick Scientific Innova（登録商標）-2100 platform shaker上で１５０ｒｐｍの速度で攪拌した。
2020078307.tif 000002
2020078307.tif 000003
2020078307.tif 000004
播種培養のための培地（産生期とは対照に）を、通常５ｍＭのグルタミン、８ｇ／Ｌのグルコース及び７５-２０００ｎＭメトトレキサート（Methotroxate）で補充した。
研究のためにｐＨ調整を必要に応じて行い、ｐＨ値を１Ｍの炭酸ナトリウムを使用して７．００±０．１０に維持した。ｐＨ値の調整は、ｐＨ単位を０．１０上げるために１ｍＬ／Ｌの１Ｍ炭酸ナトリウムを添加することによって行った。
【０１７５】
細胞培養は、３．５ｍＬのサンプルを採り最高で１４日まで分析し、生細胞数、生存度、及び細胞サイズをBeckman Coulter ViCellTM-1.0 cell counterを使用して分析した。栄養分分析をNova 400 Biomedical Bioprofile（登録商標）を使用して実施した。浸透圧をAdvanced（登録商標）Instrument multi-sample Osmometer (Model 3900)を使用して測定した。組換え産物力価濃度をAgilent 1100 Series HPLCを使用して得た。
組換えタンパク質。生成された組換えタンパク質は、Ａｐｏｍａｂ（TRAIL）、抗ＶＥＧＦ及びイムノアドヘシンＢＲ３-Ｆｃであった。
【０１７６】
データ分析。データの統計解析を、各々は離散可能値又は「レベル」を有する二以上の要因から成り、実験単位はかかる全要因にわたるこれらのレベルの全ての可能な組み合わせをとる実験である要因実験計画法を使用して実行した。要因実験は、完全交差実験とも呼ばれる。このような実験は各要因の応答変数への効果、並びに応答変数への要因間の相互作用の効果の研究を可能にする。
【０１７７】
結果
図１−５に示すように、グルタミンフリー生産培地の使用は、Ａｐｏｍａｂ抗体、ＢＲ３-Ｆｃイムノアドヘシン及び抗ＶＥＧＦ抗体の最終組換えタンパク質力価を増加した。何れの場合においても、グルタミン、グルタメート、アスパラギン及びアスパレートの異なる濃度の効果を評価する要因実験ＤＯＥによる力価結果のキューブプロット分析は、１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたグルタミンフリー培地において最も高い力価が得られることを予測する（図１−３）。
Ａｐｏｍａｂ抗体価へのグルタミンフリー、低グルタメート及び高アスパレート条件下でのアスパラギンの影響を図４に示す。グルタミンフリー培地において、Ａｐｏｍａｂ抗体価は、アスパラギン無しでのグルタミンフリー培地と比較して２．５−１５ｍＭアスパラギンの存在下で著しく増加した。これらの条件下でグルタメートの有無は力価に影響が無かった。
【０１７８】
グルタミンフリー及び低グルタメート条件における様々なアスパラギン及びアスパレート濃度にわたるＡｐｏｍａｂ抗体価生産を図５に示す。これらの条件下でアスパレートを０から１０ｍＭに増加した時、正の滴定効果が観察された。
図６Ａ−Ｃでは、１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたグルタミンフリー培地の力価への効果を示し、Ａｐｏｍａｂ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体及びＢＲ３-Ｆｃイムノアドヘシンの最終力価（それぞれＡ−Ｃ）はグルタミン含有培地と比較してグルタミンフリー培地において著しく高かった。
【０１７９】
類似の結果が市販のＤＭＥＭ／Ｆ-１２培養培地を使用して得られた。図７Ａ及びＢに示すように、Ａｐｏｍａｂ抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体の最終力価（それぞれＡ及びＢ）は、１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたグルタミン含有ＤＭＥＭ Ｆ１２培地と比較して、１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたグルタミンフリーＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において著しく高かった。
【０１８０】
図８及び９に示すように、グルタミンフリー生産培地の使用はまたＱｐ（ｍｇ／ｍＬ-ｃｅｌｌ／ｄａｙ）として決定される比生産性を増加した。図８Ａ−Ｃは、Ａｐｏｍａｂ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体及びＢＲ３-Ｆｃイムノアドヘシンの細胞比生産性（それぞれＡ−Ｃ）が、グルタミン含有培地と比較して１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたグルタミンフリー培地において著しく高いことを示す。図９Ａ及びＢは、Ａｐｏｍａｂ抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体の細胞比生産性（それぞれＡ及びＢ）が、グルタミン含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地と比較して、１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２グルタミンフリー培地において著しく高かったことを示す。
【０１８１】
図１０及び１１に示すように、グルタミンフリー培地の使用は、細胞生存率を改善し培養寿命を著しく延長することを示す。図１０Ａ−Ｃは、Ａｐｏｍａｂ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体及びＢＲ３-Ｆｃイムノアドヘシンの細胞生存率（それぞれＡ−Ｃ）は、グルタミン含有培地と比較して１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたグルタミンフリー培地において高かったことを示す。図１１Ａ及びＢは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において、１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２グルタミンフリー培地の細胞生存率の一貫した改善が無かったことを示す。注意すべきは、生存率はグルタミン含有培地と比較してＡｐｏｍａｂ抗体でより高く（図１１Ａ）、抗ＶＥＧＦ抗体でより低かった（図１１Ｂ）ことである。
【０１８２】
図１２及び１３に示すように、グルタミンフリー生産培地の使用は、グルタミン含有培地と比較してＮＨ４＋の蓄積を著しく低下した。図１２Ａ−Ｃは、アンモニアレベルが通常、グルタミン含有培地と比較して１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたグルタミンフリー培養においてより低かったことを示す。図１３Ａ及びＢは、アンモニアレベルが、グルタミン含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地と比較して、１０ｍＭアスパラギン、１０ｍＭアスパラギン酸及び１ｍＭグルタミン酸で補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２グルタミンフリー培地において著しく低減されたことを示す。
【０１８３】
ここに例証され記載される本発明は、ここに特に開示されていない要素又は要素群、限定又は限定群が存在しない状態で適切に実施することができる。よって、例えば、「含んでなる」、「含んでいる」、「含む」等の用語は、広く限定無しに読まれなければならない。加えて、ここで用いられる用語及び表現は、説明のための用語として使用されているのであって、限定としてではなく、示された発明又はその一部の均等物を排除するためにかかる用語及び表現を使用する意図はないが、様々な変形が請求項記載の発明の範囲内で可能であることが認識される。
【０１８４】
このように、本発明が好ましい実施例および任意の特徴によって特に開示されたが、開示されて本願明細書において実施される本発明の修正変更が当業者によって直ちになされることができ、そして、この種の修正変更が本願明細書において開示される本発明の範囲内であると考慮されると理解されなければならない。
【０１８５】
ここでの発明の記載から、本発明の概念をその範囲から逸脱しないで実施するのに様々な均等物を使用することができることは明らかである。更に、本発明をある実施態様を特に参照して記載したが、当業者であれば、本発明の精神及び範囲から逸脱しないで形態及び詳細を変化させることができることが分かるであろう。記載された実施態様は、あらゆる点で例示的なものであり限定するものではないと考えられる。本発明はここに記載された特定の実施態様に限定されないで、発明の範囲から逸脱しないで多くの均等物、再構成、変更、及び置換が可能になることがまた理解されなければならない。よって、更なる実施態様は本発明の範囲であり次の特許請求の範囲に入る。
【０１８６】
ここに述べた全ての米国特許及び出願；外国特許及び出願；化学的文献；本；及び刊行物は、図面、図及び表を含む各個々の特許又は刊行物が、全体が記載された状態で特にかつ個々に出典明示により援用された旨が示されているかの如く、その全体を出典明記によりここに援用する。
【図１】
2020078307.tif 000005
【図２】
2020078307.tif 000006
【図３】
2020078307.tif 000007
【図４】
2020078307.tif 000008
【図５】
2020078307.tif 000009
【図６Ａ】
2020078307.tif 000010
【図６Ｂ】
2020078307.tif 000011
【図６Ｃ】
2020078307.tif 000012
【図７Ａ】
2020078307.tif 000013
【図７Ｂ】
2020078307.tif 000014
【図８Ａ】
2020078307.tif 000015
【図８Ｂ】
2020078307.tif 000016
【図８Ｃ】
2020078307.tif 000017
【図９Ａ】
2020078307.tif 000018
【図９Ｂ】
2020078307.tif 000019
【図１０Ａ】
2020078307.tif 000020
【図１０Ｂ】
2020078307.tif 000021
【図１０Ｃ】
2020078307.tif 000022
【図１１Ａ】
2020078307.tif 000023
【図１１Ｂ】
2020078307.tif 000024
【図１２Ａ】
2020078307.tif 000025
【図１２Ｂ】
2020078307.tif 000026
【図１２Ｃ】
2020078307.tif 000027
【図１３Ａ】
2020078307.tif 000028
【図１３Ｂ】
2020078307.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月5日(2020.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８６】
ここに述べた全ての米国特許及び出願；外国特許及び出願；化学的文献；本；及び刊行物は、図面、図及び表を含む各個々の特許又は刊行物が、全体が記載された状態で特にかつ個々に出典明示により援用された旨が示されているかの如く、その全体を出典明記によりここに援用する。
＜本発明の更なる実施態様＞
［実施態様１］
ポリペプチドを、該ポリペプチドを発現している哺乳動物宿主細胞において産生する方法において、アスパラギン含有のグルタミンフリー産生培養培地における培養の産生期で哺乳動物宿主細胞を培養することを含んでなる方法。
［実施態様２］
アスパラギンが２．５ｍＭから１５ｍＭの範囲の濃度で添加される実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］
アスパラギンが７．５ｍＭから１０ｍＭの範囲の濃度で添加される実施態様１に記載の方法。
［実施態様４］
アスパラギンが１０ｍＭの濃度で添加される実施態様１に記載の方法。
［実施態様５］
アスパラギンが１０ｍＭの濃度で添加される実施態様１に記載の方法。
［実施態様６］
前記組換え宿主細胞が真核生物宿主細胞である実施態様１に記載の方法。
［実施態様７］
前記真核生物宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である実施態様６に記載の方法。
［実施態様８］
前記哺乳動物宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である実施態様７に記載の方法。
［実施態様９］
哺乳動物宿主細胞がｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞である実施態様８６に記載の方法。
［実施態様１０］
産生培地が無血清である実施態様１に記載の方法。
［実施態様１１］
産生培地が
１）エネルギー源；
２）必須アミノ酸；
３）ビタミン；
４）遊離脂肪酸；及び
５）微量元素
から成る群から選択される一又は複数の成分を含有する実施態様１に記載の方法。
［実施態様１２］
産生培養培地が
１）ホルモン及び他の増殖因子；
２）塩及びバッファー；及び
３）ヌクレオシド
から成る群から選択される一又は複数の成分を更に含有する実施態様１１に記載の方法。
［実施態様１３］
産生期が回分又は流加培養期である実施態様１に記載の方法。
［実施態様１４］
前記ポリペプチドを単離する工程を更に含んでなる実施態様１に記載の方法。
［実施態様１５］
細胞生存度、培養寿命、比生産性及び単離後の最終組換えタンパク質力価の一又は複数を決定することを更に含んでなる実施態様１４に記載の方法。
［実施態様１６］
細胞生存度、培養寿命、比生産性及び最終組換えタンパク質力価の少なくとも一つが、同じ組成のグルタミン含有産生培地で産生される同じポリペプチドと比較して増加される実施態様１５に記載の方法。
［実施態様１７］
ポリペプチドが哺乳動物糖タンパク質である実施態様１に記載の方法。
［実施態様１８］
ポリペプチドが抗体、抗体断片及びイムノアドヘシンからなる群から選択される実施態様１に記載の方法。
［実施態様１９］
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、抗体断片から形成された多重特性抗体から成る群から選択される実施態様１８に記載の方法。
［実施態様２０］
抗体又は抗体断片が、キメラ、ヒト化又はヒトである実施態様１８に記載の方法。
［実施態様２１］
抗体又は抗体断片が、治療用抗体又はそれらの生物学的に機能的な断片である実施態様１８に記載の方法。
［実施態様２２］
前記治療用抗体が、抗ＨＥＲ２抗体 抗ＣＤ２０抗体；抗ＩＬ-８抗体；抗ＶＥＧＦ抗体；抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体；抗ＣＤ１８抗体；抗免疫ＩｇＥ抗体；抗Ａｐｏ-２受容体抗体；抗組織因子（ＴＦ）抗体；抗ヒトα４β７インテグリン抗体；抗ＥＧＦＲ抗体；抗ＣＤ３抗体；抗ＣＤ２５抗体；抗ＣＤ４抗体；抗ＣＤ５２抗体；抗Ｆｃ受容体抗体；抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体；胸部上皮細胞に対する抗体；結腸癌細胞に結合する抗体；抗ＣＤ３８抗体；抗ＣＤ３３抗体；抗ＣＤ２２抗体；抗ＥｐＣＡＭ抗体；抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体；抗ＲＳＶ抗体；抗ＣＭＶ抗体；抗ＨＩＶ抗体；抗肝炎抗体；ＣＡ１２５抗体；抗αｖβ３抗体；抗ヒト腎細胞癌抗体；抗ヒト１７-１Ａ抗体；抗ヒト直腸結腸腫瘍抗体；ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒト黒色腫抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮癌；及び抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体及び抗ＨＬＡ ＤＲ抗体からなる群から選択される実施態様２１に記載の方法。
［実施態様２３］
治療用抗体が、ＨＥＲ受容体、ＶＥＧＦ、ＩｇＥ、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ４０、ＢＲ３又はＤＲ５に結合する抗体である実施態様２１に記載の方法。
［実施態様２４］
前記ＨＥＲ受容体がＨＥＲ１及び／又はＨＥＲ２である実施態様２３に記載の方法。
［実施態様２５］
前記ＨＥＲ受容体がＨＥＲ２である実施態様２４に記載の方法。
［実施態様２６］
前記治療用抗体が、配列番号：１６、１７、１８及び１９から成る群から選択される重及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を有する実施態様２５に記載の方法。
［実施態様２７］
前記治療用抗体がＣＤ２０に結合する抗体である実施態様２３に記載の方法。
［実施態様２８］
前記治療用抗体が、配列番号：１−１５から成る群から選択される重及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を有する実施態様２７に記載の方法。
［実施態様２９］
前記治療用抗体がＶＥＧＦに結合する抗体である実施態様２３に記載の方法。
［実施態様３０］
前記治療用抗体が、配列番号：２０−２５から成る群から選択される重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を有する実施態様２９に記載の方法。
［実施態様３１］
前記治療用抗体がＣＤ１１ａを結合する抗体である実施態様２３に記載の方法。
［実施態様３２］
前記治療用抗体が、配列番号：２６−２９から成る群から選択される重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン配列を有する実施態様３１に記載の方法。
［実施態様３３］
前記治療用抗体がＤＲ５受容体に結合する実施態様２３に記載の方法。
［実施態様３４］
前記治療用抗体が、Ａｐｏｍａｂｓ１．１、２．１、３．１、４．１、５．１、５．２、５．３、６．１、６．２、６．３、７．１、７．２、７．３，８．１、８．３、９．１、１．２、２．２、３．２、４．２、５．２、６．２、７．２、８．２、９．２、１．３、２．２、３．３、４．３、５．３、６．３、７．３、８．３、９．３、及び２５．３から成る群から選択される実施態様３３に記載の方法。
［実施態様３５］
前記治療用抗体がＡｐｏｍａｂ ８．３又はＡｐｏｍａｂ ７．３である実施態様３３に記載の方法。
［実施態様３６］
前記治療用抗体がＡｐｏｍａｂ ７．３である実施態様３５に記載の方法。
［実施態様３７］
前記治療用抗体が抗ＢＲ３抗体又はＢＲ３-Ｆｃイムノアドヘシンである実施態様２３に記載の方法。
［実施態様３８］
前記ポリペプチドが治療用ポリペプチドである実施態様１に記載の方法。
［実施態様３９］
治療用ポリペプチドが、成長ホルモン放出因子、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ-１-アンチトリプシン；インスリンＡ-鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子及びヴォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えばプロテインＣ；心房ナトリウム利尿因子；肺表面活性物質；プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子-α及び-β；エンケファリナーゼ；ランテス（ＲＡＮＴＥＳ(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ-１-α）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；リラキシンＡ-鎖；リラキシンＢ-鎖；プロ・リラキシン；マウス・ゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク、例えばβ‐ラクタマーゼ；デオキシリボヌクレアーゼ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えばＣＴＬＡ-４；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は増殖因子の受容体；プロテインＡ又はＤ；リウマトイド因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン-３、-４、-５又は-６（ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＮＴ-５、ＮＴ-６）、又は神経成長因子、例えばＮＧＦ-β；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子、例えばａＦＧＦ及びｂＦＧＦ；上皮成長因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦアルファ及びＴＧＦベータ、ＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４又はＴＧＦ-β５を含む；インスリン様増殖因子-Ｉ及び-ＩＩ（ＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦＩＩ）；ｄｅｓ（１-３）-ＩＧＦ-Ｉ（脳ＩＧＦ-Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４及びＣＤ４０；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン-α、-β、及び、-γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ及びＧ-ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ-１からＩＬ-１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表層膜タンパク質；崩壊促進因子；ウィルス抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ-４及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４受容体；及び前記ポリペプチドの断片から成る群から選択される実施態様３８に記載の方法。
［実施態様４０］
産生期におけるポリペプチドの産生のための使用準備済のグルタミンフリー細胞培養培地。
【外国語明細書】
2020078307000001.pdf